ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ АНАЛИЗ С ДВОЙНЫМИ ФЛУОРОФОРАМИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ БОТУЛИНИЧЕСКОГО НЕЙРОТОКСИНА
ENZYME ASSAY WITH DUPLICATE FLUOROPHORES TO ASSAY THE ENZYMATIC ACTIVITY OF BOTULINUM NEUROTOXIN

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент Соединенных Штатов №61/895533 (поданной 25 октября 2013 г.), предварительной заявки на патент Соединенных Штатов №61/897352 (поданной 30 октября 2013 г.), предварительной заявки на патент Соединенных Штатов №62/014586 (поданной 19 июня 2014 г.) и предварительной заявки на патент Соединенных Штатов №62/058532 (поданной 1 октября 2014 г.)
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0001] Область техники представляет собой анализы с применением протеаз, в частности анализы, связанные с применением нейротоксинов Clostridium botulinum.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Ботулинические нейротоксины (BoNT) продуцируются Clostridium botulinum, и они относятся к числу наиболее эффективных известных токсинов. Данные токсины являются широко известными источниками пищевого отравления, часто причиняют серьезный вред или даже приводят к гибели жертв. Существует множество близких по структуре ботулинических нейротоксинов или серотипов (BoNT/A-G, и предложенный BoNT/H), каждый из которых состоит из тяжелой цепи (~100 кДа) и легкой цепи (~50 кДа). Тяжелая цепь опосредует проникновение токсина в целевую клетку посредством опосредованного рецепторами эндоцитоза. После интернализации легкая цепь перемещается из просвета эндосомальной везикулы в цитозоль и действует в качестве цинк-зависимой протеазы, расщепляя специфичные к субстрату белки, которые опосредуют слияние везикулы с целевой мембраной, процесс, имеющий важнейшее значение для высвобождения нейромедиаторов.
[0003] Субстратные белки BoNT включают белок мембраны клетки синтаксин, периферический мембранный белок SNAP-25 и везикулярный мембранный белок синаптобревин (Syb). Данные белки совместно именуют белками SNARE (растворимый чувствительный к N-этилмалеимиду фактор, обеспечивающий прикрепление белков). Расщепление белков SNARE блокирует слияние везикул с мембраной клетки и нарушает высвобождение нейромедиаторов в нервно-мышечных соединениях. Из всех белков SNARE синтаксин и SNAP-25 обычно находятся на целевой мембране и, следовательно, их называют t-SNARE, тогда как синаптобревин связан исключительно с синаптическими везикулами внутри синапса, и его называют v-SNARE. Вместе данные три белка образуют комплекс, который считают минимальным аппаратом, необходимым для опосредования слияния между мембраной везикулы и плазматической мембраной. BoNT/A, Е и С расщепляют SNAP-25, тогда как BoNT/B, D, F и G расщепляют синаптобревин (Syb) в отдельных и различных сайтах. BoNT/C также расщепляет синтаксин дополнительно к SNAP-25. Поскольку BoNT действуют как ферменты, даже ничтожно малые их количества могут оказать разрушительное действие на пораженного индивида.
[0004] Несмотря на то, что ботулинический токсин является источником пищевого отравления и обладает потенциалом для применения в качестве биотеррористического оружия, существуют его терапевтические применения. Недавно ботулинический токсин применили для лечения состояний, связанных с нежелательными сокращениями мышц (таких как косоглазие), и для лечения хронических мигреней. Его также широко применяют в косметических целях, где избирательный паралич малых мышц под кожей временно уменьшает возникновение возрастных морщин. При таком широком применении существует потребность в чувствительном и быстром анализе белков BoNT. Данный процесс осложняется необходимостью точно определять активность BoNT, а не просто определять количество присутствующего белка BoNT, так как процессы очистки, используемые при выделении данных белков, могут приводить к значительному уровню денатурации и приводить к инактивации данных белков.
[0005] На сегодняшний день широко применяемый способ обнаружения BoNT и определения их активности состоит в проведении анализов токсичности с применением мышей. Такие способы требуют использования больших количеств мышей, требуют больших затрат времени и не могут применяться для исследования каталитической кинетики токсинов. Также было разработано множество систем иммунологического анализа, основанных на антителах, разработанных против белков BoNT, но хотя такие анализы могут быть полезны для определения количества присутствующего белка BoNT, они не могут применяться для определения ферментативной активности токсина. Были разработаны способы обнаружения продуктов реакции BoNT, чтобы измерить ферментативные активности данных токсинов, например, применяя ВЭЖХ или иммунологические анализы, позволяющие обнаружить продукты расщепления. Данные способы, тем не менее, как правило, сложны, требуют больших затрат времени и могут быть дорогостоящими (например, при применении специализированных антител), что приводит к сложности их автоматизации и непригодности для крупномасштабного скрининга.
[0006] Недавно исследователи начали изучать применение способов резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) для определения ферментативных активностей. Способы FRET включают применение двух флуоресцентных молекул: донорного флуорофора и акцепторного флуорофора. Спектр испускания донорного флуорофора перекрывается со спектром возбуждения акцепторного флуорофора, и при определенных условиях и при надлежащем расстоянии между флуорофорами и ориентации флуорофоров возбуждение донорного флуорофора может приводить к испусканию из акцепторного флуорофора. Эффективность такого переноса энергии в высокой степени зависит от расстояния между донорным флуорофором и акцепторным флуорофором, и было разработано множество флуоресцентных анализов с использованием данного феномена. Для применения в основанных на клеточной системе анализах такие зонды FRET можно получить внутри клетки путем генетической манипуляции. В таком подходе часто применяют флуоресцентные белки, в частности, зеленый флуоресцентный белок и его варианты, описанные в международной заявке на патент WO 2008/145301 A1 (от Tasdemir и Corazza), так как для флуоресцирования данных белков не требуется добавление кофактора или субстрата. Некоторые из данных анализов способны обнаружить ферментативную активность. Например, в патенте Соединенных Штатов №7749759 (от Fernandez-Salas, Steward и Aoki) описано применение клеток, содержащих субстрат для токсина Clostridium, при этом указанный субстрат (который экспрессируется с генетической конструкции) включает донорный флуорофор и акцепторный флуорофор, разделенные пептидом, который расщепляется токсином Clostridium. Воздействие токсина Clostridium приводит к расщеплению субстрата, и последующее разделение донорного флуорофора и акцепторного флуорофора приводит к изменениям в наблюдаемой флуоресценции. Такие анализы на основе FRET, тем не менее, имеют ограничения. Спектры возбуждения донорного флуорофора и акцепторного флуорофора часто перекрываются, приводя к неизбежно высокому фоновому сигналу с акцепторного флуорофора даже в отсутствие FRET. Аналогично, в некоторых репортерных конструкциях флуорофоры могут самоагрегироваться, образуя комплексы флуорофоров внутри и/или между агрегированными конструкциями, которые не диссоциируют при расщеплении целевого сайта. Кроме того, использование более длинных последовательностей пептидов в качестве сайтов расщепления для получения более сложных сайтов связывания фермента и сайтов расщепления (например, таких, как у нейротоксинов клостридий) может резко снизить эффективность переноса энергии между флуорофорами, разделенными такими последовательностями пептидов.
[0007] В результате такой низкой эффективности и высокой фоновой флуоресценции, конструкции на основе FRET часто экспрессируют на повышенном уровне внутри клеток, что приводит к нежелательной токсичности для клетки и к агрегации конструкции. В патенте Соединенных Штатов №6936428 (от Davis и Vellencourt) описан подход, в котором фоновая флуоресценция конструкций FRET, в которых используется донорный и акцепторный флуоресцентные белки, уменьшается благодаря применению конструкций, в которых пары флуорофоров мультимерного белка расположены таким образом, чтобы они образовывали внутримолекулярные гомодимеры, что позволяет уменьшить образование гетеродимеров донор/акцептор, которые порождают фоновую флуоресценцию. В качестве альтернативы в патенте Соединенных Штатов 8067231 (от Fernandez-Salas и др.) описан анализ, основанный на клеточной системе, в котором наблюдают изменение в распределении видимой флуоресценции от мембраны клетки в цитоплазматическое пространство клетки, тем не менее, для такого измерения требуются сложные оптические устройства и сложный анализ изображений.
[0008] Все другие публикации, на которые ссылаются в данной заявке, включены посредством ссылки до той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или заявка на патент были конкретно и отдельно указаны как включенные посредством ссылки. Если определение или применение некоторого термина во включенных ссылочных материалах не соответствует или противоречит определению данного термина, приведенному в данной заявке, то используется определение данного термина, приведенное в данной заявке, и определение данного термина в ссылочном материале не используется.
[0009] Таким образом, необходимы улучшенные композиции и способы для того, чтобы обеспечить быстрое и точное определение характеристик BoNT и активностей BoNT.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0010] Согласно настоящему изобретению предложены композиции и способы для применения в анализах, которые позволяют обнаружить ботулинические нейротоксины (BoNT), в которых используется конструкция, содержащая по меньшей мере две копии одного и того же репортера, такого как флуорофор или хромофор. Указанная конструкция содержит сайт заякоривания, который присоединяет конструкцию к мембране клетки и/или везикулы, что, в свою очередь, обеспечивает защиту репортера от деградирующей активности в цитозоле. Данная конструкция также содержит сайт расщепления, который отделяет сайт заякоривания от по меньшей мере одного из репортеров, а также служит в качестве субстрата для ферментативной активности (например, протеазной активности). Ферментативная активность в сайте расщепления высвобождает репортер из конструкции; последующая деградация репортеров в цитозоле приводит к измеримому изменению исходного сигнала, которое пропорционально ферментативной активности.
[0011] Варианты реализации идеи настоящего изобретения включают репортерную конструкцию, которую можно применять для измерения ферментативной активности (например, активности ботулинического нейротоксина), и клетки, которые содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую такую репортерную конструкцию. Указанная репортерная конструкция содержит домен заякоривания в мембране, который взаимодействует с мембраной клетки (например, с плазматической мембраной или с мембраной везикулы), репортерный домен, который содержит две или более копий сигналообразующего пептида (например, последовательность пептида, соответствующую флуоресцентному белку, или последовательность, идентичную по меньшей мере на 80% последовательности зеленого флуоресцентного белка), и сайт расщепления, который расположен между сайтом заякоривания в мембране и репортерным доменом. Сигналообразующие пептиды продуцируют неразличимые сигналы, и общий сигнал, продуцируемый репортерным доменом, представляет собой совокупность данных отдельных все еще неразличимых сигналов. Сайт расщепления включает пептид, который поддается расщеплению указанной ферментативной активностью (например, белком SNARE или его фрагментом), и такое расщепление приводит к высвобождению репортерного домена в цитоплазму. Такие сайты расщепления можно выбрать таким образом, чтобы они поддавались расщеплению более чем одним ферментом (например, как BoNT/A, так и BoNT/E). Репортерный домен подвергается явлениям деградации после высвобождения в цитоплазму, при этом отдельные явления деградации вызывают потерю сигнала от каждого из сигналообразующих пептидов и приводят к постепенной потере совокупного сигнала репортерного домена. В некоторых вариантах реализации между сигналообразующими пептидами встроен линкерный пептид. В предпочтительном варианте реализации идеи настоящего изобретения указанную конструкцию можно расщепить с помощью более чем одного фермента, и она проявляет пониженную склонность в отношении чувствительности к расщеплению посредством одной ферментативной активности (например, BoNT/A) относительно второй ферментативной активности (например, BoNT/E) по сравнению с аналогичной конструкцией, содержащей репортерный домен с единичным сигналообразующим пептидом. В некоторых вариантах реализации репортерная конструкция содержит вспомогательный репортерный домен, который генерирует сигнал, отличимый от такового у репортерного домена.
[0012] В другом варианте реализации идеи настоящего изобретения предложен способ измерения ферментативной активности путем получения клетки, которая экспрессирует репортерную конструкцию, приведение в контакт указанной клетки с образцом, в котором предполагают наличие ферментативной активности, и наблюдение уменьшения сигнала, продуцируемого репортерной конструкцией, в присутствии указанной ферментативной активности. Репортерная конструкция содержит домен заякоривания в мембране, который взаимодействует с мембраной клетки (например, с плазматической мембраной или мембраной везикулы), репортерный домен, который содержит две или более копий сигналообразующего пептида (например, последовательность пептида, соответствующую флуоресцентному белку, и/или последовательность, идентичную по меньшей мере на 80% последовательности зеленого флуоресцентного белка), и сайт расщепления, который расположен между сайтом заякоривания в мембране и репортерным доменом. Сигналообразующие пептиды продуцируют неразличимые сигналы, таким образом, что общий сигнал, продуцируемый репортерным доменом, представляет собой совокупность данных отдельных все еще неразличимых сигналов. Сайт расщепления включает пептид, который поддается расщеплению указанной ферментативной активностью (например, белком SNARE или его фрагментом), и такое расщепление приводит к высвобождению репортерного домена в цитоплазму. Такие сайты расщепления можно выбрать таким образом, чтобы они поддавались расщеплению более чем одним ферментом (например, как BoNT/A, так и BoNT/E). Репортерный домен подвергается явлениям деградации после высвобождения в цитоплазму, при этом отдельные явления деградации вызывают потерю сигнала от каждого из сигналообразующих пептидов и приводят к постепенной потере совокупного сигнала репортерного домена. В некоторых вариантах реализации совокупный сигнал репортерного домена можно наблюдать после потери сигнала от одного из сигналообразующих пептидов в результате явления деградации. В предпочтительном варианте реализации идеи настоящего изобретения указанную конструкцию можно расщепить с помощью более чем одного фермента, и она проявляет пониженную склонность в отношении чувствительности к расщеплению посредством одной ферментативной активности (например, BoNT/A) относительно второй ферментативной активности (например, BoNT/E) по сравнению с аналогичной конструкцией, содержащей репортерный домен с единичным сигналообразующим пептидом.
[0013] В некоторых способах идеи настоящего изобретения предложен эталонный сигнал, который отличим от сигнала, продуцируемого репортерным доменом, и его можно использовать для нормировки сигнала от репортерного домена репортерной конструкции. В некоторых вариантах реализации эталонный сигнал получают путем включения вспомогательного репортера в конструкцию, при этом вспомогательный репортер продуцирует сигнал, отличимый от такового у репортерного домена, и не расщепляется посредством ферментативной активности. В других вариантах реализации указанный эталонный сигнал получают путем приведения в контакт клетки с красителем для клеток (например, красителем для мембран или красителем для ядра/ядерным красителем). Такой краситель для клеток можно привести в контакт с клеткой до, во время или после приведения в контакт клетки с ферментативной активностью.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
[0014] На фигурах 1А-1D схематически изображены конструкции согласно идее настоящего изобретения и показаны типичные результаты. На фиг. 1А-1С схематически изображены конструкции согласно идее настоящего изобретения, которые содержат два идентичных репортерных пептида в различных конфигурациях. На фиг. 1D показаны типичные результаты основанного на клеточной системе анализа для двух различных ботулинических нейротоксинов (BoNT/A, BoNT/E), в котором используют репортер, сконфигурированный, как показано на фиг. 1А. Также показаны результаты для клеток, экспрессирующих аналогичную конструкцию, несущую единичный репортер. Неожиданно, склонность в отношении чувствительности к BoNT/A и BoNT/E резко снижена в клетках, экспрессирующих конструкцию согласно идее настоящего изобретения.
[0015] На фигурах 2А-2К схематически изображены конструкции согласно идее настоящего изобретения, которые содержат два идентичных репортера и третий, отличный репортер.
[0016] На фиг. 3 изображен основанный на клеточной системе анализ согласно настоящему изобретению, в котором указанная конструкция содержит домен для заякоривания в мембране клетки.
[0017] На фиг. 4 изображен основанный на клеточной системе анализ согласно настоящему изобретению, в котором указанная конструкция содержит домен для заякоривания в мембране везикулы.
[0018] На фиг. 5 показана процедура анализа согласно настоящему изобретению.
[0019] На фиг. 6 показана альтернативная процедура анализа согласно настоящему изобретению.
[0020] На фиг. 7 показаны спектры возбуждения и испускания для флуоресцентного белка (eYFP) и вторичного красителя.
[0021] На фиг. 8 схематически изображен метод анализа идеи настоящего изобретения, который включает применение вторичного красителя.
[0022] На фиг. 9А и 9В показаны типичные результаты анализа согласно идее настоящего изобретения в отсутствие корректировки и с нормировкой результатов с применением вторичного красителя, соответственно.
[0023] На фиг. 9С показаны микрофотографии, полученные с применением флуоресценции и микроскопии по методу светлого поля клеток, экспрессирующих конструкцию согласно идее настоящего изобретения, в отсутствие и в присутствии соответствующего ботулинического токсина.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0024] В вариантах реализации идеи настоящего изобретения используется одна или более клеток, которые содержат конструкцию (например, внедренную посредством экспрессии после трансфекции и/или микроинъекции), которая содержит компоненты, которые изолируют поддающуюся наблюдению молекулу или область репортера в защищенной области и области, чувствительной к анализируемому веществу. Репортерная молекула может содержать два или более идентичных репортеров. Такие защищенные области могут находиться в непосредственной близости от мембраны клетки и/или мембраны везикулы. Взаимодействие области, чувствительной к анализируемому веществу, с анализируемым веществом приводит к высвобождению репортера из защищенной области посредством расщепления, которое приводит к деградации репортера и наблюдаемому изменению в сигнале от репортера. Примеры анализируемых веществ могут включать протеолитические ферменты, и в таких случаях область, чувствительная к анализируемому веществу, может представлять собой сайт расщепления, который может служить в качестве субстрата для фермента.
[0025] Различные объекты, свойства, аспекты и преимущества объекта изобретения станут более очевидными после ознакомления со следующим подробным описанием предпочтительных вариантов реализации, наряду с сопроводительными фигурами, на которых сходные числа представляют собой сходные компоненты.
[0026] Варианты реализации идеи настоящего изобретения включают способы, в которых такие конструкции экспрессируются в клетках, которые затем подвергаются воздействию интересующего анализируемого вещества (например, токсина Clostridium botulinum и/или Clostridium tetani). Такие клетки могут представлять собой клетки с остановленным делением. Следует понимать, что новое устройство и состав конструкций согласно идее настоящего изобретения оказывает непосредственное влияние на механизм и рабочие характеристики таких тестов. В предпочтительных вариантах реализации идеи настоящего изобретения воздействие интересующего анализируемого вещества приводит к расщеплению в чувствительной к анализируемому веществу области или домене указанной конструкции, что приводит к высвобождению фрагмента конструкции, который содержит репортерную область, несущую две или более идентичных областей, генерирующих сигнал (например, пару идентичных флуорофоров), каждая из которых генерирует детектируемый сигнал. В отличие от конструкций и способов, в которых используют флуорофоры, устроенные в виде FRET-пар (например, различные флуорофоры, устроенные в виде гетеро-FRET-пар, и/или сходные или идентичные флуорофоры, устроенные в виде гомо-FRET-пар), каждая из генерирующих сигнал областей репортера, высвобожденная в виде фрагмента конструкции, вносит непосредственный вклад в детектируемый совокупный сигнал как до, так и непосредственно после расщепления. Например, в некоторых вариантах реализации такой совокупный сигнал может представлять собой приближенную сумму (или другую функцию) поддающихся наблюдению сигналов от каждой из генерирующих сигнал областей. В конструкциях и анализах согласно идее настоящего изобретения изменение детектируемого сигнала, который служит основой для детектирования, является результатом множества событий деградации, которые происходят в цитозоле после расщепления, так как после утраты одной из пары идентичных генерирующих сигнал областей (например, из пары по существу идентичных флуорофоров) все еще сохраняется излучающий репортерный фрагмент. В конструкции, в которой используют единичный репортер, единичное событие деградации, происходящее с высвобожденным фрагментом конструкции, может привести к фрагментации единичного репортера и потере детектируемого сигнала. Аналогично, в конструкциях, в которых используют дублированные репортеры, в которых детектируемый сигнал представляет собой результат взаимодействия между репортерами (например, в конструкции, в которой используют пару флуорофоров, устроенную подходящим образом для осуществления гетеро-FRET и/или гомо-FRET), фрагментация одной генерирующей сигнал области вследствие единичного события деградации также приводит к потере детектируемого сигнала от данной конструкции.
[0027] Наоборот, содержащий репортер фрагмент, полученный в результате расщепления, направленного на конструкцию согласно идее настоящего изобретения, которая сконфигурирована таким образом, чтобы после расщепления высвободить две или более идентичных/неразличимых генерирующих сигнал областей, способен продолжать генерировать детектируемый сигнал после единичного события деградации, произошедшего с одной из копий генерирующих сигнал областей. Поскольку должно произойти множество событий деградации, чтобы прекратилось генерирование детектируемого сигнала фрагментом, возникшим в результате расщепления указанной конструкции, детектируемый сигнал уменьшается при повышении концентрации анализируемого вещества, но сохраняется (по сравнению с конструкциями с единичными репортерами или конструкциями, для генерирования сигнала с которых необходимы спаренные репортеры) при высоких концентрациях анализируемого вещества. Это может привести к улучшенному динамическому диапазону анализов, основанных на конструкциях согласно идее настоящего изобретения.
[0028] Компоненты конструкции согласно идее настоящего изобретения могут быть расположены разнообразными способами. Следующее описание включает множество примеров, в которых функциональные домены репортерной конструкции, например, мембранный якорь (А), сайт расщепления (В), множество копий первичной генерирующей сигнал области/репортера (С, С'), и, в некоторых случаях, вторичный репортер (D), изображены соединенными в различные структуры линкерными областями или линкерами (-). Следует понимать, что, на следующих фигурах и в их описаниях присутствие таких линкеров можно считать необязательным. По этой причине в вариантах реализации идеи настоящего изобретения одной или более частей, описанных как линкер, можно пренебречь. В некоторых вариантах реализации линкерные области согласно идее настоящего изобретения также могут включать части функциональной области, которые не принимают непосредственного участия в функционировании данной области. Например, если репортер представляет собой белковый флуорофор, то линкер может представлять собой часть последовательности белкового флуорофора, не принимающую непосредственного участия в флуоресценции. Аналогично, линкер может представлять собой часть последовательности сайта расщепления, которая непосредственно не служит субстратом для протеазы. В качестве альтернативы, в других вариантах реализации идеи настоящего изобретения линкер может представлять собой синтетическую или сконструированную пептидную последовательность, которая, например, может быть разработана таким образом, чтобы уменьшить FRET (т.е. гомо-FRET и/или гетеро-FRET) между генерирующими сигнал областями до неподходящих уровней (например, менее чем приблизительно 5%). Такая синтетическая последовательность пептида может представлять собой гибкую последовательность, жесткую последовательность или последовательность как с гибкими, так и с жесткими частями. В последовательностях SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9 показаны примеры синтетических последовательностей линкеров. В некоторых вариантах реализации линкерная область может включать повторяющиеся копии таких последовательностей линкеров (например, в подобной конкатемеру структуре), чтобы получить желательную длину, гибкость и/или другие желательные структурные особенности. Следует понимать, что в данной заявке термин "линкер" не обозначает сайт расщепления, который расщепляется ферментативной активностью анализируемого вещества, но предпочтительнее обозначает структурный участок, который соединяет другие функциональные области репортерной конструкции.
[0029] В некоторых вариантах реализации содержащая репортер область может содержать по меньшей мере две копии первичного репортера, который представляет собой флуорофор и/или хромофор. В некоторых вариантах реализации идеи настоящего изобретения у двух копий первичного репортера одинаковы последовательности аминокислот. В других вариантах реализации две копии первичного репортера могут быть различного состава, но иметь по существу аналогичные спектры возбуждения и испускания (т.е. проявлять большее или равное 80% перекрывание). В предпочтительных вариантах реализации первичный репортер может представлять собой флуоресцентный белок, например, зеленый флуоресцентный белок (SEQ ID NO: 10), или пептид, последовательность которого по меньшей мере на 80% идентична последовательности зеленого флуоресцентного белка. Подходящие флуоресцентные белковые флуорофоры включают желтый флуоресцентный белок (например, eYFP, SEQ ID NO: 11), красный флуоресцентный белок, голубой флуоресцентный белок (SEQ ID NO: 12), mBanana, mStrawberry, mCherry, tdTomato, J-Red, мономер DsRed, mCitrine, Venus (SEQ ID NO: 13), YPet белок, Emerald, EGFP, CyPet, mCFPm, Cerulean, mPlum, mOrange, mKO, T-Sapphire, производное желтого флуоресцентного белка, производное mCitrine, производное Venus, производное белка YPet и/или вариант зеленого флуоресцентного белка. В особенно предпочтительном варианте реализации первичный репортер может представлять собой мономерный флуоресцентный белок, полученный из зеленого флуоресцентного белка из Aequorea victoria, такой как Sirius, Azurite, EBFP2, TagBFP, mTurqoise, ECFP, Cerulean, TagCFP, mTFP1, mUkG1, mAG1, AcGFP1, TagGFP2, EDFP, mWasabi, EmGFP, TagYFP, eYFP (SEQ ID NO: 11), Topaz, SYFP2, Venus, Citrine, mKO, mKO2, mOrange, mOrange2, TagRFP, TagRFP-T, mStrawberry, mRuby, mCherry, mRaspberry, mKate2, mPlum, mNeptune, T-Sapphire, mAmetrine и/или mKeima (см. "Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging Living Cells and Tissues" (Chudakov, D.M. и др., Physiol. Rev. 90:1103-1163, 2010). Аналогично, подходящие первичные репортеры могут представлять собой белковые флуорофоры, полученные из зеленого флуоресцентного белка из Aequorea victoria, которые содержат мутацию А206К. В качестве альтернативы, первичный репортер может представлять собой не относящуюся к флуорофорам и/или хромофорам молекулу, например, гаситель флуоресценции.
[0030] Внутри содержащей репортер части конструкций согласно идее настоящего изобретения расположение первичных репортеров может быть таким, что они отдалены на достаточное расстояние друг от друга и/или ориентированы таким образом, что они по существу не проявляют полезного (т.е. менее чем 5%) переноса энергии FRET (например, гомо-FRET). Предполагаемые низкие уровни переноса энергии гомо-FRET могут быть меньше или равны приблизительно 1%, меньше или равны приблизительно 0,1%, меньше или равны приблизительно 0,01%, и/или меньше или равны приблизительно 0,001% переноса энергии между флуорофорами. Аналогично, предполагаемые низкие уровни переноса энергии гомо-FRET могут быть меньше или равны приблизительно 10%, меньше или равны приблизительно 1%, меньше или равны приблизительно 0,1%, меньше или равны приблизительно 0,01%, и/или меньше или равны приблизительно 0,001% фонового шума наблюдаемого сигнала. В качестве альтернативы в некоторых вариантах реализации конструкции согласно настоящему изобретению первичные репортеры 120, 130 могут быть устроены таким образом, что они проявляют значимый (т.е. больший, чем приблизительно 1%) перенос энергии гомо-FRET. Такие явления можно контролировать путем выбора длины линкерной области или линкера, вставленного между такими первичными репортерами. В некоторых вариантах реализации идеи настоящего изобретения длина такого линкера может составлять 20, 30, 40 50 или более аминокислот. Аналогично, линейный размер такого линкера может составлять по меньшей мере приблизительно 4, приблизительно 6, приблизительно 8, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20 или более нанометров, когда конструкция находится в нативном свернутом состоянии.
[0031] Предполагается, что первичный репортер в конструкции согласно идее настоящего изобретения может содержать более одной флуоресцентной молекулы. Например, пара флуорофоров с различными, но перекрывающимися спектрами возбуждения и испускания может быть устроена в виде FRET-пары, которая действует в качестве единичной копии первичного репортера. Аналогично, пара идентичных флуорофоров может быть устроена в виде гомо-FRET-пары, которая действует в качестве единичной копии первичного репортера (например, что обнаружили с помощью флуоресцентной анизотропии). Например, в таком варианте реализации репортерная конструкция может содержать пару первичных флуорофоров, при этом каждый первичный флуорофор содержит два флуорофора с различными, но перекрывающимися спектрами возбуждения и испускания, устроенными в виде гетеро-FRET-пары. В качестве альтернативы, в таком варианте реализации репортерная конструкция может содержать пару первичных флуорофоров, при этом каждый первичный флуорофор содержит два флуорофора со сходными или идентичными спектрами возбуждения и испускания, устроенными в виде гетеро-FRET-пары.
[0032] Выше отмечено, что домены конструкции согласно идее настоящего изобретения могут быть расположены различными способами. Предпочтительный вариант реализации идеи настоящего изобретения, который можно описать как расположение А-В-С-С', схематически показан на фигуре 1А. Такая репортерная конструкция может содержать мембранный якорь 170, который соединен с сайтом расщепления 160 посредством вставленного между якорем/сайтом расщепления линкера 150. Сайт расщепления в свою очередь соединен с первой копией пары идентичных первичных репортеров 120 посредством вставленного между сайтом расщепления/репортером линкера 165. Такая первая копия пары идентичных первичных репортеров 120 соединена со второй копией пары идентичных первичных репортеров 130 посредством вставленного между первичным репортером/первичным репортером линкера 140. В таком варианте реализации содержащая репортер область может содержать по меньшей мере две копии первичного репортера. Пример репортерной конструкции, обладающей такой структурой, показан в последовательности SEQ ID NO: 14.
[0033] Альтернативное устройство репортерной конструкции (которое можно описать как А-С-В-С') схематически показано на фигуре 1В, в которой мембранный якорь 170 соединен с первой копией пары идентичных первичных репортеров 120 посредством вставленного между якорем/первичным репортером линкера 125. Первая копия пары идентичных первичных репортеров 120 соединена с сайтом расщепления 160 посредством вставленного между первым сайтом расщепления/флуорофором линкера 165А. Сайт расщепления 160 также соединен со второй копией пары идентичных первичных репортеров 130 посредством вставленного между вторым сайтом расщепления/флуорофором линкера 165В. Излучение такого оставшегося репортера 120 можно использовать, например, в качестве исходного или нормировочного сигнала.
[0034] Другое альтернативное устройство репортерной конструкции (которое можно описать как С-А-В-С') показано на фигуре 1С, в которой первая копия пары идентичных первичных репортеров 120 соединена с частью, содержащей мембранный якорь 170, посредством вставленного между якорем/первичным репортером линкера 125. Мембранный якорь 170 также соединен с сайтом расщепления 160 посредством вставленного между якорем/сайтом расщепления линкера 150. Сайт расщепления 160, в свою очередь, соединен со второй копией пары идентичных первичных репортеров 130 посредством вставленного между сайтом расщепления/репортером линкера 165. Излучение такого оставшегося репортера 120 можно использовать, например, в качестве исходного или нормировочного сигнала. Несмотря на то, что показано одно изображение данной конфигурации, следует понимать, что линкер репортера 140 можно поместить с любой стороны от сайта расщепления 160 в таком варианте реализации.
[0035] В конфигурациях конструкции, показанных на фигуре 1А, фигуре 1В и фигуре 1С, гидролиз сайта расщепления 160, например, с помощью протеазы, приводит к высвобождению одного или более из первичных репортеров 120, 130 из домена заякоривания в мембране 170. Сайт расщепления, следовательно, по меньшей мере частично определяет специфичность анализов, основанных на таких конструкциях, вследствие специфичных активностей ферментов, и предпочтительно включает сайты гидролиза, в которых ферментативная активность приводит к расщеплению пептидного остова указанной конструкции, и сайты распознавания, которые содержат сайты взаимодействия с ферментом и придают по меньшей мере часть субстратной специфичности. В некоторых вариантах реализации сайт расщепления может содержать участки, которые взаимодействуют с экзосайтами или аллостерическими сайтами целевого фермента. В предпочтительных вариантах реализации идеи настоящего изобретения сайт расщепления поддается расщеплению посредством протеазной активности ботулинического нейротоксина BoNT, например, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F и/или BoNT/G. Предполагается, что последовательность сайта расщепления может быть выбрана или разработана таким образом, чтобы она содержала сайты расщепления и распознавания для двух или более различных BoNT (например, как BoNT/A, так и BoNT/E). В некоторых вариантах реализации сайт расщепления может содержать интактные последовательности или последовательности, полученные из белка SNARE, такого как синаптосомально-ассоциированный белок (например, SNAP-25; SEQ ID NO: 10), ассоциированный с везикулами мембранный белок (например, VAMP или синаптобревин; SEQ ID NO: 11), и/или последовательности, полученные из синтаксина. Примеры подходящих последовательностей сайта расщепления включают SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18.
[0036] Выше отмечено, что высвобождение из домена заякоривания в мембране может позволить одному или более первичным репортерам диффундировать прочь из защищенной области. Такие защищенные области могут включать области в пространственной близости от мембраны клетки и/или мембраны везикулы. Для этой цели домен заякоривания может содержать локализующий на мембране клетки пептид и/или локализующий на мембране везикулы пептид. Такая область заякоривания может содержать трансмембранную область, в которой по меньшей мере часть пептидной цепи проникает и/или проходит через мембрану клетки. В качестве альтернативы область заякоривания может содержать сайт пальмитоилирования, который, после посттрансляционного процессинга клеткой, образует сайт, взаимодействующий с мембраной клетки. В качестве альтернативы сайт заякоривания в мембране может содержать последовательность пептида, которая взаимодействует со связанным с мембраной рецептором или лигандом. В некоторых вариантах реализации идеи настоящего изобретения домен заякоривания может содержать последовательности, полученные из синаптобревина (например, трансмембранный пептид синаптобревина) и/или из SNAP-25 (например, область пальмитоилирования из SNAP-25). В других вариантах реализации идеи настоящего изобретения домен заякоривания в мембране может представлять собой синтаксин или фрагмент синтаксина.
[0037] Выше отмечено, что после высвобождения из области заякоривания 170 первичные репортеры могут диффундировать в цитозоль. Применение двух или более первичных репортеров обеспечивает множество технологических преимуществ. Преимущества конструкций, которые высвобождают два или более первичных репортеров после расщепления, описаны выше. Другие преимущества включают возможность использовать более низкие уровни экспрессии указанной конструкции (тем самым минимизируя риск токсичности и/или агрегации конструкции) и/или возможность использовать гораздо меньшее количество клеток в анализе на основе клеток. Кроме того, относительно сильный сигнал, полученный с помощью множества первичных репортеров, может позволить осуществить более стабильные и воспроизводимые измерения исходного уровня, которые также служат для повышения чувствительности анализа, позволяя более надежно отличать сигнал от шума. Следует отметить, что авторы предшествующих исследований (A.G. von Armin, X.W. Deng и M.G. Stacey; Gene 221 (1998), стр. 35-43) применяли конструкции, содержащие два или более наборов последовательностей желтого флуоресцентного белка в качестве маркеров для экспрессия генов, но обнаружили яркую флуоресценцию во всех клетках, такие конструкции не смогли продемонстрировать явления деградации, которые не только свойственны конструкциям согласно идее настоящего изобретения, но и необходимы для их применения в основанных на клеточной системе анализах.
50
[0038] Неожиданно авторы настоящего изобретения обнаружили, что конструкции с репортерными областями, которые содержат множество первичных репортеров, могут обеспечить отличную селективность между мишенями ферментов по сравнению с аналогичными конструкциями, в которых репортерная область содержит единичную копию первичного репортера. Пример описанного случая находится на фигуре 1D, на которой показаны сравнительные результаты ответа клеток в анализах на основе клеточной системы на BoNT/A и на BoNT/E, в которых клетки содержат либо конструкцию согласно идее настоящего изобретения, которая содержит два белковых флуорофора eYFP в расположении А-В-С-С', либо аналогичную конструкцию, которая содержит единичный белковый флуорофор eYFP в расположении А-В-С. Как BoNT/A, так и BoNT/E распознает и расщепляет сайт расщепления обеих конструкций, тем не менее у конструкции с единичным флуорофором наблюдается приблизительно в 80 раз более высокий сдвиг чувствительности (т.е. приблизительно в 80 раз лучшая чувствительность, выраженная в единицах EC) по отношению к нейротоксину BoNT/A по сравнению с нейротоксином BoNT/E (см. фиг. 1D, 37°С). Такое же исследование, проведенное с применением клеток, экспрессирующих репортерную конструкцию с "двойным флуорофором" (т.е. конструкцию, несущую два флуорофора eYFP), выявило аналогичную чувствительность к BoNT/A, но повышенную чувствительность к BoNT/E, что уменьшило сдвиг чувствительности при анализе до 26 раз. Такое уменьшение сдвига чувствительности при анализе дает преимущество, состоящее в том, что он позволяет применять одну и ту же конструкцию для анализов, направленных на более чем одно анализируемое вещество с ферментативной активностью. Без привязки к какой-либо конкретной теории, авторы настоящего изобретения полагают, что применение дополнительных последовательностей флуоресцентных пептидов наделяет конструкцию третичной структурой, которая позволяет улучшенный доступ до большего количества сайтов распознавания внутри домена расщепления указанной конструкции.
[0039] В некоторых вариантах реализации идеи настоящего изобретения репортерная конструкция может содержать, дополнительно к двум или более первичным репортерам, вторичный репортер, который отличается от первичных репортеров. Указанный вторичный репортер может обладать химической структурой, непохожей или отличной от такового у первичных репортеров. Спектр испускания такого вторичного репортера может перекрываться со спектром возбуждения первичного репортера. В таком варианте реализации конструкция может быть устроена таким образом, что происходит значительный (т.е. больший, чем приблизительно 1%) перенос энергии FRET между вторичным репортером и первичным репортером. В предпочтительном варианте реализации вторичный репортер представляет собой флуоресцентный белок, такой как желтый флуоресцентный белок, красный флуоресцентный белок, голубой флуоресцентный белок, зеленый флуоресцентный белок, mBanana, mStrawberry, mCherry, tdTomato, J-Red, мономер DsRed, mCitrine, Venus, белок YPet, Emerald, EGFP, CyPet, mCFPm, Cerulean, mPlum, mOrange, mKO, T-Sapphire, производное желтого флуоресцентного белка, производное mCitrine, производное Venus, производное белка YPet и/или вариант зеленого флуоресцентного белка.
[0040] Предпочтительно репортерная конструкция может быть устроена таким образом, что между вторичным репортером и первичным репортером не происходит значительного или подходящего переноса энергии FRET (т.е. степень происходящего FRET меньше или равна 5%). Расположение вторичного репортера и по меньшей мере одного из первичных репортеров внутри репортерной конструкции может быть таким, что они достаточно отдалены от друг от друга для того, чтобы по существу не проявлять подходящего (т.е. меньшего или равного 5%) FRET. Предполагаемые неподходящие уровни переноса энергии FRET могут быть меньше или равны приблизительно 10%, меньше или равны приблизительно 5%, меньше или равны приблизительно 1%, или меньше или равны приблизительно 0,1% сопутствующей фоновой флуоресценции. Это можно осуществить путем выбора линкера, благодаря которому достигается достаточное расстояние между вторичным репортером и первичным репортером. В некоторых вариантах реализации идеи настоящего изобретения длина такого линкера может составлять 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 или более аминокислот. Аналогично, длина линкера между двумя первичными репортерами может составлять по меньшей мере приблизительно 4, приблизительно 6, приблизительно 8, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20 или более нанометров, когда конструкция находится в нативном свернутом состоянии. Подходящие линкеры могут включать синтетические пептиды, и такие пептиды могут представлять собой гибкие пептиды, жесткие пептиды или могут содержать как гибкие, так и жесткие части.
[0041] В некоторых вариантах реализации идеи настоящего изобретения сигнал или излучение вторичного репортера можно использовать в качестве эталона или в качестве нормировочных данных, полезных для корректировки или нормировки наблюдаемого сигнала от одного или более репортеров содержащей репортеры части, что позволяет улучшить точность и/или чувствительность анализа, в котором используют такую конструкцию. В других вариантах реализации сигнал или излучение вторичного репортера может использоваться системой распознавания изображений для определения положения на полученном изображении, в котором может происходить реакция данного анализа, тем самым упрощая сбор результатов.
[0042] Пример варианта реализации, который включает такой вторичный репортер (который можно описать как имеющий структуру A-D-B-C-C', где "D" представляет собой вторичный репортер), схематически показан на фигуре 2А. В такой репортерной конструкции мембранный якорь 270 соединен с вторичным репортером 280 посредством вставленного между якорем/первичным репортером линкера 285. Вторичный репортер 280 также соединен с сайтом расщепления 260 посредством вставленного между вторичным репортером/сайтом расщепления линкера 255. Сайт расщепления 260, в свою очередь, соединен с первой копией пары идентичных первичных репортеров 220 посредством вставленного между сайтом расщепления/первичным репортером линкера 265, и первая копия пары идентичных первичных репортеров 220 и вторая копия пары идентичных первичных репортеров 230 соединены посредством вставленного между первичным репортером/первичным репортером линкера 240.
[0043] Альтернативный вариант реализации репортерной конструкции с двумя или более первичными репортерами и по меньшей мере одним вторичным репортером (который можно описать как D-A-B-C-C') схематически изображен на фигуре 2В. В данном варианте реализации вторичный репортер 280 связан с мембранным якорем 270 посредством вставленного между якорем/первичным репортером линкера 285. Мембранный якорь 270, в свою очередь, соединен с сайтом расщепления 260 посредством вставленного между якорем/сайтом расщепления линкера 250. Пара идентичных первичных репортеров 220, 230, которые соединены посредством вставленного между первичным репортером/первичным репортером линкера 240, в свою очередь, присоединены к сайту расщепления расщепления 260 посредством вставленного между сайтом расщепления/первичным репортером линкера 265.
[0044] На фигуре 2С схематически изображен вариант реализации репортерной конструкции (которую можно описать как C-D-A-B-C'), в которой первая копия пары идентичных первичных репортеров 220 связана с вторичным репортером 280 посредством вставленного между первичным репортером/вторичным репортером линкера 275. Вторичный репортер 280, в свою очередь, связан с мембранным якорем 270 посредством вставленного между якорем/первичным репортером линкера 275. Мембранный якорь 270 дополнительно соединен с сайтом расщепления 260 посредством вставленного между якорем/сайтом расщепления линкера 250. Вторая копия пары идентичных первичных репортеров 230 также соединена с сайтом расщепления 260 посредством вставленного между сайтом расщепления/первичным репортером линкера 265.
[0045] На фигуре 2D схематически изображен вариант реализации репортерной конструкции (которую можно описать как D-C-A-B-C'), в котором вторичный репортер 280 соединен с первой копией пары идентичных первичных репортеров 220 посредством вставленного между первичным репортером/вторичным репортером линкера 275. Первая копия пары идентичных первичных репортеров 220, в свою очередь, связана с мембранным якорем 270, при этом между ними вставлен линкер 245, соединяющий якорь/первичный репортер. Мембранный якорь 270 также соединен с сайтом расщепления 260 посредством вставленного между якорем/сайтом расщепления линкера 250. Вторая копия пары идентичных первичных репортеров 230 соединена с сайтом расщепления 260 посредством вставленного между сайтом расщепления/первичным репортером линкера 240.
[0046] На фигуре 2Е схематически изображен вариант реализации репортерной конструкции (которую можно описать как A-D-C-B-C'), в которой мембранный якорь 270 связан с вторичным репортером 280 посредством вставленного между якорем/вторичным репортером линкера 285. Вторичный репортер 280 также соединен с первой копией пары идентичных первичных репортеров 220 посредством вставленного между первичным репортером/вторичным репортером линкера 275. Первая копия пары идентичных первичных репортеров 220, в свою очередь, связана с сайтом расщепления 260 посредством вставленного между сайтом расщепления/первичным репортером линкера 265А. Вторая копия пары идентичных первичных репортеров 230 также соединена с данным сайтом расщепления 260 посредством другого вставленного между сайтом расщепления/первичным репортером линкера 265В.
[0047] На фигуре 2F схематически изображен вариант реализации репортерной конструкции (которую можно описать как A-C-D-B-C'), в которой мембранный якорь 270 соединен с первой копией пары идентичных первичных репортеров 220 посредством вставленного между якорем/вторичным репортером линкера 245. Вторичный репортер 280 также соединен с первой копией пары идентичных первичных репортеров 220 посредством вставленного между первичным репортером/вторичным репортером линкера 275. Данный вторичный репортер 280 соединен с сайтом расщепления 260 посредством вставленного между вторичным репортером/сайтом расщепления линкера 255. Затем сайт расщепления 260 соединяют со второй копией пары идентичных первичных репортеров 230 посредством вставленного между сайтом расщепления/первичным репортером линкера 265.
[0048] На фигуре 2G схематически изображен вариант реализации репортерной конструкции (которую можно описать как А-C-B-C'-D), в которой мембранный якорь 270 соединен с первой копией пары идентичных первичных репортеров 220 посредством вставленного между якорем/первичным репортером линкера 245. Данная первая копия пары идентичных первичных репортеров 220 соединена с сайтом расщепления 260 посредством вставленного между первым сайтом расщепления/первичным репортером линкера 265А. Сайт расщепления 260 также соединен со второй копией пары идентичных первичных репортеров 230 посредством вставленного между вторым сайтом расщепления/первичным репортером линкера 265В. Вторичный репортер 280 также соединен со второй копией пары идентичных первичных репортеров 230 посредством вставленного между первичным репортером/вторичным репортером линкера 275.
[0049] На фигуре 2Н схематически изображен вариант реализации репортерной конструкции (которую можно описать как A-C-B-D-C'), в которой мембранный якорь 270 соединен с первой копией пары идентичных первичных репортеров 220 посредством вставленного между якорем/первичным репортером линкера 245. Данная первая копия пары идентичных первичных репортеров 220 соединена с сайтом расщепления 260 посредством вставленного между сайтом расщепления/первичным репортером линкера 265. Сайт расщепления 260 также соединен с вторичным репортером 280 посредством вставленного между вторичным репортером/сайтом расщепления линкера 255. Вторая копия пары идентичных первичных репортеров 230 также соединена с вторичным репортером 280, посредством вставленного между первичным репортером/вторичным репортером линкера 275.
[0050] На фигуре 21 схематически изображен вариант реализации репортерной конструкции (которую можно описать как A-B-C-D-C'), в которой мембранный якорь 270 соединен с сайтом расщепления 260 посредством вставленного между якорем/сайтом расщепления линкера 250. Данный сайт расщепления 260 соединен с первой копией пары идентичных первичных репортеров 220 посредством вставленного между сайтом расщепления/первичным репортером линкера 265. Данная первая копия пары идентичных первичных репортеров 220 также соединена с вторичным репортером 280 посредством первого вставленного между первичным репортером/вторичным репортером линкера 275А. Вторая копия пары идентичных первичных репортеров 230 также соединена с вторичным репортером 280 посредством второго вставленного между первичным репортером/вторичным репортером линкера 275 В.
[0051] На фигуре 2J схематически изображен вариант реализации репортерной конструкции (которую можно описать как C-A-B-D-C'), в которой первая копия пары идентичных первичных репортеров 220 соединена с мембранным якорем 270 посредством вставленного между якорем/первичным репортером линкера 245. Мембранный якорь 270 также соединен с сайтом расщепления 260 посредством вставленного между якорем/сайтом расщепления линкера 250. Сайт расщепления 260 последовательно соединяли с вторичным репортером 280 посредством вставленного между сайтом расщепления/вторичным репортером линкера 255. Вторая копия пары идентичных первичных репортеров 230 также соединена с вторичным репортером посредством вставленного между первичным репортером/вторичным репортером линкера 275.
[0052] На фигуре 2К схематически изображен вариант реализации репортерной конструкции (которую можно описать как С-A-B-C'-D), в которой первая копия пары идентичных первичных репортеров 220 соединена с мембранным якорем 270 посредством вставленного между якорем/первичным репортером линкера 245. Мембранный якорь 270 также соединен с сайтом расщепления 260 посредством вставленного между якорем/сайтом расщепления линкера 250. Сайт расщепления 260 последовательно соединяли со второй копией пары идентичных первичных репортеров 230 посредством вставленного между якорем/первичным репортером линкера 265. Вторичный репортер 280 также соединен со второй копией пары идентичных первичных репортеров 230 посредством вставленного между первичным репортером/вторичным репортером линкера 275.
[0053] В некоторых вариантах реализации первичный репортер соединен с вторичным репортером посредством вставленного между ними линкера. В некоторых из таких вариантов реализации вставленный между первичным репортером/вторичным репортером линкер выбирают таким образом, чтобы добиться отсутствия значительного переноса энергии FRET (т.е. менее 5%) между первичным репортером и вторичным репортером. Например, вставленный между первичным репортером/вторичным репортером линкер можно выбрать таким образом, чтобы его длина, геометрия и/или жесткость сохраняли расстояние и/или ориентацию между первичным репортером и вторичным репортером, чтобы уменьшить FRET до незначительного уровня (т.е. <5%). В других вариантах реализации вставленный между первичным репортером/вторичным репортером линкер можно сконфигурировать таким образом, чтобы получить подходящий уровень FRET (т.е. >5%) между первичным репортером и вторичным репортером.
[0054] На фигуре 3 представлено схематическое изображение типичного анализа 300 согласно идее настоящего изобретения. Клетка с клеточной мембраной 310 и цитозолем 315 экспрессировала конструкцию, которая содержит участок заякоривания в мембране клетки 350, сайт расщепления 340 и два идентичных репортера 330, 335. Находясь заякоренными в мембране клетки 310, указанные репортеры 330, 335 вырабатывают сильный сигнал 360, 365. Для проведения данного анализа клетку подвергают ферментативной активности 320, которая может действовать в сайте расщепления 340. В результате гидролиза пептидного остова в сайте расщепления указанные репортеры высвобождаются в цитозоль 315. Последующие множественные события деградации приводят к образованию деградированных репортеров 330А, 335А, которые вырабатывают модифицированный сигнал 370, 375. В некоторых вариантах реализации идеи настоящего изобретения указанные репортеры представляют собой флуоресцентные белки, и флуоресцентный сигнал из деградированных флуоресцентных белков уменьшается.
[0055] На фигуре 4 изображен альтернативный анализ 400 согласно идее настоящего изобретения. Клетка с клеточной мембраной 410, цитозолем 415 и везикулой 420 экспрессировала конструкцию, которая содержит участок заякоривания в мембране везикулы 450, сайт расщепления 440 и два репортера 430, 435. Находясь заякоренными на везикуле 420, указанные репортеры 430, 435 вырабатывают сильный сигнал 460, 465. Для проведения данного анализа клетку подвергают ферментативной активности 425, которая может действовать в сайте расщепления 440. Гидролиз сайта расщепления высвобождает репортеры, приводя к высвобождению репортеров 430, 435. Последующие множественные события деградации приводят к образованию деградированных репортеров 430А, 435А которые вырабатывают модифицированный сигнал 470, 475. В некоторых вариантах реализации идеи настоящего изобретения указанные репортеры представляют собой флуоресцентные белки, и флуоресцентный сигнал из деградированных флуоресцентных белков уменьшается.
[0056] Вдобавок к использованию различных сайтов заякоривания, в анализах согласно идее настоящего изобретения могут применяться различные протоколы тестирования. Один вариант реализации такого протокола тестирования показан на фигуре 5. Первоначально 510 получают клетку, которая экспрессирует конструкцию согласно идее настоящего изобретения. Получают исходный или первый сигнал 520, затем клетку подвергают ферментативной активности 530. Например, образец, содержащий ферментативную активность (такую как BoNT), можно добавить в среды, содержащие клетки. По прошествии периода инкубации можно детектировать второй сигнал 540, и впоследствии сравнить с первым сигналом 550. Такие первый и второй сигналы могут представлять собой мгновенные измерения, усредненные измерения, полученные в течение периода времени, и/или измерения скорости.
[0057] Альтернативный вариант реализации способа тестирования согласно идее настоящего изобретения показан на фигуре 6. Первоначально 610 получают клетку, которая экспрессирует конструкцию согласно идее настоящего изобретения. Клетку затем подвергают ферментативной активности 620. Например, образец, содержащий ферментативную активность (такую как BoNT), можно добавить в среды, содержащие клетки. По прошествии первого периода инкубации детектируют исходный или первый сигнал 630 и, после второго периода инкубации, детектируют второй сигнал 640, и впоследствии сравнивают его с первым сигналом 650. Такие первый и второй сигналы могут представлять собой мгновенные измерения, усредненные измерения, полученные в течение периода времени, и/или измерения скорости.
[0058] В другом варианте реализации идеи настоящего изобретения клетки, экспрессирующие описанные выше конструкции, подвергают воздействию одного или более вторичных красителей (например, связывающегося с клеткой красителя, такого как краситель для мембран или красящее вещество/краситель для ядер), которые отдельны от указанных конструкций и которые могут вырабатывать сигналы, которые не зависят от активности BoNT. Такие вторичные красители могут ассоциироваться с мембраной и/или ядром клетки таким образом, который не зависит от присутствия анализируемого вещества (например, BoNT или другой ферментативной активности), и их можно применять для получения исходного или эталонного сигнала, который можно использовать для нормировки. Например, клетку, экспрессирующую описанную выше конструкцию, можно подвергнуть воздействию красителя, который связывается с ядром или плазматической мембраной указанной клетки и, в свою очередь, дает исходный флуоресцентный сигнал. В предпочтительном варианте реализации идеи настоящего изобретения такой вторичный краситель выбирают таким образом, чтобы длины волн испускания указанного красителя для мембран можно было отличить от таковых у флуорофора репортера указанной конструкции, экспрессируемой в данных клетках. В некоторых вариантах реализации идеи настоящего изобретения вторичный краситель можно выбрать таким образом, что диапазон эффективных длин волн возбуждения перекрывается с таковым для флуорофора репортера указанной конструкции, что позволяет одновременное возбуждение как вторичного красителя, так и флуорофора репортера, и, следовательно, одновременное накопление исходного сигнала и сигнала флуорофора репортера. В других вариантах реализации идеи настоящего изобретения вторичный краситель можно выбрать таким образом, чтобы диапазон эффективных длин волн возбуждения значительно не перекрывался с таковым у флуорофора репортера, что позволяет избирательно возбуждать исходную флуоресценцию. Примеры подходящих вторичных красителей включают 4',6-диамидин-2-фенилиндол, дигидрохлорид (DAPI), краситель, на сегодняшний день известный как CELLMASK™, темно-красный краситель для плазматической мембраны, и краситель для окрашивания ядра, на сегодняшний день известный как HOECHST3342™. В предпочтительном варианте реализации идеи настоящего изобретения вторичный краситель выбирают таким образом, чтобы обеспечить спектры возбуждения и испускания, которые не перекрываются или незначительно перекрываются со спектрами возбуждения и испускания флуорофора репортера указанной конструкции, таким образом, что по существу не происходит переноса энергии вследствие FRET (т.е. меньше приблизительно 5%). Примеры спектров возбуждения и испускания подходящего вторичного красителя (красителя, на сегодняшний день известного как CELLMASK™, темно-красный краситель для плазматической мембраны, указанный как "Cell Mask") и флуорофора репортера YFP показаны на фигуре 7. Авторы настоящего изобретения предположили, что другие подходящие вторичные красители могут включать белки (например, антитела) или другие макромолекулы, которые обладают аффинностью к указанной клетке и были конъюгированы или образовали комплекс с флуоресцентными или другими легко детектируемыми молекулами.
[0059] Поскольку связывание вторичных красителей с клетками не зависит от присутствия анализируемого вещества или интересующей активности, они могут дать исходный сигнал, который является мерой, не зависящей от количества, плотности и/или распределения клеток. Такой исходный сигнал очень полезен для нормировки сигнала репортера, полученного от клеток в ходе проведения анализа согласно идее настоящего изобретения. Например, выражение результата такого анализа в виде отношения между измеренным сигналом репортера из репортерной конструкции, который способен отвечать на анализируемое вещество или интересующую активность, и измеренным исходным сигналом в виде флуоресценции, излучаемой красителем для мембран, позволяет скорректировать вариации в интенсивности сигнала репортера в зависимости от сайта, в котором проводят анализ, вследствие различий в количестве, плотности и/или распределении клеток. Это успешно позволяет улучшить точность таких анализов, что, в свою очередь, приводит к улучшению эффективной чувствительности. Также следует принимать во внимание, что такой исходный сигнал можно применять для получения такой нормировки сигналов репортера, отличных от флуоресцентных.
Пример.
2
[0060] 1. На фигуре 8 схематически показано, что клетки, трансформированные вектором экспрессии, кодирующим конструкцию, описанную на фигуре 1А, высевали 810 в 96-луночные планшеты и инкубировали в течение ночи при 37°С при 5% СО.
2. Клетки затем промывали культуральными средами, а затем незамедлительно подвергали воздействию BoNT 820, разбавленного в культуральных средах до 100 мкл на лунку (обычно).
2
3. Клетки затем инкубировали в течение 48 часов (обычно) при 37°С при 5% СО.
4. По окончании 48-часового периода инкубации клетки окрашивали 830 вторичным красителем. Можно применять различные вторичные красители, используя различные протоколы.
[0061] Протокол А: применим для DAPI и красителя, на сегодняшний день известного как HOECHST3342™.
1. 25 мкл 5 мкМ DAPI или 25 мкг/мл красителя, на сегодняшний день известного как HOECHST3342™, в культуральных средах добавляли непосредственно в каждую лунку 96-луночного планшета с получением конечной концентрации 1 мкМ DAPI или 5 мкг/мл красителя, на сегодняшний день известного как HOECHST3342™. Полезные конечные концентрации красителя для ядер находятся в диапазоне 0,001-10 мкМ или 0,1-50 мкг/мл. Концентрации рабочего раствора можно подводить подходящим образом.
2
2. Клетки инкубировали при 37°С, 5% СО в течение 30 минут (обычно).
[0062] Протокол В: применим для красителя, на сегодняшний день известного как CELLMASK™, темно-красного красителя для плазматических мембран.
1. Получали рабочий раствор при концентрации 0,625-10 мкг/мл в физиологическом растворе, забуференном фосфатом Дульбекко (обычно 5 мкг/мл).
2. Содержащие BoNT культуральные среды удаляли из каждой лунки.
3. 50 мкл рабочего раствора красителя для мембран добавляли непосредственно в каждую лунку.
2
4. Клетки инкубировали при 37°С, 5% СО в течение 20 минут (обычно).
[0063] После воздействия красителя для мембран аналитические планшеты промывали фосфатно-солевым буферным раствором, применяя автоматизированное устройство для промывки планшетов. Результаты затем считывали с планшетов на флуоресцентном спектрофотометре для прочтения микропланшетов, применяя фильтры с приблизительными длинами волн возбуждения и испускания флуорофора указанной конструкции и используемого вторичного красителя 840. Например, DAPI и краситель, на сегодняшний день известный как HOECHST3342™, можно отличить, используя длину волны возбуждения, приблизительно равную 345 нм, и длину волны испускания, приблизительно равную 485 нм, тогда как краситель, на сегодняшний день известный как CELLMASK™, темно-красный краситель для плазматических мембран, можно отличить, используя длину волны возбуждения, приблизительно равную 650 нм, и длину волны испускания, приблизительно равную 680 нм. Измерения сигнала флуорофора указанной конструкции осуществляют независимо от измерений сигнала красителя для мембран, используя длины волн возбуждения и испускания, свойственные флуорофору. Для анализа результатов непосредственно возбужденное излучение флуорофора конструкции (т.е. чувствительного к BoNT компонента) нормировали 850, например, путем деления излучения флуорофора указанной конструкции на излучение вторичного красителя (т.е. нечувствительного к BoNT компонента).
[0064] Типичные результаты анализов, проведенных с репортерными конструкциями, описанными выше, в комбинации с вторичными красителями показаны на фигурах 9А, 9В и 9С. На фигуре 9А показаны обычные нескорректированные результаты приведения в контакт клеток, содержащих репортерную конструкцию, с протеазой (в данном примере протеаза представляет собой BoNT/A и конструкция содержит сайт расщепления для BoNT/A). Нижний предел чувствительности (LOD) в данном примере составляет 10 пМ BoNT/A и предел количественного обнаружения (LOQ) составляет 100 пМ. На фигуре 9В показано влияние нормировки полученных значений флуоресценции на фигуре 9А с применением полученных значений излучения вторичного красителя, который добавляли в те же клетки, как описано в процедуре выше. LOD результатов, показанных на фигуре 9В, снизился до 3 пМ и LOQ снизился до 10 пМ. На фигуре 9С показаны микрофотографии двух лунок, содержащих клетки с реагирующими на BoNT/A конструкциями (слева направо), полученные с помощью флуоресцентной микроскопии методом светлого поля при длине волны испускания флуорофора указанной конструкции, и флуоресцентной микроскопии при длине волны испускания вторичного красителя, добавленного в те же клетки. В лунку на верхней серии микрофотографий не добавляли BoNT/A; в лунку на нижней серии микрофотографий добавляли 1 нМ BoNT/A. Утрата флуоресценции от флуорофора указанной конструкции была очевидной в лунке с добавлением 1 нМ BoNT/A (т.е. нижняя серия). Наоборот, испускание от вторичного красителя сохранилось на аналогичном, тем не менее на отдельном и отличном, уровне и распределении по сравнению с таковым в лунке, в которую не добавляли BoNT/A (т.е. верхняя серия).
[0065] Варианты данных протоколов также могут быть эффективны. Например, вторичные красители можно добавлять перед приведением в контакт клеток с BoNT, по существу одновременно с приведением в контакт клеток с BoNT, или через интервал времени, составляющий менее чем 48 часов, после приведения в контакт клеток с BoNT. Аналогично, предполагаются дополнительные этапы промывки до и после воздействия на клетки вторичных красителей.
[0066] Следует понимать, что анализы согласно идее настоящего изобретения основываются на непосредственных измерениях флуоресценции объемов жидкости, вместо визуализации и/или анализа отдельных клеток. Таким образом, их можно осуществить, применяя простой флуориметр (например, флуориметр для микропланшетов), и их преимущество состоит в высокой степени пригодности к адаптированию для автоматизации и процессов скрининга с высокой пропускной способностью. Анализ результатов аналогичным образом осуществляют напрямую, так как он не включает требующих интенсивной работы процессора задач обработки изображений, таких как подсчет клеток, идентификация отдельных клеток и идентификация флуоресценции, локализованной в определенных внутриклеточных областях или компартментах клетки.
[0067] Дополнительно к предоставлению исходного сигнала с целью нормировки результатов, такие вторичные красители могут служить для других целей. Например, можно установить значение исходного сигнала, ниже которого количество клеток считают недостаточным для получения точного результата анализа, что позволяет пометить или отбросить результаты такого анализируемого сайта. Аналогично, можно установить значение исходного сигнала, выше которого количество клеток считают слишком большим для получения точного результата анализа (например, вследствие оптических ограничений в системах, которые применяют для оценки флуоресценции). Включение таких вторичных красителей в состав определенных реагентов, которые добавляют в ходе анализа, также можно применять для подтверждения того, что такие реагенты действительно были доставлены в анализируемый сайт в процессе анализа, например, для подтверждения того, что системы автоматизированного анализа работают правильно.
[0068] В предпочтительных вариантах реализации анализируемая ферментативная активность связана с ботулиническим токсином, и последовательность расщепления соответствующим образом подходит. В контексте настоящей заявки BoNT можно определить как нативный или модифицированный BoNT, который способен расщепить белковую последовательность SNARE или часть белковой последовательности SNARE. Например, BoNT/A, Е и С расщепляют SNAP-25 и BoNT/B, D, F и G расщепляют синаптобревин (Syb) в единичных, но различных сайтах. BoNT/C также расщепляет синтаксин дополнительно к SNAP-25. Следовательно, конструкции для получения характеристик BoNT/A, Е и С могут содержать последовательности сайтов расщепления, которые включают весь или часть SNAP-25. Аналогично, конструкции для получения характеристик BoNT В, D, F и G могут содержать последовательности сайтов расщепления, которые включают все или части соответствующих восприимчивых областей синаптобревина. В качестве альтернативы, активность BoNT/C можно охарактеризовать, используя конструкции, которые содержат сайты расщепления с последовательностями, полученными из всего или части синтаксина.
[0069] Предполагаемые последовательности сайта расщепления могут успешно включать белок, мотив или мутеин SNARE. "Мутеины" белка в данной заявке следует интерпретировать как белки, идентичность которых соответствующему нативному белку составляет по меньшей мере 30%, включая, например, композиции, которые по меньшей мере на 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичны нативному белку. Отклонения от идентичности могут включать любое одно или более отклонений, делеций и замен. Предполагаемые мутеины включают фрагменты, укороченные белки и слитые белки.
[0070] Дополнительно предполагается, что клетки согласно идее настоящего изобретения можно модифицировать таким образом, чтобы они экспрессировали две или более конструкций. Такие конструкции, например, можно различить по спектрам испускания соответствующих репортеров, и получить по существу независимые и одновременные измерения различных активностей ферментов. В качестве альтернативы такие конструкции могут измерять активности одного и того же фермента по отношению к различным последовательностям субстрата. Например, первая конструкция может содержать сайт расщепления, полученный из SNAP-25, и вторая конструкция может содержать сайт расщепления, полученный из синтаксина, при этом обе используют для измерения активности BoNT/C. В таком варианте реализации сравнение результатов для обеих конструкций может улучшить достоверность, динамический диапазон и/или специфичность.
[0071] В другом варианте реализации идеи настоящего изобретения предложен набор, который содержит вторичный репортер. Такой набор может включать клетки, которые экспрессируют подходящую детектирующую конструкцию, описанную выше, и вторичный краситель (например, краситель для мембран). Возможно, такой набор может включать инструкции для пользователя по проведению данного анализа. В некоторых вариантах реализации такой набор может включать контрольные или калибровочные материалы, которые включают подходящие культуральные среды и активный фермент, соответствующий ферментативной активности образца, который нужно проанализировать. В данном контексте контрольный образец понимают как образец, используемый для подтверждения функционирования анализа, и образец для калибровки понимают как образец, используемый для калибровки результата анализа для получения количественного или качественного результата. Например, для образца, в котором предполагают наличие BoNT, который нужно охарактеризовать, такие контрольные и/или калибровочные образцы могут включать соответствующий BoNT. В некоторых вариантах реализации такие контрольные и/или калибровочные образцы могут быть предоставлены в заранее смешанном виде и по существу готовыми к применению. В других вариантах реализации (например, вследствие факторов стабильности) такие контрольные и/или калибровочные образцы могут быть предоставлены в виде первого контейнера с подходящей культуральной средой и второго контейнера с исходным раствором с ферментативной активностью. В таких вариантах реализации для первого и второго контейнеров могут потребоваться различные условия транспортировки и/или хранения, и, следовательно, могут транспортироваться и/или храниться отдельно, при этом оставаясь частью одного и того же набора.
[0072] Другие варианты реализации идеи настоящего изобретения включают бесклеточные анализы, в которых используют описанные выше конструкции. В таком анализе может, например, использоваться бесклеточная суспензия везикул, в которой везикулы, которые несут один или более сайтов, подходящих для взаимодействия с частью конструкции, заякоривающейся в мембране. Такие везикулы, наряду с конструкцией согласно идее настоящего изобретения, могут быть суспендированы в среде, которая содержит протеазу или аналогичный фермент, способный гидролизовать репортер, таким образом, что расщепление линкерной части указанной конструкции высвободит репортеры в среду для гидролиза. В качестве альтернативы, сайты, которые узнаются заякоривающейся частью конструкции, могут быть связаны с микрочастицей подходящего размера с подходящей химией поверхностных явлений. Такие микрочастицы могут нести стерические блокаторы, например, высокомолекулярные декстраны или полиакрилаты, которые позволят ботулиническим токсинам достичь поверхности микрочастицы, при этом препятствуя доступу протеаз или аналогичных ферментов. Для этой цели протеазы или аналогичные ферменты могут быть предоставлены в высокомолекулярных формах (например, в виде полимеров или конъюгатов молекул с большой молекулярной массой), чтобы повысить такую селективность.
[0073] Для специалистов в данной области должно быть очевидно, что возможно гораздо больше модификаций, кроме тех, которые уже описаны, не отклоняясь от идей настоящего изобретения, описанных в данной заявке. Объект изобретения, следовательно, не должен быть ограничен объемом прилагаемой формулы изобретения. Более того, при интерпретации настоящего описания и формулы изобретения все термины следует интерпретировать в наиболее широком из возможных смыслов, в соответствии с контекстом. В частности, термины "включает" и "включающий" следует интерпретировать как относящиеся к элементам, компонентам или этапам неисключительным образом, указывая на то, что упомянутые элементы, компоненты или этапы могут присутствовать, или использоваться, или объединяться с другими элементами, компонентами или этапами, которые явно не упомянуты. Если свойства, заявляемые в настоящем описании, относятся к по меньшей мере чему-то одному, выбранному из группы, состоящей из А, В, С … и N, то данную формулировку следует интерпретировать как требующую лишь один элемент из группы, а не А плюс N, или В плюс N, и т.д.