ШТАММ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНОГО Mus musculus L. 5Н6 - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЛИКОПРОТЕИНА Е ВИРУСА ЗАПАДНОГО НИЛА, МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА 5Н6, ПРОДУЦИРУЕМЫЕ УКАЗАННЫМ ШТАММОМ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК, И ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ НАБОР ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЛИКОПРОТЕИНА Е ВИРУСА ЗАПАДНОГО НИЛА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УКАЗАННЫХ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ
STRAIN OF HYBRID ANIMAL CELLS Mus musculus L. 5H6 - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES FOR DETECTING GLYCOPROTEIN E OF WEST NILE VIRUS, 5H6 MONOCLONAL ANTIBODIES PRODUCED BY SAID STRAIN OF HYBRID CELLS, AND IMMUNOENZYMOMETRIC KIT FOR DETECTING GLYCOPROTEIN E OF WEST NILE VIRUS USING SAID MONOCLONAL ANTIBODIES

Изобретение относится к штамму гибридных клеток животного Mus musculus L. - продуценту моноклональных антител для выявления гликопротеина Е вируса Западного Нила; к моноклональным антителам, продуцируемыми указанным штаммом гибридных клеток и иммуноферментному набору для выявления гликопротеина Е вируса Западного Нила с использованием указанных моноклональных антител и может быть использовано в медицине, иммунологии и биотехнологии для выявления антигена вируса Западного Нила (ВЗН) в полевых (комарах, клещах) и клинических (в гомогенатах органов человека и животных) материалах.
Возбудитель лихорадки Западного Нила (ЛЗН) - вирус Западного Нила (ВЗН) относится к семейству Flaviviridae, роду Flavivirus и входит в антигенный комплекс японского энцефалита (Львов Д.К. Лихорадка Западного Нила. //Вопросы вирусол. - 2000. - №2. - С. 4-9). Обширная вспышка среди людей в 1999 г. в Волгоградской области и Краснодарском крае ЛЗН, которая ранее считалась эндемичной для тропических и субтропических стран, привлекла внимание к проблеме диагностики этой инфекции и в России (Львов Д.К., Бутенко A.M., Гайдамович С.Я. и др. Эпидемиологическая вспышка менингоэнцефалита в Краснодарском крае и Волгоградской области, вызванная вирусом лихорадки Западного Нила (предварительное сообщение). // Вопросы вирусол. - 2000. - №1. - С. 37-38). Тем более, что позднее появились сообщения о циркуляции ВЗН в птицах, комарах и клещах от Белоруссии до Приморского края, в Закавказье, бассейне Каспийского моря, республиках средней Азии, в Сибири (Терновой В.А., Щелканов М.Ю., Шестопалов A.M. и др. Выявление вируса Западного Нила у птиц на территории Барабинской и Кулундинской низменностей (Западно-Сибирский пролетный путь) в летне-осенний период 2002 г. // Вопросы вирусол. - 2004. - №3. - С. 52-56). В 2014 г. антитела к ВЗН были зарегистрированы у населения в 25 субъектах Российской Федерации, а заболеваемость населения была зарегистрирована 8 субъектах РФ [http://ecdc.europa.eu/en/healthtopics/west_nile_fever/West-Nile-fever-maps/pages/index.aspx].
Распространение ЛЗН было также зарегистрировано не менее чем в 10 странах Европы. Многолетние наблюдения свидетельствуют о постоянной циркуляции ВЗН в Евразии, в том числе и в России. Пики заболеваемости в РФ были зарегистрированы в 1999, 2010 и 2012 годах, что свидетельствует о постоянном циркуляции ВЗН в природных очагах на территории РФ и неблагоприятном эпидемическом прогнозе по ЛЗН в РФ (Об эпидемиологической ситуации по ЛЗН в 2014 году и прогнозе на 2015 год, письмо руководителя Роспотребнадзора №01/2030-15-32 от 02.03.2015).
Вирионы ВЗН имеют типичную для флавивирусов сферическую форму и размеры от 40 до 60 нм в диаметре, содержат электронно-плотную сердцевину примерно 30 нм в диаметре, окруженную липидным бислоем. Геном ВЗН представлен одноцепочечной инфекционной РНК размером около 11 тысяч нуклеотидных остатков. Геном ВЗН кодирует один полипротеин, который подвергается процессингу вирусными и клеточными протеазами с образованием трех структурных белков (оболочечный Е, мембранный М, капсидный С) и семи неструктурных вирусных белков - NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b и NS5 (Liu J, Liu B, Cao Z et al. Characterization and application of monoclonal antibodies specific to West Nile virus envelope protein. J Virol Methods. - 2008. - Vol. 154. - №1-2. - P. 20-26). Оболочечный гликопротеин E (53 кДа) является доминирующим антигеном в реакциях гемагглютинации и нейтрализации, определяет тропизм вируса. Наибольшее количество иммунологических исследований ВЗН сфокусировано на этом белке, так как он индуцирует синтез нейтрализующих антител и является основной мишенью для них (Beasley D.W., Barrett A.D. Identification of neutralizing epitopes within structural domain III of the West Nile virus envelope protein. // Virol. - 2002. - Vol. 76. - №24. - P. 13097-13100). Генотипирование ВЗН проводят методом ОТ-ПЦР с использованием специфических праймеров к гену белка Е (Терновой В.А., Протопопова Е.В., Сурмач С.Г и др. Генотипирование вируса Западного Нила, выявленного у птиц на юге Приморского края в течение 2002-2004 гг.// Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2006. - №4. - С. 30-34). Для выявления антигена используют иммуногистологическое исследование с помощью специфических антител (Писарев В.Б., Львов Д.К, Смирнов А.В. и др. Морфологические изменения в продолговатом мозге мышей при экспериментальном заражении вирусом Западного Нила (штамм 986). // Вопросы вирусол. - 2007. - №3 - С. 23-25) и ИФА в формате "сэндвич" на основе поликлональных антител (Львов Д.К, Бутенко A.M., Вышемирский О.И. и др. Выделение вируса лихорадки западного Нила от больных людей в период эпидемической вспышки в Волгоградской и Астраханской областях. // Вопр. вирусол. - 2000. - №3. - С. 9-12).
В настоящее время в России выпускается одна коммерческая тест-система ИФА для выявления антигена ВЗН на основе поликлональных кроличьих антител (ЗАО "Биосервис", номер регистрационого удостоверения ФСР 2012/13840 от 10.09.2012).
Основным достоинством гибридомных МКА является возможность получения очищенных препаратов в неограниченном количестве с идентичными от партии к партии физико-химическими характеристиками, что позволяет создавать на их основе стандартные диагностические реагенты. Все МКА, продуцируемые гибридной клеточной линией, происходящей от одного клона одной клетки, относятся к одному классу и подклассу иммуноглобулинов, имеют абсолютно одинаковую специфичность и аффинность. Они взаимодействуют только с одним антигеном, с одной антигенной детерминантой - эпитопом, состоящим приблительно из 3-10 аминокислотных остатков (Ройт И. Иммунология. // М.: Мир, 2000. - 581 с.)
Первым наиболее близким аналогом (прототипом гибридомной клеточной линии) является мышиная гибридомная клеточная линия 9Е2, продуцирующая МКА 9Е2, специфичные к линейному эпитопу 260-466 а.о. III домена гликопротеина Е ВЗН (штамм Волгоград) и нейтрализующие вирус на культуре клеток Vero (Патент РФ №2265658, МПК C12N 5/18, A61K 39/42, опубл. 10.12.2005 г.).
Известна лабораторная ИФА тест-система на основе двух видов МКА, полученных к рекомбинантному III домену белка Е ВЗН (штамм 5810 птичий) (Liu J, Liu В, Cao Z et al. Characterization and application of monoclonal antibodies specific to West Nile virus envelope protein. // J Virol Methods. - 2008. - Vol. 154. - №1-2. - P. 20-26). Детектирующие МКА конъюгированы с биотином и система предполагает дополнительный этап сорбции конъюгата стрептавидина с пероксидазой. Эта тест-система имеет невысокую чувствительность выявления по рекомбинантному белку - 100 нг/мл.
3,8
Вторым наиболее близким аналогом (прототипом тест-системы) является описанная в научной литературе лабораторная ИФА тест-система на основе двух видов МКА, полученных к нативному ВЗН (штамм Египет-101) и имеющих специфичность к III домену белка Е и обладающие нейтрализующей активностью (Lelli D, Moreno A, Brocchi Е et al. West Nile virus: characterization and diagnostic applications of monoclonal antibodies. // Virol J. - 2012. - Vol. 13. - P. 9-81). Детектирующие МКА конъюгированы с пероксидазой. Однако данная тест-система имеет невысокую чувствительность выявления инфекционного вируса - 10 ТЦПД50/100 мкл.
Техническим результатом предлагаемого технического решения является получение штамма гибридных клеток Mus musculus L., продуцирующих специфические МКА к антигену ВЗН (штамм Волгоград - 27889), не конкурирующих с МКА 9Е2 за антигенные эпитопы гликопротеина Е, для использования пары МКА (5Н6 и 9Е2) в иммуноферментной тест-системе формата "сэндвич" для выявления гликопротеина Е ВЗН (штамм Волгоград и штамм Египет), обладающей большей чувствительностью, чем известные аналоги.
Указанный технический результат достигается созданием штамма гибридных клеток животного Mus musculus L. 5Н6, депонированного в Коотекции клеточных культур ФБУН ГНЦ ВБ ″Вектор″ под регистрационным №311 от 02.032015 г., являющимся продуцентом моноклональных антител, специфичных к вирусу Западного Нила (штамм Волгоград - 27889).
Указанный технический результат достигается также получением моноклональных антител 5Н6, продуцируемых штаммом гибридных клеток животного Mus musculus L. 5Н6 субкласса иммуноглобулинов IgGl, имеющих тяжелую 55кДа и легкую 25 кДа цепь, специфичных к конформационному (нелинейному) эпитопу гликопротеина Е вируса Западного Нила (штамм Волгоград - 27889, штамм Египет - 101) и используемых в качестве индикаторных в иммуноферментном методе для выявления антигена вируса Западного Нила в инфицированных клетках и тканях.
Указанный технический результат достигается также созданием набора для выявления гликопротеина Е вируса Западного Нила методом иммуноферментного анализа формата "сэндвич", имеющем в своем составе: 100-кратный конъюгат МКА 5Н6, меченных пероксидазой хрена; положительный контрольный образец (очищенный инактивированный антиген вируса Западного Нила (штамм Волгоград - 27889); иммуносорбент с МКА 9Е2; отрицательный контрольный образец; раствор для разведения исследуемых образцов (РГО); раствор для разведения конъюгата (РРК); субстратный буферный раствор с перекисью водорода (СЕР); 25-кратный концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином (ФСБ-Т); 025%-ный раствор тетраметилбензидина (ГМБ); стоп реагент (05 М серная кислота).
-4
-5
-5
Родословная штамма. Заявляемый штамм гибридных клеток получен путем слияния клеток мышиной p3-X63/Ag8.653 (NS/1) миеломы с клетками селезенок мышей BALB/c, иммунизированных очищенным, концентрированным, инактивированным антигеном с полным адъювантом Фрейнда (при первой иммунизации) и очищенным нативным инфекционным (при второй и бустерной иммунизациях с неполным адъювантом Фрейнда) препаратом ВЗН, полученным из мозговой ткани инфицированных мышей-сосунков. В качестве сливающего агента использовали 45% раствор полиэтиленгликоля фирмы "Sigma" с молекулярным весом 1300-1600 кДа по методу (Gefter ML, Margulies DH, Schcoff MD. A simple method for polyethylene glycol promoted hybridization of mouse myeloma cells. //Somat. Cell Genet. - 1977. - Vol. 3. - P. 231-236). Клетки после слияния выращивали в селективной среде ГАТ (10 М гипоксантина, 4×10 М тимидина, 10 М аминоптерина) в 96-луночных культуральных планшетах. В качестве фидерных клеток использовали перитонеальные макрофаги беспородных мышей. Гибридомы, стабильно продуцирующие специфические МКА, клонировали 3 раза. Выход позитивных клонов в последнем клонировании составил 100%.
Заявляемый штамм депонирован от 02.03.2015 г. в Коллекции культур клеток Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным №311. (справка о депонировании штамма прилагается).
Число пассажей к моменту депонирования: 7-10 пассажей.
Маркерные признаки и методы их оценки. Штамм секретирует мышиные моноклональные иммуноглобулины субкласса IgGl (имеющие тяжелую 55 кДа и легкую 25 кДа цепи), специфически взаимодействующие с антигеном ВЗН в ИФА. Анализ мышиных иммуноглобулинов проводили методом твердофазного ИФА (ТИФА), используя в качестве антигена инактивированный ВЗН (штамм Волгоград - 27889) в концентрации 2 мкг/мл и антитела против IgG мыши, меченные пероксидазой хрена (Sigma) в разведении 1/5000. Титр очищенных МКА 5Н6 в ТИФА составляет 1/656100. Методом иммуноблоттинга МКА 5Н6 не выявляют линейный эпитоп на белке Е в вирусном препарате и не взаимодействуют в ТИФА с рекомбинантными фрагментами белка Е ВЗН. Способность МКА 5Н6 в ИФА формата "сэндвич" "захватывать" вирусный антиген в паре с МКА 9Е2, специфичными строго к линейному эпитопу 260-466 а.о. III домена белка Е, позволяет нам предположить специфичность МКА 5Н6 к нелинейному (конформационному) эпитопу белка Е.
Контаминация бактериями и грибами не обнаружена.
Культуральные свойства. Среда для культивирования DMEM/F12 с глутамином, пиридоксином, Hepes (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора). Содержание фетальной сыворотки, оптимизированной для гибридом (HyClone, USA) в ростовой среде - 10%. В ростовую среду также добавляют 80-160 мкг/мл сульфата гентамицина.
Штамм является монослойно-суспензионной культурой, в которой до 20% клеток находится в суспензии, не прикрепляясь к поверхности посуды для культивирования. Клетки с поверхности культуральной посуды удаляются раствором трипсина/версена в соотношении 1/3 (объем/объем). Посевная доза 200 тысяч кл/мл. Частота пассирования через 3-4 суток. Индекс пролиферации - не менее 5.
Культивирование гибридом в организме животного. Самкам мышей BALB/c (виварий ГНЦВБ "Вектор") предварительно вводят внутрибрюшинно 0,3-0,5 мл пристана (Sigma). Через 2-4 недели животным прививают внутрибрюшинно 10 млн/мышь гибридных клеток. Асцитическая опухоль формируется на 7-10 день. Гибридомы прививаются в 100% случаев. От одного животного можно получить 3-5 мл асцитической жидкости, содержащей МКА.
Характеристика полезного продукта. Типирование гибридомных иммуноглобулинов проведено методом ТИФА с использованием моноспецифических мышиных антител (Sigma, США). МКА 5Н6 относятся к субклассу IgGl и специфически взаимодействуют в ТИФА с нативным инфекционным и инактивированным антигеном ВЗН. В ТИФА титр МКА в асците составляет 1/729000, в очищенном препарате 1/656100.
Стабильная продукция МКА сохраняется на протяжении не менее 10 пассажей in vitro при непрерывном культивировании. Из одного миллилитра асцитической жидкости можно получить 3-6 мг очищенных МКА.
Криоконсервирование. Среда для замораживания гибридных клеток - среда ДМЕМ(М) - 50%, фетальная сыворотка - 40%, диметилсульфоксид - 10%. 1-1,5 мл клеточной суспензии переносят в пластиковые криопробирки и помещают в пенопластовый контейнер с толщиной стенок 1 см. Контейнер вносят в пары жидкого азота и через 18-24 часа пробирки переносят в жидкий азот. Размораживание проводят, опуская пробирки в воду с температурой 37-41°С. Клетки разводят средой ДМЕМ(М) и центрифугируют при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в ростовой среде и клетки переносят в культуральные флаконы в концентрации 200-300 тысяч в миллилитре. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 60-80% (по результатам окрашивания 0,25% трипановым синим). Каждая ампула содержит не менее 1 млн/мл клеток.
Заявка иллюстрируется следующими графическими материалами. На фиг. 1 приведена электрофореграмма для оценки эффективности очистки МКА. Примечания: 1 - белковые маркеры молекулярной массы в кДа (BioLabs); 2 - антитела поликлональной сыворотки мыши, иммунизированной антигеном ВЗН, осажденные 50%-ным раствором сульфата аммония; 3 - МКА 5Н6, осажденные из асцита 50%-ным раствором сульфата аммония; 4, 5 - МКА 5Н6 и 9Е2 (в качестве контроля), очищенные из асцита каприловой кислотой, с последующим осаждением 50%-ным раствором сульфата аммония. На фиг. 2 представлен график титрования очищенного вирусного антигена ВЗН в ТИФА. Примечания: препараты очищенных МКА и мышиные сыворотки использованы в разведении 1/1000; ангивидовые меченные пероксидазой хрена антитела против IgG мыши (Sigma) использованы в разведении 1/5000. Для каждой точки титрования взят результат средней арифметической (n=3); планки погрешностей отображены с использованием стандартных ошибок. На фиг. 3 приведен график титрования в ТИФА очищенных МКА 5Н6 и сыворотки мышей, иммунизированных очищенным инфекционным антигеном. Примечания: антиген ВЗН сорбирован на пластик в концентрации 2 мкг/мл; титрование антител проведено 3-кратным шагом (12 точек) с разведения 1/300. Для каждой точки титрования взят результат средней арифметической (n=3); планки погрешностей отображены с использованием стандартных ошибок. На фиг. 4 изображен график титрования лизата и очищенного антигена в ИФА формата "сэндвич" парой МКА 9Е2 и 5Н6*. Примечания 1: очищенный антиген штамм LEIV-VLG99-27889 использован в концентрации 0,5 мг/мл; МКА 9Е2 (иммуносорбент) для сорбции в ячейках планшета использованы в концентрации 4 мкг/мл; меченные пероксидазой МКА 5Н6* (конъюгат) использованы в концентрации 1 мкг/мл. Для каждой точки титрования взят результат средней арифметической (n=3); планки погрешностей отображены с использованием стандартных ошибок. Примечания 2: ИФА формата "сэндвич" с парой МКА 9Е2 и 5Н6* не выявляет очищенные вирусы клещевого и японского энцефалитов (данные не представлены), выявляет вирусный антиген в очищенном препарате 2,4 нг/мл (график титрования). ОТ ПЦР тест-система для выявления РНК ВЗН (производство "ИнтерЛабСервис", кат. № R-V53, RG, iQ, Мх) выявляет очищенный антиген LEIV-VLG99-27889 в концентрации 1,2 мг/мл (данные не представлены).
Приведенные ниже примеры подробно раскрывают достижение технического результата объектов изобретения.
Пример 1. Культивирование гибридных клеток штамма Mus musculus L. ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" - 5Н6, продуцирующих МКА к белку Е ВЗН, в организме животных.
Мышам BALB/c (виварий ГНЦ ВБ "Вектор"), весом 20-22 г, не менее чем за 10 дней до прививки гибридомных клеток вводили внутрибрюшинно по 0,3-0,5 мл пристана. Культивируемые клетки, находящиеся в логарифмической фазе роста, стерильно центрифугировали 5-10 мин при 1000 об/мин. Надосадок удаляли, а осадок клеток суспензировали в стерильном растворе Эрла или Хенкса. Мышам внутрибрюшинно вводили каждой по 1 мл, содержащей не менее 10 млн гибридомных клеток. Через 7-10 дней животных усыпляли и в асептических условиях из брюшной полости извлекали 3-5 мл асцитической жидкости. Клетки из асцитической жидкости отделяли центрифугированием, а в надосадочной жидкости определяли титр МКА с помощью ТИФА, как описано ниже (пример 4).
Пример 2. Выделение очищенных моноклональных тел, продуцируемых гибридными культивируемыми клетками штамма Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" 5Н6.
Один объем асцитической жидкости, содержащей МКА, разводили 4 объемами 0,6 М ацетатного буфера (0,004 М лимонной кислоты; 0,2 М натрия ацетата, pH 4,0) и доводили pH до 4,5 с помощью 0,1 N раствора едкого натра. К разведенному образцу добавляли по каплям, с постоянным перемешиванием, каприловую кислоту из расчета 25 мкл на 1 мл раствора и инкубировали ночь при 4°C. Затем центрифугировали 30 мин при 8000 об./мин и осадок удаляли, а надосадок смешивали с 10-кратным фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и устанавливали pH 7,4 раствором 1,0 N едкого натра. Равный объем холодного насыщенного раствора сульфата аммония добавляли к этому раствору, встряхивали и выдерживали ночь при 4°C или 30 мин при минус 18-20°C. Центрифугировали 15 мин при 5000 об./мин. Надосадок аккуратно сливали, а осадок растворяли в ФСБ (pH 7,4). Остатки сульфата аммония удаляли путем диализа против 50-100 объемов ФСБ (pH 7,4).
Электрофорез очищенных препаратов МКА проводили по методу, описанному в работе (Остерман А.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. // Москва, 1981. - С. 37-64). в прерывистой буферной системе с использованием 10%-ного полиакридного геля (ПААГ) с 0,1% додецилсульфатом натрия (SDS) в трис-глициновом буфере. Разделяющий гель содержит 0,0625 трис-HCl (pH 8,8); 0,1% SDS; 10-15% акриламида; 1% N,N-метиленбисакриламида. Препараты МКА (по 1 мкл) наносили на дорожку в объеме 30 мкл буфера, содержащем 0,0625 М трис-HCl (pH 6,8), 2% SDS, 5% меркаптоэтанола, 10% глицерина, 0,01% бромфенолового синего. Перед нанесением буфер, содержащий МКА, прогревали 3 мин при 95°C. Электрофорез проводили в режиме 10 В/см. Окраску геля проводили при помощи Кумасси G-250. Очищенный препарат МКА 5Н6 в виде электрофореграммы представлен на рис. 1. Определение концентрации белка в очищенных препаратах МКА выполняли с использованием набора "Protein Assay Kit" (Bio-Rad, США) на спектрофотометре UV mini 1240 СЕ (Shimadzu Corporation) при длине волны 595 нм. Полученные данные оценивали по калибровочной кривой. Тигр очищенных МКА определяли с помощью ТИФА, как описано ниже (пример 4).
Пример 3. Получение антигена. Использованные в работе штаммы ВЗН получены из Государственной коллекции вирусных штаммов Института вирусологии им Д.И. Ивановского. Штамм LEIV-Vlg99-27889-human (Vlg99-27889, Волгоград - 27889) был выделен в 1999 г. из мозга умершего человека в инфекционной больнице г. Волгограда (Львов Д.К, Бутенко A.M., Вышемирский О.И. и др. Выделение вируса лихорадки западного Нила от больных людей в период эпидемической вспышки в Волгоградской и Астраханской областях. // Вопр. вирусол. - 2000. - №3. - С. 9-12) и штамм Eg-101, который был выделен в 1951 г. из сыворотки крови клинически здорового ребенка в окрестности Каира, Египет (Anishchenko М, Щелканов М.Ю., Алексеев В.В. и др. Молекулярные маркеры патогенности вируса Западного Нила. // Вопросы вирусол. - 2010. - №1. - С. 4-10). Для получения очищенного и концентрированного вирусного препарата получали клеточный лизат следующим образом: клетки Vero выращивали в стеклянных 1-литровых культуральных сосудах и заражали вирусом по стандартной методике. С монослоя инфицированных клеток (до появления явного цитопатического действия вируса в виде лизиса инфицированных клеток) удаляли поддерживающую среду, а клеточный дебрис в небольшом объеме среды без сыворотки осаждали низкоскоростным центрифугированием при 1000 об/мин. Осадок клеток в небольшом объеме STE буферного раствора (0,001М этилендиаминтетрауксусной кислоты; 0,1 М NaCl; 0,01 М трис HCl, pH 8,0) обрабатывали ультразвуком при 50 Вт в течение 30 секунд на тающем льду. Лизат клеток освобождали от осадка клеточных мембран центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 минут и наносили на линейный градиент сахарозы (13,5 мл 60% сахарозы и 13,5 мл 20% сахарозы) на STE буферном растворе. Очищенный вирусный препарат гомогенизировали в 0,05 М двузамещенном Na-фосфатном буфере (pH 7,4) для заморозки в аликвотах при минус 20°C. Определение концентрации белка в очищенных вирусных препаратах выполняли с использованием набора "Protein Assay Kit" (Bio-Rad, США) на спектрофотометре UV mini 1240 СЕ (Shimadzu Corporation) при длине волны 595 нм. Полученные данные оценивали по калибровочной кривой. На рис. 2 представлен график титрования очищенного антигена в ТИФА (как описано в примере 4). Очищенный, концентрированный вирус инактивировали в лизирующем трис-HCl буфере, содержащем детергент Nonidet-40 и формалин. Положительный контрольный образец вирусного антигена для тест-системы готовили как рабочий раствор антигена (3 мкг/мл) со стабилизаторами, консервантами, ингибиторами протеаз и красителем красного цвета.
2
3
Пример 4. Определение методом твердофазного ИФА (ТИФА) специфического взаимодействия МКА, продуцируемых гибридными клетками штаммов Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" 5Н6 с очищенным антигеном ВЗН. ТИФА проводили на полистироловых планшетах (Testiks). Очищенный антиген ВЗН в рабочем разведении (концентрация 2 мкг/мл) или в виде пошагового титрования сорбировали в ФСБ (pH 7,4) в объеме 100 мкл/лунка. Места неспецифического связывания насыщали 45 мин при 37°C 0,5%-ным раствором казеина в буфере ТСБ-Т (0,145 М хлористого натрия (AppliChem), 20 mM трис-HCl (Sigma), 0,1% Tween-20 (Serva), pH 7,4) и затем инкубировали с асцитической жидкостью или очищенными МКА 45 мин при 37°C. Специфическое связывание МКА с антигеном выявляли антивидовыми меченными пероксидазой хрена антителами против IgG мыши. Далее добавляли хромоген, (0,1% O-фенилендиамин в цитратно-фосфатном буфере, содержащем 0,2 М лимонной кислоты, 0,5 М NaHPO, pH 5,0) с 0,03% перекиси водорода. Останавливали реакцию добавлением 100 мкл на лунку 1N HCl и измеряли оптическую плотность (ОП) образцов на спекрофотометре "Multiscan" с использованием светофильтра с максимумом пропускания 492 нм. В качестве отрицательного и положительного контроля использовали гомологичные нормальную (неиммунную) и гипериммунную сыворотки, соответственно. На рис. 3 представлен график титрования очищенных МКА 5Н6 и гипериммунной мышиной сыворотки.
Пример 5. Приготовление конъюгата МКА 5Н6 с пероксидазой хрена. Приготовление конъюгатов МКА 5Н6 с пероксидазой хрена проводили по перйодатному методу Накане, описанному в руководстве (Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. Теория и практика иммуноферментного анализа. // М.: Высшая школа, - 1991. - 287 с). Для стабилизации конъюгата добавляли бычий сывороточный альбумин, мертиолят и глицерин (50% от объема) для хранения при минус 20°С.
Пример 6. Состав набора реагентов «Тест-система иммуноферментная для выявления антигена вируса Западного Нила с использованием моноклональных антител» ("Вектор - Западный Нил-антиген"). Состав набора реагентов представлен в табл. 1.
Пример 7. Выявление вирусного антигена в иммуноферментной тест-системе "Вектор - Западный Нил-антиген".
Дизайн теста - ИФА "сэндвич" на основе двух видов МКА. При наличии в исследуемом образце ВЗН, вирусный антиген (белок Е) связывается со специфичными антивирусными МКА, сорбированными в лунках планшета. Образовавшийся при этом комплекс (антитело-антиген) связывается затем с конъюгатом (вторыми антивирусными МКА, меченными пероксидазой хрена) и выявляется в реакции с индикаторным раствором, в результате которой меняется цвет (оптическая плотность) реакционной смеси в лунках планшета. ОП регистрируется спектрофотометрически.
На рис. 4 представлен график титрования антигена.
+
-
-
+
-
-
ср
ср
ср
крит
крит.
ср
Сенсибилизацию ячеек высокосорбционных полистирольных планшетов (Testiks или Nunc) проводили из объема 100 мкл очищенными МКА 9Е2 (Патент РФ №2265658) в 0,5 М карбонатном буферном растворе (pH 9,0) с концентрацией в диапазоне 0,4-8 мкг/мл в течение 18 ч при 22°C. Дополнительную блокировку поверхности ячеек осуществляли 0,5%-ным раствором казеина в течение 30 минут при 37°C. В лунки стрипа вносили по 50 мкл контрольных образцов (К и К), по 50 мкл образцов панели предприятия (содержащей 4 положительных и 4 отрицательных образца) (табл. 3) и во все лунки с пробами по 50 мкл раствора конъюгата МКА 5Н6 (с концентрацией в диапазоне 0,1-1,0 мкг/мл) с пероксидазой хрена. Инкубировали 2,5 часа при температуре 37°C на термошейкере (типа ST-3 Elmi, Латвия), с интенсивностью перемешивания 100 об./мин или 16-18 часов при температуре 4°C. Стрипы промывали 6 раз раствором для отмывки ФСБ-Т (табл. 1), приготовленного из концентрата ФСБ-Т (28 мл), разведенного очищенной водой до 700 мл. При выпадении осадка солей в концентрате необходимо прогреть его при 30-40°C до полного растворения осадка. Хранение: до 4 недель при 2-8°C). При этом в каждую лунку вносили не менее 250 мкл раствора в процессе одного промывания. Остаточную жидкость из лунок тщательно удаляли, постукивая перевернутым стрипом по фильтровальной бумаге. Далее в каждую лунку стрипа вносили по 100 мкл свежеприготовленного раствора ТМБ в СБР (табл. 1, табл. 2) и стрипы выдерживали 15-25 мин при температуре 18-25°C в темноте. Реакцию останавливали добавлением в лунки по 100 мкл стоп-реагента (0,5 М серная кислота). Величину ОП растворов в лунках иммуносорбента измеряли на спектрофотометре ″Multiscari″ при длине волны 450 нм. Качество тест-системы считали удовлетворительным, если среднее значение оптической плотности в лунках с отрицательным контролем (ОПК) не превышает 0,25 о.е., а среднее значение ОП положительного контрольного образца (ОПК) не менее, чем в 4 раза превышает ОПК. Положительными считали пробы с оптической плотностью равной или превышающей значение ОП, которое вычисляли по формуле: ОП=2×ОПК.
Пример 8. Приготовление контрольных образцов предприятия, содержащих и не содержащих вирусный антиген
В табл. 3 представлены способы приготовления образцов, их инактивации и концентрации вирусного антигена.
Исследованные свойства штамма гибридных клеток Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" 5Н6 (авторское название клеточной линии 5Н6), позволяют заключить, что впервые на основе мышиной миеломы получены гибридомы Mus musculus L. ГНЦ ВБ ″Вектор″ 5Н6 - продуценты нейтрализующих вирус МКА 5Н6, специфичных к нелинейному (конформационному) эпитопу гликопротеина Е вируса Западного Нила. Титр МКА 5Н6, выявляемый методом ТИФА (при использовании в качестве антигена инактивированного ВЗН в концентрации 2 мкг/мл и антител против IgG мыши, меченных пероксидазой хрена (в разведении 1/5000) составляет 1/656100. МКА 5Н6 не конкурируют за антигенные эпитопы с ранее описанными МКА 9Е2 (Патент РФ №2265658), что позволяет использовать их в паре в ИФА формата "сэндвич" для выявления вирусного антигена.
На базе ФКУЗ "Микроб" (г. Саратов) в 2013 г. проведены технические испытания 3-х серий медицинского изделия: набор реагентов «Тест-система иммуноферментная для выявления антигена вируса Западного Нила с использованием моноклональных антител» («Вектор - Западный Нил-антиген»). Регистрация медицинского изделия ТУ-9398-020-0566012-2013 в Федеральной службе по надзору в сфере здравоохранения КОД ОКП 939817 от 16.10.2013 г. Срок действия регистрации до 16.10.2018 г. Получено разрешение Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения (РОСЗДРАВНАДЗОР) от 23.01.2014 г. №28/2014 на проведение клинических испытаний медицинского изделия: набор «Вектор - Западный Нил-антиген». На базе ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" (р.п. Кольцово, НСО) в 2014 г. проведены клинические испытания 3-х серий медицинского изделия: набор «Вектор - Западный Нил-антиген» с использованием набора предприятия СПП-ЗН-2013 "Стандартная панель образцов, содержащих и не содержащих антиген вируса Западного Нила", состоящая из 8 образцов и набора клинических образцов (270 шт.), содержащих антиген вируса Западного Нила (в том числе: очищенные антигены штаммов Волгоград - 27889 и Египет - 101; лизаты клеток Vero, инфицированных штаммами Волгоград - 27889 (Vlg99-27889-human), Волгоград - 27924 (Vlg00-27924-human), Египет - 101 (Eg-101), Tur73-2914-ticks, Az70-72-ticks, Az67-1640-nuthatch, Ast63-94-ticks; супернатанты от инфицированных клеток Vero; 20%-ные суспензии мозга, печени, легкого, селезенки, сердца, почек белых б/п мышей, инфицированных штаммами Волгоград - 27889 и Египет - 101; пулы клещей Ixodes persulcatus, с добавлением очищенных антигенов Волгоград - 27889 и Египет - 101; 20%-ные мозговые суспензии умершего человека (мост, продолговатый мозг, мозжечок кора, зрительный бугор, хвостатое ядро), с добавлением очищенных антигенов Волгоград - 27889 и Египет - 101) и не содержащих антиген вируса Западного Нила (в том числе: не очищенный антиген клещевого энцефалита, штамм 205; лизат неинфицированных клеток Vero; 20%-ные суспензии органов чистых мышей; пулы клещей Ixodes persulcatus; 20%-ные мозговые суспензии умершего человека (мост, продолговатый мозг, мозжечок кора, зрительный бугор, хвостатое ядро).
На базе ФКУЗ "Микроб" (г. Саратов) в 2014 г. проведены клинические испытания 3-х серий медицинского изделия: набор «Вектор - Западный Нил-антиген» с использованием набора предприятия СПП-ЗН-2013 "Стандартная панель образцов, содержащих и не содержащих антиген вируса Западного Нила", состоящая из 8 образцов и набора клинических образцов (270 шт.), содержащих и не содержащих антиген вируса Западного Нила (перечисленные выше).
Заключение по протоколам медицинских испытаний 2014 г. на базе ФКУЗ "Микроб" (г.Саратов) и на базе ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" (р.п. Кольцово, НСО): Изделие медицинского назначения набор реагентов «Вектор - Западный Нил-антиген», Россия, предназначенный для качественного и количественного определения антигена вируса Западного Нила в полевых (клещах) и клинических (в гомогенатах органов животных и человека) образцах методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) на твердофазном носителе в клинических и эпидемиологических исследованиях, по результатам медицинских испытаний может быть рекомендовано к использованию в медицинской практике лечебно-профилактических и санитарно-профилактических учреждений для клинической лабораторной диагностики на территории Российской Федерации. Приказом Росздравнадзора от 09.09.2014 г. зарегистрировано медицинское изделие «Вектор - Западный Нил-антиген» и выдано регистрационное удостоверение № РЗН 2014/1944.