СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ДИФФУЗНЫХ В-КЛЕТОЧНЫХ КРУПНОКЛЕТОЧНЫХ ЛИМФОМ
METHOD OF DIFFERENTIAL DIAGNOSTICS OF DIFFUSE LARGE B-CELL LYMPHOMAS

Изобретение относится к области медицины, в частности к патоморфологии и клинической онкологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики диффузных В-клеточных крупноклеточных лимфом (ДВККЛ).
Современная классификация Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) 2017 года включает более 40 подтипов лимфом, тем самым определяя различные подходы в диагностике, лечении и разработке новых перспективных терапевтических направлений [Swerdlow SH, Campo Е, Harris NL, et al. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Lyon: International Agency for Research on Cancer (IARC); 2017].
ДВККЛ - это самая часто встречающаяся неходжкинская лимфома (НХЛ), на долю которой приходится около 30-58% всех случаев НХЛ [Н. Tilly, М. GomesdaSilva, U. Vitolo и др. Diffuse Large B-Cell Lymphoma: ESMO Clinical Practice Guidelines Ann Oncol (2015) 26 (suppl 5): v116-v125]. Несмотря на успехи лечения после внедрения в практику моноклонального антитела Ритуксимаб, 30-40% больных с ДВККЛ, по-прежнему, резистентны к проводимому лечению.
ДВККЛ представляют собой гетерогенную группу заболеваний, имеющих общие звенья патогенеза, но при этом различные клинические и иммуногистохимические (ИГХ) особенности, чувствительность к терапии и прогноз, зависящие от многих факторов [Molecular subtypes of diffuse large В cell lymphoma are associated with distinct pathogenic mechanisms and outcomes / B. Chapuy [et al.] // Nature. - 2018. - Vol. 5. - P. 679-669].
Разделение на новые молекулярные подтипы ДВККЛ в рамках классификации ВОЗ 2017 (лимфома с фенотипом клеток терминального центра (Germinal B-celllike-GCB) и из клеток с фенотипом активированных В-клеток (activated B-cell-ABC) не только помогает определить прогноз заболевания, но и позволяет применить персонализированный подход в лечении.
Известен способ дифференциальной диагностики ДВККЛ заключающийся в разделении ДВККЛ на ABC и GCB подтипы посредством анализа профиля экспрессии генов [Does cell-of-origin or MYC, BCL2 or BCL6 translocation status provide prognostic information beyond the International Prognostic Index score in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with rituximab and chemotherapy? A systematic review / M. Schmidt-Hansen [et al.] // Leuk Lymphoma. - 2017. - Vol. 58. - P. 2403-2418.]
Однако недостатком способа является его высокая стоимость и малодоступность, а также в большинстве случаев нецелесообразность его применения в ежедневной клинической практике. Суррогатной моделью может выступать Hans-алгоритм, который оценивает наличие или отсутствие экспрессии белков CD10, bcl-6, mum-1 и разделяет ДВККЛ на 2 типа: non-GCB подтип (включает в себя «неклассифицируемые» случаи и АВС-подтипы ДВККЛ, имеет худший прогноз заболевания) и GCB-подтип [Schmidt-Hansen М, Berendse S, Marafioti Т, McNamara С. Does cell-of-origin or MYC, BCL2 or BCL6 translocation status provide prognostic information beyond the International Prognostic Index score in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with rituximab and chemotherapy? A systematic review. Leuk Lymphoma 2017; 58: 2403-18.].
Согласно имеющимся литературным данным, в 79% случаев результаты использования Hans-алгоритма сопоставимы с результатами анализа профиля экспрессии генов [Batlle-Lopez A, Gonzalez de Villambrosia S, Francisco M, Malatxeberria S, Saez A, Montalban C, et al. Stratifying diffuse large B-cell lymphoma patients treated with chemoimmunotherapy: GCB/non-GCB by immunohistochemistry is still a robust and feasible marker // Oncotarget, 7 (14) (2016), pp. 18036-18049].
В предложенном усовершенствованном алгоритме диагностики ДВККЛ, помимо поэтапного ИГХ анализа для определения экспрессии белков c-myc, bcl-2 и транслокаций в генах C-MYC, BCL-2, BCL-6, в том числе включен Hans-алгоритм
В-клеточная лимфома высокой степени злокачественности с перестройками в генах MYC, BCL-2 и/или BCL-6 (альтернативным названием является DOUBLE-HIT (DH) лимфома, а при наличии перестроек во всех трех генах - TRIPLE-HIT (ТН) лимфома - крайне редкий и агрессивный подтип зрелых В-клеточных лимфом (встречается менее, чем в 3% случаях), который с учетом клинических и биологических характеристик должен быть выделен в отдельную нозологию из группы ДВККЛ с помощью анализа флуоресцентной гибридизации in situ (FISH).
Single-hit (SH) лимфомы или моно-хит лимфомы характеризуются наличием транслокации только в одном гене MYC, BCL-2 или BCL-6. (Мус+ Single-Hit Lymphoma Patients had Benefit from Dose-Intensified Chemotherapy Misyurina, Anna et al. Clinical Lymphoma, Myeloma and Leukemia, Volume 16, S109).
ВОЗ 2017 рекомендует всем пациентам с ДВККЛ выполнять анализ FISH на выявление вышеупомянутых транс локаций. В связи с высокой стоимостью данный метод не доступен для рутинного определения наличия транслокаций всем пациентам с ДВККЛ, что диктует необходимость поэтапного использования диагностического алгоритма, позволяющего выявить лимфомы с перестройками в генах MYC, BCL-2, BCL-6 (SH, DH, ТН-лимфомы).
Агрессивность течения и низкие показатели выживаемости SH, DH и ТН-лимфом обусловлены транслокациями в вышеупомянутых генах. Ген MYC регулирует апоптоз, пролиферацию, рост, клеточный цикл, миграцию клеток и метаболизм, что определяет особенности клинического течения лимфомы при его дисрегуляции.
BCL-2 - это онкоген расположенный на 18q21 хромосомы. BCL-2 кодирует белок, поддерживающий жизнеспособность клеток посредством ингибирования апоптоза. В нормальных лимфоцитах оксидативный стресс, нестабильность генома и другие патологические процессы индуцируют экспрессию белков семейства ВН3, функцией которых является ингибирование белка bcl-2 и, соответственно, инициация апоптоза (Anderson М.А., Huang D, Roberts A. Targeting BCL2 for the treatment of lymphoid malignancies. Semin Hematol. 2014; 51:219-227). В случае малигнизации клона, гиперэкспрессия c-myc, bcl-2 и других белков являются причинами прогрессирования лимфомы и резистентности к химиотерапии [Cabanillas F, Shah В. Advances in Diagnosis and Management of Diffuse Large B-cell Lymphoma // Clin Lymphoma Myeloma Leuk. 2017 Dec; 17(12):783-796].
BCL-6 - это онкоген, расположенный на 3q27 хромосоме. Белок bcl-6 функционирует как транскрипционный ингибитор и участвует в нескольких клеточных процессах, таких как активация, дифференцировка, клеточный апопотоз. В нормальных В-клетках, bcl-6 является ключевым регулятором реакций в терминальном центре. BCL-6 подавляет активность семейства белков р-53, с-myc и bcl-2 [Basso K, Dalla-Favera R. Roles of BCL6 in normal and transformed germinal center В cells. Immunol Rev. 2012; 247:172-183].
Клиническими особенностями SH, DH и ТН-лимфом являются: высокая частота выявления болезни в III-IV стадиях, тяжелое общее состояние больных (ECOG 2-4) в период манифестации болезни, поражение костного мозга, повышение уровня ЛДГ (Oki Y, Noorani М, Lin Р, et al. Double hit lymphoma: the MD Anderson Cancer Center clinical experience. Br J Haematol. 2014;166:891-901).
Кроме того, ДВККЛ NOS может экспрессировать белки c-myc и bcl-2, не имея перестройки в одноименных генах. Данный подтип, называемый Double-exspressor (DE) лимфома или ДВККЛ с коэкспрессией с-тус и bcl-2, не был выделен в отдельную нозологическую группу в новой классификации ВОЗ 2017, однако, по данным ретроспективных исследований, обладает не только отличающимися ИГХ характеристиками, но и иным клиническим течением заболевания. Наличие экспрессии белков c-myc, bcl-2 без транслокации в генах определяет лучший прогноз по сравнению с подгруппой DH и ТН-лимфом, но худший в сравнении с ДВККЛ NOS без экспрессии. В частности, Hu S. с соавт., продемонстрировали, что больные ДВККЛ NOS с двойной экспрессией белков c-myc, bcl-2, получившие химиотерапию R-CHOP [ритуксимаб, циклофосфамид, доксорубицин, винкристин, преднизолон] имели неполный ответ на лечение, более низкие показатели безрецидивной выживаемости [БРВ] и 5-летней общей выживаемости [ОВ] в сравнении с больными из группы ДВККЛ NOS без экспрессии.
Таким образом, все вышесказанное диктует необходимость разработки диагностического алгоритма, который бы включал в себя одновременное определение GCB и non-GCB-подтипов, ДВККЛ с экспрессией белков c-myc и bcl-2, а также высокоагрессивных лимфом с транлокациями в генах МУС, BCL-2, BCL-6. Это позволит четко разграничивать различные подтипы В-клеточных лимфом с использованием ИГХ и молекулярно-генетических маркеров для определения прогноза заболевания, улучшения диагностики и лечения пациентов.
Раскрыт способ дифференциальной диагностики диффузных В-клеточных крупноклеточных лимфом, заключающийся в том, что проводят иммуногистохимический поэтапный анализ биопсийного материала,
при этом на первом этапе используют Hans алгоритм для разделения на GCB или non-GCB подтипы лимфомы в зависимости от наличия или отсутствия экспрессии белков CD 10, bcl-6, mum-1 в исследуемом материале, на втором этапе определяют экспрессию с-тус и bcl-2 маркеров, при отсутствии экспрессии обоих маркеров диагностируют диффузную В-клеточную крупноклеточную лимфому без транслокаций в генах МУС и BCL2, а при наличии экспрессии с-тус и bcl-2 маркеров продолжают исследование путем FISH анализа для выявления транслокаций в гене МУС или в генах МУС, BCL2 и BCL-6.
Сущность способа иллюстрируется фиг.1-7, где: на фиг.1 -диаграмма взаимосвязи возраста и наличия/отсутствия двойной экспрессии с-тус и bcl-2;
на фиг.2 - диаграмма взаимосвязь МПИ и наличия/отсутствия двойной экспрессии с-тус и bcl-2;
на фиг.3 -транслокация МУС, FISH; на фиг. 4 -транслокация BCL-6, FISH; на фиг.5 - транслокация BCL-2, FISH;
на фиг.6 - диаграмма взаимосвязи первично-рефрактерного течения и наличия/отсутствия двойной экспрессии с-тус и bcl-2; на фиг. 7 - схема алгоритма способа.
В исследование были включены сведения о 215 пациентах с диагнозом ДВККЛ, реклассифицированным согласно новым требования ВОЗ 2017.
Двойная экспрессия с-тус и bcl-2 значимо чаще встречалась в группе более молодых пациентов (18-49 лет) в сравнении с пациентами, которым было 50 лет и более (57,1% vs 42,9%, р=0,048) (Фиг. 1). Более высокий международный прогностический индекс чаще встречался в группе с наличием двойной экспрессии с-тус и bcl-2 (Фиг. 2), что свидетельствует о более агрессивном течении болезни.
В табл.1 представлена сравнительная характеристика схем лечения в группах наличия и отсутствия экспрессии с-шус и bcl-2 (п=71).
В целом следует отметить, что с учетом более агрессивного течения болезни, большему числу пациентов с двойной экспрессией с-шус и bcl-2 чаще выполнялась ранняя интенсификация лечения в сравнении с пациентами без коэкспрессии. Так, ВДХТ с аутоТКМ чаще выполняли пациентам с коэкспрессией с-шус и bcl-2 (25,0%. Vs 10,6%), аналогичная тенденция наблюдается для применения схемы EPOCH-R (40,0% vs 14,3%), Hyper-CVAD/MtX (15% vs 2%).
Всего благодаря предложенному нами алгоритму для дифференциальной диагностики SH-лимфом при отсутствии возможности рутинного использования FISH было выявлено 10 лимфом с перестройками в генах MYC или BCL-2 или BCL-6. Данная находка помогает выделить группу пациентов, которым необходим более агрессивный подход в лечении.
Чувствительность способа на этапе разделения на GCB и non-GCB подтипы составляет 79%, на этапе определения SH, DH, и ТН-лимфом более 90%.
Среди пациентов с наличием транслокаций генов МУС (Фиг. 3), BCL-6 (Фиг. 4) либо BCL-2 (Фиг.5) наиболее часто определялись более распространенные стадии заболевания (III-IV ст. 60,0% vsI-II ст. 40,0%). Экстранодальное вовлечение определялось в трех случаях (30,0%). У части пациентов с транслокациями было зарегистрировано первично-рефрактерное течение заболевания (п=4, 40%), что в два раза выше пациентов с отсутствием подобных поломок (8 (21,6%) (Фиг. 6). Половина лимфом у пациентов с транслокациями также характеризовались высокими показателями пролиферативной активности: у половины пациентов (п=5, 50%) уровень Ki-67 превышал 90%.
В табл. 2 представлены FISH-характеристики ДВККЛ пациентов, включенных в исследование.
Способ подтверждается следующими клиническими примерами.
Пример 1. Пациент Л., женщина, 37 лет.
Диагноз: Диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома 1Устадии.
Пациенту была выполнена эксцизионная биопсия надключичного лимфатического узла. Выполнена морфологическая оценка опухоли и далее посредством поэтапного выполнения ИГХ анализа подтвержден диагноз ДВККЛ.
С использованием разработанного диагностического алгоритма выполнено определение подтипа опухоли по происхождению опухолевой клетки (non-GCB) и далее выполнена оценка экспрессии опухоли на белки с-шус и bcl-2. Экспрессия оказалась положительной, однако при выполнении анализа FISH, наличие транслокаций в гене C-MYC обнаружено не было.
После выполнения диагностического алгоритма, пациенту был выставлен диагноз, наиболее полно отражающий прогноз заболевания:
Диагноз: ДВККЛ 1Устадия, поп-ОСВподтип, с коэкспрессией белков c-myc, bcl-2
Таким, образом данный пример демонстрирует отсутствие необходимости рутинной оценки FISH и профиля экспрессии генов всем пациентам с ДВККЛ.
Пример 2. Пациент-диагноз ДВККЛ GCB подтип.
Диагноз: Диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома III стадии.
Пациенту была выполнена эксцизионная биопсия шейного лимфатического узла. Выполнена морфологическая оценка опухоли и далее посредством поэтапного выполнения ИГХ анализа подтвержден диагноз ДВККЛ.
С использованием разработанного диагностического алгоритма выполнено определение подтипа опухоли по происхождению опухолевой клетки (GCB-подтип) и далее оценка экспрессии белков c-myc, bcl-2 оказалась отрицательной. Таким образом, финальный диагноз, отражающий прогноз заболевания звучит так:
Диагноз: ДВККЛ II стадия, GCB подтип.
Таким образом, данный пример демонстрирует отсутствие необходимости рутинной оценки FISH и профиля экспрессии генов всем пациентам с ДВККЛ.
Пример 3. Пациент - диагноз ДВККЛ II стадия.
Пациенту была выполнена эксцизионная биопсия шейного лимфатического узла. Выполнена морфологическая оценка опухоли и далее посредством поэтапного выполнения ИГХ анализа подтвержден диагноз ДВККЛ.
С использованием разработанного диагностического алгоритма выполнено определение подтипа опухоли по происхождению опухолевой клетки (non-GCB-подтип) и далее, оценка экспрессии белков c-myc, bcl-2 оказалась положительной. После выполнения анализа FISH, была обнаружена транслокация в гене C-MYC, после анализа партнеров BCL-2, BCL-6 другие транслокации не обнаружены.
Таким образом финальный диагноз, отражающий прогноз заболевания звучит так:
Диагноз: диагноз ДВККЛ Пстадия, non-GCB-подтип с транслокацией в гене C-MYC (SH-лимфома)
Таким образом, данный пример демонстрирует отсутствие необходимости рутинной оценки профиля экспрессии генов всем пациентам с ДВККЛ, а также возможность поэтапной диагностики для определения транслокации в гене C-MYC.
Способ позволяет выявить агрессивные и менее агрессивные лимфомы ДВККЛ более доступными средствами со значительной экономией материальных средств, обеспечивает своевременную дифференциальную диагностику.