СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ЭМУЛЬГИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ГРИППА ПТИЦ И ВАКЦИНА ИНАКТИВИРОВАННАЯ ЭМУЛЬГИРОВАННАЯ ПРОТИВ ГРИППА ПТИЦ
METHOD FOR MAKING INACTIVATED EMULSIFIED AVIAN INFLUENZA VACCINE AND INACTIVATED EMULSIFIED AVIAN INFLUENZA VACCINE

5
2
Группа изобретений относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использована при изготовлении средств для специфической профилактики гриппа птиц, вызванного штаммом HN.
Грипп птиц - это остропротекающая инфекционная болезнь кур вирусной этиологии, наносящая значительный экономический ущерб развитому птицеводству многих стран мира.
5
2
Вирус HN вызывает заболевание молодняка и взрослой птицы всех видов. Болезнь может протекать в разных формах и в различной степени тяжести. У водоплавающей птицы болезнь обычно протекает в кишечной форме легкой степени тяжести. У остальных чувствительных птиц наиболее обычным является респираторный синдром от инаппарантного до смертельного. В целом вирус характеризуется как эпителиотропный, однако некоторые штаммы могут вызывать генерализованные формы болезни с поражением практически всех органов и систем.
Вакцинопрофилактика гриппа птиц занимает ведущее место в борьбе с этим заболеванием.
Известны способы изготовления вакцины против гриппа птиц путем использования методов генной инженерии и вакцины, полученные данными способами (см., например, US 5916879 А, 29.06.1999 или FR 2751225 А, 23.01.23). Данные вакцины обладают высокой эффективностью, но способ их изготовления очень трудоемок.
50
Известны способ изготовления инактивированной эмульгированной вакцины против гриппа птиц и вакцина инактивированная эмульгированная против гриппа птиц, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из штамма A/Chicken/queretaro/14588-19/95 (H5N2) вируса гриппа птиц, полученного в 10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 7,3 lg ЭЛД/1 мл и гемагглютинирующей активностью 1:64, очищенного от балластных примесей и инактивированного с помощью 2-бромэтиленамина гидробромида и целевую добавку в виде масляного адъюванта в соотношении 1:4 (см. например, Swayne D.E. et al., Influents of virus strain and antigen mass on efficacy of H5 avian influenza inactivated vaccines, Avian Pathol., 1999, 28, 245-255).
50
Наиболее близкими являются способ изготовления инактивированной эмульгированной вакцины против гриппа птиц и вакцина инактивированная эмульгированная против гриппа птиц, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из штамма A/ Turkey/Minnesota/3689-1551/81(H5N2) вируса гриппа птиц, полученного в 10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 8,7 lg ЭЛД/1 мл и гемагглютинирующей активностью 1:1024, очищенного от балластных примесей и инактивированного с помощью формалина, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в эффективном соотношении (см. например, Swayne D.E. et al., Efficacy of vaccines in Chicken against Patogenic Hong Kong H5N1 Avian Influenza, Avian Dis, 2001, 45, 2, 355-365).
Технология же изготовления инактивированных вакцин против гриппа птиц обладает недостатками (например, для получения антигенного материала используют только хориоаллантоисную жидкость, полученную после репродукции вируса в куриных эмбрионах, в которой содержание антигена часто варьирует), устранение которых остается актуальной задачей и служит основной предпосылкой для исследований по ее усовершенствованию и решения вопроса защиты птицеводства нашей страны от этой опасной болезни.
В задачу создания настоящего изобретения входила разработка способа изготовления инактивированной вакцины и получение вакцины против гриппа птиц с использованием непатогенного штамма с антигенной формулой H5N2, что гарантирует защиту птиц от гриппа, вызванного серовариантом Н5, не угрожая ухудшению эпизоотической ситуации, а также с использованием тест-систем на нейроминедазу, позволяющих отличать антитела к полевым штаммам от вакцинных. Данная вакцина должна обладать высокой иммуногенной активностью и безвредностью и обеспечивать защиту птицеводства Российской Федерации от вируса ГП, наносящего значительный экономический ущерб.
Технический результат от использования изобретения заключается в повышении антигенной и иммуногенной активности и безвредности инактивированной вакцины против гриппа птиц.
Поставленная задача в части способа изготовления инактивированной эмульгированной вакцины против гриппа птиц решается тем, что в способе, включающем приготовление антигенного материала из штамма вируса гриппа птиц, очистку антигенного материала от балластных примесей, инактивацию вируса, соединение антигенного материала с масляным адъювантом и контроль целевого продукта, согласно изобретению, в качестве штамма вируса гриппа птиц используют штамм «Приморский» вируса гриппа птиц, относящийся к семейству Orthomyxoviridae, роду Influenzae virus avicum, серотипа А, подтипа H5N2, коллекция ФГУ ВГНКИ, регистрационный №129-ДЕП.
Для получения антигенного материала используют тушки 11-дневных куриных эмбрионов, инфицированных возбудителем инфекции.
Антигенный материал используют в виде вируссодержащей суспензии, изготовленной из экстраэмбриональной жидкости и тушек 11-дневных куриных эмбрионов, инфицированных штаммом «Приморский» вируса гриппа птиц.
Используют антигенный материал с биологической активностью не ниже 8,0 lg
50
3
ЭИД/см.
Очищенный антигенный материал инактивируют β-пропилактоном.
β-пропилактон используют в виде 10%-ного водного раствора.
β-пропилактон вносят в антигенный материал до концентрации 0,075%.
Инактивацию антигенного материала β-пропилактоном ведут в течение 23-25 ч при 24°С и рН 7,4-7,6.
Из адъювантов используют масляный адъювант Монтанид ИЗА-70.
Масляный адъювант Монтанид ИЗА-70 соединяют с антигенным материалом для эмульгирования в количестве 60-70 мас.%.
Поставленная задача в части вакцины решается тем, что вакцина инактивированная эмульгированная против гриппа птиц, содержащая активное вещество и масляный адъювант, согласно изобретению, в качестве активного вещества содержит очищенный и авирулентный антигенный материал из штамма «Приморский», полученный описанным выше способом, в эффективном количестве.
Вакцина содержит очищенный и авирулентный антигенный материал из штамма «Приморский» и масляный адъювант в соотношении (мас.%):
Антигенный материал
30,0-40,0
Масляный адъювант
60,0-70,0
50
3
Вакцина содержит антигенный материал с биологической активностью не ниже 8,0 lg ЭИД/см.
Вакцина из адъювантов содержит масляный адъювант Монтанид ИЗА-70.
5
2
Исходный вирус для получения штамма «Приморский» выделен сотрудниками ГУ Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И.Ивановского в 2001 г. в Приморском крае от дикой утки, не имевшей клинических признаков заболевания. Производственный штамм «Приморский» вируса гриппа птиц с антигенной формулой HN получен путем многократных последовательных пассажей на куриных эмбрионах. Штамм «Приморский» депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стантартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГУ «ВГНКИ») под регистрационным №129-ДЕП.
Штамм является непатогенным и обладает высокой антигенной и иммуногенной активностью после инактивации. Экспериментально подтверждена возможность его использования для изготовления инактивированной вакцины.
Штамм «Приморский» вируса ГП характеризуется следующими признаками и свойствами.
Морфологические свойства
Штамм «Приморский» вируса ГП относится к семейству Orthomyxoviridae, роду Influenzae virus avicum, серотипа А, подтипа H5N2, обладает морфологическими признаками, характерными для ортомиксовирусов.
Вирион имеет шарообразную форму и константу осаждения 737 S. Вирионы полиморфны размером 80-120 нм представлены двумя антигенными комплексами. Наружный V - антиген состоит из гемагглютинина (Н) и фермента нейроминедазы (N). Также вирион имеет оболочку с мелкими шипами длиной 10-12 нм, диаметром 3-4 нм, которая заключает в себя свернутый в кольцо нуклеокапсид диаметром 8-9 нм. Химический состав вириона: липиды - 23,5-25%, белок - 63,2%, углеводы - 7%, РНК - 1,8%. В процессе репродукции вируса происходит накопление трех форм частиц: 1) «зрелой», полноценной, обладающей всеми свойствами, присущими вирусу; 2) «неполной формы», обладающей только гемагглютинирующей активностью; 3) в виде растворимого S-антигена, который обладает только комплементсвязывающей активностью.
Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм «Приморский» идентифицирован как вирус гриппа птиц типа А, с антигенной формулой H5N2. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой.
Вирус обладает инфекционной, гемагглютинирующей, нейраминидазной активностью, агглютинирует эритроциты кур, индеек, цесарок, голубей, морских свинок, крыс, мышей, собак, коров, свиней, кошек, лошадей, и человека. При вакцинации вирусный антиген индуцирует образование специфических антител, выявляемых в РТГА в разведении 1:64-1:128.
Биотехнологические характеристики
Штамм «Приморский» обладает высокой биологической активностью в нативном виде, а также проявляет высокие антигенные и иммуногенные свойства после инактивации. Штамм «Приморский» предназначен для использования в качестве сырья для изготовления инактивированной вакцины, а также диагностических биопрепаратов. Штамм «Приморский» репродуцируется на 11-дневных куриных эмбрионах. В течение 48-72 часов инкубирования вирус накапливается в экстраэмбриональной жидкости и тушках куриных эмбрионов в титре 8,0-9,2 lg
50/мл
ЭИД. Штамм «Приморский» является стабильным.
Устойчивость к внешним факторам
Гемагглютинирующая активность вируса гриппа штамма «Приморский» быстро инактивируется азотистой кислотой, но длительно сохраняется под действием формалина, эфира, трипсина, не пропадает при нагревании вирусной суспензии до 56-60 С°. Воздействие на вирус в течение 60 мин температуры 60С°, ультрафиолетовых лучей, 1% раствора едкого натра, 2% раствора формальдегида, азотистой кислоты, эфира, хлороформа полностью инактивируют его. Он быстро инактивируется при рН ниже 4,0 и выше 12,7. Вирус надежно обеззараживается 1% раствором серной кислоты, 3% взвесью хлорной извести, 2% раствором едкого натра, 5 % взвесью креолина, 5% раствором фенола, 0,1% раствором сулемы в течение 10-30 мин. В 50% глицерине штамм «Приморский» сохраняет инфекционные свойства более 5 месяцев. Штамм «Приморский» не теряет инфекционных свойств при сублимационном высушивании.
Дополнительные признаки и свойства
Иммуногенная активность - 100%.
Патогенность не выражена.
Вирулентность не выражена.
Контагиозность не выражена.
Онкогенность отсутствует.
Исходя из полученных данных можно утверждать, что штамм «Приморский» по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным.
Сущность изобретения пояснена примерами его исполнения.
Пример 1
Для получения вакцины из штамма «Приморский» матровым вирусом заражают 11 - суточный куриные эмбрионы, полученные из благополучных по инфекционным заболеваниям хозяйств. Зараженные вирусом куриные эмбрионы культивируют в течение 72 часов при температуре 37,0±0,5 С°. Через 72 часа инкубирования инфицированные куриные эмбрионы помещают в холодильную камеру при температуре от 2 до 8С° и выдерживают в течение 16-24 час. Охлажденные эмбрионы в стерильных условиях вскрывают, отбирают экстраэмбриональную жидкость и тушки. Тушки инфицированных куриных эмбрионов подвергают размолу на коллоидной мельнице в течение 10-12 мин, после чего эту вируссодержащую массу смешивают с фосфатным буферным раствором, получая в результате 10-15%-ную вируссодержащую суспензию. Вируссодержащую суспензию очищают от балластных примесей известным образом. Очищенную суспензию подают в стерильный реактор, где смешивают с экстраэмбриональной жидкостью. Для инактивации вируса используют β-пропилактон. Предварительно готовят 10%-ный раствор β-пропилактона на деминерализованной воде. Затем в подогретую до 24°С вируссодержащую суспензию вносят 10%-ный раствор β-пропилактона до концентрации 0,075%. Смесь тщательно перемешивают и выдерживают при 24°С в течение 23-25 час. По окончании инактивации антигенный материал охлаждают до 2-8°С. К охлажденному антигену при постоянном перемешивании добавляют масляный адъювант.В качестве масляного адъюванта используют Монтанид ИЗА-70 фирмы «Сеппик» (Франция) или его аналоги. Масляный адъювант для изготовления вакцин стерилизуют согласно наставлению, прилагаемому производителем.
Масляный адъювант и инактивированный антиген смешивают на гомогенизаторе в течение 5 мин при скорости вращения винта 4000 об/мин и температуре 10-15°С. При этом получают однородную эмульсию белого цвета типа «вода-масло».
Проведены испытания антигенной активности вакцины против гриппа птиц инактивированной эмульгированной, изготовленной по следующей прописи
мас.%:
Очищенный и авирулентный антигенный материал из штамма «Приморский» вируса ГП типа А подтипа H5N2, полученный на 11 - суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 8,55 lg ЭИД<sub>50/см</sub>3 и ГА-активностью 1:256
30,0
Масляный адъювант Монтанид ИЗА-70
70,0
3
В опыте использовали СПФ цыплят в возрасте 25 суток в количестве 12 гол. Случайным образом отобранные 2 СПФ цыпленка служили контрольной группой, оставшиеся 10 СПФ цыплят были опытной группой. СПФ цыплятам опытной группы путем внутримышечной инъекции в область груди вводили вакцину в дозе 0,5 см.
Через 21 сут. после вакцинации от СПФ цыплят опытной и контрольной групп отбирали пробы крови, получали сыворотки крови, которые по общепринятой методике исследовали в РТГА на наличие антител к вирусу гриппа птиц.
Для постановки РТГА в качестве положительного контроля использовали сыворотку крови к вирусу гриппа птиц подтипа H5N3 производства ОАО «Покровский завод биопрепаратов» (г.Покров, Россия), в качестве отрицательного контроля - нормативную сыворотку крови кур (ОАО «Покровский завод биопрепаратов», г.Покров, Россия), а в качестве антигена - инактивированный вирус гриппа птиц подтипа H5N2 штамма «Приморский». Количество испытуемых сывороток соответствует числу цыплят в опыте.
Результаты исследований представлены в таблице 1.
2
Представленные в таблице 1 результаты исследования сывороток в РТГА свидетельствуют, что уровень антител к вирусу гриппа птиц подтипа H5N2 через 21 сутки после иммунизации вакциной составил 6,13 log, доля цыплят, имеющих защитный титр антител (1:16) к вирусу гриппа птиц была 100%.
Пример 2
Проведены испытания антигенной активности вакцины против гриппа птиц инактивированной эмульгированной, изготовленной по следующей прописи
мас.%:
Очищенный и авирулентный антигенный материал из штамма «Приморский» вируса ГП типа А подтипа H5N2, полученного на 11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 8,25 lg ЭИД<sub>50/см</sub>3 и ГА-активностью 1:128
35,0
Масляный адъювант Монтанид ИЗА-70
65,0
3
В опыте использовали СПФ цыплят в возрасте 23 суток в количестве 12 гол. Случайным образом отобранные 2 СПФ цыпленка служили контрольной группой, оставшиеся 10 СПФ цыплят были опытной группой. СПФ цыплятам опытной группы путем внутримышечной инъекции в область груди вводили вакцину в дозе 0,5 см.
Через 21 сут после вакцинации от СПФ цыплят опытной и контрольной групп отбирали пробы крови, получали сыворотки крови, которые по общепринятой методике исследовали в РТГА на наличие антител к вирусу гриппа птиц.
Для постановки РТТА в качестве положительного контроля использовали сыворотку крови к вирусу гриппа птиц подтипа H5N3 производства ОАО «Покровский завод биопрепаратов» (г.Покров, Россия), в качестве отрицательного контроля - нормативную сыворотку крови кур (ОАО «Покровский завод биопрепаратов», г.Покров, Россия), а в качестве антигена - инактивированный вирус гриппа птиц подтипа H5N2 штамма «Приморский». Количество испытуемых сывороток соответствует числу цыплят в опыте.
Результаты исследований представлены в таблице 2.
2
Представленные в таблице 2 результаты исследования сывороток в РТГА свидетельствуют, что уровень антител к вирусу гриппа птиц подтипа H5N2 через 21 сутки после иммунизации вакциной составил 6,4 log, доля цыплят, имеющих защитный титр антител (1:16) к вирусу гриппа птиц была 100%.
Пример 3
Проведены испытания антигенной активности вакцины против гриппа птиц эмульгированной инактивированной, изготовленной по следующей прописи
мас.%:
Очищенный и авирулентный антигенный материал из штамма «Приморский» вируса гриппа птиц типа А подтипа H5N2, полученного в 11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 8,45 lg ЭИД<sub>50/см</sub>3 и ГА-активностью 1:256
40,0
Масляный адъювант Монтанид ИЗА-70
60,0
3
В опыте использовали СПФ цыплят в возрасте 28 суток в количестве 12 гол. Случайным образом отобранные 2 СПФ цыпленка служили контрольной группой, оставшиеся 10 СПФ цыплят были опытной группой. СПФ цыплятам опытной группы путем внутримышечной инъекции в область груди вводили вакцину в дозе 0,5 см.
Через 21 сут после вакцинации от СПФ цыплят опытной и контрольной групп отбирали пробы крови, получали сыворотки крови, которые по общепринятой методике исследовали в РТГА на наличие антител к вирусу гриппа птиц.
Для постановки РТГА в качестве положительного контроля использовали сыворотку крови к вирусу гриппа птиц подтипа H5N3 производства ОАО «Покровский завод биопрепаратов» (г.Покров, Россия), в качестве отрицательного контроля - нормативную сыворотку крови кур (ОАО «Покровский завод биопрепаратов», г.Покров, Россия), а в качестве антигена - инактивированный вирус гриппа птиц подтипа H5N2 штамма «Приморский». Количество испытуемых сывороток соответствует числу цыплят в опыте.
Результаты исследований представлены в таблице 3.
2
Представленные в таблице 3 результаты исследования сывороток в РТГА свидетельствуют, что уровень антител к вирусу гриппа птиц подтипа H5N2 через 21 сутки после иммунизации вакциной составил 6,73 log, доля цыплят, имеющих защитный титр антител (1:16) к вирусу гриппа птиц была 100%.
Пример 4
Контроль инактивированной эмульгированной вакцины против гриппа птиц из штамма «Приморский» с антигенной формулой H5N2 осуществляли определением стерильности, полноты инактивации, безвредности, антигенной активности препарата. Кроме того, вакцину тестировали на стабильность эмульсии. Проверку на стерильность проводили в соответствии с ГОСТом 28085-89 «Препараты биологические. Методы бактериологического контроля стерильности». Метод заключается в определении отсутствия роста бактериальной и грибковой микрофлоры в посевах образцов вакцины или антигена на питательных средах. Для проведения испытания на стерильность пробу вакцины или антигена встряхивают и проводят посев. В посевах не должно быть роста бактериальной и грибковой микрофлоры. Полученная вакцина была стерильной.
3
Полноту инактивации вируса гриппа птиц определяли путем инъекции десяти куриным эмбрионам 11-дневного возраста средней пробы вакцины в объеме 0,2 см в аллантоисную полость. Контролем служили 5 незараженных куриных эмбриона. Инкубировали эмбрионы в течение 96 часов при t +37,2°С. Гибель эмбрионов через 24 часа считали неспецифической. По окончании инкубации куриные эмбрионы охлаждали при t° от 2 до 8°С в течение 24 час и асептически отбирали экстраэмбриональную жидкость, индивидуально от каждого эмбриона. После чего экстраэмбриональную жидкость исследовали в РГА. Если результат отрицательный, то проводили второй пассаж, используя для заражения смесь экстраэмбриональной жидкости, отобранной в равных объемах от каждого эмбриона. РГА с экстраэмбриональной жидкостью, полученной от куриных эмбрионов после 2-х последовательных пассажей, была отрицательная. В изготовленной вакцине отсутствует активный вирус.
Пример 5
3
3
Проведены испытания безвредности вакцины против гриппа птиц эмульгированной инактивированной. В опыте использовали СПФ цыплят в возрасте 26 суток в количестве 36 гол., которых разделили на три группы, по 12 гол. в каждой. В каждой из трех групп случайным образом отобранные 2 СПФ цыпленка служили контрольной подгруппой, оставшиеся 10 СПФ цыплят были опытной подгруппой. Среднюю пробу вакцины каждой серии в объеме 1,0 см подкожно двумя инъекциями по 0,5 см вводили 10 СПФ цыплятам соответствующей опытной подгруппы. За птицей вели наблюдение с течение 21 сут, после чего их убивали. Вакцину считали безвредной, если при вскрытии тушек СПФ цыплят опытных подгрупп на месте введения вакцины не было выраженной воспалительной реакции.
Результаты исследований представлены в таблице 4.
Таблица 4 Результаты определения безвредности инактивированной эмульгированной вакцины против гриппа птиц из штамма «Приморский»
Вакцина
Безвредность
Образец 1
Безвредна
Образец 2
Безвредна
Образец 3
Безвредна
При осмотре места введения инактивированной эмульгированной вакцины против гриппа птиц из штамма «Приморский» с антигенной формулой H5N2 местных поражений выявлено не было, что свидетельствует о безвредности данной вакцины для птицы при введении объема, в 2 раза превышающего прививной объем.
Пример 6
2
2
Проведены испытания физических свойств вакцины против гриппа птиц эмульгированной инактивированной. Относительную вязкость вакцин определяли на вискозиметре ВПЖ-2 и выражали в мм/с.
3
Стабильность эмульсии определяли методом центрифугирования образца вакцины. Из трех флаконов с вакциной поле интенсивного встряхивания отбирали по 12 см эмульсии и переносили ее в три стеклянные центрифужные пробирки. Пробирки с эмульсией центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 мин. После чего измеряли линейкой высоту столба прозрачной фракции в верхней части пробирки.
Эмульсию считали стабильной, если после центрифугирования в каждой из трех пробирок в процессе визуального контроля не обнаружено никаких изменений содержимого, или если высота столба прозрачной фракции, сформировавшейся в верхней части пробирки, не превышает 10 мм. Не допускается появления после центрифугирования прозрачной фракции на дне пробирки или полного расслоения эмульсии, когда препарат полностью теряет свой белый цвет, разлагаясь на составляющие компоненты: верхнюю масляную и нижнюю водную фракции с видимой границей раздела двух фаз. Результаты исследований представлены в таблице 5.
Таблица 5. Показатели относительной вязкости и стабильности эмульсии инактивированной эмульгированной вакцины против ГП из штамма «Приморский»
Вакцина
Вязкость,мм<sup>2</sup>/с<sup>2</sup>
Центрифугирование
Образец 1
47,5
А 2% С 98%
Образец 2
43,1
А 2% С 98%
Образец 3
46,4
А3% С 97%
Примечание: фракции эмульсии: А - прозрачное масло, В - жидкая эмульсия. С - эмульсия, D - плотная эмульсия, Е - водная фаза.
2
2
Результаты тестирования вакцины против гриппа птиц инактивированной эмульгированной (серии №1, 2, 3) на физические свойства свидетельствуют о том, что вакцина имеет высокую стабильность эмульсии и низкий показатель относительной вязкости от 43,1 до 47,5 мм/с.
Таким образом, вакцина против гриппа птиц инактивированная эмульгированная, изготовленная на основе штамма «Приморский», обладает высокой антигенной активностью и способна обеспечить эффективную защиту восприимчивой птицы от эпизоотического вируса подтипа Н5.
Дополнительный технический результат от использования предлагаемого способа достигается за счет того, что инактивацию антигенного материала осуществляют β-пропилактоном, что позволяет значительно снизить трудо- и энергозатраты на изготовление вакцины и повысить качество антигенного материала.