Одноцепочечный ДНК-фрагмент гена 28S рибосомальной РНК и способ его применения для борьбы с Coccus hesperidum
SINGLE-STRANDED DNA FRAGMENT OF THE 28 S RIBOSOMAL RNA GENE AND A METHOD FOR ITS APPLICATION TO COMBAT COCCUS HESPERIDUM

Изобретение относится к области защиты растений в части борьбы с мягкой ложнощитовкой Coccus hesperidum L. из надсемейства кокцидовых (Coccoidea) отряда полужесткокрылых (Hemiptera), которая является вредителем растений. Ложнощитовка Coccus hesperidum L. питается растительными соками растений, что вызывает искривление стеблей, деформацию, засыхание и опадение листьев и в дальнейшем гибель растений, особенно молодых. Мягкая ложнощитовка выделяет на листья и стебли, которыми она питается, липкое, сладкое вещество, называемое медвяной росой. На медвяной росе поселяется сажистый грибок, который еще сильнее ослабляет растение. Примерами растений, которые могут повреждаться Coccus hesperidum являются папоротник, питтоспорум, аукуба, цитрусовые, самшит, бересклет, мирт, каллистемон, аралия, плющ, олеандр и другие, оранжерейные и субтропические растения.
Химический контроль играет важную роль в борьбе с мягкой ложнощитовкой Coccus hesperidum. Однако неизбирательное действие химических инсектицидов негативно влияет на регуляцию численности естественных врагов данного вида и других нецелевых организмов. Поэтому применение химических инсектицидов может быть оправдано только в случае, когда естественных врагов для защиты растений недостаточно.
На сегодняшний день на стадии разработки для борьбы с насекомыми-вредителями находятся препараты на основе ДНК-фрагментов, которые способны объединить наилучшие характеристики современных препаратов -доступность и высокую эффективность. Это связано с тем, что синтез ДНК становится все более недорогим, а комбинация азотистых оснований в каждом отдельном ДНК-фрагменте (ДНК-инсектициде) уникальна. Кроме этого, ДНК является полимером природного происхождения и не будет накапливаться в окружающей среде.
Известен способ борьбы с акациевой ложнощитовкой Parthenolecanium corni Bouche (Hemiptera: Coccoidea) при помощи химического инсектицида «АКТАРА» из класса неоникотиноидов (Калиновский И.Н. Эффективность инсектицидов в борьбе с акациевой ложнощитовкой на винограде в условиях Оренбургской области / И.Н. Калиновский, В.А. Симоненкова // Известия ОГАУ. - 2013. - №5 (43). - С. 20-23.), в котором используется действующее вещество тиаметоксам, быстро всасываемое растениями и транспортируемое во все его части, включая пыльцу. Инсектицид попадает в насекомое в момент кормления или при непосредственном контакте, в том числе через трахейную систему. Тиаметоксам мешает передаче импульса между нервными клетками, связываясь с никотиновыми рецепторами ацетилхолина в нервной системе и, в конечном итоге, парализует мышцы насекомых.
Недостатком этого метода является то, что тиаметоксам не обладает избирательностью в действии, накапливается в почве и в тканях растений, представляет собой неприемлемо высокий риск для пчел, в том числе проникает в насекомых через пыльцу и нектар; субнанограммы этого вещества приводят к невозможности вернуться в улей, что является причиной гибели насекомого и, в том числе, основным симптомом коллапса пчелиных колоний. Тиаметоксам обладает длительным периодом полураспада в сельскохозяйственных ирригационных каналах и почве.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ борьбы с гусеницами непарного шелкопряда (Lymantria dispar) (Патент РФ №2691614, МПК: A01N 63/00, СПК: A01N 63/00) (прототип), в котором используют инсектицид на основе нуклеиновой кислоты, избирательно действующий на личинки насекомых определенного вида с использованием короткого (11 нуклеотидов) одноцепочечного антисмыслового фрагмента ДНК гена 5,8S рибосомальной РНК непарного шелкопряда с последовательностью 5'-TGCGTTGAAA-3' в концентрации 200 пмоль/мкл таким образом, чтобы на гусеницу I-II возраста попало не менее 0,3 мкл раствора. Изобретение позволяет повысить смертность гусениц непарного шелкопряда (Lymantria dispar L.).
Способ, выбранный в качестве прототипа, не предназначен для борьбы с мягкой ложнощитовкой Coccus hesperidum, так как применяемый антисмысловой фрагмент может быть эффективен лишь под определенного целевого насекомого-вредителя - непарного шелкопряда.
Технической задачей предлагаемого изобретения является повышение смертности насекомых в результате применения одноцепочечного ДНК-фрагмента.
2
Разработанный способ борьбы с насекомым-вредителем мягкой ложнощитовкой Coccus hesperidum из надсемейства Coccoidea включает использование на поверхности листьев растения-хозяина не менее 1 мг ДНК на 1 м листвы инсектицида на основе водного раствора одноцепочечного ДНК-фрагмента гена 28S рибосомальной РНК целевого насекомого-вредителя в концентрации 100 нг/мкл.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1.
Эксперимент проводят на мягкой ложнощитовке Coccus hesperidum, находящихся на листьях питтоспорума при средней температуре 25-27°С. Применяемый одноцепочечный ДНК-фрагмент из гена 28S рибосомальной РНК Coccus hesperidum имеет следующую последовательность (oligoCH-56):
Насекомые контрольной группы, которые находятся на поверхности листьев, обрабатывают водой и тиаметоксамом (препарат «АКТ АР А»).
В ходе эксперимента на растение-хозяин попало не менее 1 мг ДНК на 1 квадратный метр листвы, концентрация ДНК, растворенная в воде, составляла 100 нг/мкл. Фрагмент был синтезирован на лабораторном ДНК-синтезаторе (БИОССЕТ, Россия). Был использован χ2-критерий Пирсона с поправкой Йетса для оценивания инсектицидного действия ДНК-фрагмента. Эксперимент провели в пятикратной повторности.
Одноцепочечный ДНК-фрагмент гена 28S рибосомальной РНК Coccus hesperidum оказал достоверное инсектицидное действие.
2
2
2
В группе, обработанной водой, тиаметоксамом и oligoCH-56, мы наблюдали смертность насекомых Coccus hesperidum на растении Pittosporum tobira (Thunberg) W. Т. Aiton 4,33%, 35,67%, 31%; 6%, 88,33%, 40%. и 9,67%, 90,67%, 46% соответственно, на 3-е, 7-е и 10-е сутки после обработки (oligoCH-56 против контроля на 3-е, 7-е и 10-е сутки после обработки соответственно: χ=23,411, р<0,001, N=200, df=1; χ=30,745, р<0,001, N=200, df=1; χ=30,382, р<0,001, N=200, df=1 (Таблица 1).
Таким образом, oligoCH-56 на основе природного одноцепочечного фрагмента ДНК оказывает достоверное инсектицидное действие на Coccus hesperidum, обладает избирательностью в действии и не накапливается в окружающей среде.