Полиморфизм гена myod1 у овец ставропольской породы

УДК 636.32/.38.082.12 ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА MYOD1 У ОВЕЦ СТАВРОПОЛЬСКОЙ

ПОРОДЫ

Е.Ю. Телегина, асп.,

A.Ю. Криворучко, д. биол. н., проф.,

B.С. Скрипкин, к. вет. н., доцент, О.А. Яцык, асп.

ФГБОУ ВО СтГАУ. Е.А. Киц, к. биол. н., с.н.с.

ФГБНУ ВНИИОК

Целью данной работы явилось исследование структуры гена MyoDI у овец ставропольской породы. Объектом исследования служили баранчики в возрасте одного года (n=15).

Секвенирование осуществляли с использованием геномного

секвенатора GS Junior (Roche, USA). Полученные в результате секвенирования фрагменты

картировали на референсный геном Ovis aries, сборка oviAri3 (National Center for Biotechnology Information. Genome. (2012) Ovis aries (sheep), 2015) с программного обеспечения GS Reference Mapper v2.9 (Roche, USA). В ходе работы выявлено 26 однонуклеотидных замен (SNP), 16 из них обнаружены впервые. В области экзона II находятся 14 замен, 13 из которых выявлены впервые.

Синонимичными являются две SNP (c.325T>A и c.483C>T), 12 SNP приводят к аминокислотным заменам. Структура

аминокислотной

последовательности белка MyoDI ставропольской породы

значительно отличается от референсной аминокислотной последовательности. Необходимо проводить дальнейшие

исследования, направленные на

UDC 636.32/.38.082.12 THE MYOD1 GENE

POLYMORPHISM IN STAVROPOL BREED SHEEP

Telegina E.Y., post-graduate student, Krivoruchko A.Y., Dr. Biol. Sci., Prof., Skripkin V. S., Cand. Vet. Sci., Asst. Рrof., Yatsyk O.A., post-graduate student

Stavropol State Agrarian University Kits E.A., Cand. Biol. Sci. FGBNU VNIIOK

The aim of this work was to study the structure of the MyoDI gene in sheep of the Stavropol breed. We have investigated 15 rams (n=15) at the age of one year. Sequencing was performed using a genomic GS Junior (Roche, USA) sequencer. The resulting sequencing fragments we mapped to the reference Ovis aries genome of oviAri3 assembly (The National Center for Biotechnology Information. Genome. (2012) Ovis aries (sheep), 2015) by software of GS Reference Mapper v2.9 (Roche, USA). The work identified 26 single nucleotide substitutions (SNP), 16 replacements from which are found for the first time. In the area of exon II are located 14 replacements, 13 of which are detected for the first time. Two SNP are synonymous, 12 SNPs are non-synonymous and lead to a amino acid substitutions. The amino acid sequence of the MyoDI protein structure on the Stavropol breed significantly differs from the reference amino acid sequence. It is necessary to carry out further researches to study the effect of detected substitutions on protein structure and indices of meat productivity.

изучение влияния обнаруженных замен на структуру белка и показатели мясной

продуктивности.

Ключевые слова: MyoDI, Key words: MyoDI, sequencing, секвенирование, SNP, овца, SNP, sheep, Stavropol breed ставропольская порода

Маркер-ассоциированная селекция - это современный и перспективный метод для точной оценки и прогнозирования племенных и продуктивных качеств животных, который позволяет ускорить селекционную работу и сократить связанные с ней затраты [9].

Одним из наиболее изученных генов, оказывающих влияние на мясную продуктивность у сельскохозяйственных животных, является ген миостатина (MSTN). Но увеличение мышечной массы часто не связано с изменением в кодирующей части миостатина, поэтому все большее внимание привлекают гены-кандидаты, влияющие на функционирование миостатина или на мышечное развитие в целом [2].

Одним из таких генов является MyoDI, который играет ключевую роль в дифференцировании и детерминации скелетной мускулатуры у позвоночных [7]. MyoDI имеет способность превращать немышечные клетки, например фибробласты, в клетки, которые способны к слиянию в мышечные волокна [5].

Выявлена взаимосвязь полиморфизма гена MyoDI с «мраморностью» мяса у свиней [8], влиянием на показатели живого веса и убойного веса у корейского крупного рогатого скота [4]. У овец позитивная корреляция обнаружена между уровнем экспрессии гена MyoDI и весом охлажденной туши [6]. Связь между полиморфизмами гена MyoDI и показателями мясной продуктивности у овец до настоящего времени не изучалась.

В связи с этим целью нашего исследования явилось изучение структуры гена MyoDI у овец ставропольской породы.

Материалы и методы Исследование было проведено на базе ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный аграрный университет». Объектом исследования служили баранчики в возрасте одного года ставропольской породы (n=15) .

Геномная ДНК выделялась из образцов крови, полученных из яремной вены в асептических условиях. Пробы крови отбирали в пробирки Vacutainer со стабилизатором ЭДТА. ДНК выделяли из 0,2 мл крови c использованием набора PureLinkGenomic DNA MiniKit (Invitrogen, USA). С целью выявления мутаций в генах проводили целевое обогащение и последующее секвенирование исследуемых фрагментов ДНК. Для обогащения целевых регионов использовали технологию NimbleGen (Roche, USA). Зонды для целевых регионов были разработаны в сотрудничестве с фирмой Roche NimbleGen (USA).

Библиотеки фрагментов ДНК исследуемых животных, подготовленные в соответствии с протоколом Rapid Library Preparation Method Manual, подвергали процедуре обогащения с использованием зондов NimbleGen SeqCap EZ Developer Libraries в соответствии с протоколом производителя (Roche, USA).

Процедуру моноклональной амплификации готовых обогащенных целевых регионов ДНК проводили по стандартному протоколу emPCR Amplification Method Manual, Lib-L (Roche, USA).

Таблица - Мутации в гене MyoDI у овец ставропольской породы.

№ Наименование SNP по номенклатуре HGVS Идентификатор в базе N08! Генотип и частота встречаемости

1 c.-2112C>G гэ 404884444 GG 0,93 GC 0,07 CC 0,00

2 c.-1806A>G гэ 424553252 TT 0,13 TC 0,13 CC 0,73

3 c.-1687T>C гэ 406278149 AA 0,26 AG 0,07 GG 0,67

4 c.-1608C>T Нет в базе GG 0,00 GA 0,13 AA 0,87

5 c.-1603G>T Нет в базе CC 0,00 CA 0,13 AA 0,87

6 c.-1578G>A Нет в базе CC 0,67 CT 0,33 TT 0,00

7 c.-1235G>A гэ 412308724 CC 0,2 CT 0,8 TT 0,0

8 c.-910G>T гэ 591152513 CC 0,8 CA 0,2 AA 0,0

9 c.-909G>T гэ 601707240 CC 0,8 CA 0,2 AA 0,0

10 c.-880G>A гэ 412662330 CC 0,67 CT 0,33 TT 0,00

11 c.-637C>T гэ 409662616 GG 0,67 GA 0,33 AA 0,00

12 o.-412G>T гэ 420129038 CC 0,87 CA 0,13 AA 0,0

13 c.244C>T Нет в базе GG 0,00 GA 0,00 AA 1,00

14 c.246G>T Нет в базе CC 0,00 CA 0,00 AA 1,00

15 c.253G>T Нет в базе CC 0,00 CA 0,07 AA 0,93

16 c.259G>C Нет в базе CC 0,00 CG 0,00 GG 1,00

17 c.261C>T Нет в базе GG 0,00 GA 0,00 AA 1,00

18 c.269C>G Нет в базе GG 0,00 GC 0,00 CC 1,00

19 c.274C>A Нет в базе GG 0,00 GT 0,00 TT 1,00

20 c.276C>G Нет в базе GG 0,00 GC 0,00 CC 1,00

21 c.277C>A Нет в базе GG 0,00 GT 0,00 TT 1,00

22 c.279C>T Нет в базе GG 0,00 GA 0,00 AA 1,00

23 c.281C>A Нет в базе GG 0,00 GT 0,00 TT 1,00

24 c.287C>A Нет в базе GG 0,00 GT 0,00 TT 1,00

25 c.325T>C rs 599663516 AA 0,67 AG 0,33 GG 0,00

26 c.483C>T Нет в базе GG 0,00 GA 0,00 AA 1,00

Секвенирование осуществляли с использованием геномного секвенатора GS Junior (Roche, USA). Полученные в результате секвенирования фрагменты картировали на референсный геном Ovis aries, сборка oviAri3 (National Center for Biotechnology Information. Genome. (2012) Ovis aries (sheep), 2015) с помощью программного обеспечения GS Reference Mapper v2.9 (Roche, USA). Для описания обнаруженных однонуклеотидных замен (SNP) использовалась номенклатура HGVS (Human Genome Variation Society).

Результаты. В ходе работы в кодирующих и регуляторных участках гена MYOD1 нами было обнаружено 26 SNP (табл.), 16 из которых описаны впервые. Из 16 новых замен 3 расположены в 5' фланкирующей области и 13 замен расположены в области экзона II. Из 10 замен, внесенных в базу данных dbSNP, девять мутаций расположены в фланкирующей области и одна находится в экзоне II.

По нашим данным, среди выявленных у ставропольской породы мутаций преобладающий процент точечных мутаций приходится на трансверсии (54%). Синонимичными являются две мутации. Двенадцать SNP приводят к аминокислотным заменам.

Большинство из обнаруженных мутаций у обследованных животных встречаются в гомозиготном мутантном варианте, кроме замены c.325T>C, - она встречается в гетерозиготном варианте.

Замены c.-1578G>A, c.-880G>A, c.-637C>T, c.325T>C выявляются у ставропольской породы в гетерозиготном варианте и только совместно. Мутации c.- 2112C>G, c.-910G>T, c.-909G>T обнаруживаются менее чем у 2% баранчиков, являются редкими.

Обсуждение. Нами впервые была исследована структура гена MyoDI у овец ставропольской породы. Данная порода отличается крепкой конституцией, хорошим телосложением, высокой шерстной продуктивностью и большим процентом выхода мытой шерсти [1]. В России секвенирование генов овец ранее не проводилось и отсутствует информация о структуре гена MyoDI у отечественных пород овец. В данном исследовании мы выявили 26 однонуклеотидных замен, 14 из которых расположены в области экзона II, и 12 замен в 5' фланкирующей области.

Большинство обнаруженных нами в экзоне II замен встречаются в мутантном гомозиготном варианте, только замена c.325T>C присутствует в гетерозиготном варианте. Вероятно, носители мутантных аллелей отличались лучшими качествами при выборе пар для скрещивания, что привело к закреплению мутаций у ставропольской породы в гомозиготной форме.

Четыре SNP (c.-1578G>A, c.-880G>A, c.-637C>T, c.325T>C) у овец ставропольской породы обнаруживаются в гетерозиготном варианте и

только совместно, что может свидетельствовать об их сцепленном наследовании. Три из них (c.-1578G>A, c.-880G>A, c.-637C>T) выявлены нами впервые.

В базе данных (Ensembl project NextGen Project populations) мы обнаружили информацию о частоте встречаемости однонуклеотидных замен в гене MyoDI у иранских и морокканских пород овец, которая оказалась близкой к ставропольской породе овец.

Вывод. Проведенное исследование говорит о значительном отличии гена MyoDI ставропольской породы овец от референсного варианта гена, причем изменения касаются кодирующих областей. В ходе работы нами было обнаружено 26 SNP, 16 из них обнаружены впервые и не внесены в базу данных dbSNP. Мы выявили четыре замены (c.-1578G>A, c.-880G>A, c.-637C>T, c.325T>C) у овец ставропольской породы в гетерозиготном варианте и только совместно, что может свидетельствовать об их сцепленном наследовании. Необходимо проводить дальнейшие исследования, направленные на изучение влияния обнаруженных замен на показатели мясной продуктивности и структуры белка.

Литература:

1. Дмитрик, И.И. Оценка мясных качеств молодняка овец ставропольской породы по комплексу свойств /И.И. Дмитрик, Е.Г.Овчинникова // Ветеринарная патология.- 2013. -№1. -С.43.

2. Эрнст, Л.К. Получение овец, трансгенных по генной конструкции as1-казеин/Л.К. Эрнст, И.Л.Гольдман, Н.А. Зиновьева, М.Д. Башкеев, П.А. Гоголевский //Доклады РАН. -1995. -№4. -С. 555-558.

3. Asakura, A. et al. Increased survival of muscle stem cells lacking the MyoD gene after transplantation into regenerating skeletal muscle // Proc Natl Acad Sci. -2007.-T. 104, -P. 1655216557.

4. Bhuiyan, M. S. et al. Identification of SNPs in MYOD gene family and their associations with carcass traits in cattle// Livestock Science. -2009. -T. 26. -P. 292-297.

5. Davis, R. L. et al. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts// Cell. -1987. - T. 51.-P.987-1000.

6. Lоbo, A. M. B. O. et al. Differentially transcribed genes in skeletal muscle of lambs// Livestock Science. -2012. -n 3. -P.31-41.

7. Mitsui, K. et al. Phosphorylation inhibits the DNA-binding activity of MyoD homodimers but not MyoD-E12 heterodimers// The Journal of Biological Chemistry. -1993 -T.32 -P. 24415-20.

8. Verner, J. et al. Impact of MYOD family genes on pork traits in Large White and Landrace pigs // Journal of Animal Breeding and Genetics. -2007. - n 2. -P. 81-85.

9. Yang, Z. Q. et al. Genetic effects of polymorphisms in myogenic regulatory factors on chicken muscle fiber traits. Asian-Australasian// Journal of Animal Sciences. -2015. -T. 28. - n 6. -P.782-787.