ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ПРОТИВ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ С МОЛЕКУЛАМИ РНКИ, НАПРАВЛЕННЫМИ ПРОТИВ HSP47
THERAPEUTIC COMPOSITIONS AND METHODS AGAINST MALIGNANT TUMORS WITH RNAi MOLECULES DIRECTED AGAINST Hsp47

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[0001] Настоящее изобретение относится к области биофармацевтических и терапевтических средств, состоящих из молекул на основе нуклеиновых кислот. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способам и композициям для доставки РНК-интерференционных средств для предотвращения, лечения или уменьшения тяжести воздействия состояний и заболеваний, включающих злокачественные опухоли.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0002] Настоящая заявка включает Список последовательностей, представленный в электронном виде в файле ASCII, созданном 2 января 2016, с названием ND5123767WO_SL.txt, который имеет размер 49542 байта и настоящим полностью включен посредством отсылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] Рост злокачественных опухолей связан с внеклеточным матриксом (ECM). Молекулярный шаперонный белок "теплового шока" Hsp47 участвует в регулировании сети транскрипции генов ECM.
[0004] Экспрессия Hsp47 может быть активирована при раке молочной железы и других онкологических заболеваниях. Снижение Hsp47 может уменьшить рост клеток рака молочной железы и ограничить рост опухоли.
[0005] Повышенная экспрессия Hsp47 может быть фактором при низкой выживаемости больных раком молочной железы. Экспрессия Hsp47 может вызывать прогрессирование рака, частично в результате повышения белков ECM. См., например, Cancer Res, 2015, 75 (8); 1580-91.
[0006] Hsp47 может с высоким уровнем экспрессироваться при раке поджелудочной железы. Hsp-47 может быть полезным специфическим маркером для диагностики рака полости рта.
[0007] Hsp47 или последовательность его гомологичных генов раскрыты, например, как GenBank AB010273 (человек), X60676 (мышь) или M69246 (крыса, gp46).
[0008] Средства для супрессии Hsp47 были раскрыты для подавления фиброза. См., например, US 8173170 B2 и US 8710209 B2. Однако информация относительно результата ингибирования Hsp47 при развитии, прогрессировании и росте злокачественной опухоли ограничена.
[0009] Белок p21 является белком, регулирующим клеточный цикл и кодируемым геном CDKN1A, и относится к семейству CIP/KIP. Данный белок имеет функцию ингибирования прогрессии клеточного цикла в фазе G1 и фазе G2/M путем ингибирования действия циклин-CDK комплекса посредством связывания с комплексом. В частности, ген p21 подвергается активации p53, одним из генов-супрессоров опухоли. Сообщали, что после активации p53 вследствие повреждения ДНК и т.п., p53 активирует p21, в результате чего клеточный цикл останавливается в фазе G1 и фазе G2/M.
[0010] p21 оверэкспрессируется во множестве раковых опухолей человека, включая карциномы предстательной железы, шейки матки, молочной железы и плоскоклеточные карциномы, и во многих случаях апрегуляция p21 положительно коррелирует со степенью злокачественности, инвазивностью и агрессивностью. См., например, Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, Vol. 97, No. 8, pp. 4291-96. Кроме того, апрегуляция p21, как сообщали, была связана с онкогенностью и неблагоприятным прогнозом при многих формах рака, включая рак мозга, предстательной железы, яичника, молочной железы и пищевода. См., например, Winters et al., Breast Cancer Research, 2003, Vol. 5, No. 6, pp. R242-R249. Кроме того, заболевание может быть возрастным заболеванием, включая атеросклероз, болезнь Альцгеймера, амилоидоз и артрит. См., например, Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, Vol. 97, No. 8, pp. 4291-96.
[0011] Существует острая необходимость в способах и композициях для разработки способов терапии для больных со злокачественными опухолями, таких как последовательности миРНК, соединения и структуры для ингибирования экспрессии Hsp47 и p21.
[0012] Требуются способы и композиции для предотвращения или лечения злокачественных опухолей. Сохраняется потребность в молекулах РНКи, направленных против Hsp47, p21, а также в других структурах и композициях для предотвращения, лечения или уменьшения злокачественных опухолей.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
in vivo
[0013] Настоящее изобретение относится к неожиданному открытию, что размер злокачественной опухоли может быть уменьшен  при лечении миРНК-ингибиторами Hsp47 и ингибиторами Hsp47 в комбинации с ингибиторами p21.
[0014] Настоящее изобретение относится к способам и композициям, включающим терапевтические соединения на основе нуклеиновой кислоты для применения в доставке в различные органы, для предотвращения, лечения или уменьшения тяжести состояний и заболеваний, связанных со злокачественной опухолью. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предложены композиции РНК-интерферирующих молекул (молекул РНКи) для сайленсинга генов различных мишеней, связанных со злокачественными опухолями.
[0015] Настоящее изобретение может обеспечивать композиции для доставки терапевтических молекул, а также способы их применения. Различные композиции на основе РНК и лекарственных средств согласно настоящему изобретению могут применяться в способах предотвращения или лечения злокачественных опухолей.
[0016] Настоящее изобретение относится к способам и композициям терапевтических соединений на основе нуклеиновой кислоты против злокачественных опухолей. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предложены молекулы РНКи, структуры и композиции, которые могут подавлять экспрессию Hsp47, а также Hsp47 и p21. Структуры и композиции настоящего описания могут применяться в предотвращении, лечении или уменьшении размера злокачественных опухолей.
[0017] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предложены двухцепочечные молекулы нуклеиновых кислот, которые являются молекулами РНКи, такими как молекулы миРНК или мшРНК для супрессии Hsp47. Варианты осуществления настоящего изобретения также могут обеспечивать молекулы РНКи для супрессии p21.
[0018] В некоторых вариантах осуществления ингибирующая молекула нуклеиновой кислоты может быть антисмысловой молекулой нуклеиновой кислоты, малой интерферирующей РНК (миРНК) или двухцепочечной РНК (дцРНК).
[0019] Молекулы РНКи настоящего изобретения могут быть активными для сайленсинга гена, например, дцРНК, которая активна для сайленсинга гена, миРНК, микро-РНК или мшРНК, активными для сайленсинга гена, а также ДНК-направленной РНК (днРНК), Piwi-взаимодействующей РНК (piРНК) и ассоциированной с повторами миРНК (rasiРНК).
[0020] В дополнительных вариантах осуществления способы настоящего изобретения могут снижать транскрипцию или трансляцию Hsp47 и/или p21 в злокачественных опухолях.
in vivo
in vitro
[0021] В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение включает способы снижения экспрессии Hsp47 или снижения экспрессии Hsp47 и p21 в клетке злокачественной опухоли, где клетка может быть клеткой человека, неопластической клеткой, клеткой  или клеткой .
[0022] Варианты осуществления настоящего изобретения могут также предоставить способы лечения субъекта, имеющего новообразование, где клетки злокачественного новообразования демонстрируют аберрантные уровни экспрессии Hsp47. Способы могут включать введение субъекту эффективного количества ингибирующей молекулы нуклеиновой кислоты, где ингибирующая молекула нуклеиновой кислоты снижает экспрессию Hsp47, или где комбинация молекул РНКи снижает экспрессию Hsp47 и p21, в результате чего осуществляется лечение новообразования. В некоторых вариантах осуществления способы настоящего изобретения могут уменьшать размер новообразования по сравнению с размером новообразования до лечения или без лечения.
[0023] В различных вариантах осуществления ингибирующая молекула нуклеиновой кислоты может быть доставлена в липосоме, полимере, микросфере, наночастице, генотерапевтическом векторе или векторе из голой ДНК.
[0024] В других аспектах настоящего изобретения предложены способы лечения субъекта, например, больного человека, имеющего новообразование, где клетки злокачественного новообразования экспрессируют Hsp47. В некоторых вариантах осуществления способы могут включать введение субъекту эффективного количества ингибирующих молекул нуклеиновой кислоты, где ингибирующие молекулы нуклеиновой кислоты являются молекулами антисмысловой нуклеиновой кислоты или молекулами РНКи, или их комбинацией, которые ингибируют экспрессию полипептида Hsp47, или которые ингибируют экспрессию полипептида Hsp47 и полипептида p21.
[0025] В определенных вариантах осуществления клетка опухоли оверэкспрессирует Hsp47.
[0026] В некоторых вариантах осуществления новообразование может быть злокачественной опухолью или раком легкого, или раком поджелудочной железы.
[0027] Варианты осуществления настоящего изобретения могут предоставлять фармацевтические композиции для лечения злокачественной опухоли, причем композиция включает наночастицы, инкапсулирующие молекулы РНКи, где молекулы РНКи направлены против Hsp47. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение включает способы распределения действующего вещества у субъекта для лечения злокачественной опухоли, где способ включает введение субъекту фармацевтической композиции, указанной выше.
[0028] В других вариантах осуществления настоящее изобретение включает фармацевтические композиции для лечения злокачественной опухоли, причем композиция включает наночастицы, инкапсулирующие молекулы РНКи, где часть молекул РНКи направлена против Hsp47, и часть молекул РНКи направлена против p21.
[0029] В настоящем изобретении также предусмотрены способы предотвращения, лечения или уменьшения тяжести одного или более симптомов злокачественной опухоли у нуждающегося в этом млекопитающего, где способ включает введение млекопитающему терапевтически эффективного количества композиции, включающей молекулы РНКи, обеспечивающие снижение экспрессии Hsp47.
[0030] В других аспектах настоящее изобретение включает способы предотвращения, лечения или уменьшения тяжести одного или более симптомов злокачественной опухоли у нуждающегося в этом млекопитающего, где способ включает введение млекопитающему терапевтически эффективного количества композиции, включающей молекулы РНКи, где часть молекул РНКи обеспечивает снижение экспрессии Hsp47, и часть молекул РНКи обеспечивает снижение экспрессии p21.
[0031] В некоторых аспектах настоящее изобретение включает способы снижения скорости роста или пролиферации раковых стволовых клеток у нуждающегося в этом млекопитающего, где способ включает введение млекопитающему терапевтически эффективного количества композиции, включающей молекулы РНКи, где часть молекул РНКи обеспечивает снижение экспрессии Hsp47, и часть молекул РНКи обеспечивает снижение экспрессии p21.
[0032] Дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения могут обеспечивать композиции для применения в распределении действующего вещества для лечения злокачественной опухоли у субъекта, где композиция включает липосомные наночастицы. Композиции могут применяться в способах распределения действующего вещества в органе субъекта для лечения злокачественной опухоли.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
in vivo
[0033] ФИГ. 1: На Фиг. 1 показаны результаты  исследования модели рака поджелудочной железы, которое проводили с целью анализа ингибирования роста опухоли с применением Hsp47 в качестве одной мишени. Как показано на Фиг. 1, в случае группы, обработанной композицией, содержащей миРНК Hsp47 (2M), в течение исследования опухоли росли медленно, если росли вообще. Снижений массы тела не зарегистрировали. Напротив, удвоение опухолей в контрольной группе на растворителе происходило только за 22 дня. В заключение, миРНК Hsp47, как наблюдали, полностью подавляла рост опухоли в дозах 0,75 мг/кг, показывая, что лекарственная форма, содержащая миРНК Hsp47, являлась мощным противоопухолевым терапевтическим средством.
[0034] ФИГ. 2: На Фиг. 2 показана экспрессия генов Hsp47, коллагена I и коллагена IV в линиях человеческих раковых клеток.
[0035] ФИГ. 3: На Фиг. 3 показан необработанный образец для способа подавления пролиферации клеток рака толстой кишки SW480 с применением миРНК, направленных против Hsp47.
[0036] ФИГ. 4: На Фиг. 4 показано действие отрицательной миРНК в концентрации 10 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака толстой кишки SW480 с применением миРНК, направленной против Hsp47.
[0037] ФИГ. 5: На Фиг. 5 показано действие отрицательной миРНК в концентрации 50 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака толстой кишки SW480 с применением миРНК, направленной против Hsp47.
[0038] ФИГ. 6: На Фиг. 6 показано действие отрицательной миРНК в концентрации 100 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака толстой кишки SW480 с применением миРНК, направленной против Hsp47.
[0039] ФИГ. 7: На Фиг. 7 показано действие активной миРНК в концентрации 10 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака толстой кишки SW480 с применением миРНК, направленной против Hsp47.
[0040] ФИГ. 8: На Фиг. 8 показано действие активной миРНК в концентрации 50 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака толстой кишки SW480 с применением миРНК, направленной против Hsp47.
[0041] ФИГ. 9: На Фиг. 9 показано действие активной миРНК в концентрации 100 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака толстой кишки SW480 с применением миРНК, направленной против Hsp47.
4
[0042] ФИГ. 10: На Фиг. 10 показаны результаты анализа роста в способе подавления пролиферации клеток рака толстой кишки SW480 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На оси ординат указано количество клеток ×10. Закрашенные кружки обозначают необработанный образец. Значки X обозначают отрицательную миРНК. Треугольные значки обозначают образец, обработанный активной миРНК, направленной против Hsp47.
[0043] ФИГ. 11: На Фиг. 11 показаны результаты анализа эксклюзии красителя в способе подавления пролиферации клеток рака толстой кишки SW480 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На оси ординат указан процент мертвых клеток. Незакрашенные кружки обозначают образец, обработанный активной миРНК, направленной против Hsp47. Значки X обозначают отрицательную миРНК. Закрашенные круглые значки обозначают необработанный образец.
[0044] ФИГ. 12: На Фиг. 12 показан необработанный образец в способе подавления пролиферации клеток рака толстой кишки HCT116 с применением миРНК, направленной против Hsp47.
[0045] ФИГ. 13: На Фиг. 13 показано действие отрицательной миРНК в концентрации 10 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака толстой кишки HCT116 с применением миРНК, направленной против Hsp47.
[0046] ФИГ. 14: На Фиг. 14 показано действие активной миРНК в концентрации 10 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака толстой кишки HCT116 с применением миРНК, направленной против Hsp47.
4
[0047] ФИГ. 15: На Фиг. 15 показаны результаты анализа роста в способе подавления пролиферации клеток рака толстой кишки HCT116 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На оси ординат указано количество клеток ×10. Закрашенные кружки обозначают необработанный образец. Незакрашенные круглые значки на восходящей кривой обозначают отрицательную миРНК. Незакрашенные круглые значки на плоской кривой обозначают образец, обработанный активной миРНК, направленной против Hsp47.
[0048] ФИГ. 16: На Фиг. 16 показаны результаты анализа эксклюзии красителя в способе подавления пролиферации клеток рака толстой кишки HCT116 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На оси ординат указан процент мертвых клеток. Незакрашенные кружки на восходящей кривой обозначают образец, обработанный активной миРНК, направленной против Hsp47. Незакрашенные круглые значки на плоской кривой обозначают отрицательную миРНК. Закрашенные круглые значки обозначают необработанный образец.
[0049] ФИГ. 17: На Фиг. 17 показан необработанный образец в способе подавления пролиферации клеток рака легкого A549 с применением миРНК, направленной против Hsp47.
[0050] ФИГ. 18: На Фиг. 18 показано действие отрицательной миРНК в концентрации 10 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака легкого A549 с применением миРНК, направленной против Hsp47.
[0051] ФИГ. 19: На Фиг. 19 показано действие отрицательной миРНК в концентрации 50 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака легкого A549 с применением миРНК, направленной против Hsp47.
[0052] ФИГ. 20: На Фиг. 20 показано действие отрицательной миРНК в концентрации 100 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака легкого A549 с применением миРНК, направленной против Hsp47.
[0053] ФИГ. 21: На Фиг. 21 показано действие активной миРНК в концентрации 10 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака легкого A549 с применением миРНК, направленной против Hsp47.
[0054] ФИГ. 22: На Фиг. 22 показано действие активной миРНК в концентрации 50 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака легкого A549 с применением миРНК, направленной против Hsp47.
[0055] ФИГ. 23: На Фиг. 23 показано действие активной миРНК в концентрации 100 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака толстой кишки SW480 с применением миРНК, направленной против Hsp47.
4
[0056] ФИГ. 24: На Фиг. 24 показаны результаты анализа роста в способе подавления пролиферации клеток рака легкого A549 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На оси ординат указано количество клеток ×10. Закрашенные кружки обозначают необработанный образец. Незакрашенные круглые значки обозначают отрицательную миРНК. Треугольные значки обозначают образец, обработанный активной миРНК, направленной против Hsp47.
[0057] ФИГ. 25: На Фиг. 25 показаны результаты анализа эксклюзии красителя в способе подавления пролиферации клеток рака легкого A549 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На оси ординат указан процент мертвых клеток. Незакрашенные кружки обозначают образец, обработанный активной миРНК, направленной против Hsp47. Значки X обозначают отрицательную миРНК. Закрашенные круглые значки обозначают необработанный образец.
[0058] ФИГ. 26: На Фиг. 26 показан необработанный образец в способе подавления пролиферации клеток рака печени HepG2 с применением миРНК, направленной против Hsp47.
[0059] ФИГ. 27: На Фиг. 27 показано действие отрицательной миРНК в концентрации 10 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака печени HepG2 с применением миРНК, направленной против Hsp47.
[0060] ФИГ. 28: На Фиг. 28 показано действие отрицательной миРНК в концентрации 50 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака печени HepG2 с применением миРНК, направленной против Hsp47.
[0061] ФИГ. 29: На Фиг. 29 показано действие отрицательной миРНК в концентрации 100 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака печени HepG2 с применением миРНК, направленной против Hsp47.
[0062] ФИГ. 30: На Фиг. 30 показано действие активной миРНК в концентрации 10 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака печени HepG2 с применением миРНК, направленной против Hsp47.
[0063] ФИГ. 31: На Фиг. 31 показано действие активной миРНК в концентрации 50 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака печени HepG2 с применением миРНК, направленной против Hsp47.
[0064] ФИГ. 32: На Фиг. 32 показано действие активной миРНК в концентрации 100 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака печени HepG2 с применением миРНК, направленной против Hsp47.
4
[0065] ФИГ. 33: На Фиг. 33 показаны результаты анализа роста в способе подавления пролиферации клеток рака печени HepG2 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На оси ординат указано количество клеток ×10. Закрашенные кружки обозначают необработанный образец. Незакрашенные круглые значки обозначают отрицательную миРНК. Значки X обозначают образец, обработанный активной миРНК, направленной против Hsp47.
[0066] ФИГ. 34: На Фиг. 34 показаны результаты анализа эксклюзии красителя в способе подавления пролиферации клеток рака печени HepG2 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На оси ординат указан процент мертвых клеток. Незакрашенные кружки обозначают образец, обработанный активной миРНК, направленной против Hsp47. Значки X обозначают отрицательную миРНК. Незакрашенные квадратные значки обозначают необработанный образец.
[0067] ФИГ. 35: На Фиг. 35 показаны результаты способа обнаружения аннексина V и PI в клетках рака толстой кишки SW480, трансфицированных активной миРНК Hsp47 в день 2 после трансфекции миРНК.
[0068] ФИГ. 36: На Фиг. 36 показаны результаты способа обнаружения аннексина V и PI в клетках рака толстой кишки HCT116, трансфицированных активной миРНК Hsp47 в день 2 после трансфекции миРНК.
[0069] ФИГ. 37: На Фиг. 37 показаны результаты способа обнаружения экспрессии прокаспазы-3 и белка Hsp47 в клетках рака толстой кишки SW480, трансфицированных активной миРНК Hsp47.
[0070] ФИГ. 38: На Фиг. 38 показаны результаты способа обнаружения экспрессии прокаспазы-3 и белка Hsp47 в клетках рака печени HepG2, трансфицированных активной миРНК Hsp47.
[0071] ФИГ. 39: На Фиг. 39 показаны результаты способа обнаружения экспрессии прокаспазы-3 и белка Hsp47 в клетках рака легкого A549, трансфицированных активной миРНК Hsp47.
[0072] ФИГ. 40: На Фиг. 40 показаны результаты способа обнаружения активности Каспазы-3/7 в клетках рака толстой кишки SW480, трансфицированных миРНК Hsp47 и миРНК p21. Эти данные показывают, что применение комбинации миРНК Hsp47 и миРНК p21 в клетках рака толстой кишки обеспечивало неожиданно эффективные повышения уровня Каспаз, и что клетки неожиданно повышали апоптоз.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0073] В настоящем изобретении предложены способы применения терапевтических композиций, которые снижают экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты или полипептида Hsp47, для лечения новообразования у субъекта. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предложены способы применения терапевтических композиций, которые снижают экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты или полипептида Hsp47 и молекулы нуклеиновой кислоты или полипептида p21, для лечения новообразования у субъекта.
in vivo
[0074] В дополнительных аспектах варианты осуществления настоящего изобретения могут предоставлять способы и композиции для снижения скорости роста или пролиферации раковых стволовых клеток. Настоящее изобретение относится к неожиданному результату, что рост или пролиферацию раковых стволовых клеток может ингибировать  обработка миРНК-ингибиторами Hsp47 и ингибиторами Hsp47 в комбинации с ингибиторами p21.
[0075] Терапевтические композиции настоящего изобретения могут включать ингибирующие молекулы нуклеиновой кислоты, в том числе молекулы РНКи, такие как миРНК, мшРНК и антисмысловые РНК.
[0076] Настоящее изобретение охватывает молекулы РНКи для супрессии ДНК, кодирующей Hsp47, рибозимы, антисмысловые нуклеиновые кислоты, ДНК/РНК химерные полинуклеотиды и векторы для их экспрессии, и доминантно негативные варианты Hsp47.
[0077] Как правило, после того как у субъекта диагностировали наличие новообразования, например рака легкого или рака поджелудочной железы, выбирают способ лечения, включающий супрессию Hsp47 или супрессию Hsp47 и p21.
[0078] Примеры средства, которое подавляет Hsp47, при использовании в настоящем описании включают лекарственное средство, которое подавляет продукцию и/или активность Hsp47, и лекарственное средство, которое вызывает деградацию и/или инактивацию Hsp47. Примеры лекарственного средства, которое подавляет продукцию Hsp47, включают молекулу РНКи, рибозим, антисмысловую нуклеиновую кислоту, ДНК/РНК химерный полинуклеотид против ДНК, кодирующей Hsp47, или вектор, экспрессирующий их.
[0079] Примеры средства, которое подавляет p21, при использовании в настоящем описании, включают лекарственное средство, которое подавляет продукцию и/или активность p21, и лекарственное средство, которое вызывает деградацию и/или инактивацию p21. Примеры лекарственного средства, которое подавляет продукцию p21, включают молекулу РНКи, рибозим, антисмысловую нуклеиновую кислоту, ДНК/РНК химерный полинуклеотид против ДНК, кодирующей p21, или вектор, экспрессирующий их.
[0080] Молекулы РНКи
[0081] Среднему специалисту в данной области будет очевидно, что описываемая последовательность может изменяться с течением времени и может включать любые изменения, требуемые в молекулах нуклеиновой кислоты в настоящей заявке, соответственно.
[0082] Варианты осуществления настоящего изобретения могут обеспечивать композиции и способы сайленсинга экспрессии Hsp47 с применением малых молекул нуклеиновых кислот. Дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения могут обеспечивать композиции и способы сайленсинга экспрессии Hsp47 и экспрессии p21 с применением малых молекул нуклеиновых кислот.
[0083] Молекулы РНКи настоящего изобретения могут быть активными для сайленсинга генов, например, дцРНК, которая активна для сайленсинга генов, миРНК, микро-РНК или мшРНК, активные для сайленсинга генов, а также ДНК-направленная РНК (днРНК), Piwi-взаимодействующая РНК (piРНК) и ассоциированная с повторами миРНК (rasiРНК). Такие молекулы способны опосредовать РНК-интерференцию.
[0084] Композиция и способы, раскрытые в настоящей заявке, также могут применяться в лечении различных видов злокачественных опухолей у субъекта.
[0085] Молекулы нуклеиновой кислоты и способы настоящего изобретения могут быть объединены или применяться в комбинации для даунрегуляции экспрессии генов, которые кодируют Hsp47, и даунрегуляции экспрессии генов, которые кодируют Hsp47 и p21, одновременно.
[0086] Композиции и способы настоящего изобретения могут включать молекулы нуклеиновой кислоты, которые могут модулировать или регулировать экспрессию белков Hsp47 и/или генов, кодирующих указанные белки, или которые могут модулировать или регулировать экспрессию белков Hsp47 и/или генов, кодирующих указанные белки, в комбинации с белками p21 и/или генами, кодирующими указанные белки, а также белки и/или гены, кодирующие белки, которые ассоциированы с сохранением и/или развитием заболеваний, а также состояний или нарушений, ассоциированных с Hsp47, таких как злокачественная опухоль.
[0087] Композиции и способы настоящего изобретения описаны со ссылкой на примерные последовательности Hsp47 и p21. Среднему специалисту в данной области техники будет очевидно, что различные аспекты и варианты осуществления изобретения направлены на любые соответствующие гены Hsp47 или p21, последовательности или варианты, такие как гены-гомологи и варианты транскрипции, а также полиморфизмы, включающие однонуклеотидный полиморфизм (SNP), связанный с любыми генами Hsp47 или p21.
[0088] Молекула РНКи настоящего изобретения может быть направлена против Hsp47 или p21 и любых гомологичных последовательностей, например, при использовании комплементарных последовательностей или включении неканонических пар оснований, например, ошибочно спаренных оснований и/или неоднозначных пар оснований, которые могут обеспечивать дополнительные последовательности-мишени.
[0089] В случаях, когда идентифицированы ошибочно спаренные основания, неканонические пары оснований, например, ошибочно спаренные основания и/или неканонические основания могут использоваться для создания молекул нуклеиновой кислоты, которые направлены против более чем одной последовательности гена.
[0090] Например, неканонические пары оснований, такие как пары оснований UU и CC, могут использоваться для создания молекул нуклеиновой кислоты, которые способны направлено воздействовать на последовательности для обнаружения мишеней, которые обладают гомологией последовательности. Таким образом, молекула РНКи может быть направлена против нуклеотидной последовательности, которая консервативна в гомологичных генах, при этом одна молекула РНКи может применяться для ингибирования экспрессии более чем одного гена.
[0091] В некоторых аспектах композиции и способы настоящего изобретения включают молекулы РНКи, которые активны против любой части мРНК Hsp47. Молекула РНКи может включать последовательность, комплементарную любой мРНК, кодирующей последовательность Hsp47.
[0092] В других аспектах композиции и способы настоящего изобретения включают молекулы РНКи, которые активны против любой части мРНК p21. Молекула РНКи может включать последовательность, комплементарную любой мРНК, кодирующей последовательность p21.
[0093] В некоторых вариантах осуществления молекула РНКи настоящего описания может обладать активностью против РНК Hsp47, где молекула РНКи включает последовательность, комплементарную РНК, имеющей последовательность, кодирующую вариант Hsp47, например, мутантный ген Hsp47, который, как известно в уровне техники, ассоциирован со злокачественной опухолью.
[0094] В других вариантах осуществления молекула РНКи настоящего изобретения может включать нуклеотидную последовательность, которая может опосредовать сайленсинг экспрессии гена Hsp47 или p21.
[0095] При использовании в настоящем описании молекула РНКи обозначает любую молекулу, которая вызывает РНК-интерференцию, включая двухцепочечную РНК, такую как миРНК (малую интерферирующую РНК), мкРНК (микроРНК), мшРНК (короткую шпилечную РНК), днРНК (ДНК-направленную РНК), piРНК (Piwi-взаимодействующую РНК) или rasiРНК (ассоциированную с повторами миРНК) и их модифицированные формы. Указанные молекулы РНКи могут быть коммерчески доступными или могут быть разработаны и получены на основе известной информации о последовательности и т.д. Антисмысловая нуклеиновая кислота включает РНК, ДНК, ПНК или их комплекс. При использовании в настоящем описании ДНК/РНК химерный полинуклеотид включает двухцепочечный полинуклеотид, состоящий из ДНК и РНК, который ингибирует экспрессию гена-мишени.
[0096] В одном варианте осуществления средства настоящего изобретения содержат миРНК в качестве терапевтического средства. Молекула миРНК может иметь длину от приблизительно 10-50 или больше нуклеотидов. Молекула миРНК может иметь длину от приблизительно 15-45 нуклеотидов. Молекула миРНК может иметь длину от приблизительно 19-40 нуклеотидов. Молекула миРНК может иметь длину от 19-23 нуклеотидов. Молекула миРНК настоящего изобретения может опосредовать РНКи против мРНК-мишени. Коммерчески доступные средства разработки и наборы, такие как доступные от Ambion, Inc. (Austin, TX) и Уайтхедовского института биомедицинских исследований при Массачусетском технологическом институте (MIT, Cambridge, MA), позволяют производить разработку и получение миРНК.
[0097] Способы лечения злокачественной опухоли
[0098] Варианты осуществления настоящего изобретения могут обеспечивать молекулы РНКи, которые могут применяться для даунрегуляции или ингибирования экспрессии Hsp47 и/или белков Hsp47, а также даунрегуляции или ингибирования экспрессии p21 и/или белков p21.
[0099] В некоторых вариантах осуществления молекула РНКи настоящего изобретения может применяться для даунрегуляции или ингибирования экспрессии Hsp47 и/или белков Hsp47, возникающих в результате гаплотип-специфических полиморфизмов Hsp47, которые могут быть связаны с заболеванием или состоянием, таким как злокачественная опухоль.
[00100] Мониторинг уровней белка или мРНК Hsp47, и/или уровней белка или мРНК p21 может использоваться для исследования сайленсинга гена и определения эффективности соединений и композиции согласно настоящему изобретению.
[00101] Молекулы РНКи настоящего описания могут применяться индивидуально или в комбинации с другими миРНК для модуляции экспрессии одного или более генов.
[00102] Молекулы РНКи настоящего описания могут применяться индивидуально или в комбинации, или в сочетании с другими известными лекарственными средствами для предотвращения или лечения заболевания или уменьшения тяжести симптомов состояний или нарушений, связанных с Hsp47, включая злокачественную опухоль.
[00103] Молекулы РНКи настоящего изобретения могут применяться для модуляции или ингибирования экспрессии Hsp47 или p21 сиквенс-специфическим способом.
[00104] Молекулы РНКи настоящего описания могут включать направляющую цепь, для которой набор смежных нуклеотидов, по меньшей мере, частично комплементарны мРНК Hsp47 или мРНК p21.
[00105] В некоторых аспектах злокачественную опухоль можно лечить РНК-интерференцией с применением одной или более молекул РНКи настоящего изобретения.
ex vivo
in vivo
[00106] Лечение злокачественной опухоли может быть исследовано на подходящих моделях на основе клеток, а также моделях на животных  или .
[00107] Лечение злокачественной опухоли может быть исследовано путем определения уровня мРНК Hsp47 или уровня белка Hsp47 в клетках пораженной ткани, и/или путем определения уровня мРНК p21 или уровня белка p21 в клетках пораженной ткани.
[00108] Лечение злокачественной опухоли может быть исследовано с помощью неинвазивного медицинского сканирования пораженного органа или ткани.
[00109] Варианты осуществления настоящего изобретения могут включать способы предотвращения, лечения или уменьшения тяжести симптомов заболевания или состояния, ассоциированного с Hsp47, у нуждающегося в этом субъекта.
[00110] В некоторых вариантах осуществления комбинация миРНК Hsp47 и миРНК p21 может обеспечивать неожиданно эффективное увеличение гибели раковых клеток. В других вариантах осуществления комбинация миРНК Hsp47 и миРНК p21 может обеспечивать неожиданно эффективное уменьшение пролиферации раковых клеток.
[00111] В некоторых вариантах осуществления способы предотвращения, лечения или уменьшения тяжести симптомов злокачественной опухоли у субъекта могут включать введение субъекту молекулы РНКи настоящего изобретения для модуляции экспрессии гена Hsp47 и/или гена p21 у субъекта или в организме.
[00112] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрены способы даунрегуляции экспрессии гена Hsp47 в клетке или организме посредством контакта клетки или организма с молекулой РНКи настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрены способы даунрегуляции экспрессии гена Hsp47 и гена p21 в клетке или организме посредством контакта клетки или организма с двумя или более молекулами РНКи настоящего изобретения.
[00113] Ингибирующие молекулы нуклеиновых кислот могут быть нуклеотидными олигомерами, которые могут применяться в виде одноцепочечной или двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты для снижения экспрессии гена. В одном методе ингибирующая молекула нуклеиновой кислоты является двухцепочечной РНК, применяемой для опосредованного РНК-интерференцией (РНКи) нокдауна экспрессии гена. В одном варианте осуществления создана молекула двухцепочечной РНК (дцРНК), которая включает от восьми до двадцати пяти (например, 8, 10, 12, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25) последовательных нуклеотидов нуклеотидного олигомера согласно изобретению. дцРНК может быть двумя комплементарными цепями РНК, которые имеют двойную или одинарную цепь РНК, которая содержит самокомлементарную малую шпилечную (мш)РНК.
in vitro
[00114] В некоторых вариантах осуществления дцРНК содержат приблизительно 21 или 22 пары оснований, но могут быть короче или длинее, до приблизительно 29 нуклеотидов. Двухцепочечная РНК может быть получена при использовании стандартных методов, например, химического синтеза или транскрипции. Доступны наборы, например, производства Ambion (Austin, Tex.) и Epicentre (Madison, Wis.).
[00115] Способы экспрессии дцРНК в клетках млекопитающих описаны в Brummelkamp et al. Science 296:550-553, 2002; Paddison et al. Genes & Devel. 16:948-958, 2002; Paul et al. Nature Biotechnol. 20:505-508, 2002; Sui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5515-5520, 2002; Yu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6047-6052, 2002; Miyagishi et al., Nature Biotechnol. 20:497-500, 2002; и Lee et al., Nature Biotechnol. 20:500-505 2002, которые настоящим включены посредством отсылки.
[00116] Ингибирующая молекула нуклеиновой кислоты, которая "соответствует" гену Hsp47, включает, по меньшей мере, фрагмент двухцепочечного гена, при этом каждая цепь двухцепочечной ингибирующей молекулы нуклеиновой кислоты способна к связыванию с комплементарной цепью гена-мишени Hsp47. Ингибирующая молекула нуклеиновой кислоты не должна обязательно обладать идеальным соответствием с референсной последовательностью Hsp47.
[00117] В одном варианте осуществления миРНК обладает по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или даже 99% идентичностью последовательности с целевой нуклеиновой кислотой. Например, двойная цепь из 19 пар оснований, содержащая 1-2 ошибочно спаренных пары оснований, считается применимой в способах согласно изобретению. В других вариантах осуществления нуклеотидная последовательность ингибирующей молекулы нуклеиновой кислоты демонстрирует 1, 2, 3, 4, 5 или больше ошибочно спаренных оснований.
in vivo
[00118] Ингибирующие молекулы нуклеиновой кислоты, предложенные в изобретении, не ограничиваются молекулами миРНК, но включают любую молекулу нуклеиновой кислоты, достаточную для снижения экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты или полипептида Hsp47 или p21. Последовательности ДНК, предложенные в настоящей заявке, могут применяться, например, в исследовании и разработке терапевтической антисмысловой молекулы нуклеиновой кислоты для снижения экспрессии кодируемого белка. В изобретении также предложены каталитические молекулы РНК или рибозимы. Такие каталитические молекулы РНК могут применяться для ингибирования экспрессии целевой молекулы нуклеиновой кислоты . Включение последовательностей рибозимов в антисмысловую РНК придает молекуле РНК-расщепляющую активность, увеличивая, таким образом, активность конструкций. Создание и применение специфичных к РНК-мишеням рибозимов описано в Haseloff et al., Nature 334:585-591. 1988, и US 2003/0003469 A1, которые включены посредством отсылки.
[00119] В различных вариантах осуществления настоящего изобретения каталитическая молекула нуклеиновой кислоты сформирована в мотиве hammerhead (с англ. - головка молотка) или шпилечном мотиве. Примеры таких мотивов hammerhead описаны в Rossi et al., Aids Research and Human Retroviruses, 8:183, 1992. Пример шпилечных мотивов описан в Hampel et al., Biochemistry, 28:4929, 1989, и Hampel et al., Nucleic Acids Research, 18: 299, 1990. Специалистам в данной области будет очевидно, что в ферментной молекуле нуклеиновой кислоты необходимо присутствие специфического субстратсвязывающего участка, который комплементарен одной или более областей РНК гена-мишени, и что она в или около субстратсвязывающего участка содержит нуклеотидные последовательности, которые придают молекуле РНК-расщепляющую активность.
[00120] Супрессия мишени может определяться экспрессией или активностью соответствующего белка в подавляемых клетках по сравнению с клетками, в которых не используется супрессорное средство. Экспрессию белка можно оценить с помощью любой известной методики; соответствующие примеры включают метод иммунопреципитации, в котором используют антитело, ИФА, ELISA, IRA, IRMA, метод вестерн-блоттинга, иммуногистохимический метод, иммуноцитохимический метод, метод проточной цитометрии, различные методы гибридизации с использованием нуклеиновой кислоты, которая специфично гибридизуется с нуклеиновой кислотой, кодирующей белок или его уникальный фрагмент, или продукт транскрипции (например, мРНК), или продукт сплайсинга указанной нуклеиновой кислоты, метод нозерн-блоттинга, метод саузерн-блоттинга и различные методы ПЦР.
[00121] Активность белка можно оценить при анализе известной активности белка, включающей связывание с белком, таким как, например, Raf-1 (в частности, фосфорилированный Raf-1) или EGFR (в частности, фосфорилированный EGFR), с помощью любого известного способа, такого как, например, метод иммунопреципитации, метод вестерн-блоттинга, метод массового анализа, метод осаждения или метод поверхностного плазмонного резонанса (ППР).
[00122] В одном аспекте изобретения представлен вектор, кодирующий ингибирующую молекулу нуклеиновой кислоты согласно любому из вышеуказанных аспектов. В конкретном варианте вектор является ретровирусным, аденовирусным, аденоассоциированным вирусным или лентивирусным вектором. В другом варианте осуществления вектор содержит промотор, подходящий для экспрессии в клетке млекопитающего.
in vitro
[00123] Количество действующего, индуцирующего РНК-интерференцию вещества, включенного в композицию согласно настоящему изобретению, может быть количеством, которое не вызывает нежелательного явления, превышающего пользу от применения. Такое количество может быть определено с помощью  анализа с использованием культивируемых клеток или анализа на модельном животном или млекопитающем, таком как мышь, крыса, собака или свинья и т.д., и такие способы анализа известны специалистам в данной области.
[00124] Количество включенного в композицию действующего вещества может изменяться в зависимости от способа, которым вводят средство или композицию. Например, в случае использования множества единиц композиции для одного введения, количество действующего вещества, включаемого в одну единицу композиции, может быть определено путем деления количества действующего вещества, требуемого для одного введения, на указанное множество единиц.
[00125] Настоящее изобретение также относится к способу получения средства или композиции для супрессии Hsp47 или p21 и применения композиции, которая подавляет Hsp47 или подавляет Hsp47 и p21, для уменьшения злокачественных опухолей.
[00126] РНК-интерференция
[00127] РНК-интерференция (РНКи) относится к сиквенс-специфическому посттранскрипционному сайленсингу генов у животных, опосредуемому короткими интерферирующими РНК (миРНК). См., например, Zamore et al., Cell, 2000, Vol. 101, стр. 25-33; Fire et al., Nature, 1998, Vol. 391, стр. 806811; Sharp, Genes & Development, 1999, Vol. 13, стр. 139-141.
[00128] РНКи ответ в клетках может быть индуцирован двухцепочечной РНК (дцРНК), хотя механизм полностью еще не изучен. Некоторые дцРНК в клетках могут подвергаться действию фермента Dicer, рибонуклеазы III. См., например, Zamore et al., Cell, 2000, Vol. 101, стр. 25-33; Hammond et al., Nature, 2000, Vol. 404, стр. 293-296. Dicer может разрезать дцРНК с получением более коротких фрагментов дцРНК, которые представляют собой молекулы миРНК.
[00129] В целом миРНК могут иметь длину от приблизительно 21 до приблизительно 23 нуклеотидов и включать область двойной цепи пар оснований длиной приблизительно 19 нуклеотидов.
[00130] РНКи включает эндонуклеазный комплекс, известный как РНК-индуцируемый комплекс сайленсинга (RISC). миРНК имеет антисмысловую цепь или направляющую цепь, которая входит в комплекс RISC и опосредует расщепление одноцепочечной РНК-мишени, имеющей последовательность, комплементарную антисмысловой цепи миРНК дуплекса. Другой цепью миРНК является сопровождающая цепь. Расщепление РНК-мишени происходит в середине области, комплементарной антисмысловой цепи миРНК дуплекса. См., например, Elbashir et al., Genes & Development, 2001, Vol. 15, стр. 188-200.
[00131] При использовании в настоящем описании термин "смысловая цепь" относится к нуклеотидной последовательности молекулы миРНК, которая частично или полностью комплементарна, по меньшей мере, части соответствующей антисмысловой цепи молекулы миРНК. Смысловая цепь молекулы миРНК может включать последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую гомологией с целевой последовательностью нуклеиновой кислоты.
[00132] При использовании в настоящем описании термин "антисмысловая цепь" относится к нуклеотидной последовательности молекулы миРНК, которая частично или полностью комплементарна, по меньшей мере, части целевой последовательности нуклеиновой кислоты. Антисмысловая цепь молекулы миРНК может включать последовательность нуклеиновой кислоты, которая комплементарна, по меньшей мере, части соответствующей смысловой цепи молекулы миРНК.
[00133] Молекулы РНКи могут даунрегулировать или выключать экспрессию гена при опосредовании РНК-интерференции сиквенс-специфическим способом. См., например, Zamore et al., Cell, 2000, Vol. 101, стр. 25-33; Elbashir et al., Nature, 2001, Vol. 411, стр. 494-498; Kreutzer et al., WO2000/044895; Zernicka-Goetz et al., WO2001/36646; Fire et al., WO1999/032619; Plaetinck et al., WO2000/01846; Mello et al., WO2001/029058.
[00134] При использовании в настоящем описании термины "ингибирует", "даунрегулирует" или "снижает" в отношении экспрессии гена означают, что экспрессия гена или уровень молекул мРНК, кодирующих один или более белков, или активность одного или более кодируемых белков уменьшаются ниже уровня, наблюдаемого в отсутствие молекулы РНКи или миРНК настоящего изобретения. Например, уровень экспрессии, уровень мРНК или уровень активности кодируемого белка могут быть уменьшены по меньшей мере на 1% или по меньшей мере на 10%, или по меньшей мере на 20%, или по меньшей мере на 50%, или по меньшей мере на 90% или больше по сравнению с уровнем, наблюдаемым в отсутствие молекулы РНКи или миРНК настоящего изобретения.
[00135] Молекулы РНКи также могут применяться для нокдауна экспрессии вирусного гена и поэтому могут влиять на вирусную репликацию.
[00136] Молекулы РНКи могут быть получены из отдельных полинуклеотидных цепей: смысловой цепи или сопровождающей цепи, и антисмысловой цепи или направляющей цепи. Направляющая и сопровождающая цепь являются, по меньшей мере частично, комплементарными. Направляющая цепь и сопровождающая цепь могут образовывать двухцепочечную области, содержащую от приблизительно 15 до приблизительно 49 пар оснований.
[00137] В некоторых вариантах осуществления двухцепочечная область миРНК может содержать 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 или 49 пар оснований.
[00138] В некоторых вариантах осуществления молекула РНКи может быть активной в комплексе RISC с длиной двухцепочечной области, активной для RISC.
[00139] В дополнительных вариантах осуществления молекула РНКи может быть активной в качестве субстрата Dicer, превращаемого в молекулу РНКи, которая может быть активной в комплексе RISC.
[00140] В некоторых аспектах молекула РНКи может содержать комплементарные направляющую и сопровождающую части последовательности на противоположных концах длинной молекулы, причем молекула может образовывать двухцепочечную область с комплементарными частями последовательности, и при этом цепи связаны на одном конце двухцепочечной области нуклеотидным или ненуклеотидным линкерами. Например, шпилечная структура или структура стебеля и петли. Взаимодействие линкера с цепями может быть ковалентными связями или нековалентными взаимодействиями.
[00141] Молекула РНКи настоящего описания может включать нуклеотид, ненуклеотид или смешанный нуклеотидный/ненуклеотидный линкер, который соединяет смысловую область нуклеиновой кислоты с антисмысловой областью нуклеиновой кислоты. Нуклеотидный линкер может быть линкером длиной≥2 нуклеотидов, например, длиной приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов. Нуклеотидный линкер может быть аптамером нуклеиновой кислоты. "Аптамер" или "аптамер нуклеиновой кислоты" при использовании в настоящем описании относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая специфично связывается с молекулой-мишенью, где молекула нуклеиновой кислоты имеет последовательность, которая включает последовательность, распознаваемую молекулой-мишенью в ее естественном окружении. Альтернативно аптамер может быть молекулой нуклеиновой кислоты, которая связывается с молекулой-мишенью, где молекула-мишень в естественном состоянии не связывается с нуклеиновой кислотой. Например, аптамер может применяться для связывания с лигандсвязывающим доменом белка, предотвращая, таким образом, взаимодействие природного лиганда с белком. См., например, Gold et al., Annu Rev Biochem, 1995, Vol. 64, стр. 763-797; Brody et al., J. Biotechnol., 2000, Vol. 74, стр. 5-13; Hermann et al., Science, 2000, Vol. 287, стр. 820-825.
[00142] Примеры ненуклеотидного линкера включают нуклеотид с удаленными основаниями, полиэфир, полиамин, полиамид, пептид, углевод, липид, полиуглеводород или другие полимерные соединения, например, полиэтиленгликоли, такие, которые содержат от 2 до 100 звеньев этиленгликоля. Некоторые примеры описаны в Seela et al., Nucleic Acids Research, 1987, Vol. 15, стр. 3113-3129; Cload et al., J. Am. Chem. Soc., 1991, Vol. 113, стр. 6324-6326; Jaeschke et al., Tetrahedron Lett., 1993, Vol. 34, стр. 301; Arnold et al., WO1989/002439; Usman et al., WO1995/006731; Dudycz et al., WO1995/011910 и Ferentz et al., J. Am. Chem. Soc., 1991, Vol. 113, стр. 4000-4002.
[00143] Молекула РНКи может иметь один или более концов, выступающих из двухцепочечной области. Выступающие концы, которые представляют собой не содержащие спаренных оснований одноцепочечные области, могут иметь длину от одного до восьми нуклеотидов или больше. Выступающий конец может быть 3′-выступающим концом, где 3′-конец цепи содержит одноцепочечную область длиной от одного до восьми нуклеотидов. Выступающий конец может быть 5′-выступающим концом, где 5′-конец цепи содержит одноцепочечную область длиной от одного до восьми нуклеотидов.
[00144] Выступающие концы молекулы РНКи могут иметь одинаковую длину или могут быть разной длины.
[00145] Молекула РНКи может иметь один или более тупых концов, в которых двухцепочечная область заканчивается без выступа, при этом основания в цепи спарены до конца двухцепочечной области.
[00146] Молекула РНКи настоящего описания может иметь один или более тупых концов, или может иметь один или более выступающих концов или может иметь комбинацию тупого конца и выступающего конца.
[00147] 5′-конец цепи молекулы РНКи может быть на тупом конце или может быть на выступающем конце. 3′-конец цепи молекулы РНКи может быть на тупом конце или может быть на выступающем конце.
[00148] 5′-конец цепи молекулы РНКи может быть на тупом конце, тогда как 3′-конец находится на выступающем конце. 3′-конец цепи молекулы РНКи может быть на тупом конце, тогда как 5′-конец находится на выступающем конце.
[00149] В некоторых вариантах осуществления оба конца молекулы РНКи являются тупыми концами.
[00150] В дополнительных вариантах осуществления оба конца молекулы РНКи имеют выступ.
[00151] Выступы на 5′- и 3′-концах могут иметь разную длину.
[00152] В некоторых вариантах осуществления молекула РНКи может иметь тупой конец, где 5′-конец антисмысловой цепи и 3′-конец смысловой цепи не имеют выступающих нуклеотидов.
[00153] В других вариантах осуществления молекула РНКи может иметь тупой конец, где 3′-конец антисмысловой цепи и 5′-конец смысловой цепи не имеют выступающих нуклеотидов.
[00154] Молекула РНКи может иметь ошибочно спаренные основания в двухцепочечной области.
[00155] Любой нуклеотид в выступающем конце молекулы РНКи может быть дезоксирибонуклеотидом или рибонуклеотидом.
[00156] Один или более дезоксирибонуклеотидов могут быть на 5′-конце, где 3′-конец другой цепи молекулы РНКи может не иметь выступ или может не иметь выступающих дезоксирибонуклеотидов.
[00157] Один или более дезоксирибонуклеотидов могут быть на 3′-конце, где 5′-конец другой цепи молекулы РНКи может не иметь выступ или может не иметь выступающих дезоксирибонуклеотидов.
[00158] В некоторых вариантах осуществления один или более, или все выступающие нуклеотиды молекулы РНКи могут быть 2′-дезоксирибонуклеотидами.
[00159] Молекулы РНКи в качестве субстрата Dicer
[00160] В некоторых аспектах молекула РНКи может иметь длину, подходящую в качестве субстрата Dicer, которая может быть процессирована с получением RISC-активной молекулы РНКи. См., например, Rossi et al., US2005/0244858.
[00161] дцРНК в качестве субстрата Dicer может иметь достаточную длину, чтобы она подвергалась процессингу Dicer с получением активной молекулы РНКи, и может также включать одно или больше следующих свойств: (i) дцРНК в качестве субстрата Dicer может быть асимметричной, например, иметь 3′-выступающий конец на антисмысловой цепи, и (ii) дцРНК в качестве субстрата Dicer может иметь модифицированный 3′-конец на смысловой цепи для направления ориентации связывания Dicer и процессинга дцРНК с получением активной молекулы РНКи.
[00162] Молекулы РНКи против p21
[00163] Примеры молекул РНКи настоящего изобретения, направленных против p21 мРНК, показаны в Таблице 1.
Таблица 1: Последовательности молекул РНКи против p21
Реф. пол.
SEQ ID NO
Смысловая цепь(5'→3')SEQ ID NO: 1-28
SEQ ID NO
Антисмысловая цепь(5'→3')SEQ ID NO: 29-56
2085
1
CUUAGUGACUUUACUUGUAmUmU
29
UACAAGUAAAGUCACUAAGmUmU
500
2
CAGACCAGCAUGACAGAUUmUmU
30
AAUCUGUCAUGCUGGUCUGmUmU
540
3
UGAUCUUCUCCAAGAGGAAmUmU
31
UUCCUCUUGGAGAAGAUCAmUmU
1706
4
GUUCAUUGCACUUUGAUUAmUmU
32
UAAUCAAAGUGCAAUGAACmUmU
1709
5
CAUUGCACUUUGAUUAGCAmUmU
33
UGCUAAUCAAAGUGCAAUGmUmU
210
6
AGCGAUGGAACUUCGACUUmUmU
34
AAGUCGAAGUUCCAUCGCUmUmU
211
7
GCGAUGGAACUUCGACUUUmUmU
35
AAAGUCGAAGUUCCAUCGCmUmU
1473
8
GGGAAGGGACACACAAGAAmUmU
36
UUCUUGUGUGUCCCUUCCCmUmU
1507
9
UCUACCUCAGGCAGCUCAAmUmU
37
UUGAGCUGCCUGAGGUAGAmUmU
2067
10
GGUGCUCAAUAAAUGAUUCmUmU
38
GAAUCAUUUAUUGAGCACCmUmU
1063
11
CAUCAUCAAAAACUUUGGAmUmU
39
UCCAAAGUUUUUGAUGAUGmUmU
1735
12
AAGGAGUCAGACAUUUUAAmUmU
40
UUAAAAUGUCUGACUCCUUmUmU
783
13
GUGCUGGGCAUUUUUAUUUmUmU
41
AAAUAAAAAUGCCCAGCACmUmU
869
14
GCCGGCUUCAUGCCAGCUAmUmU
42
UAGCUGGCAUGAAGCCGGCmUmU
1060
15
GGGCAUCAUCAAAAACUUUmUmU
43
AAAGUUUUUGAUGAUGCCCmUmU
1492
16
GAAGGGCACCCUAGUUCUAmUmU
44
UAGAACUAGGGUGCCCUUCmUmU
1704
17
CAGUUCAUUGCACUUUGAUmUmU
45
AUCAAAGUGCAAUGAACUGmUmU
1733
18
ACAAGGAGUCAGACAUUUUmUmU
46
AAAAUGUCUGACUCCUUGUmUmU
1847
19
UGGAGGCACUGAAGUGCUUmUmU
47
AAGCACUUCAGUGCCUCCAmUmU
2000
20
GCAGGGACCACACCCUGUAmUmU
48
UACAGGGUGUGGUCCCUGCmUmU
2014
21
CUGUACUGUUCUGUGUCUUmUmU
49
AAGACACAGAACAGUACAGmUmU
677
22
UUAAACACCUCCUCAUGUAmUmU
50
UACAUGAGGAGGUGUUUAAmUmU
475
23
AGACUCUCAGGGUCGAAAAmUmU
51
UUUUCGACCCUGAGAGUCUmUmU
508
24
CAUGACAGAUUUCUACCACmUmU
52
GUGGUAGAAAUCUGUCAUGmUmU
514
25
AGAUUUCUACCACUCCAAAmUmU
53
UUUGGAGUGGUAGAAAUCUmUmU
549
26
CCAAGAGGAAGCCCUAAUCmUmU
54
GAUUAGGGCUUCCUCUUGGmUmU
382
27
GACAGCAGAGGAAGACCAUmUmU
55
AUGGUCUUCCUCUGCUGUCmUmU
2042
28
CUCCCACAAUGCUGAAUAUmUmU
56
AUAUUCAGCAUUGUGGGAGmUmU
[00164] Пояснение к Таблице 1: Заглавные буквы A, G, C и U указаны для рибо-A, рибо-G, рибо-C и рибо-U, соответственно. Строчные буквы a, g, c, t обозначают 2'-дезокси-A, 2'-дезокси-G, 2'-дезокси-C и тимидин, соответственно. mU является 2'-метокси-U.
[00165] Примеры молекул РНКи настоящего изобретения, направленных против p21 мРНК, показаны в Таблице 2.
Таблица 2: Последовательности молекул РНКи против p21
Реф. пол.
SEQ ID NO
Смысловая цепь(5'→3')SEQ ID NO:57-70
SEQ ID NO
Антисмысловая цепь(5'→3')SEQ ID NO:71-84
1735'
57
AAGGAGUCAGACAUUUUAANN
71
UUAAAAUGUCUGACUCCUUNN
1
58
<u>AAG</u>GAGU<u>C</u>AGA<u>C</u>AUUU<u>U</u>AA<u>UU</u>
72
U<u>U</u>AaAa<u>U</u>gUC<u>U</u>GACUCCUU<u>UU</u>
2
59
<u>AAG</u>GAGU<u>C</u>AGA<u>C</u>A<u>UU</u>U<u>U</u>AA<u>UU</u>
73
U<u>U</u>AaAa<u>U</u>gUC<u>U</u>GACUCCUU<u>UU</u>
3
60
<u>AAG</u>GAGU<u>C</u>AGA<u>C</u>A<u>UU</u>U<u>U</u>AA<u>UU</u>
74
U<u>U</u>AaAaUgUCUGACUCCUU<u>UU</u>
4
61
<u>AAG</u>GAGU<u>C</u>AGA<u>C</u>AUUU<u>U</u>AA<u>UU</u>
75
U<u>U</u>AaAaUgUCUGACUCCUU<u>UU</u>
5
62
AAGGAGUCAGACAUUUUAA<u>UU</u>
76
UUaaaaugUCUGACUCCUU<u>UU</u>
6
63
AAGGAGUCAGACAUUUUAA<u>UU</u>
77
UUAAaaugUCUGACUCCUU<u>UU</u>
7
64
AAGGAGUCAGACAUUUUAA<u>UU</u>
78
uUaAaAuGUCUGACUCCUU<u>UU</u>
8
65
AAGGAGUCAGACAUUUUAA<u>UU</u>
79
UUaAaAuGUCUGACUCCUU<u>UU</u>
9
66
AAGGAGUCAGACAUUUUAA<u>UU</u>
80
UUAaAaUgUCUGACUCCUU<u>UU</u>
10
67
AAGGAGUCAGACAUUUUAA<u>UU</u>
81
U<u>U</u>AAAA<u>U</u>GUC<u>U</u>GACUCCUU<u>UU</u>
11
68
AAGGAGU<u>C</u>AGA<u>C</u>AUUU<u>U</u>AA<u>UU</u>
82
UUAAAAUGUCUGACUCCUU<u>UU</u>
12
69
<u>AAG</u>GAGUCAGACAUUUUAA<u>UU</u>
83
UUAAAAUGUCUGACUCCUU<u>UU</u>
13
70
<u>AAG</u>GAGU<u>C</u>AGA<u>C</u>AUUU<u>U</u>AA<u>UU</u>
84
UUAAAAUGUCUGACUCCUU<u>UU</u>
U
U
[00166] Пояснение к Таблице 2: Заглавные буквы A, G, C и U указаны для рибо-A, рибо-G, рибо-C и рибо-U, соответственно. Строчные буквы a, u, g, c, t обозначают 2'-дезокси-A, 2'-дезокси-U, 2'-дезокси-G, 2'-дезокси-C и дезокситимидин (dT=T=t), соответственно. Подчеркивание относится к 2'-OMe-замещенному, например, . N является A, C, G, U, , a, c, g, u, t или модифицированным, инвертированным или химически модифицированным нуклеотидом.
[00167] При использовании в настоящем описании молекула РНКи обозначает любую молекулу, которая вызывает РНК-интерференцию, включая двухцепочечную РНК, такую как миРНК (малую интерферирующую РНК), мкРНК (микроРНК), мшРНК (короткую шпилечную РНК), днРНК (ДНК-направленную РНК), piРНК (Piwi-взаимодействующую РНК) или rasiРНК (ассоциированную с повторами миРНК), и их модифицированные формы. Эти молекулы РНКи могут быть коммерчески доступными или могут быть созданы и получены на основе известной информации о последовательности и т.д. Антисмысловая нуклеиновая кислота включает РНК, ДНК, ПНК или их комплекс. При использовании в настоящем описании ДНК/РНК химерный полинуклеотид включает двухцепочечный полинуклеотид, состоящий из ДНК и РНК, который ингибирует экспрессию гена-мишени.
[00168] В одном варианте осуществления вещества настоящего изобретения содержат миРНК в качестве терапевтического средства. Молекула миРНК может иметь длину от приблизительно 10-50 или более нуклеотидов. Молекула миРНК может иметь длину от приблизительно 15-45 нуклеотидов. Молекула миРНК может иметь длину от приблизительно 19-40 нуклеотидов. Молекула миРНК может иметь длину от 19-23 нуклеотидов. Молекула миРНК настоящего изобретения может опосредовать РНКи против мРНК-мишени. Коммерчески доступные средства разработки и наборы, такие как доступные от Ambion, Inc. (Austin, TX) и Уайтхедовского института биомедицинских исследований при Массачусетском технологическом институте (MIT, Cambridge, MA), позволяют производить разработку и получение миРНК.
[00169] p21 присутствует у различных животных, включая людей. Информацию о последовательности человеческого CDKN1A (p21) можно найти в: NM_000389.4, NM_078467.2, NM_001291549.1, NM_001220778.1, NM_001220777.1 (NP_001207707.1, NP_001278478.1, NP_001207706.1, NP_510867.1, NP_000380.1).
[00170] Последовательность нуклеиновой кислоты примерной p21 мРНК-мишени раскрыта в регистрационном номере GenBank NM_000389.4 (CDKN1A) и имеет длину 2175 нуклеотидов.
[00171] Молекулы РНКи, направленные против Hsp47
[00172] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение может обеспечивать ряд молекул РНКи и композиций для модуляции экспрессии белка теплового шока 47 (Hsp47), коллагенспецифического молекулярного шаперона внутриклеточного транспорта и созревания.
[00173] Некоторые примеры молекул миРНК против Hsp47 приведены в US 8,710,209, который настоящим полностью включен посредством отсылки во всех отношениях.
[00174] Последовательность Hsp47 или последовательность соответствующего гомологичного гена раскрыты, например, как GenBank AB010273 (человек), X60676 (мышь) или M69246 (крыса, gp46).
[00175] Средства для супрессии Hsp47 были раскрыты для подавления фиброза. См., например, US 8,173,170 B2, который настоящим полностью включен посредством отсылки во всех отношениях. Однако в отношении эффекта ингибирования Hsp47 при развитии, прогрессировании и росте злокачественной опухоли существует ограниченная информация.
[00176] В некоторых вариантах осуществления каждая цепь молекулы миРНК настоящего изобретения может иметь длину от 15 до 60 нуклеотидов или длину от 15 до 40 нуклеотидов, или длину от 19 до 25 нуклеотидов.
[00177] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая молекулы РНКи для лечения злокачественной опухоли, которые являются молекулами РНКи, направленными против Hsp47.
[00178] Примеры молекул РНКи настоящего описания, направленных против мРНК Hsp47, показаны в Таблице 3.
Таблица 3: Последовательности молекулы РНКи против Hsp47
SEQ ID NO
Смысловая цепь(5'→3')SEQ ID NO:85-105
SEQ ID NO
Антисмысловая цепь(5'→3')SEQ ID NO:106-126
мышь
85
CGAGAACAGUUUGUACAAGUU
106
CUUGUACAAACUGUUCUCGUU
86
CAGGCCUCUACAACUACUATT
107
UAGUAGUUGUAGAGGCCUGTT
87
GAGCACUCCAAGAUCAACUUCCGCG
108
CGCGGAAGUUGAUCUUGGAGUGCUCUU
88
GGACAGGCCUCUACAACUATT
109
UAGUUGUAGAGGCCUGUCCTT
89
GAGCACUCCAAGAUCAACUTT
110
AGUUGAUCUUGGAGUGCUCTT
90
GAACACUCCAAGAUCAACUTT
111
AGUUGAUCUUGGAGUGUUCTT
91
CAGGCCUCUACAACUACUACGACGA
112
UCGUCGUAGUAGUUGUAGAGGCCUGUU
92
GAACACUCCAAGAUCAACUUCCGAG
113
CUCGGAAGUUGAUCUUGGAGUGUUCUU
93
GGACAGGCCUCUACAACUACUACGA
114
UCGUAGUAGUUGUAGAGGCCUGUCCUU
94
CAGGCCUCUACAACUACUAdTdTdAdAdAdAdA
115
UAGUAGUUGUAGAGGCCUGdTdT
95
CAGGCCUCUACAACUACUA
116
UAGUAGUUGUAGAGGCCUGdTdT
96
CAGGCCUCUACAACUACUAdTdTdAdAdAdAdAdAdAdAdAdAdAdA
117
UAGUAGUUGUAGAGGCCUGdTdT
97
dAdAdAdAdACAGGCCUCUACAACUACUAdTdT
118
UAGUAGUUGUAGAGGCCUGdTdT
98
CAGGCCUCUACAACUACUAdTdTdAdAdAdAdAdAdAdA
119
UAGUAGUUGUAGAGGCCUGdTdT
99
dAdAdAdAdAdAdAdACAGGCCUCUACAACUACUAdTdT
120
UAGUAGUUGUAGAGGCCUGdTdT
100
CAGGCCUCUACAACUACUAdTdTdAdAdAdAdAdAdAdAdAdAdAdA
121
UAGUAGUUGUAGAGGCCUGdTdT
101
dAdAdAdAdAdAdAdAdAdAdAdAdAdAdAdACAGGCCUCUACAACUACUAdTdT
122
UAGUAGUUGUAGAGGCCUGdTdT
102
CAGGCCUCUACAACUACUAdTdTdAdAdAdAdAdAdAdAdAdAdAdAdAdAdAdA
123
UAGUAGUUGUAGAGGCCUGdTdT
103
CAGGCCUCUACAACUACUAdTdT
124
UAGUAGUUGUAGAGGCCUGdTdT
мышь
104
GGACAGGCCUGUACAACUAdTdT
125
UAGUUGUACAGGCCUGUCCdTdT
человек
105
GGACAGGCCUCUACAACUAdTdT
126
UAGUUGUAGAGGCCUGUCCdTdT
[00179] Пояснение к Таблице 3: Заглавные буквы A, G, C и U указаны для рибо-A, рибо-G, рибо-C и рибо-U, соответственно. Строчная буква d обозначает "дезокси".
[00180] Дополнительные примеры молекул РНКи настоящего описания, направленных против мРНК Hsp47, показаны в Таблице 4.
Таблица 4: Последовательности молекул РНКи и контроль для Hsp47
SEQ ID NO
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
127
3'-C3-25rU-25rC-25rC-25rU-25rU-rC-rA-rA-rC-rU-rA-rG-rA-rA-rC-rC-rU-rC-rA-idAB-5'
СМЫСЛОВАЯ45-M
128
3'-C3-C3-mU-rG-mA-rG-mG-rU-mU-rC-mU-rA-rG-mU-25rU-mG-rA-mA-rG-mG-rA-5'
АНТИСМЫСЛОВАЯ45-M
129
3'-C3-rA-rG-mU-rG-rG-rG-mU-rA-mC-rA-25rC-rA-rG-rA-rG-mU-rC-rC-rU-idAB-5'
СМЫСЛОВАЯ51_M
130
3'-C3-C3-rA-rG-rG-rA-mC-rU-rC-rU-mG-rU-rG-mU-rA-25rC-rC-mC-rA-rC-mU-5'
АНТИСМЫСЛОВАЯ51_M
131
5'-idAB-rG-rA-rG-rA-rC-rA-rC-rA-rU-rG-rG-rG-rU-rG-25rC-25rU-25rA-25rU-25rA-C3-P-3'
СМЫСЛОВАЯ2_M
132
5'-mU-rA-mU-rA-mG-rC-25rA-rC-mC-rC-mA-rU-mG-rU-mG-rU-mC-rU-mC-C3-C3-3'
АНТИСМЫСЛОВАЯ2_M
133
5'-idAB-rC-mU-mU-rA-mC-rG-mC-mU-25rG-rA-rG-mU-rA-mC-mU-rU-mC-rG-rU-C3-3'
СМЫСЛОВАЯОтрицательный контроль
134
5'-rA-mC-rG-rA-rA-25rG-mU-rA-rC-rU-mC-rA-rG-rC-rG-mU-rA-rA-rG-C3-C3-3'
АНТИСМЫСЛОВАЯОтрицательный контроль
[00181] Пояснение к Таблице 4: Обозначения: rX обозначает рибонуклеотиды, mX обозначает 2'-O-метил-рибонуклеотиды, 25rX обозначает рибонуклеотиды с 2'-5' связями, C3 обозначает 1,3-пропандиольный спейсер, idAB обозначает инвертированную 1,2 дидезокси-D-рибозу, P обозначает фосфатную группу на 3'-конце.
[00182] Способы применения молекул РНКи
[00183] Молекулы нуклеиновой кислоты и молекулы РНКи настоящего изобретения могут быть доставлены в клетку или ткань при непосредственном применении молекул или с молекулами, объединенными с носителем или разбавителем.
[00184] Молекулы нуклеиновых кислот и молекулы РНКи настоящего изобретения могут быть доставлены или введены в клетку, ткань, орган или субъекту путем непосредственного применения молекул с носителем или разбавителем или с помощью любого другого средства доставки, которое способствует или облегчает проникновение в клетку, например, вирусных последовательностей, вирусного материала или липидных или липосомных композиций.
ex vivo
in vivo
[00185] Молекулы нуклеиновой кислоты и молекулы РНКи настоящего изобретения могут быть включены в комплекс с катионными липидами, упакованы в липосомы или иным способом доставлены в целевые клетки или ткани. Нуклеиновая кислота или комплексы нуклеиновой кислоты могут быть локально введены в соответствующие ткани  или  посредством прямого нанесения на кожу, трансдермального применения или инъекции.
[00186] Системы доставки могут включать, например, водные и неводные гели, кремы, эмульсии, микроэмульсии, липосомы, мази, водные и неводные растворы, лосьоны, аэрозоли, углеводородные основы и порошки, и могут содержать вспомогательные вещества, такие как солюбилизаторы и усилители проникновения.
[00187] Ингибирующая молекула нуклеиновой кислоты или композиция настоящего изобретения могут быть введены в фармацевтически приемлемых разбавителях, носителе или вспомогательном веществе, в стандартной лекарственной форме. Стандартная фармацевтическая практика может применяться для получения подходящих лекарственных форм или композиций для введения соединений больным, страдающим заболеванием, которое вызвано избыточной пролиферацией клеток. Введение можно начинать до появления у больного клинических симптомов. Может использоваться любой подходящий путь введения, например, введение может быть парентеральным, внутривенным, внутриартериальным, подкожным, внутриопухолевым, внутримышечным, внутричерепным, внутриглазничным, глазным, внутрижелудочковым, внутрипеченочным, внутрикапсульным, интратекальным, интрацистернальным, внутрибрюшинным, интраназальным, аэрозольным, в виде суппозитория или пероральным введением. Например, терапевтические композиции могут быть в форме жидких растворов или суспензий; для перорального введения лекарственные формы могут быть в форме таблеток или капсул; и в случае интраназальных лекарственных форм в форме порошков, назальных капель или аэрозолей.
[00188] Композиции и способы настоящего описания могут включать вектор экспрессии, который включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере одну молекулу РНКи настоящего изобретения таким образом, который обеспечивает экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты.
[00189] Молекулы нуклеиновой кислоты и молекулы РНКи настоящего изобретения могут экспрессироваться с единиц транскрипции, встроенных в ДНК или РНК векторы. Рекомбинантные векторы могут быть ДНК плазмидами или вирусными векторами. Могут применяться вирусные векторы, которые обеспечивают транзиентную экспрессию молекул нуклеиновой кислоты.
[00190] Например, вектор может содержать последовательности, кодирующие обе цепи молекулы РНКи двойной цепи или одну молекулу нуклеиновой кислоты, которая является самокомплементарной и таким образом формирует молекулу РНКи. Вектор экспрессии может включать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую две или более молекул нуклеиновых кислот.
[00191] Молекула нуклеиновой кислоты может экспрессироваться в клетках с эукариотических промоторов. Специалистам в данной области известно, что любая нуклеиновая кислота может экспрессироваться в эукариотических клетках с подходящего ДНК/РНК вектора.
[00192] В некоторых аспектах вирусная конструкция может применяться для введения экспрессионной конструкции в клетку для транскрипции конструкции дцРНК, кодируемой экспрессионной конструкцией.
[00193] Липидные лекарственные формы можно вводить животным внутривенной, внутримышечной или внутрибрюшинной инъекцией, или перорально, или ингаляцией, или другими способами, известными в уровне техники.
[00194] Фармацевтически приемлемые лекарственные формы для введения олигонуклеотидов известны и могут применяться.
2
2
[00195] В одном варианте осуществления вышеуказанного способа ингибирующую молекулу нуклеиновой кислоты вводят в дозе приблизительно 5-500 мг/м/день, например, 5, 25, 50, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 или 300 мг/м/день.
[00196] В некоторых вариантах осуществления ингибирующие молекулы нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению вводят системно в дозах от приблизительно 1 до 100 мг/кг, например, 1, 5, 10, 20, 25, 50, 75 или 100 мг/кг.
2
[00197] В других вариантах осуществления доза может изменяться от приблизительно 25 до 500 мг/м/день.
[00198] Способы изготовления лекарственных форм, известные в уровне техники, можно найти, например, в "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" Ed. A. R. Gennaro, Lippincourt Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa., 2000.
[00199] Лекарственные формы для парентерального введения могут, например, содержать вспомогательные вещества, стерильную воду или солевой раствор, полиалкиленгликоли, такие как полиэтиленгликоль, масла растительного происхождения или гидрированные нафталины. Биологически совместимый, биоразлагаемый лактидный полимер, сополимер лактида/гликолида или сополимеры полиоксиэтилена-полиоксипропилена могут использоваться для регулирования высвобождения соединений. Другие потенциально применимые системы парентеральной доставки для ингибирующих молекул нуклеиновых кислот включают частицы сополимера этилена-винилацетата, осмотические насосы, имплантируемые инфузионные системы и липосомы. Лекарственные формы для ингаляции могут содержать вспомогательные вещества, например лактозу, или могут быть водными растворами, содержащими, например, полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир, гликохолат и дезоксихолат, или могут быть масляными растворами для введения в форме назальных капель, или в форме геля.
[00200] Лекарственные формы можно вводить больным людям в терапевтически эффективных количествах (например, количествах, которые предотвращают, устраняют или уменьшают патологическое состояние) для обеспечения терапии онкологического заболевания или состояния. Предпочтительная доза нуклеотидного олигомера согласно изобретению может зависеть от таких факторов, как тип и степень нарушения, общее состояние здоровья конкретного больного, лекарственная форма соединения, вспомогательные вещества и их путь введения.
[00201] Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может быть эффективной при лечении ассоциированного с Hsp47 заболевания. Примеры таких заболеваний включают заболевание, вызванное аномальной пролиферацией клеток, и заболевание, представляющее чрезмерную экспрессию Hsp47.
in vitro
in vivo
in vitro
[00202] Все вышеуказанные способы уменьшения злокачественных опухолей могут быть либо  способом, либо  способом. Доза может быть определена при помощи  анализа с использованием культивируемых клеток и т.д., как известно в уровне техники. Эффективное количество может быть количеством, которое уменьшает размер опухоли по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20% или по меньшей мере на 30%, или по меньшей мере на 40%, или по меньшей мере на 50%, или по меньшей мере на 60%, или по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, до 100% размера опухоли. Эффективное количество может быть количеством, которое уменьшает пролиферацию раковых клеток по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20% или по меньшей мере на 30%, или по меньшей мере на 40%, или по меньшей мере на 50%, или по меньшей мере на 60%, или по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или до 100% по сравнению с контролем.
[00203] Примеры заболевания, вызванного аномальной пролиферацией клеток, включают злокачественные опухоли, гиперплазию, келоид, синдром Кушинга, первичный альдостеронизм, эритроплакию, истинную полицитемию, лейкоплакию, гиперпластический рубец, плоский лишай и лентигиноз.
[00204] Примеры заболевания, вызванного оверэкспрессией Hsp47, включают злокачественную опухоль.
[00205] Примеры рака включают саркомы, такие как фибросаркому, злокачественную фиброзную гистиоцитому, липосаркому, рабдомиосаркому, лейомиосаркому, ангиосаркому, саркому Капоши, лимфангиосаркому, синовиальную саркому, хондросаркому и остеосаркому, карциномы, такие как опухоль головного мозга, карциному головы и шеи, карциному молочной железы, карциному легкого, карциному пищевода, карциному желудка, карциному двенадцатиперстной кишки, карциному аппендикса, карциному толстой кишки, карциному прямой кишки, карциному печени, карциному поджелудочной железы, карциному желчного пузыря, карциному желчных протоков, карциному анального канала, почечную карциному, карциному мочеточника, карциному мочевого пузыря, карциному предстательной железы, карциному яичка, карциному матки, карциному яичника, карциному кожи, лейкоз и злокачественную лимфому.
[00206] Рак включает эпителиальное злокачественное новообразование и неэпителиальное злокачественное новообразование. Рак может присутствовать в любой области тела, например, головном мозге, голове и шее, груди, конечностях, легком, сердце, тимусе, пищеводе, желудке, тонком кишечнике (двенадцатиперстной кишке, тощей кишке, подвздошной кишке), толстом кишечнике (толстой кишке, слепой кишке, аппендиксе, прямой кишке), печени, поджелудочной железе, желчном пузыре, почке, мочевыводящем канале, мочевом пузыре, предстательной железе, яичке, матке, яичнике, коже, поперечно-полосатой мышце, гладкой мышце, синовиальной оболочке, хряще, кости, щитовидной железе, надпочечнике, брюшной полости, брыжейке, костном мозге, крови, сосудистой системе, лимфатической системе, например лимфатическом узле, лимфатическом жидкости и т.д.
[00207] В другом варианте осуществления рак включает раковые клетки, которые демонстрируют независимую от гормонов или факторов роста пролиферацию. В других вариантах осуществления рак включает раковые клетки, демонстрирующие оверэкспрессию Hsp47.
[00208] Наночастицы
[00209] В вариантах осуществления настоящего изобретения могут быть предложены композиции липосомных наночастиц. Ионизируемые молекулы настоящего изобретения могут применяться для образования липосомных композиций, которые могут содержать бислой липидоподобных молекул.
[00210] Композиция наночастиц может содержать одну или более ионизируемых молекул настоящего изобретения в липосомной структуре, бислойной структуре, мицелле, слоистой структуре или их смеси.
[00211] В некоторых вариантах осуществления композиция может включать один или более компонентов жидких растворителей. Жидкий растворитель, подходящий для доставки действующих веществ настоящего изобретения, может быть фармацевтически приемлемым жидким растворителем. Жидкий растворитель может включать органический растворитель или комбинацию воды и органического растворителя.
[00212] В вариантах осуществления настоящего изобретения могут быть предложены липидные наночастицы, имеющие размер от 10 до 1000 нм. В некоторых вариантах осуществления липосомные наночастицы могут иметь размер от 10 до 150 нм.
[00213] В некоторых вариантах осуществления липосомные наночастицы настоящего изобретения могут инкапсулировать молекулу РНКи и сохранять по меньшей мере 80% инкапсулированных молекул РНКи после воздействия человеческой сыворотки в течение 1 часа.
[00214] Фармацевтические композиции
[00215] В настоящем изобретении также рассматриваются способы распределения действующего вещества в органе субъекта для лечения злокачественной опухоли посредством введения субъекту композиции настоящего изобретения. Органы, которые можно лечить, включают легкое, печень, поджелудочную железу, толстую кишку, сердце, кость, кожу, кишечник и суставы.
[00216] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложены способы лечения онкологического заболевания легкого посредством введения субъекту композиции настоящего изобретения.
[00217] В других аспектах настоящего изобретения предложен ряд фармацевтических композиций.
[00218] Фармацевтическая композиция в настоящей заявке может включать действующее вещество, а также носитель лекарственного средства или липид согласно настоящему изобретению, вместе с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Как правило, действующие вещества настоящего описания включают молекулы миРНК, действующие вещества для лечения злокачественной опухоли, а также любое низкомолекулярное лекарственное средство.
[00219] Носитель лекарственного средства может направлять композицию в звездчатые клетки. Носитель лекарственного средства может заключать в себе лекарственное средство или может быть связан с поверхностью содержащего лекарственное средство вещества, или он может быть смешан с лекарственным средством при включении ретиноидного производного и/или аналога витамина A в носитель лекарственного средства и, по меньшей мере частично, экспонирован на внешней поверхности препарата. Композиция или препарат могут быть покрыты подходящим материалом, таким как, например, кишечнорастворимое покрытие или материал, который распадается со временем, или они могут быть включены в подходящую систему высвобождения лекарственного средства.
[00220] Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может содержать одно или более из следующего: поверхностно-активное вещество, разбавитель, вспомогательное вещество, консервант, стабилизатор, краситель и суспендирующее вещество.
[00221] Некоторые фармацевтические носители, разбавители и компоненты для фармацевтической композиции, а также способы изготовления и применения соединений и композиций настоящего изобретения описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1990).
[00222] Примеры консервантов включают бензоат натрия, аскорбиновую кислоту и сложные эфиры п-гидроксибензойной кислоты.
[00223] Примеры поверхностно-активных веществ включают спирты, сложные эфиры, сульфированные алифатические спирты.
[00224] Примеры вспомогательных веществ включают сахарозу, глюкозу, лактозу, крахмал, кристаллическую целлюлозу, маннит, легкий безводный силикат, алюминат магния, метасиликат алюминат магния, синтетический силикат алюминия, карбонат кальция, гидрокарбонат натрия, гидрофосфат кальция и кальций-карбоксиметилцеллюлозу.
[00225] Примеры суспендирующих веществ включают кокосовое масло, оливковое масло, кунжутное масло, арахисовое масло, сою, ацетат фталат целлюлозы, сополимер метилацетата-метакрилата и фталатные сложные эфиры.
[00226] Терапевтическую лекарственную форму настоящего изобретения для доставки одной или более молекул, активных для сайленсинга гена, можно вводить нуждающемуся в этом млекопитающему. Терапевтически эффективное количество лекарственной формы и действующего вещества, которое можно заключить в липосому, можно вводить млекопитающему для предотвращения или лечения злокачественной опухоли.
[00227] Путь введения может быть местным или системным.
[00228] Терапевтически эффективная лекарственная форма настоящего изобретения может быть введена различными путями, включая внутривенный, внутрибрюшинный, внутримышечный, подкожный и пероральный.
[00229] Пути введения могут включать, например, парентеральную доставку, включая внутримышечные, подкожные, внутривенные, интрамедуллярные инъекции, а также интратекальные, прямые внутрижелудочковые, внутрибрюшинные, интраназальные или внутриглазные инъекции.
[00230] Композиция также может быть введена в лекарственных формах с замедленным или контролируемым высвобождением, включая депо-инъекции, осмотические насосы и т.п., для пролонгированного и/или контролируемого по времени, импульсного введения с установленной скоростью.
[00231] Композиция настоящего изобретения может быть введена различными путями, включая пероральный и парентеральный пути, при этом соответствующие примеры включают, без ограничения, пероральный, внутривенный, внутримышечный, подкожный, местный, интрапульмонарный, в дыхательные пути, эндотрахеальный, эндобронхиальный, назальный, ректальный, внутриартериальный, внутрипортальный, внутрижелудочковый, интрамедуллярный, в лимфатические узлы, внутрилимфатический, внутримозговой, интратекальный, интрацеребровентрикулярный, чресслизистый, чрескожный, интраназальный, внутрибрюшинный и внутриматочный пути, при этом она может быть включена в лекарственную форму, подходящую для каждого пути введения. Такая лекарственная форма и способ изготовления лекарственной формы могут быть выбраны в качестве подходящих из любых известных лекарственных форм и способов. См., например, Hyojun Yakuzaigaku, Standard Pharmaceutics, Ed. by Yoshiteru Watanabe et al., Nankodo, 2003.
[00232] Примеры лекарственных форм, подходящих для приема внутрь, включают, без ограничения перечисленными, порошок, гранулу, таблетку, капсулу, жидкость, суспензию, эмульсию, гель и сироп, и примеры лекарственной формы, подходящей для парентерального введения, включают инъекции, такие как раствор для инъекций, суспензию для инъекций, эмульсию для инъекций и готовую к применению форму для инъекций. Лекарственные формы для парентерального введения могут быть такой формой, как водный или неводный изотонический стерильный раствор или суспензия.
[00233] Фармацевтические композиции для парентерального введения, например, посредством болюсного вливания или непрерывной инфузии, включают водные растворы активной композиции в водорастворимой форме. Суспензии действующих веществ могут быть приготовлены в форме подходящих масляных суспензий для инъекций. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, такие как натрий-карбоксиметилцеллюлозу, сорбит или декстран. Необязательно суспензия может также содержать подходящие стабилизаторы или вещества, которые увеличивают растворимость соединений, что обеспечивает получение высококонцентрированных растворов.
[00234] Композиции для инъекций могут быть представлены в стандартной лекарственной форме, например, в ампулах или в многодозовых контейнерах, с добавлением консерванта. Композиции могут находиться в таких формах, как суспензии, растворы или эмульсии, в масляных или водных растворителях, и могут содержать вспомогательные вещества, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие вещества. В альтернативе действующее вещество может быть в порошковой форме для восстановления подходящим растворителем, например стерильной апирогенной водой, перед применением.
[00235] В дополнение к препаратам, описанным ранее, композиции также могут быть изготовлены в форме депо-препарата. Такие лекарственные формы длительного действия можно вводить внутримышечной инъекцией. Таким образом, например, лекарственная форма может быть изготовлена с подходящими полимерными или гидрофобными материалами, например, в виде эмульсии в приемлемом масле, или ионообменными смолами или в виде умеренно растворимых производных, например умеренно растворимой соли.
[00236] Композиции и лекарственные формы настоящего изобретения также могут быть изготовлены для наружной доставки и могут быть нанесены на кожу субъекта при использовании любого подходящего способа применения растворителя для наружной доставки. Например, лекарственная форма может быть нанесена вручную, при использовании аппликатора, или способом, который включает и то, и другое. После применения лекарственную форму можно вводить в кожу субъекта, например, с помощью втирания. Нанесение можно выполнять несколько раз в день или раз в день. Например, лекарственную форму можно наносить на кожу субъекта один раз в день, два раза в день или несколько раз в день, или можно наносить один раз в два дня, один раз в три дня или один раз в неделю, один раз в две недели или один раз в несколько недель.
[00237] Лекарственные формы или фармацевтические композиции, описанные в настоящей заявке, можно вводить субъекту любыми подходящими способами. Примеры способов введения включают, среди прочих: (a) введение посредством инъекции, подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, внутрикожно, интраорбитально, интракапсулярно, интраспинально, интрастернально и т.п., включая доставку с помощью инфузионного насоса; (b) введение местно, например инъекцией, непосредственно в область почки или сердца, например, посредством депо-имплантации; а также считающееся подходящим специалистами в данной области для приведения действующего вещества в контакт с живой тканью.
in vitro
in vivo
[00238] Конкретная лекарственная форма, путь введения и схема введения для фармацевтических композиций могут быть подобраны отдельным врачом в зависимости от состояния больного. См., например, Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 12th Ed., Sec. 1, 2011. Как правило, диапазон доз композиции, вводимой больному, может составлять от приблизительно 0,5 до приблизительно 1000 мг/кг массы тела больного. Схема введения может быть однократной или серией из двух или более введений в течение одного или более дней, как необходимо больному. В случаях, когда дозы соединений для человека были установлены, по меньшей мере, для некоторого состояния, дозы будут приблизительно такими же, или дозами, которые составляют от приблизительно 0,1% до приблизительно 500%, более предпочтительно от приблизительно 25% до приблизительно 250% установленной дозы для человека. Если доза для человека не была установлена, что имеет место в случае недавно созданных фармацевтических композиций, подходящая доза для человека может быть выведена на основе значений ED50 или ID50 или других соответствующих значений, полученных в исследованиях  или , как подтверждено в исследованиях токсичности и исследованиях эффективности на животных.
[00239] Способы предотвращения или лечения злокачественной опухоли
in vitro
[00240] Настоящее изобретение также относится к способу контроля активности или роста злокачественных опухолей, включающему введение эффективного количества композиции нуждающемуся в этом субъекту. Эффективное количество, указанное в настоящем описании, в способе лечения злокачественной опухоли, облегчает ее симптомы или задерживает или останавливает ее прогрессирование, и предпочтительно является количеством, которое предотвращает возникновение или рецидив злокачественной опухоли, или излечивает ее. Оно также предпочтительно является количеством, которое не вызывает нежелательного явления, которое превышает выгоду от применения. Такое количество может быть определено как подходящее с помощью исследования  с использованием культивируемых клеток или исследования на модельном животном или млекопитающем, таком как мышь, крыса, собака или свинья, причем такие способы исследования известны специалисту в данной области. Кроме того, доза действующих веществ в носителе и доза действующих веществ, применяемых в способе настоящего изобретения, известны специалисту в данной области или могут быть определены как подходящие с помощью вышеуказанных исследований.
[00241] Частота введения зависит от свойств применяемой композиции и вышеуказанных состояний субъекта и может составлять множество раз в день (то есть 2, 3, 4, 5 или более раз в день), один раз в день, раз в несколько дней (то есть раз в 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней и т.д.), несколько раз в неделю (например, 2, 3, 4 раза и т.д. в неделю), раз в две недели или раз в несколько недель (то есть раз в 2, 3, 4 недели и т.д.).
in vitro
[00242] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к способу доставки лекарственного средства в клетку злокачественной опухоли с применением вышеуказанного носителя. Данный способ включает этап введения или добавления носителя, содержащего на себе доставляемое вещество, живому существу, или среды, например среды культивирования, содержащей клетку, продуцирующую внеклеточный матрикс, в легкое. Указанные этапы могут быть выполнены как подходящие в соответствии с любым известным способом или способом, описанным в настоящем изобретении. Кроме того, вышеуказанный способ включает схему, выполняемую , и схему, в которой мишенью в теле является клетка злокачественной опухоли в легком.
[00243] Терапевтически эффективная композиция настоящего изобретения может быть введена посредством системной доставки, которая может обеспечивать обширное биораспределение действующего вещества.
[00244] В вариантах осуществления настоящего изобретения может быть предложена терапевтическая композиция, которая включает терапевтическую молекулу согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
[00245] Эффективную дозу композиции настоящего изобретения можно вводить от 1 до 12 раз в день или один раз в неделю. Продолжительность введения может составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней или может составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 или 12 недель.
ПРИМЕРЫ
in vivo
[00246] Пример 1: Исследование  проводили с целью проверки ингибирования роста опухоли с использованием HSP47 в качестве одной мишени. Модель рака поджелудочной железы, полученную из PANC-1, выбрали из-за ее обогащения коллагеновыми белками, как показано в Таблице 5.
in vivo
Таблица 5: Исследование  для проверки ингибирования роста опухоли с использованием HSP47 в качестве одной мишени
ID группы
Модель на животных и кол-во животных
Лечение
Доза (мг/кг)
Вводимый объем (мл/кг)
Схема введения
Конечный показатель
1
PANC-1 7 животных в группе (~200 мм<sup>3</sup>)
PBS
N/A
10 мл/кг
в/в, ×4 в неделю
BW ежедневно, в течение 7 дней после первого введения дозы; 2/неделя до конца недели. Измерение опухоли 3/в течение 1-ой недели, 2/до конца недели. Конечный вес опухоли
2
Cmpd81:CH:DOPE:DOPC:DPPE-PEG-2K-2M
0,75
[00247] Методы исследования:
[00248] Клетки PANC-1 инокулировали подкожно в правый бок самок бестимусных голых мышей.
2
3
[00249] Размер опухоли измеряли и вычисляли с использованием формулы: Объем опухоли=длина×ширина/2. Когда приживленные опухоли достигали объема приблизительно 200 мм, мышей рандомизировали и назначали инъекцию исследуемого изделия.
[00250] Композицию, содержащую HSP47-миРНК (2M), вводили животному внутривенно в дозе 0,75 мг/кг, раз в неделю и в общей сложности в 4 дозах.
[00251] Массу тела животных и объемы опухоли проверяли два раза в неделю.
[00252] Результаты и выводы: Опухоли медленно росли в данной модели PANC-1, при этом время удвоения составляло 22 дня для группы на растворителе. В исследовании не было обнаружено никакой потери массы тела. Композицию, которая была основана на соединении 81 и содержала HSP47-миРНК (2M), как наблюдали, полностью подавляла рост опухоли в дозе 0,75 мг/кг. В целом, супрессия Hsp47 ингибировала рост опухоли, продемонстрировав, что данная композиция являлась эффективным противоопухолевым терапевтическим средством.
in vivo
[00253] Результаты и выводы: На Фиг. 1 показаны результаты исследования  в модели рака поджелудочной железы, которое проводили с целью проверки ингибирования роста опухоли при использовании Hsp47 в качестве одной мишени. Как показано на Фиг. 1, в группе, обработанной композицией, содержащей миРНК Hsp47 (2M), в течение исследования объемы опухоли росли медленно, если росли вообще. В исследовании не было обнаружено никакой потери массы тела. Напротив, объемы опухоли в контрольной группе на растворителе удвоились только за 22 дня. В заключение, миРНК Hsp47, как наблюдали, полностью подавляла рост опухоли в дозе 0,75 мг/кг, продемонстрировав, что композиция, содержащая миРНК Hsp47, являлась эффективным противоопухолевым терапевтическим средством.
[00254] Пример 2: Экспрессия генов Hsp47, коллагена I и коллагена IV в линиях человеческих раковых клеток A549, MCF7, MDA-MB-231, HCT116, M7609, COLO230HSR, SW480, PANC-1, SW1990, MIA-PaCa-2, HepG2, HT1080 и HeLa показана на Фиг. 2. Экспрессия выражена в SW480 и HepG2.
[00255] Пример 3: Результаты способа подавления пролиферации клеток рака толстой кишки SW480 с применением миРНК, направленной против Hsp47, показаны на Фиг. 3-11.
[00256] На Фиг. 3 показан необработанный образец для способа подавления пролиферации клеток рака толстой кишки SW480 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На Фиг. 4 показано действие отрицательной миРНК в концентрации 10 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака толстой кишки SW480 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На Фиг. 5 показано действие отрицательной миРНК в концентрации 50 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака толстой кишки SW480 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На Фиг. 6 показано действие отрицательной миРНК в концентрации 100 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака толстой кишки SW480 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На Фиг. 7 показано действие активной миРНК в концентрации 10 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака толстой кишки SW480 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На Фиг. 8 показано действие активной миРНК в концентрации 50 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака толстой кишки SW480 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На Фиг. 9 показано действие активной миРНК в концентрации 100 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака толстой кишки SW480 с применением миРНК, направленной против Hsp47.
[00257] Сравнение Фиг. 4 и 7, 5 и 8, и 6 и 9 показывает, что активная миРНК, направленная против Hsp47, подавляет клетки рака толстой кишки SW480.
4
[00258] На Фиг. 10 показаны результаты анализа роста в способе подавления пролиферации клеток рака толстой кишки SW480 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На оси ординат указано количество клеток ×10. Закрашенные кружки обозначают необработанный образец. Значки X обозначают отрицательную миРНК. Треугольные значки обозначают образец, обработанный активной миРНК, направленной против Hsp47.
[00259] На Фиг. 11 показаны результаты анализа эксклюзии красителя в способе подавления пролиферации клеток рака толстой кишки SW480 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На оси ординат указан процент мертвых клеток. Незакрашенные кружки обозначают образец, обработанный активной миРНК, направленной против Hsp47. Значки X обозначают отрицательную миРНК. Закрашенные круглые значки обозначают необработанный образец.
[00260] Пример 4: Результаты способа подавления пролиферации клеток рака толстой кишки HCT116 с применением миРНК, направленной против Hsp47, показаны на Фиг. 12-16.
[00261] На Фиг. 12 показан необработанный образец в способе подавления пролиферации клеток рака толстой кишки HCT116 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На Фиг. 13 показано действие отрицательной миРНК в концентрации 10 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака толстой кишки HCT116 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На Фиг. 14 показано действие активной миРНК в концентрации 10 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака толстой кишки HCT116 с применением миРНК, направленной против Hsp47. Сравнение Фиг. 12, 13 и 14 показывает, что активная миРНК, направленная против Hsp47, подавляет клетки рака толстой кишки HCT116.
4
[00262] На Фиг. 15 показаны результаты анализа роста в способе подавления пролиферации клеток рака толстой кишки HCT116 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На оси ординат указано количество клеток ×10. Закрашенные кружки обозначают необработанный образец. Незакрашенные круглые значки на восходящей кривой обозначают отрицательную миРНК. Незакрашенные круглые значки на плоской кривой обозначают образец, обработанный активной миРНК, направленной против Hsp47.
[00263] На Фиг. 16 показаны результаты анализа эксклюзии красителя в способе подавления пролиферации клеток рака толстой кишки HCT116 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На оси ординат указан процент мертвых клеток. Незакрашенные кружки на восходящей кривой обозначают образец, обработанный активной миРНК, направленной против Hsp47. Незакрашенные круглые значки на плоской кривой обозначают отрицательную миРНК. Закрашенные круглые значки обозначают необработанный образец.
[00264] Пример 5: Результаты способа подавления пролиферации клеток рака легкого A549 с применением миРНК, направленной против Hsp47, показаны на Фиг. 17-25.
[00265] На Фиг. 17 показан необработанный образец в способе подавления пролиферации клеток рака легкого A549 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На Фиг. 18 показано действие отрицательной миРНК в концентрации 10 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака легкого A549 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На Фиг. 19 показано действие отрицательной миРНК в концентрации 50 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака легкого A549 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На Фиг. 20 показано действие отрицательной миРНК в концентрации 100 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака легкого A549 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На Фиг. 21 показано действие активной миРНК в концентрации 10 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака легкого A549 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На Фиг. 22 показано действие активной миРНК в концентрации 50 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака легкого A549 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На Фиг. 23 показано действие активной миРНК в концентрации 100 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака толстой кишки SW480 с применением миРНК, направленной против Hsp47.
[00266] Сравнение Фиг. 18 и 21, 19 и 22, и 20 и 23 показывает, что активная миРНК, направленная против Hsp47, подавляет клетки рака легкого A549.
4
[00267] На Фиг. 24 показаны результаты анализа роста в способе подавления пролиферации клеток рака легкого A549 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На оси ординат указано количество клеток ×10. Закрашенные кружки обозначают необработанный образец. Незакрашенные круглые значки обозначают отрицательную миРНК. Треугольные значки обозначают образец, обработанный активной миРНК, направленной против Hsp47.
[00268] На Фиг. 25 показаны результаты анализа эксклюзии красителя в способе подавления пролиферации клеток рака легкого A549 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На оси ординат указан процент мертвых клеток. Незакрашенные кружки обозначают образец, обработанный активной миРНК, направленной против Hsp47. Значки X обозначают отрицательную миРНК. Закрашенные круглые значки обозначают необработанный образец.
[00269] Пример 6: Результаты способа подавления пролиферации клеток рака легкого A549 с применением миРНК, направленной против Hsp47, показаны на Фиг. 26-34.
[00270] На Фиг. 26 показан необработанный образец в способе подавления пролиферации клеток рака печени HepG2 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На Фиг. 27 показано действие отрицательной миРНК в концентрации 10 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака печени HepG2 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На Фиг. 28 показано действие отрицательной миРНК в концентрации 50 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака печени HepG2 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На Фиг. 29 показано действие отрицательной миРНК в концентрации 100 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака печени HepG2 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На Фиг. 30 показано действие активной миРНК в концентрации 10 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака печени HepG2 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На Фиг. 31 показано действие активной миРНК в концентрации 50 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака печени HepG2 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На Фиг. 32 показано действие активной миРНК в концентрации 100 нМ в способе подавления пролиферации клеток рака печени HepG2 с применением миРНК, направленной против Hsp47.
[00271] Сравнение Фиг. 27 и 30, 28 и 31, и 29 и 32 показывает, что активная миРНК, направленная против Hsp47, подавляет клетки рака печени HepG2.
4
[00272] На Фиг. 33 показаны результаты анализа роста в способе подавления пролиферации клеток рака печени HepG2 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На оси ординат указано количество клеток ×10. Закрашенные кружки обозначают необработанный образец. Незакрашенные круглые значки обозначают отрицательную миРНК. Значки X обозначают образец, обработанный активной миРНК, направленной против Hsp47.
[00273] На Фиг. 34 показаны результаты анализа эксклюзии красителя в способе подавления пролиферации клеток рака печени HepG2 с применением миРНК, направленной против Hsp47. На оси ординат указан процент мертвых клеток. Незакрашенные кружки обозначают образец, обработанный активной миРНК, направленной против Hsp47. Значки X обозначают отрицательную миРНК. Незакрашенные квадратные значки обозначают необработанный образец.
[00274] Пример 7: Результаты способа обнаружения аннексина V и PI в клетках рака толстой кишки (SW480, HCT116), трансфицированных миРНК Hsp47, показаны на Фиг. 35-36.
[00275] На Фиг. 35 показаны результаты способа обнаружения аннексина V и PI в клетках рака толстой кишки SW480, трансфицированных активной миРНК Hsp47, в день 2 после трансфекции миРНК. На Фиг. 36 показаны результаты способа обнаружения аннексина V и PI в клетках рака толстой кишки HCT116, трансфицированных активной миРНК Hsp47, в день 2 после трансфекции миРНК.
[00276] Пример 8: Результаты способа обнаружения экспрессии прокаспазы-3 и белка Hsp47 в раковых клетках, трансфицированных миРНК Hsp47, показаны на Фиг. 37-39.
[00277] На Фиг. 37 показаны результаты способа обнаружения экспрессии прокаспазы-3 и белка Hsp47 в клетках рака толстой кишки SW480, трансфицированных активной миРНК Hsp47. На Фиг. 38 показаны результаты способа обнаружения экспрессии прокаспазы-3 и белка Hsp47 в клетках рака печени HepG2, трансфицированных активной миРНК Hsp47. На Фиг. 39 показаны результаты способа обнаружения экспрессии прокаспазы-3 и белка Hsp47 в клетках рака легкого A549, трансфицированных активной миРНК Hsp47.
[00278] Пример 9: Результаты способа обнаружения активности Каспазы-3/7 в клетках рака толстой кишки (SW480), трансфицированных миРНК Hsp47 и миРНК p21, показаны на Фиг. 40. Эти данные показывают, что применение комбинации миРНК Hsp47 и миРНК p21 в клетках рака толстой кишки обеспечивало неожиданно благоприятные увеличения уровней Каспаз. Неожиданные увеличения уровня Каспаз в раковых клетках показывают, что клетки имели неожиданно увеличенный апоптоз.
in vitro
[00279] Пример 10: Трансфекцию  выполняли на клеточной линии A549 для определения эффективности нокдауна при воздействии миРНК. При применении композиции настоящего изобретения, содержащей молекулы РНКи, которые направлены против Hsp47, наблюдали дозозависимый нокдаун мРНК Hsp47.
in vitro
3
2
2
[00280] Протокол нокдауна : За один день до трансфекции клетки сеют в 96-луночный планшет в количестве 2×10 клеток в лунке с 100 мкл DMEM (номер по кат. HyClone SH30243.01), содержащей 10% FBS, и культивируют при 37°C в термостате, содержащем увлажненную атмосферу с 5% CO в воздухе. Перед трансфекцией среду заменяют на 90 мкл среды Opti-MEM I с пониженным содержанием сыворотки (номер по кат. Life Technologies 31985-070), содержащей 2% FBS. Смешивают 0,2 мкл Lipofectamine RNAiMax (номер по кат. Life Technologies. 13778-100) с 4,8 мкл Opti-MEM I в течение 5 минут при комнатной температуре. Смешивают 1 мкл миРНК с 4 мкл OPTI-MEM I и объединяют с раствором LF2000, и затем мягко перемешивают без встряхивания. Ждут 5 минут при комнатной температуре. Инкубируют смесь 10 минут при комнатной температуре, чтобы позволить образоваться комплексам РНК-RNAiMax. Добавляют 10 мкл комплексов РНК-RNAiMax в лунку и вручную мягко встряхивают планшет. Клетки инкубируют при 37°C в термостате, содержащем увлажненную атмосферу с 5% CO в воздухе, в течение 2 часов. Заменяют среду на новую среду -MEM I с пониженным содержанием сыворотки (номер по кат. Life Technologies. 31985-070), содержащую 2% FBS. Через 24 часа после трансфекции клетки один раз промывают охлажденным во льду PBS. Клетки лизируют 50 мкл буфера Cell-to-Ct Lysis Buffer (номер по кат. Life Technologies. 4391851 C) в течение 5-30 минут при комнатной температуре. Добавляют 5 мкл Stop Solution и инкубируют 2 минуты при комнатной температуре. Уровень мРНК сразу измеряют с помощью ОТ-кПЦР с TAQMAN. В альтернативе образцы можно замораживать при -80°C и анализировать после.
[00281] Пример 11: Эффективность ингибирования опухоли для миРНК Hsp47. Ксенотрансплантатную модель рака поджелудочной железы использовали с относительно низкой дозой 0,75 мг/кг миРНК, направленной против Hsp47. Объединенные миРНК демонстрируют значительную и неожиданно превосходную эффективность ингибирования опухоли в день 28.
6
6
3
3
2
[00282] В данном эксперименте линии клеток A549 и PANC-1 получили из ATCC. Суспензию клеток тщательно смешивали с размороженным на льду матригелем BD в соотношении 1:1 для инъекции. Каждой мыши, самкам бестимусных голых мышей, 6-8 недель, Charles River, в правый бок подкожно вводили 0,1 мл инокулята с 2×10 (A549) или 2,5×10 (PANC-1) клеток при помощи иглы калибра 25 G и шприца (1 инокулят на мышь). Мышам делали анестезию для инокуляции. В день, когда приживленные опухоли достигали объема приблизительно 250-350 мм (A549) или 150-250 мм (PANC-1), животных подвергали болюсному вливанию в хвостовую вену. Животных умерщвляли повышенной концентрацией CO и вырезали опухоли в различные моменты времени после введения доз. Опухоли сначала взвешивали во влажном состоянии и затем делили на три части для измерения нокдауна Hsp47, биораспределения миРНК и анализа биомаркеров. Образцы мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C до момента проведения биоанализа.
[00283] Пример 12: Оценка эффективности миРНК, инкапсулированой в липосомной композиции, в ортотопической модели рака легкого A549 на мышах.
[00284] Подопытные животные: В исследовании использовали в общей сложности шестьдесят самцов мышей NCr nu/nu, 5-6 недель. Подопытные животные были выведены и выращены в AntiCancer Inc. В течение эксперимента их содержали в среде, очищаемой HEPA-фильтром. Клетки, корм и подстилку обрабатывали в автоклаве. Корма для животных получены от Harlan Teklad (Madison, WI).
[00285] Получение липосомной композиции: Композиции приготавливали и хранили при 4°C. Их нагревали до комнатной температуры 10 минут перед введением мышам.
3
3
1
2
[00286] Ортотопическая модель рака легкого человека A549 (SOI): В день SOI стоковые опухоли собирали с подкожного участка у животных, несущих ксенотрансплантат опухоли A549, и помещали в среду RPMI-1640. Некротические ткани удаляли, а жизнеспособные ткани разрезали на части 1,5-2 мм. Животным делали анестезию ингаляцией изофлураном и операционную область стерилизовали иодом и спиртом. Поперечный разрез длиной приблизительно 1,5 см делали в левой грудной стенке мыши при помощи пары хирургических ножниц. Межреберный разрез делали между третьим и четвертым ребром, при этом обнажали левое легкое. Один фрагмент опухоли A549 пересаживали на поверхность легкого при использовании хирургической нити 8-0 (нейлон). Грудную стенку ушивали хирургической нитью 6-0 (шелк). Легкое повторно наполняли воздухом с помощью интраторакальной пункции при использовании шприца на 3 см с иглой калибра 25 G×1 / для удаления оставшегося воздуха в грудной полости. Грудную стенку ушивали хирургической шелковой нитью 6-0. Все процедуры операции, описанной выше, выполняли при 7× увеличении под микроскопом (Olympus) в ламинарном шкафу, оборудованным HEPA-фильтром.
[00287] Через три дня после имплантации опухоли, мышей-опухоленосителей рандомизированно распределяли в группы по десять мышей. Лечение для каждой группы мышей начинали через три дня после имплантации опухоли.
[00288] Конечный показатель: Подопытных мышей умерщвляли через сорок два дня после начала лечения. Первичные опухоли извлекали и взвешивали на электронных весах для последующего анализа.
[00289] Противоопухолевую эффективность композиций против рака легкого человека A549 оценивали при сравнении конечного веса первичных опухолей, измеряемого при вскрытии в каждой из групп лечения и в контрольной группе на растворителе. Измеряли средний вес опухоли в каждой группе.
[00290] Оценка токсичности соединения: Средняя масса тела мышей в группах лечения и контрольных группах сохранялась в нормальном диапазоне в течение всей продолжительности эксперимента. Другие симптомы токсичности также не были обнаружены у мышей при общем исследовании.
[00291] ВЫВОДЫ: При сравнении конечного веса опухолей, который был получен в конце эксперимента, был сделан вывод, что лечение композицией, содержащей миРНК Hsp47, в количестве 2 мг/кг в группах лечения значимо и неожиданно уменьшает рост опухоли и объем опухоли рака легкого человека A549 по сравнению с контрольными группами. Токсичность не наблюдалась.
[00292] Пример 13: Действие малой интерферирующей РНК (миРНК), направленной против Hsp47, на рост клеток A549 у голых мышей и ангиогенез в анализе хорионаллантоисной оболочки (CAM). Сконструировали три пары Hsp47 миРНК-плазмиды и не индуцирующей сайленсинг плазмиды и трансфицировали в клетки A549 при использовании LIPOFECTAMINE 2000, соответственно. Наиболее эффективную пару Hsp47 миРНК-плазмиды отбирали с помощью ELISA и ОТ-ПЦР в реальном времени. Клетки A549 трансфицировали отобранной Hsp47 миРНК-плазмидой, клетки A549 трансфицировали не индуцирующей сайленсинг плазмидой, и клетки A549 без трансфекции инокулировали голым мышам, соответственно. Куриные эмбрионы рандомизированно распределяли в четыре группы, и CAM обрабатывали различными растворами в течение 48 ч: питательной средой DMEM в группе отрицательного контроля, супернатантами культур нетрансфицированных клеток A549 в группе положительного контроля, супернатантами культур клеток A549 с миРНК Hsp47 в группе миРНК Hsp47 и супернатантами культур клеток A549 с не индуцирующей сайленсинг миРНК в группе миРНК без индукции сайленсинга. Хорионаллантоисные оболочки собирали в день 12 для микроскопических исследований.
3
[00293] По сравнению с контрольной группой, Hsp47 миРНК-плазмида вызывает снижение секреции Hsp47 клетками A549, сопровождаемое снижением мРНК Hsp47. По сравнению с группой миРНК, не индуцирующей сайленсинг, средний объем опухоли мышиного ксенотрансплантата уменьшился в группе миРНК Hsp47; время, требуемое для роста ксенотрансплантатов до объема 50 мм, увеличилось. Содержание Hsp47 в ксенотрансплантате уменьшилось. В анализах CAM содержание Hsp47 было нулевым в отрицательной группе, а в группе миРНК Hsp47 уменьшилось на 20-70% по сравнению с группой миРНК, не индуцирующей сайленсинг, или положительной группой; точки разветвления сосудов CAM в группе миРНК Hsp47 или группе миРНК, не индуцирующей сайленсинг, или положительной группе увеличились по сравнению с отрицательной группой; общая длина сосудов CAM в группе миРНК Hsp47 увеличилась по сравнению с отрицательной группой, при этом она увеличилась в группе миРНК, не индуцирующей сайленсинг, или положительной группе. По сравнению с группой отрицательного контроля пролиферация микрососудов увеличивалась при добавлении супернатанта клеточной культуры с Hsp47 в группе миРНК Hsp47, значительно пролиферировавшие сосуды наблюдали в группе миРНК, не индуцирующей сайленсинг, или положительной группе.
2
[00294] Пример 14: Культура клеток. Линию клеток немелкоклеточной карциномы легкого человека, A549, культивировали в среде F-12K (ATCC) с добавкой 10% FBS (FBS, Invitrogen) при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO. Клетки, стабильно экспрессирующие контрольные или Hsp47 миРНК, получали при трансдукции клеток A549TR соответствующими лентивирусными трансдуцирующими частицами согласно инструкциям производителя (Sigma-Aldrich). Резистентные клоны отбирали на 2,5 мкг/мл пуромицина (Invivogen) в течение 12 дней, выделяли при использовании цилиндров для клонирования и затем размножали и поддерживали в среде, содержащей пуромицин.
in vivo
[00295] Пример 15: миРНК, направленные против Hsp47, приводят к выраженному уменьшению объема опухоли .
3
[00296] Липидную композицию использовали для инкапсулирования и доставки миРНК в наночастицах в ксенотрансплантаты клеток рака легкого человека A549 у мышей с ТКИД. Ксенотрансплантаты тестировали для определения присутствия KRAS мутаций или аберрантных уровней экспрессии по сравнению с нормальными клетками. После приживления опухолей (>100 мм), мышей обрабатывали либо миРНК, направленной против Hsp47, либо контрольной (неспецифической) миРНК раз в 2 дня в течение 2 недель. Исследование прекращали, когда контрольную группу пришлось усыпить.
[00297] Результаты: Лечение миРНК, направленной против Hsp47, предотвращает увеличение опухоли и приводит к существенному уменьшению объема опухоли.
[00298] Опухоли, которые были извлечены, разрезали и визуализировали окрашиванием TUNEL. Опухоли, обработанные Hsp47-направленными миРНК, демонстрировали значимо более высокие уровни апоптоза. РНК выделяли из опухолей и проводили ПЦР в реальном времени для исследования специфического нокдауна Hsp47.
in vivo
[00299] Результаты: Лечение миРНК, направленной против Hsp47, существенно уменьшает экспрессию Hsp47 .
in vitro
[00300] Пример 16: Молекулы миРНК настоящего изобретения, направленные против p21, как обнаружили, были активны для сайленсинга гена . Дозозависимые активности молекул миРНК p21 для нокдауна гена, как обнаружили, показали IC50 ниже чем приблизительно 3 пикомоля (пМ), и не более 1 пМ.
in vitro
[00301] Трансфекцию  выполняли в клеточной линии A549 для определения эффективности нокдауна при воздействии миРНК. Дозозависимый нокдаун мРНК p21 наблюдали с молекулами миРНК в Таблице 1, как показано в Таблице 6.
Таблица 6: Дозозависимый нокдаун мРНК p21 в линии клеток A549
Структура миРНК P21
IC50 (пМ)
1735 (SEQ ID NO:12 и 40)
0,3
2042 (SEQ ID NO:28 и 56)
10
in vivo
[00302] Как показано в Таблице 6, активности миРНК p21 в Таблице 1 находились в пределах 0,3-10 пМ, что подходит для многих применений, в том числе в качестве лекарственного средства для применения .
[00303] Пример 17: Структура молекул миРНК p21 согласно настоящему изобретению, содержащих дезоксинуклеотиды, расположенные в области распознавания антисмысловой цепи миРНК, обеспечила неожиданно и эффективно увеличенную активность нокдауна генов.
in vitro
[00304] Трансфекцию  выполняли на клеточной линии A549 для определения эффективности нокдауна молекул миРНК p21, основанных на структуре 1735' (SEQ ID NO: 57 и 71). Дозозависимый нокдаун мРНК p21 наблюдали с молекулами миРНК p21 на основе структуры 1735', как показано в Таблице 7.
Таблица 7: Дозозависимый нокдаун мРНК p21 в линии клеток A549 для молекул миРНК p21 на основе структуры 1735'
Структура миРНК P21
IC50 (пМ)
1735 без дезоксинуклеотидов в двухцепочечной области (SEQ ID NO: 12 и 40)
0,3
1735 с дезоксинуклеотидами в положениях 4, 6 и 8 области распознавания антисмысловой цепи и дополнительными 2'-OMe нуклеотидами (SEQ ID NO: 58 и 72)
0,05
1735 с дезоксинуклеотидами в положениях 4, 6 и 8 области распознавания антисмысловой цепи и дополнительными 2'-OMe нуклеотидами (SEQ ID NO: 59 и 73)
0,001
1735 с дезоксинуклеотидами в положениях 4, 6, и 8 области распознавания антисмысловой цепи и дополнительными 2'-OMe нуклеотидами (SEQ ID NO: 60 и 74)
0,1
[00305] Как показано в Таблице 7, активности молекул миРНК p21 на основе структуры 1735', содержащих три дезоксинуклеотида в области распознавания антисмысловой цепи, были неожиданно увеличены до 300 раз по сравнению с миРНК p21 без дезоксинуклеотидов в двухцепочечной области.
[00306] Эти данные показывают, что молекулы миРНК p21, имеющие структуру с дезоксинуклеотидами в области распознавания антисмысловой цепи, обеспечивали неожиданно увеличенную активность нокдауна гена по сравнению с миРНК p21 без дезоксинуклеотидов в двухцепочечной области.
in vivo
[00307] Активности, показанные в Таблице 7 для молекул миРНК p21, имеющих три дезоксинуклеотида в области распознавания антисмысловой цепи, находились в пределах 0,001-0,1 пМ, что исключительно подходит для многих применений, в том числе в качестве лекарственного средства для применения .
[00308] Варианты осуществления, описанные в настоящем документе, не являются ограничивающими, при этом специалист в данной области техники может с легкостью оценить, что определенные комбинации модификаций, описанных в настоящем документе, могут быть проверены без излишних экспериментов для идентификации молекул нуклеиновых кислот с улучшенной РНКи активностью.
[00309] Все публикации, патенты и литература, прямо указанные в настоящем документе, полностью включены посредством отсылки во всех отношениях.
[00310] Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретной описанной методологией, протоколами, материалами и реактивами, поскольку они могут измениться. Также следует понимать, что терминология, используемая в настоящем документе, служит только для описания конкретных вариантов и не должна ограничивать объем настоящего изобретения. Специалисту в данной области техники будет очевидно, что различные замены и модификации могут быть внесены в описание, раскрытое в настоящем документе, без отступления от объема и сущности описания, и что такие варианты осуществления включены в настоящее описание и прилагаемую формулу изобретения.
[00311] Необходимо отметить, что при использовании в настоящем описании и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа "a", "an" и "the", в оригинальном тексте, включают множественную ссылку, если из контекста прямо не следует иное. Также термины "a" (или "an"), в оригинальном тексте, "один или более" и "по меньшей мере один" могут попеременно использоваться в настоящем документе. Также следует отметить, что термины "включают", "включающий", "содержащий" и "имеющий" могут использоваться попеременно, и их нужно понимать расширительно и без ограничения.
[00312] Перечисление диапазонов значений в настоящем документе просто предназначено в качестве метода сокращенной ссылки индивидуально на каждое отдельное значение, находящееся в пределах такого диапазона, если в настоящем документе не указано иное, при этом каждое отдельное значение включено в описание, как если бы оно было индивидуально указано в настоящем документе. В отношении групп Маркуша, специалистам в данной области известно, что настоящее описание включает отдельных членов, а также подгруппы членов группы Маркуша.
[00313] Без дополнительного исследования предполагается, что специалист в данной области техники, на основе предыдущего описания, может применить настоящее изобретение в его полном объеме. Следующие определенные варианты осуществления, таким образом, следует толковать как просто иллюстративные и не ограничивающие остальную часть описания каким-либо возможным образом.
[00314] Все функции, раскрытые в настоящем описании, можно объединить в любой комбинации. Каждый признак, раскрытый в настоящем описании, может быть заменен альтернативным признаком, служащим такой же, эквивалентной или подобной цели.