ПРОТИВОВИРУСНОЕ ГУМИНОВОЕ СРЕДСТВО
ANTIVIRAL HUMIC AGENT

Изобретение относится к области медицины и фармацевтики, а именно к гуминовым препаратам, и может найти применение в комплексной терапии вирусных заболеваний, в частности вирусов гриппа, простого герпеса 1 и 2 типа, ВИЧ и др. Заявленное средство также может найти применение в лечении и профилактике SARS-CoV-2 (COVID-19).
Гуминовые кислоты, фульвокислоты оказывают на любой живой организм мощное воздействие благодаря богатому составу. В них содержится полный набор аминокислот, макро- и микроэлементов, минералов, а также полисахариды природного происхождения, витамины, пептиды, жирные кислоты, полифенолы, кетоны, катехины и т.д. Всего около 70 полезных компонентов. Такой насыщенный состав объясняет положительные биологические эффекты гуминовой кислоты (cm.https.//fb.ru/article/288472/guminovyie-kislotyi-chto-eto-takoe-i-kak-oni-vliyayut-na-organizm).
Известно, что гуминовые кислоты способны стимулировать некоторые функции нейтрофилов человека. Для препаратов на основе гуминовых и гуминовоподобных веществ выявлена антивирусная активность, например, для симплексного вируса герпеса - HSV. Гуминовые соединения могут быть использованы в качестве микробиоцидов, профилактических средств против распространения ВИЧ/СПИД. Были исследованы цитотоксические и антивирусные свойства гуминовых кислот и фульвокислот, выделенных из угля и торфа. Исследования показали, что все изученные соединения были малотоксичными и обладали достаточно высоким ингибирующим эффектом в отношении ВИЧ-инфекции (А.И. ПОПОВ, В.Н. ЗЕЛЕНКОВ, Т.В. ТЕПЛЯКОВА Биологическая активность и биохимия гуминовых веществ. Часть 2. Медико-биологический аспект (обзор литературы). Вестник Российской Академии Наук, 2016/5, с. 9-15).
Благодаря своей разветвленной химической структуре гуминовые кислоты можно отнести к группе дендримероподобных микробицидов, представители которой демонстрируют достаточно высокую эффективность в клинических испытаниях [Moscicki et al., 2012; Cohen et al., 2012; McGowan et al., 2012]. Известны работы по установлению противовирусного действия природных и синтетических гуминовых веществ по отношению к вирусу гриппа A/WSN/1933 (H1N1) [Lu et al., 2002], вирусу простого герпеса 1 типа [Kloecking et al., 2002], вирусу геморрагической лихорадки и вирусу Коксаки А9 [Kloecking et al., 1972]. В экспериментах in vitro было показано, что синтетические аналоги гуминовых кислот (HS-1500, Оксигумат, Олипифат) способны ингибировать ВИЧ [Schneider et al., 1996; van Rensburg et al., 2002; Корнилаева и др., 2010]. Имеются литературные данные, что гуминовые вещества способны влиять на активацию иммунного ответа in vitro. Было показано, что Оксигумат повышает активность Th-1 клеток и уменьшает продукцию цитокинов Th-2 клетками [Mariette et al., 2002]. Наблюдаемая стимуляция пролиферации лимфоцитов человека была связана с повышением продукции ИЛ-2 и экспрессией ИЛ-2 рецепторов вместе с уменьшением количества ИЛ-10 под действием Оксигумата [Joone et al., 2003]. In vivo показано, что пероральный прием гуминовых веществ улучшает параметры врожденного иммунитета у экспериментальных животных: происходит усиление антибактериальной активности сыворотки крови, фагоцитарной активности, активности лизозима и бактериальной агглютинации [Sanmiguel et al., 2016]. Это делает гуминовые вещества потенциальными продуктами для разработки многомишеневьгх иммуноактивных микробицидов.
Из уровня техники известно противовирусное средство, содержащее водный раствор водорастворимой фракции гуминовых кислот (ВФГК), полученных из окисленного бурого угля, отличающееся тем, что в качестве ВФГК оно содержит водорастворимую фракцию гуминовых кислот, обработанную ферментом трипсином в соотношении ВФГК и трипсин (25-35):1 в буферном растворе 1 М Трис в течение не менее 5-6 часов с последующим осаждением ВФГК путем закисления до значения рН равного или менее 2,0 единиц с содержанием ВФГК в водном растворе в концентрации от 1,5 до 150 мкг/мл (патент RU 2678986, 05.02.2019). Недостатком известного решения является сложность процесса его получения, а также тем, что содержит только узкую фракцию гуминовых кислот и не содержит других активных компонентов гуминовых веществ.
Задачей настоящего изобретения является получение гуминового средства, содержащего широкий спектр гуминовых веществ и обладающего противовирусной активностью, без использования химических реагентов.
Техническим результатом заявленного изобретения является получение противовирусного гуминового средства, содержащего широкий спектр гуминовых веществ и не имеющего химических примесей, которое может быть использовано в области медицины и фармацевтики.
Указанный технический результат достигается за счет того, что заявленное противовирусное гуминовое средство, обладающее противовирусной активностью, содержит воду и гуминовые вещества, полученные из гуминосодержащего сырья, выбранного группы, включающей леонардит, лигнин, уголь, торф и/или сапропель, методом ультразвукового диспергирования при температуре 30-80°С и давлении 0,05-0,8 МПа, при этом масса гуминовых веществ составляет от 1 до 20 мас. %, а гуминовые вещества включают гуминовые и фульво-кислоты и их соли, а также гидрохинон в количестве не превышающем 3 мас. % от массы гуминовых веществ.
Также предлагается применение полученного противовирусного гуминового средства для лечения и/или профилактики вирусных заболеваний.
Для получения заявленного средства использовали предварительно измельченное сырье (леонардит, лигнин, уголь, торф, сапропель) в смеси с водой, которое помещали в ультразвуковую установку. Помещенную в ультразвуковую установку смесь гуминосодержащего сырья с водой нагревали до 30-80°С, и при достижении требуемой температуры производили обработку ультразвуком при давлении 0,05-0,8 МПа. После ультразвуковой обработки раствор охлаждали до комнатной температуры. Полученное средство разбавляли водой до содержания гуминовых веществ, составляющего от 1 до 20 мас. %.
Исследование состава полученного средства проводили методом ГХ-МС на анализаторе «Хроматэк», состоящем из газового хроматографа «Хроматэк-Кристал 5000» и жидкостного дозатора ДАЖ-2М. Для идентификации дериватов использовали автоматическую базу поиска и идентификации данных хромато-масс-спектрометрии NIST17MS Library.
Условия исследования:
Результаты исследования приведены в табл. 1
Согласно приведенным данным в состав заявленного средства, помимо гуминовых и фульвокислот, входят также фенольные производные, в частности гидрохинон, флаваноиды (хризин) и другие активные вещества. Следовательно, заявленное средство характеризуется широким спектром активных веществ. В частности, гидрохинон
Исследование на токсичность.
Определение показателей острой токсичности включало эксперименты на мышах. Животные распределялись по группам случайным образом методом рандомизации. В качестве критериев приемлемости рандомизации считали отсутствие внешних признаков заболеваний и гомогенность групп по массе тела (±10%). Введение препарата осуществляли внутрижелудочно в возрастающих дозах по Литчфилду-Уилкоксону. Наивысшая доза была лимитирована максимально возможным объемом введения препарата. Для исследования каждой дозы препарата использовались группы по 10 животных разного пола. Период наблюдения составлял 14 суток. При введении препарата в дозах 4000-8000 мг/кг (по гуминовой кислоте) у животных выявлено изменение реакции на взятие в руки, изменение дыхания, двигательной активности, и тонуса мускулатуры, у некоторых животных наблюдалось изменение консистенции кала. При введении препарата в дозе до 4000 мг/кг (по гуминовой кислоте) все животные выжили, при введении препарата в концентрации 6000 мг/кг (по гуминовой кислоте) погибло 5 животных из 10, а при введении препарата в дозе 8000 мг/кг (по гуминовой кислоте) погибло 8 животных из 10. Выжившие животные удовлетворительно перенесли интоксикацию и по окончании действия препарата на протяжении 14 дней наблюдения, признаков отсроченного влияния не отмечено. Признаков пролонгированной клинической интоксикации отмечено не было. Динамика массы тела опытных животных не отличалась от контроля. По окончании периода наблюдения - на 14 день, был произведен забой выживших животных с целью определения возможных патологических изменений после однократного приема препарата. Осмотр опытной и контрольных групп показал, что все животные в них были нормально упитаны, имели правильное телосложение, гладкий и блестящий волосяной покров, блестящие, обычной окраски слизистые оболочки, чистые и опрятные естественные отверстия. При макроскопическом исследовании внутренних органов каких-либо особенностей не было выявлено. Анализ величин массовых коэффициентов не выявил каких-либо достоверных отличий между группами животных, получавшими разные дозы препарата. Таким образом, полученные результаты позволяют предположить, что полученные препарат можно отнести к V классу, т.е. практически нетоксичных лекарственных веществ.
Исследование противовирусной активности заявленного средства.
В опытах по определению противовирусной активности заявленного препарата на культурах клеток MDCK и Vero использовали предварительно определенные их максимально переносимые концентрации (МПК) для этих клеточных культур.. В работе использовали штаммы РНК-геномного вируса: штамма вируса гриппа A/California/07/09 (H1N1pdm09) (получен из Сотрудничающего Центра ВОЗ (Атланта, США)), эпидемический штамма вируса гриппа A/Lipetsk/01/2018 (получен из коллекции вирусов ГНЦ ВБ «Вектор), штамма сезонного вируса гриппа B/Brisbane/60/2008 (вирусный штамм был получен из Сотрудничающего Центра ВОЗ по гриппу (Атланта, США)) и вирус гриппа птиц A/rook/Chany/32/2015 (H5N1) (получен из коллекции вирусов ГНЦ ВБ «Вектор»).
50
50
50
50
Определение противовирусной активности препарата в отношении РНК-содержащих вирусов. Вирусы гриппа A/California/07/09 (H1N1pdm09), A/Lipetsk/01/2018 и B/Brisbane/60/2008 были наработаны на клетках MDCK, после титрования определена доза вируса, инфицирующая 50% клеток (1 ТЦИД ), и доза вируса, соответствующая 100 ТЦИД  /мл. Эта доза (100 ТЦИД /мл) использовалась для заражения клеток. Вирус гриппа A/rook/Chany/32/2015 (H5N1) был наработан в развивающихся куриных эмбрионах, после титрования на клетках MDCK определена доза вируса, соответствующая 100 ТЦИД /мл. Эта доза использовалась для заражения клеток.
Для определения противовирусной активности образцов в монослой культуры клеток MDCK вносили по 50 мкл препарата гуминовых веществ в различных концентрациях и вирус в указанной дозе. Клетки инкубировали 5 сут при температуре 37°С в атмосфере 5% СO2. На 5 сутки после заражения клетки окрашивали раствором генциан фиолетового (1 г генциан фиолетового, 50 мл 96% этилового спирта, 700 мл дистиллированной воды, 300 мл 40% раствора формалина) и результаты учитывали визуально, оценивая поражение клеточного монослоя в %.
В качестве отрицательного контроля использовали интактные клетки в поддерживающей среде без добавления препарата, которые инкубировали в течение того же времени, что и в опыте.
50
В качестве положительного контроля использовали клетки, зараженные вирусом в дозе 100 ТЦД/лунку без добавления препарата.
Результаты приведены в таблице 2.
50
Также были проведены исследования противовирусной активности заявленного средства в отношении вируса простого герпеса II типа. Вирус простого герпеса II типа получен из коллекции вирусов ГНЦ ВБ «Вектор». Вирус наработан и титрован в культуре клеток VERO. Рассчитана доза вируса равная 100 ТЦИД  /мл. В серологических планшетах готовили разведения заявленного средства в 80 мкл среды. В каждую лунку с разведением вносили вирус, инкубировали при комнатной температуре 30 мин., суспензию переносили в культуральный планшет с культурой клеток VERO. Инкубировали 2 суток при 37°С, окрашивали витальным красителем нейтральным красным. Заявленный препарат проявляет выраженное противовирусное действие в отношении вируса простого герпеса. Токсичная доза для клеток VERO равна 20 мг/мл, эффективная доза 0,15 мг/мл, индекс селективности 133.
Приведенные данные подтверждают противовирусную активность заявленного гуминового средства.
Определение противовирусной активности гуминового средства in vivo. В работе были использованы аутбредные мыши ICR массой 14-16 г. В опытах in vivo по изучению противовирусных свойств гуминового средства в отношении вируса гриппа использовали лечебно-профилактическую схему: раствор гуминового средства (содержащего 10 мас. % гуминовых веществ) с концентрацией 1 мг/мл вводили перорально мышам (по 200 мкл/мышь) за час до заражения вирусом гриппа. Мышей инфицировали интраназально под легким эфирным наркозом при введении в обе ноздри суммарно 40 мкл соответствующего разведения штамма вируса гриппа A/California/07/09 (H1N1pdm09) в дозе 25 ЛД50 (50%-х летальных доз), применение которой приводило к гибели 100% животных. Далее раствор гуминового средства вводили 2 раза в сутки в течение 5 суток (включая день заражения животных вирусом). За животными наблюдали в течение 16 суток.
Высчитывали процент выживаемости животных в опыте и контроле, коэффициент защиты (КЗ) и среднюю продолжительность жизни (СПЖ) мышей. При определении СПЖ в каждой экспериментальной группе учитывали число животных, проживших определенное количество дней после заражения до гибели, и число выживших животных. За максимальное значение СПЖ для выживших животных принимали 16 суток, т.е. гарантированное время прекращения гибели инфицированных мышей. КЗ высчитывали по формуле: % гибели мышей в контроле - % гибели мышей в опыте.
В таблице 3 представлены результаты определения противовирусной активности заявленного средства на лабораторных мышах в отношении вируса гриппа A/California/07/09 (H1N1pdm09) в лечебно-профилактической схеме. Как видно из таблицы 3, в опытах in vivo, проведенных по лечебно-профилактической схеме заявленное средство показало достоверный протективный эффект по влиянию на процент выживаемости мышей, инфицированных вирусом гриппа A/California/07/09 (H1N1pdm09).
В инфицированной группе сравнения (введение Занамивира) выжило 70% животных, тогда как в контрольной инфицированной группе (введение дистиллированной воды) погибло 100% животных (табл. 3).
Средняя продолжительность жизни (СПЖ) мышей, получавших заявленный препарат, а также СПЖ мышей, получавших коммерческий противовирусный препарат Занамивир, были достоверно выше, чем в контроле (табл. 3).
Таким образом заявленное гуминовое средство имеет высокую биологическую активность, которая проявляется в том, что он эффективно ингибирует репродукцию вируса гриппа А и В в культуре клеток MDCK и достоверно защищает лабораторных мышей при их инфицировании вирусом гриппа А в дозах, вызывающих 100% летальный эффект. Следовательно, заявленное средство может использоваться в качестве противовирусного препарата для профилактики и лечения гриппа и других вирусных заболеваний, что подтверждает достижение заявленного технического результата.