СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТА (6-ГИДРОКСИ-2,5,7,8-ТЕТРАМЕТИЛХРОМАН-2-ИЛ)АЦЕТАЛЬДЕГИДА С 20-ГИДРОКСИЭКДИЗОНОМ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ АНТИОКСИДАНТНОГО СРЕДСТВА, ИНГИБИРУЮЩЕГО ПРОЦЕСС ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ
METHOD FOR PREPARING CONJUGATE OF (6-HYDROXY-2,5,7,8-TETRAMETHYLCHROMAN-2-YL)ACETALDEHYDE AND 20-HYDROXYECDYSONE AND USING IT AS ANTIOXIDANT AGENT INHIBITING LIPID PEROXIDATION PROCESS

Изобретение относится к органической химии и химии природных соединений, конкретно, способу получения нового соединения, производного 20-гидроксиэкдизона, конъюгированного с короткоцепочечным аналогом витамина Е, перспективного для медицины и фармакологии.
Экдистероиды - гормоны линьки и метаморфоза насекомых - составляют распространенный и разнообразный класс стероидных соединений в природе. Обнаружение гормонов насекомых во многих растениях, а в некоторых видах до 2-3% от сухой массы, позволило выделять эти соединения для изучения их свойств и проведения химических трансформаций [Ахрем А.А., Ковганко Н.В. Экдистероиды: химия и биологическая активность II Минск: Наука и техника, 1989, 327 с.].
Установлено, что экдистероиды обладают широким спектром биологических свойств, представляющим практический интерес для медицины, и относятся к малотоксичным соединениям [Сыров В.Н., Хушбактова З.А. Фармакотерапевтический эффект фитоэкдистероидов и неробола при токсическом поражении почек в эксперименте // Эксперим. и клин. фармакол., 2001, №4, с.56-58; Сыров В.Н., Шахмурова Г.А., Хушбактова З.А. Влияние фитоэкдистероидов и бемитила на функциональные, метаболические и иммунобиологические показатели работоспособности в эксперименте. // Эксперим. и клин. фармакол., 2008, №5, с.40-43; Шахмурова Г.А., Сыров В.Н., Хушбактова З.А. Иммуномодулирующая и стресс-протективная активность фитоэкдистероидов экдистерона и туркестерона при иммобилизационном стрессе у мышей. // Химико-фармацевтический журнал, 2010, т.44, №1, с.9-11]. В ряде модельных экспериментов показано, что 20-гидроксиэкдизон (наиболее распространенный и доступный экдистероид) и его производные проявляет выраженные антиоксидантные свойства, сопоставимые с гидрохиноном и бутилгидрокситолуолом [Кузьменко А.И., Морозова Р.П., Николаенко И.А., Донченко Г.В. // Военно-медиц. журнал., 1999, №3, с.35; Володин В.В., Ширшова Т.И., Бурцева С.А., Мельник М.В. // Раст. Ресурсы., 1999, т. 35, №2, с.76; Кузьменко А.И., Морозова Р.П., Николаенко И.А., Донченко Г.В. // Укр. биохим. журнал., 1999, т.71, №2, с.69; Коновалова Н.П., Митрохин Ю.И., Волкова Л.М., Сидоренко Л.И., Тодоров И.Н. // Изв. АН. Сер. биол., 2002, №6, с.650; Кузьменко А.И., Морозова Р.П., Николаенко И.А., Корнилец Г.В., Холодова Ю.Д. // Биохимия, 1997, т.62, №6, с.712]. Описано использование в практической медицине лекарственного средства, разработанного на основе 20-гидроксиэкдизона («экдистен») в качестве препарата коррекции нарушенных метаболических процессов в организме человека при лечении различных заболеваний [Сыров В.Н., Хушбактова ЗА., Комарин А.С. и др. Экспериментально-клиническая оценка эффективности применения экдистена при лечении гепатита // Эксперим. и клин. фармакол., 2004, №5, с.56-59; Сыров В.Н. Фитоэкдистероиды: биологические эффекты в организме высших животных и перспективы использования в медицине. // Эксперим. и клин. фармакол., 2008, №5, с.40-43].
В последнее время в медицинской химии передовым направлением в создании лекарственных средств является синтез конъюгатов путем химических комбинаций разных молекул с определенными свойствами. Полученные конъюгаты (гибридные молекулы) проявляют либо синергетический эффект, либо обладают эффектом пролонгированного действия в организме, либо строго воздействуют на орган-мишень.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является метод молекулярной конъюгации витаминов C и аналога витамина E, признанных природных антиоксидантов, взаимодействием вицинальной диольной группы аскорбиновой кислоты с альдегидной функцией хроманильного компонента (аналога витамина E) при катализе n-TsOH. Реакция проводилась в бензоле при нагревании в течение 8 часов, при этом выход образующегося коньюгата составил 55%. Полученный таким образом синтетический конъюгат показал интересные свойства. Обладая антиоксидантной активностью, соизмеримой с природными а-токоферолом или L-аскорбиновой кислотой, он способен улавливать свободные радикалы как в гидрофильной, так и в липофильной тканях организма, повышая иммунный статус [Manfredini S., Vertuani S., Manfredi B., Rossoni G., Calviello G., Palozza P Novel antioxidant agents deriving from molecular combinations of vitamins C and E analogues.// Biorganic and Medicinal Chem., 2000, 8, p.2791-2801].
2
Конъюгаты экдистероидов с аналогами витамина E или другими фармакофорами неизвестны. Задачей изобретения явился способ получения нового гибридного антиоксиданта на основе синтетической комбинации природного экдистероида - 20-гидроксиэкдизона и C-аналога α-токоферола.
Решение поставленной задачи было достигнуто взаимодействием 20-гидроксиэкдизона (1) со стехиометрическим количеством (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-ил)ацетальдегида (2) в этилацетате в присутствии каталитического количества пара-толулсульфокислоты TsOH (10% от веса экдистероида) при комнатной температуре (~20°C) течение 24 часов. При этом с выходом 62% образуется бис-конъюгированный аддукт (3). Если n-TsOH заменить на другой катализатор, например, фосфорномолибденовую кислоту (ФМК), то время реакции увеличивается.
6-Дебензилирование конъюгата (3) гладко протекает при гидрировании в растворе этанола в присутствии катализатора Pd-C и приводит к соответствующему соединению (4) со свободными фенольными группами.
1
13
+
1
13
Соединения 3, 4 являются новыми. Их структура доказана методами ЯМР H и C. Для соединения 4 был снят масс-спектр MALDI TOF и зарегистрирован ион [M+H]. В спектрах ЯМР H и C полученных гибридных соединений 3, 4 зарегистрированы сигналы всех атомов углерода и водорода экдистероидного и хроманильного фрагментов молекул.
2
Полученный экдистероидсодержащий конъюгат с C-аналогом витамина E 4 перспективен для использования в качестве адаптогенного и геропротекторного препарата при заболеваниях, связанных с активацией процессов перекисного окисления в организме.
Сущность метода продемонстрирована на следующих примерах.
2
3
f
3
D
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
2
2
2
1/2
1/2
3
2
2
20
1
18
19
21
26
27
2'
2''
4'
4''
22
2
3
2''''
2'''
7
13
18
19
4'
4''
11
16
21
2'
2''
23
26
27
15
4
3'
3''
12
9
1
10
24
13
5
1'''
17
1''''
25
2'
2''
3
2
20
22
14
2''''
2'''
8a'
8a''
7
8'
8''
7'
7''
5'
5''
4a'
4a''
6'
6''
8
6
Пример 1. 2,3:20,22-Бис-O-[2-(6-бензилокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-ил)этилиден]-20-гидроксиэкдизон (3). К раствору 0.20 г (0.42 ммоль) соединения 1 в 3 мл EtOAc прилили раствор 0.28 г (0.83 ммоль) альдегида 2 в 3 мл EtOAc и добавили 0.02 г TsOH, реакционную смесь перемешивали 24 ч при комнатной температуре и упарили. Остаток хроматографировали на колонке (20 г SiO, элюент - CHCl). Получили 0.29 г (62%) соединения 3, R 0.56 (CHCl-MeOH, 20:1), т.пл. 128-130°C, [α] +20.7° (с 2.03, CHCl). Спектр ЯМР Н (CDCl), δ, м.д., J, Гц: 0.90 с (3Н, HC), 1.00 с (3Н, НС), 1.17 с (3Н, НС), 1.27 с (3Н, HC), 1.28 с (3Н, HC), 1.37 с (6Н, СН-С и CH-C), 2.11 с, 2.18 с и 2.24 с (18Н, 6 СН-Ar), 2.63 м (4Н, HC и HC), 3.62 м (1Н, HC), 4.10 м (1Н, HC), 4.14 м (1Н, НС), 4.71 с (4Н, OCHPh), 5.18 уш.с. (1Н, НС, w=13.0 Гц), 5.24 уш.с. (1Н, НС, w=13.0 Гц), 5.85 с (1Н, НС), 7.35-7.50 м (10Н, Н-Ar). Спектр ЯМР С (CDCl), δ, м.д.: 11.92, 12.01 и 12.89 (6 Ме-Ar), 17.00 (С), 20.56 (С), 20.56 (С и С), 21.50 (C), 23.04 (C), 23.61 (C), 24.80 (MeC), 24.97 (MeC), 26.68 (С), 29.47 (С и С), 30.86 (С), 30.94 (C), 31.74 (С), 31.85 (С) 34.00 (С), 34.71 (С), 37.82 (С), 38.40 (С), 41.41 (С), 45.53 (С), 47.36 (С), 49.74 (С, С), 50.83 (С), 70.48 (С), 73.36 (С и С), 74.75 (OCHPh), 76.75 (С), 77.07 (C), 83.55 (С), 83.85 (С), 84.86 (С), 101.41 и 101.63 (С), 102.00 (С), 117.41 (C), 117.49 (C), 121.43 (С), 123.04 (С и С), 126.06 (С, С), 127.74, 127.76 и 128.47 (Ph), 128.055 (С, С), 137.97 (ОСН-С), 147.48 (C), 147.60 (C), 148.39 (С и С), 163,23 (С), 202.62 (С).
Пример 2. К раствору 0.20 г (0.42 ммоль) соединения 1 в 3 мл EtOAc прилили раствор 0.28 г (0.83 ммоль) альдегида 2 в 3 мл EtOAc и добавили 0.02 г ФМК, реакционную смесь перемешивали 54 ч при комнатной температуре и упарили. Далее обрабатывали как описано в примере 1. Получили 0.29 г (61%) соединения 3, идентичного полученному в примере 1.
2
3
D
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
2
2
3
57
80
11
20
1
18
19
21
26
27
2'
2''
4'
4''
22
2
3
2''''
2'''
7
13
18
19
4'
4''
11
16
21
2'
2''
23
26
27
15
4
3'
3''
12
9
1
10
24
13
5
17
1'''
1''''
25
2'
2''
3
2
20
22
14
2''''
2'''
8a'
8a''
5'
5''
8'
8''
7
7'
7''
4a'
4a''
6'
8
6
+
2,3:20,22-Бис-O-[2-(6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-ил)этилиден]-20-гидроксиэкдизон (4). Через суспензию 0.28 г (0.25 ммоль) соединения 3 и 0.07 г катализатора (10% Pd-C) в 5 мл абс. метанола пропускали водород (контроль ТСХ, ~3 ч). Катализатор отфильтровали, фильтрат упарили. Остаток хроматографировали на колонке (15 г SiO, элюент - CHCl). Получили 0.23 г (96%) соединения 4, т.пл. 130-134°С, [α] +24.5° (с 1.82, CHCl). Спектр ЯМР Н (CDCl), δ, м.д., J, Гц: 0.81 с (3Н, HC), 0.97 с (3Н, HC), 1.15 с (3Н, НС), 1.26 с (6Н, НС, НС), 1.33 с (3Н, СНС), 1.34 с (3Н, СНС), 2.11 с, 2.16 с и 2.18 с (18Н, 6 СН-Ar), 2.62 с (4Н, CH  и CH ), 3.59 м (1Н, С), 4.12 м (1Н, HC), 4.46 м (1Н, HC), 5.14 уш.с. (1Н, HC), 5.21 уш.с. (1Н, HC), 5.82 с (1Н, HC). Спектр ЯМР С (CDCl), δ, м.д.: 11.32, 11.85 и 12.26 (Me-Ar), 16.97 (С), 20.63 (С), 20.63 (С и С), 21.46 (С), 23.00 (С), 23.53 (С), 24.37 (МеС), 24.64 (МеС), 26.65 (С), 29.43 (С и С), 30.82 (С), 30.92 (С), 31.65 (С), 31.95 (С) 33.16 (С), 34.69 (С), 37.80 (С), 38.37 (С.), 41.38 (С), 45.42 (С), 47.33 (С), 49.71 (С), 50.90 (С и С), 70.51 (С), 73.05 (С), 73.32 (С), 76.73 (С), 77.05 (С), 83.59 (С), 83.83 (С), 84.80 (С), 101.44 и 101.66 (1Н, С) 102.01 (1Н, С), 117.10 (C и C), 118.71(C и C), 121.38 (С, С, С), 122.64 (Си С), 144.81 (C и C), 145.11 (С), 163.21 (С), 203.01 (С). MALDI-TOF MS: m/z 942.360 [М+Н]. Вычислено для (CHO+H) 942.248.
Для бисаддукта (4) было изучено влияние на процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в экспериментах in vitro на гомогенате печени. В опытах т vivo на интактных животных определяли степень накопления малонового диальдегида (МДА) в печени и активность ферментов антиоксидантной системы - каталазы и супероксиддисмутазы. У животных с острым экспериментальным гепатитом в гомогенате печени определяли содержание диеновых коньюгатов (ДН), малонового диальдегида и восстановленного глютатиона.
Биологическая активность препарата (4) продемонстрирована следующими примерами.
-4
-4
Пример 1. Опыты проводили в системе in vitro на гомогенатах печени нормальных животных (крысы-самцы - 160-180 г). Процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) активировали путем добавления сульфата железа (II) (1·10 М) и аскорбиновой кислоты (2·10 М). Один из конечных продуктов ПОЛ - малоновый диальдегид (МДА) определяли в реакции с тиобарбитуровой кислотой.
-4
Проведенные эксперименты показали выраженное ингибирующее влияние соединения 4 на процессы ПОЛ, что проявляется подавлением реакции образования МДА на 94.2%. Соответствующий эффект витамина Е (использовали аптечный препарат токоферола в конечной концентрации 1·10 г/мл) и экдистерона составлял 83.3 и 27.8% соответственно (табл.1).
Таблица 1
Сравнительное действие соединения 4, экдистерона и витамина Е на содержание МДА в гомогенате печени крыс в опытах in vitro (M±m, n=6).
Испытуемое вещество
МДА в пробе, нмоль/мг белка
Эффект, в %
Соединение 4
0.107±0.017<sup>1,2,3</sup>
-94.2
Экдистерон
1.320±0.042<sup>1</sup>
-27.8
Витамин Е
0.306±0,024<sup>1</sup>
-83.3
Контроль
1.826±0.079
Примечание. Концентрация всех образцов составляла 1·10<sup>-4</sup> г/мг (именно в этой концентрации в условиях нашего опыта проявлялась их максимально выраженное антиоксидантное действие). <sup>1</sup> - достоверно по отношению к контролю, <sup>2</sup> - по отношению к результатам пробы с экдистероном, <sup>3</sup> - по отношению к результатам пробы с витамином Е.
Пример 2. Крысам самцам (160-180 г) орально в течение 7 дней вводили соединение 4 (5 мг/кг), экдистерон (5 мг/кг) и витамин Е (50 мг/кг). (Дозы предварительно определили как наиболее оптимальные). После окончания эксперимента животных забивали декапитацией (под легким эфирным наркозом). В печени животных определяли содержания МДА [Стальная И.Д., Гариашвили Т.Г. Методы определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современные методы в биохимии, под ред. В.Н. Ореховича, М., 1977, с.66-68] и активность ферментов антиоксидантной системы: каталазы и супероксиддисмутазы (СОД) по методам [Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Т. и др. Метод определения активности каталазы // Лаб. дело, 1988, №1, с.16-19] и [Дубинина Е.Е., Сальникова Л.А., Ефимова Л.Ф. Активность и изоферментный спектр супероксиддисмутазы эритроцитов и плазмы крови человека // Лаб. дело, 1983, №10, с.30-33].
Проведенные исследования показали, что как и в опытах in vitro, введение соединения 4 в организм животных приводит к угнетению процессов ПОЛ, о чем свидетельствовало понижение содержания в печени МДА на 42% по сравнению с показателями интактной  группы. При введении экдистерона и витамина Е содержание МДА в печени понижалось только на 17.9 и 30% (табл.2). При этом в случае введения соединения 4 отмечено также более выраженное повышение активности ферментов, определяющих состояние антиоксидантной защиты организма (табл.2).
Таблица 2
Сравнительное действие соединения 4, экдистерона и витамина Е на некоторые показатели антиоксидантной системы, уровень МДА в печени крыс (М±m, n=8).
Испытуемое вещество
Каталаза, ммоль/мин/г белка
Эффект, в %
СОД, УЕ/мин/мг белка
Эффект, в %
МДА, нмоль/мг белка
Эффект, в %
Витамин Е
16.8±0.74
+6.3
1.78±0.16
+12.6
0.562±0.028<sup>1</sup>
-30
Соединение 4
19.4±1.04<sup>1</sup>
+22.07
2.10±0.20<sup>1</sup>
+32.9
0.424±0.022<sup>1,2,3</sup>
-42
Экдистерон
17.11±0.98
+8.3
1.91±0.18
+20.9
0.600±0.030<sup>1</sup>
-17,9
Контроль
15.8±0.98
-
1.58±0.12
-
0.731±0.04
-
Примечание. Обозначения достоверности те же, что и в таблице 1.
4
4
Пример 3. Опыты проводили на крысах-самцах массой 180-200 г. Поражение печени у них вызывали путем введения ССЦ (по 0.4 мл 50% масляного раствора на 100 г массы ежедневно в течение 4-х дней) [Левшин Б.И, Экспериментальная фармакотерапия препаратами селена и тиазолидина токсического повреждения печени: Автореф. дис. д-ра мед. наук., Харьков, 1973]. Известно, что CCl является сильным прооксидантом. Начиная со 2-го дня введения CCl, крысам орально при помощи специального зонда вводили внутрь экдистерон (5 мг/кг), соединение 4 (5 мг/кг) и витамин Е (50 мг/кг) (дозы подобрали как наиболее эффективные в предварительных экспериментах).
4
4
По истечении 3-х дней после повторного введения препаратов животным (через 2 часа после последнего введения) крыс забивали декапитацией (под легким эфирным наркозом). О выраженности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) судили по содержанию диеновых коньюгатов (ДК), малонового диальдегида (МДА) и восстановленного глютатиона в гомогенате печени. Содержание диеновых коньюгатов и восстановленного глютатиона определяли по методу [Стальная И.Д. Метод определения диеновой конъюгации ненасыщенных высших жирных кислот // Современные методы в биохимии, под ред. В.Н. Ореховича, М., 1977, с.63-64] и [Смирнов В.В. Глютатион - зависимая антиоксидантная система головного мозга при черепно-мозговой травме // Дис. канд. мед. наук., СПб, 1995, 153 с.]. Проведенные эксперименты показали, что введение крысам CCl приводило к резкой активации ПОЛ, о чем свидетельствовало увеличение количества ДК, МДА (на 164.8-69.7%) и снижение восстановленного глютатиона (на 51.4%) в гомогенатах печени. Соединение 4 и в этих опытах проявило выраженное антиоксидантное действие, заметно более превосходящее действие экдистерона и витамина Е. Под действием соединения 4 содержание ДК и МДА в печени крыс с CCl - гепатитом было ниже на 53.5 и 36.9% и всего на 23.1 и 7.1% (p>0.05) выше, чем у интактных животных. Экдистерон понижал содержание ДК и МДА только на 29.5 и 20.9%. Витамин Е оказывал тоже выраженный эффект, но и в этом случае содержание ДК и МДА снизилось только на 41.5 и 26.8%. Соединение 4 проявило также выраженный глютатионстабилизирующий эффект. И в этом случае соединение 4 действовало более выражено, чем собственно экдистерон и витамин Е (табл.3).
Таким образом, соединение 4 обладает выраженным антиоксидантным действием, что открывает перспективу его использования при целом ряде заболеваний, в основе которых лежит активация процессов перекисного окисления липидов.
Таблица 3
Антиоксидантная активность соединения 4 в сравнении с экдистероном и витамином Е при поражении печени крыс CCl<sub>4</sub> (М±m, n=8).
Условия эксперимента
ДК, мкмоль/г
Эффект, в %
МДА, нмоль/мг белка
Эффект, в %
Глютатион-SH, мкмоль/мг
Эффект, в %
Интактные животные
0.182±0.012
0.700±0.032
8.76±0.32
Контроль (CCl<sub>4</sub> - гепатит)
0.482±0.036<sup>1</sup>
1.188±0.094<sup>1</sup>
4.26±0.22<sup>1</sup>
CCl<sub>4 </sub>+ препарат (4)
0.224±0.014<sup>1,2</sup>
-53.5
0.750±0.034<sup>2</sup>
-36.9
8.24±0.30<sup>2</sup>
+93.4
CCl<sub>4 </sub>+ экдистерон
0.340±0.020<sup>1,2,3</sup>
-29.5
0.940±0.052<sup>1,2,3</sup>
-20.9
6,94±0.32 <sup>1,2,3</sup>
+62-9
CCl<sub>4</sub> + витамин Е
0.282±0.018<sup>1,2,3</sup>
-41.5
0.870±0.038 <sup>1,2,3</sup>
-26.8
6.30±0.24<sup>1,2,3</sup>
+47.8
Примечание. <sup>1</sup> - достоверно по отношению к интактным животным, <sup>2 </sup>- по отношению к контролю, <sup>3</sup> - по отношению к группе животных получавших на фоне CCl<sub>4</sub> соединение 4 (p>0.05).
В результате проведенного тестирования соединение 4 показало более высокую антиоксидантную активность в сравнении с витамином Е и 20-гидроксиэкдизоном (экдистерон).