Липидкоррегирующее средство из морских водорослей
LIPID-CORRECTING AGENT OF SEAWEED

Изобретение относится к применению экстрактов растительного происхождения, содержащих композицию, включающую комплекс липидов в качестве липидкоррегирующего средства для предотвращения или лечения сердечно-сосудистых патологий, а также как средства, повышающего устойчивость организма к жировой и холестериновой нагрузкам, возникающим в процессе нарушения пищевого поведения, приводящего к развитию дислипидемии (ДЛП), обусловливая развитие атеросклероза.
Известно, что большинство случаев сердечно-сосудистых заболеваний, которые являются одной из основных причин смерти, инициируются факторами риска, среди которых дислипидемии занимают не последнее место, которые можно контролировать и лечить. По литературным данным от различных форм ДЛП страдает 65% мужчин и 62% женщин [Бокерия Л.А., Оганов Р.Г. Все о холестерине: национальный доклад. Москва, 2010. Изд-во НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН], [Новгородцева Т.П., Сомова Л.М., Т.А. Гвозденко, Ю.К. Караман, Н.В. Бивалькевич. Алиментарная дислипидемия: экспериментально-морфологические аспекты. - Владивосток, 2011. Изд-во Дальневост. Федер. Унта], то есть коррекция ДЛП остается актуальной проблемой современной медицины.
Известны различные медикаментозные средства при ДЛП на базе синтетических липид-снижающих препаратов. Одним из таких базисных средств для коррекции нарушений липидного обмена являются статины, представляющие собой синтетические ингибиторы ключевого фермента биосинтеза холестерина -ГМГ-КоА-редуктазы [Оганов Р.Г. Статины - препараты первой линии в профилактике и лечении атеросклероза // Медицинский алфавит. 2013. Vol. 1, N 1. Р. 12-15]. Известны также липид-снижающие препараты относящиеся к группе веществ снижающих реабсорбцию желчных кислот, являющегося одним из важнейших факторов регулирования гомеостаза плазменного холестерина [Kramer W., Glombik Н. Bile acid reabsorption inhibitors (BARI): Novel hypolipidemic drugs // Curr. Med. Chem. 2006. V. 13. № 9. P. 997-1016]. Также достаточно широко для коррекции липидного обмена, и в частности для снижения уровня триглицеринов и повышения концентрации ЛПВП (липопротеиды высокой плотности) применяются фибраты [Gomaraschi М., Adorni М.Р., Banach М., Bernini F., Franceschini G.,Calabresi L. Effects of Established Hypolipidemic Drugs on HDL Concentration, Subclass Distribution, and Function // High Density Lipoproteins: From Biological Understanding to Clinical Exploitation. - Berlin: Springer - Verlag Berlin, 2015. P. 593-615 (Handbook of Experimental Pharmacology; Vol.224)].
Основным недостатком эффективных медикаментозных гиполипидемических средств является их высокая стоимость и наличие в ряде случаев противопоказаний. Действие синтетических препаратов является узконаправленным и не затрагивает всех звеньев патогенетического процесса. Кроме этого при их длительном применении, а также при использовании в больших дозах, они способны вызывать ряд достаточно серьезных неблагоприятных побочных эффектов, поэтому отдельным группам пациентов эти лекарственные средства противопоказаны [Дядык А.И., Куглер Т.Е., Сулиман Ю.В., Зборовский С.Р., Здиховская И.И. Побочные эффекты статинов: механизмы развития, диагностика, профилактика и лечение // Архивъ внутренней медицины. 2018. Vol. 42, N 4. Р. 266-276].
Актуальным является поиск альтернативных, более безопасных немедикаментозных гиполипидемических средств на основе природного сырья. В отличие от синтетических, природные препараты могут сочетать в себе суммарные биологические эффекты, опосредованные разнообразным составом их компонентов.
Перспективными в этом отношении являются биологически активные комплексы из сырья морского происхождения. К таковым относятся липидные комплексы из морских гидробионтов, содержащие омега-3 полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК). Известно, что омега-3 ПНЖК считаются основополагающим строительным материалом для структурных компонентов клеток, тканей и органов, также как и предшественником для синтеза целого ряда биологически активных веществ.
Экспериментальные исследования продемонстрировали, что высокое содержание омега-3 в диете играет центральную роль в предотвращении атеросклероза [Torres N.M. Guevara-Cruz L.A., Velazquez-Villegas, Tovar A.R. // Nutrition and Atherosclerosis. Archives of Medical Research. 2015. Vol. 46, N 5. P. 408-426]. При этом в отличие от статинов, омега-3 ПНЖК способны влиять на несколько ключевых клеточных процессов, связанных с развитием атеросклероза, включая снижение интенсивности миграции моноцитов и их адгезию на эндотелиальных клетках, ингибирование процесса поглощения макрофагами модифицированных ЛПНП (липопротеиды низкой плотности) и подавление миграции гладкомышечных клеток, изменяя соотношение омега-6/омега 3 жирных кислот в фосфолипидах мембран в сторону его снижения [Ramji D.P. Polyunsaturated Fatty Acids and Atherosclerosis: Insights from Pre-Clinical Studies // European Journal of Lipid Science and Technology. 2019. Vol. 121, N 1].
Указанные свойства позволят использовать комплексы морских гидробионтов, богатых омега-3 ПНЖК, для профилактики и лечения дислипидемий разного характера.
Однако, основная часть известных биологически активных добавок (БАД), использует в качестве основы жир глубоководных рыб и ракообразных холодноводных морей и его концентраты (Wild Norwegian Cod Liver Oil, Source Naturals, Arctic Pure, Wild Alskian Salmon Oil, Rimfrost Antarctic krill и т.д.), a также концентрат этиловых эфиров омега 3 ПНЖК (Ultra Omega, DHA-500, Omega-3, Тройная Омега-3 и т.д.) и омега 3 ПНЖК в виде триглицеридов (Omega-3 Triglyceride Fish Oil, CGN Omega-3 Premium Fish Oil и т.д.).
Известно также средство, выделенное из печени командорского кальмара, обладающее липидкорригирующим и иммунологическим действием (патент РФ № 2259824 С2, опубл. 10.09.2005), содержащее 10% ПНЖК, а также средство, выделенное из печени камчатского краба, обладающее липидкорригирующими, гипокоагуляционными и антиоксидантными свойствами (патент РФ № 2302248 С2, опубл. 10.07.2007).
Отметим, что основным источником сырья для получения БАД содержащих омега-3 ПНЖК и их комплексы являются нектонные и перифитонные формы гидробионтов, которые активно эксплуатируются человеком и их запасы имеют тенденцию к истощению, что стимулирует исследования, направленные на поиск и изучение новых источников биологически активных веществ. В этом плане высокий интерес представляют бентосные формы гидробионтов, а именно, различные виды морских водорослей, которые являются первичными продуцентами омега-3 ПНЖК в пищевой цепи морских организмов. Водоросли служат источником пищи для перифитонных форм гидробионтов, которые в свою очередь составляют кормовую базу для нектонных форм гидробионтов.
При этом изучению их биологических свойств и терапевтического применения в условиях гиперхолестеринового рациона в настоящее время уделяется недостаточно внимания. Известны экспериментальные исследования, в которых изучалось гиполипидемическое действие липидных экстрактов из бурой водоросли Sargassum pallidum, зеленой Ulva fenestrata и морской травы Zostera marina в условиях экспериментальной гиперлипидемии, вызванной однократным введением Тритона-1339 (Tyloxapol) [Кривошапко О.Н., Попов A.M., Артюков А.А., Костецкий Э.Я. Особенности корригирующего действия полярных липидов из морских гидробионтов при нарушениях липидного и углеводного обмена // Биомедицинская химия. 2012. Т. 58. Вып. 2. С. 189-198]. Данная модель характеризуется резким повышением содержания в сыворотке крови триглицеринов и общего холестерина, что соответствует в большей степени токсической гиперлипидемии и, которая с большими допущениями может быть экстраполирована на гиперлипидемию, развивающуюся в реальных условиях гиперхолестериновой диеты.
Известно, что липидкорригирущим свойством обладает экстракт, полученный при спиртовой экстракции измельченной сухой бурой водоросли ламинарии японской (Laminaria japonica), содержащий 80-90% липидов, в том числе 26,7-38,7 полиненасыщенных жирных кислот от суммы жирных кислот (пат. РФ № 2309763, опубл. 10.11.2007).
Таким образом стоит проблема расширения арсенала биологических липидкоррегирующих средств из морских водорослей.
Проблема решается применением при алиментарной дислипидемии в качестве липидкоррегирующего средства липидной фракции экстракта таллома анфельции тобучинской - Ahnfeltia tobuchiensis (Kanno et Matsubara) Makijenko, отдел Rodophyta, порядок Ahnfeltiales, семейства Ahnfeltiaceae.
Технический результат - снижение содержания триацилглицеринов, общего холестерина в крови, холестерина липопротеинов низкой плотности и индекса атерогенности при увеличении содержания холестерина липопротеинов высокой плотности в крови.
Известно гепатопротекторное свойство данной липидной фракции экстракта таллома анфельции тобучинской - Ahnfeltia tobuchensis, (п. РФ № 2667472 С1). Показано, что действие данной фракции экстракта в качестве гепатопротекторного средства, как и всех аналогичных гепатопротекторов, основано на его способности восстановления липидного состава и пространственного матрикса мембран гепатоцитов, которое нарушается при воздействии на печень токсинов, как и всех аналогичных гепатопротекторов.
Однако, проведенные авторами экспериментальные исследования воздействия данной фракции на показатели крови при алиментарной дислипидемии показали, что данная фракция обладает способностью восстанавливать нарушенное соотношение холестерина липопротеинов низкой и высокой плотности, а также триацилглицеринов и общего холестерина в плазме крови. Данное свойство этого экстракта ранее не было известно, что позволяет говорить о его применении в качестве липидкоррегирующего средства при нарушениях липидного обмена в условиях алиментарной дислипидемии (метаболический синдром, ожирение).
В качестве сырья для получения липидного комплекса используют таллом анфельции тобучинской (Анфельция тобучинская Ahnfeltia tobuchiensis (Kanno et Matsubara) Makijenko. Распространена в России в заливе Петра Великого (Японское море), островах Сахалин, Кунашир, Шикотан. Является важным промысловым объектом и используется как пищевой продукт повышенной биологической ценности. Следует отметить также, что в анфельции тобучинской (Ahnfeltia tobuchiensis), содержание важнейшей для проявления фармакологического эффекта эйкозапентаеновой кислоты более чем в 3 раза превышает таковую в ламинарии японской (Titlyanov Е.А., Cherbadgy L.L., Chapman D.J. A review of the biology, productivity and economic potential of the agar- containing red alga, Ahnfeltia tobuchiensis (Kanno et Matsubara) Makijenko, in the seas of the Far East of Russia // Int. J. Algae. 1999. Vol. 1, N 4. P. 28-67).
Таллом является частью растения, которая достигает наибольшего размера и характеризуется максимальной скоростью роста, что требует постоянного биосинтеза вторичных метаболитов, необходимых для построения вновь образующихся клеток. Это определяет наибольшее содержание липидов в талломе в период вегетации.
Известно, что состав комплекса полиненасыщенных жирных кислот, получаемый из водорослей зависит от вида используемого для экстракции исходного сырья, поэтому нельзя было предположить наличие у липидной фракции из Ahnfeltia tobuchiensis обнаруженного липидкоррегирующего свойства.
Выделение липидного комплекса может быть осуществлено общепринятыми для выделения липидов из растительного сырья способами, например, как приведено в п. РФ № 2667472 С1 или статье (Bligh E.G., Dyer W.J. А rapid method of total lipid extraction and purification // Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 1959. Vol. 37, N 8. P. 911-917), адаптированными к нашим условиям.
Ниже приводим способ выделения липидного комплекса, используемого далее для исследования.
Образцы водоросли Ahnfeltia tobuchiensis собирали в августе - сентябре в заливе Петра Великого Японского моря (пролив Старка, о. Попов). Собранные водоросли тщательно очищали от загрязнений другими водорослями, мелкими беспозвоночными и твердыми частицами. Водоросли промывали сначала в морской воде, потом в пресной, после этого отжимали и погружали в кипящую воду на 2 мин для инактивации ферментов. Водоросли сушили до суховоздушного состояния, что приводит к деструктивным процессам особенно фракции ПНЖК и изменению ее нативного состава, а также снижению общего выхода липидной фракции. Опытным путем было установлено, что при сушке водорослей до остаточной влажности 40% выход липидной фракции, получаемой при экстракции, увеличивается на 25% по сравнению с экстракцией суховоздушного сырья. Поэтому водоросли после инактивации ферментов сушили до остаточной влажности ~40% и хранили до этапа экстракции при температуре -18°С. Далее таллом помещали в морозильную камеру при -80°С на 2 часа для повышения хрупкости, после этого измельчали с помощью лабораторной мельницы до размеров частиц 0,5-1 мм и экстрагировали смесью хлороформ:этанол (1:2). Один килограмм сырья заливали 1,5 литрами экстракционной смеси, тщательно перемешивали и оставляли на 2 часа, далее добавляли 0,5 литра хлороформа и после тщательного перемешивания добавляли 0,5 литра воды. Полученный экстракт отделяли на воронке Бюхнера под вакуумом и оставляли на ночь в холодильнике для разделения фаз. После отстаивания удаляли верхнюю фазу, содержащую воду и этанол, с помощью водоструйного насоса. Нижнюю фазу, содержащую липиды, переносили в делительную воронку и промывали 0,2 объемами 0,73% раствора хлористого натрия. После разделения фаз нижний хлороформный слой, содержащий липиды, переносили в круглодонную колбу и упаривали на роторном испарителе (Т<37°С) до отсутствия запаха хлороформа. Полученный липидный экстракт представляет собой маслообразную массу зелено-коричневого цвета. Повторная экстракция порции сырья показала, что при однократном процессе экстрагируется более 90% липидов, что позволило принять решение об использовании одноразовой процедуры извлечения. Выход липидного комплекса составил 2,2% от массы водоросли в пересчете на суховоздушное сырье. В Таблице 1 приведен химический состав полученного липидного комплекса анфельции, соответствующий известному составу по п. РФ № 2667472 С1.
Липидный комплекс для фармакологического тестирования предварительно растворяли в соотношении 1:2 в вазелиновом масле категории «медицинское». Вазелиновое масло в качестве разбавителя было выбрано, поскольку оно не всасывается в процессе пищеварения в желудочно-кишечном тракте, имеет неизменный химический состав, не содержит токсичных для организма веществ, не скапливается в самом организме, и, следовательно, не может оказать влияние на получаемые в эксперименте результаты.
При изучении состава полученного липидного комплекса (таблица 1) было определено, что 90% составляют общие липиды, из которых 80% относятся к метаболически активным компонентам, важным для регуляции липидного обмена. В качестве метаболически активной фракции принимали сумму эссенциальных фосфолипидов (26%), гликолипидов (30%) и суммарную фракцию свободных жирных кислот и триацилглицеринов (25%), которые представляют основной источник полиненасыщенных жирных кислот, являющихся важным компонентом регуляции липидного обмена в условиях гиперлипидемии и гиперхолестеринэмии (алиментарной дислипидемии) [Таратухин Е.О. Атеросклероз и жирные кислоты: важная взаимосвязь и новое направление терапии // Российский кардиологический журнал. 2011. № 5. С. 77-80]. Суммарное содержание НЖК от общей суммы жирных кислот в липидном комплексе составляет не менее 66%, а сумма ПНЖК семейства n-3, в основном эйкозапентаеновая кислота, представляет «активное начало» и превышает 21%, что в два раза выше такового у прототипа и соответствует составу липидного комплекса по п. РФ № 2667472 С1.
Низкая токсичность (ЛД50 составляет более 5000 мг/кг) и безопасность при длительных введениях в желудок и парэнтерально позволили провести экспериментальные исследования.
Применение полученного средства в эксперименте на крысах в условиях гиперхолестеринового рациона с высокожировой нагрузкой (гипержировой рацион) дало результат, превышающий предполагаемые от его использования ожидания и, заключающийся в липидкоррегирующем действии, а именно, восстановлении нарушенного соотношения холестерина липопротеинов низкой и высокой плотности, а также триацилглицеринов и общего холестерина в плазме крови.
Эксперимент проводили на беспородных белых крысах-самцах массой тела 146±3 г, полученных из питомника филиала «Столбовая» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий» ФМБА России. Исследования на животных выполнены в соответствии с приказом Минздравсоцразвития России от 01.04.2016 № 199н «Об утверждении Правил лабораторной практики» и требованиями ГОСТ Р 53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики». Животные были адаптированы в виварии в течение 7 сут до начала эксперимента. Во время этого периода осуществляли ежедневный осмотр внешнего состояния крыс, и в эксперимент были взяты животные без признаков отклонений в состоянии здоровья. Животных содержали по 1 особи в индивидуальных пластиковых клетках на подстилке из опилок при 20-22°С и режиме освещения 12/12 ч. Животные получали питьевую воду без ограничений и корм ежедневно в одно и то же время в режиме свободного доступа. После прохождения карантина крыс произвольно распределяли на интактных (контроль), потреблявших на протяжении всего эксперимента стандартный общевиварный рацион, и крыс, подвергавшихся моделированию алиментарной дислипидемии. Наиболее популярной является модель кормления животных высокожировой диетой, представляющей собой гиперхолестериновый рацион с высокой жировой нагрузкой, вызванной путем скармливания животным диеты с избыточным количеством холестерина и насыщенных жирных кислот. Согласно исследованиям Луценко М.Т., Рыжавский Б.Я., Чертов А.Д., Луценко Н.В. Адаптация организма к повышенному содержанию холестерина / под ред. М.Т. Луценко. Благовещенск, 1973. 143 с., при воздействии гиперхолестериновой нагрузки в период 30 сут у экспериментальных животных формируется реакция организма, характеризующаяся алиментарной дислипидемией. В связи с этим, развитие алиментарной дислипидемии в нашем эксперименте осуществляли кормлением животных высокожировой диетой в течение 30 суток, состоящей из базового стандартного рациона с добавлением 2% холестерина и 20% говяжьего сала от общего состава рациона [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / под ред. А.Н. Миронова М.: Гриф и К, 2012]. Другой группе крыс в высокожировую диету добавляли липидный комплекс анфельции в дозе 1 г/кг массы животного [Новгородцева Т.П., Гвозденко Т.А., Касьянов С.П., Кнышова В.В., Караман Ю.К. Использование биологически активной добавки к пище на основе липидов морских гидробионтов в эксперименте на крысах // Вопросы питания. 2010. Т. 79, № 2. С. 24-27]. В группе с препаратом сравнения, которым является липидный препарат Омега-3 (Now Foods, USA), в диету вводили этот липидный комплекс в той же дозе. Препарат Омега-3 включал натуральный комплекс, выделенный из рыбьего жира, в состав которого входили 18% эйкозопентаеновой (ЭПК) и 12% докозогексаеновой (ДГК) кислот. Используемая доза вводимого в рацион липидного комплекса была эквивалентна суточной норме полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), разработанной для человека. Выбор в качестве препарата сравнения липидного комплекса Омега-3 связан со сходным химическим составом ПНЖК семейства n-3 в исследуемом липидном комплексе анфельции и, соответственно, предполагаемым механизмом действия. Известно, что жирные кислоты, относящиеся к семейству n-3 имеют большой потенциал применения для сохранения здоровья человека ввиду высокой эффективности при терапии различных патологий [Jump D.B., Depner С.М., Tripathy S., Lytle K.A. Potential for Dietary omega-3 Fatty Acids to Prevent Nonalcoholic Fatty Liver Disease and Reduce the Risk of Primary Liver Cancer // Adv. Nutr. 2015. Vol. 6, N 6. P. 694-702].
Животные были разделены на следующие группы по 10 крыс в каждой: 1 группа - контроль (интактные, стандартный базовый рацион), 2 группа - высокожировая диета, 3 группа - высокожировая диета + липидный комплекс анфельции, 4 группа - высокожировая диета + липидный комплекс Омега 3. Животных выводили из эксперимента декапитацией под легким эфирным наркозом с соблюдением Правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986). Дизайн эксперимента был одобрен Комиссией по вопросам этики Тихоокеанского океанологического института им. В.И. Ильичева ДВО РАН.
Терапевтическую эффективность исследованных липидных фракций оценивали по их влиянию на весовые характеристики (массу тела, массу печени) и биохимические показатели печени и плазмы крови. В плазме крови определяли уровень общего холестерина (ОХС), холестерина липопротеинов низкой плотности (ХС ЛПНП), холестерина липопротеинов высокой плотности (ХС ЛПВП) и триацилглицеринов (ТАГ), используя биохимические наборы реактивов компании «Ольвекс Диагностикум» (Россия). Также был рассчитан индекс атерогенности по формуле ОХС - ХС ЛПВП/ХС ЛПВП, где ОХС - общий холестерин, ХС ЛПВП - холестерин липопротеинов высокой плотности и т.д. [Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Обмен липидов и липопротеидов и его нарушения. СПб: Питер Ком, 1999. 512 с.], как основной критерий, позволяющий анализировать эффективность действия исследуемых липидкоррегирующих препаратов.
Состояние антиоксидантной системы оценивали по уровню антирадикальной активности (АРА) в отношении алкил-пероксильных радикалов [Bartosz G., Janaszewska A., Ertel D., Bartosz M. Simple determination of peroxyl radical-trapping capacity // Biochemistry and molecular biology international. 1998. Vol. 46, No. 3. P. 519-528], уровню малонового диальдегида (МДА) [Buege JA, Aust SD. Microsomal lipid peroxidation // Methods Enzymol. 1978;52:302-310], активности супероксиддисмутазы (СОД) [Paoletti F., Aldinucci D., Mocali A. et al. A sensitive spectrophotometric method for the determination of superoxide-dismutase activity in tissue-extracts // Anal, biochem. - 1986. - vol. 154. - n 2. - p. 536-541] и ферментов глутатионового звена - глутатионредуктазы (ГР) [D.M. Goldberg, R.J. Spoone., Methods of enzymatic analysis, H.U. Bergmeyer (ed. in-chive), Weinheim; Deerfield Beach, Florida; Basel, 3, (1983), 258-265] и глутатионпероксидазы (ГП) [R.F. Burk, R. A. Lawrence, J.M. Lane. Liver necrosis and lipid peroxidation in the rat as the result of paraquat and diquat administration. Effect of selenium deficiency // J. Clin. Invest., 65(5), 1024-1031. 1980] в плазме крови, а также по уровню восстановленого глутатиона (Г-SH) в ткани печени [Новгородцева Т.П., Эндакова Э.А., Янькова В.И. Руководство по методам исследования параметров системы «Перекисное окисление липидов - антиоксидантная защита» в биологических жидкостях. Владивосток, 2003, 80 с.]
Содержание общих липидов в анфельции определяли весовым методом. Суспензию силикагеля марки «КСК» и пластинки размером 6x6 см для двумерной микротонкослойной хроматографии фосфолипидов и нейтральных липидов готовили по методу [Svetashev V.I., Vaskovsky V.E. A simplified technique for thinlayer chromatography of lipids // J. Chromatogr. 1972. Vol. 67. P. 376-378]. Для фракционного разделения фосфолипидов использовали системы растворителей, описанные Роузером [Rouser G., Kritchevsky G., Yamamoto A. Column chromatographic and associated procedures for separation and determination of phosphatides and glicolipids // Lipid chromatogr. Anal. N.Y.: Dekker. 1967. Vol. 1. P. 99-162]. Для обнаружения холинсодержащих фосфолипидов (фосфатидилхолин, лизофосфатадилхолин, сфингомиелин) использовали реактив Драгендорфа [Wagner Н., Horhammer L., Wolff F. Thin-layer chromatography of phosphatides and glycolipides // Biochem. Z. 1961. Bd. 334. S. 175-184] - липиды проявлялись в виде оранжевых пятен на желтом фоне. Для обнаружения фосфолипидов, содержащих аминогруппу (фосфатидилэтаноламин, лизофосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин), пластинки опрыскивали 5%-ным раствором нингидрина в ацетоне [Rouser G., Kritchevsky G., Yamamoto A. Column chromatographic and associated procedures for separation and determination of phosphatides and glicolipids // Lipid chromatogr. Anal. - N.Y.: Dekker, 1967. Vol. 1. P. 99-162] с последующим нагреванием в течение 2-3 минут над парами воды до появления розовых пятен на белом фоне. Фосфолипиды, содержащие гидроксильные групы (фосфатидилинозит), обнаруживали с помощью периодатного реактива Шиффа [Кейтс М. Техника липидологии. М.: Мир. 1975. 221 с.], пятна липидов имели розово-сиреневый цвет. Для проявления всех фосфолипидных фракций применяли молибдатный реактив [Vaskovsky V.E., Kostetsky E.Y., Vasendin I.M. Anuniversal reagent for phospholipid analysis // J. Chromatogr. 1975. Vol. 114, N 1. P. 129-141] и реагент на основе малахитового зеленого [Vaskovsky V.E., Latyshev N.A. Modified Jungnickel’s reagent for detecting phospholipids and other phosphorus compounds on thin-layer chromatograms // J. Chromatogr. 1975. Vol. 115, N 1. P. 246- 249]. При этом липиды проявлялись в виде синих или зеленых пятен на белом фоне. Для количественного определения фракций использовали 10% раствор серной кислоты в метаноле с последующим нагреванием. Количество отдельных фракций фосфолипидов и величины общих фосфолипидов рассчитывали по методу [Vaskovsky V.E., Kostetsky E.Y., Vasenden I.M. A universal reagent for phospholid analysis // J. Chromatography. 1975. Vol. 114, no 1. P. 129-141] c принятым алгоритмом их количественного определения. Фракционное разделение нейтральных липидов осуществляли методом одномерной микротонкослойной хроматографии на силикагеле [Amenta J.S. A rapid chemical method for quantification of lipids separated by thin-layer chromatography // J. LipidRes. 1964. Vol. 5. P. 270-272]. Содержание отдельных фракций выражали в процентах от общей суммы фосфолипидов и нейтральных липидов, соответственно.
Количественные данные обрабатывали с использованием статистического пакета Instat 3,0 (GraphPad. Softwarelnc. USA, 2005) со встроенной процедурой проверки соответствия выборки закону нормального распределения. Для определения статистической значимости различий в зависимости от параметров распределения использовали параметрический t-критерий Стьюдента или непараметрический U-критерий Манна-Уитни.
Высокожировая диета в течение 30 дней сопровождалась увеличением массы животных на 29% (р<0,001), а удельная масса печени (г/100 г массы тела) увеличилась на 72% (р<0,001) по отношению к контрольным показателям (Таблица 2) Весовые характеристики крыс при действии высокожировой диеты и введении липидного комплекса анфельции и Омега3 (М±m)).
В таблице 3 приведены биохимические показатели плазмы крови крыс при действии гипержировой диеты и введении липидного комплекса анфельции и Омега 3 (М±m, ммоль/л). Видно, что в плазме крови повысился уровень триацилглицеринов почти в 2,5 раза (р<0,001) и общего холестерина на 55% (р<0,001) по отношению к контрольным показателям. При этом уровень атерогенного холестерина (ХС ЛПНП) был повышен на 13% при одновременном снижении ХС ЛПВП на 14% (р<0,05). То есть при влиянии высокожировой диеты в течение 30 сут у крыс сформировалась выраженная картина дислипидемии. Известно, что ЛПНП доставляют липиды (в основном холестерин) от печени, где они образуются, к периферическим тканям. В то же время снижается количество ЛПВП, которые выводят холестерин из клеточных мембран в печень. В связи с этим рассчитанный индекс атерогенности у этих животных был достоверно выше контрольных значений в 2,5 раза. Это указывает на нарушение липидного обмена в плазме крови под действием гипержировой диеты и является неблагоприятным фактором риска метаболического синдрома и сердечно-сосудистых заболеваний.
Из литературы известно, что нарушение липидного обмена вследствие высокожировой диеты (алиментарная дислипидемия, метаболический синдром) сопровождается развитием оксидативного стресса [Avelar Т.М.Т., Storch A.S., Castro L.A., Azevedo G.V.M.M., Ferraz L., Lopes P.F. Oxidative stress in the pathophysiology of metabolic syndrome: which mechanisms are involved? // Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial. 2015. V. 51. № 4. P. 231-239], выражающегося в дисбалансе системы перекисное окисление липидов - антиоксидантная защиты организма (ПОЛ-АОЗ). В связи с этим нами было изучено влияние липидного комплекса анфельции тобучинской на основные показатели данной биохимической системы.
Анализ состояния АОЗ под действием высокожировой нагрузки выявил накопление в крови вторичных продуктов пероксидации липидов. Уровень МДА повысился в 2 раза (р<0,001) при одновременном снижении АРА на 16% (р<0,05) и активности СОД (супероксиддисмутаза) на 55% (р<0,001) относительно контрольной группы (Таблица 4). СОД является ключевым ферментом, выступающим как первая линия защиты против свободных радикалов и, как следствие это приводит к их быстрому расходованию и истощению. В тоже время активность глутатионпероксидазы (ГП), катализирующей восстановление гидрогенпероксида (Н2О2) и органических перекисей в присутствии восстановленного глутатиона (Г-SH), повысилась на 17% (р<0,001). Высокая активность глутатионпероксидазы при низком содержании восстановленного глутатиона указывает на присутствие избыточного количества продуктов ПОЛ (перекисное окисление липидов), (Кулинский В.И., Колисниченко В.С. Система глутатиона. I. Синтез, транспорт глутатионтрансферазы, глутатионпероксидазы // Биомед. химия. 2009. Т. 53, № 3. С. 255-277), что подтверждается значительным увеличением уровня МДА и снижением содержания восстановленного глутатиона в плазме крови на 41% (р<0,001) на 30 сутки эксперимента. Все это указывает на исчерпание резерва адаптационных возможностей организма. Активность другого фермента глутатионового звена - глутатионредуктазы (ГР) понизилась на 13% (р<0,05), что является вполне закономерным, так как данный фермент активно расходуется для синтеза восстановленного глутатиона в присутствии НАДФН.
На основании изложенного выше следует, что выполненная экспериментальная модель гиперхолестеринового рациона с высокожировой диетой в период 30 сут сопровождалась развитием алиментарной дислипидемии с нарушением липидного метаболизма. Это проявлялось:
• в увеличении массы печени за счет жировой инфильтрации гепатоцитов;
• в увеличении уровня триацилглицеринов, общего холестерина, величины ХС ЛПНП и снижении ХС ЛПВП в плазме крови;
• рассогласованием основных параметров эндогенной системы антиоксидантной защиты, приводящим к снижению общей антирадикальной активности плазмы крови.
Исследования по применению липидного комплекса анфельции и препарата сравнения Омега-3 при введении их в высокожировую диету показали четкую направленность к нормализации исследуемых показателей по сравнению с таковыми во 2 группе (высокожировая диета). Следует отметить выраженную тенденцию к восстановлению весовых характеристик животных (табл. 2): снижение массы тела относительно 2 группы на 16% (р<0,001) при введении экстракта анфельции и на 9% (р<0,01) при введении Омега-3. Однако по отношению к контрольным показателям удельная масса печени у животных 3 группы (анфельция) оставалась несколько повышенной (на 11%; р<0,05), тогда как у животных 4 группы (Омега-3) она была выше контроля в 1,5 раза (р<0,01).
Важно отметить, что в плазме крови крыс, получавших липидный комплекс анфельции, в содержании общего холестерина, ХС ЛПВП и ХС ЛПНП не было выявлено достоверных отличий от контроля. Соответственно индекс атерогенности у этих животных оставался в пределах нормы. В то же время у животных, получавших препарат Омега 3, содержание общего холестерина было выше контроля на 18% (р<0,001), а ХС ЛПВП ниже на 10% (р<0,001). При этом индекс атерогенности был повышен на 55% (р<0,001) относительно контроля.
Состояние антиоксидантной системы у животных 3-й и 4-й групп, получавших липидные комплексы, характеризовалось положительной динамикой и тенденцией к восстановлению исследуемых показателей на фоне высокожировой нагрузки (Таблица 4), что свидетельствует о предотвращении развития процессов липопероксидации. Подтверждением ингибирования процессов ПОЛ является снижение содержания МДА при одновременном повышении уровня АРА в плазме крови по сравнению со 2-й группой. У животных, получавших липидный комплекс из анфельции (3-я группа), в активности антиоксидантных ферментов (СОД, ГР и ГП) не было выявлено достоверных отличий от контроля в противоположность животным 4-й группы (омега), у которых активность СОД была достоверно ниже.
Отмечали существенное повышение уровня Г-SH в печени животных 3-й группы (на 40%; Р<0,001), получавших липидный комплекс из анфельции, по сравнению со 2-й группой. Также следует отметить, что показатели антиоксидантной системы у животных с введением в рацион комплекса Омега все еще достоверно отличались от контрольных значений (МДА, СОД, Г-SH) в отличие от соответствующих показателей в группе с анфельцией, что может указывать на более выраженный эффект ПНЖК n-3, находящихся в нативной форме природного липидного комплекса, по сравнению с очищенным препаратом Омега-3.
Таким образом, введение липидного комплекса как анфельции так и препарата Омега-3 способствовало коррекции нарушений, вызванных высокожировой диетой в течение 30 суток, однако восстановление изученных параметров под действием липидного комплекса анфельции оказалось более эффективным. По-видимому, основной причиной наблюдаемого различия является то, что биологической активности ПНЖК семейства n-3 (эйкозопентаеновой и докозогексаеновой кислот), входящих в состав препарата Омега-3, противопоставлен многокомпонентный нативный липидный комплекс анфельции. Большая эффективность, по мнению заявителя, обусловлена наличием в его составе всех известных классов фосфолипидов морского происхождения, а также комплексом гликолипидов, которые представляют собой важный источник ПНЖК. Жирнокислотный состав липидного комплекса анфельции отличается более широким спектром жирных кислот, в состав которого помимо ПНЖК n-3, входят моноеновые жирные кислоты и ПНЖК n-6.
Таким образом, липидная фракция экстракта анфельции тобучинской Ahnfeltia tobuchiensis обладает выраженным липидкоррегирующим действием при алиментарной дислипидемии. Механизм липидкоррегирующего действия липидного комплекса анфельции обусловлен восстановлением нарушенных алиментарной нагрузкой метаболических реакций печени:
• снижает уровень триацилглицеринов, общего холестерина, ХС ЛПНП и повышает уровень ХС ЛПВП в плазме крови;
• активирует систему эндогенной антиоксидантной защиты организма и снижает накопление токсичных продуктов липопероксидации.
По исследованным показателям липидный комплекс анфельции проявляет большую эффективность в восстановлении липидного метаболизма.
Применение в условиях гиперхолестериновой и высокожировой диеты липидного комплекса анфельции тобучинской Ahnfeltia tobuchiensis (Kanno et Matsubara) Makijenko превосходит по своей терапевтической эффективности эталонный препарат сравнения омега-3 по способности восстанавливать массу тела и печени животных до контрольных значений и по эффективности снижения уровня в крови триглицеринов, общего ХС и индекса атерогенности на фоне увеличения содержания ХС ЛПВП.
Таким образом, обнаруженное, ранее неизвестное, свойство липидной фракции экстракта морской красной водоросли Ahnfeltia tobuchiensis (Kanno et Matsub.) Makijenko восстанавливать нарушенное соотношение холестерина липопротеинов низкой и высокой плотности, а также триацилглицеринов и общего холестерина в плазме крови, позволяет расширить ассортимент липидкорригирующих средств с использованием новых природных источников - морской водоросли Ahnfeltia tobuchiensis.