Ферментативный способ оценки интегральной токсичности воздушной среды
ENZYMATIC METHOD OF ASSESSING INTEGRAL TOXICITY OF AIR

Изобретение относится к области контроля загрязнений окружающей среды, а именно к методам оценки интегральной токсичности воздушной среды.
Известен способ интегральной экспресс-оценки загрязнения окружающей среды, заключающийся в инкубировании водорастворимых поллютантов с биологической тест-системой и определении количества пробы, вызывающего 50%-е снижение максимальной интенсивности люминол-зависимой хемилюминесценции по сравнению с контролем. Способ отличается тем, что в качестве тест-системы используют комплексный полиферментный препарат из корня хрена, обладающий оксидазно-пероксидазной активностью, в комбинации с сульфгидрильным реагентом в конечной концентрации не менее 0,1 мкг/мл и не более 100 мкг/мл [1]. Поллютанты воздуха отбирают с помощью аспиратора, барботируя воздух через поглотительный раствор - воду, или путем пропускания его через фильтр с последующим выдерживанием фильтра в воде.
Недостатком данного способа является то, что пробоподготовка позволяет обнаруживать только водорастворимые вещества, что не дает полной интегральной оценки токсичности среды.
Известен биосенсор токсичности воздуха, содержащий средство для размещения тест-объекта с иммобилизованной культурой генетически модифицированных бактерий, несущих комплекс генов lux оперона светящихся бактерий, и люминометр для измерения интенсивности свечения иммобилизованной культуры под действием токсичной среды. Он отличается тем, что средство для размещения тест-объекта выполнено в виде переносной металлической кюветы в форме уголка, вертикальная часть которого выполняет функцию ручки для переноса кюветы, а рабочая горизонтальная поверхность уголка снабжена посадочным местом, на котором размещен фрагмент твердой питательной среды с иммобилизованной культурой генетически модифицированных светящихся бактерий, а люминометр имеет кюветное отделение, форма которого соответствует переносной кювете. В качестве генетически модифицированных светящихся бактерий использован штамм Escherichia coli В-5356 (Н 101/pUC7 lux 37).
4
8
Тест-объект изготавливают следующим образом. В стерильные чашки Петри заливают стерильную расплавленную среду - мясо-пептонный агар слоем 2-4 мм. После застывания среды на поверхность высевают 10-1000 КОЕ культуры Е. coli В-5356 (НВ 101/pUC7 lux 37). Инкубацию бактерий осуществляют в течение 10-20 часов. Затем на внешней стороне чашки Петри маркером отмечают прямоугольный контур площадью 10×20 мм, окружающий отдельную колонию, и стерильным скальпелем вырезают фрагмент твердой питательной среды вместе с колонией и переносят его на рабочую поверхность кюветы. Для стерилизации скальпель смачивают 96% этанолом и обжигают в пламени спиртовки. Таким образом получают тест-объект, представляющий собой фрагмент твердой питательной среды, на поверхности которого расположены клетки культуры светящихся бактерий в количестве 10-10 КОЕ [2].
Недостатками данного метода является вариабельность используемой культуры бактерий, а также ограничение по агрегатному состоянию токсикантов, воздействующих на тест-объект: в воздухе определяют только твердые и некоторое количество жидких аэрозольных частиц, а газовая составляющая из органических и неорганических компонентов не улавливается. Кроме того, основным недостатком биосенсоров на живых организмах является то, что они специфичны только для одного параметра, такого как биологическая потребность в кислороде [3].
к
o
к
к
o
o
к
3
Прототипом изобретения является метод анализа образцов воздуха разной загрязненности с применением в качестве тест-объекта растворимой биферментной системы светящихся бактерий НАДН: ФМН-оксидоредуктаза + люцифераза (раствор препарата ферментов КРАБ - комплекта реактивов аналитической биолюминесценции) или иммобилизованного биолюминесцентного реагента «Энзимолюм» [4]. При проведении анализа с использованием реагента «Энзимолюм» в качестве контроля измеряют максимум интенсивности свечения реагента при добавлении к нему 300 мкл дистиллированной воды и 10 мкл 0,5 мМ раствора ФМН, I. Затем в отдельной кювете измеряют максимум интенсивности свечения реагента в присутствии 300 мкл анализируемого образца, I. Для измерения I с раствором препарата КРАБ используют реакционную смесь следующего состава: 300 мкл 0,05 М калий-фосфатного буфера рН 6,8; 5 мкл раствора КРАБ; 50 мкл 0,0025% раствора тетрадеканаля; 10 мкл 0,5 мМ раствора ФМН; 100 мкл 0,4 мМ раствора НАДН. После достижения I в кювету добавляют 50 мкл анализируемого образца воды или раствора анализируемого вещества заданной концентрации и измеряют I. Отбор проб осуществляют на открытом воздухе. Абсорбцию органических загрязнений воздуха в воду, этанол и ацетон осуществляют с помощью стандартного аспираторного устройства со скоростью 1,0 дм/мин. Степень загрязнения воздуха оценивают по количеству разведений проб, абсорбированных водой, этанолом или ацетоном, необходимому для того, чтобы максимальная интенсивность свечения I отличалась не более чем на 20% от контрольного значения I. Особенностью метода является определение токсичности среды путем применения интегрального биотеста при невозможности использования для этих целей химического анализа.
Недостатком представленного метода является отсутствие оптимально подобранных параметров пробоподготовки образцов воздушной среды для анализа (не выбраны оптимальные скорость и время пробоотбора, количество поглотительного раствора), что не позволяет проводить оценку загрязнения воздушной среды с максимальной чувствительностью. Кроме того, в методе используют высокотоксичные поглотительные растворы (этанол, ацетон). В данном методе состав иммобилизованного реагента и количество раствора препарата КРАБ и субстратов в реакционной смеси не соответствуют оптимальным значениям, учитывающим конкретные условия выполнения анализа. Действительно, высокие концентрации субстратов и ферментов в составе реагента «Энзимолюм» и реакционной смеси с раствором препарата КРАБ приводят к высокому уровню контрольного свечения, на фоне которого трудно уловить изменения, вызванные присутствием низких количеств веществ-загрязнителей, что снижает чувствительность предлагаемого способа.
Техническим результатом данного изобретения является повышение точности определения токсичности воздушной среды методом биолюминесцентного ферментативного тестирования за счет обеспечения максимальной чувствительности ферментативного тест-объекта к воздействию токсикантов, потенциально содержащихся в анализируемых пробах.
3
3
3
3
Указанный результат достигается тем, что в методе определения степени загрязнения воздушной среды, включающем отбор проб на открытом воздухе с помощью стандартного аспиратора, абсорбцию органических и неорганических загрязнителей воздуха в воду, этанол и ацетон со скоростью 1,0 дм/мин, приготовление контрольной и анализируемой проб на основе раствора препарата КРАБ и измерение максимальной интенсивности свечения в присутствии контрольной и анализируемой проб в реакционной смеси следующего состава: 300 мкл 0,05 М калий-фосфатного буфера рН 6,8; 5 мкл раствора препарата КРАБ; 50 мкл 0,0025% раствора тетрадеканаля; 10 мкл 0,5 мМ раствора ФМН; 100 мкл 0,4 мМ раствора НАДН, новым является то, что вместо токсичных этилового спирта и ацетона используют в качестве поглотительного раствора 6 см 15%-ого раствора уксуснокислого аммония, время аспирации составляет не менее 30 минут со скоростью 5 дм/мин при использовании в качестве поглотительного раствора дистиллированной воды и 1 дм/мин при использовании в качестве поглотительного раствора уксуснокислого аммония, используют модифицированный состав реакционной смеси с уменьшенным содержанием ферментов и субстратов с добавлением дистиллированной воды / уксуснокислого аммония (контроль) или анализируемого образца (водного экстракта или экстракта в уксуснокислом аммонии), измеряют максимальную интенсивность свечения в обеих пробах, при этом критерием токсичности анализируемой пробы является снижение на 20% и более величины максимальной интенсивности свечения, измеряемой в анализируемой пробе по сравнению с данным параметром в контрольной пробе.
Интегральную оценку токсичности образцов воздуха проводят следующим образом.
Готовят следующее оборудование и реактивы: люминометр, например, марки GloMax-20/20 с набором кювет; аспиратор, например, АПМ-4-128-40; комплект реактивов аналитической биолюминесценции (КРАБ), содержащий люциферазу из рекомбинантного бактериального штамма Escherichia coli и оксидоредуктазу из бактериальной культуры Vibrio fischeri; 0,05 М калий фосфатный буфер рН 6,8; растворы субстратов: НАДН (восстановленный никотинамидадениндинуклеотид), ФМН (флавинмононуклеотид), тетрадеканаль; иммобилизованный реагент «Энзимолюм», содержащий люциферазу из рекомбинантного бактериального штамма Escherichia coli и оксидоредуктазу из бактериальной культуры Vibrio fischeri, а также субстраты тетрадеканаль и НАДН.
3
3
3
Готовят поглотительный раствор - 15%-й уксуснокислый аммоний. Для этого растворяют 150 г уксуснокислого аммония в 800 см дистиллированной воды, к полученному раствору добавляют 3 см уксусной кислоты, тщательно перемешивают и доводят объем до 1000 см дистиллированной водой.
3
3
3
Осуществляют отбор проб воздуха в поглотительные растворы 1) дистиллированную воду, 2) 15%-ый раствор уксуснокислого аммония. Отбор проб осуществляют путем аспирации 6 см поглотительного раствора через поглотительные сосуды Рихтера в течение 30 минут со скоростью 1 дм/мин и 5 дм/мин при использовании в качестве поглотительного раствора дистиллированной воды и раствора уксуснокислого аммония соответственно с помощью стандартного аспираторного устройства.
к
o
Для измерения максимальной интенсивности свечения тест-объекта (раствора препарата КРАБ) в присутствии контрольного раствора (I) в измерительную кювету последовательно вносят компоненты модифицированной реакционной смеси с уменьшенным содержанием ферментов и субстратов: 350 мкл 0,05 М калий фосфатного буфера рН 6,8; 3 мкл раствора препарата КРАБ; 40 мкл 0,0025% раствора тетрадеканаля; 50 мкл 0,4 мМ раствора НАДН, 5 мкл 0,5 мМ раствора ФМН и 50 мкл контрольного раствора (дистиллированной воды или 15%-ого раствора уксуснокислого аммония, разведенного в 8 раз). Для измерения максимальной интенсивности свечения тест-объекта (раствора препарата КРАБ) в присутствии анализируемого раствора (I) в измерительную кювету последовательно вносят все компоненты реакционной смеси, но вместо контрольного раствора вносят 50 мкл анализируемого образца. Анализируемый образец, полученный путем абсорбции в 15%-ый уксуснокислый аммоний, предварительно разводят в 8 раз дистиллированной водой.
к
o
При использовании в качестве тест-объекта иммобилизованного препарата «Энзимолюм» в измерительную кювету последовательно вносят: 1 диск препарата «Энзимолюм», 350 мкл дистиллированной воды или раствора 15%-ого уксуснокислого аммония, разведенного в 16 раз (контроль), запускают реакцию добавлением 5 мкл 0,5 мМ раствора ФМН, помещают кювету в биолюминометр и измеряют максимальную интенсивность свечения тест-объекта I. В другую кювету последовательно вносят: 1 диск препарата «Энзимолюм» и 350 мкл анализируемого образца на основе дистиллированной воды или раствора 15%-ого уксуснокислого аммония, предварительно разведенного в 16 раз, запускают реакцию добавлением 5 мкл 0,5 мМ раствора ФМН, помещают кювету в биолюминометр и измеряют максимальную интенсивность свечения тест-объекта I.
к
o
к
o
Измерение I и I проводят в течение 1-2 мин на биолюминометре. За результат измерений максимальной интенсивности свечения в пробах I и I принимают среднее арифметическое значение результатов трех параллельных определений, полученных в условиях повторяемости.
Рассчитывают люциферазный индекс токсичности (ЛИТ) анализируемой пробы по формуле:
к
ср
o
ср
к
ср
ЛИТ=[(I_-I_)/I_]⋅100%,
к
ср
o
ср
к
o
где I_ и I_ - средние арифметические значения трех параллельных определений величин максимальных значений I и I.
Определяют степень интегральной химической токсичности в соответствии с. величиной ЛИТ. При ЛИТ равном менее 20% воздушная среда не токсичная; при ЛИТ от 21 до 40% - слаботоксичная; при ЛИТ от 41 до 60% - токсичная; при ЛИТ от 61 до 80% - сильно токсичная; при ЛИТ от 81 до 100% - гипертоксичная.
Пример 1.
Провели анализ интегральной токсичности 4-х проб, три из которых отобраны в промышленных зонах г. Красноярска (ул. Семафорная в районе д. 261а, ул. Перенсона в районе д. 2, пр. им. газеты «Красноярский рабочий» в районе д. 151), одна проба отобрана в экологически чистом районе с лесными насаждениями г. Красноярска (пр. Свободный в районе д. 79).
3
3
Отбор проб воздуха проводили с помощью стандартного аспираторного устройства АПМ-4-128-40, путем аспирации через поглотительные сосуды Рихтера, содержащие 6 см поглотительного раствора в течение 30 минут со скоростью 5 дм/мин. В качестве поглотительного раствора использовали дистиллированную воду. В качестве тест-объекта использовали растворимую форму биферментной системы светящихся бактерий (раствор препарата КРАБ).
к
o
к
o
к
o
Для оценки интегральной токсичности отобранных проб, изначально провели измерения максимальной интенсивности свечения тест-объекта (раствора препарата КРАБ) в присутствии контрольного раствора (I): в измерительную кювету последовательно вносили компоненты модифицированной реакционной смеси с уменьшенным содержанием ферментов и субстратов: 350 мкл 0,05 М калий фосфатного буфера рН 6,8; 3 мкл раствора препарата КРАБ; 40 мкл 0,0025% раствора тетрадеканаля; 50 мкл 0,4 мМ раствора НАДН, 5 мкл 0,5 мМ раствора ФМН и 50 мкл дистиллированной воды. Далее для измерения максимальной интенсивности свечения тест-объекта (раствора препарата КРАБ) в присутствии анализируемого образца (I) в измерительную кювету последовательно вносили все компоненты реакционной смеси, но вместо контрольного раствора внесли 50 мкл анализируемого образца. Измерение Iи I проводили в течение 1-2 мин на биолюминометре. За результат измерений максимальной интенсивности свечения в пробах I и I принимали среднее арифметическое значение результатов трех параллельных определений, полученных в условиях повторяемости.
Рассчитывали люциферазный индекс токсичности (ЛИТ) анализируемой пробы по формуле:
к
ср
o
ср
к
ср
ЛИТ=[(I_-I_)/I_]⋅100%,
к
ср
o
ср
к
o
где I_ и I_ - средние арифметические значения трех параллельных определений величин максимальных значений I и I.
Определяли степень интегральной химической токсичности в соответствии с величиной ЛИТ. При ЛИТ равном менее 20% воздушная среда не токсичная; при ЛИТ от 21 до 40% - слаботоксичная; при ЛИТ от 41 до 60% - токсичная; при ЛИТ от 61 до 80% - сильно токсичная; при ЛИТ от 81 до 100% - гипертоксичная.
На фигуре 1 показаны значения ЛИТ, полученные при анализе указанных проб воздуха с использованием в качестве тест-объекта раствора препарата КРАБ. Пробы, отобранные в промышленных районах г. Красноярска, охарактеризованы как токсичные (проба, отобранная на ул. Перенсона) и слаботоксичные (пробы, отобранные на ул. Семафорной и пр. им. газеты «Красноярский рабочий»); проба, отобранная в зеленой зоне г. Красноярска (пр. Свободный), охарактеризована как нетоксичная.
Пример 2.
3
3
Провели анализ интегральной токсичности 2-х проб, отобранных в промышленном районе г. Красноярска (КрасТЭЦ, пр. им. газеты «Красноярский рабочий» в районе д. 22г) и экологически чистом районе с лесными насаждениями (пр. Свободный в районе д. 79) г. Красноярска. Отбор проб проводили с помощью стандартного аспираторного устройства АПМ-4-128-40 путем аспирации через поглотительные сосуды Рихтера, содержащие 6 см поглотительного раствора в течение 30 минут со скоростью 1 дм/мин. В качестве поглотительного раствора использовали 15%-ый раствор уксуснокислого аммония. В качестве тест-объекта использовали растворимую форму биферментной системы светящихся бактерий (раствор препарата КРАБ).
к
o
к
o
к
o
Для оценки интегральной токсичности отобранных проб изначально провели измерения максимальной интенсивности свечения тест-объекта (раствора препарата КРАБ) в присутствии контрольного раствора (I): в измерительную кювету последовательно вносили компоненты модифицированной реакционной смеси с уменьшенным содержанием ферментов и субстратов: 350 мкл 0,05 М калий фосфатного буфера рН 6,8; 3 мкл раствора препарата КРАБ; 40 мкл 0,0025% раствора тетрадеканаля; 50 мкл 0,4 мМ раствора НАДН, 5 мкл 0,5 мМ раствора ФМН и 50 мкл 15%-ого раствора уксуснокислого аммония, предварительно разведенного дистиллированной водой в 8 раз. Далее для измерения максимальной интенсивности свечения тест-объекта (раствора препарата КРАБ) в присутствии анализируемого образца (I) в измерительную кювету последовательно вносили все компоненты реакционной смеси, но вместо контрольного раствора внесли 50 мкл анализируемого образца, предварительно разведенного дистиллированной водой в 8 раз. Измерение Iи I проводили в течение 1-2 мин на биолюминометре. За результат измерений максимальной интенсивности свечения в пробах I и I принимали среднее арифметическое значение результатов трех параллельных определений, полученных в условиях повторяемости.
Рассчитывали люциферазный индекс токсичности (ЛИТ) анализируемой пробы по формуле:
к
ср
o
ср
к
ср
ЛИТ=[(I_-I_)/I_]⋅100%,
к
ср
o
ср
к
o
где I_ и I_ - средние арифметические значения трех параллельных определений величин максимальных значений I и I.
Определяли степень интегральной химической токсичности в соответствии с величиной ЛИТ. При ЛИТ равном менее 20% воздушная среда не токсичная; при ЛИТ от 21 до 40% - слаботоксичная; при ЛИТ от 41 до 60% - токсичная; при ЛИТ от 61 до 80% - сильно токсичная; при ЛИТ от 81 до 100% - гипертоксичная.
На основании результатов, полученных при проведении анализа интегральной токсичности проб с использованием растворимой формы биферментной системы светящихся бактерий (раствора препарата КРАБ), проба, отобранная в лесном массиве (пр. Свободный), является нетоксичной, тогда как проба, отобранная в промышленно загрязненном районе (пр. им. газеты «Красноярский рабочий»), охарактеризована как токсичная (фиг. 2).
Пример 3.
3
3
Провели анализ интегральной токсичности 2-х проб, отобранных в промышленном районе (в районе алюминиевого завода, ул. Пограничников в районе д. 40к) и экологически чистом районе с лесными насаждениями (пр. Свободный, 79) г. Красноярска. Отбор проб проводили с помощью стандартного аспираторного устройства АПМ-4-128-40 путем аспирации через поглотительные сосуды Рихтера, содержащие 6 см поглотительного раствора в течение 30 минут со скоростью 1 дм/мин. В качестве поглотительного раствора использовали 15%-ый раствор уксуснокислого аммония. В качестве тест-объекта использовали иммобилизованную форму биферментной системы светящихся бактерий (препарат «Энзимолюм»).
к
к
o
к
o
к
o
Для оценки интегральной токсичности отобранных проб, изначально провели измерения максимальной интенсивности свечения тест-объекта (препарата «Энзимолюм») в присутствии контрольного раствора (I). Для этого в измерительную кювету последовательно вносили: 1 диск препарата «Энзимолюм», 350 мкл раствора 15%-ого уксуснокислого аммония, предварительно разведенного дистиллированной водой в 16 раз (контроль), запускали реакцию добавлением 5 мкл 0,5 мМ раствора ФМН, помещали кювету в биолюминометр и измеряли максимальную интенсивность свечения тест-объекта I. В другую кювету последовательно вносили: 1 диск препарата «Энзимолюм» и 350 мкл анализируемого образца, предварительно разведенного дистиллированной водой в 16 раз, запускали реакцию добавлением 5 мкл 0,5 мМ раствора ФМН, помещали кювету в биолюминометр и измеряли максимальную интенсивность свечения тест-объекта I. Измерение I и I проводили в течение 1-2 мин на биолюминометре. За результат измерений максимальной интенсивности свечения в пробах I и I принимали среднее арифметическое значение результатов трех параллельных определений, полученных в условиях повторяемости.
Рассчитывали люциферазный индекс токсичности (ЛИТ) анализируемой пробы по формуле:
к
ср
o
ср
к
ср
ЛИТ=[(I_-I_)/I_]⋅100%,
к
ср
o
ср
к
o
где I_ и I_ - средние арифметические значения трех параллельных определений величин максимальных значений I и I.
Определяли степень интегральной химической токсичности в соответствии с величиной ЛИТ. При ЛИТ равном менее 20% воздушная среда не токсичная; при ЛИТ от 21 до 40% - слаботоксичная; при ЛИТ от 41 до 60% - токсичная; при ЛИТ от 61 до 80% - сильно токсичная; при ЛИТ от 81 до 100% - гипертоксичная.
На основании результатов, полученных при проведении анализа интегральной токсичности проб с использованием иммобилизованной формы биферментной системы светящихся бактерий (препарата «Энзимолюм»), проба, отобранная в лесном массиве (пр. Свободный), является нетоксичной, тогда как проба, отобранная в промышленно загрязненном районе (ул. Пограничников в районе д. 40к), охарактеризована как токсичная (фиг. 3).
Список литературы:
[1] Патент на изобретение RU 2359036 С1 «Способ интегральной экспресс-оценки загрязнения окружающей среды», опубликован 20.06.2009
[2] Патент на изобретение RU 2381277 С1 «Биосенсор токсичности воздуха», опубликован 10.02.2010
[3] Thomas, D.J.L., Tyrrel, S.F., Smith, R., Farrow, S Bioassays for the evaluation of landfill leachate toxicity // Journal of Toxicology and Environmental Health, Part В. - 2009,83-105.
[4] Есимбекова E.H., Римацкая H.B., Суковатая И.Е., Кратасюк В.А. «Биолюминесцентный экспресс метод определения интегральной токсичности воды и загрязнения воздуха» // Вестник Оренбургского государственного университета, 2013. №10. С. 122-127.