Частоты аллелей и генотипов kitlg, bak1 и spry4, ассоциированые с развитием герминогенных опухолей яичек, повышены у пациентов с тестикулярным микролитиазом

частоты аллелей и гЕнотипов KITLG, BAK1 И SPRY4, ассоциированы^ с развитием герминогенных опухолей яичек, повышены у пациентов с тестикулярным микролитиазом

И.С. Данцев 1, Е.В. Ивкин 1, А.А. Трякин 3, А.А. Буланов 3, Д.Н. Годлевский1, О.Ю. Латышев 1, В.В. Руденко 2, С.А. Тюляндин 3, Е.А. Володько 1, А.Б. Окулов 1, О.Б. Лоран1, М.В. Немцова 14 1 Российская медицинская академия последипломного образования, Москва, Россия 2Медико-генетический научный центр, Москва, Россия 3Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина, Москва, Россия 4Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова, Москва, Россия

Frequencies of the KITLG, BAK1 and SPRY4 alleles and genotypes associating with

the development of testicular germ cell tumors, are increased in patients with testicular

microlithiasis

I.S. Dantzev1, E.V. Ivkin 13, AA. Tryakin 3, AA. Bulanov 3, D.N. Godlevski1,0.Y. Latyshev1, V.V. Rudenko 23, S.A. Tyulyandin 3, E.A. Volodko 1, A.B. Okulov1, OB. Loran 1, M.V. Nemtsova 1 4

1 Russian medical academy of postgraduate education, Moscow, Russia

2 Medical genetic research center, Moscow, Russia

3 N.N. Blokhin Russian Onctological Scientific Center, Moscow, Russia

4 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Ministry Qf Health Qf Russia, Moscow, Russia

Тестикулярный микролитиаз является случайной находкой при ультразвуковом исследовании яичек и вызывает особый интерес в качестве информативного маркера у мужчин, имеющих повышенный риск развития герминогенных опухолей яичек. Гены КПО, БРЙУ4 и ВАК1 влияют на эмбриональное развитие яичек и сперматогенез, их изменение приводит к значительному повышению риска развития герминогенных опухолей яичек.

Цель работы: выявление генетических факторов, определяющих повышенный риск развития герминогенных опухолей яичек у пациентов с тестикулярным микролитиазом. Проведено исследование частот аллелей и генотипов КПО (ГБ995030, ГБ1508595), БРЙУ4 (гб4В24820, гбВ89787В) и ВАК1 (гб210138) в группах пациентов с диагнозом герминогенных опухолей яичек, пациентов с тестикулярным микролитиазом и фертильных мужчин (контрольная группа).

Для КПО гб995030 выявлены достоверные различия частоты генотипа 99 в группах пациентов с тестикулярным микролитиазом (р = 0,013) и герминогенными опухолями яичек (р = 0,0031) по сравнению с контролем. Для КПО гб1 508595 обнаружены статистически значимые различия частоты аллеля 9 и генотипа 99 у больных с тестикулярным микролитиазом (р = 0,002 для аллеля, р = 0,01 для генотипа) и больных герминогенными опухолями яичек (р = 0,0003 для аллеля; р = 0,014 для генотипа). Для ВАК1 (гб210138) определены достоверные различия частоты аллеля 9 между группой больных тестикулярным микролитиазом и группой сравнения (р = 0,03). При исследовании сочетания генотипов высокого риска КПО (гб995030, гб1 508595) и ВАК1 (гб210138) выявлено, что оно встречается достоверно чаще у пациентов с герминогенными опухолями яичек (р = 0,0001) и с тестикулярным микролитиазом (р = 0,0053) по сравнению с контролем.

Результаты проведенного исследования показали, что частота сочетания генотипов высокого риска увеличивается у пациентов с герминогенными опухолями яичек в 4,В раза (013: 4,669 [2,172-10,034]), а у пациентов с тестикулярным микролитиазом в 3,3 раза (013: 3,355 [1,471-ъ0РР~7,В54]).

Ключевые слова: герминогенные опухоли яичек, тес-тикулярный микролитиаз, однонуклеотидные полиморфизмы, генотипы высокого риска, факторы риска.

Testicular microlithiasis is a random finding on ultrasound testicular examination. Testicular microlithiasis is of particular interest as an informative marker in men with an increased risk of testicular germ cell tumors. Genes KITLG, SPRY4 and BAK1 influence the development of the testes and spermatogenesis, their change results in a significant increase in the risk of testicular germ cell tumors.

To determine the genetic factors that determine an increased risk of testicular germ cell tumors in patients with testicular microlithiasis, we investigated the frequency of alleles and genotypes of genes KITLG (rs995030, rs1508595), SPRY4 (rs4624820, rs6897876) and BAK1 (rs210138) in groups of fertile male, patients with testicular germ cell tumors and patients with testicular microlithiasis.

For KITLG rs995030 we found significant differences in the frequency of the genotype GG in patients with testicular microlithiasis (p = 0.013) and in patients with testicular germ cell tumors (p = 0,0031) compared with the control. For KITLG rs1508595 revealed significant differences in the frequency of G allele and GG genotype in patients with testicular microlithiasis (p = 0,002 for allele, p = 0,01 for genotype) and patients with testicular germ cell tumors (p = 0.0003 for allele; p = 0,014 for genotype). For BAK1 rs210138 we found significant differences in the frequency of G allele in patients with testicular microlithiasis, compared with the control group (p = 0,03). With a combination of high-risk genotypes study KITLG (rs995030, rs1508595) an BAK1 (rs210138) showed that the combination of these genotypes were significantly more common in patients with testicular germ cell tumors (p = 0,0001) and patients with testicular microlithiasis (p = 0,0053), on compared with the control.

We have shown an increase in frequency of genotypes combination for testicular germ cell tumors at 4,6 times (OR: 4,669 [2,172-10,034]), and testicular microlithiasis -3,3 times (OR: 3,355 [1,471-7,654]).

Keywords: testicular germ cell tumors, testicular microlithiasis, single nucleotide polymorphisms, high-risk genotypes, risk factors.

e-mail: okulov20@yandex.ru

оригинальные исследования

81

Введение

Микролиты паренхимы яичка являются случайной находкой при ультразвуковом исследовании (УЗИ) органов мошонки и встречаются с частотой примерно до 9%, однако общепопуляционная частота остается неизвестной [1].

Считают, что в основе тестикулярного микролити-аза (ТМ] лежат нарушения фагоцитарной активности клеток Сертоли, что может являться проявлением синдрома тестикулярной дисгенезии (СТД). При ми-кролитиазе клетки, слущенные в просвет семенных канальцев, не уничтожаются посредством фагоцитоза и в дальнейшем подвергаются кальцификации, образуя мелкие кальцинаты [2].

При УЗИ ТМ представляет собой множество мелких гиперэхогенных включений без акустической тени размером 1—3 мм по всей паренхиме яичка (рис. 1). Максимальное количество кальцинатов на одном изображении может значительно варьировать. Классический ТМ определяют по наличию пяти и более микролитов на одном изображении УЗИ (I стадия — 5—10, II стадия — 11—20, III стадия — более 20 включений), в то время как ограниченный ТМ констатируют при наличии менее пяти кальцина-тов на всех изображениях [3].

Частота обнаружения ТМ по УЗИ характеризуется широким диапазоном. Это объясняется отсутствием четкого определения понятия ТМ, неоднородностью исследуемых групп, а также использованием различных частот ультразвука. У взрослых, имеющих симптомы со стороны органов мошонки, средняя частота ТМ варьирует в диапазоне 0,6—9,0%, а у лиц без каких-либо симптомов — 2,4—5,6%. Распространенность бессимптомного ТМ в возрасте до 18 лет составляет 2,4% и увеличивается с возрастом [4].

Хотя взаимосвязь между ТМ и герминогенными опухолями яичек (ГОЯ) отражена в ряде исследований, нет убедительных доказательств, что ТМ является предраковым состоянием [5]. Частота развития ГОЯ у пациентов ТМ составляет от 3 до 10%, при этом большинство больных были направлены на УЗИ в связи с различными жалобами со стороны мошонки, включая перекрут яичка, безболезненное уплотнение, гидроцеле, тестикулярную боль, эпидидимит и субфертильность. Лишь в редких случаях развитие ГОЯ происходило после идентификации ТМ.

Рис. 1. Классическая эхографическая картина микролитиаза. Множественные мелкие эхогенные нетеневые очаги по всей паренхиме яичка

По данным ряда исследований опухоль развивалась в сроки от 6 мес. до 11 лет после обнаружения ТМ. Относительное увеличение риска развития опухоли у мужчин с ТМ в исследуемых популяциях возрастало в 13,2-21,6 раза [6].

В последнее время благодаря полногеномным ассоциативным исследованиям удалось идентифицировать гены, которые участвуют в нормальном развитии ткани яичек и сперматогенезе. Определенное аллельное состояние этих генов приводит к повышенному риску развития ГОЯ [7]. Показано, что некоторые однонуклеотидные полиморфизмы в генах KITLG, SPRY4 и BAK1 влияют на развитие мужского бесплодия и приводят к значительному повышению риска развития ГОЯ [8].

С целью выявления генетических факторов, определяющих повышенный риск развития ГОЯ у пациентов с ТМ, мы провели исследование аллелей и генотипов KITLG (rs995030, rs1508595], SPRY4 (rs4624820, rs6897876) и BAK1 (rs210138) в группах пациентов с диагнозом герминогенных опухолей яичек, пациентов с тестикулярным микролитиа-зом и фертильных мужчин (контрольная группа).

Материал и методы

Материал для исследования (сыворотка крови пациентов с ГОЯ в возрасте от 28 до 45 лет, n = 73) был любезно предоставлен кафедрой урологии и хирургической андрологии РМАПО на базе ГКБ им. С.П. Боткина, а также отделением клинической фармакологии ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина. Диагноз ГОЯ установлен по результатам морфологического исследования.

Набор материала от пациентов с ТМ осуществили отдел детской хирургии НИЦ РМАПО и кафедра детской эндокринологии на базе ДГКБ им. З.А. Башляевой. В группу с ТМ вошли 56 детей от 2 до 18 лет (средний возраст 12,05±0,66). Микролитиаз был выявлен при УЗИ мошонки на аппаратах Voluson 730 PRO V (General Electric Company, США), Mindray DC-7 (Shenzhen Mindray Bio-Medical ElectronicCo. Ltd., Китай) с применением линейных датчиков высокой частоты (12-13 МГц). Диагноз ТМ ставили при обнаружении трех и более мелких (1-3 мм) гиперэхогенных включений без акустической тени в паренхиме яичка [9]. Показаниями к УЗИ мошонки служили варикоцеле, крипторхизм, атрофия яичек, гидроцеле, острые заболевания мошонки, нарушения формирования пола. У части пациентов ТМ был выявлен во время диспансеризации.

В качестве контроля использовали ДНК, выделенную из периферической крови фертильных доноров (n = 97), в возрасте от 26 до 41 г., не имеющих в анамнезе герминогенных опухолей яичек.

Взятие образцов крови производилось при наличии информированного согласия взрослых пациентов (с 14 лет), родителей пациентов-детей в возрасте до 14 лет и доноров.

ДНК из лейкоцитов периферической крови пациентов с ГОЯ, детей с ТМ и фертильных мужчин выделяли стандартным методом фенольно-хло-роформной экстракции, описанным J. Sambrook (1989) [10].

Определение аллелей и генотипов KITLG (rs995030, rs1508595), SPRY4 (rs4624820, rs6897876) и BAK1 (rs210138) осуществляли методом ПЦР-ПДРФ.

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием программы Prism 6 (Graph Pad Prism version 6.0). Аллельные варианты полиморфных генов сопоставляли по наличию аллелей и генотипов у пациентов с ГОЯ, ТМ и в группе контроля. Тест на соответствие выборки равновесию Харди-Вайнберга проводили методом %2 (а = 0,05, df = 1), анализ ассоциаций — расчетом показателя отношения шансов (OR-odds ratio) с 95% доверительным интервалом (95% CI). Достоверность ассоциации между заболеванием и аллельным вариантом (генотипом) определяли с помощью точного двустороннего критерия Фишера, критерия %2 (с коррекцией Йейтса на непрерывность выборки), df = 2 (общая модель наследования), либо U-критерия Манна — Уитни, сравнивая распределение генотипов и аллелей по каждому полиморфизму между группами пациентов и контролем.

Сравнение частот встречаемости сочетаний генотипов проводили с использованием точного двустороннего критерия Фишера. Для всех критериев статистически значимыми считали различия при р<0,05.

Результаты

Частоты аллелей и генотипов, определенные в группе пациентов с ГОЯ, ТМ и в контроле, представлены в табл. 1. Для KITLG были выявлены достоверные различия частоты генотипа GG rs995030 у пациентов с ТМ (р = 0,013) и пациентов с ГОЯ (р = 0,0031) по сравнению с контролем. При ТМ и ГОЯ достоверно чаще определялись аллель G (p = 0,002 и р = 0,0003 соответственно) и генотип GG (p = 0,01 и p = 0,014) по rs1508595. Для BAK1 (rs210138) были обнаружены достоверные разли-

чия частоты аллеля G в группе пациентов с ТМ по сравнению с контрольной группой (р= 0,03). Для гена БРИУ4 (пэ4624820, пэ6897876) достоверных различий в частотах аллелей и генотипов в группах ТМ и ГОЯ по сравнению с контролем отмечено не было.

При исследовании сочетания генотипов высокого риска Ктв (пэ995030, пэ1 508595) и ВАК1 (пэ210138) было показано, что их сочетание у пациентов с ГОЯ (р = 0,0001) и пациентов с ТМ (р = 0,0053) встречается достоверно чаще по сравнению с контролем (табл. 2). Поскольку в нашей выборке генотип GG по ВАК1 пэ210138 был обнаружен только у 1 пациента с ТМ и 2 пациентов с ГОЯ, расчет риска проводили для генотипов GG+AG. Было отмечено увеличение риска развития опухоли при сочетании генотипов КПв (пэ995030, пэ1508595) и ВАК1 (пэ210138) в группе ГОЯ в 4,6 раза (ОП: 4,669 [2,172-10,034]), а в группе ТМ в 3,3 раза (ОП: 3,355 [1,471-ъОПП~7,654]).

Обсуждение

Герминогенные опухоли яичек являются наиболее распространенными злокачественными новообразованиями у мужчин в возрасте 15—40 лет и встречаются с частотой 1—3%. Раннее обнаружение ГОЯ улучшает прогноз и предотвращает необходимость в радикальном хирургическом лечении (орхиоэкто-мии), а также способствует проведению органосох-раняющих операций и снижает риск последствий системного противоопухолевого лечения.

Микролитиаз яичек наряду с недостаточностью репродуктивной функции, атрофией яичка, криптор-хизмом рассматривают в качестве факторов риска для развития ГОЯ. Поэтому обнаружение ТМ может

Таблица 1. Частоты аллелей и генотипов генов, ассоциированных с повышенным риском развития ГОЯ, по данным GWAS, у пациентов с ГОЯ, ТМ и здоровых мужчин

Гены SPRY4 KITLG BAK1

Аллели rs4624820 rs6897876 rs995030 rs1508595 rs210138

Генотип А АА С СС G GG G GG G GG

К (n = 97) 0,546 0,28 0,56 0,397 0,763 0,546 0,665 0,464 0,165 0/0,0

ГОЯ (n = 73) 0,62 0,39 0,63 0,33 0,842 0,753* 0,842* 0,739* 0,247 0,028

ТМ (n = 56) 0,616 0,375 0,286 0,464 0,795 0,679* 0,83* 0,714* 0,268* 0,018

* — аллели и генотипы, частота которых статистически значимо отличается от контрольной группы, р<0,05.

таблица 2. Распределение частот встречаемости сочетания генотипов риска: GG, GG, AG/GG, для генов КШБ и ВАК1 в исследуемых группах

Группы

Сочетание генотипов риска: rs995030

Сочетание +

Сочетание

ГОЯ (n = 73) 29/0,4 44/0,6

ТМ (n = 56) 18/0,32 38/0,68

Контроль(n = 97) 12/0,12 85/0,88

p (ГОЯ - ТМ - К) 0,0002

p (ГОЯ vs К) 0,0001; OR: 4,669 [2,172-10,034]; RR: 3,211 [1,762-5,854]

p (ТМ vs К) 0,0053; OR: 3,355 [1,471^ORR"7,654]; RR: 2,598 [1,353-4,989]

способствовать выявлению группы пациентов, имеющих высокий риск развития опухоли.

J. Coffey с соавт. (2007) показали, что ТМ чаще встречается у мужчин, родственники которых имели ГОЯ, что предполагает семейный фактор риска для рака яичек [11].

Существует гипотеза, что ТМ и ГОЯ, скорее всего, являются вторичными по отношению к общему дефекту, тубулярной дегенерации, что объясняет связь между ГОЯ и ТМ [12]. TM является маркером тубулярной дегенерации, но сам по себе не является фактором риска, предрасполагающим к развитию тестикулярного рака. Подавляющее число доказательств указывают на то, что ТМ может выступать в качестве маркера только у тех мужчин, которые имеют дополнительные факторы риска для ГОЯ (крипторхизм, бесплодие, а также другие факторы) [13]. Нам удалось показать, что генетические факторы, значимые для развития ГОЯ, достоверно чаще представлены и в группе пациентов с ТМ. Генотипы AA для SPRY4 (rs4624820), CC для SPRY4 (rs6897876), GG для KITLG (rs995030), GG для KITLG (rs1508595) и GG для BAK1 (rs210138) по результатам полногеномного исследования ассоциаций и по полученным нами данным связаны с высоким риском развития ГОЯ [14].

Низкое качество спермы, крипторхизм, рак яичка и гипоспадия могут характеризовать синдром тестикулярной дисгенезии СТД, который формируется под влиянием генетических факторов и факторов окружающей среды [11]. Экспериментальные и эпидемиологические данные показывают, что СТД

ЛИТЕРАТУРА

1. Jungwirth А., Diemer T., Dohle G.R. et al. Guidelines on Male Infertility European Association of Urology 2015. http://uroweb.org/ wp-content/uploads/17-Male-Infertility_LR1.pdf.

2. van Casteren N.J., Looijenga L.H., Dohle G.R. Testicular microlithiasis and carcinoma in situ overview and proposed clinical guideline. Int. J. Androl. 2009; 32: 279-87.

3. Shanmugasundaram R., Chandra S.J., Kekre N.S. Testicular microlithiasis: Is there an agreed protocol? Indian J. Urol. 2007; 23(3): 234-9.

4. Goede J., Hack W.W., van der Voort-Doedens L.M. et al. Prevalence of testicular microlithiasis in asymptomatic males 0 to 19 years old. J. Urol. 2009; 182: 1516-20.

5. Zastrow S., Hakenberg O.W., Wirth M.P. Significance of testicular microlithiasis. Urologia Internationalis 2005; 75: 3-7.

6. Bach A.M., Hann L.E., Hadar O. et al. Testicular microlithiasis: what is its association with testicular cancer? Radiology 2001; 220: 70-5.

7. Rapley E.A., Turnbull C., Al Olama A.A. et al. A genome-wide association study of testicular germ cell tumor. Nat. Genet. 2009; 41: 807-10.

является результатом нарушения программирования и развития гонад в эмбриональный период. Поэтому будущие эпидемиологические исследования в области репродуктивного здоровья мужчин не должны ориентироваться на один симптом, необходимо принимать во внимание все аспекты СТД.

выводы

1. Полученные данные привносят дополнительные аргументы в пользу гипотезы о том, что тести-кулярный микролитиаз, по крайней мере, в части случаев, является одним из симптомов дисгенезии яичек, наряду с крипторхизмом, гипоспадией, нарушениями фертильности и ГОЯ.

2. Генетическое исследование может быть использовано для выявления лиц группы повышенного риска по развитию ГОЯ среди пациентов с тестику-лярным микролитиазом.

3. Дети и лица репродуктивного возраста с микролитиазом, у которых выявляют полиморфные варианты гена KITLG и сочетание генотипов высокого риска по двум генам KITLG (rs995030, rs1508595) и BAK1 (rs210138) должны наблюдаться как лица, имеющие повышенный риск развития герминогенных опухолей яичек. Необходимо ежегодное проведение УЗИ яичек с допплерографией, а с наступлением пубертата и до конца репродуктивного периода ежегодно исследовать онкомаркеры. Выявление даже косвенных признаков внутриканальцевой неоплазии обуславливает необходимость проведения биопсии яичка.

8. Kanetsky P.A., Mitra N., Vardhanabhuti S. et al. Common variation in KITLG and at 5q31.3 predisposes to testicular germ cell cancer. Nat. Genet. 2009; 41: 811-5.

9. Korde L.A., Premkumar A., Mueller C. et al. Increased prevalence of testicular microlithiasis in men with familial testicular cancer and their relatives. Br. J. Cancer 2008; 99 (10): 1748-53.

10. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. Nova York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989.

11. Coffey J., Huddart R.A., Elliott F. et al. Testicular microlithiasis as a familial risk factor for testicular germ cell tumour. Brit. J. Canc. 2007; 97: 1701-6.

12. Richenberg J., Belfield J., Ramchandani P. et al. Testicular microlithiasis imaging and follow-up: guidelines of the ESUR scrotal imaging subcommittee. Eur. Radiol. 2015; 25: 323-30.

13. Winter T.C., Kim B., Lowrance W.T. et al. Testicular microlithiasis: what should you recommend? AJR Am. J. Roentqenol. 2016; 206(6): 1164-69.

14. Rapley E.A., Turnbull C., Al Olama A.A. et al. A genome-wide association study of testicular germ cell tumor. Nat. Genet. 2009; 41: 807-10.

Поступила: 30.09.2016