СПОСОБ И АППАРАТ ДЛЯ ПРОЦЕССА ВОССТАНОВЛЕНИЯ АНТИГЕНА
METHOD AND APPARATUS FOR ANTIGEN RETRIEVAL PROCESS

Предшествующий уровень техники
В диагностической клеточной визуализации используются способы, посредством которых молекулы, продуцируемые клетками или тканями, могут быть специфически локализованы на этих клетках или тканях. Это предоставляет исследователю информацию о сайтах продуцирования или активности таких молекул. Для специфической локализации белков в стандартной патологии обычно используют способ, известный как иммуногистохимия (IHC). При IHC на образец фиксированной ткани наносят антитело к конкретному антигену, которое на первой стадии распознает известную конкретную молекулу. Это антитело затем обнаруживают посредством использования вторичного антитела, которое химически связано с ферментом, таким как пероксидаза хрена. После инкубации с хромогенным субстратом, таким как ди-амино-бензидин (DAB), на месте вторичного антитела, связавшегося с первичным антителом в специфическом месте интересующего белка, возникает окрашенное отложение. Этот способ в настоящее время используется для более чем 200 антител в лабораториях клинической патологии и гораздо большего количества в научно-исследовательской среде.
2
Природа обрабатываемой ткани требует, чтобы образцы были "зафиксированы" до заливки в парафин и изготовления микросрезов на микротоме с получением срезов тканей, подходящих для иммуноокрашивания. Во время этого процесса белки защищают, используя обработку формальдегидом, которая создает химическое перекрестное связывание, защищающее клеточные свойства ткани. Формальдегид защищает или фиксирует ткань или клетки преимущественно путем перекрестного связывания первичных аминогрупп в белках с другими находящимися рядом атомами азота в белке или ДНК при помощи связи -СН-. Однако данный способ фиксации ткани часто маскирует антигены на конкретных белках, обнаружение которых желательно для диагностических и прогностических целей. Типичные методики оптимизированы для обнаружения отдельных целевых молекул и, при необходимости, серийные срезы обрабатывают другим образом для обнаружения дополнительных целевых молекул. Вместе с развитием возможности обнаруживать множество антигенов в одном образце возникает необходимость в однородной обработке ткани, которая совместима с обнаружением множества белков.
Краткое изложение сущности изобретения
В первом аспекте в изобретении предложен способ восстановления антигена в фиксированном формальдегидом образце ткани, включающий стадию инкубирования образца ткани, фиксированной формальдегидом, в первом растворе для восстановления антигена при температуре выше 90°С, перенос образца ткани во второй раствор для восстановления антигена и инкубирование образца ткани во втором растворе для восстановления антигена при температуре выше 90°С.
Во втором аспекте в изобретении предложен набор для восстановления антигенов в образце ткани, фиксированной формальдегидом, содержащий первый раствор для восстановления антигена, который восстанавливает по меньшей мере часть невосстановленных антигенов в образце, и второй раствор для восстановления антигена, который восстанавливает по меньшей мере некоторые из другой части невосстановленных антигенов в образце.
В третьем аспекте в изобретении предложено устройство для обработки образца для осуществления способа восстановления антигена, содержащее подсистему для обработки образца, подсистему для распределения реагента и подсистему для обнаружения сигнала.
Графические материалы
Эти и другие особенности, аспекты и преимущества настоящего изобретения станут понятнее после прочтения следующего подробного описания со ссылкой на сопутствующие графические материалы, где аналогичные символы представляют аналогичные части в графических материалах.
На ФИГ. 1 представлено типичное устройство для обработки образца для приведения в контакт образца ткани, фиксированного формальдегидом, с растворами для восстановления антигена.
На ФИГ. 2 представлена монохроматическая микрофотография (при увеличении 20Х или 63Х), демонстрирующая усиленное окрашивание с использованием двухстадийной методики по сравнению с одностадийной методикой.
НА ФИГ. 3 представлены монохроматические микрофотографии (при увеличении 20Х), демонстрирующие усиленное окрашивание с использованием двухстадийной методики в мультиплексном анализе FISH опухоли BrCA.
На ФИГ. 4 представлена столбчатая диаграмма результатов количественного анализа, сравнивающая ручной двухстадийный способ восстановления антигена с автоматическими способами.
НА ФИГ. 5 показаны монохроматические микрофотографии (при увеличении 20Х) эффекта просветления на окрашивание антигена-S6 в образце, приготовленном либо при помощи ручного двухстадийного способа восстановления антигена, либо одного из двух автоматических способов восстановления антигена.
Подробное описание изобретения
Для более ясного и краткого описания и указания объекта заявленного изобретения предложены следующие определения конкретных терминов, которые используются в следующем описании и формуле изобретения.
Определения
2
"Антитело" относится к иммуноглобулину, который специфически связывается с конкретной пространственной и полярной организацией другой молекулы и, таким образом, определен как комплементарный ей. Антитело может быть моноклональным или поликлональным и может быть приготовлено способами, хорошо известными в области техники, такими как иммунизация хозяина и сбор сывороток (поликлональных), или путем получения стабильных гибридных клеточных линий и сбора секретируемого белка (моноклонального), или путем клонирования и экспрессирования нуклеотидных последовательностей или их мутированных вариантов, кодирующих, по меньшей мере, аминокислотные последовательности, требующиеся для специфического связывания с природными антителами. Антитела могут включать полноразмерный иммуноглобулин или его фрагмент, где иммуноглобулины включают различные классы и изотипы, такие как IgA, IgD, IgE, IgGI, IgG2a, lgG2b и lgG3, IgM. Функциональные фрагменты антител могут включать фрагменты антитела, способные сохранять связывание с полноразмерным антителом (например Fab, Fv и F (ab'), или Fab') с аналогичной аффинностью. Кроме того, агрегаты, полимеры и конъюгаты иммуноглобулинов или их фрагментов могут быть использованы при необходимости, пока по существу сохраняется связывающая аффинность в отношении конкретной молекулы.
"Антиген" относится к веществу, которое может связываться с антителом или фрагментом антитела. Антигены могут быть эндогенными, когда они продуцируются внутри клетки в результате нормального или аномального клеточного метаболизма, или в результате вирусных или внутриклеточных бактериальных инфекций. Эндогенные антигены включают ксеногенные (гетерологические), аутологические и идиотипические или аллогенные (гомологичные) антигены. Антигены могут также представлять собой опухолеспецифические антигены или презентироваться опухолевыми клетками. В этом случае они называются опухолеспецифическими антигенами (TSA) и, как правило, возникают в результате опухолеспецифической мутации. Антигены могут также представлять собой опухоль-ассоциированные антигены (ТАА), которые презентируются опухолевыми клетками и нормальными клетками. Антиген также включает CD-антигены, которые относятся к любому из множества маркеров клеточной поверхности, экспрессируемых лейкоцитами, и могут быть использованы для различения последовательностей клеточных поколений или стадий развития. Такие маркеры можно идентифицировать при помощи специфических моноклональных антител и нумеровать в соответствии с их кластером дифференцировки.
"FISH" и "CISH" относятся к флуоресцентной гибридизации in situ и хромогенной гибридизации in situ соответственно. FISH представляет собой цитогенетический метод, используемый для обнаружения и локализации присутствия или отсутствия специфических последовательностей ДНК на хромосомах или последовательностей РНК в сайтах транскрипции, а также в других частях клетки. FISH использует флуоресцентные зонды, которые связываются только с теми фрагментами хромосомы, с которыми они демонстрируют высокую степень идентичности последовательностей. CISH позволяет обнаружить амплификацию генов, хромосомные транслокации и число хромосом с использованием обычных ферментативных реакций под микроскопом со светлым полем на фиксированных формалином погруженных в парафин тканях (FFPE).
"Иммуноокрашивание" относится к основанному на антителе способу обнаружения специфического белка в образце. Иммуноокрашивание включает как иммуноцитохимическое окрашивание, так и иммуногистохимическое окрашивание. Иммуноцитохимическое (IСС) окрашивание относится к способу, в котором используются антитела, нацеленные на антигены на клетках. Оно может быть проведено для определения присутствия некоторых заболеваний, например типов рака. Иммуногистохимическое (IНС) окрашивание относится к окрашиванию и локализации антигенов в срезах ткани путем использования меченых антител в качестве специфических реагентов при взаимодействиях антиген-антитело, которые визуализируются при помощи маркера, такого как флуорофоры, прореагировавшие субстраты ферментов, радиоактивный элемент или коллоидное золото.
"Зонд" относится к агенту, имеющему связывающий элемент и метку, такому как генератор сигнала или фермент. В некоторых воплощениях связывающий элемент и метка (генератор сигнала или фермент) представляют собой один объект. При использовании здесь "связывающий элемент" относится к молекуле, способной взаимодействовать с другой молекулой или ассоциироваться с другой молекулой, такой как антиген, связывающийся с антителом. Связывающий элемент и метка могут быть присоединены непосредственно (например через флуоресцентную молекулу, включенную в связывающий элемент) или опосредованно (например через линкер, который может включать сайт расщепления) и нанесены на образец ткани за одну стадию. В альтернативных воплощениях связывающий элемент и метка представляют собой отдельные объекты (например первичное антитело, способное связываться с мишенью, и фермент или меченное генератором сигнала вторичное антитело, способное связываться с первичным антителом). Когда связывающий элемент и метка (генератор сигнала или фермент) представляют собой отдельные объекты, они могут быть нанесены на образец ткани за одну стадию или множество стадий. Термин "флуоресцентный зонд" относится к агенту, имеющему связывающий элемент, связанный с генератором флуоресцентного сигнала.
"Генератор сигнала" относится к молекуле, способной обеспечивать обнаруживаемый сигнал с использованием одного или более чем одного способа обнаружения (например спектрометрии, калориметрии, спектроскопии или визуального осмотра). Подходящие примеры обнаруживаемого сигнала могут включать оптический сигнал и электрический сигнал, или радиоактивный сигнал. Примеры генераторов сигнала включают один или более чем один из:
хромофора, флуорофора, маркера, обладающего рамановской активностью, или радиоактивной метки. Как указано выше в отношении зонда, в некоторых воплощениях генератор сигнала и связывающий элемент могут быть представлены в одном объекте (например связывающийся с мишенью белок с флуоресцентной меткой). Альтернативно, связывающий элемент и генератор сигнала могут представлять собой отдельные объекты (например рецепторный белок и меченое антитело к данному конкретному рецепторному белку), которые ассоциируются друг с другом до или после введения в образец.
"Флуорофор" или "генератор флуоресцентного сигнала" относится к химическому соединению, которое при возбуждении посредством воздействия конкретной длины волны, излучает свет с другой длиной волны. Флуорофоры могут быть описаны исходя из их эмиссионного профиля или "цвета". Зеленые флуорофоры (например Су3, FITC (флуоресцеина изотиоцианат) и Орегоновый зеленый) могут быть охарактеризованы эмиссией при длинах волн, как правило находящихся в диапазоне от 515 до 540 нанометров. Красные флуорофоры (например Техасский красный, Су5 и тетраметилродамин) могут быть охарактеризованы эмиссией при длинах волн, как правило находящихся в диапазоне от 590 до 690 нанометров. Примеры флуорофоров включают 4-ацетамидо-4'-изотиоцианатостильбен-2,2'-дисульфоновую кислоту, акридин, производные акридина и акридина изотиоцианат, 5-(2'-аминоэтил)аминонафталин-1-сульфоновую кислоту (EDANS), 4-амино-N-[3-винилсульфонил)фенил]нафталимид-3,5-дисульфонат (Lucifer Yellow VS), N-(4-анилино-1-нафтил)малеимид, антраниламид, Бриллиантовый желтый, кумарин, производные кумарина, 7-амино-4-метилкумарин (АМС, Кумарин 120), 7-амино-трифторметилкумарин (Кумаран 151), цианозин; 4',6-диаминидино-2-фенилиндол (DAPI), 5',5"-дибромпирогаллол-сульфонефталеин (Бромпирогаллоловый красный), 7-диэтиламино-3-(4'-изотиоцианатофенил)-4-метилкумарин, 4,4'-диизотиоцианатодигидро-стильбен-2,2'-дисульфоновую кислоту, 4,4'-диизотиоцианатостильбен-2,2'-дисульфоновую кислоту, 5-[диметиламино]нафталин-1-сульфонилхлорид (DNS, дансилхлорид), эозин, производные эозина, такие как эозина изотиоцианат, эритрозин, производные эритрозина, такие как эритрозин В и эритрозина изотиоцианат; этидий; флуоресцеин и производные, такие как 5-карбоксифлуоресцеин (FAM), 5-(4,6-дихлортриазин-2-ил)аминофлуоресцеин (DTAF), 2',7'-диметокси-4',5'-дихлор-6-карбоксифлуоресцеин (JOE), флуоресцеин, флуоресцеина изотиоцианат (FITC), QFITC (XRITC); производное флуорескамина (флуоресценция при взаимодействии с аминами); IR144; IR1446; Малахитовый зеленый изотиоцианат; 4-метилумбеллиферон; орто-крезолфталеин; нитротирозин; парарозанилин; феноловый красный, β-фикоэритрин; производное орто-фталдиальдегида (флуоресценция при взаимодействии с аминами); пирен и производные, такие как пирен, пиренбутират и сукцинимидил-1-пиренбутират; Reactive Red 4 (Cibacron.RTM. бриллиантовый красный 3В-А), родамин и производные, такие как 6-карбокси-Х-родамин (ROX), 6-карбоксиродамин (R6G), лиссамин-родамина В сульфонилхлорид, родамин (Rhod), родамин В, родамин 123, родамина Х изотиоцианат, сульфородамин В, сульфородамин 101 и сульфонилхлоридное производное сульфородамина 101 (техасский красный);
N,N,N',N'-тетраметил-6-карбоксиродамин (TAMRA); тетраметилродамин, тетраметилродамина изотиоцианат (TRITC); рибофлавин; хелатные производные розоловой кислоты и лантанида, квантовые точки, цианины, пирилиевые красители и скварены, но не ограничиваются ими.
"Мишень" относится к компоненту образца ткани, который может быть обнаружен, будучи представленным в образце ткани. Мишень может представлять собой любое вещество, для которого существует природный специфический связывающийся элемент (например антитело), или для которого специфический связывающийся элемент может быть получен (например низкомолекулярный связывающийся элемент или аптамер). Как правило, связывающийся элемент может связываться с мишенью посредством одной или более чем одной отдельной химической группировки мишени или трехмерного структурного компонента мишени (например 3D структур, образующихся в результате свертывания пептидов). Мишень может включать один или более природных или модифицированных пептидов, белков (например антител, аффител или аптамеров), нуклеиновые кислоты (например полинуклеотиды, ДНК, РНК или аптамеры); полисахариды (например пектины или сахара), липиды, ферменты, ферментативные субстраты, лиганды, рецепторы, антигены или гаптены. В некоторых воплощениях мишени могут включать белки или нуклеиновые кислоты. В некоторых воплощениях мишени могут включают как белки, так и нуклеиновые кислоты.
Изобретение включает воплощения, которые в целом относятся к способам, применимым в аналитических, диагностических или прогностических применениях, таких как обнаружение анализируемого вещества, гистохимия, иммуноокрашивание, иммуногистохимия, иммуноцитохимия или иммунофлуоресценция. В некоторых воплощениях раскрытые здесь способы могут быть особенно применимы в иммуногистохимии и иммуноцитохимии.
В соответствии с одним воплощением, описан способ, в котором срез ткани, полученный в результате отбора патологического образца, обрабатывают перед обнаружением белка для биомаркерной оценки. В одном воплощении способ включает двухстадийную процедуру, которая применима к множеству белковых антигенов и может обеспечивать высокий уровень восстановления антигена. В некоторых воплощениях это обеспечивает возможность мультиплексной диагностики клинически релевантных образцов.
В некоторых воплощениях образец ткани включает срезы ткани из здоровых или больных тканей (например срезы ткани толстой кишки, ткани молочной железы, предстательной железы). Образец ткани может включать единичный фрагмент или кусочек среза ткани, например тонкий срез ткани, или клетки, вычлененные из среза ткани. В некоторых воплощениях тот же самый срез образца ткани может быть проанализирован как на морфологическом, так и на молекулярном уровнях.
В некоторых воплощениях образец ткани может быть сначала зафиксирован и затем дегидратирован посредством возрастающей серии спиртов, инфильтрован и погружен в парафин или другие среды для изготовления срезов таким образом, что могут быть изготовлены срезы образца ткани. В альтернативном воплощении могут быть изготовлены срезы образца ткани и затем образец зафиксирован. В некоторых воплощениях образец ткани может быть помещен в парафин и обработан в парафине. Примеры парафина, который можно использовать, включают Paraplast, Broloid и Tissuecan, но не ограничены ими. После того как образец ткани помещен в парафин, он может быть разделен на срезы при помощи микротома. Толщина срезов может варьироваться в зависимости от типа ткани и анализа. В некоторых воплощениях срезы могут иметь предпочтительную толщину в диапазоне от приблизительно двух микрон до приблизительно пяти микрон.
После изготовления срезов они могут быть прикреплены к слайдам с использованием адгезивов. Примеры адгезивов для слайдов могут включать силан, желатин, поли-L-лизин, но не ограничиваться ими. В воплощениях, если парафин используют в качестве материала, в который помещаю образец, то срезы ткани могут быть депарафинизированы и регидратированы в воде. Срезы ткани могут быть депарафинизированы, например, с использованием органических агентов (таких как ксилолы или постепенно возрастающая серия спиртов).
В других воплощениях образец ткани, зафиксированной формальдегидом, может быть прикреплен к твердому носителю для того, чтобы обеспечить возможность его анализа, переноса и передвижения во время процессов приготовления и визуализации. Образец ткани может быть иммобилизован на твердом носителе посредством физической абсорбции, посредством образования ковалентной связи или посредством их комбинации. Твердый носитель может включать полимерный, стеклянный или металлический материал. Примеры твердых носителей включают мембрану, микротитровальный планшет, гранулы, фильтр, тестовую полоску, слайд, покровную полоску и тестовую пробирку.
В одном воплощении описан способ, в котором образец ткани, фиксированной формальдегидом, приводят в контакт с первым раствором для восстановления антигена и нагревают до температуры выше 90°С в течение периода времени более 10 минут, более предпочтительно в течение периода времени приблизительно 20 минут. Нагревание можно осуществлять с использованием скороварки, автоклава, водяной бани, электроплитки, микроволновой печи или парового нагревателя, для обеспечения равномерного нагрева образца ткани, погруженного в раствор для восстановления антигена. Образец ткани затем переносят без дополнительной обработки во второй раствор для восстановления антигена, который был предварительно нагрет до температуры выше 90°С, на аналогичный период времени. Предварительно нагревание можно осуществлять с использованием скороварки, автоклава, водяной бани, электроплитки, микроволновой печи, парового нагревателя или их комбинации, и оно может быть осуществлено в момент нагревания первого раствора для восстановления антигена. Предпочтительно инкубацию образца во втором растворе для восстановления антигена осуществляют при атмосферном давлении и путем погружения только в горячий раствор. Это может предотвратить повреждение ткани.
В одном воплощении первый раствор для восстановления антигена представляет собой буферный раствор, имеющий рН в диапазоне от приблизительно 5 до приблизительно 7. Первый раствор для восстановления антигена может представлять собой обычно используемый буферный раствор, используемый для поддержания рН в диапазоне от слегка кислого до нейтрального. В некоторых воплощениях буфер может содержать лимонную кислоту, дигидрофосфат калия, борную кислоту, диэтилбарбитуровую кислоту, пиперазин-N,N'-бис(2-этансульфоновую кислоту), диметиларсиновую кислоту, 2-(N-морфолино)этансульфоновую кислоту или их комбинации. В других воплощениях буферный раствор может представлять собой буферный раствор лимонной кислоты и фосфата натрия, имеющий рН приблизительно 6,0 при повышенных температурах.
При использовании нагревания первый раствор для восстановления антигена может действовать, гидролизуя перекрестно-сшивающие связи, которые могли образовываться между формалином и антигеном во время фиксации образца. Это приводит к тому, что по меньшей мере некоторая часть антигена в образце восстанавливается.
В одном воплощении второй раствор для восстановления антигена представляет собой буферный раствор, имеющий щелочное рН в диапазоне от приблизительно 7,5 до приблизительно 11. Второй раствор для восстановления антигена может представлять собой обычно используемый буферный раствор,используемый для поддержания рН в слегка щелочном диапазоне. В некоторых воплощениях буферный раствор может состоять из трис(гидроксиметил)метиламина (TRIS), 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (TAPS), N,N-бис(2-гидроксиэтил)глицина (Бицин), N-трис(гидроксиметил)метилглицина (Трицин), 4-2-гидроксиэтил-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты (HEPES), 2-{[трис(гидроксиметил)метил]амино}этансульфоновой кислоты (TES) или их комбинации. В еще одном воплощении буферный раствор может представлять собой буфер TRIS-HCI, имеющий рН приблизительно 10 при повышенных температурах.
Как и первый раствор для восстановления антигена, второй раствор для восстановления антигена может действовать, гидролизуя перекрестно-сшивающие связи, которые могут быть образованы между формалином и антигеном во время фиксации образца. Часть восстановленного антигена представляет собой по меньшей мере некоторые из другой части невосстановленных антигенов в образце.
Следует понимать, что в других воплощениях первый раствор для восстановления антигена может представлять собой буферный раствор в диапазоне от приблизительно 7,5 до приблизительно 11, и второй раствор для восстановления антигена может представлять собой буферный раствор в диапазоне от приблизительно 5 до приблизительно 7.
Антиген, восстанавливаемый путем воздействия первым и вторым растворами для восстановления антигена, может быть более подвержен иммуноокрашиванию для того, чтобы обеспечить и аналитические исследования и исследования функциональной морфологии. Иммуноокрашивание включает как иммуногистохимическое (IHC) окрашивание, так и иммуноцитохимическое (ICC) окрашивание. В некоторых воплощениях улучшение может включать повышенную интенсивность положительного окрашивания и уменьшение фонового окрашивания.
В некоторых воплощениях после применения второго раствора для восстановления антигена может быть осуществлено иммуноокрашивание образца. Раствор антитела (например зонда) может быть приведен в контакт со срезом ткани в течение достаточного периода времени и в условиях, подходящих для связывания меченого антитела с антигеном. Могут быть использованы два способа обнаружения: прямой или непрямой. При прямом обнаружении меченное генератором сигнала первичное антитело (например меченное флуорофором первичное антитело) можно инкубировать с антигеном в образце ткани, который может быть визуализирован без дополнительного взаимодействия с антителом. При опосредованном обнаружении неконъюгированное первичное антитело можно инкубировать с антигеном, и затем меченное вторичное антитело может связываться с первичным антителом. Может иметь место сигнальная амплификация, так как несколько вторичных антител могут взаимодействовать с разными эпитопами на первичном антителе. В тех воплощениях, где вторичное антитело может быть конъюгировано с ферментативной меткой, для обеспечения визуализации антигена может быть добавлен хромогенный или флуорогенный субстрат. В некоторых воплощениях два или более (максимально четыре) первичных антитела (меченных или немеченных) могут быть приведены в контакт с образцом ткани. Немеченые антитела могут быть затем приведены в контакт с соответствующими меченными вторичными антителами. В некоторых воплощениях для усиления сигнала можно использовать другие способы, такие как использование меченного третичного или четвертичного антитела.
В некоторых воплощениях после процесса восстановления антигена нуклеиновокислотные зонды наносят на образец для осуществления флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) или хромогенной гибридизации in situ (CISH).
Сигнал из генератора сигнала в зонде может быть обнаружен с использованием системы обнаружения. Природа используемой системы обнаружения может зависеть от природы используемых генераторов сигнала. Система обнаружения может включать систему обнаружения на основе электронно-спинового резонанса (ESR), систему обнаружения на основе прибора с зарядовой связью (CCD) (например для радиоизотопов), флуоресцентную систему обнаружения, электрическую систему обнаружения, систему обнаружения на основе фотографической пленки, хемилюминесцентную систему обнаружения, ферментативную систему обнаружения, систему обнаружения на основе атомно-силовой микроскопии (AFM) и систему обнаружения на основе сканирующей туннельной микроскопии (STM) (обе из которых используют, например, в обнаружении микрочастиц), оптическую систему обнаружения, систему обнаружения на основе ближнего поля или систему обнаружения на основе полного внутреннего отражения (TIR).
Один или более чем один из вышеупомянутых методов можно использовать для обнаружения одной или более чем одной характеристики первого сигнала с первого генератора сигнала. В некоторых воплощениях интенсивность сигнала, длина волны сигнала, локализация сигнала, частота сигнала или сдвиг сигнала можно определить, используя один или более чем один из вышеупомянутых способов. В некоторых воплощениях одна или более чем одна из вышеупомянутых характеристик сигнала может быть обнаружена, измерена и зарегистрирована. В некоторых воплощениях генератор сигнала может включать флуорофор, и длина волны флуоресценции или интенсивность флуоресценции могут быть определены с использованием флуоресцентной системы обнаружения. В некоторых воплощениях сигнал может быть обнаружен in situ, то есть сигнал может быть обнаружен непосредственно с генератора сигнала, соединенного через связывающий элемент с мишенью в образце ткани. В некоторых воплощениях сигнал с генератора сигнала может быть проанализирован в образце ткани, исключая необходимость в отдельных матричных системах обнаружения. В других воплощениях после связывания зонда сигнальный элемент может быть отделен от связывающего элемента и обнаружен на удалении от биологического образца. Способы разделения сигнала могут включать ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) и масс-спектрометрию, гибридизационные микроматрицы, но не ограничиваются ими.
В некоторых воплощениях обнаружение сигнала может включать захват изображения образца ткани. В некоторых воплощениях в качестве системы обнаружения может быть использован микроскоп, соединенный с визуализирующим устройством, в соответствии с раскрытыми здесь способами. В некоторых воплощениях генератор сигнала (такой как флуорофор) может быть возбужден, и полученный сигнал (такой как флуоресцентный сигнал) может быть обнаружен и записан в форме цифрового сигнала (например оцифрованного изображения). Тот же самый метод может быть повторен для разных генераторов сигнала (если они присутствуют), которые связаны в образце с использованием подходящих фильтров флуоресценции.
На образец ткани для модификации сигнала может быть нанесен химический агент. В некоторых воплощениях модификация сигнала может включать одно или более чем одно изменение характеристики сигнала, например уменьшение интенсивности сигнала, сдвиг пика сигнала, изменение резонансной частоты, или отщепление (удаление) генератора сигнала, что приводит к удалению сигнала.
В некоторых воплощениях химический агент может находиться в форме раствора, и образец ткани может быть приведен в контакт с раствором химического агента в течение предопределенного количества времени. Концентрация раствора химического агента и время контакта может зависеть от желательного типа модификации сигнала. В некоторых воплощениях могут быть выбраны условия контакта для химического агента, так чтобы не оказывалось влияние на связывающий элемент, мишень, образец ткани и связывание между связывающим элементом и мишенью. В некоторых воплощениях химический агент может влиять только на генератор сигнала, и химический агент может не влиять на связывание мишень/связывающий элемент или целостность связывающего элемента. Таким образом, в качестве примера, связывающий элемент может включать первичное антитело или первичное антитело/вторичная комбинация. Химический агент в соответствии с раскрытыми здесь способами может только влиять на генератор сигнала, и первичное антитело или комбинация первичное антитело/вторичное антитело может по существу оставаться незатронутыми. В некоторых воплощениях связывающий элемент (такой как первичное антитело или комбинация первичное антитело/вторичное антитело) может оставаться связанным с мишенью в образце ткани после контактирования образца с химическим агентом. В некоторых воплощениях связывающий элемент может оставаться связанным с мишенью в образце ткани после контактирования образца с химическим агентом, и целостность связывающего элемента может оставаться по существу неизменной (например антитело может по существу не денатурироваться или элюироваться в присутствии химического агента). В других воплощениях химический агент может влиять на связывание мишени/связывающего элемента или контакты/связи связывающего элемента/сигнального элемента.
В некоторых воплощениях множественные мишени могут быть обнаружены посредством "отделения" зонда и повторного зондирования образца. Отделение в общем случае относится к любому способу, такому как, но без ограничения ими, погружение в или промывание посредством неоднократного применения немеченного раствора или другого вещества, такого как, но без ограничения ими, вода, физиологический раствор, забуференный физиологический раствор или этанол, так чтобы создать среду для диссоциации, диспергирования и удаления зонда из образца. В некоторых воплощениях многие мишени могут быть обнаружены путем использования света для флуоресцентного осветления репортера или генератора сигнала, таким образом обеспечивая возможность использовать генератор сигнала повторно на новом зонде. Эти способы могут быть многократно повторены для получения множественных зондирований одного образца.
В некоторых воплощениях характеристику сигнала можно наблюдать после приведения образца в контакт с химическим агентом для определения эффективности модификации сигнала. Например, окрашивание можно наблюдать до применения химического агента, и окрашивание может отсутствовать после применения химического агента. В другом примере интенсивность флуоресценции с генератора флуоресцентного сигнала может быть обнаружена до приведения в контакт с химическим агентом и после приведения в контакт с химическим агентом. В некоторых воплощениях уменьшение интенсивности сигнала при помощи предварительно определенного количества может быть названо модификацией сигнала. В некоторых воплощениях модификация сигнала может относиться к уменьшению интенсивности сигнала на величину в диапазоне более чем приблизительно 50 процентов. В некоторых воплощениях модификация сигнала может относиться к уменьшению интенсивности сигнала на величину в диапазоне более чем приблизительно 60 процентов. В некоторых воплощениях модификация сигнала может относиться к уменьшению интенсивности сигнала на величину в диапазоне более чем приблизительно 80 процентов.
В некоторых воплощениях образец ткани может быть приведен в контакт со вторым зондом с использованием одного или более чем одного способа, описанного выше в отношении первого зонда. Второй зонд может быть способным связываться с мишенью, отличающейся от мишени, связанной с первым зондом. В воплощениях, где множество зондов может быть приведено в контакт с образцом ткани на стадии контакта с первым зондом, второй зонд может быть способен связывать мишень, отличную от мишеней, связанных с набором первых зондов. В некоторых воплощениях образец ткани может быть приведен в контакт с множеством зондов на стадии контакта со вторым зондом.
Один или более чем один из описанных ранее способов обнаружения можно использовать для наблюдения одной или более чем одной характеристики последующего (например второго, третьего и т.д.) сигнала с генератора второго сигнала (присутствующего в последующем зонде). В некоторых воплощениях интенсивность сигнала, длина волны сигнала, локализация сигнала, частота сигнала или сдвиг сигнала могут быть определены с использованием одного или более вышеупомянутых способов. По аналогии с первым сигналом, полученный последующий сигнал (например флуоресцентный сигнал) может быть зарегистрирован в форме цифрового сигнала (например оцифрованного изображения). В некоторых воплощениях наблюдение последующего сигнала также может включать захват оптического изображения образца ткани.
В некоторых воплощениях после приведения в контакт образца с последующим (например вторым, третьим и т.д.) зондом, модификация агента и последующее введение зонда могут быть повторены множество раз. В некоторых воплощениях после наблюдения второго сигнала со второго зонда образец ткани может быть приведен в контакт с химическим агентом для модификации сигнала со второго зонда. Кроме того, третий зонд может быть приведен в контакт с образцом ткани, где третий зонд может быть способен связываться с мишенью, отличной от первого и второй зондов. Аналогично, сигнал с третьего зонда может быть обнаружен после применения химического агента для модификации сигнала. Стадии приведения в контакт, связывания и обнаружения могут быть повторены неоднократно множество раз с использованием n-го зонда, способного связываться с дополнительными мишенями для обеспечения пользователя информацией о множестве мишеней с использованием множества зондов и/или генераторов сигнала.
В некоторых воплощениях серии зондов могут быть приведены в контакт с образцом ткани последовательным образом с достижением мультиплексного анализа образца ткани. В некоторых воплощениях серии наборов зондов (включающие приблизительно 4 зонда в одном наборе) могут быть приведены в контакт с образцом ткани последовательным образом для осуществления мультиплексного анализа образца ткани. Мультиплексный анализ в общем случае относится к анализу множества мишеней в образце ткани с использованием того же самого механизма обнаружения.
В некоторых воплощениях предложен набор, полезный для осуществления способов восстановления антигена, описанных выше. Набор может содержать один или более чем один из растворов для восстановления антигенов. Набор также может содержать инструкцию по применению.
В некоторых воплощениях набор включает один или более чем один дополнительный реагент для иммуноокрашивания и обнаружения. Например, в некоторых воплощениях набор может включать генератор сигнала, такой как хромофор, флуорофор, маркер, обладающий рамановской активностью, или радиоактивную метку. Набор также может включать реагенты, которые могут улучшать обнаружение или амплификацию сигнала, как описано выше, включающие, но без ограничения ими, фермент полимеразу, другие буферы, катионы и соли металлов.
В соответствии с одним воплощением, как показано на Фиг.1, описано устройство для обработки образца 10 для приведения в контакт образца ткани, фиксированного формальдегидом 15 с вышеупомянутыми растворами для восстановления антигена и другими промывающими и окрашивающими растворами. Устройство для обработки образца может состоять из подсистемы для управления образцом 20 и подсистемы для подачи реагента 30. В некоторых воплощениях устройство также может включать подсистему для обнаружения сигнала 40. В одном воплощении устройство для обработки образца может быть включено в качестве компонента аналитического устройства, такого как автоматическая высокопроизводительная система, способная окрашивать и визуализировать фиксированный формальдегидом образец ткани в одной системе и также затем анализировать изображения.
В одном воплощении сама система может включать подсистему для обработки образца для размещения и передвижения образца ткани, фиксированной формальдегидом, для анализа, и подсистему для подачи реагента для приведения образца в контакт по меньшей мере с одним из первого раствора для восстановления антигена, второго раствора для восстановления антигена и иммуноокрашивающего реагента. Система обработки образца может включать множество компонентов и обеспечивает передвижение образца от одной области в другую. Например, образец может быть приведен в контакт с реагентами с использованием одного устройства, и перемещен и зафиксирован на предметном столике для визуализации, где перемещение предметного столика является контролируемым. Предметный столик может быть включен в микроскоп и способен перемещать образец в области визуализации.
Эта система также может включать подсистему для обнаружения сигнала (не показана) для фиксации изображений образца в процессе окрашивания. Изображение может быть зафиксировано с использованием различных источников освещения. В некоторых воплощениях фиксация изображения может представлять собой часть визуализирующего микроскопа, способного фиксировать и переносить цифровое изображение образца при различных увеличениях. В еще одном воплощении автоматическая система может включать машиночитаемую среду, которая может включать инструкции по автоматизированной методике анализа окрашенного фиксированного формальдегидом образца ткани.
В других воплощениях устройство для обработки образца может быть способно пройти цикл из множества стадий восстановления антигена, прикрепления флуоресцентной метки, визуализации и отделения флуоресцентного зонда. Окрашивание также может включать введение иммунопероксидазной метки. В одном воплощении можно использовать растворимый в спирте пероксидазный субстрат 3-амино-9-этилкарбазол (АЕС) с последующим удалением осадка АЕС, возможно дополнительной инактивацией пероксидазы посредством умеренной пероксидазной обработки и повторного окрашивания. В других воплощениях флуоресцентный зонд может быть отделен посредством химической обработки, тепловой обработки или их комбинации.
Устройство для обработки образца может быть автоматизировано так, что множество циклов может быть осуществлено in situ для минимизации вытеснения образца и для того, чтобы способствовать картированию множества маркеров в одном срезе ткани или клеточном образце.
Экспериментальный раздел
Способы
Переменные, которые влияют на отношение сигнал/шум, отражающее чувствительность системы, анализировали, используя подход с планированием эксперимента (DOE). Переменные включали температуру, время воздействия, рН и последовательность промывки. Изображения регистрировали, используя микроскоп Zeiss Axilmager Z1 с 20х или 63х увеличением. Количественный анализ изображений выполняли, используя программное обеспечение для обработки изображений GNU Image Manipulation Program (GIMP), рассчитывающего среднюю интенсивность пикселей на площадь после вычитания фоновой интенсивности пикселей из неокрашенных областей. Среднюю интенсивность пикселей рассчитывали как среднее значение для 10 изображений одной и той же ткани.
Для исследования использовали следующие материалы: человеческая архивная ткань происходила из разных источников и включала образцы молочной железы, предстательной железы, легкого, толстой кишки, плаценты, слюнных желез, лимфатического узла, головного мозга и кожи. Все образцы были взяты из тканевых архивов. Специфичность примененной фиксации не известна, и, как предполагается, соответствует стандартной патологической практике. Антитела к AR были получены из Lab Vision Corporation (часть Thermo Fisher Scientific) и были конъюгированы с Су3 и Су5 флуорохромами с использованием стандартных методов. Цитратный раствор для восстановления антигена был получен из Vector Laboratories и разбавлен 1:20 до конечного значения рН 6,0. Буфер на основе Tris состоял из 10 мМ Tris (трис(гидроксиметил)аминометан), 1 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота), 1% Tween-20 (полиоксиэтиленсорбитанмонолаурат) с получением значения рН 8 (получен из свежеприготовленного 10х исходного раствора). Для нагревания использовали стандартную домашнюю скороварку, установленную на высокую мощность, в течение 20 минут, и контролировали вручную.
Фиксированные в парафине погруженные срезы ткани обрабатывали путем нагревания срезов при 65°С в течение 1 часа и депарафинизации среза образца очищающим агентом histochoice. Было обнаружено, что нагревание образцов не требовалось, но использовалось в качестве стандартной практики.
Образцы затем обрабатывали при помощи ряда спиртовых промывок с уменьшающейся концентрацией (обычно 100, 95, 70, 50%), каждая для 2х 10-минутных промывок, и затем помещали в солевые условия в растворе PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор) на 10 минут. Образцы затем делали проницаемыми посредством быстрой обработки в PBS, содержащем 0,3% Triton X-100 с последующим процессом восстановления.
Процесс восстановления включал помещение образцов в раствор A (Tris рН 8,0 с 1% Tween 20) в скороварке или микроволновой печи приблизительно на 20 минут. В конце цикла нагревания образцы помещали в предварительно нагретый раствор В (цитратный раствор, рН 6) в нагретой камере без дополнительного нагревания. Образцы не переносили в холодный раствор PBS в промежутке между двумя горячими растворами, не подвергали дополнительному нагреванию во втором раствора. После доведения образцов во втором растворе до комнатной температуры (приблизительно 20 минут), образцы интенсивно промывали PBS перед любой дополнительной стадией обработки, такой как блокирование или обработка пероксидазой (для инактивации эндогенной пероксидазы).
Образцы затем могут быть подвергнуты иммунодетекции. После первого раунда иммунодетекции образцы могут быть освобождены от сигнала и повторно помечены зондами к дополнительным антигенам.
Альтернативно, срезы обрабатывали, используя Discovery XT Autostainer (Ventana Medical Systems, Inc.) с использованием программных установок, аналогичных условиям ручного способа. После штрихового кодирования образцов и приготовления реагентов, срезы загружали в автоматический окрашиватель и обрабатывали следующим образом: образцы нагревали и депарафинизировали путем промывания в реагенте EZ-prep (раствор для депарафинизации для Ventana Discovery XT). Восстановление антигена осуществляли, используя СС1 и СС2 (два раствора для восстановления антигена, поставляемые Ventana, для применения в автоматическом окрашивателе Discovery XT), растворы на основе Tris и лимонной кислоты, соответственно. Для сравнения с ручным двухстадийным способом проводили кратковременное и среднесрочное восстановление антигена, которые указываются как мягкое и стандартное в программе Discovery XT Autostainer. Следует отметить, что в автоматических системах образцы ткани промывают в промежутке между двумя стадиями восстановления антигена, что является ключевым различием между описанным здесь ручным способом и автоматизированными способами. Срезы затем окрашивали вручную параллельно с образцами, обработанными двухстадийным ручным способом.
Результаты и наблюдения
Сначала выбрали для анализа применение антитела к рецептору андрогенов (AR) для обнаружения AR в архивных срезах ткани человеческой предстательной железы. Эту комбинацию выбрали из-за того, что при окрашивании в отсутствие демаскирования эпитопа (не показано) обнаруживаемый сигнал отсутствовал. Используя два обычных буфера для демаскирования антигена, цитратный или Tris, и обрабатывая образцы в течение 20 минут в скороварке, с использованием флуоресцентного красителя получали окрашивание умеренной интенсивности. Условия цитратного демаскирования, которые использовались, представляли собой обычно используемый протокол обнаружения AR при помощи ряда антител. Тестировали различные условия, включающие только цитрат (набор 1), только Tris (набор 2), Tris затем цитрат (набор 3), и цитрат затем Tris (набор 4). Все условия тестировали на срезах в трех параллелях за исключением контрольных образцов, когда для осуществления исходного измерения окрашивали десять срезов.
В первой серии экспериментов использовали антитело Lab Vision AR с последующим обнаружением при помощи вторичного антитела Су3 осла против кролика. Для всех сборов данных использовали одинаковые времена воздействия и картины регистрировали немедленно после окрашивания. Как показано на Фиг.2, двухстадийный способ обеспечивал значительное улучшение окрашивания AR по сравнению с только цитратом или только Tris. Фиг.2 представляет собой монохроматическое изображение окрашивания, демонстрирующее усиленное окрашивание справа с использованием двухстадийного способа.
В общем случае для каждого набора срезов наблюдалось двукратное или более чем двукратное увеличение интенсивности окрашивания AR при использовании двухстадийного способа по сравнению с контрольным образцом. Контролировали время воздействия нагретым раствором для всех срезов, при этом все слайды обрабатывали в течение общего времени 50 минут. Первую стадию нагревания осуществляли под давлением в находящейся в домашней скороварке для всех экспериментальных срезов. Через 25 минут срезы из наборов 1 и 2 помещали в новую емкость с предварительно нагретым раствором (тот же самый раствор, что и на первой стадии, нагретый в отдельных емкостях, в то время пока проходила первая стадия) и оставляли охлаждаться в скороварке (не под давлением) в течение еще 25 минут. Срезы затем промывали в PBS и окрашивали в течение ночи при 4°С с помощью первичного антитела. Для срезов из наборов 3 и 4 растворы меняли на соответствующие условия, какие описаны выше, во время последних 25 минут обработки, и обрабатывали параллельно с другими наборами.
Также тестировали несколько изменения этого двухстадийного способа. В одном изменении последовательность, в которой использовали два раствора, не оказывала влияния на результаты. В результатах не обнаруживалось никаких различий, если первым использовали кислотный раствор, а затем щелочной, или наоборот.
Оказалось, что другие изменения в способе были вредными для способа. Они включали повторное сжатие образца в течение второго периода нагревания, и промывание в PBS между первой и второй стадиями. Оба этих изменения приводили в результате к значительной потере ткани из среза и, таким образом, их избегали.
После тестирования на первичных антителах к AR и обнаружения с использованием вторичных антител тестировали AR-антитела, непосредственно конъюгированные с Су5. Аналогичные результаты наблюдались с использованием прямых конъюгатов, когда наблюдалось усиленное окрашивание при тестировании широкого спектра других имеющихся в продаже антител. Этот способ также приводил к усиленному окрашиванию с использованием ряда фосфоэпитопов торгового сорта, которые часто являются нестабильными и склонны к деградации в способах восстановления.
Этот способ также можно использовать для других применений, таких как выделение белка из тканей FFPE (фиксированных в формалине и погруженных в парафин), где способы восстановления антигена, как было показано, усиливают экстракцию и выделение белка. Этот способ также можно применять в лазерной захватывающей микродиссекции из тканей FFPE как источника белков для протеомного анализа.
В еще одном воплощении изобретение можно использовать на образцах FFPE перед анализом FISH или CISH. Обычно, образец FFPE, подвергнутый анализу FISH или CISH, подвергают стадии предварительной тепловой обработки перед денатурацией ДНК и гибридизацией зонда. В соответствии с одним воплощением двухстадийный способ может заменить стадию предварительной тепловой обработки или другие процедуры, используемые для приготовления образца ткани перед анализом FISH или CISH. На Фиг.3 показаны монохроматические микроснимки (с увеличением 20Х и 63Х), демонстрирующие усиленное окрашивание с использованием двухстадийного способа в мультиплексном анализе FISH опухоли BrCA с использованием различных антител.
Сравнение способов
Автоматический способ также оценивали с использованием Discovery XT Autostainer. Имелись различия в условиях способа между автоматическим окрашивателем и ручным двухстадийным способом, связанные с функционированием инструмента. Например, автоматический окрашиватель использовал нагрев и детергент для депарафинизации образцов, тогда как в ручном способе использовали нетоксичный очищающий от парафина реагент HistochoiceTM (Amresco).
Фиксированные в формалине погруженные в парафин (FFPE) клетки LNCaP (Американская коллекция типовых культур (АТСС, Maryland) окрашивали в отношении S6, фосфо S6 ser235/236 или фосфо S6 ser240/244, после того, как клетки были приготовлены при помощи ручного двухстадийного восстановления антигена описанного здесь или при помощи двух аналогичных способов с использованием автоматического окрашивателя Discovery XT autostainer. В то время как восстановление антигена осуществляли с использованием ручного или автоматического способа, были обнаружены различия в последовательном удалении/модификации сигнала и повторном окрашивании. В большинстве случаев уменьшение окрашивания возникает в результате 1 или 5 стадий модификации сигнала с использованием автоматизированной системы. Для S6 полная утрата окрашивания происходила в результате всего одного раунда модификации сигнала с использованием автоматических способов. Во всех случаях ручной двухстадийный способ обеспечивал наилучшее сохранение каждого антигена. Ручной двухстадийный способ также демонстрировал меньшую чувствительность при окрашивании любого фосфоэпитопа.
Различия продемонстрированы на Фиг.4, которая представляет собой графическое представление количественного анализа, сравнивающего более высокую стабильность эпитопа, обеспечиваемую ручным двухстадийным способом восстановления антигена по сравнению с двумя автоматическими способами. Показаны средние интенсивности пикселей, оценивающие действие осветления на антиген-S6. Срезы готовили при помощи трех разных способов депарафинизации и восстановления антигена и подвергали 0, 1 и 5 раундам осветления перед окрашиванием. Количественный анализ указывал на то, что ручной двухстадийный способ наилучшим образом сохранял антиген. Разные эпитопы на одном и том же белке по-разному реагировали на осветление, что может указывать на преимущественный эффект эпитопа, а не на утрату белка. Это также показано на Фиг.5, которая представляет собой монохроматический микроснимок (при 20Х увеличении) эффекта осветления на антиген-86, сравнивающий ручной двухстадийный способ восстановления антигена с двумя автоматическими способами.
Изобретение может быть воплощено в других конкретных формах, не отступая от его сущности или важнейших характеристик. Таким образом, описанные здесь предшествующие воплощения следует рассматривать во всех отношениях как иллюстративные, а не ограничивающие описанное здесь изобретение. Таким образом, объем изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения, а не предшествующим описанием, и все изменения, которые подпадают под значение и диапазон эквивалентности формулы изобретения, следовательно, как предполагается, охвачены формулой изобретения.