АНТИТЕЛО ПРОТИВ С5 И СПОСОБ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ И ЛЕЧЕНИЯ ОБУСЛОВЛЕННЫХ КОМПЛЕМЕНТОМ ЗАБОЛЕВАНИЙ
C5 ANTIBODY AND METHOD FOR PREVENTING AND TREATING COMPLEMENT-RELATED DISEASES

[Область техники]
Настоящее изобретение относится к антителу против компонента 5 комплемента (C5) и к способу предупреждения и лечения обусловленных комплементом заболеваний с использованием антитела.
[Уровень техники]
Система комплемента является первой стадией врожденного иммунитета для наиболее быстрого распознавания и уничтожения источника инфекции. Кроме того, система комплемента играет важную роль в объединении врожденного иммунитета и адаптивного иммунитета путем взаимодействия с иммунными клетками. Система комплемента активируется классическим каскадом, альтернативным каскадом или лектиновым каскадом, а затем активируются различные типы белков комплемента. Белки системы комплемента активируют секрецию воспалительных веществ, контролируют воспалительный ответ посредством взаимодействия с иммунными клетками и эффективно элиминируют внешние источники инфекции путем образования веществ, атакующих источник инфекции и т.п. Известно, что, поскольку система комплемента ингибирует избыточное увеличение активности комплемента различными типами комплемент-регулирующих белков, поддерживает гомеостаз и играет критическую роль посредством различных стадий воспалительного ответа и иммунного ответа, когда белок комплемента и комплемент-регулирующий белок не контролируются надлежащим образом, возникают различные заболевания.
Когда система комплемента активируется по классическому пути, альтернативному пути и лектиновому пути, конвертаза компонента 5 комплемента (C5) расщепляет C5 на C5a и C5b.
C5 экспрессируется внутриклеточно в качестве единичного про-C5-пептида из 1676 аминокислот, состоящего из сигнальных последовательностей из 18 остатков и Arg-богатой линкерной последовательности (RPRR) между зрелой N-концевой β-цепью и C-концевой α-цепью. Зрелый C5 имеет молекулярную массу приблизительно 190 кДа и состоит из двух полипептидных цепей (α 115 кДа и β 75 кДа), которые соединены дисульфидными связями. C5-конвертаза расщепляет остатки C5 между остатками 74 и 75 альфа-цепи, высвобождая C5a-пептид из 74 аминокислот и фрагмент C5b, который впоследствии включается в мембраноатакующий комплекс (MAC).
C5a, который представляет собой анафилатоксин, прямо активирует лейкоциты и тромбоциты и функционирует в качестве фактора хемотаксиса нейтрофилов. C5b образует мембраноатакующий комплекс вместе с C6, C7, C8 и C9 на конечной стадии активации комплемента, индуцируя гемолиз.
Когда система комплемента чрезмерно активируется вследствие аномального иммунного ответа и происходит повреждение нормальных клеток, аномальная активность системы комплемента обуславливает аутоиммунные заболевания, опосредуемые комплементом заболевания и т.п. Гемолитическое заболевание крови представляет собой обусловленное комплементом заболевание, когда клетки крови не защищены от атаки белков комплемента вследствие генетических дефектов. Было описано, что активация комплемента также связана с интенсивным иммунным ответом и разрушающей ткани реакцией, которая происходит при ревматоидном артрите, трансплантации и т.п., и при повреждении тканей, также как и при иммунной реакции вследствие активации комплемента высвобождаются такие материалы, как VEGF, вызывая ангиогенез, что приводит к связанной с возрастом дегенерации желтого пятна и диабетической ретинопатии.
Таким образом, система комплемента играет важную роль в поддержании здоровья; однако она потенциально вызывает заболевания или вносит вклад в возникновение заболеваний. Таким образом, является предпочтительной разработка нового антитела и т.п. против системы комплемента для применения для лечения и диагностики обусловленных комплементом заболеваний.
Предусматриваются композиция, содержащая ингибитор комплемента, способ лечения или предупреждения обусловленных комплементом заболеваний, и их применение.
[Сущность изобретения]
[Техническая проблема]
Настоящее изобретение было осуществлено в попытках предоставить молекулу, связывающую компонент C5 комплемента (например, связывающее C5 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент), фармацевтическую композицию, содержащую эту молекулу, способ получения молекулы и композиции, и способ применения молекулы и композиции, и применение молекулы и композиции.
Кроме того, настоящее изобретение было осуществлено в попытках предоставить антитело, специфически связывающееся с белком C5, или его антигенсвязывающий фрагмент.
Кроме того, настоящее изобретение было осуществлено в попытках предоставить нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, обладающую по меньшей мере 90%, 95%, 97%, 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 7, 17, 27, 37, 47 или 57.
Кроме того, настоящее изобретение было осуществлено в попытках предоставить нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий вариабельную область легкой цепи, имеющую по меньшей мере 90, 95%, 97%, 98% или по меньшей мере 99% идентичность последовательности с любой из последовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 8, 18, 28, 38, 48 или 58.
Кроме того, настоящее изобретение было осуществлено в попытках предоставить вектор и клетку-хозяина, содержащую нуклеиновую кислоту, как описано выше.
Кроме того, настоящее изобретение было осуществлено в попытках предоставить фармацевтическую композицию, содержащую: по меньшей мере одну связывающую C5 молекулу (например, связывающее C5 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент).
Кроме того, настоящее изобретение было осуществлено в попытках предоставить способ лечения или диагностики обусловленных комплементом заболеваний с использованием связывающей C5 молекулы.
Кроме того, настоящее изобретение было осуществлено в попытках предоставить набор для диагностики обусловленных комплементом заболеваний, содержащий связывающую C5 молекулу и контейнер.
Кроме того, настоящее изобретение было осуществлено в попытках обеспечить применение связывающей C5 молекулы для получения лекарственного средства для лечения обусловленных комплементом заболеваний.
Кроме того, настоящее изобретение было осуществлено в попытках обеспечить применение связывающей C5 молекулы для лечения обусловленных комплементом заболеваний.
[Решение проблемы]
Иллюстративный вариант осуществления настоящего изобретения относится к антителу, специфически связывающемуся с белком C5, или к его антигенсвязывающему фрагменту. Антитело по настоящему изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент могут предупреждать или лечить обусловленные комплементом заболевания путем ингибирования активации комплемента посредством специфического связывания с белком C5.
H
H
L
L
"Антитело" по настоящему изобретению включает целые антитела и любую их антигенсвязывающую часть или их отдельные цепи. Встречающееся в природе "антитело" представляет собой гликопротеин, содержащий по меньшей мере две тяжелых (H) цепи и две легких (L) цепи, связанных между собой дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (V) и константной области тяжелой цепи (C). Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов: CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (V) и константной области легкой цепи (C). Константная область легкой цепи состоит из одного домена CL. Области VH и VL могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, обозначаемые как определяющие комплементарность области (CDR), между которыми распределены области, которые являются более консервативными, которые называют каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от N-конца к C-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком C5, в соответствии с настоящим изобретением специфически связываются с бета-цепью (β-цепь) C5, более конкретно с доменом MG4 бета-цепи C5 и более конкретно, исходя из аминокислотных последовательностей бета-цепи (номера аминокислот следует считать от первой аминокислоты зрелого белка C5, Gln), с последовательностями аминокислотных остатков с 332 по 398, предпочтительно последовательностями аминокислотных остатков с 332 по 378 и более предпочтительно последовательностями аминокислотных остатков с 332 по 364, более предпочтительно последовательностями аминокислотных остатков с 332 по 348 и/или последовательностями аминокислотных остатков с 350 по 420, предпочтительно с 369 по 409, более предпочтительно с 379 по 398 и более предпочтительно с 386 по 392. Например, что касается связываемого белка C5, аминокислотные последовательности белка C5 человека представлены в SEQ ID NO: 61, аминокислотные последовательности бета-цепи белка C5 человека представлены в SEQ ID NO: 62, и аминокислотные последовательности домена MG4 бета-цепи белка C5 человека представлены в SEQ ID NO: 63. Также предусматривается межвидовая перекрестная реактивность с другими видами, такими как кролики, крысы, обезьяны и т.п.
A
7
-1
8
-1
9
-1
10
-1
11
-1
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком C5 в соответствии с настоящим изобретением, имеют константу аффинности (K) по меньшей мере 1×10 M, 1×10 M, 1×10 M, 1×10 M или 1×10 M.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением представляют собой антитела, связывающиеся с тем же эпитопом, с которым связываются антитела, представленные в таблицах 1-6 ниже, или их антигенсвязывающие фрагменты, и они обладают по меньшей мере 90%, 95%, 97%, 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с соответствующими последовательностями. Кроме того, также в объем настоящего изобретения входят антитела, обладающие активностью ингибирования комплемента. Кроме того, в случае некоторых модификаций в константных областях тяжелых и легких цепей, которые являются очевидными, в объем настоящего изобретения входят модификации в пределах, в которых обеспечивается та же или сходная активность ингибирования комплемента. Кроме того, поскольку каждое из этих антител способно связываться с C5, нуклеотидные последовательности, которые кодируют VH, VL, полноразмерные последовательности тяжелой цепи и полноразмерные последовательности легкой цепи (аминокислотные последовательности и нуклеотидные последовательности, которые кодируют аминокислотные последовательности) можно "смешивать и подбирать" для получения связывающих C5 антител по настоящему изобретению.
Таблица 1Антитело против C5 (HRA-06-H2-1)
HRA-06-H2-1
SEQ ID NO и последовательность
CDRH1CDR1 тяжелой цепи
1.GFSFSGRYWIQ
CDRH2CDR2 тяжелой цепи
2.SVWPGITGDTNYANWAKG
CDRH3CDR3 тяжелой цепи
3.EPVAWGGGLDL
CDRL1CDR1 легкой цепи
4.QASQSINNQLS
CDRL2CDR2 легкой цепи
5.YASTLAS
CDRL3CDR1 легкой цепи
6.QGSYYSGGWDYG
VHВариабельная область тяжелой цепи
7.EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSGRYWIQWVRQAPGKGLEWVASVWPGITGDTNYANWAKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREPVAWGGGLDLWGQGTLVTVSS
VLВариабельная область легкой цепи
8.DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNQLSWYQQKPGKAPKLLIYYASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGSYYSGGWDYGFGQGTKVEIK
Тяжелая цепь
9.EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSGRYWIQWVRQAPGKGLEWVASVWPGITGDTNYANWAKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREPVAWGGGLDLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
Легкая цепь
10.DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNQLSWYQQKPGKAPKLLIYYASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGSYYSGGWDYGFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Таблица 2Антитело против C5 (HRA-06-H2-7)
HRA-06-H2-7
SEQ ID NO и последовательность
CDRH1
11.GFSFSGRYWIQ
CDRH2
12.SGWPGATGDTNYANWAKG
CDRH3
13.EPVAWGGGLDL
CDRL1
14.QASQSINNQLS
CDRL2
15.YASTLAS
CDRL3
16.QGSYYSGGWDYG
VH
17.EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSGRYWIQWVRQAPGKGLEWVASGWPGATGDTNYANWAKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREPVAWGGGLDLWGQGTLVTVSS
VL
18.DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNQLSWYQQKPGKAPKLLIYYASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGSYYSGGWDYGFGQGTKVEIK
Тяжелая цепь
19.EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSGRYWIQWVRQAPGKGLEWVASGWPGATGDTNYANWAKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREPVAWGGGLDLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
Легкая цепь
20.DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNQLSWYQQKPGKAPKLLIYYASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGSYYSGGWDYGFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Таблица 3Антитело против C5 (HRA-06-H2-18)
HRA-06-H2-18
SEQ ID NO и последовательность
CDRH1
21.GFSFSGRYWIQ
CDRH2
22.SSSLRGTGDTNYANWAKG
CDRH3
23.EPVAWGGGLDL
CDRL1
24.QASQSINNQLS
CDRL2
25.YASTLAS
CDRL3
26.QGSYYSGGWDYG
VH
27.EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSGRYWIQWVRQAPGKGLEWVASSSLRGTGDTNYANWAKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREPVAWGGGLDLWGQGTLVTVSS
VL
28.DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNQLSWYQQKPGKAPKLLIYYASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGSYYSGGWDYGFGQGTKVEIK
Тяжелая цепь
29.EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSGRYWIQWVRQAPGKGLEWVASSSLRGTGDTNYANWAKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREPVAWGGGLDLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
Легкая цепь
30.DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNQLSWYQQKPGKAPKLLIYYASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGSYYSGGWDYGFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Таблица 4Антитело против C5 (HRA-06-H2-24)
HRA-06-H2-24
SEQ ID NO и последовательность
CDRH1
31.GFSFSGRYWIQ
CDRH2
32.SVWPGFTGDTNYANWAKG
CDRH3
33.EPVAWGGGLDL
CDRL1
34.QASQSINNQLS
CDRL2
35.YASTLAS
CDRL3
36.QGSYYSGGWDYG
VH
37.EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSGRYWIQWVRQAPGKGLEWVASVWPGFTGDTNYANWAKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREPVAWGGGLDLWGQGTLVTVSS
VL
38.DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNQLSWYQQKPGKAPKLLIYYASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGSYYSGGWDYGFGQGTKVEIK
Антитело по настоящему изобретению получают с использованием всех антител, содержащих аминокислоты, которые идентичны антителам, представленным в таблицах 1-6; антител, имеющих вариабельные области тяжелой цепи, содержащие последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, и вариабельные области легкой цепи, содержащие последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, где по меньшей мере одна из последовательностей CDR имеет последовательность антитела, описанного в рамках настоящего изобретения, или конкретные аминокислотные последовательности на основе его консервативных модификаций; антител, имеющих функциональные свойства связывающего С5 антитела по настоящему изобретению; антител, связывающихся с тем же эпитопом, что и антитела, представленные в таблицах 1-6; антител, имеющих по меньшей мере одну из последовательностей VH и/или VL, описанных в рамках настоящего изобретения, в качестве исходного материала для конструирования модифицированного антитела, и оно включает все антитела, имеющие свойства, которые частично модифицированы относительно исходного антитела, включая описанные выше
антитела.
Кроме того, антитело по настоящему изобретению включает антитела, в которых в каркасные остатки VH и/или VL внесены модификации для улучшения свойств антитела.
Кроме того, антитело по настоящему изобретению может представлять собой полностью человеческое антитело, специфически связывающееся с белком C5. По сравнению с химерными антителами и т.п., антитело по настоящему изобретению может иметь дополнительно сниженную антигенность при введении человеку. Антитело человека включает вариабельные области тяжелой и легкой цепей или полноразмерные тяжелые или легкие цепи, которые являются продуктами или происходят из конкретной последовательности эмбрионального типа, если вариабельные области или полноразмерные цепи антитела получены из системы, в которой используются гены иммуноглобулинов человека эмбрионального типа. Такие системы включают иммунизацию трансгенной мыши, содержащей гены иммуноглобулинов человека, представляющим интерес антигеном или скрининг библиотеки генов иммуноглобулинов человека, экспонированных на фаге, с представляющим интерес антигеном. Антитело человека, которое является "продуктом" или "происходит из" последовательности иммуноглобулина человека эмбрионального типа, можно идентифицировать по существу путем сравнения аминокислотной последовательности антитела человека с аминокислотными последовательности иммуноглобулинов человека эмбрионального типа и отбора последовательностей иммуноглобулинов человека эмбрионального типа, которые являются наиболее сходными с последовательностью антитела человека.
Кроме того, антитело по настоящему изобретению может представлять собой биспецифическое или полиспецифическое антитело. Антитело по настоящему изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент могут представлять собой биспецифические молекулы, которые связываются более чем с двумя различными участками связывания или молекулами-мишенями.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению может представлять собой моноклональное антитело, специфически связывающееся с белком C5. Например, антитело по настоящему изобретению может представлять собой моноклональное антитело человека или гуманизированное моноклональное антитело или химерное антитело, которое специфически связывается с белком C5, и оно включает константную область тяжелой цепи человека и константную область легкой цепи человека. Кроме того, антитело по настоящему изобретению может представлять собой одноцепочечное антитело, и оно может представлять собой Fab-фрагмент, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) и IgG-изотип. Предпочтительные изотипы IgG включают IgG2, IgG4 и/или IgG2/4. В некоторых иллюстративных вариантах осуществления IgG-изотип по настоящему изобретению представляет собой IgG2/4. Гибридная константная область IgG2/4 может иметь форму, в которой CH1 и шарнирная область IgG2 слиты с областями CH2 и CH3 из IgG4.
Моноклональное антитело можно получать общими способами получения моноклональных антител, и их можно экспрессировать и очищать путем встраивания синтезированного гена антитела в вектор для экспрессии антитела, предпочтительно, pcDNA, pCI, pCMV, pCEP4 и т.п. Кроме того, моноклональное антитело можно получать с использованием вирусной или канцерогенной трансформации B-лимфоцитов или на основе последовательности моноклонального антитела мыши, продуцированной с использованием системы мыши. Например, ДНК, кодирующую иммуноглобулин тяжелой цепи и легкой цепи, можно получать стандартными способами из гибридомы мыши, и, кроме того, она вместе с тем может содержать не являющиеся мышиными последовательности иммуноглобулинов. Кроме того, моноклональное антитело человека против C5 можно получать с использованием трансгенных или трансхромосомных мышей, имеющих часть иммунной системы человека вместо иммунной системы мыши.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащим каркасную область, где в соответствующие последовательности VH или VL человека эмбрионального типа внесены замены аминокислот.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком C5 в соответствии с настоящим изобретением, включают по меньшей мере одну последовательность определяющей комплементарность области (CDR), имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 21, 22, 31, 32, 41, 42, 51 или 52.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком C5 в соответствии с настоящим изобретением, включают по меньшей мере одну последовательность определяющей комплементарность области тяжелой цепи, являющуюся такой же, как и SEQ ID NO: 1, 2, 3, 11, 12, 21, 22, 31, 32, 41, 42, 51 или 52.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком C5 в соответствии с настоящим изобретением, включают по меньшей мере одну последовательность определяющей комплементарность области легкой цепи, являющуюся такой же, как и SEQ ID NO: 4, 5 или 6.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком C5 в соответствии с настоящим изобретением, включают любую определяющую комплементарность область 1 (CDR1) тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 1, 11, 21, 31, 41 или 51, любую определяющую комплементарность область 2 (CDR2) тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 2, 12, 22, 32, 42 или 52, и/или любую CDR3 тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 3, 13, 23, 33, 43 или 53.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком C5 в соответствии с настоящим изобретением, включает CDR1 легкой цепи SEQ ID NO: 4, CDR2 легкой цепи SEQ ID NO: 5 и/или CDR3 легкой цепи SEQ ID NO: 6.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком C5 в соответствии с настоящим изобретением, включают любую вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 7, 17, 27, 37, 47 или 57, или включает вариабельную область тяжелой цепи, обладающую по меньшей мере 90%, 95%, 97% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с любой вариабельной областью тяжелой цепи, выбранной из SEQ ID NO: 7, 17, 27, 37, 47 или 57.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком C5 в соответствии с настоящим изобретением, включают вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 8 или включают вариабельную область легкой цепи, обладающую по меньшей мере 90%, 95%, 97% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с вариабельной областью легкой цепи SEQ ID NO: 8.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком C5 в соответствии с настоящим изобретением, включают любую тяжелую цепь, выбранную из SEQ ID NO: 9, 19, 29, 39, 49 или 59, или включают вариабельную область тяжелой цепи, обладающую по меньшей мере 90%, 95%, 97% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с любой тяжелой цепью, выбранной из SEQ ID NO: 9, 19, 29, 39, 49 или 59.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком C5 в соответствии с настоящим изобретением, включают легкую цепь SEQ ID NO: 10, или включают легкую цепь, обладающую по меньшей мере 90%, 95%, 97% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с легкой цепью SEQ ID NO: 10.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком C5 в соответствии с настоящим изобретением, включают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с эпитопом в бета-цепи белка C5 SEQ ID NO: 62. В деталях, эпитоп может соответствовать последовательностям аминокислотных остатков с 332 по 398, предпочтительно с последовательностями аминокислотных остатков с 332 по 378, более предпочтительно с 332 по 364 и еще более предпочтительно с 332 по 348, и/или с 350 по 420, предпочтительно с 369 по 409, более предпочтительно с 379 по 398 и еще более предпочтительно с 386 по 392, на основе аминокислотной последовательности бета-цепи белка C5 (номера аминокислот следует считать от первой аминокислоты зрелого белка C5, Gln).
Кроме того, настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, обладающую по меньшей мере 90%, 95%, 97%, 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 7, 17, 27, 37, 47 или 57.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой цепи по настоящему изобретению, имеет последовательности, представленные в таблице 7 ниже, или обладает по меньшей мере 90%, 95%, 97%, 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с любой представленной в ней последовательностью.
Таблица 7Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи
Вариабельная область тяжелой цепи
SEQ ID NO и последовательность
HRA-06-H2-1
64. GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGC GGC GGA CTG GTG CAG CCT GGC GGA AGC TTG CGG CTG TCC TGC GCC GCC TCC GGA TTC TCC TTC AGT GGC AGG TAC TGG ATA CAA TGG GTG CGG CAG GCC CCT GGC AAG GGC CTC GAG TGG GTG GCC TCT GTG TGG CCT GGT ATT ACT GGT GAC ACT AAC TAC GCG AAC TGG GCG AAA GGC CGG TTC ACC ATC TCC CGG GAC GAC TCC AAG AAC ACC CTG TAC CTG CAG ATG AAC TCC CTG CGG GCC GAG GAC ACC GCC GTG TAC TAC TGC GCC AGA GAA CCT GTT GCC TGG GGT GGC GGC TTG GAC TTG TGG GGC CAG GGC ACA CTA GTG ACC GTG TCC TCC
HRA-06-H2-7
65. GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGC GGC GGA CTG GTG CAG CCT GGC GGA AGC TTG CGG CTG TCC TGC GCC GCC TCC GGA TTC TCC TTC AGT GGC AGG TAC TGG ATA CAA TGG GTG CGG CAG GCC CCT GGC AAG GGC CTC GAG TGG GTG GCC AGT GGT TGG CCG GGG GCG ACT GGT GAC ACT AAC TAC GCG AAC TGG GCG AAA GGC CGG TTC ACC ATC TCC CGG GAC GAC TCC AAG AAC ACC CTG TAC CTG CAG ATG AAC TCC CTG CGG GCC GAG GAC ACC GCC GTG TAC TAC TGC GCC AGA GAA CCT GTT GCC TGG GGT GGC GGC TTG GAC TTG TGG GGC CAG GGC ACA CTA GTG ACC GTG TCC TCC
HRA-06-H2-18
66. GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGC GGC GGA CTG GTG CAG CCT GGC GGA AGC TTG CGG CTG TCC TGC GCC GCC TCC GGA TTC TCC TTC AGT GGC AGG TAC TGG ATA CAA TGG GTG CGG CAG GCC CCT GGC AAG GGC CTC GAG TGG GTG GCC AGT TCT AGT TTG CGG GGG ACT GGT GAC ACT AAC TAC GCG AAC TGG GCG AAA GGC CGG TTC ACC ATC TCC CGG GAC GAC TCC AAG AAC ACC CTG TAC CTG CAG ATG AAC TCC CTG CGG GCC GAG GAC ACC GCC GTG TAC TAC TGC GCC AGA GAA CCT GTT GCC TGG GGT GGC GGC TTG GAC TTG TGG GGC CAG GGC ACA CTA GTG ACC GTG TCC TCC
HRA-06-H2-24
67. GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGC GGC GGA CTG GTG CAG CCT GGC GGA AGC TTG CGG CTG TCC TGC GCC GCC TCC GGA TTC TCC TTC AGT GGC AGG TAC TGG ATA CAA TGG GTG CGG CAG GCC CCT GGC AAG GGC CTC GAG TGG GTG GCC TCG GTG TGG CCG GGG TTT ACT GGT GAC ACT AAC TAC GCG AAC TGG GCG AAA GGC CGG TTC ACC ATC TCC CGG GAC GAC TCC AAG AAC ACC CTG TAC CTG CAG ATG AAC TCC CTG CGG GCC GAG GAC ACC GCC GTG TAC TAC TGC GCC AGA GAA CCT GTT GCC TGG GGT GGC GGC TTG GAC TTG TGG GGC CAG GGC ACA CTA GTG ACC GTG TCC TCC
HRA-06-H1-9-H2-7
68. GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGC GGC GGA CTG GTG CAG CCT GGC GGA AGC TTG CGG CTG TCC TGC GCC GCC TCC GGA TTC TCC CTC AGT GGC AGG TAC TGG ATA CAA TGG GTG CGG CAG GCC CCT GGC AAG GGC CTC GAG TGG GTG GCC AGT GGT TGG CCG GGG GCG ACT GGT GAC ACT AAC TAC GCG AAC TGG GCG AAA GGC CGG TTC ACC ATC TCC CGG GAC GAC TCC AAG AAC ACC CTG TAC CTG CAG ATG AAC TCC CTG CGG GCC GAG GAC ACC GCC GTG TAC TAC TGC GCC AGA GAA CCT GTT GCC TGG GGT GGC GGC TTG GAC TTG TGG GGC CAG GGC ACA CTA GTG ACC GTG TCC TCC
HRA-06-H1-9-H2-24
69. GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGC GGC GGA CTG GTG CAG CCT GGC GGA AGC TTG CGG CTG TCC TGC GCC GCC TCC GGA TTC TCC CTC AGT GGC AGG TAC TGG ATA CAA TGG GTG CGG CAG GCC CCT GGC AAG GGC CTC GAG TGG GTG GCC TCG GTG TGG CCG GGG TTT ACT GGT GAC ACT AAC TAC GCG AAC TGG GCG AAA GGC CGG TTC ACC ATC TCC CGG GAC GAC TCC AAG AAC ACC CTG TAC CTG CAG ATG AAC TCC CTG CGG GCC GAG GAC ACC GCC GTG TAC TAC TGC GCC AGA GAA CCT GTT GCC TGG GGT GGC GGC TTG GAC TTG TGG GGC CAG GGC ACA CTA GTG ACC GTG TCC TCC
Кроме того, настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий вариабельную область легкой цепи, обладающую по меньшей мере 90%, 95%, 97%, 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 8. В некоторых иллюстративных вариантах осуществления нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий вариабельную область легкой цепи по настоящему изобретению, имеет последовательности, представленные в таблице 8 ниже, или обладает по меньшей мере 90%, 95%, 97%, 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с любой представленной в ней последовательностью.
Таблица 8Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи
Вариабельная область легкой цепи
SEQ ID NO и последовательность
70. GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCC CCC TCC TCG CTG AGC GCC TCC GTG GGC GAC CGG GTG ACC ATC ACC TGC CAG GCC AGT CAG AGC ATT AAC AAC CAA CTA TCC TGG TAT CAG CAG AAG CCT GGC AAG GCG CCT AAG CTG CTG ATC TAC TAT GCA TCC ACT CTG GCA TCT GGC GTG CCT TCC CGG TTC TCC GGA TCC GGC TCC GGC ACC GAC TTC ACC CTG ACC ATC TCC TCC CTG CAA CCT GAG GAC TTC GCC ACC TAC TAC TGC CAA GGC AGT TAT TAT AGT GGT GGT TGG GAC TAT GGT TTC GGC CAG GGT ACC AAG GTG GAG ATC AAG
Кроме того, настоящее изобретение относится к вектору и клетке-хозяину, содержащим нуклеиновую кислоту, как описано выше. В одном иллюстративном варианте осуществления настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащим (1) рекомбинантный сегмент ДНК, кодирующий тяжелую цепь антитела по настоящему изобретению, и (2) второй рекомбинантный сегмент ДНК, кодирующий легкую цепь антитела по настоящему изобретению. В другом иллюстративном варианте осуществления настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей рекомбинантный сегмент ДНК, кодирующий каждую из тяжелой цепи и легкой цепи антитела по настоящему изобретению. В некоторых иллюстративных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой моноклональное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент.
Для экспрессии полинуклеотида, кодирующего связывающее C5 антитело, цепь или их связывающий фрагмент, можно использовать различные экспрессирующие векторы, и, чтобы продуцировать антитела в клетках-хозяевах млекопитающих, можно использовать как вирусные, так и невирусные экспрессирующие векторы. Можно использовать векторы, такие как pcDNA, pCI, pCMV, pCEP4 и т.п., и клетки-хозяева, такие как HEK293, CHO, CHO-DG44 и т.п.
Клетка-хозяин, в которой содержится и экспрессируется связывающее C5 антитело, может представлять собой эукариотическую клетку или прокариотическую клетку, такую как E.Coli, предпочтительно, E.coli ER2738. В качестве примеров могут быть включены HB2151, BL21 и т.п., которые представляют собой эукариотические клетки-хозяева, пригодные для клонирования и экспрессии полинуклеотида по настоящему изобретению. Другие микробные клетки-хозяева, пригодные для включения, включают палочковидные бактерии, такие как Bacillus subtilis, и другие кишечные бактерии, такие как Salmonella, Serratia и различные виды Pseudomonas. Для экспрессии связывающего C5 полипептида по настоящему изобретению можно использовать другие микроорганизмы, такие как дрожжи, и также можно использовать клетки насекомых в комбинации с бакуловирусными векторами.
В некоторых иллюстративных предпочтительных вариантах осуществления используют клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии и продуцирования связывающего C5 полипептида по настоящему изобретению. Например, они могут представлять собой либо гибридомную клеточную линию, экспрессирующую эндогенные гены иммуноглобулинов, либо клеточную линию млекопитающих, содержащую экзогенный экспрессирующий вектор. Кроме того, например, в качестве клетки животного или человека можно использовать ряд подходящих клеточных линий, способных секретировать иммуноглобулины, включая клеточные линии CHO, клеточные линии Cos, клетки HeLa, миеломные клеточные линии, клеточные линии HEK, трансформированные B-клетки и гибридомы, предпочтительно, HEK293, CHO, CHO-DG44.
Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей: по меньшей мере одну связывающую C5 молекулу (например, связывающее C5 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент).
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению является эффективной для лечения обусловленных комплементом заболеваний. Обусловленные комплементом заболевания включают все заболевания и патологические состояния, при которых возникновение заболеваний связано с аномалией активации системы комплемента, например, с дефицитом комплемента. Например, обусловленные комплементом заболевания включают воспалительные заболевания и аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит (RA), остеоартрит, острый респираторный дистресс-синдром (ARDS), отдаленное повреждение тканей после ишемии и реперфузии, активацию комплемента в ходе хирургической операции с искусственным кровообращением, дерматомиозит, пемфигус, волчаночный нефрит, гломерулонефрит, почечный васкулит, сердечно-легочное шунтирование, индуцированная сердечной недостаточностью дисфункция эндотелия коронарных артерий, мембранопролиферативный гломерулонефрит типа II, острая почечная недостаточность, антифосфолипидный синдром, дегенерация желтого пятна, эндофтальмит, болезнь, обусловленная новыми кровеносными сосудами, пересадка аллотрансплантата, сверхострое отторжение, гемодиализ, хроническое обструктивное заболевание легких (COPD), респираторный дистресс-синдром, астма, пароксизмальная ночная гемоглобинурия (PNH) и аспирационная пневмония, однако настоящее изобретение не ограничивается ими.
Кроме того, композиция может содержать одно или несколько других лекарственных средств, которые являются пригодными для лечения или предупреждения обусловленных комплементом заболеваний. Фармацевтические носители усиливают или стабилизируют композицию, или облегчают получение композиции. Фармацевтически приемлемые носители включают растворители, дисперсионные среды, материалы покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, обеспечивающие изотоничность и замедляющие всасывание средства и т.п., которые являются физиологически совместимыми.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить различными способами, известными в данной области. Путь и/или режим введения варьирует в зависимости от желаемых результатов. Является предпочтительным, чтобы введение было внутривенным, внутримышечным, внутрибрюшинным или подкожным, или проводимым проксимально области мишени. В конкретном иллюстративном варианте осуществления антитела по настоящему изобретению составляют так, чтобы их можно было вводить внутрь стекловидного тела глаза. В зависимости от пути введения активные соединения, а именно, биспецифические или полиспецифические молекулы, можно покрывать материалом для защиты соединения от действия кислот и других природных условий, которые могут инактивировать соединение.
Композиции должны быть стерильными и текучими. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, с использованием материалов покрытия, таких как лецитин, или путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсной жидкости и с использованием поверхностно-активных веществ. Во многих случаях является предпочтительным включение в композицию обеспечивающих изотоничность средств, например, сахаров, полиспиртов, таких как маннит или сорбит, и хлорида натрия. Длительного всасывания инъецируемых композиций можно достигать путем включения в композицию средства, которое замедляет всасывание, например, моностеарата алюминия или желатина.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно получать в соответствии со способами, хорошо известными и регулярно используемыми в данной области. См., например, [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000] и [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., NewYork, 1978]. Фармацевтическую композицию предпочтительно получают в условиях GMP. Как правило, в фармацевтической композиции по настоящему изобретению используют терапевтически эффективную дозу или эффективную дозу связывающего C5 антитела. Связывающие C5 антитела составляют в виде фармацевтически приемлемых дозированных форм общепринятыми способами, известными специалистам в данной области. Режимы дозирования корректируют для обеспечения оптимального желаемого ответа (например, терапевтического ответа).
Фактические дозировки активных ингредиентов в фармацевтических композициях по настоящему изобретению можно варьировать для получения количества активного ингредиента, которое является эффективным для достижения желаемого терапевтического ответа для конкретного пациента, композиции и режима введения, не являясь токсичным для пациента. Выбранная дозировка зависит от различных фармакокинетических параметров, например, активности конкретных используемых композиций по настоящему изобретению или их сложного эфира, соли или амида, пути введения, времени введения, скорости экскреции конкретного используемого соединения, продолжительности лечения, других лекарственных средств, соединений и/или материалов, используемых в комбинации с конкретными используемыми композициями, возраста, пола, массы тела, состояния, общего состояния здоровья и предшествующего медицинского анамнеза подвергаемого лечению пациента, и других факторов.
Вводимые дозировки необходимо титровать для оптимизации безопасности и эффективности. Для системного введения с антителом дозировка находится в диапазоне приблизительно от 0,0001 до 100 мг/кг и чаще от 0,01 до 15 мг/кг массы тела хозяина. Иллюстративный режим лечения охватывает системное введение раз в две недели, или раз в месяц, или раз в 3-6 месяцев. Для введения антитела внутрь стекловидного тела, дозировка находится в диапазоне от приблизительно 0,0001 до приблизительно 10 мг. Иллюстративный режим лечения охватывает системное введение один раз каждые две недели, или один раз в месяц, или один раз каждые 3-6 месяцев.
В способах системного введения дозировку корректируют для достижения концентрации антитела в плазме 1-1000 мкг/мл и в некоторых способах 25-500 мкг/мл. Альтернативно, антитело можно вводить в качестве состава с замедленным высвобождением, когда требуется менее частое введение. Дозировка и частота варьируют в зависимости от времени полужизни антитела у пациента. В профилактических применениях вводят относительно низкую дозировку с относительно нечастыми интервалами в течение длительного периода времени.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения или диагностики обусловленных комплементом заболеваний с использованием связывающей C5 молекулы.
Способ лечения обусловленных комплементом заболеваний с использованием связывающей C5 молекулы по настоящему изобретению включает: введение терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, или композиции, содержащей их. Термин "терапевтически эффективное количество", используемый в рамках настоящего изобретения, указывает на количество связывающей C5 молекулы по настоящему изобретению или количество композиции, содержащей связывающую C5 молекулу по настоящему изобретению, которое является эффективным для предупреждения или лечения обусловленных комплементом заболеваний.
Когда связывающую C5 молекулу или композицию, содержащую ее, вводят в комбинации с другим средством в качестве лекарственного средства по настоящему изобретению, эти два материала можно вводить последовательно или одновременно в любом порядке. Подходящие средства для комбинированного лечения связывающими C5 антителами включают средства, известные в данной области, которые способны модулировать активность компонентов комплемента. Например, средства включают фосфонатные сложные эфиры, полианионные вещества, сульфонилфториды, полинуклеотиды, пимаровую кислоту, некоторые противовоспалительные средства и т.п. Можно добавлять комбинированную терапию по меньшей мере одним лекарственным средством и т.п., и результатом этого может быть синергия.
Настоящее изобретение относится к диагностическому анализу для определения экспрессии белка и/или нуклеиновой кислоты C5 и функции белка C5 в биологических образцах (например, кровь, сыворотка крови, клетки, ткань) от индивидуума, страдающего обусловленным комплементом заболеванием, или индивидуума, имеющего его риск. В случае антитела по настоящему изобретению для обнаружения продукта расщепления комплемента могут использоваться, например, радиоиммунный анализ (REA), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и анализ радиальной диффузии. Кроме того, диагностический анализ, прогностический анализ, фармакологический генетический и клинический мониторинг можно использовать с целью прогнозирования (предсказания) для профилактического лечения индивидуума. Кроме того, настоящее изобретение относится к прогнозирующему (предсказывающему) анализу для определения того, имеет ли индивидуум риск возникновения заболеваний, обусловленных нарушением регуляции активации каскада комплемента. Например, можно анализировать мутацию гена C5 в биологическом образце. С использованием этого анализа с целью прогнозирования или предсказания, индивидуума можно профилактически лечить до возникновения заболеваний, характеризующихся экспрессией или активностью белка C5, нуклеиновой кислоты C5, или заболеваний, связанных с ними.
Кроме того, настоящее изобретение относится к набору для диагностики обусловленных комплементом заболеваний, содержащему связывающую C5 молекулу и контейнер. Набор для диагностики по настоящему изобретению может включать по меньшей мере любую из упомянутых выше связывающих C5 молекул. Контейнер может включать твердый носитель, и C5-связываюащя молекула может быть связана с твердым носителем, и твердый носитель может быть пористым или непористым, плоским или неплоским.
Кроме того, настоящее изобретение относится к применению связывающей C5 молекулы для получения лекарственного средства для лечения обусловленных комплементом заболеваний. Связывающую C5 молекулу по настоящему изобретению для получения лекарственного средства или композиции, содержащей его, можно смешивать с приемлемыми носителями и т.п., и можно получать в качестве комплексного лекарственного средства с другими средствами для синергического эффекта активных ингредиентов.
Кроме того, настоящее изобретение относится к применению связывающей C5 молекулы. Связывающую C5 молекулу для лечения обусловленных комплементом заболеваний по настоящему изобретению можно использовать для лечения, и ее можно использовать для прогностического анализа для определения экспрессии белка и/или нуклеиновой кислоты C5 или функции белка C5 от индивидуума, страдающего обусловленным комплементом заболеваниями, или индивидуума, имеющего риск их развития.
Для применения, композиции и способа лечения по настоящему изобретению используются одно и то же описание, если не указано иное.
Связывающая C5 молекула по настоящему изобретению является эффективной для диагностики, предупреждения и лечения обусловленных комплементом заболеваний.
[Краткое описание чертежей]
На фиг. 1 представлено поглощение для 40 клонов, случайным образом отобранных после биопэннинга с использованием иммунных библиотек кролика (A) и курицы (B) в соответствии с иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения.
На фиг. 2 представлены результаты измерения поглощения для пяти типов антител к C5 человека, выбранных из иммунных библиотек кролика и иммунных библиотек курицы в соответствии с иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения, и экулизумаба, который является антителом для сравнения.
На фиг. 3 представлены результаты для количества клонов, обладающих аффинностью связывания с C5, полученных из пяти мутантных подбиблиотек.
На фиг. 4 представлены результаты сравнения аффинности связывания клонов с увеличенной аффинностью, полученных с использованием клона HRA-06, который представляет собой гуманизированный клон в соответствии с иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения, в качестве матрицы.
На фиг. 5 показано, что антитело, продуцированное в соответствии с иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения, обладает высокой способностью ингибирования комплементзависимой цитотоксичности в анализе комплементзависимой цитотоксичности.
На фиг. 6 показано, что антитело, полученное согласно иллюстративному варианту осуществления настоящего изобретения, обладает высокой способностью ингибировать образование C5a в анализе образования C5a.
На фиг. 7 представлена перекрестно-видовая реактивность моноклонального антитела, полученного согласно иллюстративному варианту осуществления настоящего изобретения.
На фиг. 8 представлены результаты для антител, полученных и очищенных в соответствии с иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения с использованием эксклюзионной хроматографии.
На фиг. 9 показано, что антитело согласно иллюстративному варианту осуществления настоящего изобретения связывается с бета-цепью C5.
На фиг. 10 показано, что антитело согласно иллюстративному варианту осуществления настоящего изобретения связывается с доменом MG4 бета-цепи C5.
На фиг. 11 показано, что антитело согласно иллюстративному варианту осуществления настоящего изобретения специфически связывается с доменом MG4 в слитом белке мутантного Fc, в котором один домен последовательно удален с C-конца бета-цепи.
На фиг. 12 показано, что антитело согласно иллюстративному варианту осуществления настоящего изобретения связывается с аминокислотными остатками с 332 по 348 на N-конце бета-цепи в мутантной форме, из которой домен MG4 последовательно удален, что подтверждено иммуноблоттингом.
На фиг. 13 показано, что антитело согласно иллюстративному варианту осуществления настоящего изобретения связывается с аминокислотными остатками с 379 по 398 на N-конце бета-цепи, что подтверждено ELISA.
На фиг. 14 показано, что антитело согласно иллюстративному варианту осуществления настоящего изобретения связывается с аминокислотными остатками с 386 по 392 на N-конце бета-цепи (аминокислотные последовательности с 55 по 61 на основе последовательности домена MG4), что подтверждено ELISA.
[Описание вариантов осуществления]
Далее более подробно описаны компоненты и технические признаки настоящего изобретения с помощью примеров. Однако представленные ниже примеры предоставлены в качестве примеров, и, таким образом, объем охраны настоящего изобретения не ограничивается только представленными ниже примеры.
Различные примеры, описанные в настоящем описании, описаны с отсылкой на чертежи. В представленном ниже описании различные конкретные детали, например, конкретные формы, композиции и способы получения и т.п. описаны для полного понимания настоящего изобретения. Однако конкретные примеры можно использовать на практике без по меньшей мере одной конкретной детали и вместе с другими известными способами и формами. В другом иллюстративном варианте осуществления известные процессы и способы изготовления не описаны в качестве конкретных деталей, чтобы настоящее изобретение не стало чрезмерно неясным. Указание на "один иллюстративный вариант осуществления" или "примеры" в описании означает, что конкретные описанные характеристики, формы, композиции или свойства, ассоциированные с примерами, включены в один или несколько примеров настоящего изобретения. Таким образом, присутствие выражения "один иллюстративный вариант осуществления" или "примеры" в различных частях описания не обязательно указывает на один и тот же иллюстративный вариант осуществления настоящего изобретения. Кроме того, конкретные характеристики, формы, композиции или свойства можно комбинировать друг с другом любым подходящим способом по меньшей мере в одном иллюстративном варианте осуществления.
Пример 1. Конструирование иммунной библиотеки антител против C5
L
κ
λ
H
λ
H
5 мкг белка C5 человека (Calbiochem) смешивали с адъювантом RIBI MPL+TDM+CWS (Sigma, St. Louis, Mo, США) и инъецировали подкожно кроликам NZW и курам, и вспомогательные иммунизации проводили три раза у кроликов и четыре раза у кур с интервалами 2 недели. Тотальную РНК выделяли из селезенки и костного мозга кроликов после завершения иммунизации и селезенки, костного мозга и фабрициевой сумки кур после завершения иммунизации с использованием реагента TRI (Invitrogen, Carlsbad, CA, США), и первую цепь кДНК синтезировали с использованием праймера олиго-dT и системы синтеза перовой цепи SuperScript™ III First-Strand Synthesis System (Invitrogen). Библиотеки одноцепочечных Fv конструировали с использованием праймеров, представленных в таблице 9 (кролик) и в таблице 10 (курица) ниже, которые являются специфичными к вариабельным областям тяжелой цепи и вариабельным областям легкой цепи иммуноглобулина. В случае библиотеки scFv кролика для амплификации кодирующих последовательностей использовали 10 комбинаций праймеров V (9×V и 1×V) и 4 комбинации V. В случае библиотеки scFv курицы для амплификации кодирующих последовательностей использовали одну комбинацию праймеров для каждой Vи V.
Таблица 9Праймеры для V<sub>κ</sub>, V<sub>λ</sub> и V<sub>H </sub>библиотек одноцепочечных Fv кролика
5'-смысловые праймеры V<sub>κ</sub>
RSCVK1
71. GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG TGM TGA CCC AGA CTC CA
RSCVK2
72. GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG ATM TGA CCC AGA CTC CA
RSCVK3
73. GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG TGA TGA CCC AGA CTG AA
3'-обратные праймеры V<sub>κ</sub>, длинный линкер
RKB9J1ο-BL
74. GGA AGA TCT AGA GGA ACC ACC CCC ACC ACC GCC CGA GCC ACC GCC ACC AGA GGA TAG GAT CTC CAG CTC GGT CCC
RKB9Jο-BL
75. GGA AGA TCT AGA GGA ACC ACC CCC ACC ACC GCC CGA GCC ACC GCC ACC AGA GGA TAG GAT CTC CAG CTC GGT CCC
RKB42Jο-BL
76. GGA AGA TCT AGA GGA ACC ACC CCC ACC ACC GCC CGA GCC ACC GCC ACC AGA GGA TTT GAC SAC CAC CTC GGT CCC
5'-смысловой праймер V<sub>λ</sub>
RSCλ1
77. GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG TGC TGA CTC AGT CGC CCT C
3'-обратный праймер V<sub>λ</sub>, длинный линкер
RJλο-BL
78. GGA AGA TCT AGA GGA ACC ACC CCC ACC ACC GCC CGA GCC ACC GCC ACC AGA GGA GCC TGT GAC GGT CAG CTG GGT CCC
5'-смысловые праймеры V<sub>H</sub>
RSCVH1
79. GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC CAG TCG GTG GAG GAG TCC RGG
RSCVH2
80. GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC CAG TCG GTG AAG GAG TCC GAG
RSCVH3
81. GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC CAG TCG YTG GAG GAG TCC GGG
RSCVH4
82. GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC CAG SAG CAG CTG RTG GAG TCC GG
3'-обратные праймеры V<sub>H</sub>
RSCG-B
83. CCT GGC CGG CCT GGC CAC TAG TGA CTG AYG GAG CCT TAG GTT GCC C
Праймеры для удлинения с перекрыванием
RSC-F (смысловой)
84. GAG GAG GAG GAG GAG GAG GCG GGG CCC AGG CGG CCG AGC TC
RSC-B (обратный)
85. GAG GAG GAG GAG GAG GAG CCT GGC CGG CCT GGC CAC TAG TG
Таблица 10Праймеры для V<sub>λ</sub> и V<sub>H</sub> библиотек одноцепочечных Fv курицы
Праймеры V<sub>λ</sub>
CSCVK (смысловой)
86. GTG GCC CAG GCG GCC CTG ACT CAG CCG TCC TCG GTG TC
CKJo-B (обратный)
87. GGA AGA TCT AGA GGA CTG ACC TAG GAC GGT CAG G
Праймеры V<sub>H</sub>
CSCVHo-FL (смысловой)
88. GGT CAG TCC TCT AGA TCT TCC GGC GGT GGT GGC AGC TCC GGT GGT GGC GGT TCC GCC GTG ACG TTG GAC GAG
CSCG-B (обратный)
89. CTG GCC GGC CTG GCC ACT AGT GGA GGA GAC GAT GAC TTC GGT CC
Праймеры для удлинения с перекрыванием
CSC-F (смысловой)
90. GAG GAG GAG GAG GAG GAG GTG GCC CAG GCG GCC CTG ACT CAG
CSC-B (обратный)
91. GAG GAG GAG GAG GAG GAG GAG CTG GCC GGC CTG GCC ACT AGT GGA GG
L
H
L
H
11
В каждой реакции 1 мкл кДНК смешивали с 60 пмоль каждого праймера 10 мкл 10× реакционного буфера, 8 мкл 2,5 мМ dNTP, 0,5 мкл ДНК-полимеразы Taq и водой до конечного объема 100 мкл. Реакции ПЦР проводили в следующих условиях: 30 циклов в течение 15 сек при 94°С, 30 сек при 56°С и 90 сек при 72°С за которыми следует конечное удлинение в течение 10 мин при 72°С. Амплифицированные фрагменты длиной приблизительно 350 пар оснований наносили и разделяли на 1,5% агарозном геле и очищали с помощью набора для экстракции из геля QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN, Valencia, CA, США). Во втором раунде ПЦР продукты V и продукты V первого раунда связывали с использованием перекрывающейся ПЦР. Каждую реакцию ПЦР проводили в 100 мкл смеси, состоящей из 100 нг очищенного продукта V и продукта V, 60 пмоль каждого праймера, 10 мкл 10× реакционного буфера, 8 мкл 2,5 мМ dNTP и 0,5 мкл ДНК-полимеразы Taq. Реакции ПЦР проводили в следующих условиях: 20 циклов из 15 сек при 94°С, 30 сек при 56°С и 2 мин при 72°С, за которыми следует конечное удлинение в течение 10 мин при 72°С. Фрагменты scFv размером приблизительно 700 п.н. очищали с использованием набора для экстракции из геля QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN). Фрагменты scFv и вектор pComb3XSS расщепляли ферментом рестрикции SfiI (Roche Molecular Systems, Pleasanton, CA, США) посредством инкубации в течение 8 ч при 50°С. 700 нг расщепленного SfiI scFv лигировали с 1400 нг вектора pComb3X с использованием ДНК-лигазы T4 посредством инкубации реакционной смеси в течение 12 ч при 16°С, за которой следовало осаждение этанолом. Лигированную библиотеку трансформировали в E. coli ER2738 посредством электропорации. Клетки ресуспендировали с 3 мл среды Super Broth (SB) и инкубировали в течение 1 ч при 37°С при встряхивании при 250 об/мин. Затем в культуру добавляли 10 мл среды SB и 3 мкл карбенициллина в концентрации 100 мг/мл. Размер библиотеки определяли путем посева 0,1, 1 и 10 мкл культуры на планшет со средой Luria Broth (LB), содержащей 50 мкг/мл карбенициллина. После инкубации в течение одного часа в культуру добавляли 4,5 мкл карбенициллина в концентрации 100 мг/мл и инкубировали в течение дополнительного часа. Культуру добавляли к 2 мл фага-помощника VCSM13 (>10 к.о.е./мл), 183 мл SB среды и 92,5 мкл карбенициллина в концентрации 100 мг/мл и инкубировали в течение 2 ч при 37°С при встряхивании при 250 об/мин. В культуру добавляли канамицин (280 мкл) и культуру встряхивали в течение ночи при 250 об/мин и 37°С. На следующие сутки культуру центрифугировали при 3000 g в течение 15 мин. Бактериальный осадок сохраняли для получения фагмидной ДНК, и супернатант переносили в чистую центрифужную бутылку. Добавляли 8 г полиэтиленгликоля 8000 (PEG-8000, Sigma) и 6 г NaCl (Merck), и супернатант хранили на льду в течение 30 мин. Супернатант центрифугировали при 15000 g в течение 15 мин при 4°С. Осадок фага ресуспендировали в забуференном Tris солевом растворе (TBS), содержащем 1% бычий сывороточный альбумин (BSA).
Пример 2: Биопэннинг
7
3 мкг антитела C5 человека наносили на 1×10 магнитных гранул (Dynabeads M270- Epoxy, Invitrogen) при комнатной температуре в течение 16 часов. Гранулы промывали PBS и блокировали PBS, содержащим 3% BSA, при комнатной температуре в течение 1 часа. Покрытые гранулы промывали и инкубировали вместе с scFv, полученным способом фагового дисплея, в течение 2 часов при комнатной температуре. Гранулы промывали 0,5% TPBS для удаления фагов, которые не были связанными. Связанные фаги элюировали 100 мкл 0,1M глицин-HCl и нейтрализовывали 6 мкл 2 M Tris-HCl (pH 9,0). Элюированными фагами инфицировали E.coli ER2738 и восстанавливали с помощью фага-помощника VCSM13 для амплификации в течение ночи. Исходный и конечный титр фага определяли путем посева инфицированной фагом бактериальной культуры при 37°С на планшет LB, содержащий 50 мкг/мл карбенициллина. На следующие сутки фаг осаждали добавлением PEG-8000 и NaCl, как описано в примере 1.
Пример 3. Селекция клонов scFv с использованием ELISA фагов
2
2
ELISA с использованием фагов, экспонирующих scFv, проводили против C5 человека для анализа выбранных в ходе биопэннинга клонов. 96-луночные микропланшеты для титрования покрывали 100 нг C5 человека на лунку в течение ночи при 4°С и блокировали 3% BSA в PBS. Каждую культуру фага смешивали с равным объемом 6% BSA в PBS, добавляли в покрытый C5 человеком 96-луночный планшет и инкубировали в течение 2 ч при 37°С. После завершения инкубации планшет промывали и инкубировали с конъюгированным с HRP антителом против M13 (Amersham, США). После завершения инкубации планшет промывали, и в каждую лунку добавляли 1 мкг/мл 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислоты) (ABTS, Amresco, OH, USA) в 0,05 M буфере на основе лимонной кислоты, и в каждую лунку добавляли 1,0% HO, после чего следовало развитие окраски, и измеряли поглощение при 405 нм.
Результаты представлены на фиг. 1.
На фиг. 1A представлены иммунные библиотеки кролика и на фиг. 1B представлены иммунные библиотеки курицы. В качестве результатов анализа последовательности генов клонов, проявляющих поглощение 0,6 или более, против C5 человека, получили пять клонов scFv, каждый из которых имел отличающуюся последовательность, из двух типов иммунных библиотек кролика и трех типов иммунных библиотек курицы.
Кроме того, выбранные пять типов клонов scFv и экулизумаб, который является контролем, преобразовывали в слитый белок ScFv-Fc для сравнения аффинности связывания C5 посредством ELISA. Количества антител, связанных с C5, определяли с использованием связанного с HRP антитела против IgG в соответствии со способом, который описан выше, и результаты представлены на фиг. 2.
Как показано на фиг. 2, все из выбранных пяти типов клонов scFv проявляли более высокое поглощение, чем экулизумаб.
Пример 4. Конструирование подвергнутых созреванию аффинности и гуманизированных антител
6 CDR (определяющие комплементарность области, определяющие комплементарность к антигену области легкой цепи 1-3 [CDRL 1-3],
определяющие комплементарность к антигену области тяжелой цепи 1-3 [CDRH1-3]), обладающих аффинностью и способностью ингибировать активацию компонента C5 комплемента человека, встраивали межу 8 каркасными областями (FRL1-4, FRH1-4) из каппа 1 человека эмбрионального типа/IGHV3-23 для синтеза гуманизированного гена scFv против компонента C5 комплемента (HRA-06, Genscript, Piscataway, NJ, США).
Для получения мутантных подбиблиотек HRA-06 использовали олигонуклеотиды, содержащие вырожденные кодоны NNK или MNN (N = A, T, G или C, K = G или T, M = A или C). Ген ScFv HRA-06 использовали для ДНК-матрицы. Рандомизированные кодоны вносили в пять CDR, за исключением CDRH3, способом ПЦР. Амплифицированные фрагменты scFv очищали с использованием набора для экстракции из геля QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN). scFv и вектор pComb3XSS расщепляли ферментом рестрикции SfiI (Roche Molecular Systems) и лигировали, а затем проводили осаждение этанолом. Лигированные библиотеки трансфицировали в E. coli ER2738 те же способом, как и в примере 1, для конструирования фаговых библиотек. Антигены выбирали исходя из сконструированных фаговых библиотек тем же способом, как и в примере 2. Наконец, аффинность связывания с C5 подтверждали способом ELISA фагов тем же способом, как и в примере 3.
Как показано на фиг. 3, из 5 типов мутантных подбиблиотек был получен ряд клонов, обладающих аффинностью связывания с C5.
Пример 5. Конструирование рекомбинантных антител против C5 и экулизумаба в качестве контроля
1. Субклонирование антитела против C5 в полный вектор IgG и вектор scFv-Fc
κ
Ген, кодирующий шарнирную область IgG2 и гибридные CH2-CH3 IgG2/4, встраивали в вектор pCEP4 (Invitrogen) с использованием фермента рестрикции HindIII (New England Biolabs) и XhoI (New England Biolabs). Ген, кодирующий scFv против C5, субклонировали на 5'-конец области Fc с использованием двух участков рестрикции SfiI. В случае легкой цепи, ген C иммуноглобулина человека субклонировали в экспрессирующий вектор млекопитающих. В случае тяжелой цепи, ген от CH1 человека и шарнирной области IgG2 человека до гибридной области CH2-CH3 IgG2/4 субклонировали в экспрессирующий вектор млекопитающих. В этот вектор полноразмерного IgG субклонировали вариабельные легкие цепи и вариабельные тяжелые цепи. Последовательность антитела экулизумаба получали путем синтеза генов тяжелой цепи и легкой цепи на основе последовательности антитела, указанной в отчете об испытании экулизумаба (Product Name: Soliris), размещенном на "Japan Pharmaceuticals and Medical Devices Agency (PMDA)".
2. Трансфекция и очистка белка
6
2
Трансфекцию проводили для сверхэкспрессии рекомбинантных белков. 2 мкг экспрессирующего вектора млекопитающих на мл объема культуры и 4 мкг полиэтиленимина/мл (PEI, Polysciences, Warrington, PA, США) смешивали в 150 мМ NaCl, что соответствует 1/10 объема культуры и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 15 мин. Смесь добавляли к клеткам HEK 293F (2×10 клеток/мл) и инкубировали в течение 5 суток в следующих условиях: экспрессирующая среда FreeStyle™ 293, содержащая 100 Е/мл пенициллина (Invitrogen) и 100 Е/мл стрептомицина (Invitrogen), 37°С, 7% CO, 135 об/мин на орбитальном встряхивателе. Супернатанты культур клеток собирали и подвергали аффинной гель-хроматографии с белком A для очистки IgG и слитого белка Fc.
Пример 6. Измерение аффинности связывания моноклонального антитела
ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) проводили для измерения аффинности связывания компонента C5 комплемента у антител, полученных согласно примеру 5. Антитела, разбавленные до каждой концентрации, добавляли в 96-луночные планшеты, покрытые C5, для проведения реакции. В качестве вторичного антитела использовали меченное пероксидазой хрена антитело против IgG человека, после чего проводили развитие окраски с использованием ABTS (2,2'-азинобис[3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислоты]-диаммония соль), и поглощение измеряли тем же способом, что и в примере 3.
Моноклональные антитела, использованные в этом эксперименте, представляли собой шесть типов подвернутых созреванию аффинности и гуманизированных антител против C5 (HRA-06-H2-1, HRA-06-H2-7, HRA-06-H2-18, HRA-06-H2-24, HRA-06-H1-9-H2-7, HRA-06-H1-9-H2-24) и антитело группы положительного контроля экулизумаб, и антитело группы отрицательного контроля паливизумаб, и результаты представлены на фиг. 3.
Как показано на фиг. 4, все из антител против компонента C5 комплемента проявляли аффинность связывания с C5, и шесть типов подвергнутых созреванию аффинности и гуманизированных антител против C5 проявляли высокое поглощение по сравнению с экулизумабом.
Пример 7: Анализ комплементзависимой цитотоксичности (CDC) in vitro
6
Экспрессирующую CD20 клеточную линию лимфомы Беркитта человека Raji содержали в RPMI 1640, дополненной 10% FBS (Invitrogen), 100 Ед/мл пенициллина (Invitrogen) и 100 Ед/мл стрептомицина (Invitrogen). Клетки-мишени промывали и ресуспендировали в концентрации 1×10 клеток/мл. IgG человека против CD20 ритуксимаб (Roche) разбавляли раствором CDC в концентрации 3 мкг/мл. Равный объем клеток-мишеней и сенсибилизирующего антитела смешивали до объема 100 мкл/лунку в 96-луночном планшете и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 5 мин. Анализ начинали добавлением сыворотки с комплементом человека до конечного объема 150 мкл на лунку и конечной концентрации сыворотки крови 4%. После инкубации в течение 2 часов в каждую лунку добавляли 15 мкл соли тетразолия (WST-1, Takara Bio, Япония), и планшет инкубировали в течение дополнительных 2 часов. Жизнеспособные клетки анализировали путем измерения OD при 450 нм. Эффект антитела против C5 оценивали путем предварительной инкубации с сывороткой при 37°С в течение 30 мин перед добавлением к смеси клеток-мишеней и сенсибилизирующего антитела. Ту же концентрацию паливизумаба использовали в качестве IgG-контроля. Процент жизнеспособности клеток вычисляли по формуле:
антитело
без антитела
% жизнеспособность = (Тест - Фоновое значение)/(Тест - Фоновое значение)×100
Результаты представлены на фиг. 5.
Как показано на фиг. 5, подвергнутые созреванию аффинности и гуманизированные антитела против C5, полученные в соответствии с настоящим изобретением, проявляли способность ингибировать CDC, и все из антител проявляли высокую жизнеспособность клеток по сравнению с экулизумабом.
Пример 8: Измерение содержания продуцированного C5a in vitro
После инкубации в течение 2 часов клеток-мишеней, сенсибилизирующего антитела и сыворотки, клетки осаждали центрифугированием. и супернатант анализировали в отношении содержания C5a посредством сэндвич-ELISA с использованием набора BD OptiEIA™ Human C5a ELISA Kit II (BD Biosciences, San Jose, CA, США) в соответствии с инструкциями изготовителя.
Результаты представлены на фиг. 6.
Как показано на фиг. 6, все из подвергнутых созреванию аффинности и гуманизированных антител против C5, полученных в соответствии с настоящим изобретением, обладали способностью ингибирования продуцирования C5a, и все из четырех типов подвергнутых созреванию аффинности и гуманизированных антител против C5 проявляли высокую ингибиторную способность по сравнению с экулизумабом.
Пример 9: Измерение перекрестно-видовой реактивности моноклонального антитела
Иммуноблоттинг проводили для подтверждения того, что моноклональное антитело связывалось с компонентом C5 комплемента вида, отличного от человека. Сыворотку крови с белком C5 человека (Sigma), макака-резус, мыши BALB/c, крысы Wistar, кролика NZW разбавляли и подвергали SDS-PAGE, соответственно, и разделенные белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Иммуноблоттинг проводили с использованием антитела против компонента C5 комплемента HRA-06-H2-1, полученного в соответствии с настоящим изобретением.
Результаты представлены на фиг. 7.
Как показано на фиг. 7, антитела против компонента C5 комплемента проявляли аффинность связывания с C5 человека (Sigma), макака-резус, крысы Wistar и кролика NZW.
Пример 10: Эксклюзионная хроматография
Анализ с использованием эксклюзионной хроматографии (SEC) проводили на очищенных антителах с использованием системы Waters 2489 (Waters Corporation, Milford, MA, США) и колонки Zenix-C 300 (Sepax Technologies, Inc., Newark, DE, США). Состав подвижной фазы (150 мМ фосфат натрия, pH 7,0) и скорость потока (1,0 мл/мин) были постоянными при всех прогонах. Концентрацию белка определяли путем мониторинга поглощения элюата колонки при 280 нм. Относительную концентрацию вычисляли путем деления индивидуальных площадей пиков на сумму площадей пиков.
Результаты представлены на фиг. 8. На фиг. 8A-8D представлены A) HRA-06-H2-1, B) HRA-06-H2-7, C) HRA-06-H2-18, D) HRA-06-H2-24, E) HRA-06-H1-9-H2-7 и F) HRA-06-H1-9-H2-24, соответственно.
Как показано на фиг. 8, было подтверждено, что агрегация практически не обнаруживалась при исследовании физико-химических свойств антитела против компонента C5 комплемента.
Пример 11: Картирование эпитопов
1. Подтверждение связывания антитела с бета-цепью C5
Белок компонента C5 комплемента подвергали SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях (дорожка 1) и в восстанавливающих условиях (дорожка 2), соответственно, с последующим иммуноблоттингом с использованием антитела против компонента C5 комплемента для подтверждения того, что происходит связывание бета-цепи. Результаты представлены на фиг. 9.
На фиг. 9A представлено связывание, когда в качестве антитела использовали экулизумаб, и на фиг. 9B представлено связывание, когда в качестве антитела использовали HRA-06-H2-1 в соответствии с настоящим изобретением. Как известно в данной области, было подтверждено, что экулизумаб связывался с C5 (полный белок комплемента), и связывался с альфа-цепью на дорожке 2 в восстанавливающих условиях. Между тем, было подтверждено, что антитело HRA-06-H2-1 в соответствии с настоящим изобретением связывалось с C5 (полный белок комплемента), и связывалось с бета-цепью в дорожке 2 в восстанавливающих условиях.
2. Получение мутантных доменов бета-цепи C5 в качестве слитых белков с Fc и идентификация участка связывания
С кДНК амплифицировали шесть доменов, содержащих бета-цепь C5 и мутант с последовательной делецией бета-цепи. Праймеры конструировали для внесения участков рестрикции SfiI как на 5'-, так и на 3'-концах (таблица 11). Мутант с последовательной делецией бета-цепи C5 амплифицировали с использованием комбинации праймеров, как описано в таблице 12. Амплифицированные фрагменты ПЦР расщепляли SfiI и клонировали в модифицированный вектор pCEP4, содержащий шарнирную область и домен CH2-CH3 IgG1 человека в 3'-области участка клонирования. Эти клоны трансфицировали, и слитые белки Fc очищали, как описано в примере 5.
Таблица 11Последовательности праймеров для амплификации доменов бета-цепи
Прямые праймеры (5'→3')
MG1_F
92. GGCCCAGGCGGCCATGGGCCTTTTGGGAATACTTTG
MG2_F
93. GGCCCAGGCGGCCAATGGATTTCTCTTCATTCATAC
MG3_F
94. GGCCCAGGCGGCCCCACATTTTTCTGTCTCAATC
MG4_F
95. GGCCCAGGCGGCCTCTCCCTACAAACTGAATTTG
MG5_F
96. GGCCCAGGCGGCCACTGATAACCATAAGGCTTTG
Linker_F
97. GGCCCAGGCGGCCTCCTGGGTGGCATTAGC
Обратные праймеры (5'→3')
MG1_R
98. GGCCGGCCTGGCCGTCATAGGTTATTGGCATTCT
MG2_R
99. GGCCGGCCTGGCCCAAGACATATTCTTTAACTTC
MG3_R
100. GGCCGGCCTGGCCGAGGACATATTTGATGCCAG
MG4_R
101. GGCCGGCCTGGCCCCAATCAATATAAAGGTAACTTTG
MG5_R
102. GGCCGGCCTGGCCATCCATTCCAGTTGCCATATTA
Linker_R
103. GGCCGGCCTGGCCGAGAATTTCTTTACAAGGTTC
Таблица 12Комбинации праймеров для конструирования доменов бета-цепи и мутанта с делецией бета-цепи
Название домена
Комбинация праймеров
MG1
MG1_F/MG1-R
MG2
MG2_F/MG2-R
MG3
MG3_F/MG3-R
MG4
MG4_F/MG4-R
MG5
MG5_F/MG5-R
Линкер
Linker_F/Linker-R
MG1-2
MG1_F/MG2-R
MG1-3
MG1_F/MG3-R
MG1-4
MG1_F/MG4-R
MG1-5
MG1_F/MG5-R
Белки, содержащие каждый домен, подвергали SDS-PAGE, соответственно, и проводили иммуноблоттинг с использованием антитела против компонента C5 комплемента (HRA-06-H2-1). Результаты представлены на фиг. 10 и 11.
На фиг. 10A представлена схематическая диаграмма структуры бета-цепи C5 и продуцированного слитого белка Fc, и на фиг. 10B представлены результаты иммуноблоттинга. Как показано на фиг. 10, было подтверждено, что антитело HRA-06-H2-1, продуцированное в соответствии с настоящим изобретением, связывалось со слитым белком Fc, имеющим домен MG4.
На фиг. 11A представлена схематическая диаграмма, демонстрирующая структуру бета-цепи C5 и продуцированного слитого белка Fc, и на фиг. 11B представлены результаты иммуноблоттинга. Как показано на фиг. 11, было подтверждено, что антитело HRA-06-H2-1, продуцированное в соответствии с настоящим изобретением, связывалось только со слитым белком Fc, содержащим домен MG4.
3. Продуцирование доменов MG4 в качестве слитых белков Fc и идентификация участка связывания
Клонировали домен MG4 бета-цепи и пять мутантов, в которых домен MG4 последовательно удален с N-конца домена MG4. Праймеры конструировали для внесения участков рестрикции SfiI как на 5'-, так и на 3'-конце (таблица 13). Амплифицированные фрагменты ПЦР расщепляли SfiI и клонировали в модифицированный вектор pCEP4, содержащий шарнирную область и домен CH2-CH3 IgG1 человека в 3'-области участка клонирования. Эти клоны трансфицировали, и слитые белки Fc очищали, как описано в примере 5. Очищенные слитые белки Fc подвергали SDS-PAGE и проводили иммуноблоттинг, как описано выше.
Таблица 13Последовательности праймеров для амплификации доменов MG4
Прямые праймеры (5'→3')
hMG4_F
104. GGCCCAGGCGGCCTCTCCCTACAAACTGAATTTG
d332-348_F
105. GGCCCAGGCGGCCATTCCATATCCCATCAAGG
d332-378_F
106. GGCCCAGGCGGCCGTAAACCAAGAGACATCTGAC
d332-396_F
107. GGCCCAGGCGGCCGATGGAGTAGCTTCCTTTG
d332-424_F
108. GGCCCAGGCGGCCCCAGAAGAAAATCAGGCC
Обратные праймеры (5'→3')
hMG4_R
109. GGCCGGCCTGGCCCCAATCAATATAAAGGTAACTTTG
Результаты представлены на фиг. 12. На фиг. 12A представлен домен MG4 и слитый белок Fc, полученный последовательным удалением домена, и на фиг. 12B представлены результаты иммуноблоттинга с использованием антитела HRA-06-H2-1. Как показано на фиг. 12, было подтверждено, что связывание не достигалось у мутантов, у которых последовательности аминокислотных остатков 332-348 были удалены с N-конца бета-цепи, что можно было понять так, что последовательности аминокислотных остатков 332-348 в домене MG4 бета-цепи представляли собой последовательности, обладающие высокой возможностью связывания антитела.
4. Подтверждение участков связывания антитела из гибридных доменов MG4 человека/мыши
11
Гибридные домены MG4 человека/мыши бета-цепи C5 получали в перекрывающейся ПЦР. Праймеры конструировали для внесения участков рестрикции SfiI как на 5'-, так и на 3'-конце (таблица 14). Фрагменты ПЦР расщепляли SfiI и клонировали в расщепленный SfiI вектор pComb3X. Эти клоны трансфицировали в E.coli ER 2738. Единичные колонии из каждого гибрида MG4 человека/мыши инкубировали до достижения поглощения при 600 нм приблизительно 1,0. Инфицирования фагом проводили добавлением фага-помощника VCSM13 (10 к.о.е./мл), с последующей инкубацией при 37°С в течение 2 ч. Добавляли канамицин (25 мкг/мл), и культуру инкубировали при 37°С в течение ночи при постоянном встряхивании. Бактерии удаляли центрифугированием при 3000 g в течение 15 мин.
Таблица 14Последовательности праймеров для амплификации гибридных доменов MG4 человека/мыши
Структура hMG4-m332-348
m332-348_F
110. GGCCCAGGCGGCCTCTCCCTACACACTGAATTTGGTCGCTACTCCTCTTTTCGTGAAGCCCGGGATTCCATATCCCATCAAGGTGC
hMG4_R
111. GGCCCAGGCGGCCTCTCCCTACAAACTGAATTTG
Амплификация N-конца MG4 мыши
Прямые праймеры (5'→3')
mMG4_F
112. TCTCCCTACACACTGAATTTGG
Обратные праймеры (5'→3')
m332-359_R
113. GTCAAGCGAATCTTTAACCTGTGCCTTG
m332-368_R
114. TGTTACTGGGACCCCTCCTACCGCCTG
m332-378_R
115. TTGGTTTACATCGACTGTTTGTGCCATC
m332-385_R
116. TGGATCCAAGTCAGATGTCTCTTGATTCAC
m332-392_R
117. AACACGTGTGATGCTCCTCTTTGTTTCC
m332-398_R
118. GGAAGCTACTCCATCAGTGTCATGAGTG
m332-409_R
119. CACCGTCACATTTGATGGGAGGTTCAGC
Амплификация C-конца MG4 человека
Прямые праймеры (5'→3')
m332-359_F
120. GTTAAAGATTCGCTTGACCAGTTGGTAG
m332-368_F
121. GGAGGGGTCCCAGTAACACTGAATGCAC
m332-378_F
122. ACAGTCGATGTAAACCAAGAGACATCTGAC
m332-385_F
123. ACATCTGACTTGGATCCAAGCAAAAGTGT
m332-392_F
124. AGGAGCATCACACGTGTTGATGATGGAGTA
m332-398_F
125. ACTGATGGAGTAGCTTCCTTTGTGCTTAATC
m332-409_F
126. CCATCAAATGTGACGGTGCTGGAGTTTA
Обратные праймеры (5'→3')
hMG4_R
127. GGCCCAGGCGGCCTCTCCCTACAAACTGAATTTG
Структура mMG4-h332-348
h332-348_F
128.GGCCCAGGCGGCCTCTCCCTACAAACTGAATTTGGTTGCTACTCCTCTTTTCCTGAAGCCTGGGATTCCATTTTCCATCAAG
mMG4_R
129.CCAAGCGATGTAAATGTAAC
Амплификация N-конца MG4 человека
Прямые праймеры (5'→3')
hMG4_F
130. GGCCCAGGCGGCCTCTCCCTACAAACTGAATTTG
Обратные праймеры (5'→3')
h332-359_R
131. CTCGAGTGAATCTTTAACCTGCACCTTGA
h332-368_R
132. AGTTACTGGGACTCCTCCTACCAACTG
h332-378_R
133. TTGATTCACATCAATTGTTTGTGCATTCAG
h332-385_R
134. TGTTTCCAAGTCAGATGTCTCTTGGTTTAC
h332-392_R
135. GTCATGAGTTACACTTTTGCTTGGATCCA
h332-398_R
136. CACAGCTACTCCATCATCAACACGTGTTAC
h332-409_R
137. CACCGTCACTCCAGATGGGAGATTAAGCAC
Амплификация C-конца MG4 мыши
Прямые праймеры (5'→3')
h332-359_F
138. GTTAAAGATTCACTCGAGCAGGCGGT
h332-368_F
139. GGAGGAGTCCCAGTAACTCTGATGGCAC
h332-378_F
140. ACAATTGATGTGAATCAAGAGACATCTGAC
h332-385_F
141. ACATCTGACTTGGAAACAAAGAGGAGCATC
h332-392_F
142. CAAAAGTGTAACTCATGACACTGATGGAG
h332-398_F
143. GATGATGGAGTAGCTGTGTTTGTGCTGAAC
h332-409_F
144. CCATCTGGAGTGACGGTGCTAAAGTTTG
Обратные праймеры (5'→3')
mMG4_R
145. CCAAGCGATGTAAATGTAAC
ELISA фагов проводили следующим образом. IgG2/4 против C5 HRA-06-H2-7 разбавляли в 0,1 M натрий-бикарбонатном буфере (pH 8,6), и 100 нг антитела наносили на 96-луночный планшет при 4°С в течение ночи. Каждую лунку блокировали добавлением 100 мкл 5% обезжиренного молока в TBS, содержащего 0,05% Tween 20, и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Фаг разбавляли в два раза в 6% BSA/PBS, а затем в каждую лунку добавляли 50 мкл разбавленного фага и инкубировали в течение 2 ч при 37°С. Планшет промывали и добавляли 50 мкл разбавленного связанного с HRP антитела против M13 (1:5000), и планшет инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Планшет промывали, и в каждую лунку добавляли 50 мкл раствора субстрата ABTS, и измеряли поглощение при 405 нм.
Результаты представлены на фиг. 13 и 14.
На фиг. 13A представлены гибридные домены MG4 человека/мыши, и на фиг. 13B представлены результаты ELISA. Как показано на фиг. 13, антитело HRA-06-H2-7 связывалось, когда последовательности аминокислотных остатков 379-398 на основе последовательности бета-цепи представляли собой последовательности человека, что демонстрирует возможность связывания с соответствующим участком антитела.
На фиг. 14 представлены результаты, полученные путем более точного подтверждения участков связывания последовательностей. На фиг. 14A представлены гибридные домены MG4 человека/мыши, и на фиг. 14B представлены результаты ELISA. Как показано на фиг. 14, антитело HRA-06-H2-7 связывалось, когда последовательности аминокислотных остатков с 386 по 392 на основе последовательности бета-цепи (аминокислотные последовательности с 55 по 61 на основе последовательности домена MG4) представляли собой последовательности человека, что демонстрирует возможность связывания с соответствующим участком антитела.