Конъюгаты пептида и полиаминокислоты, связывающие фактор роста эндотелия сосудов
CONJUGATES OF PEPTIDE AND POLYAMINO ACID, BINDING VESSEL ENDOTHELIUM GROWTH FACTOR

Область, к которой относится изобретение.
Изобретение относится к соединениям, которые обладают высокой аффинностью к фактору роста эндотелия сосудов. В частности, изобретение относится к конъюгатам пептидов, связывающих фактор роста эндотелия сосудов, и полиаминокислот, а также к методам их получения и применения.
Предшествующий уровень техники.
Ангиогенез представляет собой один из фундаментальных процессов, который отвечает за формирование сосудов и является жизненно важным для нормального развития и поддержания жизнедеятельности живых организмов. Основным регулятором ангиогенеза является фактор роста эндотелия сосудов (VEGF). При патологическом ангиогенезе нерегулируемая экспрессия данного белка приводит к ряду заболеваний, таких как артрит, псориаз, возрастная макулярная дегенерация. Кроме того, патологический ангиогенез часто наблюдается при развитии онкологических заболеваний и сопровождает рост опухолей и их метастазов.
Для лечения патологического ангиогенеза, помимо низкомолекулярных соединений, наиболее широко используются ингибиторы эндогенного VEGF, такие как антитела к VEGF (Бевацизумаб, Пегаптаниб) и так называемые «растворимые» рецепторы (Афлиберсепт). Однако их небольшая стабильность по отношению к ферментативному расщеплению, быстрое выведение, необходимость частых инъекций и риск осложнений сильно ограничивают их применение в антиангиогенной терапии [1, 2].
n
С этой точки зрения пептиды имеют ряд преимуществ, так как могут быть легко получены и модифицированы для увеличения протеолитической стабильности с одновременным сохранением VEGF-связывающей активности. Например, Fairbrother и Haase описали ряд коротких циклических спиральных пептидов, способных связывать VEGF, в частности, v114 и v114* (VEPNCDIHVMWEWECFERL и VEPNCDIHVLWEWECFERL, Seq ID NO: 1 и Seq ID NO: 2, соответственно) [3, 4].
n
n
D
D
В заявке на патент Гурьянов и др. [5] пептид v114* был модифицирован путем введения в его структуру остатка α-аминоизобутановой кислоты, увеличившей как его аффинность к VEGF за счет уменьшения подвижности структуры, так и его устойчивость к действию ферментов. Из ряда пептидов на основе v114* наиболее высокое сродство к VEGF и стабильность по отношению к протеолитическому расщеплению показали пептиды Aib2 (VAibPNCDIHVLWEWECFERL, Seq ID NO: 3) и kv114* (KAibKKCDIHVLWEWECFERL, Seq ID NO: 4) с K=0.004 μM (с преинкубированием) и K=0.054 μМ (без преинкубирования), соответственно. Несмотря на схожесть структуры и наличие у пептида kv114* остатка α-аминоизобутановой кислоты в том же положении, что и у Aib2, он имел менее выраженную аффинность к VEGF. Одной из причин этого может быть электростатическое взаимодействие и отталкивание положительно заряженных остатков лизина N-конца и, как следствие, дестабилизация его пространственной структуры, необходимой для связывания фактора роста эндотелия сосудов.
Известно, что конъюгирование с полимерными структурами, которые способны взаимодействовать с заряженными группами боковых функциональных групп аминокислот, может стабилизировать спиральную конформацию пептидов [6]. Полиаминокислоты как стабилизаторы вторичной структуры пептидов представляют особый интерес из-за их биосовместимости и легкости функционализации. Кроме того, введение в их структуру непротеиногенных аминокислот позволяет существенно увеличить их устойчивость к ферментативному расщеплению [7]. В частности, ранее были описаны амфифильные полиаминокислоты, содержащие глутаминовую кислоту и D-фенилаланин, которые обладали высокой стабильностью в присутствии протеолитических ферментов [8].
Несмотря на высокую VEGF-связывающую активность описанных в прототипе пептидов Aib2 и kv114*, которая выше, чем у исходного родоначального пептида v114*, они имеют ряд недостатков. Наиболее существенным недостатком описанного в [5] известного пептида Aib2 является его невысокая растворимость при рН ниже 8. Наличие большого количества отрицательно заряженных карбоксильных групп и общий отрицательный заряд вызывают агрегирование пептида при понижении рН и, как следствие, уменьшение его эффективной концентрации в системе. Кроме того, его получение затрудняет присутствие в структуре аминокислотной последовательности Aib-Pro, которая образует β-поворот и имеет склонность к легкому отщеплению в виде дипептида после снятия защитной группы с аминогруппы α-аминоизобутановой кислоты в ходе пошагового твердофазного синтеза. Вследствие этого, наряду с целевым продуктом синтеза, образуется примесь, состоящая из соответствующего укороченного пептида, которую сложно отделить существующими методами, в частности, с помощью препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии. В отличие от Aib2, пептид kv114* не имеет этих ограничений, однако его наиболее существенным недостатком является невысокая аффинность к VEGF. Таким образом, желательным является увеличение VEGF-связывающей активности пептида kv114*.
Заявляемое изобретение описывает конъюгаты пептида kv114* и полиаминокислот на основе глутаминовой кислоты и D-фенилаланина с улучшенной VEGF-связывающей активностью, по сравнению со свободным пептидом kv114*. Технической задачей, лежащей в основе изобретения, является увеличение аффинности пептида kv114* к фактору роста эндотелия сосудов. Было обнаружено, что комбинирование данных полиаминокислот с пептидом kv114*, приводит к существенному увеличению аффинности полученных конъюгатов до уровня коммерчески используемого ингибитора VEGF.
Заявленное изобретение поясняется Фиг. 1-11, на которых представлены физико-химические харктеристики описываемых соединений и их VEGF-связывающая активность:
Фиг. 1: Структура пептидов v114 (Seq ID NO: 1) и v114* (Seq ID NO: 2).
Фиг. 2: Структура пептидов Aib2 (A, Seq ID NO: 3) и kv114* (В, Seq ID NO: 4).
Фиг. 3: Структура пептида VN (Seq ID NO: 5).
Фиг. 4: ВЭЖХ хроматограмма пептида kv114* (Seq ID NO: 4).
Фиг. 5: ВЭЖХ хроматограмма пептида Aib2 (Seq ID NO: 3).
Фиг. 6: ВЭЖХ хроматограмма пептида VN (Seq ID NO: 5).
Фиг. 7: Содержание пептидов в конъюгатах.
Фиг. 8: Зависимость количества комплексов VEGF-Бевацизумаб, выраженного в значениях нормализованной флуоресценции, от концентрации Бевацизумаба.
Фиг. 9: Зависимость количества комплексов VEGF-пептид от концентрации пептида в системе: А - Ef1-Aib2; В - Ef2-Aib2; С - Ef1-kv114*; D - Ef2-kv114*; Е - Ef1-VN.
Фиг. 10: Зависимость количества комплексов VEGF-Ef1, выраженного в значениях нормализованной флуоресценции, от концентрации полиаминокислоты.
Фиг. 11: Сравнение констант диссоциации комплексов фактора роста эндотелия сосудов с конъюгатами пептид-полиаминокислота.
Описание изобретения
Определения
Название «аминокислота» относится к природным и искусственным соединениям, имеющим как минимум одну аминогруппу и как минимум одну карбоксильную группу. α-Аминокислоты имеют один атом углерода между аминогруппой и карбоксильной группой и могут связываться между собой с образованием ковалентной пептидной (амидной) связи.
Полиаминокислота является синтетическим полимером, состоящим из повторяющихся аминокислотных единиц и являющимся смесью гомологов с различной степенью полимеризации. Полиаминокислоты могут быть получены различными методами, широко известными в литературе, например, полимеризацией с раскрытием кольца N-карбоксиангидридов в присутствии амина как инициатора.
Пептид представляет собой индивидуальное соединение, состоящее из аминокислот, соединенных амидной связью и чередующихся в четко определенном порядке. Пептиды могут быть получены с помощью пошагового присоединения аминокислот, например, с помощью твердофазного метода или путем синтеза в растворе.
D
«Связывание» или аффинность определяется как способность описанных в данном изобретении соединений образовывать комплекс с другим соединением, в данном случае с VEGF. Пептиды в данном изобретении связывают VEGF с констатной диссоциации (K) предпочтительно меньше, чем 3 μМ, более предпочтительно, меньше, чем 0.03 μМ, еще более предпочтительно, меньше, чем 0.01 μМ.
Получение пептидов, содержащих α-аминоизобутановую кислоту, и сополимеров глутаминовой кислоты (Е) и D-феншаланина (f)
Пептиды Aib2 и kv114*, содержащие α-аминоизобутановую кислоту, а также пептид VN, используемый в качестве сравнения и не содержащий Aib, могут быть получены различными методами, широко известными специалистам в этой области, например, как как описано в [5]. В данном изобретении пептиды были получены твердофазным методом на Ринк-амидной смоле, циклизованы с образованием дисульфидной связи в щелочной среде и очищены с помощью ВЭЖХ.
Получение сополимеров глутаминовой кислоты (Е) и D-фенилаланина (f) осуществлялось с помощью полимеризации N-карбоксиангидридов, как описано в [8]. Карбоксиангидриды γ-бензилглутаминовой кислоты и D-фенилаланина смешивались в определенных пропорциях и образовывали полиаминокислоту при добавлении инициатора н-гексиламина. Затем боковые защитные группы глутаминовой кислоты были деблокированы путем обработки раствором трифторметансульфокислоты в трифторуксусной кислоте с выделением свободной полиаминокислоты (Ef). Соотношение аминокислот в полиаминокислоте определяли путем полного гидролиза и ВЭЖХ анализа полученной смеси. В данном изобретении полиаминокислоту использовали в виде полимерных частиц, которые получали путем инверсии градиентной фазы (диализа) и далее использовали для присоединения пептидов.
Получение конъюгатов полиаминокислоты и пептида
Конъюгирование пептидов проводили карбодиимидным методом с преактивирования карбоксильных групп полиаминокислоты с использованием смеси EDC/NHS и последующим введением пептида. Содержание пептида в полиаминокислоте определяли спектрофотометрически с предварительным построением калибровочной кривой с использованием свободного пептида. Данные показывают, что эффективность конъюгирования карбодиимидным методом довольно высокая и составляет в среднем 25-75% от количества введенного в смесь пептида.
Определение VEGF-связывающей активности пептидов.
Данные по исследованию заимодействия полиаминокислоты, пептидов и конъюгатов полиаминокислота-пептид, полученные методом микроскопического термофореза (МСТ) показывают, что присоединение пептида во всех случаях увеличивает VEGF-связывание, по сравнению с полиаминокислотой без пептида (Таблица 1).
D
Использование Aib-содержащих пептидов дополнительно увеличивает аффинность конъюгата пептид-полиаминокислота по сравнению с пептидом, содержащим только протеиногенные аминокислоты, с соответствующим уменьшением K, что согласуется с [5]. В случае анионного пептида Aib2 присоединение к полиаминокислоте Ef, содержащей большое количество карбоксильных групп, уменьшает VEGF-связывание, по сравнению со свободным пептидом, по всей видимости, вследствие электростатического взаимодействия и дестабилизации структуры, в отличие от катионного пептида kv114*, стабилизированного за счет этого взаимодействия (Фиг. 10). При этом аффинность конъюгатов полиаминокислота-пептид к VEGF значительно меньше аффинности свободного пептида kv114* и в случае конъюгата с полиаминокислотой Ef1 с соотношением E/f 3:1 близка к значению, полученному для коммерческого препарата на основе анти-VEGF антитела (Бевацизумаб) и свободного пептида Aib2.
Таким образом, как показывают приведенные результаты апробации, заявленное изобретение позволяет решить задачу увеличения аффинности VEGF-связывающего пептида kv114* путем его конъюгации с анионной полиаминокислотой. Данный пептид, в отличие от родственного пептида Aib2, описанного в прототипе, имеет более предпочтительные для использования физико-химичесткие и структурные характеристики, в частности, высокую растворимость во всем диапазоне физиологических значений рН и его стандартный твердофазный синтез не представляет проблем. Результатом конъюгирования является достижение более высокой аффинности к VEGF, по сравнению со свободным пептидом kv114*, которая близка к аффинности коммерчески используемых антител и пептида Aib2, позволяя избежать присущих им недостатков, в частности, невысокой ферментативной устойчивости в случае антител и агрегирования при рН ниже 8 у Aib2, что позволяет рассматривать данные конъюгаты как перспективные соединения для создания ингибиторов VEGF.
Используемые общепринятые сокращения
Примеры
Материалы
Carbosynth (Berkshire, UK): HATU
IRIS Biotech (Marktredwitz, Germany): смола Ринка, Fmoc-защищенные аминокислоты, HBTU
Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, USA): ацетонитрил, трифторуксусная кислота, бикарбонат аммония, дихлорметан, диметилформамид, диэтиловый эфир, метанол, VEGF-A
Твердофазный синтез пептидов.
Синтез пептидов, их циклизацию и очистку с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии проводили, как описано ранее [5].
Получение сополимеров глутаминовой кислоты и D-фенилаланина
Амфифильные полипептиды были синтезированы путем полимеризации с раскрытием цикла N-карбоксиангидридов аминокислот (NCA) как описано ранее [8]. Навески мономеров отдельно растворяли в соответствии с заданным соотношением с получением конечного раствора в свежеперегнанном тетрагидрофуране с суммарной концентрацией 4%. Затем добавляли раствор инициатора (н-гексиламина) в тетрагидрофуране до достижения соотношения мономеры/инициатор = 100. Полимеризационную смесь инкубировали при 25°C при перемешивании. Через 48 ч продукт осаждали диэтиловым эфиром и осадок отделяли центрифугированием, трижды промывали диэтиловым эфиром и сушили в вакууме. Молекулярные массы полиаминокислот определяли методом ГПХ с использованием тандема из двух колонок Agilent PLgel MIXED-D (7,5 мм × 300 мм, 5 мкм) на приборе Shimadzu LC-20 Prominence с рефрактометрическим детектором RID 10-А. Анализ проводили в 0.1 М растворе LiBr в диметилформамиде в качестве элюента при скорости потока подвижной фазы 1 мл/мин и температуре 40°C. Молекулярно-массовые характеристики рассчитывали с помощью программы GPC LC Solutions с испрользованием калибровочной кривой со стандартом РММА различной молекулярной массы.
Удаление бензильной защитной группы с у-карбоксила глутаминовой кислоты проводили с использованием смеси TFMSA/TFA в соотношении 1/10 при 25°C в течение 3 ч. Сополимеры со снятой защитой затем осаждали диэтиловым эфиром, и осадок отделяли центрифугированием. Полученный осадок трижды промывали диэтиловым эфиром и сушили в вакууме.
Состав сополимеров определяли с помощью ВЭЖХ анализа свободных аминокислот с рефрактометрическим детектором RID-20A на приборе LC-20 Shimadzu. Для этого образцы сополимера гидролизовали до свободных аминокислот и анализировали, как описано в [9] (Таблица 2).
Полимерные частицы получали путем инверсии градиентной фазы (диализа) как описано в [8].
Получение конъюгатов полиаминокислоты и пептида
К 1 мг сухих частиц на основе полиаминокислоты добавляли 1 мл 0.1 М фосфатно-солевого буферного раствора, рН 7.4, и перемешивали с использованием Votrex-Genie-2 с максимальной скоростью перемешивания. Полученную смесь обрабатывали ультразвуком с использованием ультразвукового гомогенизатора SONICS Vibra-Cell™ VCX 500 в течение 15 секунд на 20% мощности. После этого суспензию 1.5 часа перемешивали со скоростью 750 об/мин с использованием инкубационного бокса Heidolph Incubator 1000, соединенного с шейкером Heidolph Unimax 1010.
Далее проводили активацию карбоксильных групп глутаминовой кислоты в составе частиц. Для этого к охлажденной до 5°C суспензии наночастиц полиаминокислоты в концентрации 1 мг/мл в 0.1М MES буферном растворе с рН 5.6 добавляли 0.7 мг 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (мольное соотношение по отношению к карбоксильным группам 1/1) в 100 ил MES-буфера 5.6. Через 5 минут к полученной суспензии добавляли 0.5 мг (мольное соотношение по отношению к карбоксильным группам 1/1) N-гидроксисукцинимида в 100 ил того же буфера, перемешивали с использованием Votrex-Genie-2 с максимальной скоростью перемешивания и оставляли на 1.5 часа при температуре 5°C. Далее с помощью пробирок-концентраторов Amicon Ultra 0.5 (MWCO: 5 000; 7000xg, 8 мин, 3 раза) и центрифуги SIGMA 2-16 РК проводили смену растворителя в суспензии с MES-буфера на 0.1 М боратный буферный раствор с рН 8.5. После смены буферного раствора, суспензия частиц (1 мл, 1 мг/мл) с активированными карбоксильными группами была обработана ультразвуком в течение 5 секунд. К полученной суспензии добавляли раствор 300 мгк пептида в 100 ил боратного буферного раствора. Реакцию связывания пептида проводили в течение 8 часов при температуре 250 (Heidolph Incubator 1000) при перемешивании (350 об/мин, Heidolph Unimax 1010). После окончания реакции несвязанный пептид был отделен от конъюгата с использованием пробирок-концентраторов Amicon Ultra 0.5 (MWCO: 5 000; 3000xg, 10 мин, 3 раза).
Определение количества конъюгированного пептида
4
2
2
3
Для определения концентрации связанного пептида в составе конъюгата использовали метод Лоури-Фолина [10]. Для этого 0.2 мл исследуемого раствора конъюгата смешивали с 0.8 мл раствора, содержащего 1 часть 0.5% CuSO⋅5HO в 1% растворе цитрата натрия и 50 частей 2% NaCO в 0.1 М NaOH. Через 10 минут к полученной системе добавляли коммерческий реактив Фолина-Чокальтеу, смесь активно перемешивали и оставили на 40 минут при комнатной температуре. Измеряли оптическую плотность растворов синего цвета при длине волны 750 нм. Для нивелирования влияния самих частиц на определение концентрации пептида в качестве холостого опыта использовали суспензию частиц с аналогичной концентрацией частиц аминокислоты. Определяли концентрацию пептида в растворе с использованием предварительно построенной калибровочной зависимости.
Определение VEGF-связывающей активности конъюгатов
Аффинность связывания конъюгатов пептидов и полиаминокислот с VEGF определяли с использованием метода микроскопического термофореза (МСТ) [11]. Для исследования использовали прибор NanoTemper Monolith NT. 115 Pico, флуоресцентно меченный белок VEGF-RED с исходной концентрацией 12 ммоль/л и капилляры серии Premium. Связывание метки (NHS-RED) с молекулой белка VEGF проводили согласно стандартному протоколу [12]. Измерения взаимодействия проводили при постоянной концентрации VEGF-RED (1 нМ), варьируя концентрацию конъюгата пептида и полиаминокислоты в диапазоне от 50 μМ до 0.5 нМ. Настройка интенсивности инфракрасного (ИК) лазера происходила в автоматическом режиме. Взаимодействие конъюгат-VEGF детектировали, изучая изменение флуоресценции комплекса конъюгат-белок под воздействием ИК-лазера, которое пропорционально термофоретической подвижности меченного белка молекул. Для обсчета полученной кривой использовалось лицензированное программное обеспечение компании NanoTemper - МО Affinity Ananlysis. На Фиг. 8 представлена зависимость количества комплексов VEGF-Бевацизумаб, выраженного в значениях нормализованной флуоресценции, от концентрации Бевацизумаба. На Фиг. 9 представлены данные по зависимости количества комплексов VEGF-пептид от концентрации пептида. На Фиг. 10 представлены данные по зависимости количества комплексов VEGF-полиаминокислота, выраженного в значениях нормализованной флуоресценции, от концентрации полиаминокислоты. На Фиг. 11 представлены данные по значениям констант диссоциации комплексов VEGF с конъюгатами полиаминокислота-пептид.
Список использованных источников информации
[1] Glade-Bender et al. Expert Opin. Biol. Ther. 2003, 3, 263-276
[2] Supuran. Expert Opin. Ther. Pat. 2019, 29, 761-767; Holash et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 2002, 99,11393-11398
[3] Fairbrother et al. Biochemistry 1998, 37, 17754-17764
[4] Haase et al. J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 7652-7655
[5] Заявка на выдачу патента (Решение о выдаче патента №2019145386 от 27.10.2020 (Заявитель: Федеральное гоучреждение СПбГУ;. авторы: Гурьянов И.А.; Коржиков-Влах В.А.; Коржикова-Влах Е. Г.; Тенникова Т.Б.) - Прототип
[6] Jain et al. Biomacromolecules 2011, 12, 2729-2734
[7] Tarasenko et al RCSAdv. 2018, 8, 34603-34613
[8] Iudin et al. Pharmaceutics 2020, 12, 868
[9] Osipova et al Pharmaceutics 2020, 12, 39
[10] Досон P. Справочник биохимика. M.: Мир. 1991
[11] Wienken et al. Nat. Commun. 2010, 1, 100
[12] Jerabek-Willemsen et al. Assay Drug. Dev. Technol. 2011, 9, 342-353