2,3-СЕКО-ПРОИЗВОДНЫЕ БЕТУЛОНОВОЙ КИСЛОТЫ
2,3-SECO-DERIVATIVES OF BETULONIC ACID

Изобретение относится к новым химическим соединениям класса лупановых 2,3-секо-тритерпеноидов.
Повышенное внимание к лупановым 2,3-секо-производным в последние годы обусловлено проявляемыми соединениями данной группы противовирусными и противоопухолевыми свойствами [Synthesis of A-seco derivatives of betulinic acid with cytotoxic activity. / M.Urban, J.Sarek, J.Klinot, G.Korinkova, M.Hajduch. // Journal Natural Products. - 2004. - V.67. - P.1100-1105; Synthesis and evaluation of A-seco type triterpenoids for anti-HIV-lprotease activity. / Y. Wei, C.M.Ma, M. Hattori. // European Journal of Medicinal Chemistry. - 2009. - V.44. - P.4112-4120].
Ближайшим аналогом описываемых соединений по структуре является метиловый эфир 2,3-секо-1-циано-луп-20(29)-ен-3,28-диовой кислоты [Синтез лупановых и 19β,28-эпокси-18α-олеанановых 2,3-секо-производных на основе бетулина. / И.А.Толмачева, А.В.Назаров, О.А.Майорова, В.В.Гришко // Химия природных соединений. - 2008. - №5. - С.491-494], биологическая активность которого не описана.
Описания заявляемых соединений и их свойств в источниках информации не обнаружено.
Технической задачей изобретения является получение новых химических соединений на основе бетулоновой кислоты для расширения сырьевой базы соединений класса лупановых 2,3-секо-тритерпеноидов.
Для решения поставленной задачи синтезированы 2,3-секо-производные бетулоновой кислоты общей формулы
где R=Н или ОН.
Соединения общей формулы, где  или , представляют собой мелкокристаллические вещества белого цвета. Указанные соединения хорошо растворимы в хлороформе, дихлорметане, четыреххлористом углероде, этиловом спирте, бензоле, толуоле, диметил-сульфоксиде, плохо растворимы в гексане и не растворимы в воде.
Синтез заявляемых соединений проводили способом, включающим стадию расщепления 3β-гидрокси-2-гидроксиминопроизводного бетулоновой кислоты по Бекману [Синтез лупановых и 19β,28-эпокси-18α-олеанановых 2,3-секо-производных на основе бетулина. / И.А.Толмачева, А.В.Назаров, О.А.Майорова, В.В.Гришко // Химия природных соединений. - 2008. - №5. - С.491-494].
1
13
3
3
Структура соединений 1 и 2 подтверждена методами ИК и ЯМР спектроскопии. ИК-спектры регистрировали на спектрофотометре SPECORD M80 (Германия) в пасте с вазелиновым маслом. Спектры ЯМР Н, С записывали для растворов в CDCl на спектрометре «Varian Mercury+» (США) при рабочей частоте прибора 300 или 75,5 МГц, внутренний стандарт гексаметилдисилан. Температуру плавления измеряли на приборе для определения температуры плавления ПТП (Россия). Величины удельного оптического вращения регистрировали для растворов в CHCl на поляриметре 341 модели Perkin-Elmer (США) при длине волны 589 нм. Элементный анализ (С, Н, N) выполняли с помощью элементного анализатора Leco CHNS-9321P (Нидерланды), данные элементного анализа соответствовали расчетным.
50
50
50
50
Изучена in vitro противовирусная активность 2,3-секо-производных бетулоновой кислоты общей формулы в отношении герпеса простого I типа и вирусов гриппа А. Установлено, что уровень вирусингибирующей активности (ЕС) 2,3-секо-производных бетулоновой кислоты общей формулы сравним с таковым бетулиновой и бетулоновой кислот [Antivirial activity of betulin, betulinic and betulonic acids against some enveloped and non-enveloped viruses. / N.I.Pavlova, O.V.Savinova, S.N.Nikolaeva, E.I.Boreko, O.B.Flekhter. // Fitoterapia. - 2003. - V.74. - P.489-492]. Противовирусную активность определяли в экспериментах на культурах клеток с вирусами герпеса простого I типа (ВГП, штамм 1 С) и гриппа A/FPV/Rostock/34 (H7N1). Исследование противовирусной активности проводили методом оценки цитопатического эффекта на перевиваемой культуре клеток рабдомиосаркомы человека (RD) с ВГП-1 и методом редукции бляшек на культуре клеток первичных фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) с FPV [Противовирусная активность 2-дезокси-2-фторогуанозина в отношении вирусов гриппа и простого герпеса в культурных клетках. / Е.И.Бореко, Н.И.Павлова, Г.В.Зайцева, И.А.Михайлопуло. // Вопросы вирусологии. - 2001. - №5. - С.40-42]. Концентрации веществ, подавляющие размножение вируса на 50% (ЕС), определяли на основе пробит-анализа и взвешенной линейной регрессии [A computer program in BASIC for estimation of ED and LD / K.P.Fung. // Computers in Biology and Medicine. - 1989. - V.19. - №2. - P.131-135].
2,3-Секо-производные бетулоновой кислоты общей формулы представляют интерес в качестве промежуточных соединений для синтеза новых биологически активных производных, в том числе амидов, сложных эфиров, гидразонов, гидразидов и так далее.
Сущность предлагаемого решения и возможность его осуществления подтверждается примерами и результатами исследований, приведенными в таблицах 1, 2.
Пример 1. Получение 2,3-секо-1-цианолуп-20(29)-ен-3-аль-28-овой кислоты (соединение 1).
2
4
3
6 Ммоль бетулоновой кислоты растворяли в 100 мл t-ВuОН в присутствии 46 ммоль KOt-Bu. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре 30 минут, затем прикапывали 18 ммоль свежеприготовленного изоамилнитрита. Перемешивание продолжали в течение 2-х часов. Образование продуктов контролировали методом тонкослойной хроматографии. В реакционную смесь добавляли 50 мл 1% водного раствора КОН, продукт экстрагировали этилацетатом (50 млх2). Объединенные этилацетатные экстракты сушили над безводным NaSO. Растворитель упаривали в вакууме водоструйного насоса, остаток очищали с помощью колоночной хроматографии, элюент - CHCl-этилацетат 10:1.
3
4
3
2
4
3
Полученную таким образом 2-гидроксимино-3-оксолуп-20(29)-ен-28-овую кислоту в количестве 3,6 ммоль растворяли в 140 мл СНОН и к образовавшемуся раствору при перемешивании порциями добавляли 37 ммоль NaBH. Реакционную смесь перемешивали в течение 40 минут при комнатной температуре и 5 минут при кипячении. Затем СНОН упаривали, полученный остаток разбавляли 100 мл 10% HCl. Продукты экстрагировали этилацетатом (50 мл×2), органический слой отделяли, сушили над безводным NaSO. Растворитель упаривали, остаток очищали с помощью колоночной хроматографии, элюент - CHCl-этилацетат 10:1.
5
5
f
3
30
45
3
Смесь полученной 3β-гидрокси-2-гидроксиминолуп-20(29)-ен-28-овой кислоты в количестве 3 ммоль с 6 ммоль хлорангидрида n-толуол-сульфокислоты в 20 мл CHN кипятили в течение 6-ти часов. Ход реакции контролировали методом тонкослойной хроматографии. Реакционную смесь обрабатывали водным раствором HCl до слабокислой реакции среды, выпавший осадок отфильтровывали и промывали водой. Целевой продукт очищали с помощью колоночной хроматографии, элюент - гексан-этилацетат 5:1. Получали 0,82 г (57%) 2,3-секо-1-цианолуп-20(29)-ен-3-аль-28-овой кислоты. R 0,46 (гексан-этилацетат 7:3). Температура плавления - 169-171°С (гексан-этилацетат).  (с 0,5; CHCl). Найдено, %: С 77,00; Н 9,85; N 2,36. CHNO. Вычислено, %: С 77,04; Н 9,70; N 2,99. Спектральные характеристики соединения 1 приведены в таблице 1.
Пример 2. Получение 2,3-секо-1-цианолуп-20(29)-ен-3,28-диовой кислоты (соединение 2).
3
f
3
3
30
45
4
К раствору 1,4 ммоль 2,3-секо-1-цианолуп-20(29)-ен-3-аль-28-овой кислоты в 50 мл ацетона при перемешивании добавляли 3,5 мл реактива Джонса. Ход реакции контролировали методом тонкослойной хроматографии. Растворитель упаривали, к остатку приливали большой объем воды. Выпавший осадок фильтровали и промывали водой, целевой продукт очищали с помощью колоночной хроматографии, элюент - CHCl-этилацетат 10:1. Получили 0,43 г (62%) 2,3-секо-1-цианолуп-20(29)-ен-3,28-диовой кислоты. R 0,2 (CHCl-этилацетат 10:1). Температура плавления - 72-74°С (гексан-этилацетат).  (с 0,2; CHCl). Найдено, %: С 74,72; Н 9,39; N 2,60. CHNO. Вычислено, %: С 74,50; Н 9,38; N 2,90. Спектральные характеристики соединения 2 приведены в таблице 1.
Полученные новые химические соединения класса лупановых 2,3-секо-тритерпеноидов проявляют противовирусную активность в отношении вирусов герпеса простого I типа и гриппа А. Заявляемые соединения перспективны также в качестве промежуточных соединений для получения функционально-замещенных производных (в том числе амидных, сложноэфирных конъюгатов, гидразонов, гидразидов и так далее). Таким образом, использование 2,3-секо-производных бетулоновой кислоты общей формулы позволит расширить сырьевую базу класса лупановых 2,3-секо-тритерпеноидов.
Таблица 1
Данные ИК, ЯМР *Н и "С спектров соединений 1 и 2
№ соединения
ИК-спектр (ν, см<sup>-1</sup>):
Спектр <sup>1</sup>Н ЯМР (300 МГц, CDCl<sub>3</sub>, δ, м.д., J/Гц):
Спектр <sup>13</sup>С ЯМР (75.5 МГц, CDCl<sub>3</sub>, δ, м.д.):
1
1688 (СНО), 1722 (СООН), 2248 (C≡N)
0,89, 0,94, 1,04, 1,08, 1,14 (5х 3Н, 5с, 5СН<sub>3</sub>); 1,68 (3Н, с, СН<sub>3</sub>-30); 2,23 и 2,59 (2Н, 2д, J=18,3, С<sub>2</sub>Н-1); 3,00 (1Н, тд, J=10,5, 5,7; СН-19); 4,61 и 4,72 (2Н, 2с, С<sub>2</sub>Н-29); 9,67 (1Н, с, СН-3)
14,59, 15,72, 18,74, 19,17, 19,50, 20,08, 21,78, 22,78, 23,50, 25,37, 29,63, 30,40, 31,87, 33,19, 36,93, 38,37, 40,57, 42,21, 42,83, 44,52, 46,83, 48,93, 49,05, 50,75, 56,33, 110,00 (С-29), 117,99 (С-2), 150,00 (С-20), 182,08 (С-28), 206,10 (С-3)
2
1690, 1710 (СООН), 2244 (C≡N)
0,92, 0,98, 1,03, 1,27, 1,35 (5х 3Н, 5с, 5СН<sub>3</sub>); 1,68 (3Н, с, СН<sub>3</sub>-30); 2,55 (2Н, с, С<sub>2</sub>Н-1); 3,00 (1Н, м, СН-19); 4,61 и 4,72 (2Н, 2с, СН<sub>2</sub>-29)
14,59, 15,84, 18,35, 19,22, 21,01, 21,68, 25,18, 25,31, 26,95, 29,15, 29,73, 30,40, 31,93, 33,24, 36,80, 38,32, 40,51, 42,33, 42,73, 44,89, 46,45, 46,87, 48,95, 50,94, 56,46, 109,94 (С-29), 118,29 (С-2), 150,06 (С-20), 182,84 (С-28), 184,49 (С-3)
Таблица 2
Противовирусные свойства исследованных соединений 1 и 2
Соединение
Противовирусные свойства EC<sub>50</sub>, µM
вирус герпеса (HSV-1)
вирус гриппа (FPV)
1
1,9
7,7
2
21,3
63,8
Бетулиновая кислота*
5,1
>219,0
Бетулоновая кислота*
0,9
5,7
Примечание. * Приведены данные из Antivirial activity of betulin, betulinic and betulonic acids against some enveloped and non-enveloped viruses / N.I.Pavlova, O.V.Savinova, S.N.Nikolaeva, E.I.Boreko, O.B.Flekhter // Fititerapia. - 2003. - V.74. - P.489-492.