ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ НЕАЛКОГОЛЬНОГО СТЕАТОГЕПАТИТА
PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING NON-ALCOHOLIC STEATOHEPATITIS

Область техники
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения или предотвращения неалкогольного стеатогепатита. Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции для лечения или предотвращения фиброза печени.
Уровень техники
Уровень распространения неалкогольного стеатогепатита в мире достигает от 2 до 4% (в США от 3 до 5%). В отличие от обыкновенного неалкогольный стеатогепатит показывает такие патологии, как баллонная дистрофия, некроз клеток и воспалительная инфильтрация, а в некоторых случаях и фиброз, такой как накопление коллагеновых волокон. Хорошо известно, что обыкновенный стеатоз показывает медленное гистологическое течение, в то время как течение неалкогольного стеатогепатита более быстрое и он может развиться до цирроза. Подтверждено, что от 5 до 10% людей, у которых было обнаружено жировое поражение печени, также имеют стеатогепатит (Metabolism Clinical and Experimental 65 (2016) 1038-1048).
В настоящее время не существует коммерчески доступной терапии для лечения стеатогепатита такого типа, и из-за ее отсутствия применяются средства для лечения других метаболических синдромов, таких как абдоминальное ожирение, гиперлипедемия, диабет, например, лекарственные средства для нормализации инсулиновой резистентности, антиоксиданты (например, витамины С, Е), лекарственные средства для лечения дислипидемии, гепатопротекторы, но все они не являются средствами для лечения непосредственно неалкогольного стеатогепатита.
В то же время 2-((R)-4-(2-фторо-4-(метилсульфонил)фенил)-2-метилпиперазин-1-ил)-N-((1R,2s,3S,5S,7S)-5-гидроксиадамантан-2-ил)пиримидин-4-карбоксамид, представленный химической Формулой 1 ниже (здесь и далее используется сокращенное наименование «пиримидин-4-карбоксамид») является соединением, которое включено в формулу, раскрытую в публикации заявки РСТ № WO 2011-139107.
Формула 1
Соединение Формулы 1 является ингибитором 11β-гидроксистероид-дегидрогеназы типа 1 (11β-HSD1), которая была разработана как терапевтический агент для лечения диабета второго типа. Однако его разработка, как и прочих ингибиторов 11β-HSD1, была прекращена, поскольку однократный прием и прием в комбинации с метформином (препарат для лечения диабета) не показали значительной эффективности.
Описание
Техническая задача
Таким образом, задачей, которую должно решить данное изобретение, является обеспечение фармацевтической композиции, подходящей для лечения, облегчения и предотвращения неалкогольного стеатогепатита.
Кроме того, задачей, которую должно решить данное изобретение, является обеспечение фармацевтической композиции, подходящей для лечения, облегчения и предотвращения фиброза печени.
Техническое решение
Для решения вышеуказанных задач в настоящем документе предложена фармацевтическая композиция для лечения, облегчения и предотвращения неалкогольного стеатогепатита, содержащая соединение пиримидин-4-карбоксамида химической формулы 1 в качестве активного ингредиента.
[Химическая Формула 1]
В настоящем документе также предложена фармацевтическая композиция для облегчения, предотвращения или лечения неалкогольного стеатогепатита, сопровождающегося фиброзом печени, содержащая соединение химической формулы 1 в качестве активного ингредиента.
В настоящем документе также предложена фармацевтическая композиция для облегчения, предотвращения или лечения фиброза печени, содержащая соединение химической формулы 1 в качестве активного ингредиента.
В настоящем документе также предложен способ облегчения, предотвращения или лечения неалкогольного стеатогепатита (предпочтительно сопровождающегося фиброзом печени) и/или фиброза печени, включающий введение субъекту, нуждающемуся в лечении, облегчении или предотвращении неалкогольного стеатогепатита и/или фиброза печени, терапевтически или профилактически эффективного количества соединения химической формулы 1.
То есть, в настоящем документе предложено медицинское применение соединения химической формулы 1 для лечения, облегчения или предотвращения неалкогольного стеатогепатита (предпочтительно неалкогольного стеатогепатита, сопровождающегося фиброзом печени) и/или фиброза печени.
Авторы настоящего изобретения завершили данное изобретение, подтвердив, что концентрация в ткани печени была выше, чем концентрация в плазме, при измерении концентрации соединения химической формулы 1 в тканях через 2 часа после перорального введения мышам, а затем также подтвердив эффективность после перорального введения на животной модели неалкогольного стеатогепатита (предотвращение и лечение).
Соединение химической формулы 1 настоящего изобретения снижает содержание липидов в ткани печени, оказывает лечебное действие на воспаление ткани печени, а также ингибирующее действие в отношении фиброза ткани печени, и, таким образом, может эффективно применяться для облегчения, предотвращения и лечения неалкогольного стеатогепатита.
Используемый в настоящем документе термин «предотвращение» включает предотвращение повторного проявления, распространения или начала неалкогольного стеатогепатита или фиброза печени у пациента.
Используемый в настоящем документе термин «лечение» включает ликвидацию, устранение, модификацию или контроль неалкогольного стеатогепатита или фиброза печени, а также минимизацию или замедление распространения неалкогольного стеатогепатита или фиброза печени.
Соединение химической формулы 1 может быть получено способом, раскрытом в публикации заявки согласно РСТ № WO 2011-139107.
Используемая в настоящем документе фраза «соединение, описываемое в настоящем документе» включает соединение или его фармацевтически приемлемую соль (соли) химической формулы 1, а также его клатраты, гидраты, сольваты или полиморфные модификации.
Используемый в настоящем документе термин «полиморф» относится к твердым кристаллическим формам соединения, описываемого в настоящем документе, или его комплексам. Различные полиморфные модификации одного и того же соединения могут проявлять различные физические, химические и/или спектроскопические свойства. Различные физические свойства включают стабильность (например, к действию теплоты или света), способность к сжатию и плотность (важно при получении лекарственной формы и производстве продукта), а также скорости растворения (которые могут повлиять на биодоступность), но не ограничиваются ими. Различия в стабильности могут привести к изменениям реакционной способности (например, разница в окислении, при которой состоящая из одной полиморфной модификации лекарственная форма выцветает быстрее, чем лекарственная форма, состоящая из другой) или механических свойств (например, таблетки рассыпаются при хранении, поскольку кинетически более подходящая полиморфная модификация переходит в более термодинамически стабильную) или обеих вышеуказанных характеристик (например, таблетки одной полиморфной модификации более склонны к разрушению при высоких значениях влажности). Различные физические свойства полиморфных модификаций могут повлиять на их переработку. Например, одна полиморфная модификация может с большей вероятностью образовывать сольваты или может труднее отфильтровываться или промываться от примесей, чем другая, вследствие, например, формы частиц или распределения частиц по размерам.
Используемый в настоящей заявке термин «сольват» означает соединение или его соль, описываемое в настоящем документе, которое дополнительно включает стехиометрическое или нестехиометрическое количество растворителя, связанного нековалентными силами межмолекулярного взаимодействия. Предпочительные растворители летучи, нетоксичны и приемлемы для употребления человеком в следовых количествах.
Используемый в настоящем документе термин «гидрат» означает соединение или его соль, описываемое в настоящем документе, которое дополнительно включает стехиометрическое или нестехиометрическое количество воды, связанной нековалентными силами межмолекулярного взаимодействия.
Используемый в настоящем документе термин «клатрат» означает соединение или его соль в форме кристаллической решетки, которая содержит полости (например, каналы), внутри которых присутствуют примесные молекулы (например, растворителя или воды).
in
vivo
in
vitro
in
vivo
Burger's
Medicinal
Chemistry
and
Drug
Discovery,
Design
and
Application
of
Prodrugs
Если вследствие разложения  какого-либо соединения (пролекарства) получается соединение, описываемое в настоящем документе, или его соль, то такое соединение включается в настоящий документ. Используемый в настоящем документе термин «пролекарство», если не указано иное, означает соединение, которое подвергаться гидролизу, окислению или иному взаимодействию в биологических условиях ( или ) с образованием активного соединения, в частности соединения, описанного в настоящем документе. Примеры пролекарств включают метаболиты соединений, включающих биогидролизуемые функциональные фрагменты, такие как биогидролизуемые амидные, биогидролизуемые сложноэфирные, биогидролизуемые карбаматные, биогидролизуемые карбонатные, биогидролизуемые уреидные группы и аналоги биогидролизуемых фосфатных групп, но не ограничиваются ими. Предпочтительно, пролекарства соединения с карбоксильными функциональными группами являются низшими алкиловыми эфирами карбоновых кислот. Традиционно карбоксилатные эфиры получают путем этерификации любых карбоксильных групп, присутствующих на молекуле. Пролекарства можно получить с применением хорошо изученных способов, как те, которые описаны в литературных источниках  6-е издание (Donald J. Abraham ed., 2001, Wiley) и  (H. Bundgaard ed., 1985, Harwood Academic Publishers Gmfh).
Соединение, описываемое в настоящем документе, обычно вводят в терапевтически эффективном количестве.
Соединение, описываемое в настоящем документе, можно вводить любым подходящим способом в форме фармацевтической композиции, приспособленной для такого способа введения, и в дозировке, эффективной для предназначенного лечения. Обычно эффективная дозировка варьируется в диапазоне от примерно 0,01 до примерно 50 мг на кг массы тела в день, предпочтительно от примерно 0,05 до примерно 20 мг/кг/день, и вводят однократно или разбивается на дозы. Уровни дозировки могут быть меньше нижнего предела этого диапазона в зависимости от возраста, состояния пациента и заболевания или патологического состояния, которое нужно вылечить. В прочих случаях могут использоваться еще большие дозировки без негативных побочных эффектов. Большие дозы также можно разделять на несколько меньших для введения в течение дня. Способы определения подходящих доз хорошо изучены в данной области, к которой относится настоящий документ. Например, может быть использован способ, описанный в литературном источнике Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20-е издание, 2000.
В другом варианте реализации предложена фармацевтическая композиция, содержащая соединение химической формулы 1 или ее фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель или добавку.
Термин «фармацевтически приемлемый» означает подходящий для применения в фармацевтических препаратах, обычно рассматриваемый как безопасный для такого применения, одобренный официально регуляторным органом или национальным правительством для такого применения или приведенный в Фармакопее США или Южной Кореи как пригодный для применения человеком.
Для лечения вышеуказанных заболеванимй или состояний описываемое в настоящем документе соединение или его фармацевтически приемлемые соли можно вводить следующими способами.
Пероральное
введение
Соединение, описываемое в настоящем документе, можно вводить перорально, в том числе путем проглатывания, так, чтобы оно попадало в желудочно-кишечный тракт или всасывалось в кровоток непосредственно из ротовой полости (например, буккальное или сублингвальное введение).
Подходящие для перорального введения композиции включают твердые, жидкие, гелевые или порошкообразные составы и представлены в лекарственной форме, такой как таблетка, пастилка, капсула, гранула или порошок.
Композиции для перорального введения можно изготавливать как с немедленным, так и модифицированным высвобождением, включая отсроченное или замедленное высвобождение, необязательно с кишечнорастворимым покрытием.
Жидкие составы могут включать растворы, сиропы и суспензии, которые можно использовать в мягких или жестких капсулах. Такие составы могут включать фармацеветически приемлемый носитель, например, воду, этанол, полиэтиленгликоль, целлюлозу или масло. Состав также может включать один или несколько эмульгирующих и/или суспендирующих агентов.
В таблетированной лекарственной форме количество присутствующего активного ингредиента может составлять от примерно 0,05 до примерно 95% по массе, более типично от примерно 2 до примерно 50% по массе лекарственной формы. Кроме того, в таблетках может содержаться разрыхлитель, содержание которого составляет от 0,5 до 35% по массе, более типично от примерно 2 до примерно 25% по массе лекарственной формы. Примеры разрыхлителей включают лактозу, крахмал, гликолят крахмала натрия, кросповидон, кроскармелозу натрия, мальтодекстрин или их смеси , но не ограничиваются ими.
Подходящие смазывающие вещества в таблетке могут присутствовать в количествах от примерно 0,1 до примерно 5% по массе и включают тальк, диоксид кремния, стеариновую кислоту, стеарат кальция, цинка или магния, стеарилфумарат натрия и тому подобное, но не ограничиваются ими.
Подходящие связующие для применения в таблетке включают желатин, полиэтиленгликоль, сахара, камеди, крахмал, поливинилпироллидон, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу и тому подобное, но не ограничиваются ими. Подходящие разбавители для применения в таблетке включают маннит, ксилит, лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, микрокристаллическую целлюлозу и крахмал, но не ограничиваются ими.
Подходящие солюбилизаторы для применения в таблетке могут присутствовать в количествах от примерно 0,1 до примерно 3% по массе и включают полисорбаты, лаурилсульфат натрия, додецилсульфат натрия, карбонат пропилена, моноэтиловый эфир диэтиленгликоля, диметилизосорбид, полиоксиэтиленгликолевое касторовое масло (естественное или гидрогенизированное), HCOR™ (Nikkol), олеиловый эфир, Gelucire™, моно/диглицерид каприловой кислоты, эфиры сорбита и жирных кислот и Solutol HS™, но не ограничиваются ими.
Парентеральное
введение
Соединения, описываемые в настоящем документе, можно вводить непосредственно в кровоток, мышцы, или внутренние органы. Подходящие способы парентерального введения включают внутривенное, внутримышечное, подкожное, внутриартериальное, интраперитонеальное, интратекальное, интракраниальное и им подобные способы введения. Подходящие устройства для парентерального введения включают инъекционные (включая шприцы с иглой и без) и инфузионные методы.
Композиции для парентерального введения можно изготавливать как с немедленным, так и модифицированным высвобождением, включая отсроченное или замедленное.
Большинство парентеральных составов являются водными растворами, содержащими вспомогательные вещества, в том числе соли, буферные агенты и изотонические агенты.
Парентеральные составы также могут быть изготовлены в безводной форме (например, путем лиофилизации) или в форме стерильных неводных растворов. Такие формы можно применять с подходящей средой-носителем, такой как стерильная вода. При приготовлении парентеральных растворов можно также использовать усилители растворимости.
Местное
применение
Описываемое в настоящем документе соединение можно применять местно на кожу или трансдермально. Составы для местного применения могут включать лосьоны, растворы, крема, гели, гидрогели, мази, пены, имплантаты, пластыри и т. п. Фармацевтические приемлемые носители для составов для местного применения могут включать воду, спирт, минеральное масло, глицерин, полиэтиленгликоль и т. п. Местное применение также можно осуществлять с помощью электропорации, ионофореза, фонофореза и т. п.
Композиции для местного применения можно изготавливать как с немедленным, так и модифицированным высвобождением, включая отсроченное или замедленное.
Ссылки
для
получения
фармацевтических
композиций
Handbook
of
Pharmaceutical
Excipients
Remington:
The
Science
and
Practice
of
Pharmacy
Encyclopedia
of
Pharmaceutical
Technology
Sustained
and
Controlled
Release
Drug
Delivery
Systems
Способы получения фармацевтических композиций для лечения или предотвращения заболевания или патологического состояния хорошо известны в данной области, к которой относится настоящий документ. Например, на основе литературных данных, приведенных в литературных источниках  (7-е издание),  (20-е издание),  (3-е издание), или  (1978), фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, носители, добавки и т. д. могут быть подобраны и затем смешаны с описываемыми в настоящем документе соединениями для приготовления фармацевтических композиций.
Положительные эффекты
В настоящем документе предложена фармацевтическая композиция, походящая для облегчения, лечения или предотвращения неалкогольного стеатогепатита или фиброза печени, содержащая соединение химической формулы 1 в качестве активного ингредиента. То есть, в настоящем документе предложено медицинское применение соединения химической формулы 1, которое подходит для облегчения, лечения или предотвращения неалкогольного стеатогепатита или фиброза печени.
Краткое описание чертежей
На следующих фигурах данные представлены в виде Среднее ± SD (стандартное отклонение) (G1: Нормальный контроль, G2: Контроль носителя, G3: Положительный контроль 10 мг/кг/день, G4: Испытуемое соединение 10 мг/кг/день, G5: Испытуемое соединение 30 мг/кг/день).
На Фигуре 1 показаны результаты биохимических анализов крови после 6 недель применения препарата на модели заболевания неалкогольного стеатогепатита.
***/**: существует значимое различие на уровне p < 0,001 / p < 0,01 соответственно, по сравнению с G1.
соответственно
###/##/#: существует значимое различие на уровне p < 0,001 / p < 0,01 / p < 0,05 , по сравнению с G2.
$$: существует значимое различие на уровне p < 0,01 по сравнению с G3.
На Фигуре 2 приведен результат измерения лактатдегидрогеназы (LDH).
: существует значимое различие на уровне p < 0,05 по сравнению с G1.
На Фигуре 3 представлены абсолютная и относительная массы соответственно.
/: существует значимое различие на уровне p < 0,001 / p < 0,05 соответственно, по сравнению с G1.
##/#: существует значимое различие на уровне p < 0,01 / p < 0,05 соответственно, по сравнению с G2.
$: существует значимое различие на уровне p < 0,05 по сравнению с G3.
На Фигуре 4 представлен результат измерения общего холестерина и триглицеридов в тканях печени с использованием твердофазного ИФА. Можно видеть, что уровни общего холестерина (TCHO) и триглицеридов (TG) снижаются дозазависимым образом в группе, получавшей исследуемое соединение.
***: существует значимое различие на уровне p < 0,05 по сравнению с G1.
###/##/#: существует значимое различие на уровне p < 0,001 / p < 0,01 / p < 0,05 соответственно, по сравнению с G2.
На Фигуре 5 приведены результаты гистопатологического исследования.
***/**/*: существует значимое различие на уровне p < 0,001 / p < 0,01 / p < 0,05 соответственно, по сравнению с G1.
###/##/#: существует значимое различие на уровне p < 0,001 / p < 0,01 / p < 0,05 соответственно, по сравнению с G2.
На Фигуре 6 приведены результаты анализов содержания триглицеридов в гепатоцитах в испытательной модели для оценки профилактического действия соединения, описываемого в настоящем документе.
*: существует значимое различие на уровне p < 0,05 по сравнению с G1.
**: существует значимое различие на уровне p < 0,05 по сравнению с G2.
Принцип изобретения
Здесь и далее в настоящем документе довольно подробно описывается настоящее изобретение с примерами, чтобы помочь понять настоящее изобретение специалистам в данной области техники. Однако нижеследующие примеры представлены с целью иллюстрации и не предназначены для ограничения объема изобретения. Следует понимать, что могут быть внесены различные изменения без отступления от существа и объема настоящего изобретения или принесения в жертву всех его материальных преимуществ.
Пример 1. Индуцирование заболевания и применение исследуемого соединения на модели лечения неалкогольного стеатогепатита
Использовали модель с дефицитом метионина и холина (MCD) - животную модель стеатогепатита. Мышей C57BL/6 кормили рационом с дефицитом метионина и холина (MCD) в течение 5 дней, а затем нормальным рационом в течение 2 дней. Диету MCD чередовали таким образом с нормальной в течение 10 недель. Животных различали по маркировке на хвостах: в течение периода акклиматизации (синие), в период введения доз и наблюдения (красные). Индивидуальные идентификационные карточки, различающиеся по цветам, прикрепляли к коробкам для мышей, а карточку учета помещения для животных ко входу в питомник.
В ходе периода акклиматизации проводили анализы биохимии крови и взвешивание массы тела. Мышей распределяли случайным образом так, чтобы среднее значение по каждой группе было распределено как можно более равномерно в соответствии с ранжированием по массе тела и уровню аланинаминотрансферазы (ALT) [10 животных в группу с нормальной диетой (G1), 40 животных по группам с MCD-диетой (G2-G5)].
Оценивали улучшение, которые наблюдались, когда испытуемое соединение систематически вводили в течение 6 недель мышам C57BL/6, у которых был смоделирован неалкогольный стеатогепатит, вызванный MCD-диетой в течение 10 дней. Испытуемое соединение вводили один раз в день в течение 6 недель. В качестве положительного контроля использовали обетихоливую кислоту (здесь и далее по тексту OCA), которая в настоящее время проходит III фазу клинических исследований как показание для лечения неалкогольного стеатогепатита.
В случае контрольного соединения (обетихоливая кислота 10 мг/кг/день) взвешивали подходящее количество, затем разбавляли в стерильной дистилированной воде и вводиди. В случае испытуемого соединения после взвешивания подходящего количества, разбавляли 0,5 масс. % водным раствором метилцеллюлозы, к которому добавляли 1 масс. % Твин 80. В ходе перорального измеряли массу мышей, и животных фиксировали с использованием метода захвата кожи в районе шеи, и каждое испытуемое соединение вводили с использованием зонда для перорального введения.
Пример 2. Параметры наблюдения и испытания моделей лечения неалкогольного стеатогепатита
(1) Взвешивание
Массу измеряли перед началом введения соединения, раз в неделю после начала введения в день проведения вскрытия.
(2) Потребление корма
Определяли непосредственно перед началом введения, и раз в неделю после начала введения испытуемого соединения. Что же касается способа измерения, оставшееся количество корма измеряли на единицу клетки-питомника на следующий день после выдачи определенного количества корма, рассчитывали разницу между исходным и оставшимся количеством и считали среднее потребление на одну мышь.
(3) Анализ биохимии крови
С помощью биохимического анализатора крови (7180 Hitachi, Япония) анализировали следующие показатели крови, собранной и разделенной непосредственно перед началом применения исследуемого соединения и на 6 неделе (день вскрытия) после начала применения.
Исследуемые показатели перед введением: аланинтрансаминаза (ALT), аспартаттрансаминаза (AST).
Исследуемые показатели спустя 6 недель после начала применения исследуемого соединения: аланинтрансаминаза (ALT), аспартаттрансаминаза (AST), триглицериды (TG), общий уровень холестерина (TCHO), липопротеин высокой плотности (HDL), липопротеин низкой плотности (LDL), гамма-глутамилтрансфераза (GGT), лактатдегидрогеназа (LDH).
(4) Вскрытие
В день проведения вскрытия пимонидазол разбавляли в физиологическом растворе с концентрацией 30 мг/мл и затем вводили внутривенно с дозировкой 60 мг/кг. Животных подвергали эвтаназии спустя 90 минут после введения. В ходе каждого вскрытия животные вдыхали пары эфира, а после того, как анестезия была подтверждена, у них брали образец крови из задней полой вены с помощью шприца. После этого отрезали брюшную аорту и заднюю полую вену, животное истекало кровью и погибало. Кровь переносили в вакуумную пробирку с активатором свертывания, позволяющим достичь коагуляции в течение 15 минут выдержки при комнатной температуре, а затем центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут, чтобы отделить сыворотку. Сыворотку хранили в низкотемпературном морозильнике при температуре - 70°C или ниже, а затем использовали для проведения анализов биохимии крови.
Во время вскрытия печень удаляли и взвешивали, правую долю печени помещали в 10% в забуференный нейтральный раствор формалина, а левую долю разрезали напополам и быстро замораживали в жидком азоте. Быстрозамороженные образцы хранили в низкотемпературном морозильнике при температуре - 70°C или ниже до проведения твердофазного ИФА.
(5) Твердофазный ИФА
Содержание TG и TCHO в ткани печени анализировали с использованием печени, извлеченной во время вскрытия. Анализ проводили с применением коммерчески доступного набора для твердофазного ИФА.
(6) Гистопатологическое исследование
Зафиксированную в формалине ткань подготавливали для гистологического исследования с помощью общих процессов гистологической обработки ткани, таких как иссечение, обезвоживание, заливка в парафин, приготовление срезов, а затем проводили окраску гематоксилин-эозином (H&E), красителем масляный красный О, и окраску трихром по Массону. Гистологические изменения наблюдали с использованием оптического микроскопа (Olympus BX53, Япония).
(7) Статистический анализ
Для результатов эксперимента предполагали нормальность данных и проводили анализ с использованием параметрических или непараметрических методов множественного сравнения.
Если результат параметрического однофакторного дисперсионного анализа был значащим, проводили апостериорные исследования с использованием апостериорного критерия множественных сравнений Даннета, а если результат непараметрического теста Краскела-Уоллиса был значащим, то проводили апостериорные исследования с использованием апостериорного критерия множественных сравнений Дьюнна.
Статистический анализ проводили с использованием ПО Prism 5.03 (GraphPad Software Inc., Сан-Диего, Калифорния, США), а p-величину менее 0,05 определяли как статистически значимую.
Пример 3. Результаты испытания на модели лечения неалкогольного стеатогепатита
(1) Взвешивание
В результате определения массы тела было установлено, что уровень массы тела во всех группах, получавших MCD-диету, (G2-G5) в ходе всего эксперимента был значительно ниже, чем у группы нормального контроля (G1) (p < 0,001). Это является обычно наблюдаемым явлением при получении MCD-диеты.
(2) Потребление корма
В результате определения потребления корма, никаких значительных различий во всех испытуемых группах по сравнению с группой нормального контроля (G1), контрольной группой, получавшей носитель (G2), и группой положительного контроля (G3) в ходе всего эксперимента не наблюдалось.
(3) Анализ биохимии крови
В результате проведения анализов биохимии крови уровни ALT и AST у всех групп, получавших MCD-диету (G2-G5), были значительно выше, чем у группы нормального контроля (G1) в начале применения исследуемого соединения (p < 0,001), а уровни TG, TCHO, и HDL были статистически значимо ниже, чем у группы нормального контроля (G1) (p < 0,001). После 6 недель применения исследуемого соединения уровни ALT и AST у всех групп, получавших MCD-диету (G2-G5), были значительно выше, чем у группы нормального контроля (G1) (p < 0,001 или p < 0,01), а уровни ALT и AST у G5 были значительно ниже, чем у контрольной группы, получавшей носитель (G2) (p < 0,001 или p < 0,05). После 6 недель применения исследуемого соединения уровни ALT групп G3 и G4 были значительно ниже, чем у контрольной группы, получавшей носитель (G2) (p < 0,05), а уровни TG, TCHO, и HDL у всех групп, получавших MCD-диету (G2-G5) были значительно ниже, чем у группы нормального контроля (G1) (p < 0,001). После 6 недель применения исследуемого соединения уровни LDL у всех групп, получавших MCD-диету (G2-G5), были значительно ниже, чем у группы нормального контроля (G1) (p < 0,001 или p < 0,01), а уровни LDL групп G4 и G5 были значительно ниже, чем у контрольной группы, получавшей носитель (G2), и группы положительного контроля (G3) (p < 0,01). После 6 недель применения исследуемого соединения уровень LDH у группы G3 был значительно выше, чем у группы нормального контроля (G1) (p < 0,05).
Результаты обобщены и представлены на фигурах 1 и 2.
На Фигуре 1 представлены результаты анализа биохимии крови после 6 недель применения исследуемого соединения для модели лечения неалкогольного стеатогепатита. Показатели функции печени, ALT и AST, продемонстрировали статистически значимое снижение дозозависимым образом в испытуемой группе, а холестерин LDL показал статистически значимое снижение по сравнению с группами G1, G2 и G3.
На Фигуре 2 представлены результаты измерения лактатдегидрогеназы LDH. Известно, что уровень LDH часто повышается при ишемическом гепатите, что связано с повреждением печени. Можно видеть, что исследуемое соединение химической формулы 1 имеет тенденцию к снижению уровня LDH при сравнении с группой положительного контроля, и в частности в группе, которой вводили высокую дозу, показывает концентрацию, сходную с концентрацией в группе нормального контроля.
(4) Взвешивание печени
На Фигуре 3 представлены результаты взвешивания печени: абсолютная масса и относительная масса. В результате определения массы печени было обнаружено, что уровень массы печени у всех групп, получавших MCD-диету, был значительно ниже, чем у группы нормального контроля (G1) (p < 0,001), а уровень массы печени у группы G5 был значительно ниже, чем у группы, получавшей носитель (G2) (p < 0,05). Относительный уровень массы печени у группы G2 был значительно выше, чем у группы нормального контроля (G1) (p < 0,05), а относительный уровень массы печени у группы G5 был значительно ниже, чем у группы, получавшей носитель (G2) и группы положительного контроля (G3) (p < 0,01 или p < 0,05).
(5) Анализ содержания жира в тканях печени
Результаты анализа представлены на Фигуре 4. В результате проведения твердофазного ИФА было обнаружено, что уровни TG и TCHO у всех групп, получавших MCD-диету (G2-G5), были значительно выше, чем у группы нормального контроля (G1) (p < 0,001), а уровни TG и TCHO у групп G4 и G5 были значительно ниже, чем у группы, получавшей носитель (G2) (p < 0,001, p < 0,01 или p < 0,05).
(6) Гистопатологическое исследование
Результаты гистопатологического исследования представлены на Фигуре 5. Уровни микровезикулярного стеатоза и воспаления у всех групп, получавших MCD-диету (G2-G5), были значительно выше, чем у группы нормального контроля (p < 0,01 или p < 0,05), а уровень микровезикулярного стеатоза у группы G5 был значительно ниже, чем у контрольной группы, получавшей носитель (p < 0,05).
Площади, окрашенные красителями масляный красный О и трихром по Массону, у групп, у которых был индуцирован неалкогольный стеатогепатит (G2-G5), были значительно больше, чем у группы нормального контроля (p < 0,001), а площади, окрашенные красителем масляный красный О, у групп G4 и G5 были значительно ниже, чем у контрольной группы, получавшей носитель (p < 0,01).
Площади экспрессии гидроксипролина у групп G2, G3, и G4 были значительно выше, чем у группы нормального контроля (G1) (p < 0,001 или p < 0,05), а площади экспрессии гидроксипролина у групп G3, G4 и G5 были значительно ниже, чем у контрольной группы, получавшей носитель (G2) (p < 0,001 или p < 0,01).
В итоге в результате гистопатологического исследования было установлено, что уровень микровезикулярного стеатоза в группах, получавших большую дозировку исследуемого соединения, был значительно ниже, чем у контрольной группы, получавшей носитель, а площадь жира, измеренная с применением красителя масляный красный О, и площадь экспрессии гидроксипролина, индикатора фиброза печени, были значительно меньше, чем у контрольной группы, получавшей носитель. С другой стороны, группа, которая получала исследуемое соединение, показала более низкие уровни воспаления, чем контрольная группа, получавшая носитель.
(7) Итоговое мнение
В условиях данного испытания, когда исследуемое соединение в течение 6 недель систематически вводили мышам C57BL/6, на которых моделировали неалкогольный стеатогепатит, индуцированный метионин-холин-дефицитной диетой (MCD), уровни ALT, AST и LDL, которые являются показателями, связанными с функцией печени, в группе, получавшей исследуемое соединение, показали статистически значимое изменение дозаззависимым образом по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель. Также было обнаружено, что уровень относительной массы печени в группе, получавшей исследуемое соединение, показал значительное снижение дозазависимым образом по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель. Кроме того, в результате гистопатологического исследования было обнаружено значительное снижение уровня микровезикулярного стеатоза, площади, окрашенной красителем масляный красный О, и уровня экспрессии гидроксипролина, а в результате анализа содержания TG и TCHO в тканях печени наблюдалось, что уровни содержания TG и TCHO в тканях печени в группе, получавшей исследуемое соединение, были значительно ниже, чем в контрольной группе, получавшей носитель. В частности, в случае группы, получавшей большую дозу исследуемого соединения, ряд таких показателей, как биохимические показатели крови, относительная масса печени, содержание TG и TCHO в тканях печени и уровень микровезикулярного стеатоза, были значительно ниже по сравнению с группой положительного контроля.
Таким образом, было подтверждено, что систематическое введение исследуемого соединения в условиях данного испытания имеет действие, купирующие неалкогольный стеатогепатит и было подтверждено, что действие исследуемого соединения в дозировке 30 мг/кг/день превосходит соединение положительного контроля.
В частности, рассматривая тот факт, что ОСА, соединение положительного контроля, привело к боли в животе и слабости у более чем 10% участников клинических испытаний, а у около 10% участников проявились побочные действия, такие как аритмия, сухость кожи, запор, боль в суставах, периферический отек, боль в горле, нестабильность тироидного гормона, сыпь и т. п. применимость соединения химической формулы 1 настоящего изобретения оценивается как очень высокая.
Пример 4. Индуцирование заболевания и применение исследуемого соединения на профилактической модели неалкогольного стеатогепатита
Оценивали эффективность исследуемого соединения для предотвращения неалкогольного стеатогепатита. В испытании использовали лабораторных мышей (C57BL/6) возрастом 7 недель, группу нормального контроля (G1) кормили обычным рационом, а контрольную группу (G2), получавшей носитель, группу положительного контроля (G3) и испытуемые группы (G4, G5) кормили рационом MCD-диеты в течение 12 недель. Одновременно с MCD-диетой мыши получали исследуемые и контрольные соединения перорально 1 раз в день. Всего в эксперименте использовали 75 мышей, которые были разделены на 5 групп по 15 мышей в каждой.
Для того, чтобы оценить профилактическую эффективность, исследуемое соединение давали в течение 12 недель как индуцирование в то же самое время, в которое мыши получали MCD-диету, и оценивали эффективность исследуемого соединения для предотвращения стеатогепатита.
Брали навески подходящих количеств контрольного (обетихолевая кислота, 10 мг/кг/день) и испытуемого соединений и затем разбавляли их в водном растворе 0,5 масс. % метилцеллюлозы, к которому добавляли 1 масс. % Твин 80. В ходе перорального введения мышей взвешивали, а затем животных фиксировали с использованием метода захвата кожи в районе шеи, и вводили испытуемое соединение с использованием зонда для перорального введения.
Пример 5. Результаты испытания на профилактической модели неалкогольного стеатогепатита
(1) Взвешивание
В результате определения массы тела установили, что уровень массы тела во всех группах, получавших MCD-диету (G2-G5), в ходе всего эксперимента был значительно ниже, чем у группы нормального контроля (G1) (p < 0,001). Это является обычно наблюдаемым явлением при получении MCD-диеты.
(2) Потребление корма
В результате определения потребления корма, никаких значительных различий во всех испытуемых группах по сравнению с группой нормального контроля (G1), контрольной группой, получавшей носитель (G2), и группой положительного контроля (G3) в ходе всего эксперимента не наблюдали.
(3) Анализ содержания триглицеридов в тканях печени
Ткани печени мыши отбирали из 5 групп, образцы экстрагировали с помощью набора для экстракции липидов (Cell biolabs, США) и анализировали содержание триглицеридов в тканях печени с использованием биохимического анализатора (7020, hitachi, Япония).
Экспериментальные результаты выражали через среднее арифметическое и стандартное отклонение, и для сравнения между группами проводили дисперсионный анализ с использованием ПО Software StatView (Версия 4.51, Abacus Concepts, Беркли, Калифорния), и, если их значимость подтверждалась, проводили апостериорное сравнительное тестирование по PLSD критерию Фишера. Значимость была подтверждена на уровне значимости 5% путем сравнения групп.
На Фигуре 6 представлены результаты применения исследуемого соединения после 12 недель, было обнаружено статистически значимое снижение содержания триглицеридов в группе положительного контроля (G3) и испытуемых группах (G4, G5) по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель (G2). Эти результаты показывают, что соединение химической формулы 1 дозазависимо ингибирует накопление триглицеридов в гепатоцитах в модели предотвращения неалкогольного стеатогепатита.
(4) Итоговое мнение
Исходя из вышеизложенных результатов было подтверждено, что описываемое в настоящем документе соединение обладает профилактическим действием на неалкогольный стеатогепатит.