СПОСОБ ОЦЕНКИ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ НАРУШЕНИЙ У ПОТОМСТВА БЕЛЫХ КРЫС С "ХИМИЧЕСКИМ НАСЛЕДСТВЕННЫМ ГРУЗОМ"
METHOD FOR ASSESSING GENETIC MORPHOFUNCTIONAL DISORDERS IN WHITE RAT OFFSPRING WITH CHEMICAL GENETIC BURDEN

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной медицине, точнее к токсикологии.
Чрезвычайно важной и актуальной на современном этапе становится проблема проявлений воздействия химических токсикантов в последующих поколениях [1, 2]. С проблемой влияния химических веществ на последующие поколения тесно переплетаются вопросы изучения в популяции мутационного груза, характеризующего частоту наследственно обусловленной патологии, связанной с влиянием факторов окружающей среды. Разработка подходов к оценке мутационного груза является одной из основных задач при определении реальной мутагенной нагрузки на население [3, 4]. Таким образом, в настоящее время назрела проблема изучения проявлений наследственного мутационного груза, а также анализа причин и механизмов данного явления. Из имеющихся на сегодняшний день в арсенале генотоксикологии методов для решения указанных задач наиболее перспективным представляется метод гель-электрофореза единичных клеток [5]. Данный метод обладает рядом преимуществ, среди которых высокая чувствительность, возможность оценки в любых клетках, небольшое количество требуемого экспериментального материала, относительно низкие стоимость и длительность проведения экспериментов [6, 7]. Однако, несмотря на свои преимущества, метод ДНК-комет требует определенных трудозатрат, наличия материальных и технических ресурсов [8].
Задачей изобретения является расширение арсенала методов оценки генетических нарушений у экспериментальных животных.
Поставленная задача решается путем изучения поведения потомства белых крыс, подвергшихся воздействию токсического вещества, в тесте «открытое поле» с регистрацией количества актов «обнюхивание», «локомоции», «движение на месте», расчета прогностического индекса и интерпретации полученного результата.
Авторы не обнаружили описания способов оценки генетических нарушений, имеющих перечисленные выше признаки. Таким образом, предлагаемый способ соответствует критерию «новизна».
Показатели поведения белых крыс, выявляемые в тесте «открытое поле», используются для оценки состояния центральной нервной системы животных [9]. Использования результатов этологических исследований для оценки генетических нарушений авторами не найдено. Таким образом, предлагаемый способ соответствует критерию «изобретательский уровень».
Способ осуществляется следующим образом.
Исследованию подвергают половозрелых белых крыс - потомков особей, подвергшихся воздействию токсического вещества. Поведение животных изучают с помощью теста «открытое поле» [9], фиксируя количество актов «обнюхивание», «локомоции», «движение на месте».
Рассчитывают прогностический индекс по формуле:
-у
Р=1/(1+е),
где Р - прогностический индекс, вероятность наличия генетических изменений;
е - математическая константа, равная 2,72;
у - регрессионное уравнение:
1
2
3
у=7,04-0,65Х+1,45Х-0,64Х,
где цифровые показатели - константы и регрессионные коэффициенты;
1
Х - количество актов «обнюхивания»;
2
Х - количество актов «локомоции»;
3
X - количество актов «движения на месте».
При Р больше 0 и меньше 0,5 вероятность наличия генетических изменений определяют как минимальную, при Р больше 0,5 и меньше 1 вероятность генетических изменений оценивают как высокую.
Заявленное решение позволяет выявлять возможное наличие генетических изменений в клетках белых крыс без проведения трудоемких генетических исследований. Способ также позволяет проводить выбраковку животных с изменениями в геноме перед экспериментом.
Показатели поведения, использованные в данном решении, характеризуют ориентировочно-исследовательское поведение (обнюхивания), двигательную активность (локомоции) и тревожность (движение на месте) [9]. Известно, что генетически предопределяются общие принципы установления межнейронных связей, основная архитектоника, которые впоследствии и определяют особенности функционирования ЦНС. Кроме этого, наследуются элементы поведения [10]. Данный факт позволяет связать генетические изменения, обнаруженные в тканях головного мозга экспериментальных животных, и показатели поведения: процент ДНК в хвосте кометы у особей опытной группы составил 3,98 (2,3-5,8)%, у контрольных - 0,56 (0,08-3,95)% при р=0,00001.
Обработка результатов обследования потомства белых крыс, подвергавшихся воздействию винилхлорида, проводилась нелинейным регрессионным анализом (логистическая регрессия) [11].
Достоверность полученных информативных показателей по результатам регрессионного анализа представлена в таблице 1.
Таблица 1
Const.B0
Акты
обнюхивание
локомоции
Движение на месте
Estimate
7,040777
-0,65067
1,45352
-0,63896
p-level
0,078059
0,02119
0,006294
0,174864
Уровень значимости для модели составил 0,00001. Оценка эффективности предлагаемого способа прогнозирования генетических нарушений проводилась в обучающей и контрольной выборках. В обучающей выборке (81 особь) правильное распознавание составило для белых крыс с повреждением ДНК 98,18% и 92,31% - для животных контрольной группы. В контрольной выборке (49 крысы) правильное распознавание составило 96,97% и 87,50% соответственно.
Пример 1
Белая крыса опытной группы, полученная от особи, подвергавшейся воздействию винилхлорида. При обследовании в тесте «открытое поле» выявлены числовые значения показателей:
X1 - количество актов «обнюхивания» - 25,
Х2 - количество актов «локомоция» - 22,
Х3 - количество актов «движения на месте» - 2.
Подставляем полученные значения в формулы:
у=7,04-0,65×27+1,45×22-0,64×5=1,41
-1,41
P=1/(1+2,72)=0,8.
Делаем вывод, что у данного животного высокая вероятность генетических изменений, что подтверждают результаты исследования генетических изменений методом «ДНК-комет». У данной особи процент ДНК в хвосте кометы составил 4,68%.
Пример 2
Белая крыса контрольной группы, полученная от особи, не подвергавшейся воздействию винилхлорида. При обследовании в тесте «открытое поле» выявлены числовые значения показателей:
X1 - количество актов «обнюхивания» - 20,
Х2 - количество актов «локомоции» - 5,
Х3 - количество актов «движения на месте» - 5.
Подставляем полученные значения в формулы:
у=7,04-0,65×27+1,45×22-0,64×5=-1,81
-1,41
P=1/(1+2,72)=0,14.
Делаем вывод, что у данной особи вероятность генетических изменений минимальная (процент ДНК в хвосте кометы составил 0,12%).
Литература
1. Антонова И.В. Роль экзогенных факторов в формировании врожденных пороков развития / И.В.Антонова, Е.В.Богачева, Ю.Ю.Китаева // Экология человека. - 2010. - №6. - С.30-35.
2. Домшлак М.Г. Информационное письмо «О необходимости расширения генетических исследований при оценке влияния химических веществ на половую функцию работников» / М.Г.Домшлак, Е.Н.Макарова-Землянская // Медицина труда и промэкология. - 2009. - №10. - С.45-48.
3. Даутов Ф.Ф. Факторы окружающей среды и здоровье населения / Ф.Ф.Даутов // Практическая медицина. - 2010. - №2. - С.68-72.
4. Дурнев А.Д. Анализ и значение мутаций в зародышевых клетках / А.Д.Дурнев // Медицинская генетика. - 2011. - №2. - С.3-11.
5. Арутюнян P.M. Анализ повреждения ДНК и хромосом методами молекулярной цитогенетики / P.M.Арутюнян, Г.Г.Оганесян // Вестник Российской академии медицинских наук. - 2011. - №9. - С.57-63.
6. Жанатаев А.К. Метод ДНК-комет в генотоксикологических исследованиях / А.К.Жанатаев, А.Д.Дурнев, С.Б.Середенин // Гигиена и санитария. - 2011. - №5. - С.86-90.
7. Brendler-Schwaab, S. The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing / S.Brendler-Schwaab, A.Hartmann, S.Pfuhler, G.Speit // Mutagenesis. - 2005. - Vol.20, №4. - P.245-54.
8. Применение метода щелочного гель-электрофореза изолированных клеток для оценки генотоксических свойств природных и синтетических соединений: Метод, рекомендации / Дурнев А.Д., Жанатаев А.К., Анисина Е.А. и др. - М., 2006.
9. Буреш Я. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения / Я.Буреш, О.Бурешова, Д.П.Хьюстон. - М.: Высш. шк., 1991. - 399 с.
10. Булаева К.Б. Генетические основы психофизиологии человека / К.Б.Булаева. - М.: Наука, 1991. - 208 с.
11. Трухачева Н.В. Математическая статистика в медико-биологических исследованиях с применением пакета Statistica. ГЭОТАР-Медиа. 2012. - 384 с.