РЕАГЕНТ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ОБЩЕЙ α-АМИЛАЗЫ
REAGENT FOR TOTAL α-AMYLASE ACTIVITY TEST

Изобретение относится к области медицины и биохимии, а именно к созданию реагентов, позволяющих определять активность общей α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче.
Для определения активности α-амилазы были разработаны различные методы, основанные на способности фермента гидролизовать внутренние α-1,4-гликозидные связи олиго- и полисахаридов.
7
1
7
1
7
7
2
3
4
3
4
5
2
3
4
7
1
Наиболее распространенным для определения активности общей α-амилазы является способ, включающий использование в качестве субстрата 4,6-ethylidene-(G)-p-nitrophenil-(G)-α,D-maltoheptaoside (4,6-этилден-(G)-п-нитрофенил-(G)-α,D-мальтогептазид; Et-GPNP), одобренный Международной федерацией клинической химии (IFCC). В процессе реакции α-амилаза расщепляет Et-GPNP до GPNP, GPNP, GPNP, Et-G, Et-G и Et-G. После этого α-глюкозидаза гидролизует GPNP, GPNP и GPNP с образованием глюкозы и окрашенного вещества п-нитрофенола. Скорость накопления окрашенного продукта прямо пропорциональна активности общей α-амилазы в образце (Kruse-Jarres J.D., Kaiser С., Hafkenscheid J.С.М. et al. Evaluation of a new α-amylase assay using 4,6-ethylidene-(G)-l-4-nitrophenil-(G)-α-D-maltoheptaoside as substrate // J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1988. Vol.27. P.103-113).
Основным недостатком известного способа является двухстадийность реакции и использование дополнительного фермента для получения окрашенного продукта.
2
2
Наиболее близким к заявляемому реагенту - прототипом, является набор реагентов для определения активности общей α-амилазы кинетическим колориметрическим методом, состоящий из двух реагентов, следующих составов: реагент 1 - хлорид натрия 50-500 ммоль/л, калий роданистый (KSCN) 50-400 ммоль/л, азид натрия 1-90 ммоль/л, хлорид кальция 0,5-10,0 ммоль/л, MES (2-морфолиноэтансульфоновая кислота) 50 ммоль/л, вода - остальное, рН реагента 5-8; реагент 2, содержащий: 2-chloro-4-nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosylmaltoside (2-хлор-4-нитрофенил-4-O-β-D-галактопиранозилмальтозид; GalGCNP) 2,4-12 ммоль/л, MES 50 ммоль/л, вода-(остальное), рН реагента 5-8. В основу набора для определения активности общей α-амилазы положен кинетический колориметрический метод, заключающийся в том, что α-амилаза гидролизует GalGCNP с образованием окрашенного продукта 2-chloro-4-nitrophenol и неокрашенного - 4-O-β-D-galactopyranosylmaltose. Скорость накопления окрашенного продукта прямо пропорциональна активности α-амилазы в образце (Morishita Y., IinumaY., Nakashima N., et al. Total and pancreatic amylase measured with 2-chloro-4-nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosylmaltoside // Clinical Chemistry. 2000. Vol 46. P.928-933).
Недостатками прототипа являются:
- небольшой срок хранения реагентов: 3 месяца при температуре 4°С;
- трудоемкость при использовании системы из двух реагентов.
Технической задачей изобретения является повышение стабильности реагента для определения активности общей α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче с сохранением высокой точности и воспроизводимости результатов анализа.
2
Поставленная техническая задача достигается предлагаемым реагентом, содержащим следующие компоненты: субстрат GalGCNP 0,5-20 ммоль/л, хлорид натрия 50-500 ммоль/л, KSCN 50-400 ммоль/л, азид натрия 1-90 ммоль/л, EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) 0,2-5,0 ммоль/л, Triton Х-100 0,075 об.%, ацетат кальция 0,7-10,0 ммоль/л, MES 50 ммоль/л, (остальное), рН 5,5-6,5.
Данный реагент характеризуется правильностью определения активности общей α-амилазы 100±5% с воспроизводимостью результатов (коэффициент вариации) менее 5%. Срок хранения реагента при температуре 2-8°С составляет 2 года.
Включение в состав реагента новых компонентов - Triton Х-100, который является неионным поверхностно-активным веществом, EDTA - образующая комплексные соединения с большинством катионов, а также замена кальция хлорида на консервант кальция ацетат позволяет повысить стабильность реагента и продлить срок его годности до 2-х лет.
Определение активности общей α-амилазы осуществляют при температуре реагента 37°С следующим образом: к 25 мкл пробы добавляют 1 мл реагента и через 1 мин начинают считывать оптическую плотность через равные промежутки времени в течение 1-3 мин при длине волны 405 нм, при этом количество считываний должно быть не менее трех. Активность общей α-амилазы (А) в Е/л рассчитывают по формуле:
А=ΔЕ/мин×3060, где ΔЕ/мин - среднее изменение оптической плотности за минуту; 3060 - фактор пересчета по уравнению Бугера-Ламберта-Бера.
Определяющими существенными отличиями предлагаемого реагента, по сравнению с прототипом, являются:
- реагент дополнительно содержит Triton Х-100 и EDTA в экспериментально подобранных, оптимальных количествах, что позволяет повысить стабильность последнего при хранении;
- в реагенте кальция хлорид заменен на более подходящий компонент - ацетат кальция, что позволяет повысить стабильность реагента при хранении;
- жидкий реагент готов к использованию, что позволяет существенно упростить процедуру анализа;
- все компоненты в реагенте использованы в оптимальных, экспериментально подобранных концентрациях, что позволяет повысить функциональность и расширить область применения реагента.
Предлагаемый реагент прошел клинические испытания и разрешен к производству, продаже и применению на территории Российской, Федерации. Предлагаемый реагент доступен для любой клинико-диагностической, поликлинической и биохимической лаборатории и позволяет получать точные, достоверные результаты анализа, соответствующие зарубежным стандартам.
Пример 1
2
2
Для приготовления реагента делают навески на аналитических весах каждого компонента. Переносят их в стеклянные стаканы и растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Растворы тщательно перемешивают на магнитной мешалке. Растворы компонентов, кроме GalGCNP, переносят в мерную колбу вместимостью 1 литр и доводят рН под контролем рН-метра до 5,73. Затем добавляют навеску GalGCNP. Объем раствора доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают. В результате получают реагент для определения общей α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче, содержащий следующие компоненты:
Хлорид натрия, ммоль/л - 50,0
KSCN, ммоль/л - 400,0
Азид натрия, ммоль/л - 90,0
EDTA, ммоль/л - 0,2
Ацетат кальция, ммоль/л - 0,7
Triton Х-100, об.% - 0,075
2
GalGCNP, ммоль/л - 0,5
MES, ммоль/л - 50,0
Вода - остальное.
При этом значение рН реагента составляет 6,0.
Пример 2
Приготовление реагента осуществляют аналогично примеру 1. Получают реагент для определения общей α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче, содержащий следующие компоненты:
Хлорид натрия, ммоль/л - 300,0
KSCN, ммоль/л - 100,0
Азид натрия, ммоль/л - 20,0
EDTA, ммоль/л - 2,5
Ацетат кальция, ммоль/л - 5,0
Triton Х-100, об.% - 0,075
2
GalGCNP, ммоль/л - 10,0
MES, ммоль/л - 50,0
Вода - остальное.
При этом значение рН реагента составляет 5,5.
Пример 3
Приготовление реагента осуществляют аналогично примеру 1.
Получают реагент для определения общей α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче, содержащий следующие компоненты:
Хлорид натрия, ммоль/л - 500,0
KSCN, ммоль/л - 50,0
Азид натрия, ммоль/л - 1,0
EDTA, ммоль/л - 5,0
Ацетат кальция, ммоль/л - 10,0
Triton X-100, об.% - 0,075
2
GalGCNP, ммоль/л - 20,0
MES, ммоль/л - 50,0
Вода - остальное.
При этом значение рН реагента составляет 6,5.
Пример 4
Определение активности панкреатической α-амилазы в контрольных сыворотках.
К 1 мл реагента, прогретому до температуры 37°С, добавили 25 мкл контрольной сыворотки «Precinorm U». Через 1 мин начали считывать оптическую плотность через равные промежутки времени в течение 1-3 мин при длине волны 405 нм. Аналогичную процедуру повторили для контрольных сывороток «Precipath U», «c.f.a.s.», «Contornorm», «Contropath», «BioCal E». Результаты анализа приведены в табл.1.
Таблица 1
Контрольная сыворотка
Аттестованное значение активности панкреатической α-амилазы (IFCC), Е/л
Полученный результат, Е/л
«Precinorm U» («Roche», Германия)
40,8 (33,6-48,0)
40
«Precipath U» («Roche», Германия)
102 (84-120)
102
«c.f.a.s.» («Roche», Германия)
162
164
«Contornorm» («Biocon», Германия)
40,1 (32,9-47,3)
41
«Contropath» («Biocon», Германия)
102 (84-120)
101
«BioCal E» («Biocon», Германия)
171
177
Из таблицы 1 видно, что предлагаемый реагент обеспечивает высокую точность определения активности общей α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче.
Использование предлагаемого реагента позволит по сравнению с прототипом:
- увеличить срок годности реагента до 2-х лет за счет обеспечения его стабильности;
- расширить область применения и повысить функциональность реагента за счет обеспечения возможности работы с ним в условиях клинико-диагностических, поликлинических и биохимических лабораторий.