Активные формы кислорода продуктов озонолиза некоторых непредельных органических соединений

РЕДЕЛЬНЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ

А.С. Гордецов, д.х.н., профессор, зав. кафедрой общей химии1; С.П. Перетягин, д.м.н., профессор2;

А.В. Кадомцева, к.х.н., старший преподаватель кафедры общей химии1;

А.Н. Новикова, к.х.н., старший преподаватель кафедры общей химии1;

О.В. Гречканева, научный сотрудник2;

С.В. Зимина, к.х.н., доцент кафедры общей химии1

приволжский исследовательский медицинский университет, пл. Минина и Пожарского, 10/1, Н. Новгород, 603005;

2Ассоциация российских озонотерапевтов, ул. Панина, 9, Н. Новгород, 603089

Цель исследования — изучение состава реакционных систем, образующихся при озонировании некоторых липидов, в частности оливкового масла и его модельной системы — олеиновой кислоты, а также выявление в них активных форм кислорода (АФК), приводящих к появлению саногенетических свойств у приготовленных на их основе лечебных препаратов.

Материалы и методы. Липиды, содержащие олеиновую кислоту в этерифицированной и свободной формах, озонировали с помощью аппарата озонотерапии с деструктором озона «Медозонс-03» (АОТ-Н-01-Арз-01) (Россия). Исследование химического состава и строения продуктов озонолиза, содержащих АФК, выполняли на ИК-Фурье спектрофотометре Shimadzu IR Prestige 21 (Япония) в области волновых чисел 4000-400 см-1 в виде жидких пленок в окошках из KBr или ZnSe. Поиск АФК проводили сравнением ИК-спектров образцов исследуемых веществ до и после озонирования. Динамику образования и изменения концентрации АФК контролировали также методом йодометрического титрования по Межгосударственному стандарту ГОСТ ISO 3960-2013. Свойства приготовленных на основе озонированных продуктов лечебных препаратов, а также динамику изменения концентраций АФК в них исследовали аналогичным образом.

Результаты. Метод ИК-Фурье-спектроскопии позволил установить, что в результате озонирования липидов, содержащих олеиновую кислоту в этерифицированной и свободной формах, в качестве основных относительно стабильных форм АФК образуются соответственно гидропероксикислоты и гидропероксиэфиры, а не озониды. Концентрация последних весьма незначительна, в то время как гидропероксипроизводные распадаются достаточно медленно и существуют в реакционных продуктах (системах) в течение нескольких месяцев. Выявлено также, что многокомпонентные гидрофильные основы лечебных препаратов практически не оказывают прямого химического влияния на данный тип АФК.

Ключевые слова: ИК-Фурье-спектроскопия; озон; гидропероксикислоты; гидропероксиэфиры.

Как цитировать: Gordetsov А^., Peretyagin S.P., Kadomtseva А.У, Novikova А.К, Grechkaneva O.V., Zimina S.V. Reactive oxygen species of ozonolysis products of some unsaturated organic compounds. Sovremennye tehnologii v medicine 2019; 11(3): 60-65, https://doi. org/10.17691/stm2019.11.3.08

Для контактов: Гордецов Александр Сергеевич, e-mail: algordetsov@yandex.ru

Reactive Oxygen Species of Ozonolysis Products of Some Unsaturated Organic Compounds

А.S. Gordetsov, DSc, Professor, Head of General Chemistry Department1;

S.P. Peretyagin, MD, DSc, Professor2;

А.V. Kadomtseva, PhD, Senior Teacher, General Chemistry Department1;

А.N. Novikova, PhD, Senior Teacher, General Chemistry Department1;

О.V. Grechkaneva, Researcher2;

S.V. Zimina, PhD, Associate Professor, General Chemistry Department1

1Privolzhsky Research Medical University, 10/1 Minin and Pozharsky Square, Nizhny Novgorod, 603005, Russia;

2Ozone Therapeutist Association, 9 Panin St., Nizhny Novgorod, 603089

The aim of the investigation was to study the composition of reaction systems formed when certain lipids are ozonized, in particular, olive oil lipids and olive oil model system — oleic acid, as well as to reveal reactive oxygen species (ROS) in the systems resulting in sanogenetic properties appearing in preparations based on the properties.

Materials and Methods. Lipids containing oleic acid in esterified and free forms were ozonized by an ozone therapy unit with an ozone destructor (Medozons-03, A0T-N-01-Arz-01, Russia). The chemical composition and structure of ozonolysis products containing ROS were studied using Fourier-transform IR spectrophotometer (Shimadzu IR Prestige 21, Japan) in a wave number area 4000-400 cm-1 in the form of liquid films in the windows from KBr or ZnSe. ROS were searched by comparing IR spectra of studied samples before and after ozonolysis. The dynamics of ROS formation and concentration changes were also controlled by iodometric titration according to Interstate standard GOST ISO 3960-2013. The properties of medicinal preparations made on ozonized products, as well as ROS concentration changes were studied in a similar way.

Results. Fourier-transform IR spectroscopy enabled to find that the ozonolysis of lipids containing oleic acid in esterified and free forms results in the formation of hydroperoxyacids and hydroperoxyesters, respectively, rather than ozonides, as basic relatively stable ROS forms. The concentration of ozonides is rather low, while hydroperoxy-derivatives segregate rather slowly, and exist in reaction products (systems) within several months. Multi-component hydrophilic bases of pharmaceuticals have a slight direct chemical effect on this ROS type.

Key words: Fourier-transform IR spectroscopy; ozone; hydroperoxyacids; hydroperoxyesters.

English

Введение

В течение последних 2-3 десятилетий началось успешное применение наружных озонидсодержащих препаратов с лечебными целями в различных областях медицины (дерматовенерологии, гинекологии, стоматологии, комбустиологии). Кроме того, ведущими мировыми производителями сразу в нескольких странах: России, Украине, Италии, Кубе, Испании, Турции, США, Мексике — несколько лет назад налажено широкое производство наружных препаратов, содержащих химически модифицированные озоном липиды типа оливкового масла [1]. Все это стимулирует более тщательное изучение химического состава образующихся реакционных смесей.

Востребованность озонидсодержащих препаратов на медицинском рынке позиционируется их мощным бактерицидным действием, антиоксидантными свойствами, способностью улучшать микроциркуляцию крови, стимулировать регенераторный потенциал клетки путем интенсификации процессов аэробного метаболизма [2]. Вместе с тем разработка новых средств, содержащих активные формы кислорода — АФК (масла, препараты на гидрофильной основе) дик-

тует проведение физико-химических и биохимических исследований для установления их состава и биологических свойств, возникающих в них в результате технологического процесса.

Цель исследования — изучение состава реакционных систем, образующихся при озонировании некоторых липидов, в частности оливкового масла и его модельной системы — олеиновой кислоты, а также выявление в них активных форм кислорода, приводящих к появлению саногенетических свойств у приготовленных на их основе лечебных препаратов.

Материалы и методы

Липиды, содержащие олеиновую кислоту в этери-фицированной и свободной формах, озонировали с помощью аппарата озонотерапии с низкой концентрацией и деструктором озона «Медозонс-03» (АОТ-Н-01-Арз-01) («Медозонс», Россия). Исследование химического состава и строения продуктов озо-нолиза, содержащих АФК, выполняли на ИК-Фурье-спектрофотометре Shimadzu IR Prestige 21 (Shimadzu Corp., Япония) в области 4000-400 см-1 в виде жидких пленок в окошках из KBr или ZnSe.

АФК идентифицировали сравнением ИК-спектров образцов исследуемых соединений до и после озонирования. Концентрацию АФК устанавливали также методом йодометрического титрования по Межгосударственному стандарту ГОСТ ISO 39602013 [3]. Аналогично исследовали свойства приготовленных на основе озонированного оливкового масла лечебных препаратов.

Результаты и обсуждение

Известно, что при озонировании органических соединений, содержащих двойные связи углерод-углерод, последние расщепляются с образованием продуктов окисления, основными из которых являются озониды [4, 5]. Однако при проведении реакции в присутствии спиртов, кислот и других кислородсодержащих веществ вместо озонидов образуются пе-рекисные продукты других типов [5, 6], например по схеме 1:

О О

R2C-CR2 "

R,C-

-CR,

О-О

I -

-CR,

R"COOH

R'OH

R2C=O+O—о—cr2

инертный (1) растворитель

О

и

,0-C-R"

.OR'

R2C\

O-OH

R2C\

O-OH

+ ^0=0

R2Cx /CR,

О +

полимерные озониды

Нас интересовало отношение свободной и этерифицированной олеиновой кислоты к воздействию озона в условиях технологии получения лечебно-косметических кремов, поскольку их основным компонентом является озонированное оливковое масло.

Был выполнен озонолиз олеиновой кислоты по методике и в условиях, аналогичных озонолизу оливкового масла. Анализ ИК-спектров исходного вещества и смеси продуктов озонирования показал, что кроме ожидаемых нонановой и азелаиновой кислот в качестве одного из основных продуктов образуется промежуточный гидроксипероксид (Б) (схема 3):

СН3-(СН2)7-СН=СН-(СН2)7СООН

Оз

о

р' No

Оз

Н3С-(СН2)7-СН-СН-(СН2)7СООН —

озонид

+о 0-Ö"

Оз

-*-Н3С-(СН2)7-СН-СН-(СН2)7СООН^»-

Оз //0 - + /Р

"7Г*- н3с-(сн2)7-сС + о—О—С-(СН2)7-сГ — — он ^ он

.0-С-С8Н17

.С-(СН2)7НС.

но о—он

гидропероксикислота

/Р

- >-(CH2)7-cf +С8Н17СООН но NOH

При осуществлении взаимодействия непредельных соединений с озоном в среде кетона выход озонида уменьшается с 86,6 до 2,9%, причем основными продуктами являются пероксиды и лактоны [5]. Следует отметить, что при обработке олеиновой кислоты озоном в среде нонановой (пеларгоновой) кислоты вместо озонидов образуется сначала гидропероксикис-лота, которая затем переходит в смесь нонановой и азелаиновой кислот [5]. Данная реакция используется для промышленного производства азелаиновой кислоты (схема 2):

СН3-(СН2)7-СН=СН-(СН2)7СООН+Оз-

О

с8н17соон , \-

V(CH2)7-C^ с8н17соон HO vOH

азелаиновая кислота пеларгоновая кислота

В ИК-спектрах реакционной смеси (рис. 1, а, б) обнаружены следующие полосы поглощения (см-1): гидропероксикислота (Б) — 3450 (валентные колебания Н-0 в свободной группе НОО), 1740 (валентные колебания группы С=О в пероксикислотах), 1095 (валентные колебания С-О-О), 885 (валентные колебания группы О-О, слабое поглощение); нона-новая кислота — 1711 (валентные колебания С=О), 1465, 1412, 1287, 1220, 950; азелаиновая кислота — 1690 (плечо, валентные колебания С=О), 2932, 2856 (валентные колебания С-Н), 1469, 1434 (деформационные колебания С-Н). Найден также пик малой интенсивности 1041 см-1 , который, по-видимому, принадлежит озониду (А) [5]. Имеется небольшая примесь олеиновой кислоты. Методом вычитания ИК-спектров [7, 8] подтверждены основные пики поглощения С=О гидроксипероксида (Б) (рис. 1, в). Таким образом, носителями АФК в реакции (3) является гидропероксикислота и озонид.

Известно [5, 9], что при озонировании оливкового масла по аналогичным схемам образуются озо-ниды, которые в присутствии продуктов окисления

быстро переходят в гидропероксиды жирных кислот и сложных эфиров. В то же время сложноэфирные связи триглицеридов также расщепляются, давая различные моно- и диглицери-ды с пероксидными группами. В итоге получается сложная смесь продуктов окисления органических веществ, среди которых идентифицированы альдегиды, кетоны, короткоцепочечные и длинноцепочечные карбоновые кислоты, а также пероксидные и гидропе-роксидные производные перечисленных соединений. Отдельные продукты озонирования доказаны методами газовой и тонкослойной хроматографии, причем наибольшую концентрацию среди идентифицированных веществ имела нонановая кислота [9].

Изучение нами исходного и озонированного оливкового масла с помощью ИК-спектров показало, что в условиях технологического процесса, во-первых, реакция проходит достаточно глубоко и, во-вторых, основными продуктами являются пероксикис-лоты и их эфиры (схема 4), а также нонановая кислота. ИК-спектры смеси продуктов реакции (рис. 2) содержат следующие основные полосы поглощения (см-1); 3478-3468 (v OOH), 1754 (v C=O), 1464, 1418, 1101 (v COO), 885 (v O-O, плечо) [гидропероксикисло-ты и их эфиры] [4], 1718-1712 (v C=O), 1464, 1418, 1243, 1105, 954 [нонановая кислота]. Имеется также полоса поглощения при 1050 см-1 [озониды]. Таким образом, как и в случае олеиновой кислоты, носителями АФК являются гидропероксикислоты и их сложные эфиры, а также незначительные количества озонидов.

Следует отметить, что интенсивность пиков АФК в ИК-спектрах продуктов реакции (4) несколько ниже, чем при озонировании индивидуальной олеиновой кислоты. Гидролиз олеатов и других триглицеридов оливкового масла не наблюдался. Так, в ИК-спектрах отсутствуют полосы поглощения основного продукта гидролиза — глицерина, причем специальными экспериментами было показано, что сам глицерин в применяемых условиях с озоном не реагирует. Предположительная схема озоноли-за триолеина, являющегося главным компонентом оливкового масла, имеет

Рис. 1. ИК-спектр:

а — олеиновой кислоты; б — продуктов озонирования олеиновой кислоты; в — гидропероксикислоты, который получен вычитанием ИК-спектров олеиновой кислоты до и после озонирования

%T

б %T

130120110100 90 8070 6050403020100-10-20-

%T 130

"Р.....т.......I 1 1 1 Ч 1 1 1 I '..............—1—1—1—г

3600 3000 2400 1950 1650 1350 1050 900 750 600

1/см

/ I

/ »1

/ . ТЛ i

Г 11 'il 1 vy^

1 : 'h : £ , '

1 ! I ' 'V ' 1 : u.

....... : 'Il : s 1

; i jj *

... 1 ' T........

........'

........Я

1 ...........?

*

F

3600 3000 2400 1950 1650 1350 1050 900 750 600

1/см

л-1-1 Ч 11-1-н-1-1-р—'-1-1-1 1 1 I......'т

3600 3000 2400 1950 1650 1350 1050 900 750 600

1/см

для отдельного фрагмента липида такой же вид (схема 4):

о

\ и Оз

—с—0-С-(СН2)7-СН = СН-(СН2)7-СНз—V

о о у

—V-^-0-C-(CH2)7CH—СН-(СН2)7-СН3—

^^-Vo-§4CH2)7XW

—»-НзС-(СН2)7Сч

он

Оз, 02^ \

г

-он

/

С-О-С- (СН2)7СН-0- С-(СН2)7-СН3-

о о

-Н3С-(СН2)7-С

/У \ N /

Г + —с-о-с-(сн2)7-с:

//

он

/

он

Рис. 2. ИК-спектр:

а — оливкового масла; б — продуктов озонирования оливкового масла; в — гидропероксиэфиров, который получен вычитанием ИК-спектров оливкового масла до и после озонирования

Очевидно, что реакция может протекать не только по трем, но и по двум и даже одному эфирному фрагменту заместителя в липиде, причем образующиеся вещества далее гидро-лизуются и окисляются, давая смесь моно-, ди- и триглицеридов более короткоцепочечных кислот [9], а также различных альдегидов и свободных кислот. Естественно, что среди продуктов озонирования оливкового масла должны присутствовать и все продукты реакции свободной олеиновой кислоты с озоном (схема 3), но их общая концентрация составляет примерно 1%, так как концентрация свободной кислоты в масле не превышает 1-2%.

В заключение исследования мы провели ИК-спектроскопический анализ лечебных препаратов, приготовленных на основе озонированного оливкового масла, добавляемого к водной суспензии многокомпонентной базы лечебного крема, состоящей из сложных эфиров, солей высших карбоновых кислот и полимерных спиртов. Как и ожидалось, основные полосы поглощения образцов базы крема отвечали характеристическим частотам воды с максимумами при 3400-3300, 2083 и 1647 см-1. В процессе прибавления к этой базе озонированного масла и увеличения концентрации последнего от 3 до 30% наблюдается постепенный рост интенсивности полос поглощения в интервале ~1745-1717 см-1 (валентные колебания С=О смеси продуктов реакции озонирования оливкового масла).

Полоса поглощения с максимумом при 1106 см-1 (V С-О-О пероксисоединений) практически не проявляется в 3, 5 и 10% кремах, однако достаточно интенсивна в 30% креме. По всей вероятности, АФК малой концентрации практически полностью реагируют с базовой основой, сложноэфирные составляющие

а

в

которой (например, изопропилмиристат) повышают растворимость ацилглицеридов оливкового масла, переводя его в гомогенную фазу с непредельными компонентами. Последние, по всей вероятности, вступают в реакцию Прилежаева, давая а-оксиды, а затем гликоли (схема 5):

R—СН

II +R'-Сх

R—СН V

О—ОН непредельные гидроперокси-соединения кислота

R—СН

I ^O+R'COOH R—СН _

а-оксид карбоновые м кислоты

'г

Р—сн-он

R—СН-ОН

Кроме того, следует ожидать прямого образования карбоновых кислот и атомарного кислорода, который объясняет отбеливающий эффект пероксикислот [4] (схема 6):

R'-

-

\ о—ОН

R'-

+0

о—н

Следует отметить также, что ИК-спектры 30% крема изменяются при хранении его в течение нескольких месяцев. Так, если после 3 мес выдержки основным пиком V С=0 является 1750-1741 см-1 (V С=0 гидро-пероксисоединений), то через 6 мес — усредненный V С=0 — 1733 см-1, а через 8 мес — 1716 см-1. Это говорит о постепенном распаде АФК и липидов в процессе хранения препаратов.

Заключение

При озонировании липидов типа оливкового масла и его модельной системы — олеиновой кислоты в качестве активных форм кислорода образуются соответственно гидропероксикислоты и гидропероксиэфиры, причем озониды содержатся только в виде примесей. Приготовленные на основе озонированного оливкового масла лечебные препараты сохраняют функцию носителей АФК достаточно долго. Контроль динамики химических превращений с участием АФК удобно реализовать методом ИК-Фурье-спектроскопии.

Финансирование исследования и конфликт интересов. Исследование не финансировалось какими-либо источниками, и конфликты интересов, связанные с данным исследованием, отсутствуют

Литература/References

1. Grechkanyova O., Bitkina O., Peretyagin S., Peretyagin P., Gabasov I., Razheva P. The usage of laser Doppler flowmetry for evaluation of the efficiency of ozone-containing drugs for external use. J Pharm Pharmacol 2018; 6(1): 3238, https://doi.org/10.17265/2328-2150/2018. 01.004.

2. Перетягин С.П., Гординская Н.А., Стручков А.А., Гордецов А.С. Химические свойства, биологическая активность и биодоступность озонированного масла. Казанский медицинский журнал 2007; 88(4): 101-102. Peretyagin S.P., Gordinskaya N.A., Struchkov A.A., Gordetsov A.S. Chemical properties, biological activity and bioavailability of ozonized oil. Kazanskij medicinskij zurnal 2007; 88(4): 101-102.

3. ГОСТ ISO 3960-2013 Жиры и масла животные и растительные. 2015. GOST ISO 3960-2013 Zhiry i masla zhivotnye i rastitel'nye [GOST ISO 3960-2013 Animal and vegetable fats and oils]. 2015.

4. Химическая энциклопедия. Т. 3. М: Большая Российская энциклопедия; 1992; 639 с. Khimicheskaya entsiklopediya. T. 3 [Chemical encyclopedia. Vol. 3]. Moscow: Bol'shaya Rossiyskaya entsiklopediya; 1992; 639 p.

5. Razumovskii S.D., Zaikov G.E. Kinetics and mechanism of the reaction of ozone with double bonds. Russian Chemical Reviews 1980; 49(12): 1163-1180, https://doi.org/10.1070/ rc1980v049n12abeh002535.

6. Rieche A., Schulz M., Becker D. Ozonisierung von Olefinalkoholen. Bildung von Hydroperoxyden cyclischer Äther. Chem Ber 1965; 98(11): 3627-3631, https://doi.org/10.1002/ cber. 19650981129.

7. Вытовтов А.А. Определение подлинности и обнаружение фальсификации пищевых продуктов методом ИК-Фурье-спектрометрии. Ученые записки Санкт-Петербургского им. В.Б. Бобкова филиала Российской таможенной академии 2010; 1(35): 193-196. Vytovtov A.A. Identification and detection of adulteration of food products by the method of the infrared Fourier spectrometi Uchenye zapiski Sankt-Peterburgskogo im. V.B. Bobko filiala Rossiyskoy tamozhennoy akademii 193-196.

8. Mishina N.E., Zilberman B.Ya., Kol'' Lumpov A.A., Puzikov E.A. Composition of barium and strontium nitrates crystalliz solutions. Radiochemistry 2014; 56(3): 252-261, https://doi. org/10.1134/s1066362214

9. Rainbauer H., Washüttl J., Steiner I., Kroyer G., Winker N., Streichs bier F. Chemische U ntersuchungen an ozonisiertem Olivenöl. Fette, Seifen, Anstrichmittel 1982; 84(5): 188-191, https://doi.org/10.1002/lipi.19820840506.