Изучение возможности применения бактериохлорофиллид-серина в качестве фотосенсибилизатора для фотодинамической терапии

УДК 615.373.36.035

LG. Meerovich1, I.Yu. Kubasova1, G.A. Meerovich2, S. A. Demura3, A. Brandis4, N.A. Oborotova1, A. Yu. Baryshnikov*, A. Scherz4

INVESTIGATION OF POSSIBILITY TO USE BACTERIOCHLOROPHYLLIDE-SERINE AS PHOTOSENSITIZER FOR PHOTODYNAMIC THERAPY

‘N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow, 2Natural Sciences Center of A.M. Prokhorov General Physics Institute RAS, Moscow,

BI.M. Setchenov Moscow Medical Academy 4Weizmann Institute of Science, Israel

ABSTRACT

Study is devoted to investigation of fluorescent and photodynamic properties of near-infrared photosensitizer bacteriochlorophyllide-serine. The peculiarities of bacteriochlorophyllide-serine fluorescence excited with He-Ne laser (wavelength 633 nm) and 775 nm semiconductor laser were analyzed. The kinetics of concentration as well as selectivity of accumulation of bacteriochlorophyllide-serine in malignant comparing to normal tissue were investigated. PDT and investigation of deoxygenation and photobleaching during photodynamic irradiation were done. It was shown that bacteriochlorophyllide-serine is effective photosensitizer for PDT and fluorescent diagnostics of tumors.

Keywords: bacteriochlorophyllide-serine; photosensitizer; laser; PDT; fluorescence; tumor.

И.Г. Меерович1, И.Ю. Кубасова1, Г.А. Мгерович2, С.А. Демура3, А. Брандис4, Н.А. Оборотова1, А.Ю. Барышников1, А.Шерц4

ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ БАКТЕРИОХЛОРОФИЛЛИД-СЕРИНА В КАЧЕСТВЕ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРА ДЛЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ

1ГУРОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва, 2Центр естественно-научных исследований Института общей физики

им. А. М. Прохорова РАН, Москва, 3Московская медицинская академия им. ИМ. Сеченова, 4Институт Науки им. Вейцмана, Израиль

РЕЗЮМЕ

Работа посвящена исследованию сенсибилизации и фотодинамических свойств инфракрасного фотосенсибилизатора бактериохлорофиллид-серина. Проанализированы особенности флюоресценции фотосенсибилизатора в растворах, а также в опухолевых и нормальных тканях сенсибилизированных мышей при возбуждении Не-Ые лазером с длиной волны 633 нм и полупроводниковым лазером с длиной волны 775 нм. Изучены кинетика концентрации и селективности накопления фотосенсибилизатора в опухолевой ткани мышей по сравнению с нормальными тканями. Проведены ФДТ, исследования деоксигенации и фотобличинга в процессе фотодина-мического воздействия. Показано, что бактериохлорофиллид-серин является эффективным фотосенсибилизатором для ФДТ и флюоресцентной диагностики опухолей.

Ключевые слова: бактериохлорофиллид-серин, фотосенсибилизатор, флюоресценция, лазер, ФДТ, опухоль.

ВВЕДЕНИЕ ческой эффективностью важную роль играют и другие

При выборе фотосенсибилизатора для фотодинами- характеристики: подходящий спектральный диапазон и ческой терапии (ФДТ) наряду с высокой фотодинами- высокий коэффициент поглощения фотосенсибилизато-

ра, флюоресцентные свойства, фотоустойчивосгь к воздействию излучения, используемого дня проведения ФДТ.

Выбор спектрального диапазона связан с глубиной фотодинамического терапевтического воздействия на новообразование. Наибольшую глубину фотодинамического воздействия могут обеспечить фотосенсибилизаторы с длиной волны спектрального максимума, превышающей 770 нм (рис. 1). Этот же диапазон предпочтителен и при ФДТ пигментированных новообразований, в частности, меланомы. Немаловажно, что в этом диапазоне есть доступные и недорогие источники света, в первую очередь, полупроводниковые лазерные диоды.

Флюоресцентные свойства фотосенсибилизатора играют важную роль при выработке тактики лечения, оценке биораспределения препарата, контроле результатов ФДТ.

Фотобличинг фотосенсибилизатора, то есть разрушение его молекул под действием возбуждающего излучения при ФДТ, ограничивает максимальную дозу светового излучения, которая может быть эффективно использована для терапевтического воздействия на патологический участок.

В настоящей работе изучались флюоресцентные и фотодинамические характеристики бактериохлоро-филлид-серина. Этот фотосенсибилизатор третьего поколения—один из немногих известных водорастворимых фотосенсибилизаторов с рабочей длиной волны, превышающей 770 нм. Бактериохлорофиллид-се-рин обеспечивает достаточно высокий квантовый выход синглетного кислорода и обладает приемлемым квантовым выходом флюоресценции в ближнем инфракрасном диапазоне [2]. С использованием этого вещества на экспериментальных животных была проведено успешное фотодинамическое лечение меланомы и некоторых других новообразований [3; 5; 6; 8; 9]. Однако особенности процессов сенсибилизации и ФДТ, характерные для бактериохлорофиллид-серина, ранее детально не исследовались, что и обусловило актуальность представляемой работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для исследований использовался бактериохлоро-филлид-серин, синтезированный в Институте Науки им. Вейцмана (Реховот, Израиль).

Спектры поглощения и флюоресценции бактерио-хлорофиллид-серина, а также деоксигенации при ФДТ исследовались с использованием спектроанализатора ЛЭСА-01-«Биоспек» («Биоспек», Россия) [4; 7]. Источниками света для исследования флюоресценции и фото-бличинга служили полупроводниковый лазер (длина волны 775 нм) и He-Ne лазер (длина волны 633 нм) со специальными фильтрами [1]. Для ФД Т был разработан источник света на основе дуговой ксеноновой лампы с перестраиваемым интерференционным фильтром, который позволял облучать патологический участок узкополосным квазимонохроматическим излучением с регулируе-мой д линой волны спектрального максимума и спектральной полушириной 30-40 нм. Он обеспечивал облучение со световой мощностью до 800 мВт при диаметре светового пучка в зоне облучения 16 мм.

Исследования in vivo проводились на мышах-гиб-ридах первого поколения с карциномой Эрлиха на

7-й день после перевивки, когда объем опухолей не превышал 1,5 см3. Бактериохлорофиллид-серин в физиологическом растворе вводился в хвостовую вену в дозе 20 мг/кг массы тела животного. Концентрация бактериохлорофиллид-серина в опухоли оценивалась in vivo по интенсивности его флюоресценции спектральнофлюоресцентным методом [4] при чрескожном возбуждении в 4-5 точках опухоли, затем эти данные усреднялись. Для определения селективности накопления (соотношения концентраций фотосенсибилизатора в опухолевых и нормальных тканях) по тому же методу дополнительно оценивалась концентрация препарата б окружающей опухоль нормальной ткани и зоне, контралатеральной опухоли.

При изучении биораспределения бактериохлорофиллид-серина в процессе сенсибилизации определялась интенсивность флюоресценции препарата в тканях и органах животных через 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 24 ч после его введения. Исследовалась флюоресценция опухолевых и мышечных тканей, а также печени, почек, селезенки и кожи у 3 животных на каждый срок наблюдения.

ФДТ проводилась через 15 мин после введения бактериохлорофиллид-серина. Опухоли облучались излучением лампового источника света с д линой волны 775 нм и плотностью мощности 250 мВт/см2. Длительность облучения составляла 20 мин, плотность дозы облучения достигала 300 Дж/см2. Д ля оценки фотобличинга бактериохлорофиллид-серина при ФДТ in vivo изучался спектр флюоресценции опухолевой ткани до и непосредственно после облучения. Во время облучения и в течение 10 мин после его завершения с помощью спектроанализатора ЛЭСА-01-«Биоспек» исследовалась оксигенация крови в микроциркуляторном русле опухоли методом обратного диффузионного отражения света [7]. Эффективность ФДТ оценивалось по торможению роста опухолей (ТРО) леченых мышей после ФДТ по сравнению с контрольными мышами, вычисляемому по формуле:

V-V

ТРО=— 0  х100%,

где:

ТРО—торможение роста опухолей;

F—средний объем опухолей в контрольной группе;

F — средний объем опухолей в опытной группе.

Статистическую обработку полученных результатов в сравниваемых опытных группах проводили по методу Фишера-Стьюдента. За минимальный критерий активности было принято торможение роста опухоли 50 %.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование устойчивости бактериохлорофиллид-серина в растворах

Проведенные спектральные исследования поглощения и флюоресценции бактериохлорофиллид-серина в среде ПКС и сыворотке человеческой крови подтвердили выводы [3; 5; 6] о частичном окислении и гидролизе бактериохлорофиллид-серина в водных растворах. Присутствие продуктов окисления проявляется в спектре как поглощения (появление пика с длиной волны спектрального максимума 690 нм —• рис. 2, А, так и флюоресценции растворов (появление полосы флюоресценции в диапазоне 680-710 нм). Уменьшение поглощения на длине волны 775 нм (в пике поглощения бактериохлорофиллид-

Поглощение, усл.ел.

Рис. 1. Спектр поглощения биологической ткани

серина), обусловленное этими процессами, за 180 мин не превышает 20 % для растворов бактериохлорофиллид-серина в среде ПКС и 15%—в сыворотке человеческой крови (рис. 2, Б). За сутки спад поглощения бактериох-лорофиллид-серина в среде ПКС составил 45 %.

Проведенные исследования позволили сделать вывод о том, что устойчивость бактериохлорофиллид-серина по крайней мере в течение первых 120 мин после растворения вполне достаточна для проведения экспериментальной ФДТ in vivo.

Исследования особенностей флюоресценции и селективности накопления

При исследованиях in vivo спектров флюоресценции бактериохлорофиллид-серина в тканях эксперименталь-

Рис. 2. Изменение поглощения бактериохлорофиллид-серина в среде ПКС и сыворотке человеческой крови:

А - спектры поглощения в различные моменты времени:

1 — 20 мин; 2 — 60 мин; 3 — 180 мин;

Б — поглощение в спектральном максимуме

ных животных установлено, что селективность накопления достигает значения 4 уже через 15-20 мин после внутривенного введения, а максимальные значения достигаются примерно через 240 мин и составляют 8-10 [1].

Спектрально-флюоресцентные исследования динамики концентрации бактериохлорофиллид-серина в опухоли, коже и мышечной ткани мышей, а также печени, почках, селезенке (рис. 3) показали, что концентрация препарата в опухолевой ткани достигает максимальных значений через 15-20 мин после введения, а затем снижается более чем вдвое в течение 4 ч из-за его выведения и метаболизма. Интенсивность флюоресценции в опухоли через 15 мин оказалась примерно в 4 раза выше по сравнению с ее значениями в коже и мышечной ткани, что согласуется с данными чрезкожных исследований in vivo. Наиболее высокая интенсивность флюоресценции на начальном этапе наблюдается в печени, почках и селезенке. Спад интенсивности флюоресценции в коже, мышечной ткани и внутренних органах в течение первых 4 ч происходит заметно быстрее по сравнению с опухолевой тканью (в коже и мышечной ткани в 4-6 раз, в селезенке—в 3-4 раза, почках— в 4-5 раз, печени — более, чем в 20 раз).

Рис. 3. Динамика интенсивности флюоресценции бактериохлорофиллид-серина в тканях и органах мышей ^ с карциномой Эрлиха

Возбуждение лазерным излучением с длинами волн:

А - 775 нм;

Б - 633 нм

Объем оиухолк, % ОТ ИСХОДПОГО 800

О • ..................

0 2 4 6 8 10

Время после ФДТ, дни

Рис. 4. Изменение объема карциномы Эрлиха:

1 - после ФДТ с использованием бактериохлорофиллид-сери-на;

2 - контрольная группа

Уровень оксигенации, %

Рис. 5. Изменение уровня оксигенации крови в микро-циркуляторном русле карциномы Эрлиха в процессе ФДТ с бактериохлорофиллид-серином

Стрелка показывает момент прекращения облучения

А

Рис. 6. Результаты патоморфологических исследований опухолевой ткани (карцинома Эрлиха) после ФДТ с фотосенсибилизатором бактериохлорофиллид-серином:

А - геморрагии на фоне некроза опухолевой ткани (гематоксилин-эозин, 4400);

Б - тромб на фоне некроза опухолевой ткани (гематоксилин-эозин, 4100);

В - апоптоз опухолевой ткани (гематоксилин-эозин, 4400);

Г - контроль (гематоксилин-эозин, 4100).

Бактериохлорофиллид-серин введен за 15 мин до облучения

Интенсивность, отн. ед.

Длина волны, нм

Рис. 7. Спектры флюоресценции тканей карциномы Эрлиха до (1,2) и после (3,4) ФДТ

Бактериохлорофиллид-серин введен за 15 мин до начала ФДТ

Полученные данные о фармакокинетике бактери-охлорофиллид-серина позволили выбрать для фото-динамического облучения временной интервал 15-35 мин после введения.

Это хорошо согласуется с результатами, полученными J. Zilberstein et al., где было показано, что экспериментальная ФДТ меланомы с использованием бак-териохлорофиллид-серина наиболее эффективна, если облучение проводится в течение первых 30 мин после введения [8].

Исследование in vivo фотодинамической эффективности и фотобличинга бактериохлорофиллид-серина

При исследовании фотодинамической эффективности опухоли облучались узкополосным излучением лампового источника света с длиной волны 775 нм и мощностью 500 мВт в пятне диаметром 16 мм (плотность мощности около 250 мВт). Облучение начиналось через 15 мин после введения, когда концентрация фотосенси-билизатора в опухоли максимальна. ФДТ привела к значительному торможению роста опухоли, достигающему на 7-е сутки после облучения 50 % (рис. 4).

Контроль оксигенации крови в микроциркуляторном русле опухоли в процессе облучения показал, что примерно на 12-й мин после его начала (что соответствует дозе облучения около 200Дж/см2) происходит полная необратимая деоксигенация (рис. 5). Полученный результат позволяет предположить сосудистый характер фотоди-намического поражения опухоли при использовании бактериохлорофиллид-серина. Это было подтверждено результатами патоморфологических исследований, показавших повреждения сосудов в виде геморрагий (А) и тромбозов (Б) на фоне выраженного некроза (А) и апоп-тоза (В) опухолевой ткани (рис. 6), и согласуется с данными, полученными при ФДТ меланомы [8; 9].

Интенсивность флюоресценции бактериохлорофиллид-серина после облучения опухолей дозой 300 Дж/ см2 снизилась из-за фотобличинга практически до нуля. При этом было отмечено возрастание флюоресцентной полосы со спектральным максимумом в диапазоне 750-770 нм (рис. 7), соответствующей бактериофеофитину, который является продуктом фотодеградации бактериохлорофиллид-серина [3].

ВЫВОДЫ

Проведенные исследования показывают, что бактериохлорофиллид-серин является эффективным фотосенсибилизатором для фотодинамической терапии и флюоресцентной диагностики новообразований. При проведении фотодинамической терапии через 15-30 мин после внутривенного введения, когда концентрация бактери-охлорофиллид-серина в опухоли максимальна, обеспечивается высокая эффективность терапевтического воздействия, а за счет высокой селективности накопления (примерно 3-4)—еще и высокая избирательность ФДТ.

ФДТ с использованием бактериохлорофиллид-серина обеспечивает существенное торможение роста опухоли (50 % на 7-й день после облучения). Контроль оксигенации крови в микроциркуляторном русле опухоли в процессе облучения и результаты патоморфологических исследований позволяют сделать вывод о сосудистом характере фотодинамического поражения опухоли при ФДТ с использованием этого препарата.

ЛИТЕРАТУРА

1. Меерович И.Г., Кубасова И.Ю., Меерович Г. А. и др. О возможности использования бактериохлорофиллид-серина в качестве фотосенсибилизатора для флюоресцентного определения новообразований // Российский Биотерапев-тический Журнал. — 2003 (в настоящем номере).

2. DeRosa М.С., Crutchley R.J. Photosensitized singlet oxygen and its applications // Coord. Chem. Rev. — 2002.

— Vol. 233-234. — P. 351-371.

3. Henderson B. W., Sumlin A.B., Owczarczak B.L., Dougherty T.J. Bacteriochlorophyll-a as photosensitizer for photodynamic treatment of transplantable murine tumors // J. Photochem. Photobiol., B: Biol. —1991. — Vol. 10, N. 6. —P. 303-312.

4. Loschenov V.B., Luckjanetz E.A., Stratonnikov A.A. et al. The noninvasive evaluation of absolute fluorochrom concentration in various tissues in vivo by means of standard samples with modeled optical properties // Proc. SPIE. — 1995. — Vol. 2326. —P. 415-419.

5. Pandey K, Shiau F.-Y., Dougherty T.J., Smith K.M. Synthesis of new Bacteriochlorins and their Antitumor Activity // Bioorg. Med. Chem. Lett. — 1994. — Vol. 4, N. 10,—P. 1253-1257.

6. Rosenbach-Belkin V., Chen L., Feodor L. et al. Serine Conjugates of Chlorophyll and Bacteriochlorophyll: Photocytotoxicity in vitro and Tissue Distributuon in Mice Bearing Melanoma Tumors // Photochem. Photobiol.

— 1996, — Vol. 64, N. 1, —P. 174-181.

7. Stratonnikov A.A., Douplik A.J., Klimov D. V. et al. The absorption spectroscopy as a tool to control blood oxygen saturation during photodynamic therapy // Proc. SPIE.

— 1997.— Vol. 3181.— P. 58-65.

8. Zilberstein J., Blomberg A., Frantz A. etal. Light-dependent oxygen consumption in bacteriochlorophyll-serine-treated melanoma tumors: on-line determination using a tissue-inserted oxygen microsensor // Photochem. Photobiol. — 1997. — Vol. 65, N. 6. — P. 1012 -1019.

9. Zilberstein J., Schreiber S., Bloemers M.C. et al. Antivascular treatment of solid melanoma tumors with bacteriochlorophyll-serine-based photodynamic therapy // Photochem. Photobiol. — 2001. — Vol. 73, N. 3. — P. 257-266.