Антипролиферативный потенциал монооксида углерода

Антипролиферативный потенциал монооксида углерода Старикова Е.Г.

Antiproliferative potential of carbon monoxide Starikova Ye.G.

В результате проведенного исследования было показано, что монооксид углерода обладает антипролиферативным потенциалом в отношении клеток линии Jurkat. Указанный газовый трансмиттер вызывает задержку клеток в G1-фазе клеточного цикла. Ингибирование р38-зависимых путей не влияет на СО-опосредованные изменения пролиферации опухолевых клеток линии Jurkat.

Ключевые слова: клеточный цикл, монооксид углерода, р38 МАР-киназа.

The investigation results showed carbon monoxide had antiproliferate potential in Jurkat cells. This gaseous transmitter led to delay of G1 phase of cell cycle. Inhibition of p38 MAPK-dependent pathways didn't influence on CO-mediated proliferation of Jurkat cells changes.

Key words: cell cycle, carbon monoxide, p38 MAP kinase.

Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск

© Старикова Е.Г.

УДК 576.36:576.385.5:612.111.14

Введение

пектам жизнедеятельности гладкомышечных клеток обусловлен способностью СО изменять сосудистый тонус. Антипролиферативный потенциал монооксида углерода, выявленный в результате данных исследований, может быть использован для управления клеточным циклом при опухолевой трансформации клеток.

Опухолевые клетки характеризуются коротким и неконтролируемым периодом пролиферации. Большинство онкогенных событий ведут к дисрегуляции клеточных процессов, ответственных за контроль клеточного цикла. Последний можно разделить на несколько стадий: G1-стадия (самая продолжительная стадия, в которой клетки подготавливаются к синтезу ДНК); S-период (необходим для репликации ДНК); G2-стадия (клетки подготавливаются к митозу) и М-фаза (представляет собой митотическое деление клеток) [4].

Целью настоящей работы явилось определение роли монооксида углерода в регуляции прогрессии фаз клеточного цикла опухолевых клеток линии Jurkat.

Материал и методы

Исследования последних лет показали, что монооксид углерода, признанный вторым газовым посредником вслед за оксидом азота, вовлечен в регуляцию пролиферации клеток. Так, СО ингибирует экспрессию мРНК циклина А и блокирует Сdk2, тем самым вызывая остановку клеточного цикла гладкомышечных клеток в G1-фазе [5]. Индукция экспрессии HO-1 (фермент, ответственный за синтез СО) ограничивает пролиферацию гладкомышечных клеток за счет ингибирования семейства транскрипционных факторов E2F. Последние участвуют в позитивной регуляции генов, продукты которых вовлечены в прогрессию S-фазы клеточного цикла [3]. Интерес исследователей к различным ас-

В качестве материала исследования были использованы клетки линии Jurkat (Т-лимфобластная лейкемия), которые инкубировали при температуре 37 °С и 5% СО2 в полной питательной среде, содержащей 90% RPMI-1640 («Вектор-Бест», г. Новосибирск), 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Биолот», г. Санкт-Петербург), инактивированной при 56 °С в течение 30 мин, L-глутамин в концентрации 0,3 мг/мл, гента-мицин в концентрации 100 мкг/мл. Донор монооксида углерода CORM-2 добавляли в среду инкубации клеток в конечной концентрации 50, 100 и 500 мкм. Оценивали распределение клеток по фазам клеточного цикла после 30 мин и 24 ч воздействия донора моно-

оксида углерода. В качестве контроля использовали интактные клетки линии Jurkat. Для определения вовлеченности р38 МАР-киназы (МАРК) в СО-опосредованную регуляцию клеточного цикла в инкубационную среду клеток добавляли 0,02 мкм ингибитора данной киназы SB203580 за 30 мин до аппликации CORM-2.

Анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла проводили с использованием программного пакета ModFit7 для проточной лазерной цитометрии (Fax Canto2 (Beckton Dickenson, США)). Для пермеа-билизации и окрашивания клеток использовали набор CycleTestKit (BD Bioscience, США).

Проверку нормальности распределения количественных показателей проводили с использованием критерия Колмогорова—Смирнова. Достоверность различий (р < 0,05) оценивали с помощью непараметрических критериев Манна—Уитни (для независимых выборок) и Вилкоксона (для зависимых выборок). Данные представлены в виде медианы Ме, верхнего и нижнего квартилей (Q1—Q3).

Результаты и обсуждение

При анализе клеточного цикла оценивается способность связывания ядерной ДНК с флуоресцентной меткой и последующий подсчет сигнала флуоресценции с помощью проточной цитометрии. Известно, что клетки в G1-фазу клеточного цикла имеют одну копию ДНК, и поэтому обладают 1Х интенсивностью флуоресценции. Клетки в G2/M-фазе имеют в своем составе двухкопийную ДНК и, соответственно, 2Х интенсивность. Таким образом, клетки в S-фазе синтеза ДНК обладают промежуточной флуоресценцией между 1Х и 2Х популяциями клеток (рисунок) [4].

При анализе распределения интактных клеток линии Jurkat по фазам клеточного цикла было продемонстрировано, что спустя 4 ч после пересева в G1-фазе клеточного цикла находились 63,93 (63,63—65,24)% клеток, в S 21,73 (19,24—22,90)% и 14,97 (14,48—15,55)% в G2. G1-фаза является критическим периодом клеточного цикла, когда позитивные и негативные сигналы могут вмешиваться в его регуляцию. Внеклеточные сигналы влияют на пролиферацию до прохождения клеткой точки рестрикции R, после которой клетка обречена на один раунд деления. Если клетка не получает митогенно-го стимула во время G1 -фазы, она остается в фазе

покоя G0. Наличие клеток в S-фазе клеточного цикла позволяет сделать вывод о том, что клетки в культуре получают достаточное количество митогенных сигналов и проходят R-точку [1].

Распределение клеток по фазам клеточного цикла в интактной культуре линии Jurkat Совместное культивирование клеток линии Jurkat с донором монооксида углерода CORM-2 в течение 4 ч сопровождалось увеличением количества клеток в G1-фазе цикла по сравнению с аналогичным значением в интактной культуре (р < 0,05). При этом наблюдалось уменьшение числа клеток в S-фазе клеточного цикла по сравнению с контролем (р < 0,05). Количество клеток в G2-фазе не отличалось от такового в интактной культуре клеток линии Jurkat (р > 0,05). Полученные данные свидетельствуют о том, что под влиянием монооксида углерода увеличивается продолжительность G1-фазы клеточного цикла (таблица). Проверка правильности прогрессии клеточного цикла осуществляется в нескольких его точках, получивших название сверочных (checkpoint). Данные участки расположены в концах фаз G1, G2 и М. В первой точке осуществляется проверка наличия повреждений ДНК, во второй наряду с повреждениями ДНК проверяется завершенность репликации, в третьей тестируется правильность расхождения хромосом в митозе. Если обнаруживается какое-либо из вышеперечисленных нарушений, то происходит остановка клеточного цикла, что дает время для их исправления [4]. Полученные данные об увеличении числа клеток в G1-фазе при действии на них донора монооксида углерода свидетельствуют о том, что СО обладает генотоксиче-

Старикова Е. Г. Антипролиферативный потенциал монооксида углерода

ским эффектом, и задержка клеток в G1-фазе необхо- дима для устранения полученных дефектов.

Таблица 1

Распределение клеток линии Jurkat по фазам клеточного цикла под воздействием монооксида углерода

Показатель Количество клеток в Gl-фазу клеточного цикла, % Количество клеток в S-фазу клеточного цикла, % Количество клеток в G2^a3y клеточного цикла, %

Интактные клетки, 4 ч 63,93

Воздействие CORM-2, 4 ч 67,28

р1 < 0,05 р1 < 0,05 р1 > 0,05

Интактные клетки, 24 ч 52,40

р1 < 0,05 р1 < 0,05 р1 > 0,05

Воздействие CORM-2, 24 ч 64,33

р2 < 0,05 р2 < 0,05 р2 > 0,05

Воздействие ингибитора 59,93

р38 и ТОт-2, 24 ч р2 < 0,05 р2 < 0,05 р2 < 0,05

ръ > 0,05 р3 > 0,05 р3 > 0,05

Примечание. р1 — достоверность различий по сравнению с контролем после 4 ч инкубации; р2 — достоверность различий по сравнению с контролем после 24 ч инкубации; р3 — достоверность различий по сравнению с воздействием монооксида углерода после 24 ч инкубации.

После суток инкубации интактных клеток линии Jurkat в полной питательной среде 52,40 (52,15— 52,48)% клеток остаются в Gl-фазе клеточного цикла, 28,96 (28,75—29,25)% клеток вступают в фазу синтеза и 18,74 (18,61—18,77)% клеток готовы начать митоз. Сравнение указанных данных с аналогичными параметрами после 4 ч инкубации позволяет сделать вывод об укорочении Gl-фазы клеточного цикла (таблица). Показано, что опухолевые клетки способны вырабатывать вещества, способствующие пролиферации [1]. Возможно, указанные ауто- и паракринные механизмы позволяют клеткам линии Jurkat укорачивать период G1-фазы.

Воздействие СО-высвобождающей молекулы на клетки линии Jurkat в течение 24 ч приводило к увеличению числа клеток в G1-фазе, их уменьшению в S-фазу по сравнению с аналогичными параметрами в контроле (р < 0,05). Количество клеток в G2-фазе клеточного цикла не отличалось от такового в ин-тактных клетках линии Jurkat (р > 0,05). Таким образом, под влиянием монооксида углерода в клетках удлиняется G1-фаза. Задержка клеток в G1-фазе клеточного цикла свидетельствует об антипролифера-тивном влиянии СО.

Было показано, что часть внутриклеточных эффектов монооксида углерода опосредованы активацией р38 МАРК [2]. Последняя является стрессактиви-руемой киназой, поскольку ее индукция происходит в

результате воздействия на клетку различных стрессовых сигналов, приводящих к гибели. Данный факт положен в основу утверждения о том, что р38 опосредует клеточную смерть. Указанное утверждение верно в большинстве случаев, однако исследования причина — эффект выявили, что при некоторых условиях р38 ответственна за выживание клеток. р38 МАРК в качестве молекулы выживания активируется в условиях повреждения клеточной ДНК. В литературе имеются данные, указывающие на то, что р38 МАРК вовлечена в обеспечение выживаемости опухолевых клеток независимо от повреждения ДНК и способствует мета-стазированию опухолей. Данный эффект опосредован р38 МАРК за счет регуляции секреции факторов, вовлеченных в выживаемость и миграцию клеток. Так, базальная активация р38 МАРК в В-клетках хронической лимфоцитарной лейкемии ответственна за экспрессию ММР-9 металлопротеазы, которая необходима для выживания данных клеток при культивировании в присутствии стромальных клеток [6]. Снижение базального уровня и TGFpi-индуцированой ММР-9 активности было обнаружено в клетках рака молочной железы при генетическом и фармакологическом инги-бировании р38 МАРК, что приводило к угнетению метастазирования in vivo [7].

Совместное инкубирование клеток с CORM-2 и ингибитором р38 не приводило к изменению распределения клеток по фазам клеточного цикла (таблица). Полу-

ченные данные свидетельствуют о том, что используемая концентрация донора монооксида углерода является физиологичной для клеток и не приводит к индукции стрессактивируемой р38 МАРК.

Таким образом, монооксид углерода вызывает задержку клеток в в1-фазе клеточного цикла, данный эффект не зависит от р38 МАР-киназы.

Заключение

При выполнении данного исследования были получены результаты, свидетельствующие об антипро-лиферативном потенциале монооксида углерода в отношении опухолевых клеток линии .Тш"ка1 Задержка клеток в в1-фазе под влиянием донора СО не зависела от р38 МАР-киназы.

Работа выполнена в рамках Федеральных целевых программ «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007—2012 годы» (ГК № 16.512.11.2087) и «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009—2013 годы» (ГК № П1311, ГК 14.740.11.0932).

Литература

1. Evan G.I., Vousden K.H. Proliferation, cell cycle and apop-tosis // Nature. 2001. V. 411. P. 342 —348.

2. Gunther L., BerberatP.O., HagaM. et al. Carbon monoxide protects pancreatic P-cells from apoptosis and improves islet function/survival after transplantation // Diabetes. 2002. V. 51. P. 994—999.

3. He S., Cook B.L., Deverman B.E. et al. E2F is required to preventinappropriate S-phase entry of mammalian cells // Mol. Cell. Biol. 2000. V. 20. P. 363—372.

4. Kasten M., BartekJ. Cell cycle checkpoints and cancer // Nature. 2004. V. 432. P. 316—323.

5. Otterbein L.E., Soares M.P., Yamashita K. Heme oxygenase-1: unleashing the protective properties of heme // Trends Immunol. 2003. V. 24. P. 449—455.

6. Ringshausen I. et al. Constitutive activation of the MAPkinase p38 is critical for MMP-9 production and survival of B-CLL cells on bone marrow stromal cells // Leukemia. 2004. V. 18. P. 1964—1968.

7. Suarez-Cuervo C. et al. Breast cancer cells with inhibition of p38alpha have decreased MMP-9 activity and exhibit decreased bone metastasis in mice // Clin. Exp. Metastasis. 2004. V. 21. P. 525—526.

Поступила в редакцию 26.01.2012 г. Утверждена к печати 30.05.2012 г.

Сведения об авторах

Е.Г. Старикова — канд. мед. наук, докторант кафедры патофизиологии СибГМУ (г. Томск). Для корреспонденции

Старикова Елена Григорьевна, тел. 8-906-951-7897; e-mail: to-elen@yandex.ru