СИСТЕМЫ И СПОСОБЫ ДВУМЕРНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ RPLC-SFC
SYSTEMS AND METHODS OF TWO-DIMENSIONAL RPLC-SFC CHROMATOGRAPHY

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
В данной заявке испрашивается приоритет для предварительной заявки на патент США №62/069219, поданной 27 октября 2014 года, раскрытие которой включается в данный документ посредством ссылки во всей ее полноте.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к системам многомерной хроматографии и к способам ортогонального разделения и анализа смесей соединений. Раскрыты типичные системы двумерной жидкостной хроматографии с обращенной фазой - сверхкритической жидкостной хроматографии и способы их применения.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Хроматография широко используется при разделении и анализе смесей соединений. Из-за ограничений пиковой емкости одномерной хроматографии были разработаны системы многомерной хроматографии со значительно повышенной пиковой емкостью для анализа сложных образцов. Двумерные (2D) хроматографические методики стали очень популярными, особенно при анализе сложных смесей. По сравнению с одномерной (1D) хроматографией 2D хроматографические методики имеют более высокую селективность и разрешающую способность, предполагая то, что механизмы удерживания являются комплементарными. Максимальная пиковая емкость в двумерной системе разделения достигается, когда селективность индивидуальных разделений является независимой (ортогональной), так что компоненты, которые плохо разделяются в первом измерении могут полностью разделяться во втором измерении. При использовании механизмов ортогонального разделения в двух измерениях теоретическая пиковая емкость системы равна произведению индивидуальных пиковых емкостей. См. Giddings, J.С. Anal. Chem. 1984, 56:1258А; Giddings, J.С., в: Cortes, Н.J. (Ed.), Multidimensional Chromatography: Techniques and Applications, Marcel Dekker, New York 1990, p. 1; Jandera, P. et al., Chromatographia 2004, 60:S27.
Однако для 2D хроматографии существуют некоторые ограничения в показателях чувствительности и совместимостей растворителей. Например, подвижная фаза, которая переносится из первого измерения, часто создает мешающее влияние на второе измерение, таким образом, ограничивая разделяющую способность второго измерения. Несовместимость растворителей, используемых в первом и втором измерениях, может вызывать серьезное рассеивание или расширение полос и ухудшение качества пиков, таким образом, делая большой вызов в отношении конструкции промежуточного устройства. Tian, Н., er al., J. Chromatogr. А 2006, 1137:42. Для ослабления озабоченности относительно несмешиваемости растворителей исследователи разработали несколько 2D систем, в которых в обоих измерениях используются совместимые подвижные фазы. Некоторые примеры включают следующее: 2D жидкостная хроматография с обращенной фазой (RPLC × RPLC) (Venkatramani, C.J. et al., J. Sep. Sci. 2012, 35:1748; Zhang, J. et al., J. Sep. Sci. 2009, 32:2084; Song, C.X. et al., Anal. Chem. 2010, 82:53; Liu, Y.M. et al., J. Chromatogr. A 2008, 1206:153), 2D жидкостная хроматография на основе гидрофильных взаимодействий (HILIC × RPLC) (Liu, Y.M. er al., J. Chromatogr. A 2008, 1208:133; Wang, Y. er al., Anal. Chem. 2008, 80:4680; Louw, S. et al., J. Chromatogr. A 2008, 1208:90), 2D жидкостная хроматография с нормальной фазой × сверхкритическая жидкостная хроматография (NPLC × SFC) (Gao, L. et al., J. Sep. Sci. 2010, 33:3817) и 2D SFC × SFC (Zeng, L. et al., J. Chromatogr. A 2011, 1218:3080; Lavison, G. et al., J. Chromatogr. A 2007, 1161:300; Hirata, Y. et al., J. Sep. Sci. 2003, 26:531; Okamoto, D. et al., Anal. Sci. 2006, 22:1437; Guibal, P. et al., J. Chromatogr. A 2012, 1255:252). В Anderer et al., US 2013/0134095 раскрыта система 2D LC и способы, в которых делается попытка дополнительно уменьшить мешающее влияние первой LC на вторую LC посредством управления событием инъекции инъецирования на выходе из первой LC во вторую LC в связи с состоянием второй LC.
2
2
Одной методикой, которая связывает несовместимые измерения «нормальной фазы» и «обращенной фазы», является 2D SFC × RPLC (Francois, I. et al., J. Sep. Sci. 2008, 31:3473-3478; Francois, I. and Sandra, P.J. Chromatogr. A 2009, 1216:4005). В данном случае неполярный сверхкритический диоксид углерода во фракциях SFC выпаривается (когда он подвергается воздействию атмосферного давления) с образованием фракций с совместимыми подвижными фазами для RPLC второго измерения (обычно спиртовой модификатор). В системе SFC × RPLC Francois, I. er al. используется 2-позиционный/10-портовый переключающий клапан для промежуточного устройства между блоком SFC первого измерения и блоком RPLC второго измерения. В системе используются уложенные петли в промежуточном устройстве для предотвращения втягивания аналитов, элюированных из колонки SFC, посредством потока CO в линию для отходов, и вода вводится в петлю для уменьшения мешающего воздействия остаточного газообразного CO во втором измерении.
2
Cortes и сотрудники (J. Microcol. Sep. 1992, 4:239-244; и патент США №5139681) описали систему 2D LC × SFC, включающую впускной капилляр для образца, в котором устраняются летучие растворители из LC первого измерения посредством пропускания газообразного азота, оставляя отложение элюированных аналитов, которые затем поглощаются подвижной фазой в виде CO для SFC второго измерения. Однако устранение растворителя посредством пропускания газообразного азота не является практичным для RPLC, в которой используется водная подвижная фаза.
Сохраняется потребность в эффективной системе хроматографии и способах разделения и анализа сложных образцов, где полезно проводить разделение посредством RPLC в первом измерении и посредством SFC во втором измерении.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Раскрыты многомерные системы хроматографии и способы разделения и/или анализа сложных смесей органических соединений, например, система двумерной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (RPLC) - сверхкритической жидкостной хроматографии (SFC), в частности, система RPLC × SFC, включающая промежуточное устройство, способное удерживать аналиты, элюированные из колонки RPLC, при одновременном обеспечении прохождения подвижной фазы RPLC, таким образом, уменьшая количество растворителей RPLC, переносимых в колонку SFC.
В одном аспекте предложена хроматографическая система для разделения образца, содержащая: (i) первый разделяющий блок, содержащий: а) первый насосный узел для продвижения первой подвижной фазы через первый разделяющий блок, б) инжектор образца для введения образца в первый разделяющий блок и в) колонку жидкостной хроматографии с обращенной фазой (RPLC); (ii) второй разделяющий блок, содержащий: а) второй насосный узел для продвижения второй подвижной фазы через второй разделяющий блок и б) колонку сверхкритической жидкостной хроматографии (SFC); и (iii) первый жидкостный направляющий блок, содержащий целый ряд пробоотборных петель, причем указанный первый жидкостный направляющий блок соединяется с первым разделяющим блоком и с вторым разделяющим блоком, где по меньшей мере одна из целого ряда пробоотборных петель содержит захватывающую колонку, причем указанная захватывающая колонка содержит неподвижную фазу; и где хроматографическая система сконфигурирована для первоначального разделения образца в первом разделяющем блоке и последующего введения по меньшей мере части образца, элюированного из колонки RPLC, во второй разделяющий блок. В некоторых воплощениях данная система дополнительно содержит детектор(ры) для первого разделяющего блока и/или для второго разделяющего блока. Данная система может дополнительно содержать одно или более чем одно управляющее устройство, соединенное функциональным образом с одним или более чем одним компонентом системы.
В некоторых воплощениях система 2D RPLC × SFC содержит первый жидкостный направляющий блок, который содержит две пробоотборные петли; где одна из двух пробоотборных петель находится в жидкостном сообщении с первым разделяющим блоком, и другая одна из двух пробоотборных петель находится в жидкостном сообщении со вторым разделящим блоком. В некоторых воплощениях первый жидкостный направляющий блок содержит три или более чем три пробоотборных петли, и где одна или более чем одна из пробоотборных петель находится в жидкостной изоляции от первого разделящего блока и второго разделящего блока. В одном варианте по меньшей мере одна пробоотборная петля, которая находится в жидкостной изоляции от первого разделящего блока и второго разделящего блока, содержит захватывающую колонку, загруженную веществом неподвижной фазы. В некоторых воплощениях первый жидкостный направляющий блок сконфигурирован для обеспечения противоточной элюции аналитов, удерживаеых в захватывающей колонке. В некоторых воплощениях первый жидкостный направляющий блок сконфигурирован для обеспечения сопоточной элюции аналитов, удерживаеых в захватывающей колонке.
В некоторых воплощениях система 2D RPLC × SFC содержит второй разделяющий блок, который содержит одну колонку SFC и, возможно, фокусирующую колонку, расположенную выше по потоку от колонки SFC. В некоторых воплощениях второй разделяющий блок содержит комплект параллельных колонок SFC, причем каждая возможно содержит фокусирующую колонку, расположенную выше по потоку от колонки SFC.
Дополнительно предложены способы применения хроматографических систем, описанных в данном документе. В некоторых воплощениях предложен способ анализа образцов (таких как сложный образец) с использованием описанной в данном документе хроматографической системы, включающий: первоначальное разделение сложного образца на фракции посредством RPLC; и дальнейшее разделение фракций из измерения RPLC посредством SFC во втором измерении.
В одном воплощении предложен способ одновременного ахирального-хирального анализа образца, содержащего смесь стереоизомерных компонентов, с использованием описанной в данном документе системы хроматографии, включающий: разделение (или различение) одного или более чем одного интересующего диастереомерного компонента в образце посредством RPLC в первом измерении, что обеспечивает ахиральную чистоту образца; и разделение (или различение) интересующей(щих) энантиомерной(ных) пары(пар) посредством SFC во втором измерении в том же самом аналитическом цикле, что дополнительно обеспечивает хиральную чистоту компонентов в образце.
В другом аспекте предложен способ разделения образца посредством многомерной хроматографии (такой как 2D RPLC × SFC), включающий следующие стадии: (i) захват по меньшей мере части образца на захватывающей колонке, причем указанная часть образуется в результате разделения образца жидкостной хроматографией с обращенной фазой (RPLC), причем указанная захватывающая колонка содержит неподвижную фазу; и (ii) подвергание части образца, захваченной на захватывающей колонке, дальнейшему разделению посредством сверхкритической жидкостной хроматографии (SFC).
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг. 1 представляет собой схему типичной системы многомерной хроматографии 10.
Фиг. 2А представляет собой схему типичного первого разделяющего блока 20, связанного с первым жидкостным направляющим блоком 30.
Фиг. 2Б представляет собой схему типичного второго разделяющего блока 40А и 40В, связанного с первым жидкостным направляющим блоком 30.
Фиг. 3А и Фиг. 3Б представляют собой схемы типичного первого жидкостного направляющего блока 30, содержащего захватывающую колонку 330, где конфигурация первого жидкостного направляющего блока 30 скомпонована для противоточного потока первой подвижной фазы и второй подвижной фазы через указанную захватывающую колонку 330.
Фиг. 3В и Фиг. 3Г представляют собой схемы типичного первого жидкостного направляющего блока 30, содержащего захватывающую колонку 370, где конфигурация первого жидкостного направляющего блока 30 скомпонована для сопоточного потока первой подвижной фазы и второй подвижной фазы через указанную захватывающую колонку 370.
Фиг. 4А и Фиг. 4Б представляют собой схемы типичного первого жидкостного направляющего блока 30, содержащего захватывающую колонку 430, где конфигурация первого жидкостного направляющего блока 30 скомпонована для сопоточного потока первой подвижной фазы и второй подвижной фазы через указанную захватывающую колонку 430.
Фиг. 5А и Фиг. 5Б представляют собой схемы типичного первого жидкостного направляющего блока 30, содержащего две захватывающие колонки 530 и 560, где конфигурация первого жидкостного направляющего блока 30 скомпонована для противоточного потока первой подвижной фазы и второй подвижной фазы через каждую из захватывающих колонок 530 и 560.
Фиг. 6А - Фиг. 6Г представляют собой схемы типичного первого жидкостного направляющего блока 30, содержащего два направляющих механизма 600 и 620.
Фиг. 7А и Фиг. 7Б представляют собой схемы типичного расположенного ниже по потоку подблока второго разделяющего блока 40В, содержащего комплект колонок SFC.
На Фиг. 8А и Фиг. 8Б показаны исходное положение/положение для анализа и захватывающее положение соответственно типичной системы 2D RPLC × SFC с одной захватывающей колонкой (сопоточный поток).
На Фиг. 9 показана схематическая диаграмма 2D RPLC-SFC с использованием комплекта захватывающих колонок, фокусирующий колонок и вторичных колонок SFC.
Фиг. 10 представляет собой фотографию типичного клапана парковочного устройства.
Фиг. 11 представляет собой наложение хроматограмм измерений поглощения (mAU (миллиединицы поглощения)) относительно времени (минуты) для многомерного разделения транс-стильбена оксида (TSO) с использованием системы с конфигурациями трех пробоотборных петель (6 мкл, 12 мкл, 24 мкл).
Фиг. 12 представляет собой наложение хроматограмм измерений поглощения в УФ (ультрафиолетовая область) (mAU) относительно времени (минуты) для многомерного разделения оцениваемого интервала концентрации (0,005-0,25 мг/мл) TSO.
Фиг. 13 представляет собой наложение хроматограмм анализов образца лекарственного вещества А без внутреннего стандарта или с внутренним стандартом, полученных на системе 2D RPLC-SFC.
Фиг. 14А и Фиг. 14Б представляют собой традиционные хроматограммы SFC и 2D RPLC-SFC соответственно образца лекарственного вещества А, содержащего варьирующие уровни нежелательного энантиомера (в интервале от 0,1 до 2,0%).
Фиг. 15 представляет собой ряд хроматограмм, иллюстрирующих разделение 8 стереоизомеров образца лекарственного вещества А с использованием системы 2D RPLC-SFC. Нижняя хроматограмма показывает разделение 4 диастереомерных пар образца лекарственного вещества А в первом измерении - RPLC. Четыре верхние хроматограммы демонстрируют то, что каждая диастереомерная пара была дополнительно разделена во втором измерении - SFC.
Фиг. 16 представляет собой график высоты пиков относительно площади пиков из анализов TSO в интервале концентрации с использованием системы 2D RPLC-SFC с или без фокусирующей колонки, расположенной выше по потоку от головки колонки SFC.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Согласно изобретению предложены эффективные хроматографические системы и способы разделения и анализа сложных образцов, в частности, двумерные системы RPLC × SFC и способы их применения.
Термины в единственном числе в том виде, в котором они используются в данном документе, относятся к одному или более чем одному.
Ссылка в данном документе на «примерно» значение или параметр включает (и описывает) воплощения, которые направлены на данное значение или параметр как таковые. Например, описание, относящееся к «примерно X», включает описание «X».
Системы
В одном аспекте согласно изобретению предложена система двумерной хроматографии RPLC × SFC для разделения образца, где образец разделяется в первом измерении посредством RPLC, а затем во втором измерении посредством SFC, причем данная система содержит первый разделяющий блок для жидкостной хроматографии с обращенной фазой, второй разделяющий блок для сверхкритической жидкостной хроматографии и промежуточное устройство, которое представляет собой жидкостный направляющий блок. Жидкостный направляющий блок содержит много пробоотборных петель, причем каждая имеет заданный объем и может быть помещена в жидкостный путь первого разделяющего блока для отбора фракций, элюированных из колонки RPLC. Пробоотборную петлю, в которую была отобрана фракция, затем помещают в жидкостный путь второго разделяющего блока для переноса фракции, отобранной в пробоотборную петлю, на колонку SFC для дальнейшего разделения. В системе по настоящему изобретению по меньшей мере одна из пробоотборных петель содержит захватывающую колонку, содержащую неподвижную фазу, для удерживания аналитов, элюированных из колонки RPLC, при одновременном обеспечении прохождения подвижной фазы. Новая конструкция промежуточного устройства обеспечивает сопряжение RPLC и SFC.
В некоторых воплощениях предложена двумерная хроматографическая онлайн система, использующая RPLC в первом измерении и SFC во втором измерении, посредством которой может достигаться одновременный ахиральный и хиральный анализ фармацевтических соединений. В некоторых воплощениях промежуточное устройство содержит 2-позиционный/8-портовый переключающий клапан с захватывающими С-18 колонками малого объема. Интересующие пики из колонки RPLC первого измерения эффективно фокусировались в виде острых концентрационных импульсов на захватывающей(щих) колонке(ках) малого объема (например, на С-18 захватывающей(щих) колонке(ках)) и затем инъецировались в колонку SFC второго измерения. Разделение RPLC в первом измерении обеспечивает результат в виде ахиральной чистоты, и разделение SFC во втором измерении обеспечивает результат в виде хиральной чистоты (энантиомерный избыток).
Обращаясь к графическим материалам, на Фиг. 1 показана обзорная схема типичной системы многомерной хроматографии 10. Первый разделяющий блок 20 и второй разделяющий блок 40А и 40В соединяются с использованием первого жидкостного направляющего блока 30. Направленный поток первой подвижной фазы через первый разделяющий блок 20 к первому жидкостному направляющему блоку 30 показан стрелкой 50. Вторая подвижная фаза, направленный поток которой показан стрелкой 60, перемещается через расположенный выше по потоку подблок 40А второго разделяющего блока в первый жидкостный направляющий блок 30 и затем направляется обратно через расположенный ниже по потоку подблок 40В второго разделяющего блока в направлении, указанном стрелкой 70.
В некоторых воплощениях система содержит одно или более чем одно управляющее устройство, соединенное функциональным образом с одним или более чем одним компонентом системы для управления работой системы, например, насосными узлами, инжектором образца, первым жидкостным направляющим блоком (промежуточным устройством) и детекторами, которые присутствуют. Управляющее устройство может включать компьютерную систему, оснащенную подходящей программой для управления работой каждого из индивидуальных устройств и для автоматизированного анализа образцов (например, программа Instrument Control от Agilent или программа Automation Studio). Обращаясь к Фиг. 1, управляющее устройство 80 присоединено функциональным образом к по меньшей мере одному из следующих: первый разделяющий блок 20, первый направляющий блок 30 и второй разделяющий блок 40А и 40В.
Состав подвижной фазы в хроматографии можно поддерживать постоянным во времени, что в данной области известно как изократический способ. В качестве альтернативы, состав подвижной фазы может изменяться во времени, что в данной области известно как градиентный способ.
Первый разделяющий блок системы хроматографии 2D RPLC × SFC содержит первый насосный узел для продвижения подвижной фазы через первый разделяющий блок, инжектор образца для введения образца в первый разделяющий блок и колонку жидкостной хроматографии с обращенной фазой (RPLC). Подвижная фаза для RPLC может содержать систему из двух растворителей (например, смеси вода-ацетонитрил и вода-метанол) и, возможно, некоторые добавки (например, уксусная кислота, трифторуксусная кислота, муравьиная кислота, гидроксид аммония, ацетат аммония, ацетат натрия и тому подобное). Насосный узел содержит один или более чем один насос для продвижения подвижной фазы для RPLC. В то время как подходящие насосы для жидкостной хроматографии хорошо известны в данной области, в некторых воплощениях насос может представлять собой поршневой насос, насос вытесняющего типа, пневматический насос и/или любую комбинацию по меньшей мере одного из приведенных выше. Система может содержать любой подходящий инжектор образца для инъецирования образца в повижную фазу для RPLC, такой как ручной инжектор для образца или автоматический пробоотборник. Колонка RPLC содержит неподвижную фазу с обращенной фазой, такую как шарики неподвижной С-18 фазы. Неподвижная фаза с обращенной фазой может быть основана на диоксиде кремния (например, содержать структуру ядра в виде силикагеля) или основана на полимере (например, содержать структуру ядра в виде органического полимера (например, полистирола)). Неограничивающие примеры веществ, подходящих для неподвижной фазы с обращенной фазой, включают С-18, С-8, С-4, фенил и фенильные производные, полярную заделанную фазу, фазу смешанного типа действия и тому подобное.
В некоторых воплощениях первый разделяющий блок дополнительно включает детектор, расположенный ниже по потоку от колонки RPLC, для выявления присутствия аналитов, элюированных из колонки RPLC. Можно использовать любой детектор, подходящий для выявления соединений в образце, такой как дифференциальный рефрактометр, ультрафиолетовый спектрофотометр, спектрофотометрический детектор, работающий в ультрафиолетовом-видимом диапазоне, детектор на основе заряженного аэрозоля, флуоресцентный детектор и масс-спектрометр. В некоторых воплощениях детектор для измерения RPLC представляет собой спектрофотометрический детектор, работающий в ультрафиолетовом-видимом диапазоне, детектор на основе заряженного аэрозоля, флуоресцентный детектор и масс-спектрометр.
Детектор может быть опционным в системе, где аналиты элюируются в заданное время, например, когда RPLC идет при заранее запрограммированных условиях, и время удерживания для интересующих аналитов является заданным.
Обращаясь к графическим материалам, на Фиг. 2А показана схема типичного первого разделяющего блока 20, соединенного с первым жидкостным направляющим блоком 30. Первый разделяющий блок 20 содержит первый насос 100 для продвижения первой подвижной фазы через первый разделяющий блок в направлении, указанном стрелкой 110. В некоторых воплощениях первая подвижная фаза может состоять только из одного растворителя. В некоторых воплощениях первая подвижная фаза может состоять из целого ряда смешанных растворителей. В некоторых воплощениях смешивание растворителей первой подвижной фазы может обеспечиваться выше по потоку от насоса 100, таким образом, что насос 100 получает смешанный растворитель в виде первой подвижной фазы. В некоторых воплощениях первая подвижная фаза хранится в приемнике 120. В некоторых воплощениях насос 100 может состоять из целого ряда индивидуальных насосных блоков со множеством насосных блоков, каждый из которых получает и прокачивает отличный растворитель или смесь растворителей таким образом, что смешивание происходит ниже по потоку относительно насоса 100. В некоторых воплощениях первая подвижная фаза может дополнительно содержать одну или более чем одну добавку. Неограничивающие примеры добавок, используемых в подвижной фазе RPLC, включают фосфорную кислоту, фосфатные буферы, уксусную кислоту, трифторуксусную кислоту, муравьиную кислоту, гидроксид аммония, ацетат аммония, ацетат натрия, алкилсульфонаты и тому подобное.
В некоторых воплощениях состав первой подвижной фазы можно поддерживать постоянным во времени (работа в изократическом режиме). В некоторых воплощениях состав первой подвижной фазы может изменяться во времени (работа в градиентном режиме). Для работы в градиентном режиме типично требуется два насоса - один для продвижения более полярного растворителя в подвижной фазе (например, воды); другой для продвижения менее полярного растворителя (например, ацетонитрила или метанола). В работе в изократическом режиме может использоваться система с двумя насосами, доставляющими два растворителя в постоянном соотношении, или система с одним насосом, продвигающим предварительно смешанную подвижную фазу.
Кроме того, схема на Фиг. 2А иллюстрирует инжектор образца 130, расположенный между насосом 100 и колонкой 150 жидкостной хроматографии с обращенной фазой (RPLC). Инжектор образца 130 вводит образец в первый разделяющий блок в направлении, указанном стрелкой 140. В некоторых воплощениях предоставляется инжектор образца 130 для добавления образца в первый разделяющий блок. В некоторых воплощениях инжектор для образца 130 может содержать клапан и пробоотборную петлю для введения образца в первый разделяющий блок. В некоторых воплощениях инжектор образца 130 может содержать клапан и пробоотборную петлю для введения образца в первый разделяющий блок. В некоторых воплощениях инжектор образца 130 может содержать автоматический пробоотборник.
Как показано на схеме Фиг. 2А, колонка RPLC 150 располагается ниже по потоку от инжектора образца 130. Колонка RPLC 150 может содержать неподвижную фазу с обращенной фазой. В некоторых воплощениях колонка RPLC 150 может содержать силикагель со связанными углеродными цепями. В некоторых воплощениях силикагель со связанными углеродными цепями может содержать углеродную цепь, которая имеет 18 углеродов в длину (т.е. силикагель с С18-обращенной фазой). В некоторых воплощениях силикагель со связанными углеродными цепями может содержать углеродную цепь, которая имеет 8 углеродов в длину (т.е. силикагель с С8-обращенной фазой). В некоторых воплощениях силикагель со связанными углеродными цепями может содержать углеродную цепь, которая имеет 4 углерода в длину (т.е. силикагель с С4-обращенной фазой). В некоторых воплощениях неподвижная фаза с обращенной фазой может содержать углеводородную цепь, связанную с полимерным ядром, таким как органический полимер (например, полистирол).
В некоторых воплощениях температура колонки RPLC 150 может поддерживаться на выбранном уровне. В некоторых воплощениях температура колонки RPLC 150 может поддерживаться в интервале от примерно 10°С до примерно 50°С. В некоторых воплощениях температура колонки RPLC 150 может поддерживаться на уровне примерно 40°С.
Возможно между колонкой RPLC 150 первого разделяющего блока 20 и первым жидкостным направляющим блоком 30 находится первый детектор 160 (Фиг. 2А). Первый детектор измеряет присутствие по меньшей мере части образца, элюированного из колонки RPLC 150. В некоторых воплощениях первый детектор 160 представляет собой оптический детектор. В некоторых воплощениях первый детектор 160 представляет собой спектрофотометрический детектор. В некоторых воплощениях первый детектор 160 выбран из одного или более чем одного из следующих: ультрафиолетовый спектрофотометр, спектрофотометрический детектор, работающий в ультрафиолетовой-видимой области, и флуоресцентный детектор.
Второй разделяющий блок системы хроматографии 2D RPLC × SFC содержит второй насосный узел для продвижения второй подвижной фазы через второй разделяющий блок и колонку сверхкритической жидкостной хроматографии (SFC). Подвижная фаза для SFC содержит сверхкритическую жидкость (например, сверхкритический диоксид углерода) и модификатор или сорастворитель (например, метанол, этанол и изопропиловый спирт), возможно одну или более чем одну добавку (например, гидроксид аммония). Второй насосный узел содержит один или более чем один насос для продвижения подвижной фазы в виде сверхкритической жидкости. В колонке SFC можно использовать любую неподвижную фазу, подходящую для SFC. Выбор вещества неподвижной фазы может зависеть от критериев разделения для второго измерения. В некоторых воплощениях колонка SFC содержит неподвижную фазу с нормальной фазой, такую как силикагель. В некоторых воплощениях система хроматографии дополнительно содержит детектор, расположенный ниже по потоку от колонки SFC для выявления присутствия аналитов, элюированных из колонки SFC. Можно использовать любые детекторы, подходящие для SFC, такие как УФ детектор, детектор на фотодиодной матрице, детектор на основе заряженного аэрозоля, флуоресцентный детектор и масс-спектрометр (МС).
Обращаясь к графическим материалам, на Фиг. 2Б показана схема типичного второго разделяющего блока, содержащего расположенный выше по потоку подблок 40А и расположенный ниже по потоку подблок 40В, связанные с первым жидкостным направляющим блоком 30. Расположенный выше по потоку подблок 40А второго разделяющего блока содержит второй насос 200 для продвижения второй подвижной фазы через второй разделяющий блок 40А и 40В в направлении, указанном стрелкой 210. Расположенный ниже по потоку подблок 40 В второго разделяющего блока содержит колонку SFC 240 и, возможно, фокусирующую колонку 260 и/или детектор 250. В некоторых воплощениях вторая подвижная фаза может состоять только из одного растворителя. В некоторых воплощениях вторая подвижная фаза может состоять из целого ряда смешанных растворителей. В некоторых воплощениях смешивание растворителей второй подвижной фазы может обеспечиваться выше по потоку от насоса 200 таким образом, что насос 200 получает смешанные растворители в виде второй подвижной фазы. В некоторых воплощениях вторая подвижная фаза хранится в приемнике 220. В некоторых воплощениях насос 200 может состоять из целого ряда индивидуальных насосных блоков, причем каждый из ряда насосных блоков получает и прокачивает отличный растворитель или смесь растворителей таким образом, что смешивание происходит ниже по потоку от насоса 200.
В некоторых воплощениях можно поддерживать постоянный состав второй подвижной фазы во времени (работа в изократическом режиме). В некоторых воплощениях состав второй подвижной фазы может изменяться во времени (работа в градиентном режиме). В то время как подходящие насосы для сверхкритической жидкостной хроматографии хорошо известны в данной области, в некоторых воплощениях насос может представлять собой поршневой насос, насос вытесняющего типа, пневматический насос и/или любую комбинацию по меньшей мере одного из приведенных выше.
Как показано на Фиг. 2Б, расположенный выше по потоку подблок 40А второго разделяющего блока связан с первым жидкостным направляющим блоком 30, расположенным ниже по потоку от насоса 200. Направленный поток второй подвижной фазы через расположенный ниже по потоку подблок 40Б второго разделяющего блока, расположенного ниже по потоку от первого жидкостного направляющего блока 30, показан стрелкой 230. Колонка SFC 240 может содержать неподвижную фазу с нормальной фазой. В некоторых воплощениях неподвижной фазой с нормальной фазой является диоксид кремния. В некоторых воплощениях неподвижной фазой с нормальной фазой является диоксид кремния, модифицированный цианопропильными функциональными группами. В некоторых воплощениях неподвижной фазой с нормальной фазой является диоксид кремния, модифицированный аминопропильными функциональными группами. В некоторых воплощениях неподвижной фазой с нормальной фазой является диоксид кремния, модифицированный этилпиридиновыми функциональными группами. В некоторых воплощениях неподвижной фазой с нормальной фазой является диоксид кремния, модифицированный функциональными группами на основе сульфоновой кислоты и/или фенильными функциональными группами. В некоторых воплощениях неподвижной фазой с нормальной фазой является диоксид кремния, модифицированный 1,2-дигидроксипропилпропилэфирными функциональными группами. В некоторых воплощениях неподвижной фазой с нормальной фазой является полимер, такой как органический полимер (например, полистирол), модифицированный функциональной группой (например, цианопропильной, аминопропильной, этилпиридиновой, на основе сульфоновой кислоты, фенильной или 1,2-дигидроксипропилпропилэфирной функциональной группой). Другие примеры веществ, подходящих для применения в неподвижной фазе для SFC, включают диоксид кремния, этилпиридин, циано, эпикдиол, пиридиламид, нитро и тому подобное.
В некоторых воплощениях температура колонки SFC 240 может поддерживаться на выбранном уровне. В некоторых воплощениях температура колонки SFC 240 может поддерживаться в интервале от примерно 35°С до примерно 45°С. В некоторых воплощениях температура колонки SFC 240 может поддерживаться на уровне примерно 40°С.
Обращаясь к Фиг. 2Б, в некоторых воплощениях возможная фокусирующая колонка 260 располагается выше по потоку от колонки SFC 240. Фокусирующая колонка 260 содержит неподвижную фазу. В некоторых воплощениях неподвижная фаза может содержать неподвижную фазу с обращенной фазой. В некоторых воплощениях неподвижная фаза с обращенной фазой может содержать силикагель со связанными углеродными цепями. В некоторых воплощениях силикагель со связанными углеродными цепями может содержать углеродную цепь, которая имеет длину 18 углеродов (т.е. силикагель с С18-обращенной фазой). В некоторых воплощениях силикагель со связанными углеродными цепями может содержать углеродную цепь, которая имеет длину 8 углеродов (т.е. силикагель с С8-обращенной фазой). В некоторых воплощениях силикагель со связанными углеродными цепями может содержать углеродную цепь, которая имеет длину 4 углерода (т.е. силикагель с С4-обращенной фазой). В некоторых воплощениях неподвижная фаза с обращенной фазой может содержать углеродную цепь (такую как С-18, С-8 или С-4 цепь), связанную с полимерным ядром, таким как органический полимер (например, полистирол). В общем, фокусирующая колонка будет иметь обращенную фазу, соответствующую обращенной фазе, используемой в первичном измерении и/или в захватывающей колонке, используемой в промежуточном устройстве.
В некоторых воплощениях температура фокусирующей колонки 260 может поддерживаться на выбранном уровне. В некоторых воплощениях фокусирующая колонка может поддерживаться при той же самой температуре, что и колонка SFC. В некоторых воплощениях температура фокусирующей колонки 260 может поддерживаться в интервале от примерно 35°С до примерно 45°С. В некоторых воплощениях температура фокусирующей колонки 260 может поддерживаться на уровне примерно 40°С.
Ниже по потоку от колонки SCF 240 располагается второй детектор 250 (Фиг. 2Б). Данный детектор измеряет присутствие и количества аналитов, элюированных из колонки SCF 240. В некоторых воплощениях второй детектор 250 представляет собой оптический детектор. В некоторых воплощениях второй детектор 250 представляет собой спектрофотометрический детектор. В некоторых воплощениях второй детектор 250 выбран из одного или более чем одного из следующих: дифференциальный рефрактометр, ультрафиолетовый спектрофотометр, спектрофотометрический детектор, работающий в ультрафиолетовом-видимом диапазоне, флуоресцентный детектор и инфракрасный спектрометр. В некоторых воплощениях второй детектор 250 представляет собой масс-спектрометр. В некоторых воплощениях масс-спектрометр может быть выбран из одного или более чем одного из следующих: секторный прибор, прибор с квадрупольным масс-фильтром, времяпролетный прибор, прибор с ионной ловушкой, прибор с квадрупольной ионной ловушкой, прибор с линейной квадрупольной ионной ловушкой, прибор с орбитальной ловушкой, прибор, работающий на основе ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье, и любая комбинация или гибрид перечисленных типов приборов. Как хорошо известно в данной области, образец вводится в масс-спектрометр посредством методик ионизации, таких как бомбардировка быстрыми атомами, химическая ионизация, химическая ионизация при атмосферном давлении, электрораспылительная ионизация и наноэлектрораспылительная ионизация, но не ограничивающихся ими. В некоторых воплощениях образец вводится в масс-спектрометр посредством химической ионизации при атмосферном давлении или электрораспылительной ионизации.
В некоторых воплощениях расположенный ниже по потоку второй разделяющий блок 40В может дополнительно содержать сборщик фракций в месте, после или параллельно второму детектору.
Возможно, в некоторых воплощениях управляющее устройство 80 соединено функциональным образом с по меньшей мере одним из следующих: насос 100 и/или 200, инжектор образца 130, первый детектор 160, первый жидкостный направляющий блок 30 и второй детектор 250.
Промежуточное устройство между двумя измерениями в системе 2D хроматографии управляет направлением аналитов, разделенных и элюированных из первого измерения во второе измерение для дальнейшего разделения и определяет режим работы. Система 2D хроматографии по настоящему изобретению сконфигурирована для первоначального разделения образца в первом разделяющем блоке посредством RPLC и последующего введения по меньшей мере части образца, элюированного из колонки RPLC, во второй разделяющий блок для дальнейшего разделения посредством SFC.
Первый жидкостный направляющий блок содержит целый ряд пробоотборных петель, причем указанный первый жидкостный направляющий блок соединяется с первым разделяющим блоком и со вторым разделяющим блоком, где по меньшей мере одна из целого ряда пробоотборных петель содержит захватывающую колонку, причем указанная захватывающая колонка содержит неподвижную фазу. Вещество неподвижной фазы в захватывающих колонках может быть таким же, как и вещество неподвижной фазы, используемое в колонке RPLC, или отличным от вещества неподвижной фазы, используемого в колонке RPLC. В некоторых воплощениях неподвижная фаза, используемая в захватывающей колонке, может содержать неподвижную фазу с обращенной фазой. В некоторых воплощениях неподвижная фаза с обращенной фазой может содержать силикагель со связанными углеродными цепями. В некоторых воплощениях силикагель со связанными углеродными цепями может содержать углеродную цепь, которая имеет 18 углеродов в длину (т.е. силикагель с С18-обращенной фазой). В некоторых воплощениях силикагель со связанными углеродными цепями может содержать углеродную цепь, которая имеет 8 углеродов в длину (т.е. силикагель с С8-обращенной фазой). В некоторых воплощениях силикагель со связанными углеродными цепями может содержать углеродную цепь, которая имеет 4 углерода в длину (т.е. риликагель с С4-обращенной фазой). В некоторых воплощениях неподвижная фаза с обращенной фазой может содержать углеродную цепь (такую как С-18, С-8 или С-4 цепь), связанную с полимерным ядром, таким как органический полимер (например, полистирол).
Первый жидкостный направляющий блок в некоторых воплощениях включает направляющий механизм (такой как переключающий клапан), содержащий целый ряд портов, каналов, обеспечивающих ток жидкости между портами, и пробоотборных петель, соединенных с портами. В некоторых воплощениях направляющий механизм представляет собой 2-позиционный/8-портовый переключающий клапан. В некоторых воплощениях направляющий механизм представляет собой 2-позиционный/10-портовый переключающий клапан. В некоторых воплощениях направляющий механизм представляет собой 2-позиционный/4-портовый двойной клапан. В некоторых воплощениях направляющий механизм представляет собой 2-позиционный 8-портовый или 10-портовый переключающий клапан.
В некоторых воплощениях первый жидкостный направляющий блок 2D RPLC × SFC системы содержит две пробоотборные петли; где одна из двух пробоотборных петель находится в жидкостном сообщении с первым разделяющим блоком, и другая одна из двух пробоотборных петель находится в жидкостном сообщении со вторым разделяющим блоком. В некоторых воплощениях одна из двух пробоотборных петель содержит захватывающую колонку, содержащую неподвижную фазу. В некоторых воплощениях каждая из обеих пробоотборных петель содержит захватывающую колонку, содержащую неподвижную фазу.
На Фиг. 3А показана схема типичного первого жидкостного направляющего блока 30, связанного с первым разделяющим блоком 20 и вторым разделяющим блоком 40А и 40В. В данном случае промежуточный жидкостный направляющий блок включает направляющий механизм 300, который в одном варианте представляет собой 2-позиционный/8-портовый переключающий клапан, содержащий целый ряд портов 305А-305Н, целый ряд каналов 310A-310D и две пробоотборные петли - 315 и 320. Как показано на Фиг. 3А, целый ряд каналов 310A-310D показан в первой из двух возможных конфигураций.
Как проиллюстрировано примерами на Фиг. 3А, первый разделяющий блок 20 соединяется с направляющим механизмом 300 в порту 305А. Первая подвижная фаза продвигается через первый разделяющий блок 20 в направлении, указанном стрелкой 325, и направляющий механизм 300 направляет первую подвижную фазу в пробоотборную петлю 315 посредством канала 310А. Пробоотборная петля 315 соединяется с направляющим механизмом 300 в порту 305В и в порту 305F. Пробоотборная петля 315 содержит захватывающую колонку 330, причем указанная захватывающая колонка содержит неподвижную фазу.
Направляющий механизм 300 направляет первую подвижную фазу в расположенный ниже по потоку приемник 340 в направлении, указанном стрелкой 345, посредством канала 310С. В некоторых воплощениях расположенный ниже по потоку приемник 340 представляет собой приемник отходов. В некоторых воплощениях расположенный ниже по потоку приемник 340 представляет собой сборщик фракций.
Как показано на Фиг. 3А, расположенный выше по потоку подблок 40А второго разделяющего блока соединяется с направляющим механизмом 300 в порте 305G. Вторая подвижная фаза продвигается через второй разделяющий блок 40А в направлении, указанном стрелкой 350, и направляющий механизм 300 направляет вторую подвижную фазу в пробоотборную петлю 320 посредством канала 310D. Пробоотборная петля 320 соединяется с направляющим механизмом 300 в порту 305Н и порту 305D, где первая подвижная фаза движется в направлении, указанном стрелкой 355. Направляющий механизм 300 соединяется с расположенным ниже по потоку подблоком 40В второго разделяющего блока через порт 305С. Направляющий механизм 300 направляет вторую подвижную фазу через расположенный ниже по потоку подблок 40В второго разделяющего блока в направлении, указанном стрелкой 360.
На схеме, проиллюстрированной на Фиг. 3В, показана такая же конфигурация первого жидкостного направляющего блока, что и показанная на Фиг. 3А, за исключением того, что целый ряд каналов 310A-310D направляющего механизма 300 на Фиг. 3А теперь находятся во втором из двух возможных положений, а именно - каналы 310Е-310Н, как показано на Фиг. 3Б. Направляющий механизм на Фиг. 3Б направляет первую подвижную фазу из первого разделяющего блока 20 в направлении, указанном стрелкой 325, через канал 310Н в пробоотборную петлю 320. Пробоотборная петля 320 соединяется с направляющим механизмом 300 в порту 305Н и в порту 305D, где первая подвижная фаза направляется в расположенный ниже по потоку приемник 340 в направлении, указанном стрелкой 345, через канал 310F.
Как показано на Фиг. 3Б, расположенный выше по потоку подблок 40А второго разделяющего блока соединяется с направляющим механизмом 300 в порту 305G. Вторая подвижная фаза продвигается через второй разделяющий блок 40А в направлении, указанном стрелкой 350, и направляющий механизм 300 теперь направляет вторую подвижную фазу в пробоотборную петлю 315 посредством канала 310G. Пробоотборная петля 315 соединяется с направляющим механизмом в порту 305В и в порту 305F. Направляющий механизм 300 напрвляет поток второй подвижной фазы через захватывающую колонку 330 в направлении, указанном стрелкой 365. По сравнению с Фиг. 3А, направляющий механизм 300, как показано на Фиг. 3Б, направляет поток второй подвижной фазы через пробоотборную петлю 315 в направлении, которое является противоположным потоку первой подвижной фазы через ту же самую пробоотборную петлю 315, показанную на Фиг. 3А. Эта приведенная в качестве примера конфигурация направляющего механизма 300 направляет поток подвижных фаз через пробоотборную петлю 315 таким образом, что в данной области известно как «противопоточный» способ.
Типичные схемы, проиллюстрированные на Фиг. 3В и Фиг. 3Г, показывают аналогичную конфигурацию первого жидкостного направляющего блока, показанного на Фиг. 3А и Фиг. 3Б, за исключением того, что, как показано на Фиг. 3В и Фиг. 3Г, захватывающая колонка 370 располагается на пробоотборной петле 320. Направляющий механизм 300 направляет поток первой подвижной фазы через пробоотборную петлю 320, содержащую захватывающую колонку 370, в направлении, указанном стрелкой 355 (Фиг. 3В). На Фиг. 3Г целый ряд каналов 310A-310D направляющего механизма 300 находится во втором из двух возможных положений. Направляющий механизм 300 направляет вторую подвижную фазу из расположенного выше по потоку подблока 40А второго разделяющего блока через пробоотборную петлю 320, содержащую захватывающую колонку 370, и через расположенную ниже по потоку часть второго разделяющего блока 40В в направлении, указанном стрелками 355 и 360. Как проиллюстрировано примерами на Фиг. 3В и Фиг. 3Г, поток первой подвижной фазы и второй подвижной фазы движется через захватывающую колонку 370 в том же самом направлении, что известно в данной области как «сопоточный» сособ.
В случае системы с использованием 2-позиционного/8-портового переключающего клапана (300) в промежуточном жидкостном направляющем блоке, сопоточные/противоточные конфигурации могут управляться помещением захватывающей колонки (370) в пробоотборную петлю 315 или 320. В качестве альтернативы, сопоточные/противоточные конфигурации могут быть изменены посредством переключения порта соединения для расположенного выше по потоку подблока 40А и расположенного ниже по потоку подблока 40В второго разделяющего блока с промежуточным жидкостным направляющим блоком.
На Фиг. 4А показана схема типичного первого жидкостного направляющего блока 30, соединенного с первым разделяющим блоком 20 и вторым разделяющим блоком 40А и 40В. В данном случае промежуточный жидкостный направлящий блок включает направляющий механизм 400, который в одном варианте представляет собой 2-позиционный/10-портовый переключающий клапан, содержащий целый ряд портов 405A-405J, целый ряд каналов 410А-410Е и две пробоотборные петли 415 и 420. Как показано на Фиг. 4А, показан целый ряд каналов 410А-410Е в первой из двух возможных конфигураций.
Как проиллюстрировано примером на Фиг. 4А, первый разделяющий блок 20 соединяется с направляющим механизмом 400 в порте 405А. Направляющий механизм 400 направляет первую подвижную фазу в одну из целого ряда пробоотборных петель 415 посредством канала 410А в направлении, указанном стрелкой 425. Пробоотборная петля 415 соединяется с направляющим механизмом 400 в порте 405В и в порте 405Е. Пробоотборная петля 415 содержит захватывающую колонку 430, причем указанная захватывающая колонка содержит неподвижную фазу.
Направляющий механизм 400 направляет первую подвижную фазу в расположенный ниже по потоку приемник 440 посредством канала 410С. В некоторых воплощениях расположенный ниже по потоку приемник 440 представляет собой приемник отходов. В некоторых воплощениях расположенный ниже по потоку приемник 440 представляет собой сборщик фракций.
Как показано на Фиг. 4А, второй разделяющий блок 40 соединяется с направляющим механизмом 400 в порте 405С. Направляющий механизм 400 направляет вторую подвижную фазу в пробоотборную петлю 420 посредством двух присоединенных каналов 410D и 410Е. Пробоотборная петля 420 соединяется с направляющим механизмом 400 в порте 405J и в порте 405G. Направляющий механизм 400 соединяется с расположенным ниже по потоку подблоком 40В второго разделяющего блока через порт 405Н. Направляющий механизм 400 направляет вторую подвижную фазу через расположенную ниже по потоку часть второго жидкостного направляющего блока 40В в направлении, указанном стрелкой 435.
На схеме, проиллюстрированной на Фиг. 4Б, показана такая же конфигурация первого жидкостного направляющего блока, что и показанная на Фиг. 4А, за исключением того, что целый ряд каналов 410А-410Е направляющего механизма 400 на Фиг. 4А теперь находится во втором из двух возможных положений, а именно каналы 410F-410J, как показано на Фиг. 4Б. Как показано на Фиг. 4А и Фиг. 4В, направляющий механизм 400 первого разделяющего блока 30 может быть сконфигурирован так, что направление потока первой подвижной фазы через пробоотборную петлю 415 (Фиг. 4А) осуществляется в том же самом направлении, указанном стрелкой 425, что и поток второй подвижной фазы через ту же самую пробоотборную петлю 415 (Фиг. 4Б). Эта показанная в качестве примера конфигурация направляющего механизма 400 направляет поток подвижных фаз через пробоотборную петлю 415 сопоточным способом.
В случае системы, использующей 2-позиционный/10-портовый переключающий клапан (400) в промежуточном жидкостном направляющем блоке, обе пробоотборные петли конфигурируются сопоточным способом, как показано на Фиг. 4А и Фиг. 4Б. Однако обе пробоотборные петли могут быть сконфигурированы противоточным способом путем переключения порта соединения для расположенного выше по потоку подблока 40А и расположенного ниже по потоку подблока 40В второго разделяющего блока с промежуточным жидкостным направляющим блоком.
На Фиг. 5А показана схема типичного первого жидкостного направляющего блока 30, связанного с первым разделяющим блоком 20 и вторым разделяющим блоком 40А и 40В. В данном случае промежуточный жидкостный направляющий блок включает направляющий механизм 500, который в одном варианте представляет собой 2-позиционный/4-портовый двойной клапан, содержащий целый ряд портов 505А-505Н, целый ряд каналов 510A-510D и две пробоотборные петли - 515 и 520. Как показано на Фиг. 5А, целый ряд каналов 510A-510D показан в первой из двух возможных конфигураций.
Как проиллюстрировано примером на Фиг. 5А, первый разделяющий блок 20 соединяется с направляющим механизмом 500 в порте 505G. Первая подвижная фаза продвигается через первый разделяющий блок 20 в направлении, указанном стрелкой 525, и направляющий механизм 500 направляет первую подвижную фазу через пробоотборную петлю 520 посредством канала 510А. Пробоотборная петля 520 соединяется с направляющим механизмом 500 в порте 505Н и порте 505В. Направляющий механизм 500 направляет первую подвижную фазу через пробоотборную петлю 520 в направлении, указанном стрелкой 535. Пробоотборная петля 520 содержит захватывающую колонку 530, причем указанная захватывающая колонка содержит неподвижную фазу.
Направляющий механизм 500 направляет первую подвижную фазу в расположенный ниже по потоку приемник 540 в направлении, указанном стрелкой 545, посредством канала 510В. В некоторых воплощениях расположенный ниже по потоку приемник 540 представляет собой приемник отходов. В некоторых воплощениях расположенный ниже по потоку приемник 540 представляет собой сборщик фракций.
Как показано на Фиг. 5А, расположенный выше по потоку подблок 40А второго разделяющего блока соединяется с направляющим механизмом 500 в порте 505Е. Вторая подвижная фаза продвигается через второй разделяющий блок 40А в направлении, указанном стрелкой 550, и направляющий механизм 500 направляет вторую подвижную фазу в пробоотборную петлю 515 посредством канала 510С. Пробоотборная петля 515 соединяется с направляющим механизмом 500 в порте 505F и порте 505С, где первая подвижная фаза движется в направлении, указанном стрелкой 555. Пробоотборная петля 515 содержит захватывающую колонку 560, причем указанная захватывающая колонка содержит неподвижную фазу. Направляющий механизм 500 соединяется с расположенным ниже по потоку подблоком 40В второго разделяющего блока через порт 505D. Направляющий механизм 500 направляет вторую подвижную фазу через расположенный ниже по потоку подблок 40В второго разделяющего блока в направлении, указанном стрелкой 565.
В некоторых воплощениях захватывающие колонки 530 и 560 содержат одинаковую неподвижную фазу. В некоторых воплощениях неподвижная фаза может содержать неподвижную фазу с обращенной фазой. В некоторых воплощениях захватывающие колонки 530 и 560 содержат отличную неподвижную фазу.
На схеме, проиллюстрированной на Фиг. 5Б, показана такая же конфигурация первого жидкостного направляющего блока, что и показанная на Фиг. 5А, за исключением того, что целый ряд каналов 510A-510D направляющего механизма 500 на Фиг. 5А теперь находится во втором из двух возможных положений, а именно - каналы 510E-510G, как показано на Фиг. 5Б. Направляющий механизм 500 на Фиг. 5Б теперь направляет первую подвижную фазу из первого разделяющего блока 20 в направлении, указанном стрелкой 525, через канал 510Е в пробоотборную петлю 515. Пробоотборная петля 515 соединяется с направляющим механизмом 500 в порте 505С и порте 505F, где первая подвижная фаза направляется в расположенный ниже по потоку приемник 540 в направлении, указанном стрелкой 545, через канал 510F. На Фиг. 5Б направляющий механизм 500 направляет поток первой подвижной фазы через пробоотборную петлю 515 в направлении, противоположном направлению второй подвижной фазы, через ту же самую пробоотборную петлю 515 на Фиг. 5А.
Как показано на Фиг. 5Б, расположенный выше по потоку подблок 40А второго разделяющего блока соединяется с направляющим механизмом 500 в порте 505Е. Вторая подвижная фаза продвигается через второй разделяющий блок 40А в направлении, указанном стрелкой 550, и направляющий механизм 500 теперь направляет вторую подвижную фазу в пробоотборную петлю 520 посредством канала 510G. Пробоотборная петля 520 соединяется с направляющим механизмом в порте 505 В и порте 505Н. Направляющий механизм 500 направляет поток второй подвижной фазы через захватывающую колонку 530 в направлении, указанном стрелкой 575. На Фиг. 5Б направляющий механизм 500 направляет поток второй подвижной фазы через пробоотборную петлю 520 в противоположном направлении, чем направление первой подвижной фазы через ту же самую пробоотборную петлю 520 на Фиг. 5А.
В случае системы с использованием 2-позиционного/4-портового двойного клапана (500) в промежуточном жидкостном направляющем блоке обе пробоотборные петли сконфигурированы противоточным способом, как описано на Фиг. 5А и Фиг. 5Б. Однако, если это желательно, обе пробоотборные петли могут быть сконфигурированы сопоточным способом путем переключения порта соединения для расположенного выше по потоку подблока 40А и расположенного ниже по потоку подблока 40В второго разделяющего блока с промежуточным жидкостным направляющим блоком.
В некоторых воплощениях первый жидкостный направляющий блок системы 2D RPLC × SFC содержит по меньшей мере три пробоотборные петли, и где по меньшей мере одна из пробоотборных петель находится в жидкостной изоляции от первого разделяющего блока и второго разделяющего блока. В такой системе одна пробоотборная петля находится в жидкостном сообщении с первым разделяющим блоком, одна пробоотборная петля находится в жидкостном сообщении со вторым разделяющим блоком, и одна или более чем одна пробоотборная петля находится в жидкостной изоляции от первого разделяющего блока и второго разделяющего блока. В некоторых воплощениях по меньшей мере одна из пробоотборных петель содержит захватывающую колонку, причем указанная захватывающая колонка содержит неподвижную фазу. В некоторых воплощениях по меньшей мере одна пробоотборная петля, которая содержит захватывающую колонку, причем указанная захватывающая колонка содержит неподвижную фазу, находится в жидкостной изоляции от первого разделяющего блока и второго разделяющего блока. В некоторых воплощениях первый жидкостный направляющий блок содержит целый ряд захватывающих колонок, причем каждая из них располагается в пробоотборной петле. В некоторых воплощениях каждая из захватывающих колонок загружается одинаковым веществом неподвижной фазы. В других воплощениях вещество неподвижной фазы может быть адаптировано для конкретных удерживаемых аналитов, таким образом, для разных фракций, элюированных из первого разделяющего блока, могут быть использованы разные вещества неподвижной фазы. В некоторых воплощениях неподвижная фаза может содержать неподвижную фазу с обращенной фазой. В некоторых воплощениях неподвижная фаза с обращенной фазой может содержать силикагель со связанными углеродными цепями. В некоторых воплощениях силикагель со связанными углеродными цепями может содержать углеродную цепь, которая имеет 18 углеродов в длину (т.е. силикагель с С18-обращенной фазой или С18 силикагель). В некоторых воплощениях силикагель со связанными углеродными цепями может содержать углеродную цепь, которая имеет 8 углеродов в длину (т.е. силикагель с С8-обращенной фазой или С8 силикагель). В некоторых воплощениях силикагель со связанными углеродными цепями может содержать углеродную цепь, которая имеет 4 углерода в длину (т.е. силикагель с С4-обращенной фазой или С4 силикагель). В некоторых воплощениях неподвижная фаза с обращенной фазой может содержать углеродную цепь (такую как С-18, С-8 или С-4 углеродная цепь), связанную с полимерным ядром, таким как органический полимер (например, полистирол).
Система, содержащая промежуточный жидкостный направляющий блок, где одна или более чем одна пробоотборная петля может быть помещена в жидкостную изоляцию от первого разделяющего блока и второго разделяющего блока обеспечивает функцию «парковки пика». Когда многочисленные фракции, разделенные и элюированные из хроматографии первого измерения, должны быть разделены далее во втором измерении, интервал времени между фракциями, элюированными из первого разделяющего блока, может быть недостаточным для того, чтобы первая фракция прошла через второй разделяющий блок. В то время как второй разделяющий блок используется для анализа более ранней фракции, более поздние фракции (или части) могут собираться на захватывающей колонке в дополнительных петлях и удерживаться в жидкостной изоляции («парковаться»), пока второй разделяющий блок не готов для анализа следующей фракции.
Обращаясь к графическим материалам, на Фиг. 6А показана схема типичного первого жидкостного направляющего блока 30, связанного с первым разделяющим блоком 20 и вторым разделяющим блоком 40А и 40Б. В данном случае промежуточный жидкостный направляющий блок включает первый направляющий механизм 600, который в одном варианте представляет собой 2-позиционный/4-портовый двойной клапан, содержащий целый ряд портов 605А-605Н, целый ряд каналов 610A-610D, пробоотборную петлю 615 и второй направляющий механизм 620, содержащий целый ряд портов, например, 625А-625Е, целый ряд пробоотборных петель, например, 630А-630С, целый ряд захватывающих колонок 635А-635Е и целый ряд каналов 675А и 675В. Пробоотборная петля 630В обеспечивает обходную петлю без захватывающей колонки. Как показано на Фиг. 6А, целый ряд каналов 610A-610D первого направляющего механизма 600 показан в первой из двух возможных конфигураций.
Как проиллюстрировано примером на Фиг. 6А, первый разделяющий блок 20 соединяется с направляющим механизмом 600 в порте 605G. Первая подвижная фаза продвигается через первый разделяющий блок 20 в направлении, указанном стрелкой 640, и направляющий механизм 600 направляет первую водвижную фазу через пробоотборную петлю 615 посредством канала 610А. Пробоотборная петля 615 соединяется с первым направляющим механизмом 600 в порте 605Н и порте 605В. Первый направляющий механизм 600 направляет первую подвижную фазу через пробоотборную петлю 615 в направлении, указанном стрелкой 645. Как показано на Фиг. 6А, направляющий механизм 600 направляет первую подвижную фазу к расположенному ниже по потоку приемнику 650 в направлении, указанном стрелкой 655, посредством канала 610В. В некоторых воплощениях расположенный ниже по потоку приемник 650 представляет собой приемник отходов. В некоторых воплощениях расположенный ниже по потоку приемник 650 представляет собой сборщик фракций.
Как показано на Фиг. 6А, расположенный выше по потоку подблок 40А второго разделяющего блока соединяется с направляющим мезанизмом 600 в порте 605Е. Вторая подвижная фаза продвигается через расположенный выше по потоку подблок 40А второго разделяющего блока в направлении, указанном стрелкой 660. Направляющий механизм 600 направляет вторую подвижную фазу в направлении, указанном стрелкой 665, к второму направляющему механизму 620 посредством канала 610С. Первый направляющий механизм 600 и второй направляющий механизм 620 соединяются через порт 605F и порт 625А.
На Фиг. 6А второй направляющий механизм 620 сконфигурирован для направления второй подвижной фазы через пробоотборную петлю 630В в направлении, указанном стрелкой 670, через канал 675А. Пробоотборная петля 630В соединяется со вторым направляющим механизмом 620 через порт 625В и порт 625Е, который соединяется с портом 625D через канал 675В. Второй направляющий механизм 620 и первый направляющий механизм 600 соединяются через порт 625F и порт 605С. Второй направляющий механизм 620 направляет поток второй подвижной фазы обратно к первому направляющему механизму 600 в направлении, указанном стрелкой 680. Первый направляющий механизм 600 направляет поток второй подвижной фазы через расположенный ниже по потоку подблок 40 В второго разделяющего блока через канал 610D в направлении, указанном стрелкой 690.
На Фиг. 6А показана конфигурация, где нет захватывающей колонки, находящейся в жидкостном сообщении либо с первым разделяющим блоком, либо со вторым разделяющим блоком. Например, данная конфигурация может быть установлена в системе, когда отсутствует интересующий пик, выходящий из колонки первого измерения, или он не анализируется в колонке второго измерения. Данная конфигурация также может быть установлена в системе, когда колонки в обоих разделяющих блоках находятся в режиме холостого хода, или колонки подвергаются регенерации/уравновешиванию. Каждая из захватывающих колонок 635А-635Е находится в жидкостной изоляции от первого и второго разделяющего блока.
На схеме, проиллюстрированной на Фиг. 6Б, показана та же самая конфигурация первого жидкостного направляющего блока, что и показанная на Фиг. 6А, за исключением того, что целый ряд каналов 610A-610D первого направляющего механизма 600 на Фиг. 6А теперь находится во втором из двух возможных положений 610Е-610Н, как показано на Фиг. 6Б. Направляющий механизм 600 на Фиг. 6Б теперь направляет первую подвижную фазу от первого разделяющего блока 20 в направлении, указанном стрелкой 640, через канал 610Е во второй направляющий механизм 620. Первый направляющий механизм 600 и второй направляющий механизм 620 соединяются в порте 605С и порте 625F. Дополнительно, на Фиг. 6Б второй направляющий механизм 620 теперь сконфигурирован для направления потока первой подвижной фазы через пробоотборную петлю 630А в направлении, указанном стрелкой 705. Пробоотборная петля 630А содержит захватывающую колонку 635А. Пробоотборная петля 630А соединяется со вторым направляющим механизмом 620 через порт 625F и порт 625С. Как показано на Фиг. 6Б, второй направляющий механизм 620 и первый направляющий механизм 600 соединяются через порт 625А и порт 605F. Второй направляющий механизм 620 направляет поток первой подвижной фазы обратно к первому направляющему механизму 600 в направлении, указанном стрелкой 710. Первый направляющий механизм 600 направляет первую подвижную фазу в расположенный ниже по потоку приемник 650 в направлении, указанном стрелкой 655, посредством канала 610F. В некоторых воплощениях расположенный ниже по потоку приемник 650 представляет собой приемник отходов. В некоторых воплощениях расположенный ниже по потоку приемник 650 представляет собой сборщик фракций. В некоторых воплощениях в качестве части второго направляющего механизма может использоваться Flexcube (Agilent).
В некоторых воплощениях конфигурация первого жидкостного направляющего блока 30, показанная на Фиг. 6Б, может использоваться для направления части образца, элюированного из первого разделяющего блока, для селективного удерживания на захватывающей колонке, например, 635А. В некоторых воплощениях захватывающая колонка может содержать неподвижную фазу. В некоторых воплощениях неподвижная фаза может содержать неподвижную фазу с обращенной фазой. В некоторых воплощениях неподвижная фаза с обращенной фазой может содержать силикагель со связанными углеродными цепями (например, С18 силикагель, С8 силикагель и С4 силикагель). В некоторых воплощениях неподвижная фаза с обращенной фазой может содержать углеродную цепь (такую как С-18, С-8 или С-4 углеродная цепь), связанную с полимерным ядром, таким как органический полимер (например, полистирол).
После удерживания пика на захватывающей колонке, например, 635А, направляющие механизмы 600 и 620 можно переключать или устанавливать в положения для обеспечения элюции и дальнейшего анализа удерживаемого пика, например, как показано на Фиг. 6В; или направляющие механизмы 600 и 620 можно переключать или устанавливать в положения для обеспечения парковки пика, удерживаемого на захватывающей колонке 635А, и отбора другого пика на другой захватывающей колонке, например, 635 В, как продемонстрировано на Фиг. 6Г.
На схеме, проиллюстрированной на Фиг. 6В, показана типичная конфигурация первого жидкостного направляющего блока 30, где первый направляющий механизм 600 сконфигурирован для направления потока первой водвижной фазы в расположенный ниже по потоку приемник 650, как показано на Фиг. 6А. Как проиллюстрировано на Фиг. 6В, первая подвижная фаза продвигается через первый разделяющий блок 20 в направлении, указанном стрелкой 640, и направляющий механизм 600 направляет первую подвижную фазу через пробоотборную петлю 615 посредством канала 610А. Пробоотборная петля 615 соединяется с первым направляющим механизмом 600 в порте 605Н и порте 605В. Первый направляющий механизм 600 направляет первую подвижную фазу через пробоотборную петлю 615 в направлении, указанном стрелкой 645. Как показано на Фиг. 6А, направляющий механизм 600 направляет первую подвижную фазу в расположенный ниже по потоку приемник 650 в направлении, указанном стрелкой 655, посредством канала 610В. В некоторых воплощениях расположенный ниже по потоку приемник 650 представляет собой приемник отходов. В некоторых воплощениях расположенный ниже по потоку приемник 650 представляет собой сборщик фракций.
На Фиг. 6В первый направляющий механизм 600 направляет поток второй подвижной фазы ко второму жидкостному направляющему механизму 620 в направлении, указанном стрелкой 665. Второй направляющий механизм 620 сконфигурирован для направления второй подвижной фазы в пробоотборную петлю 635А через канал 675D в направлении, указанном стрелкой 715. Пробоотборная петля 635А соединяется со вторым жидкостным направляющим механизмом через порт 625С и порт 625F. Второй жидкостный направляющий механизм 620 сконфигурирован для направления потока второй подвижной фазы в первый жидкостный направляющий механизм 600 через канал 675С в направлении, указанном стрелкой 680. Второй жидкостный направляющий механизм и первый жидкостный направляющий механизм соединяются через порт 625D и 605С, и вторая подвижная фаза направляется в расположенную ниже по потоку часть 40В второго разделяющего блока через канал 610D в направлении, указанном стрелкой 690.
На схеме, проиллюстрированной на Фиг. 6Г, показана такая же конфигурация первого жидкостного направляющего механизма 600 и второго жидкостного направляющего механизма 620, что и показанная на Фиг. 6Б, за исключением того, что на Фиг. 6Г второй жидкостный направляющий механизм теперь направляет поток первой подвижной фазы в пробоотборную петлю 630С в направлении, указанном стрелкой 720. Пробоотборная петля 630С соединяется с вторым жидкостным направляющим механизмом через порт 625G и порт 625Н. Канал 675F соединяет порт 625А и порт 625G. Канал 675Е соединяет порт 625D и порт 625Н. Как показано на Фиг. 6Б, пробоотборная петля 630С содержит захватывающую колонку 635В, которая может содержать неподвижную фазу, такую как неподвижная фаза, описанная в данном документе.
Как проиллюстрировано примером на Фиг. 6Г, часть образца, элюированная из первого разделяющего блока и селективно удерживаемая на захватывающей колонке 635А теперь находится в изоляции и от первого разделяющего блока 20, и от второго разделяющего блока 40А и 40В.
В некоторых воплощениях целый ряд захватывающих колонок 635А-635Е, таких как показанные на Фиг. 6А - Фиг. 6Г, может содержать одинаковую неподвижную фазу. В некоторых воплощениях неподвижная фаза может содержать неподвижную фазу с обращенной фазой. В некоторых воплощениях по меньшей мере одна из целого ряда захватывающих колонок 635А-635Е, таких как показанные на Фиг. 6А - Фиг. 6Г, может содержать такую же неподвижную фазу, как и вещество неподвижной фазы, используемое в колонке RPLC первого измерения. В некоторых воплощениях неподвижная фаза может содержать неподвижную фазу с обращенной фазой. В некоторых воплощениях неподвижная фаза с обращенной фазой может содержать силикагель со связанными углеродными цепями. В некоторых воплощениях силикагель со связанными углеродными цепями может содержать углеродную цепь, которая имеет 18 углеродов в длину (т.е. силикагель с С18-обращенной фазой). В некоторых воплощениях силикагель со связанными углеродными цепями может содержать углеродную цепь, которая имеет 8 углеродов в длину (т.е. силикагель с С8-обращенной фазой). В некоторых воплощениях силикагель со связанными углеродными цепями может содержать углеродную цепь, которая имеет 4 углерода в длину (т.е. силикагель с С4-обращенной фазой). В некоторых воплощениях неподвижная фаза с обращенной фазой может содержать углеводородную цепь (например, С-18, С-8 или С-4 цепь), связанную с полимерным ядром, таким как органический полимер (например, полистирол).
2D хроматографию можно проводить в режиме анализа части хроматограммы, псевдовсеохватывающем или всеохватывающем режимах. Анализ части хроматограммы обеспечивает характеризацию выбранной области хроматограммы, тогда как всеохватывающий режим обеспечивает характеризацию всей хроматограммы. Псевдовсеохватывающий режим обеспечивает всеохватывающее разделение для выбранных областей хроматограммы. См. Venkatramani, C.J. et al., J. Sep. Sci. 2014, 22, в печати. Промежуточное устройство в системе 2D RPLC × SFC, т.е. первый жидкостный направляющий блок, может быть адаптирован для работы в любом одном или более чем одном из режима анализа части хроматограммы, псевдовсеохватывающем и всеохватывающем режимах. Например, в режиме анализа части хроматограммы, можно использовать систему 2D RPLC × SFC, имеющую любой из промежуточных жидкостных направляющих блоков, показанных на Фиг. 3-6 в данном документе. Система, имеющая промежуточный жидкостный направляющий блок, содержащий две пробоотборные петли (каждая из которых имеет захватывающую колонку), как показано на Фиг. 5А и 5Б, может использоваться в псевдовсеохватывающем режиме, если длинная колонка RPLC в сочетании с низкой скоростью тока подвижной фазы в первом измерении обеспечивала бы полный прогон одной фракции в разделении второго измерения, в то время как другая фракция собирается во второй пробоотборной петле. Система, имеющая промежуточный жидкостный направляющий блок с функцией парковки образца, как показано на Фиг. 6А-6Г, может быть использована во всеохватывающем или псевдовсеохватывающем режиме, так как многочисленные фракции из разделения первого измерения могут собираться и удерживаться для последующего анализа во втором измерении, когда доступен второй разделяющий блок.
Критерии разделения во втором измерении могут зависеть от природы аналитов, подлежащих разделению. Для колонки SFC могут потребоваться разные вещества неподвижной фазы для того, чтобы обеспечивать оптимальное разделение для разных аналитов, элюированных из колонки RPLC первого измерения. Таким образом, предложена система 2D RPLC × SFC хроматографии, описанная в данном документе, в которой второй разделяющий блок содержит комплект колонок SFC, где колонки SFC в комплекте организованы в параллельной конфигурации; и второй жидкостный направляющий блок для направления потока второй подвижной фазы в желательную (или предварительно идентифицированную) колонку SFC в комплекте. В некоторых воплощениях второй разделяющий блок дополнительно содержит фокусирующую колонку, расположенную выше по потоку от каждой колонки SFC в комплекте колонок SFC. В некоторых воплощениях фокусирующая колонка содержит неподвижную фазу. В некоторых воплощениях неподвижная фаза может содержать неподвижную фазу с обращенной фазой. В некоторых воплощениях неподвижная фаза с обращенной фазой может содержать силикагель со связанными углеродными цепями. В некоторых воплощениях силикагель со связанными углеродными цепями может содержать углеродную цепь, которая имеет 18 углеродов в длину (т.е. силикагель с С18-обращенной фазой). В некоторых воплощениях силикагель со связанными углеродными цепями может содержать углеродную цепь, которая имеет 8 углеродов в длину (т.е. силикагель с С8-обращенной фазой). В некоторых воплощениях силикагель со связанными углеродными цепями может содержать углеродную цепь, которая имеет 4 углерода в длину (т.е. силикагель с С4-обращенной фазой). В некоторых воплощениях неподвижная фаза с обращенной фазой может содержать углеводородную цепь (например, С-18, С-8 или С-4 цепь), связанную с полимерным ядром, таким как органический полимер (например, полистирол).
Обращаясь к графическим материалам, Фиг. 7А и Фиг. 7Б представляют собой схемы типичного расположенного ниже по потоку подблока 40Б второго разделяющего блока, содержащего второй жидкостный направляющий блок 800 и комплект колонок SFC. Первый жидкостный направляющий блок 30 соединяется со вторым жидкостным направляющим блоком 800 в порте 805А. Первый жидкостный направляющий блок 30 направляет вторую подвижную фазу ко второму направляющему блоку 800 в направлении, указанном стрелкой 810. Второй направляющий блок 800 содержит целый ряд портов, таких как порт 805А и порт 805В, и целый ряд каналов, таких как канал 810А. Как показано на Фиг. 7А, второй жидкостный направляющий блок 800 направляет вторую подвижную фазу в желательную (или предварительно идентифицированную) колонку SFC 815А в направлении, указанном стрелкой 825. Возможно, фокусирующая колонка 820А располагается выше по потоку от колонки SFC 815А.
В некоторых воплощениях направляющий механизм 830 возможно располагается ниже по потоку от колонки SFC. Как показано на Фиг. 7А, направляющий механизм 830 направляет вторую подвижную фазу к детектору 250 через канал 810В в направлении, указанном стрелкой 835.
На Фиг. 7Б показан такой же комплект колонок SFC, что и проиллюстрированный на Фиг. 7А, но на Фиг. 7Б второй жидкостный направляющий блок 800 сконфигурирован для направления второй подвижной фазы из первого жидкостного направляющего блока во вторую желательную хроматографическую колонку SFC 815В. Как показано на Фиг. 7Б, вторая желательная хроматографическая колонка SFC соединяется со вторым жидкостным направляющим блоком 800 и направляющим механизмом 830 через порт 805Е и порт 805F. Второй жидкостный направляющий блок 800 направляет вторую подвижную фазу в направлении, указанном стрелкой 840. Возможно фокусирующая колонка 820 В располагается выше по потоку от колонки SFC 815В.
В некоторых воплощениях комплект колонок SFC содержит целый ряд колонок SFC, где индивидуальная колонка SFC, такая как 815А, может содержать такую же неподвижную фазу, что и по меньшей мере одна другая индивидуальная колонка SFC в комплекте, такая как 815В. В некоторых воплощениях комплект колонок SFC содержит целый ряд колонок SFC, где индивидуальная колонка SFC, такая как 815А, может содержать отличную неподвижную фазу от всех других индивидуальных колонок SFC в комплекте, таких как 815В. В некоторых воплощениях неподвижная фаза может содержать неподвижную фазу с нормальной фазой. В некоторых воплощениях неподвижная фаза с нормальной фазой представляет собой диоксид кремния. В некоторых воплощениях неподвижная фаза с нормальной фазой представляет собой диоксид кремния, модифицированный пропилциано функциональными группами. В некоторых воплощениях неподвижная фаза с нормальной фазой представляет собой диоксид кремния, модифицированный аминопропильными функциональными группами. В некоторых воплощениях неподвижная фаза с нормальной фазой представляет собой диоксид кремния, модифицированный этилпиридиновыми функциональными группами. В некоторых воплощениях неподвижная фаза с нормальной фазой представляет собой диоксид кремния, модифицированный функциональными группами на основе сульфоновой кислоты и/или фенильными функциональными группами. В некоторых воплощениях неподвижная фаза с нормальной фазой представляет собой диоксид кремния, модифицированный 1,2-дигидроксипропилпропилэфирными функциональными группами. В некоторых воплощениях неподвижная фаза с нормальной фазой представляет собой полимер, такой как органический полимер (например, полистирол), модифицированный функциональной группой (например, цианопропильной, аминопропильной, этилпиридиновой, на основе сульфоновой кислоты, фенильной или 1,2-дигидроксипропилпропилэфирной функциональной группой).
В некоторых воплощениях комплект колонок SFC содержит целый ряд фокусирующих колонок, где индивидуальная фокусирующая колонка, такая как 820А, может содержать такую же неподвижную фазу, что и по меньшей мере одна другая индивидуальная фокусирующая колонка в комплекте, такая как 820В. В некоторых воплощениях комплект колонок SFC содержит целый ряд фокусирующих колонок, где индивидуальная фокусирующая колонка, такая как 820А, может содержать отличную неподвижную фазу от всех других индивидуальных фокусирующих колонок в комплекте, таких как 820В.
На Фиг. 8А и Фиг. 8Б показана схема типичной системы 2D LC-SFC с промежуточным устройством, включающим электронно управляемый 2-позиционный/4-портовый двойной клапан V1 и захватывающую колонку Trap 1. Подвижная фаза от насоса 1 протекает через инжектор к первичной колонке с обращенной фазой. Элюент после выявления D1 протекает к отбирающему образцы клапану V1. В исходном положении/положении для анализа элюент из первичной колонки течет через пробоотборную петлю Loop 1, уходя в отходы. Подвижная фаза от насоса SFC течет через захватывающую колонку Trap 1 в колонку SFC (Фиг. 8А). Это доводит до кондиции захватывающую колонку Trap 1 и колонку SFC. Имеется непрерывный ток подвижной фазы через первичную и вторичную колонки. При элюции интересующих компонентов из первичной колонки клапан V1 переключается (положение захвата), переводя элюент первичной колонки в захватывающую колонку Trap 1 (Фиг. 8В). Переключение клапана V1 обратно в исходное положение/положение для анализа смывает компоненты образца из захватывающей колонки Т1 в колонку SFC. Разделение на колонке SFC отслеживается с использованием УФ детектора D2 и/или масс-спектрометра. Перестановка положений насоса и колонки SFC в клапане V1 будет приводить к противоточному потоку во время переключения клапана.
В 2D хроматографии, включающей повторяющиеся градиенты во втором измерении, частота перевода (отбора образцов) элюента первичной колонки во вторичную колонку зависит от скорости разрешения вторичной колонки, включая время повторного уравновешивания. В 2D LC-SFC разделение во втором измерении длится примерно 2-3 минуты, ограничивая частоту перевода элюента первичной колонки во вторичную колонку. Если многочисленные фракции аналита (например, диастереомерные пары в образце, содержащем смесь стереоизомеров) элюируются из первичной колонки в пределах 2-3 минут, промежуточное устройство 2D LC-SFC с одной захватывающей колонкой, показанное на Фиг. 8А и Фиг. 8Б, может быть непрактичным. Опцией является замедление скорости потока и градиента первичной колонки для того, чтобы удовлетворять потребностям отбора проб в связи со скоростью вторичной клонки. Однако это будет приводить к плохой форме пиков и, следовательно, препятствовать одновременному ахиральному/хиральному анализу. Это потребует промежуточного устройства с многочисленными захватывающими колонкми для удовлетворения потребностям отбора проб вторичной колонки.
На Фиг. 9 показана схема типичной системы 2D LC-SFC с промежуточным устройством с использованием комплекта захватывающих колонок и вторичных колонок SFC. Данная конфигурация используется проведения анализа многих отрезков хроматограммы. В исходном положении/положении для анализа, показанном на Фиг. 9, элюент из первичной колонки после выявления течет через полностью автоматизированный 2-позиционный/4-портовый двойной клапан V1, уходя в отходы. Подвижная фаза SFC течет следующим образом: от насоса SFC через клапан V1 до клапана V2 парковочного устройства, обратно до клапана V1 и затем до колонки(нок) SFC. В клапане V2 подвижная фаза SFC течет либо через обходную трубку, либо через комплект захватывающих колонок. Это доводит до кондиции захватывающую(щие) и SFC колонку(ки). Существует непрерывный поток подвижной фазы через первичную и вторичную колонки. При элюции интересующих компонентов из первичной колонки клапан V1 переключается (от исходного положения до положения перевода), переводя элюент первичной колонки в клапан V2 парковочного устройства (Out). Посредством переключения клапана V2 парковочного устройства туда и обратно между обходным режимом и положением захвата компоненты переводятся в разные захватывающие колонки. После перевода элюента первичной колонки клапан V1 переключается в исходное положение, перенаправляя элюент первичной колонки в отходы. Это обращает поток подвижной фазы, поступающей в клапан V2 (перевод от V2-Out до V2-In). Направление потока SFC в клапане V2 парковочного устройства обращается. Компоненты, удерживаемые в захватывающих колонках, затем вымываются обратно в колонку SFC или в комплект колонок SFC для дальнейшего разделения, в зависимости от применения. Комплект колонок SFC предоставляет системе дополнительную гибкость, так как разделение разных компонентов на одной хиральной неподвижной фазе может быть непрактичным. Разделение на вторичной колонке отслеживается с использованием УФ или MS детектора. Автоматическое промежуточное устройство является ключевым компонентом системы 2D LC-SFC, обеспечиващим одновременный ахиральный, хиральный анализ образца в одном хроматографическом цикле работы.
Подразумевается и понятно то, что в 2D хроматографической системе всякий и каждый вариант первого разделяющего блока, описанный в данном документе, можно объединять со всяким и каждым вариантом второго разделяющего блока, описанного в данном документе, и/или всякой и каждой комбинацией первого жидкостного направляющего блока, описанного в данном документе, как если бы всякая и каждая комбинация была описана индивидуально. Например, в некоторых воплощениях предложена система 2D хроматографа, содержащая:
(i) первый разделяющий блок, содержащий:
а) первый насосный узел для продвижения первой подвижной фазы через первый разделяющий блок,
б) инжектор образца для введения образца в первый разделяющий блок;
в) колонку жидкостой хроматографии с обращенной фазой (RPLC); и
г) первый детектор;
(ii) второй разделяющий блок, содержащий:
а) второй насосный узел для продвижения второй подвижной фазы через второй разделяющий блок,
б) колонку сверхкритической жидкостой хроматографии (SFC); и
в) второй детектор;
и
(iii) первый жидкостный направляющий блок, содержащий целый ряд пробоотборных петель, причем указанный первый жидкостный направляющий блок соединяется с первым разделяющим блоком и вторым разделяющим блоком,
где по меньшей мере одна из целого ряда пробоотборных петель содержит захватывающую колонку, причем указанная захватывающая колонка содержит неподвижную фазу;
и
где данная хроматографическая система сконфигурирована для первоначального разделения образца в первом разделяющем блоке и последующего введения по меньшей мере части образца, элюированного из колонки RPLC, во второй разделяющий блок.
В некоторых воплощениях предложена система 2D хроматографа, содержащая:
(i) первый разделяющий блок, содержащий:
а) первый насосный узел для продвижения первой подвижной фазы через первый разделяющий блок,
б) инжектор образца для введения образца в первый разделяющий блок;
в) колонку жидкостой хроматографии с обращенной фазой (RPLC); и
г) первый детектор;
(ii) второй разделяющий блок, содержащий:
а) второй насосный узел для продвижения второй подвижной фазы через второй разделяющий блок,
б) колонку сверхкритической жидкостой хроматографии (SFC); и
в) второй детектор;
(iii) первый жидкостный направляющий блок, содержащий две пробоотборные петли, причем указанный первый жидкостный направляющий блок соединяется с первым разделяющим блоком и вторым разделяющим блоком,
где одна из пробоотборных петель находится в жидкостном сообщении с первым разделяющим блоком, и другая одна из пробоотборных петель находится в жидкостном сообщении со вторым разделяющим блоком;
и где по меньшей мере одна из пробоотборных петель содержит захватывающую колонку, причем указанная захватывающая колонка содержит С-18 неподвижную фазу (например, С-18 диоксид кремния);
и
(iv) по меньшей мере одно управляющее устройство, соединенное функциональным образом с одним или более чем одним из следующих:
а) первый насосный узел;
б) инжектор образца;
в) первый детектор;
г) первый жидкостный направляющий блок;
д) второй насосный узел; и
е) второй детектор; и
где данная система хроматографии сконфигурирована для первоначального разделения образца в первом разделяющем блоке и последующего введения по меньшей мере части образца, элюированного из колонки RPLC, во второй разделяющий блок.
В одном варианте система 2D хроматографа дополнительно содержит по меньшей мере одно управляющее устройство, соединенное функциональным образом с одним или более чем одним из следующего: а) первый насосный узел; б) инжектор образца; в) первый детектор; г) первый жидкостный направляющий блок; д) второй насосный узел и е) второй детектор.
В некоторых воплощениях предложена система 2D хроматографа, содержащая:
(i) первый разделяющий блок, содержащий:
а) первый насосный узел для продвижения первой подвижной фазы через первый разделяющий блок,
б) инжектор образца для введения образца в первый разделяющий блок;
в) колонку RPLC, содержащую С-18 неподвижную фазу (например, С-18 диоксид кремния); и
г) первый детектор;
(ii) второй разделяющий блок, содержащий:
а) второй насосный узел для продвижения второй подвижной фазы через второй разделяющий блок,
б) колонку SFC, содержащую неподвижную фазу с нормальной фазой; и
в) второй детектор;
(iii) первый жидкостный направляющий блок, содержащий по меньшей мере три пробоотборные петли, причем указанный первый жидкостный направляющий блок соединяется с первым разделяющим блоком и вторым разделяющим блоком,
где одна из пробоотборных петель находится в жидкостном сообщении с первым разделяющим блоком, другая одна из пробоотборных петель находится в жидкостном сообщении со вторым разделяющим блоком, и по меньшей мере одна из пробоотборных петель находится в жидкостной изоляции от первого разделяющего блока и второго разделяющего блока;
и где по меньшей мере одна из пробоотборных петель содержит захватывающую колонку, причем указанная захватывающая колонка содержит С-18 неподвижную фазу (например, С-18 диоксид кремния);
и
(iv) по меньшей мере одно управляющее устройство, соединенное функциональным образом с одним или более чем одним из следующих:
а) первый насосный узел;
б) инжектор образца;
в) первый детектор;
г) первый жидкостный направляющий блок;
д) второй насосный узел; и
е) второй детектор;
и
где данная система хроматографии сконфигурирована для первоначального разделения образца в первом разделяющем блоке и последующего введения по меньшей мере части образца, элюированного из колонки RPLC, во второй разделяющий блок.
В одном варианте второй разделяющий блок содержит: а) комплект колонок SFC, где колонки SFC в комплекте организованы в параллельной конфигурации; и б) второй жидкостный направляющий блок для направления потока второй подвижной фазы в желательную (или заранее идентифицированную) колонку SFC в комплекте. В другом варианте второй разделяющий блок дополнительно содержит фокусирующую колонку (например, фокусирующую колонку, содержащую вещество С-18 неподвижной фазы (например, С-18 диоксид кремния)), расположенную выше по потоку от колонки SFC.
В некоторых воплощениях предложена система 2D хроматографа, содержащая:
(i) первый разделяющий блок, содержащий:
а) первый насосный узел для продвижения первой подвижной фазы через первый разделяющий блок,
б) инжектор образца для введения образца в первый разделяющий блок;
в) колонку RPLC; и
г) первый детектор;
(ii) второй разделяющий блок, содержащий:
а) второй насосный узел для продвижения второй подвижной фазы через второй разделяющий блок,
б) комплект колонок SFC, где колонки SFC в комплекте организованы в параллельной конфигурации;
в) второй жидкостный направляющий блок для направления потока второй подвижной фазы в желательную (или предварительно идентифицированную) колонку SFC в комплекте; и
г) второй детектор;
и
(iii) первый жидкостный направляющий блок, содержащий по меньшей мере три пробоотборные петли, причем указанный первый жидкостный направляющий блок соединяется с первым разделяющим блоком и вторым разделяющим блоком,
где одна из пробоотборных петель находится в жидкостном сообщении с первым разделяющим блоком, другая одна из пробоотборных петель находится в жидкостном сообщении со вторым разделяющим блоком, и по меньшей мере одна из пробоотборных петель находится в жидкостной изоляции от первого разделяющего блока и второго разделяющего блока;
и где по меньшей мере одна из пробоотборных петель содержит захватывающую колонку, причем указанная захватывающая колонка содержит неподвижную фазу;
и
где данная система хроматографии сконфигурирована для первоначального разделения образца в первом разделяющем блоке и последующего введения по меньшей мере части образца, элюированного из колонки RPLC, во второй разделяющий блок.
В некоторых вариантах колонка RPLC содержит С-18 неподвижную фазу (например, С-18 диоксид кремния). В некоторых вариантах колонка SFC содержит неподвижную фазу с нормальной фазой на основе диоксида кремния. В некоторых вариантах данная система дополнительно содержит по меньшей мере одно управляющее устройство, соединенное функциональным образом с одним или более чем одним из следующих:
а) первый насосный узел;
б) инжектор образца;
в) первый детектор;
г) первый жидкостный направляющий блок;
д) второй насосный узел; и
е) второй детектор.
Система 2D RPLC × SFC по настоящему изобретению решает проблемму, ассоциированную с несовместимостью растворителей, используемых в RPLC первого измерения и SFC второго измерения, посредством применения захватывающей колонки. Неподвижная фаза в захватывающей колонке удерживает аналиты при обеспечении протекания растворителей из RPLC. Это обеспечивает концентрирование аналитов в маленьком объеме для инъекции в SFC для дальнейшего разделения. Более высокое содержание воды в измерении SFC приводит к меньшему разрешению/чувствительности. Как продемонстрировано в Примере 2, при применении системы без захватывающей колонки только маленькая фракция может переноситься в колонку SFC без вредного влияния на разрешение и чувствительность анализа SFC (Фиг. 11). Переносимый объем 12 мкл приводил к умеренному расширению второго пика. При переносе фракции 24 мкл наблюдается значительное расширение второго пика, что переводится в значительную потерю чувствительности. В отличие от этого, как показано в Примере 3, при использовании системы, показанной на Фиг. 8А и 8Б, которая имеет захватывающую колонку, содержащую вещество С-18 неподвижной фазы (например, С-18 диоксид кремния), переносилось количество 160 мкл, и были получены превосходные разрешение и чувствительность (Фиг. 12). Данная система обеспечивает инъекцию пиков из RPLC первого измерения в SFC второго измерения с минимальным влиянием на разрешение и чувствительность анализа SFC. Например, в Примере 5 сравнивается разделение хирального лекарственного вещества с его энантиомером с использованием традиционной системы SFC и системы 2D LC-SFC по настоящему изобретению. Результаты продемонстрировали то, что и разрешение, и чувствительность сохранялись в 2D LC-SFC по сравнению с традиционной SFC. Ортогональный подход - условия с обращенной фазой и нормальной фазой в двух измерениях - можно использовать для увеличения уровня надежности оценки чистоты пиков HPLC из-за мультипликативной пиковой емкости многомерной системы.
Способы применения
Другим фактором, который следует рассматривать при разработке 2D систем, является способность работаль в режиме онлайн. Некоторые преимущества данного подхода включают легкость автоматизации, воспроизводимость анализа и точный перенос фракций из первого во второе измерение без какой-либо потери выхода или загрязнения.
Упускаемым из виду применением 2D систем является применение в высокопроизводительном анализе. В фармацевтической промышленности, например, активные фармацевтические ингредиенты (API) должны быть полностью охарактеризованы согласно руководствам ICH (Международная конференция по гармонизации). См. International Conference on Harmonisation (2006), Q3A(R2): Impurities in New Drug Substances. Для анализа чистоты разрабатываются два независимых аналитических способа. В способе RPLC обычно оценивается ахиральная чистота (способ определения примесей и родственных веществ), а в хиральном способе оценивалась бы хиральная чистота (количество нежелательного энантиомера). 2D система, которая может генерировать одновременные ахиральные и хиральные результаты, имела бы огромное влияние на протяжении процесса разработки API. Время приготовления образцов, хроматографического анализа и анализ данных были бы сокращены с обеспечением более высокопроизводительного анализа.
2
2
Авторы изобретения ранее сообщали о применении 2D RPLC × RPLC анализа для одновременного ахирального-хирального анализа (J. Sep. Sci. 2012, 35:1748). В мире API, однако, большинство хиральных способов представляют собой способы NPLC, и, таким образом, система 2D RPLC × NPLC имела бы большое значение в достижении одновременного ахирального-хирального анализа. Как отмечалось выше, несовместимость подвижных фаз обращенной фазы и нормальной фазы делала бы этот подход очень затруднительным. Сверхкритическую жидкостную хроматографию - нармальнофазную методику -также использовали для хирального анализа API в аналитическом, а также препаративном масштабе. Помимо того, что она является «зеленой» методикой, SFC превосходит NPLC из-за ее универсальности, более высокой эффективности, более высокой производительности и более быстрого времени анализа. Сверхкритические жидкости имеют низкую вязкость и высокую диффузионную способность (аналогичную газам) с обеспечением более высоких скоростей потока и более быстрого времени повторного уравновешивания, и имеют высокую плотность (аналогичную жидкостям) с обеспечением высокой сольватирующей способности. Первая онлайн 2D LC × SFC была описана Cortes et al. в 1992 (J. Microcol. Sep. 1992, 4:239-244). Промежуточное процедуры, которые разработали Cortes er al., являются довольно сложными и включают много стадий: устранение растворителя первого измерения путем пропускания газообразного азота, использование CO под давлением для переноса аналитов на поверхность раздела импактора и затем элюция аналитов с поверхности раздела импактора в капиллярную колонку SFC посредством программирования давления подвижной фазы в виде CO. Принятие этих промежуточных процедур для традиционных разделений 2D RPLC × SFC было бы ограниченным из-за стадии устранения растворителя. Cortes et al. использовали THF (тетрагидрофуран) (относительно низкая температура плавления - 66°С) в качестве подвижной фазы LC, тогда как самые традиционные разделений RPLC основаны на воде.
В настоящем изобретении продемонстрировано новое автоматизированное промежуточное устройство для сопряжения RPLC и SFC. Таким образом, предложены способы применения систем 2D RPLC × SFC хроматографии, описанных в данном документе, для разделения и анализа образцов, например, сложных смесей образцов, для которых может быть затруднительным достижение всеохватывающего анализа посредством 1D хроматографии или другой 2D хроматографии.
В некоторых воплощениях предложен способ проведения анализа образца (такого как сложный образец) с использованием системы хроматографии, описанной в данном документе, включающий: первоначальное разделение сложного образца на фракции посредством жидкостной хроматографии с обращенной фазой (RPLC) и дальнейшее разделение фракций из измерения RPLC посредством сверхкритической жидкостной хроматографии (SFC) во втором измерении. Разделение в первом измерении (например, RPLC на С-18 неподвижной фазе) основывается на различиях определенных характеристик или свойств компонентов в сложном образце (например, гидрофобности); тогда как разделение во втором измерении (например, SFC на неподвижной фазе на основе силикагеля с нормальной фазой) основывается на различиях других характеристик или свойств компонентов (например, хиральности), обеспечивая, таким образом, лучший всеохватывающий анализ, чем с использованием одномерной хроматографии.
N
Разработка хиральных хроматографических способов для соединений со многими хиральными центрами может быть сложной, так как число потенциальных стереоизомеров значительно возрастает с увеличением числа хиральных центров (число стереоизомеров равно 2, где N представляет собой число хиральных центров в соединении). Разработка хирального способа, главным образом, представляет собой способ проб и ошибок, где проводится обширный скрининг колонок и подвижных фаз для идентификации потенциальных лучших сочетаний. Однако разработка хиральных хроматографических способов для соединений с 3 или более чем 3 хиральными центрами может быть очень сложной из-за значительного увеличения числа стереоизомеров. Для фармацевтических соединений со многими хиральными центрами одной общей практикой является контроль энантиомерной чистоты входящих исходных веществ и демонстрация контроля процесса (возможности эпимеризации). Это ограничивало бы число потенциальных стереоизомеров в конечном API. Однако вызов данной стратегии контроля мог бы быть брошен некоторыми надзорными органами, предписывающими разработку хирального способа получения API.
Онлайн 2D RPLC × SFC по настоящему изобретению обеспечивает одновременный ахиральный и хиральный анализ (анализ посредством одной инъекции образца или в том же самом аналитическом цикле) фармацевтических образцов. Пик API в смеси водного и органического содержимого удерживался бы на С-18 захватывающей колонке малого объема и затем обратно смывался бы в колонку SFC второго измерения. Таким образом, в некоторых воплощениях предложен способ ахирального-хирального анализа образца, содержащего смесь стереоизомерных компонентов, с использованием системы хроматографии, описанной в данном документе, включающий: разделение диастереомерных компонентов в образце посредством RPLC в первом измерении, которое обеспеивает ахиральную чистоту образца; и разделение энантиомерных пар посредством SFC во втором измерении в том же самом аналитическом цикле, что дополнительно обеспечивает хиральную чистоту (% энантиомерного избытка) компонентов в образце. Ахиральная чистота образца может быть определена на основе хроматограммы из разделения RPLC, например, по относительной площади пика пиков на хроматограмме, полученных на УФ детекторе первого разделяющего блока. Хиральная чистота или энантиомерный избыток каждой энантиомерной пары могут быть определены на основе хроматограммы из разделения SFC, например, по относительной площади пика пиков на хроматограмме, полученных на УФ детекторе второго разделяющего блока, или на хроматограмме общих ионов, полученной на спектрометре MS, присоединенном ко второму разделяющему блоку.
Подразумевается и понятно, что в способах проведения анализа сложного образца или в способах одновременного ахирального-хирального анализа можно использовать всякое и каждое воплощение системы 2D хроматографа, как если бы всякая и каждая комбинация была индивидульно описана. Например, в некоторых воплощениях предложен способ одновременного ахирального-хирального анализа образца, содержащего смесь стереоизомерных компонентов, с использованием системы 2D хроматографии, причем указанная система 2D хроматографии содержит:
(i) первый разделяющий блок, содержащий:
а) первый насосный узел для продвижения первой подвижной фазы через первый разделяющий блок,
б) инжектор образца для введения образца в первый разделяющий блок;
в) колонку жидкостой хроматографии с обращенной фазой (RPLC); и
г) первый детектор;
(ii) второй разделяющий блок, содержащий:
а) второй насосный узел для продвижения второй подвижной фазы через второй разделяющий блок,
б) колонку для сверхкритической жидкостой хроматографии (SFC); и
в) второй детектор;
и
(iii) первый жидкостный направляющий блок, содержащий целый ряд пробоотборных петель, причем указанный первый жидкостный направляющий блок соединяется с первым разделяющим блоком и вторым разделяющим блоком,
где по меньшей мере одна из целого ряда пробоотборных петель содержит захватывающую колонку, причем указанная захватывающая колонка содержит неподвижную фазу;
причем указанный способ включает первоначальное разделение диастереомерных компонентов в образце посредством RPLC на первом разделяющем блоке и затем разделение энантиомерных пар посредством SFC на втором разделяющем блоке в том же самом аналитическом цикле.
В некоторых воплощениях предложен способ одновременного ахирального-хирального анализа образца, содержащего смесь стереоизомерных компонентов, с использованием системы 2D хроматографии, причем указанная система 2D хроматографии содержит:
(i) первый разделяющий блок, содержащий:
а) первый насосный узел для продвижения первой подвижной фазы через первый разделяющий блок,
б) инжектор образца для введения образца в первый разделяющий блок;
в) колонку RPLC; и
г) первый детектор;
(ii) второй разделяющий блок, содержащий:
а) второй насосный узел для продвижения второй подвижной фазы через второй разделяющий блок,
б) комплект колонок SFC, где колонки SFC в комплекте организованы в параллельной конфигурации;
в) второй жидкостный направляющий блок для направления потока второй подвижной фазы в желательную (или предварительно идентифицированную) колонку SFC в комплекте; и
г) второй детектор;
и
(iii) первый жидкостный направляющий блок, содержащий по меньшей мере три пробоотборные петли, причем указанный первый жидкостный направляющий блок соединяется с первым разделяющим блоком и вторым разделяющим блоком,
где одна из пробоотборных петель находится в жидкостном сообщении с первым разделяющим блоком, другая одна из пробоотборных петель находится в жидкостном сообщении со вторым разделяющим блоком, и по меньшей мере одна из пробоотборных петель находится в жидкостной изоляции от первого разделяющего блока и второго разделяющего блока;
и где по меньшей мере одна из пробоотборных петель содержит захватывающую колонку, причем указанная захватывающая колонка содержит неподвижную фазу;
причем указанный способ включает первоначальное разделение диастереомерных компонентов в образце посредством RPLC на первом разделяющем блоке и затем разделение энантиомерных пар посредством SFC на втором разделяющем блоке в том же самом аналитическом цикле.
В некоторых воплощениях предложен способ одновременного ахирального-хирального анализа образца, содержащего смесь стереоизомерных компонентов, с использованием системы 2D хроматографии, причем указанная система 2D хроматографии содержит:
(i) первый разделяющий блок, содержащий:
а) первый насосный узел для продвижения первой подвижной фазы через первый разделяющий блок,
б) инжектор образца для введения образца в первый разделяющий блок;
в) колонку RPLC; и
г) первый детектор;
(ii) второй разделяющий блок, содержащий:
а) второй насосный узел для продвижения второй подвижной фазы через второй разделяющий блок,
б) колонку SFC; и
в) второй детектор;
(iii) первый жидкостный направляющий блок, содержащий по меньшей мере три пробоотборные петли, причем указанный первый жидкостный направляющий блок соединяется с первым разделяющим блоком и вторым разделяющим блоком,
где одна из пробоотборных петель находится в жидкостном сообщении с первым разделяющим блоком, другая одна из пробоотборных петель находится в жидкостном сообщении со вторым разделяющим блоком, и по меньшей мере одна из пробоотборных петель находится в жидкостной изоляции от первого разделяющего блока и второго разделяющего блока;
и где по меньшей мере одна из пробоотборных петель содержит захватывающую колонку, причем указанная захватывающая колонка содержит неподвижную фазу;
и
(iv) по меньшей мере одно управляющее устройство, соединенное функциональным образом с одним или более чем одним из следующих:
а) первый насосный узел;
б) инжектор образца;
в) первый детектор;
г) первый жидкостный направляющий блок;
д) второй насосный узел; и
е) второй детектор;
причем указанный способ включает первоначальное разделение диастереомерных компонентов в образце посредством RPLC на первом разделяющем блоке и затем разделение энантиомерных пар посредством SFC на втором разделяющем блоке в том же самом аналитическом цикле.
Способы
В другом аспекте предложен способ разделения образца посредством многомерной хроматографии (такой как 2D RPLC × SFC), включающий подвергание части образца, захваченного на захватывающей колонке, причем указанная часть получена разделением образца жидкостной хроматографией с обращенной фазой (RPLC), причем указанная захватывающая колонка содержит неподвижную фазу, дальнейшему разделению посредством сверхкритической жидкостной хроматографии (SFC). В некоторых воплощениях предложен способ разделения образца, включающий следующие стадии: (i) захват по меньшей мере части образца на захватывающей колонке, причем указанную часть получают разделением образца жидкостной хроматографией с обращенной фазой (RPLC), причем указанная захватывающая колонка содержит неподвижную фазу; и (ii) подвергание части образца, захваченной на захватывающей колонке, дальнейшему разделению посредством сверхкритической жидкостной хроматографии (SFC).
В некоторых воплощениях данный способ дополнительно включает стадию разделения образца жидкостной хроматографией с обращенной фазой (RPLC), включающую: (i) введение образца в первую подвижную фазу; (ii) продвижение первой подвижной фазы, содержащей образец, через колонку RPLC; и (iii) разделение образца на колонке RPLC. В некоторых воплощениях данный способ дополнительно включает выявление присутствия компонента образца в первой подвижной фазе после пропускания через колонку RPLC. В некоторых воплощениях данный способ дополнительно включает элюирование части образца, захваченной на захватывающей колонке, с захватывающей колонки. В некоторых воплощениях данный способ дополнительно включает выявление компонента образца после дальнейшего разделения SFC.
В некоторых воплощениях данный способ дополнительно включает расположение захватывающей колонки на пути потока первой подвижной фазы ниже по потоку от колонки RPLC для захвата по меньшей мере части образца, разделенного колонкой RPLC, и/или переключение захватывающей колонки, несущей захваченную часть, на путь потока второй подвижной фазы для элюирования захваченной части с захватывающей колонки. Расположение/переключение захватывающей колонки в/из пути потока подвижной фазы блока RPLC/SFC может осуществляться в жидкостном напавляющем устройстве, располагающемся в системе 2D RPLC × SFC хроматографии между блоком RPLC и блоком SFC.
В некоторых воплощениях данный способ может быть осуществлен на системе 2D RPLC × SFC хроматографии, сконфигурированной для противоточной элюции аналитов, захваченных на захватывающей колонке. При таком варианте первая подвижная фаза протекает через захватывающую колонку в первом направлении, и часть образца, захваченная на захватывающей колонке, элюируется из захватывающей колонки посредством протекания второй подвижной фазы через захватывающую колонку в направлении, противоположном первому направлению. В некоторых воплощениях данный способ может быть осуществлен на системе 2D RPLC × SFC хроматографии, сконфигурированной для сопоточной элюции аналитов, захваченных на захватывающей колонке. При таком варианте первая подвижная фаза протекает через захватывающую колонку в первом направлении, и часть образца, захваченного на захватывающей колонке, элюируется из захватывающей колонки посредством протекания второй подвижной фазы через захватывающую колонку в том же самом направлении, что и первое направление.
В некоторых воплощениях предложен способ разделения образца многомерной хроматографией (например, системой 2D RPLC × SFC хроматографии, описанной в данном документе, или любым ее вариантом), включающий следующие стадии:
(i) введение образца в первую подвижную фазу;
(ii) продвижение первой подвижной фазы, содержащей образец, через колонку RPLC;
(iii) разделение образца на колонке RPLC;
(iv) выявление присутствия компонента образца в первой подвижной фазе после пропускания через колонку RPLC;
(v) захват на первой захватывающей колонке по меньшей первой части образца, разделенного на колонке RPLC, причем указанная первая захватывающая колонка содержит неподвижную фазу;
(vi) элюирование первой части образца, захваченного на первой захватывающей колонке, из первой захватывающей колонки;
(vii) подвергание первой части образца, захваченного на первой захватывающей колонке, дальнейшему разделению посредством SFC; и
(viii) выявление компонента образца после дальнейшего разделения посредством SFC.
В некоторых примерах 2D хроматографии, как, например, во всеохватывающем или псевдовсеохватывающем режиме, более чем одна фракция из RPLC первого измерения может быть захвачена на одной или более чем одной захватывающей колонке и высвобождена для анализа в SFC второго измерения. Таким образом, в некоторых воплощениях данный способ дополнительно включает следующие стадии:
(ix) захват на второй захватывающей колонке по меньшей мере второй части образца, разделенного на колонке RPLC, причем указанная вторая захватывающая колонка содержит неподвижную фазу;
(x) элюирование второй части образца, захваченного на второй захватывающей колонке, из второй захватывающей колонки;
(xi) подвергание второй части образца, захваченного на второй захватывающей колонке, дальнейшему разделению посредством SFC.
Данные стадии можно повторять много раз для захвата/высвобождения многочисленных фракций.
В некоторых воплощениях предложен способ разделения образца с использованием многомерной хроматографии (например, системы 2D RPLC × SFC хроматографии, описанной в данном документе, или любого ее варианта), включающий следующие стадии:
(i) введение образца в первую подвижную фазу;
(ii) продвижение первой подвижной фазы, содержащей образец, через колонку RPLC;
(iii) разделение образца на колонке RPLC;
(iv) выявление присутствия компонента образца в первой подвижной фазе после пропускания через колонку RPLC;
(v) расположение захватывающей колонки в пути потока первой подвижной фазы ниже по потоку относительно колонки RPLC;
(vi) захват на захватывающей колонке по меньшей части образца, разделенного на колонке RPLC, причем указанная захватывающая колонка содержит неподвижную фазу;
(vii) переключение захватывающей колонки, несущей захваченный белок, в путь потока второй подвижной фазы;
(viii) элюирование части образца, захваченного на захватывающей колонке, из захватывающей колонки;
(ix) подвергание части образца, захваченного на захватывающей колонке, дальнейшему разделению посредством SFC; и
(x) выявление компонента образца после дальнейшего разделения посредством SFC.
В некоторых воплощениях стадии (i)-(x) осуществляются в перечисленном порядке. В некоторых воплощениях стадии (iv)-(x) повторяются один или более чем один раз, пока не будут проанализированы все интересующие фракции.
В некоторых из данных воплощений колонка RPLC содержит неподвижную фазу с обращенной фазой, например, неподвижную фазу, содержащую вещество с обращенной фазой, такое как С-18 фаза (например, С-18 диоксид кремния), С-8 фаза (например, С-8 диоксид кремния), С-4 фаза (например, С-4 диоксид кремния) или другие вещества с обращенной фазой, описанные в данном документе. В некоторых из данных воплощений неподвижная фаза в захватывающей колонке содержит вещество с обращенной фазой, такое как С-18 фаза (например, С-18 диоксид кремния), С-8 фаза (например, С-8 диоксид кремния), С-4 фаза (например, С-4 диоксид кремния) или другие вещества с обращенной фазой, описанные в данном документе.
В некоторых из данных воплощений разделение SFC осуществляется на колонке SFC, содержащей неподвижную фазу с нормальной фазой, например, неподвижную фазу, содержащую силикагель с нормальной фазой или другие вещества с нормальной фазой, описанные в данном документе. В некоторых из данных воплощений разделение посредством SFC осуществляется на колонке SFC, выбранной из комплекта колонок SFC, организованных параллельно, причем каждая колонка SFC в комплекте может содержать неподвижную, которая может быть одинаковой или отличной. Вещество неподвижной фазы в колонке SFC может быть адаптировано для разделения специфических компонентов в образце.
В некоторых из данных воплощений способ может дополнительно включать фокусирование аналитов, элюированных из фракции, захваченной на захватывающей колонке, на фокусирующей колонке перед дальнейшим разделением на колонке SFC. Фокусирующая колонка содержит неподвижную фазу, которая может быть или может не быть такой же, что и неподвижная фаза, используемая в захватывающей колонке. В некоторых воплощениях фокусирующая колонка загружается неподвижной фазой, содержащей вещество с обращенной фазой, такое как С-18 фаза, С-8 фаза, С-4 фаза или другие вещества с обращенной фазой, описанные в данном документе.
Способы разделения образца, описанные в данном документе, могут быть адаптированы для осуществления на системе 2D RPLC × SFC хроматографии, описанной в данном документе или на любых ее описанных воплощениях или вариантах.
ПРИМЕРЫ
Следующие примеры приводятся для иллюстрации, но не ограничения изобретения.
Химические соединения и реактивы
2
4
Диоксид углерода (CO) приобретали у Praxair (Danbury, СТ, США). Ацетонитрил (ACN) покупали у Avantor's J.T. Baker (Center Valley, PA, США). Метанол (MeOH), изопропловый спирт (IPA), этиловый спирт (EtOH), 98,0%-100,0% муравьиную кислоту и 28,0%-30,0% гидроксид аммония (NHOH) покупали у EMD chemicals (Gibbstown, NJ, США). Формиат аммония покупали у Sigma Aldrich (St. Louis, МО, США). Воду Millipore уровня качества для HPLC получали из водораздатчика Purelab ultra от Millipore. Оксид транс-стильбена (TSO) покупали у TCI (Токио, Япония). Лекарственное вещество А, используемое в данном исследовании, было синтезировано в отделе химической технологии в Genentech, СА, США.
Пример 1 - оборудование
2
Аналитический прибор представляет собой приспособленную к требованиям заказчика двумерную систему 1260 2D-LC-SFC с масс-спектрометром от Agilent Technologies (Santa Clara, CA, США). Блок RPLC состоит из четверного насоса Agilent 1260 (G1311B), автоматического пробоотборника 1260 HiP ALS (G1367E), и многоволнового УФ детектора Agilent 1260 (G1365C). Во всей системе используются фитинги и труба из нержавеющей стали по причине высокого давления. Блок SFC состоит из бинарного насоса 1260 SFC (G4302A) с трехпозиционным клапаном управления растворителем, дегазирующего устройства 1260 HiP (G4225A), отсека термостатируемой колонки 1290 (G1316C), привода восьмипозиционного клапана Agilent 1290 infinity (G1170A), DAD (детектор на диодной матрице) Agilent 1260 (G1315C), оснащенного проточной ячейкой высокого давления, и управляющего модуля SFC Agilent 1260 infinity (G4301A). Часть потока SFC была направлена к квадрупольному MS Agilent 6120. Для создания потока подпитки 0,15 мл/мин для того, чтобы компенсировать потерю scC02 (сверхкритический CO), использовали насос Agilent 1260 iso (G1310B). Устанавливали Agilent 1290 Flexcube (G4227A) для обеспечения парковки многих пиков на разных захватывающих колонках с использованием сделанного на заказ 12-портового переключающего клапана. Управление прибором и отбор данных осуществлялись с использованием программы Agilent Chemstation (Santa Clara, CA, США).
Фиг. 10 представляет собой фотографию типичного клапана парковочного устройства (например, клапан V2, охарактеризованный на Фиг. 9). Как показано на Фиг. 10 имеются четыре захватывающие колонки, которые можно использовать для парковки пиков. Кроме того, как показано, имеется обходная петля, которая обеспечивает направление вниз по потоку либо подвижной фазы, происходящей из первого разделяющего блока, либо подвижной фазы, происходящей из второго разделяющего блока, без прохождения через захватывающую колонку.
Пример 2
Первичной целью данного исследования была оценка влияния объема подвижной фазы, переносимой из первого измерения во второе измерение, на разрешение разделения во втором измерении (SFC). Здесь многомерную систему хроматографии использовали для разделения энантимеров оксида транс-стильбена (TSO). Первое измерение (RPLC) было связано со вторым измерением (SFC) с использованием клапана с пробоотборной петлей, не имеющей захватывающей колонки. Пробоотборную петлю использовали для хранения выбранного объема первой подвижной фазы, содержащей часть образца, элюированного из первого измерения. Затем объем первой подвижной фазы, хранящийся в данной пробоотборной петле, переносился во второе измерение для дальнейшего разделения. Использовали пробоотборные петли, обеспечивающие хранение и последующий перенос 6 мкл, 12 мкл и 24 мкл подвижной фазы.
Для RPLC первого измерения использовали колонку ACQUITY UPLC HSS Т3 1,8 мкм 2,1×50 мм при изократических условиях: 90/10 ACN/вода при скорости потока 0,2 мл/мин. УФ выявление осуществлялось при 225 нм.
2
4
Для SFC второго измерения использовали колонку Chiralcel OD3 3,0 мкм 4,6 мм × 50 мм при 40°С с изократическим потоком 95:5 scCO (МРА)/IPA с 0,1% NHOH (МРВ). Скорость потока составляла 4,0 мл/мин с давлением на выходном отверстии 13 МПа и температурой форсунки 60°С.
Захватывающей петлей для данного эксперимента был гнутый капилляр (0,5 мм × 150 мм с внутренним объемом приблизительно 29 мкл). Тремя временами переключения были 0,03 мин, 0,06 мин и 0,12 мин, соответствующие переносимым объемам 6 мкл, 12 мкл и 24 мкл соответственно (на основе скорости потока 0,2 мл/мин).
Фиг. 11 представляет собой составную хроматограмму измерений поглощения в УФ (mAU - миллиединицы поглощения) с течением времени (минуты) для многомерного разделения TSO с использованием системы с конфигурациями трех пробоотборных петель (6 мкл, 12 мкл, 24 мкл). Как проиллюстрировано на Фиг. 11, возрастающий объем переноса первой подвижной фазы во второе измерение уменьшает разрешение и чувствительность во втором измерении.
Пример 3
В данном примере оценивали эффективность переноса образца из первого измерения (RPLC) во второе измерение (SFC) с использованием промежуточного устройства, содержащего захватывающую колонку.
Анализировали растворы стандарта - TSO - в концентрации, варьирующей от 0,005 мг/мл до 0,25 мг/мл, с использованием системы 2D LC-SFC, проиллюстрированной на Фиг. 8А и Фиг. 8Б. Второй детектор представлял собой УФ детектор. На основе результатов из Примера 2, оценивали захватывающую колонку с С18-обращенной фазой, имеющую маленький внутренний объем.
Хроматографическая колонка с обращенной фазой, используемая в первом измерении, представляла собой колонку Acquity UPLC HSS Т3 (50×2,1 мм, 1,8 мкм) от Waters Corporation (Milford, MA, США). Разделение в первом измерении проводили при изократических условиях с использованием 50:50 (0,05% муравьиная кислота в воде):(0,05% муравьиная кислота в ACN) при скорости тока 0,2 мл/мин. Колонку RPLC помещали в тепловой отсек для колонки SFC при 40°С. УФ выявление осуществлялось при 225 нм. Объем инъекции в первом измерении составлял 5 мкл.
2
Колонкой сверхкритической жидкостной хроматографии, используемой во втором измерении, была Chiralcel OD3 (50×4,6 мм, 3,0 мкм) от Chiral Technologies (West Chester, PA, США). Разделение во втором измерении осуществляли при изократическом потоке 95:5 (scCO):(изопропиловый спирт с 0,1% гидроксидом аммония). Используемая температура колонки составляла 40°С, и была установлена скорость потока 4,0 мл/мин с давлением на выходном отверстии 13 МПа и температурой форсунки 60°С. Применение фокусирующей колонки на головке колонки SFC является опционным.
Как обсуждалось выше, в промежуточном устройстве двух измерений использовали захватывающую колонку малого объема. В частности, использованной захватывающей колонкой была колонка SunShell С18 (5,0×1,0 мм, 5 мкм) от ChromaNik Technologies (Осака, Япония).
2
4
4
4
Стандартные растворы TSO (0,25; 0,1; 0,05; 0,025; 0,01; 0,005 мг/мл) готовили в 50:50 ACN/вода. Интервал 0,8 мин (~160 мкл), охватывающий вершину пика TSO, переносили в захватывающую колонку, которая была доведена до кондиции с использованием исходных условий SFC (100% scCO). Исходное выдерживание при 0% (IPA с 0,1% NHOH) сохраняли в течение первых 0,2 мин после переключения, и затем производили увеличение до 5% (IPA с 0,1% NHOH) за 0,1 мин с выдерживанием 2,35 мин. Данную колонку повторно уравновешивали с использованием 0% (IPA с 0,1% NHOH) в течение 0,2 мин. Образцы разделяли в тройных повторностях. Выявление во втором измерении осуществляли посредством УФ выявления при 225 нм.
Фиг. 12 представляет собой составную хроматограмму измерений поглощения в УФ (mAU) с течением времени (минуты) для многомерного разделения варьирующих концентраций TSO. Измерения, отраженные в верхней хроматограмме, следовали после разделения в первом измерении. Наблюдается то, что энантиомеры стандарта TSO совместно элюируются в первичной колонке с обращенной фазой. Пик, элюируемый из первичной колонки, после выявления направляли в захватывающую колонку, и осуществляли обратное вымывание во вторичную колонку для дальнейшего разделения. Как показано на Фиг. 12, измерения, отраженные в нижней хроматограмме, следовали после разделения во втором измерении. Здесь наблюдается то, что энантиомеры стандарта TSO во вторичной хиральной колонке разделяются до уровня фона.
Кроме того, как проиллюстрировано на Фиг. 12, графики наложения продемонстрировали линейность ответа детектора в оцениваемом интервале концентраций с коэффициентом корреляции, большим чем 0,99 (данные не показаны). В другом исследовании объемы, варьирующие от 10 до 100 мкл (посредством клапана V1, задающего временные интервалы), переносили во вторичную колонку SFC. Результаты данного исследования показали линейный ответ в оцениваемом интервале (результаты не показаны).
Пример 4
В данном примере систему 2D LC-SFC, описанную в Примере 3, дополнительно тестировали для демонстрации способности одновременного ахирального-хирального анализа образца лекарственного вещества А.
Хроматографической колонкой с обращенной фазой, используемой в первом измерении, была SunFire С18 (150×3,0 мм, 3,5 мкм) от Waters Corporation (Milford, MA, США), работающая при температуре 40°С. МРА (подвижная фаза А) представляла собой 5 мМ формиат аммония, рН 3,3, и МРВ (подвижная фаза Б) представляла собой 0,05% муравьиную кислоту в ACN. Программа MP для колонки RPLC представляла собой от 5% В до 25% В за 5 мин, до 29% В за 25 мин, до 90% В за 30 мин, и затем повторное уравновешивание при 5% В за 5 мин. Была установлена скорость потока 1,0 мл/мин. УФ выявление в первом измерении осуществлялось при 340 нм. Объем инъекции для первого измерения составлял 5 мкл.
2
Колонкой сверхкритической жидкостной хроматографии, используемой во втором измерении, была Chiralpak IСЗ (50×4,6 мм, 3 мкм) от Chiral Technologies (West Chester, PA, США), работающая при 40°С, с исходным потоком MP 65:35 scCO (МРА)/метанол с 0,1% гидроксида аммония (МРВ). Скорость потока составляла 4,0 мл/мин с давлением на выходном отверствии 13 МПа и температурой форсунки 60°С. В качестве захватывающей колонки использовали четыре колонки Zorbax Eclipse XDB-C18 (5,0×2,1 мм, 1,8 мкм) от Agilent Technologies (Santa Clara, CA, США).
Образец лекарственного вещества А готовили в концентрации 0,5 мг/мл в 25:75 ACN/вода с 0,05% FA. Интервал 0,1 мин (100 мкл), включающий вершину пика, переносили в предварительно доведенную до кондиции захватывающую колонку. Колонку SFC поддерживали при изократических условиях (35% МРВ) в течение 0,5 мин, затем переводили до 55% В за 2 мин с 3 мин выдерживанием. Колонку повторно уравновешивали при 35% В в течение 0,2 мин. Выявление во втором измерении осуществляли посредством SIM-MS (масс-спектрометрия в режиме мониторинга одиночного иона) при m/z 565.
Как показано на Фиг. 13, результаты по ахиральной и хиральной чистоте составляли 99,0% и 100% энантиомерного избытка (%ее) соответственно. График наложения образца без внутреннего стандарта без выявленного энантиомера (внизу), образца с 0,1% нежелательного энантиомера в качестве внутреннего стандарта (середина) и образца с 0,5% нежелательного энантиомера в качестве внутреннего стандарта (наверху) продемонстрировал способность данной системы выявлять нежелательный энантиомер с уровнем 0,1%.
Пример 5
Настоящее исследование было проведено для демонстрации совместимости и чувствительности, и разрешения между SFC второго измерения в системе 2D LC-SFC и традиционной (1D) SFC.
Система 2D LC-SFC была такой же, как и система, использованная в Примере 4. Программа подвижной фазы и время переключения были модифицированы. В первом измерении программа подвижной фазы представляла собой 25% В в течение 5 мин, от 25% до 90% В за 15 мин и затем повторное уравновешивание при 25% В в течение 5 мин. Интервал 0,1 мин (100 мкл) на вершине пика переносили в захватывающую колонку. Условия для традиционной SFC были такими же, как и условия, использованные в 2D LC-SFC второго измерения (описаны в Примере 4).
Анализировали стандартные растворы образца лекарственного вещества А, содержащего варьирующие уровни нежелательного энантиомера (в интервале от 0,1 до 2,0%), с использованием обеих методик (2D LC-SFC и SFC). Наложение стандартных хроматограмм из методик SFC и 2D LC-SFC показано на Фиг. 14А и Фиг. 14Б соответственно. Результаты проиллюстрировали сопоставимые разделения, полученные с использованием обеих методик. В 2D LC-SFC сохранялись и разрешение, и чувствительность, по сравнению с традиционной SFC.
Как продемонстрировано в Примере 2, введение подвижной фазы с обращенной фазой в измерение SFC вредно влияет на разрешение и чувствительность разделения SFC. Несмотря на то, что подвижная фаза с обращенной фазой все еще вводится в измерение SFC при использовании описанной в данном документе системы 2D LC-SFC, применение захватывающей колонки обеспечивает промежуточное устройство LC-SFC, которое не нарушает осуществляемое ниже по потоку раздление SFC.
Пример 6
В данном примере демонстрируется сложное хиральное хроматографическое разделение с желательной чувствительностью и селективностью в одном анализе.
Лекарственное вещество А имеет три хиральных центра и, следовательно, имеет четыре пары диастереомеров (восемь потенциальных стереоизомеров). Смесь 4 диастереомерных пар готовили в 30/70 ACN/вода в концентрации 0,05 мг/мл. Отношение двух энантиомеров в каждой паре (RRS/SRR, SRS/RSR, SSS/RRR; RRS/SSR) составляло приблизительно 2:1.
2
2
2
2
2
2
Разделение каждого стереоизомера достигалось с использованием системы 2D LC-SFC, показанной на Фиг. 9. Экспериментальные условия в первичной колонке были такими же, что и условия, описанные в разделе Примера 4. Во втором измерении использовали четыре захватывающие колонки с Flexcube (Agilent) для того, чтобы захватить 4 диастереомерные пары. После инъекции образца захватывающие колонки доводили до кондиции с использованием 60:40 scCO (МРА)/метанол с 0,1% гидроксида аммония (МРВ) в течение одной мин, за исключением захватывающей колонки 2, которую доводили до кондиции с использованием 65:35 scCO (МРА)/метанол с 0,1% гидроксида аммония (МРВ). Элюент первичной колонки, соответствующий интервалу 0,1 мин (100 мкл) на вершине диастереомерных пиков в 10,55 мин, 10,95 мин, 11,80 мин и 13,30 мин, последовательно переносили в четыре захватывающих колонки. Захваченные компоненты последовательно хроматографировали, начиная в 14,0 мин, 18,0 мин, 23,5 мин и 27,5 мин соответственно во втором измерении. Исходное выдерживание при 60:40 scCO (МРА)/метанол с 0,1% гидроксида аммония (МРВ) сохраняли в течение первых 0,5 мин после переключения и затем увеличивали до 40:60 scCO (МРА)/метанол с 0,1% гидроксида аммония (МРВ) за 2,5 мин с 0,3 мин выдерживанием, за исключением захваченного компонента 2. Для компонента 2 исходное выдерживание при 65:35 scCO (МРА)/метанол с 0,1% гидроксида аммония (МРВ) сохраняли в течение первой 1 мин после переключения и затем увеличивали до 55:45 scCO (МРА)/метанол с 0,1% гидроксида аммония (МРВ) за 3,0 мин с 0,3 мин выдерживанием. Выявление во втором измерении осуществляли посредством SIM-MS выявления при m/z 565.
Как проиллюстрировано на Фиг. 15, первичная ахиральная колонка RPLC отделяет четыре диастереомерные пары (RSS/SRR, SRS/RSR, RRR/SSS, SSR/RRS) и другие имеющие отношение к процессу примеси от API, обеспечивая ахиральную чистоту. Каждая из этих диастереомерных пар затем последовательно переводится из первичной колонки RPLC (после выявления) в четыре разные захватывающие колонки на клапане 2 (V2; Фиг. 9). Захваченные диастереомерные фракции затем последовательно смываются обратно и анализируются на вторичной хиральной колонке SFC, обеспечивая хиральную чистоту. Посредством предоставления более простой смеси образца во вторую хиральную колонку потенциальные стереоизомеры разделяются более эффективно. Как показано на Фиг. 15, восемь стереоизомеров, соответствующих четырем диастереомерным парам, успешно разделялись на SFC второго измерения с использованием MS выявления. С использованием клапана парковочного устройства применение 2D LC-SFC расширяется на анализ соединений со многими хиральными центрами, которые сложно разделять традиционной хиральной хроматографией.
Пример 7
Настоящее исследование проводили для тестирования системы 2D LC-SFC, в которой фокусирующая колонка помещается на головке колонки SFC.
Условия 2D LC-SFC были такими же, как и условия, описанные в Примере 3. Кроме того, образцы TSO готовили таким же способом, как описано в Примере 3. Вкратце, стандартные растворы TSO (0,25; 0,1; 0,05; 0,025; 0,01; 0,005 мг/мл) готовили в 50:50 ACN/вода. Объем инъекции для первого измерения составлял 5 мкл. Кроме того, для тех анализов, которые были укомплектованы фокусирующей колонкой, на головку колонки SFC помещали фокусирующую колонку. Использованной фокусирующей колонкой была Pursuit XRs С18 (20×2,0 мм, 5 мкм) от Agilent Technologies (Santa Clara, CA, США).
Разделение ряда концентраций стандарта TSO посредством 2D LC-SFC с фокусирующей колонкой или без нее показано на Фиг. 16. При обоих условиях энантиомеры TSO разделяются до уровня фона. Применение фокусирующей колонки, однако, приводило к увеличению наклона на графике высоты пика относительно площади пика, улучшая отношение сигнала к шуму (S/N) во втором измерении (пик 1). Аналогичные результаты наблюдали для пика 2 (данные не показаны).
ТИПИЧНЫЕ ВОПЛОЩЕНИЯ
Данное изобретение дополнительно описано посредством следующих воплощений. Характеристики каждого из данных воплощений являются комбинируемыми с любым из других воплощений, когда это подходит и является практичным.
Воплощение 1. В одном воплощении согласно изобретению предложена система хроматографии для разделения образца, содержащая: первый разделяющий блок, содержащий:
а) первый насосный узел для продвижения первой подвижной фазы через первый разделяющий блок,
б) инжектор образца для введения образца в первый разделяющий блок; и
в) колонку жидкостной хроматографии с обращенной фазой (RPLC); второй разделяющий блок, содержащий:
а) второй насосный узел для продвижения второй подвижной фазы через второй разделяющий блок, и
б) колонку сверхкритической жидкостной хроматографии (SFC);
и
первый жидкостный направляющий блок, содержащий целый ряд пробоотборных петель, причем указанный первый жидкостный направляющий блок соединяется с первым разделяющим блоком и вторым разделяющим блоком,
где по меньшей мере одна из целого ряда пробоотборных петель содержит захватывающую колонку, причем указанная захватывающая колонка содержит неподвижную фазу;
и
где данная система хроматографии сконфигурирована для первоначального разделения образца в первом разделяющем блоке и последующего введения по меньшей мере части образца, элюированного из колонки RPLC, во второй разделяющий блок.
Воплощение 2. В другом воплощении воплощения 1 первый жидкостный направляющий блок содержит две пробоотборные петли; где одна из двух пробоотборных петель находится в жидкостном сообщении с первым разделяющим блоком, и другая одна из двух пробоотборных петель находится в жидкостном сообщении со вторым разделяющим блоком.
Воплощение 3. В другом воплощении воплощения 1 первый жидкостный направляющий блок содержит по меньшей мере три пробоотборные петли, и по меньшей мере одна из пробоотборных петель находится в жидкостной изоляции от первого разделяющего блока и второго разделяющего блока.
Воплощение 4. В другом воплощении воплощения 3 по меньшей мере одна пробоотборная петля, содержащая вещество неподвижной фазы, находится в жидкостной изоляции от первого разделяющего блока и второго разделяющего блока.
Воплощение 5. В другом воплощении воплощения 1 первый жидкостный направляющий блок содержит целый ряд захватывающих колонок, причем каждая размещена в пробоотборной петле.
Воплощение 6. В другом воплощении любого из воплощений 1-5 первый жидкостный направляющий блок сконфигурирован для обеспечения потока жидкости через пробоотборную петлю в первом направлении, когда указанная пробоотборная петля размещается в жидкостном сообщении с первым разделяющим блоком, и для обеспечения потока жидкости через указанную пробоотборную петлю в направлении, противоположном первому направлению, когда указанная пробоотборная петля размещается в жидкостном сообщении со вторым разделяющим блоком.
Воплощение 7. В другом воплощении любого из воплощений 1-5 первый жидкостный направляющий блок сконфигурирован для обеспечения потока жидкости через пробоотборную петлю в первом направлении, когда указанная пробоотборная петля размещается в жидкостном сообщении с первым разделяющим блоком, и для обеспечения потока жидкости через указанную пробоотборную петлю в том же самом направлении, что и первое направление, когда указанная пробоотборная петля размещается в жидкостном сообщении со вторым разделяющим блоком.
Воплощение 8. В другом воплощении любого из воплощений 1-7 колонка RPLC содержит неподвижную фазу с обращенной фазой.
Воплощение 9. В другом воплощении воплощения 8 неподвижная фаза с обращенной фазой содержит С-18 фазу (например, С-18 диоксид кремния).
Воплощение 10. В другом воплощении воплощения 8 или 9 неподвижная фаза в захватывающей колонке содержит вещество с обращенной фазой.
Воплощение 11. В другом воплощении воплощения 9 вещество с обращенной фазой содержит С-18 фазу (например, С-18 диоксид кремния).
Воплощение 12. В другом воплощении любого из воплощений 1-11 второй разделяющий блок содержит одну колонку SFC.
Воплощение 13. В другом воплощении воплощения 12 колонка SFC содержит неподвижную фазу с нормальной фазой.
Воплощение 14. В другом воплощении воплощения 13 неподвижная фаза с нормальной фазой содержит силикагель.
Воплощение 15. В другом воплощении любого из воплощений 1-14 второй разделяющий блок дополнительно содержит фокусирующую колонку, расположенную выше по потоку от колонки SFC.
Воплощение 16. В другом воплощении воплощения 15 фокусирующая колонка содержит вещество с обращенной фазой.
Воплощение 17. В другом воплощении любого из воплощений 1-11 второй разделяющий блок содержит: а) комплект колонок SFC, где колонки SFC в комплекте организованы в параллельной конфигурации; и б) второй жидкостный направляющий блок для направления потока второй подвижной фазы в желательную (или заранее идентифицированную) колонку SFC в комплекте.
Воплощение 18. В другом воплощении воплощения 17 второй разделяющий блок дополнительно содержит фокусирующую колонку, расположенную выше по потоку от каждой колонки SFC в комплекте колонок SFC.
Воплощение 19. В другом воплощении любого из воплощений 1-18 дополнительно содержится первый детектор, размещенный ниже по потоку от колонки RPLC.
Воплощение 20. В другом воплощении любого из воплощений 1-19 дополнительно содержится второй детектор, размещенный ниже по потоку от колонки SFC.
Воплощение 21. В другом воплощении любого из воплощений 1-20 дополнительно содержится по меньшей мере одно управляющее устройство, соединенное функциональным образом с одним или более чем одним из следующих: а) первый насосный узел; б) инжектор образца; в) первый детектор; г) первый жидкостный направляющий блок; д) второй насосный узел и е) второй детектор.
Воплощение 22. В одном воплощении согласно изобретению предложен способ разделения образца, включающий следующие стадии:
(i) захват по меньшей мере части образца на захватывающей колонке, причем указанная часть получается разделением образца жидкостной хроматографией с обращенной фазой (RPLC), причем указанная захватывающая колонка содержит неподвижную фазу; и
(ii) подвергание части образца, захваченного на захватывающей колонке, дальнейшему разделению сверхкритической жидкостной хроматографией (SFC).
Воплощение 23. В другом воплощении воплощения 22 дополнительно включено разделение образца жидкостной хроматографией с обращенной фазой, включающее:
(i) введение образца в первую подвижную фазу;
(ii) продвижение первой подвижной фазы, содержащей образец, через колонку RPLC; и
(iii) разделение образца на колонке RPLC.
Воплощение 24. В другом воплощении воплощения 23 дополнительно включено выявление присутствия компонента образца в первой подвижной фазе после пропускания через колонку RPLC.
Воплощение 25. В другом воплощении любого из воплощений 22-24 дополнительно включено элюирование части образца, захваченного на захватывающей колонке, из захватывающей колонки.
Воплощение 26. В другом воплощении любого из воплощений 22-25 дополнительно включено выявление компонента образца после дополнительного разделения посредством SFC.
Воплощение 27. В другом воплощении любого из воплощений 22-26 дополнительно включено размещение захватывающей колонки в пути потока первой подвижной фазы ниже по потоку от колонки RPLC для захвата по меньшей мере части образца, разделенного колонкой RPLC.
Воплощение 28. В другом воплощении воплощения 27 дополнительно включено переключение захватывающей колонки, несущей захватывающую часть, в путь потока второй подвижной фазы для элюирования захваченной части из захватывающей колонки.
Воплощение 29. В другом воплощении воплощения 28 стадия размещения захватывающей колонки в пути потока первой подвижной фазы или стадия переключения захватывающей колонки в путь потока второй подвижной фазы проводится в жидкостном направляющем блоке, связанном с жидкостным путем RPLC и с жидкостным путем SFC.
Воплощение 30. В другом воплощении любого из воплощений 22-29 дополнительно включен повторный захват по меньшей мере части образца, элюированного из захватывающей колонки, на фокусирующей колонке перед дальнейшим разделением посредством SFC.
Воплощение 31. В другом воплощении любого из воплощений 22-30 первая подвижная фаза течет через захватывающую колонку в первом направлении, и часть образца, захваченного на захватывающей колонке, элюируется из захватывающей колонки посредством протекания второй подвижной фазы через захватывающую колонку в направлении, противоположном первому направлению.
Воплощение 32. В другом воплощении любого из воплощений 22-30 первая подвижная фаза течет через захватывающую колонку в первом направлении, и часть образца, захваченного на захватывающей колонке, элюируется из захватывающей колонки посредством протекания второй подвижной фазы через захватывающую колонку в том же самом направлении, что и первое направление.
Воплощение 33. В другом воплощении воплощения 22 включены следующие стадии:
(i) введение образца в первую подвижную фазу;
(ii) продвижение первой подвижной фазы, содержащей образец, через колонку RPLC;
(iii) разделение образца на колонке RPLC;
(iv) выявление присутствия компонента образца в первой подвижной фазе после пропускания через колонку RPLC;
(v) захват на первой захватывающей колонке по меньшей мере первой части образца, разделенного на колонке RPLC, причем указанная первая захватывающая колонка содержит неподвижную фазу;
(vi) элюирование первой части образца, захваченной на первой захватывающей клонке, из первой захватывающей колонки;
(vii) подвергание первой части образца, захваченного на первой захватывающей колонке, дальнейшему разделению посредством SFC; и
(viii) выявление компонента образца после дальнейшего разеления посредством SFC.
Воплощение 34. В другом воплощении воплощения 33 дополнительно включены следующие стадии:
(ix) захват на второй захватывающей колонке по меньшей мере второй части образца, разделенного на колонке RPLC, причем указанная вторая захватывающая колонка содержит неподвижную фазу;
(x) элюирование второй части образца, захваченного на второй захватывающей колонке из второй захватывающей колонки;
(xi) подвергание второй части образца, захваченного на второй захватывающей колонке, дальнейшему разделению посредством SFC.
Воплощение 35. В другом воплощении любого из воплощений 22-34 колонка RPLC содержит неподвижную фазу с обращенной фазой.
Воплощение 36. В другом воплощении любого из воплощений 22-35 неподвижная фаза в захватывающей колонке содержит вещество с обращенной фазой.
Воплощение 37. В другом воплощении любого из воплощений 22-36 проводится дополнительное разделение посредством SFC на колонке SFC, содержащей неподвижную фазу с нормальной фазой.
Воплощение 38. В другом воплощении любого из воплощений 22-36 проводится дополнительное разделение посредством SFC на системе SFC, содержащей комплект колонок SFC.
Воплощение 39. В другом воплощении воплощения 38 каждая из колонок SFC независимо содержит неподвижную фазу с нормальной фазой.
Воплощение 40. В другом воплощении воплощения 39 дополнительно включено направление части образца, захваченного на захватывающей колонке, в колонку SFC для дальнейшего разделения, причем указанная клонка SFC содержит неподвижную фазу, адаптированную для разделения компонентов в образце.
Воплощение 40А. В другом воплощении воплощения 22 включено направление части образца, захваченного на захватывающей колонке, в колонку SFC для дальнейшего разделения, причем указанная клонка SFC содержит неподвижную фазу, адаптированную для разделения компонентов в образце.
Воплощение 41. В одном воплощении согласно изобретению предложен способ анализа образца с использованием системы хроматографии Примера 1, включающий: разделение сложного образца на первый набор фракций посредством жидкостной хроматографии с обращенной фазой (RPLC) на первом разделяющем блоке; и дополнительное разделение одной или более чем одной фракции посредством сверхкритической жидкостной хроматографии (SFC) на втором разделяющем блоке.
Воплощение 42. В другом воплощении воплощения 41 разделение посредством RPLC на первом разделяющем блоке отчасти основано на первой характеристике сложного образца, и разделение посредством SFC на втором разделяющем блоке отчасти основано на второй характеристике сложного образца, причем указанная вторая характеристика сложного образца отличается от первой характеристики сложного образца.
Воплощение 43. В другом воплощении воплощения 41 сложный образец содержит смесь стереоизомерных компонентов.
Воплощение 44. В другом воплощении воплощения 43 диастереомерные компоненты разделяются на одну или более чем одну фракции посредством RPLC на первом разделяющем блоке, причем каждая из указанных фракций содержит энантиомерную пару.
Воплощение 45. В другом воплощении воплощения 44 разделение посредством RPLC на первом разделяющем блоке отчасти основано на гидрофобности сложного образца.
Воплощение 46. В другом воплощении воплощения 44 или 45 энантиомерная пара дополнительно разделяется на индивидуальные энантиомеры посредством SFC на втором разделяющем блоке.
Воплощение 47. В другом воплощении воплощения 46 разделение посредством SFC на втором разделяющем блоке отчасти основано на хиральности сложного образца.
Воплощение 48. В одном воплощении согласно изобретению предложен способ ахирального-хирального анализа образца, содержащего смесь стереоизомерных компонентов, с использованием системы хроматографии из Воплощения 1, включающий: разделение одного или более чем одного интересующего диастереомерного компонента в образце посредством RPLC на первом разделяющем блоке; и разделение интересующей(щих) энантиомерной(ных) пары(пар) посредством SFC на втором разделяющем блоке в том же самом аналитическом цикле.
Воплощение 49. В другом воплощении воплощения 48 дополнительно включено определение ахиральной чистоты на основе хроматограммы из разделения RPLC и определение хиральной чистоты на основе хроматограммы из разделения SFC.
Все ссылки во всем тексте, такие как публикации, патенты, патентные заявки и опубликованные патентные заявки, включаются в данный документ посредством ссылки во всей их полноте.
Несмотря на то, что описанное выше изобретение было описано в некоторых подробностях посредством иллюстрации и примеров в целях ясности понимания, для специалистов в данной области очевидно, что будут практиковаться определенные небольшие изменения и модификации. Следовательно, данное описание и примеры не следует истолковывать как ограничивающие объем изобретения.