СПОСОБ ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ОКРАШИВАНИЯ ВНУТРИСТЕНОЧНЫХ ВЕН ПОЛЫХ ОРГАНОВ БРЮШНОЙ ПОЛОСТИ ЧЕЛОВЕКА
METHOD FOR HISTOLOGICAL STAINING OF INTRAMURAL VEINS OF HOLLOW ORGANS OF HUMAN ABDOMINAL CAVITY

Изобретение относится к медицине, в частности к анатомии, гистологии, топографической анатомии, патологической анатомии и гастроэнтерологии, может быть использовано при изучении особенностей венозной ангиоархитектоники полых органов брюшной полости человека в норме и при патологии, а также в качестве наглядных пособий при преподавании гистологии в учебных заведениях.
Изготовление гистологических препаратов сосудов полых органов организма человека подразумевает окрашивание вен до или в момент гистологической обработки ткани (Авторское свидетельство СССР №78420; A01N 1/00; 01.01.1949; Авторское свидетельство СССР №1091058; G01N 1/28, А61В 10/00; 28.10.1982; Патент РФ №2213966; А61В 1/00; Бюл. №28, 10.10.2003). Результатом подобной обработки является окрашенный гистологический препарат ткани органа с дифференцированными сосудами. В большинстве случаев окрашивание сосудов в гистологическом препарате используется для создания наглядного пособия внутристеночной сосудистой системы органов, либо тканей, в которых они не доступны непосредственному изучению (Вайнер Ю.С., Атаманов К.В., Верятин Я.А. Особенности ангиоархитектоники тонкой кишки при различных способах пересечения ее стенки / Сибирское медицинское обозрение, 2017; 3(105):56-60; Патент РФ №2220411; А61В 1/00; Бюл. №36, 27.12.2003). При создании окрашенных гистологических препаратов с дифференцированными сосудами, как правило, возникают проблемы с выбором оптимального красителя, который бы отвечал всем требованиям, предъявляемым в каждом конкретном случае (Горбачева А.А. Сравнительная оценка некоторых способов заливки сосудистого русла млекопитающих / Научный результат. Серия «Физиология» Ветеринарные науки, 2016; 2(2):3-8; Гулькевич Ю.В. Методы патологической анатомии. Многотомное руководство по патологической анатомии, т. 1. М., Медгиз, 1963. 19-33). Большинство авторов предпочитают использование широкодоступных, недорогих красителей, удобных в приготовлении и работе (Коржевский Д.Э., Иванов И.Н. Гистологические методы окраски, применяемые в судебной медицине. СПб., Издательский дом СПбМАПО, 2003; Чумасов Е.И., Шайдаков Е.В., Коржевский Д.Э., Петрова Е.С. Медицинская технология гистологического исследования венозных сосудов у человека: методические рекомендации. Санкт-Петербург: Институт экспериментальной медицины, 2015. 55 с).
Известен способ изготовления учебных окрашенных анатомических препаратов кровеносных сосудов на трупном материале, заключающийся в том, что проводят наливку в сосуды наливочной массы, при этом основу массы составляет 100%-ный силикон, разбавленный бензином с добавлением масляных красок - кадмий красный и хром-кобальт для введения в артерии, берлинская лазурь или пражская синяя для вен (Патент РФ №2202776; G01N 1/30; Бюл. №27, 22.09.2000; Патент РФ №2270483; G09B 23/28; Бюл. №5, 20.02.2006). Способ обеспечивает доступность наливочной массы и качества наливки сосудов с одновременной окраской их изнутри и снаружи, упрощает процедуры, сокращает сроки приготовления препарата при сохранении естественного вида, формы и эластичности сосудов. Однако, в результате вымывания красителей в процессе гистологической обработки препаратов применять этот способ не представляется возможным при создании окрашенных гистологических препаратов с дифференцированными сосудами.
Другой известный способ «Препаровка сосудов после заполнения их инъекционными растворами желатина и целлоидина» (Закономерности строения периферической нервной системы человека и животных: [Сборник статей] / [Ред. Н.Н. Лавров и В.А. Латышев]. - Краснодар: [б. и.], 1968 [вып. дан. 1969]. 224) также имеет ряд недостатков. Во-первых, желатин при затвердевании становится твердым и хрупким, что затрудняет создание срезов на микротоме. Во-вторых, приготовление цветной желатиновой массы для наливки сосудов требует определенной последовательности смешивания различных веществ и процесс достаточно трудоемкий (набухание желатина в течение 24 ч в воде, его отжатие, нагревание на водяной бане, смешивание красителя с аммиачной водой при постепенном нагревании с последующим добавлением к смеси расплавленного желатина, глицерина и хлоралгидрата.
Известен способ окраски кровеносных сосудов внутренних органов на гистологическом препарате, содержащий в своем составе одновременно двухромовокислый калий, хромовокислый калий, формалин и воду, что позволяет повысить контрастность кровенаполненных сосудов от окружающих тканей, фиксацию и окрашивание. В результате, как заявляют авторы, на срезах видны кровенаполненные сосуды на фоне неокрашенной паренхимы органа (Авторское свидетельство СССР №957046; G01N 1/28, А61В 10/00; 02.03.1981). К недостаткам данного способа можно отнести несколько моментов. Во-первых, способ не позволяет одновременно окрашивать паренхиму органа, что уменьшает возможность разностороннего исследования сосудов в образце в целом и на уровне различных оболочек органа. Во-вторых, окрашивание сосудов возможно только с учетом их кровенаполнения, что также влияет на чистоту эксперимента, так как не все сосуды могут быть кровенаполнены в момент исследования.
Наиболее близким к предлагаемому является способ гистологического окрашивания внутристеночных вен полых органов брюшной полости человека, включающий заполнение венозных сосудов наливной массой, вырезку образцов, гистологическую обработку и окрашивание (Заболотько Л.А. Интрамуральные вены желудка в постнатальном онтогенезе и структурные механизмы, регулирующие по ним ток крови, Автореферат дисс. на соискан. докт. мед. наук, Новосибирск, 1992, с. 9, Д1). Для характеристики ангиоархитектоники интрамурального венозного русла желудка автор предлагает использовать в качестве наливной среды тушь-желатиновую массу или тонко-тертые масляные краски, а изучение морфометрических параметров вен желудка проводить на импрегнированных нитратом серебра различных отделах органа. Однако, способ подразумевает окрашивание кровенаполненных сосудов без их дифференцировки на артерии и вены той или иной венозной системы. Следовательно, использование данного способа для изучения морфометрических особенностей внутристеночных вен полых органов брюшной полости в зависимости от их системной принадлежности недопустимо.
Задачей способа является оптимизация изготовления окрашенных гистологических препаратов полых органов брюшной полости человека с контрастированием внутристеночных вен в научной, научно-исследовательской деятельности студентов, преподавателей, научных работников при изучении анатомических, топографоанатомических и гистологических вопросов изучения сосудистого русла органов, в практической деятельности врачей гастроэнтерологов, хирургов при изучении особенностей внутристеночной венозной ангиоархитектоники полых органов брюшной полости человека в норме и при патологии.
Поставленную задачу решают за счет того, что в качестве наливной инъекционной среды, контрастирующей сосуды, используют «Тушь гистологическая HistoSafe» - гистологический краситель для маркировки краев резекции макропрепарата, имеющий регистрационное удостоверение медицинского изделия (РЗН 2019/9247 от 15.11.2019 по ТУ 21.20.23-008-89079081-2017). Хорошая проницаемость туши позволяет заполнять внутристеночные сосуды малого диаметра до 0,1-0,2 мм. Текучесть массы без особых затрат и усилий проводит наполнение сосудистых структур при помощи 20 мл шприца для инъекций. Проточность массы сохраняется на открытом воздухе продолжительное время, что позволяет работать с материалом без ограничений по времени. Суть гистологического окрашивания внутристеночных вен полых органов брюшной полости человека заключается в следующем: предварительно промытые раствором 10% аммиака и воды дистиллированной венозные структуры органа плотно равномерно заполняют гистологическим красителем при помощи 20 мл шприца.
Для селективного окрашивания сосудов разных венозных систем органов используют красители 2-х цветов: оранжевый и синий (примеры окрашивания структур приведены ниже). Макропрепарат погружают в 10% раствор забуференного формалина на срок 48-72 часа. Для обеспечения полноценной фиксации полых органов в их просвет вводят марлевые прокладки. После завершения этапа фиксации, орган извлекают из формалина и промывают проточной водопроводной водой в течение 5 минут. Вырезку образцов ткани (стенки) с формированием фрагментов осуществляют в направлении перпендикулярном ходу основным сосудам в зоне изучения. Сформированные фрагменты толщиной от 2 до 3 мм подвергают гистологической обработке в условиях вакуумного гистопроцессора закрытого типа. После гистологической обработки проводят заливку образцов в тугоплавкий парафин (температура плавления 59-62 С°) с формированием гистологических блоков и последующей микротомией. Полученные гистологические срезы толщиной 2 мкм помещают на предметные стекла с положительным зарядом для обеспечения адгезии материала. Препараты окрашивают гематоксилином Майера без окраски эозином путем депарафинизации, регидратации, инкубации в течение 20 минут, промывают в проточной воде и просветляют. На завершающем этапе готовые препараты помещают в сканирующий микроскоп Pannoramic 250 Flash II 3DHistech (Венгрия) с тотальным сканированием стекол в автоматическом режиме при увеличении объектива х40. Контроль результатов проводят с применением программы CaseViewer v.2.3 3DHistech. В полученных препаратах просветы селективно окрашенных сосудов заполнены пигментом красителя с соответствующим цветом.
Пример 1. Сосуды кавальной системы стенки кардиального отдела желудка заливаются тушью гистологической синего цвета, сосуды портальной системы - тушью оранжевого цвета. После фиксации ткани, вырезки образцов и гистологической обработки, препараты окрашивают гематоксилином Майера (фиг. 1). На срезе кардиального отдела желудка представлены: слизистая оболочка с однослойным призматическим железистым эпителием (1), подслизистая основа (2), мышечная оболочка (3), серозная оболочка (4), а также внутристеночные вены кавальной системы кардиального отдела желудка с красителем в просвете синего цвета (5), его внутристеночные портальные сосуды с красителем в просвете оранжевого цвета (6) и сосуды без красителя в просвете - артерии (7).
Пример 2. Вены портальной системы стенки тощей кишки заливаются тушью гистологической оранжевого цвета. После фиксации ткани, вырезки образцов и гистологической обработки, препараты окрашивают гематоксилином Майера (фиг. 2). На срезе тощей кишки: слизистая оболочка с однослойным призматическим каемчатым эпителием (1), подслизистая основа (2), мышечная оболочка (3), серозная оболочка (4), а также внутристеночные вены с окрашенным в оранжевый цвет просветом подслизистой основы (5), мышечной оболочки (6), серозной оболочки (7), сосуды без красителя в просвете - артерии (8).
Пример 3. Вены портальной системы стенки поперечно-ободочной кишки заливаются тушью гистологической оранжевого цвета. После фиксации ткани, вырезки образцов и гистологической обработки, препараты окрашивают гематоксилином Майера (фиг. 3). На срезе поперечно-ободочной кишки показаны: слизистая оболочка с однослойным цилиндрическим каемчатым эпителием (1), подслизистая основа (2), мышечная оболочка (3), серозная оболочка (4), а также внутристеночные вены с окрашенным в оранжевый цвет просветом подслизистой основы (5), мышечной оболочки (6) и серозной оболочки (7), сосуды без красителя в просвете - артерии (8).
Высокое качество окрашенных гистологических препаратов с дифференцированными сосудами, получаемое в результате применения предлагаемого способа, не требующего больших финансовых затрат и специального технического оборудования, является его несомненным достоинством.
Таким образом, предлагаемый способ гистологического окрашивания внутристеночных вен полых органов брюшной полости человека, в отличие от ближайшего аналога, не зависит от кровенаполнения окрашиваемого сосуда и дифференцировки на артерии и вены той или иной венозной системы, а также позволяет одновременно с окрашиванием вен окрашивать паренхиму органа, что увеличивает возможность разностороннего исследования сосудов в образце в целом и на уровне различных оболочек органа.