Аккумулятивная активность ассоциации штаммов бактерий h-5-8 Bacillus megatherium и h-5-2 Bacillus cereus соли свинца

ФИЗИКО-МАТЕМАТИЧЕСКИЕ НАУКИ

Accumulative active association bacterial strains H-5-8 bacillus megatherium and H-5-2 bacillus cereus lead salts

Omurgazieva Ch.1, Beishekeeva G.2, Kenenbaeva G.3 Аккумулятивная активность ассоциации штаммов бактерий H-5-8 bacillus megatherium и H-5-2 bacillus cereus соли свинца Омургазиева Ч. М.1, Бейшекеева Г. Ж.2, Кененбаева Г. М.3

'Омургазиева Чолпон Монолдоровна / Omurgazieva Cholpon - кандидат биологических наук, доцент, кафедра ботаники и физиологии растений, факультет биологии;

2Бейшекеева Гульмира Джумабаевна /Beishekeeva Gulmira - кандидат физико-математических наук,

доцент,

кафедра физики, факультет физики и электроники;

3Кененбаева Гулайым Мекшовна /Kenenbaeva Gulayym - кандидат физико-математических наук, доцент, кафедра прикладной математики и информатики, Кыргызский национальный университет им. Ж. Баласагына, г. Бишкек, Кыргызская Республика

Аннотация: для отбора особоустойчивых штаммов бактерий к повышенным концентрациям тяжелых металлов проводили опыты по выявлению степени аккумуляции соли свинца микроорганизмами в жидкой среде. Основное внимание мы уделяли двум выделенным штаммам H-5-8 Bacillus megatherium и H-5-2 Bacillus cereus как накопителям высоких концентраций и трансформаторам соли тяжелых металлов, в целях использования их в дальнейшем для биоремедиации окружающей среды от загрязнений.

Abstract: for the selection of bacterial strains osoboustoychivyh to elevated concentrations of heavy metals were carried out experiments to determine the extent of accumulation of micro-organisms lead salt in a liquid medium. We focus on two isolated strains H-5-8 Bacillus megatherium and H-5-2 Bacillus cereus as the storage of high concentrations of salts and heavy metals transformers, in order to use them in the future for the bioremediation of the environment from pollution.

Ключевые слова: штаммы бактерий, тяжелые металлы, высокие концентрации свинца, аккумулятивная активность.

Keywords: strains of bacteria, heavy metals, high levels of lead, accumulative activity.

Загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами и радионуклидами - одна из важнейших экологических проблем конца XX - начала XXI веков. Как известно, многие тяжелые металлы представляют опасность для живых организмов благодаря своей токсичности и мутагенности, очистка окружающей среды от этих соединений в настоящее время становится все более актуальной.

Одним из наиболее перспективных способов признан биоремедиация - комплекс методов очистки почв, вод и атмосферы с использованием метаболического потенциала биологических объектов, в том числе почвенных микроорганизмов. Микробная деградация тяжелых металлов, радионуклидов и углеводородов составляет основу современной технологии биоремедиации загрязненных объектов окружающей среды. Преимущества биоремедиации как экономически выгодной, экологически безопасной и эстетически привлекательной биотехнологии восстановления загрязненных территорий показаны многими исследователями [1-13]. При этом целесообразно выявление эндемичных форм микроорганизмов для каждой техногенной провинции. Реализация такого метода очистки требует выделения специфических штаммов микроорганизмов, а также определение их редукционной активности в процессах биодеградации тяжелых металлов различного класса опасности.

С этой целью нами проводятся исследования способности почвенных микроорганизмов к биоаккумуляции и биодеградации тяжелых металлов (in vitro, лабораторное испытание).

Целью настоящего исследования явилось выявление аккумулирующей активности отобранных устойчивых штаммов бактерий к повышенным концентрациям соли свинца, использования их в дальнейшем для биоремедиации окружающей среды от загрязнений.

Материалы и методы исследования

Посевной материал - штамм Bacillus megatherium Н5-8, Bacillus cereus Н5-2 культивировали на мясопептонном агаре (МПА). Полученный посевной материал в асептических условиях вносили в

количестве 106; 107 кл/мл, дающем начальную оптическую плотность OD=0,1 (ФЭК-56 м, 540 нм, кювета 1 см) в колбы со стерильной жидкой питательной средой.

В качестве жидких питательных сред мы использовали почвенные вытяжки без добавления агара, с целью максимально приблизить к естественным условиям.

Опыты ставили в качалочных колбах емкостью 250 мл (объем среды 50 мл), в которую вносились концентрированные растворы Pb(CH3COO)2*3H2O (превышающие ПДК Pb в 10, 25, 50 раз) в дозах 1; 2,5; 5 мг/л при температуре 28-30°С, встряхивали на качалке при 200-220 об./мин., pH питательной среды доводили до 7,5. В качестве контроля на все варианты была использована культуральная жидкость без внесения металлов.

Через каждые 6, 12, 24, 48 часов аккумулятивную активность штаммов к содержанию в питательной почвенной среде соли свинца контролировали по изменению биомассы культуры. С измерением оптической плотности через ФЭК-КФ-2 (ОП540 нм, толщина кюветы 1см), а также выражали характером роста и развития колоний и численностью колониеобразующих единиц (КОЕ), путем высева из двух последних разведений (10-5, 10-6) в чашки Петри с питательным агаром и ставили в термостат при 27 -280С. Через 2-3 суток подсчитывали количество колоний. Подсчет выросших колоний проводили по двум разведениям. Опыт проведен в 3-кратной повторности. Полученные результаты обрабатывали статистически (Б. М. Доспехов, 1979).

Результаты и обсуждение

Микроорганизмы устойчивые к высоким концентрациям тяжелых металлов, были выделены из образцов почв отобранных на территориях горнорудных промышленных комбинат и урановых радиоактивных хвостохранилищах Северного Кыргызстана. Выделенные в нашей лаборатории штаммы бактерии были отселектированы по способности к росту при высоких концентрациях металлов ртути, свинца и кадмия превышающие ПДК в 1 -25 раз.

Для отбора особоустойчивых штаммов бактерий к повышенным концентрациям тяжелых металлов проводили опыты по выявлению степени аккумуляции соли свинца микроорганизмами в жидкой среде. Основное внимание мы уделяли двум выделенным штаммам H-5-8 Bacillus megatherium и H-5-2 Bacillus cereus как накопителям высоких концентраций и трансформаторам соли тяжелых металлов.

По интенсивности роста и накоплению биомассы мы судили о включении ионов металла в определенные метаболические процессы бактерий. Способность клеток микроорганизма максимально поглощать молекулы металла из окружающей среды и трансформировать их в другие невредные соединения, предопределяет использование таких бактерий для очистки от загрязнения.

Во всех вариантах опыта процент использования и трансформации соли свинца ассоциациями был выше, чем индивидуальными штаммами. По литературным данным также можно увидеть, что ассоциации до 4-х даже 5-6-х штаммов приводили к возрастанию деструктивной активности.

При моделировании состава микробной ассоциации необходимо учитывать ее устойчивость, поскольку интродукция в загрязненную среду неустойчивого сообщества приводит к резкому падению титра отдельных ее составляющих, в связи, с чем эффективность применения данной ассоциации снижается.

Как видно из табл. 1, при дозе свинца, превышающей в 10 раз ПДК (1 мг/л), наблюдалась стимуляция роста и высокая концентрация биомасс культур до 60-114% к контрольному варианту через 12-48 ч. роста. При концентрации 2,5 мг/л количество клеток (6 ч) значительно ниже, чем при концентрации 5 мг/л, но выше чем в среде контрольного варианта.

В процессе роста ассоциаций культур также измеряли D среды, однако при концентрации свинца 1мг/л значения D (540) и 2,5мг/л концентрации к 12 ч достоверно не отличались, но более при высокой концентрации свинца (5мг/л) показатель ОП увеличивается, даже большей степени, чем в контроле (рис. 1.). Наибольшая скорость изменения роста клеток наблюдалась в 12 ч культивирования при концентрациях 1 и 2.5 мг/л, кроме 5 мг/л свинца. Это свидетельствует о неравенстве метаболического потенциала культивируемых клеток, ответственных за аккумуляцию металла, при всех концентрациях в течение этого срока культивирования. Следовательно, можно предположить, что количество метаболически активных клеток бактерий в среде культивирования не одинаково для всех вариантов опыта.

Рассматривая соотношение штаммов-деструкторов бактерий в паре Bacillus megatherium + Bacillus cereus, можно отметить, что в 2-х ассоциациях при дозе 1 и 2,5 мг/л свинца, на 6 ч. до 12 ч. культивирования относительное количество клеток штамма Н5-2 уменьшалось.

Таблица 1. Динамика численности штаммов (Н-5-8+Н-5-2) в процессе аккумуляции соли свинца в жидкой среде

Ассоциация Конц. свинца Количество (кл/мл) и соотношение микроорганизмов в ассоциации, %

культивирование

6 12 24 48

B. megaterium + B. cereus (H-5-8+H-5-2) соотношение 1 мг/л 89х 105 65,1/34,8 176х105 100/0 173х 105 48,3/53,6 175х 105 51,2/47,6

B. megaterium + B. cereus (H-5-8+H-5-2) соотношение 2,5 мг/л 59х 105 47,5/52,5 108х 105 98,7/1,2 119х 105 28,5/71,4 116х 105 22,8/77,1

B. megaterium + B. cereus (H-5-8+H-5-2) соотношение 5 мг/л 61х 105 3,3/74,5 118х 105 2,5/79,3 198х 105 41,8/49,07 89х 105 42/53,1

B. megaterium + B. cereus (H-5-8+H-5-2) соотношение контроль 12,3х104 72,9/18,9 38х 105 61,4/38,5 27 х 105 28,3/71 86,6х10476,9/23

Начиная с 24-часового периода численность штаммов Н5-2 при возрастающих концентрациях 1; 2,5; 5мг/л свинца увеличивается и составляет соответственно 53,6; 71,4; 49,07%. Наиболее резкие изменения численности штаммов наблюдались при высокой концентрации свинца (5мг/л) в течение всего срока культивирования. Так, с 6 ч до 12 ч культивирования рост штамма Н5-2 доминирует. Численность штаммов Н5-8 Bacillus megatherium в ассоциациях было наименьшем количестве, именно в присутствии высоком концентрации свинца в питательной среде первые 6 и 12 ч. контакта. Вероятно, это связано с более интенсивным поглощением соли свинца клеткой штамма Н5-2, чем клетки штамма Н5-8 (табл. 1).

Таким образом, используемые штаммы H5-8 Bacillus megatherium+H5-2 Bacillus cereus могут увеличивать свою биомассу при достаточно высоких концентрациях свинца до 5 мг/л в среде, однако оптимальными являются концентрации до 1,5 мг/л, где удельная скорость роста и биомассы культур имеют максимальные значения.

0,9

6 12 24 48

время, часы

Рис. 1. Степень аккумулятивных способностей высоких концентраций свинца культурами Bacillus megatherium, Bacillus cereus (H5-8 + H5-2). Обозначения: Концентрация соли свинца 1 - 1мг/л; 2 — 2,5 мг/л;

3 — 5 мг/л; 4 — контроль

Одним из факторов, влияющих на эффективность утилизации свинца, является pH среды культивирования. При дозе 2,5 мг/л (25 раза выше ПДК) свинца закисление среды в процессе контактирования не наблюдали (табл. 2). Для биомассы ассоциации штаммов H5-8 Bacillus megatherium+ H5-2 Bacillus cereus оптимальное для трансформации значение pH лежит в области 6,78-7,33, она равняется 1 мг/л Pb и при понижении pH наблюдается постепенное

снижение адаптационной способности, при рН 3-4 и далее замечается заметное падение концентрации биомассы, характерное для всех штаммов.

Таблица 2. Влияние рН на аккумуляцию свинца ассоциациями культур Bacillus megatherium, Bacillus cereus

Концентрация соли свинца мг/л Показатели pH среды через 6, 12, 24 и 48 ч. роста

6 ч. 12 ч. 24 ч. 48 ч.

0(контроль) 7,01 6,78 7,28 6,72

1 7,21 6,78 7,21 7,33

2,5 7,23 6,87 7,04 7,40

5 6,77 6,82 7,24 6,72

Выводы: Таким образом, наибольшая скорость аккумуляции исследованных металлов

биомассой ассоциациями штаммов наблюдается экспоненциальной и ранней стационарной

фазах роста клеток.

Литература

1. Методы общей микробиологии. Т. 1 / Под ред. Герхарда Ф. М.: Мир, 1983. 536 с.

2. Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. Д. Г.Звягинцева. М., 1980. 224 с.

3. Сенцова О. Ю., Максимов В. Н. Действие тяжелых металлов на микроорганизмы // Успехи микробиологии. М., 1985. Вып. 20. С. 227-252.

4. Эрлих Х. Жизнь микроорганизмов в присутствии тяжелых металлов, мышьяка и сурьмы // Жизнь микробов в экстремальных условиях / Под ред. Д. Кашнер. М.: Мир, 1981. С. 440-469.

5. Христофорова Н. К. Биоиндикация и мониторинг загрязнения морских вод тяжелыми металлами. Л.: Наука, 1984. 192 с.

6. Ховрычев М. Н., Семенова А. М., Работнова И. Л. Действие ионов цинка на Candida utilis // Микробиология, 1980. Вып. 1. Т. 49. С. 59-63.

7. Ховрычев М. Н., Федорова Т. А., Работнова И. Л. О влиянии ионов меди на рост Candida utilis в непрерывной культуре // Микробиология, 1974. Вып. 1. Т. 43. С. 99-102.

8. Gunther T., Dornberger U. and Fritsche W. (1996) Effects of ryegrass on biodegradation of hydrocarbons in soil. Chemosphere. № 33. P. 203-215.

9. Trindade P. V. O., Sobral L. G., Rizzo A. C. L., Leite S. G. F., Soriano A. U. Bioremediation of a weathered and recently oil-contaminated soils from Brazil: a comparison study // Chemosphere, 2005. Vol. 58. P. 515-522.

10. Kechavarzi C. Root establishment of perennial ryegrass (L. perenne) in diesel contaminated surface soil layers / Pettersson, K. Leeds-Harrison P., Ritchie L., Ledin S. // Environ. Pollut., 2007. V. 145. № 1. P. 68-74.

11. Gerhardt P. Manual of methods for general bacteriology / P. Gerhardt et.al. Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1981.

12. Gerhardt I., Liu Q., Lamas-Linares A. et al., 2011. Full-field implementation of a perfect eavesdropper on a quantum cryptography system. Nat. Commun. 2: 349 p.

13. WangR., Li L. L., Cao Z. H., Zhao Q., LiM., ZhangL. Y., Hao Y. J., 2012. Molecular cloning and functional characterization of a novel apple MdCIPK6L gene reveals its involvement in multiple abiotic stress tolerance in transgenic plants. Plant Mol. Biol. 79 (1-2). P. 123-135.

14. Karthikeyan V. J. Endothelial damage/dysfunction and hypertension in pregnancy / V. J. Karthikeyan, G. Y. Lip // Front Biosci (Elite Ed), 2011. Vol. 3. P. 1100-1108.