АНТИТЕЛА ПРОТИВ CTLA4 И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
ANTIBODIES AGAINST CTLA4 AND THEIR USE

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее раскрытие относится к антителам против белка 4, ассоциированного с цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTLA4 или CTLA-4), и к их применениям.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Онкологическое заболевание в настоящее время является одним из заболеваний, которые имеют самую высокую смертность среди людей. Согласно статистическим данным Всемирной организации здравоохранения в 2012 году число случаев заболеваемости онкологическими заболеваниями и смертности в мире достигло 14 миллионов и 8,2 миллиона, соответственно. В Китае впервые диагностированных случаев онкологических заболеваний составило 3,07 миллионов, а число погибших - 2,2 миллиона.
Недавний клинический и коммерческий успех противоопухолевых антител вызвал большой интерес к терапии на основе антител. Существует необходимость в разработке противоопухолевых антител для использования в различных терапевтических средствах на основе антител для лечения онкологических заболеваний.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее раскрытие относится к антителам против CTLA4, их антигенсвязывающему фрагменту и их применению.
В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые связываются с белком 4, ассоциированным с цитотоксическими T-лимфоцитами (CTLA4), содержащим: вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую области, определяющие комплементарность, (CDR) 1, 2 и 3, где область VH CDR1 содержит аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 80% идентична выбранной аминокислотной последовательности VH CDR1, область VH CDR2 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична выбранной аминокислотной последовательности VH CDR2, а область VH CDR3 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична выбранной аминокислотной последовательности VH CDR3; и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR 1, 2 и 3, где область VL CDR1 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична выбранной аминокислотной последовательности VL CDR1, область VL CDR2 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична выбранной аминокислотной последовательности VL CDR2, и область VL CDR3 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична выбранной аминокислотной последовательности VL CDR3,
где выбранные аминокислотные последовательности VH CDR 1, 2 и 3 и выбранные аминокислотные последовательности VL CDR 1, 2 и 3 представляют собой одну из следующих:
(1) выбранные аминокислотные последовательности VH CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NO: 1, 2, 3, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности VL CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NO: 4, 5, 6, соответственно;
(2) выбранные аминокислотные последовательности VH CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NO: 7, 8, 9, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности VL CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NO: 10,11, 12, соответственно;
(3) выбранные аминокислотные последовательности VH CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NO: 45, 46, 47, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности VL CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NO: 48, 49, 50, соответственно;
(4) выбранные аминокислотные последовательности VH CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NO: 51, 52, 53, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности VL CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NO: 54, 55, 56, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления VH содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 1, 2 и 3, соответственно, и VL содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 4, 5 и 6, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления VH содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 7, 8 и 9, соответственно, и VL содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 10, 11 и 12, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с человеческим CTLA4. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFV).
В одном аспекте раскрытие относится к нуклеиновой кислоте, содержащей полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий:
(1) тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую области, определяющие комплементарность, (CDR) 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 1, 2, и 3, соответственно, и где VH, спариваясь с вариабельной областью легкой цепи (VL), содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18, 19, 20 или 70, связывается с CTLA4;
(2) легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 4, 5 и 6, соответственно, и где VL, спариваясь с VH, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 или 69, связывается с CTLA4;
(3) тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 7, 8 и 9, соответственно, и где VH, спариваясь с вариабельной областью легкой цепи (VL), содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28 или 72, связывается с CTLA4; или
(4) легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 10,11 и 12, соответственно, и где VL, спариваясь с VH, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24 или 71, связывается с CTLA4;
(5) тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 45, 46 и 47, соответственно, и где VH, спариваясь с вариабельной областью легкой цепи (VL), содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 74, связывается с CTLA4;
(6) легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 48, 49 и 50, соответственно, и где VL, спариваясь с VH, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 73, связывается с CTLA4;
(7) тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 51, 52 и 53, соответственно, и где VH, спариваясь с вариабельной областью легкой цепи (VL), содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 76, связывается с CTLA4;
(8) легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 54, 55 и 56, соответственно, и где VL, спариваясь с VH, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 75, связывается с CTLA4.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VH, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 1, 2, и 3, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 4, 5, и 6, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащий VH, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 7, 8, и 9, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 10,11, и 12, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления VH, спариваясь с VL, специфически связывается с человеческим CTLA4. В некоторых вариантах осуществления VL, спариваясь с VH, специфически связывается с человеческим CTLA4.
В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь иммуноглобулина или ее фрагмент представляют собой гуманизированную тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, и легкая цепь иммуноглобулина или ее фрагмент представляет собой гуманизированную легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота представляет собой кДНК.
В другом аспекте раскрытие также относится к вектору, содержащему одну или более нуклеиновых кислот, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления вектор кодирует область VL и область VH, которые вместе связываются с CTLA4.
В одном аспекте раскрытие относится к паре векторов, где каждый вектор содержит одну из нуклеиновых кислот, как описано в настоящем документе, где вместе пара векторов кодирует область VL и область VH, которые вместе связываются с CTLA4.
В одном аспекте раскрытие относится к клетке, содержащей вектор, как описано в настоящем документе, или пару векторов, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку CHO.
В другом аспекте раскрытие относится к клетке, содержащей одну или более нуклеиновых кислот, как описано в настоящем документе.
В одном аспекте раскрытие относится к клетке, содержащей две нуклеиновые кислоты, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления две нуклеиновые кислоты вместе кодируют область VL и область VH, которые вместе связываются с CTLA4.
В одном аспекте раскрытие также относится к способу получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Способ включает стадии культивирования клетки, как описано в настоящем документе, в условиях, достаточных для того, чтобы клетка продуцировала антитело или антигенсвязывающий фрагмент; и сбор антитела или антигенсвязывающего фрагмента, продуцируемых клеткой.
В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые связываются с CTLA4, содержащим вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична выбранной последовательности VH, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична выбранной последовательности VL, где выбранная последовательность VH и выбранная последовательность VL представляют собой одну из следующих:
(1) выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 или 69, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO: 18, 19, 20 или 70;
(2) выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24 или 71, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28 или 72;
(3) выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO: 73, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO: 74;
(4) выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO: 75, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO: 76.
В некоторых вариантах осуществления VH содержит последовательность SEQ ID NO: 13, а VL содержит последовательность SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах осуществления VH содержит последовательность SEQ ID NO: 14, а VL содержит последовательность SEQ ID NO: 19.
В некоторых вариантах осуществления VH содержит последовательность SEQ ID NO: 21, а VL содержит последовательность SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах осуществления VH содержит последовательность SEQ ID NO: 22, а VL содержит последовательность SEQ ID NO: 25.
В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с человеческим CTLA4. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFV).
В одном аспекте изобретение также относится к конъюгату антитело-лекарственное средство, содержащему антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, ковалентно или нековалентно связанные с терапевтическим агентом. В некоторых вариантах осуществления терапевтический агент представляет собой цитотоксический или цитостатический агент (например, цитохалазин B, грамицидин D, бромид этидия, эметин, митомицин, этопосид, тенопосид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрацин, майтансиноиды, такие как DM-1 и DM-4, дион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол, пуромицин, эпирубицин и циклофосфамид и их аналоги).
В одном аспекте раскрытие относится к способу лечения пациента, имеющего злокачественное новообразование. Способ включает стадии введения пациенту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей антитело или антигенсвязывающий фрагмент, как описано в настоящем документе, или конъюгат антитело-лекарственное средство, как описано в настоящем документе.
В некоторых вариантах осуществления злокачественным новообразованием является меланома. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование представляет собой неоперабельную меланому или метастатическую меланому.
В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование представляет собой немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), мелкоклеточный рак легкого (SCLC), рак мочевого пузыря или метастатический гормонально рефрактерный рак предстательной железы.
В одном аспекте раскрытие также относится к способу уменьшения скорости роста опухоли. Способ включает стадии контакта опухолевой клетки с эффективным количеством композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано в настоящем документе.
В другом аспекте раскрытие относится к способу уничтожения опухолевой клетки, причем способ включает стадии контакта опухолевой клетки с эффективным количеством композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано в настоящем документе, или конъюгат антитело-лекарственное средство, как описано в настоящем документе.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель.
В другом аспекте раскрытие относится к фармацевтической композиции, содержащей конъюгат лекарственное средство-антитело, как описано в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель.
Используемый в настоящем описании термин «злокачественное новообразование» относится к клеткам, обладающим способностью к автономному росту. Примеры таких клеток включают клетки, имеющие аномальное состояние или состояние, характеризующееся быстро пролиферирующим ростом клеток. Термин должен включать злокачественные образования, например, опухоли; онкогенные процессы, метастатические ткани и злокачественно трансформированные клетки, ткани или органы, независимо от гистопатологического типа или стадии инвазивности. Также включены злокачественные новообразования различных систем органов, таких как дыхательная, сердечно-сосудистая, почечная, репродуктивная, гематологическая, неврологическая, печеночная, желудочно-кишечная и эндокринная системы; а также аденокарциномы, которые включают злокачественные новообразования, такие как большинство видов рака толстой кишки, почечно-клеточный рак, рак предстательной железы и/или тестикулярные опухоли, немелкоклеточный рак легкого и рак тонкой кишки. Злокачественное новообразование, которое «возникает естественным путем», включает любое злокачественное новообразование, которое не индуцируется экспериментально имплантацией раковых клеток индивидууму, и включает, например, самопроизвольно возникающее злокачественное новообразование, злокачественное новообразование, вызванное воздействием на пациента канцерогена(канцерогенов), злокачественное новообразование, возникающее в результате вставки трансгенного онкогена или нокаута гена-супрессора опухоли, и злокачественное новообразование, вызванное инфекциями, например, вирусными инфекциями. Термин «карцинома» известен в данной области и относится к злокачественным новообразованиям эпителиальных или эндокринных тканей. Термин также включает карциносаркомы, которые включают злокачественные опухоли, состоящие из карциноматозных и саркоматозных тканей. «Аденокарцинома» относится к карциноме, происходящей из железистой ткани или в которой опухолевые клетки образуют узнаваемые железистые структуры. Термин «саркома» известен в данной области и относится к злокачественным опухолям мезенхимального происхождения. Термин «гематопоэтические неопластические расстройства» включает заболевания, связанные с гиперпластическими/неопластическими клетками гематопоэтического происхождения. Гематопоэтическое неопластическое расстройство может развиваться из миелоидных, лимфоидных или эритроидных линий или их клеток-предшественников.
Используемый в настоящем описании термин «антитело» относится к любой антигенсвязывающей молекуле, которая содержит по меньшей мере одну (например, одну, две, три, четыре, пять или шесть) область, определяющую комплементарность, (CDR), (например, любую из трех CDR из легкой цепи иммуноглобулина или любую из трех CDR из тяжелой цепи иммуноглобулина), и которая способна специфически связываться с эпитопом. Неограничивающие примеры антител включают: моноклональные антитела, поликлональные антитела, полиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела), одноцепочечные антитела, химерные антитела, человеческие антитела и гуманизированные антитела. В некоторых вариантах осуществления антитело может содержать Fc-область человеческого антитела. Термин антитело также включает производные, например, биспецифичные антитела, одноцепочечные антитела, диатела, линейные антитела и полиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител.
2
Используемый в настоящем описании термин «антигенсвязывающий фрагмент» относится к части полноразмерного антитела, где часть антитела способна специфически связываться с антигеном. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент содержит по меньшей мере один вариабельный домен (например, вариабельный домен тяжелой цепи или вариабельный домен легкой цепи). Неограничивающие примеры фрагментов антител включают, например, Fab, Fab', F(ab') и Fv фрагменты.
Используемый в настоящем описании термин «человеческое антитело» относится к антителу, которое кодируется эндогенной нуклеиновой кислотой (например, перегруппированный человеческий локус тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина), присутствующий у человека. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело выделяют из тканей человека или продуцируют в культуре человеческих клеток (например, в гибридомных клетках человека). В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело продуцируется в клетке, не являющейся человеческой (например, в клеточной линии мыши или хомяка). В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело продуцируется в бактериальной или дрожжевой клетке. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело продуцируется у трансгенного животного, не являющегося человеком (например, крупного рогатого скота), содержащего неперегруппированный или перегруппированный локус иммуноглобулина человека (например, локус тяжелой или легкой цепи человеческого иммуноглобулина).
Используемый в настоящем описании термин «химерное антитело» относится к антителу, которое содержит последовательность, присутствующую по меньшей мере в двух разных антителах (например, антителах от двух разных видов млекопитающих, таких как антитело человека и мыши). Неограничивающим примером химерного антитела является антитело, содержащее последовательности вариабельного домена (например, полные или частичные последовательности вариабельного домена легкой цепи и/или тяжелой цепи) антитела, не являющегося человеческим (например, мышиного антитела, и константные домены человеческого антитела. Дополнительные примеры химерных антител описаны в настоящем документе и известны в данной области.
Используемый в настоящем описании термин «гуманизированное антитело» относится к антителу, не являющемуся человеческим, которое содержит минимальную последовательность, полученную из антитела, не являющегося человеческим (например, мыши) иммуноглобулина, и содержит последовательности, полученные из человеческого иммуноглобулина. В неограничивающих примерах гуманизированные антитела представляют собой антитела человека (антитело-реципиент), в которых остатки гипервариабельной (CDR) области антитела-реципиента заменены остатками гипервариабельной (CDR) области из антитела, не являющегося человеческим (например, донорного антитела), например, антитела мыши, крысы или кролика, имеющее желаемую специфичность, аффинность и способность. В некоторых вариантах осуществления каркасные остатки Fv человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими остатками иммуноглобулина (например, мышиного), не являющегося человеческим. В некоторых вариантах осуществления гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не обнаружены в реципиентном антителе или в донорном антителе. Эти модификации могут быть сделаны для дальнейшего улучшения характеристик антител. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит по существу все, по меньшей мере, один и, как правило, два вариабельных домена, в которых все или по существу все гипервариабельные петли (CDR) соответствуют доменам иммуноглобулина, не являющегося человеческим, (например, мышиного), и все или по существу все каркасные области являются каркасными областями человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело также может содержать, по меньшей мере, часть константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, иммуноглобулина человека. Гуманизированные антитела могут быть получены с использованием методов молекулярной биологии, известных в данной области. Неограничивающие примеры способов получения гуманизированных антител описаны в настоящем документе.
Используемый в настоящем описании термин «одноцепочечное антитело» относится к одному полипептиду, который содержит по меньшей мере два вариабельных домена иммуноглобулина (например, вариабельный домен тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина млекопитающего), который способен специфически связываться с антигеном. Неограничивающие примеры одноцепочечных антител описаны в настоящем документе.
Используемый в настоящем описании термин «мультимерное антитело» относится к антителу, которое содержит четыре или более (например, шесть, восемь или десять) вариабельных доменов иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления мультимерное антитело способно к перекрестному связыванию с одной молекулой-мишенью (например, CTLA4), по меньшей мере с одной второй молекулой-мишенью (например, PD1) на поверхности клетки млекопитающего (например, Т-клетки человека).
Используемые в настоящем описании термины «субъект» и «пациент» используются взаимозаменяемо по всему описанию и описывают животное, человека или не человека, которому предоставляется лечение в соответствии со способами по настоящему изобретению. Ветеринарные и не ветеринарные применения предусмотрены настоящим изобретением. Пациенты-люди могут быть взрослыми людьми или подростками (например, люди моложе 18 лет). Помимо людей, пациенты включают, но не ограничиваются ими, мышей, крыс, хомяков, морских свинок, кроликов, хорьков, кошек, собак и приматов. Включены, например, приматы, отличные от человека (например, обезьяны, шимпанзе, гориллы и тому подобное), грызуны (например, крысы, мыши, песчанки, хомяки, хорьки, кролики), лагоморфы, свиньи (например, свинья, миниатюрная свинья), лошади, собаки, кошки, крупный рогатый скот и другие домашние, сельскохозяйственные животные и животные зоопарков.
Используемый в настоящем описании термин «специфически связывающий» и «специфически связывается» применительно к антителу означает, что антитело взаимодействует со своей молекулой-мишенью (например, CTLA4) предпочтительно относительно других молекул, поскольку взаимодействие зависит от наличия конкретной структуры (т.е. антигенной детерминанты или эпитопа) на молекуле-мишени; другими словами, реагент распознает и связывается с молекулами, которые включают специфическую структуру, а не со всеми молекулами в целом. Антитело, которое специфически связывается с молекулой-мишенью, может называться антителом-мишенью. Например, антитело, которое специфически связывается с молекулой CTLA4, может упоминаться как CTLA4-специфичное антитело, или антитело против CTLA4.
Используемые в настоящем описании термины «полипептид», «пептид» и «белок» используются взаимозаменяемо для обозначения полимеров аминокислот любой длины, по меньшей мере, из двух аминокислот.
Используемые в настоящем описании термины «полинуклеотид», «молекула нуклеиновой кислоты» и «последовательность нуклеиновой кислоты» используются в настоящем описании взаимозаменяемо для обозначения полимеров нуклеотидов любой длины, по меньшей мере, из двух нуклеотидов и включают, без ограничения, ДНК, РНК, ДНК/РНК-гибриды и их модификации.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют то же значение, которое обычно понимают специалисты в области техники, к которой относится данное изобретение. Способы и материалы описаны в настоящем документе для использования в настоящем изобретении; другие подходящие способы и материалы, известные в данной области, также могут быть использованы. Материалы, методы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения. Все публикации, заявки на патенты, патенты, последовательности, записи в базе данных и другие ссылки, упомянутые здесь, включены в качестве ссылки в полном объеме. В случае конфликта настоящее описание, включая определения, будет иметь преимущественную силу.
Другие признаки и преимущества изобретения будут очевидны из следующего подробного описания и фигур, а также из формулы изобретения.
ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
ФИГ. 1 представляет собой блок-схему, показывающую первую часть иллюстративного протокола получения антител против CTLA4.
ФИГ. 2 представляет собой блок-схему, показывающую вторую часть иллюстративного протокола получения антител против CTLA4.
ФИГ. 3 представляет собой набор графиков проточной цитометрии, показывающих, что антитела против CTLA4 блокируют связывание между CTLA4 и CD80.
ФИГ. 4 представляет собой набор графиков проточной цитометрии, показывающих, что антитела против CTLA4 блокируют связывание между CTLA4 и CD86.
ФИГ. 5 представляет собой набор графиков, показывающих результаты проточной цитометрии перекрестной реактивности антител против CTLA4 против CTLA4 обезьяны (rmCTLA4), мыши (mCTLA4) и химерного CTLA4 человека и мыши (chiCTLA4).
ФИГ. 6 представляет собой график, показывающий массу тела с течением времени у гуманизированных мышей B-hCTLA-4 с опухолью MC-38, обработанных антителами против CTLA4 13A4 и 4G12.
ФИГ. 7 представляет собой график, показывающий процентное изменение массы тела с течением времени у гуманизированных мышей B-hCTLA-4 с опухолью MC-38, обработанных антителами против CTLA4, 13A4 и 4G12.
ФИГ. 8 представляет собой график, показывающий размер опухоли с течением времени у гуманизированных мышей B-hCTLA-4 с опухолью MC-38, обработанных антителами против CTLA4, 13A4 и 4G12.
ФИГ. 9 представляет собой график, показывающий массу тела с течением времени у гуманизированных мышей B-hCTLA-4 с опухолью MC-38, обработанных Yervoy и 13A4.
ФИГ. 10 представляет собой график, показывающий процентное изменение массы тела с течением времени у гуманизированных мышей B-hCTLA-4 с опухолью MC-38, обработанных Yervoy и 13A4.
ФИГ. 11 представляет собой график, показывающий размер опухоли с течением времени у гуманизированных мышей B-hCTLA-4 с опухолью MC-38, обработанных Yervoy и 13A4.
ФИГ. 12 представляет собой график, показывающий массу тела с течением времени у гуманизированных мышей B-hCTLA-4 с опухолью MC-38, обработанных Yervoy, гуманизированными антителами против hCTLA4, 4G12-H1K1-IgG1 и 4G12-H2K1-IgG1.
ФИГ. 13 представляет собой график, показывающий процентное изменение массы тела с течением времени у гуманизированных мышей B-hCTLA-4 с опухолью MC-38, обработанных Yervoy, гуманизированными антителами против hCTLA4, 4G12-H1K1-IgG1 и 4G12-H2K1-IgG1.
ФИГ. 14 представляет собой график, показывающий размер опухоли с течением времени у гуманизированных мышей B-hCTLA-4 с опухолью MC-38, обработанных Yervoy, гуманизированными антителами против hCTLA4, 4G12-H1K1-IgG1 и 4G12-H2K1-IgG1.
ФИГ. 15 представляет собой график, показывающий массу тела с течением времени у гуманизированных мышей B-hCTLA-4 с опухолью MC-38, обработанных Yervoy, гуманизированными антителами против hCTLA4, 13A4-H1K2-IgG1, 13A4-H2K2-IgG1, 13A4-H1K2-IgG4 и 13A4-H1K2-IgG1-N297A.
ФИГ. 16 представляет собой график, показывающий процентное изменение массы тела с течением времени у гуманизированных мышей B-hCTLA-4 с опухолью MC-38, обработанных Yervoy, гуманизированными антителами против hCTLA4, 13A4-H1K2-IgG1, 13A4-H2K2-IgG1, 13A4-H1K2- IgG4 и 13A4-H1K2-IgG1-N297A.
ФИГ. 17 представляет собой график, показывающий размер опухоли с течением времени у гуманизированных мышей B-hCTLA-4 с опухолью MC-38, обработанных Yervoy, гуманизированными антителами против hCTLA4, 13A4-H1K2-IgG1, 13A4-H2K2-IgG1, 13A4-H1K2-IgG4 и 13A4-H1K2-IgG1-N297A.
ФИГ. 18 представляет собой набор графиков проточной цитометрии, показывающих, что антитела против CTLA4 блокируют связывание между CTLA4 и CD86 человека.
ФИГ. 19 представляет собой набор графиков, показывающих результаты проточной цитометрии перекрестной реактивности антител против CTLA4 против CTLA4 обезьяны, мыши и против химерного CTLA4 человека-мыши.
ФИГ. 20 представляет собой график, показывающий массу тела во времени гуманизированных мышей B-hCTLA-4 с опухолью MC-38, обработанных CT4-04-13A4, CT4-20-6D2 и CT4-20-7E12.
ФИГ. 21 представляет собой график, показывающий процентное изменение массы тела с течением времени у гуманизированных мышей B-hCTLA-4 с опухолью MC-38, обработанных CT4-04-13A4, CT4-20-6D2 и CT4-20-7E12.
ФИГ. 22 представляет собой график, показывающий размер опухоли с течением времени у гуманизированных мышей B-hCTLA-4 с опухолью MC-38, обработанных CT4-04-13A4, CT4-20-6D2 и CT4-20-7E12.
На ФИГ. 23 перечислены последовательности CDR антител против CTLA4 13A4, 4G12, 6D2, 7E12 и их гуманизированных антител, как определено нумерацией по Kabat.
На ФИГ. 24 перечислены последовательности CDR антител против CTLA4 13A4, 4G12, 6D2, 7E12 и их гуманизированных антител, как определено по нумерации Chothia.
На ФИГ. 25 перечислены аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельных областей легкой цепи гуманизированных антител против CTLA4.
На ФИГ. 26 перечислены аминокислотные последовательности CTLA4 человека, CTLA4 мыши, CTLA4 обезьяны и химерного CTLA4.
ФИГ. 27 показывает аминокислотную последовательность вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи нескольких мышиных антител против hCTLA4.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Настоящее раскрытие предоставляет примеры антител, их антигенсвязывающих фрагментов, которые связываются с белком 4, ассоциированным с цитотоксическими T-лимфоцитами (CTLA-4, CTLA4, также известный как CD152).
CTLA4 является членом суперсемейства иммуноглобулинов, который экспрессируется активированными Т-клетками и передает ингибирующий сигнал Т-клеткам. Это иммунная контрольная точка, которая действует как выключатель при связывании с CD80 или CD86, подавляя иммунные реакции.
Это раскрытие также предоставляет последовательности гуманизированных антител против CTLA4 и способы получения и использования антител.
CTLA4 и злокачественные новообразования
Иммунная система может различать нормальные клетки в организме и те, которые она считает «чужеродными», что позволяет иммунной системе атаковать чужеродные клетки, оставляя нормальные клетки в покое. Этот механизм иногда включает белки, называемые иммунными контрольными точками. Иммунные контрольные точки - это молекулы в иммунной системе, которые либо увеличивают сигнал (костимулирующие молекулы), либо понижают сигнал.
Ингибиторы контрольных точек могут предотвращать атаку иммунной системы на нормальные ткани и тем самым предотвращать аутоиммунные заболевания. Многие опухолевые клетки также экспрессируют ингибиторы контрольных точек. Эти опухолевые клетки избегают иммунного надзора, кооптируя определенные пути иммунных контрольных точек, особенно в Т-клетках, которые специфичны для опухолевых антигенов (Creelan, Benjamin C. «Update on immune checkpoint inhibitors in lung cancer.». Cancer Control 21. 1 (2014): 80-89). Поскольку многие иммунные контрольные точки инициируются взаимодействиями лиганд-рецептор, они могут быть легко заблокированы антителами против лигандов и/или их рецепторов.
Путь иммунной контрольной точки включает сложную серию клеточных взаимодействий, которые предотвращают чрезмерную эффекторную активность с помощью Т-клеток в нормальных условиях. Одной из частей этого пути является рецептор клеточной поверхности, называемый антигеном-4 цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA4, CD152). CTLA4 является членом суперсемейства иммуноглобулинов, который экспрессируется исключительно на Т-клетках. CTLA4 действует, ингибируя активацию Т-клеток, и, как сообщается, ингибирует активность хелперных Т-клеток и усиливает иммуносупрессивную активность регуляторных Т-клеток. Таким образом, CTLA-4 действует как выключатель и снижает иммунный ответ. Как только цитотоксическая Т-клетка становится активной, она экспрессирует CTLA-4 на своей клеточной поверхности, который затем конкурирует с костимулирующей молекулой CD28 за их общие лиганды, B7-1 (CD80) или B7-2 (CD86) на APC. Этот баланс «инь-янь» сдерживает цитотоксическую активность, в то же время позволяя функции Т-клеток действовать самостоятельно (Creelan, Benjamin C. «Update on immune checkpoint inhibitors in lung cancer.» Cancer Control 21. 1 (2014): 80-89).
Многие опухолевые клетки могут стимулировать аномальную экспрессию CTLA-4 в Т-клетках, и эти Т-клетки с аберрантным CTLA-4 проявляют анергический фенотип. Таким образом, опухолевые клетки могут привлекать путь CTLA-4, чтобы избежать надзора Т-клеток. Введение моноклональных антител, которые ингибируют CTLA-4, может достигать согласованных и длительных противоопухолевых ответов при некоторых видах злокачественных новообразований, таких как меланома. Эти антитела против CTLA4 (например, тремелимумаб и ипилимумаб (Yervoy)) связываются с CTLA4, блокируя ингибирующий сигнал, который позволяет цитотоксическому Т-лимфоциту разрушать опухолевые клетки. Следовательно, антитела против CTLA4 можно использовать для лечения злокачественных новообразований.
Настоящее раскрытие относится к нескольким антителам против CTLA4, их антигенсвязывающим фрагментам и к способам применения этих антител против CTLA4 и антигенсвязывающих фрагментов для лечения злокачественных новообразований.
Антитела и антигенсвязывающие фрагменты
Настоящее раскрытие относится к антителам против CTLA4 и их антигенсвязывающим фрагментам. Как правило, антитела (также называемые иммуноглобулинами) состоят из двух классов полипептидных цепей, легких цепей и тяжелых цепей. Неограничивающее антитело по настоящему изобретению может представлять собой интактное антитело с четырьмя иммуноглобулиновыми цепями, содержащее две тяжелые цепи и две легкие цепи. Тяжелая цепь антитела может иметь любой изотип, включая IgM, IgG, IgE, IgA или IgD, или субизотип, включая IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgE1, IgE2 и т. д. Легкая цепь может быть легкой цепью каппа или легкой цепью лямбда. Антитело может содержать две идентичные копии легкой цепи и две идентичные копии тяжелой цепи. Тяжелые цепи, каждая из которых содержит один вариабельный домен (или вариабельную область, VH) и множество константных доменов (или константных областей), связываются друг с другом посредством дисульфидной связи в своих константных доменах, образуя «ствол» антитела. Легкие цепи, каждая из которых содержит один вариабельный домен (или вариабельную область, VL) и один константный домен (или константную область), каждая связывается с одной тяжелой цепью посредством дисульфидного связывания. Вариабельная область каждой легкой цепи выровнена с вариабельной областью тяжелой цепи, с которой она связана. Вариабельные области как легких цепей, так и тяжелых цепей содержат три гипервариабельные области, расположенные между более консервативными каркасными областями (FR).
Эти гипервариабельные области, известные как области, определяющие комплементарность, (CDR), образуют петли, которые включают основную антигенсвязывающую поверхность антитела. Четыре каркасных области в основном принимают конформацию бета-листа, а CDR образуют петли, соединяющие, а в некоторых случаях образующие часть структуры бета-листа. CDR в каждой цепи удерживаются в непосредственной близости от каркасных областей и, вместе с CDR из другой цепи, способствуют образованию антигенсвязывающей области.
Способы идентификации областей CDR антитела путем анализа аминокислотной последовательности антитела хорошо известны, и обычно используется ряд определений CDR. Определение Kabat основано на вариабельности последовательности, а определение Chothia основано на расположении структурных петлевых областей. Эти методы и определения описаны, например, в Martin, «Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains,» Antibody engineering, Springer Berlin Heidelberg, 2001. 422-439; Abhinandan, et al. «Analysis and improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibody variable domains» Molecular immunology 45. 14 (2008): 3832-3839; Wu, T.T. and Kabat, E.A. (1970) J. Exp. Med. 132: 211-250; Martin et al., Methods Enzymol. 203: 121-53 (1991); Morea et al. Biophys Chem. 68(1-3):9-16 (Oct. 1997); Morea et al., J Mol Biol. 275(2):269-94 (Jan. 1998); Chothia et al., Nature 342(6252):877-83 (Dec. 1989); Ponomarenko and Bourne, BMC Structural Biology 7:64 (2007); каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме
CDR важны для распознавания эпитопа антигена. Используемый в настоящем описании термин «эпитоп» представляет собой наименьшую часть молекулы-мишени, способную специфически связываться с антигенсвязывающим доменом антитела. Минимальный размер эпитопа может составлять примерно три, четыре, пять, шесть или семь аминокислот, но эти аминокислоты не обязательно должны быть в последовательной линейной последовательности первичной структуры антигена, поскольку эпитоп может зависеть от трехмерной конфигурации на основе вторичной и третичной структуры антигена.
В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой интактную молекулу иммуноглобулина (например, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgD, IgE, IgA). Подклассы IgG (IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4) высоко консервативны, различаются по своей константной области, особенно по своим шарнирам и верхним доменам CH2. Последовательности и различия подклассов IgG известны в данной области и описаны, например, в Vidarsson, Gestur, Gillian Dekkers, and Theo Rispens. «IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions» Frontiers in immunology 5 (2014); Irani, Vashti, et al. «Molecular properties of human IgG subclasses and their implications for designing therapeutic monoclonal antibodies against infectious diseases.» Molecular immunology 67. 2 (2015): 171-182; Shakib, Farouk, ed. The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Elsevier, 2016; каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
2
Антитело также может представлять собой молекулу иммуноглобулина, полученную из любых видов (например, человека, грызуна, мыши, верблюда). Антитела, раскрытые в настоящем описании, также включают, но не ограничиваются ими, поликлональные, моноклональные, моноспецифичные, полиспецифичные антитела и химерные антитела, которые включают связывающий домен иммуноглобулина, слитый с другим полипептидом. Термин «антигенсвязывающий домен» или «антигенсвязывающий фрагмент» представляет собой часть антитела, которая сохраняет специфическую активность связывания интактного антитела, т. е. любой части антитела, которая способна специфически связываться с эпитопом молекулы-мишени интактного антитела. Включает в себя, например, Fab, Fab', F(ab') и варианты этих фрагментов. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут представлять собой, например, scFv, Fv, Fd, dAb, биспецифичное антитело, биспецифичный scFv, диатело, линейное антитело, одноцепочечную молекулу антитела, полиспецифичное антитело, образованное из фрагментов антитела, и любой полипептид, который включает связывающий домен, который представляет собой или гомологичен связывающему домену антитела. Неограничивающие примеры антигенсвязывающих доменов включают например, CDR тяжелой цепи и/или легкой цепи интактного антитела, вариабельные области тяжелой и/или легкой цепи интактного антитела, полноразмерные тяжелые или легкие цепи интактного антитела или индивидуальную CDR из тяжелой цепи или легкой цепи интактного антитела.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент может образовывать часть химерного антигенного рецептора (CAR). В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор представляет собой слияния одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv), как описано в настоящем документе, слитых с трансмембранным доменом CD3-дзета и эндодоменом. В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор также содержит внутриклеточные сигнальные домены из различных костимулирующих рецепторов белков (например, CD28, 41BB, ICOS). В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор содержит несколько сигнальных доменов, например, CD3z-CD28-41BB или CD3z-CD28-OX40, для увеличения эффективности. Таким образом, в одном аспекте раскрытие дополнительно относится к клеткам (например, T-клеткам), которые экспрессируют химерные антигенные рецепторы, как описано в настоящем документе.
В некоторых вариантах осуществления scFV имеет один вариабельный домен тяжелой цепи и один вариабельный домен легкой цепи.
Антитела против CTLA4 и антигенсвязывающие фрагменты
Настоящее раскрытие относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые специфически связываются с CTLA4. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем документе, способны связываться с CTLA4 и могут ингибировать путь ингибирования CTLA4, таким образом, повышая иммунный ответ. Раскрытие относится к мышиным антителам против CTLA4, CT4-04-13A4 («13A4»), CT4-03-4G12 («4G12»), CT4-20-6D2 («6D2») и CT4-20-7E12 («7E12») и к их гуманизированным антителам.
Последовательности CDR для антител, полученных из 13А4 и 13А4 (например, гуманизированных антител), включают CDR вариабельного домена тяжелой цепи, SEQ ID NO: 1-3 и CDR вариабельного домена легкой цепи, SEQ ID NO: 4-6, как определено нумерацией по Kabat. CDR также могут быть определены системой Chothia. Под нумерацией Chothia последовательности CDR вариабельного домена тяжелой цепи представлены в SEQ ID NO: 29-31, а последовательности CDR вариабельного домена легкой цепи представлены в SEQ ID NO: 32-34.
Подобным образом, последовательности CDR для антител, полученных из 4G12 и 4G12, включают CDR вариабельного домена тяжелой цепи, SEQ ID NO: 7-9, и CDR вариабельного домена легкой цепи, SEQ ID NO: 10-12, как определено нумерацией Kabat. При нумерации Chothia последовательности CDR вариабельного домена тяжелой цепи представлены в SEQ ID NO: 35-37, а CDR вариабельного домена легкой цепи представлены в SEQ ID NO: 38-40.
Последовательности CDR для антител, полученных из 6D2 и 6D2, включают CDR вариабельного домена тяжелой цепи, SEQ ID NO: 45-47, и CDR вариабельного домена легкой цепи, SEQ ID NO: 48-50, как определено нумерацией Kabat. При нумерации Chothia последовательности CDR вариабельного домена тяжелой цепи представлены в SEQ ID NO: 57-59, а CDR вариабельного домена легкой цепи представлены в SEQ ID NO: 60-62.
Последовательности CDR для антител, полученных из 7E12 и 7E12, включают CDR вариабельного домена тяжелой цепи, SEQ ID NO: 51-53 и CDR вариабельного домена легкой цепи, SEQ ID NO: 54-56, как определено нумерацией Kabat. При нумерации Chothia последовательности CDR вариабельного домена тяжелой цепи представлены в SEQ ID NO: 63-65, а CDR вариабельного домена легкой цепи представлены в SEQ ID NO: 66-68.
Также предложены аминокислотные последовательности для вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи гуманизированных антител. Поскольку существуют разные способы гуманизации мышиных антител (например, последовательность может быть замещена другими аминокислотами), тяжелая цепь и легкая цепь антитела могут иметь более одной версии гуманизированных последовательностей. Аминокислотные последовательности для вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела 13А4 представлены в SEQ ID NO: 13-17. Аминокислотные последовательности для вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела 13А4 представлены в SEQ ID NO: 18-20. Любая из этих последовательностей вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 13-17) может быть спарена с любой из этих последовательностей вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 18-20).
Аналогично, аминокислотные последовательности для вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела 4G12 представлены в SEQ ID NO: 21-24. Аминокислотные последовательности для вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела 4G12 представлены в SEQ ID NO: 25-28. Любая из этих последовательностей вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 21-24) может быть спарена с любой из этих последовательностей вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 25-28).
Как показано на ФИГ. 25, процент гуманизации означает процент идентичности последовательности вариабельной области тяжелой цепи или легкой цепи по сравнению с последовательностями антител человека в базе данных Международной иммуногенетической информационной системы (IMGT). Лучший вариант означает, что последовательность вариабельной области тяжелой цепи или легкой цепи ближе к конкретному виду, чем к другим видам. Например, лучший вариант относительно человека означает, что последовательность ближе к человеку, чем к другим видам. Лучший вариант относительно человека и Macaca flavicularis означает, что последовательность имеет одинаковую процентную идентичность с человеческой последовательностью и последовательностью Macaca flavicularis, и эти процентные идентичности являются самыми высокими по сравнению с последовательностями других видов. В некоторых вариантах осуществления процент гуманизации составляет более чем 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93% 94% или 95%. Подробное описание, касающееся того, как определять процент гуманизации и как определять лучшие варианты, известно в данной области техники и описано, например, в Jones, Tim D., et al. «The INNs and outs of antibody nonproprietary names.» MAbs. Vol. 8. № 1 Taylor & Francis, 2016, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Кроме того, в некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем документе, также могут содержать одну, две или три CDR вариабельной области тяжелой цепи, выбранные из группы SEQ ID NO: 1-3, SEQ ID NO: 7-9, SEQ ID NO: 29-31, SEQ ID NO: 35-37, SEQ ID NO: 45-47, SEQ ID NO: 51-53, SEQ ID NO: 57-59 и SEQ ID NO: 63-65; и/или одну, две или три CDR вариабельной области легкой цепи, выбранные из группы SEQ ID NO: 4-6, SEQ ID NO: 10-12, SEQ ID NO: 32-34, SEQ ID NO: 38-40,SEQ ID NO 48-50,SEQ ID NO 54-56, SEQ ID NO 60-62 и SEQ ID NO 66-68.
В некоторых вариантах осуществления антитела могут иметь вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую области, определяющие комплементарность (CDR) 1, 2, 3, где область CDR1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентична выбранной аминокислотной последовательности VH CDR1, область CDR2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80,85, 90 или 95% идентична выбранной аминокислотной последовательности VH CDR2, и область CDR3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80,85, 90 или 95% идентична выбранной аминокислотной последовательности VH CDR3, и вариабельную области легкой цепи (VL), содержащую CDR 1, 2, 3, где область CDR1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентична выбранной аминокислотной последовательности VL CDR1, область CDR2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая, по меньшей мере, на 80%, 85%, 90% или 95% идентична выбранной последовательности аминокислот VL CDR2, область CDR3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80,85, 90 или 95% идентична выбранной аминокислотной последовательности VL CDR3. Выбранные аминокислотные последовательности VH CDR 1, 2, 3 и выбранные аминокислотные последовательности VL CDR 1, 2, 3 показаны на ФИГ. 23 (Kabat CDR) и ФИГ. 24 (Chothia CDR).
В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO: 1 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 2 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 3 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами.
В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO: 7 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 8 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 9 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами.
В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO: 29 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 30 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 31 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами.
В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO: 35 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 36 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 37 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами.
В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO: 45 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 46 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 47 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами.
В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO: 51 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 52 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 53 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами.
В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO: 57 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 58 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 59 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами.
В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO: 63 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 64 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 65 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами.
В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO: 4 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 5 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 6 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами.
В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в данном документе, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO: 10 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 11 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 12 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами.
В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO: 32 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 33 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 34 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами.
В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO: 38 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 39 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 40 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами.
В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO: 48 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 49 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 50 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами.
В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO: 54 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 55 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 56 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами.
В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO: 60 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 61 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 62 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами.
В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO: 66 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 67 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 68 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами.
Вставки, делеции и замены могут располагаться внутри последовательности CDR или на одном или обоих концевых участках последовательности CDR.
Раскрытие также относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые связываются с CTLA4. Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентична выбранной последовательности VH, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентична выбранной последовательности VL. В некоторых вариантах осуществления выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 или 69, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO: 18, 19, 20 или 70. В некоторых вариантах осуществления выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24 или 71, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28 или 72. В некоторых вариантах осуществления выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO: 73, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO: 74. В некоторых вариантах осуществления выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO: 75, а выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO: 76.
Чтобы определить процентную идентичность двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновых кислот, последовательности выравнивают для оптимальных целей сравнения (например, пробелы могут быть введены в одну или обе из первой и второй последовательности аминокислот или нуклеиновых кислот для оптимального выравнивания, и негомологичные последовательности могут не учитываться для целей сравнения). Длина эталонной последовательности, выровненной для целей сравнения, составляет, по меньшей мере, 80% длины эталонной последовательности, и в некоторых вариантах осуществления составляет, по меньшей мере, 90%, 95% или 100%. Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих аминокислотных положениях или нуклеотидных положениях. Когда положение в первой последовательности занято тем же аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и соответствующее положение во второй последовательности, то молекулы в этом положении идентичны. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией количества идентичных положений, совместно используемых последовательностями, с учетом количества пробелов и длины каждого пробела, которые необходимо ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей. В целях настоящего раскрытия сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может быть выполнено с использованием матрицы оценки Blossum 62 с штрафом за пробел 12, штрафом за расширение пробела 4 и штрафом за сдвиг пробела 5.
Настоящее изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, содержащей полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий тяжелую цепь иммуноглобулина или тяжелую цепь иммуноглобулина. Тяжелая цепь иммуноглобулина или легкая цепь иммуноглобулина содержат CDR, как показано на ФИГ. 23 или ФИГ. 24 или имеют последовательности, показанные на ФИГ. 25 или ФИГ. 27. Когда полипептиды спарены с соответствующим полипептидом (например, с соответствующей вариабельной областью тяжелой цепи или соответствующей вариабельной областью легкой цепи), то спаренные полипептиды связываются с CTLA4.
Антитела против CTLA4 и антигенсвязывающие фрагменты также могут быть вариантами (включая производные и конъюгаты) антител или фрагментов антител и полиспецифичными (например, биспецифичными) антителами или фрагментами антител. Дополнительные антитела, предложенные в настоящем описании, являются поликлональными, моноклональными, полиспецифичными (мультимерными, например, биспецифичными), человеческими антителами, химерными антителами (например, химера человека и мыши), одноцепочечными антителами, антителами, продуцируемыми внутри клетки (т. е. интратела) и их антигенсвязывающими фрагментами. Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело IgG или его антигенсвязывающий фрагмент.
Фрагменты антител пригодны для использования в предложенных способах при условии, что они сохраняют желаемую аффинность и специфичность полноразмерного антитела. Таким образом, фрагмент антитела, который связывается с CTLA-4, сохранит способность связываться с CTLA-4. Фрагмент Fv представляет собой фрагмент антитела, который содержит полный сайт распознавания и связывания антигена. Эта область состоит из димера из одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи в тесной ассоциации, которая может быть ковалентной по природе, например, в scFv. Именно в этой конфигурации три CDR каждого вариабельного домена взаимодействуют, определяя антигенсвязывающий сайт на поверхности димера VH-VL. В совокупности шесть CDR или их подгруппа придают антителу антигенсвязывающую специфичность. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащего только три CDR, специфичных для антигена) может обладать способностью распознавать и связывать антиген, хотя обычно с более низкой аффинностью, чем весь сайт связывания.
Одноцепочечные фрагменты антител Fv или (scFv) содержат домены (или области) VH и VL антитела, где эти домены присутствуют в одной полипептидной цепи. Как правило, полипептид Fv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, который позволяет scFv образовывать желаемую структуру для связывания антигена.
2
Фрагмент Fab содержит вариабельный и константный домен легкой цепи, а также вариабельный домен и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. Фрагменты антитела F(ab') содержат пару фрагментов Fab, которые обычно ковалентно связаны вблизи своих карбоксиконцов посредством шарнирных цистеинов между ними. Другие химические конденсации фрагментов антител также известны в данной области.
Диатела представляют собой небольшие фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, которые содержат VH, связанную с VL в одной и той же полипептидной цепи (VH и VL). Используя линкер, который является слишком коротким, чтобы разрешить спаривание между двумя доменами в одной цепи, домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих сайта.
Линейные антитела содержат пару тандемных сегментов Fd (VH-CH1-VH-CH1), которые вместе с комплементарными полипептидами легкой цепи образуют пару антигенсвязывающих областей. Линейные антитела могут быть биспецифичными или моноспецифичными.
Антитела и фрагменты антител по настоящему изобретению могут быть модифицированы в области Fc для обеспечения желаемых эффекторных функций или периода полужизни в сыворотке.
Мультимеризация антител может быть достигнута посредством естественной агрегации антител или с помощью химических или рекомбинантных способов связывания, известных в данной области. Например, некоторый процент очищенных препаратов антител (например, очищенные молекулы IgG1) самопроизвольно образуют белковые агрегаты, содержащие гомодимеры антител и другие мультимеры антител более высокого порядка.
2
Альтернативно, гомодимеры антител могут быть получены с помощью методов химической связи, известных в данной области. Например, гетеробифункциональные сшивающие агенты, включая, но не ограничиваясь ими, SMCC (сукцинимидил-4-(малеимидометил) циклогексан-1-карбоксилат) и SATA (N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетат), можно использовать для образования мультимеров антител. Иллюстративный протокол для образования гомодимеров антител описан в Ghetie et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 7509-7514, 1997). Гомодимеры антител можно превратить в гомодимеры Fab' путем расщепления пепсином. Другой способ образования гомодимеров антител заключается в использовании аутофильного пептида T15, описанного в Zhao et al. (J. Immunol. 25: 396-404, 2002).
В некоторых вариантах осуществления полиспецифичное антитело представляет собой биспецифичное антитело. Биспецифичные антитела могут быть получены путем конструирования интерфейса между парой молекул антител, чтобы максимизировать процент гетеродимеров, которые извлекают из культуры рекомбинантных клеток. Например, интерфейс может содержать, по меньшей мере, часть домена СН3 константного домена антитела. В этом способе одну или более небольших боковых цепей аминокислот из интерфейса первой молекулы антитела заменяют более крупными боковыми цепями (например, тирозина или триптофана). Компенсаторные «полости» идентичного или сходного размера с крупной боковой цепью (цепями) создаются в интерфейсе второй молекулы антитела путем замены крупных боковых цепей аминокислот более мелкими (например, аланина или треонина). Это обеспечивает механизм для увеличения выхода гетеродимера по сравнению с другими нежелательными конечными продуктами, такими как гомодимеры. Этот метод описан, например, в WO 96/27011, которая включена в качестве ссылки в полном объеме.
Биспецифичные антитела включают сшитые или «гетероконъюгатные» антитела. Например, одно из антител в гетероконъюгате может быть связано с авидином, а другое с биотином. Гетероконъюгатные антитела также могут быть получены с использованием любых удобных способов сшивки. Подходящие сшивающие агенты и методы сшивки хорошо известны в данной области и раскрыты в патенте США № 4676980, который включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
2
Способы получения биспецифичных антител из фрагментов антител также известны в данной области. Например, биспецифичные антитела могут быть получены с использованием химической связи. Brennan et al. (Science 229: 81, 1985) описывают процедура, при которой интактные антитела протеолитически расщепляются с образованием F(ab')-фрагментов. Эти фрагменты восстанавливаются в присутствии комплексообразующего агента дитиола и арсенита натрия для стабилизации вицинальных дитиолов и предотвращения образования межмолекулярных дисульфидов. Полученные фрагменты Fab' затем превращаются в производные тионитробензоата (TNB). Затем одно из производных Fab' TNB превращается в Fab' тиол путем восстановления меркаптоэтиламином и смешивается с эквимолярным количеством другого производного Fab' TNB с образованием биспецифичного антитела.
Любое из антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе, может быть конъюгировано со стабилизирующей молекулой (например, молекулой, которая увеличивает период полужизни антитела или его антигенсвязывающего фрагмента у пациента или в растворе). Неограничивающие примеры стабилизирующих молекул включают: полимер (например, полиэтиленгликоль) или белок (например, сывороточный альбумин, такой как человеческий сывороточный альбумин). Конъюгация стабилизирующей молекулы может увеличить время полужизни или продлить биологическую активность антитела или антигенсвязывающего фрагмента in vitro (например, в тканевой клеточной культуре или при хранении в виде фармацевтической композиции) или in vivo (например, у человека).
Характеристики антител
Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем документе, могут блокировать связывание между CTLA4 и CD80 и/или связывание между CTLA4 и CD86. Блокируя связывание между CTLA4 и CD80 и/или связывание между CTLA4 и CD86, антитела против CTLA4 нарушают путь ингибирования CTLA4 и активируют иммунный ответ.
-
-
-
-
-
В некоторых осуществлениях антитело (или его антигенсвязывающие фрагменты) специфически связывается с CTLA4 (например, CTLA4 человека, CTLA4 обезьяны, CTLA4 мыши и/или с химерным CTLA4) с константой диссоциации (Kd) менее чем 1×106 М, менее чем 1×107 М, менее чем 1×108 М, менее чем 1×109 М или менее чем 1×1010 М. В некоторых вариантах осуществления Kd составляет менее чем 20 нМ, 15 нМ, 10 нМ, 9 нМ, 8 нМ, 7 нМ, 6 нМ, 5 нМ, 4 нМ, 3 нМ, 2 нМ или 1 нМ.
-
-
-
-
-
-
В некоторых вариантах осуществления Kd составляет более чем 1×107 М, более чем 1×108 М, более чем 1×109 М, более чем 1×1010 М, более чем 1×1011 М или более чем 1×1012 М.
Общие методики измерения аффинности антитела к антигену включают, например, ИФА, RIA и поверхностный плазмонный резонанс (SPR). В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с человеческим CTLA4 (SEQ ID NO: 41), CTLA4 обезьяны (например, CTLA4 макаки-резус, SEQ ID NO: 43), с химерным CTLA4 (SEQ ID NO: 44) и/или с мышиным CTLA4 (SEQ ID NO: 42). В некоторых вариантах осуществления антитело не связывается с человеческим CTLA4 (SEQ ID NO: 41), CTLA4 обезьяны (например, CTLA4 макаки-резус, SEQ ID NO: 43), с химерным CTLA4 (SEQ ID NO: 44) и/или с мышиным CTLA4 (SEQ ID NO: 42).
В некоторых вариантах осуществления антитело имеет процент ингибирования роста опухоли (TGI%), который составляет более чем 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% или 200%. В некоторых вариантах осуществления антитело имеет процент ингибирования роста опухоли, который составляет менее чем 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% или 200%. % TGI можно определить, например, через 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или через 30 дней после начала лечения или через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11 или 12 месяцев после начала обработки. Используемый в настоящем описании процент ингибирования роста опухоли (TGI%) рассчитывается по следующей формуле:
TGI(%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100
Ti - средний объем опухоли в группе обработки в день i. T0 - средний объем опухоли в группе обработки в нулевой день. Vi - средний объем опухоли в контрольной группе в день i. V0 - средний объем опухоли в контрольной группе в нулевой день.
Способы получения антител против CTLA4
Выделенный фрагмент человеческого CTLA4 может быть использован в качестве иммуногена для генерирования антител с использованием стандартных методов получения поликлональных и моноклональных антител. Поликлональные антитела могут быть получены у животных путем многократных инъекций (например, подкожных или внутрибрюшинных инъекций) антигенного пептида или белка. В некоторых вариантах осуществления антигенный пептид или белок инъецируют по меньшей мере с одним адъювантом. В некоторых вариантах осуществления антигенный пептид или белок можно конъюгировать с агентом, который является иммуногенным для видов, которые должны быть иммунизированы. Животным можно вводить антигенный пептид или белок более чем один раз (например, дважды, трижды или четыре раза).
Можно использовать полноразмерный полипептид или белок или, в качестве альтернативы, можно использовать их антигенные пептидные фрагменты в качестве иммуногенов. Антигенный пептид белка содержит по меньшей мере 8 (например, по меньшей мере 10,15, 20 или 30) аминокислотных остатков аминокислотной последовательности CTLA4 и включает эпитоп белка, так что антитело, образованное против пептида, образует специфический иммунный комплекс с белком. Как описано выше, полноразмерная последовательность человеческого CTLA4 известна в данной области (SEQ ID NO: 41).
Иммуноген обычно используется для получения антител путем иммунизации подходящего субъекта (например, человека или трансгенного животного, экспрессирующего по меньшей мере один локус иммуноглобулина человека). Подходящий иммуногенный препарат может содержать, например, рекомбинантно экспрессируемый или химически синтезированный полипептид (например, фрагмент человеческого CTLA4). Препарат может дополнительно включать адъювант, такой как полный или неполный адъювант Фрейнда, или подобный иммуностимулирующий агент.
Поликлональные антитела могут быть получены, как описано выше, путем иммунизации подходящего субъекта полипептидом CTLA4 или его антигенным пептидом (например, частью CTLA4) в качестве иммуногена. Титр антител у иммунизированного субъекта можно контролировать с течением времени стандартными методами, такими как иммуноферментный анализ (ИФА) с использованием иммобилизованного полипептида или пептида CTLA4. При желании молекулы антитела могут быть выделены из тканей млекопитающего (например, из крови) и дополнительно очищены известными методами, такими как хроматография с протеином А или с протеином G, для получения фракции IgG. В надлежащее время после иммунизации, например, когда титры специфических антител самые высокие, у субъекта могут быть получены клетки, продуцирующие антитела, и использованы для получения моноклональных антител стандартными методами, такими как метод гибридомы, первоначально описанный Kohler et al. (Nature 256: 495-497, 1975), метод B-клеточной гибридомы человека (Kozbor et al., Immunol. Today 4:72, 1983), метод EBV-гибридомы (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1985), или метод триомы. Технология получения гибридом хорошо известна (см., как правило, Current Protocols in Immunology, 1994, Coligan et al. (Eds.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY). Клетки гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело, детектируют путем скрининга супернатантов гибридомной культуры на наличие антител, которые связывают интересующий полипептид или эпитоп, например, с использованием стандартного анализа ИФА.
Варианты антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе, могут быть получены путем введения соответствующих нуклеотидных изменений в ДНК, кодирующую человеческое, гуманизированное или химерное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в настоящем документе, или путем пептидного синтеза. Такие варианты включают, например, делеции, вставки или замены остатков в аминокислотных последовательностях, которые составляют антигенсвязывающий сайт антитела или антигенсвязывающий домен. В популяции таких вариантов некоторые антитела или антигенсвязывающие фрагменты будут иметь повышенную аффинность к белку-мишени, например, CTLA4. Любая комбинация делеций, вставок и/или комбинаций может быть сделана для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, который обладает повышенной аффинностью связывания с мишенью. Аминокислотные изменения, введенные в антитело или антигенсвязывающий фрагмент, также могут изменять или вводить новые посттрансляционные модификации в антитело или антигенсвязывающий фрагмент, такие как изменение (например, увеличение или уменьшение) количества сайтов гликозилирования, изменение типа сайта гликозилирования (например, изменение аминокислотной последовательности так, что ферменты, присутствующие в клетке, присоединяют другой сахар), или введение новых сайтов гликозилирования.
Антитела, раскрытые в настоящем описании, могут быть получены из любых видов животных, включая млекопитающих. Неограничивающие примеры нативных антител включают антитела, полученные с использованием людей, приматов, например, обезьян и человекообразных обезьян, коров, свиней, лошадей, овец, верблюдов (например, верблюдов и лам), куриц, коз и грызунов (например, крыс, мышей, хомяков и кроликов), включая трансгенных грызунов, генетически сконструированных для прдуцирования антител человека.
Человеческие и гуманизированные антитела включают антитела, имеющие вариабельные и константные области, полученные из (или имеющие ту же аминокислотную последовательность, что и у полученной последовательности) последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. Человеческие антитела могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями человеческого иммуноглобулина зародышевой линии (например, мутации, введенные случайным или сайт-специфическим мутагенезом in vitro или соматической мутацией in vivo), например в CDR.
Гуманизированное антитело, как правило, имеет человеческий каркас (FR), трансплантированные CDR, не являющиеся человеческими. Таким образом, гуманизированное антитело имеет одну или более аминокислотных последовательностей, введенных в него из источника, который не является человеческим. Эти аминокислотные остатки, не являющиеся человеческими, часто называют «импортными» остатками, которые обычно берут из «импортного» вариабельного домена. Гуманизация может быть по существу выполнена с помощью, например, замены CDR грызунов или последовательностей CDR соответствующими последовательностями человеческого антитела. Эти методы описаны, например, в Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al. Science, 239: 1534-1536 (1988); каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Соответственно, «гуманизированные» антитела представляют собой химерные антитела, в которых по существу менее чем интактный человеческий V-домен, заменен соответствующей последовательностью из вида, отличного от человека. На практике гуманизированные антитела обычно представляют собой антитела мыши, в которых некоторые остатки CDR и некоторые остатки FR замещены остатками из аналогичных сайтов в антителах человека.
Выбор человеческих доменов VH и VL для использования при создании гуманизированных антител очень важен для снижения иммуногенности. В соответствии с так называемым методом «наилучшего соответствия» последовательность V-домена мышиного антитела подвергается скринингу против всей библиотеки известных последовательностей человеческого домена. Человеческая последовательность, которая наиболее близка к последовательности мыши, затем принимается в качестве FR человека для гуманизированного антитела (Sims et al. J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia et al. J. Mol. Biol. 196: 901 (1987).
Кроме того, важно, чтобы антитела были гуманизированы с сохранением высокой специфичности и аффинности к антигену и других благоприятных биологических свойств. Для достижения этой цели гуманизированные антитела могут быть получены путем анализа родительских последовательностей и различных концептуальных гуманизированных продуктов с использованием трехмерных моделей родительских и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов обычно доступны и знакомы специалистам в данной области. Доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и отображают возможные трехмерные конформационные структуры выбранных последовательностей-кандидатов иммуноглобулинов. Изучение этих дисплеев позволяет анализировать вероятную роль остатков в функционировании кандидатной последовательности иммуноглобулина, т. е. анализ остатков, которые влияют на способность иммуноглобулина-кандидата связываться с его антигеном. Таким образом, остатки FR могут быть выбраны и объединены из реципиентных и импортных последовательностей так, что достигается желаемая характеристика антитела, такая как повышенная аффинность к целевому антигену (антигенам).
Обычно варианты аминокислотной последовательности человеческого, гуманизированного или химерного антитела против CTLA4 будут содержать аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с последовательностью, присутствующей в легкой или тяжелой цепи исходного антитела.
Идентичность или гомология в отношении исходной последовательности обычно представляет собой процент аминокислотных остатков, присутствующих в последовательности-кандидате, которые идентичны последовательности, присутствующей в человеческом, гуманизированном или химерном антителе против CTLA4 или в его фрагменте, после выравнивания последовательностей и введения пробелов, если необходимо, для достижения максимальной процентной идентичности последовательности, и без учета каких-либо консервативных замен как части идентичности последовательности. Ни одно из N-концевых, С-концевых или внутренних расширений, делеций или вставок в последовательности антитела не должно рассматриваться как влияющее на идентичность или гомологию последовательности.
Могут быть сделаны дополнительные модификации антител против CTLA4 или антигенсвязывающих фрагментов. Например, остаток(и) цистеина может быть введен в Fc-область, тем самым обеспечивая образование межцепочечной дисульфидной связи в этой области. Полученное таким образом гомодимерное антитело может иметь любое увеличенное время полужизни in vitro и/или in vivo. Гомодимерные антитела с увеличенным периодом полужизни in vitro и/или in vivo также могут быть получены с использованием гетеробифункциональных сшивающих агентов, как описано, например, в Wolff et al. (Cancer Res. 53: 2560-2565, 1993). Альтернативно, может быть сконструировано антитело, которое имеет двойные области Fc (см., например, Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230,1989).
В некоторых вариантах осуществления ковалентная модификация может быть выполнена для антитела против CTLA4 или его антигенсвязывающего фрагмента. Эти ковалентные модификации могут быть сделаны химическим или ферментативным синтезом или ферментативным или химическим расщеплением. Другие типы ковалентных модификаций антитела или фрагмента антитела вводятся в молекулу путем взаимодействия целевых аминокислотных остатков антитела или фрагмента с органическим дериватизирующим агентом, который способен реагировать с выбранными боковыми цепями или N- или C-концевыми остатками.
Рекомбинантные векторы
Настоящее раскрытие также относится к рекомбинантным векторам (например, к экспрессирующим векторам), которые включают выделенный полинуклеотид, раскрытый в настоящем описании (например, полинуклеотид, который кодирует полипептид, раскрытый в настоящем описании), к клеткам-хозяевам, в которые вводятся рекомбинантные векторы (т.е. так, что клетки-хозяева содержат полинуклеотид и/или вектор, содержащий полинуклеотид), и к продуцированию полипептидов рекомбинантных антител или их фрагментов рекомбинантными способами.
Используемый в настоящем описании термин «вектор» представляет собой любую конструкцию, способную доставлять один или более представляющих интерес полинуклеотидов в клетку-хозяин, когда вектор вводится в клетку-хозяин. «Экспрессирующий вектор» способен доставлять и экспрессировать один или более представляющих интерес полинуклеотидов в виде кодируемого полипептида в клетке-хозяин, в которую был введен экспрессирующий вектор. Таким образом, в экспрессирующем векторе интересующий полинуклеотид располагается для экспрессии в векторе, будучи функционально связанным с регуляторными элементами, такими как промотор, энхансер и/или поли-А-хвост, либо внутри вектора, либо в геноме клетки-хозяина в области сайта интеграции интересующего полинуклеотида или около нее или фланкируя ее, так что интересующий полинуклеотид будет транслироваться в клетке-хозяине, в которую введен экспрессирующий вектор.
Вектор может быть введен в клетку-хозяина способами, известными в данной области техники, например, электропорацией, химической трансфекцией (например, с использованием DEAE-декстрана), трансформацией, трансфекцией и инфекцией и/или трансдукцией (например, с использованием рекомбинантного вируса). Таким образом, неограничивающие примеры векторов включают вирусные векторы (которые можно использовать для генерирования рекомбинантного вируса), депротеинизированную ДНК или РНК, плазмиды, космиды, фаговые векторы и экспрессирующие векторы ДНК или РНК, связанные с катионными конденсирующими агентами.
В некоторых осуществлениях полинуклеотид, раскрытый в настоящем описании (например, полинуклеотид, который кодирует полипептид, описанный в настоящем документе), вводят с использованием вирусной системы экспрессии (например, осповакцины или другого вируса оспы, ретровируса или аденовируса), которые могут включать использование непатогенного (дефектного), реплекативно-компетентного вируса или могут использовать реплекативно-дефектный вирус. В последнем случае размножение вируса обычно происходит только в дополняющих клетках, упаковывающих вирус. Подходящие системы раскрыты, например, в Fisher-Hoch et al. 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:317-321; Flexner et al., 1989, Ann. N. Y. Acad Sci. 569: 86-103; Flexner et al., 1990,Vaccine, 8:17-21; U. S. Pat. No 4603112, 4769330 и 5017487; WO 89/01973; Патент США No. 4777127; GB 2200651; ЕР 0,345,242; WO 91/02805; Berkner-Biotechniques, 6: 616-627, 1988; Rosenfeld et al. 1991, Science, 252: 431-434; Kolls et al. 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:215-219; Kass-Eisler et al. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11498-11502; Guzman et al., 1993, Circulation, 88: 2838-2848; и Guzman et al., 1993, Cir. Res. 73: 1202-1207. Методы включения ДНК в такие системы экспрессии хорошо известны специалистам в данной области. ДНК также может быть «депротеинизированной», как описано, например, в Ulmer et al., 1993, Science, 259: 1745-1749, и Cohen, 1993, Science, 259: 1691-1692. Поглощение депротеинизированной ДНК может быть увеличено путем нанесения ДНК на биодеградируемые гранулы, которые эффективно транспортируются в клетки.
Для экспрессии ДНК-вставка, содержащая полинуклеотид, кодирующий антитело или кодирующий полипептид, описанный в настоящем документе, может быть функционально связана с подходящим промотором (например, гетерологичным промотором), таким как промотор фага лямбда PL, промоторами E.coli lac, trp и tac, ранними и поздними промоторами SV40 и промоторами ретровирусных LTR, и со многими другими. Другие подходящие промоторы известны специалисту в данной области. Экспрессирующие конструкции могут дополнительно содержать сайты инициации, терминации транскрипции и, в транскрибируемой области, сайт связывания рибосомы для трансляции. Кодирующая часть зрелых транскриптов, экспрессируемых этими конструкциями, может включать в себя кодон инициации трансляции в начале и терминирующий кодон (UAA, UGA или UAG), соответствующим образом расположенный на конце полипептида, подлежащего трансляции.
Как указано, экспрессирующие векторы могут включать по меньшей мере один селектируемый маркер. Такие маркеры включают гены устойчивости к дигидрофолатредуктазе или неомицину для культуры эукариотических клеток и гены устойчивости к тетрациклину или ампициллину для культивирования в E.coli и других бактериях. Репрезентативные примеры подходящих хозяев включают, но не ограничиваются ими, бактериальные клетки, такие как клетки E.coli, Streptomyces и Salmonella typhimurium; грибковые клетки, такие как дрожжевые клетки; клетки насекомых, такие как клетки Drosophila S2 и Spodoptera Sf9; животные клетки, такие как клетки СНО, COS, меланомы Bowes и клетки HK 293; и растительные клетки. Подходящие культуральные среды и условия для клеток-хозяев, описанные в настоящем документе, известны в данной области.
Неограничивающие примеры векторов для использования в бактериях включают pQE70, pQE60 и pQE-9, доступные от Qiagen; векторы pBS, векторы Phagescript, векторы Bluescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, доступные от Stratagene; и ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5, доступные от Pharmacia. Неограничивающие эукариотические векторы включают pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 и pSG, доступные от Stratagene; и pSVK3, pBPV, pMSG и pSVL, доступные от Pharmacia. Другие подходящие векторы будут очевидны для специалиста в данной области.
Неограничивающие примеры бактериальных промоторов, подходящих для использования, включают промоторы E.coli lacI и lacZ, промоторы T3 и T7, промотор gpt, промоторы лямбда PR и PL и промотор trp. Подходящие эукариотические промоторы включают немедленный ранний промотор CMV, промотор тимидинкиназы HSV, ранний и поздний промоторы SV40,промоторы ретровирусных LTR, такие как промоторы вируса саркомы Рауса (RSV), и промоторы металлотионеина, такие как промотор металлотионеина-I мыши.
В дрожжах Saccharomyces cerevisiae может быть использован ряд векторов, содержащих конститутивные или индуцируемые промоторы, такие как промоторы альфа-фактора, алкогольоксидазы и PGH. Для обзоров см. Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N. Y, и Grant et al., Methods Enzymol. 153: 516-544 (1997).
Введение конструкции в клетку-хозяина может осуществляться кальцийфосфатной трансфекцией, трансфекцией, опосредованной DEAE-декстраном, трансфекцией, опосредованной катионными липидами, электропорацией, трансдукцией, инфекцией или другими методами. Такие методы описаны во многих стандартных лабораторных руководствах, таких как Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986).
Транскрипция ДНК, кодирующей антитело по настоящему изобретению, высшими эукариотами может быть увеличена путем введения энхансерной последовательности в вектор. Энхансеры представляют собой цис-действующие элементы ДНК, обычно приблизительно от 10 до 300 п.н., которые действуют для увеличения транскрипционной активности промотора в данном типе клеток-хозяев. Примеры энхансеров включают энхансер SV40, который расположен в участке позднего начала репликации на расстоянии 100-270 п.н., энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы на участке позднего начала репликации и энхансеры аденовируса.
Для секреции транслированного белка в просвет эндоплазматического ретикулума, в периплазматическое пространство или во внеклеточную среду соответствующие сигналы секреции могут быть включены в экспрессированный полипептид. Сигналы могут быть эндогенными для полипептида или они могут быть гетерологичными сигналами.
Полипептид (например, антитело) может быть экспрессирован в модифицированной форме, такой как слитый белок (например, GST-слитый) или с гистидиновой меткой и может включать не только сигналы секреции, но также дополнительные гетерологичные функциональные области. Например, область дополнительных аминокислот, в частности заряженных аминокислот, может быть добавлена к N-концу полипептида для улучшения стабильности и устойчивости в клетке-хозяине, во время очистки или во время последующей обработки и хранения. Также пептидные фрагменты могут быть добавлены к полипептиду для облегчения очистки. Такие области могут быть удалены до окончательного получения полипептида. Добавление пептидных фрагментов к полипептидам, чтобы вызвать секрецию или экскрецию, чтобы улучшить стабильность и облегчить очистку, среди прочего, являются известными и обычными методами в данной области.
Методы лечения
Антитела или антитела или их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению могут быть использованы для различных терапевтических целей. В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения злокачественного новообразования у пациента, способам снижения скорости увеличения объема опухоли у пациента с течением времени, способам снижения риска развития метастазирования или способам снижения риска развития дополнительного метастазирования у пациента. В некоторых вариантах осуществления лечение может останавливать, замедлять, тормозить или ингибировать прогрессирование злокачественного новообразования. В некоторых вариантах осуществления лечение может приводить к уменьшению количества, тяжести и/или продолжительности одного или более симптомов злокачественного новообразования у пациента.
В одном аспекте раскрытие относится к способам, которые включают введение терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, раскрытого в настоящем описании, пациенту, нуждающемуся в этом (например, пациенту, имеющему или идентифицированному или диагностированному как имеющий злокачественное новообразование), например, рак молочной железы (например, трижды негативный рак молочной железы), карциноидный рак, рак шейки матки, рак эндометрия, глиому, рак головы и шеи, рак печени, рак легких, мелкоклеточный рак легких, лимфома, меланома, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак простаты, рак почки, колоректальный рак, рак желудка, рак яичка, рак щитовидной железы, рак мочевого пузыря, рак уретры или гемобластоз. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование представляет собой неоперабельную меланому или метастатическую меланому, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), мелкоклеточный рак легкого (SCLC), рак мочевого пузыря или метастатический гормонально рефрактерный рак предстательной железы.
В некоторых вариантах осуществления композиции и способы, раскрытые в настоящем описании, можно использовать для лечения пациентов с риском развития злокачественного новообразования. Пациентов, имеющих злокачественные новообразования, можно идентифицировать различными способами, известными в данной области.
Используемый в настоящем описании термин «эффективное количество» означает количество или дозу, достаточные для достижения полезных или желаемых результатов, включая остановку, замедление, торможение или ингибирование прогрессирования заболевания, например, злокачественного новообразования. Эффективное количество будет варьироваться в зависимости от, например, возраста и массы тела пациента, которому следует вводить антитело, антигенсвязывающий фрагмент, полинуклеотид, кодирующий антитело, вектор, содержащий полинуклеотид, и/или их составов, тяжести симптомов и пути введения, и таким образом введение может быть определено на индивидуальной основе.
Эффективное количество может быть введено за одно или более введений. В качестве примера, эффективное количество антитела или антигенсвязывающего фрагмента представляет собой количество, достаточное для ослабления, остановки, стабилизации, реверсии, ингибирования, замедления и/или задержки прогрессирования злокачественного новообразования у пациента, или представляет собой количество, достаточное для ослабления, остановки, стабилизации, реверсии, ингибирования, замедления и/или задержки пролиферации клетки (например, биоптатной клетки, любой из опухолевых клеток, описанных в настоящем документе, или клеточной линии (например, опухолевой клеточной линии)) in vitro. Как понятно в данной области, эффективное количество антитела или антигенсвязывающего фрагмента может варьироваться в зависимости, в частности, от истории болезни пациента, а также от других факторов, таких как тип (и/или дозировка) используемого антитела.
Эффективные количества и схемы введения антител, полинуклеотидов, кодирующих антитела, и/или композиций, раскрытых в настоящем описании, могут быть определены эмпирически, и такие определения в компетенции специалистов в данной области. Специалистам в данной области будет понятно, что дозировка, которая должна быть введена, будет варьироваться в зависимости, например, от млекопитающего, которое получает антитела, полинуклеотиды, кодирующие антитела, и/или композиции, раскрытые в настоящем описании, от пути введения, конкретного типа используемых антител, полинуклеотидов, кодирующих антитела, антигенсвязывающих фрагментов и/или композиций, раскрытых в настоящем описании, и других лекарственных средств, вводимых млекопитающему. Руководство по выбору подходящих доз для антитела или антигенсвязывающего фрагмента можно найти в литературе по терапевтическому применению антител и антигенсвязывающих фрагментов, например, Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds. Noges Publications, Park Ridge, N.J., 1985, ch. 22 and pp. 303-357; Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York, 1977, pp. 365-389.
Типичная суточная доза эффективного количества антитела составляет 0,01 мг/кг - 100 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления дозировка может составлять менее чем100 мг/кг, 10 мг/кг, 9 мг/кг, 8 мг/кг, 7 мг/кг, 6 мг/кг, 5 мг/кг, 4 мг/кг, 3 мг/кг, 2 мг/кг, 1 мг/кг, 0,5 мг/кг или 0,1 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления дозировка может составлять более чем 10 мг/кг, 9 мг/кг, 8 мг/кг, 7 мг/кг, 6 мг/кг, 5 мг/кг, 4 мг/кг, 3 мг/кг, 2 мг/кг, 1 мг/кг, 0,5 мг/кг, 0,1 мг/кг, 0,05 мг/кг или 0,01 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления дозировка составляет примерно 10 мг/кг, 9 мг/кг, 8 мг/кг, 7 мг/кг, 6 мг/кг, 5 мг/кг, 4 мг/кг, 3 мг/кг, 2 мг/кг, 1 мг/кг, 0,9 мг/кг, 0,8 мг/кг, 0,7 мг/кг, 0,6 мг/кг, 0. 5 мг/кг, 0,4 мг/кг, 0,3 мг/кг, 0,2 мг/кг или 0,1 мг/кг.
В любом из способов, описанных в настоящем документе, по меньшей мере одно антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или фармацевтическая композиция (например, любое из антител, антигенсвязывающих фрагментов или фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе), и, необязательно, по меньшей мере, один дополнительный терапевтический агент можно вводить пациенту, по меньшей мере, один раз в неделю (например, один раз в неделю, два раза в неделю, три раза в неделю, четыре раза в неделю, один раз в день, два раза в день или три раза в день). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере два разных антитела и/или антигенсвязывающих фрагмента вводят в одной и той же композиции (например, в жидкой композиции). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно антитело или антигенсвязывающий фрагмент и по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент вводят в одной и той же композиции (например, в жидкой композиции). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно антитело или антигенсвязывающий фрагмент и по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент вводят в двух разных композициях (например, в жидкой композиции, содержащей по меньшей мере одно антитело или антигенсвязывающий фрагмент, и в твердой пероральной композиции, содержащей по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент вводят в виде пилюли, таблетки или капсулы. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, один дополнительный терапевтический агент вводят в пероральной композиции с замедленным высвобождением.
В некоторых вариантах осуществления один или более дополнительных терапевтических агентов можно вводить пациенту до или после введения по меньшей мере одного антитела, антигенсвязывающего фрагмента антитела или фармацевтической композиции (например, любого из антител, антигенсвязывающих фрагментов антител или фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе). В некоторых вариантах осуществления один или более дополнительных терапевтических агентов и, по меньшей мере, одно антитело, антигенсвязывающий фрагмент антитела или фармацевтическая композиция (например, любое из антител, антигенсвязывающих фрагментов антител или фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе), вводится пациенту таким образом, что имеет место перекрывание периода биологической активности одного или более дополнительных терапевтических агентов и по меньшей мере одного антитела или антигенсвязывающего фрагмента (например, любого из антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе) у пациента.
В некоторых вариантах осуществления пациенту можно вводить по меньшей мере одно антитело, фрагмент антигенсвязывающего антитела или фармацевтическую композицию (например, любое из антител, антигенсвязывающих фрагментов антитела или фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе) в течение продолжительного периода времени (например, в течение периода, составляющего по меньшей мере 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев, 12 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года или 5 лет). Квалифицированный медицинский работник может определить продолжительность периода лечения, используя любой из методов, описанных в настоящем документе, для диагностики или отслеживания эффективности лечения (например, наблюдения по меньшей мере одного симптома злокачественного новообразования). Как описано в настоящем документе, квалифицированный медик может также изменить идентичность и количество (например, увеличение или уменьшение) антител или антигенсвязывающих фрагментов антител (и/или одного или более дополнительных терапевтических агентов), вводимых пациенту, и, кроме того, может регулироваться (например, увеличиваться или уменьшаться) дозировка или частота введения по меньшей мере одного антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела (и/или одного или более дополнительных терапевтических агентов) пациенту на основании оценки эффективности лечения (например, с использованием любого из способов, описанных в настоящем документе и известных в данной области техники).
Фармацевтические композиции и пути введения
Также в настоящем описании предложены фармацевтические композиции, которые содержат по меньшей мере одно (например, одно, два, три или четыре) из антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе. Два или более (например, два, три или четыре) любого из антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе, могут присутствовать в фармацевтической композиции в любой комбинации. Фармацевтические композиции могут быть составлены любым способом, известным в данной области.
Фармацевтические композиции составлены так, чтобы они были совместимы с их назначенным путем введения (например, внутривенным, внутриартериальным, внутримышечным, внутрикожным, подкожным или внутрибрюшинным). Композиции могут включать стерильный разбавитель (например, стерильную воду или физиологический раствор), жирное масло, полиэтиленгликоль, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители, антибактериальные или противогрибковые агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабены, хлорбутанол, фенол, аскорбиновая кислота, тимеросал и тому подобное, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия, хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота, буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и изотонические агенты, такие как сахара (например, декстроза), полиспирты (например, маннит или сорбит) или соли (например, хлорид натрия) или любую их комбинацию. Липосомные суспензии также могут быть использованы в качестве фармацевтически приемлемых носителей (см., например, Патент США № 4522811). Препараты композиций могут быть составлены и заключены в ампулы, одноразовые шприцы или флаконы с многократными дозами. При необходимости (как, например, в инъецируемых составах) надлежащая текучесть может поддерживаться, например, путем использования покрытия, такого как лецитин или поверхностно-активное вещество. Абсорбция антитела или его антигенсвязывающего фрагмента может быть продлена путем включения агента, который задерживает абсорбцию (например, моностеарата алюминия и желатина). Альтернативно, контролируемое высвобождение может быть достигнуто с помощью имплантатов и микрокапсулированных систем доставки, которые могут включать биодеградируемые, биосовместимые полимеры (например, этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота; Alza Corporation и Nova Pharmaceutical, Inc.).
Композиции, содержащие одно или более из любых антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе, могут быть составлены для парентерального введения (например, внутривенного, внутриартериального, внутримышечного, внутрикожного, подкожного или внутрибрюшинного) в стандартной лекарственной форме (т. е. в физически дискретных единицах, содержащих заранее определенное количество активного соединения для простоты введения и единообразия дозировки).
Токсичность и терапевтическую эффективность композиций можно определить стандартными фармацевтическими процедурами на клеточных культурах или экспериментальных животных (например, обезьянах). Можно, например, определить LD50 (доза, летальная для 50% популяции) и ED50 (доза, терапевтически эффективная для 50% популяции): терапевтический индекс представляет собой соотношение LD50:ED50. Агенты, которые демонстрируют высокие терапевтические индексы, являются предпочтительными. Если агент проявляет нежелательный побочный эффект, следует позаботиться о том, чтобы минимизировать потенциальный ущерб (т.е. уменьшить нежелательные побочные эффекты). Токсичность и терапевтическая эффективность могут быть определены другими стандартными фармацевтическими процедурами.
Данные, полученные из анализов клеточных культур и исследований на животных, могут быть использованы при составлении подходящей дозы любого данного агента для применения у пациента (например, у человека). Терапевтически эффективное количество одного или более (например, одного, двух, трех или четырех) из антител или их антигенсвязывающих фрагментов (например, любого из антител или фрагментов антител, описанных в настоящем документе), будет представлять собой количество, которое лечит заболевание у пациента (например, убивает опухолевые клетки) у пациента (например, у пациента-человека, у которого выявлено злокачественное новообразование), или у пациента с риском развития заболевания (например, у пациента, у которого ранее развилось злокачественное новообразование, но теперь оно было излечено), уменьшает тяжесть, частоту и/или продолжительность одного или более симптомов заболевания у пациента (например, у человека). Эффективность и дозировка любого из антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе, может быть определена медиком или ветеринарным врачом с использованием способов, известных в данной области, а также путем наблюдения одного или более симптомов заболевания у пациента (например, у человека). Определенные факторы могут влиять на дозировку и сроки, необходимые для эффективного лечения пациента (например, тяжесть заболевания или расстройства, предшествующее лечение, общее состояние здоровья и/или возраст пациента и наличие других заболеваний).
Примерные дозы включают количества миллиграмм или микрограммов любого из антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе, на килограмм массы пациента (например, примерно от 1 мкг/кг примерно до 500 мг/кг; примерно от 100 мкг/кг примерно до 500 мг/кг; примерно от 100 мкг/кг примерно до 50 мг/кг; примерно от 10 мкг/кг примерно до 5 мг/кг; примерно от 10 мкг/кг примерно до 0,5 мг/кг; или примерно от 1 мкг/кг примерно до 50 мкг/кг). Хотя эти дозы охватывают широкий диапазон, специалист в данной области поймет, что терапевтические агенты, включая антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, различаются по своей эффективности, и эффективные количества могут быть определены способами, известными в данной области. Как правило, сначала вводят относительно низкие дозы, а лечащий врач или ветеринарный врач (в случае терапевтического применения) или исследователь (на стадии разработки) могут впоследствии и постепенно увеличивать дозу до соответствующего получаемого ответа. Кроме того, подразумевается, что конкретный уровень дозы для любого конкретного пациента будет зависеть от множества факторов, включая активность конкретного используемого соединения, возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и рацион питания пациента, время введения, пути введения, скорости выведения и времени полужизни антитела или фрагмента антитела in vivo.
Фармацевтические композиции могут быть включены в контейнер, упаковку или дозатор вместе с инструкциями для введения.
ПРИМЕРЫ
Изобретение далее описано в следующих примерах, которые не ограничивают объем изобретения, описанный в формуле изобретения.
Пример 1 Генерирование мышиных антител против hCTLA4
Для создания мышиных антител против человеческого CTLA4 (hCTLA4; SEQ ID NO: 41) мышей BALB/возрастом 6-8 недель иммунизировали человеческим CTLA4. Антитела против hCTLA4 собирали способами, описанными ниже (ФИГ. 1 и ФИГ. 2).
Иммунизация мышей
Самок мышей BALB/c в возрасте 6-8 недель иммунизировали белками CTLA4 человека, содержащими his-маркер, в дозе 20 мкг/мышь в концентрации 100 мкг/мл. Белки CTLA4 человека с маркером his эмульгировали с адъювантом и инъецировали в четыре положения на спине мышей. Для первой подкожной (s. с.) инъекции, разбавленный антиген эмульгировали с использованием полного адъюванта Фрейнда (CFA) в равном объеме. В следующих подкожных инъекциях белок был эмульгирован с неполным адъювантом Фрейнда (IFA) в равном объеме. Через три дня после третьей инъекции или бустерной иммунизации кровь (сыворотку) собирали и анализировали на титр антител с использованием ИФА.
В другом эксперименте иммунизировали самок мышей BALB/c в возрасте 6-8 недель путем введения экспрессирующей плазмиды, кодирующей человеческий CTLA4, мышам. Плазмиды, кодирующие антиген, вводили в переднюю мышцу большеберцовой кости (внутримышечная инъекция; т.е. m. инъекция) мышей с использованием генной пушки в концентрации 1000 мкг/мкл при 60 мкг на мышь. По меньшей мере четыре инъекции были выполнены с интервалами по меньшей мере 14 дней между каждой инъекцией. Кровь (сыворотку) собрали через семь дней после последней иммунизации, и сыворотку проверяли на титр антител с помощью ИФА.
Процедуры для усиления иммунизации также проводили по меньшей мере через четырнадцать дней после предыдущей иммунизации (либо путем инъекции плазмиды, либо путем введения белков). Клетки СНО, которые экспрессируют антиген CTLA4 на поверхности, внутривенно инъецировали мышам через хвостовые вены. Затем селезенку собирали через четыре дня после инъекции.
Слияние клеток SP2/0 и клеток селезенки
Ткани селезенки были измельчены. Клетки селезенки сначала отбирали с помощью микрогранул CD3ε и микрогранул с антителом против мышиного IgM, а затем сливали с клетками SP2/0. Затем клетки высевали в 96-луночные планшеты со средой гипоксантин-аминоптерин-тимидин (HAT).
Первичный скрининг гибридомы
4
Первичный скрининг супернатанта гибридомы в 96-луночных планшетах проводили с использованием флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) в соответствии со стандартными процедурами. Клетки яичника китайского хомячка (СНО) добавляли в 96-луночные планшеты (2×10 клеток на лунку) перед скринингом. Использовали 50 мкл супернатанта. Антитела, которые были использованы в экспериментах, представляли собой
2
(1) Конъюгированный с флуоресцеином (FITC) AffiniPure козий F(ab)-фрагмент против мышиного IgG, специфичный к Fcγ-фрагменту, и
2
(2) Alexa Fluor-647-конъюгированный AffiniPure козий F(ab)-фрагмент против человеческого IgG, специфичный для Fcγ-фрагмента.
Субклонирование
Субклонирование проводили с использованием ClonePix2. Вкратце, положительные лунки, идентифицированные во время первичного скрининга, переносили в полутвердую среду, и IgG-положительные клоны идентифицировали и тестировали. Использовали FITC-конъюгипрованное Fc-антитело против мышиного IgG.
Асцитная жидкость антител
6
1×10 положительных клеток гибридомы вводили внутрибрюшинно мышам B-NDG (Beijing Biocytogen, Пекин, Китай). Моноклональные антитела были получены путем выращивания клеток гибридомы в брюшной полости мыши. Клетки гибридомы размножались и производили асцитную жидкость в брюшной полости мышей. Жидкость содержала высокую концентрацию антител, которые можно собирать для последующего использования.
Очистка антител
Антитела в асцитной жидкости очищали с использованием белковой хроматографии GE AKTA (GE Healthcare, Чикаго, Иллинойс, США). CT4-04-13A4 («13A4»), CT4-03-4G12 («4G12»), CT4-20-6D2 («6D2») и CT4-20-7E12 («7E12») были среди мышиных антител, полученных методами, описанными выше. Аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи этих антител представлены на ФИГ. 27
Пример 2. Гуманизация мышиных антител
Отправной точкой для гуманизации были мышиные антитела (например, 13A4 и 4G12). Были определены аминокислотные последовательности для вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи этих мышиных антител. Пять вариантов вариабельной области гуманизированной тяжелой цепи (SEQ ID NO: 13-17) и три варианта вариабельной области гуманизированной легкой цепи (SEQ ID NO: 18-20) для 13A4 были сконструированы с различными перестановками замен (ФИГ. 25). Аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и CDR3 для гуманизированного 13A4 были показаны в SEQ ID NO: 1-6 (нумерация Kabat) или SEQ ID NO: 29-34 (нумерация Chothia).
Были сконструированы четыре варианта вариабельной области гуманизированной тяжелой цепи (SEQ ID NO: 21-24) и четыре варианта вариабельной области гуманизированной легкой цепи (SEQ ID NO: 25-28) для 4G12, содержащие различные перестановки замен (ФИГ. 25). Аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и CDR3 для гуманизированного 4G12 были показаны в SEQ ID NO: 7-12 (нумерация Kabat) или SEQ ID NO: 35-40 (нумерация Chothia).
Эти гуманизированные антитела были получены с помощью стандартных процедур и облегчены с использованием BioLuminate 1. 0 (Schrodinger, Шанхай, Китай).
Пример 3. In vitro тестирование мышиных антител против hCTLA4: блокирование связывания CTLA4 CD80 и CD86.
Были проведены анализы блокирования, чтобы определить, могут ли антитела против CTLA4 блокировать связывание между CTLA4 и CD80 и связывание между CTLA4 и CD86.
Антитела против CTLA4 собирали из асцитной жидкости мыши и очищали хроматографией. 25 мкл клеток CHO, транзиторно трансфецированных человеческим CTLA4, добавляли в каждую лунку планшета. Очищенные антитела титровали до конечных концентраций 50, 5, 0,5, 0,05, 0,005 мкг/мл. Титрованные антитела добавляли в каждую лунку при 25 мкл на лунку при 4°С и инкубировали в течение 30 минут.
Биотин-hCD80 или Биотин-hCD86 титровали до 0,4 мкг/мл. 50 мкл раствора лиганда добавляли в каждую лунку, получая конечную концентрацию биотин-hCD80 или биотин-hCD86 0,2 мкг/мл. Клетки с биотин-hCD80 или биотин-hCD86 инкубировали при 4°С в течение 15 минут.
После промывания фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) в каждую лунку добавляли 50 мкл конъюгата флуоресцеин-изотиоцианата и Fc-антитела против IgG мыши (IgG Fc-FITC) и стрептавидин-фикоэритрин (стрептавидин-РЕ) с разведением 1:100 при 4°С и инкубировали в течение 15 минут с последующей промывкой PBS. Сигналы для FITC и PE определяли с помощью проточной цитометрии.
Как показано на ФИГ. 3, когда концентрация мышиного антитела против hCTLA4 (CT4-04-13A4 и CT4-03-4G12) увеличивалась, сигнал для PE снижался, что указывает на то, что связывание между человеческим CTLA4 и биотин-hCD80 было блокировано антителами CT4-04-13A4 и CT4-03-4G12.
Аналогично, на ФИГ. 4, когда концентрация антитела против hCTLA4 (CT4-04-13A4 и CT4-03-4G12) увеличивалась, сигнал для PE снижался, что указывает на то, что связывание между человеческим CTLA4 и биотин-hCD86 было блокировано антителами CT4-04- 13A4 и CT4-03-4G12.
Пример 4. Перекрестная реактивность химерных антител против hCTLA против химерного CTLA4 обезьяны, мыши и человека-мыши
Клетки СНО трансфецировали CTLA4 макаки-резуса (rmCTLA4, SEQ ID NO: 43), CTLA4 мыши (mCTLA4, SEQ ID NO: 42) и химерным (мышь и человек) CTLA4 (chiCTLA4, SEQ ID NO: 44).
25 мкл клеток СНО добавляли в каждую лунку. 25 мкл очищенных химерных антител против hCTLA (1 мкг/мл) (CT4-03-4G12-mHvKv-IgG1 и CT4-04-13A4-mHvKv-IgG1) добавляли в каждую лунку и инкубировали при 4°С в течение 30 минут. CT4-03-4G12-mHvKv-IgG1 и CT4-04-13A4-mHvKv-IgG1 представляют собой химерные антитела против hCTLA. CT4-03-4G12-mHvKv-IgG1 имеет вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи из мышиного антитела 4G12 и константные домены человеческого IgG1-антитела (CL, CH1, CH2, CH3). Аналогично, CT4-04-13A4-mHvKv-IgG1 имеет вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи из мышиного антитела 13A4 и константные домены человеческого IgG1-антитела (CL, CH1, CH2, CH3).
После промывки PBS (1200 об/мин, 5 минут) дважды, 50 мкл конъюгата флуоресцеин-изотиоцианата и Fc-антитела против человеческого IgG (IgG Fc-FITC) добавляли при разведении 1:100 в каждую лунку и инкубировали при 4°С в течение 30 минут с последующей промывкой PBS. Сигналы для FITC определяли проточной цитометрией.
Как показано на ФИГ. 5, CT4-04-13A4-mHvKv-IgG1 не вступали в перекрестную реакцию с мышиным CTLA4 и имели сильную перекрестную реактивность с rmCTLA4 и химерным CTLA4. Подобным образом CT4-03-4G12-mHvKv-IgG1 не вступали в перекрестную реакцию с мышиным CTLA4 и имели сильную перекрестную реактивность с rmCTLA4 и химерным CTLA4. На ФИГ. 5 NC обозначает отрицательный контроль, а PC обозначает положительный контроль.
Пример 5. In vivo тестирование мышиных антител против hCTLA4
Чтобы протестировать антитела против hCTLA4 in vivo и предсказать эффекты этих антител на организм человека, была создана гуманизированная мышиная модель CTLA-4. Гуманизированная мышиная модель CTLA4 была сконструирована для экспрессии химерного белка CTLA4 (SEQ ID NO: 44), в котором часть внеклеточной области белка CTLA4 мыши была заменена внеклеточной областью человеческого CTLA4. Аминокислотные остатки из положения 41-143 SEQ ID NO: 44 получены из человеческого CTLA4. Гуманизированная мышиная модель (гуманизированные мыши B-hCTLA-4) может предоставить новый инструмент для тестирования новых терапевтических методов лечения в клинических условиях, значительно уменьшая разницу между клиническим исходом у человека и у обычных мышей, экспрессирующих CTLA4 мыши.
3
2
Антитела против hCTLA4 были протестированы, чтобы продемонстрировать их влияние на рост опухоли in vivo на модели карциномы толстой кишки. Опухолевые клетки МС-38 (клетки аденокарциномы толстой кишки) инъецировали подкожно гуманизированным мышам B-hCTLA-4. Когда объем опухолей у мышей достигал 150 ± 50 мм, мышей случайным образом распределяли по разным группам в зависимости от объема опухоли. Затем мышам внутривенно вводили PBS и антитела против hCTLA4. Антитело давали каждые три дня в течение 15 дней (всего 6 инъекций). Введенный объем рассчитывали на основе веса мыши при 10 мкл/г. Длина длинной оси и короткой оси опухоли измерялась дважды в неделю, а объем опухоли вычислялся как 0,5х(длинная ось)х(короткая ось). Массу мышей также измеряли перед инъекцией, когда мышей помещали в разные группы (до первой инъекции антитела), дважды в неделю в течение периода инъекции антитела и перед эвтаназией.
Процент ингибирования роста опухоли (TGI%) рассчитывали по следующей формуле: TGI (%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]х100. Ti - средний объем опухоли в группе обработки в день i. T0 - средний объем опухоли в группе обработки в нулевой день. Vi - средний объем опухоли в контрольной группе в день i. V0 - средний объем опухоли в контрольной группе в нулевой день.
Т-тест выполняли для статистического анализа. % TGI выше 60% указывает на значительное подавление роста опухоли. Р < 0,05 является порогом, указывающим на значимую разницу.
Результаты in vivo для мышиных антител против hCTLA4, 13A4 и 4G12
Массу мышей контролировали в течение всего периода обработки. Масса мышей в разных группах увеличивалась (ФИГ. 6 и ФИГ. 7). Не наблюдалось значимой разницы в массе между контрольной группой и группами обработки антителом против hCTLA4. Результаты показали, что антитела против hCTLA4 хорошо переносились и не токсичны для мышей.
Размер опухоли, однако, показал значимую разницу в группах, получавших антитела 13А4 и 4G12 (ФИГ.8). Как показано на ФИГ. 8, 13A4 и 4G12 ингибировали рост опухоли в зависимости от концентрации. Интересно, что 4G12 в дозе 0,3 мг/кг показали лучшие результаты по сравнению с 4G12 в дозе 1 мг/кг, что указывает на относительно низкую дозу (например, менее 0,5 мг/кг или от 0,1 мг/кг до 0,5 мг/кг 4G12 может достичь лучших результатов.
% TGI в день 22 для каждой группы обработки также рассчитывали, как показано в таблице ниже.
Таблица 1
Группа
Антитела
TGI%
G2
13A4 (3мг/кг)
103%
G3
13A4 (1 мг/кг)
82,90%
G4
13A4 (0.3 мг/кг)
69%
G5
4G12 (3 мг/кг)
45,20%
G6
4G12 (1 мг/кг)
10,10%
G7
4G12 (0,3 мг/кг)
73,60%
Результаты in vivo для 13A4 и Yervoy
Для сравнения эффективности антител к CTLA4 в тех же экспериментах с 13А4 использовали Yervoy. Масса мышей в разных группах у всех увеличивалась в течение периода обработки (ФИГ. 9 и ФИГ. 10). Никакого токсического эффекта не наблюдалось.
Обработка 13A4 и Yervoy приводило к значительному уменьшению размера опухоли (ФИГ. 11). Примечательно, что обработка 13A4 приводила по меньшей мере к сопоставимым эффектам по сравнению с Yervoy. % TGI на 28 день для обеих групп обработки показан ниже.
Таблица 2
Группа
Антитела
TGI%
G3
Yervoy
104,60%
G5
13A4
104,70%
Пример 6. Результаты in vivo для гуманизированных антител против hCTLA4.
Гуманизированные антитела были получены способами, описанными в Примере 2. Для подтверждения терапевтического действия гуманизированных антител шесть гуманизированных антител против hCTLA4 (4G12-H1K1-IgG1; 4G12-H2K1-IgG1; 13A4-H1K2-IgG1; 13A4-H2K2-IgG1; 13A4-H1K2-IgG4; 13A4-H1K2 -IgG1-N297A) тестировали на гуманизированных мышах B-hCTLA-4, чтобы продемонстрировать их влияние на рост опухоли in vivo (ФИГ. 12-17). Кроме того, чтобы уменьшить гетерогенность гликана, Fc-область гуманизированного антитела 13A4-H1K2-IgG1 была дополнительно сконструирована для замены аспарагина в положении 297 на аланин (ФИГ. 17). Вариабельные области легкой цепи и тяжелой цепи антител показаны в таблице ниже.
Таблица 3
Гуманизированные антитела
Вариабельная область тяжелой цепи
Вариабельная область легкой цепи
Тип
4G12-H1K1-IgG1
SEQ ID NO: 21
SEQ ID NO: 25
IgG1
4G12-H2K1-IgG1
SEQ ID NO: 22
SEQ ID NO: 25
IgG1
13A4-H1K2-IgG1
SEQ ID NO: 13
SEQ ID NO: 19
IgG1
13A4-H2K2-IgG1
SEQ ID NO: 14
SEQ ID NO: 19
IgG1
13A4-H1K2-IgG4
SEQ ID NO: 13
SEQ ID NO: 19
IgG4
13A4-H1K2-IgG1-N297A
SEQ ID NO: 13
SEQ ID NO: 19
IgG1 с мутацией N297A в области Fc.
3
2
Использовали процедуры, аналогичные описанным в Примере 5. Опухолевые клетки МС-38 (клетки аденокарциномы толстой кишки) инъецировали подкожно гуманизированным мышам B-hCTLA-4. Когда объем опухолей у мышей достигал 150 ± 50 мм, мышей случайным образом распределяли по разным группам в зависимости от объема опухоли. Затем мышам внутривенно вводили PBS и антитела против CTLA4. Антитело давали два раза в неделю (день 1, 4 каждой недели) в течение 3 недель (всего 6 инъекций). Дозировка рассчитывалась исходя из массы мыши при 10 мг/кг. Длина длинной оси и короткой оси опухоли измерялась дважды в неделю, а объем опухоли вычислялся как 0,5х(длинная ось)х(короткая ось). Массу мышей также измеряли перед инъекцией и в то время, когда мышей помещали в разные группы (до первой инъекции антител). Массу также измеряли два раза в неделю в течение периода введения антитела и в момент времени непосредственно перед эвтаназией.
Процент ингибирования роста опухоли (TGI%) рассчитывали по следующей формуле: TGI (%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]х100. Ti - средний объем опухоли в группе обработки в день i. T0 - средний объем опухоли в группе обработки в нулевой день. Vi - средний объем опухоли в контрольной группе в день i. V0 - средний объем опухоли в контрольной группе в нулевой день.
Т-тест выполняли для статистического анализа. % TGI выше 60% указывает на значительное подавление роста опухоли. Р < 0,05 считается значимой разницей.
Результаты in vivo для 4G12-H1K1-IgG1 и 4G12-H2K1-IgG1
Мышей разделили на 4 группы: 1) в G1 в качестве контроля использовали человеческий IgG; 2) В G4 Yervoy вводили мышам для сравнения; 3) В G10 мышам вводили 4G12-H1K1-IgG1; и 4) В G11 мышам вводили 4G12-H2K1-IgG1.
Массу мышей в четырех группах контролировали в течение всего периода обработки (ФИГ.12 и ФИГ.13). Мыши в каждой группе были в целом здоровы, и результаты показали, что антитела против CTLA4 хорошо переносились и не были токсичными для мышей.
Размер опухоли, однако, был значительно меньше в группах, получавших Yervoy, 4G12-H1K1-IgG1 и 4G12-H2K1-IgG1 (ФИГ. 14). Как показано на ФИГ. 14, 4G12-H1K1-IgG1 (р=0. 002) и 4G12-H2K1-IgG1 (P=0,002) ингибировал рост опухоли по сравнению с контрольной группой и имел лучшие результаты по сравнению с Yervoy (P=0,007). % TGI в день 21 для каждой группы обработки показан ниже.
Таблица 4
Группа
Антитела
TGI%
G4
Yervoy
82,20%
G10
4G12-H1K1-IgG1
90,50%
G11
4G12-H2K1-IgG1
90,50%
Результаты in vivo для 13A4-H1K2-IgG1, 13A4-H2K2-IgG1, 13A4-H1K2-IgG4 и 13A4-H1K2-IgG1-N297A
Мышей разделили на 6 групп: 1) в G1 в качестве контрольной группы использовали человеческий IgG; 2) в G4 Yervoy вводили мышам для сравнения; 3) в G6 мышам вводили 13A4-H1K2-IgG1; 4) в G7 мышам вводили 13A4-H2K2-IgG1; 5) в G8 мышам вводили 13A4-H1K2-IgG4; и 6) в G9 мышам вводили 13A4-H1K2-IgG1-N297A.
Массу мышей в шести группах контролировали в течение всего периода обработки (ФИГ. 15 и ФИГ. 16). Результаты показали, что мыши в каждой группе были здоровы, а антитела против CTLA4 не были токсичными для мышей.
Размеры опухолей, однако, были разными в каждой группе. Как показано на ФИГ. 17, все антитела против CTLA4 могут ингибировать рост опухоли по сравнению с контрольной группой. В частности, 13A4-H1K2-IgG1 и 13A4-H2K2-IgG1 имели лучшие результаты по сравнению с Yervoy.
% TGI в день 21 для каждой группы обработки показан ниже.
Таблица 5
Группа
Антитела
TGI%
G4
Yervoy
82,20%
G6
13A4-H1K2-IgG1
99%
G7
13A4-H2K2-IgG1
96,60%
G8
13A4-H1K2-IgG4
56,10%
G9
13A4-H1K2-IgG1-N297A
47,30%
Пример 7. In vitro тестирование мышиных антител против hCTLA4: CT4-20-6D2 («6D2») и CT4-20-7E12 («7E12»)
Антитела против CTLA4 собирали из асцитной жидкости мыши и очищали хроматографией. 25 мкл клеток CHO, транзиторно трансфецированных человеческим CTLA4, добавляли в каждую лунку планшета. Очищенные антитела титровали до конечных концентраций 50, 5, 0,5, 0,05, 0,005 мкг/мл. Титрованные антитела добавляли в каждую лунку при 25 мкл на лунку при 4°С и инкубировали в течение 30 минут. Биотин-hCD86 титровали до 0,4 мкг/мл. 50 мкл раствора лиганда добавляли в каждую лунку, получая конечную концентрацию биотин-hCD86 0,2 мкг/мл. Клетки с биотин-hCD86 инкубировали при 4°С в течение 15 минут. После промывания фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) в каждую лунку добавляли 50 мкл конъюгата флуоресцеин-изотиоцианата и Fc-антитела против IgG мыши (IgG Fc-FITC) и стрептавидин-фикоэритрин (стрептавидин-РЕ) с разведением 1:100 при 4°С и инкубировали в течение 15 минут с последующей промывкой PBS. Сигналы для FITC и PE определяли с помощью проточной цитометрии.
Как показано на ФИГ. 18, когда концентрация антитела против hCTLA4 (CT4-20-6D2 и CT4-20-7E12) увеличивалась, сигнал для PE снижался, что позволяет предположить, что связывание между человеческим CTLA4 и биотин-hCD86 было блокировано антителами CT4-20-6D2 и CT4-20-7E12.
Пример 8. Перекрестная реактивность антител против hCTLA против химерного CTLA4 обезьяны, мыши и человека-мыши
Клетки СНО трансфецировали CTLA4 макаки-резуса (rmCTLA4, SEQ ID NO: 43), CTLA4 мыши (mCTLA4, SEQ ID NO: 42) и химерным (мышь и человек) CTLA4 (chiCTLA4, SEQ ID NO: 44).
25 мкл клеток СНО добавляли в каждую лунку. 25 мкл очищенных мышиных антител против hCTLA (1 мкг/мл) (CT4-20-6D2 и CT4-20-7E12) добавляли в каждую лунку и инкубировали при 4°С в течение 30 минут.
После промывки PBS (1200 об/мин, 5 минут) дважды, 50 мкл конъюгата флуоресцеин-изотиоцианата и Fc-антитела против человеческого IgG (IgG Fc-FITC) добавляли при разведении 1:100 в каждую лунку и инкубировали при 4°С в течение 30 минут с последующей промывкой PBS. Сигналы для FITC определяли проточной цитометрией.
Как показано на ФИГ. 19, CT4-20-6D2 и CT4-20-7E12 не вступали в перекрестную реакцию с CTLA4 мыши, имели слабую перекрестную реактивность с химерным CTLA4 и относительно сильную перекрестную реактивность с rmCTLA4.
Пример 9. In vivo тестирование мышиных антител против hCTLA4
3
2
Антитела против hCTLA4 были протестированы, чтобы продемонстрировать их влияние на рост опухоли in vivo на модели карциномы толстой кишки. Опухолевые клетки МС-38 (клетки аденокарциномы толстой кишки) инъецировали подкожно гуманизированным мышам B-hCTLA-4. Когда объем опухолей у мышей достигал 150 ± 50 мм, мышей случайным образом распределяли по разным группам в зависимости от объема опухоли. Затем мышам внутривенно вводили PBS и антитела против hCTLA4. Антитело давали два раза в неделю (всего 6 инъекций). В контрольной группе мышам вводили физиологический раствор. Введенный объем рассчитывали на основе веса мыши при 10 мкл/г. Длина длинной оси и короткой оси опухоли измерялась дважды в неделю, а объем опухоли вычислялся как 0,5х(длинная ось)х(короткая ось). Массу мышей также измеряли перед инъекцией, когда мышей помещали в разные группы (до первой инъекции антитела), дважды в неделю в течение периода инъекции антитела и перед эвтаназией.
Т-тест выполняли для статистического анализа. % TGI выше 60% указывает на значительное подавление роста опухоли. Р < 0,05 считается значимой разницей.
Массу мышей контролировали в течение всего периода обработки. Масса мышей в разных группах увеличивалась (ФИГ. 20 и ФИГ. 21). Не наблюдалось значимой разницы в массе между контрольной группой и группами обработки антителом против hCTLA4. Результаты показали, что антитела против hCTLA4 не были токсичными для мышей.
Размер опухоли, однако, показал значимую разницу в группах, получавших антитела 13A4, 6D2 и 7E12 (ФИГ. 22). Как показано на ФИГ. 22, 13A4, 6D2 и 7E12 все ингибировали рост опухоли у мышей.
% TGI в день 21 для каждой группы обработки показан ниже.
Таблица 6
Группа
Антитела
TGI%
G2
13A4
109,70%
G3
6D2
69,80%
G4
7E12
65,60%
ДРУГИЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Следует понимать, что, хотя изобретение было описано в сочетании с его подробным описанием, вышеприведенное описание предназначено для иллюстрации, а не для ограничения объема изобретения, который определяется объемом прилагаемой формулы изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации находятся в пределах объема следующей формулы изобретения.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Beijing Biocytogen Co., Ltd
<120>  АНТИТЕЛА ПРОТИВ CTLA4 И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130>  20170921
<160>  76
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  1
Asp Tyr Glu Met His
1               5
<210>  2
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  2
Val Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  3
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  3
Gly Thr Thr Val Val Gly Leu Asp Tyr
1               5
<210>  4
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  4
Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210>  5
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  5
Lys Glu Lys Thr Leu Thr Asp
1               5
<210>  6
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  6
Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp Thr
1               5
<210>  7
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  7
Ser Tyr Thr Met Ser
1               5
<210>  8
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  8
Thr Ile Ser Arg Gly Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  9
<211>  13
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  9
Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Tyr Val His Trp Phe Ala Tyr
1               5                   10
<210>  10
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  10
Arg Ala Gly Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210>  11
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  11
Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu
1               5
<210>  12
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  12
Gln His His Tyr Gly Ser Pro Arg Thr
1               5
<210>  13
<211>  118
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Val Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Gly Thr Thr Val Val Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210>  14
<211>  118
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  14
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Val Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Gly Thr Thr Val Val Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210>  15
<211>  118
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Val Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Gly Thr Thr Val Val Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210>  16
<211>  118
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  16
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Glu Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Val Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Gly Thr Thr Val Val Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210>  17
<211>  118
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Val Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Gly Thr Thr Val Val Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210>  18
<211>  108
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
35                  40                  45
Tyr Lys Glu Lys Thr Leu Thr Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Arg
100                 105
<210>  19
<211>  108
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  19
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val
35                  40                  45
Tyr Lys Glu Lys Thr Leu Thr Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Arg
100                 105
<210>  20
<211>  108
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35                  40                  45
Tyr Lys Glu Lys Thr Leu Thr Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Arg
100                 105
<210>  21
<211>  122
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Thr Ile Ser Arg Gly Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Tyr Val His Trp Phe Ala Tyr Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115                 120
<210>  22
<211>  122
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Thr Ile Ser Arg Gly Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Tyr Val His Trp Phe Ala Tyr Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115                 120
<210>  23
<211>  122
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Thr Ile Ser Arg Gly Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Tyr Val His Trp Phe Ala Tyr Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115                 120
<210>  24
<211>  122
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  24
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Thr Ile Ser Arg Gly Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Tyr Val His Trp Phe Ala Tyr Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115                 120
<210>  25
<211>  108
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ser Pro Arg
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100                 105
<210>  26
<211>  108
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val
35                  40                  45
Tyr Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ser Pro Arg
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100                 105
<210>  27
<211>  108
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  27
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val
35                  40                  45
Tyr Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ser Pro Arg
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100                 105
<210>  28
<211>  108
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  28
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35                  40                  45
Tyr Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ser Pro Arg
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100                 105
<210>  29
<211>  10
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  29
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His
1               5                   10
<210>  30
<211>  6
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  30
Asp Pro Glu Thr Gly Gly
1               5
<210>  31
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  31
Gly Thr Thr Val Val Gly Leu Asp Tyr
1               5
<210>  32
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  32
Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210>  33
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  33
Lys Glu Lys Thr Leu Thr Asp
1               5
<210>  34
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  34
Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp Thr
1               5
<210>  35
<211>  10
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  35
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met Ser
1               5                   10
<210>  36
<211>  6
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  36
Ser Arg Gly Gly Gly Tyr
1               5
<210>  37
<211>  13
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  37
Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Tyr Val His Trp Phe Ala Tyr
1               5                   10
<210>  38
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  38
Arg Ala Gly Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210>  39
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  39
Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu
1               5
<210>  40
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  40
Gln His His Tyr Gly Ser Pro Arg Thr
1               5
<210>  41
<211>  223
<212>  Белок
<213>  Человек
<400>  41
Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala
1               5                   10                  15
Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro
20                  25                  30
Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala
35                  40                  45
Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly
50                  55                  60
Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln
65                  70                  75                  80
Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr
85                  90                  95
Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val
100                 105                 110
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile
115                 120                 125
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly
130                 135                 140
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
145                 150                 155                 160
Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe
165                 170                 175
Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys
180                 185                 190
Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu
195                 200                 205
Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn
210                 215                 220
<210>  42
<211>  223
<212>  Белок
<213>  Мышь
<400>  42
Met Ala Cys Leu Gly Leu Arg Arg Tyr Lys Ala Gln Leu Gln Leu Pro
1               5                   10                  15
Ser Arg Thr Trp Pro Phe Val Ala Leu Leu Thr Leu Leu Phe Ile Pro
20                  25                  30
Val Phe Ser Glu Ala Ile Gln Val Thr Gln Pro Ser Val Val Leu Ala
35                  40                  45
Ser Ser His Gly Val Ala Ser Phe Pro Cys Glu Tyr Ser Pro Ser His
50                  55                  60
Asn Thr Asp Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Thr Asn Asp Gln
65                  70                  75                  80
Met Thr Glu Val Cys Ala Thr Thr Phe Thr Glu Lys Asn Thr Val Gly
85                  90                  95
Phe Leu Asp Tyr Pro Phe Cys Ser Gly Thr Phe Asn Glu Ser Arg Val
100                 105                 110
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Leu
115                 120                 125
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Phe Val Gly Met Gly
130                 135                 140
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
145                 150                 155                 160
Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Val Ala Val Ser Leu Gly Leu Phe Phe
165                 170                 175
Tyr Ser Phe Leu Val Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys
180                 185                 190
Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu
195                 200                 205
Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn
210                 215                 220
<210>  43
<211>  223
<212>  Белок
<213>  Обезьяна
<400>  43
Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Arg Leu Asn Leu Ala
1               5                   10                  15
Thr Arg Thr Arg Pro Tyr Thr Leu Leu Phe Ser Leu Leu Phe Ile Pro
20                  25                  30
Val Phe Ser Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala
35                  40                  45
Asn Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly
50                  55                  60
Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln
65                  70                  75                  80
Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr
85                  90                  95
Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val
100                 105                 110
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile
115                 120                 125
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Met Gly Ile Gly
130                 135                 140
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
145                 150                 155                 160
Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe
165                 170                 175
Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys
180                 185                 190
Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu
195                 200                 205
Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn
210                 215                 220
<210>  44
<211>  223
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  44
Met Ala Cys Leu Gly Leu Arg Arg Tyr Lys Ala Gln Leu Gln Leu Pro
1               5                   10                  15
Ser Arg Thr Trp Pro Phe Val Ala Leu Leu Thr Leu Leu Phe Ile Pro
20                  25                  30
Val Phe Ser Glu Ala Ile Gln Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala
35                  40                  45
Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly
50                  55                  60
Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln
65                  70                  75                  80
Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr
85                  90                  95
Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val
100                 105                 110
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile
115                 120                 125
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly
130                 135                 140
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
145                 150                 155                 160
Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Val Ala Val Ser Leu Gly Leu Phe Phe
165                 170                 175
Tyr Ser Phe Leu Val Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys
180                 185                 190
Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu
195                 200                 205
Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn
210                 215                 220
<210>  45
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  45
Asp Tyr Glu Met His
1               5
<210>  46
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  46
Thr Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  47
<211>  13
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  47
Arg Gly Lys Tyr Gly Asn Tyr Asp Tyr Val Met Asp Tyr
1               5                   10
<210>  48
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  48
Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210>  49
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  49
Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp
1               5
<210>  50
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  50
Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp Thr
1               5
<210>  51
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  51
Asp Tyr Trp Met Asn
1               5
<210>  52
<211>  19
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  52
Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr His Tyr Ser Asp Ser
1               5                   10                  15
Val Lys Gly
<210>  53
<211>  4
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  53
Thr Phe Ala Tyr
1
<210>  54
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  54
Gly Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Gly Leu Asn
1               5                   10
<210>  55
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  55
Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp
1               5
<210>  56
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  56
Gln Asn Val Leu Ser Thr Pro Tyr Thr
1               5
<210>  57
<211>  10
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  57
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His
1               5                   10
<210>  58
<211>  6
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  58
Asp Pro Glu Thr Gly Gly
1               5
<210>  59
<211>  13
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  59
Arg Gly Lys Tyr Gly Asn Tyr Asp Tyr Val Met Asp Tyr
1               5                   10
<210>  60
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  60
Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210>  61
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  61
Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp
1               5
<210>  62
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  62
Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp Thr
1               5
<210>  63
<211>  10
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  63
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Trp Met Asn
1               5                   10
<210>  64
<211>  8
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  64
Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu
1               5
<210>  65
<211>  4
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  65
Thr Phe Ala Tyr
1
<210>  66
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  66
Gly Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Gly Leu Asn
1               5                   10
<210>  67
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  67
Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp
1               5
<210>  68
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  68
Gln Asn Val Leu Ser Thr Pro Tyr Thr
1               5
<210>  69
<211>  118
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  69
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Val Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Gly Thr Thr Val Val Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210>  70
<211>  107
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  70
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35                  40                  45
Tyr Lys Glu Lys Thr Leu Thr Asp Thr Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  71
<211>  122
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  71
Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Thr Ile Ser Arg Gly Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Asp Tyr Gly Ser Ser Tyr Val His Trp Phe Ala Tyr Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115                 120
<210>  72
<211>  107
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  72
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35                  40                  45
Tyr Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ser Pro Arg
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  73
<211>  141
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  73
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Ile Ala Gly
1               5                   10                  15
Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg
20                  25                  30
Pro Gly Ala Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35                  40                  45
Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu
50                  55                  60
Glu Trp Ile Gly Thr Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser
85                  90                  95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Thr Arg Arg Gly Lys Tyr Gly Asn Tyr Asp Tyr Val Met
115                 120                 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
130                 135                 140
<210>  74
<211>  127
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  74
Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1               5                   10                  15
Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser
20                  25                  30
Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn
35                  40                  45
Ile His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro
50                  55                  60
Gln Leu Leu Val Phe Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser
65                  70                  75                  80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn
85                  90                  95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp
100                 105                 110
Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115                 120                 125
<210>  75
<211>  134
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  75
Met Tyr Leu Gly Leu Ser Cys Val Phe Ile Val Phe Leu Leu Lys Gly
1               5                   10                  15
Val Gln Cys Glu Val Lys Leu Asp Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln
20                  25                  30
Pro Gly Arg Pro Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35                  40                  45
Ser Asp Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu
50                  55                  60
Glu Trp Val Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr His
65                  70                  75                  80
Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
85                  90                  95
Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Gly Glu Asp Met
100                 105                 110
Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Gly Thr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
115                 120                 125
Leu Val Thr Val Ser Ala
130
<210>  76
<211>  126
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<400>  76
Met Gly Val Pro Thr Gln Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr Val Val Val
1               5                   10                  15
Val Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ser Ala
20                  25                  30
Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Gly Thr Ser Glu Asn Ile
35                  40                  45
Tyr Gly Gly Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln
50                  55                  60
Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Met Ser Ser Arg
65                  70                  75                  80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Ser
85                  90                  95
Leu His Pro Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Ser
100                 105                 110
Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115                 120                 125
<---