СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ НАЛИЧИЯ МИКРОБНОЙ БИОМАССЫ ЗЕМНОГО ТИПА НА КОСМИЧЕСКИХ ТЕЛАХ
METHOD OF DETECTING PRESENCE OF MICROBIAL BIOMASS OF TERRESTRIAL TYPE ON SPACE BODIES

Изобретение относится к созданию способа выявления микробной биомассы на планетах и спутниках планет Солнечной системы.
Известен способ для выявления микробной биомассы по регистрации ее химических элементов, в котором важнейшие характеристики, включая физиологическое состояние клетки, определялись по измерению величины соотношения содержания в клетке некоторых биологически значимых элементов: К, Са, Р, S, что позволило отличить жизнеспособные микроорганизмы, находящиеся в вегетативной фазе, от нежизнеспособных бактерий, при этом низкое соотношение P/S и повышенное содержание кальция указывали на покоящиеся формы микробных сообществ. Для проведения измерений использовался электронный микроскоп JEM-100CXII (JEOL, Япония), снабженный сканирующей приставкой EM-ASID4D и рентгеновским микроанализатором LINK-860 с детектором Е5423, что обеспечивало необходимую чувствительность и массовое разрешение элементов (см. статью А.Л. Мулюкин и др. «Применение рентгеновского микроанализа для выявления клеток микроорганизмов различного физиологического статуса в объектах окружающей среды», журнал Микробиология, М., 2002, том 71, вып. 6, стр. 836-848).
Однако выявление биомассы с использованием рентгеновского микроанализа связано со сложностью настройки и дистанционного управления и значительным весом инструмента, а также с большими трудностями по автоматической подготовке пробы для таких измерений, которая является достаточно сложной даже в условиях земной лаборатории.
Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ обнаружения наличия микробной биомассы земного типа, заключающийся в том, что получают тестируемый образец, о котором известно, что он содержит или может содержать микроорганизмы, помещают тестируемый образец в контейнер, отделяют от тестируемого образца компоненты тестируемого образца с микроорганизмами, проводят масс-спектрометрическое исследование компонентов тестируемого образца с микроорганизмами (см. патент RU №2533252, кл. G01N 33/50, опубл. 20.11.2014).
Данный способ позволяет выявлять микроорганизмы, однако данный способ не позволяет обнаруживать наличие микроорганизмов в грунте тестируемого образца, полученного при исследованиях грунта космических тел, что сужает возможности данного способа.
Задача изобретения заключается в расширении возможностей по обнаружению наличия микробной биомассы земного типа.
Технический результат заключается в том, что достигается возможность обеспечить объемный анализ биомассы для обнаружения наличия микробной биомассы земного типа.
2
3
Указанная задача решается, а технический результат достигается за счет того, что способ обнаружения наличия микробной биомассы земного типа заключается в том, что получают тестируемый образец, о котором известно, что он содержит или может содержать микроорганизмы, отделяют от тестируемого образца компоненты тестируемого образца с микроорганизмами, проводят масс-спектрометрическое исследование компонентов тестируемого образца с микроорганизмами, при этом в качестве тестируемого образца используют полученный при исследованиях грунт космических тел, который перемешивают с водой или спиртовым растворителем и отделяют сливом верхний слой с десорбированными в воду от тестируемого образца грунта микроорганизмами в качестве компонентов тестируемого образца с микроорганизмами, причем при сливе верхний слой с микроорганизмами пропускают через смешанный слой ионообменных смол анионита АВ-17 и катеонита КУ-2, и таким образом обеспечивают очистку воды с микроорганизмами в 10-10 раз, после этого очищенную воду с микроорганизмами подают на металлическую подложку мишени для масс-спектрометрического исследования, далее испарением воды на металлической подложке формируют слой микроорганизмов и оставшихся в воде микрочастиц, а затем полученную мишень помещают через шлюз в предварительно откачанную вакуумную камеру или помещают в камеру, которую затем вакуумируют, после чего мишень подвергают масс-спектрометрическому лазерному воздействию, при этом в ходе масс-спектрометрического исследования вывод о наличии микроорганизмов земного типа делают по величинам массовых пиков химических элементов, относящихся к исследуемым биомаркерам N, С и соотношению биомаркеров: P/S и Са/К.
Дополнительно в ходе масс-спектрометрического исследования могут быть использованы маркеры биологически важных соединений (биоэлементы) Cl, Na, Mg.
Дополнительно в ходе масс-спектрометрического исследования могут быть использованы маркеры биологически важных микропримесей (микроэлементы) Mn, Zn, Cu, I, F, Со, Мо, В, Br, As, Pb, Ag, Ni, Li, V.
В ходе проведенного исследования была выявлена возможность обнаружения наличия микробной биомассы земного типа в тестируемых образцах, полученных при исследованиях грунта космических тел.
Но важно было не просто найти способ исследования, а обеспечить возможность для проведения подобных работ с борта космических аппаратов.
Для этого нужно было одновременно решить несколько взаимосвязанных задач. В частности, обеспечить объемный анализ биомассы и существенно уменьшить вес бортового прибора.
Для устранения препятствий, связанных с измерениями объемного элементного состава биологической пробы, в качестве измерительного инструмента выбран компактный, многоцелевой, несложный в управлении бортовой прибор - лазерный времяпролетный масс-спектрометр (ЛВПМС) (см. патент RU №2096861). Этот прибор обладает высоким быстродействием, чувствительностью и аналитическими характеристиками.
Подготовка пробы в данном случае может быть осуществлена при использовании относительно простого экстрактора микроорганизмов из реголита. Лазерное воздействие позволяет испарять слои толщиной несколько микрон и, следовательно, получать информацию об объемном составе элементов, входящих в состав микроорганизмов.
Эксперименты по испытанию ЛВПМС для обнаружения биомаркеров показали, что он подходит для решения поставленной задачи. Так, было установлено, что элементы, представляющие собой биомаркеры, такие как Са, К, Р, S, регистрируются с высоким разрешением и с хорошей точностью. Результаты этих измерений после их обработки позволяют с необходимой точностью определить соотношения биомаркеров.
На фиг. 1 представлены результаты серии измерений элементного состава микроорганизмов, нанесенные на диаграмму.
На осях диаграммы показаны величины соотношений биомаркеров: P/S и Са/К.
На фиг. 2 представлены геологические породы и различные микроорганизмы согласно соотношению маркеров N/C.
Условные обозначения к графикам, изображенным на фигурах 1 и 2.
А - зона, соответствующая микроорганизмам
В - зона, соответствующая составу марсианского реголита по данным McLennan et al.,2014, APXS Curiosity NASA JPL.
По результатам этих измерений была выделена зона расположения культур различных микроорганизмов и область разброса этих данных, в том числе и статистическая.
В ходе проведения исследований создавалась модель биологической пробы. Для этого чистые культуры микроорганизмов добавлялись в дистиллированную воду. Далее капля воды с культурой наносилась на вольфрамовую подложку. После высыхания капли биологическая проба, нанесенная на вольфрамовую подложку, вводилась в неоткаченную вакуумную камеру, которую затем откачивали до достижения в ней высокого вакуума, или через шлюз вводилась в откаченную вакуумную камеру, после чего проводились измерения масс-спектрометром. По результатам этих измерений определялись величины соотношений P/S и Са/К, которые наносились на график (см. фиг. 1).
Кроме этих результатов на график наносились результаты измерений соотношений элементов P/S и Са/К для марсианского реголита, измеренные с помощью прибора APXS с борта марсианского ровера Curiosity.
На этот график также были нанесены соотношения P/S и Са/К для минеральных стандартов земных пород.
Как это хорошо видно из графика, данные по соотношениям P/S и Са/К для реголита и для большинства различных геологических стандартов не попадали в область диаграммы, которой соответствовали пробы микроорганизмов.
В качестве дополнительных биомаркеров для повышения достоверности метода введены матричные биомаркеры N и С, находящиеся в микроорганизмах с концентрацией не менее 8%, а также маркеры биологически важных соединений (биоэлементы) Cl, Na, Mg и маркеры биологически важных микропримесей (микроэлементы) Mn, Zn, Cu, I, F, Со, Мо, В, Br, As, Pb, Ag, Ni, Li, V.
Проба базальта BCVO-2, согласно измерениям, находится достаточно близко к зоне микроорганизмов. Для увеличения достоверности результатов было принято решение ввести дополнительные маркеры, которые автоматически регистрировались в тех же условиях и тем же прибором. Предложенные биомаркеры N и С условно можно назвать матричными или структурными биомаркерами, так как они являются базовыми для любой живой субстанции, в том числе и для микроорганизмов. Попадание исследуемой пробы в зону жизни по всем критериям существенно увеличивает надежность результатов.
При наблюдении же клеток in situ, в составе грунтов и почв, для определения микроорганизмов по соотношению четырех элементов, необходимо экстрагировать клетки из минеральной среды, в которой они находятся.
Известно, что матричные структуры любой земной биологической субстанции содержат такие элементы, как Н, N, С, О. Однако концентрации Н и О в этих структурах зависят от влажности биомассы. Поэтому для обеспечения надежности измерений использовались в качестве дополнительных такие биомаркеры, как N и С, с тем, чтобы не связываться с элементами, входящими в состав воды.
По сути, введение дополнительных биомаркеров дополняет двумерную диаграмму (P/S-Са/К) еще одной (N-С), на которой должно было произойти существенное разделение зоны микроорганизмов от зоны марсианского реголита, а также от зоны, занятой геологическими породами земных стандартов.
Исследования, проведенные по определению содержания N и С, показывают, что для микроорганизмов обе эти величины существенно превышают 1% и располагаются в правом верхнем углу графика. В то же время, согласно последним данным по измерениям марсианского реголита эти величины не превышают 0,3% и 0,1% соответственно и располагаются в левом нижнем углу графика. Также следует отметить, что стандарты земных геологических пород не «достигают» зоны локализации микроорганизмов.
Как видно из графика на фиг. 2, проба вулканического базальта BHVO-2 по соотношению маркеров N/C не может быть ошибочно отнесена к зоне, соответствующей микроорганизмам.
Для дальнейшего увеличения надежности выявления биомассы в зависимости от поставленной задачи можно рассматривать и дополнительные биомаркеры. Так, одним из важных маркеров является хлор, который необходим для обеспечения протекания биохимических реакций. Для выявления биомассы также можно рассматривать и химические элементы, относящиеся к биологическим микроэлементам. Эти микроэлементы исполняют ряд важных функций в процессе жизнедеятельности живой субстанции, и их присутствие в пробе может рассматриваться как вспомогательный маркер живой материи.
Известно, что реголит Марса содержит значительное количество водорастворимых солей, включающих К и Са. При высокой засоленности среды в спектре в повышенных концентрациях могут оказаться элементы, совпадающие с элементами биомаркеров, что может не позволить корректно провести определение. В этом случае для проведения корректных измерений необходимо после осаждения грубых фракций и экстракции провести очистку исследуемой пробы от солей.
Подобная очистка проводилась в процессе подготовки пробы с помощью микрокартриджей, находящихся в составе устройства подготовки пробы при использовании широко известных и общепринятых стандартных методов экстракции земных микроорганизмов.
2
3
Бортовое устройство представляет собой герметичный объем 10 см. После загрузки в него реголита (от 1 до 2 см) объем наполняется водой высокой очистки. Далее происходит интенсивное перемешивание реголита с водой. При этом микрочастицы и десорбированные от грунта микроорганизмы будут перемещаться к поверхности жидкости с образованием слоя толщиной 2-3 мм, обогащенного биомассой. По грубым предварительным оценкам процесс осаждения твердых мелких частиц и всплытие микроорганизмов в условиях Марса должен занимать на 30-50% больше времени по сравнению с земными условиями. После осаждения взвеси верхний слой сливается в мини-картридж, в котором находится смешанный слой ионообменных смол анионита АВ-17 и катеонита КУ-2. Общее их действие обеспечивает очистку воды в 10-10 раз (при начальной 1500 ppm).
При лабораторной отработке методики было экспериментально определено, что характерное время осаждения твердой фракции смеси составляет 5 мин. Для условий гравитации Марса расчетное время экстракции в приближении формулы Стокса составит 13 минут.
После очистки вода, свободная от солей и насыщенная микроорганизмами, будет подаваться на подложку мишени. Ее испарение с поверхности металлической подложки обеспечивает образование слоя микроорганизмов. Далее мишень помещалась в масс-спектрометр для лазерного воздействия.
9
2
В бортовом инструменте фокальное пятно лазерного воздействия диаметром 50 мкм и плотностью мощности 10 Вт/см автоматически перемещается по поверхности мишени. После каждого воздействия фокальное пятно лазера смещается на величину не менее 100 мкм, после чего проба вновь подвергается воздействию лазера. При этом основной сигнал содержит массовые спектры от микроорганизмов, нанесенных на подложку, а сигнал от микрочастиц пренебрежимо мал. С каждой пробы можно получить до 1000 спектров. Однако для получения достоверных результатов необходимо отобрать 100-500 наиболее полных и достоверных спектров. Процесс отбора спектров выполняется автоматически специальной программой. Этой же системой проводится и статистическая обработка спектров, которые содержат информацию о том, можно ли полученные спектры отнести к спектрам биомассы.
Следует подчеркнуть, что в каждом отдельном спектре представлена вся информация о величинах массовых пиков элементов, относящихся к исследуемым биомаркерам. Это в первую очередь относится к матричным биомаркерам N и С, к биомаркерам P/S, Са/К, к биологически важным соединениям, а также микропримесям.
Чувствительность масс-спектрометра составляет 100 ppm в одном спектре или 10 ppm в 100 спектрах. Чувствительность возрастает при увеличении количества спектров. Характерная точность определения содержания элементов с концентрацией в пробе порядка 0.1% составляет 0,005% по 500 спектрам, а элементов с содержанием порядка 1% - менее 0,002%.
Вся полученная таким образом информация после обработки спектров представлена в виде таблиц с данными об интенсивности каждого конкретного пика элемента. Это позволяет сопоставить величины как биомаркеров, так биологически важных элементов и микропримесей, и сделать заключение о наличии биомассы в составе пробы с вероятностью ошибки не более 1%, что на порядок величины превосходит вероятность ошибки при учете только лишь соотношений P/S и Са/К.
Для проведения проверки работоспособности предлагаемого способа оптимальным будет проведение лабораторных опытов по моделированию условий на Марсе с использованием земных микроорганизмов и грунтов, находящихся в условиях, близких к марсианским.
Так как сегодня достоверно практически ничего не известно о наличии жизни на Марсе и о свойствах марсианских микроорганизмов, при рассмотрении задачи корректного моделирования для условий Марса необходимо сделать ряд допущений. Эти допущения, представленные ниже, сегодня можно считать достаточно хорошо обоснованными и общепризнанными, особенно тем научным сообществом и учеными, которые непосредственно соприкасаются с проблемой поиска внеземной жизни и ведут исследования на поверхности Марса.
Первое допущение заключается в том, что из-за высокого подобия геологических историй Земли и Марса жизнь на обеих планетах могла зародиться 3.5 миллиарда лет назад, в том числе и на больших глубинах в коре Марса, где уже не могла быть уничтожена полностью в процессе потери атмосферы.
Второе допущение состоит в том, что, предположительно, жизнь на Марсе с высокой вероятностью может быть земного типа.
Третье допущение, которое сегодня уже можно считать фактом, заключается в том, что самые суровые условия жизни микроорганизмов в полярных областях на Земле, в частности в арктических пустынях, близки или подобны лучшим условиям жизни микроорганизмов на экваторе Марса, поэтому для отработки на Земле в качестве модели грунтов и сообществ марсианских микроорганизмов обосновано использовать земные микроорганизмы, находящиеся в составе проб арктических и антарктических грунтов.
Согласно полученным результатам для земных микроорганизмов, находящихся в суровых климатических условиях высоких широт севера и юга, по соотношению биомаркеров определен интервал их «зоны локализации». Эти «зоны» для соотношения P/S составили от 0,15 до 3, для соотношения Са/К от 0,3 до 5 и для концентраций N и С более 1% и 10% соответственно (см фиг. 2).
Аналитические характеристики предлагаемого способа получены экспериментально, а результаты подтверждены на различных пробах с использованием лабораторного прототипа бортового прибора.
Способ положен в основу разработки бортового прибора, устанавливаемого на десантируемом модуле космического аппарата с целью обнаружения признаков жизни земного типа во льдах и реголитах на космических объектах за пределами Земли.