Применение клеточных технологий для профилактики несостоятельности легочных швов в эксперименте

Материалы и методы. Изучение участия стволовых клеток в процессах репаративной регенерации почки проведены на 64 нефробиоптатах больных различными клинико-морфологическими формами первичного гломерулонефрита. Для выявления гемопоэтических С034( + )-клеток в клубочках использовали иммуно-гистохимическое окрашивание к С031 (маркёру эндотелиальных клеток) и С034 (маркёру эндотелиальных и гемопоэтических стволовых клеток). Преобладание экспрессии С034 над С031 клетками клубочков свидетельствовало о наличии в них гемопоэтических С034( + )-клеток. Для каждого нефробиопата проводили гистоморфологическую оценку индекса воспалительной активности ХГН и индекса склероза клубочков, а также иммуногистохимическим методом изучали пролиферативную активность клеток клубочков (окрашивание к РСЫА) и их миофибробластическую транс-дифференцировку (окрашивание к б-ГМА).

Изучение участия стволовых клеток в процессах физиологической регенерации почки проведено на 15 белых беспородных крысах, которым в хвостовую вену вводили фракцию мононуклеаров пуповинной крови человека, выделенную на градиенте плотности фикол-ла. Через 2, 5, 7 и 14 сут. проводили иммуногистохи-мическое окрашивание антителами к лейкоцитарному антигену человека (ША-АВС) для изучения миграции и дифференцировки введенных клеток.

Результаты. Сравнительный анализ показал, что в 34% нефробиоптатов гемопоэтические С034( + )-клет-ки обнаруживались в клубочках. На основании того, что столовые клетки — это дополнительный регенераторный резерв, а ХГН — это хроническое иммуновос-палительное повреждение почки, мы решили изучить взаимосвязь между появлением гемопоэтических С034( + )-клеток в клубочках и морфологической активностью заболевания (индексом воспалительной активности и индексом склероза клубочков) и сопоставить это с наиболее изученными механизмами регенерации — пролиферацией клеток клубочков и их миофибробластической трансдифференцировкой. Установлено, что максимальное число нефробиоптатов с наличием гемопоэтических С034( + )-клеток обнаруживается при индексе воспалительной активности ХГН до 4 баллов и индексе склероза клубочков до 2 баллов. В то же время, значительно чаще нефро-биоптаты с повышенной пролиферативной активностью клеток клубочков и их миофибробластической трансдифференцировкой встречались у больных с индексом воспалительной активности более 4 и индексом склероза клубочков более 7 баллов.

Результатом иммуногистохимического окрашивания почек крыс антителами к НЬА-АВС после трансплантации мононуклеаров пуповинной крови человека стало обнаружение Н1_А-АВС( + )-клеток в эпителиальной выстилке дистальных канальцев нефрона на всех экспериментальных сроках — 2, 5, 7 и 14 сут. Причём НЬА-АВС экспрессировался не во всех дистальных канальцах и не всеми клетками.

Выводы.

1. Гемопоэтические С034( + )-клетки участвуют в регенерации клубочков при ХГН, и это участие максимально при минимальной и умеренной воспалительной активности заболевания (1—4 балла) и минимальном склерозе клубочка (1—2 балла). При более выраженном воспалении и склерозе основную роль в регенерации играют процессы пролиферации и миофибробластической трансдифференцировки клеток клубочка.

2. Мононуклеары пуповинной крови человека, трансплантированные в системный кровоток крыс, мигрируют в неповрежденную почку и встраиваются в эпителиальные клетки дистальных канальцев нефрона, на основании чего дистальные канальцы можно рассматривать как «нишу» стволовых клеток.

М.З. Кауламбаева \ М.К. Амиргазиева \

Г.С. Стабаева \ К.С. Бименов1, А.М. Орекешова а Применение клеточных технологий для профилактики несостоятельности легочных швов в эксперименте

1 НПП «Антиген», Алматы, Казахстан

2 Национальный научный медицинский центр,

Астана, Казахстан marzan61z@mail.ru

M.Z. Kaulambayeva, М.К. Amirgaziyeva, G.S. Stabayeva,

K.S. Bimenov, A.M. Orekeshova

Application of cell technologies for the prevention of pulmonary failure seams in the experiment

В хирургии нет более важной проблемы, чем предупреждение и борьба с послеоперационными осложнениями. Особую опасность представляет собой ранняя и поздняя несостоятельность легочных и бронхиальных швов, которая влечет за собой тяжелые последствия в виде развития гнойно-воспалительных процессов, бронхоплевральных свищей, обусловливающих высокую инвалидность и послеоперационную летальность. По данным научной литературы частота осложнений при операциях на легких с формированием легочно-бронхильно-плевральных свищей наблюдается в 7,3% случаях.

Цель работы: экспериментальное обоснование применения культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) костного мозга человека и клеток диплоидного штамма фибробластов человека ЗФЧ 01/05 на коллагеновом матриксе для профилактики несостоятельности легочных швов.

Работу проводили на кроликах весом 3—4 кг, возрастом 10—12 мес. в количестве 36 шт. Подопытные животные были разделены на 4 группы (одна контрольная и три испытуемые). Подопытным животным после введения наркоза и обработки операционного поля произведена правосторонняя торакотомия, пневмоторакс. После иссечения легочной ткани на рану были наложены швы. На поверхность швов у животных испытуемых групп была нанесена суспензия клеток (ММСК или ЗФЧ 01/05) в коллагеновом геле и наложена коллагеновая мембрана.

На 3, 7 и 14 сут. после операции животных выводили из опыта. Производили вскрытие плевральной полости. Проводили осмотр плевральной полости на предмет содержания патологической жидкости и состоятельности легочных швов. Проводили обследование легких на герметичность швов (водные пробы). Взяты кусочки легочной ткани в области шва для патоморфологических исследований.

У животных первой контрольной группы — на 3 сут. швы не состоятельны, на 7 и 14 сут. после операции швы состоятельны, но не герметичны. Во второй испытуемой группе (наложение на шов только коллагеновой мембраны) — на 3 и 7 сут. швы состоятельны, но не герметичны, на 14 сут. шов состоятелен и герметичен. В третьей испытуемой группе (с нанесением суспензии клеток ЗФЧ 01/05 с наложением коллагено-

вой мембраны) — на 3 сут. швы состоятельны, на 7 и 14 сут. швы состоятельны и герметичны. В четвертой испытуемой группе (с нанесением суспензии клеток ММСК человека с наложением коллагеновой мембраны) на 3 сут. швы состоятельны, на 7 и 14 сут. швы состоятельны и герметичны.

Гистологические исследования легочных швов, наложенных после иссечения части легкого, показали следующее. По сравнению с контрольной группой у экспериментальных животных, у которых поверхность хирургически травмированной легочной ткани обработана коллагеновой мембраной, культурой фибробластов с коллагеном и культурой ММСК, клеточные и тканевые реакции были более ярко выраженными. Это свидетельствует о стимулирующем влиянии культур клеток фибробластов и ММСК на репаративные процессы.

На основании полученных результатов макроскопических и гистологических исследований можно утверждать, что применение клеточных технологий для профилактики несостоятельности легочных является оптимальным способом лечения. В контрольной группе на 14 сут. не удается добиться герметичности легочного шва. Применение только коллагеновой мембраны позволяет получить герметичный шов на 14 сут. Сочетанное воздействие клеток ЗФЧ 01/05 и ММСК фетального костного мозга человека с коллагеновым матриксом приводит к образованию состоятельного и герметичного легочного шва уже на 7 сут. после операции.

С.Л. Киселев

Репрограммирование соматического генома

УРАН «Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН»,

Москва, Россия

sl_kiselev@yahoo.com

S.L. Kiselev

Reprogramming of somatic genome

В процессе развития организма реализуется онтогенетическая программа, в результате выполнения которой клетки индивидуального организма постепенно утрачивают потенциал дифференцировки. Однако, в целом ряде исследований было показано, что цитоплазматических и ядерных факторов, содержащихся в плюрипотентной клетке, достаточно для репрограммирования генома соматической клетки до плюрипотент-ного состояния (Kato et al., 1998; Matveeva et al., 1998). С помощью транскрипционных факторов, которые напрямую вовлечены в поддержание плюрипотен-тности, была разработана технология получения клеток с индуцированной плюрипотентностью CiPS) (Takahashi&Yamanaka, 2006). В настоящем исследовании для получения клеток с индуцированной плюрипотентностью нами были использованы фибробласты кожи, полученные от больных с нейродегенеративными заболеваниями. Полученные iPS клетки были схожи с эмбриональными стволовыми клетками человека по морфологическим, молекулярно-генетическим и функциональным параметрам. Дифференцированные из iPS клеток нейрональные производные могут служить моделями для изучения патогенеза заболеваний и их генетической коррекции.

А.В. Ковалев

Методика построения тканеинженерных конструкций на раневой поверхности восстанавливаемых органов

ФГУ «ЦИТО им. Н.Н. Приорова Росмедтехнологий»,

Москва, Россия kovalyovl @mail.ru A.V. Kovalev

Tissue reconstruction build-up on the wounded surface of recovered organs

В настоящее время выделяют три наиболее перспективные стратегии развития регенеративной медицины:

1) трансплантация клеток для формирования новой ткани в области пересадки;

2) внедрение биоискусственных тканей и органов, выращенных in vitro;

3) индукции регенерации в естественных условиях от неповрежденных тканей, смежных с раной (D. Stocum, 2006).

Нами разработан новый подход к восстановлению частей органов и тканей, позволяющий объединить эти стратегии в одной технологии. Для этого созданы специальные растворы и биореакторы, в которые возможно помещать поврежденную часть тела и длительно там удерживать, не извлекая из водной питательной среды, до восстановления целостности органа.

Само по себе длительное и непрерывное удержание травмированных органов в растворе, приближенном по физико-химическим свойствам к межклеточной среде, влияет на регенерацию. В зависимости от возраста животного, локализации и формы раны благодаря воздействию раствора на травмированные ткани в биореакторе исключается рубцевание, или значительно уменьшается фиброз кожного регенерата. Более того, водная изотоническая среда способствует регенерации, не характерной для вида и линии экспериментальных животных при обычных условиях заживления ран: в растворах отрастают кончики хвостов и пальцев у крысят. Этого не происходит при обычных условиях заживления, когда на раневой поверхности образуется рубец и остается очевидный посттравматический дефект. Обнаружено, что окружение раны способно влиять не только на морфогенез, но и на саму возможность заживления. Так, кожа хвоста или лапы у крыс не регенерирует, если циркулярно иссекается кожный полнослойный лоскут шириной 7—8 мм вокруг оси этих наружных органов. На воздухе перешеек, лишенный наружного покрова, гибнет вместе с неповрежденной частью хвоста или лапы, расположенной дистально месту травмы. В растворе-биореакторе при таком же повреждении кожа регенерирует с образованием малозаметного рубца, а конечность или хвост остаются целыми (Иванищук П.П., Ковалев А.В., 1990, Ковалев А.В., Иванищук П.П., 1991 ;1 999). Если удалить 30 и более процентов кожи от всей площади поверхности тела у крысы, то регенерации кожи не произойдет, животное гибнет от раневого истощения. Погружение животного в установку с раствором позволяет адаптировать крысу к повреждению и повысить регенеративную способность наружного покрова. В течение 30—60 сут. преимущественно за счет контракции и внераневого вставочного роста обширная рана кожи заживает (Ковалев А.В., Иванищук П.П., 1995, 1997).

Эксперименты показали возможность технического обеспечения длительного окружения области по-