Способ диагностики болезни Виллебранда (Субтип 2N)
METHOD FOR VON WILLEBRAND DISEASE (SUBTYPE 2N) DIAGNOSTICS

Изобретение относится к области медицины, в частности исследованию крови, и может быть использовано для диагностики болезни Виллебранда (БВ).
В основе клинических проявлений БВ лежат рецидивы кровотечений разных локализаций вследствие недостаточности фактора Виллебранда (ФВ).
БВ разделяют на три типа, кроме того, второй тип этой патологии принято разделять на несколько субтипов [Colman R.W., Hirsh J., Marder V.J. Hemostasis and Thrombosis: Basic Principles and Clinical Practice, 3rd ed. Philadelfia, J.B. Lippincott. 1994. - P. 3-18; Мамаев A.H. Коагулопатии. - M.: Геотар-Медиа. 2012. - 264 с.]. Наиболее проблемным для диагностики является субтип 2N, поскольку этот вариант проявляется существенным снижением коагуляционного фактора VIII (FVIII:C), что затрудняет его дифференциацию от гемофилии у лиц мужского пола.
Известен способ диагностики БВ, основанный на определении ристоцетин-кофакторной активности ФВ в плазме крови [Мамаев А.Н. Практическая гемостазиология. - М.: Практическая медицина, 2014. - 240 с.]. Однако известный способ пригоден для обнаружения 3-го типа БВ, но не пригоден для диагностики субтипа 2N, поскольку в большинстве случаев он не выявляет этот вариант заболевания.
Наиболее близким по достигаемому положительному результату (прототипом) является способ диагностики БВ, заключающийся в том, что для обнаружения 2N субтипа заболевания используют информацию о нарушении выраженности специфического связывания молекул ФВ с антителами к FVVIII:C [Casanato A., Pontara Е., Zerbinati P. et al. The evaluation of factor VIII binding activity of von Willebrand factor by means of an ELISA method: significance and practical implications. Am J Clin Pathol. 1998; 109. - Р. 347-352]. Однако недостатком известного способа является необходимость использования специального оборудования и дорогостоящих реактивов для осуществления иммуноферментного анализа.
Авторы предлагают способ, в котором технический результат достигается тем, что диагностика БВ (субтипа 2N) осуществляется при помощи тромбоэластографии и двух инфузий концентрата ФВ, который не содержит в своем составе FVIII:C. После двухкратной инфузий концентрата ФВ в кровь больного с субтипом 2N БВ происходит нормализация показателей тромбоэластограммы за счет восстановления FVIII:C, а у других пациентов, имеющих коагулопатию иного генеза (в том числе гемофилию), подобного восстановления не происходит.
Техническим результатом заявляемого способа является простота его выполнения за счет использования широко распространенного метода исследования - тромбоэластографии, отсутствие необходимости использования дорогостоящих реагентов импортного производства для иммуноферментного анализа, отсутствие необходимости этапа приготовления бедной тромбоцитами плазмы для исследования (нет необходимости центрифугировать кровь, т.к. используется цитратная кровь), а также расширение диагностических возможностей технологии тромбоэластографии.
Способ осуществляют следующим образом.
У пациента с подозрением на наличие субтипа 2N БВ (например, пациенту с неуточненным снижением FVIII:C) в день обращения следует выполнить тромбоэластографию цитратной крови (результат рекальцификации маркируют СТ1), после этого дважды (в день обращения и через 24 часа после первой внутривенной инфузий) применяют (внутривенно, струйно) высокоочищенный концентрат ФВ в дозе 40-50 МЕ/кг. Через 48 часов после первого введения высокоочищенного концентрата ФВ повторно определяют тромбоэластографию цитратной крови (результат рекальцификации маркируют СТ2) и рассчитывают отношение Ratio. При показателе Ratio более 1,3 диагностируют наличие у пациента БВ (субтип 2Т).
Реактивы и оборудование:
1. Вакуумные пробирки для забора крови, содержащие в качестве антикоагулянта 3,2% (0,109 моль/л) цитрат натрия (например, VACUETT, производитель Greiner Bio-One, Австрия), соотношение кровь+цитрат соответствует 9+1.
2. Тромбоэластограф «Rotem» (или аналогичные). В качестве реагента для определения времени рекальцификации при записи тромбоэластографии необходимо использовать Кальция хлорид (концентрированный раствор; 5,4%), 10 мл - во флаконе, производитель ООО фирма «Технология-Стандарт» (Барнаул), каталожный номер 022.
3. Концентрат фактора Виллебранда, который не содержит в своем составе FVIII:C, например WILFACTIN (LFB BIOMEDICAMTNTS) или аналогичные.
4. Дозаторы лабораторные на 0,02 и переменного объема 0,1-1,0 мл.
5. Вода дистиллированная.
6. Перчатки медицинские диагностические одноразовые.
Приготовление исследуемых образцов крови, концентрата ФВ, раствора кальция хлорида:
Приготовление исследуемой крови. Забор крови осуществляется дважды. Первый раз до введения концентрата ФВ, второй раз через 48 часов после первого введения концентрата ФВ. Оба раза кровь получают из локтевой вены иглой без жгута при помощи вакуумной пробирки для забора крови VACUETTE, содержащей в качестве антикоагулянта 3,2% (0,109 моль/л) цитрат натрия. Для определения времени рекальцификации при выполнении тромбоэластографии нет необходимости центрифугировать кровь. Исследование рекальцификации необходимо выполнить не позднее 4-х часов после забора крови.
Приготовление раствора для определения рекальцификации. Для приготовления рабочего раствора кальция хлорида в день исследования концентрированный раствор кальция хлорида развести дистиллированной водой в 1,33 раза (1 объем концентрированного раствора + 0,33 объема воды), например 1,0 мл концентрированного раствора смешать с 0,33 мл дистиллированной воды. Так получают 4,16% рабочий раствор кальция хлорида для записи тромбоэластограммы.
Приготовление раствора концентрата ФВ. Флаконы растворителя и лиофильно высушенного концентрата ФВ прогреть до комнатной температуры. Удалить защитные крышки с флаконов лиофилизата ФВ и растворителя, продезинфицировать резиновые пробки флаконов одной из дезинфицирующих салфеток. Короткий конец двухконцевой иглы освободить от пластиковой упаковки, проткнуть им в центре пробку флакона с растворителем и надавить вниз до упора. Перевернуть флакон с растворителем вместе с иглой, освободить длинный конец двухконцевой иглы от пластиковой упаковки, проткнуть им в центре пробку флакона с лиофилизатом и надавить вниз до упора. Вакуум во флаконе с лиофилизатом втянет воду. Пустой флакон от растворителя отделить вместе с иглой от флакона с лиофилизатом. Препарат быстро растворится, для этого флакон необходимо слегка покачивать.
Ход определения:
1. Определение времени рекальцификации крови при помощи тромбоэластографии до инфузий концентрата ФВ (СТ1).
Для определения показателя СТ1 используют образец крови, полученный в день обращения (до введения концентрата ФВ). После включения прибора ROTEM необходимо оставить его на 20 мин для достижения рабочей температуры, программное обеспечение при этом запускается автоматически. В меню «измерение» нужно выбрать первый канал нажатием соответствующего пункта меню или клавишей F1. Добавить 0,3 мл крови в измерительную кювету тромбоэластографа. Добавить дозатором 0,02 мл рабочего раствора кальция хлорида, нажать кнопку СТАРТ и поместить кювету для измерения на соответствующий держатель №1. После этого на экране вместо формы введения демографических данных появляется график тромбоэластограммы. Дождаться записи графика тромбоэластограммы и вычисления расчетных показателей. Полученный показатель СТ обозначить как СТ1.
2. Внутривенное введение раствора концентрата ФВ.
Внутривенное введение раствора концентрата фактора Виллебранда проводится дважды медленно (2 мл в течение минуты) при помощи шприца. Доза 40-50 МЕ/кг массы тела. Первый раз внутривенная инфузия концентрата ФВ (40-50 МЕ/кг) выполняется в день обращения после определения показателя СТ1, второй раз (40-50 МЕ/кг) через 24 часа после первого введения концентрата.
3. Определение времени рекальцификации при помощи тромбоэластографии после двукратной инфузий концентрата ФВ (СТ2). Для определения показателя СТ2 используют образец крови, полученный после двухкратной инфузий концентрата ФВ (т.е. через 48 часов после первой инъекции концентрата ФВ). После включения прибора ROTEM необходимо оставить его на 20 мин для достижения рабочей температуры, программное обеспечение при этом запускается автоматически. В меню «измерение» нужно выбрать первый канал нажатием соответствующего пункта меню или клавишей F1. Добавить 0,3 мл крови в измерительную кювету тромбоэластографа. Добавить дозатором 0,02 мл рабочего раствора кальция хлорида, нажать кнопку СТАРТ и поместить кювету для измерения на соответствующий держатель №1. После этого на экране вместо формы введения демографических данных появляется график тромбоэластограммы. Дождаться записи графика тромбоэластограммы и вычисления расчетных показателей. Полученный показатель СТ обозначить как СТ2.
Оценка полученных результатов:
Определяют отношение Ratio исследуемого больного по формуле:
;
где Ratio - математическое отношение показателя времени рекальцификации крови (при записи тромбоэластограммы) до и после двухкратной инфузий концентрата ФВ;
СТ1 - показатель рекальцификации крови (при записи тромбоэластограммы) до инфузий концентрата ФВ;
СТ2 - показатель рекальцификации крови (при записи тромбоэластограммы) после двухкратной инфузий концентрата ФВ;
При отсутствии у пациента субтипа 2N БВ время рекальцификации существенно не изменится, показатель Ratio будет менее 1,3. У больных с болезнью Виллебранда (субтип 2N) при введении концентрата фактора Виллебранда значительно уменьшится время рекальцификации при записи тромбоэластграфии за счет нормализации FVIII:C, поэтому показатель Ratio будет более 1,3.
Результаты теста считаются положительными, если R более 1,3.
Специфичность и воспроизводимость способа
Введенный внутривенно высокоочищенный или рекомбинантный концентрат ФВ сам по себе не способен изменить параметры тромбоэластограммы (например, при гемофилии), поскольку ФВ прямо не участвует в коагуляции. Однако появление в крови у больного с субтипом 2N БВ после двукратной инфузий нормального ФВ восстановит отсутствующий FVIII:C в течение суток. Именно поэтому заявляемый способ высоко специфичен, т.к. в применяемом концентрате нет FVIII:C, а восстановление FVIII:C идет за счет прекращения его разрушения в течение двух суток после применения концентрата ФВ.
Кроме того, выполнение заявляемого способа не требует применения импортных реагентов для иммуноферментного анализа, он отличается простотой и широкой доступностью за счет использования распространенного метода исследования - тромбоэласторафии. Позитивными эффектами заявляемого способа является отсутствие необходимости этапа приготовления бедной тромбоцитами плазмы для исследования (нет необходимости центрифугировать кровь, т.к. используется цитратная кровь), а также расширение диагностических возможностей технологии тромбоэластографии.
Для оценки воспроизводимости способа использовали определение коэффициента вариации (в %) при многократном исследовании одних и тех же образцов нормальной плазмы и плазмы больных с БВ. Заявляемый способ показал хорошую воспроизводимость. Коэффициент вариации (KB) не превышал 8%.
Апробация предлагаемого способа
Апробацию заявляемого способа диагностики провели на больных с геморрагическим синдромом. Диагностировали БВ (2N субтип) у трех больных. У одного мужчины (Ratio - 1,9) и двух женщин (Ratio - 1,7 и 1,8). При этом мужчина, имеющий снижение FVIII:C и нормальную ристомициновую агрегацию тромбоцитов, ранее наблюдался у гематолога по поводу гемофилии А. Применение разработанного способа позволило скорректировать неправильный диагноз у этого больного.
Пример практического использования способа
Больной Е. обратился к гематологу Алтайского гематологического центра по поводу системной кровоточивости. Кожный геморрагический синдром в виде экхимозов у пациента с раннего детства. В возрасте 1 года была гематома в области спины при падении, эпизод длительного кровотечения после экстракции зуба в возрасте 7 лет, проводилась заместительная трансфузионная терапия СЗП. Ранее при обследовании был установлен диагноз: Гемофилия А, легкое течение. Наследственность: у деда по материнской линии были геморрагии (со слов родственников, медицинские документы не представлены), умер в 45 лет от геморрагического инсульта.
Общее состояние удовлетворительное. Больной в сознании, ориентирован. На вопросы отвечает правильно. Вес 702 кг. Кожные покровы и слизистые обычной окраски. Дыхание везикулярное, хрипов нет, ЧДД-17 в мин. Тоны сердца приглушены, ритм правильный, ЧСС 86 в мин, АД 120/70. Живот мягкий, безболезненный, печень и селезенка не увеличены. Отеков нет.
Из представленной информации (Фиг. 1), следует, что у пациента имеется коагулопатия, обусловленная недостаточностью FVIII:C. Подобные результаты исследования системы гемостаза наблюдаются при гемофилии и при субтипе 2N болезни Виллебранда.
В соответствии с регламентом предлагаемого способа пациенту проведены две инфузии концентрата ФВ в дозе 42 МЕ/кг массы тела (в день обращения 3000 ME в/в и через 24 часа 3000 МБ в/в). Повторно исследование гемостаза проведено через 48 часов после первой инфузий (Фиг. 2).
В результате применения предлагаемого способа у пациента показатель Ratio превышает 1,3 за счет нормализации времени рекальцификации, что свидетельствует о наличии у больного БВ (субтипа 2N).