СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОКАПСУЛ И ЦИТОКАПСУЛЯРНЫХ ТРУБОК
METHODS FOR OBTAINING CYTOCAPSULES AND CYTOCAPSULAR TUBES

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Изобретение относится к области получения цитокапсул и цитокапсулярных трубок, а также к способам и композициям на их основе.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Клеточная граница отделяет клетку от внешней среды, тем самым обеспечивая и защищая внутриклеточные процессы, а также содержимое от нежелательного воздействия факторов окружающей среды. Клеточная граница имеет важное значение для чувствительности клеток, миграции, инвазии, перемещения, пролиферации, роста, дифференцировки, связи с окружающей средой и реагирования на нее, усвоения питательных веществ и кислорода, удаления отходов метаболитов и защиты от воздействия окружающей среды.
Движение клеток в многоклеточном организме имеет решающее значение для эмбрионального развития (Le Douarin NM (1984) Cell migrations in embryos. Cell 38(2):353-360; Reig G, Pulgar E, & Concha ML (2014) Cell migration: from tissue culture to embryos. Development 141(10): 1999-2013; Richardson BE & Lehmann R (2010) Mechanisms guiding primordial germ cell migration: strategies from different organisms. Nat Rev Mol Cell Biol 11(1):37-49), гомеостаза органов (Acloque H, Adams MS, Fishwick K, Bronner-Fraser M, & Nieto MA (2009) Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease. The Journal of clinical investigation 119(6): 1438-1449), регенерации тканей (Bryant DM & Mostov KE (2008) From cells to organs: building polarized tissue. Nat Rev Mol Cell Biol 9(11):887-901), иммунных реакций (Woodland DL & Kohlmeier JE (2009) Migration, maintenance and recall of memory T cells in peripheral tissues. Nat Rev Immunol 9(3): 153-161; Weninger W, Biro M, & Jain R (2014) Leukocyte migration in the interstitial space of non-lymphoid organs. Nat Rev Immunol 14(4):232-246), заживления ран (Gurtner GC, Werner S, Barrandon Y, & Longaker MT (2008) Wound repair and regeneration. Nature 453(7193):314-321) и распространения опухоли (Friedl P & Alexander S (2011) Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell 147(5):992-1009; Friedl P & Wolf K (2003) Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer 3(5):362-374; Barbolina MV, et al. (2009) Micro environmental regulation of ovarian cancer metastasis. Cancer Treat Res 149:319-334). Миграция клеток в трехмерном (3D) микроокружении осуществляется гетерогенными клетками и внеклеточными матриксами (ЕСМ), которые обеспечивают опорные каркасы и направляющие подсказки для направлений передвижения и в то же время формируют существенные препятствия окружающей среды, затрудняющие подвижность клеток (Thiery JP, Acloque Н, Huang RY, & Nieto MA (2009) Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell 139(5):871-890; Franz CM, Jones GE, & Ridley AJ (2002) Cell migration in development and disease. Dev Cell 2(2): 153-158). Для облегчения подвижности клетки адаптивно генерируют пространственно-временные поверхностно связанные органеллы и компартменты, включая ламеллиподии (Murphy DA & Courtneidge SA (2011) The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat Rev Mol Cell Biol 12(7):413-426), филоподии (Mattila PK & Lappalainen P (2008) Filopodia: molecular architecture and cellular functions. Nat Rev Mol Cell Biol 9(6):446-454), подосомы (Tarone G, Cirillo D, Giancotti FG, Comoglio PM, & Marchisio PC (1985) Rous sarcoma virus-transformed fibroblasts adhere primarily at discrete protrusions of the ventral membrane called podosomes. Exp CellRes 159(1): 141-157), инвадоподии (Chen WT (1989) Proteolytic activity of specialized surface protrusions formed at rosette contact sites of transformed cells. J Exp Zool 251(2): 167-185), пузырьки (Fackler ОТ & Grosse R (2008) Cell motility through plasma membrane blebbing. J Cell Biol 181(6):879-884; Ridley AJ (2011) Life at the leading edge. Cell 145(7): 1012-1022), фокальный контакт (Wehrle-Haller В (2012) Structure and function of focal adhesions. Current opinion in cell biology 24(1): 116-124), дендритный псевдоподиальный вырост и эпителиальный мостик II типа (Zani BG, Indolfi L, & Edelman ER (2010) Tubular bridges for bronchial epithelial cell migration and communication. PLoS One 5(1):e8930). Поэтому механика перемещения клеток в многоклеточном организме остается неясной.
Клеточная морфология, используемые органеллы, а также механический и сигнальный контроль при 3D-миграции клеток часто отличаются от их 2D-аналогов (Baker ВМ & Chen CS (2012) Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci 125(Pt 13):3015-3024; Wu PH, Giri A, Sun SX, & Wirtz D (2014) Three-dimensional cell migration does not follow a random walk. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111(11):3949-3954; Friedl P, Sahai E, Weiss S, & Yamada KM (2012) New dimensions in cell migration. Nat Rev Mol Cell Biol 13(11):743-747). У клеток, перемещающихся в богатом коллагеном 3D матриксе, ламеллоподии или филоподии отсутствуют, но есть сильно дендритные псевдоподиальные выросты, которые отсутствуют на поверхностях жестких пластин (Jayatilaka Н, et al. (2017) Synergistic IL-6 and IL-8 paracrine signalling pathway infers a strategy to inhibit tumour cell migration. Nature communications 8:15584; Giri A, et al. (2013) The Arp2/3 complex mediates multigeneration dendritic protrusions for efficient 3-dimensional cancer cell migration. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology 27(10):4089-4099).
В данной области техники существует постоянная потребность в способах и композициях, которые могут помочь понять клеточную подвижность в 3D внеклеточном матриксе и 3D микроокружениях.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение отвечает этой потребности и основано на открытии того, что клетки в контролируемых 3D микроокружениях, таких как 3D внеклеточный матрикс, могут образовывать по меньшей мере два типа новых мембранных органоидов, а именно цитокапсулы и цитокапсулярные трубки. Цитокапсулярные трубки обеспечивают трубчатые пути для направленной транспортировки клеток. Многочисленные цитокапсулярные трубки соединяются между собой и образуют сети трубчатых переплетений для направленной транспортировки клеток в различных направлениях. Было установлено, что повышенная инициация сар-зависимой трансляции, а также повышенная экспрессия белков, включая интегрин бета-2, связаны с образованием цитокапсул и цитокапсулярных трубок и удлинением цитокапсулярной трубки. Способы и композиции для получения цитокапсулы и цитокапсулярной трубки в контролируемом 3D внеклеточном матриксе предоставляют мощные инструменты для понимания механизмов, лежащих в основе миграции клеток в 3D микроокружении, что является предпосылкой для разработки эффективных терапевтических средств против широкого спектра заболеваний, связанных с миграцией клеток, чувствительностью клеток, защитой от клеточного стресса, пролиферацией клеток, дифференцировкой клеток, ростом опухоли, развитием опухоли, метастазированием опухоли, рецидивом опухоли и устойчивостью к лекарственному средству.
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения предложена композиция, содержащая 3D внеклеточный матрикс, цитокапсулы и цитокапсулярные трубки. Цитокапсулы и цитокапсулярные трубки образуются клетками, имплантированными в 3D матрикс или на его поверхности.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ получения цитокапсул и цитокапсулярных трубок. Способ включает имплантацию клеток в 3D матрикс или на его поверхности и инкубацию 3D матрикса с имплантированной клеткой в условиях, при которых клетки образуют цитокапсулы и цитокапсулярные трубки.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения, предложен способ получения цитокапсул и цитокапсулярных трубок in vitro. Способ включает в себя следующие стадии: имплантация клеток в виде суспензии из отдельных клеток на верхний слой 3D матрикса; и культивирование 3D матрикса с имплантированной клеткой в условиях, при которых клетки образуют цитокапсулы и цитокапсулярные трубки в 3D матриксе.
В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предложен способ получения 3D матрикса, подходящего для образования цитокапсул и цитокапсулярных трубок. Способ включает замораживание 3D матрикса и оттаивание 3D матрикса при подходящей температуре.
В контексте изобретения и, в частности, формулы изобретения и/или подразделов, термины "содержит (включает)", "заключающий в себе", "содержащий (включающий)" и подобные могут иметь значение, приписанное им в патентном законодательстве США, и могут означать "включает", "включенный", "включающий" и т.п.; подобно этому "состоящий по существу из" или "состоит по существу из" имеют значение, приписанное им в патентном законодательстве США, например, они не являются исчерпывающими и допускают присутствие большего, чем то, что излагается, при условии исключения элементов предшествующего уровня техники или элементов, влияющих на основные или новые характеристики изобретения.
Эти и другие варианты реализации изобретения раскрываются или станут очевидными из и включены в нижеследующе подробное описание
Краткое описание чертежей
Файл патента или заявки содержит по меньшей мере один чертеж, выполненный в цвете. Копии данного патента или опубликованной патентной заявкой с цветным(-ыми) чертежем(-ами) будут предоставлены Ведомством по запросу и после уплаты необходимой пошлины. Вышеизложенные и другие особенности и преимущества настоящих вариантов реализации станут более полно понятными из нижеследующего подробного описания иллюстративных вариантов реализации, взятых в совокупности с прилагаемыми чертежами, на которых:
На Фиг. 1A-1F показано изображение образования цитокапсул и цитокапсулярных трубок. На Фиг. 1А показано изображение образования цитокапсул и удлиненных цитокапсулярных трубок. Эпителиальные клетки молочной железы человека (HMECs), имплантированные в толстый и 3D матригель в указанных условиях, образуют мембранные, экстрацитоплазматические цитокапсулы и удлиненные цитокапсулярные трубки. Показаны флуоресцентные изображения цитокапсулярных трубок отдельных эпителиальных клеток молочной железы, которые транзиторно сверхэкспрессируют EGFP-PMCA2 и mCherry-β-actin с цитокапсулярными трубками. Показаны эпителиальные клетки молочной железы (красные стрелки), цитокапсула (СС, белая стрелка), цитокапсулярные мембраны (ССМ, оранжевые стрелки). На Фиг. 1В приведены результаты количественного анализа длин цитокапсулярной трубки. На Фиг. 1С показаны изображения эцеллюляризации цитокапсул в светлом поле, полученные с помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа. Синяя стрелка указывала на одиночные эпителиальные клетки молочной железы человека, образующие большую цитокапсулу (СС красная стрелка), обволакивающую клетку. Через 1 час эпителиальные клетки молочной железы человека покидают цитокапсулу, оставляя клеточную цитокапсулу (еСС, белая стрелка) без клеток внутри. Показана цитокапсулярная мембрана (СКК, оранжевая стрелка). На Фиг. 1D показана принципиальная схема эцеллюляризации цитокапсулы. На Фиг. 1Е приведены результаты количественного анализа размеров цитокапсул в диаметре. На Фиг. 1F показано изображение, полученное методом дифференциально-интерференционного контраста (левая панель) и изображение, полученное методом флуоресценции (правая панель) крупной мембранной цитокапсулы (СС, красные стрелки). Масштаб = 10 мкм.
На Фиг. 2 изображены сети цитокапсулярных трубок эпителиальных клеток молочной железы человека. Миграция эпителиальных клеток человека в цитокапсулярных трубках и формирование сети. Показаны цитокапсулярные трубки (СТ, красные стрелки), узел соединения цитокапсулярной трубки (CTN), несколько клеток, мигрирующих в единой цитокапсулярной трубке (оранжевые стрелки), и клеточная масса без цитокапсулярных трубок (черная стрелка).
На Фиг. 3А-3В изображены архитектуры сетей цитокапсулярных трубок. (Фиг. 3А) Множественные пересечения цитокапсулярной трубки опухолевых стволовых клеток рака молочной железы. Несколько цитокапсулярных трубок опухолевых стволовых клеток рака молочной железы соединяются через узел цитокапсулярной трубки (CTN) и образуют перекрестные морфологии. Клетки мигрируют в сети цитокапсулярных трубок. (Фиг. 3В) Сети цитокапсулярной трубки опухолевых стволовых клеток рака молочной железы (СТ, красные стрелки) в радикальной морфологии. Через узел цитокапсулярной трубки (CTN) соединяются до пяти цитокапсулярных трубок. Несколько клеток мигрируют в цитокапсулярных трубчатых сетях в различных морфологиях. Масштаб = 10 мкм.
На Фиг. 4 представлена мгновенное изображение с анализом лизиса клеток сетевых систем цитокапсулярных трубок опухолевых стволовых клеток рака молочной железы. Светлопольное изображение систем цитокапсулярных трубок, полученное с помощью мгновенной визуализацией с лизисом клетки. Показаны встроенные цитокапсулярные трубки (СТ, красные стрелки) и узел цитокапсулярной трубки (CTN) в сети цитокапсулярных трубок. Изображения были сделаны через 1-2 секунды после обработки буфером для начала лизиса клеток. На 3-й секунде после обработки буфером для начала лизиса все цитокапсулярные трубки и клеточные плазматические мембраны подверглись лизису и исчезли.
На Фиг. 5A-5G изображено слияние цитокапсулы и проникновение в клетку. (Фиг 5А) Светлопольное изображение слившейся цитокапсулярной трубки, объединенной двумя цитокапсулярными трубками, созданными двумя клетками. Клетка 2 расположена в слившейся цитокапсулярной трубке. Показана слитая цитокапсулярная трубка (МТР, красная стрелка), мембрана слитой цитокапсулярной трубки (МТМ, оранжевая стрелка). (Фиг 5В) Дифференциально-интерференционный контраст и изображение большой слившейся цитокапсулы с множеством клеток (клеточная масса), расположенных в слившейся и большой цитокапсуле, которое было получено с помощью флуоресцентного микроскопа. Показаны мембраны слитых цитокапсулярных трубок (МТМ, оранжевая стрелка). (Фиг. 5С) Результаты количественного определения содержимого ячейки. (Фиг. 5D) Изображение эндогенного синцитина-1 в эпителиальных клетках молочной железы человека, полученное с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии (Фиг. 5Е) Изображения экспрессии синцитина-1 во время развития цитокапсулярной трубки, полученные с помощью вестерн-блоттинга (Фиг. 5F) Выключение синцитина-1 уменьшает слияние цитокапсулярных трубок в эпителиальных клетках молочной железы человека. (Фиг. 5G) Выключение синцитина-1 не влияет на образование цитокапсулярных трубок в эпителиальных клетках молочной железы человека.
На Фиг. 6А-6В изображен ген интегрин бета-2, регулирующий удлинение цитокапсулярной трубки. (Фиг. 6А) Тепловая карта транскрипционных изменений 26 генов интегрина во время развития цитокапсулярной трубки. (Фиг. 6В) Влияние ITGB-2 на образование цитокапсулы и удлинение цитокапсулярной трубки.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Аспекты настоящего изобретения основаны на ранее неизвестном наблюдении, согласно которому клетки при имплантации и культивировании в контролируемом 3D внеклеточном матриксе, могут образовывать две новые внеклеточные мембранные органеллы, которые в данном описании называются цитокапсулами и цитокапсулярными трубками. Клетки мигрируют в цитокапсулах и образуют цитокапсулярные трубки, которые проявляют плейотропные биологические функции и обеспечивают трубчатые пути для направленного транспорта клеток в матриксе. При формировании и соединении многочисленных цитокапсулярных трубок образуются сети, поддерживающие направленную транспортировку клеток в различных направлениях внутри матрикса. Настоящее изобретение предлагает механизм направленной транслокации клеток через цитокапсулярные трубки в 3D микроокружении. Раскрытые в настоящем описании способы и композиции для создания цитокапсул и цитокапсулярных трубок будут способствовать пониманию механизмов, лежащих в основе развития эмбрионов многоклеточных организмов, гомеостаза органов, регенерации тканей и иммунных реакций, а также разработке терапевтических средств для лечения и тактики ведения широкого спектра заболеваний и биологических процессов, включая, но не ограничиваясь этим, миграцию клеток, распознавание клеток, защиту от клеточного стресса, пролиферацию клеток, дифференцировку клеток, рост опухоли, развитие опухоли, метастазирование опухоли, рецидив опухоли и устойчивость к лекарственным средствам.
Как было отмечено, жизненный цикл цитокапсулы и цитокапсулярных трубок, полученных в 3D внеклеточном матриксе в соответствии со способами, описанными в данном документе, может быть представлен следующим образом. На начальном этапе одиночные/индивидуальные клетки образуют небольшие, круглые, внеклеточные и мембранные цитокапсулы, окружающие клетку. Впоследствии цитокапсулы проходят несколько стадий развития. Сначала цитокапсулы приступают к эцеллюляризации. В результате эцеллюляризации цитокапсулы полностью отделяются от вытесненной клетки и становятся бесклеточными цитокапсулами. Также наблюдается неполное разделение цитокапсул и вытесненной клетки. В случае неполного отделения вытесненные клетки остаются связанными с бесклеточными цитокапсулами и могут повторно войти в соединенные бесклеточные цитокапсулы через область аутодоступа и реформировать закрытые цитокапсулы с клетками в просветах. Во-вторых, цитокапсулы растут и образуют крупные (около 100-250 мкм в диаметре/главной оси), круглые или овальные цитокапсулы. Крупные цитокапсулы могут слегка сжиматься, образуя сжатые цитокапсулы, охватывающие внутрипросветные клетки. С другой стороны, другие клетки из окружающей среды могут проникать в одиночные крупные цитокапсулы содержащие клетки, что приводит к появлению одиночных цитокапсул с содержанием большого количества клеток. Эцеллюляризация данных крупных цитокапсул приводит к образованию больших бесклеточных цитокапсул, которые сжимаются, сдавливаются и образуют большие сдутые вогнутые диски (или в неправильной морфологии). В-третьих, клетки мигрируют в цитокапсулах, деформируя цитокапсулярные мембраны и порождая удлиненные цитокапсулярные трубки. Аллодоступ окружающих клеток позволяет множеству клеток входить и мигрировать в цитокапсулярных трубках. Миграция клеток (одной клетки или нескольких клеток) в гомогенных и мембранно-закрытых цитокапсулярных трубках происходит быстрее, чем в гетерогенных средах, состоящих из гетерогенного экстрацеллюлярного матрикса (ЕСМ), других клеток и структур. Предположительно, миграция клеток в цитокапсулярных трубках свободна от помех экстрацеллюлярного матрикса, клеток и структур. Цитокапсулярные трубки соединяются между собой и образуют разветвленные, цельные и мембранные трубчатые сети, обеспечивая трубчатые переплетенные системы для направленного 3D транспорта/перемещения клеток в различных направлениях. В процессе эцеллюляризации образуются бесклеточные цитокапсулы и цитокапсулярные трубки. Все бесклеточные цитокапсулы и цитокапсулярные трубки подвергаются быстрому саморазложению.
5
В соответствии с одним аспектом предложена композиция, содержащая 3D внеклеточный матрикс, цитокапсулы и цитокапсулярные трубки. В одном варианте реализации цитокапсулы и цитокапсулярные трубки образуются одной клеткой, имплантированной в 3D матрикс или на его поверхности. В одном варианте реализации клетки имплантируются на верхнюю поверхность 3D матрикса. Перед имплантацией клетки обрабатывают с получением суспензии из отдельных клеток с плотностью от примерно 1×10 до примерно 1×10 клеток / мл.
Согласно одному аспекту, цитокапсулы и цитокапсулярные трубки окружают клетку, которая образует цитокапсулы и цитокапсулярную трубку. Согласно другому аспекту, цитокапсулы и цитокапсулярные трубки содержат множество клеток, которые входят в цитокапсулы и цитокапсулярные трубки из окружающей среды. Согласно еще одному аспекту, цитокапсулы и цитокапсулярные трубки подвергаются эцеллюляризации и поддерживают окруженную ими клетку, образуя бесклеточные цитокапсулы и цитокапсулярные трубки, которые лишены клеток.
В соответствии с определенными аспектами предложен 3D матрикс, где множество клеток в приблизительно одной суспензии клеток добавляется в 3D матрикс или на его поверхности. Инкубация 3D матрикса с имплантированной клеткой в контролируемых условиях приводит к тому, что одна клетка образует цитокапсулы и цитокапсулярные трубки.
Согласно одному аспекту 3D матрикс является пористым. Пористость может быть результатом полимеризации и/или сшивания молекул, используемых для изготовления матричного материала. Пористость контролируется путем изменения плотности сшивания, длины цепи и процентного содержания сополимеризованных разветвленных мономеров в соответствии с методами, известными специалистам в данной области. Согласно одному аспекту, 3D матрикс является пористым до такой степени, что дополнительные реагенты могут диффундировать или иным образом перемещаться через матрикс. Пористый матрикс может быть изготовлен в соответствии с методами, известными специалистам в данной области. Дополнительный контроль над размером и плотностью молекулярного сита достигается путем добавления дополнительных перекрестносшивающих агентов, таких как функционализированные полиэтиленгликоли.
Согласно другому аспекту 3D матрикс является вязким. Вязкость трехмерного матрикса можно регулировать любым способом, известным в данной области.
Согласно одному аспекту материал 3D матрикса является химически инертным и термически стабильным, что позволяет применять различные температуры. Согласно другому аспекту 3D матрикс является оптически прозрачным. В соответствии с одним аспектом материал 3D матрикса является оптически прозрачным, что позволяет применять методы получения трехмерного изображения, известные специалистам в данной области техники. Согласно одному аспекту матрикс является достаточно оптически прозрачным или иным образом имеет оптические свойства, подходящие для получения глубокого трехмерного изображения для считывания информации с высокой пропускной способностью.
Согласно одному аспекту, материал, используемый для формирования матрикса, является биоразлагаемым. Согласно другому аспекту, материал, используемый для формирования матрикса, совместим с широким спектром биологических и небиологических образцов in situ.
Согласно одному аспекту материал матрикса может представлять собой полутвердую среду, которая может быть изготовлена из полиакриламида, целлюлозы, альгината, полиамида, сшитой агарозы, сшитого декстрана или сшитого полиэтиленгликоля. В определенных аспектах полутвердая среда может быть прикреплена к твердой подложке, такой как предметное стекло микроскопа, культуральная пластина или проточная ячейка. Твердая опора может быть прикреплена к нижней поверхности полутвердой среды.
Материалы, образующие матрикс, включают, но не ограничиваются ими, полиакриламид, целлюлозу, альгинат, полиамид, сшитую агарозу, сшитый декстран или сшитый полиэтиленгликоль. Материалы, образующие матрикс, могут образовывать матрикс путем полимеризации и/или сшивания материалов, образующих матрикс, с использованием способов, специфичных для материалов, образующих матрикс, и способов, реагентов и условий, известных специалистам в данной области.
Материалы, образующие матрикс, дополнительно включают, но не ограничиваются ими, эластин, ламинин, протеогликаны (такие как сульфат гепарана, сульфат хондроитина и сульфат кератина) и непротеогликановые полисахариды (такие как гиалуроновая кислота). В некоторых вариантах реализации материалы, образующие матрикс, также могут содержать белки, включая, но не ограничиваясь этим, фибриллярные белки,, белки Facit, короткоцепочечные белки и белки базальных мембран. В других вариантах реализации материалы, образующие матрикс, могут дополнительно включать сигнальные белки, включая, но не ограничиваясь ими, киназу фокальной адгезии (FAK), талин, винкулин, паксиллин, α-актинин и ГТФазу. Биоразлагаемые, биосовместимые полимеры могут, например, использоваться в качестве материала матрикса, включая, но не ограничиваясь этим, этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевую кислоту, коллаген, полиортоэфиры, полимолочную кислоту и полимолочные, полигликолевые сополимеры (PLG).
Согласно некоторым аспектам, матрикс используется в сочетании с твердой подложкой. Например, матрикс может быть полимеризован таким образом, что одна поверхность матрикса прикреплена к твердой подложке (например, стеклянная поверхность), тогда как другая поверхность матрикса открыта или находится между двумя твердыми подложками. Согласно одному аспекту, матрикс может содержаться в контейнере.
Твердые подложки согласно настоящему изобретению могут быть выполнены в различных формах. В некоторых вариантах реализации твердая подложка является по существу плоской. Примеры твердых подложек включают в себя пластины, такие как предметные стекла, микротитрационные пластины, проточные ячейки, покровные стекла, микрочипы и тому подобное, контейнеры, такие как пробирки для микроцентрифугирования, пробирки и тому подобное, трубки, листы, прокладки, пленки и тому подобное. Кроме того, твердые носители могут быть, например, биологической, небиологической, органической, неорганической природы или быть их комбинацией.
Было установлено, что определенные характеристики матрикса имеют решающее значение для образования цитокапсул и цитокапсулярных трубок в матриксе. Например, степень полимеризации, концентрация белка и вязкоэластичность матрикса влияют на образование цитокапсул и цитокапсулярных трубок. Настоящее изобретение предусматривает широкую степень полимеризации матрикса от низкой, около 10%, до полной 100% полимеризации. Степень полимеризации матрикса также связана с плотностью матрикса и вязкоэластичностью. Кроме того, белки, которые присутствуют в матриксе или впоследствии добавляются в матрикс, также влияют на образование цитокапсул и цитокапсулярных трубок. Настоящее изобретение предусматривает конечную концентрацию белка в матриксе в диапазоне примерно от 2 до 12 мг/мл. Настоящее изобретение дополнительно предусматривает диапазон рН для матрикса в диапазоне 4-8. Степень полимеризации, градиент, плотность и вязкоэластичность матрикса влияют на дуротаксис миграции клеток внутри матрикса. В одном варианте реализации 3D матрикс представляет собой матригель.
Среди клеток в соответствии с настоящим изобретением есть эукариотические клетки, животные клетки, растительные клетки, клетки насекомых, включая, но не ограничиваясь ими, клетки дрозофилы, клетки С. elegant и тому подобное. Типичные клетки включают любые клетки, человека или других, включая клетки больного или клетки здорового. Среди некоторых клеток есть человеческие клетки, нечеловеческие клетки, стволовые клетки человека, дифференцированные клетки, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs), генетически модифицированные клетки, плюрипотентные клетки человека, эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, иммунные клетки, мышечные клетки, стволовые клетки мыши, первичные клеточные линии, иммортализованные клеточные линии, первичные и иммортализованные фибробласты, клетки HeLa и нейроны, а также опухолевые клетки. В одном варианте реализации клетка представляет собой клетку млекопитающего. В другом варианте реализации клетка представляет собой эпителиальную клетку молочной железы человека. В некоторых вариантах реализации клетка представляет собой стволовую клетку, будь то взрослая или эмбриональная. В одном варианте реализации клетка представляет собой плюрипотентную стволовую клетку. В другом варианте реализации клетка представляет собой индуцированную плюрипотентную стволовую клетку. В еще одном варианте реализации клетка представляет собой индуцированную плюрипотентную стволовую клетку человека. Согласно определенному аспекту, клетка представляет собой клетку in vitro, in vivo или ex vivo.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ получения цитокапсул и цитокапсулярных трубок. В одном варианте реализации способ включает стадии имплантации клеток в 3D матрикс или на его поверхности и инкубации 3D матрикса с имплантированными клетками при температуре, подходящей для образования цитокапсул и цитокапсулярных трубок. Температуры инкубации, подходящие для образования цитокапсул и цитокапсулярных трубок, составляют около 37°С, с вариациями для конкретных типов клеток. В одном варианте реализации 3D матрикс перед имплантацией замораживают. В некоторых вариантах реализации имплантация происходит при температурах в диапазоне приблизительно 1-45°С, 1-37°С, 1-6°С и 2-4°С. В других вариантах, толщина 3D матрикса находится в диапазоне между примерно 1-1000 мкм, 2-100 мкм, 5-50 мкм и 5-10 мкм.
Согласно некоторым аспектам, цитокапсулы и цитокапсулярные трубки окружают клетку, которая образует цитокапсулы и цитокапсулярные трубки. Согласно другим аспектам, цитокапсулы и цитокапсулярные трубки дают выход окруженной клетке, которая образует цитокапсулы и цитокапсулярные трубки. Согласно еще одному аспекту, цитокапсулы и цитокапсулярные трубки позволяют проникать множеству клеток из окружающей среды.
5
Согласно одному аспекту, клетки представлены в виде суспензии из отдельных клеток с плотностью примерно от 1×10 до 1×10 клеток/мл перед имплантацией.
2+
Мембрана цитокапсул и цитокапсулярных трубок имеет определенные характеристики. Согласно одному аспекту, мембрана цитокапсул и цитокапсулярных трубок содержит белок плазматической мембраны Са АТФазу 2. Согласно другому аспекту, синцитин-1 регулирует слияние цитокапсулярной трубки и вход клетки. Согласно еще одному аспекту факторы роста регулируют образование цитокапсулы и развитие цитокапсулярной трубки. Согласно еще одному аспекту интегрин бета-2 (ITGB-2) опосредует миграцию клеток в цитокапсулярных трубках и регулирует удлинение цитокапсулярной трубки. Согласно еще одному аспекту, матриксные металлопротеиназы опосредуют удлинение цитокапсулярной трубки.
В некоторых вариантах осуществления 3D матрикс содержит биологически активные и/или биологически неактивные агенты, включая, но не ограничиваясь ими, коллаген, материал матрикса матригеля, эластин, ламинин, протеогликаны (такие как гепарансульфат, хондроитинсульфат и кератинсульфат), непротеогликановые полисахариды (такие как как гиалуроновая кислота), белки (такие как фибриллярные, Facit, короткоцепочечные и белки базальной мембраны) и сигнальные белки (такие как киназа фокальной адгезии, талин, винкулин, паксиллин, α-актинин и ГТФаза).
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения, предложен способ получения цитокапсул и цитокапсулярных трубок in vitro. В одном варианте реализации способ включает в себя следующие стадии: имплантация клеток в виде суспензии из отдельных клеток на верхний слой 3D матрикса; и культивирование имплантированных клеток в подходящей среде и при подходящей температуре, где каждая отдельная клетка образует цитокапсулы и цитокапсулярные трубки в 3D матриксе.
В соответствии с еще один аспектом, предложен способ получения 3D матрикса, пригодного для образования цитокапсул и цитокапсулярных трубок. В одном варианте реализации способ включает: замораживание 3D матрикса и оттаивание 3D матрикса до подходящей температуры. Температуры, подходящие для размораживания матрикса, составляют приблизительно 1-45°С, 1-37°С, 1-6°С, и 2-4°С.
ПРИМЕРЫ
Следующие примеры приведены с целью иллюстрации различных вариантов реализации изобретения и не предназначены для ограничения настоящего изобретения каким-либо образом. Настоящие примеры вместе со способами, описанными в данном документе, в настоящее время представляют предпочтительные варианты реализации, являются примерными и не предназначены для ограничения объема изобретения. Изменения в нем и другие виды применения, которые охватываются характером изобретения, согласно объему притязаний формулы изобретения, могут быть определены специалистами в данной области техники.
Пример I
Образование цитокапсул и цитокапсулярных трубок.
3
2+
Чтобы исследовать механику клеточной границы и 3D клеточного движения, нормальные первичные эпителиальные клетки молочной железы человека (НМЕС) имплантировали в матрикс 3D матригеля, суррогат восстановленного внеклеточного матрикса (ЕСМ) в соответствии с некоторыми вариантами реализации настоящего изобретения. Одиночные сферические первичные эпителиальные клетки молочной железы человека в 3D матригеля, но не клетки в 2D средах, образовывали круглые/неправильной формы и внеклеточные капсулы в виде пузырьков в переменных размерах, окружающие клетку (Фиг. 1А). Приблизительно 96% одиночных первичных эпителиальных клеток молочной железы человека (1×10 клеток/лунка в 6-луночных планшетах, n=3) формировали внеклеточные капсулы в течение 12 часов. Диаметр/большая ось внеклеточных сферических/овальных капсул значительно увеличивался и достигал 250 мкм. Чтобы подтвердить, является ли капсульная поверхность мембранной, в первичных эпителиальных клетках молочной железы человека транзиентно сверхэкспрессировали усиленный зеленый флуоресцентный белок (EGFP) слитый с белком плазматической мембраны Са АТФазой 2 (EGFP-РМСА2). Действительно, EGFP-PMCA2 распределяется как по плазматической мембране клеток, так и по мембранам внеклеточных капсул, что подтверждает, что внеклеточные капсулы заключены в мембраны (Фиг. 1А). Эти внеклеточные цитокапсулы могут удлиняться с образованием длинных трубок различной длины (Фиг. 1B). Со временем одиночные капсулы автоматически эцеллюляризуются, оставляя бесклеточные и закрытые капсулы в нескольких морфологиях (сферической, овальной или неправильной) с натянутыми мембранами (Фиг. 1C-1D). Данные цитокапсулы имеют различные размеры и могут иметь большие размеры до 100 мкм в диаметре (Фиг. 1Е). Эти цитокапсулы являются мембранными (Фиг. 1F). Данные наблюдения свидетельствуют о том, что капсульная мембрана независимо локализуется вне плазматической мембраны и что бесклеточные капсулы могут существовать без клетки. Эта ранее недооцененная, внеклеточная мембранная капсула, образованная одной клеткой млекопитающего, была названа цитокапсулой.
Пример II
Эцеллюляризация цитокапсул.
В большинстве случаев после цитокапсулярной эцеллюляризации клетка полностью отделяется от своей бесклеточной цитокапсулы. Бесклеточные цитокапсулы разрушаются и образуют сдутые и вогнутые диски. (Фиг. 1С). Иногда эцеллюляризация цитокапсулы приводит к неполному отделению вытесненной клетки от ее бесклеточной цитокапсулы.
После эцеллюляризации рост бесклеточных цитокапсул прекращается, что убедительно свидетельствует о том, что образование и рост цитокапсул зависят от внутрипросветной клетки. Между тем, большой зазор/расстояние между плазматической мембраной и внеклеточной капсульной мембраной указывает на то, что капсульные компоненты, происходящие из внутрипросветной клетки, высвобождаются/ доставляются за пределы плазматической мембраны для построения цитокапсулы (Фиг. 1С). Впоследствии бесклеточные цитокапсулы продолжали сжиматься и сдуваться, а цитокапсулярные мембраны складывались, образуя большие, сдутые и вогнутые диски или короткие плоские трубки. Примерно через 0,5-1 ч мембраны бесклеточных цитокапсул разрушаются, и цитокапсулы саморазлагаются. Данные наблюдения позволили предположить, что жизненный цикл цитокапсул протекает через несколько последовательных и отчетливых фаз: от инициации, роста, эцеллюляризации, дефляции и усадки, деградации мембран до саморазложения.
Клеточный контакт при высокой плотности клеток уменьшает образование цитокапсул и значительно увеличивает разложение цитокапсул. Ингибирование клеточного контакта при высокой плотности клеток не полностью подавляет образование цитокапсул или полностью индуцирует их разложение. Клеточный контакт при высокой плотности клеток снижает рост цитокапсул в диаметре.
Со временем отдельные клетки мигрируют в двух направлениях в своих цитокапсулах, деформируют цитокапсулярные мембраны и формируют удлиненные цитокапсулы, образуя мембранные трубки переменной длины (Фиг. 2). Затем внутрипросветные клетки удаляли из цитокапсулярных трубок. При эцеллюляризации цитокапсулярных трубок образуются бесклеточные цитокапсулярные трубки. Затем длинные бесклеточные цитокапсулярные трубки автоматически сжимались, а мембраны сильно сгибались, образуя спущенные, спиральные, скрученные и мембранные конденсированные нити. Впоследствии мембраны длинных сжатых и бесклеточных цитокапсулярных трубок деградировали, с последующим их саморазложением. Данные последовательные стадии развития цитокапсулярных трубок из отдельных клеток показали, что жизненный цикл цитокапсулярных трубок прогрессивно протекает от миграции одной клетки в ее цитокапсулах до деформации цитокапсулярной мембраны, удлинения цитокапсулы, образования цитокапсулярной трубки, эцеллюляризации и саморазложения цитокапсулярной трубки.
Одиночные эпителиальные клетки молочной железы человека образовывали цитокапсулярные трубки, которые могут достигать длины до 820 мкм. Увеличение плотности клеток приводит к уменьшению средней длины цитокапсулярной трубки, но не средней ширины (приблизительно 11 мкм в диаметре/ширине). Кроме того, высокая плотность клеток приводит к снижению среднего срока службы цитокапсулярных трубок. Также, высокая плотность клеток уменьшает среднюю плотность цитокапсулярной трубки (по длине и количеству). Некоторые цитокапсулярные трубки выдерживают уплотненные микроокружения.
high
low
FA
2
3
Далее авторы настоящего изобретения оценивали стволовые клетки рака молочной железы субпопуляций HMLER (CD44/CD24) (Yi Т, et al. (2014) Количественный фосфопротеомный анализ выявляет общесистемные сигнальные пути по потоку SDF-1/CXCR4 в стволовых клетках рака молочной железы. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111(21):E2182-2190) на способность генерации цитокапсул. При низкой плотности клеток, равной 1×10 и 1×10 клеток /лунку, приблизительно 99% стволовых клеток рака молочной железы в течение 15 часов образовывали цитокапсулы в 3D Матригель. Цитокапсулы, образованные стволовыми клетками рака молочной железы менее подвержены остановке деления при клеточном контакте. Цитокапсулярные трубки, образованные стволовыми клетками рака молочной железы, по статистике длиннее, чем у эпителиальных клеток молочной железы человека, а одиночные цитокапсулярные трубки стволовых клеток рака молочной железы могут достигать до 1000 мкм в длину.
Пример III
Цитокапсула и цитокапсулярная трубка являются внеплазменными мембранными органеллами.
Авторы изобретения обнаружили, что цитокапсула и цитокапсулярная трубка не являются ни продолжениями плазматической мембраны, ни соединением клеточной поверхности. Они образуются одиночными клетками, окруженными собственно созданной мембраной, которая отличается от плазматической мембраны и окружает клетку, которая их создала. Помимо плейотропных биологических функций, цитокапсула и цитокапсулярная трубка имеют уникальные характеристики, включая: внеклеточные мембранные капсулы (или трубки), окружающие клетку, и допустимость эцеллюляризации и проникновения в клетку. С другой стороны, цитокапсулярная трубка, но не цитокапсула, обеспечивает длинные трубчатые каналы для направленной транспортировки множества клеток. Цитокапсулы и цитокапсулярные трубки не являются продолжениями плазматической мембраны, а представляют собой внеклеточные мембранные органеллы, окружающие клетки. Цитокапсулы и цитокапсулярные трубки не присутствуют в 2D клеточных культурах. Цитокапсулы и цитокапсулярные трубки выполняют плейотропные биологические функции, в том числе обеспечивают опорные каркасы и покрытия для окружаемых клеток, позволяя осуществлять эцеллюляризацию и проникновение в клетки. Клетки могут мигрировать в цитокапсулах, цитокапсулярных трубках и сетях цитокапсулярных трубок. Саморазложение цитокапсул и цитокапсулярных трубок не влияет на выживаемость, пролиферацию и рост клеток. Эцеллюляризованные цитокапсулы и цитокапсулярные трубки могут существовать до 98 часов. Цитокапсулы и цитокапсулярные трубки могут вместить множество, например, десятки клеток. Цитокапсулярные трубки соединяются между собой и образуют открытые трубчатые сети для направленной транслокации клеток в нескольких направлениях. Данные характеристики цитокапсулы и цитокапсулярных трубок демонстрируют, что они представляют собой две новые факультативные органеллы, которые отличаются от всех ранее описанных органелл.
Пример IV
Формирование цитокапсулярных трубчатых сетей.
Через 6 часов единичные первичные нормальные эпителиальные клетки молочной железы человека образовывали большие мембранные и короткие цитокапсулярные трубки в указанном матриксе Матригель (Фиг. 2). Через 10 часов эпителиальные клетки молочной железы человека мигрировали в короткие цитокапсулярные трубки и образовывали удлиненные цитокапсулярные трубки (Фиг. 2). Через 36 часов множественные длинные цитокапсулярные трубки, образованные НМЕС, соединялись и формировали сети посредством соединительных узлов (Фиг. 2). Через 68 часов эпителиальные клетки молочной железы человека агрегировали и образовывали клеточные массы, все клеточно-капсулярные трубки эпителиальных клеток молочной железы человека разлагались, цитокапсулярной трубки не осталось (Фиг. 2).
Через 4 часа стволовые клетки рака молочной железы (BCSC) уже сформировали большие и короткие цитокапсулярные трубки в указанном матриксе 3D Матригеля (Фиг. 3А). Стволовые клетки рака молочной железы мигрировали в цитокапсулярных трубках в двух направлениях, деформировали цитокапсулярные мембраны и формировали морфологию трубок, а также порождали длинные и изогнутые цитокапсулярные трубки (Фиг. 3В). Множество цитокапсулярных трубок стволовых клеток рака молочной железы соединялись и формировали различные морфологии, в том числе замкнутые круги. Многие раковые клетки мигрировали в цитокапсулярных трубках в различных форматах, в том числе потоковых и линейных (Фиг. 3). Позже стволовые клетки рака молочной железы агрегировали и образовывали сферические или неправильной формы опухолевые сферы. Затем количественно определяли длину цитокапсулярной трубки стволовых клеток рака молочной железы во времени. Цитокапсулярные трубки стволовых клеток рака молочной железы могут достигать 1000 μм в длину. Несколько цитокапсулярных трубок могут соединяться, образуя более длинные трубки. Количество цитокапсулярных трубок уменьшалось с течением времени, что указывает на то, что длины цитокапсулярных трубок динамически и жестко контролируются (Фиг. 4).
Вышеупомянутые данные показали, что цитокапсулярные трубки обычно проходят последовательные, но особые фазы: образование цитокапсулы, миграция клеток в цитокапсулах, удлинение цитокапсулы и формирование цитокапсулярных трубок, множество цитокапсулярных трубок соединяются и образуют сети, клетки мигрируют в цитокапсулярных трубках, агрегация клеток и образование клеточной массы/кластеров и разложение цитокапсулярной трубки.
Две или более цитокапсулярных трубок эпителиальных клеток молочной железы человека переменной длины соединяются между собой и образуют трубчатые сети через узлы соединения. Через 38 часов у стволовых клеток рака молочной железы появилось гораздо больше узлов соединения цитокапсулярной трубки, чем у эпителиальных клеток молочной железы человека. Кроме того, среднее количество цитокапсулярных трубок на узел соединения стволовых клеток рака молочной железы больше, чем у эпителиальных клеток молочной железы человека. Плотность цитокапсулярных трубок стволовых клеток рака молочной железы примерно в 3 раза выше, чем у эпителиальных клеток молочной железы человека. Эти данные показали, что стволовые клетки рака молочной железы обладают более агрессивной способностью формировать взаимосвязанные цитокапсулярные трубчатые сети. Время жизни цитокапсулярных трубок стволовых клеток рака молочной железы с изолированными или соединенными клетками намного больше, чем у бесклеточных цитокапсулярных трубок стволовых клеток рака молочной железы, что указывает на то, что внутрипросветные клетки способствуют ограничению разложения трубок. По сравнению с цитокапсулярными трубками стволовых клеток рака молочной железы, изолированными от клеток, соединенные с клетками цитокапсулярные трубки стволовых клеток рака молочной железы статистически остаются интактными в течение более длительного периода времени. Эти результаты показали, что поддержание цитокапсулярной трубки жестко контролируется и опосредуется внутрипросветными клетками. Важно отметить, что цитокапсулярные трубки стволовых клеток рака молочной железы соединяются и образуют трубчатые сети в опухолях in vivo, и в этих трубчатых сетях мигрирует множество клеток. Эти данные показали, что сети цитокапсулярных трубок формируют мембранные трубчатые ткани для направленной клеточного движения в различных направлениях.
Пример V
Магистральные цитокапсулярные трубки для транспортировки клеток.
Клетки мигрируют в сети мембранных цитокапсулярных трубок, в которых трубчатые цитокапсулярные трубки обеспечивают пути для транслокации клеток (Фиг. 2-3). Используя технологии быстрого лизиса клеток и мгновенного изображения, авторы настоящего изобретения исследовали архитектуру сети цитокапсулярных трубок. Цитокапсулярные трубки стволовых клеток рака молочной железы широко и агрессивно соединяются, в значительной степени образуют кресты, открытые круги, замкнутые круги и многие другие нерегулярные морфологии, обеспечивая сверхбольшие трубчатые сети для перемещения раковых клеток в отдаленные места в нескольких направлениях (Фиг. 4). Как одиночные, так и множества клеток мигрируют быстрее в цитокапсулярных трубках по сравнению с таковыми в 3D средах. Цитокапсулярные трубки образуют пути для направленной 3D транспортировки клеток.
Пример VI
Синцитин-1 регулирует слияние цитокапсулярной трубки и вход клетки.
Цитокапсулы разных клеток могут сливаться и образовывать более крупные цитокапсулы, а клетки могут входить в цитокапсулы других клеток (Фиг. 5А). Клетки могут входить в цитокапсулы других клеток, что приводит к образованию одиночных крупных цитокапсул, содержащих несколько клеток или клеточных масс (Фиг. 5В-5С). Далее исследовали молекулярные механизмы, лежащие в основе слияния цитокапсулярных трубок, соединения и входа клеток. Эндогенный мембранный белок слияния синцитин-1 экспрессируется в эпителиальных клетках молочной железы человека, в цитокапсулах и в цитокапсулярной трубке. Транзиторный нокдаун синцитина-1 в эпителиальных клетках молочной железы человека значительно уменьшал удлинение цитокапсулярной трубки, соединение, но не образование цитокапсулы (Фиг. 5D-5E). Кроме того, уровень белка синцитина-1 повышался при удлинении цитокапсулярной трубки (Фиг. 5Г). Синцитин-1 регулирует слияние цитокапсулярной трубки и вход клетки.
Пример VII
Субъединица интегрина бета-2 (ITGB-2) способствует развитию цитокапсулярной трубки.
Интегрины являются клеточными поверхностными поддерживающими молекулами, необходимыми для адгезии, прикрепления, миграции и инвазии клеток. Авторы настоящего изобретения исследовали 26 транскриптов гена интегрина в мезенхимальных стволовых клетках костного мозга, эпителиальных клетках молочной железы человека и стволовых клетках рака молочной железы во время развития цитокапсулярной трубки. Уровень интегрии бета-2 значительно увеличивается по ходу удлинения цитокапсулярной трубки (Фиг. 6А). Кроме того, транзиторный нокдаун интегрин бета-2, но не интегрин альфа-8, с геноспецифическими shRNAs приводит к значительному снижению удлинения цитокапсулярной трубки (Фиг. 6В). Эти данные показали, что интегрин бета-2 опосредует миграцию клеток в цитокапсулярных трубках и регулирует удлинение цитокапсулярной трубки.
Таким образом, настоящее изобретение предусматривает, что отдельные клетки генерируют две новые органеллы, внеклеточные и мембранные цитокапсулы и цитокапсулярные трубки, и что цитокапсулярные трубки обеспечивают трубчатые пути для транспортировки трехмерных клеток. Перемещение клеток в многоклеточных организмах имеет решающее значение для эмбрионального развития, формирования тканей, гомеостаза органов, иммунных реакций, заживления ран, регенерации тканей и метастазирования опухолей.
Генерация и развитие цитокапсул и цитокапсулярных трубок в значительной степени зависят как от 3D среды, так и от клеточной активности, и в исследовании они фокусируются только тогда, когда биохимические, биофизические и биомеханические характеристики 3D матрикса (такие как полимеризация, плотность и вязкоупругость) точно контролируются. Временный и пространственный внешний вид, саморазрушение и саморазложение цитокапсул и цитокапсулярных трубок затрудняет понимание и идентификацию данных ранее неидентифицированных органелл.
Цитокапсулярные мембраны обеспечивают прочные био-мембранные каркасы, поддерживающие клеточную адгезию, прикрепление, отслоение, морфологический переход и пластичность подвижности. С другой стороны, цитокапсула окружает клетки, физически защищая их от внецитокапсулярного микроокружения, что способствует переходу клетки от жесткой сферической формы в расслабленную нерегулярную морфологию и может служить защитным покрытием от воздействий окружающей среды. Цитокапсулярные трубки снабжают мембранные трубки, которые приспособлены для направленной миграции и двунаправленного передвижения множества клеток. Что еще более важно, цитокапсулярные трубки соединяют и формируют трубчатые сети, которые значительно увеличивают направления миграции клетки, усиливают области распространения клетки, и увеличивают направленную эффективность 3D миграции клетки. Хотя ингибирование контакта с клетками при высокой плотности клеток снижает процесс образования цитокапсул, увеличивает процесс разложения цитокапсул и сокращает длину цитокапсулярной трубки, все еще существуют приблизительно  нормальных клеток (эпителиальные клетки молочной железы человека) и до 1,1% стволовых клеток рака молочной железы, которые генерируют цитокапсулы, и порождают длинные капсульные трубки для направленной миграции множества клеток. Таким образом, по сравнению с форматом, в котором все клетки неизбежно подвергаются воздействию и встречают неоднородные препятствия, возникающие из-за уплотненного и гетерогенного трехмерного внеклеточного матрикса и клеток in vivo, форма, в которой небольшой процент клеток генерирует гомогенные мембранные цитокапсулярные трубки, служащие путями для направленной транспортировки нескольких клеток - это эффективная, по крайней мере, альтернативная модель. Цитокапсулы и цитокапсулярные трубки обладают потенциалом плейотропных биологических функций, а другие функции требуют большей работы для их изучения.
Увеличение цитокапсул зависит от активности внутрипросветной клетки, а бесклеточные цитокапсулы прекращают рост. С другой стороны, в бесклеточных цитокапсулах и цитокапсулярных трубках происходит быстрое саморазрушение и саморазложение. Помимо внутриклеточных органелл, эукариотические клетки содержат внеклеточные органеллы, которые высвобождаются или выделяются в микроокружение, например экзосомы (Keller S, Sanderson MP, Stoeck A, & Altevogt P (2006) Exosomes: from biogenesis and secretion to biological function. Immunology letters 107(2):102-108). Интересно, что в просветах цитокапсулярной трубки имеется ряд различных, однослойных мембранных закрытых везикул. Таким образом, эти мембранозные везикулы могут функционально связываться с носителями или грузами, которые доставляют/транспортируют цитокапсулярные компоненты клеточного происхождения, и с контейнерами, которые включают лизаты, высвобождение которых приводит к строго контролируемому саморазложению цитокапсул и цитокапсулярных трубок.
Явления, связанные с тем, что после эцеллюляризации бесклеточные цитокапсулярные трубки сжимаются, укорачиваются и становятся сдутыми, укороченными, скрученными и свернутыми нитями, согласуются с отсутствием внутрипросветного скелета в цитокапсулярных трубках. Отсутствие микрофиламентных сетей в просветах цитокапсулярных трубок согласуется с тем, что одиночные и множественные клетки активно мигрируют в цитокапсулярных трубках. С другой стороны, наличие каркасов из микрофиламентов под мембранами цитокапсулярных трубок согласуется с тем фактом, что длинные цитокапсулярные трубки могут перетаскиваться клеткой для пересечения поверхностей внеклеточного матрикса без разрушения, прерывания или перехвата.
Миграция клеток в цитокапсулах приводит к деформации и удлинению цитокапсулярной мембраны, а также к образованию и удлинению цитокапсулярной трубки. Построение мембран и других компонентов цитокапсулы и цитокапсулярных трубок требует большого количества вариабельных белков, что позволяет предположить, что трансляция мРНК и/или биосинтез белка необходимы для развития цитокапсул и цитокапсулярной трубки.
Таким образом, две новые органеллы - цитокапсула и цитокапсулярная трубка, раскрытые в этом исследовании, демонстрируют плейотропные биологические функции, включая снабжение канальцевыми путями и сетями для клеточного транспорта, перемещения и миграции, что может обеспечить понимание механизмов клеточной защиты и транслокации, участвующих в процессах развития и патогенеза заболеваний, включая метастазирование опухоли.
Пример VIII
Материалы и методы
high
low
FA
Клетки и реагенты. Первичные нормальные эпителиальные клетки молочной железы человека (HMECs) были заказаны в АТСС (PCS-600-010™). Опухолевые стволовые клетки рака молочной железы субпопуляции HMLER (CD44 / CD24) были получены, как описано ранее (27). Для сортировки клеток с помощью проточной цитометрии использовали FITC-конъюгированное анти-CD44 антитело (BD Biosciences; G44-26) и фикоэритрин-конъюгированное анти-CD24 антитело (BD Biosciences, ML15). Среду для роста эпителиальных клеток молочной железы MEGM ™ BulletKit ™ (Clonetics ™ MEGM ™ Среда для роста эпителиальных клеток молочной железы плюс пакет с набором SingleQuots ™) заказывали у Lonza (СС-3150). Мембранный матрикс Matrigel™ (СВ-40234) был приобретен у компании Corning. BD Matrigel Matrix Growth Factor Reduced (GFR, номер по каталогу 356230) был заказан у BD Bioscience.
Цейтраферная дифференциальная интерференционно-контрастная микроскопия, транзиторная трансфекция, количественная ПЦР в реальном времени и транзиторный нокдаун гена.
С помощью моторизованного инвертированного микроскопа Nikon Ti и цифровой ПЗС камеры Hamamatsu ORCA-ER с объективом 20× были проведены анализы удлинения цитокапсул и миграции клеток методом цейтраферной ДИК (дифференцировочной интерференционной контрастной) микроскопии. Культуры эпителиальных клеток молочной железы человека с цитокапсулами в матриксе матригеля (глубина> 40 мкм) анализировали с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Плазмиды EGFP-hPMCA2z/b (Addgene, #47584) и или mCherry-β-actin (# 54967) совместно трансфицировали в эпителиальные клетки молочных желез человека с использованием липофектатина 2000. Количественные ПЦР-анализы в реальном времени проводили с использованием геноспецифических праймеров (IDT Company), iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) и 7900ht Fast Real-Time PCR.
Реагенты и антитела. Плазмиды EGFP-hPMCA2z/b (#47584) и mCherry-β-actin (#54967) были заказаны от Addgene. Анти-GAPDH (каталог №2118S, разведение 1:1000 в Western blot assay) антитела были заказаны в Cell Signaling Technology. DAPI (4, 6-диамидин-2-фенилиндол, дигидрохлорид, разведение 1:1000 в иммунофлуоресцентном анализе) был заказан у KPL. Анти-γ-актин (гамма-актин, моноклональный, ab123034, разведение 1:1000 в иммунофлуоресцентном анализе), анти-пан-кадгерин (поликлональный, ab140338, разведение 1:1000 в иммунофлуоресцентном анализе) антитела были заказаны у Abcam.
2
Транзиторная трансфекция. Эпителиальные клетки молочной железы человека культивировали в среде для роста эпителиальных клеток молочных желез при 37°С в увлажненной атмосфере с 5% СО. Плазмиды EGFP-hPMCA2z / (Addgene, # 47584) и/или mCherry-β-actin (# 54967) совместно трансфицировали в эпителиальные клетки молочных желез человека с использованием липофектатина 2000 (Life Technologies, # 11668027) в соответствии с руководством. Через два дня после трансфекции клетки использовали для анализа.
high
low
FA
2
4
2
Образование цитокапсул и цитокапсулярных трубок. Эпителиальные клетки молочной железы человека (с/без трансфекции), мезенхимальные стволовые клетки костного мозга и стволовые клетки рака молочной железы субпопуляций HMLER (CD44/ CD24) высевали на слой матрикса матригеля при указанных плотностях клеток (или 5×10 клеток/ лунку в 6-луночном планшете или 1,2×10 клеток в 10 см чашках, если не указано) в среде для роста эпителиальных клеток молочных желез. 3D слои матригеля (глубиной> 40 мкм) готовили быстрым добавлением холодного и оттаявшего матрикса матригеля (оттаявшей на льду при 4°С в холодной комнате в течение ночи, с концентрацией белка 4-12 мг/мл) к предварительно охлажденным 6-луночным планшетам (с/без холодных микро-покровных стекол) с последующим добавлением холодной среды для роста эпителиальных клеток молочной железы (4°С) и инкубации в вытяжном шкафу при комнатной температуре (25°С) в течение 5-25 минут. Затем клетки имплантировали на поверхность геля 3D матригель и культивировали в инкубаторе с повышенной влажностью (37°С, 5% СО). Клетки в (или внедряют в) гель матригеля в переменных слоях и получают цитокапсулы и цитокапсулярные трубки. В данном исследовании использовались разработанные цитокапсулы и цитокапсулярные трубки на различных стадиях.
2
Цейтраферная дифференциальная интерференционно-контрастная микроскопия и видеосъемка. С помощью моторизованного инвертированного микроскопа Nikon Ti и цифровой ПЗС камеры Hamamatsu ORCA-ER с объективом 20× были проведены анализы удлинения цитокапсул и миграции клеток методом цейтраферной ДИК (дифференцировочной интерференционной контрастной) микроскопии. Цейтраферный микроскоп был оснащен дифференциально-интерференционным контрастом, фазовым контрастом и эпифлуоресцентной оптикой, моторизованным столиком и затворами Prior Proscan III, совершенной системой фокусировки и микроскопом с инкубатором OkoLab 37°С, 5% СО (OKO Lab). Снимки делались каждые 30 сек в течение 10 ~ 36 ч. Все изображения были получены с помощью программного обеспечения MetaMorph. Дорожки, сделанные при 2-часовом удлинении цитокапсулы, были получены с использованием программ MetaMorph и ImageJ. Скорости удлинения цитокапсулы также рассчитывали, измеряя длины и время. Видео были подготовлены с использованием изображений, собранных с использованием покадровой съемки и программного обеспечения MetaMorph (15 кадров в секунду, кадр/с). Получение изображений. Визуализация изображений неподвижных клеток (с/без цитокапсул) методом дифференциального интерференционного контраста (DIC) и флуоресценции были сделана с помощью прямого микроскопа 80i и цифровой ПЗС-камеры Hamamatsu ORCA-ER с объективом 20× или 40× с охлаждением. Светлопольное фазово-контрастное изображение было получено с помощью цифровой камеры Nikon. Количественно определяли коэффициент образования цитокапсул/высокоэффективное поле (HPF, 200×) и количество удлиненных цитокапсул/HPF. Все изображения были получены с использованием программного обеспечения для получения изображений MetaMorph и проанализированы с помощью программного обеспечения ImageJ.
4
Экстракция тотальной РНК и количественная ПЦР в реальном времени. TRIzol (Thermo Fisher Scientific) использовали для извлечения тотальных РНК из эпителиальных клеток молочной железы человека и опухолевых стволовых клеток рака молочной железы (1,2×10 клеток на 10 см чашки) с детектируемыми цитокапсулами и без них в указанные сроки. Используемые образцы были нанесены на матричные слои матригеля (толщиной около 10 мкм). Тотальные РНК были извлечены, как описано в руководстве. Количественные ПНР-анализы в реальном времени проводили с использованием геноспецифических праймеров (IDT Company), iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) и 7900ht Fast Real-Time PCR в соответствии с инструкциями производителя. В качестве контроля использовался GAPDH, и было проведено три независимых эксперимента. Анализ данных и диаграммы тепловой карты были рассчитаны и подготовлены, как описано выше.
4
Вестерн-блоттинг Используя буфер для радиоиммунопреципитационного анализа (RIPA) (25 мм Tris-HCl рН 7,6, 150 мм NaCl, 1% NP-40, 1% дезоксихолат натрия, 0,1% SDS) и ингибитор протеазы (Roche), общие белки экстрагировали из эпителиальных клеток молочной железы человека и опухолевых стволовых клеток рака молочной железы (1,2×10 клеток на 10 см чашки) в указанные сроки, как с цитокапсулами, так и без них. Использовались образцы, имплантированные на матричные слои матригеля. Общие белок подвергали элетрофорезу через 10% или 12% SDS-полиакрилмидные гели и мембраны из поливинилиден-дифторида immobilon™-P. Мембраны из поливинилиден-дифторида обрабатывали первичными антителами (Anti-GAPDH (Cell signaling Technology, 2118, 1: 1000), в течение 4 ч при 4°С с последующей промывкой в 0,1% Tween/TBS. Мембраны инкубировали с соответствующими вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой, при 25°С или 1 ч и трижды промывали до обнаружения сигнала. Для разработки использовали реагент для обнаружения вестерн-блоттинга ECL™.
Количественная оценка и статистический анализ
На всех фигурах: существенной разницы нет, нс/дел, Р>0,05; * Р<0,05; ** Р<0,01; *** Р<0,001.
Другие варианты осуществления будут очевидны для специалистов в данной области техники. Следует понимать, что приведенное выше описание приведено только для ясности и является исключительно иллюстративным. Сущность и объем настоящего изобретения не ограничиваются приведенными выше примерами, а охватываются приведенной формулой изобретения. Все публикации и патентные заявки, упомянутые выше, включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка была конкретно указана как включенная посредством ссылки.