КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ПРИ ЛЕЧЕНИИ БОЛИ, СВЯЗАННОЙ С МЕЖПОЗВОНОЧНЫМ ДИСКОМ
COMPOSITION FOR USE IN TREATING INTERVERTEBRAL DISK-RELATED PAIN

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к лечению боли, связанной с межпозвоночным диском, например, боли в нижней части спины, хронической боли в нижней части спины, боли в шее, хронической боли в шее и кокцигодинии (боли в области копчика), и к композиции для применения при лечении боли, связанной с межпозвоночным диском.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Боль в нижней части спины, например, хроническая боль в нижней части спины, является широко распространенным заболеванием, которое поражает около 80% взрослого населения в течение их жизни. Боль в нижней части спины представляет собой не конкретное заболевание с известной патофизиологией, а скорее симптом со многими причинами. Известно, что согласно оценкам, непосредственная причина, такая как опухоль, перелом или инфекция, была определена только у приблизительно 5-10% больных. В остальных 90-95% случаев боль в нижней части спины является идиопатической, т.е. неясного происхождения.
Структура в спине, которая, по-видимому, главным образом ответственна за образование боли в нижней части спины, относится к межпозвоночному диску. Межпозвоночный диск расположен между двумя соседними позвонками. Межпозвоночный диск, как правило, гибок и обеспечивает возможность для движения между соседними позвонками. Он формируется с помощью кольца соединительной ткани, которая, главным образом, состоит из коллагена, и полужидкого центра, состоящего из, например, коллагена и протеогликанов. Кольцо называется фиброзным кольцом, и центр называется пульпозным ядром.
Уже в возрасте 20-30 лет межпозвоночный диск человека начинает подвергаться старению, процесс часто называемый дегенерацией диска. Во время процесса старения межпозвоночный диск может протекать или выпячиваться (образовывать грыжу) и вызывать симптомы, такие как боль в нижней части спины и пояснично-крестцовый радикулит. Старение межпозвоночного диска обычно заканчивается в возрасте 60-80 лет. На данном этапе межпозвоночный диск преобразован в твердую и плотную соединительную ткань. Если это происходит, межпозвоночный диск обычно уже не будет вызывать симптомы, поскольку маловероятна утечка или выпячивание (образование грыжи). Старение межпозвоночного диска также влечет за собой уменьшение его высоты и снижение подвижности позвоночника.
Известно, что дегенерация диска вызывает трещины фиброзного кольца, что может создать возможность для контакта между центром межпозвоночного диска и наружной поверхностью фиброзного кольца. Таким образом, вещества, такие как вызывающие воспаление агенты, могут просачиваться из центра межпозвоночного диска на наружную поверхность фиброзного кольца. Рецепторы, которые, как правило, являются молчащими и размещаются на наружной поверхности фиброзного кольца, затем могут активироваться вызывающими воспаление агентами, обычно присутствующими в центре межпозвоночного диска во время его дегенерации. Этот механизм предлагается в качестве одного из механизмов, ответственных за боль в нижней части спины.
Другой механизм, о котором полагают, что он ответственен за боль в нижней части спины, заключается в том, что могут иметь место вновь сформированные кровеносные сосуды и нервы, которые растут от наружной поверхности фиброзного кольца в центр межпозвоночного диска через трещины фиброзного кольца. Предполагается, что эти нервы могут вызывать боль, когда межпозвоночный диск смещается и оказывает давление на нервы. Один способ для подавления и прерывания такого развития раскрыт в US 2007253930.
Одна общая методика для лечения боли в нижней части спины заключается в хирургической стабилизации вертебрального сегмента, включающего межпозвоночный диск, где межпозвоночный диск, по всей видимости, вызывает боль. Логическое обоснование состоит в уменьшении смещений вызывающего боль межпозвоночного диска для того, чтобы избежать прорастание сдавленных нервов и предотвратить боль. Данное хирургическое лечение является, однако, инвазивным и не вполне удовлетворительным.
Другая предлагаемая методика для лечения боли в нижней части спины, точнее пояснично-крестцового радикулита, включает так называемый хемонуклеолиз, при котором фермент в виде инъекции вводят в межпозвоночный диск для того, чтобы растворить пульпозное ядро, тем самым снизив давление, оказываемое пульпозным ядром межпозвоночного диска, например, на нерв.
Далее, другая предлагаемая методика для лечения боли в нижней части спины состоит в восстановлении или регенерации межпозвоночного диска путем введения, например, выращенных клеток диска и стволовых клеток. Однако, представляется маловероятным, что лишенная питания среда в центре межпозвоночного диска сможет успешно обеспечить выживание вновь введенных клеток.
Например, регенерация, вызванная фиброзирующим агентом, раскрытая в WO 2005/046746. WO 2005/046746, относится, например, к способу, включающему введение в пространство межпозвоночного диска пациента, который нуждается в этом, терапевтически эффективного количества фйброзирующего агента или композиции, содержащей фиброзирующий агент. Фиброзирующий агент вызывает фиброзный ответ в пространстве межпозвоночного диска пациента, тем самым, обеспечивая пациенту лечебный результат.WO 2005/046746 также относится к инъекционной композиции, содержащей фиброзирующий агент и наполнитель.
Однако, в данной области по-прежнему существует необходимость в обеспечении безопасной и удовлетворительной методики для более успешного лечения боли в нижней части спины.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Целью настоящего изобретения является создание композиции для применения при лечении боли, связанной с межпозвоночным диском, как например, боли в нижней части спины, хронической боли в нижней части спины, боли в шее, хронической боли в шее и кокцигодинии (боли в области копчика).
Композиция для применения при лечении боли, связанной с межпозвоночным диском, может иметь состав, при котором ее можно вводить в терапевтически эффективном количестве с помощью локальной инъекции в межпозвоночный диск.
Сущность настоящего изобретения заключается в уменьшении боли, связанной с межпозвоночным диском, путем ускорения старения межпозвоночного диска, таким образом, делая межпозвоночный диск более жестким, например, путем превращения межпозвоночного диска в твердую и плотную соединительную ткань. Превращение межпозвоночного диска в твердую и плотную соединительную ткань делает его более стабильным, и следовательно, межпозвоночный диск получает уменьшенный объем движения. Межпозвоночный диск, превращенный в твердую и плотную соединительную ткань, не позволит никакому жидкому компоненту просачиваться из дискового пространства, например, на наружную поверхность фиброзного кольца, и не позволит нервам отрастать в межпозвоночный диск.
Еще в 1959 году Карл Хирш (Carl Hirsch) в статье «Studies on the Pathology of Low Back Pain (Исследования патологии боли в нижней части спины)", опубликованной в журнале - The Journal of Bone and Joint Surgery, Vol. 41B, No. 2, p. 237-243, May 1959 - заявил, что: «когда-нибудь может быть найдено вещество, с помощью которого дегенерированный диск можно будет превратить в плотную соединительную ткань». Тем не менее, кажется, что никто до сих пор не представил такого вещества.
Создатель данного изобретения к удивлению обнаружил, что веществом может с успехом стать молочная кислота с рН ниже 4. Этот факт особенно удивителен с учетом предшествующего уровня техники, скорее сосредотачивающей внимание на уменьшении количества молочной кислоты или лактата внутри вызывающего боль межпозвоночного диска. Например, US 2012/0022425 А1 раскрывает способ уменьшения молочной кислоты в межпозвоночном диске путем введения инъекции ингибитора молочной кислоты в межпозвоночный диск для подавления продуцирования ее и, тем самым, облегчения боли в спине от ожога молочной кислотой. Кроме того, WO 2013/092753 А1 раскрывает соединение производных индола для подавления продуцирования лактата при лечении, например, хронической боли в спине.
3
3
-
Молочная кислота является карбоновой кислотой с химической формулой СНСН(ОН)СООН. Как показано ниже в формуле (I), молочная кислота может в водном растворе отдать протон, принадлежащий ее карбоксильной группе, образуя ион лактата СНСН(ОН)СОО. Мольная доля молочной кислоты к иону лактата составляет 1:1.
Молочная кислота и лактат естественным образом присутствуют в в человеческом организме.
Было измерено, что концентрация иона лактата в тканевой жидкости поясничного межпозвоночного диска пациента с болью в спине, находилась в интервале от 1 ммоль/л до почти 12 ммоль/л, обычно в интервале от 2 ммоль/л до 6 ммоль/л. Эти измеренные величины представлены на стр. 5 и фиг. 6 научной статьи "Oxygen and lactate concentrations measured in vivo in the intervertebral discs of patients with scoliosis and back pain (Концентрации кислорода и лактата, измеренные in vivo в межпозвоночных дисках пациентов со сколиозом и болью в спине)" by Bartels et al., опубликованной в Spine 23(1): pp. 1-8, 1998.
Как видно из таблицы 1, молекулярный вес иона лактата составляет 89,07 г/моль. Таким образом, молярная концентрация 1 ммоль иона лактата в 1 л тканевой жидкости в поясничном межпозвоночном диске соответствует концентрации по массе 89,07 мг/л. Аналогичным образом, молярная концентрация 12 ммоль иона лактата на литр тканевой жидкости в диске соответствует концентрации по массе 1067 мг/л.
У человека дисковое пространство поясничного межпозвоночного диска имеет объем, согласно оценкам, приблизительно от 1,5 мл до 3,0 мл.
С учетом вышеизложенного, специалист в данной области может легко вычислить количество лактата в диске, выраженное в молях или граммах. Пример приводится в таблице 1.
Молочная кислота может отрицательно влиять на функцию клеток межпозвоночного диска, в частности, клеток, которые продуцируют протеогликаны, необходимые для предохранения диска от старения.
Старение межпозвоночного диска инициируется пониженной подачей питательных веществ и кислорода при помощи диффузии из кровеносных сосудов соседних позвонков и из окружающих структур. Это постепенно будет стимулировать накопление конечных продуктов обмена веществ в межпозвоночном диске, например, в пульпозном ядре. Одной разновидностью конечного продукта обмена веществ, которая может присутствовать, является молочная кислота.
Молочная кислота может участвовать в нескольких механизмах, которые будут оказывать воздействие на клеточную смерть в межпозвоночных дисках, как например накопление внутриклеточного жира, митохондриальное набухание, агрегация хроматина и освобождение эксайтотоксичного глутамата.
2
Молочная кислота может высвободить PGE, вызывая воспаление и продуцирование соединительной ткани. Кроме того, молочная кислота может стимулировать высвобождение TGF-бета, который, в свою очередь, стимулирует фибробласты для продуцирования коллагена.
Молочная кислота может также участвовать в диссеминированном внутрисосудистом свертывании и коагулопатии потребления, что увеличивает тенденцию эритроцитов к агрегации, образуя «сладж крови», и делает эритроциты более устойчивыми, в свою очередь, увеличивая вязкость крови и отрицательно влияя на циркуляцию в малых сосудах.
Таким образом, увеличение концентрации молочной кислоты в межпозвоночном диске путем введения композиции, содержащей молочную кислоту, в дисковое пространство межпозвоночного диска будет, тем самым, ускорять старение диска и вызывать превращение пульпозного ядра в соединительную ткань.
Старение межпозвоночного диска, включающее превращение пульпозного ядра в соединительную ткань, делает межпозвоночный диск более жестким, и введением композиции, содержащей молочную кислоту, старение может быть ускорено поддающимся регулированию путем. Обычно концентрацию молочной кислоты можно увеличить в межпозвоночном диске, точнее, в дисковом пространстве, с тем чтобы ускорить процесс старения.
Изобретатель нашел, что композиция, содержащая молочную кислоту и имеющая рН ниже 4, вызывает заметную трансформацию межпозвоночного диска, делая его, таким образом, более жестким. Заметная трансформация была интерпретирована как ускоренное старение межпозвоночного диска путем превращения пульпозного ядра в соединительную ткань. Следовательно, изобретатель прогнозирует улучшения для больного в отношении боли, связанной с межпозвоночным диском, если композиция, содержащая молочную кислоту и имеющая рН ниже 4, вводится в пульпозное ядро межпозвоночного диска, вызывая увеличение концентрации молочной кислоты внутри дискового пространства.
Изобретатель прогнозирует улучшения для больного в отношении боли, связанной с межпозвоночным диском, такой как боль в шее, боль в нижней части спины или кокцигодиния, при введении молочной кислоты с рН ниже 4, или композиции, содержащей молочную кислоту и имеющей рН ниже 4, в дисковое пространство межпозвоночного диска, которое, по меньшей мере частично, ответственно за боль, связанную с межпозвоночным диском.
В соответствии с первым аспектом изобретения предлагается композиция, которую применяют при лечении боли, связанной с межпозвоночным диском. Композиция содержит молочную кислоту и имеет рН ниже 4. Композиция вводится в дисковое пространство, включающее пульпозное ядро межпозвоночного диска.
Преимущества композиции, которую применяют при лечении боли, связанной с межпозвоночным диском, согласно данному изобретению, заключаются в более безопасном и более эффективном лечении боли, связанной с межпозвоночным диском, при этом также являясь менее дорогостоящим и менее инвазивным, чем лечение, например, хирургическое лечение, известное в существующем уровне техники. Кроме того, молочная кислота является биосовместимой. Организм позвоночных, как например, человека, в состоянии обеспечить преобразование, такое как расщепление молочной кислоты, поскольку эти соединения являются природными соединениями, такими как продукты жизнедеятельности, присутствующие в организме позвоночных.
Изобретатель предполагает, что пульпозное ядро в дисковом пространстве межпозвоночного диска может трансформироваться в твердую и плотную соединительную ткань, похожую на соединительную ткань фиброзного кольца, если композиция, которую применяют при лечении боли, связанной с межпозвоночным диском, согласно данному изобретению, вводится в пульпозное ядро. Например, во время трансформации пульпозного ядра в соединительную ткань также может происходить свертывание крови, делая межпозвоночный диск еще более твердым и плотным. Предполагается, что увеличенная жесткость приводит к снижению боли.
Согласно осуществлению изобретения, композиция, которую применяют, вводится в количестве, эффективном для увеличения концентрации молочной кислоты в дисковом пространстве выше 12 ммоль/л.
Композиция, которую применяют, может вводиться в количестве, эффективном для увеличения концентрации молочной кислоты в дисковом пространстве до концентрации выше, чем концентрация, наблюдаемая во время естественного старения.
Согласно осуществлению изобретения, в композиции, которую применяют, концентрация молочной кислоты по меньшей мере составляет 12 ммоль/л, например в диапазоне от 12 до 12000 ммоль/л, например от 100 до 10000 ммоль/л, например от 500 до 5000 ммоль/л, например от 800 до 2000 ммоль/л.
Согласно осуществлению изобретения, композиция, которую применяют, имеет рН ниже 3,5, например ниже 3,0, например ниже 2,5, например ниже 2, например ниже 1,5.
Согласно осуществлению изобретения, композиция, которую применяют, вводится в дисковое пространство межпозвоночного диска, способствующее возникновению боли, связанной с межпозвоночным диском.
В примере, композиция, которую применяют, может вводиться в любой или во все межпозвоночные диски, которые, как полагают, способствуют возникновению связанной с межпозвоночным диском боли.
Согласно осуществлению изобретения, молочная кислота с рН ниже 4 вводится с помощью локальной инъекции в дисковое пространство, включающее пульпозное ядро.
Локальная инъекция обычно может выполняться с помощью шприца.
Согласно осуществлению изобретения, молочная кислота вводится однократной дозой в диапазоне от 2 мг до 200 мг, например от 5 мг до 200 мг, например от 10 до 100 мг, например от 10 до 50 мг, например от 15 до 30 мг. Однократная доза соответствует количеству молочной кислоты, вводимой в дисковое пространство.
Согласно осуществлению изобретения, композиция, которую применяют, включающая молочную кислоту и имеющая рН ниже 4, вводится один раз в виде однократной дозы.
Согласно осуществлению изобретения, композиция находится в форме водного раствора, содержащего упомянутую молочную кислоту.
Как правило, композиция для применения при лечении боли, связанной с межпозвоночным диском, предлагается в жидком состоянии, пригодном для локальной инъекции.
Согласно осуществлению изобретения, боль, связанная с межпозвоночным диском, выбрана из боли в шее, хронической боли в шее, боли в нижней части спины, хронической боли в нижней части спины и кокцигодинии.
В некоторых примерах композиция может дополнительно включать, по меньшей мере, один агент, выбранный из растворителей, стабилизаторов, буферов, регуляторов тоничности, объемообразующих препаратов, загустителей, средств снижающих вязкость, поверхностно-активных веществ, хелатирующих агентов, консервантов и вспомогательных веществ.
Для человека количество вводимой композиции может быть в диапазоне от 0,05 мл до 5 мл, например от 0,1 до 3 мл, например от 0,2 мл до 2 мл. Эти количества более или менее соответствуют объему пульпозного ядра человека. Для поясничного межпозвоночного диска количество вводимой композиции может быть приблизительно от 1,5 мл до 3,0 мл. Для шейного межпозвоночного диска количество вводимой композиции может приблизительно составлять 0,5 мл. Для копчикового отдела межпозвоночного диска количество вводимой композиции может приблизительно составлять 0,2 мл.
Под термином «один раз» здесь подразумевается одно посещение медицинского учреждения, например, во время визита к врачу, например, в стационарном лечебном учреждении. Визит может быть не более 24 часов, например, от 0,5 до 5 часов. Термин обычно, но не обязательно, означает, что однократную дозу вводят только в виде одной инъекции один раз. Однако термин охватывает также случаи, когда однократную дозу вводят один раз, но несколькими инъекциями, например от 2 до 10 инъекций за один раз, например от 2 до 5 инъекций за один раз.
Под термином «неоднократно» здесь подразумевается более, чем один визит, то есть некоторое количество визитов в медицинское учреждение, например, во время более, чем одного визита к врачу, например, в стационарном лечебном учреждении. Каждый визит может быть не более 24 часов, например, от 0,5 до 5 часов. Термин обычно, но не обязательно, означает, что однократную дозу вводят только в виде одной инъекции, но и несколько раз. Однако термин охватывает также случаи, когда однократную дозу вводят неоднократно, и несколькими инъекциями, например, от 2 до 10 инъекций при каждом упомянутом повторном случае, например, от 2 до 5 инъекций при каждом упомянутом повторном случае.
Под термином «межпозвоночный диск» понимают элемент, лежащий между двумя соседними позвонками в позвоночнике. Каждый межпозвоночный диск формирует хрящевое соединение, позволяющее слабое движение позвонков, и выступает в качестве связки, удерживая позвонки вместе. Межпозвоночный диск состоит из внешнего фиброзного кольца, которое окружает внутреннее пульпозное ядро. Позвоночник человека состоит из 23 межпозвоночных дисков: 6 в шеи (шейный отдел позвоночника), 12 в центральной части спины (область грудной клетки) и 5 в нижней части спины (поясничная область). Кроме того, межпозвоночные диски также расположены между копчиковыми костями. Межпозвоночный диск может также называться диском.
Термин «пульпозное ядро» означает студнеобразное вещество в середине межпозвоночного диска. Пульпозное ядро состоит из клеток подобных хондроцитам, фибрилл коллагена и аггреканов протеогликана, которые агрегируются посредством гиалуроновых цепей. Присоединенными к каждой молекуле аггрекана являются глюкозаминогликановые (glycosaminoglycan, GAG) цепочки хондроитинсульфата и кератансульфата. Пульпозное ядро действует как амортизатор и поддерживает два смежных позвонка разделенными.
Термин «фиброзное кольцо» означает пластинку фиброзной ткани и волокнистую хрящевую ткань, сформированную на окружности фиброзного кольца. Фиброзное кольцо способствует равномерному распределению давления по межпозвоночному диску.
Термин «дисковое пространство» означает пространство межпозвоночного диска, которое заполнено пульпозным ядром, и, которое имеет окружность, обозначенную фиброзным кольцом.
Термин «краниальная (черепная) концевая пластинка» означает поверхность межпозвоночного диска, обращенную к черепной коробке. Краниальная (черепная) концевая пластинка в отличие от каудальной концевой пластинки расположена на противоположной стороне межпозвоночного диска.
Термин «каудальная концевая пластинка» означает поверхность межпозвоночного диска, обращенную от черепной коробки. Каудальная концевая пластинка в отличие от краниальной (черепной) концевой пластинки расположена на противоположной стороне межпозвоночного диска.
Термин «фасеточный сустав» означает парную суставную структуру, обычно имеющую контактирующую поверхность, которая покрыта суставным хрящом. Фасеточный сустав обычно ограничен капсулой. Фасеточный сустав образует сочленение между суставными нижними отростками позвонков и суставными верхними отростками позвонков. Фасеточный сустав обычно сформирован для обеспечения возможности движения и обеспечения механической поддержки для позвоночного столба.
Термин «поперечный отросток» означает костное образование, которое простирается латерально от дуги позвонка с обеих сторон. Это также называется реберным отростком.
Термин «боль, связанная с межпозвоночным диском» здесь означает боль, относящуюся к боли, продуцируемой межпозвоночным диском. Боль, связанная с межпозвоночным диском, может быть болью, относящейся по меньшей мере к одному шейному позвонку (cervical vertebra, С), поясничному позвонку (lumbar vertebra, L), крестцовому позвонку (sacral vertebra, S) и копчиковому позвонку (coccygeal vertebra, Со). Примеры боли, связанной с межпозвоночным диском, может быть болью в нижней части спины, хронической болью в нижней части спины, болью в шее, хронической болью в шее и болью в области копчика.
Термин «хроническая боль в нижней части спины» означает боль в нижней части спины, когда симптомы имели место в течение более 12 недель.
Термин «хроническая боль в шее» означает боль в шее, когда симптомы имели место в течение более 12 недель.
Термин «боль в области копчика» означает боль в копчике или в области копчика.
Термин «скованность при сгибании (сгибательная скованность)» здесь означает характеристику, описывающую скованность межпозвоночного диска, расположенного в сегменте позвоночника. Скованность при сгибании можно определить путем применения силы к сегменту позвоночника, пока он не достигнет полного угла бокового сгибания, и, впоследствии, измерения расстояния между поперечными отростками позвонков, расположенных на двух противоположных сторонах межпозвоночного диска, соответственно. Полный угол бокового сгибания определяется как состояние, где межпозвоночный диск сегмента позвоночника не может в дальнейшем подвергаться влиянию силы без разрушения сегмента позвоночника. Данная характеристика измеряется в миллиметрах. Скованность при сгибании представляет собой состояние, которое характеризует скованность при изгибе сегмента позвоночника и, более конкретно, скованность при изгибе межпозвоночного диска.
Жесткость при изгибе обычно определяется как пара сил, необходимая для сгибания нежесткой структуры в аппарате изгиба. Это мера жесткости структурного элемента; произведение модуля упругости и момента инерции, деленное на длину элемента. Другими словами это соотношение усилия (напряжения) к деформации в упругом материале, когда данный материал сгибается.
Согласно второму аспекту, предлагается способ для лечения боли, связанной с межпозвоночным диском, путем введения терапевтически эффективного количества молочной кислоты с рН ниже 4 в пульпозное ядро межпозвоночного диска больного, нуждающегося в этом лечении. Эффекты и признаки этого второго аспекта данного изобретения аналогичны описанным выше в отношении первого аспекта настоящего изобретения.
Согласно третьему аспекту, предлагается применение молочной кислоты с рН ниже 4 в производстве медикамента для лечения боли, связанной с межпозвоночным диском. Эффекты и признаки этого третьего аспекта данного изобретения аналогичны описанным выше в отношении предшествующих аспектов настоящего изобретения.
Согласно четвертому аспекту, предлагается молочная кислота с рН ниже 4 для применения при лечении боли, связанной с межпозвоночным диском. Эффекты и признаки этого четвертого аспекта данного изобретения аналогичны описанным выше в отношении предшествующих аспектов настоящего изобретения.
Дополнительные отличительные признаки и преимущества данного изобретения станут очевидными при рассмотрении прилагаемой формулы изобретения и последующего описания. Специалист осознает, что различные отличительные признаки данного изобретения могут объединяться для создания вариантов осуществления изобретения, отличных от описанных в дальнейшем в пределах объема данного изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Эти и другие аспекты данного изобретения будут в настоящее время описаны более детально со ссылкой на прилагаемые чертежи, показывающие вариант(ы) осуществления изобретения.
На фиг. 1 схематически показан поперечный срез позвоночника человека.
На фиг. 2 схематично показан вид сбоку двух соседних позвонков позвоночника человека.
На фиг. 3 схематично показан вид сбоку нижней части позвоночника человека.
На фиг. 4 схематично показан вид сзади сегмента позвоночника.
На фиг. 5 схематично показано, как измеряется переднезадняя длина поперечного сечения межпозвоночного диска.
На фиг. 6 схематично показано как измеряется билатеральная ширина поперечного сечения межпозвоночного диска.
На Фиг. 7 показано поперечное сечение трех межпозвоночных дисков и трансформацию пульпозного ядра в соединительную ткань в диске, осуществляемую с помощью композиции согласно варианту осуществления данного изобретения.
На Фиг. 8 показаны экспериментальные результаты по исследованию продуцирования коллагена в фибробластах при обработке молочной кислотой.
На Фиг. 9 показаны экспериментальные результаты по исследованию продуцирования коллагена в клетках пульпозного ядра при обработке молочной кислотой.
На Фиг. 10 показаны экспериментальные результаты по исследованию продуцирования коллагена фибробластами человека при обработке молочной кислотой с различными величинами рН.
На Фиг. 11-15 показаны экспериментальные результаты примера 2, приведенного ниже.
Как показано на рисунках, размеры слоев и областей для наглядности увеличены и, таким образом, обеспечивают иллюстрацию общих структур вариантов выполнения данного изобретения. Одинаковые номера позиций относятся к одинаковым элементам повсюду.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
По мере того, как позвоночное стареет, его межпозвоночные диски претерпевают трансформацию. Эффект трансформации заключается в том, что пульпозное ядро начинает терять воду и концентрация протеогликанов в матрице уменьшается, приводя к уменьшению размера межпозвоночного диска. Другой эффект заключается в том, что фиброзное кольцо становится менее прочным и имеется повышенный риск разрыва. Эффекты трансформации межпозвоночного диска могут быть причиной боли, связанной с межпозвоночным диском, например, боли в шее, боли в нижней части спины или кокцигодинии (боли в области копчика) в состоянии до того как межпозвоночный диск становится достаточно твердым и плотным.
Позвоночник позвоночных состоит из позвонков, которые окружают и защищают спинной мозг. У людей позвоночник находится в спинной части туловища. Между двумя соседними позвонками расположен промежуточный межпозвоночный диск, то есть позвонки чередуются межпозвоночными дисками, образуя позвоночник. Специфическая структура и другие части позвоночника известны специалисту в данной области.
На Фиг. 1 схематически показан поперечный срез позвоночника 100 человека. Рядом с телом позвонка 15 позвоночника размещается межпозвоночный диск, включающий фиброзное кольцо 10 и пульпозное ядро 11. Пульпозное ядро 11 заполняет так называемое дисковое пространство межпозвоночного диска. Фиброзное кольцо 10 окружает пульпозное ядро 11 и определяет границу пульпозного ядра, а также дискового пространства.
Спинной мозг 17 расположен в центре позвоночника и рядом с межпозвоночным диском. Спинномозговые нервы 16, 16' выходят из спинного мозга 17 в противоположные стороны от межпозвоночного диска и близко к нему.
Фасеточный сустав 14, 14' расположен между суставным нижним отростком 13, 13' и суставным верхним отростком 12, 12'. По разные стороны спинного мозга 17 расположены, соответственно, два фасеточных сустава 14, 14',. Фасеточные суставы 14, 14' расположены приблизительно в том же поперечном срезе и плоскости.
На Фиг. 2 схематически показан сегмент позвоночника 200, включающего два соседних позвонка 20, 22. Первый позвонок 22 и второй позвонок 20 расположены по разные стороны межпозвоночного диска 21. Первый позвонок 22 расположен относительно ближе к грудной клетке и второй позвонок 20 расположен относительно ближе к крестцовому отделу позвоночника. Каудальная концевая пластинка 23 первого позвонка 22 и краниальная концевая пластинка 25 второго позвонка 20 приведены на фиг. 2. Краниальная концевая пластинка 25 и каудальная концевая пластинка 23 обращены в противоположные стороны от межпозвоночного диска 21.
На Фиг. 2 также схематически показано, как фасеточный сустав 24 расположен между суставным нижним отростком первого позвонка 22 и суставным верхним отростком второго позвонка 20. Поперечный отросток 26 простирается латерально от дуги позвонка.
На Фиг. 3 схематически показана нижняя часть позвоночника 300. Копчиковый позвонок 36 позвоночника расположен на концевом участке нижней части позвоночника 300. Крестец 39 позвоночника расположен рядом с копчиковым позвонком 36, ближе к грудной клетке, чем копчиковый позвонок 36. Пятый поясничный позвонок, называемый здесь L5, 30 расположен рядом с крестцом 39, ближе к грудной клетке, чем к крестцу 39. В направлении от крестца 39 к грудной клетке расположены несколько позвонков в ряду, начиная с L5, 30. Рядом с пятым поясничным позвонком 30, т.е. L5, расположены следующие позвонки в таком порядке: четвертый поясничный позвонок 32, т.е. L4, третий поясничный позвонок, т.е. L3, второй поясничный позвонок, т.е. L2, и первый поясничный позвонок 38, т.е. L1; причем первый поясничный позвонок расположен относительно ближе всего к грудной клетке. Между каждыми двумя соседними позвонками расположен промежуточный диск 31. Межпозвоночные диски (не показаны) также имеются на копчиковых позвонках 36.
ПРИМЕРЫ
Надежные животные модели для оценки боли отсутствуют, взамен были использованы конечная точка сгибания (например, жесткость при изгибе) и визуальное снижение пространства ядра. В связи с приведенными выше аргументами (прорастание нервов и просачивание) представляется вероятным, что твердый диск, который уменьшает сгибание, и сниженное пространство ядра будут также иметь отношение к уменьшению боли, как проверено на практике больными.
Пример 1
В дальнейшем более подробно будет описана методика индуцирования и оценки ускоренной трансформации пульпозного ядра в соединительную ткань в межпозвоночном диске у свиньи путем введения композиции, которую применяют при лечении боли, связанной с межпозвоночным диском, содержащей молочную кислоту и имеющей рН ниже 4.
В данном примере композицию, которую применяют при лечении боли, связанной с межпозвоночным диском, содержащую молочную кислоту и имеющую рН ниже 4, вводят в пульпозное ядро межпозвоночного диска, расположенного между третьим поясничным позвонком L3 и четвертым поясничным позвонком L4. Специалист в данной области может легко понять, что аналогичная методика может применяться к любому межпозвоночному диску позвоночника.
Таким образом, стадии методики следующие:
100 - получение композиции, содержащей молочную кислоту и имеющей рН ниже 4;
101 - анестезирование свиньи, включая позвоночник, включая межпозвоночный диск, включая пульпозное ядро, в которое вводится композиция;
102 - обеспечение доступа к межпозвоночному диску через боковой разрез между нижним ребром и подвздошным гребнем свиньи;
103 - разрезание (рассечение) межпозвоночного диска;
104 - введение, согласно данному изобретению, с помощью локальной инъекции композиции в пульпозное ядро, используя инъекционную иглу;
105 - обеспечение для свиньи свободного перемещения в течение семи дней после выхода из наркоза;
106 - отсечение поясничного отдела позвоночника единым блоком; отсеченный сегмент, состоящий из тел позвонков и межпозвоночного диска, включающего пульпозное ядро, которое подвергалось действию инъекции, но без задних элементов (дуги позвонка и фасеточных суставов);
107 - измерение расстояния между поперечными отростками при положениях дисков L2-3, L3-4, L4-5 без применения какого-либо внешнего усилия;
108 - применение внешнего усилия к сегменту позвоночника до достижения режима полного угла бокового сгибания для образца поясничного отдела позвоночника;
109 - измерение расстояния между поперечными отростками при положениях дисков L2-3, L3-4, L4-5 под полным углом бокового сгибания;
110 - осуществление поперечного среза дисков и измерение длины (переднезаднее направление) и ширины (билатеральное направление) дискового пространства.
Получение композиции, содержащей молочную кислоту
Чистый раствор молочной кислоты закупали у фирмы Sigma Aldrich (номер продукта: 69775 Fluka; CAS number: 50-21-5, Stockholm, Sweden). Как показано в таблице 2, молекулярный вес молочной кислоты составляет 90,08 г/моль и плотность чистого раствора от Sigma Aldrich составляла 1,209 г/мл, соответственно.
Концентрация молочной кислоты в чистом растворе от Sigma Aldrich, соответственно, была вычислена и составляла 0,0134 моль/мл, что равнялось 13,4 моль/л.
Впоследствии чистый раствор молочной кислоты разбавляли в 10 раз с использованием дистиллированной воды при комнатной температуре. Более конкретно, 1 мл чистого раствора молочной кислоты от фирмы Sigma Aldrich разбавляли 9 мл дистиллированной воды. Полученная концентрация молочной кислоты в приготовленной композиции, таким образом, составляла 1,34 моль/л и имела рН приблизительно 1,8.
Введение композиции, содержащей молочную кислоту, в пульпозное ядро межпозвоночного диска у свиньи с помощью локальной инъекции
Двум свиньям давали наркоз и помещали на правый бок. Доступ к L4-5 межпозвоночному диску получали через боковой разрез между нижним ребром и подвздошным гребнем на левой стороне каждой свиньи. Впоследствии, L3-4 межпозвоночный диск надрезали скальпелем.
Композицию, содержащую молочную кислоту, вводили в виде инъекции с помощью шприца в пульпозное ядро L3-4 межпозвоночного диска. Композицию, содержащую молочную кислоту общей концентрации 1,34 моль/л с рН 1,8, вводили в виде инъекции в количестве приблизительно 0,2 мл в пульпозное ядро, как показано в таблице 3. Композицию вводили в виде инъекции одномоментно при однократном введении.
Обе свиньи, по-видимому, хорошо переносили процедуру и не обнаруживали побочной реакции, такой как сниженная двигательная активность или голосовая активность в течение 7 дней до момента отсечения. На этапе отсечения свиней убивали.
Оценка трансформации пульпозного ядра в соединительную ткань в межпозвоночном диске при введении композиции, содержащей молочную кислоту
За местом инъекции наблюдали невооруженным глазом. Побочную реакцию на месте инъекции, такую как кровотечение, воспаление или некроз, не наблюдали ни у одной из свиней. Был удален сегмент позвоночника, простирающийся от поясничного позвонка L2 до крестцового позвонка S1. Удалялись фасеточные суставы, таким образом, обеспечивая полную гибкость дисков без ограничений другими структурами.
а - Скованность при сгибании (флексионная скованность) межпозвоночного диска до и после введения композиции, соответственно
На фиг. 4 показан сегмент позвоночника, включающий межпозвоночные диски 21, а именно межпозвоночные диски L2-3, L3-4 и L4-5.
Во время оценки скованности при сгибании расстояние между каждым из соответствующих рядом расположенных поперечных отростков 26 позвоночника, таким образом, сегмента позвоночника, простирающегося от поясничного позвонка L2 до крестцового позвонка S1, измерялось штангенциркулем, если сегмент позвоночника располагался в режиме без применения какой-либо внешней нагрузки.
Таким образом, после этого позвоночник, сегмент позвоночника, простирающийся от поясничного позвонка L2 до крестцового позвонка S1, вручную принуждали к режиму полного угла бокового сгибания путем применения внешней силы к каждой из двух концевых частей этой части позвоночника до обеспечения критического предела, т.е. до достижения режима полного угла сгибания. Движение поперечных отростков на приложенную силу схематически показано на фиг. 4 стрелками с пунктирными линиями.
Критический предел определяли как место непосредственно перед точкой разрушения сегмента позвоночника. Таким образом, внешняя сила применялась так, что максимальное боковое сгибание получали без разрушения какой-либо части сегмента позвоночника.
Принималось, что сила должна быть одинакова для сегмента позвоночника у каждой из двух свиней. В положении полного угла бокового сгибания измеряли расстояние между соседними поперечными отростками для дисков L2-3, L3-4, L4-5 с помощью штангенциркуля.
Расстояние между соседними поперечными отростками для определенного диска в режиме без внешней нагрузки вычитали из расстояния между теми же поперечными отростками в режиме с внешней нагрузкой, которую применяли для достижения режима полного угла бокового сгибания, обеспечивая, тем самым, значение сбалансированного расстояния, полученного с помощью полного угла бокового сгибания. Сбалансированная величина для межпозвоночного диска, в который вводили инъекцию, отражает скованность при сгибании межпозвоночного диска, который обработали композицией для применения при лечении боли, связанной с межпозвоночным диском, в сравнении с межпозвоночным диском, в который не вводили инъекцию.
Скованность при сгибании представляет собой косвенный показатель трансформации пульпозного ядра в соединительную ткань, чем меньше сбалансированная величина, тем скованнее межпозвоночный диск. Чем скованнее межпозвоночный диск, тем выше содержание твердой и плотной соединительной ткани. Следовательно, скованность при сгибании показывает претерпевает ли пульпозное ядро трансформацию в соединительную ткань, т.е. ускоренное старение, или нет.
Измерения показывают, что диски (L3-4), в которые вводили инъекцию, имели гораздо меньшую сбалансированную величину, чем соседние диски (L2-3; L4-5), в которые не вводили инъекцию, что свидетельствует о более высокой скованности при сгибании диска, в который вводили инъекцию. Таким образом, ускоренная трансформация пульпозного ядра в соединительную ткань имела место внутри дискового пространства диска, в который вводили инъекцию, в отличие от внутреннего дискового пространства дисков, в которые не вводили инъекции (см. таблицу 4).
б - Размеры дискового пространства до и после введения композиции, соответственно
Проведены поперечные срезы межпозвоночных дисков (L2-3, L3-4, L4-5) и штангенциркулем были измерены длина дискового пространства (переднезаднее направление) и ширина (билатеральное направление) дискового пространства.
На фиг. 5 и 6 схематически показан межпозвоночный диск в поперечном срезе. Межпозвоночный диск включает фиброзное кольцо 10 и дисковое пространство, обозначенное фиброзным кольцом, и включающее пульпозное ядро 11.
На фиг. 5 стрелка схематически показывает, как измеряется длина переднезаднего направления дискового пространства межпозвоночного диска. На фиг. 6 стрелка схематически показывает, как измеряется билатеральная ширина дискового пространства межпозвоночного диска.
Как видно из измерений, средняя переднезадняя длина дискового пространства была значительно ниже у дисков (L3-4), в которые вводили инъекцию, чем у соседних дисков (L2-3, L4-5), в которые не вводили инъекцию (см. таблицу 5).
Как видно из измерений, средняя билатеральная ширина дискового пространства была значительно ниже у дисков (L3-4), в которые вводили инъекцию, чем у соседних дисков (L2-3, L4-5), в которые не вводили инъекцию (см. таблицу 6).
На Фиг. 7 показаны межпозвоночные диски L2-3, L-3-4 и L4-5, соответственно, одной из свиней в экспериментах, описанных выше. Ширина и глубина дискового пространства указаны жирными прямыми линиями, соответствующими схематическим изображениям на фиг. 5-6.
На фиг. 7 дополнительно показано, как дисковое пространство диска L3-4, в который вводили инъекцию, имело гораздо меньшую площадь поперечного среза, чем диски L2-3 и L4-5, в которые, соответственно, не вводили инъекцию. Таким образом, с помощью невооруженного глаза можно было убедиться в том, что имело место новое образование соединительной ткани в прежнем дисковом пространстве, включающем пульпозное ядро в межпозвоночных дисках, в которые вводили инъекцию.
Выводы по примеру 1
Очевидно, что дисковое пространство в двух межпозвоночных дисках (L2-3) и (L4-5), в которые не вводили инъекцию, гораздо глубже и шире, чем в диске (L3-4), в который была введена композиция, содержащая молочную кислоту с рН 1,8. По-видимому, прежнее дисковое пространство было заменено вновь образованной соединительной тканью (выделено обесцвеченными дополнительными линиями дугообразной конфигурации на Фиг. 7), так что фиброзное кольцо (сформированное кольцом соединительной ткани, которая, главным образом, состоит из коллагена) затрачивалось на возмещение пульпозного ядра, которое уменьшилось в размере.
Таким образом, достигается скованность при сгибании межпозвоночных дисков, в которые вводили инъекцию, и скованность может подавить боль, испытываемую больным, у которого боль связана с межпозвоночным диском. Преимущество такого подхода лечения боли, связанной с межпозвоночным диском, состоит в том, что лечение является менее инвазивным, чем существующие методы лечения, например, в сравнении с современным способом лечения артродеза.
В примерах, описанных выше, межпозвоночный диск размещен в поясничном отделе позвоночника. Однако, ожидается, что аналогичный процесс должен наблюдаться в межпозвоночном диске, размещенном в шейном отделе позвоночника или в копчике.
Пример 2:
В данном примере было предпринято сравнение между применением композиции, содержащей молочную кислоту и имеющей рН ниже 4 (в дальнейшем названной активной инъекцией), и инъекцией плацебо с рН ниже 4 для введения в пульпозное ядро межпозвоночного диска, расположенного между третьим поясничным позвонком L3 и четвертым поясничным позвонком L4.
Методы и составы
Восемь свиней подвергали наркозу и помещали на правый бок. Через боковой разрез воздействовали на диск L3-4. В диск вводили инъекцию с суммарным объемом 0,2 мл активной инъекции или инъекции плацебо.
- Активная инъекция: 120 мг/мл молочной кислоты (PURAC PF 90 партия Nr.: 1406001940) + 180 мг/мл йогексола (Histodenz CAS#66108-95-0 LOT#WXBB5310V) в физиологическом растворе (0,9% NaCl), измеряли рН, равный 1,5
- Инъекция плацебо: 180 мг/мл йогексола в физиологическом растворе (0,9% NaCl), рН доводили до 1,5 с помощью HCl (соляная кислота, Titrisol).
Через четыре недели свиней убивали и отбирали для исследования поясничный отдел позвоночника. Удаляли всю мускулатуру, а также фасеточные суставы и желтую связку между позвонками L2-3, L3-4 и L4-5. Это выполняли для создания условия для оценки сгибания. Оценивали следующие измеряемые результаты:
A. Расстояние между поперечными отростками измеряли с помощью штангенциркуля при полном контралатеральном и ипсилатеральном сгибании.
B. Переднезаднее и билатеральное дисковое пространство измеряли с помощью штангенциркуля.
C. Рентгенограммы снимали в день инъекции и в день отбора образца для исследования, чтобы определить точность введения инъекции и были ли диски рентгеноконтрастными после четырех недель.
Результаты
A) Уменьшение бокового сгибания.
Значимую разницу в сгибании можно наблюдать между дисками, в которые вводили инъекцию активного вещества и инъекцию плацебо (фиг. 11). Это отчетливо показывает, что молочная кислота, а не йогексол, рН или инъекция per se, будет вызывать это уменьшение сгибания. Результаты этого исследования являются статистически значимыми.
B) Уменьшение пространства ядра.
Из фиг. 12а-с очевидно, что дисковое пространство близко по размеру между необработанным диском фиг. 12а и диском с введенной инъекцией плацебо фиг. 12b, при этом обработанный диск фиг. 12с имеет значительно меньший размер. Конкретные величины представлены на фиг. 13 и 14. Результаты этого исследования являются статистически значимыми.
C) Отсутствие уменьшения визуальной высоты диска после инъекции
Известной проблемой, относящейся к естественному старению диска, является снижение высоты диска вследствие его дегенерации. Согласно нашей оценке предполагается, что из-за быстрого процесса трансформации диска, вызванного обработкой, геометрия диска будет фиксированной и не будет или будет очень небольшое снижение высоты. Данную гипотезу проверили визуальным анализом рентгенограмм инъецированного диска (L3-L4) 4 неделями после обработки. Как показано на фиг. 15, нельзя заметить никакой разницы по высоте между обработанными и необработанными дисками.
Выводы по примеру 2:
Выводы из исследования in vivo в примере 2 заключаются в том, что обработка эффективно трансформирует пульпозное ядро в соединительную ткань, вызывая снижение сгибания и существенное уменьшение дискового пространства без какого-либо заметного снижение высоты диска. Эффект является статистически значимым по сравнению с плацебо. Можно также заключить, что регулирование рН per se не имело никакого эффекта.
Таким образом, результаты этого исследования представляют доказательство идеи о том, что продукт эффективно трансформирует дисковое пространство в соединительную ткань.
Чтобы обнаружить воздействия молочной кислоты на клеточном уровне, исследования проводились на фибробластах, обычно присутствующих в соединительной ткани, такой как фиброзное кольцо, и клетках пульпозного ядра, обычно присутствующих, соответственно, в пульпозном ядре. В качестве меры того, как клетки трансформировались в ответ на обработку (лечение) молочной кислотой, исследовали продуцирование коллагена в клетках.
Пример 3
Исследование продуцирования коллагена в фибробластах при обработке молочной кислотой
Культура фибробластов кожи взрослого человека (HDFa)
Культивировали и исследовали фибробласты кожи человека, выделенные из кожи человека, называемые HDFa (HDFa, adult human dermal fibroblasts) (Life Technologies Frederick, USA). Были описаны зрелые клетки межпозвоночного диска человека, являющиеся фиброзно-кистозными (или фибробластоподобными) во внешнем фиброзном кольце. Фибробласты являются наиболее распространенным типом клеток, найденных в соединительной ткани. Фибробласты могут естественно секретировать коллагеновые белки, которые используются для поддержания структурного каркаса для многих тканей, и также играть важную роль в заживлении ран.
Во-первых, криоконсервированные фибробласты размораживали на водяной бане при 37°С. Затем размороженные фибробласты диспергировали с помощью 1 мл пипетки для перемещения суспензии размороженных фибробластов вверх и вниз во флаконе. Далее диспергированные фибробласты разбавляли раствором трипанового синего (Cat. No. 15250-061, Lot No. 1311086, Gibco Life Technologies), и концентрацию жизнеспособного фибробласта определяли с помощью гемоцитометра.
4
3
3
Диспергированные фибробласты затем снова разбавляли, на этот раз в среде 106 с добавками до концентрации 2,5×10 жизнеспособных фибробластов на миллилитр. Далее 5 мл суспензии фибробластов прибавляли к колбе Т25 с клеточной культурой объемом 25 см для достижения исходной плотности 5,0×10 жизнеспособных фибробластов на миллилитр в Т25 колбе с последующим разбавлением средой 106 с добавками.
Среда 106 с добавками состояла из среды 106 (Cat. No. М-106-500, Life Technologies, Paisley, Great Britain), дополненной ростовой добавкой с низким содержанием сыворотки - LSGS (Low Serum Growth Supplement, Life Technologies, Paisley, Great Britain) при концентрации фетальной бычьей сыворотки в 2 объемных %.
2
Колбу Т25, содержащую приготовленные фибробласты, встряхивали, чтобы распределить фибробласты в среде. Впоследствии клеточную культуру инкубировали при 37°С, 5% СО/95% увлажненного воздуха в термостате с клеточной культурой в течение 72 часов.
При конфлуентности фибробласты растворяли в среде с добавками, чтобы избежать перемен в фенотипе клетки.
Приготовление молочной кислоты
Молочную кислоту (Fluka 69775, Sigma-Aldrich, Stockholm, Sweden) взвешивали в стерильной 10 мл пробирке или 50 мл пробирке. Для получения основного раствора молочной кислоты прибавляли Milli-Q воду (>18,2 Ω). Основной раствор смешивали и хранили до получения конечных растворов молочной кислоты различных концентраций. Срок хранения был менее 1 часа при температуре окружающей среды, или же, менее 24 часов при температуре 4°С.
Влияние молочной кислоты на продуцирование коллагена в фибробластах кожи взрослого человека (HDFa)
4
2
Фибробласты, культивированные, как описано выше, освобождали из колбы с клеточной культурой и помещали на 6-луночные планшеты при начальной плотности 6,0×10 жизнеспособных клеток в лунке. Фибробласты выращивали в среде 106 с добавками. Фибробласты в некоторых лунках также обрабатывали молочной кислотой (Fluka 69775, Sigma-Aldrich, Stockholm, Sweden) при различных концентрациях: 0, 0,5, 2, 5, 10, 20 и 50 мг/мл, соответственно. Фибробласты инкубировали в термостате с клеточной культурой при 37°С, 5% СО/95% увлажненного воздуха в течение 48 часов.
Для изучения влияния молочной кислоты на продуцирование коллагена в фибробластах применяли спектрофотометрический метод, называемый анализом растворимого коллагена (Soluble Collagen Assay) (QuickZyme Biiosciences, Leiden, Netherlands), основанный на связывании красителя сириуса красного с коллагеном. Исследование осуществляли дважды.
Клеточную среду собирали из каждой лунки и пипеткой отмеривали 140 мкл в 96-луночный планшет. Образцы отбирались дважды. Образцы среды тщательно смешивали с 60 мкл раствора красителя сириуса красного путем перемешивания в пипетке при движении вверх и вниз по меньшей мере пять раз. 96-Луночный планшет центрифугировали при 3000×g в течение 1 часа. Все эти стадии выполняли при температуре ниже 25°С, например центрифугирование осуществляли при 4°С.
Отцентрифугированные образцы промывали и супернатант удаляли. Клеточную массу повторно суспендировали в 150 мкл раствора для обнаружения путем тщательного перемешивания в пипетке при движении вверх и вниз по меньшей мере десять раз. После этого, 100 мкл каждого образца переносили в новый 96-луночный планшет и содержание коллагена измеряли спектрофотометрически при оптической плотности 540 нм.
Из двух исследований, каждое проведенное дважды, было отчетливо показано, что прибавление молочной кислоты к фибробластам увеличивает среднее продуцирование коллагена в фибробластах, как показано в таблице 7 и на фиг. 8. Среднее продуцирование измеряли после 2 дней обработки молочной кислотой.
На фиг. 8 результаты первой партии исследования представлены ромбами, при этом результаты второй партии представлены квадратами. Чтобы схематически показать тенденцию в продуцировании коллагена для каждой партии была приложена двухпериодная скользящая средняя линия. Линия для первой партии представлена точечной пунктирной линией и линия для второй партии представлена пунктирной линией, соответственно. Ось «х» показывает концентрацию молочной кислоты, прибавленной к лункам, содержащим фибробласты, и ось «у» показывает среднее количество продуцированного коллагена в этих лунках при измерении после двух дней с момента прибавления молочной кислоты к лункам.
В частности, увеличение продуцирования коллагена было значительным, когда молочную кислоту к каждой лунке прибавляли при концентрации по меньшей мере 2 мг/мл, например по меньшей мере 5 мг/мл. Кроме того, было показано, что продуцирование коллагена увеличивалось с увеличением концентрации молочной кислоты вплоть до по меньшей мере 20 мг/мл или по меньшей мере 50 мг/мл, как также показано на фиг. 8.
Поскольку среднее продуцирование коллагена коррелируется с количеством клеток, способных продуцировать коллаген, небольшая разница в среднем продуцировании коллагена между первой серией и второй серией исследования может быть из-за естественного разброса в количестве клеток в исследуемых лунках.
Пример 4
Исследование продуцирования коллагена в клетках пульпозного ядра при обработке молочной кислотой
Культура клеток пульпозного ядра человека
Клетки пульпозного ядра (Nucleus pulposus, NP), выделенные из человеческого организма (4800, ScienCell, USA), культивировали и исследовали. NP клетки представляют собой клетки межпозвоночного диска в пульпозном ядре.
3
3
Во-первых, криоконсервированные NP клетки размораживали при температуре водяной бани 37°С. Затем размороженные клетки NP суспендировали в среде клеток пульпозного ядра с добавками и далее засевали в колбу Т75 с клеточной культурой объемом 75 см и изнутри покрытой поли-L-лизином (0413, ScienCell, USA). Исходная плотность посева составляла 5,0×10 жизнеспособных NP клеток на миллилитр.
Среда клеток пульпозного ядра с добавками состояла из среды клеток пульпозного ядра (4801, ScienCell, USA), дополненной 2 объемными % фетальной бычьей сыворотки (0010, ScienCell, USA), 1 X ростовой добавкой клеток пульпозного ядра (4852, ScienCell, USA) и 1 X раствором пенициллина/стрептомицина (0503, ScienCell, USA).
2
Колбу Т75, содержащую приготовленные клетки NP, встряхивали, чтобы распределить клетки NP в среде. Далее культуру клеток инкубировали в термостате с клеточной культурой при 37°С, 5% СО/95% увлажненного воздуха в течение ночи.
При конфлуентности фибробласты растворяли в среде с добавками, чтобы избежать перемен в фенотипе клетки, пролиферации клеток и/или дифференцировки клеток.
Приготовление молочной кислоты
Молочную кислоту (PURAC PF 90, Batch No. 1406001940, Corbion Purac, the Netherlands) взвешивали в стерильной 10 мл или 50 мл пробирке. Для получения основного раствора молочной кислоты прибавляли Milli-Q воду (>18,2 Ω). Основной раствор смешивали и хранили до получения конечных растворов молочной кислоты различных концентраций. Срок хранения был менее 1 часа при температуре окружающей среды, или же, менее 24 часов при температуре 4°С.
Влияние молочной кислоты на продуцирование коллагена в клетках пульпозного ядра человека
4
2
Клетки NP, культивированные, как описано выше, освобождали из колбы с клеточной культурой и помещали на 6-луночные планшеты при начальной плотности 4,5×10 жизнеспособных клеток в лунке. Клетки NP выращивали в среде с добавками клеток пульпозного ядра. Клетки NP в некоторых лунках также обрабатывали молочной кислотой (PURAC PF 90, Batch No. 1406001940, Corbion Purac, the Netherlands) при различных концентрациях: 0, 0,5, 5, 10, 20 и 50 мг/мл, соответственно. Клетки NP инкубировали в термостате с клеточной культурой при 37°С, 5% СО/95% увлажненного воздуха в течение 48 часов.
Для изучения влияния молочной кислоты на продуцирование коллагена в клетках NP применяли спектрофотометрический метод, называемый анализом растворимого коллагена (Soluble Collagen Assay) (QuickZyme Biiosciences, Leiden, Netherlands), основанный на связывании красителя сириуса красного с коллагеном.
Клеточную среду собирали из каждой лунки и пипеткой отмеривали 140 мкл в 96-луночный планшет. Образцы отбирались трижды. Средние образцы тщательно смешивали с 60 мкл раствора красителя сириуса красного путем перемешивания в пипетке при движении вверх и вниз по меньшей мере пять раз. 96-Луночный планшет центрифугировали при 1500×g в течение 2 часов. Все эти стадии выполняли при температуре ниже 25°С, например центрифугирование осуществляли при 4°С.
Отцентрифугированные образцы промывали и супернатант удаляли. Клеточную массу повторно суспендировали в 150 мкл раствора для обнаружения путем тщательного перемешивания в пипетке при движении вверх и вниз по меньшей мере десять раз. После этого, 100 мкл каждого образца переносили в новый 96-луночный планшет и содержание коллагена измеряли спектрофотометрически при оптической плотности 540 нм.
Для того, чтобы удовлетворить требованиям прибора для измерения, клетки разбавляли фосфатным буферным раствором (phosphate buffer solution, PBS) в соотношении 1:1.
Из исследования, проведенного трижды, было отчетливо показано, что прибавление молочной кислоты к клеткам NP увеличивает среднее продуцирование коллагена в клеткам NP, как показано в таблице 8 и на фиг. 9. Среднее продуцирование измеряли после 2 дней обработки молочной кислотой.
На фиг. 9 результаты исследования представлены ромбами. Чтобы схематически показать тенденцию в продуцировании коллагена, была приложена двухпериодная скользящая средняя линия. Ось «х» показывает концентрацию молочной кислоты, прибавленной к лункам, содержащим клетки NP, и ось «у» показывает среднее количество продуцированного коллагена в этих лунках при измерении после двух дней с момента прибавления молочной кислоты к лункам.
В частности, увеличение продуцирования коллагена было значительным, когда молочную кислоту прибавляли при концентрации в лунке по меньшей мере 5 мг/мл. Кроме того, было показано, что продуцирование коллагена увеличивалось с увеличением концентрации молочной кислоты вплоть до по меньшей мере 10-20 мг/мл, где достигали горизонтального участка, как также показано на фиг. 9. Снижение продуцирования коллагена при 50 мг/мл интерпретируется таким образом, что обработка молочной кислотой при такой высокой концентрации может иметь цитотоксические эффекты, вызывающие гибель клеток.
Пример 5
Исследование продуцирования коллагена в фибробластах человека при обработке молочной кислотой с различными значениями рН
Культура фибробластов человека
Культивировали и исследовали фибробластные клетки кожи взрослого человека (Detroit 551, АТСС, CCL-110).
2
Во-первых, криоконсервированные детройтские клетки размораживали на водяной бане при 37°С. Затем размороженные клетки переносили в центрифужную пробирку, содержащую 9 мл минимальной эссенциальной среды Игла 1×(Gibco Life Technologies), дополненной неосновными аминокислотами (Thermo Scientific HyClone), 1 мл пирувата натрия (Thermo Scientific HyClone), 2 мМ L-глутамина (Lonza) и 10% (об./об.) фетальной бычьей сыворотки (GE Healthcare/PAA). Затем взвесь отмытых клеток центрифугировали при 125×g в течение 5 минут. Клеточный осадок заново суспендировали в 1 мл полной среды и производили посев в Т75 колбе, содержащей 15 мл полной среды. Клетки выращивали до конфлуентности при 37°С в увлажненном 5% СО инкубаторе. При конфлуентности детройтские клетки пересевали путем отделения с помощью трипсина/версена (Thermo Scientific Hyclone SV30037.01, Gibco Life Technologies 15040033). Клетки разводили в полной среде и производили посев в новые сосуды для культивирования при соотношении пересева от 1:2 до 1:5.
Приготовление составов
Чтобы минимизировать риск контаминации, все составы готовили в боксе с постоянным ламинарным потоком воздуха, за исключением взвешивания йогексола, где это было невозможно.
Состав раствора ЙОГЕКСОЛА: (Histodenz CAS#66108-95-0 LOT#WXBB5310V) взвешивали в стерильной 50 мл пробирке. Йогексол рассчитывали по весу йода в мл раствора, выраженного в виде мг/мл, согласно предоставленной прописи. Прибавляли раствор молочной кислоты (PURAC PF 90 Batch Nr.: 1406001940) и среду и образцы перемешивали с помощью устройства вращение с донышка на крышку в течение 30 минут и затем выдерживали охлажденными в течение 72 часов перед установкой рН.
Регулирование рН: рН корректировали 1 М NaOH (гидроксид натрия, Titrisol) или 1 М HCl (соляная кислота, Titrisol).
Ниже в таблице 9 приводится состав смесей.
Обработка составами
2
Детройтские клетки удаляли из их сосудов для культивирования и производили посев в 6-луночные планшеты при плотности 80000 клеток/лунке. Клетки выращивали в среде Детройт 551 с добавками. Все составы разбавляли в среде Детройт 551 с добавками. В первый день питательные среды для выращивания культур клеток во всех лунках заменяли составами на основе молочной кислоты (Sigma-Aldrich, Stockholm, Sweden), описанными в таблице 1. Клетки культивировали трижды. Клетки инкубировали в течение двух дней при 37°С в увлажненном 5% СО инкубаторе. Клетки обрабатывали составами при 80% конфлуентности клеток.
Анализ продуцирования коллагена
Содержание коллагена в клеточной среде измеряли с помощью спектрометрического метода, анализируя коллаген, связанный с красителем сириус красный (анализ растворимого коллагена, QuickZyme Biosciences, Leiden, Netherlands). Вкратце, клеточную среду собирали из каждой лунки и отмеривали пипеткой 140 мкл в 96-луночные планшеты. Образцы отбирали дважды. Образцы среды смешивали с 60 мкл раствора красителя сириуса красного и 96-луночный планшет центрифугировали при 1500×g при 4°С в течение 2 часов. Осадки в пробирке после центрифугирования заново суспендировали в 150 мкл раствора для обнаружения. Затем 100 мкл каждого образца переносили в новый 96-луночный планшет и содержание коллагена определяли спектрофотометрически при оптической плотности 540 нм.
Измерения рН
рН измеряли перед обработкой, через 10 минут после обработки и через два дня после обработки молочной кислотой или составами (таблица 10).
Результаты
Никаких различий в морфологии клеток или плотности клеток не наблюдалось при визуальном осмотре после обработки составом №1-4 по сравнению с соответствующим контролем №5-8. Жизнеспособность клеток также осматривали визуально в микроскопе через два дня после обработки, и в этот момент времени клеточную среду собирали и анализировали на продуцирование коллагена.
Детройтские клетки высевали в 6-луночные планшеты при плотности 80000 клеток/лунке. Клетки обрабатывали составами при 80% конфлуентности клеток. Продуцирование коллагена анализировали через два дня после прибавления составов (измерение после разбавления образцов 1:4, 1:1 и впоследствии 1:1 для обеспечения уровней поглощения для образцов в диапазоне линейности прибора. Экспериментальные точки иллюстрируются как средние значения ± SD на фиг. 10.
Составы №1 и №2 давали значительное продуцирование коллагена. Основываясь на различных разведениях, состав №1, содержащий 20 мг/мл молочной кислоты, без какого-либо регулирования рН был наиболее эффективным в отношении продуцирования коллагена, за которым следовал №2, также содержащий 20 мг/мл молочной кислоты, но с регулированием рН от 3,0 до 3,5, что приводило примерно к 35% уменьшению коллагена, по сравнению с составом №1. Обработка другими составами не приводила к существенному продуцированию коллагена.
Заключение
Авторы полагают, что применение в соответствии с конкретными примерами осуществления данного изобретения, позволит лечить боль, связанную с межпозвоночным диском, также у людей.
Ожидаемая трансформация межпозвоночного диска, в который вводили инъекцию вещества, такого как молочная кислота, в соединительную ткань может наблюдаться in vivo. Как правило, процедуру следует проводить под наркозом или под воздействием легких седативных препаратов и путем привлечения радиологического контроля. Таким образом, лечебная процедура должна быть аналогичной радиологическому обследованию межпозвоночного диска, называемому дискографией, когда контрастное вещество вводится в виде инъекции в межпозвоночный диск под радиологическим контролем.
Композиция должна включать молочную кислоту и иметь величину рН ниже 4. Как видно из результатов на фиг. 10, раствор молочной кислоты, имеющий рН 4 и выше, вероятно, не приведет к продуцированию коллагена и, соответственно, не предвиделось трансформации межпозвоночного диска, подвергнутого инъекции вещества, содержащего молочную кислоту и имеющего рН 4 или выше, в соединительную ткань.
С помощью данного изобретения изобретатели, так сказать, оспаривают то, что до настоящего времени было рассмотрено и -представлено для облегчения боли, связанной с диском. При этом известный уровень техники фокусируется на том, как сохранить межпозвоночный диск «молодым», настоящее изобретение предусматривает ускоренную дегенерацию, чтобы сделать диск «старым».
Различные исследования показали, что у пожилых людей межпозвоночные диски, как правило, трансформированы в соединительную ткань и вследствие этого скорее всего больше не должны были привести к возникновению боли. Важно отметить, что в литературе также демонстрируется, что распространенность дискогенной боли резко уменьшается с увеличением возраста. Возрастная боль в спине у пожилых людей чаще всего вызвана остеоартритом и/или остеопорозом, а не межпозвоночными дисками. См., например, статьи DePalma et al, What is the source of chronic low back pain and does age play a role? (Что является источником хронической боли в нижней части спины и играет ли роль возраст?), Pain Medicine 2011; 12:224-233, и Laplante et al, Multivariable Analysis of the Relationship Between Pain Referral Patterns and the Source of Chronic Low Back Pain (Мультивариантный анализ взаимосвязи между особенностью направления боли и источником хронической боли в нижней части спины), Pain Physician 2012; 15:171-178, которые обе раскрывают, что дискогенная боль в нижней части спины наиболее вероятна у больных молодого возраста, чем у пожилых людей.
Примеры, приведенные в данной заявке, показывают, что введение молочной кислоты приводит к изменению состава ткани диска и скованности сгибания инъецированных межпозвоночных дисков. Это не может быть прямым доказательством устранения боли. Однако, это может использоваться в качестве показателя трансформации пульпозного ядра в соединительную ткань, трансформация которого будет (а) стабилизировать внутренний объем диска; (b) уменьшать диффузию межпозвоночного диска; и (с) сокращать микроперемещения в диске, где все будут вносить вклад в уменьшение боли, связанной с межпозвоночным диском.
Известно, что повышенные уровни молочной кислоты в межпозвоночном диске вызывают дегенерацию диска, и такая дегенерация вызывает боль в спине. При естественной дегенерации диска пульпозное ядро будет медленно трансформироваться в соединительную ткань из состояния, где она первоначально вызывает боль, в состояние, где боль снимается, см. например Kirkaldy-Willis et al, Instability of the Lumbar Spine (Нестабильность поясничного отдела позвоночника), Clinical Orthopaedics and Related Research, No. 165, May 1982, pages 110-123, и особенно стр. 123, верхняя правая колонка. Такая трансформация займет около 20-40 лет без какого-либо лечения. При введении значительно более высоких концентраций молочной кислоты, чем те, которые найдены в начальной стадии дегенерации, время, необходимое для трансформации пульпозного ядра в соединительную ткань уменьшится с 20-40 лет (без лечения) до приблизительно 4 недель.
Другие вещества, способные вызвать ускоренную дегенерацию межпозвоночного диска, также могут рассматриваться в качестве заменителей и/или альтернатив молочной кислоте.