ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СВОБОДНОЖИВУЩЕЙ ПОЧВЕННОЙ НЕМАТОДЫ CAENORHABDITIS ELEGANS ДЛЯ ОЦЕНКИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЭКСТРАКТОВ РАСТЕНИЙ

ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СВОБОДНОЖИВУЩЕЙ ПОЧВЕННОЙ НЕМАТОДЫ

Caenorhabditis elegans ДЛЯ ОЦЕНКИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЭКСТРАКТОВ

РАСТЕНИЙ

Егорова А.В.

младший научный сотрудник лаборатории экспериментальной экологии Института проблем экологии и недропользования Академии наук РТ, г. Казань, Российская Федерация

Нигматуллина А.Ф.

магистрант кафедры прикладной экологии Института экологии и природопользования Казанского

федерального университета, г. Казань, Российская Федерация

Калинникова Т.Б.

кандидат биологических наук, зав. лабораторией экспериментальной экологии Института проблем экологии и недропользования Академии наук РТ, г. Казань, Российская Федерация

THE PERSPECTIVES OF APPLICATION OF FREE-LIVING SOIL NEMATODE Caenorhabditis elegans TO EVALUATE BIOLOGICAL ACTIVITY OF PLANT EXTRACTS

Egorova A.

junior researcher of the Laboratory of Experimental Ecology of Research Institute for Problems of Ecology

and Mineral Wealth Use of Tatarstan Academy of Sciences, Kazan, Russia

Nigmatullina A.

postgraduate of the Department of Applied Ecology of the Institute of Environmental Sciences of Kazan

Federal University, Kazan, Russia

Kalinnikova T.

PhD in Biology, head of the Laboratory of Experimental Ecology of Research Institute for Problems of Ecology and Mineral Wealth Use of Tatarstan Academy of Sciences, Kazan, Russia

Аннотация

В статье приведены результаты экспериментального исследования токсического действия водных экстрактов трех видов растений (Tanacetum vulgare, Artemisia absintium и Inula helenium) на локомоцию почвенной нематоды Caenorhabditis elegans. Экстракты в разведениях 1:1, 1:3 и 1:7 вызывали паралич 1076% нематод через два часа инкубации. Увеличение времени экспозиции к экстрактам до шести часов приводило к параличу 40-99% нематод. Почвенная нематода Caenorhabditis elegans может использоваться как для изучения биологической активности экстрактов растений, так и механизмов их действия на организм.

Abstract

The article describes results of experimental research of toxic action of water extracts of three plant species, namely Tanacetum vulgare, Artemisia absintium and Inula helenium on locomotion of free-living soil nematode Caenorhabditis elegans. Extracts in dilutions 1:1, 1:3 and 1:7 caused paralysis of 10-76% of nematodes after 2-hours incubation. The increase of exposer time up to six hours lead to paralysis of 40-99% of nematodes. Soil nematode Caenorhabditis elegans may be used to study both biological activity of plant extracts and mechanisms of their action on organism.

Ключевые слова: Caenorhabditis elegans, экстракты растений, биологическая активность, Tanacetum vulgare, Artemisia absintium, Inula helenium

Keywords: Caenorhabditis elegans, plant extracts, biological activity, Tanacetum vulgare, Artemisia absintium, Inula helenium

Введение

Нематоды, или круглые черви представляют собой большую группу животных, насчитывающую более 24 тысяч видов. Среди этих видов встречаются как свободноживущие, так и паразитические формы. Паразитические нематоды вызывают заболевания растений, а также нематодозы у животных и человека. Для лечения заболеваний человека и животных, вызванных нематодами, в настоящее время используются синтетические антигель-минтные препараты [7]. Несмотря на высокую эффективность, широкий спектр действия и простоту применения, эти препараты обладают целым рядом недостатков. К этим недостаткам можно отнести наличие побочных эффектов и высокую сто-

имость лекарств. Нельзя забывать и о такой проблеме, как лекарственная устойчивость гельминтов, которая возникает при регулярном применении синтетических препаратов [13]. В качестве альтернативы синтетическим антигельминтным средствам можно рассматривать фитотерапию гельмин-тозов, традиционно применяемую в народной медицине. Использование экстрактов и соков растений для лечения нематодозов человека и животных позволит избежать появления лекарственной устойчивости нематод.

В народной медицине традиционно используются местные виды растений. Для лечения гель-минтозов в России и других странах с умеренным климатом используют луковицы чеснока Allium sa-

tivum L., цветки пижмы Tanacetum vulgare L., семена тмина Carum carvi L., надземные части полыни горькой Artemisia absintium L. и полыни обыкновенной Artemisia vulgaris L., корни и корневища девясила высокого Inula helenium L., семена тыквы Cucurbita pepo L., цветки тысячелистника Achillea millefolium L., кору крушины ломкой Frangula alnus Mill., корни и корневища валерианы лекарственной Valeriana officinalis L. и др. [4, 17].

Пижма обыкновенная Tanacetum vulgare L. -многолетнее травянистое растение семейства Aster-aceae. В медицине и ветеринарии используют цветки T. vulgare [17]. В цветках пижмы содержатся эфирные масла, флавоноиды и другие биологически активные вещества. Цветки T. vulgare содержат до 0,8% эфирного масла, в состав которого входят туйон, камфора, туйол, борнеол, пинен и танацетон. Настой цветков применяют в качестве антигель-минтного и желчегонного средства. Механизмом антигельминтного действия пижмы является поражение нервной системы, приводящее к снижению двигательной активности, параличу и гибели гельминтов. В ряде случаев наблюдаются морфологические изменения тегумента паразитов [17].

Полынь горькая Artemisia absintium L. - многолетнее травянистое растение семейства Asteraceae. Эфирное масло A. absintium содержит четыре основных компонента: а-туйон, ^)-эпокси-оксимен, сабинилацетат и хризантенилацетат. A. absintium также содержит фенольные кислоты, гликозиды, флавоноиды, кумарины, каротиноиды, танины и др. [1, 11]. Антигельминтная активность Artemisia spp. определяется высоким содержанием сесквитерпе-нового лактона сантонина [14].

Девясил высокий Inula helenium L. - многолетнее травянистое растение семейства Asteraceae. В качестве лекарственного сырья используют корни и корневища девясила [3, 8]. Корни и корневища I. helenium содержат инулин, сесквитерпеновые лак-тоны (антолактон, изоалантолактон), алкалоиды, фенолкарболовые кислоты, флавоноиды и кумарины [15].

Несмотря на популярность фитотерапии, в настоящее время отсутствуют научно обоснованные доказательства эффективности растительных препаратов для лечения нематодозов. Во многом это определяется сложностью проведения экспериментов с паразитическими нематодами в лаборатории. Для изучения антигельминтой активности синтетических препаратов в последние десятилетия во многих фармацевтических компаниях используют свободноживущую почвенную нематоду Caenorhabditis elegans [7]. Преимущества C. elegans как модельного организма для фармакологии заключаются в ее безопасности для исследователей, простоте выращивания в лаборатории, коротком жизненном цикле, высокой плодовитости, простоте строения тела. Использование C. elegans для изучения токсического действия синтетических немато-цидов возможно благодаря общему плану строения тела всех нематод, сходству их физиологии и

нейрохимии. Это, и ряд других фактов позволяет говорить о том, что C. elegans отличается от паразитических нематод не более чем разные виды паразитических нематод отличаются друг от друга [6, 7]. Для изучения антигельминтных свойств растений C. elegans ранее почти не использовалась. В научной литературе имеются лишь единичные упоминания о действии растительных препаратов на эту нематоду [3, 5, 8, 9, 10, 16, 18]. Целью настоящей работы явилась экспериментальная проверка возможности использования C. elegans в качестве модельного организма для оценки нематоцидной активности экстрактов растений.

Материалы и методы исследования

В работе использовали Caenorhabditis elegans линии дикого типа N2 Bristol, предоставленной Caenorhabditis Genetic Center. Нематод выращивали при 22°C в чашках Петри со стандартной средой выращивания нематод (3 г/л NaCl, 17 г/л бактоагар, 2.5 г/л бактопептон, 5 мг/л холестерин, 1мМ CaCl2, 1мМ MgSO4, 25 мл/л калийфосфатный буфер (pH 6.0)). Для кормления нематод использовали E. coli OP50 [2]. Эксперименты проводили в NG буфере (3 г/л NaCl, 1мМ CaCl2, 1мМ MgSO4, 25 мл/л калий-фосфатный буфер (pH 7.0)). Для каждого эксперимента нематод отмывали от среды выращивания, бактерий и экзометаболитов NG буфером. Затем нематод переносили в стеклянные центрифужные пробирки объемом 10 мл (50 особей в каждую пробирку). После оседания нематод на дно пробирки супернатант удаляли и добавляли по 1 мл водного экстракта растений в соответствующем разведении. Через 2, 4 и 6 часов подсчитывали количество нематод, утративших двигательную активность. Каждый эксперимент проводили в пяти повторностях. Статистическую обработку результатов проводили с использованием углового преобразования Фишера ф*.

Для приготовления водных экстрактов растений 15 г цветков пижмы Tanacetum vulgare, 10 г травы полыни горькой Artemisia absintium или 4.5 г корней и корневищ девясила высокого Inula hele-nium заливали 200 мл горячей дистиллированной воды и выдерживали на кипящей водяной бане в течение 30 минут. Остывший настой фильтровали через мельничный газ с диаметром ячеек 35 мкм с последующим фильтрованием через бумажный фильтр. Полученный фильтрат выпаривали на водяной бане с температурой 60°C до конечного объема 10 мл. Готовый экстракт хранили при температуре -18°C и размораживали непосредственно перед экспериментом.

Результаты исследования и их обсуждение

Для проверки возможности использования Caenorhabditis elegans при оценке биологической активности экстрактов растений нами были проведены эксперименты, в которых изучалось действие водных экстрактов цветков пижмы, травы полыни и корневищ девясила на локомоцию нематод. Результаты этих экспериментов представлены в табл. 1.

Таблица 1

Действие водных экстрактов Tanacetum vulgare, Artemisia absintium и Inula helenium на локомоцию нема_тод_

Доля нематод, у которых наступил паралич, %

2 часа инкубации 4 часа инкубации 6 часов инкубации

Tanacetum vulgare 1:1 1:3 1:7 76.5±1.73 46.8±2.1 12.0±2.3 96.1±.8 50.8±2.0 13.6±2.4 98.9±04 64.3±1.9 13.3±2.4

Artemisia absintium 1:1 1:3

65.0±4.8 47.7±2.7 75.0±4.3 60.0±2.6 88.0±3.2 82.0±2.1

Inula helenium 1:1 1:3 1:7 44.7±4.1 9.1±1.7 10.0±2.4 70.7±3.7 22.4±2.4 25.7±3.6 87.3±2.7 39.1±2.8

Водный экстракт цветков пижмы при разведении 1:1 и 1:3 вызывал паралич соответственно у 76.5% и 46.8% нематод уже после 2-часовой экспозиции к нему. Более длительная экспозиция (6 часов) в обоих случаях приводила к увеличению доли обездвиженных нематод в 1.3 раза. Тот же экстракт при разведении 1:7 вызывал паралич у 12-13.6% нематод без заметного увеличения доли обездвиженных особей при более длительной экспозиции (табл. 1).

Аналогичное с экстрактом цветков пижмы действие на локомоцию нематод оказывали экстракты травы полыни и корневищ девясила (табл. 1). Увеличение времени инкубации C. elegans с экстрактом корневищ девясила с двух до шести часов увеличивало долю обездвиженных нематод в 2, 4 и 2.5 раза при разведении экстракта 1:1, 1:3 и 1:7 соответственно (табл. 1).

Результаты этих экспериментов свидетельствуют о том, что водные экстракты цветков T. vul-gare, травы A. absintium и корневищ I. helenium оказывают негативное действие на организм C. elegans. Амплитуда токсического эффекта зависит как от концентрации экстракта, так и от времени экспозиции нематод к нему. Локомоция является сложной формой поведения нематод, которая регулируется системой нейронов, состоящей из командных нейронов, интернейронов и моторных нейронов. Химические сигналы из холинергических нейронов, секретирующих ацетилхолин, вызывают сокращение мышц тела, а сигналы из ГАМК-ергических нейронов, секретирующих у-аминомас-ляную кислоту (ГАМК), наоборот, расслабляют мышцы, осуществляющие локомоцию [12]. Результаты, представленные в этой работе, позволяют предположить наличие в цветках T. vulgare, траве A. absintium и корневищах I. helenium вторичных метаболитов, влияющих на секрецию ацетилхолина и ГАМК, либо на чувствительность к ним соответствующих рецепторов. Поэтому перспективным представляется использование C. elegans не только для изучения токсического действия экстрактов растений на организмы нематод, но и для иденти-

фикации вторичных метаболитов растений, эффективных в качестве нематоцидов, и определения молекулярных механизмов их действия.

Список литературы

1. Beigh Y.A., Ganai A.M. Potential of worm-hood (Artemisia absintium Linn.) herb for use as additive in livestock feeding: A review // Pharma Innov. J. 2017. V. 6. P. 176-187.

2. Brenner S. The genetics of Caenorhabditis elegans // Genetics. 1974. V. 77. P. 71-94.

3. Bukhardt G., Becker H., Grubert M., Thomas J., Eicher T. Bioactive chromenes from Rhyncholacis penicillata // Phytochemistry. 1994. V. 37 P. 15931597.

4. Buza V., Cätanä L., Andrei S.M., §tefänut L.C., Räileanu §., Matei M.C., Vasiuc I., Cernea M. In vitro anthelmintic activity assessment of six medical plant aqueous extracts against donkey strongyles // J. Helminthol. 2020. V. 94. e147, 1-7.

5. Chitwood D.J. Phytochemical based strategies for nematode control // Annu. Rev. Phytopathol. 2002. V. 40. P. 221-249.

6. Dent J.A. What can Caenorhabditis elegans tell us about nematocides and parasites // Biotechnol. Bioprocess Eng. 2001. V. 6. P. 252-263.

7. Holden-Dye L., Walker R.J. Anthelmintic drugs and nematicides: studies in Caenorhabditis ele-gans // Wormbook, ed. The C. elegans Research Community. 2014. Режим доступа: http://www.worm-book.org, свободный

8. König M., Scholz E., Hartmann R., Lehmann W., Rimpler H. Ellagitannins and complex tannins from Quercus petraea bark // J. Nat. Prod. 1994. V. 57. P. 1411-1415.

9. Kyo M., Miyauchi Y., Fujimoto T., Mayama S. Production of nematocidal compounds by hairy root cultures of Tagetres patula L. // Plant Cell. Rep. 1990. V. 9. P. 393-397.

10. Momin R.A., Ramsewak R.S., Nair M.G. Bioactive compounds and 1,3-di[(cis)-9-octadecenoyl]-2-[(cis,cis)-9,12-octadecadienoyk]glycerol from Apium graveolens L. seeds // J. Afric. Food Chem. 2000. V. 43. P. 3785-3788.

11. Mravcakova D., Komaromyova M., Babjak M., Dolinska M.U., Konigova A., Petric D., Cobanova

A., Slusarczyk S., Cieslak A., Varady M., Varadyova Z. Anthelmintic activity of wormhood (Artemisia ab-sintium L.) and mallow (Malva sylvestris L.) against Haemonchus contortus in sheep // Animals. 2020. V. 10. P. 1-14.

12. Pereira L., Kratsios P., Serrano-Saiz E., Sheftel H., Mayo A.E., Hall D.H., White J.G., LeBoeuf

B., Garcia L.R., Alon U., Hobert O. A cellular and regulatory map of the cholinergic nervous system of C. el-egans // eLife. 2015. V. 4. P. e12432.

13. Rajesh K.D., Rajesh N.V., Vasantha S., Jeeva S., Rajasek aran D. Anthelmintic efficacy of selected ferns in sheeps (Ovis aries Linn.) // Int. J. Ethnobiol. Ethnomed. 2014. V. 1. P. 1-14.

14. Seddiek S.A., Ali M.M., Khater H.F., Ei-Shor-bagy M.M. Anthelmintic activity of the white worm-

wood, Artemisia herba-alba against Heterakis galli-narium infecting turkey poults // J. Med. Plant Res. 2011. V. 5. P. 3946-3957.

15. Spiridon I., Nechita C.B., Niculaua M., Silion M., Armatu A., Teaca C.-A., Bodirlau R. Antioxidant and chemical properties of Inula helenium root extracts // Cent. Eur. J. Chem. 2013. V. 11. 1699-1709.

16. Stadler M., Dagne E., Anke H. Nematicidal activities of two phytoalexins from Taverniera abys-sinica // Planta. Med. 1994. V. 60. P. 550-552.

17. Tolochko K.V., Vyshnevska L.I. Scientific justification of anthelmintic medicines based on m Beigh Y.A., Ganai A.M. Potential of wormhood (Artemisia absintium Linn.) herb for use as additive in livestock feeding: A review // Pharma Innov. J. 2017. V. 6. P. 176-187.

18. Yoshizawa Y., Kawaii S., Kanauchi M., Chida M., Mizutani J. Chavicol and related compounds as nematocides // Biosci. Biotech. Biochem. 1993. V. 57. P. 1572-1574.

ПРОБЛЕМЫ ИЗУЧЕНИЯ ЗАЩИТНОГО И ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОГО ПОВЕДЕНИЯ КРЫС В ЛАБИРИНТАХ ДЛЯ ОЦЕНКИ УРОВНЯ ТРЕВОЖНОСТИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ

ИССЛЕДОВАНИИ РЕАКЦИИ СТРАХА

Трофимова Н.А.

младший научный сотрудник лаборатории нейрохимии высшей нервной деятельности, Институт физиологии им. И.П. Павлова Российской Академии наук,

г. Санкт-Пертербург, Россия

PROBLEMS OF STUDY OF THE DEFENSIVE AND EXPLORATION RAT BEHAVIOR IN MAZES TO ASSESS THE LEVEL OF ANXIETY IN EXPERIMENTAL FEAR CONDITIONING RESEARCH

Trofimova N.

Researcher,

Laboratory of Neurochemistry of Higher Nervous Activity, I.P. Pavlov Institute of Physiology, Russian

Academy of Sciences, St. Petersburg, Russia.

Аннотация

В течение последних десятилетий нейробиологи пытаются понять механизмы сохранения в памяти негативных воспоминаний. Изучение процессов угасания и возобновления памяти о пережитом страхе и генерализации страха представляет особый интерес.

Реакция страха может проявиться не только в ответ на сигналы, связанные с реальной опасностью (специализированный страх), но и на нейтральные или безопасные стимулы (генерализованный страх). В норме генерализация страха является адаптивной реакцией, которая обеспечивает гибкость поведения животных в меняющихся условиях окружающей среды. Стойкая генерализация страха часто характерна для посттравматических и тревожно-депрессивных стрессовых нервных расстройств. Для понимания нейро-биологических механизмов работы мозга часто используют модели исследования на животных. При этом возникает необходимость проведения многочисленных поведенческих опытов.

Особое внимание в этой статье уделяется показателям защитного и исследовательского поведения лабораторных крыс (Rattus norvegicus), обычно регистрируемым при экспериментальном изучении формирования и генерализации условнорефлекторной реакции страха. Приводится обзор ряда имеющихся в научной литературе данных по особенностям биологии и поведения крыс Rattus norvegicus в природе и результаты наблюдений за поведением этих животных в лабиринтах открытое поле, приподнятый крестообразный лабиринт и норковая камера.

В статье показано, какие биологические и поведенческие особенности вида Rattus norvegicus важно учитывать для правильной интерпретации поведения животных в эксперименте. Особый акцент сделан на необходимости выявления индивидуальных особенностей поведения животных в ходе предварительного тестирования и учета их при интерпретации результатов, полученных в дальнейших экспериментах.

Таким образом, в статье обосновывается, что сочетание разных экспериментальных и этологических подходов позволит лучше понять, как возникают эмоциональные состояния страха и тревожности, вызывая проявление различных форм защитного поведения.