МИКРОМЕХАНИЧЕСКИЕ СПОСОБЫ И УСТРОЙСТВА ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ АНАЛИЗОВ
MICROMECHANICAL WAYS AND DEVICES FOR CARRYING OUT OF ANALYSES

Сведения о родственной заявке
Эта заявка претендует на преимущество предварительной патентной заявки США №60/515751, поданной 29 октября 2003 г., которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к устройствам микроструйной техники для проведения анализов для определения присутствия одного или нескольких выбранных анализируемых веществ в образце.
Уровень техники
Качественные и количественные иммуно- и химические анализы заслужили признание в качестве важных инструментов в медицинской и пищевой промышленности. Эти способы использовались для диагностики патологических состояний, выявления анализируемых веществ и для обнаружения микробов, таких как бактерии. Эти способы диагностики имеют установленную эффективность, и они облегчили врачам контроль над состоянием больных и ведение пациентов, подвергающихся различным видам лечения.
Традиционно диагностические анализы выполнялись в больничных и клинических учреждениях, и они связаны с использованием высокотехнологичного и дорогого оборудования, которое требует работы специально подготовленного персонала. Кроме того, результаты анализа иногда недоступны в течение дней или недель после получения образцов у пациентов. Имеющиеся в настоящее время диагностические анализы являются, таким образом, дорогостоящими, требующими длительного времени и неудобными.
Предпринимались попытки разработать менее дорогостоящие анализы. Например, обычный домашний самостоятельный тест для выявления компонентов крови требует, чтобы пациент проколол палец стерилизованным ланцетом, нанес каплю образца крови на зону нанесения образца на одноразовой пластинке и затем ожидал результатов. Анализы, при которых используются другие биологические жидкости, такие как моча, по существу работают аналогичным образом. Эти устройства сконструированы так, что средний неспециалист может правильно выполнить анализы при незначительной подготовке. Однако эти аналитические устройства в целом характеризуются низкой точностью или требуют выполнения ряда подготовительных стадий, которые могут исказить результаты теста и, таким образом, являются неподходящими.
В патенте США №5580794 на имя Allen Michael, описано электронное аналитическое устройство однократного использования, которое анализирует определенные анализируемые вещества в данном образце. В патенте США №4806312, выданном Greenquist, описан многозональный аналитический элемент, имеющий зону концентрации выявляемого сигнала. В патенте США №4627445 на имя Garcia et al. описано ручное портативное медицинское диагностическое устройство для контрольного измерения глюкозы крови, азота мочи, гемоглобина или компонентов крови, в котором упаковка одноразового игольчатого или ланцетного зонда содержит пластинку с химическим реагентом, таким как химические вещества, взаимодействующие с кровью, визуальное считывающее устройство и компьютерное устройство.
В патенте США №4197734 на имя A.Rosenberg описано устройство для измерения времени свертывания крови. Устройство включает опорную раму, которая поддерживает шприц, содержащий образец крови, и вращающийся столик. Кровь из шприца капает на вращающийся столик, где автоматически графически изображается время свертывания на диаграмме, которая вращается на вращающемся столике. Устройство можно также использовать для определения изменений вязкости плазмы крови и других жидкостей.
В патенте США №3486859 на имя Greiner et al. описано устройство, включающее держатель с двойной ручкой с камерами с жидким реагентом для крови, которые соединены друг с другом через маленький капиллярный трубопровод. Обеспечен воздушный насос для подачи меняющегося давления в одну из камер для осуществления периодического смешивания жидкостей через капиллярный канал. Индикаторные средства включены для выявления прогрессирующего ограничения капиллярного канала после свертывания крови.
Описанные выше способы имеют несколько ограничений, которые делают использование их в домашних условиях крайне затруднительным. Некоторые способы требуют специальных приготовлений и манипуляций с кровью, делая их подходящими для центральной клиники с хорошо подготовленным персоналом, в то время как другие являются дорогими или неточными. Таким образом, существует необходимость в аналитических устройствах для выявления анализируемых веществ, которые являются точными, удобными и недорогими.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к способам и микротехнологическим устройствам для проведения анализов для определения присутствия одного или нескольких заданных анализируемых веществ в образце. Устройство включает одноразовую пластиковую пластинку, которую можно вставлять в портативный, ручной тестирующий аналитический прибор. Пластинка изолирует образец так, что он не контактирует с прибором, и образец не загрязняется.
Одноразовая пластинка по настоящему изобретению может иметь множество ограниченных ячеек на твердой подложке. Лунки могут быть соединены капиллярным каналом. Поверхность ячеек и капиллярные каналы могут быть покрыты реагентами для содействия втягиванию жидкого образца из лунки с образцом в реакционную лунку. Внутри, по меньшей мере, одной из реакционных камер находится, по меньшей мере, один магнитный перемешивающий брусок, который может притягиваться магнитом и вытягиваться магнитным движущим устройством, расположенным снаружи от пластинки в тестирующем аналитическом приборе. Магнитный перемешивающий брусок способен совершать движения, которые смешивают компоненты взаимодействия, смещают компоненты взаимодействия, обменивают или систематически доставляют реагенты к мишеням в кассете и т.п.
Пластинка может быть помещена на портативный ручной прибор, имеющий датчики, предназначенные для выявления и/или количественного определения присутствия анализируемого вещества в реакционных лунках пластинки, в то же самое время реагируя на физически выявляемые изменения, продуцирующие сигналы, которые коррелируются с присутствием и количеством выбранного анализируемого вещества в образце. Реагенты могут включать устройство выявления, посредством которого возникает выявляемый результат в связи с присутствием анализируемого вещества. Сигнал может превращаться в выходной сигнал на окне визуального дисплея на наружной части основания.
Для тестирования образца одноразовая пластинка может вставляться в основание, и капля образца может помещаться в лунку пластинки для нанесения образца. Образец может быть втянут в реакционную лунку через внутренние каналы. По мере того как образец втягивается в реакционные лунки, датчики выявляют движение и активируют магнитный перемешивающий брусок в соответствующие моменты времени, что приводит к смешиванию реагентов внутри лунки для образца. Для определенных по времени анализов микропроцессор, содержащийся внутри основания, начинает отсчет времени, в то время как датчики, которые могут быть электрическими или оптическими, проводят мониторинг различных частей пластинки для выявления специфических реакций анализируемого вещества. При выявлении и/или количественном анализе результаты представляются в качественном или количественном виде в соответствующих единицах в окне дисплея на основании.
Движение и датчики могут регулироваться микропроцессором. Устройство нагревателя может активироваться в основании для чувствительных к температуре анализов, таких как тесты свертывания, и температура может поддерживаться постоянной или изменяться заданным образом в течение анализа.
В одном аспекте изобретения описана пластинка, причем одноразовая пластинка включает первый твердый субстрат, включающий лунку сбора образца, эталонную лунку и реакционную лунку, причем лунки находятся в жидкостном сообщении через первые капиллярные каналы; и второй твердый субстрат, включающий отверстия, где первый твердый субстрат и второй твердый субстрат соединяются, и отверстия сообщаются с лунками.
В другом аспекте изобретения описана одноразовая пластинка, включающая первый твердый субстрат, включающий лунку для нанесения образца, эталонную лунку и реакционную лунку, причем лунки находятся в жидкостном сообщении через капиллярные каналы, и причем эталонная лунка включает первый лизирующий агент, а реакционная лунка включает второй лизирующий агент, антитело и перемешивающий брусок; второй твердый субстрат, включающий отверстия, где первый твердый субстрат и второй твердый субстрат соединяются, и отверстия сообщаются с лунками; и мембрану, имеющую зону захвата, причем мембрана соединена с реакционной лункой через второй капиллярный канал.
В еще одном аспекте изобретение относится к способу определения процентного содержания гемоглобина, который представляет собой HbA1с, причем способ включает предоставление одноразовой пластинки, включающей первый твердый субстрат, включающий лунку для образца, эталонную лунку и реакционную лунку, причем лунки находятся в жидкостном сообщении через первый капиллярный канал и причем эталонная лунка включает первый лизирующий агент, а реакционная лунка включает второй лизирующий агент, специфическое антитело к HbA1с и перемешивающий брусок; второй твердый субстрат, включающий отверстия, где первый твердый субстрат и второй твердый субстрат соединяются, и отверстия сообщаются с лунками; и мембрану, имеющую зону захвата, причем мембрана соединена с реакционной лункой через второй капиллярный канал; помещение образца в лунку для нанесения образца; добавление разбавителя в лунку для нанесения образца; определение общего гемоглобина из эталонной лунки и общего HbA1с из зоны захвата; и деление общего HbA1с на общий гемоглобин для получения процентного содержания гемоглобина, который представляет собой HbA1с.
Эти и другие аспекты настоящего изобретения станут очевидными после ссылки на следующее подробное описание. Кроме того, здесь представлены различные ссылки, которые подробнее описывают определенные процедуры или композиции и поэтому полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки.
Краткое описание чертежей
Фиг.1 иллюстрирует вид в перспективе одноразовой пластинки с набором соединенных между собой реакционных камер со смещаемым элементом в одной из камер.
Фиг.2 иллюстрирует другой вид одноразовой пластинки, включающей композит мембран, собранных для изоляции компонентов крови и направления желательного анализируемого вещества в соответствующие зоны захвата.
Фиг.3 иллюстрирует вид в перспективе основных компонентов в базовом устройстве, как подробно описано ниже.
Подробное описание
I. Определения
При отсутствии других указаний, следующие термины, используемые в данной заявке, включая описание и формулу изобретения, имеют приведенные ниже значения. Следует отметить, что если из контекста однозначно не следует обратное, используемые в описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа “один”, “некий” и “Этот” включают их соответствующие формы множественного числа.
Все приведенные здесь публикации, патенты и патентные заявки полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки.
Используемый здесь термин “субъект” охватывает млекопитающих и немлекопитающих. Примеры млекопитающих включают, но не ограничиваются этим, любых представителей класса млекопитающих: людей, приматов, кроме человека, таких как шимпанзе, и другие виды обезьян; сельскохозяйственных животных, таких как крупный рогатый скот, лошади, овцы, козы, свиньи; домашних животных, таких как кролики, собаки и кошки; лабораторных животных, включая грызунов, таких как крысы, мыши и морские свинки и т.п. Примеры немлекопитающих включают, но не ограничиваются этим, птиц, рыб и им подобных. Термин не подразумевает определенный возраст или пол.
rd
Используемый здесь термин “антитело” включает, но не ограничивается этим, полипептид, по существу кодируемый геном иммуноглобулина или генами иммуноглобулина или их фрагментами, которые специфически связываются с анализируемым веществом (антигеном) и распознают его. “Антитело” также включает, но не ограничивается этим, полипептид, по существу кодируемый геном иммуноглобулина или генами иммуноглобулина или их фрагментами, которые специфически связываются и распознают антиген-специфическую область связывания (идиотип) антител, продуцируемых хозяином, в ответ на контакт с антигеном (антигенами) Trichomonas. Примеры включают поликлональные, моноклональные, химерные, гуманизированные и одиночноцепочечные антитела и т.п. Фрагменты иммуноглобулинов включают фрагменты Fab и фрагменты, продуцируемые библиотекой экспрессией, включая представление фага. (Структуру и терминологию антител см., например, в публикации Paul, Fundamental Immunology, 3 Ed., 1993, Raven Press, New York.)
Термины “специфически связывается с” или “специфически иммунореактивен с” относятся к реакции связывания, которая определяет присутствие анализируемого вещества-мишени в присутствии неоднородной популяции белков и других биологических веществ. Таким образом, в определенных условиях анализа указанные связывающиеся части предпочтительно связываются с определенным анализируемым веществом-мишенью и не связываются в значительном количестве с другими компонентами, присутствующими в тестируемом образце. Специфическое связывание с анализируемым веществом-мишенью в таких условиях может требовать связывающейся части, которая выбрана благодаря ее специфичности для определенного анализируемого вещества-мишени. Для отбора антител, специфически иммунореактивных с определенным антигеном, можно использовать различные виды иммуноанализа. Например, твердофазные иммуноферментные иммуноанализы (ELISA) широко используются для выбора моноклональных антител, специфически иммунореактивных с анализируемым веществом. Описание видов иммуноанализов и условий, которые можно использовать для определения специфической иммунореактивности, можно найти в руководстве Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York. Обычно специфическое или селективное взаимодействие обеспечивает соотношение между сигналом и шумом, по меньшей мере, вдвое превышающее фон, а обычно более чем в 10-100 раз превышающее фон.
Используемые здесь термины “метка” и “выявляемая метка” относятся к молекуле, способной к выявлению, включая, но не ограничиваясь этим, радиоактивные изотопы, вещества, обеспечивающие флюоресценцию, вещества, обеспечивающие хемилюминесценцию, хромофоры, ферменты, ферментные субстраты, ферментные кофакторы, ингибиторы ферментов, красители, ионы металлов, золи металлов, лиганды (например, биотин, авидин, стрепавидин или гаптены) и им подобные.
Используемый здесь термин “твердая подложка” относится к твердой поверхности, такой как пластиковая пластина, магнитный шарик, лунка титровочной микропланшеты, нейлон, агароза, акриламид и им подобные.
“Специфическое” в отношении связывания двух молекул или молекулы и комплекса молекул относится к специфическому распознаванию одной другой и образованию устойчивого комплекса по сравнению с по существу меньшим распознаванием других молекул и отсутствием образования устойчивых комплексов с такими другими молекулами. Примерами специфического связывания являются взаимодействия антител-антигенов, взаимодействия ферментов-субстратов, гибридизация полинуклеотидов и/или образование дуплексов, взаимодействия рецепторов-лигандов и т.д.
II. Обзор
Изобретение относится к одноразовой пластинке, которую можно использовать для выполнения качественных и количественных иммуно- и химических анализов. На пластинке имеются, по меньшей мере, 3 лунки, причем лунки могут находиться в жидкостном сообщении друг с другом через капиллярные каналы. В одну лунку помещается образец, предпочтительно образец жидкости для анализа. Жидкость образца движется в другие 2 лунки через капиллярные каналы. Одна из лунок может служить в качестве стандарта, который измеряет общее содержание анализируемого вещества в образце. Другая лунка может служить в качестве реакционной лунки, где могут идентифицироваться отдельные компоненты образца. Одноразовая пластинка может быть помещена в анализатор (также именуемый здесь “основанием”), который выявляет отдельные компоненты образца и общее содержание анализируемого вещества в образце. Анализатор включает устройство дисплея, которое может представлять результаты анализа, а также предоставлять инструкции во время проведения анализа.
При одном виде применения можно определить процентное содержание общего гемоглобина A1c (HbA1с) в эритроцитах человека. Кровь, полученную у субъекта, можно поместить в лунку для образца. Кровь перемещается в 2 другие лунки по капиллярным каналам. В эталонную лунку можно поместить реагент, который лизирует клетки, посредством этого высвобождая гемоглобин из эритроцитов. Концентрацию гемоглобина в эталонной лунке можно измерить, используя инфракрасные или ультрафиолетовые измерения. В реакционную лунку может быть помещен лизат, известное количество антитела, специфичного в отношении HbA1с, и магнитная мешалка. Когда кровь перемещается в реакционную лунку, магнит тщательно перемешивает жидкости в лунке. Лизат лизирует клетки, и антитело связывается с HbA1с. После определенного периода времени, дисплей может рекомендовать оператору добавить разбавитель в реакционную лунку. Разбавитель проталкивает жидкость в реакционной камере через другой капиллярный канал в направлении к одной или нескольким зонам захвата. Зоны захвата имеют иммобилизованные на них антигены, которые связываются только с комплексом связанного антитела, а на отдельной части зоны - другие антигены, которые связываются со всеми антителами. Комплекс антитело-HbA1с может захватываться антигенами в первой части зоны захвата, а все антитела могут захватываться антигенами в последней части зоны захвата. Устройство для выявления можно использовать для выявления антител, связанных в первой и второй части зоны захвата. Соотношение и/или сумму двух зон можно использовать для определения количества HbA1с. Соотношение между первой зоной и общим гемоглобином из эталонной лунки может обеспечить процентное содержание HbA1с в образце крови. Результаты могут быть представлены на устройстве дисплея.
III. Микромеханическое устройство
Изобретение предоставляет одноразовую пластинку, портативный ручной прибор (т.е. основание) и комбинацию, включающую одноразовую пластинку и основание. Пластинку можно поместить на прибор для выполнения анализов для выявления анализируемых веществ и для представления информации, такой как инструкции и результаты. Одна сторона одноразовой пластинки показана на фиг.1. Одноразовая пластинка может быть изготовлена соединением вместе двух или более твердых подложек с желобками, присутствующими, по меньшей мере, в одной подложке. Твердая подложка может быть прямоугольной, круглой, овальной или любой формы. Подложка может быть изготовлена из подходящего материала, который выбран по его свойствам, таким как достаточная теплопроводность, прозрачность для оптической передачи, механические свойства для легкой плавки, свойства поверхности, которые обеспечивают возможность равномерного покрытия и устойчивости реагента, и нейтральность для жидкой среды для предотвращения помех анализу. Для этой цели подходящие пластики включают пластики с высокой свободной поверхностной энергией и низкой сорбцией воды, включая, помимо прочих, PETG, полиэфир (Mylar), поликарбонат (Lexan), поливинилхлорид, полистирол, SAN, акрилонитрил-бутадиен-стирол (ABS), в частности ABS, поставляемый Borg Warner под торговым названием Cycolac. Когда твердая подложка представляет собой гидрофобный пластик, его можно обработать способами, известными в данной области, для придания поверхностям гидрофильности, такими как протравливанием плазмой и обработкой коронированием. Альтернативно и эквивалентно в практике изобретения можно использовать имеющуюся в продаже формованную твердую подложку.
В целях иллюстрации этот вариант осуществления изобретения описан со ссылкой на одноразовую пластинку, образованную соединением двух твердых подложек. По меньшей мере, одна из твердых подложек имеет желобки или полости, которые служат в качестве реакционных камер 5 и 7, и капиллярные каналы 2 и 8. Желобки могут иметь любую геометрическую форму и предпочтительно являются круглыми. Желобки имеют размеры, которые представляют собой достаточный объем для удерживания образцов и для обеспечения возможности возникновения реакции. Таким образом, круглые желобки могут иметь диаметр от примерно 0,01 мм до примерно 100 мм в зависимости от длины и ширины материала подложки, и они могут иметь высоту от примерно 0,001 мм до примерно 4 мм в зависимости от толщины материала подложки. Специалист в данной области может легко определить диаметр и высоту желобков. В одном аспекте изобретения одна из деталей подложки имеет отверстия, просверленные через желобки, где отверстия служат в качестве выпускных отверстий 3 и 6. Кроме того, отверстия могут обеспечить доступ в лунку, куда будет помещен образец, такую как лунка 1 для нанесения образца. Перед соединением двух деталей подвижный элемент 4 можно вставить в желательную реакционную камеру 5.
При способе формовки, по меньшей мере, на внешнем контуре, прилегающем к периферии желобка, по меньшей мере, одной из двух пластиковых деталей необходимы направляющие энергию гребни. При ультразвуковой сварке 2 пластиковые детали склеиваются вместе вдоль энергетических гребней, формируя непроницаемое для воздуха герметичное уплотнение вокруг камер и каналов, причем единственным доступом наружу из реакционных камер являются выпускные отверстия и лунка для нанесения образца. Поверхность реакционной камеры может быть необязательно слегка текстурирована для использования с подвижными элементами. Текстурирование может обеспечить разъединяющее давление Π. В случае двух пластин, погруженных в среду, Π представляет собой давление, превышающее внешнее давление, которое необходимо приложить к среде между пластинами для поддержания данного разделения. В этом случае Π в числовом виде представляет собой именно силу притяжения или отталкивания между подвижным элементом и поверхностями реакционной камеры на единицу площади. Чем шире подвижный элемент, тем больше будет давление между поверхностями, и текстурирование устранит любое нежелательное зажатие подвижного элемента стенками реакционной камеры. Более общее определение разъединяющего давления представляет собой
где  = Площадь
Т = Температура
V = Объем
G = Свободная энергия Gibb
Подвижный элемент 4 может быть изготовлен с использованием нержавеющей стали с любым другим желательным материалом с тем, чтобы он был способен притягиваться и приводиться в движение внешним магнитным движущим устройством. Материал может представлять собой любую форму намагничиваемого сплава с покрытием из нержавеющей стали для предотвращения коррозии или специально покрытого для связывания специфических молекул. Толщина подвижного элемента основана на высоте реакционной камеры. Он должен быть достаточно маленьким для помещения в реакционную камеру и свободно двигаться. Для полости реакционной камеры высотой 0,010 дюйма толщина подвижного элемента может составлять от примерно 0,007 до примерно 0,008 дюйма.
Способ нанесения образца на реакционные камеры, а также других реагентов, таких как растворы соли и сахара, в капиллярные каналы включают напыление, окрашивание, лиофилизацию, выпаривание, адсорбцию, ковалентное сопряженное связывание или им подобные. Для реагентов с компонентами в виде больших частиц соответствующими были бы окрашивание распылением или лиофилизация. Биологическое отложение капли пиколитровых размеров приводит к немедленному высыханию при подаче при комнатной температуре вследствие размера капель.
Собранная одноразовая пластинка показана на фиг.2, где 5 представляет собой слой абсорбента, 7 представляет собой пластинку мембраны внутреннего эталона, 9 представляет собой капиллярный канал, 11 представляет собой реакционную камеру, 13 представляет собой капиллярный канал, 15 представляет собой приемник образца, 17 представляет собой отверстие для нанесения образца, 19 представляет собой реакционную камеру, 21 представляет собой подвижный элемент, 23 представляют собой зоны захвата на основной мембране 25.
Фиг.3 представляет собой блок-диаграмму в перспективе основных компонентов анализатора, в который вставляется одноразовая пластинка перед нанесением тестируемого образца. Одноразовую пластинку можно расположить в 46 на основании. Пластинку можно поместить поверх устройства нагревателя 44, который может включать датчик (излучатели и/или детекторы), встроенный в него или находящийся в непосредственной близости к нему, но расположенный так, что сигнал проходит через реакционную камеру. Другой набор датчиков, которые также могут служить в качестве излучателей, детекторов или тех и других, может быть расположен с другой стороны одноразовой пластинки (не показаны). Следует отметить, что отражательное лучевое устройство, детектор и излучатель могут находиться с той же стороны пластинки в зависимости от используемого механизма выявления. Механизм выявления не ограничивается оптическим способом выявления, но также можно использовать другие способы, такие как электрический, радиоактивный и другие способы. Окно электронного дисплея 30 может представлять собой, но не ограничивается этим, жидкий кристаллический дисплей, LCD. 28 представляет выключатели или клавиши на мембране для выбора функции из меню, представляемом на LCD. Электронная плата 36 включает микропроцессор, который регулирует работу и механику анализатора. Питание может подаваться аккумуляторными батареями 38 или любым другим источником подачи питания переменным электрическим током. Мотор 40 запускает магнит 42, и эти два элемента могут быть соединены, например, стержнем. Определенный тип движения мотора и магнита ответствен за создание соответствующего движения подвижного элемента в одной или более реакционных камер одноразовой пластинки. 32 представляет разъем для подсоединения к внешнему источнику питания, а 34 представляет разъем для вывода данных.
Пример устройства выявления для автоматизированного выявления для использования в настоящей одноразовой пластинке и связанных с ней способах включает источник возбуждения, монохроматор (или любое устройство, способное спектрально разлагать компоненты света или набор узкополосных фильтров) и антенну детектора. Источник возбуждения может включать длины волн инфракрасного, синего или ультрафиолетового спектра, и длины волн возбуждения могут быть короче, чем длина волны (волн) излучения, подлежащая выявлению. Устройство выявления может представлять собой: широкополосный источник УФ-света, такой как дейтериевая лампа с размещенным перед ней фильтром; выход источника белого света, такого как ксеноновая лампа или дейтериевая лампа, после прохождения через монохроматор для выделения желательных длин волн; или любой из ряда газовых лазеров, генерирующих в непрерывном режиме (cw), включая, но не ограничиваясь, любую из линий аргоновых ионных лазеров (457, 488, 514 и т.д. нм) или HeCd-лазер; твердотельные диодные лазеры в синем спектре, такие как лазеры на основе GaN и GaAs (сдвоенные) или лазеры со сдвоенным или строенным выходом на основе YAG или YLF; или любой из импульсных лазеров с выходом в синем спектре.
Испускаемый свет от образца или реагентов в реакционной лунке можно выявить устройством, которое предоставляет спектральную информацию для субстрата, например, дифракционный спектрометр, призматический спектрометр, визуализирующий спектрометр или им подобные, или использованием фильтров подавления помех (полосовых фильтров). При использовании матричного двухмерного фотоприемника, такого как камера с CCD (управляемым компьютером дисплеем), можно одновременно визуализировать много объектов. Спектральная информация может быть получена сбором нескольких изображений через различные полосные, широкополосные или узкополосные фильтры (подходят фильтры подавления помех или электронно-настраиваемые фильтры). Более одного визуализирующего устройства можно использовать для сбора данных одновременно через постоянные фильтры, или фильтры можно менять перед одним визуализирующим устройством. Устройства на основе визуализации, подобные устройству биометрической визуализации, сканируют поверхность для обнаружения флюоресцентных сигналов.
Другие варианты осуществления устройства включают использование покрытых реагентом мембранных устройств в виде части пластинки, расположенной таким образом, который обеспечивает возможность непрерывности и направленного потока образца внутри всего устройства пластинки. Улавливающие устройства должны располагаться для возможности мониторинга мембранных частей пластинки для выявления тестируемого анализируемого вещества или реакций.
IV. Работа
Общий принцип работы устройства, показанного на фиг.3, вставку одноразовой пластинки, показанной на фиг.1 и 2, в приемное устройство, которое обеспечивает возможность помещения пластинки только в одном положении. Для анализа с требованием определенной температуры устройство нагревателя 44 нагревает одноразовую пластинку до желательной температуры, регулируемой микропроцессором. После вставки пластинки и включения анализатора LCD подсказывает простые операции, включающие добавление образца в приемник для образца, которые может выполнять оператор. Прибор может, необязательно, иметь датчики для определения присутствия адекватных количеств образца в реакционных камерах и механизм для начала и прекращения отсчета времени анализа. Датчики выявляют сигналы, возникающие при завершении реакции, такие как измерение передачи излучаемого оптического сигнала, направленного через стенки реакционной камеры.
Нанесенный образец точно распределяется в различные реакционные камеры через капиллярные каналы. Расположение реакционных камер может быть таким, что независимые реакции могут происходить в различных реакционных камерах, несмотря на то что они делят общий образец из одного и того же резервуара. Определенные типы движения подвижного элемента обеспечивают соответствующее смешивание смесей реагента и образца, а также участвуют в обмене реагентов и образцов между камерами. Для анализов, которые требуют количественного определения анализируемого вещества, улавливающее сигналы устройство контролирует изменения или в одной, или в нескольких реакционных камерах, мембранном устройстве или подвижных элементах до тех пор, пока не будет достигнут желаемый итог. Для анализов, требующих именно определения присутствия анализируемого вещества, улавливающее сигналы устройство контролирует определенные части пластинки в течение соответствующего периода времени. Микропроцессор количественно или качественно обсчитывает результаты, которые отображаются на LCD. Затем пластинку можно удалить в конце анализа и выбросить.
Таким образом, оператор вставляет пластинку в приемник в анализаторе. Затем оператор нажимает пусковую кнопку, которая может автоматически активироваться самой пластинкой, ожидает подсказки добавить каплю образца и затем получает результаты с дисплея, обычно в пределах нескольких минут или секунд, в зависимости от типа анализа.
V. Выявление гемоглобина A1c (HbA1с)
Гликированный гемоглобин относится к ряду второстепенных компонентов гемоглобина, которые образуются посредством присоединения глюкозы к молекуле гемоглобина. Эритроцит человека свободно проницаем для глюкозы. Внутри каждого эритроцита гликированный гемоглобин образуется со скоростью, которая прямо пропорциональна окружающей концентрации глюкозы. Приблизительно 97% общего гемоглобина в циркулирующих эритроцитах представляет собой гемоглобин А. Гемоглобин А состоит из четырех полипептидных цепей, двух а-цепей и двух b-цепей. Гликирование гемоглобина А происходит посредством ковалентного соединения глюкозы с N-концевой аминокислотой Валином каждой b-пептидной цепи. Сначала образуется неустойчивое основания Шиффа (алдимин), который затем подвергается необратимой перестройке Amadori для образования устойчивого кетоамина, гемоглобина A1c (HbA1с).
Продолжительность существования эритроцитов, содержащих гемоглобин А, составляет в среднем 120 д. Процентная доля гемоглобина А, который гликирован в HbA1с, прямо пропорциональна времени, в течение которого эритроциты контактируют с глюкозой, и встречающейся средней концентрации глюкозы. Измерение фракции HbA1с дает интегрированную картину средней концентрации глюкозы в крови в течение периода полуразрушения эритроцитов, то есть за последние 60 д. Уровень HbA1с обычно выражается в виде процентной доли общего гемоглобина.
У здоровых субъектов HbA1с обычно находится в диапазоне 3-6% общего гемоглобина. У пациентов с повышенными уровнями, например, в случае сахарного диабета типа 1 и типа 2, уровень может подниматься до величины, вдвое или более превышающей верхний предел нормального уровня.
Длительный контроль уровней глюкозы у больных диабетом очень важен. Слишком большое количество глюкозы в крови в течение многих лет может вызвать повреждение глаз, почек и нервов. Оно также увеличивает риск заболеваний сердца и кровеносных сосудов. Измерение HbA1с в виде процентной доли общего гемоглобина предоставляет ценное средство оценки длительного контроля уровня глюкозы, а также составляет важный индикатор риска для идентификации сахарного диабета типа 1 и типа 2.
Образец крови от субъекта можно получить в осажденном виде в лунке для образца 15 одноразовой пластинки (фиг.2). Кровь перемещается в реакционные камеры 11 и 19 через капиллярные каналы 13. Реакционная камера 11 может служить в качестве эталона, где измеряется общий гемоглобин. Реакционная камера 19 измеряет HbA1с в образце крови. Соотношение между HbA1с и общим гемоглобином предоставляет процентную долю общего гемоглобина, которая представляет собой HbA1с.
2
Обе реакционные камеры содержат лизирующий агент. Лизирующий агент лизирует образцы цельной крови, высвобождая посредством этого гемоглобин. Лизирующие агент представляют собой обычно поверхностно-активные вещества и, предпочтительно, неионные поверхностно-активные вещества, такие как, например, TRITON™ X-100. Реакционная камера 19 дополнительно содержит антитело, которое может выявить HbA1с. Антитело может представлять собой моноклональное или поликлональное антитело (Ab), или фрагмент Ab, содержащий участок связывания антигена, или область, определяющую комплементарность (CDR), такую как F(ab') или фрагмент Fab. Выявляемая составная часть или метка может представлять собой радиоактивное, флюоресцентное или хемилюминесцентное вещество или фермент. Альтернативно, можно также использовать меченое второе Ab, которое распознает специфический для вида фрагмент Fc первой Ab. Далее, антитело может быть меченым выявляемой меткой.
В одном аспекте выявляемая метка представляет собой флюоресцентную молекулу. Примеры подходящих флюоресцентных меток включают флюоресцеин (FITC), 5,6-карбоксиметилфлюоресцеин, техасский красный, нитробенз-2-окса-1,3-диазол-4-ил (NBD), кумарин, дансилхлорид, родамин, 4'-6-диамино-2-фенилинодол (DAPI) и цианиновые красители Су3, Су3.5, Су5, Су5.5 и Су7. Предпочтительными флюоресцентными метками являются флюоресцеин (сложный эфир 5-карбоксифлюоресцеин-N-гидроксисукцинимида), родамин (5,6-тетраметилродамин), замещенные соединения родамина и цианиновые красители Су3, Су3.5, Су5, Су5.5 и Су7. Максимумы поглощения и эмиссии для этих фторофоров составляют соответственно: FITC (490 нм; 520 нм), Су3 (554 нм; 568 нм), Су3.5 (581 нм; 588 нм), Су5 (652 нм; 672 нм), Су5.5 (682 нм; 703 нм) и Су7 (755 нм; 778 нм), таким образом, обеспечивая возможность их одновременного выявления. Флюоресцентные метки можно получить из разнообразных коммерческих источников, включая Molecular Probes, Eugene, OR and Research Organics, Cleveland, Ohio. В качестве другой альтернативы, вместо добавленной метки, сам связанный гемоглобин, ввиду его подобных пероксидазе свойств, может генерировать выявляемый сигнал. Это осуществляется добавлением перекиси водорода с добавлением другого субстрата (например, изолюминола) или без него.
Клетки в двух реакционных лунках лизируются. В эталонной лунке 11 общее количество гемоглобина можно получить спектроскопическими методами, такими как измерение в УФ-области или инфракрасной области. Спектроскопическое устройство известно в данной области, и оно включено внутрь портативного ручного прибора. В частности, измерения можно проводить при 880 нм и при 580 нм. В реакционной лунке 19 антитела связываются с HbA1с. Для обеспечения полной реакции жидкости в реакционных лунках могут магнитно перемешиваться и, необязательно, нагреваться до более высокой температуры.
После завершения реакции в лунку для образца 15 можно добавить разбавитель. Разбавитель вызывает движение реагентов в лунке 19 через капиллярные каналы 9 в направлении зон захвата 23. Зоны захвата могут представлять собой антигены или другие соединения, которые могут специфически связываться с комплексом антитело-HbA1с, любое антитело и им подобные или их комбинации. Таким образом, в одном аспекте первая зона захвата содержит антигены, которые специфически связываются с комплексом антитело-HbA1с, в то время как вторая зона захвата содержит антигены, которые связываются антителом и комплексом антитело-HbA1с. Слой абсорбента 5 поглощает всю жидкость и может содействовать проталкиванию жидкости из лунок через мембраны.
Количество материала в каждой зоне захвата можно определить с использованием описанных выше устройств выявления. Калибраторы или стандарты, которые используются при анализе, обеспечивают калибровочные (или стандартные) кривые, по которым % HbA1с в образце определяется с использованием измеренного сигнала. Сумма всех зон захвата предпочтительно равна количеству антитела, которое было помещено в реакционную лунку и может обеспечить внутренний контроль для определения процентной доли реакции, которая произошла. Концентрацию комплекса антитела-HbA1с можно определить по показаниям первой зоны захвата. % HbA1с в образце крови можно определить делением концентрации комплекса антитела-HbA1с на общую концентрацию гемоглобина.
В другом аспекте в одноразовую пластинку может быть включена эталонная мембрана 7 (фиг.2). Эталонная мембрана может иметь осажденные на ней известные концентрации комплекса антиген-антитело-HbA1с и комплекс антиген-антитело. Спектрофотометрические измерения по эталонной мембране можно использовать для калибровки показаний, полученных по активной мембране 25.
Хотя изобретение было конкретно показано и описано со ссылкой на предпочтительный вариант осуществления и различные альтернативные варианты осуществления, специалистам в данной области должно быть очевидно, что возможны различные изменения по форме и в деталях без отхода от сущности и объема изобретения. Все опубликованные патенты и публикации, ссылки на которые приведены в этой заявке, полностью включены в нее в качестве ссылки.