РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pЕ-Trx-Lc-def, ШТАММ Escherichia coli ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ АНТИМИКРОБНОГО ПЕПТИДА ДЕФЕНСИНА ЧЕЧЕВИЦЫ Lens culinaris И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УКАЗАННОГО ПЕПТИДА
RECOMBINANT PLASMID DNA pЕ-Trx-Lc-def, Escherichia coli STRAIN FOR EXPRESSION OF ANTIMICROBIAL PEPTIDE OF LENTIL DEFENSIN Lens culinaris AND METHOD FOR PRODUCING SAID PEPTIDE

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению антимикробного пептида дефенсина чечевицы обыкновенной Lens culinaris, который может найти применение в качестве лекарственного средства в медицинской и ветеринарной практике, а также средства, повышающего устойчивость растений к инфекции в сельском хозяйстве.
Растительные дефенсины представляют собой класс катионных, богатых цистеином пептидов длиной 45-54 аминокислотных остатков, играющих важную роль в защите растений от патогенных микроорганизмов. Растительные дефенсины кодируются генами, образующими мультигенные семейства. Индукция экспрессии этих генов происходит под действием различных биотических и абиотических факторов. Растительные дефенсины, как и дефенсины млекопитающих, являются мультифункциональными пептидами и характеризуются широким спектром биологической активности in vitro. Данные пептиды подавляют рост микроорганизмов и пролиферацию опухолевых клеток, ингибируют активность пищеварительных ферментов насекомых, биосинтез белка и обратную транскриптазу ВИЧ-1, блокируют ионные каналы, задерживают развитие паразитарных растений [Carvalho A. et al. (2009) Peptides. 30:1007-1020].
Растительные дефенсины проявляют антимикробную активность в микромолярных концентрациях в отношении большого числа фитопатогенных грибов и бактерий, а также обладают инсектицидной активностью и могут найти применение в сельском хозяйстве для создания устойчивых к заболеваниям трансгенных растений. Традиционные методы борьбы с патогенными микроорганизмами, вирусами и насекомыми-вредителями, основанные на применении пестицидов и инсектицидов, имеют такие негативные последствия, как загрязнение окружающей среды, гибель непатогенной микрофлоры, насекомых и птиц, а также появление устойчивых форм патогенов и вредителей.
Растительные дефенсины также ингибируют рост некоторых патогенных для человека грибов, характеризуются высокой специфичностью действия и отсутствием токсических эффектов на клетки млекопитающих. В последнее время отмечается рост заболеваемости микозами, причиной которых наиболее часто являются патогенные дрожжеподобные грибы рода Candida и филаментные грибы-оппортунисты, такие как Aspergillus, в отношении которых дефенсины растений способны проявлять свою активность [Aerts A.M. et al. (2008) Cell. Mol. Life Sci. 65:2069-2079]. Увеличение частоты встречаемости грибковых инфекций обусловлено изменением нормального состава микрофлоры человека, которое происходит под влиянием различных сенсибилизирующих факторов и необоснованного применения антисептических средств и антибиотиков. Появление возбудителей микозов, устойчивых к известным антимикотикам, увеличение количества пациентов с иммунодефицитом и частоты использования катетеров и имплантатов также приводят к изменению показателя заболеваемости грибковыми инфекциями и утяжелению их клинического течения. Ввиду отсутствия противогрибковых вакцин для лечения микозов используются антимикробные препараты, зачастую обладающие целым рядом недостатков. Используемые антимикотики, как правило, требуют внутривенного введения, взаимодействуют с другими лекарственными средствами, характеризуются узким спектром антимикробного действия, выраженными побочными эффектами и высокой токсичностью [Thevissen K. et al. (2007) Drug Discov. Today. 12:966-971].
Из проращенных семян чечевицы обыкновенной Lens culinaris выделен дефенсин (Lc-def) (SEQ ID No. 1), состоящий из 47 аминокислотных остатков и содержащий восемь остатков цистеина, образующих четыре дисульфидные связи. Данный пептид обладает противогрибковой активностью и ингибирует рост фитопатогенных грибов. Белок-предшественник Lc-def содержит характерный для растительных дефенсинов сигнальный пептид из 27 аминокислотных остатков [Finkina E.I. et al. (2008) Biochem. Biophys. Res. Commun. 371(4):860-5].
Известен наиболее близкий к заявленному способ получения дефенсина чечевицы Lc-def, заключающийся в гомогенизации проращенных семян чечевицы, экстракции, высаливании белков и нескольких последовательных стадиях очистки, включающих гель-фильтрацию, ионообменную и обращенно-фазовую хроматографии [Finkina E.I. et al. (2008) Biochem. Biophys. Res. Commun. 371(4):860-5]. Недостатками данного способа является сложная схема очистки и низкий выход продукта, составляющий 1 мг пептида на 1 кг семян.
Изобретение решает задачу расширения ассортимента биологически активных пептидов и получения антимикробного пептида дефенсина чечевицы обыкновенной Lens culinaris.
Поставленная задача решается за счет:
1) рекомбинантной плазмидной ДНК рЕ-Trx-Lc-def, состоящей из двух фрагментов:
- BglII/XhoI-фрагмента с нуклеотидной последовательностью SEQ ID No. 2, который содержит промотор транскрипции Т7 РНК-полимеразы, lac-оператор, участок связывания рибосомы и участок, кодирующий аффинную последовательность, белок-носитель тиоредоксин и дефенсин чечевицы;
- BglII/XhoI-фрагмента плазмиды pET31b(+), который содержит терминатор транскрипции Т7 РНК-полимеразы, сайт инициации репликации, ген β-лактамазы и ген lac-репрессора (lacI);
2) штамма-продуцента гибридного белка Trx-Lc-def путем трансформации штамма Escherichia coli BL21(DE3) указанной плазмидой pE-Trx-Lc-def;
3) способа получения дефенсина чечевицы, включающего культивирование штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/pE-Trx-Lc-def, разрушение клеток, аффинную очистку гибридного белка Trx-Lc-def на металлохелатном носителе, расщепление гибридного белка Trx-Lc-def бромцианом по остатку метионина, введенному между последовательностями дефенсина и тиоредоксина, и очистку целевого пептида методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
С целью предотвращения преждевременной гибели микроорганизма-продуцента во время экспрессии в его клетках антимикробных пептидов и связанной с этим потери продуктивности необходимо нейтрализовать на данной стадии токсичность синтезируемого продукта. Заявленная плазмидная ДНК pE-Trx-Lc-def обеспечивает высокий уровень экспрессии дефенсина в Е.coli за счет включения его аминокислотной последовательности в состав гибридного белка Trx-Lc-def (SEQ ID No. 3), несущего последовательность тиоредоксина А. Тиоредоксин способен накапливаться в высокой концентрации (до 40%) в цитоплазме Е.coli в растворимой форме и применяется для сверхэкспрессии биологически активных полипептидов [LaVallie E.R. et al. (1993) Nature BioTechnology. 11:187-193]. Необходимость использования белка-носителя обусловлена не только токсичностью зрелого дефенсина для бактериальной клетки, но и возможностью его деградации в гетерологичной системе. Для высвобождения целевого пептида из молекулы гибридного белка Trx-Lc-def между последовательностями дефенсина и тиоредоксина вводят остаток метионина, позволяющий проводить избирательное расщепление гибридного полипептида бромцианом.
При расщеплении гибридного белка Trx-Lc-def бромцианом целесообразным является использование в качестве партнера для гетерологичной экспрессии модифицированного тиоредоксина А Е.coli, содержащего замену внутреннего остатка метионина на остаток другой аминокислоты, например на лейцин (M37L). Известно, что подобное незначительное изменение первичной структуры не оказывает влияния на пространственную структуру и свойства тиоредоксина [Rudresh et al. (2002) Protein Eng. 15(8):627-33]. Отсутствие внутренних остатков метионина в последовательности белка-носителя уменьшает число индивидуальных полипептидных фрагментов, образующихся в результате реакции с бромцианом. Расщепление гибридного белка дает всего один побочный продукт, значительно отличающийся по физико-химическим свойствам от целевого пептида, что облегчает процесс очистки последнего.
Очистку целевого пептида упрощают за счет включения в состав гибридного белка Trx-Lc-def аффинной метки, позволяющей проводить очистку гибридного полипептида методом аффинной хроматографии на сорбентах с иммобилизованными (хелатированными) ионами металлов, т.е. металлохелатную очистку. В качестве такой метки обычно используют последовательность из 4-10 остатков гистидина, чаще всего - последовательность из шести остатков гистидина, которая вводится в N-концевую или С-концевую область гибридного белка либо в область, разделяющую белок-носитель и целевой белок [Terpe K. (2003) Appl Microbiol Biotechnol. 60(5):523-33]. В качестве аффинной метки для металлохелатной очистки также используют фрагменты HAT и 6xHN [US Pat. No. 7176298].
В состав заявленной плазмидной ДНК pE-Trx-Lc-def включают регуляторные элементы, контролирующие экспрессию гибридного белка: промотор и терминатор для РНК-полимеразы бактериофага Т7, lac-оператор, консенсусный сайт связывания бактериальной рибосомы, стартовый и стоп-кодоны. Для подавления базальной экспрессии гена гибридного белка в состав плазмиды pE-Trx-Lc-def включают ген lac-репрессора (lacI). В состав заявленной плазмидной ДНК входят сайт инициации репликации (Ori) плазмиды pBR322 и маркерный ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pE-Trx-Lc-def клеток Escherichia coli к ампициллину и позволяющий проводить отбор клеток, содержащих плазмидную ДНК, путем выращивания на соответствующей селективной питательной среде.
Конструирование плазмидной ДНК pE-Trx-Lc-def, экспрессирующей гибридный белок Trx-Lc-def, содержащий последовательность дефенсина, может быть осуществлено путем лигирования BglII/XhoI-фрагмента плазмиды pET-31b(+) (Novagen), содержащего область инициации репликации, Т7 терминатор, гены β-лактамазы и lacI, со вставкой, кодирующей ген гибридного белка. Искусственный ген, который кодирует гибридный белок, может быть получен химическим синтезом набора олигонуклеотидных фрагментов с последующей сборкой и амплификацией промежуточных и конечного продуктов при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР). Выбор структуры олигонуклеотидных праймеров для синтеза каждого из структурных элементов (промотора, оператора, сайта связывания рибосомы, тиоредоксина, аффинной последовательности, дефенсина) основывают на данных по их нуклеотидным последовательностям, доступных из открытых источников (банки данных GenBank, EMBL-Bank, DDBJ). Матрицей для амплификации последовательности тиоредоксина служит бактериальный геном либо плазмида рЕТ-32а(+) (Novagen). Замену метионинового кодона в составе тиоредоксина (M37L) при необходимости осуществляют на стадии сборки методом направленного мутагенеза при помощи ПЦР. Перед лигированием для получения липких концов очищенный ампликон и плазмидный вектор обрабатывают рестриктазами. Продуктами лигазной реакции трансформируют компетентные клетки Е.coli штамма с выключенной системой рекомбинации и рестрикции ДНК, например DH5α, DH10B или XL1-Blue. Отбор клонов, содержащих плазмиду со вставкой, проводят при помощи ПЦР и рестрикционного анализа выделенной плазмидной ДНК. Правильность сборки конструкции определяют секвенированием плазмидной ДНК.
Штамм-продуцент гибридного белка Trx-Lc-def, содержащего последовательность целевого пептида дефенсина, получают путем трансформации препаратом плазмидной ДНК pE-Trx-Lc-def компетентных клеток Е.coli и отбора клонов, обладающих способностью экспрессировать рекомбинантный белок. Наличие и уровень экспрессии рекомбинантного белка с молекулярной массой 19,1 кДа контролируют с помощью ПААГ-электрофореза в денатурирующих условиях. В качестве родительского штамма для создания штамма-продуцента используют Е.coli BL21(DE3). Преимущество использования данного штамма в качестве основы для создания штамма-продуцента заключается в том, что BL21(DE3) обладает фенотипом Lon OmpT, что исключает возможность протеолитического расщепления синтезируемого гибридного белка Trx-Lc-def и загрязнения препарата наиболее активными протеазами Е.coli. В хромосомную ДНК BL21(DE3) интегрирован ген Т7-РНК полимеразы, который совместно с Т7 промотором и Т7 терминатором в плазмиде pE-Trx-Lc-def обеспечивает продукцию гибридного белка Trx-Lc-def клетками Е.coli при индукции изопропилтио-β-D-галактозидом или лактозой. Базальная экспрессия (до момента добавления индуктора) Т7 РНК-полимеразы и гибридного белка Trx-Lc-def поддерживается на минимальном уровне благодаря наличию системы контроля на основе lac-операторов и генов lac-репрессора, присутствующих как в плазмиде pE-Trx-Lc-def, так и в хромосоме штамма-продуцента.
Клетки штамма-продуцента сохраняют культурально-морфологические и физиолого-биохимические признаки родительского штамма Е.coli. Клетки мелкие, палочковидной формы, грамотрицательные, 1×3,5 мкм, подвижные, хорошо растут на обычных питательных средах (мясо-пептонный агар, мясо-пептонный бульон, LB-бульон, LB-агар, минимальная среда с глюкозой). Рост в жидких средах характеризуется ровным помутнением, осадок легко седиментирует. Клетки растут при температуре от 4°С до 42°С при оптимуме рН от 6,8 до 7,5; в качестве источника азота используют как минеральные соли аммония, так и органические соединения: аминокислоты, пептон, триптон, дрожжевой экстракт. В качестве источника углерода при росте на минимальной среде используют аминокислоты, глицерин, углеводы. Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (до 500 мкг/мл), обусловленную наличием в плазмиде pE-Trx-Lc-def гена β-лактамазы.
Штамм-продуцент хранят на чашках и косяках при температуре 4°С, пересевая на свежие среды один раз в месяц, а также при температуре минус 70°С в среде LB с добавлением 10-30% глицерина.
Биосинтез продукта (экспрессию) проводят следующим образом: клетки штамма-продуцента выращивают в питательной среде (например, LB, MBL или М9) с добавлением необходимого селектирующего агента (100 мкг/мл ампициллина) при температуре 20-37°С до достижения культурой средней или поздней логарифмической фазы роста, ступенчато увеличивая объем культуральной жидкости путем последовательных пересевов материала, после чего индуцируют синтез гибридного белка добавлением изопропилтио-β-D-галактозида или лактозы и инкубируют дополнительно в течение 3-24 часов при температуре 20-37°С. Увеличения выхода гибридного белка достигают с помощью принудительной аэрации культуральной жидкости и культивирования штамма-продуцента на обогащенных питательных средах (например, с добавлением глюкозы, глицерина, дикарбоновых кислот, аминокислот, неорганических солей, в т.ч. содержащих микроэлементы).
Очистка антимикробного пептида дефенсина включает следующие обязательные стадии: разрушение клеток, металлохелатную очистку гибридного белка Trx-Lc-def, обработку гибридного белка бромцианом, разделение продуктов реакции с помощью повторной металлохелатной хроматографии и очистку целевого пептида методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
2+
2+
2+
Для очистки клеточного материала от примесей, содержащихся в культуральной жидкости, особенно при выделении гибридного белка из клеточной культуры с низкой плотностью, желательным является предварительное концентрирование клеток с помощью центрифугирования или фильтрации. Разрушение (лизис) клеток осуществляют физическим или химическим способом или комбинацией способов, например с помощью ультразвукового дезинтегратора, Френч-пресса, дезинтегратора Гаулина, с помощью осмотического шока, детергентов, хаотропных агентов, гидролитических ферментов (лизоцим, ДНКаза). С целью снижения нагрузки на аффинный сорбент нерастворимые примеси из клеточного лизата могут быть удалены центрифугированием или фильтрацией. Для металлохелатной очистки может быть использован сорбент, содержащий такие хелатирующие группы, как иминодиацетат (IDA), нитрилотриацетат (NTA) или карбоксиметиласпартат (СМА, TALON) в комплексе с катионами Ni, Со или Cu [Chaga G.S. (2001) J Biochem Biophys Methods. 49(1-3):313-34]. Элюирование гибридного белка проводят, уменьшая рН буфера или увеличивая концентрацию имидазола либо добавляя в буфер ЭДТА. Реакцию с бромцианом проводят в стандартных условиях: растворяют белок в 60-90% трифторуксусной, уксусной или муравьиной кислоте или в 6М хлориде гуанидина с добавлением 0,1М соляной кислоты, добавляют бромциан в 10-200-кратном стехиометрическом избытке по отношению к числу остатков метионина в образце, инкубируют в темноте в течение 16-20 ч. Далее проводят очистку продуктов реакции расщепления гибридного белка с помощью повторной металлохелатной хроматографии, в ходе которой белок-носитель и нерасщепленный гибридный белок связываются с носителем, а целевой пептид уходит в проскок. Очистку дефенсина проводят методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в системе ацетонитрил-вода с добавлением 0,1% трифторуксусной кислоты, используя градиент концентрации ацетонитрила. Степень чистоты пептида может быть повышена путем повторной очистки методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Идентичность рекомбинантного и природного дефенсина устанавливают методами ПААГ-электрофореза в денатурирующих условиях, МАЛДИ-времяпролетной масс-спектрометрии, секвенирования N-концевой аминокислотной последовательности по методу Эдмана, тестирования антимикробной активности методом серийных разведений в жидкой питательной среде. Степень очистки определяют методами ПААГ-электрофореза в денатурирующих условиях и МАЛДИ-времяпролетной масс-спектрометрии, а также с помощью повторной обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Изобретение иллюстрируют графические материалы:
Фиг.1. Физическая карта рекомбинантной плазмидной ДНК для экспрессии антимикробного пептида дефенсина: BglII, XhoI - сайты рестрикции; pBR322 Ori - участок инициации репликации плазмиды; bla - ген устойчивости к β-лактамным антибиотикам; lacI - ген lac-репрессора; Т7 promoter - промотор транскрипции; Т7 terminator - терминатор транскрипции; lac operator - сайт связывания lac-репрессора; RBS - сайт связывания рибосомы; His8 - аффинная последовательность из восьми остатков гистидина; Trx - последовательность, кодирующая тиоредоксин; Lc-def - последовательность, кодирующая дефенсин.
Фиг.2. Электрофоретический анализ экспрессии и очистки дефенсина: М - стандарт молекулярных масс; 1 - суммарный клеточный лизат, содержащий гибридный белок Trx-Lc-def; 2 - проскок с колонки с Ni сефарозой; 3 - элюат, содержащий гибридный белок; 4 - диализат; 5 - продукты реакции с бромцианом; 6 - Lc-def, очищенный с помощью ВЭЖХ.
Фиг.3. Хроматограмма очистки рекомбинантного дефенсина методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Фиг.4. MALDI масс-спектр дефенсина, полученного генно-инженерным способом.
Изобретение иллюстрируют примеры.
Пример 1.
Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pE-Trx-Lc-def.
Нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 2, содержащую промотор транскрипции Т7 РНК-полимеразы, lac-оператор, участок связывания рибосомы и участок, кодирующий гибридный полипептид (последовательно связанные гистидиновый октамер, тиоредоксин с заменой M37L, сайт расщепления бромцианом и дефенсин), получают химико-ферментативным синтезом с помощью ПЦР. Олигонуклеотиды, используемые в ПЦР, синтезируют твердофазным фосфоамидитным методом с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3'-конца к 5'-концу с помощью защищенных фосфамидитов - 5'-диметокситритил-N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3'-O-(β-цианэтилдиизопропиламино)-фосфитов, активированных тетразолом.
Фрагмент, кодирующий белок-носитель тиоредоксин (M37L), получают методом ПЦР-амплификации и направленного мутагенеза с помощью ген-специфических праймеров, используя в качестве исходной матрицы плазмиду рЕТ32а(+), содержащую ген тиоредоксина. Остальные участки последовательности pE-Trx-Lc-def получают путем последовательного отжига и элонгации взаимно перекрывающихся олигонуклеотидов, а также отжига, элонгации и амплификации промежуточных продуктов синтеза. На завершающей стадии синтеза последовательность амплифицируют с помощью праймеров, несущих на 5'-концах сайты узнавания рестриктаз BglII и XhoI. Продукт амплификации гидролизуют указанными рестриктазами, очищают электрофорезом в 1,5% агарозном геле, полосу ДНК величиной 650 п.н. выделяют из геля методом электроэлюции в 15% раствор ПЭГ-6000 и лигируют с фрагментом ДНК размером 5,3 тыс. п.н., полученным в результате обработки плазмиды pET31b(+) рестриктазами BglII и XhoI. В результате лигазной реакции получают кольцевую ковалентно замкнутую ДНК размером 5903 п.н. (фиг.1). Продуктами лигазной реакции трансформируют компетентные клетки E.coli DH10B, приготовленные с помощью 0,1 М хлорида кальция. После трансформации суспензию бактерий смешивают с питательной средой LB, растят 1 ч при 37°С и высевают на чашки Петри с LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина.
Первичный отбор клонов, содержащих нужную плазмиду, осуществляют методом «ПЦР с клонов» с использованием праймеров на плазмидный остов и вставку. Отобранные клоны подращивают в жидкой питательной среде и выделяют плазмидную ДНК, которую анализируют на наличие вставки с помощью рестрикционного анализа. Окончательное строение плазмид, содержащих требуемый фрагмент, подтверждают определением нуклеотидной последовательности секвенированием по Сэнгеру. По данным секвенирования отбирают плазмиду со вставкой, нуклеотидная последовательность которой полностью соответствует запланированной (SEQ ID No. 2).
Пример 2.
Получение штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/pE-Trx-Lc-def, вырабатывающего гибридный белок Trx-Lc-def, и определение его продуктивности.
Проводят трансформацию компетентных клеток Е.coli BL21(DE3), приготовленных с помощью 0,1М хлорида кальция, плазмидой pE-Trx-Lc-def, описанной в примере 1. После трансформации суспензию бактерий смешивают с питательной средой LB, растят 1 ч при 37°С и высевают на чашки Петри с LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина и 20 ммоль/л глюкозы. Чашки инкубируют при 37°С в течение 18 ч.
600
600
-1
Микробиологической петлей переносят выросшие колонии в 10 мл жидкой среды LB, содержащей 150 мкг/мл ампициллина, подращивают до оптической плотности OD 0,7 на термостатируемой качалке со скоростью вращения 200 мин при температуре 37°С, отбирают 0,3 мл культуры для последующего электрофоретического анализа, добавляют индуктор - изопропилтио-β-D-галактозид до концентрации 0,2 мМ и продолжают инкубацию при температуре 30°С в течение 5 ч, отбирая каждый час пробы по 0,3 мл для определения оптической плотности OD и последующего электрофоретического анализа. Равные аликвоты суспензии клеток, отобранных до внесения индуктора и после завершения роста, центрифугируют, отделяют супернатант и анализируют осадок клеток ПААГ-электрофорезом в денатурирующих условиях. Для этого образцы лизируют буфером, содержащим 2% додецилсульфат натрия (SDS), на водяной бане в течение 5 мин. Электрофорез проводят в 15% ПААГ в присутствии SDS. Гель прокрашивают 0,1% кумасси G-250 в присутствии 25% изопропилового спирта. Появление отчетливой полосы в области 19 кДа в образцах, отобранных после индукции, свидетельствует о способности штамма синтезировать гибридный полипептид Trx-Lc-def (фиг.2). Относительное содержание гибридного белка определяют путем сканирования и денситометрического анализа окрашенных гелей.
Пример 3.
Получение рекомбинантного антимикробного пептида дефенсина.
600
Клетки штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/pE-Trx-Lc-def, полученного согласно примеру 2, выращивают в жидкой питательной среде LB с добавлением 100 мкг/мл ампициллина и 20 ммоль/л глюкозы до достижения культурой оптической плотности OD 0,7 при температуре 37°С. Индукцию синтеза белка проводят с помощью изопропил-β-D-галактозида в концентрации 0,2 мМ, после чего инкубируют 4 часа при температуре 30°С. Уровень экспрессии гибридного белка, а также содержание гибридного белка, белка-носителя и целевого пептида в препарате на последующих стадиях очистки определяют с помощью ПААГ-электрофореза в трис-глициновой буферной системе в денатурирующих условиях.
По окончании ферментации клеточную биомассу отделяют центрифугированием при 4000 g в течение 10 мин, ресуспендируют в буфере А (50 мМ трис-HCl, 0,5 М NaCl, 20 мМ имидазол, рН 7,8), содержащем 1 мМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF), и разрушают клетки с помощью ультразвукового гомогенизатора. Полученный лизат центрифугируют (осветляют) при 25000 g в течение 20 мин. Все работы по получению осветленного лизата проводят при температуре 4°С. Очистку гибридного белка Trx-Lc-def, содержащего в качестве аффинной метки октагистидиновую последовательность, осуществляют с помощью металлохелатной хроматографии на препаративной колонке с Ni сефарозой, уравновешенной буфером А. Для этого осветленный лизат наносят на колонку, промывают колонку четырехкратным объемом буфера А и элюируют связавшийся с носителем гибридный белок буфером В (50 мМ трис-HCl, 0,5 М NaCl, 0,5 М имидазол, рН 7,8). Элюат, содержащий гибридный белок, диализируют против 100-кратного объема воды в течение ночи при температуре 4°С через мембрану с размером пор 12 кДа и лиофильно высушивают.
Очищенный гибридный белок Trx-Lc-def растворяют в 80% трифторуксусной кислоте в концентрации 20 мг/мл, добавляют равную массу бромциана (1 г бромциана на 1 г белка) и выдерживают при температуре 25°С в защищенном от света месте в течение 16 ч. Реакцию останавливают добавлением пятикратного объема деионизированной воды, после чего образец лиофильно высушивают. Процедуру добавления воды и упаривания повторяют трижды.
Очистку рекомбинантного белка от нерасщепленного гибридного белка и белка носителя проводят с помощью повторной металлохелатной хроматографии в той же буферной системе на колонке с Ni сефарозой. Образцы для нанесения на металлохелатную колонку готовят, растворяя упаренный после расщепления бромцианом образец в буфере А в концентрации 20 мг/мл. Остатки кислоты нейтрализуют, добавляя раствор щелочи (1 М NаОН) до рН 7,0.
18
Окончательную очистку дефенсина проводят с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ на препаративной колонке Reprosil-Pur C-AQ (d=5 мкм, 250×10 мм) в линейном градиенте концентрации ацетонитрила 5-80% в течение 60 мин в присутствии 0,1% трифторуксусной кислоты (фиг.3). Детектирование ведут при длине волны 214 нм. Фракцию, содержащую дефенсин, собирают и лиофильно высушивают. Выход пептида в пересчете на 1 л клеточной культуры составляет 3 мг.
Для определения N-концевой аминокислотной последовательности дефенсина применяют автоматическое микросеквенирование на приборе Procise 491 cLC Protein Sequencing System (PE Applied Biosystems). Идентификацию фенилтиогидантоин-производных аминокислот проводят на анализаторе 120А РТН Analyzer (PE Applied Biosystems). В основе методики автоматического определения аминокислотной последовательности пептидов и белков лежит метод химической деградации полипептидной цепи по методу Эдмана, позволяющий последовательно отщеплять N-концевые аминокислотные остатки в виде фенилтиогидантоинов и идентифицировать отщепленные производные аминокислот методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. В результате автоматического микросеквенирования устанавливают идентичность аминокислотных последовательностей генно-инженерного и природного дефенсина.
Для определения молекулярной массы очищенного пептида используют МАЛДИ-времяпролетный масс-спектрометрический анализ на приборе Reflex III (Bruker Daltonics), оснащенном УФ-лазером с длиной волны 336 нм. В качестве матрицы используют 2,5-дигидроксибензойную кислоту в смеси, содержащей 20% ацетонитрил и 0,1% трифторуксусную кислоту. Полученный пик с m/z 5441,29 (фиг.4) соответствует молекулярному иону природного дефенсина (расчетная молекулярная масса составляет 5440,21 Да), стабилизированного четырьмя дисульфидными связями.
Пример 4.
Тестирование антимикробной активности дефенсина.
4
50
Антимикробную активность рекомбинантного Lc-def определяют методом серийных разведений пептида в жидкой питательной среде с культурой спор. Фитопатогенные грибы Aspergillus niger VKM F-2259, Aspergillus versicolor VKM F-114, Botrytis cinerea VKM F-85, Fusarium culmorum VKM F-844, Fusarium oxysporum TCXA-4 и Neurospora crassa VKM F-184 выращивают на стерильных чашках Петри с картофельно-сахарозным агаром в течение 10 дней при комнатной температуре до начала активной споруляции. Выросший на поверхности мицелий грибов разрезают на квадраты размером 1×1 см, помещают в 3 мл стерильной воды и инкубируют на термостатируемом шейкере при 25°C с целью высвобождения и перевода в суспензию спор. Концентрацию спор определяют с помощью камеры Горяева. В лунки 96-луночного планшета вносят по 110 мкл суспензии спор, разбавленной картофельно-сахарозным бульоном до концентрации 10 спор/мл, и по 10 мкл стерильных растворов пептида различной концентрации в 0,1% трифторуксусной кислоте. Каждый вариант теста ставят в трех повторностях. Планшет инкубируют в термостатируемом шейкере при 25°С в течение 48 ч. Прорастание спор исследуют с помощью микроскопа СХ31 (Olympus) и оценивают путем измерения оптической плотности культуры в лунках при 620 нм при помощи планшетного фотометра Multiscan EX (Thermo Scientific). В качестве отрицательного контроля используют 0,1% трифторуксусную кислоту. Результаты обсчитывают с помощью программы Multiscan Magic 3.1. За МИК (минимальную ингибирующую концентрацию) дефенсина для данного штамма принимают минимальную концентрацию пептида, при которой достигается 50% ингибирование роста гриба по сравнению с отрицательным контролем. Результаты тестирования активности рекомбинантного пептида, полученного заявленным способом, представлены в таблице 1.
Таблица 1
Противогрибковая активность дефенсина
Фитопатогенные грибы
МИК<sub>50</sub>, мкМ/л
Aspergillus niger VKM F-2259
28,7
Aspergillus versicolor VKM F-114
18,5
Botrytis cinerea VKM F-85
9,25
Fusarium culmorum F-844
18,5-37
Fusarium oxysporum TCXA-4
>37
Neurospora crassa VKM F-184
9,25-18,5
Полученный рекомбинантный Lc-def ингибирует рост фитопатогенного гриба А. niger, являющегося причиной развития аспергиллезной гнили у растений и аспергиллеза у человека, с той же эффективностью, что и природный дефенсин. Рекомбинантный пептид также ингибирует рост еще пяти фитопатогенных грибов, а именно A. versicolor, F. culmorum, F. oxysporum, N. crassa и В. cinerea. Наиболее чувствительной к рекомбинантному Lc-def является культура N. crassa, эффективность ингибирования роста которой через 48 часов составляет 100% для дефенсина в концентрации 37 мкМ/л.