ПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ АКТИВНОСТЬЮ БЕЛКА SLURP-1 ЧЕЛОВЕКА, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА КАРЦИНОМ И ГЛИОМ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА КАРЦИНОМ И ГЛИОМ, И СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА КАРЦИНОМ И ГЛИОМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УКАЗАННОГО ПЕПТИДА
PEPTIDE HAVING ACTIVITY OF HUMAN SLURP-1 PROTEIN AND ITS APPLICATION FOR SUPPRESSION OF GROWTH OF CARCINOMA AND GLIOMA, PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR SUPPRESSION OF GROWTH OF CARCINOMA AND GLIOMA, AND METHOD FOR SUPPRESSION OF GROWTH OF CARCINOMA AND GLIOMA USING THE SPECIFIED PEPTIDE

Область техники
Настоящее изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности к пептиду, обладающему активностью белка SLURP-1 человека, и его применения для подавления роста карцином и глиом, к фармацевтической композиции для подавления роста карцином и глиом, содержащей указанный пептид, и способу подавления роста карцином и глиом с использованием указанного пептида.
Уровень техники
Онкологические заболевания, в частности карциномы и глиомы, являются второй по распространенности причиной смерти населения после заболеваний сердечно-сосудистой системы, как в России, так и в мире. По данным Всемирной организации здравоохранения, в 2020 г. рак унёс жизни почти 10 млн человек [Ferlay J. и др. Global Cancer Observatory: Cancer Today. Lyon: International Agency for Research on Cancer; 2020 (https://gco.iarc.fr/today, по состоянию на февраль 2021 г.]. Поэтому поиск новых эффективных стратегий терапии опухолей входит в список приоритетных проблем современной медицины.
Одним из перспективных направлений для разработки новых противоопухолевых препаратов является регуляция работы никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (nAChR), в особенности, подтипа, состоящего из пяти одинаковых α7 субъединиц (α7-nAChR). Рецепторы этого подтипа вовлечены в процессы регуляции пролиферации, миграции и апоптоза раковых клеток, а экспрессия гена CHRNA7, кодирующего α7 субъединицу nAChR, повышена в клетках карцином [Wang S., Hu Y. (2018) Oncol. Lett. V. 16. P. 1375-1382.]. Кроме того, экспрессия гена CHRNA7 повышена в глиомах по сравнению с тканями здорового мозга человека [The UCSC Xena platform for public and private cancer genomics data visualization and interpretation | bioRxiv]. Однако, участие nAChR в возникновении и развитии глиом изучено слабо.
Известно, что ингибирование никотиновых ацетилхолиновых рецепторов альфа 7 типа (α7-nAChR) в клетках карцином приводит к торможению роста опухолевых клеток [Grozio A. и др. (2008) Int. J. Cancer. 122(8):1911-5; Zhang H. (2016) Drug Design, Development and Therapy. 10:3867-72; Trombino S. и др. (2004) Cancer Res. 64(1):135-45]. Также известно, что белок SLURP-1 человека является селективным негативным аллостерическим модулятором никотиновых ацетилхолиновых рецепторов альфа 7 типа (α7-nAChR) и подавляет рост клеток карцином кожи, кишечника и легкого, а также снижает экспрессию α7-nAChR в раковых клетках [Shulepko MA. и др. (2020) Int Immunopharmacol. 82:106303; Lyukmanova EN и др. (2018). Br J Pharmacol. 175:1973-1986. doi: 10.1111/bph.14194; Е. Н. Люкманова и др. (2014) Acta Naturae, 6(4): 58-65; Bychkov M.L. и др., (2021) Front Cell Dev Biol.; 9:739391. doi: 10.3389/fcell.2021.739391].
Глиомы являются наиболее распространенными первичными опухолями головного мозга. Несмотря на использование современных подходов лечения, сочетающих хирургическую резекцию первичной опухолевой ткани, лучевую и химиотерапию, средняя выживаемость пациентов с глиомами составляет всего 12-15 месяцев [Ostrom Q.T. и др. (2018) Neuro-Oncol. V. 20. iv1-iv86.]. Низкая эффективность терапии глиом обуславливает актуальность поиска новых молекулярных мишеней и разработку новых действующих на них соединений. Авторы настоящего изобретения ранее показали, что рекомбинантный белок SLURP-1 человека значительно ингибирует рост клеток модельных линий глиом U251 MG и А172 до ~70%, что сравнимо с действием α-бунгаротоксина, селективного ингибитора α7-nAChR [М. А. Шулепко и др. (2020) Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, Том 493, Номер 1, стр. 408-412].
SLURP-1 является секретируемым белком, экспрессирующимся в эпителии человека [Chernyavsky A.I. и др. (2010) Am. J. Physiol.-Cell Physiol. V. 299. P. 903-911] и принадлежит семейству трехпетельных белков Ly6/uPAR [Loughner C.L. и др. (2016) Hum. Genomics. V. 10. P. 10.]. Снижение экспрессии гена SLURP-1 наблюдается при карциномах толстой кишки [Pettersson A. и др. (2009) Auton. Neurosci. V. 148. P. 97-100] и легкого [Russo P. и др. (2012) Life Sci. V. 91. P. 1087-1092.], в кератиноцитах человека при онкогенной трансформации, вызванной нитрозаминами NNK и NNN, содержащимися в табаке [Arredondo J. и др. (2007) Life Sci. V. 80. P. 2243-2247], а также в меланомах [Bergqvist C. и др. (2018) Int. J. Dermatol. V. 57. P. 162-170]. В то же время, повышенная концентрация эндогенного SLURP-1 в крови пациентов с раком поджелудочной железы коррелирует с большим временем жизни пациентов после хирургического удаления первичной опухоли [Throm V.M. и др. (2018) Oncotarget 9].
Краткое описание настоящего изобретения
Технической проблемой, на решение которой направлено настоящее изобретение, является разработка простых в получении препаратов пептидов, обладающих активностью полноразмерного белка SLURP-1 человека. Технический результат, который достигается заявленным изобретением, это расширение арсенала средств, используемых для подавления роста карцином и глиом у субъекта, страдающего от указанных заболеваний, предоставление пептида, обладающего активностью белка SLURP-1 человека, и его применение для подавления роста карцином и глиом у субъекта, страдающего от указанных заболеваний.
В ходе изучения белка SLURP-1 человека авторами настоящего изобретения была установлена последовательность аминокислот активного участка этого белка, а также было обнаружено, что пептид, состоящий из 21 аминокислоты и включающий активный участок белка SLURP-1 человека, обладает практически такой же эффективностью по подавлению пролиферации опухоли аденокарциномы человека в модели ксенотрансплантата на мышах, что и полноразмерный белок SLURP-1 человека. Также установлено, что указанный пептид, состоящий из 21 аминокислоты, является пептидом минимальной длины, необходимой для сохранения этим пептидом активности белка SLURP-1 человека.
Так было создано настоящее изобретение и получен пептид минимальной длины, обладающий активностью полноразмерного белка SLURP-1 человека.
Настоящее изобретение предоставляет собой циклический пептид, обладающий активностью белка SLURP-1 человека и имеющий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1. Указанный цикл образован посредством дисульфидной связи между шестым и пятнадцатым остатками указанного пептида.
Также настоящее изобретение представляет собой описанный выше пептид, имеющий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2.
Также настоящее изобретение представляет собой описанный выше пептид, у которого карбоксильная группа последней аминокислоты модифицирована и представляет собой С-концевой амид.
Также настоящее изобретение представляет собой описанный выше пептид, у которого первая аминокислота указанного пептида дополнительно содержит защитную группу, выбранную из ацетильной группы, формильной группы, остатка пироглутаминовой кислоты, а также карбоновых кислот алифатического и ароматического рядов.
Также настоящее изобретение предоставляет фармацевтическую композицию для подавления роста карцином и глиом, содержащую эффективное количество указанного выше пептида и фармацевтически приемлемый носитель. При этом указанная фармацевтическая композиция предназначена, предпочтительно, для внутривенного введения. Предпочтительно, указанная композиция содержит пептид, имеющий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1 или 2, растворенный в деионизированной воде в концентрации 0,25-2,5 мг/мл.
Также настоящее изобретение предоставляет способ подавления роста карцином и глиом, включающий введение субъекту, страдающему от указанных заболеваний, эффективного количества указанного выше пептида или указанной выше фармацевтической композиции. При этом в указанном способе указанный пептид или указанную композицию, предпочтительно, вводят внутривенно.
В указанном способе карциномы выбраны из группы, включающей рак гортани, рак желудка, рак лёгкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак печени, рак поджелудочной железы, рак почки, рак простаты, колоноректальный рак, рак шейки матки, рак щитовидной железы, рак яичника, рак мочеточника, рак пищевода, рак прямой кишки, рак ободочной кишки, рак кожи.
В указанном способе глиомы выбраны из группы, включающей астроцитомы, олигодендроглиомы, нейроцитомы, эпендимомы, глиобластомы.
Предпочтительно, в указанном способе пептид по п. 1 или 2, имеющий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1 или 2, или соответствующую фармацевтическую композицию вводят в дозировке 0,125-1,25 мкг пептида на 1 кг веса субъекта.
Наконец, настоящее изобретение обеспечивает применение указанного выше пептида или указанной выше фармацевтической композиции для подавления роста карцином и глиом у субъекта, страдающего от указанных заболеваний.
Краткое описание рисунков
На Фиг. 1 приведены результаты эксперимента по подавлению роста опухоли аденокарциномы кожи полноразмерным рекомбинантным белком SLURP-1 человека в модели ксенотрансплантата на мышах. На панелях А и Б представлен результат подсчета размера опухолей и репрезентативные изображения люминесцентных опухолей в мышах, соответственно. Визуализация опухолей проводилась на системе прижизненной визуализации IVIS Spectrum CT (Perkin Elmer) после внутрибрюшинного введения мышам субстрата NanoLuc -  фуримазина. Проведен анализ влияния на размер опухолей в мышах BALB-c/Nu-Nu рекомбинантного белка SLURP-1 в дозах 5 мг/кг и 0,5 мг/кг. Измерения объема опухолей проводили при помощи штангенциркуля.* (p < 0,05), *** (p < 0,001), **** (p < 0,0001) означает достоверное отличие между группами данных «SLURP-1, 0,5 мг/кг» и контролем согласно однофакторному критерию ANOVA/тест Туки; .# (p < 0,05), ## (p < 0,01), ### (p < 0,001), #### (p < 0,0001) означает достоверное отличие между группами данных «SLURP-1, 5 мг/кг» и контролем согласно однофакторному критерию ANOVA/тест Туки.
На Фиг. 2 показаны структуры и данные исследования антипролиферативной активности химерных белков NTII/SL-1 и SL-1/NTII для выявления активного сайта белка SLURP-1. (A) Выравнивание последовательности аминокислот SLURP-1, NTII и химерных белков. Дисульфидные связи показаны скобками. β-тяжи обозначены стрелками. Последовательности привитых петель выделены рамками. (Б) Схемы, изображающие химерные белки NTII/SL-1 и SL-1/NTII. (В) Антипролиферативная активность химерных белков в клетках А549 по тесту WST-1. Клетки инкубировали в течение 48 ч с 1 мкМ белков. Данные представлены в % от контроля (необработанные клетки, пунктирная линия) ± стандартная ошибка среднего (n = 4-22). # (p < 0,05) и ### (p < 0,001) указывают на значительное отличие от контроля (100%) по одновыборочному t-критерию. * (p < 0,05) и *** (p < 0,001) указывают на значимое отличие от группы «SLURP-1» по однофакторному критерию ANOVA/тест Даннета.
На Фиг. 3 (А) изображены последовательности белка SLURP-1 человека и пептидов на основе фрагментов его петель I и III согласно настоящему изобретению. Подчеркиванием показаны искусственно добавленные или замененные остатки аминокислот. X - норлейцин. Линиями показаны циклы, образуемые дисульфидными связями белка SLURP-1, а цикл у пептидов согласно настоящему изобретению, образуется за счёт дисульфидной связи между остатками цистеина (выделены серым фоном). На панелях (Б и В) приведены результаты масс-спектрометрического анализа циклических пептидов, имитирующих петли I и III белка SLURP-1 человека SL1-1-21 (Б) и SL1-3-19 (В). Спектры были получены на времяпролетном масс-спектрометре MALDI-TOF, BRUKER Ultraflex (Германия), оборудованном Nd:YAG лазером. Полученные спектры показали соответствие молекулярной массы циклических пептидов расчетным значениям.
X. laevis
На Фиг. 4 приведены данные об активности пептидов, имитирующих петли I и III белка SLURP-1 человека. (A) Кривые доза-ответ для ингибирования токов, вызванных ацетилхолином (ACh), в α7-nAChR, экспрессируемых в ооцитах  посредством рекомбинантного белка SLURP-1 и синтетических пептидов. Данные нормированы на пиковую амплитуду тока, зарегистрированную без применения соединений (100%), и представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (n = 4-6 ооцитов для каждого соединения). Уравнение ингибирования со стандартным наклоном (nH = 1) согласовывали с нормализованными данными. (Б) Репрезентативные ответы на 100 мс импульсы 100 мкМ ACh, зарегистрированные в отсутствие и в присутствии рекомбинантного белка SLURP-1, а также пептидов, имитирующих петли I и III. Период преинкубации ооцитов с соединениями показан горизонтальными полосами над текущими кривыми (не на шкале времени), аппликация ACh показана стрелкой. (В, Г) Антипролиферативная активность рекомбинантного белка SLURP-1 и пептидов, имитирующих петли I и III в клетках A549 после 48-часовой инкубации по данным теста WST-1. Данные представлены в % от контроля (необработанные клетки, пунктирная линия) ± стандартная ошибка среднего (n = 4-22). ## (p < 0,01) и ### (p < 0,001) указывают на значительное отличие от контроля (100 %) по одновыборочному t-критерию. *** (p < 0,001) указывает на достоверное отличие от группы «SLURP-1» по однофакторному критерию ANOVA/тест Даннета.
На Фиг. 5 приведены результаты эксперимента по подавлению роста опухоли аденокарциномы кожи пептидом SL1-1-21 (Oncotag) согласно настоящему изобретению в модели ксенотрансплантата на мышах по сравнению с полноразмерным рекомбинантным белком SLURP-1 человека. На панелях А и Б представлен результат подсчета размера опухолей и репрезентативные изображения люминесцентных опухолей в мышах, соответственно. Измерения объема опухолей проводили при помощи штангенциркуля. Визуализация опухолей проводилась на системе прижизненной визуализации IVIS Spectrum CT (Perkin Elmer) после внутрибрюшинного введения мышам субстрата NanoLuc -  фуримазина. * (p < 0,05), *** (p < 0,001), **** (p < 0,0001) означает достоверное отличие между группами данных «SLURP-1, 0,5 мг/кг» и контролем согласно однофакторному критерию ANOVA/тест Туки; ### (p < 0,001), #### (p < 0,0001) означает достоверное отличие между группами данных «пептид “Oncotag” 0,125 мг/кг» и контролем согласно однофакторному критерию ANOVA/тест Туки;  (p < 0,001) и  (p<0,0001) означает достоверное отличие между группами данных «пептид “Oncotag” 1,25 мг/кг» и контролем согласно однофакторному критерию ANOVA/тест Туки.
На Фиг. 6 представлен сравнительный анализ антипролиферативной активности белка SLURP-1 и циклических пептидов, содержащих меньшее по сравнению с пептидом SL1-1-21 (Oncotag) количество аминокислот: SL1-1-15 (YTCKEPXTSASCRTI, 15 остатков) и SL1-1-19 (KAYTCKEPXTSASCRTITR, 19 остатков).
Подробное описание настоящего изобретения
Термин «пептид, обладающий активностью белка SLURP-1 человека» означает, что указанный пептид, также как полноразмерный белка SLURP-1 человека, является селективным негативным аллостерическим модулятором никотиновых ацетилхолиновых рецепторов альфа 7 типа (α7-nAChR). Способность к взаимодействию с α7-nAChR может быть определена, например, как описано в работах М. А. Шулепко и др. (2020) Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, Том 493, Номер 1, стр. 408-412; или Bychkov M.L. и др., (2021) Front Cell Dev Biol.; 9:739391. doi: 10.3389/fcell.2021.739391.
Пептид согласно настоящему изобретению (называемый далее SL1-1-21 или «Oncotag») имеет последовательность аминокислот VKAYTCKEPXTSASCRTITRA, где X означает норлейцин (биоизостерическая замена метионина). Цикл у пептида SL1-1-21 согласно настоящему изобретению, образуется за счёт дисульфидной связи между остатками цистеина. Также указанная последовательность приведена в SEQ ID NO: 2.
Такой короткий пептид может быть получен методом химического синтеза, что кардинально облегчает его получение в количествах, необходимых для применения в медицинских целях.
Ввиду того, что некоторые аминокислоты обладают высокой гомологией друг к другу, различия между такими аминокислотами не оказывают существенного влияния на трехмерную структуру пептида и его активность. Поэтому пептид, согласно настоящему изобретению, также включают в себя варианты пептидов, обладающие активностью SLURP-1 и содержащие консервативные замены аминокислот. Примеры консервативных замен включают: замену Ala на Ser или Thr, замену Arg на Gln, His или Lys, замену Asn на Glu, Gln, Lys, His или Asp, замену Asp на Asn, Glu или Gln, замену Gln на Asn, Glu, Lys, His, Asp или Arg, замену Glu на Asn, Gln, Lys или Asp, замену Gly на Pro или Ala, замену His на Asn, Lys, Gln, Arg или Tyr, замену Ile на Leu, Met, Val, Nle или Phe, замену Leu на Ile, Met, Val, Nle или Phe, замену Lys на Asn, Glu, Gln, His или Arg, замену Met на Nle, Ile, Leu, Val или Phe, замену Phe на Trp, Tyr, Met, Ile, Nle или Leu, замену Pro на Gly, Ser или Ala, замену Ser на Thr или Ala, замену Thr на Ser или Ala, замену Trp на Phe или Tyr, замену Tyr на His, Phe или Trp, и замену Val на Met, Phe, Ile, Nle или Leu. А также замену N- и С-концевых аминокислот на Ala или Gly. Именно такая возможность консервативных замен в пептидах согласно настоящему изобретению отображена в последовательности аминокислот SEQ ID NO: 1.
В рамки настоящего изобретения также включаются модифицированные пептиды, имеющие последовательность аминокислот, приведённую в SEQ ID NO: 1. Так, например, модификация концевых аминокислот пептида позволяет увеличить его устойчивость и время жизни в организме субъекта. В связи с этим, настоящее изобретение включает описанный выше пептид, у которого карбоксильная группа последней аминокислоты модифицирована и представляет собой, например, С-концевой амид. Также настоящее изобретение включает описанный выше пептид, у которого первая аминокислота указанного пептида дополнительно содержит защитную группу, выбранную из ацетильной группы, формильной группы, остатка пироглутаминовой кислоты, а также карбоновых кислот алифатического и ароматического рядов.
Другим объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция для подавления роста карцином и глиом, содержащая эффективное количество указанного выше пептида и фармацевтически приемлемый носитель. Могут использоваться любые фармацевтически приемлемые носители, известные специалисту в данной области техники, пригодные для доставки пептидов в организм субъекта, страдающего от указанных заболеваний.
Предпочтительной формой указанной фармацевтической композиции является водный раствор для внутривенного введения (как в виде болюса, так и путем инфузии), при этом все применяемые формы являются хорошо известными специалисту в области фармацевтики. Предназначенные для введения путем инъекции растворы или суспензии можно приготавливать с помощью известных методов с использованием приемлемых нетоксичных, пригодных для парентерального введения разбавителей или растворителей, таких как, вода, раствор Рингера или изотонический раствор хлорида натрия.
Также настоящее изобретение предоставляет способ подавления роста карцином и глиом, включающий введение субъекту, страдающему от указанных заболеваний, эффективного количества указанного выше пептида или указанной выше фармацевтической композиции. При этом в указанном способе указанный пептид или указанную композицию, предпочтительно, вводят внутривенно.
Карциномы выбраны из группы, включающей рак гортани, рак желудка, рак лёгкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак печени (гепатоцеллюлярный рак (карцинома)), рак поджелудочной железы, рак почки, рак простаты, колоноректальный рак, рак шейки матки, рак щитовидной железы, рак яичника, рак мочеточника, рак пищевода, рак прямой кишки, рак ободочной кишки, рак кожи, но не ограничиваются ими.
Глиомы выбраны из группы, включающей астроцитомы, олигодендроглиомы, нейроцитомы, эпендимомы, глиобластомы, но не ограничиваются ими.
Наконец, настоящее изобретение обеспечивает применение указанного выше пептида или указанной выше фармацевтической композиции для подавления роста карцином и глиом у субъекта, страдающего от указанных заболеваний.
Эффективное количество пептида, применяемого для подавления роста карцином и глиом, может варьироваться в зависимости от пути введения, состояния, подлежащего лечению, и серьезности подлежащего лечению состояния. Таким образом, режим доз с использованием пептида, согласно настоящему изобретению, выбирают с учетом различных факторов, включающих тип, вид, возраст, вес, пол и медицинское состояние пациента; серьезность подлежащего лечению состояния; путь введения; почечную и печеночную функцию пациента. Лечащий врач или клиницист легко могут определить и назначить эффективное количество лекарственного средства, необходимое для подавления роста карцином и глиом у субъекта, нуждающегося в этом. Достижение оптимальной концентрации лекарственного средства в том диапазоне, в котором оно обладает эффективностью и в котором не наблюдается токсического действия, можно осуществлять с использованием режима, учитывающего кинетику биодоступности лекарственного средства.
Настоящее изобретение далее более детально описано со ссылкой на примеры.
Примеры
Последующие примеры приведены для целей разъяснения сущности настоящего изобретения и не ограничивают каким-либо образом объём правовой охраны, определяемый формулой настоящего изобретения.
Пример 1. Изучение эффективности рекомбинантного белка SLURP-1 человека в подавлении пролиферации опухоли человека в модели ксенотрансплантата на мышах
in vitro
in vivo
5
В качестве примера аденокарциномы использовали аденокарциному кожи человека А431, которая экспрессирует α7-nAChR и для которой показан ингибирующий эффект белка SLURP-1 человека  (Luykmanova E.N. и др. (2018) Br. Journal of Pharmacology, 175(11):1973-86. doi: 10.1111/bph.14194). Для визуализации клеток А431 в организме мышей при их подсадке животным, была получена стабильная клеточная линия A431-NanoLuc посредством трансфекции клеток плазмидой, кодирующей ген люциферазы NanoLuc под контролем CMV промотора. Для анализа эффективности подавления роста опухоли карциномы А431  рекомбинантным белком SLURP-1 BALB-c/Nu-Nu мышам подкожно вводили A431-NanoLuc в количестве 1 × 10 клеток в матригеле (3 группы по 11 мышей). Через 3 дня и далее животным из каждой группы ежедневно в течение 10 дней вводили внутривенно физраствор, 0,9 % NaCl (100 мкл, контрольная группа) или rSLURP-1 (0,5, либо 5 мг/кг). Объем опухоли измеряли штангенциркулем. Визуализация опухолей проводилась на системе прижизненной визуализации IVIS Spectrum CT (Perkin Elmer) после внутрибрюшинного введения мышам субстрата NanoLuc - фуримазина. Пример показывает, что рекомбинантный белок SLURP-1 как в дозе 5 мг/кг, так и в сниженной дозе 0,5 мг/кг, значительно тормозит динамику роста и метастазирования опухоли A431-NanoLuc (Фиг. 1).
Пример 2. Определение активного сайта белка SLURP-1 человека и изучение его свойств
Подробное описание исследования по определению активного сайта белка SLURP-1 человека приведено в статье Bychkov M.L. и др., “SLURP-1 Controls Growth and Migration of Lung Adenocarcinoma Cells, Forming a Complex With α7-nAChR and PDGFR/EGFR Heterodimer”, Front Cell Dev Biol. 2021 Sep 14; 9:739391. doi: 10.3389/fcell.2021.739391. eCollection 2021, которая целиком включена в настоящее описание посредством ссылки.
Naja oxiana
Вкратце, для идентификации активного сайта белка SLURP-1, авторы настоящего изобретения сконструировали три химерных белка, содержащих привитые петли (I, II или III) SLURP-1 на каркасе из короткого трехпальцевого нейротоксина II кобры  (NTII), см. Фиг. 2А и 2Б.
Поскольку ранее авторами настоящего изобретения было показано, что рекомбинантный белок SLURP-1 ингибирует рост клеток A549 в зависимости от концентрации, и максимальный эффект (~60% жизнеспособных клеток по сравнению с контролем) наблюдался при концентрации 1 мкМ через 48 часов инкубации [Shulepko M.A. и др. (2020) Int. Immunopharmacol. 82:106303. 10.1016/j.intimp.2020.106303], в настоящем исследовании изучали антипролиферативную активность химер по сравнению с rSLURP-1 в клетках A549, используя одну концентрацию 1 мкМ. Химерные белки NTII/SL-1(II) и NTII/SL-1(III) и сам NTII оказались полностью неактивными, тогда как химерный белок NTII/SL-1(I), содержащий первую петлю rSLURP-1, продемонстрировал антипролиферативную активность немного более слабую, чем rSLURP-1 (эффект ингибирования до ~70% жизнеспособных клеток по сравнению с контролем, См. Фиг. 2В).
Таким образом было установлено, что участок петли I является основным участком молекулы SLURP-1, ответственной за антипролиферативную активность в клетках A549.
Для дальнейшего изучения роли участка петли I в активности SLURP-1 авторы настоящего изобретения синтезировали два пептидных миметика (Фиг. 3А). Первый пептид SL1-1-21 (VKAYTCKEPXTSASCRTITRA-NH2, 21 остаток, X обозначает норлейцин) имитирует структуру петли I молекулы SLURP-1. Второй пептид SL1-3-19 (GCVATDPDSIGAAHLIFCG-NH2, 19 остатков) имеет последовательность петли III и использовался в качестве отрицательного контроля. Пептид SL1-1-21 в дальнейшем обозначен, как пептид “Oncotag”.
X. laevis
50
50
Тестировали активность пептидов по сравнению с rSLURP-1 в отношении α7-nAChR, экспрессированных в ооцитах . В соответствии с предыдущими выводами [Lyukmanova и др., (2016). PLoS One 11:e0149733. 10.1371/journal.pone.0149733], rSLURP-1 и пептид SL1-1-21 (Oncotag) продемонстрировали обратную зависимость ингибирования от концентрации α7-nAChR со значениями IC 12 ± 1 и 74 ± 4 мкМ, соответственно. В то же время пептид SL1-3-19, имитирующий петлю III, был значительно менее активным (IC>250 мкМ, Фиг. 4A).
Антипролиферативную активность пептидов SL1-1-21 (Oncotag) и SL1-3-19 изучали в сравнении с rSLURP-1 в клетках А549 или нормальных первичных фибробластах легких.
50
Согласно данным, полученным с помощью теста WST-1, при обработке клеток A549 10 мкМ пептида SL1-1-21 или 1 мкМ rSLURP-1 наблюдается аналогичное значительное снижение жизнеспособности клеток (Фиг. 4В). Сравнение кривых доза-ответ показало EC 1,8 ± 0,3 мкМ и 10,1 ± 2,6 нМ для SL1-1-21 и SLURP-1, соответственно (Фиг. 4Г). Наблюдаемые максимальные эффекты были сопоставимы (45,8 ± 5,1% и 59,0 ± 2,7% относительно контроля для пептида SL1-1-21 и SLURP-1, соответственно), хотя требовалась большая концентрация пептида SL1-1-21 (Фиг. 4В,Г).
При этом, как белок SLURP-1, так и пептид SL1-1-21 продемонстрировали значительно более низкую активность в отношении нормальных фибробластов по сравнению с раковыми клетками.
Пример 3. Синтез циклопептидов
SL1-1-21 и SL1-3-19, имитирующих структуру петель I и III молекулы SLURP-1
Твёрдофазный синтез линейных пептидил-полимеров SL1-1-21 и SL1-3-19, содержащих на остатках цистеина S-трет-бутилcульфенильные защитные группы (StBu), проводили согласно стандартным протоколам, используя Fmoc/tBu стратегию [Chan W. C., White P. D., (2000), Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach. Oxford, UK: Oxford University Press, 41-76]. Конверсию реакций ацилирования свободных аминогрупп контролировали с помощью хлоранилового теста и теста Кайзера. Для присоединения остатков Cys использовали защищенное производное Fmoc-Cys(StBu)-OH, синтезированное согласно протоколу, описанному в [Atherton E., Sheppard R. C. (1989), Solid Phase Peptide Synthesis a practical approach. 1-st edition. Oxford, UK: Information Press Ltd]. Снятие StBu защитных групп с боковых цепей остатков цистеина проводили с использованием 2-меркаптоэтанола в присутствии N-метилморфолина (NMM) в диметилформамиде (DMF) в атмосфере инертного газа.
Для получения циклических пептидов SL1-1-21 и SL1-3-19 прямо на смоле проводили реакцию циклизации с использованием тетрахлорметана и триэтиламина в N-метилпирролидоне (NMP). Наличие свободных S-H групп в пептидах, находящихся на полистироловом носителе, определяли с помощью теста Элмана. Снятие циклических пептидов со смолы проводили с помощью 95% трифторуксусной кислоты (TFA). Циклические пептиды SL1-1-21 и SL1-3-19 осаждали диэтиловым эфиром, осадок центрифугировали и сушили в среде инертного газа. Очистку целевых циклических пептидов проводили методом обращённо-фазовой ВЭЖХ на колонке Jupiter C4, А300, 4,6×250 мм (Phenomenex, США) в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 5% до 25% за 90 мин в присутствии 0,1%-ной TFA, скорость элюции - 0,2 мл/мин. Оптическую плотность элюата регистрировали при 230 нм. Идентичность полученных препаратов подтверждали методом МАЛДИ масс-спектрометрии (Фиг. 3БВ).
Пример 4. Сравнение эффективности пептида, содержащего активный сайт белка SLURP-1 человека, и рекомбинантного белка SLURP-1 человека в подавлении пролиферации опухоли человека в модели ксенотрансплантата на мышах
in vitro
in vivo
5
В качестве примера аденокарциномы использовали аденокарциному кожи человека А431, которая экспрессирует α7-nAChR и для которой показан ингибирующий эффект белка SLURP-1 человека  (Luykmanova E.N. и др. (2018) Br. Journal of Pharmacology, 175(11):1973-86. doi: 10.1111/bph.14194). Для визуализации клеток А431 в организме мышей при их подсадке животным, была получена стабильная клеточная линия A431-NanoLuc посредством трансфекции клеток плазмидой, кодирующей ген люциферазы NanoLuc под контролем CMV промотора. Для анализа эффективности подавления роста опухоли карциномы А431  рекомбинантным белком SLURP-1 мышам BALB-c/Nu-Nu подкожно вводили A431-NanoLuc в количестве 1 × 10 клеток в матригеле (4 группы по 10 мышей). Через 3 дня и далее животным из каждой группы ежедневно в течение 10 дней вводили внутривенно физраствор, 0,9 % NaCl (100 мкл, контрольная группа). или rSLURP-1 (0,5 мг/кг), или пептид “Оncotag” (0,125 мг/кг, либо 1,25 мг/кг). Объем опухоли измеряли штангенциркулем. Визуализация опухолей проводилась на системе прижизненной визуализации IVIS Spectrum CT (Perkin Elmer) после внутрибрюшинного введения мышам субстрата NanoLuc - фуримазина. Пример показывает, что пептид “Оncotag” как в дозе 0,125 мг/кг, так и в дозе 1,25 мг/кг эффективно тормозит динамику роста и метастазирования опухоли A431-NanoLuc, при этом его эффективность не отличается от таковой у полноразмерного белка SLURP-1 (Фиг 5).
Пример 5. Изучение активности пептидов, содержащих меньшее количество аминокислот по сравнению с пептидом
Oncotag).
SL1-1-21 (
Oncotag)
Oncotag)
Методом твердофазного химического синтеза, аналогичным используемому в Примере 3 были получены пептиды, содержащие меньшее по сравнению с пептидом SL1-1-21 ( количество аминокислот - пептид SL1-1-19 (KAYTCKEPXTSASCRTITR, 19 остатков, SEQ ID NO 3) и пептид SL1-1-15 (YTCKEPXTSASCRTI, 15 остатков, SEQ ID NO 4). Анализ антипролиферативной активности пептидов проводился на клетках карциномы легкого А549. Данные, полученные с помощью теста WST-1, не выявили снижения жизнеспособности клеток A549 при обработке клеток пептидами SL1-1-19 и SL1-1-15 в концентрациях 0,1 нМ - 10 мкМ (Фиг. 6). С учетом того, что наблюдаемые в примере 2 максимальные эффекты белка SLURP-1 и пептида SL1-1-21 ( сопоставимы (Фиг. 4В,Г), можно сделать вывод, что пептиды, состоящие из 19 аминокислот (SEQ ID NO: 3) и 15 аминокислот (SEQ ID NO: 4), в отличие от пептида “Oncotag”, не обладают способностью к ингибированию пролиферации клеток карциномы.
Хотя настоящее изобретение было подробно описано со ссылкой на предпочтительные варианты его осуществления, для специалиста в данной области техники ясно, что могут быть сделаны различные замены и использованы различные эквиваленты, которые не выходят за рамки настоящего изобретения. Все процитированные в настоящем описании документы являются частью настоящей заявки, включённые в неё посредством ссылки.
--->
Перечень последовательностей
<110>  Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и
Ю.А.Овчинникова
<120>  ПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ АКТИВНОСТЬЮ БЕЛКА SLURP-1 ЧЕЛОВЕКА,
И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА КАРЦИНОМ И ГЛИОМ,
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА
КАРЦИНОМ И ГЛИОМ, И СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА КАРЦИНОМ
И ГЛИОМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УКАЗАННОГО ПЕПТИДА
<130>  SLURP-1 peptides
<160>  4
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  21
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic peptide
<220>
<221>  DISULFID
<222>  (6)..(15)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  Val or Gly or Leu or Ile or Met or Nle or Phe or Ala
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (2)..(2)
<223>  Lys or Arg or His or Asn or Glu or Gln
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (3)..(3)
<223>  Ala or Ser or Thr
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (4)..(4)
<223>  Tyr or Phe or Trp or His
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (5)..(5)
<223>  Thr or Ser or Ala
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (7)..(7)
<223>  Lys or Arg or His or Asn or Glu or Gln
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (8)..(8)
<223>  Glu or Asp or Gln or Asn or Lys
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (9)..(9)
<223>  Pro or Gly or Ala or Ser
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (10)..(10)
<223>  Nle or Ile or Leu or Met or Val or Phe
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (11)..(11)
<223>  Thr or Ser or Ala
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (12)..(12)
<223>  Ser or Thr or Ala
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (13)..(13)
<223>  Ala or Ser or Thr
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (14)..(14)
<223>  Ser or Thr or Ala
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (16)..(16)
<223>  Arg or Lys or His or Gln
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (17)..(17)
<223>  Thr or Ser or Ala
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (18)..(18)
<223>  Ile or Val or Leu or Met or Nle or Phe
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (19)..(19)
<223>  Thr or Ser or Ala
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (20)..(20)
<223>  Arg or Lys or His or Gln
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (21)..(21)
<223>  Ala or Gly or Ser or Thr
<400>  1
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20
<210>  2
<211>  21
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic peptide
<220>
<221>  DISULFID
<222>  (6)..(15)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (10)..(10)
<223>  Nle
<400>  2
Val Lys Ala Tyr Thr Cys Lys Glu Pro Xaa Thr Ser Ala Ser Cys Arg
1               5                   10                  15
Thr Ile Thr Arg Ala
20
<210>  3
<211>  19
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic peptide
<220>
<221>  DISULFID
<222>  (5)..(14)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (9)..(9)
<223>  Nle
<400>  3
Lys Ala Tyr Thr Cys Lys Glu Pro Xaa Thr Ser Ala Ser Cys Arg Thr
1               5                   10                  15
Ile Thr Arg
<210>  4
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic peptide
<220>
<221>  DISULFID
<222>  (3)..(12)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (7)..(7)
<223>  Nle
<400>  4
Tyr Thr Cys Lys Glu Pro Xaa Thr Ser Ala Ser Cys Arg Thr Ile
1               5                   10                  15
<---