ВАРИАНТЫ КАПСИДОВ АДЕНОАССОЦИИРОВАННОГО ВИРУСА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
VERSIONS OF ADENOASSOCIATED VIRUS CAPSIDS AND METHODS OF USE THEREOF

[001] В соответствии с 35 USC 119(е) данная заявка заявляет приоритет на дату подачи предварительной патентной заявки США № 62/336441, поданной 13 мая 2016 года; предварительной заявки на патент США № 62/378106, поданной 22 августа 2016 года; предварительной заявки на патент США № 62/384590, поданной 7 сентября 2016 года; предварительной заявки на патент США № 62/454612, поданной 3 февраля 2017 года; полное описание которых включено в этот документ посредством ссылки.
ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПРЕДСТАВЛЕННОГО В ВИДЕ ТЕКСТОВОГО ФАЙЛА
[002] Список последовательностей представлен в данном документе в виде текстового файла «4D_ST25.txt», созданного 12 мая 2017 года и имеет размер 198 КБ. Содержимое текстового файла включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[003] Изобретение, раскрытое в данном документе, относится в целом к области вирионов аденоассоциированного вируса (AAV), содержащих варианты капсидных белков, и получения таких вариантов капсидов с использованием методов направленной эволюции.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[004] Унаследованные заболевания сетчатки охватывают большую группу гетерогенных генетических заболеваний, которые затрагивают примерно 1 из 3000 человек (более чем 2 миллиона человек во всем мире) и являются основной причиной серьезного ухудшения зрения или слепоты. Комплексные, многофакторные заболевания сетчатки, такие как влажная форма возрастной макулярной дегенерации сетчатки (wAMD) и диабетическая ретинопатия (DR), поражают еще большее количество людей, в то время как 1,7 миллиона американцев в настоящее время живут с серьезной центральным ухудшением зрения, связанным с wAMD, и почти треть взрослых людей старше 40 лет с диабетом имеет ослабленное зрение. Эти заболевания обычно связаны с дисфункцией или смертью одного или более типов клеток сетчатки, в некоторых случаях из-за отсутствия экспрессии или функции ключевого белка, например, ПЭС65 в LCA2, в других случаях из-за мутации генов, которые создают токсичные генные продукты, например, доминантные мутации, которые влияют на сворачивание белка родопсина, или в других случаях из-за изменений в физиологии сетчатки, индуцированные эктопической экспрессией белка, например, VEGF при wAMD.
[005] Одним из подходов к решению этой большой не медицинской необходимости является опосредованная аденоассоциированным вирусом (AAV) генная терапия, в которой рекомбинантный аденоассоциированный вирус (rAAV) используется для доставки гена в один или более типов клеток в сетчатке, например, для замены отсутствующего гена, для коррекции доминантного дефектного гена или для получения матрицы для непрерывной белковой терапии. Хотя клиническая генная терапия на основе AAV становится все более успешной, она все еще чревата недостатками в отношении вирусных свойств вектора, включая, например, нацеливание на нужные клетки сетчатки с высокой эффективностью. Например, были идентифицированы и охарактеризованы множественные гомологичные серотипы AAV приматов и многочисленные серотипы приматов, отличных от человека, при этом AAV2 который лучше всего охарактеризован среди серотипов AAV и был первым адаптирован как средство генной доставки в глаз. Однако не сообщалось об эффективности этих AAV (в том числе AAV2) при трансдуцировании типов более глубоких клеток сетчатки при доставке с помощью интравитреального введения. Соответственно, в данной области техники существует потребность в новых вариантах AAV с более совершенными возможностями трансдукции, которые обеспечат более эффективную генную доставку в клетки сетчатки для лечения глазной болезни. Для таких вариантов AAV существует потребность в улучшенном профиле трансдукции сетчатки - в некоторых случаях широко, в других случаях предпочтительно ограниченный определенным типам клеток сетчатки - по сравнению с AAV дикого типа и вариантами AAV, как известно в области техники.
[006] AAV природного происхождения представляет собой одноцепочечный ДНК-вирус, который содержит три открытых рамки считывания: rep, cap и aap. Первый ген, rep, кодирует четыре белка, необходимые для репликации генома (Rep78, Rep68, Rep52 и Rep40), второй, cap, экспрессирует три структурных белка (VP1-3), которые собираются образовывая вирусный капсид, а третий экспрессирует активирующий сборку белок (AAP), который необходим для сборки капсида. AAV зависит от наличия вспомогательного вируса, такого как аденовирус или герпесвирус, для активной репликации. В отсутствие вспомогательного вируса, AAV находится в латентном состоянии, в котором его геном поддерживается эписомально или интегрируется в хромосому хозяина в локус AAVS1.
[007] Методы in vitro- и in vivo-направленной эволюции могут использоваться для выбора вариантов AAV, которые предлагают улучшение по сравнению с существующими векторами доставки генов на основе AAV. Такие методы направленной эволюции известны в данной области техники и описаны, например, в публикации РСТ WO 2014/194132 и Kotterman & Schaffer (Nature Review Genetics, AOP, опубликованной в интернете 20 мая 2014 г., doi: 10.1038/nrg3742), оба из которых включены в данный документ в качестве ссылки в полном объеме. Направленная эволюция является подходом конструирования капсидов, который моделирует природную эволюцию через повторяющиеся раунды генетической диверсификации и процессов отбора, тем самым обеспечивая накопление полезных мутаций, которые постепенно улучшают функцию биомолекулы, такой как вирион на основе AAV. При таком подходе, cap гены AAV дикого типа диверсифицируют для создания больших генетических библиотек, которые упакованы для создания библиотеки вирусных частиц, и селективное давление применяют для выделения уникальных вариантов с лучшими фенотипами, которые могут преодолеть барьеры доставки генов.
[008] Варианты AAV описаны, например, в патентах США 9193956; 9;186;419; 8632764; 8663624; 8927514; 8628966; 8263396; 8734809; 8889641; 8632764; 8691948; 8299295; 8802440; 8445267; 8906307; 8574583; 8067015; 7588772; 7867484; 8163543; 8283151; 8999678; 7892809; 7906111; 7259151; 7629322; 7220577; 8802080; 7198951; 8318480; 8962332; 7790449; 7282199; 8906675; 8524446; 7712893; 6491907; 8637255; 7186522; 7105345; 6759237; 6984517; 6962815; 7749492; 7259151; и 6156303; номера публикаций США, 2013/0295614; 2015/0065562; 2014/0364338; 2013/0323226; 2014/0359799; 2013/0059732; 2014/0037585; 2014/0056854; 2013/0296409; 2014/0335054-2013/0195801; 2012/0070899; 2011/0275529; 2011/0171262; 2009/0215879; 2010/0297177; 2010/0203083; 2009/0317417; 2009/0202490; 2012/0220492; 2006/0292117; и 2004/0002159; номера европейских публикаций 2692731 A1; 2383346 B1; 2359865 B1; 2359866 B1; 2359867 B1; и 2357010 B1; 1791858 B1; 1668143 B1; 1660678 B1; 1664314 B1; 1496944 B1; 1456383 B1; 2341068 B1; 2338900 B1; 1456419 B1; 1310571 B1; 1456383 B1; 1633772 B1; и 1135468 B1; и международные (PCT) номера публикаций WO 2014/124282; WO 2013/170078; WO 2014/160092; WO 2014/103957; WO 2014/052789; WO 2013/174760; WO 2013/123503; WO 2011/038187; и WO 2008/124015; WO 2003/054197; однако, ни одна из этих ссылок не описывает варианты осуществления изобретения и/или признаки и/или состав вещества структур вариантов AAV, описанных в данном документе.
[009] Все документы и ссылки, приведенные в данном документе и в упомянутых патентных документах, включены в данный документ посредством ссылки.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0010] В данном документе представлены капсидные белки варианта аденоассоциированного вируса (AAV), имеющие одну или более модификаций в аминокислотной последовательности по сравнению с капсидным белком исходного AAV, который, когда он присутствует в AAV-вирионе, придает повышенную способность инфицировать один или более типов клеток сетчатки по сравнению со способностью инфицировать клетки сетчатки с помощью AAV-вириона, содержащего немодифицированный капсидный белок исходного AAV. Также предложены рекомбинантные вирионы AAV и их фармацевтические композиции, содержащие вариант капсидного белка AAV, как описано в данном документе, способы получения капсидных белков варианта rAAV и вирионов, и способы использования этих капсидных белков rAAV и вирионов в исследованиях и в клинической практике, например, для доставки последовательностей нуклеиновых кислот в одну или более клеток сетчатки для лечения патология и заболеваний сетчатки.
[0011] В некоторых аспектах описания, предложены капсидные белки вариантов аденоассоциированного вируса (AAV), эти капсидные белки вариантов AAV, имеющие одну или более модификаций в аминокислотной последовательности по сравнению с капсидом исходного AAV, который, если присутствует в AAV-вирионе, обеспечивает повышенную способность инфицировать один или более типов клеток сетчатки (например, фоторецепторную клетку (например, палочки, колбочки), ганглиозную клетку сетчатки (ГКС), глиальную клетку (например, глиальную клетку Мюллера, микроглиальную клетку), биполярную клетку, амакриновую клетку, горизонтальную клетку и/или клетку пигментированного эпителия (ПЭС) сетчатки) по сравнению со способностью инфицировать клетки сетчатки с помощью AAV-вириона, содержащего немодифицированный капсидный белок исходного AAV, который не содержит модификацию аминокислотной последовательности.
[0012] В некоторых аспектах описания, предложены вирионы рекомбинантного AAV (rAAV), эти rAAV-вирионы, содержащие вариант капсидного белка, как описано в данном документе, при этом вирионы rAAV проявляют повышенную способность инфицировать один или более типов клеток сетчатки (например, фоторецепторную клетку (например, палочки, колбочки), ганглиозную клетку сетчатки (ГКС), глиальную клетку (например, глиальную клетку Мюллера, микроглиальную клетку), биполярную клетку, амакриновую клетку, горизонтальную клетку и/или клетку пигментированного эпителия (ПЭС) сетчатки)) относительно способности инфицировать клетки сетчатки с помощью AAV-вириона, содержащего соответствующий немодифицированный капсидный белок исходного AAV. В некоторых вариантах осуществления изобретения, rAAV-вирион проявляет повышенную способность инфицировать все клетки сетчатки по сравнению с AAV-вирионом, содержащим капсидный белок исходного AAV. В других вариантах осуществления изобретения, rAAV-вирион проявляет повышенную способность инфицировать некоторые типы клеток сетчатки, по сравнению с AAV-вирионом, содержащим капсидный белок исходного AAV. Другими словами, rAAV-вирион проявляет повышенную способность инфицировать, которая является предпочтительной для определенных типов клеток сетчатки, но не для других, например, rAAV демонстрирует предпочтительно повышенную способность инфицировать один или более типов клеток, выбранных из фоторецепторных клеток, ганглиозных клеток сетчатки, глиальных клеток, биполярных клеток, амакриновых клеток, горизонтальной клетки и/или клетки пигментного эпителия сетчатки (ПЭС), но не демонстрирует повышенной способности инфицировать все типы клеток.
[0013] В некоторых вариантах осуществления изобретения, rAAV-вирион содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту. В некоторых таких вариантах осуществления изобретения, гетерологичная нуклеиновая кислота кодирует РНК, которая кодирует полипептид. В других таких вариантах осуществления изобретения, гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует РНК, которая не кодирует полипептид, например, гетерологичную нуклеотидную последовательность РНК-интерферирующего агента, направляющую РНК для нуклеазы и т.д.
[0014] Также в данном документе предложены фармацевтические композиции, содержащие инфекционные rAAV-вирионы согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
[0015] Также предусматривается использование rAAV-вириона, содержащего вариант капсидного белка, как описано в данном документе, в способе доставки гетерологичной нуклеиновой кислоты в клетку-мишень (такую как клетка сетчатки) путем контактирования клетки-мишени с вирионом rAAV. В некоторых вариантах осуществления изобретения, клетка-мишень находится in vivo, например, в глазу индивидуума, нуждающегося в лечении глазного заболевания. В других вариантах осуществления изобретения, клетка-мишень находится in vitro.
[0016] Также предложены способы лечения глазного заболевания путем введения субъекту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества rAAV-вирионов, содержащих вариант капсидного белка, как описано в данном документе, или фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество rAAV-вирионов.
[0017] Также предложена изолированная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующую вариант капсидного белка AAV, как описано в данном документе, и клетка-хозяин, содержащая изолированную нуклеиновую кислоту. В других вариантах осуществления изобретения, изолированная нуклеиновая кислота и/или изолированная клетка-хозяин содержит rAAV.
[0018] В некоторых аспектах, вариант капсидного белка AAV содержит вставку от около 5 аминокислот до около 20 аминокислот («гетерологичный пептид» или «пептидная вставка») в петле GH капсидного белка по сравнению с соответствующим капсидным белком исходного AAV, причем вариант белка капсида, присутствующий в AAV-вирионе, придает повышенную способность инфицировать клетки сетчатки по сравнению со способностью инфицировать клетки сетчатки вириона AAV, содержащим соответствующий капсидный белок исходного AAV. В некоторых вариантах осуществления изобретения, пептид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из: QADTTKN (SEQ ID NO: 13), ISDQTKH (SEQ ID NO: 14), ASDSTKA (SEQ ID NO: 15), NQDYTKT (SEQ ID NO: 16), HDITKNI (SEQ ID NO: 17), HPDTTKN (SEQ ID NO: 18), HQDTTKN (SEQ ID NO: 19), NKTTNKD (SEQ ID NO: 20), ISNENEH (SEQ ID NO: 21), QANANEN (SEQ ID NO: 22), GKSKVID (SEQ ID NO: 23), TNRTSPD (SEQ ID NO: 24), PNSTHGS (SEQ ID NO: 25), KDRAPST (SEQ ID NO: 26), LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 27), LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28), LGISDQTKHA (SEQ ID NO: 29), LAASDSTKAA (SEQ ID NO: 30), LANQDYTKTA (SEQ ID NO: 31), LAHDITKNIA (SEQ ID NO: 32), LAHPDTTKNA (SEQ ID NO: 33), LAHQDTTKNA (SEQ ID NO: 34), LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 35), LPISNENEHA (SEQ ID NO: 36), LPQANANENA (SEQ ID NO: 37), LAGKSKVIDA (SEQ ID NO: 38), LATNRTSPDA (SEQ ID NO: 39), LAPNSTHGSA (SEQ ID NO: 40) и LAKDRAPSTA (SEQ ID NO: 41). В некоторых вариантах осуществления изобретения, пептид состоит по существу из последовательности, выбранной из группы, состоящей из: QADTTKN (SEQ ID NO: 13), ISDQTKH (SEQ ID NO: 14), ASDSTKA (SEQ ID NO: 15), NQDYTKT (SEQ ID NO: 16), HDITKNI (SEQ ID NO: 17), HPDTTKN (SEQ ID NO: 18), HQDTTKN (SEQ ID NO: 19), NKTTNKD (SEQ ID NO: 20), ISNENEH (SEQ ID NO: 21), QANANEN (SEQ ID NO: 22), GKSKVID (SEQ ID NO: 23), TNRTSPD (SEQ ID NO: 24), PNSTHGS (SEQ ID NO: 25), KDRAPST (SEQ ID NO: 26), LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 27), LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28), LGISDQTKHA (SEQ ID NO: 29), LAASDSTKAA (SEQ ID NO: 30), LANQDYTKTA (SEQ ID NO: 31), LAHDITKNIA (SEQ ID NO: 32), LAHPDTTKNA (SEQ ID NO: ID NO: 33), LAHQDTTKNA (SEQ ID NO: 34), LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 35), LPISNENEHA (SEQ ID NO: 36), LPQANANENA (SEQ ID NO: 37), LAGKSKVIDA (SEQ ID NO: 38), LATNRTSPDA (SEQ ID NO: 39), LAPNSTHGSA (SEQ ID NO: 40) и LAKDRAPSTA (SEQ ID NO: 41). В некоторых аспектах, вариант капсидного белка AAV содержит одну или более аминокислотных замен по сравнению с соответствующим капсидным белком исходного AAV, причем вариант капсидного белка, присутствующий в вирионе AAV, придает повышенную способность инфицировать клетку сетчатки по сравнению со способностью инфицировать клетку сетчатки вирионом AAV, содержащим соответствующий капсидный белок исходного AAV.
[0019] В связанных аспектах, вариант капсидного белка AAV содержит пептидную вставку и одну или более аминокислотных замен по сравнению с соответствующим капсидным белком исходного AAV, причем вариант белка капсида, присутствующий в вирионе AAV, обеспечивает повышенную способность инфицировать клетку сетчатки по сравнению со способностью инфицировать клетку сетчатки с помощью вириона AAV, содержащего соответствующий капсидный белок исходного AAV.
[0020] Также описанный в данном документе вариант представляет собой вариант капсидного белка AAV, содержащий гетерологичный пептид LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28) и замену P34A относительно AAV2.
[0021] Также описанный в данном документе вариант представляет собой вариант капсидного белка AAV, содержащий гетерологичный пептид LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28) и аминокислотные замены N312K, N449D, N551S, I698V и L735Q относительно AAV2.
[0022] Также описанные в данном документе способы представляют собой способы производства и/или доставки rAAV, содержащего вариант капсида AAV, как описано в данном документе. Кроме того, в данном документе предложены наборы, содержащие rAAV, содержащий вариант AAV капсида, как описано в данном документе, и для использования в способах, описанных в данном документе.
[0023] В других вариантах осуществления изобретения, вирион AAV, содержащий вариант капсидного белка, в предыдущих параграфах, может включать любой из предшествующих или впоследствии описанных вариантов осуществления изобретения. Действительно, понятно, что некоторые особенности изобретения, которые для ясности, описаны в контексте отдельных вариантов осуществления изобретения, также могут быть предоставлены в комбинации в одном варианте осуществления изобретения. И наоборот, различные признаки изобретения, которые для краткости, описаны в контексте одного варианта осуществления изобретения, также могут быть предоставлены отдельно или в любой подходящей суб-комбинации. Все комбинации вариантов осуществления изобретения, относящихся к изобретению, конкретно охвачены изобретением и описаны в данном документе точно так же, как если бы каждая комбинация была индивидуально и явно раскрыта. Кроме того, все суб-комбинации различных вариантов осуществления изобретения и их элементов также специально охвачены изобретением и описаны в данном документе точно так же, как если бы каждая такая суб-комбинация была индивидуально и явно раскрыта в данном документе.
[0024] Краткое изложение сущности изобретения не предназначено для определения формулы изобретения и не предназначено для ограничения объема изобретения каким-либо образом.
[0025] Другие признаки и преимущества изобретения, описанные в данном документе, будут очевидны из следующих фигур, подробного описания и формулы изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0026] Изобретение лучше всего понятно из нижеследующего подробного описания при чтении вместе с прилагаемыми графическими материалами. Патент или файл заявки содержат по меньшей мере одну фигуру, выполненную в цвете. Копии этого патента или публикации заявки на патент с цветным графическим материалом будут предоставлены Ведомством по просьбе и после оплаты необходимой пошлиной. Подчеркивается, что, согласно обычной практике, различные детали графических материалов не масштабируются. Напротив, размеры различных деталей произвольно увеличены или уменьшены для ясности. В графические материалы входят следующие фигуры.
[0027] На Фиг. 1 изображены варианты осуществления методов направленной эволюции. Стадия (а) изображает создание библиотеки вирусного капсида, содержащей комбинацию методов мутации ДНК и генов cap. Стадия (b) изображает упаковку вирусов таким образом, что каждая вирусная частица состоит из мутантного капсида, окружающего ген cap, кодирующий этот капсид и очищистку. Затем библиотеку капсидов помещают под селективное давление in vitro или in vivo. В этом аспекте технологии направленной эволюции, собирают ткани или клеточный материал для изолирования вариантов AAV, которые успешно инфицировали эту мишень, и выделяют удачные вирусы. На этапе (с) изображено Стадию 1 увеличения количества удачных клонов посредством повторного отбора. Стадия (d) изображает Стадию 2 увеличения количества отобранных генов cap, которые подвергаются редиверсификации и улучшают с помощью дополнительных этапов отбора для интерационного повышения уровня вирусной приспособленности. Стадия (е) изображает варианты, идентифицированные как совпадения во время Стадии 1 и 2 векторной селекции, которые будут изготовлены в виде рекомбинантных векторов AAV, и охарактеризованы уровнем трансдукции различных типов клеток и тканей-мишеней. По характеру направленного эволюционного процесса AAV, варианты, описанные в данном документе, уже продемонстрировали способность трансфицировать клетки сетчатки, и доставлять геном (геном, кодирующий ген cap варианта) во время процесса отбора.
[0028] На Фиг. 2 изображена схема плоского крепления сетчатки, показывающая, где образцы, из которых амплифицируются вирусные геномы, собирают крест-на-крест широкой площади сетчатки.
[0029] На Фиг. 3 изображена ПЦР-амплификация вирусных геномов из слоя ганглиозных клеток (GCL), внутреннего ядерного слоя (INL), фоторецепторного/внешнего ядерного слоя (ONL), и слоя пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) ткани сетчатки из типового раунда отбора. И в правый глаз (верхнее изображение), и в левый глаз (нижнее изображение) была введена библиотека. Образцы брали из внутренней сетчатки (в), средней сетчатки (середина) и внешней/периферической сетчатки (вне). Полоски в красных рамках указывают на успешную амплификацию вирусных геномов.
[0030] На Фиг. 4А-4D изображена частота мотивов при секвенировании. На Фиг. 4А представлено секвенирование 3-го раунда. На Фиг. 4B представлено секвенирование 4-го раунда. На Фиг. 4C представлено секвенирование 5-го раунда. На Фиг. 4D представлено секвенирование 6-го раунда.
[0031] На Фиг. 5 представлена иллюстративная трехмерная модель AAV2, содержащая случайный гептамер после аминокислоты 587.
[0032] На Фиг. 6 представлено выравнивание SEQ ID NOS: 1-11 AAV дикого типа, показывающая местоположения аминокислот между и в пределах серотипов AAV1, AAV2, AAV3A, AAV3B и AAV4-10 дикого типа (встречающиеся в природе).
11
[0033] На Фиг. 7 представлены флюоресцентные изображения глазного дна, полученные с помощью Heidelberg Spectralis™ сетчатки африканской зеленой обезьяны после интравитреального введения 2×10 геномов вектора (гв) AAV2, доставляющих трансген GFP под контролем промотора CMV (AAV2.CMV.GFP). Изображения были сделаны на исходном уровне (A) и через 14 дней (B), 28 дней (C) и 42 дня (D) после инъекции.
11
[0034] На Фиг. 8 представлены флюоресцентные изображения глазного дна, полученные с помощью Heidelberg Spectralis™ сетчатки африканской зеленой обезьяны после интравитреального введения 2×10 геномов вектора (гв) нового варианта AAV LAISDQTKHA+P34A, доставляющего трансген GFP под контролем промотора CMV ( LAISDQTKHA+P34A.CMV.GFP). Изображения, сделанные на исходном уровне (A), и через 14 дней (B), 28 дней (C) и 42 дня (D) после инъекции.
11
12
[0035] На Фиг. 9 представлены флюоресцентные изображения глазного дна, полученные с помощью Heidelberg Spectralis™ сетчатки обезьян Cynomolgus после интравитреального введения нового варианта AAV LAISDQTKHA+P34A, доставляющего трансген GFP под контролем промотора CAG (LAISDQTKHA+P34A.CAG.EGFP). (A) Сетчатка обезьяны, в которую вводилось интравитреально 2×10 гв вектора, изображения которой получали на 14 день (А1), 21 день (А2) и 28 день (А3) после инъекции. (B) Сетчатка обезьяны, в которую вводилось интравитреально 1×10 гв вектора, изображения которой получали на 14 день (B1) и 21 день (B2) после инъекции.
12
[0036] На Фиг. 10А-10Е представлены результаты иммуногистохимического анализа сетчатки обезьяны, которой интравитреально вводили 1×10 гв нового варианта AAV LAISDQTKHA+P34A, доставляющего трансген GFP под контролем промотора CAG, проанализированного через три недели после инъекции. Вся иммуногистохимия предоставляется вместе с соответствующим флюоресцентным изображением глазного дна, с красной рамкой, чтобы приблизительно обозначить, где в сетчатке проведен анализ. Фигура 10A: Стабильная трансдукция пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) и фоторецепторов наблюдали с использованием GFP-специфичного антитела (красный). Иммуноокрашивание фоторецептора колбочки с использованием антитела к M/L опсину показано белым. Фиг. 10B и 10C: Стабильная трансдукция фоторецепторов палочек и колбочек (Фиг. 10B) и ПЭС (Фиг. 10C) наблюдалась с помощью прямой флуоресценции EGFP (зеленый) и с помощью иммуногистохимии с использованием GFP-специфического антитела (красный). Меланосомы в ПЭС кажутся черными на изображении. Фигура 10D: Трансдукция фоторецепторных колбочек (идентифицированы с помощью M/L опсина, белый) и ганглиозных клеток сетчатки (ГКС) в и вокруг центральной ямки наблюдалась с помощью прямой флуоресценции EGFP (зеленый) и иммуногистохимией с использованием GFP-специфического антитела (красный). Изображения на средних вставках - это большее увеличение (63X) области, обозначенной белой рамкой на левой панели. Фигура 10Е: Трансдукция ганглиозных клеток сетчатки (ГКС) и слоя ганглиозных клеток сетчатки наблюдалась с помощью прямой флуоресценции EGFP (правая вставка, зеленая; нижняя правая вставка - 63Х увеличение верхняя правая вставка); верхняя левая панель показывает область под ярким освещением.
[0037] На Фиг. 11А-11F представлены данные о трансдукции клетки пигментного эпителия сетчатки человека (ПЭС) in vitro рекомбинантным вирусом AAV, содержащим новый вариант AAV LAISDQTKHA+P34A капсида и трансген GFP под контролем промотора CAG. Клетки, которые были дифференцированы в клетки ПЭС из линии эмбриональных стволовых клеток человека (фигуры 11A и 11C) или из человеческих фибробласт-полученных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (FB-iPSC) (фигуры 11B и 11D), были инфицированы новым вариантом AAV LAISDQTKHA+P34A.CAG.GFP или контролем дикого типа AAV2.CAG.GFP. Фиг. 11А и 11В: Иммунофлуоресцентная визуализация культур клеток через 7 дней после заражения при MOI 500 демонстрирует, что капсид нового варианта AAV (левые панели) трансформирует клетки ПЭС лучше, чем капсид AAV2 дикого типа (правые панели). Фиг. 11C и 11D: Количественная оценка процента GFP-положительных клеток ПЭС в каждой культуре с помощью проточной цитометрии показывает, что капсид нового варианта AAV обеспечивает значительное дозозависимое улучшение количества трансдуцированных клеток по сравнению с капсидом AAV2 дикого типа, независимо от источника клетки. Фиг. 11Е и 11F: Количественное определение количества GFP в каждой культуре с помощью Вестерн-блоттинга показывает, что новый вариант AAV обеспечивает значительное улучшение экспрессии трансгена по сравнению с капсидом дикого типа независимо от источника клеток.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0038] До того, как будут описаны способы и композиции согласно изобретению, следует понимать, что это изобретение не ограничивается конкретным описанным способом или композицией и, как таковое, может варьироваться. Следует также понимать, что используемая в данном документе терминология предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления изобретения и не предназначена для ограничения, поскольку объем настоящего изобретения будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения.
[0039] Изобретение, описанное в данном документе, проиллюстрировано на фигурах и описании. Однако, хотя конкретные варианты осуществления изобретения проиллюстрированы на фигурах, нет намерения ограничить изобретение конкретным вариантом осуществления изобретения или вариантами осуществления изобретения, проиллюстрированными и/или описанными. Напротив, изобретение, описанное в данном документе, предназначено для охвата всех модификаций, альтернативных конструкций и эквивалентов, подпадающих под сущность и объем изобретения. Таким образом, фигуры должны быть иллюстративными, а не ограничивающими.
[0040] В тех случаях, когда предоставляется диапазон значений, понятно, что каждое промежуточное значение до десятой части нижнего предела, если контекст явно не указывает на иное, между верхним и нижним пределами этого диапазона также конкретно описывается. Каждый меньший диапазон между любым заявленным значением или промежуточным значением в указанном диапазоне и любым другим заявленным или промежуточным значением в указанном диапазоне охватывается этим изобретением. Верхний и нижний пределы этих меньших диапазонов могут независимо включаться или исключаться из него, и каждый диапазон, в котором ни один, ни оба предела не включены в меньшие диапазоны, также охватывается этим изобретением с учетом любого конкретно исключенного предела в указанном диапазоне. Если указанный диапазон включает один или оба предела, в изобретение также включены диапазоны, исключающие каждый или оба из указанных включенных пределов.
[0041] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в данной области техники, к которому относится настоящее изобретение. Хотя любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в данном документе, могут быть использованы в практике или испытаниях настоящего изобретения, в настоящее время описаны некоторые потенциальные и предпочтительные способы и материалы. Все публикации, упомянутые в данном документе, включены в данный документ путем ссылки для раскрытия и описания способов и/или материалов, в связи с которыми цитируются публикации. Понятно, что данное описание изобретения имеет преимущество над любым описанием включенной публикации в той степени, пока не появляется противоречие.
[0042] Как будет очевидно специалистам в данной области техники после прочтения этого описания, каждый из отдельных вариантов осуществления изобретения, описанных и проиллюстрированных в данном документе, имеет отдельные компоненты и признаки, которые могут быть легко отделены от или объединены с признаками любого из нескольких других вариантов осуществления изобретения без отхождения от объема или сущности настоящего изобретения. Любой процитированный способ может быть применен в порядке изложенных действий или в любом другом порядке, который логически возможен.
[0043] Следует отметить, что как используется в данном документе и в прилагаемой формуле изобретения, единственная форма существительного включает в себя форму множественной формы существительного, если контекст явно не указывает иное. Так, например, ссылка на «рекомбинантный вирион AAV» включает в себя множество таких вирионов, а ссылка на «фоторецепторную клетку» включает ссылку на одну или более фоторецепторных клеток и их эквиваленты, известные специалистам в данной области техники, и так далее. Кроме того, следует отметить, что формула изобретения может быть составлена для исключения любого необязательного элемента. Таким образом, это заявление предназначено для использования в качестве предшествующей основы для использования такой терминологии исключения, как «исключительно», «только» и т. п. в связи с изложением элементов формулы изобретения или использованием «отрицательного» ограничения.
[0044] Публикации, обсуждаемые в данном документе, предоставляются исключительно для их описания до даты подачи настоящей заявки. Ничто в данном документе не должно толковаться как признание того, что настоящее изобретение не имеет права противопоставляться по приоритету такой публикации в силу предшествующего изобретения. Кроме того, предоставленный даты публикации могут отличаться от фактических дат публикации, которые, возможно, необходимо будет подтвердить отдельно.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
[0045] Если не указано иное, все используемые в данном документе научные и технические термины имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в данной области техники, к которому относится эта технология.
[0046] Аденоассоциированный вирус является непатогенным парвовирусом, состоящим из генома одноцепочечной ДНК размером 4,7 кб, с без оболочечным икосаэдрическим капсидом. Геном содержит три открытых рамки считывания (ORF), фланкированные инвертированными терминальными повторами (ITR), которые функционируют как сигнал репликации и упаковки вирусного происхождения. Rep ORF кодирует четыре неструктурных белка, которые играют роль в репликации вируса, регуляции транскрипции, сайт-специфической интеграции и сборки вириона. Сap ORF кодирует три структурных белка (VP 1-3), которые собираются, чтобы образовать 60-мерный вирусный капсид. Наконец, ORF, присутствует в качестве альтернативной рамки считывания в гене cap, продуцирует активирующий сборку белок (AAP), вирусный белок, который локализует капсидные белки AAV в ядрышко и функционирует в процессе сборки капсида.
[0047] Существует несколько природных («дикого типа») серотипов и более 100 известных вариантов AAV, каждый из которых отличается аминокислотной последовательностью, особенно в гипервариабельных областях капсидных белков, и, таким образом, по своим свойствам доставки генов. Не было выявлено связи между любым AAV и какой-либо болезнью человека, что делает рекомбинантный AAV привлекательным для клинических применений.
[0048] Для целей описания в данном документе, термин «AAV» является аббревиатурой для аденоассоциированного вируса, включая, без ограничения, сам вирус и его производные. За исключением случаев, когда указано иное, терминология относится ко всем подтипам или серотипам и как репликационно-компетентные, так и рекомбинантные формы. Термин «AAV» включает, без ограничения, AAV типа 1 (AAV-1 или AAV1), AAV типа 2 (AAV-2 или AAV2), AAV типа 3A (AAV-3A или AAV3A), AAV типа 3B (AAV-3B или AAV3B), AAV типа 4 (AAV-4 или AAV4), AAV типа 5 (AAV-5 или AAV5), AAV типа 6 (AAV-6 или AAV6), AAV типа 7 (AAV-7 или AAV7), типа AAV 8 (AAV-8 или AAV8), AAV типа 9 (AAV-9 или AAV9), AAV типа 10 (AAV-10 или AAV10 или AAVrh10), птичий AAV, бычий AAV, собачий AAV, козий AAV, лошадиный AAV, AAV примата, AAV не примата, и овечий AAV. «AAV примата» относится к AAV, который заражает приматов, «AAV не примата» относится к AAV, который заражает млекопитающих, не относящихся к приматам, «бычий AAV» относится к AAV, которые заражают бычьих млекопитающих и т. д.
[0049] В данной области техники известны геномные последовательности различных серотипов AAV, а также последовательности нативных терминальных повторов (TRs), белков Rep и капсидных субъединиц. Такие последовательности можно найти в литературе или в публичных базах данных, таких как GenBank. См., например, номера доступа GenBank NC_002077.1 (AAV1), AF063497.1 (AAV1), NC_001401.2 (AAV2), AF043303.1 (AAV2), J01901.1 (AAV2), U48704.1 (AAV3A), NC_001729.1 (AAV3A), AF028705.1 (AAV3B), NC_001829.1 (AAV4), U89790.1 (AAV4), NC_006152.1 (AA5), AF085716.1 (AAV-5), AF028704.1 (AAV6), NC_006260.1 (AAV7), AF513851.1 (AAV7), AF513852.1 (AAV8) NC_006261.1 (AAV-8), AY530579.1 (AAV9), AAT46337 (AAV10) и AAO88208 (AAVrh10); описание которых включено в данный документ в качестве ссылки для обучения нуклеиновой кислоты ААВ и аминокислотных последовательностей. См. также, например, Srivistava et al. (1983) J. Virology 45:555; Chiorini et al. (1998) J. Virology 71:6823; Chiorini et al. (1999) J. Virology 73:1309; Bantel-Schaal et al. (1999) J. Virology 73:939; Xiao et al. (1999) J. Virology 73:3994; Muramatsu et al. (1996) Virology 221:208; Shade et. и др. (1986) J. Virol. 58:921; Gao et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 11854; Moris et al. (2004) Virology 33:375-383; международные патентные публикации WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; и пат. США № 6156303.
[0050] Последовательности существующих в природе cap (капсидных) белков, связанных с серотипами AAV, известные в данной области техники, и включают те, которые описаны в данном документе как AAV1 (SEQ ID NO: 1), AAV2 (SEQ ID NO: 2), AAV3A (SEQ ID NO: 3), AAV3B (SEQ ID NO: 4), AAV4 (SEQ ID NO: 5), AAV5 (SEQ ID NO: 6), AAV6 (SEQ ID NO: 7), AAV7 (SEQ ID NO: 8), AAV8 (SEQ ID NO: ID NO: 9), AAV9 (SEQ ID NO: 10), AAV10 (SEQ ID NO: 11) и AAVrh10 (SEQ ID NO: 12). Термины «вариант капсидного белка AAV» или «вариант AAV» относятся к капсидному белку AAV, содержащему аминокислотную последовательность, которая включает по меньшей мере одну модификацию или замену (включая делецию, вставку, точечную мутацию и т. д.) по сравнению с последовательностью, существующей в природе, или последовательностью капсидного белка «дикого типа» AAV, например, как указано в SEQ ID NO: l-12 в данном документе. Вариант капсидного белка AAV может иметь около 80% идентичности или более аминокислотной последовательности капсидного белка дикого типа, например, 85% идентичности или более, 90% идентичности или более, или 95% идентичности или более для аминокислотной последовательности белка капсида дикого типа, например, 98% или 99% идентичности с капсидным белком дикого типа. Вариант капсидного белка AAV может быть капсидным белком не дикого типа.
[0051] Для целей описания данного документа, «AAV вирион» или «AAV вирусная частица» относится к вирусной частице, состоящей по меньшей мере из одного капсидного белка AAV и инкапсулированного полинуклеотида AAV.
[0052] Для целей описания данного документа, термин «rAAV» представляет собой аббревиатуру, которая относится к рекомбинантному аденоассоциированному вирусу. «Рекомбинантный» применительно к полинуклеотиду означает, что полинуклеотид является продуктом различных комбинаций этапов клонирования, рестрикции или лигирования и других процедур, которые приводят к конструкту, отличному от полинуклеотида, обнаруженного в природе. Рекомбинантный вирус представляет собой вирусную частицу, содержащую рекомбинантный полинуклеотид. Термины соответственно включают репликаты исходного конструкта полинуклеотида и потомство исходного вирусного конструкта.
[0053] Термин «вектор rAAV» охватывает rAAV-вирионы (т.е. вирусные частицы rAAV) (например, инфекционный rAAV-вирион), которые по определению включают полинуклеотид rAAV; а также охватывает полинуклеотиды, кодирующие rAAV (например, одноцепочечный полинуклеотид, кодирующий rAAV (оц-rAAV), двухцепочечный полинуклеотид, кодирующий rAAV (дц-rAAV), например, плазмиды, кодирующие rAAV; и тому подобное).
[0054] Если вирион AAV содержит гетерологичный полинуклеотид (то есть полинуклеотид, отличный от генома AAV дикого типа, например, трансген, который должен быть доставлен в клетку-мишень, агент РНКи или агент CRISPR, который должен быть доставлен в клетку-мишень и т. д.), его обычно называют «рекомбинантным AAV (rAAV) вирионом» или «вирусной частицей rAAV». В общем, гетерологичный полинуклеотид фланкирован по меньшей мере одним и, как правило, двумя инвертированными последовательностями концевого повтора AAV (ITR).
[0055] Термин «упаковка» относится к серии внутриклеточных событий, которые приводят к сборке и инкапсуляции частицы AAV. Гены AAV «rep» и «cap» относятся к полинуклеотидным последовательностям, кодирующим репликацию и инкапсидирующие белки аденоассоциированного вируса. AAV rep и cap называются в данном документе «упаковочными генами» AAV.
[0056] Термин «вспомогательный вирус» для AAV относится к вирусу, который позволяет AAV (например, AAV дикого типа) реплицироваться и упаковываться с помощью клетки млекопитающих. В данной области техники известно множество таких вспомогательных вирусов для AAV, включая аденовирусы, герпесвирусы и поксвирусы, такие как коровья оспа. Аденовирусы охватывают ряд различных подгрупп, хотя аденовирус типа 5 подгруппы С наиболее часто используется. Многочисленные аденовирусы человека, не человеческого млекопитающего, и птичьего происхождения известны и доступны из хранилищ, таких как АТСС. Вирусы семейства герпеса включают, например, вирусы простого герпеса (HSV) и вирусы Эпштейна-Барра (EBV), а также цитомегаловирусы (CMV) и вирусы болезни Ауески (PRV); которые также доступны в депозитариях, таких как ATCC.
[0057] Термин «функция(и) вспомогательного вируса» относится к функции(ям), закодированным в геноме вспомогательного вируса, которые обеспечивают репликацию и упаковку AAV (в сочетании с другими требованиями для репликации и упаковки, описанными в данном документе). Как описано в данном документе, «функция вспомогательного вируса» может быть предоставлена многими способами, в том числе путем предоставления вспомогательного вируса или обеспечения, например, полинуклеотидных последовательностей, кодирующих требуемую функцию(и) в клетке-продуценте при перевозке. Например, плазмиду или другой вектор экспрессии, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие один или более аденовирусных белков, трансфицируют в клетку-продуцент вместе с вектором rAAV.
[0058] Термин «инфекционный» вирус или вирусная частица означает ту, которая содержит правильно собранный вирусный капсид и способна доставлять полинуклеотидный компонент в клетку, для которой вид вируса является тропным. Этот термин не обязательно подразумевает любую возможность репликации вируса. Анализы для подсчета инфекционных вирусных частиц описаны в другом месте этого описания и в области техники. Вирусную инфекционность можно выразить как отношение инфекционных вирусных частиц к общим вирусным частицам. Способы определения отношения инфекционной вирусной частицы к общей вирусной частице известны в данной области техники. См., например, Grainger et al. (2005) Mol. Ther. 11: S337 (описывающий анализ инфекционного титра TCID50); и Zolotukhin и др. (1999) Gene Ther. 6:973. См. также примеры.
[0059] Используемый в данном документе термин «тропизм» относится к выборочному поражению вирусом (например, AAV) клеток определенного вида хозяина или конкретных типов клеток в пределах видов-хозяев. Например, вирус, который может инфицировать клетки сердца, легких, печени и мышц, имеет более широкий (то есть повышенный) тропизм по отношению к вирусу, который может инфицировать только легкие и мышечные клетки. Тропизм также может включать зависимость вируса от конкретных типов молекул клеточной поверхности хозяина. Например, некоторые вирусы могут заражать только клетки с поверхностными гликозаминогликанами, в то время как другие вирусы могут заражать только клетки с сиаловой кислотой (такие зависимости можно тестировать с использованием различных клеточных линий, дефицитных в определенных классах молекул в качестве потенциальных клеток-хозяев для вирусной инфекции). В некоторых случаях тропизм вируса описывает относительные предпочтения вируса. Например, первый вирус может заражать все типы клеток, но гораздо более успешным является заражение этих клеток с поверхностными гликозаминогликанами. Второй вирус можно считать имеющим такой же (или идентичный) тропизм, как и первый вирус, если второй вирус также предпочитает одни и те же характеристики (например, второй вирус также более успешно заражает эти клетки с поверхностными гликозаминогликанами), даже если абсолютная эффективность трансдукции не одинакова. Например, второй вирус может быть более эффективным, чем первый вирус, при тестировании заражения каждого определенного типа клеток, но если относительные предпочтения схожи (или идентичны), второй вирус все еще можно считать имеющим похожий (или идентичный) тропизм, как и первый вирус. В некоторых вариантах осуществления изобретения, тропизм вириона, содержащего вариант капсидного белка AAV субъекта, не изменяется относительно вириона, встречающегося в природе. В некоторых вариантах осуществления изобретения, тропизм вириона, содержащего вариант капсидного белка AAV субъекта, расширяется (т.е. расширяется) относительно вириона, встречающегося в природе. В некоторых вариантах осуществления изобретения, тропизм вириона, содержащего вариант капсидного белка AAV субъекта, снижается относительно вириона, встречающегося в природе.
2
4
12
[0060] Термин «способный к репликации» вирус (например, способный реплицироваться AAC) относится к вирусу фенотипически дикого типа, который является инфекционным, и также способен реплицироваться в инфицированной клетке (то есть в присутствии вспомогательного вируса или функции вспомогательного вируса). В случае AAV способность реплицироваться обычно требует наличия функциональных генов для упаковки AAV. В общем, векторы rAAV, как описано в данном документе, являются неспособными к репликации в клетках млекопитающих (особенно в клетках человека) в силу отсутствия одного или более генов для упаковки AAV. Обычно таким векторам rAAV не хватает каких-либо последовательностей гена для упаковки AAV, чтобы свести к минимуму возможность того, что способность к репликации AAV генерируется путем рекомбинации между генами для упаковки AAV и входящим вектором rAAV. Во многих вариантах осуществления изобретения, препараты вектора rAAV, как описано в данном документе, представляют собой те, которые содержат несколько какого-либо способного реплицироваться AAV (rcAAV, также называемый RCA) (например, менее чем около 1 rcAAV на 10 rAAV-частиц, менее чем около 1 rcAAV на 10 rAAV, менее чем около 1 rcAAV на 10 rAAV-частиц, менее чем около 1 rcAAV на 10 rAAV-частиц или без rcAAV).
[0061] Термин «полинуклеотид» относится к полимерной форме нуклеотидов любой длины, включая дезоксирибонуклеотиды или рибонуклеотиды, или их аналоги. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и нуклеотидные аналоги, и может быть прерван ненуклеотидными компонентами. Если присутствуют, модификации нуклеотидной структуры могут быть представлены до или после сборки полимера. Используемый в данном документе термин «полинуклеотид» взаимозаменяемо относится к двух- и одноцепочечным молекулам. Если не указано иное или не требуется, любой вариант осуществления настоящего изобретения, который включает полинуклеотид, охватывает как двухцепочечную форму, так и каждую из двух комплементарных одноцепочечных форм, которые, как известно или предсказано, составляют двухцепочечную форму.
[0062] Полинуклеотид или полипептид имеет определенный процент «идентичности последовательности» с другим полинуклеотидом или полипептидом, что означает, что при выравнивании этот процент оснований или аминокислот одинаковый при сравнении двух последовательностей. Сходство последовательности может быть определено несколькими различными способами. Чтобы определить идентичность последовательности, последовательности можно выровнять с использованием способов и компьютерных программ, включая BLAST, доступных по всему миру в сети ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Другим алгоритмом выравнивания является FASTA, доступный в пакете Genetics Computing Group (GCG), из Мэдисона, Висконсин, США, дочерняя компания Oxford Molecular Group, Inc. Другие методы выравнивания описаны в Methods in Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., подразделение Harcourt Brace & Co., Сан-Диего, Калифорния, США. Особый интерес представляют программы выравнивания, которые допускают пробелы в последовательности. Смит-Ватерман - это один из алгоритмов, который допускает пробелы в выравниваниях последовательностей. См. Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997). Кроме того, программа GAP, использующая метод выравнивания Needleman и Wunsch, может использоваться для выравнивания последовательностей. См. J. Mol. Biol. 48: 443-445 (1970).
[0063] Термин «ген» относится к полинуклеотиду, который выполняет какую-либо функцию в клетке. Например, ген может содержать открытую рамку считывания, которая способна кодировать продукт гена. Одним из примеров продукта гена является белок, который транскрибируется и транслируется из гена. Другим примером продукта гена является РНК, например, функциональный РНК-продукт, например, аптамер, интерферирующая РНК, рибосомальная РНК (рРНК), транспортная РНК (тРНК), некодирующая РНК (нкРНК), «руководящая» РНК для нуклеаз и т. д., которая транскрибируется, но не транслируется.
[0064] Термин «продукт экспрессии генов» или «продукт гена» представляет собой молекулу, полученную в результате экспрессии определенного гена, как определено выше. Продукты экспрессии генов включают, например, полипептид, аптамер, интерферирующую РНК, информационную РНК (иРНК), рРНК, тРНК, некодирующую РНК (нкРНК) и тому подобное.
[0065] Термин «миРНК агент» («малая интерферирующая» или «короткая интерферирующая РНК» (или миРНК)) представляет собой РНК-дуплекс нуклеотидов, который нацелен на ген интереса («мишень-мишень»). «РНК-дуплекс» относится к структуре, образованной комплементарным спариванием между двумя областями молекулы РНК, образуя область двухцепочечной РНК (дцРНК). миРНК «нацеливается» на ген в том, что нуклеотидная последовательность дуплексной части миРНК комплементарна нуклеотидной последовательности гена-мишени. В некоторых вариантах осуществления изобретения, длина дуплекса миРНК составляет менее чем 30 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, дуплекс может быть длиной 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 или 10 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, длина дуплекса составляет 19-25 нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах осуществления изобретения, миРНК-опосредованное нацеливание на ген достигается за счет использования ДНК-направленной РНК интерференции (днРНКи), который является методом сайленсинга гена, который использует ДНК конструкты для активации путей эндогенной РНК интерференции животной клетки (РНКи). Такие ДНК конструкты предназначены для экспрессии самокомплементарных двухцепочечных РНК, как правило, коротких шпилечных РНК (кшРНК), которые после обработки приводят к молчанию гена-мишени или генов. Любую РНК, включая эндогенные мРНК или вирусные РНК, можно заставить молчать, конструируя конструкты для экспрессии двухцепочечной РНК, комплементарной желаемой мРНК-мишени. Таким образом, дуплексная часть РНК миРНК-агента может быть частью короткой шпилечной структуры, называемой кшРНК. В дополнение к дуплексной части, структура шпильки может содержать петлевую часть, расположенную между двумя последовательностями, которые образуют дуплекс. Петля может варьировать по длине. В некоторых вариантах осуществления изобретения, петля имеет длину 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 нуклеотидов. Структура шпильки также может содержать 3' или 5' «липкие» участки. В некоторых вариантах осуществления изобретения, «липкий» конец представляет собой 3' или 5' «липкий» конец длиной 0, 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидов. В общем, уровень продукта экспрессии (например, мРНК, полипептида и т. д.) гена-мишени снижается с помощью миРНК-агента (например, миРНК, кшРНК и т. д.), который содержит конкретные двухцепочечные нуклеотидные последовательности, которые являются комплементарными к по меньшей мере длинному сегменту длиной 19-25 нуклеотидов (например, 20-21 нуклеотидной последовательности) транскрипта гена-мишени, включая 5'-нетранслируемую (UT) область, ORF или 3'-UT-область. В некоторых вариантах осуществления изобретения, короткие интерферирующие РНК имеют длину около 19-25 нуклеотидов. См., например, заявки PCT WOO/44895, W099/32619, WO01/75164, WO01/92513, WO01/29058, WO01/89304, WO02/16620 и WO02/29858; и патентной публикации США № 20040023390 для описания технологии миРНК. МиРНК и/или кшРНК могут быть кодированы последовательностью нуклеиновой кислоты, и последовательность нуклеиновой кислоты может также включать промотор. Последовательность нуклеиновой кислоты также может включать в себя сигнал полиаденилирования. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сигнал полиаденилирования представляет собой синтетический минимальный сигнал полиаденилирования.
[0066] Термин «антисмысловая РНК» охватывает РНК, которая комплементарна продукту экспрессии гена. Например, антисмысловая РНК, нацеленная на специфическую мРНК, представляет собой агент на основе РНК (или может быть модифицированной РНК), который является комплементарным мРНК, где гибридизация антисмысловой РНК с мРНК изменяет экспрессию мРНК (например, путем изменения стабильности РНК, изменения трансляции РНК и т.д.). Также включены в «антисмысловую РНК» нуклеиновые кислоты, кодирующие антисмысловую РНК.
[0067] Что касается «агентов CRISPR/Cas9», термин «CRISPR» охватывает Кластерированные короткие палиндромные повторы с регулярными промежутками/CRISPR-ассоциированные (Cas) системы, которые эволюционировали для обеспечения бактерий и архей адаптивным иммунитетом против вирусов и плазмид с использованием РНК CRISPR (кРНК), чтобы направлять молчание вторгающихся нуклеиновых кислот. Белок Cas9 (или его функциональный эквивалент и/или его вариант, т.е. Cas9-подобный белок) естественно включает активность ДНК-эндонуклеазы, которая зависит от ассоциации белка с двумя природно-возникающими или синтетическими молекулами РНК, называемыми кРНК и малая некодирующая РНК (также называемыми направляющими РНК). В некоторых случаях две молекулы ковалентно связаны с образованием одной молекулы (также называемой одной направляющей РНК («sgRNA»)). Таким образом, Cas9 или Cas9-подобный белок ассоциируют с ДНК-нацеливающей РНК (этот термин охватывает как конфигурацию двухмолекулярной направляющей РНК, так и конфигурацию одномолекулярной направляющей РНК), которая активирует Cas9 или Cas9-подобный белок и направляет белок к последовательности нуклеиновой кислоты-мишени.
[0068] Если Cas9 или Cas9-подобный белок сохраняет свою природную ферментативную функцию, он будет расщеплять ДНК-мишень, чтобы создать разрыв двух нитей, что может привести к изменению генома (т. е. редактированию: делеция, вставка (когда присутствует донорный полинуклеотид) замена и т. д.), тем самым изменяя экспрессию гена. Некоторые варианты Cas9 (варианты которых охватываются термином Cas9-подобный) были изменены таким образом, что они имеют уменьшенную активность расщепления ДНК (в некоторых случаях они расщепляют одну нить вместо обеих нитей ДНК-мишени, тогда как в других случаях они сильно уменьшены до отсутствия активности расщепления ДНК). Cas9-подобные белки с уменьшенной активностью расщепления ДНК (даже с отсутствием активности расщепления ДНК) все еще могут направляться на ДНК-мишень для блокирования активности РНК-полимеразы. Альтернативно, Cas9 или Cas9-подобный белок может быть модифицирован путем слияния домена активации транскрипции VP64 с белком Cas9 и совместной доставки слитого белка с помощью вспомогательного белка MS2-P65-HSF1 и единственной направляющей РНК, содержащей аптамеры MS2 РНК на тетрапетле и стебель-петля, чтобы сформировать комплекс синергетической активации медиатора (Cas9-SAM) в клетке, который активирует транскрипцию. Таким образом, ферментативно неактивные Cas9-подобные белки могут быть нацелены на конкретное место в ДНК-мишени с помощью ДНК-нацеливающей РНК, чтобы блокировать или активировать транскрипцию ДНК-мишени. Используемый в данном документе термин «агенты CRISPR/Cas9» охватывает все формы CRISPR/Cas9, как описано выше, или как известно в данной области техники.
[0069] Подробную информацию об агентах CRISPR можно найти, например, в (a) Jinek et. al., Science. 2012 Aug 17; 337 (6096): 816-21: «A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity»; (b) Qi et al., Cell. 2013 28 февраля; 152 (5): 1173-83: «Repurposing CRISPR as an RNA- guided platform for sequence- specific control of gene expression», и (c) заявка на патент США № 13/842859 и номер заявки PCT PCT/US13/32589; все из которых полностью включены в настоящее описание посредством ссылки. Таким образом, термин «агент CRISPR», используемый в данном документе, охватывает любой агент (или нуклеиновую кислоту, кодирующую такой агент), содержащий последовательности природного происхождения и/или синтетические последовательности, которые могут использоваться в системе на основе Cas9 (например, Cas9 или Cas9 -подобный белок; любой компонент ДНК-нацеливающей РНК, например, кРНК-подобную РНК, малую некодирующую РНК-подобную РНК, одну направляющую РНК и т. д.; донорный полинуклеотид и тому подобное).
[0070] Под «нуклеазами цинкового пальца» (ZFN) подразумевают искусственные ДНК-эндонуклеазы, полученные путем слияния ДНК-связывающего домена «цинкового пальца» с доменом расщепления ДНК. ZFN могут быть сконструированы так, чтобы нацеливаться на желаемые последовательности ДНК, и это позволяет нуклеазам «цинкового пальца» расщеплять уникальные последовательности-мишени. При введении в клетку, ZFN можно использовать для редактирования ДНК-мишени в клетке (например, геном клетки) путем индуцирования разрывов двойной нити. Для получения дополнительной информации об использовании ZFN см., например: Asuri и др., Mol Ther. 2012 Feb; 20 (2):329-38; Bibikova и др. Science. 2003 May 2; 300(5620):764; Wood et al. Science. 2011 Jul 15; 333(6040):307; Ochiai et al. Genes Cells. 2010 Aug;15(8):875-85; Такасу и др., Insect Biochem Mol Biol. 2010 Oct;40(10):759-65; Ekker et al., Zebrafish 2008 Summer, 5(2): 121-3; Young et al, Proc Natl Acad Sci USA. 2011 Apr 26; 108(17):7052-7; Goldberg et al., Cell. 2010 Mar 5;140(5):678-91; Geurts et al., Science. 2009 Jul 24; 325(5939):433; Flisikowska и др., PLoS One. 2011;6(6):e21045. doi: 10.1371/journal.pone.0021045. Epub 2011 Jun 13; Hauschild et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2011 Jul 19; 108(29): 12013-7; и Yu et al., Cell Res. 2011 Nov; 21(l 1): 1638-40; все из которых включены в настоящее описание посредством ссылки для их изучения, относящиеся к ZFN. Термин «агент ZFN» включает в себя нуклеазу «цинкового пальца» и/или полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую нуклеазу «цинкового пальца».
[0071] Термин «Нуклеаза эффектор-подобного активатора транскрипции» или «TALEN», относится к нуклеаза эффектор-подобного активатора транскрипции (TALEN) - искусственных ДНК-эндонуклеаз, полученных путем слияния эффекторного TAL ДНК-связывающего домена (транскрипционной активатор-подобной) с доменом расщепления ДНК. TALENS можно быстро сконструировать для связывания практически любой желаемой последовательности ДНК и при введении в клетку, TALEN можно использовать для редактирования ДНК-мишени в клетке (например, геном клетки) путем индуцирования разрывов двойной цепи. Для получения дополнительной информации об использовании TALEN см., например: Hockemeyer et al. Nat Biotechnol. 2011 Jul 7, 29(8):731-4; Wood et al. Science. 2011 Jul 15;333(6040):307; Tesson et al. Nat Biotechnol. 2011 Aug 5;29(8):695-6; и Huang et al., Nat Biotechnol. 2011 Aug 5;29(8):699-700; все из которых включены в данный документ посредством ссылки для их обучения, относящегося к TALEN. Термин «агент TALEN» охватывает TALEN и/или полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую TALEN.
[0072] Термин «регуляторный элемент» или «контролирующая последовательность» относится к нуклеотидной последовательности, участвующей во взаимодействии молекул, которая способствует функциональной регуляции полинуклеотида, включая репликацию, дупликацию, транскрипцию, сплайсинг, трансляцию или деградацию полинуклеотида. Регулирование может влиять на частоту, скорость или специфичность процесса и может быть усиливающим или тормозящим по своей природе. Элементы управления, известные в данной области, включают, например, регуляторные последовательности транскрипции, такие как промоторы и энхансеры. Промотор представляет собой участок ДНК, способный при определенных условиях связывания РНК-полимеразы и инициирования транскрипции кодирующей области, обычно расположенный ниже (в направлении 3') от промотора. Промоторы могут быть повсеместно действующими, то есть активными во многих типах клеток, например, промоторы CAG или CMV; или ткань- или клетка-специфичные, например, промотор rho, который активен в палочках, или промотор опсин, который активен в колбочках.
[0073] Термин «оперативно-связанный» или «функционально-связанный» относится к сопоставлению генетических элементов, в которых элементы находятся в отношениях, позволяющих им действовать ожидаемым образом. Например, промотор функционально связан с кодирующей областью, если промотор помогает инициировать транскрипцию кодирующей последовательности. Между промотором и кодирующей областью могут существовать промежуточные остатки, пока поддерживаются эти функциональные соотношения.
[0074] Термин «вектор экспрессии» охватывает вектор, содержащий полинуклеотидную область, которая кодирует представляющий интерес полипептид, и используется для осуществления экспрессии белка в предполагаемой клетке-мишени. Вектор экспрессии может также содержать элементы управления, оперативно связанные с областью кодирования, для облегчения экспрессии белка в мишени. Комбинация элементов управления и гена или генов, с которыми они функционально связаны для экспрессии, иногда упоминается как «кассета экспрессии», большое количество которых известно и доступно в данной области техники или может быть легко сконструировано из компонентов, которые являются доступными в области техники.
[0075] Термин «гетерологичный» означает производное от генотипически отличной сущности от остальной части сущности, с которой он сравнивается. Например, полинуклеотид, вводимый методами генной инженерии в плазмиду или вектор, полученный из другого вида, представляет собой гетерологичный полинуклеотид. Промотор, удаленный из его нативной кодирующей последовательности и функционально связанный с кодирующей последовательностью, с которой он не встречается в природе, является гетерологичным промотором. Так, например, rAAV, который включает гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую гетерологичный генный продукт, представляет собой rAAV, который включает в себя полинуклеотид, который обычно не включен в AAV дикого типа природного происхождения, а закодированный гетерологичный продукт гена представляет собой продукт гена, который обычно не кодируется с помощью AAV дикого типа природного происхождения.
[0076] Терминология «генетическое изменение» и «генетическая модификация» (и их грамматические варианты) используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения процесса, в котором генетический элемент (например, полинуклеотид) вводится в клетку другим путем чем митоз или мейоз. Элемент может быть гетерологичным для клетки или может быть дополнительной копией или улучшенной версией элемента, уже присутствующего в клетке. Генетическое изменение может быть осуществлено, например, путем трансфекции клетки рекомбинантной плазмидой или другим полинуклеотидом посредством любого процесса, известного в данной области техники, такого как электропорация, осаждение фосфатом кальция или контактирование с полинуклеотид-липосомным комплексом. Генетическое изменение также может быть осуществлено, например, путем трансдукции или заражения ДНК- или РНК-вирусом или вирусным вектором. Как правило, генетический элемент вводится в хромосому или мини-хромосому в клетке; но любое изменение, которое изменяет фенотип и/или генотип клетки и ее потомство, включено в этот термин.
[0077] Что касается модификации клеток, термин «генетически модифицированная» или «трансформированная» или «трансфицированная» или «трансдуцированная» с помощью экзогенной ДНК (например, через рекомбинантный вирус) относится к тому, когда такая ДНК была введена внутрь клетки. Наличие экзогенной ДНК приводит к постоянному или временному генетическому изменению. Трансформирующая ДНК может или не может быть интегрирована (ковалентно связана) в геном клетки. «Клон» представляет собой популяцию клеток, полученных из одной клетки или общего предка с помощью митоза. «Клеточная линия» представляет собой клон первичной клетки, способный к стабильному росту in vitro для многих поколений.
[0078] Как используется в данном документе, клетка называется «стабильно» измененной, трансдуцированной, генетически модифицированной или трансформированной генетической последовательностью, если эта последовательность доступна для выполнения ее функции при длительной культуры клетки in vitro и/или в течение длительного периода времени in vivo. Как правило, такая клетка «наследуемо» изменяется (генетически модифицирована) тем, что введенное генетическое изменение, которое также наследуется потомством измененной клетки.
[0079] Термины «полипептид», «пептид» и «белок» используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения полимеров аминокислот любой длины. Термины также охватывают модифицированный аминокислотный полимер; например, образование дисульфидных связей, гликозилирование, липидация, фосфорилирования или конъюгация с меченым компонентом. Полипептиды, такие как антиангиогенные полипептиды, нейропротективные полипептиды и тому подобное, при обсуждении в контексте доставки продукта гена и его композиции субъекту млекопитающему, относятся к соответствующему интактному полипептиду или любому его фрагменту или его генетически сконструированному производному, который сохраняет желаемую биохимическую функцию интактного белка. Аналогично, ссылки на нуклеиновые кислоты, кодирующие антиангиогенные полипептиды, нуклеиновые кислоты, кодирующие нейропротекторные полипептиды, и другие такие нуклеиновые кислоты для использования при доставке продукта гена субъекту млекопитающему (который можно назвать «трансгенами», которые должны быть доставлены в клетку-реципиент) включают полинуклеотиды, кодирующие интактный полипептид или любой фрагмент или генетически сконструированное производное, обладающее требуемой биохимической функцией.
[0080] Используемый в данном документе, термин «изолированная» плазмида, нуклеиновая кислота, вектор, вирус, вирион, клетка-хозяин, белок или другое вещество относится к препарату вещества, лишенного по меньшей мере некоторых других компонентов, которые также могут присутствовать там, где вещество или подобное вещество возникает естественным образом или получено первоначально. Так, например, изолированное вещество может быть получено с использованием техники очистки для обогащения его из исходной смеси. Обогащение может быть измерено на абсолютной основе, например, такой как масса на объем раствора, или его можно измерить по отношению ко второму, потенциально мешающему веществу, присутствующему в исходной смеси. Увеличение обогащений вариантов осуществления изобретения данного описания становится все более изолированным. Изолированная плазмида, нуклеиновая кислота, вектор, вирус, клетка-хозяин или другое вещество в некоторых вариантах реализации изобретения очищается, например, от около 80% до около 90% чистоты, по меньшей мере около 90% чистоты, по меньшей мере около 95% чистоты, по меньшей мере около 98% чистоты или по меньшей мере около 99% или более чистоты.
[0081] Используемые в данном документе термины «обработка», «лечение» и т.п. относятся к получению желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффект может быть профилактическим с точки зрения полного или частичного предотвращения заболевания или его симптома и/или может быть терапевтическим с точки зрения частичного или полного лечения заболевания и/или побочного эффекта, связанного с заболеванием. «Лечение», как используется в данном документе, охватывает любое лечение заболевания у млекопитающего, особенно у человека, и включает: (а) предотвращение возникновения заболевания (и/или симптомов, вызванных заболеванием) у субъекта, который может быть предрасположен к заболеванию или находящееся под угрозой заражения болезнью, но еще не диагностировано как наличие этого заболевания; (b) ингибирование заболевания (и/или симптомов, вызванных заболеванием), т.е. прекращение его развития; и (c) облегчение болезни (и/или симптомов, вызванных заболеванием), то есть вызывание регрессии заболевания (и/или симптомов, вызванных заболеванием), то есть уменьшение интенсивности заболевания и/или одного или более симптомов болезни. Например, предлагаемые композиции и способы могут быть направлены на лечение заболевания сетчатки. Неограничивающие способы для оценки заболеваний сетчатки и их лечения включают: оценку функционирования сетчатки и ее изменения, например, изменения остроты зрения (например, наибольшая острота зрения с коррекцией [BCVA], перемещение, навигация, обнаружение и распознавание объектов), изменения поля зрения (например, периметр статичного и кинетического поля зрения), клиническое обследование (например, исследование щелевой лампой переднего и заднего сегментов глаза), электрофизиологический ответ на все длины волн света и темноты (например, все формы электроретинографии (ERG) [полного поля, мультифокальной и шаблонной], все формы индуцированного зрительного потенциала (VEP), электроокулография (EOG), цветовое зрение, адаптация к темноте и/или контрастная чувствительность; оценка изменений в анатомии или состоянии с использованием анатомических и/или фотографических измерений, например, оптической когерентной томографии (OCT), фотографировании глазного дна, адаптивная оптическая сканирующая лазерная офтальмоскопия, флуоресценция и/или аутофлуоресценция; оценка подвижности глаз и движения глаз (например, нистагм, предпочтение фиксации и стабильность), оценка сообщенных результатов (сообщенные пациентом изменения в зрительно- и не зрительно-опосредованном поведении и активностях, результаты, полученные от пациентов [PRO], основанные на вопросниках оценки качества жизни, повседневной деятельности и измерения неврологической функции (например, функциональная магнитно-резонансная томография (МРТ)).
[0082] Термины «индивидуум», «хозяин», «субъект» и «пациент» используются здесь взаимозаменяемо и относятся к млекопитающему, включая, но не ограничиваясь ими, людей; нечеловеческие приматы, включая обезьян; спортивные животные-млекопитающие (например, лошади); фермерские животные млекопитающих (например, овцы, козы и т.д.); животные млекопитающих (собаки, кошки и т.д.); и грызунов (например, мышей, крыс и т.д.).
[0083] В некоторых вариантах осуществления изобретения, индивидуум является человеком, который ранее был естественным образом подвергнут воздействию AAV и в результате имеет антитела против AAV (т.е. нейтрализующие AAV антитела). В некоторых вариантах осуществления изобретения, индивидуум является человеком, которому ранее вводили вектор AAV (и в результате могут иметь антитела против AAV) и нуждаются в повторном введении вектора для лечения другого состояния или для дальнейшего лечения того же состояния. Основываясь на положительных результатах в клинических испытаниях с использованием доставки гена AAV в, например, печень, мышцы и сетчатку - все ткани, пораженные нейтрализующими антителами против этого носителя, - существует множество таких терапевтических применений/заболеваний-мишеней.
[0084] Используемый в данном документе термин «эффективное количество» представляет собой количество, достаточное для получения полезных или желаемых клинических результатов. Эффективное количество можно вводить в одном или более введениях. Для целей данного описания, эффективное количество соединения (например, инфекционного rAAV-вириона) представляет собой количество, достаточное для временного облегчения, улучшения, стабилизации, реверсии, профилактики, замедления или приостановки прогрессирования (и/или симптомов, связанных с) конкретного состояния болезни (например, заболевание сетчатки). Соответственно, эффективное количество инфекционного rAAV-вириона представляет собой количество инфекционного rAAV-вириона, которое способно эффективно доставлять гетерологичную нуклеиновую кислоту в клетку-мишень (или клетки-мишени) индивидуума. Эффективные количества могут быть определены доклинически, например, путем обнаружения в клетке или ткани продукта гена (РНК, белка), который кодируется гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, с использованием методов, которые хорошо понятно в данной области техники, например, ОТ-ПЦР, вестерн-блоттинг, ИФА, флуоресценции или других способов получения данных и тому подобное. Эффективные количества могут быть определены клинически, например, путем обнаружения изменения начала или прогрессирования заболевания с использованием методов, известных в данной области техники, например, аутофлуоресценции глазного дна, флюоресцеиновой ангиографии, OCT, микропериметрии, адаптивной оптики и т.д. и т.п., как описано в данном документе и как известно в данной области техники.
[0085] Термин «клетка сетчатки» относится в данном документе к любому из типов клеток, которые содержатся в сетчатке, такие как, без ограничения, ганглиозная клетка сетчатки (RG), амакриновые клетки, горизонтальные клетки, биполярные клетки, фоторецепторные клетки, глиальные клетки Мюллера, клетки микроглии, и пигментный эпителий сетчатки (ПЭС). Термин «фоторецепторные клетки» относится в данном документе, без ограничения, к клеткам палочек или «палочкам» и клеткам колбочкам или «колбочки». Термин «клетки Мюллера» или «глия Мюллера» относится к глиальным клеткам, которые поддерживают нейроны в сетчатке позвоночных.
[0086] Термин «направленная эволюция» относится к методологии конструирования капсида, in vitro и/или in vivo, которая эмулирует естественную эволюцию через итеративные раунды генетической диверсификации и процессов отбора, тем самым накапливая полезные мутации, которые постепенно улучшают функцию биомолекулы. Направленная эволюция часто включает метод in vivo, называемый «биопэннинг» для выбора вариантов AAV из библиотеки, варианты которой обладают более эффективным уровнем инфекционности интересующего типа клетки или ткани.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0087] Аденоассоциированные вирусы (AAV) представляют собой семейство парвовирусов с геномом с одноцепочечной ДНК с размером 4,7 кб, содержащейся внутри безоболочечного капсида. Вирусный геном AAV природного происхождения имеет 2 инвертированных терминальных повтора (ITR), которые функционируют как сигнал репликации и упаковки вирусного происхождения - фланкирующие 2 первичные открытые рамки считывания (ORF): rep (кодирующие белки, которые функционируют при вирусной репликации, регулировании транскрипции, сайт-специфической интеграции, и сборке вирионов) и cap. Сap ORF кодирует 3 структурных белка, которые собираются, чтобы образовать 60-мерный вирусный капсид. Многие возникающие в природе варианты AAV и серотипы были изолированы, и ни один из них не был связан с болезнями человека.
[0088] Рекомбинантные варианты AAV могут быть использованы в качестве векторов доставки генов, где маркер или терапевтический ген, представляющий интерес, вставлен между ITR вместо rep и cap. Показано, что эти векторы трансдуцируют как делящиеся, так и не делящиеся клетки in vitro и in vivo и могут приводить к устойчивой трансгенной экспрессии в течение многих лет в постмитотической ткани. См., например, Knipe DM, Howley PM. Fields' Virology. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, USA, 2007; Gao G-P, Alvira MR, Wang L, Calcedo R, Johnston J, Wilson JM. Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy. Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99: 11854-9; Atchison RW, Casto BC, Hammon WM. Adenovirus-Associated Defective Virus Particles. Science 1965; 149: 754-6; Hoggan MD, Blacklow NR, Rowe WP. Studies of small DNA viruses found in various adenovirus preparations: physical, biological, and immunological characteristics. Proc Natl Acad Sci USA 1966; 55: 1467-74; Blacklow NR, Hoggan MD, Rowe WP. Isolation of adenovirus-associated viruses from man. Proc Natl Acad Sci USA 1967; 58: 1410-5; Bantel-Schaal U, zur Hausen H. Characterization of the DNA of a defective human parvovirus isolated from a genital site. Virology 1984; 134: 52-63; Mayor HD, Melnick JL. Small deoxyribonucleic acid-containing viruses (picodnavirus group). Nature 1966; 210: 331-2; Mori S, Wang L, Takeuchi T, Kanda T. Two novel adeno-associated viruses from cynomolgus monkey: pseudotyping characterization of capsid protein. Virology 2004; 330: 375-83; Flotte TR. Gene therapy progress and prospects: recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors. Gene Ther 2004; 11: 805-10.
[0089] Рекомбинантный AAV (называемый в данном документе просто как «AAV») дал многообещающие результаты во все большем числе клинических испытаний. Однако существуют препятствия для доставки генов, которые могут ограничить использование AAV, таких как иммунные ответы против капсида, низкую трансдукцию определенных тканей, невозможность целенаправленной доставки к конкретным типам клеток и относительно низкую пропускную способность. Во многих ситуациях недостаточно механистических знаний для эффективного использования рационального дизайна с возможностью улучшения AAV. В качестве альтернативы, направленная эволюция стала стратегией создания новых вариантов AAV, которые отвечают конкретным биомедицинским потребностям. Направленные стратегии эволюции используют генетическую диверсификацию и процессы отбора, чтобы обеспечить накопление полезных мутаций, которые постепенно улучшают функцию биомолекулы. В этом процессе гены cap AAV дикого типа диверсифицированы несколькими подходами к созданию больших генетических библиотек, которые упакованы для создания библиотек вирусных частиц, и затем селективное давление применяют для изолирования новых вариантов, которые могут преодолевать барьеры доставки генов. Важно отметить, что механистическая основа, лежащая в основе проблемы доставки генов, не обязательно должна быть известна для направленной эволюции функции, что может таким образом ускорить разработку усовершенствованных векторов.
th
[0090] Как правило, описанные в данном документе варианты генерируются с использованием библиотеки AAV и/или библиотек. Такая библиотека или библиотеки AAV генерируется/генерируются путем мутации гена cap, гена, который кодирует структурные белки капсида AAV, с помощью ряда методов направленной эволюции, известных и легко доступных специалисту в области конструирования вирусного генома. См., например, Bartel et al. Am. Soc. Gene Cell Ther. 15 Annu. Meet. 20, S140 (2012); Bowles, D. et al. J. Virol. 77, 423-432 (2003); Gray et al. Mol. Ther. 18, 570-578 (2010); Grimm, D. et al. J. Virol. 82, 5887-5911; Koerber, J. T. et al. Mol. Ther. 16, 1703-1709 (2008); Li W. и др. Mol. Ther. 16, 1252-1260 (2008); Koerber, J. T. et al. Methods Mol. Biol. 434, 161-170 (2008); Koerber, J. T. et al. Hum. Gene Ther. 18, 367-378 (2007); и Koerber, J. T. et al. Mol. Ther. 17, 2088-2095 (2009). Такие методы, без ограничения, следующие: i) подверженной ошибкам ПЦР, чтобы ввести случайные точечные мутации в ААВ cap открытой рамки считывания (ORF) при заданной изменяемой скорости; ii) вирусная рекомбинация in vitro или in vivo или «шаффлинг ДНК» для генерирования случайных химер генов AAV cap с получением библиотеки генов с множественными серотипами AAV; iii) случайные вставки пептидов в определенных участках капсида путем лигирования вырожденных олигонуклеотидов в cap ORF; iv) Определенные вставки последовательностей, кодирующих пептид, в случайные местоположения AAV cap ORF с использованием транспозонного мутагенеза; v) Замена поверхностных петель капсидов AAV библиотеками пептидных последовательностей, биоинформационно разработанными на основе уровня сохранения каждой аминокислотной позиции среди природных серотипов AAV и вариантов генерации «замены петли» библиотек; vi) Случайная замена аминокислот в положениях вырождения между серотипами AAV для генерации библиотек предковых вариантов (Santiago-Ortiz et al., 2015); и комбинации таких методов.
[0091] Шаффлинг ДНК создает химеры, которые сочетают свои исходные свойства в уникальных и часто полезных целях; однако некоторые могут быть неспособны к упаковке, что, по сути, уменьшает разнообразие библиотеки. Концентрация разнообразия в библиотеке достигается с помощью способов введения пептидов, таких как, без ограничения, iii-iv) выше. Разнообразие библиотеки также сосредоточено в таких методах, как v) выше, и такая концентрация направлена на несколько гипервариабельных областей, которые лежат на поверхностных открытых петлях, капсида AAV. Хотя многие из этих методов генерируют варианты капсидов с малой площадью мутаций капсида, эти методы можно сочетать с дополнительными стратегиями мутагенеза, чтобы модифицировать весь капсид.
[0092] Как только библиотека или библиотеки AAV создается/создаются, вирусы затем упаковываются, так что каждая частица AAV состоит из мутантного капсида, окружающего cap ген, кодирующий этот капсид, и очищаются. Варианты библиотеки затем подвергаются методам селективного давления in vitro и/или in vivo, известным и легко доступным для специалиста в области AAV. См., например, Maheshri, N. et al. Nature Biotech. 24, 198-204 (2006); Dalkara, D. et al. Sci. Transl. Med. 5, 189ra76 (2013); Lisowski, L. et al. Nature. 506, 382-286 (2013); Yang, L. et al. PNAS. 106, 3946-3951 (2009); Gao, G. et al. Mol. Ther. 13, 77-87 (2006); и Bell, P. et al. Hum. Gene. Ther. 22, 985-997 (2011). Например, без ограничения, варианты AAV можно селектировать, используя i) аффинные колонки, в которых элюирование различных фракций дает варианты с измененными связывающими свойствами; ii) первичные клетки - изолированные из образцов тканей или бессмертных линий клеток, которые имитируют поведение клеток в организме человека, - которые дают варианты AAV с повышенной эффективностью и/или тканевой специфичностью; iii) модели животных, которые имитируют среду клинической генной терапии, которые дают варианты AAV, которые успешно инфицировали ткань-мишень; iv) модели человеческого ксенотрансплантата, который дает варианты AAV, которые инфицировали привитые клетки человека; и/или комбинацию этих методов селекции.
[0093] После селекции вирусов они могут быть восстановлены известными способами, такими как, без ограничения, опосредованная аденовирусом репликация, амплификация ПЦР, секвенирование следующего поколения и клонирование и тому подобное. Вирусные клоны затем были обогащены посредством повторных циклов методик селекции и ААV ДНК выделена для восстановления селектированного варианта генов cap, представляющих интерес. Такие селектированные варианты могут быть подвергнуты дальнейшей модификации или мутации и как таковые служат новой отправной точкой для дальнейших этапов селекции для итерацинного увеличения вирусной пригодности AAV. Однако в некоторых случаях удачные капсиды были получены без дополнительной мутации.
[0094] Варианты AAV, описанные в данном документе, были получены, по меньшей мере частично, с использованием методики направленной эволюции in vivo, такой как методы, описанные выше, с использованием экранов сетчатки приматов после интравитреального введения. Таким образом, описанный в данном документе вариант капсида AAV содержит одну или более модификаций в аминокислотной последовательности, которые обеспечивают более эффективную трансдукцию клеток сетчатки приматов, чем соответствующий капсидный белок исходного AAV. Используемый в данном документе термин «соответствующий капсидный белок исходного AAV» относится к капсидному белку AAV того же дикого типа или варианта серотипа AAV как и исследуемый вариант капсидного белка AAV, но который не содержит одну или более модификаций аминокислотной последовательности исследуемого варианта капсидного белка AAV.
[0095] В некоторых вариантах осуществления изобретения, исследуемый вариант капсидного белка AAV содержит гетерологичный пептид, содержащий от около 5 аминокислот до около 20 аминокислот, вставленных с помощью ковалентной связи в петлю GH капсидного белка AAV, или петлю IV, относительно соответствующего капсидного белка исходного AAV. Под «петлей GH» или петлей IV капсидного белка AAV подразумевается часть, доступная для растворителей, упоминаемая в данной области техники, как петля GH, или петля IV капсидного белка AAV. Для петли GH/петли IV капсида AAV см., например, van Vliet et al. (2006) Mol. Ther. 14:809; Padron et al. (2005) J. Virol. 79:5047; и Shen et al. (2007) Mol. Ther. 15:1955. Так, например, сайт вставки может находиться в пределах около аминокислот 411-650 капсидного белка VP1 AAV. Например, сайт вставки может находиться в пределах аминокислот 571-612 AAV1 VP1, аминокислот 570-611 AAV2 VP1, в пределах аминокислот 571-612 AAV3A VP1, в пределах аминокислот 571-612 AAV3B VP1, в пределах аминокислот 569-610 AAV4 VP1, в пределах аминокислот 560-601 AAV5 VP1, в пределах аминокислот от 571 до 612 AAV6 VP1, в пределах аминокислот от 572 до 613 AAV7 VP1, в пределах аминокислот от 573 до 614 AAV8 VP1, в пределах аминокислот от 571 до 612 AAV9 VP1 или в пределах аминокислот от 573 до 614 AAV10 VP1 или соответствующих аминокислот любого их варианта. Специалисты в данной области техники должны знать, основываясь на сравнении аминокислотных последовательностей капсидных белков различных серотипов AAV, где сайт вставки, «соответствующий аминокислотам AAV2», будет находиться в капсидном белке любого данного серотипа AAV. См. также фигуру 6 для выравнивания SEQ ID NOS:1-11 AAV дикого типа, который обеспечивает расположение аминокислот между и среди серотипов AAV1, AAV2, AAV3A, AAV3B и AAV4-10 дикого типа (встречающиеся в природе).
[0096] В некоторых вариантах осуществления изобретения, сайт вставки представляет собой один сайт вставки между двумя соседними аминокислотами, расположенными между аминокислотами 570-614 VP1 любого серотипа AAV дикого типа или вариантом AAV, например, сайт вставки находится между двумя соседними аминокислотами, расположенными в аминокислотах 570-610, аминокислотах 580-600, аминокислотах 570-575, аминокислотах 575-580, аминокислотах 580-585, аминокислотах 585-590, аминокислотах 590-600 или аминокислотах 600-614 VP1 любого серотипа или варианта AAV. Например, сайт вставки может находиться между аминокислотами 580 и 581, аминокислотами 581 и 582, аминокислотами 583 и 584, аминокислотами 584 и 585, аминокислотами 585 и 586, аминокислотами 586 и 587, аминокислотами 587 и 588, аминокислотами 588 и 589 или аминокислотами 589 и 590. Сайт вставки может находиться между аминокислотами 575 и 576, аминокислотами 576 и 577, аминокислотами 577 и 578, аминокислотами 578 и 579 или аминокислотами 579 и 580. Сайт вставки может находиться между аминокислотами 590 и 591, аминокислотами 591 и 592, аминокислотами 592 и 593, аминокислотами 593 и 594, аминокислотами 594 и 595, аминокислотами 595 и 596, аминокислотами 596 и 597, аминокислотами 597 и 598, аминокислотами 598 и 599 или аминокислотами 599 и 600. Например, сайт вставки может находиться между аминокислотами 587 и 588 AAV2, между аминокислотами 590 и 591 AAV1, между аминокислотами 588 и 589 AAV3A, между аминокислотами 588 и 589 AAV3B, между аминокислотами 584 и 585 AAV4, между аминокислотами 575 и 576 AAV5, между аминокислотами 590 и 591 AAV6, между аминокислотами 589 и 590 AAV7, между аминокислотами 590 и 591 AAV8, между аминокислотами 588 и 589 AAV9, или между аминокислотами 588 и 589 AAV10.
[0097] В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанная в данном документе пептидная вставка имеет длину 5 аминокислот, 6 аминокислот, 7 аминокислот, 8 аминокислот, 9 аминокислот, 10 аминокислот, 11 аминокислот, 12 аминокислот, 13 аминокислот, 14 аминокислоты, 15 аминокислот, 16 аминокислот, 17 аминокислот, 18 аминокислот, 19 аминокислот или 20 аминокислот. В другом варианте осуществления изобретения, описанная в данном документе пептидная вставка содержит от 1 до 4 спейсерных аминокислот на аминоконце (N-конце) и/или на карбоксильном конце (С-конце) любой из описанных в данном документе пептидных вставок. Типичные спейсерные аминокислоты включают, без ограничения, лейцин (L), аланин (А), глицин (G), серин (S), треонин (T) и пролин (P). В некоторых вариантах осуществления изобретения, пептидная вставка содержит 2 спейсерных аминокислоты на N-конце и 2 спейсерных аминокислоты на С-конце. В других вариантах осуществления изобретения, пептидная вставка содержит 2 спейсерных аминокислоты на N-конце и 1 спейсерную аминокислоту на С-конце.
[0098] Описанные в данном документе пептидные вставки не были ранее описаны и/или вставлены в капсид AAV. Не желая связывать себя теорией, присутствие любой из описанных пептидных вставок может действовать, чтобы снизить аффинность варианта капсида к сульфату гепарина, который, вероятно, уменьшает связывание с внеклеточным матриксом в передней части сетчатки приматов. Кроме того, описанные в данном документе мотивы пептидной вставки могут обеспечить усиленную трансдукцию клеток сетчатки приматов посредством добавления домена связывания рецептора клеточной поверхности.
[0099] В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения, вставка пептида содержит аминокислотную последовательность любой из приведенных ниже формул.
[00100] В некоторых аспектах, пептидная вставка может представлять собой пептид длиной от 7 до 10 аминокислот, формулы 1а:
1
2
1
2
3
4
5
6
7
3
YYXXXXXXXY
1
3
где каждый из Y-Y, если присутствует, независимо выбран из Ala, Leu, Gly, Ser, Thr, Pro
1
X выбран из Gln, Asn, His, Ile и Ala
2
X выбран из Ala, Gln, Asp, Ser, Lys и Pro
3
X выбран из Asp, Ile, Thr и Asn
4
X выбран из Thr, Ser, Tyr, Gln, Glu и Ala
5
X выбран из Thr, Lys и Asn
6
X выбран из Lys, Asn и Glu
7
X выбран из Asn, Thr, Ile, His, Asp и Ala.
[00101] В некоторых вариантах осуществления изобретения, вставка пептида формулы 1a содержит аминокислотную последовательность, выбранную из QADTTKN (SEQ ID NO: 13), ISDQTKH (SEQ ID NO: 14), ASDSTKA (SEQ ID NO: 15), NQDYTKT (SEQ № 16), HDITKNI (SEQ ID NO: 17), HPDTTKN (SEQ ID NO: 18), HQDTTKN (SEQ ID NO: 19), NKTTNKD (SEQ ID NO: 20), ISNENEH (SEQ ID NO: 21) и QANANEN (SEQ ID NO: 22).
[00102] В других аспектах вставка пептида может представлять собой пептид длиной от 7 до 10 аминокислот в длину, формулы 1b:
1
2
1
2
3
4
5
6
7
3
YYXXXXXXXY
1
3
где каждый из Y-Y, если присутствует, независимо выбран из Ala, Leu, Gly, Ser, Thr, Pro
1
X выбран из Gln, Asn, His и Ile
2
X выбран из Ala, Gln, Asp и Ser
3
X выбран из Asp и Ile
4
X выбран из Thr, Tyr и Gln
5
X выбран из Thr и Lys
6
X выбран из Lys и Asn
7
X выбран из Asn, Thr, Ile и His.
[00103] В некоторых вариантах осуществления изобретения, вставка пептида формулы 1b содержит аминокислотную последовательность, выбранную из QADTTKN (SEQ ID NO: 13), ISDQTKH (SEQ ID NO: 14), NQDYTKT (SEQ ID NO: 16), HDITKNI (SEQ ID NO: 17) и HQDTTKN (SEQ ID NO: 19).
[00104] В других аспектах вставка пептида может представлять собой пептид длиной от 7 до 10 аминокислот, формулы 1c
1
2
1
2
3
4
3
YYXXAspXThrLysXY
1
3
где каждый из Y-Y, если присутствует, независимо выбран из Ala, Leu, Gly, Ser, Thr, Pro
1
X выбран из Gln, Asn, His и Ile
2
X выбран из Ala, Gln и Ser
3
X выбран из Thr, Tyr и Gln
4
X выбран из Asn, Thr и His.
[00105] В некоторых вариантах осуществления изобретения, вставка пептида формулы 1c содержит аминокислотную последовательность, выбранную из QADTTKN (SEQ ID NO: 13), ISDQTKH (SEQ ID NO: 14), NQDYTKT (SEQ NO: 16) и HQDTTKN (SEQ ID NO: 19).
[00106] В других аспектах вставка пептида может представлять собой пептид длиной от 7 до 10 аминокислот, формулы 1d:
1
2
1
2
3
4
3
YYXXAspXThrThrXY
1
3
где каждый из Y-Y, если присутствует, независимо выбран из Ala, Leu, Gly, Ser, Thr, Pro
1
X выбран из Gln и Ile
2
X выбран из Ala и Ser
3
X выбран из Thr и Gln
4
X выбран из Asn и His.
[00107] В некоторых вариантах осуществления изобретения, вставка пептида формулы 1d содержит аминокислотную последовательность, выбранную из QADTTKN (SEQ ID NO: 13) и ISDQTKH (SEQ ID NO: 14).
[00108] В других аспектах вставка пептида может представлять собой пептид длиной от 7 до 11 аминокислот, формулы Ie
1
2
1
2
3
4
3
YYXXAsnXAsnGluXY
1
3
где каждый из Y-Y, если присутствует, независимо выбран из Ala, Leu, Gly, Ser, Thr, Pro
1
X выбран из Gln и Ile
2
X выбран из Ala и Ser
3
X выбран из Glu и Ala
4
X выбран из Asn и His.
[00109] В других вариантах осуществления изобретения, вставка пептида формулы 1e содержит аминокислотную последовательность, выбранную из ISNENEH (SEQ ID NO: 21) и QANANEN (SEQ ID NO: 22).
[00110] В еще одном варианте осуществления изобретения, вставка пептида может представлять собой пептид длиной от 7 до 11 аминокислот, формулы IIa:
1
2
1
2
3
4
3
YYXXDXTKXY
1
3
где каждый из Y-Y, если присутствует, независимо выбран из Ala, Leu, Gly, Ser, Thr, Pro
1
X выбран из Q, N, A, H и I;
2
X выбран из Q, A, P и S;
3
X выбран из T, Y, S и Q; и
4
X выбран из T, N, A и H.
1
2
3
4,
[00111] В следующем варианте осуществления пептидной вставки аминокислотной последовательности формулы XXDXTKX пептидная вставка выбрана из группы, состоящей из QADTTKN (SEQ ID NO: 13), ISDQTKH (SEQ ID NO: 14), ASDSTKA, NQDYTKT (SEQ №: 16), HQDTTKN (SEQ ID NO: 19) и HPDTTKN (SEQ ID NO: 18).
[00112] В некоторых таких вариантах осуществления изобретения, вставка пептида может представлять собой пептид длиной от 7 до 11 аминокислот, формулы IIb:
1
2
1
2
3
4
3
YYXXDXTKXY
1
3
[00113] Причем каждый из Y-Y, если присутствует, независимо выбран из Ala, Leu, Gly, Ser, Thr, Pro
1
X выбран из N, A и H;
2
X выбран из Q, P и S;
3
X выбран из T, Y и S; и
4
X выбран из T, N и A.
1
2
3
4,
[00114] В следующем варианте осуществления пептидной вставки аминокислотной последовательности формулы XXDXTKX пептидная вставка выбрана из группы, состоящей из ASDSTKA, NQDYTKT (SEQ: 16), HQDTTKN (SEQ ID NO: 19) и HPDTTKN (SEQ ID NO: 18).
[00115] В других вариантах осуществления изобретения, вставка пептида содержит аминокислотную последовательность, выбранную из KDRAPST (SEQ ID NO: 26), TNRTSPD (SEQ ID NO: 24), PNSTHGS (SEQ ID NO: 25) и GKSKVID (SEQ ID NO: 23).
[00116] В некоторых вариантах осуществления изобретения, вставка пептида содержит аминокислотную последовательность, выбранную из ASDSTKA (SEQ ID NO: 15), QANANEN (SEQ ID NO: 22), QADTTKN (SEQ ID NO: 13), ISDQTKH (SEQ ID NO: 14), NQDYTKT (SEQ ID NO: 16), HDITKNI (SEQ ID NO: 17), HPDTTKN (SEQ ID NO: 18), HQDTTKN (SEQ ID NO: 19), NKTTNKD (SEQ ID NO: 20), ISNENEH (SEQ ID NO: 21), GKSKVID (SEQ ID NO: 23), TNRTSPD (SEQ ID NO: 24), PNSTHGS (SEQ ID NO: 25) и KDRAPST (SEQ ID NO: 26).
1
3
[00117] В других предпочтительных вариантах осуществления изобретения, вставка пептида имеет от 1 до 3 спейсерных аминокислот (Y-Y) на амино и/или карбоксильном конце аминокислотной последовательности, выбранной из QADTTKN (SEQ ID NO: 13), ISDQTKH (SEQ ID NO: 14), ASDSTKA (SEQ ID NO: 15), NQDYTKT (SEQ ID NO: 16), HDITKNI (SEQ ID NO: 17), HPDTTKN (SEQ ID NO: 18), HQDTTKN (SEQ ID NO: 19), NKTTNKD (SEQ ID NO: 20), ISNENEH (SEQ ID NO: 21), QANANEN (SEQ ID NO: 22), GKSKVID (SEQ ID NO: 23), TNRTSPD (SEQ ID NO: 24), PNSTHGS (SEQ ID NO: 25) и KDRAPST (SEQ ID NO: 26). В некоторых таких вариантах осуществления изобретения, вставка пептида выбирают из группы, состоящей из: LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 27), LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28), LGISDQTKHA (SEQ ID NO: 29), LAASDSTKAA (SEQ ID NO: 30), LANQDYTKTA (SEQ ID NO: 31), LAHDITKNIA (SEQ ID NO: 32), LAHPDTTKNA (SEQ ID NO: 33), LAHQDTTKNA (SEQ ID NO: 34), LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 35), LPISNENEHA (SEQ ID NO: 36), LPQANANENA (SEQ ID NO: 37), LAGKSKVIDA (SEQ ID NO: 38), LATNRTSPDA (SEQ ID NO: 39), LAPNSTHGSA (SEQ ID NO: 40) и LAKDRAPSTA (SEQ ID NO: 41).
[00118] В некоторых вариантах осуществления изобретения, исследуемый вариант капсидного белка AAV не содержит никаких других модификаций аминокислотной последовательности, отличных от пептидной вставки от около 5 аминокислот до около 20 аминокислот в петле GH или в петле IV. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения, исследуемый вариант капсидного белка AAV содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из QADTTKN (SEQ ID NO: 13), ISDQTKH (SEQ ID NO: 14), ASDSTKA (SEQ ID NO: 15), NQDYTKT (SEQ ID NO: 16), HDITKNI (SEQ ID NO: 17), HPDTTKN (SEQ ID NO: 18), HQDTTKN (SEQ ID NO: 19), NKTTNKD (SEQ ID NO: 20), ISNENEH (SEQ ID NO: 21), QANANEN (SEQ ID NO: 22), GKSKVID (SEQ ID NO: 23), TNRTSPD (SEQ ID NO: 24), PNSTHGS (SEQ ID NO: 25), KDRAPST (SEQ ID NO: 26), LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 27), LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28), LGISDQTKHA (SEQ ID NO: 29), LAASDSTKAA (SEQ ID NO: 30), LANQDYTKTA (SEQ ID NO: 31), LAHDITKNIA (SEQ ID NO: 32), LAHPDTTKNA (SEQ ID NO: 33), LAHQDTTKNA (SEQ ID NO: 34), LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 35), LPISNENEHA (SEQ ID NO: 36), LPQANANENA (SEQ ID NO: 37), LAGKSKVIDA (SEQ ID NO: 38), LATNRTSPDA (SEQ ID NO: 39), LAPNSTHGSA (SEQ ID NO: 40) и LAKDRAPSTA (SEQ ID NO: 41), и вариант AAV капсида не содержит никаких других аминокислотных замен, вставок или делеций (то есть, вариант капсидного белка AAV содержит указанную вставку и в остальном идентичен соответствующему капсидному белку AAV). Другими словами, вариант капсидного белка AAV, содержащий указанную вставку, в остальном идентичен капсидному белку исходного AAV, в который был вставлен пептид. В качестве еще одного примера, исследуемый вариант капсидного белка AAV содержит пептидную вставку, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из QADTTKN (SEQ ID NO: 13), ISDQTKH (SEQ ID NO: 14), ASDSTKA (SEQ ID NO: 15), NQDYTKT (SEQ ID NO: 16), HDITKNI (SEQ ID NO: 17), HPDTTKN (SEQ ID NO: 18), HQDTTKN (SEQ ID NO: 19), NKTTNKD (SEQ ID NO: 20), ISNENEH (SEQ ID NO: 21), QANANEN (SEQ ID NO: 22), GKSKVID (SEQ ID NO: 23), TNRTSPD (SEQ ID NO: 24), PNSTHGS (SEQ ID NO: 25), KDRAPST (SEQ ID NO: 26), LAQADTTKNA (SEQ ID NO: ID NO: 27), LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28), LGISDQTKHA (SEQ ID NO: 29), LAASDSTKAA (SEQ ID NO: 30), LANQDYTKTA (SEQ ID NO: 31), LAHDITKNIA (SEQ ID NO: 32), LAHPDTTKNA (SEQ ID NO: 33), LAHQDTTKNA (SEQ ID NO: 34), LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 35), LPISNENEHA (SEQ ID NO: 36), LPQANANENA (SEQ ID NO: 37), LAGKSKVIDA (SEQ ID NO: NO: 38), LATNRTSPDA (SEQ ID NO: 39), LAPNSTHGSA (SEQ ID NO: 40) и LAKDRAPSTA (SEQ ID NO: 41), причем пептидная вставка расположена между аминокислотами 587 и 588 капсида VP1 AAV2 или соответствующий аминокислоты VP1 другого исходного AAV, например, между аминокислотами 588 и 589 VP1 AAV1, AAV3A, AAV3B, AAV6 или AAV9, между аминокислотами 586 и 587 VP1 AAV4, между аминокислотами 577 и 578 VP1 AAV5, между аминокислотами 589 и 590 VP1 AAV7, между аминокислотами 590 до 591 VP1 AAV8 или AAV10, и т. д., причем последовательность варианта капсидного белка AAV в остальном идентична соответствующей последовательности капсидного белка исходного AAV, например, любой из SEQ ID NO: 1-12.
[00119] В других вариантах осуществления изобретения, исследуемый вариант капсидного белка AAV, в дополнение к содержащему пептидную вставку, например, как описано в данном документе, или известному в данной области техники, в петле GH, содержит от около 1 до около 100 аминокислотных замен или делеций, например от 1 до около 5, от около 2 до около 4, от около 2 до около 5, от около 5 до около 10, от около 10 до около 15, от около 15 до около 20, от около 20 до около 25, от около 25-50, от около 50-100 аминокислотных замен или делеций по сравнению с капсидным белком исходного AAV. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения, исследуемый вариант капсидного белка содержит аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности 85% или более, 90% или более, 95% или более, или 98% или более, например, или 99% идентичности с соответствующим капсидом исходного AAV, например, капсидный белок дикого типа, как указано в SEQ ID NO: 1-12.
[00120] В следующем варианте осуществления изобретения, одна или более аминокислотных замен находятся в аминокислотном остатке(ах) 1, 15, 34, 57, 66, 81, 101, 109, 144, 164, 176, 188, 196, 226, 236, 240, 250, 312, 363, 368, 449, 456, 463, 472, 484, 524, 535, 551, 593, 698, 708, 719, 721 и/или 735 капсидного белка AAV2 VP1, пронумерованному перед вставкой пептида, или соответствующего аминокислотного остатка(ов) другого капсидного белка AAV. В некоторых таких вариантах осуществления изобретения, одна или более аминокислотных замен выбраны из группы, состоящей из M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L и L735Q капсидного белка AAV2 VP1, пронумерованного перед вставкой пептида, или соответствующего аминокислотного остатка(ов) другого капсидного белка AAV.
[00121] В предпочтительном варианте осуществления изобретения, предлагается вариант капсидного белка AAV, содержащий: а) пептидную вставку в GH-петлю капсидного белка, причем пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из ISDQTKH (SEQ ID NO: 14), LGISDQTKHA (SEQ ID NO: 29) и LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28) и b) одну или более из следующих аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующей заменой в другом исходном серотипе AAV (то есть отличный от AAV2), причем замененная аминокислота(ы) не встречается в природе в соответствующих положениях: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q и их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления изобретения, одна или более аминокислотных замен выбраны из группы, состоящей из: M1L+L15P+P535S, P34A, P34A+S721L, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, Q164K+V708I, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, N312K, N312K+N449D+D472N+N551S+I698V+L735Q, P363L, R484C+V708I, T456K и V708I. Предпочтительно сайт вставки пептида расположен между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или соответствующим положением в капсидном белке другого серотипа AAV.
[00122] В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения, вариант AAV-капсида содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность ISDQTKH (SEQ ID NO: 14) или содержащую, состоящую по существу из, или состоящую из аминокислотной последовательности LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28) или LGISDQTKHA (SEQ ID NO: 29) между аминокислотами 587 и 588 VP1 AAV2 или соответствующими аминокислотами другого капсида AAV, и дополнительно содержит аминокислотную замену P34A в остатке 34 относительно аминокислотной последовательности капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующий остаток другого капсида AAV. Вариант AAV-капсида может иметь по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или, по меньшей мере около 99% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине аминокислотной последовательности, указанную в SEQ ID NO: 2, или соответствующий капсид исходного AAV. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения, вариант AAV-капсида имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% идентичности последовательности или на 100% идентичную следующей аминокислотной последовательности:
A
LAISDQTKHA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:42)
[00123] В другом особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения, вариант AAV-капсида содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность ISDQTKH (SEQ ID NO: 14) или содержащую, состоящую по существу из, состоящую из аминокислотной последовательности LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28) или LGISDQTKHA (SEQ ID NO: 29) между аминокислотами 587 и 588 капсидного белка AAV2 или соответствующим положением в капсидном белке другого серотипа AAV и содержит аминокислотную замену N312K по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующую замену в другом исходном серотипе AAV и необязательно дополнительно содержит аминокислотные замены N449D, D472N, N551S, I698V и/или L735Q по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 или соответствующими заменами в другом исходном серотипе AAV. В другом особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения, вариант AAV-капсида содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность ISDQTKH (SEQ ID NO: 14) или содержащую, содержащую, состоящую по существу из, состоящую из аминокислотной последовательности LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28) или LGISDQTKHA (SEQ ID NO: 29) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или соответствующим положением в капсидном белке другого серотипа AAV и содержит аминокислотные замены N312K, N449D, D472N, N551S, I698V и L735Q по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или замены в соответствующих остатках в другом исходном серотипе AAV. Вариант капсида AAV может иметь по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или более, идентичности аминокислотной последовательности по всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения, вариант AAV-капсида имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% идентичности последовательности или на 100% идентичную следующей аминокислотной последовательности:
K
D
N
S
LAISDQTKHA
V
Q
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRN (SEQ ID NO:43)
[00124] В другом варианте осуществления изобретения, предлагается вариант капсидного белка AAV, содержащий а) пептидную вставку, расположенную между аминокислотами 588 и 589 VP1 AAV1, AAV3A, AAV3B, AAV6 или AAV9, аминокислотами 586 и 587 AAV4, аминокислотами 577 и 578 из AAV5, аминокислотами 589 и 590 AAV7 или аминокислотами 590-591 AAV8 или AAV10, причем пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из ISDQTKH (SEQ ID NO: 14), LGISDQTKHA (SEQ ID NO: 29) и LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28) и b) замена валина на изолейцин в аминокислоте 709 AAV3A или AAV3B, замена аланина на изолейцин в положении 709 AAV1 или AAV6, замена аспарагина на изолейцин аминокислоты 707 AAV4 или аминокислоты 709 ААВ9, или замена треонина на изолейцин в аминокислоте 710 ААВ7 или аминокислоте 711 ААВ8 или ААВ10, или замена глутамина на изолейцин в аминокислоте 697 ААВ5 и необязательно иначе идентично любому из SEQ ID NO: 1 и 3-12. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит: а) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность ISDQTKH (SEQ ID NO: 14) или содержащую, состоящую по существу из, состоящую из аминокислотной последовательности LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28) или LGISDQTKHA (SEQ ID NO: 29) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и b) аминокислотную замену валина на изолейцин в аминокислоте 708 по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2, причем вариант капсидного белка содержит от 2 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен.
[00125] В еще одном варианте осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит: а) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность ISDQTKH (SEQ ID NO: 14) или содержащую, состоящую по существу из, состоящую из аминокислотной последовательности LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28) или LGISDQTKHA (SEQ ID NO: 29) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и b) аминокислотную замену валина на изолейцин в аминокислоте 708 по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 и в остальном идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.
[00126] В еще одном варианте осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит: а) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность ISDQTKH (SEQ ID NO: 14) или содержащую, состоящую по существу из, состоящую из аминокислотной последовательности LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28) или LGISDQTKHA (SEQ ID NO: 29) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, и в остальном идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения, вариант AAV-капсида имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% идентичности последовательности или на 100% идентичную следующей аминокислотной последовательности:
LGISDQTKHA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:44)
[00127] В предпочтительном варианте осуществления изобретения, предлагается вариант капсидного белка AAV, содержащий: а) пептидную вставку в GH-петлю капсидного белка, причем пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из QADTTKN (SEQ ID NO: 13) и LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 27), и b) одну или более из следующих аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующей заменой в другом исходном серотипе AAV (то есть, отличном от AAV2), причем замененная аминокислота(ы) не встречаются в природе в соответствующих положениях: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V719M, S721L, L735Q и их комбинацию, предпочтительно выбранные из S109T, P250S, A524T, A593E, I698V, V708I и/или V719M. Сайт вставки пептида предпочтительно расположен между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или соответствующим положением в капсидном белке другого серотипа AAV. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения, вариант AAV-капсида содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность QADTTKN (SEQ ID NO: 13) или содержащую, состоящую по существу из, состоящую из аминокислотной последовательности LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 27) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или соответствующим положением в капсидном белке другого серотипа AAV и содержит аминокислотную замену I698V по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 или соответствующую замену в другом исходном серотипе AAV, причем замещенная аминокислота(ы) не встречается в природе в соответствующем положении. Вариант капсида AAV может иметь по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или более, идентичности аминокислотной последовательности по всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения, соответствующая аминокислотная замена представляет собой аминокислотную замену I699V по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV3A, AAV3B или AAV9-капсида, замену I687V по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV5, замену I700V по сравнению с аминокислотой последовательность AAV7, замену I701V по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV8 или AAV10. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения, вариант AAV-капсида имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% идентичности последовательности или на 100% идентичную следующей аминокислотной последовательности:
LAQADTTKNA
V
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:45)
[00128] В других предпочтительных вариантах осуществления изобретения, вариант AAV-капсида содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность QADTTKN (SEQ ID NO: 13) или содержащую, состоящую по существу из, состоящую из аминокислотной последовательности LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 27) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или соответствующего положения в капсидном белке другого серотипа AAV и содержит замену аминокислоты V719M и, необязательно, замену V708I по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 или соответствующую замену в другом исходном серотипе AAV, причем замененная аминокислота(ы) не встречается в природе в соответствующем положении.
[00129] В другом варианте осуществления изобретения, предлагается вариант капсидного белка AAV, содержащий а) пептидную вставку, расположенную между аминокислотами 588 и 589 VP1 AAV1, AAV3A, AAV3B, AAV6 или AAV9, аминокислотами 586 и 587 AAV4, аминокислотами 577 и 578 из AAV5, аминокислотами 589 и 590 AAV7 или аминокислотами 590-591 AAV8 или AAV10, причем пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из QADTTKN (SEQ ID NO: 13) и LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 27), и b) замену валина на изолейцин в аминокислоте 709 AAV3A или AAV3B, замену аланина на изолейцин в положении 709 AAV1 или AAV6, замену аспарагина на изолейцин в аминокислоте 707 AAV4 или аминокислоте 709 AAV9 или замену треонин на изолейцин в аминокислоте 710 AAV7 или аминокислоте 711 AAV8 или AAV10, или замену глутамина на изолейцин в аминокислоте 697 AAV5. В другом варианте осуществления изобретения, предлагается вариант капсидного белка AAV, содержащий а) пептидную вставку, расположенную между аминокислотами 588 и 589 VP1 AAV1, AAV3A, AAV3B, AAV6 или AAV9, аминокислотами 586 и 587 AAV4, аминокислотами 577 и 578 из AAV5, аминокислотами 589 и 590 AAV7 или аминокислотами 590-591 AAV8 или AAV10, причем пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из QADTTKN (SEQ ID NO: 13) и LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 27), и b) аминокислотную замену серина на треонин в положении 109 по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV1, AAV3A, AAV3B, AAV4, AAV7, AAV8, AAV9 или AAV10 или в положении 108 по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV5 или AAV6. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, вариант AAV-капсида содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность QADTTKN (SEQ ID NO: 13), или содержащую, состоящую по существу из, или состоящую из аминокислотной последовательности LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 27) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и содержит замену серина на треонин в аминокислоте 109 (S109T) или аминокислотную замену валина на изолейцин в аминокислоте 708 (V708I) по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2, причем вариант капсидного белка содержит от 1 до 5, от 5 до 10, или от 10 до 15 аминокислотных замен и предпочтительно составляет по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В других предпочтительных вариантах осуществления изобретения, вариант AAV-капсида содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность QADTTKN (SEQ ID NO: 13) или содержащую, состоящую по существу из, состоящую из аминокислотной последовательности LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 27) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или соответствующего положения в капсидном белке другого серотипа AAV и содержит замену серина на треонин в аминокислоте 109 и аминокислотную замену валина на изолейцин в аминокислоте 708 по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2.
[00130] В еще одном варианте осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит: а) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность QADTTKN (SEQ ID NO: 13) или содержащую, состоящую по существу из, состоящую из аминокислотной последовательности LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 27) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и b) по меньшей мере одну аминокислотную замену, причем аминокислотная последовательность варианта капсида не содержит замену аминокислоты валина на изолейцин в аминокислоте 708 по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 и не содержит замену серина на треонин в аминокислоте 109 по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2.
[00131] В еще одном варианте осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит: а) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность QADTTKN (SEQ ID NO: 13) или содержащую, состоящую по существу из, состоящую из аминокислотной последовательности LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 27) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и в остальном идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.
[00132] В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, предлагается вариант капсидного белка AAV, содержащий: а) пептидную вставку в GH-петлю капсидного белка, причем пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из HDITKNI (SEQ ID NO: 17), IAHDITKNIA (SEQ ID NO: 60) и LAHDITKNIA (SEQ ID NO: 32), и b) одну или более из следующих аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующей заменой в другом исходном серотипе AAV (то есть, отличный от AAV2), причем замененная аминокислота(ы) не встречается в природе в соответствующих положениях: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, R389S, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления изобретения, капсидный белок AAV содержит одну или более аминокислотных замен, выбранных из S109T, R389S, A593E и/или V708I. Предпочтительно сайт вставки пептида расположен между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или соответствующим положением в капсидном белке другого серотипа AAV. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения, вариант AAV-капсида содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность HDITKNI (SEQ ID NO: 17) или содержащую, состоящую по существу из, состоящую из аминокислотной последовательности IAHDITKNIA (SEQ ID NO: 60) или LAHDITKNIA (SEQ ID NO: 32) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, и содержит аминокислотную замену S109T по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 или соответствующую замену в другом исходном серотипе AAV. Вариант AAV-капсида может иметь по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2.
[00133] В еще одном варианте осуществления изобретения, вариант капсида содержит: а) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность HDITKNI (SEQ ID NO: 17) или содержащую, состоящую по существу из, состоящую из аминокислотной последовательности IAHDITKNIA (SEQ ID NO: 60) или LAHDITKNIA (SEQ ID NO: 32) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и в остальном идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения, вариант AAV-капсида имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% идентичности последовательности или на 100% идентичную следующей аминокислотной последовательности:
LAHDITKNIA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:46)
[00134] В других вариантах осуществления изобретения, вариант капсида содержит: а) пептидную вставку, содержащую, состоящую по существу из, состоящую из аминокислотной последовательности LAHDITKNIA между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и b) по меньшей мере одну аминокислотную замену, причем аминокислотная последовательность варианта капсида не содержит аминокислотную замену валина на изолейцин в аминокислоте 708 по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2. В других вариантах осуществления изобретения, вариант капсида содержит: а) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность DITKNIA (SEQ ID NO: 61) или содержащую, состоящую по существу из, состоящую из последовательности аминокислотной последовательности IAHDITKNIA (SEQ ID NO: 60) или LAHDITKNIA (SEQ ID NO: 32) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и b) замену V708I по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2. В других вариантах осуществления изобретения, вариант капсида содержит: а) пептидную вставку, содержащую, состоящую по существу из, состоящую из аминокислотной последовательности LAHDITKNIA (SEQ ID NO: 32) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и b) две или более аминокислотные замены, причем аминокислотная последовательность варианта капсида содержит аминокислотную замену валина на изолейцин в аминокислоте 708 по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2.
[00135] В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, предлагается вариант капсидного белка AAV, содержащий: а) пептидную вставку в петле GH капсидного белка, причем пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из NQDYTKT (SEQ ID NO: 16) и LANQDYTKTA (SEQ ID NO: 31), и b) одну или более из следующих аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующей заменой в другом исходном серотипе AAV (то есть, отличном от AAV2), причем замененная аминокислота(ы) не встречаются в природе в соответствующих положениях: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q и их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления изобретения, капсидный белок AAV содержит одну или более аминокислотных замен, выбранных из S109T, S109T+S463Y, D368H и V708I. Предпочтительно сайт вставки пептида расположен между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или соответствующим положением в капсидном белке другого серотипа AAV. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения, вариант AAV-капсида содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность NQDYTKT (SEQ ID NO: 16) или содержащую, состоящую по существу из, состоящую из аминокислотной последовательности LANQDYTKTA (SEQ ID NO: 31) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и содержит аминокислотную замену V708I по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 или соответствующую замену в другом исходном серотипе AAV. Вариант AAV-капсида может иметь по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В еще одном варианте осуществления изобретения, вариант капсида содержит: а) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность NQDYTKT (SEQ ID NO: 16) или содержащую, состоящую по существу из, состоящую из аминокислотной последовательности LANQDYTKTA (SEQ ID NO: 31) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и в остальном идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения, вариант AAV-капсида имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% идентичности последовательности или на 100% идентичную следующей аминокислотной последовательности:
LANQDYTKTA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:47)
[00136] В других вариантах осуществления изобретения, вариант капсида содержит: а) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность NQDYTKT (SEQ ID NO: 16), или содержащую, состоящую по существу из, состоящую из аминокислотной последовательности LANQDYTKTA (SEQ ID NO: 31) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и b) аминокислотную замену S109T по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 2 и, необязательно, аминокислотную замену S463Y, причем вариант капсида по меньшей мере на около 85%, по меньшей мере на около 90%, по меньшей мере на около 95%, по меньшей мере на около 98% идентичен всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В соответствующих вариантах осуществления изобретения, вариант капсида содержит: а) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность NQDYTKT (SEQ ID NO: 16) или содержащую, состоящую по существу из, состоящую из аминокислотной последовательности LANQDYTKTA (SEQ ID NO: 31) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и b) аминокислотную замену S109T по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2 и в остальном идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.
[00137] В другом варианте осуществления изобретения, предлагается вариант капсидного белка AAV, содержащий а) пептидную вставку, расположенную между аминокислотами 588 и 589 VP1 AAV1, AAV3A, AAV3B, AAV6 или AAV9, аминокислотами 586 и 587 AAV4, аминокислотами 577 и 578 из AAV5, аминокислотами 589 и 590 AAV7 или аминокислотами 590-591 AAV8 или AAV10, причем пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из NQDYTKT (SEQ ID NO: 16) и LANQDYTKTA (SEQ ID NO: 31), и b) аминокислотную замену аспарагина на лизин в положении 313 по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV1 или AAV6, или в положении 314 по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV9, или заменой серина на лизин в положении 312 AAV3A или AAV3B или в положении 315 AAV8 или AAV10, или замену аргинина на лизин в положении 303 AAV4 или AAV5, или в положении 314 AAV7. В другом варианте осуществления изобретения, вариант капсида содержит: а) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность NQDYTKT (SEQ ID NO: 16), или содержащую, состоящую по существу из, состоящую из аминокислотной последовательности LANQDYTKTA (SEQ ID NO: 31) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и b) аминокислотную замену N312K, причем вариант капсидного белка содержит от 1 до 5, от 5 до 10, или от 10 до 15 аминокислотных замен.
[00138] В другом варианте осуществления изобретения, предлагается вариант капсидного белка AAV, содержащий: а) пептидную вставку в GH-петлю капсидного белка, причем пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из PNSTHGS (SEQ ID NO: 25) и LAPNSTHGSA (SEQ ID NO: 40), и b) одну или более из следующих аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующей заменой в другом исходном серотипе AAV (то есть, отличном от AAV2), причем замененная аминокислота(ы) не встречается в природе в соответствующих положениях: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q и их комбинацию. Предпочтительно сайт вставки пептида расположен между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или соответствующим положением в капсидном белке другого серотипа AAV. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения, вариант AAV-капсида содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность PNSTHGS (SEQ ID NO: 25) или содержащую, состоящую по существу из, состоящую из аминокислотной последовательности LAPNSTHGSA (SEQ ID NO: 40) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и содержит аминокислотную замену V708I по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 или соответствующую замену в другом исходном серотипе AAV. Вариант AAV-капсида может иметь по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В еще одном варианте осуществления изобретения, вариант капсида содержит: а) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность PNSTHGS (SEQ ID NO: 25) или содержащую, состоящую по существу из, состоящую из аминокислотной последовательности LAPNSTHGSA (SEQ ID NO: 40) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и в остальном идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения, вариант AAV-капсида имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% идентичности последовательности или на 100% идентичную следующей аминокислотной последовательности:
LAPNSTHGSA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ IDNO:48)
[00139] В другом варианте осуществления изобретения, предлагается вариант капсидного белка AAV, содержащий: а) пептидную вставку в петле GH капсидного белка, причем пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из NKTTNKDA (SEQ ID NO: 62) и LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 35), и b) одну или более из следующих аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующей заменой в другом исходном серотипе AAV (то есть, отличном от AAV2), причем замененная аминокислота(ы) не встречается в природе в соответствующих положениях: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q и их комбинацию. Предпочтительно сайт вставки пептида расположен между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или соответствующим положением в капсидном белке другого серотипа AAV. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения, вариант AAV-капсида содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность NKTTNKDA (SEQ ID NO: 62) или содержащую, состоящую по существу из, состоящую из аминокислотной последовательности LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 35) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и содержит аминокислотную замену N449D по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 или соответствующую замену в другом исходном серотипе AAV. Вариант AAV-капсида может иметь по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В еще одном варианте осуществления изобретения, вариант капсида содержит: а) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность NKTTNKDA (SEQ ID NO: 62) или содержащую, состоящую по существу из, состоящую из аминокислотной последовательности LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 35) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и в остальном идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения, вариант AAV-капсида имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% идентичности последовательности или на 100% идентичную следующей аминокислотной последовательности:
LANKTTNKDA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:49)
[00140] В другом варианте осуществления изобретения, предлагается вариант капсидного белка AAV, содержащий: а) пептидную вставку в GH-петлю капсидного белка, причем пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из TNRTSPD (SEQ ID NO: 24) и LATNRTSPDA (SEQ ID NO: 39), и b) одну или более из следующих аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующей заменой в другом исходном серотипе AAV (то есть, отличном от AAV2), причем замененная аминокислота(ы) не встречается в природе в соответствующих положениях: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V719M, S721L, L735Q и их комбинации. Предпочтительно сайт вставки пептида расположен между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или соответствующим положением в капсидном белке другого серотипа AAV. В соответствующем варианте осуществления изобретения, предлагается вариант капсидного белка AAV, содержащий а) пептидную вставку, расположенную между аминокислотами 588 и 589 VP1 AAV1, AAV3A, AAV3B, AAV6 или AAV9, аминокислотами 586 и 587 AAV4, аминокислотами 577 и 578 из AAV5, аминокислотами 589 и 590 AAV7 или аминокислотами 590-591 AAV8 или AAV10, причем пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из TNRTSPD (SEQ ID NO: 24) и LATNRTSPDA (SEQ ID NO: 39), и b) замену валина на изолейцин в аминокислоте 709 AAV3A или AAV3B, замену аланина и изолейцина в положении 709 AAV1 или AAV6, замену аспарагина на изолейцин в аминокислоте 707 AAV4 или аминокислоте 709 AAV9, или замену треонина на изолейцин в аминокислоте 710 AAV7 или аминокислоте 711 AAV8 или AAV10, или замену глутамина на изолейцин в аминокислоте 697 AAV5. В других вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит: а) пептидную вставку, содержащую, состоящую по существу из, состоящую из аминокислотной последовательности LATNRTSPDA (SEQ ID NO: 39) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и b) аминокислотную замену валина на изолейцин в аминокислоте 708 по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2, причем вариант капсидного белка содержит от 1 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен. В еще одном варианте осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит: а) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность TNRTSPD (SEQ ID NO: 24) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и b) аминокислотную замену валина на изолейцин в аминокислоте 708 по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2. Вариант AAV-капсида может иметь по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2.
[00141] В еще одном варианте осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит: а) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность TNRTSPD (SEQ ID NO: 24) или содержащую, состоящую по существу из, состоящую из аминокислотной последовательности LATNRTSPDA (SEQ ID NO: 39) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и в остальном идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения, вариант AAV-капсида имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% идентичности последовательности или на 100% идентичную следующей аминокислотной последовательности:
LATNRTSPDA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:50)
[00142] В другом варианте осуществления изобретения, предлагается вариант капсидного белка AAV, содержащий: а) пептидную вставку в GH-петлю капсидного белка, причем пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из GKSKVID (SEQ ID NO: 23) и LAGKSKVIDA (SEQ ID NO: 38), и b) одну или более из следующих аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующей заменой в другом исходном серотипе AAV (то есть, отличном от AAV2), причем замененная аминокислота(ы) не встречается в природе в соответствующих положениях: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q и их комбинацию. Предпочтительно сайт вставки пептида расположен между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или соответствующим положением в капсидном белке другого серотипа AAV. Вариант AAV-капсида может иметь по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения, вариант AAV-капсида содержит пептидную вставку, расположенную между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, содержащую аминокислотную последовательность GKSKVID (SEQ ID NO: 23) или содержащую, состоящую по существу из, состоящую из аминокислотной последовательности LAGKSKVIDA (SEQ ID NO: 38) и в остальном идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. В других вариантах осуществления изобретения, вариант AAV-капсида содержит: a) пептидную вставку, содержащую, состоящую по существу из, состоящую из аминокислотной последовательности LAGKSKVIDA (SEQ ID NO: 38) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену.
[00143] В некоторых вариантах осуществления изобретения, вариант AAV-капсида имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% идентичности последовательности или на 100% идентичную следующей аминокислотной последовательности:
LAGKSKVIDA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:51)
[00144] В другом варианте осуществления изобретения, предлагается вариант капсидного белка AAV, содержащий: а) пептидную вставку в GH-петлю капсидного белка, причем пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из ASDSTKA (SEQ ID NO: 15) и LAASDSTKAA (SEQ ID NO: 30), и b) одну или более из следующих аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующей заменой в другом исходном серотипе AAV (то есть, отличном от AAV2), причем замененная аминокислота(ы) не встречается в природе в соответствующих положениях: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q и их комбинации. Предпочтительно сайт вставки пептида расположен между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или соответствующим положением в капсидном белке другого серотипа AAV. Вариант AAV-капсида может иметь по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В еще одном варианте осуществления изобретения, вариант капсида содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность ASDSTKA (SEQ ID NO: 15) или содержащую, состоящую по существу из, состоящую из аминокислотной последовательности LAASDSTKAA (SEQ ID NO: 30) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и в остальном идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения, вариант AAV-капсида имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% идентичности последовательности или на 100% идентичную следующей аминокислотной последовательности:
LAASDSTKAA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:52)
[00145] В другом варианте осуществления изобретения, предлагается вариант капсидного белка AAV, содержащий: а) пептидную вставку в GH-петлю капсидного белка, причем пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из KDRAPST (SEQ ID NO: 26) и LAKDRAPTSA (SEQ ID NO: 41), и b) одну или более из следующих аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующей заменой в другом исходном серотипе AAV (то есть, отличном от AAV2), причем замененная аминокислота(ы) не встречается в природе в соответствующих положениях: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q и их комбинации. Предпочтительно сайт вставки пептида расположен между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или соответствующим положением в капсидном белке другого серотипа AAV. Вариант AAV-капсида может иметь по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В еще одном варианте осуществления изобретения, вариант капсида содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность KDRAPST (SEQ ID NO: 26) или содержащую, состоящую по существу из, состоящую из аминокислотной последовательности LAKDRAPTSA (SEQ ID NO: 41) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и в остальном идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения, вариант AAV-капсида имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% идентичности последовательности или на 100% идентичную следующей аминокислотной последовательности:
LAKDRAPSTA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:53)
[00146] В другом варианте осуществления изобретения, предлагается вариант капсидного белка AAV, содержащий: а) пептидную вставку в петле GH капсидного белка, причем пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из HQDTTKN (SEQ ID NO: 19) и LAHQDTTKNA (SEQ ID NO: 34), и b) одну или более из следующих аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующей заменой в другом исходном серотипе AAV (то есть, отличном от AAV2), причем замененная аминокислота(ы) не встречается в природе в одном или более соответствующих положениях: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q и их комбинации. Предпочтительно сайт вставки пептида расположен между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или соответствующим положением в капсидном белке другого серотипа AAV. Вариант AAV-капсида может иметь по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В еще одном варианте осуществления изобретения, вариант капсида содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность HQDTTKN (SEQ ID NO: 19) или содержащую, состоящую по существу из, состоящую из аминокислотной последовательности LAHQDTTKNA (SEQ ID NO: 34) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и в остальном идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения, вариант AAV-капсида имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% идентичности последовательности или на 100% идентичную следующей аминокислотной последовательности:
LAHQDTTKNA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:54)
[00147] В другом варианте осуществления изобретения, предлагается вариант капсидного белка AAV, содержащий: а) пептидную вставку в GH-петлю капсидного белка, причем пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из ISNENEH (SEQ ID NO: 21) и LPISNENEHA (SEQ ID NO: 36), и b) одну или более из следующих аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующей заменой в другом исходном серотипе AAV (то есть, отличном от AAV2), причем замененная аминокислота(ы) не встречается в природе в одном или более соответствующих положениях: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q и их комбинации. Предпочтительно сайт вставки пептида расположен между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или соответствующим положением в капсидном белке другого серотипа AAV. Вариант AAV-капсида может иметь по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В еще одном варианте осуществления изобретения, вариант капсида содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность ISNENEH (SEQ ID NO: 21) или содержащую, состоящую по существу из, состоящую из аминокислотной последовательности LPISNENEHA (SEQ ID NO: 36) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и в остальном идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения, вариант AAV-капсида имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% идентичности последовательности или на 100% идентичную следующей аминокислотной последовательности:
LPISNENEHA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:55)
[00148] В другом варианте осуществления изобретения, предлагается вариант капсидного белка AAV, содержащий: а) пептидную вставку в GH-петлю капсидного белка, причем пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из QANANEN (SEQ ID NO: 22) и LPQANANENA (SEQ ID NO: 37), и b) одну или более из следующих аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующей заменой в другом исходном серотипе AAV (то есть, отличном от AAV2), причем замененная аминокислота(ы) не встречается в природе в соответствующих положениях: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q и их комбинации. Предпочтительно сайт вставки пептида расположен между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или соответствующим положением в капсидном белке другого серотипа AAV. Вариант AAV-капсида может иметь по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В еще одном варианте осуществления изобретения, вариант капсида содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность QANANEN (SEQ ID NO: 22) или содержащую, состоящую по существу из, состоящую из аминокислотной последовательности LPQANANENA (SEQ ID NO: 37) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и в остальном идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения, вариант AAV-капсида имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% идентичности последовательности или на 100% идентичную следующей аминокислотной последовательности:
LPQANANENA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:56)
[00149] В другом варианте осуществления изобретения, предлагается вариант капсидного белка AAV, содержащий: а) пептидную вставку в петле GH капсидного белка, причем пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из HPDTTKN (SEQ ID NO: 18) и LAHPDTTKNA (SEQ ID NO: 33), и b) одну или более из следующих аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующей заменой в другом исходном серотипе AAV (то есть, отличном от AAV2), причем замененная аминокислота(ы) не встречается в природе в соответствующих положениях: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q и их комбинации. Предпочтительно сайт вставки пептида расположен между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или соответствующим положением в капсидном белке другого серотипа AAV. Вариант AAV-капсида может иметь по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В еще одном варианте осуществления изобретения, вариант капсида содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность HPDTTKN (SEQ ID NO: 18) или содержащую, состоящую по существу из, состоящую из аминокислотной последовательности LAHPDTTKNA (SEQ ID NO: 33) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и в остальном идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения, вариант AAV-капсида имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% идентичности последовательности или на 100% идентичную следующей аминокислотной последовательности:
LAHPDTTKNA
[00150] MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:57).
[00151] В нескольких аспектах, предлагается вариант капсидного белка AAV, содержащий одну или более аминокислотных замен относительно соответствующего капсидного белка исходного AAV, причем вариант белка капсида, присутствующий в вирионе AAV, придает повышенную способность инфицировать клетку сетчатки по сравнению со способностью инфицировать клетку сетчатки вирионом AAV, содержащим соответствующий капсидный белок исходного AAV.
[00152] В некоторых вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка AAV содержит аминокислотную замену P34A по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или аминокислотной заменой P33A по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV5 (SEQ ID NO: 6). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или, по меньшей мере около 99% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 6, и содержит аминокислотную замену P34A или P33A по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 или AAV5 соответственно. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотную замену P34A, по сравнению с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, и в остальном идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В связанных вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит аминокислотную замену P34A по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, причем вариант капсидного белка содержит от 1 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью капсидного белка AAV2, представленной в SEQ ID NO: 2.
[00153] В других вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка AAV содержит аминокислотную замену в аминокислоте 164 по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующим положением в другом исходном серотипе AAV (то есть, отличном от AAV2), причем замененная аминокислота не встречается в природе в соответствующем положении. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или, по меньшей мере около 99% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, и содержит аминокислотную замену в аминокислоте 164 по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах осуществления изобретения, rAAV-вирион содержит аминокислотную замену глутамина на лизин в аминокислоте 164 по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV1, AAV2 или AAV6 или в аминокислоте 165 по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV7, AAV8 или AAV10; или содержит замену серина на лизин в аминокислоте 160 AAV5 или содержит замену аланина на лизин в аминокислоте 164 AAV9. В соответствующих вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит аминокислотную замену в аминокислоте 164 (например, Q164K) по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2), причем вариант капсидного белка содержит от 1 до 5, от 5-10 или от 10 до 15 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью капсидного белка AAV2, представленной в SEQ ID NO: 2. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотную замену Q164K, по сравнению с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, и в остальном идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В других вариантах осуществления изобретения вариант капсидного белка содержит аминокислотные замены Q164K и V708I по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующими заменами в другом исходном серотипе AAV (то есть, отличном от AAV2), и по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или, по меньшей мере около 99% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2.
[00154] В других вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка AAV содержит аминокислотную замену в аминокислоте 698 по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующим положением в другом исходном серотипе AAV (то есть, отличном от AAV2), причем замененная аминокислота не встречается в природе в соответствующем положении. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или, по меньшей мере около 99% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, и содержит аминокислотную замену в аминокислоте 698 по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах осуществления изобретения, rAAV-вирион содержит аминокислотную замену изолейцина на валин в аминокислоте 698 по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2, или в аминокислоте 699 по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV3A, AAV3B или AAV9, или в аминокислоте 687 AAV5, или в аминокислоте 700 AAV7, или в аминокислоте 701 AAV8 или AAV10. В соответствующих вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит аминокислотную замену в аминокислоте 699 (например, I698V) по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2), причем вариант капсидного белка содержит от 1 до 5, от 5 до 10, или от 10 до 15 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью капсидного белка AAV2, представленной в SEQ ID NO: 2. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотную замену I698V, по сравнению с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, и в остальном идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2.
[00155] В других вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка AAV содержит аминокислотную замену в аминокислоте 109 по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующим положением в другом исходном серотипе AAV (то есть, отличном от AAV2). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или, по меньшей мере около 99% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, и содержит аминокислотную замену в аминокислоте 109 по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит аминокислотную замену серина на треонин в положении 109 по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV1, AAV3A, AAV3B, AAV4, AAV7, AAV8, AAV9 или AAV10 или в положении 108 по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV5 или AAV6. В соответствующих вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит аминокислотную замену S109T по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2, причем вариант капсидного белка содержит от 1 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен. В других соответствующих вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит аминокислотную замену S109T и аминокислотную замену A593E по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2. В некоторых вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит аминокислотные замены S109T и A493V и, необязательно, A593E и/или V708I, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующими заменами в другом исходном серотипе AAV (то есть, отличном от AAV2) и имеет по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или по меньшей мере около 99% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит аминокислотные замены S109T, A493V, A593E и V708I по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующими заменами в другом исходном серотипе AAV (то есть, отличном от AAV2) и по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или, по меньшей мере около 99% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO 2. В других предпочтительных вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит аминокислотные замены S109T и V708I по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 и имеет по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или по меньшей мере около 99% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, или в остальном идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.
[00156] В других вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка AAV содержит аминокислотную замену в аминокислоте 593 по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующим положением в другом исходном серотипе AAV (то есть, отличном от AAV2). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или, по меньшей мере около 99% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, и содержит аминокислотную замену в аминокислоте 593 по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит аминокислотную замену глицина на глутамат в аминокислоте 594 по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV1, AAV3A, AAV6 или AAV9, или аминокислотой 583 AAV5, или аминокислотой 596 AAV8 или AAV10, или аминокислотную замену аргинина на глутамат в аминокислоте 594 AAV3B, или аминокислотную замену аспартата на глутамат в аминокислоте 592 AAV4, или аминокислотную замену глутамина на глутамат в положении 595 AAV7. В других вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит аминокислотную замену A593E по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 и не содержит одну или более из следующих аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2: I19V, V369A, K26R, N215D, G355S, V46A и S196P. В соответствующих вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит аминокислотные замены A593E и N596D по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 и имеет по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или по меньшей мере около 99% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В других вариантах осуществления изобретения, вариант капсида содержит аминокислотные замены A593E и N596D по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 и в остальном идентична аминокислотной последовательности AAV2. В других вариантах осуществления изобретения, вариант капсида содержит аминокислотные замены A593E и V708I по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 и имеет по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или по меньшей мере около 99% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В других вариантах осуществления изобретения, вариант капсида содержит аминокислотные замены A593E и V708I по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 и в остальном идентична аминокислотной последовательности AAV2.
[00157] В других вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка AAV содержит аминокислотную замену в аминокислоте 708 по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующим положением в другом исходном серотипе AAV (то есть, отличном от AAV2), причем замененная аминокислота не встречается в природе в соответствующем положении. Предпочтительно вирион rAAV не содержит замену пролина на серин в аминокислоте 250 по сравнению с AAV2 или соответствующей аминокислотой в другом исходном серотипе AAV. В некоторых вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или, по меньшей мере около 99% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, и содержит аминокислотную замену в аминокислоте 708 по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2). В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит замену валина на изолейцин (V708I) в аминокислоте 708 по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 и имеет по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или по меньшей мере около 99% или более идентичности аминокислотной последовательности во всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 или в остальном идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, причем вариант капсидного белка не содержит замену аминокислоты P250S. В некоторых вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит замену валина на изолейцин в аминокислоте 709 AAV3A или AAV3B, замену аланина на изолейцин в положении 709 AAV1 или AAV6, замену аспарагина на изолейцин в аминокислоте 707 AAV4 или аминокислоте 709 AAV9, или замену треонина на изолейцин в аминокислоте 710 AAV7 или аминокислоте 711 AAV8 или AAV10, или замену глутамина на изолейцин в аминокислоте 697 AAV5. В соответствующих вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит аминокислотную замену V708I по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2, причем вариант капсидного белка содержит от 2 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен, и причем вариант капсидного белка не содержит аминокислотную замену P250S. В других вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит аминокислотную замену V708I и также содержит аминокислотную замену A593E и/или S109T по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2. В других соответствующих вариантах осуществления изобретения, вариант капсида содержит аминокислотные замены V708I и A593E по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2, причем вариант капсидного белка в остальном идентичен аминокислотной последовательности AAV2. В других соответствующих вариантах осуществления изобретения, вариант капсида содержит аминокислотные замены V708I и S109T по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2, причем вариант капсидного белка в остальном идентичен аминокислотной последовательности AAV2. В других предпочтительных вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит аминокислотные замены V708I и V719M по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 и имеет по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или по меньшей мере около 99% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, или в остальном идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. В других предпочтительных вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит аминокислотные замены V708I и R733C по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 и имеет по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или по меньшей мере около 99% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, или в остальном идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. В других предпочтительных вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит аминокислотные замены V708I и G727D по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 и имеет по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или по меньшей мере около 99% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, или в остальном идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.
[00158] В других вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка AAV содержит аминокислотную замену в аминокислоте 196 по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующим положением в другом исходном серотипе AAV (то есть, отличном от AAV2), причем замененная аминокислота не встречается в природе в соответствующем положении и необязательно отличается от пролина. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или, по меньшей мере около 99% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, и содержит аминокислотную замену в аминокислоте 196 по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) и необязательно отличается от замены S196P. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит аминокислотную замену серина на тирозин в аминокислоте 196 AAV2 или AAV9, или в аминокислоте 197 AAV7, AAV8 или AAV10, или в аминокислоте 186 AAV5; или замену аланина на тирозин в аминокислоте 196 AAV1 или AAV6; или замену метионина на тирозин в аминокислоте 191 AAV4; или замену треонина на тирозин в аминокислоте 196 AAV3A или AAV3B. В связанных вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотную замену S196Y по сравнению с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, и в остальном идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В соответствующих вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит аминокислотную замену в аминокислоте 196, отличную от замены S196P (например, содержит замену S196Y) по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2), причем вариант капсидного белка содержит от 1 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью капсидного белка AAV2, представленной в SEQ ID NO: 2.
[00159] В других вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка AAV содержит аминокислотную замену в аминокислоте 175 по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующим положением в другом исходном серотипе AAV (то есть, отличном от AAV2), причем замененная аминокислота не встречается в природе в соответствующем положении. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или, по меньшей мере около 99% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, и содержит аминокислотную замену в аминокислоте 175 по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах осуществления изобретения, вариант капсида содержит аминокислотную замену Q175H по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2, как указано в SEQ ID NO: 2, или замену глутамина на гистидин в соответствующем положении в другом исходном серотипе AAV. В соответствующих вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит аминокислотную замену в аминокислоте 175 (например, Q175H) по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2), причем вариант капсидного белка содержит от 1 до 5, от 5 до 10, или от 10 до 15 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью капсидного белка AAV2, представленной в SEQ ID NO: 2.
[00160] В других вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка AAV содержит аминокислотную замену в аминокислоте 64 по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующим положением в другом исходном серотипе AAV (то есть, отличном от AAV2), причем замененная аминокислота не встречается в природе в соответствующем положении. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или, по меньшей мере около 99% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, и содержит аминокислотную замену в аминокислоте 64 по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах осуществления изобретения, вирион rAAV содержит аминокислотную замену P64S по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2, как представлено в SEQ ID NO: 2, или замену пролина на серин в соответствующем положении в другом исходном серотипе AAV. В соответствующих вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит аминокислотную замену в аминокислоте 64 (например, P64S) по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2), причем вариант капсидного белка содержит от 1 до 5, от 5 до 10, или от 10 до 15 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью капсидного белка AAV2, представленной в SEQ ID NO: 2.
[00161] В других вариантах осуществления изобретения, исследуемый вариант капсидного белка AAV содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентичную капсидной последовательности AAV дикого типа, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11 и 12 и также содержит i) одну или более аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из P34A, S109T+V708I, A593E+N596D, V708I+V719M, V708I+G727D, S109T+A493V+A593E+V708I, V708I+R733C, Q164K и I698V и/или (ii) пептидную вставку, выбранную из группы, состоящей из QADTTKN (SEQ ID NO: 13), ISDQTKH (SEQ ID NO: 14), ASDSTKA (SEQ ID NO: 15), NQDYTKT (SEQ ID NO: 16), HDITKNI (SEQ ID NO: 17), PQANANEN (SEQ ID NO: 63), TNRTSPD (SEQ ID NO: 24), PNSTHGS (SEQ ID NO: 25), KDRAPST (SEQ ID NO: 26), HQDTTKN (SEQ ID NO: 19), HPDTTKN (SEQ ID NO: 18), NKTTNKD (SEQ ID NO: 20), GKSKVID (SEQ ID NO: 23), PISNENEH (SEQ ID NO: 64), LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 27), LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28), LGISDQTKHA (SEQ ID NO: 29), LAASDSTKAA (SEQ ID NO: 30), LAHDITKNIA (SEQ ID NO: 32), LPQANANENA (SEQ ID NO: 37), LANQDYTKTA (SEQ ID NO: 31), LATNRTSPDA (SEQ ID NO: 39), LAPNSTHGSA (SEQ ID NO: 40), LAKDRAPSTA (SEQ ID NO: 41), LAHQDTTKNA (SEQ ID NO: 34), LAHPDTTKNA (SEQ ID NO: 33), LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 35), LAGKSKVIDA (SEQ ID NO: 38) и LPISNENEHA (SEQ ID NO: 36). В некоторых вариантах осуществления изобретения, вариант AAV-капсида содержит указанные одну или более аминокислотных замен и/или пептидных вставок и в остальном идентичен последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-12.
[00162] В некоторых вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка AAV представляет собой предковый капсидный белок. Под предковым капсидным белком подразумевается эволюционный предок капсидного белка, который встречается в природе сейчас, например, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV13, которые генерируется in silico путем случайной аминокислотной замены в положениях вырождения между капсидными белками AAV, которые встречаются в природе сейчас. Ниже приведен один неограничивающий пример предкового капсида, в котором положения вырождения (остатки 264, 266, 268, 448, 459, 460, 467, 470, 471, 474, 495, 516, 533, 547, 551, 555, 557, 561, 563, 577, 583, 593, 596, 661, 662, 664, 665, 710, 717, 718, 719, 723) обозначены как «X»:
[00163] MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAGPSGLGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSXSXGXTNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLXRTQSTGGTAGXXELLFSQXGPXXMSXQAKNWLPGPCYRQQRVSKTLXQNNNSNFAWTGATKYHLNGRXSLVNPGVAMATHKDDEXRFFPSSGVLIFGKXGAGXNNTXLXNVMXTXEEEIKTTNPVATEXYGVVAXNLQSSNTAPXTGXVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPPXXFXXAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYAKSXNVDFAVXXXGVYXEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO: 58)
[00164] В некоторых вариантах осуществления изобретения, предковый капсидный белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или, по меньшей мере около 99% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 58. В некоторых вариантах осуществления изобретения, предковый капсидный белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или, по меньшей мере около 99% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине аминокислотной последовательности AAV2, например, как представлено в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения, предковый капсидный белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или по меньшей мере около 99% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине аминокислотной последовательности предковой последовательности, описанной в SEQ ID NO: 58 или в SEQ ID NO: 2, и содержит один или более аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из: Аланина (А) в положении 264, Аланина (А) в положении 266, Серина (S) в положении 268, Аланина (А) в положении 448, Треонина (Т) в положении 459, Аргинина (R) в положении 460, Аланина (А) в положении 467, Серина (S) в положении 470, Аспарагина (N) в положении 471, Аланина (А) в положении 474, Серина (S) в положении 495, Аспарагина (D) в положении 516, Аспарагина (D) в положении 533, Глутамина (Q) в положении 547, Аланина (А) в положении 551, Аланина (А) в положении 555, Глутаминовой кислоты (E) в положении 557, Метионина (М) в положении 561, Серина (S) в положении 563, Глутамина (Q) в положении 577, Серина (S) в положении 583, Валина (V) в положении 593, Треонина (Т) в положении 596, Аланина (А) в положении 661, Валина (V) в положении 662, Треонина (Т) в положении 664, Пролина (Р) в положении 665, Треонина (Т) в положении 710, Аспарагиновой кислоты (D) в положении 717, Аспарагина (N) в положении 718, Глутаминовой кислоты (E) в положении 719 и Серина (S) в положении 723. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения, вариант капсидного белка содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или, по меньшей мере около 99%, в некоторых случаях 100% идентичности аминокислотной последовательности по всей длине следующей аминокислотной последовательности и содержит один или более аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из: Аланина (А) в положении 264, Аланина (А) в положении 266, Серина (S) в положении 268, Аланина (А) в положении 448, Треонина (Т) в положении 459, Аргинина (R) в положении 460, Аланина (А) в положении 467, Серина (S) в положении 470, Аспарагина (N) в положении 471, Аланина (А) в положении 474, Серина (S) в положении 495, Аспарагина (D) в положении 516, Аспарагина (D) в положении 533, Глутамина (Q) в положении 547, Аланина (А) в положении 551, Аланина (А) в положении 555, Глутаминовой кислоты (E) в положении 557, Метионина (М) в положении 561, Серина (S) в положении 563, Глутамина (Q) в положении 577, Серина (S) в положении 583, Валина (V) в положении 593, Треонина (Т) в положении 596, Аланина (А) в положении 661, Валина (V) в положении 662, Треонина (Т) в положении 664, Пролина (Р) в положении 665, Треонина (Т) в положении 710, Аспарагиновой кислоты (D) в положении 717, Аспарагина (N) в положении 718, Глутаминовой кислоты (E) в положении 719 и Серина (S) в положении 723:
[00165] MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAGPSGLGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASAGSTNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLARTQSTGGTAGTRELLFSQAGPSNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSKTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEDRFFPSSGVLIFGKQGAGANNTALENVMMTSEEEIKTTNPVATEQYGVVASNLQSSNTAPVTGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPPAVFTPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYAKSTNVDFAVDNEGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO: 59).
[00166] В других вариантах осуществления изобретения, исследуемый вариант капсидного белка AAV содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентичную капсидной последовательности AAV дикого типа, выбранной из группы, состоящей из предкового варианта, описанного в данном документе как SEQ ID NO: 58, содержит один или более аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из: Аланина (А) в положении 264, Аланина (А) в положении 266, Серина (S) в положении 268, Аланина (А) в положении 448, Треонина (Т) в положении 459, Аргинина (R) в положении 460, Аланина (А) в положении 467, Серина (S) в положении 470, Аспарагина (N) в положении 471, Аланина (А) в положении 474, Серина (S) в положении 495, Аспарагина (D) в положении 516, Аспарагина (D) в положении 533, Глутамина (Q) в положении 547, Аланина (А) в положении 551, Аланина (А) в положении 555, Глутаминовой кислоты (E) в положении 557, Метионина (М) в положении 561, Серина (S) в положении 563, Глутамина (Q) в положении 577, Серина (S) в положении 583, Валина (V) в положении 593, Треонина (T) в положении 596, Аланина (A) в положении 661, Валина (V) в положении 662, Треонина (Т) в положении 664, Пролина (Р) в положении 665, Треонина (Т) в положении 710, Аспарагиновой кислоты (D) в положении 717, Аспарагина (N) в положении 718, Глутаминовой кислоты (Е) в положении 719 и Серина (S) в положении 723; и также содержит i) одну или более аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из P34A, S109T+V708I, A593E+N596D, V708I+V719M, V708I+G727D, S109T+A493V+A593E+V708I, V708I+R733C, Q164K и I698V и/или (ii) пептидную вставку, выбранную из группы, состоящей из QADTTKN (SEQ ID NO: 13), ISDQTKH (SEQ ID NO: 14), ASDSTKA (SEQ ID NO: 15), NQDYTKT (SEQ ID NO: 16), HDITKNI (SEQ ID NO: 17), PQANANEN (SEQ ID NO: 63), TNRTSPD (SEQ ID NO: 24), PNSTHGS (SEQ ID NO: 25), KDRAPST (SEQ ID NO: 26), HQDTTKN (SEQ ID NO: 19), HPDTTKN (SEQ ID NO: 18), NKTTNKD (SEQ ID NO: 20), GKSKVID (SEQ ID NO: 23), PISNENEH (SEQ ID NO: 64), LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 27), LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28), LGISDQTKHA (SEQ ID NO: 29), LAASDSTKAA (SEQ ID NO: 30), LAHDITKNIA (SEQ ID NO: 32), LPQANANENA (SEQ ID NO: 37), LANQDYTKTA (SEQ ID NO: NO: 31), LATNRTSPDA (SEQ ID NO: 39), LAPNSTHGSA (SEQ ID NO: 40), LAKDRAPSTA (SEQ ID NO: 41), LAHQDTTKNA (SEQ ID NO: 34), LAHPDTTKNA (SEQ ID NO: 33), LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 35), LAGKSKVIDA (SEQ ID NO: 38) и LPISNENEHA (SEQ ID NO: 36). В некоторых вариантах осуществления изобретения, вариант капсида AAV содержит указанные одну или более аминокислотных замен и/или пептидных вставок и в остальном идентичен SEQ ID NO: 59.
[00167] Варианты AAV, описанные в данном документе, были получены путем использования in vivo направленной эволюции с использованием экранов сетчатки приматов после интравитреального введения. В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанные в данном документе варианты капсидных белков, присутствующие в вирионе AAV, обеспечивают повышенную трансдукцию клетки сетчатки по сравнению с трансдукцией клетки сетчатки с помощью вириона AAV, содержащего соответствующий капсидный белок исходного AAV или AAV дикого типа. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения, описанные в данном документе варианты капсидных белков, когда они присутствуют в AAV-вирионе, обеспечивают более эффективную трансдукцию клеток сетчатки приматов, чем вирионы AAV, содержащие соответствующий капсидный белок исходного AAV или капсидный белок AAV дикого типа, например, клетки сетчатки принимают больше AAV-вирионов, содержащих исследуемый вариант капсидного белка AAV, чем вирионы AAV, содержащие капсидный белок исходного AAV или AAV дикого типа. В некоторых таких вариантах осуществления изобретения, вариант вириона AAV или вариант rAAV демонстрирует по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере, в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 15 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 25 раз, по меньшей мере в 50 раз, или более чем в 50 раз увеличенную трансдукцию клетки сетчатки по сравнению с трансдукцией клетки сетчатки вирионами AAV дикого типа или rAAV, содержащими соответствующий капсидный белок исходного AAV. В некоторых таких вариантах осуществления изобретения, описанные в данном документе варианты капсидных белков, присутствующие в вирионе AAV, обеспечивают более широкую трансдукцию клеток сетчатки приматов, чем вирионы AAV, содержащие соответствующий капсидный белок исходного AAV или капсидный белок AAV дикого типа. Другими словами, вариант AAV-вириона трансдуцирует типы клеток, не трансдуцированные вирионами, содержащими соответствующий капсидный белок исходного AAV, и, следовательно, больше типов клеток в сетчатке, чем соответствующий исходный AAV-вирион. В некоторых вариантах осуществления изобретения, вариант AAV-вириона предпочтительно трансдуцирует клетку сетчатки, например, исследуемый rAAV-вирион инфицирует клетку сетчатки с 2-кратной, 5-кратной, 10-кратной, 15-кратной, 20-кратной, 25-кратной, 50-кратной или более чем в 50-кратной специфичностью, чем другая клетка сетчатки или не клетка сетчатки, например клетка вне глаза. В некоторых вариантах осуществления изобретения, трансдуцированная клетка сетчатки представляет собой фоторецепторную клетку (например, палочки, колбочки). В некоторых вариантах осуществления изобретения, клетка сетчатки представляет собой ганглиозную клетку сетчатки (ГКС). В некоторых вариантах осуществления изобретения, клетка сетчатки представляет собой эпителиальную клетку сетчатки (клетку ПЭС). В некоторых вариантах осуществления изобретения, клетка сетчатки представляет собой глиальную клетку Мюллера. В некоторых вариантах осуществления изобретения, клетка сетчатки представляет собой микроглиальную клетку. В некоторых вариантах осуществления изобретения, клетка сетчатки представляет собой амакриновую клетку. В некоторых вариантах осуществления изобретения, клетка сетчатки представляет собой биполярную клетку. В некоторых вариантах осуществления изобретения, клетка сетчатки представляет собой горизонтальную клетку. Увеличение трансдукции клетки сетчатки, например, повышение эффективности трансдукции, более широкая трансдукция, более предпочтительная трансдукция и т.д., могут быть легко оценены in vitro или in vivo любым количеством методов в данной области техники для измерения экспрессии генов. Например, AAV может быть упакован с геномом, содержащим экспрессионную кассету, содержащую репортерный ген, например, флуоресцентный белок, под контролем повсеместного или тканеспецифического промотора, и степень трансдукции, оцененная путем детектирования флуоресцентного белка, например, флуоресцентной микроскопией. В качестве другого примера, AAV может быть упакован с геномом, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты с штриховой кодировкой, и степень трансдукции оценена путем детектирования последовательности нуклеиновой кислоты, например, посредством ПЦР. В качестве другого примера, AAV может быть упакован с геномом, содержащим экспрессионную кассету, содержащую терапевтический ген для лечения заболевания сетчатки, и степень трансдукции, оцененная путем обнаружения лечения заболевания сетчатки у пострадавшего пациента, которому вводили AAV.
[00168] Глазные заболевания, которые могут быть вылечены с использованием варианта rAAV-вектора или вириона и/или метода, описанного в данном документе, включают, но не ограничиваются ими, моногенные заболевания, сложные генетические заболевания, приобретенные заболевания и травматические повреждения. Примеры моногенных заболеваний включают, но не ограничиваются ими, синдром Барде-Бидла; болезнь Батена; кристаллическую дистрофию Биэтти; хороидеремию; хориоретинальную атрофию; хориоретинальную дегенерацию; колбочковые или колбочкообразные дистрофии (аутосомно-доминантная, аутосомно-рецессивная и X-связанная); врожденную стационарную ночную слепоту (аутосомно-доминантная, аутосомно-рецессивная и X-связанная); расстройство цветного зрения, включая ахроматопсию (включая ACHM2, ACHM3, ACHM4 и ACHM5), протанопию, дейтеранопию и тританопию; атаксию Фридрейха; врожденный амароз Лебера (аутосомно-доминантный и аутосомно-рецессивный), включая, но не ограничиваясь ими, LCA1, LCA2, LCA3, LCA4, LCA6, LCA7, LCA8, LCA12 и LCA15; наследственную оптическую нейропатию Лебера; макулярную дистрофию (аутосомно-доминантная и аутосомно-рецессивная), включая, но не ограничиваясь ими, острую макулярную дегенерацию, вителиформную макулярную дистрофию, узорчатую дистрофию, макулярную дистрофию Северной Каролины, унаследованные друзы, дистрофию дна Сорсби, malattia levantanese, и генетически определенную ретинопатию недоношенных; окулярно-ретинальную болезнь развития; глазной альбинизм; оптические атрофии (аутосомно-доминантная, аутосомно-рецессивная и Х-связанная); пигментную дистрофию сетчатки (аутосомно-доминантная, аутосомно-рецессивные, X-связанные и митохондриально-наследственные признаки), примеры которых включают RP1, RP2, RP3, RP10, RP20, RP38, RP40 и RP43; X-связанный ретиношизис; болезнь Старгардта; и синдром Ушера, включая, но не ограничиваясь ими, USH1B, USH1C, USH1D, USH1F, USH1G, USH2A, USH2C, USH2D и USH3. Примеры сложных генетических заболеваний включают, но не ограничиваются ими, глаукому (открытоуголовую, закрытоугловую, с низким давлением, с нормальным давлением, врожденную, неоваскулярную, пигментную, псевдоэксфолиативную); возрастные и другие формы макулярной дегенерации, как экссудативные, так и не экссудативные формы (аутосомно-доминантная и аутосомно-рецессивная), такие как острая макулярная дегенерация, врожденная макулярная дегенерация; ретинопатия недоношенных; и синдром Вогта Коянаги Гарада (VKH). Примеры приобретенных заболеваний включают, но не ограничиваются ими, острую макулярную нейроретинопатию; переднюю ишемическую оптическую невропатию и заднюю ишемическую оптическую невропатию; болезнь Бехчета; окклюзию ветки вены сетчатки; хориоидальную неоваскуляризацию; диабетическую ретинопатию, включая пролиферативную диабетическую ретинопатию и связанные с ней осложнения; диабетический увеит; отеки, такие как отек макулы, цистоидный макулярный отек и диабетический макулярный отек; нарушения эпиретинальной мембраны; макулярную телеангиэктазию; мультифокальный хориоидит; не ретинопатическую диабетическую дисфункцию сетчатки; глазные опухоли; оптические атрофии; отслойку сетчатки; нарушения сетчатки, такие как окклюзия центральной вены сетчатки, пролиферативная витреоретинопатия (PVR), артериальная и венозная окклюзионная болезнь сетчатки, окклюзия сосудов, увеитическая болезнь сетчатки; увеальный выпот; инфекционное и инфильтративное заболевание сетчатки; заболевания зрительного нерва, такие как приобретенная оптическая атрофия. Примеры травматических повреждений включают, но не ограничиваются ими, гистоплазмоз; травму зрительного нерва; глазную травму, которая поражает заднюю часть глазной сайта или локации; травму сетчатки; вирусную инфекцию глаза; вирусную инфекцию зрительного нерва; состояние задней части глаза, вызванное или возникшее под влиянием лазерного лечения глаза; состояния задней части глаза, вызванные или возникшие под влиянием фотодинамической терапии; фотокоагуляцию, радиационную ретинопатию; и симпатический увеит.
HH
[00169] В другом варианте осуществления изобретения, описанный в данном документе вариант капсида содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую генный продукт, такой как, без ограничения, интерферирующая РНК, длинная некодирующая РНК, короткая некодирующая РНК, антисмысловая РНК, аптамер, полипептид, секретируемое антитело, одноцепочечное антитело, домен V, растворимый рецептор, аффитело, ноттин, дарпин, центурин, шаперон, сайт-специфическая нуклеаза, которая обеспечивает сайт-специфическое нокаутирование функции гена, или модифицированную сайт-специфическую нуклеазу, которая обеспечивает гено-специфическую активацию транскрипции.
HH
[00170] Вирион варианта rAAV, описанный в данном документе, содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую генный продукт. В некоторых вариантах осуществления изобретения, генный продукт представляет собой интерферирующую РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, генный продукт представляет собой длинную некодирующую РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, генный продукт представляет собой короткую некодирующую РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, генный продукт представляет собой антисмысловую РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, генный продукт представляет собой аптамер. В некоторых вариантах осуществления изобретения, генный продукт представляет собой полипептид. В некоторых вариантах осуществления изобретения, генный продукт представляет собой секретируемое антитело. В некоторых вариантах осуществления изобретения, генный продукт представляет собой одноцепочечное антитело. В некоторых вариантах осуществления изобретения, генный продукт представляет собой домен V. В некоторых вариантах осуществления изобретения, генный продукт представляет собой растворимый рецептор. В некоторых вариантах осуществления изобретения, генный продукт представляет собой аффитело. В некоторых вариантах осуществления изобретения, генный продукт представляет собой ноттин. В некоторых вариантах осуществления изобретения, генный продукт представляет собой дарпин. В некоторых вариантах осуществления изобретения, генный продукт представляет собой центурин. В некоторых вариантах осуществления изобретения, генный продукт представляет собой шаперон. В некоторых вариантах осуществления изобретения, генный продукт представляет собой сайт-специфическую нуклеазу, которая обеспечивает сайт-специфическое подавление функции гена.
[00171] Использование генного продукта включает, но не ограничивается ими, повышение уровня фактора в клетке, повышение уровня фактора в соседней клетке путем секреции фактора, уменьшение уровня фактора в клетке, или уменьшение уровня фактора в соседней клетке путем секреции фактора. Генный продукт может быть разработан для восполнения уровня дефектного отсутствующего генного продукта, снижения уровня дефектного отсутствующего генного продукта, введения нового поддерживающего генного продукта, дополнения уровня поддерживающего генного продукта, снижения уровня препятствующего генного продукта, или и уменьшения уровня препятствующего генного продукта, и введения или восполнения уровня поддерживающего генного продукта.
[00172] Генные продукты, доставленные исследуемыми вариантами AAV, могут быть использованы для изменения уровня генных продуктов или активности генных продуктов, которые прямо или косвенно связаны с заболеваниями сетчатки и травмой. Гены, генные продукты которых прямо или косвенно связаны с генетическими заболеваниями, включают, например, фактор AДФ-рибозилирования, подобный белок 6 (ARL6); BBSome взаимодействующий белок 1 (BBIP1); BBSome белок 1 (BBS1); BBSome белок 2 (BBS2); BBSome белок 4 (BBS4); BBSome белок 5 (BBS5); BBSome белок 7 (BBS7); BBSome белок 9 (BBS9); BBSome белок 10 (BBS10); BBSome белок 12 (BBS12); центросомный белок 290 кДа (CEP290); интрафлагеллярный транспортный белок 172 (IFT172); интрафлагеллярный транспортный белок 27 (IFT27); инозитолполифосфат-5-фосфатаза Е (INPP5E); калиевый канал внутреннего выпрямления подсемейства J член 13 (KCNJ13); фактор транскрипции с лейциновой молнией подобный-1 (LZTFL1); белок синдрома МакКусика-Кауфмана (MKKS); белок синдрома Меккеля типа 1 (MKS1); белок нефронофтизиса 3 (NPHP1); серологически определенный антиген рака толстой кишки 8 (SDCCAG8); трехсторонний мотив-содержащий белок 32 (TRIM32); домен тетратрикопептидный повтора 8 (TTC8); белок болезни Баттена (CLN3); цитохром P450 4V2 (CYP4V2); белок который сопровождает Rab 1 (CHM); PR (позитивный регуляторный) домен-содержащий 13 белок (PRDM13); ПЭС-ретинальный G-белок-связанный рецептор (RGR); член 1 семейства домена TEA (TEAD1); арилуглеводородный-взаимодействующий рецепторный белок-подобный 1 (AIPL1); ген специфического колбочко-палочкового белка (CRX); гуанилатциклаза активирующий белок 1А (GUCA1A); сетчатко-специфическая гуанилатциклаза (GUCY2D); мембрано-ассоциированный член семейства 3 переноса фосфатидилинозитола (PITPNM3); проминин-1 (PROM1); периферин (PRPH); периферин 2 (PRPH2); белок регулирования экзоцитоза синаптической мембраны 1 (RIMS1); семафорин 4А (SEMA4A); человеческий гомолог белка C. elegans unc119 (UNC119); кассетный переносчик ретиналя, связывающий AТФ (ABCA4); ADAM домен металлопептидазы 9 (ADAM9); активирующий транскрипционный фактор 6 (ATF6); открытая рамка считывания 2 хромосомы 21 (C21orf2); открытая рамка считывания 37 хромосомы 8 (C8orf37); кальциевый канал; потенциал-зависимый; альфа 2/дельта-субъединица 4 (CACNA2D4); член семейства 1 связанный с кадгерином (протокадгерин 21) (CDHR1); церамид киназо-подобный белок (CERKL); альфа субъединица цГМФ-зависимого катионного канала фоторецептора колбочки (CNGA3); бета 3 субъединица циклический нуклеотид-зависимого катионного канала колбочки (CNGB3); циклин M4 (CNNM4); гуанин-нуклеотидный связывающий белок (белок G); полипептид 2 альфа-трансдукционной активности (GNAT2); член 2 подсемейства V калийного канала (KCNV2); Фосфодиэстераза 6C (PDE6C); Фосфодиэстераза 6H (PDE6H); протеом центриола 1 центриолярного белка B (POC1B); RAB28 член семейства онкогенов RAS (RAB28); транскрипционный фактор белка гомеобокса 2 сетчатки и передней нейрональной складки (RAX2); 11-цис ретинолдегидрогеназа 5 (RDH5); RP ГТФаза регулятор-взаимодействующий белок 1 (RPGRIP1); член 5 тубулин тирозин лигазоподобного семейства (TTLL5); альфа-1 субъединица потенциал-зависимого кальциевого канала L-типа (CACNA1F); регулятор ГТФазы пигментной дистрофии сетчатки (RPGR); альфа-субъединица трансдукции колбочки (GNAT1); бета-субъединица фосфодиэстеразы цГМФ колбочки (PDE6B); родопсин (RHO); кальций-связывающий белок 4 (CABP4); G-белок-связанный рецептор 179 (GPR179); родопсинкиназа (GRK1); метаботропный рецептор 6 глутамата (GRM6); богатые лейцином повторы иммуноглобулинподобного трансмембранного домена белка 3 (LRIT3); аррестин (s-антиген) (SAG); переносчики растворенных веществ 24 (SLC24A1); транзиторный рецепторный потенциал канала катиона, подсемейство M, член 1 (TRPM1); никталопин (NYX); зеленый конопсин (OPN1LW); красный конопсин (OPN1MW); синий конопсин (OPN1SW); фратксин (FXN); инозинмонофосфатдегидрогеназа 1 (IMPDH1); ортодентический гомеобокс 2 белок (OTX2); гомолог crumbs 1 (CRB1); домен смерти, содержащий белок 1 (DTHD1); фактор дифференциации роста 6 (GDF6); интрафлагеллярный транспортный белок гомолога Chlamydomonas 140 (IFT140); IQ-мотив, содержащий B1-белок (IQCB1); леберцилин (LCA5); лецитин-ретинол-ацилтрансфераза (LRAT); никотинамид нуклеотид аденилилтрансфераза 1 (NMNAT1); белок RD3 (RD3); ретинолдегидрогеназа 12 (RDH12); ретинальный пигментный эпителий-специфический белок 65 кД (ПЭС65); сперматогенез-связанный белок 7 (SPATA7); табби-подобный белок 1 (TULP1); митохондриальные гены (KSS, LHON, MT-ATP6, MT-TH, MT-TL1, MT-TP, MT-TS2, митохондрически кодированные НАДФ-дегидрогеназы [MT-ND]); бестрофин 1 (BEST1); C1q и связанный с некрозом опухоли белок 5 коллаген (C1QTNF5); EGF-содержащий фибриллиноподобный белок 1 внеклеточного матрикса (EFEMP1); удлинение белка очень длинных жирных кислот (ELOVL4); гомолог 2 фасцина сетчатки, актин-связывающий белок ( FSCN2); гуанилатциклаз-активирующий белок 1B (GUCA1B); гемицентин 1 (HMCN1); протеогликан 1 межфоторецепторной матрицы (IMPG1); пигментная дистрофия сетчатки 1-подобный белок 1 (RP1L1); тканевой ингибитор металлопротеиназы-3 (TIMP3); фактор комплемента H (CFH); фактор комплемента D (CFD); компонент комплемента 2 (C2); компонент комплемента 3 (C3); фактор комплемента B (CFB); Модификатор аутофагии с повреждением ДНК 2 (DRAM2); хондроитинсульфат протеогликана 2 (VCAN) ; митофузин 2 ( MFN2); подсемейство 2 ядерных рецепторов группы F член 1 (NR2F1); оптическая атрофия 1 (OPA1); трансмембранный белок 126A (TMEM126A); гомолог A транслоказы внутренней митохондриальной мембраны 8 (TIMM8A); карбонагидраза IV (CA4); гексокиназа 1 (HK1); келх-подобный белок 7 (KLHL7); подсемейство ядерных рецепторов 2 группа E3 (NR2E3); люциновая молния нейронной сетчатки (NRL); семейство обонятельных рецепторов 2 подсемейства W член 3 (OR2W3); фактор 3 процессинга пре-мРНК (PRPF3); фактор 4 процессинга пре-мРНК (PRPF4); фактор 6 процессинга пре-мРНК (PRPF6); фактор 8 процессинга пре-мРНК (PRPF8); фактор 31 процессинга пре-мРНК (PRPF31); мембранный белок 1 наружного сегмента сетчатки (ROM1); белок 1 пигментной дистрофии сетчатки (RP1); связанный с PIM1-киназой белок 1 (RP9); малый ядерный рибонуклеопротеин 200 кДа (SNRNP200); секретируемый фосфопротеин 2 (SPP2); топоизомераза I, связывающая аргинин/серин-богатый белок (TOPORS); AДФ-рибозилирующий фактор-подобный 2 связывающий белок (ARL2BP); открытая рамка считывания хромосомы 2 (C2orf71); кларин-1 (CLRN1); альфа-субъединица цГМФ-зависимого канала колбочки (CNGA1); бета-субъединица цГМФ-зависимого канала колбочки (CNGB1); цитохром P450 4V2 (CYP4V2); дегидродолихил дифосфатсинтетаза (DHDDS); DEAH бокс полипептид 38 (DHX38); субъединица 1 ER мембранного белка (EMC1); глаза замыкающий/делающий промежутки гомолог (EYS); семейство с последовательностью сходства 161 член A (FAM161A); G белок-связанный рецептор 125 (GPR125); гепаран -альфа-глюкозаминид N-ацетилтрансфераза (HGSNAT); НАД(+)-специфическая изоцитратдегидрогеназа 3 бета (IDH3B); протеогликан 2 межфорецепторной матрицы (IMPG2); белок KIAA1549 (KIAA1549); кизонный центросомальный белок (KIZ); киназа, связанная с мужской половой клеткой (MAK); c-мерная протоонкогенная рецепторная тирозинкиназа (MERTK); мевалонатная киназа (MVK); NIMA (никогда в генах митоза A)-связанная киназа 2 (NEK2); белок 1 дифференцировки нейронов (NEUROD1); альфа субъединица цГМФ фосфодиэстеразы (PDE6A); фосфодиэстераза 6G цГМФ-специфической колбочки гамма (PDE6G); прогрессирующий белок дегенерации колбочки-палочки (PRCD); ретинолсвязывающий белок 3 (RBP3); ретинальдегидсвязывающий белок 1 (RLBP1); семейство 7 переносчиков растворенных веществ член 14 (SLC7A14); ушерин (USH2A); белок цинкового пальца 408 (ZNF408); белок цинкового пальца 513 (ZNF513); белок 1 ротопальцелицевой дизостоза (OFD1); пигментная дистрофия сетчатки 2 (RP2); ретиношизин (RS1); домен абгидролазы, содержащий белок 12 (ABHD12); кадгериноподобный ген 23 (CDH23); центросомальный белок 250 кДа (CEP250); член 2 семейства связывания кальция и интегрина (CIB2); вирлин (DFNB31); гомолог 1 моногенной восприимчивости к аудиогенной судороге (GPR98); гистидил-тРНК-синтетаза (HARS); миозин VIIA (MYO7A); протокадгерин 15 (PCDH15); гармонин (USH1C); человеческий гомолог белка каркаса мыши, содержащий повторы анкиринов и домен SAM (USH1G); дистрофин (DMD); норрин (ПНР); фосфоглицераткиназа (PGK1); калпаин 5 (CAPN5); гомолог frizzled-4 Wnt рецептора (FZD4); интегральный мембранный белок 2B (ITM2B); белок 5, связанный с рецептором липопротеинов низкой плотности (LRP5); микроРНК 204 (MIR204); белок 1 ретинобластомы (RB1); тетраспанин 12 (TSPAN12); открытая рамка считывания хромосомы 12 (C12orf65); кадгерин 3 (CDH3); frizzled-связанный белок мембранного типа (MFRP); орнитин-аминотрансфераза (OAT); фосфолипаза A2 группа V (PLA2G5); ретинолсвязывающий белок 4 ( RBP4); регулятор G-белковой сигнализации 9 (RGS9); регулятор G-белкового сигнального 9-связывающего белка (RGS9BP); ARMS2; белок эксцизионного репаратора кросс-комплементарного репаратора дефицита комплементации грызунов группы 6 (ERCC6); фибулин 5 (FBLN5); HtrA серин пептидаза 1 (HTRA1); толл-подобный рецептор 3 (TLR3); и толл-подобный рецептор 4 (TLR4).
[00173] Гены, генные продукты которых индуцируют или способствуют апоптозу, в данном документе называются «про-апоптотическими генами», а продукты этих генов (мРНК, белок) называются «про-апоптотические генные продукты». Про-апоптотические мишени включают, например, генные продукты Bax; генные продукты Bid; генные продукты Bak; генные продукты Bad; Bcl-2; Bcl-X1. Анти-апоптотические генные продукты включают X-связанный ингибитор апоптоза.
[00174] Гены, генные продукты которых индуцируют или способствуют ангиогенезу, в данном документе называются «про-ангиогенными генами», а продукты этих генов (мРНК, белок) называются «про-ангиогенными генными продуктами». Про-ангиогенные мишени включают, например, фактор роста эндотелия сосудов (VEGFa, VEGFb, VEGFc, VEGFd); рецептор 1 фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR1); рецептор 2 фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR2); Fms-связанная тирозинкиназа 1 (Flt1); фактор роста плаценты (PGF); Фактор роста, полученный из тромбоцитов (PDGF); ангиопоэтины; еж Соник. Гены, генные продукты которых ингибируют ангиогенез, в данном документе называются «анти-ангиогенными генами», а продукты этих генов (мРНК, белок) называются «анти-ангиогенными генными продуктами». Анти-ангиогенные генные продукты включают эндостатин; тумстатин; ангиостатин; фактор, полученный из пигментного эпителия (PEDF), и слитые белки или антитела, специфичные для про-ангиогенных мишеней и/или их рецепторов, например, слитые белки против VEGF sFLT1 или Eylea, VEGF-специфичные антитела Lucentis™ и Avastin™, и т.д.
[00175] Гены, генные продукты которых функционируют как иммуномодуляторы, например, факторы комплемента, толл-подобные рецепторы, называются «иммуномодулирующими генами». Иллюстративные иммуномодулирующие гены включают цитокины, хемокины и слитые белки или антитела, которые являются специфическими для них и/или их рецепторов, например, слитый белок против IL-6 Rilonacept™, H-специфическое антитело фактора комплемента лампамизумаб и т.д. Гены, генные продукты которых функционируют как нейропротективные факторы, например рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGFR); глиальный нейротрофический фактор (GDNF); полученный из палочки фактор жизнеспособности колбочки (RdCVF); фактор роста фибробластов (FGF); нейртурин (NTN); цилиарный нейротрофический фактор (CNTF); фактор роста нервов (NGF); нейротрофин-4 (NT4); нейротрофический фактор мозга (BDNF); эпидермальный фактор роста. Гены, генные продукты которых функционируют как светочувствительные опсины, например, опсин; родопсин; канальный родопсин; галородопсин.
[00176] В некоторых случаях представляющим интерес продуктом гена является сайт-специфическая эндонуклеаза, которая обеспечивает сайт-специфическое нокаутирование функции гена, например, когда эндонуклеаза нокаутирует аллель, связанный с заболеванием сетчатки. Например, когда доминантный аллель кодирует дефектную копию гена, который, когда это дикий тип, является структурным белком сетчатки и/или обеспечивает нормальную функцию сетчатки, сайт-специфическая нуклеаза может быть нацелена на дефектный аллель и нокаутировать дефектный аллель.
[00177] В дополнение к нокаутированию дефектного аллеля, сайт-специфическую нуклеазу можно также использовать для стимуляции гомологичной рекомбинации донорной ДНК, которая кодирует функциональную копию белка, кодируемого дефектным аллелем. Таким образом, например, исследуемый rAAV-вирион может использоваться для доставки как сайт-специфической эндонуклеазы, которая нокаутирует дефектный аллель, так и может использоваться для доставки функциональной копии дефектного аллеля, что приводит к восстановлению дефектного аллеля, тем самым обеспечивая производство функционального белка сетчатки (например, функционального ретинохицина, функционального ПЭС65, функционального периферина и т. д.). См., например, Li et al. (2011) Nature 475:217. В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанный в данном документе rAAV-вирион содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, которая кодирует сайт-специфическую эндонуклеазу; и гетерологичную нуклеотидную последовательность, которая кодирует функциональную копию дефектного аллеля, где функциональная копия кодирует функциональный белок сетчатки. Функциональные белки сетчатки включают, например, ретиношизин, ПЭС65, ретинит, белок-1, взаимодействующий с регулятором ГТФазы пигментной дистрофии сетчатки (RGPR), периферин, периферин-2 и тому подобное.
[00178] Сайт-специфические эндонуклеазы, пригодные для использования, включают, например, мегануклеазы; нуклеазы цинкового пальца (ZFN); транскрипционные активатор-подобные эффекторные нуклеазы (TALENs); и Кластеризованные короткие палиндромные повторы с регулярными промежутками/CRISPR-ассоциированные (Cas), где такие сайт-специфические эндонуклеазы являются неприродными и модифицированы для нацеливания на определенный ген. Такие сайт-специфические нуклеазы могут быть спроектированы так, чтобы разрезать определенные места в геноме, и не гомологичное концевое соединение может затем восстановить разрыв при вставке или удалении нескольких нуклеотидов. Такие сайт-специфические эндонуклеазы (также называемые «INDEL») затем вытесняют белок из рамки и эффективно нокаутируют ген. См., например, публикацию патента США № 2011/0301073.
SB
[00179] В некоторых вариантах осуществления варианта rAAV-вектора, описанного в данном документе, нуклеотидная последовательность, кодирующая представляющий интерес генный продукт, функционально связана с конститутивным промотором. Подходящие конститутивные промоторы включают, например, промотор цитомегаловируса (CMV) (Stinski et al. (1985) Journal of Virology 55 (2): 431-441), промотор раннего энхансера/β-актина цыпленка (CBA)/интрон β-глобина кролика (CAG) (Miyazaki et al. (1989) Gene 79 (2): 269-277, CB (Jacobson et al. (2006) Molecular Therapy 13(6): 1074-1084), промотор фактора 1α элонгации человека (EF1α) (Kim et al. (1990) Gene 91 (2): 217-223), промотор фосфоглицераткиназы человека (PGK) (Singer-Sam et al. (1984) Gene 32 (3): 409-417, митохондриальный промотор тяжелой цепи (Loderio et al. (2012) PNAS 109 (17): 6513-6518), промотор убиквитина (Wulff et al. (1990) FEBS Letters 261: 101-105). В других вариантах осуществления изобретения, нуклеотидная последовательность, кодирующая представляющий интерес генный продукт, функционально связана с индуцибельным промотором. В некоторых случаях, нуклеотидная последовательность, кодирующая представляющий интерес генный продукт, функционально связана с тканеспецифическим или специфическим к клеточному типу регуляторным элементом. Например, в некоторых случаях нуклеотидная последовательность, кодирующая представляющий интерес генный продукт, функционально связана с фоторецептор-специфическим регуляторным элементом (например, фоторецептор-специфическим промотором), например, регуляторным элементом, который обеспечивает селективную экспрессию функционально связанного гена в фоторецепторной клетке. Подходящие фоторецептор-специфические регуляторные элементы включают, например, родопсиновый промотор; промотор родопсинкиназы (Young et al. (2003) Ophthalmol. Vis. Sci. 44:4076); промотор гена бета-фосфодиэстеразы (Nicoud et al. (2007) J. Gene Med.9:1015); промотор гена рецептора ретинита (Nicoud et al. (2007) выше); энхансер гена межфоторецепторного ретиноид-связывающего белка (IRBP) (Nicoud et al. (2007) выше); промотор гена IRBP (Yokoyama et al. (1992) Exp Eye Res. 55: 225), промотор гена опсина (Tucker et al. (1994) PNAS 91:2611-2615), промотор гена ретиношизина (Park et al. (2009) Gene Therapy 16 (7): 916-926), промотор гена гомеодоменного белка CRX (Furukawa et al. (2002) Journal of Neuroscience 22 (5): 1640-1647), промотор гена гуанинуклеотид-связывающего белка альфа-трансдуцирующей активности полипептида 1 (GNAT1) (Lee et al. (2010) Gene Therapy 17: 1390-1399), промотор гена нейроретинального белка с лейциновой застежкой (NRL) (Akimoto et al. (2006) PNAS 103 (10): 3890-3895), промотор аррестина колбочки человека (hCAR) (Li et al. (2002) Biochemistry and Molecular Biology 43: 1375-1383) и промоторы PR2.1, PR1.7, PR1.5 и PR1.1 (Ye et al. (2016). Human Gene Therapy 27 (1): 72-82)). В некоторых случаях нуклеотидная последовательность, кодирующая представляющий интерес генный продукт, функционально связана с регуляторным элементом, специфичным к эпителиальным клеткам пигмента сетчатки (ПЭС) (например, ПЭС-специфическим промотором), например, регуляторным элементом, который обеспечивает селективную экспрессию функционально связанного гена в клетке ПЭС. Подходящие ПЭС-специфические регуляторные элементы включают, например, промотор гена ПЭС65 (Meur et al. (2007) Gene Therapy 14: 292-303), промотор гена клеточного ретинальдегид-связывающего белка (CRALBP) (Kennedy et al. (1998) Journal of Biological Chemistry 273: 5591-5598), промотор гена фактора дифференцировки пигментного эпителия (PEDF, он же серпин F1) (Kojima et al. (2006) Molecular and Cellular Biochemistry 293 (1-2): 63-69), и промотор вителлиформной макулярной дистрофии (VMD2) (Esumi et al. (2004) The Journal of Biological Chemistry 279 (18): 19064-19073) . В некоторых случаях нуклеотидная последовательность, кодирующая представляющий интерес генный продукт, функционально связана с регуляторным элементом, специфичным для глиальных клеток Мюллера (например, глиоспецифический промотор), например, регуляторным элементом, который обеспечивает селективную экспрессию функционально связанного гена в глиальных клетках сетчатки. Подходящие глиоспецифические регуляторные элементы включают, например, промотор глиофибриллярного кислого белка (GFAP) (Besnard et al. (1991) Journal of Biological Chemistry 266 (28): 18877-18883). В некоторых случаях нуклеотидная последовательность, кодирующая представляющий интерес генный продукт, функционально связана с регуляторным элементом, специфичным для биполярных клеток (например, биполярно-специфическим промотором), например, регуляторным элементом, который обеспечивает селективную экспрессию функционально связанного гена в биполярной клетке. Подходящие биполярно-специфические регуляторные элементы включают, например, промотор GRM6 (Cronin et al. (2014) EMBO Molecular Medicine 6 (9): 1175-1190).
[00180] Для целей изобретения, описание в данном документе предоставляет изолированную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, которая кодирует вариант капсидного белка AAV, как описано выше. Изолированная нуклеиновая кислота может представлять собой вектор AAV, например, рекомбинантный вектор AAV.
[00181] В настоящем описании также раскрыт способ лечения заболевания сетчатки, причем способ включает введение нуждающемуся в этом человеку эффективного количества варианта rAAV-вириона, содержащего представляющий интерес трансген, как описано выше и описано в данном документе. Специалист в данной области техники легко мог бы определить эффективное количество исследуемого rAAV-вириона и что заболевание лечилось путем тестирования на изменение одного или более функциональных или анатомических параметров, например, остроты зрения, поля зрения, электрофизиологической чувствительности к свету и темноте, цветного зрения, контрастной чувствительности, анатомии, здоровья сетчатки и сосудистой сети, подвижности глаз, предпочтения фиксации и стабильности.
[00182] Неограничивающие способы оценки функции сетчатки и ее изменения включают в себя оценку остроты зрения (например, наибольшая острота зрения с коррекцией [BCVA], способность передвигаться, навигация, обнаружение и распознавание объектов), изменения поля зрения (например, периметр статичного и кинетического поля зрения), клиническое обследование (например, исследование щелевой лампой переднего и заднего сегментов глаза), электрофизиологический ответ на все длины волн света и темноты (например, все формы электроретинографии (ERG) [полного поля, мультифокальной и шаблонной], все формы индуцированного зрительного потенциала (VEP), электроокулография (EOG), цветовое зрение, темновая адаптация и/или контрастная чувствительность). Неограничивающие способы для оценки состояния анатомии и состояния сетчатки и ее изменений включают в себя оптическую когерентную томографию (OCT), фотографирование глазного дна, адаптивную оптическую сканирующую лазерную офтальмоскопию, флуоресценцию и/или аутофлуоресценцию; оценку подвижности глаз и движения глаз (например, нистагм, предпочтение фиксации и стабильность), оценку сообщенных результатов (сообщенные пациентом изменения в зрительно- и не зрительно-опосредованном поведении и активностях, результаты, полученные от пациентов [PRO], основанные на вопросниках оценки качества жизни, повседневной деятельности и измерения неврологической функции (например, функциональная магнитно-резонансная томография (МРТ)).
8
15
8
15
[00183] В некоторых вариантах осуществления изобретения, эффективное количество исследуемого rAAV-вириона приводит к уменьшению скорости потери функции сетчатки, анатомической целостности или здоровья сетчатки, например, в 2 раза, в 3 раза, в 4 раза или в 5 раз или более снижения скорости потери и, следовательно, прогрессирования заболевания, например, в 10 раз меньше или более в скорости потери и, следовательно, в прогрессирования заболевания. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эффективное количество исследуемого rAAV-вириона приводит к усилению зрительной функции, функции сетчатки, улучшению анатомии или здоровья сетчатки, и/или улучшению подвижности глаз, и/или улучшению неврологической функции, например, 2-кратное, 3-кратное, 4-кратное или 5-кратное улучшение или более в функции сетчатки, анатомии или здоровье сетчатки, и/или улучшение подвижности глаз, например, 10-кратное улучшение или более в функции сетчатки, анатомии или здоровье сетчатки, и/или улучшение подвижности глаз. Как будет понятно специалисту в данной области техники, доза, необходимая для достижения желаемого лечебного эффекта, обычно находится в диапазоне от 1×10 до около 1×10 рекомбинантных вирионов, обычно упоминаемых обычно квалифицированным специалистом как 1×10 до около 1×10 "геномов вектора".
[00184] Исследуемый rAAV-вирион можно вводить с помощью внутриглазной инъекции, например, путем интравитреальной инъекции, путем субретинальной инъекции, путем супрахороидальной инъекции или любым другим удобным режимом или способом введения, что приведет к доставке rAAV-вириона в глаз. Другие удобные способы или пути введения включают, без ограничения, внутривенные, внутриартериальные, периокулярные, внутрикамеральные, субконъюнктивальные и субтеноновые инъекции и местное введение и интраназальное. При введении путем интравитреальной инъекции исследуемый rAAV-вирион способен перемещаться через стекловидное тело и проходить через внутреннюю ограничительную мембрану (также называемую в данном документе внутренней ограничивающей мембраной или «ILM»; тонкая прозрачная бесклеточная мембрана на поверхности сетчатки, образующая границу между сетчаткой и стекловидным телом, образованная астроцитами и конечными ножками клеток Мюллера), и/или более эффективно проходит через слои сетчатки по сравнению со способностью вириона AAV, содержащего соответствующий капсидный белок исходного AAV.
[00185] Вариант капсидного белка, описанный в данном документе, изолируют, например, очищают. В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанный в данном документе вариант капсидного белка включен в вектор AAV или рекомбинантный AAV (rAAV) вирион. В других вариантах осуществления изобретения, такие варианты вектора AAV и/или варианты вирионов AAV используются в in vivo или ex vivo способе лечения глазной болезни в сетчатке приматов.
[00186] Описание в данном документе далее относится к клеткам-хозяевам, таким как, без ограничения, изолированные (генетически модифицированные) клетки-хозяева, содержащие исследуемую нуклеиновую кислоту. Клетка-хозяин согласно изобретению, описанная в данном документе, может быть изолированной клеткой, такой как клетка из культуры клеток in vitro. Такая клетка-хозяин полезна для получения исследуемого варианта вириона rAAV, как описано в данном документе. В одном варианте осуществления изобретения, такая клетка-хозяин стабильно генетически модифицирована нуклеиновой кислотой. В других вариантах осуществления изобретения, клетка-хозяин временно генетически модифицируется нуклеиновой кислотой. Такая нуклеиновая кислота вводится стабильно или временно в клетку-хозяин с использованием установленных методов, включая, но, не ограничиваясь ими, электропорацию, осаждение фосфатом кальция, опосредуемую липосомой трансфекцию и тому подобное. Для стабильной трансформации нуклеиновая кислота, как правило, дополнительно содержит селективный маркер, например, любой из нескольких хорошо известных маркеров, таких как устойчивость к неомицину и тому подобное. Такая клетка-хозяин генерируется путем введения нуклеиновой кислоты в любую из множества клеток, например, клеток млекопитающих, включая, например, мышиные клетки и клетки приматов (например, клетки человека). Иллюстративные клетки млекопитающих включают, но не ограничиваются ими, первичные клетки и клеточные линии, где иллюстративные клеточные линии включают, но не ограничиваются ими, 293 клетки, клетки COS, клетки HeLa, клетки Vero, мышиные фибробласты 3T3, фибробласты C3H10T1/2, CHO и тому подобное. Иллюстративные клетки-хозяева включают, без ограничения, клетки HeLa (например, Американская коллекция типовых культур (ATCC) №. CCL-2), клетки СНО (например, ATCC № CRL9618, CCL61, CRL9096), 293 клетки (например, ATCC №. CRL-1573), клетки Vero, клетки NIH 3T3 (например, ATCC №. CRL-1658), клетки Huh-7, клетки BHK (например, ATCC №. CCL10), клетки PC12 (ATCC № CRL1721), клетки COS, клетки COS-7 (ATCC № CRL1651), клетки RAT1, мышиные L-клетки (ATCC № CCLI.3), клетки эмбриональной почки человека (HEK) человека (ATCC № CRL1573), клетки HLHepG2 и тому подобное. Клетку-хозяин можно также использовать с использованием бакуловируса для инфицирования клеток насекомых, таких как клетки Sf9, которые продуцируют AAV (см., например, патент США № 7271002; Патентная заявка США Сер. № 12/297958). В некоторых вариантах осуществления изобретения, генетически модифицированная клетка-хозяин включает в дополнение к нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую капсидный белок варианта AAV, как описано выше, нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую один или более белков рецептора AAV. В других вариантах осуществления изобретения, клетка-хозяин дополнительно содержит вариант вектора rAAV. Варианта rAAV-вириона может быть сгенерирован с использованием таких клеток-хозяев. Способы генерирования rAAV-вириона описаны, например, в публикации патента США № 2005/0053922 и публикации патента США № 2009/0202490.
th
th
rd
8
15
8
15
[00187] Описание в данном документе кроме того обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую: а) вариант rAAV-вириона, как описано выше и описано в данном документе; и b) фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель, эксципиент или буфер. В некоторых вариантах осуществления изобретения, фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель, эксципиент или буфер подходит для использования у человека или пациента, не являющегося человеком. Такие эксципиенты, носители, разбавители и буферы включают любой фармацевтический агент, который можно вводить без чрезмерной токсичности. Фармацевтически приемлемые эксципиенты включают, но не ограничиваются ими, такие жидкости, как вода, физиологический раствор, глицерин и этанол. В них могут быть включены фармацевтически приемлемые соли, например, соли минеральных кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и тому подобное; и соли органических кислот, таких как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и тому подобное. Кроме того, вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие агенты, поверхностно-активные вещества, рН-буферные вещества и тому подобное, могут присутствовать в таких носителях. Широкий спектр фармацевтически приемлемых эксципиентов известен в данной области техники и не нуждается в подробном обсуждении. Фармацевтически приемлемые эксципиенты подробно описаны в различных публикациях, включая, например, A. Gennaro (2000) “Remington: The Science and Practice of Pharmacy,” 20 edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel et al., Eds., 7 ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; и Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. Н. Kibbe et al., eds., 3 ed. Amer. Pharmaceutical Assoc. В некоторых аспектах настоящего изобретения, настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую от около 1×10 до около 1×10 рекомбинантных вирусов или от 1×10 до около 1×10 геномов вектора, причем каждый указанный рекомбинантный вирус содержит геном, кодирующий один или более генных продуктов.
[00188] Следующие примеры приведены для того, чтобы предоставить квалифицированному специалисту полного описания и описания для руководства относительно того, как изготавливать и использовать описанные в данном документе варианты капсидов AAV, и не предназначены для ограничения объема описанного в данном документе изобретения. Кроме того, следующие примеры не предназначены для обеспечения того, что приведенные ниже эксперименты являются полностью или единственными выполненными экспериментами.
ПРИМЕРЫ
[00189] Следующие примеры приведены, чтобы предоставить специалистам в данной области техники полное описание и описание способов создания и использования настоящего изобретения, и не предназначены для ограничения объема того, что изобретатели считают своим изобретением, и они не предполагают, что эксперименты, приведенные ниже, являются всеми или единственными выполненными экспериментами. Были предприняты усилия для обеспечения точности в отношении используемых чисел (например, количества, температуры и т.д.), но следует учитывать некоторые экспериментальные ошибки и отклонения. Если не указано иное, части представляют собой части по массе, молекулярная масса представляет собой средневесовую молекулярную массу, температура приводится в градусах Цельсия, а давление приводится в атмосфере или вблизи атмосферы.
rd
th
[00190] Общие способы молекулярной и клеточной биохимии можно найти в таких стандартных учебниках, как Molecular Cloning: The Laboratory Manual, 3Ed. (Sambrook et al., Harbour Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4Ed. (Ausubel et al., Ed., John Wiley & Sons, 1999); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press, 1997); и Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998), описание которых включено в данный документ посредством ссылки. Реагенты, векторы клонирования и наборы для генетической манипуляции, упомянутые в этом описании, доступны от коммерческих поставщиков, таких как BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich и ClonTech.
Пример 1
[00191]
[00192] Интравитреальная инъекция и сбор тканей. Одному яванскому макаку (macaca fascicularis) в возрасте 4-10 лет и массой по меньшей мере 4 кг вводили интравитреальной инъекцией через склеру (приблизительно на 3 мм позади каймы, используя процедуру и устройство доставки, пригодные для использования человеком). Животное анестезировали и, учитывая местный анестетик, 100 мкл библиотеки вводили в каждый глаз
[00193] Эвтаназия выполнялась обученным ветеринарным персоналом с использованием внутривенной инъекции пентобарбитала натрия 100 мг/кг на 14±3. Глаза энуклеировали и хранили при 4°С до вскрытия.
[00194] Препарирование тканей. Глаза были разрезаны вдоль границы между зрительной и слепой частями сетчатки скальпелем, а передний сегмент был удален. Рельефные разрезы были сделаны в сетчатке вокруг центральной ямки, чтобы обеспечить плоскую установку сетчатки, и стекловидное тело было удалено. Было собрано шесть образцов сетчатки из каждого квадранта (верхний, нижний, назальный и темпоральный), как изображено на Фигуре 2, и клеточный материал, соответствующий клеткам ПЭС, фоторецепторам, биополярными клеткам, амакриновыми клеткам, горизонтальными клеткам и/или ганглиональными клеткам, был изолирован.
[00195] Направленная эволюция. Направленный процесс эволюции изображен на Фигуре 1A-1E. Вкратце, создается библиотека вирусных капсидов, содержащая 20+ запатентованных комбинаций техник мутаций ДНК и cap генов (Фигура 1А). Вирусы затем упаковываются (Фигура 1В) - таким образом, что каждая частица состоит из мутантного капсида, окружающего cap ген, кодирующий капсид - и очищаются. Капсидную библиотеку помещают под селективное давление in vivo. Тканевый или клеточный материал, представляющий интерес, собирают для изолирования вариантов AAV, которые успешно инфицировали эту мишень, и успешные вирусы восстанавливаются. Успешные клоны обогащаются путем повторного отбора (Стадия I - Фигура 1D). Выбранные cap гены затем подвергаются коммерческой ре-диверсификации и увеличивают их количество за счет дополнительных стадий отбора для итерационного увеличения вирусной приспособленности (Стадия 2 - Фигура 1D). Варианты, идентифицированные во время стадий отбора векторов 1 и 2, демонстрируют способность трансдуцировать клетки сетчатки приматов (Фигура 1Е).
[00196] Успешное восстановление генотипов капсида AAV: Раунды 1-6. Капсиды, выделенные после каждого раунда отбора, использовались для упаковки библиотеки, которую вводили, чтобы инициировать последующий раунд отбора. Восстановление капсидных генов из ткани представляет собой успешные интернализации библиотеки векторов в интересующей ткани. После раунда 4, дополнительная ре-диверсификация библиотеки была включена до упаковки библиотеки и инъекции для раунда 5. Восстановление вирусных геномов из ПЭС, PR, внутреннего ядерного слоя (INL), и слоя ганглиозных клеток (GCL) ткани сетчатки из репрезентативного раунда отбора показано на Фигуре 3. Полосы в рамках представляют собой успешное восстановление вирусных геномов.
[00197] Секвенирование: раунды 3-6. Во время раундов 3-6, секвенирование выполнялось на отдельных клонах в библиотеке, чтобы определить частоту вариантов внутри популяции. Варианты оценивались на наличие мотивов в данных последовательности. Варианты были сгруппированы в мотивы, основанные на присутствии объединяющей вариации (например, конкретной точечной мутации или конкретной последовательности вставки пептида в согласованном месте внутри капсида), которая произошла в нескольких последовательностях. Мотивы, представляющие по меньшей мере 5% секвенированной популяции в двух или более раундах отбора или по меньшей мере 10% секвенированной популяции в одном или более раундах отбора, представлены на Фигуре 4A (анализ последовательности раунда 3), 4B (анализ последовательности раунда 4), 4C (анализ последовательности раунда 5) и 4D (анализ последовательности раунда 6).
[00198] Несколько типичных клонов, которые были идентифицированы как обеспечивающие повышенную способность инфицировать клетки сетчатки, перечислены в таблице 1 ниже (каждый клон содержит идентифицированную замену(ы) и/или вставку пептида и в остальном идентичны SEQ ID NO: 2; отборочный раунд, число последовательностей и частота (в скобках) перечислены для каждого клона):
Таблица 1. Модификации аминокислотной последовательности капсидного белка VP1 AAV, которые придают повышенную способность инфицировать одну или более типов клеток сетчатки. Замены, перечисленные в колонке 2, основаны на аминокислотной последовательности для AAV2 дикого типа, то есть в отсутствии вставленного пептида.
Вставка
Замена
Панретинальный
ПЭС
Фоторецептор
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO: 28)
Отсутствует
Раунд 4, 5, 6
Раунд 3, 5, 6
Раунд 4, 5
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO: 28)
+M1L+L15P +P535S
Раунд 61 (1,61%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO: 28)
+P34A
Раунд 51 (1,89%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO: 28)
+P34A+S731L
Раунд 51 (1,82%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO: 28)
+N57D
Раунд 41 (1,33%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO: 28)
+N66K
Раунд 51 (1,82%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO: 28)
+R81Q
Раунд 61 (1,61%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO: 28)
+Q101R
Раунд 41 (2,27%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO: 28)
+S109T
Раунд 31 (1,85%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO: 28)
+R144K
Раунд 51 (1,82%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO: 28)
+R144M
Раунд 51 (1,82%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO: 28)
+Q164K
Раунд 41 (2,27%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO: 28)
+Q164K+V708I
Раунды 3 и 42 (3,7%)1 (1,33%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO: 28)
+T176P
Раунд 41 (1,33%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO: 28)
+L188I
Раунд 51 (2,27%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO: 28)
+S196Y
Раунд 41 (1,33%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO: 28)
+G226E
Раунд 41 (2,27%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO: 28)
+G236V
Раунд 41 (1,33%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO: 28)
+I240T
Раунд 31 (1,85%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO: 28)
+N312K
Раунд 41 (1,33%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO: 28)
+P363L
Раунд 61 (1,61%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO: 28)
+T456K
Раунд 61 (1,61%)
588-LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO: 28)
+I698V
Раунд 51 (1,89%)
588-LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO: 28)
+V708I
Раунд 4, 5, 6
Раунд 3, 4, 5
Раунд 4, 5
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO: 28)
+V708I+R484C
Раунд 51 (2,27%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO: 28)
N312K+N449D+N551S+I698V+L735Q
Сконструированные
Сконструированные
588~LGISDQTKHA~ (SEQ ID NO: 29)
Отсутствует
Раунд 51 (1,89%)
588~ LAQADTTKNA~ (SEQ ID NO: 27)
Отсутствует
Раунд 3, 4, 5, 6
Раунд 3, 4, 5
Раунд 4, 5
588~ LAQADTTKNA~ (SEQ ID NO: 27)
+E36D
Раунд 51 (2,27%)
588~ LAQADTTKNA~ (SEQ ID NO: 27)
+P250S
Раунд 61 (1,61%)
588~ LAQADTTKNA~ (SEQ ID NO: 27)
+A524T
Раунд 31 (1,85%)
588~ LAQADTTKNA~ (SEQ ID NO: 27)
+A593E
Раунд 41 (1,33%)
588~ LAQADTTKNA~ (SEQ ID NO: 27)
+I698V
Раунды 5 и 61 (1,61%)1 (1,89%)
588~ LAQADTTKNA~ (SEQ ID NO: 27)
+V708I
Раунд 3, 4, 5, 6
Раунд 3, 4, 5
588~ LAQADTTKNA~ (SEQ ID NO: 27)
+V708I+V719M
Раунды 3 и 41 (2,08%)2 (4,55%)
588~ LAQADTTKNA~ (SEQ ID NO: 27)
+V719M
Раунд 41 (2,27%)
588~LAHQDTTKNA~ (SEQ ID NO: 34)
Отсутствует
Раунд 52 (3,77%)
588~LANQDYTKTA~ (SEQ ID NO: 31)
Отсутствует
Раунды 3, 4 и 55 (9,26%)1 (1,33%)3 (5,66%)
Раунды 3, 4 и 52 (4,17%)2 (4,55%)2 (2,27%)
Раунд 51 (1,82%)
588~LANQDYTKTA~ (SEQ ID NO: 31)
+S109T+S463Y
Раунд 31 (1,85%)
588~LANQDYTKTA~ (SEQ ID NO: 31)
+D368H
Раунд 31 (1,85%)
588~LANQDYTKTA~ (SEQ ID NO: 31)
+V708I
Раунд 41 (1,33%)
Раунд 31 (2,08%)
588~LAHDITKNIA~ (SEQ ID NO: 32)
Отсутствует
Раунды 3, 4 5 и 61 (1,85%)1 (1,33%)1 (1,89%)2 (3,23%)
588~LAHDITKNIA~ (SEQ ID NO: 32)
+S109T
Раунд 41 (1,33%)
588~LAHDITKNIA~ (SEQ ID NO: 32)
+R389S
Раунд 51 (1,89%)
588~LAHDITKNIA~ (SEQ ID NO: 32)
+A593E
Раунд 31 (1,85%)
588~LAHDITKNIA~ (SEQ ID NO: 32)
+V708I
Раунд 4, 5
588~IAHDITKNIA~ (SEQ ID NO: 60)
+V708I
Раунд 31 (2,08%)
588~LAPNSTHGSA~ (SEQ ID NO: 40)
+V708I
Раунд 31 (1,85%)
588~LANKTTNKDA~ (SEQ ID NO: 35)
Отсутствует
Раунд 51 (2,27%)
588~LANKTTNKDA~ (SEQ ID NO: 35)
+N449D
Раунд 41 (2,17%)
588~LAHPDTTKNA~ (SEQ ID NO: 33)
Раунд 61 (1,61%)
588~LATNRTSPDA~ (SEQ ID NO: 39)
Раунд 61 (1,61%)
588~LPQANANENA~ (SEQ ID NO: 37)
Раунд 51 (1,89%)
588~LAASDSTKAA~ (SEQ ID NO: 30)
Раунды 3 и 41 (1,85%)1 (1,33%)
588~LAKDRAPSTA~ (SEQ ID NO: 41)
Раунд 31 (1,85%)
588~LPISNENEHA~ (SEQ ID NO: 36)
Раунд 41 (2,17%)
588~LAGKSKVIDA~ (SEQ ID NO: 38)
Раунд 51 (1,82%)
ОТСУТСТВУЕТ
P34A
Раунд 51 (1,89%)
Раунды 4, 53 (6,82%)1 (2,27%)
Раунд 41 (2,17%)
ОТСУТСТВУЕТ
P64S
Раунд 31 (1,85%)
Раунд 41 (2,27%)
ОТСУТСТВУЕТ
S109T
Раунд 42 (2,67%)
Раунды 3, 4, 54 (8,33%)1 (2,27%)1 (2,27%)
ОТСУТСТВУЕТ
S109T+P8L
Раунд 31 (2,08%)
ОТСУТСТВУЕТ
S109T+Q120R
Раунд 31 (2,08%)
ОТСУТСТВУЕТ
S109T+A493V+A593E+V708I
Раунд 31 (1,85%)
ОТСУТСТВУЕТ
Q164K
Раунды 4 и 52 (2,67%)1 (1,89%)
Раунд 41 (2,27%)
ОТСУТСТВУЕТ
Q175H
Раунд 31 (1,85%)
Раунд 41 (2,17%)
ОТСУТСТВУЕТ
S196Y
Раунд 31 (1,85%)
Раунд 41 (2,27%)
ОТСУТСТВУЕТ
A593E
Раунды 3, 4, 53 (5,56%)7 (9,33%)1 (1,89%)
Раунды 3, 4, 512 (25%)7 (15,9%)14 (31,8%)
Раунд 41 (2,17%)
ОТСУТСТВУЕТ
A593E+Q464R
Раунд 31 (2,08%)
ОТСУТСТВУЕТ
A593E+N596D
Раунд 41 (2,27%)
ОТСУТСТВУЕТ
A593E+N596D+T491A
Раунд 32 (4,17%)
ОТСУТСТВУЕТ
A593E+V708I
Раунды 3, 42 (3,7%)2 (2,67%)
Раунды 3, 4, 54 (8,33%)1 (2,27%)1 (2,27%)
ОТСУТСТВУЕТ
I698V
Раунд 51 (1,89%)
Раунд 51 (2,27%)
ОТСУТСТВУЕТ
V708I
Раунды 3, 4,2 (3,7%)5 (6,67%)
Раунды 3, 4, 51 (2,08%)4 (9,09%)4 (9,09%)
ОТСУТСТВУЕТ
V708I+V719M
Раунд 42 (4,55%)
ОТСУТСТВУЕТ
V708I+G727D
Раунд 51 (2,27%)
ОТСУТСТВУЕТ
V708I+R733C
Раунд 41 (2,17%)
[00199] Также идентифицированный как капсид, имеющий повышенную способность инфицировать одну или более клеток сетчатки, был клоном, имеющим следующую капсидную предковую последовательность VP1:
[00200] MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAGPSGLGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASAGSTNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLARTQSTGGTAGTRELLFSQAGPSNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSKTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEDRFFPSSGVLIFGKQGAGANNTALENVMMTSEEEIKTTNPVATEQYGVVASNLQSSNTAPVTGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPPAVFTPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYAKSTNVDFAVDNEGVYSEPRPIGTRYLTRNL. (SEQ ID NO: 59)
[00201] Этот предковый вариант капсида эволюционировал из предкового капсида SEQ ID NO: 58, в котором положения вырождения (остатки 264, 266, 268, 448, 459, 460, 467, 470, 471, 474, 495, 516, 533, 547, 551, 555, 557, 561, 563, 577, 583, 593, 596, 661, 662, 664, 665, 710, 717, 718, 719, 723), эволюционировали так, чтобы содержать Аланин (А) в положении 264, Аланин (А) в положении 266, Серин (S) в положении 268, Аланин (А) в положении 448, Треонин (Т) в положении 459, Аргинин (R) в положении 460, Аланин (А) в положении 467, Серин (S) в положении 470, Аспарагин (N) в положении 471, Аланин (А) в положении 474, Серин (S) в положении 495, Аспарагин (D) в положении 516, Аспарагин (D) в положении 533, Глутамин (Q) в положении 547, Аланин (А) в положении 551, Аланин (А) в положении 555, Глутаминовая кислота (E) в положении 557, Метионин (М) в положении 561, Серин (S) в положении 563, Глутамин (Q) в положении 577, Серин (S) в положении 583, Валин (V) в положении 593, Треонин (T) в положении 596, Аланин (А) в положении 661, Валин (V) в положении 662, Треонин (Т) в положении 664, Пролин (Р) в положении 665, Треонин (Т) в положении 710, Аспарагиновая кислота (D) в положении 717, Аспарагин (N) в положении 718, Глутаминовая кислота (E) в положении 719 и Серин (S) в положении 723.
[00202] Вариант вирионов AAV, описанные в данном документе, могут включать разумные рациональные проектные параметры, признаки, модификации, преимущества и вариации, которые легко очевидны специалистам в области конструирования вирусных векторов AAV.
[00203] Пример 2
[00204] Направленная эволюция использовалась для выявления новых вариантов аденоассоциированного вируса (AAV), которые лучше доставляют гены в клетки сетчатки после интравитреального введения (IVT), пути введения, который имеет существенные преимущества по сравнению с другими способами доставки гена в глаз человека (пример 1). Тропизм клеток после интравитреального введения нового варианта AAV, содержащего замещение P34A, и пептид LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28), вставленный в аминокислоту 588 (LAISDQTKHA+P34A), оценивали in vivo у не человеческих приматов (NHP) в виде репрезентативного примера способности ISDQTKH (SEQ ID NO: 14)-содержащих вариантов AAV трансдуцировать клетки сетчатки.
10
12
[00205] Рекомбинантные AAV-вирионы, содержащие либо капсид AAV2, либо новый вариант капсида LAISDQTKHA+P34A, и геном, содержащий трансген с зеленым флуоресцентным белком (GFP), функционально связанный с промотором CMV (AAV2.CMV.GFP и LAISDQTKHA+P34A.CMV.GFP, соответственно) или промотор CAG (AAV2.CAG.EGFP и LAISDQTKHA+P34A.CAG.EGFP, соответственно) были изготовлены с использованием стандартных способов. Африканским зеленым обезьянам (Фиг. 7, 8) или яванскому макаку (Фигура 9) интравитреально инъецировали различные дозы вектора в диапазоне от 4×10 мкг до 1×10 1е12 мкг на глаз (см. Подробные описания фигур), а трансдукция клеток сетчатки была оценена в при жизни фундус-флюоресцентной визуализацией с помощью Heidelberg Spectralis™.
[00206] Интравитреальная доставка AAV, содержащего новый вариант LAISDQTKHA+P34A, привела к более широкой и более устойчивой экспрессии трансгена через сетчатку NHP, чем AAV2 (фигуры 7-9). Изображения показывают, что новый вариант капсида AAV обеспечивает надежную экспрессию в центре центральной ямки (область, богатая колбочками); в парафовеальном кольце (область, богатая ганглиозными клетками сетчатки), и на периферии (область, богатая многими типами клеток, включая палочки, глия Мюллера, амакриновые клетки, биполярные клетки) уже через 2 недели после инъекции. Напротив, и в соответствии с результатами, сообщаемыми другими, дикий тип AAV2 обеспечивает более слабую экспрессию, которая в основном находится в парафовеальном кольце, и может быть обнаружена только в более поздних временных точках. Иммуногистохимический анализ различных областей сетчатки, проведенный через 3 недели после инъекции, подтвердил, что многие типы клеток сетчатки, включая эпителиальные клетки сетчатки, фоторецепторы палочки и колбочки, и ганглионарные клетки сетчатки, были успешно трансдуцированы по всей сетчатке (Фиг. 10A-10E).
[00207] Это исследование иллюстрирует превосходную доставку генов с помощью варианта, содержащего ISDQTKH, по клинически предпочтительному пути введения по сравнению с клинически значимым AAV2. Подобная эффективность достижима с другими вариантами, содержащими этот мотив пептидной вставки. Аналогично, такая же эффективность достижима с другими вариантами, описанными в данном документе, которые были идентифицированы с использованием того же подхода направленной эволюции.
[00208] Пример 3
[00209] Клеточный тропизм нового варианта AAV LAISDQTKHA+P34A для клетки пигментного эпителия сетчатки человека (ПЭС) и фоторецепторных (PR) клеток оценивали in vitro при использовании клеток ПЭС и PR-клеток, индуцированных плюрипотентных стволовых клеток полученных из фибробластов человека (FB-iPSC) или эмбриональных стволовых клеток человека (ESC).
[00210] AAV-вирионы, содержащие либо капсид AAV2, либо новый вариант капсида LAISDQTKHA+P34A, и геном, содержащий трансген зеленого флуоресцентного белка (EGFP), функционально связанный с промотором CAG (AAV2.CAG.EGFP и LAISDQTKHA+P34A.CAG.EGFP, соответственно) были изготовлены с использованием стандартных методов. Культуры клеток ПЭС человека были получены из линии эмбриональных стволовых клеток человека ESI-017 или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток полученных из фибробластов человека («FB-iPSC») с использованием 45-дневного протокола дифференцировки. Созревание в клетках ПЭС было подтверждено обнаружением экспрессии маркеров зрелых ПЭС, включая ПЭС65 и BEST1; синтезом VEGF и PEDF; и способностью к фагоцитозу наружных сегментов палочки. PR-культуры были созданы с помощью многоступенчатой парадигмы формирования глазной чаши и подтверждено, что они содержат PR путем выявления экспрессии Рековерина и Опсина S после 179 дней в культуре.
[00211] По сравнению с AAV2, LAISDQTKHA+P34A обеспечивал значительно более высокую эффективность трансдукции и экспрессию трансгена в культурах ПЭС человека через 7 дней после инфицирования, как определено иммунофлюоресценцией (фигуры 11A-B), проточной цитометрией (увеличение в 2,7 раза; фигуры 11C-D) и Вестерн-блот анализом (фигуры 11E-F). Надежная трансдукция и экспрессия также достигались с использованием LAISDQTKHA+P34A.CAG.EGFP в культурах PR человека через 32 дня после инфицирования. Это исследование иллюстрирует превосходную способность ISDQTKH (SEQ ID NO: 14)-содержащих вариантов доставлять гены в клетки сетчатки.
[00212] Предыдущее просто иллюстрирует принципы изобретения. Понятно, что специалисты в данной области техники смогут разработать различные устройства, которые, хотя они явно не описаны или не показаны в данном документе, осуществляют принципы изобретения и включены в его сущность и объем. Кроме того, все примеры и условный язык, приведенные в данном документе, в основном предназначены для того, чтобы помочь читателю понять принципы изобретения и концепции, предоставленные изобретателями для развития области техники, и должны толковаться как не имеющие ограничений на такие конкретно приведенные примеры и условия.
[00213] Кроме того, все заявления, в которых излагаются принципы, аспекты и варианты осуществления изобретения, а также их конкретные примеры, предназначены для охвата как их структурных, так и функциональных эквивалентов. Кроме того, предполагается, что такие эквиваленты включают в себя как известные в настоящее время эквиваленты, так и эквиваленты которые будут разработаны в будущем, то есть любые разработанные элементы, которые выполняют одну и ту же функцию независимо от структуры. Следовательно, объем настоящего изобретения не ограничивается представленными и описанными в данном документе иллюстративными вариантами осуществления изобретения. Скорее, объем и сущность настоящего изобретения осуществлены в прилагаемой формуле изобретения.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  4D Molecular Therapeutics, Inc.
<120>  ВАРИАНТЫ КАПСИДОВ АДЕНО-АССОЦИИРОВАННОГО ВИРУСА И МЕТОДЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
<130>  090400-5001 WO
<150>  US 62/336441
<151>  2016-05-13
<150>  US 62/378106
<151>  2016-08-22
<150>  US 62/384590
<151>  2016-09-07
<150>  US 62/454612
<151>  2017-02-03
<160>  64
<170>  PatentIn версия 3.5
<210>  1
<211>  736
<212>  БЕЛОК
<213>  Адено-ассоциированный вирус 1
<400>  1
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1. 5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly
145                 150                 155                 160
Lys Thr Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro
180                 185                 190
Ala Thr Pro Ala Ala Val Gly Pro Thr Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Ala Ser Thr Gly Ala Ser Asn Asp Asn His
260                 265                 270
Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe
275                 280                 285
His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn
290                 295                 300
Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln
305                 310                 315                 320
Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Val Thr Thr Ile Ala Asn Asn
325                 330                 335
Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro
340                 345                 350
Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala
355                 360                 365
Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly
370                 375                 380
Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro
385                 390                 395                 400
Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe
405                 410                 415
Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp
420                 425                 430
Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg
435                 440                 445
Thr Gln Asn Gln Ser Gly Ser Ala Gln Asn Lys Asp Leu Leu Phe Ser
450                 455                 460
Arg Gly Ser Pro Ala Gly Met Ser Val Gln Pro Lys Asn Trp Leu Pro
465                 470                 475                 480
Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Lys Thr Asp Asn
485                 490                 495
Asn Asn Ser Asn Phe Thr Trp Thr Gly Ala Ser Lys Tyr Asn Leu Asn
500                 505                 510
Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Pro Gly Thr Ala Met Ala Ser His Lys
515                 520                 525
Asp Asp Glu Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Met Ile Phe Gly
530                 535                 540
Lys Glu Ser Ala Gly Ala Ser Asn Thr Ala Leu Asp Asn Val Met Ile
545                 550                 555                 560
Thr Asp Glu Glu Glu Ile Lys Ala Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Arg
565                 570                 575
Phe Gly Thr Val Ala Val Asn Phe Gln Ser Ser Ser Thr Asp Pro Ala
580                 585                 590
Thr Gly Asp Val His Ala Met Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln
595                 600                 605
Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His
610                 615                 620
Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu
625                 630                 635                 640
Lys Asn Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala
645                 650                 655
Asn Pro Pro Ala Glu Phe Ser Ala Thr Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr
660                 665                 670
Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln
675                 680                 685
Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Tyr Thr Ser Asn
690                 695                 700
Tyr Ala Lys Ser Ala Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Asn Asn Gly Leu
705                 710                 715                 720
Tyr Thr Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu
725                 730                 735
<210>  2
<211>  735
<212>  БЕЛОК
<213>  Адено-ассоциированный вирус 2
<400>  2
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1. 5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20                  25                  30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435                 440                 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450                 455                 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485                 490                 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500                 505                 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515                 520                 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530                 535                 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545                 550                 555                 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565                 570                 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala Ala Thr
580                 585                 590
Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp
595                 600                 605
Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr
610                 615                 620
Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys
625                 630                 635                 640
His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn
645                 650                 655
Pro Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln
660                 665                 670
Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys
675                 680                 685
Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr
690                 695                 700
Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr
705                 710                 715                 720
Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
725                 730                 735
<210>  3
<211>  736
<212>  БЕЛОК
<213>  Адено-ассоциированный вирус 3A
<400>  3
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1. 5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Val Pro Gln Pro
20                  25                  30
Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Arg Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Ile Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Gly
130                 135                 140
Ala Val Asp Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Val Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ser Gly Lys Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Ser Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Arg Gly Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr
435                 440                 445
Gln Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Gln Ser Arg Leu Leu Phe Ser
450                 455                 460
Gln Ala Gly Pro Gln Ser Met Ser Leu Gln Ala Arg Asn Trp Leu Pro
465                 470                 475                 480
Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser Lys Thr Ala Asn Asp Asn
485                 490                 495
Asn Asn Ser Asn Phe Pro Trp Thr Ala Ala Ser Lys Tyr His Leu Asn
500                 505                 510
Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys
515                 520                 525
Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Met His Gly Asn Leu Ile Phe Gly
530                 535                 540
Lys Glu Gly Thr Thr Ala Ser Asn Ala Glu Leu Asp Asn Val Met Ile
545                 550                 555                 560
Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln
565                 570                 575
Tyr Gly Thr Val Ala Asn Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro Thr
580                 585                 590
Thr Gly Thr Val Asn His Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln
595                 600                 605
Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His
610                 615                 620
Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu
625                 630                 635                 640
Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Met Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala
645                 650                 655
Asn Pro Pro Thr Thr Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr
660                 665                 670
Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln
675                 680                 685
Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn
690                 695                 700
Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val
705                 710                 715                 720
Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
725                 730                 735
<210>  4
<211>  736
<212>  БЕЛОК
<213>  Адено-ассоциированный вирус 3B
<400>  4
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1. 5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Val Pro Gln Pro
20                  25                  30
Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Arg Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Ile Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Asp Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Val Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ser Gly Lys Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Ser Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr
435                 440                 445
Gln Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Gln Ser Arg Leu Leu Phe Ser
450                 455                 460
Gln Ala Gly Pro Gln Ser Met Ser Leu Gln Ala Arg Asn Trp Leu Pro
465                 470                 475                 480
Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser Lys Thr Ala Asn Asp Asn
485                 490                 495
Asn Asn Ser Asn Phe Pro Trp Thr Ala Ala Ser Lys Tyr His Leu Asn
500                 505                 510
Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys
515                 520                 525
Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Met His Gly Asn Leu Ile Phe Gly
530                 535                 540
Lys Glu Gly Thr Thr Ala Ser Asn Ala Glu Leu Asp Asn Val Met Ile
545                 550                 555                 560
Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln
565                 570                 575
Tyr Gly Thr Val Ala Asn Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro Thr
580                 585                 590
Thr Arg Thr Val Asn Asp Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln
595                 600                 605
Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His
610                 615                 620
Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu
625                 630                 635                 640
Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Met Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala
645                 650                 655
Asn Pro Pro Thr Thr Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr
660                 665                 670
Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln
675                 680                 685
Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn
690                 695                 700
Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val
705                 710                 715                 720
Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
725                 730                 735
<210>  5
<211>  734
<212>  БЕЛОК
<213>  Адено-ассоциированный вирус 4
<400>  5
Met Thr Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser Glu
1. 5                   10                  15
Gly Val Arg Glu Trp Trp Ala Leu Gln Pro Gly Ala Pro Lys Pro Lys
20                  25                  30
Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly
35                  40                  45
Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Val
50                  55                  60
Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Gln
65                  70                  75                  80
Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Asp
85                  90                  95
Ala Glu Phe Gln Gln Arg Leu Gln Gly Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asn
100                 105                 110
Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Leu
115                 120                 125
Gly Leu Val Glu Gln Ala Gly Glu Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg Pro
130                 135                 140
Leu Ile Glu Ser Pro Gln Gln Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile Gly Lys
145                 150                 155                 160
Lys Gly Lys Gln Pro Ala Lys Lys Lys Leu Val Phe Glu Asp Glu Thr
165                 170                 175
Gly Ala Gly Asp Gly Pro Pro Glu Gly Ser Thr Ser Gly Ala Met Ser
180                 185                 190
Asp Asp Ser Glu Met Arg Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Val Glu Gly
195                 200                 205
Gly Gln Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asp Trp His Cys
210                 215                 220
Asp Ser Thr Trp Ser Glu Gly His Val Thr Thr Thr Ser Thr Arg Thr
225                 230                 235                 240
Trp Val Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu Gly Glu
245                 250                 255
Ser Leu Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp Gly Tyr
260                 265                 270
Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln
275                 280                 285
Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Met Arg Pro Lys Ala Met Arg Val
290                 295                 300
Lys Ile Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Ser Asn Gly Glu
305                 310                 315                 320
Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Ile Phe Ala Asp
325                 330                 335
Ser Ser Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Met Asp Ala Gly Gln Glu Gly Ser
340                 345                 350
Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr
355                 360                 365
Cys Gly Leu Val Thr Gly Asn Thr Ser Gln Gln Gln Thr Asp Arg Asn
370                 375                 380
Ala Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly
385                 390                 395                 400
Asn Asn Phe Glu Ile Thr Tyr Ser Phe Glu Lys Val Pro Phe His Ser
405                 410                 415
Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile
420                 425                 430
Asp Gln Tyr Leu Trp Gly Leu Gln Ser Thr Thr Thr Gly Thr Thr Leu
435                 440                 445
Asn Ala Gly Thr Ala Thr Thr Asn Phe Thr Lys Leu Arg Pro Thr Asn
450                 455                 460
Phe Ser Asn Phe Lys Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Ser Ile Lys Gln
465                 470                 475                 480
Gln Gly Phe Ser Lys Thr Ala Asn Gln Asn Tyr Lys Ile Pro Ala Thr
485                 490                 495
Gly Ser Asp Ser Leu Ile Lys Tyr Glu Thr His Ser Thr Leu Asp Gly
500                 505                 510
Arg Trp Ser Ala Leu Thr Pro Gly Pro Pro Met Ala Thr Ala Gly Pro
515                 520                 525
Ala Asp Ser Lys Phe Ser Asn Ser Gln Leu Ile Phe Ala Gly Pro Lys
530                 535                 540
Gln Asn Gly Asn Thr Ala Thr Val Pro Gly Thr Leu Ile Phe Thr Ser
545                 550                 555                 560
Glu Glu Glu Leu Ala Ala Thr Asn Ala Thr Asp Thr Asp Met Trp Gly
565                 570                 575
Asn Leu Pro Gly Gly Asp Gln Ser Asn Ser Asn Leu Pro Thr Val Asp
580                 585                 590
Arg Leu Thr Ala Leu Gly Ala Val Pro Gly Met Val Trp Gln Asn Arg
595                 600                 605
Asp Ile Tyr Tyr Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp
610                 615                 620
Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Ile Gly Gly Phe Gly Leu Lys His
625                 630                 635                 640
Pro Pro Pro Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro
645                 650                 655
Ala Thr Thr Phe Ser Ser Thr Pro Val Asn Ser Phe Ile Thr Gln Tyr
660                 665                 670
Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Gln Ile Asp Trp Glu Ile Gln Lys Glu
675                 680                 685
Arg Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Thr Ser Asn Tyr Gly
690                 695                 700
Gln Gln Asn Ser Leu Leu Trp Ala Pro Asp Ala Ala Gly Lys Tyr Thr
705                 710                 715                 720
Glu Pro Arg Ala Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr His His Leu
725                 730
<210>  6
<211>  724
<212>  БЕЛОК
<213>  Адено-ассоциированный вирус 5
<400>  6
Met Ser Phe Val Asp His Pro Pro Asp Trp Leu Glu Glu Val Gly Glu
1. 5                   10                  15
Gly Leu Arg Glu Phe Leu Gly Leu Glu Ala Gly Pro Pro Lys Pro Lys
20                  25                  30
Pro Asn Gln Gln His Gln Asp Gln Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly
35                  40                  45
Tyr Asn Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Arg Gly Glu Pro Val
50                  55                  60
Asn Arg Ala Asp Glu Val Ala Arg Glu His Asp Ile Ser Tyr Asn Glu
65                  70                  75                  80
Gln Leu Glu Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Asp
85                  90                  95
Ala Glu Phe Gln Glu Lys Leu Ala Asp Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asn
100                 105                 110
Leu Gly Lys Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Phe
115                 120                 125
Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Thr Gly Lys Arg Ile
130                 135                 140
Asp Asp His Phe Pro Lys Arg Lys Lys Ala Arg Thr Glu Glu Asp Ser
145                 150                 155                 160
Lys Pro Ser Thr Ser Ser Asp Ala Glu Ala Gly Pro Ser Gly Ser Gln
165                 170                 175
Gln Leu Gln Ile Pro Ala Gln Pro Ala Ser Ser Leu Gly Ala Asp Thr
180                 185                 190
Met Ser Ala Gly Gly Gly Gly Pro Leu Gly Asp Asn Asn Gln Gly Ala
195                 200                 205
Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asp Trp His Cys Asp Ser Thr Trp
210                 215                 220
Met Gly Asp Arg Val Val Thr Lys Ser Thr Arg Thr Trp Val Leu Pro
225                 230                 235                 240
Ser Tyr Asn Asn His Gln Tyr Arg Glu Ile Lys Ser Gly Ser Val Asp
245                 250                 255
Gly Ser Asn Ala Asn Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr
260                 265                 270
Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Ser His Trp Ser Pro Arg Asp Trp Gln
275                 280                 285
Arg Leu Ile Asn Asn Tyr Trp Gly Phe Arg Pro Arg Ser Leu Arg Val
290                 295                 300
Lys Ile Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Val Gln Asp Ser Thr
305                 310                 315                 320
Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp
325                 330                 335
Asp Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Val Gly Asn Gly Thr Glu Gly Cys
340                 345                 350
Leu Pro Ala Phe Pro Pro Gln Val Phe Thr Leu Pro Gln Tyr Gly Tyr
355                 360                 365
Ala Thr Leu Asn Arg Asp Asn Thr Glu Asn Pro Thr Glu Arg Ser Ser
370                 375                 380
Phe Phe Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Lys Met Leu Arg Thr Gly Asn
385                 390                 395                 400
Asn Phe Glu Phe Thr Tyr Asn Phe Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser
405                 410                 415
Phe Ala Pro Ser Gln Asn Leu Phe Lys Leu Ala Asn Pro Leu Val Asp
420                 425                 430
Gln Tyr Leu Tyr Arg Phe Val Ser Thr Asn Asn Thr Gly Gly Val Gln
435                 440                 445
Phe Asn Lys Asn Leu Ala Gly Arg Tyr Ala Asn Thr Tyr Lys Asn Trp
450                 455                 460
Phe Pro Gly Pro Met Gly Arg Thr Gln Gly Trp Asn Leu Gly Ser Gly
465                 470                 475                 480
Val Asn Arg Ala Ser Val Ser Ala Phe Ala Thr Thr Asn Arg Met Glu
485                 490                 495
Leu Glu Gly Ala Ser Tyr Gln Val Pro Pro Gln Pro Asn Gly Met Thr
500                 505                 510
Asn Asn Leu Gln Gly Ser Asn Thr Tyr Ala Leu Glu Asn Thr Met Ile
515                 520                 525
Phe Asn Ser Gln Pro Ala Asn Pro Gly Thr Thr Ala Thr Tyr Leu Glu
530                 535                 540
Gly Asn Met Leu Ile Thr Ser Glu Ser Glu Thr Gln Pro Val Asn Arg
545                 550                 555                 560
Val Ala Tyr Asn Val Gly Gly Gln Met Ala Thr Asn Asn Gln Ser Ser
565                 570                 575
Thr Thr Ala Pro Ala Thr Gly Thr Tyr Asn Leu Gln Glu Ile Val Pro
580                 585                 590
Gly Ser Val Trp Met Glu Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp
595                 600                 605
Ala Lys Ile Pro Glu Thr Gly Ala His Phe His Pro Ser Pro Ala Met
610                 615                 620
Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Met Met Leu Ile Lys Asn
625                 630                 635                 640
Thr Pro Val Pro Gly Asn Ile Thr Ser Phe Ser Asp Val Pro Val Ser
645                 650                 655
Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Glu Met Glu
660                 665                 670
Trp Glu Leu Lys Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln
675                 680                 685
Tyr Thr Asn Asn Tyr Asn Asp Pro Gln Phe Val Asp Phe Ala Pro Asp
690                 695                 700
Ser Thr Gly Glu Tyr Arg Thr Thr Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu
705                 710                 715                 720
Thr Arg Pro Leu
<210>  7
<211>  736
<212>  БЕЛОК
<213>  Адено-ассоциированный вирус 6
<400>  7
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1. 5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Phe Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly
145                 150                 155                 160
Lys Thr Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro
180                 185                 190
Ala Thr Pro Ala Ala Val Gly Pro Thr Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Ala Ser Thr Gly Ala Ser Asn Asp Asn His
260                 265                 270
Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe
275                 280                 285
His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn
290                 295                 300
Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln
305                 310                 315                 320
Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Val Thr Thr Ile Ala Asn Asn
325                 330                 335
Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro
340                 345                 350
Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala
355                 360                 365
Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly
370                 375                 380
Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro
385                 390                 395                 400
Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe
405                 410                 415
Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp
420                 425                 430
Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg
435                 440                 445
Thr Gln Asn Gln Ser Gly Ser Ala Gln Asn Lys Asp Leu Leu Phe Ser
450                 455                 460
Arg Gly Ser Pro Ala Gly Met Ser Val Gln Pro Lys Asn Trp Leu Pro
465                 470                 475                 480
Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Lys Thr Asp Asn
485                 490                 495
Asn Asn Ser Asn Phe Thr Trp Thr Gly Ala Ser Lys Tyr Asn Leu Asn
500                 505                 510
Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Pro Gly Thr Ala Met Ala Ser His Lys
515                 520                 525
Asp Asp Lys Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Met Ile Phe Gly
530                 535                 540
Lys Glu Ser Ala Gly Ala Ser Asn Thr Ala Leu Asp Asn Val Met Ile
545                 550                 555                 560
Thr Asp Glu Glu Glu Ile Lys Ala Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Arg
565                 570                 575
Phe Gly Thr Val Ala Val Asn Leu Gln Ser Ser Ser Thr Asp Pro Ala
580                 585                 590
Thr Gly Asp Val His Val Met Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln
595                 600                 605
Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His
610                 615                 620
Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu
625                 630                 635                 640
Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala
645                 650                 655
Asn Pro Pro Ala Glu Phe Ser Ala Thr Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr
660                 665                 670
Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln
675                 680                 685
Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Tyr Thr Ser Asn
690                 695                 700
Tyr Ala Lys Ser Ala Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Asn Asn Gly Leu
705                 710                 715                 720
Tyr Thr Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu
725                 730                 735
<210>  8
<211>  737
<212>  БЕЛОК
<213>  Адено-ассоциированный вирус 7
<400>  8
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1. 5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asn Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Ala Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile
145                 150                 155                 160
Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln
165                 170                 175
Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro
180                 185                 190
Pro Ala Ala Pro Ser Ser Val Gly Ser Gly Thr Val Ala Ala Gly Gly
195                 200                 205
Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn
210                 215                 220
Ala Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val
225                 230                 235                 240
Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His
245                 250                 255
Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Glu Thr Ala Gly Ser Thr Asn Asp Asn
260                 265                 270
Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg
275                 280                 285
Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn
290                 295                 300
Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Arg Phe Lys Leu Phe Asn Ile
305                 310                 315                 320
Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Val Thr Thr Ile Ala Asn
325                 330                 335
Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu
340                 345                 350
Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro
355                 360                 365
Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn
370                 375                 380
Gly Ser Gln Ser Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe
385                 390                 395                 400
Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr Ser
405                 410                 415
Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu
420                 425                 430
Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ala
435                 440                 445
Arg Thr Gln Ser Asn Pro Gly Gly Thr Ala Gly Asn Arg Glu Leu Gln
450                 455                 460
Phe Tyr Gln Gly Gly Pro Ser Thr Met Ala Glu Gln Ala Lys Asn Trp
465                 470                 475                 480
Leu Pro Gly Pro Cys Phe Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Leu Asp
485                 490                 495
Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His
500                 505                 510
Leu Asn Gly Arg Asn Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr
515                 520                 525
His Lys Asp Asp Glu Asp Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Ile
530                 535                 540
Phe Gly Lys Thr Gly Ala Thr Asn Lys Thr Thr Leu Glu Asn Val Leu
545                 550                 555                 560
Met Thr Asn Glu Glu Glu Ile Arg Pro Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu
565                 570                 575
Glu Tyr Gly Ile Val Ser Ser Asn Leu Gln Ala Ala Asn Thr Ala Ala
580                 585                 590
Gln Thr Gln Val Val Asn Asn Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp
595                 600                 605
Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro
610                 615                 620
His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly
625                 630                 635                 640
Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro
645                 650                 655
Ala Asn Pro Pro Glu Val Phe Thr Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile
660                 665                 670
Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu
675                 680                 685
Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser
690                 695                 700
Asn Phe Glu Lys Gln Thr Gly Val Asp Phe Ala Val Asp Ser Gln Gly
705                 710                 715                 720
Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn
725                 730                 735
Leu
<210>  9
<211>  738
<212>  БЕЛОК
<213>  Адено-ассоциированный вирус 8
<400>  9
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1. 5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile
145                 150                 155                 160
Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln
165                 170                 175
Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro
180                 185                 190
Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly
195                 200                 205
Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser
210                 215                 220
Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val
225                 230                 235                 240
Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His
245                 250                 255
Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ala Thr Asn Asp
260                 265                 270
Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn
275                 280                 285
Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn
290                 295                 300
Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn
305                 310                 315                 320
Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala
325                 330                 335
Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln
340                 345                 350
Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe
355                 360                 365
Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn
370                 375                 380
Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr
385                 390                 395                 400
Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Thr Tyr
405                 410                 415
Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser
420                 425                 430
Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu
435                 440                 445
Ser Arg Thr Gln Thr Thr Gly Gly Thr Ala Asn Thr Gln Thr Leu Gly
450                 455                 460
Phe Ser Gln Gly Gly Pro Asn Thr Met Ala Asn Gln Ala Lys Asn Trp
465                 470                 475                 480
Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Thr Gly
485                 490                 495
Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Ala Gly Thr Lys Tyr His
500                 505                 510
Leu Asn Gly Arg Asn Ser Leu Ala Asn Pro Gly Ile Ala Met Ala Thr
515                 520                 525
His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Asn Gly Ile Leu Ile
530                 535                 540
Phe Gly Lys Gln Asn Ala Ala Arg Asp Asn Ala Asp Tyr Ser Asp Val
545                 550                 555                 560
Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr
565                 570                 575
Glu Glu Tyr Gly Ile Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Thr Ala
580                 585                 590
Pro Gln Ile Gly Thr Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val
595                 600                 605
Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile
610                 615                 620
Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe
625                 630                 635                 640
Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val
645                 650                 655
Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ser Lys Leu Asn Ser Phe
660                 665                 670
Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu
675                 680                 685
Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr
690                 695                 700
Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Ser Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu
705                 710                 715                 720
Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg
725                 730                 735
Asn Leu
<210>  10
<211>  736
<212>  БЕЛОК
<213>  Адено-ассоциированный вирус 9
<400>  10
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1. 5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro
20                  25                  30
Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195                 200                 205
Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn
260                 265                 270
Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg
275                 280                 285
Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn
290                 295                 300
Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile
305                 310                 315                 320
Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn
325                 330                 335
Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu
340                 345                 350
Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro
355                 360                 365
Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp
370                 375                 380
Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe
385                 390                 395                 400
Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu
405                 410                 415
Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu
420                 425                 430
Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser
435                 440                 445
Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser
450                 455                 460
Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro
465                 470                 475                 480
Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn
485                 490                 495
Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn
500                 505                 510
Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys
515                 520                 525
Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly
530                 535                 540
Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile
545                 550                 555                 560
Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser
565                 570                 575
Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln
580                 585                 590
Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln
595                 600                 605
Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His
610                 615                 620
Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met
625                 630                 635                 640
Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala
645                 650                 655
Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr
660                 665                 670
Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln
675                 680                 685
Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn
690                 695                 700
Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val
705                 710                 715                 720
Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
725                 730                 735
<210>  11
<211>  738
<212>  БЕЛОК
<213>  Адено-ассоциированный вирус 10
<400>  11
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1. 5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile
145                 150                 155                 160
Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln
165                 170                 175
Thr Gly Glu Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro
180                 185                 190
Pro Ala Gly Pro Ser Gly Leu Gly Ser Gly Thr Met Ala Ala Gly Gly
195                 200                 205
Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser
210                 215                 220
Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val
225                 230                 235                 240
Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His
245                 250                 255
Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp
260                 265                 270
Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn
275                 280                 285
Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn
290                 295                 300
Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn
305                 310                 315                 320
Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala
325                 330                 335
Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln
340                 345                 350
Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe
355                 360                 365
Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn
370                 375                 380
Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr
385                 390                 395                 400
Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr
405                 410                 415
Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser
420                 425                 430
Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu
435                 440                 445
Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Gln Gly Thr Gln Gln Leu Leu
450                 455                 460
Phe Ser Gln Ala Gly Pro Ala Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp
465                 470                 475                 480
Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser
485                 490                 495
Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His
500                 505                 510
Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr
515                 520                 525
His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Met
530                 535                 540
Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Arg Asp Asn Val Asp Tyr Ser Ser Val
545                 550                 555                 560
Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr
565                 570                 575
Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Ala Asn Thr Gly
580                 585                 590
Pro Ile Val Gly Asn Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val
595                 600                 605
Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile
610                 615                 620
Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe
625                 630                 635                 640
Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val
645                 650                 655
Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Ser Gln Ala Lys Leu Ala Ser Phe
660                 665                 670
Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu
675                 680                 685
Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr
690                 695                 700
Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu
705                 710                 715                 720
Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg
725                 730                 735
Asn Leu
<210>  12
<211>  738
<212>  БЕЛОК
<213>  Адено-ассоциированный вирус rh10
<400>  12
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1. 5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile
145                 150                 155                 160
Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln
165                 170                 175
Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro
180                 185                 190
Pro Ala Gly Pro Ser Gly Leu Gly Ser Gly Thr Met Ala Ala Gly Gly
195                 200                 205
Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser
210                 215                 220
Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Gly Val
225                 230                 235                 240
Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His
245                 250                 255
Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp
260                 265                 270
Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn
275                 280                 285
Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn
290                 295                 300
Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Ser Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn
305                 310                 315                 320
Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala
325                 330                 335
Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln
340                 345                 350
Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe
355                 360                 365
Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn
370                 375                 380
Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr
385                 390                 395                 400
Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr
405                 410                 415
Gln Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser
420                 425                 430
Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu
435                 440                 445
Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Gln Gln Leu Leu
450                 455                 460
Phe Ser Gln Ala Gly Pro Asn Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp
465                 470                 475                 480
Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser
485                 490                 495
Gln Asn Asp Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His
500                 505                 510
Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr
515                 520                 525
His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Met
530                 535                 540
Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Lys Asp Asn Val Asp Tyr Ser Ser Val
545                 550                 555                 560
Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr
565                 570                 575
Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Ala Ala
580                 585                 590
Pro Ile Val Gly Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val
595                 600                 605
Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile
610                 615                 620
Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe
625                 630                 635                 640
Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val
645                 650                 655
Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Ser Gln Ala Lys Leu Ala Ser Phe
660                 665                 670
Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu
675                 680                 685
Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr
690                 695                 700
Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Asp
705                 710                 715                 720
Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg
725                 730                 735
Asn Leu
<210>  13
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  13
Gln Ala Asp Thr Thr Lys Asn
1. 5
<210>  14
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  14
Ile Ser Asp Gln Thr Lys His
1. 5
<210>  15
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  15
Ala Ser Asp Ser Thr Lys Ala
1. 5
<210>  16
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  16
Asn Gln Asp Tyr Thr Lys Thr
1. 5
<210>  17
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  17
His Asp Ile Thr Lys Asn Ile
1. 5
<210>  18
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  18
His Pro Asp Thr Thr Lys Asn
1. 5
<210>  19
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  19
His Gln Asp Thr Thr Lys Asn
1. 5
<210>  20
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  20
Asn Lys Thr Thr Asn Lys Asp
1. 5
<210>  21
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  21
Ile Ser Asn Glu Asn Glu His
1. 5
<210>  22
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  22
Gln Ala Asn Ala Asn Glu Asn
1. 5
<210>  23
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  23
Gly Lys Ser Lys Val Ile Asp
1. 5
<210>  24
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  24
Thr Asn Arg Thr Ser Pro Asp
1. 5
<210>  25
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  25
Pro Asn Ser Thr His Gly Ser
1. 5
<210>  26
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  26
Lys Asp Arg Ala Pro Ser Thr
1. 5
<210>  27
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  27
Leu Ala Gln Ala Asp Thr Thr Lys Asn Ala
1. 5                   10
<210>  28
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  28
Leu Ala Ile Ser Asp Gln Thr Lys His Ala
1. 5                   10
<210>  29
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  29
Leu Gly Ile Ser Asp Gln Thr Lys His Ala
1. 5                   10
<210>  30
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  30
Leu Ala Ala Ser Asp Ser Thr Lys Ala Ala
1. 5                   10
<210>  31
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  31
Leu Ala Asn Gln Asp Tyr Thr Lys Thr Ala
1. 5                   10
<210>  32
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  32
Leu Ala His Asp Ile Thr Lys Asn Ile Ala
1. 5                   10
<210>  33
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  33
Leu Ala His Pro Asp Thr Thr Lys Asn Ala
1. 5                   10
<210>  34
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  34
Leu Ala His Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala
1. 5                   10
<210>  35
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  35
Leu Ala Asn Lys Thr Thr Asn Lys Asp Ala
1. 5                   10
<210>  36
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  36
Leu Pro Ile Ser Asn Glu Asn Glu His Ala
1. 5                   10
<210>  37
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  37
Leu Pro Gln Ala Asn Ala Asn Glu Asn Ala
1. 5                   10
<210>  38
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  38
Leu Ala Gly Lys Ser Lys Val Ile Asp Ala
1. 5                   10
<210>  39
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  39
Leu Ala Thr Asn Arg Thr Ser Pro Asp Ala
1. 5                   10
<210>  40
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  40
Leu Ala Pro Asn Ser Thr His Gly Ser Ala
1. 5                   10
<210>  41
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  41
Leu Ala Lys Asp Arg Ala Pro Ser Thr Ala
1. 5                   10
<210>  42
<211>  745
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант капсида AAV
<400>  42
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1. 5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20                  25                  30
Lys Ala Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435                 440                 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450                 455                 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485                 490                 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500                 505                 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515                 520                 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530                 535                 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545                 550                 555                 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565                 570                 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Leu Ala Ile Ser Asp
580                 585                 590
Gln Thr Lys His Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln
595                 600                 605
Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln
610                 615                 620
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro
625                 630                 635                 640
Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile
645                 650                 655
Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser
660                 665                 670
Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val
675                 680                 685
Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp
690                 695                 700
Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val
705                 710                 715                 720
Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile
725                 730                 735
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740                 745
<210>  43
<211>  745
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант капсида AAV
<400>  43
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1. 5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20                  25                  30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Lys Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435                 440                 445
Asp Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450                 455                 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asn Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485                 490                 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500                 505                 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515                 520                 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530                 535                 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Ser Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545                 550                 555                 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565                 570                 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Leu Ala Ile Ser Asp
580                 585                 590
Gln Thr Lys His Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln
595                 600                 605
Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln
610                 615                 620
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro
625                 630                 635                 640
Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile
645                 650                 655
Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser
660                 665                 670
Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val
675                 680                 685
Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp
690                 695                 700
Asn Pro Glu Val Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val
705                 710                 715                 720
Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile
725                 730                 735
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Gln
740                 745
<210>  44
<211>  745
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант капсида AAV
<400>  44
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1. 5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20                  25                  30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435                 440                 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450                 455                 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485                 490                 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500                 505                 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515                 520                 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530                 535                 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545                 550                 555                 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565                 570                 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Leu Gly Ile Ser Asp
580                 585                 590
Gln Thr Lys His Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln
595                 600                 605
Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln
610                 615                 620
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro
625                 630                 635                 640
Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile
645                 650                 655
Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser
660                 665                 670
Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val
675                 680                 685
Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp
690                 695                 700
Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val
705                 710                 715                 720
Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile
725                 730                 735
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740                 745
<210>  45
<211>  745
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант капсида AAV
<400>  45
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1. 5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20                  25                  30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435                 440                 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450                 455                 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485                 490                 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500                 505                 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515                 520                 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530                 535                 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545                 550                 555                 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565                 570                 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Leu Ala Gln Ala Asp
580                 585                 590
Thr Thr Lys Asn Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln
595                 600                 605
Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln
610                 615                 620
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro
625                 630                 635                 640
Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile
645                 650                 655
Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser
660                 665                 670
Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val
675                 680                 685
Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp
690                 695                 700
Asn Pro Glu Val Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val
705                 710                 715                 720
Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile
725                 730                 735
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740                 745
<210>  46
<211>  745
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант капсида AAV
<400>  46
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1. 5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20                  25                  30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435                 440                 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450                 455                 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485                 490                 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500                 505                 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515                 520                 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530                 535                 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545                 550                 555                 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565                 570                 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Leu Ala His Asp Ile
580                 585                 590
Thr Lys Asn Ile Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln
595                 600                 605
Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln
610                 615                 620
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro
625                 630                 635                 640
Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile
645                 650                 655
Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser
660                 665                 670
Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val
675                 680                 685
Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp
690                 695                 700
Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val
705                 710                 715                 720
Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile
725                 730                 735
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740                 745
<210>  47
<211>  745
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант капсида AAV
<400>  47
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1. 5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20                  25                  30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435                 440                 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450                 455                 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485                 490                 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500                 505                 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515                 520                 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530                 535                 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545                 550                 555                 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565                 570                 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Leu Ala Asn Gln Asp
580                 585                 590
Tyr Thr Lys Thr Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln
595                 600                 605
Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln
610                 615                 620
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro
625                 630                 635                 640
Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile
645                 650                 655
Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser
660                 665                 670
Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val
675                 680                 685
Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp
690                 695                 700
Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val
705                 710                 715                 720
Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile
725                 730                 735
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740                 745
<210>  48
<211>  745
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант капсида AAV
<400>  48
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1. 5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20                  25                  30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435                 440                 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450                 455                 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485                 490                 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500                 505                 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515                 520                 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530                 535                 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545                 550                 555                 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565                 570                 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Leu Ala Pro Asn Ser
580                 585                 590
Thr His Gly Ser Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln
595                 600                 605
Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln
610                 615                 620
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro
625                 630                 635                 640
Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile
645                 650                 655
Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser
660                 665                 670
Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val
675                 680                 685
Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp
690                 695                 700
Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val
705                 710                 715                 720
Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile
725                 730                 735
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740                 745
<210>  49
<211>  745
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант капсида AAV
<400>  49
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1. 5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20                  25                  30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435                 440                 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450                 455                 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485                 490                 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500                 505                 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515                 520                 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530                 535                 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545                 550                 555                 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565                 570                 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Leu Ala Asn Lys Thr
580                 585                 590
Thr Asn Lys Asp Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln
595                 600                 605
Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln
610                 615                 620
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro
625                 630                 635                 640
Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile
645                 650                 655
Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser
660                 665                 670
Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val
675                 680                 685
Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp
690                 695                 700
Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val
705                 710                 715                 720
Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile
725                 730                 735
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740                 745
<210>  50
<211>  745
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант капсида AAV
<400>  50
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1. 5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20                  25                  30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435                 440                 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450                 455                 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485                 490                 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500                 505                 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515                 520                 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530                 535                 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545                 550                 555                 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565                 570                 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Leu Ala Thr Asn Arg
580                 585                 590
Thr Ser Pro Asp Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln
595                 600                 605
Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln
610                 615                 620
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro
625                 630                 635                 640
Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile
645                 650                 655
Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser
660                 665                 670
Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val
675                 680                 685
Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp
690                 695                 700
Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val
705                 710                 715                 720
Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile
725                 730                 735
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740                 745
<210>  51
<211>  745
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант капсида AAV
<400>  51
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1. 5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20                  25                  30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435                 440                 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450                 455                 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485                 490                 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500                 505                 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515                 520                 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530                 535                 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545                 550                 555                 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565                 570                 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Leu Ala Gly Lys Ser
580                 585                 590
Lys Val Ile Asp Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln
595                 600                 605
Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln
610                 615                 620
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro
625                 630                 635                 640
Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile
645                 650                 655
Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser
660                 665                 670
Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val
675                 680                 685
Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp
690                 695                 700
Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val
705                 710                 715                 720
Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile
725                 730                 735
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740                 745
<210>  52
<211>  745
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант капсида AAV
<400>  52
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1. 5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20                  25                  30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435                 440                 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450                 455                 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485                 490                 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500                 505                 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515                 520                 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530                 535                 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545                 550                 555                 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565                 570                 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Leu Ala Ala Ser Asp
580                 585                 590
Ser Thr Lys Ala Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln
595                 600                 605
Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln
610                 615                 620
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro
625                 630                 635                 640
Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile
645                 650                 655
Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser
660                 665                 670
Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val
675                 680                 685
Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp
690                 695                 700
Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val
705                 710                 715                 720
Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile
725                 730                 735
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740                 745
<210>  53
<211>  745
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант капсида AAV
<400>  53
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1. 5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20                  25                  30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435                 440                 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450                 455                 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485                 490                 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500                 505                 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515                 520                 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530                 535                 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545                 550                 555                 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565                 570                 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Leu Ala Lys Asp Arg
580                 585                 590
Ala Pro Ser Thr Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln
595                 600                 605
Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln
610                 615                 620
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro
625                 630                 635                 640
Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile
645                 650                 655
Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser
660                 665                 670
Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val
675                 680                 685
Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp
690                 695                 700
Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val
705                 710                 715                 720
Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile
725                 730                 735
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740                 745
<210>  54
<211>  745
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант капсида AAV
<400>  54
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1. 5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20                  25                  30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435                 440                 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450                 455                 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485                 490                 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500                 505                 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515                 520                 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530                 535                 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545                 550                 555                 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565                 570                 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Leu Ala His Gln Asp
580                 585                 590
Thr Thr Lys Asn Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln
595                 600                 605
Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln
610                 615                 620
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro
625                 630                 635                 640
Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile
645                 650                 655
Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser
660                 665                 670
Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val
675                 680                 685
Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp
690                 695                 700
Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val
705                 710                 715                 720
Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile
725                 730                 735
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740                 745
<210>  55
<211>  745
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант капсида AAV
<400>  55
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1. 5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20                  25                  30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435                 440                 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450                 455                 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485                 490                 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500                 505                 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515                 520                 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530                 535                 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545                 550                 555                 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565                 570                 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Leu Pro Ile Ser Asn
580                 585                 590
Glu Asn Glu His Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln
595                 600                 605
Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln
610                 615                 620
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro
625                 630                 635                 640
Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile
645                 650                 655
Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser
660                 665                 670
Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val
675                 680                 685
Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp
690                 695                 700
Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val
705                 710                 715                 720
Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile
725                 730                 735
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740                 745
<210>  56
<211>  745
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант капсида AAV
<400>  56
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1. 5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20                  25                  30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435                 440                 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450                 455                 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485                 490                 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500                 505                 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515                 520                 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530                 535                 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545                 550                 555                 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565                 570                 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Leu Pro Gln Ala Asn
580                 585                 590
Ala Asn Glu Asn Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln
595                 600                 605
Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln
610                 615                 620
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro
625                 630                 635                 640
Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile
645                 650                 655
Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser
660                 665                 670
Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val
675                 680                 685
Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp
690                 695                 700
Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val
705                 710                 715                 720
Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile
725                 730                 735
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740                 745
<210>  57
<211>  745
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант капсида AAV
<400>  57
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1. 5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20                  25                  30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435                 440                 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450                 455                 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485                 490                 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500                 505                 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515                 520                 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530                 535                 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545                 550                 555                 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565                 570                 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Leu Ala His Pro Asp
580                 585                 590
Thr Thr Lys Asn Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln
595                 600                 605
Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln
610                 615                 620
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro
625                 630                 635                 640
Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile
645                 650                 655
Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser
660                 665                 670
Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val
675                 680                 685
Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp
690                 695                 700
Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val
705                 710                 715                 720
Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile
725                 730                 735
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740                 745
<210>  58
<211>  737
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Родственный капсидный белок
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (264)..(264)
<223>  Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (266)..(266)
<223>  Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (268)..(268)
<223>  Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (448)..(448)
<223>  Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (459)..(460)
<223>  Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (467)..(467)
<223>  Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (470)..(471)
<223>  Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (474)..(474)
<223>  Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (495)..(495)
<223>  Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (516)..(516)
<223>  Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (533)..(533)
<223>  Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (547)..(547)
<223>  Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (551)..(551)
<223>  Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (555)..(555)
<223>  Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (557)..(557)
<223>  Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (561)..(561)
<223>  Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (563)..(563)
<223>  Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (577)..(577)
<223>  Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (583)..(583)
<223>  Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (593)..(593)
<223>  Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (596)..(596)
<223>  Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (661)..(662)
<223>  Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (664)..(665)
<223>  Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (710)..(710)
<223>  Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (717)..(719)
<223>  Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (723)..(723)
<223>  Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<400>  58
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1. 5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile
145                 150                 155                 160
Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln
165                 170                 175
Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro
180                 185                 190
Pro Ala Gly Pro Ser Gly Leu Gly Ser Gly Thr Met Ala Ala Gly Gly
195                 200                 205
Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn
210                 215                 220
Ala Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val
225                 230                 235                 240
Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His
245                 250                 255
Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Xaa Ser Xaa Gly Xaa Thr Asn Asp Asn
260                 265                 270
His Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg
275                 280                 285
Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn
290                 295                 300
Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile
305                 310                 315                 320
Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Val Thr Thr Ile Ala Asn
325                 330                 335
Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu
340                 345                 350
Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro
355                 360                 365
Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn
370                 375                 380
Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe
385                 390                 395                 400
Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr
405                 410                 415
Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu
420                 425                 430
Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Xaa
435                 440                 445
Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly Xaa Xaa Glu Leu Leu Phe
450                 455                 460
Ser Gln Xaa Gly Pro Xaa Xaa Met Ser Xaa Gln Ala Lys Asn Trp Leu
465                 470                 475                 480
Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Leu Xaa Gln
485                 490                 495
Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu
500                 505                 510
Asn Gly Arg Xaa Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr His
515                 520                 525
Lys Asp Asp Glu Xaa Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Ile Phe
530                 535                 540
Gly Lys Xaa Gly Ala Gly Xaa Asn Asn Thr Xaa Leu Xaa Asn Val Met
545                 550                 555                 560
Xaa Thr Xaa Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu
565                 570                 575
Xaa Tyr Gly Val Val Ala Xaa Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro
580                 585                 590
Xaa Thr Gly Xaa Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp
595                 600                 605
Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro
610                 615                 620
His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly
625                 630                 635                 640
Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro
645                 650                 655
Ala Asn Pro Pro Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile
660                 665                 670
Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu
675                 680                 685
Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser
690                 695                 700
Asn Tyr Ala Lys Ser Xaa Asn Val Asp Phe Ala Val Xaa Xaa Xaa Gly
705                 710                 715                 720
Val Tyr Xaa Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn
725                 730                 735
Leu
<210>  59
<211>  737
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Родственный вариант капсида
<400>  59
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1. 5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile
145                 150                 155                 160
Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln
165                 170                 175
Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro
180                 185                 190
Pro Ala Gly Pro Ser Gly Leu Gly Ser Gly Thr Met Ala Ala Gly Gly
195                 200                 205
Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn
210                 215                 220
Ala Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val
225                 230                 235                 240
Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His
245                 250                 255
Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Ala Ser Ala Gly Ser Thr Asn Asp Asn
260                 265                 270
His Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg
275                 280                 285
Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn
290                 295                 300
Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile
305                 310                 315                 320
Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Val Thr Thr Ile Ala Asn
325                 330                 335
Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu
340                 345                 350
Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro
355                 360                 365
Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn
370                 375                 380
Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe
385                 390                 395                 400
Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr
405                 410                 415
Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu
420                 425                 430
Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ala
435                 440                 445
Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Arg Glu Leu Leu Phe
450                 455                 460
Ser Gln Ala Gly Pro Ser Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp Leu
465                 470                 475                 480
Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Leu Ser Gln
485                 490                 495
Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu
500                 505                 510
Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr His
515                 520                 525
Lys Asp Asp Glu Asp Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Ile Phe
530                 535                 540
Gly Lys Gln Gly Ala Gly Ala Asn Asn Thr Ala Leu Glu Asn Val Met
545                 550                 555                 560
Met Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu
565                 570                 575
Gln Tyr Gly Val Val Ala Ser Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro
580                 585                 590
Val Thr Gly Thr Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp
595                 600                 605
Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro
610                 615                 620
His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly
625                 630                 635                 640
Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro
645                 650                 655
Ala Asn Pro Pro Ala Val Phe Thr Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile
660                 665                 670
Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu
675                 680                 685
Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser
690                 695                 700
Asn Tyr Ala Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asp Asn Glu Gly
705                 710                 715                 720
Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn
725                 730                 735
Leu
<210>  60
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Гетерологичная пептидная вставка
<400>  60
Ile Ala His Asp Ile Thr Lys Asn Ile Ala
1. 5                   10
<210>  61
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Гетерологичная пептидная вставка
<400>  61
Asp Ile Thr Lys Asn Ile Ala
1. 5
<210>  62
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Гетерологичная пептидная вставка
<400>  62
Asn Lys Thr Thr Asn Lys Asp Ala
1. 5
<210>  63
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Гетерологичная пептидная вставка
<400>  63
Pro Gln Ala Asn Ala Asn Glu Asn
1. 5
<210>  64
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Гетерологичная пептидная вставка
<400>  64
Pro Ile Ser Asn Glu Asn Glu His
1. 5
<---