СПОСОБ МНОГОАНАЛИТНОГО ИММУНОАНАЛИЗА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИКРОЧАСТИЦ
METHOD OF MULTIANALYTIC IMMUNE ASSAY WITH USING MICROPARTICLES

Изобретение относится к многоаналитному анализу на основе иммунохимических, генетических и других видов реакций биоспецифического связывания аналита с лигандами для биологических, медицинских и других целей.
К методам мультиплексного (многоаналитного) обнаружения, идентификации и количественной оценки биологических веществ (клеток, вирионов, нуклеиновых кислот, белков, антигенных молекулярных комплексов, низкомолекулярных биологически активных соединений), находящихся в низкой концентрации в пробах сложного состава, предъявляется ряд требований: методы должны быть быстрыми, давать однозначные результаты, быть работоспособными в условиях использования различных сложных по составу матриксов, иметь необходимый уровень чувствительности и специфичности, быть пригодными для определения очень низких концентраций биологических аналитов, результаты анализа должны считываться быстро. Требованием к мультиплексности диагностических тестов с использованием нуклеотидов, химических соединений и протеомных синтетических конструкций (рекомбинантных белков, пептидов и т.п.) является возможность параллельной регистрации десятков и сотен актов взаимодействия различных аналитов в анализируемой пробе.
Известен способ и композиции для одновременного детектирования множества аналитов в исследуемом образце (заявка РСТ №01/073443, класс МКИ G01N 33/58). Изобретение может быть использовано для быстрого, точного и автоматического детектирования патогенов, а также для диагностики и прогноза заболеваний. Искомые аналиты (антигены) в образце детектируют и дифференцируют, используя множество флуоресцентных латексных частиц, связанных с различными связывающими молекулами, специфичными к искомым аналитам (антигенам). При определении множества аналитов каждая частица одной категории имеет свою, отличную от других флуоресцентную ("адресную") метку, а каждый антиген (аналит) выявляется одной и той же флуоресцентной меткой, связанной с реагентами для их выявления. Измерение флуоресценции частиц осуществляют путем определения отношения флуоресценции одного или более красителей. В качестве флуоресцентных меток для микрочастиц используют флуоресцеин, фикоэритрин, родамин и т.п., а для мечения антигенов используют вторичные флуоресцентные красители (метки), отличающиеся как по спектральной области возбуждения, так и по спектральной области эмиссии от флуоресцентных красителей, используемых для мечения категорий частиц. Для детектирования антигенов (аналитов) и оценки их количества регистрируют флуоресценцию вторичной метки, которая связана с биоспецифическими реагентами для выявления аналита, используя методы проточной цитометрии.
Недостатком способа является низкое быстродействие, обусловленное использованием методов проточной цитометрии для детектирования сигналов, а также ограниченная чувствительность, так как не связавшиеся с микрочастицами реагенты создают фоновую люминесценцию.
Известен способ одновременного анализа и детектирования множества аналитов путем использования микрочастиц (заявка РСТ №01/44812, класс МПК G01N 33/53). В изобретении предложен способ приготовления и использования реагента, содержащего несколько видов микрочастиц с набором флуорохромов для детектирования множества аналитов. Один вид частиц отличается от другого спектром эмиссии, т.е. каждый вид частиц содержит различные метки для идентификации аналитов и различные аффинные лиганды, иммобилизованные на микрочастицах. Образец с микрочастицами инкубируют при условиях и времени, необходимых и достаточных для образования биоспецифического комплекса. После инкубации анализируют образовавшиеся комплексы под микроскопом с целью выявления категорий микрочастиц (вида аналита) и концентрации искомых аналитов по флуоресценции меток, при этом каждую микрочастицу анализируют последовательно.
Недостатками способа являются ограниченная чувствительность из-за необходимости использования операции разведения образца и длительность проведения идентификации аналита под микроскопом.
Известен биоспецифический многоаналитный способ исследования биологических образцов (патент США №5891738. класс НКИ 436/501). Способ основан на использовании различных категорий микрочастиц, покрытых различными первыми специфичными к аналиту реагентами и содержащих один или несколько флуоресцентных индикаторов в одной или нескольких концентрациях. В суспензию микрочастиц добавляют исследуемый образец с искомыми аналитами и вторые биоспецифические (проявляющие) реагенты, меченные вторичной фотолюминесцентной меткой, инициируют биоспецифическую реакцию, категорию микрочастиц, т.е. вид аналитов, определяют по интенсивности флуоресценции индикаторных меток, связанных с частицами, а концентрацию аналитов определяют по интенсивности флуоресценции вторичных фотолюминесцентных меток. В качестве индикаторных веществ используют тетрапиррольные (порфирин, хлорин, фталоцианин и др.) и цианиновые вещества, а в качестве фотолюминесцентной метки - фикоэритрин. При детектировании исследуют каждую частицу отдельно на микрофлуориметре, основанном на двухфотонном методе возбуждения люминесценции и конфокальной схеме возбуждения и регистрации люминесценции.
Недостатками способа являются ограниченная производительность из-за необходимости анализировать последовательно сигналы от каждой микрочастицы и ограниченная чувствительность из-за фоновой люминесценции.
Известно использование микрочастиц с множеством флуоресцентных меток для детектирования множества аналитов (заявка РСТ №01/13120, класс МПК G01N 33/58). Способ может быть использован для исследования биологических жидкостей а также образцов, взятых из окружающей среды, воды или воздуха, промышленных источников, сточных вод и т. Способ основан на использовании микрочастиц строго фиксированного размера, имеющих на своей поверхности одну или более популяций флуоресцентно меченых наночастиц. При этом на микрочастицы наносят либо несколько видов наночастиц, равное количеству детектируемых аналитов, либо различные концентрации одних и тех же наночастиц. Изменяя количество и соотношение различных популяций наночастиц, устанавливают и различают большое число дискретных популяций частиц-носителей с одинаковым спектром эмиссии и соответственно выявляют большое число искомых аналитов. Анализ осуществляют в проточном цитометре, скорость обработки сигналов равна 2000 частиц в секунду.
Недостатками способа являются ограниченная мультиплексность системы из-за невозможности спектрально различать большое число частиц, отличающихся соотношением двух флуорохромов в частице, и низкое быстродействие, обусловленное использованием методов проточной цитометрии для анализа.
Известен способ проведения иммуноанализа с использованием двух частиц (патент США №6096563, класс НКИ 436/523), Способ может быть использован для анализа биологических образцов, а также для определения различных загрязнителей окружающей среды. Детектирование осуществляется невооруженным глазом или колориметром, рефрактометром. Сущность способа заключается в том, что на поверхность пористой мембраны наносят реакционную смесь, содержащую первые связывающие молекулы, специфичные к аналиту, исследуемый образец и частицы, покрытые вторыми связывающими молекулами, также специфичными к аналиту, но не способными пройти через поры мембраны. Затем на мембрану наносят детектирующие частицы, которые могут пройти через поры мембраны, эти частицы покрыты связывающим веществом, которое связывает детектирующие частицы с первыми связывающими молекулами, например вторыми антителами. В присутствии аналита в образце на поверхности мембраны образуется биоспецифический комплекс, который удерживается на поверхности мембраны и детектируется с помощью колориметра. Покрытые и детектирующие частицы могут отличаться цветом и размером и выполнены из разных материалов. В качестве покрытых и детектирующих частиц коммерчески выгодно использовать латексы.
Недостатком способа является ограниченная мультиплексность анализа и то, что регистрация сигнала от детектирующих молекул осуществляется колориметрически, что существенно ограничивает чувствительность анализа.
Наиболее близким является многопараметровый способ исследований с использованием различных категорий микрочастиц (ЕР №0617286, класс МПК G01N 33/533). Способ предназначен для определения множества аналитов в одном образце, в котором для маркирования (мечения) категорий микрочастиц, соответствующих различным аналитам, и для определения концентрации выявленных аналитов используют метки (флурохромы), имеющие долгоживущую флуоресценцию. В качестве флуорохромов используют редкоземельные металлы, например Eu, Sm, Tb, Dy. Способ заключается в том, что различные категории одинаковых по размеру и свойствам микрочастиц, меченных флуоресцентными молекулами (метками) и покрытых биоспецифическими (биоафинными) реагентами для связывания аналитов, смешивают с исследуемым образцом и биоспецифическим проявляющим (детектирующим) реагентом, также меченным флуоресцентной меткой, проводят биоспецифическую реакцию, возбуждают флуоресценцию всех флуорохромов и измеряют эмиссию флуоресценции для идентификации категорий микрочастиц и для определения концентрации искомых аналитов. Анализ проводят, используя регистрацию флуоресцентных сигналов в режиме временного разрешения. Микрочастицы и детектирующий реагент метят флуорохромами, испускающими долгоживущую флуоресценцию на различных длинах волн. Использование различных сочетаний концентраций флуорохромов для мечения микрочастиц позволяет выявлять большое количество аналитов в широком диапазоне концентраций.
Недостатком способа является взаимовлияние сигналов от флуорохромов, используемых для указания «адреса» (категорий) частиц и флуорохромов, используемых для детектирования аналитов в пробе, что не позволяет выявлять аналиты в широком диапазоне изменения концентраций аналитов. Кроме того, недостатком способа является необходимость использования одинаковых по размеру и свойствам микрочастиц, что усложняет и удорожает технологию их производства, а методы измерения сигналов, используемые в способе, не позволяют проводить одновременную регистрацию флуоресценции микрочастиц, что сказывается на быстродействии способа.
Задачей является создание быстрого способа обнаружения и количественного детектирования большого количества искомых аналитов в широком динамическом диапазоне анализируемых концентраций при проведении иммунохимических и клинических анализов, скрининге биологически активных соединений, генетических исследованиях и т.п.
Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является снижение взаимовлияния флуорохромов, обеспечивающих мультиплексность анализа, и флуорохромов, используемых для выявления аналита, при параллельном измерении сигналов от массива частиц, что приводит к увеличению динамического диапазона измеряемых концентраций выявляемых аналитов.
Технический результат достигается предлагаемым изобретением.
Сущность изобретения достигается тем, что в способе многоаналитного анализа с использованием микрочастиц, включающем смешивание различных категорий микрочастиц, покрытых биоспецифическими реагентами для связывания различных искомых аналитов и меченных одним или несколькими флуорохромами в различных концентрациях, испускающими долгоживущую флуоресценцию, добавление к смеси микрочастиц исследуемого образца и биоспецифического проявляющего реагента, меченного детектирующим флуорохромом, проведение реакции для образования биоспецифических комплексов, возбуждение флуорохромов и измерение в режиме временного разрешения количества долгоживущей эмиссии флуоресценции для идентификации категорий микрочастиц и количества эмиссии флуоресценции для измерения количества искомых аналитов, образовавшиеся биоспецифические комплексы осаждают на твердофазный носитель, эмиссию флуоресценции всех флуорохромов возбуждают источниками излучения в двух спектральных диапазонах, для мечения биоспецифического проявляющего реагента используют детектирующий флуорохром с короткоживущей флуоресценцией, область возбуждения флуоресценции которого находится вне областей возбуждения флуоресценции флуорохромов с долгоживущей флуоресценцией, при этом соотношение концентраций флуорохромов с долгоживущей флуоресценцией в микрочастицах для определения одного вида аналитов постоянно, а для определения разных видов аналитов соотношение концентраций различается по крайней мере в два раза.
Сущность изобретения достигается также тем, что в качестве детектирующих флуорохромов используют фикоэритрин, Су5, NIRD750 NHS, NIRD782 NHS и другие флуорохромы, испускающие короткоживущую флуоресценцию.
Сущность изобретения достигается также и тем, что для мечения категорий микрочастиц используют длительно флуоресцирующие комплексы ионов Eu, Sm, Tb, Dy и других редкоземельных элементов.
Сущность изобретения достигается также тем, что для мечения категорий микрочастиц используют длительно флуоресцирующие металлокомплексы копропорфирина, уропорфирина, протопорфирина, тетрафенилпорфирина и других порфиринов и их производных с центральными атомами платины, палладия, меди, цинка, алюминия и других металлов, обладающих замедленной флуоресценцией или фосфоресценцией при комнатной температуре.
Сущность изобретения достигается также и тем, что для биоспецифического связывания аналитов в качестве проявляющих реагентов используют полимерные наночастицы диаметром 40-150 нм, содержащие флуорохромы с коротким временем затухания флуоресценции и связанные с молекулами, обладающими высоким аффинитетом по отношению к искомым аналитам.
Сущность изобретения достигается также и тем, что в качестве различных категорий микрочастиц используют латексные частицы диаметром 0,5-5 микрон.
Авторам не известен способ, обладающий заявляемой совокупностью признаков, следовательно, предлагаемое техническое решение соответствует критерию "новизна"
Известны способы проведения многоаналитного анализа с использованием множества категорий окрашенных микрочастиц. В патентах США №5891738, класс НКИ 436/50 и №5028545, класс НКИ 435/501 и в заявке РСТ 01/13120, класс МКИ G01N 33/58 описаны способы, в которых для идентификации категорий микрочастиц и соответственно, аналитов используют флуоресцентные вещества (флуорохромы) с коротким временем затухания флуоресценции, а для детектирования концентрации аналита используют флуоресцентные вещества с длительным временем затухания флуоресценции, в частности хелаты лантанидов редкоземельных элементов (европия, тербия и др.), либо наоборот. В известных способах многоаналитного детектирования используют либо количество видов частиц, равное количеству детектируемых аналитов, либо различные концентрации одних и тех же частиц. Осуществление указанных выше способов требует либо сложных оптических устройств (спектрофлуориметры с двухфотонным возбуждением и измерением эмиссии флуоресценции, с использованием конфокальных оптических систем, микроскопы с CCD-камерами) либо дорогостоящих методов проточной цитометрии со сложной системой динамической фокусировки потока, с несколькими источниками излучения и несколькими детекторами сигналов. Мультиплексность указанных способов ограничена из-за перекрытия спектров эмиссии флуорохромов, используемых для маркирования категорий микрочастиц. По сравнению с известными техническими решениями в предлагаемом способе указанный выше технический результат может быть получен за счет предлагаемой совокупности признаков. Способ не требует использования микрочастиц строго определенного размера, так как категория каждой частицы определяется только соотношением флуорохромов, а не их абсолютным количеством, это позволяет создавать набор микрочастиц с соотношением концентраций в пределах четырех порядков - от 100:1 до 1:100. Предлагаемая совокупность признаков позволяет увеличить мультиплексность и быстродействие анализа, упрощает и удешевляет способ. Следовательно, заявляемое техническое решение соответствует критерию "уровень техники".
Изобретение может быть использовано для детектирования, идентификации и количественного определения аналитов, которые способны специфически связываться с лигандами, в частности биологических материалов, таких как биологически активные химические соединения, пептиды, белки, антигены, микроорганизмы и нуклеиновые кислоты. Способ может быть использован для прямых и конкурентных схем иммуноанализа. В частности, способ может быть использован для серодиагностики инфекционных заболеваний, детектирования низкой концентрации гормонов, микроорганизмов, их специфических генов, видов или серотипов в изолированной форме или в качестве контаминантов пищи, окружающей среды, образцов судебной экспертизы. Способ позволяет проводить высокопроизводительный анализ с использованием промышленно выпускаемых микропланшетов, стандартного оборудования для промывки и подготовки проб к анализу, на его основе могут быть созданы простые устройства, в том числе и переносные, на доступной элементной базе. Следовательно, заявляемое изобретение соответствует критерию "промышленная применимость".
На фиг.1 показаны спектры возбуждения и эмиссии флуорохромов, используемых для указания категории (адреса) микрочастиц, т.е. для детектирования типа аналита: 1-хелатный комплекс Eu-флуорена, 2 - Pt-копропорфирин, 3 - Pd-копропорфирин.
На фиг.2 показана степень перекрытия спектров эмиссии Eu-флуорена, Pt-копропорфирина, Pd-копропорфирина и NIRD782 NHS в режиме временного разрешения сигнала, максимум возбуждения λ=380 нм, за 100% принят уровень сигнала флуорохрома, для которого данная длина волны является максимумом эмиссии: 4 - Eu-флуорен; 5 - Pt-копропорфирин; 6 - Pd-копропорфирин; 7 - NIRD782 NHS. при максимумах возбуждения Eu-флуорена - 615 нм, Pt-копропорфирина 645 нм, - Pd-копропорфирина 665 нм, NIRD782 NHS - 800 нм; режимы регистрации: длина волны 615 нм - длительность импульса возбуждения 600 микросекунд, время задержки строба 300 микросекунд, длительность строба 600 микросекунд; длина волны 645 нм - длительность импульса возбуждения - 40 микросекунд, время задержки строба - 40 микросекунд, длительность строба - 80 микросекунд; длина волны 665 нм - длительность импульса возбуждения 1000 микросекунд, время задержки строба 1000 микросекунд, длительность строба 1000 микросекунд; длина волны 800 нм - без режима временного разрешения.
На фиг.3 показана схема проведения мультиплексного анализа с использованием универсального конъюгата с флуорохромом: 8 - инкубация пробы со смесью биотинилированных антител и удаление несвязавшихся реагентов фильтрацией; 9 - инкубация пробы с универсальным проявляющим реагентом (стрептавидин, маркированный Су-5 или NIRD782) и удаление несвязавшихся реагентов фильтрацией; 10 - регистрация сигнала флуоресценции от отдельных микрочастиц; 11 - мембрана; 12 - микрочастицы с Pt-копропорфирином и Еu-флуореном для связывания 1-го вида аналита; 13 - лиганды для выявления 1-го вида аналита; 14 - микрочастицы с Pd-копропорфирином и Pt-копропорфирином для связывания 2-го вида аналита; 15 - лиганды для выявления 2-го вида аналита; 16 - микрочастицы с Pd-копропорфирином и Еu-флуореном для связывания 3-го вида аналита; 17 - лиганды для выявления 3-го вида аналита; 18 - молекулы Pd-копропорфирина в микрочастице; 19 - молекулы Eu-флуорена в микрочастице; 20 - молекулы Pt-копропорфирина в микрочастице; 21 - молекулы 1-го аналита в пробе (антитела искомого аналита); 22 - молекулы 2-го аналита в пробе; 23 - молекулы 3-го аналита в пробе; 24 - молекулы универсального лиганда для выявления аналитов в пробе, маркированные биотином; 25 - универсальный проявляющий реагент - стрептавидин, маркированный NIRD782 NHS, 26 - примеси пробы.
На фиг.4 показаны результаты определения антител к клещевому энцефалиту в 20 образцах сыворотки крови человека по сравнению с результатами иммуноферментного определения антител с помощью коммерческих тестов. По оси ординат указана оптическая плотность в иммуноферментных тестах, по оси абсцисс - интенсивность сигнала эмиссии флуоресценции детектирующего флуорохрома от анализируемых микрочастиц, обработанных антигеном для выявления антител к клещевому энцефалиту.
На фиг.5 показаны результаты определения антител к бореллиям в 20 образцах сыворотки крови человека по сравнению с результатами иммуноферментного определения с помощью коммерческих тестов. По оси ординат указана оптическая плотность в иммуноферментных тестах, по оси абсцисс - интенсивность сигнала эмиссии флуоресценции детектирующего флуорохрома от анализируемых микрочастиц, обработанных антигеном для выявления антител к возбудителю Лайм-бореллиоза.
На фиг.6 показаны результаты определения антител к возбудителю сифилиса в 20 образцах сыворотки крови человека по сравнению с результатами иммуноферментного определения с помощью коммерческих тестов. По оси ординат указана оптическая плотность в иммуноферментных тестах, по оси абсцисс-интенсивность сигнала эмиссии флуоресценции детектирующего флуорохрома от анализируемых микрочастиц, обработанных антигеном для выявления антител к возбудителю сифилиса.
На фиг.7 показаны результаты определения тиреотропного гормона в 25 образцах сывороток крови новорожденных по сравнению с результатами определения с помощью лантанидного иммунофлуоресцентного метода с использованием коммерческих тестов DELFIA. По оси ординат - интенсивность сигнала эмиссии флуоресценции ионов европия в системе DELFIA; по оси абсцисс - интенсивность сигнала эмиссии флуоресценции детектирующего флуорохрома от анализируемых микрочастиц, обработанных антителами к тиреотропному гормону.
На фиг.8 показаны результаты определения тироксина в 25 образцах сывороток крови новорожденных по сравнению с результатами определения с помощью коммерческих тестов методом DELFIA. По оси ординат - интенсивность сигнала эмиссии флуоресценции ионов европия в системе DELFIA; по оси абсцисс - интенсивность сигнала эмиссии флуоресценции детектирующего флуорохрома от анализируемых микрочастиц, предназначенных для выявления тироксина.
На фиг.9 показаны результаты определения 17 гидроксипрогестерона в 25 образцах сывороток крови новорожденных по сравнению с результатами определения с помощью коммерческих тестов методом DELFIA. По оси ординат - интенсивность сигнала эмиссии флуоресценции ионов европия в системе DELFIA; по оси абсцисс - интенсивность сигнала эмиссии флуоресценции детектирующего флуорохрома от анализируемых микрочастиц, предназначенных для выявления 17 гидроксипрогестерона.
На фиг.10 показаны результаты определения иммунореактивного трипсина в 25 образцах пятен крови новорожденных по сравнению с результатами определения с помощью коммерческих тестов методом DELFIA. По оси ординат - интенсивность сигнала эмиссии флуоресценции ионов европия в системе DELFIA; по оси абсцисс - интенсивность сигнала эмиссии флуоресценции детектирующего флуорохрома от анализируемых микрочастиц, предназначенных для выявления иммунореактивного трипсина.
Проведение анализа на примере выявления антител при серодиагностических исследованиях включает следующие стадии (см. фиг.3): 8 - инкубация пробы со смесью биотинилированных антител и удаление несвязавшихся реагентов фильтрацией; 9 - инкубация пробы с универсальным проявляющим реагентом (стрептавидин, маркированный Су-5 или NIRD782 NHS) и удаление несвязавшихся реагентов фильтрацией; 10 - регистрация сигнала флуоресценции от отдельных микрочастиц. Регистрацию осуществляют на мембране 11. Для связывания 1-го вида аналита используют микрочастицы 12 с соотношением концентраций двух длительно флуоресцирующих флуорохромов Pt-копропорфирин/Eu-флуорен - 1:1. В качестве лигандов для выявления 1-го вида аналита используется сахарозо-ацетоновый антиген вируса клещевого энцефалита 13. Для выявления второго аналита используют микрочастицы 14 с соотношением концентраций двух длительно флуоресцирующих флуорохромов Pd-копропорфирин/Pt-копропорфирин - 1:1. В качестве лигандов для выявления 2-го вида аналита используют пептид 15 С6. Для выявления третьего вида аналита используют микрочастицы 16 с соотношением концентраций двух длительно флуоресцирующих флуорохромов Pd-копропорфирин/Eu-флуорен - 1:1. В качестве лигандов 17 для связывания антител к возбудителю сифилиса используют смесь рекомбинантных белков. Соотношение молекул Pd-копропорфирина - 18, Eu-флуорена 19, Pt-копропорфирина 20 в микрочастице задается с учетом их молярного коэффициента экстинкции на длине волны возбуждения 380 нм и квантового выхода излучения (эмиссии). Для выявления молекул первого аналита 21, молекул второго аналита 22 и молекул третьего аналита 23 в пробе используют конъюгат биотинилированных антител кролика против иммуноглобулинов человека. Биотинилированные антитела 24 являются универсальным реагентом для выявления всех трех аналитов. Концентрацию каждого из выявляемых аналитов определяют с помощью универсального проявляющего реагента 25 стрептавидина, маркированного СУ-5 или NIRD782. Непрореагировавшие компоненты пробы и примеси 26 удаляют фильтрацией.
2
Для проведения иммуноанализа используют 96-ячеистые микротитровальные платы (Millipore, USA) с дном ячеек площадью 30-36 мм, выполненным из фильтрующего полимерного мембранного материала (полипропилен, полиметилметакрилат) с диаметром пор меньше, чем диаметр микрочастиц - 0,2-0,4 микрона. Пробы сывороток в разведении 1:100 смешивают в равных объемах с суспензией микрочастиц и помещают в лунки микропланшета с мембранными фильтрами Unipor фирмы Biorad с диаметром пор 0,2 мкм. Инкубируют в течение 15 минут, фильтруют через пористое дно лунок микропланшета и вносят конъюгат специфических антител с флуоресцентной меткой Су-5 или NIRD782 в объеме 200 микролитров на лунку. Инкубируют в течение 10 минут, промывают осажденные микрочастицы буферным раствором, а затем высушивают под струей воздуха в течение 2-3 минут. Микропланшет с обработанными образцами проб помещают в сканирующий фосфоресцентный анализатор и измеряют сигналы люминесценции от микрочастиц, иммобилизованных на мембранном фильтре дна лунок. Распределение сигнала от каждой из микрочастиц регистрируют в спектральных и временных интервалах, оптимальных для регистрации эмиссии каждого из флуорохромов. Сканирование дна ячейки микропланшета осуществляют с разрешением микроплощадок 30×30 мкм в режиме временного разрешения люминесценции с выделением длительной флуоресценции (фосфоресценции) в диапазоне от 40 до 100 микросекунд при длине волны максимума эмиссии 645 нм для Pt-копропорфирина; с выделением длительной флуоресценции в диапазоне от 400 до 700 микросекунд при длине волны 615 нм для хелата Еu и 665 нм для Pd-копропорфирина. Суммируют сигналы флуоресценции Су-5 или NIRD782 от микрочастиц одного сорта и рассчитывают средний уровень сигнала в расчете на одну частицу. Как видно из фиг.1, область возбуждения длительно флуоресцирующих соединений (флуорохромов) ограничена максимальной длиной волны 600 нм, спектральная область эмиссии этих соединений расположена в диапазоне 540-750 нм, а спектры эмиссии флуоресценции перекрываются. В максимуме эмиссии каждого из флуорохромов присутствует флуоресценция других флуорохромов, вклад которых может достигать 1%. Для определения концентрации аналитов в предлагаемом способе использованы вещества с коротким временем затухания флуоресценции, спектральные области возбуждения и эмиссии которых находятся вне спектрального диапазона возбуждения и эмиссии длительно флуоресцирующих флуорохромов. При этом сигналы от флуорохромов с длительной флуоресценцией, используемых для идентификации категорий микрочастиц (вида аналита), измеряют в режиме временного разрешения с учетом постоянных времени затухания эмиссии. Одновременно с этими сигналами измеряют сигналы короткоживущей флуоресценции флуорохрома, используемого для выявления концентрации аналита, возбуждаемого при другой длине волны. Это исключает влияние эмиссии флуоресценции флуорохромов с длительным временем затухания флуоресценции на сигналы эмиссии флуоресценции флуорохромов с коротким временем затухания флуоресценции, повышает мультиплексность анализа и расширяет динамический диапазон измеряемых концентраций искомых аналитов за счет возможности измерения низких концентраций. Сигналы эмиссии всех флуорохромов от всего массива микрочастиц, находящихся на твердой фазе, измеряют одновременно на сканирующем фосфоресцентном анализаторе. В качестве флуорохромов с коротким временем затухания флуоресценции могут быть использованы фикоэритрин, Су5, NIRD782 NHS (N-Hydroxysuccinamide) и другие флуорохромы, максимум возбуждения и эмиссии которых находится вне диапазона возбуждения эмиссии длительно флуоресцирующих соединений, используемых для создания категорий микрочастиц. Например, NIRD782 NHS имеет длинноволновый максимум возбуждения в области 780 нм и максимум излучения на длине волны 800 нм, что исключает возможность возбуждения флуорохромов с длительной флуоресценцией, используемых для указания категории микрочастиц.
Из фиг.2 (поз.4, 5, 6, 7) видно, что эмиссия флуорохромов, используемых для выявления концентрации аналитов, не влияет на эмиссию флуорохромов, используемых для адресных частиц, и наоборот. В качестве проявляющего реагента могут быть использованы полимерные наночастицы диаметром 40-150 нм, включающие флуорохромы с коротким временем затухания флуоресценции и связанные с молекулами, обладающими высоким аффинитетом по отношению к искомым аналитам.
Пример 1. Выявление в пробах сывороток крови человека антител к возбудителям клещевого энцефалита, болезни Лайма, сифилиса с помощью универсального проявляющего реагента
3
Eu
p1KP
PdKP
PtKP
PdKP
Eu
При проведении анализа в качестве фосфоресцентной метки использовали Pt-копропорфирин и Pd-копропорфирин, в качестве длительно флуоресцирующих меток использовали хелатные комплексы ионов европия. Для анализа используют меламинформальдегидные микрочастицы ЗАО «Иммуноскрин» (ТУ 2634-015-49941990-03) диаметром от 0,5 до 5 микрон в концентрации 3·10 на пробу (0,1-0,3 мл), содержащие "адресные" длительно флуоресцирующие флуорохромы, используемые для кодирования категорий микрочастиц, спектральные характеристики возбуждения и эмиссии которых представлены на фиг.1. Заранее готовят набор микрочастиц, каждая из которых включает два из трех следующих флуорофоров: флуорофор 1 - хелат с ионом европия-флуорена, флуорофор 2 - платина-копропорфирин и флуорофор 3 - палладий-копропорфирин. Для выявления антител к трем вышеперечисленным аналитам используют три вида микрочастиц, отличающихся соотношением входящих в них длительно флуоресцирующих флуорофоров. Первые микрочастицы диаметром от 0,9 до 1,3 микрона с соотношением показателей светимости (произведения квантового выхода на молярный коэффициент экстинкции на длине волны 380 нм) εφ/εφ=1; вторые микрочастицы диаметром от 1,6 до 2,1 микрона с соотношением показателей светимости εφ/εφ=1; третьи микрочастицы диаметром от 4,3 до 5 микрон с соотношением показателей светимости εφ/εφ=1. При проведении анализа использованы образцы от доноров с низким содержанием специфических антител, а также по 3 образца с высоким содержанием специфических антител к антигенам клещевого энцефалита, антигенам к возбудителю болезни Лайма и антигенам к возбудителю сифилиса.
Микрочастицы обрабатывают специфическими антигенами (рекомбинантными белками) для специфического связывания иммуноглобулинов из образцов сывороток крови. Антигены иммобилизуют на поверхности микрочастиц по стандартным методикам путем адсорбции или ковалентного связывания через карбоксильные группы полимера, несвязавшиеся (свободные) антигены удаляют стандартными процедурами, например путем осаждения микрочастиц центрифугированием или методом гельфильтрации. При этом первую категорию микрочастиц обрабатывают антигенами для выявления антител к вирусу клещевого энцефалита, вторую категорию - антигенами для выявления антител к бореллиям - возбудителю болезни Лайма, третью категорию - антигенами к возбудителю сифилиса. Для выявления специфических антител при серодиагностических исследованиях микрочастицы первой категории для выявления первого аналита - антител к вирусу клещевого энцефалита - обрабатывают сахарозо-ацетоновым антигеном вируса клещевого энцефалита, микрочастицы второй категории для выявления второго аналита - антител к бореллиям - обрабатывают пептидом С6, микрочастицы третьей категории для выявления третьего аналита - антител к сифилису - обрабатывают смесью рекомбинантных белков. Подготовленные микрочастицы в виде смеси с концентрацией 5000 микрочастиц каждого сорта в расчете на 1 мл суспензии используют для анализа клинических образцов. Антивидовые антитела (антитела против иммуноглоублинов человека) маркированы флуорохромом NIRD782, длина волны возбуждения 780 нм, длина волны эмиссии 800 нм.
Из данных фиг.4, 5, 6 следует, что образцы сывороток, содержащие высокие титры (концентрации) антител к указанным возбудителям, имеют многократно более высокий сигнал флуоресценции детектирующих флуорохромов, а результаты мультиплексного анализа предлагаемым способом хорошо коррелируют с результатами иммуноферментного определения с помощью коммерческих тестов, при этом выявление антител предлагаемым способом осуществляется в 1000-кратном диапазоне изменения флуоресцентных сигналов, т.е. концентрации аналитов.
Пример 2. Выявление в пробах сывороток крови человека антител к возбудителям клещевого энцефалита, болезни Лайма и сифилиса
Eu
ptKP
PdKP
PtKP
PdKP
Eu
Способ анализа осуществляется аналогично тому, как описано в примере 1. При осуществлении способа используют смесь микрочастиц такого же размера, как и в примере 1, но с другим соотношением флуорохромов: для выявления антител клещевого энцефалита используют микрочастицы с соотношением εφ/εφp=1:100, для выявления антител бореллий используют микрочастицы с соотношением εφ/εφ=1:100, для выявления антител возбудителя сифилиса используют микрочастицы с соотношением εφ/εφ=1:50. В качестве проявляющего биоспецифического реагента используют антивидовые кроличьи антитела против иммуноглобулинов человека, связаны с наночастицами диаметром от 40 до 150 нм, включающие Су-5, длина волны возбуждения 710 нм, длина волны эмиссии 740 нм. Полученные результаты аналогичны результатам, показанным на фиг.4, 5, 6; изменение соотношения флуорохромов в 100 раз не привело к искажению результатов анализа, при этом детектируемый сигнал от образцов увеличивается пропорционально увеличению содержания флуорохрома СУ-5. Это свидетельствует о возможности создания большого числа комбинаций из нескольких флуорохромов в широком динамическом диапазоне концентраций и повышении надежности регистрации низких концентраций аналитов.
Пример 3. Количественное определение содержания маркеров врожденного гипотиреоза - тиротропина и тироксина, адреногенитальной гиперплазии - 17 гидроксипрогестерона и муковисцидоза - иммунореактивного трипсина в образцах из сухих пятен крови
Для проведения анализа использовали специально подобранную группу из 25 образцов крови новорожденных, в том числе включающую по 4 образца с содержанием указанных маркеров в несколько раз выше нормальных значений для группы здоровых новорожденных. Образцы получены путем экстракции материала из сухих пятен крови, нанесенных на фильтровальную бумагу. Для выявления аналитов микрочастицы, приготовленные в соответствии с примером 1, обрабатывают специфическими реагентами. Для определения тиротропина микрочастицы обрабатывают коммерческими моноклональными антителами. Для определения тироксина микрочастицы обрабатывают БСА, конъюгированным с тироксином. Для определения 17 гидроксипрогестерона микрочастицы обрабатывают БСА, конъюгированным с 17 гидроксипрогестероном. Для определения иммунореактивного трипсина микрочастицы обрабатывают моноклональными антителами, специфичными к иммунореактивному трипсину. Пробы сывороток смешивают в равных объемах с суспензией микрочастиц, вносят конъюгаты антител к тиреотропному гормону, тироксину, 17 гидроксипрогестерону и иммунореактивному трипсину и смесь помещают в лунки микропланшета с мембранными фильтрами Unipor фирмы Biorad с диаметром пор 0,2 мкм. Инкубируют в течение 25 минут, фильтруют через пористое дно лунок микропланшета и вносят смесь биотинилированных конъюгатов специфических антител с флуоресцентной меткой NIRD782 в объеме 200 микролитров на лунку. Инкубируют в течение 10 минут, промывают осажденные микрочастицы буферным раствором, а затем высушивают под струей воздуха. Микропланшет с обработанными таким образом микрочастицами анализируют на сканирующем фосфоресцентном анализаторе. Для количественной оценки содержания аналитов в пробе предварительно строят калибровочные графики. Для этого используют образцы сывороток с заведомо заданными концентрациями реагентов.
На фиг.7 представлены результаты определения тиреотропного гормона в 25 образцах сывороток крови новорожденных по сравнению с результатами определения с помощью коммерческих тестов методом DELFIA. На фиг.8 представлены результаты определения тироксина в 25 образцах сывороток крови по сравнению с результатами определения с помощью коммерческих тестов методом DELFIA. На фиг.9 представлены результаты определения 17 гидроксипрогестерона в 25 образцах пятен крови новорожденных по сравнению с результатами определения с помощью коммерческих тестов методом DELFIA. На фиг.10 представлены результаты тестирования образцов крови новорожденных для определения трипсина по сравнению с результатами определения с помощью коммерческих тестов методом.
Из данных фиг.7, 8, 9 и 10 следует, что результаты мультиплексного анализа предлагаемым способом с использованием микрочастиц при соотношении флуорохромов, изменяющемся в широком диапазоне концентраций, хорошо коррелируют с результатами иммунолюминесцентного лантанидного иммуноанализа с помощью коммерческих тестов.