НОВЫЙ ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЬСОДЕРЖАЩИЙ ГЛИЦЕРОЛИПИД
NEW POLYETHYLENE GLYCOL-CONTAINING GLYCEROLIPID

Изобретение относится к области химии, биотехнологии, медицины и химико-фармацевтической промышленности. Более конкретно, предложены новый полиэтиленгликоль-содержащий глицеролипид определенного строения, конъюгат на его основе с апконвертирующими наночастицами и способ получения такого конъюгата.
Среди разработанных на сегодняшний день липидных производных наиболее широко распространены 1,2-диолеолоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[амино(полиэтиленгликоль)-2000] (аммониевая соль) (DOPE-PEG) и 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[амино(полиэтиленгликоль)-2000] (аммониевая соль) (DSPE-PEG), благодаря таким преимуществам, как неиммуногенность, низкая токсичность, возможность крупномасштабного производства [Yang Li et al. Self-Assembled Nanoparticles Based on Amphiphilic Anticancer Drug-Phospholipid Complex for Targeted Drug Delivery and Intracellular Dual-Controlled Release / ACS Applied Materials & Interfaces, 2015, V. 7, N. 32, pp. 17573-17581; Michela Pisani et al. Metal cation induced cubic phase in poly(ethylene glycol)-functionalized dioleoylphosphatidylethanolamine aqueous dispersions / The Journal of Physical Chemistry B, 2008, V. 112, N. 17, pp. 5276-5278].
Однако за счет того, что длиноцепные заместители в 1 и 2 положении DOPE-PEG и DSPE-PEG присоединены через сложноэфирную связь, они быстро расщепляются в организме эстеразами. Кроме того, синтез глицерофосфолипидов отличается более сложной методикой по сравнению с синтезом глицеролипида на основе цистеина вместо фосфорной группы.
Из уровня техники известно, что использование полиэтиленгликоль содержащих липидов приводит к минимизации неспецифического клиренса в тканях ретикулоэндотелиальной системы, что увеличивает время удержания в кровотоке [Mark Kastantin et al. Effect of the Lipid Chain Melting Transition on the Stability of DSPE-PEG (2000) Micelles / Langmuir, 2009, V. 25, N. 13, pp. 7279-7286; Suk J.S. et al. PEGylation as a strategy for improving nanoparticle-based drug and gene delivery / Advanced Drug Delivery Reviews, 2016, V. 99, pp. 28-51]. В некоторых случаях использование полиэтиленгликоля (ПЭГ) уменьшает агрегацию эритроцитов и/или гемолиз [Eliyahu Н. et al. Lipoplex-induced hemagglutination: potential involvement in intravenous gene delivery / Gene therapy, 2002, V. 9, pp. 850-858].
Задача настоящего изобретения состояла в расширении арсенала полиэтиленгликоль-содержащих глицеролипидов, которые, в том числе, могли бы образовывать комплексы с апконвертирующими наночастицами.
Технический результат заключается в получении нового полиэтиленгликоль-содержащего глицеролипида и конъюгата на его основе с апконвертирующими наночастицами. Дополнительно технический результат заключается в придании биосовместимости и в обеспечении солюбилизации гидрофобных апконвертирующих наночастиц в биологических средах, а также в увеличении времени циркуляции в кровотоке.
Технический результат достигается ПЭГ-содержащим глицеролипидом, имеющим строение формулы (1):
где PEG - цепь полиэтиленгликоля с молекулярной массой от 750 до 2000 Да.
Структура ПЭГ-содержащего глицеролипида (1) включает:
18
- остаток глицерина с двумя жирными углеводородными хвостами с длиной цепи C для взаимодействия с остатками олеиновой кислоты на поверхности апконвертирующих наночастиц с образованием конъюгатов ПЭГ-содержащего глицеролипида с апконвертирующими наночастицами; и
- остаток полиэтиленгликоля различной молекулярной массы (от 750 до 2000 Да), необходимый для солюбилизации гидрофобных апконвертирующих наночастиц в биологических средах и образования устойчивых дисперсий в водных средах, а также для защиты комплексов глицеролипид-апконвертирующие наночастицы от воздействия сыворотки крови и увеличения времени циркуляции в кровотоке.
Для присоединения ПЭГ к глицерину в качестве линкера используют янтарный ангидрид. В качестве аминокислоты использовали цистеин. Заряженная карбоксильная группа в остатке цистеина способствует предотвращению агрегации конъюгатов ПЭГ-содержащего глицеролипида с апконвертирующими наночастицами.
4
4
4
4
3+
3+
3+
3+
Технический результат также достигается конъюгатом ПЭГ-содержащего глицеролипида (1) с апконвертирующими наночастицами NaYF:Yb:Er/NaYF или NaYF:Yb:Tm/NaYF, покрытыми остатками олеиновой кислоты
Кроме того, технический результат достигается способом получения предложенного конъюгата, согласно которому к суспензии апконвертирующих наночастиц в гексане добавляют раствор ПЭГ-содержащего глицеролипида в хлороформе, затем полученную смесь упаривают досуха и сушат в вакууме в течение 1-3 ч.
В качестве исходного соединения в синтезе ПЭГ-содержащего глицеролипида (1) использовали 1,2-изопропилиденглицерин (2), из которого при взаимодействии с бензилбромидом в N,N-диметилформамиде (ДМФА) был получен 1,2-изопропилиден-3-бензилглицерин (3). Удаление изопропилиденовой защиты в условиях кислотного гидролиза приводило к образованию 1-бензилглицерина (4), который в дальнейшем алкилировали октадецилбромидом в присутствии гидрида натрия в ДМФА с образованием 1,2-диоктадецил-3-бензилглицерина (5). Соединение (5) гидрировали в присутствии Pd/C в смеси растворителей тетрагидрофуран/метанол (ТГФ/МеОН), с образованием 1,2-диоктадецилглицерина (6). 1,2-диоктадецилглицерин растворяли в хлористом метилене, добавляли трифенилфосфин и N-бромсукцинимид, в результате получали 1,2-диоктадецил-3-бромглицерин (7) [Wenyan Wu et al. Structure-Activity relationship in Toll-like receptor-2 agonistic diacyithioglycerol lipopeptides / Journal of Medicinal Chemistry, 2010, V. 53, pp. 3198-3213]. Следующим этапом было присоединение аминокислоты к липидной части. В качестве аминокислоты использовали N-Boc-цистеин. Его алкилировали по атому серы с использованием хемоселективной реакции в ДМФА в присутствии триэтиламина и йодида калия, который добавляли в каталитических количествах и использовали как реагент для образования йодпроизводного 1,2-диоктадецилглицерина in situ, с получением соединения (9). Далее Вос-защиту удаляли 4М раствором хлороводорода в метаноле с образованием соединения со свободной аминогруппой (10), которую далее ацилировали янтарным ангидридом. Реакцию проводили в хлороформе в присутствии диизопропилэтиламина в качестве основания. В результате получали продукт со свободной карбоксильной группой (11) с количественным выходом. Для активации карбоксильной группы в соединении (11) для реакции с ПЭГ использовали N-гидроксисукцинимид в присутствии 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC). На последней стадии проводили присоединение ПЭГ к активированному производному (12) в присутствии диизопропилэтиламина с образованием целевого соединения (1).
Растворители и реагенты Sigma-Aldrich. Хлористый метилен и триэтиламин кипятили над гидридом кальция и перегоняли перед реакцией. Пиридин кипятили над гидроксидом калия и перегоняли перед реакцией.
Колоночную хроматографию осуществляли на силикагеле Silicagel 60 (0,040-0,063 мм и 0,063-0,200 мм, Merck). Обнаружение пятен на хроматограммах проводили раствором фосформолибденовая кислота/церий (IV) сульфат с последующим прогреванием и с помощью УФ-лампы (254 нм).
1
13
1
13
3
3
Н
C
3
Спектры Н-ЯМР и С-ЯМР регистрировали на приборе Bruker DPX 300 с использованием CDCl в качестве растворителя, если не указано иное. Химические сдвиги Н-ЯМР приведены относительно остаточного сигнала CHCl (δ 7.26 м.д.). Химические сдвиги С-ЯМР приведены относительно центрального сигнала растворителя (δ 77.0 м.д. для растворов в CDCl). Масс-спектры были получены на спектрометре Ultraflex II Bruker Daltonics методом MALDI TOF.
4
4
4
4
3+
3+
3+
3+
Далее осуществляли получение конъюгата ПЭГ-содержащего глицеролипида с апконвертирующими наночастицами NaYF:Yb:Er/NaYF или NaYF:Yb:Tm/NaYF. Для этого к суспензии апконвертирующих наночастиц в гексане добавляли раствор ПЭГ-содержащего глицеролипида (1) в хлороформе, затем полученную смесь упаривают досуха и сушат в вакууме в течение 1-3 ч.
4
4
4
4
3+
3+
3+
3+
Для изучения времени удержания целевого конъюгата ПЭГ-содержащего глицеролипида с апконвертирующими наночастицами NaYF:Yb:Er/NaYF или NaYF:Yb:Tm/NaYF в кровотоке использовали клетки SK-BR-3 и применяли 5% раствор исследуемого конъюгата в 0,9% растворе хлорида натрия. Далее проводилась серия экспериментов на лабораторных животных. Использовали модель черных мышей с введением наркоза золетил-рометара по 0,2 мл внутрибрюшинно, в количестве 3 шт.
Сопоставительный анализ заявляемого соединения с известными и широко используемыми DOPE-PEG и DSPE-PEG показал, что ПЭГ-содержащий глицеролипид (1) обладает следующими преимуществами:
4
4
4
4
3+
3+
3+
3+
1) увеличение времени удержания заявленного конъюгата ПЭГ-содержащего глицеролипида с апконвертирующими наночастицами NaYF:Yb:Er/NaYF или NaYF:Yb:Tm/NaYF в кровотоке по сравнению с коммерчески доступными прототипами с 15 мин до 30 мин;
4
4
4
4
3+
3+
3+
3+
2) полученный конъюгат ПЭГ-содержащего глицеролипида с апконвертирующими наночастицами NaYF:Yb:Er/NaYF или NaYF:Yb:Tm/NaYF не требует сложной процедуры приготовления;
4
4
4
4
3+
3+
3+
3+
3) предлагаемый конъюгат ПЭГ-содержащего глицеролипида с апконвертирующими наночастицами NaYF:Yb:Er/NaYF или NaYF:Yb:Tm/NaYF стабилен при хранении как в сухом виде, так и в виде водных формуляций.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Синтез ПЭГ-содержащего глицеролипида (1), молекулярная масса ПЭГ 2000 Да.
кип
К суспензии гидрида натрия (6 г, 0.14 моль) в N,N-диметилформамиде (150 мл) прикапывали 1,2-изопропилиденглицерин (2) (18.1 г, 0.14 моль) в N,N-диметилформамиде (10 мл) в течение 30 мин при охлаждении. Затем в течение 15 мин прикапывали бензилбромид (24 г, 0.14 моль), перемешивали еще 10 мин. Полученный раствор отфильтровывали, упаривали. Осадок соединения (3) растворяли в хлористом метилене (100 мл), промывали водой (50 мл) и упаривали. Остаток перегоняли в вакууме при 0,1 мм.рт.ст. (t=90°С). Получили 24.5 г (80%) 1,2-изопропилиден-3-бензилглицерина (3).
К раствору 1,2-изопропилиден-3-бензилглицерина (3) (10 г, 44.8 ммоль) в 80% водном метаноле (20 мл) добавляли смолу Dowex 50wx2 в Н+ форме (2 г) и перемешивали при кипячении 2 часа. Затем раствор отфильтровывали, промывали гексаном (200 мл), осушали над сульфатом натрия и упаривали. Остаток соединения (4) растворяли в хлороформе (30 мл) и выдерживали 2 суток над молекулярными ситами 3А, отфильтровывали, упаривали и сушили в вакууме масляного насоса в течение 3 ч. Получили 7.6 г (92%) 1-бензилглицерина (4).
К раствору 1-бензилглицерина (4) (188 мг, 1.03 ммоль) в N,N-диметилформамиде (5 мл) добавляли гидрид натрия (124 мг, 1.1 ммоль) и перемешивали в течение 15 мин. Затем добавляли октадецилбромид (824 мг, 1.03 ммоль) и перемешивали сутки. Избыток гидрида натрия нейтрализовали метанолом (2 мл). Полученный раствор растворяли в хлористом метилене (50 мл), промывали водой (50 мл). Осушали над сульфатом натрия и упаривали. Продукт очищали методом колоночной хроматографии, элюируя системой гексан/этилацетат. После чего перекристаллизовывали из изопропанола. Получили 319 мг (45%) 1,2-диоктадецил-3-бензилглицерина (5).
К раствору соединения (5) (8 г, 0.012 моль) в смеси ТГФ (100 мл) и метанола (10 мл), добавляли 10%-й палладий на угле (500 мг) и гидрировали при атмосферном давлении до поглощения необходимого объема водорода. Осадок отфильтровывали, раствор упаривали. Остаток растворяли в хлористом метилене (80 мл) и промывали водой (50 мл). Осушали над сульфатом натрия и упаривали. Продукт (6) перекристаллизовывали из гексана. Получили 4.94 г (71%) 1,2-диоктадецилглицерина (6).
К раствору соединения (6) (800 мг, 1.35 ммоль) в хлористом метилене (50 мл) добавляли трифенилфосфин (1.065 г, 4.05 ммоль) и перемешивали при охлаждении 10 мин. Затем при охлаждении к смеси добавляли N-бромсукцинимид (721 мг, 4.05 ммоль) и перемешивали 3 часа при комнатной температуре. Полученное соединение промывали водой (50 мл), осушали над сульфатом натрия и упаривали. От примесей трифенилфосфиноксида соединение (7) очищали переосаждением из гексана. Получили 797 мг (90%) 1,2-диоктадецил-3-бромглицерина (7).
К раствору метилового эфира цистеина (5 г, 29 ммоль) в ТГФ (40 мл) добавляли триэтиламин (5.8 г, 58 ммоль). Перемешивали при охлаждении в атмосфере аргона 10 мин и прикапывали раствор Вос-ангидрида (6.3 г, 29 ммоль) в ТГФ (10 мл). Затем реакционную смесь перемешивали 2 часа при комнатной температуре. Полученное соединение экстрагировали этилацетатом (100 мл), осушали над сульфатом натрия и упаривали. Получили 7 г (97%) метилового эфира N-трет-бутоксикарбонилцистеина (8).
К раствору соединения (7) (2.25 г, 3.41 ммоль) в N,N-диметилформамиде (30 мл) добавляли диизопропилэтиламин (3.7 г, 27.28 ммоль), метиловый эфир трет-бутоксицистеина (6.8 г, 27.28 ммоль) и каталитическое количество йодистого калия. Затем перемешивали 4 часа при нагревании до 80°С. Полученное соединение экстрагировали хлороформом (200 мл) и промывали 2 раза водой (2×20 мл) и 1 раз растровом разбавленной HCl, осушали над сульфатом натрия, упаривали. Продукт очищали методом колоночной хроматографии, элюируя системой гексан/этилацетат. Получили 2.5 г (90%) 1,2-диоктадецил-глицеро-S-(O-метил-N-трет-бутокси)-цистеина (9).
К раствору соединения (9) (2 г, 2.46 ммоль) в хлористом метилене (20 мл) добавляли HCl/МеОН (2 г, 28 ммоль). Перемешивали 12 часов при комнатной температуре. Полученное соединение упаривали и переосаждали из диэтилового эфира (40 мл). Получили 1.76 г (92%) гидрохлорида 1,2-диоктадецил-глицеро-S-(O-метил)-цистеина (10).
К раствору соединения (10) (200 мг, 0.28 ммоль) в хлористом метилене (5 мл) добавляли диизопропилэтиламин (15 мг, 0.7 ммоль) и янтарный ангидрид (12.5 мг, 0.7 ммоль). Перемешивали 12 часов при комнатной температуре. Полученное соединение промывали 2 раза водой (2×10 мл) и 1 раз растровом разбавленной HCl, осушали над сульфатом натрия, упаривали. В дальнейшем использовали без дополнительной очистки. Получили 200 мг (88%) 1,2-диоктадецил-глицеро-S-(O-метил-N-бутандионкарбокси)-цистеина (11).
К раствору соединения (11) (100 мг, 0.12 ммоль) в хлористом метилене (5 мл) добавляли N-гидроксисукцинимид (16 мг, 0.13 ммоль) и 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (26 мг, 0.13 ммоль). Перемешивали 12 часов при комнатной температуре. Полученный продукт промывали водой (5 мл), осушали над сульфатом натрия и упаривали. В дальнейшем использовали без дополнительной очистки. Получили 101 мг (90%) 1,2-диоктадецил-глицеро-S-(O-метил-N-бутандионкарбокси)-сукцинимидоцистеина (12).
2000
К раствору соединения (12) 100 мг (0.11 ммоль) в хлористом метелене добавляли диизопропилэтиламин (30 мг, 0.22 ммоль) и амино-метокси-ПЭГ (440 мг, 0.22 ммоль). Перемешивали 24 часа при комнатной температуре. Полученные продукты промывали 2 раза водой (2×10 мл) и 1 раз растровом разбавленной HCl, осушали над сульфатом натрия и упаривали. Продукт очищали методом колоночной хроматографии, элюируя системой хлороформ/метанол. Получили 213 мг (69%) 1,2-диоктадецил-глицеро-S-(O-метил-N-бутандионкарбокси-N-метокси)-ПЭГ-цистеина (13).
К раствору соединения (13) (100 мг, 0.03 ммоль) в ТГФ (2,5 мл) добавляли раствор гидроксида лития (27.5 мг, 1.14 ммоль) в воде (1 мл). Перемешивали 2 часа при комнатной температуре. Полученный продукт подкисляли раствором соляной кислоты до рН 4 и экстрагировали хлористым метиленом, осушали над сульфатом натрия и упаривали. Продукт очищали переосаждением из диэтилового эфира. Получили 95 мг (96%) 1,2-диоктадецил-глицеро-S-(N-бутандионкарбокси-N-метокси)-ПЭГ-цистеина (14).
2
К раствору соединения (14) (100 мг, 0.03 ммоль) в смеси МеОН/HO (2 мл/2 мл) добавляли раствор гидрокарбоната натрия (20 мг, 0.24 ммоль) в воде (1,5 мл). Перемешивали и досуха упаривали. Полученный продукт сушили в вакууме масляного насоса 30 мин. Продукт растворяли в хлороформе (5 мл) и упаривали. Продукт очищали переосаждением из диэтилового эфира. Получили 99 мг (99%) натриевой соли 1,2-диоктадецил-глицеро-S-(N-бутандионкарбокси-N-метокси)-ПЭГ-цистеина (1).
1
H
H
H
Н
Н
Н
Н
H
Н
Н
Н
Н
2
3
2
2
2
2
2
3
Соединение 14: Н-ЯМР, (δ, м.д.): 7.05 (м, 1Н, N-), 6.36 (с, 1H, ПЭГ-N-), 4.74 (дк, J=11.0, 5.6 Гц, 1Н, HN-C-), 3.96-3.22 (м, 192Н, глицерин--О, O-С-октадецил, ПЭГ-, ПЭГ-О-С), 3.04-2.98 (м, 2Н, HS-C), 2.88-2.46 (м, 6Н, С-СООН, глицерин-С-S), 1.69-1.45 (м, 4Н, O-СН-С-октадецил), 1.26 (с, 60Н, октадецил-Н), 0.86 (т, J=6.7 Гц, 6Н, С).
Пример 2. Синтез ПЭГ-содержащего глицеролипида (1), молекулярная масса ПЭГ 1500 Да.
2000
1500
ПЭГ-содержащий глицеролипид (1) с молекулярной массой ПЭГ 1500 Да получали в соответствии с аналогичной процедурой, которая подробно изложена в примере 1, за исключением в том, что вместо амино-метокси-ПЭГ использовали амино-гидрокси-ПЭГ. Получили 120 мг (39%) натриевой соли 1,2-диоктадецил-глицеро-S-(N-бутандионкарбокси-N-метокси)-ПЭГ-цистеина (1).
1
H
H
H
Н
Н
Н
Н
H
Н
H
Н
Н
2
3
2
2
2
2
2
3
Н-ЯМР, (δ, м.д.): 7.05 (м, 1Н, N-), 6.36 (с, 1Н, ПЭГ-N-), 4.74 (дк, J=11.0, 5.6 Гц, 1Н, HN-C-), 3.96-3.22 (м, 147Н, глицерин--О, О-С-октадецил, ПЭГ-, ПЭГ-О-С), 3.04-2.98 (м, 2Н, HS-C), 2.88-2.46 (м, 6Н, С-СООН, глицерин-C-S), 1.69-1.45 (м, 4Н, O-СН-С-октадецил), 1.26 (с, 60Н, октадецил-Н), 0.86 (т, J=6.7 Гц, 6Н, С).
Пример 3. Синтез ПЭГ-содержащего глицеролипида (1), молекулярная масса ПЭГ 750 Да.
2000
750
ПЭГ-содержащий глицеролипид (1) с молекулярной массой ПЭГ 750 Да получали в соответствии с аналогичной процедурой, которая подробно изложена в примере 1, за исключением в том, что вместо амино-метокси-ПЭГ использовали амино-гидрокси-ПЭГ. Получили 90 мг (37%) натриевой соли 1,2-диоктадецил-глицеро-S-(N-бутандионкарбокси-N-метокси)-ПЭГ-цистеина (1).
1
H
H
H
Н
Н
Н
Н
H
Н
H
Н
Н
2
3
2
2
2
2
2
3
Н-ЯМР, (δ, м.д.): 7.05 (м, 1Н, N-), 6.36 (с, 1H, ПЭГ-N-), 4.74 (дк, J=11.0, 5.6 Гц, 1H, HN-C-), 3.96-3.22 (м, 74Н, глицерин--О, O-С-октадецил, ПЭГ-, ПЭГ-О-С), 3.04-2.98 (м, 2Н, HS-C), 2.88-2.46 (м, 6Н, С-СООН, глицерин-C-S), 1.69-1.45 (м, 4Н, O-СН-С-октадецил), 1.26 (с, 60Н, октадецил-Н), 0.86 (т, J=6.7 Гц, 6Н, С).
4
4
4
4
3+
3+
3+
3+
Для создания конъюгатов на основе ПЭГ-содержащего глицеролипида (1) использовали апконвертирующие наночастицы со структурой ядро-оболочка NaYF:Yb:Er/NaYF или NaYF:Yb:Tm/NaYF, полученные методом высокотемпературного разложения прекурсоров в высокипящих гидрофобных растворителях, методика синтеза таких наночастиц описана в уровне техники [Khaydukov E.V. et al. Riboflavin photoactivation by apconvertion nanoparticles for cancer treatment / Scientific Reports, 2016, V. 6, 35103; Nechaev A.V. et al. Natural Chlorins Octadecylamides - Upconversion Nanoparticles Complexes for the Study of Energy Transfer Process / Macroheterocycles, 2016, V. 9, pp. 361-365]. В данных работах получены монодисперсные гидрофобные наночастицы со средним размером 60 нм, покрытые остатками олеиновой кислоты. Наночастицы обладают антистоксовой фотолюминисценцией при возбуждении на длине волны 975 нм.
4
4
3+
3+
Пример 4. Синтез конъюгата ПЭГ-содержащего глицеролипида (1) с апконвертирующими наночастицами NaYF:Yb:Er/NaYF.
4
4
3+
3+
16 мг ПЭГ-содержащего глицеролипида (1) растворяли в 2 мл хлороформа и смешивали с 4 мг апконветирующих наночастиц NaYF:Yb:Er/NaYF, диспергированных в 4 мл гексана (концентрация наночастиц 1 мг/мл). Полученную смесь медленно упаривали до образования тонкой пленки и сушили в вакууме масляного насоса 2 часа.
4
4
3+
3+
Полученный конъюгат ПЭГ-содержащего глицеролипида (1) с апконвертирующими наночастицами NaYF:Yb:Er/NaYF суспендировали в 5 мл воды и фильтровали через шприцевой фильтр с размерами пор 0,2 мкм с последующим центрифугированием в течение 1 часа при 6000 об/мин, а затем диспергированием в 2 мл 0,9% раствора хлорида натрия с образованием устойчивой дисперсии.
4
4
3+
3+
Пример 5. Синтез конъюгата ПЭГ-содержащего глицеролипида (1) с апконвертирующими наночастицами NaYF:Yb:Tm/NaYF.
4
4
4
4
4
4
3+
3+
3+
3+
3+
3+
Конъюгат ПЭГ-содержащего глицеролипида (1) с апконвертирующими наночастицами NaYF:Yb:Tm/NaYF получали в соответствии с аналогичной процедурой, которая подробно изложена в примере 4, за исключением в том, что вместо апконвертирующих наночастиц NaYF:Yb:Er/NaYF использовали наночастицы NaYF:Yb:Tm/NaYF.
4
4
4
4
3
3+
3+
3+
На фиг. 1 представлены фотографии 5% растворов полученных конъюгатов в 0,9% растворе хлорида натрия: фиг. 1а - раствор конъюгата ПЭГ-содержащего глицеролипида (1) с апконвертирующими наночастицами NaYF:Yb: Er/NaYF; фиг. 1б - раствор конъюгата ПЭГ-содержащего глицеролипида (1) с апконвертирующими наночастицами NaYF:Yb:Tm/NaYF.
Пример 6. Анализ на время циркуляции в кровотоке.
4
4
4
4
3+
3+
3+
3+
Для исследования времени циркуляции конъюгата ПЭГ-содержащего глицеролипида (1) с апконвертирующими наночастицами NaYF:Yb:Er/NaYF в кровотоке проводилась серия экспериментов на лабораторных животных. Использовали модель черных мышей с введением наркоза золетил-рометара по 0,2 мл внутрибрюшинно, в количестве 3 шт. Вводили конъюгат ПЭГ-содержащего глицеролипида (1) с апконвертирующими наночастицами NaYF:Yb:Er/NaYF в 0,9% растворе хлорида натрия по 0,15 мл внутривенно (в ретроорбитальный синус). Забор крови осуществляли из хвостовой вены через 1, 3, 5, 10, 30, 60, 120, 180 мин и 1 сутки с подрезанием хвоста. Каждый образец крови исследовался на апконверсионном люминесцентном микроскопе (с детекцией отдельных наночастиц) в четырех случайных местах. Получали соответствующие фотографии и вручную подсчитывали количество наночастиц. На фиг. 2 выборочно представлены микрофотографии образцов крови с люминесцентного микроскопа, качественно демонстрирующие изменение концентрации наночастиц с течением времени.
С помощью оригинальных имиджинговых систем, разработанных во ФНИЦ «Кристаллография и фотоника» РАН, наблюдался апконверсионный сигнал в кровеносной системе малого животного до 30 мин.
Таким образом, приведенные примеры однозначно указывают на то, что ПЭГ-содержащий глицеролипид (1) обладает способностью солюбилизировать гидрофобные апконвертирующие наночастицы в биологических средах, а также защищает полученные конъюгаты ПЭГ-содержащий глицеролипид-апконвертирующие наночастицы от воздействия сыворотки крови, что приводит к увеличению времени циркуляции в кровотоке по сравнению с коммерчески доступными производными.