НОВЫЕ ФУКОЗИЛТРАНСФЕРАЗЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
NEW FUCOSYLTRANSFERASES AND THEIR APPLICATION

Представленное изобретение касается новых фукозилтрансфераз и их применения.
Многие (глико)протеины, (глико)липиды или олигосахариды нуждаются в присутствии специфических фукозилированных структур для того, чтобы проявлять специфическую биологическую активность. Например, многие механизмы межклеточного распознавания нуждаются в фукозилированном олигосахариде, например, для того, чтобы связываться посредством молекулярной адгезии клетки, таком как L-селектин, специфические клеточные структуры должны включать фукозилированные углеводы. Другим примером фукозилированных структур, имеющих биологическую функцию, являются структуры, которые образуют АВ0 систему группы крови. Кроме того, терапевтические (глико)протеины представляют собой наиболее быстро растущий класс фармацевтических реагентов, посредством чего их фармакокинетические свойства и стабильность приписываются/приписывается их гликанам.
Вследствие их сложной природы и присущих химических свойств химический синтез гликоконъюгатов представляет собой серьезную проблему и связан с существенными трудностями. В отличие от белков и нуклеиновых кислот, для которых автоматизированные синтезаторы являются коммерчески доступными, гликаны - и не говоря уже о гликоконъюгатах - не могут (пока) быть синтезированы с использованием общей коммерческой системы. Не считая требования контроля стереохимии, образование специфических связей остается сложным.
Ввиду сложности, связанной с химическим или комбинированным ферментным/химическим синтезом гликоконъюгатов, в современных подходах используют гликозилтрансферазы для того, чтобы ферментативно синтезировать (глико)протеины и (глико)липиды, содержащие олигосахаридные остатки.
Фукозилтрансферазы, которые принадлежат к семейству ферментов гликозилтрансфераз, широко экспрессируются у позвоночных, беспозвоночных, в растениях и бактериях. Они катализируют перенос остатка фукозы от донора, как правило гуанозин-дифосфат фукозы (GDP-фукозы) к акцептору, которые включают олигосахариды, (глико)протеины и (глико)липиды. Таким образом, фукозилированные субстраты акцептора являются вовлеченными в различные биологические и патологические процессы.
Несколько фукозилтрансфераз были выявлены, например, в бактериях Helicobacter pylori, Escherichia coli, Salmonella enterica, у млекопитающих, Caenorhabditis elegans и Schistosoma mansoni, а также в растениях, посредством чего, основываясь на сайте присоединения фукозы, фукозилтрансферазы подразделяются на альфа-1, 2, альфа-1, 3/4 и O-фукозилтрансферазы.
У млекопитающих GDP-фукоза синтезируется в цитоплазме посредством de novo синтеза и "реутилизационного" пути. Касательно de novo синтеза, то GDP-манноза превращается в GDP-фукозу с помощью двух ферментов, в то время как "реутилизационный" путь использует свободную цитозольную фукозу как субстрат. В клетке GDP-фукоза концентрируется в пузырьках и распознается фукозилтрансферазами как донор субстрата.
Поскольку биологическая активность многих коммерчески важных олигосахаридов, (глико)протеинов и (глико)липидов зависит от присутствия определенных остатков фукозы, в современном уровне техники существует необходимость эффективно синтезировать или производить гликоконъюгаты, которые имеют требуемый(ые) олигосахаридный(ые) остаток(ки).
Таким образом, объектом представленного изобретения является обеспечение инструментов и способов, посредством которых фукозилированные субстраты могут быть произведены эффективным способом с экономией времени и расходов, что дает большие количества требуемого субстрата.
В соответствии с изобретением эта задача решается, среди прочего, путем предоставления выделенного полинуклеотида, который кодирует полипептид с альфа-1,3 фукозилтрансферазной активностью и который содержит последовательность или состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из:
a) SEQ ID No 1, 3 или 5 из приложенного списка последовательностей;
b) последовательности нуклеиновой кислоты комплементарной к SEQ ID No 1, 3 или 5;
c) последовательностей нуклеиновых кислот, которые гибридизируются при жестких условиях с последовательностями нуклеиновых кислот, определенных в a) и b), или их комплементарными цепями.
Полинуклеотиды в соответствии с изобретением представляют собой фукозилтрансферазы видов Akkermansia muciniphila и Bacteroides fragilis, в которых SEQ ID No 1 демонстрирует полинуклеотидную последовательность недавно идентифицированной фукозилтрансферазы из Akkermansia muciniphila и в которых SEQ ID No 3 и 5 демонстрируют полинуклеотидные последовательности двух недавно идентифицированных фукозилтрансфераз из Bacteroides fragilis.
Недавно идентифицированные фукозилтрансферазы проявляют неожиданные эффекты, поскольку с их использованием могут быть осуществлены реакции, которые не происходят в природе. В рамках представленного изобретения было обнаружено, что определенные выше альфа-1,3 фукозилтрансферазы способны использовать лактозу как субстрат и способны продуцировать фукозилированные олигосахариды, в частности 3-фукозиллактозу. До настоящего времени ни одна из известных альфа-1,3 фукозилтрансфераз, выделенных из бактерий, как было показано, не использует лактозу, как природный субстрат, для продупирования фукозиллактозы. Таким образом, пригодность недавно идентифицированных фукозилтрансфераз, чтобы быть использованными для получения фукозилированных олигосахаридов, является крайне неожиданной, и, таким образом, их использование представляет собой отличный инструмент, чтобы легко, эффективно и экономически выгодно получать, например, человеческие олигосахариды молока (НМО), такие как фукозиллактозу. Сегодня более 80 соединений, принадлежащих к НМО, были структурно охарактеризованы, они представляют класс комплексных олигосахаридов, которые функционируют как пребиотики. Кроме того, структурная гомологичность НМО к эпителиальным эпитопам объясняет защитные свойства против бактериальных патогенов. В младенческом желудочно-кишечном тракте, НМО, избирательно питает рост избранных штаммов бактерий и является, таким образом, основой развития уникальной микробиоты кишечника младенцев на вскармливании грудным молоком.
Поскольку до сих пор структурная сложность этих олигосахаридов препятствовала их синтетическому производству, основным источником НМО все еще является человеческое молоко. Таким образом, существует необходимость в быстро и легко доступных НМО, которые могут быть получены путем использования - неожиданно подходящих - фукозилтрансфераз, представленных в данном документе.
В соответствии с представленным изобретением термин "полинуклеотид(ы)" обычно касается какого-либо полирибонуклеотида или полидезоксирибонуклеотида, которые могут быть немодифицированными РНК или ДНК или модифицированными РНК или ДНК. "Полинуклеотид(ы)" включает, без ограничений, одно- и двухцепочечную ДНК, ДНК, которая представляет собой смесь одно- и двухцепочечных участков или одно-, двух- и трехцепочечных участков, одно- и двухцепочечной РНК, и РНК, которая является смесью одно- и двухцепочечных участков, гибридные молекулы, содержащие ДНК и РНК, которые могут быть одноцепочечными или, что более типично, двухцепочечными или трехцепочечными участками, или смесью одно- и двухцепочечных участков. Кроме того, "полинуклеотид", как используется в данном документе, относится к трехцепочечным участкам, содержащим РНК или ДНК, или как РНК, так и ДНК. Цепи в таких участках могут быть из той же молекулы или из разных молекул. Участки могут включать все из одной или более молекул, но более типично включают только участок какой-нибудь из молекул. Одна из молекул трехспирального участка часто представляет собой олигонуклеотид. Как используется в данном документе, термин "полинуклеотид(ы)", кроме того, включает ДНК или РНК, как описано выше, которые содержат одно или несколько модифицированных оснований. Таким образом, ДНК или РНК со скелетом, модифицированным для стабильности или по другим причинам, представляют собой "полинуклеотид(ы)", как этот термин обозначается в данном документе. Более того, ДНК или РНК, содержащие необычные основания, такие как инозин, или модифицированные основания, такие как тритилированные основания, чтобы назвать только два примера, представляют собой полинуклеотиды, как этот термин используется в данном документе. Следует принять во внимание, что большое разнообразие модификаций было сделаны для ДНК и РНК, которые благоприятствуют многим полезным намерениям, известным квалифицированным специалистам в данной области с уровня техники. Термин "полинуклеотид(ы)", как он используется в данном документе, охватывает такие химически, ферментативно или метаболически модифицированные формы полинуклеотидов, а также химические формы ДНК и РНК характерные для вирусов и клеток, включая, например, простые и сложные клетки. Кроме того, "полинуклеотид(ы)" охватывает также короткие полинуклеотиды, которые часто называют как олигонуклеотид(ы).
"Полипептид(ы)" относится к какому-либо пептиду или белку, содержащему две или более аминокислоты, связанные друг с другом пептидными связями или модифицированными пептидными связями. "Полипептид(ы)" относится как к коротким цепям, обычно называемым пептиды, олигопептиды и олигомеры, так и более длинным цепям, которые обычно называют белками. Полипептиды могут содержать аминокислоты, другие чем 20 генов, кодированных аминокислот. "Полипептид(ы)" включает те, что модифицированы в результате или естественных процессов, таких как процессинг, или других посттрансляционных модификаций, а также используя способы химической модификации. Такие модификации хорошо описаны в основных учебниках и в более подробных монографиях, а также в многотомной исследовательской литературе, и они хорошо известны квалифицированным специалистам в данной области. Следует принять во внимание, что тот же тип модификации может присутствовать в той или иной степени в нескольких сайтах в данном полипептиде. Кроме того, данный полипептид может содержать множество типов модификаций. Модификации могут происходить в любом участке полипептида, включая пептидный скелет, аминокислотные боковые цепи и амино- или карбоксильные концы. Модификации включают, например, ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение фрагмента гема, ковалентное присоединение нуклеотида или нуклеотидного производного, ковалентное присоединение липида или липидного производного, ковалентное присоединение фосфотидилинозитола, перекрестное сшивание, циклизацию, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных поперечных связей, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование GPI-якоря, гидроксилирование, иодирование, метилирование, миристоилирование, окисление, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, присоединение липида, сульфатирование, гамма-карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты, гидроксилирование и АДФ-рибозилирование, селеноилирование, присоединение, опосредованное РНК-переносом аминокислот к белкам, таким как аргинилирование и убиквитинирование. Полипептиды могут быть разветвленными или циклическими, с или без разветвлений. Циклические разветвленные и разветвленные кольцевые полипептиды могут быть результатом посттрансляционной природных процессов и могут быть получены с таким же успехом, используя полностью синтетические способы.
"Выделенный" означает измененный "руками человека" из природного состояния, то есть условия, если он встречается в природе, то он был изменен или удален из своей первоначальной среды, или обоих. Например, полинуклеотид или полипептид, по природе присутствующий в живом организме, не является "выделенным", но тот же самый полинуклеотид или полипептид, отделенный от сосуществующих веществ его естественного состояния, является "выделенным", как этот термин используется в данном документе. Подобным образом, «синтетическая» последовательность, как этот термин используется в данном документе, означает какую-нибудь последовательность, которая была произведена синтетически, а не непосредственно выделена из природного источника. "Рекомбинантный" означает генетически сконструированную ДНК, полученную путем трансплантации или сплайсинга генов из одного вида в клетки организма-хозяина из различных видов. Такая ДНК становится частью генетической структуры хозяина и реплицируется.
Термин "полинуклеотид, кодирующий полипептид", как используется в данном документе, охватывает полинуклеотиды, которые включают последовательность, кодирующую полипептид согласно изобретению, в частности, альфа-1,3-фукозилтрансферазу, который имеет аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID Nо 2, 4 и 6. Термин, кроме того, охватывает полинуклеотиды, которые включают один непрерывный участок или прерываемые участки, кодирующие полипептид (например, прерванный за счет интегрированного фага или введенной последовательности или компилирования) вместе с дополнительными участками, которые также могут содержать кодирующие и/или некодирующие последовательности.
"Вариант(ы)", как термин, используемый в данном документе, представляет собой полинуклеотид или полипептид, который отличается от стандартного полинуклеотида или полипептида, соответственно, но сохраняет основные свойства. Типичный вариант полинуклеотида отличается по нуклеотидной последовательности от другого стандартного полинуклеотида. Изменения в нуклеотидной последовательности варианта может или не может привести к изменению аминокислотной последовательности полипептида, который кодируется стандартным полинуклеотидом. Нуклеотидные изменения могут в результате привести к аминокислотным замещениям, добавлениям, делениям, слияниям и отсечениям в полипептиде, кодируемом стандартной последовательностью, как описано ниже. Типичный вариант полипептида отличается по аминокислотной последовательности от другого стандартного полипептида. Как правило, различия ограничены так, что последовательности стандартного полипептида и варианта являются очень подобными в целом и, на многих участках, идентичными. Вариант и стандартный полипептид могут отличаться по аминокислотной последовательности за счет одного или более замещений, добавлений, делеций в какой-либо комбинации. Замещенный или введенный аминокислотный остаток может или не может быть одним кодируемым генетическим кодом. Вариант полинуклеотида или полипептида может быть таким, что существует в природе, таким как аллельный вариант, или может быть вариантом, который, как известно, не встречается в природе. Не встречающиеся в природе варианты полинуклеотидов и полипептидов могут быть получены способами мутагенеза, путем прямого синтеза и с использованием других рекомбинантных способов, известных квалифицированным специалистам в данной области с уровня техники.
Термины "альфа-1,3-фукозилтрансфераза или фукозилтрансфераза" или нуклеиновая кислота/полинуклеотид, кодирующий "альфа-1,3-фукозилтрансферазу или фукозилтрансферазу" относятся к гликозилтрансферазе, которая катализирует перенос фукозы от донорного субстрата, например, GDP-фукозы, к акцепторной молекуле с альфа-1,3-связью. Акцепторная молекула может быть углеводом, олигосахаридом, белком или (глико)протеином, или липидом, или (глико)липидом и может быть, например, N-ацетилглюкозамином, N-ацетиллактозамином, галактозой, фукозой, сиаловой кислотой, глюкозой, лактозой или какой-либо их комбинацией. В рамках представленного изобретения, кроме того, нуклеиновая кислота/полинуклеотид и полипептидные полиморфные варианты, аллели, мутанты и межвидовые гомологи включаются в те термины, которые имеют аминокислотную последовательность, которая имеет большую чем примерно 60% идентичность аминокислотной последовательности, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, предпочтительно 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или большую идентичность аминокислотной последовательности, предпочтительно выше участка, содержащего, по меньшей мере, около 25, 50, 100, 200, 500, 1000 или более аминокислот, к полипептиду, кодируемому нуклеиновой кислотой, выбранной из SEQ ID Nо 1, 3 или 5, или аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID Nо 2, 4 или 6.
Кроме того, альфа-1,3-фукозилтрансферазный полипептид может быть изменен путем добавлений или делеций пептидных последовательностей для того, чтобы модифицировать его активность. Например, полипептидные последовательности могут быть слиты с альфа-1,3-фукозилтрансферазным полипептидом для того, чтобы осуществлять дополнительную ферментативную активность. Кроме того, аминокислоты могут быть делегированы, чтобы удалить или модифицировать активность белка. Белок может быть модифицирован, чтобы отсутствовала альфа-1,3-фукозилтрансферазная ферментативная активность, но при этом все-таки сохранилось его структурное трехмерное строение. Такие модификации были бы полезны при разработке антител против альфа-1,3-фукозилтрансферазного полипептида.
Кроме того, генные продукты альфа-1,3-фукозилтрансферазы могут включать белки или полипептиды, которые представляют функционально эквивалентные генные продукты. Такой эквивалентный генный продукт альфа-1,3-фукозилтрансферазы может включать делеции, добавления или замещения аминокислотных остатков на аминокислотную последовательность, кодированную альфа-1,3-фукозилтрансферазными генными последовательностями, описанными выше, но которая в результате приводит к скрытым изменениям, таким образом, продуцируя функционально эквивалентный генный продукт альфа-1,3-фукозилтрансферазы. Аминокислотные замещения могут быть выполнены на основе подобности в полярности, заряде, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природе включенных остатков. Например, неполярные (гидрофобные) аминокислоты включают аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин; планарные нейтральные аминокислоты включают глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин; положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин; и отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. В контексте данного изобретения, "функционально эквивалентный", как используется в данном документе, относится к полипептиду, способному демонстрировать в значительной степени подобную in vivo активность, как эндогенных генных продуктов альфа-1,3-фукозилтрансферазы, кодированных альфа-1,3-фукозилтрансферазными генными последовательностями, описанными выше, как оцененный по какому-либо числу критериев, включая, но не ограничиваясь этим, антигенность, то есть способность связываться с анти-альфа-1,3-фукозилтрансферазным антителом, иммуногенность, то есть способность производить антитело, которое является способным к связыванию с альфа-1,3-фукозилтрансферазным белком или полипептидом, а также ферментная активность.
Включенными в рамки данного изобретения являются альфа-1,3-фукозилтрансферазные белки, полипептиды и производные (включая фрагменты), которые дифференцированно модифицированы во время или после трансляции. Более того, неклассические аминокислоты или химические аналоги аминокислоты могут быть введенными в виде замещения или добавления в полипептидную последовательность альфа-1,3-фукозилтрансферазы.
Альфа-1,3-фукозилтрансферазный полипептид может быть получен путем рекомбинантной ДНК технологии, используя методики, хорошо известные в данной области с уровня техники. Способы, которые хорошо известны квалифицированному специалисту в данной области, могут быть использованы для конструирования векторов экспрессии, содержащих альфа-1,3-фукозилтрансферазу, которая кодирует последовательности и соответствующие транскрипционные трансляционные контрольные сигналы. Данные способы включают, например, in vitro рекомбинантные ДНК методики, синтетические методики и in vivo генетические рекомбинации. Смотри, например, методики, описанные в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).
"Олигосахарид" как термин, который используется в данном документе и который в основном понимается в уровне техники, относится к сахаридному полимеру, содержащему небольшое число, как правило от трех до десяти, простых сахаров, то есть моносахариды.
В соответствии с другим аспектом изобретения, предусматривают вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, как представлено выше, которая кодирует полипептид с альфа-1,3-фукозилтрансферазной активностью, в которой последовательность нуклеиновой кислоты реально связывается с контрольными последовательностями, идентифицированными путем трансформации клетки-хозяина с вектором. В очень предпочтительном варианте осуществления вектор является вектором экспрессии, и, в соответствии с другим аспектом изобретения, вектор может присутствовать в форме плазмиды, космиды, фага, липосомы или вируса.
Для рекомбинантного получения клетки-хозяева могут быть генетически сконструированными, чтобы включить экспрессионные системы или их части, или полинуклеотиды изобретения. Введение полинуклеотида в клетку-хозяина может быть эффективным, используя способы, описанные во многих стандартных лабораторных руководствах, таких как Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, (1986), and Sambrook et al., 1989, supra.
Таким образом, полинуклеотид в соответствии с изобретением может, например, быть включенным в вектор, который является таким, что стабильно трансформируется/трансфектируется в клетки-хозяева. В векторе полинуклеотид изобретения находится под контролем, например, индуцируемого промотора таким образом, что экспрессия гена/полинуклеотида может быть специально предназначенной и, если необходимо, ген может быть сверхэкспрессированным таким же способом.
Большое многообразие экспрессионных систем может быть использовано для получения полипептидов изобретения. Такие векторы включают, среди других, хромосомные, эписомальные и производные вируса векторы, например, векторы, производные из бактериальных плазмид, из бактериофага, из транспозон, из дрожжевых эписом, из элементов включения, из дрожжевых хромосомных элементов, из вирусов, и векторы, производные их комбинаций, таких как те, которые являются производными из плазмидных и бактериофаговых генетических элементов, таких как космиды и фагемиды. Конструкты экспрессионной системы могут включать контрольные участки, которые регулируют, а также вызывают экспрессию. Как правило, какая-либо система или вектор, подходящие для поддержания, размножения или экспрессирования полинуклеотидов и/или экспрессирования полипептида в хозяине, могут быть использованы для экспрессии в этом отношении. Соответствующая ДНК последовательность может быть включена в экспрессионную систему, используя какую-либо из многообразия хорошо известных и стандартных методик, таких как, например, те, что представлены в Sambrook et al; смотри выше.
Соответственно, представленное изобретение, кроме того, касается выделенного полипептида с альфа-1,3-фукозилтрансферазной активностью, состоящего из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:
a) аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID Nо 2, 4 или 6;
b) аминокислотной последовательности аллельного варианта аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID No 2, 4 или 6, в которых упомянутый аллельный вариант кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, которая гибридизирует при жестких условиях до противоположной цепи молекулы нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID No 1, 3 или 5;
c) аминокислотной последовательности ортолога аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID No 2, 4 или 6, в которой упомянутый ортолог кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, которая гибридизирует при жестких условиях до противоположной цепи молекулы нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID No 1, 3 или 5; и
d) фрагмента аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID No 2, 4 или 6, в которой упомянутый фрагмент содержит, по меньшей мере, 10 смежных аминокислот и в которой упомянутый фрагмент имеет альфа-1,3-фукозилтрансферазную активность.
Термин "жесткие условия" касается условий, при которых пробы будут гибридизировать до последовательности своей мишени, но не до других последовательностей. Жесткие условия являются последовательность-зависимыми и будут различными при различных обстоятельствах. Более длинные последовательности гибридизируют, в особенности, при более высоких температурах. Как правило, жесткие условия выбираются такими, чтобы быть приблизительно на 15°C ниже, чем термическая точка плавления (Tm) для конкретной последовательности при определенной ионной силе и pH. Tm представляет собой температуру (при определенной ионной силе, pH и концентрации нуклеиновой кислоты), при которой 50% образцов комплементарны последовательности мишени гибридизируют до последовательности мишени при равновесии. Иллюстративные жесткие условия гибридизации могут быть следующими: 50% формамида, 5х SSC и 1% SDS, инкубирование при 42°C или 5х SSC, 1% SDS, инкубирование при 65°C, с отмывкой 0,2х SSC и 0,1% SDS при 65°C.
Кроме того, изобретение касается клетки-хозяина, содержащей вектор, как определено выше, и, в частности, клетки-хозяина, которую выбирают из группы, которая состоит из клеток грибов, включая дрожжи, бактерий, насекомых, животных и растений. Очень предпочтительным является, если клетка-хозяин представляет собой клетку Escherichia coli.
Как используется в данном документе, термин "клетка-хозяин" собственно определяется как клетка, которую трансформировали или трансфектировали или которая является способной к трансформации или трансфекции за счет экзогенной полинуклеотидной последовательности.
Многообразие векторных систем экспрессии хозяина может быть использовано для экспрессирования гена альфа-1,3-фукозилтрансферазы, кодирующего последовательности изобретения. Такие системы экспрессии хозяина представляют собой векторы, за счет которых интересующие кодирующие последовательности могут быть получены и впоследствии очищены, но, кроме того, представляют собой клетки, которые, когда трансформировались или трансфетировались с соответствующим нуклеотидом, кодирующим последовательности, демонстрируют генный продукт альфа-1,3-фукозилтрансферазы изобретения in situ.
Ряд подходящих экспрессионных систем и хозяев может быть найден, например, в WO 98/55630, которая рассматривает фукозилтрансферазы, выделенные из Helicobacter pylori, публикация, которой явным образом адресуется к настоящему.
В соответствии с другим аспектом изобретения, нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид с альфа-1,3-фукозилтрансферазной активностью, адаптируется к частоте использования кодона соответствующей клетки.
Изобретение касается способа получения фукозилированных олигосахаридов, (глико)протеинов и (глико)липидов, который включает стадии:
a) обеспечение полипептида с альфа-1,3-фукозилтрансферазной активностью в соответствии с изобретением,
b) контактирование полипептида с альфа-1,3-фукозилтрансферазной активностью со стадии а) со смесью, включающей донорный субстрат, который содержит остаток фукозы, и акцепторный субстрат, который содержит моно- или олигосахарид, (глико)протеин или (глико)липид при условиях, при которых полипептид катализирует перенос остатка фукозы от донорного субстрата к акцепторному субстрату, таким образом продуцируя фукозилированный олигосахарид, (глико)протеин или (глико)липид.
В соответствии с изобретением способ получения фукозилированных олигосахаридов может быть осуществлен в бесклеточной системе или в системе, содержащей клетки. Субстратам разрешается реагировать с полипептидом альфа-1,3-фукозилтрансферазы в течение достаточного времени и при адекватных условиях, чтобы позволить формирование ферментативного продукта. Следует понимать, что данные условия будут меняться в зависимости от количеств и чистоты субстрата и фермента, или система является бесклеточной, или система на основании клеток. Данные переменные будут легко регулироваться квалифицированным специалистом в данной области.
В бесклеточной системы полипептид в соответствии с изобретением, акцепторный(ые) субстрат(ы), донорный(ые) субстрат(ы) и, в зависимости от обстоятельств, другие ингредиенты реакционной смеси, в том числе других гликозилтрансферазы и дополнительные ферменты, комбинируются путем подмешивания в водную реакционную среду. Ферменты могут быть использованы в свободном виде в растворе или они могут быть связанными или иммобилизованными на носителе, таком как полимер, и субстраты могут быть присоединены к носителю. Носитель может быть, например, упакованным в колонку.
Клетки, содержащие системы для синтеза фукозилированных олигосахаридов, могут включать рекомбинантно модифицированные клетки-хозяева.
Таким образом, изобретение, кроме того, касается способа получения фукозилированных олигосахаридов, (глико)протеинов и (глико)липидов, который включает стадии:
a) культивирование в подходящих питательных условиях, позволяющее получить фукозилированный олигосахарид, (глико)протеин и/или (глико)липид и позволяющее экспрессию полипептида с альфа-1,3-фукозилтрансферазной активностью, одновременно или последовательно клетки-хозяина, как описано выше;
b) обеспечение, одновременно или последовательно со стадией a), донорного субстрата, содержащего остаток фукозы, и акцепторного субстрата, содержащего олигосахарид, (глико)протеин или (глико)липид, так, что альфа-1,3-фукозилтрансфераза, экспрессированная в упомянутой клетке-хозяине, катализирует перенос остатка фукозы от донорного субстрата к акцепторному субстрату, таким образом получая фукозилированный олигосахарид, (глико)протеин или (глико)липид; и
c) выделение указанного фукозилированного олигосахарида, (глико)протеина и/или (глико)липида из клетки-хозяина или среды его роста.
В способе, в соответствии с изобретением, донорный субстрат может быть GDP-фукозой. Особенно предпочтительным является, если донорный субстрат представляет собой GDP-фукозу.
В соответствии с одним аспектом изобретения, акцепторный субстрат выбирают из N-ацетилглюкозамина, N-ацетиллактозамина, галактозы, фукозы, сиаловой кислоты, глюкозы, лактозы или какой-либо их комбинации. В частности, лактозе отдают предпочтение, как акцепторному субстрату.
Термин "субстрат", как используется в данном документе, означает какой-либо материал или комбинации различных материалов, которые могут подвергаться действию полипептида изобретения, что приводит к возникновению фукозилированных олигосахаридов, (глико)протеинов или (глико)липидов.
Субстратам дают реагировать с полипептидом альфа-1,3-фукозилтрансферазы в течение достаточного времени и при адекватных условиях, что позволяет образоваться ферментному продукту. Данные условия будут меняться в зависимости от количеств и чистоты субстрата и фермента, или система является бесклеточной, или система с клеточной основой. Данные переменные будут легко регулироваться квалифицированными специалистам в данной области.
В соответствии с одним аспектом способа в соответствии с изобретением, донорный субстрат предусматривается на стадии b), посредством которой имеют его получение внутри клетки-хозяина. С этой целью, фермент, превращающий, например, фукозу, который должен быть добавлен в клетку-хозяина так, что GDP-фукоза одновременно экспрессируется в клетке-хозяине. Данный фермент может быть, например, бифункциональной киназой фукозы/фукоза-1-фосфатгуанилилтрансферазой, аналогичной Fkp из Bacteroides fragilis, или комбинацией из одной отдельной киназы фукозы вместе с одной отдельной фукоза-1-фосфатгуанилилтрансферазой подобной тем, которые известны из нескольких видов, в том числе Homo sapiens, Sus scrofa и Rattus norvegicus.
Кроме того, на стадии b), донорный субстрат может быть добавлен к культуральной среде/клеткам-хозяинам или быть полученными с использованием клеток собственного метаболизма.
В еще одном варианте осуществления изобретение касается способа, который включает следующие стадии:
a) культивирование клетки-хозяина, трансформированные или трансфицированные, чтобы содержать последовательность нуклеиновой кислоты, выбранной из i) SEQ ID No 1, 3 или 5 из перечня кодированной последовательности, ii) последовательности нуклеиновой кислоты комплементарной к SEQ ID No 1,3 или 5 и iii) последовательностей нуклеиновых кислот, которые гибридизуются при жестких условиях с последовательностями нуклеиновых кислот, определенных в i) и ii) или их комплементарными цепями, в подходящих питательных условиях, таким образом, чтобы последовательность нуклеиновой кислоты, выбранная из i), ii) или iii), экспрессировалась как пептид, имеющий альфа-1,3-фукозилтрансферазную активность;
b) обеспечение, одновременно или последовательно со стадией a), донорного субстрата, содержащего остаток фукозы, и акцепторного субстрата, содержащего олигосахарид, (глико)протеин или (глико)липид, таким образом, чтобы альфа-1,3-фукозилтрансфераза, экспрессированная в упомянутой клетке-хозяине, катализировала перенос остатка фукозы от донорного субстрата к акцепторному субстрату, тем самым получая фукозилированный олигосахарид, (глико)протеин или (глико)липид; и
c) выделение указанного фукозилированного олигосахарида, (глико)протеина и/или (глико)липида из клетки-хозяина или из среды роста.
В способах в соответствии с изобретением, пептид, который экспрессируется в клетке-хозяине, демонстрирует альфа-1,3-фукозилтрансферазную активность и, таким образом, переносит остаток фукозы от донора, например гуанозиндифосфат фукозы (GDP-фукозы), к акцептору, который включает олигосахариды, (глико)протеины и (глико)липиды. Таким образом, в этом случае, фукозилированный акцепторный субстрат может быть использован в качестве пищевой добавки для добавления в детское питание или как терапевтически или фармацевтически активное соединение. С использованием новых способов, фукозилированные продукты легко и эффективно могут быть получены без необходимости в сложных, время и стоимость затратных процессах синтеза.
Как используется в данном документе, термин "выделения" означает собирание, накопление или отделение от системы генной экспрессии продукта, полученного с использованием альфа-1,3-фукозилтрансферазы в соответствии с изобретением.
Соответственно, изобретение, кроме того, касается фукозилированного олигосахарида, (глико)протеина и/или (глико)липида, полученного по способам в соответствии с изобретением, а также с использованием полинуклеотида, вектора или полипептида, как описано выше, для получения фукозилированных олигосахаридов, (глико)протеинов и/или (глико)липидов.
В соответствии с еще другим вариантом осуществления изобретения, получение указанного фукозилированного олигосахарида, (глико)протеина и/или (глико)липид осуществляют посредством гетерологичной или гомологичной (сверх)экспрессии полинуклеотида, кодирующего альфа-1,3-фукозилтрансферазу.
Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в данном документе, вообще имеют такое же значение, как и в обычном понимании для среднего специалиста в данной области, к которой относится данное изобретение. Как правило, номенклатура, использованная в данном документе и лабораторных методиках для клеточных культур, молекулярной генетики, органической химии и химии нуклеиновых кислот и гибридизации, описанные выше и ниже, является хорошо известной и обычно используемой в данной области. Для синтеза нуклеиновых кислот и пептидов используются стандартные методики. Как правило, ферментативные реакции и стадии очистки осуществляют в соответствии с техническими условиями производителя.
Изобретение, кроме того, охватывает фрагменты последовательностей полинуклеотидов, раскрытые в данном документе.
Дополнительные преимущества следуют из описания вариантов осуществления изобретения и прилагаемых чертежей.
Само собой разумеется, что указанные выше особенности и особенности, которые еще будут объяснены ниже, могут быть использованы не только в соответствующих указанных комбинациях, но, кроме того, и в других комбинациях или самостоятельно, не выходя за рамки представленного изобретения.
Некоторые варианты осуществления изобретения проиллюстрированы на чертежах и объяснены более подробно в следующем описании. На фигурах:
Фиг.1 показывает экспрессию Amuc0760co из pDEST14-amuc0760co в Escherichia coli JM109(DE3); 15 мкг растворимого белка из неочищенного экстракта разделяли на 15% SDS-PAGE и окрашивали кумасси бриллиантовым голубым;
Фиг.2 показывает обнаружение His-меченного Amuc0760co с помощью вестерн-блоттинга;
Фиг.3 показывает векторную карту pDEST14-amuc0760co, то есть кодон-оптимизированного гена amuc0760co, кодирующего новую альфа-1,3-фукозилтрансферазу Amuc0760co, клонированную в pDEST14 (Invitrogen) путем Gateway-реакции (А); векторную карту pDEST14-fucT6, то есть гена fucT6 из Bacteroides fragilis, кодирующего новую альфа-1,3-фукозилтрансферазу FucT6, клонированную в pDEST14 (Invitrogen, Germany) путем Gateway-реакции (В); и векторную карту pDEST14-fucT7, то есть гена fucT7 из Bacteroides fragilis, кодирующего новую альфа-1,3-фукозилтрансферазу FucT7, клонированную в pDEST14 (Invitrogen, Germany) путем Gateway-реакции (C);
Фиг.4 показывает векторную карту pACYC-amuc0760co, то есть кодон-оптимизированного гена amuc0760 со, кодирующего новую альфа-1,3-фукозилтрансферазу Amuc0760co, клонированную в pACYCDuet-1 (Novagen посредством NcoI/PstI) (A); векторную карту pACYC-fucT6, то есть кодон-оптимизированного гена fucT6 из Bacteroides fragilis, кодирующего новую альфа-1,3-фукозилтрансферазу FucT6, клонированную в pACYCDuet-1 (Novagen, UK) посредством NcoI/BamHI (B); и векторную карту pACYC-fucT7, то есть кодон-оптимизированного гена fucT7 из Bacteroides fragilis, кодирующего новую альфа-1,3-фукозилтрансферазу FucT7, клонированную в pACYCDuet-1 (Novagen, UK) посредством NcoI/EcoRI (C);
Фиг.5 показывает последовательность ДНК и аминокислотную последовательность гена amuc0760 со и белка Amuc0760co;
Фиг.6 показывает последовательность ДНК и аминокислотную последовательность гена fucT6 и белка FucT6;
Фиг.7 показывает последовательность ДНК и аминокислотную последовательность гена fucT7 и белка FucT7;
Фиг.8 показывает исследование очистки 3-фукозиллактозы посредством BioGel P-2 гельпроникающей хроматографии, используя тонкослойную хроматографию с подвижной фазой бутанол/ацетон/уксусная кислота/вода (35/35/7/23) и окрашивающий раствор дифениламина анилина (2% дифениламина, 2% анилина, 10% фосфорной кислоты, в метаноле); и
Фиг.9 показывает ВЭЖХ хроматограмму; разделение с помощью колонки Phenomenex Rezex RCM Ca2+ с водой как элюентом (0,6 мл/мин в течение 30 минут при 80°C) и детектирование с использованием рефрактометрического детектора (Shimadzu, Germany) (А); и ВЭЖХ хроматограмму; разделение с помощью колонки Dionex CarboPac PA1 с 50 мМ NaOH как элюентом (1 мл/мин в течение 30 минут при 30°C) и детектирование с использованием электрохимического детектора DECADE II (Antec Leyden, Netherlands) (B).
Примеры
Клонирование генов
Ген, кодирующий фукозилтрансферазу Amuc0760, был кодон-оптимизированным и синтезированным компанией GenScript, Piscataway, New Jersey (USA). С двумя фланкирующими последовательностями, кодирующими для attB-сайтов для Gateway-клонирования (5’-последовательность: GGGGACAAGTTTGTACA-AAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACC (SEQ ID No 7), 3’-последовательность: TAGGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTCCCC (SEQ ID No 8)), он был клонирован в pUC57 компанией GenScript. Gateway-перенос в вектор pDEST14 (Invitrogen GmbH, Germany) (смотри фиг.3A) выполняли в соответствии с руководством, которое предоставил поставщик (Invitrogen GmbH, Germany). Полинуклеотид, кодирующий для N-терминально His-меченного Amuc0760co, был амплифицирован из pUC57-amuc0760co, используя праймеры GGGGACAAGTTTGTA-CAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATACAACCATGGGCCATCACCATCATCACCA-CAAAACGCTGAAAATTAGCTTTC (SEQ ID No 9) и GGGGACCACTTTGTACAAGA-AAGCTGGGTC (SEQ ID No 10). Полинуклеотид, кодирующий для C-терминально His-меченного amuc0760co был амплифицирован из pUC57-amuc0760co, используя праймеры GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC (SEQ ID No 11) и GGGG-ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC (SEQ ID No 12).
Гены, кодирующие для фукозилтрансфераз FucT6 и FucT7 были амплифицированы из геномной ДНК из Bacteroides fragilis NCTC 9343 с праймерами GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATACAACCATGTGTGA-TTGCTTGTCTATCATATTG (SEQ ID No 13) / GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCT-GGGTCTTATTTTCTATCAAACAATTGAGAATAATATTC (SEQ ID No 14) и GGGGA-CAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATACAACCATGGATATATTGA-TTCTTTTTTATAATACGATG (SEQ ID No 15) / GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGC-TGGGTCCATATCCCTCCCAATTTTAGTTCG (SEQ ID No 16), соответственно, и, кроме того, клонированными в pDEST14, используя Gateway технологию (Invitrogen GmbH, Germany) (смотри фигуры 3B и 3C).
Экспрессия фукозилтрансфераз
Гены amuc0760co, fucT6 и fucT7 были дополнительно клонированы в векторе экспрессия pACYCDuet-1 (Novagen, UK). Для клонирования amuc0760co посредством рестрикции с NcoI/PstI и последующего лигирования праймеров были использованы AGCTAGCCATGGGCAAAACGCTGAAAATTAGCTTTCTG (SEQ ID No 17) и AGCT-AGCTGCAGTTAGCGACGCAGGCGATTTTTC (SEQ ID No 18) (сайты рестрикции подчеркнуты) и получающийся в результате продукт назван pACYC-amuc0760co (смотри фигуру 4А). fucT6 клонировали посредством NcoI/BamHI, используя праймеры GATCACCATGGGCTGTGATTGCTTGTCTATCATATTG (SEQ ID No.19) и GATCAG-GATCCTTATTTTCTATCAAACAATTGAGAATAATATTC (SEQ ID No 20) (сайты рестрикции подчеркнуты), получая в результате pACYC-fucT6 (смотри фигуру 4В), и fucT7 клонировали посредством NcoI/EcoRI, используя праймеры GATCACCATGGAT-ATATTGATTCTTTTTTATAATACGATGTGG (SEQ ID No  21) и GATCAGAATTCTC-ATATCCCTCCCAATTTTAGTTCGTG (SEQ ID No 22) (сайты рестрикции подчеркнуты) получая в результате pACYC-fucT7 (смотри фигуру 4С).
2
Штаммы Е.coli JM109(DE3) или BL21(DE3) ΔlacZ были трансформированы с соответствующими плазмидами, описанными выше. 5 мл 2YT среды были инокулированы посредством бактериальной петли и выращивали при 37°C и 180 оборотах в минуту в течение ночи. 400 мл 2YT были инокулированы с 4 мл из культуры с ночи и выращивались при 37°C и 180 оборотах в минуту до OD660 из 0,5 достигались. Экспрессию индуцировали путем добавления 0,1 мМ IPTG и рост продолжался при 28°C и 180 оборотах в минуту в течение ночи. Клетки собирали и ресуспендировали в 4 об./мас. или 50 мМ Трис-HCl pH 7,5+5 мМ MgCl или, когда использовали для очистки с помощью колонки Ni Sepharose FF (HisPrep FF 16/10, GE Healthcare, Sweden), в 4 об./мас. 20 мМ Трис-HCl pH 7,5+500 мМ NaCl+30 мМ имидазол. Стеклянные шарики были добавлены вплоть до шестикратного по массе клеточных пеллет и клеточную суспензию перемешивали дважды в течение 5 минут, с учетом того, что в промежутках клеточную суспензию помещали на лед в течение 5 минут. После разрушения обломки клеток удаляли путем центрифугирования в течение 10 минут при 15000×g. Получающийся в результате супернатант использовали для анализа на SDS-PAGE или для очистки с помощью Ni Sepharose FF.
Детектирование с помощью вестерн-блоттинга
His-меченный Amuc0760co экспрессировали, как описано выше. Из неочищенного клеточного экстракта выделяли 10 мг белка на 10% SDS геле. Белки окрашивали на PVDF мембране, используя мини-реактор Trans-Blot (Bio-Rad, Germany) в соответствии с руководством, предоставленным производителем. His-меченный Amuc0760co детектировали на блоттинге, используя конъюгатный кит His-Tag антитела HRP (Novagen, UK), в соответствии с инструкциями, предоставленными поставщиком (смотри фигуру 2).
Получение фукозилированных соединений
Клетки Е.coli BL21(DE3) ΔlacZ pDESTH-fkp pCOLA-lacY-fucP были трансформированы с pACYC переносом соответствующего гена фукозилтрансферазы. Колонии выращивали в 2YT планшетах с соответствующими антибиотиками. В течение ночи выращивали 5 мл культуры (2YT с антибиотиками) каждого штамма и из этих культур 30 мл минеральной среды каждой инокулировали до 1%. Клетки выращивали, используя глицерин, как источник углерода, и при OD600=0,2 стимулировали 0,1 мМ IPTG и добавляли 20 мМ лактозы и 20 мМ фукозы. Получение 3-фукозиллактозы контролировали, используя ТСХ и ВЭЖХ анализ. Сопоставление количества 3-фукозиллактозы (3-FL), полученной путем экспрессии FutA из Helicobacter pylori, по сравнению с экспрессией и Amuc0760co из Akkermansia muciniphila, а также FucT6 и FucT7 из Bacteroides fragilis, представлено в следующей таблице 1.
Таблица 1
Сопоставление количества 3-фукозиллактозы, полученного, используя альфа-1,3-фукозилтрансферазы FutA из Helicobacter pylori, Amuc0760co из Akkermansia muciniphila и FucT6 и FucT7 из Bacteroides fragilis
Фукозилтрансфераза
Выход 3-FL [мМ]
без (отрицательный контроль)
0
FutA (Helicobacter pylori)
3,83
Amuc0760co (Akkermansia muciniphila}
5,39
FucT6 (Bacteroides fragilis)
4,95
FucT7 (Bacteroides fragilis)
6,89
Как может быть видно из таблицы 1, количество фукозилированного продукта 3-фукозиллактозы было значительно выше, когда использовали альфа-1,3-фукозилтрансферазы в соответствии с изобретением, то есть Amuc0760co из Akkermansia muciniphila и FucT6 и FucT7 из Bacteroides fragilis, по сравнению с альфа-1,3-фукозилтрансферазой FutA из Helicobacter pylori, которая является уровнем техники.
Очистка фукозилированного продукта
3-фукозиллактозу, полученную, как описано выше, чистят в несколько стадий. Первая стадия представляла собой очистку путем адсорбции на активированном древесном угле. Супернатант культуры со стадии получения пропускали через слой активированного древесного угля. Протекшее собирали и анализировали, но остатков 3-фукозиллактозы не было обнаружено. Для удаления неспецифически связанных со средой соединений, таких как, например, соли и аминокислоты, слой промывали дистиллированной водой (не было 3-FL в промывных водах). 3-FL и остатки лактозы и фукозы затем элюировали 96% этанолом. Этанол впоследствии испаряли на роторном испарителе и остаток фильтровали с помощью 10 кДа модуль поперечного потока (Microdyn Nadir, Germany). Остающиеся соли удаляли путем электродиализа и после этого удаляли эндотоксины путем фильтрации, используя модуль поперечного потока (Pall, Germany). Затем 3-FL отделяли от лактозы и фукозы по шкале Грама, используя материал Biogel P-2 (BioRad, Germany) гельпроникающей хроматографии, запакованный в стеклянную колонку 520 мм×428 мм с фриттой. Очистку 3-FL контролировали по тонкослойной хроматографии (смотри фигуру 8). Фракции, содержащие только 3-фукозиллактозу, объединяли и сушили при заморозке.
Подтверждение идентичности продукта
Очищенную 3-фукозиллактозу, полученную, используя фукозилтрансферазы, представленные в данном изобретении, проанализировали с использованием 1H-ЯМР и масс-спектрометрии. Полученные в результате спектры согласовались со спектрами, ожидаемыми для 3-FL. В добавление к этому, чтобы проверить идентичность полученной в результате 3-FL, применяли различные ВЭРХ методы. Один метод представлял собой разделение, используя Phenomenex Rezex RCM Ca2+ колонку с водой как элюентом (0,6 мл/мин в течение 30 минут при 80°C), и детектирование, используя рефрактометрический детектор (Shimadzu, Germany) (смотри фигуру 9A). Другой метод представлял собой разделение на Dionex CarboPac PA1 колонке с 50 мМ NaOH как элюентом (1 мл/мин в течение 35 минут при 30°C) и детектирование с использованием электрохимического детектора DECADE II (Antec Leyden, Netherlands) (смотри фигуру 9В).