Среда для получения пробиотической добавки для птицы
MEDIUM FOR PRODUCING A PROBIOTIC SUPPLEMENT FOR POULTRY

Изобретение относится к микробиологии и сельскому хозяйству, а конкретно к способу культивированию микроорганизмов на основе молочнокислых бактерий для получения пробиотической добавки с целью повышения мясной продуктивности сельскохозяйственной птицы.
Современное птицеводство многими путями решает проблему максимальной реализации биоресурсного потенциала птицы и сохранения при этом ее продуктивного здоровья. Ускорение динамики роста и повышение суточных приростов живой массы птицы при снижении экономических затрат на 1 кг прироста живой массы тела является одной из основных задач птицеводства.
Известен способ, предусматривающий внесение в питательную среду пектина из расчета 5-6 г/л (0,5-0,6%), обеспечивающего накопление биомассы микроорганизмов и придачу кисломолочному продукту пре-биотических свойств (Патент РФ №2023396, МПК А23С 9/12, А23С 9/127, 02.03.1993 г.).
Известен способ предусматривающий применение в составе комбикормов для птицы пробиотической кормовой добавки, включающей три вида молочнокислых бактерий: Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus B-5788, Lactobacillus acidophilus B-3235, Lactococcus lactis ssp.lactis B-3145, выращенных на среде, состоящей из воды, мелассы свекловичной, молока или молочной сыворотки, которая обеспечивает повышение сохранности и продуктивности перепелов (Кобыляцкая Г.В. Получение и эффективность применения пробиотика Трилактобакт в перепеловодстве: автореф. дис.… канд. с.-х. наук / Г.В. Кобыляцкая. - Краснодар, 2013. - 24 с).
2
4
5
Наиболее близким является техническое решение, в котором используют для получения пробиотической добавки питательную среду, состоящую из следующих соотношений исходных компонентов (г/л): меласса свекловичная (22,5), меласса кукурузная (22,5), КНРО (2,0), дрожжевой экстракт (0,02), микроорганизмы Lactobacillus salivarius с титром не менее 1,0×10 КОЕ/мл (100), остальное вода (Патент РФ №2698213, МПК А23К 50/70, А23К 10/33, А23К 10/18, 23.08.2019 г.).
Недостатком известного технического решения является то, что при использовании данной пробиотической добавки в рационе птицы будет происходить гибель живой культуры микроорганизма из-за агрессивной среды желудочно-кишечного тракта и тем самым не будет решаться главная задача от применения биопрепарата как повышение продуктивности и сохранности с.- х. птицы.
Техническим результатом является повышение живой массы, мясной продуктивности и выживаемости птицы за счет использования в их рационе пробиотической добавки, при получении которой в питательную среду добавляют порошкообразный яблочный пектин и молочнокислую культуру, являющейся представителями естественной микрофлоры ЖКТ диких перепелов.
2
4
5
Технический результат достигается тем, что в способе получения пробиотической добавки для сельскохозяйственной птицы, состоящей из мелассы свекловичной 22-23 г, мелассы кукурузной 22-23 г, KHPO - 2,0 г и дрожжевого экстракта - 0,02 г из расчета на 1 литр воды, при температуре 30-40°С дополнительно в питательную среду вводят порошкообразный яблочный пектин из расчета 3,0 г на литр воды, после чего в полученную смесь добавляют Lactobacillus parabuchneri В-13061 с титром не менее 1,0×10 КОЕ/мл в количестве 100,0 г/л и культивируют при температуре 37°С в течение 24 ч.
Новизна заявляемого технического решения обусловлена тем, что используется среда на основе мелассы свекловичной и мелассы кукурузной, включающая в свой состав яблочный пектин (3,0 г/л), для выращивания молочнокислых микроорганизмов - Lactobacillus parabuchneri В-13061, которые независимыми микробиологическим методом, методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени и метагеномными методами были выделены из ЖКТ диких перепелов (Сравнительный анализ и пробиотический потенциал новых штаммов рода Lactobacillus из эволюцион-но закрепленных ассоциаций желудочно-кишечного тракта дикой птицы / В.В. Радченко, Е.В. Ильницкая, Т.М. Шуваева, М.В. Александрова, А.В. Лунева, Ю.А. Лысенко, Н.Ю. Басова, А.Н. Некрасов, А.Г. Кощаев // Биофармацевтический журнал. - 2020. - Т. 12. №1. - С.44-49).
Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».
Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявляемых технических решений критерию «новизна».
Соответствие заявляемого решения критерию патентоспособности «промышленная применимость» обусловлено тем, что предлагаемое техническое решение работоспособно и возможно его использование для выращивания сельскохозяйственной птицы.
Способ получения пробиотической добавки для сельскохозяйственной птицы воспроизводится следующим образом.
2
4
5
Культивирование микроорганизмов Lactobacillus parabuchneri В-13061 осуществляют в среде, состоящей из мелассы свекловичной 22-23 г, мелассы кукурузной 22-23 г, КНРО - 2,0 г, дрожжевого экстракта - 0,02 г и порошкообразного яблочного пектина, взятого в количестве 3,0 г в расчете на 1 литр воды при этом добавленного в питательную среду при температуре 30-40 С для равномерного его распределения и полного растворения. Затем в полученную смесь добавляют микроорганизмы Lactobacillus parabuchneri В-13061 с титром не менее 1,0×10 КОЕ/мл в количестве 100,0 г/л и культивируют при температуре 37 С, в течение 24 ч.
При внесении порошкообразного яблочного пектина в питательную среду при температуре ниже 30 С не происходит его полного растворения и равномерного распределения.
При внесении порошкообразного яблочного пектина в питательную среду при температуре выше 40 С происходит частичное разрушение пектина.
При использовании засевной культуры Lactobacillus parabuchneri В-13061 в количестве менее 100,0 г/л, не будет обеспечиваться достижение необходимого титра культуры в пробиотической добавке.
При использовании засевной культуры Lactobacillus parabuchneri В-13061 в количестве более 100,0 г/л достигается тот же титр и не имеет смысла брать большее количество.
При использовании порошкообразного яблочного пектина в количестве менее 3,0 г/л, не будет обеспечиваться максимальной жизнеспособности культур в пробиотической добавке.
При использовании порошкообразного яблочного пектина в количестве более 3,0 г/л, достигается та же жизнеспособность культур в пробиотической добавке, поэтому не имеет смысла брать большее количество.
Первый этап исследований включает изучение выращивания бактерий на мелассной питательной среде с добавлением в ее состав агрессивных компонентов без применения пектина. Немаловажным показателем пробиотических свойств молочнокислой флоры является их способность колонизировать желудочно-кишечный тракт, а также их резистентность к биологическим жидкостям организма-хозяина. Последний показатель визуализировали по наличию или отсутствию роста изучаемой микрофлоры в жидкой питательной среде (мелассной), содержащей натуральный желудочный сок лошади (препарат «Эквин», 90%), желчь крупного рогатого скота медицинская консервированная (20%, 30%, 40%), фенол (0,4%) и NaCl (2%, 4%). Время выращивания культуры составляло 48 ч, температурный оптимум 37°С.
Результаты по влиянию агрессивных сред на выживаемость лактобактерий Lactobacillus parabuchneri В-13061 без применения полисахаридного компонента (пектина) представлены в таблице 1.
Результаты исследований показали, что культуры изучаемых лактобактерий проявили хороший рост только на среде с содержанием 2,0 и 4,0% хлорида натрия, а также при наличии в среде желчи в концентрации 20%. Незначительный рост дала культура на питательной среде, содержащей 30% желчи. В остальных случаях рост исследуемой культуры не проявился.
Следующим этапом исследований является обоснование использования порошкообразного яблочного и цитрусового пектинов для выращивания Lactobacillus parabuchneri В-13061 на мелассной питательной среде с добавлением в ее состав агрессивных компонентов. Выбор пектинов обусловлен тем, что на данные пектины существует стандарт, позволяющий их применять для пищевых целей («ГОСТ 29186-91. Пектин. Технические условия»).
Для проведения эксперимента микроорганизмы Lactobacillus parabuchneri В-13 061 выращивали на мелассной питательной среде с добавлением в ее состав агрессивных компонентов с применением различных доз порошкообразного яблочного пектина:
2
4
1. Состав среды №1: меласса свекловичная 22-23 г, меласса кукурузная 22-23 г, КНРО - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, яблочный пектин - 1,0 г/л.
2
4
2. Состав среды №2: меласса свекловичная 22-23 г, меласса кукурузная 22-23 г, KHPO - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, яблочный пектин - 2,0 г/л.
2
4
3. Состав среды №3: меласса свекловичная 22-23 г, меласса кукурузная 22-23 г, КНРО - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, яблочный пектин - 3,0 г/л.
2
4
4. Состав среды №4: меласса свекловичная 22-23 г, меласса кукурузная 22-23 г, KHPO - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, яблочный пектин - 4,0 г/л.
2
4
5. Состав среды №5: меласса свекловичная 22-23 г, меласса кукурузная 22-23 г, KHPO - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, яблочный пектин - 5,0 г/л.
Результаты влияния различных доз полисахарида растительного происхождения (яблочного пектина) на устойчивость лактобактерий Lactobacillus parabuchneri В-13061 к агрессивным средам представлены в таблице 2.
Из таблицы 2 видно, что наилучшие результаты исследований проявились с применением в составе питательной среды, на которой выращивали изучаемые лактобактерии, яблочного пектина в дозе - 3,0; 4,0 и 5,0 г/л. В дозе 2,0 г/л яблочного пектина в составе мелассной среды выявлена устойчивость ко всем растворам NaCl и желчи, также незначительный рост в среде, содержащей 0,4% фенола, однако наблюдалось отсутствие роста в желудочном соке. При дозе 1,0 г/л яблочного пектина в составе питательной среды выявлена жизнеспособность как без отсутствия пектина.
Третьим этапом исследований является изучение выращивания Lactobacillus parabuchneri В-13061 на мелассной питательной среде с добавлением в ее состав агрессивных компонентов с применением различных доз порошкообразного цитрусового пектина:
2
4
1. Состав среды №1: меласса свекловичная 22-23 г, меласса кукурузная 22-23 г, KHPO - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, цитрусовый пектин - 1,0 г/л.
2
4
2. Состав среды №2: меласса свекловичная 22-23 г, меласса кукурузная 22-23 г, КНРО - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, цитрусовый пектин - 2,0 г/л.
2
4
3. Состав среды №3: меласса свекловичная 22-23 г, меласса кукурузная 22-23 г, КНРО - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, цитрусовый пектин - 3,0 г/л.
2
4
4. Состав среды №4: меласса свекловичная 22-23 г, меласса кукурузная 22-23 г, KHPO - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, цитрусовый пектин - 4,0 г/л.
2
4
5. Состав среды №5: меласса свекловичная 22-23 г, меласса кукурузная 22-23 г, KHPO - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, цитрусовый пектин - 5,0 г/л.
Результаты влияния различных доз полисахарида растительного происхождения (цитрусового пектина) на устойчивость лактобактерий Lactobacillus parabuchneri В-13061 к агрессивным средам представлены в таблице 3.
Из таблицы 3 видно, что наилучшие результаты исследований проявились с применением в составе питательной среды, на которой выращивали изучаемые лактобактерии, цитрусового пектина в дозе - 5,0 г/л.
2
4
Результаты проведенных исследований показали, что наиболее эффективной и оптимальной питательной средой является мелассная среда следующего состава: меласса свекловичная 22-23 г, меласса кукурузная 22-23 г, KHPO - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, порошкообразного яблочного пектина - 3,0 г/л и остальное вода. Разработанный состав питательной среды может быть использован в производственных условиях при дальнейшей разработки биопрепаратов для птицеводства.
Для доказательства эффективности полученной пробиотической добавки на основе микроорганизмов Lactobacillus parabuchneri В-13061 в мелассной среде с добавлением порошкообразного яблочного пектина были проведены научные исследования на сельскохозяйственной птице
Пример 1. Эффективность использования на перепелах Техасской породы.
Методом групп аналогов было сформировано пять групп перепелов по 200 голов в каждой: контрольная группа - в рационе присутствовал только основной полноценный комбикорм и питьевая вода; 1-я опытная группа -с основным рационом и питьем воды птице, также выпаивали разработанную пробиотическую добавку в дозе 0,25 мл/гол; 2-я опытная группа - с основным рационом и питьем воды птице, также выпаивали пробиотическую добавку в дозе 0,5 мл/гол; 3-я опытная группа - с основным рационом и питьем воды птице, также выпаивали пробиотическую добавку в дозе 0,75 мл/гол; 4-я опытная группа - с основным рационом и питьем воды птице, также выпаивали пробиотическую добавку в дозе 1,0 мл/гол. Применение пробиотической добавки в опытных группах осуществлялось ежедневно (таблица 4).
Перепела выращивались в полупромышленных многоярусных металлических клетках.
Результаты хозяйственных показателей при выращивании перепелов представлены в таблице 5.
Сохранность перепелов за весь период выращивания в опытных группах была выше, чем в контрольной на 3,5% (1-я опытная группа), 4,0% (2-4-я опытные группы).
Изучение изменения динамики живой массы перепелов показало, что использование пробиотической добавки положительно повлияло на данный показатель. В течение эксперимента наблюдалось равномерное превосходство живой массы птиц опытных групп в сравнении с контрольной и только на конец опыта была зафиксирована статистически достоверная разница. Так при взвешивании перепелов на 56-й день живая масса птиц в 1-й опытной группе была выше, чем в контрольной на 2,5%, а во 2-й, 3-й и 4-й опытных группах наблюдалось достоверное повышение показателя в сравнении с контролем на 5,2; 5,6 и 5,1% (Р < 0,05). Во все остальные дни взвешивания также наблюдалась разница по массе птиц опытных и контрольной группы, но она была не достоверна. Так на седьмые сутки масса птиц опытных групп была незначительна выше, чем в контрольной на 0,5; 1,3; 1,5 и 0,7%. На 14-е сутки в 1-й опытной группе масса перепелов превосходила контрольную группу на 1,8%, во 2-й опытной группе на 2,6%, в 3-й группе на 4,1%, а в 4-й - 3,4%. На 21-е сутки в 1-4-й опытных группах изучаемый показатель был выше аналогов в контрольной на 1,1; 3,3; 3,6 и 3,4%. Аналогичная тенденция наблюдалась и в другие дни взвешивания перепелов до 56-и суток.
Прирост живой массы перепелов за весь период выращивания в 1-й опытной группе составил 319,31 г, что на 7,97 г или 2,6% больше, чем в контрольной группе, во 2-й группе больше на 16,73 г или 5,4%, в 3-й опытной группе - 18,18 г (5,8%) и в 4-й опытной группе - 16,27 г (5,2%). При этом наилучший показатель конверсии был зафиксирован во 2-й опытной группе, который составил 3,25 кг против 3,32 кг в контрольной и 1-й опытной группах, а в 3-й и 4-й опытных группах - 3,28 кг. В целом, показатель расхода кормов на 1 кг прироста (конверсия) перепелов во 2-й, 3-й и 4-й опытных группах был ниже, чем в контрольной на 2,1 и 1,2%.
Пример 2. Эффективность использования на цыплятах-бройлерах кросса Росс 308.
Методом групп аналогов было сформировано пять групп цыплят-бройлеров по 60 голов в каждой: контрольная группа - в рационе присутствовал только основной полноценный комбикорм и питьевая вода; 1-я опытная группа - с основным рационом и питьем воды птице, также выпаивали разработанную пробиотическую добавку в дозе 0,25 мл/гол; 2-я опытная группа - с основным рационом и питьем воды птице, также выпаивали пробиотическую добавку в дозе 0,5 мл/гол; 3-я опытная группа - с основным рационом и питьем воды птице, также выпаивали пробиотическую добавку в дозе 0,75 мл/гол; 4-я опытная группа - с основным рационом и питьем воды птице, также выпаивали пробиотическую добавку в дозе 1,0 мл/гол. Применение пробиотической добавки в опытных группах осуществлялось ежедневно (таблица 6).
Результаты хозяйственных показателей при выращивании птиц представлены в таблице 7.
Результаты изучения хозяйственных показателей при выращивании цыплят-бройлеров кросса Росс 308 показали, что применение пробиотической добавки способствовало повышению сохранности птицы 1-й и 2-й опытных групп по сравнению с контрольной на 3,3%, а в 3-й и 4-й опытных группах данный показатель был максимальным и выше, чем в контрольной на 6,7%.
Изучение живой массы птиц показало, что в опытных группах изучаемый показатель в каждый период взвешивания цыплят-бройлеров равномерно повышался в зависимости от дозы пробиотической добавки. Однако статистически достоверная разница была выявлена на 35-е сутки выращивания птицы в 3-й и 4-й опытных группах по сравнению с контрольной, в которых масса оказалась выше на 2,4 и 2,3% (Р < 0,05). В 1-й и 2-й опытных группах также масса птиц была выше, чем в контрольной на 0,9 и 1,3%, но разница была не достоверна. На 42-й день взвешивания масса цыплят-бройлеров во 2-й, 3-й и 4-й опытных группах была выше, чем в контрольной на 1,7; 2,8 и 2,7% при статистически достоверной разнице (Р < 0,05). В целом, прирост цыплят-бройлеров в контрольной группе составил 2636,18 г, а в 1-4-й опытных группах 2661,37 г, 2682,37 г, 2712,92 г, 2709,42 г, соответственно, что выше, чем в контроле на 1,0; 1,6; 2,9 и 2,8%.
В связи с тем, что масса птиц опытных групп была выше, чем в контрольной, у них наблюдалась повышенная поедаемость комбикормов. Однако анализ конверсии комбикорма показал, что изучаемый показатель в опытных группах был ниже, чем в контрольной на 0,01; 0,02; 0,04 и 0,03 кг.
В целом, обосновать повышенную динамику живой массы перепелов и цыплят-бройлеров в опытных группах, можно за счет положительного воздействия пробиотической добавки на основе культур Lactobacillus parabuchneri В-13061 и мелассной питательной среды с яблочным пектином, которые способствуют лучшему усвоению энергии и питательных веществ комбикорма птицей.
Таким образом, результаты испытаний показали, что выращивание птиц с использованием разработанной пробиотической добавки на основе культуры Lactobacillus parabuchneri В-13061, выделенная из ЖКТ дикого перепела, а также выращенная на мелассной среде с добавлением порошкообразного яблочного пектина, в испытуемых дозах обеспечивает повышение продуктивности перепелов и цыплят-бройлеров, за счет нового состава питательной среды для лактобактерий, в частности Lactobacillus parabuchneri В-13061.