Способ идентификации микроскопических грибов рода Coccidioides spp. In vitro

Заключение. Микробный спектр слизистой оболочки пищевода и желудка у всех обследованных подростков представлен в большей степени нормальной и реже условно-патогенной микрофлорой. Спектр микроорганизмов, выделенных у больных с ГЭРБ и ХГД, шире, их количество часто превышало 4 lg КОЕ/г. Штаммы микроорганизмов у детей с ГЭРБ и ХГД обладают факторами агрессии (гемолизин, лецитиназа) и цитотоксичностью, наличие которой рассматривается как фактор патогенности.

В то же время Н. pylori чаще встречается в слизистой оболочке пищевода и тела желудка здоровых подростков. Уреазную активность имеет не только Н. pylori, но у данного микроорганизма она проявляется намного быстрее.

У детей с ГЭРБ микробный спектр в пищеводе шире, количество выделенных бактерий больше по сравнению не только со здоровыми подростками, но и с детьми с изолированным ХГД. В то же время различия в микробиоценозе желудка между детьми 1-й и 2-й групп не столь существенны, хотя определяются различия с контрольной группой. Мы считаем, что при ГЭРБ повреждающее действие на слизистую оболочку пищевода агрессивного желудочного содержимого приводит к созданию благоприятных условий для развития микробной флоры в данном отделе пищеварительного тракта.

ЛИТЕРАТУРА

1. Базлов С. Н., Червинец В. М., Егорова Е. Н. Эффективность трансэндоскопической санации ульцерозного процесса при рецидиве язвенной болезни, ассоциированной с дисбактериозом гастродуоде-нальной зоны. Альманах клинической медицины. 2006; 14: 13-7.

2. Егорова Е. Н. Микробная флора и лизоцим слизистой оболочки гастродуоденальной зоны при язвенной болезни и возможности их коррекции: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. СПб.; 1999.

3. Казимирова А. А., Казачков Е. Л. Структурно-функциональное состояние слизистой оболочки желудка и его микробиоценоз при хроническом гастрите у детей. Уральский медицинский журнал. 2009; 4: 17-21.

4. Лазебник Л. Б., Машарова А. А., Бордин Д. С. и др. Многоцентровое исследование "Эпидемиология гастроэзофагеальной рефлюксной болезни в России" (МЭГРЕ): первые итоги. Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2009; 6: 4-12.

5. Масевич Ц. Г., Лосева И. А. Гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь в сочетании с инфицированием пилорическим хелико-бактером. Терапевтический архив. 1998; 70 (2): 26-8.

6. Цветкова Л. Н., Горячева О. А., Цветков П. М. и др. Гастроэнтерологическая патология у детей: патоморфоз заболеваний и совершенствование методов диагностики на современном этапе. В кн.: Актуальные проблемы абдоминальной патологии у детей. М.; 2011: 5-8.

7. Червинец В. М. Изменение микробиоценоза при воспалительных и эрозивно-язвенных поражениях пищевода, желудка и двенадцатиперстной кишки и пути его коррекции: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. М.; 2002.

8. Червинец В. М. Микрофлора воспалительно-эрозивных участков пищевода при эзофагитах. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2002; 2: 73-5.

9. El-SeragН. В., SonnenbergA., JamalМ. М. et al. Corpus gastritis is protective against reflux oesophagitis. Gut. 1999; 45: 181-5.

10. O'Connor H. J. Review article: Helicobacter pylori and gastroesophageal reflux disease - clinical implications and management. Aliment. Pharmacol. Ther. 1999; 13: 111-27.

Поступила 04.07.12

© Т. А. ГРИШКИНА, В. м. САмыГИН, 2013 УДК 616-002.828-078

Т. А. Гришкина, В. м. Самыгин

СПОСОБ идентификации микроскопических ГРИБОВ РОДА CoCCiDioiDEs spp. iN ViTRo

Волгоградский государственный технический университет министерства образования и науки РФ

Исследованы морфологические особенности микроскопических грибов рода Coccidioides spp. при культивировании на культуре клеток мышиных спленоцитов. Шаммы С. immitis и С. po.sada.sii в течение 5-7 сут конверсируют из мицелиальной в сферульную форму, что позволяет использовать данный тест для идентификации возбудителей кокцидиоидомикоза.

Ключевые слова: Coccidioides immitis, Coccidioidesposadasii, возбудители кокцидиоидомикоза, мицелиальная форма, сферулы

T.A. Grishkina, V.M. Samygin

THE MODE OF IDENTIFICATION OF MICROSCOPIC FUNGI OF GENUS OF COCCIDIDOIDES SPP. IN VITRO The article deals with analysis of morphologic characteristics of microscopic fungi of genus of Coccididoides spp. under cultivation on culture of mouse splenocytes culture. During two days, the strains of C.imitis and C.posadasii converse from filamentous to spherulic form. This process makes it possible to apply this test to identify agents of coccidioidomycosis.

Key words: Coccididoides imitis, agent of coccidioidomycosis, filamentous form, spherula

Для корреспонденции:

Гришкина Татьяна Александровна, канд. мед. наук, доц. каф. пром.

экологии и безопасности жизнедеятельности

Адрес: 400005, Волгоград, пр. Ленина, 56/39

Телефон: (8442)23-16-80

E-mail: tatyana@ovel.ru

Кокцидиоидомикоз (болезнь Вернике-Посады - неконтагиозный системный микоз, проявляющийся как первичная легочная инфекция, либо как прогрессирующие гранулематозные поражения кожи, суставов, костей, внутренних органов и мозговых оболочек [14]. Возбудители кокцидиоидомикоза Coccidioides spp. до недавнего

КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № 4, 2013

времени были представлены единым видом С. immitis. Углубленные исследования генома грибов позволили разделить штаммы на 2 группы - калифорнийскую и некалифорнийскую. В соответствии с этими данными, начиная с 2004 г., грибы рода Coccidioides подразделяются на 2 вида: С. immitis и С. posadasii [8, 9, 13]. Морфологические различия между культурами разной видовой принадлежности до настоящего времени не установлены.

Проблема своевременной и правильной идентификации микромицетов (микроскопических грибов), имеющих значение в развитии патологических состояний, весьма актуальна, так как определяет в дальнейшем тактику лечения больных и подбор эффективных лекарственных средств. В микологической практике наиболее часто используют методы, направленные на изучение макро- и микроморфологии культур. Данная концепция диагностики получила название морфологической или фенотипической: для определения единицы вида проводятся определение морфологических характеристик изучаемого штамма и сравнительный анализ путем установления отличий родственных видов [10]. Этот методологический подход реализуется путем культивирования микроскопических грибов в условиях, позволяющих получить культуры микромицетов с характерной морфологией.

Возбудители кокцидиоидомикоза относятся к диморфным грибам, отличающимся способностью существовать в двух физиологических фазах и соответственно в двух морфологических формах. Сапрофитическая фаза представлена мицелиальной формой, в которой возбудители кокцидиоидомикоза обитают в окружающей среде, а также растут на питательных средах, применяемых для культивирования микроскопических грибов. Штаммы Coccidioides spp. в течение 3-5 дней инкубации при 280С на поверхности плотного питательного агара образуют сероватые плесневые колонии. При микроскопическом изучении культур, находящихся в мицелиальной форме, выявляются гифы, состоящие из бочонкообразных артроспор, чередующихся с более мелкими стерильными разделительными клетками. По мере развития и созревания мицелия происходит его распад на более короткие фрагменты и отдельно лежащие артроконидии (4-6 мкм длиной) с "обрывками" клеток разделителей в виде усиков, расположенных по углам [5]. Образование артроконидий свойственно не только Coccidioides spp., но и некоторым дрожжеподоб-ным грибам и дерматофитам, имеющим сходное строение: Auxarthron spp., Oidiodendron spp., Gymnoascus spp., следовательно, морфология мицелиальной формы Coccidioides spp. не является строго специфичной [7].

Целью настоящего исследования было изучение возможности конверсии штаммов Coccidioides spp. в сфе-рульную форму на культуре клеток.

Материалы и методы. В работе использованы штаммы возбудителей кокцидиоидомикоза Coccidioides posadasii 36 S и Coccidioides immitis С-5 из Российской коллекции микроскопических грибов II группы патоген-ности Волгоградского научно-исследовательского противочумного института.

Культуру клеток мышиных спленоцитов в виде монослоя подготавливали за сутки до этапа заражения грибными культурами. В качестве доноров спленоцитов использовали инбредных мышей BALB/c. Выделяли селезенку с соблюдением правил асептики, гомогенизировали ее в бессывороточной среде ЯРМ1-1640 с помощью стеклянногс дезинтегратора, затем дважды отмывали клеточную взвесь центрифугированием при 1000

об/мин в течение 10 мин, ресуспендировали осадок в 5-10 мл той же среды. Подсчет спленоцитов проводили в камере Горяева, оценивали их концентрацию и жизнеспособность с помощью 0,4% раствора трипанового синего. Высев спленоцитов на планшеты производили из расчета 5,0-8,0 • 104 кл/см2.

Культивирование мышиных спленоцитов осуществляли в среде ЯРМ1-1640; рН 7,2, в присутствии 2 мМ бикарбоната натрия, 20 мМ Hepes, 10% ЭТС ("Биолот"), без добавления антибиотиков, в СО2-инкубаторе (Негеш) при 370С, в атмосфере с содержанием 5% СО2 в течение 24 ч, затем инфицировали полученную в виде монослоя культуру мышиных спленоцитов взвесями грибов.

Штаммы Coccidioides posadasii 36 S и Coccidioides immitis С-5 культивировали на среде Сабуро при 280С в течение 3 сут. Затем культуры смывали 0,15 М раствором хлорида натрия; рН 6,8, готовили взвесь, соответствующую 5 ЕД отраслевого стандартного образца мутности ГИСК им. Л. А. Тарасевича (ОСО), и 0,5 мл взвеси вносили в планшеты с культурами клеток спленоцитов.

Культуры клеток, зараженные возбудителями кокци-диоидомикоза, дополнительно культивировали при тех же условиях в течение 10 сут. Пробы обеззараживали добавлением формалина в количестве 10% от объема пробы в течение 24 ч, готовили нативные препараты "раздавленной" капли и исследовали ежедневно с помощью световой микроскопии с сухим объективом при увеличении 100 и 400. Размеры клеток определяли с помощью окулярного винтового микрометра МОВ-1-15х при линейном увеличении в = 46,375.

Результаты и обсуждение. Культивирование грибов в тканевой (паразитарной) фазе на питательных средах достаточно сложная процедура, так как до настоящего времени не определены их оптимальный состав и условия культивирования, которые позволяли бы осуществить конверсию всех элементов грибной популяции [3, 6, 11, 12]. С этой же целью можно прибегнуть к заражению лабораторных животных, последующему выделению тканевых сферул и идентификации возбудителей [1, 2, 4]. При ингаляции артроконидий Coccidioides spp. в тканях легких лабораторных животных происходит развитие тканевой, или паразитарной, фазы. Она представлена сферулами - округлыми образованиями от 10 до 200 мкм в диаметре, заполненными эндоспорами (от единичных до нескольких сотен). Эндоспоры имеют овальную или неправильную форму. Двойная стенка сферул достигает 2 мкм в поперечнике. Окончательный

Рис. 1. Микрокультура Coccidiodes immitis С-5, 5 сут х 400.

Рис. 2. Микрокультура Coccidiodes posasasii 36 S, 7 сут х 400.

диагноз кокцидиоидомикоза устанавливают при выявлении способности культуры конверсировать в сфе-рульную форму. Незрелые сферулы, т. е. недифференцированные образования, нельзя принимать во внимание в связи с отсутствием типичных признаков, таких как двойная оболочка и наличие эндоспор.

Культивирование на культуре клеток мышиных спле-ноцитов приводило к изменению микроморфологии штаммов Coccidioides spp. На начальном этапе реализовывался сапрофитический путь развития и культуры в исследованных образцах представлены мицелиальной формой. В дальнейшем происходила их трансформация в паразитарную, сферульную форму. Наиболее быстро смена фаз развития наблюдалась у штамма С. immitis С-5. Формирование юных сферул начиналось на 3-и сутки культивирования. Они имели вид прозрачных округлых образований 20-30 мкм в диаметре с одноконтурной оболочкой. Через 5 сут культивирования сферулы достигали размера 50-80 мкм, приобретали двухконтурную оболочку и содержали эндоспоры (рис. 1). У штамма С. posadasii 36 S образование сферул наблюдалось на 4-5-е сутки культивирования. Через 7 сут сферулы достигали в диаметре 40-60 мкм, но лишь некоторые из них имели двойную оболочку. Дробление цитоплазмы на эндоспоры также выявлялось только у части сферул (рис. 2). Дальнейшее культивирование до 10 сут не вносило существенные изменения в микроскопическую картину изучаемых образцов.

Для подтверждения диморфности исследуемых штаммов микромицетов и установления их принад-

лежности к роду Coccidioides spp. путем трансформации сапрофитической мицелиальной формы в паразитарную сферульную форму можно использовать культуру клеток мышиных спленоцитов. Микроскопическое исследование следует проводить на 5-7-е сутки и при обнаружении округлых двухконтурных образований, заполненных эндоспорами, идентифицировать культуры как возбудители кокцидиоидоми-коза.

ЛИТЕРАТУРА

1. А.с. 2265844, РФ. Гришкина Т. А., Спиридонов В. А., Тимофеева Е. В., Лесовой В. А. Способ обнаружения возбудителей кокцидиоидомикоза. G 01N 33/48. Заявлено 26.05.2004 г.; Опубл. 10.12.2005 г., Бюл. № 34.

2. Тришкина Т. А., Лесовой B. C., ТимофееваЕ. В., Спиридонов В. А. Ускоренный способ идентификации Coccidioides immitis Rixford and Gildrist, 1896. Проблемы медицинской микологии. 2006; 8 (3): 33-5.

3. Зеленская Л. И., Зубова Л. С., Павленко З. С. Сферулообразова-ние у Coccidioides immitis in vitro. В кн.: Материалы 7-й Ленинградской микологической конференции. Л.; 1988: 76-8.

4. Лихолетов С. М., Нарбутович Н. И., Липницкий А. В., Прокофьева Е. И. Иммунологическая характеристика антигенов паразитарной фазы Coccidioides immitis. Журнал гигиены, эпидемиологии, микробиологии и иммунологии. 1979; 4: 380-5.

5. Кашкин П. Н., ХохряковМ. К., Кашкин А. П. Определитель патогенных, токсичных и вредных для человека грибов. Л.: Медицина; 1979. 270 с.

6. Черепанов Н. М., Салеева Л. С., Зубова Л. С. и др. Некоторые особенности роста грибов Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum и Blastomyces dermatitidis на различных питательных средах. В кн.: Материалы 7-й Ленинградской микологической конференции. Л.; 1988: 181-4.

7. Chester W., Emmons P. D. In: Proceedings of second coccidioidomi-cosis symposium. 1965: 333-7.

8. Fisher M. C., Koenig G. L., White T. J., Taylor J. W. Mol. Ecol. 1999; 8: 1082-4.

9. Fisher M. C., Koenig G. L., White T. J., Taylor J. W. Micologia. 2002; 94 (1): 173-84.

10. Guarro J., Gene J., Stchigel A. Clin. Microbiol. Rev. 1999: 454500.

11. Levine H. B., Jonzalez-Ochoa A., Ten Iyck D. R. Am. Rev. Respir. Dis. 1973; 107 (3): 379-86.

12. PetkusA. F., Baum L. L., Ellis R. B. J. Clin. Microbiol. 1985; 22 (2): 165-7.

13. Zimmerman C. R., Snedker C. J., Pappagianis D. J. Clin. Microbiol. 1994; 32: 3040-2.

14. Valley Fever Center for Excellence. http://www.vfce.arizona.edu/ ValleyFeverPeopele/Default.aspx

Поступила 13.06.12