МОТИВЫ СЕМЕЙСТВА ПАНКРЕАТИЧЕСКИХ ПОЛИПЕПТИДОВ, ПОЛИПЕПТИДЫ И СПОСОБЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
PANCREATIC POLYPEPTIDE FAMILY MOTIFS, POLYPEPTIDES AND METHODS OF USE

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
По настоящей заявке испрашивается приоритет находящейся на рассмотрении заявки США с номером 11/055098, поданной 11 февраля 2005 года; РСТ/US05/04351 и предварительной заявки США с номером 60/635897, поданной 13 декабря 2004 года, каждая из которых приведена в настоящем документе в качестве ссылки в полном объеме.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
et al., Endocrinology
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
et al., Nature
Ряд родственных гормонов составляют семейство панкреатических полипептидов (“PPF”). Панкреатический полипептид (“PP”) был обнаружен как примесь в экстрактах инсулина и был назван по органу его происхождения, а не по функциональному значению (Kimmel  83: 1323-30 (1968)). РР является пептидом из 36 аминокислот (SEQ ID NO:1), содержащим характерные структурные мотивы. Позднее в экстрактах кишечника был обнаружен родственный пептид, и он был назван пептидом YY (“PYY”) (SEQ ID NO:2) из-за присутствия тирозина на N- и С-конце (Tatemoto,  79: 2514-8 (1982)). Третий родственный пептид был затем обнаружен в экстрактах головного мозга и был назван нейропептидом Y (“NPY”) (SEQ ID NO:4) (Tatemoto,  79: 5485-9 (1982); Tatemoto  296: 659-60 (1982)).
Proc. Soc. Exp. Biol. Med.
Сообщалось, что эти три родственных пептида проявляют различные биологические действия. Эффекты РР включают ингибирование секреции поджелудочной железы и релаксации желчного пузыря. Введение РР в ЦНС приводит к умеренному повышению питания, что может быть опосредовано рецепторами, локализованными в гипоталамусе и стволе головного мозга (см. обзор Gehlert,  218: 7-22 (1998)).
Am. J. Physiol.
et al., Endocrinology
et al., Gastroenterology
et al., Gut
Am. J. Physiol
et al., Regul. Pept.
J. Physiol.
et al., Neurogastroenterol.
Motil
et al., Brain Res.
et al., Am. J. Physiol.
Высвобождение PYY (SEQ ID NO:2) происходит после приема пищи. Альтернативной молекулярной формой PYY является PYY(3-36) (SEQ ID NO:3) (Eberlein et al., Peptides 10: 797-803 (1989); Grandt et al., Regul. Pept. 51-9 (1994)). Этот фрагмент имеет приблизительно 40% общей PYY-подобной иммунореактивности в экстрактах кишечника человека и собаки и приблизительно 36% общей иммунореактивности PYY в плазме натощак и чуть более 50% после еды. По-видимому, фрагмент является продуктом расщепления PYY дипептидилпептидазой-IV (DPP4). Сообщалось, что PYY(3-36) является селективным лигандом рецепторов Y2 и Y5, которые, по-видимому, являются фармакологически уникальными в предпочтении N-концевого укорочения (т.е. С-концевыми фрагментами) аналогов NPY. Периферическое введение PYY, как сообщалось, уменьшает секрецию кислоты желудочного сока, двигательную функцию желудка, экзокринную секрецию поджелудочной железы (Yoshinaga et al.,  263: G695-701 (1992); Guan  128: 911-6 (1991); Pappas  91: 1386-9 (1986)), сокращение желчного пузыря и перистальтику кишечника (Savage  28: 166-70 (1987)). Действия центральной инъекции PYY на опорожнение желудка, двигательную функцию желудка и секрецию кислоты желудочного сока, а также наблюдаемые после прямой инъекции в ромбовидный мозг/ствол головного мозга или инъекции около ромбовидного мозга/ствола головного мозга (Chen and Rogers,  269: R787-92 (1995); Chen  61: 95-98 (1996); Yang and Tache, Am.  268: G943-8 (1995); Chen . 9: 109-16 (1997)) могут отличаться от их действий, наблюдаемых после периферической инъекции. Например, вводимый центрально PYY имел некоторые эффекты, противоположные эффектам, описанным здесь, для периферически инъецированного PYY(3-36), заключающиеся в том, что секреция кислоты желудочного сока стимулировалась, а не ингибировалась. Двигательная функция желудка подавлялась только вместе со стимуляцией TRH, но не при отдельном введении и была действительно стимулированной при более высоких дозах через предположительное взаимодействие с рецепторами РР. Было показано, что PYY стимулирует потребление пищи и воды после центрального введения (Morley  341: 200-3 (1985); Corp  259: R317-23 (1990)).
et al.,
Peptides
et al., Brain Res.
et al., Endocrinology
et al., J. Pharmacol. Exp. Ther.
Подобным образом, одним из самых ранних сообщенных центральных действий NPY (SEQ ID NO:4) было увеличение потребления пищи, в частности, в гипоталамусе (Stainley  6: 1205-11 (1985)). Сообщалось, что PPY и РР имитируют эти действия и PYY является более сильнодействующим или таким же сильнодействующим, как и NPY (Morley  341: 200-3 (1985); Kanatani  141: 1011-6 (2000); Nakajima  268: 1010-4 (1994)). Несколько групп обнаружили, что размер NPY-индуцированного потребления пищи был более высоким, чем размер потребления пищи, индуцированный любым предварительно испытанным фармакологическим агентом, а также чрезвычайно продолжительно длящимся. NPY-индуцированная стимуляция питания воспроизводилась в ряде видов. Среди трех основных макронутриентов (жира, белка и углевода) потребление углеводов преимущественно стимулировалось. Не наблюдали толерантности в отношении возбуждающего аппетит действия NPY и при повторении введения этого пептида на протяжении 10 дней наблюдали заметное увеличение скорости прироста массы. После голодания (натощак) концентрация NPY в PVN гипоталамуса увеличивалась со временем и быстро возвращалась к контрольным уровням после потребления пищи.
i
0
et al., Pharmacol. Rev.
Proc. Soc. Exp. Biol. Med.
Фармакологические исследования и попытки клонирования обнаружили серию из семи трансмембранных рецепторов для семейства РР пептидов, и этим рецепторам дали названия Y1 - Y6 (и предположительный PYY-предпочитающий рецептор Y7). Типичные реакции передачи сигнала этих рецепторов являются сходными с реакциями передачи сигнала других G/G-связанных рецепторов, а именно ингибирование аденилатциклазы. Даже с довольно низкой гомологией последовательности среди рецепторов очевидно, что имеется сходство образования кластеров аминокислотных последовательностей между рецепторами Y1, Y4 и Y6, в то время как Y2 и Y5 определяют другие семейства. Были идентифицированы другие сайты связывания ранжированием эффективности различных пептидов. NPY-предпочитающий рецептор, который не был клонирован, был назван Y3, и имеется доказательство существования PYY-предпочитающих рецепторов (предположительного рецептора Y7 (рецепторов Y7)) (обсуждаемых в Michel  50: 143-50 (1998); Gehlert, 218: 7-22 (1998)).
et al., Nat. Med.
et al., Endocrinology
Proc. Soc. Exp. Biol. Med.
Было сделано предположение, что рецепторы Y5 и Y1 являются первичными посредниками (медиаторами) реакции потребления пищи (Marsh  4: 718-21 (1998); Kanatani  141: 1011-6 (2000)). Превалирующей идеей было то, что эндогенный NPY через эти рецепторы увеличивает пищевое поведение. Предлагаемые терапии для лечения ожирения были неизменно направлены на антагонизм рецепторов NPY, в то время как терапии для лечения анорексии были направлены на агонисты этого семейства лигандов (см., например, Патенты США с номерами 5939462; 6013622 и 4891357). В основном, сообщалось, что PYY и NPY являются равносильными и равным образом эффективными во всех исследованных анализах рецепторов Y1, Y5 (и Y2) (Gehlert,  218: 7-22 (1998)).
et al., Soc. for Neurosci. Abstracts
Фармакологически рецептор Y2 отличается от рецептора Y1 проявлением аффинности в отношении С-концевых фрагментов нейропептида Y. Y2-рецептор наиболее часто дифференцируют по аффинности нейропептида Y(13-36), хотя фрагмент 3-36 нейропептида Y и пептид YY обеспечивали улучшенную аффинность и селективность (см. Dumont  19:725 (1993)). Передача сигнала как через рецептор Y1, так и рецептор Y2 сопряжена с ингибированием аденилатциклазы. Было обнаружено, что связывание с рецептором Y2 уменьшает внутриклеточные уровни кальция в синапсе селективным ингибированием кальциевых каналов N-типа. Кроме того, рецептор Y2, подобно рецепторам Y1, проявляет дифференциальное связывание со вторичными мессенджерами (посредниками) (см. Патент США № 6355478). Рецепторы Y2 обнаружены в различных участках головного мозга, в том числе в гиппокампе, латеральном черном веществе, таламусе, гипоталамусе и стволе головного мозга. Рецепторы Y2 человека, мыши, обезьяны и крысы были клонированы (например, см. Патент США № 6420532 и Патент США № 6355478).
Основной характеристикой предположительных рецепторов Y3 является то, что они узнают NPY, тогда как PYY является по меньшей мере на порядок величин менее сильным. Рецептор Y3 представляет единственный сайт связывания/рецептор, который проявляет предпочтение в отношении NPY.
et al., Pharmacol. Rev
Имеется дополнительный сайт связывания/рецептор, который проявляет предпочтение в отношении PYY, названный PYY-предпочитающим рецептором, который здесь называют рецептором Y7 (рецепторами Y7). Сообщались различные ранжирования связывания с этим рецептором или классом рецепторов, что предполагает, что в этом классе может быть более чем один рецептор. В большинстве случаев он был использован для описания рецептора, когда PYY был в три-пять раз более сильным, чем NPY. Рекомендации Международного Союза по Фармакологии в отношении номенклатуры рецепторов NPY, PYY и РР состоят в том, что термин PYY-предпочитающий рецептор не используется, если не наблюдается по меньшей мере двадцатикратное различие активности между PYY и NPY (Michel . 50: 143-150 (1998)). Однако для целей этого описания ссылка на рецептор Y7 или фармакологию PYY-предпочитающего рецептора обозначает рецептор, имеющий любую степень предпочтения PYY относительно NPY.
2
Ожирение и ассоциированные с ним нарушения являются обычными и очень серьезными государственными проблемами в Соединенных Штатах и во всем мире. Приближенно оценивается, что приблизительно 64% американцев имеют избыточную массу или ожирение (в среднем приблизительно 97 миллионов взрослых людей), и обычно считается, что эти цифры увеличиваются. Людьми, которые имеют избыточную массу или ожирение, считают людей с индексом массы тела (BMI), равным 25 или большим чем 25. BMI является формулой, обычно используемой для выражения отношения массы к росту; массу субъекта в килограммах делят на его или ее рост в метрах в квадрате (т.е. масса/рост). В области здравоохранения человека индивидуумы с BMI 25-29,9 обычно считаются людьми с избыточной массой, тогда как индивидуумы с BMI 30 или более обычно считаются страдающими ожирением. Ожирением, препятствующим нормальному функционированию организма, называют случаи с BMI 40 или более. В соответствии с клиническими рекомендациями Национального института здравоохранения США по идентификации, оценке и лечению избыточной массы и ожирения у взрослых все взрослые люди (в возрасте 18 лет или более), которые имеют BMI 25 или более, считаются людьми, находящимися в группе риска преждевременной смерти и потери трудоспособности вследствие избыточной массы и ожирения. Эти риски в отношении здоровья увеличиваются даже еще более по мере увеличения ожирения индивидуума.
Ожирение или избыточная масса может существенно увеличивать риск страдания от гипертензии; дислипидемии; диабета типа 2; ишемической болезни сердца; инсульта; заболевания желчного пузыря; остеоартрита; приступов апноэ во сне и респираторных проблем и раковых заболеваний эндометрия, молочной железы, предстательной железы и ободочной кишки. Более высокие массы тела ассоциированы также с увеличениями смертности от любых причинных агентов. Кроме того, ожирение или избыточная масса могут быть причиной собственного негативного мнения о своем воображаемом образе.
Ожирение верхней части тела является сильнейшим фактором риска, известным для сахарного диабета типа 2, и сильным фактором риска для сердечно-сосудистого заболевания. Ожирение является признанным фактором риска для гипертензии, атеросклероза, застойной сердечной недостаточности, инсульта, заболевания желчного пузыря, остеоартрита, приступов апноэ во сне, репродуктивных нарушений, таких как синдром поликистоза яичников, раковых заболеваний молочной железы, предстательной железы и ободочной кишки и увеличенной встречаемости осложнений общей анестезии (см., например, Kopelman, Nature 404: 635-43 (2000)). Оно уменьшает продолжительность жизни и несет серьезный риск вышеуказанных совместных заболеваний, а также нарушений, таких как инфекции, варикозные вены, акантоз (acanthosis nigricans), экзема, непереносимость физической нагрузки, инсулинорезистентность, гипертензия, гиперхолестеринемия, холелитиаз, ортопедическое повреждение и тромбоэмболическое заболевание (Rissanen et al., Br. Med. J. 301: 835-7 (1990)). Ожирение является также фактором риска для группы состояний, называемых синдромом инсулинорезистентности, или «Синдромом Х». Недавняя приближенная оценка медицинских расходов на лечение ожирения и ассоциированные нарушения является 150 миллиардов долларов во всем мире. Считается, что патогенез ожирения является многофакторным; обычно в страдающих ожирением субъектах или в субъектах с избыточной массой при равновесии доступности пищевых продуктов (нутриентов) и потребления энергии происходит образование избытка жировой ткани. В настоящее время ожирение является трудноизлечимым, хроническим, по существу неискоренимым метаболическим нарушением. Терапевтическое средство, применимое в уменьшении массы страдающих от ожирения лиц, могло бы оказывать мощное полезное действие на их здоровье.
Clinical
Endocrinology
Am. J. Clin. Nutr.,
По этим причинам существует огромная заинтересованность в лечении ожирения. Существующие терапии включают в себя стандартные диеты и физические упражнения, очень низкокалорийные диеты, поведенческую терапию, фармакотерапию, включающую в себя супрессоры аппетита, термогенные лекарственные средства, ингибиторы усвоения пищи, механические устройства, такие как фиксация проволокой челюстей, корсажи и баллоны, и хирургию, например шунтирование желудка. Jung and Chong, , 35: 11-20 (1991); Bray,  55: 538S-544S (1992).
Кроме заинтересованности в лечении ожирения для физического здоровья стремление хорошо выглядеть и хорошо чувствовать себя всегда представляло интерес и создает прибыльный рынок. American Society for Aesthetic Plastic Surgery сообщало, что в 2002 году было выполнено 6,9 миллионов косметических процедур. Наиболее частой была хирургическая процедура липосакции. Кроме того, National Center for Health Statistics сообщал, что в 2002 году приблизительно треть всех взрослых американцев участвовали в регулярной физической активности во время их досуга.
Обычно, в то время как потеря жира является желательной, потеря сухой массы (белка) тела не является желательной. Сухая масса тела является высокоактивной метаболически и физиологически. Сухая масса тела содержит весь белок тела. Реального накопления белка не существует, так как каждая молекула белка играет роль в поддержании гомеостаза. Считается, что потеря белка тела является вредной для здоровья индивидуума. Большая часть белка в сухой массе тела находится в массе скелетных мышц. Сухая масса тела является на 50-60 масс.% мышечной массой, остальное является костями и сухожилиями. Белок составляет критическую клеточную структуру в мышцах, внутренних органах, эритроцитах и соединительной ткани. Ферменты, которые управляют метаболизмом, и антитела, которые поддерживают иммунную функцию, также являются белками. Кроме того, организм с более высоким отношением сухой массы тела к жиру может быть эстетически более приятным для некоторых индивидуумов. Таким образом, желательно предотвращать или минимизировать потерю сухой массы тела даже при уменьшении жира тела.
Ограничение калорий независимо от его формы может вызывать катаболизм белка тела и вызывать отрицательный баланс азота. Таким образом, диеты с белковыми добавками приобрели популярность в качестве средств снижения потери азота во время ограничения калорий. Сообщалось, что сберегающее белок модифицированное голодание является эффективным в уменьшении массы у подростков. Lee et al., Clin. Pediatr., 31:234-236 (April 1992). Однако эти диеты могут давать лишь умеренное сохранение азота.
Остается потребность в развитии дополнительных полипептидов аналогов PYY. Таким образом, задачей данного изобретения является обеспечение таких полипептидов аналогов PYY и способов их получения и применения. Существует потребность в эффективных путях стимуляции потери жира при сохранении сухой массы тела или минимизации потери сухой массы тела. Здесь описаны новые способы для модификации состава тела.
Все документы, цитируемые здесь, включены в качестве ссылки в данную заявку, как если бы они были полностью представлены здесь.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится в общем к семейству панкреатических полипептидов ("PPF"), имеющих по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 94% или по меньшей мере 97% идентичность последовательности с PYY(3-36) на протяжении всей длины PYY(3-36), а также содержащих по меньшей мере два мотива PPF, включающих в себя по меньшей мере N-концевой мотив полипролина PPF и С-концевой мотив хвоста PPF. Дополнительные мотивы PPF данного изобретения могут соответствовать любому мотиву любого из полипептидов семейства РР, в том числе РР, PYY и NPY. В некоторых вариантах осуществления полипептиды PPF не включают в себя неприродные аминокислоты. В других вариантах осуществления эти полипептиды PPF не включают в себя природно встречающиеся видовые варианты.
В одном аспекте полипептиды PPF по изобретению включают в себя полипептиды аналогов PYY. Еще в одном варианте осуществления полипептиды PPF по изобретению включают в себя химерные полипептиды PPF, содержащие фрагмент полипептида РР, PYY или NPY, ковалентно связанный по меньшей мере с одним дополнительным фрагментом полипептида РР, PYY или NPY, где каждый фрагмент РР, PYY или NPY включает в себя PPF-мотив. Такие полипептиды аналогов PPF и химерные полипептиды PPF данного изобретения будут проявлять по меньшей мере 50% идентичность последовательности с нативным PYY(3-36) на протяжении всей длины PYY(3-36). В некоторых вариантах осуществления желаемые химерные полипептиды PPF включают в себя N-концевой фрагмент РР в комбинации с С-концевым фрагментом PYY. В других вариантах осуществления химерные полипептиды PPF включают в себя N-концевой фрагмент РР в комбинации с С-концевым фрагментом NPY. В других вариантах осуществления химерные полипептиды PPF включают в себя N-концевой фрагмент PYY и С-концевой фрагмент РР или NPY. В других вариантах осуществления химерные полипептиды PPF включают в себя N-концевой фрагмент NPY в комбинации с С-концевым фрагментом PYY или РР. В других вариантах осуществления химерные полипептиды PPF могут не включать в себя N-концевой фрагмент РР в комбинации с С-концевым фрагментом NPY. И еще в других вариантах осуществления химерные полипептиды PPF могут не включать в себя N-концевой фрагмент NPY с С-концевым фрагментом PYY.
В другом аспекте по изобретению обеспечены способы лечения или предупреждения ожирения, причем этот способ предусматривает введение терапевтически или профилактически эффективного количества полипептида PPF по изобретению субъекту, нуждающемуся в этом. В некоторых вариантах осуществления этим субъектом является страдающий ожирением или имеющий избыточную массу субъект. Хотя «ожирение» обычно определяется как индекс массы тела, превышающий 30, для целей этого описания, любой субъект, в том числе субъекты с индексом массы тела, меньшим чем 30, который нуждается в уменьшении массы тела или желает уменьшить массу тела, включен в понятие «страдающий ожирением». Субъекты, которые являются инсулинорезистентными, не толерантными к глюкозе или имеют любую форму сахарного диабета (например, типа 1, 2 или гестационного диабета), могут получать пользу от этого способа.
В одном общем аспекте способы данного изобретения включают в себя использование полипептида PPF для модификации состава тела, например уменьшения жира тела, но не сухой массы тела. Это изменение в составе тела может быть изменением, например, массы (например, снижением или приростом массы в граммах), изменением процента жира тела и процента сухой массы тела или белка (эти термины используются взаимозаменяемо) или отношения жира тела к сухой ткани.
Хотя сообщалось, что PYY может быть полезным в регуляции насыщения (US 6558708) или контроля массы (Патентная заявка США №10/016969, WO 2003/026591 и WO 2003/057235), теперь было неожиданно обнаружено, что полипептиды PPF могут иметь метаболическое действие на организм и могут быть использованы для воздействия на состав тела, приводящего к желаемой потере жира тела, но с сохранением сухой массы тела или минимизацией ее потери.
В некоторых вариантах осуществления способы по изобретению включают в себя уменьшение жира тела или уменьшение или предупреждение увеличения жира тела при сохранении, минимизации потери или даже увеличении сухой массы тела. Другие варианты осуществления включают в себя контроль массы тела и/или «ваяние» вида тела. Субъектами, для которых эти способы могут представлять интерес, являются индивидуумы, которые имеют избыточную массу или страдают от ожирения, а также субъекты, которые являются худыми. Например, субъекты с сухим составом тела, например занимающиеся бодибилдингом люди или другие атлеты, могут также иметь пользу от изобретения. Для них может быть желательным уменьшение или поддержание их массы тела для большей силы, жизнеспособности, выносливости и/или более мускулистого вида. Такие способы могут быть также использованы на любом животном, для которого желательным является более высокое отношение сухой массы тела к жиру. Примеры такого применения включают в себя, но не ограничиваются ими, создание превосходных собак для шоу или создание превосходной скаковой лошади или рабочей лошади.
В одном общем аспекте способы данного изобретения включают в себя применение полипептида PPF для уменьшения содержания жира в животных, использующихся для употребления в пищу. Способы данного изобретения могут включать в себя получение источника сухого мяса. Композиции и способы данного изобретения могут быть использованы для скота, в том числе, но не только, кур, индеек, коров, свиней и овец.
Обсуждается, что способы по изобретению могут быть использованы в комбинации с другими формами режимов питания и программ снижения массы, таких как уже описанные выше, например таких, которые включают в себя изменения жизненного стиля, которые включают в себя мониторинг потребления пищи (количества и качества) и физические упражнения, а также хирургию. Режимы питания включают в себя режимы, которые используются для увеличения сухой массы тела, такие как, например, режимы питания, которые используются лицами, занимающимися бодибилдингом.
В другом общем аспекте полипептиды PPF уменьшают дыхательный коэффициент (RQ) в животных, что является показателем улучшенной утилизации жира для энергии на тканевом и клеточном уровне (увеличенного β-окисления жирных кислот). Таким образом, полипептиды PPF могут быть терапевтически полезными в состояниях, в которых желательным является улучшенное β-окисление жирных кислот в нежировых тканях с поддержанием, минимизацией потери или увеличением сухой массы тела. Примеры таких состояний включают в себя, но не ограничиваются ими, неалкогольный стеатогепатит (NASH) (Grant et al., Nonalcoholic fatty liver disease, Ann Hepatol. 3(3):93-9 Jul-Sep 2004), при котором пациенты обнаруживают патологически повышенный уровень жира печени, и липодистрофию, при которой пациенты лишены значительных жировых отложений и, следовательно, проявляют увеличенное образование жира в нежировых тканях, таких как печень и скелетная мышца (Garg et al. Lipodystrophies: rare disorders causing metabolic syndrome, Endocrinol Metab Clin North Am. 33(2):305-31 Jun 2004).
В некоторых вариантах осуществления полипептид PPF может вводиться периферически и не центрально, т.е. не посредством центральной нервной системы. В других вариантах осуществления терапевтически или профилактически эффективное количество PPF вводят в виде единственной дозы, множественных доз или непрерывным введением.
Еще в одном аспекте осуществления соединения по изобретению могут быть использованы для способов уменьшения потребления пищи, уменьшения доступности питательных веществ (нутриентов), вызывания потери массы, влияния на состав тела, изменения содержания энергии или потребления энергии (ЕЕ) и улучшения липидного профиля (в том числе уменьшения уровней LDL-холестерина и/или триглицеридов и/или изменения уровней HDL-холестерина). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления способы данного изобретения применимы для лечения или предупреждения состояний или нарушений, которые могут быть быть ослаблены уменьшением доступности питательных веществ в субъекте, нуждающемся в этом, предусматривающие введение указанному субъекту терапевтически или профилактически эффективного количества полипептида PPF по изобретению. Такие состояния и нарушения включают в себя, но не ограничиваются ими, гипертензию, дислипидемию, сердечно-сосудистое заболевание, нарушения питания, инсулинорезистентность, ожирение, сахарный диабет любого типа, в том числе Типа I, Типа II и гестационнный диабет. Соединения по изобретению могут быть также применимы в лечении или предупреждении других состояний, ассоциированных с ожирением, в том числе инсульта, рака (например, рака эндометрия, молочной железы, предстательной железы и ободочной кишки), заболевания желчного пузыря, приступов апноэ во сне, пониженной фертильности и остеоартрита (см. Lyznicki et al., Am. Fam. Phys. 63:2185, 2001).
Соединения по изобретению могут быть также применимы для потенцирования, индукции, усиления или восстановления чувствительности к глюкозе в панкреатических островках или клетках. Эти действия могут быть также использованы для лечения или предотвращения состояний, ассоциированных с метаболическими нарушениями, такими как нарушения, описанные выше и в Заявке на патент США с номером US2004/0228846.
Кроме ослабления гипертензии в субъектах, нуждающихся в этом, соединения по изобретению могут быть использованы для лечения или предупреждения гипотензии.
Соединения по изобретению могут быть также применимы в лечении или предупреждении любого количества желудочно-кишечных нарушений, которые ассоциированы с избыточными кишечными электролитами и избыточной секрецией воды, а также уменьшенной абсорбцией, например, инфекционной (вирусной или бактериальной) диареи, воспалительной диареи, синдрома укороченного кишечника или диареи, которая обычно имеет место после хирургической процедуры, например илеостомии (см., например, Harrison's principles of Internal Medicine, McGraw Hill Inc., New York, 12 ed.). Примеры инфекционной диареи включают в себя, без ограничения, острую вирусную диарею, острую бактериальную диарею (например, вызываемую сальмонеллой, кампилобактером и клостридиумом), или диарею, вызываемую протозойными инфекциями, или диарею путешествующих (например, вызываемую вирусом Норфолка или ротавирусом). Примеры воспалительной диареи включают в себя, без ограничения, синдром мальабсорбции, тропическую спру, хронический панкреатит, болезнь Крона, диарею и синдром раздраженного кишечника. Было также обнаружено, что пептиды по изобретению могут быть использованы для лечения или предупреждения непредвиденной или угрожающей жизни ситуации, в том числе желудочно-кишечного нарушения, например, после хирургии или вследствие холеры. Кроме того, соединения по изобретению могут быть использованы для лечения кишечной дисфункции у пациентов с синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИДа), особенно во время кахексии. Соединения по изобретению могут быть также применимы для ингибирования секреции жидкости и электролитов тонкой кишкой и увеличения транспорта нутриентов, а также увеличения пролиферации клеток в желудочно-кишечном тракте, регуляции липолиза, например, в жировой ткани и регуляции кровотока в млекопитающем.
Соединения по изобретению могут быть также применимы для лечения или предупреждения описанных выше состояний посредством их желудочно-кишечной защитной активности. Таким образом, соединения по изобретению могут быть использованы для лечения желудочно-кишечного или мукозного повреждения. Примеры типов повреждения включают в себя, но не ограничиваются ими, воспалительное заболевание кишечника, атрофию кишечника, состояния, характеризующиеся потерей слизистой оболочки кишечника или функции слизистой оболочки кишечника, и другие состояния желудочно-кишечного тракта, в том числе состояния, которые могут вызываться подверганием воздействию цитотоксических агентов, облучением, токсичностью, инфекцией и/или повреждением. Кроме того, эти соединения данного изобретения могут комбинироваться с анальгезирующими, противовоспалительными агентами, гормоном роста, гепарином или любыми другими терапиями, которые могут быть использованы для лечения воспалительного заболевания пищеварительного тракта или других состояний, перечисленных выше.
Кроме того, соединения по изобретению применимы в лечении или предупреждении заболеваний и нарушений, которые могут быть облегчены или уменьшены посредством их противосекреторных свойств. Такие противосекреторные свойства включают в себя ингибирование кишечной секреции и/или секреции поджелудочной железы и могут быть применимы в лечении или предупреждении заболеваний и нарушений, включающих в себя гастрит, панкреатит, пищевод Барретта и желудочно-пищеводный рефлюкс. Эти заболевания могут также лечиться или предупреждаться желудочно-кишечными защитными функциями соединений по изобретению.
Соединения по изобретению могут быть также применимы для уменьшения концентраций алюминия в центральной нервной системе субъекта для лечения или предупреждения заболевания или состояния, ассоциированного с атипичными концентрациями алюминия (например, пациента, пораженного болезнью Альцгеймера или находящегося при риске развития болезни Альцгеймера, диализной деменцией или имеющего увеличенные уровни алюминия вследствие профессиональной деятельности, связанной с подверганием действию алюминия).
Данное изобретение относится также к фармацевтической композиции, содержащей терапевтически или профилактически эффективное количество по меньшей мере одного полипептида PPF по изобретению или его фармацевтически приемлемой соли вместе с фармацевтически приемлемыми разбавителями, солюбилизаторами, эмульгаторами, адъювантами и/или носителями, применимыми в доставке полипептидов PPF.
Эти и другие аспекты по изобретению будут более понятными со ссылкой на следующие варианты осуществления и подробное описание. Подробности одного или нескольких вариантов по изобретению представлены в сопутствующих чертежах и описании ниже. Другие признаки, цели и преимущества по изобретению будут очевидными из этого описания и графического материала и из формулы изобретения. Все цитируемые материалы включены здесь в качестве ссылки.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА
Фиг.1 демонстрирует активность некоторых полипептидов PPF по изобретению в анализе потребления корма.
Фиг.2 демонстрирует активность дополнительных полипептидов PPF по изобретению в анализе потребления корма.
Фиг.3 демонстрирует активность дополнительных полипептидов PPF по изобретению в анализах потребления корма.
Фиг.4 демонстрирует активность дополнительных полипептидов PPF по изобретению или в анализах потребления корма.
Фиг.5 демонстрирует активность определенных полипептидов PPF по изобретению в мышиной модели индуцированного диетой ожирения (DIO).
Фиг.6 демонстрирует активность дополнительных полипептидов PPF по изобретению в мышиной модели DIO.
Фиг.7. показывает прирост массы в крысах.
Фиг.8 демонстрирует активность полипептида PPF по изобретению а анализе потребления корма в мышиной модели DIO в сравнении с PYY(3-36).
Фиг.9А-D демонстрируют действие полипептидов PPF по изобретению на частоту сердечных сокращений и кровяное давление в сравнении с PYY и PYY(3-36).
Фиг.10 демонстрирует активность полипептидов PPF по изобретению в отношении секреции кислоты желудочного сока.
Фиг.11 демонстрирует активность полипептидов PPF по изобретению в отношении секреции кислоты желудочного сока.
Фиг.12-17 демонстрируют активность полипептидов PPF по изобретению в отношении опорожнения желудка.
Фиг.18 демонстрирует активность полипептидов PPF по изобретению в отношении опорожнения желчного пузыря.
Фиг.19 демонстрирует активность полипептидов PPF по изобретению в отношении опорожнения желчного пузыря.
Фиг.20 демонстрирует активность полипептидов PPF по изобретению в отношении защиты слизистой оболочки желудка.
Фиг.21А и 21В изображают пример действия введения PYY(3-36) на массу тела в мышах DIO.
Фиг.22А и 22В изображают пример действия введения PYY(3-36) на потребление корма мышами по фиг.21А и 21В соответственно.
Фиг.23А и 23В изображают пример действия введения PYY(3-36) на дыхательный коэффициент (RQ) во время циклов света и темноты в мышах по фиг.21А.
Фиг.24А и 24В изображают пример действия введения PYY(3-36) на массу эпидидимального скопления жира в мышах по фиг.21А и 21В соответственно.
Фиг.25А и 25В изображают пример действия введения PYY(3-36) на массу жира и массу сухой ткани в мышах по фиг.21В.
Фиг.26 изображает примеры действия введения PYY(3-36) на массу тела при различных дозах в мышах DIO в сравнении с контрольными мышами, получавшими корм с высоким содержанием жиров, и мышами, получавшими корм с низким содержанием жиров.
Фиг.27 изображает пример действия введения PYY(3-36) на еженедельное потребление корма в мышах по фиг.26.
Фиг.28А и 28В изображают примеры действия введения PYY(3-36) на массу жира и массу сухой ткани в мышах по фиг.26.
Фиг.29А и 29В изображают примеры действия введения PYY(3-36) на массу тела при потреблении корма в DIO мышах.
Фиг.30 изображает примеры действия введения PYY(3-36) на массу эпидидимального скопления жира в мышах фиг.29А и 29В.
Фиг.31А и 31В изображают примеры действия введения PYY(3-36) на массу жира и массу сухой ткани в мышах фиг.29А и 29В.
Фиг.32А и 32В изображают примеры действия введения PYY(3-36) на метаболическую скорость во время циклов света и темноты в DIO-мышах.
Фиг.33 изображает примеры действия различных концентраций PYY(3-36) на массу желчного пузыря в не имеющих ожирения мышах.
Фиг.34А и 34В изображают примеры действия пролонгированного введения и прекращения введения PYY(3-36) в мышах DIO.
Фиг.35 изображает зависимые от дозы PYY(3-36) уменьшения в потреблении корма и массе тела в склонных к DIO крысах.
Фиг.36 изображает примеры действия PYY(3-36) с одновременным введением амилина или без одновременного введения амилина на параметры плазмы после голодания (натощак) в склонных к DIO крысах.
Фиг.37 изображает примеры действия PYY(3-36) с одновременным введением амилина или без одновременного введения амилина на дыхательный коэффициент (RQ) и потребление энергии (ЕЕ) в склонных к DIO крысах.
Фиг.38 изображает примеры действия PYY(3-36) с одновременным введением амилина или без одновременного введения амилина на состав тела в склонных к DIO крысах.
Фиг.39 сравнивает рассчитанную скорость деградации примерного полипептида PPF со скоростью деградации PYY(3-36).
Фиг.40 демонстрирует примеры действия экстренного введения полипептида PPF в анализах потребления корма в мышиных и крысиных моделях в сравнении с PYY(3-36).
Фиг.41 демонстрирует примеры действия хронического введения полипептида PPF на массу тела в моделях DIO грызунов в сравнении с PYY(3-36).
Фиг.42 изображает действия введения примера полипептида PPF на картину потребления корма в крысиной модели.
Фиг.43 изображает действия введения примера полипептида PPF на состав тела в сравнении с PYY(3-36) в крысах DIO.
Фиг.44 изображает действия введения примера полипептида PPF на уровни триглицеридов в сравнении с PYY(3-36) в крысах DIO.
Фиг.45 изображает действия введения примера полипептида PPF на опорожнение желудка в сравнении с PYY(3-36) в крысах.
Фиг.46 изображает действия введения примера полипептида PPF на частоту сердечных сокращений и среднее артериальное давление (МАР) в крысах.
Фиг.47 изображает действия введения примера полипептида PPF на частоту сердечных сокращений и среднее артериальное давление (МАР) в крысах.
Фиг.48 изображает действия введения примера полипептида PPF в сравнении с PYY(3-36) с одновременным введением амилина и без одновременного введения амилина на массу тела склонных к DIO крыс.
Фиг.49 изображает действия двух примеров полипептида PPF с одновременным введением амилина и без одновременного введения амилина на массу тела склонных к DIO крыс.
Фиг.50 изображает действия примера полипептида PPF с одновременным введением амилина и без одновременного введения амилина на состав тела склонных к DIO крыс.
Фиг.51 изображает действия примера полипептида PPF с одновременным введением амилина и без одновременного введения амилина на состав тела склонных к DIO крыс.
Фиг.52 изображает действия PYY(3-36) или примера полипептида PPF с одновременным введением амилина и без одновременного введения амилина на уровни инсулина после голодания (натощак) в крысах.
Фиг.53 изображает действия примера полипептида PPF с одновременным введением амилина и без одновременного введения амилина на RQ и ЕЕ в крысах.
Фиг.54 сравнивает рассчитанные скорости деградации нескольких полипептидов PPF со скоростями деградации PYY(3-36).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Данное изобретение относится в общем к полипептидам семейства панкреатических белков (“PPF”), имеющим по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 94% или по меньшей мере 97% идентичность последовательности с PYY(3-36) на протяжении всей длины PYY(3-36). Полипептиды PPF могут содержать не более чем 10, не более чем 5 аминокислотных замен, не более чем 3, не более чем 2 аминокислотные замены или не более чем 1 аминокислотную замену. Полипептиды PPF содержат также по меньшей мере два мотива PPF, в том числе N-концевой мотив полипролина PPF и С-концевой мотив хвоста PPF. В данном контексте «мотив» обозначает аминокислотную последовательность, которая является характерной для конкретной биохимической функции или определяет независимо уложенный домен. Дополнительные мотивы PPF данного изобретения могут соответствовать мотиву любого из полипептидов семейства РР, в том числе РР, PYY и NPY, например мотиву района β-витка типа II PYY или α-спиральному мотиву на С-концевой стороне PYY. В некоторых вариантах осуществления полипептиды PPF по изобретению могут не включать в себя неприродные аминокислоты.
Данное изобретение относится также к полипептидам PPF, применимым в лечении и предупреждении метаболических состояний и нарушений. В некоторых вариантах осуществления полипептиды PPF по изобретению могут иметь сравнимую или более высокую эффективность в лечении и/или предупреждении метаболических состояний или нарушений в сравнении с нативными РР, PYY, PYY(3-36) или NPY человека. В некоторых вариантах осуществления полипептиды PPF по изобретению могут обнаруживать более низкую эффективность, но могут иметь другие желаемые признаки, такие как улучшенная легкость производства, стабильность и/или легкость приготовления композиций в сравнении с РР, PYY, PYY(3-36) или NPY.
В некоторых вариантах осуществления без намерения ограничения теорией авторы считают, что периферическое введение новых полипептидов PPF данного изобретения субъекту уменьшает доступность питательных веществ (нутриентов) и, следовательно, применимо в лечении и предупреждении ожирения и родственных метаболических состояний или нарушений. Как таковое данное изобретение обеспечивает композиции полипептидов PPF и способы применения их для уменьшения доступности нутриентов в субъекте, нуждающемся в этом, для лечения и предупреждения метаболических состояний или нарушений, которые могут получать пользу от уменьшения доступности питательных веществ (нутриентов). Эти способы могут быть применимыми в лечении, например, ожирения, диабета, в том числе, но не только, диабета типа 2 или инсулиннезависимого диабета, нарушений питания, синдрома инсулинорезистентности, сердечно-сосудистого заболевания или комбинации подобных состояний.
Теперь было обнаружено, что PYY, агонист PYY или полипептид PPF могут оказывать метаболические действия на организм и могут быть использованы для преимущественного уменьшения или поддержания жира тела и сохранения или увеличения сухой массы тела.
Данное изобретение направлено частично на воздействие на состав тела уменьшением массы тела, поддержанием массы тела или уменьшением прироста массы тела при селективном уменьшении жира тела или предупреждением прироста жира тела и поддержанием или увеличением сухой массы тела. Однако в некоторых ситуациях, например в бодибилдинге, может быть желательным увеличение массы тела, например, посредством потребления селективных нутриентов (например, увеличением содержания калорий или жира) при уменьшении или поддержании процента жира тела.
Способы по изобретению рассматривают введение эффективного количества PYY, агониста PYY или полипептида PPF субъекту для получения желаемых результатов, как описано в данной заявке.
Вводимые PYY, агонист PYY или полипептид PPF может быть в форме пептида, пролекарства или их фармацевтически приемлемых солей. Термин «пролекарство» относится к соединению, которое является предшественником лекарства, которое после введения высвобождает это лекарство in vivo посредством какого-либо химического или физиологического процесса, например протеолитического расщепления, или после достижения определенного рН среды.
Способы по изобретению могут быть использованы на любом индивидууме, нуждающемся в таких способах, или индивидуумах, для которых желательно использование этих способов. Этими индивидуумами могут быть любые млекопитающие, в том числе, но не только, люди, собаки, лошади, коровы, свиньи, куры, индейки и другие коммерчески ценные животные или животные-компаньоны.
Названия разделов используются здесь только для организационных целей и не предназначены для ограничения каким бы то ни было образом описанного предмета изобретения.
А. Полипептиды PPF изобретения и мотивы PPF
Как обсуждалось выше, данное изобретение относится, по меньшей мере частично, к новым полипептидам PPF, содержащим по меньшей мере два мотива PPF, где эти по меньшей мере два мотива PPF включают в себя по меньшей мере N-концевой мотив полипролина PPF и С-концевой мотив хвоста PPF. Полипептиды PPF по изобретению будут также обнаруживать по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 94% или по меньшей мере 97% идентичность последовательности с нативной PYY(3-36) на протяжении всей длины PYY(3-36). В некоторых вариантах осуществления полипептиды данного изобретения будут сохранять биологическую активность нативных РР, PYY или NPY человека, например полипептиды данного изобретения обычно будут агонистами или антагонистами РР, PYY и/или NPY. В некоторых вариантах осуществления полипептиды данного изобретения будут проявлять биологическую активность при лечении и предупреждении метаболических состояний и нарушений. Кроме того, полипептиды PPF по изобретению могут включать в себя внутренние линкерные соединения, могут включать в себя химические модификации во внутренних аминокислотных остатках или могут быть химически модифицированы на N-концевом или С-концевом остатке. В некоторых вариантах осуществления полипептиды согласно изобретению включают в себя только природный L-аминокислотный остаток и/или модифицированный L-аминокислотный остаток. В некоторых вариантах осуществления полипептиды по изобретению не включают в себя неприродные аминокислотные остатки.
Мотивы PPF согласно изобретению соответствуют любому мотиву любых из нативных полипептидов семейства РР, в том числе РР, PYY и NPY. «Мотив PPF» обычно представляет собой структурный компонент, первичный, вторичный или третичный, нативного полипептида семейства РР, который является решающим для биологической активности, т.е. биологическая активность существенно уменьшается в отсутствие или при нарушении этого мотива. Мотивы PPF могут включать в себя любые из мотивов, известных в данной области, в том числе, но не только, N-концевой мотив полипролина типа II нативного полипептида семейства РР, мотив β-витка типа II нативного полипептида семейства РР, α-спиральный мотив на С-концевой стороне нативного полипептида семейства РР и С-концевой мотив хвоста нативного полипептида семейства РР. Более конкретно, в N-концевом мотиве полипролина PPF аминокислоты, соответствующие остаткам 5 и 8 нативного полипептида семейства РР, обычно сохранены в виде пролина. Мотив β-витка типа II будет обычно включать в себя аминокислоты, соответствующие остаткам 12-14 нативного полипептида семейства РР. α-спиральный мотив может обычно простираться от аминокислот, соответствующих приблизительно остатку 14 нативного полипептида семейства РР, до любой точки вплоть до С-концевой стороны и до С-конца включительно, пока этот α-спиральный конец включает в себя достаточное количество аминокислотных остатков, так что в растворе образуется α-спиральный виток. α-спиральный мотив может также включать в себя аминокислотные замены, инсерции и делеции относительно нативной последовательности семейства РР, пока этот α-спиральный виток все еще образуется в растворе. Мотив С-концевого хвоста PPF обычно включает в себя аминокислоты, соответствующие приблизительно последним 10 остаткам нативного полипептида семейства РР. В некоторых вариантах осуществления мотив С-концевого хвоста включает в себя 7, 6 или 5 остатков нативного полипептида семейства РР. В некоторых вариантах осуществления мотив С-концевого хвоста включает в себя аминокислоты 32-35.
В одном варианте осуществления полипептиды PPF по изобретению не включают в себя никаких неприродных аминокислотных остатков и, кроме того, условием является то, что полипептиды PPF по изобретению не включают в себя никаких нативных полипептидов PPF (например, РР, NPY(1-36), NPY(3-36), PYY(1-36) PYY(3-36), NPY(2-36), NPY(4-36), PYY(2-36), PYY(4-36), РР(2-36), РР(3-36 или РР(4-36)). В некоторых вариантах осуществления полипептиды PPF по изобретению не включают в себя:
В другом варианте осуществления такие полипептиды PPF по изобретению не включают в себя также:
В другом варианте осуществления полипептиды PPF по изобретению не включают в себя никаких неприродных аминокислотных остатков и содержат С-концевой мотив хвоста PYY человека (hPYY). Этот С-концевой мотив хвоста содержит аминокислотные остатки 32-35 hPYY, например Thr, Arg, Gln, Arg (SEQ ID NO:351). В таком варианте осуществления полипептиды PPF по изобретению не включают в себя никаких нативных полипептидов PPF (например,
27
30
В другом аспекте такие полипептиды PPF по изобретению, содержащие С-концевой мотив хвоста hPYY, также не включают в себя: ThrhPYY(3-36), IlehPYY(3-36),
Еще в одном варианте осуществления полипептиды PPF данного изобретения не включают в себя PPF-родственные полипептиды, описанные в WO 03/026591 и WO 03/057235, которые включены здесь в качестве ссылки в их полном виде.
В другом варианте осуществления полипептиды по изобретению имеют длину по меньшей мере 34 аминокислоты. В других вариантах осуществления эти полипептиды PPF могут иметь длину по меньшей мере 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 или 33 аминокислоты. Кроме того, в одном варианте осуществления полипептиды по изобретению включают в себя только L-аминокислотные остатки и/или модифицированные природные L-аминокислотные остатки. Альтернативно, в другом варианте осуществления полипептиды по изобретению не включают в себя неприродных аминокислотных остатков.
Еще в одном варианте осуществления полипептиды PPF по изобретению могут обнаруживать по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 80% или 90% идентичность последовательности с нативным PYY(3-36) на протяжении всей длины PYY(3-36). Такие полипептиды PPF по изобретению могут также обнаруживать по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 94% или по меньшей мере 97% идентичность последовательности с нативным РР. Еще в одном варианте осуществления такие полипептиды PPF по изобретению могут обнаруживать по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 94% или по меньшей мере 97% идентичность последовательности с нативным NPY.
Более конкретно, в одном аспекте данное изобретение относится к новым полипептидам PPF, содержащим по меньшей мере два мотива PPF, где эти по меньшей мере два мотива PPF включают в себя по меньшей мере N-концевой мотив полипролина PPF и С-концевой мотив хвоста PPF, и этот полипептид PPF не включает в себя никаких неприродных аминокислотных остатков. Такие полипептиды PPF по изобретению будут обнаруживать по меньшей мере 50% идентичность последовательности с нативным PYY(3-36) на протяжении всей длины PYY(3-36). В некоторых вариантах осуществления такие полипептиды PPF имеют по меньшей мере 34 аминокислотных остатка. В некоторых вариантах осуществления такие полипептиды PPF могут обнаруживать по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 94% или по меньшей мере 97% идентичность последовательности с нативным PYY(3-36) на протяжении всей длины PYY(3-36). Такие полипептиды PPF могут также обнаруживать по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 94% или по меньшей мере 97% идентичность последовательности с нативным РР. В некоторых вариантах осуществления полипептиды PPF могут содержать не более чем 10, не более чем 5 аминокислотных замен, не более чем 3, не более чем 2 аминокислотные замены, или не более чем 1 аминокислотную замену. Еще в одном варианте осуществления такие полипептиды PPF по изобретению могут обнаруживать по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 94% или по меньшей мере 97% идентичность последовательности с нативным NPY.
В другом аспекте полипептиды PPF по изобретению включают в себя полипептиды аналогов PYY. Еще в одном аспекте по изобретению полипептиды PPF по изобретению включают в себя химерные полипептиды PPF, содержащие фрагмент полипептида РР, PYY или NPY, ковалентно связанный по меньшей мере с одним дополнительным фрагментом полипептида РР, PYY или NPY, где каждый из фрагментов РР, PYY или NPY включает в себя мотив PPF. Такие полипептиды аналогов PPF и химерные полипептиды PPF по изобретению будут обнаруживать по меньшей мере 50% идентичность последовательности с нативным PYY(3-36) на протяжении всей длины PYY(3-36). Полипептиды PPF по изобретению могут также обнаруживать по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 94% или по меньшей мере 97% идентичность последовательности с нативным PYY(3-36) на протяжении всей длины PYY(3-36). Такие полипептиды PPF могут также обнаруживать по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 94% или по меньшей мере 97% идентичность последовательности с нативным РР. Еще в одном варианте осуществления полипептиды PPF по изобретению могут обнаруживать по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 94% или по меньшей мере 97% идентичность последовательности с нативным NPY. В некоторых вариантах осуществления желаемые полипептиды PPF могут не включать в себя N-концевые фрагменты РР в комбинации с С-концевыми фрагментами NPY.
Полипептиды PPF, применимые в этом изобретении, могут иметь активность PPF, более высокую или менее высокую, чем природные соединения, в отношении конкретной активности. Так, например, агонисты PYY могут иметь в 3, 5, 10, 50, 100, 500, 1000 раз или большую активность, чем природный PYY. Кроме того, хотя желательно использовать агонист PYY, имеющий сходную или более высокую активность, чем активность нативного PYY, квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, что агонисты, имеющие более низкую активность, чем нативный PYY, могут также быть применимыми в данном изобретении. Такие агонисты могут иметь, например, в 2, 5, 10, 15 или 20 раз меньшую активность, чем нативный PYY, но иметь другие желаемые характеристики, например растворимость, биодоступность, легкость в получении или приготовлении композиции или меньшие побочные действия. В некоторых вариантах осуществления полипептидом PPF, применимым в этом изобретении, может быть антагонист PYY.
et al.,
Примеры агонистов PYY, более конкретно агонистов аналогов PYY или аналогов агонистов (аналогов и производных PYY), описаны в Патентах США 5574010, WO 04/089279, WO 04/066966, WO 03/057235, WO 03/026591, WO 98/20885, WO 94/22467, содержания которых включены в качестве ссылки в их полном виде. Другие агонисты аналогов описаны в Balasubramaniam  Pept Res 1(1):32-5, 1998,
и включены здесь в качестве ссылки.
PYY, NPY и РР составляют семейство амидированных на С-конце пептидов, участвующих в регуляции желудочно-кишечной функции, кровяного давления и пищевого поведения. Без намерения ограничения теорией авторы изобретения считают, что способность этих пептидов селективно связывать и активировать подтипы рецепторов Y в сильной степени зависят от стабильной в растворе структуры, в том числе от так называемой «РР-укладки». Таблица 1 (ниже) показывает активности лигандов семейства РР при известных рецепторах и ранжирование активностей различных лигандов.
Таблица 1. Суммирование фармакологии рецепторов для семейства РР рецепторов
Исследование предполагало, что различия в активностях связывания Y коррелируют с различиями вторичной и третичной структуры. См., например, Keire et al., Biochemistry 2000, 39, 9935-9942. Нативный PYY свиньи был охарактеризован как включающий в себя два С-концевых спиральных сегмента из остатков 17-22 и 25-33, разделенных петлей из остатков 23, 24 и 25, витка, центрированного вокруг остатков 12-14 и N-конца, уложенного вблизи остатков 30 и 31. Кроме того, полноразмерный PYY свиньи был охарактеризован как включающий в себя укладку РР, стабилизированную гидрофобными взаимодействиями среди остатков в N- и С-концах. См. id.
Под «РР» имеют в виду полипептид панкреатического пептида, полученный или происходящий из любого вида. Так, термин «РР» включает в себя как полноразмерный, состоящий из 36 аминокислот пептид человека, представленный в SEQ ID NO:1, так и видовые вариации РР, в том числе, например, РР мыши, хомячка, курицы, коровы, крысы и собаки. В этом смысле термины «РР», «РР дикого типа» и «нативный РР», т.е. немодифицированный РР, используются взаимозаменяемо.
Под «NPY» имеют в виду полипептид нейропептида Y, полученный или происходящий из любого вида. Так, термин «NPY» включает в себя как полноразмерный, состоящий из 36 аминокислот пептид человека, представленный в SEQ ID NO:4, так и видовые вариации NPY, в том числе, например, NPY мыши, хомячка, курицы, коровы, крысы и собаки. В этом смысле термины «NPY», «NPY дикого типа» и «нативный NPY», т.е. немодифицированный NPY, используются взаимозаменяемо.
Под «PYY» имеют в виду полипептид пептида YY, полученный или происходящий из любого вида. Так, термин «РYY» включает в себя как полноразмерный, состоящий из 36 аминокислот пептид человека, представленный в SEQ ID NO:2, так и видовые вариации PYY, в том числе, например, PYY мыши, хомячка, курицы, коровы, крысы и собаки. В этом смысле термины «РYY», «РYY дикого типа» и «нативный РYY», т.е. немодифицированный РYY, используются взаимозаменяемо. В контексте данного изобретения все модификации, обсуждаемые со ссылкой на аналоги полипептидов PYY данного изобретения, основаны на последовательности из 36 аминокислот нативного PYY человека (SEQ ID NO:2).
Под «агонистом РР», «агонистом PYY» или «агонистом NPY» имеют в виду соединение, которое индуцирует биологическую активность нативного РР, PYY или NPY человека соответственно. В некоторых вариантах осуществления эти термины относятся к соединению, которое индуцирует биологический эффект в уменьшении доступности нутриентов, сходный с эффектом нативного РР, PYY или NPY человека, например к соединению (1), имеющему активность в анализах потребления пищи, опорожнения желудка, секреции поджелудочной железы или потери массы, сходную с нативным РР, PYY или NPY человека, и/или (2) которое связывается специфически в анализе с рецептором Y или в конкурентном анализе связывания с меченым РР, PYY, PYY(3-36) или NPY из некоторых тканей, имеющих изобилие рецепторов Y, в том числе area postrema. В некоторых вариантах осуществления этот агонист не является РР, PYY, PYY(3-36) или NPY. В некоторых вариантах осуществления агонисты будут связываться в таких анализах с аффинностью, большей чем 1 мкМ. В некоторых вариантах осуществления эти агонисты будут связываться в таких анализах с аффинностью, большей чем 1-5 нМ. Такие агонисты могут содержать мотив PPF, активный фрагмент РР, PYY или NPY или малую химическую молекулу.
PYY, PYY(3-36) или их агонисты могут быть модифицированы на N-концевой стороне, С-концевой стороне и/или вдоль их длины для модификации других свойств, как это доступно в данной области. Инсерции, удлинения или замены, описанные выше, могут быть выполнены с другими природными аминокислотами, синтетическими аминокислотами, пептидомиметиками или другими химическими соединениями. Аналоги полипептидов по изобретению могут быть дериватизованы химическими изменениями, такими как амидирование, гликозилирование, ацилирование, сульфатирование, фосфорилирование, ацетилирование и циклизация. Такие химические изменения могут быть получены с использованием химических или биохимических методологий, а также с использованием процессов in vivo или любой их комбинации. Производные аналогов полипептидов по изобретению могут также включать в себя конъюгирование с одним или несколькими полимерами или низкомолекулярными заместителями. Одним типом конъюгирования с полимером является связывание или присоединение полимеров полиэтиленгликоля («ПЭГ»), полиаминокислот (например, поли-his, поли-arg, поли-lys и т.д.) и/или цепей жирных кислот разной длины к N- или С-концу или аминокислотному остатку боковой цепи аналога полипептида. Низкомолекулярные заместители включают в себя короткие алкилы и стесненные алкилы (с ограничением степеней свободы) (например, разветвленные, циклические, конденсированные, адамантил) и ароматические группы.
«Уменьшенная доступность питательных веществ (нутриентов»)» включает в себя любые средства, при помощи которых организм уменьшает нутриенты, доступные для запасания телом в виде жира. Уменьшение доступности нутриентов может достигаться при помощи средств, которые включают в себя, но не ограничиваются ими, уменьшение аппетита, увеличение насыщения, вызывание отвращения к выбору/вкусу пищевых продуктов, усиление метаболизма и/или уменьшение или ингибирование абсорбции пищи. Примеры механизмов, на которые можно воздействовать, включают в себя задержанное опорожнение желудка или уменьшение абсорбции пищи в кишечнике.
«Увеличенная доступность питательных веществ (нутриентов»)» включает в себя любые средства, при помощи которых организм увеличивает нутриенты, доступные для запасания телом в виде жира. Увеличение доступности нутриентов может достигаться при помощи средств, которые включают в себя, но не ограничиваются ими, увеличение аппетита, уменьшение насыщения, уменьшение отвращения к вкусу пищевых продуктов, уменьшение метаболизма и/или увеличение абсорбции пищи. Примеры механизмов, на которые можно воздействовать, включают в себя уменьшенную двигательную функцию желудка или увеличение абсорбции пищи в кишечнике.
Что касается способов уменьшения доступности нутриентов, в данном контексте «субъект, нуждающийся в них» включает в себя субъектов, которые имеют избыточную массу или ожирение или ожирение, препятствующее нормальному функционированию организма, или которые желают снизить массу. Кроме того, субъекты, которые являются инсулинорезистентными, нетолерантными к глюкозе или имеют любую форму сахарного диабета (например, диабет типа 1, 2 или гестационный диабет), могут получить пользу от этих способов уменьшения доступности нутриентов.
Что касается способов увеличения доступности нутриентов, в данном контексте «субъект, нуждающийся в них» включает в себя субъектов, которые имеют пониженную массу или желают увеличить массу.
Термин «субъект» включает в себя любое животное, в том числе людей, приматов и других млекопитающих, в том числе крыс, мышей, домашних животных, таких как кошки, собаки, домашний скот, такой как лошади, крупный рогатый скот, свиньи, овцы и козы, а также куры, индейки и другие коммерчески ценные животные или животные-компаньоны, для которых масса тела или изменение состава тела может быть проблемой.
В данном контексте термин «соблюдение режима питания» включает в себя любые средства, при помощи которых субъект имеет уменьшенное потребление калорий относительно его или ее потребления калорий перед началом соблюдения режима питания. Примеры соблюдения режима питания включают в себя, но не ограничиваются ими, уменьшение общего количества потребляемой пищи в целом, уменьшение потребления любых одного или нескольких из белковых, углеводных или жировых компонентов диеты или уменьшение доли жира относительно доли углеводов и/или белка в диете.
Под «метаболической скоростью» имеют в виду количество энергии, высвобождаемой/потребляемой на единицу времени. Метаболизм на единицу времени может быть определен по потреблению пищи, энергии, высвобождаемой в виде тепла или кислорода в метаболических процессах. Обычно желательно иметь более высокую метаболическую скорость, когда желательной является потеря массы. Например, субъект с высокой метаболической скоростью может быть способен расходовать больше энергии (например, организм сжигает больше калорий) для выполнения активности, чем субъект с низкой метаболической скоростью, в отношении той же самой активности.
В данном контексте «сухая масса» или «сухая масса тела» обозначает мышцы и кости. Сухая масса тела необязательно обозначает не содержащую жира массу. Сухая масса тела содержит небольшой процент жира (приблизительно 3%) в центральной нервной системе (головном мозге и спинном мозге), костном мозге и внутренних органах. Сухую массу тела измеряют в виде плотности. Способы измерения массы жира и сухой массы включают в себя, но не ограничиваются ими, подводное взвешивание, плетизмограф с вытеснением воздуха, рентгеновские лучи, DEXA-сканы, томографию с использованием ядерно-магнитного резонанса (MRI), сканы компьютерной томографии (СТ), адиабатическую калориметрию с калориметрической бомбой. В некоторых вариантах осуществления состав тела определяют перед лечением и после лечения с использованием ЯМР-установки для грызунов (EchoMRI-700™). Животных помещают в сдерживающую трубу и помещают в ЯМР на 2 минуты и определяют количественно массу жира и сухую массу в граммах. В некоторых вариантах осуществления состав тела (сухую массу, массу жира) для каждого животного анализируют с использованием установки абсорбциометрии с использованием рентгеновского излучения с двойной энергией (DEXA) в соответствии с инструкциями изготовителя (Lunar Piximus, GE Imaging System). В некоторых вариантах осуществления массу жира и сухую массу измеряют с использованием подводного взвешивания. В некоторых вариантах осуществления состав тела измеряют с использованием MRI. В некоторых вариантах осуществления состав тела измеряют с использованием СТ-скана. В некоторых вариантах осуществления состав тела измеряют адиабатической калориметрией с использованием калориметрической бомбы. В некоторых вариантах осуществления состав тела измеряют с использованием рентгеновского излучения. В некоторых вариантах осуществления в момент терминации субъектов-животных ретроперитонеальные и мезентериальные скопления жировой ткани, маркеры висцерального ожирения, иссекают и взвешивают.
Под «распределением жира» имеют в виду местоположение жировых отложений в теле. Такие местоположения отложений жира включают в себя, например, подкожные, висцеральные и эктопические жировые депо.
Под «подкожным жиром» имеют в виду отложение липидов непосредственно под поверхностью кожи. Количество подкожного жира может быть измерено с использованием любого способа, доступного для измерения подкожного жира. Способы измерения подкожного жира известны в данной области, например способы, описанные в Патенте США № 6530886, все содержание которого включено здесь в качестве ссылки.
Под «висцеральным жиром» имеют в виду отложение жира во внутриабдоминальной жировой ткани. Висцеральный жир окружает жизненно важные органы и может метаболизироваться печенью с образованием холестерина крови. Висцеральный жир ассоциировался с увеличенными рисками таких состояний, как синдром поликистоза яичника, метаболический синдром и сердечно-сосудистые заболевания.
Под «эктопическим депонированием жира» имеют в виду отложения липидов в тканях и вокруг тканей и органов, которые составляют сухую массу тела (например, скелетные мышцы, сердце, печень, поджелудочная железа, почки, кровеносные сосуды). Обычно эктопическое депонирование жира является накоплением липидов вне классических депо жировой ткани в теле.
В данном контексте и, как хорошо понятно в данной области, «лечение» является подходом для получения полезных или желаемых результатов, в том числе клинических результатов. «Лечение» или «временное облегчение» болезни, нарушения или состояния означает, что степень и/или нежелательные клинические проявления состояния, нарушения или болезненного состояния ослабляются и/или временной ход прогрессирования замедляется или удлиняется в сравнении с отсутствием лечения этого нарушения. Например, в лечении ожирения уменьшение массы тела, например по меньшей мере 5%-ное уменьшение массы тела, является примером желаемого результата лечения. Полезные или желаемые клинические результаты включают в себя, но не ограничиваются ими, облегчение или ослабление одного или нескольких симптомов, уменьшение степени заболевания, стабилизированное (т.е. не ухудшающееся) состояние заболевания, задержку или замедление прогрессирования заболевания, облегчение или ослабление болезненного состояния и ремиссию (частичную или полную), детектируемую или недетектируемую. «Лечение» может также означать пролонгирование выживания в сравнении с ожидаемым выживанием в отсутствие получения лечения. Кроме того, излечивание необязательно имеет место в результате введения одной дозы и часто имеет место после введения серии доз. Таким образом, терапевтически эффективное количество, количество, достаточное для временного облегчения, или количество, достаточное для излечения заболевания, нарушения или состояния, может вводиться в виде одного или нескольких введений.
В данном контексте термин «терапевтически эффективное количество» означает количество полипептида PPF в композиции, которое будет вызывать биологическую или медицинскую реакцию в ткани, системе, субъекте или человеке, которая была желательной для субъекта, исследователя, ветеринара, врача или другого клинициста, которая включает в себя ослабление интенсивности симптомов нарушения, которое должно лечиться. Новые способы лечения по изобретению предназначены для нарушений, известных квалифицированным в данной области специалистам.
В данном контексте термин «профилактически эффективное количество» означает количество активных соединений в композиции, которое будет вызвать биологическую или медицинскую реакцию в ткани, системе, субъекте или человеке, которая была желательной для субъекта, исследователя, ветеринара, врача или другого клинициста, для предотвращения возникновения ожирения или связанного с ожирением нарушения, состояния или заболевания в субъектах, находящихся при риске ожирения или связанного с ожирением нарушения, состояния или заболевания.
В данном контексте единственная форма включает в себя множественные ссылки, если нет других указаний или если это не ясно из контекста. Например, как будет видно из контекста, агонист PYY может включать в себя один или несколько агонистов PYY.
«Аминокислота» и «аминокислотный остаток» обозначает природные аминокислоты, неприродные аминокислоты и модифицированную аминокислоту. Если нет противоположного указания, любая ссылка на аминокислоту, в общем виде или конкретно с использованием ее названия, включает в себя ссылку как на D-, так и на L-стереоизомеры, если их структура делает возможными такие стереоизомерные формы. Природные аминокислоты включают в себя аланин (Ala), аргинин (Arg), аспарагин (Asn), аспарагиновую кислоту (Asp), цистеин (Cys), глутамин (Gln), глутаминовую кислоту (Glu), глицин (Gly), гистидин (His), изолейцин (Ile), лейцин (Leu), лизин (Lys), метионин (Met), фенилаланин (Phe), пролин (Pro), серин (Ser), треонин (Thr), триптофан (Trp), тирозин (Tyr) и валин (Val). Неприродные аминокислоты включают в себя, но не ограничиваются ими, гомолизин, гомоаргинин, азетидинкарбоновую кислоту, 2-аминоадипиновую кислоту, 3-аминоадипиновую кислоту, бета-аланин, аминопропионовую кислоту, 2-аминомасляную кислоту, 4-аминомасляную кислоту, 6-аминокапроновую кислоту, 2-аминогептановую кислоту, 2-аминоизомасляную кислоту, 3-аминоизомасляную кислоту, 2-аминопимелиновую кислоту, трет-бутилглицин, 2,4-диаминоизомасляную кислоту, десмозин, 2,2'-диаминопимелиновую кислоту, 2,3-диаминопропионовую кислоту, N-этилглицин, N-этиласпарагин, гомопролин, гидроксилизин, алло-гидроксилизин, 3-гидроксипролин, 4-гидроксипролин, изодесмозин, алло-изолейцин, N-метилаланин, N-метилглицин, N-метилизолейцин, N-метилпентилглицин, N-метилвалин, нафталанин, норвалин, норлейцин, орнитин, пентилглицин, пипеколиновую кислоту, тиопролин, саркозин и цитруллин. Дополнительные неприродные аминокислоты включают в себя модифицированные аминокислотные остатки, которые являются химически блокированными, обратимо или необратимо, или химически модифицированными на их N-концевой аминогруппе или на их группах боковых цепей, как, например, N-метилированные D- и L-аминокислоты или остатки, в которых функциональные группы боковой цепи химически модифицированы в другую функциональную группу. Например, модифицированные аминокислоты включают в себя сульфоксид метионина; сульфон метионина; бета-метиловый эфир аспарагиновой кислоты, модифицированную аспарагиновую аминокислоту; N-этилглицин, модифицированный глицин; или карбоксамид аланина, модифицированный аланин. Дополнительные остатки, которые могут быть включены, описаны в Sandberg et al., J. Med. Chem. 41: 2481-91, 1998.
“Ahx” обозначает 6-аминогексановую кислоту.
Некоторые последовательности пептидов человека в PPF являются следующими (в общепринятом однобуквенном коде аминокислот):
Видовые гомологи PYY человека включают в себя аминокислотные последовательности SEQ ID NO:7-29.
2
Как упоминалось выше, эти пептиды являются амидированными на С-конце при экспрессии физиологически, но это не является обязательным для целей данного изобретения. Другими словами, С-конец этих пептидов, а также полипептидов PPF данного изобретения может иметь свободную группу -ОН или -NH. Эти пептиды могут также иметь другие посттрансляционные модификации. Квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, что полипептиды PPF данного изобретения могут быть также сконструированы с N-концевым остатком метионина.
Полипептиды PPF по изобретению включают в себя полипептиды PPF Формулы (I) (SEQ ID NO:30):
где:
1
Хаа обозначает Tyr, Ala, Phe, Trp или отсутствует;
2
Хаа обозначает Pro, Gly, d-Ala, гомоPro, гидроксиPro или отсутствует;
3
Хаа обозначает Ile, Ala, NorVal, Val, Leu, Pro, Ser, Thr или отсутствует;
4
Хаа обозначает Lys, Ala, Gly, Arg, d-Ala, гомоLys, гомоArg, Glu, Asp или отсутствует;
6
Хаа обозначает Glu, Ala, Val, Asp, Asn или Gln;
7
Хаа обозначает Ala, Asn, His, Ser или Tyr;
9
Хаа обозначает Gly, Ala, Ser, саркозин, Pro или Aib;
10
Хаа обозначает Glu, Ala, Asp, Asn, Gln, Pro, Aib или Gly;
11
Хаа обозначает Asp, Ala, Glu, Asn, Gln, Pro, Aib или Gly;
12
Хаа обозначает Ala или d-Ala;
13
Хаа обозначает Ser, Ala, Thr, Pro или гомоSer;
14
Хаа обозначает Pro, Ala, гомоPro, гидроксиPro, Aib или Gly;
15
Хаа обозначает Glu, Ala, Asp, Asn, Gln, Pro, Aib или Gly;
16
Хаа обозначает Glu, Ala, Asp, Asn или Gln;
17
Хаа обозначает Leu, Ala, Met, Trp, Ile, Val или NorVal;
18
Хаа обозначает Asn, Asp, Ala, Glu, Gln, Ser или Thr;
19
Хаа обозначает Arg, Tyr, Lys, Ala, Gln или N(Me)Ala;
21
Хаа обозначает Tyr, Ala, Met, Phe или Leu;
22
Хаа обозначает Ala, Ser, Thr или d-Ala;
23
Хаа обозначает Ser, Ala, Asp, Thr или гомоSer;
25
Хаа обозначает Arg, гомоArg, Lys, гомоLys, Orn или Cit;
26
Хаа обозначает His, Ala, Arg, гомоArg, гомоLys, Orn или Cit;
27
Хаа обозначает Tyr или Phe;
28
Хаа обозначает Leu, Ile, Val или Ala;
29
Хаа обозначает Asn или Gln;
30
Хаа обозначает Leu, Ala, NorVal, Val, Ile или Met;
31
Хаа обозначает Ala, Val, Ile или Leu, и
36
Хаа обозначает Tyr, N(Me)Tyr, His, Trp или Phe;
при условии, что указанный полипептид PPF не является нативным полипептидом PPF,
В другом варианте осуществления полипептиды PPF Формулы I также не включают в себя:
Как будет понятно квалифицированному в данной области специалисту, полипептиды Формулы I могут быть в форме свободной кислоты или могут быть амидированы на С-конце.
1. Полипептиды аналогов PYY данного изобретения
Полипептиды аналогов PYY данного изобретения будут обычно включать в себя по меньшей мере два мотива PPF, в том числе N-концевой мотив полипролина PPF и С-концевой мотив хвоста PPF, и будут обычно сохранять, по меньшей мере частично, биологическую активность нативного PYY человека, например, полипептиды аналогов PYY данного изобретения будут обычно агонистами PYY. Кроме того, полипептид аналога PYY будет иметь по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 94% или по меньшей мере 97% идентичность последовательности с PYY(3-36). В некоторых вариантах осуществления полипептиды аналогов PYY данного изобретения будут проявлять активность PYY в лечении и предупреждении метаболических состояний и нарушений.
34
В одном варианте осуществления полипептиды аналогов PYY по изобретению не включают в себя никаких неприродных аминокислотных остатков, и дополнительным условием является то, что полипептиды аналогов PYY не включают в себя никаких нативных полипептидов PYY или их 1-4 N-концевых делеций (например, PYY(1-36), PYY(2-36), PYY(3-36), PYY(4-36)). В некоторых вариантах осуществления полипептиды аналогов PYY по изобретению не включают в себя: ProPYY,
В другом варианте осуществления такие полипептиды аналогов PYY по изобретению не включают в себя:
В некоторых вариантах осуществления полипептиды аналогов PYY по изобретению не включают в себя никаких неприродных аминокислотных остатков и содержат С-концевой мотив хвоста hPYY. Этот С-концевой мотив может содержать аминокислотные остатки 32-35 hPYY, например Thr, Arg, Gln, Arg (SEQ ID NO:351). В таком варианте осуществления полипептиды аналогов PYY по изобретению не включают в себя никаких нативных полипептидов PYY или их 1-4 N-концевых делеций (например, PYY(1-36), PYY(2-36), PYY(3-36), PYY(4-36)). В некоторых вариантах осуществления такие полипептиды аналогов PYY не включают в себя:
В другом аспекте такие полипептиды аналогов PYY по изобретению, содержащие С-концевой мотив хвоста PYY человека (hPYY), также не включают в себя:
В некоторых вариантах осуществления полипептиды аналогов PYY по изобретению имеют длину по меньшей мере 34 аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления полипептиды аналогов PYY по изобретению включают в себя только природные L-аминокислотные остатки и/или модифицированные природные L-аминокислотные остатки. В некоторых вариантах осуществления полипептиды аналогов PYY по изобретению не включают в себя неприродные аминокислотные остатки.
Более конкретно, в одном аспекте данное изобретение относится к полипептидам аналогов PYY, включающим в себя одну или несколько модификаций аминокислотной последовательности. Такие модификации включают в себя замены, инсерции и/или делеции, отдельно или в комбинации. В некоторых вариантах осуществления полипептиды аналогов PYY по изобретению включают в себя одну или несколько модификаций «заменимого» аминокислотного остатка. В контексте по изобретению «заменимым» аминокислотным остатком является остаток, который может быть изменен, т.е. быть делетирован или заменен, в нативной аминокислотной последовательности PYY человека без уничтожения или существенного уменьшения агонистической в отношении PYY активности этого полипептида аналога PYY. В некоторых вариантах осуществления полипептиды аналогов PYY по изобретению сохраняют по меньшей мере приблизительно 25% или приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 98%, или приблизительно 99% биологической активности нативного PYY человека в отношении уменьшения доступности нутриентов. В другом варианте осуществления полипептиды аналогов PYY по изобретению обнаруживают улучшенную агонистическую в отношении PYY активность. В некоторых вариантах осуществления полипептиды аналогов PYY по изобретению обнаруживают по меньшей мере приблизительно 110%, приблизительно 125%, приблизительно 130%, приблизительно 140%, приблизительно 150%, приблизительно 200% или более биологической активности нативного PYY человека в отношении уменьшения доступности нутриентов.
Полипептидами аналогов PYY являются полипептиды аналогов PYY, имеющие активность в одном из описанных здесь анализов (включающих в себя анализы потребления пищи, опорожнения желудка, секреции поджелудочной железы, состава тела или уменьшения массы), которая является равной активности NPY, PYY или PYY(3-36) или более высокой, чем активность NPY, PYY или PYY(3-36), в одном и том же анализе. В некоторых вариантах осуществления полипептиды аналогов PYY по изобретению могут обнаруживать улучшенную легкость получения, стабильность и/или легкость приготовления композиции в сравнении с РР, NPY, PYY или PYY(3-36).
Замены
а.
В одном варианте осуществления полипептиды аналогов PYY по изобретению могут иметь одну или несколько замен в аминокислотной последовательности нативного PYY человека (SEQ ID NO:2), отдельно или в комбинации с одной или несколькими инсерциями или делециями. В некоторых вариантах осуществления эта замена не устраняет или существенно не уменьшает агонистическую в отношении PYY активность полипептида аналога PYY. В одном аспекте данное изобретение относится к полипептидам аналогов PYY, которые имеют единственную замену или последовательную или непоследовательную замену более чем одного аминокислотного остатка в аминокислотной последовательности нативного PYY человека (SEQ ID NO:2). В некоторых вариантах осуществления полипептиды аналогов PYY по изобретению включают в себя одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять аминокислотных замен.
В некоторых вариантах осуществления аминокислотные остатки нативного PYY человека (SEQ ID NO:2) являются не замененными в спиральном районе С-конца PYY (например, остатки 20, 24, 25, 27 и 29), остатках конца хвоста (32-36) и/или пролинах N-конца в положениях 5 и 8. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные остатки являются не замененными в положениях 32-36 нативного PYY человека (SEQ ID NO:2). В другом варианте осуществления аминокислотные остатки нативного PYY человека (SEQ ID NO:2) являются не замененными в одном или нескольких положениях аминокислот, выбранных из: положений 5, 7, 8, 20, 24, 25, 27, 29, 32, 33, 34, 35, 36 и любой их комбинации.
Замены могут включать в себя консервативные аминокислотные замены. «Консервативная аминокислотная замена» является заменой, в которой аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь или сходные физико-химические свойства (например, электростатические, образующие водородную связь, изостерические, гидрофобные признаки). Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, известны в данной области. Эти семейства включают в себя аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, метионин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, триптофан), β-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).
2
n
2
2
2
2
m
2
В другом варианте осуществления полипептиды аналогов PYY по изобретению могут включать замены одной или нескольких неприродных аминокислот и/или не аминокислот, например миметиков аминокислот, в последовательность PYY (SEQ ID NO:2). В некоторых вариантах осуществления не аминокислоты, встроенные в последовательность PYY (SEQ ID NO:2), могут быть миметиками β-витка или линкерными молекулами, такими как -NH-X-CO-, где Х = (СН) (где n может быть равно 2-20) или -NH-CHCH(-O-CHCH-O-)-CHCO- (где m = 1-5). Линкерные молекулы могут включать в себя аминокапроил (“Aca”), β-аланил и 8-амино-3,6-диоксаоктаноил. Миметики β-витка являются коммерчески доступными (BioQuadrant Inc, Quebec, Canada) и были описаны в литературе (Hanessian et al., Tetrahedron 12789-854 (1997); Gu et al., Tetrahedron Letters 44: 5863-6 (2003); Bourguet et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 13: 1561-4 (2003); Grieco et al., Tetrahedron Letters 43: 6297-9 (2002); Souers et al., Tetrahedron 57: 7431-48 (2001); Tsai et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry 7: 29-38 (1999); Virgilio et al., Tetrahedron 53: 6635-44 (1997)). Миметики β-витка могут включать в себя миметик А и миметик В, иллюстрированные ниже.
Полипептиды аналогов PYY, содержащие замены миметика β-витка в аминокислотной последовательности, включают в себя нативный PYY человека (SEQ ID NO:2), в котором аминокислоты в положениях х и х+1 заменены миметиками β-витка, выбранными из группы, состоящей из миметика А и миметика В, где х выбран из аминокислот в положениях аминокислот 8-14 нативного PYY человека. Альтернативно, могут быть заменены известные дипептидные индукторы витка, например дипептиды Ala-Aib и Ala-Pro.
Другие полипептиды аналогов PYY, содержащие замены аминокислотной последовательности, включают в себя полипептиды аналогов PYY Формулы (II) (SEQ ID NO:88):
где:
1
Хаа обозначает Tyr, Ala, Phe, Trp или отсутствует;
2
Хаа обозначает Pro, Gly, d-Ala, гомоPro, гидроксиPro или отсутствует;
3
Хаа обозначает Ile, Ala, NorVal, Val, Leu, Pro, Ser или Thr;
4
Хаа обозначает Lys, Ala, Gly, Arg, d-Ala, гомоLys, гомоArg, Glu или Asp;
6
Хаа обозначает Glu, Ala, Val, Asp, Asn или Gln;
7
Хаа обозначает Ala, Asn, His, Ser или Tyr;
9
Хаа обозначает Gly, Ala, Ser, саркозин, Pro или Aib;
10
Хаа обозначает Glu, Ala, Asp, Asn, Gln, Pro, Aib или Gly;
11
Хаа обозначает Asp, Ala, Glu, Asn, Gln, Pro, Aib или Gly;
12
Хаа обозначает Ala или d-Ala;
13
Хаа обозначает Ser, Ala, Thr или гомоSer;
14
Хаа обозначает Pro, Ala, гомоPro, гидроксиPro, Aib или Gly;
15
Хаа обозначает Glu, Ala, Asp, Asn, Gln, Pro, Aib или Gly;
16
Хаа обозначает Glu, Ala, Asp, Asn или Gln;
17
Хаа обозначает Leu, Ala, Met, Trp, Ile, Val или NorVal;
18
Хаа обозначает Asn, Asp, Ala, Glu, Gln, Ser или Thr;
19
Хаа обозначает Arg, Tyr, Lys, Ala, Gln или N(Me)Ala;
21
Хаа обозначает Tyr, Ala, Met, Phe или Leu;
22
Хаа обозначает Ala, Ser, Thr или d-Ala;
23
Хаа обозначает Ser, Ala, Thr или гомоSer;
26
Хаа обозначает His или Ala;
28
Хаа обозначает Leu, Ile, Val или Ala;
30
Хаа обозначает Leu, Ala, NorVal, Val, Ile или Met;
31
Хаа обозначает Ala, Val, Ile или Leu, и
36
Хаа обозначает Tyr, N(Me)Tyr, His, Trp или Phe;
при условии, что указанный полипептид не является нативным полипептидом PPF,
В другом варианте осуществления полипептиды аналогов PYY Формулы II также не включают в себя:
Как будет понятно квалифицированному в данной области специалисту, полипептиды Формулы II могут быть в форме свободной кислоты или могут быть амидированы на С-конце.
Другие полипептиды аналогов PYY, содержащие замены аминокислотной последовательности, включают в себя полипептиды аналогов PYY Формулы (III) (SEQ ID NO:348):
где:
1
Хаа обозначает Tyr, Phe, Trp или отсутствует;
2
Хаа обозначает Pro, Gly, d-Ala, гомоPro, гидроксиPro или отсутствует;
3
Хаа обозначает Ile, Ala, NorVal, Val, Leu, Pro, Ser или Thr;
4
Хаа обозначает Lys, Ala, Gly, Arg, d-Ala, гомоLys, гомоArg, Glu или Asp;
6
Хаа обозначает Glu, Ala, Val, Asp, Asn или Gln;
7
Хаа обозначает Ala, Asn, His, Ser или Tyr;
9
Хаа обозначает Gly, Ala, Ser, саркозин, Pro или Aib;
10
Хаа обозначает Glu, Ala, Asp, Asn, Gln, Pro, Aib или Gly;
11
Хаа обозначает Asp, Ala, Glu, Asn, Gln, Pro, Aib или Gly;
12
Хаа обозначает Ala или d-Ala;
13
Хаа обозначает Ser, Ala, Thr, Pro или гомоSer;
14
Хаа обозначает Pro, Ala, гомоPro, гидроксиPro, Aib или Gly;
15
Хаа обозначает Glu, Ala, Asp, Asn, Gln, Pro, Aib или Gly;
16
Хаа обозначает Glu, Ala, Asp, Asn или Gln;
17
Хаа обозначает Leu, Ala, Met, Trp, Ile, Val или NorVal;
18
Хаа обозначает Asn, Asp, Ala, Glu, Gln, Ser или Thr;
19
Хаа обозначает Arg, Tyr, Lys, Ala, Gln или N(Me)Ala;
21
Хаа обозначает Tyr, Ala, Met, Phe или Leu;
22
Хаа обозначает Ala, Ser, Thr или d-Ala;
23
Хаа обозначает Ser, Ala, Thr или гомоSer;
26
Хаа обозначает His или Ala;
28
Хаа обозначает Leu, Ile, Val или Ala;
30
Хаа обозначает Leu, Ala, NorVal, Val, Ile или Met;
31
Хаа обозначает Ala, Val, Ile или Leu, и
36
Хаа обозначает Tyr, N(Me)Tyr, His, Trp или Phe;
при условии, что указанный полипептид не является нативным полипептидом PPF, NPY(2-
В другом варианте осуществления полипептиды аналогов PYY Формулы III также не включают в себя:
Как будет понятно квалифицированному в данной области специалисту, полипептиды Формулы III могут быть в форме свободной кислоты или могут быть амидированы на С-конце.
Другие полипептиды аналогов PYY, содержащие замены аминокислотной последовательности, включают в себя полипептиды аналогов PYY Формулы (IV) (SEQ ID NO:349):
где:
1
Хаа обозначает Tyr, Phe, Trp или отсутствует;
2
Хаа обозначает Pro, Gly, d-Ala, гомоPro, гидроксиPro или отсутствует;
3
Хаа обозначает Ile, Ala, NorVal, Val, Leu, Pro, Ser или Thr;
4
Хаа обозначает Lys, Ala, Gly, Arg, d-Ala, гомоLys, гомоArg, Glu или Asp;
6
Хаа обозначает Glu, Ala, Val, Asp, Asn или Gln;
7
Хаа обозначает Ala, Asn, His, Ser или Tyr;
9
Хаа обозначает Gly, Ala, Ser, саркозин, Pro или Aib;
10
Хаа обозначает Glu, Ala, Asp, Asn, Gln, Pro, Aib или Gly;
11
Хаа обозначает Asp, Ala, Glu, Asn, Gln, Pro, Aib или Gly;
12
Хаа обозначает Ala или d-Ala;
13
Хаа обозначает Ser, Ala, Thr или гомоSer;
14
Хаа обозначает Pro, Ala, гомоPro, гидроксиPro, Aib или Gly;
15
Хаа обозначает Glu, Ala, Asp, Asn, Gln, Pro, Aib или Gly;
16
Хаа обозначает Glu, Ala, Asp, Asn или Gln;
17
Хаа обозначает Leu, Ala, Met, Trp, Ile, Val или NorVal;
18
Хаа обозначает Asn, Asp, Ala, Glu, Gln, Ser или Thr;
19
Хаа обозначает Arg, Tyr, Lys, Ala, Gln или N(Me)Ala;
21
Хаа обозначает Tyr, Ala, Met, Phe или Leu;
22
Хаа обозначает Ala, Ser, Thr или d-Ala;
23
Хаа обозначает Ser, Ala, Thr или гомоSer;
26
Хаа обозначает His или Ala;
28
Хаа обозначает Leu, Ile, Val или Ala;
30
Хаа обозначает Leu, Ala, NorVal, Val, Ile или Met;
31
Хаа обозначает Ala, Val, Ile или Leu, и
36
Хаа обозначает Tyr, N(Me)Tyr, His, Trp или Phe;
13
3
3
при условии, что указанный полипептид не является нативным полипептидом PPF, PYY(2-36), AlaNPY, LeuhPYY(3-36) или ValhPYY(3-36).
В другом варианте осуществления полипептиды аналогов PYY Формулы IV также не включают в себя:
Как будет понятно квалифицированному в данной области специалисту, полипептиды Формулы IV могут быть в форме свободной кислоты или могут быть амидированы на С-конце.
5-13
5-21
5-24
Другие полипептиды аналогов PYY, содержащие линкерные замены аминокислотной последовательности, включают в себя: PYY(1-4)аминокапроил(14-36) (IUPAK [Aca]PYY) (аминокапроил имеет аббревиатуру “Aca”), PYY(1-4)Аса(15-36), PYY(1-4)Аса(16-36), PYY(1-4)Аса(22-36) (IUPAK [Aca]PYY) и PYY(1-4)Аса(25-36) (IUPAK [Aca]PYY) (SEQ ID NO:180-184).
Делеции и укорочения
b.
В другом варианте осуществления полипептиды аналогов PYY по изобретению могут иметь один или несколько аминокислотных остатков, делетированных из аминокислотной последовательности нативного PYY человека (SEQ ID NO:2), отдельно или в комбинации с одной или несколькими инсерциями или заменами. В одном аспекте полипептиды аналогов PYY по изобретению могут иметь один или несколько аминокислотных остатков, делетированных из N-конца или С-конца нативного PYY человека (SEQ ID NO:2), при условии, что этот полипептид не является SEQ ID NO:3. В другом варианте осуществления эти полипептиды аналогов PYY по изобретению могут иметь аминокислотные остатки, делетированные в положениях аминокислот 2-35 нативного PYY человека (SEQ ID NO:2). Такие делеции могут включать более чем одну последовательных или непоследовательных делеций в положениях аминокислот 2-35 нативного PYY человека (SEQ ID NO:2). В некоторых вариантах осуществления аминокислотные остатки в положениях 24-36 нативного PYY человека (SEQ ID NO:2) не являются делетированными.
В другом варианте осуществления полипептиды PPF данного изобретения, описанные в Формулах I-VII, могут иметь N- и С-концевые укорочения (усечения) или внутренние делеции в положениях аминокислот 2-35 Формулы I, II, III, IV, V, VI или VII, пока сохраняется по меньшей мере одна биологическая активность нативного полипептида PPF. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные остатки в положениях 5-8 и 24-36 не являются делетированными. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные остатки в положениях 5-8 и 32-35 не являются делетированными.
Инсерции
с.
В другом варианте осуществления полипептиды аналогов PYY по изобретению могут иметь один или несколько аминокислотных остатков, встроенных в аминокислотную последовательность нативного PYY человека (SEQ ID NO:2), отдельно или в комбинации с одной или несколькими делециями и/или заменами. В одном аспекте полипептиды аналогов PYY по изобретению могут иметь единственную инсерцию или последовательные или непоследовательные инсерции более чем одного аминокислотных остатков в аминокислотную последовательность нативного PYY человека (SEQ ID NO:2). В некоторых вариантах осуществления аминокислотные остатки не встроены в положениях 24-36 нативного PYY человека (SEQ ID NO:2).
В другом варианте осуществления полипептиды аналогов PYY по изобретению могут включать инсерции одной или нескольких неприродных аминокислот и/или не-аминокислот, например миметиков аминокислот, в последовательность PYY (SEQ ID NO:2). В некоторых вариантах осуществления эти неприродные аминокислоты, встроенные в последовательность PYY (SEQ ID NO:2) могут быть миметиками β-витка или линкерными молекулами. Линкерные молекулы могут включать в себя аминокапроил (“Aca”), β-аланил и 8-амино-3,6-диоксаоктаноил. Миметики β-витка включают в себя миметик А и миметик В, иллюстрированные ниже, а также дипептиды Ala-Aib и Ala-Pro.
В другом варианте осуществления полипептиды аналогов PYY по изобретению могут включать инсерции последовательностей полиаминокислот (например, поли-his, поли-arg, поли-lys, поли-ala и т.д.) на любом конце этого полипептида, известные как «удлинения» или «хвосты».
Полипептиды аналогов PYY, содержащие инсерции аминокислот, включают в себя замены аланина в каждом положении аминокислот вдоль длины нативного PYY человека. Такие полипептиды аналогов PYY включают в себя PYY (+Axa), где х выбран из 1'-36 (SEQ ID NO:54-87).
Производные
d.
Данное изобретение относится также к производным полипептидов аналогов PYY по изобретению. Такие производные включают в себя полипептиды аналогов PYY, конъюгированные с одной или несколькими молекулами водорастворимых полимеров, таких как полиэтиленгликоль («ПЭГ») или цепи жирных кислот разной длины (например, стеарил, пальмитоил, октаноил), добавлением полиаминокислот, таких как поли-his, поли-arg, поли-lys и поли-ala, или добавлением низкомолекулярных заместителей, в том числе коротких алкилов и стесненных алкилов (например, разветвленных, циклических, конденсированных, адамантила) и ароматических групп. В некоторых вариантах осуществления эти молекулы водорастворимых полимеров будут иметь молекулярную массу в диапазоне приблизительно 500 - приблизительно 20000 Дальтон.
Такие конъюгации с полимерами могут встречаться только на N- или С-конце или в боковых цепях аминокислотных остатков в последовательности полипептидов аналогов PYY. Альтернативно, могут быть множественные сайты дериватизации вдоль полипептида аналога PYY. Замена одной или нескольких аминокислот лизином, аспарагиновой кислотой, глутаминовой кислотой или цистеином может обеспечивать дополнительные сайты дериватизации. См., например, Патенты США с номерами 5824784 и 5824778. В некоторых вариантах осуществления полипептиды аналогов PYY могут быть конъюгированы с одной, двумя или тремя молекулами полимера.
В некоторых вариантах осуществления молекулы водорастворимых полимеров связаны с амино, карбоксильной или тиоловой группой и могут быть связаны N-концом или С-концом или в боковых цепях лизина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты или цистеина. Альтернативно, молекулы водорастворимых полимеров могут быть связаны с диаминовыми и дикарбоксильными группами. В некоторых вариантах осуществления полипептиды аналогов PYY по изобретению конъюгированы с одной, двумя или тремя молекулами ПЭГ через ε-аминогруппу на аминокислоте лизин.
2
Производные полипептидов аналогов PYY по изобретению включают в себя также полипептиды аналогов PYY с химическими изменениями одного или нескольких аминокислотных остатков. Такие химические изменения включают в себя амидирование, гликозилирование, ацилирование, сульфатирование, фосфорилирование, ацетилирование и циклизацию. Эти химические изменения могут встречаться только на N- или С-конце или в боковых цепях аминокислотных остатков в последовательности полипептидов аналогов PYY. В одном варианте осуществления С-конец этих пептидов может иметь свободную группу -ОН или -NH. В другом варианте осуществления N-концевой конец может быть кэппирован изобутилоксикарбонильной группой, изопропилоксикарбонильной группой, н-бутилоксикарбонильной группой, этоксикарбонильной группой, изокапроильной группой (“isocap”), октанильной группой, октилглициновой группой (обозначаемой “G(Oct)” или “оctylGly”), группой 8-аминооктановой кислоты, дансилом и/или Fmoc-группой. В некоторых вариантах осуществления циклизация может быть выполнена посредством образования дисульфидных мостиков, см., например, SEQ ID NO:171. Альтернативно, могут быть множественные сайты химического изменения вдоль полипептида аналога PYY.
В некоторых вариантах осуществления производные полипептидов аналогов PYY могут включать в себя полипептиды аналогов PYY с химическими изменениями одного или нескольких аминокислотных остатков. Эти химические изменения могут встречаться только на N- или С-конце или в боковых цепях аминокислотных остатков в последовательности полипептидов аналогов PYY. В примерах вариантов осуществления полипептиды аналогов PYY химически изменены для включения группы Болтона-Хантера. Реагенты Болтона-Хантера известны в данной области (Radioimmunoanalysis and related methods. A.E. Bolton and W.M. Hunter, Chapter 26 of Handbook of Experimental Immunology, Volume I, Immunochemistry, edited by D.M. Weir, Blackwell Scientific Publications, 1986) и могут быть использованы для введения тирозинподобных групп с нейтральной связью посредством амино-концевых α-аминогрупп или ε-аминогрупп лизина. В некоторых вариантах осуществления N-конец полипептида аналога PYY модифицирован группой Болтона-Хантера. В некоторых вариантах осуществления внутренний остаток лизина модифицирован группой Болтона-Хантера. В некоторых вариантах осуществления могут быть множественные сайты модификации Болтона-Хантера вдоль полипептида аналога PYY. Реагенты Болтона-Хантера являются коммерчески доступными и могут включают в себя, но не ограничиваются ими, водорастворимый реагент Болтона-Хантера, сульфосукцинимидил-3-[4-гидрофенил]пропионат (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) и реагент-2 Болтона-Хантера, N-сукцинимидил-3-(4-гидрокси-3-иодофенил)пропионат (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan, catalog # 199-09341). Пример группы Болтона-Хантера, конъюгированной через амидную связь с полипептидом аналога PYY, иллюстрирован ниже, где пунктирная линия проходит через амидную связь:
125
125
Полипептиды аналогов PYY могут быть иодинированы (например, радиоактивно помечены I) до или после модификации Болтона-Хантера. I-Болтон-Хантер-меченый PYY или аналоги PYY могут быть также куплены из Amersham Corporation (Arlington Heights, IL). Болтон-Хантер-производные имеют аббревиатуру «БХ-модифицированные» (“BH-modified”) в Таблице 4 (SEQ ID NO:475-480).
Аналоги и производные
е.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды аналогов PYY имеют комбинации вышеописанных модификаций, т.е. делецию, инсерцию и замену.
В качестве примера, полипептиды аналогов PYY могут иметь N-концевые делеции в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами. Например, полипептиды аналогов PYY включают в себя PYY(3-36) с одной или несколькими аминокислотными заменами:
В некоторых вариантах осуществления полипептид аналога PYY включает в себя одну, две или три аминокислотные замены. Некоторые полипептиды аналога PYY содержат делеции в комбинации с инсерциями аминокислот (см., например, SEQ ID NO:89-174).
Полипептиды аналогов PYY включают в себя полипептиды Формулы (V) (SEQ ID NO:350):
где:
3
Хаа обозначает Ile, Ala, Pro, Ser, Thr или NorVal;
4
Хаа обозначает Lys, Ala, Gly, Glu, Asp, d-Ala, гомоLys или гомоArg;
6
Хаа обозначает Glu, Ala, Val, Asp, Asn или Gln;
7
Хаа обозначает Ala, Asn, His, Ser или Tyr;
9
Хаа обозначает Gly, Ala, Ser, саркозин, Pro или Aib;
10
Хаа обозначает Glu, Ala, Asp, Asn, Gln, Pro, Aib или Gly;
11
Хаа обозначает Asp, Ala, Glu, Asn, Gln, Pro, Aib или Gly;
12
Хаа обозначает Ala или d-Ala;
13
Хаа обозначает Ser, Ala, Thr или гомоSer;
14
Хаа обозначает Pro, Ala, гомоPro, гидроксиPro, Aib или Gly;
15
Хаа обозначает Glu, Ala, Asp, Asn, Gln, Pro, Aib или Gly;
16
Хаа обозначает Glu, Ala, Asp, Asn или Gln;
17
Хаа обозначает Leu, Ala, Met, Trp, Ile, Val или NorVal;
18
Хаа обозначает Asn, Asp, Ala, Glu, Gln, Ser или Thr;
19
Хаа обозначает Arg, Tyr, Lys, Ala, Gln или N(Me)Ala;
21
Хаа обозначает Tyr, Ala, Met, Phe или Leu;
22
Хаа обозначает Ala, Ser, Thr или d-Ala;
23
Хаа обозначает Ser, Ala, Asp, Thr или гомоSer;
26
Хаа обозначает His или Ala;
28
Хаа обозначает Leu или Ala;
30
Хаа обозначает Leu, Ala, NorVal или Ile;
31
Хаа обозначает Ala или Val, и
36
Хаа обозначает Tyr, N(Me)Tyr, His или Trp;
при условии, что указанный полипептид не является нативным полипептидом PPF.
Как будет понятно квалифицированному в данной области специалисту, полипептиды Формулы V могут быть в форме свободной кислоты или могут быть амидированы на С-конце.
В объем по изобретению включены также полипептиды аналогов PYY Формул II-VII, в которых указанный аминокислотный остаток химически модифицирован или дериватизован (например, посредством дериватизации жирных кислот, ПЭГилирования, амидирования, гликозилирования и т.д.). В объеме по изобретению обсуждаются также D-аминокислотные остатки указанных аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды аналогов PYY включают в себя полипептиды Формул II-VII с внутренними делециями, в частности, в зонах, не соответствующих С-концевому мотиву хвоста, как описано здесь.
Полипептиды аналогов PYY, содержащие замены неприродных аминокислот, включают в себя нативный PYY(3-36), в котором аминокислоты в положениях х и х+1 заменены миметиками β-витка, выбранными из группы, состоящей из миметика А и миметика В, где х выбран из положений 8-14 (см., например, SEQ ID NO:211-217 и 231-237).
4
4
2
19
3
13
23
2
19
19
Производные полипептидов аналогов PYY по изобретению могут включать в себя конъюгированные с полимером полипептиды аналогов PYY, в которых полипептид аналога PYY включает в себя вышеописанные инсерции, делеции, замены или их комбинации, и эта молекула полимера конъюгирована при остатке лизина. Другие производные полипептидов аналогов PYY включают в себя PYY, PYY(3-36) или PYY(4-36) со следующими заменами и изменениями: [Lys-цепь жирной кислоты]PYY(3-36); [Lys-цепь жирной кислоты]PYY(4-36); [AlaLys-цепь жирной кислоты]PYY(3-36); [Ile-цепь жирной кислоты]PYY(3-36); [Ser-OAc]PYY(3-36) (ОАс обозначает О-ацилирование жирными кислотами или ацетильными группами); [Ser-OAc]PYY(3-36); [цепь Ile-октаноил]PYY(3-36); [цепь Lys-октаноил]PYY(3-36) и [цепь Lys-стеарил]PYY(3-36) (см., например, SEQ ID NO:185-208).
Дополнительные примеры полипептидов аналогов данного изобретения обеспечены в Списке последовательностей и обсуждены в разделе Примеры ниже.
Химерные полипептиды PPF
2.
Еще в одном аспекте по изобретению полипептиды PPF по изобретению включают в себя химерные полипептиды PPF, содержащие фрагмент полипептида РР, PYY или NPY, ковалентно связанный по меньшей мере с одним дополнительным фрагментом второго полипептида РР, PYY или NPY, где каждый фрагмент РР, PYY или NPY включает в себя мотив PPF. Альтернативно, химерные полипептиды PPF по изобретению могут содержать фрагмент полипептида семейства РР, связанный с одним, двумя, тремя или четырьмя полипептидными сегментами, где по меньшей мере один из этих связанных полипептидных сегментов является фрагментом второго полипептида семейства РР. В некоторых вариантах осуществления полипептиды PPF не включают в себя N-концевой фрагмент РР с С-концевым фрагментом NPY. Химерные полипептиды PPF по изобретению будут обнаруживать по меньшей мере 50% идентичность последовательности с нативным PYY(3-36) на протяжении всей длины PYY(3-36). В некоторых вариантах осуществления такие химерные полипептиды PPF могут обнаруживать по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 80% или 90% идентичность последовательности с нативным PYY(3-36) на протяжении всей длины PYY(3-36). Такие химерные полипептиды PPF по изобретению могут также обнаруживать по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 94% или по меньшей мере 97% идентичность последовательности с нативным РР. Еще в одном варианте осуществления такие полипептиды PPF по изобретению могут обнаруживать по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 94% или по меньшей мере 97% идентичность последовательности с нативным NPY. В некоторых вариантах осуществления химерные полипептиды PPF по изобретению включают в себя по меньшей мере N-концевой мотив полипролина PPF и С-концевой мотив хвоста PPF.
Опять, эти полипептиды PPF данного изобретения будут обычно сохранять, по меньшей мере частично, биологическую активность нативного РР, PYY или NPY человека. В некоторых вариантах осуществления химерные полипептиды PPF данного изобретения будут обнаруживать биологическую активность в лечении и предупреждении метаболических состояний и нарушений.
Фрагменты полипептидов могут быть ковалентно связаны вместе любым известным в данной области образом, в том числе, но не только, прямыми амидными связями или химическими линкерными группами. Химические линкерные группы могут включать в себя пептидные миметики, которые индуцируют или стабилизируют конформацию полипептидов. Химерные полипептиды по изобретению включают в себя химеры PYY-РР, PYY-NPY, РР-PYY, РР-NPY, NPY-РР или NPY-PYY.
Химерные полипептиды по изобретению могут иметь длину по меньшей мере 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 и 34 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления полипептиды аналогов PYY по изобретению включают в себя только природные L-аминокислотные остатки и/или модифицированные природные L-аминокислотные остатки. В некоторых вариантах осуществления полипептиды аналогов PYY по изобретению не включают в себя неприродные аминокислотные остатки.
В некоторых вариантах осуществления химерные полипептиды по изобретению не включают в себя:
В некоторых вариантах осуществления химерные полипептиды PPF по изобретению могут содержать фрагменты полипептидов аналогов семейства РР. Например, химерные полипептиды PPF могут содержать полипептиды аналогов PPF, описанные здесь, а также полипептиды аналогов РР и полипептиды аналогов NPY.
Полипептиды аналогов PYY являются полипептидами, имеющими активность в одном из описанных здесь анализов (включающих в себя анализы потребления пищи, опорожнения желудка, секреции поджелудочной железы, состава тела или уменьшения массы), которая является равной активности NPY, PYY или PYY(3-36) или более высокой, чем активность NPY, PYY или PYY(3-36), в одном и том же анализе. В некоторых вариантах осуществления полипептиды аналогов PYY по изобретению могут обнаруживать улучшенную легкость получения, стабильность и/или легкость приготовления композиции в сравнении с РР, NPY, PYY или PYY(3-36).
В некоторых вариантах осуществления химерные полипептиды PPF по изобретению сохраняют по меньшей мере приблизительно 25% или приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 98% или приблизительно 99% биологической активности нативного PYY человека в отношении уменьшения доступности нутриентов, уменьшения потребления пищи, влияния на прирост массы тела и/или лечения и предупреждения метаболических состояний и нарушений. В другом варианте осуществления химерные полипептиды PPF по изобретению обнаруживают улучшенную агонистическую в отношении PYY активность. В некоторых вариантах осуществления химерные полипептиды PPF по изобретению обнаруживают по меньшей мере приблизительно 110%, приблизительно 125%, приблизительно 130%, приблизительно 140%, приблизительно 150%, приблизительно 200% или более биологической активности нативного PYY человека в отношении уменьшения доступности нутриентов, уменьшения потребления пищи, влияния на прирост массы тела и/или лечения и предупреждения метаболических состояний и нарушений.
Более конкретно, в одном аспекте химерные полипептиды PPF содержат фрагмент РР, связанный с фрагментом PYY. В одном варианте осуществления химерные полипептиды PPF по изобретению содержат N-концевой фрагмент РР или полипептида аналога РР, связанный на его С-концевой стороне с С-концевым фрагментом PYY или полипептида аналога PYY. В другом варианте осуществления химерные полипептиды PPF по изобретению содержат N-концевой фрагмент PYY, PYY(3-36) или полипептида аналога PYY, связанный на его С-концевой стороне с С-концевым фрагментом РР или полипептида аналога РР.
В некоторых вариантах осуществления химерные полипептиды PPF содержат фрагмент PYY, связанный с фрагментом NPY. В одном варианте осуществления химерные полипептиды PPF по изобретению содержат N-концевой фрагмент PYY, PYY(3-36) или полипептида аналога PYY, связанный на его С-концевой стороне с С-концевым фрагментом NPY или полипептида аналога NPY. В другом варианте осуществления химерные полипептиды PPF по изобретению содержат N-концевой фрагмент NPY или полипептида аналога NPY, связанный на его С-концевой стороне с С-концевым фрагментом PYY или полипептида аналога PYY.
В некоторых вариантах осуществления химерные полипептиды PPF содержат фрагмент PР, связанный с фрагментом NPY. В одном варианте осуществления химерные полипептиды PPF по изобретению содержат N-концевой фрагмент РР или полипептида аналога РР, связанный на его С-концевой стороне с С-концевым фрагментом NPY или полипептида аналога NPY. В другом варианте осуществления химерные полипептиды PPF по изобретению содержат N-концевой фрагмент NPY или полипептида аналога NPY, связанный на его С-концевой стороне с С-концевым фрагментом PР или полипептида аналога PР.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент РР, полипептида аналога РР, PYY, PYY(3-36), полипептида аналога PYY, NPY или полипептида аналога NPY является фрагментом, содержащим в каждом случае 4-20 аминокислотных остатков РР, полипептида аналога РР, полипептида аналога РР, PYY, PYY(3-36), полипептида аналога PYY, NPY или полипептида аналога NPY. В некоторых вариантах осуществления длина фрагмента выбрана таким образом, чтобы получить конечный химерный полипептид PPF с длиной по меньшей мере 34 аминокислот.
Химерные полипептиды PPF данного изобретения могут также содержать дополнительные модификации, в том числе, но не только, замену, делецию и инсерцию относительно аминокислотной последовательности таких химерных полипептидов PPF и любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления химерные полипептиды PPF по изобретению включают в себя одну или несколько модификаций «заменимого» аминокислотного остатка. В контексте по изобретению «заменимым» аминокислотным остатком является остаток, который может быть изменен, т.е. быть делетирован или заменен, в нативной аминокислотной последовательности этого фрагмента человека, например фрагмента полипептида семейства РР, без уничтожения или существенного уменьшения агонистической в отношении PYY активности этого химерного полипептида PPF.
Данное изобретение относится также к производным химерных полипептидов PPF. Такие производные включают в себя химерные полипептиды PPF, конъюгированные с молекулами водорастворимых полимеров, такими как полиэтиленгликоль («ПЭГ») или цепи жирных кислот разной длины (например, стеарил, пальмитоил, октаноил, олеоил и т.д.), или добавлением полиаминокислот, таких как поли-his, поли-arg, поли-lys и поли-ala. Модификации химерных полипептидов PPF могут также включать в себя низкомолекулярные заместители, такие как короткие алкилы и стесненные алкилы (например, разветвленные, циклические, конденсированные, адамантил), и ароматические группы. В некоторых вариантах осуществления эти молекулы водорастворимых полимеров будут иметь молекулярную массу в диапазоне приблизительно 500 - приблизительно 20000 Дальтон.
Такие конъюгации с полимерами могут встречаться только на N- или С-конце или в боковых цепях аминокислотных остатков в последовательности химерных полипептидов PPF. Альтернативно, могут быть множественные сайты дериватизации вдоль химерного полипептида PPF. Замена одной или нескольких аминокислот лизином, аспарагиновой кислотой, глутаминовой кислотой или цистеином может обеспечивать дополнительные сайты дериватизации. См., например, Патенты США с номерами 5824784 и 5824778. В некоторых вариантах осуществления химерные полипептиды PPF могут быть конъюгированы с одной, двумя или тремя молекулами полимера.
В некоторых вариантах осуществления молекулы водорастворимых полимеров связаны с амино, карбоксильной или тиоловой группой и могут быть связаны N-концом или С-концом или в боковых цепях лизина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты или цистеина. Альтернативно, молекулы водорастворимых полимеров могут быть связаны с диаминогруппами и дикарбоксильными группами. В некоторых вариантах осуществления химерные полипептиды PPF по изобретению конъюгированы с одной, двумя или тремя молекулами ПЭГ через ε-аминогруппу на аминокислоте лизин.
2
Производные химерных полипептидов PPF по изобретению включают в себя также полипептиды аналогов PYY с химическими изменениями одного или нескольких аминокислотных остатков. Такие химические изменения включают в себя амидирование, гликозилирование, ацилирование, сульфатирование, фосфорилирование, ацетилирование и циклизацию. Эти химические изменения могут встречаться только на N- или С-конце или в боковых цепях аминокислотных остатков в последовательности химерных полипептидов PPF. В одном варианте осуществления С-конец этих пептидов может иметь свободную группу -ОН или -NH. В другом варианте осуществления N-концевая сторона может быть кэппирована изобутилоксикарбонильной группой, изопропилоксикарбонильной группой, н-бутилоксикарбонильной группой, этоксикарбонильной группой, изокапроильной группой («isocap»), октанильной группой, октилглициновой группой (G(Oct)) или группой 8-аминооктановой кислоты. В некоторых вариантах осуществления циклизация может выполнена посредством образования дисульфидных мостиков. Альтернативно, могут быть множественные сайты химического изменения вдоль химерного полипептида PPF.
В некоторых вариантах осуществления химерные полипептиды PPF включают в себя полипептиды, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:238-347.
Примеры химерных полипептидов PPF данного изобретения обеспечены в Списке последовательностей и дополнительно обсуждены в разделе Примеры ниже.
Другие полипептиды PPF включают в себя полипептиды Формулы (VI) (SEQ ID NO:481):
где:
1
Хаа обозначает Tyr или отсутствует;
2
Хаа обозначает Ile, Pro или отсутствует;
3
Хаа обозначает Ile, БХ-модифицированный Lys, Lys, Val или Pro;
4
Хаа обозначает Lys, БХ-модифицированный Lys, Lys, Ala, Ser или Arg;
7
Хаа обозначает Ala, Gly или His;
9
Хаа обозначает Gly или Ala;
12
Хаа обозначает Ala или Pro;
13
Хаа обозначает Ser или Pro;
14
Хаа обозначает Pro, Ala или Ser;
16
Хаа обозначает Glu или Asn;
17
Хаа обозначает Leu или Ile;
18
Хаа обозначает Asn или Ala;
19
Хаа обозначает Arg, Lys, БХ-модифицированный Lys, Gln или N(Me)Ala;
21
Хаа обозначает Tyr, Ala, Phe, Lys или БХ-модифицированный Lys;
22
Хаа обозначает Ala или Ser;
23
Хаа обозначает Ser, Ala или Asp;
25
Хаа обозначает Arg, Lys или БХ-модифицированный Lys;
26
Хаа обозначает His, Ala или Arg;
28
Хаа обозначает Leu или Ile;
30
Хаа обозначает Leu или Met;
31
Хаа обозначает Val, Ile или Leu;
35
Хаа обозначает Lys, БХ-модифицированный Lys или Arg;
36
Хаа обозначает Tyr, Trp или Phe;
при условии, что указанный полипептид не является нативным полипептидом PPF,
Как будет понятно квалифицированному в данной области специалисту, полипептиды Формулы VI могут быть в форме свободной кислоты или могут быть амидированы на С-конце.
В некоторых вариантах осуществления полипептид PPF может содержать N-концевой фрагмент, состоящий по существу из первых 17 аминокислотных остатков нативного PYY человека (SEQ ID NO:2), связанный с С-концевым фрагментом, состоящим по существу из аминокислотных остатков 18-36 нативного NPY человека (SEQ ID NO:4), где один или несколько аминокислотных остатков на N-конце этого фрагмента PYY могут быть делетированы или отсутствовать и где один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять аминокислотных замен могут быть выполнены в каждом из фрагментов PYY и NPY. В некоторых вариантах осуществления N-концевой фрагмент, состоящий по существу из первых 17 аминокислот полипептида PPF, может обнаруживать по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 94% или по меньшей мере 97% идентичность последовательности с первыми 17 аминокислотами нативного PYY. В некоторых вариантах осуществления С-концевой фрагмент полипептида PPF, состоящий по существу из аминокислотных остатков 18-36, может обнаруживать по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 94% или по меньшей мере 97% идентичность последовательности с аминокислотами 18-36 нативного NPY. В некоторых вариантах осуществления аминокислоты в N-концевом фрагменте PYY (например, пролины в положении 5 и 8, глутаматы в положениях 6, 10 и 15 или аспартат в положении 11) и/или аминокислоты в С-концевом фрагменте NPY (например, тирозины в положениях 20 и 27, лейцин в положении 24, аспарагин в положении 29, треонин в положении 32, аргинин в положении 33 или глутамин в положении 34) не являются замененными. В некоторых вариантах осуществления эти полипептиды PPF включают в себя полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность SEQ ID NO:266, 267, 274, 282, 320 и 436-480. В некоторых вариантах осуществления полипептиды PPF дополнительно содержат N-концевой кэп. Примеры этих полипептидов PPF включают в себя SEQ ID NO:282, 320, 437, 441, 444, 445-447, 452, 454-459, 461-464, 466, 468-470 и 472-480.
Другие полипептиды PPF включают в себя полипептиды Формулы (VII) (SEQ ID NO:482):
где:
1
Хаа обозначает Tyr или отсутствует;
2
Хаа обозначает Ile, Pro или отсутствует;
4
Хаа обозначает Lys, БХ-модифицированный Lys, Ala, Ser или Arg;
6
Хаа обозначает Glu, Gln, Ala, Asn, Asp или Val;
9
Хаа обозначает Gly или Ala;
10
Хаа обозначает Glu, Ala, Asp, Asn, Gln, Gly, Pro или Aib;
11
Хаа обозначает Glu, Ala, Asp, Asn, Gln, Gly, Pro или Aib;
12
Хаа обозначает Ala или Pro;
13
Хаа обозначает Ser или Pro;
14
Хаа обозначает Pro, Ala или Ser;
15
Хаа обозначает Glu, Ala, Asp, Asn, Gln, Gly, Pro или Aib;
16
Хаа обозначает Glu или Asp;
17
Хаа обозначает Leu или Ile;
19
Хаа обозначает Arg, Lys, БХ-модифицированный Lys, Gln или N(Me)Ala;
21
Хаа обозначает Tyr, Ala, Phe, Lys или БХ-модифицированный Lys;
22
Хаа обозначает Ala или Ser;
23
Хаа обозначает Ser, Ala или Asp;
25
Хаа обозначает Arg, Lys или БХ-модифицированный Lys;
26
Хаа обозначает His, Ala или Arg;
27
Хаа обозначает Tyr или Phe;
28
Хаа обозначает Leu или Ile;
29
Хаа обозначает Asn или Gln;
30
Хаа обозначает Leu или Met;
31
Хаа обозначает Val, Ile или Leu.
Как будет понятно квалифицированному в данной области специалисту, полипептиды Формулы VII могут быть в форме свободной кислоты или могут быть амидированы на С-конце.
В некоторых вариантах осуществления полипептид PPF может содержать N-концевой фрагмент, состоящий по существу из первых 17 аминокислотных остатков нативного PYY человека (SEQ ID NO:2), связанный с С-концевым фрагментом, состоящим по существу из аминокислотных остатков 18-36 нативного NPY человека (SEQ ID NO:4), где один или несколько аминокислотных остатков на N-конце этого фрагмента PYY могут быть делетированы или отсутствовать и где один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять аминокислотных замен могут быть выполнены в каждом из фрагментов PYY и NPY. В некоторых вариантах осуществления N-концевой фрагмент, состоящий по существу из первых 17 аминокислот полипептида PPF, может обнаруживать по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 94% или по меньшей мере 97% идентичность последовательности с первыми 17 аминокислотами нативного PYY. В некоторых вариантах осуществления С-концевой фрагмент полипептида PPF, состоящий по существу из аминокислотных остатков 18-36, может обнаруживать по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 94% или по меньшей мере 97% идентичность последовательности с аминокислотами 18-36 нативного NPY. В некоторых вариантах осуществления аминокислоты в N-концевом фрагменте PYY (например, пролины в положениях 3, 5 и 8 или гистидин в положении 7) и/или аминокислоты в С-концевом фрагменте NPY (например, аланин в положении 18, тирозины в положениях 20 и 36, лейцин в положении 24, треонин в положении 32, аргинин в положении 33, глутамин в положении 34 или аргинин в положении 35) не являются замененными. В некоторых вариантах осуществления эти полипептиды PPF включают в себя полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность SEQ ID NO:266, 437, 438, 439, 442, 462, 469, 470, 471 и 472. В некоторых вариантах осуществления эти полипептиды PPF дополнительно содержат N-концевой кэп. Примеры этих полипептидов PPF включают в себя SEQ ID NO:437, 462, 469, 470 и 472.
Примеры полипептидов PPF данного изобретения обеспечены в Списке последовательностей и дополнительно обсуждены в разделе Примеры ниже.
В. Применение полипептидов PPF в лечении или предупреждении метаболических состояний или нарушений
Обычно признавалось, что эндогенные NPY (обзор в Schwarz et al., Nature 404: 661-71 (2000)) и PYY (Morley et al., Brain Res. 341:200-3 (1985)) через их рецепторы увеличивают пищевое поведение. Способы, направленные на терапии для лечения ожирения, неизменно пытались использовать антагонизм в отношении Y-рецепторов, тогда как заявления в отношении лечения анорексии были направлены на поиски агонистов этого семейства лигандов. Однако, как описано и заявлено в совместной с авторами ожидающей рассмотрения Заявке на патент США № 2002/0141985, неожиданно было обнаружено, что периферическое введение полипептидов аналогов PYY имеет сильное действие в отношении уменьшения доступности нутриентов (см. также Batterham et al., Nature 418: 650-4, 2002); WO 02/026591 и WO 03/057235), а не в отношении увеличения доступности нутриентов, как это предполагалось сообщениями в патентной и научной литературе (см., например, Патенты США № 5912227 и 6315203, которые описывают применение агонистов рецептора PYY для увеличения прироста массы). Спектр действий ингибирования потребления пищи, замедления опорожнения желудка, ингибирования секреции кислоты желудочного сока и ингибирования секреции панкреатических ферментов применим для проявления клинической пользы в метаболических заболеваниях, таких как сахарный диабет типа 1, типа 2 или гестационный сахарный диабет, ожирение и другие проявления синдрома инсулинорезистентности (Синдрома Х), и в любом другом применении для уменьшения доступности нутриентов.
Таким образом, в другом аспекте по изобретению обеспечены способы лечения или предупреждения ожирения, причем этот способ предусматривает введение терапевтически или профилактически эффективного количества полипептида PPF субъекту, нуждающемуся в этом. В некоторых вариантах осуществления этот субъект является субъектом, страдающим от ожирения или имеющим избыточную массу тела. Хотя «ожирение» обычно определяется как индекс массы тела, превышающий 30, для целей этого описания, любой субъект, в том числе субъекты с индексом массы тела, меньшим чем 30, который нуждается в уменьшении массы тела или желает уменьшить массу тела, включен в понятие «страдающий ожирением». Субъекты, которые являются инсулинорезистентными, не толерантными к глюкозе или имеют любую форму сахарного диабета (например, типа 1, 2 или гестационного диабета), могут получать пользу от этого способа.
В других аспектах по изобретению обеспечены способы уменьшения потребления пищи, уменьшения доступности питательных веществ (нутриентов), вызывания потери массы, влияния на состав тела, изменения содержания энергии тела или увеличения расхода (потребления энергии), лечения сахарного диабета и улучшения липидного профиля (в том числе уменьшения уровней LDL-холестерина и/или триглицеридов и/или изменения уровней HDL-холестерина), причем эти способы предусматривают введение субъекту эффективного количества полипептида PPF по изобретению. В некоторых вариантах осуществления эти способы данного изобретения используют для лечения или предупреждения состояний или нарушений, которые могут быть облегчены уменьшением доступности нутриентов в субъекте, нуждающемся в этом, предусматривающие введение указанному субъекту терапевтически или профилактически эффективного количества полипептида PPF по изобретению. Такие состояния и нарушения включают в себя, но не ограничиваются ими, гипертензию, дислипидемию, сердечно-сосудистое заболевание, нарушения питания, инсулинорезистентность, ожирение и сахарный диабет любого типа.
Без намерения ограничения теорией авторы изобретения считают, что действия периферически вводимых полипептидов PPF данного изобретения в уменьшении потребления пищи, в задержке опорожнения желудка, в уменьшении доступности нутриентов и в вызывании потери массы определяются взаимодействиями с одним или несколькими уникальными классами рецепторов в рецепторах в семействе РР или сходных с ними. Более конкретно, авторы считают, что участвуют рецептор или рецепторы, сходные с предпочитающими PYY рецепторами (или Y7-рецепторами).
Дополнительные анализы, применимые по изобретению, включают в себя анализы, которые могут определять действие соединений PPF на состав тела. Примером анализа может быть анализ, который включает в себя использование мышиной модели индуцированного диетой (режимом питания) ожирения (DIO) для метаболического заболевания. Перед периодом лечения самцов мышей С57ВL/6J можно кормить кормом с высоким содержанием жира (№D12331, 58% калорий из жира; Research Diets, Inc.) в течение 6 недель, начиная с 4-недельного возраста. Во время этого исследования мыши могут продолжать есть их корм с высоким содержанием жира. Вода может предоставляться аd libitum на протяжении всего исследования. Одна группа не имеющих ожирения мышей может получать диету с низким содержанием жира (#D12329, 11% калорий из жира) для целей сравнения метаболических параметров с группами DIO.
Мышам DIO могут быть имплантированы подкожные (SC) внутрилопаточные осмотические насосы для доставки либо носителя (50% диметилсульфоксида [ДМСО] в воде) n=20, либо соединения по изобретению n=12. Насосы последней группы могут быть установлены на доставку любого количества, например 1000 мкг/кг/день, соединения по изобретению в течение 7 дней.
2
2
Массы тела и потребление корма могут измеряться на протяжении регулярных интервалов на протяжении периодов исследования. Дыхательный коэффициент (RQ, определяемый как продуцирование СО ÷ потребление О) и метаболическая скорость могут быть определены с использованием непрямой калориметрии целого животного (Oximax, Columbus Instruments, Columbus, OH). Мыши могут быть эвтанизированы избыточной дозой изофлурана и может быть измерен показатель ожирения (тучности) (масса эпидидимального скопления жировой ткани). Кроме того, перед определением эпидидимальной массы состав тела (нежирная масса, масса жира) для каждой мыши может быть анализирован с использованием установки абсорбциометрии с использованием рентгеновского излучения с двойной энергией (DEXA) в соответствии с инструкциями изготовителя (Lunar Piximus, GE Imaging System). В некоторых вариантах осуществления полипептидами PPF по изобретению являются полипептиды, имеющие активность в одном из описанных здесь анализов (в том числе в анализах потребления пищи, опорожнения желудка, секреции поджелудочной железы, уменьшения массы или состава тела), которая является более высокой, чем активность РР, PYY или PYY(3-36) в том же самом анализе.
Кроме ослабления гипертензии в субъектах, нуждающихся в этом, в результате уменьшенного потребления пищи, потери массы или лечения ожирения, соединения по изобретению могут быть использованы для лечения гипотензии, как описано в Примере 4.
125
Соединения по изобретению могут быть также полезными для потенцирования, индукции, усиления или восстановления чувствительности к глюкозе в панкреатических островках или клетках. Эти действия могут быть полезными для лечения или предупреждения состояний, ассоциированных с метаболическими нарушениями, такими как описанные выше и в Заявке на патент США № 20040228846. Анализы для определения такой активности известны в данной области. Например, в опубликованной Заявке на патент США № 20040228846 (включенной в качестве ссылки в ее полном объеме) описаны анализы для выделения и культивирования панкреатических островков, а также определения созревания фетальных островков. В примерах Заявки на патент США № 20040228846 полученные из кишечника пептиды гормонов, в том числе панкреатический полипептид (РР), нейропептид Y (NPY), нейропептид К (NPK), PYY, секретин, глюкагонподобный пептид-1 (GLP-1) и бомбезин, покупали из Sigma. Коллагеназу типа XI получали из Sigma. Культуральную среду и фетальную телячью сыворотку получали из Gibco. Набор для радиоиммуноанализа, содержащий анти-инсулин-антитело (набор [I]-RIA) получали из Linco, St. Louis).
о
о
о
125
Постнатальные панкреатические островки крыс получали из крыс Р-02 в возрасте года. Панкреатические островки взрослых крыс получали из 6-8-недельных крыс. Фетальные панкреатические островки крыс получали следующим образом. Беременных самок крыс умерщвляли в день беременности е21. Плоды извлекали из матки. 10-14 поджелудочных желез иссекали из каждого помета и промывали дважды в буфере Хенкса. Эти поджелудочные железы объединяли, суспендировали в 6 мл 1 мг/мл коллагеназы (Type XI, Sigma) и инкубировали при 37С в течение 8-10 минут с постоянным встряхиванием. Расщепление останавливали добавлением 10 объемов охлажденного на льду буфера Хенкса с последующими тремя промывками буфером Хенкса. Затем эти островки очищали при помощи градиента Фиколла и культивировали в среде 10% фетальная телячья сыворотка (ФТС)/среда RPMI с добавлением или без добавления 1 мкМ IBMX. В конце пяти дней 20 островков помещали вручную в каждую пробирку и анализировали на стационарное высвобождение инсулина. Обычно панкреатические островки сначала промывали буфером KRP и затем инкубировали с 1 мл буфера KRP, содержащего 3 мМ (низкую) глюкозу, в течение 30 минут при 37С с постоянным встряхиванием. После сбора супернатанта панкреатические островки затем инкубировали с 17 мМ (высокой) глюкозой в течение одного часа при 37С. Инсулин, высвобождаемый из стимуляции низкой или высокой глюкозой, анализировали при помощи радиоиммуноанализа (RIA) с использованием набора [I]-RIA. Е21-фетальные панкреатические островки культивировали в течение 5 дней в присутствии 200 нг/мл PYY, РР, ССК, NPK, NPY, секретина, GLP-1 или бомбезина.
Представлен также пример анализа in vivo с использованием имеющих сахарный диабет жирных (ZDF) самцов крыс, инбредной (>F30 генераций) крысиной модели, которая спонтанно проявляет диабет во всех самцах fa/fa, вскармливаемых стандартным крысиным кормовым рационом Purina 5008. В самцах ZDF fa-fa гипергликемия начинает развиваться при возрасте приблизительно семи недель, а уровни глюкозы (поддерживаемые) обычно достигают 500 мг/дл при возрасте 10-11 недель. Уровни инсулина (поддерживаемые) являются высокими во время развития диабета. Однако при возрасте 19 недель инсулин снижается приблизительно до уровня нежирных контрольных однопометных крыс. Уровни триглицеридов и холестерина в плазме жирных крыс являются обычно более высокими, чем эти уровни в нежирных крысах. В этом анализе три группы 7-недельных крыс ZDF с 6 крысами на группу получали инфузионное лечение при помощи насоса ALZA в течение 14 дней: 1) контроль-носитель, 2) и 3) PYY с двумя разными дозами, 100 пмоль/кг/ч и 500 пмоль/кг/ч соответственно. Выполняли четыре измерения до инфузии и после инфузии в день 7 и день 14: 1) уровень глюкозы в плазме, 2) уровень инсулина в плазме и 3) уровень триглицеридов в плазме (TG), а также тест на толерантность к глюкозе (OGTT). Таким образом, эти анализы могут быть использованы с соединениями по изобретению для тестирования на желаемую активность.
Другие применения, обсуждаемые для полипептидов PPF, включают в себя способы уменьшения концентрации алюминия (Al) в центральной нервной системе (см. Патент США 6734166, включенный в качестве ссылки в его полном объеме) для лечения, предупреждения или задержки появления болезни Альцгеймера. Анализы для определения действий на Al известны в данной области и могут быть найдены в Патенте США 6734166, причем они используют диплоидных и Ts-мышей. Этих мышей содержали по отдельности в клетках для исследования метаболизма Nalgen brand или полипропиленовых клетках и давали им три дня для привыкания к этим клеткам перед экспериментированием. Мыши имели свободный доступ к корму (LabDiet NIH Rat and Mouse/Auto 6F5K52, St. Louis, MO) и воде во время эксперимента за исключением 16 часов перед эвтаназией, когда корм не предоставляли. Мыши получали ежедневно подкожные инъекции либо активного соединения, либо солевого раствора. Мышей умерщвляли в конце дня 13 для одного эксперимента и дня 3 для второго и брали пробы. Пробы головного мозга мышей взвешивали в прозрачных тефлоновых вкладышах и готовили для анализа микроволновым расщеплением в азотной кислоте с низким содержанием микроэлементов. Затем пробу анализировали на содержание Al с использованием масс-спектрометрии (Inductive Coupled Plasma Mass Spectrometry. Nuttall et al., Annals of Clinical and Laboratory Science 25, 3, 264-271 (1995)). Вся обработка ткани во время анализа имела место в чистом помещении с использованием систем фильтрации воздуха HEPA для минимизации фонового загрязнения.
Соединения по изобретению проявляют широкий диапазон биологических активностей, причем некоторые из них относятся к их противосекреторным свойствам и свойствам, ингибирующим двигательную функцию. Эти соединения могут подавлять желудочно-кишечные секреции прямым взаимодействием с эпителиальными клетками или, возможно, ингибированием секреции гормонов или нейротрансмиттеров, которые стимулируют кишечную секрецию. Противосекреторные свойства включают в себя ингибирование желудочной секреции и/или секреции поджелудочной железы и могут быть применимы при лечении или предупреждении заболеваний и нарушений, в том числе гастрита, панкреатита, пищеводного синдрома Берретта и заболевания, называемого гастроэзофагеальным рефлюксом.
th
Соединения по изобретению применимы при лечении большого числа желудочно-кишечных нарушений (см., например, Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill Inco, New York, 12 Ed.), которые ассоциированы с избыточными кишечными электролитами и секрецией воды, а также уменьшенной абсорбцией, например, инфекционной диареи, воспалительной диареи, синдрома укороченной тонкой кишки или диареи, которая обычно имеет место после хирургических процедур, например илеостомии. Примеры инфекционной диареи включают в себя, без ограничения, острую вирусную диарею, острую бактериальную диарею (например, вызванную сальмонеллой, кампилобактером и клостридиумом или протозойными инфекциями) или диарею путешествующих (например, вызываемую вирусом Норфолка или ротавирусом). Примеры воспалительной диареи включают в себя, без ограничения, синдром мальабсорбции, тропическую спру, хронический панкреатит, болезнь Крона, диарею и синдром раздраженного кишечника. Было также обнаружено, что пептиды по изобретению могут быть использованы для лечения или предупреждения непредвиденной или угрожающей жизни ситуации, в том числе желудочно-кишечного нарушения, например, после хирургии или вследствие холеры.
Соединения по изобретению могут быть также применимы для лечения или предупреждения кишечного повреждения в противоположность лечению только симптомов, ассоциированных с этим кишечным повреждением (например, диареей). Таким повреждением кишечника может быть язвенный колит, воспалительное заболевание пищеварительного тракта, атрофия кишечника, утрата слизистой оболочки кишечника и/или функции слизистой оболочки кишечника или их следствие (см. WO 03/105763, включенный здесь в качестве ссылки в его полном объеме). Простая и воспроизводимая крысиная модель хронического воспаления толстой кишки была ранее описана Morris GP, et al. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology, 1989; 96:795-803. Она обнаруживает относительно большую продолжительность воспаления и образования язв, делая возможным исследование патофизиологии воспалительного заболевания толстой кишки конкретно контролируемым образом и оценку новых способов лечения, потенциально применимых для воспалительного заболевания кишечника у людей.
о
Анализы для такой активности, описанные в WO 03/105763, включают в себя 11-недельных самцов крыс HSD с диапазоном массы 250-300 граммов, содержащихся при цикле свет:темнота 12:12, которым предоставляли свободный доступ к стандартному корму для грызунов (Teklad LM 485, Madison, WI) и воде. Животные голодали в течение 24 часов перед экспериментом. Крыс анестезировали 3% изофлораном и помещали на подушку с регулируемым нагреванием, установленным при 37С. Иглу для зондового питания вставляли ректально в ободочную кишку на 7 см. Гаптен тринитробензолсульфоновую кислоту (TNBS), растворенную в 50% этаноле (об./об.), доставляли в просвет ободочной кишки через иглу для зондового питания при дозе 30 мг/кг, в общем объеме 0,4-0,6 мл, как описано в Mazelin, et al. Protective role of vagal afferents in experimentally-induced colitis in rats. Juton Nerv Syst. 1998; 73:38-45. Контрольные группы получали солевой раствор (0,9% NaCl) внутрь ободочной кишки.
Спустя четыре дня после индукции колита ободочную кишку иссекали из анестезированных крыс, которых затем эвтанизировали декапитацией. Массы вырезанных ободочной кишки и селезенки измеряли и ободочные кишки фотографировали для оценки макроскопического морфологического повреждения. Воспаление определяли в виде зон гиперемии и утолщения стенок кишечника.
о
о
2
Соединения по изобретению могут быть также использованы для лечения или предотвращения опухолей поджелудочной железы (например, ингибирования пролиферации опухолей поджелудочной железы). Типы доброкачественных опухолевых клеток поджелудочной железы, которые могут лечиться в соответствии с данным изобретением, включают в себя серозные цистаденомы (кистозные аденомы), микрокистозные опухоли и солидные кистозные опухоли. Этот способ эффективен в уменьшении пролиферации злокачественных опухолевых клеток поджелудочной железы, таких как карциномы, возникающие из протоков, ацинусов или островков поджелудочной железы. Патент США 5574010 (включенный здесь в качестве ссылки в полном объеме) обеспечивает примеры анализов для тестирования антипролиферативных свойств. Например, этот Патент США 5574010 показывает, что PANC-1 и MiaPaCa-2 являются двумя клеточными линиями раковых клеток аденокарциномы поджелудочной железы человека, которые коммерчески доступны от таких поставщиков, как American Type Culture Collection, ATCC (Rockville, Md.). Эти две линии опухолевых клеток выращивали в культуральной среде RPMI 1640, дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой, 29,2 мг/л глутамина, 25 мкг гентамицина, 5 мл раствора пенициллина, стрептомицина и фунгизона (JRH Biosciences, Lenexa, Kans.) при 37С в имеющем водяную рубашку инкубаторе с 5% СО NAPCO. Все клеточные линии отделяли 0,25% трипсином (Clinetics, San Diego, Calif.) один раз - два раза в неделю при достижении конфлюэнтного монослоя опухолевых клеток. Клетки осаждали в течение 7 минут при 500 g в охлаждающей центрифуге при 4С и ресуспендировали в не содержащей трипсина обогащенной культуральной среде RPMI 1640. Жизнеспособные клетки считали на предметном стекле гемоцитометра с красителем трипановым синим.
10000, 20000, 40000 и 80000 клеток каждого типа добавляли в 96-луночные микрокультуральные планшеты (Costar, Cambridge, Mass.) в общем объеме 200 мкл культуральной среды на лунку. Клеткам давали прикрепляться в течение 24 часов перед добавлением PYY или тест-пептида. Среду заменяли свежей средой перед добавлением пептидов. Инкубацию in vitro опухолевых клеток поджелудочной железы с PYY или тест-соединением продолжали в течение 6 часов и 36 часов. PYY добавляли к клеткам в дозах 250 пмоль, 25 пмоль и 2,5 пмоль на лунку (N=14). Тест-соединение добавляли к клеточным культурам в дозах 400 пмоль, 40 пмоль и 4 пмоль на лунку. Контрольные лунки получали 2 мкл 0,9% солевого раствора для имитации объема и физического воздействия на прикрепленные опухолевые клетки. Каждый 96-луночный планшет содержал 18 контрольных лунок для возможности сравнения в каждом планшете во время проведения эксперимента. 96-луночные планшеты повторяли 6 раз с варьирующимися концентрациями PYY и тест-соединения как в случае клеток PANC-1, так и в случае клеток MiaPaCa-2.
о
В конце инкубационного периода к свежей культуральной среде добавляли бромид 3-(4,5-диметилтиазолил-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия, бромид МТТ-тетразолия (Sigma, St. Louis, MO) при 0,5 мг/мл. Культуральную среду заменяли и опухолевые клетки инкубировали в течение 4 часов с бромидом МТТ-тетразолия при 37С. В конце инкубации культуральную среду аспирировали. Осадки кристаллов формазона растворяли в 200 мкл диметилсульфоксида (Sigma, St. Louis). Количественное определение растворенного формазона выполняли получением считываний поглощения при длине волны 500 нм на ELISA-ридере (Molecular Devices, Menlo Park, Calif.). МТТ-анализ измеряет активность митохондриальной НАДФ-зависимой дегидрогеназы, и он считается наиболее чувствительным и надежным способом для количественного определения реакций на химиотерапию in vitro опухолевых клеток. (Alley, M.C.,
Анализ считываний поглощения при 550 нм выполняли группированием лунок с одинаковыми тест-условиями и подтверждением различий, имеющих место между контролем и обработками пептидов с различными концентрациями, при помощи однофакторного ANOVA.
Обеспечен также пример анализа in vivo. Аденокарциному панкреатических протоков Mia-PaСa-2 человека испытывали на ингибирование роста in vivo пептидом YY и тест-соединением. Семьдесят тысяч - 100000 клеток Mia-PaСa-2 ортотопически трансплантировали в 48 самцов бестимусных мышей. Спустя одну неделю этих животных обрабатывали либо PYY, либо тест-соединением при 200 пмоль/кг/ч с использованием миниосмотических насосов в течение четырех недель. Параллельные культуры получали солевой раствор. При умерщвлении измеряли размер и массу опухолей. Контрольные мыши имели значимый рост раковых клеток человека в поджелудочных железах, что показано гистологическими срезами. При 9 неделях девяносто процентов (90%) контрольных мышей имели значительное метастатическое заболевание. Масса опухоли уменьшалась на 60,5% в обработанных тест-соединением мышах и на 27% в обработанных PYY мышах.
Полипептиды PPF могут вводиться отдельно или в комбинации с фармацевтически приемлемыми носителями или эксципиентами, в единственной дозе или во множественных дозах. Эти фармацевтические соединения могут быть приготовлены с фармацевтически приемлемыми носителями и разбавителями, а также любыми другими известными адъювантами и эксципиентами общепринятыми способами, такими как способы, описанные в Remington's Pharmaceutical Sciences E.W. Martin. См. также Wang, Y.J. and Hanson, M.A. Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers. Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report № 10, Supp.42:2S (1988), включенных в качестве ссылки.
Полипептиды PPF могут быть обеспечены в дозированной унифицированной форме. Например, терапевтически эффективные количества полипептида PPF для влияния на состав тела будут варьироваться в зависимости от многих факторов, в том числе возраста и массы пациента, физического состояния пациента, их использования в комбинации с другими способами лечения, конечной задачи, которая должна быть достигнута, такой как потеря общей массы и/или поддержание или увеличение сухой массы тела, а также других факторов. Однако типичные дозы могут содержать от нижнего предела приблизительно 0,05 мкг, приблизительно 0,1 мкг, приблизительно 1 мкг, приблизительно 5 мкг, приблизительно 10 мкг, приблизительно 50 мкг, приблизительно 75 мкг, приблизительно 100 мкг до верхнего предела приблизительно 50 мг, приблизительно 100 мг, приблизительно 500 мкг, приблизительно 1 мг, приблизительно 5 мг, приблизительно 10 мг, приблизительно 15 мг, приблизительно 50 мг, приблизительно 100 мг или приблизительно 150 мг фармацевтического соединения в день. Обсуждаются также другие диапазоны доз, такие как 0,1 мкг - 1 мг соединения на дозу или приблизительно при 0,001 мкг/кг - приблизительно 500 мкг/кг на дозу. В некоторых вариантах осуществления полипептид PPF по изобретению вводят периферически в дозе приблизительно 0,5 мкг - приблизительно 5 мг в день в единственной дозе, или в разделенных дозах, или регулируемым непрерывным высвобождением, или при приблизительно 0,01 мкг/кг - приблизительно 500 мкг/кг на дозу, или при приблизительно 0,05 мкг/кг - приблизительно 250 мкг/кг. В некоторых вариантах осуществления полипептид PPF вводят в дозе, более низкой чем приблизительно 50 мкг/кг. Дозы в этих диапазонах будут, конечно, варьироваться в зависимости от активности каждого аналога или производного и могут быть легко определены квалифицированным в данной области специалистом.
Суточные дозы могут доставляться в виде дискретных унифицированных доз, обеспечиваемых непрерывно в течение 24-часового периода или в течение любой части периода этих 24 часов. Количество доз в день может быть от 1 до приблизительно 4 в день, хотя оно может быть и большим. Непрерывная доставка может выполняться в форме непрерывной инфузии. Другие рассматриваемые примерные дозы и скорости инфузии включают в себя 0,005 нмоль/кг - приблизительно 20 нмоль/кг на дискретную дозу или от приблизительно 0,01 пмоль/кг/мин - приблизительно 10 пмоль/кг/мин в непрерывной инфузии. Эти дозы и инфузии могут доставляться любым известным общепринятым или разработанным в будущем периферическим способом, например внутривенным (i.v.), интрадермальным, внутримышечным введением, введением в молочную железу, интраперитонеальным, внутриоболочечным, ретробульбарным, внутрилегочным (например, ограниченное сроком высвобождение); подкожным введением (s.c.), пероральной, сублингвальной, назальной, анальной, вагинальной или трансдермальной доставкой или хирургической имплантацией в конкретном участке. Примерная общая доза/доставка этой фармацевтической композиции, вводимая i.v., может быть равна приблизительно 1 мкг - приблизительно 8 мг в день, в то время как общая доза/доставка этой фармацевтической композиции, вводимая s.c., может быть равна приблизительно 6 мкг - приблизительно 16 мг в день.
25,28,29
В одном общем аспекте способы по изобретению могут включать в себя другие регулирующие массу тела или жир тела соединения в комбинации с полипептидом PPF. В способах данного изобретения PYY агонист PYY или полипептид PPF по изобретению может вводиться отдельно или вместе с одним или несколькими другими соединениями и композициями, которые проявляют долгосрочное или краткосрочное действие в отношении, например, уменьшения доступности нутриентов, потребления пищи, массы тела, увеличения массы тела или изменения состава тела. Такие соединения включают в себя, но не ограничиваются ими, другие соединения и композиции, которые содержат амилин, агонист амилина или агонист аналога амилина, кальцитонин лосося, холецистокинин (ССК) или агонист ССК, лептин (белок ОВ) или агонист лептина, эксендин или агонист аналога эксендина, глюкагон-подобный белок-1 (GLP-1), агонист GLP-1 или агонист аналога GLP-1, ССК, агонисты ССК, кальцитонин, агонисты кальцитонина, низкомолекулярные антагонисты рецептора каннабиноида СВ1, римонабант, ингибиторы 11-бета-гидроксистероиддегидрогеназы-1, сибутрамин, фентермин и другие лекарственные средства, имеющиеся на рынке для лечения ожирения, например контролирующие аппетит. Эти соединения могут вводиться в комбинации, одновременно или последовательно. Подходящие агонисты амилина включают в себя, например, [Pro-]-амилин человека (также известный как «прамлинтид», описанный в Патентах США № 5696511 и 5998367) и кальцитонин лосося. В некоторых вариантах осуществления используемым ССК является октопептид ССК (ССК-8). Лептин обсуждается, например, в (Pelleymounter et al., Science 269: 540-3 (1995); Halaas et al., Science 269: 543-6 (1995); Campfield et al., Science 269: 546-9 (1995)). Подходящие эксендины включают в себя эксендин-3 и эксендин-4, а соединения-агонисты эксендина включают в себя, например, соединения, описанные в Публикации РСТ WO 99/07404, WO 99/25727 и WO 99/25728.
С. Получение и очистка полипептидов
Описанные здесь полипептиды PPF могут быть получены с использованием стандартных рекомбинантных способов или способов химического синтеза пептидов, известных в данной области, например, с использованием автоматизированного или полуавтоматизированного пептидного синтезатора или обоих.
Полипептиды PPF по изобретению могут быть синтезированы в растворе или на твердом носителе в соответствии с общепринятыми способами. Различные автоматические синтезаторы являются коммерчески доступными и могут быть использованы в соответствии с известными протоколами. См., например, Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d. ed., Pierce Chemical Co. (1984); Tam et al., J. Am. Chem. Soc. 105: 6442 (1983); Merrifield, Science 232: 341-7 (1986) и Barany and Merrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, eds., Academic Press, New York, 1-284 (1979). Твердофазный пептидный синтез может проводиться с использованием автоматического пептидного синтезатора (например, Model 430A, Applied Biosystems Inc., Foster City, California) с использованием системы NMP/HOBt (Option 1) и tBoc- или Fmoc-химии (см. Applied Biosystems User's Manual for the ABI 430A Peptide Synthesizer, Version 1.3B July 1, 1988, section 6, p. 49-70, Applied Biosystems, Inc., Foster City, California) с кэппингом. Пептиды могут быть также собраны с использованием Advanced ChemTech Synthesizer (Model MPS 350, Louisville, Kentucky). Пептиды могут быть очищены при помощи ОФ-ВЖХ (препаративной и аналитической) с использованием, например, системы Waters Delta Prep 3000 и препаративной колонки С4, С8 или С18 (10 микрон, 2,2×25 см; Vydac, Hesperia, California). Активный белок может быть легко синтезирован и затем подвергнут анализам скрининга, предназначенным для идентификации реакционноспособных пептидов.
Полипептиды PPF данного изобретения могут быть альтернативно получены рекомбинантными способами, хорошо известными в данной области. См., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor (1989). Эти полипептиды аналогов PYY, полученные рекомбинантными способами, могут быть экспрессированы из полинуклеотида. Квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, что эти полинуклеотиды, в том числе ДНК и РНК, могут быть получены из кДНК PYY дикого типа с учетом вырожденности использования кодонов. Эти полинуклеотидные последовательности могут содержать кодоны, облегчающие транскрипцию и трансляцию мРНК в микробных хозяевах. Такие изготовляемые последовательности могут быть легко сконструированы в соответствии со способами, хорошо известными в данной области. См., например, WO 83/04053. Описанные выше полинуклеотиды могут также, необязательно, кодировать N-концевой остаток метионина. Непептидные соединения, применимые в этом изобретении, могут быть получены известными в данной области способами. Например, фосфатсодержащие аминокислоты и пептиды, содержащие такие аминокислоты, могут быть получены с использованием способов, известных в данной области. См., например, Barlett and Landen, Bioorg. Chem. 14: 356-77 (1986).
Различные системы экспрессирующий вектор/хозяин могут быть использованы для содержания и экспрессии в них последовательности, кодирующей полипептид PPF. Они включают в себя, но не ограничиваются ими, микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные рекомбинантным бактериофагом, плазмидные или космидные экспрессирующие ДНК-векторы; дрожжи, трансформированные экспрессирующими векторами дрожжей; системы клеток насекомых, инфицированных вирусными экспрессирующими векторами (например, бакуловирусом); системы клеток растений, трансфицированных вирусными экспрессирующими векторами (например, вирусом мозаики цветной капусты, CaMV; вирусом мозаичной болезни табака, TMV) или трансформированными бактериальными экспрессирующими векторами (например, Ti-плазмидой или плазмидой pBR322) или системами клеток животных. Клетки млекопитающих, которые применимы в получении рекомбинантных белков, включают в себя, но не ограничиваются ими, клетки VERO, клетки HeLa, клеточные линии яичника Китайского хомячка (СНО), клетки COS (например, COS-7), клетки WI 38, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562 и 293. Примеры протоколов для рекомбинантной экспрессии белка описаны здесь ниже.
Полинуклеотидные последовательности, обеспеченные этим изобретением, применимы в генерировании новых и применимых плазмидных ДНК-векторов, новых и применимых трансформированных и трансфицированных прокариотических и эукариотических клеток-хозяев (в том числе бактериальных, дрожжевых клеток и клеток млекопитающих, выращенных в культуре) и новых и применимых способов для культивируемого роста таких клеток-хозяев, способных экспрессировать полипептиды PPF данного изобретения. Полинуклеотидные последовательности, кодирующие описанные здесь полипептиды PPF, могут быть использованы для генотерапии в случаях, когда могло бы ослабляться недостаточное продуцирование РР, PYY или NPY или могла бы быть удовлетворена потребность в увеличенных уровнях РР, PYY или NPY.
Данное изобретение обеспечивает также способы получения рекомбинантных ДНК полипептидов PPF изобретения. Обеспечен способ получения полипептидов PPF из клетки-хозяина, содержащей нуклеиновые кислоты, кодирующие такие полипептиды PPF, предусматривающий: (а) культивирование указанной клетки-хозяина, содержащей полинуклеотиды, кодирующие такие полипептиды PPF, в условиях, способствующих экспрессии такой молекулы ДНК, и (b) получение таких полипептидов PPF.
Клетки-хозяева могут быть прокариотическими или эукариотическими и включают в себя бактерии, клетки млекопитающих (такие, как клетки яичника Китайского хомячка, клетки обезьян, клетки почки детеныша хомячка, раковые клетки или другие клетки), дрожжевые клетки и клетки насекомых.
Системы-хозяева млекопитающих для экспрессии рекомбинантного белка также хорошо известны специалистам в данной области. Штаммы клеток-хозяев могут быть отобраны на конкретную способность процессирования экспрессируемого белка или продуцирование определенных посттрансляционных модификаций, которые будут полезны в обеспечении активности белка. Такие модификации полипептида включают в себя, но не ограничиваются ими, ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, липидирование и ацилирование. Посттрансляционный процессинг, который расщепляет «препро»-форму этого белка, может быть также важным для правильной инсерции, укладки и/или функции. Различные клетки-хозяева, такие как СНО, HeLa, MDCK, 293, WI38 и т.п., имеют специфический клеточный аппарат и характерные механизмы для таких посттрансляционных активностей и могут быть выбраны для гарантии правильных модификации и процессинга введенного чужеродного белка.
Альтернативно, система дрожжей может быть использована для генерирования полипептидов PPF данного изобретения. Кодирующий район кДНК полипептида PPF амплифицируют при помощи ПЦР. ДНК, кодирующую пре-про-альфа-лидерную последовательность дрожжей, амплифицируют из геномной ДНК дрожжей в реакции ПЦР с использованием одного праймера, содержащего нуклеотиды 1-20 гена альфа-фактора скрещивания, и другого праймера, комплементарного нуклеотидам 255-235 этого гена (Kurjan and Herskowitz, Cell, 30:933-43 (1982)). Эту кодирующую пре-про-альфа-лидер последовательность и фрагменты последовательности, кодирующей полипептид PPF, лигируют в плазмиду, содержащую промотор алкогольдегидрогеназы дрожжей (ADH2), так что этот промотор управляет экспрессией слитого белка, состоящего из пре-про-альфа-фактора, слитого со зрелым полипептидом PPF. Как описано Rose abd Broach, Meth. Enz. 185: 234-79, Goeddel ed., Academic Press, Inc., San Diego, California (1990), этот вектор дополнительно включает в себя терминатор транскрипции ADH2 справа от сайта клонирования, сайт инициации репликации дрожжей «2-микрон» (2µ), ген leu-2d дрожжей, гены REP1 и REP2 дрожжей, ген β-лактамазы E. coli и сайт инициации репликации E. coli. Гены β-лактамазы и leu-2d обеспечивают для отбора в бактериях и дрожжах соответственно. Ген leu-2d способствует также увеличенному числу копий этой плазмиды в дрожжах для индукции более высоких уровней экспрессии. Гены REP1 и REP2 кодируют белки, участвующие в регуляции числа копий плазмиды.
ДНК-конструкцию, описанную в предыдущем абзаце, трансформируют в клетки дрожжей с использованием известного способа, например обработки ацетатом лития (Steams et al., Meth. Enz. 185: 280-97 (1990)). Промотор ADH2 индуцируется после истощения глюкозы в среде для выращивания (Price et al., Gene 55: 287 (1987)). Эта пре-про-альфа-последовательность влияет на секрецию слитого белка из этих клеток. Одновременно белок KEX2 дрожжей отщепляет эту пре-про-последовательность от зрелых полипептидов аналогов PYY (Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330-4 (1984)).
Полипептиды PPF по изобретению могут быть также рекомбинантно экспрессированы в дрожжах с использованием коммерчески доступной системы экспрессии, например системы экспрессии Pichia (Invitrogen, San Diego, Caliaornia) в соответствии с инструкциями изготовителя. Эта система также основана на пре-про-последовательности для управления секрецией, но транскрипция этого инсерта запускается промотором алкогольоксидазы (AOX1) после индукции метанолом. Секретируемый полипептид PPF очищают из среды выращивания дрожжей, например, способами, используемыми для очистки полипептида PPF из бактериальных супернатантов или супернатантов клеток млекопитающих.
Альтернативно, кДНК, кодирующая полипептиды аналогов PYY, может быть клонирована в бакуловирусный экспрессирующий вектор PVL1393 (PharMingen, San Diego, California). Этот содержащий полипептиды PPF вектор используют затем в соответствии с рекомендациями изготовителя (PharMingen) для инфицирования клеток Spodoptera frugiperda в не содержащей белка sF9 среде и для продуцирования рекомбинантного белка. Этот белок очищают и концентрируют из этой среды с использованием колонки гепарин-Сефароза (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) и последовательных колонок для разделения по размерам молекул (Amicon, Beverly, Massachusetts) и ресуспендируют в ЗФР. Анализ с использованием электрофореза в ДСН-ПААГ показывает единственную полосу и подтверждает размер этого белка, а секвенирование по Эдману на пептидном секвенаторе Proton 2090 подтверждает его N-концевую последовательность.
2
Например, ДНК-последовательность, кодирующая предсказанный зрелый полипептид аналога PYY, может быть клонирована в плазмиду, содержащую желаемый промотор и, необязательно, лидерную последовательность (см., например, Better et al., Science 240: 1041-3 (1988). Последовательность этой конструкции может быть подтверждена автоматизированным секвенированием. Затем эту плазмиду трансформируют в штамм E. coli MC1061 с использованием стандартных процедур, использующих инкубирование с CaCl и обработку тепловым шоком этих бактерий (Sambrook et al., supra). Трансформированные бактерии выращивают в LB-среде, дополненной карбенициллином, и продуцирование экспрессируемого белка индуцируют выращиванием в подходящей среде. В случае ее присутствия лидерная последовательность будет вызывать секрецию зрелого полипептида аналога PYY и отщепляться во время секреции. Секретированный рекомбинантный белок очищают из среды бактериальной культуры способом, описанным ниже.
Альтернативно, полипептиды PPF по изобретению могут быть экспрессированы в системе насекомого. Системы насекомых для экспрессии белков хорошо известны квалифицированным в данной области специалистам. В одной такой системе вирус ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV) используют в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов в клетках Spodoptera frugiperda или Trichoplusia larvae. Кодирующую последовательность полипептида PPF клонируют в заменимый район этого вируса, такой как ген полиэдрина, и помещают под контроль промотора полиэдрина. Успешная инсерция полипептида аналога PYY будет делать этот ген полиэдрина неактивным и продуцировать рекомбинантный вирус, лишенный оболочки, состоящей из белка оболочки. Затем эти рекомбинантные вирусы используют для инфицирования клеток Spodoptera frugiperda или Trichoplusia larvae, в которых экспрессируется полипептид аналога PYY (Smith et al., J. Virol. 46: 584 (1983); Engelhard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3224-7 (1994)).
о
В другом примере ДНК-последовательность, кодирующая полипептид PPF, может быть амплифицирована при помощи ПЦР и клонирована в подходящий вектор, например pGEX-3X (Pharmacia, Piscataway, New Jersey). Конструируют вектор pGEX для продуцирования слитого белка, содержащего глутатион-S-трансферазу (GST), кодируемую этим вектором, и белок, кодируемый ДНК-фрагментом, встроенным в сайт клонирования этого белка. Могут быть генерированы праймеры для ПЦР для включения, например, подходящего сайта расщепления. Затем этот рекомбинантный слитый белок может быть отщеплен от GST-части слитого белка. Эту конструкцию полипептида аналога pGEX-3X/PYY трансформируют в клетки E. coli XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, California) и отдельные трансформанты выделяют и выращивают при 37С в LB-среде (дополненной карбенициллином) до оптической плотности при длине волны 600 нм 0,4 с последующей дополнительной инкубацией в течение 4 часов в присутствии 0,5 мМ изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (Sigma Chemicals Co., St. Louis, Missuri). Плазмидную ДНК из отдельных трансформантов очищают и частично секвенируют с использованием автоматизированного секвенатора для подтверждения присутствия инсерта желаемого гена, кодирующего полипептид PPF в правильной ориентации.
++
++
Этот слитый белок, который, как ожидается, продуцируется в виде нерастворимого тельца включения в бактериях, может быть очищен следующим образом. Клетки собирают центрифугированием; промывают в 0,15 М NaCl, 10 мМ Трисе, рН 8, 1 мМ ЭДТА и обрабатывают 0,1 мг/мл лизоцима (Sigma Chemicals Co.) в течение 15 минут при комнатной температуре. Лизат осветляют обработкой ультразвуком и остатки клеток осаждают центрифугированием в течение 10 минут при 12000хg. Содержащий слитый белок осадок ресуспендируют в 50 мМ Трис, рН 8 и 10 мМ ЭДТА наслаивают на 50% глицерин и центрифугируют в течение 30 минут при 6000хg. Осадок ресуспендируют в стандартном забуференном фосфатом солевом растворе (ЗФР), не содержащем Mg и Ca. Этот слитый белок дополнительно очищают фракционированием ресуспендированного осадка электрофорезом в денатурирующем ДСН-полиакриламидном геле (Sambrook et al., supra). Этот гель замачивают в 0,4 М KCl для визуализации белка, который вырезают и электроэлюируют в рабочем буфере геля, не содержащем ДСН. Если слитый белок GST/полипептид аналога PYY продуцируется в бактериях в виде растворимого белка, он может быть очищен с использованием Модуля Очистки GST (Pharmacia Biotech).
Этот слитый белок может быть подвергнут расщеплению для отделения GST от зрелого полипептида аналога PYY. Реакционную смесь для расщепления (20-40 мкг слитого белка, 20-30 единиц тромбина человека (4000 Е/мг (Sigma) в 0,5 мл ЗФР)) инкубируют 16-48 часов при комнатной температуре и наносят на гель денатурирующего электрофореза в ДСН-ПААГ для фракционирования продуктов реакции. Гель замачивают в 0,4 М KCl для визуализации белковых полос. Идентичность полосы белка, соответствующей ожидаемой молекулярной массе полипептида аналога PYY, может быть подтверждена анализом частичной аминокислотной последовательности с использованием автоматизированного секвенатора (Applied Biosystems Model 473A, Foster City, California).
В одном способе рекомбинантной экспрессии полипептидов PPF данного изобретения клетки НЕК 293 могут быть котрансфицированы плазмидами, содержащими кДНК полипептида аналога PYY в векторе pCMV (5' промотор CMV, 3' полиА-последовательность HGH), и pSV2neo (содержащем ген устойчивости к неомицину) кальций-фосфатным способом. В некоторых вариантах осуществления эти векторы должны быть линеаризованы ScaI перед трансфекцией. Подобным образом, может быть использована альтернативная конструкция, использующая сходный вектор pCMV с включенным геном neo. Стабильные клеточные линии выбирают из клонов отдельных клеток лимитирующим разведением в среде для выращивания, содержащей 0,5 мг/мл G418 (неомицинподобного антибиотика), в течение 10-14 дней. Клеточные линии подвергают скринингу на экспрессию полипептида аналога PYY при помощи ELISA или Вестерн-блота и клеточные линии с высокой экспрессией размножают для крупномасштабного выращивания.
В некоторых вариантах осуществления эти трансформированные клетки используют для долгосрочного, высокопроизводительного продуцирования белка и может быть желательной стабильная экспрессия. После трансформации таких клеток векторами, которые содержат селектируемые маркеры вместе с желаемой экспрессионной кассетой, этим клеткам дают расти в течение 1-2 дней в обогащенной среде перед их переключением на селективную среду. Селектируемый маркер предназначен для придания устойчивости к отбору, и его присутствие делает возможными выращивание и извлечение клеток, которые успешно экспрессируют введенные последовательности. Резистентные скопления стабильно трансформированных клеток могут быть подвергнуты пролиферации с использованием способов культуры ткани, подходящих для этих клеток.
Ряд систем отбора может быть использован для извлечения клеток, которые были трансформированы для продуцирования рекомбинантного белка. Такие системы отбора включают в себя, но не ограничиваются ими, гены тимидинкиназы HSV, гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы и аденинфосфорибозилтрансферазы, в tk-, hgprt- или aprt-клетках соответственно. Устойчивость к антиметаболитам также может быть использована в качестве основы для отбора на ген dhfr, который придает устойчивость к метотрексату; gpt, который придает устойчивость к микофеноловой кислоте; neo, который придает устойчивость к аминогликозиду, G418; который также придает устойчивость к хлорсульфурону, и hygro, который придает устойчивость к гигромицину. Дополнительные селектируемые гены, которые могут быть применимы, включают в себя trpB, который позволяет клеткам использовать индол вместо триптофана, или hisD, который позволяет клеткам использовать гистинол вместо гистидина. Маркеры, которые дают визуальное указание для идентификации трансформантов, включают в себя антоцианины, β-глюкуронидазу и ее субстрат, GUS, и люциферазу и ее субстрат, люциферин.
Многие полипептиды PPF данного изобретения могут быть получены с использованием комбинации как автоматизированного пептидного синтеза, так и рекомбинантных способов. Например, полипептид PPF данного изобретения может содержать комбинацию модификаций, включающих в себя делецию, замену и инсерцию, с ПЭГилированием. Такой полипептид PPF может быть получен в нескольких стадиях. В первой стадии промежуточный полипептид PPF, содержащий делецию, замену, инсерцию и любые их комбинации, может быть получен рекомбинантными способами, как описано. Затем после необязательной стадии очистки, описанной ниже, этот промежуточный полипептид PPF ПЭГилируют посредством химической модификации подходящим ПЭГилирующим реагентом (например, из NeKtar Therapeutics, San Carlos, California) с получением желаемого полипептида PPF. Квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, что вышеописанная процедура может быть распространена на применение с полипептидом PPF, содержащим комбинацию модификаций, выбранных из делеции, замены, инсерции, дериватизации и других способов модификации, хорошо известных в данной области и рассматриваемых в данном изобретении.
Может быть желательной очистка полипептидов PPF, генерированных данным изобретением. Способы очистки белков хорошо известны квалифицированным в данной области специалистам. Эти способы включают в себя на одном уровне грубое фракционирование клеточной среды на полипептидную и неполипептидную фракции. После отделения рассматриваемого полипептида от других белков представляющий интерес полипептид может быть дополнительно очищен с использованием хроматографических и электрофоретических способов для достижения частичной или полной очистки (или очистки до гомогенности). Аналитическими способами, особенно пригодными для получения чистого пептида, являются ионообменная хроматография, вытеснительная хроматография, электрофорез в полиакриламидном геле и изоэлектрическое фокусирование. Особенно эффективным способом очистки пептидов является обращенно-фазовая ВЖХ с последующей характеристикой очищенного продукта жидкостной хроматографией/масс-спектрометрией (LC/MS) и масс-спектрометрия с использованием лазерной десорбционной ионизации Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI). Дополнительное подтверждение чистоты получают с использованием аминокислотного анализа.
Определенные аспекты данного изобретения относятся к очистке и в конкретных вариантах осуществления к существенной очистке кодируемого белка или пептида. Термин «очищенный пептид» относится в данном контексте к композиции, изолируемой от других компонентов, где этот пептид очищен до любой степени относительно его природно получаемого состояния. Таким образом, очищенный пептид представляет собой пептид, свободный от окружения, в котором он может присутствовать в природе.
Обычно термин «очищенная» относится к пептидной композиции, которая была подвергнута фракционированию для удаления различных других компонентов и по существу сохраняет проявляемую ей биологическую активность. При использовании термина «по существу очищенная» это обозначение будет относиться к композиции, в которой этот пептид составляет основной компонент этой композиции, например составляет приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90%, приблизительно 95% или более пептидов в этой композиции.
Различные способы, подходящие для применения в очистке пептидов, хорошо известны квалифицированным в данной области специалистам. Они включают в себя, например, осаждение сульфатом аммония, ПЭГ, антитела и т.п.; денатурацию нагреванием с последующим центрифугированием; хроматографические стадии, такие как ионообменная, гель-фильтрационная, обращенно-фазовая, гидроксиапатитная и аффинная хроматография; изоэлектрическое фокусирование; гель-электрофорез и комбинации таких и других способов. Как обычно известно в данной области, считается, что порядок проведения различных стадий очистки может быть изменен или что некоторые стадии могут быть опущены и способ все еще будет оставаться подходящим способом для получения по существу очищенного белка или пептида.
Нет общего требования, заключающегося в том, что пептиды всегда должны обеспечиваться в их наиболее очищенном состоянии. Действительно, предполагается, что менее существенно очищенные продукты будут иметь применение в некоторых вариантах осуществления. Частичная очистка может выполняться с использованием меньших стадий очистки в комбинации или с использованием различных форм одной и той же общей схемы очистки. Например, понятно, что катионообменная колоночная хроматография, выполняемая с использованием ВЖХ-прибора, будет обычно приводить к очистке в большее число раз, чем тот же самый способ, использующий систему хроматографии с низким давлением. Способы, обнаруживающие меньшую степень относительной очистки, могут иметь преимущества в общем извлечении белкового продукта или в сохранении активности экспрессируемого белка.
Можно иногда очищать и выделять такие полипептиды PPF от других компонентов, полученных в этом способе. Способы очистки полипептида могут быть найдены в Патенте США № 5849883. Эти документы описывают конкретные примеры способов для выделения и очистки G-CSF-композиций, которые могут быть применимы в выделении и очистке полипептидов PPF данного изобретения. При наличии описания этих патентов очевидно, что специалист с квалификацией в данной области будет хорошо осведомлен о разнообразных способах очистки, которые могут быть использованы для очистки полипептидов PPF из конкретного источника.
Предполагается также, что комбинация анионообменной и иммуноаффинной хроматографии может быть использована для получения композиций очищенных полипептидов PPF данного изобретения.
D. Фармацевтические композиции
Данное изобретение относится также к фармацевтическим композициям, содержащим терапевтически или профилактически эффективное количество по меньшей мере одного полипептида PPF по изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, вместе с фармацевтически приемлемыми разбавителями, консервантами, солюбилизаторами, эмульгаторами, адъювантами и/или носителями, применимыми в доставке полипептидов PPF. Такие композиции могут включать в себя разбавители в виде различных буферов (например, ацетат, цитрат, глутамат, тартрат, фосфат, Трис) с различными рН и ионной силой; добавки, такие как поверхностно-активные вещества и солюбилизирующие агенты (например, моноолеат сорбитана, лецитин, Плуроники, Твин 20 & 80, полисорбат 320 и 680, пропиленгликоль, этанол, ПЭГ-40, додецилсульфат натрия), антиоксиданты (например, монотиоглицерин, аскорбиновую кислоту, ацетилцистеин, соли серной кислоты (бисульфит и метабисульфит), консерванты (например, фенол, метакрезол, бензиловый спирт, парабены (метил-, пропил-, бутилпарабены), хлорид бензалкония, хлорбутанол, тимерозол, соли фенилртути (ацетат, борат, нитрат) и агенты тоничности/объема (глицерин, хлорид натрия, маннит, сахарозу, трегалозу, декстрозу); включение этого материала в состоящие из частиц препараты полимерных соединений, таких как полимолочная кислота, полигликолевая кислота и т.д., или в ассоциации с липосомами. Такие композиции будут влиять на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения in vivo и скорость клиренса in vivo этих полипептидов PPF. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences 1435-712, 18 ed., Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1999).
Обычно эти полипептиды PPF будут применимы таким же образом, как и РР, PYY или NPY, ввиду их фармакологических свойств. Одним примером применения является периферическое введение таких полипептидов PPF для лечения или предупреждения метаболических состояний и нарушений. В частности, соединения данного изобретения обладают активностью в качестве агентов для уменьшения доступности нутриентов, уменьшения потребления пищи и вызывания потери массы.
Полипептиды PPF данного изобретения могут быть приготовлены для периферического введения, в том числе в виде композиции для инъекции, перорального введения, назального введения, легочного введения, местного введения или других типов введения, как будет понятно квалифицированному в данной области специалисту. Более конкретно, введение фармацевтических композиций в соответствии с данным изобретением может выполняться посредством любого обычного способа, пока ткань-мишень является доступной с использованием этого способа. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции могут вводиться субъекту любым общепринятым периферическим способом, например внутривенной, интрадермальной, внутримышечной доставкой, введением в молочную железу, внутрибрюшинной, внутриоболочечной, ретробульбарной, внутрилегочной (например, ограниченное сроком высвобождение); пероральной, сублингвальной, назальной, анальной, вагинальной или трансдермальной доставкой или хирургической имплантацией в конкретном участке. Лечение может состоять из единственной дозы или множества доз на протяжении некоторого периода времени. Обсуждается также регулируемое высвобождение композиций данного изобретения.
Композиция может быть приготовлена в различных формах, например твердой, жидкой, полутвердой или жидкой. Эта композиция может быть жидкостью или может быть твердым веществом, например лиофилизированным, для восстановления. Термин «твердое вещество» обозначает в данном контексте все обычные применения этого термина, например порошки и лиофилизированные композиции. Водные композиции по изобретению содержат эффективное количество полипептида PPF, растворенного или диспергированного в фармацевтически приемлемом носителе или водной среде. Фраза «фармацевтически или фармакологически приемлемые» относится к молекулярным частицам и композициям, которые не производят вредных, аллергических или других неблагоприятных реакций при введении в животное или в человека. В данном контексте «фармацевтически приемлемый носитель» обозначает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие абсорбцию агенты и т.п. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области. За исключением того, что какие-либо среда или агент являются несовместимыми с активным ингредиентом, их применение рассматривается в терапевтических композициях. Дополнительные активные ингредиенты также могут быть включены в эти композиции. В некоторых случаях будет удобно обеспечивать полипептид PPF и другой уменьшающий потребление пищи, понижающий глюкозу плазмы или изменяющий липиды плазмы агент, такой как амилин, аналог агониста амилина, ССК, или агонист ССК, или лептин, или агонист лептина, или эксендин, или аналог агониста эксендина, и низкомолекулярные антагонисты рецептора каннабиноида СВ1, римонабант, ингибиторы бета-гидроксистероиддегидрогеназы-1, сибутрамин, фентермин и другие лекарственные средства, имеющиеся на рынке для лечения ожирения, в виде единственной композиции или раствора для совместного введения. В других случаях может быть полезным введение дополнительного агента отдельно от указанного полипептида PPF.
Полипептид PPF по изобретению может быть приготовлен для введения в виде растворов свободного основания или фармакологически приемлемых солей в воде, подходящим образом смешанных с поверхностно-активными агентами (например, моноолеатом сорбитана, полиоксиэтиленсорбитанмонолауратом (Твином 20), полиоксиэтиленсорбитанмоноолеатом (Твином 89), лецитином, сополимерами полиоксиэтилена и полиоксипропилена (Плурониками), гидроксипропилцеллюлозой) или комплексообразующими агентами (например, гидроксипропил-β-циклодекстрином, сульфобутиловый эфир-β-циклодекстрином (Каптизолом), поливинилпирролидоном). Фармацевтически приемлемые соли включают в себя кислотно-аддитивные соли (образованные со свободными аминогруппами белка), которые образованы с неорганическими кислотами, такими как, например, хлористоводородная или фосфорная кислоты, или такими органическими кислотами, как уксусная, щавелевая, винная, миндальная и т.п. Соли, образованные со свободными карбоксильными группами, также могут быть образованы из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или трехвалентного железа, и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, гистидин, прокаин и т.п. Такие продукты можно легко получить процедурами, хорошо известными квалифицированным в данной области специалистам. Могут быть также получены дисперсии в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях и в маслах.
Консервант является в обычном фармацевтическом смысле веществом, которое предотвращает или ингибирует микробный рост и может добавляться к композиции для этой цели во избежание последующей порчи композиции микроорганизмами. Хотя количество консерванта является небольшим, он может тем не менее влиять на общую стабильность пептида. Обычно при обычных условиях хранения и применения эти препараты содержат консервант для предупреждения роста микроорганизмов. Хотя консервант для использования в фармацевтических композициях может находиться в диапазоне 0,005-1,0% (масса/объем), в некоторых вариантах осуществления диапазон для каждого консерванта, отдельного или в комбинации с другими, равен: бензиловый спирт (0,1-1,0%), или м-крезол (0,1-0,6%), или фенол (0,1-0,8%), или комбинация метил- (0,05-0,25%) и этил-, или пропил-, или бутил- (0,005%-0,03%) парабенов. Парабены являются низшими алкиловыми эфирами пара-гидроксибензойной кислоты.
Поверхностно-активные вещества могут вызывать денатурацию белка, как гидрофобным разрушением, так и разделением солевых мостиков. Относительно низкие концентрации поверхностно-активного вещества могут проявлять сильную денатурирующую активность вследствие сильных взаимодействий между частицами поверхностно-активного вещества и реактивными сайтами на белках. Однако разумное применение этого взаимодействия может стабилизировать белки против межфазной или поверхностной денатурации. Поверхностно-активные вещества, которые могли бы дополнительно стабилизировать пептид, могут необязательно присутствовать в диапазоне приблизительно 0,001-0,3% (масса/объем) общей композиции и включают в себя полисорбат 80 (т.е. полиоксиэтилен(20)сорбитанмоноолеат), CHAPS (т.е. 3-[(3-холамидопропил)диметиламмонио]-1-пропансульфонат), Brij (например, Brij 35, который является (лауриловым эфиром полиэксиэтилена(23)), полоксамер или другое неионогенное поверхностно-активное вещество.
Стабильность пептидной композиции данного изобретения усиливается поддержанием рН композиции в диапазоне приблизительно 3,0 - приблизительно 7,0, когда композиция находится в жидкой форме. В некоторых вариантах осуществления полипептид PPF суспендируют в водном носителе, например в буферном растворе при рН приблизительно 3,0 - приблизительно 8,0, приблизительно 3,5 - приблизительно 7,4, приблизительно 3,5 - приблизительно 6,0, приблизительно 3,5 - приблизительно 5,0, приблизительно 3,7 - приблизительно 4,7, приблизительно 3,7 - приблизительно 4,3 или приблизительно 3,8 - приблизительно 4,2. В некоторых вариантах осуществления парентеральная композиция является изотонической. В некоторых вариантах осуществления носителем для парентеральных продуктов является вода. Вода подходящего качества для парентеральнрого введения может быть получена дистилляцией или обратным осмосом. Вода может быть использована в качестве водного носителя для инъекции для использования в фармацевтических композициях. Применимые буферы включают в себя ацетат натрия/уксусная кислота, лактат натрия/молочная кислота, аскорбиновую кислоту, цитрат натрия/лимонная кислота, бикарбонат натрия/угольная кислота, сукцинат натрия/янтарная кислота, Гистидин, бензоат натрия/бензойная кислота и фосфаты натрия и Трис(гидроксиметил)аминометан. Форма хранилища или «депо» препарата медленного высвобождения может быть использована таким образом, что терапевтически эффективные количества препарата доставляются в кровоток на протяжении многих часов или дней после трансдермальной инъекции или доставки.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции данного изобретения готовят таким образом, что они являются пригодными для парентерального введения, например, посредством инъекции или инфузии. В некоторых вариантах осуществления жидкие композиции предназначены для парентерального введения. Подходящие способы введения включают в себя внутримышечное, внутривенное, подкожное, интрадермальное, мукозное, внутрисуставное, внутриоболочечное, бронхиальное введение и т.п. Эти способы включают в себя, но не ограничиваются ими, пероральный, назальный, подъязычный, легочный и буккальный способы, которые могут включать в себя введение полипептида PPF в жидкой, полутвердой или твердой форме. Введение посредством некоторых способов введения требуют существенно большего количества полипептида PPF для получения желаемых биологических эффектов вследствие уменьшенной биодоступности в сравнении с парентеральной доставкой. Кроме того, парентеральная доставка с регулируемым высвобождением может достигаться образованием полимерных микрокапсул, матриксов, растворов, имплантатов и устройств и введением их парентерально или хирургическими средствами. Примеры композиций регулируемого высвобождения описаны в Патентах США № 6368630, 6379704 и 5766627, которые включены здесь в качестве ссылки. Эти дозированные формы могут иметь более низкую биодоступность вследствие заключения пептида в полимерный матрикс или в устройство. См., например, патенты США № 6379704, 6379703 и 6296842. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции, пригодные для инъекционного применения, включают в себя стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для незапланированного приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий. В некоторых вариантах осуществления эта форма должна быть стерильной и должна быть текучей до степени легкого введения при помощи шприца. Желательно также, чтобы полипептид PPF по изобретению был стабильным в условиях приготовления и хранения, и он должен предохраняться против загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Этим носителем может быть растворитель или дисперсионная среда, содержащая, например, воду, этанол, полиол (например, сорбит, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленголиколь и т.п.), диметилацетамид, кремофор EL, их подходящие смеси и масла (например, соевое, кунжутное, касторовое, хлопковое масла, этилолеат, изопропилмиристат, гликофурол, кукурузное масло). Подходящая текучесть может поддерживаться, например, с использованием покрытия, такого как лецитин, поддержанием требуемого размера частиц в случае дисперсии и с использованием поверхностно-активных веществ. Предотвращение действия микроорганизмов может достигаться различными антибактериальными и противогрибковыми агентами, например мета-крезолом, бензиловым спиртом, парабенами (метил-, пропил-, бутилпарабенами), хлорбутанолом, фенолом, солями фенилртути (ацетата, бората, нитрата), сорбиновой кислотой, тимерозалом и т.п. В некоторых вариантах осуществления могут быть включены агенты тоничности (например, сахара, хлорид натрия). Пролонгированная абсорбция инъецируемых композиций может вызываться использованием в композициях агентов, задерживающих абсорбцию (например, моностеарата алюминия и желатина).
В некоторых вариантах осуществления, например в случае не парентеральных композиций, стерилизация может не требоваться. Однако, если стерилизация является желаемой или необходимой, может быть использован любой подходящий способ стерилизации в развитии пептидной фармацевтической композиции данного изобретения. Типичные способы стерилизации включают в себя фильтрацию, пар (влажное нагревание), сухое нагревание, газы (например, этиленоксид, формальдегид, диоксид хлора, пропиленоксид, бета-пропиолактон, озон, хлорпикрин, метилбромид перуксусной кислоты и т.п.), подвергание действию источника радиации и асептическую обработку. Фильтрация является предпочтительным способом стерилизации для жидких композиций данного изобретения. Стерильная фильтрация включает в себя фильтрацию через фильтры 0,45 мкм и 0,2 мкм (1 или 2), которые могут быть соединены последовательно. После фильтрации раствор заливают в подходящие флаконы или контейнеры. Стерильные инъекционные растворы могут быть приготовлены включением активных соединений в требуемом количестве в подходящем растворителе с различными другими ингредиентами, перечисленными выше, если необходимо, с последующей стерилизацией фильтрованием. Обычно дисперсии готовят включением различных стерилизованных активных ингредиентов в стерильный носитель, который содержит базовую дисперсионную среду и требуемые другие ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов примерами способов приготовления являются способы сушки в вакууме и сушки замораживанием, которые дают порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный желаемый ингредиент из его предварительно стерильно отфильтрованного раствора.
Обычно соединения PPF могут быть приготовлены в стабильную, безопасную фармацевтическую композицию для введения пациенту. Фармацевтические композиции, обсуждаемые для применения в способах по изобретению, могут содержать приблизительно 0,01 - приблизительно 20% (масса/объем) или приблизительно 0,05 - приблизительно 10% соединения PPF. Соединения PPF могут быть в ацетатном, фосфатном, цитратном или глутаматном буфере (например, в конечной концентрации композиции приблизительно 1-5 - приблизительно 60 мМ) с возможностью получения рН конечной композиции приблизительно 3,0 - приблизительно 7,0, содержащей углевод или полиатомный спирт в качестве модификатора тоничности и, необязательно, приблизительно 0,005 - 5,0% (масса/объем) консерванта, выбранного из группы, состоящей из м-крезола, бензилового спирта, метил-, этил-, пропил- и бутилпарабенов и фенола. Такой консервант обычно включают, если приготовляемый пептид должен быть включен в продукт множественного применения.
Необязательно, в данную композицию может быть включен стабилизатор. Однако если он включен, то стабилизатором, применимым в практике данного изобретения, является углевод или полиатомный спирт. Подходящим стабилизатором, применимым в практике данного изобретения, является приблизительно 1,0-10% (масса/объем) углевод или полиатомный спирт. Полиатомные спирты и углеводы имеют один и тот же признак в их молекулярном скелете, т.е. -CHOH-CHOH-, который является ответственным за стабилизацию этих белков. Полиатомные спирты включают в себя такие соединения, как сорбит, маннит, глицерин и полиэтиленгликоли (ПЭГ). Эти соединения являются молекулами с прямыми цепями. С другой стороны, такие углеводы, как манноза, рибоза, сахароза, фруктоза, трегалоза, мальтоза, инозит и лактоза, являются циклическими молекулами, которые содержат кетогруппу или альдегидную группу. Было показано, что эти два класса соединений являются эффективными в стабилизации белка против денатурации, вызываемой повышенной температурой и процессами замораживания-оттаивания или сушки замораживанием. Подходящие углеводы включают в себя: галактозу, арабинозу, лактозу или любой другой углевод, который не оказывает вредного действия на пациента, страдающего от сахарного диабета (если это является желаемым свойством), т.е. этот углевод не метаболизируется с образованием больших концентраций глюкозы в крови.
В некоторых вариантах осуществления, если включен стабилизатор, полипептид PPF стабилизируется многоатомным спиртом, таким как сорбит, маннит, инозит, глицерин, ксилит, и сополимером полипропилена/этиленгликоля, а также различными полиэтиленгликолями (ПЭГ) с молекулярной массой 200, 400, 1450, 3350, 4000, 6000 и 8000. Другим полезным признаком лиофилизированных композиций данного изобретения является поддержание тоничности описанных здесь лиофилизированных композиций тем же самым компонентом композиции, который служит для поддержания их стабильности. В некоторых вариантах осуществления используемым для этой цели полиатомным спиртом является маннит.
Контейнеры могут также рассматриваться как часть композиции инъекционного раствора, так как нет контейнера, который был бы полностью инертным или не оказывал какого-либо действия на жидкость, которую он содержит, особенно если эта жидкость является водной. Таким образом, выбор контейнера для конкретного инъекционного раствора должен быть основан на основе учета состава этого контейнера, а также раствора и обработки, которой он будет подвергнут. Если необходимо, может быть также минимизирована абсорбция пептида на стеклянной поверхности флакона с использованием боросиликатного стекла, например боросиликатного стекла №33 Wheaton Type I (Wheaton Type I-33) или его эквивалента (Wheaton Glass Co.). Другие поставщики подобных флаконов и картриджей из боросиликатного стекла, приемлемых для приготовления, включают в себя Kimbel Glass Co., West Co., Bunder Glas GMBH и Forma Vitrum. Биологические и химические свойства полипептида PPF могут быть стабилизированы приготовлением и лиофилизацией в боросиликатном Wheaton Type I-33 флаконе для сыворотки до конечной концентрации 0,1 мг/мл и 10 мг/мл полипептида PPF в присутствии 5% маннита и 0,02% Твина 80. Для создания возможности введения иглы шприца для подкожных инъекций в многодозовый флакон и обеспечения повторной герметизации сразу же после вытягивания иглы, открытый конец каждого флакона герметизируют резиновой пробкой, удерживаемой на месте полоской из алюминия. Пробки для стеклянных флаконов, такие как West 4416/50, 4416/50 (с тефлоновой облицовкой) и 4406/40, Abbott 5139 или любая эквивалентная пробка, могут быть использованы в качестве герметизации фармацевтического вещества для инъекционного раствора. Эти пробки совместимы с пептидом, а также другими компонентами композиции. Авторы изобретения обнаружили также, что эти пробки проходят тест целостности пробки при тестировании с использованием схем использования пациентом, например эта пробка может выдержать по меньшей мере приблизительно 100 инъекций. В некоторых вариантах осуществления этот пептид может быть лиофилизирован во флаконы, шприцы или картриджи для последующего восстановления. Жидкие композиции данного изобретения могут быть также помещены в одно- или двухкамерные картриджи или в одно- или двухкамерные шприцы.
В некоторых вариантах осуществления способ приготовления жидких композиций включает в себя стадии компаундирования, стерильной фильтрации и разливки. В некоторых вариантах осуществления процедура компаундирования включает в себя растворение ингредиентов в указанном порядке (консервант, затем стабилизатор/агенты тоничности, буферы и пептид) или одновременное растворение.
Фармакопея Соединенных Штатов (USP) указывает, что к препаратам, содержащимся в многодозовых контейнерах, должны быть добавлены антимикробные агенты в бактериостатических или фунгистатических концентрациях. Они должны присутствовать в адекватной концентрации в момент использования для предотвращения размножения микроорганизмов, нечаянно введенных в препарат при оттягивании части содержимого гиподермической иглой и шприцом или при использовании инвазивных средств для доставки, таких как инжекторы в виде «ручки». Антимикробные агенты должны быть оценены для гарантии совместимости со всеми другими компонентами смеси, и их активность должна быть оценена в общей смеси для гарантии того, что конкретный агент, который является эффективным в одной композиции, не является неэффективным в другой композиции. Нередко обнаруживается, что конкретный антимикробный агент будет эффективным в одной композиции, но неэффективным в другой композиции.
В конкретном варианте осуществления данного изобретения фармацевтическая композиция по данному изобретению может содержать диапазон концентраций соединений PPF, например приблизительно 0,01 масс.% - приблизительно 98 масс.%, или приблизительно 1 масс.% - приблизительно 98 масс.%, или приблизительно 80 масс.% - 90 масс.%, или приблизительно 0,01 масс.% - 50 масс.%, или приблизительно 10 масс.% - приблизительно 25 масс.%. Для получения желаемой концентрации раствора может быть добавлено достаточное количество воды для инъекционных растворов. Описанные здесь фармацевтические композиции могут быть лиофилизированы. Примерная композиция может быть композицией 1 мг/мл соединения PPF в 10 мМ натрий-ацетатном буферном растворе, рН 4,2, содержащем 9,3% сахарозу в качестве модификатора осмоляльности.
Могут присутствовать агенты тоничности, такие как хлорид натрия, а также другие известные эксципиенты, если желательно. Если такие эксципиенты присутствуют, может быть предпочтительным поддержание общей тоничности полипептида PPF. Эксципиент может быть включен в описанные здесь композиции в различных концентрациях. Например, эксципиент может быть включен в диапазоне концентраций приблизительно 0,02 масс.% - приблизительно 20 масс.%, приблизительно 0,02 масс.% - приблизительно 0,5 масс.%, приблизительно 0,02 масс.% - приблизительно 10 масс.% или приблизительно 1 масс.% - приблизительно 20 масс.%. Кроме того, подобно самим композициям по данному изобретению, эксципиент может быть включен в твердой (в том числе порошкообразной), жидкой, полутвердой форме или в форме геля.
В этих композициях могут присутствовать другие компоненты. Такие дополнительные ингредиенты могут включать в себя, например, увлажняющие агенты, эмульгаторы, масла, антиоксиданты, объемные агенты, модификаторы тоничности, хелатообразующие агенты, ионы металлов, маслянистые носители, белки (например, сывороточный альбумин, желатин или белки человека) и цвиттерион (например, аминокислоту, такую как бетаин, таурин, глицин, лизин и гистидин). Кроме того, растворы полимеров или смеси с полимерами обеспечивают возможность контролируемого высвобождения этого пептида. Такие дополнительные ингредиенты, конечно, не должны оказывать вредного действия на общую стабильность композиции по изобретению.
Обычно терапевтически или профилактически эффективное количество полипептидов PPF данного изобретения будет определяться возрастом, массой и состоянием или тяжестью заболеваний или метаболических состояний или нарушений реципиента. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences 697-773. См. также Wang and Hanson, Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers, Journal of Parenteral Sciеnce and Technology, Technical Report № 10, Suppl. 42:2S (1988). Обычно может быть использована доза приблизительно 0,001 мкг/кг массы тела/день - приблизительно 1000 мкг/кг массы тела/день, как будет понятно квалифицированному в данной области практику. Введение дозы может быть один раз, два, три, четыре или более раз в день или менее часто, например один раз в неделю, один раз в месяц или один раз в квартал, в зависимости от композиции и может выполняться вместе с другими композициями, как описано здесь.
Подходящие дозы могут быть определены с использованием установленных анализов для определения уровня метаболических состояний или нарушений вместе с релевантными данными доза-ответ. Конечная схема введения будет определяться лечащим врачом с учетом факторов, которые модифицируют действие лекарственных средств, например удельной активности лекарственного средства, состояния, массы тела, пола и диеты пациента, тяжести любой инфекции, времени введения и других клинических факторов. По мере проведения исследований будет появляться дополнительная информация в отношении подходящих уровней доз и продолжительности лечения для конкретных заболеваний и состояний.
В некоторых вариантах осуществления эффективная доза будет обычно в диапазоне приблизительно 0,5 мкг - приблизительно 5 мг/день, приблизительно 10 мкг - приблизительно 2 мг/день, приблизительно 100 мкг - приблизительно 1 мг/день или приблизительно 5 мкг - приблизительно 500 мкг/день, вводимая в виде единственной дозы или в виде разделенных двух, трех, четырех или более введений. Таким образом, примерные дозы могут быть произведены из общего количества лекарственного средства, которое должно предоставляться в день, и количества доз, вводимых в день. Примерные дозы могут быть в диапазоне приблизительно 0,125 мкг на дозу (0,5 мкг, предоставляемые четыре раза в день) - приблизительно 5 мг на дозу (5 мг, предоставляемые один раз в день). Другие дозы могут быть в диапазоне приблизительно 0,01 - приблизительно 250 мкг/кг на дозу. Точная доза, которая должна быть введена, может быть определена квалифицированным в данной области специалистом и зависит от эффективности конкретного соединения, а также от возраста, массы и состояния индивидуума. Введение должно начинаться всякий раз, когда желательным является супрессия доступности нутриентов, потребления пищи, снижения глюкозы крови или липидов плазмы, например при первом признаке симптомов или вскоре после диагностики ожирения, сахарного диабета или синдрома инсулинорезистентности. Введение может выполняться любым способом, например инъекцией, подкожной или внутримышечной, пероральной, назальной, трансдермальной и т.д. Дозы для определенных способов, например для перорального введения, могут быть увеличены вследствие уменьшенной биодоступности, например, приблизительно в 5-100 раз.
В некоторых вариантах осуществления, когда фармацевтическая композиция должна вводиться парентерально, эта композиция является препаратом для доставки дозы полипептида PPF в диапазоне от 0,1 мкг/кг до 100 мг/кг массы тела/день. В некоторых вариантах осуществления диапазон доз равен 1 мкг/кг - приблизительно 50 мг/кг массы тела/день. Примерные суточные количества могут находиться в диапазоне от нижнего предела 2, 5, 10, 20, 40, 60 или 80 до верхнего предела 80, 100, 150, 200 или 250. Парентеральное введение может проводиться с начальным болюсом с последующей непрерывной инфузией для поддержания терапевтических циркулирующих уровней лекарственного продукта. Квалифицированные в данной области специалисты смогут легко оптимизировать эффективные дозы и схемы введения, как определено хорошей медицинской практикой и клиническим состоянием индивидуального пациента.
Частота введения доз будет зависеть от фармакокинетических параметров агентов и способов введения. Оптимальная фармацевтическая композиция будет определяться квалифицированным в данной области специалистом в зависимости от способа введения и желаемой дозы. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra, p. 1435-1712. Такие композиции могут влиять на физическое состояние, стабильность, степень высвобождения in vivo и скорость клиренса in vivo введенных агентов. В зависимости от способа введения подходящая доза может быть рассчитана в соответствии с массой тела, площадями поверхностей тела или размером органа. Дополнительное уточнение расчетов, необходимое для определения подходящей дозы лечения, выполняется рутинным образом квалифицированными в данной области специалистами без чрезмерного экспериментирования, в частности в свете информации для доз и описанных здесь анализов, а также фармакокинетических данных, наблюдаемых в испытаниях на животных и клинических испытаниях на людях.
Должно быть понятно, что фармацевтические композиции и способы лечения по данному изобретению могут быть применимы в областях медицины человека и ветеринарной медицины. Таким образом, субъектом, подлежащим лечению, могут быть, например, сельскохозяйственные животные, в том числе коровы, овцы, лошади и козы, домашние животные, такие как собаки и кошки, экзотические животные и/или животные зоопарка, лабораторные животные, в том числе мыши, крысы, кролики, морские свинки и хомячки, и домашняя птица, в том числе куры, индейки, утки и гуси.
Кроме того, данное изобретение относится к набору, содержащему полипептид PPF по изобретению, компоненты, подходящие для приготовления указанного полипептида PPF по изобретению для фармацевтического применения, и инструкции для использования указанного полипептида PPF и компонентов для фармацевтического применения.
Для лучшего понимания данного изобретения включены следующие примеры. Примеры, касающиеся изобретения, конечно, не должны рассматриваться как конкретно ограничивающие это изобретение, и предполагается, что такие вариации по изобретению, известные теперь или разработанные позднее, которые находятся в сфере компетенции квалифицированного в данной области специалиста, находятся в объеме изобретения, описанного здесь и после этого в формуле изобретения.
ПРИМЕРЫ
Данное изобретение описывается более конкретно со ссылкой на следующие не ограничивающие примеры, которые предоставлены для более полной иллюстрации по изобретению, но не должны рассматриваться как ограничение его объема. Эти примеры иллюстрируют получение данных полипептидов PPF и испытание полипептидов PPF по изобретению in vitro и in vivo. Квалифицированным в данной области специалистам будет понятно, что описанные в этих примерах способы представляют наилучшие способы применения на практике и представляют способы, описанные авторами изобретения, для хорошего функционирования в применении на практике по изобретению. Однако квалифицированным в данной области специалистам должно быть понятно в свете данного описания, что могут быть произведены многие изменения в конкретных описанных способах и получен подобный или сходный результат без отклонения от идеи и объема по изобретению.
Пример 1. Получение полипептидов PPF
Пептиды по изобретению могут быть собраны на пептидном синтезаторе Symphony (Protein Technologies, Inc.) с использованием амидной смолы Ринка (Novabiochem) с нагрузкой 0,43-0,49 ммоль/г при 0,050-0,100 ммоль. Остатки Fmoc-аминокислот (5,0 экв., 0,250-0,500 ммоль) растворяют при концентрации 0,10 М в 1-метил-2-пирролидиноне (NMP). Другие реагенты ((гексафторфосфат О-бензотриазол-N,N,N'N'-тетраметилурония (HBTU), гидрат 1-гидроксибензотриазола (HOВt) и N,N-диизопропилэтиламин (DIEA) получают в виде 0,55 М растворов в диметилформамиде. Затем Fmoc-защищенные аминокислоты связывают со связанной со смолой аминокислотой с использованием HBTU (2,0 экв., 0,100-0,200 ммоль), гидрата 1-гидроксибензотриазола (1,8 экв., 0,090-0,18 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламина (2,4 экв., 0,120-0,240 ммоль) в течение 2 часов. После связывания последней аминокислоты этот пептид освобождают от защитных групп с использованием 20% (об./об.) пиперидина в диметилформамиде (ДМФ) в течение 1 часа. Когда последовательность пептида является полной, пептидный синтезатор Symphony программируют для отщепления пептида от смолы. Отщепление пептида от смолы трифторуксусной кислотой (ТФУ) проводят с использованием 93% ТФУ, 3% фенола, 3% воды и 1% триизопропилсилана в течение 1 часа. Отщепленный пептид осаждают с использованием трет-бутилового метилового эфира, осаждают центрифугированием и лиофилизируют. Осадок перерастворяют в воде (10-15 мл), фильтруют и очищают обращенно-фазовой ВЖХ с использованием колонки С18 и градиента ацетонитрил/вода, содержащего 0,1% ТФУ. Полученные пептиды очищают до гомогенности обращенно-фазовой ВЖХ и чистоту подтверждают при помощи LC/MS.
2
2
2
2
Общая процедура N-кэппирования пептидов по изобретению жирными кислотами и ацильными функциональными группами (например, октановой кислотой и стеариновой кислотой и изокапроильной и изобутилоксикарбонильной модификациями) является следующей: пептид на амидной смоле Ринка (0,1 ммоль) суспендируют в NMP (5 мл). В отдельном флаконе HBTU (0,3 ммоль), HOВt (0,3 ммоль) растворяют в ДМФ (5 мл) с последующим добавлением DIEA (0,6 ммоль). Этот раствор добавляют к смоле и эту суспензию встряхивают в течение 2 часов. Растворитель фильтруют и промывают тщательно NMP (5 мл х 4) и CHCl (20 мл), сушат и подвергают ТФУ-расщеплению в течение 1 часа. Выход желаемого пептида равен приблизительно 40 мг после отщепления и очистки. Производные N-карбамата (изобутилокси, изопропилокси, н-бутилокси, этокси) получали связыванием соответствующих карбонилхлоридов и пептидов на амидной смоле Ринка с использованием DIEA, DMAP и сухого CHCl.
Общая процедура для включения жирных кислот на ε-аминогруппу лизина является следующей: модификации проводили в растворе на не содержащем ε-аминогруппы лизине очищенного пептида в присутствии жирной кислоты и активирующего агента (HBTYU/HOВt) в ДМФ. Полученные производные очищают обращенно-фазовой ВЖХ и чистоту подтверждают LC/MS.
ПЭГ-модификация может проводиться в растворе на не содержащем ε-аминогруппы лизине очищенного пептида с использованием коммерчески доступных активированных ПЭГ сложных эфиров. Полученные ПЭГилированные производные очищают до гомогенности обращенно-фазовой ВЖХ и чистоту подтверждают LC/MS и MALDI-MS.
Образование внутримолекулярных дисульфидных связей может выполняться на свободных цистеинах с использованием иода/уксусной кислоты в качестве окислителя.
Полипептиды PPF по изобретению могут быть испытаны в различных биологических анализах in vitro, в том числе анализах связывания Y-рецептора, использующих методологии анализа связывания, обычно известные квалифицированным в данной области специалистам, или in vivo, с использованием анализов потребления пищи, массы тела и состава тела, использующих методологии, обычно известные квалифицированным в данной области специалистам. Примерные анализы включают в себя анализы, описанные ниже.
Анализы на передачу сигнала G
/G
-связанными рецепторами:
i
0
s
q
i
0
s
i
0
q
i
0
q
i
0
i
0
Без намерения ограничения теорией авторы считают, что передача сигнала G-белок-связанного рецептора (GPCR), опосредованная гетеротримерными G-белками, может быть подразделена на классы передачи сигнала на основе состава альфа-субъединиц. G-, G- и G/G-белки опосредуют внутриклеточную передачу сигнала через активацию путей передачи сигнала, приводящих к различным физиологическим конечным точкам. Активация G- и G/G-связанных рецепторов приводит к стимуляции или ингибированию аденилатциклазы соответственно, тогда как активация G-связанных рецепторов приводит к стимуляции фосфолипазы С (PLC) и увеличению внутриклеточной концентрации кальция. Измерение уменьшения цАМФ, происходящего из активации G/G-связанных рецепторов, может быть технически трудным, тогда как измерение G-связанного увеличения внутриклеточного кальция является относительно более легким. Таким образом, были разработаны анализы для оценки активности G/G-связанных рецепторов с использованием клеток, котрансфицированных разнородными G-альфа-субъединицами, для изменения направления передачи сигнала G/G через фосфолипазу (PLC) и с использованием репортерных генов или кальций-чувствительных флуорофоров, которые известны в данной области. Эти анализы могут быть использованы для оценки способности полипептидов PPF действовать в качестве агонистов или антагонистов при Y-рецепторах. См., например, Stables et al., (1997) Anal. Biochem. 252(1):115-26.
Анализ связывания рецептора NPY Y1:
125
Мембраны получают из конфлюэнтных культур клеток SK-N-MC, которые эндогенно экспрессируют рецепторы нейропептида Y1. Мембраны инкубируют с 60 пМ [I]-пептидом YY человека (2200 Ки/ммоль, PerkinElmer Life Sciences) и с немеченым полипептидом PPF в течение 60 минут при температуре окружающей среды в 96-луночном полистироловом планшете. Затем содержимое лунок собирают на 96-луночный планшет из стеклянного волокна с использованием харвестора для планшетов Perkin Elmer. Высушенные планшеты из стеклянного волокна объединяют со сцинтиллятором и считают на сцинтилляционном счетчике Perkin Elmer.
Анализ связывания рецептора NPY Y2:
125
Мембраны получают из конфлюэнтных культур клеток SK-N-ВЕ, которые эндогенно экспрессируют рецепторы нейропептида Y2. Мембраны инкубируют с 30 пМ [I]-пептидом YY человека (2200 Ки/ммоль, PerkinElmer Life Sciences) и с немеченым полипептидом PPF в течение 60 минут при температуре окружающей среды в 96-луночном полистироловом планшете. Затем содержимое лунок собирают на 96-луночный планшет из стеклянного волокна с использованием харвестора для планшетов Perkin Elmer. Высушенные планшеты из стеклянного волокна объединяют со сцинтиллятором и считают на сцинтилляционном счетчике Perkin Elmer.
Анализ связывания рецептора NPY Y4:
125
Клетки СНО-К1 транзиторно трансфицируют кДНК, кодирующей ген нейропептида Y4 и затем спустя сорок восемь часов мембраны получают из конфлюэнтных культур клеток. Мембраны инкубируют с панкреатическим 18 пМ [I]-полипептидом YY человека (2200 Ки/ммоль, PerkinElmer Life Sciences) и с немеченым полипептидом PPF в течение 60 минут при температуре окружающей среды в 96-луночном полистироловом планшете. Затем содержимое лунок собирают на 96-луночный планшет из стеклянного волокна с использованием харвестора для планшетов Perkin Elmer. Высушенные планшеты из стеклянного волокна объединяют со сцинтиллятором и считают на сцинтилляционном счетчике Perkin Elmer.
Анализ связывания рецептора NPY Y5:
125
Клетки СНО-К1 транзиторно трансфицируют кДНК, кодирующей ген нейропептида Y5 и затем спустя сорок восемь часов мембраны получают из конфлюэнтных культур клеток. Мембраны инкубируют с 44 пМ [I]-полипептидом YY человека (2200 Ки/ммоль, PerkinElmer Life Sciences) и с немеченым полипептидом PPF в течение 60 минут при температуре окружающей среды в 96-луночном полистироловом планшете. Затем содержимое лунок собирают на 96-луночный планшет из стеклянного волокна с использованием харвестора для планшетов Perkin Elmer. Высушенные планшеты из стеклянного волокна объединяют со сцинтиллятором и считают на сцинтилляционном счетчике Perkin Elmer.
Таблица 2 демонстрирует некоторые полипептиды PPF по изобретению и их активность в различных анализах связывания Y-рецептора, таких как анализы, описанные выше.
Таблица 2:
Пример 2. Полипептиды PPF подавляют потребление пищи в анализе потребления пищи
Самок мышей NIH/Swiss (в возрасте 8-24 недель) содержат с циклом 12:12 часов свет-темнота со светом, включаемым при 06.00 ч. Вода и стандартный гранулированный мышиный рацион являются доступными ad libitum за исключением указанных случаев. Животные голодают, начиная при приблизительно 15.00 ч, за один день перед экспериментом. Утром перед экспериментом животных делят на экспериментальные группы. В типичном исследовании n=4 клетки с 3 мышами на клетку.
При времени, равном 0 мин, всем животным производят внутрибрюшинную инъекцию носителя или соединения в количестве в диапазоне от приблизительно 10 нмоль/кг до 100 нмоль/кг и немедленно дают предварительно взвешенное количество (10-15 г) стандартной смеси. Корм удаляют и взвешивают при 30, 60 и 120 мин для определения количества потребленного корма (Morley, Flood et al., Am. J. Physiol. 267: R178-R184, 1994). Потребление корма рассчитывают вычитанием массы корма, остающейся при временных точках, например 30, 60 и 120, 180 и/или 240 мин, из массы корма, предоставленной первоначально при времени = 0. Значимые эффекты обработки идентифицировали при помощи ANOVA (p<0,05). В тех случаях, где существует значимое различие, средние величины теста сравнивают со средней величиной контроля с использованием критерия Дуннетта (Prism v. 2.01, GraphPad Software Inc., San Diego, California).
Фиг.1-4 показывают способность нескольких полипептидов PPF по изобретению уменьшать кумулятивное потребление пищи в анализе потребления пищи, описанном выше. Кроме того, фиг.40 показывает, что было обнаружено, что экстренное (краткосрочное) введение соединения 4883 полипептида PPF является более эффективным, чем PYY(3-36), в уменьшении потребления пищи в моделях мыши NIH/Swiss и крысы HSD.
Пример 3. Полипептиды PPF уменьшают прибавление массы тела во вскармливаемых кормом с высоким содержанием жира (индуцированное рационом ожирение, или DIO) мышах С57BL/6 и вскармливаемых кормом с высоким содержанием жира крысах HSD.
Мыши: Самцов мышей С57BL/6 (в возрасте 4 недель в начале исследования) кормят кормом с высоким содержанием жира (HF, 58% ккал рациона в виде жира) или кормом с низким содержанием жира (LF, 11% ккал рациона в виде жира). После 4 недель на этом корме каждой мыши имплантируют осмотический насос (Alzet # 2002), который доставляет подкожно заданную дозу полипептида PPF непрерывно в течение двух недель. Массу тела и потребление корма измеряют еженедельно (Surwit et al., Metabolism - Clinical and Experimental, 44: 645-51, 1995). Действия тест-соединений выражают в виде среднего ± стандартное отклонение (SD) % изменения массы тела (т.е. % изменение от исходной массы) по меньшей мере 14 мышей на группу обработки (p<0,05 ANOVA, критерий Дуннетта, Prism v. 2.01, GraphPad Software Inc., San Diego, California).
Крысы: Вечером перед обработкой самцов крыс Sprague-Dawley (средняя масса = 415), получавших рацион с высоким содержанием жира (45% ккал из жира), распределяли в две группы обработки на основе равных 24 ч потребления корма. В вечер испытания каждое животное получало единственную инъекцию носителя (10% ДМСО) или Соединения (1 мг/кг) непосредственно перед выключением света (18.00 ч) и затем животных помещали индивидуально в автоматизированную клетку для кормления DietPro. Каждая клетка содержит кормораздаточный бункер, опирающийся на чашу весов, подсоединенную к компьютеру, и бутылку с водой. Ежечасное потребление корма (в граммах) регистрируют в течение следующих 24 часов. Животные получали инъекции в течение следующих шести последовательных вечеров. Массы тела регистрировали каждый вечер.
Фиг.5-6 демонстрируют способность нескольких полипептидов PPF по изобретению уменьшать прирост массы тела в описанном выше анализе для мышей DIO. Фиг.7 демонстрирует, что инъекции один раз в день приводили к значимому уменьшению прироста массы тела в нескольких вечерах (Р<0,05) в крысах, получавших рацион с высоким содержанием жира. Например, фиг.8 демонстрирует, что полипептид PPF по изобретению проявляет более высокую эффективность, чем PYY(3-36), как в анализе потребления пищи, так и в анализе мышей DIO. Например, фиг.42 демонстрирует действия другого полипептида PPF по изобретению на картину кормления и показывает, что соединение 4883 (полипептид PPF) уменьшает потребление корма в вечера 3 и 5, значимо уменьшает массу на протяжении семи дней и уменьшает общее потребление корма в течение шести дней.
Пример 4. Полипептиды PPF уменьшают кровяное давление
о
Самцов крыс Harlan Sprague-Dawley (HSD), содержавшихся при 22,8 ± 0,8С при цикле 12:12 часов свет:темнота, использовали для исследования действий полипептидов PPF на кровеносную систему с использованием телеметрии. Эксперименты выполняли во время светового цикла. Телеметрия делает возможными гемодинамические регистрации показателей реального времени, включающих в себя артериальное кровяное давление, частоту сердечных сокращений и артериальное dP/dt, посредством имплантированного радиопередатчика в неусыпленных, неанестезированных, не ограниченных в движениях крыс. В этом примере крыс инъецировали носителем, 10 нмоль/кг PYY, 10 нмоль/кг PYY(3-36) или 10 нмоль/кг нескольких полипептидов PPF дистанционно управляемым внутривенным введением доз. Дистанционно управляемое введение доз достигается посредством постоянных васкулярных портов доступа (Access Technology (Skokie, IL). Такой порт прикреплен к лежащей ниже мышце непосредственно под кожей между лопатками. Этот катетер находится в яремной вене. Данные собирали в течение 60 минут после инъекции.
Как показано на фиг.9А-В, действия соединения 4676 в отношении увеличения среднего артериального давления (МАР) являются сходными с действиями PYY(3-36). Фиг.9С-D показывают, что, хотя действия соединения 4247 в отношении увеличения среднего артериального давления и уменьшения частоты сердечных сокращений являются сходными с действиями PYY(1-36), эти действия являются притупленными при использовании соединения 4560.
Фиг.46 демонстрирует, что соединение 4753, являющееся полипептидом PPF, также уменьшает скорость сердечных сокращений в сравнении с PYY (3-36), хотя его действие на МАР сравнимо с действием PYY(3-36). Фиг.47 демонстрирует, что действия соединения 4883 (полипептида PPF) на частоту сердечных сокращений и МАР являются сравнимыми с действиями PYY(3-36).
Пример 5. Противосекреторные действия PYY и агонистов PYY
Секреция кислоты желудочного сока
о
Самцов крыс Harlan Sprague-Dawley (HSD) содержали при 22,8 ± 0,8С при цикле 12:12 часов свет:темнота. Эксперименты выполняли во время светового цикла. Животных, получавших корм для крыс (Teklad LM 485, Madison, WI), подвергали голоданию в течение приблизительно 20 часов перед проведением эксперимента. Им давали свободный доступ к воде до начала эксперимента.
Крыс (в возрасте 11-16 недель с массой тела 291-365 г) хирургически обеспечивали желудочной фистулой, изготовленной на заказ David Osborne, Deparftment of Biology, UCLA. Голодавших в течение ночи крыс взвешивали и их желудочные фистулы открывали и подсоединяли к гибкой трубке Tygon (3/8 х 1/16), в которую вставляли кусок трубки РЕ205, который мог удлиняться в желудок. Солевой раствор инъецировали через более узкую трубку РЕ205 и эффлюент собирали из трубки Tygon. Для гарантии правильного протекания через фистулу и пустой желудок желудок промывали несколько раз ~5 мл солевого раствора при комнатной температуре, пока протекание не становилось легким и эффлюент не становился прозрачным. Секрецию кислоты желудочного сока измеряли при 10-минутных интервалах инъекцией 5 мл солевого раствора (рН 7,0) с последующими 3 мл воздуха и сбором эффлюента. Три мл каждого желудочного аспирата титровали до 7,0 0,01 н. гидроксидом натрия с использованием рН-метра (Beckman model number PHI34 Fullerton, CA). Количество основания, требующегося для каждого титрования, корректированное на общий собранный объем, использовали для расчета молей кислоты в каждой пробе.
После сбора пробы фона и регистрации извлеченного объема животному вводили подкожную инъекцию 125 мкг/кг пентагастрина (Sigma, lot#40K0616) и затем 10-минутное взятие проб продолжали в течение дополнительных 2 часов. Спустя 40 минут после инъекции пентагастрина, когда обычно наблюдали стабильное плато секреции кислоты желудочного сока, крысам вводили подкожную инъекцию PYY(3-36) в дозе на одно животное 1, 3, 10, 100 мкг или солевой раствор (3,45, 10,34, 344,8 мкг/кг, соответственно) в крысу с массой 290 граммов (n=3, 2, 4, 4, 6 соответственно).
50
Как показано на фиг.10, выход кислоты желудочного сока выражали в виде % от стимулированной пентагастрином секреции, рассчитанного как среднее временных точек 20, 30 и 40 минут после инъекции пентагастрина. В ответ на пентагастрин секреция кислоты желудочного сока увеличивалась в 6,8 раз от скорости фона 9,3±5,8 мкмоль/10 мин до 62,8±3,8 мкмоль/10 мин 40 мин после инъекции (итоговые средние значения: P<0,01). PYY(3-36), инъецированный спустя 40 минут после пентагастрина, зависимым от дозы образом и значимо ингибировал продуцирование кислоты желудочного сока. С дозами 10 мкг (34,5 мкг/кг) и 100 мкг (344,8 мкг/кг) секреция PYY(3-36) уменьшалась на 74,7±7,2% и 84,7±9,7%, соответственно (Р<0,05 и Р<0,01; t-критерий, 20 минут после инъекции PYY(3-36) (см. t=60 мин на фиг.11-17). Зависимость от дозы для ингибирования PYY(3-36) стимулируемой пентагастрином секреции кислоты показана на фиг.11. ED для действия PYY(3-36) на секрецию кислоты была 11,31 мкг/кг ± 0,054 log-единиц.
Опорожнение желудка
area postrema
о
Для определения действий PYY(3-36) на опорожнение желудка не подвергнутых анестезии и не подвергнутых голоданию самцов крыс Harlan Sprague-Dawley случайным образом распределяли на три группы общей обработки: 1) для животных, обозначенных как “APx”, повреждения вакуумной аспирацией производили в ; 2) для животных, обозначенных “Sham”, для контроля на действия хирургии, выполняли ложные операции, в которых область краниального района хирургически открывали, но повреждение головного мозга не производили, и 3) неоперированные контрольные животные, обозначенные “Контроль”, не подвергались хирургии. Затем для каждой из этих трех групп общей обработки животных делили на группы введения доз, в которых им вводили либо только солевой раствор, либо болюсные дозы 3, 30, 90 или 300 мкг/кг PYY(3-36), растворенные в солевом растворе. Эксперименты выполняли спустя по меньшей мере две недели после хирургии (масса 426±8 г) и снова спустя три недели (масса 544±9 г). Всех крыс содержали при 22,7С в цикле 12:12 ч свет:темнота (эксперименты выполняли во время светового цикла) и кормили и снабжали водой ad libitum (диета LM-485 Teklad, Madison, Wisconsin, USA).
3
PYY(3-36), растворенный в солевом растворе, вводили в виде болюса 0,1 мл за 5 минут перед введением через желудочный зонд 5 мКи D-[3-Н]-глюкозы (lot#3165036 Dupont, Wilmington, DE, USA) в 1 мл воды. Носитель или различные дозы PYY вводили подкожно после того, как животные получали пероральный жидкий корм.
Использовали 15 групп обработки:
(1) Контроль солевой раствор(2) Контроль 3 мкг/кг(3) Контроль 30 мкг/кг(4) Контроль 90 мкг/кг(5) Контроль 300 мкг/кг(6) Солевой раствор (ложнооперированные крысы)(7) 3 мкг/кг (ложнооперированные крысы)(8) 30 мкг/кг (ложнооперированные крысы)(9) 90 мкг/кг (ложнооперированные крысы)(10) 300 мкг/кг (ложнооперированные крысы)(11) АРх солевой раствор(12) АРх 3 мкг/кг(13) АРх 30 мкг/кг(14) АРх 90 мкг/кг(15) АРх 300 мкг/кг
n=4n=3n=4n=5n=5n=5n=2n=4n=3n=5n=5n=3n=3n=3n=5
Кровь брали из анестезированных хвостов крыс при -15, 0, 5, 15, 30, 60 и 90 мин после введения через желудочный зонд и плазму отделяли для измерения происходящего из глюкозы трития (имп./мин на 10 мкл при счете в β-счетчике). Ранее было показано, что появление трития в плазме отражает опорожнение желудка. Интегрированное появление трития в плазме рассчитывали с использованием трапецеидального способа в виде приращения выше уровней, имеющихся перед введением трития через желудочный зонд (площади под кривой (AUC) в течение 30 минут).
50
В неоперированных контрольных крысах PYY(3-36) зависимым от дозы образом ингибировал появление метки (10,5±1,5, 7,26±1,52 и 3,20 ± 1,21 имп./мин/мкл/мин для 30 мкг/кг, 90 мкг/кг, 300 мкг/кг соответственно; Р<0,0001 ANOVA; см. фиг.12 и 13). В ложнооперированных крысах инъекции 30 мкг/кг (n=4) и 90 мкг/кг PYY(3-36) (n=3) также задерживали появление метки в сравнении с инъецированными солевым раствором контролями (n=5) зависимым от дозы образом (11,89±3,23, 9,88±2,45, 18,94±3,23 имп./мин/мкл/мин соответственно; Р<0,05 ANOVA; см. фиг.14 и 15). Максимальное действие PYY в ложнооперированных животных было меньшим в сравнении с интактными неоперированными контрольными крысами с ED, также более низкой, чем в неоперированных контрольных животных (уменьшения от 43,77 до 10,20 мкг/кг PYY(3-36). В крысах АРх опорожнение желудка было замедленным в сравнении с опорожнением желудка в ложнооперированных или неоперированных контрольных крысах (9,38 ± 3,25 имп./мкл/мин; Р<0,05, см. фиг.16 и 17), но не изменялось введением PYY(3-36). Регрессионный анализ подтвердил отсутствие зависимости от дозы.
Результаты показали, что PYY(3-36) в сильной степени регулирует скорость опорожнения желудка в нормальных крысах Sprague-Dawley. Зависимое от дозы ингибирование опорожнения желудка наблюдали после инъекции PYY(3-36) (30, 90 и 300 мкг/кг). АР-поврежденные животные имели тенденцию задерживать опорожнение желудка в сравнении с неоперированными контрольными и ложнооперированными крысами (n.s.). Введение PYY(3-36) не имело дополнительного действия на скорость опорожнения желудка в АР-поврежденных животных.
Фиг.45 демонстрирует, что введение полипептида PPF (соединения 4883) является более эффективным, чем введение PYY(3-36) в ингибировании опорожнения желудка.
Опорожнение желчного пузыря
о
В процессах нормального усвоения пищи скорости опорожнения желудка и скорости опорожнения желчного пузыря могут быть координированными. Сообщалось, что циркулирующий PYY подавляет головную фазу возникающего после приема пищи опорожнения желчного пузыря, но не стимулируемое едой максимальное опорожнение. Высказывалась также гипотеза, что действие PYY на опорожнение желчного пузыря опосредовано зависимыми от блуждающего нерва, а не зависимыми от холецистокинина путями (Hoentjen F. et al., Scand. J. Gastroenterol. 2001 36(10): 1086-91). Для определения действия PYY(3-36) на опорожнение желчного пузыря восьминедельных самцов мышей NIH Swiss содержали при 22,8 ±0,8С при цикле 12:12 ч свет:темнота и предоставляли ad libitum доступ к стандартному рациону для грызунов (Teklad LM 7012, Madison, WI) и воде. Мышей лишали корма на период 3 часов перед выполнением эксперимента. При t=0, PYY(3-36), ССК-8 или солевой раствор инъецировали подкожно в неанестезированных мышей. Спустя тридцать минут мышей эвтанизировали цервикальным смещением, выполняли лапаротомию по средней линии и желчный пузырь иссекали и взвешивали.
Группы обработки:
Группа А: 100 мкл солевого раствора подкожно при t=0, n=14.
Группа В: PYY(3-36) 1 мкг/кг подкожно при t=0, n=6.
Группа С: PYY(3-36) 10 мкг/кг подкожно при t=0, n=10.
Группа D: PYY(3-36) 100 мкг/кг подкожно при t=0, n=8.
Группа Е: ССК-8 1 мкг/кг подкожно при t=0, n=3.
Группа F: CCK-8 10 мкг/кг подкожно при t=0, n=3.
Группа G: PYY(3-36) 10 мкг/кг + CCK 1 мкг/кг подкожно при t=0, n=4.
Группа Н: PYY(3-36) 10 мкг/кг + CCK 10 мкг/кг подкожно при t=0, n=4.
50
Эти результаты показаны на фиг.18 и 19. PYY(3-36) зависимым от дозы образом ингибировал фоновое опорожнение желчного пузыря с ED 9,94 мкг/кг ± 0,24 log-единиц. Наивысшая доза (Группа С) увеличивала массу желчного пузыря на 168% в сравнении с массой, наблюдаемой в инъецированных солевым раствором контролях (Группа А) (Р<0,005). PYY(3-36) не влиял на стимулированное ССК-8 опорожнение желчного пузыря. Эти данные указывают на то, что PYY(3-36) ингибирует опорожнение желчного пузыря через ССК-независимые пути. PYY(3-36) не влиял на опорожнение желчного пузыря в ответ на экзогенный ССК. Сходный результат был получен с PYY(1-36) в неанестезированных собаках; болюс 400 нг/кг + инфузия 800 пмоль/кг/ч не ингибировали стимулированное ССК-8 сокращение желчного пузыря.
area postrema,
Возможно, что эти действия PYY(3-36) на опорожнение желчного пузыря опосредованы вагусно-холинергическими путями. Эта идея подтверждается открытиями, что недавно были идентифицированы специфические сайты связывания пептида YY (PYY) в в ядре солитарного пучка и в дорсальных участках двигательных ядер (совместно называемых дорсальным вагусным комплексом (DVC)) в крысах. Эти медуллярные районы ствола головного мозга являются ответственными за ваговагусный контроль желудочно-кишечной функции, в том числе двигательной функции и секреции желудка и перистальтики кишечника. PYY(3-36) ингибирует другие функции пищеварения, которые опосредованы вагусно-холинергическими механизмами, такие как опорожнение желудка.
Пример 6. Желудочно-протективные действия PYY и агонистов PYY
о
Самцов крыс Harlan Sprague-Dawley (HSD) содержали при 22,8±0,8С при цикле 12:12 часов свет:темнота и предоставляли ad libitum доступ к стандартному рациону для грызунов (Teklad LM 485, Madison, WI) и воде. Этих крыс, 200-220 г, лишали корма на период приблизительно 20 часов перед выполнением эксперимента.
При t=30 PYY(3-36) или солевой раствор инъецировали подкожно (s.c.). При t=0 вводили через желудочный зонд 1 мл абсолютного спирта (этилового дегидратированного спирта пробы 200, точно соответствующего USP) или солевого раствора. При t=30 крыс анестезировали 5% изофлураном. Делали разрез лапаротомии по средней линии. Желудок открывали и лигировали при привратниковом и нижнем эзофагеальном сфинктерах. Желудок вырезали, открывали вдоль меньшей кривизны и выворачивали наизнанку для открывания слизистой оболочки. Слизистую оболочку промывали осторожно солевым раствором и ее оценивали в отношении повреждения (изъязвлений, расширенных кровеносных сосудов, отшелушивания слизистой выстилки) наблюдатели, не знающие вариантов обработки. Повреждение слизистой оболочки оценивали в баллах между 0 (нет повреждения) и 5 (100% желудка охвачена гиперемией и изъязвлениями).
Группы обработки:
2
Группа А: солевой раствор 100 мкл s.с. при t=-30, через желудочный зонд 1 мл НО при t=0, n=4.
Группа В: солевой раствор 100 мкл s.с. при t=-30, через желудочный зонд 1 мл абсолютного этанола при t=0, n=6.
Группа С: PYY(3-36) 1 мкг/кг при t=-30, через желудочный зонд 1 мл абсолютного этанола при t=0, n=5.
Группа D: PYY(3-36) 10 мкг/кг при t=-30, через желудочный зонд 1 мл абсолютного этанола при t=0, n=4.
Группа Е: PYY(3-36) 100 мкг/кг при t=-30, через желудочный зонд 1 мл абсолютного этанола при t=0, n=5.
Группа F: PYY(3-36) 300 мкг/кг при t=-30, через желудочный зонд 1 мл абсолютного этанола при t=0, n=5.
PYY(3-36) зависимым от дозы образом уменьшал оценку повреждения на 27,4±6,4, 29,3±11,6 и 53,7±7,9% (n=4,5, 5, р<0,05 ANOVA) после инъекции 10, 100 и 300 мкг/кг PYY(3-36) соответственно (фиг.20). PYY(3-36) обнаруживал желудочно-протективное действие в крысах. Эндогенно циркулирующий PYY(3-36) может играть физиологическую роль в регуляции секреции кислоты желудочного сока и защите слизистой оболочки желудка.
Примеры 7-10. Действия полипептидов PPF на потребление пищи, прирост массы тела, метаболическую скорость и состав тела
В грызунах уменьшение массы после введения PYY(3-36) может быть отнесено к уменьшенному потреблению пищи или другим процессам, влияющим на энергетический баланс (в том числе потребление энергии, распределение энергии на тканевом уровне и/или поглощение нутриентов в кишечнике). Испытывали действия непрерывной подкожной инфузии PYY(3-36) (1 мг/кг/день до 7 дней) на метаболическую скорость, сжигание (окисление) жира и/или фекальную потерю энергии в мышах с индуцированным диетой ожирением.
Уход за животными и содержание животных
о
Примеры 7-10 использовали мышиную модель индуцированного диетой ожирения (DIO). Перед периодом обработки самцов мышей C57BL/6J кормили рационом с высоким содержанием жиров (#D12331, 58% калорий из жира; Research Diets, Inc.) в течение 6 недель, начиная с возраста 4 недели. Во время исследования мышей оставляли на этом рационе с высоким содержанием жиров в порошкообразной форме на протяжении периода обработки, если нет других указаний. Воду обеспечивали ad libitum на протяжении всего этого исследования. Животных содержали при цикле 12:12 часов свет:темнота при 21-23С и предоставляли ad libitum доступ к корму до и после обработки. В некоторых вариантах осуществления восьминедельных самцов мышей NIH Swiss (не стадающих ожирением) (Harlan Teklad, Indiapolis, IN, USA), получавших стандартный смешанный рацион (Teklad #LM7012, Madison, WI), использовали в экспериментах по опорожнению желчного пузыря. Где указано, одну группу не страдающих ожирением мышей сходного возраста кормили рационом с низким содержанием жиров (#D12329, 11% калорий из жира) для целей сравнения метаболических параметров с параметрами групп DIO.
Источник пептидов
В некоторых вариантах осуществления соль трифторуксусной кислоты PYY(3-36) человека (чистота >98%) синтезировали с использованием стандартных способов (Peptisyntha, Torrance, CA) и ее идентичность подтверждали с использованием масс-спектрометрии.
Экспериментальные схемы, сбор крови и ткани для анализа состава тела
о
Исследования метаболических параметров [Исследование А], потребления нутриентов кишечником [Исследования В и С], потребление корма и состава тела [Исследования В и С] использовали мышей, которых содержали по отдельности в течение 1 недели перед обработкой. Во время периода обработки ежедневно подвергали мониторингу потребление корма и массу тела. Во время периода обработки вводили носитель (50% диметилсульфоксид в воде) и PYY(3-36) (1 мг/кг/день) непрерывной подкожной инфузией (s.c.) с использованием осмотических насосов Alzet (Durect Corp., Cupertino, CA; Models 1003D, 2001, & 2004 в течение 3-, 7-, и 28-дневных исследований соответственно), помещенных во внутрилопаточной области, при анестезии изофлураном. В конце каждого исследования животных умерщвляли после 2-4 ч голодания чрезмерной дозой изофлурана. Кровь собирали в промытые Na-гепарином шприцы сердечной пункцией и плазму немедленно замораживали. В некоторых исследованиях (исследованиях В и С) состав тела определяли при помощи абсорбциометрии с использованием рентгеновского излучения с двойной энергией (DEXA; PixiMus, GE Lunar). Билатеральные эпидидимальные жировые скопления и внутрилопаточную коричневую жировую ткань (BAT) иссекали и определяли массы. Вырезанные пробы печени помещали в RNALater (Ambion, Austin, TX) и хранили при -20С.
Непрямая калориметрия [Исследование А].
Мышей DIO акклиматизировали в клетках для непрямой калориметрии в течение 4 дней перед измерением метаболической скорости после обработки и RQ (Qxymax; software version 2.52; Columbus Instruments, Columbus, OH). CV% в животных во время 2-дневного фона перед обработкой был равен приблизительно 4,6±0,8% и 4,0±0,8% для потребления энергии цикла свет и темнота соответственно, что указывало на адекватную акклиматизацию. После имплантации осмотического насоса (контроли-носители, n=13; PYY(3-36) при 1 мг/кг/день, n=12), калориметрические измерения выполняли непрерывно на протяжении 7 дней. Образование тепла рассчитывали инструментальными программными средствами (на основе Lusk, G., (1928) The Elements of the Science of Nutrition, 4 Ed., W.B. Saunders Company, Philadelphia) и представляли относительно массы тела, измеряемой в каждый день обработки.
Анализ энергии в фекалиях [Исследования В и С].
Мышей акклиматизировали к метаболическим клеткам (Diuresis Cages; Nalge Nunc Int'l Сorp., Rochester, NY; Исследование В) или к стандартным клеткам с приподнятым проволочным решетчатым полом [Исследование С] и к порошкообразной смеси с высоким содержанием жиров в течение 4 дней перед обработкой. В Исследовании В энергетическое содержание фекалий определяли с использованием калориметрической бомбы (Covance Labs; Madison, WI). Для сбора достаточного материала использовали стратегию объединения проб для каждой мыши: сравнивали объединенные пробы из 2-дневного фонового периода индивидуумов, раннего периода обработки (дни 1, 2, 3) и позднего периода обработки (дни 5, 6, 7). В исследовании С энергетическое содержание фекалий определяли в пробах, собранных на протяжении конечных 24 часов из нижних частей клеток, выстланных абсорбирующей бумагой.
Долгосрочные действия PYY(3-36) на массу тела в мышах DIO.
50
Носитель (n=18) или PYY(3-36) (n=24; 300 мкг/кг/день, оцененная ED для изменения массы в предыдущем исследовании в этой модели (Pittner et al., (2004) Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 28: 963-71)) вводили мышам DIO s.c. при помощи осмотических насосов Alzet. При 28 днях насосы заменяли: контроли продолжали получать носитель и половина PYY(3-36)-группы (n=12) продолжала получать этот пептид. Другая половина PYY(3-36)-группы (n=12), которая получала PYY(3-36) в течение начального периода обработки, получала новые насосы, содержащие носитель, для испытания действия удаления пептида. Мышей кормили гранулярным рационом с высоким содержанием жиров и один раз в неделю регистрировали массы тела и потребление корма.
Опорожнение желчного пузыря в мышах.
Не имеющих ожирения мышей в послеабсорбционном состоянии (3 часа голодания) инъецировали s.c. солевым раствором (n=14) или PYY(3-36) при 1, 10 или 100 мкг/кг (n=6, 11, 8 соответственно). Животных умерщвляли шейным смещением при 30 минутах после инъекции и желчные пузыри извлекали и взвешивали в качестве меры скорости опорожнения желчного пузыря.
Биохимические анализы.
β-гидроксибутират плазмы (Cat. #2440, STANBIO Laboratory, Boerne, TX), глицерин (Cat. #TR0100, Sigma, St. Louis, MO) и неэтерифицированные жирные кислоты (NEFA C, Cat. #994-75409, Wako Chemicals, Richmond, VA) измеряли с использованием стандартных колориметрических анализов. Общую иммунореактивность PYY человека в плазме определяли в Linco Diagnostic Services (St. Louis, MO) с использованием радиоиммуноанализа RIA PYY человека, обнаруживающего <0,1% перекрестную реактивность с мышиным или крысиным PYY(3-36), и в среднем 39,3 нг/мл (~10 нМ) в мышах, обработанных 1 мг/кг/день PYY(3-36). Липолиз ex vivo (высвобождение глицерина на протяжении 1 часа) измеряли в препаратах ретроперитонеальных жировых скоплений с использованием способа Heffernan (Heffernan et al., (2000) Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 279: E501-7). Жировые скопления инкубировали с PYY(3-36) при концентрациях в диапазоне от высших физиологических до фармакологических уровней в плазме (0,05, 0,5 и 10 нМ). Величины сравнивали с фоновыми скоростями из необработанной жировой ткани.
Статистические сравнения между контрольными и обработанными животными во времени (Примеры 7 и 8) выполняли с использованием двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA), определяя влияния времени, обработки и взаимодействия время × обработка (Prism v. 4.01, GraphPad Software, San Diego, CA). Различия между контрольной и обработанной группами анализировали при помощи t-критериев. Различия считали статистически значимыми при р<0,05. В некоторых вариантах осуществления различия между средними величинами группы обработки для параметров, определенных во времени, анализировали с использованием дисперсионного анализа повторных измерений; после этого критерии в пределах временных точек испытывали на простые эффекты с использованием объединенной стандартной ошибки (SPSS version 13.0, Chicago, IL). Две группы сравнений проводили с использованием t-критерия Стьюдента и данные доза-ответ оценивали с использованием однофакторного ANOVA и сравнения Туки. Данные представлены в виде среднего ± SEM (стандартной ошибки среднего), причем данные с р<0,05 считали статистически значимыми.
Анализ экспрессии генов.
о
о
о
о
РНК для анализов экспрессии генов выделяли из субпопуляции тканей в соответствии с инструкциями изготовителя (RiboPure kit #1924; Ambion). Одностадийный количественный анализ ОТ-ПЦР реального времени использовали для измерения относительного содержания мРНК (ABI 790HT; Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Условиями реакции в 50 мкл были: 2,5 мкл смеси праймер/зонд Assay-on-Demand, 1Х Основная Смесь, 1Х смесь Multiscribe/ингибитор РНКазы и 50 нг РНК. Условиями ОТ-ПЦР были: 48С 30 мин, 95С 10 мин, затем 40 циклов (95С 15 сек/60С 1 мин). Для каждого гена количество циклов корректировали на вариацию нанесения с одновременным анализом относительного содержания РНК 18S с использованием коммерчески доступного набора праймер/зонд (ABI). Относительное содержание мРНК, соответствующих следующим генам, определяли с использованием наборов праймер/зонд ABI Assay-on-Demand; карнитин-пальмитоилтрансфераза 1 печеночного типа (L-CPT1 или CPT1a; Mm00550438_m1), ацетил-CoA-карбоксилаза 1 (ACC1; Mm01304257_m1), ACC2 (Mm01204677_m1), митохондриальная гидроксиметилглутарил-CoA-синтаза (HMGCS2; Mm00550050_m1), малонил-CoA-декарбоксилаза (MCD или MLYCD; Mm01245664_m1) и разобщающий белок 1 (UCP1; Mm00494069_m1). Результаты анализов экспрессии этих генов показаны в таблице 3 ниже. Относительное содержание мРНК выражено в виде различия в указанное число раз в сравнении с обработанными носителем контрольными величинами в пределах указанного времени обработки. * Р<0,05 в сравнении с носителем.
Таблица 3
Пример 7
По отдельности содержащихся мышей DIO имплантировали подкожными (SC) внутрилопаточными осмотическими насосами для доставки либо носителя (50% диметилсульфоксида [DMSO] в воде) n=13, либо синтетического PYY(3-36) человека n=12. Насосы последней группы были установлены на доставку 1000 мкг/кг/день PYY(3-36) в течение 7 дней.
2
2
Массы тела и потребление корма измеряли через регулярные интервалы на протяжении периодов исследования. Дыхательный коэффициент (RQ, определяемый в виде продуцирования СO, потребления O) и метаболическую скорость определяли с использованием непрямой калориметрии целого животного (Охутах, Columbus Instruments, Columbus, ОН).
Мышей эвтанизировали чрезмерной дозой изофлурана и измеряли показатель ожирения (массу билатеральных эпидидимальных жировых скоплений).
Пример 8
Этот эксперимент по существу повторял исследование, описанное в Примере 7, с n=9 на группу (носителя и PYY(3-36)). Однако перед определением эпидидимальной массы анализировали состав тела (сухую массу, массу жира) для каждой мыши при помощи прибора для абсорбциометрии с использованием рентгеновского излучения с двойной энергией (DEXA) в соответствии с инструкциями изготовителя (Lunar Piximus, GE Imaging System).
Фиг.21А и 21В показывают изменение массы тела в виде процента от фона для мышей DIO, которым непрерывно вводили носитель или PYY(3-36) (1000 мкг/кг/день) в течение 7 дней. Фиг.21А показывает результаты Примера 7, а фиг.21В показывает результаты Примера 8, и значимость показана как *р<0,05, **р<0,01, ***р<0,001 в сравнении с контролями.
Фиг.22А и 22В показывают изменение потребления корма в виде процента от фона для мышей DIO, которым непрерывно вводили носитель или PYY(3-36) (1000 мкг/кг/день) в течение 7 дней. Фиг.22А показывает результаты Примера 7, а фиг.22В показывает результаты Примера 8, и значимость показана как *р<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 в сравнении с контролями. По-видимому, имеется тенденция уменьшенного потребления корма в день 3 (ŧ обозначает р = 0,06) на фиг.22А и день 5 (ŧ обозначает р = 0,1) на фиг.22В.
Дыхательный коэффициент (RQ) мышей в Примере 7 измеряли и сравнивали. RQ в получавших PYY(3-36) мышах DIO уменьшался во время нескольких периодов темновых циклов и был более низким во время светового цикла на протяжении периода исследования. Величина RQ, близкая к 0,70, является показателем уверенности в том, что катаболизм жира удовлетворяет потребностям в энергии этого животного; таким образом, относительно более низкий RQ в получавших PYY(3-36) животных согласуется с увеличенной утилизацией жира для энергии в сравнении с контрольными мышами (*р<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 в сравнении с контролями). Это действие является особенно стойким во время светового цикла, когда животные находятся в послеабсорбционном состоянии (уменьшенное потребление корма в сравнении с темным циклом) (см. фиг.23А и 23В). Эти результаты указывают на то, что PYY(3-36) имеет свойства, которые запускают сжигание (окисление) жира для удовлетворения потребностей в калориях, которое может привести к предпочтительной потере жира в сравнении с белком.
Кроме того, уменьшенный RQ, наблюдаемый с введением PYY(3-36) в мышей DIO, относительно контроля с введением носителя является указанием на улучшенную утилизацию жира для энергии на тканевом и клеточном уровне (увеличенное β-окисление жирных кислот). На большую часть метаболической скорости и RQ влияет метаболизм в тканях, не содержащих жира, таких как печень и скелетные мышцы. Из этого следует, что PYY, PYY(3-36) и их агонисты могли бы быть терапевтически применимыми в ситуациях, в которых желательным является улучшенное β-окисление жирных кислот в тканях, не содержащих жира, с сохранением сухой массы тела. Примеры таких состояний включают в себя, но не ограничиваются ими, неалкогольный стеатогепатит и липодистрофию. Более конкретным примером может быть лечение пациентов со СПИДом, которые принимают ингибиторы протеаз.
Эти пациенты могут страдать от липодистрофии (неправильного распределения жира), которая имеет тенденцию к накоплению жира в области живота и туловища с одновременным уменьшением жира в руках и ногах. Задачей обработки могло бы быть уменьшение центрального жира и увеличение массы периферических мышц.
Например, фиг.24А, 24В, 25А и 25В доказывают, что PYY(3-36) и его агонисты имеют свойство предпочтительной индукции потери жира в сравнении с потерей ткани тела, не содержащей жира. Эпидидимальные жировые скопления мышей Примера 7 и Примера 8 взвешивали, и уменьшенные массы эпидидимальных жировых скоплений получавших PYY(3-36) мышей в сравнении с получавшими носитель мышами, показанные на фиг.24А и 24В, в Примерах 7 и 8 соответственно, указывают на уменьшенное ожирение в мышах DIO, получавших PYY (3-36) (**р<0,01, ***р<0,001 в сравнении с контролями). Кроме того, уменьшенное ожирение получавших PYY(3-36) мышей подтверждается определением более низкой массы жира целого животного с использованием DEXA мышей примера 8 (фиг.25А (**р<0,01 в сравнении с контролями)). Особенно интересным результатом из результатов DEXA является то, что несмотря на значимую потерю массы (фиг.21В) и потерю жира (фиг.24В и фиг.25А) сухая масса тела поддерживалась в получавших PYY(3-36) мышах и не сильно отличалась от этих параметров получавших носитель мышей (фиг.25В).
Пример 9
В этом эксперименте исследовали зависимость доза-эффект PYY(3-36) и это исследование проводили на протяжении более продолжительного периода, чем прежние эксперименты. Мышам DIO имплантировали внутрилопаточные осмотические насосы SC для доставки либо носителя (солевого раствора), либо PYY(3-36). Насосы последней группы устанавливали для доставки диапазона доз до 1000. мкг/кг/день в течение 28 дней. Массы тела и потребление корма измеряли с регулярными интервалами на протяжении периодов этого исследования.
Мышей содержали по две мыши в одной клетке. Размеры проб для массы тела и потребления корма в этом эксперименте были n=20, n=14 и n=12 для контролей с высоким содержанием жира, сравнительной группы с низким содержанием жира и получавшей корм с высоким содержанием жира и PYY(3-36) групп соответственно. Для измерения состава тела размеры проб были n=18, n=14 и n=12 для контролей с высоким содержанием жиров, сравнительной группы с низким содержанием жиров и получавшей корм с высоким содержанием жиров и PYY(3-36) групп соответственно.
Фиг.26 показывает изменение массы тела в виде процента от начальной массы тела получавших носитель мышей, вскармливаемых смесью с низким содержанием жиров, получавших носитель мышей DIO, получавших смесь с высоким содержанием жиров и получавших PYY(3-36) мышей DIO, получавших смесь с высоким содержанием жиров и PYY(3-36) групп. Увеличение доз PYY показывает увеличивающее действие на массу тела (*р<0,05 в сравнении с контролями).
Фиг.27 показывает потребление один раз в неделю корма мышей во время четырех недель исследования. Группа мышей, получавших корм с низким содержанием жиров, и мыши DIO, получавшие PYY(3-36) (1000 мкг/кг/день) и корм с высоким содержанием жиров, постоянно потребляли значимо меньше корма, чем получавшие корм с высоким содержанием жиров контроли мышей DIO, во время четырех недель этого исследования.
Фиг.28А и 28В показывают, что, хотя масса жира была более низкой у получавших корм с низким содержанием жиров мышей и мышей DIO, получавших PYY(3-36) (1000 мкг/кг/день) и корм с высоким содержанием жиров (*р<0,01; *<0,001 vs контрольные мыши DIO, получающие носитель и корм с высоким содержанием жиров), получавшие корм с низким содержанием жиров мыши имели значимо меньшую массу белка, чем контроли, получавшие корм с низким содержанием жиров. Состав всей тушки мыши определяли приближенным анализом с использованием стандартных способов (Covance Laboratories, Madison, WI).
Пример 10
В другом исследовании, сходном с исследованиями, проводимыми в Примерах 7 и 8, содержавшимся по отдельности мышам DIO имплантировали подкожные (SC) внутрилопаточные осмотические насосы для доставки либо носителя (50% диметилсульфоксида [DMSO] в воде) n=13, либо синтетического PYY(3-36) человека n=10. Насосы последней группы были установлены на доставку 1000 мкг/кг/день PYY(3-36) в течение 3 дней.
Фиг.29А и 29В показывают изменение массы тела и потребления корма соответственно в виде процента от фона для мышей DIO, которым непрерывно вводили носитель или PYY(3-36) (1000 мкг/кг/день) в течение 3 дней. Фиг.29А и 29В показывают значимое уменьшение массы тела и потребления корма в мышах DIO, которым вводили PYY(3-36), на протяжении периода обработки (*р<0,05, **р<0,01, ***р<0,001 в сравнении с контролями).
Фиг.30 показывает значимо меньшее ожирение в мышах DIO, которым вводили PYY(3-36), в сравнении с контролями, как показано более низкой массой эпидидимальных скоплений жира (**р<0,01 в сравнении с контролем). Фиг.31А показывает значимо меньшее ожирение в мышах DIO, которым вводили PYY(3-36), в сравнении с контролями, как показано определением более низкой массы жира целого животного с использованием DEXA, как описано в примере 8 (**р<0,01 в сравнении с контролем). Хотя мыши DIO, которым вводили PYY(3-36), значимо теряли массу тела и уменьшали потребление корма и имели меньшее ожирение в сравнении с контролями, фиг.31В показывает, что сухая масса тела мышей, которым вводили PYY(3-36), не отличалась значимо от контролей.
Фиг.32А и 32В показывают действия введения носителя или PYY(3-36) на метаболическую скорость во время светового цикла (верхняя панель) и темного цикла (нижняя панель) в мышах DIO. Символы: черные кружки, обработанные носителем контроли; светлые ромбы, обработанные PYY(3-36) (1 мг/кг/день) мыши, непрерывная подкожная инфузия). День 0 представляет среднюю величину фона (перед обработкой) (25,2±0,3 ккал/кг/ч и 30,8±0,3 ккал/кг/ч для светового и темного цикла соответственно).
Фиг.33 показывает действия экстренной (кратковременной) внутрибрюшинной (i.p.) инъекции PYY(3-36) на опорожнение желчного пузыря в не имеющих ожирения мышах. Изображены массы желчного пузыря, измеренные при 30 минутах после инъекции, с более высокой массой, отражающей уменьшенную базовую скорость опорожнения желчного пузыря (***р<0,001), значимо отличающуюся от обработанных солевым раствором контролей.
Фиг.34А и 34В показывают действие продолжительного введения и удаления PYY(3-36) в мышах DIO на массу тела и потребление корма соответственно. Мышей DIO обрабатывали PYY(3-36) (300 мкг/кг/день) или носителем в течение 56 дней; PYY(3-36) удаляли из некоторых животных после 28 дней и заменяли носителем. Символы: черные кружки, обработанные носителем контроли; светлые ромбы, обработанные PYY(3-36) мыши; черные ромбы, PYY(3-36) в дни 0-28, затем носитель в дни 28-56. Начальная (перед обработкой) средняя масса была 24,7±1,6 г. Масса тела значимо отличалась в PYY(3-36)-обработанных мышах во всех временных точках (р≤0,001 в сравнении с контролем-носителем); масса тела в мышах с удаленным PYY(3-36) не отличалась от контролей в день 35 или после этого.
В общем и целом наблюдали, что непрерывная подкожная инфузия PYY(3-36) (1 мг/кг/день до 7 дней) увеличивала метаболическую скорость, сжигание (окисление) жира и/или фекальную потерю энергии в имеющих индуцированное диетой ожирение (DIO) мышах. PYY(3-36) временно уменьшал потребление корма (например, на 25-43% более низкое в день 2 относительно фона перед обработкой) и уменьшал массу тела (например, на 9-10% уменьшенную в день 2 в сравнении с фоном). Действие на массу тела было продолжительным, сохраняющимся на протяжении 56-дневного исследования. Удаление PYY(3-36) после 28 дней обработки было ассоциировано с временно увеличенным потреблением корма и восстанавливало массу до контрольного уровня. Метаболическая удельная (в расчете на массу) скорость (ккал/кг/час) не отличалась от контролей. RQ светового цикла уменьшался PYY(3-36) на протяжении этого исследования (в среднем 0,730±0,006 против 0,750±0,009 в контролях; р<0,001). Дыхательный коэффициент (RQ) темного цикла временно уменьшался в PYY(3-36)-обработанных мышах (например, в день 2 0,747±0,008 против 0,786±0,004 в контролях; р<0,001). Масса эпидидимальных скоплений жира в PYY(3-36)-обработанных мышах уменьшалась на приблизительно 50%. Липолиз жировых скоплений ex vivo не стимулировался PYY(3-36), но были изменения в экспрессии генов печени, релевантных для липидного метаболизма. PYY(3-36) уменьшал базовое опорожнение желчного пузыря в не имеющих ожирения мышах; энергетическая плотность фекалий (ккал/100 г) не изменялась в достаточной степени для влияния на энергетический баланс.
о
В некоторых вариантах осуществления инбредных самцов склонных к DIO крыс получали из Charles Rivers Laboratories. Этих крыс получали из линии крыс Crl:CD(SD)BR, которые склонны становиться жирными на рационе с относительно высоким содержанием жиров и энергии. Эти животные быстро увеличивают массу и жир тела, что приводит к гипертриглицеридемическому, гиперлептинемическому и гиперинсулинемическому состоянию. Их содержали индивидуально в клетках типа коробок от туфель при 22С при цикле 12:12 часов свет:темнота. Крыс поддерживали ad libitum на корме с умеренно высоким содержанием жиров (32% ккал из жира; Research Diets D1226B) в течение 6 недель перед обработкой лекарственным средством. В конце периода откорма их массы тела были равны ~500 г. Длительное введение тест-соединений выполняли с использованием подкожного осмотического насоса. Непрямую калориметрию выполняли при 1 неделе. Аналиты плазмы анализировали в день 14 после ночного голодания. Анализы потребления корма, массы тела, увеличения массы тела, состава тела, метаболической скорости, RQ, EE, секреции кислоты желудочного сока, опорожнения желудка, опорожнения желчного пузыря и статистические сравнения выполняли, как описано выше.
Фиг.35 изображает пример зависимого от дозы уменьшения кумулятивного потребления корма и процентного изменения массы тела, наблюдаемых после введения PYY(3-36) в инбредных склонных к DIO крыс, в день 14. На основании этих данных была выбрана доза 500 мкг/кг/день PYY(3-36) для экспериментов, исследующих действия объединения PYY(3-36) с другими агентами, продаваемыми для лечения ожирения, контроля аппетита или изменения состава тела, такими как, например, но не только, амилин, агонист амилина или агонист аналога амилина, кальцитонин лосося, холецистокинин (ССК) или агонист ССК, лептин (белок ОВ) или агонист лептина, эксендин или агонист аналога эксендина, глюкагонподобный пептид-1 (GLP-1), агонист GLP-1 или агонист аналога GLP-1, CCK, агонисты ССК, кальцитонин, агонисты кальцитонина, низкомолекулярные антагонисты рецептора каннабиноида СВ1, римонабант, ингибиторы 11-бета-гидроксистероиддегидрогеназы-1, фентермин или сибутрамин. В некоторых вариантах осуществления дозу 500 мкг/кг/день PYY(3-36) комбинировали с дозой 100 мкг/кг/день амилина. В некоторых вариантах осуществления дозу 200 мкг/кг/день PYY(3-36) комбинировали с дозой 100 мкг/кг/день амилина.
Например, фиг.36 изображает примерные действия 200 мкг/кг/день PYY(3-36) с одновременным введением 100 мкг/кг/день амилина или без одновременного введения 100 мкг/кг/день амилина на массу тела, а также параметры плазмы, взятой натощак у склонных к ожирению крыс DIO. Было обнаружено, что совместное введение PYY(3-36) имело аддитивное действие в уменьшении массы тела. Наблюдали также понижающее глюкозу действие введения одного PYY(3-36). Кроме того, совместное введение амилина и PYY(3-36) уменьшало уровни триглицеридов аддитивным образом без уменьшения уровней HDL-холестерина. Аддитивное действие на потерю массы, наблюдаемое после совместного введения PYY(3-36) и амилина, сопровождалось уменьшением дыхательного коэффициента (RQ) без значимого уменьшения потребления энергии (ЕЕ) в этих склонных к DIO крысах (см. фиг.37).
Аддитивное действие на потерю массы после совместного введения PYY(3-36) и амилина сопровождалось также значимым уменьшением массы жировой ткани без совместного уменьшения массы белка относительно носителя (см. фиг.38). Таким образом, объединение PYY(3-36) и амилина, по-видимому, является эффективным в изменении состава тела посредством уменьшения жира тела с сохранением сухой массы.
Стабильность нескольких полипептидов PPF в плазме человека испытывали и сравнивали со стабильностью в плазме PYY(3-36). Для оценки деградации in vitro каждый из полипептидов PPF или PYY(3-36) инкубировали в плазме человека при 37°С в течение трех часов и брали аликвоты в указанных временных точках и анализировали на концентрацию пептидов. Концентрацию пептидов определяли сравнением с кривой стандартов и скорости деградации определяли расчетом наклона изменения концентрации во времени. Сравнение между скоростью деградации полипептида PPF и скоростью деградации PYY(3-36) показано на фиг.39. В этом примере полипептид 4883 имеет увеличенную стабильность в плазме в сравнении с PYY(3-36). Фиг.54 сравнивает рассчитанные скорости деградации нескольких других полипептидов PPF со скоростью деградации PYY(3-36). Наблюдали, что соединения 4676, 4247 и 4753 усиливали стабильность в плазме в этом исследовании в сравнении с PYY(3-36), тогда как соединение 4757 было менее стабильным, чем PYY(3-36).
В мышиных и крысиных моделях DIO было обнаружено, что продолжительное введение полипептида PPF (соединения 4883) имело увеличивающую эффективность в уменьшении массы тела в сравнении с PYY(3-36) (см. фиг.41).
В некоторых вариантах осуществления полипептид PPF может преимущественно понижать триглицериды плазмы без изменения других аналитов плазмы, таких как уровни HDL-холестерина, глюкозы или HbA1C. В некоторых вариантах осуществления полипептид PPF может понижать уровни триглицеридов плазмы и амилазы без изменения других аналитов плазмы, таких как уровни HDL-холестерина, глюкозы или HbA1C. В некоторых вариантах осуществления уменьшение уровней триглицеридов плазмы является большим, чем уменьшение уровней холестерина. В некоторых вариантах осуществления уровни триглицеридов плазмы являются пониженными и уровни LDL-холестерина являются пониженными в меньшей степени. Фиг.43 демонстрирует, что продолжительное введение полипептида PPF (соединения 4883) в крысах DIO на протяжении 28 дней изменяет состав тела уменьшением массы жировой ткани без изменения массы ткани, не содержащей жира, и фиг.44 изображает преимущественное понижение уровней триглицеридов введением полипептида PPF (соединения 4883).
В некоторых вариантах осуществления полипептид PPF и другой агент, например амилин, вводят посредством одного и того же подкожного насоса. В некоторых вариантах осуществления полипептид PPF и другой агент, такой как амилин, вводят с использованием раздельных подкожных насосов. Фиг.48 изображает примеры действий введения 500 мкг/кг/день PYY(3-36) или полипептида PPF с совместным введением 100 мкг/кг/день амилина или без совместного введения 100 мкг/кг/день амилина на массу тела в склонных к DIO крысах. Было обнаружено, что совместное введение 500 мкг/кг/день PYY(3-36) и 100 мкг/кг/день амилина оказывает аддитивное действие на снижение массы тела. Фиг.48 и 49 показывают, что соединения полипептидов PPF (соединений 4883 и 4917) является более эффективным, чем введение PYY(3-36), в уменьшении массы тела. Фиг.48 и 49 также показывают, что совместное введение 500 мкг/кг/день PYY(3-36) или полипептидов PPF (соединений 4883 или 4917) плюс 100 мкг/кг/день амилина оказывают соответственно более высокое аддитивное действие на уменьшение массы тела в сравнении с аддитивным действием PYY(3-36) плюс амилина. Аддитивное действие на потерю массы, наблюдаемое после совместного введения полипептида PPF (соединения 4883) плюс амилина, сопровождалось уменьшением дыхательного коэффициента (RQ) и потребления энергии (ЕЕ) в этих склонных к DIO крысах (см. фиг.53).
Аддитивное действие на уменьшение массы тела в склонных к DIO крысах, наблюдаемое после совместного введения амилина плюс полипептида PPF (соединения 4883 или 4917), сопровождалось значимым уменьшением массы жировой ткани без значимой потери ткани, не содержащей жира (см. фиг.50 и 51). Совместное введение соединения 4883 и амилина имеет, по-видимому, синергическое действие на уменьшение массы тела (фиг.51). В общем и целом, эти данные демонстрируют, что совместное введение амилина плюс полипептида PPF является эффективным средством изменения состава тела посредством уменьшения жира тела с сохранением сухой массы тела.
Фиг.52 показывает, что полипептид PPF (соединение 4917) с совместным введением амилина или без совместного введения амилина является более эффективным, чем PYY(3-36) в понижении уровней инсулина, измеренных натощак, в крысах DIO.
Некоторые полипептиды PPF показаны в таблице 4 ниже, хотя ожидаются и другие полипептиды. Могут быть использованы следующие аббревиатуры: hK = гомолизин, hR = гомоаргинин, hS = гомосерин, hP = гомопролин, G(oct) = октилглицин, Aib = 2-аминоизомасляная кислота, Cit = цитрулин, Dap = диаминопропионовая кислота, Sar = саркозин.
Таблица 4
Хотя данное изобретение было описано в виде нескольких примеров и вариантов осуществления, понятно, что квалифицированным в данной области специалистам будут очевидны вариации и модификации. Таким образом, предполагается, что прилагаемая формула изобретения в ее заявленном виде охватывает все такие эквивалентные вариации, которые входят в объем изобретения.