СПОСОБ ПРОГНОЗА ИСХОДОВ ЛАЗЕРНОГО ИНТРАСТРОМАЛЬНОГО КЕРАТОМИЛЕЗА ПРИ МИОПИИ ВЫСОКОЙ СТЕПЕНИ
METHOD OF PREDICTING OUTCOME OF LASER INTRASTROMAL KERATOMILEUSIS IN CASE OF HIGH DEGREE MYOPIA

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано в медицинской практике для прогнозирования исходов лазерного интрастромального кератомилеза (LASIK) при миопии высокой степени.
Прототипом изобретения является способ, заключающийся в том, что в сыворотке крови определяют трансформирующий фактор роста - β1 для выявления возникновения осложнений после антиглаукоматозной операции (патент RU 2227294, 20.01.2004).
Технический результат при использовании изобретения - получение критериев прогноза исходов LASIK при миопии высокой степени.
2
1
1
2
Указанный технический результат достигается за счет того, что в способе прогноза исхода лазерного интрастромального кератомилеза (LASIK), включающем определение трансформирующего фактора роста β1 (TGF-β1) в сыворотке крови, согласно изобретению TGF-β1 определяют до и через 1 сутки после операции LASIK, вычисляют коэффициент экспрессии TGF-β1 по формуле К=С/C, где C - содержание TGF-β1 до операции, С - содержание TGF-β1 после операции, и при значении коэффициента 1,6-1,8 прогнозируют благоприятный исход после операции, а при значении 1,1-1,3 прогнозируют неблагоприятный исход.
Предлагаемый способ прогноза исходов LASIK при миопии высокой степени основан на изучении при этой операции содержания трансформирующего фактора роста β1 (TGF-β1) в сыворотке крови. Среди различных функций TGF-β1 наиболее важной следует считать его участие в регенерации тканей. Установлено, что TGF-β1 активизирует хемотаксис воспалительных клеток и синтез экстрацеллюлярного матрикса. TGF-β1 стимулирует продукцию фибронектина и коллагена фибробластами и повышает внедрение этих белков в экстрацеллюлярный матрикс. Также TGF-β1 влияет на клеточную пролиферацию, дифференцировку и экспрессию генов всех основных типов клеток, вовлеченных в ранозаживление или в патогенез различных фиброзных заболеваний. Подтверждением достоверности предлагаемого способа прогноза является совпадение значения коэффициента экспрессии TGF-β1 в пределах 1,6-1,8 с благоприятным исходом LASIK при миопии в среднем в 100% случаев и значения коэффициента экспрессии TGF-β1 в пределах 1,1-1,3 с неблагоприятным исходом LASIK при миопии в среднем в 85,7% случаев.
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. В сыворотке крови определяют содержание TGF-β1 до операции и через 1 сутки после операции.
Взятие крови без антикоагулянта для получения сыворотки осуществляют натощак из локтевой вены обследуемых в строго стерильных условиях.
Определение уровня трансформирующего фактора роста β1 в сыворотке крови больных проводят методом иммуноферментного анализа с использованием тест-систем DRG TGF-β1 ELISA.
В соответствующие лунки вносят по 100 мкл подготовленных (подкисленных и нейтрализованных) калибратов образцов (предварительно разведенных 1:50). Планшет инкубируют в течение ночи (8-16 часов) при 4°С, в качестве альтернативы инкубируют 3 часа при комнатной температуре. Затем содержимое лунок резко вытряхивают, и планшет 3 раза промывают разведенным промывочным раствором (300 мкл/лунка). Проводят удаление оставшейся жидкости, постучав плашкой о фильтрованную бумагу.
В каждую лунку вносят по 100 мкл антисыворотки. Планшет инкубируют в течение 2 часов при комнатной температуре. Содержимое лунок резко вытряхивают и 3 раза промывают разведенным промывочным раствором (300 мкл/лунка). Удаляют остатки жидкости путем постукивания плашкой об фильтрованную бумагу.
Во все лунки планшета вносят по 100 мкл ферментного конъюгата (антимышиные биотинилированные антитела). Микропланшет инкубируют в течение 45 минут при комнатной температуре. Содержимое лунок резко вытряхивают и 3 раза промывают разведенным промывочным раствором (300 мкл/лунка). Удаляют остатки жидкости путем постукивания плашкой о фильтрованную бумагу.
Во все лунки планшета вносят по 100 мкл ферментного комплекса. Микропланшет инкубируют в течение 45 минут при комнатной температуре. Содержимое лунок резко вытряхивают и 3 раза промывают разведенным промывочным раствором (300 мкл/лунка). Удаляют остатки жидкости путем постукивания плашкой о фильтрованную бумагу.
Во все лунки вносят по 100 мкл субстратного реагента (ТМБ). Микропланшет инкубируют в течение 15 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливают добавлением по 50 мкл стоп-реагента в каждую лунку, затем определяют оптическую плотность при 450±10 нм микропланшетным ридером в течение 10 минут. Результат выражают в пкг/мл.
Затем определяют коэффициент экспрессии TGF-β1 по формуле
2
1
К=С/С,
где К - коэффициент экспрессии TGF-β1;
1
C - содержание TGF-β1 в сыворотке крови до операции;
2
C- содержание TGF-β1 в сыворотке крови после операции.
При его значении 1,6-1,8 прогнозируют благоприятный исход, если же коэффициент экспрессии TGF-β1 находится в пределах 1,1-1,3, то прогнозируют неблагоприятный исход операции.
У 39 пациентов с миопией высокой степени было изучено содержание трансформирующего фактора роста β1 в сыворотке крови до и после операции LASIK. Взятие крови без антикоагулянта для получения сыворотки осуществляли натощак из локтевой вены обследуемых в строго стерильных условиях.
Определение уровня трансформирующего фактора роста β1 в сыворотке крови больных проводили методом иммуноферментного анализа с использованием тест-систем DRG TGF-β1 ELISA.
В соответствующие лунки вносили по 100 мкл подготовленных (подкисленных и нейтрализованных) калибратов образцов (предварительно разведенных 1:50). Планшет инкубировали в течение ночи (8-16 часов) при 4°С, в качестве альтернативы инкубировали 3 часа при комнатной температуре. Затем содержимое лунок резко вытряхивали, и планшет 3 раза промывали разведенным промывочным раствором (300 мкл/лунка). Провели удаление оставшейся жидкости, постучав плашкой о фильтрованную бумагу.
В каждую лунку вносили по 100 мкл антисыворотки. Планшет инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. Содержимое лунок резко вытряхивали и 3 раза промывали разведенным промывочным раствором (300 мкл/лунка). Удаляли остатки жидкости путем постукивания плашкой об фильтрованную бумагу.
Во все лунки планшета вносили по 100 мкл ферментного конъюгата (антимышиные биотинилированные антитела). Микропланшет инкубировали в течение 45 минут при комнатной температуре. Содержимое лунок резко вытряхивали и 3 раза промывали разведенным промывочным раствором (300 мкл/лунка). Удаляли остатки жидкости путем постукивания плашкой о фильтрованную бумагу.
Во все лунки планшета вносили по 100 мкл ферментного комплекса. Микропланшет инкубировали в течение 45 минут при комнатной температуре. Содержимое лунок резко вытряхивали и 3 раза промывали разведенным промывочным раствором (300 мкл/лунка). Удаляли остатки жидкости путем постукивания плашкой о фильтрованную бумагу.
Во все лунки вносили по 100 мкл субстратного реагента (ТМБ). Микропланшет инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением по 50 мкл стоп-реагента в каждую лунку, затем определяли оптическую плотность при 450±10 нм микропланшетным ридером в течение 10 минут. Результат выражали в пкг/мл.
Коэффициент экспрессии TGF-β1 вычисляли по формуле
2
1
К=C/C,
где К - коэффициент экспрессии TGF-β1;
1
С - содержание TGF-β1 в сыворотке крови до операции;
2
С - содержание TGF-β1 в сыворотке крови после операции.
При его значении 1,6-1,8 прогнозировали благоприятный исход, если же коэффициент экспрессии TGF-β1 находился в пределах 1,1-1,3, то прогнозировался неблагоприятный исход операции.
У 14 (35,8%) из 39 пациентов коэффициент экспрессии TGF-β1 находился в пределах 1,1-1,3. При этом неблагоприятный исход операции наблюдался у 12 (85,7%) пациентов. К неблагоприятным исходам операции относили развитие помутнений подлоскутного пространства роговицы, развитие регресса близорукости, которые приводили к снижению остроты зрения. У 2 (14,3%) пациентов послеоперационный период протекал благополучно.
У 16 (41,02%) из 39 пациентов, перенесших LASIK по поводу миопии высокой степени, значение коэффициента экспрессии TGF-β1 составляло 1,6-1,8. У всех пациентов из этой группы послеоперационный период протекал без осложнений. Поэтому значение коэффициента экспрессии TGF-β1 в пределах 1,6-1,8 ассоциируется с благоприятным исходом операции.
У 9 (23,07%) из 39 прооперированных пациентов значение коэффициента экспрессии TGF-β1 не попадало в вышеуказанные интервалы. В данной группе пациентов в равной степени наблюдались как благоприятные, так и неблагоприятные исходы. В этих случаях невозможно достоверное прогнозирование исхода операции.
Таким образом, предлагаемый способ прогноза неблагоприятных исходов LASIK при миопии высокой степени подтвердился у 12 из 14 пациентов, что было достоверно в 85,7% случаев, а прогноз благоприятного исхода операции являлся правильным в 16 случаях из 16, что достоверно в 100% случаев.
Предлагаемый способ иллюстрируется следующими клиническими примерами.
Пример 1. Пациентка П., 33 года. Диагноз OU Миопия высокой степени. Острота зрения 0,08/0,09 с коррекцией -6,25/-6,5 Д=1,0/1,0. Внутриглазное давление 13/12 мм рт.ст. (бесконтактно). Рефрактометрия в условиях циклоплегии: sph - 6,00/-6,25 Д cyl-0,25/-0,25 Д ax 87°/92°. OU Спокойные. Коньюнктива бледно-розовая. Роговица прозрачная. Передняя камера средней глубины, влага прозрачная. Зрачок круглый, реакция на свет живая, содружественная. Хрусталик прозрачный. Рефлекс с глазного дна розовый. ДЗН бледно-розовый, границы четкие, физиологическая экскавация. Макулярная область без изменений. Периферическая хориоретинальная дистрофия. Сосуды нормального калибра. Проведена LASIK на оба глаза. До операции было проведено определение содержания TGF-β1 в сыворотке крови пациента, оно составило 18,25 нг/мл, через сутки после операции оно увеличилось до 20,0 нг/мл. Коэффициент экспрессии TGF-β1 составил 1,1, на основании чего прогнозировали неблагоприятный исход операции. Пациентка получала стандартное послеоперационное лечение. Через 3 месяца после операции острота зрения составила 0,8/0,8, не корригировала. OU спокойные. В подлоскутном пространстве роговицы определяется помутнение в оптической зоне. Глубжележащие среды без динамики. Следовательно, значение коэффициента экспрессии TGF-β1 1,1 совпало с прогнозом неблагоприятного исхода операции.
Таким образом, значение коэффициента экспрессии TGF-β1 в пределах 1,1-1,3 свидетельствует о прогнозе неблагоприятного исхода операции.
Пример 2. Пациентка С., 35 лет. Диагноз OU Миопия высокой степени. Острота зрения 0,07/0,08 с.к. -8,0 Д=1,0/1,0. ВГД 12/12 мм рт.ст. (бесконтактно). Рефрактометрия в условиях циклоплегии: sph - 8,25/-8,25 Д cyl +0,25/-0,25 Д ax 96°/94°. OU Спокойные. Конъюнктива бледно-розовая, Роговица прозрачная. Передняя камера средней глубины, влага прозрачная. Зрачок круглый, реакция на свет живая, содружественная. Хрусталики прозрачные. Рефлекс с глазного дна розовый. ДЗН бледно-розовый, границы четкие, миопический конус. Макулярная область без изменений. Сетчатка умеренно разрежена на периферии. Сосуды нормального калибра. Проведена LASIK на оба глаза. Определение TGF-β1 в сыворотке крови и расчет коэффициента экспрессии TGF-β1 проводились по предлагаемой методике. До операции содержание TGF-β1 в сыворотке крови составило 15,1 нг/мл, через сутки после операции его содержание повысилось до 26,95 нг/мл. Коэффициент экспрессии TGF-β1 составил 1,78, на основании чего прогнозировали благоприятный исход операции. Действительно, послеоперационный период протекал без осложнений. Острота зрения после операции составила 1,0/1,0 без коррекции и оставалась стабильной в течение всего срока наблюдения за пациентом. OU спокойные. Роговицы прозрачные, подлоскутные пространства чистые. Глубжележащие среды без динамики. Это подтвердило ранее прогнозированный благоприятный исход операции.
Таким образом, предлагаемый способ прогноза исходов LASIK при миопии высокой степени позволяет оценить характер послеоперационного периода по содержанию TGF-β1 в сыворотке крови до операции и его изменению в течение первых суток после операции.