СПОСОБЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ГАНГЛИОЗИДОВ
METHODS OF EXTRACTING AND PURIFYING GANGLIOSIDES

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США 61/238775, поданной 1 сентября 2009 года, включенной в настоящую заявку посредством ссылки в полном объеме. Настоящая заявка является родственной заявке РСТ №_____, поданной 1 сентября 2010 года, на основании предварительных заявок на Патент США 61/238735, 61/238748 и 61/238726, каждая из которых включена в настоящую заявку посредством ссылки в полном объеме.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0002] В настоящей заявке описаны способы выделения и очистки ганглиозидов, например моносиалоганглиозида (GM1).
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] Болезнь Паркинсона (БП) представляет собой медленно, но неуклонно прогрессирующее нейродегенеративное расстройство, приводящее к ухудшению с течением времени клинических симптомов. Клинические симптомы включают тремор, брадикинезию (замедление движения), ригидность мышц, нарушение осанки и равновесия, потерю автоматических движений и изменения речи. Несмотря на значительную изменчивость клинических симптомов у пациентов существующий арсенал препаратов против БП эффективно, хотя и временно, улучшает большинство основных признаков и симптомов болезни Паркинсона у большинства пациентов. Несмотря на временное облегчение симптомов благодаря традиционной лекарственной терапии, утрата функциональных способностей со временем усугубляется.
[0004] Появление терапии с использованием леводопы было связано с продлением выживаемости у пациентов с БП, хотя такая терапия не замедляет прогрессирование симптомов. Леводопа, метаболический предшественник дофамина (L-3,4-дигидроксифенилаланин), в настоящее время является единственным наиболее эффективным средством для лечения БП. Ингибиторы, вводимые совместно с леводопой для предотвращения катаболизации леводопы при пероральном введении, или ингибиторы катехол-O-метилтрансферазы (КОМТ), такие как толкапм (tolcapme) и энтакапон, таким образом, увеличивают период полужизни леводопы в плазме и процент леводопы, достигающей ЦНС. Остающаяся нерешенной проблема, связанная с терапией с использованием леводопы, заключается в том, что после длительного периода эффективности при лечении пациентов периоды эффективного ослабления симптомов с каждой дозой становятся все короче. Кроме того, с течением времени развивается дискинезия. Такие эффекты продолжительного применения леводопы являются результатом прогрессирующей дегенерации дофаминовой системы.
[0005] На сегодняшний день не выявлены лекарственные средства, которые бы окончательно замедляли или останавливали прогрессирование БП или существенно препятствовали неизбежному функциональному расстройству у пациентов, страдающих БП.
[0006] Существует острая потребность в лекарственных средствах, которые могли бы изменять клиническое течение, устранить двигательные или когнитивные нарушения, восстановить или улучшить функции оставшихся частей дофаминовой («ДА») системы или активировать компенсаторные механизмы. Ни для одного из агентов, изученных к настоящему времени, однако, не были получены убедительные доказательства его нейрозащитных свойств или влияния на ход болезни, и ни для одного из исследованных агентов не были доказаны его нейровосстанавливающие свойства.
[0007] Доклинические исследования in vitro и in vivo показали, что GM1 способен восстанавливать поврежденные ДА-нейроны, стимулировать выживаемость и восстановление дофаминэргических нейронов и прорастание функциональных дофаминэргических окончаний, повышать уровни ДА в полосатом теле и повышающе регулировать способность оставшихся нейронов синтезировать ДА. См., например, "GM1 Ganglioside in the Treatment of Parkinson's Disease," Schneider, Ann. N.Y.Acad. Sciences 845, 363-73 (Feb. 2006). Предварительные клинические исследования GM1 у пациентов с БП также показали клиническое улучшение у пациентов при краткосрочном применении GM1 и незначительное прогрессирование симптомов в подгруппе пациентов, в течение пяти лет применявших GM1, и последующее значительное прогрессирование симптомов после прекращения долгосрочного приема GM1.
[0008] Таким образом, потенциально плодотворный подход к лечению БП включает введение агентов, таких как GM1, которые могут стабилизировать поврежденные или умирающие ДА-нейроны, стимулировать прорастание новых дофаминергических волокон и окончаний, или усиливать действие оставшихся дофаминергических нейронов или стимулировать или поддерживать компенсаторные процессы.
[0009] GM1, являющийся моносиалоганглиозидом, представляет собой обычный компонент мембран нервных клеток и, как известно, модулирует ряд активностей поверхностей клеток и рецепторов, а также играет важную роль в нейрональной дифференцировке и развитии, фосфорилировании белков и в синаптической функции. В многочисленных доклинических исследованиях в результате длительной терапии с помощью GM1, направленной на различные типы поражений центральной нервной системы, происходило восстановление биохимических и поведенческих функций, и такое действие было особенно впечатляющим в поврежденной ДА системе.
[0010] До сих пор единственную применяемую в клинической практике форму GM1 получали из мозга быка. Ограниченное количество GM1, которое возможно получить из мозга, и расходы, связанные с технологией выделения GM1 из мозга, ограничивали разработку коммерческого продукта GM1. Кроме того, применение бычьего мозга в качестве источника GM1 вызывает обоснованные опасения относительно прионных заболеваний, таких как губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота («коровье бешенство»).
[0011] Существует постоянная и неудовлетворенная потребность в создании новых и более совершенных способов выделения и очистки GM1, в частности способов с применением источников не бычьего происхождения.
КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0012] В настоящем изобретении предложены новые способы выделения и очистки ганглиозидов, например моносиалоганглиозида GM1, из источников не бычьего происхождения.
[0013] В настоящей заявке предложен способ выделения ганглиозида GM1 путем получения тканей не бычьего и не свиного происхождения, содержащих клетки, продуцирующие GM1, включающий выделение из тканей клетки, продуцирующей ганглиозид GM1; экспансию клетки, продуцирующей GM1, в культуре при подходящих условиях, способствующих экспансии указанных клеток; экспрессию ганглиозида GM1 в культуре при подходящих условиях; выделение ганглиозида GM1 из культуры. Клетки, продуцирующие GM1, могут представлять собой нервные клетки. В другом аспекте клетки могут представлять собой клетки фибробластов. Упоминаемые в настоящей заявке клетки, продуцирующие GM1, представляют собой клетки, экспрессирующие GM1 либо на базальном уровне, либо на повышенном уровне, по сравнению с нормальными клетками.
[0014] В другом варианте реализации способ может включать выделение GM1 из нервных клеток, полученных из клеток фибробластов не от быка и не от свиньи, которые взяты у субъектов, страдающих GM1-ганглиозидозом I типа. Таким образом, GM1 не содержит примесей, способных вызвать губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота (bovine spongiform encephalopathy, BSE).
[0015] В другом варианте реализации предложена композиция ганглиозида GM1, при этом композицию ганглиозида GM1 получают способом, описанным в настоящей заявке, включающим получение тканей, содержащих клетки, продуцирующие GM1, полученных не от быка и не от свиньи, выделение из указанных тканей клеток, продуцирующих ганглиозид GM1, экспансию указанных клеток, продуцирующих GM1, в культуре при подходящих условиях, способствующих экспансии указанных клеток, экспрессию ганглиозида GM1 в культуре при подходящих условиях; выделение указанного ганглиозида GM1 из указанной культуры. Таким образом, GM1 по существу не содержит или не содержит примесей, способных вызвать губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота (BSE).
[0016] Дополнительные признаки будут понятны после прочтения нижеследующего подробного описания изобретения и Примеров.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
2
[0017] На Фигуре 1 представлена таблица, в которой приведены данные по экспансии клеток гиппокампа овцы в культуре с низким содержанием О в среде 1 типа, как описано в настоящей заявке.
[0018] На Фигуре 2 представлен линейный график кумулятивного удвоения популяции нервных клеток-предшественников гиппокампа.
2
[0019] На Фигуре 3 представлена таблица, в которой приведены данные по общему удвоению и выходу клеток гиппокампа в культуре с низким содержанием O в среде 1 типа, как описано в настоящей заявке.
2
[0020] На Фигуре 4 представлена таблица, в которой приведены данные по экспансии клеток фибробластов овцы в культуре с низким содержанием O в среде 1 типа, как описано в настоящей заявке.
[0021] На Фигуре 5 показан линейный график кумулятивного удвоения популяции клеток фибробластов овцы.
[0022] На Фигуре 6 представлена гистограмма, иллюстрирующая сравнение экспансии ткани легкого и эпидуральной соединительной ткани.
[0023] На Фигуре 7 представлена таблица, в которой приведено сравнение экспансии клеток фибробластов из ткани легкого и соединительной ткани.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0024] В настоящей заявке описаны новые способы очистки и выделения ганглиозида GM1 из клеток, полученных от овец, пораженных ганглиозидозом GM1, или клеток, полученных от людей, страдающих ганглиозидозом GM1, в качестве стабильных и возобновляемых источников GM1.
[0025] В настоящей заявке предложен способ выделения ганглиозида GM1 путем получения тканей не бычьего и не свиного происхождения, содержащих клетки, продуцирующие GM1, который включает выделение из тканей клеток, продуцирующих ганглиозид GM1; экспансию клеток, продуцирующих GM1, в культуре при подходящих условиях, способствующих экспансии указанных клеток; экспрессию ганглиозида GM1 в культуре при подходящих условиях; выделение ганглиозида GM1 из культуры. Клетки, продуцирующие GM1, могут представлять собой нервные клетки. В другом аспекте указанные клетки могут представлять собой клетки фибробластов. Упоминаемые в настоящей заявке клетки, продуцирующие GM1, представляют собой клетки, которые продуцируют GM1 в избытке либо на базовом уровне, либо на повышенном уровне, по сравнению с нормальными клетками. В частности, такие клетки могут быть получены от овец и/или людей, страдающих ганглиозидозом.
[0026] Ткани, из которых выделяют и получают клетки, включают полуовальный центр, кору мозжечка, гиппокамп, головку хвостатого ядра, лобную долю, теменную кору или стенки желудочков, субгранулярную зону или выстилку желудочков мозга. Способ по настоящему изобретению включает экспансию и культивирование любой комбинации клеток, полученных из указанных областей. Клетки, продуцирующие GM1, представляют собой клетки-фибробласты, полученные из эпидермальных тканей или ткани легкого, при этом клетки, продуцирующие GM1, включает клетки тканей ядра головного мозга или клетки-предшественники.
[0027] Другой аспект, описанный в настоящей заявке, включает способ получения тканей не бычьего и не свиного происхождения путем вырезания частей тканей;
помещения указанных тканей в транспортную среду, при этом такая среда может представлять собой модифицированную по способу Дульбекко среду Игла (DMEM) с высоким содержанием глюкозы, содержащую 4 мМ L-глутамин, 5-10%, 10-20% или 20-30% эмбриональной бычьей сыворотки, раствор неосновных аминокислот IX для среды MEM, пенициллин 100 ед./мл, стрептомицин, амфомицин и гентамицин; и хранение тканей на холоде при температуре, достаточной для поддержания экспансии указанных клеток.
[0028] В одном из вариантов реализации изобретения нервные клетки получают из ткани головного мозга, характеризующейся сверхэкспрессией ганглиозида GM1, или получают из мозга, пораженного ганглиозидозом GM1. Нервные клетки могут характеризоваться недостатком β-галактозидазы, что приводит к сверхэкспрессии GM1, по сравнению с нормальными клетками. Нервные клетки, применяемые в указанном способе, могут иметь частичную активность а-нейраминидазы.
[0029] В другом варианте реализации способ может включать выделение GM1 из клеток фибробластов не бычьего и не свиного происхождения, полученных от людей, страдающих ганглиозидозом GM1 I типа. Таким образом, GM1 не содержит примесей, способных вызвать губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота (BSE). Термин примеси, способные вызвать губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота (BSE), использованный в настоящей заявке, обозначает любую белковую биомолекулу, белок прион (PrP) или биомолекулу, которую можно обнаружить с помощью антител к белкам PrP. Как правило, коммерчески доступные источники GM1 получают от крупного рогатого скота, и они могут быть подвержены действию облучения для удаления возможных примесей, однако риск при терапевтическом применении такого источника сохраняется. Пример таких источников GM1 включает Sigma Aldrich.
[0030] В другом варианте реализации предложена композиция ганглиозида GM1, при этом указанную композицию ганглиозида GM1 получают способом, описанным в настоящей заявке, включающим получение тканей, не бычьего и не свиного происхождения, содержащих клетки, продуцирующие GM1, выделение из указанных тканей клеток, продуцирующих ганглиозид GM1, экспансию указанных клеток, продуцирующих GM1, в культуре при подходящих условиях, способствующих экспансии указанных клеток, экспрессию ганглиозида GM1 в культуре при подходящих условиях; выделение указанного ганглиозида GM1 из указанной культуры. Таким образом, ганглиозид GM1 не содержит примесей, способных вызвать губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота (BSE).
[0031] Настоящее изобретение предполагает применение клеток, полученных от овец, страдающих ганглиозидозом GM1, или клеток, полученных от людей, страдающих ганглиозидозом GM1, для получения коммерчески подходящего количества ганглиозида GM1 для применения для лечения болезни Паркинсона и других неврологических нарушений. Ганглиозиды можно вводить в отдельности или вместе со стандартными средствами медицинской помощи для пациентов, страдающих БП, или пациентов с другими типами нейродегенеративных заболеваний, включающих, но не ограничивающихся перечисленным, болезнь Гентингтона и т.п.
[0032] GM1 в отдельности или в комбинации с другими ганглиозидами можно вводить путем подкожной или внутривенной инъекции или с помощью назального или мукозального введения наряду с прочим. Также могут быть предусмотрены лекарственные формы пролонгированного действия, и ганглиозиды можно вводить с помощью составов с контролируемым высвобождением (липосомы, наночастицы, микросферы) для продления действия лекарственного средства. Они также могут быть конъюгированы с соответствующими транспортирующими молекулами для преодоления гематоэнцефалического барьера.
[0033] Овцы, страдающие ганглиозидозом GM1, а также процесс экстракции GM1 и других ганглиозидов из мозга таких животных описаны в патенте США №5532141, который включен в настоящую заявку посредством ссылки в полном объеме. Заболевание таких животных характеризуется дефицитом β-галактозидазной активности и частичной активностью а-нейраминидазы, в результате чего у животных в ткани головного мозга накапливается большое количество ганглиозида GM1 (до 40 раз больше, по сравнению со здоровыми животными). С учетом оптимизированного способа выделения, по оценкам, из мозга одной овцы, страдающей ганглиозидозом, можно получить 1-2 грамма GM1. Кроме того, по оценкам из 1 кг мозга пораженных ганглиозидозом животных можно получить примерно 15 г GM1. Для сравнения, из 1 кг мозга свиньи, по оценкам, можно получить 250 мг GM1. Однако даже при таком повышенном уровне экспрессии в год понадобится несколько сотен тысяч овец для получения GM1 в коммерческих количествах.
[0034] С применением клеточных технологий GM1 можно получить из нескольких потенциальных источников, полученных от овец с ганглиозидозом GM1. Например, можно осуществить выращивание и экспансию предшественников нервных клеток, довести их до нейронального фенотипа, оптимизировать их рост и развитие (и, возможно, даже продукцию GM1 с помощью различных манипуляций, включающих, но не ограничивающихся перечисленными, ингибирование продукции ганглиозидов В-серии (например, путем ингибирования GD3-синтазы) и остановку пути биосинтеза ганглиозидов А-серии на GM1, в результате чего экспрессия ганглиозидов будет сдвинута преимущественно в сторону GM1), а затем можно выделить GM1 из культивируемых нервных клеток, в дополнение к GM1, выделенному клетками в культуральную среду. Дополнительные варианты могут быть направлены на усиление выделения ганглиозидов клетками и дальнейшую оптимизацию отбора ганглиозидов из культивируемых клеток. В качестве альтернативы или в сочетании с общей схемой, описанной выше, в культуре можно выращивать фибробласты или гепатоциты и применять их в качестве источников GM1.
[0035] Клетки, применяемые в настоящем способе, могут быть получены из тканей головного мозга, включающих, но не ограничивающихся указанными, полуовальный центр, кору мозжечка, гиппокамп, хвостатое ядро, кору головного мозга, стенки желудочков или их комбинации.
[0036] Другим потенциальным источником GM1 являются фибробласты (или гепатоциты) пациентов, страдающих ганглиозидозом GM1 I типа (детским). У пациентов, страдающих ганглиозидозом GM1 I типа, как правило, количество β-галактозидазы в клетках составляет менее 1% от нормы, и, следовательно, их клетки продуцируют на высоком уровне ганглиозид GM1. Нормальные человеческие фибробласты могут содержать примерно 0,7 нмоль GM1 на мг белка. Фибробласты страдающих ганглиозидозом GM1 могут содержать до 2,58 нмоль GM1 на мг белка. Количество GM1, полученное из культивируемых фибробластов человека, страдающего ганглиозидозом GM1, может быть оптимизировано с помощью оптимальных параметров для роста клеток, условий культивирования и питательных веществ, а также определения оптимального времени для сбора клеток для экстракции GM1. Кроме того, можно осуществить скрининг многочисленных образцов от доноров-пациентов, страдающих ганглиозидозом GM1 I типа, для поиска клеточных линий с оптимальным накоплением GM1 в связи с недостатком β-галактозидазы в различной степени, которая будет отличаться от пациента к пациенту. Кроме того, можно также применять гепатоциты указанного пациента в качестве альтернативного или дополнительного клеточного источника клеток GM1.
[0037] После получения клеток от страдающих ганглиозидозом овец существует несколько возможных путей для дальнейшего увеличения выхода GM1 из таких клеток. Один из способов заключается в обработке клеток низкой концентрацией хлорохина, слабого основания, что приводит к заметному накоплению GM1 в эндосомах и на поверхности клеток (Yuyama et al., 2006). Другим способом является обработка клеток сиалидазой (нейраминидазой), которая преобразует все основные сложные ганглиозиды мозга (например, GDla, GDlb и GTlb) в GM1 в интактных клетках (Schauer, et al., 1980). Другой способ заключается в применении неферментативного способа с применением Dowex-50W-H + для катализа высокоселективной избирательной десиализации полисиалированных ганглиозидов ряда ганглио-N-тетраозы с преимущественным образованием GM1 (Schengrund and Kovac, 1999). С помощью таких способов можно увеличить количество GM1, получаемого из клеток и мембран, а также увеличить количество GM1, выделяемого в среду и восстановленного из среды.
[0038] Дополнительные возможные средства для продуцирования ганглиозида GM1 с помощью клеточных технологий могут включать программирование свойств клеток с помощью мультиплексных генно-инженерных подходов и ускоренной эволюции для стимулирования выработки ганглиозида GM1 у Е.coli. С использованием мультиплексного автоматизированного инжиниринга генома (multiplex automated genome engineering «MAGE») можно спроектировать путь биосинтеза GM1 в E.coli для сверхпродуцирования ганглиозида GM1. Например, можно одновременно вносить изменения в различные участки генома для модификации биосинтеза GM1, при этом экспрессия некоторых соответствующих генов будет отрегулирована оптимальным образом, а экспрессия некоторых других генов будет подавлена или исключена с целью оптимизации продуцирования GM1 и подавления продуцирования других ганглиозидов. Е.coli может быть модифицирована с помощью способов, известных специалистам в данной области техники, при этом гены, ответственные за синтез ганглиозида, встроены в геном E.coli с помощью стандартных способов, известных в данной области техники. К примеру, стандартные способы включают выделение плазмидной ДНК, модифицированной таким образом, что она обуславливает экспрессию GM1-синтазы, для продуцирования GM1 в культуре. Другие гены, продуцирующие ганглиозиды, включают GD3-синтазу.
[0039] Клетки Е.coli можно выращивать при определенных условиях, при которых вещества-предшественники доступны в среде при необходимости, такие как синтетический лактозилцерамид (LacCer, растительный источник) и сиаловая кислота (доступна из источников неживотного происхождения или может иметь синтетическую природу). Ферментативная активность (например, сиалилтрансфераза, N-ацетил-галактозаминилтрансфераза, галактозилтрансфераза) также может регулироваться с помощью способа MAGE, при этом могут быть предусмотрены активаторы (гуанозинтрифосфат для активации трансферазы фермента), а также N-ацетилгалактозамин и галактозы (сахара, которые преобразуются в их соответствующие нуклеотидные производные, служащие в качестве доноров сахара).
[0040] В настоящее время GM1 выделяют из мозга быка или свиньи, что представляет собой низкопродуктивный и дорогостоящий способ. Настоящее изобретение позволяет обеспечить безопасное и эффективное продуцирование ганглиозида GM1 в клеточной системе. Изобретение также предусматривает первый коммерческий источник ганглиозида GM1 человека. Другие виды ганглиозидов, помимо GM1, также можно получать с помощью данной технологии, и GM1 и другие ганглиозиды можно применять для лечения широкого спектра неврологических нарушений, таких как болезнь Паркинсона.
[0041] Описан типичный способ выделения, отделения и очистки ганглиозидов мозга, который включает: исчерпывающее экстрагирование тканей мозга с помощью буфера с тетрагидрофураном или другими растворителями, которые известны в данной области техники; разделение экстракта сначала с помощью этилового эфира, а затем с дистиллированной водой, диализ полученной водной фазы, и хроматографии диализованного раствора на колонке с силикагелем. Остаток после исчерпывающего экстрагирования содержит все гликопротеины мозга. Последующие процедуры включают экстракцию хлороформом.
ПРИМЕРЫ
[0042] Пример 1
[0043] Получали ткани мозга овцы, включающие следующие источники тканей: полуовальный центр, кору мозжечка, гиппокамп, хвостатое ядро, кору головного мозга, (например, лобную, теменную) и стенки желудочков.
2
2
[0044] Каждую ткань обрабатывали в отдельности следующим способом: промывали каждый тип ткани буферным раствором PIPES; каждую ткань расщепляли с помощью смеси ферментов папаин/ДНКаза I/диспаза (нейтральная протеаза) с использованием антибиотиков/антимикотиков, нейтрализовали ферменты и пропускали диссоциированные клетки через клеточный фильтр; клетки центрифугировали и ресуспендировали в среде DMEM/F12/N2, содержащей 5% ФБС с антибиотиками/антимикотиками; клетки подсчитывали, после чего их высевали в колбы, покрытые фибронектином: а. на среду 1 типа: DMEM/F12/N2, содержащую 5% ФБС, содержащую антибиотики/антимикотики, с добавленим 10 нг/мл bFGF (основного фактора роста фибробластов) и 20 нг/мл EGF (эпидермального фактора роста). Среда Neurocult Proliferation-A; клетки на среде каждого типа выращивали при 37°С в камере с повышенной влажностью при низком содержании O и при высоком содержании О для сравнения.
Экспансия клеток, полученных из тканей мозга овцы. Сводная таблица
Культуры при низком содержании О<sub>2</sub> - среда 1 типа
Общее число удвоений / Последний пассаж (Р)№
полуовальный центр
16.1/Р.2
2
копа головного мозга
13.8/Р.2
2
гиппокамп
21.1/Р.3
3
головка хвостатого ядра
8.9/Р.1
лобная - теменная копа
2.1 /P.1
стенка желудочка
6.8/P.l
Культуры при высоком содержании O<sub>2</sub> - среда 1 типа
Общее число удвоений/ Последний пассаж (Р)№
полуовальный центр
Р.0
копа головного мозга
Р.0
гиппокамп
Р.0
головка хвостатого ядра
Р.0
лобная - теменная кора
Р.0
стенка желудочка
Р.0
ТАБЛИЦА 1
[0045] В Таблице 1, представленной выше, описана пролиферация и экспансия клеток при различных условиях роста. Следует отметить, что культуры, выращенные в среде Neurocult Proliferation-A, характеризовались не очень хорошим ростом, таким образом, небольшое количество клеток, собранных при пассаже Р.О, замораживали, и прекращали их культивирование.
[0046] Пример 2
2
[0047] Ткани овечьего происхождения для выделения фибробластов, включали следующие источники: легкие (левое и правое легкие вместе) и эпидуральную соединительную ткань. Каждую из тканей обрабатывали в отдельности следующим способом: промывали каждый тип ткани буферным раствором PIPES; каждую ткань расщепляли с помощью коллагеназы/гиалуронидазы в среде DMEM с антибиотиками/антимикотиками, нейтрализовали ферменты в среде DMEM, содержащей 10% ФБС, и пропускали диссоциированные клетки через клеточный фильтр; клетки центрифугировали и ресуспендировали в FGM-2, содержащем антибиотики/антимикотики. Клетки подсчитывали и затем высевали в колбы, а оставшиеся ткани - на чашки со средой FGM-2. Клетки выращивали при 37°С во влажной камере только при низком содержании O.
Сводная таблица экспансии овечьих фибробластов
Общее число удвоений / Число пассажей (Р)#
Легкие
20/Р.2
Эпидуральная соединительная ткань
7,2/P.1
Таблица 1.0
[0048] Пример 3
[0049] Ферментативное расщепление. Образцы получали в различных центрифужных пробирках, пронумерованных 1-10, вынимали из коробки для транспортировки, протирали и помещали в штатив для пробирок 50 мл. Делали снимок каждой пробирки. Каждую пробирку опрыскивали этанолом, протирали еще раз и затем переносили в бокс с биозащитой для асептической обработки. Транспортную среду из каждой пробирки тщательно аспирировали с помощью чистой пипетки на 10 мл и сбрасывали в контейнер для отходов. В каждую пробирку наливали с избытком раствор PIPES (40 мл), крышки заменяли и пробирки аккуратно переворачивали горлом вниз и обратно несколько раз, чтобы смыть остатки транспортной среды в тканях. Затем среду отбирали с помощью пипетки на 10 мл и сбрасывали в контейнер для отходов.
[0050] В пробирки, содержащие ткани мозга, добавляли по двадцать миллилитров среды для ферментативного расщепления тканей мозга и каждую пробирку помечали номером от 1 до 6. Такая введенная нумерация в дальнейшем позволяла соотнести каждый номер с конкретной тканью мозга. Двадцать мл раствора коллагеназы/гиалуронидазы (IX) добавляли в каждую пробирку, содержащую ткани органов. С помощью стерильных пипеток на 25 мл и 50 мл, стерильных щипцов и скальпеля ткани из каждой пробирки переносили в стерильную чашку диаметром 10 см, погружали в среду для ферментативного расщепления и измельчали на небольшие кусочки. Содержимое каждой чашки (кусочки ткани и среду для ферментативного расщепления) отбирали пипеткой на 25 мл или 50 мл и возвращали в соответствующие пробирки, закрывали их крышкой и все помещали в инкубатор при 37°С на 45 минут. Через 45 минут пробирки с сохранением стерильности переносили обратно в ламинарный бокс и содержимое каждой из пробирок измельчали с помощью стерильных пипеток на 25 мл и 10 мл соответственно. Крышки заменяли и пробирки помещали обратно в штатив и помещали в инкубатор при 37° на 15 минут. После инкубации пробирки с сохранением стерильности переносили в бокс. В каждую из 10 пробирок добавляли двадцать пять миллилитров среды для нейтрализации, пробирки закрывали крышками и каждую из них переворачивали несколько раз для перемешивания. Пробирки центрифугировали в течение 10 минут при 200 g для осаждения клеток оставшихся кусочков ткани. Пробирки переносили с сохранением стерильности в бокс, аккуратно отбирали супернатант из каждой пробирки, удостоверившись, что не происходило засасывание любых кусочков тканей или клеток. К пробиркам, содержащим участки головного мозга 1-6, добавляли 40 мл среды 1 типа, ресуспендировали в ней клетки и оставшиеся куски тканей. Содержащиеся в пробирках ткани легких, эпидуральную соединительную ткань и костную соединительную ткань ресуспендировали в 40 мл среды для роста фибробластов FGM-2. Каждую из 10 пробирок с ресуспендированными клетками и тканями пропускали через клеточный фильтр 40 мкм в новые маркированные пробирки 50 мл. Для каждой пробирки определяли число и жизнеспособность клеток.
2
2
2
2
[0051] Условия культивирования при низком содержании O. Клетки из шести различных областей мозга высевали при плотности 100000/см в шесть покрытых фибронектином колб Т80 в 15 мл среды 1 типа или 15 мл среды 2 типа (среда Neurocult Proliferation-A) и инкубировали во влажной камере 37°С при пониженном давлении кислорода (4% О, 5% CO, сбалансированным азотом). Каждые два дня 50% питательной среды заменяли свежей средой. Культура была неоднородной. Колониеобразующие клетки вначале составляли меньшинство, но через несколько дней клетки стали формировать колонии и расти. Культуры пассажа 0 собирали на 9 день. Количество клеток на выходе см. в Таблице 1.0.
2
2
[0052] Клетки пассажа 1 высевали при плотности 100 клеток/см в две колбы Т225 см, покрытые фибронектином в 36 мл среды 1 типа и среды 2 типа для каждой из шести областей. Культуру подпитывали 100% свежей средой на 5-й день. В ходе этого пассажа культура была все еще неоднородной, но значительно более выровненной, и в ней было представлено больше колониеобразующих клеток, и клетки росли быстрее, чем в ходе предыдущего пассажа. На 6 день делали снимки культуры при 4х, 100х, 200х увеличении. Культуры собирали на 6 день.
2
2
[0053] Клетки 2 пассажа высевали при плотности 100 клеток/см в две колбы Т225 см, покрытые фибронектином, в 36 мл среды 1 типа и среды 2 типа для каждой из шести областей. Культуру подпитывали 100% свежей средой на 5-й день. Однородность культур составляла более 90%. Культуры собирали на 6 день. Все культуры, поддерживаемые в среде 2 типа, останавливались в росте и переставали делиться. Культуры, поддерживаемые в среде 1 типа (т.е., гиппокампальные клетки-предшественники) в дальнейшем субкультивировали до шестого пассажа (см. ниже).
2
2
[0054] Клетки 3 пассажа высевали при плотности 100 клеток/см в две колбы Т225 см, покрытые фибронектином в 36 мл среды 1 типа. Культуру подпитывали 100% свежей средой на 5-й день. В этом пассаже культура оказалась однородной. На 6 день делали снимки культуры при 4х, 100х, 200х увеличении. Культуры собирали на 6 день.
2
2
[0055] Клетки 4 пассажа высевали при плотности 100 клеток/см в две колбы Т225 см, покрытые фибронектином в 36 мл среды 1 типа. Культуру подпитывали 100% свежей средой FGM-2 на 5-й день. На 6 день делали снимики культуры при 4х, 100х, 200х увеличении. Культуры собирали на 6 день.
2
2
[0056] Фибробласты. После ферментативного переваривания клетки легких овцы рассевали при плотности 100000/см, и клетки эпидуральной соединительной ткани рассевали при плотности 50000 /см в среду FGM-2. Культуру подпитывали 50% свежей средой FGM-2 каждые 2 дня и пассаж 0 собирали на 5-й день. Обе культуры пересевали при низкой плотности, а остатки замораживали и консервировали.
2
2
[0057] Фибробласты эпидуральной ткани и легких 1 пассажа рассевали при плотности 100/см в среду FGM-2 в колбы Т225 см. Культуру подпитывали 100% свежей средой FGM-2 на 5-й день и собирали на 7 день. Культуры клеток легких пересевали, а остатки замораживали и консервировали. Эпидуральные фибробласты замораживали и консервировали.
2
2
[0058] Фибробласты легких 2 пассажа рассевали при плотности 100/см в колбы Т225 см со средой FGM-2. Культуру подпитывали 100% свежей средой FGM-2 на 4-й день, поскольку она была плотной, затем собирали на 5-й день. Культуры пересевали, а остатки замораживали и консервировали.
2
2
[0059] Фибробласты легких 3 пассажа рассевали при плотности 100/см в колбы Т225 см co средой FGM-2. Культуру подпитывали 100% свежей средой FGM-2 на 5-й день, и собирали культуры на 6 день. Культуры пересевали, а остатки замораживали и консервировали.
2
2
2
2
2
2
[0060] Условия с высоким содержанием О (стандартный способ). Клетки из каждой из шести областей рассевали в четыре Т25 см и одну Т80 см колбы (все были покрыты фибронектином) при плотности 100000/см в 5 мл и 13 мл соответственно, среды 1 типа и среды 2 типа, и инкубировали во влажной камере при 37°С при 18% O и 5% CO (стандартные условия). Культуру подпитывали соответствующей средой на 5-й день, затем собирали культуры через 24 часа на 6 день. На 6 день делали снимки культуры при 4х, 100х, 200х увеличении на перед их отбором. Клетки из всех областей подсчитывали, затем замораживали и консервировали.
[0061] Транспортная среда. Среда, применяемая для хранения тканей после вскрытия и во время транспортировки. Компоненты: DMEM с высоким содержанием глюкозы (Invitrogen), 4 мм L-глютамин (Hyclone), 20% эмбриональной бычьей сыворотки (Hyclone); раствор неосновных кислот MEM, IX (Invitrogen, каталожный №11140, 100Х р-р, лот №672555); пенициллин (100 ед./мл), стрептомицин (мкг/мл), Ampho (/мл) (Stem Cell Technologies, Inc, каталожный №, 100Х раствор, лот №); гентамицин (50 мкг/мл).
[0062] Среда для ферментативного расщепления
[0063] Мозг: DMEM:F12 в отношении 1:1 с высоким содержанием глюкозы: 4 мм L-глютамин, диспаза (1 ед./мл) (Roche, каталожный №04942086001); ДНКаза (250 ед./мл) (Invitrogen, каталожный №18047-019), папаин (2,5 ед./мл) (Sigma, каталожный №76218), пенициллин (100 ед./мл), стрептомицин (мкг/мл), Ampho (/мл) (Stem Cell Technologies, Inc. каталожный №, 100Х раствор, лот №); гентамицин (50 мкг/мл).
[0064] Легкие, эпидуральная ткань и кости: среда DMEM с высоким содержанием глюкозы: 4 мм L-глютамин, коллагеназа (300 ед./мл)/гиалуронидаза (100 ед./мл) (Stem Cell Technologies); гиалуронидаза (Stem Cell Technologies), пенициллин (100 ед./мл), стрептомицин (мкг/мл), Ampho (/мл) (Stem Cell Technologies, Inc.), гентамицин (50 мкг/мл).
[0065] 4. Среда для культивирования тканей мозга:
[0066] а). Среда 1 типа. 1:1 DMEM:F12 с высоким содержанием глюкозы; 4 мм L-глютамин, жидкая добавка N2 Supplement (100Х) (Invitrogen), пенициллин (100 ед./мл), стрептомицин (мкг/мл), Ampho (/мл) (технологии стволовых клеток, Inc.), гентамицин (50 мкг/мл), 20 нг/мл рекомбинантного эпидермального фактора роста человека (rh EGF) (Stem Cell Technologies), 10 нг/мл рекомбинантного основного фактора роста фибробластов человека (rh bFGF) (Stem Cell Technologies).
[0067] b). Среда 2 типа: Среда для пролиферации Newocult NS-A Proliferation Media. Основная среда Newocult NS-A (человека), 450 мл (Stem Cell Technologies); добавки для среды Neurocult NS-A (человека), 50 мл (Stem Cell Technologies), пенициллин (100 ед./мл), стрептомицин (мкг/мл), Ampho (/мл) (Stem Cell Technologies, Inc), гентамицин (50 мкг/мл), 20 нг/мл рекомбинантного эпидермального фактора роста человека (rh EGF) (Stem Cell Technologies), 10 нг/мл рекомбинантного основного фактора роста фибробластов человека (rh bFGF) (Stem Cell Technologies).
[0068] Пример 4
[0069] В клинических испытаниях лечения пациентов с болезнью Паркинсона с помощью GM1 все функциональные оценки (на начальном уровне и при всех последующих посещениях) проводили утром перед первым приемом лекарственного средства для лечения болезни Паркинсона и через не менее чем 12 часов после приема предыдущей дозы препарата (этот период на практике обозначается как «off» - период) Все пациенты были исследованы в ходе трех отдельных осмотров (в пределах двух недель) на начальное проявление следующих функциональных характеристик: (1) оценка по Унифицированной шкале оценки симптомов болезни Паркинсона ("Unified Parkinson's Disease Rating Scale, UPDRS"), независимо главным и вторым экспертами (2) время выполнения: 20 пронации/супинации кисти, 20 касаний пятка-носок, 20 касаний большой-указательный палец, время, за которое большой палец касается остальных пальцев 10 раз, время, за которое пациент проходит 20 метров с максимальной скоростью, разворачивается и возвращается в исходную точку, простые оценки времени реакции (3) проверка сенсомоторной интеграции, в ходе которой пациенту необходимо выполнить конкретные движения, основанные только на соматосенсорной и проприоцептивной обратной связи. Исследование проводили в ходе регулярных посещений в течение четырех месяцев.
[0070] Определяли средний балл, характеризующий начальное состояние каждого пациента, и сравнивали с ним балльные оценки при лечении. Основным показателем эффективности было изменение двигательного компонента системы UPDRS, стандартного клинического инструмента оценки. У группы, получающей лечение с помощью GM1 (n=22), наблюдали значительное улучшение двигательных показателей по системе UPDRS (среднее улучшение 5,05 пунктов на четвертую неделю и 7,53 пункта на 16 неделю), тогда как средние показатели для группы, получающей плацебо, оставались в основном неизменными в течение 16 недельного лечения. Величина лечебного эффекта к четвертой неделе (-5,95±1,12), восьмой неделе (-5,61±1,39), 12-й неделе (-5,37±1,30) и 16-й неделе (-6,79±1,24) была статистически значимой (ANCOVA, p<0,0002). Вторичная оценка двигательной функции показала, что хотя обе группы делали схожее количество ошибок на начальном уровне в заданиях по сенсомоторной интеграции (GM1=5,3±2,3; Плацебо = 5,4±31), пациенты, получающие лечение с помощью GM1, допускали значительно меньше ошибок после 16 недель лечения (0,7±0,8 ошибки), по сравнению с пациентами, получавшими плацебо (5,1±3,1 ошибки, р=0,0001). Группа пациентов, получавших GM1, также значительно быстрее выполняла задания на двигательную активность на время (например, пронация/супинация (р=0,0001), касание пятка/носок (р=0,0008), касание пальцев (р=0,0001), последовательное касание пальцев (р=0,0001), и ходьбу (р=0,02) на 16 неделе, по сравнению с исходными показателями, по сравнению с пациентами, получавшими плацебо. В конце 5 лет открытого применения GM1 пациенты имели более низкие показатели двигательной активности согласно UPDRS и проявляли меньше затруднений в ходе «off» - периода в повседневной активности, в сравнении с предварительно рандомизированными показателями на начальном уровне.
[0071] После завершения исследования начального состояния пациентам внутривенно вводили либо 1000 мг ганглиозида GM1 или плацебо (то есть, растворитель без GM1) в растворе 50 мл стерильного раствора Рингера. Пациентов обучили самостоятельно осуществлять подкожную инъекцию и отправляли их на домашнее лечение с четырехнедельным запасом ганглиозида GM1 (100 мг GM1 в 2,0 мл растворителе на ампулу) или плацебо, поставляемых в одинаковых флаконах по 2,0 мл. Пациенты были проинструктированы вводить содержимое двух ампул в день: одну утром и одну вечером (общая суточная доза составляла 200 мг GM1). Сопутствующие лекарственные препараты оставались неизменными.
[0072] Хотя настоящее описание ссылается на конкретные примеры вариантов реализации, специалистам в данной области будет понятно, что могут быть внесены различные изменения, и соответствующие эквиваленты могут заменять элементы вариантов реализации изобретения, не выходя за пределы объема настоящего изобретения. Кроме того, многие модификации могут быть осуществлены для того, чтобы конкретная ситуация или вещество соответствовало сути изобретения, оставаясь в пределах сути настоящего изобретения. Кроме того, в чертежах и описании раскрыты примеры вариантов реализации, и, несмотря на использование специальных условий, они представлены исключительно в общем и описательным смысле, если не указано иное, а не с целью ограничения, и, таким образом, они не ограничивают объем притязаний настоящего изобретения. Кроме того, как очевидно специалисту в данной области, определенные этапы способов, рассмотренных в настоящей заявке, могут следовать в другом порядке или этапы могут быть объединены. Таким образом, предполагается, что прилагаемая формула изобретения не ограничена конкретными вариантами реализации, описанными в настоящей заявке.
[0073] Каждая из заявок и патентов, упоминаемых в настоящем описании, а также каждый документ или источник, упоминаемый в каждой из заявок и патентов (в том числе в ходе делопроизводства по каждому выданному патенту, "упоминаемые в заявке документы"), и каждая из заявок РСТ и зарубежных заявок или патентов соответствующих и/или испрашивающих приоритет по любой из таких указанных заявок и патентов, и каждый из документов, процитированный или упомянутый в каждом из процитированных в заявке документов, в явной форме включены в настоящую заявку посредством ссылок в полном объеме. В целом, документы или ссылки процитированы в настоящем описании либо в списке процитированных источников перед Формулой изобретения, либо в самом тексте; и каждый из таких документов и справочных материалов («процитированные в настоящей заявке источники»), а также каждый документ или упоминаемый источник в каждом из упоминаемых в настоящей заявке источников (в том числе любая техническая документация от производителя, инструкции и т.д.) включены в явной форме в настоящую заявку посредством ссылки.
Ссылки
1
Neeta S. Roy, et al. 2000. J Neurosci 59:321-31.
2
(Philip H. Schwartz, et al. 2003. J Neurosci; 74:838-51.