Способ оценки активности регенерации полнослойной кожной раны крысы в эксперименте
METHOD FOR ESTIMATING ACTIVITY OF REGENERATION OF FULL-LAYER RAT SKIN WOUND IN EXPERIMENT

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к медицине, а именно к области экспериментальной хирургии.
Уровень техники
При проведении исследований эффективности использования ранозаживляющих препаратов парентерального или местного применения проводится постановка эксперимента на животных, чаще всего для этой цели используются крысы.
В настоящее время единственным общедоступным и распространенным методом оценки регенерации кожных покровов в эксперименте на лабораторных животных является гистологическое исследование срезов кожной раны, проведенных через 3, 5, 7 и 14 дней после постановки эксперимента. Животное при этом умертвляется, учитывая, что используются парные опыты и для подтверждения достоверности полученных результатов забор материала проводится у нескольких животных одномоментно, количество особей, участвующих в эксперименте превышает несколько десятков, что создает не только экономические, но и этические проблемы.
Известно несколько способов оценки протекания процесса регенерации при кожной ране, однако они разработаны для клинического применения в медицине, затратны и сложны в выполнении.
%
%
Так известен (аналог) "Способ прогнозирования репаративной регенерации при заживлении операционной раны вторичным натяжением" (патент РФ на изобретение №2225982 от 11.03.2002). Авторы предлагают на третьи сутки после разведения краев операционной раны определить синтез ДНК фибробластов и адвентициальных клеток и при их показателях соответственно менее 0,14±0,015 и адвентициальных клеток менее 0,13±0,011 прогнозируют замедление репаративной регенерации и осложненное течение раневого процесса.
Известен (аналог) "Способ оценки течения раневого процесса и эффективности лечения кожных ран различного генеза" (патент РФ на изобретение №2478963 от 21.11.2011). Данный способ включает в себя забор биологического материала из раны в течение раневого процесса и его исследование, при этом соскобы берут с поверхности раны, из них выделяют ДНК с помощью реагента ДНК-ЭКСПРЕСС с красителем для электрофоретической детекции, полученный супернатант, содержащий ДНК, вносят в лунку длиной 4 мм 2% агарозного геля с бромистым этидием и подвергают горизонтальному электрофорезу в течение 15 мин, на полученных электрофореграммах измеряют длину полученных треков, которую соотносят с длиной лунки и между собой и при длине трека, превышающей длину лунки в 4,7-5,6 раз и более, диагностируют I фазу раневого процесса, при длине трека, превышающей длину лунки в 3,8-4,6 раз, диагностируют II фазу раневого процесса, при длине трека, превышающей длину лунки в 2,6-3,7 раза и менее, диагностируют III фазу раневого процесса; укорочение длины трека в динамике раневого процесса оценивают как положительное течение заживления раны, лечение считают эффективным, удлинение трека или отсутствие изменений его длины в динамике раневого процесса оценивают как отрицательное течение заживления раны, лечение считают неэффективным и изменяют тактику лечения.
Известен (прототип) "Способ диагностики степени пролиферативной активности раневого процесса" (Бажитов А.П., Мартель И.И., Долганова Т.И., RU 2455941, опубл. 20.07.2012). Данный способ заключается в исследовании состояния капиллярного кровотока кожных покровов с применением ультразвукового допплера с высокочастотными датчиками («Минимакс-допплер К», г. С.-Петербург), устанавливаемыми в зону раневой поверхности и на ее границе. По полученным данным рассчитывают индекс перепада кровотока (см/сек). При его значении менее 1,0 диагностируют замедление пролиферативной активности течения раневого процесса, при значениях от 1,0 до 3,0 определяют умеренную пролиферативную активность течения раневого процесса, а свыше 3,0 - выраженную пролиферативную активность течения раневого процесса.
Данные способы имеет следующие недостатки:
- не применим на большинстве лабораторных животных в связи с небольшими размерами самого животного;
- с невозможно позиционировать и зафиксировать датчик в нужном месте на коже животного без применения успокаивающих или обездвиживающих препаратов, что негативно скажется на параметрах кровотока.
В заявленном способе перечисленные недостатки устранены.
Раскрытие изобретения
Задачей изобретения является оценка активности регенерации полнослойной кожной раны крысы в эксперименте
Техническим результатом способа является обеспечение достоверного выявления лабораторных животных (крыс) с не измененной активностью регенерации, животных с улучшением процесса регенерации раны и животных с ухудшением процесса регенерации раны.
Осуществление изобретения
Заявленный технический результат может быть достигнут следующим образом:
- Животное вводится в краткосрочный ингаляционный наркоз путем вдыхания паров эфира (смоченная ватка).
- На участке, превышающем размеры будущей раны, с помощью машинки для бритья удаляется волосяной покров.
2
- Операционное поле обрабатывается спиртом, затем прикладывается смоченный раствором йода квадратный трафарет площадью 225 мм. По границе отпечатка остроконечными ножницами удаляется лоскут кожи с подкожной клетчаткой.
- Проводится допплерографическое исследование (например, используется ультразвуковой компьютеризированный прибор «Минимакс-Доплер-К»)
- На 7 и 14 сутки определяется значение объемных скоростей кровотока и определяется площадь раны.
- Рассчитывается соотношение площади раны к средней систолической объемной скорости и сравнивается с предложенными пороговыми значениями (об улучшении процесса регенерации раны свидетельствует снижение данного соотношения менее 9,6 на 7 сутки и менее 4,45 на 14 сутки, об ухудшении процесса регенерации раны свидетельствует повышение данного соотношения более 10 на 7 сутки и более 4,88 на 14 сутки, во всех стальных случаях выявляется не измененная активность регенерации).
В ходе серии экспериментов мы смогли обосновать использование 7 и 14 суток для исследования
Способ иллюстрируется следующим образом: эксперимент выполнялся на 40 крысах, которых содержали в виварии на стандартном рационе при естественном освещении и средней температуре воздуха 20°±2°С, вода не ограничивается. Экспериментальные манипуляции выполняли в соответствии с международными рекомендациями по использованию животных в биологических и медицинских исследованиях (от 1986 г.), международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (от 1989 г.), методическими рекомендациями «Деонтология медико-биологического эксперимента» (от 1987 г.). Условия содержания и кормления экспериментальных животных осуществляли в соответствии «Санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник», утвержденных приказами МЗ СССР №1045 от 6.04.73., №1179 от 10.10.83 г. Все животные содержались в стандартных условиях вивария с учетом требований к работе с экспериментальными животными (Лоскутова З.Ф., 1980). Выведение животных из эксперимента проводили на 7 и 14 сутки в соответствии с Приказом №742 от 13.11.84 «Об утверждении Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». На работу получено разрешение Этического комитета ТГМУ.
2
Экспериментальные раны наносились всем животным однотипно в области дорсальной поверхности тела, под эфирным наркозом. На участке, превышающем размеры будущей раны, с помощью машинки для бритья удаляли волосяной покров. На операционное поле, обработанное спиртом, прикладывали смоченный раствором йода квадратный трафарет площадью 225 мм. По границе отпечатка остроконечными ножницами удаляли лоскут кожи с подкожной клетчаткой. Раневая поверхность составляла в среднем 14,5% от площади тела. Заживление инсеминированной полнослойной хирургической раны происходило открытым способом, без наложения повязки.
Допплерографические исследования микроциркуляции в области регенерата проводили на ультразвуковом компьютеризированном приборе «Минимакс-Доплер-К» фирмы «СП Минимакс». Данный прибор имеет набор датчиков и компьютерное обеспечение. Традиционные частоты ультразвука, применяемые в ангиологии (2-15 МГц) не дают возможности определить скорость кровотока в сосудах микроциркуляторного русла. При измерении низкоскоростного кровотока, характерного для сосудов микроциркуляторного русла, используются ультразвуковые датчики, работающие на частоте 20-25 МГц. При этом увеличивается чувствительность датчика и разрешение измерения линейной скорости кровотока. В данной технологии высокочастотная допплерография рассматривается как метод мониторирования микроциркуляции. Предлагаемая диагностическая медицинская технология позволяет в скрининговом режиме оценить состояние реактивности сосудов микроциркуляторного русла и вазомоторной функции эндотелия.
Основное действие прибора заключается в следующем: поступающий на приемный элемент датчика отраженный сигнал кровотока в микроциркуляторном русле грануляционной ткани содержит разные допплеровские частоты. В компьютерной части прибора этот сигнал автоматически усиливается, фильтруется и обрабатывается по специальной компьютерной программе. Полученные результаты выдаются на дисплей персонального компьютера в виде допплерограмм с цветным спектром, полученным через «быстрое преобразование Фурье». Чем выше скорость отражателя (красных кровяных телец - эритроцитов), тем дальше от изолинии находится соответствующая ему точка. Что соответствует темной части спектра. Наиболее быстрые частицы находятся в центре потока, медленные в пристеночных областях сосудов.
В реальном кровотоке частицы движутся с разными скоростями и в разных направлениях, в связи с этим в результате обработки допплерограмм мы получали данные о линейной систолической, линейной средней, линейной диастолической и объемной скоростях кровотока в обследуемом участке кожного регенерата. Для решения поставленных задач исследования микроциркуляции в зоне регенерации применялся датчик с частотой сигнала 20 МГц, позволяющий оценить гемодинамику на глубине от 0 до 0,8 см. Состояние микроциркуляции определялось по данным спектрального анализа допплеровского сигнала автоматически, с помощью программного обеспечения прибора. Местом конкретного расположения датчика была выбрана точка на границе с повреждением, с углом постановки, дающим возможность получить данные с наибольшего числа микрососудов - 60 градусов к поверхности.
Для исследования гемодинамических характеристик участка тканей с микрососудами применяется непрерывный ультразвуковой датчик частотой 25 МГц.
Акустический контакт обеспечивался через нанесенный на исследуемую область гель, в связи с этим показания ультразвукового допплерографа не зависели от степени прижима датчика.
Для контроля правильности установки датчика в точке локации мы использовали выход прибора на устройство слухового контроля - звуковые стереоколонки, фиксирующие шум тока крови. Также нами осуществлялся визуальный контроль наличия на экране прибора характерного для микроциркуляторного русла допплеровского спектра. Это позволило нам более точно позиционировать датчик и получить четкую спектральную картину. Ультразвуковой сигнал с группы различных по характеру сосудов грануляционной ткани выражался звуком в виде слабых по амплитуде пульсаций на фоне шума «морского прибоя» - т.е. смешанный звук. В результате обработки допплерограмм были получены значения средних линейных и объемных скоростей кровотока.
В качестве критериев оценки заживления раны использовали методы макроскопического динамического наблюдения и планиметрии (определение площади кожного дефекта) (Кузин М.И., Костюченок Б.М., 1990), а также микроскопические и иммуногистохимические методики.
2
При межгрупповых сравнениях площади раны на этапах эксперимента в контрольной группе выявлены статистически значимые различия критерий (р=0,0001). Регрессионная модель для изменения площади раны в эксперименте демонстрирует линейную зависимость Y=3,108 - 0,136хХ (р=0,0001), то есть при увеличении времени заживления на 1 сутки площадь раны уменьшится на 0,136 см. R=0,656, то есть 65,6% изменений площади раны обусловлено временем регенерации.
На основании данных математического моделирования были выделены следующие критерии: об улучшении процесса регенерации раны свидетельствует снижение данного соотношения менее 9,6 на 7 сутки и менее 4,45 на 14 сутки, об ухудшении процесса регенерации раны свидетельствует повышение данного соотношения более 10 на 7 сутки и более 4,88 на 14 сутки, в ином случае активность регенерации считается не измененной
Новизна заявляемого способа заключается в том, что:
- впервые используется неинвазивный способ получения информации о протекании процесса регенерации в ране;
- впервые не требуется забивание экспериментального животного (вывод из эксперимента не проводится);
- впервые не проводится нарушение соотношений кожных структур, участвующих в процессе регенерации кожной раны, путем механического вмешательства при заборе образцов;
- впервые появляется возможность многократной оценки процесса регенерации у одного и того же животного;
- стоимость проводимых исследований ниже, чем проведение биохимического или гистологического исследования;
- исследование может быть проведено на любой экспериментальной или клинической базе не зависимо от модели и типа допплерографического оборудования
Отличительные признаки способа:
- все измерения проводят на 7 и 14 сутки с момента нанесения повреждения,
- рассчитывается соотношение площади раны к средней систолической объемной скорости,
- об улучшении процесса регенерации раны свидетельствует снижение данного соотношения менее 9,6 на 7 сутки и менее 4,45 на 14 сутки,
- об ухудшении процесса регенерации раны свидетельствует повышение данного соотношения более 10 на 7 сутки и более 4,88 на 14 сутки,
- во всех стальных случаях выявляется не измененная активность регенерации.