Применение 5'-О-(3-фенилпропионил)-N4-гидроксицитидина для ингибирования репликации вируса гриппа in vitro и in vivo
USE OF 5'-O-(3-PHENYLPROPIONYL)-N4-HYDROXYCYTIDINE TO INHIBIT INFLUENZA VIRUS REPLICATION IN VITRO AND IN VIVO

Область техники
Изобретений относится к химии, фармацевтике и медицине, а именно к применению 5'-О-(3-фенилпропионил)-N4-гидроксицитидина для ингибирования репликации вируса гриппа.
Уровень техники
Orthomyxoviridae
Грипп - инфекционное заболевание, поражающее верхние и нижние дыхательные пути, возбудителем которого является РНК-содержащий вирус из семейства . По данным Всемирной организации здравоохранения до 10% населения планеты ежегодно болеют гриппом, у 3-5 млн человек развивается тяжелое заболевание и 290-650 тыс. человек погибают (https://www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/detail/influenza-(seasonal)). В популяции человека циркулирует 3 типа вируса гриппа (A, B, C), однако наибольшую угрозу для человека представляет вирус гриппа А из-за его сильной склонности к антигенным вариациям и пандемического потенциала.
В настоящее время наиболее эффективным способом профилактики гриппа является вакцинация, однако эффективность вакцины может существенно меняться в зависимости от вакцинных штаммов, возраста пациента и его иммунного статуса. Например, в 2017–2018 годах эффективность вакцины против преобладающего штамма H3N2 составила всего 25%, что привело к самому высокому уровню смертности с 2009 года (Umino Y., Kohama T., Sato T.A., Sugiura A., Klenk H.D., Rott R. Monoclonal antibodies to three structural proteins of Newcastle disease virus: biological characterization with particular reference to the conformational change of envelope glycoproteins associated with proteolytic cleavage. J Gen Virol. 1990;71(Pt 5):1189–1197).
Для лечения и профилактики гриппа было разработано также несколько классов противовирусных препаратов: антагонисты протонных каналов М2 (амантадин), ингибиторы нейраминидазы (NAIs; занамивир, осельтамивир, перамивир и ланинамивир) и ингибитор кислотной эндонуклеазы полимеразы (балоксавир марбоксил). Однако большой проблемой является появление вирусов, обладающих пониженной чувствительностью к одному или нескольким классам препаратов. Например, до 2009 года до 100% циркулирующих в мире подтипов вируса IAV H1N1 были устойчивы к осельтамивиру, наиболее часто используемому ингибитору нейраминидазы. Однако пандемический подтип вируса гриппа А H1N1 2009 года, который был чувствителен к ингибиторам нейраминидазы, вытеснил другие варианты вирусов (Hussain M, Galvin HD, Haw TY, Nutsford AN, Husain M. Drug resistance in influenza A virus: the epidemiology and management. Infect Drug Resist. 2017 Apr 20;10:121-134. doi: 10.2147/IDR.S105473. PMID: 28458567; PMCID: PMC5404498). Вирусы циркулирующие в настоящее время устойчивы к антагонистам протонных каналов М2, поэтому данный класс препаратов сейчас не рекомендуется для лечения гриппа (Duwe S. Influenza viruses - antiviral therapy and resistance. GMS Infect Dis. 2017 Apr 25;5:Doc04. doi: 10.3205/id000030. PMID: 30671326; PMCID: PMC6301739.). Таким образом, в уровне техники существует острая потребность в разработке новых противовирусных препаратов против гриппа, которые воздействуют на принципиально новые мишени.
Из заявки WO2012083122A1 известен ингибитор репликации вируса гриппа с химической формулой:
.
Соединение используют для ингибирования репликации вируса гриппа в биологическом образце или у пациента, для снижения количества вируса гриппа в биологическом образце или у пациента, а также для лечения гриппа у пациента.
Из патента EP3147284A1 известен ингибитор репликации вируса гриппа с химической формулой:
.
Соединение используют для ингибирования репликации вируса гриппа в биологическом образце или у пациента, для снижения количества вируса гриппа в биологическом образце или у пациента, а также для лечения гриппа у пациента.
Из патента US11014941B2 известно использование производных пирролопиримидина в качестве ингибиторов репликации вируса гриппа. В патенте раскрыты способы ингибирования репликации вируса гриппа в биологическом образце или у пациента, снижения количества вируса гриппа в биологическом образце или у пациента, а также лечения гриппа у пациента.
Из патента RU2020116571A3 известны некоторые производные N4-гидроксицитидина, фармацевтические композиции на их основе и способ их применения. Некоторые варианты применения изобретения предусматривают лечение и профилактику гриппа.
Известно производное N4-гидроксицитидина EIDD-2801 (молнупиравир), которое проявляет противовирусную активность против вируса гриппа (Toots M, Yoon JJ, Hart M, Natchus MG, Painter GR, Plemper RK. Quantitative efficacy paradigms of the influenza clinical drug candidate EIDD-2801 in the ferret model. Transl Res. 2020;218:16-28. doi:10.1016/j.trsl.2019.12.002). Данное техническое решение было выбрано за прототип. К недостаткам молнупиравира можно отнести недостаточно высокую противовирусную активность против гриппа.
Раскрытие сущности изобретения
Технической задачей данного изобретения является разработка более эффективного способа ингибирования репликации вируса гриппа.
Технический результат заключается в разработке нового применения сложноэфирного производного N4-гидроксицитидина с карбоновой кислотой для ингибирования репликации вируса гриппа.
Указанный технический результат достигается тем, что разработано применение 5'-О-(3-фенилпропионил)-N4-гидроксицитидина для ингибирования репликации вируса гриппа
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлено получение N4-тритилокси-2',3'-О-изопропилиденцитидина (3).
На фиг. 2 представлено получение 5'-О-(3-фенилпропионил)-N4-гидроксицитидина (5).
На фиг. 3 представлены дозозависимые кривые и значения IC50 (µМ) ингибирования CPE вируса гриппа А.
SN_9 – полученное соединение 5'-О-(3-фенилпропионил)- N4- гидроксицитидин;
EIDD-2801 - контрольный препарат Молнупиравир.
in vivo
р
На фиг.4 представлены данные по эффективности полученного соединения 5'-О-(3-фенилпропионил)- N4- гидроксицитидин (SN_9) против гриппозной инфекции . Показан титр вируса (А) в тканях легких и выживаемость животных (Б) в контрольной группе и группе, получавшей изучаемый препарат. Kruskal-Wallis тест: **< 0.01 – статистически достоверно.
SN_9 – полученное соединение 5'-О-(3-фенилпропионил)- N4- гидроксицитидин;
Контроль - контрольная группа животных.
Осуществление изобретения
Получение 5'-О-(3-фенилпропионил)-N4-гидроксицитидина состоит из нескольких этапов.
На первом этапе проводили блокирование вицинальных 2ˋ и 3ˋ гидроксильных групп β-D-N4-гидроксицитидина (NHC) при помощи ацетонидной защиты. При этом оптимальными условиями реакции являлись использование пара-толуолсульфокислоты (p-TSA) в качестве катализатора, проведение реакции в ацетоне при комнатной температуре в течение 2 ч.
На втором этапе проводили блокирование гидроксильной группы в 4 положении N4-гидроксицитидина. Для этих целей была выбрана тритильная (Tr) защитная группа, выбор обусловлен легкостью введения защиты, а также ее кислотолабильностью, что делает возможным деблокирование всех защитных групп в кислых условиях. Реакцию проводили в хлористом метилене действием тритилхлорида (Tr-Cl) в присутствии 4-диметиламинопиридина (DMAP) в качестве катализатора, а также триэтиламина.
На следующем этапе проводили реакцию N4-диметокситритилокси-2',3'-О-изопропилиденцитидина с фенилпропионовой кислотой в присутствии 1,3-дициклогексилкарбодиимида в хлористом метилене, перемешивание осуществляли при комнатной температуре в течение 2 ч. Промежуточный продукт очищали на силикагеле и подвергали кислотному гидролизу действием 80%-ного водного раствора муравьиной кислоты, перемешивали при комнатной температуре 20 ч. Соединение выделяли флэш-хроматографией на силикагеле в системе хлороформ:метанол (5% метанола). В результате выполнения работы было получено новое соединение - 5'-О-(3-фенилпропионил)-N4-гидроксицитидин.
Было показано, что полученное соединение способно ингибировать репликацию вируса гриппа А с эффективностью, значительно превышающей эффективность прототипа.
Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.
Пример 1. Синтез 5'-О-(3-фенилпропионил)- N4- гидроксицитидина.
Соединение получали в 4 стадии. Схема синтеза представлена на Фиг.1 и Фиг. 2. На первом этапе проводили получение промежуточного продукта 2ˋ,3ˋ-О-изопропилиден-N4-гидроксицитидина (2) (Фиг. 1). Для этого к 1.7 г (6.56 ммоль) N4-гидроксицитидина (1) в сухом ацетоне (240 мл) добавляли 3.7 г (19.69 ммоль) пара-толуолсульфокислоты, полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакцию нейтрализовывали добавлением триэтиламина, растворители отгоняли, остаток очищали флэш-хроматографией на силикагеле в системе хлороформ:метанол (5% метанола).
о
Выход соединения (2) 1.6 г (85%), Rf 0.42, Т пл. = 195-196 С.
1
3
3
2
H
H
Н-ЯМР-спектр (CDCl), δ, м.д.): 1.32 (2c, 6H, 2CH), 2.00 (c, 1H, NHO), 3.65-3.94 (м, 2Н, 5'-СН), 4.14-4.27 (м, 1Н, 4'-СН), 4.87-5.08 (м, 2Н, 2' и 3'-СН), 5.38 (д, J=2.6 Гц, 1Н, 1'-СН), 5.62 (д, J=7.8 Гц, 1Н, Н-5 Cyt), 6.65 (д, J=8.1 Гц, 1Н, Н-6 Cyt), 8.13 (c, 1H, NOH)
На втором этапе проводили получение промежуточного продукта N4-тритилокси-2',3'-О-изопропилиденцитидина (3) (Фиг. 2). Для этого к суспензии 1.6 г (5.37 ммоль) 2ˋ,3ˋ-О-изопропилиден-N4-гидроксицитидина (2) в дихлорметане (100 мл) при перемешивании при комнатной температуре добавляли 1.1 мл (8.06 ммоль) триэтиламина и 7 мг (0.054 ммоль) 4-диметиламинопиридина, смесь перемешивали в течение 15 мин. Затем в реакционную колбу по каплям добавляли раствор 1.5 г (5.37 ммоль) тритилхлорида в дихлорметане (50 мл), перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель отгоняли на роторном испарителе, остаток очищали флэш-хроматографией на силикагеле в градиенте систем – гексан:этилацетат:триэтиламин (7:3:0.25) с последующим элюированием системой хлороформ:триэтиламин (2.5% триэтиламина).
о
Выход соединения (3) 2.1 г (72 %), Rf 0.47, Т пл. = 132-133 С.
1
3
3
3
2
H
Н-ЯМР-спектр (CDCl, δ, м.д.): 1.29 (c, 3H, CH), 1.47 (c, 3H, CH), 3.66-3.99 (м, 2Н, 5'-СН), 4.12-4.25 (м, 1Н, 4'-СН), 4.89-5.11 (м, 2Н, 2' и 3'-СН), 5.34 (д, J=3.1 Гц, 1Н, 1'-СН), 5.51 (д, J=8.1 Гц, 1Н, Н-5 Cyt), 6.46 (д, J=8.2 Гц, 1Н, Н-6 Cyt), 6.79-6.86, 7.16-7.25 , 7.28-7.33 (3м, 15Н в Tr), 9.97 (c, 1H, NOH).
На следующем этапе раствор 145.2 мг (0.268 ммоль) N4-тритилокси-2',3'-О-изопропилиденцитидина (3), 60.3 мг (0.402 ммоль) 3-фенилпропановой кислоты и 99.4 мг (0.482 ммоль) 1,3-дициклогексилкарбодиимида в хлористом метилене (15 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакционную массу предочищали на силикагеле в системе хлороформ:гексан:триэтиламин (7:3:0.25).
На последнем этапе промежуточный продукт (4) подвергали действию 80%-ного водного раствора муравьиной кислоты (5 мл), перемешивали при комнатной температуре 20 ч, упаривали и очищали флэш-хроматографией на силикагеле в смеси растворителей хлороформ:метанол (5% метанола).
f
о
Выход соединения (5) 58 мг (52 %), R 0.33, Т пл. = 144-146 С.
1
6
2
2
2
Н
Н
H
H
Н-ЯМР-спектр (DMSO-d, δ, м.д.): 2.67 (т, J=7.4 Гц, 2Н, С-СО), 2.85 (т, J=7.5 Гц, 2Н, С-Ph), 3.92-4.03 (м, 2Н, 5'-СН), 4.08-4.22 (м, 1Н, 4'-СН), 5.21-5.35 (м, 2Н, 2' и 3'-СН), 5.56 (д, J=8.2 Гц, 1Н, 1'-СН), 5.70 (д, J=5.5 Гц, 1Н, Н-5 Cyt), 6.82 (д, J=8.2 Гц, 1Н, Н-6 Cyt), 7.16-7.28 (м, 5Н, Ph), 9.56 (c, 1H, NOH), 10.01 (c, 1H, NHO),.
Таким образом, в результате проведенной работы было получено новое соединение 5'-О-(3-фенилпропионил)- N4- гидроксицитидин.
Пример 2. Исследование противирусного эффекта 5'-О-(3-фенилпропионил)-N4-гидроксицитидина против вируса гриппа А.
Целью данного эксперимента являлась проверка способности 5'-О-(3-фенилпропионил)-N4-гидроксицитидин оказывать противовирусный эффект против вируса гриппа типа А.
4
2
50
В эксперименте использовали клетки Caco-2 (ATCC HTB-37), которые культивировали в ростовой среде DMEM (Gibco, USA), дополненной 10% эмбриональной бычьей сывороткой (FBS; HyClone, USA), 1× антибиотик-антимикотик (Capricorn Scientific GmbH) и 1× GlutaMAX (Gibco, USA) и вирус гриппа A/California/07/2009 (H1N1)pdm09 (ATCC VR-1894). Клетки Caco-2 (3×10 клеток/лунка) высевали в 96-луночные планшеты в среде Opti-MEM (Gibco, USA). На следующий день к монослою клеток добавляли различные разведения исследуемого соединения 5'-О-(3-фенилпропионил)-N4-гидроксицитидин или контрольного соединения EIDD-2801 (Молнупиравир), далее проводили инкубацию в течение 1 ч при 37°С и 5% CO. После этого производили заражение вирусом при 100TCID. Ингибирование вирус-индуцированного цитопатического эффекта (СРЕ) под действием соединения определяли с помощью МТТ-теста [10.1007/s00018-021-03985-6]. Через 72 ч после добавления вируса гриппа в каждую лунку добавляли раствор 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромида (МТТ) в фосфатно-солевом буфере до конечной концентрации 0,5 мг/мл. Метод основан на способности МТТ восстанавливаться до окрашенного формазана в присутствии митохондриальных ферментов живых клеток. После 2-часовой инкубации из лунок удаляли среду и добавляли 150 мкл диметилсульфоксида. Далее измеряли оптическую плотность раствора формазана, при длине волны 590нм, с помощью планшетного спектрофотометра. Результаты эксперимента представлены на фиг.3.
Анализ антивирусного действия 5'-О-(3-фенилпропионил)- N4- гидроксицитидина (SN_9) против пандемического вируса гриппа А (H1N1) показал, что данное соединение обладает активностью в ~ 2 раза большей (Фиг. 3), чем EIDD-2801.
Пример 3. Исследование эффективности препарата на животных в ходе инфекции вирусом гриппа А.
5
50
50
Самкам мышей BALB/c (n=15) перорально через зонд вводили 5'-О-(3-фенилпропионил)- N4- гидроксицитидин (SN_9) в дозе 200 мг/кг, контрольным животным вводили буферный раствор. Затем, производили интраназальное заражение животных при 10TCID A/California/07/2009 (H1N1)pdm09. Все последующие дни, животным вводили исследуемый препарат (или буферный раствор) два раза в день в течение пяти дней. На пятый день эксперимента, по пять животных из каждой группы подвергали эвтаназии, производили их вскрытие и забор легких. Остальных животных (10 голов) наблюдали в течение 12 дней для определения выживаемости. Легкие мышей подвергали гомогенизации с последующим отделением супернатанта низкоскоростным центрифугированием. Титр вируса определяли в монослое клеток Caco-2, выращенных в 96-луночных планшетах. Титр вируса для каждого образца гомогената легких был определен спустя 96 часов, и выражен в виде TCID/грамм легкого.
10
Было установлено, что у животных, получавших разработанное соединение, наблюдалось снижение титра вируса в тканях легких на ~ 1.5 Log, по сравнению с группой отрицательного контроля (Фиг. 4А). Кроме того, летальность животных из контрольной группы составила 100% на 9 сутки инфекции, в то время как животные, получавшие разработанный препарат, выжили в ходе инфекции вирусом гриппа А (Фиг. 4Б).
Таким образом, приведенные примеры показывают, что 5'-О-(3-фенилпропионил)-N4-гидроксицитидин ингибирует репликацию вируса гриппа in vitro и in vivo.
Промышленная применимость
Соединение (5'-О-(3-фенилпропионил)-N4-гидроксицитидин) может быть использовано в здравоохранении как новый лекарственный препарат для лечения и профилактики гриппа.