НОВЫЕ БИЦИКЛИЧЕСКИЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ПИРРОЛИДИНОВ, ОБЛАДАЮЩИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
NOVEL BICYCLIC PYRROLIDINE DERIVATIVES HAVING ANTIOXIDANT ACTIVITY AND METHOD FOR PRODUCTION THEREOF

Изобретение относится к медицинской и органической химии и медицине, в частности к новым производным пирролидинов, содержащим фрагмент пространственно-затрудненного фенола, общей формулы:
1
2
2
2
2
где R означает Н, Me, Et; R означает Me, Et, i-Pr, i-Bu; Ar означает Ph, 2-HalPh, 3-HalPh, 4-HalPh (где Hal означает F, Cl, Br, I), 2,6-diMePh, 2,3,5,6-tetraFPh, 2-MeOPh, 3-MeOPh, 4-MeOPh, (нафталин-1-ил), (нафталин-2-ил), 2-NOPh, 3-NOPh, 4-NOPh. Соединения обладают антиоксидантной активностью, что позволяет использовать их для снижения скорости пероксидного окисления липидов.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Наиболее близкими аналогами по структуре и биологической активности являются пространственно-затрудненные фенолы [Зайцев В.Г., Островский О.В., Закревский В.И. Связь между химическим строением и мишенью действия как основа классификации антиоксидантов прямого действия. // Экспериментальная и клиническая фармакология. -2003. - Т.66. - №4. - С.66-70], недостатками которых являются либо необходимость использования их в достаточно высоких дозах, поскольку они расходуются в ходе защитных реакций, либо проявление в определенных условиях прооксидантных свойств.
Прототипом патентуемого класса соединений является ионол (2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол) - липофильный препарат, антиоксидантные свойства которого сопряжены с его способностью связывать активные формы и соединения кислорода с образованием стабильного феноксильного радикала, не принимающего участия в цепи окислительных превращений и прерывающего цепи окисления в субстрате [Эмануэль Н.М. Кинетика экспериментальных опухолевых процессов. М.: Наука. - 1977. - 419 с.; Rice-Evans C.A., Diplock A.T. Current status of antioxidant therapy // Free Radical Biol. Med. - 1993. - Vol.15. - P.77-96]. Однако установлено, что продукты окислительной модификации ионола подавляют ферментную антиоксидантную систему, увеличивают образование кислородных радикалов, при применении его в высоких дозах происходит инверсия антиоксидантного действия в прооксидантное.
Техническим результатом, на достижение которого направлено данное изобретение, является получение новых производных пространственно-затрудненного фенола, содержащих пирролидиновый фрагмент, обладающих выраженной пролонгированной антиокеидантной активностью в минимальных концентрациях, увеличение растворимости препаратов в водных средах за счет образования солей между вторичным аминным фрагментом соединений и неорганическими и органическими кислотами, и способ их получения.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Технический результат достигается тем, что предложены производные пирролидинов, содержащие пространственно-затрудненный фенольный фрагмент, общей формулы:
1
2
2
2
2
где R означает Н, Me, Et; R означает Me, Et, i-Pr, i-Bu; Ar означает Ph, 2-HalPh, 3-HalPh, 4-HalPh (где Hal означает F, Cl, Br, I), 2,6-diMePh, 2,3,5,6-tetraFPh, 2-MeOPh, 3-MeOPh, 4-MeOPh, (нафталин-1-ил), (нафталин-2-ил), 2-NOPh, 3-NOPh, 4-NOPh, обладающие пролонгированной антиоксидантной активностью.
Предлагаемое изобретение представлено химической структурой новых соединений класса бициклических производных пирролидина, содержащих пространственно-затрудненный фенольный фрагмент, общей формулы:
1
2
2
2
2
где R означает Н, Me, Et; R означает Me, Et, i-Pr, i-Bu; Ar означает Ph, 2-HalPh, 3-HalPh, 4-HalPh (где Hal означает F, Cl, Br, I), 2,6-diMePh, 2,3,5,6-tetraFPh, 2-MeOPh, 3-MeOPh, 4-MeOPh, (нафталин-1-ил), (нафталин-2-ил), 2-NOPh, 3-NOPh, 4-NOPh, обладающих пролонгированной антиоксидантной активностью.
1
13
Заявляемые соединения представляют собой бесцветные или слабоокрашенные кристаллические вещества, хорошо растворимые в хлористом метилене, хлороформе, тетрагидрофуране, спирте, диметилсульфоксиде. Растворимость в воде может быть достигнута путем солеобразования с эквимолярным количеством неорганических (соляная, серная и др.) или органических (щавелевая, трифторуксусная и др.) кислот. Структура и индивидуальность заявляемых соединений подтверждены элементным анализом, рентгеноструктурным анализом, данными ЯМР Н, ЯМР С, тонкослойной хроматографии.
2. Технический результат достигается также тем, что предложен способ получения ранее не известных производных пирролидина, содержащих фрагмент пространственно-экранированного фенола, общей формулы:
1
2
2
2
2
где R означает Н, Me, Et; R означает Me, Et, i-Pr, i-Bu; Ar означает Ph, 2-HalPh, 3-HalPh, 4-HalPh (где Hal означает F, Cl, Br, I), 2,6-diMePh, 2,3,5,6-tetraFPh, 2-MeOPh, 3-MeOPh, 4-MeOPh, (нафталин-1-ил), (нафталин-2-ил), 2-NOPh, 3-NOPh, 4-NOPh, при котором растворы азометина формулы:
1
2
3
где R означает Н, Me, Et; R означает Me, Et, i-Pr, i-Bu, и соответствующего N-замещенного малеимида смешивают на воздухе и индуцируют их взаимодействие каталитическими количествами N-трет-бутоксикарбонильных производных альфа-аминокислот (глицина, аланина, фенилаланина) с последующим концентрированием органической фазы при пониженном давлении и очисткой остатка при помощи хроматографии на силикагеле с использованием CHCl/МеОН в качестве элюента.
Пример 1. Получение метилового эфира (1S*,3R*,3aS*,6aR*)-3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-5-(2,6-диметилфенил)-1-метил-4,6-диоксооктагидропирроло[3,4-с] пиррол-1-карбоновой кислоты (I)
1
13
3
3
31
40
2
5
К раствору 0.506 г метилового эфира 2-((3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензилиден)амино)пропионовой кислоты в 10 мл хлористого метилена добавляют раствор 0.316 г Н-(2,6-диметилфенил)малеимида и перемешивают при комнатной температуре 15 мин. В реакционную смесь вносят одной порцией 0.030 г N-трет-бутоксикарбонилглицина и перемешивают 48 ч при комнатной температуре. Раствор концентрируют в вакууме и хроматографируют на силикагеле 60, элюент хлороформ/метанол 10:1. Упариванием содержащей продукт реакции фракции получают 0.620 г (76%) заявленного соединения в виде бесцветных кристаллов, т.пл. 126-128°С. Н ЯМР (400 MHz; CDCl): δ 7.22 (s, 2H), 7.16-7.20 (m, 1H), 7.06-7.10 (m, 2H), 5.18 (s, 1H), 4.90 (dd, J 9.1, 9.1, 1H), 3.86 (s, 3H), 3.76 (dd, J 9.1, 7.8, 1H), 3.52 (d, J 7.8, 1H), 2.86 (d, J 9.1, 1H), 2.11 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.72 (s, 3H), 1.45 (s, 18H). С ЯМР (100 MHz; CDCl): δ 174.84, 173.16, 172.73, 153.38, 135.77, 135.47 (2C), 135.32, 130.28, 129.42, 128.50, 128.36, 125.82, 123.53 (2C), 67.76, 62.77, 56.36, 52.79, 50.18, 34.37, 30.29 (3C), 23.81, 18.40, 17.70. Вычислено, % CHNO: С 71.51; Н 7.74; N 5.38. Найдено, %: С 71.58; Н 7.70; N 5.63.
Получено новое бициклическое производное пирролидина, содержащее фрагмент пространственно-экранированного фенола, обладающее выраженной пролонгированной антиоксидантной активностью.
Пример 2. Получение метилового эфира (1S*,3R*,3aS*,6aR*)-3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-1-метил-4,6-диоксо-5-(2,3,5,6-тетрафторфенил)октагидропирроло[3,4-с]пиррол-1-карбоновой кислоты (II)
1
13
3
3
29
32
4
2
5
К раствору 0.497 г метилового эфира 2-((3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензилиден)амино)пропионовой кислоты в 10 мл хлористого метилена добавляют раствор 0.385 г N-(2,3,5,6-тетрафторфенил)малеимида и перемешивают при комнатной температуре 15 мин. В реакционную смесь вносят одной порцией 0.030 г N-трет-бутоксикарбонилаланина и перемешивают 48 ч при комнатной температуре. Раствор концентрируют в вакууме и хроматографируют на силикагеле 60, элюент хлороформ/метанол 10:1. Упариванием содержащей продукт реакции фракции получают 0.476 г (54%) заявленного соединения в виде бесцветных кристаллов, т.пл. 220-222°С. Н ЯМР (400 MHz; CDCl): δ 7.13-7.21 (m, 1H), 7.15 (s, 2H), 5.20 (s, 1H), 4.83 (dd, J 8.8, 8.8, 1Н), 3.86 (s, 3H), 3.76 (dd, J 8.8, 7.8, 1H), 3.56 (d, J 7.8, 1H), 2.86 (d, J 8.8, 1H), 1.69 (s, 3H), 1.43 (s, 18H). C ЯМР (100 MHz; CDCl): δ 172.91, 172.13, 171.14, 153.77, 135.77 (2C), 125.72, 123.70 (4C), 107.61, 107.39 (2C), 107.16, 68.07, 63.66, 56.76, 52.79, 51.28, 34.32, 30.15 (3C), 23.91. Вычислено, % CHFNO: С 61.70; Н 5.71; N 4.96. Найдено, %: С 61.52; Н 5.76; N 5.18.
Получено новое бициклическое производное пирролидина, содержащее фрагмент пространственно-экранированного фенола, обладающее выраженной пролонгированной антиоксидантной активностью.
Пример 3. Получение метилового эфира (1S*,3R*,3aS*,6aR*)-3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-1-метил-4,6-диоксо-5-фенилоктагидропирроло[3,4-с]пиррол-1 -карбоновой кислоты (III)
1
13
3
3
29
36
2
5
К раствору 0.596 г метилового эфира 2-((3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензилиден)амино)пропионовой кислоты в 10 мл хлористого метилена добавляют раствор 0.323 г N-фенилмалеимида и перемешивают при комнатной температуре 15 мин. В реакционную смесь вносят одной порцией 0.019 г N-трет-бутоксикарбонилглицина и перемешивают 48 ч при комнатной температуре. Раствор концентрируют в вакууме и хроматографируют на силикагеле 60, элюент хлороформ/метанол 10:1. Упариванием содержащей продукт реакции фракции получают 0.543 г (59%) заявленного соединения в виде бесцветных кристаллов, т.пл. 10б-108°С. Н ЯМР (400 MHz; CDCl): δ 7.35-7.39 (m, 3H), 7.29-7.33 (m, 1H), 7.18 (s, 2H), 7.04 (d, J 7.8, 2H), 5.21 (s, 1H), 4.85 (d, J 9.1, 1H), 3.90 (s, 3H), 3.68 (dd, J 9.1, 7.6, 1H), 3.46 (d, J 7.6, 1H), 2.74 (br, 1H), 1.65 (s, 3H), 1.40 (s, 18H). С ЯМР (100 MHz; CDCl): δ 174.92, 173.55, 173.01, 153.76, 135.78 (2C), 131.60, 128.88 (2C), 128.33, 127.32, 125.95 (2C), 123.92 (2C), 67.49, 63.32, 56.10, 52.72, 50.46, 34.35, 30.21 (3C), 24.53. Вычислено, % CHNO: С 70.71; Н 7.37; N 5.69. Найдено, %: С 70.79; Н 7.29; N 5.66.
Получено новое бициклическое производное пирролидина, содержащее фрагмент пространственно-экранированного фенола, обладающее выраженной пролонгированной антиоксидантной активностью.
Пример 4. Получение метилового эфира (1S*,3R*,3aS*,6aR*)-3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-5-(4-метоксифенил)-1-метил-4,6-диоксооктагидропирроло[3,4-с] пиррол-1-карбоновой кислоты (IV)
1
13
3
3
30
38
2
6
К раствору 0.505 г метилового эфира 2-((3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензилиден)амино)пропионовой кислоты в 10 мл хлористого метилена добавляют раствор 0.319 г N-(4-метоксифенил)малеимида и перемешивают при комнатной температуре 15 мин. В реакционную смесь вносят одной порцией 0.030 г N-трет-бутоксикарбонилаланина и перемешивают 48 ч при комнатной температуре. Раствор концентрируют в вакууме и хроматографируют на силикагеле 60, элюент хлороформ/метанол 10:1. Упариванием содержащей продукт реакции фракции получают 0.504 г (61%) заявленного соединения в виде светло-желтых кристаллов, т.пл. 107-109°С. Н ЯМР (400 MHz; CDCl): δ 7.17 (s, 2H), 6.95 (d, J 8.8, 2H), 6.86 (d, J 8.8, 2H), 5.20 (s, 1H), 4.83 (d, J 9.1, 1H), 3.89 (s, 3H), 3.78 (s, 3H), 3.66 (dd, J 9.1, 7.6, 1H), 3.43 (d, J 7.6, 1H), 2.74 (br, 1H), 1.64 (s, 3H), 1.40 (s, 18H). С ЯМР (100 MHz; CDCl): δ 175.07, 173.70, 172.97, 159.19, 153.67, 135.70 (2C), 127.28, 127.17 (2C), 124.27, 123.86 (2C), 114.13 (2C), 67.42, 63.27, 56.05, 55.40, 52.65, 50.38, 34.29, 30.17 (3C), 24.48. Вычислено, % CHNO: С 68.94; Н 7.33; N 5.36. Найдено, %: С 68.91; Н 7.27; N 5.32.
Получено новое бициклическое производное пирролидина, содержащее фрагмент пространственно-экранированного фенола, обладающее выраженной пролонгированной антиоксидантной активностью.
Пример 5. Получение метилового эфира (1S*,3R*,3aS*,6aR*)-3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-1-метил-5-(нафталин-1-ил)-4,6-диоксооктагидропирроло[3,4-с]пиррол-1-карбоновой кислоты (V)
1
13
3
3
33
38
2
5
К раствору 0.500 г метилового эфира 2-((3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензилиден)амино)пропионовой кислоты в 10 мл хлористого метилена добавляют раствор 0.351 г N-(нафталин-1-ил)малеимида и перемешивают при комнатной температуре 15 мин. В реакционную смесь вносят одной порцией 0.030 г N-трет-бутоксикарбонилаланина и перемешивают 48 ч при комнатной температуре. Раствор концентрируют в вакууме и хроматографируют на силикагеле 60, элюент хлороформ/метанол 10:1. Упариванием содержащей продукт реакции фракции получают 0.467 г (55%) заявленного соединения в виде бесцветных кристаллов, т.пл. 140-141°С. Н ЯМР (400 MHz; CDCl): δ 7.83-7.91 (m), 7.37-7.61 (m), 7.29-7.33 (m, 1H), 7.28 (br), 7.23 (br), 6.93 (d, J 7.3), 5.21 (s), 5.13 (s), 4.86-4.94 (m, 1H), 3.87 (s), 3.86-3.90 (m), 3.81 (s), 3.75 (t, J 8.1), 3.66 (d, J 7.8), 3.51 (d, J 8.1), 2.75-2.85 (m, 1H), 1.76 (s), 1.71 (s), 1.44 (s), 1.31 (s). C ЯМР (100 MHz; CDCl): δ 175.28, 173.79, 172.72, 153.58, 135.58, 134.34, 129.98, 129.85, 128.62, 128.30, 127.37, 127.01, 126.44, 126.34, 125.92, 125.16, 124.05, 123.94, 122.93, 121.95, 67.54, 63.38, 63.32, 56.26, 56.11, 52.78, 50.88, 50.51, 34.41, 34.29, 30.28, 30.23, 24.86, 23.91. Вычислено, % CHNO: С 73.04; Н 7.06; N 5.16. Найдено, %: С 73.19; Н 7.29; N 5.01.
Получено новое бициклическое производное пирролидина, содержащее фрагмент пространственно-экранированного фенола, обладающее выраженной пролонгированной антиоксидантной активностью.
Пример 6. (1S*,3R*,3aS*,6aR*)-5-(4-бромфенил)-3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-1-метил-4,6-диоксооктагидропирроло[3,4-с]пиррол-1-карбоновой кислоты (VI)
1
13
3
3
29
35
2
5
К раствору 0.501 г метилового эфира 2-((3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензилиден)амино)пропионовой кислоты в 10 мл хлористого метилена добавляют раствор 0.395 г N-(4-бромфенил)малеимида и перемешивают при комнатной температуре 15 мин. В реакционную смесь вносят одной порцией 0.030 г N-трет-бутоксикарбонилаланина и перемешивают 48 ч при комнатной температуре. Раствор концентрируют в вакууме и хроматографируют на силикагеле 60, элюент хлороформ/метанол 10:1. Упариванием содержащей продукт реакции фракции получают 0.665 г (75%) заявленного соединения в виде бесцветных кристаллов, т.пл. 195-197°С. Н ЯМР (400 MHz; CDCl): δ 7.48 (d, J 8.8, 2H), 7.16 (s, 2H), 6.93 (d, J 8.8, 2H), 5.22 (s, 1H), 4.85 (m, 1H), 3.89 (s, 3H), 3.68 (dd, J 9.2, 7.6, 1H), 3.44 (d, J 7.6, 1H), 2.69 (br, 1H), 1.65 (s, 3H), 1.40 (s, 18H). С ЯМР (100 MHz; CDCl): δ 174.60, 173.24, 172.96, 153.79, 135.83 (2С), 132.04 (2С), 130.57, 127.45 (2С), 127.28, 123.86 (2С), 122.07, 67.47, 63.20, 55.98, 52.74, 50.40, 34.34, 30.22 (3С), 24.54. Вычислено, % CHBrNO: С 60.95; Н 6.17; N 4.90. Найдено, %: С 61.23; Н 6.27; N 4.71.
Получено новое бициклическое производное пирролидина, содержащее фрагмент пространственно-экранированного фенола, обладающее выраженной пролонгированной антиоксидантной активностью.
Пример 7. Получение метилового эфира (1S*,3R*,3aS*,6aR*)-3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-1-метил-5-(2-нитрофенил)-4,6-диоксооктагидропирроло[3,4-с]пиррол-1-карбоновой кислоты (VII)
1
13
3
3
29
35
3
7
К раствору 0.500 г метилового эфира 2-((3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензилиден)амино)пропионовой кислоты в 10 мл хлористого метилена добавляют раствор 0.341 г N-(2-нитрофенил)малеимида и перемешивают при комнатной температуре 15 мин. В реакционную смесь вносят одной порцией 0.030 г N-трет-бутоксикарбонилаланина и перемешивают 48 ч при комнатной температуре. Раствор концентрируют в вакууме и хроматографируют на силикагеле 60, элюент хлороформ/метанол 10:1. Упариванием содержащей продукт реакции фракции получают 0.364 г (43%) заявленного соединения в виде светло-желтых кристаллов, т.пл. 249°С. Н ЯМР (400 MHz; CDCl): δ 8.09 (d, J 8.1, 1H), 7.62 (t, J 7.0, 1H), 7.53 (t, J 7.6, 1H), 7.21 (s, 2H), 6.89 (d, J 6.8, 1H), 5.21 (s, 1H), 4.88 (d, J 8.9, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.77-3.82 (m, 1H), 3.55 (d, J 7.6, 1H), 2.78 (br, 1H), 1.67 (s, 3H), 1.41 (s, 18H). С ЯМР (100 MHz; CDCl): δ 174.13, 173.03, 172.48, 153.70, 144.96, 135.77 (2C), 134.04, 130.38, 129.92 (2C), 127.31, 125.68, 123.89 (2C), 67.37, 62.93, 56.39, 52.75, 50.97, 34.37, 30.25 (3C), 24.63. Вычислено, % CHNO: С 64.79; Н 6.56; N 7.82. Найдено, %: С 64.93; Н 6.62; N 7.66.
Получено новое бициклическое производное пирролидина, содержащее фрагмент пространственно-экранированного фенола, обладающее выраженной пролонгированной антиоксидантной активностью.
Пример 8. Исследование синтезированных соединений в качестве антиоксидантов
Антиоксидантная активность соединений изучена на примере модельной системы пероксидного окисления липидов гомогената печени русского осетра по накоплению ТБК-зависимых продуктов. В работе использованы модельные системы с длительным протеканием пероксидного окисления липидов (ПОЛ) для выявления действия исследуемых соединений при продолжительном окислительном стрессе организма, когда интенсивность ПОЛ возрастает, а концентрация антиоксидантов падает.
Навеску 0.5 г печени гомогенизировали в 19.5 мл охлажденного до 0-4°С раствора хлорида калия, поместив стакан гомогенизатора в лед или снег. Полученный гомогенат сливали в емкость.
-4
-4
Исследуемый антиоксидант вносили в гомогенат печени в виде раствора в хлороформе. Растворы гомогената печени с антиоксидантом и без хранили в холодном темном месте в течение 2 суток. Конечная концентрация исследуемого соединения составляла 1·10 моль/л. Изменение скорости пероксидного окисления липидов в гомогенате печени осетра в присутствии исследуемых соединений оценивали в течение 2 суток путем отбора 2 мл гомогената из соответствующей емкости и выполнением всех необходимых операций. Брали три сухие пробирки. В первую пробирку (холостая проба без добавки антиоксиданта) наливали 2.0 мл гомогената и по 0.1 мл растворов аскорбиновой кислоты и соли Мора, добавляли 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Во вторую пробирку (рабочая проба с добавкой антиоксиданта) наливали 2.0 мл гомогената с антиоксидантом и по 0.1 мл растворов аскорбиновой кислоты и соли Мора, 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Начальная концентрация соединения в реакционной среде составляла 1·10 моль/л. В третьей пробирке готовили контрольную пробу (без гомогената). Для этого в пробирку наливали 2 мл раствора хлорида калия, 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты и 1 мл раствора тиобарбитуровой кислоты.
Первую и вторую пробирки помещали на 10 мин в водяную баню при 37°С, затем центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. После этого отбирали в чистые пробирки по 2 мл надосадочной жидкости, приливали по 1 мл раствора тиобарбитуровой кислоты, помещали пробы в кипящую водяную баню на 10 мин вместе с контрольной пробиркой и затем охлаждали все пробирки в ледяной воде до комнатной температуры. После того, как пробы охладились, в первую и вторую пробирки добавляют 1.0 мл хлороформа для получения прозрачного раствора и ставили центрифугировать на 15 минут при частоте боротов 3000 об/мин.
Отбирали верхнюю фазу и измеряли экстинкцию пробы по сравнению с контрольным раствором на спектрофотометре СФ-103 в кювете с толщиной слоя 1.0 см.
Расчет проводили по формуле:
Х=(Е·3·3.2)/(0.156·2),
где X - содержание малонового диальдегида в исходном гомогенате, нмоль; Е - экстинкция проб; 3.2 - общий объем исследуемых проб, мл; 2 - объем надосадочной жидкости, взятой на определение малонового диальдегида, мл; 3 - объем проб, взятых на фотометрию, мл; 0.156 - экстинкция 1 нмоль малонового диальдегида в 1 мл при 532 нм.
В отдельном эксперименте было подтверждено отсутствие в данных условиях влияния хлороформа на скорость ПОЛ в печени.
Для исследованных соединений рассчитана эффективность антиоксидантного действия (ЭАД) по формуле:
0
1
0
ЭАД=[(С-С)/С]·100%,
0
1
где С - концентрация ТБК-зависимых продуктов в гомогенате печени (контроль), С - концентрация ТБК-зависимых продуктов в гомогенате печени, содержащей исследуемое соединение.
В случае положительного значения показателя ЭАД тестируемое вещество проявляет антиоксидантное действие; в случае отрицательного значения показателя ЭАД - прооксидантное действие. Данные опытов представлены в таблице 1.
Таблица 1
ЭАД (%) некоторых соединений при длительном пероксидном окислении липидов гомогената печени русского осетра in vitro
Соединение
1 ч
3 ч
24 ч
48 ч
I
12
41
59
54
II
3
44
57
67
III
-3
20
19
38
IV
23
27
31
46
V
5
51
40
49
VI
4
14
31
40
VII
3
4
45
37
ионол
35
35
42
39
-4
Проведенные исследования показали, что все синтезированные соединения в концентрации 1·10 М эффективно снижают уровень пероксидного окисления липидов гомогената печени русского осетра на всех этапах, что свидетельствует о пролонгированной антиоксидантной активности исследуемых соединений.
Пример 9. Исследование синтезированных соединений в качестве антиоксидантов
Антиоксидантная активность соединений изучена на примере модельной системы пероксидного окисления липидов спермы русского осетра по накоплению ТБК-зависимых продуктов. Скорость ПОЛ определяли по методу, описанному в примере №8, по накоплению в сперме карбонильных продуктов, определяемых с помощью тиобарбитуровой кислоты (ТБК).
Сперму в количестве 1 мл смешивали с 19.5 мл охлажденного до 0-4°С раствора хлорида калия, полученный раствор сливали в емкость.
-4
-4
Исследуемый антиоксидант вносили в полученный раствор спермы с хлоридом калия в виде раствора в хлороформе. Растворы спермы с антиоксидантом и без хранили в холодном темном месте в течение 2 суток. Конечная концентрация исследуемого соединения составляла 1·10 моль/л. Изменение скорости пероксидного окисления липидов в гомогенате спермы осетра в присутствии исследуемых соединений оценивали в течение 2 суток путем отбора 2 мл раствора из соответствующей емкости и выполнением всех необходимых операций. Брали три сухие пробирки. В первую пробирку (холостая проба без добавки антиоксиданта) наливали 2.0 мл раствора спермы и по 0.1 мл растворов аскорбиновой кислоты и соли Мора, добавляли 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Во вторую пробирку (рабочая проба с добавкой антиоксиданта) наливали 2.0 мл раствора спермы с антиоксидантом и по 0.1 мл растворов аскорбиновой кислоты и соли Мора, 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Начальная концентрация соединения в реакционной среде составляла 1·10 моль/л. В третьей пробирке готовили контрольную пробу (без спермы). Для этого в пробирку наливали 2 мл раствора хлорида калия, 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты и 1 мл раствора тиобарбитуровой кислоты.
Первую и вторую пробирки помещали на 10 мин в водяную баню при 37°С, затем центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. После этого отбирали в чистые пробирки по 2 мл надосадочной жидкости, приливали по 1 мл раствора тиобарбитуровой кислоты, помещали пробы в кипящую водяную баню на 10 мин вместе с контрольной пробиркой и затем охлаждали все пробирки в ледяной воде до комнатной температуры. После того, как пробы охладились, в первую и вторую пробирки добавляют 1.0 мл хлороформа для получения прозрачного раствора и ставили центрифугировать на 15 минут при частоте оборотов 3000 об/мин.
Отбирали верхнюю фазу и измеряли экстинкцию пробы по сравнению с контрольным раствором на спектрофотометре СФ-103 в кювете с толщиной слоя 1.0 см.
Расчет проводили по формуле:
Х=(Е·3·3.2)/(0.156·2),
где X - содержание малонового диальдегида в исходном гомогенате, нмоль; Е - экстинкция проб; 3.2 - общий объем исследуемых проб, мл; 2 - объем надосадочной жидкости, взятой на определение малонового диальдегида, мл; 3 - объем проб, взятых на фотометрию, мл; 0.156 - экстинкция 1 нмоль малонового диальдегида в 1 мл при 532 нм.
В отдельном эксперименте было подтверждено отсутствие в данных условиях влияния хлороформа на скорость ПОЛ спермы.
0
1
0
Для исследованных соединений рассчитана эффективность антиоксидантного действия (ЭАД) по формуле: ЭАД=[(C-C)/C]·100%,
0
1
где С - концентрация ТБК-зависимых продуктов в сперме (контроль), С - концентрация ТБК-зависимых продуктов в сперме, содержащей исследуемое соединение.
В случае положительного значения показателя ЭАД тестируемое вещество проявляет антиоксидантное действие; в случае отрицательного значения показателя ЭАД - прооксидантное действие. Данные опытов представлены в таблице 2.
Таблица 2
ЭАД (%) некоторых соединений при длительном пероксидном окислении липидов спермы русского осетра in vitro
Соединение
1 ч
3 ч
24 ч
48 ч
I
27
32
50
52
II
47
21
49
44
III
24
11
25
48
IV
28
32
30
51
V
33
5
60
73
VI
42
51
62
72
VII
33
5
30
64
ионол
-12
31
12
5
-4
Проведенные исследования показали, что все синтезированные соединения в концентрации 1·10 М эффективно снижают уровень пероксидного окисления липидов спермы русского осетра на всех этапах, что свидетельствует о пролонгированной антиоксидантной активности исследуемых соединений.
Источники информации
1. Зайцев В.Г., Островский О.В., Закревский В.И. Связь между химическим строением и мишенью действия как основа классификации антиоксидантов прямого действия. // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2003 - Т.66. - №4. - С.66-70.
2. Эмануэль Н.М. Кинетика экспериментальных опухолевых процессов. М.: Наука. - 1977. - 419 с.
3. Rice-Evans C.A., Diplock A.T. Current status of antioxidant therapy. // Free Radical Biol. Med. - 1993. - Vol.15. - P.77-96. (прототип)