2,4
7-[N'-(4-ТРИФТОРМЕТИЛБЕНЗОИЛ)-ГИДРАЗИНОКАРБОНИЛ]-ТРИЦИКЛО[3.2.2.0]НОН-8-ЕН-6-КАРБОНОВАЯ КИСЛОТА, ОБЛАДАЮЩАЯ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
2,4
7-[N'-(4-TRIFLUOROMETHYLBENZOLYL)-HYDRAZINOCARBONYL]-TRICYCLO[3.2.2.0]NON-8-ENE-6-CARBOXYLIC ACID, HAVING ANTIVIRAL ACTIVITY

Изобретение относится к новому биологически активному химическому соединению, обладающему противовирусной активностью, может применяться в медицине для лечения и профилактики заболеваний, вызываемых патогенными для человека и животных вирусами, в частности ортопоксвирусами.
Наиболее опасными для человеческой популяции из-за чрезвычайно высокой патогенности, многообразия и эпидемиологических показателей являются вирусы группы оспы. В последние годы неожиданную остроту и актуальность приобрела проблема человеческой оспы, поскольку вакцинация населения с 1980 г. не проводится, появилась значительная часть населения без иммунитета или с ослабленным иммунитетом и отсутствуют гарантии полного исчезновения возбуждающих это заболевание вирусов, а также несанкционированной утечки вирусного материала из мест его официального хранения. Более того, в условиях постоянного роста категорий населения с иммунодефицитными состояниями сама идея вакцинации живым вирусом осповакцины становится проблематичной, и важное значение приобретает задача успешного купирования поствакцинальных осложнений, а также вспышек заболеваний, вызванных ортопоксвирусами, с помощью высокоэффективных химиотерапевтических препаратов. Кроме того, следует отметить и высокую патогенность вирусов оспы обезьян, коров, относящихся к тому же роду Orthopoxvirus, способных вызывать заболевание и у людей со смертельным исходом. Так, в последнее время в Африке, особенно в районах с высоким процентом ВИЧ-инфицированных, отмечаются вспышки оспы обезьян (летальность достигает 10-20%). Кроме того, существует реальная возможность генетической модификации вирусов оспы животных, что может привести к повышению их патогенности для человека.
В настоящее время практически нет средств специфической профилактики и лечения заболеваний, вызываемых вирусами группы оспы, поэтому разработка высокоэффективных противовирусных препаратов, обладающих высокой активностью, низкой токсичностью и продолжительным действием в отношении ортопоксвирусов является важной задачей для обеспечения безопасности здоровья и жизни людей.
Предшествующий уровень техники

Известен препарат метисазон (Марборан), который обладает только профилактической активностью в отношении вируса натуральной оспы.

Известен препарат цидофовир (Vistide), который проходит в настоящее время исследования как профилактический или лечебный препарат, но пока его исследования не закончены. На фармацевтическом рынке в настоящее время практически нет препаратов, активных в отношении вирусов группы оспы, в этой связи поиск (выявление?) таких веществ может стать важным шагом в обеспечении фармакологической безопасности жизни людей.
Известно, что производные адамантана являются потенциальными источниками веществ с противовирусными свойствами. В частности, ингибиторы вируса осповакцины выявлены в ряду адамантоил-1-гидразинов (Гужова С.В., Даниленко Г.И., Коробченко Л.В., Денисова Л.В., Андреева О.Т., Бореко Е.И., Даниленко В.Ф., Баклан В.Ф. Ингибиторы вируса вакцины в ряду адамантоил-1-гидразинов // Физиол. Активн. В-ва. Киев: Наукова думка. 1986. Вып.18. С.24). Изомерные 1-(аминобензоил)аминоадамантаны наряду с действием на различные типы вирусов проявляют умеренную активность в отношении вируса осповакцины (Вотяков В.И., Андреева О.Т., Кицара М.С. и др. // В сб.: Физиологически активные вещества. Киев. 1978. Вып.10. С.88). Опубликованы данные о выраженном ингибирующем действии на размножение вирусов осповакцины замещенных аминоацетиладамантиламинов, аминоалкоксиацетиладамантиламинов и тромантадина (May G., Peteri D. // Arzneimitt.- Forsch. 1973. Bd.23. N.5. S.718). Широкий ряд гидрокси-, азотсодержащих и серосодержащих функциональных производных адамантанового ряда проявил слабую и умеренную степень активности против вируса осповакцины (Климочкин Ю.Н., Леонова М.В., Коржев И.Р., Моисеев И.К., Владыко Г.В., Коробченко Л.В., Бореко Е.И., Николаева С.Н. // Хим.-фарм. журнал. 1992. N.7-8. C.58; Климочкин Ю.Н., Моисеев И.К., Владыко Г.В., Коробченко Л.В., Бореко Е.И. // Хим.-фарм. журнал. 1991. Т.25. N.7. С.46; Климочкин Ю.Н., Моисеев И.К., Абрамов О.В., Владыко Г.В., Коробченко Л.В., Бореко Е.И. // Хим.-фарм. ж. 1991. Т.25. N.7. С.49).
Недостатком вышеперечисленных аналогов является невысокая активность соединений в отношении вируса осповакцины.
Среди производных адамантана известно биологически активное соединение 1-адамантаноилгидразон α-азидометил(1-адамантил)кетона (прототип), обладающее противовирусной активностью в отношении вируса осповакцины (Авторское свидетельство СССР №1568481, МПК C07D 253/06, опубл. 2006).
Однако указанное соединение не изучалось на предмет противовирусной активности в отношении вируса оспы коров, вируса оспы обезьян и других. К недостаткам этого соединения следует отнести также и недостаточно высокую эффективность в отношении вируса осповакцины.
1
2
Известны 3-фенил-6-R-7-R-1,2,4-бензотриазины (соединение СК-29 и его производные), обладающие противовирусной активностью, в частности в отношении ортопоксвирусов, патогенных для человека (патент РФ №2252218, МПК C07D 253/10, А61К 31/53, опубл. 20.05.2005) [1].
Однако и эти химические соединения обладают недостаточной противовирусной активностью и невысоким индексом селективности в отношении ортопоксвирусов.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является химическое соединение 4-трифторметил-N-(3,3а,4,4а,5,5а,6,6а-октагидро-1,3-диоксо-4,6-этеноциклопроп[f]изоиндол-2(1H)-ил)бензамида, обладающее противовирусной активностью в отношении ортопоксвирусов с высоким индексом селективности (заявка США №20060235051, МПК А61К 31/4439, C07D 403/02, опубл. 19.10.2006 г.) [2].
Однако указанное химическое соединение имеет достаточно сложную двухстадийную технологию получения, что повышает стоимость получения данного продукта.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение нового химического соединения, имеющего более простую (одностадийную) технологию получения, обладающего высоким индексом селективности и противовирусным действием в отношении ряда ортопоксвирусов, патогенных для человека и животных.
2,4
Технический результат достигается новым химическим соединением (I): 7-[N'-(4-трифторметилбензоил)-гидразинокарбонил]-трицикло[3.2.2.0]нон-8-ен-6-карбоновой кислотой, проявляющей противовирусную активность по отношению к ортопоксвирусам.
Заявляемое соединение (I) получают взаимодействием гидразида 4-трифторбензойной кислоты с 4,4а,5,5а,6,6а-гексагидро-4,6-этено-1H-циклопроп[f]изобензофуран-1,3(3aH)-дионом, взятыми в соотношении 1:1 в метаноле при охлаждении до 0°С в течение 2.5 час по следующей схеме:
Сопоставительный анализ с аналогами показывает, что заявляемое соединение принципиально отличается тем, что является трициклическим соединением, содержит в молекуле карбоксильную группу и диацилированный гидразиновый фрагмент, не входящий в состав гетероциклической - изоиндольной структуры.
2,4
1
19
13
-1
6
6
6
6
6
19
17
3
2
4
Пример получения 7-[N'-(4-трифторметилбензоил)-гидразинокарбонил]-трицикло[3.2.2.0]нон-8-ен-6-карбоновой кислоты. К охлажденному до 0°С раствору 4.1 г (20 ммоль) гидразида 4-трифторбензойной кислоты в 20 мл метанола присыпали одной порцией 3.80 г (20 ммоль) 4,4а,5,5а,6,6а-гексагидро-4,6-этено-1H-циклопроп[f]изобензофуран-1,3(3aH)-диона. Образовался гомогенный раствор, из которого примерно через 10 мин начинает выпадать осадок. Суспензию перемешивали при 0°С 2.5 час и еще 1 час при 20°С, выпавший осадок отфильтровали, промыли на фильтре охлажденным метанолом (5 мл), сушили на воздухе до постоянного веса. Получили 7.3 г (93%) вещества в виде белых кристаллов; т.пл. 168°С. ЯМР H (300 МГц, DMSO-d), δ, м.д., J/Гц: 0.06 (м, 2Н); 0.98 (м, 2Н); 2.85 (дд, J=10.1, 1.9 Гц, 1Н); 3.00 (уш. с, 1Н); 3.10 (уш. с, 1Н), 3.15 (дд, J=10.1, 1.9 Гц, 1Н); 5.59 (т, J=7.4 Гц, 1Н); 5.82 (т, J=7.4 Гц, 1Н); 7.87 (д, J=8.0 Гц, 2Н); 8.05 (д, J=8.0 Гц, 2Н); 9.93 (с, 1Н); 10.57 (с, 1Н); 11.49 (уш. с, 1Н). ЯМР F (300 МГц, d-DMSO, стандарт - CF), δ, м.д.: 101.18. ЯМР С (300 МГц, DMSO-d), δ, м.д.: 3.42, 9.91, 10.65, 33.53, 37.10, 47.55, 48.84, 126.35, 127.04, 128.53, 128.93, 132.24, 137.35, 165.18, 172.17, 174.89, 175.68. ИК-спектр (KBr), см): 1136, 1168, 1332, 1536, 1582, 1622, 1725, 2942, 3014, 3043, 3230. Вычислено, %: С, 57.87; Н, 4.35; F, 14.45; N, 7.10. CHFNO. Найдено, %: С, 57.59, 57.44; Н, 4.37,4.40; N, 7.21,7.18.
Способ получения заявляемого вещества прост в исполнении, исходные вещества доступны, выход составляет 93% от теоретически рассчитанного. Предлагаемое соединение устойчиво на воздухе, легко растворимо в диметилформамиде и диметилсульфоксиде, малорастворимо в алифатических спиртах, ацетоне, воде, практически нерастворимо в эфире, гексане.
Пример 2. Исследование противовирусной активности заявляемого соединения.
Для оценки противовирусной активности соединений использовали следующую методику. Культуру клеток Vero выращивали в лунках плоскодонных 96-луночных планшетов. В культуральную среду добавляли серийные разведения исследуемых соединений и соответствующий вирус. После инкубирования в течение 3-5 суток монослой клеток прокрашивали витальным красителем нейтральным красным, после удаления красителя и отмывки избытка красителя вносили лизирующий раствор и количество красителя, включенного в монослой клеток, учитывали на спектрофотометре при длине волны 490 нм. В качестве контролей использовали лунки планшета, в которые вирус не вносили (контроль токсичности соединений), в которые вносили вирус без соединений (контроль вируса), и лунки, в которые не вносили ни вирус, ни соединения (контроль культуры клеток). Данная методика основана на способности тестируемых соединений предотвращать репродукцию вируса и его распространения от клетки к клетке, в связи с чем клетки не погибают и сохраняют способность фагоцитировать нейтральный красный.
Результаты анализировали с помощью программы SoftMax (версия 4.0, Molecular Devices, Menlo Park, USA). Данная методика основана на способности тестируемых соединений предотвращать репродукцию вируса и его распространение от клетки к клетке, в связи с чем клетки не погибают и сохраняют способность фагоцитировать нейтральный красный.
В качестве исследуемых вирусов использовали патогенный для человека вирус оспы коров (штамм Гришак) и вирус осповакцины, штамм ЛИВП, используемый для вакцинации населения. Помимо ортопоксвирусов, патогенных для человека, для оценки противовирусной активности использовали вирус эктромелии (оспы мышей), штамм К-1.
Анализ полученных данных наглядно показывает, что заявляемое соединение (НИОХ-14) и соединение-прототип (ST-246) обладают высоким противовирусным действием, в частности в отношении ортопоксвирусов, патогенных для человека.
Как видно из данных таблицы 1, исследованные соединения (заявляемое НИОХ-14 и прототип ST-246) эффективно подавляют размножение ортопоксвирусов в культуре клеток: ингибируют размножение вируса осповакцины в концентрациях 0.005-0.009 и 0.003 мкг/мл соответственно, значения которых по величине существенно превосходят препарат-аналог [1] на основе производных бензотриазинов, активная концентрация которого составляет 0.49-0.5 мкг/мл.
Таблица 1
Сравнение активности препаратов НИОХ-14 (заявляемое соединение), ST-246 (прототип) и СК-29 (аналог)
Препарат
Токсичность для культуры клеток Vero (ТС<sub>50</sub>, мкг/мл)
Ингибирующая активность (IC<sub>50</sub>, мкг/мл) в отношении вирусов
Индекс селективности для вируса осповакцины
Осповакцины
Оспы коров
Оспы мышей
НИОХ-14 заявляемый
>100
0,005
0,051
0,009
>20000
ST-246, прототип [2]
>100
0,003
0,002
0,003
>30000
СК-29, аналог [1]
>300
0,5
2,23
0,49
От 134 до 600
Пример 3. Оценка противовирусной активности препарата НИОХ-14 по отношению к вирусам: аденовирус человека 5-го серотипа, эховирус 12-го типа, вирус Западного Нила и вирус простого герпеса 2 типа.
50
2
50
Оценку противовирусной активности исследуемых соединений проводили на культурах клеток АД293 (аденовирус человека 5-го серотипа и эховирус 12-го типа) и Vero (вирус Западного Нила и вирус простого герпеса 2 типа) в 96-луночных планшетах. IC соединений в отношении вышеуказанных вирусов определяли посредством регистрации ингибирования вирусиндуцированного цитопатического эффекта в присутствии различных концентраций исследуемых препаратов (конечные концентрации в лунках микропланшет с клеточным монослоем 80, 40, 20, 10 и 5 мкг/мл). После добавления к клеткам исследуемых соединений в вышеуказанных концентрациях проводили инфицирование клеток различными вирусами. Для этого использовали инфицирующие дозы каждого вируса, вызывающие 90% цитопатический эффект через трое суток после инфицирования. После инкубации клеток в планшетах в течение 72 час при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO, клетки фиксировали 5% раствором глутарового альдегида. Цитопатический эффект визуализировали окрашиванием клеток 0.1% раствором кристаллического фиолетового и регистрировали спектрофотометрически при 570 нм. IC рассчитывали согласно G. Yang et al., 2005.
Результаты, представленные в таблице 2, показали, что заявляемое соединение НИОХ-14 фактически не ингибирует репликацию аденовируса человека 5-го серотипа, вируса Западного Нила и вируса простого герпеса 2 типа. В отношении эховируса 12-го типа была отмечена минимальная активность препарата НИОХ-14. Препарат использовался в субтоксических концентрациях для этого типа клеток, что также дополнительно подтверждает нетоксичность препарата для клеток АД293. Фактическое отсутствие активности препарата НИОХ-14 в отношении двух типов ДНК-содержащих вирусов и двух типов РНК-содержащих вирусов говорит о том, что механизм действия препарата не связан с типом нуклеиновой кислоты.
Таблица 2
Противовирусная активность соединения НИОХ-14 in vitro
Препарат
Ингибирующая активность (IС<sub>50</sub>, мкг/мл) в отношении вирусов
Аденовирус человека 5-го серотипа
Эховирус 12-го типа (шт. Lev4)
Вирус Западного Нила (шт. Eg101)
Вирус простого герпеса 2 типа (шт. MS)
НИОХ-14
>80.0
80.0
>80.0
>80.0
Производное глицеризиновой кислоты С<sub>19</sub>Н<sub>63</sub>N<sub>2</sub>О<sub>3</sub>
>20.0
>20.0
>80.0
>80.0
50
Для препарата НИОХ-14 IC в отношении вируса осповакцины составляет 0.005 мкг/мл (Таблица 1), что показывает высокую специфичность действия препарата в отношении ортопоксвирусов и свидетельствует о высокой степени селективности препарата НИОХ-14 в отношении этой группы вирусов. Индекс селективности составил 16000 для эховируса и вируса осповакцины, и он существенно выше для других исследованных вирусов.
2,4
Таким образом, технический результат изобретения подтверждается тем, что заявляемое соединение - 7-[N'-(4-трифторметилбензоил)-гидразинокарбонил]-трицикло[3.2.2.0]нон-8-ен-6-карбоновая кислота формулы (I) - отличается от прототипа [Заявка на патент США №20060235051] более простой технологией получения: в 1 стадию, а не в две, как в прототипе, причем реакция проводится при 0°С (а не при нагревании, как в прототипе), не требует абсолютных растворителей и использования третичных аминов в качестве катализаторов. Кроме того, технический результат изобретения дополнительно подтверждается тем, что препарат НИОХ-14 при низкой токсичности для клеток млекопитающих еще обладает очень высокой селективностью по отношению к другим РНК- и ДНК-содержащим вирусам.