Идентификация и определение антибиотиков никарбазина и макролидов в кормах и продуктах питания

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА

Идентификация и определение антибиотиков никарбазина и макролидов в кормах и продуктах питания

Т.А. Краснова1, аспирант, А.А. Тимофеев1,2, аспирант, Н.М. Волкова1,2, аспирант,

В.Г. Амелин1,2, доктор химических наук

1 Владимирский государственный университет имени А.Г. и Н.Г. Столетовых.

2 Федеральный центр охраны здоровья животных (ВНИИЗЖ) (Владимир).

Сокращения: ВЭЖХ ДМД — высокоэффективная жидкостная хроматография с диодно-матричным детектором, Да — дальтон, ДОС — диапазоны определяемых содержаний, ИФА — иммуноферментный анализ, МС МАЛДИ — масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией, ПО — пределы обнаружения, CRSO — Corporate Reference Standards Organization (корпоративная справочная организация стандартов), QuEChERS — Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe (быстрый, простой, дешевый, эффективный, точный и надежный) Ключевые слова: ВЭЖХ ДМД, корма, макролиды, МС МАЛДИ, никарбазин, продукты питания

Введение

В настоящее время в ветеринарии применяют большое количество антибиотиков различных классов. Никарбазин и макролиды часто вводят в корма и премиксы, в первую очередь для борьбы с кокцидиозом и микоп-лазмозами животных [1]. В соответствии с действующей нормативной документацией, антибиотики-мак-ролиды в кормах и премиксах определяют посредством ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектором [2]. Также для определения антибиотиков иногда используют твердофазный ИФА [3]. Указанные методы сопряжены со сложной пробоподготовкой, а продолжительность анализа достигает нескольких часов.

В последнее десятилетие были разработаны новые методики определения конкретных антибиотиков — тандемная жидкостная хроматография с масс-спект-рометрией и ионизацией электрораспылением [4, 5]. Например, в одной работе [4] предложены способы оптимизации пробоподготовки при определении посредством жидкостной хроматографии антибиотиков-макролидов в кормах для животных. Тем не менее существующие методы сложны, требуются тщательная очистка экстракта антибиотиков от соэкстрагируемых примесей (белки, жиры, сахара и пр.) или твердофазная экстракция, поэтому продолжается поиск более простого и точного способа идентификации и определения антибиотиков.

В последнее время одним из развивающихся методов исследования органических соединений является масс-спектрометрия с МС МАЛДИ в сочетании с времяпро-летным масс-анализатором [6.. .8]. Кроме того, предложен ускоренный способ пробоподготовки для извлечения органических загрязнителей из анализируемых объектов и очистки экстрактов для ВЭЖХ—QuEChERS [9]. Для извлечения никарбазина данный способ не применялся.

Цель исследования

Разработать экспресс-методику идентификации и определения антибиотиков в кормах, премиксах, пищевых продуктах посредством МС МАЛДИ и использования пробоподготовки по способу QuEChERS при определении никарбазина методом ВЭЖХ ДМД.

Материалы и методы

Аппаратура. В работе использовали масс-спектрометр МАЛДИ с времяпролетным масс-анализатором Autoflex III smartbeam («Bruker Daltonic», Германия), режим работы с рефлектроном для положительных и отрицательных ионов, основные параметры анализа: ультрафиолетовый азотный лазер с длиной волны 337 нм, длина импульса 3 нс, мощность лазерного излучения 106.107 Вт/см2. Применяли автоматическое подавление масс до 300 Да. Для анализа спектров применяли программу Flex Analysis ver. 3.3 («Bruker Daltonic», Германия).

Использовали жидкостной хроматограф с диодноматричным детектором Flexar DAD («Perkin-Elmer», США). Разделение проводили на колонке (250x4,6 мм) Supelco Ci8 (США) в режиме изократического элюирования подвижной фазой вода: ацетонитрил в соотношении 55: 45. Расход подвижной фазы 1,0 мл/мин, длина волны детектора 340 нм, объем вводимой пробы 15 мкл.

Реактивы. Использовали стандарты антибиотиков CRSO («Eli Lilly and Company», США): монензин, наразин, авиламицин; никарбазин («Sigma-Aldrich», Швейцария): тилмикозин, ласалоцид, лаидломицин, эритромицин, салиномицин, джозамицин, спирамицин, рифабутин, сем-дурамицин, мадурамицин, тилозин. Образцы антибиотиков 1 мг/мл готовили растворением соответствующих навесок в ацетонитриле («Prolabo», Австрия). Рабочие растворы готовили в день использования разбавлением исходных ацетонитрилом. В качестве матрицы использовали а-циано-4-гидроксикоричную кислоту («Bruker Daltonic», lot. 10.255344.284001). Матрицу 20 мг/мл готовили растворением соответствующей навески в ацетоне с добавлением трифторуксусной кислоты.

Пробоподготовка. Готовили пробы кормов, премиксов, пищевых продуктов по следующим методикам.

Корма и премиксы. Навеску усредненного корма (1,0 г) и премикса (0,10 г) помещали в пластиковую пробирку на 15 мл, добавляли 1 мл воды и 9 мл ацетонитрила. Встряхивали в течение 10.15 мин и центрифугировали при 2700 мин-1 — 5 мин. Для анализа методом МАЛДИ отбирали верхний слой экстракта.

Пищевые продукты. Для анализа методом МАЛДИ отбирали 5,0 г гомогенизированного пищевого продукта

Идентификация и определение антибиотиков никарбазина и макролидов в кормах и продуктах питания

в пластиковую пробирку на SO мл, добавляли 10,0 мл ацетонитрила и S мл бидистиллированной воды; встряхивали в течение S мин и вносили 4,0 г NaCl, интенсивно встряхивали 1.. .2 мин и центрифугировали при 2700 мин-1 — S мин. Верхнюю ацетонитрильную фазу отбирали для анализа. Раствор аналита смешивали с матрицей (20 мг/мл а-циано-4-гидроксикоричной кислоты) в объемном соотношении 1:1 и 1 мкл смеси наносили на стальную подложку «MTP 384 ground steel TF».

Экстракцию никарбазина и очистку экстрактов для ВЭЖХ ДМД осуществляли по методу QuEChERS [9j. Исследуемые образцы измельчали, отбирали среднюю пробу (не менее 100 г). В центрифужную пробирку на S0 мл вносили навеску измельченного и усредненного образца массой 5,0 г (яйца, мясо курицы) и 10,0 г (прочие пищевые продукты животного происхождения); добавляли 10,0 мл ацетонитрила, закрывали пробирку и энергично взбалтывали в течение одной минуты. Затем вносили смесь, состоящую из 4,0 г безводного MgSO4, 1,0 г NaCl, 1,0 г Na3C6HSO7. 2H2O и 0,5 г Na2HC6H5O7. 1,5H2O. После внесения солей взбалтывали в течение 1 мин (чтобы избежать образования комков), центрифугировали при 2700 мин-1 — 5 мин, отбирали 8,0 мл органической части экстракта и переносили в центрифужную пробирку на 15 мл, которая содержала смесь MgSO4 (0,9 г), сорбента Bondesil-PSA (0,15 г) и С18 (0,15 г). Пробирку энергично встряхивали в течение 30 с и центрифугировали при 2700 мин-1 — 5 мин. Отбирали 1,0 мл экстракта (яйца, мясо курицы) или 2,0 мл экстракта (прочие продукты) и упаривали в токе азота досуха при температуре 40 оС. К сухому остатку добавляли 100 мкл подвижной фазы, перемешивали и хроматографировали.

Результаты и обсуждение

Матрицы для МАЛДИ выбирали из а-циано-4-гид-роксикоричной и 2,5-дигидроксибензойной кислот [5.7j. Масс-спектры антибиотиков были получены только при использовании а-циано-4-гидроксикоричной кислоты в качестве матрицы. Установлено, что наилучшая кристаллизация и гомогенность образца на подложке получается при использовании матрицы и аналита в соотношении 1:1.

Масс-спектры антибиотиков при регистрации положительных ионов отличаются небольшим числом хорошо разрешенных пиков, характерных для конкретных ионов соединения, в основном это протонированные ионы [М + ^ и аддукты с натрием или калием ([М + Naj+, [М + Kj+) (табл. 1). Пределы обнаружения детектируемых компонентов при отношении сигнал/шум (S/N) = 4 составили 0,01.0,3 мкг/кг.

В масс-спектрах ацетонитрильных экстрактов продуктов животного происхождения установлено наличие пиков тилмикозина, монензина, эритромицина, нарази-на и других макролидов. Макролиды практически во всех пробах представлены ионами [М + Naj+, [М + Kj+ (табл. 2, рис. 1). Установлено наличие остатков многих макролидов, особенно в молоке (табл. 2).

В табл. 3 и 4 представлены аналитические характеристики методики и результаты определения антиби-отиков-макролидов в кормах и премиксах. В премиксах и кормах установлено присутствие никарбазина, наразина

1. Характеристические массы для антибиотиков-макролидов, полученные МС МАЛДИ (матрица -а-циано-4-гидроксикоричная кислота) при регистрации положительных ионов

Антибиотик (мол. масса, Да) Ион Характеристические массы (m/z), Да

Ласалоцид (588) ДОЦ * М]* [ЛСЦ * Na]* 589,756 611,770

Лаидломицин (669) ^M * Na]* ^M * К]* 692,458 708,354

Mонензин (670) MНЗ * Na]* MНЗ * К]* MНЗ * Na^O]* 693,636 709,611 675,616

Эритромицин (733) ЭPM * Na]* ЭPM * K]* ЭPM+ H]* 756,689 772,669 734,684

Cалиномицин (751) CЛM * М]* CЛM * Na]* ^M * К]* 752,453 774,245 790,383

Маразин (764) ^P3* Na]* ^P3* К]* 787,721 803,705

Джозамицин (828) ДЖM * М]* ДЖM * Na]* ДЖM * К]* 828,630 850,644 866,620

Pифампицин (823) PФП * М]* PФП+ Na]* PФП * К]* 824,323 846,315 862,400

^ирамицин (843) CnM * М]* CnM * Na]* CnM * К]* 843,683 865,695 881,673

Pифабутин (846) PФБ * М]* PФБ * Na]* PФБ * К]* 847,435 870,478 885,639

Тилмикозин (868) [TM^ М]* 869,835

Cемдуpамицин (873) CДM * М]* CДM * Na]* CДM * К]* 874,383 896,195 912,373

Mадуpамицин (917) MДM * М]* MДM * Na]* MДM * К]* 918,234 940,476 956,532

Тилозин (915) [ТЛЗ* М]* ^ЛЗ* Na]* 916,702 938,713

Авиламицин (1404) ABM * К]* ABM * К*2М]* ABM * 2К-М2О-3М]* 1444,137 1445,735 1461,715

Примечание. m/z — отношение массы к заряду.

2. Идентификация остаточных количеств антибиотиков в пищевых продуктах животного происхождения методом МАЛДИ

Проба Характеристические массы (m/z), Да Отношение сигнал /шум (S/N) Высота пика в спектре, отн. ед. Площадь пика в спектре, отн. ед. Идентифицированный антибиотик

Яйцо 869,743 4,5 51 7 ^лмикозин

709,567 8,2 465 61 Mонензин

Cвинина 756,733 4,4 232 22 Эритромицин

787,808 803,503 41,4 10,6 3471 938 651 144 Маразин

Cвиное сало 803,383 4,0 102 14 Маразин

734,856 71,0 18802 2997 Эритромицин

787,930 11,7 3330 565 Маразин

Mолоко коровье (3,2 %) 611,820 21,4 6938 1263 Ласалоцид

692,836 708,846 15,5 7,6 4846 2573 819 505 Лаидломицин

693,845 6,5 2354 383 Mонензин

774,458 790,941 11.5 15.5 3442 4236 503 646 Cалиномицин

Mолоко козье (1,5 %) 824,842 10,9 724 75 Pифампицин

3. ПО и ДОС антибиотиков-макролидов

Антибиотик Уравнение градуировочного графика R2

Mонензин 0,3 1.20 у = 4,858 x 0,991

Маразин 0,3 1.20 у = 13,04 x 0,999

Джозамицин 0,05 0, 5 о Внутренний стандарт -

^лмикозин 0,003 0,01.10 у = 136,4 x 0,992

Aвиламицин 0,3 1.50 у = 0,735 x 0,995

Микарбазин 0,05 0, 0 у = 66358 x 0,999

Примечание. R2 — коэффициент корреляции

4. Определение содержания наразина, авиламицина и никарбазина в кормах и премиксах

Проба Найдено наразина, мг/кг Sr Найдено авиламицина, мг/кг Sr Найдено никарбазина, мг/кг Sr

ю ю ю О р 23,4 ± 0,5 35 ± 2 31 ± 6 0,01 0,02 0,08 46 ± 8 150 ± 32 0,07 0,08 20,0 ± 0,5 29,3 ± 0,2 26,8 ± 0,7 0,04 0,02 0,09

Премикс: №1 №2 Z3 3400 ± 400 4500 ± 620 230 ± 21 0,05 0,06 0,04 214 ± 55 0,10 43 го со о ООО ООО 345 О 1>0 о о о 0,06 0,06 0,05

Примечание. Sr — относительное стандартное отклонение

РВЖ • СХЖ • № 4/2013

Т.А. Краснова, А.А. Тимофеев, Н.М. Волкова, В.Г. Амелин

100 200 300 400 500

Рис. 1. Масс-спектр экстракта из свиного сала

800 m/z

и авиламицина (рис. 2). Относительное стандартное отклонение результатов анализа не превышает 0,1. Правильность анализа проверена методом «введено — найдено» на примере корма, не содержащего антибиотиков. Установлено, что степень извлечения антибиотиков из кормов и премиксов экстракцией водным ацетонитрилом составляет 80.100 %. Никарбазин и макролиды в кормах и премиксах определяли по образцам из одной навески.

Никарбазин в пищевых продуктах определяли отдельно с использованием пробоподготовки QuEChERS. Во всех анализируемых пробах яиц обнаружен никарбазин — в трех пробах из 15 отмечено превышение его содержания (0,1 мг/кг), в мясе птицы и говядине никарбазин

СО

1

$

£

1=1

о

600 700 800 900 1000 1100

Рис. 2. Масс-спектр экстракта из премикса

1200 1300

m/z

либо отсутствовал, либо его содержание не превышало МДУ (рис. 3).

Выводы

Результаты проведенных исследований демонстрируют эффективность метода МС МАДДИ с времяпролетным масс-анализатором при идентификациии антибиотиков различных групп в продуктах животного происхождения, кормах и премиксах. Показана возможность использования пробоподготовки QuEChERS при определении ни-карбазина в пищевых продуктах методом ВЭЖХ ДМД.

Библиографию см. на сайте издательства http://logospress.ru/

4

U

600

700

1400

Рис. 3. Хроматограммы экстрактов мяса без добавки

Summary

T.A. Krasnova, А.А. Timofeev, N.M. Volkova, V.G. Amelin. Identification and Determination of Antibiotics Nikar-bazin and Macrolides in Feed and Food. The express technique of identification and determination of nicarbazin and macrolide antibiotics by mass spectrometry with matrix-assisted laser desorption / ionization (MALDI MS) and high performance liquid chromatography with diode-array detector (HPLC DAD) in food and feed from one hinge plate is developed. To remove the antibiotics from the feed, premixes and their determining by MALDI MS and HPLC DAD acetonitrile was used without further purification of the extract. For extraction of macrolide used a water acetonitrile (1:9) without purification of extract in the MALDI MS method. For extraction of nicarbazin from food used the QuEChERS method with the subsequent cleaning and extract concentration. The detection limits were 0,01.0,3 mkg/kg. Relative standard deviation of the results of the analysis did not exceed 0.1. Duration of the analysis was 30.40 min.