ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus amyloliquefaciens, ОБЛАДАЮЩИЙ НЕМАТИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПРОТИВ ГАЛЛОВЫХ НЕМАТОД
STRAIN OF BACTERIA BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS, POSSESSING NONMATICIDAL ACTIVITY AGAINST GALLOVA NEMATODES

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и сельскому хозяйству и может быть использовано для получения бактериального препарата против фитопатогенных нематод рода Meloidogyne сельскохозяйственных культур открытого и закрытого грунта.
Известны штаммы В. amyloliquefaciens, предназначенные для защиты растений от грибных и бактериальных патогенов, а также являющиеся средством повышения продуктивности растений. Например: штамм бактерий В. amyloliquefaciens subsp. plantarum S89 в качестве средства повышения продуктивности растений и их защиты от болезней (Патент РФ №2599416, опубл. 10.10.2016 г.), В. amyloliquefaciens Аб8б (ВКПМ В-12792), обладающий антибактериальной и фунгистатической активностью, и микробиологический препарат на его основе против болезни растения, вызываемой фитопатогенным микроорганизмом (Патент РФ №2673155, опубл. 22.11.2018 г.), В. amyloliquefaciens OPS-32 для получения биопрепарата комплексного действия для защиты сельскохозяйственных растений от фитопатогенных грибов, стимуляции их роста и повышения урожайности (Патент РФ №2625977, опубл. 20.07.2017 г.), В. amyloliquefaciens ВКПМ В-11475, обладающий фунгицидным и бактерицидным действием, и биологический препарат на его основе для защиты зерновых культур от заболеваний, вызываемых фитопатогенными грибами (Патент РФ №2528058, опубл. 10.09.2014 г.), штамм спорообразующих бактерий В. amyloliquefaciens ВКПМ В-11443, обладающий фунгицидным действием против фитопатогенных грибов, вызывающих заболевания овощных культур, биологический препарат на его основе (Патент РФ №2701500, опубл. 26.09.2019 г.).
Однако нет данных о нематицидной активности указанных штаммов в отношении таких экономически значимых вредителей как галловые нематоды.
Известен штамм гриба Duddingtonia flagrans Т-89, проявляющий свойства против галловых нематод растений, паразитических нематод животных, стимулирующий рост и развитие растений (Патент РФ №2253671, опубл. 10.06.2005 г.). Одним из его основных конкурентных преимуществ является проявление нематицидного эффекта против галловых нематод растений и паразитических нематод животных. К недостаткам данного штамма можно отнести относительно низкий нематицидный эффект в отношении галловых нематод - 48,5% в сравнении с контролем.
Известен штамм Agrobacterium, содержащий вектор трансформации растения, имеющий рекомбинантную ДНК, который используется в способе генной модификации организмов, обеспечивающий растения рекомбинантной ДНК в результате экспрессии. Такие растения обладают низкой восприимчивостью к фитопатогенным нематодам. В соответствии с предпочтительным вариантом указанная рекомбинантная ДНК вызывает разрушение питательной структуры для нематод, в отсутствии питательной базы нематоды погибают (Заявка на изобретение РФ №94033345, опубл. 10.05.1996 г. ). Основным недостатком данной заявки является необходимость внедрения данной ДНК в каждый сорт или гибрид, что занимает большой промежуток времени и экономически затратно.
Также известна пестицидная композиция, включающая изолированный штамм Burkholderia sp. NRRL № В-50319, не обладающая известной патогенностью в отношении позвоночных животных, таких как млекопитающие, рыбы и птицы, но обладающая пестицидной активностью против сорных растений, насекомых, грибов и нематод (Патент РФ №2577970, опубл. 20.03.2016 г.). Данная композиция имеет ряд преимуществ, так как обладает гербицидной, инсектицидной, фунгицидной и нематицидной активностью. К недостаткам относится низкая биологическая эффективность против галловых нематод - 25,2% по отношению к контролю.
Задачей изобретения является выявление штамма, обладающего нематицидной активностью против галловых нематод, позволяющего в перспективе расширить ассортимент биологических средств защиты растений от экономически значимых вредных организмов.
Поставленная задача решается тем, что выделен штамм Bacillus amyloliquefaciens, обладающий нематицидной активностью, перспективный для разработки на его основе биопрепаратов против галловых нематод.
Новый штамм выделен из ризопланы растения озимого рапса на опытных участках Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт биологической защиты растений» (ФГБНУ ВНИИБЗР) г. Краснодар Краснодарского края (тип почвы чернозем выщелоченный, слабогумусный), введен в БРК ФГБНУ ВНИИБЗР «Государственная коллекция энтомоакарифагов и микроорганизмов» и депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ФГБНУ ВНИИСХМ (г.Санкт-Петербург),под номером RCAM05296. Основными критериями отбора служили активность против галловых нематод, стимуляция роста растений и отсутствие фитотоксичности. Идентифицирование штамма проводилось с использованием молекулярно-генетических методов по последовательности нуклеотидов в 16SрРНК.
Штамм характеризуется следующими морфолого-культуральными и физиолого-биохимическими признаками.
Клетки палочковидные с закругленными концами, одиночные или соединены попарно, клетки подвижны, размеры 1,3-1,8 X 4,5-5,4 мкм. Имеются споры. Окраска по Граму положительная.
Культуральные признаки.
На мясо-пептонном агаре форма колоний круглая с фестончатым краем. Колонии матовые, бесцветные. Профиль колоний плоский, структура - мелкозернистая, консистенция мягкая, слизистая, колонии прилипают к петле. Диаметр колоний 0,5-2 мм.
На картофельно-глюкозном агаре формируются колонии ризоидной формы с гладким краем. Колонии матовые, кремового или желто-коричневого цвета. Профиль колоний выгнутый, структура - струйчатая, консистенция мягкая, слизистая, колонии прилипают к петле. Диаметр колоний 1-3 мм.
Температурный оптимум для роста штамма: +29,0 - +35,0°С. Оптимум рН для выращивания: 6,5-8,0. Продуцирует липазные и казеинолитические ферменты. В качестве источника углерода активно использует мелассу, средне усваивает глюкозу, сахарозу, глицерин. Использует пептон, дрожжевой и кукурузный экстракты в качестве источника азота.
Чистая культура штамма В. amyloliquefaciens BZR 277 хранится в пробирках на скошенной агаризированной питательной среде (картофельно-глюкозный агар или сухой питательный агар для культивирования микроорганизмов). Температура хранения +4 - +8°С. Срок хранения 12 месяцев. Питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой (г, мл/л): панкреатический гидролизат кильки - 17,9; агар микробиологический - 11,2; NaCl - 7,7. Картофельный агар (г, мл/л): глюкоза - 20,0; агар микробиологический - 20,0; картофельный отвар (из расчета 500 г очищенного и измельченного картофеля на 1000 мл водопроводной воды) - 1000. Инкубация при температуре +28 - +30°С, продолжительность выращивания - 2-3 суток.
Определение фитотоксичности штамма проводили методом замачивания семян озимой пшеницы в бактериальной суспензии. Для этого культуру активного штамма выращивали на твердой питательной среде. Затем готовили бактериальную суспензию методом смыва стерильной водой. Семена озимой пшеницы замачивали в суспензии на два часа и ставили на проращивание в рулоны из фильтровальной бумаги. Контроль - семена, замоченные в стерильной воде. По количеству проросших семян в контроле и в вариантах судили о фитотоксичности выделенных бактерий.
С целью установления влияния штамма В. amyloliquefaciens BZR 277 на растения в химические стаканы с бактериальной суспензией помещали проростки озимой пшеницы с подрезанной корневой системой. Контроль - проростки озимой пшеницы, помещенные в стерильную воду. Продолжительность теста 10 дней. По количеству увядших растений в контроле и вариантах судили о фитотоксичности штамма. Повторность во всех опытах трехкратная. Из таблицы 1 видно, что заявленный штамм В. amyloliquefaciens BZR 277 не оказывает негативного влияния на энергию прорастания и всхожесть семян, а также не вызывает увядания проростков.
Синтез нематицидных веществ (антибиотиков, гидролитических ферментов, токсинов) - один из наиболее распространенных эффектов микробного антагонизма. Определение ферментативной активности штамма В. amyloliquefaciens BZR 277 осуществляли с использованием стандартных тестов на липазу, хитиназу и протеазу.
Синтез хитинолитических ферментов у штамма В. amyloliquefaciens BZR 277 не обнаружен, но при этом выявлен активный синтез ферментов группы протеаз и липаз. Таким образом, установлено, что ингибирующее действие на галловых нематод может быть обусловлено, в том числе действием гидролитических ферментов (таблица 2).
2
4
2
4
4
4
8
Для анализа нематицидной активности В. amyloliquefaciens BZR 277 получали жидкую культуру микроорганизма. Бактерии выращивали на жидкой среде следующего состава, г/л: KHPO - 3 г, NaHPO - 1 г, NHCl - 1 г, MgSO - 0,3 г, сахароза - 10 г, пептон - 2 г, вода - 1 л. Культивирование осуществляли в колбах Эрленмейера на качалке Biosan ES-20 (время экспозиции 72 часа при 28°С, 190 об./мин.). Титр получаемой жидкой культуры составлял 1,0X10 КОЕ/мл.
Сапробиотических нематод Paraphelenchus tritici использовали для первичного скрининга.
Жидкую культуру В. amyloliquefaciens BZR 277 раскапывали по 0,5 мл в плашки, где находились живые нематоды P. tritici в количестве 0,5 мл (50 шт.). Повторность пятикратная. Смертность нематод определяли через 24 часа совместного нахождения личинок и бактерий. Нематицидный эффект определяли по формуле Шнайдера-Орелли:
Смертность, % = {[Смертность в варианте, % - Смертность в контроле, %] / [100 - Смертность в контроле, %]} × 100.
В конце эксперимента тестируемых нематод помещали в стерильную воду на 24 часа для проверки возможного нематостатического эффекта.
В контрольном варианте мертвых нематод обнаружено не было, в то время как в варианте с применением В. amyloliquefaciens BZR 277 смертность составила 92% (таблица 3).
Определение нематицидного эффекта В. amyloliquefaciens BZR 277 на фоне искусственного заражения М. incognita осуществляли в лабораторных условиях.
Личинок галловых нематод для тестирования В. amyloliquefaciens BZR 277 получали путем извлечения из оотек, отделенных от галл на корнях растении огурца сорта Атос, на которых в условиях лаборатории развивалась популяция галловых нематод М. incognita Kof. Оотеки помещали в чистую воду (50-70 мл) в чашки Петри (по 20-30 шт. на чашку) при комнатной температуре. Личинки начинали выходить через 4-7 дней, в зависимости от зрелости оотеки. По мере отрождения личинок из яиц их аккуратно собирали со дна чашки Петри в пробирку и помещали на хранение в холодильник. В опыте использовали только живых, подвижных личинок. Суспензия нематод содержала 100 особей/мл.
Смертность нематод в варианте с применением В. amyloliquefaciens BZR 277 составляла 99,8% (таблица 4).
Изучение влияния бактерии В. amyloliquefaciens BZR 277 на развитие мелойдогинеза при искусственном заражении популяцией южной галловой нематоды М. incognita сравнивали с результатом чистого контроля. Опыт проведен в пятикратной повторности. Степень поражения мелойдогинезом корневой системы растений проводили путем балльной оценки. Почвенные образцы анализировали модифицированным вороночным методом Бермана. Исследования проводили в вегетационном боксе на растениях партенокарпического огурца.
По окончании опыта все растения аккуратно извлекали из горшочков, освобождали от почвы и определяли степень галлообразования каждого экземпляра, а затем балл галлообразования в каждом варианте. Наибольшую степень развития мелойдогинеза наблюдали на растениях в контрольном варианте.
Оставшийся грунт исследовали на зараженность личинками мелойдогин. Анализ средних почвенных образцов показал, вариант «контрольный» на 25 мл почвы в среднем содержал по 20 личинок галловых нематод из 204 особей прочих видов (таблица 5). Значительно меньше обнаружено в варианте с применением жидкой культуры на основе штамма В. amyloliquefaciens BZR 277 - 6,2 из 77,8 прочих видов обнаруженных нематод, а биологическая эффективность составила 42,8%.
Определение нематицидной активности жидкой культуры на основе штамма В. amyloliquefaciens BZR 277 в отношении южной галловой нематоды М. incognita на фоне естественного заражения проводили на культуре огурца в закрытом грунте.
Эффективность определяли по соотношению количества галлов к массе корней (индекс галлообразования), а также по биометрическим показателям - высоте, массе надземной и подземной части растений и урожайности. Опыт включал в себя три варианта:
1. Однократно - внесение жидкой культуры на основе штамма В. amyloliquefaciens BZR 277 в почву, инфицированную нематодой, перед высадкой растений.
2. Двукратно - внесение жидкой культуры на основе штамма В. amyloliquefaciens BZR 277 в почву инфицированную нематодой перед высадкой растений и пролив под корень в фазе развития растений огурца 5-7 листьев.
3. Контроль - без обработок.
Полученные результаты показали высокий защитный и ростостимулирующий эффект (таблица 6, 7).
При двукратном проливе под корень жидкой культурой на основе В. amyloliquefaciens BZR 277 на протяжении всего вегетационного периода не отмечено внешних признаков поражения растений нематодой, эффективность составила 94,4% в сравнении с контролем. Однократное применение снижало количество галлов на корневой системе огурца на 25%.
Двукратное применение жидкой культурой на основе В. amyloliquefaciens BZR 277 также положительно повлияло на биометрические показатели растений огурца. Растения развивались интенсивно, показатели роста и развития существенно превысили контрольные - высота растений на 59,2%, площадь листовых пластин на 58,5%, вес надземной и подземной части в 1,6 раза.
Таким образом, штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens BZR 277 является новым, обладающим нематицидной активностью против галловых нематод, и в перспективе может быть использован как продуцент для производства биопрепаратов для защиты растений от галловых нематод с целью расширения ассортимента биологических средств защиты растений от вредных организмов.