КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГИПЕРТЕНЗИИ И/ИЛИ ФИБРОЗА
COMPOSITION FOR TREATMENT OF HYPERTENSION AND/OR FIBROSIS

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к новым соединениям и их применению при профилактическом и/или терапевтическом лечении сердечно-сосудистых заболеваний, и, в частности, при лечении предгипертензии, гипертензии и/или фиброзных состояний.
Настоящее изобретение было разработано в первую очередь для профилактического и/или терапевтического лечения сердечно-сосудистых заболеваний и будет описано ниже со ссылкой на данное применение. Однако следует принимать во внимание, что настоящее изобретение не ограничено этой конкретной областью применения.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Любое обсуждение уровня техники по всему настоящему описанию никоим образом не должно рассматриваться как допущение того, что такой уровень техники широко известен или образует часть общеизвестных знаний в данной области.
Гипертензия (высокое артериальное давление) поражает 26% взрослого населения по всему миру с частотой встречаемости 30-33% в западных странах. Ожидается, что частота встречаемости гипертензии в мире достигнет 29% к 2025 году вследствие вестернизации Индии и Китая. Современные исследования указывают на то, что менее чем 20% пациентов с гипертензией достигают рекомендованного целевого значения артериального давления (BP) и что для достижения этих целей >75% пациентов нуждаются в терапии с использованием нескольких антигипертензивных средств. Предгипертензия (немного повышенное артериальное давление) поражает 31% взрослых в США и без лечения может развиться в гипертензию.
Все доступные в настоящее время методы терапии имеют побочные эффекты:
- ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента (ACEI) - кашель, ангионевротический отек, гиперкалиемия;
- блокаторы рецепторов ангиотензина (ARB) - ангионевротический отек, гиперкалиемия;
- блокаторы кальциевых каналов (ССВ) - гиперемия, отек ноги/лодыжки, запор;
- тиазидные диуретики - впервые выявленный диабет, подагра, гипонатриемия;
- бета (β) блокаторы - впервые выявленный диабет, неспособность к физическим нагрузкам, брадикардия, скрытая гипогликемия у больных диабетом, и
- антагонисты альдостерона - гинекомастия, меноррагия, гиперкалиемия.
Необходимость применения комбинированной терапии повышает вероятность того, что пациенты будут испытывать побочные эффекты и, как следствие, не достигнут целевого значения BP.
Гипертензия и предгипертензия представляют собой основной фактор развития повреждения сердца, почек и кровеносных сосудов, приводя к замещению нормальной функциональной ткани рубцовой тканью или фиброзом. Некоторые из существующих антигипертензивных средств - ингибиторы АСЕ, ингибиторы ренина - ARB и антагонисты альдостерона, способны замедлять прогрессирование замещения функциональной ткани фиброзом, ни для кого из них не было показано обращение вспять существующего фиброза и восстановление нормального строения ткани. Таким образом, существует потребность в средствах, которые эффективны в существенном снижении значения BP и, таким образом, позволяют более значительной доле пациентов достигнуть целевого значения BP при терапии одним средством, и/или обратить существующий фиброз, и/или восстановить нормальное строение ткани.
Целью настоящего изобретения является преодоление или уменьшение по меньшей мере одного из недостатков прототипа или создание пригодной альтернативы.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что некоторые новые терфенильные соединения обладают эффектами, снижающими артериальное давление, и/или противофиброзными эффектами. Эти эффекты можно наблюдать в исследованиях с внутривенным и/или пероральным введением дозы.
Согласно одному из аспектов настоящее изобретение предусматривает соединение с формулой
,
или его стереоизомер или фармацевтически приемлемую соль. В одном варианте осуществления соединение представляет собой
,
или его стереоизомер или фармацевтически приемлемую соль.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу терапевтического лечения гипертензии или предгипертензии у субъекта, включающему введение субъекту соединения согласно настоящему изобретению.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу терапевтического лечения фиброза у субъекта, включающему введение субъекту соединения согласно настоящему изобретению.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу профилактического лечения фиброза у субъекта, включающему введение субъекту соединения согласно настоящему изобретению.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу терапевтического лечения гипертензии и фиброза у субъекта, включающему введение субъекту соединения согласно настоящему изобретению.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу терапевтического лечения предгипертензии и фиброза у субъекта, включающему введение субъекту соединения согласно настоящему изобретению.
В одном варианте осуществления фиброз представляет собой фиброз миокарда или фиброз почки.
В другом варианте осуществления фиброз представляет собой фиброз миокарда и фиброз почки.
Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение относится к соединению по настоящему изобретению для применения в терапевтическом лечении гипертензии или предгипертензии.
Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение относится к соединению по настоящему изобретению для применения в терапевтическом лечении фиброза.
Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение относится к соединению по настоящему изобретению для применения в профилактическом лечении фиброза.
Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение относится к соединению по настоящему изобретению для применения в терапевтическом лечении гипертензии и фиброза.
Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение относится к соединению по настоящему изобретению для применения в терапевтическом лечении предгипертензии и фиброза.
Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение относится к применению соединения по настоящему изобретению для изготовления лекарственного препарата для терапевтического лечения гипертензии или предгипертензии.
Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение относится к применению соединения по настоящему изобретению для изготовления лекарственного препарата для терапевтического лечения фиброза.
Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение относится к применению соединения по настоящему изобретению для изготовления лекарственного препарата для профилактического лечения фиброза.
Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение относится к применению соединения по настоящему изобретению для изготовления лекарственного препарата для терапевтического лечения гипертензии и фиброза.
Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение относится к применению соединения по настоящему изобретению для изготовления лекарственного препарата для терапевтического лечения предгипертензии и фиброза.
Если контекст явно не требует иного, по всему описанию и формуле изобретения слова "содержит", "содержащий" и тому подобное должны быть истолкованы во включающем смысле в противоположность исключающему или исчерпывающему смыслу; то есть в смысле "включая, но без ограничения".
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фигура 1: Синтез VB0004.
Фигура 2: Синтез диэтилкарбамоилметилфосфоната.
Фигура 3: Ответы с отрицательным импедансом наблюдали для соединения VB0004 в концентрациях 62,5 мкМ, 125 мкМ и 250 мкМ при инкубировании с гладкомышечными клетками сосудов А10 в приборе xCELLIgence производства Roche.
Фигура 4: Систолическое артериальное давление у SHR на 2,2% солевом рационе после 4 недель обработки пероральным введением VB0004 при 10, 100 и 500 пмоль/кг/мин.
Фигура 5: Ответы с отрицательным импедансом наблюдались для соединения VB0004 в концентрации 62,5 мкМ, 125 мкМ и 250 мкМ при инкубировании с эндотелиальными клетками бычьей аорты в приборе xCELLIgence производства Roche.
Фигура 6: Систолическое артериальное давление у SHR на 2,2% солевом рационе после 4 недель обработки с внутривенной инфузией VB0004 при 10 и 20 пмоль/кг/мин.
Фигура 7: Снижение среднего систолического артериального давления после 4 недель обработки с различными дозами VB0004 в диапазоне от 10 до 2500 пмоль/кг/мин перорально по сравнению со средним систолическим артериальным давлением у контрольных животных.
Фигура 8: Снижение среднего систолического артериального давления у SHR на 2,2% солевом рационе, обработанных перорально при помощи VB0004 при 2500 пмоль/кг/мин, по сравнению с контрольными животными в различные периоды времени вплоть до 8 недель.
Фигура 9: Фиброз в сердце после 4 недель пероральной обработки при помощи VB0004 у 18-недельных SHR на 2,2% солевом рационе в дозах от 10 до 500 пмоль/кг/мин (заштрихованные столбики) снижался по сравнению с фиброзом у 14- и 18-недельных контрольных (не заштрихованные столбики) SHR на 2,2% солевом рационе. * р<0,005, ** р<0,0005 против 18-недельного контроля, # р<0,05 против 14-недельного контроля.
Фигура 10: Фиброз в почке после 4 недель пероральной обработки при помощи VB0004 у 18-недельных SHR на 2,2% солевом рационе в дозах от 10 до 500 пмоль/кг/мин (заштрихованные столбики) снижался по сравнению с фиброзом у 14-и 18-недельных контрольных (не заштрихованные столбики) SHR на 2,2% солевом рационе. * р<0,005, ** р<0,0005 против 18-недельного контроля, # р<0,05, ## р<0,005, ### р<0,0005 против 14-недельного контроля.
Фигура 11: Микрофотографии сердца контрольных крыс и крыс, обработанных в течение четырех недель при помощи VB0004 при 500 пмоль/кг/мин. На верхней панели показан срез контрольного сердца, где фиброзная ткань отображается серым при трихромном окрашивании по Массону (см. стрелки). На нижней панели показано, что фиброзная ткань практически отсутствует на срезах от животных, обработанных при помощи VB0004.
Фигура 12: Микрофотографии почки контрольных крыс и крыс, обработанных в течение четырех недель при помощи VB0004 при 500 пмоль/кг/мин. На верхней панели показан срез контрольной почки, где фиброзная ткань отображается серым при трихромном окрашивании по Массону (см. стрелки). На нижней секции показано, что фиброзная ткань практически отсутствует на срезах от животных, обработанных при помощи VB0004.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к некоторым новым терфенильным соединениям, которые характеризуются эффектами, снижающими артериальное давление и/или противофиброзными эффектами при исследовании с внутривенным и/или пероральным введением дозы на экспериментальной животной модели. Что касается противофиброзной активности, соединения по настоящему изобретению являются эффективными в предотвращении фиброза, замедлении прогрессирования развившегося фиброза и/или снижении степени (обращении) развившегося фиброза. Это важное заключение в отношении диапазона и тяжести состояний, которые можно лечить с помощью соединений по настоящему изобретению.
Соединения по настоящему изобретению представлены формулой:
.
Следующее соединение является специфическим, но не ограничивающим примером соединений по настоящему изобретению:
.
Соединение также может быть представлено следующим названием:
2'-[3-гидрокси-(1,1':4',1''-терфенил)]пропанамид.
Соединения по настоящему изобретению могут существовать в определенных геометрических или стереоизомерных формах. Настоящее изобретение рассматривает все подобные соединения, включая цис- и транс-изомеры, (R)- и (S)-энантиомеры, диастереомеры, (d)-изомеры, (l)-изомеры, их рацемические смеси и другие их смеси, как попадающие в объем настоящего изобретения. Все подобные изомеры, а также их смеси предназначены для включения в данное изобретение.
Если, например, необходим определенный энантиомер соединения по настоящему изобретению, его можно получить путем асимметричного синтеза или путем получения производного с хиральным вспомогательным веществом, где полученную диастереомерную смесь разделяют и вспомогательную группу отщепляют с получением требуемых чистых энантиомеров. В качестве альтернативы, диастереомерные соли могут быть образованы с подходящей оптически активной кислотой или основанием с последующим разделением образованных таким образом диастереомеров с помощью фракционной кристаллизации или хроматографическими средствами, хорошо известными из уровня техники, и последующим восстановлением чистых энантиомеров.
В целом соединения по настоящему изобретению могут быть получены с помощью способов, проиллюстрированных на общих схемах реакций, как, например, описано ниже, или путем их модификаций с использованием легко доступных исходных веществ, реагентов и общепринятых методик синтеза. В данных реакциях также можно воспользоваться вариантами, которые сами по себе известны, но не упомянуты в данном документе.
Настоящее изобретение также предусматривает фармацевтически приемлемые соли соединений. Выражение "фармацевтически приемлемая соль" включает соли присоединения как кислоты, так и основания и относится к солям, которые сохраняют биологическую эффективность и свойства свободных оснований или кислот и которые не являются биологически или иным образом нежелательными. Фармацевтически приемлемые соли образуются с неорганическими или органическими кислотами или основаниям и могут быть получены in situ во время окончательного выделения и очистки соединений или путем отдельной реакции очищенного соединения в форме его свободного основания или кислоты с соответствующей органической или неорганической кислотой или основанием и выделения образованной соли.
Термин "фиброз", используемый в контексте настоящего изобретения, включает, но без ограничения, фиброз миокарда и/или фиброз почки.
В дополнение к лечению развившегося фиброза соединения по настоящему изобретению могут использоваться профилактически у субъекта с риском развития фиброза. В качестве примера субъектов в категории риска развития фиброза выступают имеющие гипертензию, диабет, миокардит, ишемическую болезнь сердца, синдром Конна, феохромоцитому, генетическую предрасположенность и высокосолевой рацион, и/или получающие лекарственные средства, используемые при химиотерапии рака (такие как даунорубицин). Термин "профилактический", используемый в контексте настоящего изобретения, предназначен inter alia для охвата способов лечения, используемых для предупреждения или замедления развития фиброза у находящихся в группе риска. Субъекты, которым может быть предоставлено профилактическое лечение, уже могут иметь признаки ранних нарушений сердца на эхокардиографии.
Термин "гипертензия", используемый в контексте настоящего изобретения, указывает на значение артериального давления у взрослого выше приблизительно 139 мм рт.ст. для систолического и/или выше приблизительно 89 мм рт.ст. для диастолического.
Термин "предгипертензия", используемый в контексте настоящего изобретения, указывает на значение артериального давления у взрослого в диапазоне приблизительно 120-139 мм рт.ст. для систолического и/или приблизительно 80-89 мм рт.ст. для диастолического.
Настоящее изобретение также предусматривает фармацевтические композиции, которые включают соединения по настоящему изобретению в сочетании с приемлемыми фармацевтическими вспомогательными веществами. Выражение "фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество", используемое в контексте настоящего изобретения, означает любой фармацевтически приемлемый неактивный компонент композиции. Как хорошо известно из уровня техники, вспомогательные вещества включают разбавители, буферы, связующие вещества, скользящие вещества, разрыхлители, красители, антиоксиданты/консерванты, регуляторы рН и т.д. Вспомогательные вещества выбирают, исходя из желаемых физических аспектов окончательной формы: например, получение таблетки с желаемой твердостью и хрупкостью, являющейся быстро диспергируемой и легко проглатываемой и т.д. Требуемая скорость высвобождения активного вещества из композиции после ее приема также играет определенную роль в выборе вспомогательных веществ. Фармацевтические композиции могут включать в себя любой тип лекарственной формы, такой как таблетки, капсулы, порошки, жидкие составы, замедленного или длительного высвобождения, пластыри, порошки для вдыхания, назальные спреи и тому подобное. Физическая форма и содержание предусмотренных фармацевтических композиций представляют собой традиционные препараты, которые могут быть составлены специалистом в области фармацевтических составов и основаны на хорошо установленных принципах и композициях, описанных, например, у Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, 1995; British Pharmacopoeia 2000 и аналогичных текстах и руководствах по составам.
Например, если соединения или композиции должны вводиться перорально, их можно составить в виде таблеток, капсул, гранул, порошков или сиропов; или для парентерального введения их можно составить в виде инъекций (внутривенных, внутримышечных или подкожных), препаратов для капельного вливания или суппозиториев. Для применения через слизистую оболочку глаза их можно составить в виде глазных капель или глазных мазей. Эти составы можно получить с помощью обычных средств, и, если необходимо, активный ингредиент можно смешивать с любой обычной добавкой, такой как вспомогательное вещество, связующее вещество, разрыхляющее средство, скользящее вещество, корригирующее вещество, солюбилизирующее средство, суспензионное вспомогательное средство, эмульгирующее средство или покрывающее средство.
Когда соединение (соединения) по настоящему изобретению вводят в виде фармацевтических препаратов человеку и животным, их можно принимать per se или в виде фармацевтической композиции, содержащей, например, от 0,1 до 99,5% (более предпочтительно, от 0,5 до 90%) активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
Дозировку соединения и частоту введения, которые следует использовать, также может легко определить практикующий врач для получения требуемого ответа.
Хотя дозировка будет варьировать в зависимости от симптомов, возраста и массы тела пациента, природы и тяжести расстройства, подлежащего лечению или профилактике, пути введения и формы лекарственного средства, в целом суточная доза от 0,0001 мг до 200 мг соединения по настоящему изобретению может быть подходящим эффективным количеством для взрослого пациента-человека, и ее можно вводить в виде одной дозы или в виде раздельных доз.
"Пациент" или "субъект", подлежащий лечению заявленным способом, может означать человека или субъекта помимо человека.
"Эффективное количество" заявленного соединения в связи со способом лечения относится к количеству терапевтического средства в препарате, которое при применении в виде части требуемого режима дозирования обеспечивает пользу согласно клинически приемлемым стандартам лечения или профилактики определенного нарушения.
Настоящее изобретение далее будет описано более подробно со ссылкой на конкретные, но не ограничивающие примеры, описывающие конкретные композиции и способы применения. Однако следует понимать, что подробное описание конкретных процедур, композиций и способов включено исключительно для целей пояснения настоящего изобретения. Его в любом случае не следует понимать в качестве ограничения широкого описания концепции изобретения, как изложено выше.
ПРИМЕРЫ
Пример 1 - Синтез соединения
Краткое описание синтеза
Синтетический путь, пригодный для получения VB0004, показан на Фигуре 1. Коротко, 5-фенилсалицилальдегид (10) получали в реакции кросс-сочетания Судзуки между 5-бромсалицилальдегидом и фенилбороновой кислотой. Затем этот фенол превращали в соответствующий арилтрифлат (11) (с помощью N-фенилтрифлимида и микроволнового излучения), который подвергали еще одной реакции Судзуки с 3-(бензилокси)фенилбороновой кислотой с образованием терфенилальдегида (12). Реакция Хорнера-Уодсворта-Эммонса между альдегидом (12) и фосфонатом (F) предоставляла α,β-ненасыщенный амид (13), который в дальнейшем восстанавливали с образованием VB0004.
Диэтилкарбамоилметилфосфонат (F) получали реакцией Арбузова между 2-хлорацетамидом и триэтилфосфитом (полученным, как показано на Фигуре 2).
Синтез 2-гидрокси-5-фенилбензальдегида (10)
5-Бромсалицилальдегид (2,49 г, 12,4 ммоль), фенилбороновую кислоту (1,51 г, 12,4 ммоль), палладия (II) ацетат (14 мг, 0,5 моль%) и калия карбонат (5,14 г, 37,2 ммоль) перемешивали в дегазированной воде (75 мл) при температуре окружающей среды в течение 2 часов в атмосфере аргона. Реакцию контролировали с помощью TLC (1:1 дихлорметан/пентан). Добавляли воду (75 мл) и реакционную смесь подкисляли (рН 6) с 10% НСl, затем экстрагировали этилацетатом (3х).
1
13
+
3
3
13
10
2
Объединенные органические экстракты промывали солевым раствором, затем сушили и концентрировали. Неочищенное вещество пропускали через короткую колонку силикагеля, элюировали смесью 1:1 дихлорметан/пентан, затем проводили рекристаллизацию из смеси этилацетат/пентан с получением 2-гидрокси-5-фенилбензальдегида (1,89 г, 77%) в виде темно-желтых кристаллов (при необходимости можно растирать в порошок с пентаном вместо рекристаллизации); т. пл. 100-101°С. Н ЯМР (400 МГц, CDCl) δ 10,99 (s, 1Н); 9,97 (s, 1H); 7,78-7,73 (m, 2H); 7,56-7,52 (m, 2H); 7,47-7,41 (m, 2H); 7,37-7,32 (m, 1H); 7,09-7,04 (m, 1H). С ЯМР (100 МГц, CDCl) δ 196,9, 161,2, 139,6, 136,0, 133,6, 132,1, 129,2, 127,6, 126,8, 121,0, 118,4. EIMS: m/z 198 [M]. HRMS, рассчитанное для CHO198,0675, обнаруженное 198,0677.
Синтез 3-формилбифенил-4-ил-трифторметансулъфоната (11)
1
13
19
+
3
3
CF
3
14
9
3
2
2-Гидрокси-5-фенилбензальдегид (100 мг, 0,50 ммоль), N-фенилтрифлимид (180,0 мг, 0,51 ммоль) и калия карбонат (209 мг, 1,51 ммоль) перемешивали в сухом THF в герметично закрытой пробирке и нагревали при 120°С в течение 6 минут с помощью микроволнового излучения. Растворитель удаляли при пониженном давлении; добавляли воду и дихлорметан и слои разделяли. Водный слой дополнительно экстрагировали дихлорметаном (2х). Объединенные органические экстракты промывали солевым раствором (1х), затем сушили и концентрировали. Очищали с помощью радиальной хроматографии, элюируя смесью 1:1 дихлорметан/пентан с получением 3-формилбифенил-4-ил-трифторметансульфоната (143 мг, 86%) в виде прозрачного бесцветного масла. Н ЯМР (200 МГц, CDCl) δ 10,32 (s, 1Н); 8,17 (d, 1Н, J=2,4 Гц); 7,89 (dd, 1H, J=8,6, 2,5 Гц); 7,63-7,36 (m, 6Н). С ЯМР (125 МГц, CDCl) δ 186,5, 149,1, 142,3, 138,0, 134,1, 129,2, 129,1, 128,8, 128,6, 127,2, 122,9, 118,7 (q, J=320,9 Гц). F ЯМР (188 МГц, CDCl) δ -73,2. EIMS: m/z 330 [М]. HRMS, рассчитанное для CHFOS, 330,0168, обнаруженное 330,0163.
Синтез 2'-[3-бензилокси-(1,1':4',1''-терфенил)]карбалъдегида (12)
1
13
+
3
3
26
20
2
3-Формилбифенил-4-ил-трифторметансульфонат (153 мг, 0,463 ммоль), 3-бензилоксифенилбороновую кислоту (116 мг, 0,51 ммоль), тетракис(трифенилфосфин)палладий(0) (13 мг, 2,5 моль %) и безводный калия фосфат (147 мг, 0,695 ммоль) помещали в колбу Шленка в атмосфере аргона. Добавляли дегазированный 1,4-диоксан (2 мл) и смесь продули аргоном. Реакционную смесь нагревали при 85°С до тех пор, пока не наблюдали полное превращение (управляемое с помощью GCMS); обычно требующее время реакции в течение всей ночи. Реакционную смесь разбавляли бензолом (4 мл) и обрабатывали 30% водным раствором перекиси водорода (10 мл). Продукт экстрагировали диэтиловым эфиром (3х); объединенные органические экстракты промывали насыщенным солевым раствором, затем сушили и концентрировали. Очищали с помощью радиальной хроматографии, элюируя смесью 1:1 дихлорметан/пентан с получением 2'-[3-бензилокси-(1,1':4',1''-терфенил)]карбальдегида (122 мг, 72%) в виде прозрачного бесцветного вязкого масла. Н ЯМР (400 МГц, CDCl) δ 10,02 (s, 1H); 8,24 (dd, 1H, J=2,1, 0,3 Гц); 7,86 (dd, 1H, J=8,0,2,1 Гц); 7,68-7,64 (m, 2Н); 7,56-7,30 (m, 10Н); 7,08-7,02 (m, 2Н); 7,01-6,97 (m, 1H); 5,11 (s, 2Н). С ЯМР (100 МГц, CDCl) δ 192,6, 159,0, 144,8, 141,0, 139,7, 139,1, 136,9, 134,2, 132,2, 131,4, 129,8, 129,2, 128,9, 128,4, 128,2, 127,8, 127,3, 126,1, 123,2, 116,9, 114,9, 70,4. EIMS: m/z 364 [М]. HRMS, рассчитанное для СНО 364,1458, обнаруженное 364,1450.
Синтез 2'-[3-бензилокси-(1,1':4',1''-терфенил)]акриламида (13)
1
13
+
6
6
28
23
2
2'-[3-Бензилокси-(1,1':4',1''-терфенил)]карбальдегид (201 мг, 0,552 ммоль) и диэтил(карбамоилметил)фосфонат (108 мг, 0,55 ммоль) растворяли в сухом THF (7 мл) и медленно добавляли к интенсивно перемешиваемой суспензии порошкообразного калия гидроксида (62 мг, 1,10 ммоль) в THF (2 мл). Реакционную смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение 1 часа в атмосфере аргона, контролируя с помощью TLC (1:1 дихлорметан/пентан). THF удаляли при пониженном давлении, а остаток растворяли в воде и экстрагировали с дихлорметаном (3x). Объединенные органические экстракты промывали солевым раствором (1х), затем сушили и концентрировали. В результате рекристаллизации из смеси этилацетат/пентан получали 2'-[3-бензилокси-(1,1':4',1''-терфенил)]акриламид (137 мг, 61%) в виде бледно-желтых кристаллов; т. пл. 175-176°С. Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d) δ 7,95 (d, 1H, J=2,0 Гц); 7,78-7,22 (m, 3Н); 7,55-7,31 (m, 12H); 7,17-7,07 (m, 2H); 6,99 (m, 1H); 6,92 (m, 1H); 6,79 (d, J=15,8 Гц, 1H); 5,16 (s, 2H). C ЯМР (125 МГц, DMSO-d) δ 166,5, 158,3, 140,8, 140,7, 139,8, 139,4, 137,5, 137,0, 133,2, 130,9, 129,5, 129,1, 128,5, 127,9, 127,8, 127,8, 127,6, 126,8, 124,5, 123,8, 122,2, 115,9, 114,0, 69,4. EIMS: m/z 405 [M]. HRMS, рассчитанное для CHNO, 405,1723, обнаруженное 405,1714.
Синтез 2'-[3-гидрокси-(1,1':4',1''-терфенил)]пропанамида (VB0004)
1
13
+
6
6
21
19
2
2'-[3-Бензилокси-(1,1':4',1''-терфенил)]акриламид (740 мг, 1,82 ммоль) и 10% катализатор из палладиевой черни (100 мг) перемешивали при температуре окружающей среды в течение 20 часов в атмосфере водорода. Катализатор удаляли фильтрацией через фильтровальную бумагу из стекловолокна с последующей фильтрацией через целит, затем концентрировали. Очищали с помощью радиальной хроматографии, элюируя смесью 1:1 дихлорметан/пентан, с последующей рекристаллизацией из смеси этилацетат/пентан с получением 2'-[3-гидрокси-(1,1':4',1''-терфенил)]пропанамида (224 мг, 39%) в виде бесцветных кристаллов; т. пл. 167,2-168,9°С. Н ЯМР (200 МГц, DMSO-d) δ 9,52 (s, 1Н); 7,77-7,15 (m, 10Н); 6,87-6,65 (m, 4H); 2,84 (m, 2H); 2,31 (m, 2H). C ЯМР (50 МГц, DMSO-d) δ 173,4, 157,1, 142,1, 140,6, 140,0, 139,1, 139,1, 130,2, 129,2, 128,9, 127,4, 127,2, 126,6, 124,1, 119,6, 115,8, 114,0, 36,2, 28,2. EIMS: m/z 317 [М]. HRMS, рассчитанное для CHNO, 317,1410, обнаруженное 317,1411.
Синтез диэтилкарбамоилметилфосфоната (F)
1
3
13
2
2
1
3
31
+
6
PH
PH
6
CP
СР
СР
CP
6
6
14
4
2-Хлорацетамид (5,01 г, 53,6 ммоль) и триэтилфосфит (9,19 мл, 53,6 ммоль) нагревали с обратным холодильником в о-ксилоле (14 мл) в течение 3,5 часов. Растворитель удалили при пониженном давлении с получением темно-коричневого дегтеобразного остатка. Остаток растворяли в дихлорметане и фильтровали через короткую колонку с силикагелем. Фильтрат концентрировали и твердый продукт рекристаллизовывали из смеси этилацетат/пентан с получением диэтилкарбамоилметилфосфоната (3,42 г, 33%) в виде светло-коричневых кристаллов. Н ЯМР (200 МГц, DMSO-d) δ 7,35 (br s, 1H); 7,02 (br s, 1Н); 4,02 (dq, 4Н, J=7,1 Гц, J=1,1 Гц); 2,80 (d, 2Н, 2J=21,4 Гц); 1,23 (t, 6Н, J=1,0 Гц). С ЯМР (50 МГц, DMSO-d) δ 166,0 (d, J=5,1 Гц); 61,5 (d, J=6,0 Гц); 34,5 (d, J=131,6 Гц); 16,2 (d, J=6,0 Гц). P ЯМР (81 МГц, DMSO-d) 23,8. ESIMS: m/z 218 [M+Na]. HRMS, рассчитанное для CHNOP, 195,0655, обнаруженное 195,0653.
Пример 2 - in vitro скрининг
Систему xCELLigence SP (Roche) использовали для измерения изменений клеточного импеданса (клеточного индекса) после обработки эмбриональных гладкомышечных клеток сосудов А10 (АТСС, CRL-1476) при помощи VB0004. Этот in vitro анализ согласовывали с данными артериального давления, полученными на животной модели, описанной ниже в примере 3, так чтобы его можно было использовать для более быстрого скрининга большего количества соединений. В этой клеточной экспериментальной системе in vitro отрицательный профиль импеданса коррелирует со снижением артериального давления у крыс - снижение импеданса связано с вазодилатацией и увеличение импеданса связано с вазоконстрикцией (Stallaert W., Dorn J.F., van der Westhuizen E., Audet M. & Bouvier M. Impedance responses reveal P-adrenergic signaling pluridensitometry and allow classification of ligands with distinct signalling profiles, PLoS ONE 2012; 7 (1): e29420, doi: 10.1371/journal.pone.0029420).
2
Коротко, 50 мкл среды для культивирования клеток (DMEM с низким уровнем глюкозы с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки при 37°С) добавляли в каждую лунку E-Plate 96 (Roche) и измеряли фоновый импеданс в каждой лунке. Затем 50 мкл суспензии клеток А-10 (10000 клеток/лунка) добавляли в соответствующие лунки E-Plate 96. Клеточный индекс контролировали для каждой лунки E-Plate 96 в RTCA SP Station внутри инкубатора для клеточных культур. После инкубирования в течение ночи на протяжении 16-20 часов при 5% СO и влажности 95%) 100 мкл раствора VB 0004 (VB 0004 готовили в DMSO и разбавляли средой для культивирования клеток до конечной концентрации DMSO 0,25%) добавляли в соответствующие лунки E-Plate 96 и значения клеточного индекса измеряли сразу же после обработки соединением через каждые 20 секунд в течение 3 часов. Значение клеточного индекса корректировали относительно исходного уровня путем вычитания клеточного индекса обработанных носителем клеток и осуществляли нормализацию путем деления на клеточный индекс в момент времени непосредственно перед добавлением соединения. Нормализованный относительно исходного значения клеточный индекс в зависимости от времени наносили на график с помощью программного обеспечения Roche RTCA.
Соединения могут достигать снижения значений артериального давления при взаимодействии с гладкомышечными клетками сосудов, вызывая расслабление этих клеток, что приводит к вазодилатации и снижению артериального давления. Они называются прямыми вазодилататорами. Ответ с отрицательным импедансом, наблюдаемый для гладкомышечных клеток сосудов А10, обработанных при помощи VB0004 в концентрациях 62,5, 125 и 250 мкМ (Фигура 3), демонстрирует, что VB0004 является прямым вазодилататором. Эти результаты хорошо коррелируют со средним значением систолического артериального давления у SHR на 2,2% солевом рационе через 4 недели пероральной обработки с 10, 100 и 500 пмоль/кг/мин VB0004 (см. Фигуру 4 и ниже).
Систему xCELLigence SP (Roche) также использовали для измерения изменений клеточного импеданса (клеточного индекса) после обработки эндотелиальных клеток бычьей аорты (Европейская коллекция клеточных культур) тестируемым соединением. Используемый способ является тем же, что и для эмбриональных гладкомышечных клеток сосудов А10, описанных выше, но со средой для культивирования клеток, дополненной 15% фетальной бычьей сывороткой вместо 10%.
Соединения могут взаимодействовать с эндотелиальными клетками сосудов, вызывая высвобождение веществ, таких как оксид азота и эндотелиальный фактор гиперполяризации, которые, в свою очередь, действуют на гладкомышечные клетки сосудов, вызывая вазодилатацию и снижение артериального давления. Такие соединения называются непрямыми вазодилататорами. Ответ с отрицательным импедансом, наблюдаемый для эндотелиальных клеток бычьей аорты, обработанных при помощи VB0004 в концентрациях 62,5, 125 и 250 мкМ (Фигура 5), демонстрирует, что VB0004 также является непрямым вазодилататором.
Пример 3 - in vivo скрининг
Пероральные исследования
Четырнадцатинедельных SHR (на 2,2% солевом рационе; Glen Forrest Stockfeeders) случайным образом распределяли в группы контроля в начальный момент времени и обработки при помощи VB0004 (10, 100, 500, 1000 и 2500 пмоль/кг/мин) в питьевом растворе или в контрольном питьевым растворе (5% этанол в деионизированной дистиллированной воде (n=5 в каждой группе). Крыс, распределенных в контрольную группу начального момента времени, анестезировали и собирали их сердца и почки, в то время как крыс, распределенных для обработки контролем и VB0004, взвешивали дважды в неделю и контролировали их потребление питьевого раствора, чтобы обеспечить регулирование концентрации VB0004 в питьевом растворе для поддержания постоянной дозы на протяжении 4-, 6- или 8-недельных периодов исследования. Значение артериального давления измеряли дважды в неделю с помощью плетизмографии с помощью хвостовой манжеты (PowerLab, ADInstruments, Касл Хилл, Новый Южный Уэльс, Австралия). Через 4, 6 или 8 недель крыс анестезировали и собирали их сердца и почки для количественной оценки фиброза.
Внутривенное введение
Четырнадцатинедельных SHR (на 2,2% солевом рационе; Glen Forrest Stockfeeders) случайным образом распределяли в группы контроля в начальный момент времени, инфузии VB0004 (10 и 20 пмоль/кг/мин) или инфузии несущей среды (20% DMSO в нормальном физиологическом растворе, Baxter Healthcare, Сидней, Новый Южный Уэльс, Австралия) (n=5 в каждой группе). Крыс анестезировали и у крыс, распределенных в контрольную группу начального момента времени, собирали сердца и почки, в то время как крысам, распределенным для инфузии VB0004 или несущей среды, вставляли в подвздошную вену канюлю, которая была соединена с осмотической минипомпой Alzet (Durect Corporation, Купертино, Калифорния, США), содержащей VB0004 или носитель. Значение артериального давления измеряли дважды в неделю с помощью плетизмографии с помощью хвостовой манжеты (PowerLab, ADInstruments, Касл Хилл, Новый Южный Уэльс, Австралия). Через 4 недели крыс снова анестезировали и собрали их сердца и почки для количественной оценки фиброза.
Количественная оценка фиброза
Для количественной оценки фиброза тканевые срезы толщиной ≤3 мм фиксировали в 10% забуференном формалине в течение 24 часов, обрабатывали и заливали в парафин. Поперечные срезы толщиной три микрометра окрашивали с использованием трихромного окрашивания по Массону. Минимум 20 случайных полей при х20 увеличении с поперечных срезов (5 на каждом из 2 уровней) оцифровывали и определяли степень фиброза как процент от площади поля каждого оцифрованного изображения с использованием Image-Pro Plus V.5 (Media Cybernetics, Бетезда, Мэриленд, США), затем усредняли для определения уровня фиброза ткани для каждой крысы.
Результаты
Среднее значение систолического артериального давления у SHR на 2,2% солевом рационе через 4 недели пероральной обработки с 10, 100 и 500 пмоль/кг/мин VB0004 показывало сниженное значение артериального давления по сравнению с контролем (Фигура 4).
Внутривенное введение VB0004 при 10 и 20 пмоль/кг/мин в течение 4 недель снижало SBP на 20 мм рт.ст. по сравнению с контролем носителя (Фигура 6).
Среднее значение систолического артериального давления у SHR на 2,2% солевом рационе, обработанных при помощи VB0004 от 10 до 2500 пмоль/кг/мин, вводимых перорально в течение 4 недель, показывало снижение значения артериального давления с увеличением дозы по сравнению с контролем (Фигура 7). Поскольку значение артериального давления продолжает снижаться с увеличением дозы без достижения плато, максимальная доза до сих пор не была установлена.
Среднее значение систолического артериального давления у SHR на 2,2% солевом рационе, обработанных при помощи VB0004 при 2500 пмоль/кг/мин, вводимых перорально, продолжало снижаться со временем, указывая, что максимальный эффект для данной дозы еще не был достигнут после 8 недель терапии (Фигура 8).
Фиброз в сердце после 4 недель пероральной обработки при помощи VB0004 у 18-недельных SHR на 2,2% солевом рационе в дозах от 10 до 500 пмоль/кг/мин (заштрихованные столбики) снижался по сравнению с фиброзом у 14- и 18-недельных контрольных (не заштрихованные столбики) SHR на 2,2% солевом рационе (Фигура 9).
Фиброз в почке после 4 недель пероральной обработки при помощи VB0004 у 18-недельных SHR на 2,2% солевом рационе в дозах от 10 до 500 пмоль/кг/мин (заштрихованные столбики) снижался по сравнению с фиброзом у 14- и 18-недельных контрольных (незаштрихованные столбики) SHR на 2,2% солевом рационе (Фигура 10).
Сердца из контрольных животных (18-недельные SHR на 2,2% солевом рационе) показывали обширный фиброз ткани (появляется серый цвет при трихромном окрашивании по Массону), в то время как в сердцах животных, обработанных VB0004, практически не присутствовала фиброзная ткань (Фигура 11).
Почки контрольных животных (18-недельные SHR на 2,2% солевом рационе) показывали обширный фиброз ткани (появляется серый цвет при трихромном окрашивании по Массону), в то время как в почках животных, обработанных VB0004, практически не присутствовала фиброзная ткань (Фигура 12).