Высокочувствительные технологии молекулярной диагностики вирусных и вироидной инфекций картофеля

ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ и ВИРОИДНОЙ ИНФЕКЦИЙ КАРТОФЕЛЯ

Ю.Ф.ДРЫГИН С.Н. ЧИРКОВ О.А. КОНДАКОВА Р.А. ЗИНОВКИН П.А. ИВАНОВ А. Н. БЛИНЦОВ ЕС. ТАВРЮ ШИНА

Московский государственный университет А.В. ЖЕРДЕВ НА. БЫЗОВА Б. Б. ДЗАНТИЕВ

Институт биохимии им. А.Н. Баха И.Г. АТАБЕКОВ

Московский государственный университет

Одна из главных причин хронически низкой урожайности картофеля в РФ — практически повсеместное использование семенного материала, зараженного вирусными, вироидными и бактериальными патогенами. Контроль его качества, начиная с элиты и при последующем репродуцировании недостаточно эффективен, поскольку проводится только путем визуальной оценки. Формирование рынка семенного картофеля в России вызвало необходимость коренного улучшения контроля его качества и сертификации. На сегодняшний день система сертификации оригинального (предбазисного) семенного материала предусматривает его обязательную лабораторную проверку на зараженность возбудителями наиболее вредоносных вирусных и бактериальных болезней в испытательных лабораториях, аккредитованных для выполнения такого рода работ. Диагностика вирусных и ви-роидных заболеваний, помимо сертификации семян, в массовых масштабах применяется для контроля процесса оздоровления растений, фитосанитарного мониторинга посевов и карантинной проверки импортируемого посадочного материала.

Современные методы лабораторной диагностики основаны на высокой специфичности молекулярного взаимодействия антител с антигеном или нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) между собой. Высокая их чувствительность обеспечивается усилением (в миллионы раз) сигнала взаимодействия молекул специальными биохимическими системами (ферментными в ИФА и множительными в ПЦР). Разработано несколько технологий молекулярной диагностики вирусных и вироидных заболеваний картофеля, которые применяются или могут быть использованы в элитном семеноводстве.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Сегодня в странах с развитым картофелеводством, в том числе и в России, лабораторная диагностика вирусной инфекции семенного материала осуществляется в ос-

новном с помощью ИФА. Этот метод обладает высокой специфичностью и чувствительностью, позволяющей количественно определять вирусы в экстракте вплоть до концентрации 1 нг/мл. Важнейшее его достоинство — высокая производительность, которая дает возможность проанализировать сотни образцов за короткое время (2 суток). Иммуноспе-цифические реагенты, диагностические наборы и приборы для выполнения ИФА производят многие фирмы и широко представлены на рынке.

Обычно в роли ферментной метки в ИФА выступает щелочная фосфатаза или пероксидаза хрена. Исследователи химического и биологического факультетов МГУ им. М.В. Ломоносова разработали усовершенствованный «сэндвич»-вариант ИФА, получивший название «Пиротест», в котором используется конъюгат антител с неорганической пирофосфатазой Е.соИ [2, 7, 12, 15]. Этот метод позволяет выявлять наличие вирусов, присутствующих в экстрактах в концентрации 5... 10 нг/мл. В зараженных растениях картофеля их содержание, как правило, значительно выше, поэтому «Пиротест» можно использовать на всех стадиях производства оздоровленного семенного картофеля. Следует отметить, что оптическая плотность ярко окрашенного продукта ферментативной реакции в положительной пробе в 7-20 раз выше, чем в отрицательной. Это дает возможность достоверно оценивать результаты анализа и без спектрофотометра. Важные особенности «Пиротеста» — высокая стабильность фермента и отсутствие у субстрата (пирофосфат натрия) токсических и канцерогенных свойств.

Использование наборов, содержащих все необходимое дня выполнения анализов, существенно облегчает работу семеновода в те сжатые сроки, которые обычно отводятся для лабораторной диагностики вирусных инфекций. Наборы «Пиротест» разработаны для диагностики 6 вирусов картофеля (X, 8, М, У, А и ВСЛК).

Метод иммунохроматографии. Для большинства практически значимых вирусов и вироида картофеля разработаны методы молекулярной диагностики, основанные на выявлении вирус-специфического белка (иммунохимические методы) или вирусных нуклеиновых кислот [ПЦР, РНК(ДНК) зонды]. Они характеризуются исключительно высокой чувствительностью, которая позволяет выявлять минимальные количества вируса. Как уже отмечалось, инструментальные методы анализа, согласно действующей системе сертификации, надлежит использовать для лабораторной проверки оригинального семенного материала (микрорастения, мини-клубни, первое полевое поколение из мини-клубней и супер-суперэлита). В то же время, они достаточно трудоемки, сложны, занимают много времени, требуют высококвалифицированного персонала и дорогостоящего оборудования, что ограничивает

применение таких методов. Сельхозпроизводителям нужны простые и доступные методы, позволяющие проводить анализы в слабооборудованных лабораториях, полевых и домашних условиях. Одно из перспективных технических решений такой задачи — иммунохроматография, основанная на использовании пористых мембранных носителей (тест-полосок), на которые в определенных зонах нанесены иммунореагенты (антитела, их конъюгаты с окрашенными коллоидными частицами и др.), способные взаимодействовать с детектируемым вирусом. При погружении пробной полоски в экстракт, содержащий вирус, последний мигрирует с фронтом жидкости вдоль поверхности мембраны. Здесь он вначале образует иммунохимичес-кие комплексы с конъюгатом (антитела к вирусу, меченные коллоидным золотом), которые улавливаются и концентрируются в зоне с иммобилизованными антителами за счет образования тройного комплекса «иммобилизованные антитела — вирус — конъюгат». В результате в зоне накопления связанных с вирусом частиц коллоидного золота формируется окрашенная полоса. При отсутствии вируса в экстракте конъюгат свободно проходит через иммобилизованные антитела к вирусу и окрашенная полоса в аналитической области отсутствует. Функциональные свойства тест-по-лоски проверяются с помощью контрольной зоны, в которой находятся антивидовые антителами, связывающими коллоидный конъюгат независимо от присут-вия вируса в образце. Таким образом, о наличии вируса и его концентрации свидетельствуют количество и интенсивность окрашенных зон, образовавшихся на тест-полоске (рис. 1).

Важнейшие достоинства

I

иммунохроматографии — высокая чувствительность и скорость (исчисляемая минутами) анализа, простота подготовки образца и выполнения анализа, не требующего лабораторного оборудования или реагентов. В результате совместной работы кафедры вирусологии биологического факультета МГУ им. М.ВЛомоносо-ва и лаборатории иммунобио-химиии Института биохимии РАН были разработаны тест-полоски для экспресс-анали-женного картофеля сорта за вирусов X и У картофеля. С Невский; В — экстракт из

м и

1

А Б В Г

Рис. 1. Определение вируса У картофеля методом иммунохроматографии: А — препарат вируса У картофеля (5 мкг/мл); Б — экстракт из листьев зара-

листьев здорового растения картофеля; Г— экстракт из листьев картофеля сорта Невский, зараженного ХВК. Аналитическая область отмечена стрелкой.

альную оценку. Кроме того, этот метод можно применять для экспресс-анализа импортируемого картофеля на карантинные и другие особо вредоносные вирусы, а также в личных, подсобных, мелких фермерских хозяйствах, в которых сегодня сосредоточено основное производство картофеля в России.

МГА-ИФА технология. На сегодняшний день в ряде регионов РФ наиболее распространенное и экономически самое опасное заболевание, вызываемое вироидом веретеновидности клубней картофеля (ВВКК) [ 13]. ВВКК — это небольшая (около 360 нуклеотидов) кольцевая молекула РНК с сильно развитой вторичной структурой [14]. Вироиды не кодируют белков и поэтому не определяются с помощью им-муноферментного анализа. Их можно обнаружить методами, основанными на молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот. Обычно диагностические фирмы для детекции вироидов используют метод молекулярной гибридизации с кРНК-зондами, меченными дигоксигенином, или ПЦР.

Мы разработали технологию МГА-ИФА (рис. 2), в которой для выявления ВВКК используют кДНК-

их помощью указанные патогенны определяются в экстракте из зараженного растения картофеля в концентрации до 0,2 мкг/мл. Результат анализа можно получить через 5 мин.

По нашему мнению, наиболее эффективно тест-полоски можно использовать, например, при сертификации элитного и репродукционного семенного материала, что будет существенно дополнять визу-

Рис. 2. Схема технологии МГА-ИФА

зонды, меченные хлордиэтилентриаминоплатиной хлористой — (диен)Р1. ДНК-зонд синтезируют на основе рекомбинантной плазмиды, содержащей вставку кДНК длиной 300 и более нуклеотидов (фрагмент ДНК, комплементарный РНК вироида и способный с ней специфически гибридизоваться).

Рекомбинантные ДНК получают методами генной инженерии, клонируют в бактериях и выделяют в препаративных количествах из размноженной бактериальной массы.

Для получения зонда мы метим рекомбинантную плазмиду комплексным соединением платины — (диен) [4]. Выбор этой метки вызван чрезвычайной простотой процедуры мечения, заключающейся в обыч-

ном смешивании ДНК с (диен)Р1, и количественным их связыванием (таким образом отпадает необходимость дополнительной очистки зонда). При этом наличие метки практически не отражается на специфической гибридизации кДНК-зонда с вироидной РНК. Еще одно важное преимущество диен-платиновой метки — высокая иммуногенность ее комплекса с ДНК, что позволяет получать аффинные антитела с высокой специфичностью, узнающие любую ДНК, меченную (диен)Р1.

Технология МГА-ИФА включает несколько этапов. Она начинается с подготовки образца к анализу, а именно, с депротеинизаци и выделения нуклеиновых кислот клеточного экстракта.

Сегодня для выделения нуклеиновых кислот из зараженных растений применяют токсичные реагенты (фенол, хлороформ и гуанидинизотиоцианат). Мы разработали новый метод, в котором оно осуществляется с использованием водорастворимого нетоксичного хаотропного агента — НТХА (находится на стадии патентования) и дешевого доступного сорбента, что заметно упрощает подготовку образцов к анализу. Выходы РНК, а также их спектральные и электрофоретические характеристики при этом соответствуют высокоочищенным вирусным РНК и идентичны для препаратов, полученных новым методом и путем фенольной депротеинизации (рис. 3).

РНК ХВК РНК втм

А

#

В

т

т

9

1 2

3

4

5

Рис. 4. Определение ВВКК с использованием диен-платино-вого ДНК-зонда в препаратах вироидной РНК (ряды 2-4), полученных из листовой ткани картофеля (ряды / и 5 — из здоровых растений); колонка А — фенольным методом; В— гунидин-тиоцианатным методом с последующей сорбцией РНК на силикагель; С — с применением НТХА.

Сравнение результатов анализов методом МГА-ИФА препаратов, полученных разными способами (фенольная депротеинизация с использованием гуани-динтиоцианата [9], сорбция на силикагель [11] и с помощью НТХА) показало, что эффективность экстракции и определения вироидной РНК, выделенной из одинакового количества листовой ткани картофеля, совпадает (рис. 4).

Технология МГА-ИФА позволяет выявить до 100 молекул РНК вироида на клетку [3, 5]. Последние несколько лет она успешно используется для практической диагностики вироида в элитном семеноводстве картофеля РФ.

МГА-ИФА технологию, первоначально разрабатывавшуюся для диагностики вироида, можно применять для определения вирусов картофеля (рис. 5).

Количество рекомбинантной Количество суммарной

плазмиды в положительном контроле (1), ПГ РНК в образцах (2-5), иг

1 2 3 4 5

4 *9 а ф 2000

20 хА 400

юо # 200

500 #' ** Ш юо

12 3 4

Рис. 3. Сравнение электрофоретической подвижности препаратов РНК ВТМ и РНК ХВК, выделенных из очищенных вирусов с помощью НТХА (/ и 3) и методом фенольной депротеинизации (2 и 4).

Рис. 5. Определение вируса X картофеля (ХВК) технологией МГА-ИФА 1 — рекомбинантная плазмида риС-19, содержащая вставку кДНК ХВК, пг. 2-5 — препараты суммарной РНК, полученные из здоровых (2, 4) и зараженных ХВК (3, 5) растений картофеля (сорт Невский) фенольным методом (4, 5) и с помощью НТХА (2, 3). Препараты суммарной РНК из анализируемых пробирочных растений картофеля наносили на нитратцеллюлозную мембрану и фиксировали облучением УФ-светом.

На сегодняшний день получены кДНК-копии РНК вирусов: X, У, А, Б, М, аукуба-мозаики картофеля, ВСЛК, ВМВК. Созданы и клонированы рекомбинантные плазмиды со вставками их кДНК.

Следует отметить, что МГА-ИФА технология имеет ряд важных преимуществ перед традиционной диагностикой вирусов с помощью серологических методов. В частности, она не требует получения вирусного антигена, иммунизации животных для получения специфических к каждому вирусу антител, так как их детекция осуществляется в конечном итоге с помощью универсальных антител к (диен)Р1>ДНК.

Технология ОТ-ПЦР. Для проверки на зараженность вирусами и вироидом коллекционных сорто-образцов необходима предельно высокая чувствительность определения РНК патогена с большой степенью надежности. Это приобретает особую важность в связи с началом работ по созданию в РФ ге-нобанка здоровых сортов картофеля [6]. Один из наиболее чувствительных методов обнаружения молекул нуклеиновых кислот — полимеразная цепная реакция (ПЦР или ОТ-ПЦР), которая позволяет размножить копию молекулы нуклеиновой кислоты патогена в анализируемом препарате в десятки миллионов раз. Его недостатки — высокая стоимость и трудность идентификации размноженной вирусной ДНК из-за присутствия артефактных зон.

Для оптимизации метода ОТ-ПЦР исследование проводили на модельной системе с высокоочшцен-ными образцами РНК ХВК, а затем на тотальных препаратах нуклеиновых кислот, полученных из инфицированных и здоровых пробирочных растений. В ка-

честве затравок для реакций обратной транскрипции (ОТ) РНК ХВК использовали комбинацию олигонуклеотидов РУХ5755+/РУХ6105-. В этом случае нам уда-лось детектировать до 1 фг вирусной РНК, что соответствует уровню 300 молекул вирусной РНК для реакции ОТ и всего лишь 30 молекул кДНК в полимеразной цепной реакции (рис. 6).

1

м

Ilf

»-«# «м|

рядок, но ее достаточно для детекции с помощью комбинированной технологии ОТ-ПЦР — МГА-ИФА одной молекулы РНК фитопатогена в анализируемой пробе.

Для сравнения чувствительности используемых технологий молекулярной диагностики препараты РНК, полученные с помощью НТХА, амплифицировали по технологии ОТ-ПЦР и продукты анализировали по флуоресценции в геле с помщью МГА-ИФА и технологии ОТ-ПЦР — МГА-ИФА (рис. 8). Результаты исследований показывают, что по чувствительности детекции патогена перечисленные методы можно расположить следующим образом: МГА-ИФА<ОТ-ПЦР « МГА-ИФА — ОТ-ПЦР (сравните пробы 10, 14, 15).

Накопленный опыт использования методов молекулярной диагностики в семеноводстве картофеля показывает, что анализ большого числа образцов экономически выгодно проводить в 2 этапа. Сначала простым, дешевым способом ИФА или МГА-ИФА для выбраковки сильно зараженных образцов, а ос-

Рис. 6. Детекция продуктов ОТ-ПЦР электрофорезом в 2 % агарозном геле. 1 — отрицательный контроль ОТ; 2 — 0,03 фг; 3 — 0,1 фг; 4 — 1 фг; 5— 10 фг; 6— 100 фг РНК ХВК; М — маркеры молекулярной массы (GeneRuler lkb Ladder). Амплифицирован-ную ДНК определяли по ее флуоресценции в комплексе с бромистым этидием.

Кроме того, мы разработали комбинированную технология ОТ-ПЦР — МГА-ИФА, позволяющую надежно идентифицировать ДНК (исходно РНК) фитопатогена (благодаря высокой специфичности реакции молекулярной гибридизации) и добиваться высокой чувствительности (за счет усиления сигнала методом ИФА).

При гибридизации ПЦР продуктов, фиксированных на нитратцеллюлозной мембране со специфическим кДНК-зондом, технологией МГА-ИФА была достигнута чувствительность менее 0,1 фг (рис. 7),

1 2 3 4 5 6 7 8 с14 М 9 10 111213 14 15 16

Б

Рис. 7. Детекция вирусной РНК комбинированной технологией диагностики ОТ-ПЦР — МГА-ИФА. 1 — 10 фг РНК ХВК в исходной пробе для ОТ-ПЦР; 2 — 1 фг РНК ХВК; 3 — 0.1 фг РНК ХВК; 4 — отрицательный контроль ОТ.

что соответствует уровню детекции всего 30 молекул вирусной РНК в исходной реакции ОТ или 3 молекул кДНК после их размножения с помощью ПЦР.

Для ОТ-ПЦР анализа РНК вироида амплифицировали после обратной транскрипции с праймером Таким образом, совокупность методов усиления сигнала в комбинированной технологии ОТ-ПЦР — МГА-ИФА позволяет экспериментально обнаруживать одиночные молекулы РНК фитопатогенов в анализируемой пробе. Чувствительность детекции вирусных и вироидной РНК в препаратах, выделенных из растительной ткани, падает практически на по-

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 13 14 15 16

к

«•ммви* т

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14 15 16

Рис. 8. Сравнительный анализ чувствительности диагностики вироидной

МГА-ИФА (б) и ОТ-ПЦР-МГА-ИФА (в) препаратов суммарной РНК, полученных из пробирочных растений коллекционного картофеля. ЮААААААОААООССОСТСООАООА-геу, а затем полимеразной цепной реакцией с праймерами ОААААААСААООСООСТСООАООА-геу и ОССОАС.АООАОТААТТС-Согу/агс!. Изучали препараты РНК, полученные из 30 мг пробирочных растений картофеля. Ампли-фицированные ДНК определяли по флуоресценции с бромистым этидием в геле после электрофореза в 1 % агарозном геле.

Для анализа технологией МГА-ИФА на нитратцеллюлоз-ный фильтр наносили 1 мкл каждой пробы суммарной РНК (из 60 мкл), а для ОТ-ПЦР-МГА-ИФА — соответствующую 1/500 мкл тех же проб.

На рис. 8а (14 — положительный контроль — рекомбинантная плазмида рОЕМ-ЗХ(Р8ТУс1)п; в верхнем ряду на рис. 86 и 8в (положительный внутренний контроль) нанесены серийные разведения плазмиды рОЕМ-Эг(Р5ТУй) в ряду 200; 66,7; 22,2; 7,4; 2,5;

0,8; 0,3; 0,1 пг. Далее следуют препараты РНК из пробирочных растений сортов Удача (1), Голубизна (2), Ильинский (3), Прайса (4), Луговской (5), Брянский (6), Скороплодный (7), Жуковский ранний (8), Брянская новинка (9), Осень (10), Рождественский (11), Петербургский (12), Елизавета (13) и РНК из инфицированных ВВКК томатов (14-15).

Проба 16 на рис. 8а — препарат РНК из инфицированных ВВКК томатов, на рис. 86 (негативный контроль) — из картофеля сорта Удача, на рис. 8в (позитивный контроль) — из сильно зараженного томата.

тавшиеся образцы — с помощью более мощных ПЦР дни, начиная от подготовки объекта к анализу и за-

или ОТ-ПЦР — МГА-ИФА методов. канчивая регистрацией полученных данных, чтобы

На сегодняшний день молекулярная диагноста- сделать возможным их массовое применение,

ка вирусных и вироидных инфекций достигла пре- Авторы выражают глубокую благодарность колле-

дельной чувствительности, когда в соответствующих гам из ВНИИ картофельного хозяйства имЛГЛорха

условиях реальным становится определение единич- и ВНИИ фитопатологии за помощь в постановке этого

ных молекул фитопатогена в целом растительном исследования.

организме. Дальнейшее их совершенствование будет Работа поддержана грантом РФФИ N2 06-04-

определяться техническим упрощением каждой ста- 08290.

Литература.

1. Анисимов Б.В., Усков А.И., Симаков ЕА. и др. (2005). Методика проведения полевых обследований и послеуборочного контроля качества семенного картофеля. М.: «Икар»,

2. Бобкова А.Ф., Блинцов А.Н, Чирков С.Н. (2003). Пиротест — метод иммуноферментного анализа вирусов картофеля. Аграрная Россия, 3:23 — 27.

3. Дрыгин Ю.Ф., Мусин С.М., Кондакова ОА., Савенков Е.И., Соломатин С.В.,Можаева К.А., Атабеков И.Г. (1996), Молекулярная диагностика зараженности оздоровленных сортообразцов картофеля Российской Федерации вироидом веретеновидности клубней. Доклады РАСХН 6:24-25.

4. Киселева В.И., Турчинский М.Ф., Колесник Т.Б., Поверенный А. М. (1994). Использование диэтилентриаминхлорплатины в гибридиза-ционном анализе специфических последовательностей нуклеиновых кислот. Биоорган, хим. 20:14-20.

5. Кондакова, О А., Дрыгин, Ю.Ф. (1999). Диагностика вироидного заболевания картофеля зондами (диен)Р1-ДНК. Биотехнология 4: 83-90.

6. Симаков ЕА., и др. О совершенствовании научного обеспечения производства оригинального, элитного и репродукционного семенного картофеля в России (2004). М., ВНИИКХ.

7. Чирков С.Н., Новиков В.К., Бобкова А.Ф., Атабеков И.Г. (2000). Пиротест — усовершенствованный вариант иммуноферментного анализа вирусов картофеля. Защита и карантин растений, 12:15-16

8. Чирков С.Н., Осипов А.П., Атабеков И.Г. (2002). Наборы «Пиротест» для лабораторной диагностики вирусов картофеля. Картофель и овощи. 1:29.

9. Chomczynski, P. and N. Sacchi (1987). Single-step method of RNA isolation by acidguanidinium thiocyonate-phenol-chloro/orm extraction. Anal Biochem. 162: 156—159.

10. Clark, M.F. and A. N Adams (1977). Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection ofplant viruses. J. gen. Virol. 34:475—483.

11. Malinowski, T. (1996). In: H.-WDehne, GAdam. etal. (Eds.) Developments in Plant Pathology, vol.ll, KluwerAcad. Publishers, .445-448.

12. Mizenina, О. А., О. V. Borisova, V. К Novikov, O. A. Evtushenko, A. A. Baykov and J. G Atabekov (1991). Inorganic pyrophosphatase from E. coli as a label for the detection ofplant viruses by ELISA. J. Phytopathol. 133:278-288.

13. Mozhaeva, K.A., NVGirsova, N. V. and T.B. Kastalyeva (2002). Main causes of Potato Spindle Tuber Viroid distribution in seed potato in Russia in 1990s. J. Russ. Phytopath. Soc. 3: 39-42.

14. Semancik, J.S. Viroids and Viroidlike Pathogens (1987). (Semancik, J. S., Ed.). CRC Press, Boca Raton, FL 127-160.

15. Surguchova N., Chirkov S., Atabekov J. (1998) ELISA-test bei Nepoviren mit einem neuen Enzym — einer anorganischen Pyrophosphatase aus Escherichia coli. Arch.Phytopath.Pflanz., 31: 535-541.

ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРИМЕНЕНИЯ УДОБРЕНИЙ В КАРТОФЕЛЕВОДСТВЕ РОССИИ

А. В. КОРШУНОВ Л.С. ФЕДОТОВА

ВНИИ картофельного хозяйства им. А.Г.Лорха

НА. ШИЛЬНИКОВ

НИ. АКАНОВА

М.М. ОВЧАРЕНКО

НИИ агрохимии им. Д.Н.Прянишникова

В российском земледелии существует неадекватное суждение об оценке экологических последствий химизации сельского хозяйства, которое сильно преувеличено в сторону ее издержек.

Конечно, экологический риск необдуманного применения средств химизации существует. Однако рациональное использование удобрений не представляет существенной опасности для окружающей среды. Гораздо хуже, если элементы минерального питания не

будут вноситься или их дозы окажутся необоснованно малы. Даже сторонники органобиологического земледелия признают необходимость минеральных удобрений для восполнения выноса питательных элементов с урожаями сельскохозяйственных культур. Поэтому для современного картофелеводства решение экологических проблем применения агрохимикатов заключается в оптимизации их доз, а не в отказе или минимальном применении. Именно рациональные дозы минеральных удобрений, химическая и биологическая мелиорация в совокупности с оптимальной агротехникой и севооборотами, адаптированными к почвенно-климатическим условиям, способствуют поддержанию устойчивости и высокой продуктивности агроценозов.

Известный немецкий ученый в области биологического растениеводства Г.Кант [2] допускает разумное использование минеральных удобрений и пестицидов. По его утверждению, агроландшафт выпол-