ШТАММ БАКТЕРИЙ SALMONELLA ENTERITIDIS VAR.ISSATSCHENKO 32/3 В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРИМАНКИ ПРОТИВ МЫШЕВИДНЫХ ГРЫЗУНОВ
SALMONELLA ENTERITIDIS VAR ISSATSCHENKO 32/3 BACTERIA STRAIN AS MEANS FOR OBTAINING BIOLOGICAL ATTRACTANT AGAINST MOUSE-LIKE RODENTS

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, в частности к микробиологическим средствам борьбы с вредными мышевидными грызунами.
Грызуны причиняют огромный вред на посевах, в закрытом грунте, на складах и в хранилищах, на фермах. Кроме того, грызуны служат источником и переносчиком многих инфекций человека и сельскохозяйственных животных, в том числе таких особо опасных, как: чума, туляремия, бруцеллез, холера. Вредоносность грызунов особенно ощутима в годы массового увеличения численности. Особенно интенсивно размножаются мыши и полевки в южных регионах нашей страны. Иногда численность вида может увеличиваться в 50-500 раз. Потери составляют 28% потенциального урожая. По видовому составу и численности грызуны - большая группа животных из класса млекопитающих. У нас в стране их насчитывается около 150 видов. Такие особенности грызунов - как широкое распространение, потенциальная плодовитость и многообразная вредоносность - вынуждают вести с ними постоянную борьбу.
Известен ряд химических пестицидов (родентицидов) для контроля численности мышевидных грызунов. Родентициды применяются для защиты сельскохозяйственных растений, запасов зерна, в ветеринарии и здравоохранении.
Эти препараты (Фумарин, Бромадиолон, Этилфенацин, Брометалин, Стрихнин, Фосфид цинка и др.) могут представлять серьезную опасность для теплокровных животных и человека. К возможности применения тех или иных токсикантов против мышевидных грызунов необходимо подходить с особой осторожностью (Яковлев А.А., Бабич Н.В. Родентициды. СПб, 2010, 63 с.).
К числу эффективных средств ограничения численности мышевидных грызунов относится биологический метод, основанный на применении бактериальных родентопатогенных препаратов.
В нашей стране разработаны две формы препарата с патогенными свойствами против массовых и вредоносных мышевидных грызунов (мышь-малютка, домовая мышь, курганчиковая мышь, серая полевка, водяная полевка, степная пеструшка и ряд других) (Кандыбин Н.В. Бактериальные средства борьбы с грызунами и вредными насекомыми. М., ВО. Агропромиздат, 1989, 176 с.) - зерновой и аминокостный бактороденцид, которые производятся на питательных средах гранулированной структуры (соответственно зерно и мелкие, не более 2 мм в диаметре, костные опилки). Зерновой бактороденцид в отличие от аминокостного применяется без приманочных продуктов, так как сам является хорошей приманкой и охотно поедается грызунами.
Широко известный и рекомендованный для применения в различных регионах РФ биопрепарат Бактороденцид выпускается на основе штамма экологически безопасной бактерии Salmonella enteritidis var. Issatschenko 29/1 (Кандыбин Н.В., Дородных Ю.Л. Бактороденцид - достойная альтернатива химическим родентицидам. Журнал «Защита и карантин растений», апрель 2007 г., с.54-56; Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории РФ (Минсельхоз России, Москва, 2008, с.81).
Штамм Salmonella enteritidis var.Issatschenko 29/1 выделен из погадок птиц, хранится с 07.02.1986 г. в коллекции ВНИИСХМ Россельхозакадемии (справка о депонировании прилагается) и выбран в качестве прототипа.
50
Диссоциационный индекс штамма 5%. Продуктивность штамма, определенная общепринятым методом серийных разведений, составляет 600-710 млн бактерий/мл культуральной жидкости. Вирулентность для белых мышей лабораторной популяции (ЛД) - 315500 микробных клеток - доза, вызывающая 50% гибели мышей.
Недостатком штамма бактерий Salmonella enteritidis var. Issatschenko 29/1 и биопрепарата на его основе является недостаточная эффективность.
Задачей заявляемого изобретения является получение более эффективного штамма на основе экологически безопасной бактерии Salmonella enteritidis var. Issatschenko в качестве средства против наиболее массовых видов вредоносных для сельского хозяйства мышевидных грызунов.
Задача решается тем, что в качестве средства для получения препарата - биологической приманки против наиболее массовых видов вредоносных для сельского хозяйства мышевидных грызунов - используют штамм Salmonella enteritidis var. Issatschenko 32/3.
Штамм выделен из погадок хищных птиц путем проведения многоступенчатой аналитической селекции с отбором варианта с высокими производственными показателями: высокой продуктивностью, низким диссоциационным индексом и высокой вирулентностью для мышей.
Штамм Salmonella enteritidis var. Issatschenko 32/3 депонирован 26.08.2011 г. в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ГНУ ВНИИСХМ Россельхозакадемии в группе неспоровых микроорганизмов под регистрационным номером RCAM 00149, что подтверждается справкой о депонировании от 4.10.2011 г. (справка прилагается).
Штамм обладает выраженными патогенными свойствами против массовых и вредоносных мышевидных грызунов.
Штамм Salmonella enteritidis var. Issatschenko 32/3 характеризуется следующими свойствами.
Морфологические признаки
Мелкие, не образующие спор палочки (1-1,5 мкм), подвижные, отрицательно окрашиваются по Граму.
Культуральные признаки
Растет в аэробных условиях при температуре 10-45°С, оптимальная температура роста 37°С, при 60°С бактерии погибают через 2 часа, при 70°С - через 40 мин, при 80°С - через 20 мин. Оптимальный рН 7,2-7,4. На мясопептонном бульоне (МПБ) образует равномерное помутнение, на рыбном агаре (PA) - круглые, с ровными краями, прозрачные колонии 1,0-3,0 мм в диаметре. На средах Эндо и Плоскирева - круглые бесцветные, на висмут-сульфитном агаре - зеленовато-черные блестящие колонии, окрашивающие среду под колониями в черный цвет.
Биохимические признаки
Не разжижает желатину, молоко не свертывает, индола не образует, выделяет сероводород.
Отношение к углеводам: разлагает глюкозу, мальтозу, ксилозу, галактозу, арабинозу, трегалозу, дульцит, маннит, сорбит; не разлагает сахарозу, лактозу, инозит, салицин, адонит, не утилизирует глицерин в бульоне Штерна.
В гипертоническом растворе хлористого натрия клетки подвергаются плазмолизису. В физиологическом растворе (0,85%) хлористого натрия не наблюдается плазмолизиса клеток.
Бактерии чувствительны к изменению осмотического состояния окружающей среды. Обладают внутриклеточным давлением 3-6 атм.
Отношение к источникам азота
Не расщепляет мочевину, восстанавливает нитраты в нитриты, может использовать азот из аминокислот. Образует каталазу, кислую и щелочную фосфатазу, эндолипазу и эндопротеиназу.
Антибиотических веществ и пигментов не образует.
Серологические свойства
По схеме Кауфмана-Уайта относится к серологической группе Д, имеет соматические O-антигены (рецепторы 1,9,12) и жгутиковые Н-антигены (рецепторы g и m).
Хранение культуры
Культура хранится на среде Мережковского (водная суспензия 10%-ного вареного белка куриного яйца) при +4°С, пересевы проводят каждые 1,5-2 месяца; либо методом криоконсервирования в лиофильно-высушенном состоянии в запаянных ампулах.
Штамм 32/3 характеризуется широким спектром действия на мышевидных грызунов. Экспериментально было установлено, что многие виды грызунов высоковосприимчивы к бактерии этого штамма, в т.ч.: домовая мышь, курганчиковая мышь, мышь-малютка, обыкновенная полевка, общественная полевка, полевка Брандта, малоазийская кустарниковая полевка, темная полевка, стадная полевка, степная пеструшка, рыжая лесная полевка, водяная полевка, серый хомячок, обыкновенная слепушонка, а также серая крыса.
Были проведены лабораторные опыты по определению производственных показателей заявляемого штамма Salmonella enter itidis var. Issatschenko 32/3 и штамма-прототипа Salmonella enteritidis var. Issatschenko 29/1: диссоциационного и токсического индексов, продуктивности и вирулентности.
Диссоциационный и токсический индексы штамма определяли с помощью реакции агглютинации с 0,1%-ным водным раствором трипафлавина.
Для определения диссоциационного индекса на РА высевали 10-суточную бульонную культуру на РА в чашки Петри, после суточного роста проводили агглютинацию изолированных колоний (100 шт.) и подсчитывали число колоний, агглютинирующих с раствором трипафлавина, т.е. определяли процент колоний в R-форме.
Для определения токсического индекса 1 - суточную бульонную культуру высевали на РА в чашки Петри, после суточного роста проводили агглютинацию изолированных колоний (100 штук) и подсчитывали число колоний, не агглютинирующих с раствором трипафлавина, т.е. определяли процент колоний в S-форме.
Для определения продуктивности штамм инкубировали на РБ в термостате. Через 24 часа роста при температуре 37°С определяли количество микробных клеток в 1 мл культуральной жидкости чашечным методом.
50
Вирулентность определяли по ЛД для белых мышей.
Штамм выращивали на рыбном бульоне (РБ), определяли титр культуральной жидкости и готовили следующие разведения, содержащиеся в 1 мл: 50 млн, 5 млн, 500000, 50000, 5000 бактерий. В опытах использовали белых мышей весом 16-18 г, на каждый вариант опыта брали по 6 грызунов. Грызунов заражали per os (кусочек белого хлеба пропитывали 1 мл бульонной культуры соответствующего разведения). Гибель мышей учитывали в течение 14 суток.
50
ЛД высчитывали по формуле Кербера (см., например, журнал «Актуальные вопросы ветеринарной медицины»,2005 г., УДК 619:616.33-002, статья С.А. Донкова (ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН) «Применение формул электронных таблиц MS. EXSEL для обработки данных при изучении патогенных свойств микроорганизмов»):
50
N
lg Ld=lgD-δ(∑L-0,5),
N
где D - величина дозы максимальная;
δ - логарифм кратности разведений;
L - отношение числа животных, погибших от введения данной дозы, к общему числу животных, которым эта доза была введена;
∑L - сумма значений L, найденных для всех испытаний доз.
Результаты полученных производственных показателей штаммов бактерий Salmonella enteritidis var. Issatschenko - заявляемого (32/3) и прототипа (29/1) представлены в таблице 1.
Таблица 1
Сравнительная оценка свойств штаммов бактерий Salmonella enteritidis var. Issatschenko
Штамм Salmonella enteritidis var. Issatschenko
Диссоциационный индекс, %
Токсический индекс, %
Продуктивность (титр бактерий в КЖ), млн/мл
Вирулентность ЛД<sub>50</sub>, микробные клетки
29/1
5,0
98,0
600-710
315500
32/3
2,0
100,0
900-1000
175000
Как видно из таблицы 1, заявляемый штамм бактерий Salmonella enteritidis var. Issatschenko 32/3 более устойчив к диссоциации, т.к. его диссоциационный индекс в 2,5 раза меньше, чем у штамма 29/1, токсический индекс - выше, продуктивность - выше в 1,5 раза, а вирулентность выше, чем у штамма-прототипа, в 1,8 раза. Это позволяет сделать вывод о более высокой эффективности заявляемого штамма бактерий Salmonella enteritidis var. Issatschenko 32/3 по сравнению с прототипом - штаммом бактерий Salmonella enteritidis var. Issatschenko 29/1.
Пример получения препарата - биоприманки для мышевидных грызунов на основе штамма бактерий Salmonella enteritidis var. Issatschenko 32/3учения биопрепарата заключается в последовательном размножении бактерий сначала на жидкой среде, затем на зерновой основе.
Приготовление среды Мережковского (жидкая)
3
Доброкачественное куриное яйцо варят вкрутую (17 мин после закипания воды), очищают от скорлупы, отделяют белок от желтка, взвешивают белок, измельчают, переносят в стерильную колбу, добавляют воду в соотношении 1:10, доводят рН до 7,2-7,4 и стерилизуют при 1атм 5 мин. Подготовленную питательную среду разливают по пробиркам (5-6 см в пробирке), стерилизуют при 1 атм 20 мин и доводят рН до 7,0-7,2. Среда Мережковского используется для хранения культуры штамма при температуре при +4°С.
Приготовление рыбного бульона (РБ)
15 г готового сухого питательного бульона (гидролизат кильки 10,05 г; натрия хлорид 4,95 г) вносят в 1 л дистиллированной воды, тщательно встряхивают, кипятят 2 мин, фильтруют через бумажный фильтр и разливают по 10 мл в стерильные пробирки или по 400 мл в колбы Эрленмейера емкостью 750 мл, стерилизуют при 1атм 20 мин. Доводят рН после стерилизации до 7,0-7,2.
Получение культуры 1-й генерации
Стерильную жидкую питательную среду (рыбный бульон) засевают культурой, хранящейся в пробирках на среде Мережковского из расчета 1 мл культуры на 250 мл бульона. Культуру штамма выращивают в термостате при 37°С в течение 24 часов. Титр культуральной жидкости (КЖ) определяют общепринятым методом серийных разведений с последующим высевом на РА. Титр КЖ 1-й генерации должен быть не меньше 200 млн кл/мл.
Получение культуры 2-й генерации
Для получения более высокого титра культуру штамма 1-й генерации пересевают еще раз на жидкий питательный бульон из расчета 1-2% от объема среды. Колбы с засеянной культурой помещают в термостат с температурой 37°С. Через 24 часа инкубации определяют титр культуральной жидкости (КЖ). Титр КЖ 2-й генерации должен быть не меньше 500 млн кл/мл.
Получение биопрепарата на зерне
2
3
Сначала готовят зерновую питательную среду. Сухое зерно (пшеница, овес, ячмень) расфасовывают по 800 г в 3-литровые стеклянные банки, 2-3 раза зерно промывают водопроводной водой, затем заливают водой и оставляют на сутки при комнатной температуре. После замачивания остатки воды сливают, а зерно еще раз промывают. Затем в банки с зерном наливают воду (10-15% к массе зерна) и для подщелачивания зерна до рН 7,5-7,6 добавляют в каждую банку по 4 мл 20%-ного раствора NaCO. Банки закрывают плотной бумагой, завязывают шпагатом, стерилизуют при 1 атм дробно по 1 часу с суточным перерывом два дня подряд. Перед и после каждой стерилизации банки тщательно встряхивают для равномерного увлажнения зерна.
Затем культурой 2-й генерации засевают стерильную зерновую питательную среду из расчета 1:2, выдерживают в термостате при 37°С в течение 2 суток, после чего препарат - биоприманка для мышевидных грызунов - готов к применению.
Таким образом, препарат - биоприманка для мышевидных грызунов, полученный на основе заявляемого штамма бактерий Salmonella enteritidis var. Issatschenko 32/3 описанным способом, как и известный Бактороденцид зерновой на основе штамма - прототипа Salmonella enteritidis var. Issatschenko 29/1, представляет собой родентицид и состоит из двух компонентов - действующего вещества (бактерии Salmonella enteritidis var. Issatschenko) и зерна (пшеницы, овса, ячменя). Препарат получается в форме сыпучей массы распаренного зерна, содержащего в себе (внутри и на поверхности) бактерии Исаченко.
Были проведены опыты по определению эффективности препарата - биоприманки для мышевидных грызунов, полученной описанным выше способом на основе заявляемого штамма Salmonella enteritidis var. Issatschenko 32/3 в хозяйствах Ленинградской области: в хранилищах зерна, овощей, картофеля и в пленочных теплицах с томатами. Для сравнения в опытах при тех же условиях использовали известный препарат Бактороденцид на основе штамма-прототипа Salmonella enteritidis var. Issatschenko 29/1.
Учет численности грызунов проводили с помощью ловушек до обработки и на 10-й, 20-й день после обработки. Ловушки располагаются на расстоянии друг от друга 0,5-1 м на площади заданного размера. Контролем служил участок, который находился на расстоянии 300 м от обработанных участков.
Испытуемый препарат раскладывали в хранилищах и теплице по 15-20 г вдоль стены, в углах постройки, т.е. в местах наибольшего их появления. В течение 20 дней вели учет погибших грызунов.
Техническую эффективность биопрепаратов подсчитывали по следующей формуле («Методические указания к Государственным испытаниям родентицидов в сельском хозяйстве», М., 1976 г.):
Э=100×((А-Б)/А-(а-б)/а),
где Э - эффективность, %;
А - количество грызунов на участке до обработки;
Б - количество грызунов на участке после обработки;
а - количество грызунов на контрольном участке до обработки;
б - количество грызунов на контрольном участке после обработки.                  Результаты испытаний препаратов представлены в таблице 2.
Таблица 2
Эффективность биопрепаратов на основе штаммов бактерий Salmonella enteritidis var. Issatschenko
Название объекта проведения опыта
Площадь обрабатываемой территории (м<sup>2</sup>)
Грызуны
Эффективность препарата, %
Штамм 32/3
Штамм 29/1
Зернохранилище
3000
Серая крыса
90,5
76,5
Овощехранилище
2000-//-
Серая крысаДомовая мышь
91,6 97,2
74,6 78,8
Картофелехранилище
2000-//-
Серая крысаДомовая мышь
92,1 97,2
75,8 79,0
Пленочные теплицы с томатами
1300-//-
Домовая мышь Обыкновенная полевка
97,2 95,9
79,2 75,2
Приведенные в таблице 2 данные подтверждают более высокую эффективность препарата - биоприманки на основе заявляемого штамма Salmonella enteritidis var. Issatschenko 32/3 по сравнению с препаратом на основе штамма -прототипа Salmonella enteritidis var. Issatschenko 29/1 - по отношению к серой крысе в среднем примерно на 21%, а по отношению к домовой мыши - на 23%.
Для летального эффекта мыши или полевки достаточно съесть 2 зерна, на котором был приготовлен препарат.
Патогенность бактерий Исаченко для полезных животных и человека изучалась многими учеными (Исаченко, Мережковский, Голубева, Прохоров и др.). В опытах были использованы: рогатый скот, овцы, лошади, куры, утки, цесарки, дикие хищники (хорь, ласка, горностай). Все авторы пришли к заключению, что бактерии Исаченко безопасны для полезных животных и обладают избирательной патогенностью.
Омельянец Т.Г. отмечает, что по данным эпидемиологических исследований, широкое использование Salmonella enteritidis var. Issatschenko в сельском хозяйстве для борьбы с грызунами не оказывает влияния на эпидемический процесс сальмонеллезной инфекции (Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук «Гигиенические аспекты окружающей среды в связи с применением в сельском хозяйстве микробных препаратов на основе неспорообразующих микроорганизмов», М., 1982, ВНИИ ГИТОКС).
В связи со строгой селективностью бактерий Исаченко для мышевидных грызунов, сохранность их вне организма грызунов непродолжительна.
За более чем 100-летний период применения бактерий Исаченко в нашей стране не было случаев выявления инфекции у людей и полезных животных, связанных с бактериальной дератизацией.(Министерство здравоохранения РФ научно-исследовательский центр токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов (НИЦ ТБП), г. Серпухов, 2001 г., 8 с.). Но при применении препарата необходимо работать в спецодежде, не принимать во время работы пищу, не пить, не курить, после работы обязательно мыть руки с мылом.