НОВЫЙ БИСПЕЦИФИЧЕСКИЙ ФОРМАТ, ПОДХОДЯЩИЙ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В СКРИНИНГЕ С ВЫСОКОЙ ПРОПУСКНОЙ СПОСОБНОСТЬЮ

1. Биспецифический белковый комплекс, имеющий формулу A-X:Y-B где:
A-X представляет собой слитый белок;
Y-B представляет собой второй слитый белок;
X:Y представляет собой гетеродимерный связующий фрагмент;
: обозначает связывающее взаимодействие между X и Y;
А представляет собой первый белковый компонент биспецифического белкового комплекса, выбранный из фрагмента Fab или Fabʹ;
В представляет собой второй белковый компонент биспецифического белкового комплекса, выбранный из фрагмента Fab или Fabʹ;
Х представляет собой первый партнер по связыванию связывающей пары, независимо выбранный из антигена, или антитела, или его связывающего фрагмента; и
Y представляет собой второй партнер по связыванию связывающей пары, независимо выбранный из антигена, или антитела, или его связывающего фрагмента;
с условием, что если Х представляет собой антиген, Y представляет собой антитело или его связывающий фрагмент, специфичные к антигену, обозначаемому X, и если Y представляет собой антиген, Х представляет собой антитело или его связывающий фрагмент, специфичные к антигену, обозначаемому Y.
2. Биспецифический белковый комплекс по п. 1, где A представляет собой фрагмент Fab.
3. Биспецифический белковый комплекс по п. 1, где B представляет собой фрагмент Fab.
4. Биспецифический белковый комплекс по п. 1, где X присоединен, необязательно через линкер, к C-концу тяжелой цепи фрагмента Fab или Fabʹ.
5. Биспецифический белковый комплекс по п. 1, где Y присоединен, необязательно через линкер, к C-концу тяжелой цепи фрагмента Fab или Fabʹ.
6. Биспецифический белковый комплекс по п. 1, где X независимо выбран из scFv, VHH и пептида, при условии, что, если X представляет собой пептид, Y представляет собой антитело, или его связывающий фрагмент, такой как scFv или VHH, а если X представляет собой scFv или VHH, Y представляет собой антиген, такой как пептид.
7. Биспецифический белковый комплекс по п. 1, где Y независимо выбран из scFv, VHH и пептида, при условии, что, если Y представляет собой пептид, X представляет собой антитело, или его связывающий фрагмент, такой как scFv или VHH, а если Y представляет собой scFv или VHH, X представляет собой антиген, такой как пептид.
8. Биспецифический белковый комплекс по п. 6, где длина пептида варьирует от 5 до 25 аминокислот.
9. Биспецифический белковый комплекс по п. 1, где сродство связывания между X и Y составляет 5 нМ или выше.
10. Биспецифический белковый комплекс по п. 9, где сродство связывания между X и Y составляет 900 пМ или выше, например, 800, 700, 600, 500, 400 или 300 пМ.
11. Биспецифический белковый комплекс по п. 1, где X ли Y представляет собой scFv или VHH, специфичный к пептиду GCN4 (SEQ ID NO:1, или аминокислоты 1-38 последовательности SEQ ID NO:1).
12. Биспецифический белковый комплекс по п. 11, где scFv представляет собой 52SR4 (SEQ ID NO:3, или аминокислоты 1-243 последовательности SEQ ID NO:3).
13. Биспецифический белковый комплекс по п. 1, где X или Y представляет собой пептид GCN4 (SEQ ID NO:1, или аминокислоты 1-38 последовательности SEQ ID NO:1).
14. Биспецифический белковый комплекс по п. 1, где A и/или B является специфичным к антигену, выбранному из группы, включающей в себя: рецепторы клеточной поверхности, такие как Т-клеточные или В-клеточные сигнальные рецепторы, костимуляторные молекулы, ингибиторы контрольных точек, рецепторы естественных клеток-киллеров, иммуноглобулиновые рецепторы, рецепторы семейства TNFR, рецепторы семейства В7, молекулы адгезии, интегрины, рецепторы цитокинов/хемокинов, GPCR, рецепторы факторов роста, киназа-содержащие рецепторы, тканеспецифические антигены, раковые антигены, рецепторы, распознающие патогены, рецепторы комплемента, рецепторы гормонов, или растворимые молекулы, такие как цитокины, хемокины, лейкотриены, факторы роста, гормоны, ферменты и ионные каналы.
15. Композиция, содержащая один или несколько биспецифических белковых комплексов, определенных по любому из пп. 1-14.
16. Биспецифический белковый комплекс по п. 1, или композиция по п. 15 для применения в терапии.
17. Способ детекции синергической функции биспецифического белкового комплекса по любому из пп. 1-14, включающий в себя тестирование биспецифического белкового комплекса с помощью одного или нескольких функциональных анализов.
18. Способ детекции синергической биологической функции гетеродимер-связанного биспецифического белкового комплекса формулы A-X:Y-B,
где Х:Y представляет собой гетеродимерный связующий фрагмент,
: обозначает связывающее взаимодействие между X и Y;
А и В представляют собой компоненты биспецифического комплекса, присутствующие в виде слитых белков с X и Y соответственно, а указанный способ включает в себя следующие стадии:
(i) тестирование части или всего мультиплекса, содержащего, по меньшей мере, один гетеродимер-связанный биспецифический белковый комплекс, на активность с помощью функционального анализа; и
(ii) анализ результатов функционального анализа с целью детекции синергической биологической функции гетеродимер-связанного биспецифического белкового комплекса;
где Y представляет собой антиген, а X представляет собой антитело, или его связывающий фрагмент, специфичный к Y, или X представляет собой антиген, а Y представляет собой антитело, или его связывающий фрагмент, специфичный к X.
19. Способ по п. 18, где мультиплекс находится в виде массива.
20. Способ по п. 18, где мультиплекс содержит, по меньшей мере, два гетеродимер-связанных биспецифических белковых комплекса.
21. Способ по п. 18, где гетеродимер-связанный биспецифический белковый комплекс (комплексы) не содержит участок Fc.
22. Способ по п. 18, где A независимо выбран из фрагмента Fab, фрагмента Fabʹ, VHH, VH, VL и scFv.
23. Способ по п. 22, где A представляет собой фрагмент Fab или Fabʹ, такой как Fab.
24. Способ по п. 18, где B независимо выбран из антитела, фрагмента Fab, фрагмента Fabʹ, VHH, VH, VL и scFv.
25. Способ по п. 24, где B представляет собой фрагмент Fab или Fabʹ, такой как Fab фрагмент.
26. Способ по п. 18, где X присоединен, необязательно через линкер, к C-концу тяжелой цепи антитела, фрагмента Fab или Fabʹ.
27. Способ по п. 18, где Y присоединен, необязательно через линкер, к C-концу тяжелой цепи антитела, фрагмента Fab или Fabʹ.
28. Способ по п. 18, где X независимо выбран из scFv, VHH и пептида, с условием, что, если Х представляет собой пептид, Y представляет собой антитело или его связывающий фрагмент, такой как scFv или VHH, а если Х представляет собой scFv или VHH, Y представляет собой антиген, такой как пептид.
29. Способ по п. 18, где Y независимо выбран из scFv, VHH и пептида, с условием, что, если Y представляет собой пептид, X представляет собой антитело или его связывающий фрагмент, такой как scFv или VHH, а если Y представляет собой scFv или VHH, X представляет собой антиген, такой как пептид.
30. Способ по п. 28, где длина пептида варьирует от 5 до 25 аминокислот.
31. Способ по п. 18, где сродство связывания между X и Y составляет 5 нМ или выше.
32. Способ по п. 31, где сродство связывания между X и Y составляет 900 пМ или выше, например, 800, 700, 600, 500, 400 или 300 пМ.
33. Способ по п. 18, где X или Y представляет собой scFv или VHH, специфичный к пептиду GCN4 (SEQ ID NO: 1, или аминокислоты 1-38 последовательности SEQ ID NO: 1).
34. Способ по п. 33, где scFv представляет собой 52SR4 (SEQ ID NO: 3, или аминокислоты 1-243 последовательности SEQ ID NO: 3).
35. Способ по п. 18, где X или Y представляет собой пептид GCN4 (SEQ ID NO: 1, или аминокислоты 1-38 последовательности SEQ ID NO: 1).
36. Способ по п. 18, где A и/или B является специфичным к антигену, выбранному из группы, включающей в себя: рецепторы клеточной поверхности, такие как Т-клеточные или В-клеточные сигнальные рецепторы, костимуляторные молекулы, ингибиторы контрольных точек, рецепторы естественных клеток-киллеров, иммуноглобулиновые рецепторы, рецепторы семейства TNFR, рецепторы семейства В7, молекулы адгезии, интегрины, рецепторы цитокинов/хемокинов, GPCR, рецепторы факторов роста, киназа-содержащие рецепторы, тканеспецифические антигены, раковые антигены, рецепторы, распознающие патогены, рецепторы комплемента, рецепторы гормонов, или растворимые молекулы, такие как цитокины, хемокины, лейкотриены, факторы роста, гормоны, ферменты и ионные каналы.
37. Способ по любому из пп. 18-36, где гетеродимер-связанные биспецифические белковые комплексы не очищают перед тестированием.
38. Способ по п. 37, где слитые белки A-X и Y-B получают путем временной экспрессии и не очищают перед смешиванием в молярном соотношении 1:1 с получением каждого гетеродимер-связанного биспецифического белкового комплекса.