Перспективная технология размножения платана испанского для зеленого строительства на юго-западе Ростовской области

Перспективная технология размножения платана испанского для зеленого строительства на юго-западе Ростовской области

М.М. Середа, Б.Л. Козловский, Е.В. Луценко Южный федеральный университет, Ростов-на-Дону

Аннотация: Для введения платана испанского в культуру in vitro наиболее эффективно использовать в качестве эксплантов семядольные листья, полученные из трехнедельных проростков. Установлено, что оптимальной средой для индукции каллусогенеза является среда МС с добавлением 2мг БАП + 0,02 мг 2,4 Д + 0,2 мг ИУК. Эмбриогенез в каллусных клетках платана с довольно высокой частотой индуцируется на среде МС с добавлением 1 мг БАП + 0,1 мг НУК.

Ключевые слова: микроклональное размножение, безвирусные растения, платан испанский, зеленое строительство.

Зеленое строительство в Ростовской области остро нуждается в высоко декоративных, быстрорастущих, долговечных и, при этом устойчивых к комплексу неблагоприятных факторов окружающей среды, древесных растениях.

К таким растениям следует отнести малораспространенный в озеленении региона платан испанский или кленолистный (Platanus х hispanica Mill. ex Muenchh.). В местной культуре это дерево до 20 м высотой, с широко раскидистой, шатровидной кроной и прямым, стройным стволом. Кора отслаивается крупными пластинами, от чего ствол приобретает красивый пятнистый узор. Листья крупные, плотные, дланевидные, с лопастями, остропильчатыми по краю. Цветки неприметные. Узкопирамидальные семянки собраны в плотные шаровидные соплодия, повисающие на длинных плодоножках. В условиях населенных пунктов юго-запада области достаточно зимостоек. В молодом возрасте подмерзает однолетний прирост, но с возрастом зимостойкость повышается. Не пригоден для озеленения открытых пространств с преобладающими восточными ветрами в зимний период, здесь может вымерзать до уровня снегового покрова или почвы. Засухоустойчив. Повреждения вредителями

незначительны. На некоторых питомниках юга России заражен раком и другими заболеваниями. Аккумуляции болезней способствует вегетативный способ размножения этого вида (черенкование). Размножение семян непродуктивно и может приводить к утрате свойств исходного образца. Платан испанский цветет в мае, плодоносит в октябре - ноябре. Предпочитает плодородные, хорошо увлажненные почвы. Растет быстро. Декоративная долговечность 40-50 лет. Декоративен корой, красивой кроной, листьями, окрашивающимися осенью в красновато-бронзовые тона и шаровидными плодами, сохраняющимися на ветвях после листопада. Перспективен для одиночных, групповых и аллейных посадок в населенных пунктах юго-запада Ростовской области.

Наряду с необходимостью расширения ассортимента декоративных растений, особую проблему для региона в настоящее время представляет высокая степень поражения древесных культур вредителями и болезнями [1], что приводит к снижению декоративных качеств, сокращению продолжительности онтогенеза, а для ряда видов к гибели. По этой причине ряд древесных пород, таких как березы, черные тополя, вязы и др. стали непригодны для озеленения и исключены из основного и дополнительного ассортимента населенных пунктов юго-запада Ростовской области [2].

Существующая проблема осложняется следующим:

1. В России и мире практически не ведется селекция декоративных растений на устойчивость к вредителям и болезням, за исключением некоторых культур, например, роз;

2. В пределах населенных пунктов невозможно вести эффективную борьбу с вредителями и болезнями растений с помощью химических средств, а биологические методы не дают практических результатов;

3. Для многих вирусных, бактериальных и грибных заболеваний, отсутствуют действенные средства борьбы.

Одним из путей решения этой проблемы является повышение резистентности растений путем получения безвирусного материала в процессе микроклонирования. Этот метод хорошо зарекомендовал себя на плодовых культурах [3], но не нашел еще широкого применения в сфере зеленого строительства. Комплексная методика получения посадочного материала, свободного от вирусов и микроорганизмов, включает в себя несколько этапов: выделение меристемы, введение в культуру in vitro, микроклональное размножение, укоренение мериклонов, адаптация регенерантов к почвенным условиям. Решающим звеном является процесс введения в культуру эксплантов, взятых с маточного растения и дальнейшее тиражирование материала или микроклонирование.

Поэтому целью работы было разработка технологии размножения платана испанского микроклональным методом. Особым требованием к технологии является ее производительность, которая должна не уступать таковой при размножении платана черенками.

Методы и материалы исследования

Для введения в культуру in vitro платана испанского в качестве экплантов были выбраны фрагменты молодых побегов длиной не более 2 см, молодые весенние листья и фрагменты проростков (семядоли с гипокотилем) на второй неделе развития. Побеги собирали со взрослых экземпляров платана испанского в конце февраля 2014 года и ставили на проращивание при t 25 C на свету. Молодые побеги и листья промывались в теплой мыльной воде 20 минут, затем отмывались в проточной воде. Последующие этапы стерилизации осуществлялись в условиях ламинар-бокса. Вначале экспланты обрабатывались 70% раствором этанола, а затем соответствующим стерилизующим агентом, в разных режимах с применением 0,1% сулемы, 5% раствора гипохлорита натрия, либо 3% раствором перекиси водорода. После трехкратно промывались в стерильной

дистиллированной воде по 15 минут. Эффективность стерилизации определяли по доле выживших свободных от микроорганизмов эксплантов, выраженной в процентах. Выборка составляла 20 экплантов на каждый вариант опыта.

Для введения в культуру in vitro использовалась среда Мурасиге-Скуга [4], широко применяемая для культивирования древесных растений [5-8]. В качестве гелеобразующего средства добавляли 7 г/л агара, кроме того, 30 г/л сахарозы, 6-бензиламинопурина (БАП), тидиазурона (ТДЗ), из ауксинов: индолилуксусную кислоту (ИУК), нафтилуксусную кислоту (НУК), 2,4 -дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д). PH среды доводился до значения 5,8 с помощью 1 М KOH. Стерилизация сред проводилась в автоклаве при температуре 121 °С в течение 20 минут. Культура помещалась в условия 16-часового фотопериода при температуре 25 °С.

Результаты исследования и их обсуждение

Выбор экспланта для введения в культуру in vitro, как правило, определяется целью исследования. Учитывая, что наиболее быстрым способом микроклонального размножения является метод микрочеренкования в асептических условиях, в качестве экспланта первоначально были взяты побеги с 1-2 узлами. Попытки введения в культуру in vitro данных экплантов оказались безуспешными. Как правило, на 2-3 неделю культивирования на поверхности побегов обнаруживались микроорганизмы, развивающиеся, по-видимому, из внутренних тканей. Таким образом, исследования были направлены на получение каллусных культур по опыту наших предыдущих работ [9]. Индукцию каллусогенеза пытались осуществить из тканей молодых весенних листьев, взятых из распускающихся почек. Оптимальная схема поверхностной стерилизации таких листьев выглядела следующим образом: 70% спирт - 30 секунд, промывка в стерильной дистиллированной воде - 1 минута, 0,1% раствор

сулемы - 5 минут, трехкратная промывка в стерильной дисстилированной воде - по 15 минут. Варианты поверхностной стерилизации различных эксплантов и ее эффективность отражены в таблице 1.

Таблица № 1.

Эффективность поверхностной стерилизации экплантов платана испанского с приминением различных стерилизующих агентов.

Вещество Экспозиция, Эффективность стерилизации, %

минуты побеги листья семядоли

Гипохлорит 3 0 10 20

натрия, 5 % 5 0 15 25

10 0 10 5

Перекись 5 0 1 10

водорода, 3 % 10 0 5 15

15 0 7 15

Сулема, 0,1 % 3 0 40 90

5 0 60 70

10 2 30 5

Попытки индуцирования каллусообразования на листовых экплантах заключались в применении среды Мурасиге-Скуга с различным сочетанием фитогормонов, что отражено в таблице 2.

Таблица № 2

Индукция каллусогенеза на средах с различным сочетанием фитогормонов

Варианты использования фитогормонов Листья Семядоли

Безгормональная среда - -

БАП 2 мг/л - -

ТДЗ 0,4 мг/л - -

БАП 2 мг/л + 2,4 Д 0,02 мг/л + + +

ИУК 0,2 мг/л

БАП - 2 мг/л + 2,4 Д 0,02 мг/л + -

БАП 2 мг/л + ИУК 0,2 мг/л - -

На пятой неделе культивирования на фрагментах молодых листовых пластинок отмечалось развитие каллуса. Морфологически каллус описывался, как плотная масса светло-желтого цвета (рис. 1). Наибольший эффект индукции каллуса наблюдался на среде MS в сочетании с фитогармонами БАП - 2 мг/л и 2,4 Д - 0,02 мг/л. Тройная комбинация фитогормонов, таких как БАП - 2 мг/л, 2,4 Д - 0,02 мг/л и ИУК - 0,2 мг/л, также индуцировала каллусообразование, но в существенно меньшей степени. В ходе дальнейшей работы этот вид каллуса не удалось стимулировать к образованию соматических зародышей. По данным Y. Sun и др. [10] в качестве экспланта для получения каллуса успешно можно использовать листья, полученные из сеянцев. Этот метод слишком растянут во времени, поэтому было решено использовать для получения каллуса семядоли с гипокотилем. Семядольные листья платана в условиях темноты на третью неделю образовывали каллусные клетки. Каллусная масса имела плотную структуру светло-серого цвета. Культивирование этого каллуса на свету в течение 2 недель приводило к смене окраски на светло-зеленый (рис.3).

Эксперименты по индукции соматического эмбриогенеза в каллусных клетках платана проводили на разных комбинациях фитогормонов, используя приблизительно равные по массе участки каллусной ткани (табл. 3).

Таблица №3

Частота органогенеза в каллусе платана испанского на среде MS с различными комбинациями фитогармонов

№ БАП + НУК, мг Число очагов соматического эмбриогенеза Число повторностей

1 1+0,1 10

2 1+0,2 10

3 1+0,3 10

4 2+0,1 10

5 2+0,2 10

Наиболее удачным сочетанием оказалась среда MS c добавлением цитокининов и ауксинов, а именно, БАП — 1 мг и НУК — 0,1. На третьей неделе культивирования на участках каллусной ткани отмечено появление 34 морфогенетических очагов, впоследствии, регенерирующих полноценные растения.

Заключение

В ходе работы выяснено, что для введения платана испанского в культуру in vitro наиболее эффективно использовать в качестве эксплантов семядольные листья, полученные из трехнедельных проростков.

Установлено, что оптимальной средой для индукции каллусогенеза является среда МС с добавлением 2мг БАП, 0,02 мг 2,4 Д,0,2 мг ИУК.

Эмбриогенез в каллусных клетках платана с довольно высокой частотой индуцируется на среде МС с добавлением 1 мг БАП и 0,1 мг НУК.

Литература

1. Козловский Б.Л., Огородникова Т.К, Федоринова О.И., Куропятников М.В. Оценка устойчивости видов семейства Betulaceae S.F. Gray к болезням при

интродукции в Ростовской области // Экологический Вестник Северного Кавказа. Т.8, №4. Краснодар, 2012. С. 51-53.

2. Козловский Б.Л., Куропятников М.В., Федоринова О.И. Основной и дополнительный ассортимент древесных растений для зеленого строительства на юго-западе ростовской области // Инженерный вестник Дона, 2013, №2 URL: ivdon.ru/magazine/archive/n2y2013/1633.

3. Knapp E., Câmara Machado A., Puhringer H. Localization of fruit tree viruses by immuno-tissue printing in infected shoots of Malus sp. and Prunus sp. // Journal of Virological Methods. Vol. 55, Iss. 2. 1995, pp. 157-173.

4. Murashige T, Skoog F A revised medium for growth and rapid bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol Plant. Vol.15. 1962, pp. 473-497.

5. Bonga J.M., Aderkas P. In vitro culture of tree. Netherlands: Kluwer Academic Publishers, 1992. 238 p.

6. Kim M.K., Sommer H.E., Bongarten B.C., Merkle S.A. Highfrequency induction of adventitious shoots from hypocotyl segments of Liquidambar styraciflua L. by thidiazuron // Plant Cell Rep. Vol.16. 1997, pp. 536-540.

7. Vieitez, A.M., San-José M., Vieitez E. In vitro plantlet regeneration from juvenile and mature Quercus robur L. // J. Hortic. Sci. Vol.60. 1985, pp. 99-106.

8. Peternel S., Gabrovsek K., Gogala N., Regvar M. In vitro propagation of European aspen (Populus tremula L.) from axillary buds via organogenesi // J. Hortic. Sci. Vol.121. 2009, pp. 109-112.

9. Козловский Б.Л., Середа М.М., Вардуни Т.В., Богословенко М.В. Технология размножения плосковеточника восточного (Platycladus orientalis (L.) Franco) для целей зеленого строительства в Ростовской области // Инженерный вестник Дона, 2014, №3 URL: ivdon.ru>magazine/archive/n2y2014/2386.

10. Yuehua S., Yanling Zh., Xiaojuan W. Adventitious bud regeneration from leaf expiants of Platanus occidentalis L. and genetic stability assessment // Acta Physiol Plant. Vol. 31. 2009, pp. 33-41.

References

1. Kozlovskij B.L., Ogorodnikova T.K, Fedorinova O.I., Kuropyatnikov M.V. Ekologicheskij Vestnik Severnogo Kavkaza. T.8, №4. Krasnodar, 2012. pp. 51-53.

2. Kozlovskij B.L., Kuropyatnikov M.V., Fedorinova O.I. Inzenernyj vestnik Dona (Rus), 2013, №2 URL: ivdon.ru/magazine/archive/n2y2013/1

3. Knapp E., Câmara Machado A., Puhringer H. Localization of fruit tree viruses by immuno-tissue printing in infected shoots of Malus sp. and Prunus sp. // Journal of Virological Methods. Vol. 55, Iss. 2. 1995, pp. 157-173.

4. Murashige T, Skoog F A revised medium for growth and rapid bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol Plant. Vol.15. 1962, pp. 473-497.

5. Bonga J.M., Aderkas P. In vitro culture of tree. Netherlands: Kluwer Academic Publishers, 1992. 238 p.

6. Kim M.K., Sommer H.E., Bongarten B.C., Merkle S.A. Highfrequency induction of adventitious shoots from hypocotyl segments of Liquidambar styraciflua L. by thidiazuron // Plant Cell Rep. Vol.16. 1997, pp. 536-540.

7. Vieitez, A.M., San-José M., Vieitez E. In vitro plantlet regeneration from juvenile and mature Quercus robur L. // J. Hortic. Sci. Vol.60. 1985, pp. 99-106.

8. Peternel S., Gabrovsek K., Gogala N., Regvar M. In vitro propagation of European aspen (Populus tremula L.) from axillary buds via organogenesi // J. Hortic. Sci. Vol.121. 2009, pp. 109-112.

9. Kozlovskij B.L., Sereda M.M., Varduni T.V., Bogoslovenko M.V. Inzenernyj vestnik Dona (Rus), 2014, №3 URL: ivdon.ru>magazine/archive/n2y2014/2386.

10. Yuehua S., Yanling Zh., Xiaojuan W. Adventitious bud regeneration from leaf explants of Platanus occidentalis L. and genetic stability assessment // Acta Physiol Plant. Vol. 31. 2009, pp. 33-41.