СПОСОБ ГЕНЕТИЧЕСКОГО INDEL-ТИПИРОВАНИЯ ШТАММОВ BRUCELLA MELITENSIS
METHOD OF GENETIC INDEL-TYPING OF STRAINS OF BRUCELLA MELITENSIS

B. melitensis
Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности к лабораторной диагностике инфекционных болезней, и может быть использовано для молекулярно-генетического типирования штаммов .
В последние годы для эпидемиологической характеристики штаммов патогенов, наряду с классическими методами, широкое применение нашли методы генетического анализа, позволяющие не только обнаружить искомый патоген, но и изучить его на молекулярно-генетическом уровне, в том числе ретроспективно.
Среди молекулярно-генетических методов, используемых для характеристики бруцелл, широкое применение получила полимеразная цепная реакция (ПЦР) с электрофоретической детекцией результатов, а в последние годы с учетом результатов в режиме реального времени [1, 2, 3]. Основной целью данной методики является дифференциация бруцелл до вида, а в некоторых случаях до биовара.
В качестве эффективных подходов для генетического типирования применяются методы MLST и SNP [4, 5, 6, 7], однако использование данных методик является длительным, трудоемким, дорогостоящим и требует участия высококвалифицированного персонала.
В настоящее время для генетического типирования бруцелл используют метод MLVA, представленный несколькими схемами, содержащими от 8 до 80 VNTR-локусов с размерами повторов от 5 до 339 п.о. [8, 9, 10].
Brucella
Принцип метода MLVA заключается в том, что после амплификации VNTR-локусов исследуемого штамма с набором специфичных праймеров образуются продукты реакции, отличающиеся по размерам. В зависимости от этого вычисляют число тандемных повторов для каждого исследуемого локуса, сочетание которых составляет уникальный аллельный MLVA-генотип для анализируемого штамма spp. Однако данный метод имеет ряд существенных недостатков. Например, для детекции локусов с длиной мотива менее 10 п.о. необходимо использовать сложные и трудоемкие методики определения молекулярных размеров амплифицированного фрагмента с применением капиллярных анализаторов. В ряде случаев MLVA типирование проводят с использованием зондов с флуоресцентной меткой, что усложняет и удорожает процедуру синтеза праймеров. Для учета результатов необходим высокотехнологичный, дорогостоящий секвенатор и импортные расходные материалы.
Одним из простых и информативных методов типирования является выявление INDEL-маркеров, представляющих собой вставки-делеции (insertions/deletions) нескольких нуклеотидов. Изучение полиморфизма INDEL-генов в настоящее время широко используется при молекулярном типировании [11, 12].
За прототип изобретения выбран способ MLVA-анализа [13], который заключается в выделении ДНК из исследуемой культуры методом теплового лизиса, постановке ПЦР со специфичными праймерами к 15 VNTR-локусам и учете полученных результатов методом электрофореза в 1,5 % агарозном геле (напряжение 20 В, время 8 часов).
Недостатком данного способа является то, что в процессе анализа результатов субъективно определяются аллельные варианты одного гена по каждому локусу, различающиеся между собой количеством повторений того или иного мотива. Полученные генотипы представлены в виде набора чисел, отражающих размеры VNTR-локусов, которые для проведения сравнения с доступными базами данных MLVA-генотипов, необходимо перевести в число тандемных повторов по каждому из локусов. Также использование данной методики требует значительных временных и экономических затрат.
Brucella melitensis
Технической задачей изобретения является разработка нового, быстрого, эффективного и экономически доступного способа генетического типирования штаммов , основанного на выявлении четко дискриминируемых INDEL-аллелей генома.
Brucella melitensis
Технический результат достигается за счет того, что из чистой культуры исследуемого штамма  проводят выделение ДНК, с помощью полимеразной цепной реакции со специфичными праймерами к каждому из десяти INDEL-локусов, имеющих по две дискриминируемых аллели, получают амплифицированные фрагменты, которые визуализируют путем электрофореза в агарозном геле и для каждого штамма устанавливают уникальный INDEL-генотип.
Brucella melitensis
На фиг. 1 представлены INDEL-локусы.
Brucella melitensis
На фиг. 2 представлен INDEL-генотип штамма  C-573.
Способ осуществляется следующим образом.
Brucella melitensis
Материалом для исследования служат чистые культуры . Обеззараживание и подготовку проб проводят согласно СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)» и МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».
Выделение ДНК проводят с использованием наборов «ДНК-сорб В» или «РИБО-преп» в соответствии с инструкциями производителя.
Далее проводят амплификацию выделенной ДНК со сконструированными специфичными праймерами к INDEL-локусам (фиг. 1).
2
Реакционную смесь объемом 20 мкл готовят отдельно для каждого локуса из расчета: 5 мкл MgCl-буфер, 2,5 мкл смеси дНТФ, по 0,2 мкл каждого праймера (SEQ ID NO: 1-10), 0,5 мкл ДНК-полимеразы, 1,6 мкл РНК-элюент и 10 мкл ДНК-матрицы.
Микропробирки помещают в термоциклер и проводят амплификацию по схеме: денатурация 95°C - 15 мин; затем 30 циклов: денатурация 95°C - 15 с, отжиг 56°C - 20 с, синтез 72°C - 15 с; синтез при 72°C - 5 мин.
Учет результатов амплификации проводят методом электрофореза в 2 % агарозном геле при напряженности электрического поля 10 В/см. Анализ результатов проводят по наличию специфических полос амплифицированной ДНК на электрофореграмме, затем определяют размеры полученных ампликонов по всем локусам для каждого исследуемого штамма, сравнивая их с маркером молекулярного размера или аллельными маркерами 1 и 2 (АМ 1 и АМ 2). Аллельные маркеры готовят заранее путем амплификации ДНК штаммов возбудителя бруцеллеза, размеры INDEL-локусов которых установлены методом капиллярного электрофореза или секвенирования.
Возможность практического применения заявленного способа подтверждается примером его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.
Пример 1
Brucella melitensis
Определение INDEL-генотипа штамма C-573.
Brucella melitensis
Из двухсуточной агаровой культуры штамма C-573, выращенного при 37°С, стандартным методом выделена ДНК, проведена амплификация по вышеуказанной схеме. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК проведено в 2% агарозном геле. В результате получен INDEL-генотип штамма, представленный на электрофореграмме в виде «локус - размер ампликона (п.о.)»: RS05410 - 86, RS06765 - 98, RS11140 - 80, RS12095 - 88, RS12365 - 76, RS14755 - 91, RS16525 - 72, RS05465 - 61, RS14470 - 84, RS16540 - 78 (фиг. 2).
Brucella melitensis
Таким образом, предлагаемый способ позволяет быстро и достоверно проводить генетическое типирование штаммов  при исследовании чистых культур возбудителя бруцеллеза.
Список литературы
1. Jung, S.C. Advanced multiplex PCR assay for differentiation of Brucella syecies / S.C. Jung // Appl. Environ. Microbiol. - 2011. -Vol. 77 (18). - P. 6726-6728.
2. Validation of the multiplex PCR for identification of Brucella spp. / L. Orzil [et al.] // Cienc. Rural. - 2016. -Vol. 46 (5). - P. 847-852.
3. Патент РФ № 2621864С1. Опубликован 06.07.2017 Бюл. № 16.
4. Genotyping of Brucella species using clade specific SNPs / T. F. Jeffrey [et al.] // BMC Microbiology. - 2012. -Vol. 12 (110). DOI: 10.1186/1471-2180-12-110.
5. Development of an extended multilocus sequence typing for genotyping of Brucella isolates / Y. J Chen [et al.] // Microbiol Methods. - 2011. -Vol. 86. - P. 252-254.
6. Changes of predominant species/biovars and sequence types of Brucella isolates, Inner Mongolia, China / Y. Chen [et al.] // BMC Infect Dis. - 2013. -Vol. 13. - P. 1-9.
7. A genome-wide SNP-based phylogenetic analysis distinguishes different biovars of Brucella suis / J. Sankarasubramanian [et al.] // Infection, Genetics and Evolution. - 2016. -Vol. 41. - P. 213-217.
Brucella abortus
8. Bricker B.J. Evaluation of the HOOF-Print assay for typing  strains isolated from cattle in the United States: results with four performance criteria / B.J. Bricker, D.R. Ewalt // BMC Microbiol. - 2005. - Vol. 5 (37). DOI:10.1186/1471-2180-5-37.
9. MLVA16 loci panel on Brucella spp. using multiplex PCR and multicolor capillary electrophoresis. / G. Garofolo [et al.] // J. Microbiol. Methods. - 2013. - Vol. 92. - Р. 103-107.
Brucella
Brucella
10. Genotypic Expansion Within the Population Structure of Classical  Species Revealed by MLVA16 Typing of 1404  Isolates From Different Anima Geographic Origins, 1974-2006 / G. Vergnaud [et al.] // Frontiers in Microbiology. - 2018. - Vol. 9. - P. 1545.
11. Canonical insertion-deletion markers for rapid DNA typing of Francisella tularensis / P. Larsson // Emerging Infectious Diseases - 2007. - Vol. 13 (11). - P. 1725 - 1732.
12. Minimum InDel pattern analysis of the Zika virus / H. Lee, M.P. Nguyen, Y. Choi, Y.H. Kim // BMC Genomics. - 2018. - Vol. 19, No. 1. - P. 535 / doi: 10.1186/s12864-018-4935-z.
Brucella
13. Evaluation and selection of tandem repeat loci for a  MLVA typing assay / P. Le Flèche [et al.] // BMC Microbiol. - 2006. - Vol. 6 (9). https://doi.org/10.1186/1471-2180-6-9.
--->
Перечень последовательностей праймеров 5' - 3'
Идентификатор
Элементы данных
<110>
ФКУЗ Ставропольский противочумный институт РоспотребнадзораFGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
<120>
Method for genetic INDEL typing of <i>Brucella melitensis</i> strains
<160>
20
<210>
SEQ ID NO: 1
<211>
20
<212>
DNA
<213>
<i>Brucella melitensis</i>
<223>
Genetic locus RS05410 = forward primer
<400>
1gctgccgacg atttcctgaa 20
Идентификатор
Элементы данных
<110>
ФКУЗ Ставропольский противочумный институт РоспотребнадзораFGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
<120>
Method for genetic INDEL typing of <i>Brucella melitensis</i> strains
<160>
20
<210>
SEQ ID NO: 2
<211>
20
<212>
DNA
<213>
<i>Brucella melitensis</i>
<223>
Genetic locus RS05410  = reverse primer
<400>
2gtttcgtcca cttccccttc 20
Идентификатор
Элементы данных
<110>
ФКУЗ Ставропольский противочумный институт РоспотребнадзораFGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
<120>
Method for genetic INDEL typing of <i>Brucella melitensis</i> strains
<160>
20
<210>
SEQ ID NO: 3
<211>
18
<212>
DNA
<213>
<i>Brucella melitensis</i>
<223>
Genetic locus RS06765 = forward primer
<400>
3ctggcggcgc ttatcttg 18
Идентификатор
Элементы данных
<110>
ФКУЗ Ставропольский противочумный институт РоспотребнадзораFGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
<120>
Method for genetic INDEL typing of <i>Brucella melitensis</i> strains
<160>
20
<210>
SEQ ID NO: 4
<211>
20
<212>
DNA
<213>
<i>Brucella melitensis</i>
<223>
Genetic locus RS06765= reverse primer
<400>
4aacttcggcc agcatgtttt 20
Идентификатор
Элементы данных
<110>
ФКУЗ Ставропольский противочумный институт РоспотребнадзораFGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
<120>
Method for genetic INDEL typing of <i>Brucella melitensis</i> strains
<160>
20
<210>
SEQ ID NO: 5
<211>
20
<212>
DNA
<213>
<i>Brucella melitensis</i>
<223>
Genetic locus RS11140 = forward primer
<400>
5tctggcttgc aatcctgatt 20
Идентификатор
Элементы данных
<110>
ФКУЗ Ставропольский противочумный институт РоспотребнадзораFGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
<120>
Method for genetic INDEL typing of <i>Brucella melitensis</i> strains
<160>
20
<210>
SEQ ID NO: 6
<211>
19
<212>
DNA
<213>
<i>Brucella melitensis</i>
<223>
Genetic locus RS11140 = reverse primer
<400>
6gacacggcgc aaaatgaag 19
Идентификатор
Элементы данных
<110>
ФКУЗ Ставропольский противочумный институт РоспотребнадзораFGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
<120>
Method for genetic INDEL typing of <i>Brucella melitensis</i> strains
<160>
20
<210>
SEQ ID NO: 7
<211>
19
<212>
DNA
<213>
<i>Brucella melitensis</i>
<223>
Genetic locus RS12095 = forward primer
<400>
7tccttctgcc tgaccaagc 19
Идентификатор
Элементы данных
<110>
ФКУЗ Ставропольский противочумный институт РоспотребнадзораFGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
<120>
Method for genetic INDEL typing of <i>Brucella melitensis</i> strains
<160>
20
<210>
SEQ ID NO: 8
<211>
23
<212>
DNA
<213>
<i>Brucella melitensis</i>
<223>
Genetic locus RS12095 = reverse primer
<400>
8tgagaatata gaaatcgccg tcg 23
Идентификатор
Элементы данных
<110>
ФКУЗ Ставропольский противочумный институт РоспотребнадзораFGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
<120>
Method for genetic INDEL typing of <i>Brucella melitensis</i> strains
<160>
20
<210>
SEQ ID NO: 9
<211>
20
<212>
DNA
<213>
<i>Brucella melitensis</i>
<223>
Genetic locus RS12365 = forward primer
<400>
9ctggctgttc tttgtgctga 20
Идентификатор
Элементы данных
<110>
ФКУЗ Ставропольский противочумный институт РоспотребнадзораFGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
<120>
Method for genetic INDEL typing of <i>Brucella melitensis</i> strains
<160>
20
<210>
SEQ ID NO: 10
<211>
20
<212>
DNA
<213>
<i>Brucella melitensis</i>
<223>
Genetic locus RS12365 = reverse primer
<400>
10gccgatagtc tgtccctgat 20
Идентификатор
Элементы данных
<110>
ФКУЗ Ставропольский противочумный институт РоспотребнадзораFGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
<120>
Method for genetic INDEL typing of <i>Brucella melitensis</i> strains
<160>
20
<210>
SEQ ID NO:11
<211>
18
<212>
DNA
<213>
<i>Brucella melitensis</i>
<223>
Genetic locus RS14755 = forward primer
<400>
11aatgtggtga cgggcctt 18
Идентификатор
Элементы данных
<110>
ФКУЗ Ставропольский противочумный институт РоспотребнадзораFGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
<120>
Method for genetic INDEL typing of <i>Brucella melitensis</i> strains
<160>
20
<210>
SEQ ID NO: 12
<211>
20
<212>
DNA
<213>
<i>Brucella melitensis</i>
<223>
Genetic locus RS14755<i></i>= reverse primer
<400>
12cggaaagcag gttgagatcg 20
Идентификатор
Элементы данных
<110>
ФКУЗ Ставропольский противочумный институт РоспотребнадзораFGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
<120>
Method for genetic INDEL typing of <i>Brucella melitensis</i> strains
<160>
20
<210>
SEQ ID NO:13
<211>
18
<212>
DNA
<213>
<i>Brucella melitensis</i>
<223>
Genetic locus RS16525 = forward primer
<400>
13cggatcatcg ggcgtgac 18
Идентификатор
Элементы данных
<110>
ФКУЗ Ставропольский противочумный институт РоспотребнадзораFGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
<120>
Method for genetic INDEL typing of <i>Brucella melitensis</i> strains
<160>
20
<210>
SEQ ID NO: 14
<211>
18
<212>
DNA
<213>
<i>Brucella melitensis</i>
<223>
Genetic locus RS16525 = reverse primer
<400>
14cgcttgaaac gcaggaag 18
Идентификатор
Элементы данных
<110>
ФКУЗ Ставропольский противочумный институт РоспотребнадзораFGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
<120>
Method for genetic INDEL typing of <i>Brucella melitensis</i> strains
<160>
20
<210>
SEQ ID NO:15
<211>
20
<212>
DNA
<213>
<i>Brucella melitensis</i>
<223>
Genetic locus RS05465 = forward primer
<400>
15gaaaactcgg ccattggtga 20
Идентификатор
Элементы данных
<110>
ФКУЗ Ставропольский противочумный институт РоспотребнадзораFGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
<120>
Method for genetic INDEL typing of <i>Brucella melitensis</i> strains
<160>
20
<210>
SEQ ID NO: 16
<211>
19
<212>
DNA
<213>
<i>Brucella melitensis</i>
<223>
Genetic locus RS05465 = reverse primer
<400>
16catcgaccac ctcttccga 19
Идентификатор
Элементы данных
<110>
ФКУЗ Ставропольский противочумный институт РоспотребнадзораFGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
<120>
Method for genetic INDEL typing of <i>Brucella melitensis</i> strains
<160>
20
<210>
SEQ ID NO:17
<211>
20
<212>
DNA
<213>
<i>Brucella melitensis</i>
<223>
Genetic locus RS14470 = forward primer
<400>
17gccggacagt tgacttttga 20
Идентификатор
Элементы данных
<110>
ФКУЗ Ставропольский противочумный институт РоспотребнадзораFGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
<120>
Method for genetic INDEL typing of <i>Brucella melitensis</i> strains
<160>
20
<210>
SEQ ID NO: 18
<211>
18
<212>
DNA
<213>
<i>Brucella melitensis</i>
<223>
Genetic locus RS14470 = reverse primer
<400>
18catgtccacg atgcaggc 18
Идентификатор
Элементы данных
<110>
ФКУЗ Ставропольский противочумный институт РоспотребнадзораFGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
<120>
Method for genetic INDEL typing of <i>Brucella melitensis</i> strains
<160>
20
<210>
SEQ ID NO:19
<211>
19
<212>
DNA
<213>
<i>Brucella melitensis</i>
<223>
Genetic locus RS16540 = forward primer
<400>
19cattccgttg caggttcgc 19
Идентификатор
Элементы данных
<110>
ФКУЗ Ставропольский противочумный институт РоспотребнадзораFGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
<120>
Method for genetic INDEL typing of <i>Brucella melitensis</i> strains
<160>
20
<210>
SEQ ID NO: 20
<211>
20
<212>
DNA
<213>
<i>Brucella melitensis</i>
<223>
Genetic locus RS16540 = reverse primer
<400>
20acgatgcgct gaagaacaag 20
<---