ВАКЦИНА АССОЦИИРОВАННАЯ ПРОТИВ АНАЭРОБНОЙ ЭНТЕРОТОКСЕМИИ И ЭШЕРИХИОЗНОЙ ДИАРЕИ ТЕЛЯТ
ASSOCIATED VACCINE AGAINST ANAEROBIC ENTEROTOXEMIA AND COLIBACILLOSIS DIARRHEA IN CALVES

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биотехнологии, в частности к производству и применению биологических препаратов против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозной диареи телят.
В последние годы желудочно-кишечные заболевания телят получили широкое распространение. Они наносят значительный экономический ущерб. В этиологии этих болезней многими отечественными и иностранными авторами отмечается возрастающее значение бактерий Clostridium perfringens и их ассоциаций с другими видами энтеробактерий, в частности с Escherichia coli.
Эшерихиоз - остропротекающая инфекционная болезнь молодняка, проявляющаяся септицемией, токсемией и энтеритом, обезвоживанием организма, поражением нервной системы, нарастающей депрессией и слабостью, иногда пневмонией и артритами. Болезнь вызывается энтеротоксигенными штаммами Escherichia coli (Е. coli), синтезирующими адгезивные антигены К88, К99, 987Р, F41, А20, Att25. У телят в более 80% случаях эшерихиоз вызывается бактериями E. coli, продуцирующими адгезивные антигены А20 и К99. Для профилактики эшерихиоза в РФ применяются: «Вакцина поливалентная гидроокисьалюминиевая против колибактериоза (эшерихиоза) поросят, телят, ягнят», «Вакцина против эшерихиоза с.-х. животных «Коли-Вак», содержащая адгезивные антигены К99, К88, 987Р, F41, ТЛ-, ТС-анатоксины и соматические антигены серотипов 078, 0141. Эти вакцины имеют повышенную реактогенность для крупного рогатого скота за счет содержания в ней высокотоксичных штаммов E.coli, продуцирующих адгезивные антигены К88 и 987Р, не вызывающих заболевание у телят.
Анаэробная энтеротоксемия - остропротекающая болезнь животных различных видов (овец, телят, поросят, пушных зверей, птиц и др.), характеризующаяся общим токсикозом организма с признаками поражения нервной системы и желудочно-кишечного тракта, стационарностью, значительным охватом поголовья и высокой летальностью (до 60-100%). Болезнь вызывают спорообразующие грамположительные бактерии Clostridium perfringens (CI. perfringens), которых подразделяют на шесть типов: A, B, C, D, E, F, отличающихся друг от друга антигенной структурой вырабатываемых ими токсинов. У телят анаэробную энтеротоксемию вызывают возбудители серотипов A, C и D [Антонов Б.И., Борисова В.В., Волков П.М. и др. Лабораторные исследования в ветеринарии. Бактериальные инфекции. М.: «Агропромиздат». - 1986, с.48-51; Куриленко А.Н., Крупальник В.Л., Пименов Н.В. Бактериальные и вирусные болезни молодняка с.-х. животных. - М.: «КолосС», 2005, с.84-91; Салимов В.А., Салимова Н.П. Некоторые особенности паталогоанатомической диагностики анаэробной энтеротоксемии телят, вызванной Cl. perfringens типа A. Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях. - Матер, науч.-практич. конф., Воронеж, 2002, с.527-528].
В РФ разработаны и выпускаются биологической промышленностью вакцины против энтеротоксемии овец и поросят, такие как «Концентрированная поливалентная гидроокисьалюминиевая вакцина против брадзота, инфекционной энтеротоксемии, злокачественного отека и дизентерии ягнят», содержащая в своем составе антигены Cl. perfringens типов B, C и D; «Поливалентный анатоксин против клостридиозов овец» на основе анатоксинов Cl. perfringens типов C и D; «Вакцина ассоциированная против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиоза поросят», на основе микробных клеток бактерий Cl. perfringens типа C и эшерихий 7 серологических групп [Каталог лекарственных средств для животных. РОАО «Росагробиопром», Торговый дом «Биопром», М.: 2005, с.92, 104, 105]. В хозяйствах, стационарно неблагополучных по анаэробной энтеротоксемии телят, применяется первая из вышеуказанных вакцин. Недостатком этой вакцины является неполный ее антигенный состав, а именно отсутствие в ней антигена типа A - основного возбудителя анаэробной энтеротоксемии телят, приводящий к низкой ее иммуногенной активности для телят из-за отсутствия в ней анатоксинов Cl. perfringens типа A, что делает ее малоэффективной в хозяйствах, где превалирует возбудитель этого типа.
Вакцина против анаэробной энтеротоксемии телят в Российской Федерации не разработана и не выпускается.
Известно, что анаэробная энтеротоксемия у телят часто проявляется в виде смешанной инфекции с эшерихиозом. Поэтому актуальна разработка ассоциированной вакцины против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозной диареи телят.
Наиболее близким аналогом является вакцина ассоциированная против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиоза поросят, содержащая антигены Cl. perfringens типа C, адгезивные антигены E.coli К88, К99, 987Р, F41, ТС-, и ТЛ-анатоксины эшерихий, инактиватор формалин и адъювант (патент RU №2129441, A61K 39/116 // A61K 39/08, 39/108, за 1999 г.).
Причиной невозможности использования этой вакцины для иммунизации телят является ее узкий антигенный спектр (отсутствие в составе вакцины антигенов Cl. perfringens типов А, Д и адгезивного антигена E.coli А20, часто вызывающих заболевание у телят), высокая ее реактогенность из-за содержания в ней высокотоксичных штаммов E.coli, продуцирующих адгезивные антигены К88 и 987Р, не вызывающих заболевание у телят.
Задачей изобретения является повышение антигенной и иммуногенной активности, расширение спектра действия и защитного эффекта вакцины, а также снижение ее реактогенности.
Поставленная задача решается тем, что вакцина ассоциированная против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозной диареи телят, содержащая антигены клостридий, антигены эшерихий, инактиватор формалин и адъювант, из антигенов клостридий она содержит В-токсин и суспензию клеток штамма №28 Cl. perfringens типа A, В-токсин и суспензию клеток штамма №392 Cl. perfringens типа C, В-токсин и суспензию клеток штамма №213 Cl. perfringens типа Д, из антигенов эшерихий - суспензию клеток штамма E. coli КВ-1, содержащую адгезивный антиген К99 на физиологическом растворе, суспензию клеток штамма Е. coli ПЗ-3, содержащую адгезивный антиген А20 на физиологическом растворе, термолабильные и термостабильные анатоксины в культуральной среде, полученные при культивировании штаммов Е. coli КВ-1 и ПЗ-3 в культуральной среде, из адъювантов - гель гидроокиси алюминия при следующем соотношении компонентов на 1 л вакцины:
12
12
3
Суспензия клеток штамма №28 Cl. perfringens типа А в культуральной среде с концентрацией 3,5·10-4,0·10, см - 140,0-160,0.
12
12
3
Суспензия клеток штамма №392 Cl. perfringens типа C в культуральной среде с концентрацией 3,5·10-4,0·10, см - 140,0-160,0.
12
12
3
Суспензия клеток штамма №213 Cl. perfringens типа Д в культуральной среде с концентрацией 3,5·10-4,0·10, см - 140,0-160,0.
12
12
3
Суспензия клеток штамма E. coli КВ-1, содержащая адгезивный антиген К99 на физиологическом растворе с концентрацией 100·10-120·10, см - 25,0-30,0.
12
12
3
Суспензия клеток штамма E. coli ПЗ-3, содержащая адгезивный антиген А20 на физиологическом растворе с концентрацией 100·10-120·10, см - 25,0-30,0.
3
Гидроокись алюминия, 6%-ная, см - 200,0-250,0.
3
Формалин, см - 4,0-5,0.
ТС- и ТЛ-анатоксины штаммов E. coli КВ-1 и E. coli ПЗ-3 в соотношении 1:1 в культуральной среде с титром в РДП 1:8-1:16, л. - До 1.
Клостридиозные антигены получают из штаммов Cl. perfringens №28, №392, №213, относящихся соответственно к серогруппам А, С и Д.
Штаммы имеют следующие свойства. На среде Китта-Тароцци бактерии дают бурный рост с сильным равномерным помутнением бульона и обильным газообразованием. В мазках из культуры бактерии представляют собой грамположительные короткие толстые палочки с обрубленными концами без спор. На глюкозо-кровяном агаре бактерии образуют крупные, гладкие, выпуклые колонии с ровными краями, окруженные зоной сильного непрозрачного (неполного) гемолиза. Культуры токсичны, вызывают гибель белых мышей в течение 12 часов.
Эшерихиозные антигены получают из эпителиотропных энтеротоксигенных штаммов Escherichia coli «КВ-1» и «ПЗ-3», выделенных из тонких отделов кишечника больных диареей новорожденных телят.
Штаммы имеют следующие свойства.
Морфологические свойства: полиморфные, грамотрицательные палочки, не образуют спор, располагаются в мазках одиночно.
Культуральные свойства: в мясопептонном бульоне штаммы вызывают интенсивное помутнение, на мясопептонном агаре образуют сочные, блестящие, выпуклые, гладкие с ровными краями колонии круглой формы. На среде Эндо колонии малинного цвета с металлическим отливом.
Ферментативные свойства: ферментируют глюкозу, лактозу, маннит, ксилозу и другие углеводы, не разжижают желатину, образуют индол, не образуют сероводород.
Серологические свойства: имеют высокую антигенную активность в РА, имеют группоспецифические и видоспецифические антигены, штамм "КВ-1" синтезирует адгезивный антиген К99, штамм «П3-3» - адгезивный антиген А20.
Входящие в состав ассоциированной вакцины антигены в эффективных количествах обеспечивают синергетический эффект, проявляемый в увеличении напряженности и длительности иммунитета.
3
3
Пример 1. Для изготовления клостридиозных компонентов ассоциированной вакцины производственные штаммы Cl. perfringens №28, №392, №213 выращивают на мясо-печеночно-казеиновой среде в реакторе в течение 5-6 часов при температуре 37-38°C до накопления не менее 4 млрд/см микробных клеток. Проверяют токсичность выращенной культуры на белых мышах, которые должны погибнуть после внутривенного введения 0,5 см культуры в срок до 24 часов.
Для изготовления вакцины используют культуры, содержащие не менее 6000 ДЛМ/см для белых мышей. В реактор добавляют формалин до 0,7%-ной концентрации, выдерживают 8 суток при температуре 37-38°C, добавляют 6%-ную гидроокись алюминия до 10%-ной концентрации, выдерживают 3-5 суток и удаляют 50% общего объема надосадочной жидкости, устанавливают рН 7,2-7,4.
Пример 2. Эшерихиозные компоненты получают из штаммов E. coli КВ-1 и П3-3, синтезирующих соответственно адгезивные антигены К99 и А20. Указанные штаммы вызывают гибель белых мышей массой 14-16 г в течение 24 ч после внутрибрюшинного заражения в дозе 500 млн м.к.
3
3
Для получения бактериальной массы Е. coli используют мясо-пептонный агар (для штамма П3-3) и среду Минка (для штамма КВ-1). С этой целью указанные питательные среды разливают в матры по 300 см и стерилизуют при 0,5 атм (110°C) в течение 15 минут. После застывания сред делают посев указанных культур по 3,0 см 10 млрд суспензии. Посевы выдерживают в термостате при температуре 37-38°C. Через 24 часа выросшие колонии культур E. coli смывают 0,85%-ным стерильным раствором хлорида натрия, готовят суспензию в концентрации 100-120 млрд м.к. в 1 см по бактерийному или оптическому стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича.
Инактивацию бактериальной взвеси осуществляют формалином. Для этого во взвесь добавляют формалин до 0,5% конечной концентрации и выдерживают 4-5 суток в термостате при температуре 37-38°C. Затем проверяют полноту инактивации путем посева на соответствующие питательные среды.
Для получения анатоксина каждый штамм Е. coli засевают отдельно в реактор с бульоном Хоттингера, выращивают 5-7 суток при температуре 37-38°C. Определяют концентрацию ТЛ-, ТС-токсинов в реакции диффузионной преципитации (РДП). Титр ТЛ-, ТС-токсинов в культуральной жидкости должен быть не менее 1:4-1:8. Затем к культуре добавляют формалин до 0,4-0,5% и выдерживают при температуре 37-38°C в течение 10-12 суток, затем добавляют 6%-ную гидроокись алюминия до 10%-ной концентрации, выдерживают 3 суток и удаляют 50% общего объема надосадочной жидкости, устанавливают рН 7,2-7,4.
Пример 3. Контроль вакцины на стерильность, безвредность и иммуногенную активность. Для проверки на стерильность из 6 флаконов каждой серии вакцины делают посевы на МПБ, МПА, МППБ под вазелиновым маслом и агар Сабуро по 2 пробирки на каждый флакон. Посевы со средами выдерживают в термостате при температуре 37-38°C, а агар Сабуро - при температуре 22-23°C в течение 15 суток. При этом питательные среды должны оставаться стерильными.
3
3
3
Для проверки на безвредность отбирают 10 белых мышей живой массой 16-18 г и вводят им вакцину в дозе 0,5 см подкожно. Вакцину считают безвредной, если мыши в течение 10 суток после введения вакцины остаются живыми и клинически здоровыми. Контроль иммуногенной активности вакцины осуществляют на 3 кроликах, которым препарат вводят внутримышечно двукратно с интервалом 15 дней в дозе 4 см. Через 20 суток после второй инъекции в сыворотке крови каждого кролика определяют титр антитоксических антител в реакции нейтрализации токсина Cl. perfringens на белых мышах. Вакцину считают активной против энтеротоксемии, если сыворотка крови иммунизированных кроликов предохраняет не менее двух мышей из трех, взятых в опыт, при гибели всех мышей контрольной группы. Иммуногенную активность вакцины к эшерихиям проверяют на 40 белых мышах массой 16-18 г. Вакцину вводят 20 мышам (опытные) подкожно двукратно с интервалом 10 дней в дозе 0,3 см, а 20 мышей (контрольные) не вакцинируют. Через 15 дней после второго введения вакцины животным вводят внутрибрюшинно подтитрованную смертельную дозу двух контрольных штаммов E. coli (К99 и А20), используя на каждый штамм эшерихий 10 вакцинированных и 10 невакцинированньгх животных. Вакцину считают активной против E. coli при выживании не менее 7 из 10 вакцинированных и гибели не менее 8 невакцинированньгх белых мышей.
3
3
Пример 4. Эффективность вакцины оценивают по количеству заболевших и павших от анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозной диареи телят в неблагополучном по этим инфекциям хозяйстве. Производственное испытание экспериментальной серии ассоциированной вакцины проведено в СХПК «Девятовское» Лаишевского района РТ, стационарно неблагополучном по анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозной диареи. Опыты проводились на 46 глубокостельных коровах и 60 телятах 30-35 дневного возраста. Коровам вакцину вводили подкожно в дозе 10 см двукратно за 50-60 дней до отела с интервалом 15-18 дней. Телят иммунизировали в возрасте 18-20 дней также двукратно с интервалом 15-18 дней в дозе 4 см. В результате исследований установлено, что вакцина безвредна для животных, не вызывает осложнений и создает у животных активный поствакцинальный иммунитет. Так, в группе новорожденных телят, полученных от вакцинированных коров, заболеваемость составила 13,1%, сохранность - 89,9%, тогда как в группе телят, полученных от невакцинированных коров, эти показатели составили 78,8 и 77,7% соответственно. В группе телят старшего возраста, вакцинированных ассоциированной вакциной, заболеваемость анаэробной энтеротоксемией и эшерихиозной диареей составила 8,3%, сохранность 91,6%, а в группе невакцинированных телят эти показатели составили соответственно 21,9 и 73,9%. Следовательно, вакцина против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозной диареи телят обладает достаточно высокой иммуногенной активностью. Применение ее с профилактической целью в стационарно неблагополучном хозяйстве позволило снизить заболеваемость новорожденных телят в 6,4 раза, телят старшего возраста - в 2,63 раза и тем самым повысить сохранность новорожденных телят на 12,2%, телят старшего возраста - на 17,7% (см. табл.2).
Пример 5. Общие сведения биологические свойства, порядок применения вакцины ассоциированной против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозной диареи телят.
Общие сведения
Вакцина представляет собой непрозрачную жидкость соломенно-желтого цвета с обильным сероватым осадком, который при встряхивании флакона легко разбивается, образуя гомогенную взвесь.
3
Вакцину расфасовывают по 100 и 200 см во флаконы стеклянные соответствующей вместимости, укупоривают резиновыми пробками, обкатывают алюминиевыми колпачками и этикетируют. На этикетке указывают: наименование организации-производителя, ее адрес и товарный знак, название вакцины, количество доз во флаконе, дозу и способ применения, условия хранения, номер серии, номер госконтроля, дату изготовления (месяц, год), срок годности, обозначения ТУ, регистрационный номер и надпись «Для животных».
Флаконы с вакциной упаковывают в ящики из фанеры, для обеспечения целостности флаконы обертывают бумагой или алигнином, в холодное время года - ватой или другими теплоизолирующими материалами. Внутрь каждого ящика вкладывают 3 экз. инструкции по применению вакцины.
На упаковку с флаконами (транспортная тара) наклеивают этикетку, на которой указывают: наименование ведомства, наименование организации-производителя, ее адрес и товарный знак, название препарата, его количества в ящике, объем вакцины во флаконе, номер серии, номер контроля, дату изготовления (месяц, год), срок годности, условия хранения, обозначение технических условий, регистрационный номер, надпись «Для животных».
Вакцину транспортируют и хранят в сухом, защищенном от света месте при температуре от 4 до 8°C. Срок годности вакцины 12 месяцев со дня изготовления при соблюдении условий транспортировки и хранения.
Вакцину с нарушенной целостностью флакона и подвергшихся замораживанию, без этикеток, наличием посторонних примесей, а также не использованную в день вскрытия флакона, выбраковывают. Выбракованную вакцину подвергают кипячению в течение 15 минут.
Биологические свойства
Активными компонентами вакцины являются антигены бактерий Clostridium perfringens типов А, С, Д и эшерихий коли, синтезирующих адгезивные антигены К99, А20, а также их ТЛ- и ТС-анатоксины. Все компоненты вакцины безвредны, обладают высокой иммуногенностью и полностью совместимы.
Вакцина при двукратном введении с интервалом 18-20 дней в соответствующих дозах вызывает у молодняка и взрослого поголовья крупного рогатого скота образование напряженного иммунитета продолжительностью 12 месяцев. У телят, полученных от вакцинированных коров, формируется после приема молозива колостральный иммунитет продолжительностью до 1,5 месяцев.
Порядок применения вакцины
Вакцину применяют с профилактической целью в угрожаемых и стационарно неблагополучных хозяйствах по анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозной диареи телят.
3
3
Вакцинации подлежат клинически здоровые животные. В хозяйствах, неблагополучных по анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозу, специфическую профилактику начинают с иммунизации стельных коров и нетелей, которым вакцину в дозе 10 см вводят подкожно двукратно за 50-60 дней до отела с интервалом 14-15 дней. Телят, полученных от вакцинированных коров, вакцинируют в возрасте 18-20 дней в дозе 3 см двукратно с интервалом 14-15 дней.
Перед применением флаконы с вакциной необходимо тщательно встряхивать, а в холодное время подогревать в водяной бане до 37-38°C.
Молоко и продукты убоя, полученные от вакцинированных животных, в любое время после прививки реализуются без ограничений.
При проведении прививок необходимо соблюдать правила асептики и антисептики. Место введения вакцины дезинфицируют 70% раствором этилового спирта. Шприцы и иглы перед применением стерилизуют кипячением, для каждого животного используют отдельную иглу.
Наряду с вакцинацией животных необходимо проводить в хозяйстве ветеринарно-санитарные мероприятия, направленные на уничтожение инфекционного начала.
Противопоказания к применению:
- не вакцинировать больных и ослабленных животных;
- не применять гипериммунные сыворотки или иммунодепрессанты в течение 1 месяца после вакцинации.
Меры личной профилактики
При проведении вакцинации необходимо соблюдать правила личной гигиены, принятые при работе с лекарственными средствами. В местах работы должна находиться аптечка для оказания первой доврачебной помощи.
В случае попадания вакцины на открытые участки тела или слизистые оболочки глаз, рта, носа и после окончания работы руки и другие открытые участки тела моют водой с мылом.
Вакцина по истечении срока годности применению не подлежит. Вакцину следует хранить в местах, недоступных для детей.
Таблица 1
Состав вакцины ассоциированной против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозной диареи телят
№ п.п.
Компоненты вакцины
Содержание в 1 л вакцины (см<sup>3</sup>)
1
Суспензия клеток штамма №28 Cl. perfringens типа А в культуральной среде с концентрацией 3,5·10<sup>12</sup>-4,0·10<sup>12</sup> в см<sup>3</sup>
+
140,0-160,0
2
Суспензия клеток штамма №392 Cl. perfringens типа С в культуральной среде с концентрацией 3,5·10<sup>12</sup>-4,0·10<sup>12</sup> в см<sup>3</sup>
140,0-160,0
3
Суспензия клеток штамма №213 Cl. perfringens типа Д в культуральной среде с концентрацией 3,5·10<sup>12</sup>-4,0·10<sup>12</sup> в см<sup>3</sup>
140,0-160,0
4
Суспензия клеток штамма Е. coli КВ-1, содержащая адгезивный антиген К99 на физиологическом растворе с концентрацией 100·10<sup>12</sup>-120·10<sup>12</sup> в см<sup>3</sup>
25,0-30,0
5
Суспензия клеток штамма E. coli ПЗ-3, содержащая адгезивный антиген А20 на физиологическом растворе сконцентрацией 100·10<sup>12</sup>-120·10<sup>12</sup> в см<sup>3</sup>
25,0-30,0
6
Гидроокись алюминия, 6%-ная
200,0-250,0
7
Формалин
4,0-5,0
8
ТС- и ТЛ-анатоксины штаммов E. coli КВ-1 и Е. coli ПЗ-3 в соотношении 1:1 в культуральной среде с титром вРДП 1:8-1:16
остальное
Таблица 2
Показатели эффективности применения вакцины против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозной диареи телят
№№ п.п.
Возрастные группы животных
Кол-во гол.
Заболееваемость, %
Сохранность, %
1
Новорожденные телята, полученные от вакцинированных коров
46
13,04
89,95
2
Новорожденные телята, полученные от не вакцинированных коров
274
78,83
77,73
3
Телята, вакцинированные против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозной диареи
60
8,33
91,66
4
Телята, не вакцинированные против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозной диареи
246
21,95
73,98