СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОВЕДЕНИЯ И ФИЗИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ МЕЛКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ
METHOD OF STUDYING BEHAVIOR AND PHYSICAL STATE OF SMALL LABORATORY ANIMALS

Изобретение относится к биомедицине, в частности к экспериментальной фармакологии и экспериментальной токсикологии и может использоваться для определения специфического влияния некоторых лекарственных средств и химических соединений на организм мелких лабораторных животных.
Известен способ исследования кинезодинамики и поведения подопытных животных (патент РФ №2520155 от 20.06.2014 г.), включающий предварительное обучение целенаправленному плаванию. В процессе эксперимента животное помещают в воду бассейна оборудованного насосом переменной производительности, в котором создают искусственное однонаправленное течение потока, предпочтительно ламинарное. Регулируют скорость течения и температуру воды, а так же давление воздуха над потоком. При этом бассейн выполнен с возможностью его герметизации и регулирования давления воздуха. Регистрацию движения животного осуществляют с помощью бесконтактных средств, а физическое состояние с помощью беспроводных средств и приспособлений. Подопытное животное помещают в чашу гидроканала бассейна у торца и отслеживают скорость движения подопытного животного по направлению к домику-приманке. Когда животное достигает домика-приманки, срабатывает датчик и прокачка воды прекращается, животное извлекают из воды и приступают к подсчетам результатов исследования.
Недостатками данного способа являются, сложность и дороговизна конструкции. Экспериментальный процесс растянут по времени в виду необходимости обучения животных предварительному плаванию и при этом способ малоинформативен при исследовании поведения.
Из известных технических решений наиболее близким по назначению и технической сущности к заявленному объекту является способ исследования поведения и физической выносливости подопытных животных (патент РФ №2699483), включающий размещение подопытного животного на середине искусственно созданного из среднезернистого песка уклона песчаного перевернутого конуса. Для более равномерного и быстрого помещения на песчаный уклон животное фиксируют двумя руками, за загривок и корень хвоста и медленно опускают на уклон. Песок начинает осыпаться и увлекать за собой животное, которое сопротивляясь сползанию, начинает карабкаться вверх. В качестве регистраторов движения животного применяют бесконтактные дистанционные приборы, физические параметры животных регистрируют с помощью беспроводных средств. На получившейся песочной воронке с помощью лазерных указателей отмечают заданные расстояния и по ним судят о времени преодоления животными контрольного расстояния.
Недостатками данного способа являются, низкая информативность при оценке поведения.
Стресс - это структурный ответ организма, с подключением помимо гуморальных, вегетативных, нейрональных и иммунных систем вовлечены и поведенческие механизмы. Поведение аффилированное стрессом является неспецифической интегральной реакцией нацеленной на аккомодацию организма, с первоначальным доминированием дальнейшей биологической модальности, ее ключевой алгоритм лабильности и вероятной аградации организма в стресс-индуцированное патологическое состояние. (Григорян, Г.А. Стресс-реактивность и стресс-устойчивость в патогенезе депрессивных расстройств: роль эпигенетических механизмов / Г.А. Григорян, Н.В. Гуляева // Журнал высшей нервной деятельности им. И.П. Павлова.-2015. - Т. 65, №1.- С.19-23. В процессе исследования поведения применяют биологические модели стресса в разнообразных формах с обширным списком поведенческих тестов и средств изучения поведенческих показателей (Умрюхин, А.Е. Микродиализное исследование мозговых нейрохимических механизмов результативного поведения активных и пассивных крыс / А.Е. Умрюхин // Здоровье, демография, экология фино-угорских народов. - 2015. - №4. - С. 56-58.) (Four factors underlying mouse dehavior in an open fieid / S. Tanaka, J.W. Younh, A.L. Halberstad [et al.] // Behavioural Brain Research. - 2012. - T. 223, №1. - P. 55-60.).
В последнее время была создана группа стандартных тестов используемых для поведенческого фенотипирования включающий более 40 пунктов и является незаменимым при исследовании морфологических дефектов и сбоев в нервно-мышечной, вегетативной и сенсорной системах организма мелких лабораторных животных (Brown R.E., Stanford L., Schellinck H.M. Developing standardized behavioral tests for knockout and mutant mice // ILAR J. 2000. V. 41. P. 163-172.) (Crawley J.N. Behavioral phenotyping strategies for mutant mice // Neuron. 2008. Vol. 57. P. 808-818.)
Цель изобретения - создание максимально объективного способа позволяющего получить данные о поведении и физическом состоянии мелких лабораторных животных для выявления специфического влияния некоторых лекарственных средств и химических соединений на организм, путем разработки экспериментальных условий, в которых животные подвергаются принудительному нерефлекторному поведению, но при этом исключающий воздействие болезненных физических раздражителей.
Поставленная цель достигается тем, что опытной группе мелких лабораторных животных перед проведением исследования вводят исследуемое химическое соединение. Контрольная группа получает в аналогичной дозе нейтральное вещество. Затем проводят замер расстояния, пройденного животными из экспериментальной и контрольной групп за определенный промежуток времени. Также подсчитывают количество пристеночных стоек (с опорой на стенки ящика передними лапами), количество стоек без опоры (подъем на задние лапы) и количество дефекаций. Движение регистрируют с помощью камер видеофиксации, физическое состояние с помощью тепловизора. Сравнивают поведенческие показатели животных из экспериментальной и контрольной групп и по результатам судят о степени воздействия специфического влияния некоторых лекарственных средств и химических соединений, на организм мелких лабораторных животных.
Для достижения поставленной цели каждое животное поочередно помещают на искусственно созданную горизонтальную площадку, расположенную в ящике (Фиг. 1) длиной 800 мм, шириной 800 мм, высотой боковых стенок 300 мм и бортиком высотой 5 мм, расположенном по периметру дна ящика. Горизонтальную площадку готовят следующим образом: ящик [1] устанавливают на ножки [2] и заполняют слоем мелкого обогащенного песка с Мк 1,5-2,0 (ГОСТ 8736-2014), затем на ящике опускают боковые стенки [3] и при помощи правила выравнивают поверхность ровно по граням бортика [4]. Излишки песка, которые выступают выше уровня бортика, при этом падают вниз, где по стенкам воронки [5] ссыпаются в резервуар [6] для сбора излишков песка. Пятимиллиметровый слой обогащенного мелкого песка обусловлен тем, что при толщине слоя больше 5 мм животное начинает зарываться в песок, а при слое меньше 3 мм животное при резком движении скользит по площадке. Затем стенки ящика поднимают и закрепляют, после чего на площадку помещают животное. Незнакомая (аверсивная) среда песочной площадки побуждает животное к проявлению активного поведения. При помощи камеры видеофиксации проводят съемку площадки, где находится животное. После окончания исследования проводят просмотр видеозаписи в замедленном режиме во время, которого проводят подсчет пройденного расстояния, количество пристеночных стоек, количество стоек (подъем на задние лапы), количество дефекаций. Для определения изменения температурных показателей тела используют тепловизор.
Примеры конкретного выполнения. Исследование эффективности предложенного способа проводились на белых не линейных мышах в возрасте 4 месяцев (самцы) массой тела 20-23 г. В эксперименте использовались 2 группы животных: контрольная (n=10) и опытная(n=10). Работа выполнена в соответствии с «Правила проведения лабораторной практики в Российской Федерации» (приказ Министерства здравоохранения РФ от 01.04.2016 года №199).
Пример 1. Опытной группе белых беспородных мышей в возрасте 4 месяцев с массой тела 20-23 г за час до проведения исследования добровольно давали раствор креатин моногидрата в дозе 5 мл/кг (патент РФ №2634373). Контрольная группа получала подслащенную воду в эквивалентной дозе и в те же сроки. В опыте проводился замер расстояния, пройденного животным за 3 минуты и количество пристеночных стоек (с опорой на стенки ящика передними лапами), количество стоек без опоры и количество дефекаций за 10 минут.
Пример 2. При изучения влияния химических соединений на физическое состояние и поведение мелких лабораторных животных путем сбора поведенческих параметров с целью обнаружения сбоев в работе центральной нервной системы применялся 20% водный раствор этилового спирта вводимый животным за 30 минут до начала опыта внутрижелудочно (таблица №2). В опыте на белых беспородных мышах массой тела 20-23 г в возрасте 4 месяцев за полчаса до проведения исследования опытной группе внутрижелудочно через зонд вводили 20% водный раствор этилового спирта в количестве 5 мл/кг. Контрольная группа получала дистиллированную воду в эквивалентных объемах и в те же сроки. В опыте проводился замер расстояния, пройденного животным за 3 минуты и количество пристеночных стоек (с опорой на стенки ящика передними лапами), количество стоек без опоры и количество дефекаций за 10 минут.
Пример 3. В опыте на белых беспородных мышах массой тела 20-23 г в возрасте 4 месяцев за 30 минут до проведения исследования опытной группе внутрижелудочно через зонд вводили 20% водный раствор этилового спирта в количестве 10 мл/кг. Контрольная группа получала дистиллированную воду в эквивалентных объемах и в те же сроки. В опыте проводился замер расстояния, пройденного животным за 3 минуты и количество пристеночных стоек (с опорой на стенки ящика передними лапами), количество стоек без опоры и количество дефекаций за 10 минут.
Представленные примеры наглядно иллюстрируют возможности предложенного способа в получении данных, интерпретация которых позволяет оценить физическое состояние и общее поведение мелких лабораторных животных в эксперименте.
Предложенный способ позволяет проводить комплексное исследование поведенческих характеристик мелких лабораторных животных с целью обнаружения нарушений при исследовании специфического влияния некоторых лекарственных средств и химических соединений на организм мелких лабораторных животных, при этом животное не подвергается воздействию болезненных физических раздражителей.
Способ дешев, прост в применении, в ряде случаев позволяет получить некоторые данные без привлечения каких либо средств и приборов регистрации, таких например, как просмотр и сравнительный анализ картины следов отображенных на песке, а так же подсчет количества дефекаций и мочеиспусканий.