Изменение состава и свойств гуминовых кислот под влиянием микроорганизмов

УДК 631.411.6

ИЗМЕНЕНИЕ СОСТАВА И СВОЙСТВ ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ ПОД ВЛИЯНИЕМ МИКРООРГАНИЗМОВ

И.В. Чистяков, С.Я. Трофимов, Л.В. Лысак, А.А. Степанов

Методом гель-фильтрации на 8ерЬаёех в-50 и в-75 исследованы изменения в составе и соотношении молекулярных фракций гуминовых кислот под воздействием нативного бактериального комплекса (перегнойно-глеевая почва). Наибольшая степень разложения гуми-новой кислоты наблюдалась при росте бактериального комплекса на минеральной среде, где в качестве источника азота использовался нитрат аммония.

Появление на хроматограмме низкомолекулярной фракции может быть связано с образованием бактериями простых органических соединений при росте на среде с препаратом гу-миновой кислоты в качестве единственного источника углерода.

Ключевые слова: гуминовые кислоты, нативный бактериальный комплекс, почвенные микроорганизмы.

Введение

Молекулы гуминовых кислот (ГК) представляют собой, вероятно, наиболее сложные природные биополимеры, подвергающиеся разложению почвенными микроорганизмами. Существуют несколько гипотез механизма этого процесса. По мнению некоторых ученых [27], устойчивость ГК к действию почвенной микробиоты связана со сферической формой их молекул, состоящих из многих гетерогенных единиц, нерегулярно соединенных ковалентными связями. Для разложения требуется система внеклеточных ферментов, имеющихся у многих микроорганизмов и способных постепенно воздействовать на молекулы гу-миновых кислот. По этой причине разложение гумусовых веществ — процесс длительный, требующий участия многих микроорганизмов. Сходная концепция высказана Б. КМпЬетре1 [22], который считал, что высокая степень молекулярной неупорядоченности (структурной энтропии), присущая гуминовым кислотам, затрудняет действие на них ферментов микроорганизмов.

Факт биодеградации гуминовых кислот в почвах подтверждается тем, что существуют равновесные их концентрации (содержание гумуса), характерные для отдельных специфических почвенных экосистем. Если бы такая сложная молекула была абсолютно устойчивой к биодеградации, то при условии, что синтез катализируется и биологически и химически, следовало бы ожидать непрерывного накопления гуми-новых кислот. Однако этого не происходит [5, 16].

Анализ любой из гипотетических структур, предложенных для гуминовых кислот [10, 12, 24—26, 28, 30], позволяет определить главные причины их относительной устойчивости к биодеградации по сравнению с быстро разлагаемыми растительными компонентами. В первую очередь следует отметить, что гуминовые кислоты не содержат какой-либо одной повторяющейся субъединицы. В настоящее время считается, что

ГК — это рандомизированные полимеры, содержащие разнообразные ароматические субъединицы. Анализ гуминовых кислот, полученных из разных источников, показывает сходство качественного состава ароматических и фенольных соединений, в то же время порядок полимеризации и соотношение между разными компонентами варьируют в зависимости от источника. Практический результат такой вариабельности структуры состоит в том, что для катаболизма гуминовых кислот необходимы различные ферменты. Потребность в энергии для синтеза этой «батареи» ферментов является вторым препятствием к быстрому общему разложению гуминовых кислот. Ядро молекулы состоит из большого количества соединений, содержащих ароматические кольца, расщепление которых сопряжено со значительными тратами энергии до того, как микроорганизм получит какую-либо энергетическую «прибыль», а синтез большого количества ферментов, необходимых для полной минерализации гуминовых кислот, является энергоемким. Синтез белков требует относительно большого расхода энергии, но микроорганизмам более логично катабо-лизировать простой полимер, такой, как белок, для чего нужно всего несколько ферментов, а не создание сложных систем ферментов, чтобы минерализировать гуминовые кислоты [19, 22, 23].

Комплекс ферментов, необходимый для полной минерализации молекулы гуминовой кислоты, обязательно включает таковые, участвующие в разложении ассоциированных с ней гумифицированных веществ, таких, как белки и полисахариды. По сути, эти ферменты могут действительно обеспечить возврат основной массы углерода, азота и энергии растущему организму. В категорию ферментов такого рода входят протеазы, карбогидразы и другие гидролазы. Этот арсенал дополняется монофенолоксидазами, перок-сидазами и эстеразами, которые синтезируются, скорее всего, для других клеточных функций, но ввиду низкой субстратной специфичности участвуют в раз-

ложении гуминовых кислот [18, 20, 29]. Монофено-локсидазы и пероксидазы участвуют как в синтезе, так и в разложении, поскольку гидроксилирование ароматических ядер происходит в обоих процессах. На самом деле, вероятно, активность этих ферментов способствует в основном процессам разложения, так как ароматическое ядро должно быть гидрокси-лировано перед расщеплением. Следовательно, реакцию полимеризации можно было бы считать побочной или вторичной реакцией [16, 23]. Основной фактор, регулирующий скорость разложения гуминовых кислот, — выход энергии для роста и развития микроорганизмов. В случае сложной структуры, такой как гуминовые кислоты, наиболее эффективным будет тот организм, который использует для получения углерода и энергии ассоциированные гумифи-цированные белки и углеводы, а не сложный рандомизированный полимер из ароматических единиц [13—15, 17]. Микроорганизмы получают некоторое количество энергии за счет деградации алифатических частей молекулы и боковых цепей ароматических структур, однако остается неясным, встречаются ли эти компоненты в достаточных концентрациях, чтобы обеспечить микроорганизмы энергией для их роста. В соответствии с этим микроорганизм, участвующий в разложении гуминового вещества, должен был бы извлекать пользу главным образом из медленного катаболизма гумифицированных субстратов типа белков и углеводов при некотором прямом или комета-болическом воздействии на связанные с ними ароматические соединения [8, 9]. Трудно определить истинную природу взаимодействия микроорганизмов с гумусовыми кислотами, так как в основе подбора питательной среды лежит рабочее определение гумусовой кислоты, поскольку для получения накопительных культур микроорганизмов используется растворимый в щелочи, осаждаемый кислотой продукт [1—4, 6, 7]. Весьма вероятно, что в первую очередь микроорганизмы используют входящие в гумусовую кислоту белки, пептиды, аминокислоты и полисахариды в качестве источников углерода, азота и энергии [17, 19, 21].

Таким образом, в настоящее время существуют разные точки зрения на механизм разложения гумусовых кислот микроорганизмами, но ни одна из них не дает однозначного исчерпывающего объяснения процесса, что связано с неясностями в вопросе о молекулярной структуре ГК, которая очень сложна и до сих пор остается недостаточно исследованной. Однако характеристика продуктов разложения гуминовых кислот почвенными микроорганизмами поможет внести некоторую ясность в представления об их молекулярной структуре.

Цель нашей работы — оценка изменения моле-кулярно-массового распределения (ММР) препарата гуминовой кислоты на начальной и конечной стадиях эксперимента под воздействием нативного почвенного комплекса микроорганизмов.

Объекты и методы исследования

Объект исследования — коммерческий препарат гуминовой кислоты из бурого угля производства фирмы «Агросинтез». Это 10%-й гель гуминовой кислоты, рН 6,5, концентрация углерода — 56,49%, водорода — 3,73, азота — 1,41, кислорода — 36,70%. ГК в виде геля добавляли в 100 мл минеральной среды до конечной концентрации 0,01%. Состав минеральной среды (г/л): КН2РО4 — 0,9; К2НРО4 — 1,7; Мб8О4 — 0,3; СаС12 — 0,1; — 0,5. В некоторых случаях в минеральную среду добавляли (г/л): дрожжевой экстракт — 0,1; сахарозу — 0,01; (N^^04 — 0,01. Среду стерилизовали в автоклаве при 1 атм. 20 мин., после чего ее инокулировали нативным бактериальным комплексом из перегнойно-глеевой почвы до конечной концентрации 108 кл/мл и инкубировали на качалке (180 об/мин.). Нативный бактериальный комплекс (НБК) получали из свежеотобранного образца пе-регнойно-глеевой почвы по методу П.А. Кожевина [5]. Продолжительность опыта — 2 мес. Опыт ставили в следующих вариантах: I — контроль — водный раствор ГК + НБК; II — ГК + минеральная среда + дрожжевой экстракт + НБК; III — ГК + минеральная среда + НБК; IV — ГК + минеральная среда + НБК + + 0,01 г сахарозы; V — ГК + минеральная среда + + НБК + 0,01 г N^N03.

Для изучения процесса деструкции гумусовых кислот и характеристики изменений, произошедших в их структуре после действия бактерий, был применен метод гель-фильтрации. Колоночную жидкостную хроматографию ГК до и после их инкубации с бактериями проводили с использованием гелей 8е-рИаёех 0-50 и 0-75; элюирующий раствор — трис-НС1-буфер (рН 7,2). При определении молекулярно-массового распределения препарата ГК и продуктов деструкции использовали хроматографическую колонку 10 х 560 мм (ЬКБ). Скорость элюции — 10 мл/ч, чувствительность в зависимости от концентрации раствора образца — 0,05; 0,1; 0,2. Профили элюции получали измерением поглощения раствора с помощью УФ-детектора 2138 Цугсогё 8 в проточной кварцевой кювете при 280 нм. Показания прибора регистрировали на двухканальном самописце 2210. Молекулярные массы рассчитывали по формулам Детермана [12]. Применение двух марок геля было обусловлено тем, что на 8ерИаёех 0-50 для всех веществ с молекулярными массами выше 23 400 атомных единиц массы (а.е.м.) объем выхода равен свободному объему, что позволяет более точно оценить изменения в структуре ГК в области средних и низких молекулярных масс. Для 8ерИаёех 0-75 предел эксклюзии составляет 74 400, т.е. в этом случае можно точнее оценить изменения в области высоких молекулярных масс.

Результаты и их обсуждение

В начале эксперимента было проведено хрома-тографирование исходного препарата ГК, выделен-

ного из бурого угля (рис. 1). Кривая элюции содержит три максимума, что свидетельствует о присутствии в составе исследуемых ГК фракций с молекулярной массой около 70 000, 30 000—11 000 и 7000—4000 а.е.м. При фракционировании препарата на БерИаёех 0-50 большая часть среднемолекуляр-ных компонентов ГК выходит в свободном объеме (ММ > 23 000 а.е.м.), поэтому правое плечо хрома-тограммы содержит два пика — с ММ около 7000 и 5000 а.е.м. Двухмесячная инкубация исходного препарата с НБК приводит к изменению характера моле-кулярно-массового распределения ГК. На хромато-грамме (рис. 1, вариант I), выполненной на геле 0-75, увеличивается интенсивность пика с ММ 7000 а.е.м. и появляется дополнительный пик с ММ около 4500 а.е.м. Кривая элюции, выполненная на БерИа-ёех 0-50, изменяется аналогичным образом. На первом максимуме формируется «плечо», обусловленное увеличением доли среднемолекулярных компонентов в составе исследуемого препарата. Кроме того,

Рис. 1. Молекулярно-массовое распределение исходного препарата

увеличивается интенсивность двух низкомолекулярных пиков.

Накопление вещества с помощью коллектора фракций «LKB 2212» позволило провести анализ элементного состава отдельных пиков на углерод-, водород-, азот- и кислород-анализаторе «Vario EL III». Молекулярные фракции исходного препарата ГК имели следующий состав: 1-й пик (~ 70 000 а.е.м.): C - 57,26; H - 2,22; N - 1,56; O - 38,1; 2-й пик (30 000-11 000 а.е.м.): C - 56,59; H - 3,97; N - 1,58; O - 37,7; 3-й пик (7000-4000 а.е.м.): C - 56,31; H - 3,73; N - 1,48; O - 37,9.

После инкубации исходного препарата с НБК произошли некоторые изменения в элементном составе фракций: 1-й пик (- 70 000 а.е.м.): C - 57,24; H - 2,23; N - 1,51; O - 38,7; 2-й пик (30 000-11 000 а.е.м.): C - 57,07; H - 3,00; N - 1,56; O - 37,1; 3-й пик (- 7000 а.е.м.): C - 51,10; H - 4,62; N - 1,62; O -42,0; 4-й пик (4500 а.е.м.): C - 30,07; H - 2,13; N - 1,70; O - 65,2.

гуминовых кислот

V, мл V, мл

Рис. 2. Молекулярно-массовое распределение гуминовых кислот в вариантах опыта с разными добавками

Состав средне- и низкомолекулярных фракций после инкубации ГК с НБК заметно отличается от такового фракций исходного препарата: снижается содержание углерода и увеличивается содержание азота и кислорода. Возможно, это связано с накоплением в составе данных фракций, с одной стороны, продуктов деструкции ГК, с другой — продуктов жизнедеятельности микроорганизмов (углеводов, аминокислот, аминосахаров, полиолов и проч.).

В следующих вариантах опыта для лучшего роста и размножения микроорганизмов мы использовали питательную минеральную среду с добавлением дрожжевого экстракта (источник витаминов для бактерий) и сахарозы (для изучения возможности разложения ГК в условия соокисления).

Присутствие в составе питательной среды дрожжевого экстракта (рис. 2, вариант II) не изменило характер ММР и соотношение фракций в составе исследуемых ГК. Можно предположить, что в этом случае микроорганизмы используют для роста и разви-

тия дрожжевой экстракт, а не разлагают ГК. Поэтому в дальнейшем мы исключили дрожжевой экстракт из состава среды (вариант III), а также вводили в состав среды 0,01 г сахарозы (вариант IV) и 0,01 г нитрата аммония (вариант V).

Выводы

Анализ полученных хроматограмм позволяет сделать вывод о том, что разложение гуминовых кислот микроорганизмами происходит наиболее активно при добавлении в качестве дополнительного источника азота нитрата аммония и питательной среды без дрожжевого экстракта. Такой результат можно объяснить тем, что в составе периферийных частей ГК относительно мало легко доступного для микроорганизмов азота (в гидролизуемой части он в основном содержится в аминокислотах и аминосахарах — около 8—9% от всей ГК). Азот в форме нитрата аммония легко усваивается микроорганизмами и может акти-

визировать разложение ими более стойкой молекулы ГК. В гидролизуемой ее части углеводов больше (около 30%), поэтому при добавлении сахарозы в качестве источника энергии не происходит такого активного разложения, т.е. прайминг-эффекта не наблюдается.

Характер изменений ММР анализируемых ГК позволяет предположить, что появление на их хро-матограммах в разных вариантах опыта низкомолекулярной фракции связано с жизнедеятельностью бактерий и накоплением продуктов деструкции гуми-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Емцев В.Т. Закономерности трансформации органических веществ анаэробными бактериями, выделенными из почв различных типов / Микробиологическая деструкция органических остатков в биогеоценозе. М., 1987.

2. Заварзин Г.А. Лекции по природоведческой микробиологии. М., 2003.

3. Звягинцев Д.Г. Почва и микроорганизмы. М., 1987.

4. Звягинцев Д.Г, Шаповалов А.А., Пуцыкин Ю.Г. и др. Очистка гуминовых кислот с помощью почвенных микроорганизмов // ДАН. 2008. Т. 420, № 5.

5. Кожевин П.А. Микробные популяции в природе. М., 1989.

6. Кононова М.М. Формирование гумуса в почве и его разложение // Успехи микробиол. 1976. Т. 11.

7. Кудрина Е. С. Влияние гуминовой кислоты на некоторые группы почвенных микроорганизмов и ее значение для этих организмов как источника питательных веществ // Тез. докл. Почв. ин-та им. Докучаева АН СССР. 1951. Т. 38.

8. Лысак Л.В., Добровольская Т.Т., Скворцова И.Н. Методы выделения и идентификации почвенных бактерий. М., 2003.

9. Мишустин Е.Н., Никитин Д.И., Очилова М. Микроорганизмы, разлагающие гуминовую кислоту почвы // Докл. сов. почвовед. к VII Междунар. конгр. в США. М., 1960.

10. Никитин Д.И. Разложение почвенных гуминовых кислот микроорганизмами. Изв. АН СССР. Сер. биол. 1960. № 4.

11. Орлов Д.С. Гумусовые кислоты почв и общая теория гумификации. М., 1990.

12. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М., 1985.

13. Перминова И.В., Карпюк Л.А, Щербина Н.С. и др. Дизайн адгезионных гуминовых полимеров и их самосборка в биосовместимые нанопокрытия / Сб. тез. докл. участ. Второго международ. форума по нанотехнологиям. 6—8 октября 2009. Секция 11. Химические технологии на-номатериалов. М., 2009.

14. Ручко Р.В. Трансформация гумусовых веществ анаэробными бактериями рода Clostridium: Автореф. дисс. ... канд. биол. наук. М., 1984.

15. Сидоренко О.Д., Аристархова В.И, Черников В.А. Изменение состава и свойства гуминовой кислоты под воздействием микроорганизмов рода Nocardia // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1978. № 2.

новых веществ — простых органических соединений, составлявших ранее периферийную часть молекул ГК. Появление дополнительных максимумов в высоко-и среднемолекулярной области хроматограмм обусловлено формированием надмолекулярных структур — мицелл и агрегатов ГК (и, возможно, молекул белка или других продуктов микробного синтеза), устойчивость которых поддерживается многочисленными водородными мостиками, гидрофобным взаимодействием или другими слабыми связями.

16. Стом Д.И, Боярова Н.А., Дагуров А.В. и др. Возможные механизмы биологического действия гуминовыгх веществ // Сиб. мед. журн. (Иркутск). 2008. Т. 81, № 6.

17. Тейт Р. Органическое вещество почвы. М., 1991.

18. Тихонов В.В., Якушев А.В, Завгородняя Ю.А. и др. Действие гуминовыгх кислот на рост бактерий // Почвоведение. 2010. № 3.

19. Туев Н.А. Микробиологические процессы гумусо-образования. М., 1989.

20. Федоров М.В., Ильина Т.Х.Микробная трансформация гумуса // Микробиол. 1963. Т. 32.

21. Цыганова Е.Н, Звягинцев Д.Т., Лысак Л.В., Степанов А.Л. Микробная трансформация грибного мицелия как возможного предшественника гуминовых кислот // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 17. Почвоведение. 2011. № 1.

22. Kleinhempel D. // Eun Beutrag zur Fheorie des Hu-minstoff zur Standes. Albrecht—Thaer—Archiv. 1970. N 14(1).

23. Laird D.A. Nature of Clay-Humic Complexes in an Agricultural Soil: Chemical, Biochemical, and Spectroscopic Analysis // Soil Sci. Soc. Am. J. 2001. Vol. 65.

24. Piccolo A., Conte P., Cozzolino A., Spaccini R. Molecular Sizes and Association Forces of Humic Substances in Solution. In: Humic Substances and Chemical Contaminants. Madison, 2001.

25. Pullerton V. Humic substances and microorganisms: influence and answer // Royal Soc. of Chem. Cambridge, 2000.

26. Spaccini R., Piccolo A., Conte P. et al. Increased soil organic carbon sequestration through hydrophobic protection by humic substances // Soil Biology and Biochemistry. 2002. Vol. 34, N 12.

27. Stevenson F.J. Humates: Facts and fantasies on their value as commercial soil amendments // Crops and Soils Magazine. 1979. Vol. 5.

28. Stevenson F.J. Humic chemistry: genesis, composition, reactions. In: Humic chemistry. N.Y., 1982.

29. Swift R.S., Ladd J.N. Chemical nature, microbial resistance and origin of soil humus // Intern. soil conf. Wellington, 1962.

30. Zavarzina A.G., Leontievsky A.A., Golovleva L.A, Tro-fimov S.Ya. Biotransformation of soil humic acids by blue laccase of Panus tigrinus 8/186 an in vitro study // Soil Biol. and Biochem. 2004. Vol. 36.

Поступила в редакцию 16.07.2012

CHANGES IN THE COMPOSITION AND PROPERTIES

OF HUMIC ACIDS UNDER THE INFLUENCE OF MICROORGANISMS

I.V. Chistyakov, S.Ya. Trofimov, L.V. Lysak, A.A. Stepanov

By gel filtration on Sephadex G-50 and G-75 have investigated the changes in the composition and the ratio of the molecular fractions of humic acids under the influence of native soil microbial complex from soil. The highest degree of decomposition of the initial HA was observed when used as a source of additional energy of ammonium nitrate and mineral nutrient medium without yeast extract.

The appearance on chromatograms low molecular fraction of organic substances may be connected with the syntheses by bacteria simple organic substances on the medium with humic acids as the single course carbon.

Key words: humic acids, native soil bacterial complex, soil microorganisms.

Сведения об авторе

Чистяков Игорь Владимирович, аспирант каф. химии почв ф-та почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова. Тел.: 8 (495) 939-22-71. Трофимов Сергей Яковлевич, докт. биол. наук, профессор, зав. каф. химии почв ф-та почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова. Тел.: 8 (495) 932-11-82; e-mail: strofimov@inbox.ru. Лысак Людмила Вячеславовна, докт. биол. наук, доцент каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова. Тел.: 8 (495) 939-22-17; e-mail: lvlysak@mail.ru. Степанов Андрей Анатольевич, канд. биол. наук, ст. науч. сотр. каф. химии почв ф-та почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова. Тел.: 8 (495) 939-22-71; e-mail: stepan.1963@mail.ru.