Выявление гаплоидов у пурпурных форм кукурузы

Проведенное нами исследование тстраплоидов и гипотетраплоидов табака показало, что изученные формы характеризуются уменьшением размеров растений, цветков и их отдельных компонентов по сравнению с диплоидами, при этом наблюдается значительное варьирование исследованных признаков у различных растений. Структурные изменения в цветках, наблюдаемые у потомков тстраплоида, выражались в увеличении числа тычинок до 6-7 и появлении трехлопастных рылец.

Идентифицированные формы представляют интерес в качестве материала для дальнейшего эмбриолог ического исследования.

Работа выполнена при поддержке фонда МО РФ по фундаментальным исследованиям в области естественных наук (грант Е02-6.0-315).

Литература

Афанасьева А. С. Аутотстраплоиды проса, полученные действием колхицина // Полиплоидия у растений. M., 1962. С. 154-163.

Бреславец Л. П. Полиплоидия в природе и опыте. М., 1963. 364 с.

Жуковский П. М. Эволюционные аспекты полиплоидии растений // Полиплоидия у растений / Тр. совещ. по полиплоидии растений 25-28 июня 1958 г. М., 1962. С. 27-32.

Колесова А. Ю., Госенова О. Л., Еналеева H. X. Характеристика пыльцы у тетраплоидных и гипотетраплоидных форм табака, полученных на основе десинаптического мутанта Dsyl // Бюл. ботанического сада СГУ. Вып. 2. Саратов, 2003. С. 215-220.

Костов Д. Цитогенетика на рода Nicotiana. София, 1941-1943. 1072 с.

Лутков А И. Тетраплоидия у льна, вызванная действием высокой температуры на зиготу // Докл. АН СССР. 1939. Т. 19. ДЬ 1-2. С. 87-90.

Паушева 3. П. Практикум по цитологии растений. М., 1974. 288 с.

Синнот Э. Морфогенез растений. M., 1963. 603 с.

Шевцов И. А., Тимошенко В. М. Аиеуплоидия у триплоидных кормово-сахарных гибридов свеклы // Ци тология и генетика. 1974. Т. 8. Ки 1.С. 69-72.

Щавинская С. А. Тетраплоидная капуста, полученная путем регенерации // Тр. по прикл. бот., ген. и сел. 1937. Сер. 2. № 7. С. 13-36.

Юркевич Л. Н. Изменчивость некоторых морфологических и цитогенетических признаков разнохромосомных анеуплоидов из тетранлоидной популяции клевера красного АН-тетра-1 // Экспериментальная генетика растений. Киев, 1977. С. 73-84.

Blakeslee A. Effect of induced polyploidy in plants // Amer. Naturalist. 1940. N75. P. 117-135.

Coen E. S. The role of homeotic genes in flower development and evolution//Ann. Rev. PI. Physiol. Pl. Mol. Biol. 1991. Vol. 42. P. 241-279.

Izmailow R. Reproductive strategy in the Ranunculus auricomus complex (Ranunculaccae) Source // Acta Soc. Bot. Pol. 1996. Vol. 65. N 1-2. P. 167-170.

Quarin C. L., Espinoza F., Martinez E. J., Pessino S. C., Bovo O. A. A rise of ploidy level induces the expression of apomixis in Paspalum notatum // Scx.Plant Reprod. 2001.Vol. N 5. P.243-249.

Naumova T. N., Hay ward M. D., Wagenvooit M. Apomixis and sexuality in diploid and tetraploid accessions of Brachiaria dccumbens // Sex. Plant Reprod. 1999. Vol. 12. N 1. P. 43-52.

Smith H. H. The genus as a genetic resourse // Nicotiana. Procedures tor experimental use. Techn. Bui. 1979. Vol. t. N 1586. P. 1-16.

Wcigel D., Meyerowitz E. M. Activation of floral homeotic genes in Arabidopsis//Science. 1993. Vol. 261. P. 1723-1726.

УДК: 581.165.1

ВЫЯВЛЕНИЕ ГАПЛОИДОВ У ПУРПУРНЫХ ФОРМ КУКУРУЗЫ

Ю.В. Смолькина, JI.B. Сериков. Э.В. Калашникова Саратовский государственный университет им. H Г. Чернышевского

У кукурузы известны линии, у которых окраска стебля и листьев отличается от типичной зелёной. Она может иметь разные оттенки коричневого или пурпурного двега. Розовыми, красными или пурпурными могут быть первичные корешки проростков, причем такая окраска у одних форм проявляется при проращивании зерновок только при освещении, у других - как при освещении, так и в темноте. У некоторых линий может быть окрашенным нерикарп, алейрон и зародыш. Окраска и её степень определяется рядом генов (индивидуально или при взаимодействии друг с другом), контролирующих синтез пигментов(Сое et al.., 1988). Такие линии часто используются как генетические маркёры для получения гаплоидов у обычных «зелёных» линий, сортов и гибридов. Пурпурная окраска по отношению к зеленой или белой у корней является доминантным признаком. Поэтому гибридное потомство Fl, полученное после опыления «зелёных» форм пыльцой «пурпурных» маркёров будет тскже пурпурным. Гаплоиды не будут нести генов пурпурной окраски, и поэтому возможна их лёгкая диагностика среди гибридных растений (Сое, 1969; Хохлов и др., 1976). Полученные таким образом гаплоиды успешно используются для практических целей - ускоренного создания гомозиготных линий, мутантов, повышения эффективности отбора и проведения ряда биотехнологических операций (Тырнов,1988).

Вместе с тем, в последнее время пурпурные линии стали представлять интерес как самостоятельный объект селекции, поскольку7 они содержат ряд ценных химических соединении, которые могут использоваться в пищевой и фармацевтической промышленности; у некоторых линий подтверждено наличие не менее 4 антоцианов, 13 флавоноидов и 11 фенол ьных кислот (Купчак и др., 1996). Поэтому встала проблема получения матроклинных

гаплоидов для селекционных целей у самих пурпурных линий, когда они используются в качестве материнских форм.

Материал и методы

В качестве материнской формы использовалась типичная пурпурная линия - Пурпурный тестер (ПТ) и трёх (ПТ-1 ПТ-3) производных от него более скороспелых (на 7-12 дней) линий, полученных путём самоопыления между ПТ и «зелёными» скороспелыми линиями селекции кафедры генетики СГУ. Все эти линии имеют гены Al Al А2 А2 ВВ PIPI PrPr R-gR-gCC, вызывающие в совокупности интенсивную пурпурную окраску стебля, листьев, метёлки и покраснение корней в темноте.

В качестве пыльцевого родителя использовали линии ЗМ-gl и ЗМС-8. Использование пыльцы ЗМ-gl ведёт к возникновению матроклинных гаплоидов с частотой около 0,05%, ЗМС-8 - до 5 - 10% (Тырнов, Завалишина, 1984; Zavalishina, Tyrnov, 1992). То есть, использовались низко- и высокоэффективные гаилоиндукторы. Эти опылители имеют аллель гена R-R nj.Cudu, который вместе с другими генами (A А2 С С2 pr P-wr b PI) вызывает сильную пигментацию алейрона, щитка и зародыша (Chase, 1969).

Початки линии ПТ и её скороспелых производных изолировали до появления пестичных нитей пергаментными пакетиками, и после появления пестичных нитей их опыляли пыльцой линий ЗМ-gl и ЗМС-8. Полученные зерновки проращивали на фильтровальной бумаге. Среди них на разных стадиях прорастания выявляли гаплоиды.

Результаты и обсуждение

Основная теоретически ожидаемая трудность состояла в том, что как матери некая, так и отцовская линия несли гены окраски. Гибридные зерновки имели окраску близкую к темно фиолетовой. Поэтому цвет зародыша не просматривался как при наличии гена R-g, гак и аллеля Rnj: Cudu. Следовательно, браковка заведомо гибридных особей в сухих зерновках практически невозможна.

Снятие перикарпа у зерновок всех линий серии ПТ показало, что зародыш у них имеет слабо-желтоватую окраску. Однако гибридные зародыши были пигментированы с разной степенью интенсивности, но достаточной для надёжной идентификации их гибридной природы. Это открывало принципиальную возможность выявления гаплоидов. Однако, снятие перикарпа над зародышем - достаточно трудоёмкая процедура и занимает много времени. Частично это могло бы быть оправдано при очень высокой частоте гаплоид и и, например, около 10%. Однако, как известно, частота гаплоидии может зависеть от ряда генотипических особенностей материнских форм и паратипичсских факторов (Тырнов, 1976; Тырнов, Завалишина, 1984). В перспективе же предполагается работа именно с разнообразными формами, поскольку селекционная работа связана с аккумуляцией в одной линии разных признаков, что решается, как правило, путем гибридизации разного исходного материала.

Далее нами были проанализированы набухшие зерновки после 18 часов замачивания в обычной водопроводной воде. Среди них лишь в единичных случаях можно было определить, что зародыш окрашен. Это, в основном, касалось тех случаев, когда зародыш как бы приподымал перикарп в виде валика. Возможно, это связано с высокой степенью набухания зародыша, расположением на самой поверхности щитка или ещё какими-то причинами. Снятие перикарпа у набухших зерновок значительно легче, чем у сухих, но, тем не менее, остаётся достаточно трудоёмким процессом.

Положительные результаты проявились лишь после начала прорастания зерновок. Оптимальной стадией является та, когда лопается перикарп или колеоптиле равно 3-5 миллиметрам. Обычно это наблюдается на вторые сутки после начала проращивания предварительно замоченных (12 - 24 часов) зерновок. В это время окраска зародыша достаточно хорошо выражена. При дальнейшем росте колеоптиле до 1 - 3 сантиметров окраска может исчезать или сохраняться в еле-заметном состоянии на самом кончике. В разных вариантах количество отобранных зерновок с гибридными (окрашенными) зародышами варьировало в пределах 85-95 процентов. Дальнейший анализ показал, что среди оставшихся неиигментированных проростков наряду с диплоидами встречаются также и гаплоиды. Причина появления неокрашенных диплоидов неясна. Их выращивание и самоопыление показало, что они являются гибридами и наблюдается расщепление на зернозки с пигментированными и непигментированными зародышами, что соответствует теоретически ожидаемому результату. Не исключено, что ингибирование окраски связано с какими-то временно действующими физиолого-боихимическими причинами, охраничением питания или разной степенью освещённости (например, полное отсутствие таковой в некоторых точках между стеблем и початком). Как было отмечено выше, при наличии некоторых генотипов окраска может проявляться при освещении и отсутствовать в темноте. Перечисленные вопросы нуждаются в дополнительных специальных исследованиях.

Возникновение непигментированных гибридов не является существенно значимым отрицательным фактором. Во-первых, их количество не слишком велико и лежит в пределах 5-14 процентов (Таблица). Кроме того, при использовании ЗМС-8 непигментированиые зародыши встречались в 2-3 раза реже, что указывает на явную зависимость данного явления от отцовской формы. Не исключено, что путём дальнейшей селекции можно будет ещё больше улучшить маркирующую способность пыльцевых форм. Во-вторых, ранее было показано, что гаплоиды и диплоиды существенно отличаются друг от друга по размерам на стадии колеоптиле (3-й 5-й день) и особенно па стадии 2-х - 3-х листьев. Гаплоиды значительно меньше, что хорошо выявляется визуально. На этой основе был предложен так называемый морфометрический метод диагностики гаплоидов (Тырнов, 1969). Линии с генами окраски подчиняются тем же закономерностям, и использование морфометрического метода позволяет легко и быстро, практически ещё на стадии колеоптиле, избавиться почти от всех диплоидов. Небольшое количество уменьшенных проростков включают в себя мутантов, триплоидов, анеуплоидов и

поражённых какими-то болезнями особей. Все они, тем не менее, отличаются от типичных гаплоидов. Они более тонкие и имеют, как правило, более длинный первый лист. Все сомнительные особи лучше браковать, чтобы не увеличивать объём достаточно трудоёмких цитологических работ.

Необходимо было также проверить, как наличие генов пурпурной окраски влияет на частоту возникновения гаплоидов.

Встречаемость гаплоидов у пурпурных линий при использовании высоко- и низкоэффективных гаплоиндукторов - линий - опылителей ЗМ-%\ и ЗМС-8

Количество

неокрашенных

количество гибридных диплондов

Материнская форма гаплоидов

Опылитель зерновок ШТ. % ШТ. %*

пт ЗМ-gl 2640 2 0,08 356 14

ЗМС-8 1742 76 4,36 156 9

ITT-1 ЗМ-gl 1920 1 0,05 230 12

ЗМС-8 1346 58 5,05 67 5

ПТ-2 ЗМ-gl 2004 2 0,09 362 16

ЗМС-8 1218 73 6,07 133 11

1IT-3 ЗМ-gl 2421 2 0,08 193 8

ЗМС-8 1406 62 4,40 98 7

♦Проценты округлены до целых значений

Их возникновение практически полностью соответствовало закономерностям установленным для многих обычных линий кукурузы. То есть, при использовании неэффективного опылителя ЗМ-gl гаплоиды возникали крайне редко (сотые доли процента). Напротив, при использовании пыльцы высокоэффективного опылителя ЗМС-8 частоты гаплоидии возросли до 4-6 процентов, то есть в 50-100 раз. При этом также изменилось соотношение гаплоид: негшгментированный диплоид. 11ри использовании ЗМ-gl оно лежало в пределах 1:100 - 1:230. В вариантах с ЗМС-8 оно не превышало 1:2, что значительно облегчает работу по выявлению гаплоидов.

Уровень в 4-6% можно считать очень хорошим показателем, вполне достаточным для получения гаплоидов в количестве достаточном для практической селекционной работы.

Литература

Купчак Т.В., Николаева Л.А., Тырнов B.C. Новое лекарственное сырьё -трава гибридной формы кукурузы // Современное состояние и перспективы научных исследований в области фармации. Самара, 1996.С. 145-146