ОПТИЧЕСКОЕ ПРОСВЕТЛЕНИЕ ДЛЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ВИЗУАЛИЗАЦИИ ЭКСПРЕССИИ DCAS9/FP В ПОДКОЖНЫХ КСЕНОГРАФТАХ ОПУХОЛЕЙ У МЫШЕЙ

ОПТИЧЕСКОЕ ПРОСВЕТЛЕНИЕ ДЛЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ВИЗУАЛИЗАЦИИ ЭКСПРЕССИИ DCAS9/FP В ПОДКОЖНЫХ КСЕНОГРАФТАХ ОПУХОЛЕЙ У МЫШЕЙ

Г.А. Абушинова и, В.В.Жердева1, Л.Г. Малошенок 1,2

1ФИЦ Биотехнологии РАН, Россия, Москва 2Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова, Россия Москва

DOI:10.24412/cl-37145-2023-1-24-29

Впервые получены модели опухолевых ксенографтов с регулируемой экспрессией химер на основе ортологов dCas9, слитых с флуоресцентными цветными белками, на мышах линии nude, продемонстрирована возможность их флуоресцентной визуализации с использованием оптического просветления (ОП). Для этого были получены генно -инженерные конструкции, несущие различные сочетания химер ортологов каталитически неактивного мутанта эндонуклеазы Cas9 (dCas9) из двух видов бактерий: Neisseriameningitides (Nm) и Streptococcusthermophillus (St1) и двух флуоресцентных белков (EGFP и mCherry). Полученные конструкции с помощью лентивирусной трансфекции были внесены в клетки аденокарциномы легкого человека A549. Клетки, экспрессирующие двойные химеры (St1dCas9-EGFP и NmdCas9 -mCherry, клон E9) под индуцибельным доксициклиновым промотором Tet-On, были стабилизированы в виде опухолевых ксенографтов на бестимусных мышах. Для индукции флуоресценции химерных ортологов в ксенграфтах животным вводили через зонд доксициклин (400 мкг двукратно) и регистрировали флуоресценцию с использованием планарной системы имиджинга. Максимальная интенсивность флуоресценции в ксенографтах опухолей регистрируется на 3-и сутки после индукции экспрессии химерного белка. Для улучшения контраста использовали 0,7 М раствор гадобутрола (ГБ), что приводило к увеличению интенсивности флуоресценции красной химеры на ~15 % раз вследствие эффекта оптического просветления (ОП) кожи. Использование метода оптического просветления позволило получить высококонтрастную визуализацию двойной (красной и зеленой) флуоресцентной экспрессии химерных белков на основе dCas9 в опухолевых ксенографтах.

Введение

Оптическая визуализация тканей и органов значительно усложняется из-за сильного рассеяния света. Уменьшению рассеяния способствует ряд подходов, в том числе такой недорогой и методически несложный подход как оптическое просветление (ОП). Оптическое просветление основано на обратимом выравнивании разницы между показателями преломления твердых компонентов ткани и межтканевой жидкости для уменьшения структурной неоднородности и, соответственно, светорассеяния, что обеспечивается применением иммерсионных растворов -оптических просветляющих агентов (ОПА) [1, 2].

Ранее продемонстрировано использование оптического просветления с использованием 70% раствора гадобутрола (ГБ) для визуализации низкоинтенсивной флуоресценции красного белка TagRFP, экспрессируемого клетками подкожного опухолевого ксенографта на мышах линии nude [3]. Если экспрессия флуоресцентных белков или химер осуществляется под индуцибельным промотером, то в этом случае флуоресцентный сигнал может развиваться во времени на протяжении нескольких дней. Поэтому интересным представлялось оценить возможность использования оптического просветления с использование 70% раствора ГБ на более сложных моделях, а именно на

подкожных ксенографтах, экспрессирующих химеры на основе ортологов daca9 и цветных флуоресцентных белков, и подобрать соответствующий протокол ОП.

Создание генно-инженерных сенсоров DCAS9-FP. Индуцибельная экспрессия под tet-on промотером

Генно-инженерные конструкции, несущие различные сочетания химер ортологов каталитически неактивного мутанта эндонуклеазы Cas9 (dCas9) и флуоресцентных белков (FU-tet-o-SpdCas9-EGFP, FU-tet-o-StCas9-EGFP, FU-tet-o-NmdCas9-mCherry), экспрессия которых находятся под контролем регулируемого промотора, индуцируемого тетрациклином (Tet-ON) получали по стандартным протоколам [4, 5].

При создании генетически-кодируемых гибридных молекул-сенсоров на основе флуоресцентных белков и мутантов семейства эндонуклеаз Cas9 был выполнен ряд требований. Во-первый, было необходимо, чтобы продукты экспрессии не накапливались в клетках в высокой

концентрации, следствием чего могли стать цитотоксичность и фототоксичность. Для выполнения этого требования в качестве основы для получения конструкций был выбран лентивирусный вектор 3-го поколения FUdeltaGW, позволяющий регулировать экспрессию целевого и флуоресцентного белка в одной плазмиде по системе Tet-on.

Во-вторых, принимали во внимание ограничения, связанные с емкостью кассеты лентивирусных частиц, - не более 4kb. Ортологи dCas9 отличаются друг от друга тем, что узнают разные РАМы. Учитывая возможность использования РАМ последовательностей как на (+), так и в (-) ориентации на комплементарных цепях ДНК, наличие трех ортологов dCas9 дает возможность создавать десятки различных комбинаций FRET-пар с различной взаимной ориентацией и линейным расстоянием друг от друга. Для выполнения второго условия было решено использовать два каталитически неактивных ортолога dCas9 из двух видов бактерий Streptococcus thermophillus (St1), и Neisseria meningitides (Nm). Специфичность последовательности геномной ДНК, узнаваемой системой CRISPR-Cas9, определяется РАМ и фрагментом sgRNA. Использование нескольких ортологов Cas9 различного бактериального происхождения, которые отличаются по РАМ, увеличивает число возможных наборов последовательностей для специфической сборки Cas9 рибонуклеопротеина.

В-третьих, должны быть подобраны флуоресцентные белки на основе их яркости, устойчивости к фотовыцветанию, мономеры, для которых при sgRNA-опосредованном направлении химерных белков dCas9-FP к таргетным локусам ДНК, могут быть выполнены условия индуктивно-резонансного переноса энергии (FRET) при их взаимном близком расположении. С учетом данных требований были выбраны пары белков EGFP и mCherry.

Были получены генно-инженерные конструкции, несущие различные сочетания химер ортологов каталитически неактивного мутанта эндонуклеазы Cas9 (dCas9) из двух видов бактерий: Neisseriameningitides (Nm) и Streptococcusthermophillus (St1) и двух флуоресцентных белков (EGFP и mCherry).

В результате было получено 2 генно-инженерные конструкции с индуцибельной экспрессией dCas9-FP (Рисунок 1). Правильность сборки полученных конструкций была подтверждена секвенированием по методу Сэнгера.

Получение клеток, экспрессирующих химеры DCA9-FP. Доксициклин (DOX) зависимая tet-on экспрессия

Полученные трансферные векторы были использованы для сборки лентивирусных частиц. Далее была проведена трансдукция лентивирусными частицами линии аденокарциномы легкого человека А549. В результате такой трансдукции была получена клеточная линия, экспрессирующая конструкции Fu-tet-o-NmdCas9-mCherry и Fu-tet-o-StdCas9-EGFP, в которой экспрессию флуоресцентных химер индуцировали добавлением доксициклина 1 мкг/мл. При отсутствии доксициклина экспрессии, и, соответственно, флуоресцентного сигнала не наблюдалось. Максимальный уровень экспрессии, определяемый по уровню флуоресценции, во всех случаях достигался через 72-96 ч после добавления доксициклина. Для получения стабильных клеточных линий проводили селекцию на пуромицине (1 мкг/мл) и последующий отбор клеток по интенсивности флуоресценции методом сбора клеток в одну пробирку на сортере FACS Aria SORP (Beckton Dickinson). Таким образом была получена клеточная линия, экспрессирующая одновременно StdCas9-EGFP и NmdCas9-mCherry (рисунок 2).

Флуоресцентная визуализация химер DCA 9-FP в подкожных ксенографтах у мышей. Индукция экспрессии химеры DCA9-FPINVIVO

Для прививки клеток животным использовали полученные клоны StdCas9-EGFP-NmdCas9-mCherrу. В качестве экспериментальных животных были использованы мыши nu/nu, самки, массой 19-21 г, полученные на основе линии Balb/с (разведение питомника «Пущино» ФИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова). Перед исследованием мышей наркотизировали смесью «Золетил» (пр-во «VirbacSanteAnimale», Франция) с концентрацией 25 мг/мл и ксилазина в

концентрации 20 мг/мл (препарат «Рометар», пр-во Bioveta, а^., Чешская Республика) внутримышечно в соотношении золетил : рометар 1:1 в объеме 5 мкл.

В результате инокуляции опухолевых клеток в течение 10-14 дней у животных формировались опухолевые подкожные узлы. По достижении опухолями размера 5 мм животным давали доксициклин в количестве 200 мкг двукратно перорально через шприцевой зонд [6]. Экспрессия ортологов st1dCas9-EGFP и Nm dCas9-mCherry воспроизводилась на выборке из трех животных. При этом уровень сигнала варьировался от животного к животному. По литературным данным в различных моделях TET-on индукция может развиваться начиная с 4 часов после активации. Для опухолевых ксенографтов данный период индукции может составлять от 24 ч и выше [7].

KS prjmer

Рис.1. Карта генно-инженерной конструкции Fu-tet-O-dCas9-FP

Рис. 2. Флуоресцентная микроскопия клеток линии A549, экспрессирующей StdCas9-EGFP-NmdCas9-mCherry через 48 ч после Tet-индуцированной экспрессии химер доксициклином (1 мкг/мл). Zeiss Axio Observer Z1, DI-AxioCam-HRm, x100 (Масштаб (мкм/пиксель): 100x/1,4 пикселя = 0,063 микрона), A - зеленый куб Пр. БП 470/40, БС ФТ 495/Эм. БП 525/50; Б - красный кубик: Пр. БП 550/25 БС ФТ 570/Эм.

БП 605/70; C- наложение изображений (А) и (Б).

Регистрацию флуоресценции в подкожных ксенографтах и изучение влияние ОП на флуоресценцию проводили с использованием автоматизированной системы iBox (UVP, США). Базовым элементом установки является тёмный бокс с моторизованным лифтом и фильтрами для выделения диапазона длин волн, требуемого для возбуждения и регистрации флуоресценции. Установка оснащена автоматизированным источником Biolite для возбуждения люминесценции и

охлаждаемой CCD-камерой. Источник света оснащен встроенной каруселью с фильтрами на возбуждение 440-470 нм, 502-547 нм.

Для регистрации флуоресценции белка mCherry использовали комбинацию фильтров: возбуждение - 502-547 нм и регистрация - 570-640 нм. Для регистрации флуоресценции белка EGFP использовали комбинацию фильтров: возбуждение - 440-470 нм и регистрация - 515-570 нм. Экспозицию варьировали от 10 до15 секунд.

В нашем случае флуоресцентный сигнал регистрировали через сутки (24 ч) после доксициклиновой индукции, затем на 3-и сутки (72 ч) и на 6-е сутки (148 ч). Результаты приведены на Рисунке 3. Из Рисунка 3-А видно, что уровень флуоресцентного сигнала в опухоли растет и увеличивается в 1,6 и 1,8 раз на 1-ый и 3-ий день соответственно, а далее начинает медленно снижаться - 1,4 раза на 6-ой день.

В качестве просветляющего агента использовали гадобутрол («Гадовист», Bayer, ФРГ), который применялся в водных растворах в концентрации 0,7 М с добавлением 5% ДМСО. Гадобутрол наносили на кожу в зоне опухолевого роста, апплицировали 15 минут, после чего снимали видимые остатки просветляющего агента ватным тампоном согласно ранее предложенному протоколу [8].

О

1

клон Е9

200

Ё Одень 1-ындень 3-ындень б-ойдень б-ойдень б-ойдень

после после после после после

индукции индукции индукции до индукции индукции гадовиста сразу после через 30 мин гадовиста после

гадовиста

Дни регистрации флуоресценции

А Б

Рис. 3. Изменение интенсивности нормированной флуоресценции в опухоли Е9 (линия А549 st1dCas9 -EGFP- Nm dCas9-mCherry) после индукции Те^оп доксициклин-зависимой экспрессии ортолога Nm dCas9-mCherry до индукции (0 день), на 1-ый, 3-ий и 6-ой день после индукции.

Возбуждение 502-547нм, регистрация 570-640 нм, Шох (и\Р, США) (А). Выбор областей нормирования сигнала флуоресценции опухолей на примере одного животного, где 1- область

опухоли, 2- кожа

Анализ изображений проводили с помощью программы ImageJ. При математической обработке полученных данных выделяли области опухоли и кожи (рис.3-Б). Рассчитывали среднюю интенсивность флуоресценции опухоли и кожи и нормировали среднюю интенсивность флуоресценции опухоли на таковую у кожи. Участок кожи выбирался таким образом, чтобы он не подвергался воздействию гадобутрола.

Ранее было показано, что наиболее подходящий период наблюдения - сразу после 15-минутного нанесения для измерения интенсивности флуоресценции после нанесения гадобутрола, также показано, что 0,7М гадобутрол с добавлением 5% ДМСО предпочтительнее 1 М гадобутрола, поскольку он позволяет наблюдать эффект ОП в течение более длительного периода времени [9].

Схожий эффект наблюдали и в случае оптического просветления на основе 0,7 М гадобутрола для визуализации химерных белков dcas9-FP, экспрессируемых подкожными опухолевыми ксенографтами (Рис.3).

Использование ГБ на 6-ой день привело к незначительному увеличению сигнала. Таким образом, в результате предварительных исследований было показано, что через 48 часов после индукции регистрируется максимально высокий сигнал флуоресценции в опухолевых ксенографтах Е9. В дальнейшем регистрацию флуоресценции на данных моделях проводили на 3-и сутки.

На рисунке 4-А приведены выделенные в программе ImageJ участки кожи с опухолью, на которых представлены флуоресцентные изображения опухоли в красном канале флуоресценции, где регистрируется флуоресценция ортолога Nm dCas9-mCherry. Из данных на Рисунке 4-Б следует, что максимальное увеличение интенсивности флуоресценции наблюдается в диапазоне 15-30 мин после аппликации гадобутрола и снижается до исходного уровня на 45-60 минутах, что согласуется с нашими предыдущими данными [9].

Как показано на Рисунке 4-А, аппликация 70% раствора гадобутрола улучшает разрешение объекта и его контраст в режиме планарной съемки. В меньшей степени выявляется изменение сигнала при возбуждении зеленой флуоресценции химеры St1dCas9-EGFP и красной флуоресценции NmdCas9-mCherry в диапазоне 440-470 нм в связи с большим рассеянием света в верхних слоях кожи (данные не приведены).

В связи с этим предварительную оценку уровня флуоресцентного сигнала в опухолях с низким сигналом флуоресценции не имеет смысл проводить при более коротковолновом возбуждении флуоресценции, а для повышения контраста изображения наиболее оптимально вести съемку во временном диапазоне 15-30 мин после снятия оптического просветляющего агента.

4 К

Исходный

уровень

флуоресценции

Через 15 мин после ОП

Через 30 после ОП

мин

А

Через 45 после ОП

Через 60 мин после ОП

Рис. 4. Флуоресценция опухоли Е9 (линия А549 St1dCas9-EGFP- NmdCas9-mCherry) после индукции Tet-on доксициклин-зависимой экспрессии химерного ортолога dcas9mnmCheny на 3-ий день с использованием 0,7М гадобутрола в качестве оптического просветляющего агента.

Флуоресцентные изображения, возбуждение 502-547нм, регистрация 570-640 нм, iBox (UVP, США) (А) и нормированная на кожу флуоресценция в опухоли (Б) до оптического просветления, через 15 мин после ОП, через 30 мин после ОП, через 45 мин после ОП, через 60 мин после ОП. Результаты представлены для одного животного.

Б

Выводы

Таким образом, оптическое просветление с использованием 70% раствора гадобутрола способствует небольшому увеличению интенсивности флуоресцентного сигнала (от 10 до 15 %), а что более важно, повышает контраст флуоресцентного изображения подкожных опухолевых ксенографтов экспериментальных животных после индукции экспрессии химерных белков dCas9-FP доксициклином, максимальный эффект достигается на 72 ч после индукции.

Благодарность

Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда № 22-14-00205 https://rscf.ru/project/22-14-00205/

Список литературы

1. Tuchin V.V. Tissue Optics: Light Scattering Methods and Instruments for Medical Diagnostics. 3rd ed., PM254, Bellingham, WA, SPIE Press. 2015.

2. Башкатов А. Н., Генина Э. А., Тучин В. В. // Альманах клинической медицины. 2008. №17. С.1.

3. Bogdanov A.A. Jr., et al., "Magnetic resonance imaging study of diamagnetic and paramagnetic agents for optical clearing of tumor-specific fluorescent signal in vivo", Chapter 25. In : Tissue optical clearing: new prospects in optical imaging, D. Zhu, E. Genina, and V. Tuchin (Eds.), CRC Press (Taylor & Francis Group, LLC), Boca Raton FL; 2021.

4. Cong L., Ran F.A., Cox D. et al.// Science. 2013. Vol. 339. P. 819-823.

5. Ma H., Naseri A., Reyes-Gutierrez P. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2015. Vol. 112. P.3002-3007.

6. Cawthorne Christopher, Swindell Ric, Stratford Ian J. et al. // J. Biomol. Tech. 2007. Vol. 18 (2). P. 120-123.

7. Kistner M., Gossen F., Zimmermann J., Jerecic C. et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences. 1996. Vol. 93 (20). P. 10933-10938.

8. Kazachkina N.I., Zherdeva V.V., Saydasheva A.N. et al. // Journal of Biomedical Photonics & Engineering. 2021. Vol.7(2). P. 0203011-0203017.

ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ДЕКОРИРОВАННЫХ ОКСИДОМ ЖЕЛЕЗА УГЛЕРОДНЫХ НАНОТРУБОК В КАЧЕСТВЕ БИОСЕНСОРОВ НОВОГО

ПОКОЛЕНИЯ

И. В. Запороцкова, С. В. Борознин, П. А. Запороцков, Н. П. Борознина, А. Р. Эль Занин

Волгоградский государственный университет, Россия, Волгоград

DOI:10.24412/cl-37145-2023-1-29-35

Установлено, что электрические и оптические свойства углеродных нанотрубок чувствительны к взаимодействию с биологическими молекулами. Данная особенность привела ученых к выводу, что УНТ могут быть перспективным материалом для использования в качестве биосенсоров. Было обнаружено, что УНТ, декорированные металлами, могут демонстрировать изменение намагниченности, плавные S-образные петли гистерезиса и полуметаллическое поведение. Все вышесказанное обуславливает актуальность теоретического исследования взаимодействия оксидов железа и углеродных нанотрубок. Это позволит уточнить детали данного процесса: геометрические и энергетические. В данной статье представлены результаты теоретического исследования свойств двух типов углеродных нанотрубок (кресло и зигзаг) с использованием квантово-химического метода теории функционала плотности в рамках модели молекулярного кластера. Исследован процесс внешней адсорбции оксида железа на поверхности нанотрубок. Определены основные энергетические характеристики этих процессов, такие как расстояние и энергия адсорбции. Для этого мы провели моделирование добавления оксида железа в трех положениях (над атомом, в центре связи между ними, в центре гексагона) и установили их наиболее эффективное взаимное расположение. Энергетически выгодными позициями являются расположение оксида железа над атомом поверхности нанотрубки или в центре связи между ними. Было обнаружено, что при взаимодействии нанотрубки и оксида металла происходит изменение зарядового распределения и ширины запрещенной зоны. Проведенные модельные эксперименты позволяют предсказать строение датчиков биосенсоров и заложить базис для дальнейших исследований в области взаимодействия декорированных нанотрубок с биообъектами.