Генетический полиморфизм сортов картофеля при использовании метода RAPD

Литература.

1. Савостьянов В.К. Освоение целинных и залежных земель в Восточной Сибири. В сб., поев. 50-летию целинных и залежных земель в Сибири. СО Россельхозакадемии. Новосибирск, 2004, с. 110-118.

2. Субрегиональная национальная программа действий по борьбе с опустыниванием для юга Средней Сибири Российской Федерации (Республика Хакасия, Республика Тыва, южные районы Красноярского края)// Программа ООН по окружающей среде, Центр Международных проектов, НИИ аграрных проблем Хакасии СО РАСХН. Коллектив авторов. Научн. рук. и отв. редактор В.КСавостьянов. Абакан, 2000.- 295 с.

3. Савостьянов В.К.. Научное обеспечение АПК засушлевой зоны Средней Сибири// Достижения науки и техники АПК. — 2007. — №5. - с.9-21.

4. Савостьянов В.К. Консервация земель в аридной зоне. //Аграрная наука. — 2004. -Ml.— с. 14-16.

5. Концепция ведения сельскохозяйственного производства в засушливых условиях // Россельхозакадемия, Сиб. отд., НИИ аграрных проблем Хакасии. Сост. В.К.Савостьянов. Абакан, 2006,- 6 с.

6. Межрегиональная схема специализации сельскохозяйственного производства в субъектах Российской Федерации Сибирского Федерального округа // Сибирское отделение Россельхозакадемии, Межрегиональная ассоциация «Сибирское соглашение», аппарат Полномочного представителя Президента Российской Федерации в Сибирском Федеральном округе. Под ред. А.С.Донченко, Н.И.Каше-варова, В.К.Каличкина. Новосибирск, 2008.

7. Савостьянов В.К. Использование опустыненных земель аридной зоны: современное состояние и ближайшие задачи. Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. — 2004. — №2. — с. 112-114.

8. Концепция и технологии земледелия в аридной зоне Алтае-Саянского субрегиона //Россельхозакадемия, Сиб. отд., НИИ аграрных проблем Хакасии, Бурятский НИИСХ, Горно-Алтайский НИИСХ, Тувинский НИИСХ, НИИ растениеводства и земледелия Монголии. Под ред. В.К.Савостьянова, А.Т.Подкорытова, Ж.Мижиддоржа, Ч.М.Санданова, Р.Б.Чысыма. Абакан, 2009.- 378 с.

9. Повышение эффективности сельскохозяйственного производства на опустыненных землях аридной зоны // Россельхозакадемия, Сиб. отд., НИИ аграрных проблем Хакасии, ТувНИИСХ, УВС-Отделение НИИ растениеводства и земледе-лия Монголии. Под ред. В.К.Савостьянова, Р.Б.Чысыма, Д.Улзий. Абакан, 2006,- 196 с.

10. Технологии возделывания сельскохозяйственных культур в Хакасии // Россельхозакадемия, Сиб. отд., НИИ аграрных проблем Хакасии, Министерство сельского хозяйства и продовольствия Республики Хакасия. Коллектив авторов. Под ред. В.К. Савостьянова. Абакан, 2009.- 43 с.

11. Патенты на изобретения и селекционные достижения, авторские свидетельства 1994-2009 гг. //Россельхозакадемия, Сибирское отделение, НИИ аграрных проблем Хакасии. Сост. В.К.Савостьянов, О.А.Иванов, Т.Е.Иванова. Абакан, 2009 — 92 с.

LAND USE FOR CONDUCTING FARMING IN THE ARID REGION OF SIBERIA

V.K. Savostyanov

Summary. According to the long-term research and the analysis of statistics a modern unsatisfactory land use for agricultural purpose of the south of Media Siberia to conduct farming is shown and its prospects are determined. Concrete suggestions are given that one should urgently bring it to reality to order land use and rational conduct of agricultural production in the arid region.

Key words: arable land, ground degradation, fallow land, land conservation, specialization of agricultural production.

УДК 575.174.015:582.

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ СОРТОВ КАРТОФЕЛЯ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ МЕТОДА ИАРБ

Э. Ф. ДАВЛЕТШИНА, научный сотрудник М.Ш. ТЛ1ЖР0В, кандидат сельскохозяйственных наук, директор

Татарский НИИСХ E-mail: tatniva@mail.ru

Резюме. В результате молекулярного анализа генома 85 сортов картофеля выявлен генетический полиморфизм, на основе которого определены филогенетические связи между различными представителями рода Solanum. Получено 120 полиморфных фрагментов ДНК. Для некоторых образцов определены видоспецифичные маркеры, которые в дальнейшем можно использовать при идентификации сортов.

Ключевые слова: ПЦР, RAPD, полиморфизм, маркеры, картофель, Solanum.

Высокие темпы исследований в области моле-

кулярной генетики растений объясняются в первую очередь необходимостью создания новых сортов, обладающих рядом полезных свойств. Однако для этого нужна предварительная идентификация, изучение полиморфизма и филогенетического родства уже существующих генотипов растений. Создание молекулярных маркерных систем, основанных на профилировании ДНК, открыло широкие перспективы для идентификации и регистрации генотипов, определения генетической чистоты линий и уровня гибридности [1]. Это позволяет на любой стадии развития растения дать характеристику генотипа [2] и составить подробные генетические карты [3, 4]. Молекулярные маркеры используют для точной и быстрой паспортизации видов и сортов растений, а также для изучения филогенетического родства [5, 6, 7, 8].

Один из способов получения молекулярных маркеров — КАРО-метод полимеразной цепной ре-

14

Достижения науки и техники АПК, №12-2009

акции с использованием короткого случайного праймера [9, 10]. Его широко применяют для определения меж- и внутривидового геномного полиморфизма, а также филогенетических и эволюционных отношений между видами [5, 6].

Благодаря комплексному применению классической и молекулярной генетики с практическим выходом на маркер-вспомогательную селекцию стала возможной более осознанная и целенаправленная работа по выведению новых сортов с желаемыми хозяйственно -полезными признаками.

Цель нашей работы состояла в проведении молекулярного маркирования генома сортов картофеля с помощью КАР О-метода, определении межсортового полиморфизма и выявлении сортоспецифичных ЯАР О-фрагментов для дальнейшего использования их в качестве ДНК-маркеров.

Условия, материалы и методы. Для молекулярного анализа были отобраны 83 образца из коллекций сортов картофеля Татарского НИИСХ и ВНИИР им. Н.И. Вавилова.

Образцы подбирали с учетом различных школ селекции, как отечественных, так и зарубежных.

Выделение ДНК проводили из проростков по стандартной методике [11, 12].

Реакционная смесь для ЯДРО-РСII (объемом 15 мкл) содержала 100 нгтотальной ДНК растений; 0,5 мкМ праймера; 2 мкМ каждого сЮТР; 2,5 мМ М§С12; 0,7 ед Год-полимеразы («Биомастер», Москва) в соответствующем 1хТВЕ-буфере. РСК-реакцию с предафительной денатурацией (94°С, 5 мин) проводили в термоциклере ОепеАгпр РСК 5уйет2700 в режиме: денатурация — 94°С, 30 сек; отжиг праймера — 37°С, 45 сек, элонгация ДНК—72°С,

1 мин (39 циклов). Продукты реакции амплификации разделяли электрофорезом в 1,7 %-ном агарозном геле в lxTBE-буфере, окрашивали бромистым этидием и фо-тодокументировали.

В работе использовали восемь 10-членных олигонук-леотидных праймеров фирмы «Орегоп Technologies» серии ОРА, OPD, ОРЕ, ОРК, OPN.

Для проведения статистического анализа по каждому из праймеров составляли бинарные матрицы, на основании которых методом иерерхического кластерного анализа (UPGMA) была построена дендрограмма.

Уровень полиморфизма в каждой выборке определяли как отношение количества полиморфных фрагментов к общему количеству полученных фрагментов, выраженное в процентах.

Результаты и обсуждение. При RAPD-марки-ровании 83 сортов картофеля каждый из праймеров амплифицировал 8...23 фрагмента ДНК генома картофеля. Всего амплифицировано 120 полиморфных маркерных фрагментов. Размер RAPD-фраг-ментов в спектре варьировал от 0,3 до 2,5 тпн. Для каждого сорта был получен уникальный RAPD-спектр. Для 4-х сортов определены фрагменты, которые, по всей видимости, можно считать видоспецифичными маркерами (рис. 1).

Лучше всего для последующего клонирования и получения видоспецифичных маркеров к сорту Сантэ подходит OPN 15/650 (праймер/размер видоспецифичного фрагмента) и ОРЕ 6/420, Розара — OPN 15/820, Живица — OPD 6/860,1алубизна — ОРЕ 6/770.

Уровень выявляемого внутривидового полиморфизма при использовании предварительно отобранных праймеров в целом был довольно высок (87,5... 100 %).

Рис. 1. Электрофореграмма КАРО-фрагментов сортов картофеля, полученных при ПЦР с использованием праймера ОРВб. Выделенные фрагменты — сортоспецифичные.

5,000

2,000

1,650

1,000

850

650

500

400

300

200

Достижения науки и техники АПК, N912-2009

15

ол

05

_4—

йл

оз

0.1

А

гС

47

и

в

гс

ВС

€

из Германии, Украины, Бе-ларуссии и некоторые сорта Северо-Западного НИИСХ и ВНИИКХ. Сходство геномов этих сортов частично подтверждается данными ISSR-анализа [13], а также сведениями из каталога сортов [14].

Сорта Superior и Chiften (США) образуют один субкластер и обособлены от других, часто использующихся в селекции, сортов, на что следует обратить внимание селекционерам.

Никулинский и Осень (ВНИИКХ) - блок G, Руби-• мтз»“£вйекийР“в<кй новый (ВНИИКХ) и Росинка (Белоруссия) — блок F, Живица (Белоруссия) и Москворецкий (ВНИИКХ) — блок С, Roset Berbank, Shepord (США) и Чародей (СЗНИИСХ) - блок D незначительно обособлены от представителей субкластера В и формируют отдельные субкластеры. Такое разделение можно трактовать как результат скрещивания с дикими видами Solanum, которое широко используют зарубежные селекционеры, или гибридизации отечественных и зарубежных сортов. Однако для корректировки и уточнения таксономического деления необходим более детальный анализ.

Выводы. Таким образом,

в результате широкомаспггаб-

Рис. 2. Дендрограмма генетических расстояний между 85 сортами картофеля, построенная^

- 66 Ял&бкмец

- 68ПВ*зЬесШ

- 34~Яш'/рт

* UTLju

*

* М2 СтІ‘рт-%

- 21~Шсііа

- ?йНВрктщез&

-71 Брянсгшй іїаяняй

- ¿ГХогог.*

*

- 72 В&гтшзг

- TST ояхбшхш

-

- £3~АЬоз;?г4

- 24~ЧЫ

*

-

- 59~Удіча

- 79~3ард

-

«

«

«

«5-f Соті&сіМі ~ ?6~Т<епйяртааі р&икий

- ?2~Ерьт:

- 6і~ШтжіШін

-*

* бСТшш роз*

• 40~П mp бургеїзт

• %Trmt

•

* 46

- 4?^£ъш<>тжт&

•

• 4'/lzöisi

- ЗГ"Шеукок

~ 43НР сжд <; ьтшй

- 3$~Агяш?

• 3$~>Ліа»

•

• б Zkumh

• ЗТеІсх

- 27 Сшсхтк Кие*до&

• ТҐ"11^йнЬті

- 12 Ässk

- 4С$Ї«ашмшасмй

• 9“Kotlіяа

-

* Жхшг*ский й^кнйй

• 1$~<Яом

• іГКігі*

• З’РНКйбский

• \Т^т£хят -

• ТГУтенок -

- 4х“'Вее$кг>»$кий » 32l$hmca

• 65]м<«я»©р«ізрайй

• З Bhfipotd

• Etobtnk

- 45 Чародей

• Н-ПКйІ4

• Ж71ушхт1и«зМ

- Луг0#сс«ій

• 51

• 4§Tt> ффюгг

• 4^11 арх

-

’ ьгй

' 52“НжуШ'««окий

-

с использованием метода иерархического кластерного анализа (иРОМА) по результатам КАРО маркирования генома картофеля.

На дендрограмме (рис. 2), построенной на основании данных ЯАРО-анализа можно выделить 2 достаточно больших субкластера. Первый (А) образуют сорта селекции ВНИИКХ и голландские сорта, второй (В) — более разнороден и объединяет сорта

ного мультилокусного молекулярного анализ генома картофеля с помощью RAPD-метода были получены сортоспецифичные спектры для всех анализируемых сортов, установлены филогенетические связи между 83 представителями рода Solanum, а также видоспецифичные маркеры дня сортов Сантэ, Розара, Живица и Голубизна.

Литература.

1. Jaroslaw Przet Kiewicz, Anna Nadolska-Orczyk, Waclaw Orczyk. The use of RAPD and semi-random markers to verify somatic hybrids between

diploid lines of Solanum tuberosum L / // Cellular and Molecular Biolology Letters. — 2002. — V. 7. — P. 671—676.

2. Mullis K, Faloona F., Scharf S. [et al.J Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. - 1986. - V. 51. - P. 263-273.

3. Rameau C., Denoue D., Fraval F. [et al.] Genetic mapping in pea. Identification of RAPD and SCAR markers linked to genes affecting plant

architecture // Theor. Appl. Genet. — 1998. — V. 97. — P. 916-928.

4. Efficiency of RFLP, RAPD and AFLP markers for the construction of an intraspecific map of the tomato genome / V. Saliba-Colombani, M. Causse,

16

Достижения науки и техники АПК, №12-2009

L. Gervais, J. PhUouze // Genome. — 2000. — V. 43. — P. 29-40.

5. Kochieva E. Z. Molecular markers of potato and tomato species and cultivars genome // Molecular Biology — 2005. — Vol. 39. — PI 73-176.

6. Кочиева E.3., Супрунова Т.П. Идентификация меж- и внутривидового птиморфизма у томатов // Генетика. — 1999. — Т. 35. — № 10. - С. 1386-1389.

7. Антонов А.С. Геносистематика растений. — М.: Академкнига, 2006. — 294 с.

8. Гостимский С А., Кокаева З.Г., Боброва В.К. Использование молекулярных маркеров для анализа генома растений. // Генетика. — 1999. — Г. 35, № 11. - С. 1538-1549.

9. Genetic analysis using amplified polymorphic DNA markers. / J. Williams, M. Hanafey, A. Rafalski, S. Tingey // Meth. Enz. — 1993. — C. 704- 740.

10. Williams J.G.K, Kubelik A.R., Livak K.J. fet al.l DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucl. Acids Research. - 1990. - V. 18. - P. 6531-6535.

11. Salach М., Aljanabi, Iciar Martinez. Universal and rapid salt-extraction of high quality genomic DNA for PCR-based techniques // Nucleic Acids Research. - 1997. - V. 25. - № 22.

12. RAPD-анализ внутривидовой изменчивости и филогенетических связей видов эгтопса (Aegilops L.), содержащих d-геном / С.В. Горюнова, Е.З. Кочиева, НИ. Чикида, В А. Пухальасий // Генетика. — 2004. — Т. 40, № 5. — С. 642-651.

13. Генетическая дифференциация сортов картофеля с использованием SSR-маркеров/ О.Ю. Антонова, ПА. Швачко, Л.И. Костина, Л.Л. Малышев, ТА. Гавриленко //Аграрная Россия. — 2004 — Мб — С. 19-24.

14. Сорта картофеля селекции ВНИИКХ. Каталог / Всерос. НИИ картофельного хозяйства им. А.Г. Лорха; сост.: И.М. Яшина, Н.П. Склярова, ЕА. Симаков, А.В. Коршунов, Г.И. Филиппова, НА. Сажина //М. — Колос — 2000. — 38 с.

GENETIC POLYMORPHISM OF POTATO VARIETIES IDENTIFIED WITH RAPD-ANALYSIS

E.F. Davletshina, M.Sh. Tagirov

Summary. As a result of large-scale molecular analysis of the genome of 85 cultivated potato varieties identified genetic polymorphism, which is determined on the basis of phylogenetic relationships among representatives of Solanum tuberosum, There were 120 polymorphic DNA fragments. For some samples obtained specific markers with the possibility of further use in the identification of varieties.

Key words: PCR, RAPD, polymorphism, markers, potato, Solanum

УДК 635.21:631.531.02

ВОСПРОИЗВОДСТВО ОЗДОРОВЛЕННОГО исходного МАТЕРИАЛА ДЛЯ СЕМЕНОВОДСТВА КАРТОФЕЛЯ: 3. РАЗМНОЖЕНИЕ ИСХОДНЫХ РАСТЕНИЙ

А.И.УСКОВ, кандидат биологических наук, зав. отделом

ВНИИ картофельного хозяйства E-mail: Icorenevo2000@mail.ru

Резюме. Приведены результаты исследований по совершенствованию технологии размножения оздоровленного исходного материала при помощи системного и направленного воздействия биологически активных веществ нового поколения.

Ключевые слова: воспроизводство, оздоровленный исходный материал, биологически активные вещества.

После получения оздоровленных исходных растений следующий важный этап воспроизводства — их дальнейшее размножение. При этом задача состоит в быстром увеличении объемов исходного материала с одновременным сохранением высокой потенциальной энергии роста и продуктивности, а также отсутствия патогенов.

В семеноводстве картофеля известно много способов ускоренного размножения оздоровленного исходного материала, включая стерильное и нестерильное черенкование, а также манипуляции с условия-

Достижения науки и техники АПК, №12-2009 _

ми выращивания [1]. Схема ускоренного воспроизводства с максимальной нормой размножения за единицу времени включает четыре этапа [14]: размножение in vitro; нормализация (адаптация) in vitro; трансплантация (пересадка) ex vitro; полевое размножение клубней.

Стратегии оптимизации производства должны быть направлены на получение облиственного исходного материала, снижение стрессов при изменении внешних условий и оптимизацию параметров производства клубней.

Определяющее значение при размножении имеет исходная степень облиственности микро-растений, которая служит показателем их потенциальной энергии роста, поскольку листья — это место детерминации физиологических процессов, происходящих в растениях, включая фотосинтез и транспирацию. Не менее важно сбалансированное развитие корневой системы микро-растений [11]. При более высоких значениях этих показателей улучшается состояние растений на следующей стадии размножения при выращивании рассады — наблюдается увеличение площади листьев и густоты стеблестоя, а урожай клубней возрастает прямо пропорционально развитию листовой поверхности рассады [13]. ------------------------------------------- 17