КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ УДАЛЕНИЯ ДНК И/ИЛИ РНК-СОДЕРЖАЩЕГО БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА (ВАРИАНТЫ)
COMPOSITION FOR REMOVING DNA- AND/OR RNA-CONTAINING BIOLOGICAL MATERIAL (VARIANTS)

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к жидкостным композициям, предназначенным для удаления ДНК, РНК, ДНК- и РНК-содержащего биологического материала на поверхности объектов неорганического и органического происхождения, в том числе в пробах костного материала в лабораторных условиях.
Уровень техники
При работе с биологическим материалом в современных лабораториях существует риск контаминации (ДНК/РНК-загрязнения) инструментов, материалов, исследуемых объектов, проб и т.д., что может приводить к недостоверным результатам, особенно при поточных молекулярно-генетических исследованиях. Источники контаминации могут быть различные: ампликоны, присутствующие в большом количестве в ПЦР-лабораториях, кровь, слюна, контактные следы людей, взаимодействующих с исследуемым образцом и/или рабочей поверхностью в лаборатории.
Применение деконтаминационных средств направлено на удаление загрязнений биологического происхождения и предупреждение их вторичного переноса. Большинство таких агентов представлено в форме растворов, которые просты в применении и не требуют особых условий хранения. В качестве дезактивирующего агента чаще всего используются ионы металлов, в основном соли железа, и перекись водорода. По результатам различных исследований показано использование Sodium dodecyl sulfate (SDS), бензоата натрия и пероксида водорода как дезактивирующего агента ( I., Hyslop Р.А., Jackson J.H. et al. Oxidant-induced DNA damage of target cells // The Journal of clinical investigation. - 1988. - V. 82. - №. 3. - P. 1040-1050; Gutteridge J. M.C. Ferrous-salt-promoted damage to deoxyribose and benzoate. The increased effectiveness of hydroxyl-radical scavengers in the presence of EDTA // Biochemical journal. - 1987. - V. 243. - №. 3. - P. 709-714).
В лабораториях, где исследуются нуклеиновые кислоты, с целью деконтаминации широко используются растворы DNARid (Биомедицинские инновации, Россия), DNA-ExitusPlus (AppliChem, США), а также коммерческий раствор «Белизна» - водный раствор 70 мМ или 0,5% гипохлорита натрия (NaOCl). Действие этих средств направлено на деградацию молекул нуклеиновых кислот. Однако в окружающей среде генетический материал, как загрязнитель, не всегда существует в виде свободных молекул. Чаще всего нуклеиновые кислоты входят в состав биологического материала, такого как клетки, выделения физиологической природы, потожировое вещество рук и т.п.
4
4
2
2
2
2
Существуют патенты на изобретения, которые относятся к реагентам для дезактивации нуклеиновых кислот, способам их получения и использования. В патенте US8765652 раскрыто применение перекиси водорода и ионов металлов, таких как, например, ионы меди, кобальта, железа в качестве дезактивирующего агента. Соединения, которые не были эффективными в конкретных условиях экспериментов, включают только 15% пероксида; перекись + ионы калия, натрия или железа; 5 мМ бром- или хлоргидантоин и KMnO. В данном патенте концентрация компонентов: SDS от 0,005 до 1%, сульфат меди(II) (CuSO) от 0,1 до 5 мМ, пероксида водорода (HO) от 0,5 до 30%, при этом такая концентрация HO может иметь негативный эффект при деконтаминации объектов биологического происхождения. В данном патенте не раскрыто влияние состава химических композиций на клетки, а указано только воздействие на молекулы нуклеиновых кислот относительно растворов коммерческой белизны.
4
2
2
4
2
2
В заявке US9371556, относящейся к реагентам для дезактивации нуклеиновых кислот и способам их получения и использования, обозначены следующие компоненты: соотношение CuSO/HO (2 мМ/3%), соотношение CuSO/HO (1 мМ/3%). Однако в данной работе не указано влияние композиций на ДНК-содержащий биологический материал и воздействие на клетки.
По результатам исследований ряда авторов раскрыт модифицированный метод экстракции ДНК на основе SDS для получения высококачественной ДНК. При этом концентрация SDS 20%, Tris-буфер 100 мМ.
4
2
2
Также известно, что перекись водорода высвобождает гидроксильные свободные радикалы (•OH) при окислении Cu (I) до Cu (II) посредством реакции типа Фентона, вызывающие повреждение ДНК, объясняя взаимное использование сульфата меди и пероксида водорода в соотношении CuSO/HO (5 мМ /не указана) (Natarajan V.P., Zhang X., Morono Y. et al. A modified SDS-based DNA extraction method for high quality environmental DNA from seafloor environments // Frontiers in microbiology. - 2016. - V. 7. - P. 986; Chattopadhyay D., Somaiah A., Raghunathan D. et al. Dichotomous effect of caffeine, curcumin, and naringenin on genomic DNA of normal and diabetic subjects // Scientifica. - 2014. - V. 2014).
Таким образом, универсального деконтаминационного способа избавления от нуклеиновых кислот и разрушения клеточных мембран на поверхности объектов неорганического и органического происхождения, включая костный материал, в лабораторных условиях до настоящего времени предложено не было.
Раскрытие изобретения
В настоящем изобретении предложены:
4
2
2
3
2
2
2
6
5
(1) Композиция для удаления ДНК, РНК, ДНК- и РНК-содержащего биологического материала в виде двухкомпонентного деконтаминационного раствора (ДКР) №1, включающего компонент 1 (деконтаминационный раствор-1, ДКР-1): 0,5-2% Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), 1-5 мМ пентагидрата сульфата меди(II) (CuSO×5HO), 1-15 мМ Триса (гидроксиметил) аминометана (Трис, (НОСН)CNH), 0,1-1 об. % глицерина, деионизованная вода-остальное и компонент 2 (деконтаминационный раствор-2, ДКР-2): 0,1-3% пероксида водорода (HO) и 0,01-0,1% бензоата натрия (CHCOONa), деионизованная вода - остальное.
4
2
2
3
2
2
2
6
5
(2) Композиция (1), где ДКР №1 представляют собой смесь ДКР-1: 100 мг Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), 12,5 мг пентагидрата сульфата меди(II) (CuSO×5HO), 3,63 мг Триса (гидроксиметил) аминометана (Трис, (HOCH)CNH), 50 мкл глицерина, доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой и ДКР-2: 330 мкл 30% водного раствора пероксида водорода (HO) и 5 мг бензоата натрия (CHCOONa), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.
(3) Композиция (1), где соотношение ДКР №1 к биообразцу составляет 1:1.
(4) Композиция (1), где соотношение ДКР №1 к биообразцу, представленному клеточной культурой, составляет 25,8:1.
(5) Композиция (1), где соотношение ДКР-1 к ДКР-2 составляет 8,5:1, когда биообразец представлен препаратом ДНК или РНК.
(6) Композиция (1), где соотношение ДКР-1 к ДКР-2 составляет 9:1, когда биообразец представлен препаратом ДНК или РНК.
(7) Композиция (1), где соотношение ДКР-1 к ДКР-2 составляет 3,7:1, когда биообразец представлен ампликоном.
(8) Композиция (1), где соотношение ДКР-1 к ДКР-2 составляет 6:1, когда биообразец представлен ампликоном.
(9) Композиция (1), где соотношение ДКР-1 к ДКР-2 составляет 4:1, когда биообразец представлен ДНК- и/или РНК-содержащим препаратом/мазком/следом.
(10) Композиция (1), где соотношение ДКР-1 к ДКР-2 составляет 32,25:1, когда биообразец представлен суспензией клеточной культуры.
(11) Композиция (1), где препарат ДНК или РНК, а также ДНК- и/или РНК-содержащий препарат/мазок/след представляет собой биообразец.
(12) Композиция (1), где ампликон представляет собой биообразец.
(13) Композиция (1), где клетки и/или клеточная культура представляет собой биообразец.
(14) Композиция (1), где костный материал (кость, фрагмент кости, костная стружка, костный порошок) представляет собой деконтаминируемый объект.
4
2
2
3
2
4
2
2
2
6
5
(15) Композиция для удаления ДНК, РНК, ДНК- и РНК-содержащего биологического материала в виде двухкомпонентного деконтаминационного раствора (ДКР) №2, включающего компонент 1 (деконтаминационный раствор-1, ДКР-1): 0,5-2% Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), 1-5 мМ пентагидрата сульфата меди(II) (CuSO×5HO), 1-15 мМ Триса (гидроксиметил) аминометана (Трис, (HOCH)CNH), 1-3 мМ гептагидрата железа(II) (FeSO×7HO) и деионизованная вода - остальное и компонент 2 (деконтаминационный раствор-2, ДКР-2): 0,1-3% пероксида водорода (HO) и 0,01-0,1% бензоата натрия (CHCOONa), деионизованная вода - остальное.
4
2
2
3
2
4
2
2
2
6
5
(16) Композиция (15), где ДКР №2 представляют собой смесь ДКР-1: 100 мг Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), 12,5 мг пентагидрата сульфата меди(II) (CuSO×5HO), 3,63 мг Триса (гидроксиметил) аминометана (Трис, (HOCH)CNH), 5,6 мг гептагидрата железа(II) (FeSO×7HO), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой и ДКР-2: 330 мкл 30% водного раствора пероксида водорода (HO) и 5 мг бензоата натрия (CHCOONa), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.
(17) Композиция (15), где соотношение ДКР №2 к биообразцу составляет 1:1.
(18) Композиция (15), где соотношение ДКР-1 к ДКР-2 составляет 8,5:1, когда биообразец представлен препаратом ДНК или РНК.
(19) Композиция (15), где соотношение ДКР-1 к ДКР-2 составляет 9:1, когда биообразец представлен препаратом ДНК или РНК.
(20) Композиция (15), где соотношение ДКР-1 к ДКР-2 составляет 3,7:1, когда биообразец представлен ампликоном.
(21) Композиция (15), где соотношение ДКР-1 к ДКР-2 составляет 6:1, когда биообразец представлен ампликоном.
(22) Композиция (15), где соотношение ДКР-1 к ДКР-2 составляет 4:1, когда биообразец представлен ДНК- и/или РНК-содержащим препаратом/мазком/следом.
(23) Композиция (15), где препарат ДНК или РНК, а также ДНК- и/или РНК-содержащий препарат/мазок/след представляет собой биообразец.
(24) Композиция (15), где ампликон представляет собой биообразец.
(25) Композиция (15), где костный материал (кость, фрагмент кости, костная стружка, костный порошок) представляет собой деконтаминируемый объект.
4
2
2
3
2
4
2
2
2
6
5
(26) Композиция для удаления ДНК, РНК, ДНК- и РНК-содержащего биологического материала в виде двухкомпонентного деконтаминационного раствора (ДКР) №3, включающего компонент 1 (деконтаминационный раствор-1, ДКР-1): 0,5-2% Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), 1-5 мМ пентагидрата сульфата меди(II) (CuSO×5HO), 1-15 мМ Триса (гидроксиметил) аминометана (Трис, (HOCH)CNH), 1-3 мМ гептагидрата железа(II) (FeSO×7HO), 0,1-1 об. % глицерина и деионизованная вода - остальное и компонент 2 (деконтаминационный раствор-2, ДКР-2): 0,1-3% пероксида водорода (HO) и 0,01-0,1% бензоата натрия (CHCOONa), деионизованная вода - остальное.
4
2
2
3
2
4
2
2
2
6
5
(27) Композиция (26), где ДКР №3 представляют собой смесь ДКР-1: 100 мг Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), 12,5 мг пентагидрата сульфата меди(II) (CuSO×5HO), 3,63 мг Триса (гидроксиметил) аминометана (Трис, (HOCH)CNH), 5,6 мг гептагидрата железа(II) (FeSO×7HO), 50 мкл глицерина, доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой и ДКР-2: 330 мкл 30% водного раствора пероксида водорода (HO) и 5 мг бензоата натрия (CHCOONa), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.
(28) Композиция (26), где соотношение ДКР №3 к биообразцу составляет 1:1.
(29) Композиция (26), где соотношение ДКР-1 к ДКР-2 составляет 8,5:1, когда биообразец представлен препаратом ДНК или РНК.
(30) Композиция (26), где соотношение ДКР-1 к ДКР-2 составляет 9:1, когда биообразец представлен препаратом ДНК или РНК.
(31) Композиция (26), где соотношение ДКР-1 к ДКР-2 составляет 3,7:1, когда биообразец представлен ампликоном.
(32) Композиция (26), где соотношение ДКР-1 к ДКР-2 составляет 6:1, когда биообразец представлен ампликоном.
(33) Композиция (26), где соотношение ДКР-1 к ДКР-2 составляет 4:1, когда биообразец представлен ДНК- и/или РНК-содержащим препаратом/мазком/следом.
(34) Композиция (26), где препарат ДНК или РНК, а также ДНК- и/или РНК-содержащий препарат/мазок/след представляет собой биообразец.
(35) Композиция (26), где ампликон представляет собой биообразец.
(36) Композиция (26), где костный материал (кость, фрагмент кости, костная стружка, костный порошок) представляет собой деконтаминируемый объект.
4
2
2
2
6
5
(37) Композиция для удаления ДНК, РНК, ДНК- и РНК-содержащего биологического материала в виде двухкомпонентного деконтаминационного раствора (ДКР) №4, включающего компонент 1 (деконтаминационный раствор-1, ДКР-1): 0,5-2% Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), 1-5 мМ пентагидрата сульфата меди(II) (CuSO×5HO), деионизованная вода - остальное и компонент 2 (деконтаминационный раствор-2, ДКР-2): 0,1-3% пероксида водорода (HO) и 0,01-0,1% бензоата натрия (CHCOONa), деионизованная вода - остальное.
4
2
2
2
6
5
(38) Композиция (37), где ДКР №4 представляют собой смесь ДКР-1: 100 мг Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), 12,5 мг пентагидрата сульфата меди(II) (CuSO×5HO), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой и ДКР-2: 330 мкл 30% водного раствора пероксида водорода (HO) и 5 мг бензоата натрия (CHCOONa), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.
(39) Композиция (37), где соотношение ДКР №4 к биообразцу составляет 1:1.
(40) Композиция (37), где соотношение ДКР №4 к биообразцу, представленному клеточной культурой, составляет 25,8:1.
(41) Композиция (37), где соотношение ДКР-1 к ДКР-2 составляет 8,5:1, когда биообразец представлен препаратом ДНК или РНК.
(42) Композиция (37), где соотношение ДКР-1 к ДКР-2 составляет 9:1, когда биообразец представлен препаратом ДНК или РНК.
(43) Композиция (37), где соотношение ДКР-1 к ДКР-2 составляет 3,7:1, когда биообразец представлен ампликоном.
(44) Композиция (37), где соотношение ДКР-1 к ДКР-2 составляет 6:1, когда биообразец представлен ампликоном.
(45) Композиция (37), где соотношение ДКР-1 к ДКР-2 составляет 4:1, когда биообразец представлен ДНК- и/или РНК-содержащим препаратом/мазком/следом.
(46) Композиция (37), где соотношение ДКР-1 к ДКР-2 составляет 32,25:1, когда биообразец представлен суспензией клеточной культуры.
(47) Композиция (37), где препарат ДНК или РНК, а также ДНК- и/или РНК-содержащий препарат/мазок/след представляет собой биообразец.
(48) Композиция (37), где ампликон представляет собой биообразец.
(49) Композиция (37), где клетки и/или клеточная культура представляет собой биообразец.
(50) Композиция (37), где костный материал (кость, фрагмент кости, костная стружка, костный порошок) представляет собой деконтаминируемый объект.
В одном из вариантов изобретение включает композицию как указано выше, где соотношение деконтаминационного раствора к образцу биологического материала составляет от 1:10 до 30:1, включая все соотношения, входящие в указанный диапазон, например, 1:9, 1:8, 1:7 и т.д. Или, например, 25,8:1.
В одном из вариантов изобретение включает композицию как указано выше, где соотношение компонента 1 к компоненту 2 составляет от 1:1 до 35:1, включая все соотношения, входящие в указанный диапазон, например, 2:1, 3:1, 4:1 и т.д. Или, например, 32,25:1.
I. Объекты настоящего изобретения представляет собой композиции растворов для деконтаминационной обработки различных поверхностей неорганического происхождения, например, лабораторного оборудования и инструментов, а также органического происхождения, например, костного материала, что позволяет избавиться от экзогенной ДНК, РНК, ДНК- и РНК-содержащего биологического материала (кровь, слюна, потожировое вещество и т.д.).
Знак «%» как используется в настоящем изобретении, означает процентное содержание по массе указанного компонента в указанном растворе.
0,5-2% Додецилсульфат натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS) является одним из постоянных составляющих жидких композиций и представляет собой наиболее мощный детергент, приводящий к разрушению клеточных структур и высвобождению нуклеиновых кислот.
4
2
Также, постоянным составляющим композиций является 1-5 мМ пентагидрата сульфата меди(II) (CuSO×5HO). Установлено, что ионы меди вызывают инактивирующий эффект и повреждения ДНК и РНК. С другой стороны, окислительно-восстановительные свойства меди могут также вызвать повреждение клеток, что позволяет отнести медь к эффективному деконтаминирующему реагенту. Кроме того, использование меди как деактивирующего иона, вместо ионов железа, повышает стойкость и срок хранения растворов (De Benedictis P., Beato M.S., Capua I. Inactivation of avian influenza viruses by chemical agents and physical conditions: a review // Zoonoses and public health. - 2007. - V. 54. - №. 2. - P. 51-68; Steuer P., Tejeda C., Martinez O. et al. Effectiveness of copper ions against Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and bacterial communities in naturally contaminated raw cow's milk // Journal of applied microbiology. - 2021. - V. 131. - №. 1. - P. 146-154).
4
2
2
2
2+
-
2+
Добавление в раствор 1-3 мМ гептагидрата железа(II) (FeSO×7HO) ускоряет химическую реакцию при взаимодействии с пероксидом водорода (HO+Fe=НО•+НО+Fe - реакция Фентона) и приводит к повышению скорости химической деградации молекул нуклеиновых кислот под действием формирующихся активных форм кислорода (АФК).
2
3
2
Для создания и поддержания щелочного значения рН, а также дестабилизации нуклеиновых кислот в раствор добавляется 1-15 мМ Триса (гидроксиметил) аминометана (Трис, (HOCH)CNH).
0,1-1 об. % глицерина используется в растворе с целью предотвращения выпадения осадка гидроксида меди(II). Для этого добавляют 50 мкл глицерина и взбалтывают содержимое. Осадок растворяется, а раствор приобретает темно-синее окрашивание вследствие образования глицерата меди.
2
2
Пероксид водорода (HO) 0,1-3%, входящий в состав второго компонента деконтаминационного раствора, является мощным деактивирующим агентом ДНК и РНК, а также способствует разрушению мембран клеток (Schraufstatter I., Hyslop Р.А., Jackson J.H. et al. Oxidant-induced DNA damage of target cells // The Journal of clinical investigation. - 1988. - V. 82. - №. 3. - P. 1040-1050).
6
5
Бензоат натрия (CHCOONa), являющийся консервантом, позволяет увеличить срок хранения раствора пероксида водорода. Во втором компоненте деконтаминационного раствора его концентрация составляет 0,01-0,1%.
Настоящее изобретение представляет собой комбинации растворов вышеперечисленных компонентов:
4
2
2
3
2
2
2
6
5
2
2
6
5
1. Жидкая композиция (1) представляет собой смесь растворов (ДКР-1: 0,5-2% Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), предпочтительно 1%, 1-5 мМ пентагидрата сульфата меди(II) (CuSO×5HO), предпочтительно 5 мМ, 1-15 мМ Триса (гидроксиметил) аминометана (Трис, (HOCH)CNH), предпочтительно 3 мМ, 0,1-1 об. % глицерина, предпочтительно 0,5 об. %; ДКР-2: 0,1-3% пероксида водорода (HO), предпочтительно 1%, 0,01-0,1% бензоата натрия (CHCOONa), предпочтительно 0,05%). Например, смесь ДКР-1: 100 мг Додецилсульфата натрия, 12,5 мг пентагидрата сульфата меди(II), 3,63 мг Триса (гидроксиметил) аминометана, 50 мкл глицерина, доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой, и ДКР-2: 330 мкл 30% водного раствора пероксида водорода (HO) и 5 мг бензоата натрия (CHCOONa), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.
4
2
2
3
2
4
2
2
2
6
5
4
2
2
2
6
5
2. Жидкая композиция (2) представляет собой смесь растворов (ДКР-1: 0,5-2% Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), предпочтительно 1%, 1-5 мМ пентагидрата сульфата меди(II) (CuSO×5HO), предпочтительно 5 мМ, 1-15 мМ Триса (гидроксиметил) аминометана (Трис, (HOCH)CNH), предпочтительно 3 мМ, 1-3 мМ гептагидрата железа(II) (FeSO×7HO), предпочтительно 2 мМ; ДКР-2: 0,1-3% пероксида водорода (HO), предпочтительно 1%, 0,01-0,1% бензоата натрия (CHCOONa), предпочтительно 0,05%). Например, смесь ДКР-1: 100 мг Додецилсульфата натрия, 12,5 мг пентагидрата сульфата меди(II), 3,63 мг Триса (гидроксиметил) аминометана, 5,6 мг гептагидрата железа(II) (FeSO×7HO), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой, и ДКР-2: 330 мкл 30% водного раствора пероксида водорода (HO) и 5 мг бензоата натрия (CHCOONa), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.
4
2
2
3
2
4
2
2
2
6
5
4
2
2
2
6
5
3. Жидкая композиция (3) представляет собой смесь растворов (ДКР-1: 0,5-2% Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), предпочтительно 1%, 1-5 мМ пентагидрата сульфата меди(II) (CuSO×5HO), предпочтительно 5 мМ, 1-15 мМ Триса (гидроксиметил) аминометана (Трис, (HOCH)CNH), предпочтительно 3 мМ, 1-3 мМ гептагидрата железа(II) (FeSO×7HO), предпочтительно 2 мМ, 0,1-1 об. % глицерина, предпочтительно 0,5 об. %; ДКР-2: 0,1-3% пероксида водорода (HO), предпочтительно 1%, 0,01-0,1% бензоата натрия (CHCOONa), предпочтительно 0,05%). Например, смесь ДКР-1: 100 мг Додецилсульфата натрия, 12,5 мг пентагидрата сульфата меди(II), 3,63 мг Триса (гидроксиметил) аминометана, 5,6 мг гептагидрата железа(II) (FeSO×7HO), 50 мкл глицерина, доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой, и ДКР-2: 330 мкл 30% водного раствора пероксида водорода (HO) и 5 мг бензоата натрия (CHCOONa), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.
4
2
2
2
6
5
2
2
6
5
4. Жидкая композиция (4) представляет собой смесь растворов (ДКР-1: 0,5-2% Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), предпочтительно 1%, 1-5 мМ пентагидрата сульфата меди(II) (CuSO×5HO), предпочтительно 5 мМ; ДКР-2: 0,1-3% пероксида водорода (HO), предпочтительно 1%, 0,01-0,1% бензоата натрия (CHCOONa), предпочтительно 0,05%). Например, смесь ДКР-1: 100 мг Додецилсульфата натрия, 12,5 мг пентагидрата сульфата меди(II), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой, и ДКР-2: 330 мкл 30% водного раствора пероксида водорода (HO) и 5 мг бензоата натрия (CHCOONa), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.
Предлагаемая методика очистки от ДНК, РНК, ДНК- и РНК - содержащего биологического материала проводится путем его механического и химического удаления с исследуемой поверхности. Для очистки поверхностей неорганического происхождения, например, лабораторного оборудования и инструментария, и органического, например, кость, фрагмент кости, необходимо последовательно нанести компоненты (компонент 1 (ДКР-1), затем компонент 2 (ДКР-2)) деконтаминационных растворов на обрабатываемую поверхность. Перед обработкой закрытые емкости с компонентами раствора следует слегка перемешать в руках. В случаях, когда в качестве объекта обработки представлена кость или костный фрагмент, необходимо сначала механически избавиться от поверхностных наложений и загрязнений (остатки мягких тканей, почва и пр.). Обрабатываемую поверхность протирают салфеткой (хлопчатобумажная ткань), пропитанной ДКР-1. Экспозиция составляет 15 мин. Далее салфетку промывают в проточной воде, выжимают, после чего пропитывают ДКР-2. Поверхность, обработанную ДКР-1, протирают салфеткой, пропитанной ДКР-2. Экспозиция не менее 15 мин. Соотношение объемов ДКР-1 и ДКР-2 должно составлять 1:1. Затем обработанную поверхность протирают сухой стерильной салфеткой. Время экспозиции растворов может быть изменено в зависимость от объекта и степени его загрязнения.
Таким образом, настоящее изобретение относится к композициям, способным избавиться от контаминации, вызывая лизис клеточных мембран и деградацию нуклеиновых кислот.
II. Еще одним объектом настоящего изобретения является способ деконтаминации чужеродной ДНК и клеток в составе костной стружки и костного порошка (далее именуются как «образец»):
(i) добавление жидких композиций по настоящему изобретению в качестве деконтаминирующего реагента в процессе пробоподготовки после гомогенизации костного материала и перед декальцинацией и экстракцией нуклеиновых кислот.
(ii) смешивание ДКР и образца по настоящему изобретению в соотношении 25,8:1.
(iii) соотношение ДКР-1 к ДКР-2 составляет 32,25:1.
В одном из вариантов, объекты настоящего изобретения представляет собой жидкие композиции для удаления экзогенной ДНК и ДНК-содержащего биологического материала в составе пробы с образцом.
Настоящее изобретение представляет собой комбинацию вышеперечисленных компонентов в растворе:
4
2
2
2
6
5
2
2
6
5
Жидкая композиция (4) представляет собой смесь растворов (ДКР-1: 0,5-2% Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), предпочтительно 1%, 1-5 мМ пентагидрата сульфата меди(II) (CuSO×5HO), предпочтительно 5 мМ; ДКР-2: 0,1-3% пероксида водорода (HO), предпочтительно 1%, 0,01-0,1% бензоата натрия (CHCOONa), предпочтительно 0,05%). Например, смесь ДКР-1: 100 мг Додецилсульфата натрия, 12,5 мг пентагидрата сульфата меди(II), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой, и ДКР-2: 330 мкл 30% водного раствора пероксида водорода (HO) и 5 мг бензоата натрия (CHCOONa), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.
Деконтаминационная обработка образцов проводится в процессе их пробоподготовки перед декальцинацией и экстракцией нуклеиновых кислот. Для этого сначала получают образец в виде стружки или порошка (различие в размере частиц). Образец вносят в стерильную 50 мл пробирку. В расчете на 1 г образца в пробирку добавляют 800 мкл ДКР-2, а затем 25 мл ДКР-1. Перемешивают 10 сек на вортексе. Инкубируют на горизонтальном шейкере при 200 об/мин. в течение 10 мин. Центрифугируют при 1500 g в течение 5 мин. Сливают надосадок. К осадку повторно добавляют 800 мкл ДКР-2, затем добавляют 25 мл ДКР-1. Перемешивают 10 сек на вортексе до полного разбивания осадка. Инкубируют на горизонтальном шейкере при 200 об/мин. в течение 10 мин. Центрифугируют при 1500 g в течение 5 мин. Сливают надосадок. К надосадку добавляют 20-25 мл ДКР-1. Перемешивают 30 сек на вортексе до полного разбивания осадка. Центрифугируют при 1500 g в течение 5 мин. Сливают надосадок. Далее проводят декальцинацию и экстракцию нуклеиновых кислот согласно стандартным протоколам.
Таким образом, настоящее изобретение относится к жидким композициям, позволяющим избавиться от загрязнения ДНК и ДНК-содержащим биологическим материалом поверхностей органического происхождения.
Дополнительные объекты и преимущества изобретения указаны в следующем далее разделе описания и частично становятся очевидными из описания или могут быть изучены при применении изобретения. Объекты и преимущества изобретения понимают и реализуют при помощи подробно перечисленных в прилагаемой формуле изобретения признаков и сочетаний.
Следует понимать, что в рамках заявленного изложенное выше общее описание и следующее далее подробное описание являются лишь иллюстративными и поясняющими и не ограничивают объем изобретения. Дополняющие включенные и составляющие часть данного описания Фигуры иллюстрируют некоторые варианты преимущества изобретения и вместе с описанием помогают объяснить принципы изобретения.
Краткое описание чертежей
На Фиг. 1 показаны результаты электрофореза в 0,9% агарозном геле препаратов высокомолекулярной ДНК K562 (Promega, США) после ее обработки ДКР №№1-4 (пробы 1-7), коммерческими растворами 0,1Х «Белизна» (пробы 8), DNARid (Биомедицинские инновации, Россия) (пробы 9), DNA-ExitusPlus (AppliChem, США) (пробы 10), а также без деконтаминационного воздействия (контроль, пробы 11) в двух параллелях; L - обозначает маркер молекулярных масс.
На Фиг. 2А-Г показаны электрофореграммы генотипирования высокомолекулярной ДНК K562 (Promega, США) после ее обработки ДКР №№1-4 (А), коммерческими растворами 0,1Х «Белизна» (Б), DNARid (Биомедицинские инновации, Россия) (В), DNA-ExitusPlus (AppliChem, США) (Г) и без деконтаминационной обработки (контроль) (Д) (тест-система COrDIS «ЭКСПЕРТ» (ГОРДИЗ, Россия)).
На Фиг. 3 показаны результаты электрофореза в 2% агарозном геле ПЦР-продуктов ДНК 9947А после их обработки ДКР №№1-4 (пробы 1-7), коммерческими растворами 0,1Х «Белизна» (пробы 8), DNARid (Биомедицинские инновации, Россия) (пробы 9), DNA-ExitusPlus (AppliChem, США) (пробы 10), а также без деконтаминационного воздействия (контроль, пробы 11) в двух параллелях; L - обозначает маркер молекулярных масс.
На Фиг. 4 Микрофотографии камеры Горяева с нанесенной суспензии клеток линии HeLa (10к) после обработки и инкубации в ДКР №4 в трех параллелях (А-В).
На Фиг. 5 Микрофотографии камеры Горяева с нанесенной суспензии клеток линии HeLa (10к) после обработки и инкубации в DBPS в трех параллелях (А-В).
На Фиг. 6 Микрофотографии камеры Горяева с нанесенной суспензии клеток линии HeLa (10к) после обработки и инкубации в деионизованной воде в трех параллелях (А-В).
На Фиг. 7 показаны электрофореграммы по испытанию ДКР в пробах костного порошка, контаминированного клеточной культурой HeLa: профиль контаминированного клеточной культурой HeLa костного образца без обработки ДКР №4 (А), профиль контаминированного клеточной культурой HeLa костного образца после обработки ДКР №4 (Б), профиль не контаминированного костного образца (В), профиль клеточной культуры HeLa (Г) и профиль холостой пробы - отрицательного контроля (Д) (тест-системы «COrDIS Plus» и COrDIS «ЭКСПЕРТ» (ГОРДИЗ, Россия)).
На Фиг. 8А представлены результаты ОТ и ПЦР-РВ по каналу ROX мазков из полости носа и ротоглотки больных новой коронавирусной инфекцией (возбудитель SARS-CoV-2) после их обработки ДКР и его влиянию на генетический материал (РНК) возбудителя коронавирусной инфекции (SARS-CoV-2, ген Е) (тест-система РУ № РЗН 2020/9948 (ДНК-Технология, Россия)).
На Фиг. 8Б представлены результаты ОТ и ПЦР-РВ по каналу FAM мазков из полости носа и ротоглотки больных новой коронавирусной инфекцией (возбудитель SARS-CoV-2) после их обработки ДКР и его влиянию на генетический материал (РНК) возбудителя коронавирусной инфекции (тест-система РУ № РЗН 2020/9948 (ДНК-Технология, Россия)).
На Фиг. 8В представлены результаты ОТ и ПЦР-РВ по каналу Су5 мазков из полости носа и ротоглотки больных новой коронавирусной инфекцией (возбудитель SARS-CoV-2) после их обработки ДКР и его влиянию на генетический материал (РНК) возбудителя коронавирусной инфекции (SARS-CoV-2, ген N) (тест-система РУ № РЗН 2020/9948 (ДНК-Технология, Россия)).
На Фиг. 9 представлены результаты ОТ и ПЦР-РВ по каналу ROX (регистрации сигнала кДНК SARS-CoV-2) мазков из полости носа и ротоглотки больных новой коронавирусной инфекцией (возбудитель SARS-CoV-2) после их обработки ДКР, а также коммерческим дезинфицирующим средством «Фориспот» (Альфа, Россия) (тест-система «РеалБест РНК SARS-CoV-2» (Вектор Бест, Россия)).
Осуществление изобретения
Пример 1.
Проводили сравнительное исследование деконтаминационного эффекта на высокомолекулярную ДНК жидких композиций, раскрываемых в настоящем изобретении ДКР №№1-4, коммерческих растворов: «Белизна», DNARid (Биомедицинские инновации, Россия) и DNA-ExitusPlus (AppliChem, США). Экспериментальное исследование проводили в восьми повторностях.
4
2
2
3
2
2
2
6
5
2
2
6
5
1. Состав жидкой композиции ДКР №1 (ДКР-1: 1% Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), 5 мМ пентагидрата сульфата меди(II) (CuSO×5HO), 3 мМ Триса (гидроксиметил) аминометана (Трис, (НОСН)CNH), 0,5 об. % глицерина; ДКР-2: 1% пероксида водорода (HO), 0,05% бензоата натрия (CHCOONa)): смесь растворов ДКР-1: 100 мг Додецилсульфата натрия, 12,5 мг пентагидрата сульфата меди(II), 3,63 мг Триса (гидроксиметил) аминометана, 50 мкл глицерина, доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой, и ДКР-2: 330 мкл 30% водного раствора пероксида водорода (HO) и 5 мг бензоата натрия (CHCOONa), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.
4
2
2
3
2
2
2
6
5
2
2
6
5
2. Состав жидкой композиции ДКР №1 (ДКР-1: 1% Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), 5 мМ пентагидрата сульфата меди(II) (CuSO×5HO), 6 мМ Триса (гидроксиметил) аминометана (Трис, (HOCH)CNH), 0,5 об. % глицерина; ДКР-2: 1% пероксида водорода (HO), 0,05% бензоата натрия (CHCOONa)): смесь растворов ДКР-1: 100 мг Додецилсульфата натрия, 12,5 мг пентагидрата сульфата меди(II), 7,26 мг Триса (гидроксиметил) аминометана, 50 мкл глицерина, доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой, и ДКР-2: 330 мкл 30% водного раствора пероксида водорода (HO) и 5 мг бензоата натрия (CHCOONa), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.
4
2
2
3
2
2
2
6
5
2
2
6
5
3. Состав жидкой композиции ДКР №1 (ДКР-1: 1% Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), 5 мМ пентагидрата сульфата меди(II) (CuSO×5HO), 12 мМ Триса (гидроксиметил) аминометана (Трис, (HOCH)CNH), 0,5 об. % глицерина; ДКР-2: 1% пероксида водорода (HO), 0,05% бензоата натрия (CHCOONa)): смесь растворов ДКР-1: 100 мг Додецилсульфата натрия, 12,5 мг пентагидрата сульфата меди(II), 14,52 мг Триса (гидроксиметил) аминометана, 50 мкл глицерина, доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой, и ДКР-2: 330 мкл 30% водного раствора пероксида водорода (HO) и 5 мг бензоата натрия (CHCOONa), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.
4
2
2
3
2
4
2
2
2
6
5
4
2
2
2
6
5
4. Состав жидкой композиции ДКР №2 (ДКР-1: 1% Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), 5 мМ пентагидрата сульфата меди(II) (CuSO×5HO), 3 мМ Триса (гидроксиметил) аминометана (Трис, (HOCH)CNH), 2 мМ гептагидрата железа(II) (FeSO×7HO); ДКР-2: 1% пероксида водорода (HO), 0,05% бензоата натрия (CHCOONa)): смесь растворов ДКР-1: 100 мг Додецилсульфата натрия, 12,5 мг пентагидрата сульфата меди(II), 3,63 мг Триса (гидроксиметил) аминометана, 5,6 мг гептагидрата железа(II) (FeSO×7HO), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой, и ДКР-2: 330 мкл 30% водного раствора пероксида водорода (HO) и 5 мг бензоата натрия (CHCOONa), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.
4
2
2
3
2
4
2
2
2
6
5
4
2
2
2
6
5
5. Состав жидкой композиции ДКР №3 (ДКР-1: 1% Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), 5 мМ пентагидрата сульфата меди(II) (CuSO×5HO), 3 мМ Триса (гидроксиметил) аминометана (Трис, (HOCH)CNH), 2 мМ гептагидрата железа(II) (FeSO×7HO), 0,5 об. % глицерина; ДКР-2: 1% пероксида водорода (HO), 0,05% бензоата натрия (CHCOONa)): смесь растворов ДКР-1: 100 мг Додецилсульфата натрия, 12,5 мг пентагидрата сульфата меди(II), 3,63 мг Триса (гидроксиметил) аминометана, 5,6 мг гептагидрата железа(II) (FeSO×7HO), 50 мкл глицерина, доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой, и ДКР-2: 330 мкл 30% водного раствора пероксида водорода (HO) и 5 мг бензоата натрия (CHCOONa), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.
4
2
2
2
6
5
2
2
6
5
6. Состав жидкой композиции ДКР №4 (ДКР-1: 1% Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), 5 мМ пентагидрата сульфата меди(II) (CuSO×5HO); ДКР-2: 1% пероксида водорода (HO), 0,05% бензоата натрия (CHCOONa)): смесь растворов ДКР-1: 100 мг Додецилсульфата натрия, 12,5 мг пентагидрата сульфата меди(II), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой, и ДКР-2: 330 мкл 30% водного раствора пероксида водорода (HO) и 5 мг бензоата натрия (CHCOONa), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.
4
2
2
2
6
5
2
2
6
5
7. Состав жидкой композиции ДКР №4 (ДКР-1: 2% Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), 5 мМ пентагидрата сульфата меди(II) (CuSO×5HO); ДКР-2: 1% пероксида водорода (HO), 0,05% бензоата натрия (CHCOONa)): смесь растворов ДКР-1: 200 мг Додецилсульфата натрия, 12,5 мг пентагидрата сульфата меди(II), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой, и ДКР-2: 330 мкл 30% водного раствора пероксида водорода (HO) и 5 мг бензоата натрия (CHCOONa), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.
8. Коммерческий раствор «Белизна» является водным раствором 70 мМ или 0,5% гипохлорита натрия (NaOCl), разбавленный деионизованной водой в соотношении 1:10 до получения 7 мМ или 0,05% раствора гипохлорита натрия (NaOCl).
9. DNARid (Биомедицинские инновации, Россия) является двухкомпонентным набором растворов и включает реагент для ДНК-деконтаминации 1 и реагент для ДНК-деконтаминации 2, состав которых производителем не раскрывается.
10. Состав реагента DNA-ExitusPlus (AppliChem, США) производителем не раскрывается.
2
11. Контрольный образец с ДНК и деионизированной водой (diHO).
Для исследования стабильности высокомолекулярной ДНК при деконтаминационном воздействии исследуемых реагентов использовали стандартную ДНК K562 (Promega, США) в концентрации 20 нг/мкл. Концентрация ДНК была измерена с помощью флуориметра QuantiFluor-P (Green/Blue, Promega Corporation) в трех повторностях.
Перед началом эксперимента ДНК K562 перемешивали и кратко центрифугировали. Вносили по 20 мкл ДНК в 0,2 мл ПЦР-пробирки для проведения ПЦР. К ДНК добавляли исследуемые растворы в следующем соотношении:
1. 20 мкл ДНК + 20 мкл композиции (1): 18 мкл ДКР-1 + 2 мкл ДКР-2
2. 20 мкл ДНК + 20 мкл композиции (2): 18 мкл ДКР-1 + 2 мкл ДКР-2
3. 20 мкл ДНК + 20 мкл композиции (3): 18 мкл ДКР-1 + 2 мкл ДКР-2
4. 20 мкл ДНК + 20 мкл композиции (4): 18 мкл ДКР-1 + 2 мкл ДКР-2
5. 20 мкл ДНК + 20 мкл композиции (5): 18 мкл ДКР-1 + 2 мкл ДКР-2
6. 20 мкл ДНК + 20 мкл композиции (6): 18 мкл ДКР-1 + 2 мкл ДКР-2
7. 20 мкл ДНК + 20 мкл композиции (1): 18 мкл ДКР-1 + 2 мкл ДКР-2
8. 20 мкл ДНК + 20 мкл коммерческого 0,1Х раствора «Белизна»
9. 20 мкл ДНК + 10 мкл реагента для ДНК-деконтаминации 1 и 10 мкл реагента для ДНК-деконтаминации 2 DNARid (Биомедицинские инновации, Россия)
10. 20 мкл ДНК + 20 мкл DNA-ExitusPlus (AppliChem, США)
2
11. 20 мкл ДНК + 20 мкл diHO
Исследуемые пробы перемешивали и кратко центрифугировали. Затем инкубировали с помощью термоциклера GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, США) в течение 15 мин при температуре 25°С. После инкубации кратко центрифугировали и проводили электрофорез исследуемых проб в 0,9% агарозном геле. Для этого 6 мкл каждого препарата ДНК смешивали с 1,5 мкл шестикратного буфера для нанесения (5:1, о/о), содержащим бромфеноловый синий и ксиленцианол в 30% растворе глицерина. В отдельные лунки вносили маркер молекулярных масс ДНК фага λ, обработанную рестриктазой HindIII (на фото электрофореза Фиг. 1 обозначен как «L»). Электрофорез проводился 5 мин при 120 V, затем 15 мин при 100 V. Гель располагали в УФ-трансиллюминаторе прибора ChemiDoc XRS+System (Bio-Rad, США) и фотографировали. Оценивали интенсивность свечения опытных препаратов ДНК и ПЦР-продукта относительно контрольных образцов (Корниенко И.В., Харламов С.Г. Методы исследования ДНК человека. Выделение ДНК и ее количественная оценка в аспекте судебно-медицинского исследования вещественных доказательств биологического происхождения: учебно-методическое пособие. Ростов н/Д: ЮФУ, 2012. - 216 с.).
После деконтаминационной обработки была измерена концентрация оставшейся ДНК при помощи помощью флуориметра QuantiFluor-P (Green/Blue, Promega Corporation, США) в 3 повторностях. Результаты представлены в табл. 1.
Проводили генотипирование исследуемых образцов с использованием набора реагентов для мультиплексного анализа 19-и STR-маркеров (D3S1358, ТН01, D12S391, D1S1656, D10S1248, D22S1045, D2S441, D7S820, D13S317, FGA, ТРОХ, D18S51, D16S539, D8S1179, CSF1PO, D5S818, vWA, D21S11, SE33) и фрагмента гена амелогенина человека (Amelogenin) по тест-системе COrDIS «ЭКСПЕРТ» (ГОРДИЗ, Россия) в соответствии с инструкцией пользователя.
2
Для проведения ПЦР предварительно готовили реакционную смесь, состоящую из компонентов, входящих в состав набора: в каждую ПЦР-пробирку вносили по 10 мкл Реакционной смеси (содержащей фермент Taq-полимеразу, флуоресцентно-меченные праймеры, dNTPs), 5 мкл раствора Активатора (содержащего MgCl), 5 мкл ДНК и доводили стерильной деионизованной водой до конечного объема 25 мкл. Для проверки чистоты реактивов и эксперимента в пробирку с отрицательным контролем добавляли 5 мкл деионизованной воды. Амплификацию ДНК осуществляли методом ПЦР с помощью термоциклера GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, США) в режиме эмуляции «9600», параметры реакции представлены в табл. 2.
Электрофорез ампликонов проводили с помощью генетического анализатора ABI PRISM 3130xl (Applied Biosystems, США) в соответствии с руководством пользователя. Идентификацию аллелей проводили по размерному стандарту S550 относительно аллельного леддера, прилагаемого к набору COrDIS «ЭКСПЕРТ».
1
3
Данные флуориметрии показывают, что после обработки ДКР №№1-4 высокомолекулярной ДНК концентрация последней в среднем не превышает 0,21 нг/мкл (Me = 0,18, Q = 0,09, Q = 0,23). В пробах, обработанных коммерческим 0,1 кратным (0,1Х) раствором «Белизна», ДНК отсутствовала (0 нг/мкл). При этом значения концентраций ДНК после деконтаминационной обработки коммерческими реагентами DNARid (Биомедицинские инновации, Россия) (Me = 1,98, min = 1,95, max = 1,99) и DNA-ExitusPlus (AppliChem, США) (Me = 2,18, min = 2,17, max = 2,21) были близки к контролю (без деконтаминационной обработки) (Me = 2,32, min = 2,32, max = 2,35).
На Фиг. 1 представлены результаты электрофореза образцов в 0,9% агарозном геле. Отсутствие полос белого цвета в лунках 1-8 и следов «шмера» низкомолекулярной ДНК проб, обработанных ДКР №№1-4 и коммерческим 0,1 кратным (0,1Х) раствором «Белизна», свидетельствует о полной деградации ДНК. В лунках 9 проб, обработанных DNARid (Биомедицинские инновации, Россия), не визуализируется высокомолекулярная ДНК, однако отчетливо заметен «шмер», что свидетельствует о наличии в пробах низкомолекулярной ДНК. В лунках 10 проб, обработанных и DNA-ExitusPlus (AppliChem, США), хорошо заметна высокомолекулярная ДНК, а также «шмер» низкомолекулярной ДНК.
При генотипировании проб высокомолекулярной ДНК, обработанных ДКР №№1-4 (Фиг. 2А), 0,1-кратным (0,1Х) раствором «Белизна» (Фиг. 2Б) и DNARid (Биомедицинские инновации, Россия) (Фиг. 2В) продукт амплификации не был получен, что отражено в отсутствии аллельных пиков на электрофореграммах. В пробах высокомолекулярной ДНК после воздействия DNA-ExitusPlus (AppliChem, США) был получен ПЦР-продукт в виде полного профиля ДНК К562 (Promega, США) на электрофореграммах (Фиг. 2Г), что подтверждают результаты генотипирования положительного контроля (Фиг. 2Д).
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о наличии устойчивого эффекта, оказываемого ДКР №№1-4 и 0,1 кратным (0,1Х) раствором «Белизна» на высокомолекулярную ДНК, проявляющегося в виде ее деградации. Применение коммерческих реагентов DNARid (Биомедицинские инновации, Россия) не позволило получить стабильные результаты в отношении деградации высокомолекулярной ДНК. DNA-ExitusPlus (AppliChem, США) не оказал существенного воздействия на высокомолекулярную ДНК, что отражено в виде отсутствия ее деградации.
Пример 2.
Проводили сравнительное исследование деконтаминационного эффекта на ампликоны жидких композиций, раскрываемых в настоящем изобретении ДКР №№1-4, коммерческих растворов: «Белизна», DNARid (Биомедицинские инновации, Россия) и DNA-ExitusPlus (AppliChem, США). Экспериментальное исследование проводили в восьми повторностях.
4
2
2
3
2
2
2
6
5
2
2
6
5
1. Состав жидкой композиции ДКР №1 (ДКР-1: 1% Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), 5 мМ пентагидрата сульфата меди(II) (CuSO×5HO), 3 мМ Триса (гидроксиметил) аминометана (Трис, (HOCH)CNH), 0,5 об. % глицерина; ДКР-2: 1% пероксида водорода (HO), 0,05% бензоата натрия (CHCOONa)): смесь растворов ДКР-1: 100 мг Додецилсульфата натрия, 12,5 мг пентагидрата сульфата меди(II), 3,63 мг Триса (гидроксиметил) аминометана, 50 мкл глицерина, доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой, и ДКР-2: 330 мкл 30% водного раствора пероксида водорода (HO) и 5 мг бензоата натрия (CHCOONa), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.
4
2
2
3
2
2
2
6
5
2
2
6
5
2. Состав жидкой композиции ДКР №1 (ДКР-1: 1% Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), 5 мМ пентагидрата сульфата меди(II) (CuSO×5HO), 6 мМ Триса (гидроксиметил) аминометана (Трис, (HOCH)CNH), 0,5 об. % глицерина; ДКР-2: 1% пероксида водорода (HO), 0,05% бензоата натрия (CHCOONa)): смесь растворов ДКР-1: 100 мг Додецилсульфата натрия, 12,5 мг пентагидрата сульфата меди(II), 7,26 мг Триса (гидроксиметил) аминометана, 50 мкл глицерина, доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой, и ДКР-2: 330 мкл 30% водного раствора пероксида водорода (HO) и 5 мг бензоата натрия (CHCOONa), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.
4
2
2
3
2
2
2
6
5
2
2
6
5
3. Состав жидкой композиции ДКР №1 (ДКР-1: 1% Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), 5 мМ пентагидрата сульфата меди(II) (CuSO×5HO), 12 мМ Триса (гидроксиметил) аминометана (Трис, (HOCH)CNH), 0,5 об. % глицерина; ДКР-2: 1% пероксида водорода (HO), 0,05% бензоата натрия (CHCOONa)): смесь растворов ДКР-1: 100 мг Додецилсульфата натрия, 12,5 мг пентагидрата сульфата меди(II), 14,52 мг Триса (гидроксиметил) аминометана, 50 мкл глицерина, доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой, и ДКР-2: 330 мкл 30% водного раствора пероксида водорода (HO) и 5 мг бензоата натрия (CHCOONa), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.
4
2
2
3
2
4
2
2
2
6
5
4
2
2
2
6
5
4. Состав жидкой композиции ДКР №2 (ДКР-1: 1% Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), 5 мМ пентагидрата сульфата меди(II) (CuSO×5HO), 3 мМ Триса (гидроксиметил) аминометана (Трис, (HOCH)CNH), 2 мМ гептагидрата железа(II) (FeSO×7HO); ДКР-2: 1% пероксида водорода (HO), 0,05% бензоата натрия (CHCOONa)): смесь растворов ДКР-1: 100 мг Додецилсульфата натрия, 12,5 мг пентагидрата сульфата меди(II), 3,63 мг Триса (гидроксиметил) аминометана, 5,6 мг гептагидрата железа(II) (FeSO×7HO), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой, и ДКР-2: 330 мкл 30% водного раствора пероксида водорода (HO) и 5 мг бензоата натрия (CHCOONa), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.
4
2
2
3
2
4
2
2
2
6
5
4
2
2
2
6
5
5. Состав жидкой композиции ДКР №3 (ДКР-1: 1% Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), 5 мМ пентагидрата сульфата меди(II) (CuSO×5HO), 3 мМ Триса (гидроксиметил) аминометана (Трис, (HOCH)CNH), 2 мМ гептагидрата железа(II) (FeSO×7HO), 0,5 об. % глицерина; ДКР-2: 1% пероксида водорода (HO), 0,05% бензоата натрия (CHCOONa)): смесь растворов ДКР-1: 100 мг Додецилсульфата натрия, 12,5 мг пентагидрата сульфата меди(II), 3,63 мг Триса (гидроксиметил) аминометана, 5,6 мг гептагидрата железа(II) (FeSO×7HO), 50 мкл глицерина, доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой, и ДКР-2: 330 мкл 30% водного раствора пероксида водорода (HO) и 5 мг бензоата натрия (CHCOONa), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.
4
2
2
2
6
5
2
2
6
5
6. Состав жидкой композиции ДКР №4 (ДКР-1: 1% Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), 5 мМ пентагидрата сульфата меди(II) (CuSO×5HO); ДКР-2: 1% пероксида водорода (HO), 0,05% бензоата натрия (CHCOONa)): смесь растворов ДКР-1: 100 мг Додецилсульфата натрия, 12,5 мг пентагидрата сульфата меди(II), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой, и ДКР-2: 330 мкл 30% водного раствора пероксида водорода (HO) и 5 мг бензоата натрия (CHCOONa), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.
4
2
2
2
6
5
2
2
6
5
7. Состав жидкой композиции ДКР №4 (ДКР-1: 2% Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), 5 мМ пентагидрата сульфата меди(II) (CuSO×5HO); ДКР-2: 1% пероксида водорода (HO), 0,05% бензоата натрия (CHCOONa)): смесь растворов ДКР-1: 200 мг Додецилсульфата натрия, 12,5 мг пентагидрата сульфата меди(II), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой, и ДКР-2: 330 мкл 30% водного раствора пероксида водорода (HO) и 5 мг бензоата натрия (CHCOONa), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.
8. Коммерческий раствор «Белизна» является водным раствором 70 мМ или 0,5% гипохлорита натрия (NaOCl), разбавленный деионизованной водой в соотношении 1:10 до получения 7 мМ или 0,05% раствора гипохлорита натрия (NaOCl).
9. DNARid (Биомедицинские инновации, Россия) является двухкомпонентным набором растворов и включает реагент для ДНК-деконтаминации 1 и реагент для ДНК-деконтаминации 2, состав которых производителем не раскрывается.
10. Состав жидких композиций DNA-ExitusPlus (AppliChem, США) производителем не раскрывается.
2
11. Контрольный образец с ДНК и деионизированной водой (diHO).
Для исследования стабильности ампликонов при деконтаминационном воздействии исследуемых реагентов использовали ПЦР-продукты стандартной ДНК 9947А. Ампликоны были получены при помощи ПЦР-анализатора Real-Time PCR iQ5 (Bio-Rad, США). Для энзиматической амплификации локуса гена HBG (Human beta globin), длиной 120 нуклеотидных пар, использовали следующую пару праймеров (Фалеева Т.Г., Иванов И.Н., Мишин Е.С. и др. Проблемы молекулярно-генетической идентификации потожировых следов отпечатков пальцев человека // Судебно-медицинская экспертиза. - 2016. - Т. 59, №2. - С. 14-18):
HBG1: 5'-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3'
HBG2: 5'-CACCAACTTCATCCACGTTCACC-3'
Амплификацию проводили с использованием набора реагентов EVA Green (Синтол, Россия). В каждую пробирку вносили по 20 мкл реакционной смеси и по 5 мкл ДНК 9947А. Объемы компонентов ПЦР смеси представлены в табл. 3.
Амплификацию проводили в следующем режиме:
Эффективность ПЦР в реальном времени, вычисленная по стандартной кривой, составляла не менее 0,92. Анализ данных проводился с помощью программы «iQ5 Optical System Software» (версия 2.0). Температура плавления ПЦР-продукта составляла 84,5±0,5°С.
Также была измерена концентрация полученных ПЦР-продуктов HBG 9947А с помощью флуориметра QuantiFluor-P (Green/Blue, Promega Corporation, США) в трех проворностях. Концентрация составила: Me = 7,363, min = 7,327, max = 8,112.
Перед началом эксперимента ПЦР-продукты HBG 9947А перемешивали и кратко центрифугировали. Вносили по 14 мкл ампликонов в 0,2 мл ПЦР-пробирки для проведения ПЦР. К ДНК добавляли исследуемые растворы в следующем соотношении:
1. 14 мкл ПЦР-продукта + 14 мкл композиции (1): 12 мкл ДКР-1 + 2 мкл ДКР-2
2. 14 мкл ПЦР-продукта + 14 мкл композиции (2): 12 мкл ДКР-1 + 2 мкл ДКР-2
3. 14 мкл ПЦР-продукта + 14 мкл композиции (3): 12 мкл ДКР-1 + 2 мкл ДКР-2
4. 14 мкл ПЦР-продукта + 14 мкл композиции (4): 12 мкл ДКР-1 + 2 мкл ДКР-2
5. 14 мкл ПЦР-продукта + 14 мкл композиции (5): 12 мкл ДКР-1 + 2 мкл ДКР-2
6. 14 мкл ПЦР-продукта + 14 мкл композиции (6): 12 мкл ДКР-1 + 2 мкл ДКР-2
7. 14 мкл ПЦР-продукта + 14 мкл композиции (7): 11 мкл ДКР-1 + 3 мкл ДКР-2
8. 14 мкл ПЦР-продукта + 14 мкл коммерческого 0,1Х раствора «Белизна»
9. 14 мкл ПЦР-продукта + 7 мкл реагента для ДНК-деконтаминации 1 и 7 мкл реагента для ДНК-деконтаминации 2 DNARid (Биомедицинские инновации, Россия)
10. 14 мкл ПЦР-продукта + 14 мкл DNA-ExitusPlus (AppliChem, США)
2
11. 14 мкл ПЦР-продукта + 14 мкл diHO
Исследуемые пробы перемешивали и кратко центрифугировали. Затем инкубировали с помощью термоциклера GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) в течение 15 мин при температуре 25°С. После инкубации кратко центрифугировали и проводили электрофорез исследуемых проб в 2% агарозном геле. Для этого 6 мкл каждого ампликона смешивали с 1,5 мкл шестикратного буфера для нанесения (5:1, о/о), содержащим бромфеноловый синий и ксиленцианол в 30% растворе глицерина. В качестве размерного стандарта использовали маркер «Bench Тор 100 bp DNA Ladder» (Promega, США) (на фото электрофореза Фиг. 3 обозначен как «L»). Электрофорез проводился 5 мин при 120 V, затем 15 мин при 100 V. Гель располагали в УФ-трансиллюминаторе прибора ChemiDoc XRS+ System (Bio-Rad, США) и фотографировали. Оценивали интенсивность свечения опытных препаратов ДНК и ПЦР-продукта относительно контрольных образцов (Корниенко И.В., Харламов С.Г. Методы исследования ДНК человека. Выделение ДНК и ее количественная оценка в аспекте судебно-медицинского исследования вещественных доказательств биологического происхождения: учебно-методическое пособие. Ростов н/Д: ЮФУ, 2012. - 216 с.).
Далее проводили измерение концентрации ПЦР-продуктов после воздействия на них различных исследуемых реагентов при помощи флуориметра QuantiFluor-P (Green/Blue, Promega Corporation, США) в 3 повторностях. Результаты представлены в табл. 4.
1
3
Данные флуориметрии показывают, что концентрация ПЦР-продуктов после обработки ДКР №№1-4 в среднем не превышает 0,12 нг/мкл (Me = 0,10, Q = 0,09, Q = 0,18). Содержание ПЦР-продуктов в образцах после деконтаминационной обработки коммерческим 0,1 кратным (0,1Х) раствором «Белизна» (Me = 2,92, min = 2,89, max = 2,94) и DNA-ExitusPlus (AppliChem, США) (Me = 3,17, min = 3,14, max = 3,19) были близки к контролю (без деконтаминационной обработки) (Me = 3,45, min = 3,44, max = 3,49). Значения концентраций ПЦР-продуктов, обработанных коммерческими реагентами DNARid (Биомедицинские инновации, Россия), занимали промежуточное положение (Me = 0,80, min = 0,79, max = 0,83).
На Фиг. 3 представлены результаты электрофореза образцов в 2% агарозном геле. В пробах 1-7 и 9 отмечается отсутствие полос и следов «шмера» белого цвета, что свидетельствует о деградации ампликона в пробах, обработанных ДКР №№1-4 и реагентом DNARid (Биомедицинские инновации, Россия). В 8 пробах, обработанных коммерческим 0,1 кратным (0,1Х) раствором «Белизна», и 10, обработанных реагентом DNA-ExitusPlus (AppliChem, США), отчетливо заметен ПЦР-продукт схожий по интенсивности свечения с контролем, что отражает отсутствие деконтминационного воздействия данных реагентов в отношении ампликонов.
Полученные данные отражают наличие устойчивого эффекта, оказываемого ДКР №№1-4» на ПЦР-продукт, проявляющегося в виде его значительной деградации. Применение коммерческого реагента DNARid (Биомедицинские инновации, Россия) не позволило получить стабильные результаты в отношении деградации ампликонов. Коммерческий раствор «Белизна» и реагент DNA-ExitusPlus (AppliChem, США) не оказали существенного деконтаминационного воздействия на ПЦР-продукт.
Пример 3.
Проводили исследование стабильности мембран клеток под воздействием предлагаемых в настоящем изобретении жидких композиций. Коммерческие аналоги в настоящем примере не рассматривали, поскольку их производителями не заявлено о способности данных растворов разрушать мембраны клеток.
4
2
2
2
6
5
2
2
6
5
Состав жидкой композиции ДКР №4 (ДКР-1: 1% Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), 5 мМ пентагидрата сульфата меди(II) (CuSO×5HO); ДКР-2: 1% пероксида водорода (HO), 0,05% бензоата натрия (CHCOONa)): смесь растворов ДКР-1: 100 мг Додецилсульфата натрия, 12,5 мг пентагидрата сульфата меди(II), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой, и ДКР-2: 330 мкл 30% водного раствора пероксида водорода (HO) и 5 мг бензоата натрия (CHCOONa), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.
2
2+
2+
2+
2+
Для исследования стабильности клеток при воздействии на них различных деконтаминационных средств были исследованы клетки клеточной линии HeLa. Клетки культивировали на питательной среде Игла MEM (Биолот, Россия) в инкубаторе Sanyo 18М при 37°С в атмосфере с 5% CO. Для проведения обработки клеток они были отделены от подложки обработкой трипсином в растворе Версена (2:1) в течение 5 мин. После добавления культуральной среды для остановки трипсинизации, клетки были суспендированы, а затем осаждены в центрифуге ELMI СМ-6М при 1 тыс.об. (~188 G) в течение 5 мин. После отделения супернатанта клетки были ресуспендированы в растворе DPBS без Са и Mg и повторно осаждены на центрифуге. После отделения отмывочного раствора к осажденным клеткам был добавлен Натрий-фосфатный буфер Дульбекко (Dulbecco's phosphate-buffered saline, DPBS) без Ca и Mg для получения суспензии с плотностью клеток 0,5-1 млн. в 1 мл. По 0,1 мл полученной суспензии клеток было внесено в конические пробирки объемом 1,5 мл с предварительно добавленными 0,9 мл исследуемых растворов. Пробирки с образцами инкубировали 30 мин на твердотельном термостате при комнатной температуре при покачивании столика с частотой 500 об/мин. Половину из обработанных образцов дополнительно инкубировали 9 мин на твердотельном термостате при температуре 99°С при покачиваниях столика с частотой 500 об/мин. Для стабилизации состояния проб они были охлаждены до 4°С.
2+
2+
Далее проводили микроскопирование образцов. Определено количество клеток в суспензии разрабатываемых растворов, воды и DBPS (без Са и Mg). После интенсивного перемешивания содержимого пробирок в течение 5 сек из пробирок было отобрано по две пробы (по 9 мкл) содержимого: одна у поверхности жидкости, вторая у дна пробирки. Каждая из проб была помещена в камеру для счета форменных элементов крови (Камера Горяева, ТУ 9443-007-29508133-2007, 2-х сет.) (МиниМед, Россия), где на инвертированном микроскопе Nikon T100F были подсчитаны клетки на трех полосах размеченной поверхности камеры. Длина каждой из полос составляла 3 мм при ширине 0,2 мм, что при высоте камеры 0,1 мм соответствует объему жидкости 0,06 мм. Для каждой из полос была получена плотность клеток в 1 мкл путем перемножения посчитанного количества на коэффициент 1/0,06. Из полученных оценок по образцу были рассчитаны арифметическое среднее и вычислен ее 95% доверительный интервал. Результаты отражены в табл. 5, а также на Фиг. 4-6.
Результаты, представленные в табл. 5, отражают высокую способность предлагаемых в настоящем изобретении деконтаминационных растворов разрушать мембраны клеток в исследованных режимах. Полученные данные подтверждают микрофотографии в камере Горяева образцов клеточных суспензий линии HeLa (10к) после их обработки и инкубации в ДКР №4: цельные клетки и клеточные структуры не визуализируются (Фиг. 4А-В). При этом обработка и инкубация клеток HeLa (10к) в DBPS (Фиг. 5А-В) и деионизованной воде (контроль) (Фиг. 6А-В) не привела к разрушению мембран клеток и клеточных структур, что отражается в обильном наличии клеток на микрофотографиях.
Пример 4.
Исследовали возможность удаления ДНК-содержащего биологического материала (клеточной линии) из проб с биологическим материалом. Для этого использовали следующую жидкую композицию, предлагаемую в настоящем изобретении:
4
2
2
2
6
5
2
2
6
5
Состав жидкой композиции ДКР №4 (ДКР-1: 1% Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), 5 мМ пентагидрата сульфата меди(II) (CuSO×5HO); ДКР-2: 1% пероксида водорода (HO), 0,05% бензоата натрия (CHCOONa)): смесь растворов ДКР-1: 100 мг Додецилсульфата натрия, 12,5 мг пентагидрата сульфата меди(II), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой, и ДКР-2: 330 мкл 30% водного раствора пероксида водорода (HO) и 5 мг бензоата натрия (CHCOONa), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.
В качестве контаминирующего материала использовали клеточную линию HeLa, а в качестве контаминируемого биологического материала - костный порошок. Исследования проводили в 5 повторностях. Получали порошок из компактного слоя длинных трубчатых костей (плечевых, бедренных) двух скелетов человека с использованием вибрационной мельницы Retsch ММ 200 в течение 2,5-3 мин при скорости 1500 об/мин. или при помощи мини-дрели Hammer Flex MD135A. В 50 мл пробирки помещали по 1 г костного порошка, добавляли по 1 мл водного раствора ДНК HeLa (всего 60 нг, 60 нг/мл). Для эффективного перемешивания смеси и разбивания осадка после центрифугирования отдельно в каждую пробирку со смесью помещали стерильный стеклянный шарик диаметром 16 мм. Перемешивали несколько сек на вортексе, пока весь костный порошок не перемешается с раствором ДНК HeLa.
2
Затем в пробирки с контаминированным порошком добавляли по 800 мкл композиции ДКР-2, а затем добавляли по 25 мл ДКР-1. Перемешивали 10 сек на вортексе. Инкубировали на горизонтальном шейкере при 200 об/мин. в течение 10 мин. Центрифугировали при 1500 g в течение 5 мин. Аккуратно сливали надосадок так, чтобы стеклянный шарик оставался в пробирке. К осадку повторно добавляли по 800 мкл композиции ДКР-2. Далее повторно добавляли по 25 мл ДКР-1. Перемешивали 10 сек на вортексе до полного разбивания осадка. Инкубировали на горизонтальном шейкере при 200 об/мин. в течение 10 мин. Центрифугировали при 1500 g в течение 5 мин. Аккуратно сливали надосадок так, чтобы стеклянный шарик оставался в пробирке. К надосадку добавляли 20-25 мл композиции ДКР-1. Перемешивали 30 сек на вортексе до полного разбивания осадка. Центрифугировали при 1500 g в течение 5 мин. Аккуратно сливали надосадок так, чтобы стеклянный шарик оставался в пробирке. К надосадку добавляли по 20-25 мл раствора 0,5% лаурилсаркозила в 0,5 М ЭДТА. Перемешивали 40 сек на вортексе до полного разбивания осадка. Центрифугировали при 1500 g в течение 5 мин. Аккуратно сливали надосадок так, чтобы стеклянный шарик оставался в пробирке. К надосадку добавляли повторно по 20-25 мл раствора 0,5% лаурилсаркозила в 0,5 М ЭДТА. Перемешивали 40 сек на вортексе до полного разбивания осадка. Центрифугировали при 1500 g в течение 5 мин. Аккуратно сливали надосадок так, чтобы стеклянный шарик оставался в пробирке. К надосадку третий раз добавляли по 20-25 мл раствора 0,5% лаурилсаркозила в 0,5 М ЭДТА. Перемешивали 40 сек на вортексе до полного разбивания осадка. Гомогенную взвесь отмытого и декальцинированного костного порошка переливали в чистую 50 мл пробирку так, чтобы стеклянный шарик оставался в первой пробирке. Центрифугировали при 1500 g в течение 5 мин. Надосадок удаляли. Затем к осадку добавляли по 4 мл лизирующего раствора №2: 10 мМ трис-HCl, рН 8,3; 50 мМ KCl; 2,5 мМ MgCl; 0,45% Tween 20 (Корниенко И.В., Харламов С.Г. Методы исследования ДНК человека. Выделение ДНК и ее количественная оценка в аспекте судебно-медицинского исследования вещественных доказательств биологического происхождения: учебно-методическое пособие. Ростов н/Д: ЮФУ, 2012. - 216 с.). Тщательно перемешивали. Инкубировали при 43°С в термошейкере при 160 об/мин. в течение 12 часов. Центрифугировали при 4000 g в течение 10 мин.
Надосадок переносили в отдельные стерильные 50 мл пробирки. К надосадку добавляли равный содержимому пробирки объем смеси фенол/хлороформ/изоамилол (25:24:1). Тщательно перемешивали на вортексе не менее 10 сек. Центрифугировали содержимое пробирок при 4000 g в течение 10 мин. Верхнюю водную фазу осторожно, не затрагивая интерфазу, переносили в стерильные 50 мл пробирки. Экстрагировали смесью фенол/хлороформ/изоамилол дважды. К водному раствору с ДНК добавляли равный объем н-бутанола или хлороформ. Тщательно перемешивали на вортексе не менее 10 сек. Центрифугировали содержимое пробирок при 4000 g в течение 5 мин. Верхний слой бутанола (или хлороформа) удаляли, оставив в пробирке водный раствор с ДНК.
Для дополнительной очистки и концентрирования препаратов ДНК использовали устройство «AmiconUltra-4, ultracel30k» в соответствии с руководством пользователя.
Далее проводили генотипирование исследуемых образцов с использованием наборов реагентов для мультиплексного анализа 19-и STR-маркеров (D3S1358, ТН01, D12S391, D1S1656, D10S1248, D22S1045, D2S441, D7S820, D13S317, FGA, ТРОХ, D18S51, D16S539, D8S1179, CSF1PO, D5S818, vWA, D21S11, SE33) и фрагмента гена амелогенина человека (Amelogenin) по тест-системам «COrDIS Plus» и COrDIS «ЭКСПЕРТ» (ГОРДИЗ, Россия) в соответствии с инструкциями пользователя. Условия проведения ПЦР и генотипирования препаратов ДНК описаны в примере 1 настоящего изобретения. Результаты генотипирования представлены на Фиг. 7.
На электрофореграмме Фиг. 7А представлен генетический профиль контаминированного клеточной культурой HeLa костного образца без предварительной обработки предлагаемыми в настоящем изобретении ДКР. Данный профиль носит смешанный характер, так как содержит до четырех аллелей в исследованных локусах. При этом в данном профиле присутствуют генетические признаки свойственные как генотипу костного материала (Фиг. 7В), так и генотипу клеточной культурой HeLa (Фиг. 7Г) (аллели выделены). Обработка контаминированного костного порошка с использованием ДКР позволила получить аутентичный профиль кости без примеси: на электрофореграмме (Фиг. 7Б) в генотипе присутствуют аллели, свойственные кости данного скелета. Контроль чистоты реагентов отражен в виде отсутствия аллельных пиков в профиле на электрофореграмме Фиг. 7Д (холостая проба).
Полученные данные свидетельствуют о том, что предварительная обработка проб костного порошка предлагаемыми в настоящем изобретении ДКР способствует удалению привнесенной клеточной линии и позволяет получить чистый профиль исследуемого костного образца. Приведенная в данном примере настоящего изобретения обработка измельченных костных объектов (порошок, стружка) при помощи ДКР рассматривается как способ деконтаминационной очистки в процессе пробоподготовки образцов перед декальцинацией и экстракцией из них ДНК.
Пример 5.
Исследовали влияние на генетический материал возбудителя новой коронавирусной инфекции SARS-CoV-2 жидкой композиции ДКР №4, предлагаемой в настоящем изобретении, а также коммерческих дезинфицирующих средств: «Асепт Про» («Asept Pro») (АЦЕЯ, Россия), «Фармсепт» («Pharmsept») (Уралхимфарм - Плюс, Россия), «Фориспот» (Альфа, Россия), Антисептик для рук «Аптеки Дона» (ГУП РО «Ростовоблфармация», Россия) и «КОРОНОСЕПТ Dr. Arsenin» (НАТУРОТЕРАПИЯ, Россия). Экспериментальное исследование проводили в восьми повторностях.
4
2
2
2
6
5
2
2
6
5
1. Состав жидкой композиции ДКР №4 (ДКР-1: 1% Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), 5 мМ пентагидрата сульфата меди(II) (CuSO×5HO); ДКР-2: 1% пероксида водорода (HO), 0,05% бензоата натрия (CHCOONa)): смесь растворов ДКР-1: 100 мг Додецилсульфата натрия, 12,5 мг пентагидрата сульфата меди(II), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой, и ДКР-2: 330 мкл 30% водного раствора пероксида водорода (HO) и 5 мг бензоата натрия (CHCOONa), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.
2. «Асепт Про» («Asept Pro») производства ООО «АЦЕЯ», зарегистрировано в Евразийском экономическом сообществе, № KZ.16.01.98.002.E.000270.04.19 от 05.04.2019 г. (г. Москва).
3. «Фармсепт» («Pharmsept»), производства ООО «Уралхимфарм - Плюс», номер госрегистрации № RU.77.99.88.002.Е.007106.06.15 от 18.06.2015 г. (г. Челябинск).
4. «Фориспот», производства ООО НПК «Альфа», номер госрегистрации NQRU.77.99.88.002.E.003495.08.18 от 14.08.2018 г. (г. Ростов-на-Дону).
5. Антисептик для рук «Аптеки Дона», производства ГУП РО «Ростовоблфармация» (г. Ростов-на-Дону).
6. «КОРОНОСЕПТ Dr. Arsenin», производства ЗАО «НАТУРОТЕРАПИЯ» (г. Ногинск).
Состав жидких композиций коммерческих дезинфицирующих средств производителями не раскрывается.
Отбор биологического материала проводился медицинским работником в медицинском кабинете ФБУН «Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии» Роспотребнадзора, с использованием средств индивидуальной защиты. Осуществляли мазки вращательными движениями с поверхности миндалин, небных дужек и задних стенок носоглотки и ротоглотки у больных новой коронавирусной инфекцией (возбудитель SARS-CoV-2) с использованием специальных сухих стерильных зондов. Влияние на генетический материал возбудителя новой коронавирусной инфекции SARS-CoV-2 жидкой композиции ДКР №4 исследовали на биологическом материале от 14 больных, а коммерческих дезинфицирующих средств - от 8 больных.
Стерильными наконечниками раскапывали по 500 мкл реагента для хранения и транспортировки респираторных мазков «Транспортная среда для хранения и транспортировки респираторных мазков» (производство ИнтерЛабСервис) в стерильные пробирки типа «Эппендорф» объемом 2,0 мл. В пробирки с транспортной средой помещали тампоны с выполненными смывами. При этом совмещали мазки из полости носа и ротоглотки в одной пробирке. Концы зондов отламывали так, чтобы они позволяли плотно закрыть крышку пробирки.
Пробирки с содержимым кратко встряхивали на вортексе. Стерильными наконечниками раскапывали по 50 мкл транспортной среды с мазками из полости носа и ротоглотки в стерильные пробирки типа «Эппендорф» объемом 1,5 мл. К образцам добавляли исследуемые реагенты в следующем соотношении:
1. 50 мкл образца + 50 мкл композиции (1): 40 мкл ДКР-1 + 10 мкл ДКР-2
2. 50 мкл образца + 50 мкл «Асепт Про» («Asept Pro») (АЦЕЯ, Россия)
3. 50 мкл образца + 50 мкл «Фармсепт» («Pharmsept») (Уралхимфарм - Плюс, Россия)
4. 50 мкл образца + 50 мкл «Фориспот» (Альфа, Россия)
5. 50 мкл образца + 50 мкл Антисептик для рук «Аптеки Дона» (ГУП РО «Ростовоблфармация», Россия)
6. 50 мкл образца + 50 мкл «КОРОНОСЕПТ Dr. Arsenin» (НАТУРОТЕРАПИЯ, Россия)
7. 50 мкл образца + 50 мкл деионизованной воды (контроль)
Пробы инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре (22-25°С). Сразу же после инкубации проводили выделение РНК возбудителя SARS-CoV-2 с помощью набора «РИБО-преп» (производство ИнтерЛабСервис).
Для этого вносили в 1,5 мл пробирки по 300 мкл раствора для лизиса, затем вносили по 100 мкл подготовленных проб после 30 минут инкубации. Содержимое пробирок тщательно перемешивали на вортексе, центрифугировали в течение 5 сек на микроцентрифуге для удаления капель с внутренней поверхности крышки и прогревали в течение 5 мин при 65°С в термостате. Добавляли в пробирки по 400 мкл раствора для преципитации, перемешивали на вортексе. Центрифугировали пробирки на микроцентрифуге в течение 5 мин при 13 000 об/мин. Аккуратно отбирали надосадочную жидкость, не задевая осадок. Добавляли в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки 3, плотно закрывали крышки, осторожно промывали осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз. Центрифугировали при 13 000 об/мин в течение 1-2 мин на микроцентрифуге. Осторожно, не захватывая осадок, отбирали надосадочную жидкость. Добавляли в пробирки по 200 мкл раствора для отмывки 4, плотно закрывали крышки и осторожно промывали осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз. Центрифугировали при 13 000 об/мин в течение 1-2 мин на микроцентрифуге. Осторожно, не захватывая осадок, отбирали надосадочную жидкость. Помещали пробирки в термостат при температуре 65°С на 5 мин для подсушивания осадка (при этом крышки пробирок оставляли открытыми). Добавляли в пробирки по 50 мкл РНК-буфера. Перемешивали на вортексе. Помещали в термостат при температуре 65°С на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе. Центрифугировали пробирки при 13 000 об/мин в течение 1 мин на микроцентрифуге. Далее исследовали надосадочную жидкость.
Выявление РНК коронавируса SARS-CoV-2 осуществляли методом обратной транскрипции (ОТ) и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с помощью специализированной тест-системы РУ № РЗН 2020/9948 от 01 апреля 2020 года (ДНК-Технология, Россия).
Готовили смесь ОТ-ПЦР-буфера с ферментом Taq/RT. Смешивали в отдельной пробирке:
15 × (N+1) мкл ОТ-ПЦР-буфера,
0,5 × (N+1) мкл фермента Taq/RT,
где N - количество промаркированных пробирок с учетом «K-» и «K+».
Встряхивали пробирку в течение 3-5 сек на микроцентрифуге-вортексе и центрифугировали в течение 1-3 сек на микроцентрифуге-вортексе. Добавляли в каждую промаркированную пробирку, не повреждая слой парафина, по 15 мкл смеси ОТ-ПЦР-буфера с ферментом Taq/RT. Закрывали крышки пробирок. Встряхивали пробирки с исследуемыми и контрольными образцами в течение 3-5 сек на микроцентрифуге-вортексе и центрифугировали в течение 1-3 сек на микроцентрифуге-вортексе. Вносили по 10 мкл исследуемых образцов, отрицательного и положительного контрольного образца в соответствующие пробирки, не повреждая слой парафина. Центрифугировали пробирки в течение 3-5 сек на микроцентрифуге-вортексе. Устанавливали все пробирки в блок детектирующего амплификатора ДТпрайм (ДНК-технология, Россия) и проводили ОТ-ПЦР с учетом объема реакционной смеси, равного 40 мкл. Запускали программное обеспечение RealTime PCR в режиме «Работа с прибором». Проводили ПЦР по следующей программе энзиматической амплификации (табл. 6):
Устанавливали измерение флуоресценции по каналам FAM, HEX, ROX и Су5 при 64°С (табл. 7).
Выявление РНК коронавируса SARS-CoV-2, вызывающего новую коронавирусную инфекцию COVID-19, осуществляли также методом ОТ и ПЦР-РВ с помощью набора реагентов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 методом ОТ-ПЦР-РВ «РеалБест РНК SARS-CoV-2» (Вектор Бест, Россия).
В пробирки с готовой лиофилизированной реакционной смесью для ОТ-ПЦР вносили по 50 мкл раствора выделенной РНК. Заклеивали пробирки оптической пленкой. Помещали пробирки в мини-шейкер. Перемешивали содержимое пробирок с частотой вращения 1200 об/мин в течение 1 мин. Помещали пробирки в блок детектирующего амплификатора ДТпрайм (ДНК-технология, Россия). Проводили реакцию ОТ-ПЦР в соответствии с программой, указанной в табл. 8. Выбрали каналы детекции результатов амплификации кДНК ВКО и кДНК возбудителя инфекции:
«РчОХ» - для регистрации сигнала кДНК SARS-CoV-2;
«FAM» - для регистрации сигнала кДНК ВКО.
Анализируемый образец считали положительным, если для этого образца значение Ct по каналу «ROX» был меньше или равен 40.
Результаты испытаний ДКР по их влиянию на генетический материал (РНК) возбудителя новой коронавирусной инфекции (SARS-CoV-2) с использованием метода ОТ и ПЦР-РВ с помощью специализированной тест-системы РУ № РЗН 2020/9948 от 01 апреля 2020 года (ДНК-Технология, Россия) приведены в табл. 9 и Фиг. 8А-В
9,6
Полученные данные показывают, что инкубация мазков из носоглотки и ротоглотки больных новой коронавирусной инфекцией (возбудитель SARS-CoV-2) с ДКР №4 в течение 30 мин приводит к полной деградации генома вируса SARS-CoV-2 в 5 из 6 проб. В одном случае (образец 4) выявлено снижение концентрации генетического материала вируса в 776 (2) раз.
Сравнительные результаты исследований воздействия ДКР №4 и коммерческих дезинфицирующих средств «Асепт Про», «Фармсепт», «Фориспот», Антисептика для рук «Аптеки Дона» и «КОРОНОСЕПТ Dr. Arsenin») на генетический материал (РНК) возбудителя новой коронавирусной инфекции методом ОТ-ПЦР-РВ с использованием набора реагентов «РеалБест РНК SARS-CoV-2» (Вектор Бест, Россия) приведены в табл. 10.
Вследствие недостаточного перемешивания реакционных смесей в образцах №№4, 6 и 7 при проведении методики воздействия ДКР №4 на геном возбудителя SARS-CoV-2 были проведены повторные исследования для данных объектов. Дополнительно в качестве потенциально деконтаминирующего агента исследовали коммерческое дезинфицирующее средство «Фориспот» (Альфа, Россия).
Сравнительные результаты повторных ДКР №4 и коммерческого дезинфицирующего средства «Фориспот» в отношении деградационного воздействия на генетический материал (РНК) возбудителя новой коронавирусной инфекции методом ОТ-ПЦР-РВ с использованием набора реагентов «РеалБест РНК SARS-CoV-2» (Вектор Бест, Россия) приведены в табл. 11 и Фиг. 9.
Инкубация мазков из носоглотки и ротоглотки больных новой коронавирусной инфекцией с ДКР №4 в течение 30 мин привела к полной деградации генома вируса SARS-CoV-2 в 2 из 8 проб. В 7,1% проб (1 из 14) ДКР №4 привели к уменьшению концентрации генетического материала вируса SARS-CoV-2 в 776 раз. В остальных 42,9% проб (6 из 14) инкубация мазков из носоглотки и ротоглотки больных новой коронавирусной инфекцией с ДКР №4 привела к значительному снижению концентрации генетического материала вируса:
16,9
1. в пробе 2 - в 122294,5 (2) раз;
22,7
2. в пробе 3 - в 6813667,0 (2) раз;
23,2
3. в пробе 5 - в 9635980,2 (2) раз;
12,2
4. в пробе 6 - в 4705,1 (2) раз;
21,5
5. в пробе 7 - в 2965820,8 (2) раз;
20,5
6. в пробе 8 - в 1482910,4 (2) раз.
Полученные данные свидетельствуют о том, что инкубация мазков из носоглотки и ротоглотки больных новой коронавирусной инфекцией с коммерческими дезинфицирующими средствами «Асепт Про», «Фармсепт», «Фориспот», Антисептик для рук «Аптеки Дона», «КОРОНОСЕПТ Dr. Arsenin» в течение 30 мин показала меньшую эффективность по сравнению с ДКР №4 на деградацию генома возбудителя новой коронавирусной инфекции. Так, ни один из вышеуказанных коммерческих дезинфицирующих средств не привел к полному уничтожению генома вируса SARS-CoV-2.