СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАНОЧАСТИЦ ХИТОЗАНА С ВКЛЮЧЕННЫМ ЦИПРОФЛОКСАЦИНОМ
METHOD FOR OBTAINING CHITOSAN NANOPARTICLES WITH INCLUDED CIPROFLOXACIN

Изобретение относится к медицине и биотехнологии, и представляет собой способ микрокапсулирования антимикробных препаратов в наноконтейнеры. Может быть использовано в медицинской и ветеринарной практике при применении антибиотиков в составе наночастиц, что снижает степень их инактивации и позволяет снизить нежелательные реакции организма на терапию, сократить терапевтическую дозу лекарства и кратность его введения.
Известна система доставки биологически активных веществ с помощью нанокапсул или наночастиц, представляющая собой гель-состав с миноциклином, заключающаяся в механическом смешивании при комнатной температуре миноциклина, хитозана в растворе уксусной кислоты при показателе рН, равном 5,5 и водного раствора глицерофосфата динатрия. Данная композиция используется только при лечении заболеваний уха путем внутрибарабанного введения в мембрану окна улитки или вблизи мембраны окна улитки, содержащей приемлемый для лечения уха термообратимый водный гель. Недостатком данного способа является отсутствие сведений об эффективности включения действующих веществ в соответствующих препаратах [1].
Описан способ получения наночастиц с увеличенной реакционной способностью вследствие легирования металлами (Ag, Cu), в ходе которого проводят реакцию совместного осаждения хитозана, паров металлов (Cu и Ag) с парами органического вещества (этоксиэтанол-2) в атмосфере жидкого азота. Реактор со смесью вакуумируют до достижения максимального уровня вакуума в 10,5 бар и погружают в жидкий азот. Концентрация паров металлов по массе по отношению к хитозановому полимеру составляла от 1% до 5% по массе. Размер частиц металлов варьировал от 10 нм до 100 нм в зависимости от соотношения компонентов системы. Антибиотики в систему добавляли методом диспергирования с перемешиванием в атмосфере газообразного азота, в концентрации от 0,1 до 5% по массе. Недостатком данного способа является отсутствие информации о способах определения эффективности включения действующего вещества в микровезикулы [2].
in vitro
in vivo
Известен способ получения наноструктур из золота (GNP-Chit), стабилизированных хитозаном, функционализированных путем ковалентного связывания с белком эпидермального фактора роста (EGF). Согласно этому способу, смесь 0,1 г хитозана, 10 мл уксусной кислоты 0,3%, 90 мл дистиллированной воды и 10 мг тетрахлороаурата(III) водорода нагревают до 100°С с перемешиванием в течение 90 мин. К полученному раствору наночастиц золота, стабилизированных хитозаном, добавляют 15 мл смеси 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида/N-гидроксисукцинимида NHS (10 мг:10 мг/мл) и перемешивают 30 минут при комнатной температуре. После чего раствор центрифугируют при 15000 об/мин 20 мин, супернатант удаляют, повторно диспергируют дистиллированной водой и добавляют 1 мл 30 мкМ EGF. На основании данных атомно-силовой микроскопии среднее значение размеров частиц дисперсии GNP-Chit-EGF при этом составляло 83-121 нм. В описанном способе отсутствуют данные о результатах исследования цитотоксичности в экспериментах  и  [3].
Описан способ получения микровизикул методом ионной кросс-сшивки из хитозана, триполифосфата и бычьего альбумина. После полного растворения хитозана и альбумина в 0,5 М уксусной кислоте раствор перемешивали в течение 30 минут. Затем 5 мл полученного раствора по каплям добавляли в 100 мл раствора триполифосфата с непрерывной обработкой ультразвуком на ледяной бане. Полученную суспензию выдерживали при непрерывном перемешивании в течение 1 часа и промывали водой с ультрацентрифугированием. Перемешивание в темноте при комнатной температуре в течение 17 ч наночастиц (20 мг) и водного раствора лекарственного вещества (доксорубицина гидрохлорид 150 мкг/мл) приводило к его инкапсулированию. Эффективность включения действующего вещества в полученном препарате не превышала 34%, что является существенным недостатком данного способа получения микровизикул [4].
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Clostridioides difficile, Mycobacteria spp., Group A Streptococcus, Group В Streptococcus
Известна композиция для доставки биологически активных веществ в форме микровизикул с антибактериальной активностью против грамположительных бактерий (), представляющая собой суспензию, основными активными компонентами которой являются производные лауриновой кислоты (0,001% и 30% от общего состава), лецитина или его производных (до 10%) и хитозана (до 10%). Данный способ содержит несколько недостатков, во-первых, отсутствует описание параметров технологического процесса получения микровизикул, во-вторых, размер получаемых наночастиц колеблется в широком диапазоне от 1 нм до 1000 нм [5].
Известен способ получения наночастиц методом ионной кросс-сшивки катионных производных хитозана с отрицательно заряженными ионами антибиотика (даптомицин, фосфомицин, флавомицин). Согласно этому способу интенсивно перемешивают раствор хитозана в ацетатном буфере и водный раствор антибиотика (0,5-20 мкг/мл) в течение 30 минут. Конечный продукт очищали диализом. Описанный способ получения наночастиц на основе ионной сшивки хитозана и отрицательно заряженного антибиотика исключает использование амфотерных и отрицательно заряженных антибиотиков [6].
Известен способ получения наночастиц для доставки фармацевтически активного агента (ципрофлоксацин) из поли-ε-капролактона, хитозана и фосфолипидов. В соответствии с этой методикой структура микровизикул содержит две полости: внутреннюю и внешнюю, внутренняя полость образована низкомолекулярным хитозаном, внешняя - гиалуроновой кислотой. Внутреннюю и внешнюю полимерные матрицы сшивают глутаральдегидом и с использованием карбодиимидного метода. Недостатком карбодиимидного метода является малая скорость реакции и образование большого числа побочных продуктов. Кроме того в описании отсутствуют сведения об эффективности включения действующих веществ в соответствующих препаратах [7].
Разработан способ определения наночастиц диаметром от 1 до 1000 нм, содержащих сшитый хитозан, магнитные фрагменты и терапевтический агент (ванкомицин) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Для образования трехмерно взаимосвязанных линейных полимерных цепей хитозана использовали различные сшивающие агенты (триполифосфат натрия, диглицидиловый эфир этиленгликоля, этиленоксид, глутаровый альдегид, эпихлоргидрин, диизоцианат и генипин). Согласно методике готовили водный раствор хитозана, оксида железа(III), уксусной кислоты и ванкомицина с центрифугированием и обработкой ультразвуком в течение 1 ч. Для эмульгирования смесь Span 80, полиэтилендиметакрилата, легкого и тяжелого минерального масла смешивали с водным раствором хитозана. На третьей стадии целевой продукт промывали последовательно гексаном, метанолом и ацетоном. К основным недостаткам этого способа получения можно отнести трудоемкость метода и отсутствие информации об эффективности включения действующих веществ в соответствующих препаратах [8].
Целью предлагаемого изобретения является разработка способа получения наночастиц хитозана, содержащих ципрофлоксацин.
Технический результат предлагаемого изобретения достигается путем оптимизации технологии конструирования наночастиц, состава и соотношения структурообразующих компонентов. Введение в состав дисперсии октановой кислоты как ион-парного агента позволяет существенно повысить эффективность включения ципрофлоксацина в состав наночастиц хитозана. Способ осуществляется следующим образом.
Хитозан растворяли при перемешивании в 0,5% водном растворе уксусной кислоты до концентрации 4 мг/мл, затем рН раствора доводили до 4,6 0,1 М раствором NaOH. Триполифосфат натрия и октановую кислоту растворяли при перемешивании в воде 1 типа до концентрации 4 и 20 мг/мл соответственно. К раствору хитозана при интенсивном перемешивании по каплям добавляли воды 1 типа и раствора ципрофлоксацина (2 мг/мл), после чего к полученной смеси добавляли по каплям в течение 5 минут раствор, содержащий триполифосфат натрия и октановую кислоту, и перемешивали в течение 1 часа при (26±1)°С. Наночастицы, содержащие ципрофлоксацин, отделяют центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 мин.
Определение эффективности включения ципрофлоксацина в наночастицы осуществляли по следующей методике.
Суспензию наночастиц, полученную согласно описанной методике, центрифугировали при 5000 об/мин в течение 30 мин. К супернатанту добавляли 4-кратный объем 15% раствора ацетонитрила и тщательно перемешивали и фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм. Раствор использовали для количественного анализа содержания ципрофлоксацина. Количественный анализ на содержание антибиотика проводили методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием калибровочных растворов ципрофлоксацина в качестве стандарта. Проводили не менее пяти измерений для каждого раствора. Эффективность включения антибиотика определяли относительно исходной концентрации по формуле:
где ЭВ - эффективность включения ципрофлоксацина в наночастицы, %; С - концентрация антибиотика в супернатанте, мг/мл; Сисх - исходная концентрация антибиотика в растворе, мг/мл.
Визуализация частиц в составе препарата проводится методом сканирующей зондовой микроскопии в электронном микроскопе для биологических исследований «EVO LS 10» («Carl Zeiss», NTS Германия).
Для получения препаратов пригодных к изучению в электронном микроскопе взвесь везикул разводили в дистиллированной воде по стандарту мутности Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов (ГИСК) им. Л.А. Тарасевича. За единицу мутности была принята мутность суспензии живых клеток бактерий-возбудителей тифа в физиологических растворах, содержащих в 1 мл 100 млн клеток. Полученный раствор соответствующей мутности затем разводили водой I типа в соотношении 1:50 по объему. На двухсторонний углеродный диск наносили 1 мкл полученной взвеси, равномерно распределяя по поверхности. Полученные препараты высушивали на воздухе и сканировали в электронном микроскопе для определения формы и размера микрочастиц.
Исследование гомогенности дисперсий с помощью проточной цитометрии проводили на приборе «Attune». Параметры измерения: объем пробы - 300 мкл, скорость потока - 100 мкл/мин. Условия прекращения регистрации: 10000 частиц, 5 мин. Для анализа результатов выбирают следующие оси соответствующих гистограмм: VL1-H - VL2-H.
Возможность практического применения заявленного способа подтверждается примерами его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.
Пример 1.
К 5 мл раствора хитозана в 0,5% водном растворе уксусной кислоты (4 мг/мл, рН=4,6) при постоянном перемешивании по каплям добавляли 1 мл воды 1 типа и 6 мл раствора ципрофлоксацина (2 мг/мл), после чего к полученной смеси добавляли по каплям в течение 5 минут 8 мл раствора, содержащего триполифосфат натрия и октановую кислоту, и перемешивали в течение 1 часа при (26±1)°С. Наночастицы, содержащие ципрофлоксацин, отделяют центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 мин.
Эффективность включения антибиотика составила 80,16±1,37%. Опытные препараты наночастиц содержат сферические или овальные частицы со средним размером частиц 262±56 нм, частицы на гистограмме VL1-H - VL2-H формируют одну субпопуляцию.
Используемая литература
1. Патент RU 2493828С2. Опубликован 27.09.2013 Б №27.
2. Патент WO 2019232656(А1). Опубликован 22.01.2020.
3. Патент RO 20170001054. Опубликован 30.07.2019.
4. Montero N., Perez Е., Benito М., Teijon С., Teijon J.M., Olmo R., Blanco M.D. Biocompatibility studies of intravenously administered ionic-crosslinked chitosan-BSA nanoparticles as vehicles for antitumour drugs // Int J Pharm. - 2019. - Vol. 10, N 554. - P. 337-351. doi: 10.1016/j.ijpharm.2018.11.027.
5. Патент US 2019046483 (A1). Опубликован 14.02.2019.
6. Патент CN 104784120 (А). Опубликован 22.09.2014.
7. Патент US 2014023692 (A1). Опубликован 23.01.2014.
8. Патент WO 2018064150 (A1). Опубликован 05.04.2018.