Использование клеточного биосенсора Spirostomum ambigua  для характеристики  биологической активности компонентов фармацевтических препаратов 

Использование клеточного биосенсора Spirostomum ambigua для характеристики биологической активности компонентов

фармацевтических препаратов

Быканова С.Н.

(1) Кафедра фармацевтической и токсикологической химии медицинского факультета Российского университета дружбы народов (РУДН); (2) ГНИИ «Биоэффект»; (3) МНПК «Биотики»; (4) Лаборатория прикладной гидрохимии и аналитической химии ГОИН

Росгидромета

Диаграммы «Доза-Ответ» (концентрация-время жизни) и зависимости времени жизни свободноживущей инфузории S. ambigua от температуры использованы для характеристики биологической активности компонентов фармацевтических препаратов при индивидуальном и комбинированном действии, в том числе и со вспомогательными веществами. Определены параметры взаимодействия S. ambigua с рядом соединений (некоторыми аминокислотами, лекарственным препаратом MP-33 на основе аминокислот, ионами цинка, бихромат-ионами, сульфаниламидными препаратами, противолейкозными препаратами, минеральными водами) в двухстадийной кинетической схеме, включающей быстрое образование промежуточного состояния клетки с последующим медленным (минуты-часы) переходом в неподвижное, нереактивное состояние (гибели) по закону аррениусовской кинетики. Показано, что энергия активации (Ea) стадии этого медленного перехода S. ambigua является инвариантным (по отношению к состоянию клеток) параметром, находящимся во взаимно однозначном соответствии с природой химического соединения или фармацевтического препарата. Обсуждается смысл Ea для клеточных переходов по аналогии со структурными перестройками мембранных олигомерных ферментов и применимости аналогичных кинетических схем лиганд-индуцированных клеточных переходов для описания ряда сложных процессов (возникновения лекарственной устойчивости, эффективности химиотерапии, апоптоза). Продемонстрированы различные варианты нарушения аррениусовской зависимости при комбинированном действии компонентов фармацевтических препаратов и использования этих данных, как и параметров двухстадийных клеточных переходов, для оптимизации начальных стадий разработки новых лекарственных средств.

1. Характеристика Spirostomum ambigua

Методология использования простейших для оценки биологической активности химических разработана на основе изучения кинетики токсических воздействий [1-8]. Оценка

1114

биологической активности токсикантов с использованием клеточных культур или простейших организмов имеет ряд преимуществ перед использованием лабораторных животных (млекопитающих). Во-первых, снимаются целый ряд проблем этического характера. Во-вторых, одноклеточные организмы способны обеспечить получение обширной информации при относительной небольших материальных и финансовых затратах, и могут использоваться как базовые модели для оценки токсической активности. Кроме того, при работе с такими объектами упрощается трактовка физиологических проявлений токсических воздействий через выявления механизмов на субклеточном и надмолекулярном уровнях. Для изучения токсичности неорганических соединений исторически на фармацевтическом факультете ММА им. И.М. Сеченова использовали инфузорию P. caudatum [7]. Для исследования водных растворов сложного состава (в том числе содержащих высокомолекулярные соединения, поверхностно-активные вещества), предпочтительнее использовать свободноживущие в объемной фазе простейшие, не зависящие от свойств раздела вода-дно. Такой организм - Spirostomum ambigua -широко применяется как тест-культура для токсикологических и фармакологических исследований [9-13].

Spirostomum ambigua O.F.MÜller, 1786 - одна из наиболее широко распространённых спиральноресничных инфузорий (Spirostomidae, Heterotricha, Ciliophora), классический объект исследований в биологии клетки и при биоиндикации. В природных условиях сапротроф-детритофаг, часто обнаруживается в сильно загрязнённых и крайне микроанаэробных точках. Имеет лентовидную, несколько дорзо-вентрально уплощенную форму тела, около 1 мм длиной, соотношение длины тела к его ширине примерно 1:10, макронуклеус четковидный, ротовой аппарат доходит до задней трети тела. Будучи потревоженным, клетка даёт мгновенный ответ, сокращаясь по своей длине в 2-3 раза. Параметры сокращения зависят от температуры [14]. При благоприятных условиях характеризуется высокой подвижностью как в горизонтальном, так и вертикальном направлении. В ГНИИ «Биоэффект» постоянно поддерживается в культуре штамм S. ambigua (штамм проф. Леонидова). Клетки S. ambigua в благоприятных условиях (слабоминерализованная среда культивирования или дистиллированная вода, 19оС - 29оС) не гибнут в течении времени, превышающем клеточный цикл (~20 часов). При внесении в среду определенных химических веществ погибают в течении интервала времени, являющегося функцией как концентрации, так и температуры [15-18]. Время жизни клетки рассчитывается как интервал от момента посадки до гибели клетки. Гибель клетки констатируется, либо по разрыву мембраны с выходом содержимого протоплазмы наружу, либо по обездвиживанию с отсутствием сократительной реакции на механическое раздражение. Относительная ошибка измерения времени жизни не превышает 15-20%. Гибели клетки предшествует формирование промежуточного состояния (описанного ниже, с изменением морфометрических характеристик,

и оптических свойств, зернистости цитоплазмы) а также целый комплекс специфических поведенческих реакций. В норме, S. ambigua совершает свободное передвижения в толще раствора с характерным чередованием сжатия/вытягивания клетки. В среде, содержащей компоненты фармацевтических препаратов, такое передвижение может сопровождаться конвульсивными подергиваниями, фиксацией около стенки ячейки, прецессионными движениями и другими характерными отклонениями от нормального плавания в трехмерной среде. Ряд особенностей формирования промежуточного состояния и изменения поведенческих реакций будут доступны в виде фильма в формате mpeg4 на сайте www.oceanography.ru с 20.05.2003.

2. Кинетика лиганд-индуцируемых клеточных переходов S. ambigua

Для описания кинетики развития клеточных популяции под действием ингибиторов и промоторов, при культивировании в ферментерах, при развитии раковых опухолей [19-22] успешно используется аппарат химической кинетики. С нашей точки зрения основа удачного применения квазихимических моделей состоит в адекватности представлений клетки как полиферментного химического реактора. В соответствии с этим деление клетки или ее гибель есть интегральное отражение усиления или прекращения тех или иных ферментативных химических процессов. В предыдущих работах [15-18] мы обосновали возможность такого подхода, как теоретически, так и при исследовании лиганд-индуцируемой кинетики гибели инфузорий. Для S. ambigua обнаружено образование в процессе лиганд-индуцируемой гибели промежуточного состояния, эквивалентного комплексу фермента с субстратами/продуктами реакции. Особенностью этой схемы является тот факт, что клеточные переходы вызываются лигандами самого различного происхождения, как заведомо токсичными соединениями (например, бихромат калия), так и природными метаболитами (например, глицин). Кинетическая схема взаимодействия лиганд-индуцируемой гибели S. ambigua имеет следующий вид [18]:

быстро fm, медленно

С

Kp

Решение этой схемы для наблюдаемой константы скорости образования устойчивой формы идентично уравнению Хилла или кинетической схеме, где первая стадия соотвествует адсорбции Френдлиха:

obs

f =

•m

Kp

1 + — ь"

А выражение для времени жизни будет иметь следующий вид:

Kp

1 + —

Ln

Tl = __(2),

Промежуточное состояние хорошо идентифицируется на размерных спектрах тест-культуры [16, 23], полученных с помощью малоуглового измерителя дисперсности (particle sizer) [24]:

m

Рисунок 1. Действие токсикантов на формообразование (А) и кинетику гибели (В) инфузории S. ambigua. Кривые объемного распределения культуры клеток были получены с помощью лазерного дифракционного определителя размеров частиц (particle sizer) Malvern 3600 Ec: белые кружки соответствуют контрольной культуре в отсутствии токсикантов (общее число клеток - 1000, концентрация 100 клеток / мл); концентрации токсикантов - 5% ДМСО (черные кружки), 20 мМ сульфаметаксазол (черные квадраты). Ось ординат-линейные размеры ширины клеток S. ambigua. Кинетику гибели исследовали для сульфаметаксазола. Все исследования проведены при 20 оС.

Данные статистической морфометрии подтверждаются и при микроскопическом исследовании, позволяющем визуально идентифицировать промежуточное состояние (рис. 2). Низкомолекулярные лигандов - компонентов фармацевтических препаратов приводят, в основном, к «истоньшению» клетки, как показано на рис. 2. Для некоторых соединений возможны и иные морфометрические изменения, например, в 2% растворе тяжелой воды S. ambigua приобретает колбообразную форму.

При микроскопическом исследовании возможно выделение нескольких промежуточных

Рисунок 2. S. ambigua. Общий вид исходного организма и. лиганд-индуцированное переходное состояние, соответствующие двум максимума размерного спектра (рис. 1) .

состояний при лиганд-индуцированной гибели. Количественно кинетику гибели можно описать на основании минимальной кинетической схемы (с1) (и соответствующего ей уравнения (2) или более сложных аналогичных кинетических схем. Выделение на схеме (с1) быстрой стадии связывания лиганда и медленной стадии клеточного перехода составляют для изученных лигандов секунды и десятки минут, соответственно. Однако возможно более медленное протекание стадий связывания лиганда (при сохранении соотношения длительности первой и второй стадии). Так, например, в 1,5 % растворе поливинилпирролидона наблюдаются осцилляции S. ambigua из исходного в промежуточное состояние с интервалами времени прямого перехода около 5 мин., а обратного 20 мин. (при 25 оС).

В практике исследования токсичности широко применяются диаграммы «Доза-Ответ» [25]. При характеристике биологической активности химических соединений с использованием кинетика клеточных переходов S. ambigua в качестве данных диаграмм как экспресс характеристики токсичности химического соединения могут служить зависимости «Концентрация-время жизни» (рис. 3, а также [17]).

0 100 200 300 400 500 сульфацил, мМ

СУЛЬФОМЕТАКСАЗОЛ, мМ

этанол, %

Рисунок 3. Примеры диаграмм «Доза-Ответ» (концентрация - время жизни S. ambigua.

10

20

40

30

20

10

10

DO, %

При фиксированной температуре можно получить линеаризованные зависимости Ть от Ь-п при итерационном подборе параметра п, который может варьировать от 1 (рис. 4) до 9 [17].

Рис.4. Концентрационная зависимость времени жизни S. ambigua в растворе сульфата цинка.

Отклонения от такой простейшей линеаризации диаграмм «Доза-Ответ» являются тестом для уточнения кинетического механизма взаимодействия тест-объекта с лигандом. Графически это выражается либо в смещение линеаризованной зависимости и пересечении ее с осью ординат при отрицательных значениях или появления бифазных зависимостей (например, для этанола). Действительно, малейшее усложнение кинетической схемы (с1), как-то введение второго пути связывания лиганда (2Kp) со стехиометрией b и соответствующего ему процесса гибели с вероятностью im приводит к следующему виду уравнения для времени жизни:

1

Tl =__, где a= 2fm / fm (3),

fm Ln

Уравнение (3) даже при значительных упрощениях не дает возможности определения всех параметров без длительного кинетического исследования. Оказалось, что наиболее информативной биологически активного действия химических соединений являются аррениусовские характеристики кинетики гибели.

Было обнаружено [15-18], что при лиганд-индуцированных клеточных переходах зависимость времени жизни S. ambigua от температуры линеаризуется в аррениусовских координатах, как показано на рис. 5. Наблюдаемая величина энергии активации (Ea) для глицина практически не зависела от концентрации в интервале от 60 до 250 мМ. Это связано либо с низким значением Kp в уравнении (2), либо с высоким значением n, что отражает высокое «сродство» и кооперативность к «естественному» лиганду, принимающему участие в метаболических процессах. Это положение является верным и для ряда других аминокислот,

35 3025

I 20"

й 15-и

10 5 0

0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 [Gly], M

C

Еа=110 кДж/моль

Рисунок 5. Кинеткиа глицин-индуцируемых клеточных

переходов S. ambigua А. Концентрационная зависимость времени жизни в растворе глицина. В. Зависимость времени жизни S. ambigua от температуры в прямых (В) и аррениусовских координатах (С) при инкубации инфузории в 0, 125 М глицине. Используемый интервал температур от 19 °С до 31 оС.

3,28 3,36 3,44

1000/T, K-1

5

0

20

24

28

32

t, oC

их комбинаций, малотоксичных микроэлементов (2и), минеральных вод (см. ниже). При этом, токсичные неприродные (например, бихромат калия, диметилсудьфоксид - рис. 7 и [17]) соединения демонстрируют сильную зависимость кажущейся энергии активации от концентрации токсиканта.

5 6 7 8 9 10 ДМСО, %

0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10

Рис. 7. Зависисмость кажущейся энергии активации кинетики гибели S. ambigua от концентрации токсиканта. Пример определения истинной энергии активаци приведен в работе [17].

800

600-

400-

200

50

К2Сг207, М

Параметр истинной энергии активации лиганд-индуцируемой гибели S. ambigua, рассчитываемый из аррениусовской линеаризации кинетики гибели, зависит от вида химического соединения ^м. рис. 7 и [18]). Тот факт, что все эти вещества приводят к гибели инфузории легко объяснить, приняв, что повышение температуры является фактором, ускоряющим естественную гибель клетки по причине сильной зависимости ее сократимости от температуры [14].

50

-+-

цинка сульфат треонин

ДМСО

глутумат

Рис. 8. Зависимость энергии активации лиганд-индуцируемой гибели S. ambigua от природы низкомолекулярного соединения.

0

Кажущееся бессмертие простейших обусловлено, по-видимому, тем, что потенциальное время жизни клетки намного больше времени деления. Низкомолекулярный лиганд фактически катализирует процесс гибели, ускоряя его до лабораторно регистрируемых времен. Именно при таком рассмотрении схема с1 близка по смыслу к схемам лиганд-зависимой инактивации фермента, а энергия активации является параметром, отражающим условия промотирования или катализа процесса гибели клетки. При значительных (по сравнению с ПДК для пресноводных водоемов) концентраций Zn2+ очевидно должно приводить к гибели клетки по типу некроза. Отсюда следует предположить, что параметр Ea может служить количественным критерием при необходимости дискриминировать апоптозный и некрозный тип процесса. Величина Ea характеризует интенсивность перестроек клеточных структур, индуцированных определенным лигандом. Из электрохимической кинетики хорошо известно, что процессы разряжения электроактивных частиц имеют Еа<10 кДж/моль при условии контролирования диффузии. Процессы, контролируемые кинетикой, т.е. зависящие от механизма реакции, имеют Еа>10 кДж/моль. Нами описана возможность кинетического представления клеточных превращений с использованием схем ферментативной кинетики, в которых клетка описывается как полиферментный реактор [23]. Медленность второй стадии лиганд-индуцируемой гибели S. ambigua у и высокие значения энергии активации указывают на явление значительных конформационных перестроек подобных медленным конформационным переходом олигомерных мембранных ферментов из деактивированного в активное состояние [27, 28].

3. Изучение неаддитивных эффектов при комбинированном действии компонентов фармпрепаратов

Кинетическая схема (с1) может описывать действие и многокомпонентных фармацевтических препаратов при условии, что после взаимодействия с лигандами возникает одно промежуточное (предсмертное) состояние - С*: +L2

C + Ll .

+Ll ^ C* ................................................•>

C +L2 CL2 ^^ .

Схема с2 может быть хорошо проиллюстрирована при описании движении пробной точки в 2-0 потенциальном поле [29]. Нам удалось описать по такой схеме ряд многокомпонентных лекарственных препаратов (препараты, применяемые для лечения острых лейкозов у детей, лечебные и лечебно-столовые минеральные воды), которые демонстрируют простейшую аррениусовскую зависимость кинетики гибели, что и указывает на однонаправленность биологического действия (табл. 1) составляющих эти препараты компоненты. Нарушения же аррениусовской кинетики можно интерпретировать как возникновение, как минимум, двух типов промежуточного состояния (С1* и С2* на схеме с3) с разными константами скорости гибели Чт и

т

Ч

т

C + Li CLi ... <> Ci*

C +L2 ^^ CL2 ^^ ... C2* ................................................>

2f

Кинетическая схема с3 предполагает нарушения аррениусовской зависимости (рис. 9). Вид нарушения аррениусовской зависимости (нелинейность в координатах 1п(1/Ьь) от (1/Т), число

18

20 22

t, °С

24 26

Рис. 9 Отклонение от аррениусовской зависимости кинетики гибели S. ambigua при комбинированном действии ДМСО и сульфалена. Пунктиром показана экспоненциальная кривая при ДМСО-индуцированной гибели (концентрация - 10%).

перегибов может служить тестом на одно- или разнонаправленность механизмов действия компонентов фармацевтических препаратов, также как эти данные используются в энзимологии мембранных ферментов [30]. На рис. 10 приведен пример обнаружение сильного антагонистического эффекта при комбинированном действии глицина и ионов цинка. Начальный участок (вставка на левом графике рис. 10) подчиняется аррениусовской зависимости и может быть описан по схеме с1, где в качестве лиганда выступает комплекс глицина с ионами цинка (концентрации свободных глицина и Zn2+ подобраны так, что не оказывают действия на тест-объект). После достижения значений температуры в 29 оС начинается триггерное усиление выживаемости S. ambigua, проявляющееся в многократном увеличении продолжительности жизни клеток. Следует ожидать, что применение комбинированного препарата глицина и солей

Зависимость времени жизни S. ambigua от температуры при комбинрованном действии глицина и ионов цинка, [Zn+]t:[Gly]=1:10

t, oC

Рис. 10. Температурная зависимость кинетики комбинированного действия глицина и сульфата цинка на S. ambigua. На правом графике - линеаризация начального участка зависимости.

цинка будет дополнительно усиливать неспецифическую резистентность и адаптационные свойства клеток человека, помимо уже известных фармакологических свойств этих субстанций, применяемых по отдельности в составе препаратов «Глицин» производства МНПК «Биотики» и «Цинкит» зарубежного производства.

Вид неаддитивных эффекты при комбинированном действии возможно определить при использовании упомянутых выше диаграмм «Доза-Ответ». Классическим примером синергического противомикробного действия является препарат «Бисептол», включающий в качестве действующих субстанций сульфаметаксазол и триметаприм. На рис. 11 продемонстрирован синергический эффект, выражающийся в неаддитивном уменьшении времени жизни S. ambigua при комбинированном действии указанных субстанций.

Сульфаметоксазол, мМ

Концентрация сульфаметоксазола, мМ

Рис. 11. Синергический эффект при комбинированном действии сульфаметаксазола и триметаприма. Правый график получен вычитанием кривых на диаграмме «Доза-Ответ» при различных концентрациях триметаприма.

4. S. ambigua как клеточный биосенсор

Кинетические характеристики клеточных переходов S. ambigua (от образования промежуточного состояния до гибели), морфометрическое описание изменения формы, подвижности объекта, строения цитоплазмы зависят и от природы, и от концентрации определенного химического соединения. Принципиально возможна постановка задачи идентификации природы химического соединения в зависимости от количественных и качественных показателей клеточных переходов S. ambigua [15-18], в том числе и для природных метаболитов (например, аминокислот). В этом смысле данный тест-объект является клеточным биосенсором, позволяющим проводить исследования одно- и многокомпонентных растворов на предмет выявления и идентификации (теоретически - вплоть до определения концентрации) химических соединений, обладающих биологической активностью (в том числе и токсичных).

Результаты по определению вида комбинированного воздействия химических соединений могут быть использованы, с нашей точки зрения, для ранних стадий доклинических испытаний, как-то продемонстрировано ниже при разработке лекарственной композиции MP-33. S. ambigua как свободноживущая инфузория не является узкоспециализированной клеткой как клетки, образующие ткани человеческого организма. Поэтому факт действия на этот тест-объект определенного соединения может быть перенесен на любые клетки человека. При этом остается справедливой кинетическая схема (с1) или ее усложненные варианты (с2, с3 и т.п.). Для клеток человека будут изменяться только численные значения констант. Медленный переход на второй стадии не обязательно является процессом гибели. Кинетически идентичное описание может быть получено и для образования лекарственно-устойчивых форм (патогенных бактерий,

раковых клеток). Возможность кинетического описания возникновения лекарственной устойчивости, образования споровых и дормантных форм описано нами ранее [16, 18]. Описанные способы использования диаграмм «Доза-Ответ» и температурных зависимостей кинетики клеточных переходов были использованы для исследования биологической активности компонентов лекарственной композиции MP-33 и разработки методологии оптимизации состава лекарственной формы.

5. Методология оптимизация выбора вспомогательного вещества лекарственного препарата на примере метаболитной композиции «МР-33»

Разработанная МНПК «Биотики» метаболитная композиция «MP-33» к активации различных систем антиокидантной защиты организма и обладает радиопротекторными свойствами [31-33]. Препарат MP-33 практически нетоксичен: ЛД 50 при введении per os составляет > 3000 мг/кг [34]. В стадии доклинических испытаний препарат находит применение для профилактики и лечения хронического алкоголизма, алкогольной абстиненции, интоксикаций на производствах химической промышленности, различных форм химической, мышечной гипоксии, при вынашивании и рождении ребенка, ишемии миокарда, пневмониях, а также в качестве радиопротектора для лиц, находящихся на территориях с повышенным уровнем радиации, особенно для беременных и их плода [35, 36].

Для исследования индивидуального и комбинированного действия на кинетику клеточных переходов S. ambigua субстанций и вспомогательных веществ, входящих в состав MP-33 концентрации аминокислот и других компонентов были подобраны в соответствии с растворимостью аминокислот и в количественном соотношении их в таблетке. Как видно из сводных данных, приведенных в таблице 1 энергия активации клеточных переходов при комбинированном действии глицина и L-глутаминовой кислоты имеет значение, отличающееся от Ea при индивидуальном действии аминокислот. Наличие аррениусовской кинетики при комбинированном действии соединений означает, что аминокислоты вызывают клеточные переходы по типу схемы с2, причем промежуточное состояние клетки отличается от такового при индивидуальном действии аминокислот. Причем клеточный переход при комбинированном действии этих аминокислот ускоряется (энергия активации имеет меньшее значение). Вспомогательные вещества в составе таблеток МР-33 либо приводили к вырождению комбинированного действия аминокислот (ПВП и крахмал), либо не влияли на значение энергии активации (МЦ). Полная биологическая инертность и требуется от вспомогательного вещества. Применительно к препарату MP-33 биологическая инертность метилцеллюлозы не будет влиять на сублингвальное всасывание субстанций.

Следует отметить, что крахмал, как и метилцеллюлозы различных марок (МЦ-16, МЦ-100), оксипропилметилцеллюлоза в различных концентрациях (от 0,2 до 1,5% раствора) не оказывают никакого влияния на их жизнедеятельность S. ambigua при индивидуальном применении. Следовательно, в составе таблетки вспомогательные вещества не только обуславливают технологические качества лекарства в целом, но и выступают как носители и регуляторы биологической активности лекарств. Применительно к МР-33 максимальное действие лекарственных веществ достигается при использовании в качестве вспомогательных веществ метилцеллюлозы водорастворимой.

Таблица 1. Сводная таблица данных по энергиям активации кинетики клеточных переходов S. ambigua индивидуальных аминокислот, их комбинаций и лекарственного препарата МР-33 (общие для всех препаратов таблеток компоненты - глицин, глутаминовая кислота, цистин, стеарат магния) с различными вспомогательными веществами. Концентрации аминокислот и вспомогательных веществ при индивидуальном, комбинированном действии и в составе таблетки идентичны. Не растворяющиеся компоненты таблеток МР-33 отделяли фильтрованием. МЦ - метилцеллюлоза водорастворимая (МЦ-16). ПВП - поливинилпирролидон. Использовали крахмал -модифицированный «Starch».

Название Энергия активации клеточных переходов Еа, кДж/моль

Индивидуальные вещества Gly 115 ±5

Glu 115 ±5

ПВП *

Крахмал **

Мц **

Комбинация аминокислот Gly+Glu 85± 6

Лекарственный препарат с различными наполнителями МР-33 с МЦ * 90±4

МР-33 с ПВП ** 115±7

МР-33 с крахмалом*** 115±7

* - ПВП вызывает медленные осцилляции S. ambigua из исходного состояния в промежуточное (рис. 12) ** - вещество не индуцирует клеточные переходы

Библиографический список

1. Ershov Yu.A., Pleteneva T.V. On a thermodynamic and kinetic methods of evaluation of the toxicity of arsenic compounds// Toxicol. Environ. Chem. - 1983. - V. 7. - № 1. - P. 41-46.

2. Плетенева Т.В., Тарнавская Н.А., Есменская Н.Б., Ершов Ю.А. Комбинированное действие растворов серебра и меди на инфузорий Paramecium caudatum// «Серебро в медицине, биологии и технике». СО РАМН Новосибирск. - 1995. - №4. - С. 124-130

3. Pleteneva T.V. On electrochemical method of evaluating the toxicity of inorganic compounds// The first international conference of electrochemistry and its applications. - Luxor. South Valley University, Qena,Egypt. - 1996. - P. 245-248.

4. Слонская T.K., Плетенева Т.В., Ершов Ю.А. Оценка биологической активности токсических агентов с помощью одноклеточных моделей// Бюл. эксп. биол. и мед. - 1997. - Т. 123. - № 5. -С. 519-526.

5. Pleteneva T.V. Physicochemical factors of inorganic compounds toxic actions// 4-th European Biological Inorganic Chemistry Conference - EUROBIC-4. - 1998. - Sevilia, Spain P. MM-27.

6. Pleteneva T.V., Rulenko I.A., Sinuk T.F., Ershov Y.A., Tukavkina N.A. Effects of chelating agents, polyphenols, on heavy metal ions biological activity (Protozoan models)// The 3-rd Tannin Conference "Plant Polyphenols: Chemistry and Biology", USA. - 1998. - P. 163-164.

7. Ershov Yu.A., Pleteneva T.V., Siniuk T.F., Dolgopolova V.A. Determination of growth parameters of the Paramecium caudatum test-system during standardization of studies of biological activity of chemicals// Biull. Eksp. Biol. Med. - 1999 - V. 127. - P. 717-720.

8. Сыроешкин А.В., Плетенева Т.В. Прогнозирование биологической активности химических соединений. Проблемы и перспективы// Научно-педаг. конференция "Медицинское образование в наступающем XXI веке", РУДН. - 2000. - М. - C. 28-30.

9. Applewhite PB Drugs affecting sensitivity to stimuli in the plant Mimosa and the protozoan Spirostomum// Physiol. Behav. - 1972 - V. 9. No. 5. P. 869-871.

10. Dikstein S., Hawkes R.B. Metabolically regulated cyclical contractures in microinjected Spirostomum: a pharmacological study// Experientia. - 1976 - V. 32. No.8. - P.1029-1031.

11. Nalecz-Jawecki G., Rudz B., Sawicki J. Evaluation of toxicity of medical devices using Spirotox and Microtox tests: I. Toxicity of selected toxicants in various diluents// J. Biomed. Mater. Res. - 1997. -V. 35. No.1. P. 101-105.

12. Nalecz-Jawecki G., Sawicki J. Toxicity of inorganic compounds in the Spirotox test: a miniaturized version of the Spirostomum ambiguum test// Arch. Environ. Contam. Toxicol. - 1998. - V. 34. No.1. -P. 1-5.

13. Nalecz-Jawecki G., Sawicki J. Spirotox--a new tool for testing the toxicity of volatile compounds// Chemosphere. - 1999 - V. 38. - No.14 -P. 3211-3218.

14. Hawkes R.B., Holberton D.V. Myonemal contraction of Spirostomum. III. The thermal dependence of contraction, relaxation and excitation-contraction coupling// J. Cell. Physiol. 1975. V. 87. No.2. -P. 253-263.

15. Сыроешкин А.В., Плетенева Т.В., Долгополова В.А.. Разработка биологической модели для оценки комбинированного действия лекарственных веществ по кинетике гибели S. ambigua// Патофизиология и современная медицина. Материалы научно-практической конференции,

посвященной 100-летию со дня рождения профессора С.М. Павленко. 13-14 октября 2000 -Москва, Издательство РУДН, 2000. - С.196-197.

16. Сыроешкин А.В., Березинская Т.Л., Долгополова В.А., Ковалева А.А., Бикетов С.Ф., Плетенева Т.В. Дормантные формы клеток и споры: кинетическая теория клеточных превращений// Электронный журнал "Исследовано в России". - 2001. - 112. - С.1204-1214. http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2001/112.pdf

17. Ковалева А.А., Плетенева Т.В., Серегина О.Б., Сыроешкин А.В. Клетка как химический реактор: аррениусовская зависимость ДМСО-индуцируемой кинетики гибели инфузории Spirostomum ambigua от температуры// Электронный журнал "Исследовано в России". - 2001. - 113. - C.1215-1224. http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2001/113.pdf

18. Сыроешкин А.В., Суздалева О.В., Кискина Л.П., Долгополова В. А., Быканова С.Н., Плетенева Т. В. Кинетическое описание взаимодействия клетки с низкомолекулярными лигандами// Вестник РУДН. - 2001, № 3. http://med.pfu.edu.ru/ new/russian/win/library/vestnik/v013/03 2001.html

19. Ершов Ю.А. Квазихимические модели роста биологических популяций под действием ингибиторов и промоторов// Ж. физ. химии. - 1998. - Т. 72. - №3 - С. 553-559.

20. Варфоломеев С.Д., Калюжный С.В. Биотехнология. Кинетические основы микробиологических процессов, М., 1990.

21. Emanuel N.M. Kinetics and free-radical mechanisms of ageing and carcinogenesis// IARC Sci. Publ. -1985 - V. 58. P. 127-150.

22. Emanuel N.M. Kinetics and the free-radical mechanisms of tumor growth// Ann. N. Y. Acad. Sci. -1973. - V. 222. - P. 1010-1030.

23. Сыроешкин А.В.. Кинетика клеточных процессов в норме и патологии (2002), Автореферат .. ..дис. докт. биол. н., М., РУДН. 34 с.

24. Сыроешкин А.В., Гребенникова Т.В., Байкова В.Н., Ковалева А.А., Лебедев И.М., Бикетов С.Ф., Плетенева Т.В., Фролов В.А.' Новый подход к исследованию патофизиологии клетки: изучение распределения клеток по размерам и форме как метод диагностики и мониторинга заболеваний.(2002) Клиническая лабораторная диагностика, №5, 35-40

25. Плетенева Т.В. Прогнозирование экологической опасности неорганических соединений по их физико-химическим свойствам: Автореф. дис. ... докт. хим. наук. - М., 1993. - 84 с.

26. Сыроешкин А.В., Плетенева Т.В. Прогнозирование биологической активности химических соединений. Проблемы и перспективы// Научно-педаг. конференция «Медицинское образование в наступающем XXI веке». - Москва, 2000. - C. 28-30

27. Maklashina E.O., Sled' V.D., Vinogradov AD. Hysteresis behavior of complex I from bovine heart mitochondria: kinetic andthermodynamic parameters of retarded reverse transition from the inactive toactive state // Biokhimiia. - 1994. -V. 59. - Вып. 7. - P. 946-957

28. Syroeshkin A.V., Bakeeva L.E., Cherepanov D.A. Contraction transitions of F1-FO ATPase during catalytic turnover//Biochim. Biophys. Acta. - 1998. - V.1495909. - P.59-71

29. Романовский Ю.М. Молекулярная динамика ферментов. М.: изд-во МГУ, 2000. - 169с.

30. . Болдырев А. А. Биологические мембраны и транспорт ионов. - М.: Наука. - 1985. - 350 с.

31. Калинина Е.В., Комиссарова И. А., Заславская Р.М., Жданов Ю.А. повышение антиоксидантного статуса больных ишемической болезьнью сердца пожилого возраста при действии аминокислотной композиции МР-33 в комбинированной терапии с триметазидином// Клиническая медицина. - 2002. - №5. - С.50-53.

32. Калинина Е.В., Новичкова М.Д., Чиркова Е.М., Коппель М.А., Комиссарова И.А. Повышение радиорезистентности организма при действии метаболитного препарата «MP-33»// РАН. Радиационная биология и радиоэкология. - М., 1999, Т. 39, № 2-3, С.272-276.

33. Фармацевтическая композиция, индуцирующая биосинтез глутатиона, активность глутатионтрансферазы и оказывающая антитоксическое, радиопротекторное и антигипоксическое действие, и способы лечения, профилактики и защиты с ее использованием: А.С. 2096034 РФ/ И.А. Комиссарова, Е.В. Калинина, Ю.В. Гудкова и др. - № 94042317/14; Заявл. 30.11.94; Опубл. 20.11.97. - Бюл. № 32. - 44с.

34. Калинина Е.В., Новичкова М.Д., Чиркова Е.М., Коппель М.А., Комиссарова И.А. Повышение радиорезистентности организма при действии метаболитного препарата «MP-33»// РАН. Радиационная биология и радиоэкология.- М., 1999, Т. 39, № 2-3.-С.272-276.

35. Калинина Е.В., Чиркова Е.М., Новичкова М.Д., Коппель М.А., Комиссарова И.А Биохимические механизмы повышения резистентности системы мать-плод к условиям хронической гемической гипоксии при действии метаболитного препарат «MP-33»//V Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». Тез. докл. - М., 21-25 апреля 1998 г. - С.571.

36. Комиссарова И. А. Охрана внутренней среды организма как основа формирования психического здоровья// Конгресс «Охрана психического здоровья детей и подростков». - М., 1998. - С.44.