Influence of the CYP3A4 isoenzyme metabolic activity and cyp2c19 gene polymorphisms on clopidogrel antiplatelet effect in patients with acute coronary syndrome undergoing percutaneous coronary intervention

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

INFLUENCE OF THE CYP3A4 ISOENZYME METABOLIC ACTIVITY AND CYP2C19 GENE POLYMORPHISMS ON CLOPIDOGREL ANTIPLATELET EFFECT IN PATIENTS WITH ACUTE CORONARY SYNDROME UNDERGOING PERCUTANEOUS CORONARY INTERVENTION

K.B. Mirzaev1, R.E. Kazakov2, V.V. Smirnov3, D.A. Andreev4, D.A. Sychev1

1 Russian Medical Academy of Postgraduate Education. Barricadnaya ul. 2/1, Moscow, 123995, Russia

2 Research Center for Evaluation of Medical Products. Petrovsky bulv. 8, Moscow, 127051 Russia

3 State Research Center Institute of Immunology, Federal Medical-Biological Agency of Russia. Kashirskoye shosse, 24-2, Moscow, 115478 Russia

4 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University. Trubetskaya ul. 8-2, Moscow, 119991, Russia

Aim. Carriership of CYP2C19*2 allelic variant and reduced CYP3A4 activity can affect the formation of clopidogrel's active metabolite and, respectively, its antiplatelet effect. We sought to determine the impact of CYP3A4 isoenzyme activity and CYP2C19 polymorphisms on platelet aggregation.

Material and methods. The study included 81 patients with acute coronary syndrome (ACS) and subsequent percutaneous coronary intervention (PCI): 64 males and 17 females, mean age 63.9± 10.9 years. CYP2C19 allelic variants were detected by the method of real-time polymerase chain reaction. CYP3A4 isoenzyme activity was estimated by urinary 6- в -hyd roxycortisol/free cortisol ratio (6-OHC/FC) using the method of high-performance liquid chromatography. Platelet functional activity was evaluated by a portative aggregometer - the VerifyNow P2Y12 assay. Results. Logistic regression analysis has demonstrated significantly increased risk of clopidogrel resistance in patients-carriers of the CYP2C19*2 polymorphism (p=0.022). CYP2C19*2 non-carriers had significantly higher mean platelet inhibition percentage as compared with the carriers of this allele: 30.7±20.1 in the CYP2C19*1/*1 group vs 18.2± 16.4 in the CYP2C19*1/*2 one (р=0.03). Clopidogrel laboratory resistance (P2Y12 Reaction Units (PRU)>208) was found out to be higher in the CYP2C19*2-carriers as compared with non-carriers: 53.8% in the patients with the CYP2C19*1/*2 genotype and 16.2% in subjects with the CYP2C19*1/*1 genotype (odds ratio [OR]=1.8; 95% confidence interval [95% CI]: 1.0-3.2; р=0.0067). Linear regression analysis has revealed that smaller mean diameter of stent slightly reduces the risk of clopidogrel resistance development. No significant distinctions in urinary 6-OHC/FC ratios (the marker of CYP3A4 activity) were observed:

з.4±2.8 in the PRU>208 group and 3.2±3.0 in the PRU<208 group (p=0.8). Besides, no significant correlation between platelet activity and the 6-OHC/FC ratio was found (р=0.84). Conclusion. CYP2C19*2-carriership in ACS patients undergoing PCI significantly increases the risk of clopidogrel laboratory resistance. The urinary 6-OHC/FC ratio (as a marker of CYP3A4 isoenzyme activity) does not correlate with platelett functional activity.

Key words: CYP2C19*2; acute coronary syndrome; CYP3A4; pharmacogenetics; clopidogrel; P2Y12-receptor blockers. Ration Pharmacother Cardiol 2015;11(4):344-354

Влияние метаболической активности изофермента CYP3A4 и полиморфных маркеров гена CYP2C19 на антиагрегантный эффект клопидогрела у больных с острым коронарным синдромом, перенесших чрескожное коронарное вмешательство

К.Б. Мирзаев1*, Р.Е. Казаков2, В.В. Смирнов3, Д.А. Андреев4, Д.А. Сычев1

1 Российская медицинская академия последипломного образования. 123995, Москва, ул. Баррикадная, 2/1

2 Научный центр экспертизы средств медицинского применения. 127051, Москва, Петровский бульвар, 8

3 Государственный научный центр Институт иммунологии, Федеральное медико-биологическое агентство России. 1 15478, Москва, Каширское шоссе, 24 корп. 2

4 Первый московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова. 1 19991, Москва, ул. Трубецкая, 8 стр. 2

Цель. Носительство аллельного варианта CYP2C19*2 и снижение активности изофермента CYP3A4 может влиять на процесс образования активного метаболита клопидогрела,

и, соответственно, на его антиагрегантный эффект. Целью исследования является оценка влияния активности изофермента CYP3A4 и полиморфных маркеров гена CYP2C19 на функциональную активность тромбоцитов.

Материал и методы. В исследование включен 81 пациент с острым коронарным синдромом (ОКС) и последующим чрескожным коронарным вмешательством (ЧКВ): 64 мужчины и 17 женщин; средний возраст: 63,9±10,9 года. Аллельные варианты гена CYP2C19 определялись методом полимеразной цепной реакции в реальном времени. Активность изофермента CYP3A4 оценивалась через измерение отношения концентрации 6-р-гидроксикортизола к кортизолу (6-OHC/FC) в утренней моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Функциональная активность тромбоцитов оценивалась с использованием портативного агрегометра VerifyNow P2Y12 assay.

Результаты. Логистический регрессионный анализ показал достоверное повышение риска развития резистентности к клопидогрелу у пациентов-носителей полиморфного маркера CYP2C19*2 (р=0,022). Средний процент ингибирования тромбоцитов был значительно выше у пациентов без CYP2C19*2 по сравнению с носителями данного аллеля: 30,7±20,1 в группе CYP2C19*1/*1 против 18,2± 16,4 в группе CYP2C19*1/*2 (р=0,03). Лабораторная резистентность к клопидогрелу (P2Y12 Reaction Units (PRU)>208) оказалась выше среди носителей CYP2C19*2, по сравнению с пациентами без данного аллеля: 53,8% среди пациентов с генотипом CYP2C19*1/*2 и 16,2% с генотипом CYP2C19*1/*1 (отношение шансов [ОШ]=1,8; 95% доверительный интервал [95% ДИ]: 1,0-3,2; р=0,0067). Линейный регрессионный анализ показал, что меньшее значение среднего диаметра стента незначительно снижает риск развития резистентности к клопидогрелу. Значимых различий по показателю 6-OHC/FC в утренней моче (маркер активности CYP3A4) не обнаружено: 3,4±2,8 в группе PRU>208 и 3,2±3,0 в группе PRU<208 (p=0,8). Кроме того, не отмечалось статистически значимой корреляции между активностью тромбоцитов и отношением 6-OHC/FC (р=0,84). Заключение. Носительство CYP2C19*2 у пациентов с ОКС, подвергнутых ЧКВ, достоверно повышает риск развития лабораторной резистентности к клопидогрелу. Отношение 6-OHC/FC в утренней моче, как маркер активности изофермента CYP3A4, не коррелирует с функциональной активностью тромбоцитов. Ключевые слова: CYP2C19*2, острый коронарный синдром, CYP3A4, фармакогенетика, клопидогрел, блокаторы P2Y12-рецепторов. Рациональная фармакотерапия в кардиологии 2015;11 (4):344-354

Corresponding author (Автор, ответственный за переписку): karin05doc@yandex.ru

Author's information:

Karin B. Mirzaev - MD, Junior Researcher, Group of Clinical and Pharmacological Technology of the Research Center, Russian Medical Academy of Postgraduate Education Ruslan E. Kazakov - PhD, Head of the Laboratory of Clinical Pharmacogenetics and Personalized Medicine, Research Center for Evaluation of Medical Products

Valeriy V. Smirnov - PhD, Head of the Laboratory of Clinical Pharmacology, State Research Center Institute of Immunology, Federal Medical-Biological Agency of Russia Denis A. Andreev - MD, PhD, Professor, Chair of the Urgent Cardiology, I.M. Sechenov First Moscow State Medical University Dmitriy A. Sychev - MD, PhD, Professor, Head of the Chair of Clinical Pharmacology and Therapy; Leading Researcher, Group of Clinical and Pharmacological Technology of the Research Center, Russian Medical Academy of Postgraduate Education

Сведения об авторах:

Мирзаев Карин Бадавиевич - м.н.с. группы клинико-фармакологических технологий, Научно-исследовательский центр РМАПО

Казаков Руслан Евгеньевич - к.б.н, руководитель лаборатории клинической фармакогенетики и персонализированной медицины НЦЭСМП

Смирнов Валерий Валерьевич - к.фарм.н., зав. лабораторией клинической фармакологии ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России

Андреев Денис Анатольевич - д.м.н., профессор кафедры неотложной кардиологии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Сычев Дмитрий Алексеевич - д.м.н., профессор, зав. кафедрой клинической фармакологии и терапии РМАПО, в.н.с. группы клинико-фармакологических технологий НИЦРМАПО

Platelets activation plays a key role in the development of thrombotic complications at a place of atheroma lesion [1]. Acute coronary syndrome (ACS), ischemic stroke and peripheral arteries thrombotic occlusion are the clinical consequences of such complications [1]. Dual antiplatelet therapy (DAT) comprised of acetylsalicylic acid (ASA) and one of P2Y-|2-receptor blockers is the standard of ACS patients' treatment regardless of treatment strategy [24]. Non-responsiveness to antiplatelet agents is one of the key problems in the prevention of thrombotic events in cardiovascular diseases. So, clopidogrel non-responsiveness may reach 30% [5]. Intrinsic ASA non-responsiveness is rather rare, that is why non-responsiveness to clopidogrel (the most frequently used P2Yi|2-receptor blocker) deserves more attention. A lot of factors (genetic, clinical, demographic, laboratory and other) influence clopidogrel pharmacodynamics, clinical efficacy and safety [6,7] (Table 1), that is why the response to clopidogrel varies significantly [8,9]. Two-step bioactivation involving enzymes of cytochrome P450 system is necessary to realize the antiplatelet effect of clopidogrel [10]. At that cytochrome P450 enzyme 2C19 plays a key role in the formation of active metabolite R-130964, while other P450 isoenzymes, such as 2B6, 1A2, 3A4, 3A5 and 2C9 are less important [11]. The most prevalent polymorphisms of CYP2C19 gene are CYP2C19*2, CYP2C19*3, which are responsible for the synthesis of isoenzyme with reduced function and insufficient clopidogrel antiplatelet effect, and CYP2C19*17, which is related to the synthesis of isoenzyme with high activity and excessive platelets' inactivation [1 2]. The CYP3A4 isoenzyme can also play an important role in changes of clopidogrel antiplatelet effect. Several studies have demonstrated significant interindividual variability of this isoenzyme's activity due to it's induction or inhibition by endo- or exogenous substrates, in particular, by drugs. At that CYP3A4 gene polymorphism was noted as less significant factor determining CYP3A4 activity [13]. So, phenotypic methods of CYP3A4 enzyme activity estimation overweigh genotypic ones. These methods are as follows: erythromycin breath test, midazolam test, urinary 6-p-hydrocortizol to free cortizol ratio (6-OHC/FC) assessment and others. Evaluation of 6-p-hydrocortizol to free cortizol ratio in morning urine is the most simple and safe method of CYP3A4 activity estimation [14].

The aim of our study was to evaluate the influence of CYP3A4 isoenzyme metabolic activity, CYP2C19 polymorphisms and different clinical, demographic, laboratory and instrumental factors on platelets' functional activity.

Активация тромбоцитов играет ведущую роль в развитии тромботических осложнений на месте повреждения атеро-склеротической бляшки [1]. Клиническими последствиями подобных осложнений является развитие острого коронарного синдрома (ОКС), а так же ишемического инсульта и тром-ботической окклюзии периферических артерий [1]. Стандартом лечения больных с ОКС, независимо от стратегии лечения, является двойная антитромбоцитарная терапия (ДАТ), в состав которой входит ацетилсалициловая кислота (АСК) и один из блокаторов P2Y12-рецепторов [2-4]. Одной из ключевых проблем в профилактике тромботических осложнений сердечно-сосудистых заболеваний является проблема резистентности к антиагрегантным препаратам. Так, частота резистентности к клопидогрелу может доходить до 30% [5]. Истинная резистентность к АСК встречается достаточно редко, и поэтому большего внимания заслуживает резистентность к наиболее часто применяемому блокатору P2Yl 2-рецепто-ров - клопидогрелу. На фармакодинамический ответ, клиническую эффективность и безопасность клопидогрела влияет множество факторов: генетических, клинических, демографических, лабораторных и др. [6,7] (табл. 1), в связи с чем ответ на клопидогрел отличается значительной вариабельностью [8,9]. Для реализации антиагрегантного эффекта требуется двухступенчатая биоактивация клопидо-грела в организме человека при участии ферментов системы цитохрома Р450 [10], при этом главенствующая роль в образовании активного метаболита R-130964 играет изофер-мент Р450 2С19, в меньшей степени участвуют другие изо-ферменты Р450: 2В6, 1А2, 3А4, 3А5 и 2С9 [11]. Наиболее распространенными полиморфными маркерами гена СУР2С19 являются СУР2С19*2, СУР2С19*3, которые приводят к синтезу изофермента с низкой ферментативной активностью и недостаточным антиагрегантным эффектом клопидогрела, а так же СУР2С19*17, связанный с синтезом изофермента с высокой ферментативной активности и чрезмерным подавлением функциональной активности тромбоцитов [1 2]. Важную роль в изменении антиагрегантного эффекта клопидогрела может играть и изофермент CYP3А4. В нескольких исследованиях была продемонстрирована выраженная межиндивидуальная вариабельность активности этого изофермента вследствие индукции или ингибирования активности изофермента эндо- и экзогенными субстратами и, в частности, лекарственными препаратами, при этом было отмечено, что полиморфизм гена CYP3A4 - менее значимый фактор, определяющий активность изофермента СУР3А4 [13]. Таким образом, фенотипические методы оценки активности изофермента СУР3А4 имеют большее значение, чем генотипи-ческие. К таким методам относятся эритромициновый дыхательный тест, мидозаламовый тест, определение отношения концентрации 6-р-гидроксикортизола к свободному кортизолу (6-ОНСДС) в моче и др. Наиболее удобным и безопасным методом оценки активности CYP3A4 является метод определения отношения концентрации 6-р-гидрокси-кортизола к свободному кортизолу в утренней моче [14].

Table 1. Factors associated with alteration of pharmacological response to clopidogrel

Таблица 1. Факторы, ассоциированные с нарушением фармакологического ответа на клопидогрел

Nongenetic / Негенетические Genetic / Генетические

I. Clinical and demographic / Клинико-демографические: I. Gene polymorphisms / Полиморфизмы генов:

1. Age / Возраст 1. CYP2C19

2. Renal failure / Почечная недостаточность 2. CYP2C9

3. Gender/ Пол 3. CYP3A4

4. Body mass index / Индекс массы тела 4. CYP3A5

5. Diabetes mellitus / Сахарный диабет 5. ABCB1

6. Systemic inflammation / Системное воспаление б. ABCC3

7. Hematocrit / Гематокрит 7. ITGB3

8. Platelet count / Количество тромбоцитов 8. IRS-1

9. Fibrinogen level / Уровень фибриногена 9. P2Y12

10. Acute coronary syndrome / Острый коронарный синдром 10. PON-1

11. Low ejection fraction / Низкая фракция выброса 11. CYP4F2

12. Smoking / Курение 12. CES1

13. Inadequate dose / Неадекватная доза

II. Interaction with medications and herbs / Взаимодействие с лекарственными средствами и травами:

1. Proton pump inhibitors / Ингибиторы протонной помпы

2. Calcium-channel blockers / Блокаторы кальциевых каналов

3. Statins / Статины

4. Coumarin derivatives / Производные кумарина

5. Ketoconazole / Кетоконозол

6. Morphine / Морфин

7. Rifampicine / Рифампицин

8. Hypericum perforatum / Зверобой продырявленный

III. Low treatment adherence / Низкая приверженность лечению

Material and methods

Population. The clinical part of the study (including estimation of platelets' functional activity) was conducted in Moscow city clinical hospital №1 and №7. Genotyping for CYP2C19 and phenotyping for CYP3A4 were performed in "Research Center for Evaluation of Medical Products" of the Ministry of Health of the Russian Federation. The research protocol was approved by a local Ethics Committee.

The inclusion criteria were as follows: ACS with subsequent percutaneous coronary intervention (PCI); ASA intake in the loading dose of 300 mg and in the maintaining one of 100 mg, clopidogrel intake in the loading dose of 300 mg and in the maintaining one - 75 mg (11 patients were receiving 600 mg as the loading dose and 2 patients - 150 mg as the maintaining one); patient's written consent for participation in the study.

Exclusion criteria were as follows: individual ASA or clopidogrel intolerance, active bleeding, major trauma or surgical interventions during the last month, severe renal and liver failure.

A total of 81 patients with ACS and subsequent PCI (64 males) were enrolled into the study. All the patients were prescribed DAT: ASA in the loading dose of 300 mg and maintaining dose of 100 mg, clopidogrel in the loading dose of 300 mg and in the maintaining one - 75 mg (11 patients received 600 mg

Целью нашего исследования является оценка влияния метаболической активности изофермента CYP3A4, полиморфных маркеров гена СУР2С19, а также различных кли-нико-демографических и лабораторно-инструментальных факторов на функциональную активность тромбоцитов.

Материал и методы

Популяция. Клиническая часть исследования (включая оценку функциональной активности тромбоцитов) проводилась на базе ГКБ №1 и ГКБ №7 города Москвы. Геноти-пирование по СУР2С19 и фенотипирование по CYP3A4 проводились на базе ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России. Протокол исследования был одобрен локальным Этическим комитетом.

Критерии включения: ОКС с последующим чрескожным коронарным вмешательством (ЧКВ); прием АСК в дозе 300 мг - нагрузочная и 100 мг - поддерживающая; клопидогрел в дозе 300 мг - нагрузочная, 75 мг - поддерживающая (11 пациентов получали нагрузочную дозу - 600 мг и 2 пациента поддерживающую дозу - 150 мг); письменное согласие пациента на участие в исследовании.

Критерии исключения: индивидуальная непереносимость АСК или клопидогрела, активное кровотечение, обширные травмы и операции за последний месяц, тяжелая почечная и печеночная недостаточность.

В исследование включен 81 пациент (64 мужчины и 17 женщин) с ОКС и последующим ЧКВ. Всем больным была

as the loading dose and 2 patients - 150 mg as the maintaining one). ACS with ST-segment elevation was diagnosed in 50 patients and ACS with no ST-seg-ment elevation - in 31 patients.

Patient selection and biological material sampling were performed 2-5 days after the intervention. In patients receiving Ilb-IIIa glycoprotein inhibitors platelet aggregation was evaluated no sooner than

5-6 days after cessation of intravenous administration of the drug. 77 patients had undergone coronary artery stenting, to 30 of them (38.9%) drug-eluting stents were implanted; mean number of stents for one patient was 1.13.

Estimation of platelet aggregation. Venous blood samples obtained no sooner than 24 hours after the PCI in 2 ml vacutainer tubes with 3.2% sodium citrate were used to estimate platelet functional activity.

The assessment of platelet on-treatment reactivity was carried out using a test-system for bed-side test of platelet activity - the VerifyNow P2Y12 («Accu-metrics», the USA). Platelets are activated due to ADP influence and interact with fibrinogen on micropar-ticles in the solution. The more agglutination is expressed, the less an optical dense of the solution is. The blockade of the P2Y12 receptors results in the absence of platelet activation and, consequently, of agglutination on microparticles. The level of platelet aggregation is expressed in units of the PRU reaction and in platelet inhibition percentage. The assessment was performed within one hour after venous blood collection.

Identification of CYP2C19 gene polymorphisms. Venous blood samples obtained on 2-5 day after the PCI in the VACUETTE vacutainer tubes (Greiner Bio-One, Austria) with ethylenediaminete-traacetic acid (EDTA) were used for genotyping. Car-riership of CYP2C19 polymorphisms was revealed by the method of polymerase chain reaction in real time (the Real-Time PCR) on the Applied Biosystems StepOne™ device (Life Technologies, the USA). The PCR sets "Clopidogrel 1" and "Clopidogrel 2" ("Litech", Russia) were used for genotyping.

Measurement of CYP3А4 isoenzyme metabolic activity. 5 ml of patient's morning urine samples collected on 2-5 day in tubes without preserving additives were used as a material for the assay.

6-p-hydroxycortizol and cortizol levels were measured by the chromatography-mass spectrometry analysis on a high-performance liquid chromatograph - the Agilent G1978B Multimode Sourse for 6410 Triple Quade LC/MS (Agilent Technologies, Inc., USA). Metabolic activity of the CYP3A4 was estimated by urinary 6-OHC/FC ratio.

назначена ДАТ: АСК в дозе 300 мг - нагрузочная и 100 мг - поддерживающая; клопидогрел в дозе 300 мг - нагрузочная, 75 мг - поддерживающая (11 пациентов получали нагрузочную дозу - 600 мг и 2 пациента поддерживающую дозу - 150 мг). У 50 пациентов наблюдался ОКС с подъемом сегмента ST, и у 31 - ОКС без подъема сегмента ST.

Отбор пациентов и набор биологического материала осуществлялся на 2-5 день после вмешательства. У пациентов, получавших ингибиторы гликопротеина Ilb-IIIa, агрегация оценивалась не ранее 5-6 дней после окончания внутривенного введения препарата. Стентирование коронарных артерий было выполнено 77 пациентам: 30 (38,9%) с лекарственным покрытием; среднее количество стентов на пациента - 1,13.

Оценка агрегации тромбоцитов. Для оценки функциональной активности тромбоцитов использовали венозную кровь, набранную не ранее 24 часов после ЧКВ в вакуумные пробирки объемом 2 мл с 3,2% цитратом натрия. Измерение остаточной реактивности тромбоцитов осуществлялось на тест-системе для прикроватной оценки активности тромбоцитов - VerifyNow P2Y12 («Accumetncs», США). Тромбоциты под влиянием АДФ активируются и взаимодействуют с фибриногеном на микрочастицах в растворе. Чем больше выражена агглютинация, тем ниже оптическая плотность раствора. При блокаде P2Y12 рецепторов активации тромбоцитов и, следовательно, агглютинации на микрочастицах, не происходит. Степень агрегации тромбоцитов выражается в единицах реакции PRU (P2Y12 Reaction Units) и процентах ингибирования. Исследование проводилось в течение 1 часа после взятия образца цельной венозной крови.

Определение полиморфизмов гена CYP2C19. Для ге-нотипирования использовали венозную кровь, собранную на 2-5 сутки после ЧКВ в вакуумные пробирки VACUETTE (Greiner Bio-One, Автрия) с этилендиаминтетраа-цетатом (ЭДТА). Носительство полиморфных маркеров гена CYP2C19 выявлялось методом полимеразно-цепной реакции в реальном времени (Real-Time PCR) на приборе Applied Biosystems StepOne™ (Life Technologies, USA). При проведении генотипировнаия были использованы наборы для ПЦР реакции: «Клопидогрел 1» и «Клопидогрел 2» (ООО НПФ «Литех», Россия).

Измерение метаболической активности изофер-мента CYP3А4. Материал для исследования: 5 мл утренней мочи пациента, собранные на 2-5 день в пробирки без консерванта. Содержание 6^-гидроксикортизола и кор-тизола определялось методом хромато-масс-спектромет-рического анализа на высокоэффективном жидкостном хроматографе Agilent G1978B Multimode Sourse for 6410 Triple Quade LC/MS (Agilent Technologies, Inc., USA). Метаболическая активность CYP3А4 оценивалась по отношению 6-OHC/FC в утренней моче.

Статистическая обработка результатов. Статистическая обработка результатов проводилась в SPSS Statistics 20.0.

Statistical processing of the results. Statistical processing of the results was performed using the Statistics 20.0 SPSS. Mean values are presented as M±SD, where M - Mean and SD - Standard Deviation. To estimate significance of differences between quantitative variables the one-way analysis of variance (ANOVA) was used. The influence of quantitative factors on platelet activity was estimated by the linear regression analysis. To determine distinctions in categorical variables the Pearson's chi-squared (x2) test was used. The influence of CYP2C19 genotypes on platelet aggregation was assessed by the logistic regression method. Variables which revealed tendency to statistical significance of differences in groups of aggregation in variance analysis (heart rhythm disturbances, calcium channel blockers intake) were also included in a number of co-variates. To check on compliance with the Hardy-Weinberg equilibrium the Fisher's exact test was applied. Differences with p<0.05 were regarded as significant.

Results

Characteristics of the patients enrolled into the study are shown in Tables 2-4.

Linear regression analysis revealed that a smaller mean stent diameter slightly decreased the risk of high on-treatment platelet reactivity (HPR) (Table 5). Other quantitative clinical, demographic and laboratory parameters did not influence the risk of HPR occurrence (Table 2-4). Logistic regression analysis revealed significant increase in HPR risk in patients-carriers of CYP2C19*2 polymorphism (Table 5). The tendency of increasing HPR risk was also shown in those who were receiving calcium channel blockers or had different heart rhythm disturbances.

Influence of CYP2C19 gene polymorphism on platelet activity. CYP2C19 genotypes were distributed as follows: 68 (84.0%) patients had normal genotype (CYP2C19*1/*1) and 13 (16.0%) were the carriers of the allele associated with reduced metabolism (CYP2C19*1/*2) (Fig.1). CYP2C19*2/*2 genotype and CYP2C19*3 allelic variant were not revealed. Distribution of alleles and genotypes was in line with Hardy-Weinberg law (x2=0.61; p=0.43). Patients non-responsive to clopidogrel (PRU>208) were significantly more often the CYP2C19*2 carriers: 36.8% vs 9.7% (p=0.01) (Fig.2). The mean platelet inhibition percentage was significantly higher in patients with no CYP2C19*2 as compared to the carriers of this allele: 30.7±20.1 in the group of the CYP2C19*1/*1 vs 18.2±16.4 in the group of the CYP2C19*1/*2 (p=0.03) (Fig.3). A share of patients with laboratory non-re-

Средние показатели представлены как М±SD, где М -среднее, SD - стандартное отклонение. Для оценки достоверности различий количественных показателей был применен однофакторный дисперсионный анализ ANOVA. Определение влияния количественных факторов на активность тромбоцитов проводилась при помощи линейного регрессионного анализа. Для установления различий категориальных показателей был применен критерий хи-квад-рат Пирсона х2. Влияния генотипов СУР2С19 на агрегацию тромбоцитов оценивалось методом логистической регрессии; в число ковариат были также включены переменные, имеющие тенденцию к значимости различий между группами агрегации в вариационном анализе (нарушение ритма, прием блокаторов медленных кальциевых каналов). Для проверки соблюдения равновесия Харди-Вайнберга применялся точный критерий Фишера. Различия считались значимыми при р<0,05.

Результаты

Характеристика пациентов, включенных в исследование, представлена в табл. 2-4.

Линейный регрессионный анализ показал, что меньшее значение среднего диаметра стента незначительно снижает риск развития высокой остаточной реактивности тромбоцитов (ВОРТ) (табл. 5). Остальные количественные клинические, демографические и лабораторные показатели не влияли на риск развития ВОРТ (табл. 2-4). В результате логистического регрессионного анализа было выявлено значимое повышение риска развития ВОРТ у пациентов-носителей полиморфного маркера СУР2С19*2 (табл. 5), а также наблюдалась тенденция к повышению риска ВОРТ среди пациентов, принимающих блокаторы медленных кальциевых каналов, и имеющих различные виды нарушения ритма сердца.

Влияние полиморфизма гена CYP2C19 на активность тромбоцитов. Распределение генотипов СУР2С19: 68 (84,0%) пациентов имели нормальный генотип (СУР2С19*1/*1) и 13 (16,0%) являлись носителями аллеля, связанного со сниженным метаболизмом (СУР2С19*1/*2) (рис. 1). Генотип СУР2С19*2/*2 и аллельный вариант СУР2С19*3 обнаружены не были. Распределение аллелей и генотипов соответствовало закону Харди-Вайнберга (х2=0,61; р=0,43). Носительство СУР2С19*2 значимо чаще встречалось в группе резистентных к клопидогрелу ^и>208): 36,8% (п=7) против 9,7% (п= 6; р=0,01) (рис. 2). Средний процент ингибирования тромбоцитов был значительно выше у пациентов без СУР2С19*2 по сравнению с носителями данного аллеля: 30,7±20,1 в группе СУР2С19*1/*1 против 1 8,2±1 6,4 в группе СУР2С19*1/*2 (р=0,03) (рис. 3). Доля пациентов с лабораторной резистентностью к клопидогрелу ^и>208) оказалась выше среди носителей СУР2С19*2 по сравнению с пациентами без данного аллеля: 53,8% среди пациентов с генотипом СУР2С19*1/*2 и 16,2% с генотипом СУР2С19*1/*1 (от-

Table 2. Clinical and demographic data Таблица 2. Клинико-демографические данные

Parameters Параметры All patients Patients with PRU<208 Все пациенты Пациенты с PRU<208 Patients with PRU<208 Пациенты с PRU>208 Р

Age, years / Возраст, годы 63.9±10.9 63.2±11.0 66.2±10.4 0.265

Men / Число мужчин, n (%) 64 (79.0) 50 (80.6) 14 (73.7) 0.360

BMI, kg/m2/ ИМТ, кг/м2 27.8±3.1 28.0±3.2 27.8±3.1 0.361

Diagnosis / Диагноз

Unstable angina pectoris / Нестабильная стенокардия, n

Q-wave myocardial infarction Q-образующий инфаркт миокарда, n

Non-Q-wave myocardial infarction Не^-образующий инфаркт миокарда, n (%) 17 (21.0) 14 (22.6) 3 (15.8) 0.290

Unspecified myocardial infarction Инфаркт миокарда неуточненный, n

Risk factors / Факторы риска

Type 2 diabetes mellitus / Сахарный диабет 2 тип, n (%) 16 (19.8) 12 (19.4) 4 (21.1) 0.552

Arterial hypertension / Артериальная гипертония, n (%) 75 (92.5) 58 (95.1 ) 17 (89.5) 0.340

Anemia / Анемия, n (%) 4 (4.9) 4 (6.5) 0 (0.0) 0.335

Active smoking / Активное курение, n (%) 17 (21.5) 20 (0.0) 5 (26.3) 0.385

Myocardial infarction / Инфаркт миокарда, n (%) 14 (17.2) 8 (12.9) 6 (31.5) 0.497

Ischemic stroke / Ишемический инсульт, n (%) 5 (6.2) 4 (6.5) 1 (5.6) 0.686

FC II-III CHF / ХСН II-III ФК, n (%) 3 (3.7) 1 (1.6) 2 (10.5) 0.136

Heart rhythm disturbances, n (%) / Нарушения ритма, n (%) 8(9.9) 4 (6.5) 4 (21.1) 0.083

Previous PCI / Выполненное ЧКВ, n (%) 12 (14.8) 8 (12.9) 4 (21.1) 0.295

PRU - P2Y12 Reaction Units; FC - functional class; CHF - chronic heart failure; PCI - percutaneous coronary intervention; BMI - body mass index

PRU - единицы реакции тромбоцитов (P2Y12 Reaction Units); ФК - функциональный класс; ХСН - хроническая сердечная недостаточность; ЧКВ - чрескожное коронарное вмешательство; ИМТ - индекс массы тела

sponsiveness to clopidogrel was higher among the CYP2C19*2 carriers as compared to non-carriers: 53.8% among the CYP2C19*1/*2 patients and 16.2% - in those with the CYP2C19*1/*1 genotype (odds ratio [OR]=1.8; 95% confidence interval [95% CI]: 1.0-3.2; p=0.0067). Carriership of CYP2C19*2 responsible for hypometabolism irrespectively increased the HPR risk (OR=4.3; 95% CI: 1.3-17.6; p=0.022).

Estimation of CYP3А4 metabolic activity influence on platelet activity. According to linear regression analysis results the levels of 6- -hydrocor-tizol, cortizol and their ratio did not significantly influence the HPR. No significant distinctions with respect to urinary 6-OHC/FC ratio (the marker of CYP3A4 activity) were found: 3.4±2.8 in the group of PRU>208 and 3.2±3.0 in the group of PRU<208 (p=0.8) (Fig.4). Moreover, we revealed no significant correlation between platelet activity and 6-OHC/FC ratio (p=0,849).

Discussion

Previous studies have proved the association of HPR with ischemic complications in patients with is-

ношение шансов [ОШ]=1,8; 95% доверительный интервал [95% ДИ]: 1,0-3,2; р=0,0067). Носительство аллеля, ответственного за сниженный метаболизм CYP2C19*2, независимо повышало риск развития ВОРТ (ОШ=4,3; 95% ДИ: 1,3-17,6; р=0,022).

Оценка влияния метаболической активности CYP3A4 на активность тромбоцитов. По результатам линейного регрессионного анализа, достоверного влияния уровня 6-р-гидроксикортизола, кортизола, а также их соотношения на ВОРТ не обнаружено. Не наблюдалось и значимых различий по показателю 6-OHC/FC в утренней моче (маркер активности CYP3A4): 3,4±2,8 в группе PRU>208 и 3,2±3,0 в группе PRU<208 (p=0,8) (рис. 4). Кроме того, не было отмечено статистически значимой корреляции между активностью тромбоцитов и отношением 6-OHC/FC (р=0,849).

Обсуждение

В проведенных ранее исследованиях была доказана ассоциация ВОРТ с развитием ишемических осложнений у больных ишемической болезнью сердца (ИБС) [15-17]. Так, в многоцентровом регистре ADAPT-DES (Assessment of Dual Anti Platelet Therapy with Drug Eluting Stents) [18] с участием 8583 пациентов с ИБС, подвергнутых ЧКВ (50% с

Table 3. Angiographic data

Таблица 3. Ангиографические данные

Parameters Параметры All patients Все пациенты Patients with PRU<208 Пациенты с PRU<208 Patients with PRU>208 Пациенты с PRU>208 p

Single-vessel disease / Поражен 1 сосуд, n

Two-vessel disease / Поражено 2 сосуда, n (%) 7(8.6) 5 (8.1) 2 (10.5) 0,508

Three-vessel disease / Поражено 3 сосуда, n

Left main coronary artery / Ствол левой коронарной артерии, n (%) 4 (4.9) 4 (6.5) 0 (0.0) 0.335

Circumflex artery / Огибающая артерия, n (%) 27 (34.2) 22 (36.7) 5 (26.3) 0.295

Right coronary artery / Правая коронарная артерия, n (%) 23 (28.3) 15 (24.6) 8 (42.1) 0.115

Obtuse marginal artery / Артерия тупого края, n (%) 4 (4.9) 3 (4.8) 1 (5.3) 0.665

Anterior descending artery / Передняя нисходящая артерия, n (%) 39 (49.4) 32 (53.3) 7 (36.8) 0.161

Stent thrombosis / Тромбоз стента, n (%) 2 (2.5) 1 (1.7) 1 (5.3) 0.416

Drug-eluting stents / Стенты с лекарственным покрытием, n (%) 30 (38.9) 25 (43.1 ) 5 (26.3) 0.331

Stent mean diameter, mm / Средний диаметр стента, мм 2.75±6.8 2.6±0.8 3.0±0.3 0.049

Mean overall stent length for a patient, mm Средняя суммарная длина стентов на пациента, мм 25.5±5.1 26.3 (10.9) 22.7 (6.4) 0.178

1 stent deployment / Установлен 1 стент, n (%) 67 (82.7) 50 (86.2) 17 (89.4) 0.489

2 stents deployment / Установлено 2 стента, n

PRU - P2Y12 Reaction Units PRU - единицы реакции тромбоцитов

Table 4. Laboratory and instrumental parameters and medical co-therapy 2-5 days after PCI

Таблица 4. Лабораторно-инструментальные показатели и сопутствующая медикаментозная терапия через 2-5 дней после ЧКВ

Parameters Параметры All patients Все пациенты Patients with PRU<208 Пациенты с PRU<208 Patients with PRU>208 Пациенты с PRU>208 p

Left ventricle ejection fraction Фракция выброса левого желудочка, % 48.8±8.8 48.8±9.1 49.0±8.2 0.922

Left ventricle aneurism / Аневризма левого желудочка, n (%) 8 (10.0) 7 (11.3) 1 (5.3) 0.396

White blood count, 109cell/l / Лейкоциты, 109 клеток /л 8.9±2.5 8.8±2.7 9.5±1.6 0.275

Platelet count, 109 cell/l / Тромбоциты, 109 клеток /л 229.2±59.5 228.4±55.9 219±20.3 0.614

Hemoglobin, g/l / Гемоглобин, г/л 142.1 ±17.4 143.4±18.1 137±14.6 0.233

Total cholesterol, mmol/l / Общий холестерин, ммоль/л 5.1±1.1 5.2±1.2 4.9±1.1 0.415

LDL-C, mmol/l / ЛПНП, ммоль/л 2.8±1.2 2.88±1.1 2.8±1.0 0.810

Triglycerides, mmol/l / Триглицериды, ммоль/л 1.6±0.6 1.7±0.7 1.6±0.5 0.729

Creatinine, mcmol/l / Креатинин, мкмоль/л 105.1 ±20.3 104.9±21.2 105.8±17.9 0.862

Glucose, mmol/l / Глюкоза, ммоль/л 6.1 ±1.7 6.9±2.4 6.2±2.0 0.657

Hematocrit / Гематокрит, % 43±3.4 41.9±7.5 42.1 ±3.6 0.689

Calcium channel blockers / Блокаторы кальциевых каналов, n (%) 5 (6.2) 2 (3.2) 3 (15.8) 0.081

Diuretics / Диуретики, n (%) 22 (27.2) 17 (27.4) 5 (26.3) 0.588

Proton pump inhibitors / Ингибиторы протонной помпы, n (%) 80 (98.8) 62 (100) 18 (94.7) 0.235

Beta-adrenoblockers / Бета-адреноблокаторы, n (%) 71 (89.9) 54 (90.0) 17 (89.5) 0.621

ACE-inhibitors / Ингибиторы АПФ, n (%) 62 (76.5) 49 (79.0) 13 (68.4) 0.254

LDL-C - low-density lipoprotein cholesterol; ACE-inhibitors - angiotensin-converting-enzyme inhibitors ЛПНП - липопротеиды низкой плотности; ингибиторы АПФ - ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента

chemic heart disease (IHD) [15-17]. So, the multicenter ADAPT-DES register of 8583 IHD patients undergoing PCI (50% with ACS) has shown that HPR development on clopidogrel treatment (PRU>208; method: VerifyNow) was irrespectively associated

ОКС), было выявлено, что развитие ВОРТ на терапии кло-пидогрелом ^и>208; метод: VerifyNow) независимо ассоциировано с трехкратным повышением риска вероятного/определенного тромбоза стента как в первые 30 дней (ОШ: 3,00; 95% ДИ: 1,39-6,49; р=0,005), так и инфарк-

Table 5. High on-treatment platelet reactivity predictors

Таблица 5. Предикторы высокой остаточной реактивности тромбоцитов

Factors / Факторы Odds ratio 95% confidence interval

Отношение шансов 95% Доверительный интервал p

CYP2C19*2 4.365 1.248-17.673 0.022

Mean stent diameter / Средний диаметр стента 0.219 0.002-0.229 0.049

™ Amplification Plot

Интенсивность „ , п11„

флуоресценции Кривая амлификации ДНК

Cycle / Количество циклов I allel*1 / аллель 1

n

60

PRU< 208 PRU> 208

CYP2C19*1/*1  CYP2C19*1/*2 PRU - P2Y12 Reaction Units

PRU - единицы реакции тромбоцитов

Figure 1. The Real-Time PCR results of the patient D.M. with

the CYP2C19*1/*2 genotype Рисунок 1. Результат ПЦР в реальном времени пациента Д.М. с генотипом CYP2C19*1/*2

Figure 2. CYP2C19*2 carriership influence on the absolute

platelet reactivity Рисунок 2. Влияние носительства CYP2C19*2 на абсолютную реактивность тромбоцитов

6-OHC/FC 35

30

25

20

15

10

5

p = 0,038

CYP2C19*1/*1

% PI I YP2C19*1/*2

%PI - Platelet Inhibition Percentage %PI - процент ингибиции тромбоцитов

6-OHC/FC - отношение концентрации 6-|3-гидроксикортизола к кортизолу

0

PRU - P2Y12 Reaction Units; 6-OHC/FC - б-в-hydroxycortisol/cortisol

PRU - единицы реакции тромбоцитов (P2Y12 Reaction Units);

6-OHC/FC - отношение концентрации 6-в-гидроксикортизола к кортизолу

Figure 3. CYP2C19*2 carriership influence on mean platelet

inhibition percentage Рисунок 3. Влияние носительства CYP2C19*2 на средний процент ингибирования тромбоцитов

Figure 4. Influence of the index of CYP3A4 metabolic activity

on platelet aggregation Рисунок 4. Влияние показателя метаболической активности CYP3A4 на активность тромбоцитов

with three-fold increase both in the risk of probable/definite stent thrombosis in the first 30 days (OR: 3.00; 95% CI: 1.39-6.49; p=0.005) and of myocardial infarction (MI) and stent thrombosis a year after the intervention: (OR: 2.49; 95% CI: 1.434.31; p=0.001) and (OR: 1.42; 95% CI: 1.09-1.86; p=0.01) respectively. Independent meta-analyses have also confirmed significant increase in the risks of MI, stent thrombosis and cardiovascular death [19,20]. According to the guidelines of the European Society of Cardiology the assessment of platelet functional activity is indicated for ACS patients at a high risk for stent thrombosis: left main coronary artery (LMCA) lesion, history of stent thrombosis, thrombosis of an only patent artery, multivascular lesion [21]. So, it is important to additive determine different clinical, demographic, laboratory and genetic factors influencing platelet activity to detect predictors of clopidogrel non-responsiveness. Our study revealed no significant impact of any clinical, demographic, laboratory and instrumental factors on the risk of clopidogrel non-resposiveness development. Insufficient sample size is a possible reason for this result. Mean stent diameter was the only angiographic index which significantly influenced HPR risk (p=0.049). At that carriership of the CYP2C19*2 allele significantly several times increased the risk of HPR development (p=0.022). This is in line with the literature data. For example, Mega et al. in a well-known meta-analy-sis of 9685 patients (PCI - 91%, ACS - 55%) [22] demonstrated significant increase in the risk of composite endpoint (cardiovascular death, myocardial infarction or stroke) in carriers of CYP2C19 alleles encoding enzyme with reduced function (OR=1.76; 95% CI: 1.24-2.50; p=0.002). According to guidelines of the International Pharmacogenetics Implementation Consortium in patients with revealed CYP2C19 gene alleles P2Y^-recep-tors blockers, that are not metabolized by P4502C19 (ticagrelor, prasugrel), should be recommended, [23], at that genotyping for P2Y12-receptors blockers selection is not indicated for everyone, but first of all, for patients at a high risk for stent thrombosis (grade of recommendation IIB [4,24,25]): interventions on unprotected left main coronary artery (LMCA), stenosis of LMCA bifurcation, stenosis of the only patent coronary artery, repeated PCI. The influence of new genetic markers on platelet functional activity is being extensively studied. So, V. Tatarunas et al. studied the effect of CYP4F2 gene polymorphisms on the platelet activity in 89 IHD patients receiving clopidogrel as a part of DAT: patients with GA genotype for polymorphic marker CYP4F2 G1347A had significantly higher platelet aggregation level as

та миокарда (ИМ) и тромбоза стента через год после вмешательства (ОШ: 2,49; 95% ДИ: 1,43-4,31; р=0,001) и (ОШ: 1,42; 95% ДИ: 1,09-1,86; р=0,01) соответственно. Достоверное повышение риска ИМ, тромбоза стента и смерти от сердечно-сосудистых причин также подтверждено результатами независимых мета-анализов [19, 20]. Согласно рекомендациям экспертов Европейского общества кардиологов оценка функциональной активности тромбоцитов показана прежде всего пациентам с ОКС, имеющим высокий риск тромбоза стента: поражение ствола левой коронарной артерии, тромбоз стента в анамнезе, тромбоз единственной проходимой артерии, многососудистое поражение [21 ]. Таким образом, чрезвычайно важно установить различные клинико-демографические, лабораторные и генетические факторы, влияющие на активность тромбоцитов, с целью выявления предикторов резистентности к клопи-догрелу. В проведенном нами исследовании достоверного влияния различных клинико-демографических и лабо-раторно-инструментальных факторов на риск развития резистентности к клопидогрелу обнаружено не было. Возможной причиной такого результата является недостаточный объем выборки. Единственным ангиографическим показателем, достоверно влияющим на риск развития ВОРТ, оказался средний диаметр стента (р=0,049). Вместе с тем, носительство аллеля CYP2C19*2 достоверно повышало в несколько раз риск развития высокой остаточной реактивности тромбоцитов (р=0,022). В этом наши результаты согласуются с литературными данными. Например, в известном мета-анализе Mega и соавт. [22] с включением 9685 пациентов (ЧКВ - 91 %, ОКС - 55%) продемонстрировано значительное повышение риска комбинированной конечной точки в виде сердечно-сосудистой смерти, инфаркта миокарда или инсульта у носителей аллелей CYP2C19, кодирующих фермент со сниженной функциональной активностью (ОШ=1,76; 95% ДИ: 1,24-2,50; р=0,002). Согласно рекомендациям международного консорциума по внедрению фармакогенетики при выявлении у пациента аллей гена CYP2C19 рекомендуется назначение блокатора P2Y12-рецепторов, не метаболизирующегося изоферментом Р4502С19 (тикагрелор, прасугрел) [23], при этом генотипирование для выбора блокатора P2Y^^-цепторов показано не всем пациентам, а, прежде всего, имеющим высокий риск тромбоза стента (класс рекомендаций IIB [4, 24, 25]): вмешательства на незащищенном стволе левой коронарной артерии (ЛКА), бифуркационный стеноз ствола ЛКА, стеноз единственной проходимой коронарной артерии, повторные ЧКВ. Активно изучается и влияние новых генетических маркеров на функциональную активность тромбоцитов. Так, в исследовании V. Tatarunas и соавт. среди 89 больных ИБС, получающих клопидогрел в составе ДАТ, было изучено влияние полиморфизма гена CYP4F2 на активность тромбоцитов: пациенты с генотипом GA по полиморфному маркеру CYP4F2 G1347A имели достоверно более высокий уровень агрегации тромбоцитов

compared with the carriers of GG (p=0.04) or AA (p=0.01) genotypes [26].

Russian studies experience. While discussing the issue of clopidogrel resistance it is necessary to mention one of the first full-value studies on this problem conducted by V. A. Sulimov et al in Russian Federation [27]. The study included 100 patients (74 males) with angina pectoris of functional class II-IV and mean age 61 (40-79) years. The main results of this research related to the aspects studied in our trial are listed below: 1) incidence rate of clopidogrel in standard dose non-responsiveness was 56%; 2) such factors as diabetes mellitus, obesity, omeprazol intake and angina pectoris functional class significantly influenced the development of non-responsiveness. Unlike V.A. Sulimov's et al research our study included patients with ACS, and the primary goal was to estimate the influence of CYP3A4 metabolic activity and CYP2C19 polymorphisms on platelet functional activity. Contribution of genetic factors to clinical and laboratory clopidogrel non-responsiveness was studied in some other more recent studies that revealed similar data with some limitations (A.L. Komarov, 201 2 [28]; E.Z. Goluhova, 2014 [29]; A.V. Mazurov, 2014 [30]). The study of Komarov A.L. et al demonstrated that male sex, low ejection fraction, multivascular lesion of coronary arteries, the ABCB1 C3435T polymorphism and proton pump inhibitors intake significantly increase the risk of clopidogrel non-responsiveness. Carrier-ship of CYP2C19*2 allelic variant in homozygous state 2.4-times increased the risk of thrombotic cardiovascular complications (95% CI=1.2-4.9; p=0.01) [28].

Our study was the first to assess the influence of CYP3A4 isoenzyme metabolic activity on platelet functional activity in ACS patient undergoing PCI on dual antiplatelet therapy. According to the study data there was no significant association between the CYP3A4 isoenzyme activity and platelet on-treatment reactivity. This may be a result (1) of inadequacy of the method for CYP3A4 metabolic activity estimation [31] due to significant variability of cortizol and its metabolites levels in urine as well as (2) of relatively small sample size.

Conclusion

CYP2C19*2 carriership in ACS patients subjected to PCI significantly increases the risk of clopidogrel resistance (high on-treatment platelet reactivity). Urinary 6-OHC/FC ratio used as a marker of CYP3A4 isoenzyme activity does not correlate with platelet functional activity.

по сравнению с носителями генотипа GG (р=0,04) или АА (р=0,01) [26].

Опыт российских исследований. Раскрывая различные аспекты проблемы резистентности к клопидогрелу, необходимо упомянуть одно из первых полноценных исследований по данной проблеме в Российской Федерации, проведенное В.А. Сулимовым и соавт. [27]. Приведем основные результаты данного исследования (100 пациентов со стенокардией напряжения И-М функционального класса, 74 мужчины, средний возраст 61 (40-79) лет), имеющие отношение к аспектам, изучаемым в проведенном нами исследовании: 1) частота резистентности к клопидогрелу в стандартной дозе составила 56 %; 2) на развитие резистентности значимо влияли такие факторы, как сахарный диабет, ожирение, прием омепразола и функциональный класс стенокардии. В отличие от работы В.А. Сулимова и соавт., в нашем исследовании участвовали больные с ОКС, и основной целью являлась оценка влияния метаболической активности изофермента CYP3A4 и полиморфных маркеров гена СУР2С19 на функциональную активность тромбоцитов. Вклад генетических факторов в развитии лабораторной и клинической резистентности к клопидогрелу изучался в ряде других, более поздних исследований, где получены схожие данные, с некоторыми ограничениями (А.Л. Комаров, 201 2 [28]; Е.З. Голухова, 2014 [29]; А.В. Мазуров, 2014 [30]). В исследовании Комарова А.Л., и соавт. было продемонстрировано, что мужской пол, низкая фракция выброса, многососудистое поражение коронарного русла, полиморфизм АВСВ1 С3435Т и прием ингибиторов протонного насоса достоверно повышают риск развития резистентности к клопидогрелу. Носительство аллельного варианта СУР2С19*2 в гомозиготном состоянии повышает риск тром-ботических осложнений сердечно-сосудистой системы в 2,4 раза (95% ДИ=1,2-4,9; р=0,01) [28].

В нашем исследовании впервые изучалось влияние метаболической активности изофермента СУР3А4 на функциональную активность тромбоцитов на фоне ДАТ терапии у пациентов с ОКС, перенесших ЧКВ. По результатам исследования статистически значимой ассоциации между активностью изофермента СУР3А4 и остаточной реактивностью тромбоцитов не обнаружено. Причиной этого может послужить (1) несовершенство метода оценки метаболической активности СУР3А4 [31] из-за значительной вариабельности уровня кортизола и его метаболитов в моче, а также (2) относительно небольшое число пациентов, включенных в исследование.

Заключение

Носительство СУР2С19*2 у пациентов с ОКС, подвергнутых ЧКВ, значимо повышает риск развития резистентности (высокой остаточной реактивности тромбоцитов) к клопидогрелу. Отношение 6-ОНСДС в утренней моче, используемое в качестве маркера активности изофермента СУР3А4, не коррелирует с функциональной активностью тромбоцитов.

Disclosures. All authors disclose that have no po- Конфликт интересов. Все авторы заявляют об отсутствии

tential conflict of interest regarding the content of this потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия paper. в данной статье.

References / H MTepaiypa

1. Ruggeri Z.M., Platelets in atherothrombosis, Nature Med, 2002;8:1227-34.

2. Montalescot G, Sechtem U, Achenbach S, et al. ESC guidelines on the management of stable coronary artery disease: the Task Force on the management of stable coronary artery disease of the European Society of Cardiology. Eur Heart J 2013;34(38):2949-3003.

3. Steg PG, James SK, Atar D, et al. ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation: Task Force on the management of ST-segment elevation acute myocardial infarction of the European Society of Cardiology (ESC). Eur Heart J 2012;33(20):2569-61 9.

4. Hamm CW, Bassand JP, Agewall S, et al. ESC Guidelines for the management of acute coronary syndromes in patients presenting without persistent ST-segment elevation: the Task Force for the management of acute coronary syndromes (ACS) in patients presenting without persistent ST-segment elevation of the European Society of Cardiology (ESC). Eur Heart J 2011 ;32(23):2999-3054.

5. Breet NJ, van Werkum JW, Bouman HJ, et al. Comparison of platelet function tests in predicting clinical outcome in patients undergoing coronary stent implantation. JAMA 2010;303(8):754-762.

6. Elsenberg EH, van Werkum JW, van de Wal RM, et al. The influence of clinical characteristics, laboratory and inflammatory markers on 'high on-treatment platelet reactivity' as measured with different platelet function tests. Thromb Haemost 2009;102:719-27.

7. Voisin S1, Bongard V, Tidjane MA, et al. Are P2Y12 reaction unit (PRU) and % inhibition index equivalent for the expression of P2Y12 inhibition by the VerifyNow assay? Role of haematocrit and haemoglobin levels. Thromb Haemost2011 ;106(2):227-9.

8. Gurbel PA, Bliden KP, Hiatt BL, et al. Clopidogrel for coronary stenting: response variability, drug resistance, and the effect of pretreatment platelet reactivity. Circulation 2003; 107: 2908-2913.

9. Serebruany VL, Steinhubl SR, Berger PB, et al. Variability in platelet responsiveness to clopidogrel among 544 individuals. J Am Coll Cardiol 2005; 45: 246-251.

10. Savi P, Herbert JM, Pflieger AM, et al. Importance of hepatic metabolism in the antiaggregating activity of the thienopyridine clopidogrel. Biochem Pharmacol. 1992 ;44(3) :527-32.

11. Kazui M, Nishiya Y Ishizuka T, et al. Identification of the human cytochrome P450 enzymes involved in the two oxidative steps in the bioactivation of clopidogrel to its pharmacologically active metabolite. Drug Metab Dispos 2010;38:92-9

12. Beitelshees AL, Horenstein RB, Vesely MR, Mehra MR, Shuldiner AR. Pharmacogenetics and clopidogrel response in patients undergoing percutaneous coronary interventions. Clin Pharmacol Ther. 2011;89:455-9.

13. Lamba JK, Lin YS, Thummel K, Daly A, et al. Common allelic variants of cytochrome P4503A4 and their prevalence in different populations. Pharmacogenetics 2002;12:121-32.

14. Micuda S, Sispera L, Hodac M, et al. Diurnal Variation of 6ß-Hydroxycortisol in Cardiac Patients. Physiol Res 2007; 56: 307-313.

15. Angiolillo DJ, Bernardo E, Sabate M, et al. Impact of platelet reactivity on cardiovascular outcomes in patients with type 2 diabetes mellitus and coronary artery disease. J Am Coll Cardiol 2007;50: 1 541 -1 547.

16. Sibbing D, Braun S, Morath T, Mehilli J, Vogt W, Schomig A et al. Platelet reactivity after clopidogrel treatment assessed with point-of-care analysis and early drug-eluting stent thrombosis. J Am Coll Car-diol 2009; 53: 849-856.

17. Pettersen AÂ, Seljeflot I, Abdelnoor M, et al. High on aspirin platelet reactivity and clinical outcome in patients with stable coronary artery disease: results from ASCET (Aspirin Nonresponsiveness and Clopidogrel Endpoint Trial). J Am Heart Assoc. 2012;1:e000703

18. Stone GW, Witzenbichler B, Weisz G, et al. Platelet reactivity and clinical outcomes after coronary artery implantation of drug-eluting stents (ADAPT-DES): a prospective multicentre registry study. Lancet 2013;382: 614-23.

19. Sofi F, Marcucci R, Gori AM, Giusti B, Abbate R, Gensini GF. Clopidogrel non-responsiveness and risk of cardiovascular morbidity. An updated meta-analysis. Thromb Haemost. 2010;1 03(4):841 -848.

20. Aradi D, Kom' ocsi A, Vorobcsuk A, et al. Prognostic significance of high on-clopidogrel platelet reactivity after percutaneous coronary intervention: systematic review and meta-analysis. Am Heart J. 201 0;160(3):543-551.

21. Aradi D, Storey RF, Komócsi A, Trenk D, Gulba D, Kiss RG et al. Expert position paper on the role of platelet function testing in patients undergoing percutaneous coronary intervention. Eur Heart J. 201 4;35(4):209-21 5.

22. Mega JL, Simon T, Collet JP, et al. Reduced-function CYP2C19 genotype and risk of adverse clinical outcomes among patients treated with clopidogrel predominantly for PCI: a meta-analysis. JAMA 201 0;304(16):1 821-30.

23. Scott SA, Sangkuhl K, Stein CM et al. Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium guidelines for CYP2C19 genotype and clopidogrel therapy: 2013 update. Clin Pharmacol Ther. 201 3;94(3):317-23.

24. Levine GN, Bates ER, Blankenship JC, et al. 2011 ACCF/AHA/SCAI guideline for percutaneous coronary intervention: a report of the American College of Cardiology Foundation/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines and the Society for Cardiovascular Angiography and Interventions. J Am Coll Cardiol 2011 ;58:e44-122.

25. Jneid H, Anderson JL, Wright RS, et al. 2012 ACCF/AHA focused update of the guideline for the management of patients with unstable angina/non-ST-elevation myocardial infarction: a report of the American College of Cardiology Foundation/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines. J Am Coll Cardiol 2012;60:645-81.

26. Tatarunas V, Jankauskiene L, Kupstyte N, et al. The role of clinical parameters and of CYP2C19 G681 and CYP4F2 G1347A polymorphisms on platelet reactivity during dual antiplatelet therapy. Blood Co-agul Fibrinolysis 2014;25(4):369-74.

27. Sulimov V.A., Moroz E.V Resistance to antiplatelet drugs

28. Komarov A.L., Shahmatova O.O., Iljushhenko TA., et al. Assessing Risk of Cardiovascular Events in Clopi-dogrel-Treated Patients with Stable CHD: Platelet Function or Genetic Testing? Doktor.Ru 2012; 6:1119. Russian

29. Goluhova E.Z., Grigorjan M.V., Rjabinina M.N., et al. The platelet reactivity after percutaneous coronary intervention in patients with double antiplatelet therapy: impact of genetic polymorphisms. Kreativnaja kardiologija 2014; 3:39-52. Russian

30. Mazurov A.V., Zjurjaev I.T., Haspekova S. G., et al. Factors influencing platelet aggregation in patients with acute coronary syndrome. Terapevticheskij arhiv 2014; 9:83-89. Russian

31. Hu ZY Zhao YS, Wu D et al. Endogenous cortisol 6 beta-hydroxylation clearance is not an accurate probe for overall cytochrome P450 3A phenotyping in humans. Clin Chim Acta 2009;408(1-2): 92-7.

Received / Поступила: 22.06.201 5 Accepted / Принята в печать: 14.07.201 5