Применение иммунохроматографического анализа для серодиагностики бруцеллеза крупного рогатого скота

Экспрессный способ определения афлатоксинов В1, B2, G1, G2 в зерне и кормах

Библиография

1. ГОСТР 53162-2008. Продукты пищевые. Определение аф-латоксина B1 и общего содержания афлатоксинов B1, B2, G1 и G2 в зерновых культурах, орехах и продуктах их переработки. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии. — М.: Стандар-тинформ, 2009.

2. Максимально допустимые уровни (МДУ) микотоксинов в кормах для сельскохозяйственных животных, утвержденные ГУВ Минсельхоза СССР N 434-7 от 01.02.89.

3. СанПиН 2.3.2.1078-01. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов санитарно-эпидемиологические правила и нормы. — М.: Академия, 2002.

4. Brera C., Debegnach F., Minardi V., Pannunzi Е., De Santis B., Miraglia М., Lombardi F.M.P. Immunoaffinity Column Cleanup with Liquid Chromatography for Determination of Aflatoxin B1 in Corn Samples: Interlaboratory Study // J. AOAC Int., 2007; 90 (3): 765-772.

Summary

V.G. Amelin, T.B. Nikeshina, N.M. Karaseva. Rapid Method for Detection of Aflatoxins B1, B2, G1, G2 in Grains and Feeds. Rapid method for detection of aflatoxins B1, B2, G1, G2 in grains and feeds by HPLC with fluo-remetric detector was developed. The possibility of usage of rapid sample preparation with QuEChERS in conjunction with dispersive liquid-liquid microextraction for aflatoxin B1, B2, G1, G2 extraction and determination was demonstrated. The detection limits for aflatoxins B1, G1 and B2, G2 were 0,1 Mg/kg and 0,08 Mg/kg, respectively. The analysis duration was 1...1,5 h.

УДК 619: 616.98: 616-078

Применение иммунохроматографического анализа для серодиагностики бруцеллеза крупного рогатого скота

Д.В. Сотников, Н.А. Бызова, Н.П. Староверова, А.В. Жердев, кандидат биологических наук,

Б.Б. Дзантиев, доктор химических наук Институт биохимии имени А.Н. Баха РАН (Москва).

Ключевые слова: бруцеллез, иммунохроматография, крупный рогатый скот, липополисахарид, серодиагностика

Сокращения: БСА — бычий сывороточный альбумин, ИФА — иммуноферментный анализ, ИХА — иммунохроматографический анализ, КРС — крупный рогатый скот, ЛПС — липополисахарид, ПЦР — полимеразная цепная реакция

Введение

Бруцеллез является опасным заболеванием, которое наносит значительный экономический ущерб и приводит к негативным социальным последствиям. Наиболее широко бруцеллез распространен в странах Средиземноморья, Малой Азии, Африки, Центральной и Южной Америки [4], весьма неблагоприятна

ситуация по данной инфекции в России и странах СНГ [6, 8].

Одно из основных направлений в борьбе с бруцеллезом — своевременное выявление очагов инфекции. Эффективность выявления основана на достоверной, оперативной и информативной лабораторной диагностике заболевания.

Традиционно для выявления бруцеллеза используют различные методы: бактериологический, ПЦР, имму-ноаналитические, в том числе серологические анализы (выявление специфических антител против бактериальных антигенов) и др. [7]. Однако для подавляющего большинства методов характерна большая продолжительность (от нескольких часов до суток), требуется специальное оборудование и квалифицированный персонал. Развитие диагностики в последние годы показало, что

5. Campone L., Piccinelli A.L., Celano R., Rastrelli L. Application of dispersive liquid-liquid microextraction for the determination of aflatoxins B1, B2, G1 and G2 in cereal products // J. Chromatogr. A., 2011; 1218: 7648-7654.

6. Guevara-Gonzalez R.G. Aflatoxins. Biochemistry and molecular biology. — Croatia: InTech, 2011.

7. Sirhan A., Tan G.H, Wong R.C.S. Method validation in the determination of aflatoxins in noodle samples using the QuEChERS method (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe) and high performance liquid chromatography coupled to a fluorescence detector (HPLC-FLD) // Food Control., 2011; 22 (12): 1801-1813.

8. Trucksess M.W., Stack M. E., Nesheim S., Page S.W., Albert R., Hansen T.J., Donahue K.F. Immunoaffinity column coupled with solution fluorometry or liquid chromatography postcolumn derivatization for determination of aflatoxins in corn, peanuts, and peanut butter: collaborative study // J. AOAC Int., 1991; 74 (1): 81-88.

РВЖ • СХЖ • № 3/2013

наряду с увеличением чувствительности и повышением специфичности наблюдается тенденция упрощения анализа, обеспечения возможности его проведения во внелабораторных условиях. Немаловажную роль играет также снижение стоимости определения, что необходимо при скрининге большого числа образцов при массовой диагностике в целях локализации и ликвидации очагов инфекции.

Перечисленным условиям на сегодняшний день в наибольшей степени удовлетворяет иммунохроматография. В данном методе все необходимые реагенты предварительно нанесены на мембранные компоненты тест-полоски и ее контакт с тестируемой пробой непосредственно инициирует движение фронта жидкости по мембранам, протекание специфических реакций и формирование иммунных комплексов, которые благодаря включению в их состав окрашенного маркера могут детектироваться визуально или с помощью оптического детектора [5, 9]. Этот метод диагностики характеризуется высокой чувствительностью, не сопряжен с использованием сложного оборудования и хорошо подходит для массовых анализов. ИХА обеспечивает возможность своевременных противоэпизоотических мероприятий. Исключение необходимости посылать биологический материал в лабораторию уменьшает время постановки диагноза, что в некоторых случаях имеет решающее значение. Методическая простота, быстрота анализа (10_15 мин), чувствительность иммунохро-

матографии обусловили ее активное применение для решения разнообразных диагностических задач.

По таким аналитическим характеристикам, как чувствительность и специфичность, метод ИХА не уступает ИФА, а по скорости получения результата значительно его превосходит. Таким образом, применение иммунохрома-тографических тестов представляется наиболее оправданным для первичного скрининга, однако для подтверждающего анализа необходимо дополнять ИХА другими методами, прежде всего, традиционными методами микробиологического контроля как наиболее надежными.

Цель исследования

Разработать и охарактеризовать экспрессные имму-нохроматографические тесты для детекции антител против ЛПС Brucella abortus.

Материалы и методы

В работе были использованы кроличьи (RABIss) антитела против иммуноглобулинов КРС («Имтек», Россия), твин-20, азид натрия («Sigma», США), золотохлористоводородная кислота («Fluka», Германия), БСА («MP Biomedicals», США), рекомбинантный белок G («Государственный исследовательский центр прикладной микробиологии и биотехнологии», Россия).

Все соли были аналитической или химической чистоты. Воду для приготовления растворов очищали на установке MilliQ («Millipore», США).

Для изготовления иммунохроматографических тест-систем использовали набор mdi Easypack («Advanced Microdevices», Индия), включающий в себя рабочие мембраны CNPH90 с размером пор 15 мкм, подлож-

ку под конъюгат PT-R5, мембрану для нанесения образца FR1(0.6), конечную адсорбирующую мембрану AP045 и ламинирующую защитную пленку на клейкой основе МТ-1.

Панель сывороток и ЛПС Brucella abortus. Данные компоненты были предоставлены Республиканским государственным предприятием «Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан» (Астана, Казахстан). Наличие или отсутствие противобруцеллезных антител в сыворотках было подтверждено результатами ИФА. ЛПС получен методом водно-фенольной экстракции [3]

Нанесение реагентов на иммунохроматографичес-кие мембраны. Конъюгат коллоидного золота с рекомбинантным белком G наносили на стекловолоконную мембрану (PT-R5, «Advanced Microdevices», Индия) в разведении, соответствующем D520=10,0, в объеме 11 мкл на 1 см полосы с помощью диспенсера IsoFlow («Imagene Technology», США).

Для формирования аналитической зоны использовали препарат ЛПС Brucella abortus. На 1 см полосы наносили 2 мкл препарата (1,0 мг/мл в дистиллированной воде). Для формирования контрольной зоны использовали кроличьи антитела против иммуноглобулинов КРС. На 1 см полосы наносили 2 мкл антител (0, 5 мг/мл в PBS).

Изготовление иммунохроматографических тест-систем. Полученные подложки и рабочие мембраны сушили на воздухе при 20_22°C не менее 20 ч. Собирали мультимембранный композит, из которого получали полоски шириной 3,5 мм, используя автоматический гильотинный нарезчик Index Cutter-1 («A-Point Technologies», США). Тест-полоски помещали в пластиковые кассеты, которые с силикагелем в качестве осушителя герметично упаковывали в пакеты из ламинированной алюминиевой фольги с помощью запаивателя с миниконвейером FR-900 («Wenzhou dingli packing machinery», Китай). Тест-полоски изготавливали и упаковывали при 20_22°C в специальном помещении с относительной влажностью воздуха не более 30 %. Упакованные тест-полоски хранили при температуре 20_22°C [1, 2].

Иммунохроматография. ИХА проводили при комнатной температуре. Одну каплю сыворотки крови помещали в окошко для проб на пластиковой кассете и добавляли 3 капли PBST. Через 10 мин визуально контролировали результат ИХА. Количественно связывание коллоида в контрольной и аналитической зонах регистрировали с помощью портативного анализатора «Рефлеком» [10].

Результаты и обсуждение

ИХА был реализован по схеме (рис. 1), которая предполагает взаимодействие содержащихся в пробе IgG с конъюгатом коллоидное золото — белок G и последующую детекцию специфических антител в комплексе с коллоидным золотом путем их связывания в аналитической зоне с иммобилизованным препаратом ЛПС.

Результат ИХА можно оценивать визуально, однако для документирования и более объективной оценки

Применение иммунохроматографического анализа для серодиагностики бруцеллеза крупного рогатого скота

Движение жидкого образца

Отсутствие антител

Наличие антител

Требуется повторный анализ

Рис. 1. Принцип ИХА

результатов анализа используют оптические детекторы, регистрирующие интенсивность окраски аналитической и контрольной зон тест-полоски [5, 9, 10]. Детекция результатов анализа с помощью приборов обусловливает необходимость установления порогового уровня («cut-off») — значения сигнала регистрирующего устройства, ниже которого результат тестирования считается отрицательным, выше — положительным.

Выбор уровня cut-off сводится к установлению значения сигнала, обеспечивающего максимальные показатели чувствительности (процент выявления зараженных особей) и специфичности (процент отрицательных результатов тестирования среди отрицательных проб). Обычно увеличение чувствительности анализа сопровождается уменьшением его специфичности, и наоборот. Такая зависимость обусловлена тем, что сыворотки здоровых животных могут содержать определенное количество специфических антител (в случае, если контакт животного с возбудителем заболевания не привел к развитию инфекционного процесса). Поэтому достичь сочетания высокой чувствительности и специфичности — сложная задача для всех методов диагностики. В качестве интегральной характеристики анализа можно использовать параметр эффективности, соответствующий значениям чувствительности и специфичности в точке их равенства.

Для установления указанных параметров была исследована группа больных бруцеллезом (n=63) и здоровых коров (n=21) с помощью изготовленных имму-нохроматографических тест-систем. Результаты для положительной, слабо положительной и отрицательной сывороток приведены на рисунке 2.

С помощью портативного анализатора «Рефлеком» получили значения интенсивности окраски аналитической зоны тест-полосок. Затем рассчитывали значения чувствительности и специфичности при различном уровне cut-off от 0,1 до 12,0 усл. ед. анализатора. Для каждого выбранного уровня cut-off определены параметры чувствительности и специфичности (рис. 3).

Рис. 2. Внешний вид тест-полосок после проведения анализа: К — контрольная зона, А — аналитическая зона;

1 — положительная сыворотка, 2 — слабоположительная,

3 — отрицательная сыворотка

Значение сигнала Cut-off, усл. уд.

Рис. 3. Значения параметров чувствительности (1) и специфичности (2) иммунохроматографической тест-системы для серодиагностики бруцеллеза КРС при разном выборе значения сигнала cut-off

На основании полученных данных выбрали значение уровня cut-off 0,5 усл. ед., при котором эффективность тест-системы достигает 100 %.

Следует отметить, что значение 0,5 усл. ед. «Рефлеко-ма» очень близко к пределу визуальной детекции, что свидетельствует о пригодности тест-систем для беспри-борной диагностики бруцеллеза с высокой достоверностью.

При высоких значениях чувствительности и специфичности, не уступающих твердофазному ИФА, ИХА значительно превосходит традиционные методы диагностики бруцеллеза по скорости получения результата: 10 мин для иммунохроматографии против 2 ч для ИФА и более 5 суток для микробиологического метода. Кроме того ИХА может проводиться непосредственно

РВЖ • СХЖ • № 3/2013

на месте отбора проб и не сопряжен с использованием дорогостоящего оборудования и привлечением высококвалифицированного персонала, что значительно упрощает скрининговые исследования большого числа животных.

Выводы

Разработанная иммунохроматографическая тест-система позволяет выявлять специфические антитела против ЛПС Brucella abortus, а сочетание иммунохроматографии с видеоцифровой регистрацией результатов при правильно подобранном cut-off уровне сигнала обеспечивает 100%-ю эффективность анализа. Время тестирования — 10 мин, что значительно меньше продолжительности традиционно используемых для диагностики бруцеллеза методов анализа.

Библиография

1. Byzova N.A., Zvereva E.A., Zherdev A.V., Eremin S.A., Dzantiev B.B. Rapid pretreatment-free immunochromatographic assay of chloramphenicol in milk // Talanta, 2010; 81 (3): 838-848.

2. Byzova N.A., Zvereva E.A., Zherdev A.V., Eremin S.A., Svesh-nikov P.G., Dzantiev B.B. Pretreatment-free immunochromatographic assay for the detection of streptomycin and its application to the control of milk and dairy products // Anal. Chim. Acta, 2011; 701 (2): 209-217.

3. Gerhardt P. Manual of Methods for General Bacteriology. — N.Y.: American Society of Microbiology, 1981.

4. Godfroid J., Cloeckaert A., Liautard J.P., Kohler S., Fretin D., Walravens K., Garin-Bastuji B., Letesson J.J. From the discovery of the Malta fever's agent to the discovery of a marine mammal reservoir, brucellosis has continuously been a re-emerging zoonosis // Vet. Res. 2005; 36 (3): 313-326.

5. von Lode P. Point-of-care immunotesting: Approaching the analytical performance of central laboratory methods // J. Clin. Biochem., 2005; 38 (7): 591-606.

Благодарности

Исследования проведены за счет средств Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007 — 2013 годы», государственный контракт № 11.519.11.2046, и Российского фонда фундаментальных исследований, грант № 12-08-01303.

Авторы выражают благодарность С.Ф. Бикетову («Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», Оболенск, Россия) за предоставленный рекомбинантный белок G и C.3. Ескенди-ровой (Республиканское государственное предприятие «Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан», Астана, Казахстан) за предоставленный ЛПС Brucella abortus.

6. Mizanbayeva S., Smits H.L., Zhalilova K., Abdoel T.H., Kozakov S., Ospanov K.S., Elzer P.H., Douglas J.T. The evaluation of a user-friendly lateral flow assay for the serodiagnosis of human brucellosis in Kazakhstan // Diagnostic Microbiology & Infectious Disease, 2009; 65 (1): 14-20.

7. Poester P., Nielsen K., Samartino L.E., Yu W.L. Diagnosis of Brucellosis // Open Vet. Sci. J., 2010; 4: 46-60.

8. Sklyarov O., Shumilov K., Klimanov A., Denisov A. Targeted prevention of brucellosis in cattle, sheep, and goats in the Russian Federation // Vaccine, 2010; 28 (Suppl. 5): F54-F58.

9. Wong R.C., Tse H.Y. Lateral Flow Immunoassay. — N.Y.: Humana Press, 2009.

10. Zaiko V., Martinkina L., Steriopolo N., Kutvitsky V., Tugo-lukov A., Egorov E., Voloshchuk S., Starovoitova T., Toguzov R., Vengerov Yu. Microarray method for multiplex and serial latex agglutination tests with digital image registration // Clin. Lab., 2008; 54: 273-279.

Summary

D.V. Sotnikov, N.A. Byzova, N.P. Staroverova, A.V. Zherdev, B.B. Dzantiev. Application of Immunochromatographic Assay for Serodiagnosis of Brucellosis in Cattle. Immunochromatographic test-system for rapid detection of specific antibodies against lipopolysaccharide of Brucella abortus for diagnosis of brucellosis in cattle is developed. The manufactured tests have been applied for 63 serum samples of cows with brucellosis and 21 samples from healthy cows. The obtained results of the diagnostics using immunochromatographic assay with video digital recording completely accord to ELISA data. The developed test-system allows to reduce time of assay of specific antibodies to 10 minutes and may be offered as an alternative to the existing diagnostic techniques.

По данным информационно-аналитического центра Россельхознадзора ситуация по бруцеллезу

на 1-й квартал 2013 год

Ситуация: эндемическая (заболеваемость среди с/х животных на два порядка выше, чем заболеваемость людей).

Пики регистрации неблагополучия среди с/х животных приходятся на 2-й квартал года (выгон скота на пастбища и проведение массовых исследований).

Очаговая инцидентность (п = 9,25) КРС = 46; МРС = 41;

в 2012 г. зарегистрирован 361 новый неблагополучных пунктов по бруцеллезу КРС, 28 — по бруцеллезу МРС; в 1-м квартале 2013 г. выявлено 73 неблагополучных пункта по бруцеллезу КРС, 6 — по бруцеллезу МРС.

Незначительно превзойден эпидемический порог по неблагополучию среди КРС.

Видовая дифференциация Br. abortus, Br. melitensis, Br. suis, Br.canis не отслеживается по отчетным документам. Бруцеллез северных оленей вероятно распространен шире, в 2010 выявлено 678 случаев заболевания, а в 2011 — 1448, в 2012 — 767, в 1-м квартале 2013 — 24 случая.