Способ постановки реакции непрямой иммунофлюоресценции для диагностики лейкоза крупного рогатого скота
METHOD FOR STAGING INDIRECT IMMUNOFLUORESCENCE REACTION FOR DIAGNOSING BOVINE LEUKAEMIA

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии, а именно к лабораторным методам исследований, и может быть использовано для выявления инфицированного вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) путем исследования клеточной взвеси лимфоцитов с помощью реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ).
В настоящее время в государственных программах по борьбе с лейкозом крупного рогатого скота основу диагностики составляют серологические методы исследования - реакция иммунодиффузии (РИД) и иммуноферментный анализ (ИФА); гематологические, клинические и патоморфологические методы служат для уточнения диагноза.
Ни РИД, ни более чувствительный ИФА метод диагностики в ряде случаев не дают адекватного ответа о зараженности. Так, при развитии заболевания у одного и того же животного может волнообразно подниматься и снижаться уровень антител, а в некоторых случаях протекать без их образования, что не позволяет полностью выявить всех животных-вирусоносителей [Крикун В.А. Лейкоз крупного рогатого скота и иммунологическая толерантность // Ветеринария. - 2002. - № 6. - С. 7-9.]. Помимо этого, эти методы не позволяют отличать колостральные антитела от активных антител, продуцирующихся при вирусной инфекции.
Методом, обладающим максимальной чувствительностью и высокой специфичностью, позволяющим более эффективно выявлять инфицированных ВЛКРС животных, а также отличать инфицированных телят от телят с колостральными антителами является полимеразная цепная реакция (ПЦР). Однако широкое применение этого метода в диагностике лейкоза сдерживается, прежде всего, высокой стоимостью оборудования и реактивов для ПЦР.
3
Известен способ выделения лимфоцитов из крови крупного рогатого скота с помощью центрифугирования в градиенте плотности урографина [B.C. Власенко, М.А. Бажин и др. Оценка иммунного статуса у крупного рогатого скота при лейкозе: методические рекомендации. - Омск, 2010. - С. 9-10.]. Выделение лимфоцитов осуществляют следующим образом: из 76 или 60%-ного урографина с помощью дистиллированной воды получают 17%-ный раствор, доводя плотность до 1,092 г/см. В пробирки Флоринского с помощью шприца с длинной иглой вносят по 1-2 мл 17%-ного раствора урографина, на который наслаивают по 1-2 мл смеси равных объемов крови и раствора Версена, а затем центрифугируют по 20-30 минут при 420 g, если кровь от взрослых животных, или при 600 g, если кровь от молодых животных. После центрифугирования лимфоциты концентрируются в виде матового диска на границе двух жидкостей, а гранулоциты и эритроциты оседают на дно пробирки. Образовавшийся слой лимфоцитов извлекают шприцем с длинной иглой. Способ позволяет осуществлять выделение лимфоидной популяции клеток из цельной крови, обеспечивая быстрый и прямой доступ к максимальному числу клеток при изучении их количественных и функциональных характеристик при различных состояниях организма.
Для идентификации ВЛКРС также используют прямой и непрямой варианты иммунофлюоресценции с помощью исследования мазков крови и измененных органов, краткосрочных и перевиваемых культур крови и тканей. Особенно можно отметить реакцию непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ), ставшую наряду с ИФА и полимеразной цепной реакцией (ПЦР) неотъемлемой частью протокола исследований большинства заболеваний инфекционной природы. Помимо высокой чувствительности иммунофлюоресцентного метода, его специфичности, универсальности, экономичности, а также скорости постановки диагноза, важным его преимуществом является возможность прямой детекции патогена, в отличие от косвенной, при которой определяется уровень специфических антител.
Известен способ постановки РНИФ, включающий исследование краткосрочных и длительно живущих культур лейкоцитов, использование в качестве антител сыворотки больной коровы и меченой флюоресцеин-5-изотиоционатом (ФИТЦ) кроличьей сыворотки против глобулинов быка [Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.Ф., Фомина Н.В. Вирусные болезни животных. - М.: ВНИТИБП, 2001. - С. 398]. Однако при использовании культур лейкоцитов от лейкозных животных происходит дегенерация и отмирание части клеток, что значительно засоряет препарат продуктами распада клеток.
Наиболее близким техническим решением к заявленному является способ постановки реакции [Новикова Н.Н., Байсеитов С.Т., Власенко B.C., Красиков А.П. Применение реакции непрямой иммунофлюоресценции для диагностики лейкоза крупного рогатого скота: методические рекомендации. - Омск, 2020. - С. 8-9.], включающий нанесение 50 мкл положительной сыворотки на фиксированный мазок крови (испытуемая проба), инкубацию во влажной камере в термостате при 37-38°С в течение 30 минут для образования комплекса антиген-антитело. После этого мазок трижды промывают дистиллированной водой от не связавшихся антител, подсушивают и наносят в красящем титре люминесцирующую сыворотку против глобулинов быка. Затем снова помещают во влажную камеру в термостат при температуре 37-38°С на 15-20 минут. По истечении этого времени мазки трижды отмывают дистиллированной водой, просушивают и просматривают в люминесцентном микроскопе с обязательными контролями реакции (с отрицательной сывороткой и физиологическим раствором).
Индикация лейкозного антигена в мазках крови позволяет увидеть не только светящийся антиген-антительный комплекс внутри лимфоцитов, но и все форменные элементы, фиксированные на стекле. Сложность учета реакции состоит в том, что у зараженного животного, при отсутствии лимфоцитоза в поле зрения объектива микроскопа мы можем увидеть только эритроциты или наблюдать от одного до трех лейкоцитов, которые представлены как гранулоцитами, так и моноцитами без специфического люминесцирующего свечения. В рекомендациях по технике постановке реакции указано, что при отрицательной реакции следует просматривать мазок в 30 полях зрения микроскопа, что создает усиленную нагрузку для исследователя.
Техническим результатом изобретения является повышение точности и достоверности, а также сокращение времени анализа мазков.
Техническим решением способа постановки реакции непрямой иммунофлюоресценции для диагностики лейкоза крупного рогатого скота является: выделение лимфоцитов из крови крупного рогатого скота центрифугированием в градиенте плотности рентгеноконтрастного вещества (урографина). Из выделенной взвеси лимфоцитов делают мазок типа «высушенной капли», высушивают, фиксируют в этиловом спирте 20 минут, затем наносят 50 мкл положительной сыворотки, инкубируют во влажной камере в термостате при 37-38°С 30 минут, трижды промывают дистиллированной водой, подсушивают и наносят в красящем титре люминесцирующую сыворотку против глобулинов быка. Затем снова помещают во влажную камеру в термостат на 15-20 минут, трижды отмывают дистиллированной водой, просушивают и просматривают в люминесцентном микроскопе. Также осуществляют контроль реакции с отрицательной сывороткой и физиологическим раствором. Для оценки интенсивности свечения используют четырех крестовую систему:
(++++) - очень яркая люминесценция, четко контрастирующая на темном фоне;
(+++) - яркая люминесценция;
(++) или (+) - слабое свечение;
(-) - отсутствие люминесценции.
За положительный результат принимают специфическое свечение антигена с оценкой в четыре, три креста.
Отличительными признаками предложенного способа является то, что для приготовления мазков используется взвесь лимфоцитов, выделенная центрифугированием на градиенте плотности урографина. Предлагаемый способ позволит повысить точность и достоверность метода за счет освобождения от балластных элементов и использования в реакции высокой концентрации лимфоцитов, в которых локализуется вирус лейкоза крупного рогатого скота, а также значительно сократит затраты времени на микроскопию мазков.
Сущность изобретения поясняется на конкретных примерах выполнения способа.
Пример 1. Исследование молодняка крупного рогатого скота
В хозяйстве с широким распространением лейкоза (до 70% инфицированных коров) после предварительного исследования поголовья с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) отбирают кровь от 33 голов молодняка крупного рогатого скота, родившихся от матерей-вирусоносителей, разного возрастного периода: до 1,5 и 3-4 месяцев. Проводят исследование крови с помощью РНИФ путем ее постановки по общепринятой методике и по предлагаемому способу.
Результаты исследований представлены в таблице 1.
Как видно из таблицы 1, в 11 пробах телят в возрасте до 1,5 мес, в которых был выявлен ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота, в 100 % случаев была отмечена положительная реакция в РНИФ в мазках с клеточной взвесью, тогда как в мазках крови только у 8 из 11 голов.
У молодняка 3-4-месячного возраста установлено совпадение результатов ПЦР с РНИФ независимо от способа ее постановки.
С помощью модифицированного метода постановки РНИФ в 3-х из 10-и (в 30,0% случаев) ПЦР-отрицательных проб был выявлен ВЛКРС и только в 2-х общепризнанным способом. Сходная картина наблюдалась при исследовании проб крови молодняка 3-4-месячного возраста, в которых дополнительно установлено соответственно 20 и 10% носителей ВЛКРС.
Все это свидетельствовало о более высокой точности и достоверности предлагаемого нами метода.
Пример 2. Исследование коров
Отбирают кровь от 20 голов крупного рогатого скота в возрасте от 3 до 5 лет из хозяйства с широким распространением лейкозной инфекции. В качестве контроля используют 10 коров этого же возраста из благополучного по данному заболеванию хозяйства. Проводят диагностическое исследование крови всех животных с помощью реакции иммунной диффузии (РИД), а также РНИФ путем ее постановки по общепринятой методике и по предлагаемому способу.
Результаты исследований представлены в таблице 2.
Как видно из таблицы 2, в неблагополучном по лейкозу хозяйстве (А) с помощью РИД было идентифицировано 12 носителей ВЛКРС. Все РИД-позитивные животные также имели положительную РНИФ как при постановке реакции с цельной кровью, так и с клеточной взвесью.
С помощью РНИФ, проводимой по предлагаемому способу, дополнительно выявлено 4 (50%) вирусоносителя, тогда как при использовании мазков крови установлена только одна положительная проба.
Следует отметить, что при исследовании коров из благополучного хозяйства (Б) была отмечена отрицательная реакция с использованием как РИД, так и обоих вариантов РНИФ.
Таким образом, предложенный нами способ постановки РНИФ повышает точность и достоверность, при этом существенно облегчая процесс интерпретации результатов при микроскопии. Окрашивая лимфоциты без балластных элементов, мы концентрируем вирус лейкоза в них. Объектив микроскопа настраиваем только на мазок в одном поле зрения и сразу учитываем результат по наличию или отсутствию специфического люминесцирующего свечения.
Специалист, занимающийся микроскопией, затрачивает на визуализацию одного мазка крови 15-30 минут рабочего времени, т.е. в среднем минуту на просмотр одного поля зрения из рекомендуемых 30-и полей при отрицательном результате. При исследовании мазка крови без лимфоцитоза, даже при положительном результате на ВЛКРС, чтобы увидеть антиген в лимфоцитах приходится просматривать от 5 до 10 полей зрения в поисках специфического люминесцирующего свечения, что занимает 5-10 минут и более. Выделение лимфоцитов позволяет сконцентрировать антиген, который можно увидеть с помощью РНИФ в 1-2 полях зрения, что сокращает время проведения люминесцентной микроскопии максимум до 2-х минут (в 7,5-15 раз).
Следовательно, предлагаемый способ постановки РНИФ способствует сокращению времени проведения исследования и уменьшению трудозатрат работы специалиста, позволяет выявить вирус ВЛКРС на ранних стадиях развития заболевания. Может быть использован, как альтернативный метод ПЦР диагностики.