ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОГЕНЕЗА МИКРОРНК В ЭКЗОСОМАХ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ
USE OF microRNA BIOGENESIS IN EXOSOMES FOR DIAGNOSTICS AND TREATMENT

[001] В данной заявке заявлено преимущественный приоритет согласно предварительной заявке на патент 61/791301, поданной 15 марта 2013 г., содержание которой в полном объеме включено в настоящий документ посредством ссылки.
[002] Данное изобретение выполнено при государственной поддержке по грантам №№ ЕВ 003472, ЕВ 006462, СА 135444, СА 125550, СА 155370, СА 151925, DK 081576 и DK 055001, предоставленным Национальными институтами здравоохранения, и грантам №№ EFRI-1240410, СВЕТ-0922876 и СВЕТ-1144025, предоставленным Национальным научным фондом. В данном изобретении государство имеет определенные права.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Область техники
[003] Данное изобретение в целом относится к области молекулярной биологии, онкологии и медицины. Конкретнее, оно относится к способам выявления раковых заболеваний по уникальному содержанию их экзосом и способам улучшенного лечения на основе ингибирующих РНК.
2. Описание предшествующего уровня техники
[004] Все клетки осуществляют связь с окружающей их средой посредством множества разных механизмов, включающих факторы роста, цитокины, гормоны, хемокины, мембраносвязанные белки и липиды. Экзосомы способны опосредовать такие коммуникации и обеспечивать их на больших расстояниях (Mathivanan et al., 2010; Kahlert and Kalluri, 2013). Коммуникация посредством экзосом вероятно может преодолевать ограничения, связанные со стабильностью и диффузией факторов роста цитокинов/хемокинов/гормонов (Mathivanan et al., 2010). Экзосомы представляют собой нановезикулы размером 30-140 нм, которые содержат белки, мРНК и микроРНК (miRNA), защищенные липидным бислоем (Cocucci et al., 2009; Simons и Raposo, 2009; Simpson et al., 2008; Thery et al., 2002). В нескольких последних исследованиях продемонстрировано, что экзосомы секретируются многими типами клеток, включая раковые клетки, стволовые клетки, иммунные клетки и нейроны (Simpson et al., 2008; Thery, 2001). Отмечено, что раковые клетки секретируют больше экзосом, чем нормальные клетки (Taylor и Gercel-Taylor, 2011). Более того, содержание экзосом увеличено в системе кровообращения пациентов с раковыми заболеваниями по сравнению со здоровыми субъектами (Logozzi et al., 2009; Taylor и Gercel-Taylor, 2008); однако, функциональная роль экзосом остается неизвестной. Последние данные дают основание предположить, что экзосомы могут играть важную роль в развитии рака и метастаз (Luga et al., 2012; Peinado et al., 2012; Yang et al., 2011).
[005] Предположение, что экзосомы опосредуют перенос РНК и микроРНК между клетками дополнительно увеличивает сложность коммуникаций клетки с клеткой в организме. RNAi представляет собой природный биологический процесс внутри живых клеток, который принимает участие в контроле экспрессии и активности генов. Изначально исключительно думали, что микроРНК для внеклеточных взаимодействий должны содержаться внутри экзосом (Valadi et al., 2007). После этого несколько сообщений подтвердили присутствие микроРНК в апоптотических тельцах (Zernecke et al., 2009), липопротеинах высокой и низкой плотности (Vickers et al., 2011) (HDL/LDL), больших внеклеточных везикулах, названных микровезикулами и ассоциированных с AGO2 (Arroyo et al., 2011; Li et al., 2012; Turchinovich et al., 2011). Однако, в последнем сообщении высказано предположение, что большинство микроРНК, обнаруженных в сыворотке и слюне человека, главным образом, сконцентрировано внутри экзосом (Gallo et al., 2012). Присутствие микроРНК в экзосомах предполагает возможность регулирования экспрессии генов клеток в удаленных местах (Guescini et al., 2010; Valadi et al., 2007; Mittelbrunn et al., 2011; van Balkom et al., 2013). Посредством регуляции ими трансляции мРНК, микроРНК координируют экспрессию целых наборов генов и придают форму транскриптому организма (Bartel, 2009).
[006] микроРНК накапливаются в экзосомах, полученных из многих типов разных клеток (Valadi et al., 2007). Они представляют собой малые некодирующие РНК длиной 18-24 нуклеотидов (нт), которые посттранскрипционно контролируют экспрессию генов. Они синтезируются посредством последовательных действий эндонуклеаз Drosha и Dicer и внедряются в RISC (РНК-индуцируемый комплекс сайленсинга) для нацеливания на мРНК (Bartel, 2009; Maniataki и Mourelatos, 2005). У мышей с нокаутом гена Dicer, нарушение биосинтеза микроРНК приводит к летальному исходу из-за дефектной пролиферации и дифференциации эмбриональных стволовых клеток (Bernstein et al., 2003; Fukagawa et al., 2004).
[007] МикроРНК действуют посредством последовательность-специфического взаимодействия и спаривания микроРНК-ассоциированного RISC (состоящего из белков Dicer, TRBP и AGO2) с мРНК-мишенями (Bartel, 2009). Это воздействие ингибирует трансляцию и/или вызывает дестабилизацию мРНК (Filipowicz, 2005). Степень комплементарности микроРНК и их мРНК-мишеней обуславливает процесс сайленсинга мРНК или посредством дестабилизации/деградации мРНК или ингибированием трансляции (Ambros, 2004; Bartel, 2009). Если имеется полная комплементарность между последовательностью микроРНК и мРНК, комплекс RISC воздействует, расщепляя связанную мРНК, что обеспечивает ее деградацию (Ambros, 2004; Bartel, 2009). Если нет абсолютной комплементарности, как в большинстве случаев микроРНК в животных клетках, то предотвращается трансляция, чем достигается сайленсинг генов (Ambros, 2004; Bartel, 2009).
[008] Для того, чтобы микроРНК была функциональной и обеспечивала эффективный микроРНК-опосредованный сайленсинг генов, она должна образовывать комплекс с RLC-белками (RISC-нагруженный комплекс) Dicer, TRBP и AGO2. Для механизма RLC для процессирования предшественников микроРНК (пре-микроРНК) требуются Dicer и TRBP, после чего они выходят из ядра через экспортин-5 для образования микроРНК и ассоциации с AGO2. AGO2, связанный со зрелыми микроРНК, составляет минимальный комплекс RISC и в дальнейшем может диссоциировать от Dicer и TRBP (Chendrimada et al., 2005; Gregory et al., 2005; Haase et al., 2005; MacRae et al., 2008; Maniataki и Mourelatos, 2005; Melo et al., 2009). Одноцепочечные микроРНК сами по себе внедряются в RISC очень слабо и, поэтому, не могут эффективно направляться на свои мРНК-мишени для посттранскрипционной регуляции (Tang, 2005; Thomson et al., 2013).
[009] Синтетические миРНК (двухцепочечные) вызывают распад мРНК благодаря совершенному спариванию оснований с их мРНК-мишенями (Ambros, 2004; Bartel, 2009). Такие миРНК непосредственно внедряются в RISC-белки Dicer, TRBP и AGO2 благодаря их двухцепочечной природы (Tang, 2005). Одноцепочечные микроРНК не могут внедриться в RISC и, поэтому, не могут направляться на свои мРНК-мишени для ингибирования трансляции и деградации (Tang, 2005; Thomson et al., 2005).
[0010] В некоторых сообщениях предполагают, что микроРНК, содержащиеся в экзосомах могут влиять на экспрессию генов в клетках-мишенях (Ismail et al., 2013; Kogure et al., 2011; Kosaka et al., 2013; Narayanan et al., 2013; Pegtel et al., 2010; Valadi et al., 2007; Zhang et al., 2010), но остается вопрос: насколько эффективными являются эти микроРНК для сайленсинга мРНК, могут ли они внедряться в RISC как пре-микроРНК для полноценного распознавания мРНК и эффективной блокировки трансляции. В то время как зрелые микроРНК (одноцепочечные) не могут ассоциировать с RISC клеток-мишеней, пре-микроРНК экзосом до некоторой степени могут индуцировать сайленсинг генов присоединением RISC-белков клеток-мишеней. Однако при этом, такой процесс является очень неэффективным и медленным из-за потенциально насыщенного состояния белков, вовлеченных в механизм биогенеза микроРНК клеток-мишеней. В последнем сообщении показано наличие Drosha и Dicer в экзосомах из супернатантов культур клеток, полученных из инфицированных ВИЧ-1 клеток и сыворотки пациентов с ВИЧ (Narayanan et al., 2013). В дополнение к этому, в другом исследовании показано совместное фракционное выделение Dicer, TRBP и AGO2 в поздних эндосомах/МВТ (мультивезикулярных тельцах) (Shen et al., 2013).
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0011] Экзосомы, секретированные раковыми клетками, являются уникально похожими на нераковые экзосомы, раковые экзосомы содержат уникальные репертуары микроРНК, а также активные RISC-комплексы, процессирующие РНК. Такие инкапсулированные комплексы РНК-RISC также могли бы применяться для биогенеза микроРНК независимого от клеток и высокоэффективного сайленсинга мРНК в клетках-мишенях.
[0012] В одном варианте реализации изобретения данное описание представляет способ выявления ракового биомаркера у субъекта включающий: (а) получение от субъекта биологического образца; (b) измерение уровней чего-либо из: (i) одной или нескольких микроРНК, выбранных из микроРНК, представленных в табл. 5, во фракции экзосом образца; (ii) предшественника микроРНК; (iii) RISC-белка во фракции экзосом образца; или (iv) активности процессинга микроРНК {например, первичной микроРНК и/или активности процессинга предшественника-микроРНК) во фракции экзосом образца и (с) идентификацию субъекта, обладающего или не обладающего раковым биомаркером, на основании измеренного уровня указанной(ых) микроРНК, предшественника микроРНК, RISC-белка или активности процессинга микроРНК. В некоторых аспектах изобретения способ включает измерение уровня по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 указанных микроРНК. В дополнительных аспектах изобретения способ включает измерение уровня белка AGO2, TRBP или DICER.
[0013] В некоторых аспектах изобретения биологический образец преимущественно свободен от клеток. К примеру, образец может содержать менее 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 клетки (клеток). В одном аспекте изобретения биологический образец не содержит клеток. В некоторых аспектах изобретения биологический образец может быть образцом лимфы, слюны, мочи или крови (например, плазмы). В дополнительном аспекте изобретения способ может дополнительно включать очистку фракции экзосом образца и/или увеличение продукции фракции экзосом образца.
[0014] В некоторых аспектах изобретения раковое заболевание представляет собой рак молочной железы, рак легких, рак головы и шеи, рак простаты, рак пищевода, рак трахеи, рак головного мозга, рак печени, рак мочевого пузыря, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак яичников, рак матки, рак шейки матки, рак яичек, рак толстого кишечника, рак прямой кишки или рак кожи. В некоторых аспектах изобретения раковым заболеванием является рак молочной железы. В одном аспекте изобретения субъекта предварительно лечили от ракового заболевания или у него предварительно хирургическим путем удалили опухоль.
[0015] В некоторых аспектах изобретения идентификация субъекта, обладающего или не обладающего раковым биомаркером, дополнительно включает определение корреляции измеренного(ых) уровня(ей) микроРНК, уровня предшественника микроРНК, уровня RISC или активности процессинга микроРНК с риском развития ракового заболевания. В дополнительном аспекте изобретения идентификация субъекта, обладающего или не обладающего раковым биомаркером, дополнительно включает анализ измеренного(ых) уровня(ей) микроРНК, уровня предшественника микроРНК, уровня RISC или активности процессинга микроРНК с использованием алгоритма. В некоторых случаях анализ может быть выполнен на компьютере.
[0016] В некоторых аспектах изобретения способ по вариантам реализации изобретения дополнительно включает измерение уровня чего-либо из: (i) одной или нескольких микроРНК, выбранных из микроРНК, представленных в табл. 5, во фракции экзосом образца и эталонного образца; (ii) предшественника микроРНК; (iii) RISC-белка во фракции экзосом образца и эталонного образца; или (iv) активности процессинга микроРНК во фракции экзосом образца и эталонного образца; и (с) идентификацию субъекта, обладающего или не обладающего раковым биомаркером, при сравнении уровня(ей) микроРНК, предшественника микроРНК, активности процессинга RISC или микроРНК в образце, полученном от субъекта, с уровнем(ями) микроРНК, предшественника микроРНК, активности процессинга RISC микроРНК в эталонном образце.
[0017] В некоторых аспектах изобретения измерение уровней RISC-белка включает проведение вестерн-блоттинга, ИФА или анализа связывания на матрице с множеством антител. В других аспектах изобретения измерение уровней микроРНК включает измерение уровней процессированных микроРНК. В некоторых случаях измерение уровней микроРНК включает проведение ПЦР-РВ, нозерн-блоттинга или гибридизацию на матрице.
[0018] В некоторых аспектах изобретения способ дополнительно включает предоставление информации того обладает ли субъект раковым биомаркером или нет. Предоставление информации может включать подготовку письменного, устного или электронного отчета. К примеру, отчет может быть предоставлен пациенту, врачу, медицинскому учреждению или страховой компании.
[0019] В дополнительном варианте реализации изобретения данное описание представляет способ лечения субъекта, включающий выбор субъекта, идентифицированного как обладающего раковым биомаркером, в соответствии с вариантами реализации, и назначение субъекту противораковой терапии. К примеру, способ может включать: (а) определение уровня: (i) одной или нескольких микроРНК, выбранных из микроРНК, представленных в табл. 5; (ii) предшественника микроРНК; (iii) RISC-белка или (iv) активности процессинга микроРНК во фракции экзосом образца, полученного от субъекта; (b) выбор субъекта, обладающего раковым биомаркером, на основании уровня указанной(ых) микроРНК, предшественника микроРНК, RISC-белка или активности процессинга микроРНК и (с) лечение выбранного субъекта с помощью противораковой терапии. В некоторых аспектах изобретения противораковая терапия представляет собой химиотерапию, радиационную терапию, гормональную терапию, таргетную терапию, иммунотерапию или хирургическое лечение.
[0020] В дополнительном варианте реализации изобретения данное описание представляет способ выбора субъекта с помощью диагностической процедуры, включающей: (а) определение уровня чего-либо из: (i) одной или нескольких микроРНК, выбранных из микроРНК, представленных в табл. 5; (ii) уровня предшественника микроРНК; (iii) RISC-белка или (iv) активности процессинга микроРНК, во фракции экзосом образца, полученного от субъекта; (b) выбор субъекта, обладающего раковым биомаркером, на основании уровня указанной(ых) микроРНК, RISC-белка или активности процессинга микроРНК и (с) выполнение для субъекта диагностической процедуры. В одном аспекте изобретения диагностическая процедура включает диагностическую визуализацию. Визуализация может быть визуализацией с использованием биопсии, рентгеновской, КТ-, МРТ- или ПЭТ-визуализацией.
[0021] В еще одном дополнительном варианте реализации изобретения данное описание представляет материальный машиночитаемый носитель, содержащий машиночитаемый код, который при выполнении компьютером, обуславливает выполнение компьютером операций, включающий: (а) получение информации, соответствующей уровню чего-либо из: (i) одной или нескольких микроРНК, выбранных из микроРНК, представленных в табл. 5; (ii) предшественника микроРНК; (iii) RISC-белка или (iv) активности процессинга микроРНК, во фракции экзосом образца, полученного от субъекта, и (b) определение относительного уровня одной или нескольких из указанных микроРНК, предшественника микроРНК, RISC-белков или активности процессинга микроРНК по сравнению с эталонным уровнем, причем измененный уровень сравнивался с эталонным уровнем, указывавшим, что субъект обладает раковым биомаркером.
[0022] В некоторых аспектах изобретения функционирование материального машиночитаемого носителя, дополнительно включает получение информации, соответствующей эталонному уровню: (i) одной или нескольких микроРНК, выбранных из микроРНК, представленных в табл. 5; (ii) предшественника микроРНК; (iii) RISC-белка или (iv) активности процессинга микроРНК, во фракции экзосом субъекта, не имеющего ракового заболевания.
[0023] В некоторых аспектах изобретения физический машиночитаемый носитель дополнительно содержит машиночитаемый код, который при выполнении компьютером, обуславливает выполнение компьютером одной или нескольких дополнительных операций, включающих: отправку информации, соответствующей относительному уровню микроРНК, предшественника микроРНК, RISC-белка или активности процессинга микроРНК, на материальное устройство хранения данных.
[0024] В дополнительном аспекте изобретения эталонный уровень хранится на указанном материальном машиночитаемом носителе. В одном аспекте изобретения получение информации включает получение из материального устройства хранения данных информации, соответствующей уровню микроРНК, уровню предшественника микроРНК, RISC-белка или активности процессинга микроРНК в образце, полученном от субъекта. В некоторых аспектах изобретения получение информации дополнительно включает получение информации соответствующей уровню в образце, полученном от субъекта, по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 указанных микроРНК.
[0025] В некоторых аспектах изобретения машиночитаемый код, при выполнении компьютером, обуславливает выполнение компьютером операций дополнительно включающих (с) расчет диагностической оценки образца, причем диагностическая оценка представляет собой величину вероятности того, что образец получен от субъекта, имеющего раковое заболевание.
[0026] В дополнительном варианте реализации изобретения данное описание представляет способ выявления ракового биомаркера у субъекта, включающий: (а) получение от субъекта биологического образца; (b) измерение в образце уровня одной или нескольких микроРНК, выбранных из микроРНК, представленных в табл. 5, или ее предшественника микроРНК, и (с) идентификацию субъекта, обладающего или не обладающего раковым биомаркером, на основании измеренного уровня указанной(ых) микроРНК. В одном аспекте изобретения биологический образец преимущественно свободен от клеток. В некоторых аспектах изобретения биологический образец может быть образцом лимфы, слюны, мочи или плазмы. В одном аспекте изобретения способ может дополнительно включать очистку фракции экзосом из жидкости организма.
[0027] В еще одном дополнительном варианте реализации изобретения данное описание представляет способ доставки активной ингибирующей РНК, включающий приведение в контакт клетки с ингибирующей РНК, которая доставляется в ассоциации с комплексом RISC-белка. В одном аспекте изобретения комплекс RISC-белка содержит TRBP, DICER и AGO2. В некоторых аспектах изобретения ингибирующая РНК представляет собой миРНК или мшРНК. В одном аспекте изобретения ингибирующая РНК представляет собой микроРНК человека.
[0028] В некоторых аспектах изобретения ингибирующая РНК и комплекс RISC-белка заключены в липосому, наночастицу или микрокапсулу, содержащие липидный бислой. В одном аспекте изобретения микрокапсула представляет собой экзосому.
[0029] В некоторых аспектах изобретения способ дополнительно включает трансфецирование клетки ингибирующей РНК и комплексом RISC-белка. В другом аспекте изобретения способ дополнительно включает введение субъекту ингибирующей РНК и комплекса RISC-белка.
[0030] В еще одном дополнительном варианте реализации изобретения данное описание представляет композицию, содержащую рекомбинантную или синтетическую ингибирующую РНК в ассоциации с комплексом RISC-белка, причем указанный комплекс заключен в липосому, наночастицу или микрокапсулу. В одном аспекте изобретения комплекс RISC-белка содержит TRBP, DICER и AGO2. В некоторых аспектах изобретения ингибирующая РНК представляет собой миРНК или мшРНК. В некоторых аспектах изобретения ингибирующая РНК представляет собой микроРНК человека. В некоторых аспектах изобретения комплекс заключен в синтетическую липосому, наночастицу или микрокапсулу. В одном аспекте изобретения микрокапсула представляет собой экзосому.
[0031] Некоторые аспекты изобретения варианты реализации изобретения, как подробно описано выше, касаются измерения уровня одной или нескольких микроРНК (или предшественника микроРНК) во фракции экзосом образца, выбранных из представленных в табл. 5. К примеру, способ может включать измерение уровня одной или нескольких микроРНК, выбранных из группы, состоящей из: mmu-miR-709, hsa-miR-1308, mmu-miR-615-3р, hsa-miR-1260b, mmu-miR-1937a, mmu-mir-321-A, hsa-miR-615-3p, hsa-miR-1979, mmu-miR-1937b, hsa-mir-373, mmu-miR-1937c, hsa-miR-1273d-P, mmu-miR-720, mmu-miR-1274a, hsa-mir-565-A, mmu-miR-1931, hsa-miR-1246, hsa-mir-594-P, hsa-mir-321-A, mmu-miR-2145-1-P, hsa-mir-639-P, hsa-miR-720, hsa-miR-1280, mmu-miR-3473, hsa-miR-1260, hsa-miR-1281, mmu-miR-1224-P, mmu-miR-690, hsa-miR-375-P, hsa-miR-4301, mmu-miR-700, mmu-miR-125b-5p, mmu-miR-1191-P, hsa-miR-1274a, hsa-miR-3197, mmu-miR-1935, hsa-miR-1975-P, hsa-miR-4324, hsa-miR-886-3р, hsa-miR-1274b, mmu-miR-1957, hsa-miR-933, hsa-mir-675, hsa-miR-595, mmu-miR-2137, hsa-mir-572-P, mmu-miR-1195, hsa-miR-4294-P, mmu-mir-1899-P, mmu-miR-689-P, hsa-miR-199b-3p, hsa-miR-3117-P, mmu-mir-321-P, mmu-miR-1961-P, hsa-mir-10а, mmu-miR-669d-P, mmu-miR-1937b-2-P, hsa-miR-3125-P, mmu-miR-1934-P, hsa-miR-574-3р, hsa-miR-718, mmu-miR-1198, mmu-miR-2182-P, hsa-miR-1273, mmu-miR-2133-P, hsa-miR-92b*, hsa-miR-1290, hsa-miR-448, mmu-miR-689, mmu-miR-449a, mmu-miR-1937b-4-P, hsa-miR-4286, mmu-miR-1947, mmu-miR-342-3р, hsa-miR-1303-P, mmu-miR-2132, hsa-miR-4321-P, hsa-miR-4256-P, hsa-miR-4311, mmu-miR-130a, mmu-miR-1939, hsa-miR-1268-P, mmu-miR-31, mmu-miR-99b, mmu-miR-2141, hsa-miR-1202-P, mmu-miR-466b-3p, mmu-miR-2133, hsa-miR-1268, hsa-miR-466, mmu-miR-494, hsa-miR-1289, hsa-miR-320b, hsa-miR-4254, hsa-mir-7-3-Р, hsa-miR-923, hsa-miR-764, mmu-miR-291a-3p, mmu-miR-883b-3p, hsa-mir-594-A, mmu-miR-1948-P, hsa-miR-206, hsa-mir-565-P, mmu-miR-467e*, hsa-miR-1826, mmu-miR-467a*, mmu-miR-1983, hsa-miR-324-5p, mmu-let-7c, mmu-miR-1965, hsa-mir-632-P, hsa-miR-181a*MM2GT/AC, hsa-miR-1265, hsa-miR-323b-5p, hsa-mir-1914, hsa-mir-1910, hsa-miR-21, hsa-miR-431*, hsa-miR-3135-P, mmu-miR-187-P, mmu-miR-126-3p, mmu-miR-669a-P, hsa-miR-367, mmu-mir-320-P, hsa-miR-181a*MM1G/C, mmu-miR-484-P, mmu-miR-467c-P, hsa-miR-3154, mmu-miR-466d-3p, hsa-miR-3162-P, mmu-miR-201, mmu-miR-1946a, hsa-miR-937, hsa-miR-3147, hsa-mir-596-P, hsa-miR-3148, hsa-miR-1304, hsa-miR-222MM2GG/AC, mmu-miR-125a-5p, hsa-miR-1272-P, hsa-miR-638, hsa-mir-320, hsa-miR-545*, hsa-mir-1908-P, hsa-let-7d-v2-P, mmu-mir-30d-P, hsa-miR-4297, mmu-miR-182, hsa-miR-3166-P, hsa-miR-494, mmu-miR-669o-P, hsa-miR-566, mmu-miR-1188, mmu-miR-2134-AP, hsa-miR-4259-P, mmu-miR-152, mmu-miR-2134, hsa-miR-3193-AP, hsa-miR-125b, hsa-miR-3124-P, hsa-miR-10b, hsa-miR-455-5p, mmu-miR-144, hsa-miR-130a, hsa-miR-1285, hsa-miR-516b*, hsa-miR-27a, hsa-miR-138-1*, mmu-miR-471, hsa-miR-4298-P, hsa-miR-301b, hsa-mir-147-P, hsa-miR-362-5p, mmu-mir-471-P, mmu-miR-466a-3p, hsa-miR-561, hsa-miR-486-5p, mmu-miR-2861, hsa-miR-587, mmu-miR-375, hsa-mir-329-2-P, mmu-miR-2861-P, hsa-miR-144*, hsa-miR-1255a-P, hsa-mir-519a-2-P, hsa-miR-34c-5p, mmu-miR-466e-3p, mmu-miR-743b-5p, mmu-mir-350-P, mmu-miR-181d, hsa-miR-376a*, hsa-miR-1308-P, mmu-miR-467g, mmu-miR-1946a-P, hsa-miR-147-P, hsa-miR-923-P, mmu-miR-465c-5p, hsa-miR-891a, hsa-miR-28-5p, hsa-miR-4292, mmu-miR-677-P, hsa-miR-4257, hsa-miR-4326, hsa-miR-17*MM2GG/AA, hsa-miR-939-P, mmu-miR-2182, hsa-miR-220c-P, hsa-miR-3132-P, hsa-miR-532-5p, mmu-miR-1947-P, mmu-miR-29a, hsa-miR-3162, hsa-miR-375MM1C/G, hsa-miR-768-3р, mmu-miR-182-P, mmu-miR-205-P, hsa-miR-505, hsa-miR-3146-P, mmu-miR-721, mmu-miR-376c, hsa-miR-1179-P, mmu-miR-1970, hsa-miR-3133-P, hsa-miR-200c, hsa-miR-220a, mmu-miR-100, hsa-miR-1255b, hsa-miR-222MM1G/A, hsa-miR-885-3р, hsa-miR-517b, hsa-miR-200a, hsa-miR-3141, mmu-miR-669h-3p, hsa-miR-1301, hsa-miR-877, hsa-mir-941-2, hsa-mir-487b-P, hsa-miR-4302, hsa-miR-99b, hsa-miR-1253, hsa-let-7a*, hsa-miR-34aMM2CT/TC, hsa-miR-3181-P, hsa-miR-3200, hsa-miR-3129-P, hsa-miR-93*, hsa-miR-548q-P, mmu-miR-466g, mmu-miR-155, hsa-miR-2278-P, hsa-miR-3065-5p, hsa-miR-633, hsa-miR-4265, mmu-miR-2135-P, hsa-miR-190, mmu-miR-669f, hsa-miR-1323, hsa-miR-588, mmu-miR-183*, hsa-mir-941-4, hsa-mir-1913, hsa-miR-2116*, hsa-miR-1178, mmu-miR-196a, mmu-miR-574-3р, hsa-miR-346, mmu-miR-1199, mmu-miR-681, hsa-miR-4292-P, hsa-miR-522, hsa-mir-611-P, hsa-miR-3171, hsa-miR-635, hsa-miR-1197-P, hsa-miR-604, mmu-let-7a*, hsa-miR-335, mmu-miR-466c-3p, mmu-miR-466i, hsa-miR-1297, mmu-miR-338-5p, hsa-mir-526a-2-P, hsa-miR-181aMM2GC/AG, hsa-miR-18, hsa-miR-924-P, mmu-miR-190-P, hsa-miR-345, mmu-miR-711, hsa-miR-3116-2-P, hsa-miR-99a, mmu-miR-26a, hsa-miR- 1248-P, mmu-miR-721-P, mmu-miR-801-P, hsa-miR-1826-P, hsa-miR-1236, hsa-miR-339-5p, mmu-miR-804, mmu-miR-467d*, mmu-miR-1191, hsa-miR-148a, hsa-miR-141, mmu-miR-1937a-P, mmu-miR-696 and hsa-miR-302a (т.е. перечисленных в табл. 5).
[0032] Как используется в данном документе формулировка с единственным числом может означать один или несколько объектов. Как используется в пункте(ах) формулы изобретения, использование слова «включающий, содержащий» со словами в единственном числе может означать один или более одного объекта.
[0033] Использование слова «или» в пунктах формулы изобретения применяется для обозначения «и/или», если только это явно не указано в отношении альтернативных вариантов или альтернативные варианты не являются взаимоисключающими, тем не менее, данное описание подтверждает определение, которое относится только к альтернативным вариантам, и подразумевает «и/или». Как используется в данном документе слово «другой» может означать по меньшей мере второй или несколько.
[0034] Во всем объеме этой заявки слово «около» применяется для указания того, что значение включает собственную вариацию погрешности устройства, способа, примененного для определения величины, или вариацию, которая существует среди исследуемых субъектов.
[0035] Другие объекты, особенности и преимущества по данному изобретению станут очевидными из следующего подробного описания. Однако, следует понимать, что подробное описание и специальные примеры, при указании предпочтительных вариантов реализации изобретения, даются таким образом, чтобы служить только иллюстрацией, поскольку различные изменения и модификации в пределах существа и объема изобретения станут очевидными специалистам в данной области техники из этого подробного описания.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0036] Следующие графические материалы составляют часть данного описания и включены для дополнительной демонстрации некоторых аспектов по данному изобретению. Файл патента или заявки содержит по меньшей мере один графический материал, выполненный в цвете. Копии этого патента или публикации патентной заявки с цветным(и) графическим(и) материалом(ами) будут предоставлены администрацией после запроса и оплаты требуемого сбора. Изобретение может быть лучше понято при рассмотрении одного или нескольких из этих графических материалов в комбинации с подробным описанием специальных вариантов реализации изобретения, представленных в данном документе.
[0037] Фиг. 1A-F. Определение характеристик экзосом. - Онкосомы по сравнению с нормосомами накапливают онкогенные микроРНК. (А) Микрофотография онкосом, полученная с помощью просвечивающей электронной микроскопии (верхнее левое фото, нижнее левое фото и увеличенная вставка; пунктирная линия очерчивает увеличенную область). Нижние правые изображения получены с помощью иммунометок с частицами золота с использованием анти-CD9 антитела и просвечивающей электронной микроскопии. Частицы золота видны в виде черных точек. На графике представлен средний размер препаратов экзосом, полученный при анализе 112 изображений ПЭМ. (В) Изображение экзосом из раковых клеток молочной железы, полученное с помощью атомно-силовой микроскопии. Средний график представляет дисперсию частиц на покровном стекле с диапазоном размеров экзосом. Правый график представляет средний размер препаратов экзосом, полученный при анализе 26 изображений АСМ. (С) Иммуноблот с использованием анти-Dicer антитела на экзосомах, собранных из: линий клеток нетуморогенных мышей (NMuMG) и человека (MCF10A) (левый блот, первое изображение); линий раковых клеток мыши, 67NR и 4Т1 (средний блот, первое изображение); линий раковых клеток человека MCF7 и MDA-MB231 (правый блот, первое изображение). Использованные контроли были: экзосомами, обработанными Тритоном X и далее протеиназой K (Тритон + ПК), для индуцирования лизиса экзосом и последующей деградации экзосомальных белков; экзосомами, обработанными протеиназой K (ПК) для деградации внеэкзосомальных белков; супернатантом после ультрацентрифугирования для сбора экзосом (супернатант). TSG101- (второй ряд) и CD9-иммуноблоты (третий ряд) использовали для подтверждения наличия экзосом. (D) Результаты анализа проточной цитометрии, с использованием антител против маркеров экзосом TSG101, CD9, флотиллина-1 и CD63, полученных из клеток MDA-MB231 экзосом, связанных с гранулами размером 0,4 мкм. (Е) Определение размеров экзосом с помощью спектроскопии рассеяния света (СРС). Калибровка системы проведена с использованием сигналов суспензий стеклянных микросфер в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБ) с номинальными диаметрами 24 нм и 100 нм и полистирольных микросфер с номинальными диаметрами 119 нм, 175 нм, 356 нм и 457 нм. Экспериментальные спектры и результаты подбора показаны на левом графике для стеклянных микросфер с номинальным диаметром 100 нм и полистирольных микросфер с номинальным диаметром 356 нм. На правом графике представлены результаты измерения размеров суспензии раковых экзосом в ФСБ. Вставка показывает тот же график с масштабом вплоть до 10 мкм для исключения потенциальной контаминации препаратов полученных авторами экзосом с клетками и клеточным дебрисом. (F) Распределение размеров экзосом, полученное с использованием оборудования NanoSight. На левом графике представлено распределение размеров частиц в растворе, отображающее средний размер 105 нм, а также не отображающее пиков больших размеров. На правом графике представлено распределение по размеру и концентрации частиц в растворе, полученном с помощью NanoSight. Данные, приведенные на этой фигуре и представленные в виде ± с.о., являются результатом трех независимых экспериментов, каждый проведен в трех повторах.
[0038] Фиг. 2A-F. Онкосомы накапливали микроРНК. (А) График корреляции экспрессированных микроРНК в экзосомах MDA-MB231 и экзосомах MCF10A. (В) Графики корреляции среди микроРНК в клетках и соответствующими экзосомами с использованием 6 из дифференциально экспрессировавшихся микроРНК между нормосомами и онкосомами (miR-10a, miR-10b, miR-21, miR-27a, miR-155 и miR-373) после 72 ч бесклеточного культивирования. (С) Нормосомы и онкосомы ресуспендировали в среде DMEM и поддерживали в бесклеточной культуре в течение 24 и 72 ч. После 24 и 72 ч выделяли экзосомы и 15 микроРНК (см. табл. 4) определяли количественно методом кПЦР. Кратность изменения каждой микроРНК в экзосомах после 72 ч бесклеточного культивирования определяли количественно относительно такой же микроРНК в экзосомах после 24 ч бесклеточного культивирования. На графических диаграммах представлены средняя кратность изменения опухолесупрессорных (TS) и онкогенных (ONC) микроРНК в экзосомах, собранных после 72 ч по сравнению с экзосомами, собранными после 24 ч. (D) Нозерн-блоты для miR-10b и miR-21, полученных из нормосом после 24 и 72 ч бесклеточного культивирования, и онкосом без культивирования и с 24 ч, 72 ч и 96 ч бесклеточного культивирования. В качестве контроля нагрузки использовали tRNAMet. Количественное определение проводили с использованием программного обеспечения Image J. (Е) Диаграммы корреляции среди 15 количественно определенных микроРНК в клетках MCF10A, MDA-MB231 и 4Т1 и соответствующим им экзосомам после 72 ч бесклеточного культивирования. Онкосомы проявляли низкие значение корреляции со своими клетками происхождения (средний и правый график) по сравнении с нормосомами (левый график). (F) На графике, полученном с помощью биоанализатора, представленном в единицах флуоресценции (ЕФ) за секунду (с), представлены изображения гелей для определения содержания РНК экзосом в нормосомах и онкосомах.
[0039] Фиг. 3А-Е. Экзосомы содержат пре-микроРНК. (А) Пятнадцать пре-микроРНК, соответствующих зрелым исследованным микроРНК, определяли количественно с использованием кПЦР в экзосомах MCF10A и MDA-MB231. Для каждой пре-микроРНК для отражения ее содержания на график нанесли обратное значение ΔCt и значения представили в виде ± с.о. (В) Онкосомы и нормосомы ресуспендировали в среде DMEM и поддерживали в условиях бесклеточной культуры в течение 24 и 72 ч. После 24 и 72 ч еще раз извлекали экзосомы и 15 пре-микроРНК определяли количественно методом кПЦР. На графиках, представленных в виде ± с.о., показана кратность изменения каждой пре-микроРНК в экзосомах MCF10A и MDA-МВ231 после 72 ч бесклеточного культивирования относительно 24 ч бесклеточного культивирования. (С) Нозерн-блоты для premiR-10b и pre-miR-21, полученных с использованием нормосом MCF10A после 24 и 72 ч бесклеточного культивирования, и онкосом MDA-MB231 с 0 ч, 24 ч, 72 ч и 96 ч бесклеточного культивирования. В качестве контроля нагрузки использовали tRNAMet. Количественное определение проводили с использованием программного обеспечения Image J. (D) Верхние графики: После 24 ч и 72 ч в условиях бесклеточного культивирования определили количество онкогенных пре-микроРНК (левый график) и онкогенных микроРНК (правый график) из онкосом (MDA-MB231) Для каждой пре-микроРНК (левый график) и микроРНК (правый график) на график нанесли обратное значение ΔCt в разные временные точки для отражения их относительного содержания и по данным был отмечен экспоненциальный тренд. Приведенные данные, представленные в виде СО, являются результатом трех повторных анализов биологических образцов. Нижние графики: В условиях бесклеточного культивирования через 6 ч, 12 ч, 24 ч, 36 ч, 48 ч, 72 ч и 96 ч определили количество пре-микроРНК (левый график) и зрелых микроРНК (правый график) из онкосом (MDA-MB231). Для каждой пре-микроРНК (левый график) и микроРНК (правый график) на график нанесли обратное значение ΔCt в разные временные точки и по данным был отмечен экспоненциальный тренд. Данные, приведенные на этой фигуре и представленные в виде ± с.о., являются результатом трех независимых экспериментов, каждый проведен в трех повторах. (В) Онкосомы и нормосомы ресуспендировали в среде DMEM и поддерживали в условиях бесклеточной культуры в течение 0 ч, 24 ч, 72 ч и 96 ч. Экзосомы извлекали в разные временные точки и методом кПЦР определяли количественно пре-микроРНК. Для каждой пре-микроРНК на график нанесли обратное значение ΔCt в разные временные точки для отражения их относительного содержания.
[0040] Фиг. 4A-N. Онкосомы содержат RLC-белки. (А) Иммуноблот с использованием анти-Dicer антитела на экзосомах, собранных из: линий клеток нетуморогенных мышей (NMuMG) и человека (MCF10A); линий раковых клеток мыши, 67NR и 4Т1 и линий раковых клеток человека MCF7 и MDA-MB231. Использованные контроли были: экзосомами, обработанными Тритоном X и с последующей обработкой протеиназой K (Тритон + ПК), для индуцирования лизиса экзосом и последующей деградации экзосомальных белков, и экзосомами, обработанными протеиназой K (ПК) для деградации внеэкзосомальных белков. TSG101- (второй ряд) и CD9-иммуноблоты (третий ряд) использовали для подтверждения наличия экзосом. (В) Микрофотографии, полученные методом просвечивающей электронной микроскопии, иммунометок с частицами золота с использованием анти-Dicer антитела в онкосомах (MDA-MB231). Правое верхнее изображение увеличено цифровом способом из нового независимого изображения этого выделения. Отрицательный контроль относится к IgG. Частицы золота видны в виде черных точек и указаны черными стрелками на нижнем изображении. На графике приведено количественное определение по двум верхним изображениям слева. (С) Иммуноблот с использованием анти-flag антитела (верхнее изображение) в экзосомах MCF10A и MDA-MB231, собранных из клеток, трансфецированных пустым вектором (pCMV-Tag4B; первая и третья дорожки, соответственно) и вектор Flag-Dicer (вторая и четвертая дорожки). Для подтверждения наличия экзосом, а также для контроля нагрузки (нижнее изображение), использовали иммуноблот CD9. (D) Иммуноблот для Dicer в экзосомах, собранных из клеток MCF10A и MDA-MB231, обработанных кальциевым ионофором А23187 (верхнее изображение). В качестве контроля использовали экзосомы, извлеченные из необработанных клеток. Для того, чтобы показать увеличившуюся секрецию экзосом в качестве контроля использовали иммуноблот CD9 (нижнее изображение). (Е) Иммуноблот касательно Dicer в экзосомах, извлеченных из исходных клеток MCF10A и MDA-MB231 и клеток, трансфецированных плазмидами shScramble и shDicer (верхний блот). Для того, чтобы показать наличие экзосом, а также для контроля нагрузки (нижнее изображение), использовали иммуноблот CD9. Количественное определение при иммуноблоттинге проводили с использованием программного обеспечения Image J. (F) Микрофотографии, полученные методом просвечивающей электронной микроскопии, иммунометок с частицами золота с использованием анти-Dicer антитела в онкосомах, полученных из клеток MDAMB231shDicer. Частицы золота видны в виде черных точек. На правом графике изображено количественное определение золотых частиц на изображениях ЭМ. (G) Иммуноблот с использованием анти-AGO2 антитела в экзосомах, собранных из онкосом (MCF7 и MDA-MB231) и нормосом (MCF10A). Использованные контроля были: экзосомами, обработанными Тритоном X и далее протеиназой K (Тритон + ПК), для индуцирования лизиса экзосом и последующей деградации экзосомальных белков; экзосомами, обработанными протеиназой K (ПК) для деградации внеэкзосомальных белков; и супернатантом после ультрацентрифугирования для сбора экзосом (супернатант). TSG101- (второй ряд) и CD9-иммуноблоты (третий ряд) использовали для подтверждения наличия экзосом. (Н) Иммуноблот с использованием анти-TRBP антитела в экзосомах, собранных из онкосом (MCF7 и MDA-MB231) и нормосом (MCF10A). Использованные контроли были: экзосомами, обработанными Тритоном X и далее протеиназой K (Тритон + ПК), для индуцирования лизиса экзосом и последующей деградации экзосомальных белков; экзосомами, обработанными протеиназой K (ПК) для деградации внеэкзосомальных белков; и супернатантом после ультрацентрифугирования для сбора экзосом (супернатант). В качестве маркеров экзосом использовали TSG101- (второй ряд) и CD9-иммуноблоты (третий ряд). (I) Иммуноблот с использованием анти-GFP антитела в клетках MCF10A и MDA-MB231, трансфецированных плазмидой GFP-AGO2 (верхнее изображение). В качестве контроля нагрузки использовали бета-актин (нижнее изображение). (J) Иммуноблот с использованием анти-GFP антитела в экзосомах, извлеченных из клеток MCF10A и MDA-MB231, трансфецированных плазмидой GFP-AGO2 (верхнее изображение). В качестве маркеров экзосом и контролей нагрузки использовали TSG101 (среднее изображение) и CD9 (нижнее изображение). (K) Экспрессия мРНК AGO2 в клетках MCF10A и MDA-MB231, трансфецированных siAGO2. В качестве относительных контролей для сравнения кратности изменений использовали исходные клетки MCF10A и MDA-MB231. Данные, представленные в виде СО, являются результатом трех повторных анализов биологических образцов. (L) Иммуноблот с использованием антитела к AGO2 в экзосомах, извлеченных из исходных клеток MCF10A и MDA-MB231 или клеток, трансфецированных sicontrol или siAGO2 (верхнее изображение). В качестве маркеров экзосом и контролей нагрузки использовали TSG101 (средний блот) и CD9 (нижний блот). Количественное определение проводили с использованием программного обеспечения Image J. (М) Иммуноблот с использованием антитела к AGO2 в экзосомальных белках, извлеченных из клеток MCF10A и MDA-MB231, осажденных иммунопреципитацией с антителом к Dicer или IgG (верхнее изображение). В качестве контроля использовали 5% лизата введенных экзосом, извлеченных из клеток MDA-MB231. В качестве контроля иммунопреципитации (нижнее изображение) использовали иммуноблот Dicer. (N) Иммуноблот с использованием анти-TRBP антитела в экзосомальных белках, извлеченных из клеток MCF10A и MDA-MB231, осажденных иммунопреципитацией с антителом к Dicer или IgG (верхнее изображение). В качестве контроля использовали лизат введенных экзосом (5%), извлеченных из клеток MDA-MB231. В качестве контроля (нижнее изображение) использовали иммуноблот Dicer.
[0041] Фиг. 5А-Е. Онкосомы процессируют пре-микроРНК для образования зрелых микроРНК. (А) Экзосомы собирали из клеток MCF10A, MCF10A shScramble, MCF10A shDicer (верхний график), клеток MDA-MB231, MDA-MB231 shScramble и MDA-MB231shDicer (нижний график) и поддерживали в условиях бесклеточного культивирования в течение 24 и 72 ч. После 24 и 72 ч выделяли экзосомы и 15 пре-микроРНК определяли количественно методом кПЦР. На графиках, представленных в виде ± с.о., показана кратность изменения каждой пре-микроРНК в разных экзосомах после 72 ч бесклеточного культивирования относительно 24 ч бесклеточного культивирования. (В) Экзосомы собирали из клеток MCF10A, MCF10A shScramble, MCF10A shDicer (верхний график), клеток MDA-MB231, MDA-MB231 shScramble и MDA-MB231shDicer (нижний график) и поддерживали в условиях бесклеточного культивирования в течение 24 и 72 ч. После 24 и 72 ч еще раз извлекали экзосомы и 15 микроРНК определяли количественно методом кПЦР. На графиках, представленных в виде ± с.о., показана кратность изменения каждой микроРНК в разных экзосомах после 72 ч бесклеточного культивирования относительно 24 ч бесклеточного культивирования. (С) Иммуноблот с использованием антикроличьего и антимышиного вторичного антитела для детекции тяжелой цепи (ТЦ) и легкой цепи (ЛЦ) первичного антитела к Dicer и первичного антитела к актину, введенных электропорацией в экзосомы клеток MDA-MB231. В качестве отрицательного контроля использовали экзосомы без антител, полученные из клеток MDA-MB231. Для обеспечения удаления антител, не включенных в экзосомы, после электропорации проводили обработки протеиназой K. (D) Онкосомы (MDA-MB231) собирали в двух повторах (нижний график) или в четырех повторах (верхний график). Образцы подвергали электропорации с анти-Dicer антителом, анти-актиновым антителом или анти-TRBP антителом. Образцы плюс контроль оставляли в условиях бесклеточного культивирования в течение 24 и 72 ч. После 24 и 72 ч еще раз извлекали экзосомы и 6 онкогенных пре-микроРНК (верхний график) или 15 пре-микроРНК (нижний график) определяли количественно методом кПЦР. Кратность изменения каждой пре-микроРНК в экзосомах после 72 ч бесклеточного культивирования определяли количественно в каждом образце относительно такой же пре-микроРНК в экзосомах после 24 ч бесклеточного культивирования. На графических диаграммах, представленных в виде ± с.о., приведена средняя кратность изменения для пре-микроРНК (значение на нижнем графике - TS = опухолесупрессорная; ONC = онкогенная) в экзосомах через 72 ч относительно экзосом через 24 ч. (D) Онкосомы (MDAMB231) собирали в четырех повторах (верхний график) или в двух повторах (нижний график). Образцы подвергали электропорации с анти-Dicer антителом, анти-актиновым антителом или анти-TRBP антителом. Образцы плюс контроль оставляли в условиях бесклеточного культивирования в течение 24 и 72 ч. После 24 и 72 ч еще раз извлекали экзосомы и 6 онкогенных микроРНК (верхний график) или 15 микроРНК (нижний график) определяли количественно методом кПЦР. В каждом образце кратность изменения каждой микроРНК в экзосомах после 72 ч бесклеточного культивирования определяли количественно относительно такой же микроРНК в экзосомах после 24 ч бесклеточного культивирования. На графических диаграммах, представленных в виде ± с.о., приведена средняя кратность изменения для микроРНК (значение на нижнем графике - TS = опухолесупрессорная; ONC = онкогенная) в экзосомах через 72 ч относительно экзосом через 24 ч.
[0042] Фиг. 6A-F. Онкосомы процессируют пре-микроРНК для образования зрелых микроРНК. (А) Экзосомы из клеток MDA-MB231 собирали и подвергали электропорации с глендамицином. Образцы оставляли в условиях бесклеточного культивирования в течение 24 и 72 ч, после чего экзосомы извлекали и определяли количественно 6 микроРНК методом кПЦР. В каждом образце кратность изменения каждой микроРНК в экзосомах после 72 ч бесклеточного культивирования определяли количественно относительно такой же микроРНК в экзосомах после 24 ч бесклеточного культивирования. На графических диаграммах, представленных в виде ± с.о., приведена средняя кратность изменения для микроРНК в экзосомах через 72 ч относительно экзосом через 24 ч. (В) Синтетические пре-микроРНК -10b, -21 и -cel-1 подвергали электропорации в экзосомы, собранные из клеток MCF10A (MCF10A электроп.), MCF10AshDicer (MCF10AshDicer электроп.), MDAMB231 (MDA-MB231 электроп.) и MDA-MB231shDicer (MDAMB231shDicer электроп.). Экзосомы выделяли после условий бесклеточного культивирования в течение 72 ч. Методом кПЦР определяли количество pre-miR-10b, -21 и -cel-1 перед и после 72 ч проведения электропорации и культивирования. Каждый прямоугольник на диаграммах, представленных в виде ± с.о., показывает кратность изменения pre-miR-10b, -21 и -cel-1 через 72 ч после проведения электропорации относительно 0 ч после электропорации. Экзосомы MCF10A и MDA-MB231, подвергшиеся электропорации в отсутствие пре-микроРНК, использовали в качестве контролей для демонстрации исходных уровней. (С) Синтетические пре-микроРНК -10b, -21 и -cel-1 подвергали электропорации в экзосомы, собранные из клеток MCF10A (MCF10A электроп.), MCF10AshDicer (MCF10AshDicer электроп.), MDA-MB231 (MDA-MB231 электроп.) и MDAMB231shDicer (MDA-MB231shDicer электроп.). Экзосомы выделяли после условий бесклеточного культивирования в течение 72 ч. Методом кПЦР определяли количество miR-10b, -21 и -cel-1 перед и после 72 ч проведения электропорации и культивирования. Каждый прямоугольник на диаграммах, представленных в виде ± с.о., показывает кратность изменения miR-10b, -21 и -cel-1 через 72 ч после проведения электропорации относительно 0 ч (верхний график) или 24 ч (нижний график) после электропорации. Экзосомы MCF10A и MDA-MB231, подвергшиеся электропорации в отсутствии пре-микроРНК, использовали в качестве контролей для определения исходных уровней. (D) Нозерн-блот без зонда для детекции с использованием образцов из dicing-анализа. Экстракты разных экзосомальных белков и синтетической pre-miR-10b, внутримолекулярно меченые биотином, использовали для dicing-анализа. Использованные образцы были экзосомами MCF10A, MCF10AshDicer, MDA-MB231 (MDA231 Exos), экзосомами из клона 1 и клона 2 MDA-MB231shDicer (MDA231shDicer 1 exos и MDA231shDicer 2 exos, соответственно), экзосомами клеток MDA-MB231shDicer и экзосомами MDA-MB231, подвергшимися электропорации с антителом к Dicer (MDA231 exos + Dicer АВ). (Е) Нозерн-блот без зонда для детекции с использованием образцов из dicing-анализа. Экстракты разных экзосомальных белков и синтетической pre-miR-21, внутримолекулярно меченые биотином, использовали для dicing-анализа. Использованные образцы были экзосомами MCF10A, MCF10AshDicer, MDA-MB231 (MDA231 Exos), экзосомами из клона 1 и клона 2 MDA-MB231shDicer (MDA231shDicer 1 exos и MDA231shDicer 2 exos, соответственно), экзосомами клеток MDA-MB231shDicer и экзосомами MDA-MB231, подвергшимися электропорации с антителом к Dicer (MDA231 exos + Dicer АВ). (F) Нозерн-блот без зонда для детекции с использованием образцов из dicing-анализа. Экстракты разных экзосомальных белков и синтетической pre-cel-miR-1, внутримолекулярно меченые биотином, использовали для dicing-анализа. Использованные образцы были экзосомами MCF10A, MCF10AshDicer, MDA-MB231 (MDA231 Exos), экзосомами MDA-MB231shDicer (MDA231shDicer exos) и экзосомами MDAMB231, подвергшимися электропорации с антителом к Dicer (MDA231 exos + Dicer АВ). Данные, представленные в виде СО, являются результатом трех повторных анализов биологических образцов.
[0043] Фиг. 7А-Н. Онкосомы индуцируют изменения транскриптома в клетках-реципиентах и образование опухоли Dicer-зависимым способом. (А) Иммуноблот с использованием анти-PTEN антитела и белковых экстрактов клеток MCF10A, обработанных в течение 0, 30 мин, 1 ч, 12 ч и 24 ч онкосомами MDA-MB231 после бесклеточного культивирования. В качестве контроля нагрузки использовали бета-актин. (В) Иммуноблот с использованием анти-HOXD10 антитела и белковых экстрактов клеток MCF10A, обработанных в течение 0, 30 мин, 1 ч, 12 ч и 24 ч онкосомами MDA-MB231 после условий бесклеточного культивирования. В качестве контроля нагрузки использовали бета-актин. (С) График, показывающий активность люциферазного репортера в клетках MCF10A, транзиентно трансфецированных 3'UTR-PTEN-WT, 3'UTRPTEN-Mut, 3'UTR-HOXD10-WT и 3'UTR-HOXD10-Mut и обработанных онкосомами, полученными из клеток MDA-MB231. (D) Иммуноблот с использованием анти-PTEN антитела (верхнее изображение), анти-HOXD10 антитела (среднее изображение) и белковых экстрактов из клеток MCF10A, обработанных в течение 0, 30 мин, 1 ч, 12 ч и 24 ч онкосомами MDAMB231, подвергшихся электропорации антителом Dicer после условий бесклеточного культивирования. В качестве контроля нагрузки использовали бета-актин. (Е) Иммуноблот с использованием анти-Smad4 антитела (верхнее изображение) и белковых экстрактов клеток MCF10A и клеток MCF10A, обработанных экзосомами MDA-MB231 с анти-miR-182-5p и экзосомами MDA-MB231 без проведения бесклеточного культивирования. В качестве контроля нагрузки использовали бета-актин. (F) Жизнеспособность клеток, представленную в виде ± с.о., измеряли анализом с МТТ в течение 5 суток культивирования клеток MCF10A, клеток MCF10A, обработанных экзосомами MDA-MB231 без бесклеточного культивирования (MCF10A + MDA231 exos), клеток MCF10A, обработанных экзосомами MDA-MB231 с бесклеточным культивированием (клетки MCF10A + культивирование с MDA231 exos) и клеток MCF10A, обработанных экзосомами MDA-MB231, подвергшихся электропорации с антителом к Dicer с бесклеточным культивированием (клетки MCF10A + MDA231 exos Dicer АВ).* р=0,0027. (G) Анализ образования колоний показывает образование колоний на культуральном планшете и меченых реактивом МТТ через 8 суток культивирования клеток MCF10A, клеток MCF10A, обработанных экзосомами MDA-МВ231 без бесклеточного культивирования (MCF10A + MDA231 exos), клеток MCF10A, обработанных экзосомами MDA-MB231 с бесклеточным культивированием (клетки MCF10A + культивирование с MDA231 exos) и клеток MCF10A, обработанных экзосомами MDA-MB231, подвергшихся электропорации антителом к Dicer с бесклеточным культивированием (клетки MCF10A + MDA231 exos Dicer АВ). (Н) Верхний график: Клетки MCF10A и клетки MCF10A, подвергшиеся воздействию онкосом MDA-MB-231 (клетки MCF10A + культивирование с MDA231 exos), клетки MCF10A, подвергшиеся воздействию онкосом MDA-MB231, введенных электропорацией с антителом к Dicer (клетки MCF10A + MDA231 exos Dicer АВ), и клетки MCF10A, подвергшиеся воздействию онкосом MDAMB231, введенных электропорацией с антителом к актину (клетки MCF10A + MDA231 exos актин АВ), ортотопически инъецировали в подложки молочных желез бестимусных мышей. На графике изображен объем опухоли, представленный в виде ± с.о., с течением времени. *р=0,005. Нижний график: Клетки MCF10A, клетки MDA-MB231 и клетки MCF10A, подвергшиеся воздействию онкосом (MDA-MB231), ортотопически инъецировали в подложки молочных желез бестимусных мышей. На графике изображен объем опухоли в отношении времени.
[0044] Фиг. 8A-I. Сыворотка от пациентов с раком молочной железы содержит Dicer и процессирует пре-микроРНК. (А) Иммуноблот с использованием анти-Dicer антител, которые распознают Dicer человека и мыши, и белковые экстракты из сывороточных экзосом, собранных у мышей с ксенотрансплантатами опухоли человека (как показано на фиг. 18А). OVA1-5 представляет ксенотрансплантат яичника; END 1-3 представляет ксенотрансплантат эндометрия человека; a BRST1 и 2 представляет ксенотрансплантат молочной железы человека. В качестве контроля для мышиного Dicer использовали экзосомы 4Т1 и клеток. hsa-Dicer представляет молекулярную массу человеческого Dicer, a mmu-Dicer представляет молекулярную массу мышиного Dicer. См. фиг. 18D по окрашиванию Кумасси мембран, в качестве контроля нагрузки. (В) Анализ отслеживания частиц NanoSight показывает распределение размеров экзосом, извлеченных из сыворотки 8 здоровых доноров (левый график) и 11 пациентов с раком молочной железы (правый график). Для лучшей демонстрации размера концентрацию образцов стандартизировали. (С) Микрофотография экзосом, полученная методом просвечивающей электронной микроскопии, собранных из сыворотки пациентов с раком молочной железы. (D) Концентрация экзосом из сыворотки 8 здоровых доноров и 11 пациентов с раком молочной железы оценивали анализом отслеживания частиц NanoSight. *р=0,012 (Е) Экзосомы собирали из свежей сыворотки у 8 здоровых доноров и 11 пациентов с раком молочной железы. Извлеченные образцы оставляли в условиях бесклеточного культивирования в течение 24 и 72 ч. После 24 и 72 ч выделяли экзосомы и 6 пре-микроРНК определяли количественно методом кПЦР. Кратность изменения каждой пре-микроРНК в экзосомах после 72 ч бесклеточного культивирования определяли количественно в каждом образце относительно такой же пре-микроРНК в экзосомах после 24 ч бесклеточного культивирования. На графических точечных диаграммах, представленных в виде ± с.о., приведена средняя кратность изменения для микроРНК в экзосомах через 72 ч относительно экзосом через 24 ч. (F) Экзосомы собирали из свежей сыворотки у 8 здоровых доноров и 11 пациентов с раком молочной железы. Извлеченные образцы оставляли в условиях бесклеточного культивирования в течение 24 и 72 ч. После 24 и 72 ч выделяли экзосомы и 6 пре-микроРНК определяли количественно методом кПЦР. В каждом образце кратность изменения каждой микроРНК в экзосомах после 72 ч бесклеточного культивирования определяли количественно относительно такой же микроРНК в экзосомах после 24 ч бесклеточного культивирования. На графических точечных диаграммах приведена средняя кратность изменения для микроРНК в экзосомах через 72 ч относительно экзосом через 24 ч. Оба изображения Е и F, представленные в виде ± с.о., являются результатом трех независимых экспериментов, каждый проведен в трех повторах. (G) Клетки MCF10A и клетки MCF10A, смешанные с экзосомами от здоровых доноров (HI-8), и клетки MCF10A, смешанные с экзосомами от пациентов с раком грудной железы (ВС1-11), ортотопически инъецировали в подложки молочных желез бестимусных мышей. Количество использованных экзосом, отражающее начальную концентрацию собранных из сыворотки экзосом, рассчитывали на массу тела. Образцы, которые не привели к образованию опухоли, оказались перекрывающимися на х-оси графика. На графике изображен объем опухоли, представленный в виде ± с.о., в отношении времени. (Н) Иммуноблоты с использованием анти-Dicer антитела и белковых экстрактов из сывороточных экзосом, собранных у 5 здоровых индивидов (С46, С45, С44, С43 и С41) и 4 метастатических карцином молочной железы (Met219, Met354, Met299 и Met356) с использованием CD9-блота в качестве контроля нагрузки. (I) Удвоение времени HDF и обработанных онкосомами (MDA-MB231) HDF. *р=0,0114. Количественное определение при иммуноблоттинге проводили с использованием программного обеспечения Image J.
[0045] Фиг. 9А-В. Dicer присутствует в мультивезикулярных тельцах, а цитоплазматический CD43 мобилизирует Dicer в экзосомах. (А) Иммуноблот CD43 в белковых экстрактах клеток MDA-MB231, осажденных иммунопреципитацией с антителом к Dicer (IP Dicer) или с IgG (верхнее изображение, правая и средняя дорожки, соответственно). В качестве контроля (нижнее изображение) использовали иммуноблот одного Dicer. (В) Иммуноблот Dicer в белковых экстрактах MDA-MB231, полученных из экзосом, и MDA-MB231 siCD43, полученных из экзосом. В качестве контроля нагрузки использовали иммуноблот CD9. Количественное определение проводили с использованием программного обеспечения Image J.
[0046] Фиг. 10А-Е. Определение характеристик экзосом. (А) Фотография окрашенных PKH26 экзосом на дне пробирки для ультрацентрифугирования. На вставке приведено изображение с цифровым увеличением экзосом. (В) Схематическое представление экспериментальной системы, использованной для получения спектров СРС. (С) Жизнеспособность клеток, измеренная анализом в течение 5 суток культивирования клеток MCF10A, NMuMG, MDA-MB231 и 4Т1. (D) Анализ методом проточной цитометрии клеток MDA-MB231 и 4Т1 с йодидом пропидия (PI) и алексином V. В качестве положительного контроля апоптоза использовали клетки MDA-MB231, обработанные этопозидом. (Е) Анализ методом иммуноблоттинга цитохрома С в экзосомах с использованием клеток MDA-MB231 в качестве положительного контроля и TSG101 в качестве контроля нагрузки экзосом. Данные, приведенные на этой фигуре и представленные в виде ± с.о., являются результатом трех независимых экспериментов, каждый проведен в трех повторах.
[0047] Фиг. 11А-Е. В онкосомах по сравнению с нормосомами накапливаются онкогенные микроРНК. (А) На графике, полученном с помощью биоанализатора, представленном в единицах флуоресценции (ЕФ) на нуклеотид (нт) (графики), представлены изображения гелей (правое изображение) для определения содержания РНК в линиях клеток MCF10A молочной железы человека (нетуморогенной) и MDA-МВ231 (рак молочной железы). (В) Экзосомы, собранные из клеток 4Т1, MCF10A и MDA-MB231, ресуспендировали в среде DMEM и поддерживали в условиях бесклеточного культивирования в течение 24 и 72 ч. После 24 и 72 ч выделяли экзосомы и 15 микроРНК (см. табл. 4) определяли количественно методом кПЦР. На графиках показана кратность изменения каждой микроРНК в экзосомах после бесклеточного культивирования в течение 24 ч (верхний график) и 72 ч (нижние графики) относительно нормосом после 24 и 72 ч бесклеточного культивирования, соответственно. Приведенные данные, представленные в виде СО, являются результатом трех повторных анализов биологических образцов. (С) Методом кПЦР определяли количественно пятнадцать зрелых микроРНК (см. табл. 4) в клетках MCF10A (левый график), MDA-MB231 (средний график) и 4Т1 (правый график) и соответствующих им экзосомах. Кратность изменения каждой микроРНК в экзосомах определяли количественно относительно такой же микроРНК в клетках. TS: опухолесупрессорные микроРНК; ONC: онкогенные микроРНК. Данные, представленные в виде СО, являются результатом трех повторных анализов биологических образцов. (D) Экзосомы, собранные из клеток MCF10A, MDA-MB231 и 4Т1, ресуспендировали в среде DMEM и поддерживали в течение 24 и 72 ч в условиях бесклеточного культивирования. После 24 и 72 ч еще раз извлекали экзосомы и 15 микроРНК (см. табл. 4) определяли количественно методом кПЦР. Кратность изменения каждой микроРНК в экзосомах после 72 ч бесклеточного культивирования определяли количественно относительно такой же микроРНК в экзосомах после 24 ч бесклеточного культивирования. Данные соответствуют подробным графикам средней кратности изменения на фиг. 2С. Данные, приведенные на этой фигуре и представленные в виде ± с.о., являются результатом трех независимых экспериментов, каждый проведен в трех повторах. (Е) Диаграммы корреляции среди 15 количественно определенных микроРНК в клетках MCF7 и 67NR и соответствующим им экзосомам после 72 ч бесклеточного культивирования.
[0048] Фиг. 12А-Е. Экзосомы содержат пре-микроРНК. (А) Пятнадцать пре-микроРНК, соответствующих зрелым микроРНК, которые предварительно количественно определены (см. табл. 4), определяли количественно методом кПЦР в экзосомах NMuMG и 4Т1. Для каждой пре-микроРНК для отражения ее содержания на график нанесли обратное значение ΔCt. Данные, представленные в виде ± с.о., являются результатом трех повторных анализов биологических образцов. (В) Экзосомы, собранные из клеток NMuMG и 4Т1, ресуспендировали в среде DMEM и поддерживали в течение 24 и 72 ч в условиях бесклеточного культивирования. После 24 и 72 ч еще раз извлекали экзосомы и 15 пре-микроРНК определяли количественно методом кПЦР. На графиках показана кратность изменения каждой пре-микроРНК в экзосомах NMuMG и 4Т1 после 72 ч бесклеточного культивирования относительно 24 ч бесклеточного культивирования. Данные, представленные в виде СО, являются результатом трех повторных анализов биологических образцов. (С) Экспрессия XPO5 мРНК в клетках MDAMB231 с двумя транзиентно трансфецированными миРНК, нацеленными на ХРO5, в сравнении с кратностью изменения относительно контрольных клеток. (D) Клетки MDA-MB231 трансфецировали конструкциями XPO5 миРНК, а экспрессию miR-21 оценивали в нескольких временных точках через 12 ч после трансфекции (0 ч, 6 ч, 12 ч, 24 ч, 36 ч, 48 ч, 72 ч и 96 ч). Для сравнения, чтобы показать влияние долгих периодов времени центрифугирования клетки MDA-MB231, трансфецированые конструкциями XPO5 миРНК, центрифугировали при 4°С в течение 3 ч и возвращали в культуру. Экспрессию miR-21 оценивали в нескольких временных точках после центрифугирования (0 ч, 6 ч, 12 ч, 24 ч, 36 ч, 48 ч, 72 ч и 96 ч). Процессинг premiR21 в miR-21 показан в центрифугированных клетках (зеленый прямоугольник). Приведенные на этой фигуре данные и представленные в виде ± с.о., являются результатом трех независимых экспериментов, каждый проведен в трех повторах. (Е) Экзосомы, собранные из клеток NMuMG и 4Т1, ресуспендировали в среде DMEM и поддерживали в течение 0, 24, 72 и 96 ч в условиях бесклеточного культивирования. Экзосомы извлекали в разные временные точки и методом кПЦР определяли количественно пре-микроРНК. Для каждой пре-микроРНК на график нанесли обратное значение ΔCt в разные временные точки для отражения их относительного содержания. Данные, представленные в виде СО, являются результатом трех повторных анализов биологических образцов.
[0049] Фиг. 13А-Н. Онкосомы содержат Dicer. (А) Изображение микрофотографии, полученное методом просвечивающей электронной микроскопии с помощью иммунометок с частицами золота с использованием анти-Dicer антитела (правые фотографии), и отрицательный контроль (левые фотографии) в экзосомах, полученных из клеток MCF10A. Сравнение с фиг. 4В для положительного введения иммунометок с частицами золота в экзосомы MDA-MB231. (В) Изображение микрофотографии, полученное методом просвечивающей электронной микроскопии с помощью иммунометок с частицами золота с использованием анти-GFP антитела в экзосомах, полученных из клеток MDA-MB231. (С) Иммуноблот с использованием анти-flag антитела (верхнее изображение) в клетках MCF10A и MDAMB231, трансфецированных пустым вектором (pCMV-Tag4B; первая и третья дорожки, соответственно) и вектором Flag-Dicer (вторая и четвертая дорожки). В качестве контроля нагрузки использовали иммуноблот бета-актина (нижнее изображение). (D) Иммуноблот с использованием анти-Dicer антитела (верхнее изображение) в клонах 1 и 2 MCF10A, MCF10AshScramble и MCF10AshDicer, соответствующих клеткам (клон 1 MCF10AshDicer и клон 2 MCF10AshDicer). В качестве контроля нагрузки использовали иммуноблот бета-актина (нижнее изображение). (Е) Иммуноблот с использованием анти-Dicer антитела (верхнее изображение) в клонах 1 и 2 MDA-MB231, MDA-МВ231 shScramble и MDA-MB231shDicer, соответствующих клеткам (клон 1 MDA-МВ231 shDicer и клон2 MDA-MB231shDicer). В качестве контроля нагрузки использовали иммуноблот бета-актина (нижнее изображение). Количественное определение при иммуноблоттинге проводили с использованием программного обеспечения Image J. (F) Иммуноблот с использованием антитела к AGO2 в экзосомальных белках, извлеченных из клеток MCF10A и MDA-MB231, осажденных иммунопреципитацией с антителом к Dicer или IgG (верхнее изображение). В качестве контроля использовали 5% лизата введенных экзосом, извлеченных из клеток MDA-МВ231. В качестве контроля иммунопреципитации (нижнее изображение) использовали иммуноблот Dicer. (G) Иммуноблот с использованием анти-TRBP антитела в экзосомальных белках, извлеченных из клеток MCF10A и MDA-MB231, осажденных иммунопреципитацией с антителом к Dicer или IgG (верхнее изображение). В качестве контроля использовали лизат введенных экзосом (5%), извлеченных из клеток MDA-MB231. В качестве контроля иммунопреципитации (нижнее изображение) использовали иммуноблот Dicer. (Н) Иммуноблот Dicer в онкосомах из линий клеток А549 (рак легких человека), SW480 (рак толстого кишечника человека), HeLa (рак шейки матки человека) и 4Т07 (мышиный рак молочной железы) (верхний блот). Для подтверждения наличия экзосом и нагрузки (нижний блот) использовали иммуноблот TSG101.
[0050] Фиг. 14A-F. Выявление Dicer в экзосомах. (А) Иммуноблот с использованием анти-Dicer антитела в клетках 4Т1, 4Т1 shScramble и 4Т1 shDicer и экзосомах, собранных из клеток 4Т1 (4Т1 exos) и 4Т1 shDicer (4Т1 shDicer exos) (верхний блот). В качестве контроля нагрузки использовали иммуноблот GADPH (нижний блот). Количественное определение проводили с использованием программного обеспечения Image J. (В) Экзосомы собирали из клеток 4Т1, 4Т1 shScramble и 4Т1 shDicer и поддерживали в условиях бесклеточного культивирования в течение 24 и 72 ч. После 24 и 72 ч еще раз извлекали экзосомы и 15 пре-микроРНК определяли количественно методом кПЦР. На графиках показана кратность изменения каждой пре-микроРНК в разных экзосомах после 72 ч бесклеточного культивирования относительно 24 ч бесклеточного культивирования. Данные, представленные в виде СО, являются результатом трех повторных анализов биологических образцов. (С) Экзосомы собирали из клеток 4Т1, 4Т1 shScramble и 4Т1 shDicer и поддерживали в условиях бесклеточного культивирования в течение 24 и 72 ч. После 24 и 72 ч еще раз извлекали экзосомы и 15 микроРНК определяли количественно методом кПЦР. На графиках показана кратность изменения каждой микроРНК в разных экзосомах после 72 ч бесклеточного культивирования относительно 24 ч бесклеточного культивирования. Данные, представленные в виде СО, являются результатом трех повторных анализов биологических образцов. (D) Экзосомы собирали из клеток MDA-MB231 в двух повторах. Один из образцов подвергали электропорации с анти-Dicer антителом. Оба образца оставляли в условиях бесклеточного культивирования в течение 24 и 72 ч. После 24 и 72 ч еще раз извлекали экзосомы и 15 пре-микроРНК (см. табл. 4) определяли количественно методом кПЦР. Кратность изменения каждой пре-микроРНК в экзосомах после 72 ч бесклеточного культивирования определяли количественно в каждом образце относительно такой же пре-микроРНК в экзосомах после 24 ч бесклеточного культивирования. На графических диаграммах приведена кратность изменения для пре-микроРНК в экзосомах через 72 ч относительно экзосом через 24 ч, а подробный анализ графика представлен на фиг. 5D. Данные, представленные в виде СО, являются результатом трех повторных анализов биологических образцов. (Е) Экзосомы собирали из клеток MDA-MB231 в двух повторах. Один из образцов подвергали электропорации с анти-Dicer антителом. Оба образца оставляли в условиях бесклеточного культивирования в течение 24 и 72 ч. После 24 и 72 ч еще раз извлекали экзосомы и 15 микроРНК (см. табл. 4) определяли количественно методом кПЦР. В каждом образце кратность изменения каждой микроРНК в экзосомах после 72 ч бесклеточного культивирования определяли количественно относительно такой же микроРНК в экзосомах после 24 ч бесклеточного культивирования. На графических диаграммах приведена кратность изменения для микроРНК в экзосомах через 72 ч относительно экзосом через 24 ч, а подробный анализ графика представлен на фиг. 5Е. Данные, представленные в виде СО, являются результатом трех повторных анализов биологических образцов. (F) Графическое представление категорий (оногенных, опухолесупрессорных и с неустановленной активностью относительно развития рака) подавляющих микроРНК в экзосомах MDA-MB231, с введенным электропорацией Dicer (MDA-MB231 exos Dicer АВ), по сравнению с экзосомами MDA-MB231 (MDA-MB231 exos). На основании литературных данных микроРНК причисляют к каждой категории. Приведенные на этой фигуре данные и представленные в виде ± с.о., являются результатом трех независимых экспериментов, каждый проведен в трех повторах.
[0051] Фиг. 15А-С. Выявление Dicer в экзосомах. (А) Экзосомы собирали из клеток MCF10, MCF10AshDicer, MDA-MB231 и MDA-MB231shDicer и проводили электропорацию синтетическими пре-микроРНК-10b, -21 и -cel-1. Каждую пре-микроРНК определяли количественно методом кПЦР в измененных электропорацией экзосомах, а результаты представляли как кратность изменения по сравнению с экзосомами, для которых проводили электропорацию только буферным раствором для электропорации. (В) Точечный блот биотина, внутримолекулярно метившего pre-miR-21, -10b и -cel-1. (С) Анализ экспрессии miR-10b, -21 и -cel-1 клеток MCF10A, трансфецированных pre-miR-10b, -21 и -cel-1. Каждый прямоугольник представляет кратность изменения трансфецированных клеток по сравнению с нетрансфецированными. Приведенные на этой фигуре данные и представленные в виде ± с.о., являются результатом трех независимых экспериментов, каждый проведен в трех повторах.
[0052] Фиг. 16A-I. Dicer присутствует в мультивезикулярных тельцах, а цитоплазматический CD43 мобилизирует Dicer в экзосомы. (А) На графике приведено процентное значение колокализации на конфокальных изображениях, как определено количественно с использованием программного обеспечения image J. (В) Экспрессия мРНК Hrs, TSG101 и BiG2 после подавления с использованием двух разных миРНК для Hrs и TSG101 и двух разных sh-клонов для BiG2. В качестве контроля использовали нетрансфецированные и трансфецированные shScramble клетки. (С) Количественное определение белка анализом Брэдфорд в экзосомах, извлеченных из MCF10A, MCF10AsiHrs, MDA-MB231 и MDA-MB231siHrs (левый график), MCF10shScramble, MCF10AshBiG2, MDA-MB231 shScramble, MDA-MB231 shBiG2 (средний график), MCF10AsiTSG101 и MDA-MB231siTSG101 (правый график). В качестве относительных контролей для анализа кратности изменений использовали исходные нетрансфецированные клетки. Данные, нормализированные по количеству клеток, представляют результат, представленный в виде СО, трех повторных анализов биологических образцов. (D) Иммуноблот CD9 в экзосомальных белковых экстрактах из клеток MCF10A, MCF10AsiTSG101 (siTSG101), MCF10AsiHrs (siHrs) и MCF10AshBiG2 (shBiG2) (верхний блот); иммуноблот CD9 в экзосомальных белковых экстрактах из клеток MDA-MB231, MDA-MB231siTSG101 (siTSG101), MDA-MB231siHrs (siHrs) и MDA-MB231 shBiG2 (shBiG2) (нижний блот). (E) Анализ отслеживания частиц NanoSight для экзосом MDA-MB231, MDA-MB-231 siTSG101, -siHrs и полученных из shBiG2 экзосом, показывает подавление количества экзосом в ингибированных по Hrs, TSG101 и BiG2 клетках и предполагаемое распределение экзосом. (F) Экспрессия мРНК Dicer в клетках MCF10A, MCF10AshScramble, MCF10AsiHrs, MCF10AshBiG2, MCF10AsiTSG101, MDA-MB231, MDA-MB231shScramble, MDA-MB231siHrs, MDA-MB231shBiG2, MDA-MB231siTSG101, 4T1, 4T1siHrs, 4T1shBiG2 и 4T1siTSG101. В качестве относительного контроля для сравнения кратности изменений использовали исходные клетки. Данные, представленные в виде СО, являются результатом трех повторных анализов биологических образцов. (G) Иммуноблот Dicer в белковых экстрактах раковых клеток MDA-MB231 и 4Т1, осажденных иммунопреципитацией с анти-Dicer антителом (верхний блот, две левые дорожки) вместе с 5% введения, которое соответствует белковому лизату, использованному для иммунопреципитации (верхний блот, две правые дорожки). Иммуноблот поли-убиквитина в белковых экстрактах клеток MDA-МВ231 и 4Т1, осажденных иммунопреципитацией с анти-Dicer антителом (нижний блот, две левые дорожки) вместе с 5% введения, которое соответствует белковому лизату, использованному для иммунопреципитации (нижний блот, две правые дорожки). (Н) Экспрессия мРНК CD43 в клетках MCF10A, MCF10AsiCD43, MDA-МВ231 и MDA-MB231siCD43. В качестве относительного контроля для сравнения кратности изменений использовали исходные клетки MCF10A и MDA-MB231. Данные, представленные в виде СО, являются результатом трех повторных анализов биологических образцов. (I) Экспрессия мРНК Dicer в клетках MCF10A, MCF10AsiCD43, MDA-MB231 и MDA-MB231siCD43. В качестве относительного контроля для сравнения кратности изменений использовали исходные клетки MCF10A и MDA-MB231. Данные, представленные в виде СО, являются результатом трех повторных анализов биологических образцов.
[0053] Фиг. 17A-G. Онкосомы индуцируют изменения транскриптома в получающих их клетках и образование опухоли Dicer-зависимым способом. (А) Анализ отслеживания частиц NanoSight в экзосомах, полученных из клеток MDA-MB231 CD63-GFP. Черная линия представляет результат измерения общей популяции экзосом, а зеленая линия отображает популяцию экзосом, меченых CD63-GFP с использованием прибора NanoSight, оборудованного лазерным лучом с длиной волны 488 нм. Светло-серая и светло-зеленая линии представляют прямоугольники с величиной ошибки для каждого измерения. (В) Иммуноблот с использованием анти-PTEN антитела и белковых экстрактов клеток MCF10A, обработанных в течение 0, 30 мин, 1 ч, 12 ч и 24 ч свежевыделенными онкосомами MDA-MB231. В качестве контроля нагрузки использовали бета-актин. (С) Иммуноблот с использованием анти-HOXD10 антитела и белковых экстрактов клеток MCF10A, обработанных в течение 0, 30 мин, 1 ч, 12 ч и 24 ч свежевыделенными онкосомами MDA-MB231. В качестве контроля нагрузки использовали бета-актин. (D) Клетки MCF10A трансфецировали миРНКк XPO5 для подавления потока пре-микроРНК из ядра в цитоплазму. Процессинг pre-miR15 оценивали измерением уровней miR-15 с течением времени (6 ч, 12 ч, 24 ч, 36 ч и 48 ч) в клетках MCF10AsiXPO5 и клетках MCF10AsiXPO5, обработанных экзосомами MDA-МВ231 с и без антитела к Dicer. Значимых изменений отмечено не было. (Е) Экспрессию miR182-5p мониторили в экзосомах, полученных из MDA-MB231, с течением времени (0 ч, 6 ч, 12 ч, 24 ч, 36 ч, 48 ч, 72 ч и 96 ч). Каждый прямоугольник представляет кратность изменения каждой временной точки по сравнению с 0 ч. Значимых изменений отмечено не было. (F) На графике представлено определение количества колоний из фиг. 7G. *р=0,0006. (G) Иммуноблот с использованием анти-Dicer антитела и белковых экстрактов клеток MCF10A, обработанных в течение 0, 30 мин, 1, 12 и 24 ч онкосомами MDA-MB231, с веденным электропорацией антителом Dicer после условий бесклеточного культивирования. В качестве контроля нагрузки использовали альфа-тубулин.
[0054] Фиг. 18A-D. Экзосомы от пациентов с раком молочной железы содержат Dicer, процессируют пре-микроРНК и вводят клетки в разные органы. (А) Репрезентативные фотографии ортотопических ксенотрансплантатов, полученных у бестимусных мышей из фрагментов свежей первичной опухоли яичника человека, опухолей эндометрия и молочной железы. (В) Окрашивание гематоксилином-эозином (НЕ) ортотопических ксенотрансплантатов яичника, эндометрия и рака молочной железы. (С) Микрофотография сывороточных экзосом, полученная методом просвечивающей электронной микроскопии, собранных у мышей с ортотопическими ксенотрансплантатами. (D) Окрашивание Кумасси мембран из иммуноблотов, отображенных на фиг. 8А.
ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ РЕАЛИЗАЦИИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0055] Прогрессирование рака зависит от эффективной коммуникации между клетками опухоли. Экзосомы представляют собой нановезикулы, секретируемые всеми типами клеток, и содержат белки и нуклеиновые кислоты. Экзосомы, секретируемые раковыми клетками, содержат исключительно микроРНК (микроРНК), ассоциированные с РНК-индуцируемым комплексом сайленсинга (RISC; Dicer/TRBP/AGO2), и обладают автономной от клетки способностью процессировать предшественники микроРНК (пре-микроРНК) в зрелые микроРНК. Наличие RISC-ассоциированных микроРНК, вместо голых микроРНК, позволяет обеспечивать высокоэффективный и быстрый сайленсинг мРНК в клетках-мишенях эффективно изменяя их транскиптом. RISC-белки в раковых клетках исключительно направлены на мультивезикулярные тельца (MVB) и далее на экзосомы CD43-зависимым способом. RISC-внедренные микроРНК экзосом стимулируют нетуморогенные эпителиальные клетки, вызывая образование опухолей посредством специфической индукции онкогенных механизмов и активируя стромальные фибробласты. Это исследование раскрывает возможную роль раковых экзосом в индуцировании онкогенного «полевого эффекта», который далее подчиняет нормальные клетки относительно участия в развитии и прогрессировании рака. Более того, биогенез микроРНК может происходить в экзосомах независимым от клеток способом, который предлагает новые возможности для конструирования эффективной микроРНК-опосредованной таргетной терапии большого количества заболеваний.
I. Экзосомы, возникающие при раковых заболеваниях
[0056] Опухоли содержат раковые клетки и стромальные элементы (Tse и Kalluri, 2011). Появившееся доказательство свидетельствует о том, что коммуникация между клетками опухолей и их окружением также определяет скорость и интенсивность системного распространения при раковом заболевании (Luga et al., 2012). В некоторых исследованиях предполагается, что первичные опухоли могут обучаться и подготавливать места для вторичных опухолей для развития будущих метастаз посредством секретируемых раковыми клетками факторов (Hood et al., 2011; Peinado et al., 2012). Идентифицировали несколько таких медиаторов, которые включают растворимые факторы роста, метаболиты глюкозы, хемокины, ферменты, микрочастицы, микровезикулы, экзосомы и свободные нуклеиновые кислоты (Guermonprez et al., 2002; Luga et al., 2012; Peinado et al., 2012; Simons and Raposo, 2009; Thery and Casas, 2002).
[0057] В последние годы выпущено множество публикаций, касающихся экзосом и их связи с раковыми заболеваниями (Yang и Robbins, 2011). В большинстве исследований показано, что раковые клетки секретируют большое количество экзосом по сравнению с нормальными клетками (Yang и Robbins, 2011). Раковые клетки в условиях гипоксии выбрасывают больше экзосом, чем раковые клетки в нормоксических условиях (King et al., 2012). Предполагают, что экзосомы, полученные при раковых заболеваниях, несут специфические нагрузочные вещества из белков и нуклеиновых кислот, включая микроРНК (Valadi et al., 2007). Вызывая размышления, таким исследованиям не хватает объяснения как белки и микроРНК могут индуцировать значительные функциональные, близкие или дальние, изменения в клетках-мишенях. В большинстве исследований идентифицировали зрелые микроРНК в экзосомах, но их функции в большой степени неизвестны. Более того, одноцепочечные микроРНК без включения RISC для облегчения распознавания мРНК являются в высшей мере неэффективными при сайленсинге мРНК-мишеней. Белки RLC распознают пре-микроРНК и процессируют ее в 22-нуклеотидный РНК-дуплекс. AGO2 выбирает одну цепь для последующего сайленсинга гена, в то время как другая цепь часто деградирует. Общая реакция является спонтанной и не требует каких-либо факторов кроме трех белков и внедренных пре-микроРНК (Maniataki и Mourelatos, 2005). Следовательно, для того чтобы микроРНК были полностью функциональными, они требуют RLC-внедренного процессинга своих пре-микроРНК и AGO-опосредованного распознавания и сайленсинга мРНК.
[0058] В данном документе, исследовали микроРНК-профили экзосом из раковых клеток (онкосом) и контрольных клеток (нормосом), а для оценки достижения сайленсинга генов и изменения транскриптома клетки-мишени оценивали функциональные характеристики экзосомальных микроРНК. Онкосомы содержат исключительно Dicer, TRBP и AGO2 в качестве функционального комплекса с возможностью процессировать пре-микроРНК в микроРНК. пре-микроРНК присутствовали во всех экзосомах, но процессировались только в онкосомах, благодаря наличию RLC. Интересно, что наблюдалась предпочтительная аккумуляции онкогенных пре-микроРНК/микроРНК в онкосомах, и это могло быть простым отражением содержания пре-микроРНК в раковых клетках, которые в большинстве случаев обогащены онкогенными микроРНК/пре-микроРНК (Bartels и Tsongalis, 2009; Nicoloso et al., 2009).
[0059] В предыдущих сообщениях предполагали наличие микроРНК в экзосомах и размышляли об их функции (Valadi et al., 2007; Zhang et al., 2010). Учитывая, что для надлежащего сайленсинга мРНК-мишеней требуется, чтобы микроРНК присутствовала в стехиометрической концентрации, то кажется маловероятным, что экзосомы в системе кровообращения будут обеспечивать достаточную концентрацию зрелой микроРНК для репрессии транскриптома-мишени. Процессинг пре-микроРНК, возникающих из экзосом в клетках-реципиентах, представляет собой маловероятное событие, потому что биогенез микроРНК в клетках-реципиентах является скорость-лимитирующим не только благодаря общему количеству пре-микроРНК, доступному для процессинга, которое уже существует внутри клетки, но также благодаря скорость-лимитирующим количествам требуемых ферментов. Следовательно, эффективнее обеспечивать введение в клетки-реципиенты зрелых микроРНК для прямого изменения посттранскрипционной экспрессии генов без прохождения через механизм процессинга, как это могло бы произойти в случае, когда пре-микроРНК, а не соответствующие зрелые микроРНК, передаются клеткам-реципиентам. Специфический биогенез микроРНК в экзосомах разрешает эту парадоксальную ситуацию для раковых клеток. Онкосомы становятся в высокой степени обогащены подмножеством зрелых микроРНК, которые являются RISC-ассоциированными и могут играть важную биологическую роль в формировании фенотипа клеток-мишеней.
[0060] Более того, раковые клетки сверхэкспрессируют микроРНК с онкогенным потенциалом, такие как miR-21 и miR-155, которые придают им пролиферативные и жизнеспособные преимущества и ассоциируются с поздней клинической стадией заболевания, метастазами и плохим прогнозом (Yan et al., 2008). Ранее также сообщали, что эти микроРНК сверхэкспрессируются в системе кровообращения пациентов с раковыми заболеваниями (Мао et al., 2013). Синтез микроРНК в клетках представляет собой ферментативную реакцию и, поэтому, зависит от количества ключевых ферментов, таких как Dicer, присутствующих в их цитоплазме. Описано, что Dicer подавляет раковые клетки молочной железы и опухоли (Grelier et al., 2009; Martello et al., 2010). Следовательно, количество микроРНК, которое могут синтезировать эти раковые клетки, ограничено. Из-за того, что продукция экзосом является непрерывным процессом, была предложена гипотеза, что раковые клетки упаковывают специфические пре-микроРНК с RLC-белками, что позволяет обогатить экзосомы зрелыми микроРНК и, одновременно, сохранять эти микроРНК в состоянии активации в клетках происхождения. Онкосомы в высокой степени обогащены зрелыми микроРНК, которые являются RISC-ассоциированными и могут играть важную биологическую роль в формировании фенотипа клеток-мишеней. Одновременно, клетки происхождения поддерживают их сверхэкспрессию преимущественных онкогенных микроРНК, тогда как клетки-реципиенты не показывают перенасыщения механизма биогенеза при прохождении пре-микроРНК через экзосомы.
[0061] Данные исследования раскрывают RISC-зависимый механизм с помощью которого раковые экзосомы становятся обогащенными подмножеством микроРНК. Использование миРНК/мшРНК против Dicer в раковых клетках не было целесообразным решением для исследования содержания микроРНК в экзосомах, поскольку любое уменьшение экзосомальных микроРНК может быть простым отражением низкого уровня микроРНК благодаря супрессии Dicer. Поэтому, для доставки антител непосредственно в экзосомы разработали способ электропорации. Этот способ эффективно работал в отношении ингибирования активности Dicer в экзосомах и предупреждении процессинга пре-микроРНК.
[0062] В то время как определенные микроРНК активированы в специфических опухолях (Volinia et al., 2006), также сообщалось об общей редукции микроРНК, которая наблюдалась в раковых опухолях человека (Kumar et al., 2007; Lu et al., 2005; Melo et al., 2011; Melo et al., 2010; Melo et al., 2009; Ozen et al., 2008). Описано, что Dicer супрессирован в раковых клетках, но его низкие уровни достаточны для поддержания роста опухоли (Kumar et al., 2009). Частичное подавление Dicer посредством miR-103/107 улучшает инвазивность раковых клеток без воздействия на клеточную пролиферацию (Martello et al., 2010). Полная потеря Dicer является губительной для выживания клеток (Fukagawa et al., 2004). Тогда как низкие уровни Dicer ассоциированы с плохим выживанием пациентов с раком легких и яичников (Karube et al., 2005; Merritt et al., 2008). Аналогичным образом, гетерозиготная потеря Dicer коррелирует с метастазами у пациентов с раком молочной железы (Martello et al., 2010). Подавление Dicer при раке молочной железы также происходит посттранскрипционно из-за того, что уровни мРНК остаются неизменными (Grelier et al., 2009; Wiesen и Tomasi, 2009). В раковых клетках фракция Dicer нацелена на эндосомы/MVB CD43-зависимым способом. Наконец, Dicer секретируется через экзосомы. Подавление Hrs, BiG2 и TSG101, компонентов экзосомального механизма биогенеза, приводило к значительным переменам клеточной локализации белка Dicer. Одним возможным объяснением супрессированных уровней Dicer в раковых клетках может заключаться в активном экспорте посредством экзосом. Если механизм секреции экзосом выключен, то раковые клетки обнаруживают увеличение белка Dicer и подавляют экспрессию своих мРНК. Кроме того, они переносят этот белок в ядерный компартмент, где он больше не может содействовать продукции зрелых микроРНК. В этой связи, активация Dicer в агрессивных раковых клетках делает их медленнее растущими (Park et al., 2011).
[0063] CD43 представляет собой трансмебранный белок, который главным образом присутствует в лейкоцитах. В некоторых раковых клетках в цитоплазме и ядре обнаруживается усеченный CD43 (Shelley at al. 2012). Ранее было показано, что CD43 может нацеливать определенные мембранные белки на экзосомы (Shen et al., 2011а). Супрессия CD43 в мышиной модели ортотопического рака молочной железы снижает опухолевую массу на 76% (Shelley et al., 2012). При проведении клинических исследований предположили, что экспрессия CD43 коррелирует с плохим выживанием пациентов с раком молочной железы (de Laurentiis et al., 2011). В этом отчете определено, что CD43 функционально вовлечен в направлении Dicer в онкосомы.
[0064] Последние исследования показывают, что экзосомы, полученные из меланомы, играют роль в метастазах, а экзосомы, полученные из фибробластов, играют роль в миграции раковых клеток молочной железы (Luga et al., 2012; Peinado et al., 2012). Экзосомы, полученные из раковых клеток, обладают протуморогенной ролью, связанной с переносом мРНК и проангиогенных белков (Luga et al., 2012; Peinado et al., 2012; Skog et al., 2008). Экзосомы, полученные из раковых клеток, также могут участвовать в горизонтальном переносе онкогенов, таких как EGFRvIII (Skog et al., 2008). Онкосомы опосредуют значительные изменения транскриптома в клетках-мишенях через RISC-ассоциированные микроРНК. В клетках-мишенях задействуется большое количество биологических процессов, включающих пролиферацию и превращение нетуморогенной клетки в опухолеобразующие клетки. Тем не менее потенциальное влияние онкосом на клетки-реципиенты in vivo вероятно зависит от нескольких других параметров окружения и барьеров доступности.
[0065] Онкосомы также активируют стромальные фибробласты для приобретения фенотипа миофибробластов. Например, проиллюстрирована способность онкосом подавлять опухолевые супрессоры PTEN и HOXD10 посредством онкосом, происходящих из miR-21 и miR-10b, соответственно (Ma et al., 2007; Maehama, 2007). Эти результаты подчеркивают комплексную природу коммуникации, принятой раковыми клетками для достижения злокачественности. Эти данные иллюстрируют, что раковые клетки могут использовать экзосомы для манипулирования окружающими нормальными клетками для ускорения прогрессирования рака и рекрутирования реактивной стромы.
[0066] Во многих исследованиях показано, что фибробласты и нормальные эпителиальные клетки, также проявляют подавление опухолевых супрессоров и активацию онкогенов без очевидных мутаций. Обобщенно, это исследование раскрывает возможную роль раковых экзосом, которую они играют в индуцировании онкогенного «полевого эффекта», который дополнительно подчиняет соседние нормальные клетки относительно участия в развитии и прогрессировании рака. Онкосомы могут превращать нетуморогенные клетки в опухолеобразующие клетки посредством активации онкогенных механизмов. В дополнение, онкосомы также могут принимать участие в образовании реактивной стромы. Вероятно, это достигается без необходимости осуществления определенных генетических мутаций и объясняет комплексную природу того, как мутировавшие раковые клетки распространяют свою программу для рекрутирования поддержки от своего микро- и макроокружения.
II. Выявление биомаркеров
[0067] Экспрессия биомаркеров или генов может измеряться разнообразными методиками, которые хорошо известны в данной области техники. Количественное определение уровней матричной РНК (мРНК) биомаркера может использоваться для измерения экспрессии биомаркера. Альтернативно, количественное определение уровней белкового продукта биомаркера может использоваться для измерения экспрессии биомаркера. Дополнительная информация относительно методов, обсуждаемых ниже, может быть найдена в публикации Ausubel et al. (2003) или Sambrook et al. (1989). Каждый специалист в данной области должен знать, какими параметрами можно манипулировать для оптимизации выявления целевой мРНК или белка.
[0068] В некоторых вариантах реализации изобретения указанное получение информации об экспрессии может включать количественное определение содержания РНК, например, с использованием микроматрицы для кДНК, количественного ПЦР-РВ, гибридизации in situ, нозерн-блоттинга или нуклеазной защиты. Указанное получение информации об экспрессии может включать количественное определение содержания белка, например, количественное определение содержания белка включает методы иммуногистохимии, ИФА, радиоиммунологический анализ (РИА), иммунорадиометрический анализ, флуороиммуноанализ, хемилюминисцентный анализ, биолюминисцентный анализ, гель-электрофорез, вестерн-блоттинг анализ, масс-спектрометрический анализ или микроматрицу для белков.
[0069] Микроматрица для нуклеиновых кислот может использоваться для количественного определения дифференциальной экспрессии множества биомаркеров. Микроматричный анализ может проводиться с использованием коммерчески доступного оборудования, следуя протоколам производителей, таким образом как при использовании технологии Affymetrix GeneChip (г. Санта-Клара, Калифорния) или систему для микроматриц от компании Incyte (г. Фремонт, Калифорния). К примеру, одноцепочечные нуклеиновые кислоты {например, кДНК или олигонуклеотиды) могут быть помещены на планшет или размещены в виде матрицы на субстрат микрочипа. Размещенные на матрице последовательности потом гибридизируются со специфическими зондами нуклеиновых кислот из целевых клеток. Флуоресцентно меченые зонды кДНК могут создаваться путем внедрения флуоресцентно меченых дезоксинуклеотидов методом обратной транскрипции РНК, извлеченной из целевых клеток. Альтернативно, РНК может амплифицироваться транскрипцией in vitro и метиться маркером, таким как биотин. Меченые зонды потом гибридизируют с иммобилизированными нуклеиновыми кислотами на микрочипе в особо жестких условиях. После промывания в жестких условиях для удаления неспецифически связанных зондов чип сканируют методом конфокальной лазерной микроскопии или другим методом детекции, таким как ПЗС-камера. Исходные данные интенсивности флуоресценции в файлах гибридизации в большинстве случаев предварительно обрабатывают алгоритмом грубого многокристального усреднения (ГМУГМУ) для получения значений экспрессии.
[0070] Для измерения дифференциальной экспрессии множества биомаркеров также может использоваться количественная ПЦР в режиме реального времени (кПЦР-РВ). В кПЦР-РВ матрица РНК в большинстве случаев обратно транскрибируется в кДНК, которая потом амплифицируется посредством реакции ПЦР. Количество продукта ПЦР отслеживается цикл за циклом в режиме реального времени, что позволяет проводить определение начальных концентраций мРНК. Для измерения количества продукта реакцию ПЦР могут проводить в присутствии флуоресцентного красителя, такого как SYBR Green, который связывается с двухцепочечной ДНК. Реакцию также может проводиться с флуоресцентным репортерным зондом, который специфичен к амплифицируемой ДНК.
[0071] Неограничивающим примером флуоресцентного репортерного зонда является зонд TaqMan (Applied Biosystems, г. Фостер Сити, Калифорния). Флуоресцентный репортерный зонд флуоресцирует, когда гаситель удаляется в процессе цикла удлинения ПЦР. Мультиплексная кПЦР-РВ может выполняться путем использования множественных ген-специфических репортерных зондов, каждый из которых содержит разный флуорофор. Значения флуоресценции записывают во время каждого цикла и представляет количество продукта, амплифицированного до этого момента в реакции амплификации. Для минимизации ошибок и снижения вариации от образца к образцу кПЦР-РВ может проводиться с использованием эталонного стандарта. Идеальный эталонный стандарт экспрессируется на постоянном уровне в разных тканях и не подвержен влиянию экспериментальных условий обработки. Подходящие эталонные стандарты включают без ограничения мРНК для конститутивных генов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) и β-актина. Уровень мРНК в оригинальном образце или кратность изменения экспрессии каждого биомаркера может определяться с использованием расчетов, хорошо известных в данной области техники.
[0072] Для измерения дифференциальной экспрессии множества биомаркеров также может использоваться иммуногистохимическое окрашивание. Этот способ обеспечивает локализацию белка в клетках среза ткани путем взаимодействия белка со специфическим антителом. Для этого ткань может фиксироваться в формальдегиде или другом подходящем фиксаторе, помещенном в воск или пластик, и разрезаться на тонкие срезы (от около 0,1 мм до нескольких мм толщиной), используя микротом. Альтернативно, ткань может замораживаться и разрезаться на тонкие срезы, используя криостат. Срезы ткани могут размещаться в виде матрицы и прикрепляться к твердой поверхности (т.е. образовывать тканевую микроматрицу) Срезы ткани инкубируют с первичным антителом против целевого антигена с последующими промывками для удаления несвязанных антител. Первичное антитело может соединяться с системой детекции или первичное антитело может детектироваться со вторичным антителом, которое соединяется с системой детекции. Система детекции может быть флуорофором или может быть ферментом, таким как пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза, которая может превращать субстрат в колориметрический, флуоресцентный или хемифлуоресцентный продукт. Окрашенные срезы ткани в большинстве случаев сканируют под микроскопом. Из-за того, что образец ткани от субъекта с раковым заболеванием может быть гетерогенным, т.е., некоторые клетки могут быть нормальными, а другие клетки могут быть злокачественными, то в ткани может быть определен процент положительно окрашенных клеток. Это измерение вместе с количественным определением интенсивности окрашивания может использоваться для получения величины экспрессии биомаркера.
[0073] Для измерения дифференциальной экспрессии множества биомаркеров также может использоваться твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА). Существует множество вариаций анализа ИФА. Все основаны на иммобилизации антигена или антитела на твердой поверхности, в большинстве случаев, на планшете для микротитрования. Оригинальный метод ИФА включает приготовление образца, содержащего целевые биомаркерные белки, покрытие лунок планшета для микротитрования образцом, инкубирование каждой лунки с первичным антителом, которое распознает специфический антиген, смывание несвязанного антитела, а потом выявление антитело-антигенных комплексов. Комплексы антитело-антитело могут выявляться непосредственно. Для этого первичное антитело конъюгируют с системой детекции, такой как фермент, который продуцирует детектируемый продукт. Комплексы антитело-антитело могут выявляться косвенно. Для этого первичное антитело выявляют с помощью вторичного антитела, которое конъюгировано с системой детекции, как описано выше. Потом планшет для микротитрования сканируют и исходные данные могут конвертироваться в величины экспрессии, используя способы, известные в данной области техники.
[0074] Для измерения дифференциальной экспрессии множества биомаркеров также может использоваться микроматрица с антителами. Для этого множество антител размещают в виде матрицы и ковалентно присоединяют к поверхности микроматрицы или биочипа. Белковый экстракт, содержащий целевые биомаркерные белки, в большинстве случаев метят флуоресцентным красителем или биотином. Меченые биомаркерные белки инкубируют с микроматрицей для белков. После промывок для удаления несвязанных белков микроматрицу сканируют. Исходные данные интенсивности флуоресценции могут конвертироваться в величины экспрессии, используя способы, известные в данной области техники.
[0075] Для измерения дифференциальной экспрессии множества биомаркеров также могут использоваться мультиплексные микросферы Luminex. Эти микроскопические полистирольные гранулы внутри кодированы цветом флуоресцентными красителями, такими что каждая гранула обладает уникальной спектральной сигнатурой (которых существует вплоть до 100). Гранулы с одинаковой сигнатурой маркируются специфическим олигонуклеотидом или специфическим антителом, которое будет связывать целевую мишень (т.е. биомаркер мРНК или белок, соответственно). Мишень в свою очередь тоже маркирована флуоресцентным репортером. Вследствие этого существует два источника цвета, один от гранулы, а другой от репортерной молекулы на мишени. Потом гранулы инкубируют с образцом, содержащим мишени, которые в количестве до 100 могут детектироваться в одной лунке. Малый размер/поверхность площади гранул и трехмерная доступность гранул к мишеням позволяет практически изучать жидкостно-фазную кинетику во время реакции связывания. Захваченные мишени выявляют высокотехнологическими струйными элементами, основанными на проточной цитометрии, в которых лазеры возбуждают внутренний краситель, что идентифицирует каждую гранулу, а также любой репортерный краситель, захваченный в процессе анализа. Данные полученных файлов могут конвертироваться в величины экспрессии, используя способы, известные в данной области техники.
[0076] Для измерения дифференциальной экспрессии множества биомаркеров также может использоваться гибридизация in situ. Этот способ позволяет локализовать мРНК в клетках среза ткани. Для этого метода ткань может замораживаться или фиксироваться и помещаться в носителе, а потом разрезаться на срезы, которые размещаются в виде матрицы и фиксируются на твердой поверхности. Срезы ткани инкубируют с меченым антисмысловым зондом, который будет гибридизироваться с целевой мРНК. Стадии гибридизации и промывания в большинстве случаев выполняют в очень жестких условиях. Зонд может метиться флуорофором или малым маркером (таким как биотин или дигоксигенин), который может детектироваться другим белком или антителом, таким образом, что меченый гибрид может детектироваться и визуализироваться под микроскопом. Множество мРНК может детектироваться одновременно, что достигается тем, что каждый антисмысловой зонд имеет различимую метку. В большинстве случаев матрицу с гибридизированной тканью сканируют под микроскопом. Из-за того, что образец ткани от субъекта с раковым заболеванием может быть гетерогенным, т.е., некоторые клетки могут быть нормальными, а другие клетки могут быть злокачественными, то в ткани может быть определен процент положительно окрашенных клеток. Это измерение вместе с количественным определением интенсивности окрашивания может использоваться для получения величины экспрессии каждого биомаркера.
[0077] В дополнительном варианте реализации изобретения уровень маркера может сравниваться с уровнем маркера в контроле, причем контроль может включать один или несколько образцов опухоли, взятых у одного или нескольких пациентов, которых определили как обладающих определенной метастатической опухолью или не обладающих определенной метастатической опухолью или имеющих оба варианта опухолей.
[0078] Контроль может включать данные, полученные одновременно (например, в одном эксперименте по гибридизации) как индивидуальные данные пациента или могут быть сохраненным значением или набором значений, например, сохраненные на компьютере или машиночитаемом носителе. Если используется последний, то новые данные пациента относительно выбранного(ых) маркера(ов), полученные из начальных или последующих образцов, могут сравниваться с сохраненными данными для того же маркера(ов) без необходимости дополнительных контрольных экспериментов.
III. Определения
[0079] Как используется в данном документе в данном документе выражение «получение биологического образца» или «получение образца крови» относится к получению биологического образца или образца крови, например, непосредственно или косвенно. К примеру, в некоторых вариантах реализации изобретения биологический образец, такой как образец крови или образец, содержащий периферическую кровь, мононуклеарные клетки (МКПК), непосредственно получают у субъекта в или возле лаборатории или подразделения, где будет анализироваться биологический образец. В других вариантах реализации изобретения биологический образец может забираться или отбираться третьей стороной и потом перевозиться, например, в отдельную организацию или подразделение для проведения анализа. В других вариантах реализации изобретения образец может быть получен и исследован в том же подразделении, используя исследование по месту лечения. В этих вариантах реализации изобретения указанное получение относится к получению образца, например, от пациента, из лаборатории, в кабинета врача, по почте, курьером или в почтовом отделении и т.п. В некоторых дополнительных аспектах изобретения способ получения может дополнительно включать сообщение субъекту, плательщику медицинского обслуживания, лечащему врачу, аптекарю, менеджеру управления прибылью аптеки или любому лицу, которому может быть интересно определение результата.
[0080] Под терминами «субъект» или «пациент» понимают любого единичного субъекта, которому требуется проведение лечения или диагностического испытания. В этом случае обычно субъекты или пациенты являются людьми. В качестве субъекта также предполагается включать любых субъектов, вовлеченных в клинические исследовательские испытания, которые не проявляют каких-либо клинических признаков заболевания, или субъектов, вовлеченных в эпидемиологические исследования, или субъектов, используемых для контроля.
[0081] Как используется в данном документе выражение «увеличенная экспрессия» относится к повышенному или увеличенному уровню экспрессии в образце опухоли относительно подходящего контроля (например, незлокачественный образец ткани или клеток, эталонный стандарт), причем повышение или увеличение уровня экспрессии генов является статистически значимым (р<0,05). Если увеличение экспрессии гена в образце опухоли относительно контроля является статистически значимым, то оно может быть определено с использованием соответствующего t-критерия (например, одновыборочный t-критерий, двухвыборочный t-критерий, t-критерий Уэлча) или другого статистического критерия, известного специалистам в данной области. Гены, которые сверхэкспрессируются при раковом заболевании могут быть, к примеру, генами, которые известны или были ранее определены как сверхэкспрессирующиеся при раковом заболевании.
[0082] Как используется в данном документе в данном документе выражение «уменьшенная экспрессия» относится к пониженному или уменьшенному уровню экспрессии в образце опухоли относительно подходящего контроля (например, незлокачественный образец ткани или клеток, эталонный стандарт), причем снижение или уменьшение уровня экспрессии генов является статистически значимым (р<0,05). В некоторых вариантах реализации изобретения сниженный или уменьшенных уровень генной экспрессии может представлять полное отсутствие экспрессии генов или уровень экспрессии равный нулю. Если уменьшение экспрессии гена в образце опухоли относительно контроля является статистически значимым, то оно может быть определено с использованием соответствующего t-критерия (например, одновыборочный t-критерий, двухвыборочный t-критерий, t-критерий Уэлча) или другого статистического критерия, известного специалистам в данной области. Гены, которые недостаточно экспрессируются при раковом заболевании могут быть, к примеру, генами, которые известны или были ранее определены как недостаточно экспрессирующиеся при раковом заболевании.
[0083] Термин «антигенсвязывающий фрагмент» используется в данном документе в самом широком смысле и охватывает исключительно интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), образованные по меньшей мере двумя интактными антителами, и фрагменты антител.
[0084] Термин «праймер», как используется в данном документе, имеет значение, охватывающее любую нуклеиновую кислоту, которая способна инициировать синтез образующейся нуклеиновой кислоты в матрицезависимом процессе. Праймеры могут быть олигонуклеотидами длиной от десяти до двадцати и/или тридцати пар оснований, но могут применяться и более длинные последовательности. Праймеры могут быть представлены в двухцепочечной и/или одноцепочечной форме, однако одноцепочечная форма является предпочтительной.
IV. Примеры
[0085] Следующие примеры включены для демонстрации предпочтительных вариантов реализации изобретения. Специалисты в данной области техники должны понимать, что методики, описанные в примерах, которые сопровождают разработанные изобретателем представленные методики, хорошо работают в практической реализации изобретения, и поэтому могут рассматриваться как составная часть предпочтительных способов при их практической реализации. Однако, в свете данного описания специалисты в данной области техники должны понимать, что могут быть внесены многие изменения в особые варианты реализации изобретения, которые описаны, и при этом получится похожий или сходный результат без отступления от сути и объема изобретения.
Пример 1. - Экспериментальные методики.
[0086] Выделение и очистка экзосом. Экзосомы очищали методом дифференциального центрифугирования, как описано ранее (Thery et al., 2006; Luga et al., 2012). Вкратце, супернатант клеток, культивированных в течение 24 часов, подвергали последовательным стадиям центрифугирования при 800 g и 2000 g, а супернатант фильтровали с использованием фильтра на 0,2 мкм в культуральные сосуды. Экзосомы осаждали при 100000 g на роторе с качающимися стаканами SW40Ti в течение 2 часов (Beckman). Супернатант отбрасывали и добавляли ФСБ для 1-часовой стадии промывания. Осадок анализировали на наличие экзосом. Для извлечения РНК экзосомы ресуспендировали в 500 мкл Тризола, для извлечения белков экзосомы ресуспендировали в 250 мкл буферного раствора для лизиса (8М раствор мочевины/2,5% SDS, 5 мкг/мл лейпептина, 1 мкг/мл пепстатина и 1 мМ фенилметилсульфонилфторида), а экзосомы для обработок ресуспендировали в ФСБ. Замороженные образцы сыворотки оттаивали на льду и 500 мкл добавляли к 12 мл ФСБ и проводили ту же вышеупомянутую процедуру. Экзосомы, очищенные центрифугированием, обрабатывали (37°С, 60 минут) 500 г/мл протеиназы K (Sigma-Aldrich), растворенной в воде без РНКазной активности, с последующей инактивацией нагреванием протеазы (60°С, 10 минут) и инкубацией (37°С, 15 минут) с 2 г/мл РНКазы А без протеазной активности (Sigma-Aldrich) с последующим добавлением 10Х концентрированного ингибитора РНКазы (Ambion). Для проведения обработки экзосомами экзосомы очищали дважды и один из осадков использовали для количественного определения белка.
[0087] Проточный цитометрический анализ экзосом. Препараты экзосом (5-10 мкг) инкубировали с 5 мкл альдегид/сульфатных латексных гранул диаметром 4 мкм (Interfacial Dynamics, г. Портленд, Орегон) и ресуспендировали в 400 мкл ФСБ, содержащем 2% БСА. Покрытые экзосомами гранулы (20 мкл) инкубировали со следующими антителами: анти-CD63 (Санта-Круз), анти-CD9 (abeam), анти-TSG101 (abeam), анти-флотиллин-1 (Санта-Круз) в течение 30 минут при 4°C с последующей, если необходимо, инкубацией с FITC-конъюгированным вторичным антителом и анализом на проточном цитометре FACS Calibur (BD Biosciences).
[0088] Электропорация экзосом. Экзосомы при общей концентрации белка 100 мг (измеренной анализом Брэдфорд) и 5 мкг антитела к Dicer (поликлональное SC-30226, г. Санта-Круз, Калифорния), 5 мкг антитела к актину, или 10 мкг пре-микроРНК-21, -10b и -cell, смешивали в 400 мкл буферного раствора для электропорации (1,15 мМ фосфата калия рН 7,2, 25 мМ хлорида калия, 21% Optiprep) и проводили электропорацию в 4 мм кювете, используя систему для электропорации Gene Pulser Xcell (Biorad), как описано ранее (Alvarez-Erviti et al., 2011). После электропорации экзосомы обрабатывали протеиназой K и/или РНКазой, при целесообразности.
[0089] Спектроскопия рассеяния света (СРС). Спектры СРС получали используя экспериментальную систему, описанную на фиг. 10В. В качестве источника белого света использовали широкополосный лазер с непрерывным излучением Fianium SC-450-2. Свет от лазера с непрерывным излучением фокусировали на образце с помощью длиннофокусных линз. Образцы, содержащие жидкие суспензии или микросферы, помещали в специальный кварцевый держатель образца кубической формы. От образцов растворителей без экзосом или микросфер получали фоновые сигналы. Свет, рассеянный экзосомами или микросферами на 90° от падающего луча, собирали другими длиннофокусными линзами и передавали на отображающий спектрограф Princiton Instrument Acton 2300i, связанный с высокоэффективным детектором Andor Technology iXon DV885 EMCCD. Детекцию проводили в диапазоне длин волн 470-870 нм. Детектор управлялся компьютером, в который передавались, сохранялись и обрабатывались данные.
[0090] Для калибровки системы и определения возможности точного определения размеров частиц, которые могли быть меньше, чем длина волны, измеряли сигналы от суспензий стеклянных микросфер в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБ) с номинальными диаметрами 24 нм и 100 нм и полистирольных микросфер с номинальными диаметрами 119 нм, 175 нм, 356 нм и 457 нм. По данным подбирали спектры, предсказанные теорией Mie, с использованием ранее разработанного метода минимизации наименьших квадратов (Fang et al., 2003). Экспериментальные спектры и результаты подбора соответствия показаны на фиг. 1Е для стеклянных микросфер с номинальным диаметром 100 нм и полистирольных микросфер с номинальным диаметром 356 нм. Однако показано, что отклонение от рэлеевского рассеяния умноженное на длину волны в четвертой степени усиливает нерэлеевское поведение спектров СРС. При сравнении полученных по СРС распределений размеров микросфер с предоставленными производителем спецификациями, заключили, что оценочная точность метода СРС составляла 10 нм. Было также установлено, что реконструированные распределения размеров не чувствительны к коэффициентам преломления микросфер и растворителя. Здесь следует отметить, что поскольку рассеяние света малыми частицами пропорционально шестой степени их размера, то определение частиц менее 50 нм в присутствии больших частиц потребует значительного увеличения соотношения сигнал/шум в экспериментальной системе.
[0091] Потом проводили эксперименты по СРС с суспензией экзосом в ФСБ. Экспериментальный спектр СРС экзосом и соответствующий подбор по Mie представлены на фиг. 1В. Соответствие реконструированного спектра было превосходным. При использовании упомянутой выше методики реконструирования (Fang et al. 2003; Itzkan et al. 2007; Fang et al. 2007) найдено распределение размеров экзосом (см. фиг. 1R, правый график и вставка), которое имело пик при 104 нм. Это выделенное распределение размеров сравнивали с измерениями, выполненными на фотографиях ПЭМ сходных образцов экзосом (фиг. 1А). Поскольку количество частиц на фотографиях ПЭМ не было достаточно большим для построения статистически значимого распределения, то из фотографии ПЭМ рассчитывали средний размер частиц больше 50 нм и нашли его равным 95 нм. Таким образом, реконструированное по СРС распределение размеров и морфометрические измерения, выполненные по фотографиям ПЭМ экзосом, согласуются со всеми данными.
[0092] Обработки N-Rh-PE. Клетки метили N-Rh-PE инкубированием с 8 мкМ N-Rh-PE (Avanti Polar Lipids, г. Алабастер, Алабама), разбавленным в ледяном 1 X буферном растворе Хэнкса (Invitrogen, г. Карлсбад, Калифорния) в течение 1 часа на льду. Потом клетки 3 раза промывали ледяным буферным раствором Хэнкса перед высаживанием их на планшет обратно в среду DMEM. Клетки с N-Rh-PE использовали для конфокальной визуализации приблизительно 24 часа после введения метки.
[0093] Введение иммунометок с частицами золота и электронная микроскопия. Фиксированные образцы в оптимальной концентрации помещали на покрытые углеродом/формваром сетки, меш 300, и давали возможность абсорбироваться в слой формвара в течение 1 минуты. Для окрашивания иммунометками с частицами золота сетки помещали в блокирующий буферный раствор для проведения стадии блокирования/пермеабилизации в течение 1 часа. Без ополаскивания сетки немедленно помещали в раствор певичного антитела в соответствующем разведении на ночь при 4°С (поликлональное анти-Dicer 1:10 SC-30226, Санта-Круз; моноклональное анти-CD9 1:10, Abeam). В качестве контролей некоторые сетки не подвергали воздействию первичного антитела. На следующий день все сетки ополаскивали ФСБ, а потом наносили на капли соответствующего вторичного антитела с присоединенными 10 нм золотыми частицами (AURJON, г. Хатфилд, Пенсильвания) в течение 2 часов при комнатной температуре. Сетки ополаскивали ФСБ и помещали в 2,5% глутаральдегид в 0,1 М фосфатном буферном растворе в течение 15 минут. После промывания в ФСБ и дистиллированной воде сеткам давали возможность высохнуть и окрашивали для контраста уранилацетатом. Образцы просматривали под посвечивающим электронным микроскопом Tecnai Bio Twin (FEI, г. Хилсборо, Орегон) и получали изображения ПЗС-камерой АМТ (Advanced Microscopy Techniques, г. Данверз, Массачусетс).
[0094] Белковый блот и антитела. Для мониторинга отклика эндогенных генов клетки выращивали в буферном растворе RIPA, а экзосомы помещали в буферный раствор с 8М мочевины/2,5% SDS, 5 мкг/мл лейпептина, 1 мкг/мл пепстатина и 1 мМ фенилметилсульфонилфторида. Белки нагружали в соответствии с результатами количественного определения Брэдфорда на акриламидных гелях и переносили на ПВДФ-мембраны (ImmobilonP) методом влажного электрофоретического переноса. Для образцов белков сывороточных экзосом, собранных из моделей с ортотопическими ксенотрансплантатами, для разделения полос Dicer человека и мыши использовали 4% акриламидный гель высотой 15 см. В общем, блоты блокировали в течение 1 часа при КТ с 5% нежирного сухого молока в ФСБ/0,05% Твин и инкубировали в течение ночи при 4°С со следующими первичными антителами: 1:500 анти-Dicer (SC-30226) Santa Cruz; 1:1000 анти-убиквитинилированные белки, клон FK2 Millipore; 1:500 анти-Flag М2-пероксидаза клон М2 Sigma; 1:500 анти-CD43 ab9088 Abeam; 1:500 анти-PTEN, ab32199, Abeam; 1:300 анти-CD9 ab92726, Abeam; 1:500 анти-GADPH ab9483, Abeam; 1:250 анти-TRBP ab72110, Abeam; 1:300 анти-TSG101 ab83, Abeam; 1:400 анти-AGO2 ab32381, Abeam; 1:4000 анти-β-актин пероксидаза клон АС-15, Sigma; 1:500 анти-GFP ab6556, Abeam; 1:500 анти-HOXD10 ab76897 Abeam. Вторичные антитела инкубировали 1 час при КТ. Промывки после инкубирования с антителами проводили на орбитальном шейкере, четыре раза с интервалами 10 мин с IX ФСБ с 0,05% Твин 20. Блоты проявляли хемилюминисцентными реактивами от компании Pierce.
[0095] Анализ ПЦР в режиме реального времени. Обработанную ДНКазой РНК обратно транскрибировали обратной транскриптазой MultiScribe (Applied Biosystems) с олиго-d(Т) праймерами с последующей очисткой всей РНК Тризолом (Invitrogen). ПЦР в режиме реального времени проводили на приборе с системой детекции последовательностей ABI PRISM 7300НТ, используя мастер-микс SYBR Green (Applied Biosystems) и β-актин, в качестве контроля. Праймеры перечислены в табл. 1.
[0096] пре-микроРНК количественно определяли, используя РНК, обработанной 150 нг ДНКазы, и одностадийный набор для кПЦР-РВ Superscript III Platinum (Invitrogen) (Schmittgen et al., 2004). Праймеры перечислены в табл. 1.
-ΔCt
[0097] Для анализа экспрессии микроРНК 10 нг РНК смешивали с реактивом набора TaqMan для обратной транскрипции микроРНК, содержащим специфические праймеры микроРНК, и проводили обратную транскрипцию в соответствии с указаниями производителя (Applied Biosystems). Реакционные смеси инкубировали при 16°С в течение 30 минут, 42°С в течение 30 минут и 85°С в течение 5 минут. ПЦР в режиме реального времени проводили на приборе с системой детекции последовательностей ABI PRISM 7300HT, используя коммерчески доступный анализ по требованию для каждой микроРНК (Applied Biosystems). Экспрессию микроРНК нормализировали по экспрессии 18S рРНК (предварительно подготовленный реактив для анализа TaqMan; Applied Biosystems), которая служит внутренним контролем количества и целостности РНК. Каждое измерение выполняли в трех повторах. Определяли пороговый цикл (Ct), количество дробных циклов, при котором количество амплифицированной мишени достигает фиксированного порога, и измеряли экспрессию, используя формулу 2, как сообщалось ранее (Livak и Schmittgen, 2001).
[0098] Нозерн-блоттинг. Нозерн-блоттинг проводили с использованием в качестве зондов 3'Bio[TEG] ДНК-олигонуклеотидов обратно комплементарных зрелой микроРНК (см. табл. 2). Для нагрузки 40 мкг экзосомальной РНК (обработанной ДНКазой) использовали 15% гели мочевины/акриламида вместе с IX РНК, нагруженной красителем после 2 минут при 95°C с последующим 2 минутным периодом на льду. Маркер микроРНК использовали в соответствии с указаниями производителя (N2102, New England BioLabs). Электрофорез проводили при 4°С в течение 3 часов, используя IX ТВЕ. Перенос выполняли с использованием бумаги для блоттинга Whatman и положительнозаряженной нейлоновой мембраны BrightStar-Plus (Ambion) в течение 2 часов при 4°C с 0,5Х ТВЕ. РНК перекрестно связывали с мембраной, используя УФ-трансиллюминатор в течение 20 минут. Мембраны предварительно гибридизировали вращением в течение 1 часа при 42°С в растворе для гибридизации Ambion's ULTRAhyb-Oligo (Ambion). Зонды оттаивали на льду и добавляли 150 нг на мл буферного раствора для гибридизации после 5 минут инкубации при 95°С, после которой мембраны оставляли вращаться в течение ночи при 42°С. Выполняли следующие промывки: 2Х SSPE/0,5% SDS - дважды в течение 15 минут; 0,2 SSPE/0,5% SDS - дважды в течение 30 минут и 2Х SSPE - 5 минут. Эти начальные стадии промывки сопровождали несколькими промывками, а потом блоты проявляли, используя набор BrightStar BioDetect в соответствии с указаниями производителя (Ambion). Блоты выдерживали в течение ночи с двумя приложенными пленками. Блоты успешно разделяли на полосы и повторно обрабатывали зондами еще два раза.
[0099] Культуры клеток, плазмиды, пре-микроРНК и миРНК. Линии клеток человека MCF10A, MCF7, MDA-MB231, А549, SW480 и HeLa, а также линии клеток молочной железы мыши NMuMG, 67NR и 4Т1 культивировали в DMEM 10% ФСБ (все клетки происходили из Американской коллекции типовых культур - АТСС). Трансфекции выполняли, используя реактив липофектамин 2000 (Invitrogen) для миРНК. Для трансфекций синтетическими пре-микроРНК для всех линий клеток использовали RNAiFect (Qiagen). Последовательности миРНК перечислены в табл. 3.
[00100] Плазмиды. p-CMV-Tag4B-Dicer (Melo et al., 2009); p-CMV6-CD63-GFP от компании Origene (RG217238); GFP-hAGO2 от компании Addgene (плазмида 11590); pGFP-shBiG2 от компании Origene (TG314697); pGFP-shDicer от компании Origene (TG304991); синтетические pre-miR-10b, -21 и -cel-1 приобретали у компании Ambion; 3'UTR-WTPTEN, 3'UTR-Mutant-PTEN (Dr. Joshua Mendell laboratory), 3'UTR-WTHOXD10 и 3'UTR-Mutant-HOXD10 (Dr. Robert Weinberg laboratory) получены из компании Addgene.
[00101] Иммуноцитохимические методы и конфокальная микроскопия. Клетки высаживали при соответствующей заселенности на 12-луночные планшеты на вставленные покровные стекла и культивировали в течение ночи. На следующий день клетки промывали холодным IX ФСБ и фиксировали в течение 20 мин при КТ с помощью 4% ПФА/ФСБ. Слайды пермеабилизировали в течение 10 мин при КТ в ФСБ с 0,5% Тритона Х-100, блокировали в течение 1 часа при КТ с помощью 5% БСА и инкубировали в течение ночи при 4°С с первичными антителами в ФСБТ (ФСБ, 0,1% Тритон) 2% БСА: 1:100 анти-Dicer (SC-30226) Santa Cruz; 1:500 анти-Flag Sigma; 1:50 анти-CD43 ab9088 (Abeam); 1:100 анти-TSG101 ab83 (Abeam); 1:500 анти-GFP ab6556 (Abeam); 1:100 анти-LAPM-1 ab25630 (Abeam); 1:100 анти-Hrs ab56468 (Abeam); 1:100 анти-BiG2 ab75001 (Abeam); 1:500 анти-биотин ab66233 (Abeam). Вторичные антитела, козьи анти-кроличьи Alexa 543 или козьи анти-мышиные Alexa-488 инкубировали 1 час при КТ, разведенные 1:200 в ФСБТ с 2% БСА. Для окрашивания ядер использовали DAPI. Для анализа экзосом собранные экзосомы инкубировали с Тритоном X 0,05% в течение 15 мин и далее с 5% БСА в течение 1 часа при КТ. Первое первичное антитело (анти-CD9, 1:50) инкубировали в течение ночи в 100 мкл ФСБТ при 4°С, а второе первичное антитело, анти-flag (1:50), добавляли на следующий день и инкубировали в течение 1 часа при КТ. Последовательно добавляли вторичные антитела и также инкубировали 1 час при КТ. Экзосомы помещали поверх покровных стекол в 12-луночные планшеты в 4% ПФА в течение 45 мин и промывали холодным ФСБ. Изображения получали с помощью вертикальной конфокальной системы Zeiss LSM510, используя устройство рециркуляции для поддержания идентичных параметров. Агрегированные экзосомы приводили к образованию структур более 200 нм, видимых при конфокальной микроскопии. Для анализа данных изображения выбирали из базы, собранной при проведении по меньшей мере двух независимых экспериментов. На фигурах показаны репрезентативные поля микроскопирования.
2
[00102] Dicing-анализы in vitro. Экстракты экзосомальных белков (10 мкг) инкубировали при 37°C с 3 пмоль pre-miR-10b, -21 и -cel-1 с внутримолекулярно меченными биотином шпильками в присутствии 3 мМ MgCl, 30 мМ NaCl и 100 мМ Гэпэс, рН 7,5. Конечный объем каждой реакционной смеси составлял 10 мкл. Прохождение реакции останавливали добавлением 10 мкл буферного раствора для нагрузки формамидного геля. РНК распознавали, используя гель-электрофорез в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях, и проявляли набором BrightStar BioDetect в соответствии с указаниями производителя (Ambion).
[00103] Анализы на жизнеспособность клеток и образование колоний. Клетки высаживали на 96-луночные планшеты и добавляли собранные экзосомы в 1-й день в концентрации 100 мкг/мл. Жизнеспособность клеток определяли анализом с 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолием бромидом (МТТ). В экспериментах по образованию колоний клетки высаживали на 12-луночные планшеты и добавляли экзосомы в 1-й день и на 5-й день культивирования в концентрации 100 мкг/мл. Через 8 дней колонии фиксировали и окрашивали реактивом МТТ.
[00104] Определение экспрессии мРНК человека-НТ12 Illumina. РНК гибридизировали рамках на экспрессионной матрице для мРНК человека-НТ12 Illumina. Данные нормализировали, используя режим neqc, предложенный R-пакетом «limma» (Shi et al., 2010). Относительное содержание генов определяли по медианному соотношению зондов на ген. Кластеризацию определяли по среднему арифметическому значению эвклидовых расстояний для генов (строки) и образцов (столбцы).
[00105] Определение экспрессии микроРНК. Использовали специальный анализ для микроРНК как описано в литературном источнике 9. Матрица содержала 1833 зондов микроРНК человека, 1084 зондов микроРНК мыши и других 78 зондов некодирующих РНК. Зонды наносили в двух повторах. Матрица включала соответствие каждого зонда ID номеру доступа GenBank. Биоинформационный анализ выполняли с использованием программ R (версия 2.14.2) (доступна в Интернете на сайте r-project.org) и Bioconductor (доступна в Интернете на сайте bioconductor.org/). Исходная интенсивность для каждой пробы представляет собой медианную характеристику интенсивности пикселя за вычетом медианного фонового значения. Установка коррекции на 1 обеспечивала, что после логарифмического преобразования данных не будут получены отрицательные величины. Данные нормализовали по квантилям с последующим log2-преобразованием. Сигналы от зондов, полученные при измерении одинаковых микроРНК, усредняли. Анализ проводили с использованием функций библиотеки LIMMA. Используя функцию heatplot из библиотеки made4, создавали карты интенсивности. При выполнении технических повторов карта интенсивности отображала средние величины экспрессии, полученные при повторных измерениях.
[00106] Ортотопические ксенотрансплантаты опухолей яичника, эндометрия и молочной железы. Самки бестимусных мышей nu/nu (Harlan) возрастом между 4 и 6 неделями поселяли в отдельные вентилируемые клетки с 12-часовым светотемновым циклом при температуре 21-23°С и 40%-60% влажности. Мышам обеспечивали свободный доступ к облученной пище и стерилизованной воде. Все протоколы по обращению с животными просматривались и одобрялись испанским институциональным комитетом по содержанию и использованию животных.
3
[00107] Образцы первичных опухолей получали в университетской больнице Bellvitge (L'Hospitalet de Llobregat, г. Барселона, Испания). Институтский наблюдательный совет утверждал исследование. От пациентов получали письменное информированное согласие. При комнатной температуре отбирали фрагменты ткани без некроза (около 2-3 мм) из пяти репрезентативных иссеченных опухолей эпителия яичника человека (ЕОС): серозной, эндометриоидной, светлоклеточной и муцинозной опухоли и помещали их в среду DMEM (BioWhittaker) с добавкой 10% ФБС и пенициллином/стрептомицином. Под изофлюран-индуцированной анестезией, животных подвергали латеральной лапаротомии, обнажали их яичники и закрепляли фрагменты опухоли на поверхности яичника с помощью хирургических нитей пролен 7,0. В дополнение к этому, фрагменты опухолей молочной железы и эндометрия человека имплантировали в жировые подложки молочных желез и стенку эндометрия, соответственно.
[00108] Ортотопически привитые опухоли давали возможность расти и в момент умерщвления у мышей под анестезией отбирали 2 мл крови методом сердечной пункции. Образцы центрифугировали при 14000 об./мин и замораживали при -80°С.
[00109] Иммунопреципитация. Клетки и экзосомы после сбора промывали в ФСБ и центрифугировали или ультрацентрифугировали, соответственно, для получения осадков. Охлажденный на льду буферный раствор RIPA или буферный раствор 8 М мочевины/SDS добавляли к клеткам и экзосомам, соответственно. Суспензии осторожно перемешивали покачиванием при 4°С, 15 мин для клеток и 2 часа для экзосом. Лизаты центрифугировали при 14000 g в предварительно охлажденной в течение 15 минут, а осадок отбрасывали. Гранулы агарозы/сефарозы с белком А или G промывали дважды ФСБ и разбавляли 50% взвесью с ФСБ. Смесь гранул/взвеси (100 мкл) добавляли к 1 мл клеточного лизата и 500 мкл экзосомального лизата и инкубировали при 4°С в течение 10 мин. Гранулы удаляли центрифугированием при 14000×g при 4°С в течение 10 минут, а осадки удаляли. Антитело к Dicer (5 мкг для клеток и 10 мкг для экзосом) добавляли к 500 мкл клеточного лизата или 250 мкл экзосомального лизата (1 мкг/мл клеток, 10 мкг/мл экзосом) и инкубировали в течение ночи при 4°С на орбитальном шейкере. 100 мкл взвеси гранул агарозы/сефарозы с белком А или G добавляли и оставляли при 4°С в течение ночи. После центрифугирования супернатант отбрасывали, а гранулы промывали 3 раза охлажденным на льду буферным раствором RTPA для клеток или буферным раствором мочевины/SDS для экзосом. Гранулы агарозы/сефарозы собирали центрифугированием в течение 5 минут для диссоциации иммунокомплексов с поверхности гранул. Гранулы собирали центрифугированием, и белковый блоттинг проводили с супернатантом.
2+
7
5
[00110] Условия культивирования в присутствии Са-ионофора А23187. Клетки (8×10 клеток) высевали в концентрации 5×10 клеток/мл в DMEM. Для обработки клеток, через четыре часа к культурам добавляли А23187 (конечная концентрация 200 нМ, Calbiochem, г. Ла-Хойя, Калифорния). Собирали среду от обработанных и необработанных клеток и выделяли экзосомы.
5
[00111] Ортотопическая инъекция клеток бестимусным мышам. Рост ортотопической опухоли измеряли инъецированием нетуморогенных клеток эпителия молочной железы MCF10A; нетуморогенные клетки эпителия молочной железы MCF10A, которых подвергали воздействию экзосом, полученных от MDA-MB231, и раковые клетки молочной железы MDA-MB-231 (1×10 клеток в 0,2 мл ФСБ) вводили в жировую подложку молочной железы 3-недельных самок бестимусных мышей возрастом, как описано ранее (Welch, 1997). Рост опухоли мониторили каждую неделю путем измерения длины и ширины опухоли с помощью циркуля и отмечали в виде среднего диаметра опухоли, как описано ранее (Welch, 1997). Всех животных подвергали эвтаназии через 21 день после инъекции опухолевых клеток.
[00112] Статистический анализ. Планки погрешностей показывают С.О. между повторами биологических анализов. Для каждого эксперимента выполняли три повтора для технических, а также для биологических анализов. Статистическую значимость рассчитывали по t-критерию Стьюдента.
Пример 2. Результаты.
[00113] Выделение и идентификация экзосом. Используя принятые методы ультрацентрифугирования выделяли экзосомы из раковых клеток (трижды отрицательной метастатической карциномы молочной железы человека MDA-MB231, аденокарциномы молочной железы человека MCF7, неметастатической карциномы молочной железы мыши 67NR и метастатической карциномы молочной железы мыши 4Т1) и контрольных клеток (нетуморогенных эпителиальных клеток молочной железы человека MCF10A и нетуморогенных эпителиальных клеток молочной железы мыши NMuMG) (фиг. 10А) (Luga et al., 2012; Thery et al., 2006). Собранные экзосомы анализировали методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и атомно-силовой микроскопии (АСМ). Идентифицировали частицы размером между 40-140 нм (фиг. 1А-В) (Thery et al., 2002). Дополнительно идентичность экзосом подтверждали выявлением TSG101 и CD9, двух маркеров экзосом (фиг. 1С) (Ostrowski et al., 2010). Выделенные экзосомы также были положительными по CD9-MapKepy, при анализе методом электронной микроскопии с иммунометками с частицами золота (фиг. 1А). Экзосомы, связанные с латексными гранулами также анализировали методом проточной цитометрии, что показало поверхностную экспрессию тетраспанинов CD9, CD63, TSG101 и флотиллина 1, которые являются обычно применяемыми маркерами экзосом (фиг. 1D). Для демонстрации того, что выделенные образцы проявляли узкий пик распределения размеров для диаметра 104 нм, в дополнение к этому, использовали спектроскопию рассеяния света (СРС) (Fang et al., 2007; Itzkan et al., 2007; Bang и Setabutr, 2010; Benitez-vieyra et al., 2009; Khairkar et al., 2010; Min et al., 2010) (фиг. 1E, правое изображение). Система СРС позволила провести точное определение всех размеров частиц в экстрактах экзосом путем использования в качестве внутренних контролей стеклянных микросфер разных диаметров. При СРС также исключались потенциальные микровезикулы и контаминация этих изолятов бактериальным или клеточным дебрисом (фиг. 1Е, см. вставку на правом графике). Более того, в соответствии с данными СРС, анализ отслеживания наночастиц NanoSight выявил частицы с пиком распределения размеров для диаметра 105±1,0 нм (фиг. 1F), дополнительно исключая существование потенциальных контаминантов в разных диапазонах размеров, которые существуют в растворе, который не отфильтровали (фиг. 1F, правый график). Использовали колориметрическое определение жизнеспособности клеток (МТТ), анализ с внесением концевой метки dUTP-ник терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (TUNEL), проточный цитометрический анализ на анексине V с йодидом пропидия и иммуноблоттинги с цитохромом С экзосом (фиг. 10С-Е) для демонстрации жизнеспособности клеток перед извлечением экзосом для того, чтобы исключить возможность контаминации изолятов апоптотическими тельцами или случайным клеточным дебрисом. Экзосомы, выделенные из раковых клеток, обобщенно названы онкосомами, как определено ранее (Lee et al., 2011). Экзосомы, выделенные из контрольных клеток, обобщенно названы нормосомами.
2
[00114] Онкосомы особенно обогащены онкогенными микроРНК по сравнению с нормосомами. Исследовали общее содержание микроРНК в онкосомах и нормосомах. Микрогидродинамический анализ РНК, выделенной из экзосом, выявил увеличение содержания малых РНК в онкосомах по сравнению с нормосомами (фиг. 2F). Более того, наблюдали плохую корреляцию между уровнями микроРНК в нормосомах (полученных из MCF10A) и онкосомах (полученных из MDA-MB-231) со значением R равным 0,35 (фиг. 2А). Матричный анализ общей микроРНК показал накопление содержания микроРНК в онкосомах по сравнению с нормосомами. В этом анализе также выявлено сильно отличающийся профиль экспрессии микроРНК в онкосомах по сравнению с нормосомами. Данные матричного анализа микроРНК показали 305 дифференциально экспрессировавшихся микроРНК между онкосомами и нормосомами (табл. 5), с общим обогащением содержания микроРНК в онкосомах по сравнению с нормосомами. Накопление микроРНК в онкосомах не было простым отражением увеличения содержания микроРНК в раковых клетках, потому что раковые клетки показывали уменьшение общего количества всех малых РНК по сравнению с нетуморогенными клетками (фиг. 11А). Следовательно, аккумуляция микроРНК в экзосомах выявилась специфической и направленной.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
[00115] Дополнительно оценивали экспрессию 15 микроРНК в раковых клетках и экзосомах, полученных из этих клеток, для которых выявлена на матрице для микроРНК отличающаяся экспрессия между онкосомами и нормосомами (табл. 4 и 5). Шесть микроРНК из этого набора были вовлечены в прогрессирование раковых заболеваний (онкогенные микроРНК: miR-10a, miR-10b, miR-21, miR-27a, miR-155 и miR-373), а для девяти микроРНК сообщали об обладании ими опухолесупрессивных функций (опухолесупрессорные микроРНК: let7a, miR15b, miR26a, miR31, miR125a, miR125b, miR200a, miR200c, miR335) и они экспрессировались в клетках и экзосомах, полученных из таких клеток (фиг. 11В-С и табл. 4). Для определения периода полужизни микроРНК в экзосомах, для их исследования в выделенных экзосомах разрабатывали бесклеточную систему. Очищенные экзосомы, свободные от клеток, помещали в культуральную среду и инкубировали 24 ч или 72 ч при 37°С. После периода инкубации экзосомы анализировали на содержание в них микроРНК и сравнивали с клетками, из которых они происходили. Наблюдали уменьшение значений корреляции этих микроРНК в онкосомах в сравнении с клетками через 72 ч, по сравнению с 24 ч (с R=0,60 до R=0,43), тогда как между нормосомами и клетками MCF10A (клетки, использованные для получения нормосом) сохранялась высокая корреляция (от R=0,98 до R=0,98) (фиг. 2В). Неожиданную активацию шести проанализированных онкогенных микроРНК наблюдали исключительно в онкосомах, культивированных в течение 72 ч, по сравнению с онкосомами, культивированными 24 ч, со средней кратностью изменения 17,6 и 13,2 для онкосом, полученных из клеток MDA-MB231 и 4Т1, соответственно, дополнительно подтверждая специфическое увеличение содержания микроРНК в онкосомах с течением времени (фиг. 2С, средний и нижний графики, и фиг. 11D, правый, верхний и нижний графики). Незначительные отличия отмечали для опухолесупрессивных микроРНК, когда онкосомы культивировали в течение 24 ч или 72 ч (фиг. 2С и фиг. 11D). Нормосомы не выявили каких-либо отличий в содержании их микроРНК независимо от времени культивирования (фиг. 2С и фиг. 11D). Наличие всех 15 микроРНК было идентичным в культивированных 72 ч нормосомах и клетках, из которых они были получены, с коэффициентом корреляции 0,93 (фиг. 2Е, слева). Коэффициенты корреляции экзосом MDA-MB231 и 4Т1 были значительно ниже (r=0,56 и 0,42, соответственно), дополнительно подтверждая специфическое изменение уровней микроРНК в онкосомах с течением времени (фиг. 2Е, посредине и справа). В дополнение к этому, уровни корреляции уменьшались с увеличением злокачественности линий клеток, когда сравнивали онкосомы от клеток MCF7 (r=0,76), MDA-MB231 (r=0,56), 67NR (r=0,64) и 4Т1 (r=0,42) (фиг. 2Е и фиг. НЕ). Следовательно, содержание микроРНК в нормосомах всегда отражало их клетки происхождения, тогда как онкосомы, изменяли свое содержание микроРНК с течением времени независимым от клеток способом.
[00116] Когда содержание микроРНК в онкосомах MDA-MB231 и 4Т1 сравнивали с таким содержанием в нормосомах от клеток MCF10A и NMuMG, то наблюдали накопление в онкосомах, культивированных в течение 24 ч, онкогенных микроРНК со средней кратностью изменения 2,7 и 2,0, соответственно (фиг. 11В). Во временной точке 72 ч среднюю кратность изменения 30 и 18,2 обнаруживали для онкогенных микроРНК в онкосомах, полученных из клеток MDA-MB231 и 4Т1, соответственно, по сравнению с нормосомами, полученными из клеток MCF10A и NMuMG (фиг. 11В). Результаты нозерн-блоттинга подтвердили активацию в онкосомах исключительно онкогенных miR-10b и miR-21, подтверждая как результаты матричного анализа микроРНК, так и кПЦР-анализа (фиг. 2D).
[00117] Онкосомы содержат пре-микроРНК и коровые RLC-белки. Бесклеточное культивирование свежевыделенных онкосом привело к увеличению содержания микроРНК, подтверждая прохождение в экзосомах активного биогенеза. В дополнение к этому, микрогидродинамический анализ также показал наличие больших молекул РНК (фиг. 2F). Следовательно, наблюдали потенциальное присутствие пре-микроРНК в препаратах нормосом и онкосом. Проводили бесклеточное культивирование экзосом после их выделения в течение 24 ч или 72 ч и подвергали их обработке РНКазы для удаления любой возможной внеэкзосомальной РНК. После этого следовало выявление пре-микроРНК в экзосомах. Проанализированные пре-микроРНК были теми, которые соответствовали ранее исследованным 15 зрелым микроРНК (табл. 4).
[00118] Все 15 проанализированных пре-микроРНК присутствовали в экзосомах (нормосомах и онкосомах) (фиг. 3А и фиг. 12А). Как наблюдали для микроРНК, онкосомы сильно накапливали онкогенные пре-микроРНК, тогда как в опухолесупрессивные пре-микроРНК были представлены в меньшем количестве (фиг. 3А и фиг. 12А). Когда экзосомы культивировали в течение 24 ч и 72 ч, наблюдали значительное подавление онкогенных пре-микроРНК в онкосомах, которых культивировали в течение 72 ч по сравнению с онкосомами, которых культивировали в течение 24 ч. Такую вариацию не обнаруживали в нормосомах (фиг. 3В и фиг. 12В). Для опухолесупрессивных пре-микроРНК не было показано какой-либо разницы в онкосомах и нормосомах (фиг. 3В и фиг. 12В). Более того, уменьшенные количества онкогенных пре-микроРНК в онкосомах, но не в нормосомах, отмечали после 96 ч культивирования, в этой точке уровни онкогенных пре-микроРНК достигали уровней опухолесупрессивных пре-микроРНК (фиг. 3Е и фиг. 12Е). Подавление содержания онкогенных пре-микроРНК в онкосомах подтверждали нозеон-блоттингом для пре-miR10b и пре-miR21 (фиг. 3С). Далее в экзосомах проводили анализ зависимости пре-микроРНК и микроРНК от времени. Путем культивирования выделенных онкосом в течение 6 ч, 12 ч, 24 ч, 36 ч, 48 ч, 72 ч и 96 ч, выявлено, что уровни 6 проанализированных пре-микроРНК с увеличением периода времени были обратно пропорциональны соответствующим им микроРНК (фиг. 3D). Количество зрелых микроРНК увеличивалось между 24 и 72 ч культивирования, после чего их количество достигало плато (фиг. 3D). Следовательно, онкосомы истощали содержание своих pre-микроРНК с сопутствующим увеличением соответствующим им зрелым микроРНК с течением времени. Это наблюдение привело к выдвижению гипотезы, что онкосомы обладают способностью обеспечивать биогенез микроРНК.
[00119] Для того, чтобы понять, почему процессинг пре-микроРНК в культивируемых экзосомах начинается после 24 ч, а не сразу, мониторили все шесть микроРНК в клетках MDA-MB-231, подвергшихся сайленсингу по экспортину-5 (ХР05) (фиг. 12С и D). Белок XPO5 отвечает за транспорт пре-микроРНК из ядра в цитоплазму (Yi et al., 2003). Сайленсинг XPO5 предупреждает поток пре-микроРНК из ядра в цитоплазму и позволяет провести оценку цитоплазматического процессинга пре-микроРНК без введения новых цитоплазматических пре-микроРНК из ядра. МикроРНК-21 мониторили в клетках MDA-MB-231siXP05 до и после центрифугирования (фиг. 12С и D), которое происходило при 4°С в течение 3 часов для имитации условий выделения экзосом. В те же временные точки между центрифугированными и нецентрифугированными клетками не наблюдалось значительной активации miR-21, когда предыдущие клетки отмечали задержку в виде лаг-периода в 24 ч (фиг. 12С и D). Следовательно, как клетки так и экзосомы требовали период времени для восстановления от стресса центрифугирования при 4°С для начала процессинга пре-микроРНК. Такая адаптация для культивируемых клеток предполагается для ферментативной активности после проведения пассажа культуры ткани.
[00120] Онкосомы содержат коровые RISC (RLC)-белки. Онкосомы истощали концентрацию своих пре-микроРНК с сопутствующим увеличением соответствующим им зрелым микроРНК с течением времени. Это привело авторов к проверке способности экзосом к биогенезу микроРНК и процессингу пре-микроРНК. Биогенез микроРНК требует ключевых белковых компонентов RLC, Dicer, TRBP и AGO2 (Chendrimada et al., 2005). Ранее было показано, что Dicer и TRBP образуют комплекс, который обеспечивает стабильность белку Dicer, тогда как AGO2 задействуется в механизме биогенеза позже для содействия в выборе цепей и процесса раскручивания РНК (Chendrimada et al., 2005). Белок Dicer обнаруживали в онкосомах, полученных от раковых клеток MCF7, MDA-MB231, 67NR и 4Т1 (фиг. 1С и фиг. 4А-В). Возможность выявления контаминирующего внеэкзосомального белка Dicer удаляли обработкой всех препаратов экзосом протеиназой K перед выделением экзосомальных белков, как описано ранее (Montecalvo et al., 2012) (фиг. 1С и фиг. 4А-В). В дополнение, различные линии раковых клеток, такие как А549 (рак легких человека), SW480 (колоректальный рак человека), HeLa (рак шейки матки человека) и 4Т07 (рак молочной железы мыши) также продуцировали Dicer-содержащие экзосомы (фиг. 13Н). Белок Dicer не обнаруживали в нормосомах, которых продуцировали линии клеток MCF10A (нетуморогенные клетки эпителия молочной железы человека) и NMuMG (нетуморогенные клетки эпителия молочной железы мыши) (фиг. 1С и фиг. 4А). Использование иммунометок с частицами золота в экзосомах с применением просвечивающей электронной микроскопии подтверждало присутствие белка Dicer в экзосомах, но не нормосомах (фиг. 4В и фиг. 13А). В дополнение к этому, в экспериментах с иммунометками с частицами золота использовали анти-GFP антитело в качестве другого отрицательного контроля и в экзосомах ничего не было обнаружено (фиг. 13В).
2+
[00121] Белок Dicer дополнительно сверхэкспрессировался с N-терминальным Flag-маркером в клетках MCF10A и MDA-MB231 (фиг. 13С). Иммуноблоттинг и конфокальная микроскопия дополнительно подтверждали присутствие белка Flag-Dicer исключительно в онкосомах, а не в нормосомах (фиг. 4С). Увеличение внутриклеточных уровней Са2+ стимулирует секрецию экзосом (Savina et al., 2003). Са-ионофор А23187 добавляли к культуральной среде клеток MCF10A и MDA-MB231 и собирали экзосомы. Авторы наблюдали значительное увеличение продукции экзосом, о которой судили по экспрессии CD9 (фиг. 4D). Белок Dicer обнаруживали в онкосомах, но не в нормосомах (фиг. 4D). По этим результатам дополнительно предполагали, что это обнаружено не количество экзосом, определяющих содержание, но скорее специфический механизм, который ведет к аккумуляции Dicer. В дополнение, экспрессия Dicer была уменьшенной из-за стабильной экспрессии двух коротко шпилечных конструкций в клетках MCF10A и MDA-MB-231 (фиг. 13D-E). Онкосомы, полученные из клеток MDA-MB-231 shDicer, содержали значительно меньше Dicer по сравнению с shScramble или исходными клетками MDA-MB-231, что обнаружено иммуноблоттингом и иммунометками с частицами золота (фиг. 4E-F). Dicer также не обнаруживался в нормосомах, полученных от клеток MCF10AshDicer (фиг. 4Е).
[00122] В дополнение к этому, RLC-белки, AGO2 и TRBP также обнаруживали в онкосомах, но не в нормосомах (фиг. 4G-H). Экзосомы извлекали из клеток MCF10A и MDA-MB231, трансфецированных GFP-маркированным AGO2 (фиг. 41). Используя анти-GFP антитела, обнаружили присутствие GFP-AGO2 в экзосомах, выделенных из клеток MDA-MB231-GFP-AGO2 (фиг. 4J). После сайленсинга с помощью mhPHKAGO2 в клетках MCF10A и MDA-MB231, наблюдали подавление белка AGO2 в онкосомах, полученных из MDA-MB231 (фиг. 4K-L). Авторами методом иммунопреципитации показано, что в онкосомах AGO2 связывает Dicer, тогда как оба белка не детектируются в нормосомах (фиг. 4М). Основным партнером, который индуцирует стабильность Dicer и способствует его активности расщеплять пре-микроРНК, является TRBP (Chendrimada et al., 2005; Melo et al., 2009). Иммунопреципитация выявила присутствие комплекса Dicer/TRBP в онкосомах, но не в нормосомах (фиг. 4N).
[00123] Иммунопреципитация с использованием анти-Dicer антитела выявила, что в онкосомах AGO2 связывается с Dicer, тогда как оба белка не детектируются в нормосомах (фиг. 13F). Основным партнером, который индуцирует стабильность Dicer и способствует его активности расщеплять пре-микроРНК, является TRBP (Chendrimada et al., 2005; Melo et al., 2009). Иммунопреципитация с анти-Dicer антителом выявила присутствие комплекса Dicer/TRBP в онкосомах, но не в нормосомах (фиг. 13G).
2
2
[00124] Онкосомы используют RLC для процессирования пре-микроРНК с образованием зрелых микроРНК. Функциональность RLC-белков (свойства, обеспечивающие нарезание, и сайленсинг) в онкосомах исследовали с целью получения зрелых микроРНК из пре-микроРНК. Экзосомы, лишенные Dicer, извлекали из клеток MCF10AshDicer, MDA-MB231shDicer и 4TlshDicer (фиг. 14А). Содержание пре-микроРНК и микроРНК не выявило каких-либо значимых изменений при подавлении Dicer в экзосомах с течением времени, что указывает на то, что пре-микроРНК не процессировались с образованием микроРНК в отсутствии в онкосомах Dicer (фиг. 5А-В и фиг. 14В-С). Далее электропорацией внутрь экзосом вводили анти-Dicer и анти-TRBP антитела и сравнивали с онкосомами и нормосомами с контролем с анти-актиновым антителом, обработанные после электропорации протеиназой K, чтобы избежать присутствия антител снаружи экзосом (фиг. 5С). Онкосомы с введенным электропорацией контрольным анти-актиновым антителом показали такие же вариации уровней пре-микроРНК и микроРНК, что упомянутые ранее (фиг. 5D-E и фиг. 14D-E). В онкосомах с анти-Dicer и анти-TRBP антителами, наблюдали незначительные изменения уровней пре-микроРНК и микроРНК с течение времени, что предполагает ингибирование процессинга пре-микроРНК (фиг. 5D-e и фиг. 14D-E). Общее содержание микроРНК оценивали с помощью экспрессионных матриц для микроРНК онкосом (полученных из MDA-MB-231), онкосом с введенным электропорацией анти-Dicer антителом (полученных из MDA-MB231) и нормосом (полученных из MCF10A) после 72 ч бесклеточного культивирования. Общее содержание микроРНК в онкосомах с анти-Dicer антителом было больше похоже на такое содержание в нормосомах MCF10A (R=0,79), чем в онкосомах, полученных из MDA-MB231 (R=0,48). При сравнении онкосом с онкосомами, содержащими анти-Dicer антитела, наблюдали 198 дифференциально экспрессировавшихся микроРНК, 48% из которых были в значительной мере подавлены (табл. 6). Из них 19% являлись онкогенными, тогда как только 1%, по сообщениям на основе ранее опубликованной литературы, обладали опухолесупрессивными свойствами (фиг. 14F, табл. 6).
[00125] Известно, что ферментативная реакция, которая преобразует пре-микроРНК в зрелую микроРНК является спонтанной и не требует каких-либо факторов кроме трех RLC-белков, включенных в пре-микроРНК, и Hsp90, белка, присутствующего в экзосомах (Maniataki and Mourelatos, 2005; McCready et al., 2010). Для дополнительного подтверждения этого факта с онкосомами проводили электропорацию с глендамицином, лекарственным веществом, которое избирательно ингибирует активность Hsp90 (Miyata, 2005). Обнаружено значительное увеличение количества зрелых микроРНК, синтезированных в присутствии глендамицина, по сравнению с контролями (фиг. 6А). Влияние белков Hsp90 на экспрессию зрелой микроРНК может быть опосредовано двумя потенциально перекрывающимися процессами: активной ролью в способствовании активности AGO2 в биогенезе микроРНК и стабилизацией зрелых микроРНК, связанных с белками AGO2 в RISC.
[00126] Для дополнительного подтверждения специфической способности онкосом к процессингу пре-микроРНК, синтетические пре-микроРНК -10b и -21, а также предшественник pre-cel-1 пре-микроРНК C.elegans подвергли электропорации в экзосомы для исследования их процессинга (фиг. 15А). В онкосомах после 72 ч культивирования наблюдали значительное подавление пре-микроРНК и активацию соответствующих им микроРНК (фиг. 6В-С). Онкосомы с антителом Dicer не выявили разницы в содержании пре-микроРНК после 72 ч культивирования (фиг. 6В-С). Онкосомы, полученные из клеток shDicer, не выявили разницы в содержании пре-микроРНК после 72 ч культивирования (фиг. 6В-С). В дополнение к этому, pre-miR-10b, -21 и -cel-1 внутримолекулярно метили биотин-дезокситимидином (dT) и переносили их в клетки MCF10A. dT-модифицированные пре-микроРНК процессировались, что приводило к образованию зрелых микроРНК, подтвержденному тем, что введение меток не изменяло их потенциал процессинга (фиг. 15В-С). Модифицированные пре-микроРНК использовали в «dicing»-анализе для того, чтобы показать, что Dicer-содержащие экзосомы были особенно способны процессировать пре-микроРНК и создавать зрелые микроРНК (фиг. 6D-F).
[00127] Цитоплазматические CD43 в раковых клетках способствуют мобилизации Dicer. Мультивезикулярные тельца (MVB) являются клеточными органеллами, которые содержат эндосомы, что в конечном счете высвобождаются как экзосомы при слиянии с плазматической мембраной (Pant et al., 2012). Исследовали возможный механизм, который позволяет рекрутировать RISC-белки в эндосомы и их последующее высвобождение в экзосомы. Сначала исследовали возможность ассоциации Dicer с MVB в раковых клетках по сравнению с контрольными клетками. Сравнивали клеточное распределение Dicer в сочетании с маркерами MVB и механизмом биогенеза экзосом. Hrs и BiG2 являются первыми маркерами эндосом, а TSG101 является маркером MVB (Razi и Futter, 2006; Shin et al., 2004). В клетках MDA-МВ231 и 4Т1 Dicer совместно локализовался с Hrs, BiG2 и TSG101 (фиг. 16А). Экзогенно доставленный фосфотидилэтаноламин, меченный N-родамином (NRhPE) поглощался клетками и сохранялся внутри MVB (Sherer et al., 2003). Окрашивание Dicer в клетках MDA-MB231 и 4Т1 главным образом совместно локализуется с NRhPE в MVB, которые в конечном счете образуют экзосомы. Эти данные согласуются с предыдущими наблюдениями в исследованиях по совместному фракционированию, в которых Dicer, TRBP и AGO2 оказывались во фракциях поздних эндосом/MVB (Shen et al., 2013). В противоположность этому, в контрольных клетках (NMuMG и MCF10A) не было совместной локализации с Hrs, BiG2, TSG101 или NRhPE (фиг. 16А). Дополнительно, в клетках MDA-MB231 и MCF10A гены Hrs и TSG101 подвергли сайленсингу с использованием двух разных миРНК, а также BiG2, с использованием двух разных мшРНК, и оценивали экспрессию белка Dicer (фиг. 16В). Сайленсинг Hrs, BiG2 и TSG101 нарушал образование MVB и приводил к подавлению продукции экзосом (фиг. 16С-Е). Повышение содержания белка Dicer наблюдали в цитоплазме и ядре клеток MDA-MB231 с siHrs, shBiG2 или siTSG101. Сходные результаты получены, когда вместо клеток MDA-MB231 использовали клетки 4Т1. Когда в клетках MCF10A подвергали сайленсингу гены Hrs, BiG2 или TSG101, то не наблюдали изменения экспрессии белка Dicer и его локации (цитоплазма). Интересно, что экспрессия мРНК Dicer уменьшалась в клетках MDA-MB231 и 4Т1 с подавлением siHrs, shBiG2 и siTSG101 (фиг. 16F). Это наблюдение может отображать отрицательную обратную связь между количеством белка Dicer в клетке и его уровнем транскрипции. Эти результаты дают основание для предположения, что опосредованный экзосомами экспорт белка Dicer является потенциально скорость-лимитирующей стадией для удаления Dicer из раковых клеток. Нарушение образования MVB приводит к аккумуляции белка Dicer везде в цитоплазме и ядре без увеличения уровней транскрипции Dicer.
[00128] MVB также изолируют убиквитинилированные белки от последующей деградации лизосомами (Luzio et al., 2009). Авторами показано, что белок Dicer не убиквитинилируется и совместно не локализируется с LAMP-1, широко используемым маркером лизосом. Эти результаты предполагают, что Dicer не направляется на деградацию в раковых клетках, но скорее секретируется через экзосомы (фиг. 16G).
[00129] Сигналы, которые направляют белки в MVB и экзосомы по большей части неизвестны. Недавно, предположили, что множество якорных белков цитоплазматической мембраны, таких как CD43, вероятно являются медиаторами транспорта белков в MVB и экзосомы (Shen et al., 2011b). CD43, главным образом, представляет собой лейкоцитарный трансмебранный сиалогликопротеин, который сильно экспрессируется в раковых клетках (в своей усеченной цитоплазматической форме), а не в контрольных клетках (Shelley et al., 2012). CD43 обнаружен во многих солидных опухолях, включающих рак молочной железы, где его содержание коррелирует с прогрессированием рака и метастазами (Shelley et al., 2012). Авторы исследовали может ли CD43 способствовать транспортированию RISC-белков в MVB. Авторы показали, что Dicer осаждается иммунопреципитацией с белком CD43 в клетках MDA-MB231 (фиг. 9А). Когда CD43 подавляли с использованием миРНК в клетках MCF10A и MDA-MB231, уровни Dicer в онкосомах значительно уменьшались (фиг. 9В и 16Н), с ядерной и цитоплазматической аккумуляцией белка Dicer. В раковых клетках MDA-MB231siCD43 наблюдали подавление экспрессии мРНК Dicer, но не в нетуморогенных клетках MCF10AsiCD43, как также наблюдали ранее с подавлением siHrs, shBiG2 и siTSG101 (фиг. 16I).
[00130] Онкосомы изменяют транскриптом клеток-мишеней Dicer-зависимым способом. Раковые клетки (клетки MDA-MB231) трансфецировали CD63-GFP, маркером экзосом (Escola et al., 1998). Клетки CD63-GFP MDA-MB231 использовали для выделения экзосом GFP+, которые впоследствии инкубировали с клетками MCF10A. Показано, что экзосомы из MDA-MB231-CD63-GFP становились зеленые при использовании оборудования NanoSight, дополненного лазерным лучом, который детектирует частицы, испускающие зеленую флуоресценцию (фиг. 17А). Показано, что онкосомы CD63-GFP+ входят в клетки MCF10A, в которых онкосомы оказываются в цитоплазме. Используя экспрессионные матрицы для микроРНК, показано, что клетки MCF10A, подвергшиеся воздействию онкосом, полученных из MDA-MB231, приобретают новый профиль экспрессии микроРНК, отличающийся от профиля исходных клеток MCF10A и напоминающий профиль клеток MDA-MB231. Используя экспрессионные матрицы для микроРНК, показано, что клетки MCF10A, подвергшиеся воздействию онкосом, полученных из MDA-MB-231, приобретают новый профиль экспрессии микроРНК, отличающийся от профиля исходных клеток MCF10A. Общий профиль транскриптома MCF10A, обработанных онкосомами, более точно напоминает профиль клеток MDA-MB231. Такие значительные изменения в профиле экспрессии мРНК меняют направление, когда клетки MCF10A подвергают воздействию онкосом MDA-MB231 с антителом к Dicer, а паттерны экспрессии повторно кластеризируются с исходными клетками МС10А.
[00131] Всесторонний анализ профилей экспрессии микроРНК и мРНК клеток MCF10A, подвергшихся воздействию онкосом MDA-MB231, по сравнению с исходными клетками MCF10A, выявил значительную активацию определенных микроРНК и подавление их описанных мРНК-мишеней в обработанных клетках MCF10A. Например, микроРНК-21 и -10b подавлялись (в 4,6 и 2,3 раза, соответственно) в обработанных клетках MCF10A, среди обработок другими онкогенными микроРНК. Предполагали, что микроРНК-21 и -10b участвуют в прогрессировании рака молочной железы, проявлении инвазивности и метастаз (Ma et al., 2007; Yan et al., 2011). Как показано ранее, miR-21 и -10b синтезировались в онкосомах из своих пре-микроРНК. PTEN и HOXD10, описанные как мишени miR-21 и miR-10b, супрессировали клетки MCF10A, обработанные онкосомами, в анализе с экспрессионной матрицей по сравнению с контрольными клетками MCF10A. Вестерн-блоттинг анализ показал, что уровни PTEN и HOXD10 супрессировались в клетках MCF10A, подвергшихся воздействию онкосом (фиг. 7А-В). Для исследования того, могли ли miR-21 и miR-10b в онкосомах обеспечивать сайленсинг PTEN и HOXD10 в клетках-реципиентах MCF10A, клетки MCF10A были транзиентно трансфецированы люциферазными репортерами, содержащими 3'UTR дикого типа генов PTEN или HOXD10, которые способны связывать miR-21 и miR-10b. В качестве контроля использовали мутантные векторы 3'UTR PTEN или HOXD10. Увеличение активности люциферазных репортеров отмечено в клетках MCF10A, инкубированных с онкосомах, что подтверждает доставку микроРНК из онкосом в клетки-реципиенты (фиг. 1С). В онкосомах, инкубированных с клетками MCF10A, в разные временные точки оценивали уровни экспрессии PTEN и HOXD10. Значительное уменьшение экспрессии обнаружили для PTEN и HOXD10 непосредственно после обработки клеток экзосомами, которых культивировали 72 ч (фиг. 7А-В). Уровни экспрессии PTEN и HOXD10 изменялись минимально в клетках MCF10A, обработанных свежевыделенными экзосомами, что дает основание предполагать, что достаточная концентрация зрелых микроРНК не может присутствовать в этой временной точке (фиг. 17В-С). В клетках MCF10A, обработанных культивированными 72 ч онкосомами с анти-Dicer антителом, выявлено незначительным подавлением PTEN и HOXD10 (фиг. 7D и фиг. 17G). В дополнение к этому, процессинг miR-15 в клетки, при отсутствии обнаружения микроРНК в полученных из MDA-MB231 онкосомах, не изменялся из-за обработки клеток MCF10A экзосомами MDA-MB-231, содержащими антитело к Dicer, что показывает незначительное влияние антитела к Dicer в обработанных клетках (фиг. 17D). В некоторых сообщениях показано подавление мишеней микроРНК в клетках, инкубированных с экзосомами без необходимости проведения длительных периодов культивирования (Kosaka et al., 2013; Narayanan et al., 2013; Pegtel et al., 2010). MiR-182-5p является одной из микроРНК, которые активируются в клетках MCF10A после обработки онкосомами, и активирует ген Smad4, мишень miR-182-5p (Hirata et al., 2012), который является одним из генов, который подавляется при обработке онкосомами этих клеток (фиг. 7Е). Активация miR-182-5p в онкосомах не наблюдалась во время периода культивирования, a pre-miR182-5р не выявлялась в онкосомах (фиг. 17Е). Следовательно, онкосомы также упаковывают зрелые микроРНК без необходимости процессинга pre-miR. Если такие зрелые miR присутствуют в соответствующих стехиометрических количествах, они могут обладать способностью регулировать экспрессию генов в клетках-реципиентах, как показано ранее (Ismail et al., 2013; Kogure et al., 2011; Kosaka et al., 2013; Narayanan et al., 2013; Pegtel et al., 2010; Valadi et al., 2007; Zhang et al., 2010). Однако, если некоторые зрелые микроРНК отсутствуют в экзосомах, но присутствуют их пре-микроРНК, то последние все же могут обладать биологическим действием на свои мишени, поскольку они будут процессироваться в зрелые RLC-ассоциированные микроРНК.
[00132] Жизнеспособность клеток и пролиферация клеток MCF10A, обработанных культивированными 72 ч онкосомами, увеличивалась, что не наблюдали, когда использовали свежевыделенные онкосомы (фиг. 7F). Разницу не наблюдали, когда клетки MCF10A обрабатывали полученными из MDA-MB231 онкосомами, содержащими анти-Dicer антитела (фиг. 7F). Такой же паттерн сохранялся для способности образовывать колонии клеток MCF10A, обработанных онкосомами (фиг. 7G и 17F). Клетки MCF10A, обработанные культивированными 72 ч онкосомами, образуют колонии, по сравнению с необработанными клетками (фиг. 7G). Образование колоний не наблюдали, когда использовали свежевыделенные онкосомы или онкосомы сАВ Dicer (фиг. 7G).
[00133] Онкосомы индуцируют образование опухолей нетуморогенных эпителиальных клеток и активируют фибробласты. В последних исследованиях предположили, что экзосомы, полученные из мезенхимальных стромальных клеток костного мозга поддерживают рост клеток множественной миеломы (Roccaro et al., 2013). Для рассмотрения функционального «онкогенного потенциала» клеток MCF10A и MCF10A перед воздействием онкосом (онкосомы из клеток MCF10A), эти клетки ортотопически инъецировали в жировые подложки молочных желез самок мышей nu/nu, подобно недавно описанному протоколу (Luga et al., 2012). Клетки MCF10A не формировали опухоли у этих мышей, как тоже сообщалось ранее (Mavel et al., 2002; Thery et al., 2002) (фиг. 7H). Онкосомы из клеток MCF10A формировали опухоли после 21 суток, также как и контрольные клетки MDA-MB231 (фиг. 7Н). Клетки MCF10A, инкубированные с онкосомами, содержащими анти-Dicer антитело (но не контрольные анти-актиновые антитела), показали статистически значимое уменьшение объема опухоли (фиг. 7Н). Эти результаты подтверждают прохождение онкогенного превращения клеток MCF10A при воздействии онкосом, содержащих белок Dicer (фиг. 7F-Н и фиг. 17F).
[00134] Сывороточные экзосомы от пациентов с раковыми заболеваниями содержат Dicer и процессируют пре-микроРНК с образованием зрелых микроРНК. Экзосомы опухолей человека исследовали на наличие RISC-белков. Для достижения специфичности раковых клеток, свежевыделенные фрагменты первичной опухоли яичников, молочной железы и эндометрия человека ортотопически вживляли в соответствующие органы самок бестимусных мышей nu/nu (фиг. 18А-В). Сывороточные экзосомы из этих мышей оценивали методом электронной микроскопии (фиг. 18С). Блоттинг с разделенными по размеру белками содержимого, выделенного из этих экзосом, продемонстрировал присутствие белка Dicer исключительно человеческого происхождения (hsa-Dicer) (фиг. 8А и фиг. 18D). Белковые экстракты из полученных из клеток 4Т1 экзосом и клеток 4Т1 использовали в качестве контролей, чтобы показать Dicer мышиного происхождения, который выявляет отличающуюся молекулярную массу (mmu-Dicer) (фиг. 8А).
[00135] Онкосомы из клеток MDA-MB231 инкубировали с дермальными фибробластами человека (HDF). Определение общих профилей экспрессии генов онкосом из инкубированных фибробластов, выявило значительное влияние на их транскриптом по сравнению с контрольными клетками. Наблюдали активацию aSMA (ACTA) (в 18 раз), COL1A1 (в 12 раз), TGFp1 (в 15 раз), CTGF (в 8 раз), Ras (в 6 раз) и ERK (в 4 раза). Фибробласты, инкубированные с онкосомами, пролиферировали с большей скоростью (фиг. 81). Эти результаты свидетельствовали о том, что онкосомы могут активировать стромальные фибробласты, обладающие схожим фенотипом миофибробластов и показывали характеристические особенности, связанные с ассоциированными с карциномой фибробластами.
[00136] Далее, экзосомы выделяли из 100 мл свежих образцов сыворотки от 8 здоровых индивидов (Н) и 11 пациентов с карциномой молочной железы (ВС) (фиг. 8В). На экзосомах методом электронной микроскопии различали липидные бислойные мембраны (фиг. 8С). Сыворотка пациентов с раком молочной железы содержала значительно больше экзосом по сравнению с сывороткой здоровых доноров (фиг. 8D). Когда равное количество экзосом помещали в культуру в течение 24 и 72 ч, то обнаруживали, что 6 пре-микроРНК подавлялись исключительно у пациентов с раком молочной железы, а соответствующие им зрелые микроРНК подавлялись после 72 ч культивирования, что давало основание предполагать, что микроРНК в экзосомах из свежей сыворотки пациентов с раком молочной железы, но не здоровых контрольных образцов, процессировались в зрелую форму (фиг. 8E-F). Далее, экзосомы сами или в комбинации с клетками MCF10A, ортотопически инъецировали в жировые подложки молочных желез самок мышей nu/nu. Пять из 11 сывороточных экзосом, полученных от пациентов с раком молочной железы объединенных с клетками MCF10A, формировали опухоли, в то время как ни одна из экзосом здоровых доноров или самих экзосом, не формировала опухоли (фиг. 8G). Интересно, что экзосомы, которые формировали опухоли, также, как показано, обладают свойством наибольшего увеличения значения 5 кратности изменения количества зрелых микроРНК после 72 ч культивирования (фиг. 8E-F).
[00137] Экзосомы дополнительно выделяли из нового набора образцов сыворотки, полученных у 5 здоровых индивидов (С46, С45, С44, С43 и С41) и 4 пациентов с метастатической карциномой молочной железы (Met219, Met354, Met299 и) Met356). Экспрессию Dicer в экзосомах наблюдали только в образцах метастатической карциномы молочной железы, а не в экзосомах из сыворотки здоровых пациентов (фиг. 8Н).
* * *
[00138] Все способы, описанные и заявленные в данном документе, могут реализовываться и выполняться без излишнего экспериментирования в свете данного описания. Так как композиции и способы этого изобретения были описаны в соответствии с предпочтительными вариантами реализации изобретения, то специалистам в данной области техники будет понятно, что могут применяться вариации способов и стадий или последовательности стадий способа, описанных в данном документе, без отступления от идеи, существа и объема данного изобретения. Конкретнее, будет понятно, что определенные вещества, которые являются как химически так и физиологически родственными, могут быть заменены на вещества, описанные в данном документе, при этом могут быть достигнуты те же или сходные результаты. Все такие сходные заместители и модификации, очевидны специалистам в данной области техники, и считаются находящимися в пределах существа, объема и идеи изобретения, как определено прилагаемыми пунктами формулы изобретения.
ЛИТЕРАТУРНЫЕ ССЫЛКИ
Следующие ссылки, в тех случаях, когда они представляют иллюстративные методические или другие подробности, дополняющие те, которые изложены в данном документе, специально включены в данный документ посредством ссылки.
Al-Nedawi, K., Meehan, В., Micallef, J., Lhotak, V., May, L., Guha, A., and Rak, J. (2008). Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFRvIII by microvesicles derived from tumour cells. Nature cell biology 10, 619-624.
Alvarez-Erviti, L., Seow, Y., Yin, H., Betts, C., Lakhal, S., and Wood, M.J. (2011). Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nature biotechnology 29, 341-345.
Ambros, V. (2004). The functions of animal microRNAs. Nature 431, 350-355.
Arroyo, J.D., Chevillet, J.R., Kroh, E.M., Ruf, I.K., Pritchard, С.C., Gibson, D.F., Mitchell, P.S., Bennett, C.F., Pogosova-Agadjanyan, E.L., Stirewalt, D.L., et al. (2011). Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108, 5003-5008.
Ausubel et al., Current protocols in molecular biology, John Wiley & Sons Ltd, Wiley Interscience, 2003.
Bang, G.M., and Setabutr, P. (2010). Periocular capillary hemangiomas: indications and options for treatment. Middle East Afr J Ophthalmol 17, 121-128.
Bartel, D.P. (2009). MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell 136, 215-233.
Bartels, C.L., and Tsongalis, G.J. (2009). MicroRNAs: novel biomarkers for human cancer. Clinical chemistry 55, 623-631.
Benitez-vieyra, S., Medina, A.M., and Cocucci, A.A. (2009). Variable selection patterns on the labellum shape of Geoblasta pennicillata, a sexually deceptive orchid. J Evol Biol 22, 2354-2362.
Bernstein, E., Kim, S.Y., Carmell, M.A., Murchison, E.P., Alcorn, H., Li, M.Z., Mills, A.A., Elledge, S.J., Anderson, K.V., and Hannon, G.J. (2003). Dicer is essential for mouse development. Nature genetics 35, 215-217.
Chendrimada, T.P., Gregory, R.I., Kumaraswamy, E., Norman, J., Cooch, N., Nishikura, K., and Shiekhattar, R. (2005). TRBP recruits the Dicer complex to Ago2 for microRNA processing and gene silencing. Nature 436, 740-744.
Cocucci, E., Racchetti, G., and Meldolesi, J. (2009). Shedding micro vesicles: artefacts no more. Trends Cell Biol 19, 43-51.
Cosacov, A. et al. New insights into the phylogenetic relationships, character evolution, and phytogeographic patterns of Calceolaria (Calceolariaceae). Am J Bot 96, 2240-2255, (2009).
de Laurentiis, A., Gaspari, M., Palmieri, C., Falcone, C., Iaccino, E., Fiume, G., Massa, O., Masullo, M., Tuccillo, F.M., Roveda, L., et al. (2011). Mass spectrometry-based identification of the tumor antigen UN1 as the transmembrane CD43 sialoglycoprotein. Mol Cell Proteomics 10, M111 007898.
Escola, J.M., Kleijmeer, M.J., Stoorvogel, W., Griffith, J.M., Yoshie, O., and Geuze, H.J. (1998). Selective enrichment of tetraspan proteins on the internal vesicles of multivesicular endosomes and on exosomes secreted by human B-lymphocytes. The Journal of biological chemistry 273, 20121-20127.
Fang, H., Qiu, L., Vitkin, E., Zaman, M.M., Andersson, C., Salahuddin, S., Kimerer, L.M., Cipolloni, P.В., Modell, M.D., Turner, B.S., et al. (2007). Confocal light absorption and scattering spectroscopic microscopy. Applied optics 46, 1760-1769.
Filipowicz, W. (2005). RNAi: the nuts and bolts of the RISC machine. Cell 122, 17-20.
Fukagawa, Т., Nogami, M., Yoshikawa, M., Ikeno, M., Okazaki, Т., Takami, Y., Nakayama, Т., and Oshimura, M. (2004). Dicer is essential for formation of the heterochromatin structure in vertebrate cells. Nature cell biology 6, 784-791.
Gallo, A., Tandon, M., Alevizos, I., and Illei, G.G. (2012). The majority of microRNAs detectable in serum and saliva is concentrated in exosomes. PloS one 7, e30679.
Gibbings, D.J., Ciaudo, C., Erhardt, M., and Voinnet, O. (2009). Multivesicular bodies associate with components of miRNA effector complexes and modulate miRNA activity. Nature cell biology 11, 1143-1149.
Gregory, R.I., Chendrimada, T.P., Cooch, N., and Shiekhattar, R. (2005). Human RISC couples microRNA biogenesis and posttranscriptional gene silencing. Cell 123, 631-640.
Grelier, G., Voirin, N., Ay, A.S., Cox, D.G., Chabaud, S., Treilleux, I., Leon-Goddard, S., Rimokh, R., Mikaelian, I., Venoux, C., et al. (2009). Prognostic value of Dicer expression in human breast cancers and association with the mesenchymal phenotype. British journal of cancer 101, 673-683.
Guermonprez, P., Valladeau, J., Zitvogel, L., Thery, C., and Amigorena, S. (2002). Antigen presentation and T cell stimulation by dendritic cells. Annu Rev Immunol 20, 621-667.
Guescini, M., Genedani, S., Stocchi, V., and Agnati, L.F. (2010). Astrocytes and Glioblastoma cells release exosomes carrying mtDNA. J Neural Transm 117, 1-4.
Gyorgy, В., Szabo, T.G., Pasztoi, M., Pal, Z., Misjak, P., Aradi, В., Laszlo, V., Pallinger, E., Pap, E., Kittel, A., et al. (2011). Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci 68, 2667-2688.
Haase, A.D., Jaskiewicz, L., Zhang, H., Laine, S., Sack, R., Gatignol, A., and Filipowicz, W. (2005). TRBP, a regulator of cellular PKR and HIV-1 virus expression, interacts with Dicer and functions in RNA silencing. EMBO reports 6, 961-967.
Hirata, H., Ueno, K., Shahryari, V., Tanaka, Y., Tabatabai, Z.L., Hinoda, Y., and Dahiya, R. (2012). Oncogenic miRNA -182-5p targets Smad4 and RECK in human bladder cancer. PloS one 7, e51056.
Hood, J.L., San, R.S., and Wickline, S.A. (2011). Exosomes released by melanoma cells prepare sentinel lymph nodes for tumor metastasis. Cancer research 71, 3792-3801.
Ismail, N., Wang, Y., Dakhlallah, D., Moldovan, L., Agarwal, K., Batte, K., Shah, P., Wisler, J., Eubank, T.D., Tridandapani, S., et al. (2013). Macrophage microvesicles induce macrophage differentiation and miR-223 transfer. Blood 121, 984-995.
Itzkan, I., Qiu, L., Fang, H., Zaman, M.M., Vitkin, E., Ghiran, I.C., Salahuddin, S., Modell, M., Andersson, C., Kimerer, L.M., et al. (2007). Confocal light absorption and scattering spectroscopic microscopy monitors organelles in live cells with no exogenous labels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, 17255-17260.
Kahlert, C., and Kalluri, R. (2013). Exosomes in tumor microenvironment influence cancer progression and metastasis. J Mol Med (Berl) 91, 431-437.
Karube, Y., Tanaka, H., Osada, H., Tomida, S., Tatematsu, Y., Yanagisawa, K., Yatabe, Y., Takamizawa, J., Miyoshi, S., Mitsudomi, Т., et al. (2005). Reduced expression of Dicer associated with poor prognosis in lung cancer patients. Cancer science 96, 111-115.
Khairkar, P.H., Bang, G.M., Singh, A.B., and Tiple, P.G. (2010). Possible cross-sensitivity between sertraline and paroxetine in a panic disorder patient. Indian J Pharmacol 42, 110-111.
King, H.W., Michael, M.Z., and Gleadle, J.M. (2012). Hypoxic enhancement of exosome release by breast cancer cells. BMC Cancer 12, 421.
Kogure, Т., Lin, W.L., Yan, I.K., Braconi, C., and Patel, T. (2011). Intercellular nanovesicle-mediated microRNA transfer: a mechanism of environmental modulation of hepatocellular cancer cell growth. Hepatology 54, 1237-1248.
Kosaka, N., Iguchi, H., Hagiwara, K., Yoshioka, Y., Takeshita, F., and Ochiya, T. (2013). Neutral sphingomyelinase 2 (nSMase2)-dependent exosomal transfer of angiogenic microRNAs regulate cancer cell metastasis. The Journal of biological chemistry 288, 10849-10859.
Kumar, M.S., Lu, J., Mercer, K.L., Golub, T.R., and Jacks, T. (2007). Impaired microRNA processing enhances cellular transformation and tumorigenesis. Nature genetics 39, 673-677.
Kumar, S., Ansari, F.A., and Scaria, V. (2009). Prediction of viral microRNA precursors based on human microRNA precursor sequence and structural features. Virol J 6, 129.
Lee, Т.Н., D'Asti, E., Magnus, N., Al-Nedawi, K., Meehan, В., and Rak, J. (2011). Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer-the emerging science of cellular 'debris'. Semin Immunopathol 33, 455-467.
Li, L., Zhu, D., Huang, L., Zhang, J., Bian, Z., Chen, X., Liu, Y., Zhang, C.Y, and Zen, K. (2012). Argonaute 2 complexes selectively protect the circulating microRNAs in cell-secreted microvesicles. PloS one 7, e46957.
Liu, C.G, Calin, G.A., Volinia, S. & Croce, С.M. MicroRNA expression profiling using microarrays. Nat Protoc 3, 563-578, (2008).
Livak, K.J., and Schmittgen, T.D. (2001). Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods 25, 402-408.
Logozzi, M., De Milito, A., Lugini, L., Borghi, M., Calabro, L., Spada, M., Perdicchio, M., Marino, M.L., Federici, C., Iessi, E., et al. (2009). High levels of exosomes expressing CD63 and caveolin-1 in plasma of melanoma patients. PloS one 4, e5219.
Lu, J., Getz, G., Miska, E.A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., Sweet-Cordero, A., Ebert, B.L., Mak, R.H., Ferrando, A.A., et al. (2005). MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature 435, 834-838.
Luga, V., Zhang, L., Viloria-Petit, A.M., Ogunjimi, A.A., Inanlou, M.R., Chiu, E., Buchanan, M., Hosein, A.N., Basik, M., and Wrana, J.L. (2012). Exosomes Mediate Stromal Mobilization of Autocrine Wnt-PCP Signaling in Breast Cancer Cell Migration. Cell 151, 1542-1556.
Luzio, J.P., Parkinson, M.D., Gray, S.R., and Bright, N.A. (2009). The delivery of endocytosed cargo to lysosomes. Biochemical Society transactions 37, 1019-1021.
Ma, L., Teruya-Feldstein, J., and Weinberg, R.A. (2007). Tumour invasion and metastasis initiated by microRNA-10b in breast cancer. Nature 449, 682-688.
MacRae, I.J., Ma, E., Zhou, M., Robinson, С.V., and Doudna, J.A. (2008). In vitro reconstitution of the human RISC-loading complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105, 512-517.
Maehama, T. (2007). PTEN: its deregulation and tumorigenesis. Biological & pharmaceutical bulletin 30, 1624-1627.
Maniataki, E., and Mourelatos, Z. (2005). A human, ATP-independent, RISC assembly machine fueled by pre-miRNA. Genes & development 19, 2979-2990.
Мао, X., Sun, Y., and Tang, J. (2013). Serum miR-21 is a diagnostic and prognostic marker of primary central nervous system lymphoma. Neurological sciences: official journal of the Italian Neurological Society and of the Italian Society of Clinical Neurophysiology.
Martello, G., Rosato, A., Ferrari, F., Manfrin, A., Cordenonsi, M., Dupont, S., Enzo, E., Guzzardo, V., Rondina, M., Spruce, Т., et al. (2010). A MicroRNA targeting dicer for metastasis control. Cell 141, 1195-1207.
Mathivanan, S., Ji, H., and Simpson, R.J. (2010). Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication. Journal of proteomics 73, 1907-1920.
Mavel, S., Thery, I., and Gueiffier, A. (2002). Synthesis of imidazo[2,1-a]phthalazines, potential inhibitors of p38 MAP kinase. Prediction of binding affinities of protein ligands. Arch Pharm (Weinheim) 335, 7-14.
McCready, J., Sims, J.D., Chan, D., and Jay, D.G. (2010). Secretion of extracellular hsp90alpha via exosomes increases cancer cell motility: a role for plasminogen activation. BMC cancer 10, 294.
Melo, S., Villanueva, A., Moutinho, C., Davalos, V., Spizzo, R., Ivan, C., Rossi, S., Setien, R., Casanovas, O., Simo-Riudalbas, L., et al. (2011). Small molecule enoxacin is a cancer-specific growth inhibitor that acts by enhancing TAR RNA-binding protein 2-mediated microRNA processing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108, 4394-4399.
Melo, S.A., Moutinho, C., Ropero, S., Calin, G.A., Rossi, S., Spizzo, R., Fernandez, A.F., Davalos, V., Villanueva, A., Montoya, G., et al. (2010). A genetic defect in exportin-5 traps precursor microRNAs in the nucleus of cancer cells. Cancer cell 18, 303-315.
Melo, S.A., Ropero, S., Moutinho, C., Aaltonen, L.A., Yamamoto, H., Calin, G.A., Rossi, S., Fernandez, A.F., Carneiro, F., Oliveira, C., et al. (2009). A TARBP2 mutation in human cancer impairs microRNA processing and DICER1 function. Nature genetics 41, 365-370.
Merritt, W.M., Lin, Y.G., Han, L.Y., Kamat, A.A., Spannuth, W.A., Schmandt, R., Urbauer, D., Pennacchio, L.A., Cheng, J.F., Nick, A.M., et al. (2008). Dicer, Drosha, and outcomes in patients with ovarian cancer. The New England journal of medicine 359, 2641-2650.
Min, M., Bang, G.S., Lee, H., and Yu, B.C. (2010). A photoswitchable methylene-spaced fluorinated aryl azobenzene monolayer grafted on silicon. Chem Commun (Camb) 46, 5232-5234.
Mittelbrunn, M., Gutierrez-Vazquez, C., Villarroya-Beltri, C., Gonzalez, S., Sanchez-Cabo, R., Gonzalez, M.A., Bernad, A., and Sanchez-Madrid, F. (2011). Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature communications 2, 282.
Miyata, Y. (2005). Hsp90 inhibitor geldanamycin and its derivatives as novel cancer chemotherapeutic agents. Current pharmaceutical design 11, 1131-1138.
Montecalvo, A., Larregina, А.Т., Shufesky, W.J., Stolz, D.В., Sullivan, M.L., Karlsson, J.M., Baty, C.J., Gibson, G.A., Erdos, G., Wang, Z., et al. (2012). Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood 119, 756-766.
Narayanan, A., Iordanskiy, S., Das, R., Van Duyne, R., Santos, S., Jaworski, E., Guendel, I., Sampey, G., Dalby, E., Iglesias-Ussel, M., et al. (2013). Exosomes derived from HIV-1-infected cells contain trans-activation response element RNA. The Journal of biological chemistry 288, 20014-20033.
Nicoloso, M.S., Spizzo, R., Shimizu, M., Rossi, S., and Calin, G.A. (2009). MicroRNAs-the micro steering wheel of tumour metastases. Nature reviews Cancer 9, 293-302.
Ostrowski, M., Carmo, N.B., Krumeich, S., Fanget, I., Raposo, G., Savina, A., Moita, C.F., Schauer, K., Hume, A.N., Freitas, R.P., et al. (2010). Rab27a and Rab27b control different steps of the exosome secretion pathway. Nature cell biology 12, 19-30; sup pp 11-13.
Ozen, M., Creighton, C.J., Ozdemir, M., and Ittmann, M. (2008). Widespread deregulation of microRNA expression in human prostate cancer. Oncogene 27, 1788-1793.
Pant, S., Hilton, H., and Burczynski, M.E. (2012). The multifaceted exosome: biogenesis, role in normal and aberrant cellular function, and frontiers for pharmacological and biomarker opportunities. Biochemical pharmacology 83, 1484-1494.
Park, H.J., Bang, G., Lee, B.R., Kim, H.O., and Lee, P.H. (2011). Neuroprotective effect of human mesenchymal stem cells in an animal model of double toxin-induced multiple system atrophy parkinsonism. Cell Transplant 20, 827-835.
Pegtel, D.M., Cosmopoulos, K., Thorley-Lawson, D.A., van Eijndhoven, M.A., Hopmans, E.S., Lindenberg, J.L., de Gruijl, T.D., Wurdinger, Т., and Middeldorp, J.M. (2010). Functional delivery of viral miRNAs via exosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107, 6328-6333.
Peinado, H., Aleckovic, M., Lavotshkin, S., Matei, I., Costa-Silva, В., Moreno-Bueno, G., Hergueta-Redondo, M., Williams, C., Garcia-Santos, G., Ghajar, C., et al. (2012). Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat Med 18, 883-891.
Razi, M., and Futter, С.E. (2006). Distinct roles for Tsg101 and Hrs in multivesicular body formation and inward vesiculation. Molecular biology of the cell 17, 3469-3483.
Roccaro, A.M., Sacco, A., Maiso, P., Azab, A.K., Tai, Y.Т., Reagan, M., Azab, R., Flores, L.M., Campigotto, F., Weller, E., et al. (2013). BM mesenchymal stromal cell-derived exosomes facilitate multiple myeloma progression. The Journal of clinical investigation.
Rothstein, D.M. et al. Targeting signal 1 through CD45RB synergizes with CD40 ligand blockade and promotes long term engraftment and tolerance in stringent transplant models. J Immunol 166, 322-329 (2001).
Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
Savina, A., Furlan, M., Vidal, M., and Colombo, M.I. (2003). Exosome release is regulated by a calcium-dependent mechanism in K562 cells. The Journal of biological chemistry 278, 20083-20090.
Schmittgen, T.D., Jiang, J., Liu, Q., and Yang, L. (2004). A high-throughput method to monitor the expression of microRNA precursors. Nucleic acids research 32, e43.
Shen, В., Fang, Y., Wu, N., and Gould, S.J. (2011a). Biogenesis of the posterior pole is mediated by the exosome/microvesicle protein-sorting pathway. The Journal of biological chemistry 286, 44162-44176.
Shen, В., Wu, N., Yang, J.M., and Gould, S.J. (2011b). Protein targeting to exosomes/microvesicles by plasma membrane anchors. The Journal of biological chemistry 286, 14383-14395.
Shen, J., Xia, W., Khotskaya, Y.В., Huo, L., Nakanishi, K., Lim, S.O., Du, Y., Wang, Y., Chang, W.C., Chen, С.H., et al. (2013). EGFR modulates microRNA maturation in response to hypoxia through phosphorylation of AGO2. Nature 497, 383-387.
Sherer, N.M., Lehmann, M.J., Jimenez-Soto, L.F., Ingmundson, A., Horner, S.M., Cicchetti, G., Allen, P.G, Pypaert, M., Cunningham, J.M., and Mothes, W. (2003). Visualization of retroviral replication in living cells reveals budding into multivesicular bodies. Traffic 4, 785-801.
Shi, W., Oshlack, A., and Smyth, G.K. (2010). Optimizing the noise versus bias trade-off for Illumina whole genome expression BeadChips. Nucleic acids research 38, e204.
Shin, H.W., Morinaga, N., Noda, M., and Nakayama, K. (2004). BIG2, a guanine nucleotide exchange factor for ADP-ribosylation factors: its localization to recycling endosomes and implication in the endosome integrity. Molecular biology of the cell 15, 5283-5294.
Simons, M., and Raposo, G. (2009). Exosomes-vesicular carriers for intercellular communication. Curr Opin Cell Biol 21, 575-581.
Simpson, R.J., Jensen, S.S., and Lim, J.W. (2008). Proteomic profiling of exosomes: current perspectives. Proteomics 8, 4083-4099.
Skog, J., Wurdinger, Т., van Rijn, S., Meijer, D.H., Gainche, L., Sena-Esteves, M., Curry, W.T., Jr., Carter, B.S., Krichevsky, A.M., and Breakefield, X.O. (2008). Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature cell biology 10, 1470-1476.
Tang, G. (2005). siRNA and miRNA: an insight into RISCs. Trends Biochem Sci 30, 106-114.
Taylor, D.D., and Gercel-Taylor, C. (2008). MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecologic oncology 110, 13-21.
Taylor, D.D., and Gercel-Taylor, C. (2011). Exosomes/microvesicles: mediators of cancer-associated immunosuppressive microenvironments. Semin Immunopathol 33, 441-454.
Thery, С., Amigorena, S., Raposo, G., and Clayton, A. (2006). Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S Bonifacino [et al] Chapter 3, Unit 3 22.
Thery, C. et al. Indirect activation of naive CD4+ T cells by dendritic cell-derived exosomes. Nat Immunol 3, 1156-1162, (2002).
Thery, C., Zitvogel, L., and Amigorena, S. (2002). Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat Rev Immunol 2, 569-579.
Thery, C. (2011). Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 biology reports 3, 15.
Thery, M., and Casas, J. (2002). Predator and prey views of spider camouflage. Nature 415, 133.
Thomson, D.W., Bracken, C.P., Szubert, J.M., and Goodall, G.J. (2013). On measuring miRNAs after transient transfection of mimics or antisense inhibitors. PloS one 8, e55214.
Tse, J.C., and Kalluri, R. (2011). Waking up dormant tumors. Breast cancer research: BCR 13, 310.
Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., and Burwinkel, B. (2011). Characterization of extracellular circulating microRNA. Nucleic acids research 39, 7223-7233.
Valadi, H., Ekstrom, K., Bossios, A., Sjostrand, M., Lee, J.J., and Lotvall, J.O. (2007). Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature cell biology 9, 654-659.
van Balkom, B.W., de Jong, O.G., Smits, M., Brummelman, J., den Ouden, K., de Bree, P.M., van Eijndhoven, M.A., Pegtel, D.M., Stoorvogel, W., Wurdinger, Т., and Verhaar, M.C. (2013). Endothelial cells require miR-214 to secrete exosomes that suppress senescence and induce angiogenesis in human and mouse endothelial cells. Blood 121, 3997-4006, S3991-3915.
Vickers, K.C, Palmisano, В.Т., Shoucri, В.M., Shamburek, R.D., and Remaley, A.T. (2011). MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nature cell biology 13, 423-433.
Volinia, S., Calin, G.A., Liu, C.G., Ambs, S., Cimmino, A., Petrocca, R., Visone, R., Iorio, M., Roldo, C., Ferracin, M., et al. (2006). A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103, 2257-2261.
Welch, D.R. (1997). Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clinical & experimental metastasis 15, 272-306.
Wiesen, J.L., and Tomasi, T.B. (2009). Dicer is regulated by cellular stresses and interferons. Mol Immunol 46, 1222-1228.
Yan, L.X., Huang, X.R., Shao, Q., Huang, M.Y., Deng, L., Wu, Q.L., Zeng, Y.X., and Shao, J.Y. (2008). MicroRNA miR-21 overexpression in human breast cancer is associated with advanced clinical stage, lymph node metastasis and patient poor prognosis. RNA14, 2348-2360.
Yan, L.X., Wu, Q.N., Zhang, Y., Li, Y.Y., Liao, D.Z., Hou, J.H., Fu, J., Zeng, M.S., Yun, J.P., Wu, Q.L., et al. (2011). Knockdown of miR-21 in human breast cancer cell lines inhibits proliferation, in vitro migration and in vivo tumor growth. Breast cancer research: BCR 13, R2.
Yang, C, and Robbins, RD. (2011). The roles of tumor-derived exosomes in cancer pathogenesis. Clin Dev Immunol 2011, 842849.
Yang, X., Meng, S., Jiang, H., Zhu, C., and Wu, W. (2011). Exosomes derived from immature bone marrow dendritic cells induce tolerogenicity of intestinal transplantation in rats. J Surg Res 171, 826-832.
Yi, R., Qin, Y., Macara, I.G, and Cullen, B.R. (2003). Exportin-5 mediates the nuclear export of pre-microRNAs and short hairpin RNAs. Genes & development 17, 3011-3016.
Zernecke, A., Bidzhekov, K., Noels, H., Shagdarsuren, E., Gan, L., Denecke, В., Hristov, M., Koppel, Т., Jahantigh, M.N., Lutgens, E., et al. (2009). Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Science signaling 2, ra81.
Zhang, Y., Liu, D., Chen, X., Li, J., Li, L., Bian, Z., Sun, R., Lu, J., Yin, Y., Cai, X., et al. (2010). Secreted monocytic miR-150 enhances targeted endothelial cell migration. Molecular cell 39, 133-144.