СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСОВ И ЛУНКА ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ДАННОМ СПОСОБЕ
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR VIRUSES AND WELL APPLICABLE FOR PURPOSES OF SUCH TECHNIQUE

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к отдельной лунке с плоским дном для применения в способе диагностики вирусов. Более конкретно, данная лунка имеет планарное или плоское дно в противоположность закругленному дну. Изобретение также относится к способу диагностики вирусов, в котором используют такие отдельные лунки. В одном из вариантов осуществления данного способа используют специально разработанную среду для тканевых культур с добавлением гормонов и ферментов.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Общепринятые диагностические методики идентификации вирусов включают засев контейнеров конкретными клеточными линиями, отобранными на основании их чувствительности к определенным вирусам, а затем инокуляцию этой клеточной культуры биологическим образцом, предположительно содержащим вирус. Такие биологические образцы включают, среди прочего, слюну, мочу, фекалии, цереброспинальную жидкость (ЦСЖ), жидкости дыхательных путей и мазки, такие как, например, из ротовой полости, носовой полости, горла, кожи и половых органов. Затем инокулированную клеточную культуру инкубируют и клетки исследуют на цитопатологические эффекты, индуцированные вирусом. Поскольку определенные вирусы растут только на определенных клетках, вирус можно идентифицировать на основании клеточного типа, в котором он либо индуцирует цитопатический эффект (ЦПЭ), либо не индуцирует цитопатический эффект.
Существует ряд альтернативных протоколов данной методики, при которых клетки, которые инокулированы препаратом вируса, подвергают трипсинизации для удаления клеток с последующим обнаружением вируса с использованием моноклональных антител, специфичных к полипептидам вирусного происхождения, которые мечены молекулой-репортером, такой как молекула флуоресцеина (ФИТЦ). Еще одной альтернативой является включение покровного стекла внутрь культуральной пробирки с целью повышения выхода клеток.
В общепринятом (или традиционном - барабанном) способе используют пробирки с завинчивающимися крышками, которые засевают соответствующими клеточными линиями. После того как клетки достигают примерно 80% конфлюентности, пробирку инокулируют соответствующим образцом и проводят мониторинг на ЦПЭ в течение вплоть до трех недель. Ежесуточный мониторинг ЦПЭ требуется в течение первой недели. Менее частый мониторинг необходим в течение второй и третьей недель. Часто требуется слепой пассаж для повышения выхода вируса.
Одним из недостатков данного способа является то, что он требует интенсивных затрат труда и времени, поскольку необходим ежесуточный мониторинг пробирок. Как правило, два человека исследуют одну и ту же пробирку на ЦПЭ под световым микроскопом во избежание субъективности. Кроме того, не все вирусы вызывают видимый ЦПЭ, и те, которые его не вызывают, невозможно обнаружить данным способом. Кроме того, образование ЦПЭ, контролируемое в общепринятом пробирочном способе, в высокой степени зависит от чувствительности клеточных линий и от способности вируса давать видимый ЦПЭ. Токсичность образца может также, к сожалению, вызывать изменения, подобные ЦПЭ вируса, что дает ложный результат. Также некоторые вирусы вызывают ЦПЭ только после длительного периода времени (например, цитомегаловирус (CMV)). Таким образом, поскольку результаты, получаемые общепринятым пробирочным способом, преимущественно основаны на обнаружении ЦПЭ и рутинно не подтверждаются каким-либо другим способом, может иметь место неточная диагностика. Другое ограничение этого общепринятого пробирочного способа состоит в том, что он является трудным для использования более чем 2 или 3 пробирок на образец из-за получающегося в результате накопления пробирок. Например, 40 образцов в сутки будет давать 500 пробирок для анализа только в первую неделю.
Способ с использованием однослойных культур клеток в настоящее время является наиболее распространенным способом, используемым специалистами в данной области техники для выделения вируса. В этом способе используют 5-мл пластмассовый флакон (для однослойной культуры клеток), 16 мм в диаметре, который имеет полупрозрачную крышку. После соответствующей обработки округлое (13 мм) покровное стекло вставляют во флакон. Затем флакон засевают чувствительной клеточной линией, которая растет в виде монослоя на этом покровном стекле. Когда монослой клеток достигает примерно 80-90% конфлюентности, среду отбрасывают, монослой инокулируют образцом от пациента и флакон инкубируют. Затем инкубированный флакон подвергают мониторингу на ЦПЭ с последующим извлечением покровного стекла. Затем это стекло можно зафиксировать на предметном стекле микроскопа и окрашивать, используя моноклональные антитела.
Преимущество способа с использованием однослойных культур клеток состоит в том, что выход вируса можно повысить путем центрифугирования флаконов после инокуляции, что может сократить продолжительность времени, требуемого для получения результатов, до настолько малого, как 2-3 суток. Кроме того, при использовании способа с однослойными культурами клеток нет необходимости в ожидании видимого ЦПЭ. Покровное стекло можно извлечь на вторые или третьи сутки и окрасить соответствующими моноклональными антителами, а результаты подтвердить с использованием окрашивания антиген-антитело.
Однако способ с использованием однослойных культур клеток также имеет ряд недостатков. Он требует затрат времени, поскольку для покровных стекол необходима специальная обработка, такая как многократные отмывки детергентом и ацетоном с последующей отмывкой в дистиллированной воде и стерилизацией. Покровные стекла также приходится вручную вставлять во флаконы. Кроме того, если необходимо иммунофлуоресцентное окрашивание, эта методика становится еще более сложной и требующей затрат времени. Среду из флакона, используемого в способе с однослойными культ                                                                урами клеток, необходимо удалять, и покровное стекло извлекать вручную, используя специальные пинцеты, сушить на воздухе и фиксировать на предметном стекле микроскопа, используя вакуумную смазку. Извлечение покровных стекол является трудоемким, поскольку покровные стекла могут разбиться из-за грубого обращения или могут быть неправильно повернуты и зафиксированы на предметном стекле микроскопа верхней стороной монослоя вниз. Другое осложнение может возникнуть, если засеянные клетки также растут на дне покровного стекла, тем самым вызывая фиксацию покровного стекла на флаконе и делая извлечение покровного стекла очень трудным. Практически, как и для общепринятого пробирочного способа, при использовании способа с однослойными культурами клеток невозможно использовать более чем 2 или 3 пробирки на образец из-за накопления пробирок (то есть 40 образцов в сутки дает 500 флаконов, используемых в способе с однослойными культурами клеток, в неделю). Кроме того, большое количество моноклональных антител необходимо для иммунофлуоресцентного окрашивания, чтобы покрыть округлое 13-мм покровное стекло.
Способ с использованием 96-луночных планшетов представляет собой другой способ, который используют только в ограниченных случаях для выделения вирусов, которые растут на одной и той же клеточной линии. Например, если лунки засевают клеточной линией LLC-MK2, возможно выделение вируса парагриппа, а также вируса гриппа. Способ с использованием 96-луночных планшетов обладает теми преимуществами, что он является относительно простым для инокуляции засеянных клеточных линий конкретным образцом. Кроме того, можно инокулировать большое количество образцов на одном и том же планшете, и также возможно усиление путем центрифугирования. Кроме того, в способе 96-луночных планшетов используют только небольшое количество среды (0,3 мл вместо 1-1,5 мл, используемых в способе с однослойными культурами клеток), методики антиген-антитело можно использовать для подтверждения результатов, и этот способ также дает возможность легко "считывать" мониторинг ЦПЭ.
Однако способ с использованием 96-луночных планшетов также имеет свои недостатки. Целый планшет необходимо использовать для обнаружения антиген-антитело, что является в целом непрактичным, и целый планшет приходится использовать на одни и те же сутки, даже когда число образцов меньше, чем требуется для целого планшета. Это означает, что на каждые сутки необходимо использовать новую серию различных планшетов. Результатом этого, к сожалению, является ситуация, в которой, как только обнаружение завершено, не остается клеток, доступных для повторной процедуры в случае ошибки или после продолжительного периода инкубации. Кроме того, обычно только одну или две различные клеточные линии можно использовать на один планшет, и один и тот же тип образца инокулировать на один планшет. Методология отдельной лунки, как описано в австралийской заявке №2001100242, частично решает проблемы, связанные с общепринятыми способами, описанными выше, и обеспечивает альтернативный, эффективный и экономичный процесс для проведения диагностики вирусов. Описание этой заявки включено здесь в полном объеме путем ссылки.
Известно, что лунки с плоским дном дают некоторые преимущества, когда их используют в случае диагностических анализов. В частности, они обеспечивают более точный анализ по сравнению с указанными лунками с округлым или закругленным дном. Однако простые лунки с плоским дном также обладают недостатком в том, что мениск имеет тенденцию образовываться на дне лунки, что приводит в результате к неравномерному распределению раствора по дну лунки. В свете этого автором изобретения разработана лунка с плоским дном, как описано ниже, которая решает данную проблему.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Соответственно, в первом аспекте изобретения предложена лунка с плоским дном для применения в анализе, содержащая:
главную камеру с отверстием для приема жидкой пробы, с боковыми стенками, проходящими от отверстия, и с основанием камеры; и
дополнительную камеру, проходящую от основания камеры главной камеры, выполненную для приема заранее заданного количества жидкой пробы,
в которой указанная дополнительная камера имеет плоское дно.
Данное устройство имеет преимущество, заключающееся в том, что жидкая проба, помещенная в дополнительную камеру, может не образовывать мениск на боковых стенках главной камеры. Напротив, жидкая проба, помещенная в дополнительную камеру, может сохранять выпуклую поверхность, выступающую из дополнительной камеры в направлении главной камеры и/или внутрь нее. Это устройство также обеспечивает плоскую поверхность дна, на которой находится любая жидкая проба, что дает возможность более точного анализа, как было описано выше.
В другом варианте выполнения изобретения предложен набор лунок, содержащий одну или более чем одну отдельную лунку с плоским дном в соответствии с изобретением.
В еще одном аспекте изобретения предложен способ осуществления анализа, включающий использование отдельной лунки с плоским дном по изобретению или использование набора лунок по изобретению.
Еще в одном аспекте изобретения предложен способ обнаружения вируса, включающий:
предоставление одной или более чем одной отдельной лунки с плоским дном по изобретению, как описано здесь, засеянной предварительно отобранной клеточной линией;
инокуляцию образца, подлежащего анализу, в одну или более чем одну лунку;
исследование на один или более чем один предварительно отобранный вирус в одной или более чем одной лунке.
В дополнительном воплощении изобретения предложен способ обнаружения вируса, включающий:
предоставление одной или более чем одной отдельной лунки с плоским дном по изобретению, как описано здесь, засеянной клеточной линией, подходящей для инокуляции вируса;
проведение специальной предварительной обработки образца для получения пробы, которая потенциально содержит вирус, подлежащий обнаружению;
инокуляцию клеточной линии этой пробой;
инкубацию этой инокулированной клеточной линии;
замену среды для клеточной линии, инокулированной пробой, средой для выделения вируса, содержащей клеточную культуральную среду с добавлением по меньшей мере одного гормона и по меньшей мере одного фермента;
инкубацию данной инокулированной клеточной линии; и
анализ данной инокулированной клеточной линии на присутствие вируса.
В еще одном воплощении изобретения предложено применение отдельной лунки с плоским дном или применение набора лунок по изобретению в анализе.
В другом аспекте изобретения предложено применение отдельной лунки с плоским дном по изобретению в способе обнаружения вируса, включающем:
предоставление одной или более чем одной отдельной лунки с плоским дном по изобретению, как описано здесь, засеянной предварительно отобранной клеточной линией;
инокуляцию образца, подлежащего анализу, в одну или более чем одну лунку; и
исследование на один или более чем один предварительно отобранный вирус в одной или более чем одной лунке.
В следующем воплощении изобретения предложено применение отдельной лунки с плоским дном по изобретению в способе обнаружения вируса, включающем:
предоставление одной или более чем одной отдельной лунки с плоским дном по изобретению, как описано здесь, засеянной клеточной линией, подходящей для инокуляции вируса;
проведение специальной предварительной обработки образца для получения пробы, которая потенциально содержит вирус, подлежащий обнаружению;
инокуляцию клеточной линии этой пробой;
инкубацию этой инокулированной клеточной линии;
замену среды для клеточной линии, инокулированной пробой, средой для выделения вируса, содержащей клеточную культуральную среду с добавлением по меньшей мере одного гормона и по меньшей мере одного фермента;
инкубацию этой инокулированной клеточной линии; и
анализ инкубированной клеточной линии на присутствие вируса.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Варианты выполнения настоящего изобретения проиллюстрированы в прилагаемых не ограничивающих графических материалах, в которых:
Фиг.1 является схематическим изображением, которое иллюстрирует вид лунки в перспективе;
Фиг.2 является схематическим изображением, которое иллюстрирует вид лунки сбоку в разрезе;
Фиг.3 является схематическим изображением, которое иллюстрирует вид лунки снизу; и
Фиг.4 является схематическим изображением, которое иллюстрирует типичную конфигурацию лунки для ряда 12×8.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Главная камера и дополнительная камера могут иметь любую подходящую форму, при условии, что дополнительная камера проходит от основания главной камеры. Отдельные лунки с плоским дном могут иметь любую подходящую форму, при условии, что дно лунки, в которое поступает образец, является плоским. Например, лунки могут иметь круглое, квадратное, треугольное или гексагональное поперечное сечение. Также лунки могут быть равномерными в поперечном сечении по всей их высоте. Альтернативно, лунки могут сужаться в направлении их верхнего или их нижнего конца. Следует понимать, что лунки могут быть произведены с использованием стандартных материалов, которые применяют для общепринятых микротитрационных планшетов, и с помощью стандартных методик.
Предпочтительно главная камера имеет квадратное поперечное сечение, а дополнительная камера имеет круглое поперечное сечение. Контур круглой стенки дополнительной камеры в данном варианте выполнения предпочтительно проходит до края каждой стенки главной камеры. Это должно быть понятно из прилагаемых графических материалов, которые лучше иллюстрируют данный признак.
Обычно дополнительная камера может удерживать заранее заданный объем примерно 30 мкл в сумме, так что в дополнительной камере жидкая проба преобразуется в каплю, предпочтительно имеющую выпуклую поверхность, выступающую из отверстия дополнительной камеры и далее, так что глубина жидкости является по существу постоянной во всей дополнительной камере, тем самым уменьшая недостаток жидкой пробы, которую помещают в лунку и которая образует мениск на боковых стенках лунки.
Отношение высоты главной камеры к высоте дополнительной камеры предпочтительно составляет 10:1, а отношение ширины главной камеры к ширине дополнительной камеры составляет между 2:1 и 1:1. В предпочтительном варианте выполнения высота лунки составляет 11 мм, включая 10 мм высоты главной камеры и 1 мм глубины дополнительной камеры. Ширина лунки составляет как правило 8 мм, толщина стенки - примерно 1 мм, а внутренняя ширина дополнительной камеры составляет примерно 6 мм. Таким образом, обычно объем главной камеры составляет примерно 360 мкл, а дополнительной камеры - примерно 28,3 мкл.
Этот конкретный вариант выполнения может иметь преимущества в равной степени, когда лунки используют в виде набора лунок. Например, когда ряд лунок соединен, а не используется индивидуально. Таким образом, согласно альтернативному варианту выполнения изобретения, предложен набор лунок, содержащий более одной лунки по изобретению. Набор лунок может иметь, например, конфигурацию 96- или 48-луночного планшета или устройства, как описано в австралийской заявке №2001100242.
Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что в контексте некоторых способов анализа, где требуются лунки, которые должны быть вставлены в планшет, эти лунки могут содержать средства для облегчения сцепления с луночным планшетом, в который они должны быть вставлены. Например, эти лунки могут сужаться, как упомянуто выше, для обеспечения плотной посадки за счет трения в гнезде луночного планшета. Альтернативно, лунки могут иметь либо ребро, либо углубление, либо желоб, которые взаимодействуют с гнездом планшета, в которое должна быть вставлена лунка.
В некоторых случаях лунки могут быть удалены из луночного планшета во время анализа или во время транспортировки планшета. В предпочтительном варианте выполнения лунки как таковые имеют маркировку, такую как цветовая маркировка или метка. Лунки могут, например, иметь метки, указывающие их расположение (колонку или ряд) в планшете.
Для облегчения анализа лунки могут также иметь плоское дно, выполненное с градуированными делениями. Например, плоское дно каждой лунки может включать крестообразный волосок, который делит это плоское дно на четыре четверти. Таким образом, анализ одной четверти будет давать данные, применимые для анализа этого плоского дна в целом. Следует понимать, что любое число делений плоского дна может подходить для данной цели.
Лунки по изобретению имеют очень широкий ряд применений. В широком смысле лунки по настоящему изобретению применимы в анализах. Специалистам в данной области техники будет понятно, что такие анализы включают, но не ограничены ими, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), бактериальную клеточную культуру, методики ПЦР-амплификации, методики кристаллизации белка, тест на противовирусную чувствительность, а также методики скрининга химических и лекарственных веществ. В одном воплощении, например, лунки по изобретению применимы для диагностических анализов на вирусы.
Ссылку на анализ, как он использован здесь, следует понимать как ссылку на любые общепринятые лабораторные методики, в которых используют микротитрационные лунки.
Соответственно, во втором аспекте изобретения предложен способ обнаружения вируса, включающий:
предоставление одной или более чем одной отдельной лунки с плоским дном по изобретению, как описано здесь, засеянной предварительно отобранной клеточной линией;
инокуляцию образца, подлежащего анализу, в одну или более чем одну лунку; и
исследование на один или более чем один предварительно отобранный вирус в одной или более чем одной лунке.
В одном аспекте изобретения предложен способ осуществления анализа, включающий использование одной или более чем одной отдельной лунки с плоским дном по изобретению, как описано здесь. Предпочтительно этот анализ представляет собой диагностический анализ на вирусы.
В следующем аспекте изобретения предложен способ обнаружения вируса, включающий:
предоставление одной или более чем одной отдельной лунки с плоским дном по изобретению, как описано здесь, засеянной клеточной линией, подходящей для инокуляции вируса;
проведение специальной предварительной обработки образца для получения пробы, которая потенциально содержит вирус, подлежащий обнаружению;
инокуляцию клеточной линии этой пробой;
инкубацию этой инокулированной клеточной линии;
замену среды для клеточной линии, инокулированной пробой, средой для выделения вируса, содержащей клеточную культуральную среду с добавлением по меньшей мере одного гормона и по меньшей мере одного фермента;
инкубацию этой инокулированной клеточной линии; и анализ этой инкубированной клеточной линии на присутствие вируса.
Следует понимать, что в данном способе среда для пробы будет обычно представлять собой поддерживающую среду, которая была инокулирована этой пробой.
Термин "отдельная лунка с плоским дном", как он использован здесь, включает отдельную лунку, имеющую любую форму поперечного сечения, при условии, что дно лунки, в которую поступает образец, является плоским.
В контексте аспектов вирусной диагностики по настоящему изобретению применение отдельной лунки с плоским дном обеспечивает более точные результаты по сравнению, например, с исследованием пробы, помещенной на дно лунки, имеющей круглое или слегка закругленное основание, при исследовании на вирусы с использованием стандартных методик, таких как инвертированная флуоресцентная или оптическая микроскопия.
Отдельные лунки с плоским дном могут быть предоставлены уже засеянными предварительно отобранной клеточной линией, которая будет определена в зависимости от ее пригодности для роста и выделения конкретного вируса или вирусов, на которые проводят анализ. Например, клеточная линия LLC-MK2 подходит для обнаружения вирусов парагриппа, MDCK для вирусов гриппа; НЕР-2 для респираторного синцитиального вируса (RSV) и MRC-5 для цитомегаловируса (CMV), вируса простого герпеса (HSV), энтеровирусов и риновирусов. Специалист в данной области техники может выбрать подходящую клеточную линию для роста и выделения данного вируса.
Следует понимать, что засеянные отдельные лунки с плоским дном, описанные здесь, могут быть представлены в форме, подходящей для непосредственного применения (то есть готовый к использованию формат) в выбранном способе анализа. Специалисту в данной области техники будет понятно, что в готовом к использованию формате предварительно отобранная клеточная линия будет обычно представлена с конфлюентностью приблизительно 80-90%. Следует также понимать, что стабильность при хранении такой предварительно отобранной клеточной линии будет зависеть от конкретной предоставленной клеточной линии.
Альтернативно, засеянные отдельные лунки с плоским дном могут быть представлены в форме, подходящей для длительного хранения. Например, засеянные отдельные лунки с плоским дном могут быть представлены в замороженном виде, используя стандартные методики для долгосрочной консервации клеток. В качестве примера, но без ограничения, в процессе замораживания клеток любым путем клетки можно выращивать до подходящей конфлюентности в отдельных лунках с плоским дном и заменять ростовую среду подходящей средой для хранения. После этой стадии клетки можно подвергать процессу охлаждения и, наконец, хранить при - 70-80 градусах Цельсия. Среда хранения может содержать или не содержать криоконсервант. Криоконсервант, который можно добавлять в среду хранения, конкретно не ограничен, но может включать ДМСО и/или сыворотку. Специалист в данной области техники должен быть знаком с подходящими криоконсервантами и их применением. Не все клеточные линии могут выдерживать процесс замораживания, и специалист в данной области техники сможет распознать, какие клеточные линии будут пригодны или непригодны в данном отношении.
Следует понимать, что клеточные линии, представленные в замороженном виде, затем будут подвергать соответствующему процессу оттаивания и заменять среду хранения средой для выделения вируса. Специалисту в данной области техники будет понятно, что, как только клетки оттаяли, их будут обычно выращивать до 80-90% конфлюентности перед использованием в способе по изобретению, как описано здесь.
2
Ссылку на объект лунка с плоским дном, "засеянная" клеточной линией, следует понимать как ссылку на лунку, предварительно засеянную предварительно отобранной клеточной линией перед предоставлением для применения в анализе диагностики вирусов. Альтернативно, засеянные лунки могут в действительности быть засеяны после предоставления для применения в анализе диагностики вирусов. Стадия засева лунок может включать подстадии депонирования предварительно отобранной клеточной линии, разведенной в ростовой среде в лунках, инкубации клеток в СО инкубаторе до достижения клетками примерно 80-90% конфлюентности и замены ростовой среды поддерживающей средой.
Следует понимать, что, когда множество лунок необходимо сравнивать непосредственно в отношении роста и выделения конкретного вируса, объем среды в каждой лунке должен быть идентичным.
В некоторых воплощениях множество лунок засевают предварительно отобранной клеточной линией с получением ряда лунок, например, общепринятого ряда 12×8 для 96-луночного планшета или ряда 6×8 для 48-луночного планшета. Альтернативно, при желании может быть получен больший ряд, такой как ряд 14×8. Число предоставленных лунок конкретно не ограничено. Следует понимать, что, если предложены такие ряды, различные клетки будут как правило засевать в различные колонки этого ряда, опять же, в зависимости от вирусов, подлежащих обнаружению.
Следует понимать, что предварительно засеянные отдельные лунки с плоским дном по изобретению могут быть представлены в соответствующем герметизированном виде для обеспечения транспортировки и предотвращения контаминации и испарения. Например, в случае множества лунок герметизация может быть обеспечена покрытием, которое закрывает весь ряд лунок, такое как стандартное покрытие для 48- или 96-луночного планшета. Альтернативно, в случае отдельной лунки с плоским дном, герметизация может быть обеспечена подходящим колпачком, который герметично закрывает индивидуальную лунку. В другой альтернативе герметизация может быть обеспечена подходящей герметичной мембраной.
Следует также понимать, что покрытие, либо для множества лунок, либо для отдельной лунки с плоским дном по изобретению, как описано здесь, может содержать метки для облегчения в использовании. Например, покрытие может содержать символ или букву, которые представляют клеточную линию, находящуюся внутри.
Стадию инокуляции образцом, подлежащим анализу, одной или более чем одной клетки проводят в соответствии с известными методиками. Например, эта стадия будет, как правило, включать удаление соответствующего количества поддерживающей среды из каждой лунки, подлежащей инокуляции, и депонирование количества, как правило примерно 200-300 мкл, надосадочной жидкости образца в каждой лунке. Затем лунки можно центрифугировать/инкубировать, например при 4000 об/мин при 35°С в течение примерно 50-60 минут в зависимости от типа используемой центрифуги.
После извлечения из центрифуги инокулят можно удалить из лунок, например, путем вакуумной аспирации, и заменить подходящей поддерживающей средой или средой для выделения вируса. Эта среда предпочтительно включает клеточную культуральную среду с добавлением гормона и фермента.
Термин "образец, подлежащий анализу", как он использован здесь, включает отобранные образцы, полученные от субъекта, который может быть инфицирован вирусом или не инфицирован им. Таким образом, проба может содержать обнаружимый вирус или может быть свободной от вируса. Подходящие пробы могут быть получены из слюны, сыворотки, мочи, фекалий, цереброспинальной жидкости (ЦСЖ), жидкостей дыхательных путей, таких как бронхиальные альвеолярные лаважи и носоглоточные аспираты, а также мазков, таких как мазки из ротовой полости, носовой полости, горла, кожи и половых органов. Отобранный образец может быть подготовлен для применения путем разведения подходящей средой, которая совместима с клеточной линией и вирусом.
Субъект может представлять собой любой вид животного, который может быть инфицирован вирусом. Например, субъект может представлять собой птицу, рыбу или млекопитающее. В некоторых воплощениях субъект представляет собой млекопитающее. Подходящие млекопитающие включают сельскохозяйственных животных, таких как овцы, крупный рогатый скот, свиней, оленей и тому подобное, домашних животных, таких как собаки, кошки, кролики, морские свинки и тому подобное, лабораторных животных, таких как мыши, крысы, обезьяны и тому подобное, животных, находящихся в неволе, таких как содержащиеся в зоопарках, и людей. Предпочтительными млекопитающими являются люди. В других воплощениях субъект может представлять собой птицу, в частности домашних птиц, таких как куры и индейки. Специальные способы предварительной обработки образцов для получения проб, пригодных для обнаружения вируса, хорошо известны специалистам в данной области техники, но могут включать, без ограничения, обработку ультразвуком и центрифугирование.
Термины "среда для выделения вируса" или "среды для выделения вируса", как они использованы здесь, относятся к среде или средам, которые используют для роста и выделения вируса. Например, среда для выделения вируса включает поддерживающую среду. Автор настоящего изобретения обнаружил, что клеточная культуральная среда, в которую добавляют как гормон, так и фермент, преимущественно оптимизирует выделение вируса посредством поддержания чувствительности клеточной линии на ее максимуме, а также способствует прикреплению вирусов к клеточной стенке и в некоторых случаях сокращает время, необходимое для получения результата.
Фермент, добавленный в клеточную культуральную среду, не ограничен, и специалист в данной области техники может идентифицировать подходящие ферменты. В некоторых воплощениях термин "фермент" относится к протеолитическому ферменту. В этих воплощениях фермент предпочтительно представляет собой серин- или аспартат-протеазу. Примерные ферменты включают трипсин, химотрипсин или пепсин. В предпочтительных воплощениях фермент представляет собой трипсин.
Гормон, добавленный к клеточной культуральной среде, не ограничен, и специалист в данной области техники может идентифицировать подходящие гормоны. В некоторых воплощениях термин "гормон" относится к кортикостероидам, предпочтительно глюкокортикоиду. Более предпочтительно гормон выбран из дексаметазона, гидрокортизона, кортизона ацетата, преднизона, преднизолона, метилпреднизолона, бетаметазона, триамцинолона, беклометазона, флудрокортизона ацетата, дезоксикортикостерона ацетата (DOCA) и альдостерона. В предпочтительном воплощении гормон представляет собой дексаметазон. Гормон может быть либо синтетическим, либо встречающимся в природе.
Хотя комбинация гормона и фермента является наиболее предпочтительным воплощением, альтернативно обнаружено, что ДМСО (диметилсульфоксид) и ДЭАЭ (декстран) могут быть также полезны.
-4
-6
-5
-5
Количество фермента, добавленного в культуральную среду, предпочтительно находится в интервале 1-5 мкг/мл, и предпочтительно составляет примерно 2,5 мкг/мл. Концентрация гормона в культуральной среде предпочтительно находится в интервале 10 М - 10 М, и предпочтительно составляет примерно 10 М. Однако в случае дексаметазона и трипсина, который является предпочтительным, обнаружено, что клеточные культуральные среды, в которые добавлено примерно 2,5 мкг/мл трипсина и дексаметазон в концентрации примерно 10 М, дают оптимальный результат.
-5
Соответственно, в конкретном воплощении способа по изобретению используют среду для выделения вируса, которая включает клеточные культуральные среды, в которые добавлено примерно 2,5 мкг/мл трипсина и дексаметазон в концентрации примерно 10 М.
Клеточные культуральные среды, которые можно использовать в соответствии с изобретением, конкретно не ограничены. Например, они могут включать среду-199, DMEM (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла), RPMI-1640 или MEM-EAGLE. Однако, как будет легко понятно, существует широкое разнообразие различных сред, которые могут поддерживать рост клеток и которые легко доступны специалистам в данной области техники. Тем не менее, согласно предпочтительному воплощению клеточная культуральная среда представляет собой MEM-EAGLE.
В клеточную культуральную среду могут быть добавлены добавки, которые поддерживают рост клетки и вируса, и такие добавки известны специалистам в данной области техники. Известно, что конкретным клеточным линиям и/или вирусам могут требоваться специальные добавки для оптимального роста и жизнеспособности. Примерные добавки включают L-глутамин, аминокислоты, антибиотики, сыворотку, сбалансированные соли Хэнкса, сахара, такие как D-глюкоза, неорганические соли, витамины, феноловый красный, буферы, такие как HEPES, и поверхностно-активные вещества, такие как Твин 80.
Среду для выделения вируса, описанную выше, можно использовать в общепринятых диагностических методиках для идентификации вирусов, таких как общепринятый пробирочный способ и способ с однослойными клеточными культурами. Альтернативно, среду для выделения вируса можно использовать в способе по изобретению, как описано здесь.
Среду для выделения вируса, используемую в способе по изобретению, можно использовать для выделения ряда различных вирусов, которые подходят для клеточной культуры. Специалисту в данной области техники известно, что такие вирусы включают, но не ограничены ими, респираторные вирусы, вирусы парагриппа 1, 2, 3, 4 (PI 1, 2, 3, 4), гриппа А, В (Inf A, B), респираторный синцитиальный вирус (RSV), аденовирус (AD), риновирус (RH), цитомегаловирус (CMV) и вирусы из группы энтеровирусов (ENT), состоящей из кишечного цитопатогенного вируса-сиротки (Echo), вируса Коксаки, энтеровируса и вируса полиомиелита, а также нереспираторные вирусы, такие как, но не ограниченные ими, вирус простого герпеса (HSV) 1, 2, вирус опоясывающего лишая (VZV), вирус краснухи, вирус эпидемического паротита, вирус кори, ротавирус и вирус полиомы.
В способе по изобретению инокулированные клетки можно инкубировать с образцом, подлежащим анализу, используя известные условия. Например, инокулированные клетки можно инкубировать при 37°С в течение периода, который является результатом инфицирования клеток вирусом, такого как от 45 до 90 минут, в частности 60 минут. Инкубацию можно проводить в инкубаторе, либо ее можно проводить с центрифугированием.
Вирус можно обнаружить, используя общепринятые способы обнаружения, известные в данной области техники, такие как методики иммунологического обнаружения, такие как иммунофлуоресценция, окрашивание, визуализация ЦПЭ, общепринято используемые молекулярные методики, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР), ПЦР с обратной транскрипцией - (ОТ-ПЦР) и амплификация, основанная на секвенировании нуклеиновых кислот (NASBA).
В целях подготовки лунок к исследованию обычно используют ряд стадий отмывки в соответствии с общепринятой методологией. Например, поддерживающую среду обычно удаляют и клетки высушивают на воздухе в лунках. Затем лунки можно заполнять, например, холодной смесью метанолацетон (отношение 1:2) и фиксировать в течение 15 минут при -25°С. После удаления этой смеси лунки можно снова сушить на воздухе. Затем в каждую из лунок можно добавить специфичные моноклональные антитела в зависимости от вируса, подлежащего обнаружению, и инкубировать лунки, как необходимо. Затем моноклональные антитела можно отбросить, а лунки снова отмыть. Этот процесс можно повторить со вторыми антителами.
После последнего высушивания на воздухе в лунки можно добавить 1-2 капли флуоресцентной заливочной среды и исследовать содержимое на иммунофлуоресценцию.
Далее будет сделана ссылка на прилагаемые графические материалы, которые иллюстрируют варианты выполнения настоящего изобретения.
Со ссылкой на Фиг.1, показан особенно предпочтительный вариант выполнения лунки с плоским дном 10 для использования в соответствии с изобретением, которая содержит главную камеру 11, которая является квадратной в поперечном сечении, и дополнительную камеру 12, которая является круглой в поперечном сечении. Дополнительная камера 12 проходит от основания 13 камеры главной камеры 11. Таким образом, отверстие 14 дополнительной камеры ограничено основанием 13 камеры главной камеры. Контур наружной стенки 15 дополнительной камеры 12 проходит до наружных сторон каждой стенки 16 главной камеры 11 (лучше всего проиллюстрировано на Фиг.3).
Одна стенка 16 главной камеры 11 имеет желоб 17 для расположения в нем соответствующей части луночного планшета (не показан), в который нужно поместить лунку 10. Это способствует надежному закреплению лунки 10 в планшете и решает проблемы, связанные с отсоединением лунок 10 от планшета.
Дополнительная камера 12 имеет заранее заданный объем, так что в нее поступает жидкая проба, преобразующаяся в каплю, предпочтительно имеющую выпуклую поверхность, выступающую из отверстия 14 дополнительной камеры. Это обеспечивает по существу постоянную глубину жидкости во всей дополнительной камере по сравнению с жидкой пробой, которую помещают в лунку и которая образует мениск на боковых стенках лунки. В этом случае глубина жидкости около боковой стенки лунки, где образован мениск, существенно больше, чем в середине лунки, где мениск ниже всего.
Высота Х лунки предпочтительно составляет 11 мм, включая 10 мм высоты Y главной камеры и 1 мм глубины Z дополнительной камеры. Ширина W лунки обычно составляет 8 мм, а толщина стенки Т - примерно 1 мм. Таким образом, внутренняя ширина Wi составляет примерно 6 мм. Обычно объем главной камеры составляет примерно 360 мкл, а дополнительной камеры - примерно 28,3 мкл.
На Фиг.4 приведен один из примеров типичной конфигурации 12×8 луночного планшета (то есть 2×6×8), включая перечень вирусов, подлежащих обнаружению, соответствующих клеточных линий и сутки, на которые извлекают каждую линию. Планшет выполнен из 96 индивидуальных лунок с плоским дном в соответствии с настоящим изобретением.
Как видно из Фиг.4, планшет можно засеять различными клеточными линиями в приведенном ниже порядке:
Колонки 1-3
LLC-MK2
Колонки 4, 5
MDCK
Колонка 6
Нер2
Колонка 7
А549
Колонка 8
RK13
Колонки 9-12
MRC-5
Устройство планшета таким образом будет давать возможность для отбора, например, респираторных вирусов парагриппа 1, 2, 3, 4 (PI 1, 2, 3, 4), гриппа А, В (Inf A, B), RSV, аденовируса (AD), риновируса (RH), цитомегаловируса (CMV) и вирусов из группы энтеровирусов (ENT), состоящей из кишечного цитопатогенного вируса-сиротки (Есо), вируса Коксаки (сох), энтеровируса (Ent) и вируса полиомиелита (Polio), а также, но не ограничиваясь ими, нереспираторных вирусов вируса простого герпеса (HSV) 1, 2 и вируса опоясывающего лишая (VZV), без ограничения ими.
В следующем примере конфигурация 6×8 луночного планшета может состоять из клеточных линий, засеянных в приведенном ниже порядке:
Колонки 1-3
А549
Колонки 4-6
MRC-5
Это будет давать возможность, например, обнаружения вирусов, таких как CMV, HSV 1, 2, VZV, AD и вирусов из группы энтеровирусов.
Наконец, конфигурация из 14×8 лунок будет в итоге давать возможность обнаружения патогенов, таких как PI 1,2, 3, 4; Inf A, В; RSV; AD; RH; ENT (Echo, cox, Ent, Polio); HSV 1, 2; VZV; вируса краснухи; вируса эпидемического паротита; вируса кори; ротавируса; вируса полиомы, а также других патогенов-вирусов, используя соответствующие клеточные линии.
Извлечение клеточных линий, благодаря индивидуальной природе лунок, может быть избирательным в зависимости от временного режима, который является подходящим для обнаружения конкретного интересующего вируса. В частности, если желательно обнаружение PI 1-4, например для ряда А, лунки А1-A3 извлекают на вторые сутки. Подобным образом, если желательно обнаружение Inf А, В, лунки А4 и А5 извлекают на вторые сутки. Однако, если необходимо обнаружение Entero, тогда лунку АН извлекают на соответствующие сутки (1-3). Специфичная природа индивидуальных лунок способствует избирательному извлечению и обнаружению вируса.
Далее будет сделана ссылка на конкретную методику, которой можно следовать, используя набор по одному аспекту изобретения, многие стадии которого могут быть не обязательными, и ее никоим образом не следует рассматривать как ограничивающую изобретение.
Используя вакуум и стерильные стеклянные пастеровские пипетки, среду отсасывают из всех лунок, подлежащих инокуляции. Распределение пастеровских пипеток в больших остроконечных контейнерах предпочтительно облегчает задачу.
Используя одноразовую пипетку, соответствующее число лунок луночного планшета инокулируют примерно 150-200 мкл образца на лунку. Оставшийся образец хранят при -70°С. Затем на планшет помещают крышку и надписывают дату над лунками, инокулированными в этом планшете.
Затем планшет взвешивают на цифровых весах и уравновешивают по планшетам-противовесам и единицам скорости считывания до тех пор, пока все планшеты не будут иметь одинаковую массу (+/- 0,5 г) и могут быть уравновешены в центрифуге. Центрифугу запускают примерно при 37°С и 3500 об/мин на период 60 мин. Затем, используя вакуум и стерильные стеклянные пастеровские пипетки, каждый образец отсасывают из каждой лунки, и, используя новую одноразовую пипетку для каждого образца, каждую лунку заполняют средой для выделения вируса ВАС.
2
2
Затем образцы инкубируют в увлажненной окружающей среде при 37°С в СO инкубаторе (5%) путем осторожного помещения планшетов в СO инкубатор и инкубации при 37°С в течение вплоть до семи суток после инокуляции последнего образца.
Иммунофлуоресцентное окрашивание предпочтительно используют для обнаружения конкретных вирусов в отдельных лунках, используя специфичные моноклональные антитела. Как правило, следуют приведенной ниже методике:
Используя вакуумное отсасывание, среду удаляют из соответствующей лунки (лунок), и лунки извлекают из планшета, используя специальный пинцет, и переносят в другой держатель. Затем их высушивают на воздухе в течение 3 минут. Затем в каждую лунку добавляют 300 мкл холодной смеси ацетона и метанола (2:1) и дают фиксироваться в течение 15 минут при -20°С. Затем фиксатор отбрасывают, и образец снова сушат на воздухе в течение 2-3 минут. Затем в каждую лунку добавляют специфичное моноклональное антитело (первое), и крышку планшета ставят на место и инкубируют образцы в течение 30 минут при 37°С. Затем образцы извлекают из инкубатора, и каждую лунку заполняют фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). Затем PBS отбрасывают. Этот процесс повторяют еще четыре раза. Снова образец сушат на воздухе в течение 3 минут, после чего в каждую лунку добавляют второе антитело, специфичное для первого антитела. После этого опять проводят инкубацию образца с последующими повторными обработками PBS, как упомянуто выше, и конечной отмывкой дважды дистиллированной водой. Затем добавляют небольшое количество (1 каплю) специально приготовленной заливочной среды и результаты наблюдают под флуоресцентным микроскопом. Можно также использовать одну стадию иммунофлуоресцентного окрашивания.
На протяжении всего данного описания и прилагаемой формулы изобретения, если контекст не требует иного, слово "содержать" и его вариации, такие как "содержит" и "содержащий", следует понимать как предполагающий включение указанного целого числа, либо группы целых чисел, либо стадий, но не исключение любого другого целого числа, либо группы целых чисел, либо стадий.
Специалистам в данной области техники будет понятно, что изобретение, описанное здесь, допускает вариации и модификации, отличные от конкретно описанных. Должно быть понятно, что изобретение включает все такие вариации и модификации. Изобретение также включает все стадии, признаки, композиции и соединения, на которые ссылаются, или которые указаны в данном описании, индивидуально или вместе, а также любую из комбинаций любых двух или более указанных стадий или признаков.