СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХИТОЗАНА ИЗ МУХИ ЧЕРНАЯ ЛЬВИНКА HERMETIA ILLUCENS
METHOD FOR OBTAINING CHITOSAN FROM FLY BLACK LION HERMETIA ILLUCENS

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения высокомолекулярного хитозана. Полученный биополимер может быть в дальнейшем деполимеризован с помощью химического или ферментативного гидролиза и может быть использован в различных областях народного хозяйства, например, в сельском хозяйстве, медицине, косметологии и т.д.
За последнее десятилетие муха черная львинка (Hermetia illucens, H. illucens) получила широкое распространение благодаря глобальному развитию технологии по утилизации с помощью ее личинок органических отходов. Помимо экологически безопасной переработки отходов технология предлагает ряд продуктов с высокой добавочной стоимостью. На сегодняшний день основными коммерческими продуктами служат кормовой белок, зоогумус, энтомологический жир. Кроме того, как известно, насекомые являются источниками биополимеров - хитина, содержащегося в экзоскелете, и его дезацетилированного производного хитозана. В сравнении с другими промышленно разводимыми насекомыми черная львинка доступна в качестве источника биополимеров на разных стадиях онтогенеза и в зависимости от этапа развития может содержать примеси в разных количествах. Например, на более поздних стадиях, в куколках и подморе, присутствует пигмент меланин, который наблюдается при визуальном рассмотрении. Наличие данного пигмента определяет возможность получения из подмора ковалентно-связанного хитозан-меланинового комплекса [Лопатин С.А., Хайрова А.Ш., Соколов И.В., Варламов В.П. «Способ получения ковалентно-связанного хитозан-меланинового комплекса из мухи черная львинка Hermetia illucens», Патент РФ №2728458, 29.07.2020]. Ввиду этого можно сделать вывод о том, что для получения чистого хитозана подходят только непигментированные личинки до пятого возраста.
4
Известные способы получения хитина из черной львинки основаны на стандартном подходе, включающем последовательное удаление примесей из исходного сырья. В работе [Waśko A. и др. The first report of the physicochemical structure of chitin isolated from Hermetia illucens // Int. J. Biol. Macromol. 2016. Т. 92. С. 316-320] был предложен способ для получения хитина из кутикул куколок и подмора H. illucens. Деминерализацию проводили с использованием 1 М HCl в течение часа и в конце промывали дистиллированной водой. Затем деминерализованную материю депротеинировали с использованием 1 М NaOH в течение 24 ч при 80°C. Для обесцвечивания хитина авторы предлагают обработку 1% KMnO, удаляя избыток 4% щавелевой кислотой. В результате был получен бело-серый продукт, который фильтровали, промывали дистиллированной водой и высушивали. Важно отметить, что авторы работы предлагают дополнительную стадию обесцвечивания для удаления меланина. Тем не менее, такой обработки недостаточно, чтобы разрушить прочную связь между биополимерами и полностью удалить меланин. Кроме того, концентрация щелочи была не достаточно высокой для полного удаления примесей из исходного сырья, включая жир, протеины. Отсутствие контроля за примесями влияет на рассчитанную авторами степень ацетилирования хитина, значения которого превышали теоретически возможные 100%. Это свидетельствует о наличие в конечном продукте примесей не хитиновой природы. Ранее в работе [Khayrova A., Lopatin S., Varlamov V. Obtaining Chitin/Chitosan-Melanin Complexes from Black Soldier Fly Hermetia Illucens // IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 2020. №809 (1). P. 012020] были представлены данные о содержании примесей при проведении различных обработок кутикул куколок и подмора H. illucens. Например, при обработке 30% (в/в) NaOH содержание белка в кутикуле куколок составляло около 1,7%, в подморе - около 3,8%, а жир не был полностью удален в подморе при щелочной обработке (5,4%). Также в работе было определено содержание меланина в комплексах: в хитин- и хитозан-меланиновых комплексах, полученных из подмора, значение меланина составляло 14,3%. Содержание белка определяли хроматографическим методом с помощью проведения аминокислотного анализа, жира - экстракцией органическим растворителем. Корректным способом для определения содержания меланина, вещества со свободными электронами, является электронный парамагнитный резонанс.
2
3
4
В другой работе [Nafisah A. и др. Chemical composition, chitin and cell wall nitrogen content of Black Soldier Fly (Hermetia illucens) larvae after physical and biological treatment // IOP Conf. Ser. Mater. Sci. Eng. 2019. Т. 546. С. 42028] авторы использовали личинки возраста 20-23 дней, т.е. предкуколки. Тем не менее, в работе не берется во внимание наличие меланина на этой стадии развития у черной львинки. Личинки H. illucens обезжиривали в растворе гексана в течение 6 ч. Хитин экстрагировали по методу [Paulino, A.T., Julliana, I., Simionato, Juliana, C.G., Jorge, N. 2006. Characterization of chitosan and chitin produced from silkworm crysalides. Carbohydrate Polymers 64: 98-103], что означает, что предложенный способ был ранее использован для выделения хитозана из тутового шелкопряда. Кроме того, авторы не уточняют какой именно из двух методов, в открытой (в стакане) или закрытой (тефлоновый реактор) системе, применялся в работе. Деминерализация проходила в 1 М HCl в течение 20 мин при 100°C, депротеинирование - в 1 М NaOH в течение 24 ч в течение 80°C. Затем образцы несколько раз обрабатывали 0,4% NaCO и сушили. Хитин дезацетилировали 40% раствором NaOH (в/в), с использованием NaBH в качестве восстанавливающего агента. Тем не менее, такой концентрации щелочи не достаточно для дезацетилирования хитина. Авторы работы не определяли примеси на каждом этапе обработки, а только в исходном сырье. Содержание белка в личинках составляло около 43,0%.
Наиболее близким к заявленному является способ, описанный в работе [Hahn T. и др. Chitosan production with larval exoskeletons derived from the insect protein production // J. Biotechnol. 2020. Т. 310. С. 62-67], в которой авторы получают хитозан из личиночных экзоскелетов H. illucens, основываясь на методе для производства хитозана из ракообразных. Исходная биомасса (7% влаги) была измельчена в порошок. Для проведения деминерализации использовалась муравьиная кислота (5 моль на кг личиночных экзоскелетов). Деминерализованная материя промывалась 70 л теплой воды и высушивалась при 105°C, а затем обрабатывалась 2 М NaOH в течение 2 ч при 80 °C. Авторы проводили два вида реакции дезацетилирования. В первом способе использовали 12 М NaOH при 120°C; это приводило к степени дезацетилирования (СДА) 72% и максимальному выходу 43% по отношению к хитину. Второй метод проводили с использованием 10 М NaOH при 4°C в течение 12 ч; он приводил к низкому выходу хитозана 13% и СДА 34%. Однако авторы не учитывают наличие примеси в конечном продукте - белково-жировой фракции, которую невозможно удалить при такой концентрации щелочи [Khayrova A., Lopatin S., Varlamov V. Obtaining Chitin/Chitosan-Melanin Complexes from Black Soldier Fly Hermetia Illucens // IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 2020. №809 (1). P. 012020]. СДА 34% свидетельствует о том, что полученный продукт является хитином, а не хитозаном. Кроме того, авторы работы предлагают условия для получения хитозана из ракообразных, не учитывая при этом особенности черной львинки, в частности, наличие примесей, отличных от ракообразных (например, меланина).
Можно сделать вывод, что черная львинка может служить источником непигментированного хитина и хитозана только на ранних стадиях своего развития, включая личинки 5-го возраста. На более поздних стадиях онтогенеза (предкуколки, куколки, имаго) в насекомых образуется меланин, который соединен с хитином прочными ковалентными связями. Тем не менее, зачастую авторы работ не учитывают, что химическая обработка такого комплекса не позволяет разорвать эти связи и полностью удалить меланин, поэтому чистый хитин на более поздних стадиях получить не удается.
С целью преодоления перечисленных выше недостатков предлагается для получения хитозана из мухи использование личинок 5-го возраста H. illucens.
Сущность способа получения хитозана из мухи черная львинка H. illucens заключается в следующем: 3000 г личинок H. illucens 5-го возраста бланшируют. Личинки проходят обработку через пресс, в результате чего удаляют большую часть липидов, протеина и влаги. Затем обработанные таким образом личинки лиофильно высушивают и хранят в герметичных условиях. Полученный продукт содержит около 6% жира, 7% золы (выход = 250 г). Из полученных 250 г материи берут 100 г оболочек личинок, добавляют 1 л 1% HCl и перемешивают 2 ч при комнатной температуре. После этого твердый остаток отделяют на пористом стеклянном фильтре, промывают дистиллированной водой до нейтральных значений рН, высушивают в сушильном шкафу, получают 49,2 г материи. Высушенную деминерализованную материю просеивают на ситах с диаметром отверстий 2 мм и работают с более крупной фракцией (выход = 44,9 г). Далее к 44,9 г деминерализованной биомассы добавляют 600 мл 30% NaOH, выдерживают 30 мин при комнатной температуре и проводят реакцию на водяной бане в течение 2 часов при 100°C при перемешивании. Полученный хитин отделяют на пористом стеклянном фильтре, промывают дистиллированной водой до нейтрального значения pH, высушивают в сушильном шкафу, получают 9,0 г хитина. К хитину добавляют 360 мл 50% NaOH и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Реакцию проводят при 100°C водяной бане в течение 2 ч, перемешивая. Реакционную массу охлаждают, осадок отделяют на пористом стеклянном фильтре, промывают водой до нейтрального рН и высушивают в сушильном шкафу. Получают 7,3 г высушенной материи. Повторное дезацетилирование проводят с использованием 290 мл 50% NaOH. Реакцию выдерживают 30 мин при комнатной температуре. Затем дезацетилирование проводят при 100°C водяной бане в течение 2 ч, перемешивая. Реакционную массу охлаждают, осадок отделяют на пористом стеклянном фильтре, промывают водой до нейтрального рН и высушивают в сушильном шкафу. Получают 7,0-7,2 г хитозана с содержанием белка 0,3-0,6%.
Технический результат от реализации заявленного способа заключается в получении высокомолекулярного хитозана с широким спектром потенциальных областей применения.
Основное отличие данного способа заключается в том, что после деминерализации сырье фракционировали на ситах и разделяли на различные фракции - более 5 мм, 2-5 мм и менее 2 мм. Количества хитина во фракциях определяли по отдельности: выход составлял 30, 14 и 2 % соответственно. Это свидетельствует об очень низком содержании хитина в малоразмерной фракции, которая не подвергалась дальнейшей обработке ввиду экономической нецелесообразности, однако она может быть использована в качестве кормовой добавки. Хитин подвергался реакции дезацетилирования при обработке объединенного сырья (более 2-5 и 5 мм) 50% NaOH.
Полученный хитозан был охарактеризован с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Молекулярная масса составляла 350-500 кДа, а индекс полидисперсности - 1,6-2,1. СДА хитозана рассчитывали с использованием метода кондуктометрического титрования и протонного магнитного резонанса, и она составила 87-92%.
Пример 1
3000 г личинок H. illucens 5-го возраста бланшируют. Личинки проходят обработку через пресс, в результате чего удаляют большую часть липидов, протеина и влаги. Затем обработанные таким образом личинки лиофильно высушивают и хранят в герметичных условиях (выход = 250 г).
100 г оболочек личинок деминерализуют 1 л 1% HCl, перемешивая в течение 2 ч при комнатной температуре. После этого твердый остаток отделяют на пористом стеклянном фильтре, промывают дистиллированной водой до нейтральных значений рН и высушивают в сушильном шкафу. Получают 49,2 г материи.
Далее 49,2 г деминерализованной биомассы фракционируют на ситах с размером ячеек 2 и 5 мм, депротеинируют 600 мл 30% NaOH. Вначале выдерживают 30 мин при комнатной температуре и затем проводят реакцию на водяной бане в течение 2 часов при 100°C при перемешивании. Полученный хитин отделяют на пористом стеклянном фильтре, промывают дистиллированной водой до нейтрального значения pH, высушивают в сушильном шкафу, получают 9,0 г хитина.
К 9,0 г хитина добавляют 360 мл 50% NaOH и выдерживают при комнатной температуре на 30 мин. Реакцию проводят при 100°C водяной бане в течение 2 ч, перемешивая. Реакционную массу охлаждают, осадок отделяют на пористом стеклянном фильтре, промывают водой до нейтрального рН и высушивают в сушильном шкафу (выход = 7,3 г).
Повторное дезацетилирование проводят с использованием 290 мл 50% NaOH. Реакцию выдерживают при комнатной температуре на 30 мин. Затем проводят при 100°C водяной бане в течение 2 ч, перемешивая. Реакционную массу охлаждают, осадок отделяют на пористом стеклянном фильтре, промывают водой до нейтрального рН и высушивают в сушильном шкафу. Получают 7,0 г хитозана с содержанием белка не более 0,3%.
Пример 2
Аналогично примеру 1, но после стадии депротеинирования 9,0 г хитина обрабатывают 360 мл 50% NaOH и выдерживают при комнатной температуре на 30 мин. Реакцию дезацетилирования проводят при 100°C водяной бане в течение 5 ч, перемешивая. Реакционную массу охлаждают, осадок отделяют на пористом стеклянном фильтре, промывают водой до нейтрального рН и высушивают в сушильном шкафу. Получают 7,2 г хитозана с содержанием белка около 0,6%.
Пример 3
Аналогично примеру 1, но после стадии депротеинирования  9 г хитина обрабатывают 360 мл 50% NaOH и выдерживают при комнатной температуре на 30 мин. Реакцию дезацетилирования проводят при 120°C в течение 5 ч, перемешивая. Реакционную массу охлаждают, осадок отделяют на пористом стеклянном фильтре, промывают водой до нейтрального рН и высушивают в сушильном шкафу. Получают 7,1 г хитозана с содержанием белка около 0,4%.