МАСШТАБИРУЕМЫЕ СПОСОБЫ С ВЫСОКИМ УРОВНЕМ ВЫДЕЛЕНИЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОГО ВЫХОДА РЕКОМБИНАНТНОГО АДЕНОАССОЦИИРОВАННОГО ВИРУСНОГО ВЕКТОРА (rAAV) И ПОЛУЧЕННЫЕ ТАКИМ ОБРАЗОМ РЕКОМБИНАНТНЫЕ АДЕНОАССОЦИИРОВАННЫЕ ВИРУСЫ (rAAV)

1. Способ получения частиц рекомбинантного аденоассоциированного вирусного вектора (rAAV) с высоким уровнем выделения или с высоким титром, включающий стадии:
(a) сбора клеток и/или супернатанта культуры клеток, содержащих частицы вектора rAAV;
(b) необязательно, концентрации указанных клеток и/или супернатанта указанной культуры клеток, собранного на стадии (a), необязательно, посредством проточной фильтрации вдоль потока, для получения концентрированного собранного материала;
(c) лизиса указанного собранного материала, полученного на стадии (a), или указанного концентрированного собранного материала, полученного на стадии (b), необязательно, посредством микрофлюидизации, для получения лизата;
(d) фильтрации указанного лизата, полученного на стадии (c), для получения осветленного лизата;
(e) подвергания указанного осветленного лизата, полученного на стадии (d), ионообменной хроматографии на колонке для получения элюата с колонки, содержащего очищенные частицы вектора rAAV, и необязательно, концентрации указанного элюата с колонки посредством проточной фильтрации вдоль потока для получения концентрированного элюата с колонки;
(f) смешивания указанного элюата с колонки или указанного концентрированного элюата с колонки, полученного на стадии (e), с хлоридом цезия для получения смеси, и подвергания указанной смеси градиентному ультрацентрифугированию для отделения, в основном, частиц полноценного вектора rAAV от частиц пустого капсида AAV и других связанных с вектором AAV примесей;
(g)(1) сбора указанных частиц полноценного вектора rAAV, отделенных на стадии (f), и (g)(2) получения состава указанных частиц полноценного вектора rAAV в буфере с неионным поверхностно-активным веществом;
(h) подвергания указанных частиц полноценного вектора rAAV на стадии (g)(2) обмену буфера посредством проточной фильтрации вдоль потока для получения состава вектора AAV; и
(i) фильтрации указанного состава вектора AAV, полученного на стадии (h), таким образом, получения состава частиц полноценного вектора rAAV с высоким уровнем выделения или с высоким титром.
2. Способ по п. 1, где указанный буфер со стадии (g)(1) содержит хлорид натрия и/или фосфат натрия.
3. Способ по п. 1, где указанный буфер со стадии (g)(1) содержит хлорид натрия от концентрации приблизительно 10 мМ до концентрации приблизительно 500 мМ.
4. Способ по п. 1, где указанный буфер со стадии (g)(1) содержит фосфат натрия от концентрации приблизительно 5 мМ до концентрации приблизительно 50 мМ.
5. Способ по п. 1, где указанное неионное поверхностно-активное вещество со стадии (g)(2) содержит полиалкиленгликоль.
6. Способ по п. 1, где указанное неионное поверхностно-активное вещество со стадии (g)(2) содержит блок-сополимер, содержащий один блок полиэтиленгликоля и по меньшей мере один блок полипропиленгликоля.
7. Способ по п. 1, где указанное неионное поверхностно-активное вещество со стадии (g)(2) включает алкилполигликозид, цетостеариловый спирт, цетиловый спирт, кокамид DEA, кокамид MEA, децилглюкозид, этоксилат, IGEPAL CA-630, изоцетет-20, глюкозиды, мальтозиды, монолаурин, нонидет P-40, ноноксинолы, такие как ноноксинол-9, NP-40, монододециловый эфир октаэтиленгликоля, N-октил-бета-D-тиоглюкопиранозиды, октилглюкозиды, олеиловый спирт, PEG-10 глицериды подсолнечника, монододециловый эфир пентаэтиленгликоля, полоксамеры, такие как полоксамер 407, полоксамер 188 (сополимер(этиленоксида-полипропиленоксида)), полирицинолеат полиглицерина, сорбитаны, стеариловый спирт, тритон X-100 и твин 80.
8. Способ по п. 7, где указанный этоксилат включает этоксилированную жирную кислоту, этоксилат спирта, этоксилат тристирилфенола, или этоксилированный сложный эфир сорбитана и жирной кислоты.
9. Способ по п. 7, где указанный сорбитан включает моностеарат сорбитана или тристеарат сорбитана.
10. Способ по п. 1, где указанное неионное поверхностно-активное вещество со стадии (g)(2) включает цетомакрогол 1000, полисорбаты, такие как полисорбат 20 (монолаурат полиоксиэтилен(20)сорбитана), полисорбат 40 (монопальмитат полиоксиэтилен(20)сорбитана), полисорбат 60 (моностеарат полиоксиэтилен(20)сорбитана), полисорбат 80 (моноолеат полиоксиэтилен(20)сорбитана); полирицинолеат полиглицерина, [2-[(2R,3S,4R)-3,4-дигидрокси-2-тетрагидрофуранил]-2-гидроксиэтиловый] сложный эфир октадекановой кислоты, [(2R,3S,4R)-2-[1,2-бис(1-оксооктадецокси)этил]-4-гидрокси-3-тетрагидрофураниловый] сложный эфир октадекановой кислоты; спирты с длиной цепи C8-C22, такие как 1-октадеканол, цетилстеариловый спирт, гексадекан-1-ол и цис-9-октадецен-1-ол; замещенный или незамещенный октилфенол, в котором заместители могут включать полиэтоксиэтанольную группу (например, с образованием октилфеноксиполиэтоксиэтанола) или любой другой заместитель, образующий неионное поверхностно-активное вещество с октилфенолом; моноизогексадециловый эфир полиэтиленгликоля; 2,3-дигидроксипропиловый эфир додекановой кислоты; глюкозиды могут включать лаурилглюкозид, октилглюкозид и децилглюкозид; амиды жирных кислот, такие как кокамид диэтаноламина и кокамид моноэтаноламина; и неионные поверхностно-активные вещества, имеющие гидрофильную цепь полиэтиленоксида и липофильную или гидрофильную ароматическую группу углеводорода, такие как ноноксинол-9 и тритон X-100.
11. Способ по п. 1, где указанное неионное поверхностно-активное вещество со стадии (g)(2) включает полиэтиленгликоль-блок-полипропиленгликоль-блок-полиэтиленгликоль или триблок-сополимер, состоящий из центральной гидрофобной цепи полиоксипропилен(поли(пропиленоксида)), фланкированной двумя гидрофильными цепями полиоксиэтилен(поли(этиленоксида)).
12. Способ по п. 11, где указанный полиэтиленгликоль-блок-полипропиленгликоль-блок-полиэтиленгликоль или триблок-сополимер включает SYNPERONIC F108 (Aldrich).
13. Способ по п. 1, где указанное неионное поверхностно-активное вещество со стадии (g)(2) имеет концентрацию от приблизительно 0,0001% до концентрации приблизительно 0,1%.
14. Способ по п. 1, где указанное неионное поверхностно-активное вещество со стадии (g)(2) имеет концентрацию от приблизительно 0,0001% до концентрации приблизительно 0,01%.
15
18
15. Способ по п. 1, где указанные частицы полноценного вектора rAAV присутствуют в указанном составе, полученном на стадии (i), при концентрации от приблизительно 10 частиц на мл до концентрации приблизительно 10 частиц полноценного вектора rAAV на мл.
12
16. Способ по п. 1, где выход указанных частиц полноценного вектора rAAV на стадии (i) составляет по меньшей мере приблизительно 5×10 частиц полноценного вектора rAAV/мл.
13
17. Способ по п. 1, где выход указанных частиц полноценного вектора rAAV на стадии (i) составляет по меньшей мере приблизительно 1×10 частиц полноценного вектора rAAV/мл.
13
18. Способ по п. 1, где выход указанных частиц полноценного вектора rAAV на стадии (i) составляет по меньшей мере приблизительно 5×10 частиц полноценного вектора rAAV/мл.
19. Способ по п. 1, где выделение указанных частиц полноценного вектора rAAV на стадии (i) составляет по меньшей мере приблизительно 60% от общего количества частиц вектора rAAV со стадии (a).
20. Способ по п. 1, где выделение указанных частиц полноценного вектора rAAV на стадии (i) составляет по меньшей мере приблизительно 70% от общего количества частиц вектора rAAV со стадии (a).
21. Способ по п. 1, где указанные частицы полноценного вектора rAAV получены из AAV, выбранного из группы, состоящей из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 и Rh74.
22. Способ по п. 1, где указанные частицы полноценногоrAAV содержат трансген, который кодирует ингибирующую нуклеиновую кислоту.
23. Способ по п. 22, где указанная ингибирующая нуклеиновая кислота выбрана из группы, состоящей из миРНК, антисмысловой молекулы, мкРНК, рибозима и кшРНК.
24. Способ по п. 1, где указанные частицы полноценногоrAAV содержат трансген, который кодирует продукт гена, выбранный из группы, состоящей из инсулина, глюкагона, гормона роста (GH), паратиреоидного гормона (PTH), фактора, высвобождающего гормон роста (GRF), фолликулостимулирующего гормона (FSH), лютеинизирующего гормона (LH), хорионического гонадотропина человека (hCG), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), ангиопоэтинов, ангиостатина, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (GCSF), эритропоэтина (EPO), фактора роста соединительной ткани (CTGF), основного фактора роста фибробластов (bFGF), кислого фактора роста фибробластов (aFGF), эпидермального фактора роста (EGF), трансформирующего фактора роста α (TGFα), фактора роста тромбоцитов (PDGF), инсулиновых факторов роста I и II (IGF-I и IGF-II), TGFβ, активинов, ингибинов, морфогенетического белка кости BMP (BMP), фактора роста нервов (NGF), нейротрофического фактора головного мозга (BDNF), нейтрофинов NT-3 и NT4/5, цилиарного нейротрофического фактора (CNTF), нейротрофического фактора линии глиальных клеток (GDNF), нейртурина, агрина, нетрина-1 и нетрина-2, фактора роста гепатоцитов (HGF), эфринов, ноггина, sonic hedgehog и тирозингидроксилазы.
25. Способ по п. 1, где указанные частицы полноценногоrAAV содержат трансген, который кодирует продукт гена, выбранный из группы, состоящей из тромбопоэтина (TPO), интерлейкинов (IL1-IL-17), моноцитарного хемоаттрактантного белка, ингибирующего лейкоз фактора, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, лиганда Fas, факторов некроза опухолей α и β, интерферонов α, β и γ, фактора стволовых клеток, лиганда flk-2/flt3, IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, химерных иммуноглобулинов, гуманизированных антител, одноцепочечных антител, T-клеточных рецепторов, химерных T-клеточных рецепторов, одноцепочечных T-клеточных рецепторов, молекул MHC класса I и класса II.
26. Способ по п. 1, где указанные частицы полноценного вектора rAAV содержат трансген, кодирующий белок, который можно применять для коррекции врожденных ошибок метаболизма, выбранный из группы, состоящей из карбамоилсинтетазы I, орнитинтранскарбамилазы, аргиносукцинатсинтетазы, аргиносукцинатлиазы, аргиназы, фумарилацетоацетатгидролазы, фенилаланингидроксилазы, альфа-1-антитрипсина, глюкозо-6-фосфатазы, порфобилиногендезаминазы, фактора V, фактора VIII, фактора IX, цистатион-бета-синтазы, декарбоксилазы кетокислот с разветвленной цепью, альбумина, изовалерил-coA-дегидрогеназы, пропионил-CoA-карбоксилазы, метилмалонил-CoA-мутазы, глутарил-CoA-дегидрогеназы, инсулина, бета-глюкозидазы, пируваткарбоксилазы, печеночной фосфорилазы, киназы фосфорилазы, глициндекарбоксилазы, RPE65, H-белка, T-белка, последовательности трансмембранного регулятора кистозного фиброза (CFTR) и последовательности кДНК дистрофина.
27. Способ по п. 26, где указанный белок представляет собой фактор VIII или фактор IX.
28. Способ по п. 1, где указанные частицы полноценного вектора rAAV содержат трансген, кодирующий белок, который можно применять для коррекции нейродегенеративных заболеваний.
29. Способ по п. 28, где указанный белок представляет собой трипептидилпептидазу 1 (TPP1).
30. Способ по п. 1, включающий сбор частиц пустого капсида отдельно на стадии (f).
31. Способ по п. 1, где чистота указанных частиц полноценного вектора rAAV в указанном фильтрате со стадии (i) составляет по меньшей мере приблизительно 80%.
32. Способ по п. 1, где чистота указанных частиц полноценного вектора rAAV в указанном фильтрате со стадии (i) составляет по меньшей мере приблизительно 90%.
33. Способ по п. 1, где чистота указанных частиц полноценного вектора rAAV в указанном фильтрате со стадии (i) составляет по меньшей мере приблизительно 95%.
34. Способ по п. 1, где указанные частицы пустого капсида присутствуют в указанном фильтрате со стадии (i) в количестве 10% или менее.
35. Способ по п. 1, где указанные частицы пустого капсида присутствуют в указанном фильтрате со стадии (i) в количестве 5% или менее.
36. Способ по п. 1, где указанный фильтрат со стадии (i) имеет не более, чем приблизительно 10% агрегированных частиц rAAV.
37. Способ по п. 1, где указанный фильтрат со стадии (i) имеет не более, чем приблизительно 5% агрегированных частиц rAAV.
38. Способ по п. 1, где указанный фильтрат со стадии (i) имеет менее, чем приблизительно 3% агрегированных частиц rAAV.
39. Способ по п. 1, где указанный фильтрат со стадии (i) имеет приблизительно 1-3% агрегированных частиц rAAV.
40. Способ по п. 1, где указанное центрифугирование на стадии (f) проводят за одну стадию.
41. Способ по п. 1, где указанное центрифугирование на стадии (f) представляет собой ультрацентрифугирование в градиенте плотности.
42. Способ по п. 1, где указанный элюат с колонки на стадии (e) концентрируют посредством проточной фильтрации вдоль потока для получения концентрированного элюата с колонки.
43. Способ по п. 1, дополнительно включающий добавление нуклеазы в лизат, полученный на стадии (c).
44. Способ по любому из пп. 1-43, обеспечивающий получение частиц вектора rAAV, имеющих более высокий уровень выделения, чем частицы вектора rAAV, полученные, когда неионное поверхностно-активное вещество добавляют к составу вектора AAV после замены буфера посредством проточной фильтрации вдоль потока со стадии (h).
45. Способ по любому из пп. 1-43, обеспечивающий получение частиц вектора rAAV, имеющих более высокий титр, чем частицы вектора rAAV, полученные, когда неионное поверхностно-активное вещество добавляют к составу вектора AAV после замены буфера посредством проточной фильтрации вдоль потока со стадии (h).
12
46. Способ по любому из пп. 1-43, где собранные частицы полноценного вектора rAAV со стадии (g)(1) разводят до концентрации менее, чем приблизительно 5×10 частиц вектора rAAV/мл, до, по существу во время или после стадии (g)(2).
47. Способ по любому из пп. 1-43, где проточную фильтрацию вдоль потока со стадии (b), (e) и/или (h) проводят при трансмембранном давлении между приблизительно 2-15 фунтов на кв. дюйм (14-103 кПа).
48. Способ по любому из пп. 1-43, где проточную фильтрацию вдоль потока со стадии (b), (e) и/или (h) проводят при трансмембранном давлении между приблизительно 4-12 фунтов на кв. дюйм (28-83 кПа).
49. Способ по любому из пп. 1-43, где проточную фильтрацию вдоль потока со стадии (b), (e) и/или (h) проводят при скорости сдвига более, чем приблизительно 3000 с-1.
50. Способ по любому из пп. 1-43, где проточную фильтрацию вдоль потока со стадии (b), (e) и/или (h) проводят при скорости сдвига более, чем приблизительно 5000 с-1.
51. Способ по любому из пп. 1-43, где проточную фильтрацию вдоль потока со стадии (b), (e) и/или (h) проводят при скорости сдвига межу приблизительно 5000-15000 с-1.
52. Способ по любому из пп. 1-43, где проточную фильтрацию вдоль потока со стадии (b), (e) и/или (h) проводят при скорости сдвига приблизительно 8000-12000 с-1.