Индукция нейральной дифференцировки стромальных клеток жировой ткани

Оригинальные исследования

Индукция нейральной дифференцировки стромальных клеток жировой ткани

ТВ. Лопатина1, Н.И. Калинина1, А.В. Ревищин 2, АА. Беме1, И А. Спирова1, Г.В. Павлова 2, Е.В. Парфенова 3

1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва

2 Институт биологии гена РАН, Москва

3 Кардиологический научно-производственный центр, Москва

Induction of neural differentiation of adipose stromal cells

T.V. Lopatina1, N.I. Kalinina1, A.V. Revischin 3, A.A. Beme1,1 A. Spirova1,

G.V. Pavlova 3, E.V. Parfenova 3 1 Lomonosov Moscow State University 3 RAS Institute of Gene Biology, Moscow

3 Cardiology Research Center, Moscow

В работе исследованы способы индукции нейральной дифференцировки стромальных клеток жировой ткани (СКЖТ). Для выделения стромальных клеток использовали жировую ткань человека и мыши. СКЖТ второго пассажа были индуцированы различными агентами, в том числе изобутилметилксантином (Isobutylmethylxanthine, IBMX], $-меркаптоэтанолом, глия-производным нейротрофическим фактором, (glial cell line derived neurotrophic factor, GDNF), мозг-производным нейротрофическим фактором, (brain-derived neurotrophic factor; BDNF), рети-ноевой кислотой (retinoic acid, RA), 5-азацитидином, а также сочетанием этих веществ. Через 3 сут. после индукции проводили анализ дифференциальной экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени. Эффективность индукции оценивали на основе повышения транскрипции маркерных генов нейральной дифференцировки: нестина, $3-тубулина, МАР2 и нейрон-спе-цифической енолазы (Епо2). Экспрессию маркерных белков нейральной дифференцировки тестировали с помощью вестерн-блот анализа. При добавлении в индуцирующую среду RA или BDNF в сочетании с 5-азацитидином и культивировании СКЖТ с этими индукторами в течение недели увеличивается количество мРНК и белка нестина, тубулина и Епо2. При трансплантации в головной мозг мыши индуцированных мышиных СКЖТ, увеличивается время жизни этих клеток, а также наблюдается миграция из области введения в ткани мозга реципиента. Таким образом, воздействие на СКЖТ ретиноевой кислоты и BDNF в сочетании с 5-азацитидином повышает уровень транскрипции нейральных маркеров, а также жизнеспособность и интеграцию этих клеток после трансплантации в головной мозг мыши.

Ключевые слова: стромальные клетки жировой ткани, нейральная дифференцировка.

Adipose stromal cells (ASCs) are progenitor cells capable to differentiate into a large variety of cell types including neuronal cells. Many active ingredients were suggested for the induction of neural differentiation of stromal progenitor cells. Flowever the combination of pharmaceutically approved agents allowing stable induction of neural differentiation of ASCs is not established. Flere, we tested the ability of brain derived neurotrophic factor (BDNF) and retinoic acid (RA) alone as well as together with DNA demethylating agent 5-azacytidine to induce stable neural differentiation of ASCs. ASCs were isolated from human or mouse (BIG strain) sub cutis as described by Zuk et at. At passages 2—5 the cells were induced with NIM (DMEM/F12, 3% FBS and 1 mcM azacytidine supplemented with 1mcM RA or 20ng/ml BDNF) for 3 days. The efficiency of neural differentiation was estimated by the change of expression of neuronal markers, including nestin, tubulin-beta3, neuron-specific enolase 2 and microtubule-associated protein 2, at 3 and 7 days after induction using Real Time PCR. The expression of marker genes increased 6-10 times after incubation in the NIM, supplemented with RA, and up to

4 times in the medium containing BDNF 3 days after induction. Furthermore, ASCs primed to neural differentiation demonstrate significantly better surviving and incorporation in the brain tissue after transplantation into the mouse brain. Taken together, our data suggest that the combination of BDNF or RA with 5-azacytidine could be suggested for the induction of stable neural transdifferentiation.

Keywords: adipose stromal cells, neural differentiation.

Введение

Строма жировой ткани содержит малодифференцированные клетки-предшественницы, которые по своему фенотипу и экспрессионному профилю сходны с мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга

[1]. Стромальные клетки-предшественницы из жировой ткани (СКЖТ) под действием различных индукторов способны дифференцироваться in vitro в различные типы клеток: остеобласты, хондробласты, адипоциты

[2], гепатоциты, эндотелиальные клетки [3], миоблас-ты [4], кардиомиоциты [5], эпителиальные клетки [6], а также нейральные предшественники [7]. В частности, нейральную дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток можно индуцировать с помощью ретиноевой кислоты [8] и нейротрофических факторов [9, 10]. Однако способность СКЖТ воспринимать сигналы

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, ІУ» 4, 2008

нейротрофических факторов остается невыясненной. Кроме того, до сих пор не было предложено оптимального способа индукции нейральной дифференцировки СКЖТ in vitro.

В данной работе проведен сравнительный анализ эффективности нейральной дифференцировки под действием различных индукторов, как по ранее опубликованным [2], так и по разработанным нами протоколам, основанным на использовании ретиноевой кислоты и BDNF в сочетании с 5-азацитидином — химическим соединением, вызывающим деметилирование ДНК. BDNF способен активировать пролиферацию нейральных стволовых клеток и их дифференцировку [11]. Ретиноевая кислота активирует транскрипцию генов, участвующих в регуляции нейральной дифференцировки, посредством взаимодействия с ядерными рецепторами.

А

Оригинальные исследования

51

Материал и методы

Выделение стромальных клеток из жировой ткани

СКЖТ были выделены по протоколу Р.А. 2ик еЬ а1. [12]. Подкожная жировая клетчатка человека была получена при полостных операциях у неонкологических больных, средний возраст которых составлял 4СЫ30 лет. СКЖТ мыши были выделены из подкожного жира паховой области самцов линии В1аск/6. Жировую ткань измельчали ножницами, затем обрабатывали коллагеназой Ыпуйгодеп», США, 30 ед. на мл ткани) и протеазой С«0!Ьсо», США, 200 ед. на мл ткани) в течение 40 мин при 37°С при постоянном перемешивании. Затем в суспензию добавляли равный объем среды ОМЕМ С«0!Ьсо», США) с 10% фетальной сыворотки коров (РВБ, «В1Ьсо», США) и центрифугировали 5^10 мин при 900 оборотах в минуту. Осадок, в котором находилась фракция стро-мально-васкулярных клеток, ресуспендировали в ОМЕМ

Таблица 1. Индукторы нейральной дифференцировки

1. 5-азацитидин (I цМ), «Sigma», США

2. p-меркаптоэтанол (I цМ), «Helicon», Россия

3. BDNF (20 ng/ml), «PeproTech», США

4. GDNF (20 ng/ml), «Clontech», США

5. IBMX (S00 цМ), «Sigma», США

6. Ретиноевая кислота (I цМ), «Sigma», США

7. Кондиционированная среда с нейральных стволовых клеток

8. S-азацитидин

9. S-азацитидин

10. S-азацитидин

11. S-азацитидин (1 цМ) + BDNF (20 ng/ml),

GDNF

Таблица 2. Сиквенс праймеров

с 10% FBS и фильтровали через 100-мм клеточный фильтр (BD Biosciences, Bedford, МА). Далее клетки высаживали на культуральные чашки Петри («Costar Corning», США) и помещали в С02-инкубатор при 37°С и 5% С02. На следующий день в чашках меняли среду. Таким образом, в культуре оставались только прикрепившиеся клетки. После образования монослоя клетки снимали трипсином и рассевали в соотношении 1:2.

Окрашивание клеток и проточная цитометрия СКЖТ были охарактеризованы по наличию антигенов CD34 (Dako, # С7238), c-kit (Dako, # R7145), CD73 (BD, # 550257), CD105 (Serotec, # MCA1557). Клеточную суспензию (0,5^1 x108 клеток) первичной культуры и второго пассажа в 500 ц1 PBS буфера (phosphate buffered saline) инкубировали с первичными антителами в течение 40 мин. После трехкратной отмывки в PBS клетки инкубировали с вторичными антителами. Флуоресценция клеток была оценена методом проточной цитометрии на приборе MoFlo (Dako Cytomation, Дания) и проанализирована с помощью программы Summit 4.1. Изотипический контроль присутствовал в каждом эксперименте, и специфичность окрашивания была подтверждена сравнением флуоресценции между контролем и специфическими антителами. Всего для определения наличия антигена анализировали более 300 ООО клеток.

Индукция нейральной дифференцировки После 2-го пассажа СКЖТ переносили в 6-луночную плату и заливали средой DMEM с 10% FBS. Через сутки среду заменяли на DMEM/F12 с 3% FBS и добавляли индукторы (табл. 1).

Анализ изменения транскрипции генов Через 3 сут. после индукции из клеток выделяли суммарную РНК («RNeasy Mini Kit», «QIAGEN», США). Затем синтезировали кДНК согласно стандартному протоколу фирмы «Fermentas», используя олиго^Т-праймеры. Анализ дифференциальной экспрессии генов проводили методом ПЦР в реальном времени с применением Sybr Green («Синтол», Россия). Используемые в работе праймеры представлены в табл. 2.

Название праймера Последовательность t°C отжига праймеров Длина продукта

B-actin for CCTGGCACCCAGCACAAT 60 144

B-actin rev GGGCCGGACTCGTCATAC 60 144

Gapdh for TGCACCACCAACTGCTTAGC 60 87

Gapgh rev GGCATGGACTGTGGTCATGAG 60 87

TUBB for GCCAGACGCGCCCAGTATGAGG 64,4 232

TUBB rev GGTTCCGGGTTCCAGGTCCAC 61,1 232

MAP-2 for CAACAGGAATTGACTCCCTCTAC 60 80

MAP-2 rev TCACCAGGCTTACTTTGCTTC 60,2 80

Eno-2 for CCACCGCCACCGCCACTACCA 66,4 162

Eno-2 rev GCACTGCAGCCCGGAAAAGACC 63,6 162

Nestin for GCAGCTGGCGCACCTCAAGATGTC 6S,7 22S

Nestin rev GGCAAGGGTGAGGGGAGGGAAGTT 65,1 22S

GFAP for CACCGCAGCCCTGAAAGAGA S7,6 172

GFAP rev CTGGCGCCGGTAGTCGTT SS,9 172

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, N» 4, 2008

Оригинальные исследования

Иммунофлуоресцентное окрашивание

индуцированных СКЖТ

Для анализа индукции дифференцировки на белковом уровне СКЖТ 2-го пассажа переносили в 8-луноч-ные стеклянные платы (Lab-Tek Chamber Slide, Nalge Nunc Int.) и на следующий день вносили индукторы. Через 3 сут. индуцирующую среду меняли на свежую, также содержащую соответствующие индукторы, культивировали еще 4 сут., после чего фиксировали в 4% растворе формальдегида 2 мин при комнатной температуре с последующей 3-х кратной отмывкой PBS. После отмывки клетки обрабатывали 1% раствором БСА (бычий сывороточный альбумин) с 10% козьей сыворотки в течение 30 мин, затем в течение 1 часа инкубировали при комнатной температуре в растворе кроличьих антител против нестина (Chemicon, США, 1:100), Eno2 (Chemicon, США, 1:50) и мышиных против тубу-лина (Abeam, 1:100). В качестве отрицательного контроля использовался 1% раствор БСА с 10% козьей сывороткой. После отмывки в PBS клетки в течение 30 мин инкубировали в растворе PBS с флуоресцентными вторичными козьими антителами (1:100) против иммуноглобулина мыши (Alexa 488, Molecular Probes, США) или против иммуноглобулина кролика (Alexa 568, Molecular Probes, США).

Статистический анализ

Статистический анализ данных проводился с использованием программы SigmaStat 9.0. Для сравнения маленьких групп и ненормальных распределений использовался U-критерий Манна-Уитни. Различия считались статистически значимыми при уровне значимости р<0,05.

Результаты и обсуждение

Характеристика первичной культуры СКЖТ

Исходная популяция стромально-васкулярных клеток жировой ткани гетерогенна. На основании анализа экспрессии маркерных антигенов на поверхности этих клеток можно утверждать, что в этой популяции содержатся стволовые клетки, сходные по антигенному профилю с мезенхимальными и гемопоэтическими клетками-пред-шественницами [13—15]. После выделения из ткани культивируемые СКЖТ образовывали монослой фиброб-ластоподобных клеток. Через 8^9 сут. культивирования определяли соотношение мезенхимальных и гемо-поэтических клеток-предшественниц в этой популяции. Оказалось, что популяция клеток 2-го пассажа содержит около 98% клеток, имеющих фенотип мезенхимальных клеток-предшественниц, содержащих антигены CD73 и CD105. Несмотря на то, что в первичной культуре СКЖТ большинство клеток, несущих антиген CD73, экспрессировали также маркерный антиген гемопоэти-ческих стволовых клеток CD34, на клетках 2 пассажа экспрессия этого антигена практически была нулевая. Это согласуется с ранее опубликованными данными о том, что экспрессия мембранного гликопротеида CD34 на клетках снижается по мере их культивирования. Что касается маркера гемопоэтических стволовых клеток с-kit, то в популяции СКЖТ 2 пассажа обнаружено около 1% клеток, несущих этот антиген. Доля клеток, содержащих c-kit, не изменилась по сравнению с популяцией свежевыделенных СКЖТ. Эти данные свидетельствуют о способности гемопоэтических предшественников к са-моподдержанию в составе популяции.

Проверка эффективности различных индукторов дифференцировки

Нейральная дифференцировка клеток сопровождается повышением экспрессии специфичных генов. В частности, клетки, дифференцирующиеся в нейральном направлении, содержат белок цитоскелета нестин (маркер ранних нейральных предшественников), нейрональную форму рЗ-тубулина, глиальный кислый фибриллярный белок GFAP (маркер астроцитарной глии), белок, взаимодействующий с микротрубочками МАР2, специфичную для нейронов енолазу Епо2 и другие маркеры нейральной дифференцировки.

Нами было проанализировано содержание продуктов, перечисленных выше, маркерных генов нейральной дифференцировки в СКЖТ, инкубированных в присутствии

р

5-азацитидин [2, 7, 16], а также нейротрофических факторов роста BDNF и GDNF (см. табл. 1). Продукт гена GFAP не определялся ни в контрольных СКЖТ, ни в клетках, инкубированных в присутствии индукторов, перечисленных в табл. 1. Анализ содержания мРНК других маркерных генов показал, что уровень экспрессии Eno2, МАР2, TUBB и Nestin был выше в клетках, инкубированных в присутствии ретиноевой кислоты или BDNF на фоне 5-азацитидина (табл. 3).

В СКЖТ, культивированных в присутствии других индукторов нейральной дифференцировки, увеличения уровня мРНК маркерных генов нейральной дифференцировки не наблюдалось (см. табл. 3).

На основании полученных результатов для индукции нейральной дифференцировки СКЖТ были выбраны ретиноевая кислота или BDNF в сочетании с 5-азацитидином. При индукции дифференцировки СКЖТ, полученных от 8 доноров, было установлено, что при культивировании клеток в присутствии ретиноевой кислоты в сочетании с 5-азацитидином в этих клетках возрастал уровень мРНК, нестина и тубулина. Индукция нейральной дифференцировки клеток с помощью BDNF в сочетании с 5-азацитидином вызывает увеличение экспрессии всех

4 проанализированных генов (табл. 4).

Таблица 3. Относительный уровень амплификации фрагментов маркерных генов в СКЖТ, индуцированных различными агентами

Nestin TUBB Eno2 MAP2

Control 11,7 З,8 7,З 7,O

aza 4,б 17,1 P,7 6O,O

p-merc O,O O,7 З,8 P,9

IBMX O,O 4,1 P,9 O,7

BDNF 1,9 7,4 7,б 1O,O

GDNF O,O O,7 P,8 1,4

RA O,O O,8 P^ 1,4

Cond. Media 9,O 4,S 4,7 S,O

BDNF+aza 6O,4 1O,2 3OO,3 17O,O

GDNF+aza S,7 4,1 2O,8 19,3

RA+aza 262,1 137,8 48,7 6,P

BDNF,GDNF,RA+aza 17,4 1,4 З^ З^

Примечание. Уровень амплификации находится в прямой зависимости от уровня мРНК генов в СКЖТ.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, N» 4, 2008

Оригинальные исследования

Таблица 4. Относительный уровень амплификации фрагментов маркерных генов в СКЖТ, индуцированных BDIMF и RA на фоне 5-азацитидина

Nestin TUBB Eno2

МАР2

^ntrol 0,34 0,63 0,07 0,07

aza 0,04 0,86 0,17 0,0S

BDNF+aza 1,02 1,64 2,09 2,11

RA+aza 2,01 2,3 0,41 0,39

Примечание. Уровень амплификации находится в прямой зависимости от уровня мРНК генов в СКЖТ. Жирным шрифтом показаны увеличенные значения уровней экспрессии мар-кёрных генов.

Полученные данные были подтверждены с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания индуцированных клеток. Показано, что инкубация клеток с ретиноевой кислотой приводит к повышению содержания в них не-р

сутствии BDNF, возрастает содержание как нестина и р

Епо2 (рис. 1).

Активация экспрессии генов Епо2, МАР2, TUBB и Nestin в СКЖТ, культивированных в присутствии BDNF или ретиноевой кислоты, может свидетельствовать об индукции нейральной дифференцировки этих клеток. Ретиноевая кислота в комплексе с белком CRABP входит в ядра клеток и взаимодействует с транскрипционным комплексом, который включает пару рецепторов ретиноевой кислоты RAR (retinoic acid receptor) и RXR (retinoic X receptor). По последним данным, ретиноевая кислота влияет на экспрессию около 530 генов, из них более 27 являются ее непосредственными мишенями. В частности, это гены транскрипционных факторов, таких как Hoxal, Н0ХА4, НохМ, Hoxb4, Hoxd4, Cdx1, и Pit1, которые принимают участие в регуляции эмбрионального развития [17]. BDNF — это нейротрофический фактор, контролирующий жизнеспособность, развитие и функционирование нервных клеток в центральной и периферической нервной системе [11].

Индуцированные мышиные СКЖТ способны

встраиваться в ткань стриатума мыши

Для того чтобы проанализировать способность СКЖТ после индукции нейральной дифференцировки встраиваться в ткань мозга мыши, нами были использованы клетки самцов мышей линии Black/б, трансгенных по гену GFP. СКЖТ, содержащие зеленый флуоресцентный

Nestin

TUBB

EN02

Контроль

>1 / VV i /' 4 >

f i /// '

г т

RA

BDNF

^ / У , -.

У ч. ^

N ) .>]•

Т "/ \/

. , * ч.

* V V-

Рис. 1. Содержание маркерных белков нейральной ифференцировки в стромальных клетках жировой ткани:

Nestin - окрашивание антителами к нестину; NUBB - антителами к р3-тубупину; EN02 - к нейрональной енолазе;

RA - культивирование в присутствии ретиноевой кислоты; BDNF - в присутствии мозг-производного нейротрофического фактора, х 250

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, N» 4, 2008

Оригинальные исследования

Контроль НА BDNF

Рис. 2. вРР-положительные стромальные клетки жировой ткани мыши через 9 сут. после трансплантации в головной мозг мыши. Контрольные клетки [верхняя панель) находятся в области трека, и их отделяет от мозговой ткани слой межклеточного вещества [на фотографии виден как черная прослойка между зелеными клетками и слабо аутофлуоресцирующей тканью мозга). Между клетками, индуцированными с помощью ретиноевой кислоты [РА) или ВО№, и тканью реципиента границы не формируются, клетки мигрируют из области введения в ткань мозга реципиента, х 80

белок, культивировали в присутствии ретиноевой кислоты или ЕЮЫР в течение 3-х сут. Затем эти клетки были введены в стриатум мышей линии В1аск/6, не экспрессирующих белок БРР. Через 7, 9 и 11 сут. головной мозг извлекали, проводили анализ распределения трансплантированных клеток с помощью флуоресцентного микроскопа. Уже через 9 сут. после инъекции были заметны различия в распределении контрольных и индуцированных клеток в ткани мозга. Так, контрольные клетки не контактировали с тканью реципиента и располагались исключительно в области трека, оставленного иглой. Напротив, СКЖТ, культивированные в присутствии индукторов, мигрировали в ткани мозга (рис. 2).

Более того, через 11 дней после инъекции в стриа-туме не обнаруживалось контрольных клеток, тогда как СКЖТ, индуцированные в нейральную дифференциров-ку, выживали в мозге мыши-реципиента.

Заключение

Обнаружено, что ВОЫР и ретиноевая кислота в сочетании с 5-азацитидином вызывают активацию экспрессии

маркерных генов нейральной дифференцировки в СКЖТ. Однако использование этих факторов без 5-азацитиди-на оказалось малоэффективным. С помощью анализа увеличения транскрипции маркерных генов нами были подобраны эффективные индукторы нейральной дифференцировки СКЖТ. Выживаемость и способность индуцированных клеток к миграции была проверена in vivo с помощью трансплантации индуцированных мышиных СКЖТ, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок (GFP), в головной мозг мыши. Клетки, в которых была индуцирована нейральная дифференцировка, способны встраиваться в ткань мозга реципиента после трансплантации и сохранять жизнеспособность более 11 сут. после введения. Для того чтобы установить, какие пути внутриклеточной сигнализации опосредуют индуцирующее воздействие BDNF и ретиноевой кислоты на нейральную дифференцировку СКЖТ, необходимы дальнейшие исследования. Таким образом, трансплантация СКЖТ, в которых была индуцирована нейральная дифференцировка, может являться перспективным подходом для восстановления нервной ткани.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Gronthos S., Franklin D.M., Leddy H.A. et al. Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells. J. Cell. Physiol. 2001; 189[1]: 54-63.

2. Ashjian P.H., Elbarbary A.S., Edmonds B. et al. In vitro differentiation of human processed lipoaspirate cells into early neural progenitors. Plast. Reconstr. Surg. 2003; 111 [61: 1922—31.

3. Seo M.J., Suh S.Y., Bae Y.C., Jung J.S. Differentiation of human adipose stromal cells into hepatic lineage in vitro and in vivo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005; 328И): 258—64.

4. Mizuno H., Zuk P.A., Zhu M. et al. Myogenic differentiation by human processed lipoaspirate cells. Plast. Reconstr. Surg. 2002; 109C1 ]; 199-211.

5. Planat-Benard V., Menard C., Andre M. et al. Spontaneous cardiomyocyte differentiation from adipose tissue stroma cells. Circ. Res. 2004; 94t2]: 223-9.

6. Brzoska М., Geiger H., Gauer S., Baer P. Epithelial differentiation of human adipose tissue-derived adult stem cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005; 330t1]; 142—50.

7. Fujimura J., Ogawa R., Mizuno H. et al. Neural differentiation of adipose-derived stem cells isolated from GFP transgenic mice. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005; 333t1]; 116—21.

8. Kim B.J., Seo J.H., Bubien J.K., Oh Y.S. Differentiation of adult bone marrow stem cells into neuroprogenitor cells in vitro. Neuroreport 2002; 13t9]: 1185-8.

9. Lim J.Y., Park S.I., Oh J.H. et al. Brain-derived neurotrophic factor stimulates the neural differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells and survival of differentiated cells through MAPK/ ERK and PI3K/Akt-dependent signaling pathways. J. Neurosci. Res. 2008 [in press],

10. Rivera F.J., Sierralta W.D., Minguell J.J., Agner L. Adult hippocampus derived soluble factors induce a neuronal-like phenotype in mesenchymal stem cells. Neurosci. Lett. 2006; 406C1-2): 49—54.

11. Reichardt L.F. Neurotrophin-regulated signalling pathways. Philos. Trans. R Soc. Lond. B Biol. Sci. 2006; 361 [14731; 1545—64.

12. Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H. et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 2001; 7 [21: 211-28.

13. Miranville A., Heeschen C., Sengenes C. et al. Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells. Circulation 2004; 110(31: 349—55.

14. Planat-Benard V., Silvestre J.S., Cousin B. et al. Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives. Circulation 2004; 109C5): 656—63.

15. Zuk P.A., Zhu M., Ashjian P. et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell 2002; 13C12): 4279—95.

16. Ning H., Lin G., Lue T.F., Lin C.S. Neuron-like differentiation of adipose tissue-derived stromal cells and vascular smooth muscle cells. Differentiation 2006; 74(9-101: 510—8.

17.Balmer J.E. Blomhoff R. Gene expression regulation by retinoic acid. J. Lipid Res. 2002; 43C11): 1773-808.

Поступила 10.102008

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, N» 4, 2008