СТАБИЛЬНАЯ ЖИДКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ БОТУЛИНИЧЕСКИЙ ТОКСИН
STABLE LIQUID COMPOSITION CONTAINING BOTULINUM TOXIN

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к стабильной жидкой композиции, содержащей ботулинический токсин в качестве активного ингредиента, которая готова к применению без необходимости процесса восстановления, и, в частности, к жидкой композиции, способной предотвращать агрегацию ботулинического токсина, даже когда ботулинический токсин содержится в низкой концентрации, что дает исключительную стабильность при хранении, и эффективно предотвращает адсорбцию и т. д., относится к контейнеру, относится к постоянной поддержке активности ботулинического токсина в каждой партии или в каждом наливном флаконе.
В частности, настоящее изобретение относится к жидкой композиции, содержащей (i) ботулинический токсин в качестве активного ингредиента, (ii) L-аланин или метилцеллюлозу, (iii) неионное поверхностно-активное вещество и (iv) буфер и, необязательно, изотонический агент.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу стабилизации ботулинического токсина с использованием жидкой композиции, причем жидкая композиция содержит (i) ботулинический токсин, (ii) L-аланин или метилцеллюлозу, (iii) неионное поверхностно-активное вещество и (iv) буфер и, необязательно, изотонический агент.
Предшествующий уровень техники
Множество штаммов Clostridium sp., которые выделяют нейротоксические токсины, было обнаружено начиная с 1890-х годов, и описание характеристик токсинов, которые секретируются этими бактериями, было проведено в течение последних 70 лет (Schant, E. J. et al., Microbiol. Rev., 56:80, 1992).
Обладающий нейротоксичностью токсин, полученный из штаммов рода Clostridium, то есть ботулинический токсин, классифицируется на 7 типов от типов A до G в соответствии с его серологическими характеристиками. Каждый из токсинов имеет белок токсина размером около 150 кДа, и в природе содержит комплекс нескольких нетоксичных белков, связанных с ним. Средний комплекс (300 кДа) состоит из белка токсина и нетоксичного белка негемагглютинина, а большой комплекс (450 кДа) и очень большой комплекс (900 кДа) состоит из средних размеров комплексов, связанных с гемагглютинином (Sugiyama H., Microbiol. Rev., 44:419, 1980). Такие нетоксичные гемагглютининовые белки, как известно, действуют, выполняя роль защиты токсина от низкого рН и различных протеаз в кишечнике.
В частности, было обнаружено, что, когда ботулинический токсин типа А вводят локально в дозировке, которая не оказывает системного воздействия на организм человека, то возможно парализовать мышцы, локализованные в участках местного введения, при этом данная особенность широко используется для удаления морщин, для терапевтических применений при ригидности при гемиплегии и церебральном параличе и т.д., и, следовательно, спрос быстро растет.
Между тем, готовая к употреблению форма жидкой композиции, содержащая ботулинический токсин в качестве активного ингредиента без проведения процесса восстановления, является предпочтительной с точки зрения удобства пользователя, но ботулинический токсин имеет недостаток, который заключается в том, что стабильность ботулинического токсина значительно снижается в жидкой форме и, таким образом, для того, чтобы повысить стабильность белка, обычные коммерческие препараты ботулинического токсина готовят в лиофилизированной форме или в форме сухого порошка, который сушат в вакууме.
Однако составы сухого порошка, полученные лиофилизацией и т.п., имеют проблемы, которые заключаются в том, что, поскольку во время использования требуется выполнять процесс восстановления, это неудобно при использовании, и отклонение количества вводимого ботулинического токсина, в частности, отклонение по активности и т.п. имеют место из-за ошибок процесса разбавления в процессе восстановления и т.п. Таким образом, существует растущая потребность в жидкой композиции, способной повысить удобство пользователя и минимизировать ошибки в процессе восстановления.
В частности, поскольку ботулинический токсин является высокотоксичным, для терапевтических или косметических целей следует вводить следовое количество, и, таким образом, предпочтительной является жидкая композиция ботулинического токсина в более низкой концентрации, чем жидкая композиция ботулинического токсина высокой концентрации.
Однако известно, что когда ботулинический токсин присутствует в низкой концентрации, он имеет тенденцию агрегировать друг с другом и адсорбироваться в контейнере, и, таким образом, искомая и достаточная активность ботулинического токсина не проявляется или наоборот активность токсина становится выше и т.д., то есть отклонение активности ботулинического токсина происходит в каждой партии или в каждом наливном флаконе, что вызывает неожиданные побочные эффекты и т.п., и, следовательно, нелегко приготовить стабилизированную жидкую композицию, имеющую низкую концентрацию ботулинического токсина.
В этом аспекте существует острая потребность в новой форме жидкой композиции, способной улучшить удобство при использовании пользователем, эффективно предотвращающей агрегацию ботулинического токсина даже при низкой концентрации ботулинического токсина, эффективно предотвращающей адсорбцию ботулинического токсина контейнером, для постоянной поддержки активности ботулинического токсина в каждой партии или в каждом наливном флаконе.
Описание изобретения
Техническая проблема
Задачей настоящего изобретения является создание новой формы жидкой композиции, способной эффективно предотвращать агрегацию ботулинического токсина даже при низкой концентрации ботулинического токсина, эффективно предотвращать адсорбцию ботулинического токсина в контейнере, для постоянной поддержки активности ботулинического токсина в каждой партии или в каждом наливном флаконе.
Техническое решение
Для достижения вышеуказанных целей настоящее изобретение обеспечивает стабильную жидкую композицию ботулинического токсина, содержащую (i) ботулинический токсин в качестве активного ингредиента, (ii) L-аланин или метилцеллюлозу, (iii) неионное поверхностно-активное вещество и (iv) буфер и, необязательно, изотонический агент.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу стабилизации ботулинического токсина с использованием жидкой композиции, причем жидкая композиция содержит (i) ботулинический токсин, (ii) L-аланин или метилцеллюлозу, (iii) неионное поверхностно-активное вещество и (iv) буфер и, необязательно, изотонический агент.
Лучшее воплощение изобретения
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют те же значения, что и те, которые обычно понимаются специалистами в области техники, к которой относится настоящее изобретение. В целом, номенклатура, используемая в настоящем описании, хорошо известна в технических областях и широко используется.
В частности, настоящее изобретение относится к жидкой композиции, содержащей (i) ботулинический токсин в качестве активного ингредиента, (ii) L-аланин или метилцеллюлозу, (iii) неионное поверхностно-активное вещество и (iv) буфер и, необязательно, изотонический агент.
В настоящем описании термин «ботулинический токсин» используется для охвата как нейротоксинов (NTX), продуцируемых штаммами Clostridium botulinum или их мутантами, так и модифицированных, рекомбинантных, гибридных и химерных ботулинических токсинов.
Рекомбинантный ботулинический токсин может иметь легкую цепь и/или тяжелую цепь, рекомбинантно продуцируемую видами, не являющимися Clostridium. Кроме того, ботулинический токсин по настоящему изобретению охватывает серотипы ботулинического токсина A, B, C, D, E, F и G и охватывает не только комплексы ботулинического токсина (то есть комплексы 300, 600 и 900 кДа), но также чистый ботулинический токсин (то есть, нейротоксичная молекула массой около 150 кДа), которые оба полезны при практическом осуществлении настоящего изобретения.
Предпочтительно ботулинический токсин, содержащийся в жидкой композиции по настоящему изобретению, представляет собой ботулинический токсин типа А.
Жидкая композиция согласно настоящему раскрытию может содержать ботулинический токсин в количестве от около 10 до 200 единиц/мл, или от около 20 до 150 единиц/мл, предпочтительно от около 25 до 100 единиц/мл, или от 25 до 75 единиц/мл, и наиболее предпочтительно от 25 до 50 ед./мл, но содержание ботулинического токсина этим не ограничивается.
Жидкой композиции ботулинического токсина согласно настоящему изобретению придается гидрофобность при использовании L-аланина, которая является разновидностью неполярной аминокислоты, или метилцеллюлозы. L-аланин может повышать растворимость ботулинического токсина за счет гидрофобного или солевого эффекта и может регулировать критическую концентрацию мицелл при использовании в комбинации с неионным поверхностно-активным веществом, в частности, с полисорбатом 20 или полисорбатом 80. Метилцеллюлоза представляет собой полимер, который обладает амфипатическим свойством, аналогичным полисорбату 20 или полисорбату 80, но обладает температурной чувствительностью в другой форме поверхностно-активного вещества, что, как ожидается, будет способствовать термической стабильности.
В жидкой композиции ботулинического токсина согласно настоящему раскрытию содержание L-аланина может составлять от 0,01 до 1% (масс./об.), предпочтительно от 0,05 до 0,5% (масс./об.) и наиболее предпочтительно от 0,075 до 0,3% (масс./об.) в расчете на общее содержание композиции. В примерном воплощении содержание L-аланина может составлять 0,1% (масс./об.) в расчете на общее содержание композиции.
В жидкой композиции ботулинического токсина согласно настоящему раскрытию содержание метилцеллюлозы может составлять от 0,00001 до 0,1% (масс./об.), предпочтительно от 0,0001 до 0,01% (масс./об.) и наиболее предпочтительно от 0,0005 до 0,0015 % (масс./об.) в расчете на общее содержание композиции. В примерном воплощении содержание метилцеллюлозы может составлять 0,00125 или 0,000625% (масс./об.) в расчете на общее содержание композиции.
В жидкой композиции ботулинического токсина по настоящему изобретению неионное поверхностно-активное вещество может представлять собой полисорбат 20 или полисорбат 80, но не ограничивается ими. Предпочтительно можно использовать полисорбат 20. Обнаружено, что неионное поверхностно-активное вещество, в частности, полисорбат 20, при использовании для предотвращения адсорбции ботулинического токсина в контейнере значительно повышает стабильность ботулинического токсина, одновременно улучшая гидрофобность и взаимодействие с поверхностью, и предотвращая адсорбцию в контейнере. Однако когда полисорбат 20 или полисорбат 80 включен в жидкую композицию, ботулинический токсин может быть одновременно стабилизирован, но существует проблема, которая заключается в том, что активность ботулинического токсина может быть выше, чем искомое значение.
Чтобы решить эту проблему, в настоящем раскрытии обнаружено, что при использовании полисорбата 20 или полисорбата 80 в следовом количестве в диапазоне от 0,00001 до 0,1% (масс./об.), предпочтительно от 0,0001 до 0,01% (масс./об.) и наиболее предпочтительно от 0,0005 до 0,0015% (масс./об.) в расчете на общее содержание композиции, проблема, связанная с высокой активностью ботулинического токсина, может быть предотвращена, и адсорбция в контейнере может быть эффективно предотвращена, что позволяет поддерживать активность ботулинического токсина в каждой партии или в каждом наливном флаконе. В примерном воплощении содержание полисорбата 20 составляет 0,001% (масс./об.) в расчете на общее содержание композиции.
Жидкая композиция ботулинического токсина по настоящему изобретению может содержать физиологически совместимый буфер для поддержания рН ниже изоэлектрической точки, тем самым обеспечивая долгосрочную стабильность. Требуется, чтобы физиологически совместимый буфер был способен поддерживать рН в диапазоне от 4,5 до 6,5, предпочтительно в диапазоне от 5,0 до 6,0 и наиболее предпочтительно около 5,5. В качестве физиологически подходящего буфера могут быть использованы цитрат натрия, янтарная кислота, фосфорная кислота, монофосфат калия, ацетат натрия, хлорид натрия и т.д. Предпочтительно в качестве буфера в жидкой композиции согласно настоящему раскрытию может быть использован цитрат натрия. Натрий-цитратный буфер способен контролировать изменение рН, что оказывает серьезное влияние на стабильность во время длительного хранения белковых лекарств, но может уменьшать их содержание и активность (эффективность) при использовании в сочетании со специфическими наполнителями, и, таким образом, использование натрий-цитратного буфера должно быть определено путем проведения теста на совместимость.
Физиологически совместимый буфер в жидкой композиции ботулинического токсина по настоящему изобретению может иметь содержание от 5 до 35 мМ, предпочтительно от 10 до 30 мМ и наиболее предпочтительно от 15 до 25 мМ в расчете на общее содержание композиции. В типичном воплощении цитрат натрия при рН 5,5 содержится в качестве физиологически совместимого буфера с содержанием 20 мМ в расчете на общее содержание композиции. Было обнаружено, что комбинация L-аланина и натрий-цитратного буфера значительно повышает стабильность ботулинического токсина типа А.
Кроме того, жидкая композиция ботулинического токсина по настоящему изобретению может дополнительно содержать изотонический агент. Примеры изотонического агента включают хлорид натрия, глицерин, маннит, сахарозу, хлорид калия, декстрозу и т.д. Содержание изотонического агента может составлять от 0,7 до 0,95% (масс./об.) в расчете на общее содержание композиции. Предпочтительно жидкая композиция ботулинического токсина по настоящему изобретению содержит от 0,7 до 0,95% (масс./об.) и наиболее предпочтительно 0,9% (масс./об.) хлорида натрия в качестве изотонического агента.
В примерном воплощении жидкая композиция ботулинического токсина по настоящему изобретению может содержать от 0,01 до 1% (масс./об.) аланина, от 0,00001 до 0,1% (масс./об.) полисорбата 20 или полисорбата 80, от 5 до 35 мМ цитрата натрия и от 0,7 до 0,95% (масс./об.) изотонического агента в расчете на общее содержание композиции.
В другом типичном воплощении жидкая инъекция ботулинического токсина типа А по настоящему изобретению может содержать от 0,00001 до 0,1% (масс./об.) метилцеллюлозы, от 0,00001 до 0,1% (масс./об.) полисорбата 20 или полисорбата 80, от 5 до 35 мМ натрия цитрат и от 0,7 до 0,95% (масс./об.) изотонического агента в расчете на общее содержание композиции.
Жидкую композицию ботулинического токсина по настоящему изобретению можно вводить обычными путями введения. В некоторых примерах осуществления настоящего изобретения жидкую композицию ботулинического токсина вводят путем внутримышечной инъекции или подкожной инъекции, которая представляет собой способ местного введения, объекту, нуждающемуся в этом. Поскольку жидкая композиция ботулинического токсина по настоящему изобретению находится в жидком состоянии, ее можно вводить непосредственно без выполнения стадии восстановления при использовании. Кроме того, ботулинический токсин, включенный в жидкую композицию ботулинического токсина согласно настоящему раскрытию, может сохранять стабильность в течение около 12 недель при комнатной температуре или до 5 недель в стрессовых условиях.
Стабилизированная жидкая композиция ботулинического токсина по настоящему изобретению применима для лечения нервно-мышечных нарушений, характеризующихся гиперактивной скелетной мышцей. Кроме того, жидкая композиция ботулинического токсина по настоящему изобретению может быть использована для различных целей, таких как лечение заболеваний и совершенствование красоты и т.д., для лечения головной боли, мигрени, головной боли от напряжения, синусовой головной боли, головной боли в шейном отделе, нарушения потоотделения, аксиллярного гипергидроза, гипергидроза рук, гипергидроза стоп, синдрома Фрея, гиперкинетических кожных морщин, мимических морщин, межбровных морщин, морщин вокруг глаз, морщин возле рта, носогубной складки, кожных заболеваний, ахалазии, страбизма, хронической анальной трещины, судорог век, мышечно-скелетной боли, фибромиалгии, панкреатита, тахикардии, гипертрофии простаты, простатита, задержки мочи, недержания мочи, раздраженного мочевого пузыря, конвульсии половины лица, тремора, мышечных спазмов, желудочно-кишечных расстройств, диабета, сиализма, кооперативного расстройства детрузора-сфинктера, постинсультной ригидности, восстановления ран, детского церебрального паралича, спазма гладких мышц, рестеноза, местной дистонии, эпилепсии, шейной дистонии, нарушения щитовидной железы, гиперкальциемии, обсессивного расстройства, боли при артрите, синдрома Рейно, растяжки, перитонеальной адгезии, спазма сосудов, насморка, мышечной контрактуры, ларингеальной дистонии, почечного спазма и синдрома запястного канала и т.д.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу стабилизации ботулинического токсина с использованием жидкой композиции, причем жидкая композиция содержит (i) ботулинический токсин, (ii) L-аланин или метилцеллюлозу, (iii) неионное поверхностно-активное вещество и (iv) буфер и, необязательно, изотонический агент.
В примерном воплощении настоящее изобретение относится к способу стабилизации препарата ботулинического токсина, включающему формирование жидкой композиции путем объединения (i) ботулинического токсина с (ii) L-аланином, (iii) полисорбатом 20 или полисорбатом 80, (iv) цитратом натрия и, необязательно, хлоридом натрия, который является изотоническим агентом, где содержание аланина составляет от 0,01 до 1% (масс./об.), содержание полисорбата 20 или полисорбата 80 составляет от 0,00001 до 0,1% (масс./об.) цитрат натрия имеет концентрацию от 5 до 35 мМ, а хлорид натрия, который является изотоническим агентом, имеет содержание от 0,7 до 0,95% (масс./об.) в расчете на общее содержание жидкой композиции.
В другом типичном воплощении настоящее изобретение относится к способу стабилизации препарата ботулинического токсина, включающему формирование жидкой композиции путем смешивания (i) ботулинического токсина с (ii) метилцеллюлозой, (iii) полисорбатом 20 или полисорбатом 80, (iv) цитратом натрия и, необязательно, хлоридом натрия, который является изотоническим агентом, где содержание метилцеллюлозы составляет от 0,00001 до 0,1 (масс./об.), содержание полисорбата 20 или полисорбата 80 составляет от 0,00001 до 0,1% (масс./об.), цитрат натрия имеет концентрацию от 5 до 35 мМ, а хлорид натрия, который является изотоническим агентом, имеет содержание от 0,7 до 0,95% (масс./об.) в расчете на всю жидкую композицию.
Поскольку состав ботулинического токсина, стабилизированный способом по настоящему изобретению, можно использовать как инъекцию, так же как и в виде жидкого препарата, отдельный процесс восстановления не является необходимым перед использованием, и, таким образом, препарат ботулинического токсина может быть удобно использован и может храниться в стабильном состоянии около 6 месяцев и более.
Примеры
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на следующие примеры. Однако следующие примеры предназначены только для иллюстрации настоящего изобретения, и специалистам в данной области техники будет очевидно, что объем настоящего изобретения не должен быть ограничен этими примерами.
Пример 1. Оценка содержания ботулинического токсина по типам и содержанию амфипатического наполнителя
Чтобы найти эксципиент, подходящий для повышения стабильности ботулинического токсина, различные типы амфипатических эксципиентов были добавлены к ботулиническому токсину Clostridium типа A, и затем влияние типов и содержания амфипатических эксципиентов на содержание ботулинического токсина было оценено с помощью теста ELISA с использованием считывателей микропланшетов Versamax BC-138 и BC-378 (Molecular Devices, LLC). В качестве буферов использовали натрий-цитратный буфер (далее называемый «SC-буфер» или «SC-буферный раствор») и хлоридно-натриевый буфер. Если не указано иное, использовали натрий-цитратный буфер, полученный с добавлением 0,9% (масс./об.) хлорида натрия в качестве изотонического агента.
Ботулинический токсин типа А, использованный в тесте, был получен способом, описанным в патенте Кореи № 1,339,349.
Для теста ELISA стандарты ботулинического токсина типа A (Daewoong Pharmaceutical), разведенные до различных концентраций, и жидкую композицию в соответствии с настоящим изобретением распределяли в 96-луночный планшет, покрытый антителом против ботулинического токсина типа A (NIBSC, 59/021), и проводили тест ELISA с использованием способа сэндвич-ELISA.
Соответствующие стандарты и жидкая композиция подвергались реакциям с первичными и вторичными антителами с последующей реакцией с субстратом. Затем активность жидкой композиции в соответствии со стандартной кривой измеряли путем измерения поглощения при длине волны от 450 до 540 нм. Здесь и далее в настоящем раскрытии другие способы ELISA также были испытаны тем же способом, и было рассчитано содержание.
Результаты теста выражали в процентах по сравнению с контрольной группой (0,02% человеческого сывороточного альбумина, 0,9% хлорида натрия), добавленной при той же концентрации исходного вещества (2 нг/мл), что и каждая другая композиция. К каждой композиции, показанной в таблице 1, добавляли эксципиент для приготовления 1 л жидкости-эксципиента, а затем добавляли ботулинический токсин в концентрации 40 ед/мл, и подтверждали пониженное содержание по сравнению с 40 ед/мл.
Таблица 1. Влияние типов и содержания амфипатических наполнителей на содержание ботулинического токсина
№ партии
Амфипатические эксципиенты
Содержание (масс./об.%)
Содержание (масс./об.%)
Буфер
Отношение концентраций
1
PEG 400
5
5
0,9% NaCl
2%
2
PEG 400
5
5
SC-буфер (рН 5,5)
11%
3
PEG 400
0,5
0,5
0,9% NaCl
7%
4
PEG 400
0,5
0,5
SC-буфер (рН 5,5)
9%
5
PEG 400
0,05
0,05
0,9% NaCl
3%
6
PEG 400
0,05
0,05
SC-буфер (рН 5,5)
8%
7
Метилцеллюлоза
0,05
0,05
0,9% NaCl
117%
8
Метилцеллюлоза
0,05
0,05
SC-буфер (рН 5,5)
99%
9
Метилцеллюлоза
0,01
0,01
0,9% NaCl
104%
10
Метилцеллюлоза
0,01
0,01
SC-буфер (рН 5,5)
103%
11
Метилцеллюлоза
0,002
0,002
0,9% NaCl
81%
12
Метилцеллюлоза
0,002
0,002
SC-буфер (рН 5,5)
96%
13
sod. CMC
0,1
0,1
0,9% NaCl
10%
14
sod. CMC
0,1
0,1
SC-буфер (рН 5,5)
24%
15
sod. CMC
0,02
0,02
0,9% NaCl
12%
16
sod. CMC
0,02
0,02
SC-буфер (рН 5,5)
18%
17
sod. CMC
0,04
0,004
0,9% NaCl
15%
18
sod. CMC
0,004
0,004
SC-буфер (рН 5,5)
17%
19
PVPK 17
1
1
0,9% NaCl
46%
20
PVPK 17
1
1
SC-буфер (рН 5,5)
84%
21
PVPK 17
0,2
0,2
0,9% NaCl
15%
22
PVPK 17
0,2
0,2
SC-буфер (рН 5,5)
74%
23
PVPK 17
0,04
0,04
0,9% NaCl
66%
24
PVPK 17
0,04
0,04
SC-буфер (рН 5,5)
74%
25
Полисорбат 20
0,05
0,05
0,9% NaCl
99%
26
Полисорбат 20
0,05
0,05
SC-буфер (рН 5,5)
93%
27
Полисорбат 20
0,01
0,01
0,9% NaCl
93%
28
Полисорбат 20
0,01
0,01
SC-буфер (рН 5,5)
96%
29
Полисорбат 20
0,002
0,002
0,9% NaCl
91%
30
Полисорбат 20
0,002
0,002
SC-буфер (рН 5,5)
101%
Как показано в таблице 1, было подтверждено, что при добавлении метилцеллюлозы или полисорбата 20 активность ботулинического токсина типа А сохраняется высокой. Напротив, при добавлении PEG 400, натрий карбоксиметилцеллюлозы (Sod. CMC) или повидона К17 (PVPK17), активность ботулинического токсина типа А была снижена. Соответственно, в настоящем описании метилцеллюлоза или полисорбат 20 использовались в качестве амфипатического эксципиента для стабилизации ботулинического токсина. Кроме того, можно подтвердить, что, когда буфер, в частности, натрий-цитратный буфер или натрий-хлоридный буфер, использовались вместе, свойство, которое служит для сохранения активности ботулинического токсина типа А, то есть свойство стабильности, было другим.
Пример 2. Другой эксципиент, который можно использовать в комбинации с полисорбатом 20
Была подтверждена максимальная доступная концентрация полисорбата 20, и было оценено влияние на содержание ботулинического токсина при использовании в сочетании с другим наполнителем, при этом полисорбат 20 был выбран в качестве основного наполнителя. Полисорбат 20 был выбран в качестве основного наполнителя в соответствии с результатами примера 1, и был проведен скрининг каждого наполнителя с использованием способа ELISA.
В качестве стабилизаторов, которые, как ожидается, будут функционировать вместе с выбранным полисорбатом 20, были добавлены L-пролин и L-аланин в качестве вспомогательных веществ-кандидатов с учетом физических свойств, таких как гидрофобность, величина pKa, pKb и изоэлектрическая точка аминокислоты и т.д. Поскольку для поддержания структурной стабильности белка требуется дополнительный стабилизатор, а также полисорбат 20, две аминокислоты, L-пролин и L-аланин, были выбраны с учетом pKa 6,0 ботулинического токсина А.
Тест на эффективность в животных проводили путем введения стандартных растворов, в которых ботулинический токсин типа A в форме сухого порошка разводили до различных концентраций и жидкую композицию в соответствии с настоящим изобретением вводили в брюшную полость 10 ICR-мышей (4 недели, масса тела: от 18 до 22 г) (0,1 мл/мышь), соответственно, и количество погибших животных и количество выживших животных подтверждали в течение 3 дней, а затем рассчитывали активность с использованием статистической программы (программа StatPlus 2009) (релиз 5.9.8, AnalystSoft)). В дальнейшем, другие тесты на активность животных и расчет активности в настоящем раскрытии также выполнялись тем же способом.
Таблица. 2. Результаты комбинированного применения полисорбата 20 с аминокислотами
№ партии
Наполнитель 1
Содержание (масс./об.)
Наполнитель 2
Содержание (масс./об.%)
Буфер
ELISA
Тест активности на животных
NBT-25I-L169
L-аланин (25 мМ)
0,223
Полисорбат 20
0,5
N/A
117%
143,8%
NBT-25I-L163
L-аланин (25 мМ)
0,223
Полисорбат 20
1
N/A
79%
N/A
NBT-25I-L164
L-аланин (25 мМ)
0,223
Полисорбат 20!!!!!
2
N/A
48%
N/A
NBT-25I-L 165
L-пролин (25 мМ)
0,29
Полисорбат 80
0.5
N/A
86%
N/A
NBT-25I-L166
L-пролин (25 мМ)
0,29
Полисорбат 80
1
N/A
65%
N/A
NBT-25I-L167
L-пролин (25 мМ)
0,29
Полисорбат 80
2
N/A
35%
N/A
N/A; не применимо
Когда количество ботулинического токсина, обработанного в концентрации 40 Ед./мл, было конвертировано в 100% и проанализировано способом ELISA, содержание ботулинического токсина снижалось до 80% или менее, при содержании полисорбата 20 1% или более, что демонстрирует уменьшение содержания. В результате проведения теста на эффективность в животных с использованием тестовой группы NBT-25I-L169, которая является единственной группой, сохраняющей 100% содержание, активность составила 143,8% по сравнению со значением для 100% содержания, и эта активность была высоко оценена. Кроме того, когда полисорбат 20 использовали в комбинации с L-аланином, начальное значение содержания ботулинического токсина типа A было выше в тесте ELISA по сравнению с тем, когда полисорбат 20 использовался в комбинации с L-пролином и, таким образом, полисорбат 20 и L-аланин в настоящем раскрытии были использованы вместе.
Пример 3. Влияние комбинации полисорбата 20 и L-аланина на активность
Чтобы подтвердить влияние полисорбата 20 и L-аланина, которые были выбраны в примере 2, на активность (эффективность) ботулинического токсина, полисорбат 20 и L-аланин использовали вместе для приготовления композиции ботулинического токсина типа A, как описано ниже, и влияние на активность (эффективность) было подтверждено.
Таблица 3. Результаты измерения эффективности комбинации полисорбата 20 и L-аланина
№ партии
Наполнитель 1
Содержание(масс./об.)
Наполнитель 2
Содержание (масс./об.%)
Эффективность на животных (%)
NBTS 50I-T009
Полисорбат 80
0,015
L-аланин
0,01
120,7
NBTS 50I-T010
Полисорбат 80
0,015
L-аланин
0,01
114,3
NBTS 50I-T021
Полисорбат 80
0,1
L-аланин
0,1
201,4
NBTS 50I-T022
Полисорбат 80
0,1
L-аланин
0,1
142
NBTS 50I-T007
Полисорбат 80
0,1
L-аланин
0,2
148,2
NBTS 50I-T008
Полисорбат 80
0,1
L-аланин
0,2
136,8
Таблица 3 показывает, что даже при использовании одинакового содержания полисорбата 20 и L-аланина в одних и тех же экспериментальных условиях, активность (эффективность) ботулинического токсина типа A была различной для каждой партии, и активность в целом имела высокую оценку. В целом, высокая оценка активности ботулинического токсина с полисорбатом 20 имеет место до тех пор, пока концентрация полисорбата 20 не достигнет 0,015%, что указывает на то, что поток значений для каждой произведенной партии не является постоянным и нестабильным. Поскольку считается, что это явление вызвано полисорбатом 20, обладающим амфипатическим свойством, было подтверждено, что необходимо включать полисорбат 20 в жидкую композицию в количестве, способном постоянно поддерживать активность (эффективность) ботулинического токсина.
Пример 4. Оценка активности в зависимости от содержания полисорбата 20
Чтобы исследовать влияние содержания полисорбата 20 на активность ботулинического токсина, проводили скрининг на эффективность в животных жидкой композиции, имеющей представленный ниже состав, путем изменения содержания. Тесты на эффективность в животных в отношении полисорбата 20 в различных концентрациях проводили, как описано ниже, для того, чтобы подтвердить, высокую оценку активность в зависимости от концентрации полисорбата 20. 5 мМ цитрата натрия использовали для компенсации явления, которое заключается в том, что стабильность белка снижается при уменьшении полисорбата 20.
Таблица 4. Результаты измерения эффективности на животных в зависимости от содержания полисорбата 20
№ партии
L-аланин (масс./об.%)
полисорбат 20 (масс./об.%)
Буфер
Эффективность на животных(масс./об.)
NBTS-50-T078
0,1
0,0025
5 мМ SC-буфер, pH 5,5
132,6
NBTS-50-T079
0,1
0,001
5 мМ SC-буфер, pH 5,5
121,1
NBTS-50-T080
0,1
0,00075
5 мМ SC-буфер, pH 5,5
114,4
NBTS-50-T081
0,1
0,0005
5 мМ SC-буфер, pH 5,5
109,5
В тесте оценки активности ботулинического токсина с помощью теста на эффективность в животных в качестве подходящего диапазона приняли диапазон от 80 до 125%. Это явление вызвано изменением в тесте на эффективность в животных, и, таким образом, степень значительно выше по сравнению с обычными методами тестирования. Как показано в таблице 4 выше, было подтверждено, что титр ботулинического токсина составлял 114,4%, который был стабильным, даже при использовании незначительного количества полисорбата 20, например, следового количества 0,00075% (масс./об.).
Пример 5. Оценка титра и стабильности в зависимости от концентрации L-аланина
Чтобы исследовать влияние содержания L-аланина на эффективность ботулинического токсина, скрининг эффективности на животных проводили путем изменения содержания L-аланина. Чтобы подтвердить влияние L-аланина на эффективность синергического действия полисорбата 20 и влияние L-аланина на взаимодействие с натрий-цитратным буфером и стабильность, готовили жидкие инъекции, содержащие 5 мМ натрий-цитратный буфер и 0,001% полисорбат 20. L-аланин использовали в концентрациях 0,1%, 0,02% и 0,05%, и сравнивали и оценивали стабильность в стрессовых условиях от 0,1% до 0,02%.
При оценке стабильности в стрессовых условиях стрессовые условия были определены при 40ºС и 75% относительной влажности в соответствии с уведомлением KFDA или при 37ºС для того, чтобы сравнить и оценить аспект снижения эффективности с учетом термостабильности ботулинического токсина типа А и распорядка проведения теста эффективности на животных. Здесь и далее все оценки устойчивости в стрессовых условиях проводились с использованием одного и того же способа.
Таблица 5. Результаты измерения эффективности в животных и стабильности в зависимости от концентрации L-аланина
№ партии
L-аланин (масс./об.%)
Полисорбат 20 (масс./об.%)
Буфер
Титр в животных (%)
1 неделя в стрессовых условиях
3 недели в стрессовых условиях
NBTS-50-T084
0,1
0,001
5 мМ SC-буфер, pH 5,5
103,5
103,8
89,4
NBTS-50-T082
0.05
0,001
5 мМ SC-буфер, pH 5,5
104,4
N/A
NBTS-50-T083
0.02
0,001
5 мМ SC-буфер, pH 5,5
110,1
84,7
74,4
Подтвердилось, что чем выше содержание L-аланина, тем выше стабильность в стрессовых условиях, и что синергетическое действие титра полисорбата 20 также частично подавляется. Предполагалось, что L-аланин влияет на критическую концентрацию мицелл полисорбата 20, и было подтверждено, что комбинация с 0,1% L-аланином имела только 14% снижение активности в течение 3 недель в стрессовых условиях. Принимая во внимание вышеуказанные результаты, стабильность была особенно превосходной, когда концентрация L-аланина составляла 0,1%.
Пример 6. Оценка активности и стабильности ботулинического токсина типа А в зависимости от буфера
Буфер жидкой композиции был выбран с учетом изоэлектрической точки ботулинического токсина типа А. Натрий-цитратный буфер и хлорид натрия, которые имеют буферную емкость ниже рН 6,0, изоэлектрической точки ботулинического токсина, и которые наиболее широко используются в продуктах для введения в мышцу, что подтверждает безопасность, были определены в качестве основного буфера состава. Во всех настоящих экспериментах натрий-цитратный буфер готовили путем включения 0,9% (масс./об.) хлорида натрия в качестве изотонического агента, если не указано иное.
Состав ботулинического токсина типа A был приготовлен путем объединения (i) L-аланина или метилцеллюлозы и (ii) полисорбата 20 с любым одним из (iii) двух буферов, натрий-цитратным буфером (pH 5,5) и 0,9% (масс./об.) хлоридом натрия. Типы и концентрации эксципиентов, добавляемых к ботулиническому токсину Clostridium типа A, приведены в таблице 6 ниже.
После того, как буфер был приготовлен, добавляли L-аланин, метилцеллюлозу и полисорбат 20, в соответствии с каждой из концентраций, получая, таким образом, раствор эксципиента. Затем добавляли ботулинический токсин до концентрации 40 ед/мл.
Таблица 6. Результаты измерения стабильности ботулинического токсина типа А в зависимости от типа буфера
№ партии
L-аланин (масс./об.%)
Метилцел-люлоза (масс./об.%)
Полисор-бат 20(масс./об.)
буфер
Титр в живот-ных (%)
1 неделя в стрессовых условиях
2 недели в стрессовых условиях
NBTS-50-T068
0,1
0,001
0.9% NaCl
116
96
72,8
NBTS-50-T070
0,00125
0,001
0.9% NaCl
93,1
56,5
N/A
NBTS-50-T076
0,1
0,001
5 мМ SC-буфер (рН 5,5), 0,9% NaCl
111,9
92,9
73
NBTS-50-T077
0,00125
0,001
5 мМ SC-буфер (рН 5,5), 0,9% NaCl
128,6
86,7
86,7
Согласно экспериментальным результатам, показанным в таблице 6, при использовании буфера с хлоридом натрия 0,9% (масс./об.) комбинация метилцеллюлозы и полисорбата 20 показала очень низкую стабильность в стрессовых условиях. С другой стороны, комбинация L-аланина и полисорбата 20 показала снижение активности ниже, чем у комбинации метилцеллюлозы и полисорбата 20 через 1 неделю в стрессовых условиях по сравнению с 0 неделей.
Между тем, когда использовали натриево-цитратный буфер, стабильность комбинации метилцеллюлозы и полисорбата 20 достаточно выросла, и стабильность сохранялась 1 - 2 недели в стрессовых условиях.
То есть можно подтвердить, что при использовании натрий-цитратного буфера сохранение стабильности улучшалось. Это связано с тем, что стабильность ботулинического токсина может поддерживаться на уровне рН 6,0 или менее, и такое явление, как окисление, происходящее в таких окружающих условиях, как стрессовые условия и т.д., может быть смягчено функцией натрий-цитратного буфера.
Таблица 7. Результаты измерения эффективности на животных и стабильности ввиду эффективности на животных (2-й тест) в соответствии с концентрацией натрий-цитратного буфера (pH 5,5)
№ партии
L-аланин (%)
полисорбат 20 (%)
SC-буфер(рН 5,5), 0,9% NaCl)
Эффективность на животных (%)
1 неделя в стрессовых условиях
2 недели в стрессовых условиях
NBTS-50-T076
0,1
0.001
5 мМ
111,9
92,9
73
NBTS-50-T084
0,1
0,001
10 мМ
103,5
103,8
82,1
NBTS-50-T085
0,1
0,001
20 мМ
106,6
97,5
89,4
Кроме того, в результатах вторичных испытаний было подтверждено, что 10 мМ или более натрий-цитратный буфер частично способствует поддержанию стабильности в стрессовых условиях. В частности, стабильность была самой высокой, когда использовали 20 мМ натрий-цитратный буфер.
Промышленная применимость
Жидкая композиция ботулинического токсина в соответствии с настоящим изобретением готова к использованию без выполнения процесса восстановления, и, таким образом, можно улучшить удобство для пользователя и уменьшить отклонение активности ботулинического токсина из-за ошибок разбавления в процесс восстановления и т.п. Кроме того, жидкая композиция в соответствии с настоящим изобретением эффективно предотвращает агрегацию ботулинического токсина даже при низкой концентрации ботулинического токсина, что позволяет получить исключительную стабильность при хранении, и эффективно предотвращает адсорбцию ботулинического токсина в контейнере, тем самым постоянно поддерживая активность ботулинического токсина в каждой партии или в каждом наливном флаконе.
Хотя конкретные воплощения настоящего изобретения подробно описаны, специалистам в данной области техники должно быть очевидно, что конкретное описание является просто желательным примерным воплощением и не должны рассматриваться как ограничение объема настоящего изобретения. Следовательно, существенный объем настоящего изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентом.