СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНТЕГРАЛЬНОЙ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОЛИМЕТАКРИЛАТНОЙ МАТРИЦЫ
METHOD OF DETERMINING INTEGRAL ANTIOXIDANT ACTIVITY USING POLYMETHACRYLATE MATRIX

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано для определения интегральной антиоксидантной активности (АОА) растительного сырья и продуктов питания на его основе.
Известен способ спектрофотометрического определения суммарной АОА растительного сырья и пищевых продуктов на его основе (Патент 2282851, Россия, МПК G01N 33/02. Способ определения суммарной антиоксидантной активности. Цюпко Т.Г., Темердашев З.Ф., Воронова О.Б., Храпко Н.В. - 2004138188/13, заявл 27.12.2004; опубл. 27.08.2006). Способ основан на взаимодействии аналита с реагентом 0,06 М Fe(III) - 0,01 М о-фенантролин и аскорбиновой кислоты (АК) с таким же реагентом, который добавляют в соотношении 1:100, инкубировании не менее 90 мин, фотометрировании при (510±20) нм, с последующим установлением зависимости величины аналитического сигнала от количества вещества и расчетом величины суммарной АОА. Недостатком данного способа можно считать низкую оперативность.
Повысить оперативность определения можно путем иммобилизации аналитических реагентов на твердых матрицах. Иммобилизация аналитических реагентов на твердых матрицах представляет большой практический интерес ввиду возможности их использования для изготовления чувствительных элементов, которые являются основной частью оптических сенсоров и тест-методов, позволяющих проводить экспрессное определение.
Известен тест-метод определения АОА растительных продуктов, основанный на редокс-реакции на поверхности модифицированного сорбента (Zaporozhets O.A., Krushynska O.A., Lipkovska N.A., Barvinchenko V.N. A new test method for the evaluation of total antioxidant activity of herbal products // Agricultural and food chemistry. 2004. №52. P. 21-25). Определение АОА основано на восстановлении комплекса тетрабензо[b,f,j,n]-[l,5,9,13] тетраазациклогексадецинмедь (II) нитрат, адсорбированного на силикагеле до его Cu(1)-аналога при воздействии восстановителей органической природы, присутствующих в анализируемом объекте с последующим фотометрированием мембраны при 712 нм.
К недостаткам предложенного способа определения можно отнести сложность измерения светопоглощения суспензии силикагеля, что ведет к необходимости использования метода «двух длин волн» для учета влияния неоднородности сорбента на величину измеряемого сигнала. Кроме того, используемая в предложенном способе индикаторная система Cu(II)/Cu(I)-тетрабензо[b,f,j,n]-[1,5,9,13] тетраазациклогексадецин нитрат обладает низким окислительно-восстановительным потенциалом [Липковская Н.А., Кольчинский А.Г., Чуйко А.А. Определение редокс - потенциала соединения, иммобилизованного на сорбенте // Журнал физической химии. 1991. Т.65. №11. С.3005-3010], что ограничивает ее применение для определения широкого круга восстановителей.
Наиболее близким аналогом к заявляемому изобретению является способ качественной оценки АОА пищевых продуктов с использованием оптической мембраны на основе поливинилхлорида с иммобилизованным хромогенным радикалом (Murkovic Steinberg I., Milardovic S. Chromogenic radical based optical sensor membrane for screening of antioxidant activity // Talanta. 2007. V.71. P.1782-1787). Способ основан на гашении свободных радикалов антиоксидантами. Оптическая мембрана с иммобилизованным хромогенным радикалом DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилгидразил радикал) реагирует с антиоксидантами в водных растворах с необратимым изменением цвета мембраны с фиолетового (максимум поглощения при 520 нм) на желтый.
Недостаткам данного способа можно считать сложность процесса изготовления оптической мембраны на основе поливинилхлорида, так как необходимо контролировать много факторов, особенно, совместимость реагента с поливинилхлоридной мембраной. Предложенная оптическая мембрана не может быть использована для количественной оценки антиоксидантной активности, а только в виде индикаторной тест-системы для ее качественной оценки. Также использование метода гашения свободных радикалов усложняет интерпретацию полученных результатов из-за отсутствия теоретической обоснованности самого метода (Antolovich М., Prenzler P.D., Patsalides E., McDonald S. and Robards K. Methods for testing antioxidant activity // Analyst. 2002. 127. P.183-198).
Задачей настоящего изобретения является разработка способа определения интегральной антиоксидантной активности с использованием иммобилизованной индикаторной окислительно-восстановительной системы.
Решение указанной задачи достигается тем, что в способе определения интегральной антиоксидантной активности, включающем взаимодействие реагента, иммобилизованного в оптическую мембрану, с аналитом, последующее ее отделение от раствора и оценку величины антиоксидантной активности, отличающемся тем, что в качестве мембраны применяют полиметакрилатную матрицу с иммобилизованной индикаторной системой железо (III) - о-фенантролин, аналитический сигнал представляют в виде светопоглощения при (510±20) нм, координаты цвета или визуальной оценки интенсивности окраски оптической мембраны, количественную и/или качественную оценку интегральной антиоксидантной активности проводят по градуировочному графику и/или цветовой шкале, построенных для аскорбиновой кислоты, используемой в качестве вещества-стандарта.
Сущность заявляемого способа заключается во взаимодействии восстановителей органической природы с индикаторной системой железо (III) - о-фенантролин, иммобилизованной в полиметакрилатную матрицу. При этом железо (III) восстанавливается до железа (II), которое образует с о-фенантролином прочный, окрашенный в оранжевый цвет комплекс, имеющий в спектре поглощения максимум при λ=510 нм.
Иммобилизацию индикаторной системы железо (III) - о-фенантролин в полиметакрилатную матрицу проводили ее сорбцией из раствора в статическом режиме в две стадии. Для этого полиметакрилатную матрицу перемешивали в 0,5% водном растворе о-фенантролина в течение 5 мин, затем в водном растворе железа (III) в течение 5 мин.
510
510
asc
Условия взаимодействия восстановителей с индикаторной системой железо (III) - о-фенантролин, иммобилизованной в полиметакрилатную матрицу, были определены в результате изучения изменения поглощения (A) от рН раствора и концентрации аскорбиновой кислоты при различном времени контакта оптической мембраны с раствором аскорбиновой кислоты объемом 50 мл. Было установлено, что оптимальное pH раствора аскорбиновой кислоты для восстановления железа в полиметакрилатной матрице и образования окрашенного комплекса соответствует 3-6. С увеличением времени контакта диапазон линейности зависимости A=f(c) падает, но при этом возрастает чувствительность определения. Поэтому в качестве условий исследования взаимодействия восстановителей с иммобилизованными индикаторными системами были выбраны время контакта 45 мин и pH растворов, равный 3.
510
Для исследования влияния восстановителей органической природы на изучаемые индикаторные системы были выбраны наиболее часто встречающиеся в реальных объектах антиоксиданты: рутин, танин, кверцетин, галловая кислота, цистеин. Зависимости A от содержания восстановителя в растворе и их параметры представлены на фиг.1 и в таблице 1.
510
Для доказательства суммирующего характера определяемой величины интегральной АОА был использован подход, представленный в статье по определению антиоксидантной активности пищевых продуктов (Темердашев З.А., Храпко Н.В., Цюпко Т.Г., Воронова О.Б., Балаба А.Н. Определение антиоксидантной активности пищевых продуктов с использованием индикаторной системы Fe(III)/Fe(II) - органический реагент.// Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 2006. Т. 72. №11. С.15-19). Для этого изучено влияние модельных смесей, в состав которых входили восстановители танин, рутин, кверцетин и АК в различных соотношениях, на индикаторную систему железо (III) - о-фенантролин, иммобилизованную в полиметакрилатную матрицу. Расчет теоретической величины интегральной АОА проводили по уравнениям количественного соответствия, характеризующим антиоксидантную способность исследуемого восстановителя по отношению к аскорбиновой кислоте как вещества-стандарта (таблица 2). Экспериментальные значения АОА рассчитывали по усредненному уравнению регрессии для зависимости A от количества аскорбиновой кислоты. Из результатов, представленных в таблице 3, видно, что экспериментально полученные величины АОА удовлетворительно согласуются с теоретически рассчитанными. Полученные данные показывают, что определяемая величина АОА является результатом совместного действия всех присутствующих в модельной смеси восстановителей. Таким образом, определяемый показатель является интегральным, и оптическая мембрана на основе полиметакрилатной матрицы с иммобилизованной системой железо (III) - о-фенантролин может быть использована при разработке способа оценки интегральной АОА.
Пример 1. Измерение поглощения оптической мембраны и определение интегральной АОА по градуировочному графику.
510
АK
АK
В 50 мл анализируемого раствора с суммарным содержанием антиоксидантов не более 1,5 мг с pH 3 (цитратный буфер, контроль pH-метром) помещали пластинку полиметакрилатной матрицы с иммобилизованной индикаторной системой и перемешивали в течение 45 минут, затем вынимали, подсушивали фильтровальной бумагой и измеряли поглощение при 510 нм. Содержание интегральной АОА находили по градуировочной зависимости, построенной для АК в аналогичных условиях, с последующим расчетом величины суммарной АОА в виде количества вещества-стандарта (аскорбиновой кислоты), производящего антиоксидантный эффект, эквивалентный действию суммы восстановителей в аналите. Уравнение градуировочной зависимости имеет вид: A=0,12+19,61·c (r=0,999), где c - концентрация AK, мг/мл. Диапазон линейности градуировочной зависимости составляет 0-0,03 мг/мл.
Пример 2. Измерение координаты цвета В оптической мембраны и определение интегральной АОА по градуировочному графику.
АK
АK
В 50 мл анализируемого раствора с суммарным содержанием антиоксидантов не более 1,5 мг с pH 3 (цитратный буфер, контроль pH-метром) помещали пластинку полиметакрилатной матрицы с иммобилизованной индикаторной системой и перемешивали в течение 45 минут, затем вынимали, подсушивали фильтровальной бумагой. Мембраны сканировали с применением настольного офисного сканера, обрабатывали полученные изображения с помощью компьютерной программы цифровой обработки изображений «Adobe Photoshop» по светлоте в координатах R, G, В. В качестве аналитического сигнала выбран голубой канал В. Содержание суммарной АОА находили по градуировочной зависимости, построенной для АК в аналогичных условиях с последующим расчетом величины суммарной АОА в виде количества вещества-стандарта (аскорбиновой кислоты), производящего антиоксидантный эффект, эквивалентный действию суммы восстановителей в аналите. Уравнение градуировочной зависимости имеет вид: В=145,9-2969,7 c (r=0,9880), где c - концентрация аскорбиновой кислоты, мг/мл. Диапазон линейности градуировочной зависимости составляет 0-0,03 мг/мл.
Пример 3. Визуально-тестовое определение интегральной АОА.
Для визуально-тестового определения АОА получены цветовые шкалы путем сканирования образцов, полученных при построении градуировочных зависимостей для АК. Визуальное тест-определение выполняли аналогично методике, описанной в примере 1, с тем отличием, что после контакта с аналитом поглощение полиметакрилатных матриц не измеряли, а проводили сравнение их окраски с цветовой шкалой (фиг.2) и полуколичественно определяли концентрацию восстановителей.
Пример 4. Определение интегральной АОА чая.
Подготовку чая к анализу проводили по ГОСТу (ГОСТ 19885-74. Чай. Методы определения содержания танина и кофеина). Далее поступали, как указано в примере 1, 2. Для подтверждения правильности предлагаемого способа определения АОА использовали метод разбавления анализируемой пробы. Показатель правильности в виде относительной систематической погрешности (±δ, %) определяли в соответствии с требованиями РМГ 61 - 2003.
Результаты определения интегральной АОА заявляемым способом представлены в таблице 4. Как видно, границы относительной систематической погрешности (правильности) не более 10%.
Преимуществом заявленного изобретения является возможность использования нескольких вариантов измерения аналитического сигнала оптической мембраны на основе полиметакрилатной матрицы с иммобилизованной индикаторной системой железо (III) - о-фенантролин для качественной и/или количественной оценки АОА.
Таблица 1Зависимость A<sub>510</sub> от концентрации-восстановителя
Восстановитель
Уравнение зависимости A<sub>510</sub>=f(c<sub>восст</sub>), c<sub>восст</sub> в г/л
r
Диапазон линейности, г/л
Аскорбиновая кислота
A<sub>510</sub>=0,12+19,61·c<sub>АК</sub>
0,999
0-0,03
Танин
A<sub>510</sub>=0,10+8,23·c<sub>T</sub>
0,997
0-0,05
Рутин
A<sub>510</sub>=0,14+2,36·c<sub>P</sub>
0,998
0-0,03
Кверцетин
A<sub>510</sub>=0,15+50,17·с<sub>K</sub>
0,993
0-0,01
Галловая кислота
A<sub>510</sub>=0,13+95,38·с<sub>Г</sub>
0,999
0-0,01
Цистеин
A<sub>510</sub>=0,14+0,98·с<sub>Ц</sub>
0,997
0-0,03
Таблица 2Уравнения количественного соответствия для восстановителей
Восстановитель
Усредненные значения функции
Уравнения количественного соответствия
Для вещества-стандарта (АК)
Для данного восстановителя
Танин
A<sub>510</sub>=0,12+19,61·c<sub>AK</sub>
A<sub>510</sub>=0,10+8,23·c<sub>T</sub>
c<sub>AK</sub>=0,42·c<sub>T</sub>-0,02
Рутин
A<sub>510</sub>=0,14+2,36·c<sub>P</sub>
c<sub>AK</sub>=0,12·c<sub>P</sub>+0,02
Кверцетин
A<sub>510</sub>=0,15+50,17·c<sub>K</sub>
c<sub>AK</sub>=2,56·c<sub>K</sub>+0,03
Таблица 4Результаты определения интегральной АОА (n=4, P=0,95)
Марка чая
АОА, г AK/100 г продукта
s<sub>r</sub>, %
X, мг/мл
±δ,%
без разбавления
с разбавлением η=2
Зеленый чай
«Tess»
7,5±0,7
6
0,023
0,011
7
«Jaf Tea»
9,1±0,5
3
0,027
0,014
10
Черный чай
«Беседа»
3,0±0,3
6
0,009
0,005
7
Примечание. X - результат анализа пробы