Способ создания биоинженерных сосудистых графтов большого и среднего диаметров
METHOD FOR CREATING BIOENGINEERED VASCULAR GRAFTS OF LARGE AND MEDIUM DIAMETERS

Способ относится к медицине, а именно к биоинженерии, трансплантологии и сосудистой хирургии, и может быть использован для изготовления биоинженерных сосудистых протезов на основе альгинатно-желатинового гидрогеля.
Известен способ изготовления искусственных многослойных сосудистых трубочек [US20200188082A1 опубл. 18.06.2020]. В данном способе для изготовления сосудов использовали продольные клеточные стержни, которыми печатали сосуды в поддерживающей среде – гидрогелевом матриксе NovaGel. При этом NovaGel служил не только поддерживающей структурой, но и средой, высвобождающей необходимые клеткам сосудистой стенки факторы роста и питательные вещества. Для оптимального слияния клеточных стержней друг с другом полученную заготовку культивировали в течение 3-х недель в инкубаторе, после чего поддерживающий гидрогель удаляли. Достоинством данного метода является разнообразие форм получаемых сосудистых графтов, возможность точного контроля формы и размеров сосудов при помощи программного обеспечения биопринтера и 3D-моделирования, возможность создавать сосудистые графты неограниченной длины. Однако, данный способ имеет и недостатки: длительность изготовления получаемого сосудистого протеза, включая как процесс биопринтинга, так и дальнейшую выдержку сосудистого графта с гидрогелем-опорой, и необходимость постоянной его поддержки до слияния между собой клеточных стержней, требования наличия дорогостоящего коммерческого оборудования (биопринтеры и NovaGel), ограничение по величине получаемых сосудов из-за смещения слоёв гидрогеля и клеточных стержней относительно друг друга с увеличением высоты конструкции и создаваемой таким образом её неустойчивости; наличие соединений между слоями сосудистого графта, которые потенциально являются слабым местом его стенки и необратимое расходование опорного гидрогеля.
Другим известным аналогом является способ изготовления искусственных сосудистых протезов методом электроспиннинга из биорезорбируемых искусственных материалов с добавлением в стенку факторов роста и хемоаттрактантов [RU 2642259 опубл. 21.01.2018]. Для его создания приготавливаются 2 смеси: полигидроксибутирата валерата с поликапролактоном и VEGF (vascular endothelial growth factor), а также полигидроксибутирата валерата с поликапролактоном, bFGF (basic fibroblast growth factor) и SDF-1a (stromal cell-derived factor-1). Полученные полимерные композиции наслаивают в электромагнитном поле на вращающуюся иглу так, чтобы получить в стенке сосудистого протеза 2 слоя: внутренний с VEGF и наружный с bFGF и SDF-1a.  Однако, указанный способ имеет ряд недостатков: длительность процесса изготовления сосудистого графта, возможность микрокровоизлияний через стенку протеза из-за её большой пористости, долгий срок заселения клетками, а также трудности в адаптации методики электроспиннинга под изготовление сосудистых графтов больших размеров.
Прототипом данного способа является метод изготовления искусственных полых биологических тканей [US9851706B2 опубл. 26.12.2017]. Этот метод схож с первым из ранее описанных, но принципиальное его отличие заключается в том, что печать сосудистого графта происходит не в горизонтальном, а в вертикальном направлении. Это позволяет увеличить давление слоёв друг на друга, что облегчает их слияние и получение гомогенной гистологически корректной стенки. Недостатки этого метода также схожи с описанным ранее, но включают ещё и ограниченную длину получаемого графта, так как с увеличением высоты конструкции происходит смещение слоёв друг относительно друга.
Техническим результатом настоящего изобретения является разработка простого, экономичного способа создания биоинженерных сосудистых графтов различного диаметра и конфигурации на основе альгинатного гидрогеля с возможностью включения клеток сосудистой стенки в структуру графтов.
Описание чертежей:
Фиг. 1. Схема создания заготовки для «линейного» сосуда из основного гидрогеля и опорного гидрогеля.
Фиг. 2. Схема создания заготовки для «бифуркационного» сосуда из основного гидрогеля и опорного гидрогеля
Фиг. 3. Фотография «простого» сосуда.
Фиг. 4. Фотография «бифуркационного» сосуда.
1 – вид на фронтальном срезе.
2 – вид сверху.
3 – опорный гидрогель.
4 – основной гидрогель.
Осуществление способа происходит следующим образом:
Этап I. Приготовление желированных основного гидрогеля, гидрогеля-опоры, гидрогеля-адвентиции и других реактивов:
1. Для приготовления основного гидрогеля в 100 мл дистиллированной воды растворяют 4 г порошка альгината натрия. Растворение необходимо осуществлять при нагревании до 37°С и непрерывном перемешивании, добавляя порошок альгината натрия малыми порциями для предотвращения образования комков и облегчения процесса растворения. Затем в полученный раствор при тех же условиях добавляют 6 г порошка желатина и перемешивают до достижения гомогенности раствора. Таким образом, получается раствор, содержащий 4% альгината натрия и 6% желатина (на 100 мл воды).
2. Для приготовления гидрогеля-опоры в 100 мл дистиллированной воды растворяют 8 г порошка желатина. Растворение целесообразно осуществлять при нагревании на водяной бане до температуры 37°С и непрерывном перемешивании до получения гомогенного раствора. Таким образом, получается раствор, содержащий 8% желатина (на 100 мл воды).
3. Для приготовления гидрогеля-адвентиции в 100 мл дистиллированной воды растворяют 2 г порошка альгината натрия при нагревании до 37°С и непрерывном перемешивании. Таким образом, получают раствор, содержащий 2% альгината натрия (на 100 мл воды).
4. Раствор хлорида кальция готовят, добавляя к 100 мл дистиллированной воды 1 г порошка хлорида кальция. Таким образом, получается раствор, содержащий 1% хлорида кальция (на 100 мл воды). Раствор хлорида натрия необходим для полимеризации альгината натрия в гидрогелях на следующих этапах.
5. Раствор цитрата натрия готовят, добавляя к 100 мл дистиллированной воды 5 г порошка цитрата натрия. Таким образом, получается раствор, содержащий 5% цитрата натрия (на 100 мл воды). Раствор цитрата натрия необходим для деполимеризации альгинатного гидрогеля на этапе модификационной обработки.
6. Далее приготовленные растворы подвергают стерилизации. Стерилизацию растворов альгината-желатина, желатина и альгината проводят автоклавированием при 120°С в течение 1 ч. Автоклавирование позволяет не только достичь стерилизации, но и эффективно избавляет вязкие растворы от пузырьков воздуха, попадающих в них на этапе приготовления. Растворы хлорида кальция и цитрата натрия целесообразнее стерилизовать фильтрованием через шприцевые фильтрующие насадки диаметром пор 0,22 мкм; допустима стерилизация автоклавированием.
7. По окончании стерилизации растворы необходимо охладить и хранить в холодильнике, при этом альгинатно-желатиновый и желатиновый растворы затвердевают и переходят в желеобразное состояние.
Этап 2. Заселение гидрогелей клетками (осуществляется при необходимости исследователя включить в структуру сосудистого графта клеточный материал):
1. Полученные на прошлом этапе гидрогели альгината-желатина и альгината переводят в жидкое состояние, нагревание на водяной бане при 37°С.
2. В стерильном ламинарном боксе культуры клеток, полученные в результате снятия с культуральной посуды в соответствии с применяемыми исследователем протоколами, ресуспендируют в разжиженных гелях в необходимой концентрации и загружают в стерильные медицинские шприцы.
3. Гидрогели с клетками повторно желируют, погружая шприцы с гелями в стерильную ёмкость в низкотемпературный холодильник при -80°С на 15 мин.
Этап 3. Создание заготовки сосудистого графта.
1. В чашки Петри послойно выдавливают гидрогели из шприцев, придавая заготовке циркулярную форму, подобную сосуду. При этом каждый циркулярный слой альгинатно-желатинового гидрогеля обкладывают снаружи и изнутри опорным желатиновым гидрогелем (фиг. 1 и 2).
2. Выкладывание слоёв продолжают до тех пор, пока длина конструкции не достигнет желаемой. При этом желатиновый гидрогель-опора создаёт поддержку основному гидрогелю и позволяет сохранять форму сосудистого графта.
3. Полученную конструкцию из гидрогелей со всех сторон обливают из шприцев или опрыскивают из пульверизаторов 1%-ным раствором хлорида кальция и ждут 2 мин для более полной полимеризации основного гидрогеля на основе альгината натрия.
4. Далее заготовку сосудистого графта освобождают от желатиновой опоры, выдерживая конструкцию в водяной бане при температуре 37°С до полного перехода желатина в жидкое состояние.
5. Высвобожденную заготовку на основе полимеризованного альгинатного гидрогеля погружают 1%-ный раствор хлорида кальция на 2 мин для равномерной обработки как снаружи, так и изнутри, и промывают дистиллированной водой 3 раза для удаления остатков желатина и избытка раствора хлорида кальция. Обработка хлоридом кальция на данном этапе необходима для того, чтобы выложенные нами слои заготовки скрепились друг с другом.
Этап 4. Модификационная обработка заготовки.
1. Полученную заготовку погружают в 5%-ный раствор цитрата натрия на 3 минуты для частичной деполимеризации основного гидрогеля.
2. Частично деполимеризованную заготовку прокатывают изнутри гладкими стеклянными палочками или расплющивают стенки заготовки гладкими пинцетами (швейными или анатомическими лапчатыми) до достижения необходимой толщины стенки, увеличения диаметра сосуда и достижения гладкости внутренней и наружной поверхностей.
3. Частично деполимеризованную заготовку вновь полимеризуют в растворе хлорида кальция и промывают.
4. При необходимости повторяют шаги 1-3 3 этапа.
5. Для создания модели адвентициальной оболочки полученного сосудистого графта его вновь деполимеризуют в растворе цитрата натрия, тонким слоем наносят 2%-ный альгинатный гидрогель (при необходимости, засеянный клетками) и полимеризуют в растворе хлорида кальция.
Этап 5. Хранение.
Изготовленные сосудистые графты хранят в стерильных условиях. Если они включают в себя клеточные культуры, то их культивируют в культуральной среде в инкубаторах
Описанным нами способом было получено 5 сосудистых графтов, включая 2 графта, заселенные клетками сосудистой стенки, моделирующих общую сонную артерию и аорту человека.