Особенности биотестирования почв с целью их экотоксикологической оценки

Биология

Вестник Нижегородского университета и/м. Н.И. Лобачевского, 2009, № 1, с. 84-93

УДК 504.064.3;57.084

ОСОБЕННОСТИ БИОТЕСТИРОВАНИЯ ПОЧВ С ЦЕЛЬЮ ИХ ЭКОТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ

© 2009 г. Н.В. Маячкина, М.В. Чугунова

Санкт-Петербургский научно-исследовательский центр экологической безопасности РАН

vestnik@unn.ru

Поступила в редакцию 14.10.2008

Рассматриваются проблемы токсикологической оценки загрязненных почв и выбора методик биотестирования. Предлагается комплекс биотестов, использование которого дает надежную характеристику экотоксикологического состояния почвы. Показана высокая чувствительность и информативность методики определения фитотоксичности почв, разработанной в СПб НИЦЭБ РАН и внесенной в Федеральный реестр МВИ. Предлагаемый комплекс методик по биотестированию апробирован на дерново-подзолистой суглинистой почве, загрязненной разными дозами нефти в полевом эксперименте. Проводится сравнение полученных результатов лабораторных экспериментов с данными полевых исследований.

Ключевые слова: экологическая оценка, биотестирование почв, класс опасности.

Действующая система контроля за загрязнением окружающей среды основана на количественном сравнении компонентного состава проб с предельно допустимыми концентрациями (ПДК) загрязняющих веществ. Опасность техногенного воздействия оценивается на основании суммарного коэффициента техногенного загрязнения, рассчитанного в соответствии с данными валового содержания химических элементов. Такой подход является не всегда эффективным. В настоящее время число веществ-загрязнителей, способных влиять на экологическое состояние биоты, превысило миллион наименований, и ежегодно синтезируется свыше четверти миллиона новых веществ [1]. В результате преобразований в природной среде происходит синтез новых соединений, которые могут быть токсичнее исходных ингредиентов. Примерами таких веществ могут быть метил-ртуть, соединения тяжелых металлов с детергентами, пестицидами и т.д. [2]. Вредное действие физических, химических и других факторов при их комбинировании может ослабляться (антагонизм) или усиливаться (синергизм). Изолированного действия не существует, есть лишь совместное действие всего комплекса факторов.

Разработка экологических нормативов применительно к почвам значительно отстает от создания нормативов для других сред (атмосфера, водные системы). Это связано со сложностью и неоднородностью объекта - почва состоит из четырех фаз: твердой, жидкой, газообразной и биотической. Это свойство почвы,

отличающее ее от других природных сред, во многом затрудняет нормирование содержания загрязняющих веществ в почве и адекватную экологическую оценку почв, особенно в случае комплексного техногенного загрязнения.

Методы биотестирования, основанные на ответной реакции живых организмов на негативное воздействие загрязняющих веществ, способны давать достоверную информацию о качестве компонентов окружающей среды, в том числе почв. Эти методы оценки имеют следующие характеристики:

• быстрота проведения;

• доступность и простота проведения экспериментов;

• воспроизводимость и достоверность полученных результатов;

• экономичность как в материальном отношении, так и по трудозатратам;

• объективность полученных данных.

По сути, биотестирование - это определение токсичности пробы (воды, почвы, донных осадков и т.д.) для данной культуры организмов в лабораторном эксперименте. В основе биотестирования лежит такой метод научного познания, как биологическое моделирование. Всякая модель является в определенной мере специфической формой отражения действительности. При биотестировании происходит перенос знаний с простой системы (смоделированной экосистемы в лабораторном опыте) на более сложную (экосистему в реальных условиях). При таком подходе важным является выбор тест-

Особенности биотестирования почв с целью их экотоксикологической оценки

85

культуры и параметров изменения ее жизнедеятельности.

В научной литературе некоторые авторы критикуют метод биотестирования как плохо воспроизводимый и недостоверный, считая его непригодным для оценки окружающей среды, так как результаты исследований часто имеют значительный разброс (до 35%) при воспроизведении в разных лабораториях [3]. Действительно, высокая внутривидовая вариабельность живых организмов, играя важнейшую роль в межвидовых отношениях и выживаемости видов, является при проведении биотестирования существенной проблемой. В идеале для этих целей хотелось бы использовать клонированных особей, имеющих генетически одинаковый потенциал реагирования на факторы окружающей среды. Однако при современном развитии биологии этот вопрос неразрешим. Тем не менее существуют способы сведения разброса результатов опытов с живыми организмами к минимуму и тем самым повышения их достоверности и воспроизводимости.

В первую очередь, подопытные организмы в рамках одного эксперимента должны быть визуально одинаковыми. Это означает, что для семян растений необходима калибровка по массе и длине, для животных имеют значение возраст и размеры. Например, для опыта с дафниями подбирают молодых особей в возрасте от 1 до 3 дней, культивируемых в лабораторных условиях. Кроме того, лабораторная культура дафний периодически должна проходить тест на чувствительность к токсикантам (по калию двухромовокислому К2Сг207). Во-вторых, необходимо уравнять для всех вариантов опыта внешние факторы, такие как освещенность, температура, влажность субстрата (при фитотестировании). В-третьих, число параллельных определений в каждом варианте должно быть достаточным для проведения дальнейшей статистической обработки полученных данных.

Некоторые исследователи рекомендуют определять степень токсичности почв используя биохимические, генетические, биофизические, цитологические или иммунологические показатели животных и растений [4]. Живой организм реагирует на изменение окружающей среды изменением гомеостаза. Этот механизм обеспечивает протекание жизненных процессов. Под воздействием неблагоприятных условий внешней среды механизмы поддержания гомеостаза могут быть нарушены, что приводит к состоянию стресса. Однако показатели нарушения гомеостаза не могут дать прогноза о дальнейшей жизнеспособности организма в силу своей

динамичности. Поэтому в подавляющем большинстве методов биотестирования тест-функции организмов являются наиболее общими, отражающими состояние организмов в целом: выживаемость, репродуктивную функцию, ростовые показатели и т.д.

В настоящее время для определения токсичности почв методами биотестирования используются показатели токсичности водных вытяжек из почв, определяемые на организмах-гидробионтах [5, 6, 7]. Как было показано нами ранее [8], результаты определения токсичности почв и водных вытяжек из них методом биотестирования в некоторых случаях существенно отличаются. Например, токсичность почв, определяемая методом проращивания семян высших растений непосредственно в почве, выше, чем токсичность водных вытяжек из этих же почв, определяемая на традиционных для водной токсикологии тест-объектах. Разница результатов особенно велика при загрязнении почв токсикантами, малорастворимыми в воде, например нефтью или продуктами гидролиза иприта.

Необходимо отметить, что современные методические разработки по биотестированию, где в качестве тест-объектов используются высшие растения, имеют некоторые недостатки. К примеру, авторы РД 52.18.344-93 [9] предлагают определять уровень интегральной токсичности почв на основе прироста отрезков коле-оптилей злаковых культур длиной 4 мм, помещенных в почву на 24 часа. Точность измерений при таком исследовании составляет 0.1 мм. Измерения проводятся при помощи лупы или окулярного микрометра. Такая методика определения токсичности почв, на наш взгляд, противоречит одному из важных достоинств метода биотестирования - простоте его использования.

Авторы другой методики по биотестированию ИСО 11269-1 [10] для быстрой оценки качества почвы рекомендуют проращивать семена растений в горшках диаметром 8 см и высотой 11 см. Это означает, что для одного варианта опыта в трехкратной повторности потребуется проба почвы массой 1.5-2 кг. Однако во многих случаях у исследователей нет таких объемов проб (например, при проведении лабораторных модельных экспериментов).

При определении степени токсичности почв методами биотестирования большое значение имеет чувствительность к токсикантам подопытных организмов. Наиболее корректный результат достигается при использовании нескольких тест-объектов из разных систематиче-

86

Н.В. Маячкина, М.В. Чугунова

ских групп. В нормативных документах [11] рекомендовано использовать минимум два тест-организма. В научной литературе опубликованы разработки по созданию тест-системы, состоящей из четырех представителей животного и растительного мира [12].

Объекты и методы исследования

На основании многолетних исследований комплексной экотоксикологической оценки техногенно загрязненных почв авторами настоящей работы из всего комплекса методов биотестирования, существующих в настоящее время, предложен комплекс тест-орга-низмов, включающий в себя исследования на трех тест-объектах: представителе гидробионтов Daphnia magna St., микроорганизмах и представителе высших растений Avena sativa. По нашему мнению, именно эти представители биоты, используемые в лабораторных экспериментах, могут дать адекватную оценку качества почвы.

В рассматриваемом комплексе тест-организмов для экотоксикологической оценки почв наряду с организмами-педобионтами присутствует представитель гидробионтов, чтобы исключить риск загрязнения сопредельной водной среды, так как загрязняющие вещества путем миграции по почвенному профилю могут попадать в грунтовые воды или при поверхностном смыве - в различные водные объекты (ручьи, реки, озера и т.д.). Наиболее пригодным для биотестирования водных вытяжек из почв является, по нашему мнению, ветвистоусый рачок Daphnia magna Straus. Литературные данные [13], подтвержденные собственными исследованиями, свидетельствуют о том, что этот представитель планктона является универсальным и весьма чувствительным к загрязнению тест-объектом.

Биотестирование на дафниях проводили по методике ФР.1.39.2001.00283. Водные вытяжки из почв готовились в соотношении почва:вода 1:4. В качестве экстрагента использовали культивационную воду. Кратковременное биотестирование водных вытяжек из почв позволяет определить их острое токсическое действие на дафний по смертности. Критерием острой токсичности служит гибель 50% и более дафний за 96 часов в исследуемой воде по отношению к контролю при условии, что в контрольном эксперименте гибель не превышает 10%.

Вторым тест-объектом в предлагаемом комплексе биотестов являются почвенные микроорганизмы, а точнее естественный микробоце-ноз, содержащийся в исследуемых почвах. Как важнейший компонент наземных экосистем микроорганизмы активно участвуют в регуля-

ции почвообразовательных процессов, разложении растительных и животных остатков, контролируют широкий спектр других экосистем-ных функций [14]. Определение биологической активности почвы, под которой понимают совокупность протекающих в ней микробиологических процессов, характеризует состояние почвенного микробиоценоза. Традиционными и широко используемыми показателями биологической активности являются численность микроорганизмов и видовой состав микрофлоры. Однако необходимо принимать во внимание тот факт, что по количественному и качественному составу почвенной микрофлоры не всегда можно судить об интенсивности процессов, проходящих в загрязненной почве. Поэтому, на наш взгляд, наиболее объективной следует считать характеристику функциональных способностей микроорганизмов, так как именно функциональные свойства обусловливают стабильность сложившегося в почве микробиоценоза и в конечном счете определяют свойственный ей тип превращения веществ.

Одним из распространенных интегральных методов определения биологической активности почв и грунтов является актуальное почвенное дыхание, то есть выделение почвенной биотой углекислоты. Определение токсичности почвы основано на изменении биологической активности почвенных проб под влиянием содержащихся в них токсичных веществ по сравнению с контрольной пробой. Следует отметить, что определение биологической активности почвы выявляет тенденции в динамике биологических процессов. Поэтому для оценки степени токсичности загрязненной почвы проведение исследований по изучению этого показателя является, на наш взгляд, обязательным.

Количество СО2 определяли по методу

Э.А. Головко [15]. В сосуды объемом 500 см3 помещают рядом небольшую влажную навеску почвы в чашке Петри и стаканчики со щелочью (для поглощения выделенного СО2). Сосуды герметично закрывают. Одновременно стаканчики со щелочью ставятся в пустые сосуды (без навесок почвы) для холостого определения СО2, которое необходимо, чтобы исключить в тестируемых вариантах из общего объема поглощенной щелочью углекислоты ту ее часть, которая не связана с жизнедеятельностью микроорганизмов. Количество выделившегося СО2 определяется через 24 часа. Содержимое стаканчиков титруют раствором Н^04 в присутствии фенолфталеина до обесцвечивания раствора. Полученные данные обрабатываются методом вариационной статистики [16].

сроки наблюдений

4.0 л/м2

сроки наблюдений

04 05

сроки наблюдений

10.0 л/м2

сроки наблюдений

250

200

150

100

50

96,2

226,7

107,4

133,3

0

июнь -04 октябрь - июнь -05 октябрь -04 05

сроки наблюдений

4.0 л/м2

^ 350

о4

2 300 с

§. 250 ° 200 ш 150

I 100

3

о 50

I-

° 0

94,5

295,2

181,8

100,7

июнь -04 октябрь - июнь -05 октябрь  04 05

сроки наблюдений

Рис. 2. Динамика интенсивности актуального дыхания нефтезагрязненной дерново-подзолистой почвы при разных дозах внесения нефти

июль -04 окт -04 июль -05 окт -05

сроки наблюдений

4.0 л/м2

июль -04 окт -04 июль -05 окт -05

сроки наблюдений

июль -04 окт -04 июль -05 окт -05

сроки наблюдений

10.0 л/м2

сроки наблюдений

сроки наблюдений

4.0 л/м2

сроки наблюдений

сроки наблюдений

10.0 л/м2

сроки наблюдений

Особенности биотестирования почв с целью их экотоксикологической оценки

91

Следующим тест-объектом в предлагаемой системе биотестов для определения токсичности почв стали высшие растения, поскольку продуктивность является важнейшим критерием качества почвы. Выше было отмечено несовершенство существующих методик определения фитотоксичности почв. В лаборатории мониторинга и проблем реабилитации техногенных ландшафтов СПб НИЦЭБ РАН была разработана методика определения токсичности техногенно загрязненных почв, которая позволяет выявить потенциальную продуктивность и пригодность почвы обеспечивать рост и развитие растений. Данная методика прошла метрологическую аттестацию и внесена в Федеральный реестр МВИ под шифром ФР. 1.39.2006.02264 [17].

Фитотестирование проводится следующим образом. В чашки Петри помещают увлажненные почвенные образцы и высаживают в них откалиброванные семена овса. В течение 3-4 дней поддерживается постоянная влажность почвы и температура окружающей среды. При достижении проростками стадии колеоптиля учитывается количество проросших семян и проводится измерение корней. Полученные данные обрабатываются методом вариационной статистики. Критерием токсичности, согласно методике, считаются достоверно значимые различия между исследуемыми образцами и контролем, превышающие 20%.

Результаты и их обсуждение

Рассматриваемая тест-система апробирована на дерново-подзолистой почве, загрязненной различными дозами нефти в полевом опыте.

Загрязнение нефтью было произведено в мае 2004 года. Дозы внесения нефти следующие:

0.7; 1.4; 4.0; 10.0 л/м2. Повторность опыта трехкратная. Размер делянки - 1 м2. Период наблюдения - два года после нефтезагрязнения. Для лабораторных экспериментов по биотестированию образцы почв отбирали в начале и в конце периода вегетации - июнь, октябрь 2004 и июнь, октябрь 2005 года.

По результатам биотестирования на дафниях проб нефтезагрязненной дерново-подзолистой почвы, представленным на рис. 1, установлено, что дозы внесения нефти 0.7 и 1.4 л/м2 не оказывали острого токсического действия на дафний даже при свежем трехнедельном разливе. Достоверная гибель дафний относительно контроля составила 21% и 42% особей соответственно.

Почвенные образцы с дозой нефти 4 л/м2 обладали острой токсичностью до начала второго вегетационного сезона - гибель дафний превы-

шала 50%. Тем не менее к последнему сроку наблюдений гибель дафний составляла 27%, что, согласно методике, означает отсутствие острой токсичности. И лишь максимальная доза нефти, внесенная нами (10 л/м2), не изменила острой токсичности до конца второго вегетационного сезона, хотя гибель дафний и снизилась с 90% в первом до 63% в последнем сроках наблюдений.

Следующим этапом определения токсичности нефтезагрязненных почв было определение их биологической активности. Результаты, представленные на рис. 2, свидетельствуют о том, что во всех вариантах опыта при свежем разливе нефти активность почвенного дыхания несколько снижается. Однако уже через три месяца фиксируется статистически достоверное увеличение микробиологической активности по сравнению с контрольной (не загрязненной нефтью) почвой. Этот подъем свидетельствует о том, что вносимый нами уровень токсической нагрузки не является для данного микробоцено-за губительным и не оказывает на него острого токсического действия даже при максимальной опытной дозе внесения нефти.

Определение фитотоксичности почвы представлены на диаграммах рис. 3. Контролируемым показателем являются данные измерений длины корней проростков как наиболее информативный показатель при определении степени токсичности почвы. Они свидетельствуют, что даже при свежем трехнедельном разливе нефти первые две дозы (0.7 и 1.4 л/м2) были нетоксичны для высших растений. Почвы с внесением двух следующих доз (4.0 и 10.0 л/м2) обладали умеренной фитотоксичностью, которая сохранялась до конца первого вегетационного сезона. Во втором вегетационном сезоне токсичность этих образцов исчезла (отличия от контроля по длине корней не превышали 15%). Важно отметить, что на протяжении всех сроков исследований всхожесть растений не имела достоверных отличий ни в одном из исследуемых вариантов нефтезагрязнения.

Если сопоставить результаты учета биомассы многолетних трав (рис. 4), выращиваемых в условиях полевого опыта на нефтезагрязненной дерново-подзолистой почве в течение двух вегетационных сезонов, с данными биотестирования за этот же период, то никаких принципиальных противоречий не обнаруживается. То есть исследование продуктивности дерновоподзолистой почвы, загрязненной различными дозами нефти, по урожайности наземной биомассы трав в условиях полевого опыта подтверждает результаты лабораторного исследо-

92

Н.В. Маячкина, М.В. Чугунова

вания по определению токсичности этих почв методом биотестирования. При свежем разливе нефти дозы до 1.4 л/м2 включительно не уменьшают продукционных свойств почвы, следовательно, не обладают острой токсичностью. Более высокие исследуемые дозы внесения нефти вызывают достоверное угнетение растений, а значит, являются токсичными. Бесспорно, условия модельного эксперимента и естественные условия существенно отличаются [18]. Тем не менее показанная корреляция результатов биотестирования и полевых экспериментов является, на наш взгляд, убедительным доказательством надежности предлагаемого комплекса биотестов для токсикологической оценки почв.

Выводы

1. Предложен комплекс тест-организмов для биотестирования почв с целью их экотокси-кологической оценки, состоящий из высших растений, микроорганизмов и гидробионтов.

2. Биотестирование на микроорганизмах и высших растениях позволяет оценить уровень токсичности почвы для организмов-педобионтов.

3. Использование в комплексе биотестов представителя гидробионтов позволяет контролировать загрязнение сопредельной водной среды

4. Предложенная тест-система не только дает возможность определять уровень интегральной токсичности почвы, но и позволяет следить за динамикой ее самоочищения, а также восстановления с применением рекультивационных мероприятий, например при внесении бакпрепаратов.

Список литературы

1. Булгаков Н.Г. Контроль природной среды как совокупность методов биоиндикации, экологической диагностики и нормирования // Проблемы окружающей среды и природных ресурсов: Обзорная информация. ВИНИТИ. 2003. № 4. С. 33-70.

2. Донченко В.К. Актуальные проблемы изучения техногенного загрязнения окружающей среды // Экологическая безопасность. 2007. № 1-2. С. 4-24.

3. Основы экогеологии, биоиндикации и биотестирования водных экосистем: Учеб. пособие. / Под ред. В.В. Куриленко. СПб.: Изд-во СПбГУ. 2004. 448 с.

4. Биологический контроль окружающей среды: биоиндикация и биотестирование: Учеб. пос. / Под ред. О.П. Мелеховой, Е.И. Егоровой. М.: Академия, 2007. 288 с.

5. Методика определения токсичности почвы и донных осадков по хемотаксической реакции инфузорий. ПНД ФТ 16.2:2.2-98. М., 1998. 12 с.

6. Методика определения токсичности воды и водных вытяжек из почв, осадков сточных вод, отходов по смертности и изменению плодовитости дафний. ФР.1.39.2001.00283. М.: Акварос, 2001. 47 с.

7. Методика определения токсичности воды и водных вытяжек из почв, осадков сточных вод, отходов по смертности и изменению плодовитости це-риодафний. ФР.1.39.2001.00282. М.: Акварос, 2001. 51 с.

8. Бакина Л.Г., Бардина Т.В., Маячкина Н.В. и др. К методике фитотестирования техногенно загрязненных почв и грунтов // Мат. Межд. конф. «Экологические проблемы северных регионов и пути их решения». Апатиты, 31 августа - 3 сентября 2004 г. Апатиты: Изд-во Кольского научного центра РАН, 2004. Ч. 1. С. 167-169.

9. Методика выполнения измерений интегрального уровня загрязнения почвы техногенных районов методом биотестирования. РД 52.18.344-93. М., 1993. 24 с.

10. Фомин Г.С., Фомин А.Г. Почва. Контроль качества и экологической безопасности по международным стандартам. Справочник. М.: Протектор, 2001. 304 с.

11. Критерии отнесения отходов к классам опасности для окружающей природной среды. Приказ МПР РФ № 511 от 15.06.2001. 13 с.

12. Селивановская С.Ю., Латыпова В.З. Создание тест-системы для оценки токсичности многокомпонентных образований, размещаемых в природной среде // Экология. 2004. № 1. С. 21-24.

13. Куделин В.М., Тимошенко Г.А., Толстихина В.С. Токсикологическая оценка сточных и дренажных вод Байкальского целлюлозно-бумажного комбината // Экология. 2004. № 1. С. 74-76.

14. Терехова В.А. Микромицеты в экологической оценке водных и наземных экосистем. М.: Наука, 2007. 215 с.

15. Головко Э.А. О методах изучения биологической активности торфяных почв // Мат. научн. конф. по методам микробиол. и биохим. исследований почв, Киев, 28-31 окт., 1971. Киев, 1971. С. 68-76.

16. Доспехов б.а. методика полевого опыта. Л.: Колос, 1986. 336 с.

17. Методика выполнения измерений всхожести семян и длины корней проростков высших растений для определения токсичности техногенно загрязненных почв. ФР.1.39.2006.02264.

18. Мотузова Г.В., Безуглова О.С. Экологический мониторинг почв. М.: Изд-во «Академический Проект»; «Гаудеамус», 2007. 237 с.

PECULIARITIES OF SOIL BIOTESTS TO EVALUATE SOIL ECOTOXICITY

N. V. Mayachkina, M. V. Chugunova

The problems of polluted soil ecotoxicological evaluation and the choice of biotest techniques are considered. A biotest complex is proposed whose application gives a reliable characteristic of the soil ecotoxicological state. The biotest technique to determine soil phytotoxicity developed at the St. Petersburg Scientific Research Centre for Ecological Safety (RAS) and listed in the Federal Register is shown to be highly sensitive and informative. The proposed biotest complex has been tested in the field experiment on soddy-podzolic loamy soil contaminated by different oil doses. A comparison is made of laboratory experiment results with the field experiment data.