Вирусологии, как hауке, 120 лет

ИСТОРИЯ БИОМЕДИЦИНЫ

ВИРУСОЛОГИИ, КАК НАУКЕ, 120 ЛЕТ

М.К.Мамедов

Hациональный центр онкологии, г. Баку

Днем рождения учения о вирусах, ставшего в дальнейшем основой одной из динамично развивающихся не только медицинских, но и фундаментальных биологических наук - вирусологии, принято считать 12 февраля 1892 г, когда в г.Петербурге на заседании Российской Академии Наук в докладе молодого ботаника Дмитрия Иосифовича Ивановского были представлены данные об открытии принципиально нового типа живых существ, впоследствие получивших название "вирусов".

Надо отметить, что Д.И.Ивановский описал первый вирус растений - вирус табачной мозаики. Вскоре, в 1897-1898 гг был открыт и первый вирус животных - им оказался вирус ящура, идентифицированный немецкими бактериалога-ми Фридрихом Леффлером и Паулем Фрошем. И, наконец, в 1913 г был открыт первый вирус бактерий - его идентифицировал английский военный врач Уильям Туорт. В 1917 г работавший в Институте Пастера в Париже Феликс д'Эррель назвал его "бактериофагом".

И хотя вирусы бактерий были открыты последними, простота получения бактерифагов и наблюдения за их размножением обеспечили то, что исследования фагов по темпам значительно опередили изучение вирусов животных и человека и внесли неоценимый вклад в понимание биологической природы вирусов, вообще. Изучение фагов открыло ряд фундаментальных закономерностей, позволивших понять механизмы репродукции вирусов вообще и уяснить как этот процесс оказывает воздействие на организм.

Теоретическое значение исследований по фагам имело исключительную ценность и для других областей биологии и медицины. Надо отметить, что концепция об интеграции профага в клеточный геном оказалась чрезвычайно плодотворной при трактовке молекулярных механизмов вирусного канцерогенеза и подтверждении основных положений вирусно-генетической кон-

цепции злокачественных опухолей.

Кроме того, сегодня можно уверенно говорить о том, что проведенные за период 30-50 гг ХХ в исследования фагов привели к двум важнейшим последствиям для биологии.

Во-первых, в процессе изучения фагов был сформирован тот идеологический массив и методический арсенал, который лег в основу формирования вирусологии, как биологической науки и

Во-вторых, научные данные, полученные при изучении фагов уже в 40-е гг ХХ в стали основой новой науки - молекулярной биологии, на базисе которой сформировалось прикладное современное направление биологии и биотехнологии - генная инженерия.

Необходимо отметить и то, что технология получения вирусов растений и, в первую очередь, открытого еще Д.И.Ивановским вируса табачной мозайки (ВТМ), также была довольно простой. Благодаря этому на протяжении 30-40-х гг ХХ в были получены ценные данные о химическом составе и строении частиц ВТМ.

В 1935 г американский биохимик У.Стенли получил препарат чистого ВТМ, имеющего вид мелких игольчатых кристаллов. Последние, будучи вновь растворены, оказались способными вызывать типичную мозаичную болезнь табака.

В целом получение вирусов в кристаллическом состоянии открыло новые возможности для химического анализа вирусов и имело неоценимое значение для дальнейшего развития вирусологии, и, в частности, биохимии вирусов.

В 1937 г английские биохимик Ф.Боуден и вирусолог Н.Пири установили, что ВТМ лишь на 94% состоит из рибонуклеиновой кислоты (РНК). Вскоре было доказано, что все вирусы содержат как белки, так и нуклеиновые кислоты.

В 1956 г вирусологи Альфред Гирер и Герхард Шрамм из Германии доказали, что у ВТМ носителем генетической информации явля-

ется РHК. В 1957 г Хейнц Френкель-Конрат из США химически (с помощью фенола) расщепил ВТМ на белок и РНК и показал, что последующее смешивание этих компонентов приводило к образованию вирулентного вируса. Этот феномен был назван "реконструкцией" (позднее была воспpоизведена перекрестная реконструкция компонентов разных вирусов pастений).

Еще в 1956 г Ф.Крик и Дж.Уотсон пришли к выводу, что генетическая информация, заключенная в РНК ВТМ недостаточна для кодирования белка, входящего в состав оболочки этого вируса, и обладающего молекулярным весом около 38 мегадальтон. Поэтому ученые предположили, что белок оболочки частиц ВТМ не является одной непрерывной полипептидной цепью, а представлен несколькими абсолютно одинаковыми по первичной структуре полипептидами, которые синтезируются на одной и той же матрице РНК.

В 1958 г англичане Р.Фрэнклин и К.Холмс подтвеpдили это пpедположение - с помощью рентгеноструктурного анализа они показали, что частицы ВТМ по конфигуpации пpедставляют собой полые цилиндрические образования, стенки котоpых постpоены более, чем из 2 тысяч абсолютно одинаковых белковых субъединиц. В 1960 г амеpиканцы Р.Маркхэм и К.Смит пришли к аналогичному выводу, но при этом показали, что некоторые растительные вирусы имеют сфеpическую форму, но также построены из упоpядоченно pасположенных белковых субъединиц. Таким образом была установлена периодичность структуры вирусных белков, характерная для кристаллоподобных образований, обpазуемых вкусами pастений.

В заключение отметим, что в 1967 г амеpиканский фитовиpусолог Теодоp Дайнеp об-наpужил группу особых вкусных агентов, являющихся возбудителями нескольких своеобразных болезней pастений. Поскольку они, как и вирусы, имели малые pазмеpы, но пpедставляли собой лишенные белковой оболочки молекулы нуклеиновых кислот, способные к pепpодукции и больше напоминали плазмиды бактеpий, в 1971 г Дайнеp пpедложил назвать их "вироидами".

Изучение виpусов животных и человека заметно "отставало" от исследований фагов и вкусов pастений, в основном, из-за отсутствия возможности получения их в количествах, достаточных для их детального изучения - выделение и культивирование этих вирусов осуществлялось почти исключительно путем заражения доступных восприимчивых животных или, даже, лю-

дей-добpовольцев, а выделение их из крови и оpганов инфицированных животных всегда было сопряжено со значительными техническими тpудностями.

И хотя в 1925 г была доказана принципиальная возможность использования этого подхода для воспроизведения процесса pазмножения вкусов, вплоть до конца 40-х гг ХХ в технология культивации клеточных систем в искусственных питательных сpедах оставалась весьма тpудоемкой, методически несовеpшенной, а сама пpоцедуpа длительного сохpанения тканей и клеток in vitro плохо поддавалась стандаpтизации - в итоге pезультаты их инфицирования виpусами отличались низкой воспpоизводимостью.

Ситуация изменилась в лучшую стоpону лишь в 1931 г, когда американские вирусологи Эрнст Гудпасчур и Элис Вудроф показали возможность pазмножения вируса оспы внутpи куpиных яиц и пpедложили использовать метод культивиpования вирусов на куриных эмбрионах. Широкое распространение этот метод получил после его модификации, предложенной в 1933 г Ф.Бэрнетом и УБевеpиджем, позволявшей накапливать некотоpые вирусы в больших количествах. Этот метод сыграл немалую роль для прогресса в области изучения вкусных инфекций человека и животных. К пpимеpу, с его помощью Макс Тейлеp, ученый из ЮАР pазpаботал пеpвую эффективную вакцину против желтой ли-хоpадки.

Вместе с тем, необходимо подчеpкнуть, что интенсивное исследование вкусов животных и человека началось лишь в конце 40-х гг ХХ в, после того как в 1949 г, когда амеpиканские вирусологи Дж. Эндерс, Ф.Роббинс и Т.Уэллер разработали удобный метод выращивания шиpокого спектра вирусов в среде содержащей аминокислоты, витамины и азотистые основания в культуре клеток, организованной в виде одного сплошного слоя на стекле.

Метод отличался целым рядом ценных преимуществ перед методом куриных эмбрионов и, позволяя получать большие количества вируса, был взят на вооружение вирусологами всего мира. Благодаря ему была создана первая вакцина против полиомиелита (вакцина Дж.Солка).

В 1952 г метод усовершенствовали американцы Р.Дульбекко и Мартин Фогт, которые разработали методику покрытия монослоя инфицированных вирусом клеток прозрачным агаром, что позволяло фиксировать появляющиеся (из-за размножения вируса) в монослое клеток очаги деструкции в виде "просветленных" участков.

Использование этого метода упростило титрование вирусов (расчет количества инфекционных вирусных частиц) и методически приблизило ее к известному методу титрования бактериофагов на "газоне" выросших на поверхности агара бактерий по методу, разработанному Андре Грация еще в 1936 г. И, наконец, он обеспечил возможность количественно оценивать противовирусное действие тех или иных факторов и создал предпосылки для развития противовирусной терапии.

Помимо появления почти универсальной методики культивирования вирусов in vitro, важной особенностью развития вирусологии на протяжении 50-хх гг минувшего столетия являлось широкое внедрение в вирусологию, с одной стороны, таких методов как радиометрия и авторадиография, электрофорез, гель-фильтрация и др., а с другой стороны, идеологии и новой методологии, "родившейся" в процессе интенсивного развития генетики бактерий и фагов, а также молекулярной теории наследственности.

В то же время, получение кристаллической формы вирусов человека потребовало немало усилий - это впервые удалось лишь в 1955 г, когда К.Швердт и Ф.Шеффер в США получили in vitro кристаллы вируса полиомиелита, сохраняющие свою инфекционность.

Вместе с тем, за 50-60 гг ХХ в впечатляющие успехи были достигнуты в установлении вирусной этиологии десятков инфекционных заболеваний человека и животных и в выделении соответствующих вирусов и их изучении.

Более того, именно в эти годы началось изучение особой группы, как оказалось, инфекционных по характеру распространения, заболеваний центральной нервной системы, которые исландский ученый Бьерн Сигурдсон в 1954 г предложил объединить под названием "медленных инфекций" животных и человека. К середине 60-х гг американец К.Гайдушек (на основе своих, проведенный в Новой Гвинее/Папуе наблюдений за местными жителями, у которых развивалось прогрессирующее заболевание нервной системы, известное под названием "куру", означавшем на местном языке "дрожание") доказал, что они обусловлены вирусоподобными агентами, способными передаваться из одного организма в другой, но имеющими существенные отличия от всех известных тогда вирусов - вот почему Гай-душек назвал их "некононическими вирусами".

В 1963 г американский ученый Б.Бламберг идентифицировал антиген вируса гепатита В, что вскоре позволило открыть этот вирус и стало на-

чалом череды открытий вирусов других гепатитов.

60-е гг ХХ в ознаменовались началом широкого внедрения в вирусологию ряда новых аналитических методов, использованных в биохимии и иммунологии. Но особое значение для развития вирусологии в тот период имело развитие молекулярно-гибридизационных технологий, позволявших с помощью "меченной" молекулы известной ДНК (или РНК) идентифицировать наличие в тестируемых пробах и даже клетках полностью или частично гомологичных (совпадающих по первичной структуре) макромолекул.

В 1961 г Р.Дульбекко и Джордж Уэстфаль впервые в вирусологии использовали метод гибридизации ДНК, основанный на введении в клетку "меченной" радиоактивным изотопом РНК, искусственно полученной с ДНК искомого вируса и являющейся "зеркальной копией" этой ДНК. Оценивая степень связывания клеточной ДНК с РНК-копией вирусной ДНК, можно было судить о степени комплементарности (т.е., гомологии) нуклеотидных последовательностей в этих молекулах.

Этот же период ознаменовался началом направленного поиска противовирусных лекарственных препаратов и создания новых вакцин против вирусных инфекций. И, наконец, в этот период началась подготовка к созданию Международной классификации вирусов.

Важно также отметить, что период 50-60 гг ХХ в ознаменовался быстрым развитием одного из важнейших направлений вирусологии - изучением онкогенных вирусов животных, основы которого были заложены американским вирусологом Ф.Раусом еще в 1910 г.

70-е гг ХХ в ознаменовались открытием, имеющих исключительно важное значение для науки - в 1970 г два ученых, независимо друг от друга, впервые обнаружили фермент РНК-зави-симую-ДНК-полимеразу - ими оказались американец Г.Темин из университета Висконсина и англичанин Д.Балтимор из Кембриджского университета. Существование этого фермента, названного "обратной транскриптазой", поколебало "центральную догму молекулярной биологии", но объяснило механизмы не только онко-генного действия РНК-содержащих вирусов, но и их длительного латентного пребывания в клетке.

Важным успехом вирусологии этого периода стала впервые реализованная в 1972 г П.Бергом и его коллегами из Стенфордского университета технология получения рекомбинантной молекулы ДНК - используя ДНК фага лямбда (в качест-

ве "вектора", направленно переносящего клеточные гены и встраивающего их в ДНК бактериальной клетки-реципиента), ученые внедрили фрагменты ДНК вируса SV40 в геном кишечной палочки. Это исследование заложило основы метода клонирования генов в бактериях, а затем и в грибах.

За этот же период, благодаря применению радиоиммунологического метода и иммуноэ-лектроннной микроскопии был открыт ряд новых вирусов: ротавирусного гастроэнтерита, гепатита А, гепатита D (дельта) и некоторые другие.

В 80-х гг в вирусологических исследованиях начали использоваться иммуноферментный метод, иммуноблотинг и, главное, методы молекулярной амплификации ДНК и РНК, пришедшие на смену широко использовавшихся в 70-е гг методов их гибридизации.

Идеологические принципы этих методов были заложены Кери Мюллисом, американским биохимиком, который в 1983 г воспроизвел in vitro феномен амплифицированного ферментативного синтеза на матрице одной из цепей ДНК ее второй цепи de novo. Этот феномен лег в основу "полимеразной цепной реакции" (ПЦР), принципиально изменившей принципы идентификации вирусов.

Заметным событием того периода стало то, что менее, чем за 3 года была установлена вирусная этиология синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД), впервые обнаруженного в 1981 г - уже в 1983 г во Франции, а в 1984 г - в США был выявлен вирус, признанный возбудителем СПИД и названный "вирусом иммунодефицита человека".

В середине 80-х гг начатое Гайдушеком исследование неканонических вирусов - возбудителей медленных инфекций завершилось. Американский исследователь С.Празинер доказал, что их сходство с вирусами ограничивается лишь малыми размерами - в остальном они имеют кардинальные отличия от вирусов. Оказалось, что это особая группа не связанных с нуклеиновыми кислотами низкомолекулярных эндогенных белков с неясной функцией. Ученый предложил назвать их "прионами" - термином, образованным из фрагментов полного названия этих агентов "PRoteinaceous InfectiON".

В этот период метод клонирования генов позволил решить ряд задач биотехнологии (на его основе уже в 1986 г было налажено производство интерферона человека) и диагностики (в 1989 г методом клонирования генов в бактериях

были экспрессированы белки вируса, позволившие серологически идентифицировать вирус, получивший название вируса гепатита С).

В последнем десятилетии минувшего века вирусология вступила в современный этап и развивалась на основе применения современных мо-лекулярно-генетических методов. Была доказана возможность использования аденовирусов и ретровирусов в качестве векторов, переносящих клеточные гены. Это позволило наметить пути к разработке молекулярно-генетических вакцин и методов "генной" терапии, причем как вирусных и иных инфекционных, так и онкологических заболеваний человека и животных.

В заключение, надо отметить, что открытия сделанные в вирусологии получили высокую оценку мирового научного сообщества. Для подтверждения этого положения ниже мы в форме таблицы приводим перечень всех Нобелевских премий (как по физиологии и медицине, так и по химии), присужденных ученым, внесшим наиболее весомый вклад в развитие вирусологии.

Надо особо отметить, что первоначально развитие вирусологии на протяжении более полувека было подчинено лишь стремлению ученых раскрыть этиологию тех инфекционных заболеваний растений, животных и человека, возбудителей которых было невозможно найти среди бактерий, грибов и простейших.

Иначе говоря, период своего становления вирусология начала как часть бактериологии, а позднее как прикладная медицинская, ветеринарная или сельскохозяйственная наука, занятая исследованием только вирусов, патогенных для человека, животных и растений. Эти роли вирусология частично сохранила и сегодня.

В процессе решения прикладных задач все отчетливее становилась необходимость для более глубокого изучения вирусов использования физических и химических методов, отсутствовавших в арсенале классической бактериологии. По мере внедрения этих методов в вирусологические исследования и получения с их помощью новой информации о природе вирусов постепенно формировалась своя, отличная от бактериологической, научная идеология, которая в свою очередь, "подпитывая" все новые изыскания, самосовершенствовалась, углублялась и расширялась, все более отдаляясь от бактериологии.

Это отдаление ускорилось в период после 2-й мировой войны и было связано с двумя важнейшими научными достижениями - внедрением в исследования электронной микроскопии и мето-

Таблица. Иоблевские пpемии, пpисужденные за исследования, связанные с виpусами и

виpусными болезнями

в 1946 г - Уиндэлу Стенли за получение белковых вирусов в чистом кристаллическом виде; в 1951 г - Максу Тейлеру за создание вакцины против желтой лихорадки;

в 1954 г - Джону Эндерсу, Фредерику Роббинсу и Томасу Уэллеру за разработку метода культивации вируса полиомиелита в культурах тканей;

в 1958 г - Джошуа Ледербергу за открытия, касающиеся генетической рекомбинации у бактерий и структуры их генетического аппарата;

в 1966 г - Френсису Роусу за открытие опухолеродных вирусов;

в 1969 г - Максу Дельбрюку, Альфреду Херши и Сальвадору Лурия за открытие цикла репродукции вирусов и развитие генетики бактерий и вирусов;

в 1975 г - Ренато Дульбекко за исследование механизма действия онкогенных вирусов и Говарду Темину и Дэвиду Балтимору за открытие обратной транскриптазы;

в 1976 г - Барри Бламбергу и Карлтону Гайдушеку за открытие новых механизмов возникновения инфекционных заболеваний;

в 1980 г. - Полу Бергу за фундаментальные исследования в области биохимии нуклеиновых кислот, в частности рекомбинантной ДНК;

в 1982 г. - Аарону Клагу за работы в области электронной микроскопии и открытие структур биологически важных нуклеопротеиновых комплексов;

в 1988 г - Джемсу Блэку, Гертруде Элион и Джорджу Хичингсу за создание новых противовирусных лекарственных препаратов;

в 1989 г - Майклу Бишопу и Гарольжу Вармусу за открытие клеточного происхождения ретровирусных онкогенов;

в 1997 г - Стенли Празинеру за открытие прионов - инфекционных агентов нового типа; в 2008 г - Харальду зур Хаузену за открытие связи вируса папилломы человека с раком шейки матки, а также Франсуазе Барре-Синуасси и Люку Монтанье за открытие вируса иммунодефицита человека, вызывающего СПИД._

дов культивирования вирусов в клеточных системах in vitro. К этому времени, в основном, завершилось четкое отделение вирусологии от бактериологии, а сам термин "вирусология" получил широкое распространение.

Но обретение вирусологией статуса вполне самостоятельной биологической науки стало возможным лишь во второй половине 50-х гг ХХ в после революционных открытий в биологии и генетике и, главное, после того, как было установлено, что любой вирус может содержать лишь одну из нуклеиновых кислот - или ДНК, или РНК. Именно это открытие позволило постулировать одно из кардинальных отличий вирусов от любых других живых существ и, соответственно, выделить вирусологию в качестве самостоятельной биологической науки.

Уже начиная со второй половины 50-х гг прошлого века, т.е. полвека назад, методология вирусологических исследований стала стремительно приближаться к методологии биохимии и молекулярной генетики, а научная идеология вирусологии стала развиваться в неразрывной связи с идеологией молекулярной биологии. Сли-

яние этих идеологий нашло выражение в широком внедрении методов генной инженерии в методологию изучения вирусов.

Сегодня вирусология, оставаясь "молодой" наукой, является не только одной из наиболее интенсивно развивающихся областей биологии, но и одним из ее флагманских направлений, поскольку, помимо решения важных утилитарных задач, находящихся в центре внимания медицинской и ветеринарной вирусологии, всестороннее изучение вирусов открывает широкие возможности для решения целого ряда фундаментальных биологических проблем и решения насущных практических задач.

Среди них, в первую очередь, следует назвать теоретические проблемы самовоспроизведения "живых структур", происхождения и эволюции жизни на Земле и имеющие важное практическое значение проблемы выяснения молекулярных и субмолекулярных механизмов развития морфофункциональных нарушений жизнедеятельности клеток, возникновения и развития злокачественных опухолей и даже совершенствования важных биотехнологических процессов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Мамедов М.К. Вирусы: эволюция представлений и развитие вирусологии. Баку: Билик, 2001, 144 с.;

2. Мамедов М.К. Вирусы бактерий: на переднем крае науки и биотехнологии. // Биомедицина, 2007, N.4, с.50-53;

3. Мамедов М.К. Нобелевской премии - 110 лет. // Биомедици-на,2011, N.4, c.42-47;

4. Мамедов М.К., Кадырова А.А. Культивируемые клеточные системы - столетие на службе науки. // Биомедицина, 2007, N.4, с.46-49;

5. Мамедов М.К., Кадырова А.А., Дадашева А.Э. Вирус иммунодефицита человека и вызываемая им инфекция. Н.Новгород: Изд-во НГМА, 2009, 278 с.;

6. Мамедов М.К., Михайлов М.И. От вируса гепатита С до TTV и далее. // Вирусные гепатиты (Москва), 2005, N.2, с. 1115;

7. Михайлов М.И., Мамедов М.К. Эволюция взглядов на этиологию гепатита: от дискразической теории к вирусной. // Вирусные гепатиты (Москва), 2004, N.1, с.3-7.

ХРОНИКА

О ПРИСУЖДЕHИИ ШБЕЛЕВСКОЙ ПРЕМИИ ЗА 2012 г.

В 2012 г Нобелевская премия по физиологии и медицине была присуждена "за открытие возможности перепрограммирования дифференцированных клеток в плюрипотентные" Джон Гёрдон (John Bertrand Gurdon), pаботающему в кембриджском Гёрдоновском институте (Gurdon Institute) и Синъя Яманака (Shinya Yamanaka), сотруднику Института сердечно-сосудистых заболеваний Глэдстона в Сан-Франциско (Gladstone Institute of Cardiovascular Disease in San Francisco) и профессору Университета Киото (Kyoto University).

ISSN 1815-3917

Сдано в набор 25.12.2012. Подписано к печати 18.12.2012. Распространяется бесплатно. Тираж 500.