УПАКОВКА ДЛЯ ПРОТИВОМИКРОБНОЙ ОБРАБОТКИ РАСТЕНИЙ
PACKAGE FOR ANTIMICROBIAL TREATMENT

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Описание настоящего изобретения относится к сфере продуктов для противомикробного применения и, в частности, для защиты растений и биологического контроля растений.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Ниже перечислены ссылки, которые рассмотрены в качестве соответствующих уровню техники в отношении объекта изобретения, описываемого в настоящем документе:
Публикация заявки на патент США № US2011028500
Публикация заявки на патент США № US2011014596
Публикация заявки на патент США № IN03603CH2010
Патент США № 7485451
Ait Ben Aoumar A. et al. J. Med. Plants Res. 6(17):4332-4338, 2011
Pouvova D. et al. Zemdirbyste-Agrucyktyre 95(3):440-446, 2008
Lanteigne C, et al. Phytopathology. 102(10):967-73, 2012
Slusarski C. Vegetable Crop Research Bulletin 69:125-134 2008
Признание вышеуказанных ссылок в настоящем документе не означает того, что они имеют какое-либо отношение к патентоспособности объекта изобретения, описанного в настоящем документе.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Сельскохозяйственные культуры подвержены большому количеству различных бактериальных патогенов, что приводит к ежегодным убыткам и экономическому ущербу. Способы, разработанные для защиты культур от заболеваний растений, включают селекцию растений на устойчивость, практику культивирования, применение химических средств и биологический контроль.
Ввиду того, что использование химических пестицидов привело к интенсивному загрязнению окружающей среды, и, что у многих патогенов развивается резистентность к существующим химикатам, в настоящее время многие пестициды запрещены к применению, и вовсе не допускается зависимость от таких веществ в земледелии с применением только органических удобрений. Таким образом, главной целью является разработка новых, экологически безопасных инструментов контроля патогенов, а именно методов биологического контроля.
В патенте США № 6495133 описан штамм Glicladium roseum, проявляющий антагонистическое воздействие по отношению к патогенам растений. Агент биологического контроля используют при обработке семян, почвы или растений для защиты от грибковых патогенов различных растений, включая томат.
В публикациях заявок на патент США US2011028500 и US2011014596 описана комбинация ингибитора растительного патогена, содержащая экстракт растения, который содержит один или более антрахинон; антифитопатогенный агент, который может включать натуральное масло или масляный продукт с фунгицидной активностью.
В заявке на патент Индии № IN03603CH2010 описан состав инвертной эмульсии грибковых организмов в качестве биологического контроля. Состав находится в форме инвертной эмульсии. Описанный процесс включает получение грибковых спор посредством ферментации или в твердом, или в жидком состоянии; получение конидиальной суспензии или клеточной суспензии; получение водной фазы посредством смешивания конидиальной суспензии, воды, эмульгатора и глицерина; получение масляной фазы посредством добавления смеси растительного жира к теплой смеси растительного масла; смешивание водной фазы с масляной фазой для получения воды в масле или состава инвертной эмульсии с использованием гомогенизиторов. Продукт можно использовать для обработки семян, внесения в почву и опрыскивания листьев.
В патенте США № 7485451 также описаны инвертные эмульсии (эмульсии «вода в масле»), содержащие клеточный материал, выбранный из живых и/или дремлющих прокариотических и/или эукариотических клеток и тканей, при этом клеточный материал совместим с эмульсиями «вода в масле». Примеры клеточного материала включали клетки грибов, водной плесени, морских водорослей, дрожжей, бактерий, растений, насекомых и животных. Инвертная эмульсия также содержит масло, такое как растительное масло и/или рыбий жир, а также масло, маслорастворимое неионное поверхностно-активное вещество и воду. Необязательно композиция содержит загуститель, такой как коллоидальная двуокись кремния или бентонит.
Также исследованы эфирные масла с антагонистическим эффектом. Например, описана антибактериальная активность экстрактов мароккских растений по отношению к Clavibacter michiganensis подвида Michiganensis (CBM), вызывающему бактериальный рак томата [Ait Ben Aoumar A. et al. J. Med. Plants Res. 6(17):4332-4338, 2011]. Кроме того, была изучена эффективность растительных эфирных масел из 34 ароматических растений по отношению к CBM [Pouvova D. et al. Zemdirbyste-Agrucyktyre 95(3):440-446, 2008].
В недавнем времени было обнаружено, что одновременное получение диацетилфлороглюцина и цианистого водорода с помощью вида Pseudomonas LBUM300 имеет практическую значимость для биологического контроля бактериального рака томата, вызванного Clavibacter michiganensis подвида michiganensis [Lanteigne C, et al. Phytopathology. 102(10):967-73, 2012].
Кроме того, описаны попытки биологического контроля томатов с CBM, выращенных в теплице из минеральной ваты. В частности, искусственная инокуляция двухлетних и трехлетних плит минеральной ваты с погибшими растениями с бактериями CBM снижает гибель растений [Slusarski C. Vegetable Crop Research Bulletin 69:125-134 2008].
ОБЩЕЕ ОПИСАНИЕ
Как правило, биологический контроль заболеваний растений определяют как подавление патогенов посредством использования одного или нескольких организмов, проявляющих антагонистическую активность по отношению к патогенам. Организмы, выступающие в качестве антагонистов, считаются агентами биологического контроля (BCA), и механизмы антагонистического воздействия основаны на различных биологических свойствах BCA. Они включают получение антибиотических соединений, экспрессию ферментов, катализирующих разложение клеточных компонентов патогенов, конкуренцию за пространство и питательные вещества, способность паразитировать на патогенах и индукцию иммунитета растений.
Целью описания настоящего изобретения является обеспечение готового к применению комплекта для биологического контроля культур в отношении микробной инфекции, а также для профилактики развития такой инфекции. Как будет очевидно из последующего описания, представлены такие упаковки, в которых компоненты биологического контроля отделены друг от друга в течение длительного периода хранения и легко смешиваются при предварительно определенной концентрации по необходимости без какого-либо риска загрязнения окружающей среды компонентами комплекта. Было выявлено, что конфигурация упаковки обеспечивает химическую стабильность компонентов, т.е. отсутствие какого-либо повреждения после длительного хранения.
Таким образом и согласно первому аспекту, описание настоящего изобретения относится к упаковке, включающей:
по меньшей мере, один первый компонент, содержащий твердые частицы, которые содержат по меньшей мере одно натуральное масло;
по меньшей мере один второй компонент, содержащий по меньшей мере один антагонист микробного патогена;
где по меньшей мере один первый компонент и по меньшей мере один второй компонент содержатся в отдельных ячейках указанной упаковки.
В некоторых вариантах осуществления ячейки определены как отсеки в рамках элемента-носителя, являющегося частью упаковки.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, упаковка включает:
(i) один или несколько первых отсеков (ячеек), содержащих первый компонент, который содержит твердые частицы, содержащие по меньшей мере одно натуральное масло;
(ii) один или несколько вторых отсеков (ячеек), содержащих второй компонент, который содержит по меньшей мере один антагонист микробного патогена;
каждый из одного или нескольких первых отсеков и одного или нескольких вторых отсеков имеет верхнее отверстие и углубление, расположенное ниже указанного верхнего отверстия, отсеки при этом скреплены в преимущественно плоской форме; и
(iii) первую пленку, герметизирующую отверстия одного или нескольких первых отсеков; и
(iv) вторую пленку, герметизирующую отверстия одного или нескольких вторых отсеков.
В соответствии со вторым аспектом, представлен способ получения антибактериального агента, включающий смешивание одного или нескольких первых компонентов, содержащих твердые частицы, служащие носителем по меньшей мере одного натурального масла с одним или несколькими вторыми компонентами, содержащими по меньшей мере один антагонист микробного патогена, и обеспечивающий образование эмульсии из полученной таким образом смеси. Таким образом, образованная эмульсия обладает антибактериальной активностью. Эмульсия, полученная с помощью компонентов, описываемых в настоящем документе, является стабильной эмульсией, т.е. не наблюдается разделение фаз в течение по меньшей мере нескольких часов, в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и даже 24 часов.
В некоторых вариантах осуществления изобретения способ обеспечивает применение упаковок, описываемых в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления изобретения использование упаковки относится к композиции или эмульсии, содержащей твердые частицы, поверхностно-активное вещество, по меньшей мере одно натуральное масло и по меньшей мере один бактериальный антагонист растительного патогена. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист принадлежит к виду, способному к росту на сезамовом масле как единственном источнике углерода.
В соответствии с еще одним, третьим аспектом, описание настоящего изобретения относится к способу лечения или профилактики патогенной инфекции у растения, включающему нанесение на указанное растение количества эмульсии, содержащей твердые частицы по меньшей мере одного натурального масла и по меньшей мере одного антагониста патогена, вызывающего инфекцию.
В соответствии с четвертым аспектом, описание настоящего изобретения относится к выделенной антагонистической бактерии, образец которой находится на хранении в институте CBS- KNAW и имеет номер доступа, выбранный из группы, состоящей из CBS133252, CBS133254, CBS133255, CBS133256, CBS133257, CBS133258, CBS133259, CBS134566, CBS134567 и CBS134568. В некоторых вариантах осуществления изобретения эти антагонистические бактерии предназначены для применения в защите или лечении растений от инфекции, вызванной патогеном.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
С целью лучшего понимания объекта изобретения, описываемого в настоящем документе, и для подтверждения примером того, как его можно осуществить на практике, далее представлено описание вариантов осуществления изобретения посредством исключительно неограничивающего примера со ссылкой на сопутствующие чертежи, в которых:
на фигурах 1A-1D показан элемент-носитель, являющийся частью упаковки по варианту осуществления изобретения с различных ракурсов, где фигура 1A представляет собой изометрический вид, фигура 1B представляет собой вид сверху и фигуры 1C и ID представляют собой виды со стороны X и стороны Y фигуры 1B.
На фигурах 2A-2B показаны ракурсы элемента-носителя в соответствии с фигурами 1A-1D, включая пленки, герметизирующие различные отсеки элемента-носителя, в соответствии с вариантом осуществления изобретения.
На фигурах 3A-3E показан элемент-носитель по варианту осуществления изобретения с различных ракурсов, где фигура 3A представляет собой изометрический вид, фигура 3B представляет собой вид сверху, и фигуры 3C, 3D и 3E представляют собой вид со сторон Z, X и Y фигуры 3B.
На фигурах 4A-4C показано воздействие двух выбранных антагонистов на рост CBM (фигура 4A) и Xanthromonas (фигура 4B) по сравнению с контролем (фигура AC).
На фигурах с 5A по 5E показаны чашки Петри с различными патогенами после обработки растительным патогеном, с или без антагонистических бактерий
Фигура 6 представляет собой график, на котором показан уровень гибели томатных растений после воздействия на них Clavibacter michiganensis подвида Michiganensis (CBM), растения или обрабатывали комбинациями в соответствии с некоторыми вариантами осуществления описания настоящего изобретения, или контролями перед инокуляцией с CBM.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРТЕНИЯ
Целью настоящего изобретения является обеспечение упаковки, которая подходит для длительного хранения и которая при необходимости обеспечивает безопасный и простой способ получения противомикробных композиций для различных применений, таких как защита сельскохозяйственных культур. С этой целью была разработана упаковка с двумя (или более) отсеками или набором отсеков, каждый отсек или набор отсеков содержит различный компонент. Упаковка сформирована таким образом, что два (или более) отсеков герметизированы по отдельности и различным образом, ввиду, в числе прочего, различных физических и химических характеристик веществ в ячейках, как будет рассмотрено далее в настоящем документе.
Как правило, упаковка включает:
по меньшей мере один первый компонент, содержащий твердые частицы, которые содержат по меньшей мере одно натуральное масло;
по меньшей мере один второй компонент, содержащий антагонист микробного патогена;
где по меньшей мере один первый компонент и по меньшей мере один второй компонент содержатся в отдельных ячейках в указанной упаковке. Другими словами, при условии, что набор герметизирован, два компонента не смешаны или не находятся во взаимодействии друг с другом.
При смешивании первого и второго компонентов (т.е. взяв два компонента из двух отдельных ячеек), получают стабильную эмульсию, подходящую для применения на культуре, подлежащей лечению или защите. Эмульсию наносят в форме мелких капель.
В контексте описания настоящего изобретения термин «твердые частицы» используют для обозначения вещества в форме множества частиц. Частицы могут быть в виде любых частиц, включая, но не ограничиваясь ими, от мелких округленных гранул до аморфных структур. Твердые частицы включают любой вид порошка.
2
В некоторых вариантах осуществления изобретения твердые частицы содержат диоксид кремния (SiO, в краткой форме обозначаемом в настоящем документе как кремнезем). Кремнезем может представлять собой частицы природного кремнезема, такие как гранулы бентонитовой глины, а также синтетические кремнеземовые гранулы.
В некоторых вариантах осуществления изобретения твердые частицы содержат частицы синтетического кремнезема. В контексте описания настоящего изобретения можно использовать различные частицы синтетического кремнезема. Например, твердые частицы могут содержать гранулы осажденного синтетического аморфного кремнезема, такие как коммерчески доступные продукты Tixosil и Aerosil 200.
В некоторых других вариантах осуществления изобретения твердые частицы содержат гранулы синтетического или природного происхождения, обладающие способностью абсорбировать натуральные масла. Такие гранулы могут включать, но не ограничиваются ими, гранулы Latex; гранулы сорбента - карбоната кальция; целлюлозные гранулы; гранулы полистирольного адсорбента, например, Amberlite XAD-2, который представляет собой абсорбирующую смолу гидрофобного сшитого сополимера полистирола; древесный уголь; гранулы Sepharose™; эмульсан-альгинатные гранулы; хитозановые гранулы; альгинат натрия; гранулы сополимера стирола и малеиновой кислоты и стирол-дивинилбензоловые гранулы; целлюлозные гранулы.
Для обеспечения хорошего распределения конечной эмульсии и в соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения распределение по размеру твердых частиц (частиц) находится в диапазоне 10-25 мкм.
Твердые частицы можно также охарактеризовать, н не ограничиваясь
2
2
этим, одной или несколькими площадями поверхности, в некоторых вариантах осуществления изобретения в диапазоне 400-500 м N/г и маслоемкостью в диапазоне 300-350 ДБФ/100 грамм частиц.
Первый компонент содержит твердые частицы, которые содержат одно или комбинацию натуральных масел. В отношении описания настоящего изобретения следует понимать, что «натуральное масло» включает любое органическое масло природного происхождения.
Натуральным маслом предпочтительно является масло, полученное из растения. В некоторых вариантах осуществления натуральные масла известны как эфирные масла. Эфирными маслами предпочтительно являются те, которые, как известно, проявляют противомикробные (например, антибактериальные, противогрибковые, антинематодные) свойства.
В отношении антимикробных свойств следует понимать, что они являются эффективными по отношению к любому микробному патогену, как более подробно рассмотрено ниже.
Не ограничиваясь ими, эфирными маслами для использования в соответствии с описанием настоящего изобретения могут быть те, которые получают из растений Origanum vulgare и вида Origanum, (например, Oregano), вида Mentha (мяты), вида Thymus (тимьяна), вида Myrtus, вида Ocimun (например, Ocimun basilicum, также известного как базилик), вида Lavandula (например, Lavender), вида Micromeria, вида Coriandum (например, кориандра/петрушки), вида Aloysia, вида Melissa, вида Salvia, вида Petoselinum, вида Rosmarinus (например, розмарина), вида Prunella, вида Cuminum (например, тмина).
В некоторых других вариантах осуществления натуральными маслами являются масла растительного происхождения, которых используют в качестве источника углерода, например, в качестве пищи/питательного вещества для антагонистических микроорганизмов. В настоящем документе их обозначают термином «масло на основе углерода» или «насыщенное углеродом питательное масло». В некоторых вариантах осуществления маслами на основе углерода являются растительные масла. Не ограничиваясь ими, масло на основе углерода выбрано из группы, состоящей из сезамового масла, оливкового масла, арахисового масла, хлопкового масла, соевого масла, пальмового масла, подсолнечного масла, сафлорового масла, канолового масла, касторового масла, кокосового масла, арахисового масла.
В некоторых вариантах осуществления термин «натуральное масло» при использовании во множественном числе включает комбинацию по меньшей мере одного эфирного масла и по меньшей мере одного масла на основе углерода, оба из которых имеют природное происхождение.
В некоторых вариантах осуществления натуральное масло содержит по меньшей мере масло орегано в комбинации с по меньшей мере одним маслом на основе углерода. Масло орегано иногда сочетают с по меньшей мере сезамовым маслом.
Неожиданным образом было обнаружено, что антагонистические бактерии можно различать от других бактерий, не обладающих антагонистической активностью по отношению к по меньшей мере CBM, с помощью их способности к росту на масле на основе углерода, таком как сезамовое масло. В одном из вариантов осуществления маслом на основе углерода, на котором прорастают все антагонистические бактерии (в то же время на нем не прорастают испытанные неантагонистические бактерии), является сезамовое масло.
Количество натурального масла в первом компоненте (например, содержащемся в твердых частицах) может варьироваться в зависимости от вида(ов) используемого натурального масла, количества при наполнении, вида твердых частиц, условий наполнения натуральным маслом твердых частиц, поверхностно-активных веществ или растворителей, используемых для наполнения и т.д.
Под наполнением маслом твердых частиц следует понимать любую форму соединения масла и твердых частиц (например, кремнеземовые частицы). Не ограничиваясь этим, масло удерживается в твердых частицах посредством абсорбции на и/или в частицах. Соединение частиц и масла носит обратимый характер, а именно при подходящих условиях, таких как при взаимодействии с водой, масло легко высвобождается из частиц для образования эмульсии.
В некоторых вариантах осуществления изобретения твердые частицы содержат от 20% до 50% масс./масс. натурального масла от общей массы твердых частиц (после наполнения). Это определяют посредством общепринятых способов, таких как ВЭЖХ или газовая хроматография, примеры которых также приведены ниже. В некоторых других вариантах осуществления изобретения твердые частицы содержат приблизительно 30% масс./масс. Натурального масла (термин «приблизительно'' включает диапазон от 25 до 35%, иногда от 28% до 32% или около 30%).
В некоторых вариантах осуществления изобретения натуральное масло содержит или только эфирное(ые) масло(а), или комбинацию по меньшей мере одного эфирного масла и по меньшей мере одного масла на основе углерода. В сущности в отношении натуральных масел следует понимать, что они включают эфирное(ые) масло(а, а также масло(а) на основе углерода. Соотношение по меньшей мере одного эфирного масла и по меньшей мере одного масла на основе углерода находится в диапазоне 60:40 и 100:0, иногда диапазон составляет приблизительно 80:20.
При использовании сочетания масел следует понимать, что они могут совместно абсорбироваться на твердых частицах, т.е. одни и те же твердые частицы содержат более одного вида масла. В некоторых вариантах осуществления для удобства в обращении, каждый вид масла помещается отдельно на твердые частицы так, чтобы образовались различные виды твердых частиц, каждая из которых характеризуется видом масла, которое в ней содержится.
Таким образом, под обозначением твердых частиц, относящихся к орегано и сезаму в соотношении 80:20, следует понимать смесь двух совокупностей твердых частиц, содержащих 80% масла орегано и 20% - твердых частиц, содержащих сезамовое масло, или единичную совокупность частиц, при этом каждая частица абсорбирует два масла в определенном или необходимом соотношении (т.е. масла предварительно смешивают, а затем соединяют с абсорбирующим носителем/частицей). Вне зависимости от вида масла, от 20% до 50% масс./масс. твердых частиц от общей массы составляет наполняющее их масло.
Твердые частицы могут также содержать по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество. Следует понимать, что поверхностно-активным веществом является соединение, снижающее поверхностное натяжение жидкости и в сущности междуфазное натяжение между двумя жидкостями для обеспечения образования, например, эмульсии. Поверхностно-активное вещество может быть любого вида, которое, как известно в данной области, является безопасным для использования (например, нетоксично для растений или животных), включая ионные поверхностно-активные вещества, анионные поверхностно-активные вещества, катионные поверхностно-активные вещества, а также цвиттерионные (или неионные) поверхностно-активные вещества.
В некоторых вариантах осуществления поверхностно-активное вещество принадлежит к виду, доступному в органическом сельском хозяйстве. Неограничивающий перечень возможных поверхностно-активных веществ для использования в соответствии с описанием настоящего изобретения включает полиэтиленгликоль сорбитан триолеаты (Tween, например, Tween 85, Tween 65), сложные эфиры жирных кислот и сорбитана (например, Span 40).
В некоторых других вариантах осуществления поверхностно-активное вещество содержит соль жирной кислоты. Соль может содержать щелочь, такую как соли калия, кальция, натрия, а также аммонийная соль.
В некоторых вариантах осуществления соль жирной кислоты содержит калиевые соли жирных кислот (также известные как соли мыла), которые иногда используют в качестве инсектицидов, гербицидов, фунгицидов и/или альгицидов. В некоторых вариантах осуществления калиевые соли жирных кислот можно получать посредством добавления гидроксида калия к природным жирным кислотам, таким как те, которые имеются в животных жирах и в растительных маслах. Жирные кислоты можно экстрагировать из маслин, семян хлопчатника, соевых бобов, арахиса, подсолнечника, кокосовой пальмы, рапса, сезамового масла, амаранта, кукурузы, ятрофы.
Жирная кислота, образующая поверхностно-активное вещество, может быть также синтетической, а также полусинтетической жирной кислотой (например, природной жирной кислотой, подвергнутой модификации).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество является признанным или меченным как обладающее инсектицидной и/или фунгицидной активностью. Не ограничиваясь этим, пестицидные и/или фунгицидные поверхностно-активные вещества могут включать коммерческие продукты Zohar PT-50 и Zohar LQ-215, производителем обоих из которых является Zohar Dalia, Израиль.
В одном конкретном варианте осуществления поверхностно-активное вещество выбрано из Zohar PT-50 и Zohar LQ-215.
Композиции этих поверхностно-активных веществ доступны от Zohar Dalia. Например, известно, что Zohar PT-50 имеет следующую композицию:
Растительные масла
Вид
Насыщенные жирные кислоты
Мононенасыщенные жирные кислоты
Полиненасыщенные жирные кислоты
Олеиновая кислота(ω-9)
Максимальная высота некоптящего пламени
Всего
Линоленовая кислота(ω-3)
Линолевая кислота(ω-6)
Негидрогенизированные
Каноловое (рапсовое)
7,365
63,276
28,14
9-11
19-21
204°C
Кокосовое
91,00
6,000
3,000
-
2
6
177°C
Кукурузное
12,948
27,576
54,67
1
58
28
232°C
Хлопковое
25,900
17,800
51,90
1
54
19
216°C
Льняного семени/Льняного семени(европейского)
6-9
10-22
68-89
56-71
12-18
10-22
107°C
Оливковое
14,00
72,00
14,00
<1,5
9-20
-
193°C
Пальмовое
49,300
37,000
9,300
-
10
40
235°C
Арахисовое
16,900
46,200
32,00
-
32
48
225°C
Сафлоровое(>70% линолевое)
8,00
15,00
75,00
210°C
Сафлоровое(высокоолеиновое)
7,541
75,221
12,82
210°C
Соевое
15,650
22,783
57,74
7
50
24
238°C
Подсолнечное(<60%линолевое)
10,100
45,400
40,10
0,200
39,800
45,30 0
227°C
Подсолнечное(>70%олеиновое)
9,859
83,689
3,798
227°C
Полностью гидрогенизированные
Хлопковое (гидрогенизированное)
93,600
1,529
0,587
0,287
Пальмовое(гидрогенизированное)
47,500
40,600
7,50
Соевое (гидрогенизированное
21,100
73,700
0,400
0,096
Значения указаны в процентах (%) по массе от общего содержания жира.
Согласно результатам, приведенным в настоящем документе, соль жирной кислоты, как описано в настоящем документе, имела некоторое преимущество в отношении свойств стабильности и/или эмульгирования порошка и антимикробной активности, по сравнению с другими известными поверхностно-активными веществами, такими как коммерчески известный Tween 20 или Tween 80.
Количество поверхностно-активного вещества в первом компоненте может варьироваться. Однако в некоторых вариантах осуществления твердые частицы содержат от 5% до 10% масс./масс. поверхностно-активного вещества или комбинации поверхностно-активных веществ.
Первый компонент, содержащий твердые частицы, представлен по существу в сухом виде. Под термином «по существу сухой» следует понимать то, что первый компонент может содержать малое количество воды, в некоторых вариантах осуществления не более 10% (масс./масс.). В некоторых других или дополнительных вариантах осуществления изобретения содержание воды в первом компоненте находится в диапазоне от 1% до 7% (масс./масс.). В еще одних других вариантах осуществления изобретения термин «по существу сухой» подразумевает отсутствие содержания воды, определенного посредством общепринятых способов (т.е. количество воды не обнаружено).
Первый компонент может также содержать некоторые незначительное количество органического растворителя. Как будет рассмотрено ниже, растворитель может быть необходим доя получения твердых частиц, и некоторое остаточное количество может присутствовать при условии, что растворитель не является токсичным. В некоторых вариантах осуществления первый компонент или не содержит растворителя (т.е. не содержит выявляемого количества органического растворителя), или содержит незначительное количество, т.е. не более 5%, 4%, 3% или даже 2% масс./масс. органического растворителя. Растворителем является, как правило, органический летучий полярный растворитель, такой как, но не ограничиваясь им, растворитель, выбранный из группы, состоящей из ацетона, изопропилового спирта, ацетонитрила, этанола и метанола.
В некоторых вариантах осуществления в первом компоненте обнаружено незначительное количество спирта.
Твердые частицы первого компонента обладают уникальной способностью образования стабильной эмульсии при вступлении во взаимодействие с водой. Это достигается, в числе прочего, ввиду присутствия поверхностно-активного вещества в первом
компоненте. Поверхностно-активное вещество добавляют к частицам с маслом перед высушиванием компонентов.
В контексте описания настоящего изобретения под стабильной эмульсии следует понимать масляную дисперсию (дисперсную фазу) в воде (диспергирующей среде) в течение периода, составляющего по меньшей мере 1 час, иногда по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 10 или даже 24 часа после образования эмульсии. Другими словами, стабильность определяют посредством отсутствия разделения в масляной фазе и водной фазе. Отсутствие разделения можно определять любым способом, известным в данной области, включая визуальный осмотр.
Не будучи связанными теорией, автор полагает, что включение поверхностно-активного вещества в твердые частицы способствует стабильности образующейся эмульсии. Это также очевидно из неограничивающих примеров, приведенных ниже, на которых показано, что использование калиевых солей жирных кислот представляет преимущество в отношении стабильности и безопасности по сравнению с другими видами коммерчески доступных поверхностно-активных веществ.
Для образования эмульсии твердые частицы смешивают с водой. Количество воды зависит от количества твердых частиц. В некоторых вариантах осуществления на каждый грамм твердых частиц (30% которых составляет масло), воду добавляют для получения одного литра эмульсии. По существу в 1 литре эмульсии 0,1 г твердых частиц представлена масляная концентрация, составляющая 0,03% об./об.). В некоторых вариантах осуществления изобретения процентное содержание масла в конечной эмульсии находится в диапазоне от 0,03% до 2% об./об.
В некоторых вариантах осуществления изобретения посредством смешивания твердых частиц с водой получают эмульсию с размером капли в диапазоне от 1 до 20 мкм и в некоторых вариантах осуществления изобретения в диапазоне от 3 до 10 мкм.
В некоторых вариантах осуществления изобретения эмульсия представляет собой антимикробную эмульсию.
Упаковка включает второй компонент, содержащий по меньшей мере один антагонист микробного патогена.
В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один антагонист микробного патогена содержался в геле или гелеподобном носителе. С целью образования гелевой формы в качестве носителя антагонистов можно использовать различные материалы.
Например, гель может быть образован из полисахарида или комбинации полисахаридов с другими веществами.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, гель выбран из группы, состоящей из агарового геля (агар-агар), гуаровой камеди, желатина, ксантановой камеди, метилцеллюлозного геля (целлюлозной камеди), геля на основе пектина, желатинового геля и других, как известно в данной области.
В некоторых вариантах осуществления второй компонент содержит агар-агар, образуя, таким образом, гель, содержащий микробных антагонистов.
В контексте описания настоящего изобретения под антагонистами микробного патогена или патогеновым антагонистом следует понимать биологический организм, ингибирующий растительный патоген (растительный патоген может также обозначаться как фитопатоген). Под ингибированием в отношении описания настоящего изобретения следует понимать уменьшение роста патогена на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 90% или даже по существу уничтожение патогена. В контексте настоящего изобретения растительным патогеном может быть любой прокариотический или эукариотический организм, включая, но не ограничиваясь ими, бактерии, грибы, простейших, нематодов или любого другого паразита, вызывающего заболевание. В сущности микробная активность по меньшей мере одного антагониста может быть любой из антибактериальной, противогрибковой, антипротозойной, антинематодной и т.д.
В некоторых вариантах осуществления второй компонент содержит по меньшей мере одного антагониста. В некоторых других вариантах осуществления второй компонент содержит смесь антагонистов. Под смесью подразумевается комбинация двух или более, иногда 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 антагонистов, которые объединены в одинаковой или различной концентрации.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антагонист принадлежит к виду, способному к росту на сезамовом масле как единственном источнике углерода, как показано ниже в таблице 3 настоящего документа. Таких антагонистов можно легко определить посредством проведения общепринятого анализа культивирования с использованием сезама в качестве единственного источника углерода и выявления тех сортов, которые выжили после экспериментального вегетационного периода.
В некоторых вариантах осуществления антагонист может обозначаться как бактериостат, т.е. тот, который снижает рост организмов, и в некоторых других вариантах осуществления антагонист может обозначаться как бактериоцид, а именно, тот, который уничтожает организм.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антагонист микробного патогена является антагонистом, передающимся через почву. В этом контексте следует понимать, что по меньшей мере один антагонист можно получать и выделять из корней, почвы и/или ризосферы растения, проявившего устойчивость (например, частичную резистентность) или резистентность к микробному патогену.
В некоторых других вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один антагонист микробного патогена является антагонистом растительного происхождения, например, выделенным из части растения, такой как листья, стебель, цветок, сосудистая система.
Может также присутствовать по меньшей мере один антагонист микробного патогена, который является таким образом полученным из почвы (т.е. передающимся через почву) и из части растения (например, сосудистой системы).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, антагонисты принадлежат к патогену, вызывающему инфекцию у томатов.
В других некоторых вариантах осуществления изобретения антагонисты принадлежат к патогену, подлежащего обработке.
Второй компонент может включать одного или нескольких антагонистов. В некоторых вариантах осуществления изобретения второй компонент включает комбинацию нескольких антагонистов в том же самом геле. Однако в некоторых других вариантах осуществления изобретения при необходимости использования комбинации антагонистов каждый из них содержится в отдельном геле и смешивается только перед использованием. Другими словами, второй компонент является комбинацией нескольких «вторых компонентов», в которой каждый из антагонистов содержится отдельно и в зависимости от типа патогена, подлежащего обработке, сочетается перед воздействием на растение.
При использовании комбинации антагонистов их можно получать/наносить на растение в одинаковом количестве (КОЕ/мл) или в различных количествах.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, количество антагониста во втором компоненте (либо в качестве единичного антагониста или в качестве смеси антагонистов) может находиться в диапазоне от 500 до 5000 КОЕ/мл. Соотношение антагонистов при использовании в качестве смеси может варьироваться в зависимости от вида патогена, подлежащего обработке, и может быть предварительно определено посредством общепринятых лабораторных способов, например, по наилучшему бактериостатическому/бактерицидному эффекту в чашке для культивирования.
Тип антагониста зависит от вида патогена, подлежащего обработке посредством упаковки.
В некоторых дополнительных вариантах осуществления изобретения патогеном является Clavibacter michiganensis подвида Michiganensis (CBM). В этом варианте осуществления изобретения некоторые антагонисты, выделенные из томатов, проявляющих устойчивость к CBM, выбраны из группы, не имеющей ограничительного характера, состоящей из вида Pseudomonas (номер доступа CBS133252), Pseudomonas alcaliphila (номер доступа CBS133254), Bacillus subtilis (номер доступа CBS133255), Pseudomonas cedrina (номер доступа CBS133256), вида Pseudomonas (номер доступа CBS133257), вида Pseudomonas (номер доступа CBS133258), Pseudomonas spanius (номер доступа CBS133259).
В данной области известны другие антагонисты, такие как те, которые представлены в таблице 4 отчета международной организации Биологического и интегрированного контроля вредных животных и растений [под редакцией Philippe C. Nicot 2011], содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки.
В некоторых других вариантах осуществления изобретения антагонисты других растений могут входить в состав второго компонента упаковки, описываемого в настоящем документе. Они могут включать другие сельскохозяйственные культуры, такие как, но не ограничиваясь ими, те, которые принадлежат к семейству Solanaceae, например, томат, перец, баклажан, картофель; к семейству Cucurbitaceae, например, тыква крупноплодная, дыня, горлянка, огурец, тыква обыкновенная, люффа и арбузы, но также любые другие семенные растения, включая плодовые культуры, деревья и т.д. Упаковка, как правило, содержит инструкции для применения первого компонента и второго компонента для образования эмульсии, подлежащей нанесению на растение. Инструкции включают по меньшей мере смешивание первого компонента со вторым компонентом, необязательно с добавлением количества воды для образования эмульсии. В некоторых вариантах осуществления изобретения концентрация по меньшей мере одного антагониста в эмульсия составляет минимум 1000 КОЕ/мл или находится в диапазоне от 500 КОЕ/мл до 5000 КОЕ/мл.
Кроме того, в различной литературе можно найти антагонисты, такие как, но не ограничиваясь ими, следующие, которые включены в настоящий документ посредством ссылки:
Патоген
Инфицированное растение
Антагонисты
Источник информации
Ralstonia Solanacearum
Томат, перец
Bacillus megaterium, Enterobacter cloacae, Pichia guillermondii и Candida ethanolica
Journal of Plant Pathology 92(2):395-406 (2010)
E. carotovora подвида carotovora P-138
E-65 как вид Bacillus и E-45 как вид Lactobacillus
The Scientific World Journal (2012), Article ID 723293.
Leptosphaeria maculans
Канола
Pseudomonas chlororaphis и P. aurantiaca
Biocontrol Science и Technology 16(5/6):567582 (2006)
Ralstonia solanacearum (Pseudomonas solanacearum)
Грибы в арахисе
Pseudomonas fluorescens RH4003 и Bacillus subtilis AB89
J. ISSAAS Vol. 18(1):185-192 (2012)
Ralstonia solanacearum
Сосудистое заболевание картофеля
Изоляты Pseudomonas solanacearum: B82;wl63;wp95 и P. fluorescens
http://www.apsent.org/publications/PlantDisease/BackIssues/Documents/1983Articles/ PlantDisease67n05_499.pdf
Rhizoctonia solani
Картофель
Коммерческие продукты Bacillus subtilis (Kodiak)
Crop Protection 24(11):939-950, (2005)
Actinomycetes
Phytoprotection 82:85-102 (2001)
Xanthomonas oryzae pv.oryzae
Бактериальный ожог листьев риса
Вид Streptomyces
American Journal of Agricultural and Biological Sciences 7(2): 217-223 (2012)
Xanthomonas oryzae pv.oryzae
Изоляты из почвы и воды
Rice Industry, culture, and environment 549-553
Вид Streptomyces
Парша картофеля
Phytopathology 85:261-268 (1995);Can J Microbiol. 47(4): 332-40 (2001)
Sclerotinia sclerotiorum, вид Streptomyces и Phytophthora capsici
Соевые бобыПарша картофеляОвощные культуры
BacillusAmyloliquefaciens (BAC03)
MSU AgBioResearch 2011 Annual Report, (2012) URL: http://research.msu.edu/stories/getting-root-soil-borne-diseases
Rhizoctonia solani и Fusarium sambucinum,
Черная парша, сухая гниль картофеля
Egypt. J. Phytopathol., 36(1-2):45-56 (2008)
Rhizoctonia solani
Салат-латук
Штаммы Endophytic, Serratia plymuthica 3Re4-18 и Pseudomonas trivialis 3Re2-7, rhizobacterium Pseudomonas fluorescens LI3-6-12
FEMS Microbiol Ecol 64:106-116(2008)
Rhizoctonia solani
Картофель
Pseudomonas fluorescens
Acta biol.Colomb. 12(1) pages XXX (2007)
Xanthomonas campestris pv. vesicatoria
Томат
Rahnella aquatilis
Microbiological Research, 160(4):343-352 (2005)
Erwinia amylovora (красная бактериальная гниль корней)
Pseudomonas fluorescens A506, Pantoea agglomerans C9-1 и Pantoea
Plant Disease 93(4):386 URL:http://apsjournals.apsnet.org/doi/pdf/10,1094/PDIS-93-4-0386
Erwinia amylovora (красная бактериальная гниль корней)
Erwinia herbicola
ISHS Acta Horticulturae 117: II Symposium on Fireblight URL: http://www.actahort.org/books/117/117_21.htm
Clavibactermichiganensisподвидаmichiganensis
Bacillus subtilis;Rhodosporidiumdiobovatum
BioControl 49: 305-313, 2004
Как указано выше, в некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист принадлежит к виду, способному к росту на сезамовом масле как единственном источнике углерода.
Иногда для получения эмульсии можно добавлять воду. При добавлении воды количество воды зависит от количества первого компонента. В некоторых вариантах осуществления изобретения на каждый грамм первого компонента (например, 30% которого составляет масло) воду добавляют для получения одного литра эмульсии. По существу в 1 литре эмульсии 0,1 г твердых частиц представлена масляная концентрация, составляющая 0,03% об./об.
В некоторых вариантах осуществления изобретения процентное содержание масла в конечной эмульсии находится в диапазоне от 0,03% до 2% об./об.
Согласно вышеизложенному, конечный состав может быть представлен в упаковке, содержащей 20 грамм порошка первого компонента (30% которого составляет масло) и 120 мл гелевого антагониста второго компонента, и инструкции могут включать смешивание первого компонента и второго компонента с водой для образования 20 литров эмульсии, содержащей 0,3% об./об. масла.
Аналогичным образом, упаковка может содержать 50 грамм или 100 грамм порошка первого компонента и 120 мл гелевого антагониста второго компонента, и инструкции могут включать смешивание первого компонента и второго компонента с водой для образования 50 или 100 литров эмульсии.
В некоторых вариантах осуществления изобретения второй компонент представлен в упаковке в отдельных разделах, каждый раздел содержит различный антагонист в геле. Например, в упаковке, содержащей 120 мл геля, гель может являться составной частью нескольких гелевых разделов, при этом каждый гелевый раздел содержит одинаковый или различный антагонист, например, 8 гелей по 15 мл геля каждый. Это обеспечивает отбор типов антагонистов для использования и позволяет менять комбинации в смеси по мере необходимости для получения более эффективного биоконтроля патогена.
Упаковка по настоящему описанию является подходящей для обеспечения новой эмульсии. В этом отношении описание настоящего изобретения также относится к эмульсии, содержащей твердые частицы, поверхностно-активное вещество, по меньшей мере одно натуральное масло и по меньшей мере один бактериальный антагонист, все из которых, как определено в настоящем документе, выступают в качестве компонентов упаковки, где по меньшей мере один антагонист принадлежит к виду, прорастающему на сезамовом масле как единственном источнике углерода.
Упаковка, описываемая в настоящем документе, в особенности пригодна для использования в профилактике или лечении патогенной инфекции у растения. Обработка может включать ингибирование роста патогена (бактериостатический эффект), а также полное уничтожение патогенной инфекции (бактерицидный эффект).
В некоторых вариантах осуществления изобретения лечение или профилактика проводится по отношению к инфекции, вызванной Clavibacter michiganensis подвида Michiganensis (CBM).
В некоторых вариантах осуществления изобретения обработка или профилактика проводится по отношению к инфекции, вызванной xanthomonas vesicatoria. В некоторых других вариантах осуществления изобретения лечение или профилактика проводится по отношению к инфекции, вызванной Streptomyces scabies.
В некоторых вариантах осуществления изобретения лечение или профилактика проводится по отношению к инфекции у растения, принадлежащего к семейству Solanaceae, например, у томата, перца, баклажана, картофеля. В одном из вариантов осуществления изобретения растением является томат.
В некоторых вариантах осуществления изобретения упаковка в соответствии с настоящим описанием, содержит элемент-носитель, содержащий по существу плоскую форму, скрепляющую одну или несколько первых ячеек/отсеков для содержания по меньшей мере одного первого компонента, который содержит твердые частицы, включая по меньшей мере одно натуральное масло; и один или несколько вторых отсеков/ячеек для содержания по меньшей мере одного второго компонента, который содержит по меньшей мере одного антагониста микробного патогена; один или несколько первых отсеков и один или несколько вторых отсеков, при этом каждого из отсеков отличает верхнее отверстие и углубление, расположенное ниже верхнего отверстия;
- первую пленку, герметизирующую отверстия одного или нескольких первых отсеков; и
- вторую пленку, герметизирующую отверстия одного или нескольких вторых отсеков.
Как очевидно, каждый отсек является отдельным подразделением, и смешивание содержания одного отсека с другим возможно только после открытия герметизирующих пленок.
Неограничивающий пример элемента-носителя показан на фигурах 1A-1D, на которых представлен изометрический вид (фигура 1A) и вид сверху и сбоку (фигуры с 1B по 1D) элемента 100, включая плоскую форму 110, включая единичную первый отсек 120 и множество расположенных на расстоянии друг от друга вторых отсеков 130. В этом неограничивающем примере первый отсек 120, который является съемным, установлен в углублении 140, находящемся в плоской форме 110. В некоторых других вариантах осуществления изобретения съемный отсек, такой как отсек 120, может находиться внутри отверстия (углубления) в плоской форме 110 (не показано). Альтернативно, первый отсек может составлять неотъемлемую часть плоской формы 110 (не показано).
В этом конкретном варианте осуществления изобретения образуется множество вторых отсеков 130 в качестве неотъемлемой части плоской формы 110. В альтернативном варианте осуществления изобретения любой из второго(ых) отсека(ов) 130 может быть такого вида, который может быть съемным в углублении 140, как показано для первого отсека 120, или в отверстии, находящемся в плоской форме (не показано). По этому варианту осуществления изобретения первый отсек 120 фактически представляет собой вид лунки, который можно удалить из углубления (в форме удерживающего отсека) плоской формы перед использованием.
Элемент-носитель 100 также включает зажимное устройство 150, в форме ручки. Зажимное устройство может быть приставлено в других формах с целью способствования устойчивому и прочному удерживанию элемента-носителя при отрывании и удалении из упаковки герметизирующих пленок для высвобождения содержания первых и вторых отсеков.
В соответствии с этим неограничивающим вариантом осуществления изобретения внутренний диаметр A первого отсека 110, сконфигурированного для содержания антагонистических бактерий, может составлять 80-300 мм и иногда может находиться в диапазоне 100 мм-200 мм или 120-150 мм. Внутренний диаметр B вторых отсеков 130, сконфигурированных для содержания одинаковых или различных бактериальных антагонистов, находится в диапазоне 20-40 мм, иногда в пределах диапазона 25-35 мм. Глубина отсеков, как правило, составляет 20-60 мм, иногда находится в диапазоне 20-30 мм.
В некоторых вариантах осуществления изобретения габаритные размеры упаковки составляют 500-550 мм в длину и 30-40 мм в ширину.
На фигуре 1C, которая представляет собой ракурс фигуры 1B, также показано углубление 140 (углубление или удерживающий отсек) для вмещения первого отсека 120, расположенное ниже по отношению к верхней стороне 160 элемента-носителя. Фигура 1D представляет собой другой вид элемента 100 со стороны Y фигуры 1B.
Каждая из первой пленки и второй пленки может отдельно покрывать и герметизировать соответствующие первые отсеки и вторые отсеки. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения и также, как показано на фигурах 2A и 2B, элемент-носитель 100, как показано на фигурах с 1A по 1D, сочетают с первым отсеком 170, в частности покрывающим отверстие первого отсека 120, и вторую пленку 180 накладывают на первую пленку 170 и покрывают (герметизируют) вторые отсеки 130. Первая пленка 170 и вторая пленка 180 могут быть прикреплены друг к другу таким образом, что при отрывании второй пленки 180 также отрывается первая пленка 170, обеспечивая, таким образом, в сущности одномоментное открытие первых отсеков 120 и вторых отсеков 130. Однако аналогичным образом, первая пленка 170 может быть отелена от второй пленки 180 для обеспечения раздельного открытия первых отсеков 120 и вторых отсеков 130.
На фигурах 3A-3E представлен элемент для применения в упаковке в соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения. Таким образом, для простоты, позиционные обозначения, аналогичные тем, которые используются на фигурах 1A-1D, с разницей 100 используют для определения компонентов с аналогичной функцией на фигурах с 3A по 3E. Например, компонент 110 на фигуре 1A является отсеком с аналогичной функцией, как у отсека 210 на фигуре 2A.
В частности, фигура 2A представляет собой изометрический вид, фигура 3B представляет собой вид сверху и фигуры с 3C по 3E представляет собой вид сбоку элемента 200 со сторон Z, X и Y, элемент 200 имеет в целом продолговатую (прямоугольную) конфигурацию, с плоской формой 210, включая единичный первый отсек 220, установленный и являющийся съемным в углублении 240, находящемся в плоской форме 210, и множество расположенных на расстоянии друг от друга вторых отсеков 230. В соответствии с этим неограничивающим вариантом осуществления изобретения первый отсек 220 и вторые отсеки 230 имеют многоугольную форму, в этом конкретном варианте осуществления изобретения - четырехугольную.
Кроме того, в соответствии с этим неограничивающим вариантом осуществления изобретения, второй отсек 230 показан как неотъемлемая часть элемента-носителя 200, но он может аналогичным образом быть съемным отсеком, как показано на неограничивающем примере фигуры 1A.
Размеры элемента-носителя по этому варианту осуществления могут отличаться от тех, которые приведены в отношении элемента 100, и в этом конкретном варианте осуществления изобретения его габаритные размеры могут составлять 200-300 мм в длину и 150-250 мм в ширину, при этом отсеки являются глубже, т.е. имеют глубину в диапазоне 50-60 нм.
Как очевидно, размеры элемента-носителя и в частности приведенных, таким образом, отсеков могут варьироваться в зависимости от конкретного применения упаковки и материала, который будет в нее помещен. Специалистам в данной области будет нетрудно определить необходимые модификации в размерах для соответствия носителя конкретному применению.
Как подробно указано выше, первый(ые) отсек(и) упаковки в соответствии с описанием настоящего изобретения содержит(ат) композицию вещества, содержащего масло. В сущности по меньшей мере один или несколько первых отсеков образованы из совместимых с маслом полимеров. Под совместимыми с маслом полимерами следует понимать полимеры, являющиеся инертными и не изменяющие свойств композиционного материала, включая натуральное масло. По той же причине, первая пленка, покрывающая первый(ые) отсек(и) состоит из совместимого с маслом полимер.
В некоторых вариантах осуществления изобретения первая пленка соответствующих первых отсеков является или содержит совместимые с маслом термопластические полимеры.
2
2
3
3
2
В некоторых вариантах осуществления изобретения необходимо поддержание композиционного материала в сухом виде. С этой целью первая пленка является не пропускающим жидкость полимером. В данной области их обозначают как высоконепроницаемые пленки. Высоконепроницаемые пленки можно определить по пропускающей способности HO в диапазоне 3-4 г/м/24 ч и по пропускающей способности O в диапазоне 6-8 см/м/24 ч.
Некоторые неограничивающие примеры высоконепроницаемых полимеров, которые могут образовать первую пленку, получают из любого из полиолефинов, поливинилов, сложных полиэфиров.
Высоконепроницаемая пленка, как правило, принадлежит к виду, который можно легко снять с носителя.
В некоторых вариантах осуществления изобретения первая герметизирующая пленка представляет собой слоистый материал толщиной в диапазоне 40-100 мкм, иногда 60-80 мкм.
2
2
3
3
2
Относительно одного или нескольких вторых отсеков, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, так как вторые отсеки содержат живое вещество, необходимо, чтобы герметизирующая пленка этих вторых отсеков, а именно, вторая пленка, была газопроницаемой. В соответствии с некоторым вариантом осуществления изобретения, вторая пленка является кислородопроницаемой или пропускающей кислород, содержащий газ. С этой целью, способность второй пленки пропускать HO может находиться в диапазоне 8-10 г/м/24 ч и способность пропускать O - приблизительно 1,200 см/м/24 ч.
Первая и вторая пленки могут состоять из термопластических пленок, содержащих один или смесь полимеров, выбранных из группы, состоящей из полиэтилентерефталата, ориентированного в двух взаимноперпендикулярных направлениях (BOPET), полипропилена, ориентированного в двух взаимноперпендикулярных направлениях (BOPP), поливинилиденхлорида (PVDC), полиэтиленполипропилена, поливинилового спирта.
В некоторых вариантах осуществления пленки содержат полипропилен, ориентированный в двух взаимноперпендикулярных направлениях (BOPP). В некоторых других вариантах осуществления изобретения пленки представляют собой слоистый материал BOPP с другим полимером, таким как полиэтилен (ПЭ). Слоистый материал может содержать два, три или более слоев. Пленки для использования являются коммерчески доступными, например, от Glob-Plast (Plastart, Израиль) и широко используются в данной области.
Описание настоящего изобретения также относится к способу получения композиции для лечения или профилактики патогенной инфекции у растения, включающему смешивание первого компонента, содержащего твердые частицы, которые содержат по меньшей мере одно натуральное масло, со вторым компонентом, содержащим по меньшей мере одного антагониста микробного патогена, и обеспечивающему образование эмульсии из указанной смеси. Полученная в результате эмульсия может быть обозначена в настоящем документе как эмульсия противомикробного (например, бактерицидного, фунгицидного и т.д.) действия.
В соответствии с этим аспектом способа, первый компонент и второй компонент представляют собой, как определено в настоящем документе.
Для смешивания может также потребоваться добавление воды для образования эмульсии. В некоторых вариантах осуществления изобретения в результате смешивания получают эмульсию с размером капли в диапазоне от 1 до 20 мкм и в некоторых вариантах осуществления изобретения - в диапазоне от 3 до 10 мкм.
Описание настоящего изобретения также относится к способу лечения или профилактики патогенной инфекции у растения, включающему нанесение на указанное растение количества эмульсии, содержащей твердые частицы, по меньшей мере одно натуральное масло и по меньшей мере одного антагониста микробного патогена. В соответствии с этим аспектом описания настоящего изобретения, эмульсию получают посредством смешивания, предпочтительно непосредственно перед нанесением, первого компонента и второго компонента, как определено в настоящем документе.
В некоторых вариантах осуществления способ лечения или профилактики содержит нанесение эмульсии на растение. Нанесение эмульсии может быть осуществлено любым способом, известным в сельском хозяйстве, включая, но не ограничиваясь ими, опрыскивание растения, орошение.
В еще одних других вариантах осуществления изобретения лечение или профилактика может включать нанесение на клубни растения, такое как опрыскивание клубней картофеля (иногда обозначаемое как обозначаемый как низкообъемное опрыскивание клубней).
Для достижения противомикробного эффекта эмульсию можно наносить на растение однократно или два или более раз. При нанесении более чем одной дозы, дозы можно вносить с временными интервалами между нанесениями, составляющими от одних суток до более чем одни сутки (с интервалом, составляющим двое, трое и более суток). Разные дозы могут быть одинаковыми или различными по количеству антагонистов, количеству натурального масла или по тому и другому одновременно, а также одинаковыми или различными по виду представленных антагонистов и/или натуральных масел.
В некоторых вариантах осуществления изобретения при внесении более чем одной дозы многократное нанесение осуществляют с интервалами от 2 до 10 суток, иногда от 3 до 8 суток.
В некоторых вариантах осуществления изобретения растение получает по меньшей мере 2, 3, 4 и иногда по меньшей мере 5 доз эмульсии(й) в соответствии с описанием настоящего изобретения.
Частота обработки и количество доз зависит от вида инфекции (например, интенсивности развития/вреда/угрозы для жизни), степени тяжести инфекции, если она уже развилась, условий окружающей среды и т.д. Специалисты в области сельского хозяйства смогут определить график обработки на основе обычно используемых параметров.
С целью профилактики развития инфекции, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, необходимо нанесение эмульсии на растение, начиная с суток посадки растения или с первых суток возникновения подозрения на инфекцию.
Для лечения инфекции, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, необходимо нанесение эмульсии на растение, начиная с суток выявления подозреваемой инфекции.
Описание настоящего изобретения также относится к выделенной антагонистической бактерии, выбранной из группы, состоящей из вида Pseudomonas (номер доступа CBS133252), Pseudomonas alcaliphila (номер доступа CBS133254), Bacillus subtilis (номер доступа CBS133255), Pseudomonas cedrina (номер доступа CBS133256), вида Pseudomonas (номер доступа CBS133257), вида Pseudomonas (номер доступа CBS133258), вида Pseudomonas (номер доступа CBS134568), Pseudomonas spanius (номер доступа CBS133259), Pseudomonas mediterranea (номер доступа CBS134566), Pseudomonas chlororahis (номер доступа CBS134567) и вида Pseudomonas (номер доступа CBS134568).
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная антагонистическая бактерия входит в состав носителя. В некоторых вариантах осуществления изобретения носителем является гель или гелеподобный носитель, как определено выше в настоящем документе.
Выделенная бактерия может иметь различное применение. В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенную бактерию в отдельности или в составе бактериальной смеси можно использовать для лечения или защиты растения от заболевания, вызванного патогеном, таким как те, которые описаны выше в настоящем документе. Перечислены некоторые из неограничивающих примеров для осуществления изобретения. Как будет показано далее, составы для контроля заболеваний растений, ингредиенты масел и соотношение сезамового масла или его составляющих и масла орегано и его составляющих является приблизительно постоянным (соотношение масла орегано:сезамового масла 1:0,25 (масс./масс.)), в то время как количество других дополнительных составляющих масляного состава меняется в соответствии с растением, сельскохозяйственным вредителем и условиями окружающей среды. По меньшей мере одна антагонистическая бактерия из возможных бактерий используется в комбинации с составом масел для контроля для контроля заболеваний растений.
ОПИСАНИЕ НЕОГРАНИЧИВАЮЩИХ ПРИМЕРОВ
Исследование состояло из трех частей: (i) выделения и размножения патогенов и потенциальных антагонистов; (ii) in vitro скрининга потенциальных антагонистов по отношению к Clavibacter michiganensis подвида Michiganensis (CBM), и (iii) in vivo оценки отобранных антагонистов для контроля заболевания бактериальным увяданием у томатов.
Выделение патогенов и потенциальные антагонистические бактериальные штаммы
Томатные растения (Daniela, Hazera, Israel) выращивали в теплицах в двойных рядах растений на каждой грядке с системой капельного орошения. Всходы сажали в ряд, составляющий приблизительно 3 растения на метр, и культивировали в соответствии с голландским способом. Эти участки находились под наблюдением за развитием инфекции CBM. При возникновении инфекции выявляли растения, которые выжили после инфицирования, и образцы, содержащие корневые части, почву (на глубине 30 см) и ризосферу собирали в стерильные пакеты и относили в лабораторию.
В лаборатории каждый из образцов по 10 грамм, содержащий корневые части, почву и ризосферу, вводили в пакет Стомахер, содержащий 90 мл агарового раствора 0,1% масс./об. (раздавленного двойной дистиллированной водой(ДДВ), герметизировали и стерилизовали в автоклаве при 121°C, 1 атм, 20 минут). После стерилизации образцы встряхивали в течение 2 часов при скорости 20 об./мин. и комнатной температуре. Затем пакеты переносили в устройство Стомахер в течение 1 минуты при средней скорости.
После обработки в Стомахере образцов каждый пакет открывали стерильными ножницами и получали различные растворы образцов в стерильных пробирках, каждая из которых содержала 9 мл агарого раствора (0,1% масс./об.). Первый раствор получали из 1 мл образца в 9 мл агара (×10-2 разведение), и доводили до ×10-8 разведения.
Из каждого разведенного образца 100 мкл переносили в чашки Петри, дополненные средой, выбранной из одного из следующих агаров: картофельного агара с декстрозой (PDA, Difco), питательного агара, псевдомонадного агара F (Difco) и инкубировали в инкубаторе (28°C) в течение 5 суток. Представляющие интерес колонии отмечали и переносили с использованием бактериальной иглы в свежую среду (аналогичную той, которую использовали для выращивания перед выделением) для получения выделенного единичного вида микробных колоний потенциальных антагонистов.
Размножение выделенных антагонистов
4
3
Микробные колонии, которые, возможно, обладали антагонистическим эффектом, очищали от микроорганизмов, растущих на чашках с агаром под укрытием с ламинарным потоком воздуха и повторно культивировали в колбе Эрленмейера в питательной среде для культивирования, содержащей пептон (10 г/литр), экстракт дрожжей (20 г/литр), глицерин (10 г/литр), MgSO (0,1 г/литр), CaCO (2 г/литр). В каждую колбу помещали единичную выделенную колонию для культивирования в качестве чистого антагониста, и каждую колбу закрывали пластмассовой крышкой, стерилизовали в автоклаве в течение 20 минут при 121°C и хранили при комнатной температуре в течение одних суток.
Скрининг эффективных антагонистов CBM и/или Xanthromonas.
Культуры, проявляющие антагонистическую активность, проходили поверку на эффективное in vitro подавление патогена посредством перенесения каждого возможного антагониста с использованием бактериальной иглы в чашку Петри, содержащую питательную агаровую среду, дополненную 0,1% экстрактом дрожжей и 1% глицерином. Бактерии помещали ровной линией в чашке и затем чашку инкубировали в течение 24 часов при 28°C. После периода инкубации патоген CBM высевали на воображаемой линии перпендикулярно бактериальной линии, и чашку снова инкубировали в течение дополнительного 3-суточного периода. Если бактерия обладает антагонистической активностью, во время периода инкубации образовывался пропуск между бактериальной линией и патогенной линией, тех, у которых образовался больший пропуск, отбирали в качестве потенциальных антагонистов. Далее их выявляли в центре Centraalbureau voor Schimmelcultures (Центре биоразнообразия грибов Института нидерландской королевской академии гуманитарных и точных наук (CBS-KNAW).
В таблице 1 представлен перечень видов, депонированных в Институте CBS-KNAW 19 ноября 2012 года и использованных в конечной комбинации/смеси. Виды хранили при -80°C в глицериновом растворе (15%).
Таблица 1Депонированные антагонисты
Антагонист
Номер доступа
Название
Вид Pseudomonas
CBS133252
BN12-27A
Pseudomonas alcaliphila
CBS133254
BN12-28
Bacillus subtilis
CBS133255
BN12-29
Pseudomonas cedrina
CBS133256
BN12-30
Вид Pseudomonas
CBS133257
BN-12-31
Вид Pseudomonas
CBS133258
BN12-32
Pseudomonas spanius
CBS133259
BN12-33
Pseudomonas mediterranea AN1
CBS134566
BN13-01
Pseudomonas chlororahis AN 10
CBS134567
BN13-02
Вид Pseudomonas AN21
CBS134568
BN13-03
Кроме того, на фигурах 4A-4C показано воздействие антагонистов Pseudomonas cedrina (CBS1333256, "AN4") (фигура 4A) и вида Pseudomonas (CBS1333258, «AN19») (фигура 4B) на рост CBM и Xanthromonas (два отдельных участка/линии на чашке) по сравнению с воздействием контроля, которым являются неантагонистические бактерии, выделенные из аналогичного источника антагонистических бактерий и выращенные на среде без сезамового масла (контрольные бактерии, фигура 4C). В частности, на фигуре 4A и фигуре 4B зона отсутствия роста показана там, где патогенные линии CBM и Xanthromonas не могли прорасти в направлении антагонистической линии. На контрольной фигуре 4C патогенные линии CBM и Xanthromonas достигли контрольной бактерии линии. Эти результаты демонстрируют, что AN4 и AN 19 обладают антагонистической активностью по отношению к по меньшей мере CBM и Xanthromonas.
Аналогичный эксперимент проводили для каждой выделенной бактерии, вследствие которого получили перечень антагонистических бактерий, представленный в таблице 1.
Получение антагонистического микробного геля
4
3
7
8
Выделенные антагонисты раздельно переносили в колбу Эрленмейера, содержащую среду, используемую для размножения (пептон (10 г/литр), экстракт дрожжей (20 г/литр), глицерин (10 г/литр), MgSO (0,1 г/литр), CaCO (2 г/литр), дополненную 0,15% гранулированным агаром (Difco), и каждый антагонист при концентрации от 10 до 10 КОЕ/мл и встряхивали в течение 72 часов при 28°C. Затем полученную в результате гелеподобную смесь сохраняли в гелевой форме при комнатной температуре до использования. Показано, что антагонисты могут храниться в такой форме до 12 месяцев со снижением бактериальной популяции в логарифмическом порядке, составляющим не более, чем 2.
Определение среды для сохранения антагониста
С целью определения наиболее подходящей среды для хранения антагонистических бактерий, тестировали следующие возможные среды для хранения:
Испытанные антагонистические бактерии:
Испытанными антагонистическими бактериями являлись CBS133252; CBS133255 и CBS134567.
9
Каждую из антагонистических бактерий выращивали в течение 48 часов на чашках Петри, содержащих антагонистическую среду. Колонии каждой бактерии собирали с поверхности среды для выращивания в стерильную дистиллированную воду до конечной концентрации, составлявшей 10 КОЕ/мл.
Испытанные среды для хранения:
a. Дистиллированная вода (ДВ)
b. Масло орегано 79% и сезамовое масло 19% и ДВ 2%.
c. Масло орегано 4% и сезамовое масло 0,8% в ДВ.
d. Эмульсия, содержащая масло орегано 4%, сезамовое масло 0,8% в ДВ + 0,05% Tween 80 (поверхностно-активное вещество TWEEN 80(номер продукта: P4780, фирма: Sigma).
4
3
e. Антагонистическая среда («антагонистическая среда») в виде мягкого геля, содержащего экстракт дрожжей (20 г/литр), глицерин (10 г/литр), MgSO (0,1 г/литр), CaCO (2 г/литр), дополненного 0,15% гранулированным агаром (Difco).
Получение среды для хранения:
Каждую испытуемую среду для хранения (9 мл) переливали в 15 мл стерильные пробирки при стерильных условиях. Всего получилось 120 пробирок для каждой испытуемой среды для хранения.
9
8
В каждую пробирку добавляли 1 мл предварительно приготовленных антагонистических бактерий (10 клетки/мл), инокулировали в каждую пробирку до конечной концентрации 10 КОЕ испытуемых бактерий в каждой пробирке. Инокулированные пробирки инкубировали в течение 300 суточного периода при комнатной температуре приблизительно 25°C.
Оценка жизнеспособности испытуемых бактерий в различных средах для хранения:
-8
В течение 294 суток инкубации из каждой пробирки периодически брали образцы (5 репликаций из каждой). Из каждой пробирки получали десятикратное разведение в стерильной дистиллированной воде от 1 до 10. Затем из каждого раствора 100 микролитров распределяли на поверхности антагонистической среды. После инкубации в течение 5 суток при 25°C популяцию определяли как КОЕ/мл исходной пробирки, взятой в определенное время. Результаты представляют собой среднее значение 5 репликаций в каждое время.
Результаты:
Результаты по жизнеспособности приведены ниже в таблицах 2A-2E:
Таблица 2AЖизнеспособность антагонистических бактерий в дистиллированной воде
Сутки от момента инокуляции
CBS133252
CBS133255
CBS133255
1
3,1×10<sup>8</sup>
2,6×10<sup>8</sup>
1,8×10<sup>8</sup>
14
1,6×10<sup>3</sup>
1×10<sup>6</sup>
4×10<sup>3</sup>
28
40
6×10<sup>3</sup>
10
42
0
2×10<sup>2</sup>
0
56
0
20
0
70
0
0
0
84
0
0
0
98
-
-
-
112
-
-
-
126
-
-
-
140
-
-
-
154
-
-
-
168
-
-
-
189
-
-
-
210
-
-
-
231
-
-
-
252
-
-
-
273
-
-
-
294
-
-
-
Таблица 2BЖизнеспособность антагонистических бактерий в 79% масле орегано, 19% сезамовом масле и ДВ 2%
Сутки от момента инокуляции
CBS133252
CBS133255
CBS133255
1
6×10<sup>3</sup>
8,5×10<sup>3</sup>
1×10<sup>3</sup>
14
0
20
0
28
0
0
0
42
0
0
0
56
-
-
-
70
-
-
-
84
-
-
-
98
-
-
-
112
-
-
-
126
-
-
-
140
-
-
-
154
-
-
-
168
-
-
-
189
-
-
-
210
-
-
-
231
-
-
-
252
-
-
-
273
-
-
-
294
-
-
-
Таблица 2CЖизнеспособность антагонистических бактерий в 4% масле орегано и 0,8% сезамовом масле в ДВ
Сутки от момента инокуляции
CBS133252
CBS133255
CBS133255
1
2,4×10<sup>8</sup>
2,5×10<sup>8</sup>
1,7×10<sup>3</sup>
14
0
10
0
28
0
0
0
42
0
0
0
56
-
-
-
70
-
-
-
84
-
-
-
98
-
-
-
112
-
-
-
126
-
-
-
140
-
-
-
154
-
-
-
168
-
-
-
189
-
-
-
210
-
-
-
231
-
-
-
252
-
-
-
273
-
-
-
294
-
-
-
Таблица 2DЖизнеспособность антагонистических бактерий в эмульсии (4% масле орегано, 0,8% сезамовом масле в ДВ + 0,05% Tween 80)
Сутки от момента инокуляции
CBS133252
CBS133255
CBS133255
1
2×10<sup>8</sup>
3×10<sup>8</sup>
2×10<sup>8</sup>
14
0
30
0
28
0
10
0
42
0
0
0
56
0
0
0
70
0
0
0
84
-
-
-
98
-
-
-
112
-
-
-
126
-
-
-
140
-
-
-
154
-
-
-
168
-
-
-
189
-
-
-
210
-
-
-
231
-
-
-
252
-
-
-
273
-
-
-
294
-
-
-
Таблица 2EЖизнеспособность антагонистических бактерий в геле (экстракт дрожжей, глицерин, MgSO<sub>4</sub> CaCO<sub>3</sub>, гранулированный агар)
Сутки после инокуляции
CBS133252
CBS133255
CBS133255
1
3,2×10<sup>8</sup>
2,6×108
1,9×108
14
3,6×10<sup>8</sup>
3,0×108
1,6×108
28
3,5×10<sup>8</sup>
3,0×108
1,5×108
42
3,6×10<sup>8</sup>
3,0×108
1,6×108
56
3,5×108
2,6×108
1,5×108
70
4,2×107
2,2×108
3,5×107
84
1,0×107
1,0×108
1,0×107
98
3,0×106
3,3×107
1,0×106
112
3,0×106
3,0×107
1,0×106
126
4,0×106
4,0×107
9,0×105
140
8,0×105
9,3×106
6,0×105
154
8,0×105
8,8×106
4,0×105
168
3,0×105
6,0×106
5,0×105
189
3,0×105
3,0×106
1,0×105
210
1,0×105
9,0×105
1,0×105
231
8,0×104
8,1×105
6,1×104
252
7,4×104
8,1×105
7,4×104
273
7,6×104
8,1×105
6,4×104
294
7,6×104
8,1×105
5,8×104
В частности, результаты, представленные в таблицах с 2A по 2E, показывают, что жизнеспособность трех испытанных антагонистических бактерий в четырех первых испытанных средах для хранения существенным образом отличается от среды на основе геля.
4
5
В частности, только гелевая (содержащая агар) среда поддерживала длительную (294 суток) жизнеспособность антагонистических бактерий. В конце эксперимента популяция CBS133252 и CBS133255 превышала 5,0×10 КОЕ/мл, в то время как уровень выживших CBS133255 составил приблизительно 8,0×10. Во всех других испытанных средах антагонистические бактерии не выжили спустя приблизительно 40 суток.
Дополнительная характеризация антагонистических бактерий
С целью дополнительной характеризации антагонистических бактерий исследовали разницу в росте бактерий (а также неантагонистов) на различном источнике углерода. В частности, исследовали рост 10 антагонистических бактерий и 6 неантагонистических бактерий на сезамовом масле, глюкозе или глицерине в качестве источников углерода. Среду без источника углерода использовали в качестве контроля.
Материалы
Среды для выращивания включали:
Дистиллированную воду
500 мл
NH<sub>4</sub>H<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
0,10 г
MgS0<sub>4</sub>*7H<sub>2</sub>O
0,01 г
KCl
0,10 г
Испытанный источник углерода
4,20 г
Исходный бактериальный раствор включал:
Бактерии собирали из 24-часовой бактериальной культуры, из которой получали раствор с оптической плотностью 0,65 при 480 нм, разбавленный дистиллированной водой 1:100.
Способ
Десять миллилитров среды для выращивания с или без испытанного источника углерода выливали в 30 мл колбу Эрленмейера и инокулировали с 100 мкл отобранного бактериального раствора. Инокулированные колбы инкубировали при 26°C в течение 24 часов, а затем подвергали десятикратному разведению и подсчитывали. Воду использовали как контроль.
В таблице 3 представлены колониеобразующие единицы/мл для каждого указанного источника углерода и бактерии. В таблице 3 выделенные и депонированные бактерии из таблицы 1 сравнивали с бактериями, выделенными из почвы, как описано выше, но они, как было обнаружено, не проявили антагонистической активности и обозначены как вид Pseudomonas 12 (вид P. 12), вид Pseudomonas 13 (вид P. 13), вид Pseudomonas 14 (вид P. 14), вид Pseudomonas 15 (вид P. 15), вид Bacilus 36, E. coli 4.
Согласно результатам в таблице 3, бактерии с невыявленной антагонистической активностью не были способны к росту на сезамовом масле как единственном источнике углерода.
Таблица 3Бактериальный рост
Номер депонированной бактерии
Контроль*
Сезамовое масло
Глюкоза
Глицерин
CBS134566
60
5×108
107
2×109
CBS133252
80
3×108
102
4×108
CBS133254
100
1×109
6×102
1×109
CBS133255
50
6×108
7×102
7×108
CBS133256
110
9×107
6×108
5×108
CBS134567
90
3×108
1×109
5×108
CBS133257
130
2×109
120
4×109
CBS133258
140
7×107
156
1×108
CBS133259
60
1×108
150
1×108
CBS134568
70
6×107
3×108
7×107
Вид P. 12
60
75
4×109
8×108
Вид P. 13
70
54
3×108
1×108
Вид P. 14
90
100
8×108
5×108
Вид P. 15
90
86
3×109
6×108
Вид Bacilus 36
90
100
3×109
7×108
E. coli 4
110
98
8×108
4×108
Вода
0
0
0
Подтверждение антибактериального эффекта эфирных масел
Материалы и способы
Для проверки антибактериального эффекта эфирных масел проводили следующий анализ.
Масло: масло орегано со следующими особенностями: страна происхождения: Болгария; части растения: цветущее растение; способ культивирования: сертифицированные органические удобрения, способ экстракции: паровая дистилляция.
Бактериальные штаммы: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella, Clavibacter и Xanthomonas campestris получали из коллекции проф. Г. Крицмана, Израиль.
2
2
Диск-диффузионный метод: бактерии выращивали в пробирках с жидкой питательной средой при 27°C в течение 24 часов. Для подготовки к диск-диффузионному способу бумажные диски стерилизовали в автоклаве. Каждую бактерию (100 мкл) помещали в чашки с питательным агаром и оставляли для высыхания в течение 3-5 минут. Бумажные диски пропитывали в 100% концентрированном эфирном масле орегано (20 мкл), а затем помещали в каждую чашку с питательным агаром, свежепокрытым бактериями. Использованным положительным контролем являлся 3% раствор HO и отрицательным контролем была деионизированная вода. Чашки инкубировали при 27°C в течение 48 часов. Зону ингибирования измеряли стандартной линейкой.
Результаты
Антибактериальное воздействие на бактерии коммерческих органических масел кратко изложено в таблице 4, в которой показана более значительная зона ингибирования бактерий, обработанных маслами орегано, по сравнению с контролями.
Таблица 4Антибактериальный эффект масла орегано
Протестированные бактерии
Зона ингибирования (мм)
E. coli
15
S. aureus
19
Salmonela
21
Clavibacter
24
Xanthomonas campestris
22
Положительный контроль
8
Отрицательный контроль
0
Получение эфирно-масляного порошка
Материалы
Для получения масляного порошка использовали следующие материалы:
Натуральные масла:
Масло орегано 100% (эфирное масло) и сезамовое масло 100% (масло на основе углерода), и то, и другое приобретали от Makes Scents Natural SPA line, город Ланкастер, штат Пенсильвания, США.
Поверхностно-активные вещества:
Тимол, карвакрол, Tween 80, Tween 65, Tween R85 и яичный лецитин, все из которых приобретали от Sigma-Aldrich.
Span 40, приобретенный от Fluka, Израиль.
Zohar LQ-215 (жирные кислоты калия) и Zohar PT-50 (жирные кислоты калия), приобретенные от Zohar Dalia.
Кремнеземовые гранулы:
2
Тиксозил (SiO), приобретенный от Rhodia group.
2
Аэрозил 200 и Sipernat 50S (SiO, 20 мкм), приобретенные от Evonik Industries AG.
Растворитель:
Ацетон и ацетонитрил, приобретенные от J.T. Becker, изопропанол (IPA), Gadot.
Способы
Получение порошка
В лабораторных масштабах порошки, содержащие натуральные масла, поверхностно-активные вещества и кремнеземовые гранулы, получали с использованием обычного набора лабораторной посуды из стекла, включая лабораторные бутылки размером 20-50 мл, лопаточки, магнитные мешалки и нагревательные плиты. В целом, натуральное масло взвешивали, и каждое раздельно смешивали с выбранным поверхностно-активным веществом во флаконе 20 мл, в который добавляли растворитель. Смесь каждого масла смешивали и нагревали до температуры приблизительно 40°C до получения гомогенных растворов. К гомогенным растворам добавляли кремнеземовые гранулы до впитывания гранулами жидкости. Бутылки оставляли в вытяжном шкафу в течение ночи до полного испарения растворителя.
Концентрация каждого масла в конечных сухих порошках составляла 30-42%. Сухие порошки содержали 2%-7% воды.
Все соотношения ингредиентов для получения порошка представлены в таблицах 5A-5D:
Таблица 5AПорошок на основе масла орегано
№ состава
Масло орегано
Поверхностно-активное вещество
Кремнеземовые гранулы
Растворитель
Tween 80
Лецитин
Tween 85
Tween 65
Span 40
Тиксозил
Аэрозил 200
Ацетон
ORG-18A
0,5 г
0,5 г
0,1 г
0,8 г
1 г
ORG-18B
0,5 г
0,5 г
0,1 г
0,8 г
1 г
ORG-18C
0,5 г
0,5 г
0,1 г
0,8 г
1 г
ORG-18D
0,5 г
0,5 г
0,1 г
0,8 г
1 г
ORG-20C
0,5 г
0,5 г
0,1 г
0,56 г
0,24 г
1 г
ORG-20D
0,5 г
0,5 г
0,1 г
0,4 г
0,4 г
1 г
Таблица 5BПорошок на основе сезамового масла
№ состава
Масло орегано
Поверхностно-активное вещество
Кремнеземовые гранулы
Растворитель
Tween 80
Лецитин
Tween 85
Tween 65
Span 40
Тиксозил
Аэрозил 200
Ацетон
SES-19A
0,5 г
0,5 г
0,1 г
0,8 г
1 г
SES-19B
0,5 г
0,5 г
0,1 г
0,8 г
1 г
SES-19C
0,5 г
0,5 г
0,1 г
0,8 г
1 г
SES-19D
0,5 г
0,5 г
0,1 г
0,8 г
1 г
ORG-21C
0,5 г
0,5 г
0,1 г
0,56 г
024 г
1 г
ORG-21D
0,5 г
0,5 г
0,1 г
0,4 г
0,4 г
1 г
Таблица 5CСамоэмульгирующийся порошок на основе масла орегано с использованием анионного поверхностно-активного вещества
№ состава
Масло орегано
Поверхностно-активное вещество
Кремнеземовые гранулы
Растворитель
Zohar PT-50
Zohar LQ 215
Тиксозил
Аэрозил 200
Изопропиловый спирт
Ацетон
ORG-22A
0,5 г
0,5 г
0,56 г
0,24 г
0
ORG-22B
0,5 г
0,5 г
0,4 г
0,4 г
1 г
ORG-24A
0,5 г
0,25 г
0,4 г
0,4 г
0
ORG-24B
0,5 г
0,25 г
0,4 г
0,4 г
0,5 г
ORG-24C
0,75 г
0,25 г
0,4 г
0,4 г
1 г
ORG-28
0,5 г
0,25 г
0,56
0,24 г
1 г
Таблица 5DСамоэмульгирующийся порошок на основе сезамового масла с использованием анионных поверхностно-активных веществ
№ состава
Масло орегано
Поверхностно-активное вещество
Кремнеземовые гранулы
Растворитель
Zohar PT-50
Zohar LQ 215
Тиксозил
Аэрозил 200
Изопропиловый спирт
Ацетон
ORG-23A
0,5 г
0,5 г
0,56 г
0,24 г
0
ORG-23B
0,5 г
0,5 г
0,4 г
0,4 г
1 г
ORG-25A
0,5 г
0,25 г
0,4 г
0,4 г
0
ORG-25B
0,5 г
0,25 г
0,4 г
0,4 г
0,5 г
ORG-25C
0,75 г
0,25 г
0,4 г
0,4 г
1 г
ORG-29
0,5 г
0,25 г
0,56
0,24 г
1 г
Для получения большего количество применяли лабораторные электро-механические средства, аналогичные тем, которые используют в промышленности. Они включали:
1. Вертикальную механическую мешалку DC Hsiangtai, оснащенную винтом;
2. Трубку и стабилизатор давления перистальтического насоса 4.4 Carter 4/6 кассетного типа;
3. Смеситель порошков Dynamic Exim 5 л, оснащенный ленточной лопастной мешалкой
4. Весы
5. Стаканы 1-2 л и контейнеры 1-3 л
Получение включали взвешивание и смешивание масла с поверхностно-активным(и) веществом(ами) в 1 л стакане, к которому добавляли изопропиловый спирт при перемешивании до получения гомогенного раствора. Кремнеземовые гранулы (Sipernat 50S) добавляли в 2 л стакан, в который медленно добавляли гомогенный раствор (при скорости 10 мл/мин) во время смешивания (30 об./мин.) до полного впитывания гранулами жидкости.
Все соотношения ингредиентов для получения порошков представлены в таблицах 6A и 6B. Концентрацию масла сохраняли в диапазоне приблизительно 30%-42%.
Таблица 6AПорошок на основе масла орегано
№ состава
Масло орегано
Поверхностно-активное вещество
Кремнеземовые гранулы
Растворитель
Zohar PT 50
Sipernat 50S
Изопропанол
33
20 г
10 г
30 г
20 г
34
200 г
I00 г
300 г
200 г
37A
20 г
15 г
30 г
20 г
37B
20 г
10 г
300 г
15 г
38
2×200 г
2×125 г
2×300 г
2×125 г
Таблица 6BПорошок на основе масла орегано
№ состава
Масло орегано
Поверхностно-активное вещество
Кремнеземовые гранулы
Растворитель
Zohar PT 50
Sipernat 50S
Изопропанол
35
200 г
100 г
300 г
200 г
39
200 г
125 г
300 г
125 г
Кроме того, получали смеси порошков (содержащих масло орегано и содержащих сезамовое масло). В частности, 400 г состава ORG-34 (гранулы, содержащие масло орегано) смешивали с 100 г состава SES-35 (гранулы, содержащие сезамовое масло) в 5-литровом смесителе порошков Dynamic Exim при 10 об./мин. с получением O&S-A.
Каждый вид порошка на основе масла сушили в вакуумной печи при 40°C в течение 24 часов перед смешиванием двух составов.
В другом процессе 800 г состава ORG-38 смешивали с 200 г состава SES-39 в 5-литровом смесителе порошков Dynamic Exim при 10 об./мин. с получением состава со смешанными гранулами O&S-B.
Порошки со смешанными гранулами использовали в том виде, в котором они есть.
Характеризация
Определение содержания воды в порошке
Содержание воды определяли с использованием титратора Mettler Toledo DL-38 Karl Fisher в соответствии со способом Американской Фармакопеи <921>.
Определение изопропанола в порошке
Содержание изопропанола определяли с использованием парофазного анализа в соответствии с параметрами, приведенными ниже:
Газовый хроматограф
-
Agilent 7890 A
Колонка
-
BPX Volatiles, 60 м × 0,25 мм, 1,4 мкм, SGE
Режим термостата
-
45°C в течение 2 минут, затем 10°C/мин до 100°C, затем 25°C/мин до 240°C, в течение 5 минут.
Деление потока
-
1:25
Масс-спектрометр
-
Agilent 5975C
Режим автосамплера
-
CTC Combi PALВремя перед инкубацией: 300 секундТемпература инкубации: 80°CТемпература шприца: 100°CОбъем инъекции: 500 мкл
Флакон со свободным объемом
20 мл
Объем образца (вода)
2 мл
Точки для калибровки (мкг/мл)
10, 25, 100, 500, 1000
Концентрация внутреннего стандарта (этанола)
50 мкг/мл
Анализ масла орегано в сухом порошке с использованием ВЭЖХ
Профиль примесей определяли в соответствии со способом, представленным в H. Hajimehdipoor «A validated high performance liquid chromatography method for the analysis of thymol и carvacrol in Thymus vulgaris L. volatile oil» в журнале Pharmacogn Mag., июль-сентябрь 2010 года; 6(23): 154 158 и внедренным SoluBest. Для этой цели использовали систему ВЭЖХ Nucleosil 100 C18 HD, 3мк, колонка 150×3 мм и Ultimate 3000 Dionex (Германия) с диодно-матричными детекторами и комплекс программного обеспечения Chromeleon версии 6,80. Подвижная фаза представляет собой ацетонитрил:вода (50:50, об./об.). Минимальное разрешение между пиками карвакрола и тимола составляет 1,5.
Стандартные растворы получали в двух параллельных анализах следующим образом:
Приблизительно 3 мг тимола и 20 мг карвакрола взвешивали в 50 мл мерной колба и растворяли в 40 мл разбавителя, затем доводили до объема с использованием разбавителя и смешивали. Полученная в результате концентрация стандартного раствора тимола составляла приблизительно 0,06 мг/мл, а стандартного раствора карвакрола - приблизительно 0,4 мг/мл.
Анализируемые получали в двух параллельных анализах следующим образом:
Приблизительно 70 мг порошкового образца взвешивали в 25 мл мерной колбе, затем доводили до объема с использованием ацетона и смешивали.
Анализ сезомового масла в составе с использованием ГХ
Сезамовое масло, впитавшееся в кремнеземовые гранулы, трансметилировали в течение ночи с помощью метального раствора HCl при 60°C. К гранулам добавляли гептадекановую кислоту, используемую в качестве внутреннего стандарта, перед дериватизацией. Метиловые сложные эфиры жирных кислот экстрагировали с помощью гексана и сушили над безводным сульфатом натрия перед проведением анализа ГХ.
Калибровочные стандарты получали от различных концентраций сезамового масла и пустых гранул. Условия дериватизации и количество внутреннего стандарта были такими же, как описано при получении образца.
Количественный анализ сезамового масла в гранулах проводили с использованием газового хроматографа Agilent 7890, оснащенного детектором ионизации. Соединения разделяли на капиллярной колонке DB-23.
Результаты
Использовали общепринятые аналитические способы ВЭЖХ и ГХ для проведения анализа масла орегано и сезамового масла.
Хроматограммы тестируемых порошков показали, что порошки получение порошка и хранение не привело к разложению (согласно общепринятым показателям, ароматическим соединениям тимола и карвакрола) масла. В таблице 7, представленной ниже, приведены % масла орегано и сезамового масла, соответственно, в порошке на основе анализа ароматических соединений тимола и карвакрола посредством ВЭЖХ.
Таблица 7Содержание масла орегано в составах согласно измерению посредством ВЭЖХ
№ состава
Образец
% с использованием тимола
% с использованием карвакрола
ORG-18A-1
25,2
27,1
ORG-18A
ORG-18A-2
27,1
28,3
Среднее
26,1
27,7
Разница, %
7,2
4,3
ORG-28-1
33,8
34,9
ORG-28
ORG-28-2
32,1
33,2
Среднее
32,9
34,1
Разница
5,5
5,2
ORG-32-1
28,0
30,3
ORG-32
ORG-32-2
28,1
30,7
Среднее
28,0
30,5
Разница
0,6
0,7
В таблице 8 приведены % сезамового масла в составе, как определено посредством газового хроматографа.
Таблица 8Содержание сезамового масла в составах согласно измерению с помощью ГХ
№ состава
Образец
% с использо-ванием CI6:0
% v с использо-ванием C18:0
% с использо-ванием C18:2
SES-19A
SES-19A-1
-
-
28,0
SES-19A-2
-
-
27,6
Среднее
-
-
27,8
Разница, %
-
-
1,4
SES-35
SES-35-1
29,8
30,5
37,5
SES-35-2
30,6
30,6
33,4
Среднее
30,2
30,6
35,5
Разница, %
2,6
0,3
12,3
SES-39
SES-39-1
32,8
33,0
39,8
SES-30-2
31,5
32,3
37,4
Среднее
32,2
32,7
38,6
Разница, %
4,1
2,2
6,4
При измерении содержания воды с использованием титрирования по Карлу-Фишеру обнаружили, что порошок содержит 5-7% воды. Очевидно, что источником воды является поверхностно-активное вещество Zohar PT 50, содержащее 50% воды.
В отношении содержания изопропанола, парофазный анализ ГХ точно указал на содержание изопропанола в составах, что представлено в таблице 9.
Таблица 9Содержание изопропанола в порошках
№ состава
Количество образца (г)
Изопропанол (мкг/мл)
Изопропанол (%)
34
19,6
1,265
12,9
35
200
1,139
11,4
38
20,3
1,117
11,0
39
19,8
492
5,0
Как следует из таблицы 9, количество изопропанола варьируется от 5 до 13%. Однако в производственных условиях составы разбавляли по меньшей мере 30 раз и в сущности содержание изопропанола снижали до 0,17-0,43%, что является ничтожно малым и безопасным количеством.
Различные виды полученных сухих порошков проявили стабильность после длительного (более одного года) хранения. В дополнение к вышеизложенному, следует отметить, что порошки обладают характерным запахом. Составы на основе масла орегано имеют белый цвет с желтоватым оттенком и порошки на основе сезамового масла имеют белый цвет.
При контакте с водой тестируемые составы (ORG-28 и SES-29) незамедлительно образуют эмульсию, оставаясь стабильными в течение 24 часов. Эмульсии состояли из мелких капель размером 3-10 микрон. Эмульсия показала хорошую способность наноситься распылением без закупорирования фильтров.
Исследования безопасности в производственных условиях показали, что тестируемые порошки на основе масла являются безопасными. Это определяли посредством присутствия (или отсутствия) ожогов на растениях согласно определению с помощью общепринятых параметров фитотоксичности.
Кроме того, определили длительную (8-недельная) стабильность порошков. В частности, порошки на основе масла орегано и сезамового масла раздельно герметизировали в пакетах из алюминиевой фольги и помещали в условия хранения при ускоренном испытании (при 40°C в течение 8 недель). Анализ масла орегано измеряли с использованием двух главных составляющих - карвакрола и тимола- в начале исследования на стабильность (начальная точка) и спустя 8 недель с использованием метода ВЭЖХ-УФ. Полученные значения нормализовали до количества показателей в чистом масле орегано.
Анализ сезамового масла измеряли с использованием двух главных составляющих - C16:0 и C18:0 - в начале исследования на стабильность (начальная точка) и спустя 8 недель с использованием анализа газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектором метилированных жирных кислот. Трансметилирование проводили при кислотном катализе (с помощью MeOH/HCl) с использованием C17:0 в качестве внутреннего стандарта. Полученные значения нормализовали до количества показателей в чистом сезамовом масле.
Не наблюдали значительных изменений в обоих составах: количество масло орегано и сезамового масла было аналогичным до и после проведения исследований стабильности.
Содержание воды тестировали с использованием способа Карла Фишера. Количество воды уменьшали до 42% в обоих составах спустя 8 недель хранения в условиях ускоренного испытания.
Содержание изопропанола тестировали с использованием способа ГХ. Количество изопропанола снизился до 36% спустя 8 недели хранения в условиях ускоренного испытания в составе орегано, но оно сохранилось в сезамовом составе.
Не будучи связанными теорией, авторы полагают, что контейнеры были негерметичными и с целью снижения потери воды или изопропанола контейнеры можно более надежно герметизировать.
Порошки, которых хранили в течение 8 недель при 40°C, показали хорошую способность к образованию стабильной эмульсии, аналогично исходным порошкам. Результаты измерений стабильности приведены ниже в таблице 10:
Таблица 10Анализы стабильности
Момент времени
Масло орегано (%)
Сезамовое масло (%)
Вода,%
Изопропанол, %
с использо-ванием C16:0
с использо-ванием C18:0
с использо-ванием тимола
с использованием карвакрола
Порошок орегано
Исходный
28,4
29,0
7,05
11
SORG-121-38
8 недели
29,1
4,05
7
Сезамовый порошок
Исходный
32,2
32,7
6,65
5
SES-121-39
8 недели
33,3
34,2
3,81
5
Растворимость и антибактериальная активность с различными поверхностно-активными веществами
С целью создания стабильной эмульсии «масло-в-воде» необходимо поверхностно-активное вещество (эмульгатор) с ГЛБ 8-20. Таким образом, далее тестировали два поверхностно-активных вещества - Tween 80 со значением ГЛБ 15 и калиевую соль жирных кислот, экстрагированную из растений пальмы, кокоса, маслины, клещевины и хлопчатника (олеат калиевой соли со значением ГЛБ 20).
Выявлено, что в случае с калиевыми солями жирных кислот соотношение масла/поверхностно-активного вещества, необходимого для получения стабильной эмульсии масел орегано составило 1:0,4 в то время как с Tween 80, необходимое соотношение масла/поверхностно-активного вещества составило 1:1.
Корреляция между значениями ГЛБ и растворимость каждого поверхностно-активного вещества была обнаружена в рассматриваемом случае масла орегано, т.е. более высокая растворимость с калиевыми солями жирных кислот. Изопропанол использовали в процессе в качестве вспомогательного соединения, также обеспечившего дополнительную стабильность для получения эмульсий.
В отношении антибактериального эффекта, тестировали несколько эмульгаторов с масло орегано и сезамовым маслом в воде.
Протестированные эмульгаторы включали: Tween 20; Tween 80; Triton X 100; лецитин; ДСН; стеарат натрия и жирная кислота калия. Каждый из эмульгаторов тестировали при следующих концентрациях (в процентах) 1;5;10;15;20 для смеси воды, содержащей 25% масла орегано с 5% сезамовым маслом.
Определяли стабильность в течение первых 24 часов (т.е. отсутствие фазового разделения) и антибактериальную активность каждой эмульсии. Антибактериальную активность определяли посредством измерения зон ингибирования 20 мкл эмульсии по отношению к следующим патогенным бактериям растений: Clavi bacter; Xanthomonas и видам Streptomyces и посредством распыления эмульсий на растения перца, выступающие в качестве испытательных растений на симптомы фитотоксичности.
Результаты показали, что жирная кислота калия была наиболее подходящим материалом для создания стабильной эмульсии при 10% концентрации; зона ингибирования калиевой соли жирной кислоты была больше, чем у других испытанных эмульсий и не была фитотоксичной для растений перца. Полученные данные (не показаны) ясно демонстрируют фитотоксичность на растениях перца, когда эмульгаторами являлись Tween 20 Tween 80, Triton Х100 или ДСН, так как растения, опрысканные эмульсиями, полученными с помощью них, погибли, в то время как при опрыскивании стеаратом натрия или калиевой жирной кислотой.
В другой серии экспериментов масло орегано и поверхностно-активное вещество впитывалось в кремнеземовые гранулы (с помощью изопропанола, как описано выше). Хорошие результаты антибактериальности получали при диспергировании 0,5% порошка на основе орегано в воде. Этот порошок содержал приблизительно 25% масла орегано и эмульгатор - 10% жирные кислоты калия, а именно, концентрация 0,125% масла орегано в эмульсии была в достаточной мере активной, и для растворения порошковой формы потребовалось только 0,05% поверхностно-активного вещества.
Удивительным образом, даже более низкая концентрация порошка была достаточной для достижения хорошей защиты сельскохозяйственной культуры в исследовании в теплице. Только 0,2% порошка и таким образом 0,05% масла орегано было достаточно для диспергирования в воде (для образования эмульсии) и показало отличный и многократный антибактериальный эффект на растениях, обработанных им, с полным сохранением жизнеспособности по сравнению с инфицированным, но не обработанным контролем.
Получение смесей биологического контроля
Три смеси биологического контроля получали следующим образом:
7
8
Каждый из антагонистических гелей, содержащих смесь бактерий, перечень которых приведен выше в таблице 1, использовали в количестве 10-10 КОЕ/мл от каждого антагониста.
7
8
Затем каждый из антагонистических гелей использовали в двух концентрациях, первую - исходную, т.е. без разбавления (в количестве 10-10 КОЕ/мл от каждого антагониста) смешивали с гранулами, содержащими 0,03% натурального масла (эквивалент 1 г гранул в 1 литре воды), обозначенную NB, и второй состав разбавляли x2 водой для образования состава NBx2, в котором концентрация масла составляет 0,06%.
Эксперименты по биологическому контролю
При проведении анализов биологического контроля использовали следующую композицию масляного порошка:
Материалы и композиции
Масла: сезамовое масло 100% (SPAline, серия sicP1A11/01); масло орегано 100% (SPAline, серия 0015181)
Поверхностно-активное вещество: Zohar PT-50 (Zohar Dalia, партия 05511PM1142);
2
Частицы SiO: Sipernet 50S (20μm, Evonik Industries, серия 1462) Спирт: изопропиловый (IPA, Gadot). Состав:
Количество
Масло орегано
Сезамовое масло
ZoharPT-50
Sipernat 50S
Изопропиловый спирт
Всего
кг
40
10
31
75
21
177
%
22,6
5,6
17,5
42,4
11,9
100
Получение порошка
2
Сначала смешивали масло орегано и сезамовое масло, добавляли к ним изопропанол до получения гомогенного раствора. К раствору добавляли поверхностно-активное вещество посредством смешивания до получения невязкого гомогенного раствора. Раствор наносили опрыскиванием на порошок SiO и осуществляли смешивание с использованием оборудования с малым усилием сдвига до полного впитывания всей жидкости и продолжали в течение дополнительного периода продолжительностью 15-30 минут. Затем порошок размалывали для устранения агрегатов и просеивали через сито размером 1000 мкм. Для хранения пакет, содержащий порошок, герметически закупоривали и хранили. Срок хранения составлял по меньшей мере 2 года при 15-30°C.
Пример биоконтроля 1 - In vitro эффекты смеси биоконтроля на различных патогенах
Протестированные патогены: тестировали следующие четыре антагонистические бактерии (определенные по номеру депонирования): CBS133252, CBS133254, CBS134567 и CBS133259.
Clavibacter, Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria и дрожжи брали из частной коллекции автора изобретения.
Способ:
Получение патогена - каждый из тестируемых патогенов отдельно высевали на дектрозном агаре с дрожжевым экстрактом (YDC) и выращивали в течение 48 часов при 25+1°C, после этого поверхность каждой чашки промывали стерильной дистиллированной водой. Затем патоген собирали в пробирки, содержащие стерильную дистиллированную воду. Для каждого испытания два тестируемых патогена объединяли и высевали на чашке Петри.
Получение антагониста - антагонист получали, распределив образец (100 мкл) одного из вышеперечисленных тестируемых антагонистов на поверхности чашки Петри, содержащей среду, и выращивая антагонист в течение 48 часов при 25±1°C на антагонистической среде (геле на основе агара, описываемом в настоящем документе). Затем с помощью резака для пробок части среды, включая антагонистическую смесь, удаляли и помещали на поверхности чашек, содержащих два патогена для комбинированной инкубации.
Спустя 24 часа инкубации патогена при 25±1°C вместе с каждым антагонистом создавали зону ингибирования вокруг частей антагонистов. Зоны ингибирования показаны в виде ореола вокруг колоний. На фигуре 5A показан рост патогенных бактерий без обработки с помощью антагониста, на фигуре 5B показан эффект CBS133252, на фигуре 5C показан эффект CBS133254, на фигуре 5D показан эффект CBS133567, и на фигуре 5E показан эффект CBS133259.
Пример биоконтроля 2 - эффекты смеси биоконтроля на увядание томата
Анализ in vivo проводили в трех сетчатых теплицах для оценки антибактериальной активности трех смесей биоконтроля на томатных растениях Daniella. Томатные растения выращивали с помощью шпалеры.
В качестве положительного контроля использовали гидроксид меди (Kocide, Milchan Bros) в концентрации 0,3% (контроль медью)
Необработанные растения использовали в качестве отрицательного контроля.
Все растения смачивали 50 мл смесью биоконтроля, контролем медью или ничем (отрицательный контроль) в течение трех последующих суток после посадки, с последующим опрыскиванием растений каждые 7 суток. Для опрыскивания эфирно-масляный порошок (в соответствующем количестве) и антагонистический гель смешивали непосредственно в контейнере ранцевого моторного опрыскивателя, и полностью опрыскивали растение, включая листья и стебли.
Спустя 2 недели второе растение в каждом ряду для выращивания в теплице инфицировали инокулятом CBM, содержащим два штамма CBM, выделенных из инфицированных растений, выращенных в регионе Бесор, Израиль. Инокулят включал 2 штамма CBM- номер штамма 32 (обозначение штамма 189/1-1) и номер штамма 42 (обозначение штамма 189/6-1) [Frida Kleitman et al. Characterization of Clavibacter Michiganensis Subsp. Michiganensis population in Israel Eur. J. Plant Pathol (2008) 121:463-475]
Инокуляцию проводили посредством осуществления среза в листе растения, вблизи стебля и погружения листа в инокулят CBM.
Во время роста растения находились под контролем, и осуществляли наблюдение за инфицированными растениями.
Статистический тест
Результаты анализировали с использованием критерия Стьюдента.
Результаты
Вышеуказанное испытание в полевых условиях повторяли шесть раз, и результаты шести повторений приведены в таблице 11 A, в которой представлен уровень гибели томатного растения, и в таблице 11B представлен уровень инфицирования CBM, согласно испытанию с использованием набора Agria для CBM (Cmm ImmunoStrip Test, кат. номер STX 44001 Agdia Incorporated 30380 County Road 6 Eelkhart, штат Индиана, 46514, США)
Таблица 11AКоэффициент выживаемости томатных растений
Обработка
Уровень гибели
Отрицательный контроль
18%
Контроль медью
8%
NB
2%
NBx2
1%
Таблица 11BПроцент инфекции CBM у томатных растений
Обработка
Инфекция CBM
Отрицательный контроль
83,5±11
Контроль медью
58,8+15
NB
50,5+14
NBx2
25,8+12
В таблице 12 приведено статистическое сравнение результатов таблицы 11A
Таблица 12Статистическое сравнение уровня гибели в экспериментальных группах
Сопоставленные группы
P<0,05
Без обработки по сравнению с NBx2
Да
Без обработки по сравнению с NB
Да
Без обработки по сравнению с составом с медью
Нет
Медь состав по сравнению с NB
Да
NB по сравнению с NBx2
Да
В таблице «ДА» обозначает наличие статистически значимого отличия; в то время как «НЕТ» обозначает отсутствие статистически значимого отличия. В таблице 9 показано, что при сравнении NB с любой другой экспериментальной группой положительный эффект является статистически значимым. При сравнении контроля медью с отрицательным контролем положительный эффект обработки гидроксидом меди является незначительным. Удвоение дозы (концентрации NB относительно NBx2) также показывает увеличение статистически значимого эффекта.
Кроме того, в таблице 13 и на фигуре 6 показан эффект обработки в отношении гибели растений.
Таблица 13Гибель
Обработка
% гибели
Отрицательный контроль
18%
Контроль медью
8%
NB
2%
NBx2
1%
В частности, в таблице 13 показано, что необработанная группа отрицательного контроля (контроль) и группа с медью (Cu) имеют более высокий процент гибели по сравнению с экспериментальными группами NB и NBx2. В каждой группе боковой ряд был более сенситивным, чем центральный ряд (не показано). Различие между боковыми рядами и центральными рядами может быть связано с местоположением боковых рядов в теплице, на которое оказывали влияние внешние параметры.
Результаты также указывают на синергизм. В таблице 14 показано, что при более широком температурном диапазоне комбинация натуральных масел (гранул сезамового масла и гранул масла орегано) с антагонистами повышает жизнестойкость растений в большей степени, чем эффект каждого компонента в отдельности [(A+B)/C>1].
В частности, результаты демонстрируют, что комбинированный эффект только антагонистов (A) и только масел (B), разделенный на контроль (C), составляет более чем 1, т.е. синергизм.
Таблица 14Синергизм
Темп. °C
ТОЛЬКОАнтагонист ("A")
% контроля ("A")
Антагонист и масла ("C")
% контроля ("C")
Только масла ("B")
% контроля ("B")
Без обработки (контроль)
% без обработки (контроль)
A+B/C
18
3,33*
60
0
0
3,3
66
5
100
Да
20
14,2
65,4
0
0
15,8
72,8
21,7
100
Да
25
35,8
44,8
4,2
5,3
64,2
80,25
80
100
Да
28
44,2
45
5
5,1
66,7
67,9
98,3
100
Да
32
39,2
53,5
0
0
54,2
73,9
73,3
100
Да
Пример биоконтроля 2 - воздействие смеси биоконтроля на перец
С целью профилактики инфекции xanthomonas vesicatoria (XV) у перца используют аналогичную смесь биоконтроля, которую используют в примере 1, с таким же способом обработки. Патоген изначально был выделен автором изобретения из заболевших перцев и рассады перца. Изоляты xanthomonas vesicatoria (XV) находятся в коллекции Г. Крицмана.
Пример биоконтроля 3 - воздействие смеси биоконтроля на картофель
С целью профилактики инфекции видами Streptomyces у картофеля, вызывающими возбудитель Streptomyces scabies., использовали смесь биоконтроля, содержащую изоляты трех антагонистов, полученные в соответствии с вышеуказанным процессом, осуществленным с некоторыми из предыдущего перечня. Три антагониста представлены ниже в таблице 15.
Таблица 15Депонированные антагонисты для обработки картофеля
Антагонист
Номер доступа
Название
Pseudomonas mediterranea AN1
CBS134566
BN13-01
Pseudomonas chlororahis AN 10
CBS134567
BN13-02
Вид Pseudomonas AN21
CBS134568
BN13-03
3
Смеси биоконтроля получают, как описано выше, в трех концентрациях 1% (без разбавления); 0,5% (при разбавлении 1:1) и 0,025% (1:4 при разбавлении) активного ингредиента (масляного состава) с постоянной концентрацией бактериальных антагонистов при конечной концентрации в баковой смеси, составляющей 10 КОЕ/мл.
Перед использованием антагонистов смешивают в смесительном баке с одним из сухих составов, содержащих, наряду с другими ингредиентами, сухой порошок масла орегано и сухой порошок сезамового масла (в соотношении 80:20, как описано выше). Семенные клубни картофеля вводят в распылительную камеру, распределяя на вращающемся конвейере. В камере клубни проходят через облако капель (приблизительно диаметром 80 мк каждая). После вращения каждого клубня приблизительно 8 раз вокруг своей оси обработанные клубни собирают в контейнер в виде сухих обработанных клубней. Далее обработанные клубни, покрытые тонким слоем конечного состава, готовы для посадки не ранее, чем через 72 часа после обработки.
В случае парши картофеля, эффективность лечения тестируют не посредством искусственной инокуляции клубней, но посредством отбора партий семян картофеля, которые имеется высокая степень заражения естественным образом со многими типичными симптомами на каждом семенном клубне. Это могут быть симптомы обыкновенной парши или парши, отличающейся глубокими впадинками. Исследование семян состояло из двух процессов:
a) образцы 60 клубней с репликациями относят в лабораторию. В лаборатории все клубни очищают коммерческой картофелечисткой, которую используют без смачивания водой клубней во время процесса очистки. Из картофельных очисток собирают крупный образец. Десять граммов помещают в пакет Стомахер, содержащий 90 мл 0,1% (масс./об.) водного агара, дополненного 0,05% (масс./об.) аскорбиновой кислоты. Эту суспензию смешивают в течение 2 часов на ротационном шейкере, а затем в течение 1 минуты в Стомахере. После осуществления этой гомогенизации приготавливают десятикратно разведенные растворы и аликвоты по 100 мкл инокулируют на поверхности чашек Петри, содержащих полуселективную среду для выделения Streptomyces. Спустя 5-суточной инкубации при 28°C КОЕ/г кожуры подсчитывают для обработанных семян картофеля и в сравнении с необработанным контролем.
b) каждое из обработанных и необработанных семян картофеля сажают на опытном поле с по меньшей мере 4 репликациями. В таком эксперименте оценивают параметры роста и урожайности, а также осуществляют контроль парши на дочерних клубнях в период урожая.
Подсчитывали популяцию Streptomyces на грамм кожуры, и результаты приведены в таблице 16:
Таблица 16Обработка парши картофеля
Разведение масляного компонента
Вид Streptomyces
КОЕ/г кожуры
Без разведения (1% масс./об.)
40
1:1
3×10<sup>2</sup>
1:2
1×10<sup>4</sup>
Контроль (необработанный)
1×10<sup>7</sup>
Дополнительные эксперименты по биоконтролю
Для испытания лечения или профилактики других патогенных инфекций можно использовать следующие протоколы.
I. Протоколы для in vitro антагонистической активности
Переносят каждую антагонистическую бактерию в отдельную чашку Петри (9 см) с использованием бактериологической петли для пересевов для образования единичной антагонистической линии по диаметру чашки, и инкубируют чашку в течение 48 часов при 28°C.
Переносят тестируемый патоген по линии перпендикулярно антагонистической линии, не прикасаясь к стенкам чашки.
Инкубируют чашки в течение дополнительного 5-суточного периода при температуре от 25°C до 28°C.
Измеряют зону, в которой антагонист ингибировал рост патогена («зона ингибирования»). Размер зоны ингибирования указывает на уровень антагонистической активности бактерии.
II. Воздействие масляного состава без антагониста.
Создают исходный раствор масляного состава (описан выше, без антагонистических бактерий) посредством растворения масляного порошка в среде, подходящей для культивирования тестируемой патогенной бактерии (среде для культивирования, включающей агар, являющийся жидким при при 37°C) при конечной концентрации масла 1% масс./об. Из исходного раствора получают серию разбавленных вдвое концентраций со средой для культивирования (с разведением 1:1, 1:2, 1:4, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256 и 1:512) масляного состава. Вводят в чашки Петри и оставляют масло, содержащее среду, для затвердения.
Приготавливают патогенную суспензию посредством разбавления физиологическим раствором колоний спустя 48 часов культивирования и выверяют патогенную концентрацию в суспензии до достижения оптической плотности 0,6 ЕОП при 480 нм.
-8
Разбавляют патогенные бактерии до концентрации 10/мл и высевают 100 мкл на затвердевших средах для культивирования, содержащих масло.
Через 5 суток инкубации при 25°C-28°C каждой чашки при различной концентрации масла определяют количество колоний.
III. Бактерицидная или бактериостатическая активность
3
Приготавливают антагонистические составы с различным количеством масла, разбавленным, как описано выше, даже если стерилизованной водой, и каждый разбавленный масляный состав с антагонистами при постоянной концентрации 10 антагонистов на мл.
8
Количество 9 мл антагонистических составов с различными разведениями масла инкубировали в пробирке с аликвотой 1 мл тестируемой патогенной суспензии в концентрации 10 КОЕ/мл. Патогенную суспензию получали из культур спустя 72-часового культивирования.
После инкубации в течение 3 часов содержание каждой пробирки фильтруют на сетчатой мембране 0,45 мм со стерилизованной водой, затем патоген смывают с мембраны с использованием стерилизованной воды и перемешивания вихревым способом.
-8
Затем смытые бактерии десятикратно серийно разбавляют до концентрации 10 КОЕ/мл. Из каждого раствора аликвоты по 100 мкл высевают на чашку Петри с подходящей средой для культивирования и культивируют. Образование колоний является показателем бактериостатической активности составов, в то время как отсутствие колоний является показателем бактерицидной активности.
IV. Испытание растения:
Испытание растения проводят в горшке или в теплице. Для испытания растения с по меньшей мере 5 листьями.
В горшке:
6
На 1 сутки растение опрыскивают тестируемым составом масла/антагониста при различных концентрациях и спустя 12 часов растение опрыскивают раствором патогена в концентрации приблизительно 10 КОЕ/мл.
Спустя два часа после инфицирования растения снова опрыскивали таким же составом масла/антагониста и продолжали опрыскивать каждые 6 суток в течение 6 недель. По прошествии 6 недель оценивали и фиксировали распространение заболевания.
В открытом поле для испытаний или теплице:
Растения выращивают с использованием общепринятого способа посадки и выращивания в теплице.
После посадки растения поливают количеством приблизительно 100 мл масла/антагонистического состава/растение, а затем каждое растение опрыскивают таким же составом и продолжают опрыскивание каждые 5-6 суток.
Оценивают и фиксируют распространение заболевания. Токсикологический анализ
9
Различные токсикологические анализы проводили с использованием состава, включающего смесь с каждым из депонированных антагонистов (таблица 1) при концентрации 10 следующим образом:
(i) Острая пероральная токсичность у крысы:
Протокол:
Самок крыс Sprague-Dawley™ (SD™) разделяли на две группы (n=3), каждая из которых получала однократную дозу 2000 мг/кг тестируемого состава (объем дозировки 1,97 мл/кг, пероральное принудительное кормление (пероральное введение)), с интервалом введения между двумя группами, составляющим 24 часа.
Результаты:
- Не наступила гибель ни одной из испытанных крыс на всем протяжении 14-суточного наблюдения.
- Ни у одного из животных не было очевидных заметных клинических признаков в ответ на введение дозы в период непосредственно после введения дозы или на протяжении всего 14-суточного периода наблюдения.
- По окончании 14-суточного периода исследования было установлено увеличение массы тела всех животных в диапазоне типичных ожидаемых значений.
- Ни у одного из животных не было обнаружено каких-либо тяжелых патологий во время предусмотренного вскрытия животных.
- На основании отсутствия неблагоприятных реакций после единичного перорального введения крысам при предельно допустимом уровне дозирования 2000 мг/кг, тестируемый состав может считаться как не представляющий риска острой токсичности при этом способе введения, и установленная средняя смертельная доза по оценке острой дермальной токсичности (LD50) составляет более чем 2000 мг/кг.
(ii) Острая дермальная токсичность
Протокол:
Однократную дозу 2000 мг/кг тестируемого состава местно наносили в течение 24-часового периода воздействия 5 самкам и 5 самцам крыс Sprague-Dawley (SD™). Крыс наблюдали в течение 14 суток.
Результаты:
- Не наступила гибель ни одной из испытанных крыс на всем протяжении 14-суточного периода наблюдения.
- Ни у одной из испытанных крыс не было очевидных заметных клинических признаков в ответ на введение дозы на протяжении всего 14-суточного периода наблюдения.
- По окончании 14-суточного периода исследования было установлено увеличение массы тела всех крыс в диапазоне типичных ожидаемых значений.
- Ни у одной из крыс не было обнаружено каких-либо тяжелых патологий во время предусмотренного вскрытия животных.
- На основании отсутствия неблагоприятных реакций после единичного нанесения на кожу крысам тестируемый состав не представляет риска острой токсичности при этом способе введения, и установленная средняя смертельная доза по оценке острой дермальной токсичности (LD50) составила более чем 2000 мг/кг.
Острое дермальное раздражение/коррозия у кроликов
Протокол:
Возможные эффекты раздражения кожи тестируемого состава оценивали после единичного нанесения на кожу группе из 3 самцов кроликов породы NZW, в соответствии с процедурой проведения испытаний, рекомендованной разделом 4, № 404, «Острое дермальное раздражение/коррозия» Руководства по испытаниям химических веществ ОЭСР, принятым 24 апреля 2002 года.
В частности, всем кроликам местно наносили единичный образец гигроскопической марли размером 2×3 см, каждый из которых смачивали 0,5 мл тестируемого состава на протяжении 4-часового периода воздействия. Каждый кусочек марли прилегал к коже при помощи не раздражающего кожу пластыря и подходящей полузакрытой повязки (трикотажной TUBIGRIP) для удерживания марлевой повязки и тестируемого состава на всем протяжении периода воздействия.
Кожные реакции оценивали и фиксировали в стандартные моменты времени - 1, 24, 48 и 72 часов после снятия повязки.
Результаты:
- Ни у одного из кроликов не отмечено эритемы или отека на всем протяжении 72-часового периода исследования.
- ни у одного из кроликов не отмечено других кожных реакций на всем протяжении 72-часового периода исследования.
- Ни у одного из кроликов не было очевидных заметных клинических признаков в ответ на обработку на всем протяжении периода исследования.
- Ни у одного из кроликов не отмечено аномальных изменений массы тела на всем протяжении периода исследования.
- Рассматриваемый фактор измеренного индекса первичного раздражения (PII), составившего 0, привел к выводу о том, что ответная реакция на раздражение относится к категории несущественной.
(iii) Кожная сенсибилизация (оценка локальных лимфатических узлов)
Протокол:
Способность тестируемого состава вызывать кожную сенсибилизацию оценивали на основе процедуры проведения испытаний, рекомендованной разделом 4, № 429, «Кожная сенсибилизация: оценка локальных лимфатических узлов» Руководства по испытаниям химических веществ ОЭСР, принятым 22 июля 2010 года.
В частности, три разведения тестируемого состава получали в физиологическом растворе. Pluronic  L92 (1% об./об.) добавляли в каждый дозированный раствор перед применением.
С целью обеспечения воспроизводимости и сензитивности процедуры испытания в это исследование включали контакт, от слабого до умеренного, с общеизвестным аллергеном, 25% ГХА, разведенным с используемым отрицательным контролем.
Три группы самок мышей BALB/c (n=5) подвергали нанесению тестируемого состава (одно разведение на группу) один раз в сутки в течение трех последующих суток, с объемом дозировки 25 мкл, нанесенной на тыльную сторону каждого наружного уха. Две дополнительные группы с равным количеством подвергали нанесению или отрицательного контроля (физиологического раствора), или положительного контроля (25% ГХА), при одинаковых условиях.
Спустя пять суток после первого местного применения всех мышей инъецировали 3H-метил-тимидином посредством внутривенной (в/в) инъекции. Приблизительно через 5 часов всех мышей подвергали эвтаназии, и вырезали ушные лимфоузлы. Получали суспензию отдельных клеток и левого, и правого лимфоузла отдельных животных.
Включение 3H-метил-тимидина измеряли посредством β-Counter и выражали как число распадов в минуту (DPM)/животное.
Индекс стимуляции (SI) рассчитывали для групп, обработанных разведенным тестируемым составом, и положительного контроля. Значения SI для всех разведений были ниже 3 и значения SI для положительного контроля были выше 3.
Результаты:
- Ни одна мышь не погибла во всех группах на всем протяжении 5-суточного периода исследования.
- Не наблюдали заметных клинических признаков в ответ на обработку ни у одной из мышей, обработанных тестируемым составом, или мышей отрицательного контроля на всем протяжении 5-суточного периода исследования. У всех обработанных мышей положительного контроля проявилось покраснение на ушах.
- у всех мышей отмечено увеличение массы тела по окончании 5-суточного периода исследования.
- В условиях исследования и в соответствии с рассчитанными значениями индекса стимуляции, был сделан вывод о том, что протестированный состав не вызывает реакций, связанных с кожной сенсибилизацией.
(iv) Резкое раздражение/коррозия глаз у кроликов
Протокол:
Возможный эффект раздражения/коррозии глаз тестируемого состава оценивали после закапывания в один глаз группе из 3 самцов кроликов породы NZW, в соответствии с процедурой проведения испытаний, рекомендованной разделом 4, № 405, «Острое раздражение/коррозия глаз» Руководства по испытаниям химических веществ ОЭСР, принятым 02 октября 2012 года.
Сначала однократную дозу 0,1 мл тестируемого состава наносили на правый глаз одного кролика (предварительный тест), а затем - еще двум кроликам (контрольный тест). Левый глаз каждого кролика не обрабатывали, и он служил в качестве контроля.
Окулярные реакции оценивали и записывали в стандартные моменты времени - 1, 24, 48 и 72 часа после нанесения.
Результаты:
- Не была отмечена окулярная реакция на всем протяжении 72-часового исследования ни у одного из кроликов.
- Не было очевидных заметных клинических признаков в ответ на обработку ни у одного из кроликов на всем протяжении периода исследования.
- Не было отмечено аномальных изменений массы тела ни у одного из кроликов на всем протяжении периода исследования.
- в условиях этого исследования был сделан вывод о том, что протестированный состав не вызывает реакций, связанных с раздражением/коррозией глаз.