Влияние бактериального липополисахарида Escherichia coli, введенного самцам крыс, на активность некоторых ферментов в цитоплазме сперматоцитов первого порядка

© ПОПЛАВСКАЯ Е.А., ЛИС Р.Е., 2013

ВЛИЯНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОГО ЛИПОПОЛИСАХАРИДА Escherichia гоИ, ВВЕДЕННОГО САМЦАМ КРЫС, НА АКТИВНОСТЬ НЕКОТОРЫХ ФЕРМЕНТОВ В ЦИТОПЛАЗМЕ СПЕРМАТОЦИТОВ ПЕРВОГО ПОРЯДКА

ПОПЛАВСКАЯ Е.А., ЛИС Р.Е.

УО «Гродненский государственный медицинский университет»

Резюме.

В работе изложены результаты экспериментальных исследований, касающихся влияния бактериального липополисахарида E.coli, введенного самцам крыс, на активность Г6ФДГ, ЛДГ, НАДН2ДГ и НАДФН2ДГ в цитоплазме сперматоцитов 1-го порядка семенных канальцев на 10-60 сутки после введения. Показано, что введение ЛПС E.coli самцам белых крыс приводит к снижению уровня активности ключевых ферментов пентозофосфатного шунта, анаэробного гликолиза, а также НАДН-дегидрогеназы и НАДФН-дегидрогеназы в цитоплазме сперматоцитов 1-го порядка семенных канальцев в течение длительного периода после введения.

Ключевые слова: бактериальный липополисахарид, семенник, ферменты.

Abstract.

The paper deals with the results of experimental studies concerning the influence of bacterial lipopolysaccharide E.coli, administered to male rats, on the activity of G6PDH, LDH, NADH-dehydrogenase and NADPH-dehydrogenase in the cytoplasm of primary spermatocytes of the seminiferous tubules on the 10th-60th days after administration. The administration of LPS E.coli to white male rats was shown to lead to decreased level of the activity of key enzymes of the pentose phosphate shunt, anaerobic glycolysis, and NADH-dehydrogenase and NADPH-dehydrogenase in the cytoplasm of primary spermatocytes of the seminiferous tubules for a long period after administration.

Key words: bacterial lipopolysaccharide, testis, enzymes.

В настоящее время во многих странах мира наблюдается неблагоприятная демографическая ситуация. Эта проблема является актуальной и для Беларуси. Снижение прироста населения обусловлено как социальными, так и биологическими аспектами. В качестве социальных аспектов выступают: во-первых, вступление в фазу генерации поколения второй половины 80-х, первой половины 90-х годов прошлого века, когда рождаемость была снижена, во-вторых, менталитет населения в отношении численности семьи. Биологическими аспектами являются возрастание мужского и женского бесплодия, а также возрастание числа невынашиваний беременности. Значительно повлиять на социальный аспект данной проблемы не представляется возможным,

поэтому внимание исследователей концентрируется, прежде всего, на вопросах снижения процента невынашивания беременности. По разным данным, в 20-40% случаев причина невынашиваний беременности остается до конца неясной [4, 8, 14].

Невынашивание беременности может происходить как в результате преждевременной родовой деятельности, так и в результате гибели зародыша. Среди причин гибели зародыша инфекции, возбудителями которых выступают как грамположительные, так и грамотрицательные микроорганизмы, рассматриваются как ведущий фактор [3]. Кроме жизнеспособных грамотрицательных микробов, эмбриотоксическое действие оказывают и их эндотоксины, представляющие собой

липополисахариды (ЛПС). Известно, что бактериальные липополисахариды грамотрица-тельных микроорганизмов при воздействии на организм матери во время беременности вызывают нарушения процессов антенатального развития, и, как следствие, приводят к нарушениям процессов постнатального развития потомства [1, 6]. При этом наблюдается прямой контакт эндотоксинов с организмом матери. Все вышеприведённые факты ставят во главу угла в этиологии прерывания беременности или нарушений процессов антенатального развития только взаимоотношение организма матери и зародыша [2]. Однако, согласно нашим исследованиям, бактериальные липополисахариды грамотрицательных микроорганизмов, введенные самцам крыс за 45-55 суток до спаривания, приводят к резкому увеличению доимплантационной гибели их потомства [10, 11]. В данном случае прямое действие липополисахаридов на зародыш исключается, так как единственным связующим звеном между организмом самки и самца является сперматозоид. Исходя из этого, можно предположить, что одной из причин репродуктивных потерь является нарушение сперматогенеза под воздействием липополисахаридов грамотрицательных микроорганизмов.

Сперматогенез - сложный многостадийный процесс роста, созревания и формирования сперматозоидов из незрелых половых клеток. Нормальное протекание сперматогенеза требует скоординированного влияния многочисленных факторов - генетических, клеточных, гормональных и других. Подобная сложность делает сперматогенез «легкой мишенью» для всякого рода негативных воздействий, в том числе и воздействия липополисахаридов грамотрицательных микроорганизмов [12]. На наш взгляд, клетки сперматогенного эпителия наиболее подвержены воздействиям различных факторов в профазе первого мейотическо-го деления из-за большой продолжительности фазы и уникальности процессов, происходящих при этом: коньюгации и кроссинговера гомологичных хромосом.

В связи с вышеизложенным, представляет несомненный интерес исследование влияния бактериальных ЛПС грамотрицательных микроорганизмов на сперматогенез и, в частности, на клетки сперматогенного эпителия семенных канальцев семенников. Поэтому в

нашем исследовании была поставлена цель -изучить влияние бактериального липополисахарида Escherichia coli (E.coli), введенного самцам крыс, на активность ключевых ферментов пентозофосфатного шунта, анаэробного гликолиза, а также НАДН2-дегидрогеназы и НАДФН2-дегидрогеназы в цитоплазме сперматоцитов 1-го порядка семенных канальцев на 10 - 60 сутки после введения.

Методы

Объектом исследования являлись половозрелые самцы беспородных белых крыс. В качестве агента воздействия использовали бактериальный липополисахарид Escherichia coli серотип 0111:B4, производство фирмы «Sigma», США.

В эксперименте было использовано 78 самцов беспородных белых крыс. Масса самцов составляла 200 - 250 грамм. Все животные содержались в стандартных условиях вивария с соблюдением требований, изложенных в Хельсинской декларации о гуманном обращении с животными.

Из самцов были сформированы шесть подопытных, шесть контрольных и одна ин-тактная группы. Самцам подопытных групп вводился ЛПС Е. соИ в дозе 50 мкг/кг массы внутрибрюшинно, однократно. Самцам контрольных групп вводили физиологический раствор в эквиобъёмном количестве. Самцы интактной группы не подвергались никаким воздействиям. На 10-й, 20-й, 30-й, 40-й, 50-й и 60-й дни после воздействия ЛПС самцов подопытных, контрольных и интактной групп усыпляли парами эфира с последующей де-капитацией. Животных вскрывали и выделяли семенники. Сразу после взятия половину семенника замораживали в жидком азоте. Из замороженного кусочка семенника готовили криостатные срезы толщиной 10 мкм в микротоме-криостате Microm HM 525 при температуре минус 25°С. На криостатных срезах проводили гистохимические реакции по выявлению активности: лактатдегидро-геназы

- показателя активности митохондриальных процессов; глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы

- показателя обеспеченности синтетических процессов [5, 7]. Все гистохимические исследования сопровождались безсубстратными кон-тролями.

Уровень активности ферментов учитывали с помощью компьютерной системы анализа изображений БЮБСЛМ-МТ по коэффициенту пропускания окрашенного среза в единицах оптической плотности. Оценку достоверности изменения численных значений проводили с помощью непараметрической статистики с применением компьютерной программы 81ай8йса 6.0 для Windows. Сравнение групп по одному признаку осуществляли с помощью критерия Манна-Уитни для независимых выборок (Мапп^ЫШеу U-test). Различие между показателями считали статистически достоверными, если вероятность ошибочной оценки не превышала 5% (р<0,05).

Результаты

У самцов, получавших ЛПС Е. соН, происходило значительное снижение уровня активности исследуемых ферментов в цитоплазме сперматоцитов 1-го порядка на все сроки после введения.

На 10-е сутки после введения происходило снижение уровня активности всех исследуемых ферментов: активность ГбФДГснижена на 53,04%; ЛДГ - на 37,89%; НАДН2ДГ - на

40,28% и НАДФН2ДГ - на 32,24%. Различия статистически достоверны по сравнению и с интактными и контрольными показателями (рис. 1). У контрольных животных активность Г6ФДГ была снижена на 46,20%, ЛДГ - на 25,76%, НАДН2ДГ - на 34,89%, НАДФН2ДГ

- на 26,80% (рис.1).

На 20-е сутки после введения происходило снижение уровня активности Г6ФДГ на 71,93%, ЛДГ - на 19,66%, НАДН2ДГ - на 28,38%, НАДФН2ДГ - на 14,31%. Различия были статистически достоверными по сравнению с интактными показателями (рис. 2). Наблюдались статистически достоверные различия и по сравнению с контрольными показателями: были снижены Г6ФДГ- на 65,44% и НАДН2ДГ - на 22,71% (рис. 2).

На 30-е сутки после введения происходило снижение уровня активности следующих ферментов: Г6ФДГ - на 35,95%, НАДН2ДГ -на 33,68%, НАДФН2ДГ - на 22,48%. При этом различия были статистически достоверными по сравнению с интактными показателями (рис. 3). Происходило статистически достоверное снижение уровня активности по сравнению с контрольными показателями перечисленных ниже ферментов: НАДН2ДГ - на 39,73%, НАДФН2ДГ - на 17,87%. Однако статистически достоверно повышался уровень активности ЛДГ по сравнению с контрольными показателями и составлял 15,21% (рис. 3).

Рисунок 1 - Уровень активности (в единицах оптической плотности х 1000) Г6ФДГ, ЛДГ, НАДДГ и НАДФДГ в цитоплазме сперматоцитов I порядка самцов интактных, контрольных и подопытных групп на 10-е сутки после воздействия. Примечание: Р<0,05*- статистически достоверные различия с интактными показателями; р<0,05+- статистически достоверные различия с контрольными показателями.

Рисунок 2 - Уровень активности (в единицах оптической плотности х 1000) Г6ФДГ, ЛДГ, НАДДГ и НАДФДГ в цитоплазме сперматоцитов I порядка самцов интактных, контрольных и подопытных групп на 20-е сутки после воздействия. Примечание: Р<0,05*- статистически достоверные различия с интактными показателями; р<0,05+- статистически достоверные различия с контрольными показателями.

Г-б-ФДГ ЛДГ НАДДГ НАДФДГ

интактные  контроль Е.соИ

Рисунок 3 - Уровень активности (в единицах оптической плотности х 1000) Г6ФДГ, ЛДГ, НАДДГ и НАДФДГ в цитоплазме сперматоцитов I порядка самцов интактных, контрольных и подопытных групп на 30-е сутки после воздействия. Примечание: Р<0,05*- статистически достоверные различия с интактными показателями; р<0,05+- статистически достоверные различия с контрольными показателями.

На 40-е сутки после введения происходило снижение уровня активности Г6ФДГ - на 58,67% и ЛДГ - на 8,32%. Различия были статистически достоверными с интактными показателями (рис. 4). Статистически достоверно по сравнению с контрольными показателями снижался уровень активности Г6ФДГ и составлял 45,52% (рис. 4).

На 50-е сутки после введения наблюдалось статистически достоверное снижение уровня активности Г6ФДГ - на 27,06% и

НАДН2ДГ - на 31,72 % по сравнению с интактными показателями (рис. 5). Наблюдались также статистически достоверные различия и с контрольными показателями: были снижены НАДН2ДГ и НАДФН2ДГ - на 28,07% и 6,17% соответственно (рис. 5).

На 60-е сутки после введения также происходило снижение уровня активности всех исследуемых ферментов, однако статистически достоверные различия наблюдались по сравнению с интактными показателями в измене-

Г-б-ФДГ ЛДГ НАДДГ НАДФДГ

интактные  контроль Е.соІІ

Рисунок 4 - Уровень активности (в единицах оптической плотности х 1000) Г6ФДГ, ЛДГ, НАДДГ и НАДФДГ в цитоплазме сперматоцитов I порядка самцов интактных, контрольных и подопытных групп на 40-е сутки после воздействия. Примечание: Р<0,05* - статистически достоверные различия с интактными показателями; р<0,05+ - статистически достоверные различия с контрольными показателями.

Г-б-ФДГ ЛДГ НАДДГ НАДФДГ

интактные  контроль Е.соІІ

Рисунок 5 - Уровень активности (в единицах оптической плотности х 1000) Г6ФДГ, ЛДГ, НАДДГ и НАДФДГ в цитоплазме сперматоцитов I порядка самцов интактных, контрольных и подопытных групп на 50-е сутки после воздействия. Примечание: Р<0,05*- статистически достоверные различия с интактными показателями; р<0,05+- статистически достоверные различия с контрольными показателями.

нии уровня активности ЛДГ (на 18,48%) (рис. 6). Статистически достоверно по сравнению с контрольными показателями снижался уровень активности Г6ФДГ, ЛДГ, НАДФН2ДГ и составлял 12,85%, 13,91% и 7,95% соответственно (рис. 6).

Обсуждение

Согласно полученным данным, введение ЛПС Е.соИ вызывает у самцов белых крыс снижение уровня активности Г6ФДГ, ЛДГ, НАДН2ДГ и НАДФН2ДГ на все исследуемые

сроки после введения. На 10-е сутки после введения происходит достоверное снижение уровня активности всех исследуемых ферментов по сравнению с интактными показателями. Наблюдаются также статистически достоверные различия всех исследуемых ферментов и с контрольными показателями, кроме ЛДГ. Снижение активности ферментов наблюдается и все последующие сроки после введения. На 20-е сутки достоверно по сравнению с интакт-ными снижается уровень активности Г6ФДГ, ЛДГ, НАДН2ДГ и НАДФН2ДГ, по сравнению с контрольными - Г6ФДГ и НАДН2ДГ. На 30-е

120 -100 -80 -60 -40 -20 -0

ШЖ

Г-б-ФДГ ЛДГ НАДДГ НАДФДГ

интактные  контроль Е.соИ

Рисунок 6 - Уровень активности (в единицах оптической плотности х 1000) Г6ФДГ, ЛДГ, НАДДГ и НАДФДГ в цитоплазме сперматоцитов I порядка самцов интактных, контрольных и подопытных групп на 60-е сутки после воздействия. Примечание: Р<0,05*- статистически достоверные различия с интактными показателями; р<0,05+- статистически достоверные различия с контрольными показателями.

сутки снижается уровень активности Г6ФДГ, НАДН2ДГ и НАДФН2ДГ, различия статистически достоверны по сравнению с интактными показателями. По сравнению с контрольными показателями снижается уровень активности НАДН2ДГ и НАДФН2ДГ. В свою очередь, уровень активности ЛДГ повышается - различия статистически достоверны по сравнению с контрольными показателями. На 40-е сутки после введения происходит снижение уровня активности ферментов Г6ФДГ, различия статистически достоверны и с интактными, и с контрольными показателями. Происходит также снижение уровня активности ЛДГ по сравнению с интактными показателями. Уровень активности НАДН2ДГ и НАДФН2ДГ не имеет достоверных различий ни с интакт-ными, ни с контрольными показателями. На 50-е сутки после введения наблюдается статистически достоверное снижение уровня активности Г6ФДГ и НАДН2ДГ по сравнению с интактными показателями. Достоверно снижены также уровни активности НАДН2ДГ и НАДФН2ДГ по сравнению с контрольными показателями. Уровень активности ЛДГ практически от интактных и контрольных показателей не отличается. На 60-е сутки после введения ЛПС Е.соИ также происходит снижение уровня активности всех исследуемых ферментов. Однако статистически достоверные раз-

личия наблюдаются по сравнению с интакт-ными показателями только уровня активности ЛДГ, а по сравнению с контрольными - уровней активности Г6ФДГ, ЛДГ и НАДФН2ДГ. Изменение уровня активности НАДН2ДГ по сравнению с интактными и контрольными показателями статистически не достоверно.

Изменение уровня активности исследуемых ферментов является следствием изменения окислительного статуса в организме крыс и, в частности, в семенниках, в ответ на введение ЛПС [13]. Снижение активности НАДФН2ДГ свидетельствует об уменьшении выработки НАДФН2, который используется для восстановления активности антиоксидантов (глу-татиона, аскорбиновой кислоты и витамина Е) [9]. В свою очередь, снижение выработки НАДФН2 подтверждается также уменьшением уровня активности Г6ФДГ, ключевого фермента пентозофосфатного шунта [5], которое регистрируется практически во все сроки после введения липополисахарида. Известно, что пентозофосфатный шунт является одним из основных поставщиков восстановленной формы НАДФ в организме. Снижение активности НАДН2ДГ - первого фермента элек-трон-транспортной цепи - свидетельствует об ослаблении окисления в дыхательной цепи митохондрий НАД-зависимых субстратов с получением АТФ.

Заключение

Введение ЛПС Е.соИ самцам белых крыс приводит к снижению уровня активности Г6ФДГ, ЛДГ, НАДН2ДГ и НАДФН2ДГ в цитоплазме сперматоцитов первого порядка в течение длительного периода после введения. Изменение активности вышеперечисленных ферментов связано напрямую или косвенно с процессами окислительного стресса, который вызывается введением липополисахарида.

Литература

1. Бандажевский, Ю.И. Иммунная регуляция онтогенеза. - Гомель: Гомел. гос. мед. ун-т, 1994.

- 59 с.

2. Качество гамет и особенности гормонального статуса мужчин из супружеских пар с неблагоприятным течением беременности / С. Р. Бе-ломестнов [и др.] // Мать и Дитя: материалы 4 Рос. форума. - М., 2004. - С. 602-603.

3. Гуртовой, Б.Л. Применение антибиотиков в акушерстве и гинекологии / Б.Л. Гуртовой, В. И. Кулаков, С. Д. Воропаева. - 2-е изд., доп. и испр. - М.:Триада-Х,1Д 2004. - 176 с.

4. Доброхотова, Ю. Э. Неразвивающаяся беременность: учебно-методическое пособие / Ю. Э. Доброхотова, Т. Н. Савченко; под ред.О. В. Макарова. - М.: РГМУ, 2002. - С. 5-10.

5. Ковальский, Г.Б. Количественная гистохимия дегидрогеназ // Введение в количественную гистохимию ферментов / Г. Б. Ковальский, Т. В. Журавлева, Р. А. Прочуханова; под ред. Т. В. Журавлевой, Р. А. Прочухановой. - М.: Медицина, 1978. - 58 с.

6. Лис, Р.Е. Влияние бактериального липополиса-харида продигиозана на антенатальный нейро-

генез коры больших полушарий плодов белых крыс / Р. Е. Лис, Ю.И. Бандажевский // Изв. АН БССР. Сер. биол. наук. - 1986. - № 4. - С. 76-79.

7. Лойда, З. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы / З. Лойда, Р. Госсрау, Т. Шиблер.

- М.: Мир, 1982. - 272 с.

8. Тромбофилические состояния в акушерской и гинекологической практике / А.Д. Макацария [и др.] // Новые технологии в акушерстве и гинекологии: матер. науч. фор. - М., 1999. - С. 239-47.

9. Оковитый, С.В. Клиническая фармакология антиоксидантов / С. В. Оковитый. - ФАРМин-декс-Практик, 2003. - № 5. - С. 85-111.

10. Поплавская, Е.А. Эмбриотропное действие бактериальных липополисахаридов грамо-трицательных микроорганизмов (Е. соН и S. marcescens) при введении их самцам крыс перед спариванием / Е.А. Поплавская, Р.Е. Лис // Журн. ГрГМУ - 2007. - № 1. - С. 165-66.

11. Поплавская, Е.А. Влияние бактериальных липополисахаридов E. coli и S. marcescens, введённых самцам крыс перед спариванием, на показатели пре- и постимплантационной гибели и развитие плодов / Е. А. Поплавская, Р. Е. Лис // Новости мед.-биол. наук. News of biomedical sciens. - 2012. - Т. 6, № 4. - C. 140-44.

12. Черных, В. Что такое репродукция. Мужское бесплодие // Журн. 9 месяцев. - № 9. - 2005. - C. 1-3.

13. Aly, H.A. Mitochondrial dysfunction induced impairment of spermatogenesis in LPS-treated rats: modulatory role of lycopene / H.A. Aly, H.A. El-Beshbishy, Z.M. Banjar // Eur J Pharmacol. -2012. - Vol. 677, N 1-3. - P. 31-8.

14. Picciano, M.F. Is homocysteine a biomarker for identifying women at risk of complications and adverse pregnancy outcomes? / M.F. Picciano // Am J Clin Nutr. - 2000. - Vol. 71, N 4. - P. 857-58.

Поступила 08.10.2013 г. Принята в печать 06.12.2013 г.

Сведения об авторах:

Поплавская Е.А. - ассистент кафедры гистологии, цитологии, эмбриологии УО «ГрГМУ»;

Лис Р.Е. - к.б.н., ассистент кафедры гистологии, цитологии, эмбриологии УО «ГрГМУ».

Адрес для корреспонденции: 230021, г. Гродно, ул. Белые Росы, 71А-42. Тел.моб.: +375 (29) 580-72-02, e-mail: Len.poplavska@mail.ru - Поплавская Елена Александровна.