СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
MEDICATION FOR TREATMENT OF CARDIOVASCULAR DISEASES

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и касается средств, обладающих гемореологической, антиагрегатной, антитромбогенной, ретинопротекторной, эндотелийпротекторной, нейропротекторной, противоаритмической и противоишемической активностью, а также увеличивающих мозговой кровоток.
Известно средство, обладающее антирадикальной, гемореологической, антитромбоцитарной и антитромбогенной активностью [Патент №2347561, A61K 31/05, 2008].
Известно средство, проявляющее противоишемические свойства [Патент №2499593, A61K 31/05, 2013].
Известно средство, проявляющее противоаритмическую активность [Щетинин П.П. Противоаритмическая активность диборнола в условиях модели острой ишемии - реперфузии миокарда / Бюллетень сибирской медицины, 2003, том 12, №3, с. 153-156].
Известно средство, обладающее нейропротекторной активностью [Патент №2406488, A61K 31/05, 2010].
Известно средство, обладающее ретинопротекторной активностью [Патент №2406487, A61K 31/05, 2010].
Известно средство, проявляющее эндотелийпротекторные свойства [Иванов И.С. Нейропротекторная и антитромбогенная активность 4-метил-2,6-диизоборнилфенола / Автореферат диссертации кандидата биологических наук, Томск, 2009, 24 с].
Известно средство, способное увеличивать мозговой кровоток [Патент №2351321, A61K 31/05, 2009].
Указанные средства представляют собой 4-метил-2,6-диизоборнилфенол.
Известно, что данное соединений представляет смесь структурных изомеров [Патент №2502719, С07С 39/17, 2013], однако не известно о соотношении данных изомеров в смеси, и влияние их соотношения на проявляемую ими фармакологическую активность.
Задачей изобретения является расширение арсенала средств, обладающих одновременно гемореологической, антиагрегатной, антитромбогенной, ретинопротекторной, эндотелийпротекторной, нейропротекторной, противоаритмической и противоишемической активностью, увеличивающих мозговой кровоток. Также в задачу изобретения входило выявление фармакологической активности указанного средства, проявляющего указанные свойства.
Поставленная задача достигается использованием смеси структурных изомеров 2,6-ди(1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)-4-метилфенола (изомер 1) и 2-(1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил), 6-(2,2,1-триметилбицикло[2.2.1]гепт-5-ил)-4-метилфенола (изомер 2) в качестве лекарственного средства, обладающего гемореологическими, антиагрегатными, антитромбогенными, ретинопротекторными, эндотелийпротекторными, нейропротекторными, противоаритмическими и противоишемическими свойствами, увеличивающего мозговой кровоток с высокой степенью активности при следующем соотношении изомеров:
от 60 до 95 мас.% для первого изомера и от 40 до 5 мас.% для второго изомера.
В литературе отсутствует информация по применению смеси структурных изомеров 2,6-ди(1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)-4-метилфенола и 2-(1,7,7-триметил-бицикло[2.2.1]гепт-2-ил), 6-(2,2,1-триметилбицикло[2.2.1]гепт-5-ил)-4-метилфенола с указанным соотношением изомеров как гемореологического, антиагрегатного, антитромбогенного, ретинопротекторного, эндотелийпротекторного, нейропротекторного, противоаритмического, противоишемического, увеличивающего мозговой кровоток средства при заболеваниях сердечно-сосудистой системы. В литературе описано применение только одного изомера - 2,6-ди(1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)-4-метилфенола, однако выделение его в чистом виде приводит к большим потерям в выходе и удорожанию препарата.
Новым в предлагаемом изобретении является то, что в качестве гемореологического, антиагрегатного, антитромбогенного, ретинопротекторного, эндотелийпротекторного, нейропротекторного, противоаритмического, противоишемического, увеличивающего мозговой кровоток средства используется смесь указанных диастереомеров 2,6-ди(1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)-4-метилфенола и 2-(1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил), 6-(2,2,1-триметилбицикло[2.2.1]гепт-5-ил)-4-метилфенола с соотношением изомеров 60:40 мас.% + 95:5 мас.%, которое может применяться для лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Данная смесь получается в результате подбора условий реакции алкилирования по Фриделю-Крафтсу пара-крезола камфеном и не требует дорогостоящих методов очистки. Соотношение изомеров рассчитывалось по спектрам ЯМР (Фиг. 1) и соотношению площадей пиков на ВЭЖХ (Фиг. 2 - 95:5 и Фиг. 3 - 60:40). Для анализа использовали жидкостной хроматограф «SURVEYOR LC», оснащенный УФ-детектором с фотодиодной матрицей (фирмы Thermo, США).
2
Разделение смеси диастереоизомеров проводили на колонке Hypercarb, 100×2.1 мм, размер частиц 5 мкм (Thermo, США). Подвижная фаза - ацетонитрил + 0.1% муравьиной кислоты, режим элюирования - изократический, скорость потока - 600 мкл/мин (Фиг. 2) или элюент ацетонитрил + НО + 0.1% муравьиной кислоты, режим элюирования - градиентный, скорость потока - 300 мкл/мин (Фиг. 3). Структура 2,6-ди(1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)-4-метилфенола была подтверждена рентгеноструктурным анализом (Фиг. 4).
Для специалиста эти свойства явным образом не вытекают из уровня техники.
Таким образом, предметом исследования явились следующие соединения.
Соединение 1 - 4-метил-2,6-диизоборнилфенол.
Соединение 2 - смесь структурных изомеров и их диастереомеров: 2,6-ди(1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)-4-метилфенола и 2-(1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил), 6-(2,2,1-триметилбицикло[2.2.1]гепт-5-ил)-4-метилфенола с соотношением изомеров от 60% до 95 мас.% для первого изомера и от 40% до 5 мас.% для второго изомера.
Эффективность соединения 2 по сравнению с контролем и соединением 1 продемонстрирована в модельных экспериментах на крысах линии Wistar при внутрижелудочном введении в дозе 100 мг/кг.
2
Во всех примерах статистическая обработка результатов была осуществлена с помощью пакетов программ "BioStat" для Windows с применением t-критерия Стьюдента и критерия χ. Для оценки достоверности различий при сравнении средних величин использовали непараметрический критерий Манна-Уитни.
Сущность изобретения поясняется примерами конкретного выполнения.
Пример 1. Эксперименты проведены на 90 крысах-самках линии Wistar массой 190-210 г. Крысы были разделены на 3 группы по 30 животных в каждой. На модели тотальной транзиторной ишемии головного мозга по методу W.A. Pulsinelli, J.B. Brierley [1979] оценивались нейропротекторные эффекты. Для этого за 1 сутки до моделирования ишемии у наркотизированных крыс (тиопенталом-натрия 60 мг/кг, внутрибрюшинно) на уровне первого шейного позвонка производилось термокоагуляция обеих вертебральных артерий. Через 24 ч под эфирным наркозом на обе сонные артерии накладывались окклюдеры на 30 мин. Состоятельность модели оценивалось по побледнению видимой части сосудистой оболочки глаза, расширению зрачков, развитию гипервентиляции. Реперфузия проводилась снятием окклюдеров. Крысам контрольной группы вводилось внутрижелудочно 1 мл 1% крахмального геля, животным опытных групп - соединения 1 и 2 в дозе 100 мг/кг в 1 мл крахмального геля один раз в сутки в течение 7 суток. Первое введение осуществлялось через 1 ч после создания модели ишемии, последнее введение - за 1 ч до забора крови. В первые 2-5 ч после воспроизведения модели тотальной транзиторной ишемии головного мозга у крыс наблюдались наиболее тяжелые симптомы повреждения центральной нервной системы в виде арефлексии, судорог, спастического паралича конечностей, тонического напряжения мышц туловища, бокового положения. Оценку функционального состояния высшей нервной деятельности на 1-е, 4-е, 5-е и 7-е сутки после создания модели тотальной транзиторной ишемией головного мозга проводили по шкале Stroke-index [McGraw СР., 1977] по следующим показателям: спонтанная двигательная активность (нормальная, повышенная или сниженная, отсутствие), расстройства походки (скованность, шаткость, замедленность движений, нарушение ориентации), рефлексы отдергивания хвоста, обеих передних и задних лап, реакция на звук, тремор, судороги, тонус мышц туловища и конечностей (нормальный, повышенный, отсутствие), признаки птоза (отсутствие, односторонний, двусторонний). Каждый показатель оценивали в баллах: О баллов - норма; 1 балл - умеренно выраженные изменения; 2 балла - резко выраженные изменения. Неврологический дефицит животного оценивали суммой баллов по всем показателям. Кроме того, в каждой группе крыс определяли долю животных с тяжелыми неврологическими расстройствами (6 баллов и более), с нарушениями средней тяжести (3-5 баллов) и с легкими изменениями (до 2 баллов). Выживаемость животных регистрировали на 1-е, 4-и, 5-е и 7-е сутки после тотальной транзиторной ишемии головного мозга. По завершению экспериментов проводилась эвтаназия животных.
Результаты исследований показывают, что в контроле в течение первых суток после тотальной транзиторной ишемии головного мозга погибло 30% крыс. В то же время у леченных животных соединениями 1 и 2, в первые сутки соответственно погибло 15 и 11% крыс, что было приблизительно в 2 раза ниже контрольного показателя (табл. 1). Несмотря на то, что средний балл неврологического дефицита у вышивших крыс всех групп достоверно не различался (табл. 2), отмечена отчетливая тенденция к уменьшению под влиянием соединений 1 и 2 количества животных с тяжелыми неврологическими нарушениями и соответствующее достоверное увеличение количества животных со средней степенью неврологического дефицита (табл. 2). При лечении соединением 2 отмечалось достоверное снижение уровня смертности крыс и неврологических нарушений по сравнению как с контролем, так и при применении соединения 1.
В контроле смертность крыс к четвертым суткам после тотальной транзиторной ишемии головного мозга достигала максимальных значений (45%), в течение последующего периода наблюдения летальность не увеличивалась. В опытных группах гибель животных к этому сроку была существенно ниже и не изменялась к 5-7-м суткам (табл. 1). Структура тяжести неврологических расстройств была сходной у выживших животных, получавших соединение 1 и контроля к 4-м суткам. У крыс, леченных соединением 2, было отмечено улучшение неврологических расстройств (табл. 2). Начиная с 4-х суток, у животных контрольной группы происходило снижение тяжести неврологической симптоматики. Однако восстановление неврологического статуса у крыс, леченных соединениями 1 и 2, происходило более высокими темпами. Так, к 5-м суткам средний балл неврологического дефицита в группах леченных соединениями 1 и 2 был соответственно в 1,6 и 2 раза ниже контроля, а к 7 суткам сохранялась тенденция к полному восстановлению функции центральной нервной системы.
Таким образом, применение соединения 2 в терапии ишемического повреждения головного мозга в наибольшей степени по сравнению с соединением 1 снижает гибель животных и ускоряет восстановление неврологического статуса у вышивших животных.
Пример 2. Исследование эндотелийпротекторной активности соединений 1 и 2 было проведено на моделях патологических состояний (неполной ишемии головного мозга и сахарного диабета).
Модель неполной ишемии головного мозга у наркотизированных (эфирный наркоз) крыс-самок линии Wistar воспроизводился путем полной окклюзии левой сонной артерии и ограничения кровотока по правой сонной артерии на 50% от исходного под контролем электромагнитного флоуметра. У ложнооперированных животных проводилось аналогичное оперативное вмешательство, но без перевязки сосудов. Раны были обработаны антисептиками и на них наложены швы.
Для оценки эндотелиальной дисфункции исследовалась эндотелийзависимая и эндотелийнезависимая реакция сосудов у крыс. Для этого у наркотизированных животных непрерывно регистрировалось системное артериальное давление (САД). Для измерения САД животным в правую сонную артерию имплантировали катетер, заполненной смесью физиологического раствора и гепарина. Эндотелийзависимую вазодилатация регистрировалась при болюсном внутривенном введении ацетилхолина (5 мкг/кг), эндотелийнезависимую вазодилатацию - при болюсном внутривенном введении нитропруссида натрия (30 мкг/кг). Ацетилхолин и нитропруссид натрия вводились в бедренную вену. Функциональное состояние эндотелия оценивалось с использованием коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), рассчитываемого как отношение площадей под кривыми снижения артериального давления в ответ на внутривенное введение натрия нитропруссида и в ответ на внутривенное введение ацетилхолина [Тюренков И.Ю., Воронов А.В., 2008].
Эксперименты с воспроизведением модели неполной ишемии головного мозга проведены на крысах-самках линии Wistar массой 260-280 г. Были сформированы 5 групп животных по 10 в каждой. Группы крыс: интактная, контрольная, ложнооперированная и леченные соединением 1 и соединением 2. Животным контрольных, ложнооперированных и интактных групп вводился внутрижелудочно 1 мл крахмальной гели. Крысам, леченным соединениями 1 и 2, вводились препараты в дозе 100 мг/кг. Крахмальная гель и суспензия соединений 1 и 2 в крахмальном геле вводились животным один раз в сутки в течение 5 суток. Первое введение осуществлялось через 1 ч после создания модели неполной ишемии головного мозга. На 5-е сутки через 1 ч после последнего введения соединений 1 и 2 или крахмальной гели крысы были наркотизированы (тиопенталом-натрия 60 мг/кг, внутрибрюшинно) и проведена оценка функции эндотелия.
Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что в группе ложнооперированных крыс изменений эндотелийнезависимой и эндотелийзависимой вазодилатации по сравнению с интактными животными не выявлено, КЭД составил 2,1±0,2 (табл. 3). Следовательно, все наблюдаемые изменения в контроле и группах, леченных соединениями 1 и 2, не связаны с влиянием оперативного вмешательства. У ишемизированных крыс контрольной группы КЭД составил 3,4±0,4, что на 60% превышало значение в группе ложнооперированных крыс (табл. 3). Таким образом, неполная ишемия головного мозга у крыс сопровождалось эндотелиальной дисфункцией. Описанные изменения функции эндотелия с преимущественным нарушением эндотелийзависимой вазодилатации согласуются с данными о формировании эндотелиальной дисфункции при ишемическом и реперфузионном повреждении тканей головного мозга крыс. В группе крыс с ишемией головного мозга, леченных соединением 2, КЭД составил 1,9±0,2, что достоверно отличалось от контроля и группы, получавших соединение 1 и было аналогично ложнооперированным животным.
Таким образом, при курсовом внутрижелудочном введении соединение 2 по сравнению с соединением 1 проявляет более высокую эндотелийпротекторную активность в условиях модели неполной ишемии головного мозга у крыс.
Для создания модели сахарного диабета крысам-самкам линии Wistar однократно внутрибрюшинно вводился стрептозотоцин в дозе 60 мг/кг в цитратном буфере. В эксперимент отбирались животные с уровнем глюкозы в крови от 19 до 26 ммоль/л. Уровень глюкозы в цельной крови измерялся с помощью глюкометра (Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.).
Оценка эндотелиальной дисфункции проведена в соответствии с методикой, изложенной в предыдущем разделе.
Эксперименты с воспроизведением модели сахарного диабета проведены на крысах-самках линии Wistar массой 240-260 г. У 30 животных воспроизводилась модель сахарного диабета и через 1 месяц после инъекции стрептозотоцина были отобраны крысы в группы леченные соединением 1, соединением 2 и контроля с близким уровнем глюкозы в крови, находящимся в пределах от 19 до 26 ммоль/л. В течение последующего месяца ежедневно внутрижелудочно животным контрольной и интактной групп вводился крахмальный гель, крысам опытных групп - соединения 1 и 2 в дозе 100 мг/кг в крахмальном геле. Через 1 ч после последнего введения соединений 1 и 2 крысы были наркотизированы (тиопенталом-натрия 60 мг/кг, внутрибрюшинно) и проведена оценка функции эндотелия.
Результаты исследований показали, что у крыс контрольной группы была выявлена эндотелиальная дисфункция. Об этом свидетельствовало достоверное увеличение КЭД в 1,5 раза по сравнению с интактными животными. Описанные изменения в контрольной группе животных согласуются с данными о наличии эндотелиальной дисфункции у больных сахарным диабетом и у животных с моделями данного заболевания. У животных, леченных соединением 2, КЭД был достоверно значимо в 1,6 и 1,2 соответственно ниже, чем в контроле и при применении соединения 1 в терапии сахарного диабета.
Таким образом, при курсовом внутрижелудочном введении соединение 2 по сравнению с соединением 1 проявляет более высокую эндотелийпротекторную активность при сахарном диабете у крыс.
2
Пример 3. На модели диабетической ретинопатии оценивались ретинопротекторные эффекты соединений 1 и 2. Эксперименты проведены на 40 крысах-самках линии Wistar массой 220-250 г. Модель диабетической ретинопатии у крыс воспроизводилась путем однократного внутрибрюшинного введения стрептозотоцина в дозе 60 мг/кг массы тела. Уровень гипергликемии (свыше 18 ммоль/л), потеря массы тела, выраженность полиурии и полидипсии являлись критериями тяжести сахарного диабета. Через 30 суток после введения стрептозотоцина крысы были разделены на 3 группы. Крысам опытных групп с концентрацией глюкозы 21,8±2,5 (соединение 1) и 22,0±1,9 (соединение 2) ммоль/л ежедневно в течение 30 суток вводились внутрижелудочно соединения 1 и 2 в дозе 100 мг/кг массы тела, в виде суспензии в 1 мл крахмальной гели. Животным контрольной группы с концентрацией глюкозы 22,3±2,2 ммоль/л вводился такое же количество крахмальной гели по той же схеме. Группа интактных животных, находившихся в аналогичных условиях. Центральные отделы сетчаток крыс являлись материалом исследования, которые были отпрепарированы (через 60 суток после начала инъекции стрептозотоцина) сразу после эвтаназии эфирным наркозом животных. Центральные участки задней стенки глаза были фиксированы в 2,5% растворе глютаральдегида на 0,2 М какодилатном буфере (рН 7,4), после фиксированы в 2% растворе четырехокиси осмия и залиты в смесь смол эпон-аралдит. Полутонкие срезы были окрашены толуидиновым синим, ультратонкие контрастированы уранилацетатом и цитратом свинца, просмотрены и сфотографированы в электронном микроскопе. На полутонких срезах производен подсчет нейросенсорных клеток с пикнозом ядра на 1000 клеток с каждой сетчатки, гиперхромных и пикноморфных ассоциативных нейронов и радиальных глиоцитов, ганглионарных нейронов с тотальным, очаговым хроматолизом и пикноморфных на 200 клеток с каждой сетчатки. С использованием окулярной измерительной сетки Автандилова были высчитаны численная плотность ядер в наружном ядерном слое на площади 900 мкм, удельная площадь сосудов со стазом, сладжем и тромбозом, глионейрональный индекс.
Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что после развития стрептозотоцинового диабета в сетчатках животных отмечаются морфологические признаки дегенерации всех структурных компонентов сетчатки. Деструктивные изменения нейросенсорных клеток выражаются в появлении перикарионов различного размера, деформации ядер, между которыми разрастаются гипертрофированные склеральные отростки радиальной глии. Наблюдается смещение одиночных ядер нейросенсорных клеток в фотосенсорный и наружный сетчатый слои. Количественный анализ показал трехкратное увеличение процента нейросенсорных клеток с пикнозом ядра, характеризующихся повышением осмиофилии ядра и цитоплазмы, и снижение в 1,56 раз плотности распределения ядер нейросенсорных клеток в наружный ядерный слой по отношению к интактному контролю (табл. 5). Изменения ассоциативных нейронов носят реактивный характер. При стрептозотоциновом диабете у крыс контрольной группы наблюдалось увеличение процента гиперхромных нейронов по сравнению с интактным контролем (табл. 6). Дегенерации мультиполярных нейронов при длительной гипергликемии на фоне стрептозотоцинового диабета характеризуются в основном различной степени выраженности хроматолизом. В контрольной группе в первую очередь отмечены хроматолитические изменения ганглионарных нейронов (табл. 7): повышение уровня нейронов с очаговым и тотальным хроматолизом в 6-7 раз по отношению к интактному контролю, при этом количество пикноморфных нейронов возрастает в 3,8 раза. При длительной гипергликемии у крыс контрольной группы были выявлены деструктивные процессы в радиальных глиоцитах, что выражалось повышением электронной плотности цитоплазмы и ядра. Количество пикноморфных радиальных глиоцитов относительно значений интактного контроля увеличивается, что сопровождается снижением глионейронального индекса (табл. 8). В контрольной группе отмечались выраженные расстройства микроваскуляризации, характеризующиеся достоверным увеличением по сравнению с интактным контролем удельной площади хориоидальных сосудов со сладжем и стазом форменных элементов (табл. 9).
Лечение соединением 2 более эффективно предотвращает деструкцию нейросенсорных клеток, что выражается в снижении процента пикнотичных ядер нейронов до значений интактного контроля и повышении количества рядов ядер относительно контрольной группы и группы крыс, леченных соединением 1 (табл. 5). Вместе с тем плотность распределения ядер нейросенсорных клеток в наружном ядерном слое остается сниженным, что связано, вероятно, пролиферативно-прогрессивной реакцией радиальной глии в виде пролиферации и гипертрофии склеральных отростков. Введение соединения 2 в отличие от соединения 1 способствовало полной сохранности нейронов внутреннего ядерного слоя от повреждающего действия стойкой длительной гипергликемии, что выражалось в отсутствии достоверных различий по всем показателям деструкции ассоциативных нейронов крыс леченных соединением 2 и интактной групп (табл. 6). Внутрижелудочное введение соединения 2 оказывало положительное влияние на состояние ганглионарных нейронов сетчатки, причем процент нейронов с тотальным и очаговым хроматолизом снижалось относительно значений контрольной группы и группы животных леченных соединением 1, оставаясь при этом все же достоверно выше значений интактного контроля (табл. 7). Также при введении крысам соединения 2 отмечалось полное восстановление всех показателей деструкции радиальных глиоцитов (табл. 8). Так, процент пикноморфных радиальных глиоцитов снижался при этом глионейрональный индекс возрастал по отношению как к контрольным значениям, так и значениям группы крыс леченных соединением 1. При введении животным соединения 2 отмечалось значительное улучшение гемодинамики, что выражалось в достоверном снижении удельной площади сосудов со стазом, сладжем и тромбозом по сравнению с аналогичными показателями крыс контроля и леченных соединением 1 (табл. 9).
Таким образом, курсовое лечение соединением 2 в дозе 100 мг/кг по сравнению с соединением 1 в течение 30 суток крысам с диабетической ретинопатией, развившейся на фоне стрептозотоцинового диабета, оказывало более выраженный ретинопротекторный эффект, приводя к снижению выраженности деструкции всех структурных компонентов сетчатки. Соединение 2 в отличие от соединения 1 обладает достоверно более высокой ретинопротекторной активностью.
Пример 4. Влияние соединений 1 и 2 при однократном парентеральном и трехкратном внутрижелудочном введении крысам на мозговой кровоток исследовалось путем регистрации в сонной артерии скорости тока крови с помощью электромагнитного расходомера.
Эксперименты по изучению влияния однократного парентерального введения соединений 1 и 2 на динамику мозгового кровотока (МК) и системного артериального давления (САД) проведены на 26 крысах-самцах линии Wistar массой 340-360 г. Были сформированы 3 группы животных. Животным контрольной группы (n=8) подкожно был введен 1 мл кремофора. Крысам опытных групп (n=18) подкожно были введены соединения 1 и 2 в дозе 100 мг/кг в виде раствора в 1 мл кремофора.
У наркотизированных крыс (тиопенталом-натрия 60 мг/кг, внутрибрюшинно) были отпрепарированы правая бедренная артерия и имплантирован катетер для измерения системного артериального давления. Левая общая сонная артерия была отпрепарирована и перевязана наружная сонная артерия. На общую сонную артерию был наложен манжеточный датчик, и регистрировалась величина мозгового кровотока с помощью электромагнитного расходомера крови.
Эксперименты по изучению влияния трехкратного внутрижелудочного введения соединений 1 и 2 на мозговой кровоток был проведен на 18 крысах-самцах линии Wistar массой 250-280 г. Были сформированы 3 группы животных. Крысам контрольной группы (n=6) вводился внутрижелудочно ежедневно однократно в течение 3 суток эквиобъемное количество крахмальной гели. Животным опытных групп внутрижелудочно ежедневно однократно в течение 3 суток были введены соединения 1 (n=6) и 2 (n=6) в дозе 100 мг/кг в крахмальном геле. На 3-и сутки эксперимента через 1 ч после последнего введения были проведены измерения мозгового кровотока у крыс.
Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что в контроле при однократном парентеральном (подкожном) введении кремафора крысам уровень МК в течение 1 ч был стабильным, в последующие 30 мин измерения выявлена незначительная тенденция к снижению мозгового кровотока. При этом отмечена тенденция к снижению САД в течение проведения измерения, что, очевидно, связано с условиями опыта (наличие операционной травмы и использование наркоза) (табл. 10). При внутрижелудочном трехдневном введении крахмального геля у животных контрольной группы значение мозгового кровотока составляло 5,9±0,5 мл/мин (табл. 11).
Подкожное введение масляного раствора соединений 1 и 2 крысам способствовало, начиная с 5 мин измерения и до конца наблюдения значимому повышению МК. В период с 45 до 90 мин эксперимента значения МК у крыс, леченных соединением 2, достоверно были выше величин этого показателя в группах контроля и леченных соединением 1. При этом по уровню САД в течение всего периода наблюдения достоверных различий между группами животных не выявлено (табл. 10).
При курсовом внутрижелудочном введении крысам соединения 2 в дозе 100 мг/кг значение мозгового кровотока составляло 8,9±0,4 мл/мин, что было, соответственно, на 47 и 22% выше, чем показатель контрольной группы и животных леченных соединением 1 (табл. 11).
Таким образом, подкожное введение масляного раствора соединения 2 в дозе 100 мг/кг повышает более значимо по сравнению с контролем и животными леченными соединением 1 мозговой кровоток, не вызывая снижение системного артериального давления. Трехкратное внутрижелудочное введение соединения 2 в дозе 100 мг/кг вызывает значимое увеличение мозгового кровотока и по выраженности эффекта превосходит соединение 1. Предлагаемое изобретение расширяет арсенал средств, способных увеличивать мозговой кровоток.
Пример 5. Исследование гемореологической, антитробоцитарной и антитромбогенной активностей соединений 1 и 2 было проведено на моделях гипервязкости крови ех vivo, внутрисосудистого тромбоза у крыс.
Эксперименты по изучению гемореологических свойств соединений 1 и 2 были проведены на 20 крысах-самцах линии Wistar массой 270-290 г. Крысы были рандомизированы на 4 группы по 5 животных в каждой. Крысам контрольной группы вводился крахмальный гель, животные опытных групп - пентоксифиллин (400 мг/кг) или соединения 1 и 2 (100 мг/кг). Препараты и эквиобъемное количество крахмальной гели (2 мл) вводили внутрижелудочно через зонд за один час до забора крови.
-1
Значения вязкости крови и агрегации эритроцитов оценивалось в пробах крови сразу после взятия и через 1 ч после инкубации крови при температуре 20,0±0,4°C. Кровь забиралось из общей сонной артерии под эфирным наркозом. В качестве антикоагулянта был использован 3,8% раствор цитрата натрия в соотношении с кровью 1:9. Вязкость крови была измерена на ротационном вискозиметре в диапазоне скоростей сдвига от 5 до 300 с до и после инкубации образцов при температуре 20,0±0,4°C в течение 60 мин.
1/2
В этой же серии экспериментов спонтанная агрегация эритроцитов исследовалось с помощью силлектометрического метода. Критерием агрегационной активности эритроцитов являлся полупериод агрегации Т - время, за которое величина фотометрического сигнала снижается в два раза.
-1
Исходные значения вязкости крови животных контрольной группы при скоростях сдвига от 5 до 300 с находились в диапазоне от 8,3±0,1 до 4,5±0,1 мПа с. Инкубирование данных образцов крови в течение 60 мин при температуре 20,0±0,4°C приводило к значимому (на 16-31%) повышению вязкости крови. Пентоксифиллин вызывал достоверное по сравнению с контролем понижение вязкости крови на низких скоростях сдвига до инкубации. После инкубации отмечалось повышение вязкости крови во всем исследуемом диапазоне скоростей сдвига, однако значения этого показателя были достоверно ниже по сравнению со значениями в контрольной группе. Следовательно, внутрижелудочное введение пентоксифиллина крысам улучшало исходные гемореологические показатели на низких скоростях сдвига и замедляло развитие «гипервязкости» крови в условиях in vitro. Соединение 2 по сравнению с контролем и соединением 1 оказывал выраженное влияние на вязкость крови. У животных, леченных соединением 2 по сравнению с контролем и группой животных с введением соединения 1, сразу после взятия крови выявлено достоверное снижение вязкости крови как на низких скоростях сдвига, так и после инкубации на высоких скоростях сдвига (табл. 12).
Исходные значения агрегации эритроцитов между группами существенно не отличались. Инкубация крови крыс контрольной группы приводила к возрастанию агрегации эритроцитов на 37%. Введение пентоксифиллина предотвращало ускорение агрегации эритроцитов при инкубации. Внутрижелудочное введение крысам соединения 2 замедляло агрегацию эритроцитов при инкубации крови, что выразилось в достоверном повышении полупериода агрегации эритроцитов по сравнению с контролем и соединением 1 на 55% и 22% соответственно (табл. 13).
Таким образом, соединение 2 способно ограничивать развитие гипервязкости крови и повышение агрегации эритроцитов ex vivo. Эффект соединения 2 по выраженности выше, чем эффект соединения 1 и сопоставим с пентоксифиллином.
3
-6
Эксперименты по изучению антитромбоцитарной активности соединений 1 и 2 были проведены 20 крысах-самцах линии Wistar массой 300-320 г, которые Крысы были разделены на 4 группы (по 5 особей в каждой). За час до взятия крови животным опытных групп вводился пентоксифиллин (400 мг/кг) или соединения 1 и 2 (100 мг/кг). Крысам контрольной группы вводился эквиобъемные количества крахмальной гели. Кровь была взята из общей сонной артерии под эфирным наркозом. В качестве антикоагулянта был использован 3,8% раствор цитрата натрия в соотношении с кровью 1:9. Агрегация тромбоцитов определялась нефелометрическим методом. По стандартному методу были получены богатая (БТП) и бедная (БеТП) тромбоцитами плазма и подсчитывалось число тромбоцитов. После определения числа тромбоцитов в БТП была проведена стандартизация числа тромбоцитов, для чего БТП разводилось необходимым количеством БеТП до 400±27 тыс.тромбоцитов в 1 мм в пробе. Для оценки антитромбоцитарного эффекта сосудистой стенки были использованы БТП и БеТП интактных крыс-доноров. Агрегация тромбоцитов оценивалось в стандартизованной плазме на приборе, агрегатограммы регистрировали с помощью самописца. После добавления индуктора агрегации регистрировалось изменение уровня оптической плотности БТП. В качестве критерия агрегационной активности тромбоцитов был использован показатель степени агрегации (в %), характеризуемый изменением оптической плотности БТП после добавления в кювету индуктора агрегации. При этом за 100% принимали величину оптической плотности БеТП, а за 0% - величину оптической плотности БТП. В качестве индуктора агрегации использовали АДФ в конечной концентрации 4·10 М.
-6
Результаты проведенных исследований показали, что у животных контрольной группы амплитуда агрегации тромбоцитов, индуцированная АДФ в конечной концентрации 4·10 М, составила 29±2%. Амплитуда АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов после введения пентоксифиллина была достоверно ниже аналогичного показателя в контрольной группе. После введения соединения 2 амплитуда агрегации тромбоцитов также была значимо достоверно ниже показателей в контрольной группе и группе с введением соединения 1 (табл. 14).
Таким образом, соединение 2 по сравнению с соединением 1 обладает выраженным влиянием на сосудисто-тромбоцитарный гемостаз. Антитромбогенная активность соединения 2 может быть обусловлена как антитромбоцитарными, так и эндотелийпротекторными свойствами.
2
Опыты по исследованию антитромбогенной активности соединений 1 и 2 были проведены на 24 крысах-самцах линии Wistar массой 260-280 г. Были сформированы 4 группы по 6 животных в каждой. Животным контрольной группы вводился крахмальный гель. Крысам опытных групп соответственно вводились пентоксифиллин (400 мг/кг), соединения 1 и 2 (100 мг/кг). Соединения и эквиобъемное количество крахмальной гели (2 мл) вводились внутрижелудочно через зонд 1 раз в день в течение 5 суток. На 5-е сутки эксперимента, через 1 ч после последнего введения животные были наркотизированы (тиопентал натрия в дозе 60 мг/кг, внутрибрюшинно), выделена левая общая сонная артерия и воспроизведена модель внутрисосудистого тромбоза. На отпрепарированную сонную артерию были наложены манжеточные датчики, и регистрировалась величина кровотока по сосуду с помощью электромагнитного расходомера крови. Далее под сонную артерию была подложена полоски фильтровальной бумаги и полиэтиленовой пленки. На эту артерию сверху накладывалась полоска фильтровальной бумаги, на которую была нанесена 1 капля 10% раствора FeCl. Измерения величины кровотока в артерии проводились от момента нанесения хлорида железа на левую сонную артерию до полной остановки кровотока в ней (время образования тромба). Расчет снижения кровотока относительно исходной величины кровотока был выражен в процентах. Масса тромба оценивалась гравиметрическим методом.
2
2
2
У животных контрольной группы после воздействия на сосудистую стенку раствором FeCl происходило полное прекращение кровотока по сосуду. Среднее время полной остановки кровотока до нуля составило 22±1 мин. Масса тромба, определяемая через сутки после аппликации хлорида железа, составила 1,40±0,1 мг (табл. 15). При курсовом внутрижелудочном введении крысам пентоксифиллина зарегистрировано снижение кровотока на 28% от исходного значения к 90-й мин эксперимента. На следующие сутки в просвете сонных артерий у крыс этой группы тромбов не обнаружено. Применение пентоксифиллина уменьшает тромбообразование в зоне стеноза. Курсовое внутрижелудочное введение животным соединения 2 предотвращало прекращение кровотока после аппликации раствором FeCl. К 90-й мин эксперимента у крыс, леченных соединением 2, было отмечено снижение кровотока на 9%. Введение соединения 2 полностью препятствовало тромбообразованию в сонной артерии на следующие сутки после аппликации раствором FeCl. По антитромбогенной активности соединение 2 существенно превосходило соединение 1.
Таким образом, соединение 2 по сравнению с соединением 1 обладает выраженной антитромбогенной активностью.
Пример 6. Изучение противоишемической и противоаритмической активности соединений 1 и 2 выполнено согласно Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств (Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.) на модели ишемии и реперфузии миокарда у крыс, которая рекомендована для воспроизведения ишемии и аритмий желудочкового типа.
Эксперименты проведены на 66 крысах-самцах линии Wistar массой 260-280 г. Крысы были рандомизированы в 3 группы. Крысам опытных групп соответственно вводились соединения 1 и 2 в дозе 100 мг/кг в виде суспензии на 1% крахмальном геле (2 мл) внутрижелудочно через зонд 1 раз в день в течение 3 суток до и 3 суток после создания модели. Животным контрольной группы вводилось эквиобъемное количество крахмального геля по аналогичной схеме.
Соединения 1 и 2 были исследованы с помощью электрокардиографического (ЭКГ) и морфологического методов. Для воспроизведения модели животные были наркотизированы тиопенталом натрия (60 мг/кг, внутрибрюшинно), интубированы и подключены к аппарату искусственной вентиляции легких. После проведения торако- и перикардотомии была проведена окклюзия левой коронарной артерии на уровне нижнего края auricula sinistra без нарушения топографии сердца в грудной клетке по методу Когана [Коган А.Х. Хирургический метод моделирования коронароокклюзионного инфаркта и аневризма сердца у крыс // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 1979. №3. с. 79-81]. Длительность окклюзии левой коронарной артерии составляла 20 мин, после чего лигатуру развязывалась и осуществлялась постишемическая реперфузия. В течение периода ишемии и 10 мин реперфузии проводилось мониторирование ЭКГ во II стандартном отведении с помощью компьютерного электрокардиографа. Верификацию правильности наложения лигатуры и адекватность модели отслеживалось по степени изменения высоты ST-сегмента на ЭКГ. У ложнооперированных животных проводилось аналогичное оперативное вмешательство без наложения лигатур на левую коронарную артерию.
На 3-и сутки после реперфузии крысы были вновь наркотизированы тиопенталом натрия (60 мг/кг, внутрибрюшинно), интубированы и подключены к аппарату искусственной вентиляции легких и наложена лигатура. Для выявления зоны гипоперфузии в бедренную вену болюсно вводился 0,2 мл 5% раствора красителя patent blue violet, и в течение последующих 20-30 с извлекалось сердце. Участки миокарда с сохраненной перфузией окрашивались в зеленый цвет, неперфузируемые оставались неокрашенными.
Срезы сердца были приготовлены на замораживающем микротоме. Часть срезов оставлялись в нативном виде для оценки зоны гипоперфузии. Другая часть срезов окрашивалась нитросиним тетразолием (НСТ) с целью выявления в ткани дегидрогеназной активности. Срезы были заключены в глицериново-желатиновый гель и сканированы. Размер зон гипоперфузии и изменения дегидрогеназной активности оценивалось с применением программы Adobe Photoshop. За зону инфаркта принимались зоны с резким снижением дегидрогеназной активности. Для этого на срезах миокарда выделялись участки, суммарная интенсивность окраски которых была снижена в 2,5 раза и более относительно интактных областей миокарда, что отражало топографию снижения в той же степени дегидрогеназной активности [Коган А.Х. Хирургический метод моделирования коронароокклюзионного инфаркта и аневризма сердца у крыс // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 1979. №3. с. 79-81].
Результаты исследований свидетельствуют, что в контрольной группе в течение первых часов после восстановления кровоснабжения миокарда левого желудочка погибло 11 животных из 22 (50%). У животных, леченных соединением 2, в период реперфузии из 22 животных погибло 1. Смертность в группе крыс леченных соединением 2 составила 4%, что достоверно отличалось от показателя в контроле и группе животных, получавших внутрижелудочно соединение 1 (табл. 16).
У крыс контрольной группы к первым суткам и в течение последующих 3 суток после возобновления перфузии миокарда левого желудочка на ЭКГ отмечалось появление патологического зубца Q, свидетельствующего о наличии некротических изменений в миокарде, и снижение амплитуды зубца Т относительно исходных значений. После восстановления кровоснабжения миокарда в течение периода реперфузии у крыс контрольной группы сохранялось существенное снижение амплитуды зубца R относительно исходных значений, характеризующее нарушение процесса деполяризации желудочков вследствие выключения части миокарда из процессов возбуждения. В группе крыс с введением соединения 2 по сравнению с контролем и группой животных леченных соединением 1 в течение 1-3 суток после реперфузии миокарда отмечено достоверное снижение амплитуды зубца Q на ЭКГ после эпизода ишемии/реперфузии. В течение периода реперфузии к третьим суткам в группе крыс, леченных соединением 2 было выявлено отчетливое достоверное повышение амплитуды зубцов R и Т относительно контроля и группы животных с введением соединения 1 (табл. 17).
Как видно из таблицы 19 по размеру зоны гипоперфузии от общей площади поперечных срезов миокард исследуемые группы существенно не отличались. У животных, леченных соединением 2, по сравнению с контролем и группой крыс с введением соединения 1 отмечено достоверное уменьшение зоны резко сниженной дегидрогеназной активности от общей площади миокарда и от площади зоны гипоперфузии. Следовательно, лечебно-профилактическое введение соединения 2 в дозе 100 мг/кг снижает смертность животных после эпизода ишемии/реперфузии и значимо уменьшало зону инфаркта как от общей площади миокарда, так и от площади гипоперфузии по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы и группы животных леченных соединением 1 (табл. 18).
У животных контрольной и опытных групп в ишемический и реперфузионный периоды в разных соотношениях отмечались все виды желудочковых аритмий высоких градаций по Lown: политопная желудочковая экстрасистолия, желудочковые тахикардии, фибрилляции желудочков. У контрольных крыс в ишемический период основную долю в нарушениях ритма сердца составили желудочковые фибрилляции (50%) и желудочковая тахикардия (27%) (табл. 20). Смертность в контрольной группе крыс составила 50% (табл. 16). Основной причиной гибели животных явились фатальные аритмии, в частности фибрилляции левого желудочка с последующей остановкой сердца.
У животных опытных групп профилактическое введение соединений 1 и 2 во время эпизода ишемии существенно не изменяло структуру ритма сердца в сравнении с частотой и характером аритмий у животных контроля (табл. 19). Существенные различия в количестве и тяжести аритмий у крыс исследуемых групп были выявлены в реперфузионный период. В группе животных, леченных соединением 2, по сравнению с контролем и группой с введением соединения 1 значительно (в 6 раза и 1,7 раза соответственно) увеличилось число животных без желудочковых аритмий и достоверно снизилось количество крыс с фатальными желудочковыми фибрилляциями (табл. 20). Снижение патологических изменений ритма сердца и уменьшение числа крыс с наиболее тяжелым видом аритмии - желудочковыми фибрилляциями - проявились уменьшением летальности животных, защищенных соединением 2 в перефузионный период.
Соединение 2 в дозе 100 мг/кг массы тела, в отличие от контроля и соединения 1 при его лечебно-профилактическом введении в условиях модели ишемии и реперфузии миокарда статистически значимо снижал частоту возникновения и тяжесть аритмий, уменьшал смертность животных, обусловленную фатальными аритмиями.
Таким образом, значимое уменьшение зоны инфаркта миокарда, снижение частоты и тяжести аритмии и смертности животных, защищенных соединением 2, обусловлено его противоишемическим и противоаритмическим действиями.
Предлагаемое изобретение расширяет арсенал средств, обладающих одновременно гемореологической, антиагрегатной, антитромбогенной, ретинопротекторной, эндотелийпротекторной, нейропротекторной, противоаритмической и противоишемической активностью, увеличивающих мозговой кровоток.