СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ СВОБОДНОЙ ГИББЕРЕЛЛОВОЙ КИСЛОТЫ В ВЕГЕТАТИВНЫХ ОРГАНАХ РАСТЕНИЙ МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
METHOD OF DETERMINING CONTENT OF FREE GIBBERELLIC ACID IN VEGETATIVE PLANT ORGANS BY METHOD OF CAPILLARY ELECTROPHORESIS

3
Изобретение относится к аналитической химии дитерпеноидов флуоренового ряда, в частности к способу определения содержания свободной гибберелловой кислоты (ГК) в вегетативных органах растений.
Гиббереллины активируют рост стеблей растений, вызывают прорастание покоящихся семян и нарушают период покоя у растений, стимулируют цветение фотопериодически чувствительных растений, способствуют образованию партенокарпических плодов, стимулируют образование и лигнификацию вторичной ксилемы клеток (число лигнифицированных клеток возрастает с увеличением дозы гибберелловой кислоты) [Г.-В. Хелдт. Биохимия растений. - М.: БИНОМ, 2011. - 471 с.].
3
Известно, что для выделения и изучения гиббереллинов, в том числе гибберелловой кислоты (ГК), используют различные методы, в том числе хроматографию, а для определения их содержания - метод биотестов.
Метод биологических проб (биотестов) применяют для определения активности эндогенных биологически активных веществ, химическая природа которых еще не известна. Метод основан на подсчете числа проросших семян салата в опытных вариантах к числу проросших семян в контрольном варианте. Уровень активации прорастания семян характеризует содержание гиббереллинов в исследуемом материале [Методические рекомендации по определению фитогормонов. Киев: Институт ботаники АН УССР, 1988 - 78 с.]. Недостатками этого метода являются длительность его проведения (не менее 2 суток), относительные показатели содержания гиббереллинов в исследуемом материале и отсутствие требуемой точности количественного анализа.
Наиболее близким к заявляемому способу техническим решением является способ количественного выделения гиббереллинов из растительного материала 80%-ным этанолом в течение 48 часов, концентрирование экстракта до водного остатка упариванием спиртового раствора при 40°C, удаление белков и пигментов вымораживанием в течение 24 часов при -24°C, отделение осадка центрифугированием, доведение рН водного остатка до 2,5 с помощью 1н. соляной кислоты и трехкратная экстракция свободных гиббереллинов из подкисленного супернатанта этилацетатом в соотношении 1:3, упаривание этилацетатной фракции до сухого остатка [Методические рекомендации по определению фитогормонов. Киев: Институт ботаники АН УССР, 1988 - 78 с.].
Недостатки способа: совместная экстракция как свободных, так и связанных гиббереллинов, сложная методика очистки экстракта, большая длительность проведения анализа. При анализе сложных по составу биологических проб методом капиллярного электрофореза происходит быстрое загрязнение разделяющего капилляра.
3
Задачей изобретения является экспрессный анализ, включающий выделение свободной гибберелловой кислоты (ГК) из растительного материала, эффективное разделение и определение содержания свободной гибберелловой кислоты методом высокоэффективного капиллярного электрофореза, обеспечение экспрессных и достоверных количественных результатов при минимальных затратах на пробоподготовку и выполнение анализа.
3
Техническим результатом при использовании предлагаемого изобретения является экспрессность и достоверность количественного определения содержания свободной гибберелловой кислоты (ГК) методом капиллярного электрофореза.
3
Технический результат достигают за счет того, что способ определения содержания свободной гибберелловой кислоты (ГК) предусматривает экстракцию пробы биологического материала этилацетатом, с последующей фильтрацией экстракта, выпаривание его до сухого остатка, растворение сухого остатка в 60%-ном водном ацетоне и количественное определение содержания свободной гибберелловой кислоты на системе капиллярного электрофореза в кварцевом капилляре, эффективной длиной 0,5 м, внутренним диаметром 75 мкм с использованием водного раствора ведущего электролита, содержащего 0,33% масс., борной кислоты, 0,05% масс. тетрабората натрия, 0,5% об. изопропанола (pH 9,3) при положительной полярности напряжения и длине волны детектирования - 254 нм.
3
Способ отличается тем, что, с целью обеспечения экспрессности и достоверности анализа содержания свободной гибберелловой кислоты (ГК), для ее выделения из растительного материала используют этилацетат с последующей фильтрацией экстракта, упариванием его до сухого остатка, растворением сухого остатка в 60%-ном водном ацетоне и количественном определении содержания свободной гибберелловой кислоты на системе капиллярного электрофореза 105М в кварцевом капилляре, эффективной длиной 0,5 м, внутренним диаметром 75 мкм, с использованием водного раствора ведущего электролита, содержащего 0,33% масс. борной кислоты, 0,05% масс. тетрабората натрия, 0,5% об. изопропанола (pH 9,3) при положительной полярности напряжения и длине волны детектирования - 254 нм.
3
Поставленная задача решается за счет того, что использование этилацетата позволяет выделить из растительного материала свободную гибберелловую кислоту (ГК), свойства ведущего электролита позволяют исключить из процесса анализа многостадийную пробоподготовку и обеспечить эффективное разделение анализируемого компонента при длине волны детектирования 254 нм.
3
В результате проведенных исследований и сравнения с аналогом установлено, что предлагаемый способ количественного определения содержания свободной гибберелловой кислоты (ГК) в вегетативных органах растений, включающий экстракцию пробы биологического материала с использованием этилацетата, фильтрацию экстракта, упаривание его до сухого остатка, растворение сухого остатка в 60%-ном водном ацетоне и количественное определение свободной гибберелловой кислоты на системе капиллярного электрофореза 105М в кварцевом капилляре, эффективной длиной 0,5 м, внутренним диаметром 75 мкм, с использованием водного раствора ведущего электролита, содержащего 0,33% масс. борной кислоты, 0,05% масс. тетрабората натрия, 0,5% об. изопропанола (pH 9,3) при положительной полярности напряжения и длине волны детектирования - 254 нм, позволяет достичь объективного, экспрессного определения массового содержания свободной гибберелловой кислоты как в градуировочных растворах, так и в биологических пробах.
Преимущества заявляемого способа заключаются в выделении свободной формы гибберелловой кислоты, в экспрессности, использовании доступных реактивов при осуществлении анализа на системах капиллярного электрофореза, например серии «Капель», обеспечении объективности и достоверности анализа реальных проб, стабильности во времени ведущего электролита, позволяющего исключить из процесса анализа многостадийную пробоподготовку и обеспечить эффективное разделение анализируемого компонента. Контролем служило определение гибберелловой кислоты в этой же пробе согласно способа-прототипа.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1.
3
Определение содержания свободной гибберелловой кислоты (ГК) методом капиллярного электрофореза в листьях яблони при стандартной и упрощенной пробоподготовке
При стандартной подготовке для извлечения суммарного количества гиббереллинов (свободных и связанных) пробу листьев яблони сорта Айдаред массой 1,00 г гомогенизировали с 80%-ным этанолом в соотношении 1:3 и оставляли для экстракции в течение 48 часов. Операцию повторяли еще дважды. Все порции экстракта объединяли, фильтровали через стеклянный фильтр и упаривали при 40°C до водной фазы. Водный остаток промораживали в течение суток при температуре -24°C, центрифугировали в течение 10 мин при 10000 об/мин. Супернатант подкисляли 1 н. HCl до pH 2,5.
3
Извлечение свободной гибберелловой кислоты из супернатанта проводили путем экстракции трижды равными объемами этилацетата в соотношении 1:3. Объединенные этилацетатные экстракты высушивали безводным сульфатом натрия и упаривали досуха в токе холодного воздуха при температуре 40°C. Сухой остаток растворяли в 2 см 60%-ного водного ацетона.
Содержание свободной гибберелловой кислоты в полученном растворе определяли на системе капиллярного электрофореза 105М в кварцевом капилляре, эффективной длиной 0,5 м, внутренним диаметром 75 мкм, с использованием водного ведущего электролита, содержащего 0,33% масс. борной кислоты, 0,05% масс. тетрабората натрия, 0,5% об. изопропанола (pH 9,3) при положительной полярности напряжения и длине волны детектирования - 254 нм.
Осуществляли подготовку пробы упрощенным способом.
3
При упрощенной пробоподготовке для выделения свободной гибберелловой кислоты пробу листьев яблони сорта Айдаред массой 1,00 г заливали этилацетатом, в соотношении 1:10, и растирали в смеси с кварцевым песком, фильтровали через стеклянный фильтр. Эфирный экстракт переносили в стаканы и выпаривали досуха в токе холодного воздуха. Полученный сухой остаток, содержащий анализируемое вещество, растворяли в 2 см 60%-ного водного ацетона. Количественно содержание свободной гибберелловой кислоты определяли на системе капиллярного электрофореза в кварцевом капилляре, эффективной длиной 0,5 м, внутренним диаметром 75 мкм, с использованием водного ведущего электролита, содержащего 0,33% масс. борной кислоты, 0,05% масс. тетрабората натрия, 0,5% об. изопропанола (pH 9,3) при положительной полярности напряжения и длине волны детектирования - 254 нм. Контролем служило определение содержания свободной гибберелловой кислоты в этой же пробе, согласно способа-прототипа.
Полученные результаты приведены в таблице.
Электрофореграмма количественного определения содержания свободной гибберелловой кислоты в экстракте листьев яблони методом капиллярного электрофореза при стандартной пробоподготовке приведена на фигуре 1; в экстракте листьев яблони при упрощенной пробоподготовке - на фигуре 2. Пример идентификации свободной гибберелловой кислоты методом капиллярного электрофореза при упрощенной пробоподготовке методом добавки показан на фигуре 3.
Пример 2.
3
Определение содержания свободной гибберелловой кислоты (ГК) в листьях винограда методом капиллярного электрофореза при стандартной и упрощенной пробоподготовке
Аналогично примеру 1, кроме того, что пробоподготовке подвергали листья винограда сорта Бианка. Полученные результаты приведены в таблице.
Пример 3.
3
Определение содержания свободной гибберелловой кислоты (ГК) в проростках озимой пшеницы сорта Краснодарская 99 методом капиллярного электрофореза при стандартной и упрощенной пробоподготовке
Аналогично примеру 1, кроме того, что пробоподготовке подвергали проростки озимой пшеницы сорта Краснодарская 99. Полученные результаты приведены в таблице.
Анализ полученных результатов показал, что в случае анализа листьев яблони, винограда, проростков озимой пшеницы содержание свободной гибберелловой кислоты, выделенной по стандартной процедуре подготовки пробы, согласно прототипа, снижается на 47,6 - 77,8 - 101,1% (примеры 1-3) в сравнении с результатами предлагаемого способа.
Применение стандартной процедуры (способа-прототипа) подготовки пробы (примеры 1-3), увеличивающей продолжительность анализа в несколько раз, оказалось неприемлемым, так как результат искажался в 1,5-2 раза, что связано с быстрым загрязнением капилляра и, соответственно, ухудшением качества разделения компонентов.
Таблица - Результаты определения гибберелловой кислоты, мг/кг, в исследуемых объектах при стандартной и упрощенной пробоподготовке
Применение заявляемого способа позволило получить воспроизводимый результат в случае упрощенной подготовки пробы для объектов примеров 1-3.
Для проверки надежности метода упрощенной подготовки пробы, реализованного в примере №1, использовали метод добавки свободной гибберелловой кислоты в пробу биологического материала и проводили экстракционную подготовку.
Установлено, что степень извлечения гибберелловой кислоты для анализируемого образца составила 102-104%.
Эти данные свидетельствуют о возможности корректного определения свободной гибберелловой кислоты согласно примеру №1 (упрощенная пробоподготовка).
Предлагаемый способ практически лишен таких недостатков, как необходимость длительной очистки проб для корректного анализа, влияние мешающих веществ биологической пробы - фенольных соединений, аминокислот, анионов, органических кислот; водный раствор ведущего электролита стабилен во времени и не загрязняет внутреннюю поверхность капилляра.
При реализации способа получены количественные результаты определения массовой концентрации гибберелловой кислоты, превосходящие по своему качеству прототип.