Перспективы применения генетически модифицированных лимфоцитов с химерным Т-клеточным рецептором (CAR-T-клеток) для терапии солидных опухолей

© Коллектив авторов, 2019

Киселевский М.В.1, Чикилева И.О.1, Ситдикова С.М.1, Власенко Р.Я.1, Караулов А.В.2

Перспективы применения генетически модифицированных лимфоцитов с химерным Т-клеточным рецептором (CAR-T-клеток) для терапии солидных опухолей

1 ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, 115478, г. Москва, Россия

2 ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский университет), 119991, г. Москва, Россия

В последние годы в клиническую практику онкологии внедряются новые методы адаптивной клеточной терапии с использованием генно-инженерных Т-клеток. Модификация химерными антигенными рецепторами (CAR) наделяет T-клетки специфической активностью и таким образом индуцирует иммунный ответ против злокачественных новообразований. Несмотря на значительные успехи применения этих стратегий при гемобластозах нацеливание CAR-T-клеток на солидные опухоли является более сложным процессом из-за особенностей гистопатологической структуры, дефицита специфических антигенов и иммуносупрессивной среды солидных новообразований. Кроме того, токсичность, вызванная относительной экспрессией мишени на нормальных тканях, является еще одной проблемой, которую следует учитывать. В настоящем обзоре анализируются факторы, ограничивающие применение терапии CAR-T-клетками при лечении солидных опухолей, и описаны некоторые новые подходы, которые рассматриваются как перспективные для преодоления этих препятствий.

Ключевые слова: CAR-T-клетки; иммунотерапия; солидные опухоли; обзор

Статья поступила 24.03.2019. Принята в печать 16.04.2019.

Для цитирования: Киселевский М.В., Чикилева И.О., Ситдикова С.М., Власенко Р.Я., Караулов А.В. Перспективы применения генетически модифицированных лимфоцитов с химерным Т-клеточным рецептором (CAR-T-клеток) для терапии солидных опухолей. Иммунология. 2019; 40 (4): 48-55. doi: 10.24411/0206-4952-2019-14006

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Для корреспонденции

Киселевский Михаил Валентинович -доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией клеточного иммунитета ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва, Россия E-mail: kisele@inbox.ru http://orcid.org/0000-0002-0132-167X

Kiselevsky M.V.1, Chikileva I.O.1, Sitdikova S.M.1, Vlasenko R.Ya.1, Karaulov A.V.2

Prospectives of application of the genetically modified lymphocytes with chimeric T-cell receptor (CAR-T-cells) for the therapy of solid tumors

1 N.N. Blokhin National Medical Research Centre of Oncology, 115478, Moscow, Russia

2 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), 119991, Moscow, Russia

In recent years new methods of adoptive cell therapy using genetically engineered T-cells have been introduced into clinical practice of oncology. Modification of chimeric antigenic receptors (CARs) confers T-cells with specific antitumor cytotoxicity and, thus, induces immune response against malignant neoplasms. Despite the significant success of these strategies in hemoblastoses, targeting CAR-T-cells to solid tumors is more difficult due to the characteristics of the histopathological structure, lack of specific antigens and the immunosuppressive environment of solid tumors. In addition, toxicity caused by the relative target expression in normal tissues is another problem that should be considered. This review is devoted to analysis of factors limiting the use of CAR-T-cell therapy in the treatment of solid tumors and description of some new approaches that are considered promising for overcoming these obstacles.

Keywords: CAR-T-cells; immunotherapy; solid tumors; review

Received 24.03.2019. Accepted 16.04.2019.

For citation: Kiselevsky M.V., Chikileva I.O., Sitdikova S.M., Vlasenko R.Ya., Karaulov A.V. Prospectives of application of the genetically modified lymphocytes with chimeric T-cell receptor

Acknowledgements. The study had no sponsor support.

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

For correspondence

Kiselevskiy Mikhail V. -MD, Professor, Head of the Laboratory of Cell Immunity, N.N. Blokhin National Medical Research Centre of Oncology, Ministry of public health of Russian Federation, Moscow, Russia E-mail: kisele@inbox.ru http://orcid.org/0000-0002-0132-167X

Современные достижения в области взаимодействия иммунной системы с опухолевыми клетками способствовали разработке инновационных терапевтических стратегий, основанных на генетически модифицированных Т-клетках, экспрессирующих химерный антигенный рецептор (CAR). CAR наделяют T-клетки антиген-специфическим распознаванием, активацией и пролиферацией независимо от главного комплекса гистосовместимости (MHC). В настоящее время эти технологии значительно эволюционировали, и уже созданы CAR-Т-клетки 3-го поколения, содержащие две костимулирующие молекулы, такие как CD28+-CD134 (OX40) или CD28+-CD137 (4-1BB), которые связаны с повышенной продукцией цитокинов и литической активностью по отношению к опухоли.

В настоящее время большинство клинических исследований проводят для лечения В-клеточных гемоблас-тозов, и только незначительное количество испытаний посвящено солидным новообразованиям. К сожалению, клинические результаты CAR-T-клеток при солидных опухолях оказались менее обнадеживающими, были отмечены многочисленные случаи токсичности при отсутствии значимого терапевтического ответа [1]. Хотя лечение солидных опухолей CAR-T-клетками не показало высокой эффективности, необходимо всестороннее рассмотрение многочисленных барьеров, препятствующих реализации CAR-Т-клетками своего противоопухолевого потенциала.

Опухолевые антигены - биомишень для CAR-Т-клеток

Первоочередной задачей при разработке терапии солидных опухолей CAR-Т-клетками является идентификация целевого опухолевого антигена, на который может быть нацелен CAR [2]. Чтобы избежать риска токсичности за счет иммунной реакции против нетранс-формированных тканей, в идеале терапия с использованием CAR-Т-клеток должна быть нацелена на антиген, спе-цифичный для опухоли. Это важно учитывать, поскольку ответ CAR-Т-клеток весьма специфичен и модифицированный рецептор может связываться с антигеном даже при низких уровнях его экспрессии в нормальных тканях. Поэтому тонкая настройка дизайна CAR для распознавания дифференциальной экспрессии антигенов на опухолевых клетках продолжает развиваться. Проводятся интенсивные исследования, направленные на расширение области применения CAR-терапии, так как опухоль-ассоциированные антигены (OAA) экспрес-сируются на различных видах опухолевых клеток [3]. Многие из идентифицированных OAA, например EGFR/ EGFRvIII, Kn-13Ro2, HER2, CD171, мезотелин (MSLN), GD2 и карциноэмбриональный антиген (СЕА) экспрес-сируются широким спектром солидных опухолей, и это дает возможность применять комбинированную терапию с использованием CAR, нацеленных на несколько антигенов одновременно. В табл. 1 перечислены OAA, которые служат мишенями для CAR-Т-клеток.

Основной проблемой применения CAR-Т-клеток является вариабельность экспрессии поверхностных антигенов клетками солидных опухолей. Так, в клиническом исследовании эффективности EGFRVIII-CAR-Т-клеточной терапии глиобластомы была установлена значительная вариация экспрессии EGFRvIII. Большинство образцов опухоли не экспрессировали или имели низкий уровень экспрессии EGFRvIII. Это исследование поставило вопрос о достаточности одного антигена EGFRvIII для реализации эффекта CAR-Т-клеток. C.E. Brown и соавт. сообщили, что лечение Hn-13Ra2-CAR-T-клетками опосредовало полный эффект у одного пациента, но через 228 дней был отмечен рецидив заболевания. Предварительные результаты показали, что причиной рецидива было снижение экспрессии Hn-13Ra2 [4]. Эти и многие другие исследования указывают на важность избыточной экспрессии целевого антигена на большинстве, если не на всех, опухолевых клетках для успешной CAR-Т-терапии. Поэтому в качестве критерия для рекрутирования пациентов для терапии CAR-Т-клетками должен использоваться предварительный скрининг на интенсивность и процентное соотношение экспрессии целевого антигена на опухолевых клетках с помощью методов иммуногистохимии и/или иммунофлюоресценции [5].

Способы получения CAR-Т-клеток

В зависимости от метода трансфекции/трансдукции Т-клетки могут постоянно или транзиторно экспресси-ровать CAR. Конструкции, полученные на основе ретро-или лентивирусных векторов, интегрируются в геном хозяина, что приводит к стабильной экспрессии химерного рецептора. Напротив, трансфекция матричной РНК позволяет получить временную экспрессию без постоянной модификации генома клетки-хозяина. Введение ДНК-конструкции (эписомы), которая не будет ни встраиваться в геном, ни реплицироваться с клеточными хромосомами может привести лишь к временной экспрессии целевого продукта, так как чужеродная конструкция не будет переходить в дочерние клетки.

В большинстве клинических испытаний использовали неселективную in vitro пролиферацию (амплификацию) Т-клеток из мононуклеарных клеток периферической крови (ПК). Для последующего получения путем генной инженерии CAR-Т-клеток исходные клетки наращивают in vitro с помощью различных культуральных систем. Различные системы культивирования позволяют обрести широкий спектр субпопуляций Т-клеток, состоящих из нативных, эффекторных и Т-клеток памяти в разных пропорциях. Поскольку эта композиция может быть существенна для размножения и длительности существования, некоторые авторы пытались обогатить популяцию лимфоцитов центральными Т-клетками памяти [6].

Пути введения и миграции CAR-Т-клеток

Еще одной задачей CAR-терапии солидных опухолей является обеспечение миграции инъецируемых модифицированных лимфоцитов в область локализации опухоли и проникновения их внутрь опухолевого узла.

Таблица 1. Виды CAR-T-клеток и способы переноса генов

Антиген/Экзодомен Тип новообразования Эндодомен Способ переноса гена

CD171 Рецидивирующая/рефрактерная нейробластома CD3Z Электропорация

EGFRvIII Глиома CD28+CD3Z, 4-1BB у-ретровирус

Epidermal growth factor receptor Рак желудка - у-ретровирус

Carbonic anhydrase IX Метастатический рак почки FcRy у-ретровирус

a-folate receptor Рак яичников FcRy у-ретровирус

HER2 Саркома CD28-CD3Z у-ретровирус

HER2 Глиобластома CD28-CD3Z piggyBac

HER2 Остеосаркома CD28-CD3Z SFG-ретровирус

aHER2/CD3 Рак желудка CD28-CD3Z у-ретровирус

СЕА Метастазы в печень CD28-CD3Z у-ретровирус

Rn-13Ra2 Глиобластома CD3Z Электропорация

Rn-13Ra2 Глиобластома 4-1BB, CD3Z Лентивирус

HER2 Метастатический рак толстой кишки 4-1BB, CD28, CD3Z у-ретровирус

GD2 Нейробластома CD3Z у-ретровирус

GD2 Нейробластома CD28, CD3Z, OX40 SFG-ретровирус

ErbB2+MUC1 Рак молочной железы CD28, CD3Z SFG-ретровирус

Vascular endothelial growth factor receptor Меланома - у-ретровирус

FAP Рак толстой кишки и рак яичников CD8a, CD3Z, 4-1BB у-ретровирус

HER2+CD19 Медуллобластома CD28+CD3Z SFG-ретровирус

(*) NKG2D Рак молочной железы CD28+CD3Z у-ретровирус

CD171 Рецидивирующая/рефрактерная нейробластома CD3Z Электропорация

EGFRvIII Глиома CD28+CD3Z, 4-1BB у-ретровирус

Epidermal growth factor receptor Рак желудка - у-ретровирус

Carbonic anhydrase IX Метастатический рак почки FcRy у-ретровирус

a-folate receptor Рак яичников FcRy у-ретровирус

HER2 Саркома CD28-CD3Z у-ретровирус

HER2 Глиобластома CD28-CD3Z Комбинированная

HER2 Остеосаркома CD28-CD3Z SFG-ретровирус

aHER2/CD3 Рак желудка CD28-CD3Z у-ретровирус

ИЛ-13Ra2 Глиобластома CD3Z Электропорация

ИЛ-13Ra2 Глиобластома 4-1BB, CD3Z Лентивирус

HER2 Метастатический рак толстой кишки 4-1BB, CD28, CD3Z у-ретровирус

GD2 Нейробластома CD3Z у-ретровирус

GD2 Нейробластома CD28, CD3Z, OX40 SFG-ретровирус

ErbB2+MUC1 Рак молочной железы CD28, CD3Z SFG-ретровирус

Vascular endothelial growth factor receptor Меланома - у-ретровирус

FAP Рак толстой кишки и рак яичников CD8a, CD3Z, 4-1BB у-ретровирус

HER2+CD19 Медуллобластома CD28+CD3Z SFG-ретровирус

Mesothelin (MSLN) Мезотелиома плевры CD3Z и 4-1BB Лентивирус

MSLN Рак поджелудочной железы CD3Z и 4-1BB у-ретровирус

MSLN Мезотелиома плевры CD3Z и 4-1BB у-ретровирус

Наиболее очевидным представляется решение вводить CAR-T-клетки не внутривенно, а локально - в опухоль или в область, из которой опухоль была удалена хирургически. Действительно, в некоторых работах были продемонстрированы преимущества такого подхода [7]. Однако в другом исследовании было показано, что инъекции CAR-T-клеток в полость после удаления глиобластомы не предотвращают образования отдаленных метастазов в спинном мозге, в то время как переход к инъекциям в желудочек, откуда клетки попадают в спинномозговую жидкость, приводит к полному исчезновению уже возникших метастазов [4].

Обеспечить миграцию к опухоли адаптивно перенесенных CAR-T-клеток можно с помощью экспрессии в них рецепторов к хемокинам, выделяемым опухолями. Зачастую такие хемокины существуют, однако Т-клетки хозяина лишены рецепторов к ним. Некоторые опухоли синтезируют хемокин CCL-2, обычно свойственный местам воспаления или травмы. Рецепторы CCR2 для CCL-2 есть у моноцитов, дендритных клеток, Т-клеток памяти, но не у Т-киллеров. В двух исследованиях авторы экспрессировали CCR2b - субъединицу рецептора в CAR-T клетках. В одной из них эффективность хоу-минга клеток по направлению к нейробластоме увеличилась на порядок [8]. В другом исследовании аналогичного эффекта удалось добиться в экспериментах со злокачественной плевральной мезотелиомой мышей [9]. В обоих случаях рост эффективности хоуминга сопровождался ростом противоопухолевой активности CAR-T-клеток. Аналогичных результатов удалось добиться, экспрессируя в CAR-T-клетках CXCR2-рецептор, распознающий опухолевый хемокин CXCL1 [10].

Облегчить Т-клеткам инфильтрацию внутрь опухоли может экспрессия гепараназы - фермента, расщепляющего гепарансульфат. Гепарансульфат - протеогликан, из которого в том числе состоит межклеточный матрикс (ECM), образующий опухолевую строму. Оказалось, что CAR-T-лимфоциты, вооруженные геном гепараназы, способны разрушать опухолевую строму и лучше проникают внутрь клетки. Противоопухолевая активность CAR-T-клеток вследствие такой модификации также возросла [11].

Результаты клинических испытаний CAR-T-терапии солидных опухолей

В настоящее время проводится ряд исследований для определения эффективности терапии CAR-Т-клетками солидных опухолей, таких как рак молочной железы, саркома, нейробластомы и т. д. Ряд исследователей используют химерные конструкции, нацеленные на поверхностные белки, включая СЕА, - для колоректальной аденокарциномы [12], белок активации фибробластов (FAP) - для злокачественной мезотелиомы плевры [13], диганглиозид GD2 - для нейробластомы и остеосаркомы

[14], рецептор человеческого эпидермального фактора роста 2 (HER2) - для HER2-положительных опухолей

[15], мезотелин - для рака поджелудочной железы [16], рецептор интерлейкина-13 (KH-13Ra) - для глиомы [17], аберрантный интегрин avß6 - для опухолей поджелудочной железы [18] и т. д. Тем не менее результаты испытаний только с натяжкой можно признать удовлет-

ворительными. Так, в исследованиях с применением ОБ2-специфичных САЯ-Т-клеток у больных нейроблас-томой отмечен только незначительный противоопухолевый эффект [19]. Применение анти-НЕЯ2-САЯ-Т-клеток при НЕЯ2-положительной саркоме позволило установить, что только у 4 из 17 пациентов выявлена стабилизация заболевания в течение 12-14 мес. Из них у 3 пациентов после иммунотерапии была удалена опухоль, в одной из которых обнаружен 90% патоморфоз. Из 11 пациентов с немелкоклеточным раком легкого, получавших САЯ-Т-клетки, нацеленные на эпидермальный фактор роста (БвРЯ), в 2 случаях наблюдался частичный ответ и у 5 больных - стабилизация заболевания [12]. Анти-СЕА-САЯ-Т-клетки исследовали у 6 больных с СЕА+-метастазами в печени. Трое больных получили анти-СЕА-САЯ-Т-клетки в режиме эскалации дозы от 108 до 1010 клеток, других пациентов лечили максимальной запланированной дозой САЯ-Т (1010 клеток трижды) вместе с системным введением ИЛ-2. Только у 1 пациента была отмечена стабилизация, остальные 5 больных умерли от прогрессирования заболевания [21].

Хемокины, секретируемые солидными опухолями, физические барьеры, создаваемые окружающей стромой и иммунными клетками, и девиантное кровоснабжение опухоли препятствуют проникновению САЯ-Т-клеток в опухоль. Солидные опухоли выделяют целый ряд хе-мокинов, таких как СХСЬ5 и СХСЯ2, которые образуют сигнальный путь, предотвращающий миграцию Т-клеток в опухоль [22]. Иммуносупрессивная микросреда опухоли рекрутирует супрессорные миелоидные клетки и фибробласты, которые составляют фиброзный внеклеточный матрикс, окружающий опухоль, и ингиби-руют проникновение Т-клеток в опухоль [23]. Более того, неблагоприятная паратуморальная среда, состоящая из разнообразных молекулярных и клеточных элементов, вызывает дисфункцию Т-клеток. Например, окислительный стресс, кислая рН и гипоксия снижают эффективность САЯ-Т-клеток. Секреция иммуносупрессивных цитокинов ТвР-Р и ИЛ-10, клетки-супрессоры - МБ8С, регуляторные Т-клетки (Т1^б) и макрофаги (ТАМ) или нейтрофилы - и лиганды ингибиторов контрольных точек, включая РБ-Ь1, ингибируют противоопухолевую функцию САЯ-Т-клеток. Из-за потенциальной иммуно-генности и токсичности сами САЯ-Т-клетки могут влиять на окружающую иммунную систему.

Необходимо предусмотреть неизбежные побочные эффекты при САЯ-Т-терапии солидных опухолей. Помимо опухоли, САЯ-Т-клетки атакуют нормальные ткани, включая сердце, легкие, мозг и печень, из-за целевых антигенов, которые могут быть экспрессированы в этих органах. Как упоминалось выше, терапия САЯ-Т-клетками является многообещающей, но требующей решения многих проблем.

Проблемы и возможные решения повышения эффективности для CAR-T-терапии солидных опухолей

Клеточная терапия солидных опухолей в настоящее время сталкивается с многочисленными проблемами.

Во-первых, физические барьеры препятствуют проникновению CAR-Т-клеток в опухоли. Во-вторых, CAR-T-клетки подвергаются воздействию иммуносупрессивного микроокружения опухоли. Не менее важно учитывать специфичность и безопасность CAR-T-клеток.

Проникновение через физические барьеры

Физический барьер является первым препятствием, с которым сталкиваются CAR-T-клетки, предотвращающим эффективную инфильтрацию опухолевого узла. Опухолевые фибробласты и миелоидные клетки формируют фиброзный внеклеточный матрикс (ECM), который мешает проникновению Т-клеток. L.C. Wang и соавт. на экспериментальных животных продемонстрировали усиление функции CAR-Т-клеток за счет уменьшения числа фибробластов опухоли при сочетании с FAP-CAR-Т-клетками, нацеленными на белок FAP в опухолевой строме [24]. Фермент гепараназа (HPSE) может дезинтегрировать протеогликаны гепарансульфата, которые в основном составляют ECM. Однако T-клетки, культивируемые in vitro, не экспрессируют HPSE. Поэтому были разработаны HPSE+CAR-T-клетки, чтобы преодолеть физические барьеры, улучшить инфильтрацию опухоли CAR-Т-клетками и их противоопухолевую активность [11]. В отличие от гематологических новообразований, солидные опухоли могут выделять некоторые хемокины, предотвращающие миграцию Т-клеток в опухоль, такие, как CXCL12 и CXCL5 [25]. Из-за рассогласования экспрессии хемокиновых рецепторов на CAR-Т-клетках и хемокинов опухоли, Т-лимфоциты не могут мигрировать в опухоль и, таким образом, не способны оказывать цитотоксический эффект на опухолевые клетки [26]. Учитывая это, целесообразно генетически модулировать Т-клетки для экспрессии рецепторов к опухолевым хемокинам, что позволит Т-клеткам успешно мигрировать к опухолевому очагу. Использование CAR-Т-клеток, ориентированных на сосуды, может улучшить скорость их доставки в опухолевый сайт. Этот метод был продемонстрирован при лимфоме Ходжкина с использованием CCR4-несущих CAR-Т-клеток [27], а также на ксено-трансплантатах мезотелиомы и нейробластомы с использованием CCR2b-CAR-T-клеток [9].

Иммуносупрессивное микроокружение опухоли

Микроокружение опухоли (МО) в основном состоит из различных супрессорных иммунных клеток и молекулярных факторов, способных ингибировать активность CAR-Т-клеток. Внутри МО противоопухолевая активность T-лимфоцитов может подавляться супрес-сорными факторами, такими как Tregs, MDSC, и TAM, цитокинами и растворимыми факторами, связанными с иммуносупрессией (TGF-ß и ИЛ-10), а также лиган-дами ингибиторов контрольных точек - PD-L1. Следовательно, подавление иммунодепрессивного влияния МО может восстановить противоопухолевый эффект CAR-T-клеток и повысить эффективность CAR-Т-клеток.

Лиганды ингибиторов контрольных точек опухолей, например PD-L1, связываясь с его ингибирующим ре-

цептором PD-1 на CAR-Т-клетках, могут нейтрализовать негативное влияние PD-L1. Поэтому предпринимаются попытки создать CAR-Т-клетки четвертого поколения, способные секретировать антитела к PD-L1 вместо введения анти-PD-L1-антител одновременно с CAR-Т-терапией [28]. Помимо значительного уменьшения роста опухоли на модели гуманизированных мышей с карциномой почек, секреция CAR-T-клетками анти-PD-L1-антител также позволила NK-клеткам мигрировать в опухолевый сайт in vivo. NK-клетки проявляли противоопухолевую активность посредством антителозависимой цитоток-сичности, а также обеспечивали стимуляцию CD8+^-клеток посредством продукции ИФН-у. Таким образом, описанная локальная секреция антител повышала эффективность CAR-Т-терапии солидной опухоли, усиливая инфильтрацию опухоли не-Т-клеточными эффекторами противоопухолевого иммунитета.

Ряд исследований показал, что блокада ингибиру-ющего рецептора PD-1 так же эффективно улучшает CAR-T-терапию, как и блокирование PD-L1. Например, HER^-CAR-T-R^ran в сочетании с антителами против PD-1 приводили к значительной регрессии опухолей у мышей [29]. При этом количество MDSC в МО значительно уменьшилось. E.K. Moon и соавт. [30], изучавшие человеческие CAR-Т-клетки с блокадой PD-1 на модели иммунодефицитных животных, показали, что блокада PD-1 с использованием антител улучшает противоопухолевую активность CAR-T-клеток, нацеленных на ме-зотелин. Таким образом, блокада PD-1 может повысить эффективность CAR-Т-терапии солидных опухолей.

TGF-ß является одним из значимых ингибирующих опухолевых цитокинов. TGF-ß ослабляет противоопухолевые ответы посредством отрицательной регуляции функции цитотоксических клеток и стимулирования созревания Tregs, т. е. нейтрализация TGF-ß может усилить противоопухолевый потенциал CD8+-T-клеток. Для достижения этого эффекта использовали несколько подходов. Блокада рецепторов TGF-ß значительно увеличила эффективность адаптивного переноса лимфоцитов у животных с солидными опухолями [31]. Для трансформации микроокружения опухоли в доклинических исследованиях были изучены «бронированные» CAR-T-клетки, способные секретировать провоспалительные цитокины, чтобы улучшить функционирование CAR-T-клеток в микроокружении опухоли. M. Koneru и соавт. [32] продемонстрировали эффективность этого подхода у мышей с ксенотрансплан-татами рака яичников человека. Установлено, что CAR-Т-клетки, секретирующие ИЛ-12, проявляют более высокую противоопухолевую эффективность и более длительное время сохраняют свою активность.

Специфичность и безопасность CAR-T-клеток

Подавляющее большинство CAR-T-клеток распознают опухолевые клетки неопухолеспецифическим образом, другими словами, мишенями для CAR являются ОАА, которые гиперэкспрессируются на опухолевых клетках по сравнению с нормальными клетками. Поэтому распознавание мишеней CAR-T-клетками на здо-

ровых тканях может привести к тяжелой и даже опасной для жизни токсичности, особенно при солидных опухолях. Необходимы стратегии для повышения специфичности и, соответственно, безопасности CAR-T-терапии, а также разработка эффективных методов для снижения нецелевой токсичности.

До сих пор единственным истинно опухолеспе-цифическим антигеном CAR был вариант EGFR III (EGFRvIII) [33]. EGFRvIII-CAR-T-клетки могут точно нацеливаться на опухолевые клетки, повышая эффективность и одновременно снижая токсичность CAR-терапии. EGFRvIII-CAR-T-клетки продемонстрировали свою перспективность при лечении глиобластомы у экспериментальных животных [34] и в клинических испытаниях у пациентов с этой патологией.

Разнообразные стратегии используют для повышения специфичности и безопасности терапии Т-клеток. Одна из них основана на CAR-Т-клетках, модифицированных двумя различными CAR, что улучшает способность CAR-T-клеток дифференцировать опухолевые и нормальные клетки. Для этих целей создаются генетически модифицированные лимфоциты с двумя CAR-рецепторами: один CAR содержит сигнальный домен CD3Z, активирующий функцию Т-клеток, тогда как второй CAR обеспечивает функцию костимуляции за счет CD28 и/или CD137 [35]. Полная активация и функциональность CAR-Т-клеток достигаются только в контексте наличия обоих антигенов на клетках-мишенях. Недавно было доказано, что с помощью изменения аффинности CAR CAR-T-клетки могут отличать опухоль от нормальных клеток, экспрессирующих тот же целевой антиген, но в меньшем количестве. Противоопухолевая эффективность in vivo при этом сохранялась [36]. Таким образом, понижение чувствительности CAR модификацией срод-

ства scFv с антигеном предлагает стратегию для более широкого использования CAR-T-клеток в терапии солидных опухолей с гиперэкспрессией ОАА.

Альтернативой уменьшению нежелательных эффектов являются ингибирующие CAR (iCAR). iCAR, специфичные для антигена, экспрессируемого только на нормальных клетках, будут защищать их от CAR-T-клеточной атаки вследствие ингибирующих сигналов iCAR. В. Д. Федоров и соавт. [37] показали в моделях на мышах, что iCAR, реализуют ингибиторные эффекты на Т-клетки посредством PD-1 и CTLA-4, защищая нормальную ткань от действия CAR-Т-клеток. Однако iCAR не полностью отменяет функцию Т-клеток, поэтому необходимы дальнейшие модификации CAR-T-терапии, которые могут способствовать снижению нежелательной токсичности.

Следовательно, основными побочными эффектами терапии CAR-Т-клетками являются синдром гиперпродукции цитокинов - «цитокиновый шторм» (лихорадка, озноб, гипотония, медиаторный шок), тумор-лизис-синдром (метаболические нарушения, почечная недостаточность); поражение клеток нормальных тканей, несущих целевые - опухоль-ассоциированные антигены (органная, полиорганная недостаточность) (см. рисунок).

Сочетание CAR-T-клеток и других терапевтических средств

Описаны попытки объединить технологию адоптивного переноса CAR-T-клеток с другими генно-инженерными противоопухолевыми подходами. Один из таких подходов - онколитические вирусы. Последние благодаря своим природным свойствам и качествам, которые они приобретают за счет генетической модификации,

Механизм побочного действия CAR-T-клеток

заражают преимущественно опухолевые клетки, вызывая их селективную гибель, подавляют опухолевый ан-гиогенез или делают опухоли чувствительными к радиотерапии. Обычно для достижения противоопухолевого эффекта требуются очень высокие дозы онколитических вирусов. H. van Seggelen и соавт. [38] не стали вводить онколитические вирусы, экспрессирующие ИЛ-15 напрямую, а заразили ими CAR-T-клетки перед адаптивным переносом. При этом им удалось значительно снизить необходимую дозу вирусов и повысить терапевтический эффект по сравнению с использованием методик по отдельности. Аналогичных результатов удалось добиться с помощью вируса, экспрессирующего одновременно ИЛ-15 и хемокин CCL5 [39].

Чтобы CAR-T-клетки не проявляли цитотоксической активности по отношению к нетрансформированным клеткам, несущим тот же антиген, против которого создан CAR-рецептор, была предпринята попытка ввести в состав химерного рецептора субъединицу HIFla-фактора, индуцируемого гипоксией. Этот белок стабилен только при гипоксии - состоянии, характерном для солидных опухолей. Модифицированные таким образом CAR-T-клетки способны экспрессировать химерный рецептор только в непосредственной близости от опухоли [40].

Большинство scFvs, изучаемых до настоящего времени, имеют мышиное происхождение и, следовательно, могут индуцировать продукцию антител (human antimouse antibody - HAMA) или иммунный идиоти-пический ответ. Ряд исследователей изучали стратегии гуманизации scFV [41], чтобы исключить индукцию HAMA, однако этот подход не будет препятствовать образованию идиотипических антител.

Сочетание CAR-Т-клеток с другими видами терапии является перспективным направлением, усиливающим их противоопухолевую эффективность. Например, ин-гибирующие рецепторы МО, такие как CTLA-4 и PD-1, ограничивают эффективность любой стратегии, направленной на стимулирование иммунного ответа [42]. Системное введение антагонистов (блокирующих антител) этих ингибирующих рецепторов приводит к усилению противоопухолевого эффекта [43], поэтому комбинация блокирующих антител и CAR-Т-клеток может повысить эффективность последних.

Концепция CAR-T-клеток в сочетании с другими препаратами открывает новые терапевтические подходы. В настоящее время большинство лекарственных препаратов назначают без адаптивной клеточной иммунотерапии (АКИ). Однако существует множество возможностей сочетать современные методы лечения с АКИ, при этом важно выбрать рациональный препарат, основанный на

Литература/References_

1. Maus M.V., Haas A.R., Beatty G.L., et al. T cells expressing chimeric antigen receptors can cause anaphylaxis in humans. Cancer Immunol. Res. 2013; 1: 26-31. doi: 10.1158/2326-6066.CIR-13-0006.

2. Hinrichs C.S., Restifo N.P. Reassessing target antigens for adoptive T-cell therapy. Nat. Biotechnol. 2013; 31 (11): 999-1008. doi: 10.1038/ nbt.2725.

3. Yu S., Li A., Liu Q., et al. Chimeric antigen receptor T cells: a novel therapy for solid tumors. J. Hematol. Oncol. 2017; 10 (1): 78. doi: 10.1186/ s13045-017-0444-9.

понимании его взаимодействия с иммунной системой. Например, леналидомид проявлял значительные противоопухолевые эффекты у пациентов с множественной миело-мой [44], а при комбинации с CAR-Т-клетками увеличивал их проникновение в опухоль, усиливал продукцию ИФН-у и цитотоксичность, что приводило к полной регрессии опухоли у мышей [45]. Трансретиноевая кислота (ATRA) может вызывать дифференцировку незрелых миелоид-ных бластов - одного из ключевых иммуносупрессивных игроков в МО. Доклинические исследования ATRA показали, что дифференцировка иммуносупрессивных незрелых миелоидных клеток может восстановить функцию противоопухолевых лимфоцитов [46]. При использовании ATRA в комбинации с CAR-Т-клетками, нацеленными на антиген GD2-ксенотрансплантатов остеосаркомы, значительно снижались частота и функция инфильтрирующих опухоль MDSC, что приводило к улучшению общей выживаемости мышей с привитой остеосаркомой по сравнению с животными, получавшими GD2-CAR-Т-клетки в монорежиме [47]. Таким образом, эта комбинированная терапия может иметь большие перспективы у пациентов с солидными опухолями.

Заключение

К сожалению, результаты большого количества клинических исследований не оправдали ожиданий. CAR-Т-клеточная терапия для солидных опухолей оказалась менее эффективной, чем для гематологических новообразований. В связи с этим необходимо учитывать различия между злокачественными гематологическими и солидными новообразованиями. Во-первых, онкоге-матологические заболевания обычно диссеминированы, тогда как солидная опухоль на ранней стадии - плотная масса, расположенная в одном органе. Во-вторых, целевые антигены гематологических злокачественных новообразований, как правило, однотипны. Напротив, антигены, экспрессируемые на солидных опухолях, в основном гетерогенны и отличаются не только у опухолей различного гистологического варианта, но и у метастазов и у первичного опухолевого узла. Кроме того, в отличие от гематологических новообразований, солидные опухоли имеют иммунодепрессивное микроокружение, препятствующее миграции привносимых клеток. Помимо упомянутых выше различий, необходимо учитывать многие дополнительные факторы, приводящие к незначительным клиническим результатам. Оптимизация дизайна CAR, исследование новых биомишений и безопасных комбинаций с другими методами лечения повысят эффективность иммунотерапии на основе клеток CAR-T-клеток против солидных опухолей.

4. Brown C.E., Alizadeh D., Starr R., et al. Regression of glioblastoma after chimeric antigen receptor T-cell therapy. N. Engl. J. Med. 2016; 375 (26): 2561-9. doi: 10.1056/NEJMoa1610497.

5. Wilkie S., van Schalkwyk M.C., Hobbs S., et al. Dual targeting of ErbB2 and MUC1 in breast cancer using chimeric antigen receptors engineered to provide complementary signaling. J. Clin. Immunol. 2012; 32 (5): 1059-70. doi: 10.1007/s10875-012-9689-9.

6. Sommermeyer D., Hudecek M., Kosasih P.L., et al. Riddell SR. Chimeric antigen receptor-modified T cells derived from defined CD8+ and CD4+ subsets confer superior antitumor reactivity in vivo. Leukemia. 2016; 30: 492-500. doi: 10.1038/leu.2015.247.

7. Adusumilli P.S., Cherkassky L., Villena-Vargas J., et al. Regional delivery of mesothelin-targeted CAR T cell therapy generates potent and long-lasting CD4-dependent tumor immunity. Sci. Transl. Med. 2014; 6 (261): 261ra151.

8. Craddock J.A., Lu A., Bear A., et al. Enhanced tumor trafficking of GD2 chimeric antigen receptor T cells by expression of the chemokine receptor CCR2b. J. Immunother. 2010; 33 (8): 780-8.

9. Moon E.K., Carpenito C., Sun J., et al. Expression of a functional CCR2 receptor enhances tumor localization and tumor eradication by retargeted human T cells expressing a mesothelin-specific chimeric antibody receptor. Clin. Cancer Res. 2011; 17: 4719-30. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-11-0351.

10. Peng W., Ye Y., Rabinovich B.A., et al. Transduction of tumor-specific T cells with CXCR2 chemokine receptor improves migration to tumor and antitumor immune responses. Clin. Cancer Res. 2010; 16 (22): 5458-68.

11. Caruana I., Savoldo B., Hoyos V., et al. Heparanase promotes tumor infiltration and antitumor activity of CAR-redirected T lymphocytes. Nat. Med. 2015; 21: 524-9. doi: 10.1038/nm.3833.

12. Zhang C., Wang Z., Yang Z., et al. Phase I escalating-dose trial of CAR-T therapy targeting CEA+ metastatic colorectal cancers. Mol. Ther. 2017; 25 (5): 1248-58. doi: 10.1016/j.ymthe.2017.03.010.

13. Schuberth P.C., Hagedorn C., Jensen S.M., et al. Treatment of malignant pleural mesothelioma by fibroblast activation protein-specific redirected T cells. J. Transl. Med. 2013; 11: 187. doi: 10.1186/1479-5876-11-187.

14. Stroncek D.F., Ren J., Lee D.W., et al. Myeloid cells in peripheral blood mononuclear cell concentrates inhibit the expansion of chimeric antigen receptor T cells. Cytotherapy. 2016; 18: 893-901. doi: 10.1016/j. jcyt.2016.04.003.

15. Ahmed N., Brawley V.S., Hegde M., et al. Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2)-specific chimeric antigen receptor-modified T cells for the immunotherapy of HER2-positive sarcoma. J. Clin. Oncol. 2015; 33: 1688-96. doi: 10.1200/JC0.2014.58.0225.

16. Hassan R., Thomas A., Alewine C., et al. Mesothelin immunotherapy for cancer: ready for prime time? J. Clin. Oncol. 2016; 34: 4171-9. doi: 10.1200/JC0.2016.68.3672.

17. Krenciute G., Krebs S., Torres D., et al. Characterization and functional analysis of scFv-based chimeric antigen receptors to redirect T cells to IL13Ralpha2-positive glioma. Mol. Ther. 2016; 24: 354-63. doi: 10.1038/mt.2015.199.

18. Whilding L.M., Parente-Pereira A.C., Zabinski T., et al. Targeting of aberrant alphavbeta6 integrin expression in solid tumors using chimeric antigen receptor-engineered T cells. Mol. Ther. 2017; 25: 259-73. doi: 10.1016/j.ymthe.2016.10.012.

19. Pule M.A., Savoldo B., Myers G.D., et al. Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma. Nat. Med. 2008; 14: 1264-70. doi: 10.1038/nm.1882.

20. Feng K., Guo Y., Dai H., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for the immunotherapy of patients with EGFR-expressing advanced relapsed/refractory non-small cell lung cancer. Sci. China Life Sci. 2016; 59: 468-79. doi: 10.1007/s11427-016-5023-8.

21. Katz S.C., Burga R.A., McCormack E., et al. Phase I Hepatic immunotherapy for metastases study of intra-arterial chimeric antigen receptor-modified T-cell therapy for CEA+ liver metastases. Clin. Cancer Res. 2015; 21: 3149-59. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-14-1421.

22. Wang G., Lu X., Dey P., et al. Targeting YAP-dependent MDSC infiltration impairs tumor progression. Cancer Discov. 2016; 6: 80-95. doi: 10.1158/2159-8290.CD-15-0224.

23. Slaney C.Y., Kershaw M.H., Darcy P.K. Trafficking of T cells into tumors. Cancer Res. 2014; 74: 7168-74. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-14-2458.

24. Wang L.C., Lo A., Scholler J., et al. Targeting fibroblast activation protein in tumor stroma with chimeric antigen receptor T cells can inhibit tumor growth and augment host immunity without severe toxicity. Cancer Immunol. Res. 2014; 2: 154-66. doi: 10.1158/2326-6066.CIR-13-0027.

25. Feig C., Jones J.O., Kraman M., et al. Targeting CXCL12 from FAP-expressing carcinoma-associated fibroblasts synergizes with anti-PD-L1 immunotherapy in pancreatic cancer. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2013; 110: 20 212-7. doi: 10.1073/pnas.1320318110.

26. Harlin H., Meng Y., Peterson A.C., et al. Chemokine expression in melanoma metastases associated with CD8+ T-cell recruitment. Cancer Res. 2009; 69: 3077-85. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-08-2281.

27. Di Stasi A., De Angelis B., Rooney C.M., et al. T lymphocytes coexpressing CCR4 and a chimeric antigen receptor targeting CD30 have improved homing and antitumor activity in a Hodgkin tumor model. Blood. 2009; 113: 6392-402. doi: 10.1182/blood-2009-03-209650.

28. Suarez E.R., Chang de K., Sun J., et al. Chimeric antigen receptor T cells secreting anti-PD-L1 antibodies more effectively regress renal cell carcinoma in a humanized mouse model. Oncotarget. 2016; 7: 34341-55. doi: 10.18632/oncotarget.9114.

29. John L.B., Devaud C., Duong C.P., et al. Anti-PD-1 antibody therapy potently enhances the eradication of established tumors by gene-modified T cells. Clin. Cancer Res. 2013; 19: 5636-46. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-13-0458.

30. Moon E.K., Wang L.C., Dolfi D.V., et al. Multifactorial T-cell hypofunction that is reversible can limit the efficacy of chimeric antigen receptor-transduced human T cells in solid tumors. Clin. Cancer Res. 2014; 20: 4262-73. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-13-2627.

31. Wallace A., Kapoor V., Sun J., et al. Transforming growth factor-beta receptor blockade augments the effectiveness of adoptive T-cell therapy of established solid cancers. Clin. Cancer Res. 2008; 14: 3966-74. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-08-0356.

32. Koneru M., Purdon T.J., Spriggs D., et al. IL-12 secreting tumor-targeted chimeric antigen receptor T cells eradicate ovarian tumors in vivo. Oncoimmunology. 2015; 4: e994446. doi: 10.4161/2162402X.2014.994446.

33. Choi B.D., Archer G.E., Mitchell D.A., et al. EGFRvIII-targeted vaccination therapy of malignant glioma. Brain Pathol. 2009; 19: 713-23. doi: 10.1111/j.1750-3639.2009.00318.x.

34. Johnson L.A., Scholler J., Ohkuri T., et al. Rational development and characterization of humanized anti-EGFR variant III chimeric antigen receptor T cells for glioblastoma. Sci. Transl. Med. 2015; 7: 275ra22. doi: 10.1126/scitranslmed.aaa4963.

35. Kloss C.C., Condomines M., Cartellieri M., et al. Combinatorial antigen recognition with balanced signaling promotes selective tumor eradication by engineered T cells. Nat. Biotechnol. 2013; 31: 71-5. doi: 10.1038/nbt.2459.

36. Caruso H.G., Hurton L.V., Najjar A., et al. Tuning sensitivity of CAR to EGFR density limits recognition of normal tissue while maintaining potent antitumor activity. Cancer Res. 2015; 75: 3505-18. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-15-0139.

37. Fedorov V.D., Themeli M., Sadelain M. PD-1- and CTLA-4-based inhibitory chimeric antigen receptors (iCARs) divert off-target immunotherapy responses. Sci. Transl. Med. 2013; 5: 215ra172. doi: 10.1126/scitranslmed.3006597.

38. Van Seggelen H., Tantalo D.G., Afsahi A., et al. Chimeric antigen receptor-engineered T cells as oncolytic virus carriers. Mol. Ther. Oncolytics. 2015; 2: 15014.

39. Nishio N., Dotti G. Oncolytic virus expressing RANTES and IL-15 enhances function of CAR-modified T cells in solid tumors. Oncoimmunology. 2015; 4 (2): e988098.

40. Juillerat A., Marechal A., Filhol J.M., et al. An oxygen sensitive self-decision making engineered CAR T-cell. Sci. Rep. 2017; 7: 39833.

41. Sommermeyer D., Hill T., Shamah S.M., et al. Fully human CD19-specific chimeric antigen receptors for T-cell therapy. Leukemia. 2017; 31 (10): 2191-9. doi: 10.1038/leu.2017.57.

42. Peggs K.S., Quezada S.A., Allison J.P. Cancer immunotherapy: co-stimulatory agonists and co-inhibitory antagonists. Clin. Exp. Immunol. 2009; 157: 9-19. doi: 10.1111/j.1365-2249.2009.03912.x.

43. Topalian S.L., Hodi F.S., Brahmer J.R., et al. Safety, activity, and immune correlates of anti-PD-1 antibody in cancer. N. Engl. J. Med. 2012; 366: 2443-54. doi: 10.1056/NEJMoa1200690.

44. Chanan-Khan A.A., Cheson B.D. Lenalidomide for the treatment of B-cell malignancies. J. Clin. Oncol. 2008; 26: 1544-52. doi: 10.1200/ JCO.2007.14.5367.

45. Kuramitsu S., Ohno M., Ohka F., et al. Lenalidomide enhances the function of chimeric antigen receptor T cells against the epidermal growth factor receptor variant III by enhancing immune synapses. Cancer Gene Ther. 2015; 22: 487-95. doi: 10.1038/cgt.2015.47.

46. Kusmartsev S., Cheng F., Yu B., et al. All-trans-retinoic acid eliminates immature myeloid cells from tumor-bearing mice and improves the effect of vaccination. Cancer Res. 2003; 63: 4441-9.

47. Long A.H., Highfill S.L., Cui Y., et al. Reduction of MDSCs with all-trans retinoic acid improves CAR therapy efficacy for sarcomas. Cancer Immunol. Res. 2016; 4: 869-80. doi: 10.1158/2326-6066.CIR-15-0230.