Особенности влияния комплексного фитосредства на процессы свертывания при токсическом гепатите у белых крыс

УДК 616.36-002-092.4:615.9:615.322 doi.org:10.31684/2541-8475.2019.1(13).32-35

ОСОБЕННОСТИ ВЛИЯНИЯ КОМПЛЕКСНОГО ФИТОСРЕДСТВА НА ПРОЦЕССЫ СВЕРТЫВАНИЯ ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ У БЕЛЫХ КРЫС

1 Бурятский государственный университет, г. Улан-Удэ

2 Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, г. Улан-Удэ

Убеева Е.А.1, Николаев С.М.1,2, Оленников Д.Н.2, Убеева И.П.1

Цель работы заключалась в определении нарушений гемостаза при остром экспериментальном токсическом гепатите, вызванном введением D-галактозамина гидрохлорида у белых крыс, и возможности коррекции с помощью использования нового комплексного фитосредства. Состав исследуемого фито-экстракта включал гипекоум прямой Hypecoum erectus L., копеечник даурский Hedysarum dauricum, солодку уральскую Glycyrhhiza uralensis Fischer, календулу лекарственную Calendula officinalis и шлемник байкальский Scutellaria baicalensis. Применение фитополиэкстракта способствовало коррекции функционального состояния печени и проявлений гипокоагуляции.

Ключевые слова: комплексное растительное лекарственное средство, экспериментальный гепатит, гипокоагуляция, гепатопротекторный эффект.

The aim of the study is to determine the hemostasis disorders in acute experimental toxic hepatitis caused by the introduction of D-Galactosamine hydrochloride in white rats and the possibility of correction with the help of the use of a new complex herbal product. The composition of the analysed phytoextract included Hypecoum erectus L. (hypecoum straight), Hedysarum dauricum (Daur sweetvetch), Glycyrhhiza uralensis Fischer (Ural licorice), Calendula officinalis (pot marigold) and Scutellaria baicalensis (Baikal skullcap). The use of phytoextract contributed to the correction of the functional state of the liver and hypocoagulation manifestations. Key words: complex herbal medicine, experimental hepatitis, hypocoagulation, hepatoprotective effect.

Актуальность. Широкое распространение

Материалы и методы

вирусных гепатитов, увеличение частоты токсических, медикаментозных повреждений печени, метаболических нарушений определяет необходимость создания средств, обладающих гепатопротекторными свойствами. При определении тяжести течения заболеваний печени в клинике большое значение имеет выявление нарушений коагуляции, поскольку протромбин и другие факторы свертывания синтезируются в печени. Нарушения гемокоагуля-ции играют существенную роль в патогенезе повреждений печени, способны приобретать каскадный характер, приводить к диссемини-рованному внутрисосудистому свертыванию, нарушениям микроциркуляции, отягощать течение патологического процесса, определяя исход заболеваний [1, 2].

Лекарственные средства растительного происхождения привлекают внимание исследователей ввиду широкого спектра фармакотера-певтического воздействия, низкой токсичности, возможности потенцировать эффект благодаря сочетанию различных биологически активных веществ, особенно в комплексных фитосред-ствах [3, 4, 5].

Цель работы заключалась в определении характера изменений коагуляционного гемостаза у крыс под влиянием нового комплексного растительного средства на модели токсического гепатита, вызванного введением D-галактозамина гидрохлорида.

Исследуемое комплексное фитосредство (КФС) представляло собой комбинированный сухой экстракт, состоящий из сухих экстрактов травы гипекоума прямостоячего (Hypecoum erectum L.; Papaveraceae), травы копеечника альпийского (Hedysarum alpinum L.; Leguminosae), цветков календулы лекарственной (Calendula officinalis L.; Compositae), корней солодки уральской (Glycyrrhiza uralensis Fisch.; Leguminosae) и корней шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi; Lamiaceae) в соотношении 5:5:4:4:2. Количественную стандартизацию средства проводили методом ВЭЖХ-УФ с использованием микроколоночного жидкостного хроматографа Милихром А-02 (Эконова, Новосибирск, Россия).

Фармакотерапевтическая эффективность комплексного фитосредства КФС определялась при токсическом гепатите, вызванном введением D-галактозамина гидрохлорида. Для определения нарушений процесса коагуляции при повреждении печени гидрохлоридом D-галак-тозамина использовали общепринятые в ге-мостазиологии методы и определяли уровень фибриногена, активированное частичное тром-бопластиновое время (АЧТВ), протромбино-вый индекс (ПИ), протромбиновое время (ПВ), международное нормализованное отношение (МНО), протромбиновое отношение (ПО) в сыворотке крови белых крыс общепринятыми методами [6]. Состояние коагуляционного звена

системы гемостаза исследовали с помощью серии тестов, выполненных с использованием стандартного набора реактивов АО «Абрис» и «Витал» на анализаторе «Витарей».

По мнению исследователей, D-галактозами-на гидрохлорид вызывает нарушения синтеза РНК и белка, формирует острый гепатит, идентичный по морфологическим и биохимическим изменениям в печени вирусному гепатиту человека [7]. Повреждение печени D-галактоза-мином вызывалось однократным внутрибрю-шинным введением в дозе 400 мг/кг белым крысам [7]. КФС, полученный в виде сухого экстракта, растворяли в очищенной воде и вводили внутрижелудочно трем группам белых крыс за 1 ч до введения гепатотоксина в дозах 100 мг/кг, 200 мг/кг, 300 мг/кг. В дальнейшем сухой экстракт продолжали вводить внутрижелудоч-но группам животных в указанных дозах 1 раз в сутки в течение 14 дней эксперимента. Препаратом сравнения являлся карсил (Саш1) с международным названием силибинин (SiHЫmn) из расторопши пятнистой Silybum тапапит (Ь.) Gaertn. Карсил вводили внутрижелудочно в дозе 100 мг/кг в аналогичном режиме. Контрольной группе белых крыс после введения D-галакто-замина гидрохлорида вводили эквивалентный объем очищенной воды в аналогичном режиме. Интактная группа животных состояла из белых крыс того же возраста и пола и получала по данной схеме в соответствующем объеме очищенную воду.

Эксперименты проведены на 96 белых крысах обоего пола с исходной массой 180±20 г. Содержание животных осуществляли в соответствии с «Правилами лабораторной практики» ^Р) и Приказом МЗ РФ № 708Н от 23.08.2010 г. «Об утверждении правил лабораторной практики». Лабораторные животные, соответствующие требованиям для включения в эксперимент, разделялись на группы с учетом пола, возраста, массы и принципа рандомизации. Экспериментальную работу проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.77 г.), «Правилами, принятыми в Европейской конвенции по защите позвоночных животных» (Страсбург, 1986 г). Протокол исследования согласован с комитетом по этике Бурятского госуниверситета (№ 2 от 04.12.2016).

Фармакотерапевтическую эффективность исследуемого фитоэкстракта определяли через 7, 14 суток с начала эксперимента. Статистическая обработка полученных данных осуществлялась на основе современных пакетов прикладных математических программ с использованием критерия Стьюдента. Различия считались статистически достоверными при р<0,05.

Результаты и обсуждение

При введении D-галактозамина гидрохлорида экспериментальным животным в ранние сроки опыта не наблюдалось резкого ухудшения их состояния, у них сохранялись двигательная активность и аппетит. Масса тела белых крыс опытных групп в течение первой недели опыта не менялась, а у интактных животных масса увеличилась на 20-25 г. На второй неделе у опытных животных снижалась двигательная активность, страдал аппетит, масса тела уменьшалась на 10-12% по сравнению с интактными крысами.

Результаты исследований показали, что формирование экспериментального гепатита, вызванного D-галактозамином гидрохлорида, сопровождалось значительными нарушениями гемостаза (таблица 1, 2). На 7 день эксперимента содержание фибриногена, одного из важнейших показателей гемостаза, достоверно снижалось по сравнению с уровнем интактных крыс. В контрольной группе животных показатель фибриногена оставался сниженным и на 14 сутки опыта, указывая на сохранение гипокоа-гуляции. В группе сравнения на фоне введения карсила у большинства животных данный показатель сохранялся сниженным и отличался от контрольной группы не более чем на 10%. В группе крыс, получавших КФС (таблица 1), уровень фибриногена повышался у 6 из 8 до 2,0 г/л и выше.

Показатель АЧТВ, один из базовых показателей коагулограммы, зависящий от концентрации плазменных факторов (II, V, VIII, IX, X, XI, XII и фибриногена), позволяющий оценить эффективность внутреннего пути свертывания крови, отражал в группе опытных животных существенные изменения системы коагуляции. На 7 день опыта в группе животных, получавших карсил, АЧТВ повышался на 8,21%, а при введении исследуемого полиэкстракта на 15,6%-18,5%, отражая уменьшение проявлений гипокоагуляции.

Протромбиновый индекс (ПИ), используемый в клинических условиях в качестве объективного критерия тяжести повреждения печени и нарушения свертывания, значительно уменьшался при формировании D-галактозаминово-го гепатита. При введении эталонного гепато-протектора карсила белым крысам отмечалось повышение ПИ у 3 из 8 животных и составило в среднем 9,75% на 7 сутки опыта. При использовании исследуемого фитополиэкстракта увеличение показателя ПИ у белых крыс составило 20,6 -23% при введении в дозах 100 мг/кг, 200 мг/ кг, 300 мг/кг на 7 сутки опыта.

Показатель протромбинового времени (ПВ) дает возможность быстро оценить не только внешнюю систему гемостаза, но и весь каскад реакций свертывания крови. При повреждении печени белых крыс D-галактозамином показатель ПВ значительно возрастал, причем

Таблица 1

Состояние коагуляционного каскада крови у белых крыс при повреждении печени гидрохлоридом D-галак-тозамина при использовании комплексного растительного средства на 7 сутки эксперимента

Опытные группы животных ^-галактозаминовый гепатит)

Биохимиче- Интакт-

№ ские показатели ные крысы Контроль + Н2О Группа сравнения + карсил Группа 1 + 100 мг/кг КФС Группа 2 + 200 мг/кг КФС Группа 3 +300 мг/кг КФС

1 Фибриноген, г/л 2,43±0,13 1,51±0,11*1 1,67±0,18 1,92±0,13*2 1,97±0,12*2 1,99±0,11*2

2 АЧТВ, сек 23,04±1,9 34,24±1,7*1 31,4±1,53 28,9±1,4*2 28,2±1,3*2 27,89±1,25*2

3 ПИ, % 84,4±4,7 51,3±2,4*1 56,3±3,7 62,1±3,16*2 61,9±2,8*2 60,8±3,2*2

4 ПВ, сек 19,5±1,6 33,7±1,7*1 27,8±1,9 26,8±1,9*2 25,9±1,7*2 26,3±2,1*2

5 МНО, усл. ед. 1,22±0,12 2,93±0,14*1 2,57±0,18 * 2,34±0,17*2 2,32±0,19*2 2,16±0,17*2

6 ПО, % 1,16±0,12 2,53±0,17*1 2,17±0,19 2,05±0,112 2,02±0,13*2 2,04±0,11*2

Примечание. Здесь и далее: *1 - различия статистически достоверны между интактной и контрольной группами животных при р<0,05;

*2 - различия статистически достоверны между контрольной и опытной группами; п - число животных в группе.

существенные отличия от интактной группы сохранялись и на 14 день опыта (таблица 2). На 7-е сутки опыта в группе сравнения, получавшей карсил, у половины животных отмечалась тенденция к повышению ПВ. При использовании КФС на 7 сутки опыта в группах животных при остром гепатите в дозах 100 мг/кг, 200 мг/кг, 300 мг/кг отмечалось отчетливое снижение ПВ по сравнению с контрольной группой (21-23%).

При D-галактозаминовом гепатите протром-биновое отношение (ПО), неотъемлемая часть исследования протромбинового комплекса крови, значительно возрастало в группе контрольных животных. На фоне введения карсила белым крысам отмечалось снижение ПО в сравнении с контрольной группой у 2 из 8 животных, и в среднем уменьшение составило 14,2%. Использование исследуемого полиэкстракта у белых крыс отчетливо уменьшало ПО и проявление гипокоагуляции по сравнению с контрольной группой - выявлялось у 6 из 8 животных.

Для оценки состояния протромбинового комплекса при повреждении печени D-галак-тозамином использовали показатель международного нормализованного отношения (МНО), который подтверждал развитие значительных гипокоагуляционных нарушений в контрольной группе животных. В группе сравнения при введении карсила белым крысам в данные сроки отмечено отличие этого показателя от контроля на 12%. При использовании изучаемого фитосредства в дозах 100 мг/кг, 200 мг/кг, 300 мг/ кг в группах животных в ранние сроки эксперимента отличие МНО составило 20% и более по сравнению с контролем.

На 14 сутки эксперимента в контрольной группе животных при повреждении печени D-галактозамином сохранялись значительные отличия показателей, указывающих на наруше-

ния коагулограммы (таблица 2). При введении карсила у животных наблюдалась тенденция к повышению протромбинового индекса, фибриногена и АЧТВ, но достоверных значений в данной группе животных не выявлялось.

На второй неделе наблюдения при введении исследуемого полиэкстракта в дозах 100 мг/кг, 200 мг/кг, 300 мг/кг у белых крыс содержание фибриногена повышалось на 27-30% по сравнению с контрольной группой. Использование КФС способствовало повышению протромби-нового индекса (таблица 2) на 25-27% по сравнению с контролем. На 2-ой неделе опыта уровень АЧТВ снижался на 21,5 % и у большинства животных приближался к уровню интактной группы. При этом показатели ПО и МНО достоверно снижались, подтверждая уменьшение гипокоагуляционных нарушений в группе животных, получавших КФС.

Заключение

Экспериментальный гепатит, вызванный введением D-галактозамина гидрохлорида, характеризовался развитием гипокоагуляцонных нарушений, связанных со снижением уровня фибриногена, факторов протромбинового комплекса ввиду нарушений синтезирующей функции гепатоцитов. Динамика дополнительных показателей коагулограммы, АЧТВ, ПИ, ПО и МНО, подтверждала нарушения свертывания.

При тяжелом течении патологического процесса в печени особое значение приобретает возможность развития синдрома диссемини-рованного внутрисосудистого свертывания (ДВС), имеющего общебиологическую направленность, способного приобретать каскадный характер. ДВС, как известно, может протекать не только в выраженной клинической форме, но и в виде компенсированного или субкомпен-

сированного процесса, существенно отягощать течение патологического процесса. Выявляемые гипокоагуляционные нарушения у экспе-

Нарушения гемостаза при повреждении печени D-галактозамином гидрохлорида могут вызываться сочетанием недостаточности синтетической функции гепатоцитов в образовании факторов свертывания и возможностью развития ДВС-синдрома. Определение коагуляцион-ных нарушений свидетельствует о диагностической ценности данных отклонений в оценке степени тяжести, вероятном прогнозе и необходимости коррекции при повреждениях печени.

При использовании эталонного гепатопро-тектора карсила в группе экспериментальных животных с D-галактозаминовым гепатитом можно отметить отчетливую тенденцию к уменьшению проявлений нарушений свертывания, но достоверных отличий не наблюдалось. Введение КФС приводило к достоверному уменьшению гипокоагуляции, причем с ранних сроков эксперимента, но отчетливого дозо-зависимого эффекта при этом не выявлено.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Список литературы:

1. Инфекционные болезни. Национальное руководство. Под ред. Н.Д. Ющука, Ю.Я. Венгеро-ва. М., 2010: 1056.

2. Шерлок Ш., Дули Д. Заболевания печени и желчных путей. Под ред. З.Г. Апросиной, Н.А. Мухина. М., 2002: 864.

3. Никонов Г.К., Мануйлов Б.М. Основы современной фитотерапии. М., 2005: 520.

4. Николаев С.М. Фитофармакотера-пия и фитофармакопрофилактика заболеваний. Улан-Удэ, 2012: 286.

5. Лесиовская Е.Е. Доказательная фитотерапия. М., 2014.

риментальных животных соответствуют второй фазе ДВС-синдрома.

6. Баркаган З.С., Момот А.П. Основы диагностики нарушений гемостаза. М., 1999: 290.

7. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под ред. Р.У. Хабриева. М., 2012: 832.

Контактные данные

Автор, ответственный за переписку: Убеева Елена Александровна, аспирант кафедры фармакологии Бурятского государственного университета, г. Улан-Удэ.

670002, г. Улан-Удэ, ул. Октябрьская, 36а. Тел.: 8 (9021) 612296. E-mail: ubeeva.ip@mail.ru

Информация об авторах

Николаев Сергей Матвеевич, д.м.н., профессор кафедры фармакологии и традиционной медицины Бурятского государственного университета, в.н.с. ИОЭБ СО РАН, г. Улан-Удэ. 670002, г. Улан-Удэ, ул. Октябрьская, 36а. Тел.: (3012) 297170. E-mail: univer@bsu.ru

Оленников Даниил Николаевич, д.б.н., с.н.с.

ИОЭБ СО РАН, г. Улан-Удэ

670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, д.6

Тел.: 8 (9021) 600627.

E-mail: olennikovdn@mail.ru

Убеева Ираида Поликарповна, д.м.н., профессор кафедры инфекционных болезней Бурятского государственного университета, г. Улан-Удэ.

670002, г. Улан-Удэ, ул. Октябрьская, 36а. Тел.: (3012) 297170. E-mail: univer@bsu.ru

Таблица 2

Состояние коагуляционного каскада крови у белых крыс при повреждении печени гидрохлоридом D-галактозамина при введении комплексного растительного средства на 14 сутки эксперимента

№№ Биохи- Опытные группы животных

Интакт-

мические показатели ные крысы Контроль + Н2О Группа сравнения + карсил Группа 1 + КФС 100 мг/ кг Группа 2 + КФС 200 мг/кг Группа 3 + КФС 300 мг/ кг

1 Фибриноген, г/л 2,43±0,13 1,64±0,11*1 1,85±0,19 2,01±0,10*2 2,04±0,12*2 1,99±0,11*2

2 АЧТВ, сек 23,04±1,9 29,7±2,1*1 25,7±1,9 23,5±1,17*2 23,4±1,21*2 23,3±1,112

3 ПИ, % 84,4±4,7 62,1±3,4*1 75,4±6,4 79,5±3,9*2 80,7±6,2*2 79,8±5,7*2

4 ПВ, сек 19,9±1,6 25,9±1,2*1 23,2±1,7 21,83±1,1*2 21,6±1,3*2 21,46±1,2*2

5 МНО, усл. ед. 1,22 ± 0,12 2,13 ±0,15« 1,97 ±0,19 1,58 ±0,12* 1,62 ±0,14*2 1,57 ±0,15*2

6 ПО, % 1,16±0,12 1,87±0,11*1 1,48±0,13 1,41±0,12* 1,38±0,13 *2 1,37±0,10*2