Способ повышения чувствительности иммунохроматографических тест-систем лактатом серебра и гидрохиноном
METHOD FOR INCREASING SENSITIVITY OF IMMUNOCHROMATOGRAPHIC TEST SYSTEMS WITH SILVER LACTATE AND HYDROQUINONE

Данное изобретение относится к области иммунохроматографического анализа и может быть использовано с целью повышения чувствительности разрабатываемых иммунохроматографических тест-систем.
Иммунохроматографическая тест-система представляет собой мультимембранный композит, состоящий из нитроцеллюлозной мембраны, мембраны с иммобилизованным конъюгатом моно- или поликлональных антител к детектируемому антигену с маркером, мембраны для внесения образца и адсорбирующей мембраны. В качестве маркера в иммунохроматографии чаще всего используют наночастицы коллоидного золота.
Существуют различные методики усиления оптического сигнала, генерируемого наночастицами коллоидного золота в тест-системах.
-3
-3
Из уровня техники известна методика, основанная на применении ферментов [Parolo, C. Enhanced lateral flow immunoassay using gold nanoparticles loaded with enzymes / C. Parolo, A. de la Escosura-Muñiz, A.  Merkoçi // Biosensors and Bioelectronics. – 2013. – V. 40. – P. 412-416.]. Предложена иммунохроматографическая тест-система, в которой наночастицы золота конъюгированы с антителами и пероксидазой. После проведения иммунохроматографического анализа тест-полоску отмывают от несвязавшихся реагентов и погружают в раствор субстрата пероксидазы (тетраметилбензидина), дающего ярко-синий нерастворимый продукт окисления. Усиление окрашивания позволило снизить предел обнаружения с 5 нг×см до 200 пг×см.
Дрыгин Ю.Ф. и соавторы предложили другой способ усиления аналитического сигнала в иммунохроматографии, который состоит в использовании наночастиц серебра диаметром 20 нм, агрегирующих на поверхности наночастиц коллоидного золота (НчКЗ) и в10 раз увеличивающих интенсивность окрашивания [Дрыгин, Ю.Ф. Высокочувствительный иммунохроматографический экспресс-метод определения зараженности растений вирусом табачной мозаики / Ю.Ф. Дрыгин, А.Н. Блинцов и соавт. // Биохимия. — Т. 74. – № 9. – 2009. — С. 986-993].
Методика усиления серебром основана на реакции физического проявления, используемой в фотографии. Помимо восстановителя «физический» проявитель содержит ионы или комплексы металлов. Из таких растворов происходит осаждение металлов на центры скрытого изображения.  При гистохимическом серебрении в качестве подобных центров выступают НчКЗ. Наночастицы катализируют восстановление ионов серебра из соли до металлического серебра. Оболочка металлического серебра вокруг частицы золота, в свою очередь, ускоряет восстановление, и реакция становится автокаталитической. Впервые эта методика была использована для гистохимического анализа в 1981 г. В качестве восстановителя автор использовал гидрохинон, а из солей серебра отдал предпочтение лактату [Дыкман, Л.А. Золотые наночастицы. Синтез, свойства, биомедицинское применение [Текст] / Л.А. Дыкман, В.А. Богатырев, С.Ю. Щеголев, Н.Г. Хлебцов // М: Наука. – 2008. – С. 195-196].
H. pylori
Helicobacter pylori
Наиболее близкой к изобретению является иммунохроматографическая тест-система для детекции белка CagA  [Богачева, Н.В. Иммунохроматографическая тест-система для выявления патогенных штаммов  / Н.В. Богачева, И.В. Дармов, Д.Н. Смирнова // Патент на изобретение RU 2642588 C1, МПК G01N33/543, G01N33/577, заявка №2017108557 от 14.03.2017, опубл.: 25.01.2018 в Бюл. № 3]. Данная тест-система представляет собой мультимембранный композит, состоящий из мембраны для образца, адсорбирующей мембраны, нитроцеллюлозной мембраны, на поверхность которой наклеена мембрана, пропитанная конъюгатом моноклональных антител, клон НР-387 («Биалекса», Россия), с наночастицами колодного золота со средним диаметром 30 нм, и нанесены в поперечном направлении моноклональные антитела, клон HP-1811 («Биалекса», Россия), в тестовой и антивидовые антитела козы против Ig мыши («Биалекса», Россия) – в контрольной зонах.
H. pylori
Авторами предложен способ повышения чувствительности иммунохроматографических тест-систем с применением лактата серебра и гидрохинона на примере тест-системы для детекции белка CagA .
Технический результат изобретения – разработка способа повышение чувствительности иммунохроматографических тест-систем, предначначенных для детекции как инфекционных, так и неинфекционных агентов, не менее чем в четыре раза.
H.pylori
Технический результат достигается путем отработки вариантов нанесения лактата серебра на компоненты мультимембранного композита, выбора концентрации лактата серебра, оценки влияния гидрохинона на усиление оптического сигнала в аналитической зоне тест-системы, с последующим определением порога чувствительности усиленного вышеуказанными иммунохимическими компонентами экспериментального образца иммунохроматографической тест-системы при теститровании с музейными культурами  и антигеном AGHPY-0100.
Способ повышения чувствительности иммунохроматографических тест-систем заключается в предварительной подготовке двух мембран – нитроцеллюлозной, пропитанной  0,075 % раствором лактата серебра, и мембраны, обработанной 3 % раствором гидрохинона, приготовленном на 0,5 М цитратном буфере с рН 4,0; сборке готового мультимемранного композита иммунохроматографической тест-системы с нанесенными на мембраны иммунохимическими компонентами; тестировании готовой имунохроматографической тест-системы путем внесения 100 мкл пробы на мембрану для образца; наложении через 10 минут после внесения пробы на детектируемую зону тест-системы мембраны, пропитанной 3 % гидрохиноном; нанесении на наложенную мембрану 30 мл буфера разгона, экспозиции в течении 5 мин, удалении мембраны с гидрохиноном и определении в тестовой зоне детектируемого антигена.
H.pylori,
H. pylori
Полученное повышение чувствительности иммунохроматографической тест-системы в четыре раза подтверждено примерами тестирования разработанной иммунохроматографической тест-системы, для выявления белка CagA  как при тестировании с культурой микроорганизма, так и при тестировании антигена AGHPY-0100, в состав которого входят внутриклеточные белки , ассоциированные с генами cagA (120 kd) и vacA (87 kd) и уреазой.
H.pylori
В работе использовали моноклональные антитела к белку cagA , клоны НР-1811 и НР-387 («Биалекса», Россия); антивидовые антитела козы против IgG мыши («Биалекса», Россия); соляную кислоту (ГОСТ 3118-77); лактат серебра («Sigma Aldrich», США); гидрохинон (Россия); антиген AGHPY-0100 («Arista Biologicals»); цитрат натрия («Реахим», Россия); лимонную кислоту («Реахим», Россия); трис(гидроксиметил)аминометан C4H11NO3 («Sigma», США); трис гидрохлорид C4H12ClNO3 («Panreac», Испания); Tween-20 («AppliChem», Германия).
В состав мультимембранного комплекса вошли мембраны фирмы «MDI», Индия: нитроцеллюлозные мембраны TYРЕ-СNРF-SN12-L2-Р25 8μ и 10μ; мембраны для нанесения образцов TYPE-GFB-R4(0.35); мембраны из стекловолокна для конъюгата PT-R5; мембраны для абсорбента TYPE-AP 045.
Все растворы готовили на деионизированной воде. Для получения деионизированной воды применяли систему UF Arium 611 UF («Sartorius», Германия).
H.pylori
Helicobacter pylori
Этапы разработки способа повышения чувствительности иммунохроматографических тест систем лактатом серебра и гиброхиноном рассмотрим на примере совершенствования иммунохроматографтической тест-системы для детекции белка CagA [Богачева, Н.В. Иммунохроматографическая тест-система для выявления патогенных штаммов  / Н.В. Богачева, И.В. Дармов, Д.Н. Смирнова // Патент на изобретение RU 2642588 C1, МПК G01N33/543, G01N33/577, заявка №2017108557 от 14.03.2017, опубл.: 25.01.2018 в Бюл. № 3].
H.pylori.
Получение экспериментального образца иммунохроматографтической тест-системы для детекции белка CagA
Готовили конъюгат наночастиц коллоидного золота размером 30 нм с МкАТ НР-387 согласно методике, указанной в патенте на изобретение RU 2642588 C1.
2
Раствор конъюгата методом пропитывания наносили на мембраны для конъюгата с плотностью нанесения 30 мкл на 1 сми высушивали на воздухе при комнатной температуре в течение 24 часов.
-3
Для формирования тестовой зоны использовали МкАТ НР-1811, для формирования контрольной зоны – антивидовые антитела козы против иммуноглобулинов мыши в концентрации 10 мг×см. Тест-системы высушивали при комнатной температуре в течение суток.
Склеивание тест-систем проводили последовательно: на нитроцеллюлозную мембрану наклеивали мембрану с иммобилизованным конъюгатом, мембрану для образца и мембрану для адсорбента. Затем полученный мультимембранный композит нарезали при помощи резака («Rahmenlos Katze Geschenk Shirt», CША) на отдельные полоски шириной 3,5 ÷ 4,0 мм.
Разработанный экспериментальный образец иммунохроматографической тест-системы поясняется фиг. 1, на которой представлен состав мультимембранного композита и основные иммунохимические компоненты тест-системы:
1 – мембрана для нанесения образца TYPE-GFB-R4(0.35);
2 – конъюгат НчКЗ с МкАТ НР-387, нанесенный на мембрану РТ-R5;
-3
3 – МкАТ НР-1811 в концентрации 12 мг×см;
4 – нитроцеллюлозная мембрана TYРЕ-СNРF-SN12-L2-Р25 10μ;
-3
5 – антивидовые козьи АТ против Ig мыши в концентрации 10 мг×см;
6 – адсорбирующая мембрана TYPE-AP 045.
Усиление тест-системы лактатом серебра и гидрохиноном
На нитроцеллюлозную (рабочую) мембрану иммунохроматографической тест-системы наносили 0,075 % раствор лактата серебра. Оставляли сушиться в темноте на сутки. Полученную мембрану использовали для изготовления иммунохроматографических тест-систем.
На мембрану из стекловолокна PT-R5 наносили 3 % раствором гидрохинона, приготовленный на 0,5 М цитратном буфере с рН 4,0. Мембрану сушили при комнатной температуре в темном месте.
H. pylori
При тестировании иммунохроматографической тест-системы после нанесения на мембрану для образца исследуемого материала ждали 10 мин до появления сигнала в контрольной и, при наличии в пробе белка CagA , в аналитической зоне, а затем накладывали поверх нитроцеллюлозной мембраны, в область детекции, мембрану из стекловолокна PT-R5, пропитанную 3 % раствором гидрохинона. Поверх мембран капали 30 мкл буфера разгона (0,01 М Трис-HCl буфер с 1 М NaCl с0,1 % Tween-20, pH 7,5). Через 10 мин снимали мембрану с гидрохиноном и учитывали результат.
H. pylori
Изобретение иллюстрируется примерами сранительной оценки чувствительности немодифицированного и модифицированного, усиленного лактактом серебра и гидрохиноном, вариантов тест-системы с cag+ штаммом  и антигеном AGHPY-0100 («Arista Biologicals», США).
H. pylori.
Пример 1. Тестирование немодифицированного и модифицированного вариантов иммунохроматографической тест-системы со штаммом
H. pylori.
H.pylori
H. pylori
Для оценки чувствительности использовали cag+ штамм  Данный штамм был выделены из биологических материалов лиц, имеющих в анамнезе гастрит и язвенную болезнь желудка (содержимое зубодесневых карманов и биоптаты слизистой оболочки желудка). Принадлежность культур к подтверждена бактериологическим и биохимическим методами, а к cag+ штамму  – путем постановки ПЦР при использовании коммерческих тест-систем («Хеликопол VA», «Хеликопол CA», «Хеликопол IA», «Хеликопол BA» (Россия), «ДНК-технологии», Россия) и методом иммунохроматографии при использовании коммерческой тест-системы («NovaMed», Израиль).
H.pylori,
9
9
-3
Для тестирования использовали культуру разведенную буфером разгона начиная с концентрации 10×10 с «шагом два» до концентрации 0,31×10м.к.×см. В качестве контроля использовали буфер разгона.
На мембрану для образца немодифицированной и модифицированной тест-систем наносили 100 мкл исследуемой пробы в определенной концентрации. В случае с модифицированным вариантом, после нанесения культуры через 10-15 минут поверх тестовой и контрольной зон тест-систем накладывали мембрану PT-R5, пропитанную 3 % раствором гидрохинона.
H.pylori
Результаты определяли визуально в течение 20-25 мин. При наличии белка СagA  в пробе, при нанесении ее в объеме 100 мкл на подложку для образца, антиген взаимодействует с конъюгатом МкАТ с НчКЗ, образуя окрашенный иммунокомплекс «антиген-антитело», который движется под действием капиллярных сил вдоль нитроцеллюлозной мембраны, пересекает тестовую зону и взаимодействует с иммобилизованными на указанной тестовой зоне специфическими МкАТ – тестовая зоны окрашивается в розовый цвет. Далее несвязавшийся в тестовой зоне конъюгат продолжает движение вдоль хроматографической мембраны и взаимодействует с иммобилизованными в контрольной зоне антивидовыми кроличьим антителами против иммуноглобулинов мыши. В результате контрольная зона также окрашивается в розовый цвет, что является внутренним контролем теста. Если анализ проведен правильно, она должна проявляться всегда, независимо от присутствия антигена в исследуемом образце.
H. pylori
9
-3
8
-3
Результаты тестирования разработанных вариантов тест-систем с культурой , представленные на фиг. 2, свидетельствуют о снижении порога детекции в четыре раза – с 2,5×10м.к.×см до 6,25×10м.к.×см.
Пример 2. Тестирование иммунохроматографической тест-системы с антигенным препаратом AGHPY-0100 («Arista Biologicals», США)
H. pylori
В состав антигенного препарата AGHPY-0100 («Arista Biologicals», США) входят внутриклеточные белки , ассоциированные с генами cagA (120 kd) и vacA (87 kd) и уреазой.
-3
Исследование чувствительности иммунохроматографической тест-системы с антигенным препаратом AGHPY-0100 проводили аналогично, с использованием немодифицированного и модифицированного лактатом серебра вариатов тест-систем. Антиген разводили буфером разгона от 0,5 до 0,062 мг×см и наносили по 100 мкл на мембрану для образца. Результат оценивали через 20-25 мин.
-3
-3
Результаты анализа разработанных вариантов тест-систем с антигенным препаратом, представленные на фиг. 3, свидетельствуют о снижении порога детекции также в четыре раза – с 0,5 мг×см до 0,125 мг×см.