Способ прогнозирования преждевременного разрыва плодных оболочек в сроке от 22 до 28 недель беременности
METHOD FOR PREDICTING PREMATURE RUPTURE OF MEMBRANES IN THE PERIOD FROM 22 TO 28 WEEKS OF GESTATION

Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования преждевременного разрыва плодных оболочек (ПРПО) в сроке 22-28 нед. беременности.
Преждевременный разрыв плодных оболочек (ПРПО) - нарушение целости оболочек плода и излитие околоплодных вод до начала родовой деятельности независимо от срока беременности.
На долю ПРПО при недоношенной беременности приходится 20-40%, что сочетается с 30-40% преждевременных родов. Роды до 28 недель беременности (или экстремально ранние преждевременные роды) являются глобальной проблемой здравоохранения [March of Dimes, PMNCH, Save the Children, WHO. Born Too Soon: The Global Action Report on Preterm Birth. Geneva: World Health Organization; 2012.: http.//www.who.int/pmnch/media/news/2012/201204_borntoosoon-report.pdf.] и осложняют примерно 0,4-0,7% всех беременностей. Это состояние связано с очень высоким уровнем неонатальной смертности, а также с повышенным риском как краткосрочной, так и долгосрочной и неонатальной заболеваемости. Среди детей, рожденных в сроке 22 - 24 недели гестации смертность в течение нескольких недель составляет 97-98%, при этом только 1% выживает без нарушений развития нервной системы. Среди рожденных в сроке 24 - 25 недель 55% новорожденных выживают, но только 32% не имеют неврологических дефицитов в возрасте 18-22 месяцев жизни [Noelle Younge et al., 2017]
Согласно данным литературы, вопрос об этиологии ПРПО не имеет однозначного ответа. На сегодняшний день именно инфекционно-воспалительный фактор является наиболее изученным и распространенным компонентом патогенеза ПРПО. Косвенным доказательством значимой роли инфекционно-воспалительного фактора является высокая частота развития хориоамнионита у беременных с ПРПО. Гистологический хориоамнионит наблюдается почти в половине всех случаев ПРПО, возникающих до 34 недель беременности, а частота клинического хориоамнинита даже при коротком латентном периоде (менее 7 дней в 75,7%) составляет 17,8% [Yu Н. et al., 2015].
Если говорить о видовой структуре возбудителя, то по-прежнему вопрос диагностики актуален, и связано это не только с самим фактом верификации возбудителя, сколько с формированием штаммов, резистентным к антибактериальным препаратам. Работы последних лет показали, что культуральные исследования реже выявляют микроорганизмы (34%) по сравнению с методом полимеразной цепной реакции (45%) [DiGiulio D.B. et al., 2010], а в случаях с микроорганизмами класса Микоплазмы, использование только бактериологического исследования может привести к ложноотрицательным результатам при исследовании амниотической жидкости в 91% случаев [Oh K.J. et al., 2010; Kasper D.C. et al., 2011]. Данный факт особенно важен, так как микоплазмы по данным Romero R. и соавт. являются одними из наиболее часто выявляемых микроорганизмов у женщин с ПРПО [Romero R. et al., 2015].
К предполагаемым этиологически важным микроорганизмам, обнаруживаемым при ПРПО относят также Sneathia amnii [Romero R. et al., 2015], коагулазо-негативный Staphylococcus, Streptococcus viridans [ M. et al., 2008]. Кроме того, стоит отметить следующую закономерность: чем меньше гестационный возраст при ПРПО, тем выше вероятность микробного воспаления [Romero R. et al., 2015].
Несмотря на частое выявление инфекционного фактора, в большинстве случаев причина ПРПО и связанных с ним перинатальных осложнений остается неизвестной. Основная проблема, с которой столкнулись исследователи при попытках анализировать генетический материал в биологическом образце (например, в вагинальной жидкости), состояла в том, чтобы отличить бактериальную ДНК от всех прочих - в первую очередь от ДНК собственных клеток организма. Эту проблему удалось решить только благодаря открытию американского ученого Карла Ричарда Везе (Carl Woese), сделанному в конце прошлого столетия (1985): рибосомальная РНК (рРНК) уникальна для каждого вида ядерных и безъядерных клеток, в том числе и бактерий, и к тому же находится вне влияния естественного отбора, а потому ее гены наиболее стабильны [Goldenfeld N., Расе N.R. Carl R. Woese, 2013]. Компонент 16S субъединицы бактериальной рРНК оказался наиболее рациональным для анализа потому, что его нет ни у эукариот, ни у архей - он характерен только для бактерий. Благодаря методу метагеномного секвенирования 16S рРНК появилась возможность раннего прогнозирования преждевременного разрыва плодных оболочек.
Актуальным представляется дальнейшее выявление ранних диагностических маркеров ПРПО с целью проведения своевременных лечебных мероприятий. Ранняя, доклиническая диагностика и прогнозирование развития ПРПО позволит оптимизировать тактику ведения беременных, что поможет своевременно выявить данное осложнение и улучшить перинатальные исходы.
Из существующего уровня техники известен способ прогнозирования преждевременного разрыва плодных оболочек путем исследования содержимого влагалища, отличающийся тем, что с целью повышения точности прогноза определяют активность нейроминидазы и при величине ее, равной 2,5 ммоль/л и выше, прогнозируют преждевременный разрыв плодных оболочек (патент РФ №2014601, 1994.06.15).
Недостатки данного способа: метод забора влагалищного содержимого не стандартизирован; срок гестации для забора содержимого влагалища и сроки беременности, в которые прогнозируется преждевременное излитие околоплодных вод - от 30 нед.
Известен способ прогнозирования преждевременного излития околоплодных вод у беременных путем исследования биологического материала, отличающийся тем, что у женщин в сроке гестации 32-36 недель в сыворотке крови определяют уровень IL-8 и при его значении, равном или менее 15,4 нг/мл, прогнозируют преждевременное излитие околоплодных вод (патент РФ№2405453, опубл. 10.12.2010).
Недостатком данного технического решения является то, что прогноз ПРПО путем исследования периферической венозной крови у беременных женщин осуществляется в сроке гестации 32-36 недель, и таким образом, не позволяет прогнозировать сверхранние и ранние преждевременные роды. Что значительно снижает значение данного метода для выбора акушерской тактики именно в данный период беременности.
Известен способ прогнозирования преждевременных родов путем совместного определения внеклеточной ДНК и интерлейкина-8 в плазме периферической крови, отличающийся тем, что в данном методе используют одновременное измерение общего количества внеклеточной ДНК методом полимеразной цепной реакции в реальном времени и IL-8 иммуноферментным методом в плазме крови у беременных женщин на 22-36 неделях гестации для определения переменной Р по формуле:
Р = 1/(1+ехр(-(-4,1+4×Х1+0,0001×Х2))), где
X1 - концентрация IL-8 в плазме периферической крови, выраженная в пг/мл;
Х2 - концентрация овДНК в плазме периферической крови, выраженная в ГЕ/мл,
при Р>0,5 преждевременные роды произойдут; при Р≤0,5 преждевременные роды не произойдут (патент РФ№2682713, опубликован 21.03.2019).
Недостатком данного технического решения_является то, что прогноз ПРПО осуществляется в сроке гестации 32-36 недель, и таким образом, не позволяет прогнозировать сверхранние и ранние преждевременные роды. Что значительно снижает значение данного метода для выбора акушерской тактики именно в данный период беременности.
Известен способ прогнозирования преждевременных родов у женщин с угрозой прерывания беременности, включающий исследование крови, отличающийся тем, что в сыворотке крови беременной в 18-22 нед определяют иммуноферментным методом уровень ИЛ-33 и при его значении выше 0,98 пг/мл прогнозируют исход беременности в виде преждевременных родов (патент №2710244, опубликован 25.12.2019).
Недостатком данного технического решения является то, что выполняется прогноз преждевременных родов без указания срока наступления, что является важным в дальнейшей акушерской тактике ведения.
Известен способ прогнозирования продолжительности латентного периода при сверхранних и ранних преждевременных родах, осложненных разрывом околоплодных оболочек, отличающийся тем, что в качестве предикторов используются показатели высокочувствительного С-реактивного белка - XhsCRP и противовоспалительного цитокина ИЛ-6 - ХИЛ6, которые определяют в сыворотке венозной крови и по формуле: Yдлп = 450,1 - 14,84*XhsCRP - 14,54*ХИЛ6 рассчитывают продолжительность латентного периода в часах (патент №2716973, опубликован 17.03.2020).
Недостатком данного технического решения является то, что прогнозируется только возможная длительность пролонгирования беременности после констатации наступления преждевременного разрыва плодных оболочек (ПРПО), а сам факт наступления ПРПО не прогнозируется при интактных плодных оболочках
Известен способ оценки риска преждевременного разрыва плодных оболочек у беременных, включающий выполнение соскоба эпителия цервикального канала, оценку местного иммунного статуса на основании определения с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени уровня экспрессии мРНК генов цитокинов, отличающийся тем, что у беременных при сроке гестации 37 недель и более определяют уровни экспрессии мРНК генов IL-18 и TLR-2, нормированных на референсный ген В2М; на основании полученных результатов вычисляют риск преждевременного разрыва плодных оболочек Р по формуле: Р=1/1+е-(-0,92×Х1+88,2×Х2), где X1 - значение уровня экспрессии мРНК гена 11-18 в относительных единицах; Х2 - значение уровня экспрессии мРНК гена TLR-2 в относительных единицах; при значении Р, большем или равном 0,5, риск оценивают как высокий; при значении Р меньше 0,5 - как низкий (патент РФ№2740950, опуб. 21.01.2021).
Недостаток данного способа в том, что он применим только при сроке гестации 37 недель и более. Решить задачу прогнозирования ПРПО на сверхранних сроках гестации он не может.
Наиболее близким к заявленному техническому решению является способ прогнозирования преждевременного разрыва плодных оболочек по патенту РФ №2014601, публикация 15. 06.1994, принятый нами за прототип.
Указанные недостатки способа-прототипа устраняются в заявляемом техническом решении.
Задачей заявляемого изобретения является разработка способа прогнозирования преждевременного разрыва плодных оболочек в ранние сроки для выделения беременных группы риска по формированию данной патологии.
Данная задача решается за счет того, что у беременных в сроки гестации от 22 до 28 недель получают отделяемое из заднего свода влагалища, анализируют микробном и определяют относительную представленность бактерий рода Lactobacillus и Staphylococcus, рассчитывают вероятность преждевременного разрыва плодных оболочек в сроки до 28 нед. беременности р по формуле:
-z
р=1/(1+e)*100%, где
е - константа Эйлера ≈2.718281,
Lactobacillus
Staphylococcus
z = 2,99 - 0,06*Х  + 6,71*Х , где
Lactobacillus
X  - относительная представленность бактерий рода Lactobacillus, числовое значение;
Staphylococcus
X  - относительная представленность бактерий рода Staphylococcus, числовое значение;
если величина р составляет 57,42% и более, прогнозируют риск преждевременного разрыва плодных оболочек в сроки гестации 22-28 недель.
Техническим результатом, обеспечиваемым приведенной совокупностью признаков, является повышение точности и специфичности прогнозирования ПРПО на доклинической стадии, когда еще не произошел разрыв оболочек. За счет этого можно осуществить своевременную оптимизацию тактики ведения беременности и улучшить перинатальные исходы.
Одним из наиболее изученных компонентов патогенеза ПРПО является инфекционно-воспалительный фактор. Косвенным доказательством значимой роли инфекционно-воспалительного фактора является высокая частота развития хориоамнионита у беременных с ПРПО. Гистологический хориоамнионит наблюдается почти в половине всех случаев ПРПО, возникающих до 34 недель беременности, а частота клинического хориоамнинита даже при коротком латентном периоде (менее 7 дней в 75,7%) составляет 17,8% [Haiyan Yu et al., 2015].
В литературе имеются данные о результатах исследования микробиома влагалища у женщин с ПРПО в сроке 24-33,6 недель в больнице г. Ванкувер, Канада. Микробном - совокупность генов микроорганизмов, населяющих определенную среду обитания (в данном случае - влагалища). [Teenus Paramel Jayaprakash et al., 2016]. Беременные имели смешанный микробном влагалища, но специфический тип профиля при ПРПО не коррелировал с длительностью безводного периода.
Исследование, проведенное в Корее [Young-Ah You et al., 2019] показало, что женщины в сроке 22,0-36,6 недель с ПРПО, имели большее количество и разнообразие бактерий на момент поступления, чем женщины с преждевременными родами. Женщины, которые родили преждевременно имели бактериальное сообщество, в котором преобладают Bacteroides и Lactobacillus crispatus. Отмечается, что женщины с обилием Weissella в бактериальном сообществе, где преобладают бактероиды, родили в доношенном сроке. Кроме того, в бактериальных сообществах с Lactobacillus преобладание Weissella и Rickettsiales было связано со срочными родами, а преобладание Bacteroides и Escherichia-Shigella было связана с преждевременными родами. Опираясь на имеющиеся в литературе данные, анализ микробиома проводился по общим правилам с использованием мировой базы данных SILVA v132 для определения известных бактерий.
Нами установлены прогностические параметры развития данной акушерской патологии беременности по расчету диагностического индекса, основанного на определении относительной представленности бактерий рода Lactobacillus и Staphylococcus в микробиоме влагалища. Из проанализированных всех родов бактерий в микробиоме влагалища, выявлено снижение относительной представленности бактерий рода Lactobacillus и повышение относительной представленности бактерий рода Staphylococcus в микробиоме влагалища беременных с преждевременным разрывом плодных оболочек по сравнению с группой контроля.
Таким образом, полученные нами результаты позволили судить об изменении относительной представленности бактерий рода Lactobacillus и Staphylococcus в микробиоме влагалища у беременных с преждевременным разрывом плодных оболочек по сравнению с женщинами, чья беременность протекает без осложнений и разработать метод прогнозирования данной патологии у беременных в сроки от 22 до 28 недель гестации.
Для классификации пациенток по степени риска развития ПРПО методом бинарной логистической регрессии была построена прогностическая модель на основании результатов определения относительной представленности наиболее информативного сочетания родов бактерий в микробиоме влагалища {Lactobacillus и Staphylococcus).
Совокупность всех микроорганизмов (бактерии, археи, простейшие, грибы и т.д.) различных областей человеческого организма принято называть микробиотой, а вместе с геномом микробиомом [Eamonn М М Quigley, 2017; Ron Sender et al., 2016], таким образом, микробном - совокупность генов микроорганизмов, населяющих определенную среду обитания (https://bn-cl.ru/images/2020/01/20/microbiom.pdf) (в нашем случае - влагалища).
Относительная представленность бактерий рода - это относительное содержание (доля) рода микроорганизма, выраженная в процентах (%) от общего состава микробиома влагалища, принятого за 100%.
Вероятность развития ПРПО описывается следующим регрессионным уравнением:
Lactobacillus
Staphylococcus
в котором z = 2,99 - 0,06*Х  + 6,71*Х
Lactobacillus
Staphylococcus
где р - прогностический индекс, характеризующий вероятность наличия ПРПО, е - число Эйлера, математическая константа (≈2,718), z - коэффициент регрессионной функции, X  - относительная представленность рода Lactobacillus, числовое значение; X  - относительная представленность рода Staphylococcus, числовое значение; если величина р составляет 57,42% и более, прогнозируют развитие преждевременного разрыва плодных оболочек в срок от 22 до 28 недель беременности.
Полученная регрессионная модель является статистически значимой (р<0,001). Исходя из значения коэффициента детерминации Найджелкерка, модель учитывает 65,9% факторов, определяющих вероятность развития заболевания (ПРПО). С целью повышения диагностической эффективности модели, нами была произведена корректировка порога классификации, исходя из результатов анализа ROC-кривой. Пороговым значением стало -57,42%. Если величина р составляет 57,42% и более, прогнозируют риск преждевременного разрыва плодных оболочек.
С помощью ROC-анализа были определены пороговые значения уровня относительной представленности бактерий рода Lactobacillus и Staphylococcus. Значение AUC составило 92.9%. Чувствительность модели - 83,3%, специфичность - 86,7% (фиг. 1).
Таким образом, принадлежность пациентов к группе высокого или низкого риска развития ПРПО определялась исходя из рассчитанных значений диагностической регрессионной функции: при значении прогностического индекса 57,42% и более беременная относилась к группе высокого риска развития ПРПО за счет нарушения бактериального баланса в микробиоме влагалища, при значении функции менее 57,42% - к группе низкого риска.
Заявленным способом нами обследовано 60 беременных в сроки 22-28 недель, у которых проведено исследование бактериального баланса в микробиоме влагалища заявленным методом. У 40 беременных значение прогностического индекса было равно или более 57,42%, т.е. беременные относились к группе высокого риска развития преждевременного разрыва плодных оболочек. Таким образом, заявляемый способ позволяет своевременно выделять беременных группы риска по формированию данной патологии. У 20 беременных значение прогностического индекса составило менее 57,42%, т.е. они относились к группе низкого риска по развитию ПРПО. Полученные данные обработаны с помощью программы IBM SPSS Statistics 23.
Подробное описание способа и примеры его клинического выполнения
Способ осуществляют следующим образом. У беременных в сроке 22-28 недель гестации осуществляют забор отделяемого из заднего свода влагалища с помощью стерильного одноразового универсального урогенитального зонда. Образцы помещают в стерильные пробирки с транспортной средой "транспортная среда с муколитиком" (государственное учреждение Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии, Россия) и хранят при температуре +4°С до выделения ДНК (микробиома влагалища). Общая ДНК была выделена из образцов с помощью набора "РИБО-преп" (государственное учреждение Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии, Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. Библиотеки ДНК 16S были подготовлены в соответствии с протоколом Illumina "подготовка библиотеки метагеномного секвенирования 16S " (часть №15044223 Rev.B). Биоинформатический анализ данных секвенирования проводился с использованием языков программирования: R v.3.6 и Python 3.6.9. На первом этапе последовательности праймеров были обрезаны с начала парных конечных считываний, причем пары считываний, не содержащие последовательности праймеров, отбрасывались. Затем были обрезаны конечные 25 пар оснований от конца каждого считывания как низкокачественные базы и обработаны полученные данные с помощью рабочего процесса DADA2 для точной идентификации вариантов последовательности. После вывода точных вариантов последовательностей прямые и обратные считывания были объединены с помощью конкатенации, и полученные последовательности были использованы для сравнения по Байесовской таксономической классификации с использованием базы данных SILVA v132 в качестве эталона.
Lactobacillus
Staphylococcus
Определяемые значения относительной представленности - это относительное содержание (доля) рода микроорганизма, выраженная в проценте (%) от общего состава микробиома влагалища, принятого за 100%. При этом X  - относительная представленность рода Lactobacillus и X  - относительная представленность рода Staphylococcus абсолютными числами (числовыми значениями) подставляются в формулу для расчета z - коэффициента регрессионной функции:
Lactobacillus
Staphylococcus
z = 2,99 - 0,06*Х  + 6,71 *Х , после чего расчитывают
р - прогностический индекс, характеризующий вероятность развития ПРПО, который рассчитывается по формуле:
Если величина р составляет 57,42% и более, устанавливают высокую вероятность развития ПРПО в сверхранние сроки беременности (до 28 нед.).
Это позволяет своевременно выделять беременных группы риска по формированию данной патологии и провести необходимый комплекс лечебно-профилактических мероприятий, что будет способствовать снижению риска перинатальной смертности и заболеваемости, и уменьшению экономических затрат на лечение и выхаживание недоношенных новорожденных.
Работоспособность заявляемого способа подтверждается следующими клиническими примерами:
Пример 1.
Беременная М-ова, 26 лет, обследована по заявляемому способу на плановом амбулаторном приеме в поликлиническом отделении ГБУ РО «ПЦ» в сроке 22 недели гестации. При лабораторном исследовании отделяемого из заднего свода влагалища получены следующие показатели относительной представленности родов микробиома влагалища:
Lactobacillus
X  = 45,38%;
Staphylococcus
X  = 0,09%;
z = 2,99 - 0,06*45,38 + 6,71*0,09 =0,87.
-0,87
Значение прогностического индекса составило: р=1/(1+е)*100%=70,5%. Данное значение превышает 57,42%, что, согласно заявляемому способу, свидетельствует о необходимости данную пациентку отнести в группу высокого риска развития ПРПО.
В сроке 25 недель 4 дня была госпитализирована в ГБУ РО Перинатальный центр в отделение патологии беременности с жалобами на подтекание светлых околоплодных вод. Диагноз при поступлении: Беременность 25 недель 4 дня. ПРПО. Угроза преждевременных родов. Анемия легкой степени.
Женщина была госпитализирована в стационар, наблюдалась и получала терапию в соответствии со стандартом оказания медицинской помощи, в сроке 26 недель 1 день развилась регулярная родовая деятельность.
Беременность завершилась преждевременными оперативными родами в сроке гестации 26 недель 1 день и рождением живого недоношенного ребенка с массой тела 850 г, длиной 37 см, с оценкой по шкале Апгар 4/5 баллов.
Пример 2.
Беременная Г-ва, 25 лет, на плановом амбулаторном приеме в сроке 24 недели гестации была обследована по заявляемому способу. При лабораторном исследовании отделяемого из заднего свода влагалища получены следующие показатели относительной представленности родов микробиома влагалища:
Lactobacillus
Staphylococcus
X  45,9%; X  0,02%;
-0,37
z = 2,99 - 0,06*47,09 + 6,71*0,02 = 0,2988. Значение прогностического индекса составило: р=1/(1+е)*100%=57,42%.
Данное значение совпадает с граничным значением 57,42%, что, согласно заявляемому способу, свидетельствует о необходимости данную пациентку отнести в группу риска развития ПРПО. Беременной была проведена корректировка плана лечения, проведена двухэтапная терапия (антибактериальные препараты на первом этапе, затем использование препаратов с пробиотическими штаммами лактобактерий), что позволило своевременно профилактировать развитие ПРПО.
При дальнейшем наблюдении, по данным объективного, влагалищного, ультразвукового исследований, а также по данным микробиологического и микроскопического исследования отделяемого из влагалища и цервикального канала в течение беременности отклонений выявлено не было, состояние плода оценивалось как нормальное, беременность завершилась срочными родами через естественные родовые пути в сроке 40 недель и рождением живого доношенного мальчика с массой тела 3400 г, ростом 52 см, оценкой по шкале Апгар 9/10 баллов. Диагноз ребенка при рождении: здоров. Пример 3.
Беременная Г-ева, 28 лет, на плановом амбулаторном приеме в сроке 26 недель гестации была обследована по заявляемому способу При лабораторном исследовании отделяемого из заднего свода влагалища получены следующие показатели относительной представленности родов микробиома влагалища:
Lactobacillus
Staphylococcus
X  = 71,82%; X  = 0,03%;
z = 2,99 - 0,06*71,82 + 6,71*0,03 =-1,12.
1,12
Значение прогностического индекса составило: р=1/(1+е)*100%=24,64%. Данное значение менее 57,42%, что согласно заявляемому способу свидетельствует об отсутствии у этой беременной риска развития ПРПО.
При дальнейшем наблюдении, по данным объективного, влагалищного, ультразвукового исследований, а также по данным микробиологического и микроскопического исследования отделяемого из влагалища и цервикального канала в течение беременности отклонений выявлено не было, состояние плода оценивалось как нормальное, беременность завершилась срочными родами через естественные родовые пути в сроке 39 недель и рождением живого доношенного мальчика с массой тела 3800 г, ростом 50 см, оценкой по шкале Апгар 10/10 баллов. Диагноз ребенка при рождении: здоров.
Заявленный способ позволяет получить надежные результаты и является более эффективным по сравнению с известными, обладая рядом преимуществ:
1. Способ специфичен - он позволяет прогнозировать риск формирования ПРПО с использованием относительной представленности только двух родов бактерий (Lactobacillus и Staphylococcus) в микробиоме влагалища, являющихся предикторами ПРПО, что делает его высоко специфическим методом.
2. Способ высокочувствителен, дает возможность прогнозирования ПРПО на доклинической стадии, своевременно выделять беременных группы риска по формированию данной патологии, что позволяет осуществить превентивные мероприятие, направленные на профилактику данного патологического состояния.
3. Способ является малоинвазивным, поскольку диагностика осуществляется по результатам исследования отделяемого из заднего свода влагалища.
Заявляемый способ прогнозирования преждевременного разрыва плодных оболочек позволяет на основании высокочувствительных современных лабораторных маркеров своевременно осуществить необходимый комплекс лечебно-профилактических мероприятий, что будет способствовать снижению риска перинатальной смертности и заболеваемости, и уменьшению экономических затрат на лечение и выхаживание недоношенных новорожденных.
Апробация заявляемого изобретения проведена на достаточном по объему клиническом материале, что подтвердило работоспособность метода и возможность его применения в широкой клинической практике.