Офтальмологические композиции, содержащие кооперативные комплексы низко- и высокомолекулярной гиалуроновой кислоты
OPHTHALMIC COMPOSITIONS CONTAINING COOPERATIVE COMPLEXES OF LOW- AND HIGH-MOLECULAR HYALURONIC ACID

Настоящее изобретение относится к офтальмологическим композициям, содержащим кооперативные комплексы низко- и высокомолекулярных гликозаминогликанов.
Уровень техники
Расстройства глазного аппарата непрерывно возрастают в связи с растущим загрязнением окружающей среды, широко распространенным использованием контактных линз, повышенной резистентностью к антибиотикам у инфекционных микроорганизмов и ростом расстройств, таких как диабет, которые вызывают тяжелое поражение глаз.
В связи с этим растет интерес к разработке все более эффективных офтальмологических продуктов, которые лечат расстройство, не вызывая дискомфорт у пациента, особенно когда лекарственное средство должно применяться часто, на постоянной основе.
Глазные капли играют главную роль среди офтальмологических продуктов из-за легкости их применения и их эффективности при некоторых расстройствах, таких как синдром сухого глаза, которые очень ограничивают дееспособность пациента.
Наиболее широко используемые офтальмологические препараты представляют собой глазные капли, которые состоят из стерильной водной или масляной суспензии или раствора, содержащих один или более активных ингредиентов и различных добавок и реологических ингредиентов. Глазные капли вливают в нижний конъюнктивальный мешок, и они представляют собой предпочтительную фармацевтическую форму для лечения глазных расстройств различной этиологии, таких как синдром сухого глаза, воспаление, инфекция, раздражение, глаукома и конъюнктивит, и для применения перед диагностическими процедурами или после хирургических операций.
Глазные капли содержат следующие типы эксципиентов:
1) Регуляторы тоничности. Глазные капли, как правило, должны быть изотоническими со слезной жидкостью. Офтальмологический раствор считается изотоническим, когда его тоничность равна тоничности физиологического раствора (0,9% масс./масс. хлорида натрия). Хлорид натрия является наиболее широко применяемым регулятором тоничности, но глаз также переносит другие соединения, при условии что их тоничность равна тоничности хлорида натрия в концентрации в диапазоне от 0,5% до 1,8% масс./масс.
-1
2) Агенты, контролирующие вязкость. Контроль вязкости в офтальмологической композиции играет стратегически важную роль в эффективности продукта, поскольку препараты с низкой вязкостью снижают биодоступность активных веществ из-за более короткого времени удержания продукта на поверхности глаза, вызванного морганием, во время которого, по имеющимся оценкам, имеет место скорость сдвига 20000 с, и его прохождения через носослезной канал. Полимеры, такие как гиалуроновая кислота, полиакрилаты, хитозан, производные целлюлозы, пектины, альгинат, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон и так далее, обычно используют для контроля вязкости и мукоадгезии. В разработке офтальмологической композиции вязкость не должна превышать 30 мПа⋅с для предупреждения дискомфорта, вызываемого чрезмерным сопротивлением вязкого раствора движению век, и нечеткости зрения. Факторы, такие как гидратация, молекулярная масса, форма и концентрация полимера и присутствие конкретных функциональных групп в цепи, оказывают сильное влияние на мукоадгезию композиции, которая порождается, главным образом, процессом молекулярного переплетения между цепями полимера и макромолекулярным компонентом слизистого слоя, особенно муцином. Минимальная длина полимерной цепи контролирующего вязкость агента должна, вследствие этого, составлять по меньшей мере 100 кДа, и не следует использовать макромолекулярные ингредиенты с прочным поперечным сшиванием, которое препятствуют эффективному переплетению. В общем, чем больше гибкость полимерной цепи контролирующего вязкость агента, тем более значительно его распространение в слизистом слое и переплетение с муцином, причем оба этих фактора комбинируют для получения высокой мукоадгезии, обеспечивая оптимальное время удержания продукта, нанесенного на поверхность глаза.
3) Стабилизаторы рН. Назначение этих эксципиентов заключается в сохранении продукта изогидрическим со слезной жидкостью. Офтальмологические препараты с рН ниже 4 или выше 10 вызывают раздражение и сильное слезоотделение, особенно когда рН является сильнощелочным. При выборе типа буфера для добавления в офтальмологическую композицию следует помнить о стабильности активного ингредиента при физиологических значениях рН, так как лекарственные средства, такие как пилокарпин, применяемые в лечении глаукомы, требуют рН 4-5 для обеспечения достаточной химической стабильности молекулы.
4) Консерванты. Применяются для обеспечения того, что стерильность композиции сохраняется, что является ключевым требованием для офтальмологических препаратов. Этот тип эксципиента используют только в многодозовых композициях, так как после открытия контейнера стерильность по прошествии некоторого времени не гарантируется. Примеры консервантов представляют собой фенилэтиловый спирт, хлоргексидина ацетат, хлоргексидина глюконат, хлорбутанол, бензалкония хлорид, фенилртути нитрат и так далее. Однако так как все такие консерванты обычно обладают неблагоприятным воздействием на поверхность глаза, в настоящее время наблюдается тенденция удалять их из многодозовых систем, в которых используют особые дозирующие системы, оснащенные фильтром, который изолирует офтальмологический раствор от внешней среды при применении продукта.
5) Солюбилизаторы и суспендирующие агенты. Применяются для композиций в суспензии, когда активный ингредиент является плохо растворимым. Примеры таких продуктов представляют собой полисорбаты, лаурилсульфат натрия и сорбитанмоноолеат.
Гиалуроновая кислота и ее соли, известные как гиалуронаны (в совокупности именуемые далее "НА"), широко используются для приготовления офтальмологических продуктов вследствие их контролирующего вязкость, мукоадгезивного и гидратирующего действия.

Псевдопластическое поведение НА является особенно важным, так как оно приводит к высоким значениям вязкости в покое и низким значениям вязкости во время быстрого моргания, идеальной характеристикой для уменьшения сопротивления движению век во время моргания, обеспечивая в то же время то, что продукт остается на поверхности глаза в течение достаточного времени. Многочисленные исследования демонстрируют, что применение НА в офтальмологических композициях увеличивает время удержания в прероговичной области многочисленных активных ингредиентов, таких как пилокарпин, тимолол, ацеклидин (лечение глаукомы), тропикамид (мидриатический агент), ареколин (митотический агент), гентамицин и торбамицин (противомикробные препараты) (Yong-Hong Liao et al., Hyaluronan: Pharmaceutical Characterization and Drags Delivery 2005, Vol. 12, No 6. Pages 327-342). Растворы НА с успехом используют в качестве искусственных слез в случаях синдрома сухого глаза благодаря способности полимера связывать воду и эпителиальные клетки, таким образом значительно повышая стабильность слезной жидкости, особенно в случаях, когда муциновый компонент в дефиците. Примеры офтальмологических продуктов, содержащих НА, разработанных для дополнения секреции слез, которая недостаточна из-за механического, обусловленного влиянием условий среды или визуального стресса, и для восстановления физиологических условий слезной пленки, представляют собой Blugel и Bluyal, два бренда глазных капель, состоящих из НА и N-гидроксиметилглицината, комбинированного с эдетатом натрия в качестве консерванта; Hyalistif и Miens, применяемые для улучшения переносимости контактных линз и в симптоматическом лечении синдрома сухого глаза; Artelac Splash, успокаивающий, увлажняющий, оздоравливающий продукт, применяемый для сухих, уставших, воспаленных, красных глаз; и Nebuvis, смазывающий продукт для уставших, красных глаз, применяемый в случае скудного слезоотделения, длительного применения контактных линз, времени, проводимого в замкнутых, прокуренных или кондиционируемых помещениях, и длительных периодов, проводимых за работой у экрана компьютера.
Несмотря на бесспорные преимущества применения НА для получения офтальмологических композиций, все еще не были решены следующие проблемы:
а) невозможность оптимизирования увлажняющей способности офтальмологической композиции путем использования более высоких концентраций НА, так как предел 0,5% масс./масс. не может быть превышен, для того чтобы не превышать вязкость 30 мПа⋅с, выше которой дискомфорт становится чрезмерным из-за сопротивления вязкого раствора движению век и возникает нечеткость зрения;
б) невозможность обойти этот предел посредством применения низкомолекулярного НА, который является менее вязким, так как уменьшение молекулярной массы имеет тенденцию снижать мукоадгезию композиции вследствие меньшей способности более коротких цепей НА переплетаться с муцином;
в) невозможность полного применения дифференцированных биологических эффектов НА в соответствии с молекулярной массой (Stern R., et al. Eur. J. Cell Biol. 2006; 85 (8 Suppl): 699-715), так как применение высоко- и низкомолекулярных смесей НА приводило к быстрой селективной потере фракции с самой низкой молекулярной массой из-за снижения мукоадгезии в зависимости от длины полисахаридной цепи.
В ЕР 2614090 раскрыты кооперативные комплексы гиалуроновой кислоты с высокой (Н-НА) и низкой (L-HA) молекулярной массой, которые являются полезными для внутрикожных средств биоревитализации кожи, внутрисуставных средств восстановления вязкости синовиальной жидкости, внутрипузырного лечения цистита и средств лечения для воспалительных расстройств влагалища, альвеолярных расстройств и расстройств полости рта.
6
3
5
Молекулы НА в растворе характеризуются явлениями кооперативного взаимодействия, основанного на образовании гидрофобных связей и межцепочечных водородных связей. Кооперативный эффект указанных взаимодействий зависит от длины и, следовательно, от молекулярной массы цепей. Длинные цепи Н-НА дают устойчивые взаимодействия друг с другом, которые влияют на все молекулы, присутствующие в растворе, вызывая образование трехмерной сетки, в то время как молекулы L-HA дают менее устойчивые взаимодействия, которые приводят к агрегированным системам, которые одновременно не вовлекают все присутствующие молекулы, которые взаимодействуют друг с другом в кластерах. Этот особый тип агрегации Н-НА и L-HA в растворе отвечает за очень разные реологические характеристики, такие как вязкость, очень важное свойство для многочисленных применений, особенно в медицинской области. Быстрое снижение вязкости растворов НА в зависимости от молекулярной массы зависит от способности к этому особому межмолекулярному взаимодействию, благодаря чему, при равных концентрациях, вязкость растворов Н-НА с молекулярной массой более 1⋅10 Да на порядок выше вязкости растворов L-HA с молекулярной массой в диапазоне от 5⋅10 до 5⋅10 Да.
Указанные кооперативные комплексы L/H-HA образуются посредством подвергания водных растворов, содержащих и Н-НА, и L-HA, соответствующим образом скомпонованному тепловому циклу. Растворы кооперативных гибридов L/H-HA характеризуются вязкостями, которые не изменяются со временем и являются значительно более низкими, чем вязкости до теплового цикла, где создаются энергетические условия, которые способны одновременно разрывать все взаимодействия между цепями Н-НА и взаимодействия между цепями L-HA. В указанных условиях уже не существуют необходимые условия для слабых взаимодействий, которые развиваются между молекулами в растворе, подлежащем кооперации, и полимерные цепи действуют как независимые объекты. Позже, когда раствор охлаждают во время цикла тепловой обработки, межцепочечные взаимодействия начинают все больше и больше формироваться заново и в этом случае развиваются, по статистике, между всеми молекулами НА, присутствующими в растворе, как с высокой, так и с низкой молекулярной массой, вызывая образование гибридных систем, которые стабилизируются, когда в результате увеличения числа слабых межмолекулярных связей и их кооперативного эффекта система взаимодействия, установившаяся между полимерными цепями с разными молекулярными массами, уже не поддается изменению с течением времени. Правильность этого механизма подтверждается тем фактом, что, когда два раствора, один L-HA и другой Н-НА, раздельно подвергают тепловому циклу и затем смешивают вместе после охлаждения, концентрация соединений в растворе является одинаковой, резкое немедленное снижение вязкости, объясняемое образованием гибридной системы, не наблюдается, так как оно может появляться, если только два молекулярных соединения одновременно присутствуют во время теплового цикла. Молекулярная масса используемых НА и относительное соотношение между L-HA и Н-НА критически влияют на реологические характеристики комплекса L/H-HA, который образуется; чем больше различие молекулярных масс между используемыми L-HA и Н-НА и чем выше соотношение между L-HA и Н-НА, тем больше снижение вязкости гибридной системы.
Комплексы одного и того же типа L/H-HA могут быть получены путем замены L-НА другими низкомолекулярными гликозаминогликанами (15-150 кДа), такими как хондроитинсульфат (CS), кератансульфат (KS) и хондроитин (С).
Описание изобретения
В настоящее время было обнаружено, что указанные гибридные кооперативные комплексы высоко- и низкомолекулярных гликозаминогликанов, известных из ЕР 2614090, делают возможным получение офтальмологических композиций, обладающих особыми преимуществами.
4
5
4
6
Следовательно, изобретение относится к офтальмологическим композициям, содержащим в качестве активных ингредиентов гибридные кооперативные комплексы (L/H-HA), получаемые нагреванием при 100-130°С в течение 10-30 мин смеси водных растворов по меньшей мере одной фракции (L-HA) гиалуроновой кислоты или хондроитинсульфата, кератансульфата или хондроитина (CS, KS, С), где указанная фракция имеет среднюю молекулярную массу в диапазоне от 1⋅10 до 5⋅10 Да, и водного раствора по меньшей мере одной фракции (Н-НА) гиалуроновой кислоты, имеющей среднюю молекулярную массу по меньшей мере в 5 раз выше, чем молекулярная масса L-НА, и в любом случае в диапазоне от 5⋅10 Да до 5⋅10 Да, причем соотношение масс между L-HA и Н-НА в комплексе L/H-HA находится в диапазоне от 0,5 до 2.
5
6
4
5
Средняя молекулярная масса фракции Н-НА предпочтительно находится в диапазоне от 5⋅10 Да до 3⋅10 Да, в те время как средняя молекулярная масса фракции L-НА предпочтительно находится в диапазоне от 3⋅10 Да до 1⋅10 Да.
4
5
Если низкомолекулярная фракция состоит не из гиалуроновой кислоты, а из других гликозаминогликанов, ее средняя молекулярная масса предпочтительно находится в диапазоне от 1⋅10 до 1⋅10 Да.
Композиции по изобретению, обычно в форме глазных капель, мазей или спреев, предпочтительно содержат воду в качестве растворителя и характеризуются вязкостью, не превышающей 100 мПа⋅с, предпочтительно не превышающей 30 мПа⋅с.
Концентрация комплексов, как определено выше, в композициях по изобретению может находиться в диапазоне от 0,1 до 1% масс.
Композиции по изобретению могут включать в офтальмологическое применение другие активные ингредиенты (нестероидные противовоспалительные лекарственные средства, антибиотики, бета-блокаторы, антигистаминные средства и так далее), буферные системы, соли, осморегуляторы, консерванты, успокаивающие агенты и реологические реагенты.
Композиции по изобретению являются особенно полезными в качестве заменителей слезы для лечения синдрома сухого глаза.
Применение кооперативных комплексов L/H-HA и их структурных аналогов, где L-НА заменен другими низкомолекулярными гликозаминогликанами, такими как CS, KS и С, обеспечивает следующие преимущества по сравнению с обычными композициями на основе Н-НА:
а) вязкость композиции можно менять постоянно путем модулирования молекулярной массы и относительного соотношения соединений НА, используемых для образования комплекса L/H-HA;
б) на практике это делает концентрацию НА не зависящей от вязкости раствора и улучшает увлажняющее и смазывающее действие офтальмологической композиции, увеличивая количество НА, используемой в виде комплекса L/H-HA, без превышения предела 30 мПа⋅с, выше которого, при наличии высокой вязкости, вызывается чрезмерный дискомфорт сопротивлением раствора движению век и возникает нечеткость зрения;
в) биологические эффекты, ассоциированные с одновременным применением НА с разными молекулярными массами, можно оптимизировать, так как при контакте с поверхностью глаза комплексы L/H-HA действуют как системы L-HA и Н-НА с медленным высвобождением; гарантируется высокая мукоадгезия, хотя присутствует фракция L-HA, которая, взятая отдельно, является менее мукоадгезивной из-за ее низкой молекулярной массы;
г) неожиданно, испытания на клеточных моделях дегидратационного стресса демонстрируют, что комплексы L/H-HA гораздо лучше одной Н-НА в функциональном отношении.
д) испытания на добровольцах демонстрируют превосходство композиции по изобретению по сравнению с обычными офтальмологическими композициями на основе Н-НА.
Изобретение подробно иллюстрируется в примерах, представленных ниже.
ПРИМЕР 1 - Получение офтальмологических композиций на основе комплексов L/H-HA с изменяющейся стехиометрией и предварительно установленной вязкостью
6
4
Получают 4 офтальмологические композиции с водной основой, которые содержат комплексы L/H-HA разных составов в качестве активного ингредиента и реологического компонента. Н-НА (ММ (молекулярная масса) 1,36⋅10 Да; ММ/млн 1,43) и L-HA (ММ 8,41⋅10 Да; ММ/млн 1,75) растворяют в 100 мл воды в количествах, описанных в Таблице 1. Полученные растворы, все из которых содержат одно и то же количество Н-НА и увеличивающиеся количества L-HA, подвергают следующему тепловому циклу в системе под давлением: от 20°С до 120°С в течение 12 мин, в течение 1 мин при 120°С, от 120°С до 20°С в течение 15 мин. Динамическая вязкость образцов, ММ и показатель полидисперсности ММ/млн L-HA, Н-НА и L/H-HA определяют с помощью системы Viscotek, подробно описанной ниже. Данные в Таблице 1 демонстрируют, что вязкость кооперативных комплексов L/H-HA зависит от соотношения L-HA/H-HA; чем выше соотношение, тем ниже вязкость. В любом случае наиболее важное изменение η имеет место при образовании комплекса L/H-HA, которое уже является значительным, начиная с самого низкого значения соотношения (L-HA/H-HA масс./масс.). Офтальмологические композиции, содержащие описанные комплексы L/H-HA, можно использовать для изготовления новых глазных капель, где суммарное количество НА можно изменять свободно, не вызывая дискомфорт у пациента.
* Измерения η проводят сразу после перемешивания
Таблица 1 - Измерение динамической вязкости η гибридных кооперативных комплексов L/H-HA с разным соотношением L-HA/H-HA. Измерения η проводят сразу после тепловой обработки
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
2
Измерения посредством Viscotek. ММ и показатель полидисперсности ММ/млн определяют с помощью системы гель-хроматографии, оснащенной мультидетектором, состоящим из четырехмостового вискозиметра, рефрактометра, детектора прямоугольного рассеяния света (RALS) и детектора рассеяния света под малым углом (LALS), изготовленным Viscotek (www.viscotek.com). Сигнал, измеренный с помощью LALS, пропорционален молекулярной массе и концентрации, и сигнал, измеренный с помощью вискозиметрического детектора, пропорционален концентрации образца и внутренней вязкости, хотя рефрактометр измеряет концентрацию. Прибор Viscotek не только определяет молекулярную массу НА, но также позволяет оценивать степень гетерогенности молекулярной массы в популяции присутствующих молекул, описываемую показателем полидисперсности ММ/млн, автоматически вычисляемым прибором Viscotek, и определяемым в виде соотношения между средней молекулярной массой (ММ=ΣmM/Σm, где m представляет собой массу полимера с молекулярной массой M, и Σm представляет собой суммарную массу полимера, выражение, которое, принимая m=nM, также можно представить в виде ММ=ΣnM/ΣnM) и среднемассовой молекулярной массой (млн=ΣnM/Σn, где nM представляет собой массу полимера с молекулярной массой M и Σn представляет собой суммарное число молей присутствующего полимера).
-1
-1
-1
Измерения динамической вязкости η проводят с помощью реометра Anton Paar Physica MCR 301, используя коаксиальную геометрию. Определяют η при 25°С с постоянной скоростью сдвига (γ'=2 с), которая входит в диапазон ньютоновской вязкости раствора полимера (η является постоянной относительно γ' и зависит только от конформации полимера в растворе). Измерения динамической вязкости в качестве функции скорости сдвига измеряют в диапазоне от 0,1 с до 1000 с, получая 50 точек в режиме "отсутствия установки времени" для каждого измерения.
ПРИМЕР 2 - Получение офтальмологических композиций, содержащих комплексы L/H-HA с разными значениями молекулярных масс L-HA и Н-НА и предварительно установленной вязкостью
6
4
5
Получают 4 офтальмологические композиции с водной основой, которые содержат в качестве активного ингредиента и реологического компонента, комплексы L/H-HA с таким же соотношением 1:1 масс./масс. между Н-НА и L-HA, но используют L/HA с другой молекулярной массой. Водные растворы Н-НА (ММ 1,36⋅10 Да; ММ/млн 1,43) и L-HA (ММ 8,41⋅10 Да; ММ/млн 1,75); L-HA (ММ 2,12⋅10 Да; ММ/млн 1,61) получают в концентрации 2% масс./об. в дистиллированной воде и используют для получения различных растворов, описанных в Таблице 2. Полученные растворы подвергаются следующему тепловому циклу в системе под давлением: от 20°С до 120°С в течение 12 мин, в течение 1 мин при 120°С, от 120°С до 20°С в 15 мин. Динамическую вязкость η образцов, ММ и показатель полидисперсности ММ/млн L-HA, Н-НА и L/H-HA определяют, как описано в Примере 1.
4
5
H-HA
L/H-HA
Данные в Таблице 2 демонстрируют, что, при равенстве всех других параметров, чем ниже MM L-HA, используемой для образования комплекса L/H-HA, тем больше снижение η. По сравнению со значениями η гибридных комплексов L/H-HA с использованием L-HA с ММ 8,41⋅10 Да или 2,20⋅10 Да, значение соотношения η/η увеличивается примерно в 50 раз.
H-HA
L/H-HA
Данные в Таблице 2 демонстрируют, что вязкость кооперативных комплексов L/H-НА зависит от молекулярной массы L-HA, используемой для образования комплекса; чем ниже MM L-HA, тем ниже вязкость комплекса. Если обобщить такой подход, чем больше разница ММ между Н-НА и L-HA, тем больше будет значение η/ηОфтальмологические композиции, содержащие комплекс L/H-HA, описанный в этом примере, можно использовать для приготовления новых глазных капель, где количество НА можно увеличивать без достижения значений η, которые вызывают дискомфорт у пациента, путем использования пар Н-НА и L-HA с большим отличием ММ.
ПРИМЕР 3 - Получение офтальмологических композиций, содержащих кооперативные комплексы между Н-НА и гликозаминогликанами с низкой молекулярной массой
6
4
4
4
4
Получают 4 офтальмологические композиции с водной основой, которые содержат комплексы между Н-НА и гликозаминогликанами с низкой молекулярной массой в качестве активного ингредиента и реологического компонента. Н-НА (ММ 1,36⋅10 Да; ММ/млн 1,43), L-HA (MW 8,41⋅10 Да; ММ/млн 1,75), CS (ММ 3,8⋅10 Да; ММ/млн 1,65), KS (ММ 3,45⋅10 Да, ММ/млн 1,52), С (ММ 2,9⋅10 Да ММ/млн 1,66) растворяют в 100 мл воды в количествах, описанных в Таблице 3. Полученные растворы, все из которых содержат одно и то же количество Н-НА и содержат низкомолекулярную L-HA, CS, KS или С в качестве компонента, подвергаются следующему тепловому циклу в системе под давлением: от 20°С до 120°С в течение 12 мин, в течение 1 мин при 120°С, от 120°С до 20°С в течение 15 мин. Динамическую вязкость образцов, ММ и показатель полидисперсности определяют с помощью системы Viscotek, как подробно описано в Примере 1. Данные в Таблице 3 демонстрируют, что гликозаминогликаны, отличные от L-НА, такие как CS, KS и С, образуют кооперативные комплексы с Н-НА, хотя и с феноменологией, вовлекая снижение вязкости после образования комплекса, которое менее заметно, чем когда низкомолекулярный компонент представляет собой L-HA. Офтальмологические композиции, содержащие комплексы между Н-НА и CS, или KS, или С, можно использовать для приготовления глазных капель, где суммарное количество НА можно свободно изменять, не вызывая дискомфорт у пациента.
* Измерения η проводят сразу после перемешивания.
** X=CS, или KS, или C.
Таблица 3 - Измерение динамической вязкости η гибридных кооперативных комплексов L/H-HA, CS/H-HA, KS/H-HA и С/Н-НА, характеризующихся стехиометрией 1:1 масс/масс, между низкомолекулярным гликозаминогликаном и Н-НА. Измерения η проводят сразу после тепловой обработки
ПРИМЕР 4 - Мукоадгезия комплексов L/H-HA, указанных в примерах 1 и 2
Мукоадгезию определяют, как описано у Hassan et al. (1990, Pharm Res. May; 7(5):491-5) и Oechsner et al. (1999, Eur J Pharm Biopharm. Mar; 47 (2): 113-8).
Используют муцин Sigma M2378 PCode 1001622405.
Получают следующие растворы и измеряют их вязкость:
3
4
1) первый, суспензию 15% (масс./масс.) муцина в стерильной воде, которая имеет рН примерно 3,8-4,0, корректируемый до 7,4 путем добавления 0,35 М NaPO. Нейтральный раствор затем разбавляют водой до 10% масс./масс.;
2) раствор полимера, мукоадгезия которого подлежит оцениванию в фосфатном буфере при рН 7,4;
3) смесь, содержащая 10% масс./масс. муцина и полимер таким образом, что полимер имеет конечную концентрацию, равную его концентрации в растворе 2.
Полимер может быть описан как мукоадгезивный, если значение вязкости раствора, содержащего полимер и муцин (раствор 3), больше суммы вязкостей раствора полимера (раствора 2) и раствора муцина (раствора 1). Это увеличение вязкости объясняется взаимодействием полимер-муцин; степень этого увеличения показывает мукоадгезивную прочность полимера (2015, Biomacromolecules. Mar 9; 16(3):924-35. doi: 0.1021/bm501832y. Epub 2015 Feb 18).
Когда получают три раствора, важно сохранять рН в диапазоне 7,0-7,6 и проводимость в диапазоне 12,0-14,0 мСм/см для обеспечения того, чтобы изменения в диапазонах их рН и проводимости не влияли значительно на вязкость анализируемых растворов.
Мукоадгезию вычисляют в показателях Δ%, используя следующую формулу:
где:
муц+HAS
η представляет собой вязкость раствора, содержащего и муцин, и НА (раствор 3);
муц
η представляет собой вязкость раствора только муцина (раствор 1);
HA
η представляет собой вязкость раствора только НА (раствор 2).
Измерения вязкости проводят в 8 растворах муцина, полученных независимо друг от друга.
6
4
3
4
Растворы Н-НА (ММ 1,36⋅10 Да; ММ/млн 1,43), L-HA (ММ 8,41⋅10 Да; ММ/млн 1,75) и L/H-HA 1:1 масс./масс., полученные посредством использования упомянутых выше Н-НА и L-HA, получают растворением образца в фосфатном буфере при рН 7,4. Используемый фосфатный буфер получают путем добавления 0,5 М HCl к 0,35 М раствору NaPO до достижения рН 7,4 для получения концентрации соли, аналогичной концентрации в растворе муцина (раствор 1).
Растворы Н-НА получают в концентрации 0,15, 0,23, 0,28 и 0,30% масс./масс., и растворы L-HA и L/H-HA получают в концентрации 0,15, 0,30, 0,45, 0,80 и 1,03% масс./масс.; каждый раствор получают в двух повторностях.
Концентрированный раствор образца НА в воде добавляют к забуференному раствору муцина с получением, после перемешивания, НА в концентрации раствора 2. Раствор доводят до риски водой. Каждый раствор получают в двух повторностях.
-1
В Таблице 4 показаны значения "9% для растворов Н-НА, L-HA и комплекса L/H-НА при одном и том же значении концентрации (0,30%) и при двух разных значениях скорости сдвига (33,9 и 222,2 с).
В Таблице 5 показаны значения Δ% для растворов Н-НА, L-HA и комплекса L/H-НА в концентрациях с одним и тем же значением динамической вязкости (η).
-1
Данные в таблицах 4 и 5, рассматриваемые в целом, демонстрируют, что: а) когда концентрации являются равными, Н-НА представляет собой наиболее мукоадгезивную форму биополимера в широком диапазоне скорости сдвига (3-200 с), в то время как при более высоких значениях значения мукоадгезии разных форм становятся сопоставимыми; б) где динамические вязкости являются равными, L/H-HA и L-HA являются более мукоадгезивными, чем Н-НА, во всем диапазоне скорости сдвига.
ПРИМЕР 5 - Оценка биологической реакции на свиные первичные роговичные клетки: анализ заживления ран
Получение культур первичных роговичных эпителиальных клеток из свиного глаза. Глаза карликовых свиней, используемых для хирургического обучения, удаляют в момент эвтаназии и извлекают роговицы. Затем роговицы подвергают ферментативному расщеплению с помощью раствора 3 мг/мл коллагеназы и 4 мг/мл диспазы, разбавленного 1:5 в культуральной среде DMEM/F12 (среда Игла, модифицированная по способу Дульбекко /питательная смесь F-12, GIBCO Invitrogen USA) 15% FBS (GIBCO Invitrogen, USA) при перемешивании (600 об/мин) при 37°С. Среда, используемая для выращивания свиных роговичных эпителиальных клеток, представляет собой DMEM/F12 с добавлением 15% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 10 нг/мл EGF (эпидермального фактора роста, GIBCO Invitrogen, USA) и 40 мкг (г/мл гентамицина сульфата (Fisiopharma, Italy). Через 20 часов клетки фильтруют через фильтры 0,70 мкм и центрифугируют при 1500 об/мин в течение 10 мин. Осадок ресуспендируют в культуральной среде и засевают клетки для увеличения культуры, которая через 4 суток после посева состоит, главным образом, из эндотелиальных клеток с незначительным загрязнением фибробластами.
2
5
Тест заживления ран. Биологическую активность и эффект комплекса L/H-HA, полученного, как описано в Примере 1, в сравнении с одной Н-НА оценивают с помощью теста заживления ран, наблюдая за процессом заживления ран с помощью замедленной видеомикроскопии (TLVM), где столик инкубатора поддерживают при 37°С в атмосфере 5% СО. Тест заживления ран включает посев примерно 1×10 свиных роговичных эндотелиальных клеток в каждую лунку 12-луночного планшета. Клетки достигают 100% конфлюэнтности через двое суток. Рану наносят механическим путем на монослое клеток, используя стерильный наконечник (∅=0,1 мм). Поврежденные клетки обрабатывают: а) 0,3% масс./об. Н-НА (1300-1400 кДа); б) 0,3% комплексом L/H-HA, стехиометрия 1:1 масс./масс. H-HA/L-HA; в) 0,6% комплексом L/H-HA, стехиометрия 1:1 масс./масс. Н-HA/L-HA) в среде для выращивания DMEM 1,5% FBS; одну культуральную среду, следовательно, используют в качестве контроля (CTR).
Сравнение (а) и (б) дает измерения при равном содержании НА независимо от их ММ, тогда как сравнение (а) и (в) анализирует две композиции, которые содержат одно и то же количество одной Н-НА. Растворы стерилизуют путем фильтрации, используя фильтры 0,22 мкм. Полученный таким образом планшет помещают на столик инкубатора устройства TLVM и выбирают 5 полей обзора для каждой лунки, устанавливают время задержки 60 мин. Каждый тест проводят в трех повторностях и устанавливают общую продолжительность эксперимента 24 ч, заметив, что полное заживление раны происходит примерно через 12 ч для всех обработок.
Количественный анализ, проведенный на записанных изображениях, полученных с помощью программы OKO-Vision2009 (OKOLAB Italy), показывает, что обработка комплексом 0,6% H-HA/L-HA приводит к 95% заживлению раны всего лишь через 6 часов, тогда как за то же самое время обработка комплексом H-HA/L-HA с более низкими, чем 0,3%, концентрациями и одной 0,3% Н-НА дает заживление раны 70% и 62%, соответственно. У клеток, не обработанных НА (CTR), присутствует всего лишь 50% заживление через 6 ч.
ПРИМЕР 6 - Тесты на клеточной модели корнеоцитов из эксплантатов из свиного глаза: in vitro модель синдрома сухого глаза
4
2
Суспензию, содержащую 5×10 роговичных клеток из эксплантатов карликовых свиней, полученную, как описано в Примере 4, засевают в каждую лунку 24-луночного планшета и клетки, растущие в среде DMEM 15% FBS, достигают 70% конфлюэнтности через одни сутки при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО. Клетки обрабатывают в течение 2 часов 0,3% масс./масс. Н-НА и комплексом 0,6% масс./масс. H-HA/L-HA, используемых в соотношении 1:1 масс./масс. Н-НА к L-HA, как показано в Таблице 1. В этом тесте растворы используют «как есть» и разбавляют 1:3, 1:10 и 1:30. Все растворы получают в среде для выращивания роговицы. После обработки клетки подвергают дегидратационному стрессу, будучи инкубированными сухими и без крышки при 37°С в течение 20 мин. Положительный контроль (CTR) представлен клетками, не подвергнутыми дегидратации, в то время как клетки отрицательного контроля (NC) подвергаются дегидратации, но не защищены предварительной обработкой Н-НА или L/H-HA.
В конце испытания определяют жизнеспособность клеток с помощью анализа жизнеспособности с Presto Blue (Invitrogen, GIBCO), проводимого путем добавления 1 мл раствора Presto Blue, разбавленного 1:10, в среду для выращивания в каждую лунку. Присутствие метаболически активных клеток демонстрируют посредством превращения реагента Presto Blue (синий резазурин) в соединение с окраской цветов фуксии (резоруфин). Спектрофотометрические показания при 570 нм (максимальный пик поглощения для резазурина) и 600 нм (максимальный пик поглощения для резоруфина) делают возможной количественную оценку жизнеспособности клеток на основе количества клеток, способных активизировать реакцию. Все образцы в разных концентрациях анализировали в трех повторностях. Результаты, выраженные в виде процента жизнеспособности клеток в сравнении с положительным контролем, демонстрируют, что предварительная обработка комплексом L/H-HA гарантирует лучшую защиту слоя роговичных клеток, чем предварительная обработка Н-НА, и это различие усугубляется, когда активный ингредиент разбавляют: NC (48%), 0,3% Н-НА (94%) и 0,6% L/H-HA (98%); NC (56%), 0,1% Н-НА (80%) и 0,2% L/H-HA (100%); NC (40%), 0,03% Н-НА (52%) и 0,06% L/H-HA (98%); NC (45%), 0,001% Н-НА (48%) и 0,002% L/H-HA (62%).
ПРИМЕР 7 - Офтальмологические композиции, содержащие комплексы L/H-HA
Глазные капли 1. 0,6% масс./масс. комплекса L/H-HA (стехиометрия L-HA/H-HA 1,5:1 масс./масс.), полученного, как описано в Примере 1, в водном растворе, рН 7,2 для фосфатного буфера, конечная осмолярность 300 мосмоль/л, корректируемая NaCl или другим биосовместимым осмолитом, содержащим 0,05% масс./масс. натриевой соли PUFA (полиненасыщенной жирной кислоты).
Глазные капли 2. 0,6% масс./масс. комплекса L/H-HA (стехиометрия L-HA/H-HA 1:1 масс./масс.), полученного, как описано в Примере 1, в водном растворе, рН 7,2 для фосфатного буфера, конечная осмолярность 300 мосмоль/л, корректируемая NaCl или другим биосовместимым осмолитом, содержащим подходящую концентрацию активного ингредиента с антимикробной активностью, обычно используемого в офтальмологической области.
Глазные капли 3. 0,6% масс./масс. комплекса L/H-HA (стехиометрия L-HA/H-HA 0,5:1 масс./масс.), полученного, как описано в Примере 1, в водном растворе, рН 7,2 для фосфатного буфера, конечная осмолярность 300 мосмоль/л, корректируемая NaCl или другим биосовместимым осмолитом, содержащим подходящую концентрацию активного ингредиента с противовоспалительной активностью, обычно используемого в офтальмологической области.
Глазные капли 4. 0,4% масс./масс. комплекса С/Н-НА (стехиометрия С/Н-НА 1:1 масс/масс), полученного, как описано в Примере 3, в водном растворе, рН 7,2 для фосфатного буфера, конечная осмолярность 300 мосмоль/л, корректируемая NaCl или другим биосовместимым осмолитом, содержащим 0,1% масс./масс. кортизона.
Глазные капли 5. 0,3% масс./масс. комплекса KS/H-HA (стехиометрия KS/H-HA 1:1 масс/масс), полученного, как описано в Примере 3, в водном растворе, рН 7,2 для фосфатного буфера, конечная осмолярность 300 мосмоль/л, корректируемая NaCl или другим биосовместимым осмолитом, содержащим дексаметазон 0,1% масс./масс.
Глазные капли 6. 0,3% масс./масс. комплекса CS/H-HA (стехиометрия CS/H-HA 0,5:1 масс./масс.), полученного, как описано в Примере 3, в водном растворе, рН 7,2 для фосфатного буфера, конечная осмолярность 300 мосмоль/л, корректируемая NaCl или другим биосовместимым осмолитом, содержащим 0,1% масс./масс. тетразолина гидрохлорида.
ПРИМЕР 8 - Другие офтальмологические композиции
а) Офтальмологическая мазь с жировой матрицей, содержащая в диспергированной форме 300 мосмоль водного раствора, рН 7, 1,0% масс./масс. комплекса L/H-HA (стехиометрия L-HA/H-HA 0,5:1 масс./масс.), полученного, как описано в Примере 1, содержащего один или более активных ингредиентов, представляющих интерес в офтальмологической области.
б) Спрей для глаз, состоящий из 300 мосмоль водного раствора, рН 7, 0,5% масс./масс. комплекса L/H-HA (стехиометрия L-HA/H-HA 1,5:1 масс./масс.), полученного, как описано в Примере 1, содержащего один или более активных ингредиентов, представляющих интерес в офтальмологической области.