СПОСОБ БАЦИЛЛЯРНОЙ ТЕРМОАНАЭРОБНОЙ ПОДГОТОВКИ КАЧЕСТВЕННОГО СОЛОМИСТОГО СУБСТРАТА ДЛЯ ИНТЕНСИВНОГО НЕСТЕРИЛЬНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВЕШЕНКИ ОБЫКНОВЕННОЙ
METHOD OF BACILLAR THERMOANAEROBIC PREPARATION OF HIGH-QUALITY STRAW SUBSTRATE FOR INTENSE NON-STERILE CULTIVATION OF OYSTER MUSHROOM

Предлагаемое изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии, а именно к грибоводству, базирующемуся на культуре гриба-ксилотрофа вешенки обыкновенной, выращиваемой по индустриальной интенсивной европейской технологии.
Ксилосапротроф - вешенка обыкновенная (Pleurotus ostreatus) - является одним из наиболее ценных объектов мирового и отечественного грибоводства. Она самая экономически выгодная среди других культивируемых видов грибов [1, 2].
Существует два метода ее искусственного выращивания: экстенсивный (летом на чурках осины, тополя, в трехлетних оборотах) и интенсивный (с конца лета до начала следующего лета, в двух-трех «волновых» двухмесячных грибооборотах) в контролируемых условиях закрытых помещений, на соломистых или опилочных субстратах.
Все многообразие существующих способов и приемов интенсивного культивирования вешенок составляют две различные технологии. Первая - это индустриальная полустерильная евротехнология, где грибы растут на крупных блоках или перфорированных полиэтиленовых мешках, наполненных предварительно подготовленным (инокулированным зерновым посевным мицелием) и заращенным грибницей доступном соломистом субстрате (солома зерновых, полова, стержни кукурузы, шелуха подсолнечника и т.д.). Вторая - азиатская, абсолютно стерильная технология, с плодоношением грибов из открываемых отверстий небольших сосудов (керамических, стеклянных, полипропиленовых) или термопластиковых пакетиков с обогащенным питательными добавками (отруби, крупа, труха, мука и т.д.) стерильным опилочным субстратом (в России для товарного производства грибов практически не используется [3, 4]). Европейская технология характеризуется меньшими затратами ручного труда и потенциальными резервами по ее дальнейшей модернизации, механизации и автоматизации, эффективным применением на крупных индустриальных грибных производствах.
После разработки и внедрения евротехнологии (40 лет назад) для подготовки субстратов использовалась тщательная термическая обработка (автоклавирование, длительное пропаривание или кипячение) [5]. Подготавливаемый для инокуляции субстрат (как правило, это солома) являлся фактически стерильным, но не обладал избирательностью (селективностью). Поэтому после инокуляции его посевным мицелием, особенно в отсутствие «чистой» зоны (т.е. при несоблюдении строгих правил асепции), наблюдалось бурное развитие контаминирующих спор конкурирующих микроорганизмов, что зачастую приводило к значительному снижению, а в некоторых случаях и к полной потере урожая. Это подтверждалось и в ранних исследованиях (табл.1) авторов настоящего технического решения при разработке научно-технологических основ интенсивного культивирования вешенок в условиях Приамурья.
К числу наиболее вредных [6] относятся так называемые «сорные» плесени (виды микромицетов из родов Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Rhizomukor и др.). В процессе метаболизма большинство из них выделяет сильные токсины (антимикотики), к которым у еще не развитого мицелия вешенки отсутствует устойчивость, он останавливается в росте и гибнет. Сильное негативное влияние на развитие мицелия вешенки токсинов микромицетов, которые не разрушаются даже при многочасовом воздействии высокими температурами, было обнаружено в процессе производства зерновой посадочной грибницы в ГНУ-ДВ ордена ТКЗ НИИСХ Россельхозакадемии. Для получения качественного питательного субстрата для выращивания вешенок по евротехнологии, при любом способе его подготовки, важен тщательный выбор партий качественной злаковой соломы, которая должна быть сухой, золотистого цвета, не иметь очагов прелости и сырости. При этом качественная солома злаковых, как известно, не стерильна и содержит определенную композицию покоящихся форм микроорганизмов, представленную бактериями, актиномицетами и микроскопическими грибами [9]. При увлажнении такого соломистого сырья активность микрофлоры начинает быстро возрастать. Искусство приготовления качественного селективного субстрата состоит в сохранении полезной (термофильной) микрофлоры и в достаточном наращивании ее численности, одновременно в инактивации или уничтожении вредных конкурентных организмов.
В настоящее время широко известен способ аэробной ферментации, позволяющий создавать селективный субстрат с хорошей плодоотдачей вешенок [5, 6, 9, 10]. Ферментация субстрата отличается от простой термообработки тем, что при подъеме температуры до 60-62°С (более 10 часов) происходит только частичная пастеризация субстрата (уничтожаются мезофильные вегетативные формы широкого спектра, но сохраняются термофильные спорообразующие бактерии), а постоянная подача свежего воздуха (в тоннелях) создает благоприятные условия для развития полезной аэробной микрофлоры, что позволяет получать соломистую питательную среду наивысшего качества для мицелия вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus). Этот способ (аэробная ферментация и сохранение термофильных спорообразующих бактерий) наиболее близок к заявляемому [9, 10].
Однако для проведения такой аэробной ферментации необходимы сложные и дорогие специальные капитальные сооружения, так называемые тоннели. Процесс классической аэробной ферментации соломы с предварительным длительным увлажнением в кучах длительный (до 10 дней) и проблемный для регионов с суровой зимой.
Назрела необходимость модернизировать процесс, упростить его и удешевить за счет совмещения технологических операций по замачиванию фрагментированной соломы и проведения предварительной анаэробной низкотемпературной ферментации, но с возросшей результативностью - за счет использования для заливки водной суспензии специально подобранных и культивируемых эффективных микроорганизмов - факультативных анаэробов.
Задачей настоящего изобретения явилась разработка способа использования эффективной чистой бациллярной культуры при анаэробной подготовке качественных соломистых субстратов для выращивания вешенки, с упрощением процесса предварительной ферментации и сокращением времени на подготовку субстрата экономически достаточной селективности и плодоотдачи.
Поставленная задача решается за счет использования при анаэробной ферментации в качестве бациллярного микроорганизма термофильной культуры В.cereus из рода Bacillus.
Предполагалось, что из термофильных микроорганизмов способствуют повышению селективности субстрата для выращивания вешенки обыкновенной актиномицеты и бациллы [5, 9], обладающие высокой антагонистической активностью по отношению ко многим видам микроорганизмов [12]. Опытным путем было обнаружено (табл.2), что наибольшая эффективность в защите от конкурентов и в стимуляции продуктивности вешенок, растущих на «живых» субстратах, присуща взятым для опыта видам из рода Bacillus. Было определено, что для повышения качества субстрата и продуктивности у вешенок наиболее подходят бациллярные микроорганизмы. Патентный поиск показал, что основная масса спорообразующих бактерий рода Bacillus является мезофилами с оптимумом роста до 40-45°С, и лишь отдельные представители термофильные, т.е. растут при температуре до 65°С [13]. Термофильные виды бацилл делятся на группы. В первую группу объединены бактерии с бациллярным (палочковидным) типом спороношения, в которой выделяются две подгруппы: В.subtilis (аэробы) и В.cereus (факультативные анаэробы). B.subtilis (ранее называемая «сенной» палочкой), как и другой известный представитель B.mesentericus (Вас.subtilis var. mesentericus), или «картофельная» палочка, используют углеводы только в аэробных условиях. Бактерии подгруппы B.subtilis - это почвенные бактерии южного типа, наиболее распространены на пашнях основных зернопроизводящих регионов [14]. В России и за рубежом [15] запатентован ряд штаммов B.subtilis, ингибирующих рост фитопатогенных грибов.
Для бактерий подгруппы B.cereus отличительным признаком является способность использовать сахара как аэробно, так и анаэробно, т.е. при отсутствии кислорода воздуха [13], в т.ч. и второй представитель Вас.cereus var. micodes (по современной классификации). Это северные виды, которые выступают доминантой в экосистемах, где слабо протекают процессы трансформации органического вещества, т.е. на влажных сенокосах и полях с тяжелыми, периодически переувлажненными почвами. Вас.cereus является продуцентом термостабильного антибиотика широкого спектра действия цвиттермицина [17].
Бациллы первой группы (бациллярный тип спороношения) самые термофильные, их вегетативные формы способны сохранять жизнедеятельность при многочасовом воздействии температурой в 60-62°С. Их созревшие покоящиеся споры, имеющие многослойную оболочку, приобретают сверхвысокую термоустойчивость, что обусловлено накоплением в них ионов кальция, связанных с пиколиновой кислотой [18]. Они выдерживают сухой жар в 100°С в течение 3-х часов (или кипячение в течение 30 минут). На устойчивость спор к температуре заметное влияние оказывает кислотность среды. С понижением рН устойчивость спор обычно снижается [18]. Бактерии второй группы B.maserans и B.polymyxa также используют для придания селективности субстратам при культивировании вешенки [10]. Подобно бактериям первой группы они способны сбраживать углеводы; при росте в анаэробных условиях эти культуры обладают способностью фиксировать азот, что важно при подготовке качественного субстрата, однако они менее термостойки и поэтому способны расти и развиваться только при температурах ниже 58°С [6]. Кроме того, у них пока не обнаружены активные метаболиты, которые могли бы не только тормозить рост, но и радикально угнетать конкурентные микроскопические грибы, как это делают бациллы первой группы.
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. Отбирают качественные соломистые сельскохозяйственные отходы (солому, полову, труху), прошедшие комбайновый обмолот, сухие, золотистого цвета, не имеющие очагов прелости и сырости, замачивают их в горячей воде со слабой разводкой бациллярной термофильной культуры B.cereus, в эмалированных емкостях (чанах) с крышками и оставляют для последующего медленного остывания - упрощенная схема. Или залитые горячей водой емкости с разводкой В.cereus помещают в термостаты для 12-часового прогревания (пастеризации) при 60°С и последующего 1,5-2-суточного остывания до 30°С - классическая схема. Культуру В.cereus используют «чистую», выращенную на питательной среде КГА, молодого возраста (до 15 дней). Бациллы В. cereus вносят в подготавливаемый субстрат в умеренном количестве - из расчета одного пробирочного косячка на 50-75-литровую емкость или одного газона обычной чашки Петри на 1,5-2-тонную емкость. Это относится к обеим схемам.
Это позволяет иметь во влаге приготовленного субстрата, в момент его инокуляции вешенкой, содержание живых бацилл около 10 КОЕ/см (г).
Пример 1. Весной 2007 г. был заложен масштабный опыт (табл.3) для экспериментальной проверки предлагаемого способа использования «чистых» культур B.cereus для создания качественных избирательных субстратов по известным в стране и за рубежом [5] схемам аэробной ферментации (в тоннелях, которые ранее были разработаны под производство компостов для выращивания шампиньонов), но с переводом на анаэробный путь, т.е. предварительной ферментации путем 2,5-суточного замачивания субстрата в емкостях и использованием для проведения пастеризации и основной термоферментации термокомнаты (термостатов), что соответствует существующему технологическому уровню товарного производства вешенок в большинстве регионов страны. Было обнаружено (табл.3), что при использовании для замачивания и приготовления соломистого субстрата слабой водной разводки «молодых» (свежих) культур B.subtilis или B.cereus продуктивность культивируемого гриба существенно возрастает относительно контроля. Максимально высокая продуктивность вешенки в опыте на анаэробно ферментированной овсяной полове отмечена в вариантах с B.cereus. Было обнаружено (вариант 4), что нельзя использовать смесь этих важнейших бациллярных микроорганизмов для замачивания субстратов, поскольку в питательной среде они конкурируют и сдерживают развитие друг друга, а качество готового субстрата при этом снижается. Избирательность анаэробно ферментированных субстратов во всех вариантах опыта была высокой. Это позволяет проводить инокуляцию (особенно при использовании B.cereus) без опасения образования очагов конкурентов (т.е. вне «чистой» зоны) и снизить расход дорогого зернового посевного мицелия до 3-4%.
В литературе [9] отмечается, что бациллы при приготовлении субстрата иногда могут выделять антимикотики в количествах, сильно ограничивающих развитие конкурентных плесневых грибов, но иногда и мицелия вешенки. Это наблюдалось и авторами при обработке субстрата кипятком, когда из-за отсутствия свежевысеянных бациллярных культур использовали старые, длительно хранившиеся в холодильнике, уже подсохшие культуры, когда превысили норму и внесли на бак две пробирки B.cereus с огромным количеством накопившихся зрелых (покоящихся) спор, а в качестве субстрата, наоборот, применялась не чистая солома, а дробленые высушенные стержни селекционной кукурузы с низким исходным титром природной (в т.ч. термофильной) микрофлоры, поскольку уборка початков была ручная и проводилась в обвертках с превентивной их сушкой.
Пример 2. Для понимания механизмов замеченных явлений и проверки модифицированного ускоренного (упрощенного) способа анаэробной ферментации (с использованием культуры B.cereus) был проведен опыт, включающий два варианта. В каждом варианте для контроля имелся мешочек, незасеянный мицелием вешенки. На контрольном мешочке первого варианта вообще ничего не росло в течение 15 дней, что почти в 2 раза превышало период (8 дней) до начала накопления биомассы сорных микромицетов в контрольном мешочке второго варианта. На инокулированных двухкилограммовых мешочках в варианте первом наблюдалась задержка роста не только конкурентов, но и вешенки, что негативно сказалось на формировании первой волны грибов. Но и продуктивность второй волны была ниже, чем во втором варианте.
При заливке субстрата кипятком гибнут или получают сильный стресс вегетирующие формы широкого спектра вредных и полезных микроорганизмов, в т.ч. термотолерантных и термофильных бактерий, но при этом активируется прорастание и бурное развитие их покоящихся спор, наблюдается прогрессирующая чрезмерная продукция активных метаболитов, чему нет фактически никакого противодействия в первом варианте. Поэтому для повышения качества субстратов, получаемых по упрощенной схеме анаэробной ферментации, так же, как и при классических схемах, имеет значение тип и качество исходного сырья, его микробиологическое состояние и объем вносимой культуры B.cereus. Модернизированная схема - это замачивание субстрата со слабой разводкой B.cereus горячей водой в эмалированных емкостях (баках) с крышками, помещением их в термостаты для 12-часового прогревания (пастеризации) при 60°С и последующего 1,5-2-суточного остывания до температуры 30°С.
Предлагаемый способ убедительно доказывает, что при анаэробных способах ферментации субстратов (в термокамерах и чанах), когда наблюдаются изменения условий от аэробных к анаэробным, более эффективным для качественной подготовки соломы (на фоне ее исходной микрофлоры) является использование «молодой» культуры факультативно анаэробной B.cereus, в отличие от рекомендуемого ранее в литературе аэроба B.subtilis.
Использование модифицированного и адаптированного для условий, аналогичных характерным для зоны Приамурья, способа анаэробного повышения избирательности и качества питательных субстратов способствует стабилизации товарного производства вешенки обыкновенной, ведущегося по индустриальной нестерильной евротехнологии.
Литература
1. Чайка А.К., Анненков Б.Г., Азарова В.А. Научное обеспечение развития грибоводства в Дальневосточном Федеральной округе // Инновационное развитие как приоритет экономической политики в регионах Востока России. (Мат. Второго дальнев. межд. эконом. форума, Хабаровск, 18-19 сент. 2007 г., том 7). - Хабаровск: Правит. Хаб. края, ТОГУ, 2007. - С.214-222.
2. Анненков Б.Г., Азарова В.А. Хабаровский центр научного обеспечения дальневосточного грибоводства // Школа грибоводства, 2008, №1. - С.46-53.
3. Анненков Б.Г., Азарова В.А. Научные основы грибоводства и интенсивного культивирования вешенок в Приамурье // Научные основы повышения эффективности с.-х. производства на Дальнем Востоке России (Мат. IV Казьминских чтений, 29.11.2005). - Хабаровск: ДВНИИСХ РАСХН, 2006. - С.130-140.
4. Тишенков А.Д. Грибоводство в Китае // Школа грибоводства, 2006, №1, с.29-35), №2 (с.29-36), №3 (с.25-31).
5. Тишенков А.Д. Европа голосует за селективный субстрат вешенки // Школа грибоводства, 2007, №2. - С.23-25.
6. Капич А.Н., Мишин Л.Т. Аэробная ферментация субстрата для выращивания вешенки обыкновенной…с участием бактерий рода Bacillus // Микология и фитопатология, 1998, том 32, вып.5. - С.61-66.
7. Новикова И.И., Бойкова И.В., Шенин Ю.Д. Биологические особенности и компонентный состав активного комплекса штамма Streptomyces chrisomallus P-21 антагониста фитопатогенных грибов // Вестник защиты растений, 2006, №3. - С.13-21.
8. Jackson M., Karwowski J., Humphrey P. Calbistrins, novel antifangal agents produced by Penicillium restrictum // J.Antibiotics, 1993, 46, 1.-H. 34-38.
9. Тишенков А.Д. Повышение селективности субстрата для выращивания вешенки с помощью аэробной ферментации // Школа грибоводства, 2000, №5. - С.14-17.
10. Бисько Н.А., Билай В.Т. Термофильные бактерии и элективность субстрата для выращивания съедобных грибов рода Вешенка // Школа грибоводства, 2006, №5. - С.49-53.
11. Матершев В.Г. Сколько стоит … селективность ? // Школа грибоводства, 2007, №1. - С.25-26.
12. Тен Хак Мун. Микробиологический метод агротехники.- Хабаровск: Крайгосстат, 2004. - 97 с.
13. Прудникова С.В., Гусян Ц.М., Сарматова Н.И. Микробиология: руководство для работ по малому практикуму. - Красноярск: Краснояр. гос. ун-т, 2004. - 105 с.
14. Черников В.А., Грингоф И.Г., Емцев В.Т. и др. Агроэкология: методология, технология, экономика. - М.: Колос, 2004. - 400 с. (С.49).
15. Kubo K. Fungal inhibiting composition coprising Bacillus subtilis FERM ВР-3418 (Патент США №5667779, 1999).
16. Список пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации в 2006 году (Приложение к журналу «Защита и карантин растений», 2006, №6). - М., 2006.
17. Handelsman J., Halverson L., Stabb E. Method of identifying Bacillus cereus having biocontrol activity (Патент США №5543301, 1996).
18. Шапиро Я.С. Микроорганизмы: вирусы, бактерии, грибы. - СПб.: «ЭЛБИ-СПб, 2003. - 323 с. (С.104).