СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АУТОАНТИТЕЛ К ТРОМБОЦИТАМ
METHOD FOR PLATELET AUTOANTIBODY TEST

Изобретение относится к области медицины, конкретно к методам диагностики аутоиммунных заболеваний крови человека. Способ заключается в определении процентного содержания тромбоцитов, покрытых иммуноглобулинами классов G и M, с использованием проточной цитометрии. Способ позволяет повысить точность диагностики иммунной тромбоцитопении, определить тактику лечения и контролировать его эффективность.
Изобретение относится к области медицины, конкретно к проточно-цитометрическому способу диагностики аутоиммунной тромбоцитопении. Для осуществления способа из периферической крови человека выделяют тромбоциты, окрашивают их мечеными моноклональными антителами к CD41, IgG, IgM человека и анализируют с помощью проточной цитометрии. Показатель аутосенсибилизации вычисляют как отношение числа IgG (IgM)-позитивных клеток к числу клеток, фиксирующих анти-CD41 антитела. Использование способа направлено на диагностику этиологии тромбоцитопении.
Снижение количества тромбоцитов в периферической крови человека может быть следствием воздействия ряда факторов, основными из которых являются образование аутоиммунных антитромбоцитарных антител, депрессия костномозгового кроветворения, диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови, сепсис, прием лекарственных средств, гемодилюция. Для решения вопроса о вовлечении иммунных механизмов в развитие тромбоцитопении необходимо определение аутоантител как фиксированных на поверхности клеток, так и циркулирующих в плазме крови. Результаты исследования применимы для определения тактики ведения больных и контроля эффективности кортикостероидной терапии.
9
Известен способ выявления антитромбоцитарных аутоантител иммуноферментным методом с нативными и модифицированными тромбоцитами (Зотиков Е.А., 2003). Однако использование данного метода для обнаружения аутоантител, фиксированных на собственных тромбоцитах больного, возможно только при числе тромбоцитов в периферической крови более 70×10/л. В то же время наибольшую диагностическую значимость имеет выявление аутоантител при низких значениях тромбоцитов в крови, т.к. именно эти состояния требуют медикаментозного лечения.
Известен способ определения антитромбоцитарных аутоантител, выполняющийся с помощью иммунофлуоресцентного теста с использованием сыворотки против иммуноглобулинов человека, меченой флуоресцирующим красителем (Катанджян Н.М., 1985). Недостатком метода является отсутствие автоматизации при оценке результатов исследования, что не исключает влияния субъективности.
9
Известен способ определения антител к тромбоцитам твердофазным методом (Capture-P) с образованием монослоя тромбоцитов с использованием специфического реагента Capture LISS и индикаторных эритроцитов. Недостатком данного способа является существенное затруднение при проведении исследования образцов крови больных с глубокой тромбоцитопенией (количество тромбоцитов в крови менее 20×10/л).
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ обнаружения антитромбоцитарных антител с помощью проточной цитометрии (Kohler М., 1996), при котором приготовленную суспензию тромбоцитов и лимфоцитов донора инкубируют с сывороткой крови реципиента, окрашивают моноклональными флуорисцентмечеными антителами и выявляют фиксированные на клетках антитела на проточном цитофлуориметре. Способ используется для определения иммунологической совместимости донора и реципиента по антигенам тромбоцитов и лимфоцитов перед трансфузией тромбоцитных концентратов. Данный способ, обладая высокой специфичностью и чувствительностью, позволяет получить результат в течение 2 часов, что имеет несомненное значение для практической трансфузиологии. Однако он применяется только для диагностики аллосенсибилизации больных и не предусматривает выявления антител аутологичной направленности.
Техническим результатом заявляемого изобретения является создание способа, позволяющего выявлять фиксированные и циркулирующие в плазме крови антитромбоцитарные аутоантитела, принадлежащие к иммуноглобулинам классов G и M. Предлагаемый способ определения фиксированных и циркулирующих антитромбоцитарных аутоантител повышает точность диагностики аутоиммунной тромбоцитопении, что, в сою очередь, позволяет:
- назначать адекватную медикаментозную терапию;
- проводить контроль эффективности лечения;
- отслеживать момент возникновения рецидива заболевания.
Для достижения указанного результата в соответствии с прототипом из периферической крови выделяют суспензию тромбоцитов, окрашивают их мечеными антителами к CD41 и Anti-Human IgG и анализируют с помощью проточной цитометрии. В отличие от прототипа, в котором проводится выделение клеток крови доноров и определение аллоантител в сыворотке крови реципиента, в предлагаемом способе выделяют тромбоциты больного, добавляют аутосыворотку крови пациента и исследуют фиксированные и циркулирующие антитромбоцитарные аутоантитела. Оценку результата проводят в соответствии с разработанными критериями нормы. В отличие от прототипа выделенные тромбоциты дополнительно окрашивают мечеными антителами Anti-Human IgM, что необходимо для диагностики аутоиммунного заболевания в начальной стадии. Коэффициент аутосенсибилизации тромбоцитов определяют по соотношению числа Anti-Human IgG- (или Anti-Human IgM) позитивных тромбоцитов и числа клеток, фиксирующих CD41.
Способ осуществляется следующим образом:
Вариант 1
5
1. Выделение суспензии тромбоцитов: 3 мл венозной крови собирают в пробирки с антикоагулянтом. Кровь разбавляют в 2 раза раствором Хенкса (НПО «Микроген» ТУ 9385-088-1423783-08), затем ее наслаивают на эквивалентный объем фиколл-урографина (плотность 1,078) (Фиколл 400 NPS400, Урографин 76% N ЛС-001850) в силиконированную пробирку с коническим дном и центрифугируют 15 мин при 1200 g. Клетки из интерфазного кольца собирают, добавляют 10 мл раствора Хенкса и центрифугируют 5 мин при 700 g. Супернатант удаляют, а осадок ресуспензируют в растворе Хенкса, доводя концентрацию тромбоцитов до 4-6×10/мкл.
2. Маркируют пробирки для каждого пациента в расчете на три пробы (A, B, C). Полученную суспензию тромбоцитов вносят по 100 мкл в каждую пробу. В пробу с маркировкой «C» добавляют 100 мкл аутосыворотки пациента и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем во все пробы добавляют по 5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) (Биоло T), содержащего 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) (Sigma). Центрифугируют 5 мин при 3000 g. Последнюю процедуру повторяют 2 раза. Осадок клеток ресуспензируют в 100 мкл PBS.
3. В пробирки первой пробы (А) вносят по 10 мкл моноклональных антител CD41-FITC (меченые флуоресцеинизотиоционатом) (Beckman Coulter IOTest pN IM0649V), в пробирки второй и третьей пробы (B, C) - по 100 мкл моноклональных антител Goat F(ab')2 Anti-Human IgG-FITC, предварительно разведенных в PBS в соотношении 1:20. Пробы инкубируют в темноте 20 минут. Затем добавляют по 5 мл буфера PBS+BSA, и центрифугируют 5 мин при 3000 g. Последнюю процедуру повторяют.
4. Образцы анализируют на проточном цитофлуориметре, оснащенном двумя флуоресцентными каналами и лазером (длина волны 488 нм). Анализ клеток в образце проводят по трем параметрам: интенсивности прямого и бокового (бидиректного) светорассеяния (линейная шкала), флуоресценции FITC.
5
Полученные данные регистрируют в табличном виде. Анализ результатов осуществляют в следующем порядке. С помощью известных технических средств строят график распределения клеток по интенсивности светорассеяния и флуоресценции FITC. При анализе пробы «А» на графике выбирают регион неповрежденных тромбоцитов и определяют количество клеток, окрашенных моноклональными антителами к CD41. Далее анализируют тот же регион, но в пробах «B» и «C», определяя количество клеток, окрашенных моноклональными антителами Anti-Human IgG. В каждом образце анализируют 2×10 тромбоцитов.
Коэффициент аутосенсибилизации определяют как отношение числа клеток, окрашенных Anti-Human IgG, к числу CD41-положительных клеток.
Установлено, что у 95% здоровых лиц (доноров компонентов крови) значение фиксированных антител не превышает 2%, циркулирующих антител - 5%.
Вариант 2
В постановке вместо моноклональных антител Goat F(ab')2 Anti-Human IgG-FITC используются антитела Mouse Anti-Human IgM-FITC (Clone UHB). Данный вариант, направленный на исследование аутоантител класса IgM, применяется при анализе крови пациентов, имеющих клиническую картину иммунной тромбоцитопении в остром периоде заболевания, у которых аутоиммунные антитромбоцитарные IgG антитела не выявляются.
Ниже приводятся клинические примеры.
Пример 1
9
Пациент С., 71 год. Обследование во время диспансеризации. Диагноз: тромбоцитопения неясной этиологии (количество тромбоцитов в периферической крови - 98×10/л). В таблице 1 приведен результат иммуногематологического исследования фиксированных и циркулирующих антитромбоцитарных аутоантител.
Заключение: Коэффициент аутосенсибилизации тромбоцитов соответствует значениям нормы. Данных за иммунную природу тромбоцитопении не получено.
Пример 2
Пациент А., 57 лет. Клинический диагноз: иммунная тромбоцитопения, впервые выявленная. Острое течение. Стационарное лечение с 15.03.10 по 30.03.10. Проводимая терапия: метипред по стандартной схеме. В таблице 2 приведен результат иммуногематологического исследования фиксированных и циркулирующих антитромбоцитарных аутоантител от 15.03.10.
Заключение: Выявлен высокий коэффициент аутосенсибилизации тромбоцитов без инкубации (4,9%) и после инкубации с аутосывороткой (42,8%), что характерно для тромбоцитопении иммунной этиологии.
В таблице 3 приведен результат иммуногематологического исследования фиксированных и циркулирующих антитромбоцитарных аутоантител от 30.03.10.
Заключение: Коэффициент аутосенсибилизии тромбоцитов соответствует значениям нормы. Получено иммуногематологическое подтверждение эффективности медикаментозной терапии.
Таблица 1
Проба
Объект исследования
Моноклональные антитела
Количество MKA-позитивных клеток, %
Коэффициент аутосенсибилизации
A
Тромбоциты
CD41
98,4
B
Тромбоциты
Anti-Human IgG
0,3
0,3
C
Тромбоциты + аутосыворотка
Anti-Human
0,04
0,04
Примечание. Количество тромбоцитов в периферической крови - 98×10<sup>9</sup>/л.
Таблица 2
Проба
Объект исследования
Моноклональные антитела
Количество MKA-позитивных клеток, %
Коэффициент аутосенсибилизации
A
Тромбоциты
CD41
44,6
B
Тромбоциты
Anti-Human IgG
2,2
4,9
C
Тромбоциты + аутосыворотка
Anti-Human IgG
19,1
42,8
Примечание. Количество тромбоцитов в периферической крови - 5×10<sup>9</sup>/л.
Таблица 3
Проба
Объект исследования
Моноклональные антитела
Количество MKA-позитивных клеток, %
Коэффициент аутосенсибилизации
A
Тромбоциты
CD41
89,9
B
Тромбоциты
Anti-Human IgG
1,2
1,3
C
Тромбоциты + аутосыворотка
Anti-Human IgG
1,4
1,6
Примечание. Количество тромбоцитов в периферической крови -200×10<sup>9</sup>/л.
Список литературы:
1. Kohler М., Dittmann J., Legler T.J., Lynen R., Humpe A., Riggert J., Neumeyer H., Pies A., Panzer S., Mayr W.R. Flow cytometric detection of platelet-reactive antibodies and application in platelet crossmatching // Transfusion, 1996, 366: 250-255.
rd
2. R.Hoffman, E.J.Benz, S.J.Shattil, B.Furie, H.J.Cohen, L.E.Silberstein, P.McGlave. Hematology: basic principles and practice / (edited by) - 3 Edition, 2000, 2584 p.
3. G.F.Lucas and P.Metcalfe Platelet and granulocyte glycoprotein polymorphisms Transfusion Medicine, 2000, 10, 157-154
4. Annette Von Drygalski, M.D., Brian R.Curtis, M.S., Danial W. Bougie, Ph.D., et al. Vancomycin-Induced Immune Thrombocytopenia The New England Journal of Medicine pp.904-910
5. Головкина Л.Л., Кутьина, Пушкина Т.Д. и соавт. Гуморальный ответ на антигены тромбоцитов у больных заболеваниями системы крови при трансфузиях тромбоцитов. // Вестник гематологии. - 2009. - №2. - T.V. - С.13-14.
6. Зотиков Е.А., Бабаева А.Г., Головкина Л.Л. Тромбоциты и антитромбоцитарные антитела. - М.: Монолит, 2003. - 128 с.
7. Масчан А.А., Румянцев А.Г. Стимуляция продукции тромбоцитов: новый подход к лечению хронической иммунной тромбоцитопенической пурпуры. // Онкогематология. - 2009. - N1. - С.51-56.
8. Основы клинической иммунологии / Перевод с англ. - 5-е изд. - М: ГЭОТАР - Медия, 2008. - 416 с; ил.
9. Руководство по лабораторной гематологии / Б.Сисла; пер. с англ. Под общ. ред. А.И.Воробьева. - М.: Практическая медицина, 2011. - 352 с.: ил.