СПОСОБ СОЗДАНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ ОСТЕОПОРОЗА
METHOD OF PRODUCING EXPERIMENTAL MODEL OF OSTEOPOROSIS

Изобретение относится к области медицины, в частности, экспериментальной медицины при изучении различных состояний организма, связанных с остеопорозом.
Создание модели остеопороза в эксперименте на крупных животных продиктовано необходимостью прогнозирования течения и возможных исходов различных патологических состояний организма (перелом костей скелета, воспалительные процессы внутренних органов, пародонтит) на фоне сопутствующего остеопороза.
Из литературы известны модели экспериментального остеопороза у животных. Как правило, для этих целей используют мышей, крыс, кроликов, собак и морских свинок [1].
Такие модели имеют ряд недостатков.
Основной из них - размер животного. Для полноценной экстраполяции результатов моделирования, полученных у животных, на организм человека, необходимо проведение исследования на сопоставимых по объему тканях в организме, таком, как, например, организм овцы.
Из уровня техники известно, что для создания остеопороза используется введение глюкокортикоидов [2], удаление яичников [3]. Следует отметить, что применение глюкокортикоидов приводит к большому количеству летальных осложнений у небольших по размеру животных, поскольку у них трудно правильно рассчитать необходимую дозировку.
Существуют разработанные схемы применения гормонов у собак и крыс [4]. Использование обоих видов животных затруднено вследствие высокого уровня агрессии при длительном содержании, невозможности использования одних и тех же животных повторно.
В экспериментальной медицине в качестве подопытных животных одними из наиболее широко используемых являются кролики [5].
С рядом преимуществ, например меньшей степенью фенотипического полиморфизма, относительной простотой воспроизведения популяции, низким уровнем агрессии, использование кроликов связано с их высокой смертностью ввиду худшей, по сравнению с крупными животными, переносимостью медикаментозных и хирургических вмешательств [6].
Наиболее оптимальными по воспроизводимости являются модели, в которых используется комбинация удаления яичников и применения глюкокортикоидов. Такая комбинация методов хирургического вмешательства и медикаментозной коррекции позволяет снизить дозу глюкокортикоидов и, следовательно, нивелировать негативные последствия их применения.
Дальнейшее совершенствование методов формирования модели остеопороза возможно по пути снижения инвазии для получения остеопороза при отсутствии летальных исходов (т.е. 100% выживаемости опытных животных), минимизации послеоперационных осложнений, не позволяющих сразу включать животного в исследование, а также возможность полного управления уже сформированной моделью (необратимость искусственно созданных изменений организма, отсутствие «синдрома отмены»).
Наиболее близким по сути и выбранным в качестве прототипа является «Способ создания модели остеопороза у кролика в эксперименте» (патент РФ на изобретение №248084 от 27.04.2013) [7].
Технический результат прототипа (создание модели остеопороза у кролика в эксперименте) достигается путем сочетания различных методов воздействия с разнесением их во времени и постепенного наращивания дозы медикаментозного вмешательства, т.е. кролику проводят одностороннюю овариоэктомию, а затем через 3 дня производят инъекции гидрокортизона по схеме: 1, 14 день 0,1 мл (мг); 2, 3, 12, 13 дни - 0,2 мл (мг); 4-11 дни 0,3 мл (мг). Наступление остеопороза авторы контролируют при помощи рентгеновской денситометрии.
Преимущества метода прототипа: по цифровым показателям индекса плотности костной ткани установлено снижение минеральной плотности костной ткани в результате экспериментального воздействия на фоне короткого по времени периода формирования модели.
Недостатки методики прототипа: летальные исходы в послеоперационном периоде на фоне терапии глюкокортикоидом, требующие исключения животных из исследования и замену их другими особями, что приводит в конечном итоге к удлинению срока формирования модели, ограниченный объем тканей, пригодных для исследования, «синдром отмены» стероидных гормонов.
Поставлена задача: разработать способ создания экспериментальной модели остеопороза, позволяющей исключить летальность подопытных субъектов, получив при этом полноценную (по данным рентгеновской денситометрии) и необратимую (в течение всей жизни животного) модель остеопороза с большим объемом тканей, доступных для исследования.
Поставленная задача решена путем двухсторонней овариоэктомии трехлетних овец Северо-Кавказской породы в сочетании с внутримышечным введением декскаметазона в течение 3 месяцев в дозе 12 мг на 1 кг массы по 6 инъекций в неделю.
Исследование проведено на 10 трехлетних овцах Северо-Кавказской породы. Все животные разделены на 2 группы: основную (6 животных) и контрольную (4 животных).
Способ создания экспериментальной модели остеопороза овец осуществляли следующим образом.
В основной группе под общим наркозом (Zoletil 50) выполняли двухстороннюю овариоэктомию, затем начиная со второго дня после операции в течение 3 месяцев проводили внутримышечные инъекции дексаметазона по 12 мг на 1 кг массы животного по 6 инъекций в неделю.
В контрольной группе под общим наркозом (Zoletil 50) выполняли одностороннюю овариоэктомию, затем через 3 дня производили инъекции гидрокортизона по методике прототипа: 1,14 день 0,1 мл (мг); 2, 3, 12, 13 дни - 0,2 мл (мг); 4-11 дни 0,3 мл (мг).
Экспериментальную модель считали окончательно сформированной при плотности костной ткани нижней челюсти ниже 750 ЕД по шкале Хаунсфилда.
На фигурах изображены отпечатки скриншотов с экрана компьютера при проведении рентгеновской денситометрии овец (выполненной для контроля формирования остеопороза).
Фиг. 1: результаты рентгеновской денситометрии челюстных костей овцы через 3 месяца после начала эксперимента (основная группа).
Фиг. 2: результаты рентгеновской денситометрии челюстных костей овцы через 3 месяца после начала эксперимента (контрольная группа).
Результаты проведенного исследования показали, что в основной группе через 3 месяца плотность костной ткани челюстных костей по шкале Хаунсфилда составила 725 ЕД, а в контрольной группе, где экспериментальная модель сформирована по описанию прототипа, плотность костной ткани челюстных костей по шкале Хаунсфилда составила 925 ЕД.
Обоснование выбора животного.
Северо-Кавказская мясошерстная порода овец выведена в 1958 году в Ставропольском крае учеными Всероссийского НИИ овцеводства и козоводства в результате селекционной работы по выведению породы овец, адаптированной к неблагоприятным условиям проживания (сухой климат, резкие перепады температуры). Северо-Кавказские овцы - животные с крепкой конституцией, крупные (бараны до 100 кг, матки - до 70 кг), высота в холке достигает 75 см. Хорошо выражены мускулы на конечностях и окороках. Ноги средние, крепкие, правильно поставленные. Животные комолые (безрогие). Овцы Северо-Кавказской породы отличаются хорошими нагульными качествами. Среднесуточный прирост на выгуле с подкормкой - 200 грамм. Животное считается взрослым с полностью сформированными органами и тканями, начиная с трехлетнего возраста.
Выбор в качестве экспериментальной модели овцы Северо-Кавказской породы также обусловлен следующими причинами: большой объем пригодных для исследования тканей (костной, мышечной, нервной), простота и экономичность содержания, низкий уровень агрессии животного, типичный вид животных для региона Северного Кавказа, высокий регенераторный потенциал донорских зон, позволяющий в соответствии с законом РФ «О защите животных от жестокого обращения» и Болонской конвенции (1999) не умерщвлять животное при заборе экспериментального материала (мягкие ткани, зубы, фрагменты костей).
Примеры практического использования разработанной модели.
Проведена серия опытов с целью изучения возможности активизации репаративного остеогенеза челюстных костей овец в искусственно созданном дефекте при использовании остеопластических материалов на основе аллогенной кости, пористого титана и β-трикальцийфосфата. При этом в группе овец (n=12) предварительно сформирован экспериментальный остеопороз по разработанному способу. Далее животные поделены на опытную и контрольную группы в зависимости от исследуемого остеопластического материала. На предварительной фазе эксперимента, проведенного по разработанному способу, удалось добиться значимого снижения минеральной плотности костной ткани у всех животных (ниже 750 ЕД по шкале Хаунсфилда). В результате эксперимента летальных исходов в послеоперационном периоде на фоне терапии глюкокортикоидом не отмечено. Исследования завершены успешно, все животные могут быть использованы в исследованиях повторно.
В результате проведенного исследования получена экспериментальная модель остеопороза, наиболее пригодная для исследований в области оперативной хирургии, клеточных технологий, челюстно-лицевой хирургии, травматологии, дентальной имплантологии, пародонтологии, а также для изучения особенностей действия некоторых фармакологических препаратов условиях остеопороза.
Таким образом, в результате практического использования разработанной модели остеопороза получен технический результат, ранее не известный, который будет широко востребован в экспериментальной медицине и фармакологии. Заявляемое изобретение, по мнению авторов, полностью удовлетворяет основным критериям оценки патентоспособности - новизне, воспроизводимости и промышленной применимости.
Заявляемая модель полностью лишена недостатков прототипа, что позволяет исключить летальные исходы в послеоперационном периоде на фоне терапии глюкокортикоидом, предоставляет неограниченный объем тканей, пригодных для научного исследования, позволяет снизить экстремальное влияние стероидных гормонов и предупредить «синдром отмены», а также существенно расширяет границы практической применимости модели по сравнению с прототипом.