ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫЕ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ГЕНОТЕРАПИИ ГОЛОЙ ДНК
LYOPHILIZED PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR NAKED DNA GENE THERAPY

1. Перекрестная ссылка на родственные заявки
В настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США №62/700655, поданной 19 июля 2018 г, которая является тем самым включенной посредством ссылки во всей ее полноте.
2. Перечень последовательностей
Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был подан посредством файловой системы электронного архивирования EFS-Web EFS, от англ. electronic filing system) и тем самым является включенным посредством ссылки во всей его полноте. Указанная копия ASCII, созданная 16 июля 2019 г, называется 40319US_CRF_sequencelisting и имеет размер 125979 байт.
3. Предшествующий уровень техники
В настоящее время имеется существенное клиническое доказательство того, что генотерапия, включающая прямую доставку in vivo конструкций нуклеиновых кислот, которые не были упакованы в вирус или вирусоподобные частицы, - так называемых контрукций «голых» ДНК или РНК - может быть эффективной в лечении разных заболеваний. Например, было продемонстрировано, что прямая внутримышечная инъекция конструкции ДНК-плазмиды, которая экспрессирует две изоформы человеческого белка HGF (фактор роста гепатоцитов) (т.е. pCK-HGF-X7, также именуемая "VM202"), является эффективной в лечении невропатической боли. В клиническом испытании фазы II было показано, что инъекции VM202 в икроножную мышцу пациентов с диабетической периферической нейропатией значительно уменьшают боль - двое суток обработки с интервалом в две недели были достаточными для обеспечения симптоматического облегчения с улучшением качества жизни в течение 3 месяцев. Kessler et al., Annals Clin. Transl. Neurology 2(5): 465-478 (2015). Также было показано, что такая же конструкция ДНК-плазмиды является эффективной в лечении пациентов с боковым амиотрофическим склерозом (ALS, от англ. amyotrophic lateral sclerosis). В клиническом испытании фазы I близкая к половине часть пациентов с ALS оставалась стабильной или демонстрировала улучшение после введения VM202 с 47%, 50% и 24% субъектов в месяцы 1, 2 и 3, соответственно, не испытывающих ни снижения, ни улучшения балла ALSFRS-R (пересмотренная шкала функционального рейтинга бокового амиотрофического склероза), указывая на физическое функционирование пациентов с ALS, что лучше, чем наблюдаемое у исторических контролен. Robert L. Sufit et al., Amyotrophic Lateral Sclerosis and Frontoemporal Degeneration 18: 269-278 (2017).
Однако, несмотря на недавнее одобрение двух антисмысловых олигонуклеотидных лекарственных средств для непосредственной инъекции - нусинерсена для подоболочечной инъекции и этеплирсена для внутривенной инъекции - для генотерапии человека фактически было одобрено мало конструкций голых ДНК или РНК. Таким образом, несмотря на десятилетия опыта приготовления голых нуклеиновых кислот в виде препаратов для лабораторного применения и более недавний опыт приготовления нуклеиновых кислот в виде препаратов для подходов генотерапии ex vivo, провели мало исследований по приготовлению ДНК в виде фармацевтического продукта для прямой терапевтической доставки. В частности, было мало исследований по стабильности активного ингредиента в виде нуклеиновой кислоты при разных условиях хранения или по эксципиентам, требующимся для обеспечения однородного растворения препарата для введения, или по способам уменьшения нагрузки примесей и т.д. Данные свойства являются важными для лучшей и более воспроизводимой терапевтической эффективности и безопасности лекарственных средств на основе ДНК, а также для экономически оправданной возможности масштабирования производства и распространения лекарственных средств.
Следовательно, существует потребность в приготовлении фармацевтического продукта лекарственного средства на основе голой ДНК, которое обеспечивает улучшенную стабильность, безопасность и экономическую обоснованность.
4. Краткое изложение сущности изобретения
В одном аспекте согласно настоящему изобретению предложена новая лиофилизированная фармацевтическая композиция, которая поддерживает стабильность конструкции ДНК (например, плазмиды) во время лиофилизации. В частности, данный препарат уменьшает конформационное изменение конструкций ДНК во время лиофилизации от более стабильной суперспирализованной формы до менее стабильной открытой кольцевой и линейной формы. Данный новый лиофилизированный препарат дополнительно обеспечивает однородное растворение конструкций ДНК в фармацевтически приемлемом растворе, обеспечивая полное извлечение активных ингредиентов, минимизацию частичной потери эффективности и обеспечение введения активных ингредиентов точным и единообразным способом. Кроме того, новый лиофилизированный препарат дает однородный и первоклассный вид осадка после лиофилизации, таким образом, делая возможной визуальную проверку качества лекарственного средства на основе ДНК.
В некоторых воплощениях данный новый лиофилизированный препарат содержит плазмидную ДНК, где данную фармацевтическую композицию получают лиофилизацией жидкой композиции, которая содержит перед лиофилизацией: а. ДНК первой плазмиды; b. калий-фосфатный буфер с рН в интервале от 7,0 до 9,0; с. маннит в концентрации в интервале от 0 масс./об. % до 3 масс./об. %; d. сахарозу в концентрации больше, чем 0,5 масс./об. % и меньше, чем 1,1 масс./об. % и е. NaCl в концентрации в интервале от 0,1 масс./об. % до 0,9 масс./об. %. Первую плазмиду можно выбрать из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Еа, pTx-IGF-1X6, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой VM202. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-HGF-Х7. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-IGF-1Ес. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-IGF-1X6. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1X6, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-IGF-1X6. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-IGF-1X10. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pCK-SDF-1α. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6 и pTx-IGF-1X10.
В некоторых воплощениях по меньшей мере 90% плазмидной ДНК в жидкой композиции является суперспирализоваиной. В некоторых воплощениях по меньшей мере 92,5% плазмидной ДНК в жидкой композиции является суперспирализованной. В некоторых воплощениях по меньшей мере 95% плазмидной ДНК в жидкой композиции является суперспирализованной. В некоторых воплощениях по меньшей мере 97% плазмидной ДНК в жидкой композиции является суперспирализованной. В некоторых воплощениях по меньшей мере 98% плазмидной ДНК в жидкой композиции является суперспирализованной.
В некоторых воплощениях по меньшей мере 90% плазмидной ДНК остается суперспирализованной через 30 минут после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции. В некоторых воплощениях по меньшей мере 92,5% плазмидной ДНК остается суперспирализованной через 30 минут после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции. В некоторых воплощениях по меньшей мере 95% плазмидной ДНК остается суперспирализованной через 30 минут после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции. В некоторых воплощениях по меньшей мере 97% плазмидной ДНК остается суперспирализованной через 30 минут после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции. В некоторых воплощениях по меньшей мере 98% плазмидной ДНК остается суперспирализованной через 30 минут после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции.
В некоторых воплощениях по меньшей мере 90% плазмидной ДНК остается суперспирализованной после хранения при 25°С в течение 3-7 суток после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции. В некоторых воплощениях по меньшей мере 92,5% плазмидной ДНК остается суперспирализованной после хранения при 25°С в течение 3-7 суток после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции. В некоторых воплощениях по меньшей мере 95% плазмидной ДНК остается суперспирализованной после хранения при 25°С в течение 3-7 суток после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции.
В некоторых воплощениях по меньшей мере 80% плазмидной ДНК остается суперспирализованной после 30 минут после растворения, где лиофилизированную фармацевтическую композицию хранили при 40°С в течение 10 недель перед растворением.
В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция содержит суперспирализованную ДНК в количестве по меньшей мере 90% от общего количества суперспирализованной ДНК в жидкой композиции. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция содержит суперспирализованную ДНК в количестве по меньшей мере 92,5% от общего количества суперспирализованной ДНК в жидкой композиции. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция содержит суперспирализованную ДНК в количестве по меньшей мере 95% от общего количества суперспирализованной ДНК в жидкой композиции.
В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит первую плазмидную ДНК в концентрации в интервале от 0,1 до 1 мг/мл. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит первую плазмидную ДНК в концентрации в интервале от 0,25 до 0,75 мг/мл. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит первую плазмидную ДНК в концентрации в интервале от 0,4 до 0,6 мг/мл. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит первую плазмидную ДНК в концентрации 0,5 мг/мл.
В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит вторую плазмидную ДНК в концентрации в интервале от 0,1 до 1 мг/мл. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит вторую плазмидную ДНК в концентрации в интервале от 0,25 до 0,75 мг/мл. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит вторую плазмидную ДНК в концентрации в интервале от 0,4 до 0,6 мг/мл. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит вторую плазмидную ДНК в концентрации 0,5 мг/мл.
В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит фосфат калия в концентрации в интервале от 5 мМ до 15 мМ. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит фосфат калия в концентрации с интервале от 7,5 мМ до 12,5 мМ. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит фосфат калия в концентрации в интервале от 9 мМ до 11 мМ. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит фосфат калия в концентрации 10 мМ.
В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит калий-фосфатный буфер с рН в интервале от 7,0 до 8,5. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит калий-фосфатный буфер с рН в интервале от 7,0 до 8,0. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит калий-фосфатный буфер с рН 8,0.
В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит маннит в концентрации в интервале от 1,5 масс./об. % до 3 масс./об. %. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит маннит в концентрации в интервале от 2 масс./об. % до 3 масс./об. %. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит маннит в концентрации 2 масс./об. %.
В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит сахарозу в концентрации в интервале от 0,75 масс./об. % до 1,1 масс./об. %. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит сахарозу в концентрации в интервале от 0,9 масс./об. % до 1,0 масс./об. %. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит сахарозу в концентрации 1,0 масс./об. %.
В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит NaCl в концентрации в интервале от 0,1 масс./об. % до 0,75 масс./об. %. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит NaCl в концентрации в интервале от 0,1 масс./об. % до 0,6 масс./об. %. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит NaCl в концентрации от 0,4 масс./об. % до 0,5 масс./об. %. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит NaCl в концентрации 0,45 масс./об. %.
Некоторые воплощения настоящего изобретения относятся к лиофилизированной фармацевтической композиции, содержащей плазмидную ДНК, где данную фармацевтическую композицию получают осуществлением лиофилизации жидкой композиции, которая содержит перед лиофилизацией: а. ДНК первой плазмиды в концентрации 0,5 мг/мл; b. 10 мМ калий-фосфатный буфер с рН 8,0; с. маннит в концентрации 2 масс./об. %; d. сахарозу в концентрации 1,0 масс./об. % и е. NaCl в концентрации 0,45 масс./об. %, где по меньшей мере 95% плазмидной ДНК является суперспирализованной и по меньшей мере 90% плазмидной ДНК остается суперспирализованной после хранения при 25°С в течение 3-7 суток после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции. Первая плазмида может быть выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой VM202. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-HGF-Х7. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-IGF-1Ес. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-IGF-1Еа. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1X6, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-IGF-1X6. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-IGF-1X10. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pCK-SDF-1α. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6 и pTx-IGF-1X10.
Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к растворенной композиции, полученной растворением лиофилизированной фармацевтической композиции в воде.
В некоторых воплощениях светопоглощение растворенной композиции при 450 нм меньше, чем 0,002. В некоторых воплощениях светопоглощение растворенной композиции при 450 нм составляет 0,001 или меньше, чем 0,001. В некоторых воплощениях светопоглощение измеряют в сутки растворения. В некоторых воплощениях светопоглощение растворенной композиции при 450 нм измеряют после хранения лиофилизированной фармацевтической композиции в течение 10 недель.
Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к лиофилизированной фармацевтической композиции, содержащей плазмидную ДНК, в разовой дозе, где данную фармацевтическую композицию получают осуществлением лиофилизации жидкой композиции, которая содержит перед лиофилизацией: а. ДНК первой плазмиды в концентрации 0,5 мг/мл; b. 10 мМ калий-фосфатный буфер с рН 8,0; с. маннит в концентрации 2 масс./об. %; d. сахарозу в концентрации 1,0 масс./об. % и е. NaCl в концентрации 0,45 масс./об. %, где данная лиофилизированная фармацевтическая композиция находится во флаконе, и данный флакон содержит суммарно 2,5 мг плазмидной ДНК. Первая плазмида может быть выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, рТх-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой VM202. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-HGF-Х7. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-IGF-1Ес. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-IGF-1Еа. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1X6, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-IGF-1X6. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-IGF-1X10. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pCK-SDF-1α. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6 и pTx-IGF-1X10.
Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к растворенной композиции, полученной растворением лиофилизированной фармацевтической композиции.
Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к способу получения лиофилизированной фармацевтической композиции, содержащей плазмидную ДНК, причем данный способ включает: предоставление жидкой композиции, содержащей: а. ДНК первой плазмиды; b. калий-фосфатный буфер с рН в интервале от 7,0 до 9,0; с. маннит в концентрации в интервале от 0 масс./об. % до 3 масс./об. %; d. сахарозу в концентрации больше, чем 0,5 масс./об. % и меньше, чем 1,1 масс./об. % и е. NaCl в концентрации в интервале от 0,1 масс./об. % до 0,9 масс./об. %; и осуществление лиофилизации данной жидкой композиции, получая, посредством этого, лиофилизированную фармацевтическую композицию. Первая плазмида может быть выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, рТх-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой VM202. В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-HGF-X7. В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-IGF-1X6. В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-IGF-1X10. В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-IGF-1Ec. В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-IGF-1Ea. В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях стадия осуществления лиофилизации включает: (i) загрузку жидкой композиции; (ii) замораживание; (iii) первичную сушку и (iv) вторичную сушку.
В некоторых воплощениях стадия загрузки осуществляется при 5°С.
В некоторых воплощениях стадия замораживания проводится при повышении температур в интервале от -50°С до -20°С.
В некоторых воплощениях стадия первичной сушки проводится при -20°С.
В некоторых воплощениях стадия вторичной сушки проводится при повышении температур в интервале от -20°С до 20°С.
В некоторых воплощениях по меньшей мере 90% плазмидной ДНК в жидкой композиции является супе рспирализова иной. В некоторых воплощениях по меньшей мере 92,5% плазмидной ДНК в жидкой композиции является суперспирализованной. В некоторых воплощениях по меньшей мере 95% плазмидной ДНК в жидкой композиции является суперспирализованной. В некоторых воплощениях по меньшей мере 97% плазмидной ДНК в жидкой композиции является суперспирализованной.
В некоторых воплощениях по меньшей мере 90% плазмидной ДНК остается суперспирализованной через 30 минут после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции. В некоторых воплощениях по меньшей мере 92,5% плазмидной ДНК остается суперспирализованной через 30 минут после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции. В некоторых воплощениях по меньшей мере 95% плазмидной ДНК остается суперспирализованной через 30 минут после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции. В некоторых воплощениях по меньшей мере 97% плазмидной ДНК остается суперспирализованной через 30 минут после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции. В некоторых воплощениях по меньшей мере 98% плазмидной ДНК остается суперспирализованной через 30 минут после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции.
В некоторых воплощениях по меньшей мере 90% плазмидной ДНК остается суперспирализованной после хранения при 25°С в течение 3-7 суток после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции. В некоторых воплощениях по меньшей мере 92,5% плазмидной ДНК остается суперспирализованной после хранения при 25°С в течение 3-7 суток после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции. В некоторых воплощениях по меньшей мере 95% плазмидной ДНК остается суперспирализованной после хранения при 25°С в течение 3-7 суток после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции.
В некоторых воплощениях по меньшей мере 80% плазмидной ДНК остается суперспирализованной через 30 минут после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции, где данную лиофилизированную фармацевтическую композицию хранили при 40°С в течение 10 недель перед растворением.
В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция содержит суперспирализованную ДНК в количестве по меньшей мере 90% от общего количества суперспирализованной ДНК в жидкой композиции. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция содержит суперспирализованную ДНК в количестве по меньшей мере 92,5% от общего количества суперспирализованной ДНК в жидкой композиции. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция содержит суперспирализованную ДНК в количестве по меньшей мере 95% от общего количества суперспирализованной ДНК в жидкой композиции.
В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит плазмиду в концентрации в интервале от 0,1 до 1 мг/мл. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит первую плазмиду в концентрации в интервале от 0,25 до 0,75 мг/мл. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит первую плазмиду в концентрации в интервале от 0,4 до 0,6 мг/мл. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит первую плазмиду в концентрации 0,5 мг/мл.
В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит фосфат калия в концентрации в интервале от 5 мМ до 15 мМ. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит фосфат калия в концентрации в интервале от 7,5 мМ до 12,5 мМ. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит фосфат калия в концентрации в интервале от 9 мМ до 11 мМ. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит фосфат калия в концентрации 10 мМ.
В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит калий-фосфатный буфер с рН в интервале от 7,0 до 8,5. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит калий-фосфатный буфер с рН в интервале от 7,0 до 8,0. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит калий-фосфатный буфер с рН 8,0.
В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит маннит в концентрации в интервале от 1,5 масс./об. % до 3 масс./об. %. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит маннит в концентрации в интервале от 2 масс./об. % до 3 масс./об. %. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит маннит в концентрации 2 масс./об. %.
В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит сахарозу в концентрации больше, чем 0,75 масс./об. % и меньше, чем 1,1 масс./об. %. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит сахарозу в концентрации больше, чем 0,9 масс./об. % и меньше, чем 1,1 масс./об. %. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит сахарозу в концентрации 1,0 масс./об. %.
В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит NaCl в концентрации в интервале от 0,1 масс./об. % до 0,75 масс./об. %. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит NaCl в концентрации в интервале от 0,1 масс./об. % до 0,6 масс./об. %. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит NaCl в концентрации в интервале от 0,4 масс./об. % до 0,5 масс./об. %. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит NaCl в концентрации 0,45 масс./об. %.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу лечения заболевания, включающему стадию: введения эффективного количества растворенного лекарственного средства пациенту с заболеванием, где данное растворенное лекарственное средство получают посредством растворения лиофилизированной фармацевтической композиции по настоящему изобретению.
В некоторых воплощениях данный способ дополнительно включает стадию растворения лиофилизированной фармацевтической композиции в воде, получая, посредством этого, растворенное лекарственное средство.
В некоторых воплощениях светопоглощение растворенного лекарственного средства при 450 нм (А450) составляет меньше, чем 0,003. В некоторых воплощениях светопоглощение составляет меньше, чем 0,002. В некоторых воплощениях светопоглощение составляет 0,001 или меньше, чем 0,001.
В некоторых воплощениях данное заболевание выбрано из группы, состоящей из нейропатии, ишемического заболевания, мышечной атрофии, сосудистого заболевания и сердечного заболевания. В некоторых воплощениях данное заболевание выбрано из ишемического заболевания конечностей, диабетической периферической нейропатии (DPN, от англ. diabetic peripheral neuropathy), бокового амиотрофического склероза (ALS), периферического сосудистого заболевания и заболевания коронарных артерий (CAD, от англ. coronary artery disease).
В некоторых воплощениях стадия введения включает внутримышечную инъекцию растворенного лекарственного средства.
5. Краткое описание графических материалов
На Фиг. 1 предложен типичный результат от капиллярного электрофореза (СЕ, от англ. capillary electrophoresis) VM202. Данный результат показывает два пика - один для суперспирализованной формы и другой для открытой кольцевой формы.
На Фиг. 2A-2D предложены результаты анализа ДСК (дифференциальная сканирующая калориметрия) при условиях, близких к условиям окружающей среды, для жидкого состояния разных препаратов из 1-го раунда цикла лиофилизации в малом масштабе со стадией отжига или без нее. В частности, на Фиг. 2А приведен результат для KP8M2SN, на Фиг. 2В приведен результат для KP8MS3N, на Фиг. 2С приведен результат для KP8MT3N, и на Фиг. 2D приведен результат для контроля. На графиках отмечены температура стеклования (Tg'), температура эвтектического плавления (Те) и температура расстеклования (Td).
На Фиг. 3 приведена динамика изменения температур (ордината слева) и давлений (ордината справа) во время 1-го раунда цикла лиофилизации KP8M2SN, KP8MS3N, KP8MT3N и контроля.
На Фиг. 4А-4С приведены изображения флаконов, содержащих разные препараты от 1-го раунда цикла лиофилизации в малом масштабе, перед лиофилизацией (Фиг. 4А), после лиофилизации (Фиг. 4В) и после растворения (Фиг. 4С).
На Фиг. 5 приведен результат от капиллярного электрофореза (СЕ) препаратов VM202 от 1-го раунда цикла лиофилизации в малом масштабе перед лиофилизацией или после растворения.
На Фиг. 6A-6D приведены результаты анализа ДСК при условиях, близких к условиям окружающей среды, для жидкого состояния разных препаратов из 2-го раунда цикла лиофилизации в малом масштабе со стадией отжига или без нее. В частности, на Фиг. 6А приведен результат для 4MSN, на Фиг. 6В приведен результат для 3MSN, на Фиг. 6С приведен результат для 2MSN, и на Фиг. 6D приведен результат для контроля.
На Фиг. 7 приведена динамика изменения температур (ордината слева) и давлений (ордината справа) во время 2-го раунда цикла лиофилизации первого набора 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроля.
На Фиг. 8А-8С приведены изображения флаконов, содержащих первый набор 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроля от 2-го раунда цикла лиофилизации в малом масштабе, перед лиофилизацией (Фиг. 8А), после лиофилизации (Фиг. 8В) и после растворения (Фиг. 8С).
На Фиг. 9 приведен результат от капиллярного электрофореза (СЕ) первого набора 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроля от второго 2-го раунда цикла лиофилизации в малом масштабе перед лиофилизацией или после растворения.
На Фиг. 10 приведена динамика изменения температур (ордината слева) и давлений (ордината справа) во время 2-го раунда цикла лиофилизации второго набора 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроля.
На Фиг. 11А-11В приведены изображения флаконов, содержащих второй набор 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроль, от второго 2-го раунда цикла лиофилизации в малом масштабе перед лиофилизацией (Фиг. 11А) и после лиофилизации (Фиг. 11В). На Фиг. 11С-11F показаны изображения флаконов, содержащих второй набор 4MSN (Фиг. 11 С), 3MSN (Фиг. 11D), 2MSN (Фиг. 11Е) и контроль (Фиг. 11F) после растворения.
На Фиг. 12 приведен результат от капиллярного электрофореза (СЕ) второго набора 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроля от второго 2-го раунда цикла лиофилизации в малом масштабе перед лиофилизацией или после растворения.
На Фиг. 13 приведена динамика изменения температур (ордината слева) и давлений (ордината справа) во время цикла лиофилизации 2MSN и 2M1SN.
На Фиг. 14А-14В приведены изображения флаконов, содержащих 2MSN и 2M1SN перед лиофилизацией (Фиг. 14А) и после лиофилизации (Фиг. 14В). На Фиг. 14C-14D показаны изображения флаконов, содержащих 2MSN (Фиг. 14С) и 2M1SN (Фиг. 14D) после растворения.
На Фиг. 15 приведен результат от капиллярного электрофореза (СЕ) 2MSN и 2M1SN перед лиофилизацией или после растворения.
На Фиг. 16А-16В приведены изображения флаконов, содержащих 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроль, после хранения при 25°С в течение 3 суток (Фиг. 16А) или 7 суток (Фиг. 16В) после растворения в Т равно 0.
На Фиг. 17А-17В приведены результаты от капиллярного электрофореза (СЕ) 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроля после хранения при 25°С в течение 3 суток (Фиг. 17А) или 7 суток (Фиг. 17В).
На Фиг. 18А-18С приведены изображения флаконов, содержащих 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроль до и после растворения лиофилизированного препарата, хранящегося в течение 10 недель при 25°С (Фиг. 18А), при 40°С (Фиг. 18В) или при 5°С (Фиг. 18С).
На Фиг. 19 приведен результат от капиллярного электрофореза (СЕ) 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроля после хранения при 40°С в течение 10 недель.
На Фиг. 20А-20С приведена динамика изменений процентных содержаний суперспирализованной ДНК, измеренных на основе результатов капиллярного электрофореза (СЕ) для 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроля при хранении данных препаратов при 5°С (Фиг. 20А), 25°С (Фиг. 20В) или 40°С (Фиг. 20С).
На Фиг. 21А-21С приведена динамика изменений процентных содержаний открытой кольцевой ДНК, измеренных на основе результатов капиллярного электрофореза (СЕ) для 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроля при хранении данных препаратов при 5°С (Фиг. 21А), 25°С (Фиг. 21В) или 40°С (Фиг. 21С).
На Фиг. 22А-22В приведены изображения флаконов, содержащих 2MSN (Фиг. 22А) или 2M1SN (Фиг. 22В), хранящихся при 25°С в течение 3 суток после растворения. На Фиг. 22C-22D приведены изображения флаконов, содержащих 2MSN (Фиг. 22С) или 2M1SN (Фиг. 22D), хранящихся при 25°С в течение 7 суток после растворения.
На Фиг. 23А-23В приведены результаты от капиллярного электрофореза (СЕ) 2MSN и 2M1SN после хранения при 25°С в течение 3 суток (Фиг. 23А) или 7 суток (Фиг. 23В).
На Фиг. 24А-24С приведены изображения флаконов, содержащих 2MSN или 2M1SN до или после растворения лиофилизированного препарата, хранящегося в течение 10 недель при 25°С (Фиг. 24А), при 40°С (Фиг. 24В) или при 5°С (Фиг. 24С).
На Фиг. 25 приведен результат от капиллярного электрофореза (СЕ) 2MSN и 2M1SN после хранения при 40°С в течение 10 недель.
На Фиг. 26А-26С приведена динамика изменений процентных содержаний суперспирализованной ДНК, измеренных на основе результатов капиллярного электрофореза (СЕ) для 2MSN и 2M1SN при хранении данных препаратов при 5°С (Фиг. 26А), 25°С (Фиг. 26В) или 40°С (Фиг. 26С).
На Фиг. 27А-27С приведена динамика изменений процентных содержаний открытой кольцевой ДНК, измеренных на основе результатов капиллярного электрофореза (СЕ) для 2MSN и 2M1SN при хранении данных препаратов при 5°С (Фиг. 27А), 25°С (Фиг. 27В) или 40°С (Фиг. 27С).
На Фиг. 28 приведена динамика изменения температур (ордината слева) и давлений (ордината справа) во время цикла лиофилизации, использованного в Примере 2.
На Фиг. 29 приведены изображения флаконов, содержащих F1 Примера 2 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 30 приведены изображения флаконов, содержащих F2 Примера 2 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 31 приведены изображения флаконов, содержащих F3 Примера 2 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 32 приведены изображения флаконов, содержащих F4 Примера 2 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 33 приведены изображения флаконов, содержащих F5 Примера 2 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 34 приведены изображения флаконов, содержащих F6 Примера 2 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 35 приведен результат капиллярного электрофореза (СЕ) F1, F2, F3, F4 и F5 Примера 2.
На Фиг. 36 приведены изображения флаконов, содержащих F1 Примера 3 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 37 приведены изображения флаконов, содержащих F2 Примера 3 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 38 приведены изображения флаконов, содержащих F3 Примера 3 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 39 приведены изображения флаконов, содержащих F4 Примера 3 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 40 приведены изображения флаконов, содержащих F5 Примера 3 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 41 приведены изображения флаконов, содержащих F6 Примера 3 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 42 приведены изображения флаконов, содержащих F7 Примера 3 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 43 приведены изображения флаконов, содержащих F8 Примера 3 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 44 приведены изображения флаконов, содержащих F9 Примера 3 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 45 приведен результат капиллярного электрофореза (СЕ) F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8 и F9 Примера 3 (ТАБЛИЦА 40).
На Фиг. 46 приведены изображения флаконов, содержащих F1 Примера 4 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 47 приведены изображения флаконов, содержащих F2 Примера 4 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 48 приведены изображения флаконов, содержащих F3 Примера 4 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 49 приведены изображения флаконов, содержащих F4 Примера 4 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 50 приведены изображения флаконов, содержащих F5 Примера 4 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 51 приведены изображения флаконов, содержащих F6 Примера 4 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 52 приведены изображения флаконов, содержащих F7 Примера 4 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 53 приведены изображения флаконов, содержащих F8 Примера 4 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 54 приведены изображения флаконов, содержащих F9 Примера 4 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 55 приведен результат капиллярного электрофореза (СЕ) F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8 и F9 Примера 4 (ТАБЛИЦА 44).
На данных Фиг. описаны разные воплощения настоящего изобретения лишь в целях иллюстрации. Специалист в данной области легко поймет из следующего обсуждения, что можно применять альтернативные воплощения структур и способов, проиллюстрированных в данном документе, без отступления от принципов изобретения, описанного в данном документе.
6. Подробное описание изобретения
6.1 Определения
Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют значение, обычно понятное специалисту в области, к которой принадлежит данное изобретение. Следующие термины в том виде, в котором они используются в данном документе, имеют значения, приписываемые им ниже.
Термин «жидкая композиция» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к композиции в жидкой форме, которая содержит плазмидную ДНК и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент, и которая может быть лиофилизированной для получения лиофилизированной фармацевтической композиции, как описано в данном документе.
Термин «лиофилизированная композиция» или «лиофилизированная фармацевтическая композиция» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к любой композиции или фармацевтической композиции в сухой форме, которую получают лиофилизацией. Термины «осуществление лиофилизации» или «лиофилизация» имеют значения, понятные специалистам в данной области, относящиеся в широком смысле к любому способу замораживания, с последующей дегидратацией в замороженном состоянии под вакуумом. Лиофилизированные композиции могут быть растворены для инъекции.
Термин «растворенный» или «растворение» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к восстановлению исходной формы вещества, ранее измененной для консервации и хранения, как, например, к регидрации, т.е. восстановлению жидкого состояния препарата плазмидной ДНК, который был ранее лиофилизирован и хранился. Лиофилизированную композицию по настоящему изобретению можно растворять в любом водном растворе, который дает стабильный раствор, подходящий для фармацевтического введения. Такие водные растворы, включают стерильную воду, Tris-EDTA (ТЕ), фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), Tris буфер и нормальный физиологический раствор, но не ограничиваются ими.
Термин «выделенный» или «биологически чистый» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к веществу, которое по существу не содержит компонентов, которые обычно сопровождают данное вещество в том виде, в котором оно находится в его природном состоянии. Таким образом, выделенная плазмидная ДНК в том виде, в котором она используется в данном документе, по существу не содержит компонентов, обычно ассоциированных с плазмидной ДНК в ее окружении in situ, таких как бактериальные белки, липиды или компоненты клеточной стенки.
Термин «VM202» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к плазмидной ДНК, также именуемой pCK-HGF-X7, содержащей вектор pCK (SEQ ID NO 5) и HGF-X7 (SEQ ID NO 13), клонированный в вектор pCK. VM202 была депонирована согласно условиям Будапештского соглашения в Корейском центре культуры микроорганизмов (KCCM) под номером доступа KCCM-10361 12 марта 2002 г.
Термин «изоформы HGF» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности встречающегося в природе полипептида HGF у животного. Данный термин включает полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 80% идентичной любому полноразмерному полипептиду HGF дикого типа, и включает полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 80% идентичной встречающемуся в природе аллельному варианту HGF, варианту, образовавшемуся в результате сплайсинга, или варианту, образовавшемуся в результате делеции. Изоформы HGF, предпочтительные для применения в настоящем изобретении, включают две или более чем две изоформы, выбранные из группы, состоящей из полноразмерного HGF (fIGF) (синонимично fHGF), варианта HGF с делецией (dHGF), NK1, NK2 и NK4. Согласно более предпочтительному воплощению настоящего изобретения изоформы HGF, используемые в способах, описанных в данном документе, включают fIHGF (SEQ ID NO 1) и dHGF (SEQ ID NO 2).
Термины «человеческий flHGF», «flHGF» и «fHGF» используются в данном документе взаимозаменяемо для названия белка, состоящего из аминокислот 1-728 человеческого белка HGF. Последовательность fIHGF приводится в SEQ ID NO 1.
Термины «человеческий dHGF» и «dHGF» используются в данном документе взаимозаменяемо для названия образовавшегося в результате делеции варианта белка HGF, продуцированного альтернативным сплайсингом человеческого гена HGH. В частности, «человеческий dHGF» или «dHGF» относится к человеческому белку HGF с делецией пяти аминокислот (F, L, Р, S и S) в первом домене «двойная петля» альфа-цепи из полноразмерной последовательности HGF. Человеческий dHGF имеет 723 аминокислоты в длину. Аминокислотная последовательность человеческого dHGF приводится в SEQ ID NO 2.
Термин «изоформа IGF-1 (инсули но подобный фактор роста-1)» или «изоформа человеческого IGF-1» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности одного из встречающихся в природе полипептидов пре-про-IGF1 человека или их аллельному варианту, варианту, образующемуся в результате сплайсинга, или варианту, образующемуся в результате делеции. Встречающиеся в природе полипептиды пре-про-IGF1 включают изоформы Класса I, Ec (SEQ ID NO 25); Класса II, Еа (SEQ ID NO 27); Класса I, Eb (SEQ ID NO 29) и Класса I, Ea (SEQ ID NO 23).
Термины "Изоформа #1," "Изоформа класса I, Ec", "Изоформа класса I, IGF-1Ec" или "Класс I, IGF-1Ec" используются в данном документе взаимозаменяемо для названия полипептида SEQ ID NO 25.
Термины "Изоформа #2," "Изоформа класса II, Еа", "Изоформа класса II, IGF-1 Еа" или "Класс II, IGF-1 Еа" используются в данном документе взаимозаменяемо для названия полипептида SEQ ID NO 27.
Термины "Изоформа #3," "Изоформа класса I, Eb", "Изоформа класса I, IGF-1 Eb" или "Класс I, IGF-1 Eb" используются в данном документе взаимозаменяемо для названия полипептида SEQ ID NO 29.
Термины "Изоформа #4," "Изоформа класса I, Еа", "Изоформа класса I, IGF-1 Еа" или "Класс I, IGF-1 Еа" используются в данном документе взаимозаменяемо для названия полипептида SEQ ID NO 23.
Термин «лечение» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к по меньшей мере одному из следующих: (а) подавление симптома заболевания; (b) облегчение симптома заболевания; и (с) устранение симптома заболевания.
В некоторых воплощениях композиция по настоящему изобретению может лечить симптом, ассоциированный с нейропатией, ишемическим заболеванием, мышечной атрофией или сердечным заболеванием.
Термин «терапевтически эффективная доза» или «эффективное количество» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к дозе или количеству, которое продуцирует желательный эффект, для которого его вводят. В контексте настоящих способов терапевтически эффективное количество представляет собой эффективное количество для лечения симптома заболевания. Точная доза или количество будет зависеть от цели лечения и будет устанавливаемым обычным специалистом в данной области с использованием известных методик (см., например, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).
Термин «достаточное количество» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к достаточному количеству для получения желательного эффекта.
Термин «вырожденная последовательность» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая может транслироваться с получением идентичной аминокислотной последовательности относительно последовательности, транслируемой от эталонной последовательности нуклеиновой кислоты.
6.2. Другие интерпретируемые условные обозначения
Понятно, что интервалы, перечисленные в данном документе, представляют собой сокращение для всех значений в пределах данного интервала, включая перечисленные конечные точки. Например, понятно то, что интервал от 1 до 50 включает любое число, комбинацию чисел или под интервал из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25,26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 и 50.
Если не указано иное, ссылка на соединение, которое имеет один или более чем один стереоцентр, подразумевает каждый стереоизомер и все комбинации его стереоизомеров.
6.3. Лиофилизированная фармацевтическая композиция
В первом аспекте представлена лиофилизированная фармацевтическая композиция. Данная лиофилизированная фармацевтическая композиция содержит плазмидную ДНК и получается осуществлением лиофилизации жидкой композиции, которая перед лиофилизацией содержит:
a. плазмидную ДНК первой плазмиды;
b. калий-фосфатный буфер с рН от 7,0 до 9,0;
c. маннит в концентрации от 0 масс./об. % до 3 масс./об. %;
d. сахарозу в концентрации больше, чем 0,5 масс./об. % и меньше, чем 1,1 масс./об. %; и
e. NaCl в концентрации от 0,1 масс./об. % до 0,9 масс./об. %.
Данная первая плазмида может быть выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
6.3.1. Плазмидная ДНК
Данная жидкая композиция включает плазмидную ДНК, которая представляет собой активный ингредиент фармацевтической композиции. Данная плазмидная ДНК может включать генетический материал для генотерапии. В частности, данная плазмидная ДНК может кодировать генетический продукт, который может корректировать функцию дефектного гена или транскрипта или кодировать полипептиды, смысловые или антисмысловые олигонуклеотиды, или РНК (кодирующую или некодирующую; например, миРНК (малая интерферирующая РНК), кшРНК (короткая шпилечная РНК), микро-РНК и их антисмысловые эквиваленты (например, антагоMiR)). Препарат, содержащий любую плазмидную ДНК, известную в данной области для применения в генотерапии, попадает в пределы объема настоящего изобретения.
Данная жидкая композиция может содержать плазмидную ДНК в концентрации, которая обеспечивает последующее растворение лиофилизированной фармацевтической композиции с предоставлением эффективной концентрации для терапевтического применения растворенного лекарственного средства. Концентрация плазмидной ДНК может корректироваться, в зависимости от разных факторов, включающих количество композиции, подлежащее доставке, заболевания, подлежащие лечению, возраст и массу субъекта, способ доставки и путь введения, и т.д.
В частности, данная жидкая композиция может включать плазмидную ДНК в концентрации от 0,1 до 5 мг/мл, от 0,1 до 3 мг/мл, от 0,1 до 2 мг/мл, от 0,1 до 1 мг/мл, от 0,25 до 0,75 мг/мл, от 0,4 до 0,6 мг/мл или в концентрации 0,5 мг/мл.
Данная плазмидная ДНК может представлять собой полинуклеотид длины от 3000 до 15000 пар оснований, от 3000 до 10000 пар оснований, от 3000 до 9000 пар оснований, от 3000 до 8000 пар оснований, от 3000 до 7000 пар оснований, от 3000 до 6000 пар оснований, от 3000 до 5000 пар оснований, от 4000 до 8000 пар оснований, от 4000 до 7500 пар оснований, от 4000 до 6000 пар оснований, от 6000 до 9000 пар оснований или от 7000 до 8000 пар оснований. Данная плазмидная ДНК может представлять собой полинуклеотид длины, которая попадает в пределы предложенного в данном документе объема.
6.3.1.1. вектор
Плазмидная ДНК, используемая в способах по настоящему изобретению, типично содержит вектор с одной или более чем одной регуляторной последовательностью (например, промотор или энхансер), связанной функциональным образом с экспрессируемыми последовательностями. Данная регуляторная последовательность регулирует экспрессию белка (например, одной или более чем одной изоформы HGF или IGF-1).
Предпочтительным является то, что полинуклеотид, кодирующий белок, связан функциональным образом с промотором в экспрессионной конструкции. Термин «связанный функциональным образом» относится к функциональной связи между последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты (такой как промотор, сигнальная последовательность или чип с сайтами связывания транскрипционного фактора) и второй последовательностью нуклеиновой кислоты, где последовательность контроля экспрессии влияет на транскрипцию и/или трансляцию нуклеиновой кислоты, соответствующей второй последовательности.
В типичных воплощениях промотор, связанный с полинуклеотидом, является функциональным предпочтительно в животных клетках, более предпочтительно в клетках млекопитающих, для контроля транскрипции полинуклеотида, включая промоторы, полученные из генома клеток млекопитающих или из вирусов млекопитающих, например, промотор CMV (цитомегаловирус), поздний промотор аденовируса, промотор 7.5K вируса осповакцины, промотор SV40, промотор tk HSV (вирус простого герпеса), промотор RSV (вирус саркомы Рауса), промотор фактора элонгации 1-альфа (EFI альфа), промотор металлотионеина, промотор бета-актина, промотор гена человеческого IL-2 (интерлейкин-2), промотор гена человеческого IFN (интерферон), промотор гена человеческого IL-4, промотор гена человеческого лимфотоксина и промотор гена человеческого GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирущий фактор), но не ограничиваясь ими. Более предпочтительно полезный в данном изобретении промотор представляет собой промотор, происходящий из IE (немедленный ранний) гена человеческого CMV (hCMV) или промотор EFI альфа, наиболее предпочтительно промотор/энхансер, происходящий из гена IE hCMV, и 5'-UTR (нетранслируемая область), содержащая всю последовательность последовательности экзона 1 и экзона 2, охватывающей последовательность непосредственно перед инициирующим кодоном ATG.
Экспрессионная кассета, используемая в данном изобретении, может содержать последовательность полиаденилирования, например, включающую терминатор коровьего гормона роста (Gimmi, Е.R., et al., Nucleic Acids Res. 17: 6983-6998 (1989)), последовательность полиаденилирования, происходящую из SV40 (Schek, N, et al., Mol. Cell Biol. 12: 5386-5393 (1992)), полиА ВИЧ-1 (вирус иммунодефицита человека) (Klasens, В.I. F., et al., Nucleic Acids Res. 26: 1870-1876 (1998)), полиА β-глобина (Gil, A., et al, Cell 49: 399-406 (1987)), полиА TK HSV (Cole, C.N. and T.P. Stacy, Mol. Cell. 5 Biol. 5: 2104-2113 (1985)) или полиА вируса полиомы (Batt, D. Band G.G. Carmichael, Mol. Cell. Biol. 15: 4783-4790 (1995)), но не ограничивающуюся ими.
В предпочтительных в настоящее время воплощениях вектор представляет собой pCK, рСР, pVAXI, рТх или pCY. В особенно предпочтительных воплощениях данный вектор представляет собой pCK, подробности о котором могут быть найдены в WO 2000/040737 и Lee et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 272: 230-235 (2000), которые обе включены в данный документ посредством ссылки во всей их полноте. Е. coli, трансформированную pCK (Тор10-pCK), депонировали в Корейском центре культуры микроорганизмов (KCCM) согласно условиям Будапештского соглашения 21 марта 2003 г. (№ доступа: KCCM-10476). Е. coli, трансформированную pCK-VEGF165 (т.е. вектор pCK с кодирующей последовательностью VEGF (фактор роста эндотелия сосудов) - Тор10-pCK/VEGF165'), депонировали в Корейском центре культуры микроорганизмов (KCCM) согласно условиям Будапештского соглашения 27 декабря 1999 г. (№ доступа: KCCM-10179).
Вектор pCK конструируется таким образом, что экспрессия гена, например, гена HGF или гена IGF-1, регулируется под энхансером/промотором человеческого цитомегаловируса (HCMV), как подробно раскрыто в Lee et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 272: 230 (2000); WO 2000/040737, которые обе включены посредством ссылки во всей их полноте. Вектор pCK использовали для клинических испытаний на человеческом организме, и подтвердили его безопасность и эффективность (Henry et al., Gene Ther. 18:788 (2011)).
В других предпочтительных воплощениях данный вектор представляет собой рТх (SEQ ID NO 15) - плазмидный вектор, полученный из pCK. рТх был получен двумя последовательными циклами мутагенеза pCK. Первую кампанию делетацио иного мутагенеза проводили для удаления ненеобходимой последовательности между геном устойчивости к канамицину и ColE1 pCK. В частности, делеционный ПЦР-мутагенез проводили с использованием первой пары праймеров (SEQ ID NO: 17 и 18). Делецию 228 пар оснований между геном устойчивости к канамицину и ColE1 подтверждали секвенированием плазмиды. Затем проводили вторую кампанию делетационного мутагенеза с использованием второй пары праймеров (SEQ ID NO: 19 и 20) для оптимизации размера последовательности интрона HCMV. Последовательность интрона HCMV (421 пар оснований) между экзоном 1 и экзоном 2 IE1 подвергали делеции, и данную делецию подтверждали секвенированием.
6.3.1.2. плазмидная ДНК, кодирующая человеческий HGF
В некоторых воплощениях плазмидная ДНК кодирует человеческий HGF или его вариант.
Фактор роста гепатоцитов (HGF) предсталяет собой гепаринсвязывающий гликопротеин, также известный как фактор рассеивания или гепатопоэтин-А. Эндогенный ген, кодирующий человеческий HGF, локализуется в хромосоме 7q21.1 и содержит 18 экзонов и 17 интронов (Seki Т., et al., Gene 102: 213-219 (1991)). Транскрипт примерно в 6 т.п.н. транскрибируется от гена HGF, и затем от него синтезируется полипептидный предшественник HGF (fIHGF), состоящий из 728 аминокислот. Одновременно полипептид предшественника dHGF, состоящий из 723 аминокислот, также синтезируется альтернативным сплайсингом гена HGF. Биологически неактивные предшественники могут превращаться в активные формы связанного дисульфидом гетеродимера посредством протеазы в сыворотке. В данных гетеродимерах альфа цепь, имеющая высокую молекулярную массу, образует четыре домена «двойная петля» и N-концевую шпиль ко подобную предактивационную пептидную область плазминогена. Домены «двойная петля» тройной связанной дисульфидами петлевой структуры, состоящей из примерно 80 аминокислот, могут играть важную роль во взаимодействии белок-белок. Низкомолекулярная бета-цепь образует неактивный домен, подобный сериновой протеазе. dHGF, состоящий из 723 аминокислот, представляет собой полипептид с делецией пяти аминокислот в 1-ом домене «двойная петля» альфа-цепи, т.е. F, L, Р, S и S.
HGF имеет разные биологические функции, например, 1) индуцирование эпителиальных клеток в трубчатую структуру; 2) стимулирование васкуляризации от эндотелиальных клеток in vitro и in vivo; 3) регенерация печени и почки, благодаря его антиапоптозной активности; 4) органогенез почки, яичника и яичка; 5) обеспечение контроля остеогенеза; 6) стимулирование роста и дифференциации эритроидных гематопоэтических клеток-предшественников; и 7) спраутинг аксонов нейронов (Stella, М.С. and Comoglio, P.М., The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 31: 1357-1362 (1999)). На основе данных разных функций HGF или ген, кодирущий HGF или его вариант, может быть разработан в качестве терапевтического средства.
На самом деле, разработали плазмиды, кодирующие одну или более чем одну изоформу человеческого HGF и использовали для лечения разных заболеваний, как описано в патентах США №7812146, 8338385 и 8389492, и публикациях США №20140296142 и 20160250291, которые включены в данный документ посредством ссылки во всей их полноте. Данные плазмиды можно использовать в разных воплощениях настоящего раскрытия.
В частности, данная плазмида может экспрессировать две или более чем две изоформы HGF посредством включения последовательности регуляции экспрессии для каждой последовательности, кодирующей изоформу (CDS, от англ. coding sequence). В некоторых воплощениях данная конструкция содержит внутренний участок посадки рибосомы (IRES, от англ. internal ribosomal entry site) между двумя кодирующими последовательностями, например, в следующем порядке: (1) последовательность регуляции экспрессии - (2) кодирующая последовательность первой изоформы - (3) IRES - (4) кодирующая последовательность второй изоформы - (5) последовательность терминации транскрипции. IRES обеспечивает начало трансляции в последовательности IRES, обеспечивая, посредством этого, экспрессию двух интресующих генов от одной конструкции. В других воплощениях для индукции экспрессии более чем одной изоформы HGF у субъекта, которому осуществляется введение, вместе используют целый ряд конструкций, причем каждая кодирует одну изоформу HGF.
В предпочтительных воплощениях данных способов используется конструкция, которая одновременно экспрессирует два или более чем два разных типа изоформ HGF - т.е. fIHGF и dHGF - посредством включения сайта альтернативного сплайсинга. Ранее в патенте США №7812146, включенном в данный документ посредством ссылки, продемонстрировали то, что конструкция, кодирующая две изоформы HGF (fIHGF и dHGF) через альтернативный сплайсинг, имеет значительно более высокую (почти в 250 раз большую) эффективность экспрессии, чем конструкция, кодирующая одну изоформу HGF (либо fIHGF, либо dHGF). В типичных воплощениях данная конструкция содержит (i) первую последовательность, содержащую экзоны 1-4 человеческого гена HGF (SEQ ID NO 3), или вырожденную последовательность первой последовательности; (ii) вторую последовательность, содержащую интрон 4 человеческого гена HGF (SEQ ID NO 6) или фрагмент второй последовательности; и (iii) третью последовательность, содержащую экзоны 5-18 человеческого гена HGF (SEQ ID NO 4), или вырожденную последовательность данной третьей последовательности. Из данной конструкции могут быть получены две изоформы HGF (fIHGF и dHGF) посредством альтернативного сплайсинга между экзоном 4 и экзоном 5.
В некоторых воплощениях данная конструкция содержит полную последовательность интрона 4. В некоторых воплощениях данная конструкция содержит фрагмент интрона 4. В предпочтительных воплощениях данная конструкция содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO 7 - SEQ ID NO 14. Нуклеотидная последовательность SEQ ID NO 7 соответствует 7113 п. н. полинуклеотиду, кодирующему fIHGF и dHGF, и включая полную последовательность интрона 4. Нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 8-14 соответствуют полинуклеотидам, кодирующим fIHGF и dHGF, и включающим разные фрагменты интрона 4.
Разные конструкции нуклеиновых кислот, содержащих кДНК, соответствующую экзонам 1-18 человеческого HGF и интрону 4 человеческого гена HGF или его фрагментам, называются «HGF-Х», с последующим уникальным номером, как описано в патенте США №7812146. HGF-Х, проанализированные заявителем, включают HGF-X1 (SEQ ID NO 7), HGF-X2 (SEQ ID NO 8), HGF-X3 (SEQ ID NO 9), HGF-X4 (SEQ ID NO 10), HGF-X5 (SEQ ID NO 11), HGF-X6 (SEQ ID NO 12), HGF-X7 (SEQ ID NO 13) и HGF-X8 (SEQ ID NO 14), но не ограничиваются ими.
Ранее было продемонстрировано то, что две изоформы HGF (т.е. fIHGF и dHGF) могут быть получены альтернативным сплайсингом между экзоном 4 и экзоном 5 каждой из конструкций. Кроме того, среди разных конструкций HGF HGF-Х7 показала наивысший уровень экспрессии двух изоформ HGF (т.е. fIHGF и dHGF), как раскрыто в патенте США №7812146, включенном в данный документ посредством ссылки во всей его полноте. Соответственно, конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую HGF-X7, можно использовать в предпочтительных воплощениях способов по настоящему изобретению.
В особенно предпочтительных воплощениях плазмида pCK, содержащая экспрессионные последовательности HGF-X7, используется в способах по настоящему изобретению в качестве конструкции нуклеиновой кислоты. В частности, можно использовать pCK-HGF-X7 (также именуемую "VM202"). pCK-HGF-X7 представляет собой конструкцию, содержащую вектор pCK (SEQ ID NO 5) и HGF-X7 (SEQ ID NO 13), клонированную в вектор pCK. pCK-HGF-X7 депонировали согласно условиям Будапештского соглашения в Корейском центре культуры микроорганизмов (KCCM) под номером доступа KCCM-10361 12 марта 2002 г.
Аминокислотные последовательности и нуклеотидные последовательности изоформ HGF, использованных в способах, описанных в данном документе, могут дополнительно включать аминокислотные последовательности и нуклеотидные последовательности, по существу идентичные последовательностям изоформ человеческого HGF дикого типа. Существенная идентичность включает последовательности с по меньшей мере 80%-ной идентичностью, более предпочтительно по меньшей мере 90%-ной идентичностью и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%-ной идентичностью, где аминокислотная последовательность или нуклеотидная последовательность изоформы человеческого HGF дикого типа выравнивается с последовательностью максимальным образом. Способы выравнивания последовательностей для сравнения являются хорошо известными в данной области. В частности, алгоритм выравнивания, раскрытый на сайте Средства поиска основного локального выравнивания (BLAST - от англ. Basic Local Alignment Search Tool) NCBI национального центра биотехнологической информации (NBCI - от англ. National Center for Biotechnological Information, Bethesda, Md.) и используемый в связи с программами анализа последовательностей blastp, blasm, blastx, tblastn и tblastx, можно использовать для определения процента идентичности.
6.3.1.3. плазмидная ДНК, кодирующая IGF-1
В некоторых воплощениях плазмидная ДНК кодирует человеческий IGF-1 или его вариант.
Инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1) представляет собой гормон, аналогичный по молекулярной структуру инсулину, который играет важную роль в росте в детстве и имеет анаболические эффекты у взрослых. Человеческий ген IGF-1 содержит шесть экзонов (экзоны 1, 2, 3, 4, 5 и 6 (6-1 и 6-2)), охватывающих почти 90 т.п.н. геномной ДНК. Экзоны 1 и 2 являются взаимоисключающими лидерными экзонами, причем каждый имеет множественные промоторные сайты, которые используются по-разному. Кроме того, ген IGF-1 может подвергаться дифференциальному сплайсингу с созданием множества вариантов транскриптов. Каждый вариант транскрипта кодирует другой пре-про-IGF-1 белок («изоформа IGF-1»), обладающий вариабельными лидерными последовательностями сигнальных пептидов. Тем не менее, все изоформы транскрипта приводят к тому же самому 70-аминокислотному пептиду IGF-1, который использует тот же самый рецептор после процессинга.
Пре-про-IGF-1 пептиды отличаются по их лидерным или сигнальным последовательностям и по их карбокси (С)-концу. Включение экзона 1 или экзона 2 является взаимоисключающим, и один из них служит в качестве лидерной последовательности пре-про-IGF-1 пептида; разные лидерные экзоны создают разные 5'-UTR. Пре-про-IGF-1 полипептиды подвергаются посттранскрипционному протеолитическому расщеплению с удалением лидера и карбокси-конца Е-пептида, приводя к зрелому 70-аминокислотному IGF-1.
Транскрипты, содержащие экзон 1, называются транскриптами Класса 1 (например, Класс I, Ec; Класс II, Eb и Класс I, Еа), тогда как транскрипты, содержащие экзон 2, называются транскриптами Класса 2 (например, Класс II, Еа). Почти все пре-пропептиды включают 27 аминокислот в сигнальном пептиде, происходящем из экзона 3, причем остальные сигнальные последовательности поисходят от включения экзона 1 или 2. У меньшинства транскриптов используется другой сайт инициации транскрипции в пределах экзона 3, генерируя более короткий сигнальный пептид из 22 аминокислот. Экзоны 3 и 4 являются неизменными и кодируют домены В, С, А и D зрелого пептида IGF-1; экзон 4 кодирует две третьих зрелого пептида IGF-1. Человеческий пептид Eb состоит только из экзонов 4 и 5, тогда как Ec содержит экзоны 4, 5 и 6.
Альтернативный сплайсинг и взаимоисключающая инициация транскрипции приводит к образованию разных полипептидов пре-про-IGF-1 (т.е. изоформ IGF-1). В частности, изоформа IGF-1 Класса I, Ec (SEQ ID NO 25), содержащая по меньшей мере фрагмент экзонов 1, 3/4, 5 и 6, образуется из транскрипта, содержащего последовательность SEQ ID NO 26. Изоформа IGF-1 Класса II, Еа (SEQ ID NO 27), содержащая по меньшей мере фрагмент экзонов 2, 3/4 и 6, генерируется из транскрипта, содержащего последовательность SEQ ID NO 28. Изоформа IGF-1 Класса I, Eb (SEQ ID NO 29), содержащая по меньшей мере фрагмент экзонов 1, 3/4 и 5, генерируется из транскрипта, содержащего последовательность SEQ ID NO 30. Изоформа IGF-1 Класса I, Еа (SEQ ID NO 23), содержащая по меньшей мере фрагмент экзонов 1, 3/4 и 6, генерируется из транскрипта, содержащего последовательность SEQ ID NO 24.
Хотя зрелый белок IGF-1, происходящий из разных транскриптов, и не отличается, предполагали, что разные изоформы транскриптов имеют разные регуляторные функции. Варианты форм обладают разными стабильностями, партнерами связывания и активностью, указывая на ключевую регуляторную роль данных изоформ. Биологическое значение данных изоформ остается не ясным, хотя предполагали то, что изоформы Класса I с экзоном 1 являются аутокринными/паракринными формами, тогда как изоформы класса II с экзоном 2 представляют собой секретируемые эндокринные формы. Это основывается на данных о том, что транскрипты Класса II включают типичный мотив сигнального пептида, ассоциированный с эффективной секрецией, тогда как транскрипты Класса I имеют более длинный сигнальный пептид, который возможно может препятствовать секреции.
Были разработаны плазмиды, кодирующие одну или более чем одну изоформу человеческого IGF-1, и проанализированы на лечение нейропатии, как описано в заявках США №16/513560 и/или 16/513564, которые включаются в данный документ посредством ссылки во всей их полноте. Данные плазмиды можно использовать в разных воплощениях настоящего раскрытия.
В частности, в некоторых воплощениях данная плазмида содержит кодирующую последовательность одной из изоформ IGF-1. Например, конструкция ДНК может содержать последовательность, кодирующую Класс I, Еа (SEQ ID NO 24); Класс I, Eb (SEQ ID NO 30); Класс I, Ec (SEQ ID NO 26) или Класс II, Еа (SEQ ID NO 28).
В некоторых воплощениях конструкция ДНК представляет собой двойную экспрессионную конструкцию - конструкцию ДНК, которая экспресирует более чем одну изоформу IGF-1, посредством включения последовательности, регулирующей экспрессию, для кодирующей последовательности каждой изоформы (CDS). В некоторых воплощениях данная конструкция содержит внутренний сайт посадки рибосомы (IRES) между двумя кодирующими последовательностями, например, в в следующем порядке: (1) последовательность регуляции экспрессии - (2) кодирующая последовательность первой изоформы - (3) IRES - (4) кодирующая последовательность второй изоформы - (5) последовательность терминации транскрипции. IRES обеспечивает начало трансляции в последовательности IRES, обеспечивая, посредством этого, экспресию двух белковых продуктов от одного транскрипта. В других воплощениях для индукции экспрессии более чем одной изоформы IGF-1 у субъекта, которому осуществляется введение, совместно используют целый ряд конструкций, причем каждая кодирует одну изоформу IGF-1.
В предпочтительных воплощениях конструкция ДНК способна одновременно экспрессировать две или более чем две следующие изоформы IGF-1: например, (i) изоформа Ec, Класс I (изоформа №1) и изоформа Еа, Класс II (изоформа №2); (ii) изоформа Ec, Класс I (изоформа №1) и изоформа Eb, Класс I (изоформа №3); (iii) изоформа Ec, Класс I (изоформа №1) и изоформа Еа, Класс I (изоформа №4); (iv) изоформа Еа, Класс II (изоформа №2) и изоформа Eb, Класс I (изоформа №3); (iv) изоформа Еа, Класс II (изоформа №2) и изоформа Eb, Класс I (изоформа №3); (v) изоформа Еа, Класс II (изоформа №2) и изоформа Еа, Класс I (изоформа №4); (vi) изоформа Eb, Класс I (изоформа №3) и изоформа Еа, Класс I (изоформа №4) -посредством содержания сайта альтернативного сплайсинга.
Например, конструкция ДНК может содержать (i) первую последовательность, содержащую экзоны 1, 3 и 4 человеческого гена IGF-1 (SEQ ID NO 31), или вырожденную последовательность первой последовательности; (ii) вторую последовательность, содержащую интрон 4 человеческого гена IGF-1 (SEQ ID NO 32), или фрагмент данной второй последовательности; (iii) третью последовательность, содержащую экзоны 5 и 6-1 человеческого гена IGF-1 (SEQ ID NO 33), или вырожденную последовательность данной третьей последовательности; (iv) четвертую последовательность, содержащую интрон 5 человеческого гена IGF-1 (SEQ ID NO 34), или фрагмент данной второй последовательности; и (v) пятую последовательность, содержащую экзон 6-2 человеческого гена IGF-1 (SEQ ID NO 35), или вырожденную последовательность данной пятой последовательности. Интроны 4 и 5 могут подвергаться альтернативному сплайсингу, приводя к образованию двух изоформ IGF-1 (например, Класса I, Ec и Класса I, Еа).
В некоторых воплощениях конструкция ДНК тестируется in vitro и/или in vivo в отношении ее способности экспрессировать одну или более чем одну изоформу IGF-1. В предпочтительных воплощениях выбирают конструкции ДНК, способные экспрессировать обе изоформы IGF-1 - Класса I, Ec и Класса I, Еа.
Разные конструкции ДНК, содержащие кДНК, соответствующую (i) экзонам 1-6 человеческого гена IGF-1 и (ii) интронам 4 и 5 человеческого гена IGF-1 или разным фрагментам интронов 4 и 5, называются «IGF-1X», с последующим уникальным номером. Конструкции IGF-1X, проанализированные заявителем, включают IGF-1X1, IGF-1X2, IGF-1X3, IGF-1X4, IGF-1X5, IGF-1X6, IGF-1X7, IGF-1X8, IGF-1X9 и IGF-1X10, но не ограничиваются ими. Среди проанализированных конструкций было идентифицировано то, что IGF-1X6 и IGF-1X10 экспрессируют изоформы IGF-1 и Класса I, Ec, и Класса I, Еа.
В предпочтительных воплощениях используются IGF-1X6 (SEQ ID NO 21) или IGF-1X10 (SEQ ID NO 22). IGF-1X6 (SEQ ID NO 21) и IGF-1X10 (SEQ ID NO 22), клонированные в вектор pCK, называются pCK-IGF-1X6 и pCK-IGF-1X10 соответстенно. Клетки Е. coli, трансформированные pCK-IGF-1X6 ("DH5α_pCK-IGF1 Х6"), депонировали согласно условиям Будапештского соглашения в Корейской коллекции типовых культур (KCTC, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB) 181, Ipsin-gil, Jeongeup-si, Jeollabuk-do, 56212, Корейская Республика) под номером доступа KCTC 13539 ВР 30 мая 2018 г. Клетки Е. coli, трансформированные pCK-IGF-1X10 ("DH5α_pCK-IGF1 Х10"), депонировали согласно условиям Будапештского соглашения в Корейской коллекции типовых культур (KCTC, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB) 181, Ipsin-gil, Jeongeup-si, Jeollabuk-do, 56212, Корейская Республика) под номером доступа KCTC 13540 ВР30 мая 2018 г.
В некоторых воплощениях плазмида рТх содержит IGF-1X6 (т.е. pTx-IGF-1X6) или IGF-1 Х10 (т.е. pTx-IGF-1X10). Например, можно использовать pTx-IGF-1X10 (SEQ ID NO 16), полученную посредством лигирования IGF-1X10 в рТх, расщепленную ферментом Clal на 5' и ферментом Sah на 3'.
В некоторых воплощениях плазмида рТх содержит IGF-1Ec или IGF-1Ea. Например, pTx-IGF-1Ec получается лигированием IGF-1Ec (SEQ ID NO 26) в рТх, и pTx-IGF-1Ea получается лигированием IGF-1Ea (SEQ ID NO 24) в рТх. Данные плазмиды экспрессируют изоформу IGF-1Ec (SEQ ID NO 25) или изоформу IGF-1 Еа (SEQ ID NO 23) соответственно.
Изоформы IGF-1 или плазмиды, кодирующие IGF-1, описанные в данном документе, могут включать модификации от изоформ человеческого IGF-1 дикого типа. Данные модифицированные последовательности могут включать последовательности с по меньшей мере 80%-ной идентичностью, более предпочтительно по меньшей мере 90%-ной идентичностью и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%-ной идентичностью при выравнивании данных модифицированных последовательностей с последовательностями изоформы человеческого IGF-1 дикого типа максимальным образом. Способы выравнивания последовательностей для сравнения являются хорошо известными в данной области. В частности, для определения процента идентичности можно использовать алгоритм выравнивания, раскрытый в NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) веб-сайта Национального центра биологической информации (NBCI, Bethesda, Md.) и используемый в связи с программами анализа последовательностей blastp, blasm, blastx, tblastn и tblastx.
6.3.1.4. Плазмидная ДНК, кодирующая SDF-1α
Происходящий из стромальной клетки фактор 1 (SDF-1), также известный как хемокин 12 с мотивом С-Х-С (CXCL12), представляет собой белок-хемокин, который кодируется у человека геном CXCL12 на хромосоме 10. Он повсюду экспрессируется во многих типах тканей и клеток. Происходящие из стромальных клеток факторы 1а (SDF-1α) и 1р (SDF-1 р) представляют собой маленькие цитокины, которые принадлежат к семейству хемокинов, члены которого активируют лейкоциты и часто индуцируются провоспалительными стимулами, такими как липополисахарид, TNF (фактор некроза опухолей) или IL1 (интерлейкин-1). SDF-1 продуцируется в двух формах SDF-1α/СХС1_12а и SDF-1β/CXCL12b посредством альтернативного сплайсинга того же самого гена.
Были разработаны плазмиды, кодирующие одну или более чем одну изоформу человеческого SDF-1, и проанализированы на лечение периферического сосудистого заболевания, как описано в заявке США №15/514244, включенной в данный документ посредством ссылки во всей ее полноте. В частности, полинуклеотид, кодирующий SDF-1α, эффективно стимулировал миграцию клеток сосудистого эндотелия и ангиогенез при введении совместно с полинуклеотидом, кодирующим человеческий HGF.
Плазмиды, кодирующие одну или более чем одну изоформу SDF-1, можно использовать в разных воплощениях настоящего раскрытия. В некоторых воплощениях используется плазмида, кодирующая одну или более чем одну SDF-1, раскрытая в заявке США №13/514244. В некоторых воплощениях используется плазмида, содержащая кодирующую последовательность SDF-1α. В некоторых воплощениях используется плазмида, содержащая кодирующую последовательность SDF-1β. В некоторых воплощениях используется плазмида, кодирующая и SDF-1α, и SDF-1β. В конкретном воплощении используется плазмида, содержащая последовательность SEQ ID NO 36.
6.3.2. Буфер
Жидкая композиция дополнительно содержит буфер для поддержания рН данной фармацевтической композиции. Данный буфер может включать буферное соединение, известное в данной области, такое как TAPS, бицин, Tris, трицин, TAPSO, HEPES, TES, MPOS, PIPES, какодилат или MES. Данный буфер может содержать лимонную кислоту, монокалия фосфат, борную кислоту или диэтилбарбитуровую кислоту. Данный буфер может представлять собой буфер PBS, HEPES, TRIS или TRIS/EDTA. Данный буфер может представлять собой другой фосфатный буфер. Фосфатные буферы могут содержать смесь одноосновного дигидрофосфата и двухосновного моногидрофосфата.
В частности, данный буфер может представлять собой калий-фосфатный буфер. Калий-фосфатный буфер может содержать фосфат калия в концентрации от 5 мМ до 15 мМ, от 7,5 мМ до 12,5 мМ, от 9 мМ до 11 мМ или 10 мМ.
Буфер, содержащийся в данной жидкой композиции, может иметь рН от 7 до 9. В некоторых воплощениях рН составляет от 7,0 до 8,5 или 8,0. В некоторых воплощениях рН составляет от 7,0 до 8,0.
В некоторых воплощениях данная жидкая композиция содержит 7,5-12 мМ калий-фосфатный буфер с рН до 7 до 9. В некоторых воплощениях данная жидкая композиция содержит 7,5-12 мМ калий-фосфатный буфер с рН до 7,0 до 8,0. В некоторых воплощениях данная жидкая композиция содержит 9-11 мМ калий-фосфатный буфер с рН до 7,0 до 8,5. В некоторых воплощениях данная жидкая композиция включает 10 мМ калий-фосфатный буфер с рН 8,0.
6.3.3. Углевод
Стабильность плазмидной ДНК в данной лиофилизированной фармацевтической композиции может быть повышена приготовлением данной пазмидной ДНК перед лиофилизацией в виде препарата с водным раствором, содержащим стабилизирующее количество углевода. Данный углевод может представлять собой маннит или сахарозу.
Данный углевод можно добавлять в жидкую композицию так, чтобы иметь конечную концентрацию углевода от примерно 0,05% до примерно 30%, от примерно 0,1% до примерно 15%, от примерно 0,2% до примерно 15%, от примерно 0,2% до примерно 10%, от примерно 0,5% до примерно 10%, от примерно 1% до примерно 5%, от примерно 1% до примерно 3%, от примерно 0,75% до 1,1%, от примерно 0,9% до 1,1%, от примерно 1,0% до примерно 1,1%.
В некоторых воплощениях жидкая композиция имеет конечную концентрацию по меньшей мере одного углевода больше, чем 0,1% и меньше, чем 15%, больше, чем 0,2% и меньше, чем 10%, больше, чем 0,3% и меньше, чем 7,5%, больше, чем 0,5% и меньше, чем 5%, больше, чем 0,5% и меньше, чем 3%, больше, чем 0,5% и меньше, чем 2%, больше, чем 0,5% и меньше, чем 1,1%, больше, чем 0,75% и меньше, чем 1,1%, больше, чем 0,9% и меньше, чем 1,1% или 1,0%.
В частности, данная жидкая композиция может иметь конечную концентрацию сахарозы от примерно 0,05% до примерно 30%, от примерно 0,1% до примерно 15%, от примерно 0,2% до примерно 15%, от примерно 0,2% до примерно 10%, от примерно 0,5% до примерно 10%, от примерно 1% до примерно 5%, от примерно 1% до примерно 3%, от примерно 0,75% до примерно 1,1%, от примерно 0,9% до примерно 1,1% или примерно 1,0%.
В некоторых воплощениях данная жидкая композиция имеет конечную концентрацию сахарозу больше, чем 0,1% и меньше, чем 15%, больше, чем 0,2% и меньше, чем 10%, больше, чем 0,3% и меньше, чем 7,5%, больше, чем 0,5% и меньше, чем 5%, больше, чем 0,5% и меньше, чем 3%, больше, чем 0,5% и меньше, чем 2%, больше, чем 0,5% и меньше, чем 1,1%, больше, чем 0,75% и меньше, чем 1,1%, больше, чем 0,9% и меньше, чем 1,1% или 1,0%.
В некоторых воплощениях данная жидкая композиция имеет конечную концентрацию маннита меньше, чем 5%, меньше, чем 4%, меньше, чем 3%. В некоторых воплощениях данная жидкая композиция имеет конечную концентрацию маннита от 0% до 10%, от 1% до 9%, от 2% до 7,5%, от 2% до 3%, от 2% до 5%, от 2% до 4%, от 0% до 3%, от 0% до 2%, от 1% до 2%, от 1,5% до 3% или 2%.
В некоторых воплощениях данная жидкая композиция имеет конечную концентрацию маннита больше, чем 0% и меньше, чем 10%, больше, чем 0% и меньше, чем 7,5%, больше, чем 0% и меньше, чем 5%, больше, чем 0% и меньше, чем 4%, больше, чем 0% и меньше, чем 3% или больше, чем 0% и меньше, чем 2,5%, или больше, чем 1% и меньше, чем 2,5%.
В некоторых воплощениях данная жидкая композиция имеет конечную концентрацию сахарозы больше, чем 0,5% и меньше, чем 1,1% и конечную концентрацию маннита больше, чем 0% и меньше, чем 3%. В некоторых воплощениях данная жидкая композиция имеет конечную концентрацию сахарозы от 0,7% до 1,1% и конечную концентрацию маннита от 1,5% до 3% или 2%. В некоторых воплощениях данная жидкая композиция имеет конечную концентрацию сахарозы от 0,9% до 1,1% и конечную концентрацию маннита от 1,5% до 3% или 2%. В некоторых воплощениях данная жидкая композиция имеет конечную концентрацию сахарозы 1,0% и конечную концентрацию маннита от 1,5% до 3%, от 2% до 3% или 2%.
В некоторых воплощениях в данной композиции используется другой углевод. Данный углевод может представлять собой моно-, олиго- или полисахарид, такой как сахароза, глюкоза, лактоза, трегалоза, арабиноза, пентоза, рибоза, ксилоза, галактоза, гексоза, идоза, манноза, талоза, гептоза, фруктоза, глюконовая кислота, сорбит, маннит, метил-а-глюкопиранозид, мальтоза, изоаскорбиновая кислота, аскорбиновая кислота, лактон, сорбоза, глюкаровая кислота, эритроза, треоза, аллоза, альтроза, гулоза, эритрулоза, рибулоза, ксилулоза, псикоза, тагатоза, глюкуроновая кислота, галактуроновая кислота, маннуроновая кислота, глюкозамин, галактозамин, нейраминовая кислота, арабинаны, фруктаны, фуканы, галактаны, галактеронаны, глюканы, маннаны, ксиланы, леван, фукоидан, каррагенан, галактокаролоза, пектины, пектиновые кислоты, амилоза, пуллулан, гликоген, амилопектин, целлюлоза, декстран, циклодекстрин, пустулан, хитин, агароза, кератин, хондроитин, дерматан, гиалуроновая кислота, альгиновая кислота, ксантановая камедь или крахмал.
6.3.4. Соль
Жидкая композиция дополнительно содержит соль. Данная соль может представлять собой NaCl или KCl.
В некоторых воплощениях данная жидкая композиция содержит соль в концентрации больше, чем 0,1% и меньше, чем 0,9%, больше, чем 0,25% и меньше, чем 0,75%, больше, чем 0,4% и меньше, чем 0,6%, больше, чем 0,4% и меньше, чем 0,5% или в концентрации 0,45%. В некоторых воплощениях данная жидкая композиция содержит соль в концентрации от 0,1% до 0,9%, от 0,1% до 0,6%, от 0,25% до 0,75%, от 0,4% до 0,6%, от 0,4% до 0,5% или в концентрации 0,45%.
В некоторых воплощениях данная жидкая композиция содержит NaCl в концентрации больше, чем 0,1% и меньше, чем 0,9%, больше, чем 0,25% и меньше, чем 0,75%, больше, чем 0,4% и меньше, чем 0,6%, больше, чем 0,4% и меньше, чем 0,5% или в концентрации 0,45%. В некоторых воплощениях данная жидкая композиция содержит NaCl в концентрации от 0,1% до 0,9%, от 0,1% до 0,6%, от 0,25% до 0,75%, от 0,4% до 0,6%, от 0,4% до 0,5% или в концентрации 0,45%.
В некоторых воплощениях данная жидкая композиция содержит KCl в концентрации больше, чем 0,1% и меньше, чем 0,9%, больше, чем 0,25% и меньше, чем 0,75%, больше, чем 0,4% и меньше, чем 0,6%, больше, чем 0,4% и меньше, чем 0,5% или в концентрации 0,45%. В некоторых воплощениях данная жидкая композиция содержит KCl в концентрации от 0,1% до 0,9%, от 0,25% до 0,75%, от 0,4% до 0,6%, от 0,4% до 0,5% или в концентрации 0,45%.
В некоторых воплощениях в данной композиции используется другая соль. Данная соль может представлять собой одновалентную катионную галогенную соль (например, хлорид натрия, хлорид калия, бромид натрия, хлорид лития, йодид натрия, бромид калия, бромид лития, фторид натрия, фторид калия, фторид лития и/или йодид лития), двухвалентную или трехвалентную соль (например, хлорид кальция, хлорид магния, сульфат кальция, сульфат натрия, сульфат магния, трихлорид хрома, сульфат хрома, цитрат натрия, хлорид железа(III), хлорид иттрия(III), фосфат калия, сульфат калия, хлорид калия, ацетат натрия, фосфат натрия, фосфат калия, хлорид железа(II), хлорид железа(III) или их комбинацию.
6.4. Условия лиофилизации
Лиофилизированную композицию по настоящему изобретению получают посредством лиофилизации жидкой композиции, описанной в данном документе. Данную жидкую композицию можно лиофилизировать при стандартных условиях лиофилизации, известных в данной области, или их модификаций.
Способ осуществления лиофилизации жидкой композиции по изобретению может включать (а) загрузку контейнера жидкой композицией при исходной температуре от примерно 5°С до примерно -50°С; (b) охлаждение препарата ДНК до температур ниже нуля (например, от -10°С до -50°С); и (с) по существу высушивание данного препарата ДНК. Условия для лиофилизации, например, температуру и продолжительность, препарата ДНК по изобретению могут корректироваться обычным специалистом в данной области, принимая во внимание факторы, которые влияют на параметры лиофилизации, например, тип используемой лиофилизационной установки, количество используемой ДНК и размер используемого контейнера.
В некоторых воплощениях стадии (b) охлаждения и (с) сушки проводятся при изменении температур. Например, стадию замораживания можно проводить при увеличении температур от -50°С до -40°С, от -50°С до -30°С, от -50°С до -20°С, от -50°С до -10°С или от -50°С до 0°С. В некоторых воплощениях стадию замораживания можно проводить при снижении температур от -40°С до -50°С, от -30°С до -50°С, от -20°С до -50°С, от -10°С до -50°С, от 0°С до -50°С или от 5°С до -50°С. В некоторых воплощениях стадия замораживания проводится при уменьшении температуры и затем увеличении температуры.
Некоторые аморфные продукты (такие как маннит или глицин) формируют метастабильное стекло с неполной кристаллизацией при первом замораживании. Данные продукты могут получать пользу от способа тепловой обработки, который также называется отжиг. Во время отжига температура продукта циклически изменяется (например: от -40°С до -20°С в течение нескольких часов и затем обратно до -40°С; от -50°С до -20°С, выдерживая в течение двух (2) часов, затем вводя вакуум; или от -50°С до -20°С и затем обратно до -50°С с получением более полной кристаллизации. Отжиг имеет дополнительное преимущество большего роста кристаллов и соответствующего более короткого времени сушки. Вода, удерживаемая в аморфной фазе, может быть дополнительно удалена во время вторичной сушки.
В некоторых воплощениях стадия сушки проводится в два этапа - (i) первичная сушка и (ii) вторичная сушка.
В некоторых воплощениях первичная сушка проводится при поддержании температуры или при повышении или снижении температуры. В некоторых воплощениях первичная сушка проводится при поддержании температуры при -50°С, -40°С, -30°С, -20°С, -10°С или 0°С. В некоторых воплощениях вторичная сушка проводится при поддержании температуры или при повышении или снижении температуры. В некоторых воплощениях вторичная сушка может проводиться при увеличении температуры от -50°С до 20°С, от -40°С до 20°С, от -30°С до 20°С, от -20°С до 20°С, от -10°С до 20°С, от -50°С до 10°С, от -40°С до 10°С, от -30°С до 10°С, от -20°С до 10°С или от -10°С до 10°С.
Во время процесса лиофилизации может происходить разделение фаз. Например, чистая кристаллическая фаза может отделяться от насыщенной аморфной фазы. Данная кристаллическая фаза может включать лед или другие кристаллизующиеся эксципиенты. Таким образом, во время первичной сушки может удаляться фаза чистого льда, оставляя за собой другие кристаллические фазы и любые насыщенные аморфные фазы. Условия для первичной сушки могут быть скорректированы для эффективного удаления данной несвязанной воды при сохранении структуры осадка и стабильности ДНК. Первичная сушка (сублимация) представляет собой медленный процесс, проводящийся при более холодных температурах, безопасно более низких, чем критическая температура разрушения продукта (англ. «collapse temperature»). Для сублимации требуется тепловая энергия для управления процессом изменения фазы от твердого вещества до газообразного. При лиофилизации продукта необходимо рассматривать все три способа переноса теплоты - кондуктивную теплопередачу, конвекцию и излучение.
Каждая жидкая композиция имеет уникальную критическую температуру. Необходимо поддерживать композицию при температуре безопасно меньше, этой критической температуры во время первичной сушки для того, чтобы избежать разрушения. Данная температура зависит от давления пара на поверхности контакта льда, и, в свою очередь, данное давление пара зависит и от скорости теплопередачи в композицию (которая контролируется посредством корректировки температуры полки), и от заданной точки уровня вакуума системы. Во время первичной сушки давление системы и температуру полки устанавливают и контролируют в комбинации с получением подходящей температуры продукта. С установленными параметрами температуры и давления первичная сушка затем продолжается в течение достаточной продолжительности времени для сублимации всех кристаллов льда.
Помимо свободного льда, который сублимируется во время первичной сушки, остается существенное количество молекул воды, которые связаны с продуктом. Это вода, которая удаляется (десорбируется) во время вторичной сушки. Поскольку весь свободный лед был удален при первичной сушке, температура продукта теперь может быть значительно увеличена без страха плавления или разрушения. Вторичная сушка фактически начинается во время первичной фазы, но при повышенных температурах (типично в интервале от 20 до 50°С), десорбция идет значительно быстрее. Скорости вторичной сушки зависят от температуры продукта. Вакуум системы может сохраняться на том же самом уровне, что и используемый во время первичной сушки; меньшие уровни вакуума не будут улучшать время вторичной сушки.
Вторичная сушка продолжается, пока данный продукт не имеет приемлемого содержания влаги для долговременного хранения. В зависимости от применения, содержание влаги в полностью высушенных продуктах типично составляет от 0,5% до 3%. В большинстве случаев чем суше продукт, тем дольше будет его срок хранения. Однако определенные сложные биологические продукты могут фактически становиться слишком сухими для оптимальных результатов хранения, и способ вторичной сушки должен контролироваться соответствующим образом.
Стадию вторичной сушки можно проводить при увеличении температур от -50°С до 20°С, от -40°С до 20°С, от -30°С до 20°С, от -20°С до 20°С, от -10°С до 20°С, от -50°С до 10°С, от -40°С до 10°С, от -30°С до 10°С, от -20°С до 10°С, от -10°С до 10°С.
6.5. Лиофилизированная композиция в разовой дозе
Другим аспектом настоящего изобретения является лиофилизированная фармацевтическая композиция в разовой дозе. В некоторых воплощениях стандартная лекарственная форма представляет собой флакон, ампулу, бутыль или предварительно заполненный шприц. В некоторых воплощениях разовая доза содержит примерно от 50 мкг до 1 г плазмидной ДНК, от 100 мкг до 1 г плазмидной ДНК, от 100 мкг до 100 мг плазмидной ДНК, от 1 мг до 100 мг плазмидной ДНК, от 10 мг до 100 мг плазмидной ДНК, от 10 мг до 50 мг плазмидной ДНК. Разовая доза может содержать примерно 10 мкг, 50 мкг, 100 мкг, 1 мг, 10 мг, 100 мг или 1 г плазмидной ДНК. Стандартная лекарственная форма может содержать 0,01 мг, 0,1 мг, 0,2 мг, 0,25 мг, 0,5 мг, 1 мг, 2,5 мг, 5 мг, 8 мг, 10 мг, 12,5 мг, 16 мг, 24 мг, 25 мг, 50 мг, 75 мг, 100 мг, 150 мг или 200 мг плазмидной ДНК.
В типичных воплощениях стандартная лекарственная форма представляет собой флакон, содержащий 50 мг, 10 мг, 7,5 мг, 5, мг, 1 мг, 100 мкг или 50 мкг лиофилизированной фармацевтической композиции, подходящей для введения после растворения. Введение включает подкожное, внутрикожное или внутримышечное введение с использованием предварительно загруженных шприцев, автоинъекторов и авто инъецирующих шприцев-ручек, причем каждый содержит заданное количество фармацевтической композиции, описанной выше.
Разовая доза в контейнере может быть определена на основе разных факторов, таких как активный ингредиент (например, плазмидная ДНК), заболевание, подлежащее лечению, субъект, путь и способ введения. Разовая доза может быть определена на основе исследований in vitro или in vivo, включая клинические испытания.
Разовая доза в контейнере может быть запечатана и может храниться в течение увеличенного периода времени при разных температурах (например, от комнатной температуры до примерно -180°С, предпочтительно от примерно 2-8°С до примерно -80°С, более предпочтительно от примерно -20°С до примерно -80°С и наиболее предпочтительно при примерно -20°С).
Лиофилизированные композиции ДНК, хранящиеся в контейнере, предпочтительно являются стабильными в пределах интервала от примерно 2-20°С до примерно -80°С в течение периода по меньшей мере 1 месяц, 3 месяца, 6 месяцев или 1 год без потери значительной активности. Срок хранения может быть таким длительным, как несколько месяцев, 1 год, 5 лет, 10 лет, 15 лет или вплоть до 20 лет. Предпочтительно данный препарат является стабильным в течение периода по меньшей мере примерно 3 лет.
6.6. Характеристика лиофилизированной композиции
Согласно настоящему изобретению предложена лиофилизированная фармацевтическая композиция, имеющая одно или более чем одно желательное свойство в качестве фармацевтического продукта. Данные свойства могут включать стабильность и эффективность активного ингредиента при разных условиях хранения, образование осадка, однородное растворение данного препарата для введения, меньшее количество загрязнений и т.д. Разные свойства, предоставленные в данном документе, можно использовать для выбора предпочтительной лиофилизированной композиции или для определения идеальных условий хранения для лиофилизированной композиции.
Стабильность плазмидной ДНК в данной лиофилизированной композиции можно определять на основе известных в данной области способов. В частности, стабильность можно определять на основе конформации плазмидной ДНК, например, например, существуют ли они в виде более стабильной суперспирализованной формы или менее стабильной открытой кольцевой или линейной формы. Конформация плазмидной ДНК может определяться посредством капиллярного электрофореза образца, содержащего плазмидную ДНК. Содержание суперспирализованной ДНК по сравнению с открытой кольцевой или линейной формой можно измерять в разных условиях. Например, содержание суперспирализованной ДНК можно определять перед, во время или после лиофилизации, или перед, во время или после растворения данной лиофилизированной композиции. Содержание суперспирализованной ДНК также можно определять перед, во время или после хранения при разных температурах для выбора стабильной лиофилизированной композиции, а также для определения идеальных условий хранения.
Другой способ определения стабильности плазмидной ДНК основывается на концентрациях ДНК. Можно применять разные способы измерения концентраций ДНК, известные в данной области. Например, концентрации ДНК можно измерять на основе на основе светопоглощения при 260 нм. Данный способ может дополнительно включать измерение загрязнителей для лучшего количественного измерения концентраций ДНК в образце.
Внешний вид осадка может быть другой важной характеристикой лиофилизированного продукта. Обычно предпочтительным является однородный и первоклассный внешний вид осадка. Неидеальный внешний вид осадка может влиять на качество продукта, например, затрудняя определение качества продукта на основе визуальной проверки или делая затруднительным извлечение всего количества активного ингредиента в контейнере. Кроме того, частичное или полное обратное плавление осадка может приводить к нестабильности и деградации активного ингредиента. Обратное плавление представляет собой вид разрушения осадка, и оно вызвано изменением от твердого до жидкого состояния. То есть, имеется неполная сублимация (изменение от твердого до газообразного состояния) во флаконе. Данные изменения могут включать изменение физической формы лекарственного вещества и карман влаги.
Внешний вид осадка может определяться визуальной проверкой, которая может включать фотографирование. Визуальные проверки могут осуществляться, главным образом, на основе исторического прецедента. Перед суждением о качестве продукта важной является надежная программа качественной оценки для визуальной проверки. Данная программа качественной оценки может быть основана на прошлом опыте или опубликованной информации. Для лекарственного продукта могут быть разработаны конкретные руководства визуальной проверки, например, на основе информации, предоставленной в руководстве по проверке «Lyophilization of Parenterals: Guide To Inspections of Lyophilization of Parenterals (7/93)», опубликованной Управлением США по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств.
Другой характеристикой лиофилизированного продукта, которая может влиять на качество лекарственного продукта, является мутность растворенного лекарственного средства, полученного посредством растворения лиофилизированного продукта. Мутность растворенного лекарственного средства может коррелировать с выходом активных ингредиентов в данной лиофилизированной композиции. В общем, предпочтительным является полное растворение, т.е. низкая мутность выделенного лекарственного средства. Неполное растворение может приводить к отходам активных ингредиентов фармацевтической композиции и к закупорке шприца для введения растворенного лекарственного средства.
Мутность растворенного лекарственного средства можно измерять визуальными проверками или измерением светопоглощения при определенных длинах волн, например, при 450 нм и 650 нм. Светопоглощение можно измерять с использованием доступного в данной области устройства, например, микропланшета ThermoMAX от Molecular Devices.
Время растворения является другим фактором, который можно связать с качеством лекарственного продукта. В общем, предпочтительным является короткое время растворения. Увеличенное время растворения на этапе пользователя может приводить к частичной потере эффективности, если данное лекарственное средство не полностью растворяется, так как во время введения пациенту обычным является применение инфузионных фильтров. Время, требующееся для растворения лиофилизированного продукта, можно определять, например, измерением мутности растворенного лекарственного средства в разные моменты времени после растворения. Например, мутность можно измерять через 1 мин, 5 мин, 10 мин, 15 мин, 20 мин, 25 мин, 30 мин, 1 час, 2 часа или более.
Остаточная влага после лиофилизации также может быть важной. Для измерения остаточной влаги в лиофилизированной композиции можно применять разные способы, известные в данной области. Например, для анализа содержания влаги можно использовать Karl Fisher Coulometer С20 (Mettler Toledo). Карман влаги в лиофилизированной композиции может приводить к большей нестабильности и повышенной деградации продукта. Таким образом, меньшее содержание влаги может быть предпочтительным.
6.7. Способы лечения заболевания с использованием лиофилизированной композиции
Способы лечения заболеваний с использованием лиофилизированной композиции находятся в пределах объема настоящего изобретения.
6.7.1. Растворение лиофилизированной композиции
Можно использовать разные способы растворения, такие как способы вихревого перемешивания, способы с использованием механического орбитального шейкера или способы с поддержанием флакона в стационарном состоянии.
Конечная концентрация растворенного лекарственного средства для введения может корректироваться, в зависимости от многих факторов, включая количество препарата, подлежащего доставке, возраст и массу субъекта, способ доставки, путь и иммуногенность доставляемого антигена.
Лиофилизированную композицию по настоящему изобретению можно растворять с использованием подходящего раствора, такого как вода, ТЕ, PBS (фосфатно-солевой буферный раствор), Tris буфер или нормальный физиологический раствор, до конечной концентрации примерно 10 мг/мл, 5 мг/мл, 1 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,3 мг/мл, 0,2 мг/мл, 0,1 мг/мл или 0,05 мг/мл.
6.7.2. Введение растворенного лекарственного средства
Растворенное лекарственное средство по настоящему изобретению можно вводить млекопитающему субъекту для лечения разных заболеваний. Растворенную лиофилизированную композицию по изобретению можно вводить разными способами доставки, например, перорально или посредством парентеральных путей, таких как внутривенная, внутримышечная, внутриэндокардиальная, внутримиокардиальная, внутриперикардиальная, внутрижелудочковая, внутрисуставная, внутрикожная, внутримозговая, внутрипочечная, внутрипеченочная, внутриселезеночная, внутрилимфатическая, подкожная, внутрибрюшная, интратестикулярная, внутрияичниковая, внутриматочная, грудинная, внутритрахеальная, внутриплевральная, интраторакальная, интрадуральная, внутриспинальная, интрамедуллярная, интрамуральная, интраскорионная и артериальная инъекция или инфузия, или местно посредством ректального, внутриназального, ингаляционного или внутриглазмого введения. В некоторых воплощениях способом доставки является внутримышечная, внутримиокардиальная, внутривенная, внутримозговая или внутрипочечная доставка.
В типичных воплощениях конструкция нуклеиновой кислоты вводится посредством инъекции жидкой фармацевтической композиции. В предпочтительных в настоящее время воплощениях полинуклеотидная конструкция вводится посредством внутримышечной инъекции. Типично данная полинуклеотидная конструкция вводится посредством внутримышечной инъекции близко к пораженному участку. В некоторых воплощениях полинуклеотидные конструкции вводится в мышцы конечностей, сердца или других частей организма субъекта.
В некоторых воплощениях данная конструкция инъецируется подкожно или внутрикожно. В некоторых воплощениях данная полинуклеотидная конструкция вводится посредством внутрисосудистой доставки. В некоторых воплощениях данная конструкция инъецируется ретроградной внутривенной инъекцией.
Следует понимать то, что типичную ежесуточную дозу растворенной лиофилизированной композиции по настоящему изобретению следует определять в свете разных релевантных факторов, включающих состояния, подлежащие лечению, выбранный путь введения, возраст, пол и массу тела индивидуального пациента, тяжесть симптома пациента, и она может вводиться в одной дозе или в раздельных дозах. Полинуклеотидная конструкция вводится в терапевтически эффективной дозе.
В некоторых воплощениях описанных в данном документе способов полинуклеотидная конструкция вводится в общей дозе от 1 мкг до 200 мг, от 1 мг до 200 мг, от 1 мг до 100 мг, от 1 мг до 50 мг, от 1 мг до 20 мг, от 5 мг до 10 мг, 16 мг, 8 мг или 4 мг.
В типичных воплощениях общая доза делится на целый ряд индивидуальных инъекционных доз. В некоторых воплощениях общая доза делится на целый ряд равных инъекционных доз. В некоторых воплощениях общая доза делится на неравные инъекционные дозы.
В разных воплощениях с раздельными дозами общая доза вводится в 4, 8, 16, 24 или 32 разных инъекционных участка.
В некоторых воплощениях инъекционная доза составляет 0,1-5 мг. В определенных воплощениях инъекционная доза составляет 0,1 мг, 0,15 мг, 0,2 мг, 0,25 мг, 0,3 мг, 0,35 мг, 0,4 мг, 0,45 мг или 0,5 мг.
Данная общая доза может вводиться во время одного посещения или за два или более чем два посещения.
В типичных воплощениях с раздельной дозой все из целого ряда инъекционных доз вводятся в пределах 1 часа друг от друга. В некоторых воплощениях все из целого ряда инъекционных доз вводятся в пределах 1,5; 2; 2,5 или 3 часов друг от друга.
В разных воплощениях данных способов общая доза полинуклеотидной конструкции, независимо от того, вводится ли она в виде одиночной унитарной дозы или разделенной на множество инъекционных доз, вводится субъекту только один раз.
В некоторых воплощениях один цикл может включать введение общей дозы полинуклеотидной конструкции во множество мест инъекции за один, два, три или четыре посещения. В частности, один цикл может включать введение 32 мг, 16 мг, 8 мг или 4 мг полинуклеотидной конструкции во множество мест инъекции за два посещения. Данные два посещения могут быть отделены друг от друга 3, 5, 7, 14, 21 или 28 сутками.
В некоторых воплощениях цикл можно повторять. Данный цикл можно повторять дважды, три раза, четыре раза, пять раз, шесть раз или более.
В некоторых воплощениях данный цикл можно повторять через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или более месяцев после предыдущего цикла.
В некоторых воплощениях общая введенная доза в последующем цикле является такой же, как и общая введенная доза в предыдущем цикле. В некоторых воплощениях общая введенная доза в последующем цикле является отличной от общей введенной дозы в предыдущем цикле.
В предпочтительных в настоящее время воплощениях данная конструкция нуклеиновой кислоты вводится в дозе 8 мг на пораженную конечность, равномерно разделенной на целый ряд внутримышечных инъекций и целый ряд посещений, где каждая из целого ряда инъекций в любое одно посещение проводится в отдельное место инъекции. В некоторых воплощениях данная конструкция нуклеиновой кислоты вводится в дозе 8 мг на пораженную конечность, равномерно разделенной на первую дозу в 4 мг на конечность в сутки 0 и вторую дозу в 4 мг на конечность в сутки 14, где каждая из первой и второй дозы равномерно разделена на множество инъекционных доз.
Фактическое введенное количество, скорость и динамика введения будут зависеть от природы и тяжести заболевания, которое лечат. В типичных воплощениях полинуклеотидная конструкция вводится в эффективном количестве для уменьшения симптомов заболевания, например, боли. В некоторых воплощениях данное количество является эффективным для уменьшения симптома в пределах 1 недели после введения. В некоторых воплощениях данное количество является эффективным для уменьшения симптома в пределах 2 недель, 3 недель или 4 недель введения.
Данная плазмидная ДНК может вводиться одна или в комбинации с другой плазмидной ДНК либо одновременно, либо последовательно, в зависимости от состояния, которое лечат.
В некоторых воплощениях растворенная композиция содержит плазмидную ДНК, кодирующую человеческий HGF. Данное растворенное лекарственное средство может вводиться для лечения разных заболеваний, например, заболевания, для которого ранее было продемонстрировано то, что оно лечится введением плазмидной ДНК. Данная плазмидная ДНК может кодировать терапевтический ген, как, например, человеческого HGF. Данное заболевание включает ишемическое или печеночное заболевание, болезнь коронарных артерий («CAD»), боковой амиотрофический склероз («ALS»), болезнь периферических артерий («диабетическая язва») и диабетическую периферическую нейропатию («DPN») или нейропатию, вызванную заболеваниями, повреждениями, инфекциями или состояниями недостаточности витаминов, но не ограничивается ими. Например, нейропатия может быть вызвана диабетом, недостаточностями витаминов, аутоиммунными заболеваниями, генетическими или наследственными расстройствами, амилоидозом, уремией, токсинами или ядами, травмой или повреждением, опухолями или может быть идиопатической. Для лечения заболеваний посредством введения лиофилизированной композиции можно применять способы, описанные в патентах США №7812146; 7838505; 7745174; 8338385; 8389492 и заявках США №12/359137; 14/355792; 15/030999. Приведенные в данном документе ссылки являются включенными в данный документ посредством ссылки во всей их полноте.
В некоторых воплощениях растворенная композиция содержит плазмидную ДНК, кодирующую человеческий IGF-1. Данное растворенное лекарственное средство может вводиться для лечения разных заболеваний, например, заболевания, для которого ранее было продемонстрировано то, что оно лечится введением плазмидной ДНК, кодирующей человеческий IGF-1 или белок человеческого IGF-1. Данное заболевание включает нейропатию, вызванную заболеваниями, повреждениями, инфекциями или состояниями недостаточности витаминов, но не ограничивается ей. Например, данная нейропатия может быть вызвана диабетом, недостаточностями витаминов, аутоиммунными заболеваниями, генетическими или наследственными расстройствами, амилоидозом, уремией, токсинами или ядами, травмой или повреждением, опухолями или может быть идиопатической. В некоторых воплощениях плазмида, кодирующая человеческий белок IGF-1 (pTx-IGF-1), вводится с другой плазмидой, кодирующей человеческий HGF (например, VM202), для лечения заболевания. Для лечения заболеваний посредством введения лиофилизированной композиции можно применять способы, описанные в заявках США №16/513560 и/или 16/513564.
В некоторых воплощениях растворенная композиция содержит плазмидную ДНК, кодирующую человеческий SDF-1α. Для лечения заболевания данную плазмиду можно вводить одну или совместно с другой плазмидной ДНК. В некоторых воплощениях плазмида, кодирующая человеческий SDF-1α (например, pCK-SDF-1α) вводится с другой плазмидной ДНК, кодирующей человеческий HGF (например, VM202), для лечения заболевания. Данное заболевание включает сосудистое заболевание, такое как заболевание периферических сосудов, но не ограничивается им. Для лечения заболевания посредством введения плазмиды, кодирующей человеческий SDF-1α, можно применять способы, описанные в заявке США №15/514244.
6.8. Примеры
Следующие примеры излагаются таким образом, чтобы давать обычным специалистам в данной области полное раскрытие и описание того, как использовать настоящее изобретение, и они не предназначены ни для того, чтобы ограничивать объем того, что авторы данного изобретения рассматривают как их изобретение, ни для представления того, что эксперименты ниже являются всеми или единственными проведенными экспериментами. Были предприняты усилия для обеспечения точности в отношении использованных чисел (например, количеств, температуры и т.д.), но необходимо учитывать некоторые экспериментальные ошибки и отклонения. Если не указано иное, части являются частями по массе, молекулярная масса представляет собой среднюю молекулярную массу, температура приводится в градусах Цельсия, и давление является атмосферным или около атмосферного. Могут использоваться стандартные сокращения, например, п.о. - пара(ры) оснований; т.п.н. - тысяча(чи) пар нуклеотидов; пл - пиколитр(ы); с - секунда(ды); мин - минута(ты); ч - час(сы); ак - аминокислота(ты); нт - нуклеотид(ды) и тому подобные.
В воплощении настоящего изобретения на практике, если не указано иное, будут использоваться традиционные способы белковой химии, биохимии, методики генной инженерии и фармакологии, находящиеся в пределах квалификации в данной области.
6.8.1. Пример 1: лиофилизированная композиция VM202 (исследование 001) 6.8.1.1. Проанализированная фармацевтическая композиция, содержащая VM202
Получали разные препараты, содержащие VM202, как приводится ниже в ТАБЛИЦЕ 1. Активный ингредиент - плазмида VM202 - получали из замороженных маточных растворов, содержащих либо 1,6 мг/мл VM202 в 0,9% NaCl, либо 1,3 мг/мл VM202 в 0,9% NaCl.
Данные препараты получали с использованием имеющихся в продаже веществ и оборудования, например, одноосновного фосфата калия (Spectrum, каталожный № РО200), двухосновного фосфата калия (EMD, каталожный № РХ1570-1), маннит (J.T. Baker, каталожный №2553-05), сахарозы (J.T. Baker, каталожный №4074-05), хлорида натрия (Millipore, каталожный №1.06404.5000) и трегалозы (Pfanstiehl, каталожный №Т-104-04), диализной кассеты (Thermo Scientific, каталожный №66380 (10000 MWCO (порог отсечения молекулярной массы)), стеклянных флаконов (3 мл или 20 мл стеклянные флаконы (Schott, Типа I, борсиликатные, каталожный №68000316 или 68000321)) и пробки (13 мм или 20 мм лиокрышка с одним вентиляционным отверстием, Flurotec, (West Pharmaceutical, каталожный №19700034 или 19700311)). Также использовали эксципиенты, такие как декстран (MP Biomedicals, каталожный №101514), гидроксид лития (Sigma Aldrich, каталожный № L4533-100G) и фосфорная кислота (J.T. Baker, каталожный №0262-01).
6.8.1.2. Анализ разных препаратов в малом масштабе
6.8.1.2.1. Приготовление образца
Для получения разных препаратов флаконы с VM202 в концентрации 1,6 мг/мл в 0,9% NaCl удаляли с хранения при -70°С и оттаивали при температуре окружающей среды.
Образцы для 1 раунда анализа в малом масштабе: затем получали KP8M2SN (см. Таблицу 1) посредством диализа с использованием диализной кассеты Thermo с MWCO 10000 при 10000-кратной или более замене объема относительно препарата целевого буфера (10 мМ фосфат калия, 2% маннита, 1,0% сахарозы, 0,1% NaCl, рН 8,0) за 24 часа при 2-8°С. После диализа концентрацию KP8M2SN доводили до 0,5 мг/мл VM202 с использованием буфера для приготовления препарата.
KP8MS3N, KP8MT3N и контроль получали разведением лекарственного вещества. В частности, 1,7 мл VM202 (т.е. VM202 в 0,9% NaCl) разводили 0,85 мл буферов для разведения (буфер №2 для KP8MS3N, буфер №3 для KP8MT3N и буфер №8 для контроля), приведенных в ТАБЛИЦЕ 2. После разведений каждый препарат доводили таким образом, чтобы он содержал 0,5 мг/мл VM202 для KP8MS3N и KP8MT3N, соответственно, с использованием буфера для приготовления препарата, содержащего 0,45% NaCl.
Образцы для 2-го раунда анализов в малом масштабе: 4MSN, 3MSN и 2MSN получали разведением 0,84 мл лекарственного вещества (т.е. VM202 в 0,9% NaCl) с использованием 0,42 мл буферов для разведения (буфер 4 для 4MSN, буфер 5 для 3MSN и буфер 6 для 2MSN), также приведенных ниже в ТАБЛИЦЕ 2. После разведения каждый препарат, за исключением контроля, доводили таким образом, чтобы он включал 0,5 мг/мл VM202 с использованием каждого буфера для приготовления препарата, содержащего 0,45% NaCl.
Приготовление образцов для исследования стабильности с ускоренной деградацией: для исследования стабильности с ускоренной деградацией дополнительно получали отдельный набор препаратов. Для данного отдельного набора 4MSN, 3MSN, 2MSN, 2M1SN и контроль получали разведением лекарственного вещества (т.е. VM202 в 0,9% NaCl) буферами для разведения, приведенными выше в ТАБЛИЦЕ 2, в соотношении 2:1 (буфер 4 для 4MSN, буфер 5 для 3MSN, буфер 6 для 2MSN, буфер 7 для 2M1SN и буфер 8 для контроля). После разведений все препараты, за исключением контроля, доводили таким образом, чтобы они содержали VM202 в концентрации 0,5 мг/мл с использованием каждого буфера для приготовления препарата, содержащего 0,45% NaCl.
Имитирующий препарат получали с использованием декстрана в концентрации 0,5 мг/мл в 0,9% NaCl и 1,1% сахарозе.
Лиофилизация образцов: после доведения концентрации до 0,5 мг/мл приготовленный в виде препарата VM202 подвергали стерилизующей фильтрации через 0,2 мкм фильтр PES (исследования в малом масштабе и исследования стабильности с ускоренной деградацией) или фильтр на основе ацетата целлюлозы (СА) (дополнительное исследование стабильности с ускоренной деградацией) при асептических условиях. Всеми образцами заполняли при асептических условиях стерилизованные 3 мл флаконы с объемом заполнения 0,75 мл на флакон для лиофилизации в малом масштабе или стерилизованные 20 мл флаконы с объемом заполнения 5 мл на флакон для исследований стабильности с ускоренной деградацией в боксе микробиологической безопасности. В частности, заполнение данными препаратами осуществляли с использованием шприцевого фильтра (PALL Life Science, 13 мм Acrodisc с 0,2 мкм мембраной PES, каталожный №4602) с использованием системы вакуумной фильтрации (Corning, 1 л система вакуумный фильтр/бутыль для хранения, 0,2 мкм СА мембрана, каталожный №431-205; Thermo scientific, фильтрующий элемент для быстрого тока, 0,2 мкм PES мембрана, каталожный №567-0020) в боксе микробиологической безопасности (бокс микробиологической безопасности NuAire, класс II, тип А/В3, №модели NU-425-600)).
После заполнения данные флаконы частично закупоривали стерильными крыжками и загружали в лиофилизатор (VirTis (№ модели 25L Genesis SQ Super XL-70) для лиофилизации с использованием цикла, описанного в ТАБЛИЦЕ 3. Флаконы имитации использовали для полного окружения флаконов VM202 таким образом, что во время процесса сушки для лиофилизации в малом масштабе обеспечивается сравнимая излучательная теплопередача от соседних флаконов.
После лиофилизации данные флаконы полностью закупоривали при частичном вакууме 600 мТорр (79,99 Па), обжимали алюминиевыми колпачками и метили. Метки включали информацию относительно проекта, дату, температуру инкубации/стрессовое условие и момент времени. После мечения образцы помещали в соответствующие им условия стабильности.
6.8.1.2.2. Анализы для тестирования разных препаратов
Лиофилизированные препараты подвергали воздействию разных стрессовых условий для оценки их относительной стабильности. Для теплового стрессового воздействия на образцы все препараты хранили при 5°С, 25°С или 40°С в течение вплоть до 10 недель. Для оценки стабильности после растворения образцы растворяли в боксе микробиологической безопасности с использованием целевого объема 5,0 мл фильтрованной воды для инъекции (WFI), повторно закупоривали и повторно запечатывали. После растворения образцы хранили при 25°С в течение 3 или 7 суток. Разные условия, проанализированные в данном эксперименте, обобщаются ниже в ТАБЛИЦЕ 4.
Следующие анализы проводили для анализа стабильности разных препаратов в разных условиях.
(1) Визуальная проверка: визуальную проверку проводили относительно темного и белого фона. Получали цифровые фотографии.
(2) УФ (ультрафиолетовая) спектрофотометрия: анализ УФ спектрофотометрией проводили с использованием нанофотометра Implen с фактором крышки 10. Концентрацию плазмидной ДНК опытных образцов определяли измерением поглощения при 230, 260, 280 и 350 нм. Анализы концентрации проводили с использованием протокола в УФ/видимой области ViroMed. Расчеты проводили с использованием следующих уравнений:
Концентрация (мкг/мл) = [(D-E)/C] × (В/А)
Выход = (низкая мкг/мл) / (высокая мкг/мл) × 100%
260нм
280нм
ОП/ОП=D/F
260nm
230nm
ОП/ОП=D/G
где:
А - масса образца, взятого для получения разведения.
В - общая масса образца и буфера для получения разведения.
С - коэффициент экстинкции 0,005% раствора в кювете с длиной пути 1 см (0,02).
D - оптическая плотность для максимума при 260 нм.
Е - поглощение, измеренное при 350 нм.
F - поглощение, измеренное при 280 нм.
G - поглощение, измеренное при 230 нм.
Критерии принятия:
D должно попадать в интервал от 0,5 до 1,5 единиц ОП (оптическая плотность)
Выход должен быть большим или равным 98%
260нм
280нм
ОП/ОП должно находиться в интервале от 1,8 до 2,0
260нм
230нм
ОП/ОП должно быть большим или равным 1,1
(3) Капиллярный электрофорез: для структурного анализа плазмидной ДНК (чистота и суперспирализованная ДНК) использовали прибор Beckman Coulter, ProteomeLab™ PA 800 СЕ, оснащенный УФ детектором Р/АСЕ™ MDQ. Для анализа результатов использовали программу 32 Karat (версия 7.0). Перед анализом посредством капиллярного электрофореза 40 см покрытый капилляр Beckman Coulter Neutral с 50 мкм внутренним диаметром (№ части 477441) и 8 мкм окном апертуры кондиционировали посредством пропускания воды класса ультрачистая для ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) при 137,9 кПа в течение 1 минуты, с последующей промывкой 100 мМ фосфорной кислотой (рН 2,6) при 137,9 кПа в течение 1 минуты. Разделение происходило посредством приложения постоянного напряжения 17 кВ в течение 14 минут. 40 мкл образца в концентрации 0,5 мг/мл добавляли в полиэтиленовую вставку для анализов. Использовали следующие параметры:
• Давление/ время инъекции: 3,45 кПа/11 с.
• Буфер для разделения/давление: 100 мМ фосфорная кислота (рН 2,60), 85% / 137,9 кПа; 60 с.
• Промывочный буфер/давление: ультрачистая вода класса для ВЭЖХ / 137,9 кПа; 60 с
• Длина волны детектора: 254 нм.
• Напряжение разделения: 17 кВ; 0,17 мин; 14 мин.
Типичный результат капиллярного электрофореза VM202 приводится на Фиг. 1.
(4) Мутность: мутность определяли измерением поглощения образца при 450 нм и 650 нм с использованием микропланшет-ридера ThermoMAX от Molecular Devices.
(5) Анализ ДСК (дифференциальная сканирующая калориметрия) при условиях, близких к условиям окружающей среды: с использованием ДСК Pyris Diamond с Intercooler II замораживали приблизительно 10 мкл каждого препарата при -60°С. При скорости изменения 5°С/мин образец нагревали до 25°С, и записывали тепловой поток во время процесса нагревания. Также осуществлялась программа, включающая стадию отжига. Стадию отжига проводили посредством нагревания образца до -15°С при скорости изменения 5°С/мин.
(6) Анализ влаги по Карлу Фишеру: для анализа содержания влаги использовали Karl Fisher Coulometer С20 (Mettler Toledo). Для определения точности системы использовали AquaStar Water Standard Oven 1%. Перед удалением колпачков для анализа флаконы с образцами доводили до комнатной температуры. Лодочки для взвешивания взвешивали до и после добавления образцов для определения количества лиофилизированного порошка, использованного для анализа. Для анализа использовали приблизительно 10-160 мг вещества.
6.8.1.2.3. Анализ KP8M2SN, KP8MS3N и KP8MT3N (1-ый раунд анализа в малом масштабе)
Анализ ДСК при условиях, близких к условиям окружающей среды: перед процессом лиофилизации 10 мкл образцов приготовленной в виде препрата VM202 - т.е. KP8M2SN, KP8MS3N, KP8MT3N и контроль (ТАБЛИЦА 1) - в концентрации 0,5 мг/мл анализировали посредством дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) при условиях, близких к условиям окружающей среды, для характеристики препаратов-кандидатов. Проанализированные сигналы включают температуру разрушения (Tg'), температуру расстеклования (Td) и пользу отжига разных препаратов с VM202 в замороженных состояниях. На Фиг. 2A-2D проиллюстрированы результаты ДСК жидкого состояния для 1-го раунда лиофилизации в малом масштабе KP8M2SN (Фиг. 2А), KP8MS3N (Фиг. 2В), KP8MT3N (Фиг. 2С) и контроля (Фиг. 2D) без отжига (слева) или с отжигом (справа) VM202. Температуру стеклования (Tg') KP8M2SN наблюдали при -44°С. Контроль демонстрировал эвтектическую температуру плавления (Те) при примерно -21°С. Температура расстеклования (Td) наблюдалась во всех препаратах и исчезала после отжига. Поскольку некоторые из добавок демонстрировали сигналы рассеклования, которые исчезали после отжига, цикл 1 лиофилизации (ТАБЛИЦА 3) разрабатывали так, чтобы он включал стадию отжига во время замораживания для 1-го раунда в малом масштабе.
Увеличение температуры замораживания от -50°С до -20°С и выдерживание в течение двух (2) часов, затем последующее введение вакуума обеспечивали отжиг и индукцию кристаллизации маннита. Первичную сушку проводили при температуре полки -20°С (24 часа) с давлением камеры 80 мТорр (10,66 Па) (ТАБЛИЦА 3). Вторичную сушку при температуре полки 20°С разрабатывали для удаления остаточной воды, которая не сублимировалась во время стадии первичной сушки.
На Фиг. 3 показан график динамики температур (левая ордината) и давлений (правая ордината) во время процесса лиофилизации для 1-го раунда проведения анализа в малом масштабе. Температура продукта падала ниже -36°С из-за потери тепла сублимации при приложении вакуума. Значение манометра Пирани сливалось с показанием емкостного манометра приблизительно в 30 часов во время стадии первичной сушки, что подтверждало завершение процесса первичной сушки. Инициировали вторичную сушку, и давали образцам сохнуть в течение еще 13 часов. Весь цикл длился 46 часов с потенциалом уменьшения до 43 часов, если вторичная сушка инициировалась сразу при завершении первичной сушки.
При завершении 1-го раунда цикла лиофилизации в малом масштабе все флаконы закупоривали с давлением вакуума 600 торр. Данные лиофилизаты удаляли из камеры и анализировали. Лиофилизированный осадок KP8M2SN имел первоклассный внешний вид. Другие осадки демонстрировали признаки разрушения, особенно контроль. Растворенные образцы были прозрачными и сравнимыми с образцами перед лиофилизацией (Фиг. 4А-С). Содержание влаги данных осадков составляло 1,37% (KP8M2SN), 2,40% (KP8MS3N), 1,44% (KP8MT3N) и 1,25% (контроль) соответственно.
Концентрацию VM202 в каждом образце измеряли после растворения образца из 1-го раунда цикла лиофилизации в малом масштабе, и результаты обобщаются в ТАБЛИЦЕ 5. Данные результаты показали то, что каждый образец содержал VM202 в аналогичной концентрации.
Капиллярный электрофорез: растворенные образцы дополнительно проверяли СЕ в отношении чистоты продукта. Хроматограммы и данные по площади пиков (%) после СЕ показаны на Фиг. 5 и в ТАБЛИЦЕ 6. Результаты из анализов СЕ показали уменьшение площади пика суперспирализованной у KP8M2SN, KP8MT3N и контроля после лиофилизации и растворения. KP8MS3N имел самую большую площадь пика суперспирализованной после лиофилизации и растворения.
В заключение, результаты показывают то, что KP8M2SN, содержащий 1,0% сахарозы и 0,1% NaCl, дает лучший лиофилизированный осадок, чем KP8MS3N, содержащий 0,5% сахарозы и 0,45% NaCl, или KP8MT3N, содержащий 0,5% трегалозы и 0,45% NaCl. Данные результаты дополнительно показывали то, что KP8MS3N, содержащий 0,5% сахарозы и 0,45% NaCl, имел наименьший уровень деградации при измерении СЕ. В целом, это свидетельствует о том, что препараты, содержащие сахарозу (KP8M2SN и KP8MS3N), имеют лучшие свойства (например, образование первоклассного осадка и стабильность), чем препарат, содержащий трегалозу (KP8MT3N).
6.8.1.2.4. Анализ 1-го набора 4MSN, 3MSN и 2MSN (2-ой раунд цикла лиофилизации в малом масштабе)
На основе результатов из 1-го раунда цикла лиофилизации в малом масштабе следующий цикл лиофилизации (2-ой раунд анализа в малом масштабе) сосредоточен на улучшении внешнего вида осадка посредством изменения концентрации маннита в KP8MS3N при поддержании его концентраций сахарозы (0,5%) и NaCl (0,45%).
Перед процессом лиофилизации 10 мкл образцы приготовленной в виде препарата VM202 - т.е. 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроль (ТАБЛИЦА 1) - в концентрации 0,5 мг/мл анализировали посредством ДСК в условиях, близких к условиям окружающей среды, для характеристики препаратов-кандидатов. На Фиг. 6A-D проиллюстрированы результаты ДСК жидкого состояния из 2-го раунда анализа лиофилизации в малом масштабе. Контроль (Фиг. 6D) демонстрировал эвтектическую температуру плавления (Те) порядка -21°С. Температуру расстеклования (Td) наблюдали во всех препаратах (без отжига слева), и оно исчезало после отжига (справа). Из-за наблюдения сигналов расстеклования цикл лиофилизации 2 (ТАБЛИЦА 3) разрабатывали так, чтобы он включал стадию отжига во время замораживания для 2-го раунда анализа в малом масштабе.
Увеличение температуры замораживания от -50°С до -20°С и выдерживание в течение двух (2) часов, затем последующее введение вакуума обеспечивало отжиг и индукцию кристаллизации маннита. Первичную сушку проводили при температуре полки -20°С (25 часов) с давлением камеры 50 мТорр (6,67 Па) (ТАБЛИЦА 3). Вторичную сушку при температуре полки 20°С разрабатывали для удаления остаточной воды, которая не сублимировалась во время стадии первичной сушки.
На Фиг. 7 показан график динамики температур (левая ордината) и давлений (правая ордината) во время процесса лиофилизации для 2-го цикла анализа в малом масштабе. Температура продукта падала ниже -37°С из-за теплопотери сублимации при приложении вакуума. Значение манометра Пирани сливалось с показанием емкостного манометра приблизительно в 23 часа во время стадии первичной сушки, что подтверждало завершение процесса первичной сушки. Инициировали вторичную сушку, и давали образцам сохнуть в течение еще 13 часов. Весь цикл длился 47 часов с потенциалом уменьшения до 42 часов, если вторичная сушка инициировалась сразу при завершении первичной сушки.
Как только цикл был завершен, образцы удаляли из лиофилизатора и анализировали. Посредством визуальной проверки 4MSN демонстрировал первоклассный осадок. 3MSN и 2MSN также демонстрировали неплохой осадок с пересыханием, тогда как контроль демонстрировал признаки разрушения осадка после лиофилизации. Образцы были прозрачными и бесцветными после растворения, сравнимыми с образцами до лиофилизации (Фиг. 8А-С). Содержание влаги осадка составляло 2,51% (4MSN), 2,15% (3MSN), 2,01% (2MSN) и 1,12% (контроль).
Концентрацию VM202 в каждом образце измеряли после растворения образца из 2-го раунда цикла лиофилизации в малом масштабе, и результаты обобщаются в ТАБЛИЦЕ 7. Данные результаты показали то, что каждый образец содержал VM202 в аналогичной концентрации.
Капиллярный электрофорез: растворенные образцы дополнительно проверяли на чистоту продукта посредством СЕ. Хроматограммы и результаты в табличной форме от СЕ подробно описываются на Фиг. 9 и в ТАБЛИЦЕ 8. 4MSN и 3MSN демонстрировали минимальную деградацию по площади пика суперспирализованной, тогда как 2MSN и контроль демонстрировали уменьшения пика суперспирализованной после лиофилизации и растворения.
Данные результаты свидетельствовали о том, что 4MSN (10 мМ фосфат калия, 4% маннит, 0,5% сахароза, 0,45% NaCl при рН 8,0) давал наилучший лиофилизированный осадок и наименьшую степень деградации при определении посредством СЕ во 2-ом раунде цикла лиофилизации в малом масштабе.
6.8.1.2.5. Анализ 2-го набора 4MSN, 3MSN и 2MSN (2-ой раунд цикла лиофилизации в малом масштабе)
Другой набор 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроля получали посредством 2-го раунда цикла лиофилизации в малом масштабе, разработанного с температурой полки первичной сушки -20°С при давлении камеры 50 мТорр (6,67 Па) и температурой полки вторичной сушки 20°С при давлении камеры 50 мТорр (6,67 Па) (ТАБЛИЦА 3). На Фиг. 10 показан график динамики температур и давлений, полученных во время данного цикла. Температура продукта падала ниже -37°С из-за теплопотери сублимации при приложении вакуума. Значения манометра Пирани сливались с показанием емкостного манометра приблизительно в 75 часов во время первичной сушки. Инициировали вторичную сушку, и давали образцам сохнуть в течение еще 13 часов. Весь цикл длился 87 часов.
Как только цикл был завершен, образцы удаляли из лиофилизатора и анализировали. Посредством визуальной проверки 4MSN демонстрировал первоклассный осадок. 3MSN и 2MSN также демонстрировали неплохой осадок с пересыханием, тогда как контроль демонстрировал признаки разрушения осадка после лиофилизации. При растворении некоторые флаконы во всех препаратах, за исключением контроля, демонстрировали замутненность, тогда как все образцы были прозрачными перед лиофилизацией (Фиг. 11A-F). Содержание влаги осадка составляло 0,97% (4MSN), 0,95% (3MSN), 1,69% (2MSN) и 1,06% (контроль).
Мутность: результаты по концентрации и мутности обобщаются в ТАБЛИЦЕ 9. Все образцы демонстрировали аналогичные значения концентрации после растворения. Для всех препаратов не было выявлено мутности перед лиофилизацией и после растворения.
Капиллярный электрофорез: растворенные образцы дополнительно проверяли на чистоту продукта посредством СЕ. Хроматограммы и процентные содержания пиков из СЕ показаны на Фиг. 12 и в ТАБЛИЦЕ 10. 4MSN, 3MSN и контроль демонстрировали значительное уменьшение площади пика суперспирализованной после лиофилизации и растворения. 2MSN демонстрировал минимальную деградацию в площади пика суперспирализованной после лиофилизации и растворения.
Данные результаты свидетельствовали о том, что 2MSN (10 мМ фосфат калия, 2% маннит, 0,5% сахароза, 0,45% NaCl с рН 8,0) давал наименьшую степень деградации, определенную СЕ, в данном отдельном наборе экспериментов для 2-го раунда анализа в малом масштабе.
Образцы, полученные в данном цикле лиофилизации, использовали на протяжении 10 недель исследования стабильности с ускоренной деградацией.
6.8.1.2.6. Анализ 2MSN и 2M1SN
Принимая во внимание то, что KP8MS3N и 2MSN, содержащие 2% маннита, 0,5% сахарозы и 0,45% NaCl, демонстрировали наименьшую степень деградации при измерении посредством СЕ в анализах 1-ого раунда и определенных анализах 2-го раунда в малом масштабе, препараты KP8MS3N и 2MSN дополнительно оптимизировали посредством изменения концентрации сахарозы при сохранении концентраций маннита (2%) и NaCl (0,45%) на том же самом уровне. В частности, готовили препарат 2M1SN, содержащий 2% маннита, 0,45% NaCl и 1,0% сахарозы, и анализировали по сравнению с 2MSN.
2M1SN и 2MSN лиофилизировали с использованием аналогичных параметров цикла лиофилизации относительно параметров, использованных в исследовании стабильности с ускоренной деградацией. На Фиг. 13 показаны измерения температуры и давления из данного цикла. Температура продукта падала ниже -41°С из-за теплопотери сублимации при приложении вакуума. Значения манометра Пирани сливались с показанием емкостного манометра приблизительно в 60 часов во время первичной сушки. Инициировали вторичную сушку, и давали образцам сохнуть в течение еще 13 часов. Весь цикл длился 76 часов с потенциалом уменьшения до 70 часов, если вторичную сушку инициировали немедленно при завершении первичной сушки.
После лиофилизации 2M1SN демонстрировал первоклассный осадок, а 2MSN демонстрировал неплохой осадок с небольшим пересыханием (Фиг. 14). При растворении 2M1SN давал прозрачный раствор, тогда как 2MSN демонстрировал замутненность. Оба препарата были прозрачными перед лиофилизацией. Содержание влаги осадков составляло 1,31% (2MSN) и 1,44% (2M1SN).
Мутность: препараты оценивали на концентрацию и мутность, и результаты обобщаются в ТАБЛИЦЕ 11. Все образцы демонстрировали аналогичные значения концентрации после растворения. Для дополнительного исследования стабильности с ускоренной деградацией определили, что измерения мутности при 450 нм лучше могли оценивать различия препаратов. Для 2M1SN не выявляли мутности перед лиофилизацией и после растворения. После растворения 2MSN наблюдали значительное увеличение мутности при 450 нм.
Капиллярный электрофорез: растворенные образцы дополнительно проверяли на чистоту продукта посредством СЕ. Хроматограммы и результаты в табличной форме от СЕ подробно описываются на Фиг. 15 и в ТАБЛИЦЕ 12. 2MSN демонстрировал уменьшение площади пика суперспирализованной после лиофилизации и растворения. 2M1SN демонстрировал минимальную деградацию в площади пика суперспирализованной после лиофилизации и растворения.
Образцы, продуцированные в данном цикле лиофилизации, использовали в течение 10 недель для дополнительного исследования стабильности с ускоренной деградацией.
6.8.1.3. Исследование стабильности с ускоренной деградацией 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроля
Стабильности лиофилизированных препаратов VM202 - 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроля - оценивали при разных условиях хранения при температуре охлаждения (5 плюс/минус 3°С), окружающей среды (25 плюс/минус 3°С) и ускоренной деградации (40 плюс/минус 3°С), а растворенных препаратов VM202 - при температуре окружающей среды в течение 3 или 7 суток.
Лиофилизированные образцы из исследования стабильности с ускоренной деградацией растворяли 5 мл фильтрованной воды в боксе микробиологической безопасности, повторно закупоривали, запечатывали и инкубировали при 25°С в течение 3 и 7 суток. После 3 и 7 суток инкубированные образцы удаляли из инкубатора и анализировали визуально, на концентрацию и анализом СЕ.
Визуальная проверка: после хранения препаратов 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроля при 25°С в течение 3 суток (Фиг. 16А) и 7 суток (Фиг. 16В) не наблюдали изменений внешнего вида после растворения по сравнению с Т, равным 0.
В каждый момент времени образцы анализировали на поглощение при 260 нм для определения концентрации VM202. Концентрация каждого препарата после хранения при 25°С в течение 3 и 7 суток является аналогичной результатам, полученным в Т, равное 0 (ТАБЛИЦА 13). Все образцы находились в пределах 5% от целевого значения концентрации. Следовательно, температурный стресс не индуцировал больших изменений в концентрации VM202.
Капиллярный электрофорез: анализ СЕ использовали для отслеживания чистоты продукта во время хранения при заданной температуре. Хроматограммы СЕ и результаты в табличной форме для препаратов после хранения подробно описываются на Фиг. 17А-В и в ТАБЛИЦЕ 14. Все препараты (т.е. 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроль) демонстрировали снижения площади пика суперспирализованной после хранения при 25°С от 3 до 7 суток. 2MSN демонстрировал наилучшую стабильность от 3 до 7 суток только с 1,1% уменьшения площади пика суперспирализованной.
Лиофилизированные препараты VM202 хранили в течение 10 недель при 5°С, 25°С и 40°С (ТАБЛИЦА 4). В каждый момент времени образцы удаляли с хранения при заданной температуре и оценивали визуально. Делали фотографии флаконов, и образцы оценивали на форму осадка. Все лиофилизированные осадки оставались интактными и не демонстрировали каких-либо признаков изменения при хранении, независимо от температурных условий (контрольный осадок оставался поднятым). Данные образцы затем растворяли 5 мл фильтрованной воды и оценивали на прозрачность и выпадение осадка. Большинство образцов для 4MSN, 3MSN и 2MSN демонстрировали небольшие различия в прозрачности по сравнению с Т равно 0. Внешний вид каждого препарата после хранения при 5°С (Фиг. 18С), 25°С (Фиг. 18А) и 40°С (Фиг. 18В) в течение 10 недель показан на Фиг. 18А-С.
Также проводили анализы концентрации, мутности, содержания влаги и анализы капиллярным электрофорезом для оценки стабильности лиофилизированного VM202 во время температурных стрессов.
В каждый момент времени образцы растворяли и анализировали на поглощение при 260 нм для определения концентрации VM202 во флаконах. В ТАБЛИЦЕ 15 показано то, что концентрация VM202 в лиофилизированных образцах после 10 недель хранения при заданной температуре является аналогичной результатам, полученным при Т равно 0. Следовательно, температурный стресс не индуцировал больших изменений в концентрации VM202.
Мутность: мутность каждого образца также оценивали в каждый момент времени в данном исследовании. Результаты подробно описываются в ТАБЛИЦЕ 16. Мутность растворенных препаратов 4MSN, 3MSN и 2MSN значительно не изменялась после 10 недель хранения, независимо от температурных условий.
В каждый момент времени также проводили анализ содержания влаги. В ТАБЛИЦЕ 17 описаны результаты для содержания влаги после 10 недель хранения при заданной температуре. После 10 недель хранения при 5°С, 25°С и 40°С наблюдали небольшие снижения содержания влаги зависимым от температуры образом. Более высокие температуры хранения приводили к меньшему содержанию влаги. 2MSN имел наибольшее содержание влаги во время исследования стабильности с ускоренной деградацией.
Капиллярный электрофорез: анализ капиллярным электрофорезом использовали для отслеживания чистоты продукта. Хроматограммы СЕ и значения площади пиков после 10 недель инкубации при 40°С показаны на Фиг. 19 и в ТАБЛИЦЕ 18 соответственно. Все препараты демонстрировали значительные снижения площади пика суперспирализованной с соответствующими увеличениями площади пика открытой кольцевой по сравнению с Т равно 0 после растворения после хранения в течение 10 недель при 40°С. 2MSN демонстрировал наибольшую площадь пика суперспирализованной, хотя данное значение и было значительно ниже в 10 недель хранения при 40°С, чем во время ноль. Большие уровни площади пика открытой кольцевой наблюдали в препаратах, содержащих 3% и 4% маннита, а также в контрольном препарате.
Тенденции по чистоте пика суперспирализованной, определенного СЕ, взвешенные стандартным отклонением и включающие планки ошибок отклонения, в течение 10 недель при разных температурах подробно описываются на Фиг. 20А-С - 5°С (Фиг. 20А), 25°С (Фиг. 20В) или 40°С (Фиг. 20С). Значительные различия в чистоте наблюдали после инкубации при повышенной температуре. Как проиллюстрировано на Фиг. 20А-С, 2MSN, содержащий 2% маннита и 0,45% NaCl, демонстрировал наивысший уровень чистоты после хранения при 40°С.
Тенденции примесей пиков открытой кольцевой, выявленных СЕ, после хранения при разных температурах также представлены на Фиг. 21А-С. Небольшие увеличения площадей пиков открытой кольцевой наблюдали при 5°С. Однако при 25°С или выше все препараты демонстрировали значительную деградацию. После инкубации при 40°С более высокие уровни примесей открытой кольцевой наблюдали для 4MSN, 3MSN и контроля. По сравнению с этим 2MSN демонстрировал значительно меньшую деградацию при всех температурах.
6.8.1.4. Исследование стабильности с ускоренной деградацией 2MSN и 2M1SN
Стабильности лиофилизированных препаратов VM202, 2MSN и 2M1SN также оценивали после инкубации при температуре окружающей среды (25°С) в течение 3 или 7 суток. Образцы растворяли 5 мл фильтрованной воды в боксе микробиологической безопасности, повторно закупоривали, запечатывали и инкубировали при 25°С в течение 3 и 7 суток. После 3 и 7 суток инкубированные образцы удаляли из инкубатора и анализировали посредством визуальной проверки, концентрационного анализа и анализа СЕ.
Визуальная проверка: визуальную проверку проводили в оба момента времени (Фиг. 22A-D). Замутненность наблюдали в 2MSN после 3 и 7 суток хранения при 25° после растворения. 2M1SN оставался прозрачным в оба момента времени.
В каждый момент времени образцы анализировали на поглощение при 260 нм для определения концентрации VM202. Концентрации VM202 в обоих препаратах были целевыми в Т, равное 0, и после инкубации при 25°С в течение 3 и 7 суток после растворения (ТАБЛИЦА 19). Следовательно, температурный стресс не индуцировал значительных изменений концентрации VM202.
Капиллярный электрофорез: Образцы также анализировали на чистоту продукта посредством СЕ после хранения при заданной температуре. Хроматограммы СЕ и результаты по площади пиков образцов после хранения иллюстрируются на Фиг. 23А-В и в ТАБЛИЦЕ 20. Оба препарата демонстрировали аналогичные площади пиков суперспирализованной после хранения. 2M1SN демонстрировал большую площадь пика суперспирализованной по сравнению с 2MSN.
Стабильность во время хранения: лиофилизированные препараты VM202 для дополнительного исследования стабильности с ускоренной деградацией хранили на протяжении 10-недельного периода при 5°С, 25°С и 40°С (ТАБЛИЦА 4). В каждый момент времени образцы забирали с хранения при заданной температуре и оценивали визуально. Делали фотографии флаконов, и образцы оценивали на форму осадка. Образцы растворяли 5 мл фильтрованной воды и оценивали на прозрачность и выпадение осадка. Все лиофилизированные осадки оставались интактными и не показывали какого-либо признака изменения при хранении независимо от температурных условий. Наблюдали замутненность в растворенном 2MSN после хранения в течение 10 недель. 2M1SN был прозрачным после хранения. Внешний вид каждого препарата после хранения в течение 10 недель при 5°С, 25°С и 40°С показан на Фиг. 24А-С.
Проводили анализы концентрации, мутности, содержания влаги и анализ капиллярным электрофорезом для оценки стабильности лиофилизированного VM202 во время температурных стрессов.
В каждый момент времени образцы растворяли и анализировали на поглощение при 260 нм для определения концентрации VM202 во флаконах. В ТАБЛИЦЕ 21 показано то, что концентрация VM202 в лиофилизированных образцах после 10 недель хранения при заданной температуре является аналогичной результатам, полученным при Т, равном 0. Следовательно, температурный стресс не индуцировал больших изменений в концентрации VM202.
Мутность каждого образца также оценивали в каждый момент времени для двух (2) разных длин волн. В то время как операторы выявляли видимую замутненность в образцах, значимое различие в мутности не наблюдалось при измерении при длине волны 650 нм. Следовательно, определяли то, что 450 нм были адекватными для оценки различий в мутности между препаратами. Результаты из данной оценки подробно описываются в ТАБЛИЦЕ 22. 2MSN демонстрировал умеренное поглощение при 450 нм, независимо от температурных условий хранения. 2M1SN демонстрировал низкое поглощение при 450 нм при всех температурах.
Анализ содержания влаги также проводили в каждый момент времени. В ТАБЛИЦЕ 23 описаны результаты относительно содержания влаги после 10 недель хранения при заданной температуре. После 10 недель хранения при 5°С, 25°С и 40°С наблюдали аналогичное содержание влаги во всех образцах, за исключением 2M1SN, хранящегося при 5°С, который демонстрировал слегка повышенное содержание влаги (1,56%).
Анализ капиллярным электрофорезом использовали для отслеживания чистоты продукта. Хроматограммы СЕ и значения площади пиков после 10 недель инкубации при 40° показаны на Фиг. 25 и в ТАБЛИЦЕ 24 соответственно. Оба препарата демонстрировали значительные уменьшения площади пика суперспирализованной с соответствующими увеличениями пика открытой кольцевой по сравнению с Т, равным 0, после растворения после хранения в течение 10 недель при 40°С. 2M1SN демонстрировал наибольшую площадь пика суперспирализованной, хотя данное значение и было значительно ниже в 10 недель хранения при 40°С, чем во время ноль. Наибольшие уровни площади пика открытой кольцевой наблюдались у 2 MS N.
Тенденции чистоты пика суперспирализованной, определенного СЕ, на протяжении 10 недель при разных температурах подробно описываются на Фиг. 26А-С - при 5°С (Фиг. 26А), при 25°С (Фиг. 26 В) или при 40°С (Фиг. 26С). Значительные различия в чистоте наблюдали после инкубации при повышенной температуре. Как проиллюстрировано в ТАБЛИЦЕ 24, 2M1SN, содержащий 1% сахарозы и 0,45% NaCl, демонстрировал наивысший уровень чистоты после хранения при 40°С.
Тенденции примесей пиков открытой кольцевой, выявленных СЕ, во время хранения при заданной температуре представлены на Фиг. 27А-С - при 5°С (Фиг. 27А), при 25°С (Фиг. 27В) или при 40°С (Фиг. 27С). Данные графики демонстрируют увеличения пика открытой кольцевой, соответствующие хранению при повышенной температуре хранения. После инкубации при 40°С более высокий уровень примеси пика открытой кольцевой наблюдали для 2MSN. 2M1SN демонстрировал меньший пик открытой кольцевой при всех температурах, но следовал такой же тенденции, что и 2MSN.
6.8.1.5. Краткое изложение результатов анализа
Перед лиофилизацией все проанализированные препараты, содержащие плазмидную ДНК (VM202), оставались прозрачными, без обесцвечивания или видимых частиц. Кроме того, результаты капиллярного электрофореза (СЕ) согласованно демонстрировали высокую чистоту всех данных композиций.
Первый и второй раунды анализа лиофилизации в малом масштабе осуществляли для VM202 с использованием шести (6) разных препаратов (KP8M2SN, KP8MS3N(равно 2MSN), KP8MT3N, 4MSN, 3MSN и контроль), где продукт заполняли в объеме 0,75 мл в 3 мл стеклянные флаконы. Исследование стабильности с ускоренной деградацией осуществляли для VM202 с использованием таких же четырех (4) препаратов (4MSN, 3MSN, 2MSN и контроль) второго раунда лиофилизации в малом масштабе, заполненных в объеме 5 мл в 20 мл стеклянные флаконы, и параметры лиофилизации определяли из данных, полученных из исследований лиофилизации в малом масштабе. Также два (2) других препарата (2MSN и 2M1SN) анализировали в дополнительном исследовании стабильности с ускоренной деградацией на основе данных из исходного исследования стабильности с ускоренной деградацией. Данные циклы лиофилизации разрабатывали из результатов, полученных после анализа ДСК при условиях, близких к условиям окружающей среды. В лиофилизационный цикл включали стадию отжига, так как было определено то, что после отжига устранялась температура расстеклования.
После лиофилизации наблюдали первоклассные или неплохие осадки для всех композиций, за исключением контроля, содержащего 0,9% NaCl и 1,1% сахарозы. Контролем является препарат, описанный ранее в патенте США №8389492, который включается в данный документ посредством ссылки во всей его полноте.
Однако после растворения лиофилизированных композиций все проанализированные композиции, за исключением 2M1SN (10 мМ фосфат калия, рН 8,0, 2% маннит, 1% сахароза, 0,45% NaCl) оказывались помутневшими. Данное замутнение оставалось даже после хранения растворенных композиций при 25°С в течение 3 и 7 суток после растворения. Только 2M1SN оставался прозрачным после растворения и следующего хранения при 25°С в течение 3 и 7 суток после растворения, и отсутствовало изменение концентраций VM202 в 2M1SN на протяжении всего данного исследования.
Капиллярный электрофорез был эффективным в оценке чистоты продукта VM202. После лиофилизации и растворения все препараты демонстрировали уменьшения площади пика суперспирализованной. Уменьшение площади пика суперспирализованной также наблюдали во всех препаратах после 10 недель хранения при 25°С и 40°С. Однако 2M1SN демонстрировал наибольшую процентную долю пика суперспирализованной, соответствующую наименьшему увеличению процентной доли пика открытой кольцевой на протяжении 10 недель исследования стабильности.
Данные результаты свидетельствуют о том, что лиофилизированная VM202 сохраняет первоклассный вид осадка и наивысший уровень чистоты (суперспирализованной ДНК) после лиофилизации и хранения при приготовлении в концентрации 0,5 мг/мл с 10 мМ фосфатом калия, рН 8,0, 2% маннитом, 1% сахарозой, 0,45% NaCl при объеме заполнения 5 мл в 20 мл флаконах (2M1SN в ТАБЛИЦЕ 25). Хотя показатель нестабильности и возрастает для VM202 при более высоких температурах, в данном препарате 2M1SN наблюдали меньше деградации, чем в других проанализированных препаратах.
6.8.2. Пример 2: лиофилизированная композиция VM202 (исследование 002)
Получали разные лиофилизированные препараты, содержащие VM202, и анализировали для того, чтобы протестировать качество VM202 в препарате лекарственного продукта после лиофилизации, а также качество VM202 в препаратах с небольшими вариациями рН и/или концентраций наполнителей и стабилизаторов.
6.8.2.1. Схема экспериментов
Материалы: активным фармацевтическим ингредиентом (API, от англ. active pharmaceutical ingredient), проверенным в данном исследовании, была VM202. Вещество, используемое для данного исследования, содержало следующее: реактивы и вещества, использованные для приготовления и анализа VM202 были следующими:
Параметр приготовления препарата: в данном исследовании фиксировали следующие параметры:
(1) Объем заполнения: 5 мл
(2) Концентрация API: 0,5 мг/мл
(3) Концентрация буфера: 10 мМ калий-фосфатный
(4) Концентрация сахарозы: 1%
В данных препаратах проверяли следующие параметры приготовления препарата:
(1) рН: 7,0; 8,0 и 9,0
(2) Концентрация маннита: 1% и 2%
(3) Концентрация хлорида натрия: 0,45%, 0,6% и 0,9%
Для анализа готовили препарат, перечисленный ниже в ТАБЛИЦЕ 27:
6.8.2.2. Получение препаратов
6.8.2.2.1. Исследование в малом масштабе
Анализ в малом масштабе проводили для определения значений рН буфера, требующихся для того, чтобы разводить лекарственное вещество (DS, от англ. drug substance) для достижения целевых значений рН препарата в ТАБЛИЦЕ 27. Для консервации лекарственного вещества проводили исследование разведений в малом масштабе с плацебо в виде 0,9% NaCl (такой же препарат, что и для DS) вместо DS. Плацебо в виде 0,9% NaCl готовили без корректировки рН для лучшего представления композиции препарата DS. Композицию буфера для разведения (ТАБЛИЦА 28) рассчитывали на основе разведения DS от 1,6 мг/мл до 0,5 мг/мл. Анализ в малом масштабе выявил то, что после разведения буферами для приготовления препаратов все конечные препараты демонстрировали значения рН в или около целевых значений в ТАБЛИЦЕ 27. Однако, поскольку рН препарата F3 (9,0) находился за пределами буферизующего интервала фосфата, наблюдали сползание рН к меньшим значениям. Для наилучшей компенсации этого выбирали буфер для разведения с более высоким рН (9,5). Тестирование в малом масштабе продемонстрировало рН 9,2 сразу после разведения, затем снижение рН до 9,1 и 8,5 через 24 и 48 часов соответственно.
Для наилучшего достижения целевых значений рН для данного исследования готовили препараты в пределах одних суток после лиофилизации, и отслеживали изменения рН после растворения. Для получения препарата использовали буферы для разведения, показанные в ТАБЛИЦЕ 28.
6.8.2.2.2. Лиофилизация
VM202 в концентрации 1,6 мг/мл в 0,9% NaCl, поставленном от Cobra, удаляли с хранения при -70°С и оттаивали при 5°С в течение ночи. 35 мл DS разводили в 21 мл буферов для разведения (ТАБЛИЦА 28) до концентрации 1,0 мг/мл. После разведения измеряли рН и концентрацию API. Несмотря на результаты анализа в малом масштабе с использованием плацебо, данные препараты в присутствии VM202 не давали целевых значений рН, таким образом, рН исходных буферов для разведения дополнительно корректировали во время разведения 1,0 мг/мл DS в 48 мл буфера для разведения (ТАБЛИЦА 29) до конечной концентрации 0,5 мг/мл.
После разведения препараты подвергали стерилизующему фильтрованию с использованием 0,2 мкм фильтра на основе ацетата целлюлозы, заполняли в 20 мл стеклянные, апирстенные флаконы с 5 мл объемом заполнения (доза 2,5 мг) в BSC (бокс микробиологической безопасности). После заполнения флаконы частично закупоривали и загружали в лиофилизатор для сублимационной сушки. Пустые флаконы использовали для полного окружения флаконов, содержащих DS VM202. После лиофилизации данные флаконы полностью закупоривали внутри лиофилизационной камеры с частичным вакуумом 600 торр перед удалением. Данные флаконы закрывали обжимными колпачками, метили и помещали при -70°С. Один (1) флакон каждого препарата помещали при 5°С. Один (1) флакон на каждый препарат растворяли 5 мл фильтрованной воды Milli-Q и анализировали с использованием образцов до лиофилизации.
6.8.2.2.3. Способы анализа
Лиофилизированные препараты анализировали в разные моменты времени, как обобщено в ТАБЛИЦЕ 30.
Визуальная проверка: визуальную проверку проводили под источником белого света (13 Вт флуоресцентная трубка) относительно черного и белого фона. Получали цифровые фотографии всех препаратов.
Измерение концентрации (А260): спектрофотометрический анализ проводили с кварцевой кюветой с 1 см длиной пути посредством Beckman Coulter DU800. Концентрацию плазмидной ДНК опытных образцов определяли посредством измерения поглощения при 230, 260, 280 и 350 нм. Анализы концентрации проводили с использованием протокола УФ/Вид. от Helixmith. Расчеты проводили с использованием следующих уравнений:
Концентрация (мкг/мл)=[(D-E)/C] × (В/А)
Выход=(низкая мкг/мл) / (высокая мкг/мл) × 100%
260nm
280nm
ОП / ОП=D / F
260nm
230nm
ОП / ОП=D / G
Где:
А - масса образца, взятого для разведения
В - общая масса образца и буфера, используемых для разведения
С - коэффициент экстинкции 0,005% раствора в кювете с длиной пути 1 см (0,02)
D - оптическая плотность для максимума при 260 нм. Е - поглощение, измеренное при 350 нм
F - поглощение, измеренное при 280 нм
G - поглощение, измеренное при 230 нм
Критерии принятия:
D должна попадать в интервал от 0,5 до 1,5 единиц ОП
Выход должен составлять 98% или больше
260нм
280нм
ОП / ОП - должно попадать в интервал от 1,8 до 2,0
260нм
230нм
ОП/ ОП - должно составлять 1,1 или больше
рН: анализ рН проводили с использованием рН-метра SympHony (VWR Scientific, каталожный № SB70P), откалиброванного с тремя стандартными растворами рН (рН 4, 7 и 10) с наклоном калибровки 95% или выше. В образцах не корректировали температуру, обеспечивали их уравновешивание при температуре окружающей среды и осуществляли измерение.
Измерение мутности (А350, А450, А650): мутность определяли посредством измерения поглощения образца при 350, 450 и 650 нм с использованием Beckman Coulter DU800. Обычно считается, что препараты с А650 больше 0,01 демонстрируют повышенную мутность.
Капиллярный зональный электрофорез: перед анализом капилляр доводили до кондиции посредством пропускания воды Milli-Q, 0,1 н. NaOH, 0,1 н. HCl и вновь воды Milli-Q - каждого при 137,9 кПа в течение 10 минут (доведение до кондиции длилось всего 40 минут). 40 мкл образца в концентрации 0,5 мг/мл загружали в полиэтиленовую вставку для анализа.
Прибор: Beckman Coulter PA 800+ СЕ (S/N 3063309)
Капилляр: нейтральный покрытый капилляр, внутренний диаметр 50 мкм, общая длина 40 см, эффективная длина 30 см, апертура 8 мкм (Beckman Coulter P/N 477441, № партии М812134)
Анализ данных: 32 Karat (версия 9.0)
Давление/время инъекции: 3,447 кПа; 60 с
Буфер для разделения/давление: 100 мМ фосфорная кислота (рН 2,60), 85%/137,9 кПа; 60 с
Промывочный буфер/давление: вода Milli-Q / 137,9 кПа; 60 с
Выявление: УФ при 254 нм
Напряжение разделения: 17 кВ; линейное изменение - 0,17 мин; 14 мин.
Остаточное содержание влаги: для анализа содержания влаги использовали Karl Fisher Coulometer С20 (Mettler Toledo). Для определения точности системы использовали печь водного стандарта Apura 1%. Флаконы с образцами доводили до комнатной температуры перед удалением колпачков для анализа. Для каждого анализа использовали приблизительно 100 мг вещества.
6.8.2.3. Краткое изложение результатов анализа
В данном разделе обобщается качество лиофилизированной VM202 в разных препаратах.
6.8.2.3.1. Профиль цикла лиофилизации
Для лиофилизации 2,5 мг доз VM202 в разных препаратах использовали разработанный ранее цикл лиофилизации. Линейное изменение температуры замораживания от -50°С до -20°С и выдерживание в течение двух (2) часов перед созданием вакуума обеспечивало осуществление отжига. Процесс отжига помогает кристаллизации аморфных эксципиентов. Из-за уникальной характеристики лиофилизатора, используемого в данных экспериментах, который может прекратить программу, если вакуум не достигает установленной точки в пределах данных временных рамок, в начале первичной сушки использовали стадию, где исходно создается вакуум 100 мТорр (13,33 Па), и он корректируется до конечного вакуума по мере начала первичной сушки. Первичная сушка проводится при температуре полки -20°С (порядка 53,4 часов) с давлением камеры 50 мТорр (6,67 Па) (ТАБЛИЦА 31). Вторичная сушка при температуре полки 20°С разработана для удаления остаточной воды, которая не сублимировалась во время стадии первичной сушки.
* Время первичной сушки изменяли от 3240 мин до 3200 мин из-за ограничений программы. Показания манометра Пирани и емкостного манометра сливались перед переходом ко вторичной сушке.
На Фиг. 28 показан график всего цикла лиофилизации. Температура продукта падала до примерно -40°С из-за теплопотери от сублимации при приложении вакуума. Значение манометра Пирани сливалось с показанием емкостного манометра приблизительно в 41 час, что подтверждало завершение процесса первичной сушки. После 62 часов всего цикла инициировали вторичную сушку пи 20°С, и давали образцам сохнуть в течение еще 13 часов. Весь цикл длился приблизительно 75 часов.
Измеренное содержание влаги осадков показано в ТАБЛИЦЕ 32.
6.8.2.3.2. Исследование лиофилизации
Визуальная проверка: после лиофилизации F1, F2 и F3 демонстрировали неплохие осадки лишь с легким пересыханием. F5 демонстрировал значительное пересыхание осадка. Полное разрушение осадков наблюдали для F4 (Фиг. 32) и F6 (Фиг. 34). Растворенные жидкие образцы F1 (Фиг. 29), F2 (Фиг. 30), F3 (Фиг. 31), F4 (Фиг. 32) и F5 (Фиг. 33) были прозрачными, бесцветными и не содержали видимых частиц, что сравнимо с контролем перед лиофилизацией. После растворения F6 был помутневшим.
260
Концентрация (А): все образцы имели их целевые концентрации перед лиофилизацией и после растворения, как приводится в ТАБЛИЦЕ 33.
рН и время растворения: из-за ограничения буферизации препарата F3 рН F3 не был стабильным и быстро снижался во время заполнения. Ко времени анализа образцов перед лиофилизацией он уже снижался от рН 9,0 до 8,7. Дальнейшее снижение значения рН наблюдали после растворения (Δ равно -0,4) по сравнению с контролем перед лиофилизацией. После растворения препараты F1, F2, F4, F5, F6 демонстрировали такие же значения рН (Δ меньше или равно 0,1) по сравнению с их контролями перед лиофилизацией. Анализ времени растворения показал то, что лиофилизированный осадок растворялся через 1-1,5 минуты. Результаты по рН и времени растворения подробно описываются в ТАБЛИЦЕ 34.
350
450
650
Мутность (А, А, А): небольшие увеличения мутности наблюдали для F6 при 350 нм, 450 нм и 650 нм после растворения. Все другие препараты не демонстрировали значительной мутности перед лиофилизацией или после растворения, как приводится ниже в ТАБЛИЦЕ 35.
650
Примечание: поглощение воды вычитали для получения значений мутности для образцов с А, большим или равным 0,01, рассматриваемым как мутный.
Капиллярный зональный электрофорез (CZE): растворенные образцы дополнительно проверяли на чистоту продукта посредством CZE. F6 не анализировали из-за мутности. Электрофореграммы и результаты в табличной форме от CZE подробно описываются на Фиг. 35 и в ТАБЛИЦЕ 36 соответственно. После растворения все препараты демонстрировали небольшие увеличения пика открытой кольцевой с соответствующими снижениями пика суперспирализованной (97,5%-99,0%) по сравнению с образцами перед лиофилизацией (99,1%-100,0%). F4 и F5 демонстрировали наименьшее увеличение процентной доли пика открытой кольцевой, меньшее чем или равное 0,4% по сравнению с другими препаратами. За исключением препаратов с плохим внешним видом осадка, настоящий препарат (F1) демонстрировал наивысшую чистоту перед (100%) и после лиофилизации (98,6%).
Заключения: целью данного исследования была оценка качества VM202 в препарате лекарственного продукта - 0,5 мг/мл VM202 в 10 мМ фосфате калия с 2% маннита, 1% сахарозы, 0,45% NaCl при рН 8,0, с последующей лиофилизацией, а также качества VM202 в препаратах с легкими вариациями рН и/или концентраций наполнителей и стабилизаторов из препарата лекарственного продукта. Аналитические способы, применяемые в данном исследовании, включали капиллярный зональный электрофорез (CZE, от англ. capillary zone electrophoresis), визуальную проверку на прозрачность и внешний вид осадка, анализы мутности, концентрации (А260), рН и содержание влаги (Карл Фишер), которые все, как было показано, являются эффективными указывающими стабильность анализами продукта.
В данном исследовании лиофилизированного препарата VM202 оценивали в дозе 2,5 мг на флакон при объеме заполнения 5 мл. Анализ рН в малом масштабе проводили с плацебо в виде 0,9% NaCl для установления правильных процедур приготовления препарата посредством способа разведения для VM202 в большем масштабе.
Перед лиофилизацией все препараты VM202 были прозрачными без обесцвечивания, не содержали видимых частиц, а концентрация была целевой. рН препарата 10 мМ фосфата калия, составляющий 9,0, не был стабильным и быстро снижался во время заполнения, с дальнейшими снижениями, наблюдаемыми после лиофилизации и растворения. Результаты капиллярного зонального электрофореза для всех препаратов перед лиофилизацией демонстрировали высокую чистоту, причем препарат лекарственного продукта демонстрирует наивысшую процентную долю пика суперспирализованной.
После лиофилизации для препарата лекарственного продукта и препаратов лекарственного продукта при более высоких и более низких рН наблюдали неплохие осадки. После растворения препарат с наивысшей концентрацией NaCl демонстрировал мутность, тогда как остальные препараты были прозрачными, бесцветными и не содержали видимых частиц, сопоставимо с контролем перед лиофилизацией. После растворения все препараты демонстрировали небольшие увеличения пика открытой кольцевой с соответствующими снижениями пика суперспирализованной. Исключая препараты с плохим внешним видом осадка, препарат лекарственного продукта после лиофилизации демонстрировал наивысшую чистоту, определенную посредством капиллярного зонального электрофореза.
Результаты, полученные из данного исследования, свидетельствуют о том, что лиофилизированный VM202 сохраняет неплохой внешний вид осадка и наивысший уровень чистоты (суперспирализованной ДНК) после лиофилизации в концентрации 0,5 мг/мл с 10 мМ фосфатом калия при рН 8,0, 2% маннита, 1% сахарозы, 0,45% NaCl при объеме заполнения 5 мл в 20 мл флаконах.
6.8.3. Пример 3: лиофилизированная композиция pTx-IGF-1X10
Разные лиофилизированные препараты, содержащие pTx-IGF-1X10 получали и анализировали на качество pTx-IGF-1X10 в препарате после лиофилизации. Для анализа получали препараты, перечисленные ниже в ТАБЛИЦЕ 37.
6.8.3.1. Краткое изложение результатов анализа
Визуальная проверка: после лиофилизации F1, F2, F7, F8 и F9 демонстрировали неплохие осадки лишь с легким пересыханием. F5 демонстрировал значительное пересыхание осадка. F3 имел разбрызганный вид. Для F4 и F6 наблюдали полное разрушение осадков. Растворенные жидкие образцы F1 (Фиг. 36), F2 (Фиг. 37), F3 (Фиг. 38), F4 (Фиг. 39), F5 (Фиг. 40), F6 (Фиг. 41), F7 (Фиг. 42), F8 (Фиг. 43) и F9 (Фиг. 44) были прозрачными, бесцветными и не содержали видимых частиц - сопоставимо с контролем перед лиофилизацией. Для определения мутности (прозрачности) образцов образцы сравнивали с калибровочным стандартом мутности 4000NTU I, II, III, IV. Препарат с «прозрачностью меньше 1» может оцениваться как немутный.
Концентрация (А260): все образцы имели их целевые концентрации до лиофилизации и после растворения, как приводится ниже в ТАБЛИЦЕ 38.
рН и время растворения: значение рН F3 снижалось от рН 9,0 до 7,6 после растворения. После растворения препараты F1, F2, F4, F5, F6, F7, F8, F9 демонстрировали такие же значения рН (Δ меньше или равно 0,5) по сравнению с их контролями перед лиофилизацией. Анализ времени растворения показал то, что лиофилизированный осадок растворялся от 1 мин 20 с до 4 мин 05 с. Результаты по рН и времени растворения подробно описываются в ТАБЛИЦЕ 39.
Капиллярный электрофорез (СЕ): растворенные образцы дополнительно проверяли на чистоту продукта посредством СЕ. Электрофореграммы и результаты в табличной форме от СЕ подробно описываются на Фиг. 45 и в ТАБЛИЦЕ 40 соответственно. После растворения все препараты, за исключением F3, демонстрировали небольшие увеличения (0,5-3%) пика открытой кольцевой с соответствующими уменьшениями пика сверхспральной по сравнению с препаратами перед лиофилизацией. За исключением препаратов с плохим внешним видом осадка, настоящий препарат (F1) демонстрировал наименьшее уменьшение пика суперспирализованной после лиофилизации.
6.8.4. Пример 4: Лиофилизированная композиция pCK-SDF-1α
6.8.4.1. Схема эксперимента
Разные лиофилизированные препараты, содержащие pCK-SDF-1α, получали и анализировали на качество pCK-SDF-1α в препарате после лиофилизации. Для анализа получали препараты, перечисленные ниже в ТАБЛИЦЕ 41.
6.8.4.2. Краткое изложение результатов анализа
Визуальная проверка: после лиофилизации F1, F2, F3, F7, F8 и F9 демонстрировали неплохие осадки лишь с легким пересыханием. F5 демонстрировал значительное пересыхание осадка. Полное разрушение осадков наблюдали для F4 и F6. Образцы полученной в результате растворения жидкости F1 (Фиг. 46), F2 (Фиг. 47), F3 (Фиг. 48), F4 (Фиг. 49), F5 (Фиг. 50), F6 (Фиг. 51), F7 (Фиг. 52), F8 (Фиг. 53) и F9 (Фиг. 54) были прозрачными, бесцветными и не содержали видимых частиц, сопоставимо с контролем до лиофилизации. Для определения мутности (прозрачности) образцов образцы сравнивали с калибровочным стандартом мутности 4000NTU I, II, III, IV. Препарат с «прозрачностью меньше I» может оцениваться как немутный.
Концентрация (А260): все образцы находились в их целевых концентрациях перед лиофилизацией и после растворения, как приводится ниже в ТАБЛИЦЕ 42.
рН и время растворения: значение рН F3 снижалось от рН 9,0 до 7,9 после растворения. После растворения препараты F1, F2, F4, F5, F6, F7, F8, F9 демонстрировали такие же значения рН (Δ меньше или равно 0,5) по сравнению с их контролями перед лиофилизацией. Анализ времени растворения показал то, что лиофилизированный осадок растворялся от 1,5 мин до 4 мин. Результаты по рН и времени растворения подробно описываются ниже в ТАБЛИЦЕ 43.
Капиллярный электрофорез: растворенные образцы дополнительно проверяли на чистоту продукта посредством СЕ. Электрофореграммы и результаты в табличной форме от СЕ подробно описываются на Фиг. 55 и в ТАБЛИЦЕ 44 соответственно. После растворения все препараты демонстрировали небольшие увеличения (0,5-2%) пика открытой кольцевой с соответствующими снижениями пика суперспирализованной по сравнению с препаратами перед лиофилизацией. С исключением препаратов с плохим внешним видом осадка, настоящий препарат (F1) демонстрировал наименьшее уменьшение пика суперспирализованной после лиофилизации.
7. Включение посредством ссылки
Все публикации, патенты, патентные заявки и другие документы, процитированные в данной заявке, являются тем самым включенными посредством ссылки во всей их полноте для всех целей в той же самой степени, как если бы каждая индивидуальная публикация, патент, патентная заявка или другой документ были индивидуально указанными как включенные посредством ссылки для всех целей.
8. Эквиваленты
В то время как разные конкретные воплощения были проиллюстрированы и описаны, приведенное выше описание изобретения не является ограничивающим. Будет понятно, что могут быть сделаны разные изменения без отступления от сущности и объема данного(ных) изобретения(ний). Многие вариации станут очевидными для специалистов в данной области при обзоре данного описания изобретения.
Перечень последовательностей:
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> HELIXMITH CO., LTD.
<120> ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫЕ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ГЕНОТЕРАПИИ ГОЛОЙ ДНК
<130> 33730-40319/WO (014WO)
<140>
<141>
<150> 62/700,655
<151> 2018-07-19
<160> 36
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 728
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu
1               5                   10                  15
Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln
20                  25                  30
Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr
35                  40                  45
Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val
50                  55                  60
Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu
65                  70                  75                  80
Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys
85                  90                  95
Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe
100                 105                 110
Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys
115                 120                 125
Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys
130                 135                 140
Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His
145                 150                 155                 160
Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr
165                 170                 175
Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser
180                 185                 190
Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu
195                 200                 205
Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp
210                 215                 220
His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro
225                 230                 235                 240
His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp
245                 250                 255
Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr
260                 265                 270
Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys
275                 280                 285
Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu
290                 295                 300
Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile
305                 310                 315                 320
Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu
325                 330                 335
His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn
340                 345                 350
Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr
355                 360                 365
Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp
370                 375                 380
Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met
385                 390                 395                 400
Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp
405                 410                 415
Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala
420                 425                 430
Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His
435                 440                 445
Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys
450                 455                 460
Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu
465                 470                 475                 480
Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val
485                 490                 495
Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg
500                 505                 510
Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp
515                 520                 525
Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr
530                 535                 540
Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys
545                 550                 555                 560
Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly
565                 570                 575
Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp
580                 585                 590
Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu
595                 600                 605
Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn
610                 615                 620
Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu
625                 630                 635                 640
Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu
645                 650                 655
Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp
660                 665                 670
Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu
675                 680                 685
Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly
690                 695                 700
Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile
705                 710                 715                 720
Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser
725
<210> 2
<211> 723
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu
1               5                   10                  15
Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln
20                  25                  30
Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr
35                  40                  45
Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val
50                  55                  60
Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu
65                  70                  75                  80
Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys
85                  90                  95
Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe
100                 105                 110
Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys
115                 120                 125
Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys
130                 135                 140
Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His
145                 150                 155                 160
Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg
165                 170                 175
Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu Val Arg
180                 185                 190
Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu Val Glu Cys Met Thr
195                 200                 205
Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp His Thr Glu Ser Gly
210                 215                 220
Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro His Arg His Lys Phe
225                 230                 235                 240
Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr Cys Arg
245                 250                 255
Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Leu Asp Pro His
260                 265                 270
Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys Ala Asp Asn Thr Met
275                 280                 285
Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu Cys Ile Gln Gly Gln
290                 295                 300
Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile Trp Asn Gly Ile Pro
305                 310                 315                 320
Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu His Asp Met Thr Pro
325                 330                 335
Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro
340                 345                 350
Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Ile Arg
355                 360                 365
Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp Met Ser His Gly Gln
370                 375                 380
Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu Ser Gln
385                 390                 395                 400
Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp Lys Asn Met Glu Asp
405                 410                 415
Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala Ser Lys Leu Asn Glu
420                 425                 430
Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Trp Cys Tyr
435                 440                 445
Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys Pro Ile Ser Arg Cys
450                 455                 460
Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu Asp His Pro Val Ile
465                 470                 475                 480
Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val Asn Gly Ile Pro Thr
485                 490                 495
Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg Tyr Arg Asn Lys His
500                 505                 510
Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp Val Leu Thr Ala Arg
515                 520                 525
Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Ala Trp Leu Gly
530                 535                 540
Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys Cys Lys Gln Val Leu
545                 550                 555                 560
Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly Ser Asp Leu Val Leu
565                 570                 575
Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp Phe Val Ser Thr Ile
580                 585                 590
Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu Lys Thr Ser Cys Ser
595                 600                 605
Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn Tyr Asp Gly Leu Leu
610                 615                 620
Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu Lys Cys Ser Gln His
625                 630                 635                 640
His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu Ile Cys Ala Gly Ala
645                 650                 655
Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu
660                 665                 670
Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu Gly Val Ile Val Pro
675                 680                 685
Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly Ile Phe Val Arg Val
690                 695                 700
Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile Leu Thr Tyr Lys Val
705                 710                 715                 720
Pro Gln Ser
<210> 3
<211> 482
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 3
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc       60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat      120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa      180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt      240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc      300
ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa      360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta      420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac      480
ag                                                                     482
<210> 4
<211> 1675
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 4
cctacaggaa aactactgtc gaaatcctcg aggggaagaa gggggaccct ggtgtttcac       60
aagcaatcca gaggtacgct acgaagtctg tgacattcct cagtgttcag aagttgaatg      120
catgacctgc aatggggaga gttatcgagg tctcatggat catacagaat caggcaagat      180
ttgtcagcgc tgggatcatc agacaccaca ccggcacaaa ttcttgcctg aaagatatcc      240
cgacaagggc tttgatgata attattgccg caatcccgat ggccagccga ggccatggtg      300
ctatactctt gaccctcaca cccgctggga gtactgtgca attaaaacat gcgctgacaa      360
tactatgaat gacactgatg ttcctttgga aacaactgaa tgcatccaag gtcaaggaga      420
aggctacagg ggcactgtca ataccatttg gaatggaatt ccatgtcagc gttgggattc      480
tcagtatcct cacgagcatg acatgactcc tgaaaatttc aagtgcaagg acctacgaga      540
aaattactgc cgaaatccag atgggtctga atcaccctgg tgttttacca ctgatccaaa      600
catccgagtt ggctactgct cccaaattcc aaactgtgat atgtcacatg gacaagattg      660
ttatcgtggg aatggcaaaa attatatggg caacttatcc caaacaagat ctggactaac      720
atgttcaatg tgggacaaga acatggaaga cttacatcgt catatcttct gggaaccaga      780
tgcaagtaag ctgaatgaga attactgccg aaatccagat gatgatgctc atggaccctg      840
gtgctacacg ggaaatccac tcattccttg ggattattgc cctatttctc gttgtgaagg      900
tgataccaca cctacaatag tcaatttaga ccatcccgta atatcttgtg ccaaaacgaa      960
acaattgcga gttgtaaatg ggattccaac acgaacaaac ataggatgga tggttagttt     1020
gagatacaga aataaacata tctgcggagg atcattgata aaggagagtt gggttcttac     1080
tgcacgacag tgtttccctt ctcgagactt gaaagattat gaagcttggc ttggaattca     1140
tgatgtccac ggaagaggag atgagaaatg caaacaggtt ctcaatgttt cccagctggt     1200
atatggccct gaaggatcag atctggtttt aatgaagctt gccaggcctg ctgtcctgga     1260
tgattttgtt agtacgattg atttacctaa ttatggatgc acaattcctg aaaagaccag     1320
ttgcagtgtt tatggctggg gctacactgg attgatcaac tatgatggcc tattacgagt     1380
ggcacatctc tatataatgg gaaatgagaa atgcagccag catcatcgag ggaaggtgac     1440
tctgaatgag tctgaaatat gtgctggggc tgaaaagatt ggatcaggac catgtgaggg     1500
ggattatggt ggcccacttg tttgtgagca acataaaatg agaatggttc ttggtgtcat     1560
tgttcctggt cgtggatgtg ccattccaaa tcgtcctggt atttttgtcc gagtagcata     1620
ttatgcaaaa tggatacaca aaattatttt aacatataag gtaccacagt catag          1675
<210> 5
<211> 3756
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид
<400> 5
cgcgttgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc       60
atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac      120
cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa      180
tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag      240
tacatcaagt gtatcatatg ccaagtccgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc      300
ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tacgggactt tcctacttgg cagtacatct      360
acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacacc aatgggcgtg      420
gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt      480
tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taataacccc gccccgttga      540
cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct cgtttagtga      600
accgtcagat cgcctggaga cgccatccac gctgttttga cctccataga agacaccggg      660
accgatccag cctccgcggc cgggaacggt gcattggaac gcggattccc cgtgccaaga      720
gtgacgtaag taccgcctat agactctata ggcacacccc tttggctctt atgcatgcta      780
tactgttttt ggcttggggc ctatacaccc ccgcttcctt atgctatagg tgatggtata      840
gcttagccta taggtgtggg ttattgacca ttattgacca ctcccctatt ggtgacgata      900
ctttccatta ctaatccata acatggctct ttgccacaac tatctctatt ggctatatgc      960
caatactctg tccttcagag actgacacgg actctgtatt tttacaggat ggggtcccat     1020
ttattattta caaattcaca tatacaacaa cgccgtcccc cgtgcccgca gtttttatta     1080
aacatagcgt gggatctcca cgcgaatctc gggtacgtgt tccggacatg ggctcttctc     1140
cggtagcggc ggagcttcca catccgagcc ctggtcccat gcctccagcg gctcatggtc     1200
gctcggcagc tccttgctcc taacagtgga ggccagactt aggcacagca caatgcccac     1260
caccaccagt gtgccgcaca aggccgtggc ggtagggtat gtgtctgaaa atgagctcgg     1320
agattgggct cgcaccgctg acgcagatgg aagacttaag gcagcggcag aagaagatgc     1380
aggcagctga gttgttgtat tctgataaga gtcagaggta actcccgttg cggtgctgtt     1440
aacggtggag ggcagtgtag tctgagcagt actcgttgct gccgcgcgcg ccaccagaca     1500
taatagctga cagactaaca gactgttcct ttccatgggt cttttctgca gtcaccgtcc     1560
ttgacacgaa gcttggtacc gagctcggat ccactagtcc agtgtggtgg aattctgcag     1620
atatccagca cagtggcggc cgctcgagtc tagagggccc gtttaaaccc gctgatcagc     1680
ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt     1740
gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca     1800
ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga     1860
ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggagtcgaaa ttcagaagaa ctcgtcaaga     1920
aggcgataga aggcgatgcg ctgcgaatcg ggagcggcga taccgtaaag cacgaggaag     1980
cggtcagccc attcgccgcc aagctcttca gcaatatcac gggtagccaa cgctatgtcc     2040
tgatagcggt ccgccacacc cagccggcca cagtcgatga atccagaaaa gcggccattt     2100
tccaccatga tattcggcaa gcaggcatcg ccatgggtca cgacgagatc ctcgccgtcg     2160
ggcatgctcg ccttgagcct ggcgaacagt tcggctggcg cgagcccctg atgctcttcg     2220
tccagatcat cctgatcgac aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga     2280
tgtttcgctt ggtggtcgaa tgggcaggta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt     2340
gcatcagcca tgatggatac tttctcggca ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc     2400
cccggcactt cgcccaatag cagccagtcc cttcccgctt cagtgacaac gtcgagcaca     2460
gctgcgcaag gaacgcccgt cgtggccagc cacgatagcc gcgctgcctc gtcttgcagt     2520
tcattcaggg caccggacag gtcggtcttg acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac     2580
agccggaaca cggcggcatc agagcagccg attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat     2640
agcctctcca cccaagcggc cggagaacct gcgtgcaatc catcttgttc aatcatgcga     2700
aacgatcctc atcctgtctc ttgatcagat cttgatcccc tgcgccatca gatccttggc     2760
ggcaagaaag ccatccagtt tactttgcag ggcttcccaa ccttaccaga gggcgcccca     2820
gctggcaatt ccggttcgct tgctgtccat aaaaccgccc agtctagcta tcgccatgta     2880
agcccactgc aagctacctg ctttctcttt gcgcttgcgt tttcccttgt ccagatagcc     2940
cagtagctga cattcatccg gggtcagcac cgtttctgcg gactggcttt ctacgtgaaa     3000
aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt     3060
tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt     3120
tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt     3180
ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag     3240
ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta     3300
gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat     3360
aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg     3420
ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg     3480
agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac     3540
aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga     3600
aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt     3660
ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta     3720
cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatg                               3756
<210> 6
<211> 4956
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 6
gtaagaacag tatgaagaaa agagatgaag cctctgtctt ttttacatgt taacagtctc       60
atattagtcc ttcagaataa ttctacaatc ctaaaataac ttagccaact tgctgaattg      120
tattacggca aggtttatat gaattcatga ctgatattta gcaaatgatt aattaatatg      180
ttaataaaat gtagccaaaa caatatctta ccttaatgcc tcaatttgta gatctcggta      240
tttgtgaaat aataacgtaa acttcgttta aaaggattct tcttcctgtc tttgagaaag      300
tacggcactg tgcaggggga gaggttgatt gtgaaaaatc agaggtagat gagaatctta      360
ctgagggctg agggttcttt aaccttggtg gatctcaaca ttggttgcac attaaaatca      420
cctgctgcaa gcccttgacg aatcttactt agaagatgac aacacagaac aattaaatca      480
gaatctctgg ggagaatagg gcaccagtat tttttgagct cccaccatga ttccaaagtg      540
cagccaaatt tgagaaccac tgctaaaagc tcaagcttca gattgaccag cttttccatc      600
tcacctatcg cctaaagacc aaattggata aatgtgttca ttacgacaga tgggtactat      660
ttaaagatga gtaaacacaa tatacttagg ctcgtcagac tgagagtttt aatcatcact      720
gaggaaaaac atagatatct aatactgact ggagtattag tcaaggctta tttcacacac      780
aattttatca gaaaccaaag tagtttaaaa cagctctccc cttattagta atgcattgga      840
gggtttactt taccatgtac cttgctgagc actgtacctt gttaatctca tttacttgta      900
atgagaacca cacagcgggt agttttattg gttctatttt acctacatga caaaactgaa      960
gcataaaaac acttagtaag ttttcagtgt catgcacaac taggaagtga catggccaga     1020
atataagccc agtcaccatc actctataac ctgcgctttt aacaacttca gggcatgaca     1080
catttggccg gtcagtagaa cccatgctgt gatttgtttt tgcagtggtg gtgatgactg     1140
ccttgttgaa tccacttttt attctattcc attttgggga cacaattctg caagatgatt     1200
cttcattagg aaacagagat gagttattga ccaacacaga aagaaaaaga gtttgttgct     1260
ccacactggg attaaaccta tgatcttggc ctaattaaca ctagctagta agtgtccaag     1320
ctgatcatct ctacaacatt tcaataacag aaaacaacaa ttttcaaaat tagttactta     1380
caattatgta gaaatgcctc taaaacacag tattttcctt atattacaaa aacaaaaatt     1440
ataattggtt ttgtcctctt ttgagagttt gcatggtgtt actccctgca tagtgaagaa     1500
aacattttat ttaagtagat ggatctaagt ttttcatgaa caaaggaatg acatttgaaa     1560
tcaatcctac cctagtccag gagaatgcat tagattaacc tagtagaggt cttatttcac     1620
cctgagtttt ctatgatcgt gattctctgc tggaggagta attgtgaaat agatctctct     1680
gggaactggc ttcctagtcc aatcagctct tttaccaatg aacacttcct tgtgatatag     1740
atgtttatgg ccgagaggat ccagtatatt aataaaatcc ctttttgtat tcaatgaggg     1800
aaacacataa ttttcatcaa ttagcagctt attggaatat ctgcatgatg gtttaacact     1860
tttaagtgtt gactaaagat taattttaca gaaaatagaa aaagaaatat gtttctgtct     1920
ggaggaatga tttattgttg acccctaaat tgaaatattt tactagtggc ttaatggaaa     1980
gatgatgaaa gatgatgaaa ttaatgtaga agcttaacta gaaaatcagg tgacctgata     2040
tctacatctg tatccttcat tggccaccca gcattcatta atgaatcaga tgatggaata     2100
gatcaagttt cctaggaaca cagtgaatat taaaagaaaa caaagggagc ctagcaccta     2160
gaagacctag tttatatttc aaagtatatt tggatgtaac ccaattttaa acatttcctc     2220
acttgtctct cttaaagcct tgccaacagc aaggacagag aaccaaaaat agtgtatata     2280
tgaataaatg cttattacag aatctgctga ctggcacatg ctttgtgtgt aatgggttct     2340
cataaacact tgttgaatga acacacataa gtgaaagagc atggctaggc ttcatccctt     2400
ggtcaaatat ggggtgctaa agaaaagcag gggaaataca ttgggacact aacaaaaaaa     2460
aacagttaat ttaggtaaaa gataaaatac accacagaat gaagaaaaga gatgacccag     2520
actgctcttt aaccttcatg tcctagagag gtttttgata tgaattgcat tcagaattgt     2580
ggaaaggagc ccatcttttc tcttcatttt gattttatta actccaatgg gggaatttta     2640
ttcgtgtttt ggccatatct acttttgatt tctacattat tctctcttcc tttctacctg     2700
tatttgtcct aataaattgt tgacttatta attcactact tcctcacagc ttttttttgg     2760
ctttacaaat ccactggaaa ggtatatggg tgtatcactt tgtgtatttc ggtgtgcatg     2820
tgtagagggg acaaaaatcc tctctcaaac tataaatatt gagtatttgt gtattgaaca     2880
tttgctataa ctactaggtt tcttaaataa tcttaatata taaaatgata tagaaaaagg     2940
gaaattatag ttcgtattat tcatctaagt gaagagatta aaacccaggg agtaaataaa     3000
ttgtctaagg actaaggttg tatactattt aggtgataga tatggggcaa ccgtatgggt     3060
tttatgatta acaaataaac ttctcaccac tctaccatat caacttttcc ataaaagaga     3120
gctatagtat tctttgctta aataaatttg attagtgcat gacttcttga aaacatataa     3180
agcaaaagtc acatttgatt ctatcagaaa agtgagtaag ccatggccca aacaaaagat     3240
gcattaaaat attctggaat gatggagcta aaagtaagaa aaatgacttt ttaaaaaagt     3300
ttactgttag gaattgtgaa attatgctga attttagttg cattataatt tttgtcagtc     3360
atacggtctg acaacctgtc ttatttctat ttccccatat gaggaatgct agttaagtat     3420
ggatattaac tattactact tagatgcatt gaagttgcat aatatggata atacttcact     3480
ggttccctga aaatgtttag ttagtaataa gtctcttaca ctatttgttt tgtccaataa     3540
tttatatttt ctgaagactt aactctagaa tacactcatg tcaaaatgaa agaatttcat     3600
tgcaaaatat tgcttggtac atgacgcata cctgtatttg ttttgtgtca caacatgaaa     3660
aatgatggtt tattagaagt ttcattgggt aggaaacaca tttgaatggt atttactaag     3720
atactaaaat ccttggactt cactctaatt ttagtgccat ttagaactca aggtctcagt     3780
aaaagtagaa ataaagcctg ttaacaaaac acaaactgaa tattaaaaat gtaactggat     3840
tttcaaagaa atgtttactg gtattacctg tagatgtata ttctttatta tgatcttttg     3900
tgtaaagtct ggcagacaaa tgcaatatct aattgttgag tccaatatca caagcagtac     3960
aaaagtataa aaaagacttg gccttttcta atgtgttaaa atactttatg ctggtaataa     4020
cactaagagt agggcactag aaattttaag tgaagataat gtgttgcagt tactgcactc     4080
aatggcttac tattataaac caaaactggg atcactaagc tccagtcagt caaaatgatc     4140
aaaattattg aagagaataa gcaattctgt tctttattag gacacagtag atacagacta     4200
caaagtggag tgtgcttaat aagaggtagc atttgttaag tgtcaattac tctattatcc     4260
cttggagctt ctcaaaataa ccatataagg tgtaagatgt taaaggttat ggttacactc     4320
agtgcacagg taagctaata ggctgagaga agctaaatta cttactgggg tctcacagta     4380
agaaagtgag ctgaagtttc agcccagatt taactggatt ctgggctctt tattcatgtt     4440
acttcatgaa tctgtttctc aattgtgcag aaaaaagggg gctatttata agaaaagcaa     4500
taaacaaaca agtaatgatc tcaaataagt aatgcaagaa atagtgagat ttcaaaatca     4560
gtggcagcga tttctcagtt ctgtcctaag tggccttgct caatcacctg ctatctttta     4620
gtggagcttt gaaattatgt ttcagacaac ttcgattcag ttctagaatg tttgactcag     4680
caaattcaca ggctcatctt tctaacttga tggtgaatat ggaaattcag ctaaatggat     4740
gttaataaaa ttcaaacgtt ttaaggacag atggaaatga cagaatttta aggtaaaata     4800
tatgaaggaa tataagataa aggatttttc taccttcagc aaaaacatac ccactaatta     4860
gtaaaattaa taggcgaaaa aaagttgcat gctcttatac tgtaatgatt atcattttaa     4920
aactagcttt ttgccttcga gctatcgggg taaaga                               4956
<210> 7
<211> 7113
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид
<400> 7
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc       60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat      120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa      180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt      240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc      300
ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa      360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta      420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac      480
aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc      540
tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat      600
tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata      660
tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg      720
tatttgtgaa ataataacgt aaacttcgtt taaaaggatt cttcttcctg tctttgagaa      780
agtacggcac tgtgcagggg gagaggttga ttgtgaaaaa tcagaggtag atgagaatct      840
tactgagggc tgagggttct ttaaccttgg tggatctcaa cattggttgc acattaaaat      900
cacctgctgc aagcccttga cgaatcttac ttagaagatg acaacacaga acaattaaat      960
cagaatctct ggggagaata gggcaccagt attttttgag ctcccaccat gattccaaag     1020
tgcagccaaa tttgagaacc actgctaaaa gctcaagctt cagattgacc agcttttcca     1080
tctcacctat cgcctaaaga ccaaattgga taaatgtgtt cattacgaca gatgggtact     1140
atttaaagat gagtaaacac aatatactta ggctcgtcag actgagagtt ttaatcatca     1200
ctgaggaaaa acatagatat ctaatactga ctggagtatt agtcaaggct tatttcacac     1260
acaattttat cagaaaccaa agtagtttaa aacagctctc cccttattag taatgcattg     1320
gagggtttac tttaccatgt accttgctga gcactgtacc ttgttaatct catttacttg     1380
taatgagaac cacacagcgg gtagttttat tggttctatt ttacctacat gacaaaactg     1440
aagcataaaa acacttagta agttttcagt gtcatgcaca actaggaagt gacatggcca     1500
gaatataagc ccagtcacca tcactctata acctgcgctt ttaacaactt cagggcatga     1560
cacatttggc cggtcagtag aacccatgct gtgatttgtt tttgcagtgg tggtgatgac     1620
tgccttgttg aatccacttt ttattctatt ccattttggg gacacaattc tgcaagatga     1680
ttcttcatta ggaaacagag atgagttatt gaccaacaca gaaagaaaaa gagtttgttg     1740
ctccacactg ggattaaacc tatgatcttg gcctaattaa cactagctag taagtgtcca     1800
agctgatcat ctctacaaca tttcaataac agaaaacaac aattttcaaa attagttact     1860
tacaattatg tagaaatgcc tctaaaacac agtattttcc ttatattaca aaaacaaaaa     1920
ttataattgg ttttgtcctc ttttgagagt ttgcatggtg ttactccctg catagtgaag     1980
aaaacatttt atttaagtag atggatctaa gtttttcatg aacaaaggaa tgacatttga     2040
aatcaatcct accctagtcc aggagaatgc attagattaa cctagtagag gtcttatttc     2100
accctgagtt ttctatgatc gtgattctct gctggaggag taattgtgaa atagatctct     2160
ctgggaactg gcttcctagt ccaatcagct cttttaccaa tgaacacttc cttgtgatat     2220
agatgtttat ggccgagagg atccagtata ttaataaaat ccctttttgt attcaatgag     2280
ggaaacacat aattttcatc aattagcagc ttattggaat atctgcatga tggtttaaca     2340
cttttaagtg ttgactaaag attaatttta cagaaaatag aaaaagaaat atgtttctgt     2400
ctggaggaat gatttattgt tgacccctaa attgaaatat tttactagtg gcttaatgga     2460
aagatgatga aagatgatga aattaatgta gaagcttaac tagaaaatca ggtgacctga     2520
tatctacatc tgtatccttc attggccacc cagcattcat taatgaatca gatgatggaa     2580
tagatcaagt ttcctaggaa cacagtgaat attaaaagaa aacaaaggga gcctagcacc     2640
tagaagacct agtttatatt tcaaagtata tttggatgta acccaatttt aaacatttcc     2700
tcacttgtct ctcttaaagc cttgccaaca gcaaggacag agaaccaaaa atagtgtata     2760
tatgaataaa tgcttattac agaatctgct gactggcaca tgctttgtgt gtaatgggtt     2820
ctcataaaca cttgttgaat gaacacacat aagtgaaaga gcatggctag gcttcatccc     2880
ttggtcaaat atggggtgct aaagaaaagc aggggaaata cattgggaca ctaacaaaaa     2940
aaaacagtta atttaggtaa aagataaaat acaccacaga atgaagaaaa gagatgaccc     3000
agactgctct ttaaccttca tgtcctagag aggtttttga tatgaattgc attcagaatt     3060
gtggaaagga gcccatcttt tctcttcatt ttgattttat taactccaat gggggaattt     3120
tattcgtgtt ttggccatat ctacttttga tttctacatt attctctctt cctttctacc     3180
tgtatttgtc ctaataaatt gttgacttat taattcacta cttcctcaca gctttttttt     3240
ggctttacaa atccactgga aaggtatatg ggtgtatcac tttgtgtatt tcggtgtgca     3300
tgtgtagagg ggacaaaaat cctctctcaa actataaata ttgagtattt gtgtattgaa     3360
catttgctat aactactagg tttcttaaat aatcttaata tataaaatga tatagaaaaa     3420
gggaaattat agttcgtatt attcatctaa gtgaagagat taaaacccag ggagtaaata     3480
aattgtctaa ggactaaggt tgtatactat ttaggtgata gatatggggc aaccgtatgg     3540
gttttatgat taacaaataa acttctcacc actctaccat atcaactttt ccataaaaga     3600
gagctatagt attctttgct taaataaatt tgattagtgc atgacttctt gaaaacatat     3660
aaagcaaaag tcacatttga ttctatcaga aaagtgagta agccatggcc caaacaaaag     3720
atgcattaaa atattctgga atgatggagc taaaagtaag aaaaatgact ttttaaaaaa     3780
gtttactgtt aggaattgtg aaattatgct gaattttagt tgcattataa tttttgtcag     3840
tcatacggtc tgacaacctg tcttatttct atttccccat atgaggaatg ctagttaagt     3900
atggatatta actattacta cttagatgca ttgaagttgc ataatatgga taatacttca     3960
ctggttccct gaaaatgttt agttagtaat aagtctctta cactatttgt tttgtccaat     4020
aatttatatt ttctgaagac ttaactctag aatacactca tgtcaaaatg aaagaatttc     4080
attgcaaaat attgcttggt acatgacgca tacctgtatt tgttttgtgt cacaacatga     4140
aaaatgatgg tttattagaa gtttcattgg gtaggaaaca catttgaatg gtatttacta     4200
agatactaaa atccttggac ttcactctaa ttttagtgcc atttagaact caaggtctca     4260
gtaaaagtag aaataaagcc tgttaacaaa acacaaactg aatattaaaa atgtaactgg     4320
attttcaaag aaatgtttac tggtattacc tgtagatgta tattctttat tatgatcttt     4380
tgtgtaaagt ctggcagaca aatgcaatat ctaattgttg agtccaatat cacaagcagt     4440
acaaaagtat aaaaaagact tggccttttc taatgtgtta aaatacttta tgctggtaat     4500
aacactaaga gtagggcact agaaatttta agtgaagata atgtgttgca gttactgcac     4560
tcaatggctt actattataa accaaaactg ggatcactaa gctccagtca gtcaaaatga     4620
tcaaaattat tgaagagaat aagcaattct gttctttatt aggacacagt agatacagac     4680
tacaaagtgg agtgtgctta ataagaggta gcatttgtta agtgtcaatt actctattat     4740
cccttggagc ttctcaaaat aaccatataa ggtgtaagat gttaaaggtt atggttacac     4800
tcagtgcaca ggtaagctaa taggctgaga gaagctaaat tacttactgg ggtctcacag     4860
taagaaagtg agctgaagtt tcagcccaga tttaactgga ttctgggctc tttattcatg     4920
ttacttcatg aatctgtttc tcaattgtgc agaaaaaagg gggctattta taagaaaagc     4980
aataaacaaa caagtaatga tctcaaataa gtaatgcaag aaatagtgag atttcaaaat     5040
cagtggcagc gatttctcag ttctgtccta agtggccttg ctcaatcacc tgctatcttt     5100
tagtggagct ttgaaattat gtttcagaca acttcgattc agttctagaa tgtttgactc     5160
agcaaattca caggctcatc tttctaactt gatggtgaat atggaaattc agctaaatgg     5220
atgttaataa aattcaaacg ttttaaggac agatggaaat gacagaattt taaggtaaaa     5280
tatatgaagg aatataagat aaaggatttt tctaccttca gcaaaaacat acccactaat     5340
tagtaaaatt aataggcgaa aaaaagttgc atgctcttat actgtaatga ttatcatttt     5400
aaaactagct ttttgccttc gagctatcgg ggtaaagacc tacaggaaaa ctactgtcga     5460
aatcctcgag gggaagaagg gggaccctgg tgtttcacaa gcaatccaga ggtacgctac     5520
gaagtctgtg acattcctca gtgttcagaa gttgaatgca tgacctgcaa tggggagagt     5580
tatcgaggtc tcatggatca tacagaatca ggcaagattt gtcagcgctg ggatcatcag     5640
acaccacacc ggcacaaatt cttgcctgaa agatatcccg acaagggctt tgatgataat     5700
tattgccgca atcccgatgg ccagccgagg ccatggtgct atactcttga ccctcacacc     5760
cgctgggagt actgtgcaat taaaacatgc gctgacaata ctatgaatga cactgatgtt     5820
cctttggaaa caactgaatg catccaaggt caaggagaag gctacagggg cactgtcaat     5880
accatttgga atggaattcc atgtcagcgt tgggattctc agtatcctca cgagcatgac     5940
atgactcctg aaaatttcaa gtgcaaggac ctacgagaaa attactgccg aaatccagat     6000
gggtctgaat caccctggtg ttttaccact gatccaaaca tccgagttgg ctactgctcc     6060
caaattccaa actgtgatat gtcacatgga caagattgtt atcgtgggaa tggcaaaaat     6120
tatatgggca acttatccca aacaagatct ggactaacat gttcaatgtg ggacaagaac     6180
atggaagact tacatcgtca tatcttctgg gaaccagatg caagtaagct gaatgagaat     6240
tactgccgaa atccagatga tgatgctcat ggaccctggt gctacacggg aaatccactc     6300
attccttggg attattgccc tatttctcgt tgtgaaggtg ataccacacc tacaatagtc     6360
aatttagacc atcccgtaat atcttgtgcc aaaacgaaac aattgcgagt tgtaaatggg     6420
attccaacac gaacaaacat aggatggatg gttagtttga gatacagaaa taaacatatc     6480
tgcggaggat cattgataaa ggagagttgg gttcttactg cacgacagtg tttcccttct     6540
cgagacttga aagattatga agcttggctt ggaattcatg atgtccacgg aagaggagat     6600
gagaaatgca aacaggttct caatgtttcc cagctggtat atggccctga aggatcagat     6660
ctggttttaa tgaagcttgc caggcctgct gtcctggatg attttgttag tacgattgat     6720
ttacctaatt atggatgcac aattcctgaa aagaccagtt gcagtgttta tggctggggc     6780
tacactggat tgatcaacta tgatggccta ttacgagtgg cacatctcta tataatggga     6840
aatgagaaat gcagccagca tcatcgaggg aaggtgactc tgaatgagtc tgaaatatgt     6900
gctggggctg aaaagattgg atcaggacca tgtgaggggg attatggtgg cccacttgtt     6960
tgtgagcaac ataaaatgag aatggttctt ggtgtcattg ttcctggtcg tggatgtgcc     7020
attccaaatc gtcctggtat ttttgtccga gtagcatatt atgcaaaatg gatacacaaa     7080
attattttaa catataaggt accacagtca tag                                  7113
<210> 8
<211> 6190
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид
<400> 8
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc       60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat      120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa      180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt      240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc      300
ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa      360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta      420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac      480
aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc      540
tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat      600
tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata      660
tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg      720
tatttgtgaa ataataacgt aaacttcgtt taaaaggatt cttcttcctg tctttgagaa      780
agtacggcac tgtgcagggg gagaggttga ttgtgaaaaa tcagaggtag atgagaatct      840
tactgagggc tgagggttct ttaaccttgg tggatctcaa cattggttgc acattaaaat      900
cacctgctgc aagcccttga cgaatcttac ttagaagatg acaacacaga acaattaaat      960
cagaatctct ggggagaata gggcaccagt attttttgag ctcccaccat gattccaaag     1020
tgcagccaaa tttgagaacc actgctaaaa gctcaagctt cagattgacc agcttttcca     1080
tctcacctat cgcctaaaga ccaaattgga taaatgtgtt cattacgaca gatgggtact     1140
atttaaagat gagtaaacac aatatactta ggctcgtcag actgagagtt ttaatcatca     1200
ctgaggaaaa acatagatat ctaatactga ctggagtatt agtcaaggct tatttcacac     1260
acaattttat cagaaaccaa agtagtttaa aacagctctc cccttattag taatgcattg     1320
gagggtttac tttaccatgt accttgctga gcactgtacc ttgttaatct catttacttg     1380
taatgagaac cacacagcgg gtagttttat tggttctatt ttacctacat gacaaaactg     1440
aagcataaaa acacttagta agttttcagt gtcatgcaca actaggaagt gacatggcca     1500
gaatataagc ccagtcacca tcactctata acctgcgctt ttaacaactt cagggcatga     1560
cacatttggc cggtcagtag aacccatgct gtgatttgtt tttgcagtgg tggtgatgac     1620
tgccttgttg aatccacttt ttattctatt ccattttggg gacacaattc tgcaagatga     1680
ttcttcatta ggaaacagag atgagttatt gaccaacaca gaaagaaaaa gagtttgttg     1740
ctccacactg ggattaaacc tatgatcttg gcctaattaa cactagctag taagtgtcca     1800
agctgatcat ctctacaaca tttcaataac agaaaacaac aattttcaaa attagttact     1860
tacaattatg tagaaatgcc tctaaaacac agtattttcc ttatattaca aaaacaaaaa     1920
ttataattgg ttttgtcctc ttttgagagt ttgcatggtg ttactccctg catagtgaag     1980
aaaacatttt atttaagtag atggatctaa gtttttcatg aacaaaggaa tgacatttga     2040
aatcaatcct accctagtcc aggagaatgc attagattaa cctagtagag gtcttatttc     2100
accctgagtt ttctatgatc gtgattctct gctggaggag taattgtgaa atagatctct     2160
ctgggaactg gcttcctagt ccaatcagct cttttaccaa tgaacacttc cttgtgatat     2220
agatgtttat ggccgagagg atctcttcct ttctacctgt atttgtccta ataaattgtt     2280
gacttattaa ttcactactt cctcacagct tttttttggc tttacaaatc cactggaaag     2340
gtatatgggt gtatcacttt gtgtatttcg gtgtgcatgt gtagagggga caaaaatcct     2400
ctctcaaact ataaatattg agtatttgtg tattgaacat ttgctataac tactaggttt     2460
cttaaataat cttaatatat aaaatgatat agaaaaaggg aaattatagt tcgtattatt     2520
catctaagtg aagagattaa aacccaggga gtaaataaat tgtctaagga ctaaggttgt     2580
atactattta ggtgatagat atggggcaac cgtatgggtt ttatgattaa caaataaact     2640
tctcaccact ctaccatatc aacttttcca taaaagagag ctatagtatt ctttgcttaa     2700
ataaatttga ttagtgcatg acttcttgaa aacatataaa gcaaaagtca catttgattc     2760
tatcagaaaa gtgagtaagc catggcccaa acaaaagatg cattaaaata ttctggaatg     2820
atggagctaa aagtaagaaa aatgactttt taaaaaagtt tactgttagg aattgtgaaa     2880
ttatgctgaa ttttagttgc attataattt ttgtcagtca tacggtctga caacctgtct     2940
tatttctatt tccccatatg aggaatgcta gttaagtatg gatattaact attactactt     3000
agatgcattg aagttgcata atatggataa tacttcactg gttccctgaa aatgtttagt     3060
tagtaataag tctcttacac tatttgtttt gtccaataat ttatattttc tgaagactta     3120
actctagaat acactcatgt caaaatgaaa gaatttcatt gcaaaatatt gcttggtaca     3180
tgacgcatac ctgtatttgt tttgtgtcac aacatgaaaa atgatggttt attagaagtt     3240
tcattgggta ggaaacacat ttgaatggta tttactaaga tactaaaatc cttggacttc     3300
actctaattt tagtgccatt tagaactcaa ggtctcagta aaagtagaaa taaagcctgt     3360
taacaaaaca caaactgaat attaaaaatg taactggatt ttcaaagaaa tgtttactgg     3420
tattacctgt agatgtatat tctttattat gatcttttgt gtaaagtctg gcagacaaat     3480
gcaatatcta attgttgagt ccaatatcac aagcagtaca aaagtataaa aaagacttgg     3540
ccttttctaa tgtgttaaaa tactttatgc tggtaataac actaagagta gggcactaga     3600
aattttaagt gaagataatg tgttgcagtt actgcactca atggcttact attataaacc     3660
aaaactggga tcactaagct ccagtcagtc aaaatgatca aaattattga agagaataag     3720
caattctgtt ctttattagg acacagtaga tacagactac aaagtggagt gtgcttaata     3780
agaggtagca tttgttaagt gtcaattact ctattatccc ttggagcttc tcaaaataac     3840
catataaggt gtaagatgtt aaaggttatg gttacactca gtgcacaggt aagctaatag     3900
gctgagagaa gctaaattac ttactggggt ctcacagtaa gaaagtgagc tgaagtttca     3960
gcccagattt aactggattc tgggctcttt attcatgtta cttcatgaat ctgtttctca     4020
attgtgcaga aaaaaggggg ctatttataa gaaaagcaat aaacaaacaa gtaatgatct     4080
caaataagta atgcaagaaa tagtgagatt tcaaaatcag tggcagcgat ttctcagttc     4140
tgtcctaagt ggccttgctc aatcacctgc tatcttttag tggagctttg aaattatgtt     4200
tcagacaact tcgattcagt tctagaatgt ttgactcagc aaattcacag gctcatcttt     4260
ctaacttgat ggtgaatatg gaaattcagc taaatggatg ttaataaaat tcaaacgttt     4320
taaggacaga tggaaatgac agaattttaa ggtaaaatat atgaaggaat ataagataaa     4380
ggatttttct accttcagca aaaacatacc cactaattag taaaattaat aggcgaaaaa     4440
aagttgcatg ctcttatact gtaatgatta tcattttaaa actagctttt tgccttcgag     4500
ctatcggggt aaagacctac aggaaaacta ctgtcgaaat cctcgagggg aagaaggggg     4560
accctggtgt ttcacaagca atccagaggt acgctacgaa gtctgtgaca ttcctcagtg     4620
ttcagaagtt gaatgcatga cctgcaatgg ggagagttat cgaggtctca tggatcatac     4680
agaatcaggc aagatttgtc agcgctggga tcatcagaca ccacaccggc acaaattctt     4740
gcctgaaaga tatcccgaca agggctttga tgataattat tgccgcaatc ccgatggcca     4800
gccgaggcca tggtgctata ctcttgaccc tcacacccgc tgggagtact gtgcaattaa     4860
aacatgcgct gacaatacta tgaatgacac tgatgttcct ttggaaacaa ctgaatgcat     4920
ccaaggtcaa ggagaaggct acaggggcac tgtcaatacc atttggaatg gaattccatg     4980
tcagcgttgg gattctcagt atcctcacga gcatgacatg actcctgaaa atttcaagtg     5040
caaggaccta cgagaaaatt actgccgaaa tccagatggg tctgaatcac cctggtgttt     5100
taccactgat ccaaacatcc gagttggcta ctgctcccaa attccaaact gtgatatgtc     5160
acatggacaa gattgttatc gtgggaatgg caaaaattat atgggcaact tatcccaaac     5220
aagatctgga ctaacatgtt caatgtggga caagaacatg gaagacttac atcgtcatat     5280
cttctgggaa ccagatgcaa gtaagctgaa tgagaattac tgccgaaatc cagatgatga     5340
tgctcatgga ccctggtgct acacgggaaa tccactcatt ccttgggatt attgccctat     5400
ttctcgttgt gaaggtgata ccacacctac aatagtcaat ttagaccatc ccgtaatatc     5460
ttgtgccaaa acgaaacaat tgcgagttgt aaatgggatt ccaacacgaa caaacatagg     5520
atggatggtt agtttgagat acagaaataa acatatctgc ggaggatcat tgataaagga     5580
gagttgggtt cttactgcac gacagtgttt cccttctcga gacttgaaag attatgaagc     5640
ttggcttgga attcatgatg tccacggaag aggagatgag aaatgcaaac aggttctcaa     5700
tgtttcccag ctggtatatg gccctgaagg atcagatctg gttttaatga agcttgccag     5760
gcctgctgtc ctggatgatt ttgttagtac gattgattta cctaattatg gatgcacaat     5820
tcctgaaaag accagttgca gtgtttatgg ctggggctac actggattga tcaactatga     5880
tggcctatta cgagtggcac atctctatat aatgggaaat gagaaatgca gccagcatca     5940
tcgagggaag gtgactctga atgagtctga aatatgtgct ggggctgaaa agattggatc     6000
aggaccatgt gagggggatt atggtggccc acttgtttgt gagcaacata aaatgagaat     6060
ggttcttggt gtcattgttc ctggtcgtgg atgtgccatt ccaaatcgtc ctggtatttt     6120
tgtccgagta gcatattatg caaaatggat acacaaaatt attttaacat ataaggtacc     6180
acagtcatag                                                            6190
<210> 9
<211> 5190
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид
<400> 9
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc       60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat      120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa      180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt      240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc      300
ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa      360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta      420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac      480
aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc      540
tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat      600
tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata      660
tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg      720
tatttgtgaa ataataacgt aaacttcgtt taaaaggatt cttcttcctg tctttgagaa      780
agtacggcac tgtgcagggg gagaggttga ttgtgaaaaa tcagaggtag atgagaatct      840
tactgagggc tgagggttct ttaaccttgg tggatctcaa cattggttgc acattaaaat      900
cacctgctgc aagcccttga cgaatcttac ttagaagatg acaacacaga acaattaaat      960
cagaatctct ggggagaata gggcaccagt attttttgag ctcccaccat gattccaaag     1020
tgcagccaaa tttgagaacc actgctaaaa gctcaagctt cagattgacc agcttttcca     1080
tctcacctat cgcctaaaga ccaaattgga taaatgtgtt cattacgaca gatgggtact     1140
atttaaagat gagtaaacac aatatactta ggctcgtcag actgagagtt ttaatcatca     1200
ctgaggaaaa acatagatat ctaatactga ctggagtatt agtcaaggct tatttcacac     1260
acaattttat cagaaaccaa agtagtttaa aacagctctc cccttattag taatgcattg     1320
gagggtttac tttaccatgt accttgctga gcactgtacc ttgttaatct catttacttg     1380
taatgagaac cacacagcgg gtagttttat tggttctatt ttacctacat gacaaaactg     1440
aagcataaaa acacttagta agttttcagt gtcatgcaca actaggaagt gacatggcca     1500
gaatataagc ccagtcacca tcactctata acctgcgctt ttaacaactt cagggcatga     1560
cacatttggc cggtcagtag aacccatgct gtgatttgtt tttgcagtgg tggtgatgac     1620
tgccttgttg aatccacttt ttattctatt ccattttggg gacacaattc tgcaagatga     1680
ttcttcatta ggaaacagag atgagttatt gaccaacaca gaaagaaaaa gagtttgttg     1740
ctccacactg ggattaaacc tatgatcttg gcctaattaa cactagctag taagtgtcca     1800
agctgatcat ctctacaaca tttcaataac agaaaacaac aattttcaaa attagttact     1860
tacaattatg tagaaatgcc tctaaaacac agtattttcc ttatattaca aaaacaaaaa     1920
ttataattgg ttttgtcctc ttttgagagt ttgcatggtg ttactccctg catagtgaag     1980
aaaacatttt atttaagtag atggatctaa gtttttcatg aacaaaggaa tgacatttga     2040
aatcaatcct accctagtcc aggagaatgc attagattaa cctagtagag gtcttatttc     2100
accctgagtt ttctatgatc gtgattctct gctggaggag taattgtgaa atagatctct     2160
ctgggaactg gcttcctagt ccaatcagct cttttaccaa tgaacacttc cttgtgatat     2220
agatgtttat ggccgagagg atcctgggta ggaaacacat ttgaatggta tttactaaga     2280
tactaaaatc cttggacttc actctaattt tagtgccatt tagaactcaa ggtctcagta     2340
aaagtagaaa taaagcctgt taacaaaaca caaactgaat attaaaaatg taactggatt     2400
ttcaaagaaa tgtttactgg tattacctgt agatgtatat tctttattat gatcttttgt     2460
gtaaagtctg gcagacaaat gcaatatcta attgttgagt ccaatatcac aagcagtaca     2520
aaagtataaa aaagacttgg ccttttctaa tgtgttaaaa tactttatgc tggtaataac     2580
actaagagta gggcactaga aattttaagt gaagataatg tgttgcagtt actgcactca     2640
atggcttact attataaacc aaaactggga tcactaagct ccagtcagtc aaaatgatca     2700
aaattattga agagaataag caattctgtt ctttattagg acacagtaga tacagactac     2760
aaagtggagt gtgcttaata agaggtagca tttgttaagt gtcaattact ctattatccc     2820
ttggagcttc tcaaaataac catataaggt gtaagatgtt aaaggttatg gttacactca     2880
gtgcacaggt aagctaatag gctgagagaa gctaaattac ttactggggt ctcacagtaa     2940
gaaagtgagc tgaagtttca gcccagattt aactggattc tgggctcttt attcatgtta     3000
cttcatgaat ctgtttctca attgtgcaga aaaaaggggg ctatttataa gaaaagcaat     3060
aaacaaacaa gtaatgatct caaataagta atgcaagaaa tagtgagatt tcaaaatcag     3120
tggcagcgat ttctcagttc tgtcctaagt ggccttgctc aatcacctgc tatcttttag     3180
tggagctttg aaattatgtt tcagacaact tcgattcagt tctagaatgt ttgactcagc     3240
aaattcacag gctcatcttt ctaacttgat ggtgaatatg gaaattcagc taaatggatg     3300
ttaataaaat tcaaacgttt taaggacaga tggaaatgac agaattttaa ggtaaaatat     3360
atgaaggaat ataagataaa ggatttttct accttcagca aaaacatacc cactaattag     3420
taaaattaat aggcgaaaaa aagttgcatg ctcttatact gtaatgatta tcattttaaa     3480
actagctttt tgccttcgag ctatcggggt aaagacctac aggaaaacta ctgtcgaaat     3540
cctcgagggg aagaaggggg accctggtgt ttcacaagca atccagaggt acgctacgaa     3600
gtctgtgaca ttcctcagtg ttcagaagtt gaatgcatga cctgcaatgg ggagagttat     3660
cgaggtctca tggatcatac agaatcaggc aagatttgtc agcgctggga tcatcagaca     3720
ccacaccggc acaaattctt gcctgaaaga tatcccgaca agggctttga tgataattat     3780
tgccgcaatc ccgatggcca gccgaggcca tggtgctata ctcttgaccc tcacacccgc     3840
tgggagtact gtgcaattaa aacatgcgct gacaatacta tgaatgacac tgatgttcct     3900
ttggaaacaa ctgaatgcat ccaaggtcaa ggagaaggct acaggggcac tgtcaatacc     3960
atttggaatg gaattccatg tcagcgttgg gattctcagt atcctcacga gcatgacatg     4020
actcctgaaa atttcaagtg caaggaccta cgagaaaatt actgccgaaa tccagatggg     4080
tctgaatcac cctggtgttt taccactgat ccaaacatcc gagttggcta ctgctcccaa     4140
attccaaact gtgatatgtc acatggacaa gattgttatc gtgggaatgg caaaaattat     4200
atgggcaact tatcccaaac aagatctgga ctaacatgtt caatgtggga caagaacatg     4260
gaagacttac atcgtcatat cttctgggaa ccagatgcaa gtaagctgaa tgagaattac     4320
tgccgaaatc cagatgatga tgctcatgga ccctggtgct acacgggaaa tccactcatt     4380
ccttgggatt attgccctat ttctcgttgt gaaggtgata ccacacctac aatagtcaat     4440
ttagaccatc ccgtaatatc ttgtgccaaa acgaaacaat tgcgagttgt aaatgggatt     4500
ccaacacgaa caaacatagg atggatggtt agtttgagat acagaaataa acatatctgc     4560
ggaggatcat tgataaagga gagttgggtt cttactgcac gacagtgttt cccttctcga     4620
gacttgaaag attatgaagc ttggcttgga attcatgatg tccacggaag aggagatgag     4680
aaatgcaaac aggttctcaa tgtttcccag ctggtatatg gccctgaagg atcagatctg     4740
gttttaatga agcttgccag gcctgctgtc ctggatgatt ttgttagtac gattgattta     4800
cctaattatg gatgcacaat tcctgaaaag accagttgca gtgtttatgg ctggggctac     4860
actggattga tcaactatga tggcctatta cgagtggcac atctctatat aatgggaaat     4920
gagaaatgca gccagcatca tcgagggaag gtgactctga atgagtctga aatatgtgct     4980
ggggctgaaa agattggatc aggaccatgt gagggggatt atggtggccc acttgtttgt     5040
gagcaacata aaatgagaat ggttcttggt gtcattgttc ctggtcgtgg atgtgccatt     5100
ccaaatcgtc ctggtatttt tgtccgagta gcatattatg caaaatggat acacaaaatt     5160
attttaacat ataaggtacc acagtcatag                                      5190
<210> 10
<211> 4241
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид
<400> 10
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc       60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat      120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa      180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt      240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc      300
ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa      360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta      420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac      480
aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc      540
tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat      600
tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata      660
tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg      720
tatttgtgaa ataataacgt aaacttcgtt taaaaggatt cttcttcctg tctttgagaa      780
agtacggcac tgtgcagggg gagaggttga ttgtgaaaaa tcagaggtag atgagaatct      840
tactgagggc tgagggttct ttaaccttgg tggatctcaa cattggttgc acattaaaat      900
cacctgctgc aagcccttga cgaatcttac ttagaagatg acaacacaga acaattaaat      960
cagaatctct ggggagaata gggcaccagt attttttgag ctcccaccat gattccaaag     1020
tgcagccaaa tttgagaacc actgctaaaa gctcaagctt cagattgacc agcttttcca     1080
tctcacctat cgcctaaaga ccaaattgga taaatgtgtt cattacgaca gatgggtact     1140
atttaaagat gagtaaacac aatatactta ggctcgtcag actgagagtt ttaatcatca     1200
ctgaggaaaa acatagatat ctaatactga ctggagtatt agtcaaggct tatttcacac     1260
acaattttat cagaaaccaa agtagtttaa aacagctctc cccttattag taatgcattg     1320
gagggtttac tttaccatgt accttgctga gcactgtacc ttgttaatct catttacttg     1380
taatgagaac cacacagcgg gtagttttat tggttctatt ttacctacat gacaaaactg     1440
aagcataaaa acacttagta agttttcagt gtcatgcaca actaggaagt gacatggcca     1500
gaatataagc ccagtcacca tcactctata acctgcgctt ttaacaactt cagggcatga     1560
cacatttggc cggtcagtag aacccatgct gtgatttgtt tttgcagtgg tggtgatgac     1620
tgccttgttg aatccacttt ttattctatt ccattttggg gacacaattc tgcaagatga     1680
ttcttcatta ggaaacagag atgagttatt gaccaacaca gaaagaaaaa gagtttgttg     1740
ctccacactg ggattaaacc tatgatcttg gcctaattaa cactagctag taagtgtcca     1800
agctgatcat ctctacaaca tttcaataac agaaaacaac aattttcaaa attagttact     1860
tacaattatg tagaaatgcc tctaaaacac agtattttcc ttatattaca aaaacaaaaa     1920
ttataattgg ttttgtcctc ttttgagagt ttgcatggtg ttactccctg catagtgaag     1980
aaaacatttt atttaagtag atggatctaa gtttttcatg aacaaaggaa tgacatttga     2040
aatcaatcct accctagtcc aggagaatgc attagattaa cctagtagag gtcttatttc     2100
accctgagtt ttctatgatc gtgattctct gctggaggag taattgtgaa atagatctct     2160
ctgggaactg gcttcctagt ccaatcagct cttttaccaa tgaacacttc cttgtgatat     2220
agatgtttat ggccgagagg atccttatgt ttcagacaac ttcgattcag ttctagaatg     2280
tttgactcag caaattcaca ggctcatctt tctaacttga tggtgaatat ggaaattcag     2340
ctaaatggat gttaataaaa ttcaaacgtt ttaaggacag atggaaatga cagaatttta     2400
aggtaaaata tatgaaggaa tataagataa aggatttttc taccttcagc aaaaacatac     2460
ccactaatta gtaaaattaa taggcgaaaa aaagttgcat gctcttatac tgtaatgatt     2520
atcattttaa aactagcttt ttgccttcga gctatcgggg taaagaccta caggaaaact     2580
actgtcgaaa tcctcgaggg gaagaagggg gaccctggtg tttcacaagc aatccagagg     2640
tacgctacga agtctgtgac attcctcagt gttcagaagt tgaatgcatg acctgcaatg     2700
gggagagtta tcgaggtctc atggatcata cagaatcagg caagatttgt cagcgctggg     2760
atcatcagac accacaccgg cacaaattct tgcctgaaag atatcccgac aagggctttg     2820
atgataatta ttgccgcaat cccgatggcc agccgaggcc atggtgctat actcttgacc     2880
ctcacacccg ctgggagtac tgtgcaatta aaacatgcgc tgacaatact atgaatgaca     2940
ctgatgttcc tttggaaaca actgaatgca tccaaggtca aggagaaggc tacaggggca     3000
ctgtcaatac catttggaat ggaattccat gtcagcgttg ggattctcag tatcctcacg     3060
agcatgacat gactcctgaa aatttcaagt gcaaggacct acgagaaaat tactgccgaa     3120
atccagatgg gtctgaatca ccctggtgtt ttaccactga tccaaacatc cgagttggct     3180
actgctccca aattccaaac tgtgatatgt cacatggaca agattgttat cgtgggaatg     3240
gcaaaaatta tatgggcaac ttatcccaaa caagatctgg actaacatgt tcaatgtggg     3300
acaagaacat ggaagactta catcgtcata tcttctggga accagatgca agtaagctga     3360
atgagaatta ctgccgaaat ccagatgatg atgctcatgg accctggtgc tacacgggaa     3420
atccactcat tccttgggat tattgcccta tttctcgttg tgaaggtgat accacaccta     3480
caatagtcaa tttagaccat cccgtaatat cttgtgccaa aacgaaacaa ttgcgagttg     3540
taaatgggat tccaacacga acaaacatag gatggatggt tagtttgaga tacagaaata     3600
aacatatctg cggaggatca ttgataaagg agagttgggt tcttactgca cgacagtgtt     3660
tcccttctcg agacttgaaa gattatgaag cttggcttgg aattcatgat gtccacggaa     3720
gaggagatga gaaatgcaaa caggttctca atgtttccca gctggtatat ggccctgaag     3780
gatcagatct ggttttaatg aagcttgcca ggcctgctgt cctggatgat tttgttagta     3840
cgattgattt acctaattat ggatgcacaa ttcctgaaaa gaccagttgc agtgtttatg     3900
gctggggcta cactggattg atcaactatg atggcctatt acgagtggca catctctata     3960
taatgggaaa tgagaaatgc agccagcatc atcgagggaa ggtgactctg aatgagtctg     4020
aaatatgtgc tggggctgaa aagattggat caggaccatg tgagggggat tatggtggcc     4080
cacttgtttg tgagcaacat aaaatgagaa tggttcttgg tgtcattgtt cctggtcgtg     4140
gatgtgccat tccaaatcgt cctggtattt ttgtccgagt agcatattat gcaaaatgga     4200
tacacaaaat tattttaaca tataaggtac cacagtcata g                         4241
<210> 11
<211> 5602
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид
<400> 11
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc       60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat      120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa      180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt      240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc      300
ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa      360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta      420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac      480
aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc      540
tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat      600
tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata      660
tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg      720
tatttgtgga tccagtatat taataaaatc cctttttgta ttcaatgagg gaaacacata      780
attttcatca attagcagct tattggaata tctgcatgat ggtttaacac ttttaagtgt      840
tgactaaaga ttaattttac agaaaataga aaaagaaata tgtttctgtc tggaggaatg      900
atttattgtt gacccctaaa ttgaaatatt ttactagtgg cttaatggaa agatgatgaa      960
agatgatgaa attaatgtag aagcttaact agaaaatcag gtgacctgat atctacatct     1020
gtatccttca ttggccaccc agcattcatt aatgaatcag atgatggaat agatcaagtt     1080
tcctaggaac acagtgaata ttaaaagaaa acaaagggag cctagcacct agaagaccta     1140
gtttatattt caaagtatat ttggatgtaa cccaatttta aacatttcct cacttgtctc     1200
tcttaaagcc ttgccaacag caaggacaga gaaccaaaaa tagtgtatat atgaataaat     1260
gcttattaca gaatctgctg actggcacat gctttgtgtg taatgggttc tcataaacac     1320
ttgttgaatg aacacacata agtgaaagag catggctagg cttcatccct tggtcaaata     1380
tggggtgcta aagaaaagca ggggaaatac attgggacac taacaaaaaa aaacagttaa     1440
tttaggtaaa agataaaata caccacagaa tgaagaaaag agatgaccca gactgctctt     1500
taaccttcat gtcctagaga ggtttttgat atgaattgca ttcagaattg tggaaaggag     1560
cccatctttt ctcttcattt tgattttatt aactccaatg ggggaatttt attcgtgttt     1620
tggccatatc tacttttgat ttctacatta ttctctcttc ctttctacct gtatttgtcc     1680
taataaattg ttgacttatt aattcactac ttcctcacag cttttttttg gctttacaaa     1740
tccactggaa aggtatatgg gtgtatcact ttgtgtattt cggtgtgcat gtgtagaggg     1800
gacaaaaatc ctctctcaaa ctataaatat tgagtatttg tgtattgaac atttgctata     1860
actactaggt ttcttaaata atcttaatat ataaaatgat atagaaaaag ggaaattata     1920
gttcgtatta ttcatctaag tgaagagatt aaaacccagg gagtaaataa attgtctaag     1980
gactaaggtt gtatactatt taggtgatag atatggggca accgtatggg ttttatgatt     2040
aacaaataaa cttctcacca ctctaccata tcaacttttc cataaaagag agctatagta     2100
ttctttgctt aaataaattt gattagtgca tgacttcttg aaaacatata aagcaaaagt     2160
cacatttgat tctatcagaa aagtgagtaa gccatggccc aaacaaaaga tgcattaaaa     2220
tattctggaa tgatggagct aaaagtaaga aaaatgactt tttaaaaaag tttactgtta     2280
ggaattgtga aattatgctg aattttagtt gcattataat ttttgtcagt catacggtct     2340
gacaacctgt cttatttcta tttccccata tgaggaatgc tagttaagta tggatattaa     2400
ctattactac ttagatgcat tgaagttgca taatatggat aatacttcac tggttccctg     2460
aaaatgttta gttagtaata agtctcttac actatttgtt ttgtccaata atttatattt     2520
tctgaagact taactctaga atacactcat gtcaaaatga aagaatttca ttgcaaaata     2580
ttgcttggta catgacgcat acctgtattt gttttgtgtc acaacatgaa aaatgatggt     2640
ttattagaag tttcattggg taggaaacac atttgaatgg tatttactaa gatactaaaa     2700
tccttggact tcactctaat tttagtgcca tttagaactc aaggtctcag taaaagtaga     2760
aataaagcct gttaacaaaa cacaaactga atattaaaaa tgtaactgga ttttcaaaga     2820
aatgtttact ggtattacct gtagatgtat attctttatt atgatctttt gtgtaaagtc     2880
tggcagacaa atgcaatatc taattgttga gtccaatatc acaagcagta caaaagtata     2940
aaaaagactt ggccttttct aatgtgttaa aatactttat gctggtaata acactaagag     3000
tagggcacta gaaattttaa gtgaagataa tgtgttgcag ttactgcact caatggctta     3060
ctattataaa ccaaaactgg gatcactaag ctccagtcag tcaaaatgat caaaattatt     3120
gaagagaata agcaattctg ttctttatta ggacacagta gatacagact acaaagtgga     3180
gtgtgcttaa taagaggtag catttgttaa gtgtcaatta ctctattatc ccttggagct     3240
tctcaaaata accatataag gtgtaagatg ttaaaggtta tggttacact cagtgcacag     3300
gtaagctaat aggctgagag aagctaaatt acttactggg gtctcacagt aagaaagtga     3360
gctgaagttt cagcccagat ttaactggat tctgggctct ttattcatgt tacttcatga     3420
atctgtttct caattgtgca gaaaaaaggg ggctatttat aagaaaagca ataaacaaac     3480
aagtaatgat ctcaaataag taatgcaaga aatagtgaga tttcaaaatc agtggcagcg     3540
atttctcagt tctgtcctaa gtggccttgc tcaatcacct gctatctttt agtggagctt     3600
tgaaattatg tttcagacaa cttcgattca gttctagaat gtttgactca gcaaattcac     3660
aggctcatct ttctaacttg atggtgaata tggaaattca gctaaatgga tgttaataaa     3720
attcaaacgt tttaaggaca gatggaaatg acagaatttt aaggtaaaat atatgaagga     3780
atataagata aaggattttt ctaccttcag caaaaacata cccactaatt agtaaaatta     3840
ataggcgaaa aaaagttgca tgctcttata ctgtaatgat tatcatttta aaactagctt     3900
tttgccttcg agctatcggg gtaaagacct acaggaaaac tactgtcgaa atcctcgagg     3960
ggaagaaggg ggaccctggt gtttcacaag caatccagag gtacgctacg aagtctgtga     4020
cattcctcag tgttcagaag ttgaatgcat gacctgcaat ggggagagtt atcgaggtct     4080
catggatcat acagaatcag gcaagatttg tcagcgctgg gatcatcaga caccacaccg     4140
gcacaaattc ttgcctgaaa gatatcccga caagggcttt gatgataatt attgccgcaa     4200
tcccgatggc cagccgaggc catggtgcta tactcttgac cctcacaccc gctgggagta     4260
ctgtgcaatt aaaacatgcg ctgacaatac tatgaatgac actgatgttc ctttggaaac     4320
aactgaatgc atccaaggtc aaggagaagg ctacaggggc actgtcaata ccatttggaa     4380
tggaattcca tgtcagcgtt gggattctca gtatcctcac gagcatgaca tgactcctga     4440
aaatttcaag tgcaaggacc tacgagaaaa ttactgccga aatccagatg ggtctgaatc     4500
accctggtgt tttaccactg atccaaacat ccgagttggc tactgctccc aaattccaaa     4560
ctgtgatatg tcacatggac aagattgtta tcgtgggaat ggcaaaaatt atatgggcaa     4620
cttatcccaa acaagatctg gactaacatg ttcaatgtgg gacaagaaca tggaagactt     4680
acatcgtcat atcttctggg aaccagatgc aagtaagctg aatgagaatt actgccgaaa     4740
tccagatgat gatgctcatg gaccctggtg ctacacggga aatccactca ttccttggga     4800
ttattgccct atttctcgtt gtgaaggtga taccacacct acaatagtca atttagacca     4860
tcccgtaata tcttgtgcca aaacgaaaca attgcgagtt gtaaatggga ttccaacacg     4920
aacaaacata ggatggatgg ttagtttgag atacagaaat aaacatatct gcggaggatc     4980
attgataaag gagagttggg ttcttactgc acgacagtgt ttcccttctc gagacttgaa     5040
agattatgaa gcttggcttg gaattcatga tgtccacgga agaggagatg agaaatgcaa     5100
acaggttctc aatgtttccc agctggtata tggccctgaa ggatcagatc tggttttaat     5160
gaagcttgcc aggcctgctg tcctggatga ttttgttagt acgattgatt tacctaatta     5220
tggatgcaca attcctgaaa agaccagttg cagtgtttat ggctggggct acactggatt     5280
gatcaactat gatggcctat tacgagtggc acatctctat ataatgggaa atgagaaatg     5340
cagccagcat catcgaggga aggtgactct gaatgagtct gaaatatgtg ctggggctga     5400
aaagattgga tcaggaccat gtgaggggga ttatggtggc ccacttgttt gtgagcaaca     5460
taaaatgaga atggttcttg gtgtcattgt tcctggtcgt ggatgtgcca ttccaaatcg     5520
tcctggtatt tttgtccgag tagcatatta tgcaaaatgg atacacaaaa ttattttaac     5580
atataaggta ccacagtcat ag                                              5602
<210> 12
<211> 4679
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид
<400> 12
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc       60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat      120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa      180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt      240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc      300
ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa      360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta      420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac      480
aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc      540
tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat      600
tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata      660
tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg      720
tatttgtgga tctcttcctt tctacctgta tttgtcctaa taaattgttg acttattaat      780
tcactacttc ctcacagctt ttttttggct ttacaaatcc actggaaagg tatatgggtg      840
tatcactttg tgtatttcgg tgtgcatgtg tagaggggac aaaaatcctc tctcaaacta      900
taaatattga gtatttgtgt attgaacatt tgctataact actaggtttc ttaaataatc      960
ttaatatata aaatgatata gaaaaaggga aattatagtt cgtattattc atctaagtga     1020
agagattaaa acccagggag taaataaatt gtctaaggac taaggttgta tactatttag     1080
gtgatagata tggggcaacc gtatgggttt tatgattaac aaataaactt ctcaccactc     1140
taccatatca acttttccat aaaagagagc tatagtattc tttgcttaaa taaatttgat     1200
tagtgcatga cttcttgaaa acatataaag caaaagtcac atttgattct atcagaaaag     1260
tgagtaagcc atggcccaaa caaaagatgc attaaaatat tctggaatga tggagctaaa     1320
agtaagaaaa atgacttttt aaaaaagttt actgttagga attgtgaaat tatgctgaat     1380
tttagttgca ttataatttt tgtcagtcat acggtctgac aacctgtctt atttctattt     1440
ccccatatga ggaatgctag ttaagtatgg atattaacta ttactactta gatgcattga     1500
agttgcataa tatggataat acttcactgg ttccctgaaa atgtttagtt agtaataagt     1560
ctcttacact atttgttttg tccaataatt tatattttct gaagacttaa ctctagaata     1620
cactcatgtc aaaatgaaag aatttcattg caaaatattg cttggtacat gacgcatacc     1680
tgtatttgtt ttgtgtcaca acatgaaaaa tgatggttta ttagaagttt cattgggtag     1740
gaaacacatt tgaatggtat ttactaagat actaaaatcc ttggacttca ctctaatttt     1800
agtgccattt agaactcaag gtctcagtaa aagtagaaat aaagcctgtt aacaaaacac     1860
aaactgaata ttaaaaatgt aactggattt tcaaagaaat gtttactggt attacctgta     1920
gatgtatatt ctttattatg atcttttgtg taaagtctgg cagacaaatg caatatctaa     1980
ttgttgagtc caatatcaca agcagtacaa aagtataaaa aagacttggc cttttctaat     2040
gtgttaaaat actttatgct ggtaataaca ctaagagtag ggcactagaa attttaagtg     2100
aagataatgt gttgcagtta ctgcactcaa tggcttacta ttataaacca aaactgggat     2160
cactaagctc cagtcagtca aaatgatcaa aattattgaa gagaataagc aattctgttc     2220
tttattagga cacagtagat acagactaca aagtggagtg tgcttaataa gaggtagcat     2280
ttgttaagtg tcaattactc tattatccct tggagcttct caaaataacc atataaggtg     2340
taagatgtta aaggttatgg ttacactcag tgcacaggta agctaatagg ctgagagaag     2400
ctaaattact tactggggtc tcacagtaag aaagtgagct gaagtttcag cccagattta     2460
actggattct gggctcttta ttcatgttac ttcatgaatc tgtttctcaa ttgtgcagaa     2520
aaaagggggc tatttataag aaaagcaata aacaaacaag taatgatctc aaataagtaa     2580
tgcaagaaat agtgagattt caaaatcagt ggcagcgatt tctcagttct gtcctaagtg     2640
gccttgctca atcacctgct atcttttagt ggagctttga aattatgttt cagacaactt     2700
cgattcagtt ctagaatgtt tgactcagca aattcacagg ctcatctttc taacttgatg     2760
gtgaatatgg aaattcagct aaatggatgt taataaaatt caaacgtttt aaggacagat     2820
ggaaatgaca gaattttaag gtaaaatata tgaaggaata taagataaag gatttttcta     2880
ccttcagcaa aaacataccc actaattagt aaaattaata ggcgaaaaaa agttgcatgc     2940
tcttatactg taatgattat cattttaaaa ctagcttttt gccttcgagc tatcggggta     3000
aagacctaca ggaaaactac tgtcgaaatc ctcgagggga agaaggggga ccctggtgtt     3060
tcacaagcaa tccagaggta cgctacgaag tctgtgacat tcctcagtgt tcagaagttg     3120
aatgcatgac ctgcaatggg gagagttatc gaggtctcat ggatcataca gaatcaggca     3180
agatttgtca gcgctgggat catcagacac cacaccggca caaattcttg cctgaaagat     3240
atcccgacaa gggctttgat gataattatt gccgcaatcc cgatggccag ccgaggccat     3300
ggtgctatac tcttgaccct cacacccgct gggagtactg tgcaattaaa acatgcgctg     3360
acaatactat gaatgacact gatgttcctt tggaaacaac tgaatgcatc caaggtcaag     3420
gagaaggcta caggggcact gtcaatacca tttggaatgg aattccatgt cagcgttggg     3480
attctcagta tcctcacgag catgacatga ctcctgaaaa tttcaagtgc aaggacctac     3540
gagaaaatta ctgccgaaat ccagatgggt ctgaatcacc ctggtgtttt accactgatc     3600
caaacatccg agttggctac tgctcccaaa ttccaaactg tgatatgtca catggacaag     3660
attgttatcg tgggaatggc aaaaattata tgggcaactt atcccaaaca agatctggac     3720
taacatgttc aatgtgggac aagaacatgg aagacttaca tcgtcatatc ttctgggaac     3780
cagatgcaag taagctgaat gagaattact gccgaaatcc agatgatgat gctcatggac     3840
cctggtgcta cacgggaaat ccactcattc cttgggatta ttgccctatt tctcgttgtg     3900
aaggtgatac cacacctaca atagtcaatt tagaccatcc cgtaatatct tgtgccaaaa     3960
cgaaacaatt gcgagttgta aatgggattc caacacgaac aaacatagga tggatggtta     4020
gtttgagata cagaaataaa catatctgcg gaggatcatt gataaaggag agttgggttc     4080
ttactgcacg acagtgtttc ccttctcgag acttgaaaga ttatgaagct tggcttggaa     4140
ttcatgatgt ccacggaaga ggagatgaga aatgcaaaca ggttctcaat gtttcccagc     4200
tggtatatgg ccctgaagga tcagatctgg ttttaatgaa gcttgccagg cctgctgtcc     4260
tggatgattt tgttagtacg attgatttac ctaattatgg atgcacaatt cctgaaaaga     4320
ccagttgcag tgtttatggc tggggctaca ctggattgat caactatgat ggcctattac     4380
gagtggcaca tctctatata atgggaaatg agaaatgcag ccagcatcat cgagggaagg     4440
tgactctgaa tgagtctgaa atatgtgctg gggctgaaaa gattggatca ggaccatgtg     4500
agggggatta tggtggccca cttgtttgtg agcaacataa aatgagaatg gttcttggtg     4560
tcattgttcc tggtcgtgga tgtgccattc caaatcgtcc tggtattttt gtccgagtag     4620
catattatgc aaaatggata cacaaaatta ttttaacata taaggtacca cagtcatag      4679
<210> 13
<211> 3679
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид
<400> 13
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc       60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat      120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa      180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt      240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc      300
ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa      360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta      420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac      480
aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc      540
tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat      600
tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata      660
tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg      720
tatttgtgga tcctgggtag gaaacacatt tgaatggtat ttactaagat actaaaatcc      780
ttggacttca ctctaatttt agtgccattt agaactcaag gtctcagtaa aagtagaaat      840
aaagcctgtt aacaaaacac aaactgaata ttaaaaatgt aactggattt tcaaagaaat      900
gtttactggt attacctgta gatgtatatt ctttattatg atcttttgtg taaagtctgg      960
cagacaaatg caatatctaa ttgttgagtc caatatcaca agcagtacaa aagtataaaa     1020
aagacttggc cttttctaat gtgttaaaat actttatgct ggtaataaca ctaagagtag     1080
ggcactagaa attttaagtg aagataatgt gttgcagtta ctgcactcaa tggcttacta     1140
ttataaacca aaactgggat cactaagctc cagtcagtca aaatgatcaa aattattgaa     1200
gagaataagc aattctgttc tttattagga cacagtagat acagactaca aagtggagtg     1260
tgcttaataa gaggtagcat ttgttaagtg tcaattactc tattatccct tggagcttct     1320
caaaataacc atataaggtg taagatgtta aaggttatgg ttacactcag tgcacaggta     1380
agctaatagg ctgagagaag ctaaattact tactggggtc tcacagtaag aaagtgagct     1440
gaagtttcag cccagattta actggattct gggctcttta ttcatgttac ttcatgaatc     1500
tgtttctcaa ttgtgcagaa aaaagggggc tatttataag aaaagcaata aacaaacaag     1560
taatgatctc aaataagtaa tgcaagaaat agtgagattt caaaatcagt ggcagcgatt     1620
tctcagttct gtcctaagtg gccttgctca atcacctgct atcttttagt ggagctttga     1680
aattatgttt cagacaactt cgattcagtt ctagaatgtt tgactcagca aattcacagg     1740
ctcatctttc taacttgatg gtgaatatgg aaattcagct aaatggatgt taataaaatt     1800
caaacgtttt aaggacagat ggaaatgaca gaattttaag gtaaaatata tgaaggaata     1860
taagataaag gatttttcta ccttcagcaa aaacataccc actaattagt aaaattaata     1920
ggcgaaaaaa agttgcatgc tcttatactg taatgattat cattttaaaa ctagcttttt     1980
gccttcgagc tatcggggta aagacctaca ggaaaactac tgtcgaaatc ctcgagggga     2040
agaaggggga ccctggtgtt tcacaagcaa tccagaggta cgctacgaag tctgtgacat     2100
tcctcagtgt tcagaagttg aatgcatgac ctgcaatggg gagagttatc gaggtctcat     2160
ggatcataca gaatcaggca agatttgtca gcgctgggat catcagacac cacaccggca     2220
caaattcttg cctgaaagat atcccgacaa gggctttgat gataattatt gccgcaatcc     2280
cgatggccag ccgaggccat ggtgctatac tcttgaccct cacacccgct gggagtactg     2340
tgcaattaaa acatgcgctg acaatactat gaatgacact gatgttcctt tggaaacaac     2400
tgaatgcatc caaggtcaag gagaaggcta caggggcact gtcaatacca tttggaatgg     2460
aattccatgt cagcgttggg attctcagta tcctcacgag catgacatga ctcctgaaaa     2520
tttcaagtgc aaggacctac gagaaaatta ctgccgaaat ccagatgggt ctgaatcacc     2580
ctggtgtttt accactgatc caaacatccg agttggctac tgctcccaaa ttccaaactg     2640
tgatatgtca catggacaag attgttatcg tgggaatggc aaaaattata tgggcaactt     2700
atcccaaaca agatctggac taacatgttc aatgtgggac aagaacatgg aagacttaca     2760
tcgtcatatc ttctgggaac cagatgcaag taagctgaat gagaattact gccgaaatcc     2820
agatgatgat gctcatggac cctggtgcta cacgggaaat ccactcattc cttgggatta     2880
ttgccctatt tctcgttgtg aaggtgatac cacacctaca atagtcaatt tagaccatcc     2940
cgtaatatct tgtgccaaaa cgaaacaatt gcgagttgta aatgggattc caacacgaac     3000
aaacatagga tggatggtta gtttgagata cagaaataaa catatctgcg gaggatcatt     3060
gataaaggag agttgggttc ttactgcacg acagtgtttc ccttctcgag acttgaaaga     3120
ttatgaagct tggcttggaa ttcatgatgt ccacggaaga ggagatgaga aatgcaaaca     3180
ggttctcaat gtttcccagc tggtatatgg ccctgaagga tcagatctgg ttttaatgaa     3240
gcttgccagg cctgctgtcc tggatgattt tgttagtacg attgatttac ctaattatgg     3300
atgcacaatt cctgaaaaga ccagttgcag tgtttatggc tggggctaca ctggattgat     3360
caactatgat ggcctattac gagtggcaca tctctatata atgggaaatg agaaatgcag     3420
ccagcatcat cgagggaagg tgactctgaa tgagtctgaa atatgtgctg gggctgaaaa     3480
gattggatca ggaccatgtg agggggatta tggtggccca cttgtttgtg agcaacataa     3540
aatgagaatg gttcttggtg tcattgttcc tggtcgtgga tgtgccattc caaatcgtcc     3600
tggtattttt gtccgagtag catattatgc aaaatggata cacaaaatta ttttaacata     3660
taaggtacca cagtcatag                                                  3679
<210> 14
<211> 2730
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид
<400> 14
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc       60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat      120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa      180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt      240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc      300
ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa      360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta      420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac      480
aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc      540
tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat      600
tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata      660
tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg      720
tatttgtgga tccttatgtt tcagacaact tcgattcagt tctagaatgt ttgactcagc      780
aaattcacag gctcatcttt ctaacttgat ggtgaatatg gaaattcagc taaatggatg      840
ttaataaaat tcaaacgttt taaggacaga tggaaatgac agaattttaa ggtaaaatat      900
atgaaggaat ataagataaa ggatttttct accttcagca aaaacatacc cactaattag      960
taaaattaat aggcgaaaaa aagttgcatg ctcttatact gtaatgatta tcattttaaa     1020
actagctttt tgccttcgag ctatcggggt aaagacctac aggaaaacta ctgtcgaaat     1080
cctcgagggg aagaaggggg accctggtgt ttcacaagca atccagaggt acgctacgaa     1140
gtctgtgaca ttcctcagtg ttcagaagtt gaatgcatga cctgcaatgg ggagagttat     1200
cgaggtctca tggatcatac agaatcaggc aagatttgtc agcgctggga tcatcagaca     1260
ccacaccggc acaaattctt gcctgaaaga tatcccgaca agggctttga tgataattat     1320
tgccgcaatc ccgatggcca gccgaggcca tggtgctata ctcttgaccc tcacacccgc     1380
tgggagtact gtgcaattaa aacatgcgct gacaatacta tgaatgacac tgatgttcct     1440
ttggaaacaa ctgaatgcat ccaaggtcaa ggagaaggct acaggggcac tgtcaatacc     1500
atttggaatg gaattccatg tcagcgttgg gattctcagt atcctcacga gcatgacatg     1560
actcctgaaa atttcaagtg caaggaccta cgagaaaatt actgccgaaa tccagatggg     1620
tctgaatcac cctggtgttt taccactgat ccaaacatcc gagttggcta ctgctcccaa     1680
attccaaact gtgatatgtc acatggacaa gattgttatc gtgggaatgg caaaaattat     1740
atgggcaact tatcccaaac aagatctgga ctaacatgtt caatgtggga caagaacatg     1800
gaagacttac atcgtcatat cttctgggaa ccagatgcaa gtaagctgaa tgagaattac     1860
tgccgaaatc cagatgatga tgctcatgga ccctggtgct acacgggaaa tccactcatt     1920
ccttgggatt attgccctat ttctcgttgt gaaggtgata ccacacctac aatagtcaat     1980
ttagaccatc ccgtaatatc ttgtgccaaa acgaaacaat tgcgagttgt aaatgggatt     2040
ccaacacgaa caaacatagg atggatggtt agtttgagat acagaaataa acatatctgc     2100
ggaggatcat tgataaagga gagttgggtt cttactgcac gacagtgttt cccttctcga     2160
gacttgaaag attatgaagc ttggcttgga attcatgatg tccacggaag aggagatgag     2220
aaatgcaaac aggttctcaa tgtttcccag ctggtatatg gccctgaagg atcagatctg     2280
gttttaatga agcttgccag gcctgctgtc ctggatgatt ttgttagtac gattgattta     2340
cctaattatg gatgcacaat tcctgaaaag accagttgca gtgtttatgg ctggggctac     2400
actggattga tcaactatga tggcctatta cgagtggcac atctctatat aatgggaaat     2460
gagaaatgca gccagcatca tcgagggaag gtgactctga atgagtctga aatatgtgct     2520
ggggctgaaa agattggatc aggaccatgt gagggggatt atggtggccc acttgtttgt     2580
gagcaacata aaatgagaat ggttcttggt gtcattgttc ctggtcgtgg atgtgccatt     2640
ccaaatcgtc ctggtatttt tgtccgagta gcatattatg caaaatggat acacaaaatt     2700
attttaacat ataaggtacc acagtcatag                                      2730
<210> 15
<211> 3250
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид
<400> 15
cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta       60
tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg      120
ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg      180
ctggcctttt gctcacatgc gcgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca      240
attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta      300
aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat      360
gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg      420
taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtccgcc ccctattgac      480
gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt acgggacttt      540
cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg      600
cagtacacca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc      660
attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt      720
aataaccccg ccccgttgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata      780
agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac      840
ctccatagaa gacaccggga ccgatccagc ctccgcggcc gggaacggtg cattggaacg      900
cggattcccc gtgccaagag tgacgtaagt accgcctata gactctatag gcacacccct      960
ttggctctta tgcatgctat actgtttttg gcttggggcc tatacacccc cgcttcctta     1020
tgctataggt gatggtatag cttagcctat aggtgtgggt tattgaccat tattgaccac     1080
tcccctattg gtgacgatac tttccattac taatccataa catggctcta gacttaaggc     1140
agcggcagaa gaagatgtag gcagctgagt tgttgtattc tgataagagt cagaggtaac     1200
tcccgttgcg gtgctgttaa cggtggaggg cagtgtagtc tgagcagtac tcgttgctgc     1260
cgcgcgcgcc accagacata atagctgaca gactaacaga ctgttccttt ccatgggtct     1320
tttctgcagt caccgtcctt gacacgaagc ttatcgatgt cgacctcgag tctagagggc     1380
ccgtttaaac ccgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt     1440
gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat     1500
aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg     1560
tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggagtcga     1620
aattcagaag aactcgtcaa gaaggcgata gaaggcgatg cgctgcgaat cgggagcggc     1680
gataccgtaa agcacgagga agcggtcagc ccattcgccg ccaagctctt cagcaatatc     1740
acgggtagcc aacgctatgt cctgatagcg gtccgccaca cccagccggc cacagtcgat     1800
gaatccagaa aagcggccat tttccaccat gatattcggc aagcaggcat cgccatgggt     1860
cacgacgaga tcctcgccgt cgggcatgct cgccttgagc ctggcgaaca gttcggctgg     1920
cgcgagcccc tgatgctctt cgtccagatc atcctgatcg acaagaccgg cttccatccg     1980
agtacgtgct cgctcgatgc gatgtttcgc ttggtggtcg aatgggcagg tagccggatc     2040
aagcgtatgc agccgccgca ttgcatcagc catgatggat actttctcgg caggagcaag     2100
gtgagatgac aggagatcct gccccggcac ttcgcccaat agcagccagt cccttcccgc     2160
ttcagtgaca acgtcgagca cagctgcgca aggaacgccc gtcgtggcca gccacgatag     2220
ccgcgctgcc tcgtcttgca gttcattcag ggcaccggac aggtcggtct tgacaaaaag     2280
aaccgggcgc ccctgcgctg acagccggaa cacggcggca tcagagcagc cgattgtctg     2340
ttgtgcccag tcatagccga atagcctctc cacccaagcg gccggagaac ctgcgtgcaa     2400
tccatcttgt tcaatcatgc gaaacgatcc tcatcctgtc tcttgatcag atcttgatcc     2460
cctgcgccat cagatccttg gcggcaagaa agccatccag tttactttgc agggcttccc     2520
aaccttacca gagggcgccc cagctggcaa ttccggttcg cttgctgcgt cagaccccgt     2580
agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca     2640
aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct     2700
ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc ttctagtgta     2760
gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct     2820
aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc     2880
aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca     2940
gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga     3000
aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg     3060
aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt     3120
cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag     3180
cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt     3240
tgctcacatg                                                            3250
<210> 16
<211> 4108
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид
<400> 16
cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta       60
tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg      120
ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg      180
ctggcctttt gctcacatgc gcgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca      240
attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta      300
aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat      360
gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg      420
taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtccgcc ccctattgac      480
gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt acgggacttt      540
cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg      600
cagtacacca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc      660
attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt      720
aataaccccg ccccgttgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata      780
agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac      840
ctccatagaa gacaccggga ccgatccagc ctccgcggcc gggaacggtg cattggaacg      900
cggattcccc gtgccaagag tgacgtaagt accgcctata gactctatag gcacacccct      960
ttggctctta tgcatgctat actgtttttg gcttggggcc tatacacccc cgcttcctta     1020
tgctataggt gatggtatag cttagcctat aggtgtgggt tattgaccat tattgaccac     1080
tcccctattg gtgacgatac tttccattac taatccataa catggctcta gacttaaggc     1140
agcggcagaa gaagatgtag gcagctgagt tgttgtattc tgataagagt cagaggtaac     1200
tcccgttgcg gtgctgttaa cggtggaggg cagtgtagtc tgagcagtac tcgttgctgc     1260
cgcgcgcgcc accagacata atagctgaca gactaacaga ctgttccttt ccatgggtct     1320
tttctgcagt caccgtcctt gacacgaagc ttatcgatat gggaaaaatc agcagtcttc     1380
caacccaatt atttaagtgc tgcttttgtg atttcttgaa ggtgaagatg cacaccatgt     1440
cctcctcgca tctcttctac ctggcgctgt gcctgctcac cttcaccagc tctgccacgg     1500
ctggaccgga gacgctctgc ggggctgagc tggtggatgc tcttcagttc gtgtgtggag     1560
acaggggctt ttatttcaac aagcccacag ggtatggctc cagcagtcgg agggcgcctc     1620
agacaggcat cgtggatgag tgctgcttcc ggagctgtga tctaaggagg ctggagatgt     1680
attgcgcacc cctcaagcct gccaagtcag ctcgctctgt ccgtgcccag cgccacaccg     1740
acatgcccaa gacccagaag gtaagcccac ctgggtggga tccagccatc ctcaagtggt     1800
ctctctcttg tgcatgtggg tgggccaagc agaaatcctg ccccatagtc tcctggctta     1860
caagtcagaa aagctccttt gcaccaaagg gatggattac atccccatct ctttgctaaa     1920
caaacatggg ctttggtgtc agacaaaagt gaagtcctgg ctttctcaca caccagctta     1980
gagagaaaag acttttaggt gaatgtggca ggaaagcgtg cttgctgggg caaaggcaga     2040
ttcattcttt ctcttcccag tatcagcccc catctaccaa caagaacacg aagtctcaga     2100
gaaggaaagg aagtacattt gaagaacgca agtagctttt tctcctttat ttataggaag     2160
tacatttgaa gaacgcaagt agagggagtg caggaaacaa gaactacagg atgtaggtcg     2220
acctcgagtc tagagggccc gtttaaaccc gctgatcagc ctcgactgtg ccttctagtt     2280
gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc     2340
ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt     2400
ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca     2460
ggcatgctgg ggagtcgaaa ttcagaagaa ctcgtcaaga aggcgataga aggcgatgcg     2520
ctgcgaatcg ggagcggcga taccgtaaag cacgaggaag cggtcagccc attcgccgcc     2580
aagctcttca gcaatatcac gggtagccaa cgctatgtcc tgatagcggt ccgccacacc     2640
cagccggcca cagtcgatga atccagaaaa gcggccattt tccaccatga tattcggcaa     2700
gcaggcatcg ccatgggtca cgacgagatc ctcgccgtcg ggcatgctcg ccttgagcct     2760
ggcgaacagt tcggctggcg cgagcccctg atgctcttcg tccagatcat cctgatcgac     2820
aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga tgtttcgctt ggtggtcgaa     2880
tgggcaggta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt gcatcagcca tgatggatac     2940
tttctcggca ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc cccggcactt cgcccaatag     3000
cagccagtcc cttcccgctt cagtgacaac gtcgagcaca gctgcgcaag gaacgcccgt     3060
cgtggccagc cacgatagcc gcgctgcctc gtcttgcagt tcattcaggg caccggacag     3120
gtcggtcttg acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac agccggaaca cggcggcatc     3180
agagcagccg attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat agcctctcca cccaagcggc     3240
cggagaacct gcgtgcaatc catcttgttc aatcatgcga aacgatcctc atcctgtctc     3300
ttgatcagat cttgatcccc tgcgccatca gatccttggc ggcaagaaag ccatccagtt     3360
tactttgcag ggcttcccaa ccttaccaga gggcgcccca gctggcaatt ccggttcgct     3420
tgctgcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg     3480
cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga     3540
tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa     3600
tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc     3660
tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg     3720
tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac     3780
ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct     3840
acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc     3900
ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg     3960
gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg     4020
ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct     4080
ggccttttgc tggccttttg ctcacatg                                        4108
<210> 17
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер
<400> 17
agctggcaat tccggttcgc ttgctgcgtc agaccccgta                             40
<210> 18
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Sсинтетический праймер
<400> 18
tacggggtct gacgcagcaa gcgaaccgga attgccagct                             40
<210> 19
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер
<400> 19
ctaatccata acatggctct agacttaagg cagcggcaga                             40
<210> 20
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер
<400> 20
tctgccgctg ccttaagtct agagccatgt tatggattag                             40
<210> 21
<211> 933
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид
<400> 21
atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg       60
aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc      120
accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat      180
gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc      240
tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt      300
gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct      360
gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga aggtaagccc acctgggtgg      420
gatccagcca tcctcaagtg gtctctctct tgtgcatgtg ggtgggccaa gcagaaatcc      480
tgccccatag tctcctggct tacaagtcag aaaagctcct ttgcaccaaa gggatggatt      540
acatccccat ctctttggtc actctgcatt gcaaatttcc cctcccaccg ctatggacga      600
tgtgatgatt ggaagatgtt acaaaacagt ggctaaacaa acatgggctt tggtgtcaga      660
caaaagtgaa gtcctggctt tctcacacac cagcttagag agaaaagact tttaggtgaa      720
tgtggcagga aagcgtgctt gctggggcaa aggcagattc attctttctc ttcccagtat      780
cagcccccat ctaccaacaa gaacacgaag tctcagagaa ggaaaggaag tacatttgaa      840
gaacgcaagt agctttttct cctttattta taggaagtac atttgaagaa cgcaagtaga      900
gggagtgcag gaaacaagaa ctacaggatg tag                                   933
<210> 22
<211> 858
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид
<400> 22
atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg       60
aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc      120
accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat      180
gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc      240
tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt      300
gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct      360
gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga aggtaagccc acctgggtgg      420
gatccagcca tcctcaagtg gtctctctct tgtgcatgtg ggtgggccaa gcagaaatcc      480
tgccccatag tctcctggct tacaagtcag aaaagctcct ttgcaccaaa gggatggatt      540
acatccccat ctctttgcta aacaaacatg ggctttggtg tcagacaaaa gtgaagtcct      600
ggctttctca cacaccagct tagagagaaa agacttttag gtgaatgtgg caggaaagcg      660
tgcttgctgg ggcaaaggca gattcattct ttctcttccc agtatcagcc cccatctacc      720
aacaagaaca cgaagtctca gagaaggaaa ggaagtacat ttgaagaacg caagtagctt      780
tttctccttt atttatagga agtacatttg aagaacgcaa gtagagggag tgcaggaaac      840
aagaactaca ggatgtag                                                    858
<210> 23
<211> 153
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 23
Met Gly Lys Ile Ser Ser Leu Pro Thr Gln Leu Phe Lys Cys Cys Phe
1               5                   10                  15
Cys Asp Phe Leu Lys Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu
20                  25                  30
Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala
35                  40                  45
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe
50                  55                  60
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
65                  70                  75                  80
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys
85                  90                  95
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu
100                 105                 110
Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp
115                 120                 125
Met Pro Lys Thr Gln Lys Glu Val His Leu Lys Asn Ala Ser Arg Gly
130                 135                 140
Ser Ala Gly Asn Lys Asn Tyr Arg Met
145                 150
<210> 24
<211> 462
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 24
atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg       60
aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc      120
accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat      180
gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc      240
tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt      300
gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct      360
gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga aggaagtaca tttgaagaac      420
gcaagtagag ggagtgcagg aaacaagaac tacaggatgt ag                         462
<210> 25
<211> 158
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 25
Met Gly Lys Ile Ser Ser Leu Pro Thr Gln Leu Phe Lys Cys Cys Phe
1               5                   10                  15
Cys Asp Phe Leu Lys Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu
20                  25                  30
Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala
35                  40                  45
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe
50                  55                  60
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
65                  70                  75                  80
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys
85                  90                  95
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu
100                 105                 110
Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp
115                 120                 125
Met Pro Lys Thr Gln Lys Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr
130                 135                 140
Lys Ser Gln Arg Arg Lys Gly Ser Thr Phe Glu Glu Arg Lys
145                 150                 155
<210> 26
<211> 477
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 26
atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg       60
aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc      120
accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat      180
gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc      240
tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt      300
gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct      360
gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga agtatcagcc cccatctacc      420
aacaagaaca cgaagtctca gagaaggaaa ggaagtacat ttgaagaacg caagtag         477
<210> 27
<211> 137
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 27
Met Ile Thr Pro Thr Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu
1               5                   10                  15
Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala
20                  25                  30
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe
35                  40                  45
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
50                  55                  60
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys
65                  70                  75                  80
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu
85                  90                  95
Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp
100                 105                 110
Met Pro Lys Thr Gln Lys Glu Val His Leu Lys Asn Ala Ser Arg Gly
115                 120                 125
Ser Ala Gly Asn Lys Asn Tyr Arg Met
130                 135
<210> 28
<211> 414
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 28
atgattacac ctacagtgaa gatgcacacc atgtcctcct cgcatctctt ctacctggcg       60
ctgtgcctgc tcaccttcac cagctctgcc acggctggac cggagacgct ctgcggggct      120
gagctggtgg atgctcttca gttcgtgtgt ggagacaggg gcttttattt caacaagccc      180
acagggtatg gctccagcag tcggagggcg cctcagacag gcatcgtgga tgagtgctgc      240
ttccggagct gtgatctaag gaggctggag atgtattgcg cacccctcaa gcctgccaag      300
tcagctcgct ctgtccgtgc ccagcgccac accgacatgc ccaagaccca gaaggaagta      360
catttgaaga acgcaagtag agggagtgca ggaaacaaga actacaggat gtag            414
<210> 29
<211> 195
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 29
Met Gly Lys Ile Ser Ser Leu Pro Thr Gln Leu Phe Lys Cys Cys Phe
1               5                   10                  15
Cys Asp Phe Leu Lys Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu
20                  25                  30
Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala
35                  40                  45
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe
50                  55                  60
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
65                  70                  75                  80
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys
85                  90                  95
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu
100                 105                 110
Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp
115                 120                 125
Met Pro Lys Thr Gln Lys Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr
130                 135                 140
Lys Ser Gln Arg Arg Lys Gly Trp Pro Lys Thr His Pro Gly Gly Glu
145                 150                 155                 160
Gln Lys Glu Gly Thr Glu Ala Ser Leu Gln Ile Arg Gly Lys Lys Lys
165                 170                 175
Glu Gln Arg Arg Glu Ile Gly Ser Arg Asn Ala Glu Cys Arg Gly Lys
180                 185                 190
Lys Gly Lys
195
<210> 30
<211> 588
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 30
atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg       60
aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc      120
accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat      180
gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc      240
tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt      300
gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct      360
gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga agtatcagcc cccatctacc      420
aacaagaaca cgaagtctca gagaaggaaa ggttggccaa agacacatcc aggaggggaa      480
cagaaggagg ggacagaagc aagtctgcag atcagaggaa agaagaaaga gcagaggagg      540
gagattggaa gtagaaatgc tgaatgcaga ggcaaaaaag gaaaatga                   588
<210> 31
<211> 402
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 31
atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg       60
aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc      120
accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat      180
gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc      240
tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt      300
gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct      360
gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga ag                         402
<210> 32
<211> 1505
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 32
gtaagcccac ctgggtggga tccagccatc ctcaagtggt ctctctcttg tgcatgtggg       60
tgggccaagc agaaatcctg ccccatagtc tcctggctta caagtcagaa aagctccttt      120
gcaccaaagg gatggattac atccccatct ctttggtcac tctgcattgc aaatttcccc      180
tcccaccgct atggacgatg tgatgattgg aagatgttac aaaacagtgg ctaaacaaac      240
atgggctttg gtgtcagaca aaagtgaagt cctggctttc tcacacacca gcttagagcc      300
cttggcaaat aatgtgatgt acccaagcct cagtttcatc agtaacattg ggataataat      360
aatatctacc acatcagttt gttgtcaaaa ttaagtagct catgcatata ctttgagatg      420
cttttcacat gcctgcataa agtaattgtt ggaccatcgt taatgtctgc cataattgca      480
cttaataaca aagcttgtaa cctttcaagt tctgagattc tacaatcttc caaagaaaat      540
aaaaggctaa tgggaactat tcaaaattca tattcagtag caagcataat taaacatgaa      600
acattaaaaa tagaaatttc tgtttggcta taagaatgcc tagacatttg taatgatcaa      660
aatctgcagg catcattttc taagagctag actgtaaaca aacctcagag gtaccaacta      720
tgccatcagt agtacataaa acatctgatg cacatttagt cacttgatcg atttctcttg      780
aatgagtgaa cgaatgaaca aatgaatata agagattaaa attttagcca ttaagtagaa      840
agaataagaa ctaaagagaa ggtaaaggag gaaaaagaga aggcaaggaa gttgagtaag      900
ggaagaaata gctctcgttt aagtattttg gggactctgt tgaaaaaaga aatgccaaca      960
tgtggtttta atctttggag ctagaactaa taatattgtg caaaagcaca agatgagaga     1020
tcaagaagtt caccatgaca ccttcgctgc ttcctggtct taaacctcag ctgaggctgg     1080
aagaggacca tggtggctta ttggagatgt gaccccaggg agcccctctg aaggatggaa     1140
ggggactggg caagacccaa cacacacaga acacagtagc cactggccag gcaggaagca     1200
aggatctcag aaaagacttt taggtgaatg tggcaggaaa gcgtgcttgc tggggcaaag     1260
gcagattcat tctttctctt cccaggtgac ccagcgcctc ttggtttcta actggggagg     1320
gggtaggtgt caagagatga gtcccaaagt tctggaatgg tgggtcttgt gactgaggtc     1380
tagacccctc tccagcatga gtgctgtctc ctgcatcata tggagcctgg gcattctgag     1440
ctcattcaaa gggacaccat gggaaccact tgttctcaat gcaattattt ttgtgatgtt     1500
tacag                                                                 1505
<210> 33
<211> 75
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 33
tatcagcccc catctaccaa caagaacacg aagtctcaga gaaggaaagg aagtacattt       60
gaagaacgca agtag                                                        75
<210> 34
<211> 15250
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 34
aggacaggag gattaaacag acagaggcaa ggatgatgag agaggagcag acagcaagaa       60
tgaaaagcag aaaatacaat agaggaaatg aagaaaagta ggcctgctgg agctagatga      120
tgatgtgatg gaaatagaag taacctttta gagaatctcg ctaagaaaca tggagaaaac      180
ggaaaagaaa aatgtaatgc cctagaaagc gcaaagaaag acagtggcaa aaatgaaaaa      240
aaaaaataaa aattataaaa gaggcaaaaa aagacacact attctctgcc tctaaaacac      300
aattaaataa aagaatttaa ataaaaatta aggcttctat atgcattttt aaattttgta      360
tgaatctgtt atggaagaat tgcctatgtc aatatatgtt cagagttaaa tattagcccc      420
aaatgctcag caagactgaa ttgtgtcata gaagttccca gattcccttt tcccgcaatg      480
tcattggagg ctgcatttct tagtcaagtc cagggtttag gccaaagggc atccggtatt      540
gcctaaaacc ctgtgaggtc tgtgaggtaa cttttgagaa gaggtcactg cactcttcat      600
cttttttgca ctttggaatc agatataaaa gatgtataag tttgctaggg ctgccataac      660
aaagtatcat aggctaggta gtttaaacca cagaaattga ttttttcata gttctgggag      720
ttgaaagtcc aaaatcaaag tatcagccct tgcaagggcc ttagagaagg ctctgtcatg      780
ggctcctccc ctcggcttgt aggtggcctc cttcttctcc ccctgtgtct tcacttcatc      840
ttccctccat acatatctct gtgtctaaac atcctctgtg tgaaacaaca ccagccaggt      900
tggatttggg cccaccccac tgacctcatt ttaacttaat tatctctgta aagactctgt      960
ctccaaatac agtcatattt tgacgtactg ggagttaggg cttcaacaca tgaatttgga     1020
cacaattcag ccagtgacag aagacttctg atctctgatg ataaccactg cattttgatt     1080
acagctccta gaaaacactc ccctccacca ccccaccaca gatctatttt tatatctgaa     1140
accctgagtt tctgctccat gagaacccca ggaacatact atgttagatc tggaagaagc     1200
ctcagaaatc cccttatttt gaagactagg acactgagat ccagaagtgg gtaaagatgt     1260
gcttgggttc taagctgctc ttcttttggc caggagacaa cagcacataa tcaaagtggg     1320
tcaactaaga aagaattcca gaaggaaaag agagggcaga aatgaaggga gagaatgaga     1380
gcaaaagtgc tggatttccc tgagggtgaa gaaaagttaa atagaatcac agaattcaga     1440
ttttagagat cttctccttc agatcccttg gtttaatcag taggattggg gtcttcatag     1500
ataataaagc aaaaactctc gccatcctcc aagttgtgaa ttagaagagc tgagaaaggg     1560
tacaagacgg aagttctcta ccaaacaaat ggtgacattt tggggtaaga atatgactaa     1620
cccagaagtg aagcatttca tccaagtagt ctattttgaa gatgtcatgg tataaaggaa     1680
cctcctttct gcctggtcct ccatgcctct gccatgcttt ttactccagg atcacccttt     1740
ctagtggttc actgaaaacc caggattact taaatatgat ggacatgttc acggctcaat     1800
ccaggaggaa aaggtcgaac tgaaagcatg ccaaagcccc acatgggagc caagccactg     1860
ctgctgtggt tgcaaagtgg atcctggctt atcagagcag agagaagcca ggctcgtgcc     1920
ttagcccaag tggccagtca ccttattcag gagatactaa gttctccagc taagacatcc     1980
atgctttggg accagctgca gacagaagcc aattcctact acaaccatca ccttagagta     2040
gcatatagac acagatggct cttcaaagga ccacagttcc atggaataac taagaattca     2100
tgtcctgtgg aaaggtttga ataaactata attataccca atcataaatt tcattcaaga     2160
agaactaaag caaaggcaaa gacagagaga agaaggaagg aaggagggag ggagggaggg     2220
aaggaaggaa ggaaggaagg aaggaaggaa ggaaggaagg aaggaaggaa ggaaagggaa     2280
ggaagaacaa aaagactttc tagttaaaga atgcttaact agcaaactat gtactataag     2340
acagttcttt tcggaatgag ttttatcaac tctaaagcaa ttatcttgaa tgcctacatg     2400
tgattactga ataatatgaa ccaagaaaac agaaagaatc tatattatct ttccatttcc     2460
ttctttccag tatcaatacc caagcctcta gtgatacatg gcatataatg ttggatggat     2520
ggatggatgg atggatggat ggatggatgg atggatggat gaatggatgg ttggatggac     2580
aaatgagtaa cataggctga tgaatagtgg tagaaagaca caccataaaa acaagtggca     2640
cttctgagat gaaatgattc ctattctcct acacaagaca gtgaggcaag tacagagtaa     2700
aaaaggaaag gcataggagc tatgcttata caagtattgt atgtttggaa tttccttcgc     2760
tggccaaatt gaaattgttc aaggacctat tgctacaggt ggcaactggc taagaatttc     2820
atagtgaata ttatacacct attactcccc ttaatgtttc tttgaagtaa gcagaatatt     2880
aataatcatt taaaattcca gtgtttcaac ttcaattgtt tcctagggca aattgataat     2940
tgtgtgtaaa actaattgga atatgtatgg aataatcatc ctgaaataaa attggtgaaa     3000
agtatttgtt attgggcatc tacaatgtgc aaacctctgt actaggcatg aacaagagtt     3060
ataagcattg gagaggctaa aatatagtcc ttaaggctgg gcacagtggc tcatgcctgt     3120
aatcctagca ctttgggagg ccaaggcggg cagattgcct gagctcagga gttcaagacc     3180
agcctgggca acatagcgaa accccatctc tactaaaaat acaaaaaaat tacctgggca     3240
tggtggcacg cacctgtaat cccagctact caggaggctg aggcatgaga attccttgaa     3300
cctgggaggc agaggttgca gcgagccgag atcctgccgc tgcatcccag cttgggtgac     3360
agagtgagac tctgtctcaa aaaaaaatta aataataaat aaatagtaaa atacagtcat     3420
taagagtaca aaatgtagat tcagactacc tgggttcaaa tcttggctct tacttgcatt     3480
gtggctttgg gcagatcatg taacttatgt gtgcctcagt ttcctcatct gttaaatagg     3540
ggcaacaact gaatctacct tattcagttg ttgtgagggt ttattgagat tgtgtgtgtg     3600
tatgtgtgtg agtgtagtgt gtgcatgtgt gtgtctgtgc aaggagtggg aggtgtatat     3660
tcagagacac atattacagc acttaaaatg gtatctagca cttagtaagc attattcaag     3720
ttttagttaa cattatttta cttacctctg aaaattggag ctatgtgaaa aagaagttgg     3780
tctcctgaag tagaagccag tcttgtgtca ccaaaaactt caagcccaag cttgccaacg     3840
cttttccatg atgtggtagt agagtttcaa gcatgtggta ggataagaga actcaatgac     3900
ctaagaacca ttccaaccca gagaacccct ggttctatga ataattccaa cttaaatagg     3960
tagcttggct ctcccaagtg agagccattg cttctgtttc cgggtcatat aatgaacttt     4020
cagaaaacca ccatttttct caaccagtta aaattaagtg taatacgtgc tttcatttca     4080
tggtgcctgg ggaaaattta attgtagtat gaactccagt tattggtagt cttaagtaaa     4140
attgccaaaa taaatagaaa tgcaggatat ttctgggctc acacagcttc cgggacactt     4200
tagtttcttg ggctgccaat ccagtgcctt tcacaagcat ttgatctttt ttcaaacatc     4260
tcttgaaaac aaacaaaacc tcacacagct tctaatgtgt gcactgttcg aatgtaaggg     4320
tggaaaagga ggcaaagaaa tgagctccca aagagcaatt ccccttctct cgcctccatc     4380
ccttgacgac ctccctccca ctaaagggaa acattgtttt cttaggtaat aaattctgca     4440
atttctcaag tccattaaca tccactgggc aagatgagat ctattctttt tatttgccca     4500
taggaaaaga atagtgcttt tttgcaatat tcactagata acacagagtt gacttttaat     4560
ccaagggcaa cattgatagt ctctagttaa aggggaagcc ttcaggagca atgaaaagat     4620
taatagtttt agatgaagca gaatccaaat ccctttttat gagttttgaa atatccagtt     4680
tgtatgctca cctcaatact taaagcccag ttactgattc ctttggccta agcaagacag     4740
gtcaattttt aaagagggag tagctgaggt tagcaaaaat tctccaggtc cacaaaactt     4800
ccagacctgc aaggtgaaaa tcagcttttc tgtcatccct aaaggcctaa ctggaatcag     4860
aacttttccc tgatgcccac atatttggag gtcctttttt aatgggactc cttaatgcct     4920
ttagtgccat cccattttca tccagtgtcc aaaagaaatg atttaaaaat ataaacgtat     4980
gtttaaattc cagaagagag aaatggagat tgagaacaat agggaaatga tgagagctat     5040
gggaaaagag gtttatgagt ccatgtctga ttcttccaga gagcccctaa gaaagttctt     5100
atcataccag gaactcaatt ataactttca ttgcctattg ttagatgagt aacaggagct     5160
agaaaacatt ttggaaattc ccatctttat ttttttaact aatatgatta tagttttaag     5220
aaccattggt caagaagcta actttttaaa aagtggaagt atgatggtta gaaataagaa     5280
tgctaaaggt gcatcaagct gattttaatt ctaaatgtcc ttggcagcaa tttagaatct     5340
gtaataaact acaccaaaca gttttgaggg gaaggggatt agtttctccc cttccttcgt     5400
gtgtgtgtgt gcgcgtgtgt gtgtgtgcac ctttgtgttc tagcattgtt gcacccatta     5460
cagagctggg gggaactatt ttccaaaatt ataggtgaga acagtttctt ggattgtctt     5520
tcagtgaagg taaattcctc tgtaaaaact aaccatcatt cagtaaaaac tgcaggattc     5580
ctttgtcttc tcaaaagcct gtttctcatc ctaaattaaa aattattcag gaaatagaga     5640
ggacattatt ggaggggtgg aaataagttg gttttctttt tattgtatct tttgaggatc     5700
cagggacttc taccatttcc catctaacat acagagaagg attctctagg tccctgtcta     5760
tagactgcag taactttcct atagaaccaa tttgcaattt tagaaatttc taggtctaat     5820
tattgaccca ttacaaccaa aggtcaatgc atccagccaa tcttccttct atcatcccct     5880
gcccttactt ctattaggga ctgggattac aggcaaaacc catcaaatgc ctcttctacc     5940
actttcccat ttcttaacca ttagcctcta acttcctcta ttcagtttct catatgcttt     6000
catgcccatt gggtcagata aaggaacatt catttatttg agtaggcatc tgttatgatc     6060
actccggaaa aaagatgaca atgggttacc ttgtcctcct gggcttctct aactgacatg     6120
gtcaaaatgc ccatatgaag ataagatgtt aagagcaaga tttatgaaaa gctgagtatg     6180
atggcagctc ttgtctcata aaataactcg aaagttccca gtgaaagacc aagaaatttt     6240
acatcaaacc caaaccggcc aaatggtcca agcttccaag ctgggatcca tggctaaagt     6300
ttctacaaaa ttctgggtac aatgtataaa cattcacttg gggctttctg tctagccagc     6360
accaagaggt caagtaatca aggaccaact agccctgcca tctgtgaaaa tatgtgctat     6420
tttcacggct ttagttcaca attatggcaa gacaaaagtt ccaaataatt aggagcaaga     6480
ccatggcagg ttgacggttg agtaaggttc tcaatcagcc gacaattgta gagttgggga     6540
tgtgcaatgt ttatgtcatg gtgtaagtat gtggcatgct tgactagctt gtgaggcact     6600
ggaagactag aaggaatgaa aaatatgaat gaatcaataa atgcatagta taattactgt     6660
tattttgtca gtattgtttt acctaggtca ctattgaatg ctctgatttg tctctttata     6720
aataataata tgttttcttc ttcaaaagaa cactaggatg aaggtagagg tgcttttggc     6780
acaatgccac aattctgatt tttttaaaac tgtatgcatg cataaaatgt tcttgagcca     6840
ttctctgcct tggaatagca ctggctggca ttctgcatgt ttacttttat atgctgaagg     6900
cccccatcaa cctcaaacag aggcaaatca atttaacttc tcatagtgtt attttgttca     6960
tcctaaaagt tcaagagagc cttccaaact tccaaaattt ctctcaattc agtgaggagg     7020
aaaattcaga acacagcatt tgaatgttct gcccagattt gtcacacaca caaggaatga     7080
gtgaaagagg gcaacaccct ttcctcctaa ccctgtgaac tcatcactat tgcattgaaa     7140
tgacaccaaa aggtaaaaac cctaggcctc acatctccca agaacactgc aataggagtt     7200
actgcataca ccagtttaag taactctagc ataaattgta tgtcagatga aacaatggca     7260
ttttggaggc ttaagagaaa aagaataatc aaatccagtt tttaggtact aatgtgctga     7320
atctttagca catagcagca aaattgctag aatctggtgt ttcacttttt aaaataccac     7380
atttgaacct ttcagcaatt ccaaaatcaa ctccctctgc gaaagataat aagcttaaac     7440
attttttaaa tttaaaaatg taacacaaac aaacagctaa gcaaacaagc tgcccataaa     7500
atcaacagtc tggggagccc tgatcctgaa gtattttaca acatccttca tgactattaa     7560
aggcaacata aacacctctt gtcagcaagg gaaactaccc ttggcatttt tttttctttg     7620
ttccccaggc ttttaaacca ttttgataga gattttttac atcacaggca gaaatatttg     7680
aaatagagtc aggtggtagt ctttaaaaga gtaagaaagt tgctaagtca agataatctt     7740
ggaataaagt cctctgattc ctggggattc ctagggatgc cccagtcact agaaaacaga     7800
gctgtaagtc cactctccca gcactcaacg gagctccgga aaccaaggag ctagctactg     7860
tttccccaca ttcagccaga gaaagggcag cactctagca tgcaaactgc tttgacaata     7920
gtaacaatta aaaagtaaat taaaaagaat cataatagct gatattgatt aggtacttgc     7980
cctgtggcaa gagctatagg gaatcacctc atttaatctt cacatgaagc ttgcagagtg     8040
agtaccacaa ttatcactat tgtatagaca ggaaaactca ggctgagtat ggctaagtgt     8100
cttgccaacg tcttgggcta acaagcggtc aagcagaatc caaacccgag atagatagac     8160
cacagtgtgc taatcaagca ctgcactctc tcctgcattt cttagttgat atttaccata     8220
tacaatctgt cacttgtatg agatggcagg gggttctgtg ctatttgtcc ttgtagagaa     8280
taccacagga agaaagtaag cagccatgca atatttgctg ttgacctgaa ctccattcca     8340
tcattcctgc aggaaattcg catccattaa atgagcattt cctggtttgc cactttgctc     8400
aaacactttg cttggatctg gagaggatat agaagtgaag gaaatatgct acctgctctc     8460
aaggaactta tgttttagtg gagagacaaa catgcagaat ttactctaca gaacatcaat     8520
gcttgagcaa atgtagaccc agagagggct cttacagcac acaagccaga acagactgat     8580
ggtgctaaca attaggttca aggtttttct aaacagtaga ctctcctgca tacaactata     8640
ccgcatgcca ggtaaatgac tgagggttat tacatccaat tataacacca ctgtgatgta     8700
ggtgctctta ccccacactt tcattttaca gaagaggaaa ttgaggacag cacaatgtag     8760
tgattatcaa aggtcacacg actactgtgt gggagagcta ggatttaaac cagatgcata     8820
agatgaggtc ctccaagaaa cagaagatga gaaggtgtta aatgagcagg ggttttatta     8880
gggggaatta atgtgtgaac agaaataggg gaggataggc aaagccatca gattgcaagg     8940
caagcctaac cccaagggaa ggagagagag agagtagatt ggttggaaac atttttggtg     9000
ggtctatggt ctaaggaaag ttcagcaaag tcatcatgga gtttttgagc caaagttggg     9060
caatacagtt gcccaacaaa tttctgtgtt tctcagaaat aggtctgcct caatgtcccc     9120
accatacttg gtcactggct cttgggaggg gcctgccctg ttccaatcca ctagagccaa     9180
agaagagccg ttgtactggc agggggtggg ggaattccta caaccacata aaaagtgggg     9240
tgaggtttcc agaaaaaaac gtgatgctgg gctaaccaaa actgtgtcca gtaagtacat     9300
atccctcact ctgttaaaga agcagccaca taaacaagga gtacacgttt ctcaaaatgt     9360
gcaccttgtt ctttggtttt gaagtcacat cccaaagtgc tgagtagatc gcatgaccct     9420
cgctttgcct ggctgccaga gaggaaaggc tgatccaact ctcctggaat ttgaacttgt     9480
gattccctga agtaaagaga tatcaaagtt gatactgaga catctaaatc atcctccacc     9540
atttcacatg tccccaggcc aagccagcaa aattgctata gcacatccct ttcaacaggt     9600
aaagggctga tatctgagcc ctctttccaa tcatccactg ctcttttctt ctcattttgc     9660
cctttttggg agcaggtcaa tgctgagtta gtactttatg ctgtacaata agctgctgat     9720
attccatgct ggacagaatt ttcccagtat tttttataga gtgccaggct tttcctagac     9780
ttcatgtcat acaatactta acttgtttgg agtgggtgga gatggaaaca tagtctattg     9840
aaaacatcac tgcttcctcc ctgaagttta aagagcctat ttttatcctt ttagattcta     9900
tctctcaggc aaaatctcat aaagataagt ggggaggaaa aaaagggggt tataatacct     9960
agggagtttg cttttgctaa ttgaatactg tgctcctaga cttctataaa taccattaca    10020
aatgggtccc agcttgtggt aatactcacc ctcctcattg agtcttctgt cccatggcac    10080
agcctttccc tccaaactag catctacccc catctggaag catgggcagc tcatgatatt    10140
atcaactatt gctattggaa agtgatttgg acttgaaagc actagatatt ttttacctct    10200
tggggaggca gtttagcaga gtggttaact ggtgagctcc agaatcagaa ggaataggtc    10260
caaattccaa ccactattac atctccatca taagaaatta ggcaagttgt ttatcctaag    10320
tttcagattc cttaaagata aaacagtcaa gacagtagta cttatccctg agagaagtat    10380
aggaaacaag aaaatatatg caatttacat acatactaca atccccagca catgacaaat    10440
gttcaagtaa tgggaactgt tattatttta gccctttgtc tatcagtttg ttcctctgtg    10500
acctcaagca cattactaaa tgttagcgag cttcagcttg tacgtgggac tgacaggaat    10560
aacaccgcat cacctcatgt ggtgattgta aggattcagt gatattattt tgtaaactgt    10620
aaagcctttg caaatgttaa gcaagattat tattattgcc gttgttatta gtcctcagtg    10680
atcttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttggagacag agttttactc    10740
tgtcgccaag gctggaatgc agtggcacaa tctcagctca ctgcaacctc cgcctcctgg    10800
gttcaagcaa ttttcctgcc tcagcctcct gagtagctga aactacaggc acacgccacc    10860
acaccaggct aattttttgt atttttagta gagacggggt ttcaccatgt tggccaggct    10920
ggtctccagc tcctgacctc aagtgatctg cccacctcgg cctcccaaag tgctgggatt    10980
acaggtgtga gccaccacac ctggcacagt aatcttaatt gaaaagtctg tggatagctt    11040
tccaaaggaa agcttggagc ttggataaga accaagagat aatgggagaa ggtgaatggc    11100
ctcttcaggg ccttttctag caccctaaat atgcgtgtct gtccataatg ggtaatcata    11160
tatatcacaa atcaaaccct ccacaaactt atttcctaat gtgtttgtta acctttcctt    11220
ctaaagggta aacttcttta accaacccca gtgagctgga ggatcaatgt tttcttaata    11280
gtcttacctt cgttggtgtc aataggaaac agtatttact cactactgtt ttccttttaa    11340
aaatctgtct agttgcatac tagaaacagt ttcagctggt ttgtttgtat tggacaagct    11400
gctgaagtga aaagtttttg cttgactgaa tgtgagacag tttcataact cttcaagaag    11460
tgcaccaaag gtgggtgcca gctctgatga cggctgcttc taacatgcct ccacttgccg    11520
cccattgtca agggtggctg gcgtaattaa gttaagacaa tgagcaaagc aacagatgca    11580
actgagacct agtccctgag tgcttttgtt ttgtcactgt cattgtctgc aacaaagaag    11640
tcacatgtga cagcctggga agagagccaa atgcaaacca gacgatatcc cagctggttt    11700
gaatggcctc caccgtgcac gtgtgtgcat gggaatcatg ctacttggta cagcatctgc    11760
ttcactcaag tgagtttcag cccatggctt tgctgtgatg ctgagacaga cccagaagaa    11820
acagaccagg gaatccctcc gctcagactt tacactttat accttgtgct ttgagagaaa    11880
agaaaaagaa tctctctatt ggagacaaaa aataggatgt atgtggttgg tcaatctaac    11940
ctcaattctt tttgctatag ccccccgcta atttaaagag tgaagcatag atggtatctt    12000
aatgttttct tgtagaaatt tgggattaat ttggcttgag aggaagaatg gagattaaac    12060
gctttatgag gctttctttt aatttgttcc catttcattc ctgaatattt tcttagtttg    12120
ggcattgcag atgtttaaag aacttcttat tttgagctgg tatgcctctt aaacagaaaa    12180
acaaaaggta aaattcaaat tagtgtgttt ctccgcctgt taattaattt ggttagtagt    12240
taggcagaga gatggcatcc ttaataatat ctattttgcg ggtttgatca gctacagacc    12300
atcaacagtg ttgattgaga attgaacaaa aacatttcaa ggagtttggg aacattaggg    12360
atgctattct gtggccccat gtgtccttct ctcatttttc tagagaactc ctataagaaa    12420
gcagaacacg gccaggcatg atggctcatg cctgtaatcc cagcacttca ggaggctgag    12480
gcaggcagat cacctgaggt caggagttca agaccagcct ggccaacatg gtgaaaccct    12540
atctctatta aaaatacaaa aaattagctg ggcatgatgg cgcgtgcctg taatcccagc    12600
tacttgggag gctgaggcag gagaatcact tgaactggga ggcaaaggtt gcagtgagcc    12660
tagatcacac cactgcactc cagcctgggt gacagagtga gactccaact caaaaaaaag    12720
aaagaaagaa agaaagaaag cagaacccaa tggaagatta agaacacaca tttagcttac    12780
gcctgtaata ccagcacttt gggaggccaa ggcgggtgga tcacaaggtc agaagttcga    12840
gaccaacctg gccaatatgg tgaaacccca tctctactaa aaagtacaaa aattagccat    12900
gcatggtggc aggcgtctgt aatcccagct actacagagg ctgaggcagg agaatcactt    12960
gaacccggga ggcagaggtt gcagtgagct gagaacgcgc cactgcactc cagcctgggt    13020
gacagagcga gactccatct caaaaaaaaa aaacaacaaa aaaaaacaaa acacaagttt    13080
actgggaact tagcagtaga tgctttgcac cacaacaaat gtatcttaag tggtcttttg    13140
tgatatttga gggaaagtgc cagaatttaa aacaaatggc atttcaagtt attctataca    13200
aatgcccagt ttctttctac catctttttt tcctttttgc agtggtcact gagctatttt    13260
agtgaatgtt tttacacaat gatgccatct tccttctact cagtcagtac aagatgttga    13320
ccatcgactc ataaaacact agctaccttt catgaaggac ttggtgataa ctctcatgtt    13380
ccaagtagaa ccggaaaaca tgtgtaagaa aacctgccga tccctatggg ccttggccaa    13440
taggtattat tcccaagggg tggcagttta tctttttccc cagccttcat attaaaacct    13500
ctcaccttct ccaggtctca ggtctgtgta atctcaaatg tgctttagct cctcacaata    13560
ttgtaactgt gtgggtgttc attaccttag ccagaagaca gtttacagat tccaggtctc    13620
atggagagaa cttttgtttt tggttatgaa cctcactgta taccaataat tatccattac    13680
atccttctgt agagggctct ctggctagag ataaaaccaa aaaaagaagt acctcaggtt    13740
tatgcatata aatgccagtt cctccttgat tttatttcaa aactcctgtc tacatacttt    13800
gcaatttaaa tacattcaag gataaagtaa taactgtagg aaaagtatta taatataatg    13860
acttagttct gcacatcaca agggggtccc tcatactcat tcattcattt cactcatttt    13920
acagatattt attgagcacc tgcaataacc tgcacactgc tctagacact gggactataa    13980
cagtaaacag acagatacat ctctggtctc acagggcttc tattctaagc aaaactcaat    14040
atccaggccg ggtgcagtgg ctcatgcctg gaatgccagc actttgggag accaaggcca    14100
ggcagatcac ctgagcccac tagttgaaga ccagcctggg caatatagca aaaccccgtc    14160
tctacaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaattgtcaa ggcatggtgg catgcgcctg    14220
tggtcccagc tacttaggag gctgaggcag gaggattgtg taagcctggg aggcagaggt    14280
tgcagtgacc tgagatggca ccaccacact ccagcctggg caacagagtg agaccctgtc    14340
caaaaaaaaa aaaccctcac tatccttaag ataacatcat tgcttgttga tgagtgaatg    14400
ttaacaccaa attaggaacc caggactttt agtcttggca tggttacttt ccaataaaga    14460
tgacaatact aagaagagaa aaatgattta ataatgataa tagtggctaa tacttatgta    14520
gtgcttacca tgtgccaggt ctattgtaag tacttttata tatattaatt atttaatctt    14580
tgatcctata aggtagatat tattgttacc ctagtttata gatgaagaaa cggaaacaca    14640
agagattgcc actcatacaa gtttacacag ccagaaaata gaaaagctac gagttgagct    14700
cagcccagta tgtctatgat tttacagact caaaattaat tataagattt cctaatcttc    14760
gatttctgaa actctgcctt gctctagagg aaaacaagaa aaacaatgaa aaataaatgt    14820
ctctttttta caaaaattaa aacagaacaa actgcaataa aacaacagag gatgaatcca    14880
gaatgtgatt gatttttttt cttactagga aaggatctag aggccagaag gctggatttt    14940
tcaggatctc ctttcaatca atgaatctgt gatagaagca gatgaatcaa atctcatctt    15000
tgtgtgatta taaagctgtc tgtggtattc acgccaccag gggtacatag aagatgcctg    15060
agtgaggttt ggcaaaagta ctaagggcct gtccacctat acatgccctt ctcaggaaaa    15120
ccaaggttca agctctctat tagctcaact ggtaaggcgt aagacatgga aggttgaggc    15180
ccaatgttag aaatagatgg atacataaaa cttcatcaag ttaatgtcac tttttctcct    15240
ttatttatag                                                           15250
<210> 35
<211> 60
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 35
gaagtacatt tgaagaacgc aagtagaggg agtgcaggaa acaagaacta caggatgtag       60
<210> 36
<211> 270
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид
<400> 36
atgaacgcca aggtcgtggt cgtgctggtc ctcgtgctga ccgcgctctg cctcagcgac       60
gggaagcccg tcagcctgag ctacagatgc ccatgccgat tcttcgaaag ccatgttgcc      120
agagccaacg tcaagcatct caaaattctc aacactccaa actgtgccct tcagattgta      180
gcccggctga agaacaacaa cagacaagtg tgcattgacc cgaagctaaa gtggattcag      240
gagtacctgg agaaagcttt aaacaagtaa                                       270
<---