ВЛИЯНИЕ ЭКТОМИИ ОБОНЯТЕЛЬНЫХ ЛУКОВИЦ НА АКТИВНОСТЬ ГЛЮКОЗО-6-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В МОЗГЕ СТАРЫХ КРЫС

БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ BIOLOGICAL SCIENCES

УДК 577.15;612.8

ВЛИЯНИЕ ЭКТОМИИ ОБОНЯТЕЛЬНЫХ ЛУКОВИЦ НА АКТИВНОСТЬ ГЛЮКОЗО-6-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В МОЗГЕ СТАРЫХ КРЫС

МАММЕДХАНОВА В.В.

АБИЕВА Э.Ш.

Науч. сотр. Института Физиологии им. академика Абдуллы Гараева, Баку,

Азербайджан

Аннотация: Впервые были получены данные о показателях активности фермента (Г6Ф-ДГ) в структурах головного мозга старых белых крыс возраста ~ 24-28 мес: орбитальной, сенсорномоторной, лимбической коре, гипоталамусе, мозжечке и гиппокампе на цитозольном субклеточном уровне после билатерального удаления обонятельной луковицы. Нарушение функции обонятельной луковицы представляет собой животную модель хронической депрессии, в связи с этим, чтобы установить проявление патологического состояния связанного с депрессией, нами были изучены старые крысы по гендерной принадлежности. Анализ данных показал, что в структурах головного мозга крыс старческого возраста (~24-28 месяцев) наибольшая активность Г6ФД-ДГ фиксировалась в группе самок порядка 2-4 раз в сравнении с самцами (р<0,01). Также, в результате эктомии обонятельных луковиц в обеих группах животных наибольшее поражение наблюдается в гиппокампе, что можно расценивать как начало нейродегенеративных изменений в организме.

Ключевые слова: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (Г6Ф-ДГ), гиппокамп, мозжечок, нейродегенерация, билатеральная эктомия.

EFFECT OF OLFACTORY BULB ECTOMY ON GLUCOSE-6-PHOSPHATE DEHYDROGENASE ACTIVITY IN THE BRAIN OF OLD RATS

For the first time, the data on the Glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD) enzyme activity in the structures of the brain: orbital, sensory-motor, limbic cortex, hypothalamus, cerebellum and hippocampus at the cytosol subcellular level was collected after bilateral removal of the olfactory bulb of old male white rats (~ 24-28 months).

The results of the research project show that there are different indicators of the studied glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in old age (~ 24-28 months) white male rats' brain structures. The findings reveal that more hippocampal damage is neurodegeneration observed as a result of the olfactory bulbectomy for both groups of animals, which indicates the beginning of the neurodegenerative changes in rats.

Key words: Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD), hippocampus, cytosol, cerebellum, neurodegeneration, bulbectomy.

Введение: Процесс старения - это возрастные изменения, возникающие и начинающиеся задолго до старости. Старение проявляется прежде всего во внешних признаках и на уровне систем органов, в изменении физиологических функций, гибели клеток, снижении приспособительных возможностей организма, приводя в итоге к развитию возрастных патологий и увеличению вероятности смерти. Меняется форма тела, меняется очертание тела, уменьшаются его размеры, кожа теряет эластичность, появляются морщины. Ухудшается зрение, слух и память. С возрастом в легких разрастается соединительная ткань, что приводит к снижению эффективности кислородного обмена [8,10], а также уменьщению кислородной насыщенности артериальной крови. В итоге ухудшается снабжение организма кислородом.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ BIOLOGICAL SCIENCES

Потребность мозга в энергии в 20 раз превышает потребность в энергии других тканей. Поэтому головной мозг является органом, наиболее чувствительным к гипоксии, возникающей в результате возрастной утраты функциональных свойств сосудов. Поскольку центральная нервная система традиционно рассматривается как интегратор функциональной деятельности организма, возрастное нарушение кровообращения в головном мозге оказывает неблагоприятное влияние на деятельность всех органов организма. Многолетние наблюдения клиницистов сосредоточены на афоризме: «Человек настолько молод, насколько молоды его артерии». В современных исследованиях [1], оценка энергетического метаболизма головного мозга основывается на анализе мозгового кровообращения, проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), а также глюкозного и кислородного обмена.

На сегодняшний день вопросы старения как никогда становятся актуальными в связи с увеличением продолжительности жизни человека и, как следствие, формированием депрессии и когнитивного снижения у пожилых лиц, а также ростом распространенности возрастных нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона.

Нейродегенеративные заболевания характеризуются гибелью или повреждением клеток, что приводит к нарушению функций разных органов, проявляющегося в потере их способности к синтезу, метаболизму и правильной сборке жизненно важных биологически активных эндогенных соединений [7,8]. Несмотря на огромный объем накопленных знаний ученые лишь приближаются к пониманию механизмов работы мозга, которые обеспечивают огромное разнообразие вариантов нормального функционирования психики человека и участвуют в патогенезе не только самых распространенных психических, но и соматических заболеваний.

В данной работе были проведены исследования активности Г6Ф-ДГ в структурах головного мозга нелинейных белых крыс возраста -24-28 месяцев в результате эктомии обонятельных луковиц. Нарушение функции обонятельной луковицы представляет собой животную модель хронической депрессии [11], в связи с этим, чтобы установить проявление патологического состояния связанного с депрессией, нами были изучены старые крысы по гендерной принадлежности. Животная модель достаточно перспективна для понимания психопатологии, но не как отклонений поведения, а как последовательности психологических процессов, подчиняющихся определенным законам.

Материалы и методика. Самцов и самок нелинейных белых крыс возраста -24-28 месяцев обезболивали калипсолом (0,9 мг/0,3 кг) и хирургическим путем удаляли обонятельные луковицы с помощью затупленной иглы для подкожных инъекций, без повреждения лобных долей. Двустороннюю эктомию обонятельных луковиц выполняли по модифицированной схеме, методом описанным разными исследователями [11]. После фиксации крыс, была проведена трепанация черепа (отверстия диаметром 2 мм). Отверстия просверливали на 8 мм спереди от брегмы и на 2 мм по обе стороны от средней линии, что соответствует заднему краю глазных орбит. Обе обонятельные луковицы удаляли отсасыванием, образовавшиеся пространства заполняли гемостатической губкой, скальп ушивали рассасывающиемися хирургическими нитями. После операции подопытных животных в течение 14 дней содержали в условиях вивария, при этом самок и самцов изолировали друг от друга во избежание агрессии.

Контрольная группа- это самки и самцы беспородных белых крыс в возрасте - 24-28 месяцев содержащиеся в условиях вивария.

После окончания опыта, животных декапитировали, извлекали головной мозг и отделяли необходимые участки мозга [3]. Ткани гомогенизировали в 0,25 М растворе сахарозы в соотношении 1:9, центрифугировали при 20 000g в течении 20 мин, для отделения митохондриальной фракции от цитозольной жидкости. Все эти процедуры проводили при 0-40С. В цитозольной фракции определяли активность глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (Г6Ф-ДГ) [5], в орбитальной, лимбической и сенсомоторной коре, а также в гипоталамусе, мозжечке

и гипокампе. В процессе экспериментов соблюдались правила гуманного обращения с экспериментальными животными, указанные в Директиве Совета Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) под контролем локального комитета по биоэтике НАН Азербайджана.

Результаты исследования: Полученные в экспериментах данные отображены на рисунках. На рис.1 показана зависимость активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в головном мозге старых самцов белых крыс (~ 24-28 месяцев). Как видно из рисунка, в результате двусторонней эктомии обонятельных луковиц в цитозоле исследованных тканей мозга старых самцов активность фермента снижалась по отношению к контролю в большинстве структур. Особенно значительное снижение активности фермента наблюдалось в гиппокампе (опыт 0,17±0,0082; контроль 0,42±0,032, р<0,001), орбитальной коре (опыт 0,32±0,025; контроль 0,53±0,045, р < 0,01) и мозжечке (опыт 0,79±0,08; контроль 1,4±0,21, р<0,05) и в лимбической коре (опыт 0,60±0,058; контроль 0,7±0,046, р<0,05). В сенсорномоторной коре (опыт 0,76±0,06; контроль 0,61±0,056, р>0,05) и гипоталамусе (опыт

котроль

опыт

s 1,6

ct 1,4

H

u "as 1,2

S 1

5

A

0,8

e

VO 0,6

L.

J3 H 0,4

u

X И 0,2

=

< 0

L

орбит.к. сенсомот.к. лимбич.к. гипоталамус мозжечок гипокамп

Рисунок 1. Активность глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы в структурах головного мозга старых самцов

Рисунок 2. Активность глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы в структурах головного мозга старых самок

1,45±0,95; контроль 1,1±0,28, р>0,05) наблюдается незначительное увеличение активности фермента по сравнению с контрольными данными.

По результатам исследования активности Г6Ф-ДГ у самок (рис.2) активность изменялась иначе, чем у крыс-самцов, так, снижение активности фермента наблюдалось в большинстве исследуемых областей, причем выраженные изменения были в гипоталамусе (опыт 0,68±0,054; контроль 1,41±0,2, р<0,05) и в гиппокампе (опыт 0,37±0,041; контроль 0,78±0,012, р<0,01). В орбитальной коре (опыт 0,83±0,09; контроль 1,23±0,18, р>0,05) и в мозжечке (опыт 1,6±0,015; контроль 2,3±0,24, р<0,001) снижение активности фермента было более незначительным. В сенсомоторной (опыт 1.56± 0.13; контроль 1.05 ± 0.16, p<0.05) и лимбической коре по сравнению с контрольными данными наблюдается повышение активности фермента (опыт: 1,75 ± 0,15; контроль: 1,12 ± 0,175, р < 0,05).

Результаты проведенных исследований показывают, что в структурах головного мозга крыс старческого возраста (-24-28 месяцев) наибольшая активность Г6ФД-ДГ фиксировалась в группе самок порядка 2-4 раз в сравнении с самцами (р<0,01). Резюмируя, можно прийти к выводу, что активность фермента связана с угнетением энергетического обмена, который приводит к необратимым изменениям в организме старых животных и этот эффект по гендерной принадлежности сравнительно более значим в группе самок.

Также следует отметить, что в результате эктомии обонятельных луковиц в обеих группах животных наибольшее поражение наблюдается в гиппокампе, что можно расценивать как начало нейродегенеративных изменений в организме.

Известно, что одной из областей головного мозга, где возрастные изменения наиболее выражены, является гиппокамп [4]. Учитывая роль гиппокампа в формировании памяти, становится понятно, что функциональные и структурные изменения в этой зоне при старении обусловливают трудности запоминания контекста, в котором была получена информация.

В опытах на лабораторных животных показано, что в результате экспериментальной модели депрессии статистически достоверно уменьшается объем гиппокампа (до 10%, как и у больных депрессией), в зубчатой извилине снижается число гранулярных клеток, а в полях СА1 и СА3 гиппокампа уменьшаются размеры тел пирамидных клеток и развивается атрофия их апикальных дендритов (до 50% длины) и дендритных шипиков, что ведет к нарушению

БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ BIOLOGICAL SCIENCES

нормального функционирования лимбической системы и ее связей с другими отделами мозга [2].

Таким образом, большинство исследований мозга человека указывают на преимущественную потерю нейронов в коре, гиппокампе и мозжечке. В большинстве подкорковых образований клеточный состав остается неизменным до старческого возраста [1,2]. При этом филогенетически более «новые» структуры мозга, связанные с познавательной функцией, в большей степени подвержены возрастной потере нейронов, чем филогенетически «старые» (ствол мозга). Хотя данных по-прежнему не хватает, нейрогенез, по-видимому, снижается с возрастом, особенно в гиппокампе [4].

При старении головного мозга в коре больших полушарий, главным образом в лобных долях, а также в гиппокампе и подкорковых узлах увеличивается число глиальных элементов и выявляются старческие (сенильные) бляшки. Они располагаются рядом с сосудами микроциркуляторного русла коры и представляют собой скопления аргирофильного бесструктурного материала, содержащие амилоид и окруженные переплетениями утолщенных аксонов и клетками макро- и микроглии, имеющими мало цитоплазмы [6].

Данные наблюдения приводят к мысли, что ведущую роль в патогенезе депрессии, играют все-таки нарушения нейрональной пластичности, связанные с нейродегенеративными процессами, чему в последние годы появляется все больше доказательств. Более того, согласно последним данным депрессивное растройство официально признано умеренно выраженным нейродегенеративным заболеванием.

Растущее количество данных последних лет указывает на биоэнергетические нарушения, а также нарушения окислительно-восстановительного гомеостаза в головном мозге с возрастом. Известно, что недостаток кислорода не позволяет полностью расщепить глюкозу в клетках (в цикле трех карбоновых кислот) и превращает образующийся в тканях пируват в лактат [6,10]. В результате рН внутри клетки снижается, то есть наблюдается ацидоз и нарушается регуляция биохимических процессов. Поскольку энергетический обмен в головном мозге находится на очень высоком уровне, деятельность организма должна быть направлена в первую очередь на обеспечение и поддержание потребностей головного мозга. При этом ведущая роль принадлежит глюкозо-6-фосфату, который используется для обеспечения клетки энергией посредством гликолиза, а часть используется для восстановительного биосинтеза через пентозофосфатный цикл. Поэтому снижение активности изучаемого нами фермента глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы говорит о том, что в этих частях головного мозга старых крыс идет угнетение биосинтетических процессов, важнуюроль в которых играют продукты пентозофосфатного цикла.

В совокупности эти данные подчеркивают, что старение мозга характеризуется снижением антиоксидантной защиты и повышенным окислительным стрессом [9].

Полученные результаты позволяют констатировать значимость изучения механизмов влияния эктомии обонятельных луковиц на активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в структурах головного мозга старых крыс.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Голубев В. Н., Королев Ю. М., Тимофеев Н. Н. Реакция дыхательной системы человека на гипоксическую гипоксию // Вест. Тверского гос. университета. Серия: Биол. и экология. — 2013. — № 29. — С. 56-64.

2. Изнак А.Ф. Нейрональная пластичность как один из аспектов патогенеза и терапии аффективных расстройств // Психиатрия и психофармакотерапия. 2005. Т. 7. № 1. С. 24-27.

3. Светухин В.М. Цитоархитектоника новой коры головного мозга в отряде грызунов. Архив анатомии, эмбриологии и гистологии. 1968. т.42, № 2, с.31-45

4. Baptista, P., & Andrade, J. P. (2018). Adult Hippocampal Neurogenesis: Regulation and Possible Functional and Clinical Correlates. Frontiers in neuroanatomy, 12. https://doi .org/10.3389/fnana.2018.00044

5. Bergmeyer - Methods of Enzimatyc Analisis, Verlag Chemie, Weinhein, Biochemicca information. From HU. 2-nd enlarged elition, 1973, p.99

6.Buffenstein, R., Y. H. Edrey, T. Yang, and J. Mele. 2008. The oxidative stress theory of aging: embattled or invincible? Insights from non-traditional model organisms. Age (Dordr) 30:99-109.

7. Chinopoulos C., Zhang S.F., Thomas B., Ten V., Starkov A.A. Isolation and functional assessment of mitochondria from small amounts of mouse brain tissue // Methods Mol Biol. 2011. V. 793. P.311-324. D0I:10.1007/978-1-61779-328-8_20

8. De Waal, E. M., H. Liang, A. Pierce, R. T. Hamilton, R. Buffenstein, and A. R. Chaudhuri. 2013. Elevated protein carbonylation and oxidative stress do not affect protein structure and function in the long-living naked-mole rat: a proteomic approach. Biochem. Biophys. Res. Commun. 434:815-819

9. Grimm, A, & Eckert, A. (2017). Brain aging and neurodegeneration: from a mitochondrial point of view. Journal of Neurochemistry, 143(4), 418-431. https://doi.org/10.1111/jnc.14037

10. Morimoto R. I., Cuervo A. M. Proteostasis and the aging proteome in health and disease. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 69 (suppl. 1), S33-S38 (2014).

11. Van Reizen H, Leonard BE (1990) Effects of psychotropic drugs on the behaviour and neurochemistry of olfactory bulbectomised rats. Pharmacol Ther 47: 21-34.