СПОСОБ ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ЭНДОТЕЛИЯ У БОЛЬНЫХ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТОНИЕЙ И ЕЕ ЦЕРЕБРАЛЬНЫМИ ОСЛОЖНЕНИЯМИ
METHOD OF ESTIMATING FUNCTIONAL STATUS OF ENDOTHELIUM IN PATIENT WITH ARTERIAL HYPERTENSION AND ITS CEREBRAL COMPLICATIONS

Изобретение относится к медицине, а именно к внутренним болезням (оценке эндотелиальной функции у больных артериальной гипертонией).
По данным патентно-информационного поиска на сегодняшний день существует множество методик оценки эндотелиальной функции. Эндотелиальная регуляция сосудистого тонуса может оцениваться ангиографически (Ludmer P.L. et al. Paradoxical vasoconstriction induced by acetylcholine in atherosclerotic coronary arteries. // N. Engl. J. Med. 1986. Vol.513. P.1046-51) и с помощью ультразвука высокого разрешения в условиях реактивной гиперемии (Celermajer D.S. Non-invasive detection of endothelial dysfunction in children and adults at risk of atherosclerosis. // Lancet. 1992. Vol.340. P.1111-15).
В качестве маркеров эндотелиальной дисфункции (ЭД) рассматриваются различные субстанции, синтезируемые эндотелием: эндотелии-1 (Lechleitner P. et al. Plasma immunoreactive endothelin-1 in the acute and subacute phases of myocardial infarction in patients undergoing fibrinolysis // Clinical chemistry. 1993. Vol.39. P.955-59), фактор Виллебранда (Ruggeri Z.M. Structure and function of von Willebrand factor // Thrombos. Haemost. 1999. Vol.82. P.576-84), селектины (Atalar E. et al. Increased plasma levels of soluble selectins in patients with unstable angina. // Int. J. Cardiol. 2001. Vol.78. P.69-73) и молекулы клеточной адгезии (Gearing A. et al. Circulation adhesion molecules and atherogenesis. // Immunol. Today. 1993. Vol.14. P.506-12) и др.
Оксид азота (NO) является важнейшим эндотелиальным медиатором (Furchgott R.F. et al. The obligatory role of the endothelial cells in relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. // Nature. 1980. Vol.288. P.373-76). По данным В.П.Реутова в организме млекопитающих существует цикл NO (Реутов В.П. Роль нейромедиаторов и регуляторных пептидов в процессах жизнедеятельности. - М., 1999). Так, в клетках млекопитающих NO ферментативно образуется из терминального гуанидинового азота L-аргинина семейством трех изоферментов NO-синтазы: конститутивными нейрональными (nNOS), индуцибельными (iNOS) и конститутивными эндотелиальными (eNOS). Также источником мощного выброса оксида азота, наряду с другими свободными радикалами, является индуцибельная NO-синтаза макрофагов. L-аргинин в ходе этой реакции превращается в L-цитруллин (Ц). NO является очень нестойким соединением. В результате неферментативного / ферментативного окисления NO в организме быстро образуются нитрит- и нитрат-ионы. Обратное восстановление нитритов в NO осуществляется в ходе нитритредуктазной реакции. Кроме того, оксид азота и нитраты / нитриты могут поступать в организм извне: с лекарственными препаратами (всем известные «нитраты», использующиеся при лечении ишемической болезни сердца), пищевыми продуктами (Granger D.L. et al. Measuring nitric oxide production in human clinical studies. Methods Enzymol 1999; 301: 49-61; Метельская В.А. и др. Скрининг-метод определения уровня метаболитов оксида азота в сыворотке крови. // Клиническая и лабораторная диагностика. 2005; 5: 15-18).
Несмотря на то, что NO-синтазная реакция в эндотелии - основной, но не единственный источник NO и нитрит-ионов, уже на протяжении ряда лет определение суммарной концентрации нитрит- и нитрат-ионов является общепризнанным методом оценки активности eNOS и продукции NO в организме человека (Miranda K.M. et al. A rapid, simple spectrophotometric method for simultaneous detection of nitrate and nitrite. // Nitric oxide: biology and chemistry. 2001. Vol.5. P.62-71). Поскольку в организме человека NO образуется при участии NO-синтазы в эквимолярных количествах с Ц, то содержание последнего также может косвенно свидетельствовать об активности eNOS (Савельев С.А. Чувствительный метод определения цитруллина для прижизненного мониторинга продукции оксида азота в ЦНС. Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова, 2005; 91; 9: 587-591). Использование этих двух методов в совокупности позволяет увеличить точность и достоверность оценки продукции NO у обследуемых пациентов.
К клеточным маркерам ЭД относят количество циркулирующих десквамированных эндотелиоцитов (ДЭ) (Hiadovec J. et al. Circulating endothelial cells in acute myocardial infarction and angina pectoris. // Klin. Wochenschr. 1978. Vol.56, №20. P.1033-36). Эндотелий служит одновременно мишенью и медиатором сердечно-сосудистых болезней, изменения его функции наблюдаются уже на ранних стадиях заболевания. Усиление десквамации эндотелиальных клеток в кровь наблюдается при повреждении эндотелия при том или ином патологическом процессе. Автор метода J.Hladovec связывал увеличение количества ДЭ с тенденцией к тромбозу и повышенной проницаемостью сосудистой стенки.
Таким образом, до настоящего времени не разработано интегральной оценки функционального состояния эндотелия, а традиционная диагностика ЭД сводится к определению отдельных ее маркеров. Однако из сказанного выше становится понятным, что не существует маркеров, строго специфичных для ЭД. Так, концентрация нитратов / нитритов в плазме крови уменьшается при ЭД, но может увеличиваться при любых процессах воспаления, при пониженной активности нитрит-редуктазных систем, при приеме пациентом указанных выше лекарств или пищевых продуктов. Концентрация цитруллина отражает активность NO-синтаз, следовательно, уменьшается при ЭД и повышается при воспалительных процессах (активностью нейрональных ферментов можно пренебречь), однако не изменяется под влиянием диеты. Десквамация эндотелия усиливается при ЭД, нарушениях гемодинамики, а также при любых воспалительных заболеваниях, в т.ч. местных, и при чрезмерной травматизации сосуда пункционной иглой.
Кроме того, диагностическая чувствительность наших лабораторных методов часто оказывается недостаточно высокой, чтобы точно оценивать состояние эндотелия и контролировать его в динамике.
Технический результат предлагаемого способа заключается в повышении точности оценки патологии функционального состояния эндотелия у больных артериальной гипертонией и ее церебральными осложнениями за счет определения суммарной концентрации нитрит- и нитрат-ионов, цитруллина, количества десквамированных эндотелиоцитов в плазме крови и расчета интегрального показателя эндотелиальной дисфункции (ИПЭД) с помощью факторного анализа. При значениях ИПЭД 1,25±0,31 усл.ед. функциональное состояние эндотелия оценивается как нормальное, значения ИПЭД 0,14±0,09 усл.ед. свидетельствуют о компенсированной эндотелиальной дисфункции и -0,96±0,29 усл.ед. - о декомпенсации эндотелиальной дисфункции (см. таблицу).
Сущность предлагаемого нами способа заключается в том, что на основании определения суммарной концентрация нитратов и нитритов, цитруллина и количества десквамированных эндотелиоцитов в плазме крови у пациентов с артериальной гипертонией и ее церебральными осложнениями рассчитывается интегральный показатель эндотелиальной дисфункции с помощью факторного анализа.
Применение факторного анализа в целях диагностики явилось реализацией давно известного метода линейного преобразования факторного пространства с целью сокращения его размерности (Айвазян С.А. и др. Классификация многомерных наблюдений. - М., 1974; Факторный дискриминантный и кластерный анализ: Пер. с англ. / Под ред. И.С.Енюкова. - М., 1989; Харман Г. Современный факторный анализ. - М., 1972). Гипотеза Ч.Спирмена (Андрукович И.Ф. Заметки о факторном анализе. // Многомерный статистический анализ и вероятностное моделирование реальных процессов: Ученые записки по статистике. Т.54. Сб. научн. статей. - М., 1990) о существовании общих факторов (common factors), которые можно считать причинами (а измеренные параметры - следствиями) происходящих в объекте процессов, оказалась очень продуктивной. Установлено, что выделение и последующее наблюдение за уровнем общих факторов в динамике дает возможность обнаруживать минимальные изменения состояния объекта на очень ранних стадиях развития патологии и исключать влияние неспецифических факторов (Рыбалко В.В. Параметрическое диагностирование энергетических объектов на основе факторного анализа в среде STATISTICA. // Научно-Практический журнал Exponenta Pro 2 (6)/2004).
Для пояснения метода следует привести несколько основных положений факторного анализа.
Пусть для матрицы X(1:p,1:n) зафиксированных параметров объекта существует ковариационная (корреляционная) матрица Σ(1:p,1:p), где p - число параметров, n - число строк. Путем линейного преобразования  можно уменьшить размерность исходного факторного пространства X(1:p) до уровня Y(1:p') при этом p'<<p (Айвазян С.А. и др. Классификация многомерных наблюдений. - М., 1974). Это соответствует преобразованию точки, характеризующей состояние объекта в p-мерном пространстве, в новое пространство измерений с меньшей размерностью p'. Практическая значимость преобразования повышается в том случае, когда новое факторное пространство имеет ясный физический и клинический смысл.
Матрица Y(1:p',1:n) содержит общие (ненаблюдаемые в действительности) факторы, которые по существу являются гиперпараметрами, характеризующими наиболее общие свойства анализируемого объекта. Общие факторы чаще всего выбирают ортогональными (статистически независимыми), что облегчает их физическую интерпретацию. Как отмечено выше, вектор наблюдаемых признаков X(1:p) имеет смысл следствия изменения этих гиперпараметров.
Модель факторного анализа (1) похожа на модели многомерного регрессионного и дисперсионного анализа. Принципиальное отличие модели (1) в том, что вектор Y(1:p') - это ненаблюдаемые в реальности факторы, а в регрессионном анализе - это регистрируемые факторы.
Пакет статистического анализа STATISTICA позволяет в диалоговом режиме вычислить матрицу факторных нагрузок Q(1:p,1:p'), а также значения нескольких заранее заданных главных факторов (чаще всего двух - по первым двум главным компонентам исходной матрицы параметров).
Нами обследовано 42 больных с ишемическим инсультом. Критерии отбора больных: наличие в анамнезе артериальной гипертонии; первое в жизни острое нарушение мозгового кровообращения; ишемический тип острого нарушения мозгового кровообращения в бассейне сонных артерий (полушарный инсульт); возраст больных до 59 лет. Критерии исключения: заболевания легких, печени и почек в стадии декомпенсации; сахарный диабет; ишемическая болезнь сердца; застойная сердечная недостаточность; прием пациентами нитросодержащих препаратов. Эти больные составили I группу, средний возраст 51,4±1,5 лет (пределы колебаний от 37 до 59 лет), среди них мужчин - 22 (52,4%), женщин - 20 (47,6%). Группу сравнения (II группа) составили 26 пациентов (16 мужчин и 10 женщин) с неосложненной артериальной гипертонией, средний возраст 52,6±1,7. В контрольную группу, сопоставимую по полу и возрасту с обследованными пациентами, вошли 25 практически здоровых доноров крови без сердечно-сосудистых факторов риска.
Верификация диагноза у пациентов, включенных в исследование, была проведена на основании клинико-лабораторных и инструментальных данных с учетом соответствующих классификационных требований. Дополнительно определялись показатели ЭД. Все исследования по оценке показателей ЭД выполнялись в утренние часы, натощак, с исключением курения, употребления крепкого чая, кофе, чрезмерных физических нагрузок, приема всех лекарственных препаратов. Для β-блокаторов, антагонистов кальция и ингибиторов АПФ свободный промежуток составлял не менее 24 часов. Всем обследуемым исходно объяснялась необходимость строгого соблюдения безнитратной диеты накануне исследования (Метельская В.А. и др. Скрининг-метод определения уровня метаболитов оксида азота в сыворотке крови. // Клиническая и лабораторная диагностика. 2005; 5: 15-18).
Для определения суммарной концентрации нитрит- и нитрат-ионов предварительно плазма крови депротеинизировалась с помощью этанола, нитраты восстанавливались до нитритов в реакции с хлоридом ванадия. Содержание нитритов в плазме крови оценивалось по методике Грисса спектрофотометрически при длине волны 540 нм (Miranda K.M. et al. A rapid, simple spectrophotometric method for simultaneous detection of nitrate and nitrite. // Nitric oxide: biology and chemistry. 2001. Vol.5. P.62-71). Для определения концентрации Ц в плазме крови нами использован метод, основанный на реакции остатков Ц с диацетилмоноксимом в присутствии разбавленной серной кислоты и хлористого железа. Оптическая плотность полученного окрашенного комплекса измерялась на спектрофотометре при длине волны 464 нм (Kiyoshi Sugawara et all. Colorimetric determination of Citrulline residues in proteins. Analyt. biochem. 1998. 265, 92-96). Подсчет ДЭ проводился по методу J.Hladovec (Hladovec J. et al. Circulating endothelial cells in acute myocardial infarction and angina pectoris. // Klin. Wochenschr. 1978. Vol.56, №20. P.1033-36).
Статистическая обработка полученных результатов проводилась в пакете прикладных программ «Statistica - v.6.0 for Windows» с использованием описательной статистики, t-критерия Стьюдента, корреляционного, факторного и регрессионного анализов.
С помощью факторного анализа нам удалось найти показатель, достоверно отражающий функцию эндотелия в целом. Суммарная концентрация нитритов и нитратов, содержание Ц в плазме крови и количество ДЭ статистически достоверно формировали один действующий фактор, который мы определили как «интегральный показатель эндотелиальной дисфункции». Вклад этих показателей в результирующий фактор оказался примерно одинаков (Factor Score Coefficients -0,39; -0,43 и 0,37 соответственно).
Факторный анализ показал, что у пациентов с неосложненной артериальной гипертонией ИПЭД выходит за пределы полученного контрольного значения, приближаясь к 0, но все же остается положительным. При развитии инсульта этот показатель достоверно снижается и становится отрицательным. Таким образом, при неосложненной артериальной гипертонии наблюдается ЭД, но она компенсирована, а развитие ишемического инсульта на фоне артериальной гипертонии сопровождается декомпенсацией системы NO-эндотелий. На практике рассчитанный для каждого пациента ИПЭД сравнивается с полученными нормативами оценки состояния эндотелиальной функции (см. таблицу), на основании чего делается вывод о наличии и степени выраженности ЭД.
Клинический пример №1 (I группа)
Больная М., 51 г., находилась на стационарном лечении в нейрососудистом отделении Ивановской областной клинической больницы с 19.10.2007 по 06.11.2007 с диагнозом: Ишемический инсульт в бассейне ЛВСА от 18.10.07, острый период. Мнестические нарушения. Церебральный атеросклероз. Гипертоническая болезнь III ст. Артериальная гипертония II ст. Риск 4. HI. Данный диагноз поставлен на основании: жалоб, данных анамнеза, наличия в неврологическом статусе умеренного гемипареза, гиперрефлексии справа, мнестических нарушений, что свидетельствует об очаге в левом полушарии головного мозга.
При поступлении предъявляла жалобы на слабость в правых руке и ноге, головную боль в лобно-теменной области, нарушение памяти.
История заболевания: Около 10 лет страдает гипертонической болезнью с подъемами АД до 180/100 мм рт.ст. Систематически не лечилась. 18.10.2007 г. около 21:00 внезапно потеряла сознание, затем были нарушения речи, слабость в правых руке и ноге, нарушение ориентировки, памяти (забыла всех своих знакомых). Машиной скорой помощи доставлена в НСО ОКБ для обследования и лечения.
Из анамнеза: Образование высшее. Наследственность отягощена по гипертонической болезни, онкопатологии. Курение отрицает. Менструальная функция: менопауза несколько мес. Б - 5, Р - 2.
Status praesens: Общее состояние удовлетворительное. Сознание ясное. Кожные покровы чистые. Питание нормальное. ОТ 0,80 м, ОБ 1,02 м; коэффициент ОТ/ОБ=0,78. Вес=72 кг, рост - 1,62 м; ИМТ - 27,4. АД 150/90 мм рт.ст. Пульс 76 в 1 мин, ритмичный, удовлетворительного наполнения и напряжения. Смещение левой границы относительной сердечной тупости: на 1,5 см кнаружи от среднеключичной линии на уровне 5 межреберья. Тоны сердца ясные, шумы не выслушиваются, акцент II тона на аорте. В неврологическом статусе умеренный центральный гемипарез, гиперрефлексия справа. Память снижена.
Обследование:
Общий анализ крови и мочи: без патологических изменений.
Биохимический анализ крови: креатинин 98,9 мкмоль/л, о.белок 66,9 г/л, ОХС 4,3 ммоль/л, ТГ 1,34 ммоль/л, сахар крови 4,8 ммоль/л, мочевая кислота крови 0,185 ммоль/л.
Коагулограмма: склонность к гиперкоагуляции.
ЭКГ: ЭОС отклонена вправо. Ритм синусовый с ЧСС 66 в минуту. Признаки гипертрофии миокарда левых отделов сердца.
ЭхоКГ: КДР ЛЖ 51,5 мм, КСР ЛЖ 32,0 мм; ТМЖП 12,7 мм, ТЗС ЛЖ 12,5 мм; ФВ 65%. ЛП 38*63 мм. Диастолическая дисфункция ЛЖ I типа. Клапаны без особенностей. Атеросклероз аорты с расширением восходящего отдела.
Осмотр глазного дна: Венозная ангиопатия сетчатки OU.
ЭхоЭС: смещения срединных структур нет.
ЭЭГ: очаговые изменения в отведениях левого полушария.
РЭГ: гипертонический тип кривых, венозный отток в норме.
Исследование функции эндотелия: суммарная концентрация нитрит- и нитрат-ионов 136 ммоль/л, L-цитруллин 8 ммоль/л, десквамированные эндотелиоциты в плазме 18 кл., ИПЭД (-1,09) усл.ед.
Лечение: семакс, кавинтон, церебролизин, инстенон, эднит, занятия с логопедом. На фоне лечения состояние улучшилось.
Таким образом, исследование функции эндотелия у больной М. выявило значительное снижение по сравнению с контрольным значением уровня нитратов-нитритов и L-цитруллина, повышение числа десквамированных эндотелиоцитов в плазме крови. С помощью расчета ИПЭД нам удалось доказать наличие у больной декомпенсированной эндотелиальной дисфункции.
Клинический пример №2 (II группа)
Больная К., 59 лет, находилась на стационарном лечении в кардиоревматологическом отделении Ивановской областной клинической больницы с 4 по 18 февраля 2008 г. с диагнозом:
Гипертоническая болезнь II ст. Артериальная гипертония 2 ст. Гипертрофия миокарда левого желудочка. Гипертоническая ангиопатия сетчатки 2 ст. Риск 4. HI.
При поступлении предъявляла жалобы на повышение АД, иногда сопровождающееся возникновением головных болей, головокружением, шумом в голове, тошнотой, изредка - рвотой.
История заболевания: Впервые подобные симптомы стала отмечать около 2 лет назад. Лекарственных препаратов не принимала, за медицинской помощью обратилась впервые в октябре 2007 г. После начала антигипертензивной терапии, рекомендованной участковым терапевтом (амлодипин, конкор) отмечает стабилизацию АД на нормальных цифрах. Настоящее ухудшение самочувствия - около 1 месяца назад, когда пациентка самостоятельно прекратила лечение с последующим появлением вновь вышеописанных симптомов. Адаптирована к АД 160/90-100 мм рт.ст.
Из анамнеза: Наследственность по ИБС не отягощена. Курение отрицает. Менструальная функция: менопауза в 53 года; Б - 3, Р - 2.
Status praesens: Общее состояние удовлетворительное, кожа чистая, обычного питания. ОТ=0,72 м, ОБ=0,95 м; коэффициент ОТ/ОБ=0,76. Вес=74 кг, рост=1,67 м; ИМТ=26,5. АД 160/95 мм рт.ст. Пульс = 70 в 1 мин, ритмичный, удовлетворительного наполнения и напряжения. Смещение левой границы относительной сердечной тупости: до среднеключичной линии на уровне 5 межреберья. Тоны сердца средней интенсивности, шумы не выслушиваются.
Обследование:
Общий анализ крови и мочи: без патологических изменений.
Биохимический анализ крови: Креатинин 96,5 мкмоль/л, ОХС 5,25 ммоль/л, В-ЛП 61 ед., ТГ 1,39 ммоль/л, калий 4,3 ммоль/л, натрий 141,7 ммоль/л, сахар 6,0 ммоль/л, мочевая кислота 0,213 ммоль/л.
ЭКГ: ЭОС отклонена влево. Ритм синусовый с ЧСС 75 в минуту. Гипертрофия миокарда ЛЖ, повышена нагрузка на ЛП.
2
ЭхоКГ: КДР ЛЖ 53,4 мм, КСР ЛЖ 32,1 мм; ТМЖП 13,7 мм, ТЗС ЛЖ 12,8 мм; ИММЛЖ 221 кг/м, ФВ 67%. Диастолическая дисфункция ЛЖ I типа. ЛП 37 мм, длина 61 мм. Клапаны не изменены. Осмотр глазного дна: Гипертоническая ангиопатия сетчатки 2 ст. УЗИ органов брюшной полости: без патологических изменений. Исследование функции эндотелия: суммарная концентрация нитрит- и нитрат-ионов 164,4 ммоль/л, L-цитруллин 17,4 ммоль/л, десквамированные эндотелиоциты в плазме 12 кл., ИПЭД 0,23 усл.ед. Лечение: арифон-ретард, конкор, экватор, тромбо АСС. Таким образом, исследование функции эндотелия у больной К. выявило умеренное снижение по сравнению с контрольным значением уровня нитратов-нитритов и L-цитруллина, повышение числа десквамированных эндотелиоцитов в плазме крови. С помощью расчета ИПЭД нам удалось доказать наличие у больной компенсированной эндотелиальной дисфункции.
Отдельные маркеры и интегральный показатель эндотелиальной дисфункции у пациентов с ишемическим инсультом, неосложненной артериальной гипертонией и здоровых лиц.
Таблица
Показатель (М±m)
I группа (n=42)
II группа (n=26)
Контрольная группа (n=25)
Р
1
2
3
Суммарная концентрация нитритов и нитратов в плазме крови, мкмоль/л
146,4±13,3
182,1±9,4
241,3±27,4
P<sub>1-3</sub><0,005
Р<sub>2-3</sub><0,05
P<sub>1-2</sub><0,05
Концентрация цитруллина в плазме крови, ммоль/л
14,5±4,84
17,2±3,85
29,7±4,15
Р<sub>1-3</sub><0,05
Р<sub>2-3</sub><0,01
P<sub>1-2</sub>>0,05
Количество десквамированных эндотелиоцитов в плазме крови, кл.
14,7±2,9
6,8±0,7
3,6±1,4
P<sub>1-3</sub><0,01
Р<sub>2-3</sub><0,05
P<sub>1-2</sub><0,05
Интегральный показатель эндотелиальной дисфункции, усл.ед.
-0,96±0,29
0,14±0,09
1,25±0,31
P<sub>1-3</sub><0,005
Р<sub>2-3</sub><0,001
P<sub>1-2</sub><0,005