СПОСОБ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ АНАЛИТА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО БИОСЕНСОРА
METHOD AND APPARATUS FOR DETECTING ANALYTE USING ELECTROCHEMICAL BIOSENSOR

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] В настоящей заявке на патент испрашиваются приоритеты по заявке на патент США с порядковым № 16/024353, поданной 29 июня 2018 года; предварительной заявке на патент США с порядковым № 62/527981, поданной 30 июня 2017 года; предварительной заявке на патент США с порядковым № 62/544692, поданной 11 августа 2017 года; и предварительной заявке на патент США с порядковым № 62/545252, поданной 14 августа 2017 года, полное содержание которых настоящим в явном виде включено в данное описание по ссылке.
ПОЛОЖЕНИЕ, КАСАЮЩЕЕСЯ ФИНАНСИРУЕМЫХ ИЗ ФЕДЕРАЛЬНОГО БЮДЖЕТА ИССЛЕДОВАНИЙ ИЛИ РАЗРАБОТОК
[0002] Настоящее изобретение было создано при правительственной поддержке по контракту № HDTRA–1–16–C–0048, заключенному Агентством по сокращению военной угрозы Министерства обороны США. Правительство обладает некоторыми правами на изобретение.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0003] Варианты осуществления настоящего изобретения относятся к обнаружению аналита с использованием электрохимических ферментативных биосенсоров. Например, варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способу и ферментативному биосенсору, делающим возможной детекцию низких концентраций аналита, позволяя аналиту накапливаться на биосенсоре.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0004] Разработаны и используются ферментативные биосенсоры, в которых используют ферменты, ассоциированные с трансдуктором, в качестве элемента биораспознавания целевого аналита. Хотя было использовано множество различных способов преобразования сигнала, чаще всего используемым стал электрохимический. Электрохимические биосенсоры позволяют напрямую преобразовывать биологическое событие (например, детекцию аналита) в электрический сигнал, что устраняет потребность в сложном оборудовании, таким образом придавая электрохимическим биосенсорам желаемые признаки по размерам, стоимости и портативности. Среди электрохимических способов, используемых для преобразования сигнала, зачастую используют амперометрию. В амперометрическом измерении рабочий электрод сенсора держат под постоянным потенциалом (напряжением), измеряя ток, протекающий через сенсор. Сенсор сконструирован таким образом, что ток зависит от концентрации аналита.
in vivo
2
[0005] Примером ферментативного биосенсора с использованием амперометрии является сенсор глюкозы непрерывного действия, являющийся носимым  устройством, предназначенным для обеспечения частых измерений концентрации глюкозы в крови у пользователя. В этих устройствах используется фермент глюкозооксидоредуктаза, такой как глюкозооксидаза (GOx), иммобилизованный на рабочем электроде в качестве глюкозо–чувствительного элемента. Сначала электроны переходят от глюкозы к ферменту посредством ферментативного окисления, а затем к рабочему электроду через медиатор электронного транспорта, такой как кислород (O) или осмий(Os)–содержащий редокс–полимер. Хотя амперометрия оказалась пригодной для измерения аналитов, таких как глюкоза, которая присутствует в относительно высоких физиологических концентрациях (на уровне или выше 5 миллимоль (мМ)), она может не подходить для измерения аналитов, находящихся в более низких концентрациях.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0006] Аспекты вариантов осуществления настоящего изобретения относятся к детекции низких концентраций (например, на уровне или менее 5 мМ, от 1 наномоль (нМ) до 5 мМ или от 4,7 нМ до 5 мМ) аналита посредством обеспечения накопления аналита на ферментативном биосенсоре.
[0007] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в способе обнаружения аналита используют сенсор, имеющий рабочий электрод, причем способ включает обеспечение рабочего электрода с аналит–специфическим ферментом и медиатором электронного транспорта, снабжение рабочего электрода аналитом, накопление заряда, полученного от аналита, реагирующего с аналит–специфическим ферментом и медиатором электронного транспорта, в течение установленного периода времени, подключение рабочего электрода к цепи после установленного периода времени и измерение сигнала от накопленного заряда.
[0008] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения перед снабжением рабочего электрода аналитом способ включает подключение рабочего электрода к цепи, и перед снабжением рабочего электрода аналитом способ включает отключение рабочего электрода от цепи.
[0009] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения рабочий электрод подключают к цепи перед снабжением рабочего электрода аналитом, и способ включает отключение рабочего электрода от цепи перед снабжением рабочего электрода аналитом.
[0010] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения сенсор является ферментативным электрохимическим биосенсором.
[0011] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения медиатор электронного транспорта является иммобилизованным редокс–полимером.
[0012] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения иммобилизованный редокс–полимер включает окислительно–восстановительное вещество и полимер, причем окислительно–восстановительное вещество выбрано из полимера, содержащего осмий (Os), рутений (Ru), железо (Fe) или кобальт (Co), а полимер выбран из поливинилпиридина, политиофена, полианилина, полипиррола или полиацетилена.
[0013] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения иммобилизованный редокс–полимер является Os–содержащим поливинилпиридином.
[0014] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения аналит выбран из кортизола, глюкозы, лактата, 3–гидроксибутирата, спирта, пирувата, глутамата, теофиллина или креатинина.
[0015] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения аналит–специфический фермент является никотинамидадениндинуклеотид (NAD)–зависимой дегидрогеназой, флавинадениндинуклеотид (FAD)–зависимой оксидазой и/или флавинмононуклеотид (FMN)–зависимой оксидазой.
[0016] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения аналит–специфический фермент выбран из 11β–гидроксистероиддегидрогеназы типа 2 (11β–HSD–2), глюкозооксидазы, NAD–глюкозодегидрогеназы, FAD–глюкозодегидрогеназы, лактатоксидазы, NAD–лактатдегидрогеназы, NAD–алкогольдегидрогеназы, пируватоксидазы, NAD–глутаматдегидрогеназы или ксантиноксидазы.
[0017] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения накопление заряда включает накопление электронов.
[0018] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения сенсор вводят индивидууму подкожно.
[0019] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения аналит находится в такой низкой концентрации, как 4,7 наномоль (нМ).
[0020] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения установленный период времени находится в диапазоне от 60 секунд до 30 минут. В некоторых вариантах осуществления установленный период времени находится в диапазоне от 120 секунд до 30 минут. В некоторых вариантах осуществления установленный период времени находится в диапазоне от 120 секунд до 10 минут.
[0021] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения сенсор включает внешнюю мембрану. В некоторых вариантах осуществления внешняя мембрана является ограничивающей поток мембраной. В некоторых вариантах осуществления внешняя мембрана является проницаемой для аналита мембраной.
[0022] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения измерение сигнала от накопленного заряда включает измерение высоты пика сигнала и/или измерение площади пика сигнала.
[0023] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает калибровку измеренной высоты пика для получения концентрации аналита.
[0024] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает калибровку измеренной площади пика для получения концентрации аналита.
[0025] В некоторых вариантах осуществления измерение сигнала от накопленного заряда включает регистрацию сигнала при частоте замеров от 0,1 до 0,5 герц (Гц) и/или фильтрацию сигнала с частотой от 0,032 до 3,2 герц (Гц).
[0026] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения рабочий электрод включает в себя чувствительный элемент, содержащий аналит–специфический фермент и медиатор электронного транспорта. В некоторых вариантах осуществления чувствительный элемент также включает углеродные нанотрубки.
[0027] В некоторых вариантах осуществления способ обнаружения аналита с использованием сенсора, включающего рабочий электрод, включающий аналит–специфический фермент и медиатор электронного транспорта, включает: снабжение рабочего электрода аналитом; накопление заряда, полученного от аналита, реагирующего с аналит–специфическим ферментом и медиатором электронного транспорта; и измерение сигнала от накопленного заряда посредством измерения высоты пика сигнала и/или измерения площади пика сигнала.
[0028] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения система для обнаружения аналита включает рабочий электрод, чувствительный элемент, расположенный на рабочем электроде и включающий аналит–специфический фермент и медиатор электронного транспорта, причем чувствительный элемент выполнен с возможностью накопления заряда, полученного от аналита, реагирующего с аналит–специфическим ферментом, в течение установленного периода времени, и цепь, выполненную с возможностью соединения с рабочим электродом после установленного периода времени и измерения сигнала от накопленного заряда. В некоторых вариантах осуществления чувствительный элемент в этой системе включает углеродные нанотрубки. В некоторых вариантах осуществления эта система также включает внешнюю мембрану, покрывающую по меньшей мере чувствительный элемент. В некоторых вариантах осуществления аналит–специфический фермент в этой системе выбран из никотинамидадениндинуклеотид (NAD)–зависимой дегидрогеназы, флавинадениндинуклеотид (FAD)–зависимой оксидазы или флавинмононуклеотид (FMN)–зависимой оксидазы. Например, в некоторых вариантах осуществления аналит–специфический фермент в этой системе выбран из 11β–гидроксистероиддегидрогеназы типа 2 (11β–HSD–2), глюкозооксидазы, NAD–глюкозодегидрогеназы, FAD–глюкозодегидрогеназы, лактатоксидазы, NAD–лактатдегидрогеназы, NAD–алкогольдегидрогеназы, пируватоксидазы, NAD–глутаматдегидрогеназы и ксантиноксидазы.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0029] Фиг. 1 является блок-схемой, на которой показан способ обнаружения с режимом накопления, включающий действия 10, 15, 20, 25 и 30, как указано, в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0030] На фиг. 2 показана схематическая диаграмма электродных установок, используемых для обнаружения с режимом накопления в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, в которых, когда цепь подключена, как указано на левой панели, рабочий электрод находится под потенциалом (напряжением), достаточным для прохождения окислительно–восстановительной реакции аналита при установившихся условиях, а когда цепь отключена, как показано на правой панели, рабочий электрод электрически отключен от цепи, что позволяет электронам из аналита храниться в редокс–полимере до повторного подключения рабочего электрода к цепи, и этот хранящийся заряд можно измерять.
[0031] На фиг. 3A показан расчетный ток относительно сигнала времени и некоторые количественные параметры (время накопления при размыкании цепи, площадь пика и высота пика, как указано) для обнаружения с режимом накопления в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
3+
[0032] На фиг. 3B показана схема окислительно–восстановительных реакций, происходящих во время обнаружения с режимом накопления (когда цепь разомкнута, что указано как "размыкание цепи") окисляемого аналита (аналита A) с использованием фермента оксидазы (AOx), иммобилизованного совместно с редокс–полимером с осмием (Os), в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0033] На фиг. 3C показаны записи изменения тока от времени, полученные при обнаружении с режимом накопления (указано белым цветом) 2 мкМ глюкозы с использованием примерного сенсора глюкозы (при +40 мВ, что указано штрихованной линией) и измеренные для пяти разных времен накопления, в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0034] На фиг. 3D показаны калибровочные кривые амперометрии и сигналы режима накопления, измеряемые по высоте пика или площади пика для времен накопления, показанных на фиг. 3C, в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0035] На фиг. 4A показана типичная запись изменения тока от времени для эксперимента по калибровке с использованием обнаружения с режимом накопления с помощью примерного сенсора глюкозы (при +40 мВ, что указано штрихованной линией) и временем накопления 60 секунд (когда цепь разомкнута, что указано белым цветом) для каждой детекции, в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0036] На фиг. 4B показано сравнение калибровочных кривых, полученных в результате амперометрии, и сигналов режима накопления, измеряемых в эксперименте по обнаружению, показанном на фиг. 4A, в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0037] На фиг. 5 показаны калибровочные кривые для амперометрического обнаружения и обнаружения с режимом накопления (высота пика и площадь пика) при временах накопления 1 (ромбы), 2 (треугольники), 5 (квадраты) и 10 (кружки) минут, как указано, при концентрациях глюкозы 0, 50, 100, 200 и 500 мкМ, при этом каждая калибровочная кривая соответствует среднему отклику четырех сенсоров, в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0038] На фиг. 6A показан график потенциала относительно сигнала времени у модельного сенсора глюкозы, полученный с использованием метода потенциала разомкнутой цепи для обнаружения различных наномолярных (нМ) концентраций глюкозы, как указано, в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0039] На фиг. 6B показана калибровочная кривая (угол наклона относительно концентрации глюкозы (нМ)) графических данных на фиг. 6A в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0040] На фиг. 6C показан график потенциала относительно сигнала времени у модельного сенсора глюкозы, полученный с использованием метода потенциала разомкнутой цепи для обнаружения различных наномолярных концентраций глюкозы, как указано, в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0041] На фиг. 6D показана калибровочная кривая (угол наклона относительно концентрации глюкозы (нМ)) графических данных на фиг. 6C, в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
in vitro
[0042] На фиг. 6E показана совмещенная калибровочная кривая для модельных сенсоров глюкозы (точки данных с закрашенными кружками, n=8) и контрольных сенсоров (точки данных с незакрашенными кружками, n=4) при обнаружении глюкозы с использованием метода потенциала разомкнутой цепи в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0043] На фиг. 6F показано увеличенное изображение калибровочной кривой с фиг. 6E для концентрации глюкозы от 0 до 200 нМ в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0044] На фиг. 6G показан график потенциала относительно сигнала времени у модельного сенсора глюкозы, полученный с использованием метода потенциала разомкнутой цепи, при модельном сенсоре глюкозы в качестве рабочего электрода и контрольном сенсоре (обладающем редокс–полимером, но без глюкозооксидазы) в качестве электрода сравнения, причем модельный сенсор глюкозы предназначен для обнаружения различных наномолярных концентраций глюкозы, как указано, в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0045] На фиг. 6H показана калибровочная кривая (угол наклона относительно концентрации глюкозы (нМ)) графических данных на фиг. 6G в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0046] На фиг. 7 показано сравнение формы сигнала режима накопления при различных частотах фильтрации, при этом частота 3,2 Гц указана сплошной черной линией, а частота 0,032 Гц указана пунктирной линией, в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0047] На фиг. 8A показаны две микрофотографии осаждаемого чувствительного к глюкозе реагента с углеродными нанотрубками, УНТ, (правая панель) и без них (левая панель) в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0048] На фиг. 8B показаны калибровочные кривые для амперометрической детекции и детекции с режимом накопления (высота пика и площадь пика) с использованием различных частот фильтрации (частота 0,032 Гц указана кружками, а частота 3,2 Гц – треугольниками) и чувствительного реагента с УНТ и без них в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0049] На фиг. 9A показаны сигналы режима накопления, полученные для типичного сенсора глюкозы во время эксперимента по калибровке с использованием концентраций глюкозы от 0 до 200 нМ с временем накопления 30 минут для каждой детекции, причем сигнал фильтровали на частоте 3,2 Гц, а в чувствительный реагент добавляли УНТ, в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0050] На фиг. 9B показаны калибровочные кривые с соответствующей линейной аппроксимацией, полученные из сигналов амперометрии и режима накопления, измеренных в эксперименте по обнаружению, показанном на фиг. 8A, в котором каждый сигнал представляет собой среднее значение для 8 сенсоров с вычитанием фона, при этом планки погрешности соответствуют стандартному отклонению, и нижний ряд графиков представляет собой увеличенные изображения, показывающие концентрации глюкозы от 0 до 50 нМ, в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0051] На фиг. 10A показаны сигналы режима накопления от типичного сенсора глюкозы при фоновых условиях ([глюкоза] = 0) в сообщающемся с атмосферой (толстая линия) и продуваемым кислородом (тонкая линия) буферном растворе, в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0052] На фиг. 10B показано обобщение фоновых сигналов амперометрии и режима накопления из эксперимента, показанного на фиг. 10A, в котором сигналы представляют собой среднее значение (среднее) для 4 сенсоров, и данные для продувания кислородом указаны закрашенными кружками, а данные для атмосферных условий указаны незакрашенными кружками, в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0053] На фиг. 11 показаны калибровочные кривые, полученные для амперометрии и обнаружения с режимом накопления (высота пика и площадь пика) во время эксперимента по обнаружению с использованием концентраций глюкозы от 0 до 200 мкМ, при этом прямые линии показаны как линии линейной наилучшей аппроксимации, полученные для концентраций от 0 до 200 нМ, которые спрогнозированы на более высокие концентрации, и каждый сигнал представляет собой среднее значение для 8 сенсоров, в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0054] На фиг. 12 показана схематическая диаграмма сенсора аналита в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0055] Фиг. 13 представляет собой вид в разрезе, где показана часть сенсора аналита, совместимого с одним или более вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0056] На фиг. 14A показан вид сверху имплантируемого сенсора аналита, совместимого с одним или более вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0057] Фиг. 14B представляет собой вид в разрезе, где показана часть любого сенсора аналита, обладающего мембраной, совместимого с одним или более вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0058] На фиг. 14C показан крупный план чувствительного слоя, рабочего электрода и подложки с поверхлежащей внешней мембраной в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0059] Фиг. 14D является схемой, на которой показана окислительно–восстановительная реакция аналита с аналит–специфическим ферментом и медиатором электронного транспорта на рабочем электроде, в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0060] Фиг. 15 является блок–схемой варианта осуществления системы мониторинга аналита в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0061] Фиг. 16 является блок–схемой варианта осуществления считывающего устройства системы мониторинга аналита по фиг. 15 в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0062] Фиг. 17 является блок–схемой варианта осуществления управляющего сенсором устройства системы мониторинга аналита по фиг. 15 в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
in vitro
in vivo
[0063] Варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способу электрохимического измерения с использованием электрохимического сенсора для измерения низких наномолярных концентраций аналита  и . Варианты осуществления настоящего изобретения включают электрохимический сенсор, такой как ферментативный биосенсор, модифицированный для измерения низких наномолярных концентраций аналита.
[0064] Если представлен диапазон значений, следует понимать, что также конкретно включено каждое промежуточное значение между верхним и нижним пределами этого диапазона до десятой доли единицы нижнего предела, если контекст четко не указывает на иное. В описание включен каждый меньший диапазон между любым указанным значением или промежуточным значением в указанном диапазоне и любым другим указанным или промежуточным значением в этом указанном диапазоне. Верхний и нижний пределы этих меньших диапазонов можно независимо включать или исключать из диапазона, и каждый диапазон, в котором любой, никакой или оба предела включены в меньшие диапазоны, также включен в описание с учетом любого конкретно исключенного предела в указанном диапазоне. Если указанный диапазон включает один или оба предела, диапазоны, исключающие любой или оба из этих включенных пределов, также включены в описание.
[0065] В рамках изобретения термины "практически", "примерно" и подобные термины используются в качестве терминов приближения, а не в качестве терминов степени, и они предназначены для учета характерных отклонений измеренных или вычисленных значений, которые будут известны обычным специалистам в этой области техники.
[0066] В рамках описания раскрытого здесь изобретения следует понимать, что термин в единственном числе охватывает соответствующий термин во множественном числе, а термин во множественном числе охватывает соответствующий термин в единственном числе, если явно или неявно не понятно или не указано иное. Исключительно в качестве примера, ссылка на "аналит" охватывает единственный аналит, а также комбинацию и/или смесь двух или более разных аналитов, ссылка на "значение концентрации" охватывает единственное значение концентрации, а также два или более значения концентраций и т.п., если явно или неявно не понятно или не указано иное. Кроме того, следует понимать, что в случае любого данного компонента, представленного в настоящем описании, любой из возможных кандидатов или альтернативных вариантов, указанных для этого компонента, можно в общем использовать в отдельности или в сочетании друг с другом, если явно или неявно не понятно или не указано иное. Кроме того, следует понимать, что любой список таких кандидатов или альтернативных вариантов является исключительно иллюстративным, а не ограничивающим, если явно или неявно не понятно или не указано иное.
[0067] В рамках изобретения термины "измерять", "измерение" и "измеренный" могут охватывать смысловое значение соответствующего из терминов "определять", "определение", "определенный", "вычислять", "вычисление" и "вычисленный".
[0068] В рамках изобретения "электрохимический сенсор" является устройством, выполненным с возможностью обнаружения наличия и/или измерения уровня аналита в образце посредством электрохимических реакций окисления и восстановления на сенсоре. Эти реакции преобразуются в электрический сигнал, который может коррелировать с количеством, концентрацией или уровнем аналита в образце.
[0069] В рамках изобретения "рабочий электрод" является электродом, на котором аналит (или второе соединение, уровень которого зависит от уровня аналита) электроокисляется или электровосстанавливается с помощью средства переноса электронов или без него.
[0070] В рамках изобретения термин "противоэлектрод" относится к спаренному с рабочим электродом электроду, через который проходит ток, равный по величине и обратный по знаку току, проходящему через рабочий электрод. В контексте вариантов осуществления настоящего изобретения термин "противоэлектрод" включает a) противоэлектроды и b) противоэлектроды, которые также выполняют функцию электродов сравнения (т.е. противоэлектроды сравнения), если не указано иное.
[0071] В рамках изобретения "электрод сравнения" включает a) электроды сравнения и b) электроды сравнения, которые также выполняют функцию противоэлектродов (т.е. противоэлектроды сравнения), если не указано иное.
[0072] В рамках изобретения "электролиз" представляет собой электроокисление или электровосстановление соединения либо непосредственно на электроде, либо с помощью одного или более средств переноса электронов.
[0073] В рамках изобретения компоненты являются "иммобилизованными" в сенсоре, например, когда эти компоненты захвачены на или ковалентно, ионно или координационно связаны с составляющими сенсора и/или заключены в полимерной или золь–гелевой матрице или мембране, мешающей подвижности.
[0074] В рамках изобретения "средство переноса электронов" является соединением, переносящим электроны между аналитом и рабочим электродом либо напрямую, либо во взаимодействии с другими средствами переноса электронов. Одним из примеров средства переноса электронов является медиатор электронного транспорта.
[0075] В рамках изобретения "медиатор электронного транспорта" является средством переноса электронов, предназначенным для переноса электронов между аналитом, восстановленным аналитом или окисленным аналитом ферментом и электродом либо напрямую, либо с помощью одного или более дополнительных средств переноса электронов. Медиатор электронного транспорта, включающий полимерную основную цепь, может также называться "редокс–полимером".
[0076] В рамках изобретения термин "полимер–предшественник" относится к исходному полимеру до присоединения различных групп–модификаторов для получения модифицированного полимера.
[0077] В рамках изобретения "чувствительный слой" является компонентом сенсора, включающим составляющие, способствующие электролизу аналита. Чувствительный слой может включать такие составляющие, как средство переноса электронов (например, медиатор электронного транспорта или редокс–полимер), катализатор (например, аналит–специфический фермент), катализирующий реакцию аналита с получением отклика на рабочем электроде, или как средство переноса электронов, так и катализатор. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения сенсор включает чувствительный слой, невымываемо расположенный вблизи рабочего электрода или на рабочем электроде.
[0078] В рамках изобретения "чувствительный элемент" является аппликацией или областью аналит–специфического фермента, расположенного в чувствительном слое. В связи с этим, чувствительный элемент способен взаимодействовать с аналитом. Чувствительный слой может иметь более чем один чувствительный элемент, составляющий область детекции аналита, расположенную на рабочем электроде. В некоторых вариантах осуществления чувствительный элемент включает аналит–специфический фермент и средство переноса электронов (например, медиатор электронного транспорта). В некоторых вариантах осуществления чувствительный элемент включает аналит–специфический фермент, средство переноса электронов и кросслинкер.
[0079] В рамках изобретения термины "невымываемое" или "невысвобождаемое" соединение или "невымываемо расположенное" соединение предназначены для обозначения соединения, прикрепленного к сенсору таким образом, что оно практически не диффундирует наружу из чувствительного слоя рабочего электрода в течение того периода, в котором сенсор применяют (например, периода, в течение которого сенсор имплантирован пациенту, или периода измерения образца).
[0080] В рамках изобретения "кросслинкер" представляет собой молекулу, содержащую по меньшей мере две реакционноспособные группы, способные связывать друг с другом по меньшей мере две молекулы или связывать друг с другом по меньшей мере две части одной и той же молекулы. Связывание по меньшей мере двух молекул называют межмолекулярной сшивкой, в то время как связывание по меньшей мере двух частей одной и той же молекулы называют внутримолекулярной сшивкой. Кросслинкер с более чем двумя реакционноспособными группами можно быть способен осуществлять межмолекулярную и внутримолекулярную сшивки одновременно.
[0081] "Раствор мембраны" является раствором, содержащим все необходимые компоненты для сшивки и образования мембраны, включая модифицированный полимер, содержащий гетероциклические азотные группы, кросслинкер и буфер или смешанный растворитель спирт–буфер.
[0082] В рамках изобретения "биологическая жидкость" или "биожидкость" является любой физиологической жидкостью или производным физиологической жидкости, в которых можно измерять аналит, например, кровью, интерстициальной жидкостью, плазмой, дермальной интерстициальной жидкостью, потом и слезами.
[0083] В рамках изобретения термин "обнаружение с режимом накопления" относится к накоплению электронов, полученных при окислении аналита, происходящем у или на чувствительном элементе рабочего электрода, который не подсоединен к цепи, тем самым создавая накопление электронов.
Обнаружение с режимом накопления
[0084] Со ссылкой на блок-схему способа по фиг. 1, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения включают способ получения сигнала от аналита с использованием сенсора, включающего рабочий электрод и другой электрод (например, противоэлектрод и/или электрод сравнения), причем рабочий электрод снабжают или модифицируют (10) катализатором, таким как аналит–специфический фермент, и средством переноса электронов (например, медиатором электронного транспорта). Область рабочего электрода, модифицированного аналит–специфическим ферментом и медиатором электронного транспорта, можно назвать чувствительным элементом или чувствительным слоем рабочего электрода. Как показано на фиг. 1, рабочий электрод, снабженный (например, модифицированный) аналит–специфическим ферментом, снабжают (15) аналитом. В присутствии аналита модифицированный рабочий электрод окисляет аналит, и величину окисления измеряют как количество электронного заряда, образовавшегося из-за этой реакции. При условии, что рабочий электрод не соединен с другим электродом, заряд от окислительно–восстановительной реакции будет продолжать накапливаться (20) на рабочем электроде. В случае аналитов с низкой концентрацией в организме (например, кортизола), накопление заряда (электронов) в течение установленного периода времени позволяет низким концентрациям аналита приводить к выходному сигналу, который легко измерять и количественно анализировать по сравнению с другими известными способами. После установленного периода времени для накопления заряда (например, до 120 секунд, до 3 минут, до 5 минут, до 10 минут, до 15 минут, до 20 минут, до 25 минут или до 30 минут) рабочий электрод соединяют (25) с по меньшей мере одним другим электродом, таким как противоэлектрод и/или электрод сравнения, с образованием цепи. После образования цепи накопленные электроны на рабочем электроде разряжаются в виде электрического сигнала, амплитуду которого измеряют (30), и она коррелирует с количеством аналита, находящегося на рабочем электроде. По сути, способом по вариантам осуществления настоящего изобретения, изображенным в действиях 10, 15, 20, 25 и 30 на фиг. 1, можно легко определять и измерять низкие концентрации аналита (например, такие низкие наномолярные количества, как 4,7 нМ).
[0085] Со ссылкой на фиг. 2 показан пример трехэлектродной установки с рабочим электродом 40, электродом 50 сравнения и противоэлектродом 60, используемой для обнаружения с режимом накопления в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, в которых, когда цепь 70 соединена, как показано на левой панели, рабочий электрод находится под потенциалом (напряжением), достаточным для прохождения окислительно–восстановительной реакции аналита при установившихся условиях. Например, в случае используемого здесь примерного сенсора глюкозы, потенциал (напряжение), достаточный для прохождения окислительно–восстановительной реакции, составляет +40 мВ относительно Ag/AgCl. Когда цепь 70 не соединена, как показано на правой панели, рабочий электрод 40 электрически отключен от цепи 70, позволяя заряду (например, электронам) из аналита накапливаться и храниться в редокс–полимере до тех пор, пока рабочий электрод 40 не будет повторно подключен к цепи 70, и этот хранящийся заряд измеряют.
3+
3+
2+
2+
2+
–
[0086] Со ссылкой на фиг. 3A и 3B показан пример электрохимического ферментативного биосенсора в общем обзоре режима накопления. В этом примере обнаружение аналита (A) основано на электрическом "подсоединении" фермента оксидоредуктазы (AOx) к рабочему электроду сенсора через редокс–полимер. При нормальном амперометрическом обнаружении электрод находится под потенциалом (напряжением) так, что аналит реагирует с постоянной скоростью, пропорциональной концентрации аналита. В случае реакции окисления аналита (A до A+), как показано на фиг. 3B, электроны будут перетекать от аналита (A) к аналит–специфическому ферменту (AOx) к редокс–полимеру (например, Os) к рабочему электроду с постоянной скоростью, приводя к установившемуся току, как показано на фиг. 3A. Если рабочий электрод отключен от цепи, поток электронов от редокс–полимера к рабочему электроду будет прекращаться, что приводит к отсутствию тока в цепи. Однако аналит все равно будет подвергаться ферментативному окислению, которое, в свою очередь, приводит к восстановлению редокс–полимера (Os до Os). Это приводит к скоплению (изображенному как "облако" Os) восстановленной формы редокс–полимера (Os) с течением времени, т.к. электроны (e) из аналита накапливаются и хранятся в редокс–полимере. Когда рабочий электрод снова подключают к цепи так, что он находится под своим исходным потенциалом (напряжением), скопление восстановленной формы редокс–полимера будет окисляться, приводя к большому выбросу тока, как показано на фиг. 3A. Затем ток будет спадать обратно к исходному амперометрическому току, т.к. окислительно–восстановительная система снова достигнет своего установившегося состояния. Этот двухстадийный процесс составляет основу обнаружения с режимом накопления: одна стадия, на которой рабочий электрод сенсора отсоединяют от цепи или не соединяют с цепью в течение установленного периода времени (также называемого временем накопления), позволяя заряду из аналита "аккумулироваться" в редокс–полимере, и вторая стадия, на которой рабочий электрод сенсора подключают к цепи после времени накопления, позволяя аккумулированному (накопленному) заряду разрядиться и быть измеренным в виде острого пика.
J. Am. Chem. Soc.
J. Am. Chem. Soc.
Anal. Chem.
Diabetes Technol. Ther.
J. Diabetes Sci. Technol.
J. Diabetes Sci. Technol.
[0087] Со ссылкой на фиг. 3C и 3D был продемонстрирован пример обнаружения с режимом накопления с использованием разработанного сенсора глюкозы, состоящего из глюкозо–специфического чувствительного реагента, осаждаемого на полученном методом трафаретной печати углеродном электроде. Чувствительный к глюкозе реагент состоит из фермента глюкозооксидазы, сшитого с Os–содержащим редокс–полимером. Уже показано использование этого реагента в глюкозных биотопливных элементах, а также автономных и питаемых потенциостатом сенсорах глюкозы непрерывного действия. См., например, Mao et al., 2003, 125:4951–4957; Mano et al., 2003, 125:6588–6594; Liu et al.,  2012, 84:3403–3409; Feldman et al., 2003, 5:769–779; Hoss et al., 2013, 7:1210–1219; и Hoss et al., 2014, 8:89–94, полное содержание всех которых включено в настоящее описание по ссылке. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения способ обнаружения с режимом накопления можно использовать для повышения чувствительности электрохимического измерения. В эксперименте, показанном на фиг. 3C и 3D, сенсор глюкозы помещали в раствор 2 мкМ глюкозы и 100 мМ фосфатно–солевого буфера (PBS) и осуществляли несколько измерений с режимом накопления, проводя мониторинг тока сенсора. Для каждого измерения сенсор исходно помещали под +40 мВ для прохождения установившегося окисления глюкозы, затем рабочий электрод электрически отключали на установленный период времени (время накопления), чтобы сделать возможным накопление заряда, а затем рабочий электрод обратно подключали для измерения накопленного заряда. Как показано, размер окислительного выброса тока повышается с повышением времени накопления. Соответственно, просто повышая время накопления (например, до 30 секунд, до 60 секунд или до 120 секунд), повышают чувствительность измерения с этим сенсором глюкозы и концентрацией глюкозы. Графики амперометрического сигнала, который измеряли в качестве установившегося тока сенсора, а также высоты пика и площади пика выбросов тока, показанных на фиг. 3C, построены по отношению к времени накопления на фиг. 3D. Как показано, амперометрический ток не зависит от времени накопления и остается постоянным. Однако высота и площадь пика выброса тока демонстрируют линейную зависимость от времени накопления, подчеркивая преимущество обнаружения с режимом накопления относительно общепринятой амперометрии. То есть чувствительность сенсора можно настраивать, изменяя легко корректируемый параметр метода измерения, например, период времени накопления заряда.
[0088] В вариантах осуществления настоящего изобретения способ обнаружения с режимом накопления обеспечивает сигнал в диапазоне концентраций аналита. На фиг. 4A и 4B показан пример эксперимента по калибровке с использованием примерного сенсора глюкозы для концентраций глюкозы до 100 мкМ. Как указано, для каждой детекции использовали время накопления 60 секунд. На фиг. 4A показана результирующая запись изменения тока относительно времени в этом эксперименте. Как показано, установившийся амперометрический ток и размер пиков тока режима накопления повышаются с повышением концентрации глюкозы. На фиг. 4B показаны графики амперометрического тока и высоты пика и площади пика выбросов тока как функция концентрации глюкозы, при этом все три сигнала проявляли линейную зависимость от концентрации аналита. Следовательно, эти результаты свидетельствуют о том, что обнаружение с режимом накопления, измеряемое с использованием высоты пика или площади пика, дает линейные калибровочные кривые и поэтому может использоваться для обнаружения аналогичным общепринятой амперометрии образом с повышенной чувствительностью. По сути, т.к. высота пика, полученная при обнаружении с режимом накопления, измеряется в единицах тока, чувствительность этого способа измерения можно количественно сравнить с чувствительностью амперометрии. Например, чувствительность способа измерения можно определять посредством сравнения углов наклона калибровочных кривых, таких как показанные на фиг. 4B. При сравнении амперометрия имеет чувствительность 0,44 нА/мкМ, в то время как обнаружение с режимом накопления (с использованием измерения высоты пика) имеет чувствительность 1,69 нА/мкМ. Таким образом, при времени накопления 60 секунд обнаружение с режимом накопления по вариантам осуществления настоящего изобретения повышает чувствительность электрохимического измерения приблизительно в 4 раза по сравнению с амперометрией.
[0089] Кроме того, т.к. и высота пика, и площадь пика обеспечивают одинаковые результат и чувствительность, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения средство измерения результирующего сигнала тока рабочего электрода включает вычисление высоты пика и/или площади пика.
[0090] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения обнаружение с режимом накопления осуществляют с использованием сенсора, имеющего внешнюю мембрану. Т.к. электрохимические сенсоры зачастую покрывают внешней мембраной (например, полимерной мембраной) для обеспечения стабильности чувствительных реагентов, ограничений массообмена, биосовместимости и/или для предотвращения загрязнения электрода, покрытый полимером сенсор тестировали для того, чтобы убедиться, что обнаружение с режимом накопления происходит в соответствии с ожидаемым. Со ссылкой на фиг. 5 показано, что примерный сенсор глюкозы, покрытый ограничивающей поток внешней полимерной мембраной, использовали для получения калибровочных кривых посредством амперометрии и обнаружения с режимом накопления при концентрациях глюкозы 0, 50, 100, 200 и 500 мкМ. Осуществляли четыре последовательных измерения при каждой концентрации глюкозы с использованием разного времени накопления в 1, 2, 5 и 10 минут, как соответственно указано точками данных на фиг. 5.
[0091] Как показано на фиг. 5, амперометрия (левый график) и измерения с режимом накопления (средний и правый графики) дают линейный отклик на концентрацию аналита. Как и ожидалось, при использовании амперометрии (левый график на фиг. 5) чувствительность сенсора является независимой от времени накопления. Однако, при использовании обнаружения с режимом накопления (средний и правый графики на фиг. 5) чувствительность сенсора повышается с повышением времени накопления. Из–за ограничивающей поток внешней мембраны чувствительности сенсора при использовании амперометрии и обнаружения с режимом накопления гораздо ниже, чем у сенсоров без внешней мембраны. Этого и ожидали, т.к. внешняя мембрана ограничивает диффузию аналита к чувствительному реагенту. Однако, как показано на фиг. 5, при добавлении внешней полимерной мембраны к сенсору обнаружение с режимом накопления проходило в соответствии с ожидаемым и дает другой пример того, как чувствительность сенсора можно настраивать, изменяя время накопления. Кроме того, следует отметить, что установленный период времени более 10 минут для накопления заряда при использовании обнаружения с режимом накопления с сенсорами непрерывного мониторинга может вызвать отрицательные эффекты в отношении временного разрешения сенсора. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения обнаружение с режимом накопления осуществляют с использованием сенсора, имеющего внешнюю мембрану, причем установленный период времени для накопления заряда составляет до 10 минут.
in vivo
[0092] Также следует отметить, что хотя внешняя мембрана, такая как ограничивающая поток внешняя мембрана, может не потребоваться для предотвращения загрязнения электрода при измерениях аналитов в низких концентрациях, внешняя мембрана может обеспечивать биосовместимую границу раздела со средой  и/или обеспечивать стабильность нижележащего чувствительного слоя, включающего средства переноса электронов и/или аналит–специфические ферменты на нем. В случае обнаружения с режимом накопления, при котором используют внешнюю мембрану, установленный период времени для накопления заряда можно повышать, чтобы сделать возможным окисление всей концентрации аналита. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения способ обнаружения с режимом накопления с использованием сенсора, имеющего внешнюю мембрану, включает повышение установленного периода времени для накопления заряда до 1 минуты, до 2 минут, до 3 минут, до 4 минут, до 5 минут, до 6 минут, до 7 минут, до 8 минут, до 9 минут или до 10 минут для того, чтобы сделать возможным завершение реакции всего аналита, присутствующего на рабочем электроде. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения способ обнаружения с режимом накопления с использованием сенсора, имеющего внешнюю мембрану, включает повышение установленного периода времени для накопления заряда с 10 минут до 30 минут.
[0093] Альтернативно, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения внешняя мембрана может быть выполнена из высокопроницаемого материала, и, таким образом, хотя проницаемая мембрана не снижает скорость, с которой аналит достигает чувствительного слоя рабочего электрода, проницаемая мембрана делает возможными стабильность, ограничения массообмена и/или биосовместимость. Неограничивающие примеры высокопроницаемых материалов мембран включают поливинилпиридин, сшитый с высокомолекулярным (MW ≥ 400 г/моль) диглицидиловым простым эфиром полиэтиленгликоля, дериватизированный поливинилпиридин, сшитый с высокомолекулярным (MW ≥ 400 г/моль) диглицидиловым простым эфиром полиэтиленгликоля, поливиниловый спирт, полиакриловую кислоту и полиметакриловую кислоту.
in vitro
[0094] Со ссылкой на фиг. 6A–6B, электрохимический сенсор глюкозы использовали в эксперименте для измерения (например, обнаружения) концентраций глюкозы в диапазоне от 0 до 1000 наномоль (нМ). В этом примере рабочий электрод сенсора включал фермент глюкозооксидазу, сшитый с Os–содержащим редокс–полимером, осажденным и иммобилизованным на полученном методом трафаретной печати углеродном электроде. Эксперимент осуществляли, как представлено в настоящем описании (например, в примере 8). Кроме того, использовали полученный методом трафаретной печати углеродный противоэлектрод и электрод сравнения Ag/AgCl. Перед каждым измерением рабочий электрод поддерживали при +40 мВ относительно Ag/AgCl в течение 3 минут, после чего измеряли потенциал разомкнутой цепи электрода в течение 3 минут. График на фиг. 6A показывает записи изменения результирующего потенциала от времени для указанных концентраций глюкозы (от 0 до 1000 нМ глюкозы). Соответственно, как показано, более высокие концентрации глюкозы приводят к большей величине скорости дрейфа потенциала. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения скорость дрейфа вычисляют как угол наклона записей изменения потенциала от времени. На фиг. 6B показана калибровочная кривая, представляющая собой график скорости дрейфа (вычисленной как угол наклона от 30 до 180 секунд) относительно концентрации глюкозы. Как показано на фиг. 6B, скорость дрейфа потенциала проявляет линейную зависимость от концентрации глюкозы.
in vitro
[0095] Со ссылкой на фиг. 6C–6D, тот же электрохимический сенсор глюкозы, использованный в эксперименте, показанном на фиг. 6A–6B, использовали в эксперименте  для измерения концентраций глюкозы в диапазоне от 0 до 750 нМ, включая концентрации глюкозы ниже 100 нМ (например, 10 нМ, 25 нМ и 50 нМ). На графике на фиг. 6C показаны записи изменения результирующего потенциала от времени для указанных концентраций глюкозы. Соответственно, как показано на фиг. 6D, график скорости дрейфа в этом эксперименте остается линейным до 10 нМ глюкозы. Эта корреляция дополнительно показана на фиг. 6E, на которой показана калибровочная кривая, полученная в результате тестирования 8 отдельных сенсоров глюкозы. Кроме того, в этом эксперименте также тестировали контрольные сенсоры, в которых отсутствует фермент глюкозооксидаза (но все равно обладающие Os–содержащим редокс–полимером). Как показано на фиг. 6E и 6F, скорость дрейфа в контрольных сенсорах, представленных незакрашенными кружками, не зависела от концентраций глюкозы.
[0096] В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения раскрытый сейчас способ можно использовать для снижения фонового сигнала (например, сигнал при [аналит]=0). Со ссылкой на фиг. 6G–6H, эксперимент осуществляли с использованием сенсора глюкозы, используемого в эксперименте, показанном на фиг. 6A, в качестве рабочего электрода. Кроме того, во время измерения потенциала разомкнутой цепи использовали в качестве электрода сравнения контрольный сенсор, в котором отсутствует фермент глюкозооксидаза, но все еще присутствует Os–содержащий редокс–полимер. Используя эту конфигурацию, минимизируют величину измеряемого сигнала, получаемого не от окисления глюкозы. Например, при использовании безглюкозооксидазного контрольного сенсора в качестве электрода сравнения фоновый сигнал (угол наклона записи изменения потенциала от времени) для нулевой концентрации глюкозы составляет приблизительно нуль. Результирующее пересечение калибровочной кривой, показанной на фиг. 6H, на два порядка величины меньше, чем пересечение показанной на фиг. 6F калибровочной кривой, которую получали с использованием электрода сравнения Ag/AgCl. Соответственно, способы и системы по настоящему изобретению включают использование безглюкозооксидазного контрольного сенсора в качестве электрода сравнения во время измерения потенциала разомкнутой цепи в качестве эффективного способа снижения фонового сигнала.
[0097] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения сигнал, получаемый при окислительно–восстановительной реакции аналита на чувствительном слое рабочего электрода, можно настраивать или модифицировать для повышения выходного сигнала для любого данного сенсора и/или любой данной концентрации аналита. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения сигнал повышают, модифицируя частоту, с которой регистрируют сигнал тока. Например, как показано на фиг. 7, для максимизации высоты пика, измеряемой во время выброса тока при детекции накопления, сигнал можно регистрировать при более быстрой частоте замеров (например, 0,1 Гц) и фильтровать при более высокой частоте (например, 3,2 Гц), чем частота замеров 0,5 Гц и частота фильтра 0,03 Гц, которые использовали для экспериментов по обнаружению с режимом накопления, представленных в настоящем описании и показанных на фиг. 3A–3D, 4A–4B и 5. Как показано на фиг. 7, пик детекции является гораздо более острым при более высокой частоте 3,2 Гц, что приводит к большей высоте пика. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения способ обнаружения с режимом накопления включает повышение частоты фильтра до 3,2 Гц для максимизации величины сигнала. Следует отметить, что при частоте выше 3,2 Гц соотношение сигнал-шум является слишком большим для точных измерений, будь то при использовании измерения амперометрического тока или пика накопления.
[0098] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в чувствительный элемент рабочего электрода добавляют углеродные нанотрубки (УНТ). Например, УНТ добавляют в чувствительный реагент, включающий медиатор электронного транспорта и аналит–специфический фермент, и наносят на рабочий электрод. Со ссылкой на фиг. 8A, на микрофотографии справа УНТ добавляли в чувствительный реагент, а на микрофотографии слева УНТ не добавляли. Обнаружение с режимом накопления измеряли с УНТ и без них. Как показано на фиг. 8B, при добавлении УНТ в чувствительный элемент на рабочем электроде выброс тока в режиме накопления имеет большую высоту пика.
[0099] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения обнаружение с режимом накопления включает использование сенсора с временем накопления (например, установленным периодом времени для накопления заряда) 30 минут, частотным фильтром сигнала 3,2 Гц и добавлением углеродных нанотрубок (УНТ) в чувствительный элемент на рабочем электроде. На фиг. 9A показаны сигналы в режиме накопления, полученные для типичного сенсора глюкозы при концентрациях глюкозы от 0 до 200 нМ в присутствии УНТ, с временем накопления 30 минут и фильтрацией сигнала при 3,2 Гц. Соответственно, как показано на калибровочных кривых сигнала на фиг. 9B, по сравнению с амперометрией обнаружение с режимом накопления по вариантам осуществления настоящего изобретения обеспечивает повышенную чувствительность для аналитов в низких концентрациях. Как видно, при времени накопления 30 минут обнаружение с режимом накопления с использованием измерения высоты пика дает 800–кратное повышение чувствительности по сравнению с амперометрией. Что касается предела детекции, обнаружение с режимом накопления с использованием измерения площади пика превосходно, приводя к нижнему пределу детекции (LOD) 4,7±1,4 нМ, что представляет собой 25–кратное улучшение относительно амперометрии. Хотя линейный диапазон обнаружения с режимом накопления является более ограниченным, чем при амперометрии, следует отметить, что этот диапазон можно сдвигать к более высоким концентрациям с использованием меньшего времени накопления.
Сенсор для обнаружения с режимом накопления
in vivo
in vitro
[00100] Сенсор, представленный в настоящем описании, может являться сенсором  или сенсором  (т.е. индикаторной полоской для дискретного мониторинга). Такой сенсор можно формировать на подложке, например, практически плоской подложке. В некоторых вариантах осуществления сенсор является проводом, например, проводной внутренней частью рабочего электрода с одним или более другими связанными с ним электродами (например, расположенными на нем, включая обернутые вокруг него). Сенсор также может включать по меньшей мере один противоэлектрод (или противоэлектрод сравнения), и/или по меньшей мере один электрод сравнения или по меньшей мере один противоэлектрод сравнения.
[00101] На фиг. 12 схематически показан вариант осуществления сенсора 800 аналита в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения. Этот сенсор включает электроды 801, 802 и 803 на основе 804. Электроды (и/или другие элементы) можно наносить или обрабатывать иным образом с использованием любой подходящей технологии, например, химического осаждения из паровой фазы (CVD), физического осаждения из паровой фазы, катодного распыления, реакционного катодного распыления, печати, нанесения покрытия, абляции (например, лазерной абляции), нанесения краски, нанесения покрытия погружением, травления и т.п. Материалы включают, но не ограничены ими, любой один или более из алюминия, углерода (включая графит), кобальта, меди, галлия, золота, индия, иридия, железа, свинца, магния, ртути (в виде амальгамы), никеля, ниобия, осмия, палладия, платины, рения, родия, селена, кремния (например, легированного поликристаллического кремния), серебра, тантала, олова, титана, вольфрама, урана, ванадия, цинка, циркония, их смесей и сплавов, оксидов или металлических соединений этих элементов.
[00102] Сенсор 800 аналита может быть полностью имплантируемым пользователю, или же может быть выполнен так, что только его часть располагается внутри пользователя (внутренняя), а другая часть располагается вне пользователя (внешняя). Например, сенсор 800 может включать первую часть, располагаемую над поверхностью кожи 810, и вторую часть, располагаемую под поверхностью кожи. В таких вариантах осуществления внешняя часть может включать контакты (соединенные с соответствующими электродами второй части дорожками) для соединения с другим устройством, тоже внешним по отношению к пользователю, таким как передатчик. Хотя в варианте осуществления на фиг. 12 показаны три электрода 801, 802 и 803 бок о бок на одной поверхности основы 804, предусмотрены и другие конфигурации, например, с меньшим или большим количеством электродов, некоторые или все электроды расположены на разных поверхностях основы или присутствуют на другой основе, некоторые или все электроды расположены стопкой, электроды из разных материалов и разных размеров, и т.д.
[00103] На фиг. 13 показан вид в разрезе варианта осуществления сенсора 500 аналита, имеющего первую часть (которую в этом варианте осуществления можно охарактеризовать как основную часть), располагаемую над поверхностью кожи, и вторую часть (которую в этом варианте осуществления можно охарактеризовать как второстепенную часть), которая включает хвост 530 сенсора (который может также называться здесь вводимым наконечником), располагаемый под поверхностью кожи (например, проникающий через кожу (дерму) в подкожное пространство и приводимый в контакт с биологической жидкостью носителя, такой как интерстициальная жидкость). Электродные контакты (не показаны) размещены на первой части сенсора 500, располагающейся выше поверхности кожи, и проходят до места в хвосте 530 сенсора. Рабочий электрод 501, электрод 502 сравнения и противоэлектрод 503 показаны во второй части сенсора 500 и, в частности, в нижней части хвоста 530 сенсора. Следует понимать, что в сенсоре может быть предусмотрено большее или меньшее количество электродов, без отклонения от объема настоящего изобретения. Например, сенсор может включать более чем один рабочий электрод, и/или противоэлектрод и электрод сравнения могут быть единственным противоэлектродом сравнения, и т.п.
[00104] Как показано на фиг. 13, сенсор 500 включает подложку (или слой подложки) 504 и первый проводящий слой 508, такой как углерод, золото и т.д., который электрически связан с чувствительным участком 509, тем самым в совокупности определяя рабочий электрод 501. Чувствительный участок 509 можно защищать от микроорганизмов, придавая одному или более компонентам сенсора 500 противомикробное качество, что предназначено для защиты здоровья кожи носителя и/или чувствительного участка 509 от потенциального воздействия таких микроорганизмов (например, образования биологической пленки из–за потенциальной миграции микроорганизмов). Различные электроды и чувствительные участки, образованные на нижней части хвоста 530 сенсора на фиг. 13, в совокупности могут представлять собой чувствительную область, и любое такое противомикробное качество, придаваемое описанному здесь хвосту сенсора, придают в верхней части (верхним 25%) хвоста 530 сенсора выше упомянутой области (например, выше чувствительного участка 509 или выше электрода 503).
[00105] Первый изоляционный слой 505, такой как первый слой диэлектрика в некоторых вариантах осуществления, можно располагать или наслаивать на по меньшей мере часть первого проводящего слоя 508, и, кроме того, второй проводящий слой 511 можно располагать или укладывать поверх по меньшей мере части первого изоляционного слоя (или слоя диэлектрика) 505. Как показано на фиг. 13, второй проводящий слой 511 в совокупности со вторым проводящим материалом 510, таким как слой серебра/хлорида серебра (Ag/AgCl), может обеспечивать электрод 502 сравнения. Другое возможное расположение второго проводящего материала 510 показано на фиг. 14B вместе с внешней мембраной 520, покрывающей различные слои.
[00106] Второй изоляционный слой 506, такой как второй слой диэлектрика в некоторых вариантах осуществления, можно располагать или наслаивать на по меньшей мере часть второго проводящего слоя 511. Кроме того, третий проводящий слой 513 может располагаться на по меньшей мере части второго изоляционного слоя 506 и может обеспечивать противоэлектрод 503. Наконец, третий изоляционный слой 507 можно располагать или наслаивать на по меньшей мере часть третьего проводящего слоя 513. Таким образом, сенсор 500 можно наслаивать таким образом, что по меньшей мере часть каждого из проводящих слоев отделена соответствующим изоляционным слоем (например, слоем диэлектрика). Другая возможная конфигурация слоев показана на фиг. 14B. В вариантах осуществления на фиг. 13 и 14B показаны слои, имеющие разную длину; однако, некоторые или все слои могут иметь одинаковую или разную длину и/или ширину без отклонения от объема настоящего изобретения.
[00107] В любом или всех вариантах осуществления некоторые или все из электродов 501, 502 и 503 могут быть предусмотрены на одной и той же стороне подложки 504 в многослойной конструкции, описанной выше, или альтернативно, могут быть предусмотрены компланарно таким образом, что два или более электрода могут располагаться в одной плоскости (например, бок о бок, параллельно или под углом друг к другу) на подложке 504. Например, компланарные электроды могут иметь подходящее разделяющее пространство между ними и/или включать диэлектрический материал или изоляционный материал, расположенный между проводящими слоями/электродами. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления один или более из электродов 501, 502 и 503 могут располагаться на противоположных сторонах подложки 504. В таких вариантах осуществления контактные площадки могут находиться на одной и той же стороне или разных сторонах подложки. Например, электрод может находиться на первой стороне, а соответствующий ему контакт может находиться на второй стороне, например, соединяющая электрод и контакт дорожка может проходить через подложку.
[00108] Обращаясь теперь к фиг.14A, там показан другой вариант сенсора аналита в соответствии с одним или более вариантами осуществления настоящего изобретения, и он представляет собой вариацию сенсора 500 по фиг. 13 и 14B. На фиг. 14A показана имплантируемая (например, подкожная или чрескожная) чувствительная область 920 по одному или более вариантам осуществления настоящего изобретения, включающая рабочий электрод 922 с чувствительными элементами 931. Проксимальный конец 940 выполнен с возможностью его соединения с различными электрическими соединителями для передачи выходных сигналов чувствительной области 920. В совокупности, дистальный конец 925 и проксимальный конец 940 образуют хвост сенсора. Чувствительная область 920 охватывает нижнюю часть хвоста сенсора. Как изображено, чувствительная область 920 содержит закругленный наконечник, но альтернативно можно использовать другие формы наконечников для облегчения введения в кожу носителя.
[00109] Кроме того, в одном или более вариантах осуществления чувствительная область 920 может включать электрод сравнения, противоэлектрод или противоэлектроды сравнения, такие как показанные на фиг. 13 и 14B. Можно использовать альтернативные конфигурации электродов без отклонения от объема настоящего изобретения.
[00110] Со ссылкой на фиг. 13, 14A и 14B, примечательно, что сенсор (или чувствительная область) 500, 920 имеет функциональность обнаружения на дистальной части своих соответствующих хвостов сенсора. Как описано выше, это расположение может сделать возможным увеличенный контакт с более глубокими участками под кожей носителя (например, в подкожном пространстве), при этом больший доступ к интерстициальной жидкости носителя может сделать возможным больший доступ к измеряемому интересующему аналиту (например, его концентрации). То есть чувствительная область располагается достаточно глубоко в коже носителя, чтобы сделать возможным точное измерение конкретного аналита, в то время как размещение чувствительной области на участке, более близком к поверхности кожи, может быть неадекватным для правильного определения концентрации или другой характеристики желаемого аналита.
[00111] Со ссылкой на фиг. 13 и 14B–14D, один или более вариантов осуществления настоящего изобретения включают рабочий электрод 501 или 320, имеющий чувствительный участок 509, причем чувствительный участок 509 имеет по меньшей мере один чувствительный элемент 322, включающий, например, аналит–специфический фермент 323 и средство переноса электронов (например, медиатор электронного транспорта) 324. Рабочий электрод 501 или 320 расположен на подложке 504 или 325, которая размещена в контакте с и между рабочим электродом 501 или 320 и противоэлектродом 503. Первый изоляционный слой 505 расположен в контакте с поверхностью рабочего электрода 501 или 320, которая не контактирует с подложкой 504 или 325. Электрод 502 сравнения расположен в контакте с поверхностью первого изоляционного слоя 505, которая не контактирует с рабочим электродом 501 или 320, и второй проводящий материал (или слой) 510 расположен в контакте с поверхностью электрода 502 сравнения, которая не контактирует с первым изоляционным слоем 505.
[00112] На фиг. 14C также показано, что на по меньшей мере части рабочего электрода 320 расположен чувствительный элемент 322. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения два или более чувствительных элемента 322 могут быть предусмотрены на чувствительном слое рабочего электрода, причем эти два или более чувствительных элемента располагаются латерально друг относительно друга.
[00113] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения на рабочем электроде 320 может располагаться любая подходящая конфигурация чувствительных элементов 322. Дополнительные конфигурации чувствительных элементов описаны, например, в публикации Хосса и др. (Hoss et al., US 2012/0150005), полное содержание которой включено в настоящее описание по ссылке.
[00114] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, как показано на фиг. 14B, сенсор 500 включает внешнюю мембрану 520, которая покрывает по меньшей мере рабочий электрод 501 и чувствительный участок 509. В других вариантах осуществления внешняя мембрана 520 покрывает весь сенсор 500. В некоторых вариантах осуществления внешняя мембрана 520 покрывает все активные участки сенсора 500. Например, активные участки сенсора 500 находятся на чувствительной области 920, как показано на фиг. 14A, и чувствительном участке 509, как показано на фиг. 14B. В некоторых вариантах осуществления внешняя мембрана 520 покрывает рабочий электрод, противоэлектрод и/или электрод сравнения на чувствительной области 920 или чувствительном участке 509.
[00115] На фиг. 14C показано приближенное изображение внешней мембраны 335, покрывающей чувствительный элемент 322, расположенный на рабочем электроде 320, расположенном на подложке 325. Как показано, внешняя мембрана 335 находится в процессе покрывания. Внешняя мембрана 335 покрывает по меньшей мере весь чувствительный элемент 322.
Аналит–специфические ферменты и средство переноса электронов (медиатор электронного транспорта)
[00116] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения сенсоры по настоящему изобретению не способны измерять аналит напрямую. То есть электроды на сенсоре не могут напрямую взаимодействовать с аналитом. Соответственно, аналит определяют посредством белка–фермента, способного напрямую взаимодействовать с молекулой аналита. Однако, некоторые ферменты (например, глюкозооксидаза) не могут обмениваться электронами напрямую с электродами, так как их окислительно–восстановительные активные центры погружены глубоко в структуру белка–фермента. Поэтому для переноса электронов между окислительно–восстановительным активным центром фермента и электродами используют средство переноса электронов (т.е. медиатор электронного транспорта). Иммобилизация средства переноса электронов и аналит–специфического фермента на чувствительном слое создает то, что называют "проводом", т.к. иммобилизованные молекулы способны передавать электроны и, как таковые, являются "электрически подключенными". Аналит–специфический фермент также называют "проводным ферментом". Проводные ферменты описаны, например, у Gregg et al. (патент США № 5262035), Say et al. (патент США № 6134461) и Hoss et al., (публикация заявки на патент США № 2012/0150005), полное содержание каждого из которых включено в настоящее описание по ссылке. В некоторых вариантах осуществления аналит–специфический фермент сшит со средством переноса электронов.
[00117] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения средства переноса электронов (например, медиаторы электронного транспорта) являются электровосстанавливаемыми и электроокисляемыми ионами или молекулами, имеющими окислительно–восстановительные потенциалы (напряжения) на несколько сотен милливольт выше или ниже окислительно–восстановительного потенциала (напряжения) нормального каломельного электрода (НКЭ). В некоторых вариантах осуществления средства переноса электронов не восстанавливаются на более чем примерно –150 мВ и не окисляются на более чем примерно +400 мВ относительно НКЭ. Примеры подходящих медиаторов электронного транспорта в виде редокс–полимеров описаны, например, в Mao et al. (патент США № 6605200), полное содержание которого включено в настоящее описание по ссылке.
[00118] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, как показано на фиг. 14D, средство 324 переноса электронов иммобилизовано на рабочем электроде 320. В некоторых вариантах осуществления средство 324 переноса электронов и аналит–специфический фермент 323 иммобилизуют на рабочем электроде 320 любыми подходящими способами. В некоторых вариантах осуществления средство переноса электронов и аналит–специфический фермент совместно иммобилизуют на рабочем электроде с использованием любого подходящего кросслинкера. В некоторых вариантах осуществления средство переноса электронов и аналит–специфический фермент совместно иммобилизуют с использованием химического кросслинкера, например, диглицидилового простого эфира полиэтиленгликоля (PEGDGE).
[00119] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения средство переноса электронов для использования в обнаружении с режимом накопления включает окислительно–восстановительное вещество, выбранное из осмия, рутения, железа или кобальта, связанных с полимером, выбранным из поливинилпиридина, политиофена, полианилина, полипиррола или полиацетилена. В некоторых вариантах осуществления средство переноса электронов является осмий (Os)–содержащим поливинилпиридиновым редокс–полимером формулы I.
Формула I
[00120] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения средство переноса электронов может являться органическим, металлорганическим или неорганическим. Примерами органических окислительно–восстановительных веществ являются хиноны и вещества, которые в своем окисленном состоянии имеют хиноидные структуры, такие как нильский голубой и индофенол. Некоторые хиноны и частично окисленные хингидроны реагируют с функциональными группами белков, такими как тиоловые группы цистеина, аминогруппы лизина и аргинина и феноловые группы тирозина, которые могут делать эти окислительно–восстановительные вещества неподходящими для некоторых из сенсоров по настоящему изобретению из–за наличия мешающих белков в содержащей аналит жидкости. Следует отметить, что большинство замещенных хинонов и молекул с хиноидной структурой менее способны реагировать с белками. В некоторых вариантах осуществления тетразамещенный хинон содержит атомы углерода в положениях 1, 2, 3 и 4.
[00121] Средства переноса электронов, подходящие для использования в способе обнаружения с режимом накопления по вариантам осуществления настоящего изобретения, имеют структуры или заряды, предотвращающие или существенно снижающие диффузионные потери средства переноса электронов в ходе периода времени, в течение которого анализируют образец. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения средство переноса электронов включает окислительно–восстановительное вещество, связанное с полимером, который можно иммобилизовать на чувствительном слое рабочего электрода. Связь между окислительно–восстановительным веществом и полимером может быть ковалентной, координационной или ионной. Пригодные средства переноса электронов и способы их получения описаны в патентах США №№ 5264104, 5356786, 5262035 и 5320725, полное содержание каждого из которых включено в настоящее описание по ссылке. Хотя с полимером можно связывать любые органические или металлорганические окислительно–восстановительные вещества и использовать их в качестве средства переноса электронов, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения медиатор электронного транспорта является соединением или комплексом переходного металла. В некоторых вариантах осуществления соединения или комплексы переходных металлов включают соединения или комплексы осмия, рутения, железа и кобальта. Следует понимать, что многие из медиаторов электронного транспорта, представленных в настоящем описании, также можно использовать, например, без полимерного компонента в качестве средств переноса электронов в жидкости–носителе или в чувствительном слое сенсора, причем утечка средства переноса электронов является приемлемой.
[00122] Один из типов невысвобождаемого полимерного средства переноса электронов включает окислительно–восстановительное вещество, ковалентно связанное в полимерной композиции. Примером этого типа медиатора является поливинилферроцен.
[00123] Другой тип невысвобождаемого средства переноса электронов содержит ионно–связанное окислительно–восстановительное вещество. Как правило, этот тип медиатора включает заряженный полимер, связанный с противоположно заряженным окислительно–восстановительным веществом. Примеры этого типа медиатора включают отрицательно заряженный полимер, такой как нафион (Dupont), связанный с положительно заряженным окислительно–восстановительным веществом, таким как связанный с осмием, рутением, железом или кобальтом полипиридиловый катион. Другим примером ионно–связанного медиатора является положительно заряженный полимер, такой как кватернизованный поли–4–винилпиридин или поли–1–винилимидазол, связанный с отрицательно заряженным окислительно–восстановительным веществом, такими как феррицианид или ферроцианид. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения связанное окислительно–восстановительное вещество является сильно заряженным окислительно–восстановительным веществом, связанным с противоположно заряженным редокс–полимером.
[00124] В другом варианте осуществления изобретения подходящие невысвобождаемые средства переноса электронов включают окислительно–восстановительное вещество, координационно связанное с полимером. Например, медиатор можно получать посредством координации комплекса осмий– или кобальт–содержащего 2,2'–бипиридила с поли–1–винилимидазолом или поли–4–винилпиридином.
[00125] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения средства переноса электронов являются комплексами переходного металла осмия с одним или более лигандами, причем каждый лиганд имеет азотсодержащий гетероцикл, такой как 2,2'–бипиридин, 1,10–фенантролин или их производные. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления средства переноса электронов имеют один или более лигандов, ковалентно связанных в полимере, причем каждый лиганд имеет по меньшей мере один азотсодержащий гетероцикл, такой как пиридин, имидазол или их производные. Эти предпочтительные средства переноса электронов быстро обмениваются электронами между собой и с рабочим электродом, так что комплекс может быстро окисляться и восстанавливаться.
[00126] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения средство переноса электронов включает (a) полимер или сополимер, содержащий функциональные группы пиридина или имидазола, и (b) катионы осмия, комплексированные с двумя лигандами, причем каждый лиганд содержит 2,2'–бипиридин, 1,10–фенантролин или их производные, при этом два лиганда не обязательно являются одинаковыми. В некоторых вариантах осуществления производными 2,2'–бипиридина для комплексирования с катионом осмия являются 4,4'–диметил–2,2'–бипиридин и моно–, ди– и полиалкокси–2,2'–бипиридины, такие как 4,4'–диметокси–2,2'–бипиридин. В некоторых вариантах осуществления производными 1,10–фенантролина для комплексирования с катионом осмия являются 4,7–диметил–1,10–фенантролин и моно–, ди– и полиалкокси–1,10–фенантролины, такие как 4,7–диметокси–1,10–фенантролин. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения полимеры для комплексирования с катионом осмия включают полимеры и сополимеры поли–1–винилимидазола (обозначаемые как "PVI") и поли–4–винилпиридина (обозначаемые как "PVP"). Подходящие заместители для сополимера поли–1–винилимидазола включают акрилонитрил, акриламид и замещенный или кватернизованный N–винилимидазол. В некоторых вариантах осуществления средства переноса электронов включают осмий, комплексированный с полимером или сополимером поли–1–винилимидазола.
[00127] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения средства переноса электронов имеют окислительно–восстановительный потенциал (напряжение) в диапазоне от –100 мВ до примерно +150 мВ относительно нормального каломельного электрода (НКЭ). Более конкретно, потенциал (напряжение) средства переноса электронов находится в диапазоне от –100 мВ до +150 мВ. В некоторых вариантах осуществления потенциал (напряжение) находится в диапазоне от –50 мВ до +50 мВ. В других вариантах осуществления настоящего изобретения средства переноса электронов имеют окислительно–восстановительные центры осмия, рутения, железа или кобальта и окислительно–восстановительный потенциал (напряжение) в диапазоне от +50 мВ до –150 мВ относительно НКЭ.
Примеры аналит–специфического фермента
[00128] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения аналит–специфический фермент наносят (например, иммобилизуют) на рабочий электрод для катализа окисления аналита, подлежащего измерению. В рамках изобретения аналит–специфический фермент может также называться аналит–окисляющим ферментом. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения аналит–специфический фермент выбран из глюкозооксидазы, NAD–глюкозодегидрогеназы и FAD–глюкозодегидрогеназы для окисления глюкозы. В некоторых вариантах осуществления аналит–специфический фермент является лактатоксидазой или NAD–лактатдегидрогеназой для окисления лактата. В некоторых вариантах осуществления аналит–специфический фермент является NAD–3–гидроксибутиратдегидрогеназой для окисления 3–гидроксибутирата. В некоторых вариантах осуществления аналит–специфический фермент является 11β–гидроксистероиддегидрогеназой типа 2 для окисления кортизола. В некоторых вариантах осуществления аналит–специфический фермент является NAD–алкогольдегидрогеназой для окисления спирта. В некоторых вариантах осуществления аналит–специфический фермент является пируватоксидазой для окисления пирувата. В некоторых вариантах осуществления аналит–специфический фермент является NAD–глутаматдегидрогеназой для окисления глутамата. В некоторых вариантах осуществления аналит–специфический фермент является ксантиноксидазой для окисления теофиллина.
[00129] Как будет понятно специалисту в этой области техники, любой фермент никотинамидадениндинуклеотид (NAD)– или флавиноксидазу можно присоединять к или иммобилизовать на чувствительном слое рабочего электрода для окисления соответствующего субстрата–аналита.
[00130] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения примеры NAD–зависимых ферментов включают (–)–борнеолдегидрогеназу, (+)–борнеолдегидрогеназу, (+)–сабинолдегидрогеназу, (+)–транс–карвеолдегидрогеназу, (3S,4R)–3,4–дигидроксициклогекса–1,5–диен–1,4–дикарбоксилатдегидрогеназу, (R,R)–бутандиолдегидрогеназу, дегидрогеназу (R)–2–гидроксижирных кислот, дегидрогеназу (R)–2–гидроксикислот, (R)–4–гидроксифениллактатдегидрогеназу, (R)–аминопропанолдегидрогеназу, (R)–дегидропантоатдегидрогеназу, (S,S)–бутандиолдегидрогеназу, дегидрогеназу (S)–2–гидрокси–жирных кислот, (S)–карнитин–3–дегидрогеназу, (S)–уснинатредуктазу, 1,2–дигидрокси–6–метилциклогекса–3,5–диенкарбоксилатдегидрогеназу, 1,3–пропандиолдегидрогеназу, 1,6–дигидроксициклогекса–2,4–диен–1–карбоксилатдегидрогеназу, 2–(R)–гидроксипропил–КоМ–дегидрогеназу, 2–(S)–гидроксипропил–КоМ–дегидрогеназу, 2–алкенальредуктазу, 2–алкин–1–олдегидрогеназу, 2–аминобензолсульфонат–2,3–диоксигеназу, 2–хлорбензоат–1,2–диоксигеназу, 2–кумаратредуктазу, 2–дегидро–3–дезокси–D–глюконат–5–дегидрогеназу, 2–дезокси–D–глюконат–3–дегидрогеназу, 2–еноатредуктазу, 2–гидрокси–1,4–бензохинонредуктазу, 2–гидрокси–3–оксопропионатредуктазу, 2–гидроксибифенил–3–монооксигеназу, 2–гидроксиметилглутаратдегидрогеназу, 2–гидроксихинолин–5,6–диоксигеназу, 2–гидроксихинолин–8–монооксигеназу, 2–оксоадипатредуктазу, 2–оксоальдегиддегидрогеназу (NAD+), 2–оксоизовалератдегидрогеназу (ацилирующую), 2,3–дигидро–2,3–дигидроксибензоатдегидрогеназу, 2,3–дигидрокси–2,3–дигидро–p–куматдегидрогеназу, 2,4–диаминопентаноатдегидрогеназу, 2,6–дигидроксипиридин–3–монооксигеназу, 2'–фосфотрансферазу, 3–(имидазол–5–ил)лактатдегидрогеназу, 3"–дезамино–3"–оксоникотинаминредуктазу, 3–дегидро–L–гулонат–2–дегидрогеназу, 3–гидрокси–2–метилбутирил–КоА–дегидрогеназу, 3–гидрокси–2–метилпиридинкарбоксилатдиоксигеназу, 3–гидроксиацил–КоА–дегидрогеназу, 3–гидроксибензоат–6–монооксигеназу, 3–гидроксибутиратдегидрогеназу, 3–гидроксиизобутиратдегидрогеназу, 3–гидроксифенилацетат–6–гидроксилазу, 3–гидроксипимелоил–КоА–дегидрогеназу, 3–гидроксипропионатдегидрогеназу, 3–метилбутанальредуктазу, 3–оксоацил–(ацил–переносящий белок)–редуктазу (NADH), 3–фенилпропаноатдиоксигеназу, 3(или 17)a–гидроксистероиддегидрогеназу, 3альфа–гидрокси–5бета–андростан–17–он–3альфа–дегидрогеназу, 3альфа–гидроксихоланатдегидрогеназу, 3альфа–гидроксистероиддегидрогеназу (A–специфическкую), 3альфа–гидроксистероиддегидрогеназу (B–специфическую), 3альфа,7альфа,12альфа–тригидроксихолестан–26–аль–26–оксидоредуктазу, 3альфа(17бета)–гидроксистероиддегидрогеназу (NAD+), 3альфа(или 20бета)–гидроксистероиддегидрогеназу, 3β–гидроксистероиддегидрогеназу, 4–(гидроксиметил)бензолсульфонатдегидрогеназу, 4–аминобензоат–1–монооксигеназу, 4–хлорфенилацетат–3,4–диоксигеназу, 4–формилбензолсульфонатдегидрогеназу, 4–гидрокси–тетрагидродипиколинатредуктазу, 4–гидроксибензальдегиддегидрогеназу, 4–гидроксибензоат–1–гидроксилазу, 4–гидроксибензоат–3–монооксигеназу (NAD(P)H), 4–гидроксибутиратдегидрогеназу, 4–гидроксициклогексанкарбоксилатдегидрогеназу, дегидрогеназу 4–гидроксимуконового полуальдегида, 4–гидроксифенилацетальдегиддегидрогеназу, 4–гидроксифенилацетат–1–монооксигеназу, 4–гидроксихинолин–3–монооксигеназу, 4–гидрокситреонин–4–фосфатдегидрогеназу, 4–нитрофенол–2–монооксигеназу, 4–оксопролинредуктазу, 4–фосфоэритронатдегидрогеназу, 4–сульфобензоат–3,4–диоксигеназу, 4–триметиламмониобутиральдегиддегидрогеназу, дегидрогеназу 5–карбоксиметил–2–гидроксимуконового полуальдегида, 5,6–дигидрокси–3–метил–2–оксо–1,2,5,6–тетрагидрохинолиндегидрогеназу, 6–эндо–гидроксицинеолдегидрогеназу, 6–гидроксигексаноатдегидрогеназу, 6,7–дигидроптеридинредуктазу, 7–альфа–гидроксистероиддегидрогеназу, 15–гидроксиикосатетраеноатдегидрогеназу, 15–гидроксипростагландиндегидрогеназу (NAD+), 15–оксопростагландин–13–оксидазу, 16–альфа–гидроксистероиддегидрогеназу, 17β–гидроксистероиддегидрогеназу, 20–альфа–гидроксистероиддегидрогеназу, 21–гидроксистероиддегидрогеназу (NAD+), ADP–глицероманно–гептозо–6–эпимеразу, аланиндегидрогеназу, аланопиндегидрогеназу, алкогольдегидрогеназу, алкогольдегидрогеназу (NAD(P)+), альдегиддегидрогеназу (NAD(P)+), альдегиддегидрогеназу (NAD+), альдозо–1–дегидрогеназу, алкенмонооксигеназу, альфа–сантонин–1,2–редуктазу, аминобутиральдегиддегидрогеназу, дегидрогеназу аминомуконового полуальдегида, антоцианидинредуктазу, антранилат–1,2–диоксигеназу (дезаминирующую, декарбоксилирующую), антранилоил–КоА–монооксигеназу, апиозо–1–редуктазу, аквакобаламинредуктазу, арогенатдегидрогеназу, арогенатдегидрогеназу (NAD(P)+), арил–алкогольдегидрогеназу, арил–альдегиддегидрогеназу, аспарагусатредуктазу, аспартатдегидрогеназу, АТФ–зависимую NAD(P)H–гидратдегидратазу, бензальдегиддегидрогеназу (NAD+), бензол–1,2–диоксигеназу, бензоат–1,2–диоксигеназу, бета–аланопиндегидрогеназу, бетаин–альдегиддегидрогеназу, бифенил–2,3–диоксигеназу, бутанальдегидрогеназу, карнитин–3–дегидрогеназу, CDP–4–дегидро–6–дезоксиглюкозоредуктазу, CDP–глюкозо–4,6–дегидратазу, CDP–паратозо–2–эпимеразу, холест–5–ен–3бета,7альфа–диол–3бета–дегидрогеназу, холестантетраол–26–дегидрогеназу, цис–1,2–дигидро–1,2–дигидроксинафталиндегидрогеназу, цис–1,2–дигидробензол–1,2–диолдегидрогеназу, цис–1,2–дигидрокси–4–метилциклогекса–3,5–диен–1–карбоксилатдегидрогеназу, цис–2,3–дигидробифенил–2,3–диолдегидрогеназу, цис–3,4–дигидрофенантрен–3,4–диолдегидрогеназу, цис–дигидроэтилкатехолдегидрогеназу, КоА–дисульфидредуктазу, кобаламинредуктазу, кониферил–альдегиддегидрогеназу, кукурбитацин–дельта23–редуктазу, циклогексан–1,2–диолдегидрогеназу, циклогексанолдегидрогеназу, циклопентанолдегидрогеназу, цистинредуктазу, D–арабинитол–2–дегидрогеназу, D–арабинитол–4–дегидрогеназу, D–арабинозо–1–дегидрогеназу, D–арабинозо–1–дегидрогеназу (NAD(P)+), D–идитол–2–дегидрогеназу, D–малатдегидрогеназу (декарбоксилирующую), D–трео–альдозо–1–дегидрогеназу, D–ксилозо–1–дегидрогеназу, D–ксилулозоредуктазу, дибензотиофендигидродиолдегидрогеназу, редуктазу дижелезистого трансферрина, дигидроурацилдегидрогеназу (NAD+), дийодофенилпируватредуктазу, диметилмалатдегидрогеназу, DTDP–глюкозо–4,6–дегидратазу, эфедриндегидрогеназу, эритрозо–4–фосфатдегидрогеназу, эстрадиол–17альфа–дегидрогеназу, эстрадиол–17бета–дегидрогеназу, ацил–КоА–синтазу жирных кислот, ферредоксин–NAD(+)–редуктазу, редуктазу хелата оксида железа (III), флуорен–9–олдегидрогеназу, фторацетальдегиддегидрогеназу, FMN–редуктазу, формальдегиддегидрогеназу, фруктуронатредуктазу, фумаратредуктазу (NADH), фурилфурамидизомеразу, галактитол–2–дегидрогеназу, галактитол–1–фосфат–5–дегидрогеназу, галактозо–1–дегидрогеназу, гамма–гуанидинобутиральдегиддегидрогеназу, ГДФ–4–дегидро–6–дезокси–D–маннозоредуктазу, ГДФ–4–дегидро–D–рамнозоредуктазу, ГДФ–6–дезокси–D–талозо–4–дегидрогеназу, ГДФ–маннозо–4,6–дегидратазу, ГДФ–маннозо–6–дегидрогеназу, глюконат–5–дегидрогеназу, глюкозо–1–дегидрогеназу, глюкозо–1–дегидрогеназу (NAD+), глутаматсинтазу (NADH), глутарат–полуальдегиддегидрогеназу, глицеральдегид–3–фосфатдегидрогеназу (NAD(P)+), глицеральдегид–3–фосфатдегидрогеназу (фосфорилирующую), глицератдегидрогеназу, глицериндегидрогеназу, глицерин–3–фосфатдегидрогеназу (NAD(P)+), глицерин–3–фосфатдегидрогеназу (NAD+), систему расщепления глицина, глициндегидрогеназу, дегидрогеназу гликолевого альдегида, глиоксилатредуктазу, гексадеканальдегидрогеназу (ацилирующую), гексадеканолдегидрогеназу, гистидинолдегидрогеназу, гомоизоцитратдегидрогеназу, гомосериндегидрогеназу, водородную дегидрогеназу, гидроксициклогексанкарбоксилатдегидрогеназу, гидроксиламинредуктазу (NADH), гидроксималонатдегидрогеназу, гидроксиметилглутарил–КоА–редуктазу, гидроксифенилпируватредуктазу, гидроксипируватредуктазу, гипонитритредуктазу, гипотауриндегидрогеназу, икосаноил–КоА–синтазу, имидазолацетат–4–монооксигеназу, IMP–дегидрогеназу, инданолдегидрогеназу, индол–3–ацетальдегидредуктазу (NADH), индоллактатдегидрогеназу, инозитол–2–дегидрогеназу, инозитол–3–фосфатсинтетазу, изоцитратдегидрогеназу, изопиперитенолдегидрогеназу, кинуренат–7,8–дигидродиолдегидрогеназу, дегидрогеназу L–аминокислот, L–аминоадипат–полуальдегиддегидрогеназу, L–арабинитол–2–дегидрогеназу, L–арабинитол–4–дегидрогеназу, L–арабинозо–1–дегидрогеназу, L–эритро–3,5–диаминогексаноатдегидрогеназу, L–гликольдегидрогеназу, L–гулонат–3–дегидрогеназу, L–идитол–2–дегидрогеназу, L–идонат–5–дегидрогеназу, L–рамнозо–1–дегидрогеназу, L–треонат–3–дегидрогеназу, L–треонин–3–дегидрогеназу, лактальдегиддегидрогеназу, лактальдегидредуктазу, латостериноксидазу, леггемоглобинредуктазу, лейциндегидрогеназу, дегидрогеназу жирных спиртов, лизиндегидрогеназу, малатдегидрогеназу (декарбоксилирующую), малатдегидрогеназу (оксалоацетат–декарбоксилирующую), малеилацетатредуктазу, малонат–полуальдегиддегидрогеназу, малонат–полуальдегиддегидрогеназу (ацетилирующую), маннит–2–дегидрогеназу, маннитдегидрогеназу, маннит–1–фосфат–5–дегидрогеназу, маннуронатредуктазу, мелилотат–3–монооксигеназу, мезо–тартратдегидрогеназу, метанолдегидрогеназу, метилентетрагидрофолатдегидрогеназу (NAD+), метилглиоксальредуктазу (NADH–зависимую), метилмалонат–полуальдегиддегидрогеназу (ацилирующую), мевалдатредуктазу, монодегидроаскорбатредуктазу (NADH), морфин–6–дегидрогеназу, микотиол–зависимую формальдегиддегидрогеназу, микотионредуктазу, миристоил–КоА–11–(E)–десатуразу, миристоил–КоА–11–(Z) десатуразу, N–ацетилгексозамин–1–дегидрогеназу, N–ацилманнозамин–1–дегидрогеназу, N–гидрокси–2–ацетамидофлуоренредуктазу, NAD(+)–редуктазу динитрогеназы, АДФ–D–рибозилтрансферазу, NAD(+)–дифтамид–АДФ–рибозилтрансферазу, NAD(P)(+)–аргинин–АДФ–рибозилтрансферазу, NAD(P)+–нуклеозидазу, NAD(P)+–трансгидрогеназу (Re/Si–специфическую), NAD(P)+–трансгидрогеназу (Si–специфическую), NAD(P)H–дегидрогеназу (хинон 1), NAD(P)H–дегидрогеназу (хинон), NAD–дифосфатазу, NAD+–нуклеозидазу, NAD+–синтазу, NAD+–синтазу (глутамин–гидролизующую), NADH–дегидрогеназу (хинон), NADH–пероксидазу, нафталин–1,2–диоксигеназу, никотинамид–нуклеотид–аденилилтрансферазу, диоксигеназу оксида азота, нитритредуктазу (NAD(P)H), нитрохинолин–N–оксидредуктазу, октанолдегидрогеназу, омега–гидроксидеканоатдегидрогеназу, опиндегидрогеназу, орсин–2–монооксигеназу, орнитинциклодезаминазу, оротатредуктазу (NADH), оксалогликолятредуктазу (декарбоксилирующую), пантоат–4–дегидрогеназу, периллил–алкогольдегидрогеназу, фенилацетальдегиддегидрогеназу, фенилаланиндегидрогеназу, фенилглиоксилатдегидрогеназу (ацилирующую), фосфатидилхолин–12–монооксигеназу, фосфатидилхолиндесатуразу, фосфоглюконат–2–дегидрогеназу, фосфоглицератдегидрогеназу, фосфонатдегидрогеназу, фталат–4,5–цис–дигидродиолдегидрогеназу, фталат–4,5–диоксигеназу, пимелоил–КоА–дегидрогеназу, прекоррин–2–дегидрогеназу, прекоррин–3B–синтазу, префенатдегидрогеназу, пропандиолфосфатдегидрогеназу, протеиндисульфидредуктазу, пиридоксаль–4–дегидрогеназу, пирролин–2–карбоксилатредуктазу, пирролин–5–карбоксилатредуктазу, хинатдегидрогеназу, ретинальдегидрогеназу, ретинолдегидрогеназу, рибитол–2–дегидрогеназу, рибитол–5–фосфат–2–дегидрогеназу, рубредоксин–NAD(+)–редуктазу, рубредоксин–NAD(P)(+)–редуктазу, S–(гидроксиметил)глутатиондегидрогеназу, сахаропиндегидрогеназу (NAD+, L–глутамат–образующую), сахаропиндегидрогеназу (NAD+, L–лизин–образующую), салицилальдегиддегидрогеназу, салицилат–1–монооксигеназу, секвойитолдегидрогеназу, серин–2–дегидрогеназу, sn–глицерин–1–фосфатдегидрогеназу, сорбит–6–фосфат–2–дегидрогеназу, стероид–17альфа–монооксигеназу, стерол–4альфа–карбоксилат–3–дегидрогеназу (декарбоксилирующую), стромбиндегидрогеназу, сукцинат–полуальдегиддегидрогеназу, сукцинат–полуальдегиддегидрогеназу (NAD(P)+), сукцинилглутамат–полуальдегиддегидрогеназу, сулкатонредуктазу, тагатуронатредуктазу, тартратдегидрогеназу, тауропиндегидрогеназу, таксифолин–8–монооксигеназу, терефталат–1,2–цис–дигидродиолдегидрогеназу, терефталат–1,2–диоксигеназу, тестостерон–17бета–дегидрогеназу, тетрагидроксиптеридинциклоизомеразу, тиоморфолин–карбоксилатдегидрогеназу, TM0436, толуолдиоксигеназу, транс–2–еноил–КоА–редуктазу (NAD+), триметиламин–N–оксидредуктазу, триптофандегидрогеназу, УДФ–глюкозо–4–эпимеразу, УДФ–глюкозо–6–дегидрогеназу, УДФ–глюкуронат–5'–эпимеразу, УДФ–глюкуронатдекарбоксилазу, УДФ–N–ацетилглюкозамин–6–дегидрогеназу, уреидогликолятдегидрогеназу, уронатдегидрогеназу, ванилатмонооксигеназу, ванилиндегидрогеназу, вомифолиолдегидрогеназу, ксантиндегидрогеназу, ксантомматинредуктазу или ксантоксиндегидрогеназу.
[00131] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения аналит–специфический фермент включает флавиноксидазу, такую как флавинадениндинуклеотид (FAD)–зависимую или флавинмононуклеотид (FMN)–зависимую оксидазу. Примеры FAD–зависимой или FMN–зависимой оксидазы включают: (R)–6–гидроксиникотиноксидазу, оксидазу (S)–2–гидроксикислот, (S)–6–гидроксиникотиноксидазу, 2–еноатредуктазу, редуктазу 2–метил–разветвленного еноил–КоА, 2–нитропропандиоксигеназу, 2,4–дихлорфенол–6–монооксигеназу, 2,6–дигидроксипиридин–3–монооксигеназу, 3–аци–нитропропаноатоксидазу, 3–гидрокси–2–метилпиридинкарбоксилатдиоксигеназу, 3–гидроксибензоат–4–монооксигеназу, 3–гидроксибензоат–6–монооксигеназу, 3–гидроксифенилацетат–6–гидроксилазу, 4–аминобензоат–1–монооксигеназу, 4–крезолдегидрогеназу (гидроксилирующую), 4–гидроксибензоат–1–гидроксилазу, 4–гидроксибензоат–3–монооксигеназу, 4–гидроксибензоат–3–монооксигеназу (NAD(P)H), 4–гидроксиманделатоксидазу, 4–гидроксифенилацетат–1–монооксигеназу, 4–гидроксифенилацетат–3–монооксигеназу, 4–нитрофенол–2–монооксигеназу, 4–сульфобензоат–3,4–диоксигеназу, 5–пиридоксатдиоксигеназу, ацил–КоА–оксидазу, аденилил–сульфатредуктазу, альбендазолмонооксигеназу, алкогольоксидазу, антранилоил–КоА–монооксигеназу, аквакобаламинредуктазу, аквакобаламинредуктазу (NADPH), аргинин–2–монооксигеназу, бензол–1,2–диоксигеназу, бензоат–1,2–диоксигеназу, бета–циклопиазонатдегидрогеназу, целлобиозодегидрогеназу (акцептор), холиноксидазу, КоА–глутатионредуктазу, кобаламинредуктазу, цианокобаламинредуктазу (удаляющую цианид), циклогексиламиноксидазу, дегидрогеназу D–2–гидроксикислот, оксидазу D–аминокислот, D–арабиноно–1,4–лактоноксидазу, D–аспартатоксидазу, D–глутамат(D–аспартат)оксидазу, D–лактатдегидрогеназу (цитохром), D–сорбитдегидрогеназу (акцептор), дегидроглюконатдегидрогеназу, дезоксирибодипиримидинфотолиазу, дигидроурацилоксидазу, диметиламиндегидрогеназу, диметилглициндегидрогеназу, диметилглициноксидазу, ферредоксин–NADP(+)–редуктазу, глюконат–2–дегидрогеназу (акцептор), глюкозодегидрогеназу (акцептор), глюкозид–3–дегидрогеназу, глутаматсинтазу (ферредоксин), глутаматсинтазу (NADH), глутаматсинтазу (NADPH), глутатионоксидазу, глицерин–3–фосфатоксидазу, водородную дегидрогеназу, гидроксиламинредуктазу, имидазолацетат–4–монооксигеназу, индол–2,3–диоксигеназу, индол–3–ацетальдегидоксидазу, изовалерил–КоА–дегидрогеназу, кинуренин–3–монооксигеназу, оксидазу L–аминокислот, L–аспартатоксидазу, L–галактонолактоноксидазу, L–глутаматоксидазу, L–лактатдегидрогеназу (цитохром), лактат–2–монооксигеназу, латостериноксидазу, монооксигеназу люциферина латии (деметилирующую), дегидрогеназу длинноцепочечного ацил–КоА, лизин–2–монооксигеназу, малатдегидрогеназу (хинон), малатоксидазу, манделонитриллиазу, мелилотат–3–монооксигеназу, оксидазу N–метил–L–аминокислот, NAD(P)+–трансгидрогеназу (Si–специфическую), NAD(P)H–дегидрогеназу (хинон 1), NAD(P)H–дегидрогеназу (хинон), NADH–пероксидазу, NADPH–дегидрогеназу, NADPH–дегидрогеназу (хинон), NADPH–цитохром–c2–редуктазу, NADPH–гемопротеинредуктазу, никотинатдегидрогеназу, никотиндегидрогеназу, нитрилредуктазу (NAD(P)H), нитритредуктазу (NO–образующую), орсин–2–монооксигеназу, оротатредуктазу (NADH), оротатредуктазу (NADPH), оксалатоксидазу, фенол–2–монооксигеназу, фенилглиоксилатдегидрогеназу (ацилирующую), фталат–4,5–диоксигеназу, полиаминоксидазу, пролиндегидрогеназу, путресциноксидазу, пиранозооксидазу, пиридоксин–4–оксидазу, пиридоксин–5–дегидрогеназу, пируватдегидрогеназу (цитохром), пируватоксидазу, пируватоксидазу (КоА–ацетилирующую), ретинальдегидрогеназу, рубредоксин–NAD(+)–редуктазу, салицилат–1–монооксигеназу, саркозиндегидрогеназу, дегидрогеназу короткоцепочечного ацил–КоА, спермидиндегидрогеназу, стероид–9альфа–монооксигеназу, тартронат–полуальдегидсинтазу, таксифолин–8–монооксигеназу, тиаминоксидазу, трипанотион–дисульфидредуктазу, УДФ–N–ацетилмураматдегидрогеназу или ванилилалкогольоксидазу.
Мембрана сенсора
[00132] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, как показано на фиг. 13 и 14B–14D, сенсор 500 или часть сенсора 500 включает внешнюю мембрану 520 или 335, покрывающую по меньшей мере рабочий электрод 501 или 320 и чувствительный элемент 322 или чувствительный участок 509. Электрохимические сенсоры зачастую покрыты внешней мембраной 520 или 335 (например, полимерной мембраной) для обеспечения стабильности чувствительных реагентов (например, аналит–специфического фермента 323 и медиатора 324 электронного транспорта), а также обеспечения ограничения массообмена, биосовместимости и/или предотвращения загрязнения электрода.
in vivo
[00133] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения мембрана состоит из двух компонентов: гидрофильного полимера и кросслинкера. Кросслинкер связывает молекулы полимера друг с другом и заякоривает их в чувствительном слое сенсора. В случае аналитов, таких как глюкоза, обнаруживаемых  в концентрациях примерно 5 мМ, ограничивающая поток мембрана необходима для предотвращения загрязнения электрода. Примеры ограничивающих поток мембран сенсоров описаны, например, в патенте США № 6932894 на имя Mao et al., полное содержание которого включено в настоящее описание по ссылке.
[00134] В случае аналитов в более низких концентрациях ограничивающую поток мембрану можно использовать с увеличенным временем накопления, например, до 30 минут. Альтернативно, в случае аналитов в более низких концентрациях можно использовать высокопроницаемую мембрану для поддержания естественного потока аналита к чувствительному слою, а также мембрану для повышения биосовместимости сенсора. Например, поверхность гидрофильной мембраны не провоцирует иммунную систему организма, тем самым снижая риск воспаления и других ответов, которые могут отрицательно сказываться на работе сенсора.
Системы мониторинга аналита
in vivo
[00135] Соответственно, варианты осуществления включают устройства и системы мониторинга аналита, включающие сенсор аналита, по меньшей мере часть которого позиционируется под поверхностью кожи пользователя для детекции  аналита в физиологической жидкости. Системы мониторинга аналита описаны в Say et al. (патент США № 6134461) и Hoss et al. (публикации заявки на патент США № 2012/0150005), полное содержание которых включено в настоящее описание по ссылке. Варианты осуществления настоящего изобретения включают полностью имплантируемые сенсоры аналита и сенсоры аналита, в которых только часть сенсора располагается под кожей, а часть сенсора остается над кожей, например, для контакта с управляющим сенсором устройством (которое может включать передатчик), приемником/блоком индикации, приемопередатчиком, процессором и т.д. Сенсор, например, можно располагать под кожей пользователя для непрерывного или периодического мониторинга уровня аналита в интерстициальной жидкости пользователя. В целях данного описания непрерывный мониторинг и периодический мониторинг будут использоваться взаимозаменяемо, если не указано иное. Отклик сенсора может быть скоррелирован с и/или преобразован в уровни аналита в крови или других жидкостях. В некоторых вариантах осуществления сенсор аналита может быть расположен в контакте с интерстициальной жидкостью для детекции уровня аналита, который можно использовать для определения уровня аналита в кровотоке пользователя. Сенсоры аналита можно вводить в вену, артерию или другую часть тела, содержащую жидкость. В некоторых вариантах осуществления сенсоры аналита могут быть предназначены для мониторинга уровня аналита за период времени, который может составлять в диапазоне от секунд, минут, часов, дней и недель до месяцев или дольше.
in vivo
0
[00136] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения сенсоры аналита способны на  детекцию аналита в течение одного часа или более, например, нескольких часов или более, например, нескольких дней или более, например, трех или более дней, например, пяти дней или более, например, семи дней или более, например, нескольких недель или более или одного месяца или более. На основе полученной информации можно прогнозировать будущие уровни аналита, например, текущий уровень аналита в момент времени t, скорость изменения аналита и т.д. Прогнозная сигнализация может уведомлять пользователя о прогностическом уровне аналита, который может представлять интерес заранее, до того как уровень аналита у пользователя достигнет будущего спрогнозированного уровня аналита. Это дает пользователю возможность принять меры по его коррекции.
[00137] На фиг. 15 показана система мониторинга и управления данными, такая как, например, система 400 мониторинга аналита в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения. Аспекты вариантов осуществления настоящего изобретения описаны далее исключительно для удобства, главным образом, в отношении устройств и систем мониторинга глюкозы и способов детекции глюкозы, и такое описание никоим образом не предназначено для ограничения объема вариантов осуществления. Следует понимать, что система мониторинга аналита может быть предназначена для мониторинга множества различных аналитов, как представлено в настоящем описании, одновременно или в разное время.
[00138] Аналиты, которые можно подвергать мониторингу, включают, в качестве неограничивающих примеров, глюкозу, лактат, 3–гидроксибутират, кортизол, спирт, пируват, глутамат, теофиллин, ацетилхолин, амилазу, билирубин, холестерин, хорионический гонадотропин, гликозилированный гемоглобин (HbA1c), креатинкиназу (например, CK–MB), креатин, креатинин, ДНК, фруктозамин, производные глюкозы, глутамин, гормоны роста, гормоны, 3–гидроксибутират, кетоны, кетоновые тела, пероксид, простатспецифический антиген, протромбин, РНК, тиреотропный гормон и тропонин. Аналиты также включают лекарственные средства, такие как, например, антибиотики (например, гентамицин, ванкомицин и т.п.), дигитоксин, дигоксин, лекарственные средства, вызывающие зависимость, теофиллин и варфарин, которые также можно подвергать мониторингу. В некоторых вариантах осуществления мониторингу подвергают несколько аналитов, и аналиты можно подвергать мониторингу одновременно или в разное время.
[00139] Система 400 мониторинга аналита включает сенсор 401 аналита, блок 402 обработки данных, который можно соединять с сенсором 401, и первичный приемный блок 404. В некоторых случаях первичный приемный блок 404 выполнен с возможностью связи с блоком 402 обработки данных по линии 403 связи. В некоторых вариантах осуществления первичный приемный блок 404 может быть дополнительно выполнен с возможностью передачи данных в терминал 405 обработки данных для оценки или иной обработки, или форматирования данных, принятых первичным приемным блоком 404. Терминал 405 обработки данных может быть выполнен с возможностью приема данных напрямую из блока 402 обработки данных по линии 407 связи, которая, необязательно, может быть выполнена с возможностью двухсторонней связи. Кроме того, блок 402 обработки данных может включать передатчик или приемопередатчик для передачи и/или приема данных в и/или из первичного приемного блока 404, и/или терминала 405 обработки данных, и/или, необязательно, вторичного приемного блока 406.
[00140] На фиг. 15 также показан необязательный вторичный приемный блок 406, функционально связанный с линией 403 связи и выполненный с возможностью приема данных, передаваемых из блока 402 обработки данных. Вторичный приемный блок 406 может быть выполнен с возможностью связи с первичным приемным блоком 404, а также терминалом 405 обработки данных. В некоторых вариантах осуществления вторичный приемный блок 406 может быть выполнен с возможностью двухсторонней беспроводной связи с каждым из первичного приемного блока 404 и терминала 405 обработки данных. Как подробно обсуждается ниже, в некоторых случаях вторичный приемный блок 406 может быть приемником со сниженной функциональностью по сравнению с первичным приемным блоком 404, например, вторичный приемный блок 406 может иметь ограниченное или минимальное количество функций и характеристик по сравнению с первичным приемным блоком 404. По сути, вторичный приемный блок 406 может включать меньший (по одному или более, включая все, размерам), компактный корпус или может быть встроен в устройство, включая, например, наручные часы, нарукавную повязку, карманный персональный компьютер (КПК или PDA), mp3–плеер, сотовый телефон и т.д. Альтернативно, вторичный приемный блок 406 может быть выполнен с теми же или по существу аналогичными функциями и характеристиками, что и первичный приемный блок 404. Вторичный приемный блок 406 может включать включают разъем, выполненный с возможностью сопряжения с блоком док–станции для размещения, например, у постели для ночного мониторинга, и/или устройством двухсторонней связи. С помощью док–станции можно перезаряжать источник электропитания.
[00141] В варианте осуществления системы 400 мониторинга аналита, изображенной на фиг. 15, показаны только один сенсор 401 аналита, блок 402 обработки данных и терминал 405 обработки данных. Однако специалисту в этой области техники будет понятно, что система 400 мониторинга аналита может включать более чем один сенсор 401 и/или более чем один блок 402 обработки данных, и/или более чем один терминал 405 обработки данных. Можно размещать множественные сенсоры в пользователе для мониторинга аналита одновременно или в разное время. В некоторых вариантах осуществления информацию об аналите, полученную с помощью первого сенсора, расположенного в пользователе, можно использовать для сравнения с информацией об аналите, полученной с помощью второго сенсора. Это можно использовать для подтверждения или валидации информации об аналите, полученной с помощью одного или обоих сенсоров. Такая избыточность может быть полезной, если информация об аналите предусмотрена учитываться при принятии критических решений, касающихся терапии. В некоторых вариантах осуществления первый сенсор можно использовать для калибровки второго сенсора.
[00142] Система 400 мониторинга аналита может являться системой непрерывного мониторинга или системой полунепрерывного или дискретного мониторинга. В многокомпонентной среде каждый компонент может быть выполнен уникально идентифицируемым одним или более из других компонентов в системе, так что легко можно разрешить конфликт связи между различными компонентами в системе 400 мониторинга аналита. Например, можно использовать уникальные ID, каналы связи и т.п.
[00143] В некоторых вариантах осуществления сенсор 401 физически располагают в теле или на теле пользователя, уровень аналита у которого подвергают мониторингу. Сенсор 401 может быть выполнен с возможностью по меньшей мере периодических замеров уровня аналита у пользователя и преобразования замеренного уровня аналита в соответствующий сигнал для передачи блоком 402 обработки данных. Блок 402 обработки данных способен сопрягаться с сенсором 401 так, что оба устройства располагают в или на теле пользователя, с по меньшей мере частью сенсора 401 аналита, располагающейся чрескожно. Блок обработки данных может включать фиксирующий элемент, такой как адгезив или т.п., для его закрепления на теле пользователя. Можно использовать крепление, закрепляемое на пользователе и подходящее для блока 402 обработки данных. Например, крепление может включать адгезивную поверхность. Блок 402 обработки данных выполняет функции обработки данных, причем такие функции могут включать, но не ограничиваясь ими, фильтрование и кодирование сигналов данных, каждый из которых соответствует замеренному уровню аналита у пользователя, для передачи в первичный приемный блок 404 по линии 403 связи. В некоторых вариантах осуществления сенсор 401 или блок 402 обработки данных, или комбинированный сенсор/блок обработки данных можно полностью имплантировать под поверхность кожи пользователя.
[00144] В некоторых вариантах осуществления первичный приемный блок 404 может включать в себя модуль аналогового интерфейса, включающий в себя радиочастотный (РЧ) приемник и антенну, выполненную с возможностью связи с блоком 402 обработки данных по линии 403 связи, и модуль обработки данных для обработки данных, принятых из блока 402 обработки данных, включая декодирование данных, обнаружение и исправление ошибок, генерацию тактовых импульсов, восстановление битов данных и т.д., или любую их комбинацию.
[00145] При работе первичный приемный блок 404 в некоторых вариантах осуществления выполнен с возможностью синхронизации с блоком 402 обработки данных для уникальной идентификации блока 402 обработки данных, основанной, например, на идентификационной информации блока 402 обработки данных, а после этого с возможностью периодического приема сигналов, передаваемых из блока 402 обработки данных и связанных с контролируемыми уровнями аналита, обнаруженными сенсором 401.
TM
TM
[00146] Как показано на фиг. 15, терминал 405 обработки данных может включать персональный компьютер, портативный компьютер, включая ноутбук или переносное устройство (например, карманный персональный компьютер (PDA), телефон, включая сотовый телефон (например, мультимедийный мобильный телефон и мобильный телефон с выходом в интернет, включая iPhone, Blackberry или схожий телефон), mp3–плеер (например, iPOD и т.д.), пейджер и т.п.) и/или устройство для введения лекарственного средства (например, инфузионное устройство), каждое из которых может быть предназначено для обмена данными с приемником посредством проводного или беспроводного соединения. Кроме того, терминал 405 обработки данных может быть дополнительно подключен к сети передачи данных (не показана) для хранения, извлечения, обновления и/или анализа данных, соответствующих детектируемому уровню аналита у пользователя.
[00147] Терминал 405 обработки данных может включать устройство для введения лекарственного средства (например, инфузионное устройство), такое как инсулиновая помпа или т.п., которое может быть выполнено с возможностью введения лекарственного средства (например, инсулина) пользователю и которое может быть выполнено с возможностью связи с первичным приемным блоком 404 для приема, помимо прочего, измеренного уровня аналита. Альтернативно, первичный приемный блок 404 может быть выполнен с возможностью встраивания в него инфузионного устройства так, что первичный приемный блок 404 выполнен с возможностью введения нужного лекарственного средства (например, инсулина) пользователям, например, для введения и модификации базальных профилей, а также для определения соответствующих болюсов для введения с учетом, помимо прочего, обнаруженных уровней аналита, принятых от блока 402 обработки данных. Инфузионное устройство может являться внешним устройством или внутренним устройством, таким как устройство, полностью имплантируемое пользователю.
[00148] В некоторых вариантах осуществления терминал 405 обработки данных, который может включать в себя инфузионное устройство, например, инсулиновую помпу, может быть выполнен с возможностью приема сигналов аналита от блока 402 обработки данных, и, таким образом, он имеет функции первичного приемного блока 404, включая обработку данных для регуляции инсулиновой терапии пользователя и мониторинга аналита. В некоторых вариантах осуществления в линии 403 связи, а также одном или более из других интерфейсов связи, показанных на фиг. 15, можно использовать один или более протоколов беспроводной связи, таких как, но не ограничиваясь ими: протокол радиочастотной связи, протокол связи в инфракрасном диапазоне, протокол связи по технологии Bluetooth, протокол беспроводной связи 802.11x или эквивалентный протокол беспроводной связи, который будет обеспечивать безопасную беспроводную связь нескольких блоков (например, в соответствии с Законом о преемственности и подотчетности медицинского страхования (HIPPA)), при этом позволяя избегать потенциального конфликта данных и помех.
[00149] В дополнительных вариантах осуществления блок 402 обработки данных и/или первичный приемный блок 404, и/или вторичный приемный блок 406, и/или терминал 405 обработки данных (инфузионное устройство) могут быть выполнены с возможностью приема значения аналита беспроводным образом по линии связи, например, от прибора измерения аналита в крови. В дополнительных вариантах осуществления пользователь, обращающийся с или использующий систему 400 мониторинга аналита (фиг. 15), может вручную вводить значение аналита с использованием, например, пользовательского интерфейса (например, клавиатуры, клавишной панели, голосовых команд и т.п.), встроенного в один или более из блока 402 обработки данных, первичного приемного блока 404, вторичного приемного блока 406 или терминала 405 обработки данных (инфузионного устройства).
in vivo,
in vivo
in vivo
[00150] Раскрытый здесь сенсор (например, ферментативный биосенсор) для измерения низких наномолярных концентраций аналита может применяться в системе мониторинга  которая при ее расположении  в организме пользователя (например, человека) контактирует с физиологической жидкостью пользователя и воспринимает уровни одного или более содержащихся в ней аналитов. Система мониторинга  может включать одно или более считывающих устройств, принимающих данные об обнаруженном аналите от управляющего сенсором устройства. Эти считывающие устройства могут обрабатывать и/или отображать пользователю данные об обнаруженном аналите или данные сенсора в любой из форм.
[00151] Со ссылкой на фиг. 16, в некоторых вариантах осуществления считывающее устройство 120 может быть мобильным устройством связи, таким как специальное считывающее устройство (выполненное с возможностью связи с управляющим сенсором устройством 102 (фиг. 17) и, необязательно, компьютерной системой, но без возможности мобильной телефонной связи), или мобильный телефон, включая, но не ограничиваясь ими, смартфон, планшет или карманный персональный компьютер (PDA) с возможностью связи через Wi–Fi или с выходом в интернет. Примеры смартфонов могут включать мобильные телефоны на основе операционной системы Windows, операционной системы Android™, операционной системы iPhone, Palm WebOS™, операционной системы Blackberry или операционной системы Symbian с функциональностью связи через сеть передачи данных для обмена данными через подключение к сети интернет и/или локальной сети (LAN).
[00152] Считывающее устройство 120 может быть также выполнено в виде мобильного интеллектуального портативного электронного прибора, такого как оптический прибор, носимый поверх или вблизи глаза пользователя (например, умное стекло или умные очки, такие как очки Google, являющиеся мобильным устройством связи). Этот оптический прибор может иметь прозрачный дисплей, отображающий пользователю информацию об имеющемся у него уровне аналита, в то же время позволяющий пользователю смотреть через дисплей, так что общее зрение пользователя затруднено минимально. Оптический прибор может быть пригодным для беспроводной связи аналогично смартфону. Другие примеры портативных электронных приборов включают устройства, носимые вокруг или вблизи запястья (например, наручные часы и т.д.), шеи (например, ожерелье и т.д.), головы (например, повязка на голову, головной убор и т.д.), грудной клетки пользователя или т.п.
[00153] Фиг. 16 является блок–схемой примерного варианта осуществления считывающего устройства 120, выполненного в виде смартфона. В этом случае считывающее устройство 120 включает компонент 121 ввода, дисплей 122 и электрическую цепь 206 обработки данных, которая может включать один или более процессоров, микропроцессоров, контроллеров и/или микроконтроллеров, каждый из которых может являться дискретным чипом или может быть распределен среди (и быть частью) ряда различных чипов. В этом случае электрическая цепь 206 обработки данных включает процессор 202 передачи данных, имеющий внутриплатное запоминающее устройство 203, и прикладной процессор 204, имеющий внутриплатное запоминающее устройство 205. Считывающее устройство 120 дополнительно включает электрическую цепь 208 радиочастотной связи, соединенную с радиочастотной антенной 209, запоминающее устройство 210, многофункциональную электрическую цепь 212 с одной или более связанными антеннами 214, источник 216 электропитания, электрическую цепь 218 управления электропитанием и часы 219. На фиг. 16 в сокращенном виде представлены типичные аппаратные средства и их функциональность, воплощенные в смартфоне, и специалистам в этой области техники будет понятно, что можно включать другие аппаратные средства и функциональность (например, кодеры/декодеры, драйверы, связующие логические схемы).
[00154] На фиг. 16 также показано, что процессор 202 передачи данных может взаимодействовать с электрической цепью 208 радиочастотной связи и выполнять аналого–цифровое преобразование, кодирование и декодирование, обработку цифрового сигнала и другие функции, способствующие преобразованию голосовых сигналов, видеосигналов и сигналов данных в формат (например, синфазный и со сдвигом на 90 градусов), подходящий для подачи в электрическую цепь 208 радиочастотной связи, которая затем может передавать сигналы по беспроводной связи. Процессор 202 передачи данных также может взаимодействовать с электрической цепью 208 радиочастотной связи для выполнения обратных функций, необходимых для приема беспроводной передачи и преобразования ее в цифровые данные, голосовые и видеосигналы. Электрическая цепь 208 радиочастотной связи может включать передатчик и приемник (например, интегрированные в виде приемопередатчика) и связанную с ними логическую схему кодера.
in vitro
[00155] Как показано на фиг. 16, прикладной процессор 204 можно адаптировать для исполнения операционной системы и любых программных приложений, находящихся на считывающем устройстве 120, обработки видео и графики и выполнения других функций, не связанных с обработкой данных, передаваемых и принимаемых через радиочастотную антенну 209. Операционная система смартфона будет работать в сочетании с рядом приложений на считывающем устройстве 120. На считывающем устройстве 120 можно запускать любое количество приложений (также известных как "приложения пользовательского интерфейса") в любой момент одновременно, и они могут включать одно или более приложений, связанных с режимом мониторинга диабета, в дополнение к другим общеупотребительным приложениям, не связанным с таким режимом, например, электронной почтой, календарем, погодным приложением, спортивным приложением, игровыми приложениями и т.д. Например, данные, указывающие на уровень обнаруженного аналита и измерения аналита в крови  и принятые считывающим устройством, могут безопасно передаваться приложениям пользовательского интерфейса, находящимся в запоминающем устройстве 210 считывающего устройства 120. Такую передачу данных можно безопасно осуществлять, например, с использованием технологий контейнеризации или обертывания мобильных приложений.
[00156] Запоминающее устройство 210 может быть общим для одного или более из различных функциональных блоков, находящихся в считывающем устройстве 120, или может быть распределено среди двух или более из них (например, в виде отдельных запоминающих устройств, находящихся в разных чипах). Запоминающее устройство 210 также может быть отдельным чипом само по себе. Запоминающие устройства 203, 205 и 210 являются постоянными и могут быть энергозависимыми (например, RAM и т.д.) и/или энергонезависимыми (например, ROM, устройство флэш–памяти, F–RAM и т.д.). Многофункциональная электрическая цепь 212 может быть реализована в виде одного или более чипов и/или компонентов (например, передатчика, приемника, приемопередатчика и/или другой электрической цепи передачи данных), выполняющих другие функции, такие как локальная беспроводная связь, например, с управляющим сенсором устройством 102 под управлением соответствующего протокола (например, Wi–Fi, Bluetooth, Bluetooth с низким энергопотреблением, ближней бесконтактной связи (NFC), радиочастотной идентификации (RFID), проприетарных протоколов и других), и определение географического положения считывающего устройства 120 (например, аппаратных средств системы глобального позиционирования (GPS)). С функциональной электрической цепью 212 соединяют одну или более других антенн 214, по мере необходимости, для работы с различными протоколами и цепями.
[00157] Источник 216 электропитания может включать одну или более батарей, которые могут быть перезаряжаемыми или одноразовыми батареями однократного применения. Электрическая цепь 218 управления электропитанием может регулировать зарядку батареи и контроль источника электропитания, повышать питание, осуществлять преобразование постоянного тока и т.п.
[00158] Считывающее устройство 120 также может включать в себя или быть интегрированным с устройством для введения лекарственного средства (например, инсулина и т.д.), так что они, например, находятся в общем корпусе. Примеры таких устройств для введения лекарственного средства могут включать медикаментозные помпы с катетером, остающимся в организме, чтобы позволить осуществлять инфузию в течение многочасового или многодневного периода времени (например, носимые помпы для введения базального и болюсного инсулина). При комбинировании с медикаментозной помпой считывающее устройство 120 может включать резервуар для хранения лекарственного средства, насос, соединяемый с трубками для переливания, и катетер для инфузии. Насос может нагнетать лекарственное средство из резервуара через трубки в организм диабетика с помощью введенного ему катетера. Другие примеры устройств для введения лекарственного средства, которые можно включать в состав считывающего устройства 120 (или интегрировать с ним), включают портативные инъекционные устройства, с помощью которых кожу прокалывают только для каждого введения, а затем удаляют (например, шприц–ручка с инсулином). При комбинировании с портативным инъекционным устройством считывающее устройство 120 может включать инъекционную иглу, картридж для хранения лекарственного средства, интерфейс для контроля вводимого количества лекарственного средства и привод для проведения инъекции. Устройство можно использовать многократно до тех пор, пока не закончится лекарственное средство, и в этот момент комбинированное устройство можно выбрасывать, или картридж можно заменять новым, после чего комбинированное устройство снова можно использовать повторно. Иглу можно заменять после каждой инъекции.
[00159] Комбинированное устройство может функционировать как часть системы с замкнутым контуром (например, системы искусственной поджелудочной железы, для работы которой не требуется вмешательство пользователя) или системы с полузамкнутым контуром (например, системы с инсулиновым контуром, для работы которой изредка требуется вмешательство пользователя, например, для подтверждения изменений дозы). Например, уровень аналита диабетика можно отслеживать повторяющимся автоматическим образом с помощью управляющего сенсором устройства 102, которое затем может передавать отслеживаемый уровень аналита в считывающее устройство 120, и соответствующая доза лекарственного средства для контроля уровня аналита у диабетика может быть определена автоматически, а затем введена в организм диабетика. Программные команды для управления насосом и вводимым количеством инсулина могут храниться в памяти считывающего устройства 120 и исполняться электрической цепью обработки данных считывающего устройства. Эти команды также могут приводить к вычислению количеств вводимого лекарственного средства и длительностей его введения (например, болюсной инфузии и/или базального инфузионного профиля) на основании измерений уровня аналита, получаемых непосредственно или опосредованно от управляющего сенсором устройства 102. В некоторых вариантах осуществления управляющее сенсором устройство 102 может определять дозу лекарственного средства и передавать ее в считывающее устройство 120.
[00160] Фиг. 17 является блок–схемой, изображающей примерный вариант осуществления управляющего сенсором устройства 102 с сенсором 104 аналита и сенсорной электроникой 250 (включая электрическую цепь мониторинга аналита), которое может выполнять основную часть обработки данных, чтобы сделать конечные данные подходящими для отображения пользователю. На фиг. 17 показана отдельная полупроводниковая микросхема 251, которая может быть выполненной на заказ специализированной интегральной схемой (ASIC). В ASIC 251 показаны некоторые высокоуровневые функциональные блоки, включая аналоговый входной блок (AFE) 252, электрическую цепь 254 управления электропитанием (или его контроля), процессор 256 и электрическую цепь 258 передачи данных (которая может быть реализована в виде передатчика, приемника, приемопередатчика, пассивной цепи или иным образом в соответствии с протоколом связи). В этом варианте осуществления как AFE 252, так и процессор 256 используются в качестве электрической цепи мониторинга аналита, но в других вариантах осуществления любая цепь может выполнять функцию мониторинга аналита. Процессор 256 может включать один или более процессоров, микропроцессоров, контроллеров и/или микроконтроллеров, каждый из которых может являться дискретным чипом или может быть распределен среди (и быть частью) ряда различных чипов.
in vivo
[00161] Запоминающее устройство 253 также может быть включено в состав ASIC 251 и может быть общим для различных функциональных блоков, присутствующих в ASIC 251, или может быть распределено среди двух или более из них. Запоминающее устройство 253 также может быть отдельным чипом. Запоминающее устройство 253 является постоянным и может быть энергозависимым и/или энергонезависимым запоминающим устройством. В этом варианте осуществления ASIC 251 соединена с источником 260 электропитания, который может быть кнопочным элементом питания или т.п. AFE 252 взаимодействует с сенсором 104 аналита , принимает от него данные об измерениях и передает эти данные процессору 256 в цифровой форме, который, в свою очередь, может в некоторых вариантах осуществления обрабатывать любым подходящим образом. Затем эти данные можно подавать в электрическую цепь 258 передачи данных для отправки с помощью антенны 261 в считывающее устройство 120, например, там, где необходима минимальная дальнейшая обработка с помощью резидентного программного приложения для отображения данных. Антенна 261 может быть выполнена в соответствии с потребностями применения и протоколом связи. Антенна 261 может являться, например, антенной с дорожками печатной платы (PCB), керамической антенной или дискретной металлической антенной. Антенна 261 может быть выполнена в виде однополюсной антенны, дипольной антенны, антенны F–типа, рамочной антенны и др.
[00162] Информация может передаваться от управляющего сенсором устройства 102 ко второму устройству (например, считывающему устройству 120) по инициативе управляющего сенсором устройства 102 или считывающего устройства 120. Например, информация может передаваться управляющим сенсором устройством 102 автоматически и/или многократно (например, непрерывно), когда доступна информация об аналите, или по плану (например, примерно каждую 1 минуту, примерно каждые 5 минут, примерно каждые 10 минут или т.п.), и в этом случае информация может сохраняться или загружаться в память управляющего сенсором устройства 102 для последующей передачи. Информация может передаваться от управляющего сенсором устройства 102 в ответ на получение запроса от второго устройства. Такой запрос может быть автоматическим запросом, например, запросом, передаваемым вторым устройством по плану, или запросом, генерируемым по инициативе пользователя (например, ситуативным или введенным вручную запросом). В некоторых вариантах осуществления введенный вручную запрос данных называют "сканированием" управляющего сенсором устройства 102 или передачей данных "по требованию" от устройства 102. В некоторых вариантах осуществления второе устройство может передавать сигнал опроса или пакет данных в управляющее сенсором устройство 102, и устройство 102 может обрабатывать каждый опрос (или опросы, происходящие через некоторые временные интервалы) как запрос данных и, если данные доступны, то может передавать такие данные во второе устройство. Во многих вариантах осуществления соединение между управляющим сенсором устройством 102 и вторым устройством является безопасным (например, шифрованным соединением и/или соединением между аутентифицированными устройствами), но в некоторых вариантах осуществления данные могут передаваться от управляющего сенсором устройства 102 небезопасным образом, например, в виде трансляции всем прослушивающим устройствам в диапазоне.
[00163] В качестве части каждой передачи можно отправлять различные типы и/или формы и/или количества информации, включая, но не ограничиваясь ими, одно или более из текущих измерений сенсора (например, последнюю полученную информацию об уровне аналита, по времени соответствующую моменту начала считывания), скорости изменения измеренного показателя за заданный период времени, темпа скорости изменения показателя (ускорения скорости изменения) или информации о показателе за прошлые периоды, соответствующей информации о показателе, полученной перед указанным считыванием и хранящейся в памяти управляющего сенсором устройства 102.
[00164] Некоторые или все из информации в реальном времени, информации за прошлые периоды, информации о скорости изменения, информации о темпе скорости изменения (такой как ускорение или замедление) могут передаваться в считывающее устройство 120 в данном сообщении или данной передаче. В некоторых вариантах осуществления тип и/или форма и/или количество информации, передаваемой в считывающее устройство 120, могут быть перепрограммируемыми и/или неизменяемыми (например, предустановленными при производстве), или могут не быть перепрограммируемыми и/или неизменяемыми, так что их можно выбирать и/или изменять в поле один или более раз (например, посредством активации переключателя системы и т.д.). Соответственно, в некоторых вариантах осуществления считывающее устройство 120 может выдавать выведенное сенсором текущее (в реальном времени) значение аналита (например, в числовом формате), текущую скорость изменения аналита (например, в виде индикатора скорости аналита, такого как стрелка, указывающая в некотором направлении для указания текущей скорости) и данные об предыстории динамики аналита на основании показаний сенсора, полученных и хранящихся в памяти управляющего сенсором устройства 102 (например, в виде графической записи). Кроме того, показания или измерения температуры на коже или сенсора могут быть сняты необязательным датчиком 257 температуры. Эти показания или измерения могут передаваться (отдельно или в виде совокупного измерения за период времени) от управляющего сенсором устройства 102 к другому устройству (например, считывателю или считывающему устройству 120). Однако считывание или измерение температуры можно использовать в сочетании с программой программного обеспечения, выполняемой считывающим устройством 120 для коррекции или компенсации результатов измерения аналита, выдаваемых пользователю, вместо или в дополнение к отображению пользователю результата измерения температуры.
[00165] Следующие примеры представлены исключительно в иллюстративных целях и не предназначены для ограничения объема или сущности настоящего изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1.
Вычисление чувствительности детекции с режимом накопления с использованием покрытых полимером сенсоров и длительных времен накопления.
[00166] На фиг. 5 показаны калибровочные кривые, полученные посредством амперометрии и обнаружения с режимом накопления с использованием покрытых полимером сенсоров глюкозы при концентрациях глюкозы от 0 до 500 мкМ. Каждая калибровочная кривая представляет собой средний отклик четырех сенсоров. Однако, в отличие от амперометрии, обнаружение с режимом накопления позволяет легко настраивать чувствительность сенсора, меняя время накопления. В случае измерений высоты пика и площади пика чувствительность сенсора повышается приблизительно в 10 раз при повышении времени накопления с 1 мин до 10 мин. Чувствительность для каждой калибровочной кривой, показанной на фиг. 5, вычисляли в виде угла наклона при линейной аппроксимации с использованием данных, приведенных в таблице 1.
[00167] Таблица 1.
<b>Время накопления (минуты)</b>
<b>Чувствительность</b>
<b>Амперометрия</b><b>(нА/мкМ)</b>
<b>Режим накопления</b><b>Высота пика</b><b>(нА/мкМ)</b>
<b>Режим накопления</b><b>Площадь пика</b><b>(нКл/мкМ)</b>
1
0,0022
0,0043
0,11
2
0,0023
0,0086
0,26
5
0,0024
0,020
0,65
10
0,0025
0,039
1,33
[00168] Поскольку измерения высоты пика и амперометрические измерения осуществляли в одних и тех же единицах, их чувствительности можно сравнивать напрямую. Используя данные от сенсора с ограничивающей поток мембраной, как показано на фиг. 5, вычисляли соотношение (т.е. кратное повышение) чувствительности обнаружения с режимом накопления к чувствительности амперометрии при эквивалентных условиях сенсоров с использованием данных, приведенных в таблице 2. Как указано, при времени накопления 1 минута, чувствительность сенсора была в 2 раза выше при использовании обнаружения с режимом накопления по сравнению с амперометрией. Таким образом, при повышении времени накопления до 10 минут разница в чувствительности повышается в 15 раз.
[00169] Таблица 2.
<b>Время накопления (минуты)</b>
<b>Соотношение</b><b>Высота пика/Амперометрия</b>
1
2,0
2
3,7
5
8,3
10
15,6
Пример 2.
Оптимизация сигнала в режиме накопления для высокочувствительной детекции при повышенной частоте и добавлении углеродных нанотрубок.
[00170] На фиг. 7 показана детекция с режимом накопления 200 нМ глюкозы при двух разных частотах фильтрации сигнала в 0,032 Гц и 3,2 Гц. Как показано, пик детекции является гораздо более острым при использовании фильтра с более высокой частотой, что приводит к большей высоте пика. Однако площадь под двумя кривыми не изменяется. Это свидетельствует о том, что при использовании измерения высоты пика фильтр с более высокой частотой отлично подходит для максимизации величины сигнала. В частности, обнаружили, что изменение частоты фильтрации с 0,032 Гц на 3,2 Гц приводит к повышению сигнала высоты пика в 2–3 раза. Кроме того, при более высоких частотах фильтрации, чем 3,2 Гц, шум в сигнале был слишком высоким для проведения точных измерений и амперометрического тока, и характеристик пика накопления (высоты и площади пика).
[00171] В качестве средства механизма усиления сигнала в режиме накопления добавляли углеродные нанотрубки (УНТ), чтобы сделать осаждаемый чувствительный реагент более однородным и электропроводным, тем самым повышая кинетику опосредуемой медиатором электронного транспорта стадии окисления. Это повышение кинетики приводило к выбросу тока в режиме накопления, имеющему большую высоту пика. На фиг. 8A показаны микрофотографии осажденного и отвержденного чувствительного к глюкозе реагента с УНТ или без них. Как показано, чувствительный реагент, содержащий УНТ, осаждается более однородно, в то время как чувствительный реагент без УНТ проявляет значительный "эффект кофейного пятна". Обнаружили, что добавление УНТ к чувствительному реагенту повышает сигнал высоты пика в 5–6 раз.
[00172] Кроме того, на фиг. 8B показаны результаты эксперимента, исследующего влияние как частоты фильтрации сигнала, так и добавления УНТ к чувствительному реагенту на чувствительность сенсора при использовании амперометрии и обнаружения с режимом накопления, измеряемого по высоте пика и площади пика с использованием примерных сенсоров глюкозы при концентрациях глюкозы 0–200 нМ, как указано. Тестировали четыре сенсора обоих типов (с УНТ в чувствительном реагенте и без них), и каждая калибровочная кривая представляет собой средний отклик четырех указанных сенсоров. Использовали время накопления десять минут для каждой детекции с режимом накопления. Осуществляли два последовательных измерения при каждой концентрации глюкозы: одно с использованием частоты фильтрации 0,032 Гц и другое с использованием частоты фильтрации 3,2 Гц.
[00173] Чувствительность для каждой калибровочной кривой на фиг. 8B вычисляли в виде угла наклона при линейной аппроксимации, и данные приведены в таблице 3. Как видно, чувствительность сенсора при амперометрических измерениях изменяется минимально с частотой фильтрации и при наличии УНТ, оставаясь менее 0,0003 нА/нМ для всех условиях. В случае измерения с режимом накопления с использованием площади пика чувствительность сенсора не изменяется с частотой фильтрации, но немного повышается при добавлении УНТ к чувствительному реагенту. Наиболее значительные изменения чувствительности сенсора наблюдаются в случае измерения с режимом накопления с использованием высоты пика. И частота фильтрация, и добавление УНТ к чувствительному реагенту повышают чувствительность сенсора. Повышение частоты фильтрации с 0,032 Гц до 3,2 Гц повышает чувствительности примерно в 2,5 раза, в то время как добавление УНТ к чувствительному реагенту повышает чувствительность примерно в 5,5 раза. Кроме того, повышение частоты фильтрации в комбинации с добавлением УНТ повышает чувствительность измерения с режимом накопления примерно в 14 раз.
[00174] Таблица 3.
<b>Переменные</b>
<b>Чувствительность</b>
<b>Частота фильтрации (Гц)</b>
<b>УНТ в чувствительном реагенте?</b>
<b>Амперометрия</b><b>(нA/нМ)</b>
<b>Режим накопления</b><b>Высота пика</b><b>(нA/нМ)</b>
<b>Режим накопления</b><b>Площадь пика</b><b>(нКл/нМ)</b>
0,032
Нет
0,00023
0,0071
0,11
3,2
Нет
0,00024
0,018
0,10
0,032
Да
0,00026
0,041
0,14
3,2
Да
0,00027
0,10
0,15
[00175] Поскольку измерения высоты пика и амперометрические измерения осуществляют в одних и тех же единицах, их чувствительности можно сравнивать напрямую. В таблице 4 приведено соотношение чувствительности в режиме накопления и чувствительности амперометрии при эквивалентных условиях сенсоров. Как показано, даже при частоте фильтрации 0,032 Гц и без УНТ в чувствительном реагенте, чувствительность сенсора в 30 раз выше при использовании обнаружения с режимом накопления по сравнению с амперометрией. Соответственно, при повышении частоты фильтрации и добавлении УНТ к чувствительному реагенту для оптимизации высоты пика режима накопления разница чувствительности повышается почти в 400 раз.
[00176] Таблица 4.
<b>Переменные</b>
<b>Соотношение</b>
<b>Частота фильтрации (Гц)</b>
<b>УНТ в чувствительном реагенте?</b>
<b>Высота пика/Амперометрия</b>
0,032
Нет
31
3,2
Нет
75
0,032
Да
158
3,2
Да
370
Пример. 3.
Pure Appl. Chem.
[00177]  Сравнение чувствительности, предела детекции и линейного диапазона амперометрии и обнаружения с режимом накопления при использовании времени накопления 30 минут, частоты сигнала 3,2 Гц и добавлении углеродных нанотрубок. Как показано на фиг. 9B, токи, связанные с амперометрическими измерениями, являются чрезвычайно слабыми (<50 пА) и теряют линейность ниже 100 нМ, в то время как сигналы при обнаружении с режимом накопления являются гораздо более сильными и сохраняют линейность гораздо ниже 100 нМ. В таблице 5 показана чувствительность, нижний предел детекции (LOD) (вычисленный как 3σ/угол наклона с использованием стандартного подхода 1) и линейный диапазон детекции, связанные с этими измерениями, как описано в примере 5. Стандартный подход 1 описан в статье Mocak et al., 1997, 69:297–328, полное содержание которой включено в настоящее описание по ссылке. В частности, стандартный подход 1 является способом вычисления LOD как "3σ/угол наклона", где "σ" является стандартным отклонением пустой пробы, а "угол наклона" является углом наклона калибровочной кривой.
[00178] Таблица 5.
<b>Способ измерения</b>
<b>Чувствительность</b>
<b>LOD (нМ)</b>
<b>Линейный диапазон (мкМ)</b>
Амперометрия
0,00017±0,00001 нА/нМ
120±42
0,12–>100
Режим накопленияВысота пика
0,14±0,03 нA/нМ
20±16
0,02–2
Режим накопленияПлощадь пика
0,33±0,04 нКл/нМ
4,7±1,4
0,004–5
Пример 4.
Анализ фонового сигнала.
3+
3+
[00179]  Как показано на фиг. 9A и 9B, отрицательный (катодный) фоновый сигнал наблюдается, когда обнаружение осуществляют в буферном растворе, открытом для воздействия атмосферы. Не желая быть связанными какой–либо теорией, полагают, что за этот отрицательный фон, вероятно, отвечает реакция восстановления кислорода. В частности, осмиевый медиатор электронного транспорта и УНТ могут катализировать реакцию восстановления кислорода, которая будет приводить к окислению осмиевого медиатора, приводящему к образованию Os, когда цепь разомкнута в ходе периода накопления. Когда цепь повторно замыкают, это скопление Os может восстанавливаться, приводя к катодному пику. Для проверки этой гипотезы примерные сенсоры глюкозы тестировали в 100 мМ фосфатном буфере, не содержащем глюкозу, при атмосферных условиях и условиях продувания кислородом (например, посредством барботирования). На фиг. 10A показан результирующий сигнал режима накопления, полученный для типичного сенсора при временах накопления 2, 5 и 10 минут в атмосферных условиях и условиях продувания кислородом, как указано. Как наблюдалось, сигналы представляли собой катодные пики при атмосферных условиях, в то время как при условиях продувания кислородом сигналы представляли собой меньшие анодные пики. Графики средних сигналов для 4 сенсоров построены на фиг. 10B. Как показано, наблюдали сигнал амперометрии от немного отрицательного при атмосферных условиях до немного положительного при условиях продувания кислородом. Результаты этого эксперимента свидетельствуют о том, что отрицательный фон вызван катализуемым Os восстановлением кислорода.
Пример 5.
Линейный диапазон детекции.
[00180] Для определения линейного диапазона детекции при обнаружении с режимом накопления осуществляли эксперимент по калибровке, показанный на фиг. 9A и 9B, вплоть до концентрации глюкозы 200 мкМ. Полученные калибровочные кривые амперометрии и режима накопления показаны на фиг. 11. Линию наилучшей линейной аппроксимации, определенную для концентраций от 0 до 200 нМ, прогнозировали (продлевали) до более высоких концентраций. Как видно, сигнал амперометрии остается линейным вплоть до по меньшей мере 100 мкМ. С другой стороны, сигнал режима накопления остается линейным вплоть до 2–5 мкМ перед началом плато при более высоких концентрациях. Этого и ожидали, т.к. Os–содержащий медиатор электронного транспорта имеет конечную емкость накопленного заряда. В случае сенсоров, использованных в этом эксперименте, эта емкость, по–видимому, составляет примерно 5000 нКл. Следует отметить, что линейный диапазон обнаружения с режимом накопления можно сдвигать в сторону более высоких концентраций, если использовать более короткое время накопления. Для представленных здесь данных использовали относительно длительное (например, 30 минут) время накопления для достижения высокой чувствительности.
Пример 6.
Материалы.
Aspergillus
2
–1
[00181]  Полученные методом трафаретной печати углеродные сенсоры на подложках из PET приобретали у компании Steven Label, Inc. (г. Санта-Фе-Спрингс, шт. Калифорния, США). Активную зону рабочего электрода задавали площадью осаждения окисляющего глюкозу катализатора, составляющей около 0,1 мм. Патентованный редокс–полимер, используемый для "проводки" глюкозооксидазы (GOx), и патентованный полимер ограничивающей поток мембраны синтезировали описанными в опубликованной литературе способами и приобретали у компании Nanosyn, Inc. (г. Санта-Роза, шт. Калифорния, США) и Regis Technologies, Inc. (г. Мортон Гров, шт. Иллинойс, США) соответственно. Глюкозооксидазу (GOx, EC 1.1.3.4, активность 130 ед./мг) из  sp. II приобретали у компании Toyobo Co, Ltd. (г. Осака, Япония). Диглицидиловый простой эфир полиэтиленгликоля (400) (PEGDGE400) и триглицидиловый простой эфир глицерина приобретали у компании Polysciences, Inc. (г. Уоррингтон, шт. Пенсильвания, США). Многостенные углеродные нанотрубки (УНТ, внешний диаметр 20–40 нм, длина 10–20 мкм) приобретали у компании MK Nano (г. Миссисауга, Онтарио, Канада). Глюкозу и обычные химические вещества, используемые для буферных растворов, приобретали в компании Sigma–Aldrich (г. Сент-Луис, шт. Миссури, США). Все водные растворы получали с использованием деионизированной воды с удельным сопротивлением >18,0 МОм⋅см, полученной с помощью системы очистки воды до сверхвысокой чистоты Thermo Scientific Barnstead E–Pure.
Пример 7.
Изготовление сенсора.
Anal. Chem.
2
[00182] Использовали два разных типа чувствительных к глюкозе реагентов: один без УНТ и один с УНТ. Реагент без УНТ приготовили следующим образом. Сначала приготовили три раствора в 10 мМ буфере 4–(2–гидроксиэтил)пиперазин–1–этансульфоновой кислоты (HEPES) (pH 8): 4% (масс./об.) редокс–полимера, 8,08% (масс./об.) GOx и 8,08% (масс./об.) PEGDGE400. Эти три раствора смешивали в соотношении 3,04:5,1:1,86 для получения чувствительного к глюкозе реагента. Для приготовления чувствительного к глюкозе реагента с УНТ следовали описанной выше процедуре, за исключением того, что 4%–ый раствор редокс–полимера и 8,08%–ый раствор PEGDGE400 приготовили в водном растворе 5% (масс./об.) УНТ вместо 10 мМ раствора HEPES. После приготовления чувствительный к глюкозе реагент наносили на углеродный рабочий электрод сенсора с помощью микрошприца (Hamilton Co.) аликвотами по 15 нл. Активная зона каждого рабочего электрода определялась площадью капли нанесенного чувствительного реагента. Эта площадь, как правило, составляла 0,1 мм. После нанесения чувствительного реагента сенсоры отверждали при 25°C и относительной влажности 60% в течение по меньшей мере 12 часов. В случае сенсоров, используемых в эксперименте, показанном на фиг. 5, на сенсоры наносили внешнюю, ограничивающую поток полимерную мембрану. Эту мембрану, состоящую из смеси 14% (масс./об.) полимера мембраны и 3,5% (масс./об.) триглицидилового простого эфира глицерина в соотношении 4:1 по объему в этаноле/воде 80/20, наносили погружением, как описано ранее в статье Liu et al.,  2012, 84:3403–3409, полное содержание которой включено в настоящее описание по ссылке.
Пример 8.
Электрохимические измерения.
[00183]  Если не указано иное, все электрохимические измерения осуществляли с использованием подходящей трехэлектродной ячейки с сенсором глюкозы в качестве рабочего электрода, электродом сравнения Ag/AgCl (в 3 M KCl; Bioanalytical Systems, Inc.) и полученным методом трафаретной печати углеродным противоэлектродом. Кривую тока от времени для сенсора измеряли на всем протяжении эксперимента с режимом накопления, используя потенциостат. Для измерения с режимом накопления рабочий электрод электрически отключали от потенциостата на установленное количество времени (время накопления), после чего его обратно подключали к цепи. На фиг. 2 показана схема электродов. Когда рабочий электрод сенсора электрически подключен, он находится под +40 мВ. В экспериментах, показанных на фиг. 3A–3D, 4A–4B, 5 и 6A–6H, для измерений тока использовали потенциостат BASi Petit Ampere (модель LC–3D; Bioanalytical Systems, Inc., г. Уэст-Лафайетт, шт. Индиана, США). Использовали интервал между замерами 0,5 секунды (с) и фильтр 0,03 Гц и регистрировали сигнал тока с использованием собственного программного обеспечения LabView (National Instruments). Во всех других экспериментах желательным было увеличенное разрешение по времени. Поэтому использовали потенциостат с более высоким разрешением по времени (модель 1030C; CH Instruments, Inc., г. Остин, шт. Техас, США). Этот потенциостат использовали с интервалом между замерами 0,1 секунды и фильтром 3,2 Гц, за исключением экспериментов, показанных на фиг. 7 и 8B. В таких экспериментах этот потенциостат использовали с интервалом между замерами 0,1 с и либо фильтром 3,2 Гц, либо фильтром 0,032 Гц, как указано. Этот сигнал регистрировали с использованием предоставленного производителем программного обеспечения. Измерения площади пика, высоты пика и амперометрического тока в записях изменения результирующего тока от времени осуществляли с использованием программного обеспечения Graphpad Prism 6. Все эксперименты осуществляли в буфере 100 мМ PBS (pH=7,4, 100 мМ NaCl) при 33°C.
[00184] Как раскрыто и показано по всему описанию, обнаружение с режимом накопления в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения может быть использовано для достижения лучшей детекции по сравнению с амперометрией при низких концентрациях аналита.
[00185] Хотя настоящее изобретение проиллюстрировано и описано со ссылкой на некоторые иллюстративные варианты осуществления, специалистам в этой области техники будет понятно, что в описанные варианты осуществления можно внести различные модификации и изменения без отклонения от сущности и объема настоящего изобретения, охарактеризованного в нижеследующей формуле изобретения.