Молекулярно-генетическая идентификация популяций Pinus sylvestrys L. на Востоке русской равнины на основании полиморфизма ISSR-маркеров

ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

2016

БИОЛОГИЯ

Вып. 2

ГЕНЕТИКА

УДК 5 75.2:575.22:574.3

Я. В. ПришнивскаяаЬ, В. П. Красильников1, С. В. Боронникова3

а Пермский государственный национальный исследовательский университет, Пермь, Россия ь Естественнонаучный институт Пермского государственного национального исследовательского универ-

ситета, Пермь, Россия

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕИЕТИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПОПУЛЯЦИЙ PIN US SYLVESTRYS L. НА ВОСТОКЕ РУССКОЙ РАВНИНЫ НА ОСНОВАНИИ ПОЛИМОРФИЗМА ISSR-MAPKEPOB

Проведены молекулярно-генетический анализ и идентификация четырех популяций Pinus sylvestis L., расположенных в Республике Коми и в Кировской обл., с использованием ISSR-метода анализа полиморфизма ДНК. У четырех изученных популяций Р. sylvestris выявлены 117 ISSR-маркеров; установлена высокая доля полиморфных локусов (Р95 =0.949). Один ISSR-праймер инициировал у Р. sylvestris синтез в среднем 16.7 ISSR-маркеров. В изученных популяциях выявлено 16 редких ISSR-маркеров. Выявлены идентификационные мономорфные видовые и полиморфные ISSR-маркеры, а также их сочетания для молекулярно-генетической идентификации изученных популяций. Составлены молекулярно-генетические формулы и штрихкоды четырех изученных популяций. Полученные данные могут быть использованы для идентификации популяций и древесины Р. sylvestris в изученных регионах.

Ключевые слова: полиморфизм ДНК, ISSR-маркеры, молекулярно-генетическая идентификация, Pinus sylvestris L.

Ya. V. Prishnivskayaa'b, V. P. Krasilnikov3, S. V. Boronnikova3

a Perm State University, Perm, Russian Federation

b Natural Sciences Institute of Perm State University, Perm, Russian Federation

MOLECULAR GENETIC IDENTIFICATION OF POPULATIONS OF PINUS SYLVESTRYS L. IN THE EAST OF THE RUSSIAN PLAIN BASED ON POLYMORPHISM ISSR-MARKERS

A molecular genetic analysis and identification of the four populations of Pinus sylvestris L., located in the Komi Republic and Kirov region, using ISSR-method of DNA polymorphism analysis. In four studied populations P. sylvestris identified 117 ISSR-markers; a high percentage of polymorphic loci (P95 = 0.949). One ISSR-primer initiated synthesis in P. sylvestris on average 16.7 ISSR-markers. In the studied populations of P. sylvestris identified 16 rare ISSR-markers. Revealed the identity of the monomorphic species and polymorphic ISSR-markers, and combinations there of for the molecular genetic identification of the populations studied. Compiled by molecular genetic formula and barcodes four studied populations of P. sylvestris. The data obtained can be used to identify populations and wood of P. sylvestris in the studied region.

Key words: DNA polymorphism, ISSR-markers, molecular genetic identification, Pinus sylvestris L.

Сохранение биологического разнообразия лесов как основы стабильности экосистем является важной проблемой современности. По разным оценкам площади лесов ежегодно сокращаются на 7-9 млн га. Известно, что за счёт сокращения эффек-

Введение

тивной численности особей в популяциях древесных растений вследствие проведения сплошноле-сосечных рубок, гибели насаждений в результате пожаров, болезней, ветровала, загрязнения окружающей среды наблюдается неуклонное снижение генетического разнообразия лесов [СеЬигек, Тигок, 2005]. Поколения леса, возникшие в результате ес-

© Пришнивская Я. В., Красильников В. П., Боронникова С. В., 2016

171

тественного или искусственного возобновления от ограниченного количества особей, будут генетически менее разнообразными, а, следовательно, исходя из наличия взаимосвязи уровня генетической изменчивости, с одной стороны, и интенсивности роста и гомеостазом - с другой [Левонтин, 1978; Грант, 1984], и менее продуктивными, менее устойчивыми к экологическим факторам.

Вырубка леса, в особенности несанкционированная, ликвидируя часть генотипов, неминуемо ведет к генетическому обеднению популяций и уменьшению генетического разнообразия [Ветчин-никова, Титов, Кузнецова, 2013]. Согласно данным Министерства природных ресурсов и экологии РФ, ущерб от незаконных рубок в 2014 г. составил 14 млрд руб. [Материалы ..., 2012]. Для сокращения количества несанкционированных рубок необходимы точные сведения о популяции, в которой произведена заготовка древесины. Существуют разнообразные технологии, направленные на идентификацию места происхождения древесины после ее вырубки, например, методы дендрохронологии. Однако этот подход имеет ограниченное применение [Основные ..., 2013]. В качестве альтернативы могут использоваться методы, основанные на мо-лекулярно-генетической идентификации. Известно, что генетический контроль является наиболее надежным способом идентификации популяций и определения географического происхождения древесины [Исаев, Коровин, 2009]. В связи с этим мо-лекулярно-генетическая идентификация популяций хвойных видов растений является весьма актуальной.

Материал и методы

Молекулярно-генетическая идентификация проведена у четырех популяций Р. sylvestris, которые расположены на востоке Русской равнины: Psl - около пос. Мордино Республики Коми, Ps2 -около пос. Визинга Республики Коми, Ps3 - из Шабалинского лесничества Кировской обл., Ps4 -из Ежихинского лесничества Кировской обл. Для проведения исследований материал собирался в каждой популяции индивидуально с 46 деревьев, расположенных на расстоянии не менее 100 м друг от друга. Молекулярно-генетический анализ и выявление идентификационных молекулярных маркеров проводилось по результатам ПЦР с пробами ДНК, выделенными как из хвои, так и из древесины.

Для молекулярно-генетического анализа Р. sylvestris был избран ISSR (Inter Simple Sequence Rcpcats)-\icTOj [Zietkiewicz, Rafalski, Labuda, 1994]. Метод основан на использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР) с одним или несколькими праймерами длиной 15-24 нуклеоти-да, состоящих из тандемных коротких 2-4 нуклео-

тидных повторов и одного селективного нуклеоти-да на 3'-конце праймера [Боронникова, Календарь, 2010]. Концентрацию ДНК определяли с помощью спектрофотометра SmartSpecTM Plus Nano Drop («BioRad», USA). Праймеры для ПЦР синтезированы в ЗАО «Синтол» (Москва). Тотальная ДНК выделена из древесины и хвои 184 деревьев с использованием модифицированной нами методики выделения ДНК С.О. Роджерса и Э. Дж. Бендича [Rogers, Bendich, 1985] в которой в качестве сорбента использовался PVPP, то есть поливинилпо-липирролидон [Нечаева, 2011]. При выделении ДНК брали навеску 100 мг. Для ПЦР-анализа использовали пробы с концентрацией 5 нг/мкл. Амплификацию проводили в амплификаторе GeneAmp PCR System 9700 («Applied Biosystems», USA) по типичной для ISSR-метода программе [Боронникова, 2009]. Температура отжига в зависимости от G/C-состава праймеров варьировала от 46 до 64°С. Для проверки достоверности полученных ДНК-спектров опыт повторяли не менее трех раз. В качестве отрицательного (К-) контроля в реакционную смесь добавляли вместо ДНК 5 мкл деионизированной воды. Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 1.7%-ном ага-розном геле в lx TBE буфере. Гели окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете в системе Gel-Doc XR («Bio-Rad», USA). Для определения длины фрагментов ДНК использовали маркер молекулярной массы (100 bp +1.5 + 3 Kb DNA Ladder; «ООО-СибЭнзим-М», Москва). Определение длин фрагментов проводилось с использованием программы Quantity One в системе гель-документации Gel-Doc XR («Bio-Rad», USA).

Результаты и их обсуждение

При молекулярно-генетическом анализе Р. sylvestris выявлено 117 ISSR-маркеров (табл. 1), из которых 111 были полиморфными (Р95 = 0.949). Число ISSR-маркеров Р. sylvestris варьировало в зависимости от праймера от 13 (праймер М27) до 21 (праймеры Х10 и CR215), а их размеры - от 150 до 1400 пн. В среднем один ISSR-праймер инициировал у Р. sylvestris синтез 16.7 ISSR-маркеров. Число полиморфных маркеров в общей выборке Р. sylvestris варьировало от 19 до 28, а доля полиморфных локусов в зависимости от ISSR-праймера колебалась от 0.880 до 1.000. Для характеристики генетической структуры популяций важны редкие, то есть встречающиеся с частотой менее 5%, маркеры. В изученных популяциях Р. sylvestris выявлено 16 редких ISSR-маркеров, из которых в популяции Psl выявлено 7, в популяции Ps2 - 3, в популяции Ps3 - 2, а в популяции Ps4 - 4 уникальных ISSR-маркеров.

Для молекулярно-генетической идентификации веден отбор идентификационных молекулярных мар-отобраны наиболее информативные ISSR-праймеры, керов, а также определены их сочетания для иденти-с помощью которых выявлены родовые (надвидо- фикации популяций (табл. 2). вые), видовые и полиморфные ISSR-маркеры и про-

Таблица 1

Характеристика ISSR-маркеров в четырех популяций Р. sylvestris

ISSR-праймеры Нуклеотидная последовательность (5'—» 3') Длина фрагментов, ПН Число полиморфных ISSR-маркеров в популяциях

Psl Ps2 Ps3 Ps4 на o6i всего цую выборку полиморфных

ISSR-1

CR-212

CR-215

М27

Х10

Всего ISSR-маркеров

Таблица 2

Характеристика идентификационных ISSR-маркеров популяций Р. sylvestris

Обозначение Нуклеотидная последова- Размеры ISSR- ISSR-маркеры, избранные для паспортиза-

праймера тельность (5'—» 3') маркеров, ПН ции

Мономорфные ISSR-маркеры

CR-212 (CT)8TG 1400-250 PSv670CR212 PSv450CR212 PSv390CR212

М27 (GA)8C 1020-150 PSv500M27 PSv460M27

Х10 (AGC)6C 1400-200 PSv440X10

Полиморфные ISSR-маркеры

ISSR-1 (АС)8Т 1115-220 Pslp930ISl

CR-212 (CT)8TG 1400-250 Pslp260CR212 Ps4p290CR212 Ps4p250CR212

CR-215 (CA)6GT 1280-150 Ps3pl400CR215 Ps3pl200CR215

М27 (GA)8C 1020-150 Pslp210M27 Pslpl80M27 Pslpl70M27 Ps2p350M27

Х10 (AGC)6C 1400-200 Ps3p410X10 Ps2p250X10 Ps2p200X10 Ps4pl650X10 Ps4p900X10

Примечание. PSv - ISSR-маркеры, характерные для всех популяций; Pslp, Ps2p, Ps3p и Ps4p - полиморфные

ISSR-маркеры, характерные для отдельных популяций.

Молекулярные маркеры, избранные для идентификации четырех популяций Р. sylvestris, представлены в виде молекулярно-генетической формулы, при составлении которой использовались так называемые «видовые» и «полиморфные» ISSR-маркеры. «Родовые» ISSR-маркеры использованы не были, так как для их обнаружения необходимо исследовать как минимум еще один вид рода Pinus. Мономорфные ISSR-маркеры, характерные для вида, обозначены как PSv а полиморфные как Pslp - для популяции Psl, Ps2p - для популяции Ps2, Ps3p - для популяции Ps3, Ps4p - для популяции Ps4. Основная характеристика молекулярного маркера (его длина) указана большими буквами после указания типа маркера -Pslp260CR2i2. В молекулярно-генетической форму-

ле приведены тип и номер праймера нижним индексом. Так, молекулярный маркер Р53р1200Ск.215 выявлен ISSR-мeтoдoм с использованием праймера С11215. В случае, когда праймер возможно записать в виде короткой формулы как при ISSR-анализе, запись молекулярного маркера можно представить в следующем виде Р53р1200(СА)бот-Данная форма записи молекулярного маркера является самой информативной. Таким образом, в предлагаемой записи молекулярно-генетической формулы указан вид растения, тип амплифициро-ванного ISSR-мapкepa, его размер и дана характеристика исследуемой части генома посредством указания метода анализа полиморфизма ДНК и номера или последовательности праймера.

Для изученных популяций Р. sylvestris установлены шесть видовых ISSR-маркеров, выявленные у всех изученных популяций: PSv670Cr212 PSv500M2 PSv460M27 PSv450Cr212 PSv440xlo PSv390CR2i2. На основе ISSR-спектров удалось установить идентификационные ISSR-маркеры или их сочетания для популяций, с достаточно высокой частотой встречаемости в популяции. Для популяции Psl идентификационными маркерами являются Pslp930Isl

Pslp260CR2i2 Pslp210M27 Pslpl80M27 Pslpl70M27; для популяции Ps2 - Ps2p350M27 Ps2p250Xio Ps2p200xlo; для Ps3 - Ps3pl400CR2i5 Ps3pl200CR2i5 Ps3p410xlo; для Ps4 - Ps4pl650Xio Ps4p900xlo Ps4p290CR2i2 Ps4p250CR2i2- На основании полученных данных были составлены молекулярно-генетические формулы для изученных популяций Р. sylvestris (табл. 3).

Таблица 3

Молекулярно-генетические формулы четырех популяций Р. sylvestris

Популяции Тип ISSR-маркера ISSR-маркеры, избранные для паспортизации

Psl vid PSv670CR212 PSv500M27 PSv460M27 PSv450CR212 PSv440X10 PSv390CR212

polimorph Pslp930ISl Pslp260CR212 Pslp210M27 Pslpl80M27 Pslpl70M27

Ps2 vid PSv670CR212 PSv500M27 PSv460M27 PSv450CR212 PSv440X10 PSv390CR212

polimorph Ps2p350M27 Ps2p250X10 Ps2p200X10

Ps3 vid PSv670CR212 PSv500M27 PSv460M27 PSv450CR212 PSv440X10 PSv390CR212

polimorph Ps3pl400CR215 Ps3pl200CR215 Ps3p410X10

Ps4 vid PSv670CR212 PSv500M27 PSv460M27 PSv450CR212 PSv440X10 PSv390CR212

polimorph Ps4pl650X10 Ps4p900X10 Ps4p290CR212 Ps4p250CR212

Примечание. PSv - ISSR-ISSR-маркеры, характерные ISSR-маркеры.

маркеры, характерные для всех популяций; Pslp, Ps2p, Ps3p и Ps4p - полиморфные для отдельной популяции; vid - видовые ISSR-маркеры; polymorph - полиморфные

На основании полученных молекулярно-генетических формул рекомендуется составлять штрихкоды [Боронникова, 2013]. Как молекуляр-но-генетическая формула, так и штрихкод позволят идентифицировать принадлежность особей не только к роду и виду, но и к определенной популяции.

Маркер

_молекулярной массы, пн

1500

Штрихкод

1000

700

600

500

400

Родовые маркеры предлагается обозначить толстой линией, видовые - линией средней толщины, а полиморфные маркеры - тонкой линией. Для штрихкода предлагается использовать от 9 до 12 штрихов. ISSR-мapкepы в штрихкоде располагаются в зависимости от их длины от большего к меньшему (рисунок).

№ ISSR- Обозначение

маркера маркера

1 Р83р1400СИ215

2 РвЗрШОсми

PSV670CR212

PSV500M27

PSv460M27

PSV450CR212

PSv440xio

Ps3p4 lOxio

PSV390Cr212

Штрихкод популяции Ps3, расположенной в Шабалинском лесничестве Кировской обл.

Таким образом, в основу методики молекуляр-но-генетической идентификации популяций заложен молекулярный анализ высоко полиморфных областей геномов изучаемых видов. Молекулярно-генетическая идентификация популяций включает в себя молекулярно-генетический анализ на основании полиморфизма ISSR-мapкepoв, выявление идентификационных маркеров, редких и уникаль-

ных аллелей, составление для каждой популяции молекулярно-генетической формулы и штрихкода.

Заключение

У четырех изученных популяций Р. sylvestris выявлено 117 ISSR-маркеров. Установлено, что доля полиморфных локусов у этих популяций высока (Рд5 = 0.949), поэтому они могут быть исполь-

зованы для идентификации на популяционном уровне. Выявлены идентификационные видовые для Р. sylvestris и полиморфные ISSR-маркеры, а также их сочетания для молекулярно-генетической идентификации изученных популяций. Составлены молекулярно-генетические формулы и штрих-коды четырех изученных популяций Р. sylvestris. Полученные данные могут быть использованы для идентификации популяций и древесины Р. sylvestris в изученных регионах.

Работа выполнена при финансовой поддержке программы «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» (УМНИК) Фонда содействия развития малых форм предприятий в на-учно-технической сфере» 2016-2018 гг., договор № 9000ГУ/2015 от 22.12.2015.

Библиографический список

Боронникова C.B. Исследование генетической изменчивости популяций редкого вида Урала Adenophora lilifolia (L.) DC. на основании анализа полиморфизма ISSR-маркеров // Генетика. 2009. Т. 45, № 5. С. 652-655. Боронникова C.B. Молекулярно-генетический анализ и оценка состояния генофондов ресурсных видов растений Пермского края: монография. Пермь, 2013. 223 с. Боронникова C.B., Календарь Р.И. Использование IRAP-метода для анализа генетической изменчивости популяций ресурсных и редких видов растений // Генетика. 2010. Т. 46, № 1 С. 44-50. Ветчинникова Л.В., Титов А. Ф., Кузнецова Т.Ю. Карельская береза: биологические особенности, динамика ресурсов и воспроизводство. Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2013. 312 с.

Грант В. Видообразование у растений. М.: Мир, 1984. 528 с.

Исаев A.C., Коровин Г.И. Актуальные проблемы национальной лесной политики / Центр по проблемам экологии и продуктивности лесов Российской академии наук. М., 2009. 108 с. Левонтин P.C. Генетические основы эволюции.

М.: Мир, 1978. 351 с. Материалы к заседанию "круглого стола" на тему «Законодательное обеспечение основных направлений развития лесного хозяйства на базе инновационных научно-технических достижений». 2012. URL:

http://council.gov.ru/media/files/41d4935c0f740f5 ela2b.pdf (дата обращения: 03.04.2016). Нечаева Ю.С. Оптимизация методики выделения ДНК некоторых хвойных видов растений Пермского края // Материалы международной конференции «Синтез знаний в естественных науках. Рудник будущего: проекты, технологии,

оборудование». Пермь, 2011. С. 278-282.

Основные результаты работы Министерства природных ресурсов и экологии Российской Федерации за 2013 г. URL: http://government.ru/dep_news/11859/ (дата обращения: 02.04.2016).

Geburek Т., Turok J. Conservation and sustainable management of forest genetic resources in Europe

- an introduction // Conservation and Management of Forest Genetic Resources in Europe. Ar-bora Publishers, Zvolen, 2005. P. 3-8.

Rogers S.O., Bendich A.J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues // Plant Molecular Biology. 1985. Vol. 1, № 19. P. 69-76.

Zietkiewicz E. Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification // Genomics. 1994. Vol. 20. P. 176-183.

References

Boronnikova S.V. Molekuljarno-genetuceskij analiz i ocenka sostojanija genofondov resursnych vidov rastenij Permskogo kraja [Molecular genetic analysis and assessment of gene pools of resource species of plants of Perm region: monograph], Perm, 2013. 223 p. (InRuss.).

Boronnikova S.V. Genetic variation in Ural populations of the rare plant species Adenophora lilifolia (L.) D. on the basis of analysis of polymorphism of ISSR-markers. Russian Journal of Genetics. 2009, V. 45, N5, pp. 571-574.

Boronnikova S.V., Kalendar R.N. Using IRAP-markers for analisis of genetic variability in populations of resource and rare species of plants. Russian Jornal of Genetics. 2010, N 1 (46), pp. 36-42.

Geburek Т., Turok J. Conservation and sustainable management of forest genetic resources in Europe

- an introduction. Conservation and Management of Forest Genetic Resources in Europe. Arbora Publishers, Zvolen, 2005, pp. 3-8.

Grant B. Vidoobrazovanie и rastenij [Speciation in plants], Moscow, Mir Publ., 1984. 528 p. (In Russ.).

Isaev A.S., Korovin G.N. Aktual'nye problemy national 'noj lesnoj politiki [Actual problems of the National Forest Policy]. Moscow, 2009. 108 p. (In Russ.).

LewontinR.S. Geneticeskie osnovy Svoljucii [Genetic bases of the evolution], Moscow, Mir Publ., 1978. 351 p. (In Russ.).

Materials for the meeting of the "round table" on "Legislative support of the main directions of forestry development based on innovative scientific and technological achievements." 2012. URL: http://council.gov.ru/media/files/41d4935c0f740f5el

a2b.pdf (reference date 03/04/2016). (In Russ.). Nechaeva Yu.S. [Optimization of DNA extraction methods of some coniferous species of plants of Perm region], Materialy mezdunarodnoj konfer-encii "Sintez znanij v estestvennych naukach. Rudnik buduscego: proekty, technologii, oborudo-vanie" [Proceedings of the international conference «Knowledge Synthesis in the natural sciences. Rudnik future: projects, technologies and equipment»]. Perm, 2011, pp. 278- 282. (In Russ.).

Rogers S.O., Bendich A.J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues. Plant Molecular Biology, 1985, V. 1, N 19, pp. 69-76. The main results of the Ministry of Natural Resources

Об авторах

Пришнивская Яна Викторовна, аспирант кафедры ботаники и генетики растений ФГБОУВО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» 614990, Пермь, ул. Букирева, 15; yana_prishnivskaya@mail.ru; (342)2396729

инженер-исследователь лаборатории молекулярной биологии и генетики Естественнонаучный институт ПГНИУ 614990, г. Пермь, ул. Генкеля, 4

Красилъников Виталий Павлович, магистрант биологического факультета ФГБОУВО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» 614990, Пермь, ул. Букирева, 15; trait969@gmail .com

Боронникова Светлана Витальевна, доктор биологических наук, профессор, зав. кафедрой ботаники и генетики растений ФГБОУВО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» 614990, Пермь, ул. Букирева, 15; svboronnikova@yandex.ru; (342)2396229

and Ecology of the Russian Federation in 2013. URL: http://government.ru/dep_news/11859/ (reference date 02/04/2016). (In Russ.). Vetchinnikova L.V., Titov A.F., Kuznetsova T.Y. Karel'skaja bereza: biologiceskie osobennosti, dinamika resursov i vosproizvodstvo [Karelian birch: biological features, dynamics and reproduction of resources]. Petrozavodsk, Karelian Research Centre of Russian Academy of Science, 2013. 312 p. (In Russ.). Zietkiewicz E. Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR) -anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics, 1994, V. 20, pp. 176-183.

Поступила в редакцию 12.04.2016

About the authors

Prishnivskaya Yana Viktorovna, PhD student of the Department of Botany and Plant Genetics Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990; yana_prishnivskaya@mail.ru; (342)2396729

engineer-researcher of the laboratory of molecular biology, and finally genetics Natural Science Institute Perm State University. 4, Genkelja str., Perm, Russia, 614990

Krasilnikov Vitaliy Pavlovich, graduate student faculty of Biology

Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990; trait969@gmail.com

Boronnikova Svetlana Vitalievna, Doctor of Biological Sciences, Professor, Head of the Department of Botany and Plant Genetics Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990; svboronnikova@yandex.ru; (342)2396229