СПОСОБ ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ СЕРОДИАГНОСТИКИ С ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНЫМ ДОБАВЛЕНИЕМ РЕАГЕНТОВ
METHOD OF IMMUNOCHROMATOGRAPHIC SERODIAGNOGY WITH SEQUENTIAL ADDITION OF REAGENTS

P. Bailey & Scott's Diagnostic Microbiology-E-Book, 13th ed.; Elsevier Ltd.: St. Louis, MO, USA, 2013; p. 1056. ISBN 9780323083300.
Изобретение относится к области иммунологии, медицинской и ветеринарной диагностике и представляет собой способ проведения иммунохроматографической серодиагностики. Одним из основных методов скрининговой диагностики бруцеллеза является серодиагностика - определение специфических антител против антигенов возбудителя бруцеллеза в крови зараженных животных (). Особенно перспективным представляется реализация серодиагностики в формате иммунохроматографии (ИХ), позволяющей проводить диагностику непосредственно на месте отбора проб неквалифицированным персоналом. Принцип работы ИХ основан на движении жидкой пробы вдоль мембран (формирующих тест-полоску) под действием капиллярных сил, которое приводит к последовательному взаимодействию реагентов на разных участках мембран и окрашиванию функциональных участков тест-полоски. Благодаря такой реализации анализа количество манипуляционных стадий сводится к минимуму, что делает ИХ идеальным решением для внелабораторной диагностики.
Staphylococcus aureus
Streptococcus spp.
Sajid, M., Kawde, A.N., & Daud, M. (2015). Designs, formats and applications of lateral flow assay: A literature review. Journal of Saudi Chemical Society, 19(6), 689-705.
Традиционная схема иммунохроматографического анализа для серодиагностики основана на взаимодействии иммуноглобулинов в тестируемой сыворотке крови с меченым иммуноглобулин-связывающим реагентом (обычно в качестве такового реагента выбирают антивидовые антитела, белок А из  или белок G из ). Традиционно меченый иммуноглобулин-связывающий реагент предварительно наносится и высушивается на специальной подложке, расположенной между мембраной для нанесения пробы и рабочей мембраной с аналитической зоной. После добавления жидкой пробы она протекает через подложку с меченым иммуноглобулин-связывающим реагентом. Вследствие этого проба смешивается с меченым иммуноглобулин-связывающим реагентом, который связывает все иммуноглобулины в пробе. Последующая детекция специфических антител, образовавших комплекс с меткой, осуществляется путем их взаимодействия в аналитической зоне тест-полоски с иммобилизованным антигеном, что приводит к концентрированию метки в аналитической зоне и формированию окрашенной полосы (). На данном принципе основано большинство используемых на сегодняшний день систем для ИХ-серодиагностики, в частности тест-система для серодиагностики лейкоза крупного рогатого скота, описанная Mukantayev и соавт. (Mukantayev, K., Tursunov, K., Raimbek, G., Shustov, A., Begaliyeva, A., Ingirbay, B., Mukanov, K. & Ramanculov, E. (2018). IMMUNOCHROMATOGRAPHIC ASSAY FOR DIAGNOSIS OF BOVINE LEUKAEMIA VIRUS INFECTION IN COWS USING THE RECOMBINANT PROTEIN GP51. Veterinarija ir Zootechnika, 76(98). https://vetzoo.lsmuni.lt/data/vols/2018/76/pdf/mukantayev.pdf), использованная в настоящей заявке в качестве наиболее близкого аналога.
Схематичное изображение тест-полоски, основанной на данном принципе, представлено на рис. 1А. Тест-полоска для ИХ-серодиагностики с традиционной схемой включает следующий набор компонентов:
• начальная мембрана, абсорбирующая образец, на которую наносится анализируемая проба;
• подложка под конъюгат, на которую наносится конъюгат маркера с рецепторными молекулами (антивидовыми антителами, белками A/G и пр.);
• рабочей мембраны с иммобилизованным антигеном патогена;
• конечной абсорбирующей мембраны, впитывающей жидкость, протекающую через рабочую мембрану.
Процедура анализа в данной системе сводится к добавлению на один и тот же участок начальной абсорбирующей мембраны пробы и разбавляющего буфера и, через 10-15 мин, регистрацию результатов анализа.
Sotnikov, D.V., Zherdev, A.V., & Dzantiev, B.B. (2017). Theoretical and experimental comparison of different formats of immunochromatographic serodiagnostics. Sensors, 18(1), 36.
Данная схема ИХ-серодиагностики предполагает взаимодействие всех иммуноглобулинов, содержащихся в пробе, с реагентом для связывания иммуноглобулинов. С антигеном же взаимодействует только небольшая доля специфичных к нему иммуноглобулинов, которая обычно не превышает 1% от общей концентрации иммуноглобулинов в крови. Таким образом, сигнал ИХ-анализа (интенсивность окраски аналитической зоны) в традиционной схеме зависит не только от концентрации специфических антител, но и от общего содержания иммуноглобулинов в пробе, что не является диагностически значимым параметром. Конкуренция между специфическими и общими иммуноглобулинами за связывание с иммуноглобулин-связывающим белком негативно сказывается на достоверности диагностики. Поэтому иммунохроматография зачастую уступает по чувствительности альтернативным методам серодиагностики ().
Предлагаемый альтернативный способ ИХ-серодиагностики заключается в разделении стадий связывания специфических иммуноглобулинов с иммобилизованным антигеном и меченым иммуноглобулин-связывающим белком. Для последовательного связывания иммуноглобулинов и меченого реагента в аналитической зоне проба, раствор, содержащий меченый иммуноглобулин-связывающий белок и смывающий буфер последовательно наносятся на начальную мембрану тест-полоски как показано на рис. 1Б. На первой стадии специфические иммуноглобулины в пробе сначала взаимодействуют с антигеном в аналитической зоне, при этом не связавшиеся иммуноглобулины увлекаются потоком жидкости и вымываются из реакционной зоны. На второй стадии иммуноглобулины, связавшиеся в аналитической зоне, проявляются посредством взаимодействия с меченым иммуноглобулин-связывающим белком. Смывающий буфер необходим для поддержания постоянного потока жидкости через мембраны теста. Состав тест-полоски отличается от традиционного только отсутствием подложки под конъюгат. Продолжительность анализа составляет 10-15 мин.
Преимущество предлагаемого подхода продемонстрировано на примере ИХ-системы для определения специфических антител против рекомбинантного антигена P24 вируса лейкоза крупного рогатого скота.
Пример
Для формирования тест-систем использовали набор мембран компании Advanced Microdevices (Индия), включающий рабочую мембрану CNPC15, подложку под конъюгат PT-R5 (только в тест-системе с традиционным форматом), мембрану для нанесения образца GFB-R4 и конечную адсорбирующую мембрану CFSP 223000 Millipore (США).
520
520
520
Для формирования аналитической зоны использовали антиген P24 производства РГП «Национальный центр биотехнологии» Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан. На 1 см полосы наносили 2 мкл раствора антигена (1 мг/мл в 100 мМ Na - цитратном буфере, рН 6). Конъюгат коллоидного золота (средний диаметр частиц 25 нм) со стрептококковым белком G синтезировали при концентрации белка 10 мкг/мл и оптической плотности золота D=1. Конъюгат очищали от не связавшегося белка посредством центрифугирования при 10000 g и концентрировали до D=20. Для тест-системы в традиционном формате (рис. 1А) конъюгат наносили на подложку в объеме 15 мкл на 1 см полосы. В тест-системе в предложенном альтернативном формате (рис. 1Б) конъюгат использовали в жидком виде, нанося 5 мкл конъюгата D=20 на начальную адсорбирующую мембрану непосредственно после добавления анализируемой пробы. Для нанесения реагентов использовали диспенсер «IsoFlow» фирмы «Imagene Technology» (США). Листы мембран с нанесенными иммунореагентами нарезали на индивидуальные тест-полоски шириной 3,5 мм.
Иммунохроматографический анализ проводили при комнатной температуре. В тест-системе с традиционным форматом анализа (рис. 1А) на начальную адсорбирующую мембрану наносили 10 мкл сыворотки крови коровы зараженной вирусом лейкоза КРС. Затем в то же место наносили 50 мкл разбавляющего раствора (50 мМ К-фосфатный буфер, рН 7,4, с 0,1 М NaCl и 1% Tween-20). Фиксацию результата тестирования осуществляли через 10 мин.
В тест-системе с предложенным альтернативным форматом анализа (рис. 1Б) на начальную адсорбирующую мембрану наносили 5 мкл сыворотки крови коровы зараженной вирусом лейкоза КРС. Далее примерно на 1 см ниже места нанесения сыворотки наносили 5 мкл конъюгата белка G с коллоидным золотом D520=20. Затем примерно на 1 см ниже места нанесения конъюгата наносили 50 мкл смывающего раствора (50 мМ К-фосфатный буфер, рН 7,4, с 0,1 М NaCl и 1% Tween-20). Фиксацию результата тестирования осуществляли через 10 мин.
Пример результата тестирования сыворотки крови коровы с диагнозом «лейкоз» в двух форматах анализа представлен на рис. 2. Представленные результаты демонстрируют повышение интенсивности сигнала в аналитической зоне в предложенном способе серодиагностики и, таким образом, повышение достоверности анализа.