Способ получения препарата натуральных половых феромонов хряка
METHOD FOR OBTAINING A PREPARATION OF NATURAL HE-PIG SEX PHEROMONES

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к получению биологически активных препаратов, которые используются в свиноводстве в качестве биологических стимуляторов репродуктивной функции у свиноматок.
Известен способ получения препарата, содержащего натуральные половые феромоны хряка (H. Schremmer, et al. Industriemossige Schweineproduktion. VEB Deutscher Landwirtschafts Verlag. Berlin, 1975. - 250 с.), который предусматривает смешивание мочи и эякулята, полученных от половозрелых хряков, с метиловым эфиром параоксибензойной кислоты. Недостатком этого способа является большое содержание в полученном препарате балластных веществ, что снижает его биологическую активность и сокращает сроки хранения. При этом способ не предусматривает надежного обеззараживания препарата, что не исключает распространения инфекционных болезней среди свинопоголовья в случае получения исходного материала (мочи и эякулята) от больных хряков.
Существует способ получения препарата натуральных половых феромонов из мочи быков (Авторское св. СССР №1666102. - 1991 г. Авт. В.П. Кононов и др.), который предусматривает пропитывание обезвоженного селикогеля мочой с последующим удалением мочи с использованием пятиокиси фосфора или другого влагопоглотителя и экстрагирования оставшихся сухих адсорбированных селикогелем феромонов этиловым спиртом. Полученный экстракт является препаратом половых феромонов быка. Недостатком указанного способа является то, что в качестве источника феромонов используется только моча и не используется другое сырье (семенники), в котором также содержатся половые феромоны. При этом применение в технологическом процессе обезвоживания сопровождается частичной потерей препарата. В результате конечный продукт имеет относительно низкую биологическую активность.
Известен препарат 2α-метил-5α-антрост-16-ен-3-он, который используют в качестве обонятельного стимулятора воспроизводительной функции у коров и свиноматок (Патент РФ 2183640, 2002 г. Авт. Э.П. Зинкевич и др.). Недостатком этого препарата является его низкая биологическая активность, так как он представляет собой синтетический аналог только одного из компонентов натуральных половых феромонов самцов, которые, как известно, включают и другие химические соединения, обладающие феромональной активностью.
Известен способ получения препарата натуральных половых феромонов хряка (Патент РФ №2034521, 1995 г. Авт. О.Б. Сеин и др.), сущность которого заключается в получении препарата натуральных половых феромонов из тканей и экскретов хряков. При этом в качестве биологического материала используют семенники, подчелюстные железы и мочу половозрелых хряков. Существует также способ получения препарата натуральных половых феромонов самцов (Патент РФ №2159597, 2000 г. Авт. Ю.В. Фурман, О.Б. Сеин и др.), который включает измельчение семенников, их гомогенизацию, инкубирование, центрифугирование, смешивание с мочой и перегонку с водяным паром.
Общим недостатком указанных способов является то, что полученные препараты имеют относительно низкую биологическую активность.
Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является способ получения натуральных половых феромонов хряка (Патент РФ №2431491, 2010. Авт. Д.О. Сеин и др.).
Данный способ заключается в том, что в качестве исходного сырья используют семенники и мочу половозрелых хряков, а также корни сельдерея корневого и пастернака посевного, которые содержат стероиды 5α-андрост-16-ен-3-он и 5-α-андрост-16-ен-3α-ол, являющиеся основой половых феромонов хряка. Семенники и корни сельдерея и пастернака в соотношении 1,0:0,25:0,25 измельчают до фаршеобразного состояния и гомогенизируют в гомогенизаторе до однородной массы. Затем в гомогенизат вносят фермент протосубтилин (ГЗХ ГОСТ 23636-79) в количестве 1,0-1,5% от общей массы исходного сырья. Полученную смесь инкубируют в термостате при температуре 37-39°C в течение 50-60 мин, после чего смешивают с мочой половозрелых хряков в соотношении 1:1,0-1,5 и отжимают с использованием пресса с ячейками 0,7×0,7 мм. Полученная жидкость представляет собой препарат натуральных половых феромонов хряка, ее разливают в стеклянные флаконы по 15,0 мл и подвергают сублимации. После сублимации флаконы закрывают резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками.
Недостатком способа-прототипа является низкая биологическая активность конечного продукта, так как при использовании данного способа не происходит полного извлечения соединений, содержащих половые феромоны, из растительного сырья.
Технической задачей изобретения является получение нового препарата с высоким содержанием натуральных половых феромонов хряка, который применяется для проведения стимуляции воспроизводительной функции у свиноматок.
2
Решение технической задачи достигается тем, что проводят гомогенизацию 100-140 г семенников половозрелых хряков в присутствии 0,10-0,15 мл полисорбата ТВИН-80 с последующим инкубированием гомогенизата при температуре 37-39°C в течение 50-60 мин. Затем измельчают корни пастернака посевного и сельдерея корневого в соотношении 1:1 (по 50-70 г каждого) до фаршеобразного состояния и гомогенизируют до размера частиц 1,0-1,5 мм, добавляют 50-70%-ный этанол 500-600 мл и подвергают гомогенизат ультразвуковому воздействию с частотой 20-22 кГц с интенсивностью 10-20 Вт/см в течение 5-7 мин. В полученную массу вносят гомогенизат семенников и добавляют мочу половозрелых хряков до 1 л, смешивают и подвергают фильтрации с отжимом в прессе с ячейками 0,7×0,7 мм, полученный фильтрат сублимируют.
Указанные оптимальные соотношения используемых компонентов, режимы гомогенизации и ультразвукового воздействия подбирали экспериментальным путем. Выход за указанные оптимальные пределы сопровождался снижением биологической активности полученного препарата или нахождением ее на неизменном уровне.
Отличительной особенностью предлагаемого способа получения натуральных половых феромонов хряка является использование полисорбата ТВИН-80, который является эмульгатором и солюбилизатором жиров и эфирных масел, а также применение ультразвукового воздействия на корни пастернака посевного и сельдерея корневого, содержащие стероиды 5α-антрост-16-ен-3-он и 5α-антрост-16-ен-3α-ол, входящие в состав половых феромонов хряка.
Воздействие ультразвука создает кавитацию и турбулентные потоки в жидком экстрагенте, в результате происходит быстрое набухание материала и растворение содержимого клеток, увеличивается скорость обтекания частиц сырья, в пограничном диффузном слое возникают турбулентные и вихревые потоки. Молекулярная диффузия внутри частиц материала и в пограничном диффузном слое практически заменяется конвективной, что приводит к интенсификации массообмена. В результате кавитации происходит разрушение клеточных структур, что ускоряет процесс перехода соединений, обладающих феромональной активностью, из растительного сырья в экстрагент.
2
Пример. Для приготовления препарата натуральных половых феромонов хряка проводили отбор семенников при убое половозрелых хряков в условиях мясокомбината или боенских площадок. Взвешивали 100 г семенников и измельчали их до фаршеобразного состояния, вносили 0,1 мл полисорбата ТВИН-80, гомогенизировали до однородной массы и инкубировали в термостате при температуре 37-39°C в течение 60 мин. Затем измельчали 50 г корней сельдерея корневого и 50 г пастернака посевного до фаршеобразного состояния и гомогенизировали до размера частиц 1,0-1,5 мм, добавляли 500 мл 70%-ного этанола, перемешивали и подвергали смесь ультразвуковому воздействию с использованием ультразвукового процессора УЗП-125 с частотой 20 кГц с интенсивностью 10 Вт/см в течение 5 мин. В полученную массу вносили 100 г гомогенизата семенников и добавляли мочу половозрелых хряков до 1 л, смешивали и подвергали фильтрации с отжимом в прессе с ячейками 0,7×0,7 мм. Фильтрат разливали в стеклянные флаконы по 15 мл и подвергали сублимации (сублимацию проводили на ФКП «Курская биофабрика - фирма БИОК»). После сублимации флаконы закрывали резиновыми пробками и обкатывали алюминиевыми колпачками.
Полученный конечный продукт представляет собой сухую пористую массу буроватого оттенка со специфическим запахом. Срок хранения 24 мес. при температуре 20°C.
Препарат подвергали проверке на безвредность согласно существующим требованиям. Токсичность препарата определяли на 4-5-месячных свинках крупной белой породы, которых помещали в специальную камеру-станок и распыляли препарат аэрозольным генератором САГ-2. При этом используемые дозы препарата превышали оптимальные в 3-5 раз. Поведенческие реакции, основные клинические и гематологические показатели у свинок после обработки препаратом находились в пределах физиологических границ (табл. 1).
Не регистрировались признаки токсикоза и у морских свинок после внутрибрюшинного введения препарата в дозе 0,5-0,1 мл/гол., все подопытные животные в период эксперимента были живы.
Биологическую активность полученного препарата определяли с использованием специального ольфактометра разработанной нами конструкции (Патент РФ на полезную модель №99179, 2010. Авт. Д.О. Сеин и др.). Результаты биологического тестирования показали (табл. 2), что полученный препарат с использованием заявленного способа имел более высокую биологическую активность по сравнению с препаратом-прототипом и синтетическим аналогом половых феромонов хряка «Суидор» (производство Германия).
Научно-производственные испытания изготовленного препарата натуральных половых феромонов с применением предложенного способа проводили в ЗАО «Любимовское» Курской области и ЗАО «Свинокомплекс Ивановский» Белгородской области.
Первый научно-производственный опыт был проведен на неполовозрелых свинках-аналогах крупной белой породы 5-месячного возраста, из которых было отобрано три группы по 20 голов. Свинок 1 опытной группы стимулировали препаратом, изготовленным по заявленному способу. Свинок 2 опытной группы стимулировали препаратом-прототипом. Свинки 3 группы являлись контролем, их обрабатывали дистиллированной водой.
Препарат половых феромонов применяли путем распыления пульверизатором на уровне носового зеркала животных в дозе 0,5 мл/гол. через день в течение 20 дней. Опытные и контрольные животные находились в стереотипных условиях и получали одинаковый рацион. Половую охоту у свинок определяли с использованием хряка-пробника два раза в день утром и вечером. До начала и в конце эксперимента у свиноматок брали кровь, в которой определяли содержание половых гормонов (эстрадиол-17β; прогестерон) с использованием иммуноферментного метода.
На 15-й день после выявления первой половой охоты проводили контрольный убой свинок всех групп. После убоя свинок извлекали репродуктивные органы, взвешивали их, измеряли линейные параметры, определяли площадь рогов матки методом проекции на миллиметровую бумагу, устанавливали объем яичников путем погружения в измерительный сосуд с водой, определяли количество фолликулов и желтых тел и их размеры с использованием штангенциркуля. Гистоморфологические исследования тканей органов проводили по общепринятым методикам (Г.А. Меркулов, 1969; Д.С. Саркисов и др., 1996).
В ходе проведения опыта было установлено, что наступление полового созревания у свинок 1 опытной группы происходило в 170-дневном возрасте, у животных 2 опытной группы в 179 дней, а у контрольных животных в 185 дней. При этом у большинства свинок опытных групп половозрелость наступала в первые 10 дней после начала стимуляции (табл. 3), а у свинок контрольной группы она «растягивалась» и за 30-суточный период наблюдений проявилась только у 44% животных.
Иммуноферментный анализ показал, что у свинок, стимулированных разработанным препаратом половых феромонов хряка, в крови содержалось больше половых гормонов (табл. 4), а репродуктивные органы были более развитыми по сравнению со свинками, обработанными препаратом-прототипом, и контрольными животными (табл. 5, 6). Так, у свинок 1 опытной группы была больше масса матки, площадь ее рогов, толщина эндометрия, количество маточных желез, масса и объем яичников. При этом в их яичниках обнаруживалось больше желтых тел прошлого (первого) полового цикла примордиальных и развивающих фолликулов (рис. 1, 3) по сравнению с контрольными животными (рис. 2, 4).
На рисунке 1 показан яичник свинки №4 (1 опытная группа). В поле зрения просматривается большое количество примордиальных фолликулов. Окраска гематоксилин-эозином. Ув. об. 20, ок. 7.
На рисунке 2 показан яичник свинки №5 (контрольная группа). Количество примордиальных фолликулов уменьшено. Окраска гематоксилин-эозином. Ув. об. 20, ок. 7.
На рисунке 3 показан яичник свинки №3 (1 опытная группа). На гистосрезе представлены циклические желтые тела, третичный фолликул и множество примордиальных фолликулов. Окраска гематоксилин-эозином. Ув. об. 20, ок. 7.
На рисунке 4 показан яичник свинки №3 (контрольная группа). В поле зрения примордиальные и формирующиеся фолликулы в небольшом количестве. Окраска гематоксилин-эозином. Ув. об. 20, ок. 7.
Второй научно-производственный опыт был проведен на ремонтных свинках 8-месячного возраста, у которых регистрировалась задержка полового созревания. Было сформировано три группы свинок по 11 голов в каждой. Свинки 1 опытной группы подвергались стимуляции изготовленным препаратом. Свинок 2 опытной группы стимулировали препаратом-прототипом. Свинки 3 группы являлись контрольными и их обрабатывали дистиллированной водой. Стимуляцию феромонами проводили ежедневно в течение 20 дней, доза препарата составляла 0,5 мл/гол. Наблюдение за подопытными животными осуществляли в течение 30 дней, половую охоту определяли с использованием хряка-пробника.
Было установлено, что после применения стимуляции изготовленным препаратом у 8 (72%) свинок наступило половое созревание. При использовании препарата-прототипа половозрел ость проявлялась у 6 (54%) свинок, а в контрольной группе у 2 (18%) свинок (табл. 7).
Третий научно-производственный опыт проводили на подсосных свиноматках крупной белой породы. Было отобрано три группы свиноматок по 15 голов в каждой. Свиноматок 1 опытной группы стимулировали изготовленным препаратом. Свиноматок 2 опытной группы стимулировали препаратом-прототипом. Свиноматки 3 группы являлись контрольными, их обрабатывали дистиллированной водой. Стимулировали свиноматок феромонами в дозе 0,5 мл/гол. за 5 суток до отъема поросят и последующие 15 суток ежедневно до наступления половой охоты. При выявлении у свиноматок половой охоты их искусственно осеменяли и после опороса проводили оценку воспроизводительных показателей.
Было установлено, что в течение 20 дней после отъема поросят среди свиноматок, подвергавшихся стимуляции изготовленным препаратом половых феромонов хряка, была выявлена половая охота у 20 (100%) свиноматок. При стимуляции препаратом-прототипом половая охота была установлена у 18 (90%) свиноматок, а у контрольных животных - 16 (80%) (табл. 8). Сравнительный анализ воспроизводительных качеств показал, что у свиноматок 1 опытной группы были выше показатели многоплодия и крупноплодности, чем у свиноматок 2 опытной и 3 контрольной группы.
Полученные результаты научно-производственных опытов свидетельствуют о том, что предлагаемый способ позволяет получить препарат натуральных половых феромонов хряка с более высокой биологической активностью по сравнению с препаратом-прототипом.
Примечание: * - при р<0,05 по сравнению с 3 контрольной группой
Примечание: * - при р<0,05 по сравнению с 3 контрольной группой
Примечание: * - при р<0,05 по сравнению с 3 контрольной группой