СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ТРОМБОЦИТОВ К АЦЕТИЛСАЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЕ
METHOD OF DETERMINING THROMBOCYTE SENSITIVITY TO ACETYLSALICYLIC ACID

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано для диагностики чувствительности тромбоцитов к действию ацетилсалициловой кислоты (АСК) у больных с ишемической болезнью сердца (ИБС).
Известно, что резистентность к АСК при ИБС встречается в 8-48% случаев [Neubauer Н., Kaiser A.F., Endres H.G. et al. Tailored antiplatelet therapy can overcome clopidogrel and aspirin resistance - the BOchum CLopidogrel and Aspirin Plan (BOCLA-Plan) to improve antiplatelet therapy // BMC Medicine. - 2011. - Vol. 9, №3. - P. 1-12]. Такая вариабельность данных связана, в первую очередь, с отсутствием стандартной общепринятой методики определения чувствительности тромбоцитов к АСК.
Существуют несколько прототипов способа определения резистентности к АСК с помощью агрегометрии. Известен оптический метод агрегометрии с коллагеном, где за пороговый уровень принимают 70%, с АДФ пороговый уровень 70%, при агрегации с арахидоновой кислотой - 20%, при агрегации в цельной крови импедансным методом - 18 Ом [Голухова Е.З., Рябинина М.Н. Современные аспекты антиагрегантной терапии // Креативная кардиология. - 2013. - Т.7, №1. - С. 46-58; Demen't'eva I.I., Charnaya М.А., Morozov Yu.A. Hemostasis system at surgery on heart and mainvessels. Disorders, prophylaxis, correction // Moscow: GEOTAR-Media. - 2009. - P. 360-372]. Существенный недостаток этого метода кроется в невозможности определения резистентности к АСК до начала терапии.
Известен способ диагностики резистентности, который заключается в исследовании АДФ - индуцированной и АСК-зависимой агрегации тромбоцитов с определением коэфициента ингибирования агрегации (КИА): величина КИА<24% свидетельствует о резистентности к АСК, при КИА 24% - о чувствительности к АСК [Способ диагностики резистентности к ацетилсалициловой кислоте [Электронный ресурс] : пат. 2413953 Рос. Федерация : МПК G01N 33/86 / Гринштейн Ю.И., Филоненко И.В., Савченко А.А. [и др.]; заявитель и патентообладатель Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации". - 2009131242/15; заявл. 17.08.2009; опубл. 10.03.2011, Бюл. №7]. Этот способ является длительным в исполнении и трудоемким.
Известен способ количественного анализа содержания в моче одного из метаболитов тромбоксана А2 - 11-дегидротромбоксана В2 (11-ДТхВ2). Наблюдается положительная корреляционная зависимость между концентрацией этого метаболита в моче и частотой сердечно-сосудистых событий на фоне приема аспирина [Eikelboom J., Hirsh J., Weitz J.I. et al. Aspirin-resistant thromboxane biosynthesis and the risk of myocardial infarction, stroke, or cardiovascular death in patients at high risk for cardiovascular events // Circulation Journal. - 2002. - Vol.14, №105. - P. 1650-1655.]. Минусом такого определения является дороговизна, необходимость наличия специального оборудования, а также то, что о резистентности судят не по активности самих клеток, а лишь по продуктам их метаболизма.
Также известно, что у больных с ИБС резистентность к АСК диагностируют с помощью измерения активности до начала терапии НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ в тромбоцитах. При этом вычисляется коэффициент кофакторной активности (ККОТ). При ККОТ>0,3 говорят о резистентности [Способ диагностики аспиринорезистентности у больных ишемической болезнью сердца [Электронный ресурс] : пат. 2348041 Рос. Федерация : МПК G01N 33/68 / Савченко А.А., Гринштейн Ю.И., Савченко Е.А. [и др.]; заявитель и патентообладатель Государственное учреждение Научно-исследовательский институт медицинских проблем Севера Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. - 2007129257/15; заявл. 30.07.2007; опубл. 27.02.2009, Бюл. №6]. Такой метод дает возможность определять резистентность тромбоцитов к АСК до приема препарата, но он достаточно трудоемкий, требует долгой и кропотливой пробоподготовки для исследования ферментов.
Известен способ импедансного определения агрегации с коллагеном и с одновременным измерением динамики высвобождения АТФ из гранул тромбоцитов люминесцентным методом при инкубации с АСК. Далее, на основании полученных данных рассчитывается индекс резистентности [Способ определения резистентности тромбоцитов к ацетилсалициловой кислоте [Электронный ресурс] : пат. 2538219 Рос. Федерация: МПК G01N 33/86, G01N 33/15 / Ольховский И.А., Столяр М.А.; заявитель и патентообладатель Федеральное государственное бюджетное учреждение "Гематологический научный центр" Министерства здравоохранения Российской Федерации, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук", Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Институт физики им. Л.В. Киренского Сибирского отделения Российской академии наук". - 2013116658/15; заявл. 11.04.2013; опубл. 10.01.2015, Бюл. №1]. Диагностическая ценность такого способа определения резистентности тромбоцитов к АСК ограничена ввиду его длительности и сложности выполнения.
Так как непосредственным компонентом сгустков являются тромбоциты, то их качественная составляющая влияет на процесс тромбообразования. Хемилюминесценция клеток связана с их способностью к синтезу активных форм кислорода при изменении функциональной активности и поэтому использование данных свойств тромбоцитов является обоснованным при рассмотрении вопроса резистентности к проводимой терапии.
Принцип метода заключается в том, что у больных ИБС до начала приема АСК исследуют АДФ-индуцированную люцигенин-зависимую хемилюминесценцию тромбоцитов. По значению площади (S) под кривой хемилюминесценции определяют чувствительность тромбоцитов к АСК: S<360000 у.ед. указывает на недостаточный ответ тромбоцитов, если же S≥360000, то говорят о чувствительности к АСК. Способ позволяет достоверно осуществить диагностику резистентности к АСК у пациента до проведения лечения, что помогает подобрать более адекватное и обоснованное лечение для больных с высоким риском тромботических осложнений.
Задачей изобретения является определение чувствительности тромбоцитов к АСК для повышения эффективности вторичной профилактики сердечно-сосудистых заболеваний у больных ИБС, снижение у них риска развития неблагоприятных коронарных событий и определение тактики лечения на этапе до приема препарата.
Задачу решают путем исследования до начала приема АСК АДФ-индуцированной люцигенин-зависимой хемилюминесценции тромбоцитов. Площадь (S) под кривой хемилюминесценции меньше 360000 у.ед. указывает на на отсутствие чувствительности тромбоцитов к АСК, при S≥360000 наблюдается чувствительность тромбоцитов к АСК..
8
Способ выполняют следующим образом. Из 4,5 мл стабилизированной 3,2% цитратом натрия крови выделяют по методу поэтапного центрифугирования с буферами, предложенному Савченко Е.А. с соавт. (2006) [Савченко Е.А., Савченко А.А., Герасимчук А.Н., Грищенко Д.А. Оценка метаболического статуса тромбоцитов в норме и при ишемической болезни сердца. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2006. - №5. - С. 33-36]. Для дальнейших исследований забирают супернатант. Хемилюминесценцию тромбоцитов измеряют на биохемилюминисцентном анализаторе БЛМ-3607 (ООО «МедБиоТех», Россия) в течение 90 минут. Для этого к 200 мкл тромбоцитарного супернатанта (содержание тромбоцитов 10 в мкл) добавляют 200 мкл буфера №2 (0,13 М NaCl, 0,02 М Трис-HCl буфера, 0,03 М ЭДТА, 0,015 М глюкозы, рН=7,4), 40 мкл АДФ 0,1 М и 50 мкл люцигенина в концентрации 50 мкг/мл. Затем измеряют площадь (S) под кривой хемилюминесценции.
Пограничное значение S=360000 у.ед. было получено опытным путем сопоставления результатов группы чувствительных и резистентных к АСК пациентов, у которых наблюдались статистически значимые различия по показателю S. Резистентность и чувствительность к АСК подтверждали измерением агрегации тромбоцитов с арахидоновой кислотой (АК) до и после инкубации с АСК до начала лечения антитромбоцитарными препаратами и на 8-10 сутки лечения. Чувствительность тромбоцитов к АСК определяли при уровне агрегации с АК (и/или после инкубации с АСК) ниже 20%, в противоположном случае диагностировали резистентность к АСК.
В таблице 1 представлены результаты обследования 34 больных ИБС кардиохирургического отделения Федерального центра сердечно-сосудистой хирургии г. Красноярска. Из них методом оптической агрегации тромбоцитов с арахидоновой кислотой было выявлено 12 резистентных к АСК. До начала лечения АСК был получен результат значения S.
Исходя из полученных данных можно полагать, что резистентные тромбоциты обладают меньшей АДФ-индуцированной люцигенин-зависимой хемилюминесцентной активностью по сравнению с чувствительными, что сказывается на площади под кривой хемилюминесценции.
Из всех 12 резистентных к АСК пациентов оптическим методом с арахидоновой кислотой при инкубации с АСК только 8 были выявлены на этапе до лечения (№2, 9, 14, 21, 26, 30, 31, 34), а остальные 4 (№6, 7, 17, 19) уже на фоне терапии препаратом. При этом хемилюминесцентный анализ показал резистентность у 11 больных еще до приема ими аспирина. Такие данные указывают на большую достоверность и информативность предлагаемого способа, ведь он позволяет выявить до назначения лечения еще и тех резистентных к АСК больных ИБС, которые проявляют данное свойство лишь при приеме лекарственного средства, а в пробирочной пробе показывают себя чувствительными к АСК. Лишь один пациент, отнесенный к резистентным по оптическому методу, по результатам хемилюминесценции был помещен в группу чувствительных.
Таким образом, чувствительность предлагаемого способа равна 91%, а специфичность 100%.
Клинический пример 1. Больной Ш., 60 лет (данные №1 в таблице). Находился на стационарном лечении в кардиохирургическом отделении Федерального центра сердечно-сосудистой хирургии с 25.04.2017 по 05.05.2017 с диагнозом: ИБС, стабильная стенокардия напряжения 3 функционального класса. При поступлении пациента в стационар было выполнено исследование АДФ-стимулированной люцигенин-зависимой хемилюминесценции тромбоцитов и вычислена площадь под кривой хемилюминесценции (S=2039000), что отражает чувствительность тромбоцитов к АСК. Также была проведена оптическая агрегация тромбоцитов с арахидоновой кислотой и с арахидоновой кислотой при инкубации с АСК. Агрегация с арахидоновой кислотой равнялась 61%, а при инкубации с АСК равнялась 3%, что соответствует чувствительности тромбоцитов.
Клинический пример 2. Больной Г., 62 года (данные №2 в таблице). Находился на стационарном лечении в кардиохирургическом отделении Федерального центра сердечно-сосудистой хирургии с 15.05.2017 по 26.05.2017 с диагнозом: ИБС, стабильная стенокардия напряжения 2 функционального класса, постинфарктный кардиосклероз. При поступлении пациента в стационар было выполнено исследование АДФ-стимулированной люцигенин-зависимой хемилюминесценции тромбоцитов и вычислена площадь под кривой хемилюминесценции (S=202900), что отражает резистентность тромбоцитов к АСК. Также была проведена оптическая агрегация тромбоцитов с арахидоновой кислотой и с арахидоновой кислотой при инкубации с АСК. Агрегация с арахидоновой кислотой равнялась 73%, а при инкубации с АСК равнялась 62%, что соответствует резистентности тромбоцитов.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет в лечебном учреждении с высокой чувствительностью (91%) осуществить диагностику чувствительности тромбоцитов к АСК до начала лечения, что является очень важным параметром. Своевременная диагностика резистентности к АСК предотвратит развитие нежелательных коронарных событий у больных ИБС, резистентных к препарату. Способ может быть рекомендован для применения в клинической практике.