СПОСОБ СКРИНИНГА НОВОРОЖДЕННЫХ НА МОНОГЕННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ И БИОЧИП ДЛЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ЭТОГО СПОСОБА
METHOD OF SCREENING NEWBORNS FOR MONOGENIC DISEASES AND BIOCHIP FOR SAID METHOD REALISATION

Изобретение относится к молекулярной биологии, микробиологии и медицине. Изобретение также относится к технологии изготовления биочипов, находящих применение в молекулярной биологии при секвенировании и картировании ДНК, детектировании мутаций и целого ряда медицинских приложений.
Точная диагностика в сочетании с детальным анализом типа наследования того или иного заболевания имеет определяющее значение для формирования групп риска, то есть отбора семей, в которых вероятность рождения больных детей повышена. Прежде всего, это те семьи, где уже есть или был ребенок, страдающий каким-либо моногенным наследственным заболеванием. Фенилкетонурия, врожденный гипотиреоз, муковисцидоз и галактоземия - часто встречающиеся в детском возрасте наследственные патологии. Муковисцидоз - одно из наиболее часто встречающихся наследственных заболеваний, вызываемое мутацией гена трансмембранного регулятора. Это заболевание характеризуется поражением экзокринных желез жизненно важных органов и систем и имеет тяжелое течение и прогноз особенно при позднем выявлении.
Своевременное обнаружение предрасположенности к данным заболеваниям и соответствующая терапия позволяют резко повысить качество жизни детей с моногенными заболеваниями.
В настоящее время известно несколько десятков методов используемых для скрининга новорожденных на моногенные заболевания. Например, можно выделить следующие.
Известен «Способ диагностики врожденного гипотиреоза» с помощью скрининг-контроля уровня тиреотропина (ТТГ) или уровня общего тироксина (Т4) в сухих пятнах крови новорожденных иммунофлуоресцентным методом с использованием наборов «Delfia Neonatal hTSH and T4» (Дедов И.И., Петерков В.А., Безлепкина О.Б., Алексеева P.M. Скринингпрограмма ранней диагностики и лечения врожденного гипотиреоза у детей. Методические рекомендации. М., 1996, - с.14-19). Недостатки данного метода: рекомендуется контроль в динамике через 2-3 недели, чтобы обеспечить надежность скрининга, в результате заместительная терапия начинается не ранее чем через месяц после рождения.
Известен «Способ диагностики муковисцидоза» (Патент RU №2141670, 1999.11.20) Пробу пота пациента обрабатывают сильнокислотными катеонитами в кислотной форме в присутствии кислотно-основного индикатора. Предварительно сильнокислотные катеониты в кислотной форме отмывают дистиллированной водой до нейтральной реакции. Определение концентрации хлорида натрия проводят спектрофотометрически, а муковисцидоз диагностируют по возрастанию концентрации хлорида натрия в поте пациента. Использование данного метода возможно, начиная только с 4 месяца жизни ребенка.
Известен «Способ диагностики врожденного гипотиреоза у новорожденных» (Патент RU №2138807, 1999.09.27). Метод основан на кристаллоскопии сыворотки крови новорожденных: каплю крови наносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и инкубируют в термостате 2-2,5 часа, полученные образцы исследуют на поляризационном микроскопе; образец, имеющий характерное кристаллическое включение холестерина, реагирует на поляризационный свет в виде оптически активных морфотипов-сферолитов, у здоровых лиц морфотипы-сферолиты не определяются. Недостатком метода является ручное определение наличия/отсутствия морфотипов-сферолитов, при котором (особенно при проведении скрининговых исследований ввиду большого количества анализов) резко повышается вероятность ошибки и увеличивается стоимость метода в человеко-часах. Кроме того, метод используется лишь на 5-й день после рождения, в то время как каждый день без заместительной терапии при данном заболевании имеет большое значение для развития.
Известен «Способ диагностики муковисцидоза» (Патент RU №2151188, 2000.06.20). Способ заключается в следующем: геномную ДНК выделяют из 5-10 мл периферической крови по стандартной методике с использованием протеиназы К с последующей экстракцией фенол/хлороформом. Для амплификации нормального аллеля используют прямой праймер 5'-GGCAC-CATTA-AAGAA-ААТАТ-САТСТТ-3', оканчивающийся на 3'-конце тринуклеотидом СТТ, отсутствующем в мутантном аллеле. Для амплификации аллеля с делецией используют прямой праймер 5'-GGCAC-CATTA-AAGAA-AATAT-CATTG-G-3', без СТТ, оканчивающийся последующим за ним тринуклеотидом TGG на 3'-конце. В качестве обратного праймера для амплификации обоих аллелей используют праймер 5'-CATTC-ACAGT-AGCTT-ACCCA-3'. Недостатком данного метода является определение только одной частой мутации, которая определяется у 56% больных муковисцидозом на территории России. Остальные 44% больных имеют другие мутации и у них диагностика муковисцидоза данным методом невозможна.
Известен «Способ определения точечных нуклеотидных замен в ДНК микобактерий, способ диагностики устойчивости микобактерий к рифампицину, биочип для осуществления этих способов» (Патент RU.N0 2175015, 2001.10.20). Проводят амплификацию фрагмента rроВ гена с получением одноцепочечного флюоресцентно меченого продукта методом ПЦР. Готовят биочип для определения рифампицин-устойчивых микобактерий. Проводят гибридизацию амплифицированного меченого продукта на биочип. Регистрируют результаты гибридизации и интерпретируют их путем сравнения интенсивности флюоресценции сигналов, полученных при совершенной и несовершенной гибридизации. Биочип представляет собой микроматрицу с ячейками, в которых иммобилизован набор олигонуклеотидов. Последовательности последних приведены в описании. Верхний ряд биочипа содержит олигонуклеотиды, комплементарные последовательности ДНК дикого типа. Соответствующий столбец под каждой ячейкой содержит олигонуклеотиды, комплементарные последовательностям ДНК мутантных типов, ответственных за замену одной аминокислоты. Диагностику устойчивости микобактерий туберкулеза к рифампицину проводят путем определения точечных нуклеотидных замен в ДНК возбудителя. Данный способ является наиболее близким по существенным признакам к заявляемому.
Описана «Молекулярная диагностика галактоземии» (Патент US №6420550, 2002.07.16), предназначенная для детекции мутации в гене GALT, с помощью набора, включающего: (а) пробы, каждая из которых длиной от 10 до 25 нуклеотидов, содержащие последовательности, комплементарные к следующим последовательностям: TGGTTGGAT, TGCCGGGTA, TTCCCGCCA, CCAATTATG, CTGGGACCA, и GCCTGTAAG, и (b) праймеры для амплификации, каждый длиной по крайней мере 14 нуклеотидов, и комплементарный к последовательности, отобранной из SEQ ID NO: 7, которая является результатом амплификации области гена GALT, содержащего сайты мутаций. Набор по первому пункту, в котором праймеры включают единственный набор, который амплифицирует область человеческого гена GALT, включающего SEQ ID NO: 8. Недостатком данного метода является его ограниченность для массового скрининга только одним заболеванием - галактоземией.
Известен «Метод диагностики заболеваний, связанных с дефектом трансмембранного регулятора проводимости при муковисцидозе» (Патент US №7160729, 2007.01.09 Method for detecting diseases that are associated with defects of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein). Метод основан на дестабилизации CFTR-зависимой регуляции объема клеток и дальнейшее определение объема обработанных клеток, при этом изменившие объем клетки являются здоровыми, а если клетки не изменили объем, диагностируют муковисцидоз
Известен «Способ генетического скрининга врожденных нарушений метаболизма у новорожденных с помощью тандемной масс-спектрометрии», который заключается в восстановлении активности ферментов из образца крови пациента и определении ферментативной активности, концентрации фермента или анализируемого вещества по количеству связавшегося с ними флуоресцентно-меченного субстрата. (Заявка US №2005/0048499, TANDEM MASS SPECTROMETRY METHOD FOR THE GENETIC SCREENING OF INBORN ERRORS OF METABOLISM IN NEWBORNS). Недостатки - возможность определить генетические отклонения только по продукту этого гена. Для осуществления метода необходимо очень дорогое оборудование и высококвалифицированные специалисты, что также удорожает метод.
Общий недостаток вышеперечисленных методов: их нецелесообразно применять для массового скрининга, т.к. они трудоемки и позволяют диагностировать только одно заболевание.
Знаменательным достижением биотехнологии последних лет стали биочипы. Точнее всего их описывает английское название DNA-microarrays, т.е. это организованное размещение молекул ДНК на специальном носителе. Необычные устройства позволяют за короткое время определять несколько тысяч аллергенов, онкогенов, различных биологически активных веществ, и даже генетических дефектов. За короткое время биологические микрочипы выделились в самостоятельную область анализа с приложениями от исследования фундаментальных проблем молекулярной биологии и молекулярной эволюции до практических применений в медицине, фармакологии, экологии, судебно-медицинской экспертизе и др.
Технология биочипов, заменяющих целые иммунологические лаборатории, дает возможность в тысячи и десятки тысяч раз увеличить производительность большинства диагностических методов и резко снизить себестоимость анализов.
Известны способы изготовления биочипов на основе гидрогелей, в которых технологический цикл состоит из этапов: (1) подготовки подложки, (2) формирования на ней матрицы ячеек геля, (3) нанесения на ячейки растворов биологических макромолекул в соответствии с заранее составленной схемой биочипа, (4) химической обработки ячеек с целью иммобилизации молекул-зондов, (5) отмывки и просушки полученных биочипов.
Известен способ приготовления биочипа (Патент US №5574142, 1996.11.12), согласно которому используют специальную тонкослойную (5 мкм) камеру с реакционным объемом, ограниченным с одной стороны подложкой будущего биочипа, а с другой - окном, прозрачным в УФ-области. Ячейки биочипа формируют одну за другой путем циклического выполнения следующих операций: (1) заполнения камеры композицией с соответствующим зондом, (2) полимеризации композиции в месте нахождения будущей ячейки под действием УФ-излучения, сфокусированным в квадратное пятно необходимого размера, (3) промывки камеры перед заполнением ее очередным раствором.
Известен «Способ изготовления микрочипа на основе олигонуклеотидов» (Патент RU №2157385, 2000.10.10.), согласно которому изготовляют микрочип на основе олигонуклеотидов, иммобилизованных в органическом геле, приготовленном путем сополимеризации непредельных производных олигонуклеотидов с ненасыщенными мономерами, причем водно-солевые растворы, содержащие ненасыщенные мономеры, модифицированные непредельными фрагментами олигонуклеотиды и компонент каталитической системы, индуцирующей полимеризацию, растворимый только в воде, наносят на стеклянную подложку в виде микрокапель и проводят сополимеризацию мономеров погружением сформированной матрицы в не смешивающийся с водой органический растворитель, содержащий растворенный другой компонент каталитической системы.
Известно изобретение «Композиция (К) для иммобилизации биологических макромолекул в гидрогелях методом сополимеризации, способ приготовления композиции и биочип» (Патент RU №2206575, 2003.06.20), которое относится к композициям (К) для полимеризационной иммобилизации биологических макромолекул в гидрогелях при формировании биочипов К=аА+bB+cC+dD+eE, включающим А - мономер на основе производных акриловой и метакриловой кислот; В - водорастворимый сшивающий агент; С - модифицированную биологическую макромолекулу, содержащую ненасыщенную группу, D - водорастворимое соединение как компонент среды проведения сополимеризации; Е - воду, где а, b, с, d, е - процентное содержание (X) каждого компонента в композиции (Х=m/v100% для твердых веществ и X=v/v100% для жидких веществ), в которой общее содержание мономера и сшивающего агента лежит в интервале 3-40% (3(a+b)(40), соотношение мономера и сшивающего агента находится в пределах 97:3-60:40, а процентное содержание компонентов С, D и Е находится в пределах (с) от 0,0001% до 10%; (d) от 0% до 90%; (е) от 5% до 95%, способу их приготовления, к модифицированным биологически значимым соединениям ДНК и белкам, биочипу, в котором сформированный на подложке слой ила разделен пустыми промежутками на несколько ячеек, причем каждая из ячеек может содержать либо не содержать иммобилизованные макромолекулы, а макромолекулы, иммобилизованные в разных ячейках, могут различаться по своей природе и свойствам, и двум способам проведения полимеризационно-цепной реакции на биочипе.
Однако известные композиции для иммобилизации биологических макромолекул в гидрогелях при формировании биочипов, биочипы и способы их изготовления имеют ряд недостатков.
1. Использование только акриламида как гелеобразующего компонента и N,N'-метиленбисакриламида как сшивающего агента при изготовлении гелей сильно ограничивает спектр получаемых гидрогелей по структуре и пористости.
2. Модифицированные олигонуклеотиды, используемые для изготовления биочипов, содержат только 5'-концевую метакриламидную группу, связанную с молекулой олигонуклеотида кислотолабильной фосфорамидной связью, или концевую аллильную группу, обладающую низким сродством к акриламиду и N,N'-метиленбисакриламиду в реакции сополимеризации.
3. Известные биочипы отличаются низкой воспроизводимостью свойств гелевых ячеек и неоднородностью распределения в объеме ячейки иммобилизуемого соединения.
4. Известный способ проведения химической полимеризации компонентов композиции при изготовлении биочипа осуществляют в атмосфере влажного азота, что снижает эффективность полимеризации.
5. Известный способ фотоиндуцируемой полимеризации использует УФ-излучение с длиной волны 254 нм, что приводит к деструкции олигонуклеотидов.
6. Известные способы изготовления биочипов технически сложны и используют процедуры, не обеспечивающие необходимой однородности и воспроизводимости свойств гелевых ячеек и плохо поддающиеся автоматизации.
Вышеперечисленные недостатки методов диагностики моногенных заболеваний и биочипов для их осуществления устраняются заявляемым изобретением.
Задача настоящего изобретения - создание нового ускоренного метода массового скрининга новорожденных на наличие предрасположенности к моногенным заболеваниям. В основу изобретения положена также задача создания биочипа, обеспечивающего оптимальное функционирование иммобилизованных в нем биологически значимых макромолекул.
Поставленная задача решается новым способом обнаружения большого количества мутаций в ДНК обследуемого за один анализ крови. В заявленном методе предложено использование: получения одноцепочечных меченых фрагментов ДНК генома человека непосредственно из клинического образца (цельной пуповинной крови). Присутствие или отсутствие мутаций ДНК определяют с помощью гибридизации полученных фрагментов на специализированном олигонуклеотидном биочипе. Метод включает также способы регистрации и интерпретации результатов анализа. Существенные признаки метода:
(а) выделение геномной ДНК из клинического образца и амплификацию гена и получение одноцепочечного флюоресцентно меченого продукта; (б) - приготовление биочипа с иммобилизованными нуклеотидами; (в) - гибридизацию амплифицированного меченого продукта на биочипе; (г) - регистрацию и (д) - интерпретацию результатов гибридизации путем сравнения интенсивности флюоресцентных сигналов, полученных при совершенной и несовершенной гибридизации. Новым в данной методике является то, что на стадии (а) используют амплификацию РАН, CFTR, PAX8, GALT генов и получение одноцепочечного флюоресцентно меченого продукта методом ник-трансляции и рестрикции, при этом на стадии (а) применяется рестриктаза DPN2; на стадии (б) приготавливают биочип для скрининга новорожденных, содержащий набор иммобилизованных олигонуклеотидов SEQ ID 1-82 (табл.1-4); на стадии (в) осуществляют гибридизацию меченого амплифицированного продукта на указанном биочипе; на стадии (г) регистрацию результатов проводят на длине волны 635 нм и 532 нм для красителей Су5 и Су3 соответственно; на стадии (д) - интерпретацию результатов гибридизации осуществляют путем сравнения интенсивности флюоресцентных сигналов, полученных при совершенной и несовершенной гибридизации: если в ячейке первого ряда такого участка интенсивность сигнала выше, чем в остальных рядах, и выше порогового уровня определяемого отрицательным контролем, образец относят к дикому типу по данному нуклеотиду (не имеющему мутации в данном положении); если интенсивность сигнала в ячейке 2, 3 или 4 ряда отдельно или попарно (например, ячейки 2 и 3 ряда) выше, чем в остальных рядах и выше порогового уровня, определяемого отрицательным контролем образец, относят к мутантному типу по данному нуклеотиду; если интенсивность сигнала в ячейке первого ряда и одной из ячеек 2, 3 или 4 ряда выше, чем в остальных ячейках участка и выше порогового уровня определяемого отрицательным контролем, то образец относят к гетерозиготному типу.
Размер амплифицированного одноцепочечного флюоресцентно меченого фрагмента составляет около 60 п.о.
В качестве клинического образца используют пуповинную кровь новорожденного.
Биочип для скрининга новорожденных содержит набор иммобилизованных олигонуклеотидов SEQ ID 1-82 и 10 неспецифичных олигонуклеотидов в качестве контроля, применение которого позволяет детектировать точечные мутации и делеции в генах РАН, CFTR, PAX8, GALT с высокой специфичностью, а порядок размещения олигонуклеотидов обеспечивает возможность наиболее достоверно оценить наличие или отсутствие мутации и ее точную локализацию. При этом биочип содержит набор олигонуклеотидов SEQ ID 1-82 и 10 неспецифичных олигонуклеотидов в качестве контроля, а также олигонуклеотиды, комплементарные олигонуклеотидам SEQ ID 1-82. А также он содержит от 1 до 4 копий набора олигонуклеотидов SEQ ID 1-82.
Новый технический результат изобретения состоит в том, что разработанные нами новые приемы изобретения позволяют быстро и с высокой точностью провести анализ ДНК новорожденных на наличие предрасположенности к следующим наследственным заболеваниям: муковисцидоз, врожденный гипотиреоз, галактоземия, фенилкетонурия, при этом для анализа достаточно одной пробы пуповинной крови.
Достижение нового технического результата обусловлено следующими положениями.
Применение рестрикции и ник-трансляции позволяет получать меченые фрагменты небольшого размера - около 60 п.о. - геномной ДНК. Получаемые одноцепочечные меченые фрагменты ДНК способны вступать в специфическое гибридизационное взаимодействие с олигонуклеотидами, иммобилизованными на биочипе. Известный порядок расположения олигонуклеотидов на биочипе дает возможность установить наличие или отсутствие мутаций генов, ответственных за развитие моногенных заболеваний в образце ДНК. Разработанные условия подготовки образца и гибридизации обеспечивают высокую степень дифференциации между теми ячейками биочипа, где прошла гибридизация, и теми, где не возникло специфических гибридизационных комплексов. Дизайн олигонуклеотидов обеспечивает абсолютную специфичность их взаимодействия с участками генов, ответственных за развитие моногенных заболеваний, содержащими исследуемую мутацию. Регистрация и обработка результатов осуществляется специализированной программой, позволяющей достоверно определить наличие сигнала по отношению к фоновому уровню.
Подробное описание способа и клинические примеры его выполнения.
Набор олигонуклеотидов (ячейки биочипа) приведенных в SEQ ID I - 82 (Табл. 1-4) наносят на стеклянную подложку в виде капель с максимальной аккуратностью и воспроизводимостью с помощью роботов (например, BioOdyssey, Bio-Rad, США). Каждая сформированная ячейка представляет собой полусферу диаметром 1 мкм и периодом около 8 мкм и содержит иммобилизованный олигонуклеотид - зонд, комплементарный последовательности участка гена, связанного с наличием или отсутствием предрасположенности к моногенному заболеванию.
Олигонуклеотиды для иммобилизации на биочипе синтезированы на автоматическом синтезаторе (типа 394 DNA/RNA synthesizer. Applied Biosystems, США) и содержат спейсер со свободной аминогруппой 3'-Ammo-Modifier C7 CPG 500 (Glen Research) для последующей иммобилизации на подложку биочипа.
Берут 1 мл пуповинной крови новорожденного, выделяют геномную ДНК с помощью коммерческого набора DNA Box 500 (Protrans).
Полученную геномную ДНК фрагментируют с помощью рестриктазы DPN2. После фрагментации ДНК проводят реакцию ник-трансляции с помощью Klenow Fragment (Sigma, 40 ед/мкл) в присутствии Cy5-dCTP или Су3-dCTP (Amersham, I мМ раствор). Затем очищают ДНК с помощью фильтра microcon 30 (Amicon/Millipore) и проводят гибридизацию на биочипе.
Гибридизацию меченого образца на биочипе проводят в буфере следующего состава: 1М GuSCN; 50 мМ HEPES, рН 7,5; 5 мМ ЭДТА, рН 7.0. Гибридизацию выполняют в коммерчески производимой гибиридизационной камере объемом 30 мкл (Sigma) в течение ночи (16-18 часов) при 65°С. Отмывку проводят трижды в следующих буферах.
Первая отмывка: 2Х SSC, 0.03% SDS, 5 мин 70°С (для точного отделения специфичного от неспецифичного гибридизационного сигнала).
Вторая отмывка: 1X SSC, 5 мин при комнатной температуре.
Третья отмывка: 0.2Х SSC, 5 мин при комнатной температуре.
Регистрацию и фиксирование гибридизационной картины проводят с помощью автоматического комплекса, состоящего из сканера биочипов типа Innoscan 700 (Inopsys) и компьютера, на длине волны 635 нм и 532 нм для красителей Су5 и Су3 соответственно. Обработку интенсивности флуоресцентного сигнала проводят с помощью программы MapixSoftware (Inopsys).
По наличию флуоресценции в ячейках биочипа делают выводы о наличии, либо отсутствии исследуемого полиморфизма в определенном гене.
Обработка клинического образца.
Выделение геномной ДНК.
Выделение геномной ДНК осуществляют с помощью коммерчески производимого набора DNA Box 500 (Protrans) согласно рекомендаций производителя.
Мечение ДНК флуоресцентными красителями.
Полученную геномную ДНК фрагментируют с помощью рестриктазы DPN2. После фрагментации ДНК проводят реакцию ник-трансляции с помощью Klenow Fragment (Sigma, 40 ед/мкл) в присутствии Cy5-dCTP или Су3-dCTP (Amersham, I мМ раствор). Затем очищают ДНК с помощью фильтра microcon 30 (Amicon/Millipore) и проводят гибридизацию на биочипе.
Гибридизация меченого образца на биочипе.
Гибридизацию меченного образца на биочипе проводят в буфере следующего состава: 1М GuSCN; 50 мМ HEPES, рН 7,5; 5 мМ ЭДТА, рН 7.0. Гибридизацию выполняют в коммерчески производимой гибиридизационной камере объемом 30 мкл (Sigma) в течение ночи (16-18 часов) при 65°С. Отмывку проводят трижды в следующих буферах.
Первая отмывка: 2Х SSC, 0.03% SDS, 5 мин 70°С (для точного отделения специфичного от неспецифичного гибридизационного сигнала).
Вторая отмывка: 1X SSC, 5 мин при комнатной температуре.
Третья отмывка: 0.2Х SSC, 5 мин при комнатной температуре.
Регистрация и интерпретация результатов гибридизации - стадия (д).
Регистрацию и фиксирование гибридизационной картины проводят с помощью автоматического комплекса, состоящего из сканера биочипов типа Innoscan 700 (Inopsys) и компьютера на длине волны 635 нм и 532 нм для красителей Су5 и Су3 соответственно. Обработку интенсивности флуоресцентного сигнала проводят визуально или с помощью программы MapixSoftware (Inopsys).
Интерпретацию результатов проводят следующим образом.
Внутри каждого участка биочипа размером 1 на 4 ячейки визуально или с помощью программного обеспечения сравнивают интенсивности флуоресцентного сигнала. Если в ячейке первого ряда такого участка интенсивность сигнала выше, чем в остальных рядах, и выше порогового уровня, определяемого отрицательным контролем, образец относят к дикому типу по данному нуклеотиду (не имеющему мутации в данном положении). Если интенсивность сигнала в ячейке 2-го, 3-го или 4-го ряда отдельно или попарно (например, ячейки 2-го и 3-го ряда) выше, чем в остальных рядах и выше порогового уровня, определяемого отрицательным контролем, образец относят к мутантному типу по данному нуклеотиду (тип и расположение мутации устанавливают путем сравнения со схемой расположения олигонуклеотидов на биочипе). Если интенсивность сигнала в ячейке первого ряда и одной из ячеек 2-го, 3-го или 4-го ряда выше, чем в остальных ячейках участка и выше порогового уровня, определяемого отрицательным контролем, то образец относят к гетерозиготному типу (одна аллель - дикий тип, вторая аллель - мутантный тип). В результате выдается заключение о наличии или отсутствии мутаций в анализируемых положениях соответствующих генов.
Олигонуклеотидный биочип для скрининга новорожденных на моногенные заболевания.
Олигонуклеотиды для иммобилизации на биочипе синтезируют на автоматическом синтезаторе (типа 394 DNA/RNA synthesizer. Applied Biosystems, США) и содержат спейсер со свободной аминогруппой 3'-Amino-Modifier C7 CPG 500 (Glen Researh) для последующей иммобилизации на подложку биочипа или 5'-Amino-Modifier C6 (Glen Researh) для введения флуоресцентной метки. Введение флуоресцентной метки Су5 осуществляют в соответствии с рекомендациями производителя. (Amersham)
Синтезированный набор олигонуклеотидов (ячейки биочипа) наносят на стеклянную подложку в виде капель с максимальной аккуратностью и воспроизводимостью с помощью роботов (BioOdyssey, Bio-Rad, США). Каждая сформированная ячейка представляет собой полусферу диаметром 1 мкм и периодом около 8 мкм и содержит иммобилизованный олигонуклеотид - зонд, комплементарный последовательности участка гена, связанного с наличием или отсутствием предрасположенности к моногенному заболеванию.
Структура биочипа.
Биочип представляет собой набор олигонуклеотидов, иммобилизованных на твердой подложке.
Для детекции мутаций типа SNP используют набор олигонуклеотидов, состоящий из двух частей. Первая часть представляет собой множество олигонуклеотидов, каждый олигонуклеотид точно комплементарен участку ДНК гена, содержащему исследуемую позицию. Вторая часть набора состоит из олигонуклеотидов, точно комплементарных участку ДНК гена, содержащему исследуемую позицию, за исключением нуклеотида в исследуемой позиции таким образом, что на одну исследуемую позицию приходится 3 олигонуклеотида с разными нуклеотидами в исследуемом положении. В итоге на одно исследуемое положение для одной цепи ДНК приходится 4 олигонуклеотида, отличающиеся нуклеотидом в исследуемом положении. Такой подход позволяет определить, какой из нуклеотидов А, С, G или Т находится в исследуемой позиции и соответственно сделать заключение о наличии или отсутствии мутации в данном положении. В набор олигонуклеотидов биочипа входят олигонуклеотиды, комплементарные как прямой цепи ДНК гена, так и обратной. Кроме того, набор олигонуклеотидов может быть нанесен на биочип в нескольких копиях (от 1 до 4 копий). Это позволяет повысить чувствительность анализа.
Для детекции делеций используют набор олигонуклеотидов, состоящий из двух частей. Первая часть набора олигонуклеотидов такая же, как и для детекции мутаций типа SNP. Вторая часть состоит из множества олигонуклеотидов, точно комплементарных участку ДНК гена, за исключением того, что в данных олигонуклеотидах отсутствует нуклеотид(ы) в исследуемом положении. В результате для исследования одной делеций в одной цепи ДНК используется 2 олигонуклеотида. В набор олигонуклеотидов биочипа входят олигонуклеотиды, комплементарные как прямой цепи ДНК гена, так и обратной. Кроме того, набор олигонуклеотидов может быть нанесен на биочип в нескольких копиях (от 1 до 4 копий).
Олигонуклеотиды синтезируют на автоматическом синтезаторе ДИК и наносят на биочип таким образом, что олигонуклеотиды, комплементарные участку гена прямой цепи ДНК («прямые» олигонуклеотиды), содержащему 1 положение мутации расположены в столбик один за другим, при этом верхнее положение занимает олигонуклеотид, комплементарный дикому типу гена (т.е. не содержащий мутации). Олигонуклеотиды, комплементарные участку гена обратной цепи ДНК, содержащему соответствующее положение мутации, располагают таким же образом, как и «прямые». Олигонуклеотиды располагают на биочипе случайным образом с учетом выше указанных условий. Для увеличения чувствительности метода биочип может содержать от 2-х до нескольких копий набора олигонуклеотидов. Кроме того, на биочипе расположены 10 ячеек, содержащих неспецифичные к исследуемому геному олигонуклеотиды, выполняющие роль отрицательного контроля.
Статистика и клинические примеры
При клинических испытаниях предлагаемого способа выявления мутаций было обследовано 10 новорожденных с клиническим диагнозом фенилкетонурия, 7 новорожденных с клиническим диагнозом муковисцидоз, 2 новорожденных с диагнозом врожденный гипотиреоз, 1 ребенок с диагнозом галактоземия и 40 здоровых новорожденных. В результате испытаний предлагаемого способа были получены следующие результаты:
- среди больных фенилкетонурией 8 новорожденных оказались гомозиготами по мутации R408W/R408W, 1 - гетерозиготой с генотипом R408W/R261Q, 1 - гетерозиготой с генотипом I65T/R408W по гену РАН.
- среди больных муковисцидозом 6 новорожденных являлись гомозиготами DelF508/DelF508 и один - оказался гетерозиготой с генотипом G542X/DelF508 по гену CFTR.
- среди больных врожденным гипотиреозом один ребенок являлся гомозиготой по мутации Q40P/Q40P, другой - гетерозиготой с генотипом R31H/X по гену РАХ8.
- среди новорожденных с диагнозом галактоземия 1 больной являлся гомозиготой по мутации Q188R по гену GALT.
Клинический пример 1.
Больная Ш-ва. Диагноз фенилкетонурия был поставлен в 2005 в результате проведения скрининговых исследований. Материалом для скринингового исследования служили бланки с кровью новорожденных, проживающих на территории Ростовской области. Уровень ФА определяли с применением «набора реагентов для количественного определения ФА в сухих пятнах крови флуориметрическим методом - «ФА-Флуор» (ООО «Инновационные биотехнологии», Россия) на приборе «Флюороскан-2» («Labsystems», Финляндия).
Уровень фенилаланина у больной Ш-вой на момент постановки на учет (1 мес.) - 769,8 мкмоль/л (рефересные значения до 120,0 мкмоль/л). На момент проведения нашего исследования (2007 г.) больная получала диету, и значения ФА находились в пределах физиологической нормы.
Нами было проведено молекулярно-генетическое типирование по заявляемому методу с помощью биочипа на 6 наиболее частых мутаций в гене РАН (ФАГ) (R408W, P281L, R261Q, R158Q, R252W, I65T).
С помощью предлагаемого метода установлен генотип больной Ш-вой: - R408W/R408W.
Клинический пример 2.
Больной А-ин. Диагноз врожденный гипотиреоз был поставлен в 2007 в возрасте 1 месяц в результате проведения скрининговых исследований по определению уровня тиреотропного (ТТГ) в сухих пятнах крови новорожденных иммунофлуоресцентным методом с использованием наборов «Delfia Neonatal hTSH». У больного А-ина концентрация ТТГ на 3 день после родов 124 мкЕд/мл при норме до 20 мкЕд/мл.
Нами было проведено молекулярно-генетическое типирование по заявляемому методу с помощью разработанного нами биочипа на 5 наиболее частых мутаций в гене РАХ8 (R31H, Q40P, С57O, L62R, R108X). С помощью биочипа установлен генотип больного А -ина: - Q40P/Q40P
Клинический пример 3.
Больной Ц-ко. Диагноз муковисцидоз был поставлен в возрасте 3 лет на основании клинической картины - хронический бронхолегочный процесс и кишечный синдром, наличие муковисцидоза у сибса и положительного результата потового теста концентрации хлорида натрия.
Определение концентрации хлорида натрия проводили спектрофотометрически. У больного Ц-ко регистрировали положительный трехкратный потовый тест с содержанием хлоридов пота выше 60 мм.
Нами было проведено молекулярно-генетическое типирование по заявленной методике с помощью биочипа на 5 наиболее частых мутаций в гене CFTR (delF508, G542X, G551D, N1303K, W1282X).
С помощью разработанного нами биочипа установлен генотип больного Ц-ко:
- DelF508/DelF508.
Клинический пример 4.
У новорожденного К-ова из пуповинной крови была выделена ДНК и проанализирована с помощью предлагаемого метода. Генотипирование проводилось на наличие следующих мутаций: в гене РАН (R408W, P281L, R261Q, R158Q, R252W, I65T), в гене CFTR (delF508, G542X, G551D, N1303K, W1282X), в гене GALT (Q188R, K285N, L195P, F171S, S135L), в гене РАХ8 (R31H, Q40P, С57O, L62R, R108X)/ Было установлено, что новорожденный К-ов являлся гетерозиготой с генотипом R408W/- по гену РАН, других исследуемых мутаций обнаружено не было. При проведении через 1 месяц после рождения исследования в рамках скрининговой программы отклонения в биохимических показателях обнаружены не были.
Преимущества для клинической практики заявляемого нами способа диагностики и биочипа для его осуществления состоят в следующем.
Продолжительность анализа составляет 24 ч. Точность метода составляет 98% и перекрывает 78% случаев обнаруженных моногенных заболеваний у детей.
Условия гибридизации и отмывки обеспечивают высокую степень дифференциации между совершенными и несовершенными гибридизационными дуплексами, и таким образом позволяют осуществлять процедуру в условиях ординарной диагностической лаборатории
Метод выгодно отличается от существующих в настоящее время аналогов простотой выполнения и низкой себестоимостью и может быть широко рекомендован в клиническую практику.