СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ НЕЙТРОПЕНИИ С ПРИМЕНЕНИЕМ РЕТИНОИДНЫХ АГОНИСТОВ
METHODS FOR TREATING NEUTROPENIA USING RETINOID AGONISTS

ПРАВА ПРАВИТЕЛЬСТВА
[0001] Настоящее изобретение было создано при поддержке правительства в рамках грантов № CA111440, № CA120512 и № CA120512-02S1, каждый из которых был присужден Национальными институтами здоровья (National Institutes of Health). Правительство обладает определенными правами на настоящее изобретение.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0002] Настоящее изобретение относится к способам лечения, подавления, уменьшения и/или обеспечения профилактики нейтропении у нуждающегося в этом субъекта, включающим введение ретиноидного агониста, например тамибаротена.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] Все публикации, цитируемые в настоящем описании, включены в настоящий документ полностью, в той же степени, как если бы для каждой отдельной публикации или патентной заявки было конкретно индивидуальным образом указано, что она включена посредством ссылки. Приведенное ниже описание включает информацию, которая может быть полезной для понимания настоящего изобретения. Это не является признанием того, что какая-либо информация, изложенная в настоящем документе, представляет известный уровень техники или имеет отношение к данному заявленному изобретению, или что любая публикация, цитируемая прямым или косвенным образом, представляет известный уровень техники.
[0004] Нейтрофилы, наиболее распространенные гранулоциты, составляют до 70% от циркулирующих лейкоцитов, в первую очередь обеспечивающих защиту от патогенных инфекций. Индуцированная химиотерапией при лечении раковых заболеваний нейтропения представляет собой гематологическое расстройство, для которого характерно значительное снижение числа нейтрофилов в кровотоке. Впервые Г-КСФ был использован для лечения приобретенной и врожденной нейтропении [1, 2] путем стимуляции гранулопоэза ГСК более двадцати лет назад. Из-за низкого терапевтического индекса злокачественной трансформации [2] индуцированная химиотерапией при онкологических заболеваниях нейтропения остается одним значительным источником заболеваемости, смертности и расходов на здравоохранение [3, 4]. Недавние исследования показывают, что в отличие от НПК нарушения киллинга бактерий нейтрофилами, индуцированные Г-КСФ CD34+ клеток, связаны с недостатком зрелых гранул в результате аномального гранулопоэза на ранних этапах дифференцировки [5]. Таким образом, успешность разработки более эффективной терапии нейтропении может зависеть от выяснения того, как происходит координация гранулопоэза с развитием нейтрофильного иммунитета.
[0005] Ретиноидный агонист Am80 [6-8] предназначен для облегчения побочных эффектов политрансретиноевой кислоты (РК) за счет селективного связывания с альфа-рецептором ретиноевой кислоты (РРК-α) [6, 9, 10], транскрипционного фактора, активируемого РК [11, 12] для регуляции дифференцировки в гранулоциты как лейкозных миелобластов, так и ГСК [13-17]. РК, встречающаяся в природе форма витамина A, играет ключевую роль в формировании строения тела при развитии и индуцирует дифференцировку многих типов нормальных и злокачественных клеток [18-20]. На сегодняшний день лечение острого промиелоцитарного лейкоза (ОПЛ) с применением РК является лучшим примером успешной терапии с индукцией дифференцировки в клинической онкологии [21], однако побочные эффекты, связанные с терапией РК, как правило, являются серьезными, и РК-резистентность является распространенным явлением [22-24]. В нескольких исследованиях было показано, что РРК-α регулирует индуцированную Am80 дифференцировку в гранулоциты [25-27]. Кроме того, Am80 приблизительно в 10 раз более эффективен, чем РК или другие ретиноиды, применяемые для терапии с индуцированием дифференцировки у пациентов с ОПЛ, при меньшей токсичности [7, 8, 28]. К настоящему моменту Am80 одобрен для применения при лечении ОПЛ в Японии [7, 8] и проходит клинические испытания для применения при лечении ряда других заболеваний/раковых заболеваний в США и Европе (http://www.cytrx.com/tamibarotene.html; http://clinicaltrials.gov). Успешность использования Am80 для индуцирования дифференцировки в гранулоциты привела авторов к идее тестирования этого агента в качестве способа стимуляции бактерицидной активности нейтрофилов, возникающей в результате гранулопоэза при развитии иммунитета. Мы сообщаем, что Am80 обладает значительно большей по сравнению с Г-КСФ активностью в качестве индуктора дифференцировки нейтрофилов и развития иммунитета, предположительно благодаря стимуляции гранулопоэза ГСК, за счет опосредования дифференциального влияния CD66 на активацию CD18.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0006] Настоящее изобретение обеспечивает способы лечения, подавления и/или снижения тяжести нейтропении, острой бактериальной инфекции, нейтропении, индуцированной химиотерапией при раковых заболеваниях, и/или различных форм врожденной нейтропении у нуждающихся в этом субъектов. Указанные способы включают обеспечение композиции, содержащей ретиноидный агонист, и введение эффективного количества указанной композиции субъекту для лечения, подавления и/или уменьшения тяжести нейтропении у указанного субъекта. Указанные способы также включают введение дополнительных терапевтических агентов одновременно или последовательно с композициями согласно настоящему изобретению для лечения, подавления и/или уменьшения тяжести нейтропении, острой бактериальной инфекции, нейтропении, индуцированной химиотерапией при раковых заболеваниях, и/или различных форм врожденной нейтропении у указанных субъектов. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ретиноидный агонист представляет собой что-либо одно или более из тамибаротена (AM80), CH55, ITYA (IT-YA-01115) или их комбинации.
[0007] Настоящее изобретение также обеспечивает фармацевтические композиции и наборы для лечения, подавления и/или снижения тяжести нейтропении, острой бактериальной инфекции, нейтропении, индуцированной химиотерапией при раковых заболеваниях, и/или различных форм врожденной нейтропении у нуждающихся в этом субъектов. Указанные фармацевтические композиции и наборы содержат ретиноидные агонисты. Согласно некоторым вариантам реализации ретиноидный агонист представляет собой что-либо одно или более из тамибаротена (AM80), CH55, ITYA (IT-YA-01115) или их комбинации.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0008] Примеры вариантов реализации проиллюстрированы прилагаемыми фигурами. Предполагается, что варианты реализации и фигуры, приведенные в настоящем документе, следует рассматривать как иллюстративные, а не ограничивающие.
[0009] На Фиг. 1 показано, в соответствии с различными вариантами реализации настоящего изобретения, что Am80 стимулирует дифференцировку нейтрофилов более эффективно, чем Г-КСФ, проявляя при этом близкую низкую токсичность. (A) Лучшая индукция гранулоцитов, ассоциированная с меньшей индукцией моноцитов, в CD34+ клетках, обрабатываемых Г-КСФ на протяжении 6 дней по сравнению с 9 или 12 днями. (B и C) Более низкая концентрация Am80 (2,5 нМ) обеспечивает более эффективную индукцию дифференцировки в гранулоциты, чем обеспечиваемая применением Г-КСФ (поле B), при наблюдаемой меньшей цитотоксичности (поле C). (D) Общее сравнение Am80 и Г-КСФ в условиях, определенных как оптимальные для дифференцировки в гранулоциты.
[0010] На Фиг. 2 показано, в соответствии с различными вариантами реализации настоящего изобретения, что индуцированные Am80 нейтрофилы (А-ИН) синтезируют и секретируют гранулы более эффективно, чем индуцированные Г-КСФ нейтрофилы (Г-ИН). (A) Эффективное секретирование лактоферрина А-ИН по сравнению с Г-ИН при стимуляции E. coli. (B) Более высокие уровни синтеза и дегрануляции LL-37 для А-ИН по сравнению с Г-ИН. (C) Повышенное содержание внутриклеточного MMP9 при стимуляции E. coli, но недостаточная дегрануляция, как в Г-ИН, так и в А-ИН.
[0011] На Фиг. 3 показано, в соответствии с различными вариантами реализации настоящего изобретения, что и несортированные, и сортированные с применением антитела против CD15 А-ИН проявляют более высокую способность к клиренсу бактерий, чем несортированные и сортированные Г-ИН. (A) Представлено количественное определение моноцитов (Г-ИН). (B) Представлено количественное определение палочкоядерных/сегментированных нейтрофилов Г-ИН/А-ИН. (C и D) Сравнение эффекта несортированных и сортированных Г-ИН и А-ИН на клиренс внутриклеточных бактерий. Эффективность клиренса определяли по числу жизнеспособных бактерий, выделенных из внутриклеточного компартмента после инфицирования.
[0012] На Фиг. 4 показано, в соответствии с различными вариантами реализации настоящего изобретения, что А-ИН обладают значительно более высокой фагоцитарной и бактерицидной активностью, чем Г-ИН. (A-D) Фагоцитарная и бактерицидная активность, определенные по числу внеклеточных бактерий (поле A), фагоцитированных бактерий (поле B), выделенных внутриклеточных бактерий (поле C) и убитых бактерий (поле D). На протяжении 45 минут эксперимента наблюдалось увеличение числа бактерий в 1,26 ± 0,01 раз. *: Сравнение Г-ИН и А-ИН, P составляет по меньшей мере <0,03. (E) Количественное определение как внеклеточных бактерий после инфицирования, так и убитых in situ бактерий в Г-ИН, А-ИН и нейтрофилах периферической крови (НПК) человека. *: Сравнение Г-ИН и А-ИН или НПК, P составляет по меньшей мере <0,003.
[0013] На Фиг. 5 представлены, в соответствии с различными вариантами реализации настоящего изобретения, структуры ATRA (РК) и новых синтетических ретиноидных агонистов Am80, CH55 и IT-YA01115 (IT-YA).
[0014] На Фиг. 6 показано, в соответствии с различными вариантами реализации настоящего изобретения, что Am80 индуцирует у CD34+ клеток морфологическую дифференцировку в гранулоциты более эффективно, чем Г-КСФ и другие ретиноидные соединения. (A-B) Более высокая по сравнению с Г-КСФ эффективность РК для индуцирования дифференцировки в гранулоциты (поле A) была связана со значительной гибелью клеток (поле B). Более низкая эффективность индуцирования дифференцировки CD34+ клеток в гранулоциты при применении Г-КСФ была связана с более высокой индукцией моноцитов на 12 день (поля A). (C–D) Am80 (10 нМ) обладал эффективностью в отношении индуцирования дифференцировки в гранулоциты (поля A, C), аналогичной РК и CH55, при меньшей наблюдаемой индукции моноцитов по сравнению с Г-КСФ, или IT-YA, или CH55 (поля A, C), и обеспечивал более низкие показатели клеточной смерти по сравнению с РК и CH55 (поля B, D).
[0015] На Фиг. 7 показано, в соответствии с различными вариантами реализации настоящего изобретения, что AM80 индуцирует сопоставимое восстановление нейтрофилов у мышей с нейтропенией по сравнению с получавшими лечение Г-КСФ. (A) Представлен дизайн эксперимента для анализа восстановления нейтрофилов, измеряемого на 3 день после введения ЦФА, при применении разных дозировок Am80 и Г-КСФ. (B) Периферическую кровь (ПК) получали от контрольных мышей после умерщвления на 3 день; нейтрофилы ПК очищали с применением среды Фиколл-пак (Ficoll-paque) (1,084). (C) Анализ восстановления лейкоцитов и нейтрофилов у мышей с нейтропенией, получавших лечение различными дозами Am80 или Г-КСФ, на 3 день.
-6
-5
-8
-6
-4
-4
-4
7
-8
-9
-3
-9
-6
-9
-4
-7
-5
[0016] На Фиг. 8 показано, в соответствии с различными вариантами реализации настоящего изобретения, что нейтрофилы, мобилизованные Am80, у мышей с нейтропенией проявляют более высокую бактерицидную активность по сравнению с мобилизованными Г-КСФ. (A) Г-КСФ индуцировал значительно ускоренное восстановление нейтрофилов по сравнению с мышами, получавшими лечение Am80 или основой, на 5 день. (B) Анализ нейтрофилов ПК на 5 день. *Сравнение Г-КСФ и Am80, P < 1,2×10; сравнение Г-КСФ и контроля, P < 4,0×10 ; сравнение Г-КСФ и основы, P < 8,2×10; Сравнение Am80 и основы, P < 1,3×10; Сравнение Am80 и контроля, P < 0,016. (C) Фагоцитарную и бактерицидную активность нейтрофилов, выделенных из ПК различных мышей, отражает количество внеклеточных бактерий, фагоцитированных бактерий и убитых бактерий после воздействия на выделенные нейтрофилы S. aureus in vitro. *Внеклеточные: Сравнение А-ИН и Г-ИН, P < 0,043; Сравнение А-ИН и Ц-НПКМ (НПК мышей с индуцированной ЦФА нейтропенией), P < 1,1×10; Сравнение НПКМ (НПК мышей) и Ц-НПКМ, P < 3,7×10; Сравнение Г-ИН и Ц-НПКМ, P < 0,049. *Фагоцитоз: Сравнение А-ИН и Г-ИН, P < 0,026; Сравнение А-ИН и Ц-НПКМ, P < 0,02; Сравнение НПКМ и Г-ИН, P < 0,042; Сравнение НПКМ и Ц-НПКМ, P < 0,003; Сравнение Г-ИН и Ц-НПКМ, P < 0,009. *Киллинг: Сравнение А-ИН и Г-ИН, P < 0,026; Сравнение А-ИН и Ц-НПКМ, P < 0,005; Сравнение НПКМ и Г-ИН, P < 0,015; Сравнение НПКМ и Ц-НПКМ, P < 0,003; Сравнение Г-ИН и Ц-НПКМ, P < 0,009. (D) Ускоренное восстановление лейкоцитов и нейтрофилов прекращалось на 7 день после 96 часов стимуляции Г-КСФ, Am80 или основой. (E) Анализ нейтрофилов ПК на 9 день. *Сравнение Г-КСФ и контроля, P < 0,005; Сравнение Am80 и контроля, P < 3,9×10; Сравнение Am80 и основы, P < 0,03; Сравнение основы и контроля, P < 0,03. (F) А-ИН обладали значительно более высокой фагоцитарной и бактерицидной активностью, чем Г-ИН, на 9 день, через 48 часов после прекращения ускоренного восстановления нейтрофилов. *Внеклеточные: Сравнение А-ИН и Г-ИН, P < 0,02; Сравнение А-ИН и Ц-НПКМ, P < 0,007; Сравнение НПКМ и Г-ИН, P < 0,04; Сравнение НПКМ и Ц-НПКМ, P < 0,02. *Фагоцитоз: Сравнение А-ИН и Ц-НПКМ, P < 0,034; Сравнение НПКМ и Ц-НПКМ, P < 0,043. *Киллинг: Сравнение А-ИН и Ц-НПКМ, P < 0,034; Сравнение НПКМ и Ц-НПКМ, P < 0,043. (G) Данные in vivo показывают, что Am80 индуцирует у мышей с нейтропенией достаточно эффективных нейтрофилов, проявляющих более высокую бактерицидную активность по сравнению с мобилизованными Г-КСФ. Двадцать мышей C57BL6/J рандомизировали в 4 группы для проведения экспериментов. Одну внутрибрюшинную инъекцию циклофосфамида (ЦФА) в дозе 200 мг/кг осуществляли на 0-й день. Am80, или Г-КСФ, или основу вводили через 4 ч после ЦФА в течение 3-х последовательных дней. Нейтропения у мышей была индуцирована через 48–60 ч после инъекции ЦФА. Эксперимент проводили на 3 день через 16 часов после внутрибрюшинной инъекции 3×10 S. aureus. Анализировали бактерицидную активность очищенных нейтрофилов, определяя количество жизнеспособных внеклеточных бактерий в брюшинной полости (поле G-i) и ПК (поле G-ii). Количество жизнеспособных бактерий подсчитывали в 3 мл промытой ФСБ перитонеальной жидкости, а также приблизительно 1,5 мл от общего объема плазмы крови. P-значение для жизнеспособных бактерий в брюшинной полости: сравнение Am80 и Г-КСФ, P < 2,4×10; сравнение контроля и Г-КСФ, P < 4,7×10; сравнение основы и Г-КСФ, P < 8,3×10; сравнение Am80 и основы, P < 3,1×10; сравнение Am80 и контроля, P < 0,038. *Общее число жизнеспособных внеклеточных бактерий в поле G-iii: сравнение Am80 и Г-КСФ, P < 1,9×10; сравнение контроля и Г-КСФ, P < 9,4×10; сравнение основы и Г-КСФ, P < 6,5×10; сравнение Am80 и основы, P < 6,8×10; сравнение контроля и Am80, P < 3,8×10. Кратность изменения количества жизнеспособных бактерий представлена на поле G-iv. Количество жизнеспособных бактерий в контрольной группе принимали за стандарт кратности, равный 1.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
rd
th
[0017] Все цитируемые в настоящем документе источники полностью включены посредством ссылок в той же мере, как если бы они были приведены целиком. Если не указано иное, технические и научные термины в настоящем документе используются в значениях, общепринятых среди специалистов в области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение. Источники: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3 ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 2001); March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 5 ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 2001); и Sambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2001) содержат общие руководства для специалистов в данной области техники, включающие многие используемые в настоящей заявке термины.
[0018] Для специалиста в данной области техники будут очевидны многие аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем документе способы, которые подходят для применения в реализации настоящего изобретения. Настоящее изобретение никоим образом не ограничено описанными способами и материалами. Определения используемых далее для целей настоящего изобретения терминов приводятся ниже.
[0019] «Благоприятные результаты» могут включать, ослабление или уменьшение тяжести болезненного состояния, предотвращение ухудшения болезненного состояния, излечение болезненного состояния, предотвращение развития болезненного состояния, уменьшение вероятности развития болезненного состояния у пациента и увеличение продолжительности жизни или прогнозируемой продолжительности жизни пациента, но не ограничиваются этим.
[0020] «Млекопитающее» в настоящем документе относится к любому представителю класса Mammalia, включая, без ограничения, человека и не являющихся человеком приматов, таких как шимпанзе, и другие виды обезьян и человекообразных обезьян; сельскохозяйственных животных, таких как крупный рогатый скот, овца, свинья, коза и лошадь; домашних животных-млекопитающих, таких как собаки и кошки; лабораторных животных, в том числе грызунов, таких как мыши, крысы и морские свинки, и т.п. Термин не определяет конкретный возраст или пол. Таким образом, указанный термин также включает взрослых и новорожденных субъектов, а также утробные плоды, как мужского, так и женского пола.
12
[0021] «Нейтропения» в настоящем документе относится к аномально низким уровням нейтрофилов в крови. Нейтропения может быть обусловлена пониженным синтезом лейкоцитов (например, но не ограничиваясь перечисленным, из-за применения терапевтических агентов, оказывающих влияние на костный мозг, наследственных/врожденных нарушений, которые влияют на костный мозг, апластической анемии, ракового заболевания, лучевой терапии, недостаточности витамина B, фолатов или меди, и/или воздействия пестицидов). Нейтропения может также быть обусловлена разрушением лейкоцитов (например, но не ограничиваясь перечисленным, из-за острых бактериальных инфекций, определенных аутоиммунных заболеваний, химиотерапевтического лечения и/или терапевтических агентов). Нейтропения может также быть обусловлена секвестрированием и/или миграцией лейкоцитов (например, но не ограничиваясь перечисленным, в результате гемодиализа, малярии и/или бактериальных инфекций). Некоторые лекарства, такие как флекаинид, фенитоин, индометацин, пропилтиоурацил, карбимазол, аминазин, триметоприм/сульфаметоксазол (котримоксазол), клозапин, тиклодипин, также могут приводить к нейтропении. Способы и композиции согласно настоящему изобретению могут применяться для лечения, подавления, уменьшения тяжести и/или обеспечения профилактики нейтропении, обусловленной любой из вышеперечисленных причин. Способы и композиции согласно настоящему изобретению могут также применяться для лечения, подавления, уменьшения тяжести и/или обеспечения профилактики болезненных состояний, обусловленных любой из вышеперечисленных причин нейтропении, посредством лечения, подавления, уменьшения симптомов и/или обеспечения профилактики нейтропении.
[0022] «Лечение» и «лечить» в настоящем документе относятся как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или предупреждающим мерам, цель которых заключается в предотвращении или замедлении развития (облегчении) целевого патологического состояния, предотвращении патологического состояния, стремлении к получению или получении благоприятных результатов, или снижении вероятности развития указанного состояния у индивидуума, даже если указанное лечение в конечном итоге не является успешным. Нуждающиеся в лечении включают тех, у кого уже имеется указанное состояние, а также подверженных развитию указанного состояния или тех, наступление указанного состояния у кого необходимо предотвратить.
[0023] «Терапевтически эффективное количество» в настоящем документе относится к количеству, способному обеспечить благоприятные результаты у субъекта-млекопитающего с нейтропенией. Терапевтически эффективное количество может быть определено на индивидуальной основе, на основе, по меньшей мере отчасти, оценки физиологических характеристик указанного млекопитающего, используемого типа системы доставки или терапевтической техники и времени введения относительно прогрессирования заболевания.
[0024] Несмотря на успешность терапевтического применения рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) для стимуляции гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) человека в направлении гранулопоэза, нейтропения остается одним из наиболее серьезных осложнений химиотерапии раковых заболеваний. При применении ex vivo модели для индуцирования дифференцировки в гранулоциты стволовых CD34+ гемопоэтических клеток авторы обнаружили, что Am80 (тамибаротен), новый ретиноидный агонист, является более эффективным, чем с Г-КСФ средство, для координирования дифференцировки нейтрофилов и развития иммунитета. Функциональный анализ и визуализация in situ синтеза гранул, инфекции E. coli и киллинга бактерий продемонстрировали, что аналогично нейтрофилам периферической крови (НПК) человека, индуцированные Am80 нейтрофилы (А-ИН) обладали большей бактерицидной активностью, чем индуцированные Г-КСФ нейтрофилыи (Г-ИН). В отличие от Г-ИН, но аналогично НПК, усиленный киллинг бактерий А-ИН был связан с бόльшим уровнем коэкспрессии антигена CD66 и субъединицы интегрина β2 CD18. Соответственно, антитело против CD18 нейтрализовало индуцированную Am80 бактерицидную активность А-ИН. Таким образом, было обнаружено, что А-ИН представляет собой более эффективное средство стимуляции дифференцировки и бактерицидной активности нейтрофилов, чем Г-КСФ, предположительно за счет координирования функционального взаимодействия CD66 с CD18, стимулирующего развитие нейтрофильного иммунитета при гранулопоэзе. Эти описанные в настоящем документе обнаруженные факты обеспечивают молекулярное обоснование для разработки нового средства лечения нейтропении с применением Am80, как экономически целесообразного варианта лечения.
[0025] Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает способы лечения нейтропении у нуждающегося в этом субъекта-млекопитающего. Указанный способ включает обеспечение композиции, содержащей ретиноидный агонист, и введение терапевтически эффективного количества указанной композиции субъекту для лечения нейтропении у указанного субъекта. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ретиноидный агонист представляет собой что-либо одно или более из тамибаротена (AM80), CH55, ITYA (IT-YA-01115) или их комбинации. Согласно одному варианту реализации указанный ретиноидный агонист представляет собой тамибаротен (AM80), его аналог и/или соль.
[0026] Настоящее изобретение также обеспечивает способы снижения тяжести нейтропении у нуждающегося в этом субъекта-млекопитающего. Указанный способ включает обеспечение композиции, содержащей ретиноидный агонист, и введение терапевтически эффективного количества указанной композиции субъекту для уменьшения тяжести нейтропении у указанного субъекта. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ретиноидный агонист представляет собой что-либо одно или более из тамибаротена (AM80), CH55, ITYA (IT-YA-01115) или их комбинации. Согласно одному варианту реализации указанный ретиноидный агонист представляет собой тамибаротен (AM80), его аналог и/или соль.
[0027] Настоящее изобретение также обеспечивает способы подавления нейтропении у нуждающегося в этом субъекта-млекопитающего. Указанный способ включает обеспечение композиции, содержащей ретиноидный агонист, и введение субъекту терапевтически эффективного количества указанной композиции для подавления нейтропении у указанного субъекта. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ретиноидный агонист представляет собой что-либо одно или более из тамибаротена (AM80), CH55, ITYA (IT-YA-01115) или их комбинации. Согласно одному варианту реализации указанный ретиноидный агонист представляет собой тамибаротен (AM80), его аналог и/или соль.
[0028] Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способы для обеспечения профилактики нейтропении у нуждающегося в этом субъекта. Указанный способ включает обеспечение композиции, содержащей ретиноидный агонист, и введение терапевтически эффективного количества указанной композиции субъекту для обеспечения профилактики нейтропении у указанного субъекта. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ретиноидный агонист представляет собой что-либо одно или более из тамибаротена (AM80), CH55, ITYA (IT-YA-01115) или их комбинации. Согласно одному варианту реализации указанный ретиноидный агонист представляет собой тамибаротен (AM80) его аналог и/или соль.
[0029] В настоящем изобретении также предложен способ лечения, подавления и/или снижения тяжести нейтропении, индуцированной химиотерапией при раковых заболеваниях, у нуждающегося в этом субъекта. Указанный способ включает обеспечение композиции, содержащей ретиноидный агонист, и введение терапевтически эффективного количества указанной композиции субъекту для лечения, подавления и/или уменьшения тяжести нейтропении, индуцированной химиотерапией при раковых заболеваниях. Указанный способ также включает введение химиотерапевтического агента. Согласно одному варианту реализации указанный химиотерапевтический агент и указанную композицию, содержащую ретиноидный агонист, вводят одновременно. Согласно другому варианту реализации указанный химиотерапевтический агент и указанную композицию, содержащую ретиноидный агонист, вводят последовательно. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ретиноидный агонист представляет собой что-либо одно или более из тамибаротена (AM80), CH55, ITYA (IT-YA-01115) или их комбинации. Согласно одному варианту реализации указанный ретиноидный агонист представляет собой тамибаротен (AM80) его аналог и/или соль.
[0030] Примеры химиотерапевтических агентов включают, не ограничиваясь перечисленными, актиномицин, алитретиноин, политрансретиноевую кислоту, азацитидин, азатиоприн, бевацизумаб, бексаротен, блеомицин, бортезомиб, карбоплатин капецитабин, цетуксимаб, цисплатин, хлорамбуцил, циклофосфамид, цитарабин, даунорубицин, доцетаксел, доксифлуридин, доксорубицин, эпирубицин, эпотилон, эрлотиниб, этопозид, фторурацил, гефинитиб, гемцитабин, гидроксимочевину, идарубицин, иматиниб, ипилимумаб, иринотекан, мехлоретамин, мелфалан, меркаптопурин, метотрексат, митоксантрон, окрелизумаб, офатумумаб, оксалиплатин, паклитаксел, панитумумаб, пеметрексед, ритуксимаб, тафлупозид, тенипозид, тиогуанин, топотекан, третиноин, валрубицин, вемурафениб, винбластин, винкристин, виндезин, винорелбин, вориностат, ромидепсин, 5-фторурацил (5-FU), 6-меркаптопурин (6-MP), кладрибин, клофарабин, флоксуридин, флударабин, пентостатин, митомицин, иксабепилон, эстрамустин, преднизолон, метилпреднизолон, дексаметазон или их комбинацию.
[0031] В настоящем изобретении также предложен способ лечения, подавления, снижения тяжести и/или обеспечения профилактики острой бактериальной инфекции у нуждающегося в этом субъекта. Указанный способ включает обеспечение композиции, содержащей ретиноидный агонист, обеспечение композиции, содержащей антибактериальный терапевтический агент, и введение терапевтически эффективного количества каждой из указанных композиций указанному субъекту для лечения, подавления, уменьшения тяжести и/или обеспечения профилактики острой бактериальной инфекции у указанного субъекта. Согласно одному варианту реализации композицию, содержащую ретиноидный агонист, и композицию, содержащую антибактериальный терапевтический агент, вводят одновременно. Согласно другому варианту реализации композицию, содержащую ретиноидный агонист и композицию, содержащую антибактериальный терапевтический агент, вводят последовательно. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ретиноидный агонист представляет собой что-либо одно или более из тамибаротена (AM80), CH55, ITYA (IT-YA-01115) или их комбинации. Согласно одному варианту реализации указанный ретиноидный агонист представляет собой тамибаротен (AM80), его аналог и/или соль.
[0032] Настоящее изобретение также обеспечивает способы лечения, подавления, снижения тяжести и/или обеспечения профилактики врожденной нейтропении (в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, синдрома Костманна, циклической нейтропении или синдрома Чедиака-Хигаши) у нуждающегося в этом субъекта-млекопитающего. Указанный способ включает обеспечение композиции, содержащей ретиноидный агонист, и введение терапевтически эффективного количества указанной композиции субъекту для лечения, подавления, уменьшения тяжести и/или обеспечения профилактики врожденной нейтропении у указанного субъекта. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ретиноидный агонист представляет собой что-либо одно или более из тамибаротена (AM80), CH55, ITYA (IT-YA-01115) или их комбинации. Согласно одному варианту реализации указанный ретиноидный агонист представляет собой тамибаротен (AM80), его аналог и/или соль.
12
[0033] Согласно некоторым вариантам реализации субъекты-млекопитающие, нуждающиеся в композициях согласно описанию в настоящем документе, представляют собой пациентов, у которых понижен синтез лейкоцитов в результате, в том числе, но не ограничиваясь перечисленным, применения медикамента, оказывающего влияние на костный мозг (например, противораковых лекарственных средств, антипсихотических лекарственных средств, противосудорожных лекарственных средств), наследственных и/или врожденных расстройств, оказывающих влияние на костный мозг; пациентов, которым проводят лучевую терапию; пациентов с недостаточностью витамина B, дефицитом фолиевой кислоты; или их комбинацией.
[0034] Согласно дополнительным вариантам реализации субъекты-млекопитающие, нуждающиеся в композициях, описанных в настоящем тексте, представляют собой субъектов, лейкоциты у которых повреждены, уничтожены или их количество понижено в результате, например, но не ограничиваясь перечисленными, острых бактериальных инфекций, аутоиммунных нарушений (таких как системная красная волчанка), применения сульфонамидных лекарств или комбинации перечисленного.
[0035] Согласно дополнительным вариантам реализации субъекты-млекопитающие, нуждающиеся в композициях согласно описанию в настоящем документе, представляют собой субъектов, у которых происходит секвестрирование и/или миграция лейкоцитов (таких как нейтрофилы) в результате, например, но не ограничиваясь перечисленным, гемодиализа, малярии, бактериальных инфекций или их комбинации.
[0036] Согласно различным вариантам реализации композиция согласно настоящему изобретению, содержащая ретиноидный агонист, может вводиться одновременно или последовательно с другими терапевтическими агентами, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, химиотерапевтическими агентами и/или лучевой терапией. Химиотерапевтические агенты и/или лучевая терапия часто снижают количество лейкоцитов, что приводит к нейтропении. Введение композиция согласно настоящему изобретению одновременно или последовательно с химиотерапевтическими агентами и/или лучевой терапией может подавлять и/или уменьшать тяжесть нейтропении. Согласно различным вариантам реализации композицию согласно настоящему изобретению, содержащую ретиноидный агонист, вводят до, во время или после введения химиотерапевтических агентов и/или проведения лучевой терапии. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ретиноидный агонист представляет собой что-либо одно или более из тамибаротена (AM80), CH55, ITYA (IT-YA-01115) или их комбинации. Согласно одному варианту реализации указанный ретиноидный агонист представляет собой тамибаротен (AM80), его аналог и/или соль.
[0037] Аналогичным образом, композицию, содержащую ретиноидный агонист, можно вводить одновременно или последовательно с противосудорожными и/или антипсихотическими лекарственными средствами для подавления и/или уменьшения тяжести нейтропении, обусловленной применением указанных лекарственных средств. Согласно различным вариантам реализации композицию согласно настоящему изобретению, содержащую ретиноидный агонист, вводят до, во время или после введения противосудорожных и/или антипсихотических лекарственных средств. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ретиноидный агонист представляет собой что-либо одно или более из тамибаротена (AM80), CH55, ITYA (IT-YA-01115) или их комбинации. Согласно одному варианту реализации указанный ретиноидный агонист представляет собой тамибаротен (AM80), его аналог и/или соль.
[0038] Кроме того, композицию, содержащую ретиноидный агонист, можно вводить одновременно или последовательно с терапевтическими агентами, применяемыми для лечения острых бактериальных инфекций, грибковых инфекций и/или аутоиммунных заболеваний для подавления и/или уменьшения тяжести нейтропении, которая может развиваться в результате бактериальных и грибковых инфекций, и/или аутоиммунных заболеваний, и/или быть обусловлена терапевтическими агентами, которые могут применяться для лечения бактериальной инфекции, грибковой инфекции и/или аутоиммунных заболеваний. Согласно различным вариантам реализации композицию согласно настоящему изобретению, содержащую ретиноидный агонист, вводят до, во время или после введения терапевтических агентов, применяемых для лечения острых бактериальных инфекций, грибковых инфекций и/или аутоиммунных заболеваний. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ретиноидный агонист представляет собой что-либо одно или более из тамибаротена (AM80), CH55, ITYA (IT-YA-01115) или их комбинации. Согласно одному варианту реализации указанный ретиноидный агонист представляет собой тамибаротен (AM80), его аналог и/или соль.
[0039] Согласно различным вариантам реализации ретиноидный агонист вводят внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно, перорально или посредством ингаляции. Согласно одному варианту реализации ретиноидный агонист представляет собой тамибаротен.
[0040] Согласно различным вариантам реализации эффективное количество указанного ретиноидного агониста представлено каким-либо одним или несколькими из приблизительно 0,01–0,05 мкг/кг/день, 0,05–0,1 мкг/кг/день, 0,1–0,5 мкг/кг/день, 0,5–5 мкг/кг/день, 5–10 мкг/кг/день, 10–20 мкг/кг/день, 20–50 мкг/кг/день, 50–100 мкг/кг/день, 100–150 мкг/кг/день, 150–200 мкг/кг/день, 200–250 мкг/кг/день, 250–300 мкг/кг/день, 300–350 мкг/кг/день, 350–400 мкг/кг/день, 400–500 мкг/кг/день, 500–600 мкг/кг/день, 600–700 мкг/кг/день, 700–800 мкг/кг/день, 800–900 мкг/кг/день, 900–1000 мкг/кг/день, 0,01–0,05 мг/кг/день, 0,05–0,1 мг/кг/день, 0,1–0,5 мг/кг/день, 0,5–1 мг/кг/день, 1–5 мг/кг/день, 5–10 мг/кг/день, 10–15 мг/кг/день, 15–20 мг/кг/день, 20–50 мг/кг/день, 50–100 мг/кг/день, 100–200 мг/кг/день, 200–300 мг/кг/день, 300–400 мг/кг/день, 400–500 мг/кг/день, 500–600 мг/кг/день, 600–700 мг/кг/день, 700–800 мг/кг/день, 800–900 мг/кг/день, 900–1000 мг/кг/день, или их комбинацией. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ретиноидный агонист представляет собой что-либо одно или более из тамибаротена (AM80), CH55, ITYA (IT-YA-01115) или их комбинации. Согласно одному варианту реализации указанный ретиноидный агонист представляет собой тамибаротен (AM80), его аналог и/или соль. Примеры дозировок, содержащих эффективное количество ретиноидного агониста, могут находиться в пределах диапазонов, рекомендованных производителем при использовании известных терапевтических соединений, а также определенных специалистом в данной области техники по реакции in vitro или реакции в моделях на животных. Такие дозировки обычно могут быть снижены вплоть до значений концентрации или количества, уменьшенных приблизительно на один порядок, без потери релевантной биологической активности. Фактическая дозировка может зависеть от мнения врача, состояния пациента и эффективности способа терапии, на основании, например, оценки in vitro реакции соответствующих культивируемых клеток или образца гистокультуры ткани, такого как биопсийный материал злокачественных опухолей, или откликов, наблюдаемых в подходящих моделях на животных. Согласно различным вариантам реализации композиции согласно настоящему изобретению, содержащие ретиноидный агонист, могут вводиться один раз в сутки (SID/QD), два раза в сутки (BID), три раза в сутки (TID), четыре раза в сутки (QID) или более, для введения эффективного количества ретиноидного агониста указанному субъекту, где эффективное количество представляет собой одну или несколько доз из описанных в настоящем документе.
[0041] Настоящее изобретение также обеспечивает способы идентификации ретиноидного агониста. Указанный способ включает приведение CD34+ клеток в контакт с представляющей интерес молекулой, последующее приведение в контакт CD34+ клеток и представляющей интерес молекулы с антигеном для стимуляции иммунного ответа, и оценка того, приводит ли контакт между клетками CD34+, указанной представляющей интерес молекулой и указанным антигеном к повышенной секреции лактоферрина, LL-37 или их комбинации. Согласно одному варианту реализации повышенная секреция лактоферрина, LL-37 или их комбинации указывает на то, что указанная представляющая интерес молекула представляет собой ретиноидный агонист.
[0042] Анализы, которые могут применяться для идентификации соединений, являющихся ретиноидными агонистами, включают, не ограничиваясь перечисленными, анализ на микрочипах, количественную ПЦР, анализы с применением нозерн-блоттинга, саузерн-блоттинга, вестерн-блоттинга, иммуногистохимические анализы, анализ связывания, анализ методом замедления в геле или анализы с применением дрожжевых двухгибридных систем. Специалист в данной области техники сможет легко использовать множество методик, известных в данной области техники, для определения того, является ли конкретный представляющий интерес агент /молекула ретиноидным агонистом.
[0043] Согласно различным вариантам реализации субъект выбран из группы, состоящей из человека, не являющегося человеком примата, обезьяны, человекообразной обезьяны, собаки, кошки, коровы, лошади, кролика, мыши и крысы.
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ
[0044] Согласно различным вариантам реализации настоящее изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, включающие фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество вместе с терапевтически эффективным количеством ретиноидного агониста, такого как тамибаротен (AM80), CH55, ITYA (IT-YA-01115) или их комбинации. «Фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество» означает вспомогательное вещество, подходящее для получения фармацевтической композиции, являющееся в целом безопасным, нетоксичным и желательным, и включает вспомогательные вещества, приемлемые для применения в ветеринарии, а также для фармацевтического применения у человека. Такие вспомогательные вещества могут быть твердыми, жидкими, полутвердыми, либо в случае аэрозольной композиции, газообразными.
[0045] Согласно различным вариантам реализации фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением могут входить в состав, подходящий для доставки с применением любого способа введения. «Путь введения» может относиться к любому маршруту введения, известному в данной области техники, включая, но не ограничиваясь перечисленными, аэрозольный, назальный, пероральный, трансмукозальный, трансдермальный, парентеральный или энтеральный. «Парентеральный» относится к способу введения, в общем связанному с инъецированием, в том числе интраорбитальным, инфузионным, внутриартериальным, интракапсулярным, внутрисердечным, интрадермальным, внутримышечным, внутрибрюшинным, внутрилегочным, интраспинальным, внутригрудинным, интратекальным, внутриматочным, внутривенным, субарахноидальным, субкапсулярным, подкожным, трансмукозальным или транстрахеальным. Композиции для парентерального введения могут быть представлены в форме растворов или суспензий для введения путем инъекции или инфузии, или в виде лиофилизированных порошков. Композиции для парентерального введения могут быть представлены в форме растворов или суспензий для введения путем инъекции или инфузии. Фармацевтические композиции для энтерального введения могут быть представлены в форме таблеток, желатиновых капсул, драже, сиропов, суспензий, растворов, порошков, гранул, эмульсий, микросфер или наносфер, липидных везикул или полимерных везикул, обеспечивающих контролируемое высвобождение.
[0046] Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением могут также содержать любой фармацевтически приемлемый носитель. «Фармацевтически приемлемый носитель» в настоящем документе относится к фармацевтически приемлемому материалу, композиции или основе, участвующей в переносе или транспорте представляющего интерес соединения из одной ткани, органа или части тела в другую ткань, орган или часть тела. Например, носитель может представлять собой жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, вспомогательное вещество, растворитель или материал для инкапсулирования, или их комбинацию. Каждый компонент указанного носителя должен быть «фармацевтически приемлемым», то есть должен быть совместим с другими ингредиентами состава. Он также должен подходить для применения в контакте с любыми тканями или органами, с которыми может контактировать, то есть он не должен представлять риск токсичности, раздражения, аллергического ответа, иммуногенности или какой-либо другого осложнения, значительно превосходящего благоприятные терапевтические эффекты.
[0047] Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением могут также инкапсулированы, таблетированы или приготовлены в эмульсии или сиропе для перорального введения. Могут быть добавлены фармацевтически приемлемые твердые или жидкие носители для усиления или стабилизации композиции, или для облегчения получения указанной композиции. Жидкие носители включают сироп, арахисовое масло, оливковое масло, глицерин, солевой раствор, спирты и воду. Твердые носители включают крахмал, лактозу, сульфат кальция, дигидрат, белую глину, стеарат магния или стеариновую кислоту, тальк, пектин, аравийскую камедь, агар или желатин. Носитель может также включать материал для обеспечения замедленного высвобождения, такой как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат, отдельно или с воском.
[0048] Фармацевтические составы получают с применением обычных фармацевтических методик, включающих измельчение, смешивание, гранулирование, и, при необходимости, прессование для таблетированных форм; или измельчение, смешивание и наполнение для твердых желатиновых капсульных форм. При использовании жидкого носителя состав получают в форме сиропа, эликсира, эмульсии или водной или неводной суспензии. Такой жидкий состав может вводиться непосредственным образом перорально, либо им наполняют мягкую желатиновую капсулу.
[0049] Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением могут доставляться в терапевтически эффективном количестве. Точное терапевтически эффективное количество представляет собой количество указанной композиции, обеспечивающее наиболее эффективные результаты в смысле эффективности лечения определенного субъекта. Указанное количество варьирует в зависимости от разнообразных факторов, включая, но не ограничиваясь перечисленными, характеристики терапевтического соединения (в том числе активность, фармакокинетику, фармакодинамику и биодоступность), физиологическое состояние указанного субъекта (включая возраст, пол, тип и стадию заболевания, общее физическое состояние, отвечаемость при определенной дозировке, и тип медикамента), природу фармацевтически приемлемого носителя или носителей в составе, и способ введения. Специалист в области клинической практики и фармакологии сможет определить терапевтически эффективное количество с помощью рутинных экспериментов, например, путем мониторинга отклика субъекта на введение соединения и соответствующей коррекции дозировки. Для ознакомления с дополнительными указаниями см. Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro ed. 20th edition, Williams & Wilkins PA, USA) (2000).
НАБОРЫ СОГЛАСНО НАСТОЯЩЕМУ ИЗОБРЕТЕНИЮ
[0050] В настоящем изобретении также предложен набор для лечения нейтропении, подавления нейтропении, уменьшения нейтропении или обеспечения профилактики нейтропении у нуждающегося в этом субъекта. Указанный набор содержит композицию, содержащую ретиноидный агонист и инструкции для применения указанной композиции для лечения, подавления и/или снижения тяжести нейтропении, острой бактериальной инфекции, нейтропении, индуцированной химиотерапией при раковых заболеваниях, и/или различных форм врожденной нейтропении у нуждающихся в этом субъектов. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ретиноидный агонист представляет собой что-либо одно или более из тамибаротена (AM80), CH55, ITYA (IT-YA-01115) или их комбинации. Согласно одному варианту реализации указанный ретиноидный агонист представляет собой тамибаротен (AM80).
[0051] Указанный набор представляет собой совокупность материалов или компонентов, включающих по меньшей мере одну из композиций согласно настоящему изобретению. Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации указанный набор содержит композицию, включающую ретиноидный агонист, например, что-либо одно или более из тамибаротена (AM80), CH55, ITYA (IT-YA-01115) или их комбинации, согласно описанию выше.
[0052] Конкретная природа компонентов, входящих в состав набора согласно настоящему изобретению, зависит от предусмотренного назначения. Согласно одному варианту реализации указанный набор получен с возможностью, в частности, применения у субъектов-людей. Согласно дополнительным вариантам реализации указанный набор получен с возможностью применения в ветеринарии, лечения, например, но не ограничиваясь перечисленными, субъектов, представляющих собой сельскохозяйственных животных, домашних животных и лабораторных животных.
[0053] В указанный набор могут быть включены инструкции по применению. «Инструкции по применению», как правило, включают описание на материальном носителе надлежащей техники применения компонентов набора для достижения требуемого результата, такого как лечение, уменьшение тяжести, подавление или предотвращение нейтропении у субъекта. Указанный набор необязательно содержит также другие подходящие компоненты, такие как измерительные инструменты, разбавители, буферы, фармацевтически приемлемые носители, шприцы или другие подходящие атрибуты, которые могут быть легко определены специалистами в данной области техники.
[0054] Предлагаемые практикующему специалисту материалы или компоненты, собранные в указанный набор, могут храниться любым удобным и подходящим образом, позволяющим сохранить их функциональность и полезность. Например, указанные компоненты могут находиться в растворенной, дегидрированной или лиофилизированной форме; они могут предоставляться при комнатной температуре, при температурах охлаждения или замораживания. Указанные компоненты, как правило, помещают в подходящий(ие) упаковочный(ые) материал(ы). В настоящем документе выражение «упаковочный материал» относится к одной или нескольким физическим структурам, используемым для размещения содержимого набора, например, композиций согласно настоящему изобретению и т.п. Указанный упаковочный материал конструируют с применением хорошо известных способов, предпочтительно с получением стерильной свободной от загрязнителей среды. В настоящем документе термин «упаковка» относится к подходящей твердой подложке или материалу, такому как стекло, пластик, бумага, фольга и т.п., способному вмещать индивидуальные компоненты набора. Таким образом, например, упаковка может представлять собой бутыль, используемую для размещения подходящих количеств композиции согласно настоящему изобретению, содержащей ретиноидный агонист, такой как что-либо одно или более из тамибаротена (AM80), CH55, ITYA (IT-YA-01115) или их комбинации. Упаковочный материал, как правило, включает внешнюю этикетку, на которой указано содержимое и/или назначение набора и/или его компонентов.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Клетки и клеточная культура
[0055] Нормальные стволовые CD34+ клетки пуповинной крови человека получали в AllCells (Эмеривилл, Калифорния). CD34+ клетки размножали [29] приблизительно до 50× с применением бессывороточной среды StemSpan (StemCell Technologies, Ванкувер, Канада) на протяжении 6 дней в соответствии с протоколом производителя. Для индуцирования гранулопоэза CD34+ клетки культивировали на миелоидной среде с добавлением 25 нг/мл Г-КСФ [17, 29] на протяжении 6–12 дней. Лимфоидные и эритроидные клетки блокировали в процессе гранулопоэза добавлением гидрокортизона и исключением эритропоэтина [17, 29]. Политрансретиноевую кислоту (РК) получали от Sigma (Сент-Луис, Миссури), а ретиноидные агонисты Am80, CH55 и IT-YA-01115 (ITYA) - из лаборатории Research Foundation ITSUU Laboratory (Токио, Япония). Каждое ретиноидное соединение растворяли в этаноле. Экспериментально определенные условия, с применением 25 нг/мл Г-КСФ [17, 29] или 2,5 нМ Am80 для индукции гранулоцитов за 6 дней (Фиг. 1), использовали для исследований.
НПК человека
[0056] У здоровых добровольцев брали кровь из периферической вены в соответствии с протоколом, утвержденным Комитетом по клиническим исследованиям Детской больницы Лос-Анджелеса/Медицинского института Кека университета Южной Калифорнии (Children’s Hospital Los Angeles/University of Southern California Keck School of Medicine, CHLA/ОСК). Каждые 20 мл крови отбирали в вакуумные пробирки для исследования коагуляции Vacutainer (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния) и разбавляли одним объемом сбалансированного солевого раствора Хенкса (HBSS) при комнатной температуре. Разбавленную кровь наносили на 10 мл Фиколлпак-Премиум (Ficoll-paque premium, GE Healthcare, Пискатауэй, Нью-Джерси) и центрифугировали при 400×g в течение 40 минут. Затем собранный слой НПК/эритроцитов смешивали с 15 мл 3% декстрана T500 (Sigma) для осаждения в течение 2 ч при комнатной температуре. Эритроциты удаляли гипотоническим лизисом с применением стерильной воды в течение 18 секунд, и затем собирали центрифугированием обогащенный НПК слой. Чистота собранных НПК составляла >95%, по оценке с помощью морфологического анализа с окрашиванием по Райту-Гимзе. Свежеочищенные НПК использовали для анализов непосредственно после завершения выделения НПК.
Пролиферация клеток и клеточная смерть
[0057] Пролиферацию клеток определяли путем подсчета клеток с помощью стандартного гемоцитометра, согласно описанию [17, 29]. Вкратце, равные количества клеток высевали в трех повторах и подсчитывали по истечении периодов времени от 72 ч после высевания до 13 дней. Методом вытеснения трипанового синего одновременно измеряли пролиферацию клеток и ассоциированную с ней клеточную смерть в культурах.
Морфологический анализ дифференцировки в гранулоциты
[0058] Суспензии клеток цитоцентрифугировали для получения микропрепаратов на слайдах с последующей фиксацией метанолом и окрашивали по Райту-Гимзе (Sigma) согласно описанию [17, 29]. Морфологические показатели дифференцировки оценивали с помощью микроскопа Zeiss Axioplan; цветокоррекцию изображений проводили в Adobe Photoshop согласно описанию [17].
Трансмиссионная электронная микроскопия
[0059] Исследование ультраструктуры нейтрофилов и бактериальной инфекции проводилось сотрудниками лаборатории электронной микроскопии отделения патологии и лабораторной медицины (Electron Microscopy Laboratory, Department of Pathology and Laboratory Medicine) CHLA/USC. Процедуры подробно описаны ниже.
Вестерн-блоттинг
[0060] Вестерн-блоттинг (ВБ) проводили согласно описанию [15]. Для анализов использовали антитела к лактоферрину (Abcam, Кембридж, Великобритания), MMP-9 (Merck Chemicals, Дармштадт, Германия) и LL-37 (Biolegend, Сан-Диего, Калифорния).
Анализ дегрануляции
[0061] Клетки инкубировали в присутствии или в отсутствие E. coli DH5α (при значении показателя множественности инфекции (MOI) = 5; пропорция клетки:бактерии = 1:5) в бессывороточной среде DMEM в течение 30 минут при 37°C. И клеточную массу, и супернатанты собирали центрифугированием на 3000 об/мин на протяжении 7 минут. Клеточную массу суспендировали с 100 мкг/мл гентамицина и инкубировали при 37°C на протяжении 1 часа, с последующим сбором клеток и экстрагированием клеточных белков. Супернатант фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм (Pall corporation, Энн Арбор, Мичиган), затем белки в супернатанте концентрировали с применением центрифужного фильтра Amicon Ultra-4, предназначенного для отбора белков с массами более 3000 дальтон (Millipore, Биллерика, Массачусетс). Количество белка измеряли с применением набора для определения белка Bio-Rad DC Protein Assay (Геркулес, Калифорния) [29]. Параллельно анализировали изменение уровней белков гранул со стимуляцией или без стимуляции E. coli с применением ВБ.
Анализ фагоцитоза и киллинга бактерий
5
6
[0062] Каждые 5×10–2×10 свежеочищенных НПК, а также индуцированные ex vivo Г-ИН и А-ИН суспендировали с 500 мкл культуральной среды (DMEM с 10% ФБС) в пробирках объемом 1,5 мл. Клетки инкубировали с Escherichia coli (E. coli) DH5α в лог-фазе (предоставлены партнерами) или Staphylococcus aureus (S. aureus; ATCC) с MOI = 5 или 10 при 37°C на протяжении 15, 30 и/или 60 минут, при этом бактерии в отсутствие клеток использовали для определения роста. Образцы в присутствии или в отсутствие клеток центрифугировали при 1000 об/мин в каждый момент времени. Внеклеточные бактерии в присутствии клеток получали из супернатантов и размножали, высевая в разных разведениях (по 20 мкл каждого) на кровяной агар. Клеточную массу, собранную из образцов, инфицированных бактериями, дополнительно инкубировали с 100 мкг/мл гентамицина (Sigma) на протяжении 1 часа при 37°C для уничтожения внешних бактерий. Затем клетки промывали двукратно и лизировали 100 мкл 0,5% Triton X-100. Аликвоты разных разведений (по 20 мкл каждого) жизнеспособных внутриклеточных бактерий, выделенных из клеточных лизатов, высевали на кровяной агар. Количества внеклеточных и жизнеспособных внутриклеточных бактерий в каждый момент времени определяли по числу КОЕ согласно описанию [5, 30], а количество фагоцитированных и убитых бактерий определяли на основании числа внеклеточных и жизнеспособных внутриклеточных бактерий по сравнению с числом соответствующих бактерий в контроле в условиях без нейтрофилов [5, 30].
Магнитная сортировка нейтрофилов CD15+
[0063] Клетки, суспендированные в ФСБ, содержащем 0,5% БСА и 2 мМ ЭДТК, смешивали с антителами против CD15, конъюгированными с магнитными микрогранулами (Miltenyi Biotec, Бергиш-Гладбах, Германия) для инкубирования в течение 30 минут при 4°C. Затем субпопуляцию CD15+ очищали с применением магнитного сортера (Miltenyi Biotec, Бергиш-Гладбах, Германия) в соответствии с протоколом производителя.
Статистический анализ
[0064] Показатели описательной статистики, включая среднее, стандартное отклонение и размах, вычисляли при необходимости и анализировали с применением непарного двухстороннего T-критерия Стьюдента. Результаты считали статистически значимыми при Р-значениях, составляющих 0,05 или менее.
Киллинг бактерий in situ
[0065] Клетки инкубировали с E. coli или S. aureus в течение 15 минут и/или 60 минут, с последующим сбором клеток центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 минут. Клеточную массу суспендировали с 100 мкг/мл гентамицина и инкубировали при 37°C на протяжении 1 часа. После троекратного промывания клетки пермеабилизировали раствором Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) при 4°C на протяжении 20 минут. Затем клетки повторно промывали и ресуспендировали в ФСБ для мечения внутриклеточных живых и погибших бактерий с применением набора для мониторинга жизнеспособности бактерий LIVE/DEAD BacLight Viability Kit (Life Technologies, Гранд Айленд, Нью-Йорк) в соответствии с протоколом производителя. Клетки центрифугировали для получения микропрепаратов на слайдах и исследовали под конфокальным микроскопом с применением излучения криптон-аргонового лазера с длинами волн 488 и 564 нм. Окрашенные флуоресцентным красителем SYTO9 живые бактерии с интактными мембранами имеют зеленый цвет, тогда как погибшие бактерии с поврежденными мембранами окрашиваются в красный цвет флуоресцентным красителем пропидийиодидом (PI).
Обнаружение бактериальной инфекции методом иммунофлуоресценции
[0066] Г-ИН, А-ИН и НПК инкубировали с E. coli или S. aureus при MOI = 10 при 37°C в течение 15 минут и 60 минут. Клетки фиксировали 2% параформальдегидом при комнатной температуре на протяжении 20 минут с последующим блокированием ФСБ, содержащим 5% нормальной козьей сыворотки, в течение 30 минут. Для блокирования антигенов OmpA бактерий, оставшихся на поверхности клеток после инфицирования, клетки сначала инкубировали с антителом против OmpA на протяжении 1 часа при комнатной температуре, а затем инкубировали с конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP) антителом против IgG кролика при комнатной температуре в течение 30 минут для блокирования внешних первичных участков антител. После тщательного промывания клетки пермеабилизировали раствором для пермеабилизации (BD Biosciences) на протяжении 20 минут и затем инкубировали с антителом против OmpA для мечения внутриклеточных бактерий при комнатной температуре на протяжении 1 часа. После инкубирования клеток с козьим антителом против IgG кролика, конъюгированным с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), в течение 30 минут, клетки центрифугировали для получения микропрепаратов на слайдах и монтировали в растворе Vectashield Anti-Fade Solution (Vector laboratories, Берлингейм, Калифорния). Окрашенные FITC бактерии визуализировали с помощью конфокального микроскопа.
Проточно-цитометрический анализ
[0067] Меченые фикоэритрином антитела против CD66 (анти-CD66-PE) человека (распознающие субъединицы CD66a, CD66c, CD66d, и CD66e), антитела CD11b-APC, CD18-FITC и CD66b-PE, а также соответствующие им изотипы получали от BD Biosciences. Меченое фикоэритрином антитело против CD66a человека (анти-CD66a-PE) и соответствующий ему изотип получали от R&D Systems (Миннеаполис, Миннесота). Данные получали и анализировали с применением программного обеспечения FlowJo (версия 7.6.5; Tree star, Ашленд, Орегон).
Пример 2
Am80 стимулирует дифференцировку нейтрофилов более эффективно, чем Г-КСФ
[0068] Am80, CH55 и ITYA представляют собой группу ретиноидных агонистов, синтезированных путем введения гетероатомов в РК-подобные структуры (Фиг. 5). Поскольку все указанные агонисты обладают мощной ретиноидной активностью, эффективность указанных соединений для индуцирования гранулопоэза в CD34+ клетках сравнивали с Г-КСФ и РК, с применением разработанной авторами настоящего изобретения методологии [17, 29]. Авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что Г-КСФ был менее эффективен, чем РК, при индуцировании морфологической дифференцировки CD34+ клеток в гранулоциты, а также вызывал бόльшую индукцию моноцитов (Фиг. 6A). Однако при этом Г-КСФ индуцировал бόльшую пролиферацию клеток и обеспечивал более низкий показатель клеточной смерти по сравнению с РК (Фиг. 6B). Что касается других ретиноидных агонистов, Am80 (10 нМ) и CH55 (5 нМ) стимулировали >75% дифференцировку в гранулоциты к 13 дню, в отличие от ITYA (5 нМ), дававшего >60% моноцитов (Фиг. 6C). Хотя и Am80, и CH55 подавляли пролиферацию клеток (Фиг. 6D), как и РК (Фиг. 6B), показатель клеточной смерти, связанный с обработкой Am80, был ниже, чем наблюдаемый при обработке чем-либо из CH55 или РК (Фиг. 6B, 6D). В совокупности эти данные говорят о том, что Г-КСФ значительно менее эффективен в качестве индуктора дифференцировки в гранулоциты, чем РК, CH55 и Am80, а ITYA в основном индуцирует дифференцировку в моноциты. При том, что Am80, РК и CH55 стимулируют дифференцировку в гранулоциты с аналогичной эффективностью, Am80 индуцирует более низкий показатель клеточной смерти.
[0069] Поскольку более низкий уровень дифференцировки CD34+ клеток в гранулоциты, индуцируемый Г-КСФ на 12 день, была связан с более высоким уровнем индукции моноцитов, Г-КСФ способен индуцировать дифференцировку в гранулоциты более эффективно за короткий период времени. Соответственно, CD34+ клетки обрабатывали Г-КСФ в течение 6, 9 и 12 дней. Проведя анализ морфологической дифференцировки указанных клеток, авторы настоящего изобретения обнаружили, что более эффективная дифференцировка в гранулоциты при минимальном показателе индукции моноцитов происходит на 6 день, по сравнению как с 9-м днем, так и 12-м днем (Фиг. 1A). Используя указанные оптимальные условия 6-дневной индукции, сравнивали способность Г-КСФ и Am80 индуцировать дифференцировку CD34+ клеток в гранулоциты. Поскольку 10 нМ Am80 индуцировал большую клеточную смерть (Фиг. 6C), в тестах концентрацию Am80 заменили на пониженную (2,5 нМ или 5 нМ). Результаты показали, что 2,5 нМ Am80 не только выраженно индуцировал дифференцировку в гранулоциты при пренебрежимо малой индукции моноцитов (Фиг. 1B), но также проявлял меньшую токсичность по сравнению с 5 нМ Am80 (Фиг. 1C). Соответственно, эти результаты показывают, что оптимальный для Г-КСФ 6-дневный период индукции также подходит для Am80 (2,5 нМ), вследствие чего авторы использовали указанные длительность воздействия и дозировку лекарственных средств до конца исследования.
[0070] Дифференцировку CD34+ клеток в нейтрофилы анализировали на стадиях промиелоцитов, миелоцитов, метамиелоцитов и палочкоядерных нейтрофилов и до стадии зрелых сегментированных нейтрофилов. CD34+ клетки обрабатывали Г-КСФ или Am80 на протяжении 6 дней. Морфологический анализ гранулоцитов показал, что Am80 удовлетворительно индуцировал последовательное развитие нейтрофилов. И напротив, Г-КСФ индуцировал образование большего числа миелобластов, а также промиелоцитов и миелоцитов, чем палочкоядерных и сегментированных нейтрофилов (Фиг. 1D). Кроме того, Г-КСФ стабильно индуцировал моноциты (приблизительно 10%; Фиг. 1A, 1D). Указанные результаты показывают, что Am80 более эффективен, чем Г-КСФ, для индуцирования морфологической дифференцировки нейтрофилов, при аналогичном показателе цитотоксичности.
А-ИН более эффективен, чем Г-ИН, при синтезе и секретировании гранул
[0071] Во время дифференцировки нейтрофилов гетерогенные популяции белков гранул последовательно синтезируются и накапливаются в цитоплазме в качестве первой линии защиты против различных патогенов [32, 33]. Авторы настоящего изобретения провели исследование, чтобы выяснить, связано ли стимулируемое Am80 созревание нейтрофилов с повышенным синтезом гранул. Нейтрофилы, образующиеся при индуцировании Г-КСФ и Am80 в течение 6 дней из CD34+ клеток, анализировали с применением трансмиссионной электронной микроскопии. Снимки ультраструктуры показали, что на уровне сегментированных нейтрофилов Г-ИН содержали вариабельное количество везикул, часто содержащих менее плотный аморфный материал, наряду с небольшим количеством первично- и вторично-подобных гранул. Напротив, везикулы, обнаруженные в А-ИН, часто были наполнены плотным материалом или как аморфным, так и плотным материалом. По сравнению с Г-ИН, А-ИН содержали повышенное количество первично- и вторично-подобных гранул, наблюдаемых в НПК. Таким образом, эти данные указывают на заметные различия в образовании везикул и синтезе гранул между Г-ИН и А-ИН.
[0072] Авторы настоящего изобретения провели проверку того, действительно ли индуцированная Am80 дифференцировка в гранулоциты была связана с достаточным синтезом гранул, и протестировали способность А-ИН к дегрануляции при бактериальной стимуляции. CD34+ клетки обрабатывали Г-КСФ или Am80 на протяжении 6 дней. Полученные Г-ИН и А-ИН затем инкубировали в присутствии или в отсутствие E. coli в течение 30 минут, с последующим экстрагированием белков и из клеточных лизатов, и из супернатантов. ВБ-анализ синтеза и секретирования гранул показал, что лактоферрин, вторичная гранула, обладающая мощной антимикробной активностью широкого спектра [34, 35], накапливался в А-ИН и секретировался в среду в достаточных количествах при бактериальной стимуляции. И напротив, хотя уровень лактоферрина повышался при бактериальной стимуляции в Г-ИН, эффективность секретирования лактоферрина Г-ИН была значительно ниже, чем наблюдаемая для А-ИН (Фиг. 2A). Аналогичным образом, высокий уровень вторичных гранул LL-37 наблюдался в А-ИН, и при бактериальной стимуляции гранулы LL-37 эффективно высвобождались в среду. Г-ИН, с другой стороны, демонстрировали недостаточность как синтеза LL-37, так и дегрануляции (Фиг. 2B). Таким образом, и лактоферрин, и LL-37 эффективно синтезируются и секретируются А-ИН, но не Г-ИН.
[0073] Даже в отсутствие E. coli Г-ИН секретировали MMP-9 (третичные гранулы) в среду, и указанное секретирование подавлялось бактериальной стимуляцией (Фиг. 2C). С другой стороны, хотя присутствие E. coli повышало экспрессию MMP-9 в А-ИН, бактериальная стимуляция не была способна индуцировать секретирование MMP-9 А-ИН (Фиг. 2C). Указанные наблюдения указывают на возможные нарушения индукции или дегрануляции MMP-9 (или и того, и другого) в индуцированных ex vivo Г-ИН и А-ИН.
А-ИН обладают значительно более высокой фагоцитарной и бактерицидной активностью, чем Г-ИН
[0074] Описанные выше исследования показывают, что Am80 более эффективен, чем Г-КСФ, для стимуляции как морфологической дифференцировки в гранулоциты, так и синтеза/секретирования гранул (Фиг. 1, 2). Авторы настоящего изобретения установили, означает ли указанная более высокая степень дифференцировки нейтрофилов, индуцированная Am80, более высокий нейтрофильный иммунитет против бактериальной инфекции. Поскольку Am80 индуцирует больше палочкоядерных и сегментированных нейтрофилов, чем Г-КСФ (Фиг. 1), проверяли, обладали ли аналогичной бактерицидной активностью сортированные палочкоядерные и сегментированные нейтрофилы Г-ИН и А-ИН. Так как нейтрофилы являются клетками CD15+ [36], Г-ИН и А-ИН очищали с применением антитела против CD15, конъюгированного с магнитными микрогранулами. После очищения пропорция палочкоядерных к сегментированным нейтрофилам в несортированных Г-ИН повышалась от 21% до 63% в сортированных Г-ИН, аналогично данным, полученным для сортированных А-ИН (Фиг. 3B). Кроме того, фракция остаточных моноцитов в сортированных Г-ИН составляла всего приблизительно 1% (Фиг. 3A). Указанные несортированные и сортированные Г-ИН и А-ИН затем тестировали на способность к киллингу E. coli в лог-фазе вместе с свежевыделенными/очищенными НПК, состоящими из >95% сегментированных нейтрофилов (Фиг. 3B). Следует отметить, что по числу КОЕ видно, что лишь незначительное количество жизнеспособных бактерий выделяется из внутриклеточных компартментов НПК и несортированных А-ИН по сравнению с несортированными Г-ИН (Фиг. 3C). Как и несортированные Г-ИН, сортированные Г-ИН также обладали значительно меньшей способностью по сравнению с сортированными А-ИН к киллингу бактерий (Фиг. 3D). Усиленный бактериальный клиренс в А-ИН подтверждали мечением E. coli in situ с применением антитела против OmpA, специфически распознающим внешнюю мембрану E. coli. Эти результаты показывают, что уровни дифференцировки нейтрофилов в результате индуцированного Am80 гранулопоэза имеют важное значение для эффективного нейтрофильного иммунитета против бактериальной инфекции. Указанное наблюдение подтверждается данными, что в Г-ИН с морфологией сегментированных нейтрофилов все же наблюдается более низкий уровень гранулоподобных молекул и содержится большее количество менее плотных аморфных везикул.
[0075] Естественный иммунитет против бактериальной инфекции развивается во время дифференцировки нейтрофилов. Для сравнения указанной функции в А-ИН и Г-ИН CD34+ клетки обрабатывали Г-КСФ или Am80 на протяжении 6 дней с последующим анализом фагоцитирования и киллинга бактерий. С применением описанной ранее методологии [31, 37] Г-ИН, А-ИН и НПК инкубировали с E. coli в лог-фазе при MOI = 5 на протяжении 15 или 60 минут, или использовали E. coli в отсутствие нейтрофилов для мониторинга бактериального роста. И внеклеточные, и выделенные жизнеспособные внутриклеточные бактерии количественно определяли по числу КОЕ в образцах, где нейтрофилы приводили в контакт с бактериями. Затем определяли количества фагоцитированных и убитых бактерий, вычитая количество только внеклеточных бактерий, либо и внеклеточных, и внутриклеточных бактерий, соответственно, из количества бактерий в условиях без нейтрофилов. Количество внеклеточных бактерий было значительно снижено в образцах как НПК, так и А-ИН (Фиг. 4A, 4B). НПК быстро убивали бактерии в течение периода, не превышающего 15 минут, а через 60 минут и в образцах НПК, и в образцах А-ИН оставалось лишь незначительное количество жизнеспособных внутриклеточных бактерий (Фиг. 4C). С другой стороны, для Г-ИН наблюдался по существу нарушенный клиренс внутриклеточных бактерий через 60 минут после инфицирования, сохранялся более высокий уровень внеклеточных бактерий и наблюдался недостаточный киллинг бактерий (Фиг. 4A-D). Для подтверждения того, что А-ИН обладают более высокой бактерицидной активностью, чем Г-ИН, исследовали киллинг бактерий in situ, с применением конфокальной микроскопии для анализа как жизнеспособных бактерий, меченых флуоресцентным красителем SYTO9, так и убитых бактерий, меченых флуоресцентным красителем пропидийиодидом (PI). Результаты показали, что значительно больше выживших E. coli оставалось в образцах Г-ИН, где авторами было обнаружено значительно меньше погибших бактерий, по сравнению с наблюдениями в образцах А-ИН или НПК. Количественное определение как внеклеточных бактерий после инфицирования, так и погибших in situ бактерий подтвердило, что и А-ИН, и НПК обладают большей бактерицидной активностью по сравнению с Г-ИН (Фиг. 4E). Кроме того, на снимках ультраструктуры инфекции E. coli, полученных с помощью электронного микроскопа, видно, что в Г-ИН, содержащих менее плотные везикулы, оставались многочисленные интактные/выжившие бактерии; в тоже время, аналогично НПК, лишь немногочисленные интактные/выжившие бактерии были обнаружены в А-ИН, цитоплазма которых содержала плотные везикулы наряду с некоторым количеством первично- и вторично-подобных гранул. В совокупности эти данные говорят о том, что индуцированная Am80 дифференцировка в гранулоциты связана с повышенным нейтрофильным естественным иммунитетом против бактериальной инфекции.
Пример 3
Am80 индуцирует сопоставимое восстановление нейтрофилов по сравнению с Г-КСФ
[0076] Тридцать мышей C57BL6/J рандомизировали в шесть групп для проведения экспериментов. Дизайн эксперимента для анализа восстановления нейтрофилов с применением разных доз Am80 и Г-КСФ представлен на Фиг. 7A. Для индуцирования нейтропения на 0-й день проводили одну внутрибрюшинную инъекцию циклофосфамида (ЦФА) в дозе 200 мг/кг. Am80, Г-КСФ или основу вводили спустя 4 ч после ЦФА в течение 3-х последовательных дней. Нейтропения у мышей была индуцирована через 48–60 ч после инъекции ЦФА. Эксперимент проводили на 3 день. Периферическую кровь (ПК) собирали от умерщвленных контрольных мышей на 3 день; нейтрофилы ПК очищали с применением Фиколл-Пак (Ficoll-paque) (1.084). Бόльшая часть нейтрофилов была обнаружена на нижнем уровне Фиколл-Пак, что отражает анализ морфологии гранулоцитов (Фиг. 7B). Анализ восстановления лейкоцитов и нейтрофилов у мышей с нейтропенией, получавших лечение различными дозами Am80 или Г-КСФ, на 3 день, представлен на Фиг. 7C. Для Am80 в дозе 5 мг/кг наблюдалось сопоставимое восстановление нейтрофилов на нижнем уровне Фиколл-Пак по сравнению с 250 мкг Г-КСФ.
Пример 4
Мобилизованные Am80 нейтрофилы у мышей с нейтропенией проявляют более высокую бактерицидную активность по сравнению с мобилизованными Г-КСФ
[0077] Авторы обнаружили, что у всех экспериментальных мышей через 3 дня после инъекции ЦФА происходило значительное снижение числа как лейкоцитов, так и нейтрофилов по сравнению с контрольными мышами (Фиг. 8A). Вскоре после этого, на 5 день при инъецировании Г-КСФ, Am80 или основы на протяжении 2-х последовательных дней, Г-КСФ индуцировал значительно ускоренное восстановление нейтрофилов по сравнению с Am80, при этом количество нейтрофилов в получавшей основу группе также практически возвращалось к контрольным значениям (Фиг. 8A-B). Указанные нейтрофилы очищали из ПК разных групп мышей (всего 20 мышей), как показано на образце Г-ИН, и использовали для анализа бактерицидной активности, направленной против инфекции S. aureus in vitro. Авторы обнаружили (Фиг. 8C), что и НПКМ, и А-ИН либо Г-ИН значительно элиминировали внеклеточные бактерии по сравнению с нейтрофилами, выделенными из Ц-НПКМ, обработанных основой, при этом А-ИН значительно более эффективно элиминировали бактерии, чем и Г-ИН, и Ц-НПКМ. Аналогично НПКМ, А-ИН фагоцитировали и убивали значительно больше бактерий по сравнению как с Г-ИН, так и с Ц-НПКМ. Поскольку ускоренное восстановление нейтрофилов прекращалось на 7 день (Фиг. 8D), авторы очищали нейтрофилы из ПК различных мышей на 9 день (Фиг. 8E) для сравнения их бактерицидной активности после прекращения ускоренного восстановления нейтрофилов. Результаты показали, что и НПКМ, и А-ИН по-прежнему проявляли значительно более высокую бактерицидную активность, чем Ц-НПКМ, в то же время различий в фагоцитозе или киллинге бактерий между Г-ИН и Ц-НПКМ не наблюдалось (Фиг. 8F). Эти данные указывают на то, что аналогично НПКМ, мобилизованные Am80 нейтрофилы у мышей с нейтропенией значительно более эффективны против инфекции S. aureus по сравнению с мобилизованными Г-КСФ, даже, несмотря на то, что Г-КСФ способен индуцировать значительно больше нейтрофилов, чем Am80, на ранней стадии восстановления нейтрофилов. Кроме того, хотя количества Ц-НПКМ достигают значительно более высокого уровня, чем контрольные значения, на более поздней стадии восстановления нейтрофилов, бактерицидная активность Ц-НПКМ остается значительно более низкой, чем у НПКМ или А-ИН.
7
[0078] С применением модели на мышах с нейтропенией, индуцированной одной дозой ЦФА согласно описанию [31, 32], авторы настоящего изобретения проводили тестирование для установления того, действительно ли мобилизованные Am80 in vivo нейтрофилы обладают таким же более высоким нейтрофильным иммунитетом против бактериальной инфекции по сравнению с индуцированными Г-КСФ, как и наблюдавшийся в модели ex vivo (Фиг. 8A-F). Двадцать мышей C57BL6/J рандомизировали в 4 группы для экспериментов in vivo. ЦФА в количестве 200мг/кг вводили на 0-й день. Г-КСФ, 250 мкг/кг, или Am80, 5 мг/кг, вводили на 0, 1 и 2 дни. Спустя 16 часов после внутрибрюшинной инокуляции 3×10 S. aureus в логарифмической фазе роста анализировали бактерицидную активность очищенных нейтрофилов, определяя количество жизнеспособных внеклеточных бактерий в брюшинной полости (Фиг. 8G-i) и ПК (Фиг. 8G-ii). Количество жизнеспособных бактерий подсчитывали в 3 мл промытой ФСБ перитонеальной жидкости, а также приблизительно 1,5 мл от общего объема плазмы крови. P-значение для жизнеспособных бактерий в брюшинной полости: сравнение Am80 и Г-КСФ, P <2,4E-8; сравнение контроля и Г-КСФ, P <4,7E-9; сравнение основы и Г-КСФ, P <8,3E-3; сравнение Am80 и основы, P <3,1E-9; сравнение Am80 и контроля, P <0,038. На Фиг. 8A-iii представлено общее количество жизнеспособных внеклеточных бактерий на Фиг. 8G-i и -ii. Сравнение Am80 и Г-КСФ, P <1,9E-6; сравнение контроля и Г-КСФ, P <9,4E-9; сравнение основы и Г-КСФ, P <6,5E-4; сравнение Am80 и основы, P <6,8E-7; сравнение контроля и Am80, P <3,8E-5. На Фиг. 8G-iv приведены значения кратности изменения количества жизнеспособных бактерий из Фиг. 8G-iii. Жизнеспособные бактерии в контрольной группе используют в качестве стандарта кратности, равного 1.
[0079] С применением модели на мышах с нейтропенией, индуцированной одной дозой ЦФА согласно описанию [31, 32], авторы настоящего изобретения проводили тестирование для установления того, действительно ли мобилизованные Am80 in vivo нейтрофилы обладают таким же, более высоким, нейтрофильным иммунитетом против бактериальной инфекции по сравнению с индуцированными Г-КСФ, как и наблюдавшийся в модели in vivo (Фиг. 8A). Авторы обнаружили, что у всех экспериментальных мышей происходило значительное снижение числа как лейкоцитов, так и нейтрофилов по сравнению с контрольными мышами через 3 дня после инъекции ЦФА (Фиг. 8B). Вскоре после этого, на 5 день при инъецировании Г-КСФ, Am80 или основы на протяжении 2-х последовательных дней, Г-КСФ индуцировал значительно ускоренное восстановление нейтрофилов по сравнению с Am80, при этом количество нейтрофилов в получавшей основу группе также практически возвращалось к контрольным значениям (Фиг. 8B-C). Указанные нейтрофилы очищали из ПК различных мышей, как показано на образце Г-ИН, и использовали для анализа бактерицидной активности, направленной против инфекции S. aureus in vitro. Авторы обнаружили (Фиг. 8D), что как НПКМ, так и А-ИН, или Г-ИН существенно элиминировали внеклеточные бактерии по сравнению с нейтрофилами, выделенными из Ц-НПКМ, обработанных основой, при этом А-ИН значительно более эффективно элиминировали бактерии, чем и Г-ИН, и Ц-НПКМ. Аналогично НПКМ, А-ИН фагоцитировали и убивали значительно больше бактерий по сравнению как с Г-ИН, так и с Ц-НПКМ. Поскольку ускоренное восстановление нейтрофилов прекращалось на 7 день (Фиг. 8E), авторы очищали нейтрофилы из ПК различных мышей на 9 день (Фиг. 8F) для сравнения их бактерицидной активности после прекращения ускоренного восстановления нейтрофилов. Результаты показали, что и НПКМ, и А-ИН по-прежнему проявляли значительно более высокую бактерицидную активность, чем Ц-НПКМ, тогда как различий в фагоцитозе или киллинге бактерий Г-ИН и Ц-НПКМ не наблюдалось (Фиг. 8G). Эти данные указывают на то, что аналогично НПКМ, мобилизованные Am80 нейтрофилы у мышей с нейтропенией значительно более эффективны против инфекции S. aureus по сравнению с мобилизованными Г-КСФ, даже, несмотря на то, что Г-КСФ способен индуцировать значительно больше нейтрофилов, чем Am80, на ранней стадии восстановления нейтрофилов. Кроме того, хотя количества Ц-НПКМ достигают уровня, значительно более высокого, чем контрольные значения, на более поздней стадии восстановления нейтрофилов, бактерицидная активность Ц-НПКМ все же остается значительно более низкой по сравнению с НПКМ или А-ИН.
[0080] Описанные в настоящем документе исследования демонстрируют, что полученные ex vivo и in-vivo посредством обработки Am80 CD34+ клеток нейтрофилы не только проявляют более высокую зрелость дифференцировки, но также обладают более высокой эффективностью против бактериальной инфекции по сравнению с Г-КСФ. Предположительно, это обусловлено координированием функционального взаимодействия CD66 с CD18, стимулирующего развитие нейтрофильного естественного иммунитета в результате гранулопоэза. Дальнейший анализ подобного регуляторного механизма должен обеспечить новое понимание опосредованного ретиноидами гранулопоэза и дифференцировки нейтрофилов. Это, в свою очередь, обеспечит убедительную молекулярную основу для разработки эффективных способов терапии нейтропении, а также для получения гранулоцитов ex vivo для трансфузионной терапии для снижения продолжительности нейтропении, с применением Am80 в качестве экономически целесообразной терапевтической молекулы.
УКАЗАТЕЛЬ ССЫЛОЧНЫХ МАТЕРИАЛОВ
1. Huston A, Lyman GH. Agents under investigation for the treatment and prevention of neutropenia. Expert Opin Investig Drugs. 2007;16:1831-1840.
2. Beekman R, Touw IP. G-CSF and its receptor in myeloid malignancy. Blood. 2010;115:5131-5136.
3. Kuderer NM, Dale DC, Crawford J, Cosler LE, Lyman GH. Mortality, morbidity, and cost associated with febrile neutropenia in adult cancer patients. Cancer. 2006;106:2258-2266.
4. Marti FM, Cullen MH, Roila F. Management of febrile neutropenia: ESMO clinical recommendations. Ann Oncol. 2009;20 Suppl 4:166-169.
5. Dick EP, Prince LR, Sabroe I. Ex vivo-expanded bone marrow CD34+ derived neutrophils have limited bactericidal ability. Stem Cells. 2008;26:2552-2563.
6. Kagechika H. Novel synthetic retinoids and separation of the pleiotropic retinoidal activities. Curr Med Chem. 2002;9:591-608.
7. Miwako I, Kagechika H. Tamibarotene. Drugs Today (Barc). 2007;43:563-568.
8. Ohnishi K. PML-RARalpha inhibitors (ATRA, tamibaroten, arsenic troxide) for acute promyelocytic leukemia. Int J Clin Oncol. 2007;12:313-317.
9. Fukasawa H, Iijima T, Kagechika H, Hashimoto Y, Shudo K. Expression of the ligandbinding domain-containing region of retinoic acid receptors alpha, beta and gamma in Escherichia coli and evaluation of ligand-binding selectivity. Biol Pharm Bull. 1993;16:343- 348.
10. Hashimoto Y, Kagechika H, Shudo K. Expression of retinoic acid receptor genes and the ligand-binding selectivity of retinoic acid receptors (RAR's). Biochem Biophys Res Commun. 1990;166:1300-1307.
11. de The H, Marchio A, Tiollais P, Dejean A. Differential expression and ligand regulation of the retinoic acid receptor alpha and beta genes. Embo J. 1989;8:429-433.
12. Chambon P. A decade of molecular biology of retinoic acid receptors. Faseb J. 1996;10:940-954.
13. Evans T. Regulation of hematopoiesis by retinoid signaling. Exp Hematol. 2005;33:1055- 1061.
14. Douer D, Ramezani L, Parker J, Levine AM. All-trans-retinoic acid effects the growth, differentiation and apoptosis of normal human myeloid progenitors derived from purified CD34+ bone marrow cells. Leukemia. 2000;14:874-881.
15. Wang J, Barsky LW, Shum CH, et al. Retinoid-induced G1 arrest and differentiation activation are associated with a switch to cyclin-dependent kinase-activating kinase hypophosphorylation of retinoic acid receptor alpha. Journal of Biological Chemistry. 2002;277:43369-43376.
16. Wang JG, Barsky LW, Davicioni E, et al. Retinoic acid induces leukemia cell G1 arrest and transition into differentiation by inhibiting cyclin-dependent kinase-activating kinase binding and phosphorylation of PML/RARalpha. Faseb J. 2006;20:2142-2144.
17. Luo P, Wang A, Payne KJ, et al. Intrinsic retinoic acid receptor alpha-cyclin-dependent kinase-activating kinase signaling involves coordination of the restricted proliferation and granulocytic differentiation of human hematopoietic stem cells. Stem Cells. 2007;25:2628- 2637.
18. Gudas LJ. Emerging roles for retinoids in regeneration and differentiation in normal and disease states. Biochim Biophys Acta. 2012;1821:213-221.
19. Soprano DR, Qin P, Soprano KJ. Retinoic acid receptors and cancers. Annu Rev Nutr. 2004;24:201-221.
20. Melnick A, Licht JD. Deconstructing a disease: RARalpha, its fusion partners, and their roles in the pathogenesis of acute promyelocytic leukemia. Blood. 1999;93:3167-3215.
21. Collins SJ. Retinoic acid receptors, hematopoiesis and leukemogenesis. Curr Opin Hematol. 2008;15:346-351.
22. Cornic M, Delva L, Castaigne S, et al. In vitro all-trans retinoic acid (ATRA) sensitivity and cellular retinoic acid binding protein (CRABP) levels in relapse leukemic cells after remission induction by ATRA in acute promyelocytic leukemia. Leukemia. 1994;8 Suppl 2:S16-19.
23. Degos L, Dombret H, Chomienne C, et al. All-trans-retinoic acid as a differentiating agent in the treatment of acute promyelocytic leukemia. Blood. 1995;85:2643-2653.
24. Delva L, Cornic M, Balitrand N, et al. Resistance to all-trans retinoic acid (ATRA) therapy in relapsing acute promyelocytic leukemia: study of in vitro ATRA sensitivity and cellular retinoic acid binding protein levels in leukemic cells. Blood. 1993;82:2175-2181.
25. Ishida S, Shigemoto-Mogami Y, Shinozaki Y, et al. Differential modulation of PI3-kinase/Akt pathway during all-trans retinoic acid- and Am80-induced HL-60 cell differentiation revealed by DNA microarray analysis. Biochem Pharmacol. 2004;68:2177-2186.
26. Jimi S, Mashima K, Matsumoto T, Hara S, Suzumiya J, Tamura K. RARalpha is a regulatory factor for Am-80-induced cell growth inhibition of hematologic malignant cells. Int J Oncol. 2007;31:397-404.
27. Hashimoto Y, Kagechika H, Kawachi E, Fukasawa H, Saito G, Shudo K. Correlation of differentiation-inducing activity of retinoids on human leukemia cell lines HL-60 and NB4. J Cancer Res Clin Oncol. 1995;121:696-698.
28. Tobita T, Takeshita A, Kitamura K, et al. Treatment with a new synthetic retinoid, Am80, of acute promyelocytic leukemia relapsed from complete remission induced by all-trans retinoic acid. Blood. 1997;90:967-973.
29. Chaudhry P, Yang X, Wagner M, Jong AY, Wu L. Retinoid-regulated FGF8f secretion by osteoblasts bypasses retinoid stimuli to mediate granulocytic differentiation of myeloid leukemia cells. Mol Cancer Ther. 2012;11:267-276.
30. Mittal R, Krishnan S, Gonzalez-Gomez I, Prasadarao NV. Deciphering the roles of outer membrane protein A extracellular loops in the pathogenesis of Escherichia coli K1 meningitis. J Biol Chem. 2011;286:2183-2193.
31. Mittal R, Bulgheresi S, Emami C, Prasadarao NV. Enterobacter sakazakii targets DC-SIGN to induce immunosuppressive responses in dendritic cells by modulating MAPKs. J Immunol. 2009;183:6588-6599.
32. Hager M, Cowland JB, Borregaard N. Neutrophil granules in health and disease. J Intern Med. 2010;268:25-34.
33. Borregaard N, Sorensen OE, Theilgaard-Monch K. Neutrophil granules: a library of innate immunity proteins. Trends Immunol. 2007;28:340-345.
34. van der Velden WJ, Blijlevens NM, Donnelly JP. The potential role of lactoferrin and derivatives in the management of infectious and inflammatory complications of hematology patients receiving a hematopoietic stem cell transplantation. Transpl Infect Dis. 2008;10:80- 89.
35. Ward PP, Paz E, Conneely OM. Multifunctional roles of lactoferrin: a critical overview. Cell Mol Life Sci. 2005;62:2540-2548.
36. Kerr MA, Stocks SC. The role of CD15-(Le(X))-related carbohydrates in neutrophil adhesion. Histochem J. 1992;24:811-826.
37. Mittal R, Prasadarao NV. Outer membrane protein A expression in Escherichia coli K1 is required to prevent the maturation of myeloid dendritic cells and the induction of IL-10 and TGF-beta. J Immunol. 2008;181:2672-2682.
38. Groves E, Dart AE, Covarelli V, Caron E. Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells. Cell Mol Life Sci. 2008;65:1957-1976.
39. Kuespert K, Pils S, Hauck CR. CEACAMs: their role in physiology and pathophysiology. Curr Opin Cell Biol. 2006;18:565-571.
40. Kuijpers TW, van der Schoot CE, Hoogerwerf M, Roos D. Cross-linking of the carcinoembryonic antigen-like glycoproteins CD66 and CD67 induces neutrophil aggregation. J Immunol. 1993;151:4934-4940.
41. Lo SK, Lee S, Ramos RA, et al. Endothelial-leukocyte adhesion molecule 1 stimulates the adhesive activity of leukocyte integrin CR3 (CD11b/CD18, Mac-1, alpha m beta 2) on human neutrophils. J Exp Med. 1991;173:1493-1500.
42. Skubitz KM, Campbell KD, Skubitz AP. CD66a, CD66b, CD66c, and CD66d each independently stimulate neutrophils. J Leukoc Biol. 1996;60:106-117.
43. Ando K, Muguruma Y, Yahata T. Humanizing bone marrow in immune-deficient mice. Curr Top Microbiol Immunol. 2008;324:77-86.
44. Mayack SR, Wagers AJ. Osteolineage niche cells initiate hematopoietic stem cell mobilization. Blood. 2008;112:519-531.
45. Kuijpers TW, Hoogerwerf M, van der Laan LJ, et al. CD66 nonspecific cross-reacting antigens are involved in neutrophil adherence to cytokine-activated endothelial cells. J Cell Biol. 1992;118:457-466.
46. Park DJ, Chumakov AM, Vuong PT, et al. CCAAT/enhancer binding protein epsilon is a potential retinoid target gene in acute promyelocytic leukemia treatment. J Clin Invest. 1999;103:1399-1408.
47. Bush TS, St Coeur M, Resendes KK, Rosmarin AG. GA-binding protein (GABP) and Sp1 are required, along with retinoid receptors, to mediate retinoic acid responsiveness of CD18 (beta 2 leukocyte integrin): a novel mechanism of transcriptional regulation in myeloid cells. Blood. 2003;101:311-317.
48. Hickstein DD, Baker DM, Gollahon KA, Back AL. Identification of the promoter of the myelomonocytic leukocyte integrin CD11b. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992;89:2105-2109.
49. Chih DY, Chumakov AM, Park DJ, Silla AG, Koeffler HP. Modulation of mRNA expression of a novel human myeloid-selective CCAAT/enhancer binding protein gene (C/EBP epsilon). Blood. 1997;90:2987-2994.
50. Faurschou M, Borregaard N. Neutrophil granules and secretory vesicles in inflammation. Microbes Infect. 2003;5:1317-1327.
[0081] Различные описанные выше способы и техники обеспечивают ряд способов реализации описанного изобретения. Конечно, следует понимать, что не обязательно могут достигаться все описанные цели или преимущества согласно какому-либо описанному в настоящем документе конкретному варианту реализации. Соответственно, например, специалистам в данной области техники будет понятно, что указанные способы могут осуществляться таким образом, чтобы обеспечить или оптимизировать одно из преимуществ или группу преимуществ согласно настоящему описанию, необязательно обеспечивающим достижение других целей или преимуществ в соответствии с описанными или предложенными в настоящем документе. Различные альтернативные варианты упомянуты в настоящем документе. Следует понимать, что некоторые предпочтительные варианты конкретным образом включают тот или иной признак, или несколько признаков, в то время как другие конкретным образом исключают тот или иной признак, или несколько признаков, тогда как третьи ограничивают конкретный признак путем включения того или иного благоприятного признака, или нескольких благоприятных признаков.
[0082] Кроме того, специалист в данной области техники сможет увидеть применимость различных признаков разных вариантов реализации. Аналогичным образом, различные элементы, признаки и шаги изобретения, описанные выше, а также другие известные эквиваленты для каждого такого элемента, признака или шага, могут быть использованы в различных комбинациях специалистом в указанной области техники для реализации способов в соответствии с описанными в настоящем документе принципами. Некоторые из различных элементов, признаков и шагов изобретения конкретно включены, а другие конкретно исключены согласно разнообразным вариантам реализации изобретения.
[0083] Хотя в настоящей заявке изобретение было раскрыто в контексте определенных вариантов и примеров реализации, специалистам в данной области техники будет понятно, что варианты реализации настоящего изобретения выходят за рамки конкретно описанных вариантов реализации, включая другие альтернативные варианты реализации и/или применения, и их модификации и эквиваленты.
[0084] Согласно некоторым вариантам реализации термины в единственном числе, в том числе предваряемые определением «указанный(ая, ое)», и аналогичные обозначения при использовании в контексте описания конкретного варианта реализации согласно настоящей заявке (в частности, в контексте определенных пунктов приводимой ниже формулы изобретения) могут толковаться как охватывающие и единственное, и множественное число. Указание диапазонов значений в настоящем документе используется исключительно в качестве способа краткого обозначения индивидуально каждого из отдельных значений, попадающих в указанный диапазон. Если иное не указано в настоящем документе, каждое индивидуальное значение включено в настоящее описание в той же степени, как если бы оно было указано индивидуально. Все описанные в настоящем документе способы могут быть реализованы в любом подходящем порядке, если иное не указано в настоящем документе или если это иным образом явно не противоречит контексту. Использование всех и каждого из примеров, или выражений для обозначения примеров (например, «такой как»), относящихся к определенным вариантам реализации согласно настоящему описанию, предназначено исключительно для лучшего разъяснения настоящей заявки и не накладывает ограничений на объем иным образом заявленного в настоящем описании изобретения. Никакое из использованных в настоящем описании выражений не должно быть истолковано как указание на любой незаявленный элемент, имеющий существенное значение для реализации настоящего заявленного изобретения.
[0085] В настоящем документе описаны предпочтительные варианты реализации заявленного изобретения, в том числе наилучший известный авторам настоящего изобретения вариант реализации заявленного изобретения. Вариации указанных предпочтительных вариантов реализации будут очевидными для специалистов в данной в данной области техники после прочтения приведенного выше описания. Предполагается, что специалисты смогут использовать такие вариации в надлежащих случаях, и что заявленное изобретение может быть реализовано иным образом, отличным от конкретно описанных в настоящем документе. Соответственно, многие варианты реализации заявленного изобретения включают все модификации и эквиваленты объекта изобретения, включенного в прилагаемую к настоящему описанию формулу изобретения, в соответствии с применимым законодательством. Кроме того, в настоящую заявку включена любая комбинация описанных выше элементов во всех возможных вариантах, если иное не указано в настоящем документе или если это иным образом явно не противоречит контексту.
[0086] Все упоминаемые здесь патенты, патентные заявки, опубликованные патентные заявки и другой материал, такой как статьи, книги, технические описания, публикации, документы, предметы и/или т.п., включены в настоящий документ полностью для всех целей посредством данной ссылки, исключая любые связанные с ними материалы делопроизводства, и любые из указанных материалов, не согласующиеся с настоящим документом или противоречащие ему, или любые из указанных материалов, которые могут ограничивать максимальный объем формулы настоящего изобретения, в настоящий момент или позже связанной с настоящим документом. Например, в случае возникновения какого-либо несоответствия или конфликта между описанием, определением и/или использованием термина, связанным с любым включенным материалом, и описанием, определением и/или использованием термина, связанным с настоящим документом, преимущественную силу будет иметь описание, определение и/или использование термина в настоящем документе.
[0087] В заключение, следует понимать, что варианты реализации заявленного изобретения, раскрытые в настоящем документе, иллюстрируют принципы вариантов реализации заявленного изобретения. Другие подходящие для применения модификации могут входить в объем заявленного изобретения. Таким образом, в качестве примера, но без ограничений, альтернативные конфигурации вариантов реализации заявленного изобретения могут быть использованы в соответствии с представленными в настоящем документе принципами. Соответственно, варианты реализации заявленного изобретения не ограничиваются вариантами, точно соответствующими представленным и описанным вариантам.