Способ повышения эффективности действия ионизирующих излучений на меланому
METHOD FOR INCREASING THE EFFECTIVENESS OF IONIZING RADIATION ON MELANOMA

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии и радиологии, и может быть использовано для повышения эффективности лучевой терапии меланомы.
В индустриально развитых странах более 50% онкологических больных получают лучевую терапию в виде основного, адъювантного, неоадъювантного и паллиативного лечения. Со временем роль ионизирующих излучений в лечении злокачественных новообразований (ЗНО) не только не уменьшается, но даже возрастает, что, с одной стороны, связано с постоянным совершенствованием существующих и внедрением новых методов лучевого лечения (адронная, бинарная, тканевая, фотодинамическая терапия и др.), а, с другой стороны, обусловлено органосохраняющей направленностью лучевого воздействия на пораженный орган, позволяющей достичь выздоровления на фоне хорошей социальной и семейной реабилитации. Вместе с тем следует признать, что у части больных не удается добиться удовлетворительного клинического эффекта из-за высокой радиорезистентности ЗНО.
Как известно, меланома кожи является одной из самых агрессивных опухолей и характеризуется ранним метастазированием. Основным методом лечения меланомы  является хирургический, по показаниям дополняющийся системной терапией.
Однако в случаях невозможности хирургического иссечения первичной опухоли локальная лучевая терапия является рекомендованным методом лечения первичной меланомы кожи (Клинические рекомендации Министерства здравоохранения Российской Федерации «Меланома кожи и слизистых оболочек», Версия 1.2019;  Строяковский Д.Л., Абрамов М.Е., Демидов Л.В., Новик А.В., Орлова К.В., Проценко С.А, Самойленко И.В., Трофимова О.П., Харкевич Г.Ю., Юрченков А.Н. Практические рекомендации  по лекарственному лечению меланомы кожи // Злокачественные опухоли. 2019. Том 9.  № 3s2. С. 243-258). Кроме того, в исследованиях последних лет продемонстрирована целесообразность проведения лучевой терапии после радикальной лимфаденэктомии в адъювантном режиме (с использованием противоопухолевых препаратов) при высоком риске регионарного рецидива. Поэтому совершенствование лучевой терапии меланомы (как и других ЗНО) является актуальной проблемой радиационной онкологии. Ряд специалистов в этой области полагает, что в целом, современные методики радиотерапии вплотную приблизились к потолку возможностей компьютерного и технологического обеспечения. Перспективы дальнейшего повышения эффективности лучевой терапии могут быть связаны, прежде всего, с разработкой новых радимодификаторов, сенсибилизирующих опухолевые клетки или защищающих нормальные от радиационных повреждений.
В последние десятилетия разработано множество способов повышения радиочувствительности опухолевых клеток и тканей с помощью малых молекул, макромолекул и наночастиц, реализующих эффекты радиосенсибилизации на основе различных механизмов действия и обладающих своими достоинствами и недостатками, которые делают необходимым поиск новых способов радиосенсибилизации (Wang H., Mu X., He H., Zhang X.-D. Cancer Radiosensitizers // Trends Pharmacol. Sci., 2018, Vol. 39. № 1. P. 24-48).
Среди известных радиосенсибилизаторов заметное место занимают галогенированные аналоги пиримидиновых оснований и нуклеозидов, например, 5-фторурацил, 5-фтордезоксиуридин, бромдезоксиуридин, иоддезоксиуридин, 2’2-дифтордезоксицитидин (гемцитабин) и др. Такие химические соединения или их метаболиты нарушают репликацию ДНК или встраиваются в новосинтезированную ДНК, что при последующем облучении приводит к подавлению репарации повреждений этой молекулы. В итоге, в клетках сохраняется больше радиационно-индуцированных повреждений ДНК, чем в отсутствие таких соединений, а клеточная гибель повышается. Со временем после комбинированного действия таких соединений и ионизирующего излучения количество повреждений ДНК постепенно снижается, хотя и в меньшей степени, чем после одиночного облучения.
Снижение количества повреждений ДНК после комбинированного действия вышеупомянутых радиосенсибилизаторов и ионизирующего излучения является недостатком этих способов радиосенсибилизации, что, по-видимому, в конечном итоге определяет их относительно невысокую эффективность и приводит к необходимости применения и других противоопухолевых препаратов в комплексе с радиосенсибилизаторами и облучением (Hennequin C., Guillerm S., Quero L. Combination of chemotherapy and radiotherapy: A thirty years evolution // Cancer/Radiothérapie, 2019. Vol. 23. № 6-7. P. 662-665;  Suker M., Beumer B.R., Sadot E., Marthey L., Faris J.E., Mellon E.A., El-Rayes B.F., Wang-Gillam A., Lacy J., Hosein P.J., Moorcraft S.Y., Conroy T., Hohla F., Allen P., Taieb J., Hong T.S., Shridhar R., Chau I., van Eijck C.H., Koerkamp B.G. FOLFIRINOX for locally advanced pancreatic cancer: a systematic review and patient-level meta-analysis // Lancet Oncol., 2016, Vol. 17. № 6. P. 801-810. Clifford R., Govindarajah N., Parsons J.L., Gollins S., West N.P., Vimalachandran D. Systematic review of treatment intensification using novel agents for chemoradiotherapy in rectal cancer // Br. J. Surg., 2018. Vol. 105. № 12. P. 1553-1572).
Этот подход позволяет повысить эффективность лечения ЗНО, но увеличивает его токсичность в отношении нормальных тканей и стоимость. Поэтому поиск новых эффективных способов радиосенсибилизации ЗНО с целью повышения эффективности лучевой терапии не теряет своей актуальности до сих пор.
Известно, что наиболее тяжелыми нарушениями, приводящими к клеточной гибели под влиянием ионизирующих излучений, являются двунитевые разрывы (ДР) ДНК. Поэтому повышение количества радиационно-индуцированных ДР является привлекательным подходом к радиосенсибилизации ЗНО и, в конечном итоге, к повышению эффективности лучевой терапии.
Прототипом настоящего изобретения является способ повышения частоты образования ДР ДНК в клетках человека при применении перед облучением комбинации из официнальных препаратов 1-β-D-арабинофуранозилцитозина (АраЦ) и гидроксимочевины (RU 2699670 С1). АраЦ (химическое название 4-Амино-1-бета-В-арабинофуранозил-2(1Н)-пиримидинон) является синтетическим нуклеозидом, содержащим арабинозу в углеводной части молекулы. АраЦ (торговые названия цитозар, алексан, цитарабин, цитостадин, цитарабин-ЛЭНС, цитастадин, цитозар НоваМедика) используется в клинике при лечении острых и хронических лейкозов. В присутствии АраЦ и гидроксимочевины происходит ингибирование репарации радиационных повреждений ДНК и, более того, осуществляется трансформация однонитевых разрывов ДНК в двунитевые разрывы в условиях in vitro. Важно, что количество ДР ДНК не только не уменьшается, но даже увеличивается со временем после указанного комбинированного воздействия. Изобретение позволяет повысить эффективность радиационного воздействия на опухолевые клетки по критерию количества ДР ДНК in vitro и уменьшить локальную дозу облучения.
Недостатком этого способа является отсутствие информации о кинетике формирования и элиминации ДР ДНК в клетках ЗНО после комбинированного воздействия in vivo, а также отсутствие данных об влиянии такого воздействия на размер опухолевого очага. Вместе с тем, радиационный ответ опухолевых клеток в условиях влияния радиомодификаторов in vitro и in vivo может существенно различаться, учитывая влияние в последнем случае многочисленных факторов микроокружения: физических (давление кислорода), химических (pH тканевой среды), гуморальных (сигнальные молекулы TGF-b1, FGF, IL-6, HIF и др.), клеточных (взаимодействие со стромальными клетками, включая эндотелиальные, иммунные клетки, опухоль-ассоциированные макрофаги, фибробласты, нормальные стволовые клетки и др.).
Технический результат заявляемого изобретения заключается в повышении эффективности действия ионизирующих излучений на меланому за счет увеличения количества ДР ДНК.
Технический результат достигается тем, что так же как и в известном способе клетки подвергают воздействию АраЦ, а затем облучают пучком протонов или γ-квантов.
Особенность заявляемого способа заключается в том, что  АраЦ вводят in vivo внутривенно из расчета 125 мг/кг за 1 час до локального облучения меланомы в дозе 10 Гр.
Изобретение иллюстрируется подробным описанием, примерами и иллюстрациями, на которых изображено:
Фиг. 1. Двунитевые разрывы ДНК в клетках меланомы линии В16 через 2 суток после локального облучения опухолевого очага пучком протонов в дозе 10 Гр или комбинированного воздействия АраЦ и протонного излучения в той же дозе.  По оси ординат:  средние значения момента хвоста ± SD.
# p<0,001 по сравнению с группой «Контроль»
* p<0,001 по сравнению с группой «Облучение (протоны)»
Фиг. 2. Двунитевые разрывы ДНК в клетках меланомы линии В16 через 9 суток после локального облучения опухолевого очага пучком протонов в дозе 10 Гр или комбинированного воздействия АраЦ и протонного излучения в той же дозе. По оси ординат:  средние значения момента хвоста ± SD.
# p<0,001 по сравнению с группой «Контроль»
* p<0,001 по сравнению с группой «Облучение (протоны)»
Фиг. 3. Изменение размеров первичного очага меланомы линии В16 в группе контрольных животных и в разные сроки после облучения протонами или комбинированного действия АраЦ и протонного излучения в дозе 10 Гр.
Фиг. 4. Изменение размеров первичного очага меланомы В16 в разные сроки после облучения протонами или комбинированного действия АраЦ и протонного излучения в дозе 10 Гр.
* p<0,05 по сравнению с группой «Облучение (протоны)»
Фиг. 5. Торможение роста опухолей в группе комбинированного действия АраЦ и протонного излучения в разные сроки после облучения по сравнению с одиночным действием протонного излучения в дозе 10 Гр.
Фиг. 6. Изменение размеров первичного очага меланомы линии В16 в группе контрольных животных и в разные сроки после γ-облучения или комбинированного действия АраЦ и γ-излучения в дозе 10 Гр.
Фиг. 7. Изменение размеров первичного очага меланомы В16 в разные сроки после γ-облучения или комбинированного действия АраЦ и γ-излучения в дозе 10 Гр.
* p<0,05 по сравнению с группой «Облучение (γ-кванты)»
Фиг. 8. Торможение роста опухолей в группе комбинированного действия АраЦ и γ-излучения в разные сроки после облучения по сравнению с одиночным действием γ-излучения в дозе 10 Гр.
Способ осуществляют следующим образом.
2
2
Клетки мышиной меланомы линии В16, полученные из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург), культивируют в полной питательной среде DMEM (ПанЭко, РФ), содержащей 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (СКРС) (Gibco, США), пенициллин (50 ед/мл), стрептомицин (50 мкг/мл) и глютамин (292 мкг/мл), в CO инкубаторе (NuAire, США) в увлажненной атмосфере с 5% содержанием CO при температуре +37°С. Для трансплантации используют опухолевые клетки в логарифмической стадии роста.
6
Клетки снимают с подложки в среду DMEM в концентрации 2,0⋅10кл/мл, затем вводят внутримышечно по 200 тыс. клеток в заднюю правую лапу мышей линии С57Bl/6j в возрасте 1,5-2,0 мес с массой тела 20 г (Питомник лабораторных животных «Андреевка» - филиал Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Научный центр биомедицинских технологий» Федерального медико-биологического агентства России). Через 9 суток после трансплантации опухолевых клеток начинают проводить визуальный контроль первичного очага меланомы. Формируют группы животных с одинаковым средним размером опухолевого очага: 1) контроль (интактные животные-опухоленосители); 2) облучение (протоны или γ-кванты); 3) АраЦ+Облучение.
Введение АраЦ и облучение производят на 12 сутки после введения опухолевых клеток, когда опухоли визуализируются макроскопически. За 1 час перед облучением выполняют введение АраЦ (2,5 мг/мышь; 125 мг/кг) в хвостовую вену мышей.
Выполняют локальное облучение опухолевого очага в дозе 10 Гр:
1) пучком протонов в модифицированном пике Брэгга (комплекс протонной терапии «Прометеус», МРНЦ им. А.Ф. Цыба - филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России). Диапазон энергий в модифицированном пике - от 33 до 56 МэВ, размер модифицированного пика - 20 мм. Длительность синхротронного импульса - 250 мс, пауза между импульсами - 1,3 с;
60
14
2) или пучком γ-квантов от источника Co со средней энергией излучения 1,25 МэВ и начальной активностью 1,48⋅10 Бк («Луч-1», Россия).
Далее оценивают эффекты комбинированного действия АраЦ и ионизирующих излучений (протонов или γ-квантов) в сравнении с соответствующим одиночным радиационным воздействием и контролем. При этом используют критерии:
5
А) Количество ДР ДНК в клетках опухолей через 2 и 9 суток после комбинированного воздействия и одиночного облучения, а также в клетках контрольных опухолей в тех же временных точках. В указанные сроки забирают аутопсийный материал опухолевой ткани, который подвергают ферментативной дезагрегации в среде DMEM (Панэко, Россия), содержащей коллагеназу (1 мг/мл, Sigma, США) и ДНКазу (0.02%, Sigma, США), в течение 1 часа при +37°С и постоянном перемешивании. Полученную суспензию клеток фильтруют через нейлоновый фильтр с диаметром пор 40 мкм и определяют концентрацию ядросодержащих клеток с помощью камеры Горяева, после чего отбирают аликвоты по 2,5⋅10 клеток для последующего исследования ДР ДНК.
Для оценки степени поврежденности ДНК и изучения процесса репарации используют нейтральную версию метода ДНК-комет, позволяющую оценивать степень поврежденности ДНК и изучать процесс репарации ДНК на уровне одиночных клеток. В основе метода лежит проведение гель-электрофореза единичных лизированных клеток. При этом под воздействием электрического поля молекулы ДНК выпетливаются в порах геля, а поврежденную ДНК визуализируют посредством окрашивания флуоресцентным красителем, после чего образцы изучают микроскопически. При наличии разрывов ДНК нарушается структурная организация хроматина и утрачивается сверхспирализация ДНК, что приводит к ее релаксации, формируются фрагменты ДНК. В электрическом поле релаксированные петли и фрагменты ДНК вытягиваются по направлению к аноду, формируя электрофоретический след, визуально напоминающий хвост кометы. С использованием компьютерных программных средств обработки изображений рассчитывают момент хвоста - произведение длины хвоста на процентное содержание ДНК в хвосте.
Б) Ингибирование роста опухолей в течение 3-32 суток после комбинированного воздействия и одиночного облучения. Выполняют измерение размеров опухолевого очага с помощью штангенциркуля в двух взаимно перпендикулярных направлениях каждые 2-3 дня, начиная с момента облучения. Измерение размеров опухолевого очага заканчивают в момент начала гибели животных в каждой группе. Для каждой опухоли вычисляют средний диаметр и объем по формуле:
3
V=⅙ π D, где V - объём опухолевого очага, D - средний диаметр опухоли.
Данные объема используют для расчета процента торможения роста опухоли под влиянием комбинированного воздействия по сравнению с одиночным облучением (ТРО, %) по формуле:
Облучение
АраЦ+Облучение
Облучение
ТРО, % = (V- V) / V × 100.
Примеры повышения эффективности действия ионизирующих излучений на меланому.
Пример 1. Повышение количества ДР ДНК в клетках меланомы через 2 и 9 суток после комбинированного действия АраЦ и протонного излучения
Установлено статистически значимое превышение количества ДР ДНК, которое оценивалось по значению момента хвоста, в клетках меланомы B16 в пострадиационный период при действии протонного излучения и его комбинированного применения с АраЦ по сравнению с контролем как на 2-е, так и на 9-е сутки (р<0,001) (Фиг. 1 и 2). На 2 сутки количество повреждений при комбинированном применении протонного излучения и АраЦ (группа «АраЦ+Облучение (протоны)») статистически значимо (р<0,001) ~ в 3 раза превышает количество ДР ДНК, оставшихся после облучения протонами без введения АраЦ (группа «Облучение (протоны)») (Фиг. 1). На 9 сутки (Фиг. 2) количество ДР ДНК в клетках меланомы при комбинированном применении протонного излучения и АраЦ (группа «АраЦ+Облучение (протоны)») также статистически значимо (р<0,001) превышает количество ДР ДНК, оставшихся после облучения протонами без введения АраЦ (группа «Облучение (протоны)»). И хотя количество повреждений после комбинированного воздействия протонного излучения и АраЦ превышает количество ДР ДНК после воздействия только протонов, это соотношение снижается до ~ 1,5 раз (Фиг. 2).
Пример 2. Уменьшение объема первичного очага меланомы после комбинированного действия АраЦ и протонного излучения по сравнению с контролем и одиночным облучением пучком протонов
Установлено статистически значимое подавление роста меланомы линии В16 под влиянием протонного излучения или его комбинированного применения с АраЦ по сравнению с контролем, начиная с 9 суток после облучения (р<0,05) (Фиг.3). Различия в среднем объеме опухолей в группах «Облучение (протоны)» и «АраЦ+Облучение (протоны)» достигали статистической значимости (р<0,05), начиная с 18 суток после облучения, и продолжались до конца периода наблюдения (Фиг. 4). В эти сроки различия между указанными группами варьировали от 1,7 до 2,0 раз; соответственно, торможение роста опухолей в группе «АраЦ+Облучение (протоны)» по сравнению с группой «Облучение (протоны)» достигало 37-51% (Фиг. 5).
Пример 3. Уменьшение объема первичного очага меланомы после комбинированного действия АраЦ и γ-излучения по сравнению с контролем и одиночным γ-облучением
Установлено статистически значимое подавление роста меланомы линии В16 под влиянием γ-излучения или его комбинированного применения с АраЦ по сравнению с контролем, начиная с 9 суток после облучения (p<0,05) (Фиг. 6). При этом наиболее значительное подавление роста опухолей обнаружено при комбинированном действии γ-излучения на фоне АраЦ. Различия в среднем объеме опухолей в группах «Облучение (γ-кванты)» и «АраЦ+Облучение (γ-кванты)» достигали статистической значимости, начиная с 12 суток после облучения, и продолжались до конца периода наблюдения (Фиг.7). В эти сроки различия между указанными группами варьировали от 1,2 до 1,3 раз; соответственно, торможение роста опухолей в группе «АраЦ+Облучение (γ-кванты)» по сравнению с группой «Облучение (γ-кванты)» составляло 12-22% (Фиг.8).
Пример № 1 показывает, что при внутривенном введении АраЦ за 1 час до облучения меланомы пучком протонов происходит значительное пострадиационное повышение количества ДР ДНК, которые являются смертельно опасными для клеток. Важно, что повышенное количество ДР (по сравнению с таковым при действии протонного излучения) сохраняется в течение длительного времени после комбинированного воздействия, тем самым увеличивая его эффективность.
Примеры № 2 и № 3 доказывают, что новый способ, заключающийся во внутривенном введении АраЦ за 1 час до радиационного воздействия (пучком протонов или γ-квантов) на меланому, тормозит рост опухолей по сравнению как с интактным контролем, так и с одиночным радиационным воздействием.
Изобретение позволяет повысить эффективность действия ионизирующих излучений на радиорезистентное ЗНО - меланому - и является основой для совершенствования лучевой терапии онкологических больных.