Этапы становления, основные достижения и перспективы развития лаборатории пренатальной диагностики НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН

из истории МЕДИЦИНЫ

© В. С. Баранов

НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН,

С анкт-Петербург

этапы становления, основные достижения и перспективы развития ЛАБОРАТОРИИ пренатальной ДИАГНОСТИКИ НИИ АКУШЕРСТВА И ГИНЕКОЛОГИИ ИМ. Д. О. ОТТА РАМН

Обзор становления и развития лаборатории, создания службы пренатальной диагностики в городе, внедрения в практику диагностики моногенных и хромосомных болезней у плода биохимического скрининга беременных, техники получения плодного материала. Приведены основные итоги работы лаборатории пренатальной диагностики наследственных болезней за 20 лет. Суммированы достижения и перспективы нового научного направления, зародившегося в лаборатории — предиктивной (предсказательной) медицины, основанного на тестировании генов «предрасположенности». Отмечены успехи в изучении наследственной предрасположенности к остеопорозу, эндометриозу, бронхиальной астме, сердечно-сосудистым и онкологическим заболеваниям, тромбофилии, болезням, часто осложняющим беременность (гестозы, привычное невынашивание). Суммированы разработанные

в лаборатории варианты «Генетического паспорта» и «Генетической карты репродуктивного здоровья». Обобщены результаты исследований по разработке научных основ генной терапии наиболее частых наследственных болезней — миодистрофии Дюшенна, муковисцидоза. Отмечены определенные достижения в лечении спинальной мышечной атрофии (болезнь Верднига-Гоффмана). Рассмотрено современное состояние исследований по изучению функциональной геномики хромосом в раннем развитии человека. Кратко намечены перспективы дальнейших исследований по основным направлениям научнопрактической деятельности лаборатории: предиктивной медицине, функциональной геномике, пренатальной диагностике и генной терапии.

Ключевые слова: пренатальная диагностика; наследственные болезни; предиктивная медицина; генная терапия; генетический паспорт

Краткая история лаборатории

Лаборатория пренатальной диагностики наследственных и врожденных заболеваний организована Приказом по институту №30-0 от 17 апреля 1987 года на базе ранее существовавшей лаборатории генетики человека (руководитель д. б. н. Г. Д. Головачев).

Становление лаборатории совпало по времени с началом крупномасштабных исследований в мире и в нашей стране, направленных на расшифровку генома человека. Международная программа «Геном человека» явилась тем благоприятным научным фоном, на котором разворачивалась научно-практическая деятельность лаборатории, направленная на разработку и внедрение в практику новых методов диагностики генных и хромосомных болезней у плода. Другой важной предпосылкой ее быстрого развития явились впечатляющие достижения клинических дисциплин, таких как акушерство и ультразвуковая диагностика. Программа «Геном человека» вооружила лабораторию универсальными методами молекулярной диагностики генных и хромосомных болезней. Благодаря достижениям УЗ-диагностики удалось быстро решить проблему получения плодного материала на любом сроке беременности, а также определять УЗ-маркеры хромосомных болезней и врожденные пороки развития у плода. С первых лет жизни лаборатория активно включилась в выполнение российской части международной программы «Геном человека», важным разделом которой были идентификация мутаций и изучение популяционных особенностей полиморфизмов генов, мутации которых приводят к тяжелым и частым моногенным заболеваниям. Продуктивность наших исследований была отмечена 1-й премией имени академика А. А. Баева «За разработку научных основ и внедрение в клиническую практику методов генодиагностики наиболее распространенных социально значимых наследственных болезней», которой в 1995 году был удостоен руководитель лаборатории проф. В. С. Баранов. За работы по молекулярной генетике в области пренатальной диагностики (ПД) ведущий сотрудник лаборатории, ныне д. б. н. Т. Э. Иващенко (1993) и старший научный сотрудник к. б. н. М. В. Асеев (1995) были награждены дипломами и памятными медалями Европейской академии. В феврале 2001 года работа лаборатории «Механизмы детоксикации и гены <внешней среды>» была удостоена Золотой медали и диплома 1-го Международного салона инноваций и инвестиций.

В 1989 году на базе лаборатории был создан Федеральный центр по пренатальной диагностике муковисцидоза (кистозного фиброза) — самой частой наследственной болезни. В 1989 году лаборатории были переданы ставки отделения

пренатальной диагностики Городского центра охраны здоровья матери и ребенка, созданного на базе 1-го родильного дома, что позволило значительно интенсифицировать работу по созданию службы пренатальной диагностики в городе. С 1989 вплоть до 2005 года лаборатория выполняла функции единственного в Санкт-Петербурге и во всем Северо-Западном регионе РФ центра по пренатальной диагностике наследст-венных и врожденных болезней, а ее руководитель уже на протяжении почти 20 лет является главным специалистом города по медицинской генетике. В 1993 году лаборатория обрела статус Федерального медико-генетического центра (одного из пяти ФМГЦ РФ).

Со времени основания и по настоящее время вся практическая деятельность лаборатории, связанная с ПД, проходила в тесном контакте с Медикогенетическим центром Санкт-Петербурга. Именно из этого центра в лабораторию направляется основной контингент женщин города, нуждающихся в ПД. Разработанная в лаборатории система биохимического скрининга беременных на содержание маркерных белков, сигнализирующих о хромосомной патологии или о некоторых врожденных дефектах у плода, была внедрена в практику работы медико-генетического центра. В дальнейшем она была дополнена компьютерной программой с автоматическим расчетом риска, также разработанной с участием сотрудников лаборатории. Часть сотрудников Медико-генетического центра (врачи, цитогенетики), прикомандированных к лаборатории еще в 1989 году и в настоящее время официально являющихся сотрудниками Городского консультативного диагностического (медико-генетического) центра, продолжают работать в лаборатории, осуществляя забор плодного материала, а также участвуя в клинических и лабораторных исследованиях. В связи с увеличением числа беременных, направляемых на инвазивную пренатальную диагностику, начиная с 2005 года в соответствии с распоряжением Комитета по здравоохранению правительства Санкт-Петербурга № 45 (21 февраля 2006 года) инвазивная ПД проводится как на базе лаборатории НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН, так и в СПб ГУЗ Диагностическом центре (медикогенетическом). Важно подчеркнуть, что по своей организации (централизация в сочетании с четким разделением функций) и эффективности служба ПД Санкт-Петербурга признана лучшей среди служб пренатальной диагностики других городов РФ. Успехи этой службы были отмечены грамотами Минсоцразвития и президиума РАМН, а также в постановлении специального рабочего совещания «Современное состояние профилактики на-

следственных и врожденных пороков развития», организованного и проходившего 17-19 ноября 2005 года на базе лаборатории НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН. У истоков лаборатории стояли два человека: д. м. н. В. С. Баранов и к. б. н. В. Н. Горбунова, в то время научные сотрудники лаборатории биохимической генетики ИЭМ АМН СССР. По конкурсу 25 апреля 1987 года они были зачислены в Институт акушерства и гинекологии соответственно на должность заведующего лабораторией и старшего научного сотрудника. Забегая вперед, следует отметить, что Виктория Николаевна Горбунова сыграла решающую роль во внедрении методов молекулярной диагностики и биохимического анализа для решения практических задач пренатальной диагностики наследственных болезней. В 1987 году ей впервые в стране удалось провести биохимическую пренатальную диагностику муковисцидоза — самого частого и очень тяжелого моногенного заболевания. К сожалению, трагические события, затронувшие ее семью, вынудили В. Н. Горбунову покинуть лабораторию в 1993 году. Но начатые под ее руководством исследования заложили основу молекулярной диагностики моногенных болезней и в 1997 году были обобщены в совместной монографии [8]. История становления молекулярной диагностики в лаборатории подробно рассмотрена ниже.

Структура лаборатории и основные направления практической деятельности

В настоящее время лаборатория насчитывает 36 человек, включая заведующего (член-корреспондент РАМН, профессор В. С. Баранов), двух ведущих научных сотрудников, докторов биологических наук (Т. Э. Иващенко — молекулярная биология и Т. В. Кузнецова — цитогенетика), 10 научных сотрудников, 10 врачей-лаборантов, 7 врачей, аспирантов и вспомогательный персонал. Лаборатория является ведущим в России и основным в Северо-Западном регионе РФ центром по проблемам ПД. Здесь проводится диагностика всех сложных случаев хромосомных и 12-ти наиболее частых моногенных болезней. Кроме того, лаборатория является учебно-консультативным центром по обучению методам ПД и их внедрению в практическое здравоохранение. В ней постоянно работают и повышают квалификацию специалисты разных медико-генетических центров России и ближнего зарубежья. На рабочих местах уже прошли обучение свыше 200 врачей медико-генетических центров России.

В соответствии с особенностями методов, спецификой практических и научных задач, в лабо-

ратории de facto организованы и активно работают 5 функциональных групп: цитогенетическая, молекулярная, биохимическая, генотерапевтическая, клиническая. Основные итоги их научной и практической деятельности суммированы в монографии [1].

Цитогенетическая группа

На долю этой группы приходится свыше 90 % обращений беременных, нуждающихся в инвазивной ПД с целью кариотипирования плода для исключения возможных хромосомных болезней. Такая массовая востребованность объясняется широтой показаний для проведения подобной диагностики. В группу риска входят беременные старше 35 лет, беременные, уже родившие детей с хромосомными болезнями или врожденными пороками развития, беременные групп высокого риска по биохимическому и ультразвуковому скринингу и другие.

На момент организации лаборатории надежных методов приготовления хромосомных препаратов из провизорных органов плода (хорион, плацента) не существовало. Это потребовало разработки собственных, вполне оригинальных методик. Их наиболее удачной модификацией является прямой ускоренный метод приготовления хромосомных препаратов [12]. Решающую роль в распространении и широком использовании метода сыграл предложенный руководителем цитогенетической группы д. б. н. Т. В. Кузнецовой вариант окраски хромосомных препаратов из клеток хориона с помощью актиномицина D/Hoechst 33258. Метод дает стабильную дифференциальную окраску хромосом, что позволяет не только идентифицировать все гомологичные пары хромосом, но и проводить детальный анализ их структуры [5]. Методы получения и окраски метафазных хромосом хориона и плаценты применяются не только в нашей лаборатории, но широко используются и во многих других диагностических центрах РФ. В лаборатории также внедрены различные варианты гибридизации хромосом с локус- и хромосом-спе-цифичными ДНК-зондами (методы FISH). Подробно с этими и другими методами цитогенетического анализа, применяемыми в работе данной группы, можно ознакомиться в соответствующих руководствах [5, 14] и методических рекомендациях [2, 13]. Достаточно простые и эффективные методы получения хромосомных препаратов, оригинальные надежные методы дифференциальной окраски хромосом, дополненные при необходимости высокоразрешающими методами молекулярной цитогенетики, позволили за 20 лет (1987-2007 годы) провести кариотипирование свыше 10 000 плодов у женщин групп высокого риска и предотвратить рождение 324 плодов с тяжелыми хромосомными болезнями, в том числе около 170 — с болезнью Дауна.

В настоящее время цитогенетическая группа состоит из 8 человек, ее руководитель — ведущий научный сотрудник д. б. н. Татьяна Владимировна Кузнецова — признанный специалист в области цитогенетики и ПД. Помимо огромной практической работы, сотрудники группы проводят интересные научные исследования. Подробнее о работе цитогенетической группы лаборатории можно ознакомиться в обзоре Т. В. Кузнецовой и статьях ее сотрудников в данном номере журнала. Молекулярная группа

Важная роль в освоении и внедрении методов молекулярной биологии принадлежит ныне ведущему научному сотруднику лаборатории, руководителю молекулярной группы д. б. н. Т. Э. Иващенко и старшему научному сотруднику к. б. н. М. В. Асееву. В течение нескольких лет после создания лаборатории под их руководством и при непосредственном участии были внедрены все основные методы ДНК-диагностики, спектр которых, по мере прогресса программы «Геном человека», постоянно обогащался. Благодаря инициативе и тесному контакту с проф. Е. И. Шварцем нам удалось впервые в России освоить и на практике применить знаменитую сегодня полимеразную цепную реакцию (ПЦР). В 1989 году Т. Э. Иващенко первая осуществила молекулярную диагностику муковисцидоза, открыла (идентифицировала) ряд новых мутаций в гене муковисцидоза — СЕТЯ и разработала оптимальные алгоритмы прямой и косвенной диагностики этого тяжелого заболевания. Итоги этой работы отражены в соответствующих методических рекомендациях [3] и в совместной монографии [9]. В 1989 году М. В. Асеевым впервые в России была проведена ПД гемофилии А, причем до настоящего времени лаборатория продолжает оставаться единственной в стране, где осуществляется дородовая диагностика этого тяжелого заболевания. Благодаря активной работе молекулярной группы, предложившей вполне оригинальные собственные модификации методов ДНК-анализа, впервые в стране осуществлена ПД таких частых моногенных болезней, как муковисцидоз, миодистрофия Дюшенна, гемофилия А и В, фенилкетонурия, синдром ломкой Х-хромосомы (синдром Мартина-Белл), мио-тоническая дистрофия, спинальная мышечная атрофия, хорея Гентингтона и другие. ПД каждого из перечисленных недугов предшествовала огромная работа, направленная на изучение частот и спектра мутаций, анализ особенностей полиморфизма соответствующих генов. Всего в лаборатории сегодня возможна диагностика 12-ти наиболее частых тяжелых моногенных болезней. За 20 лет группой проведено более

600 ПД. В 250 случаях диагноз был подтвержден и беременность было рекомендовано прервать. В настоящее время группа состоит из 11 человек, включая 1 ведущего и 1 старшего научных сотрудников. Подробно с работами по молекулярной диагностике моногенных болезней у плода можно ознакомиться в обзоре руководителя группы д. б. н. Т. Э. Иващенко в данном номере журнала. Помимо практической работы группа выполняет большой объем научных исследований, связанных с изучением генов «предрасположенности» к различным частым мультифакториальным заболеваниям.

Биохимическая группа

Первые работы лаборатории по анализу маркерных сывороточных белков в крови беременных проведены в 1987 году В. Н. Горбуновой. В дальнейшем они были продолжены, существенно углублены и расширены старшим научным сотрудником к. б. н. Т. К. Кащеевой. Биохимические тесты включали не только анализ эмбрионспеци-фических белков в крови матери, но также биохимическую диагностику муковисцидоза по эмбриональным белкам в амниотической жидкости и уточняющую диагностику дефектов заращения нервной трубки также по белкам амниотической жидкости. После отработки метода биохимического скрининга маркерных белков в сыворотке крови беременных, тест был передан в Городской консультативный диагностический (медико-генетический) центр, совместно с которым в 1997 году в городе была внедрена широкомасштабная программа биохимического скрининга маркерных сывороточных белков (альфа-фетопротеина — АФП и хориального гонадотропина — ХГ) с целью отбора беременных групп высокого риска по рождению детей с дефектами нервной трубки (ДЗНТ) и с хромосомными болезнями (болезнь Дауна). В 2001 году при непосредственном участии сотрудников лаборатории была создана специальная компьютерная программа автоматического подсчета риска, которая существенно облегчила процедуру биохимического скрининга и унифицировала показания для направления женщин на инвазивную процедуру для получения плодного материала.

В настоящее время группа активно разрабатывает и внедряет в практику новый, так называемый комбинированный тест, позволяющий эффективно отбирать женщин групп высокого риска хромосомной патологии (болезнь Дауна) у плода уже в I триместре беременности. Тест представляет собой комбинацию биохимического исследования сывороточных белков крови женщины (РАРР-А и свободная Р-субъединица хориального гонадотропина) и УЗ-обследования плода (толщина воротникового пространства, носовые кости) на

9-13-й неделях беременности. Подробно этот и другие методы биохимического скрининга изложены в статьях Т. К. Кащеевой в данном номере журнала.

Клиническая группа

Клиническая группа включает врачей аку-шеров-гинекологов, врачей — медицинских генетиков и врачей ультразвуковой диагностики. В первые годы группой руководил к. м. н. В. М. Лебедев, а с 2ОО1 года — старший научный сотрудник к. м. н. А. Л. Коротеев. Уже в течение первых лет специалистами данной группы был освоен и внедрен в практику весь набор инвазивных методов, позволяющий практически безопасно для матери и плода проводить в амбулаторных условиях забор плодного материала в I (ворсины хориона) и II (ворсины плаценты, пуповинная кровь плода, амниотическая жидкость) триместрах беременности. Врачами лаборатории выполнено более 1О ООО инвазивных процедур (хорионбиопсий, плацентобиопсий, кордоценте-зов, амниоцентезов). Насколько нам известно, это больше, чем в любом отдельно взятом диагностическом центре РФ. Важно отметить, что риск осложнений после этих инвазивных вмешательств не превысил 1 %. Врачами-генетиками проконсультированы тысячи беременных женщин, направляемых на диагностику и сотни семей групп высокого риска. Специфика работы врача-гене-тика в лаборатории пренатальной диагностики подробно освещена в главах V и XIII нашей монографии [14], а также в статье врача-генетика М. В. Кречмар в данном номере журнала.

В настоящее время усилия клинической группы направлены на разработку и внедрение в практику алгоритма «Клиника одного дня», позволяющей беременной женщине в течение одного приема пройти УЗ и биохимический скрининг и, таким образом, оценить риск хромосомных нарушений у плода. Подробно с деятельностью клинической группы можно ознакомиться в наших методических рекомендациях [13], в соответствующих главах наших монографий [14, 16] и в статьях данного номера журнала.

Группа генной терапии

Группа генной терапии организована в 1995 году, включает 3 сотрудников и 2 аспирантов. Руководитель группы — старший научный сотрудник к. б. н. А. Н. Баранов. Основное внимание обращено на создание и тестирование невирусных носителей, обеспечивающих доставку чужеродных генов в клетки млекопитающих in vivo и in vitro. Исследования группы имеют преимущественно научное (фундаментальное) значение, однако в последние годы они неожиданно приобрели и определенную практическую направленность. Дело в том, что, используя препа-

раты вальпроевой кислоты, широко применяемой в клинике для лечения эпилепсии и депрессивных состояний, нам удалось у нескольких детей, больных тяжелым моногенным заболеванием — спинальной мышечной атрофией — СМА (болезнь Верднига-Гоффмана) добиться серьезных клинических улучшений [12]. Позитивный клинический эффект достигался за счет того, что введение вальпроевой кислоты корректировало работу мутантного псевдогена SMN2, что приводило к выработке дополнительного количества нейротрофического фактора, обеспечивающего выживание нейронов передних рогов спинного мозга. В настоящее время проводится работа по оптимизации алгоритма лечения больных СМА препаратами вальпроевой кислоты. Учитывая высокую частоту данного заболевания, разработка генотерапевтического подхода к его лечению представляется весьма актуальной.

Основные направления научной деятельности

Учитывая практически полное отсутствие данных о полиморфизме, а также о природе и частоте мутаций в генах, которые приводят к частым моногенным болезням, требующим пренатальной диагностики, более 10 лет фундаментальные исследования молекулярной группы были преимущественно посвящены изучению именно этих факторов. Так, нами впервые были изучены десятки генов, идентифицированы новые мутации и установлены частоты известных мутаций, что особенно важно для проведения прямой диагностики наличия (отсутствия) болезни у плода. Были также исследованы популяционные особенности частот внутригенных и внегенных полиморфизмов, являющихся основными молекулярными маркерами при косвенном (непрямом) методе диагностики моногенных болезней. Результаты этих исследований обобщены во многих (более 100) оригинальных статьях, обзорах (свыше 20), методических рекомендациях [6, 10, 11, 17], в 4 монографиях [1, 4, 7, 14].

С 1994 года в лаборатории начаты исследования по изучению наследственной предрасположенности человека к самым частым хроническим мультифакторным заболеваниям. Не сколько позже это новое направление было названо нами «предиктивная» (предсказательная) медицина, цель которой — определить с помощью тестирования отдельных генов (генов «предрасположенности») врожденную предрасположенность человека к болезням, вызываемым сочетанием неблагоприятных факторов внешней среды и функциональными дефектами продуктов определенных генов. Первым заболеванием, для которого были установлены гены «предрасположенности», был эндо-метриоз [18]. В дальнейшем такие исследования

стали массовыми. Гены «предрасположенности» были изучены для таких частых заболеваний, как остеопороз, бронхиальная астма, диабет I типа, сердечно-сосудистые заболевания. Уже в 2000 году многие результаты этих исследований были обобщены в первой, и пока единственной в своем роде, отечественной монографии В. С. Баранова и соавт. — «Геном человека и гены предрасположенности. Введение в предиктивную медицину» [4]. В настоящее время готовится к публикации продолжение этой книги «Генетический паспорт — основа предиктивной медицины».

Тестирование генов «предрасположенности» активно проводится сегодня во многих научноисследовательских лабораториях и диагностических центрах Санкт-Петербурга, Москвы, Томска, Новосибирска, Уфы и в других городах РФ.

Важными направлениями исследований по генетическому полиморфизму являются также анализ генетически обусловленных различий в реакции на лекарственные препараты (фармакогенетика), а также тестирование больных с целью прогноза течения заболевания и выработки оптимальной стратегии его терапии [7].

В результате тестирования полиморфизма генов «предрасположенности» формируетсяиндиви-дуальная база данных о геноме каждого человека— его «генетический паспорт». Кстати, этот термин был предложен нами еще в 1997 году, когда такие исследования только набирали силу. В настоящее время термин получил широкое распространение. Генетический паспорт, разработанный нами и уже нашедший практическое применение, включает результаты тестирования мутаций в генах болезней с поздней манифестацией (ней-родегенеративные заболевания, например, хорея Гентингтона, семейный рак толстого кишечника, болезнь Альцгеймера, рак молочной железы) (1);. носительство мутаций наиболее частых тяжелых наследственных заболеваний, которые могут передаваться потомству (фенилкетонурия, муковис-цидоз, спинальная мышечная атрофия и др.) (2); полиморфизма генов, указывающих на предрасположенность к бронхиальной астме, хроническим обструктивным заболеваниям легких, остеопорозу, диабету I типа, к некоторым сердечно-сосудистым и онкологическим заболеваниям (3).

При необходимости, паспорт может содержать и уникальный код (генетический номер) каждого человека. Кстати, исследования по геномной дактилоскопии (идентификации личности) также явились результатом работы молекулярной группы лаборатории и в настоящее время применяются для верификации отцовства и иногда при необходимости для идентификации образцов ДНК при проведении пренатальной диагностики.

Более 15 лет научные исследования молекулярной группы сосредоточены и на анализе наследственной предрасположенности к наиболее частым заболеваниям, препятствующим наступлению нормальной беременности (эндометриоз, аденомиоз) или серьезно осложняющим ее течение (гестозы, плацентарная недостаточность, преждевременные роды, привычное невынашивание беременности, тромбофилия и др.). Итоги этих исследований обобщены в «Генетической карте репродуктивного здоровья» (ГКРЗ) [14]. Помимо перечисленных заболеваний эта база данных предусматривает также тестирование скрытого носительства мутаций частых наследственных болезней (см. выше) у обоих супругов и анализ кариотипа. В настоящее время ГКРЗ находится на стадии внедрения.

Учитывая резко увеличивающийся поток генетических тестов, назрела необходимость в автоматизации ДНК-тестирования. С этой целью лабораторией совместно с Институтом молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта был разработан вариант диагностики с помощью биочипов. В част-ности, были разработаны биочипы для диагностики полиморфизма генов системы детоксикации (фармачип) и биочип для диагностики заболеваний сердечно-сосудистой системы (кардиочип). В работе находятся биочипы для диагностики тромбофилии и остеопороза [14]. Нет сомнения, что широкое использование биочипов позволит сделать ДНК-диагностику массовой, а досимпто-матическое выявление лиц групп высокого риска поможет резко повысить эффективность профилактики тяжелых хронических заболеваний, а также заболеваний, серьезно осложняющих течение беременности.

Неожиданным и весьма перспективным направлением молекулярных исследований явилось исследование полиморфизма генов, прямо или косвенно связанных с процессами старения. Для этого проведено сравнение частот полиморфизма 12 различных генов у новорожденных, лиц среднего возраста и у пожилых. В результате этих работ выяснены некоторые аллельные варианты генов и их сочетания, неблагоприятно влияющие на продолжительность жизни.

Таким образом, безусловные успехи молекулярных исследований лаборатории в области фундаментальной науки касаются результатов анализа качественных и количественных особенностей мутаций и полиморфизма генов, вызывающих наиболее частые наследственные заболевания; тестирования полиморфизма генов «предрасположенности», неблагоприятные аллельные варианты которых ассоциированы с развитием тяжелых хронических заболеваний,

разработки технологии создания биочипов, позволяющих сделать исследования генетического полиморфизма массовыми, и, наконец, исследования по разработке и внедрению генетического паспорта, генетической карты репродуктивного здоровья, а также генетических факторов старения.

Научные исследования цитогенетической группы сосредоточены на изучении роли числовых и структурных аномалий хромосом в патологии зародышей человека, структурно-функциональной организации хромосом в процессе эмбриогенеза человека.

Установлены особенности пороков развития эмбрионов человека и его провизорных органов (ворсинки хориона, структура, размеры плаценты и пр.) в условиях триплоидии, трисомии по некоторым хромосомам. Установлена неспецифичность большинства таких нарушений, что не позволяет только на основании даже самого тщательного УЗ-иссле-дования плода судить о наличии или отсутствии у него определенной хромосомной болезни.

Исследования по изучению структурно-функциональных особенностей хромосом человека были сосредоточены на изучении динамики изменений активности ядрышкообразующих районов хромосом, пролиферативного статуса клеток хориона в зависимости от срока беременности, изучения функциональной активности хромосом ци-тотрофобласта и органов плода с помощью метода ник-трансляции. Специальные серии исследований были посвящены изучению пре- и постнатального проявления моносомии Х (синдром Шерешевско-го-Тернера), а также анализу процессов оогенеза у плодов и частоты хромосомных аномалий в зрелых сперматозоидах человека. В последнем случае был применен оригинальный метод инъекции сперматозоидов человека в яйцеклетки лабораторных мышей с последующей регистрацией хромосомных аберраций в мужском пронуклеусе.

Цитогенетические исследования последних 5 лет сосредоточены на изучении особенностей метилирования хромосом человека у зародышей доимплантационных стадий развития, а также в тканях хориона и внутренних органов имплантировавшихся эмбрионов I триместра. Впервые с помощью моноклональных антител к метилци-тозину обнаружен и описан новый вариант дифференциальной окраски метафазных хромосом, названный нами «М-сегментация». Выяснены паттерны метилирования хромосом в клетках эмбрионов до и после имплантации. Полученные результаты открывают широкие возможности для развития нового перспективного направления — функциональной геномики хромосом человека. Теоретические и практические итоги обширных цитогенетических исследований лаборатории

суммированы в недавно опубликованной монографии В. С. Баранова, Т. В. Кузнецовой «Цитогенетика эмбрионального развития человека» [5].

Некоторые перспективы дальнейших исследований

В лаборатории не предполагается расширять спектр нозологий моногенных наследственных болезней, диагностируемых до рождения. Вместе с тем, будут активно развиваться исследования по изучению генных сетей частых хронических заболеваний, особенно тех, которые связаны с нарушением процессов репродукции, поиск ассоциации функционально неполноценных аллелей с патологией беременности, с тяжелыми хроническими заболеваниями. Дальнейшее развитие получат исследования генетических механизмов старения. Возможно, что удобной моделью для изучения старения человека будет плацента человека, программированное развитие которой от «рождения до смерти» занимает всего 9 месяцев.

Важными и перспективными в научном и практическом отношении представляются отработка и внедрение методов диагностики резус-принадлежности плода, его пола, а со временем, возможно, и хромосомных болезней по ДНК плода, флотирующей в крови матери.

Не менее существенным является широкое внедрение в практическую деятельность лаборатории диагностики наиболее частых хромосомных болезней плода методом количественной полимеразной цепной реакции (QF-PCR). Успешное сочетание этого метода с массовым получением образцов плодного материала от женщин групп высокого риска хромосомной патологии позволит радикально решить проблему эффективной профилактики рождения плодов с частыми хромосомными болезнями, прежде всего, с болезнью Дауна.

Анализ особенностей экспрессии генов «старения» позволит понять их функцию, оценить их роль в развитии и, возможно, откроет механизмы регуляции процессов старения. В частности, большой интерес представляет анализ взаимодействия промоторных областей этих генов с цитаминами и другими короткими биологически активными пептидами.

Несомненное развитие получит чиповый метод диагностики полиморфизмов и генных мутаций. В настоящее время уже разрабатываются биочипы для диагностики наследственной предрасположенности к тромбофилии и остеопорозу. Дальнейшее увеличение объема исследований по предиктивной медицине будет способствовать все более широкому внедрению в молекулярную диагностику этого сравнительно дешевого и несомненно более

эффективного метода исследования.

Дальнейшее развитие получат исследования по функциональной геномике хромосом человека. В частности, предполагается провести анализ экспрессии генов, локализованных в метилированных районах метафазных хромосом, провести детальное сравнение паттернов метилирования хромосом в клетках плода и в плаценте, сравнить рисунок метилирования с паттерном ацетилиро-вания гистонов тех же хромосом.

Наконец, вполне реальной перспективой в практическом плане представляется организация «Клиники одного дня», где в течение одного приема (в среднем, за 3 часа) будут проведены необходимые биохимические и ультразвуковые тесты, которые позволят определить риск рождения плода с хромосомной патологией. В дальнейшем вполне вероятным представляется в течение одного рабочего дня (6 часов) осуществить получение плодного материала и кариотипирование плода.

Важным для медико-генетической службы города и других регионов страны является внедрение метода количественного определения продуктов экспрессии гена SMN2. Он позволит оперативно организовать и эффективно вести лечение детей с тяжелой неизлечимой болезнью — спинальной мышечной атрофией.

Будут продолжены исследования по поиску новых пептидных невирусных носителей по доставке чужеродных генов в клетки млекопитающих in vitro и in vivo. При этом особое внимание будет обращено на трансфекцию стволовых клеток, применение которых в терапии плода и некоторых наиболее частых мышечных дистрофий (миодист-рофии Дюшенна) представляется особенно перспективным.

заключение

За двадцать лет в лаборатории разработаны эффективные методы пренатальной диагностики наследственных и врожденных болезней; идентифицированы новые мутации, исследованы полиморфизмы генов и предложены оптимальные для РФ алгоритмы пренатальной диагностики хромосомных и моногенных болезней. Впервые в стране проведена пренатальная диагностика многих тяжелых наследственных болезней, таких как муковисцидоз, гемофилии А и В, миодист-рофия Дюшенна, спинальная мышечная атрофия и др. Разработан и внедрен в практику биохимический скрининг для отбора женщин групп высокого риска хромосомных болезней у плода в I и во II триместрах беременности, а также инвазивные методы получения плодного материала на любых сроках беременности. Выполнено свыше 10 000 инвазивных пренатальных диагностик, в результате которых у

более 600 плодов выявлена тяжелая наследственная патология. Сформулированы принципы нового научно-практического направления — предиктивной (предсказательной) медицины, основу которой составляет тестирование генов «предрасположенности» к тяжелым частым хроническим заболеваниям. В рамках этого направления предложена концепция генетического паспорта — индивидуальной базы ДНК-данных, специальным вариантом которого является «Генетическая карта репродуктивного здоровья». Разработана и активно внедряется техника биочипов, позволяющая существенно автоматизировать и повысить эффективность генетического тестирования. Впервые достигнуты положительные результаты при лечении тяжелой наследственной болезни — спинальной мышечной атрофии. Современные перспективные направления касаются разработки молекулярных методов диагностики хромосомных болезней, диагностики резус-принадлежности и пола плода по ДНК-плода в крови матери, организации «Клиники одного дня». Перспективные фундаментальные исследования лаборатории направлены на изучение функциональной геномики хромосом и выяснение генетических механизмов старения. За истекший период в лаборатории защищено 4 докторских и свыше 35 кандидатских диссертаций, опубликовано более 200 статей в научных журналах, 10 монографий, 12 методических рекомендаций.

Литература

1. Баранов В. С. Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике / Баранов В. С.; Под ред. А. Б. Масленникова. Вып. 5. — Новосибирск: Альфа Виста, 2004. — 169 с.

2. Баранов В. С. Пренатальная диагностика хромосомных болезней у плода: метод. реком. / Баранов В. С., Кузнецова Т. В., Швед Н. Ю., Баранов А. Н. — СПб., 1995. — 21 с.

3. Баранов В. С. Пренатальная диагностика, медико-генетическое консультирование и профилактика муковисцидо-за (кистозного фиброза): метод. реком. / Баранов В. С., Горбунова В. Н., Иващенко Т. Э. — М., 1991. — 30 с.

4. Баранов В. С. Геном человека и гены «предрасположенности». Введение в предиктивную медицину / Баранов В. С., Баранова Е. В., Иващенко Т. Э., Асеев М. В. —• СПб.: Интермедика, 2000. — 271 с.

5. Баранов В. С. Цитогенетика эмбрионального развития человека / Баранов В. С., Кузнецова Т. В. — СПб.: Изд-во Н-Л, 2007. — 600 с.

6. Генетические аспекты профилактики и лечения эндомет-риоза : пособие для врачей / Баранов В. С., Иващенко Т. Э., Швед Н. Ю. [и др.] —— СПб.: Изд-во Н-Л, 2004. — 24 с.

7. Геномика — медицине. — М.: ИКЦ «Академкнига», 2005. — 392 с.

8. Горбунова В. Н. Введение в молекулярную диагностику и ге-нотерапию наследственных заболеваний / Горбунова В. Н.,

Баранов В. С. — СПб.: Специальная литература, 1997. — 286 с.

9. Иващенко Т. Э. Биохимические и молекулярно-генетические аспекты патогенеза муковисцидоза / Иващенко Т. Э.,

Баранов В. С. — СПб.: Интермедика, 2002. — 252 с.

10. Определение генетической предрасположенности к некоторым мультифакториальным заболеваниям. Генетический паспорт: метод. реком. / Баранов В. С., Хавинсон В. Х., Иващенко Т. Э. [и др.] — СПб.: ИКФ «Фолиант», 2001. — 48 с.

11. Остеопороз. Генетическая предрасположенность. Современная диагностика, профилактика: метод. пособие / Зазерская И. Е., Асеев М. В., Кузнецова Л. В. [и др.] — СПб.: Никомед, 2003. — 32 с.

12. Первый опыт лечения больных спинальной мышечной атрофией препаратом вальпроевой кислоты / Баранов В. С., Вахарловский В. Г., Команцев В. Н [и др.] // Медицинская генетика. — 2005. — Т. 4, Т 3. — С. 119-122.

13. Пренатальная диагностика в акушерстве. Современное состояние, методы, перспективы: метод. пособие / Баранов В. С., Кузнецова Т. В., Вахарловский В. Г. [и др.] — СПб.: Изд-во Н-Л, 2002. — 64 с.

14. Пренатальная диагностика наследственных и врожденных болезней / Ред. Э. К. Айламазян, В. С. Баранов — М.: МЕДпресс-информ, 2005. — 415 с.

15. Ускоренный прямой метод получения метафазных и про-метафазных хромосом из клеток биоптата хориона и эмбрионов человека в I триместре беременности / Баранов В. С., Лебедев В. М., Полеев А. В. [и др.] // Бюл. экспе-рим. биологии медицины. — 1990. — № 8. — С. 196-198.

16. Частота, диагностика, профилактика наследственных болезней и врожденных пороков развития в Санкт-Петербурге / Баранов В. С., Романенко О. П., Симаходский А. С. [и др.] — СПб., 2004. — 128 с.

17. Эндотелиальная дисфункция при гестозе. Патогенез, генетическая предрасположенность, диагностика и профилактика: метод. реком. / Мозговая Е. В., Малышева О. В., Иващенко Т. Э. [и др.] — СПб.: Изд-во Н-Л, 2003. — 32 с.

18. Proportion of GSTM1 0/0 genotype in some Slavic populations and its correlation with cystic fibrosis and some multifactorial diseases / Baranov V. S., Ivaschenko T., Bakay M. [et al.] // Hum. Genet. — 1996. — Vol. 97, N 4. — P. 516-520.

STAGES OF DEVELOPMENT, BASIC ACHIEVEMENTS AND FURTHER PERSPECTIVES IN ACTIVITIES OF LABORATORY FOR PRENATAL DIAGNOSTICS IN OTT'S INSTITUTE OF OBSTETRICS AND GYNECOLOGY

Baranov V. S.

Summary: Basic steps in development of laboratory, its impact in creation of prenatal diagnostic service in Saint-Petersburg, including prenatal diagnostics of monogenic and chromosomal diseases, biochemical screening in pregnancy, invasive fetal sampling techniques. Basic practical and scientific achievements of the laboratory for 20 years of its activity are outlined. Special emphases are paid to predictive genetic testing of common multifactotial diseases related to common obstetric and gynecological pathology. Suggested “Gene-pass” and

Genetic Chart of Reproductive Health are briefly discussed. The experimental results in gene therapy of Duchenne Muscle Diseases and the first steps in clinical trails of Spinal Muscular Atrophy are summarized. Perspectives of further investigations both practical and fundamental are highlighted.

Key words: prenatal diagnostic; inherited disorders; predictive medicine; chromosomal genomics