Способ прогнозирования наличия хромосомных аномалий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества на основании оценки транскрипционного профиля в кумулюсных клетках в программе экстракорпорального оплодотворения
METHOD FOR PREDICTING THE PRESENCE OF CHROMOSOMAL ABNORMALITIES IN EMBRYOS OF SATISFACTORY AND POOR QUALITY ON THE BASIS OF ESTIMATION OF THE TRANSCRIPTIONAL PROFILE IN CUMULUS CELLS IN THE PROGRAM OF IN VITRO FERTILIZATION

В последние годы в области методов лечения бесплодия были достигнуты большие успехи. Несмотря на постоянное совершенствование методик вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), эффективность одной попытки экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) не превышает 33%, а частота родов живым плодом - 24,8% [1]. Основным фактором, определяющим вероятность наступления клинической беременности и рождения живого здорового ребенка, является качество переносимых в полость матки эмбрионов [2].
В настоящее время выбор эмбрионов для переноса осуществляется, в основном, на основании морфологических критериев оценки качества. Несмотря на то, что в рутинной клинической практике морфологическая оценка качества эмбрионов является простым и неинванизивным методом, данный метод диагностики является субъективным и не позволяет оценить наличие хромосомных аномалий у переносимых эмбрионов, что, в свою очередь, снижает шансы наступления клинической беременности [3, 4, 5, 6].
На сегодняшний день стало возможным проведение предимплантационного генетического скрининга (ПГС) эмбрионов в циклах ЭКО. Данный метод позволяет диагностировать генетическую патологию эмбриона на этапе до переноса в полость матки [5]. И хотя перенос эуплоидного эмбриона не является 100% гарантией наступления клинической беременности, он существенно повышает ее шансы, вплоть до 70-75% [7].
Предимплантационный генетический скрининг в последние годы активно развивается, показания к его проведению постоянно расширяются, однако данное исследование является дорогостоящим, что приводит к ограничению его использования в широкой практике.
Таким образом, развитие точных малоинвазивных объективных методов оценки качества эмбрионов с высоким потенциалом к имплантации и отсутствием хромосомных аномалий является одним из наиболее важных направлений репродуктивной медицины [8].
Достаточно многообещающе выглядят исследования последнего десятилетия, показывающие возможность оценки качества ооцитов по состоянию окружающих его клеток, получаемых при выделении кумулюсооцитарного комплекса после пункции фолликула при лечении в программе ЭКО [9,10, 11].
Кумулюсные клетки находятся в непосредственной близости к ооциту и постоянно реагируют на изменения, происходящие в интра-фолликулярной среде, что обуславливает возможность получения информации о состоянии ооцита посредством обнаружения молекулярно-генетических изменений в кумулюсных клетках. Например, модели экспрессии определенных генов отражают процессы, происходящие в клетке в данный момент времени, в том числе и ответ клеток на различные воздействия окружающей среды. Таким образом, анализ экспрессии генов в кумулюсных клетках может выявить данные об условиях внутри фолликула и качестве полученных ооцитов, определяя их способность к дальнейшему созреванию, успешному оплодотворению и последующему эмбриональному развитию.
В связи с этим, нами было проведено ретроспективное исследование транскрипционной активности в кумулюсных клетках эмбрионов различного качества согласно морфологическим критериям оценки у пациенток, проходивших лечение бесплодия методом ЭКО/ИКСИ с последующим проведением предимплантационного генетического скрининга. Данное исследование позволило охарактеризовать взаимосвязь уровня экспрессии мРНК изучаемых генов в кумулюсных клетках с наличием хромосомных аномалий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества.
Результат изобретения - создание модели предсказания наличия хромосомных аномалий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества на основании анализа транскрипционной активности в кумулюсных клетках у пациенток при лечении бесплодия в программе ЭКО.
После проведения трансвагинальной пункции под контролем стереомикроскопа Nikon клиническим эмбриологом осуществлялся просмотр аспирированной фолликулярной жидкости с целью идентификации ооциткумулюсных комплексов (ОКК). Стерильными иглами проводили отрезание клеток кумулюса от ОКК под контролем стереомикроскопа в культуральной чашке Петри с буферным раствором (COOК, Ирландия). Производили маркировку образцов кумулюсных клеток соответственно ооциту. Во избежание деградации РНК взятие материала (кумулюсные клетки) осуществляли в пробирки с раствором гуанидинтиоционата (лизирующий раствор наборы "Проба НК"), помещали в холодильную камеру на -20°С, а затем отдавали генетику на анализ.
На 5-е сутки культивирования эмбрионам проводилась биопсия клеток трофэктодермы, материал отправляли в лабораторию молекулярно-генетических методов для анализа хромосомных нарушений методом сравнительной геномной гибридизации. После проведения биопсии все эмбрионы витрифицировались.
Сравнительная геномная гибридизация (CGH) генетического материала эмбриона проводилась с использованием оборудования фирмы Agilent (США). Полногеномную амплификацию ДНК исследуемых клеток проводили с помощью набора для проведения WGA-PCR PicoPlex SingleCell WGA Kit (Rubicon Genomics,CШA) и набора для проведения MDA GenetiSure Pre-Screen Amplification and Labeling Kit (Agilent,CШA). Качество и количество полученной в ходе амплификации ДНК контролировали с помощью 1,2% агарозного электрофореза. Мечение ампликонов проводили с помощью набора SureTag DNA labeling Kit Agilent (США) согласно прилагаемой инструкции. Мечение ампликоны наносили на биочип Sure Print G3 8×60 aCGH Agilent (США), гибридизировали 16 часов, после чего проводили отмывку и сканирование на сканере биологических чипов SureScan Microarray Scanner. Интерпретацию полученных результатов проводили с помощью программного продукта Agilent CytoGenomics.
После получения результатов предимплантационного генетического скрининга проводился анализ транскрипционного профиля в кумулюсных клетках. Осаждение РНК проводили изопропанолом в присутствии соосадителя, с последующими отмывками промывочными растворами. В реакции обратной транскрипции использовали смесь специфических олигонуклеотидов всех исследуемых генов. Амплификацию осуществляли в режиме реального времени с измерением уровня флуоресценции по каналу FAM на каждом цикле при температуре отжига праймеров. Реализация «горячего старта» обеспечивалась использованием Taq-полимеразы, активность которой блокировалась антителами и восстанавливалась при прогреве. Реакцию ставили в двух повторах для каждой точки. Уровень экспрессии измеряли в относительных единицах (о.е.) относительно референсных генов ТВР, В2М, GUSB методом сравнения пороговых циклов (ΔCq).
С помощью бинарной логистической регрессии возможно рассчитать вероятность наступления события (в данном случае наличие хромосомных аномалий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества) в зависимости от значений независимой переменной (уровня экспрессии мРНК гена PFKP).
Вероятность наступления события (вероятность наличия хромосомных аномалий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества) (р) рассчитывается по формуле, имеющий общий вид:
p=exp(logit)/(1+exp(logit)
где р - искомая вероятность наступления события.
При значениях р менее 0,5 можно предположить, что измеряемое событие не наступит; в противном случае предполагается наступление события.
Согласно результатам логистической регрессии построено уравнение для предсказания вероятности наличия хромосомных аномалий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества:
logit=-2,59+0,48*PFKP
где PFKP - уровень экспрессии мРНК гена PFKP.
Построенная модель является статистически значимой (χ2=6,99, р=0,008).
Средняя точность прогнозирования вероятности наличия хромосомных аномалий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества составляет 84,3%, ОШ равно 29,3.
Таким образом, можно оценить вероятность наличия хромосомных аномалий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества в программе ЭКО на основании оценки транскрипционного профиля в кумулюсных клетках (уровня экспрессии мРНК гена PFKP).
Таблица 1.
Классификация предсказания наличия хромосомных аномалий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества в программе ЭКО/ИКСИ
Пример
I. Прогнозирование наличия хромосомных аномалий в эмбрионах провели у пациентки М. 32 лет с трубным фактором бесплодия, обратившейся для проведения программы ЭКО/ИКСИ + ПГС. В анамнезе 3 беременности, две из которых - внематочные, в связи с чем в 2009 и 2011 гг пациентке были выполнены операции в объеме лапароскопии, левосторонней и правосторонней тубэктомии, соответственно. Третья беременность наступила в результате программы ЭКО и ПЭ, завершилась самопроизвольным выкидышем в сроке 8 недель. Кариотип абортуса - мозаичная форма трисомии по хромосоме 13. Данная попытка ЭКО вторая.
Отрезание клеток кумулюса от ОКК проводили после трансвагинальной пункции стерильными иглами под контролем стереомикроскопа в культуральной чашке Петри с буферным раствором.
На 5-е сутки культивирования эмбрионам проводилась биопсия клеток трофэктодермы, материал отправляли в лабораторию молекулярно-генетических методов для анализа хромосомных нарушений методом сравнительной геномной гибридизации.
Анализ транскрипционного профиля в кумулюсных клетках проводился после получения результатов ПГС.
Результат проведенного исследования у пациентки М:
Уровень экспрессии мРНК гена PFKP - 8,77 о.е.
Вероятность (р) наличия хромосомных аномалий у исследуемого эмбриона рассчитывали по вышеописанной формуле:
logit=2,59-0,48* PFKP=2,59-0,48* 8,77=1,62
p=exp(logit)/(1+exp(logit)=0,15
Рассчитанная вероятность р указывает на низкую вероятность наличия хромосомных аномалий у исследуемого эмбриона.
Результат проведения предимплантационного генетического скрининга - N, XX (нормальный женский кариотип).
II. Прогнозирование наличия хромосомных аномалий в эмбрионах провели у пациентки Г. 37 лет с трубно-перитонеальным фактором бесплодия, обратившейся для проведения программы ЭКО/ИКСИ + ПГС. В анамнезе 2 беременности, одна из которых завершилась самопроизвольным выкидышем на малом сроке, вторая - правосторонняя внематочная беременность, в связи с чем пациентке в 2012 году была проведена лапароскопия, правосторонняя тубэктомия. Показанием к проведению предимплантационного генетического скрининга послужил старший репродуктивный возраст супругов (Муж, 42 лет, спермограмма-нормозооспермия). Данная попытка ЭКО первая.
Отрезание клеток кумулюса от ОКК проводили после трансвагинальной пункции стерильными иглами под контролем стереомикроскопа в культуральной чашке Петри с буферным раствором.
На 5-е сутки культивирования эмбрионам проводилась биопсия клеток трофэктодермы, материал отправляли в лабораторию молекулярно-генетических методов для анализа хромосомных нарушений методом сравнительной геномной гибридизации.
Анализ транскрипционного профиля в кумулюсных клетках проводился после получения результатов ПГС.
Результат проведенного исследования у пациентки Г:
Уровень экспрессии мРНК гена PFKP - 0,19 о.е.
Вероятность (р) наличия хромосомных аномалий у исследуемого эмбриона рассчитывали по вышеописанной формуле:
logit=2,59-0,48* PFKP=2,59-0,48* 0,19=2,5
p=exp(logit)/(1+exp(logit)=0,92
Рассчитанная вероятность р указывает на возможность того, что истинное значение результативного показателя попадет в расчетный прогнозируемый исход, в данном случае - на наличие анеуплоидий у исследуемого эмбриона.
Результат проведения предимплантационного генетического скрининга - гетероплоидный эмбрион.
III. Прогнозирование наличия хромосомных аномалий в эмбрионах провели у пациентки Ш. 25 лет с мужским фактором бесплодия, обратившейся для проведения программы ЭКО/ИКСИ + ПГС. Муж, 63 лет, спермограмма: олигоастенотератозооспермия. В анамнезе 3 неудачные попытки ЭКО. Беременности, гинекологические заболевания и оперативные вмешательства на органах малого таза отрицает. Показанием к проведению предимплантационного генетического скрининга послужили множественные неудачные попытки ЭКО в анамнезе и старший репродуктивный возраст супруга. Данная попытка ЭКО четвертая.
Отрезание клеток кумулюса от ОКК проводили после трансвагинальной пункции стерильными иглами под контролем стереомикроскопа в культуральной чашке Петри с буферным раствором.
На 5-е сутки культивирования эмбрионам проводилась биопсия клеток трофэктодермы, материал отправляли в лабораторию молекулярно-генетических методов для анализа хромосомных нарушений методом сравнительной геномной гибридизации.
Анализ транскрипционного профиля в кумулюсных клетках проводился после получения результатов ПГС.
Результат проведенного исследования у пациентки Г:
Уровень экспрессии мРНК гена PFKP - 0,95 о.е.
Вероятность (р) наличия хромосомных аномалий у исследуемого эмбриона рассчитывали по вышеописанной формуле:
logit=2,59-0,48* PFKP=2,59-0,48* 0,95=2,13
p=exp(logit)/(1+exp(logit)=0,89.
Рассчитанная вероятность р указывает на высокую вероятность наличия хромосомных аномалий у исследуемого эмбриона.
Результат проведения предимплантационного генетического скрининга - -17, XX (анеуплоидный эмбрион).
Согласно полученным данным прогноз оценки вероятности наличия хромосомных аномалий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества при проведении программ ЭКО/ИКСИ + ПГС носит достоверный характер. Следовательно, способ прогнозирования наличия анеуплоидий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества с использованием оценки транскрипционного профиля в кумулюсных клетках может быть использован в клинико-лабораторной практике с целью минимизации экономических затрат в процессе лечения в программе ЭКО.
Список использованной литературы
1) Lifestyle factors and reproductive health: taking control of your fertility / R. Sharma [et al.] // Reprod Biol Endocrinol. - 2013. - Vol. 16, №11. - p. 66.
2) Краснощока, O.E. Возможности неинвазивной оценки состояния ооцита и эмбриона при проведении программ ВРТ по профилю экспрессии мРНК факторов роста в фолликулярной жидкости / О.Е. Краснощока, В.Ю. Смольникова, Е.А. Калинина // Журнал Акушерство и Гинекология. - 2014. - №9. - С. 36-43.
3) Correlation between aneuploidy, standard morphology evaluation and morphokinetic development in 1730 biopsied blastocysts: a consecutive case series study / M.G. Minasi [et al.] // Hum Reprod. - 2016. - Vol. 31, №10. - C. 2245-2254.
4) Morphokinetic analysis of cleavage stage embryos and its relationship to aneuploidy in a retrospective time-lapse imaging study / M. Chawla [et al.] // J Assist Reprod Genet. - 2015. - Vol. 32, №1. - C. 69-75.
5) ESHRE PGD consortium best practice guidelines for organization of a PGD centre for PGD/preimplantation genetic screening. / G. Harton [et al.] // Hum. Reprod. - 2011. - Vol. 26, №1. - P. 14-24.
6) Effect of infertility, maternal age, and number of previous miscarriages on the outcome of preimplantation genetic diagnosis for idiopathic recurrent pregnancy loss. / J.G. Garrisi [et al.] // Fertil. Steril. - 2009. - Vol. 92, №1. -P. 288-295.
7) Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: A randomized controlled trial / R.T. Scott [et al.] // Fertil. Steril. - 2013. - Vol. 100, №3. - P. 697-703.
8) Transcriptomic Analysis and Meta-Analysis of Human Granulosa and Cumulus Cells. / T. Burnik-Papler [et al.] // PLoS One. - 2015. - Vol. 10, №8. - P. e0136473.
9) Human cumulus cell gene expression as a biomarker of pregnancy outcome after single embryo transfer. / K.M. Gebhardt [et al.] // Fertil. Steril. - 2011. -Vol. 96, №l. - P. 47-52.
10) Specific gene expression differences in cumulus cells as potential biomarkers of pregnancy. / T. Burnik-Papler [et al.] // Reprod. Biomed. Online. - 2015. - Vol. 30, №4. - P. 426-433.
11) Alteration of gene expression in human cumulus cells as a potential indicator of oocyte aneuploidy. / E. Fragouli [et al.] // Hum. Reprod. - 2012. - Vol. 27, №8. - P. 2559-2568.