СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К ОНКОПАТОЛОГИИ
METHOD OF PREDISPOSITION TO ONCOPATHOLOGY DETERMINATION

Настоящее изобретение относится к области медицинской генетики и может быть использовано для диагностики предрасположенности к различным видам онкологии.
Рак является одной из основных причин смерти в мире; так, в 2015 г. от этого заболевания умерли 8,8 млн человек. В России у женщин и мужчин преобладают разные формы рака. В целом на первом месте находится рак кожи, на втором месте располагается опухоль молочных желез. Далее по убывающей распространенности расположились такие формы злокачественных новообразований: рак легких, желудка, толстого кишечника, простаты, прямой кишки, лимфоидной ткани, кроветворных органов, матки, почки, поджелудочной железы, шейки матки, мочевого пузыря и яичников. Существует много предложений по диагностике предрасположенности к различным типам рака.
Известен способ прогнозирования наследственной
предрасположенности к раку молочной железы, который характеризуется тем, что проводят амплификацию коротких фрагментов гена BLM протяженностью до 200 и.о., с последующим высокоразрешающим плавлением, включающим оптимизированный для гена BLM этап формирования гетеродуплексов: быстрый нагрев до 95°С и медленное снижение температуры до 50°С; выбирают один фрагмент с аберрантным профилем плавления для секвенирования, секвенируют выбранный фрагмент и при выявлении мутации гена BLM прогнозируют наследственную предрасположенность к раку молочной железы. Способ повышает точность детекции мутации, прост в исполнении и высокоинформативен: позволяет выявлять до 100% мутаций в гене BLM [Патент РФ 2522501 от 17.10.2012].
Известен способ диагностики рака, предраковых состояний и предрасположенности к другим формам заболеваний путем использования в качестве молекулярного маркера интерферон-регулирующего фактора 1 (IRF-1). Способ отличается тем, что IRF-1 - специфичная РНК, анализируется в образце крови или образце, содержащем другой материал, полученный путем биопсии, преимущественно путем обратной транскрипции - реакции удлинения цепи полимеразой, или в таком образце определяется содержание биологически активного полипептида IRF-1. Изобретение основано на том, что новый механизм инактивации генасупрессора опухоли IRF-1 играет критическую роль, например, в гематопоэтической малигнизации. Необычный скиппинг экзонов приводит к образованию молекул РНК, которые утратили экзон 2 или экзоны 2 и 3. Относительные количества молекул РНК полной длины и укороченных молекул значительно различаются в образцах, полученных от больных с опухолями и от здоровых доноров. Изобретение также относится к IRF-1 - специфичным олигонуклеотидам [Заявка на патент РФ 95102480 от 27.12.1996].
Прототипом изобретения является способ прогнозирования повышенного риска, включающий обнаружение в биологическом образце от субъекта комбинированного генотипа на основе идентифицированных вариантов гена CYP1B1, гена СНЕК2 и гена BRCA2, где присутствие комбинированного генотипа является показателем предрасположенности с высоким риском по меньшей мере к одному из приведенных ниже типов рака: рака молочной железы, ободочной кишки, почки, гортани, легкого, поджелудочной железы, простаты, щитовидной железы, женских половых путей и яичников, который является качественно и количественно отличным от суммы эффектов низкого риска вариантов этих трех генов, взятых по отдельности [Патент РФ №2009 127 735 от 27.01.2011]. Недостатком данного прототипа является повышенная трудоемкость при генотипировании образцов ДНК.
Задачей изобретения является расширение арсенала средств, направленных на прогнозирование предрасположенности к онкологии, повышение точности и информативности в индивидуальном прогнозе, снижение материальных затрат.
Техническим результатом изобретения является повышение точности и расширение выбора ассоциированных генов, направленных на прогнозирование предрасположенности к раку, повышение точности и информативности в индивидуальном прогнозе, снижение материальных затрат.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе обнаружения предрасположенности к онкологии, включающем выделение тотальной нативной ДНК из периферической крови, генотипирование путем проведения полимеразной цепной реакции, согласно изобретению проводят генотипирование полиморфных вариантов rs3134613 гена Myc-L, rs137853294 гена RB1 и rs2072052 гена CDK4 в качестве праймеров используют олигонуклеотиды 5'-tttgggatgtagggaagcctgc-3', 5'-tttgggatgtagggaagcctgc-3 для гена Myc-L, 5'-tgggggaaagaaaagagtggtagaa-3', 5'-gaggagagaaggtgaagtgcttg-3' для гена RB1, 5'-caccttttcgctccaccatg-3', 5'-ggattaccttgtcactgagcc-3' для гена CDK4, и при выявлении генотипа *G/*G и аллеля *G полиморфного локуса rs3134613 гена Myc-L, генотипа *G/*G и аллеля *G полиморфного локуса rs137853294 гена RB1 и гетерозиготного генотипа *А/*С полиморфного варианта rs2072052 гена CDK4 прогнозируют высокий риск развития рака молочной железы.
Поиск новых генов, ассоциированных с онкологией, представляется достаточно важной задачей. Во-первых, сведения о присутствии предрасполагающих мутаций к раку у той или иной женщины позволяют сформировать индивидуальный комплекс медицинских мероприятий, направленных на профилактику и своевременную диагностику этого заболевания. Во-вторых, данные последних лет свидетельствуют о том, что онкопатологии нуждаются в особых, отличных от «спорадических» карцином, схемах лечебных воздействий.
Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.
Используют метод фенольно-хлороформной экстракции ДНК из периферической крови (Mathew, 1984). Образцы ДНК получают из 4 мл венозной крови человека. В качестве антикоагулирующего соединения используют 0.5 мл 0.5 М раствора ЭДТА. Для получения фракции клеточных ядер к 4 мл крови добавляют 10 мл лизирующего буфера (0.32 М сахароза; 5 мМ MgCl2; 1% тритон Хх100; 10 мМтрис-HCl, рН=7.5), инкубируют 15 мин в морозильнике и центрифугируют 20 мин при 1500g. Полученный осадок ресуспензируют в 400 мкл STE-буфера, затем добавляют 20 мкг/мл протеиназы К и инкубируют при температуре 370С в течение 12 часов. Из полученного лизата выделяют ДНК. Для этого проводят три экстракции по 8 мин при 10000 об/мин: первую - 500 мкл забуферного фенола, вторую-смесью фенол-хлороформ (1:1) и одну экстракцию хлороформом. ДНК осаждают холодным 96% этанолом. Осадок промывают 70% этанолом, подсушивают на воздухе и растворяют в 200-500 мкл дезионизированной воды.
В дальнейшем, полученную ДНК используют в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПНР) полиморфных локусов генов Myc-L, CDK4 и RB1. Амплификацию изученных локусов проводят с помощью метода полимеразной цепной реакции синтеза ДНК на амплификаторе «Терцик».
ПНР проводили по следующей схеме:
1. При использовании ScreenMix компании Евроген на 1 образец ДНК используют реактивы в следующем соотношении: 3,5 мкл воды, 1,5 мкл ScreenMix(5x), обратный и прямой праймеры по 2 мкл. Затем добавляют по капле вазелинового масла для предотвращения испарения смеси.
2. При приготовлении рабочей смеси с Taq-полимеразы к 1 мкл геномной ДНК добавляют 2 мкл прямого и обратного олигопраймеров, 1 мкл дезоксинуклеотидтрифосфата, 0,15 мкл термофильной ДНК-полимеразы, 1 мкл буфера для ПЦР, 3,35 мкл воды для инъекций. Затем добавляют вазелинового масла для предотвращения испарения смеси.
В качестве праймеров используют следующие последовательности олигонуклеотидов: 5'-caccttttcgctccaccatg-3', 5'-ggattaccttgtcactgagcc-3' для гена CDK4, 5'-tttgggatgtagggaagcctgc-3', 5'-tttgggatgtagggaagcctgc-3 для гена Myc-L, 5'-tgggggaaagaaaagagtggtagaa-3', 5'-gaggagagaaggtgaagtgcttg-3' для гена RB1.
Режим амплификации для гена Myc-L: 35 циклов со следующими параметрами: 95°С - 30 секунд, 53°С - 30 секунд, 72°С - 30 секунд. После 35-го цикла проводили инкубацию при 72°С в течение 7 минут. Программа для амплификации гена CDK4 следующая: начальная денатурация при 95°С в течение 5 мин.; 30 циклов, включая денатурацию при 95°С - 30 секунд, отжиг праймеров при 61°С - 30 секунд, синтез ДНК при 72°С - секунд; инкубацию при 72°С в течение 7 минут. Для гена RB1 программа амплификации состояла из следующих этапов: денатурации при 95°С - 5 минут; 35 циклов, включая денатурацию при 95°С - 50 секунд, отжиг праймеров при 62°С - 50 секунд, синтез ДНК при 72°С - 50 секунд; и последующую инкубацию при 72°С в течении 7 минут.
Полиморфные варианты rs2072052 гена CDK4, rs3134613 гена Myc-L и rs137853294 гена RB1 являются рестрикционными. Поэтому после проведения полимеразной цепной реакции продукты амплификации подвергают последующей рестрикции - обрабатывают рестрикционной смесью, состоящей из 1 мкл буфера и 0,1 мкл рестриктазы. Для этого 7 мкл амплификата смешивают с 1,1 мкл эндонуклеазами рестрикции. Для полиморфного варианта rs2072052 гена CDK4 используют эндонуклеазу Bst2UI, инкубируют в течение 16 часов в термостате при 60°С и затем идентифицируют аллель *С по фрагментам длиной 133+165 нуклеотидных пар, а аллель *А - 299 нуклеотидных пар.
При идентификации аллелей по полиморфному локусу rs3134613 гена Myc-L смесь амплификата обрабатывают эндонуклеазой рестрикции EcoRI, затем проводят инкубацию при 37°С в течение 16 часов и определяют аллель *Т состоящий из 2 фрагментов длиной 196 и 165 пар оснований и аллеля *G длиной в 361 нуклеотидную пару.
Для полиморфного варианта rs137853294 гена RB1 синтезируют ДНК-продукт длиной 327 нуклеотидных пар, который расщепляют рестриктазой MSP1, образуя фрагменты ДНК и при этом идентифицируют аллель *С длиной в 327 нуклеотидных пар, аллель *G длиной фрагментов в 168 и 159 нуклеотидных пар.
Затем проводят электрофорез в вертикальном 7% полиакриламидном геле. В качестве электролита для электрофореза применяют 1X боратный буфер (0,089 М трис HCl рН=7,8; 0,089 М борная кислота, 0,002 М ЭДТА с рН=8,0).
Перед нанесением на вертикальный электрофорез пробы смешивают в соотношении 1:5 с краской, содержащей 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола, 15% фикола. Эти пробы вводят в лунки и проводят электрофорез при напряжении 300 В в течение 20-30 минут после 15-минутного преэлектрофореза. После разделения продуктов гель 3 минуты окрашивают в бромистом этидии (0,1 мкг/мл в 1*ТАЕ), затем промывают дистиллированной водой и визуализируют под УФ свете при длине волны 254 нм. Генотипы типируют по критерию присутствия или отсутствия сайта рестрикции и соответствующего фрагмента на электрофорезе.
Было обследовано 220 проживающих в Республике Башкортостан пациентов, образцы ДНК которых, были взяты при информированном согласии на взятие крови, проведение лабораторных и генетических исследований. Из них 120 здоровых индивидов без отягощенного онкологического анамнеза и 100 онкологических больных с клинически подтвержденным онкологическим анамнезом, находившихся на стационарном лечении в ГБУЗ «Республиканский клинический онкологический диспансер» МЗ Республики Башкортостан. Клиническое обследование больных проведено врачами отделений.
2
2
Исследование полиморфного локуса rs3134613 гена Myc-L выявило существенные различия в частотах генотипов у больных раком и в группе контроля. Так в группе онкобольных выявлено достоверно значимое увеличение частоты генотипа *G/*G (р=0,001, χ=6,71) и аллеля *G (p=0,003, χ=4,75).
2
2
При анализе распределения частот генотипов и аллелей полиморфного локуса rs2072052 гена CDK4 было выявлено достоверно значимое повышение частоты гетерозиготного генотипа *А/*С (р=0,05, χ=3,85) и непротективного аллеля *С (р=0,02, χ=5,3) в группе онкобольных.
2
2
Анализ распределения частот генотипов и аллелей полиморфного локуса rs137853294 гена RB1 показал достоверно значимое повышение частоты гомозиготного генотипа *G/*G (р=0,0005, χ=57,61) и непротективного аллеля *G (р=0,0005, χ=19,84) в группе онкобольных.
2
2
2
2
2
В результате сравнительного анализа распределения частот сочетаний генотипов полиморфных локусов изучаемых генов для оценки взаимодействия генов-онкосупрессоров с онкогенами при предрасположенности к онкологии были выявлены достоверно значимые различия в исследуемых выборках, так было выявлено повышение частот 6 сочетаний, не выявленных в группе контроля. В группе онкобольныхвыявлены рисковые сочетания генотипов по полиморфным локусам rs137853294 гена Rb1, rs3134613 гена Myc-L и rs2072052 гена CDK4, которые в группе контроля не были выявлены: GG/TT/AC (р=0,002, χ=14,36), GG/TT/AC (р=0,001, χ=6,22), GG/TG/AC (р=0,002, χ=14,36), CG/GG/AC (р=0,002, χ=10,29), CG/GG/AA (р=0,001, χ=6,22).
На основании полученных результатов можно сделать вывод об ассоциации генотипа *G/*G и аллеля *G полиморфного локуса rs3134613 гена Myc-L, генотипа *А/*С полиморфного варианта rs2072052 гена CDK4 и генотипа *G/*G и аллеля *G полиморфного локуса rs137853294 гена RB1 с повышенным риском развития онкопатологии и возможности использования данных полиморфизмов для прогнозирования онкологического заболевания. Выявленные сочетания генотипов включают как рисковые генотипы генов онкосупрессии, так и онкогена, что свидетельствует о совместном влиянии данных генов на риск развития онкопатологии.
Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Пациентка Н., 49 лет, поступила с жалобами на уплотнения в правой молочной железе.
Предварительный диагноз: рак молочной железы.
Семейный анамнез: онкологическими заболеваниями не отягощен.
Результаты лабораторных исследований: опухоль в верхненаружном квадранте правой молочной железы 2,5 см. Лимфоузлы не увеличены. Слева без патологии. Цитология: протоковый рак умеренно-дифференцированный.
Результаты ПНР: в клиническом материале выявлен генотип *G/*G и аллель *G полиморфного локуса rs3134613 гена Myc-L, генотип *А/*С полиморфного варианта rs2072052 гена CDK4 и генотип *G/*G, аллель *G полиморфного локуса rs!37853294 гена RB1.
Окончательный диагноз: рак правой молочной железы II стадии без метастаз.
Пример 2. А., 45 лет, из группы контроля.
Результаты ПЦР: в клиническом материале выявлен генотип *Т/*Т и аллель *Т полиморфного локуса rs3134613 гена Myc-L, генотип *А/*А полиморфного варианта rs2072052 гена CDK4 и генотип *С/*С полиморфного локуса rs137853294 гена RB1.
Таким образом, предлагаемый способ определения предрасположенности к онкологии позволяет выявлять и идентифицировать риск развития рака в доступном клиническом материале, что коррелирует с результатами других исследований и, соответственно, обеспечивает единую интерпретацию данных.