АРАБИНОКСИЛООЛИГОСАХАРИДЫ В ПИВЕ
ARABINOXYLOOLIGOSACCHARIDES IN BEER

Настоящее изобретение относится к способам увеличения уровня растворимых арабиноксилоолигосахаридов в пиве, чтобы улучшить его вкус и ощущение во рту от такого пива. Кроме того, настоящее изобретение относится к видам пива, обогащенного растворимыми арабиноксилоолигосахаридами.
Пиво богато калориями из-за относительно высокой концентрации алкоголя и перевариваемых углеводов, в частности мальтодекстринов, мальтозы и глюкозы. Перевариваемые углеводы оказываются в пиве в результате неполной деградации крахмала до мальтозы и глюкозы и/или неполной ферментации мальтозы и глюкозы до алкоголя. Уменьшение калорийности пива путем снижения спиртового содержания и/или содержания перевариваемых углеводов, обычно приводит к потере желаемого вкуса и/или ощущения во рту, что отрицательно воспринимается большинством потребителей. При производстве низкокалорийных видов пива и низкоалкогольных видов пива требуется найти баланс между уменьшением уровня перевариваемых углеводов и поддержанием приемлемого вкуса и/или ощущения во рту, которое обычно придают эти углеводы. В данной области существует потребность в решении этой задачи с сохранением умеренной стоимости продукта и, по возможности, без значительных модификаций традиционных технологий пивоварения.
Настоящее изобретение основано на обнаружении того, что увеличение концентрации растворимых низкомолекулярных арабиноксиланов выше концентрации, естественно присутствующей в пиве, улучшает вкус и/или ощущение во рту от указанного пива. В таблице 1 приведен обзор содержания растворимых арабиноксиланов в различных коммерчески доступных видах пива, показывающий, что большинство видов пива содержат ограниченное количество растворимых арабиноксиланов, обычно, менее чем около 2,0 г/л. Кроме того, концентрация указанных низкомолекулярных растворимых арабиноксиланов изменяется в зависимости от типа пива. Аналогичную степень изменения растворимых арабиноксиланов в соответствии с типом пива ранее наблюдали Schwarz and Han, 1995 с использованием своего неутвержденного метода для определения содержания арабиноксиланов в пиве.
Настоящее изобретение основано на обнаружении того, что концентрация растворимых арабиноксиланов, главным образом, низкомолекулярных арабиноксилоолигосахаридов, определяет вкус и/или вкусовое ощущение различных видов пива, особенно видов пива низового брожения. Кроме того, обнаружили, что вкус и/или вкусовое ощущение пива улучшают увеличением концентрации арабиноксилоолигосахаридов (далее обозначаемых здесь «AXOS» - структур по Фиг.1 EP-1418819-B1) со средней степенью полимеризации ниже 50 в указанном пиве выше конкретного уровня. AXOS обычно существуют в виде гетерогенной смеси родственных олигосахаридов, отличающихся друг от друга степенью полимеризации (далее обозначаемой «DP») бета-1,4-ксилозного остова и степени замещения (DS) бета-1,4-ксилозного остова звеньями арабинозы. AXOS могут также нести замещения либо ксилозных, либо арабинозных звеньев такими остатками, как 4-O-метилглюкуроновая кислота, уксусная кислота, феруловая кислота или п-кумаровая кислота. AXOS можно получать из арабиноксилана частичным гидролизом, с использованием, например, либо кислот, либо ферментов эндоксиланаз. Арабиноксилан, обозначаемый также как пентозан (поскольку он состоит из моносахаридов пентозного типа ксилозы и арабинозы), обладает таким же составом, как и AXOS, за исключением того, что полисахаридные цепи намного длинней, обычно, с DP 5000 или выше. Арабиноксилан и AXOS представляют собой неперевариваемые углеводы. Цельные зерна ячменя и пшеницы, сырье, традиционно применяемое для изготовления пива, являются особенно богатыми арабиноксиланом и содержат до 6-10% этого полисахарида. Во время традиционного пивоварения главная часть арабиноксиланов не экстрагируется из зерен и остается в пивной дробине после фильтрации. Известно, что растворимые арабиноксиланы производят серьезные проблемы в пивоварении, включая уменьшенные скорости разделения сусла, низкие скорости выделения экстракта солода, укороченное время службы фильтра и уменьшенные скорости фильтрации пива.
Настоящее изобретение относится к способу увеличения по меньшей мере приблизительно на 5%, предпочтительно, по меньшей мере на 20%, более предпочтительно, по меньшей мере на 30%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 40%, например, по меньшей мере на 50% уровней содержания растворимых арабиноксилоолигосахаридов в пиве, например, деградацией арабиноксиланов из зерновых во время изготовления пива посредством экзогенно добавляемых ферментов, или дополнением сусла или пива полученными внешним образом арабиноксилоолигосахаридами. В одном варианте осуществления изобретения экзогенно добавляемые ферменты, применяемые во время изготовления пива, представляют собой эндоксиланазы. В другом варианте осуществления изобретения полученными внешним образом арабиноксилоолигосахариды получены из природных источников, таких как растительный материал, и более предпочтительно, из зерновых источников. Виды пива по этому изобретению с увеличенными уровнями арабиноксилоолигосахаридов обладают улучшенным вкусом и вкусовым ощущением.
На прилагаемых иллюстрациях:
фиг.1 - данные органолептического анализа коммерческого пива (Bud Light), к которому добавляли либо 2 г/л, либо 10 г/л AXOS. Столбцы представляют средние баллы, и планки погрешностей указывают стандартное отклонение. Столбцы с разными буквами значимо отличаются друг от друга согласно тесту Фридмана в ANOVA при p<0,05.
Фиг.2 - данные органолептического анализа двух видов экспериментального пива, сваренных из одного и того же сусла, до и после обогащения AXOS. Столбцы представляют средние баллы, и планки погрешностей указывают стандартное отклонение. Для столбцов со звездочкой показали значимое отличие от соответствующего значения согласно знаковому ранговому критерию Уилкоксона при p<0,05.
Анализ содержания растворимого арабиноксилана в различных видах коммерчески доступного пива показал, что большинство видов пива содержат ограниченное количество растворимых арабиноксиланов, обычно, менее чем около 2,0 г/л. Концентрация указанных растворимых арабиноксиланов меняется согласно типу пива, как показано в таблице 1 ниже, однако на основании содержания растворимого арабиноксилана коммерчески доступные в настоящее время виды пива можно разделить на две отдельные группы.
Первая группа содержит виды пива, которые, обычно, получают низовым брожением сусла малой плотности или разведенного сусла, или разведением сусла после низового брожения, и которые содержат менее 0,75 г растворимых арабиноксиланов на литр. Внутри указанной первой группы можно идентифицировать два различных типа пива:
(i) виды пива, содержащие менее 3,5% (об./об.) алкоголя, предпочтительно, менее 1,5% (об./об.), и обычно обозначаемые как низкоалкогольные виды пива или «безалкогольные» виды пива; содержание мальтодекстрина в этом типе пива может являться довольно высоким, обычно, по меньшей мере 30 г на литр;
(ii) виды пива, содержащие более 3,5% (об./об.) алкоголя, но содержащие менее 3 г действительного содержания экстрактивных веществ на 100 мл, предпочтительно, менее 2,5 г на 100 мл, и обычно обозначаемые как низкокалорийные виды пива или «светлые» виды пива; обычно, содержание мальтодекстрина в этом типе пива менее чем около 15 г на литр.
Вторая группа содержит виды пива, обладающие содержанием алкоголя выше 3,5% (об./об.) и содержащие более 3 г действительного содержания экстрактивных веществ на 100 мл. Виды пива, содержащиеся в этой второй группе, обычно, содержат от около 0,7 до около 2,0 г растворимых арабиноксиланов на литр, и внутри указанной группы можно идентифицировать два главных типа пива:
(i) Пиво «лагер», т.е. низового брожения, называют также пивом «пильзенер». Многие из видов пива этого типа содержат между 3,5% и 6% (об./об.) алкоголя и между 3,0 и 5,0 г действительного содержания экстрактивных веществ на 100 мл. Однако лагерные виды пива, содержащие более 6% (об./об.) алкоголя и/или более 5,0 г действительного содержания экстрактивных веществ на 100 мл, могут также являться коммерчески доступными.
(iii) Виды пива верхового брожения, содержащие более 3,5% (об./об.) алкоголя и более 3,0 г действительного содержания экстрактивных веществ на 100 мл. Они могут содержать до приблизительно 12,0% (об./об.) алкоголя и/или до 9,0 г действительного содержания экстрактивных веществ на 100 мл.
Настоящее изобретение основано на обнаружении, что увеличение по меньшей мере на приблизительно 5% концентрации растворимых арабиноксиланов в пиве улучшает вкус и/или вкусовое ощущение указанного пива. Таким образом, первый объект настоящего изобретения относится к способу улучшения вкуса и/или вкусового ощущения пива увеличением концентрации растворимых арабиноксиланов по меньшей мере приблизительно на 5%, например, по меньшей мере приблизительно на 30%, например, по меньшей мере на 40% или по меньшей мере на 50% и до увеличения приблизительно на 150% или более, выше концентрации, полученной в результате обычного способа пивоварения, как в настоящее время известно в данной области. Увеличенные уровни растворимых арабиноксиланов в сусле или пиве не влияют отрицательно на процесс пивоварения, когда такие растворимые арабиноксиланы имеют среднюю степень полимеризации (DP) ниже 50. Кроме того, органолептический анализ видов пива, обогащенных такими растворимыми арабиноксиланами, обладающих DP ниже 50, не выявил каких-либо нежелательных увеличений ощущаемой вязкости пива. Таким образом, настоящее изобретение относится к обогащению пива растворимыми арабиноксиланами, обладающими средней DP ниже 50, предпочтительно, с DP между 3 и 40, более предпочтительно, между 3 и 30, например между 5 и 20.
В первом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу улучшения вкуса и/или вкусового ощущение пива, полученного способом низового брожения, в котором пиво содержит либо уровень алкоголя ниже 3,5% (об./об.), либо действительное содержание экстрактивных веществ менее 3,0 г на 100 мл, посредством обогащения указанного пива растворимыми арабиноксиланами, как описано в настоящем описании выше, таким образом, получая концентрацию более 1,2 г растворимых арабиноксиланов со средней DP ниже 50, предпочтительно, между 3 и 40, более предпочтительно, между 3 и 30, например между 5 и 20 на литр пива, например более 1,4 г на литр, предпочтительно, более 1,6 г на литр, более предпочтительно, более 1,8 г на литр, и наиболее предпочтительно, более 2,0 г на литр, например более 3,0 г на литр или даже более 4,0 г на литр, и до приблизительно 20 г на литр. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, указанное пиво является так называемым низкоалкогольным или «безалкогольным» пивом, содержащим менее 3,5% (об./об.) алкоголя, предпочтительно, менее 1,5% (об./об.) алкоголя, более предпочтительно, менее 1,0% (об./об.) алкоголя. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанное пиво представляет собой так называемое низкокалорийное или «светлое» пиво, содержащее менее 3,0 г на 100 мл действительного содержания экстрактивных веществ, более предпочтительно, менее 2,0 г на 100 мл.
Во втором варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу улучшения вкуса и/или вкусового ощущения пива, содержащего уровень алкоголя между 3,5 и 6% (об./об.) алкоголя и действительное содержание экстрактивных веществ между приблизительно 3,0 и 5,0 г на 100 мл, посредством обогащения указанного пива растворимыми арабиноксиланами способом, как описано в настоящем описании выше, таким образом, получая концентрацию более приблизительно 2,0 г растворимых арабиноксиланов со средней DP ниже 50, предпочтительно, между 3 и 40, более предпочтительно, между 3 и 30, например между 5 и 20 на литр пива, например более 2,5 г на литр, предпочтительно, более 3,0 г на литр, более предпочтительно, более 3,5 г на литр, наиболее предпочтительно, более 4,0 г на литр, например, более 4,5 г на литр или более 5,0 или 6,0 г на литр, и до приблизительно 25 г на литр. В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанное пиво получают с использованием способа низового брожения, хорошо известного в данной области. Предпочтительно, такие виды пива, полученные низовым брожением, обогащают растворимыми арабиноксиланами способом, как описано в настоящем описании, таким образом, получая концентрацию более приблизительно 2,0 г растворимых арабиноксиланов со средней DP ниже 50, предпочтительно, между 3 и 40, более предпочтительно, между 3 и 30, например между 5 и 20 на литр пива, например более 2,5 г на литр, предпочтительно, более 3,0 г на литр, более предпочтительно, более 3,5 г на литр, наиболее предпочтительно, более 4,0 г на литр, например, более 4,5 г на литр или более 5,0 или 6,0 г на литр, и до приблизительно 25 г на литр.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанное пиво получают с использованием способа верхового брожения, хорошо известного в данной области. Предпочтительно, такие виды пива, полученные верховым брожением, обогащают растворимыми арабиноксиланами способом, как описано в настоящем описании, таким образом, получая концентрацию более приблизительно 2,0 г растворимых арабиноксиланов со средней DP ниже 50, предпочтительно, между 3 и 40, более предпочтительно, между 3 и 30, например между 5 и 20 на литр пива, например более 2,5 г на литр, предпочтительно, более 3,0 г на литр, более предпочтительно, более 3,5 г на литр, наиболее предпочтительно, более 4,0 г на литр, например более 4,5 г на литр или более 5,0 или 6,0 г на литр, и до приблизительно 25 г на литр. В конкретном варианте осуществления такие виды пива, полученные верховым брожением, обогащают указанными растворимыми арабиноксиланами, таким образом, получая концентрацию более приблизительно 7,0 г, более предпочтительно, более 8,0 г указанных растворимых арабиноксиланов на литр и до приблизительно 25 г на литр.
В следующем варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу улучшения вкуса и/или вкусового ощущения пива, содержащего уровень алкоголя выше 6% (об./об.) алкоголя и действительное содержание экстрактивных веществ выше 5,0 г на 100 мл, посредством обогащения указанного пива растворимыми арабиноксиланами способом, как описано в настоящем описании выше, таким образом, получая концентрацию более 2,4 г растворимых арабиноксиланов со средней DP ниже 50, предпочтительно, между 3 и 40, более предпочтительно, между 3 и 30, например между 5 и 20 на литр пива, предпочтительно, более 3,0 г на литр, более предпочтительно, более 4,0 г на литр, например более 5,0 г на литр или более 6,0 г на литр, и до приблизительно 30 г на литр. В предпочтительном варианте осуществления указанное пиво получают с использованием способа низового брожения, хорошо известного в данной области. В другом предпочтительном варианте осуществления указанное пиво получают с использованием способа верхового брожения, хорошо известного в данной области.
Концентрацию растворимого арабиноксилана в образцах пива предпочтительно определяют следующим образом. Сначала образец пива декарбонизируют обработкой ультразвуком в течение 10 минут с последующей фильтрацией через общепринятую бумажную мембрану. 2,5 мл указанного декарбонизированного образца пива смешивают с 2,5 мл 4,0 M трифторуксусной кислоты (конечная концентрация 2,0 M) и инкубируют при 110°C в течение 60 минут. После гидролиза смесь фильтруют и 3,0 мл фильтрата дополнительно обрабатывают добавлением 1,0 мл раствора внутреннего стандарта (100 мг бета-D-аллозы в 100 мл насыщенного до 50% раствора бензойной кислоты), 1,0 мл раствора аммиака (25% об./об.) и 3 капель 2-октанола. Моносахариды восстанавливают до альдитов добавлением 200 мкл раствора борогидрида натрия (200 мг борогидрида натрия в 1,0 мл 2 M аммиака) и образец инкубируют в течение 30 минут при 40°C. Реакцию останавливают добавлением 400 мкл ледяной уксусной кислоты. Для реакции ацетилирования 500 мкл образца, содержащего альдиты, добавляют к 5,0 мл уксусного ангидрида и 500 мкл 1-метилимидазола. Через 10 минут избыток уксусного ангидрида удаляют добавлением 900 мкл этанола к образцу. Затем ацетаты альдитов концентрируют в органической фазе добавлением воды (10 мл) и раствора гидроксида калия (2 раза по 5,0 мл 7,5 M раствора, с промежуточной выдержкой несколько минут). Раствор бромфенолового синего (500 мкл, 0,04% мас./об.) добавляют в качестве индикатора для водной фазы. Аликвоты по 1 мкл органической фазы, содержащей образованные ацетаты альдитов, разделяют газовой хроматографией на подходящей полярной колонке (например, колонке Supelco SP-2380, 30 м X 0,32 мм I.D.; толщина пленки 0,2 мкм, Supelco, Bellefonte, PA, USA) в хроматографе (например, серий Agilent 6890, Wilmington, DE, USA), оборудованном детектором ионизации пламени. Очищенные моносахариды D-ксилозу, L-арабинозу и, необязательно, D-галактозу обрабатывают параллельно с каждым набором образцов для целей калибровки.
Для цели по настоящему изобретению содержание растворимых арабиноксиланов в образцах пива предпочтительно рассчитывают с использованием формулы:
содержание растворимого арабиноксилана = 0,88×(% арабинозы +% ксилозы) (1).
Однако специалист в данной области будет сознавать, что в предшествующем уровне техники содержание арабиноксилана иногда рассчитывали с использованием коррекции на содержание арабиногалактана с использованием предполагаемой формулы:
корр.
содержание растворимого арабиноксилана=0,88×(% арабинозы -0,7 ×% галактозы +% ксилозы) (2).
Обогащение видов пива по меньшей мере на 5%, предпочтительно, по меньшей мере на 20%, более предпочтительно, по меньшей мере на 30%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 40%, например, по меньшей мере на 50% растворимых арабиноксиланов, обладающих желательной DP, можно получать, с использованием, т.е. добавлением, препарата, содержащего растворимые арабиноксиланы, в качестве ингредиента в способе пивоварения. Предпочтительно, указанный содержащий арабиноксилан препарат получают из зерновых, например, таких как пшеница, рожь, ячмень, овес, тритикале, рис, просо, сорго или кукуруза, и он может содержать более приблизительно 15 вес.% арабиноксилана, имеющего среднюю DP менее 50, предпочтительно, между 3 и 40, еще предпочтительнее между 3 и 30, например между 5 и 20, предпочтительно, более 30 вес.% таких растворимых арабиноксиланов, более предпочтительно, более 40 вес.%, например более 50% в указанном препарате. В подходящем варианте осуществления способ по изобретению включает добавление указанного содержащего растворимый арабиноксилан препарата в качестве вспомогательного средства или добавки во время одной из стадий затирания, варки сусла, охлаждения сусла, брожения или вторичного брожения процесса пивоварения. Если указанный содержащий растворимый арабиноксилан препарат используют как добавку для предоставления ингредиента по этому изобретению для вкуса и/или вкусового ощущения в изготовлении низкоалкогольного или низкокалорийного пива, преимущественно, указанный препарат не должен содержать значительных или высоких уровней поддающихся ферментации или метаболизируемых углеводов.
Альтернативно, обогащение различных видов пива по меньшей мере на 5%, предпочтительно, по меньшей мере на 20%, более предпочтительно, по меньшей мере на 30%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 40%, например по меньшей мере на 50% растворимыми арабиноксиланами, обладающими желательной DP, можно получать с использованием препарата эндоксиланазы, содержащего отдельную эндоксиланазу или комбинацию различных типов эндоксиланаз, во время процесса пивоварения. Предпочтительно, указанную эндоксиланазу или комбинацию эндоксиланаз выбирают так, чтобы стимулировать солюбилизацию как экстрагируемых водой, так и не экстрагируемых водой арабиноксиланов из содержащих арабиноксилан ингредиентов пивоварения, таких как осоложенное зерно злаков, не осоложенное зерно злаков, или полученные из зерен злаков фракции. Предпочтительно, добавление данного количества препарата эндоксиланазы должно приводить к повышенному на 30%, более предпочтительно, на 40%, например на 50%, присутствию растворимых арабиноксиланов в сусле по сравнению с суслом, полученным в отсутствие какой-либо добавленной эндоксиланазы. Пригодность данной концентрации эндоксиланазы или комбинации эндоксиланаз для обогащения пива растворимыми арабиноксиланами в соответствии с настоящим изобретением можно определять следующим образом:
• получение при 45°C сусла, содержащего 200 г солода /л воды, где указанный солод может, например, содержать 100% ячменного солода или 80% ячменного солода и 20% пшеничного солода;
• добавление указанного препарата эндоксиланазы в данной концентрации;
• инкубация сусла при 45°C в течение 2 часов;
• нагревание сусла до 70°C при скорости 1°C в минуту и поддержание сусла при 70°C в течение 60 минут;
• фильтрация сусла посредством фильтрации с последующей варкой жидкой фракции в течение 30 минут;
• получение образца для анализа растворимого арабиноксилана после центрифугирования (10000 г, 15 мин) сваренного сусла для удаления суспендированных частиц;
• определение растворимых арабиноксиланов в указанном образце сусла и сравнение содержания растворимого арабиноксилана в указанном образце с содержанием растворимого арабиноксилана в контрольном образце сусла, полученном, как описано выше, но в отсутствие каких-либо добавленных эндоксиланаз. В случае, когда концентрация растворимых арабиноксиланов в образце, содержащем эндоксиланазу или комбинацию эндоксиланаз, выше более чем на 25%, более предпочтительно, более чем на 30%, наиболее предпочтительно, более чем на 40%, например более чем на 50%, чем в контрольном образце, можно решить, что эндоксиланаза или комбинация эндоксиланаз в тестируемой концентрации является пригодной для обогащения пива растворимыми арабиноксиланами в соответствии с настоящим изобретением.
Одну или более эндоксиланаз предпочтительно добавляют во время затирания, однако может являться благоприятным также добавлять эндоксиланазу в течение любой другой стадии процесса пивоварения, такой как варка сусла, охлаждение сусла, брожение и вторичное брожение. Если более одного типа эндоксиланаз используют в способе пивоварения, можно либо добавлять различные типы эндоксиланаз одновременно, либо можно каждый тип эндоксиланазы добавлять во время различной стадии процесса пивоварения. Поскольку является особенно важным солюбилизировать не экстрагируемые водой арабиноксиланы, содержащиеся в осоложенном зерне, чтобы увеличивать общую концентрацию растворимых арабиноксиланов в пиве, является преимущественным, чтобы на стадии затирания процесса пивоварения добавляли по меньшей мере одну эндоксиланазу, способную легко солюбилизировать не экстрагируемые водой арабиноксиланы, такую как эндоксиланаза семейства гликозидгидролаз 11. Кроме того, обнаружили, что из-за присутствия ингибиторов эндоксиланаз в злаках некоторые ингибированные эндоксиланазы, включая семейство 11 эндоксиланаз, являлись неэффективными для солюбилизации соответствующих количеств арабиноксиланов. Таким образом, является предпочтительным, чтобы одна или более из добавленных эндоксиланаз менее легко поддавались ингибированию видом ингибиторов эндоксиланаз, часто присутствующих в злаках.
Кроме того, гидролиз и/или солюбилизация арабиноксиланов, содержащихся в осоложенном зерне, обычно увеличивается, когда по меньшей мере одна эндоксиланаза из указанных одной или более эндоксиланаз остается активной в пределах полного диапазона температур, применяемых во время стадии затирания и стадии фильтрации, где указанные температуры, обычно, меняются от приблизительно 40°C до приблизительно 80°C, предпочтительно, между 45°C и 78°C, например, между 60°C и 72°C. Кроме того, является преимущественным, чтобы по меньшей мере одна эндоксиланаза из указанных одной или более эндоксиланаз проявляла при 72°C ферментативную активность, соответствующую не менее 20% ее ферментативной активности в пределах оптимального диапазона температур для указанного фермента, в сусле на основе злаков.
В конкретном варианте осуществления этого изобретения добавление или использование эндоксиланазы(эндоксиланаз), подходящей для солюбилизации не экстрагируемых водой арабиноксиланов, можно сочетать с добавлением материала, содержащего соответствующие количества не экстрагируемых водой арабиноксиланов, такого как кожура семян, отруби из семян или полученный из отрубей материал, к ингредиентам для пивоварения. Указанную кожуру, отруби или полученный из отрубей материал можно, например, получать в виде фракций размола зерен злаков, таких как пшеница, рожь, ячмень, овес, тритикале, рис, просо, сорго или кукуруза. Массовое соотношение отрубей или полученного из отрубей материала к осоложенному или не осоложенному зерну в солоде предпочтительно составляет более чем приблизительно 1:30, более предпочтительно, более чем приблизительно 1:20, например более чем приблизительно 1:15. В этом варианте осуществления изобретения обогащение пива растворимыми арабиноксиланами происходит в результате солюбилизации и фрагментации арабиноксиланов, содержащихся в осоложенном зерне, и добавления содержащего арабиноксилан материала.
Обогащение видов пива растворимыми арабиноксиланами в соответствии с настоящим изобретением можно также получать с использованием смесей ферментов, обладающих, помимо активности эндоксиланазы, одной или более дополнительными ферментативными активностями, выбранными из группы α-L-арабинофуранозидаз (которые отщепляют боковые цепи арабинозы от арабиноксилана), метилглюкуронидаз (которые удаляют от него боковые цепи метилглюкуроновой кислоты), ферулоилэстераз (которые гидролизуют эфирную связь между феруловой кислотой и арабиноксиланом), бета-глюканаз (которые гидролизуют бета-глюканы, которые могут являться связанными с арабиноксилан) и целлюлаз (которые гидролизуют целлюлозу, которая может являться связанной с арабиноксиланом).
Известно, что рожь и ржаной солод содержат относительно высокие количества арабиноксиланов. Таким образом, можно рассматривать использование эндоксиланазы(эндоксиланаз) для изготовления видов пива в соответствии с настоящим изобретением с использованием солода, содержащего рожь или ржаной солод. Однако наблюдали, что использование ржи или ржаного солода являлось связанным с проблемами на нижележащих стадиях пивоварения, таких как фильтрация сусла и фильтрация, в частности, в сочетании с препаратом эндоксиланазы в соответствии с настоящим изобретением. Таким образом, является предпочтительным, чтобы солод видов пива, полученного в соответствии с настоящим изобретением, не содержал или содержал только ограниченные количества ржи, ржаного солода или полученного из ржи солода, например, менее 25%, более предпочтительно, менее 15%, например менее 10%.
Второй объект изобретения относится к видам пива, полученным в соответствии с настоящим изобретением.
Одним из существенных преимуществ способа по настоящему изобретению по сравнению с использованием других углеводов, включая инулин, лактосахарозу, лактулозу, рафинозу, стахиозу, арабиногалактаны, устойчивый крахмал, изомальтозу и тагатозу, является то, что растворимые арабиноксиланы со степенью полимеризации ниже 50 (AXOS) уже естественным образом присутствуют на поддающихся детекции уровнях во многих, если не во всех, типах пива. Это означает, что в способе по настоящему изобретению не вводят соединение, чужеродное для обычного пива, а просто увеличивают его содержание, пока не получают уникального эффекта на вкусовое ощущение и/или вкус. Поскольку AXOS уже присутствуют в пиве и их можно экстрагировать из пшеницы или ячменя, т.е. ингредиентов, которые, обычно, используют для изготовления пива, способ по настоящему изобретению отвечает всем нормативным требованиям пивоварения в большинстве, если не во всех, странах, и, в частности, отвечает «закону о чистоте пива» Германии.
in situ
Другим преимуществом способа по настоящему изобретению по сравнению с использованием XOS в качестве добавки к пиву является то, что AXOS, в отличие от XOS, не являются сладкими и таким образом лучше соответствуют требованиям к вкусу пива. Показано, что XOS являются приблизительно на 30% настолько сладкими, как сахароза, тогда как AXOS обладают менее 10% сладости сахарозы. Кроме того, XOS обладают очень высоким уровнем цен, который препятствует их использованию в массовом продукте, таком как пиво, тогда как AXOS можно либо получать  во время пивоварения посредством добавления соответствующих ферментов, либо добавлять в виде продукта, очень дешевого при изготовлении, например, в виде экстракта из отрубей или в виде побочного продукта промышленного разделения крахмала/глютена.
Другим преимуществом способа по настоящему изобретению по сравнению с известными способами для увеличения содержания неперевариваемых углеводов в пиве является то, что не требуется ни одного изменения в процессе пивоварения, за исключением простого добавления одной или более подходящих эндоксиланаз, или простого добавления богатого AXOS ингредиента в подходящих дозах во время стадий затирания, варки, охлаждения, брожения и/или после брожения. Кроме того, в отличие от конкретных способов, известных в данной области, способ по настоящему изобретению не влечет за собой увеличения содержания перевариваемых углеводов.
По настоящему изобретению термин «пиво» относится к любому ферментированному напитку, изготовленному из зерен злаков, предпочтительно, ячменя, пшеницы, тритикале, овса, ржи, кукурузы, сорго, проса или риса, так же как молотых злаков или солода, полученных из таких зерен злаков, с добавлением или без добавления частей или экстрактов из ароматических растений, таких как хмель, кориандр, можжевельник, лавр, розмарин, имбирь, мята, солодка, тысячелистник, анис или цитрусовые, и с добавлением или без добавления фруктов или экстрактов фруктов. Термин «пиво», как применяют здесь, предназначен, чтобы включать, без ограничения, эль, крепкий эль, средний эль, горький эль, светлый эль, кислый эль, стаут, портер, лагер, солодовый раствор, ячменное вино, happoushu, бок, доппельбок, пиво Кельш, мюнхенское пиво, дортмундское пиво, дюссельдорфское старое пиво, пильзенское пиво, мартовское пиво, немецкое пшеничное пиво, берлинское белое пиво, пиво Сезон, аббатское пиво, пиво Траппист, пиво Гез, пиво ламбик, фруктовое пиво, бельгийское белое пиво, высокоалкогольное пиво, низкоалкогольное пиво, безалкогольное пиво, низкокалорийное пиво, светлое пиво и т.п.
Стадии, включенные в пивоварение, могут отличаться до некоторой степени в соответствии со стилем пива, однако, обычно, они состоят из следующих главных стадий:
«Получение солода»
включает проращивание зерен злаков замачиванием и смачиванием в воде, чтобы позволить проращивание. Во время проращивания продуцируется несколько типов ферментов, включая ферменты, катализирующие превращение крахмала в простые ферментируемые сахара. Затем проросшие зерна высушивают и обжаривают (процесс, называемый «убиванием») для уничтожения побегов и для придания зерну вкуса и цвета обжаренного зерна. Зерна, обработанные этим способом, называют осоложенным зерном или просто «солодом». Солод размалывают, чтобы разломить зерна и удалить побеги, что позволяет содержимому осоложенного зерна лучше подвергаться воздействию воды во время затирания и варки.
«Затирание»
включает смешивание солода, т.е. молотого осоложенного зерна, в присутствии или в отсутствие вспомогательных веществ, с водой для получения так называемого «сусла». Вспомогательные вещества представляют собой добавляемые к солоду богатые углеводом ингредиенты, отличные от молотого осоложенного зерна. Сусло нагревают для достижения более оптимальных температур для активности ферментов солода или экзогенно добавленных ферментов. Затирание, обычно, выполняют при температурах в диапазоне от приблизительно 45°C до приблизительно 75°C. Во время затирания олигосахариды, дисахариды и моносахариды получают ферментативным разрушением комплексных углеводов, в основном, крахмала. Такие простые сахара составляют источник углерода и энергии для микроорганизмов во время сбраживания.
«Фильтрация»
включает разделение сусла на жидкий экстракт, называемый «суслом», и нерастворимые материалы, называемые «пивной дробиной». Фильтрацию, обычно, выполняют при температуре приблизительно 78°C.
«Варка сусла»
включает нагревание сусла при температуре варки воды. Ключевыми целями варки является (i) убить микроорганизмы, чтобы исключить конкуренцию с вызывающими брожение микроорганизмами, (ii) коагулировать и преципитировать белки или другие твердые вещества, которые могут вызывать мутность пива, и (iii) экстрагировать и химически модифицировать горькие, ароматические и вкусовые соединения из трав или экстрактов трав, добавленных до или во время варки сусла.
«Охлаждение и инокуляция»
Saccharomyces cerevisiae
включает охлаждение сваренного сусла до температуры, оптимальной для вызывающих брожение микроорганизмов. Эти вызывающие брожение микроорганизмы, например пивные дрожжи (), либо специально добавляют в сусло (что называют «засеванием»), либо добавляют посредством спонтанной инокуляции.
«Брожение»
включает инкубацию сусла, инокулированного вызывающими брожение микроорганизмами. Во время брожения эти микроорганизмы превращают простые сахара в диоксид углерода, этанол и многочисленные другие побочные продукты.
«Обработка после брожения»
представляет собой стадии после первичного брожения до получения и упаковки готового пива. В зависимости от используемых типа пива и способа такая обработка после брожения может включать одно или более из следующего: пиво можно кондиционировать, чтобы дополнительно развивать желательные вкусы и запахи и/или уменьшать уровни нежелательных вкусов и запахов; пиво можно фильтровать для удаления остаточных дрожжей и других вызывающих мутность материалов; пиво можно обрабатывать абсорбентом для удаления конкретных соединений, таких как гидрофильные белки или полифенолы; пиво можно подвергать дополнительным стадиям брожения (с добавлением или без добавления дополнительного источника углерода); можно добавлять травы или экстракты трав; можно добавлять фрукты или экстракты фруктов; пиво можно насыщать углекислым газом для увеличения свойства образования пены пива; пиво можно подвергать пастеризации или микрофильтрации для улучшения устойчивости к микроорганизмам; и пиво можно упаковывать, например, разливом в бутылки, банки или бочки.
«действительное содержание экстрактивных веществ»
Термин , в контексте этого изобретения, определяют в граммах сухого вещества на 100 мл пива, полученного после испарения жидкой и газообразной фракции (вода, спирт, растворенные газы) из пива.
«эндоксиланаза»
Aspergillus
Penicillium
Disporotrichum
Neurospora
Fusarium
Humicola
Trichoderma
Bacillus
Aeromonas
Streptomyces
Nocardiopsis
Thermomyces
В контексте настоящего изобретения термин относится к ферменту, способному гидролизовать гликозильные связи, связывающие остатки ксилозы в содержащих ксилозу полисахаридах. Эндоксиланазы можно получать из множества организмов, включая растения, грибы (например, виды , , , , , , ) или виды бактерий (например, виды , , , , ). Коммерчески доступные очищенные или частично очищенные препараты эндоксиланаз, подходящие для практического осуществления этого изобретения, включают в качестве неограничивающих примеров, Shearzyme™ (Novozymes), Biofeed Wheat™ (Novozymes), Pentopan™ Mono (Novozymes), Pulpzyme™ (Novozymes), Ecopulp™ (AB Enzymes), Veron™ 191 (AB Enzymes), Veron™ Special (AB Enzymes), Multifect™ Xylanase (Genencor/Danisco), Multifect™ 720 (Genencor/Danisco), Spezyme™ CP (Genencor/Danisco), Grindamyl™ H640 (Danisco), и Grindamyl™ Powerbake™ (Danisco).
Термин «неингибируемая эндоксиланаза» относится к ферменту эндоксиланазе, активность которого в течение 1 час инкубации ингибируют менее чем на 20% посредством присутствия белкового ингибитора эндоксиланазы, присутствующего в концентрациях, типичных в обычном сусле на основе злаков с начальной плотностью в диапазоне приблизительно от 7 до 25 г/100 мл. Неограничивающим примером коммерчески доступной неингибируемой эндоксиланазы, подходящей для практического осуществления этого изобретения, является Grindamyl™ Powerbake™ (Danisco). Другие примеры таких менее ингибируемых ферментов, принадлежащих к семейству 11 эндоксиланаз, описаны в WO 2001066711.
«термостабильная эндоксиланаза»
Термин  относится к ферменту, активность которого при 72°C в течение 1 час инкубации уменьшена не менее чем до 80% по сравнению с оптимальной температурой в условиях, существующих в сусле на основе злаков с начальной плотностью в диапазоне приблизительно от 7 до 25 г/100 мл. Неограничивающим примером коммерчески доступной термостабильной эндоксиланазы, подходящей для практического осуществления этого изобретения, является Ecopulp™ TX200A (AB Enzymes).
«термостабильная неингибируемая эндоксиланаза»
Термин  относится к эндоксиланазе, сочетающей свойства неингибируемой эндоксиланазы и термостабильной эндоксиланазы. Примеры таких термостабильных неингибируемых эндоксиланаз семейства 11 эндоксиланаз описаны в WO 200302923.
«вкусовое ощущение»
Термин  используют для описания насыщения углекислым газом, полноты вкуса и послевкусия пива, где эти определения используют для описания атрибутов текстуры, ответственных за получение характерных тактильных ощущений на поверхности полости рта.
«отруби»
Термин  в контексте настоящего изобретения обозначает полученную из семян фракцию помола, полученную из зерен злаков, которая является обогащенной любой или всеми из тканей, выбранных из алейрона, перикарпия, семенной оболочки, чашелистников и лепестков, по сравнению с соответствующим интактным семенем.
Настоящее изобретение может, при необходимости, для контроля качества способа получения, включать измерение и/или анализ концентрации AXOS в пиве на одной или более стадиях процесса пивоварения.
Указанный способ включает аналитические способы, описанные в примере 1 по настоящему изобретению.
Изобретение далее проиллюстрировано посредством неограничивающих иллюстративных вариантов осуществления, описанных ниже.
ПРИМЕР 1: содержание AXOS в различных типах пива
Аналитические способы
. Различные аналитические способы использовали для полной характеризации коммерческих видов пива.
Содержание алкоголя в образцах пива измеряли спектроскопией в ближней инфракрасной области (Alcolyzer Plus, Anton Paar, Graz, Austria), кажущееся содержание экстрактивных веществ измеряли на основании плотности раствора осциллирующим денситометром с U-образной трубкой (Alcolyzer Plus, Anton Paar), и действительное содержание экстрактивных веществ и начальное содержание экстрактивных веществ (начальную плотность сусла) рассчитывали по измерениям алкоголя и плотности, все согласно общепринятым способам, описанным в Analytica EBC (1998).
Определение содержания общего и восстанавливающего сахара в пиве выполняли на основе способа Courtin et al. 2000 (Journal of Chromatography A, 866, 97-104). Образцы пива сначала декарбонизировали обработкой ультразвуком в течение 10 минут с последующей фильтрацией через общепринятую бумажную мембрану. Для определения содержания AXOS и мальтодекстрина 2,5 мл пива смешивали с 2,5 мл 4,0 M трифторуксусной кислоты (конечная концентрация 2,0 M) и инкубировали при 110°C в течение 60 минут. После гидролиза смесь фильтровали, и 3,0 мл фильтрата дополнительно обрабатывали добавлением 1,0 мл раствора внутреннего стандарта (100 мг бета-D-аллозы в 100 мл насыщенного до 50% раствора бензойной кислоты), 1,0 мл раствора аммиака (25% об./об.) и 3 капель 2-октанола. Моносахариды восстанавливали до альдитов добавлением 200 мкл раствора борогидрида натрия (200 мг борогидрида натрия в 1,0 мл 2 M аммиака) и образец инкубировали в течение 30 минут при 40°C. Реакцию останавливали добавлением 400 мкл ледяной уксусной кислоты. Для реакции ацетилирования 500 мкл образца, содержащего альдиты, добавляли к 5,0 мл уксусного ангидрида и 500 мкл 1-метилимидазола. Через 10 минут избыток уксусного ангидрида удаляли добавлением 900 мкл этанола к образцу. Затем ацетаты альдитов концентрировали в органической фазе добавлением воды (10 мл) и раствора гидроксида калия (2 раза по 5,0 мл 7,5 M раствора, с промежуточной выдержкой несколько минут). Раствор бромфенолового синего (500 мкл, 0,04% мас./об.) добавляли в качестве индикатора для водной фазы. Аликвоты по 1 мкл органической фазы, содержащей образованные ацетаты альдитов, разделяли газовой хроматографией на полярной колонке Supelco SP-2380 (30 м X 0,32 мм I. D.; толщина пленки 0,2 мкм) (Supelco, Bellefonte, PA, USA) в хроматографе Agilent (Agilent серий 6890, Wilmington, DE, USA), оборудованном автоматическим пробоотборником, разделяющим инжектором (соотношение разделения 1:20) и детектором ионизации пламени. Очищенные моносахариды D-галактозу, D-ксилозу, D-глюкозу и L-арабинозу обрабатывали параллельно с каждым набором образцов для целей калибровки.
Для определения средней DP AXOS в пиве 2,5 мл пива обрабатывали добавлением 500 мкл внутреннего стандарта (100 мг бета-D-аллозы в 100 мл насыщенного до 50% раствора бензойной кислоты), 50 мкл раствора аммиака (25% об./об.) и 9 капель 2-октанола. Сахариды восстанавливали до альдитов добавлением 200 мкл раствора борогидрида натрия (200 мг борогидрида натрия в 1,0 мл 2 M аммиак) и образец инкубировали в течение 30 минут при 40°C. Реакцию останавливали добавлением 400 мкл ледяной уксусной кислоты. Аликвоту 2,5 мл образца, содержащего восстановленные сахариды, гидролизовали добавлением 500 мкл трифторуксусной кислоты (99%), и образец инкубировали при 110°C в течение 60 минут. После гидролиза проводили ацетилирование и анализ газовой хроматографией, как описано выше. Очищенные моносахариды D-ксилозу, D-глюкозу и L-арабинозу обрабатывали параллельно с каждым набором образцов для целей калибровки.
корр
корр
Содержание AXOS (C-AXOS), называемое также далее в этом документе содержанием растворимых арабиноксиланов, для образцов пива рассчитывали с использованием формулы (1). Содержание AXOS с коррекцией на содержание арабиногалактана (AXOS) рассчитывали по формуле (2). Соотношение арабинозы и ксилозы AXOS (A/X AXOS) рассчитывали по формуле (3). Соотношение арабинозы и ксилозы AXOS с коррекцией на содержание арабиногалактана (A/X AXOS) рассчитывали по формуле (4). Среднюю степень полимеризации (avDP) AXOS (avDP AXOS), называемое также далее в этом документе средней степенью полимеризации растворимых арабиноксиланов, рассчитывали с использованием формулы (5). Среднюю степень полимеризации ксиланового остова AXOS (avDP ксилан) рассчитывали с использованием формулы (6). Концентрацию мальтодекстрина рассчитывали по формуле (7).
(1) C-AXOS= 0,88×(% арабинозы+% ксилозы).
корр
(2) C-AXOS=0,88×(% арабинозы-0,7×% галактозы+% ксилозы).
(3) A/X AXOS = % арабинозы/% ксилозы.
корр
(4) A/X AXOS =(% арабинозы-0,7×% галактозы)/% ксилозы.
(5) avDP AXOS =(% арабинозы-0,7×% галактозы+% ксилозы)/% восстанавливающей концевой ксилозы.
(6) avDP ксилан = % ксилозы/% восстанавливающей концевой ксилозы.
(7) мальтодекстрин = 0,9×(% глюкозы).
Вычитание % галактозы в формулах (2), (4) и (5) означает коррекцию на содержание арабиногалактана в пиве или сусле (Van den Bulck et al. 2005). Следует отметить, что в формуле (6), avDP конкретно относится к бета-1,4-D-ксилопиранозиловому остову AXOS, и не принимает во внимание боковые цепи арабинозы.
Собирали серию коммерческих видов пива, представляющих широко различающиеся стили пива, безалкогольные виды пива, пильзенские стили пива, американские светлые виды пива, эли, кислые эли, бельгийские белые виды пива, немецкие белые виды пива (пшеничные виды пива), светлые крепкие эли (среди которых бельгийские аббатские трипели), темные крепкие эли, и виды пива гез и ламбик. В каждом пиве анализировали содержание алкоголя, действительное содержание экстрактивных веществ, начальное содержание экстрактивных веществ (начальную плотность сусла), содержание мальтодекстрина, содержание арабиноксилоолигосахарида (AXOS), и среднее соотношение арабинозы и ксилозы (A/X) и среднюю степень полимеризации (avDP) AXOS, и результаты показаны в таблице 1.
Содержание AXOS являлось самым низким в американских светлых видах пива, которые содержали между 0,58 г/л («Natural Light») и 0,68 г/л («Bud Light») AXOS. Самое высокое содержание AXOS наблюдали в крепких элях, в диапазоне между 1,44 г/л («Westmalle Tripel») и 2,14 г/л («Kasteelbier bruin»). Обычно, существует хорошая корреляция между содержанием AXOS и начальным содержанием экстрактивных веществ, что неудивительно, поскольку виды сусла с более высокой плотностью будут приводить к большей солюбилизации углеводов, включая арабиноксиланы. Средняя степень полимеризации AXOS (avDP AXOS) в различных видах пива лежала в диапазоне от 8 в светлом крепком эле «Tripel Karmeliet» до 25 в немецком белом пиве «Paulaner Hefe-Weissbier». Не существует известной корреляции между средней степенью полимеризации AXOS и уровнями действительного или начального содержания экстрактивных веществ в пиве. Низкая обнаруженная средняя степень полимеризации может указывать на то, что эндогенные эндоксиланазы из зерновых являются активными во время получения солода, и/или во время затирания. Среднее соотношение A/X AXOS колеблется в относительно узком диапазоне от 0,66 до 0,80 (между 0,55 и 0,67 после коррекции на арабиногалактан).
Аналогичную степень изменчивости содержания растворимого арабиноксилана в соответствии с типом пива ранее наблюдали Schwarz and Han (1995) с использованием неподтвержденного способа определения содержания арабиноксилана в пиве. Однако значения, как опубликовано Schwarz and Han, систематически превышают уровни растворимого арабиноксилана, измеренные в настоящем исследовании. Это несоответствие может быть обусловлено завышенной оценкой уровней арабиноксилана в исследовании Schwarz and Han (1995). Например, в исследовании Schwarz and Han (1995) опубликовано содержание арабиноксилана 12,6% в пшеничном солоде, тогда как обычно публикуют, что содержание арабиноксилана в пшенице составляет между 6 и 7% (Egi et al., 2004, MBAA TQ vol. 41 (3)), и не ожидают, что процесс получения солода оказывает главный эффект на общее содержание арабиноксилана в пшенице.
ПРИМЕР 2 - увеличение уровня AXOS в пиве использованием ферментов эндоксиланаз
Материалы
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis
Aspergillus niger
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis
Trichoderma longibrachiatum
Aspergillus oryzae
Aspergillus aculeatus

. Grindamyl H640 представляет собой коммерческий препарат эндоксиланазы пищевого качества из Danisco (Copenhagen, Denmark), полученный посредством экспрессии в  гена эндоксиланазы семейства гликозидгидролаз (GHF) 11 . Grindamyl H190 представляет собой коммерческий препарат эндоксиланазы пищевого качества из Danisco (Copenhagen, Denmark), полученный из . Grindamyl Powerbake представляет собой коммерческий препарат эндоксиланазы пищевого качества из Danisco (Copenhagen, Denmark), полученный посредством экспрессии в  гена неингибируемой мутантной эндоксиланазы GHF11 . Ecopulp TX200A (ECOP) представляет собой коммерческий препарат эндоксиланазы технического качества из AB Enzymes (Darmstadt, Germany), полученный посредством рекомбинантной экспрессии гена термофильной мутантной эндоксиланазы GHF11 из . Shearzyme 500L представляет собой коммерческий препарат эндоксиланазы пищевого качества из Novozymes (Bagsvaerd, Denmark), полученный посредством рекомбинантной экспрессии в  гена эндоксиланазы GHF10 . Ингибитор эндоксиланазы пшеницы TAXI I очищали, как описано в литературе (Gebruers et al. 2001, Biochem. J. 353: 239-244). Ячменный солод и пшеница получены из Cargill (Herent, Belgium), пшеничные отруби получены из Dossche Mills & Bakery (Deinze, Belgium), и ржаные отруби получены из Molens Goethals (Ghent, Belgium).
Аналитические способы.
Для вычисления содержания AXOS в различных препаратах сусла или пива, обработанных в параллельных экспериментах, данные стандартизировали по эффективности экстракции углевода с использованием фактора, состоящего из средней концентрации маннозы во всех экспериментальных образцах, тестированных параллельно, деленной на концентрацию маннозы в каждом индивидуальном экспериментальном образце.
Определение активности ксиланолитических ферментов.
Эндоксиланазную активность ферментов измеряли колориметрически с использованием перекрестно сшитого азурином арабиноксилана (таблетки Xylazyme AX, Megazyme, Bray, Ireland) в качестве нерастворимого субстрата, как описано в Megazyme Data Sheet 9/95, с использованием 25 мМ ацетата натрия (pH 4,7) в качестве буфера и инкубации в течение 10 минут при 40°C. Одну единицу определяли как количество фермента, необходимого для получения изменения оптической плотности при 590 нм на 1,0 в условиях анализа.
Saccharomyces cerevisiaea
Bacillus subtilus
В первом эксперименте тестировали различные типы ферментов эндоксиланаз, субстратов и условий инкубации для обнаружения условий, приводящих к повышению уровней AXOS в сусле во время процесса затирания. Когда AXOS получены во время затирания, они окажутся в конечном пивном продукте, поскольку AXOS очень термостабильны, так что они не будут разрушаться во время варки, и поскольку их невозможно использовать в качестве источника углерода для  с учетом того, что этот организм даже не содержит генов, кодирующих эндоксиланазу или арабинофуранозидазу. Grindamyl Powerbake, a гликозидгидролаза семейства 11 эндоксиланаз из  модифицирована для уменьшения ингибирования активности эндоксиланазы ингибиторами эндоксиланазы из зерновых, таких как TAXI и родственные белки. Сусло состояло из ячменного солода пильзенского типа при 200 г/л, а другое состояло из смеси ячменного солода пильзенского типа при 140 г/л и пшеничных отрубей при 60 г/л. Образцы сусла суспендировали в воде при 45°C и ферменты добавляли в начале процесса. Сначала образцы сусла инкубировали при 45°C в течение либо 90 минут, либо 150 минут, затем нагревали до 70°C при 1°C в минуту, и выдерживали при 70°C в течение 60 минут. После разделения сусла фильтрацией сусло варили в течение 60 минут. После охлаждения образцы сусла замораживали при -20°C до анализа углеводов. Перед анализом углеводов образцы сусла центрифугировали (10000 g, 15 мин, 18°C) для удаления материала твердых частиц.
Как показано в таблице 2, неингибируемый фермент Grindamyl Powerbake, добавляемый при активностях фермента 20 единиц/л или 100 единиц/л, действительно вызывал значительное повышение уровней AXOS. В дозе 100 единиц/л и при времени инкубации 150 мин Grindamyl Powerbake увеличивал содержание AXOS в сусле из ячменного солода на 47% относительно основной обработки без добавления фермента.
Bacillus subtilis
Aspergillus niger
Bacillus subtilus
Aspergillus aculeatus
Во втором эксперименте анализировали эффект добавления различных типов эндоксиланаз на высвобождения AXOS в сусле, полученном из ячменного солода пильзенского типа, суспендированного при 200 г/л в сусле. Температурный режим представлял собой 120 минут при 45°C, 30 минут при 60°C, и 60 минут при 72°C. Различные тестированные ферменты представляли собой Grindamyl H640, эндоксиланазу GHF11 из , ингибируемую ингибиторами эндоксиланазы из зерновых; Grindamyl H190, GHF 11-эндоксиланазу из , ингибируемую ингибиторами эндоксиланазы из зерновых; Grindamyl Powerbake, эндоксиланазу GHF11 из , модифицированную для уменьшения ингибирования активности эндоксиланазы ингибиторами эндоксиланазы из зерновых; Shearzyme 500 L, эндоксиланазу GHF10 из , активность которой не ингибируют ингибиторы эндоксиланазы злаков.
Эквивалентные активности эндоксиланазы (250 единиц/л) Grindamyl Powerbake высвобождали по существу более AXOS, чем Grindamyl H640 или Grindamyl H190, показывая, что неингибируемые эндоксиланазы являются более эффективными по сравнению с ингибируемыми эндоксиланазами для высвобождения AXOS в пиве (Таблица 3). Grindamyl Powerbake высвобождала также более AXOS, чем Shearzyme 500L при эквивалентных активностях фермента (250 единиц/л), показывая, что эндоксиланазы семейства гликозидгидролаз 11 действуют лучше, чем эндоксиланазы семейства гликозидгидролаз 10, по отношению к солюбилизации AXOS в сусле. Shearzyme 500L, с другой стороны, вызывала наиболее высокое восстановление avDP из AXOS, восстанавливая avDP в сусле от 13 до 6, в то время как Grindamyl H640 и Grindamyl Powerbake оказывали малый эффект или не оказывали эффекта на этот параметр. Это согласуется с мнением, что каталитические свойства эндоксиланаз семейства гликозидгидролаз 11 благоприятны для высвобождения AXOS из нерастворимого субстрата арабиноксилана, в то время как эндоксиланазы семейства гликозидгидролаз 10 предпочтительно расщепляют растворимый AXOS.
Trichoderma longibrachiatum
Trichoderma reesei
В предыдущих экспериментах температуру при затирании поддерживали относительно низкой (45°C). Для большинства типов пива является желательным использовать более высокую температуру затирания, поскольку это уменьшает реакции окисления и предотвращает нежелательный привкус и нестабильность вкуса. В третьем эксперименте тестировали эффект добавления Ecopulp TX200A, эндоксиланазы GHF11 из  (ранее ), модифицированной для увеличения термостабильности. Температурный режим представлял собой 30 минут при 60°C, 60 минут при 72°C и 120 минут при 78°C.
При дозах 2500 единиц/л эндоксиланазы и 5000 единиц/л эндоксиланазы Ecopulp TX200A увеличивал уровень AXOS на 129% (приблизительно в 2,3 раза) и на 140% (приблизительно в 2,4 раза), соответственно, относительно уровня при контрольной варке без добавления фермента (Таблица 4). Уровни AXOS в сусле до 3,7 г/л получали при добавлении Ecopulp TX200A. Комбинация Ecopulp TX200A и Shearzyme 500L приводила к высокой солюбилизации AXOS, так же как к восстановлению avDP из AXOS до 8 ниже чем 16 в соответствующем контрольном сусле. Из этих экспериментов следует, что термостабильный фермент является предпочтительным для обогащения AXOS в пиве при работе при высоких температурах затирания.
Ингибирование активности эндоксиланазы Ecopulp TX200A ингибитором эндоксиланазы из пшеницы TAXI I оценивали следующим образом. Две единицы эндоксиланазы Ecopulp TX200A предварительно инкубировали в 0,5 мл буфера фосфате натрия (25 мМ, pH 6,0) либо в отсутствие, либо в присутствии 65 мкг очищенного TAXI I при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем активности эндоксиланазы растворов определяли при 70°C колориметрическим способом с использованием Xylazyme (Megazyme, Bray, Ireland) в качестве субстрата в соответствии с инструкциями производителя. Активность смеси Ecopulp TX200A и TAXI I составляла 104% относительно активности Ecopulp TX200A в отсутствие TAXI. Таким образом, можно заключить, что Ecopulp TX200A не является значительно ингибируемой присутствием ингибиторов эндоксиланазы злаков, таких как TAXI, при ее оптимальной температуре 70°C, что вносит вклад в высокую эффективность этого фермента для солюбилизации AXOS во время процесса затирания.
Trichoderma longibrachiatum
Trichoderma reesei
В четвертом эксперименте тестировали эффект добавления Ecopulp TX200A, термостабильной неингибируемой эндоксиланазы семейства гликозидгидролаз 11 из  (ранее ), к трем различным видам солода: первому, состоящему из 100% ячменного солода пильзенского типа при 200 г/л, второму, состоящему из смеси 90% ячменного солода пильзенского типа при 180 г/л и 10% пшеничных отрубей при 20 г/л, и третьему, состоящему из смеси 90% ячменного солода пильзенского типа при 180 г/л и 10% ржаных отрубей при 20 г/л. Температурный режим представлял собой 60 мин при 62°C, 30 минут при 72°C и 60 минут при 78°C, и фермент эндоксиланазу Ecopulp TX200A добавляли в дозе 4000 единиц/л.
Как показано в таблице 5, добавление эндоксиланазы Ecopulp TX200A повышало содержание AXOS от 1,6 г/л до 2,2 г/л в сусле, полученном на основе 100% пильзенского ячменного солода, от 1,7 г/л до 4,0 г/л в смеси солода/пшеничных отрубей и от 2,0 до 3,6 г/л в смеси солода/ржаных отрубей, соответственно.
2+
2+
7
2
Два вида пива получали в пилотном масштабе согласно следующему способу. Сусло для пива A получали смешиванием 10 кг пильзенского солода с 50 литрами воды для пивоварения. Сусло для пива B получали смешиванием 9 кг пильзенского солода, 1 кг ржаных отрубей и 10 мл Ecopulp TX200A (15000 Units/мл; AB Enzymes) и 5 мл Shearzyme 500L (2500 единиц/мл; Novozymes) с 50 литрами воды. Вода для пивоварения состоит из воды, очищенной обратным осмосом, к которой добавляли Ca до конечной концентрации 40 мг/л. Температурная схема затирания являлась следующей: 63°C (45 минут), 72°C (45 минут), 78°C (1 минута). pH сусла составлял 5,6. Препарат фермента альфа-амилазы Termamyl (Termamyl 120 L, из Novozymes) добавляли к обеим варкам при 7,5 мл на сусло для пивоварения, когда температура достигала 78°C. Фильтрацию проводили в фильтрационном чане при температуре 78°C в течение 60 минут. Фильтрованные образцы сусла варили в течение 60 минут и добавляли Zn до конечной концентрации 0,2 мг/л за 5 минут до окончания варки. Сваренные образцы сусла осветляли с использованием гидроциклонного чана. Одну часть осветленных образцов сусла разводили 1:1 (об.:об.) свободной от кислорода водой, чтобы получить светлое лагерное пиво. Другую часть осветленных образцов сусла оставляли без разведения и использовали для получения лагерного пива пильзенского стиля. Охлажденные осветленные образцы сусла засевали лагерными дрожжами (Saflager 3470, из Lesaffre) при 10 клеток/мл с последующим брожением в течение 8 суток при 12°C и лагерной выдержкой в течение 7 суток при 0°C. Горечь разведенных образцов пива регулировали добавлением изомеризованного кислого экстракта хмеля (20% изокислот мас./об., Botanix Ltd., Paddock Wood, England) до конечной концентрации 25 мг/л изокислот. Пиво фильтровали через листы кизельгура/целлюлозы (1 мкм) и наконец разливали и закупоривали в коричневые стандартные бутылки по 25 сентилитров (250 мл) (содержание O<80 частей на миллиард) с использованием изобарической разливной машины с двойным предварительным опорожнением (America monobloc, из Cimec, Italy).
Уровень AXOS пива B составлял 3,53 г/л по сравнению с 0,95 г/л для контрольного пива A (Таблица 6). Таким образом, сочетание замены 10% солода ржаными отрубями и добавления солюбилизирующих арабиноксилан эндоксиланаз в течение процесса затирания приводило к увеличению в 3,7 раза (т.е. увеличению на 272%) содержания AXOS. Содержание AXOS в сусле являлось сходным с содержанием в соответствующем пиве, указывая на то, что измерение содержания AXOS в сусле является высоко предсказательным для содержания AXOS в конечном пиве. Содержание AXOS в пиве B являлось даже немного более высоким, чем в сусле B, что объясняют концентрированием пива из-за испарения, происходящего в основном во время варки сусла. Уровень AXOS в светлом пиве B составлял 1,93 г/л по сравнению с 0,88 г/л для контрольного светлого пива A, таким образом, приводя к увеличению приблизительно в 2,2 раза (т.е. увеличению на 119%) содержания AXOS по сравнению с контрольным светлым пивом. Увеличение содержания AXOS в сусле явно не ингибирует процесс брожения, как показывает наблюдение, что содержание алкоголя в пиве B и светлом пиве B не было ниже, чем в контрольном пиве A и контрольном светлом пиве A, соответственно (Таблица 6).
Специалисту в данной области также будет понятно, что термостабильные и неингибируемые ферменты, отличные от Ecopulp TX200A, можно использовать в экспериментах, описанных выше. Способы, которые можно использовать для улучшения ферментов, включают в себя, например, способы направленной эволюции для увеличения термостабильности эндоксиланаз получением библиотеки вариантов фермента посредством сочетания сайт-насыщающего мутагенеза гена и способа перетасовки генов с последующим скринингом по ксиланолитической активности при высокой температуре. Улучшение ферментов можно также осуществлять рациональной сайт-направленной модификацией для введения выбранных замен кодонов, приводящих к ферменту с улучшенной каталитической активностью при высоких температурах. Альтернативно, ортологичные гены для генов, применяемых в настоящее время ферментов эндоксиланаз бактерий или грибов, можно выделять из родственных термофильных или гипертермофильных микроорганизмов и применять для получения термостабильных ферментов посредством экспрессии в гетерологичном организме-хозяине.
Ферменты, отличные от эндоксиланаз, можно использовать вместе с эндоксиланазами для дополнительного увеличения высвобождения AXOS во время затирания или других стадий производства пива, например, такие как арабинофураногидролазы, ферулоилэстеразы, метилглюкуронидазы, бета-глюканазы или целлюлазы. Такие ферменты либо удаляют боковые цепи арабиноксилана, либо деградируют другие субстраты, связанные с арабиноксиланами, и таким образом, облегчают доступность арабиноксиланов для эндоксиланаз.
Специалисту в данной области будет понятно также, что эндоксиланазы можно использовать в сочетании с такими ферментами, как амилоглюкозидазы и/или пуллуланазы, которые добавляют с целью уменьшить содержание ферментируемых сахаров в конечном пиве. Амилоглюкозидазы, пуллуланазы или другие так называемые сбраживающие ферменты, обычно, используют для получения светлых видов пива и/или низкоуглеводных видов пива, обладающих уменьшенным уровнем остаточных ферментируемых мальтодекстринов. Таким образом, комбинированное использование эндоксиланаз и сбраживающих ферментов, добавленных во время затирания или других стадий при производстве пива, можно использовать для получения светлых видов пива с увеличенным содержанием AXOS.
ПРИМЕР 3 - увеличение уровня AXOS в пиве добавлением богатых AXOS препаратов после брожения
Препарат AXOS из отрубей (AXOS-18-0.31).
Коммерческие пшеничные отруби (Dossche из Mills & Bakery, Deinze, Belgium) использовали в качестве исходного материала для препарата AXOS-18-0.31. Суспензию пшеничных отрубей в воде (1:7 мас./об.) сначала обрабатывали термостабильной α-амилазой (Termamyl 120LS, из Novozymes, Bagsvaerd, Denmark; 1 мкл/г пшеничных отрубей) в течение 90 минут при 90°C для гидролиза крахмала. После охлаждения до 50°C pH суспензии доводили до 6,0 с использованием концентрированной HCl, и суспензию инкубировали с протеазой (Neutrase 0,8L, Novozymes, Bagsvaerd, Denmark; 40 мкл/г пшеничных отрубей) в течение 4 часов при 50°C для гидролиза остаточных белков. Затем суспензию варили в течение 20 минут, фильтровали и отбрасывали фильтрат. Осадок промывали водой и ресуспендировали в деионизованной воде (1:14 мас./об.). Суспензию инкубировали при постоянном перемешивании в течение 10 часов при 50°C с эндоксиланазой Grindamyl H640 (Danisco, Copenhagen, Denmark) при 1,4 единиц на г обескрахмаленных и депротеинизированных пшеничных отрубей, и в течение следующих 10 часов при 50°C после добавления второй дозы Grindamyl H640 при 1,1 единиц на г обескрахмаленных и депротеинизированных пшеничных отрубей. После инактивации фермента варкой (30 минут) раствор концентрировали до 20% сухого вещества в испарителе с падающей пленкой и высушивали в распылительной сушилке. Высушенный распылением материал растворяли в воде (1:25 мас./об.) и обрабатывали активированным углем для удаления возможных привкусов, возникающих в результате производственного процесса. Суспензию AXOS и активированного угля (0,75 г/г AXOS) перемешивали в течение 1 часа при 18°C. После декантации активированный уголь удаляли центрифугированием (10000 g, 30 минут, 18°C), и супернатант лиофилизировали. Препарат обладал содержанием AXOS (выраженным как % арабиноксилана в сухом веществе) 78,8%, где AXOS обладали соотношением арабинозы и ксилозы 0,31, avDP 18.
Получение содержащих AXOS видов пива.
Коммерческое светлое пиво (Bud light, сваренное в Anheuser-Bush, St Louis, USA) использовали в качестве основы для получения содержащих AXOS видов пива. Пиво, содержащее 2 г/л чистого AXOS-18-0,31, получали растворением 25,4 г/л AXOS-18-0,31 (78,8% чистоты) в пиве посредством перемешивания и затем разбавления раствора 1:10 (об./об.) в пиве. Пиво, содержащее 10 г/л чистого AXOS-18-0,31, получали растворением 127 г/л AXOS-18-0,31 (78,8% чистоты) в пиве посредством перемешивания и затем разбавления раствора 1:10 (об./об.) в пиве. Соответствующее контрольное пиво получали разбавлением перемешанного пива 1:10 в пиве.
Органолептические анализы.
Органолептические анализы проводили в тихой комнате сеансами, включающими максимум 10 добровольцев одновременно. Субъектов сначала знакомили с процедурами и затем просили дегустировать закодированные образцы пива с различными концентрациями AXOS. Во время дегустации субъекты носили светонепроницаемые маски для глаз, и им индивидуально помогал ассистент, подающий образцы и записывающий отзывы. Порядок представления образцов являлся случайным. Субъектов просили провести ранжирование образцов в порядке увеличения вкусового ощущения. Данные анализировали статистически по критерию суммы рангов Фридмана с использованием программного обеспечения Analyse-it, версии 1.71.
Коммерческое светлое пиво (Bud light, сваренное в Anheuser-Bush, St Louis, USA) дополняли либо 2 г/л, либо 10 г/л богатого AXOS препарата, называемого AXOS-18-0,31, который выделяли из пшеничных отрубей с использованием способа, включающего эндоксиланазы. Органолептический анализ проводили для определения эффекта добавления AXOS на вкусовое ощущение светлого пива. Как показано на Фиг.1, добавление AXOS-18-0,31 улучшало вкусовое ощущение светлого пива как при 2 г/л, так и при 10 г/л, и различие с контрольным пивом являлось значимым при соотношении 10 г/л.
Из этого эксперимента заключили, что AXOS, полученные внешним образом из богатого арабиноксиланом источника, можно добавлять к пиву, и что добавление AXOS к пиву улучшает вкусовое ощущение пива. Ни для одного из видов пива, дополненного AXOS, не показали заметного увеличения вязкости.
Специалисту в данной области будет понятно, что обогащенный AXOS препарат можно добавлять на различных стадиях процесса изготовления пива, включая, без ограничения, затирание, варку сусла, охлаждение сусла, брожение сусла, кондиционирование пива или окончательную обработку пива.
ПРИМЕР 4 - увеличение уровня AXOS в пиве добавлением богатых AXOS препаратов перед брожением
Получение AXOS из побочной фракции разделения крахмала/глютена (AXOS-5-0,5).
Концентрат пшеничного пентозана (WPC, из Pfeifer & Langen, Dormagen, Germany) получали из побочной фракции переработки пшеничной муки в крахмал и глютен, и его химический состав подробно описан Courtin and Delcour (1998, J. Agric. Food Chem., 46: 4066-4073). WPC богат экстрагируемым водой арабиноксиланом (приблизительно 43%) и белковым материалом (приблизительно 30%). Оставшаяся часть в основном состоит из пептида арабиногалактана (приблизительно 14%) и, в меньшей степени, полимерной глюкозы (6%). Арабиноксилан в WPC обладает соотношением арабинозы и ксилозы 0,58, и avDP 58. WPC солюбилизировали в деионизованной воде (1:10 мас./об.) и добавляли силикагель в виде водной суспензии (20% мас./об.) до соотношения силикагель/белок 7:1. pH смеси доводили до 4,8 с использованием 0,1 M HCl, чтобы получить максимальную адсорбцию белков на силикагеле. Через 30 минут перемешивания суспензию фильтровали на воронке Бюхнера. Осадок, содержащий силикагель/белок, отбрасывали, тогда как фильтрат далее инкубировали при 30°C в течение 24 часов с Shearzyme 500L (Novozymes, Bagsvaerd, Denmark) при 29 единицах на г WPC. После инактивации фермента варкой (30 минут) полученный раствор охлаждали и подвергали преципитации этанолом. Этанол (95% об./об.) добавляли при постоянном перемешивании до конечной концентрации 80% (об./об.) и после перемешивания в течение дополнительных 30 минут, осаждения (24 часа, 4°C) и фильтрации полученный осадок растворяли в деионизованной воде и опять подвергали преципитации этанолом. Этанол (95% об./об.) добавляли при постоянном перемешивании до конечной концентрации 65% (об./об.) и после перемешивания в течение дополнительных 30 минут, осаждения (24 часа, 4°C) и фильтрации преципитированный материал удаляли. Оставшийся супернатант подвергали роторному испарению для удаления этанола, растворяли в деионизованной воде и лиофилизировали. Полученный материал гомогенизировали и просеивали через сито 250 мкм. Препарат обладал содержанием AXOS (выраженным как % арабиноксилана в сухом веществе) 78,5%, где AXOS обладал соотношением арабинозы и ксилозы 0,5, avDP 5.
Получение содержащих AXOS видов пива.
2+
2+
Экспериментальные виды пива получали в пилотном масштабе следующим образом. Затирание проводили перемешиванием 33,33 кг пильзенского солода (помол двухвальцовой мельницей), 2,83 кг глюкозы и 120 л воды для пивоварения (обратный осмос с добавлением Ca до конечной концентрации 40 мг/л). Температурная схема затирания являлась следующей: 63°C (35 минут), 72°C (20 минут), 78°C (1 минута). pH сусла контролировали при pH 5,2 добавлением молочной кислоты. Фильтрацию проводили в фильтрационном чане при температуре 78°C в течение 90 минут. Фильтрованное сусло разделяли на две фракции: первая фракция из 10 л (контрольное пиво) и вторая фракция из 10 л (обогащенное AXOS пиво). Две фракции сусла варили отдельно в течение 60 минут. Образцы сусла охмеляли добавлением изомеризованного кислого экстракта хмеля (20% изо-альфа-кислот мас./об., из Botanix ltd., Paddock Wood, England) до конечной концентрации 25 мг/л изо-альфа-кислот за 5 минут до окончания варки. Zn добавляли до конечной концентрации 0,2 мг/л за 5 минут до окончания варки. За 5 мин минут до окончания варки 76,4 г AXOS-5-0,5 добавляли ко второй фракции 10 л сусла для получения обогащенного AXOS пива. Перед добавлением AXOS-5-0,5 растворяли при 1:10 (мас./об.) в воде и перемешивали в течение 30 минут.
7
Сваренные образцы сусла осветляли с использованием гидроциклонного чана. Осветленные образцы сусла разводили 1:1 (об.:об.) свободной от кислорода водой. Охлажденные осветленные образцы сусла засевали лагерными дрожжами (Saflager 3470, Lesaffre) при 10 клеток/мл с последующим брожением в течение 8 суток при 12°C и лагерной выдержкой в течение 7 суток при 0°C.
2
Горечь разведенных образцов пива регулировали добавлением изомеризованного кислого экстракта хмеля (20% изо-альфа-кислот мас./об., Botanix ltd., Paddock Wood, England) при конечной концентрации 25 мг/л изо-альфа-кислот. Пиво фильтровали через листы кизельгура/целлюлозы (1 мкм), разливали и закупоривали в коричневые стандартные бутылки по 25 сентилитров (250 мл) (содержание O<80 частей на миллиард) с использованием изобарической разливной машины с двойным предварительным опорожнением (America monobloc, Cimec, Italy).
Органолептические анализы.
Органолептические анализы проводила в тихой комнате обученная комиссия. Порядок представления образцов являлся случайным. Органолептическим свойствам сладости, кислоты, горечи, терпкости и вкусового ощущения (полноты) давали оценку по шкале от 0 (не поддается детекции) до 8 (очень сильное). Качеству органолептического свойства горечи давали оценку от 0 (очень неприятное) до 8 (очень приятное). Оценки анализировали статистически двусторонними t-тестами с использованием программного обеспечения Analyse-it software, версии 1.73. Членов комиссии просили также указать предпочтение для одного из двух видов пива. Данные предпочтения анализировали статистически по критерию изменений Мак-Немара с использованием программного обеспечения Analyse-it, версии 1.73.
Два экспериментальных светлых низкоалкогольных вида пива получали в пилотном масштабе, начиная с одного и того же сусла, одно с добавлением и одно без добавления AXOS. Препарат AXOS, обладающий средней DP 5 и соотношением A/X 0,5, называемый AXOS-5-0,5, который выделяли из побочной фракции промышленной переработки пшеницы (смотри материалы и методы), добавляли при одной из двух варок в конце варки сусла. Свойства двух видов пива показаны в таблице 7. Оба вида пива обладали очень сходным содержанием алкоголя (приблизительно 2,7% об./об.), сходным действительным содержанием экстрактивных веществ (приблизительно 2,3 г/100 мл) и начальным содержанием экстрактивных веществ (приблизительно 6,7 г/100 мл), хотя содержание мальтодекстрина в обогащенном AXOS пиве являлось немного более низким, в то время как его содержание в AXOS было приблизительно в 2,5 раза выше (увеличено на 151%), чем в контрольном пиве (2,78 г/л по сравнению с 1,09 г/л для обогащенного AXOS и контрольного пива, соответственно).
Органолептический анализ проводили для определения эффекта добавления этого препарата AXOS на вкус и вкусовое ощущение пива (Фигура 2). Добавление AXOS-5-0,5 к пиву приводило к значимо (p<0,05) уменьшенному ощущению кислоты и горечи, в то время как качество горечи, так же как вкусовое ощущение, значительно улучшилось. Из 13 членов комиссии, 12 предпочитали обогащенное AXOS пиво по сравнению с контрольным пивом (точное значение p = 0,0034 по критерию изменений Мак-Немара). Эти данные снова ясно показывают, что AXOS действительно оказывает положительное влияние на вкус и вкусовое ощущение пива.
ПРИМЕР 5 - увеличение уровня AXOS в пиве, содержащем приблизительно 7% алкоголя и 5,8 г/100 мл действительного содержания экстрактивных веществ
2+
2+
6
Другое обогащенное axos крепкое пиво получали следующим образом: солод: пильзенский солод тонкого помола (28 кг), богатый AXOS препарат из пшеничных отрубей, называемый AXOS-18-0,31 (смотри материалы и методы из примера 3) (6 г/л); вода для пивоварения: обратный осмос (100 л) с добавлением Ca (40 мг/л); схема пивоварения: 63°C (30 мин), 72°C (45 мин), 78°C (120 мин, включая фильтрацию сусла в фильтрационном чане); pH сусла контролировали при pH 5,6; варка сусла: 75 мин; осветление сусла: гидроциклонный чан; добавление Zn (0,2 мг/л) к осветленному суслу; охмеление: добавление изомеризованного кислого экстракта хмеля (20% изо-α-кислот мас./об., Botanix ltd., Paddock Wood, England) в конце варки сусла; соотношение засева дрожжами: 5×10 клеток/мл дрожжей для верхового брожения; брожение: 9 суток при 22-25°C; созревание: в бочке (10 суток при 2°C); фильтрация пива: листы кизельгура/целлюлозы (1 мкм). Обогащенный axos крепкий эль обладал процентом алкоголя приблизительно 7%, действительным содержанием экстрактивных веществ приблизительно 5,8 г/100 мл и содержанием AXOS приблизительно 5 г/л.