Новые данные по спонтанной онкогенетической трансформации «Взрослых» стволовых клеток костного мозга человека in vitro

Новости клеточных технологий

диабетиков мигрировавшие клетки одновременно несли генетические метки как донора, так и реципиента [GFP+/beta-даГ), что указывало на клеточное слияние. Было показано слияние ККМ с нейронами и шванновскими клетками в седалищном нерве и СНГ только мышей-диабетиков, но не здоровых животных.

Из недиабетических и диабетических животных были выделены нейроны для определения плоидности. У недиабетических крыс 99,1% нейронов СНГ были диплоидные (2п), а тетраплоидны (4п) - только 0,9%. Напротив, среди нейронов от диабетических животных была более низкая пропорция диплоидных клеток (2п) - 86,6%, более высокая пропорция полиплоидных клеток: 12,5% - тетраплоидны (4п), и 0,7% (6п) и 0,2% (8п). Кроме того, присутствие полиплоидии прямо коррелировало с экспрессией проинсулина.

Далее авторы показали, что слияние ККМ с нервными клетками в СНГ и седалищном нерве вызывает нарушение функции нервных клеток и их преждевременный апоптоз. Так, у диабетических животных гибридные клетки при слиянии начинают производить TNF-p и экспрессировать caspase-3 - проапоптотические факторы, которые участвуют в патогенезе периферической невропатии. Только у диабетических животных в СНГ были обнаружены единичные апоптотические клетки. Авторы полагают, что и полиплоид-ность, предположительно, ведет к выключению клеток из кле-

точного цикла, что вызывает апоптоз. Так, изолированные гибридные нейроны (проинсулин-позитивные) гораздо быстрее умирали в культуре, чем негибридные (проинсулин-негативные), выделенные из одной и той же ткани. Кроме того, авторы показали, что в клетках-гибридах седалищного нерва и СНГ значительно нарушен кальциевый гомеостаз, что может приводить к нарушению электрофизиологичес-кой функции таких нейронов и усугублять невропатию.

Таким образом, авторы исследования показали, что ККМ в процессе развития сахарного диабета активно мигрируют в различные органы, сливаются с нервными клетками, что приводит к ускорению апоптоза и развитию невропатии. Остаётся неясным, какие именно клетки костного мозга в данной модели обладают способностью к миграции и слиянию. Только ли патологическое значение имеет слияние в данной модели? Поскольку клетки-гибриды экспрессировали проинсулин и инсулин, то возможна ли секреция этих гормонов и экстра-панкреатическая компенсация синтеза инсулина?

Следует отметить, что это исследование, как и большая часть остальных, было выполнено на грызунах, поэтому остаётся неизученным, имеет ли феномен слияния ККМ негативные стороны в организме человека. Сможем ли мы управлять слиянием и возможно ли его применение только с терапевтической целью? Будущие исследования призваны ответить на эти вопросы.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Terada N., Hamazaki T., Oka M. et al. Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion. Nature 2002;.416[6880): 542-5.

2. Wang X., Willenbring H., Akkari Y. et al. Cell fusion is the principal source of bone-marrow-derived hepatocytes. Nature 2003; 422: 897.

3. Ferrari G., Cusella-De Angelis G., Coletta M. et al. Muscle regeneration by bone marrow derived myogenic progenitors. Science 1998; 279: 1528-30.

4. Nygren J.M., Jovinge S., Breitbach M. et al. Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nature Med. 2004; 10: 494-501.

5. Alvarez-Dolado M., Pardal R., Garcia-Verdugo J. et al. Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes. Nature 2003; 425: 968-73.

6. Abedi M., Greer D.A., Colvin G.A. et al. Robust conversion of marrow cells to skeletal muscle with formation of marrow-derived muscle cell colonies: a multifactorial process. Exp. Hematol. 2004; 32: 426-34.

7. Willenbring H., Bailey A.S., Foster M. et al. Myelomonocytic cells are sufficient for therapeutic cell fusion in liver. Nat. Med. 2004; 10; 7: 744-8.

8. Shi D., Reinecke H., Murry C.E., Torok-Storb B. Myogenic fusion of human bone marrow stromal cells, but not hematopoietic cells. Blood 2004; 104(1): 290-4.

9. Ogle B.M. et al. Spontaneous fusion of cells between species yields transdifferentiation and retroviral in vivo. FASEB J. 2004; 18: 548-50.

10. Ogle B.M., Cascalho M., Platt J.L. Biological implications of cell fusion. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005; 6(7): 567-75.

11. Lapidos K.A., Chen Y.E., Earley J.U. et al. Transplanted hematopoietic stem cells demonstrate impaired sarcoglycan expression after engraftment into cardiac and skeletal muscle. J. Clin. Invest. 2004; 114: 1577-85.

12. Dell'Agnola C., Wang Z., Storb R. et al. Hematopoietic stem cell transplantation does not restore dystrophin expression in Duchenne muscula dystrophy dogs. Blood 2004; 104(13): 4311-8.

13. Kojima H., Fujimiya M., Matsumura K. et al. Extrapancreatic insulin-producing cells in multiple organs in diabetes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004; 101(8): 2458-63.

Подготовил А. Поспелов По материалам Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005; 102: 12525-30

Новые данные по спонтанной онкогенетической трансформации «взрослых» стволовых клеток костного мозга человека in vitro

Широкое начало клинических испытаний методов терапии прогениторными и стволовыми клетками костного мозга при различных заболеваниях требует уверенности в их безопасности прежде всего - онкогенной. На потенциальный риск канцерогенеза из «взрослых» стволовых клеток человека после их трансплантации указывает тот факт, что они экспрессируют общие маркёры с эмбриональными стволовыми клетками и многими злокачественными линиями [1]. Кроме того, из многих злокачественных новообра-

зований человека были выделены и охарактеризованы так называемые опухоль-инициирующие клетки, которые, как оказалось, имеют общие характеристики [маркёры) с нормальными «взрослыми» стволовыми клетками [2].

Daniel Rubio описал популяцию мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток [MM^) человека, выделенную из подкожной жировой клетчатки, демонстрирующую злокачественные характеристики [3]. В культуре CD13+/

Новости клеточных технологий

CD90+/CD105+/CD106+ ММСК после двухмесячного пассирования[более 20 делений)стали появляться трансформированные клетки, характеризующиеся высокой способностью к канцерогенезу у 100% SCID-мышей-реци-пиентов [4]. Данные были тщательно проверены путём повторов экспериментов для других аликвот одного и того же образца. Кроме того, материал брали от пациентов, подвергшихся аппендэктомии и не страдающих злокачественными новообразованиями. Всё это позволило исключить перекрёстную контаминацию культур злокачественными клетками [3, 4]. Авторы работы указывают, что нужно провести широкомасштабные и более детальные исследования, поскольку такая спонтанная трансформация не являлась универсальной и наблюдалась не во всех образцах. По-видимому, это связано с высокой гетерогенностью популяции ММСК, хотя эксперименты дали схожие результаты у мыши и у человека [3, 8].

Работа, выполненная в Johns Hopkins University [Baltimore, USA), опубликованная в журнале Cytotherapy, подтверждает данные, полученные группой Rubio, и позволяет более детально взглянуть на проблему. Исследователи попытались ответить на вопрос - насколько безопасен феномен высокой пластичности (мультипотентности) ММСК в контексте их клинического применения?

ММСК выделяли из образцов костного мозга человека, полученных от нормальных доноров, используя высокую способность клеток к адгезии. На 3-м пассаже клетки имели типичную морфологию ММСК, фенотип CD105+/ CD73+/CD13+/CD90+/CD34-/CD45-/CD133- и легко подвергались адипо- и остеогенной дифференцировке в индукционной среде.

В монослойной культуре ММСК одного из образцов с 3-го пассажа появлялись колонии клеток, отличающиеся морфологически и интенсивно делящиеся при дальнейшем субкультивировании. Иммунофенотипически эти клетки характеризовали как CD133+/CD34-/CD38-/CD117-/ CD45-/CD105-/CD13-/CD73+/CD90low/CD31-/ABCG-BCRP+/ H LA-DR+-/VEGFR1-/VEGFR2+-. По сравнению с исходными, эти CD133+ клетки легко клонировались, теряли способность к «контанктному торможению», имели в 2 раза меньшее время удвоения и характеризовались высоким уровнем теломеразной активности. Эти клоны легко поддерживались в культуре около года без каких-либо признаков старения. Кариотипический анализ клонов [на 5-м, 7-м и 13-м пассажах) выявил множественные хромосомные аномалии, характерные для злокачественных клеток.

CD133+ клетки вызывали канцерогенез [преимущественно в лёгких, печени и канцероматоз брюшины) у облучённых NOD/SCID мышей через 4-6 недель после интра-перитонеальной и внутривенной трансплантации 2,5-10 млн клеток в 10 из 13 и в 3 из 12 случаев соответственно, и у 100% животных - через 8 недель.

Таким образом, авторы подтвердили данные о том, что нормальные ММСК человека способны к спонтанной он-когенетической трансформации в культуре. При увеличении числа пассажей в культуре ММСК появляются клоны, характеризующиеся всеми признаками злокачественности. В отличие от работы Rubio, в данном исследовании такие клетки появлялись уже на 3-м пассаже и проявляли типичные признаки злокачественности с 5-7 пассажа. Однако, такие клоны были выделены только из одного образца ядросодержащих клеток костного мозга, и остаётся неясным, насколько они универсальны и присутствуют ли в остальных образцах.

Основным отличительным признаком этих клеток от исходных [1 -2 пассажи) была высокая экспрессия С0133+ и утрата

экспрессии типичных маркёров, чаще всего описываемых у ММСК - С0105, CD13, CD90. Интересно, что в работе Rubio трансформированные клетки также теряли исходно высокую экспрессию CD105 и CD90, однако данных по CD133 не приводится. Отсюда можно предположить, что, возможно, речь идёт об одной и той же популяции клеток, описанной среди ММСК как подкожной жировой клетчатки, так и костного мозга. В обеих работах использовались среды без факторов роста, поэтому условия культивирования можно считать более-менее сходными.

Происхождение туморогенной популяции стволовых клеток среди пластик-адгезивных мононуклеарных клеток остаётся неясным. Популяция CD133+ [имеющая также фенотип ММСК) туморогенных клеток могла изначально присутствать в образцах или же появиться в культуре при пассировании гетерогенной популяции ММСК. Авторы настоящей работы указывают на большую вероятность второй теории, поскольку до 3-го пассажа экспрессия CD133 была недетектабельна. Интересно, что фенотип трансформированных клеток CD133+/CD31-/VEGFR2+ может указывать на то, что они происходят из эндотелиальных прогениторов. Чтобы выяснить этот вопрос, в будущих экспериментах придётся исключать различные популяции из общей гетерогенной пластик-адгезивной фракции, демонстрирующей свойства ММСК, методом сортинга и последующего их анализа в долговременной культуре. Тем не менее, проблема возникновения злокачественных опухолей из CD133+ клеток человека не нова и довольно неплохо изучена в настоящее время [1,7]. Данная работа только подтверждает теорию участия этих клеток в канцерогенезе и указывает на то, что, возможно, эти клетки -самые «молодые» в организме человека и обладают максимальной «стволовостью».

Общая биологическая способность ММСК к онкогене-тической трансформации остаётся дискутабельной. Так, было показано, что ММСК костного мозга человека легко иммортализуются и после 256 удвоений дают рост опухолей in vivo в 100% случаев [8]. С другой стороны, группа Kassem указывает, что при длительном пассировании ММСК, выделенных из костного мозга человека, они не получили никаких признаков иммортализации после 40 удвоений [4, 6]. Интересно, что ММСК мыши также подвержены спонтанной трансформации в культуре и демонстрируют сходную [с человеческими) злокачественность in vivo [3, 8]. В дискуссии к статье Rubio Kassem говорит о том, что результаты таких работ должны широко обсуждаться среди специалистов, поскольку речь идёт о широком применении этих клеток в клинике. Необходимы дополнительные исследования с более широким набором методов, например ДНК-отпечатков и микросателлитов [4].

Основной проблемой в интерпретации результатов работ нескольких групп исследователей может стать различие протоколов по выделению, культивированию и характеристике ММСК. Тем не менее, на сегодняшний день ясно, что при пассировании гетерогенной популяции пластик-адгезивных мононуклеарных клеток костного мозга и подкожного жира человека, обладающих характеристиками ММСК, появляются трансформированные клетки, способные к канцерогенезу in vivo. Эта работа ещё раз показывает, что клинические исследования по терапевтической эффективности ММСК преждевременны, и им должно предшествовать более детальное изучение онкогенетической безопасности такой терапии. Поскольку клинические испытания, использующие очищенные CD133+ клетки, в настоящее время уже проводятся в разных странах мира, авторы работы призывают, как минимум, проверять кариотип клеток перед введением.

Новости клеточных технологий

ЛИТЕРАТУРА:

1. Tai M.-H., Chang C.-C., Olson L.K., Trosko J.E. Oct4 expression in adult human stem cells: evidence in support of the stem cell theory of carcinogenesis. Carcinogenesis doi:10.1093/carcin/bgh321.

2. Singh S.K., Hawkins C., Clarke I.D. et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature 2004; 432: 396-401.

3. Rubio D., Garcia-Castro J., Martin M.C. et al. Spontaneous human adult stem cell transformation. Cancer Res. 2005; 65: 3035-9.

4. Kassem M., Burns J.S., Garcia C.J., Rubio M.D. Adult stem cells and cancer. Cancer Res. 2005; 65: 9601.

5. Serakinci N., Guldberg P., Burns J.S. et al. Adult human mesenchymal

stem cell as a target for neoplastic transformation. Oncogene 2004; 23; 29: 5095-8.

6. Stenderup K., Justesen J., Clausen C., Kassem M. Aging is associated with decreased maximal life span and accelerated senescence of bone marrow stromal cells. Bone 2003; 33: 919-26.

7. Toren A., Bielorai B., Jacob-Hirsch J. et al. CD133-positive hematopoietic stem cell «sternness» genes contain many genes mutated or abnormally expressed in leukemia. Stem Cells 2005; 23[8):1142-53.

8. Miura M., Miura Y., Padilla-Nash H.M. et al. Accumulated chromosomal instability in murine bone marrow mesenchymal stemcells leads to malignant transformation. Stem Cells 2005; Epub.

Подготовил A.B. Берсенев По материалам Cytotherapy 2005; 7: 509-19

К вопросу о репопуляции лёгочного эпителия человека клетками костного мозга

Возможным механизмом восстановления альвеолярного эпителия после повреждения лёгких является способность аль-веолоцитов II типа к делению. Многие ткани содержат в себе субпопуляцию так называемых камбиальных клеток, способных к пролиферации и дифференцировке, служащих для её восстановления при физиологической регенерации, а также в случае её повреждения. Кроме того, многими исследователями была показана миграция и участие в репаративной регенерации ткани прогениторных клеток костного мозга.

Было показано, что взрослые мультипотентные клетки-предшественники костного мозга мышей могут дифференцироваться в ткани всех трёх зародышевых листков in vitro [1 ]. Механизм, посредством которого клетки костномозгового происхождения мигрируют в различные ткани и дифференцируются, неизвестен, однако ясно, что это происходит под воздействим сигналов, вызванных повреждением [2, 3]. Также предполагается, что пластичность стволовых клеток может быть объяснена их слиянием с клетками ткани in situ [4].

В лёгких камбиальные клетки дифференцируются в базальные и слизистые секреторные клетки бронхов и клетки II типа альвеол. Результаты, полученные на различных экспериментальных моделях, показывают, что стволовые клетки костного мозга могут химеризовать лёгкие и дифференцироваться в альвеолоциты [2, 5, 6]. У человека в сериях назальных биопсий, взятых у женщин, получивших мужские трансплантаты костного мозга, не было выявлено Y-хромосом в эпителии верхних дыхательных путей [7]. Однако, в более поздних исследованиях был показан химеризм человеческого лёгочного эпителия, включая альвеолярный, после трансплантации ге-мапоэтических стволовых клеток [8, 9], но никто не показывал энграфтинга клеток костного мозга. Слияние стволовых клеток костного мозга с лёгочным эпителием человека было продемонстрировано in vitro [10], однако не было обнаружено в тканях, полученных от пациентов, которым были трансплантированы клетки противоположного пола [8, 9, 11].

Авторы статьи, недавно опубликованной в журнале Tissue Engineering, предположили, что клетки костного мозга могут участвовать в реэпителизации альвеол. С целью проверки этой гипотезы были исследованы архивные образцы тканей от пациентов-мужчин, которые получили трансплантаты от доноров-женщин, а также образцы, взятые при вскрытии от женщин, получивших трансплантаты костного мозга от до-норов-мужчин. Идентификацию клеток костного мозга и изу-

чение возможного слияния проводили методом выявления X- и Y-хромосом.

Было показано, что клетки внелегочного происхождения могут химеризовать лёгкие и дифференцироваться в альвеолярный эпителий, а также, что, по крайней мере, часть из этих клеток имеет костномозговое происхождение [материал от реципиентов после трансплантации костного мозга). У женщин, получивших костный мозг от доноров-мужчин, во многих типах лёгочных клеток была найдена Y-хромосома. Подтверждение наличия энтодермальных производных из стволовых клеток костного мозга имеет большее значение, так как об этой возможности сообщается в ряде исследований [2, 5, 8, 9, 11, 12] [если не принимать в расчет альтернативную точку зрения о развитии легочного эпителия из материала прехордальной пластинки, т.е. эктодермального происхождения). Наблюдения исследователей показали, что эпителий лёгких взрослого человека обладает способностью к восстановлению, используя клетки из одного или нескольких внелёгочных источников. Сами авторы указывают на то, что им, как и другим группам, пытавшимся обнаружить в лёгких клетки внелёгочного происхождения [8, 9], пришлось столкнуться с определёнными проблемами, главным образом, заключавшимися в плохой сохранности ткани, что может сказаться на чувствительности методов детекции.

Все образцы лёгочных трансплантатов имели явную патологию, все пациенты страдали хроническим отторжением трансплантата. Что касается пациентов, которым была проведена трансплантация костного мозга, то их смерть наступила в результате дыхательной недостаточности. Таким образом, привлечение клеток могло быть ответом на сигналы, порождённые тканями лёгкого в процессе патогенеза. В свете этого можно предположить необходимость дальнейших исследований сходных образцов здоровых лёгких, чтобы определить, является ли привлечение внелёгочных клеток частью нормального процесса обновления, или же оно задействуется исключительно при повреждении. Свидетельства, полученные на экспериментальных моделях, указывают на последнее, так как клетки внелёгочного происхождения обнаруживаются в тканях сразу после повреждения [5].

Хотя эксперименты in vitro, рассматривающие ответ человеческих мезенхимальных клеток на повреждение дыхательного эпителия, показывают слияние некоторых клеток [10], такое слияние не было обнаружено у пациентов,