ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЙ СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ L-ТИРОКСИНА
VOLTAMMETRIC METHOD FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF L-THYROXINE

Изобретение относится к области аналитической химии, в частности к вольтамперометрическим способам количественного определения гормонов (тироксина), и может быть использовано в контроле качества лекарственных препаратов, содержащих L-тироксин.
L-тироксин - гормон щитовидной железы. Он образуется в щитовидной железе под контролем тиреотропного гормона. Регулирует практически все процессы обмена. По химической структуре представляет собой L-2-амино-3-[4-(3,5-дийод-4-гидрокси-фенокси)-3,5-дииодфенил] пропионовую кислоту.
На сегодняшний день в контроле качества лекарственного препарата L-тироксин (далее - тироксин) для количественной оценки его содержания используется высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) (фармакопейный метод).
При количественном определении тироксина данным методом его идентификация в исследуемой пробе осуществляется по времени удержания, которое исчисляется от момента введения исследуемой пробы в колонку до появления максимума пика (время удержания для тироксина предварительно определяется с помощью стандартной пробы тироксина), и УФ-спектру, который также предварительно определяется с помощью стандартной пробы тироксина.
3
4
Определение содержания тироксина производят с использованием следующих реактивов: 1. Метанол (метанол должен иметь степень чистоты, требуемую при использовании метода ВЭЖХ); 2. Фосфорная кислота НРO, 85% (ос.ч.); 3. Триэтиламин (высшего качества).
Готовят растворяющий буфер, экстракционный растворитель и элюент.
Выборку таблеток (10 штук) смешивают с экстракционным растворителем, встряхивают на шейкере, полученный раствор центрифугируют, 20 мл надосадочной жидкости инъецируют в хроматограф. С помощью элюента извлекают тироксин из хроматографической колонки.
Детекцию производят при 225 нм, калибровку осуществляют по внутреннему стандарту. Совпадение времени удержания в стандарте и в анализируемой пробе служит для идентификации пика, соответствующего тироксину. По соотношению площадей под кривыми и концентрации тироксина в стандартном растворе составляют пропорцию и определяют концентрацию тироксина в исследуемом растворе (Государственная Фармакопея РФ, ХI-е издание, ФС (ФС - фармакопейная статья) №42-912-90).
Определение тироксина данным способом занимает довольно много времени (не менее 2-х часов).
Известен иммунохимический способ определения тироксина (Т4) в сыворотке крови человека. В лунках стрипа, при добавлении исследуемого образца и конъюгата тироксин-пероксидазы, во время инкубации устанавливается равновесие между конъюгатом и свободным Т4 сыворотки крови в процессе связывания с антителами, иммобилизованными на внутренней поверхности лунок. При удалении содержимого из лунок происходит разделение свободного и связанного антителами конъюгата тироксин-пероксидазы, причем количество связанного антителами конъюгата обратно пропорционально количеству свободного Т4 в образце сыворотки крови.
Во время инкубации с тетраметилбензидином происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству связанного антителами конъюгата тироксин-пероксидазы. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочного графика рассчитывают концентрацию свободного тироксина в исследуемых образцах.
-12
Чувствительность метода - 1,0×10 моль/л
(http://www.alkorbio.ru/shop/nabori/iagnostika_funktsijj_shhitovidnojj_zhelezy/vobodnyjj_tiroksin_svobodnyjj_4_/).
Известны вольтамперометрические методы количественного определения тироксина. Их используют, как правило, после хроматографической очистки пробы и выделения из нее тироксина.
Известен вольтамперометрический способ количественного определения тироксина в моче (Hernlindez, P. Hernhdez and O.Nieto. Determination of Thyroxine in Urine by Cathodic Stripping Square-wave Voltammetry, Analyst, July 1994, Vol.119, pp.1579-1583). Он состоит в следующем. Из собранного суточного объема мочи отбирают аликвоту в 100 мл, отстаивают для осаждения белков при температуре 4°С, затем центрифугируют. Из супернатанта хроматографически на сорбенте С18 выделяют тироксин элюированием его из картриджа минимальным количеством водно-метанольной смеси. К выделенному раствору тироксина добавляют карбонатный буфер до рН 6,0, затем рН постепенно доводят до 10 гидроксидом натрия. Для вольтамперометрического измерения концентрации тироксина в качестве рабочего электрода используют ртутно-капающий электрод. Рабочим электродом и электродом сравнения служат платиновый и хлорид-серебряный электроды. Рабочий раствор добавляют в электрохимическую ячейку, и в течение 30 с через ячейку пропускают азот. Затем, продолжая пропускать азот через раствор, в течение 180 с накапливают тироксин на рабочем электроде при потенциале накопления. Использовали линейную развертку потенциала.
Достигнутый предел чувствительности составил 2,71 нг/мл.
Время количественного определения тироксина в моче данным способом - не менее 2 часов в связи с длительностью хроматографического выделения тироксина из мочи.
Известен вольтамперометрический способ количественного определения тироксина в модельных растворах (ближайший аналог) (Qiong Не, Xueping Dang, Chengguo Нu / The effect of cetyltrimethylammonium bromide on the electrochemical determination of thyroxine, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 35 (2004), pp. 93-98; Chengguo Нu, Qiong Не, Qing Li / Enhanced reduction and determination of trace thyroxine at carbon paste electrode in the presence of trace cetyltrimethylammonium bromide, Analytical Sciences, juli 2004, vol.20, pp. 1049-1054). Метод был разработан для оценки влияния цетилтриметиламмония бромида (СТАВ) на количественное определение различных веществ.
-4
-2
Электрохимическое измерение было выполнено в трехэлектродной системе. В качестве рабочего использовали углеродно-пастовый электрод. Платиновый и насыщенный каломельный электроды использовали как рабочий электрод и электрод сравнения. Раствор тироксина в концентрации 5×10 М был приготовлен путем растворения тироксина в 0,1 М растворе едкого натра в этаноле. Растворы выдерживали в темноте при температуре 4°С. Сурфактанты растворяли в воде до концентрации 1×10 М. Другие использованные химические вещества были аналитической степени чистоты, кроме спектроскопически чистого порошка графита. Все растворы были приготовлены на бидистилляте и все химические вещества были использованы без дальнейшей очистки.
Углеродно-пастовый электрод изготавливали следующим образом. 25 микролитров парафинового масла добавляли к 100 мг спектроскопически чистого графитового порошка для приготовления гомогенной угольной пасты. Пасту упаковывали в тефлоновую тубу электрода (4,5 мм в диаметре) и вставляли в нее проводник.
Процедура измерения была следующей. В электрохимическую ячейку вносили фоновый электролит: 0,1 М соляную кислоту и 60 мкл раствора СТАВ. Затем стандартный раствор тироксина добавляли в ячейку до получения 10 мл раствора смеси. К рабочему электроду прикладывали потенциал 0,9 В в течение 5 мин при встряхивании раствора. Записывали вольтамперограммы тироксина в пределах потенциала 0,0-1,0 В. Возникали четыре пика, из которых чувствительный пик восстановления около 0,40 В был использован для определения тироксина. Ячейку держали в темноте в течение всего времени измерения. Затем ту же процедуру осуществляли с исследуемым раствором. Использовали катодную квадратно-волновую развертку.
-8
-3
Чувствительность метода составила 10 моль/л (7,8×10 мг/л) тироксина. Время определения - около 10 мин. Поры угольно-пастовых электродов быстро забиваются, и рабочую поверхность электрода необходимо возобновлять удалением краевого слоя.
Раскрытие изобретения.
Суть предлагаемого вольтамперометрического способа количественного определения тироксина [L-2-амино-3-[4-(3,5-дийод-4-гидрокси-фенокси)-3,5-дииодфенил] пропионовой кислоты] в модельных растворах и растворах лекарственных препаратов состоит в том, что проводят электрохимическое концентрирование тироксина на поверхности ртутно-пленочного электрода в течение 150 с (при 18-22°С) при потенциале электролиза -1,8 В на фоне боратного буфера с рН 10 с последующей регистрацией анодных вольтамперных кривых при постоянно-токовой скорости развертки потенциала 50 мВ/с, а концентрацию тироксина определяют по высоте волны при значении потенциала -0,18 В относительно хлорид-серебряного электрода.
Предлагаемый способ пригоден для количественного определения тироксина как в модельных растворах, так и в растворе лекарственного монопрепарата.
Используемый в предлагаемом способе электрод представляет собой серебряную проволоку, на которую нанесена пленка ртути. После определения электрод легко восстанавливается: его опускают в раствор азотной кислоты, затем - в ртуть.
-8
-14
Предлагаемый способ характеризуется высокой чувствительностью (2×10 мг/л или 2,63×10 моль/л). Осуществление предлагаемого способа требует не более 20 мин (пробоподготовка около 15 мин, измерение около 5 мин).
Определение тироксина проводят на вольтамперометрическом анализаторе ТА-4.
Перед электрохимическим концентрированием тироксина на поверхности ртутно-пленочного электрода для удаления кислорода из электрохимической ячейки через раствор с пробой при перемешивании пропускают газообразный азот с содержанием кислорода менее 0,001% в течение 30 с. Затем, не прекращая подачи азота и перемешивания раствора, проводят электролиз раствора при потенциале -1,8 В в течение 150 с, в результате чего тироксин концентрируется на поверхности ртутно-пленочного электрода.
Все условия определения тироксина были подобраны экспериментально. Приготовление фоновых и стандартных растворов тироксина является общепринятым.
В процессе поиска оптимальных условий вольтамперометрического определения тироксина было изучено влияние ряда факторов на высоту аналитического сигнала: рабочего электрода; фонового электролита, его концентрация и рН; времени и потенциала электролиза; скорости и варианта развертки потенциала.
В качестве рабочего (индикаторного) электрода были исследованы стекло-углеродный и ртутно-пленочный электроды. Для осуществления предлагаемого способа был выбран ртутно-пленочный электрод. Его рабочей поверхностью является ртутная пленка на серебряном стержне. Преимуществом такого электрода является возможность получения более четкого аналитического сигнала тироксина, служащего количественной характеристикой определяемого вещества, что повышает разрешающую способность метода. Тироксин легко адсорбируется на рабочей поверхности ртутно-пленочного электрода, что позволяет концентрировать его на рабочем электроде.
В качестве фоновых электролитов были исследованы растворы гидроксидов натрия, калия; хлоридов натрия, кальция; фосфата и гидрофосфата натрия; нитратов натрия, алюминия, аммония; боратный буфер с различными значениями рН. Исходя из полученных результатов, в качестве фонового электролита был выбран боратный буфер с рН=10, так как при его использовании на вольтамперограмме наблюдалась четкая волна восстановления тироксина. Кроме того, данный раствор обеспечивал широкую рабочую область, хорошую электропроводность и необходимую площадь для обработки сигнала. В кислой среде при подобранных условиях сигнал тироксина отсутствовал, а в нейтральной и слабощелочной - резко сужалась рабочая область и возрастала величина остаточного тока, при этом невозможно было зафиксировать высоту волны тироксина. Результаты эксперимента показали, что оптимальным решением является электролиз без добавления дополнительных электролитов.
Оптимальное время накопления тироксина на электроде составило 150 с. При этом достигаются максимальное значение величины тока растворения накопленных осадков с поверхности ртутно-пленочного электрода и хорошая воспроизводимость результатов его количественного определения. При увеличении времени накопления более 150 с происходит насыщение осадка на электроде, аналитический сигнал тироксина искажается и затрудняется обработка полярограмм. При времени накопления менее 150 с величина тока растворения не достигает максимального значения, что снижает чувствительность определения исследуемого вещества (табл.1).
Оптимальный потенциал электролиза составил -1,8 В. При значениях потенциала электролиза менее -1,8 В величина регистрируемого анодного тока значительно уменьшается, что снижает чувствительность определения, а при значениях потенциала электролиза более -1,8 В происходит частичное накопление осадка (неполное извлечение анализируемого вещества) (табл.2).
Экспериментально найденная оптимальная скорость развертки потенциала составила 50 мВ/с. Изменение скорости развертки потенциала в сторону увеличения или уменьшения заметно снижало высоту аналитического сигнала, при этом уменьшалась и разрешающая способность метода, что затрудняло обработку полярограмм, увеличивало время анализа и не позволяло определять очень низкие концентрации тироксина.
Форма развертки потенциала была подобрана экспериментально. Для определения тироксина оптимальной оказалась постоянно-токовая скорость развертки потенциала. При постоянно-токовой форме скорости развертки потенциала наиболее четко просматривался аналитический сигнал.
-2
-8
Относительная ошибка среднего результата измерений тироксина в диапазоне концентраций 2×10-2×10 мг/л не превышает 2,05% в модельном растворе и 1,82% в препарате «L-тироксин» производства «Берлин-Хеми».
Данный способ предполагает дополнительную пробоподготовку, заключающуюся в растворении навески таблеток и центрифугировании (либо фильтровании) полученного раствора с последующим разведением. Время, необходимое для проведения единичного определения тироксина, не превышает 20 мин.
Пример 1. Определение тироксина предлагаемым методом анодной вольтамперометрии с накоплением в модельном растворе.
В стаканчик емкостью 20 мл наливают 10 мл боратного буфера с рН=10. При потенциале -1,8 В раствор деаэрируют азотом с содержанием кислорода менее 0,001% в течение 30 с и, не прекращая перемешивания и подачи азота, проводят электролиз при потенциале -1,8 В в течение 150 с. Фиксируют вольтамперограмму при постоянно-токовой форме скорости развертки потенциала 50 мВ/с. Отсутствие пиков свидетельствует о чистоте фона.
-8
Затем добавляют 0,05 мл стандартного раствора тироксина с концентрацией 2×10 мг/л. При потенциале -1,8 В раствор деаэрируют азотом с содержанием кислорода менее 0,001% в течение 30 с и, не прекращая перемешивания и подачи азота, проводят электролиз при потенциале -1,8 В в течение 150 с. Фиксируют вольтамперограмму при постоянно-токовой скорости развертки потенциала 50 мВ/с относительно хлорид-серебряного электрода.
Аналитический сигнал регистрируют при значении потенциала -0,18 В.
Время единичного анализа для модельного раствора тироксина не превышает 5 мин.
Правильность установленных параметров методики проверяли методом «введено-найдено» (табл.3; табл.3.1).
Пример 2. Определение тироксина предлагаемым методом анодной вольтамперометрии с накоплением в лекарственном препарате.
В стаканчик емкостью 20 мл наливают 10 мл боратного буфера с рН=10. При потенциале -1,8 В раствор деаэрируют азотом с содержанием кислорода менее 0,001% в течение 30 с и, не прекращая перемешивания и подачи азота, проводят электролиз при потенциале -1,8 В в течение 150 с. Фиксируют вольтамперограмму при постоянно-токовой форме скорости развертки потенциала 50 мВ/с. Отсутствие пиков свидетельствует о чистоте фона.
Затем готовят раствор из таблеток, содержащих тироксин. 20 таблеток растирают в ступке. Полученный порошок растворяют в 200 мл 0,01 М раствора гидроксида натрия при перемешивании магнитной мешалкой в течение 10 мин. Раствор фильтруют, фильтрат переносят в мерную колбу на 1 л. Доводят объем жидкости до 1 л 0,01 М раствором гидроксида натрия. Отбирают 1 мл полученного раствора, переносят в мерную колбу и доводят объем до 1 л (также раствором гидроксида натрия). Процедуру повторяют еще раз. Из полученного раствора вновь отбирают 1 мл и переносят в мерную колбу на 10 мл, объем доводят до метки водой.
0,05 мл полученного раствора добавляют в электролитическую ячейку. При потенциале -1,8 В раствор деаэрируют азотом с содержанием кислорода менее 0,001% в течение 30 с и, не прекращая перемешивания и подачи азота, проводят электролиз при потенциале -1,8 В в течение 150 с. Фиксируют вольтамперограмму при постоянно-токовой форме скорости развертки потенциала 50 мВ/с.
-4
Затем добавляют 0,05 мл стандартного раствора тироксина с концентрацией 2×10 мг/мл. При потенциале -1,8 В раствор деаэрируют азотом с содержанием кислорода менее 0,001% в течение 30 с и, не прекращая перемешивания и подачи азота, проводят электролиз при потенциале -1,8 В в течение 150 с. Фиксируют вольтамперограмму при постоянно-токовой скорости развертки потенциала 50 мВ/с относительно хлорид-серебряного электрода.
Аналитический сигнал регистрируют при значении потенциала -0,18 В. По высоте волны (пика) тироксина на вольтамперограмме прибор определяет концентрацию тироксина в сыворотке крови.
Правильность установленных параметров методики была проверена методом «введено-найдено» (табл. 4; 4,1).
Таблица 1
Влияние времени электролиза на высоту аналитического сигнала
№ п/п
Концентрация раствора стандартного образца тироксина в электролитической ячейке, мг/л
Время электролиза, с
Высота аналитического сигнала, мкА
1
2×10<sup>-8</sup>
120
0,3
2
140
0,37
3
150
0,45
4
160
0,42
5
180
0,4
Таблица 2
Влияние потенциала электролиза на высоту аналитического сигнала
№ п/п
Концентрация раствора стандартного образца тироксина в электролитической ячейке, мг/л
Потенциал электролиза, В
Высота аналитического сигнала, мкА
1
2×10<sup>-8</sup>
-1,4
0,09
2
-1,5
0,115
3
-1,6
0,1
4
-1,7
0,12
5
-1,8
0,14
6
-1,9
0,133
Таблица 3
Результаты теста «введено-найдено» количественного определения тироксина в модельном растворе
Введено С×10<sup>-8</sup> мг/л
Найдено С<sub>х</sub>×10<sup>-8</sup> мг/л
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
2
2,1
2,05
1,97
1,89
1,96
1,99
2,01
1,95
1,99
1,97
Таблица 3.1
Расчет относительной ошибки метода ε
С×10<sup>-8</sup>
2,1; 2,05; 1,97; 1,89; 1,96; 1,99; 2,01; 1,95; 1,99; 1,97
n
10
Х<sub>cр</sub>
1,988·10<sup>-8</sup>
S
5,71159·10<sup>-10</sup>
ΔХ
4,08193·10<sup>-10</sup>
X<sub>cp</sub>±ΔX
1,988·10<sup>-8</sup>±4,08193·10<sup>-10</sup>
ε
2,05% - (относительная ошибка)
Таблица 4
Результаты теста «введено-найдено» количественного определения тироксина в препарате
Введено
Найдено Сх×10<sup>-4</sup> мг/л
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
2×10<sup>-4 </sup>мг/л
2,12
2,06
1,978
1,996
2,04
2,04
1,992
1,99
1,974
2,1
0,1 мг*
0,106
0,103
0,0989
0,0998
0,102
0,102
0,0996
0,0995
0,0987
0,105
*Примечание. Пересчет на одну таблетку с учетом разведения - т.е. полученный результат единичного измерения умножали на разведение и делили на количество таблеток, взятых для приготовления анализируемого раствора
Таблица 4.1
Расчет относительной ошибки метода ε
m, мг
0,106; 0,103; 0,0989; 0,0998; 0,102; 0,102; 0,0996; 0,0995; 0,0987; 0,105
n
10
Х<sub>cр</sub>
0,10145
S
2,588×10<sup>-2</sup>
ΔХ
1,8503×10<sup>-3</sup>
Х<sub>сp</sub>±ΔХ
0,10145±1,8503×10<sup>-3</sup>
ε
1,8238%-