СПОСОБ АФФИННОГО ВЫДЕЛЕНИЯ АУТОАНТИТЕЛ КЛАССА IgG К ИММУНОРЕГУЛЯТОРНОМУ ЦИТОКИНУ TNF
METHOD FOR AFFINE SEPARATION OF AUTOANTIBODIES OF IgG CLASS TO IMMUNOREGULATORY CYTOKINE TNF

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, а именно к способам аффинного выделения аутоантител к цитокинам.
Аутоантитела к цитокинам признаются исследователями как весьма существенные биологические эффекторные молекулы, регулирующие иммунный ответ in vivo. Аутоантитела к цитокинам были обнаружены в фармацевтических препаратах иммуноглобулина (VIIg) и у здоровых людей, от которых данные препараты были получены. Характеристика человеческих аутоантител к цитокинам выявляет их поликлональную природу и принадлежность преимущественно к IgG классу. В последние годы многими исследовательскими группами сообщается об обнаружении аутоантител, специфичных к интерферонам (INF-α, INF-β, INF-γ), некоторым интерлейкинам (IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12), факторам роста (GM-CSF, M-CSF, LIF, Oncostatin M, VEGF) и фактору некроза опухолей (Watanabe M., Uchida К., Nakagaki К., Trapnell В., Nakata К. High avidity cytokine autoantibodies in health and disease: Pathogenesis and mechanisms. // Cytokine & Growth Factor Reviews. - 2010. - doi: 10.1016/j.cytogfr. 2010.03.003).
Аутоантитела к цитокинам способны играть роль в патогенезе заболеваний или предрасположенности к ним, а также могут нести ответственность за физические проявления связанные с заболеванием.
Одним из значимых цитокинов с широким спектром действия является фактор некроза опухоли (TNF), для которого показано увеличение содержания при различных состояниях. Существует широкий спектр заболеваний, при которых роль TNF считается крайне важной.
На сегодняшний день исследованию аутоантител к фактору некроза опухоли посвящено небольшое количество работ. Так, аутоантитела к TNF были обнаружены в сыворотках крови здоровых доноров, в большем количестве - в сыворотках крови пациентов с туберкулезом, грамотрицательной бактериальной септицемией, кистозным фиброзом с хронической легочной инфекцией, рассеянным склерозом, а также с различными ревматическими заболеваниями. Вместе с тем, наличие аутоантилел к TNF, их вклад в регуляцию биологической активности самого цитокина и участие в патогенетических процессах при различных заболеваниях изучены недостаточно.
На сегодняшний день, в большинстве работ по изучению участия аутоантител к цитокинам, и в том числе к TNF, в регуляции их активности содержание аутоантител выражают в единицах оптической плотности. Однако, такой подход создает трудности при сравнении данных, полученных различными группами исследователей вследствие использования различных реагентов и методов для определения аутоантител и делает невозможным сравнение содержания аутоантител различных классов и подклассов в пределах каждой исследуемой группы доноров.
В связи с чем, предпочтительным представляется выделение чистых фракций аутоантител, которые могут быть использованы в качестве калибровочных образцов при постановке ИФА для определения абсолютных количеств аутоантител к цитокинам, а также позволят определить биологическую активность аутоантител.
Описан способ (прототип), при котором фракции аутоантител выделяли из сыворотки крови человека методом аффинной хроматографии с использованием хроматографического сорбента (CNBr)-активированной Sepharose 4B (Pharmacia, Uppsala, Sweden), связанного с TNF. Фракции, связавшиеся с TNF, были собраны и нейтрализованы. В каждой собранной фракции методом ИФА было определено содержание антител, и фракции с наиболее высоким содержанием антител были объединены и диализованы против PBS. Далее данные фракции были дополнительно очищены с использованием колонки с Protein А сорбентом, нейтрализованы и сконцентрированы. Была показана нейтрализующая активность полученной фракции аутоантител в отношении TNF (цитотоксический тест на клеточной линии WEHI 164). (Sioud M., Dybwad A., Jespersen L., Suleyman S., Natvig J.B., Føorre O. Characterization of naturally occurring autoantibodies against tumour necrosis factor-alpha (TNF-alpha): in vitro function and precise epitope mapping by phage epitope library. // Clin Exp Immunol. - 1994. - Vol.98 (3). - P.520-525.)
Недостатком данного подхода является отсутствие очистки полученной фракции аутоантител от примеси TNF, которая при элюировании может смываться с колонки с аффинным сорбентом Sepharose, таким образом, часть аутоантител во фракции может находится в связанном с цитокином состоянии, что может оказать влияние при использовании полученной фракции аутоантител для постановки тестов на биологическую активность и при применении полученной фракции в качестве калибровочного образца для определения абсолютного содержания аутоантител в сыворотке крови человека. Кроме того, используемый на второй стадии очистки сорбент Protein А не позволяет выделить аутоантитела подкласса IgG3, что делает невозможным применение очищенной фракции аутоантител к TNF в качестве калибровочного образца для определения абсолютного содержания аутоантител к TNF подкласса IgG3 в сыворотке крови человека.
Задачей настоящего изобретения является создание эффективного способа выделения аутоантител класса IgG к иммунорегуляторному цитокину TNF.
Сущность предлагаемого изобретения заключается в следующем:
Из сыворотки крови человека выделяют антитела класса IgG с использованием колонки с аффинным сорбентом Protein G. При проведении элюции полученные фракции аутоантител нейтрализуют, объединяют и диализуют. Далее фракции аутоантител наносят на колонку со связанным с TNF аффинным сорбентом. При проведении элюции полученные фракции аутоантител к TNF нейтрализуют, объединяют и диализуют. Далее проводят магнитную сепарацию для очистки фракции аутоантител к TNF от примеси TNF. Для магнитной сепарации используют магнитные частицы, покрытые стрептавидином и поликлональные антитела к TNF. Поликлональные антитела к TNF метят биотином, проводят совместную инкубацию магнитных частиц и меченых биотином поликлональных антител, полученный комплекс инкубируют с фракциями аутоантител к TNF, выделенных в ходе процедур аффинной хроматографии, и собирают надосадочную жидкость, содержащую очищенные фракции аутоантител.
Принципиальным отличием разработанного способа от прототипа является использование магнитных частиц, связанных с мечеными биотином поликлональными антителами к TNF, для очистки фракции аутоантител к TNF от примеси самого цитокина, что исключает возможность искажения результатов тестов на биологическую активность полученной фракции аутоантител, вследствие влияния TNF, а также результатов иммуноферментного анализа для определения абсолютного содержания аутоантител к TNF в сыворотках крови человека с использованием в качестве калибровочных образцов полученных фракций аутоантител к TNF, из-за возможности конкуренции присутствующего во фракции аутоантител TNF с TNF, пришитым к подложке для проведения ИФА.
Кроме того, использование сорбента Protein G позволяет выделить аутоантитела класса IgG всех четырех подклассов, что позволяет применение очищенной фракции аутоантител к TNF в качестве калибровочного образца для определения абсолютного содержания аутоантител к TNF подклассов IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 в сыворотке крови человека, а также при постановке тестов на биологическую активность аутоантител к TNF позволяет учесть вклад всех подклассов IgG.
Предлагаемое изобретение позволяет выделить чистые фракции аутоантител к TNF всех четырех подклассов иммуноглобулина G, очищенные от примеси самого TNF, в связи с чем полученная фракция может быть использована в различных биологических тестах предполагающих использование аутоантител к TNF класса IgG.
Техническим результатом изобретения является получение чистых фракций аутоантител к TNF класса IgG.
Изобретение осуществляется следующим образом.
Сыворотка крови человека получается путем центрифугирования цельной крови в течение 15 мин (3000 об/мин). Перенос сыворотки крови человека в соответствующий буфер, необходимый для дальнейших процедур аффинной очистки антител, осуществляется с помощью колонки с сорбентом Bio-Gel P6 DG (Bio-Rad, США). Высокомолекулярные фракции с Bio Gel P6 DG наносятся на колонку с Protein G Sepharose Fast Flow аффинным сорбентом (GE Healthcare, США). Хроматографические процедуры проводятся в соответствии с инструкцией производителя. Используются следующие буфера: рабочий буфер - 20 mM фосфатно-солевой буфер (PBS) (рН=7,4), буфер для удаления неспецифически связавшихся компонентов - 20 mM PBS, содержащий тритон × 100 (0,1%) (рН=7,4), буфер для элюции - 0,1 М Gly - Cl (рН=2,5). При проведении элюции полученную фракцию нейтрализуют до физиологических значений рН 1М Tris-HCl буфером (рН 9,0). Фракции антител объединяют и диализуют против 20 mM PBS (рН=7,4). Диализованные фракции антител наносят на колонку со связанным с TNF аффинным сорбентом Affi-Gel (Bio-Rad, США).
Связывание TNF с аффинным сорбентом и Хроматографические процедуры по выделению антител проводят согласно инструкции производителя. Используются следующие буфера: рабочий буфер - 20 mM PBS (pH=7,4), буфер для удаления неспецифически связавшихся компонентов - 1М гуанидин-HCl (рН=7,4), буфер для элюции - 0,1 М Gly-HCl (рН=2,5). При проведении элюции полученную фракцию нейтрализуют до физиологических значений рН 1М Tris-HCl буфером (рН 9,0). Фракции аутоантител к TNF объединяют и диализуют против 20 mM PBS (pH=7,4).
Для магнитной сепарации используют магнитные частицы (Dynabeads М-280, Dynalbiotech) покрытые стрептавидином. Кроличьи поликлональные антитела к TNF метят биотином (ORIGEN, США), далее проводится соинкубация магнитных частиц и поликлональных антител, после отмывки, полученный комплекс инкубируют с фракциями аутоантител к TNF, полученных в ходе процедур аффинной хроматографии, и собирают надосадок, содержащий очищенные фракции аутоантител.
Фракция аутоантител к TNF была выделена из сыворотки крови условно здоровых доноров. Чистота фракции и соответствие по молекулярному весу иммуноглобулинам класса G были подтверждены электрофоретически (данные не представлены). Чистота фракции, а именно отсутствие в ней примеси TNF, дополнительно проверена методами ИФА и ЭХЛ (данные не представлены).
Далее с использованием набора для проведения ИФА, включающего рекомбинантный человеческий TNF и моноклональные антитела к классам и подклассам иммуноглобулинов человека меченные пероксидазой хрена, были определены абсолютное содержание аутоантител к TNF подклассов IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 в сыворотках крови условно здоровых доноров с использованием в качестве калибровочного материала полученной фракции аутоантител к TNF (табл.1).
Таблица 1Содержание аутоантител к TNF по подклассам в сыворотке крови условно здоровых доноров (n=10). Результаты представлены в нг/мл.
IgG1
IgG2
IgG3
IgG4
169,1* (35,1-180,8)
66,6*# (47,8-69,8)
109,0* (85,3- 128,0)
34,7 (28,4-42,4)
Примечание: * - достоверно (р<0,05) по сравнению содержанием IgG4;
# - достоверно (р<0,05) по сравнению содержанием IgG3.
Использование колонок с аффинными сорбентами Protein G и Affi-Gel, связанного с TNF, и процедуры дополнительной очистки с применением магнитных бус является эффективным способом получения аутоантител класса IgG к TNF, что подтверждается тестами на чистоту фракции и соответствие ее по молекулярному весу иммуноглобулинам класса G, а также возможностью использования полученной фракции в качестве калибровочного материала для определения абсолютного содержания аутоантител к TNF в сывоторках крови человека. Таким образом, в результате проведенных исследований разработан способ аффинного выделения аутоантител класса IgG к иммунорегуляторному цитокину TNF, котый может быть использован для всех других цитокинов.