Чувствительность грамотрицательных бактерий, продуцентов карбапенемаз, к антибиотикам различныгх групп

Чувствительность грамотрицательных бактерий, продуцентов карбапенемаз, к антибиотикам различных групп

В.А. АГЕЕВЕЦ1, И. В. ПАРТИНА', Е. С. ЛИСИЦЫНА2, И. М. БАТЫРШИН4, Л. Н. ПОПЕНКО4, С. А. ШЛЯПНИКОВ4, Е. Н. ИЛЬИНА3, С. В. СИДОРЕНКО1

Susceptibility of Gramnegative Carbapenemase-Producing Bacteria to Various Group Antibiotics

V. A. AGEEVETS, I. V. PARTINA, E. S. LISITSINA, I. M. BATYRSHIN, L. N. POPENKO, S. A. SHLYAPNIKOV, E. N. ILYINA, S. V. SIDORENKO

Research Institute of Children's Infections, St.Petersburg Litekh, Moscow

Research Institute of Physico-Chemical Medicine, Moscow Dzhanelidze Research Institute of Emergent Medical Service, St.Petersburg

В исследование включено 25 изолятов грамотрицательных бактерий, продуцирующих карбапенемазы. 17 изолятов Klebsiella pneumoniae продуцировали карбапенемазу NDM-1 и проявляли высокий уровень устойчивости к цефалоспоринам (МПК>128 мкг/мл), карбапенемам (МПК>16 мкг/мл), аминогликозидам и фторхинолонам, однако среди этих изолятов 4 сохраняли чувствительность к азтреонаму, и все они были чувствительны к тигециклину и полимиксину. Два изолята Acinetobacter genomospecies 13 продуцировали NDM-1, они были устойчивы ко всем беталактамам и амикацину, но сохраняли чувствительность к гентамицину, ко-тримоксазолу, тигециклину и полимиксину, чувствительность к ципрофлоксаци-ну была снижена. Карбапенемазу VIM-4 продуцировали два изолята Enterobacter cloacae, они демонстрировали высокий уровень устойчивости к цефалоспоринам и азтреонаму, но при этом между цефепимом и клавуланатом проявлялся выраженный синергизм. Уровень устойчивости к карбапенемам у этих изолятов был невысоким (МПК 0,5—4,0 мкг/мл), они были также устойчивы к аминогликозидам и ципрофлоксацину, но чувствительны к тигециклину и полимиксину. Карбапене-мазы КРС-2 были выявлены у двух изолятов K.pneumoniae и у одного изолята E.cloacae. Перечисленные изоляты были устойчивы ко всем беталактамам, ципрофлоксацину, аминогликозидам и ко-тримоксазолу. Один изолят E.cloacae проявлял устойчивость к тигециклину, и один изолят K.pneumoniae — к полимиксину. У одного изолята K.pneumoniae была обнаружена карбапенемаза ОХА-48, он был устойчив ко всем беталактамам, ципрофлоксацину, ко-тримоксазолу, но чувствителен к аминогликозидам, тигециклину и полимиксину.

Ключевые слова: карбапенемазы, продуценты, грамотрицательные бактерии, антибиотикограммы.

The study involved 25 isolates of gramnegative carbapenemase-producing bacteria. 17 isolates of Klebsiella pneumonia produced car-bapenemase NDM-1 and were highly resistant to cephalosporins (MIC>128 mcg/ml), carbapenems (MIC>16 mcg/ml), aminoglycosides and fluoroquinolones, while among them 4 isolates preserved susceptibility to azthreonam and all of them were susceptible to tige-cycline and polymyxin. 2 isolates of Acinetobacter genomospecies 13 produced NDM-1 and were resistant to all the beta-lactams and amikacin, while preserved susceptibility to gentamicin, co-trimoxazole, tigecycline and polymyxin, the susceptibility to ciprofloxacin being lowered. Carbapenemase VIM-4 was produced by 2 isolates of Enterobacter cloacae, which were highly resistant to cephalosporins and azthreonam, significant synergism being observed between cefepim and clavulanate. The resistance of the isolates to carbapenems was low (MIC 0.5—4.0 mcg/ml), they also being resistant to aminoglycosides and ciprofloxacin and susceptible to tigecycline and polymyxin. Carbapenemases KPC-2 were detected in 2 isolates of K.pneumoniae and in 1 isolate of E.cloacae. The above isolates were resistant to all the beta-lactams, ciprofloxacin, aminoglycosides and co-trimoxazole. 1 isolate of E.cloacae showed resistance to tigecycline and 1 isolate of K.pneumoniae was resistant to polymyxin. Carbapenemase OXA-48 was detected in 1 isolate of K.pneumoniae. It was resistant to all the beta-lactams, ciprofloxacin and co-trimoxazole and susceptible to aminoglycosides, tigecycline and polymyxin.

Key words: carbapenemases, producers, gramnegative bacteria, antibioticograms.

В течение более 30 лет карбапенемы составля- ций, вызванных грамотрицательными бактерия-ли основу этиотропной терапии тяжёлых инфек- ми, устойчивыми к антибиотикам других групп.

Однако в последние годы наблюдается быстрое

1 НИИ детских инфекций ФМБА России, Санкт-Петербург

2 ООО НПФ Литех, Москва

3 НИИ физико-химической медицины ФМБА России, Москва

4 НИИ скорой помощи им. Джанелидзе, Санкт-Петербург

Адрес для корреспонденции: 197022, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, д.9. НИИ детских инфекций

© Коллектив авторов, 2013

распространение резистентности и к этим антибиотикам. Резистентность к карбапенемам может быть обусловлена несколькими механизмами, но

основную угрозу представляют ферменты карба-пенемазы [1], гены которых локализованы на различных подвижных генетических элементах, что определяет их способность к быстрому внутри- и межвидовому распространению.

Первоначально карбапенемазы выявляли преимущественно среди штаммов Pseudomonas aeruginosa, но в настоящее время они быстро распространяются среди других грамотрицательных бактерий, прежде всего среди представителей семейства Enterobacteriaceae.

Между географическими регионами наблюдаются различия в распространении отдельных карбапенемаз, но в целом наибольшее значение имеют следующие: КРС-тип (молекулярный класс А), группа ферментов ОХА-типа (молекулярный класс D) и обширная группа ферментов молекулярного класса В (IMP-тип, VIM-тип, SPM-тип и GIM-тип, SIM-тип, AIM-тип). К классу В также относится необычайно быстро распространяющаяся и эволюционирующая группа ферментов NDM-типа [2].

Целью работы явилось определение чувствительности грамотрицательных бактерий, продуцирующих карпапенемазы, к антибиотикам различных групп.

Материал и методы

В исследование были включены грамотрицательные бактерии, продуцирующие карбапенемазы различных групп, выделенные в стационарах Санкт-Петербурга в 2011—2013 гг. Определение чувствительности к антимикробным препаратам проводили методом серийных микроразведений в бульоне Мюллера-Хинтон (BD, США) согласно рекомендациям CLSI [3] в 96-луночных планшетах для иммунологических исследований. МПК определяли для следующих антибиотиков: цефо-таксим (CTX), цефепим (FEP), цефтазидим (CAZ), гентами-цин (GEN), амикацин (AN), имипенем (IMP), дорипенем (DOR), меропенем (MEM), ко-тримоксазол (SXT), тигециклин (TGC), полимиксин (PB), азтреонам (AZT), ципрофлоксацин (CIP), цефепим/клавуланат (FEP/CL), цефтазидим/клавула-нат (CAZ/CL), цефоперазон/сульбактам (CFP/SU).

Для приготовления рабочих растворов антибиотиков использовали субстанции антибактериальных препаратов с известной активностью (Sigma Aldrich). Микропланшеты с внесённым туда бульоном Мюллера-Хинтон и 2-кратными разведениями антибиотиков сохранялись до использования при -80°C. Перед тестированием культур микропланшеты однократно размораживались.

Постановка МПК проводилась микрометодом при величине конечного объёма 0,2 мл. Постановка каждой новой серии планшетов сопровождалась тремя контролями: контроль пригодности используемых антибактериальных препаратов со штаммом E.coli ATCC 25922, контроль роста тестируемых штаммов и контроль стерильности используемого субстрата (бульона Мюллера-Хинтон). Для интерпретации результатов оценки чувствительности использовали критерии CLSI [3] и EUCAST [4].

Результаты исследований

Результаты оценки антибиотикочувствитель-ности продуцентов карбапенемаз представлены в таблице. Изоляты K.pneumoniae, продуцирующие

NDM-1 проявляли высокий уровень устойчивости к подавляющему большинству беталактамныгх антибиотиков. МПК цефотаксима, цефепима, комбинаций этих антибиотиков с клавулановой кислотой, а также цефоперазона/сульбактама были равны или превышали 128 мкг/мл, МПК карбапенемов были равны или превышали 16,0 мкг/мл. Определённые различия быши вымвлены1 лишь по уровню чувствительности к азтреонаму. Четыре изолята проявляли чувствительность, а 13 — устойчивость. Известно, что азтреонам устойчив к гидролизу многими карбапенемазами, в том числе и NDM-1. Появление у части изолятов устойчивости к этому антибиотику, вероятно, связано с приобретением ими генов бета-лактамаз расширенного спектра. Все K.pneumoniae, продуцирующие NDM-1, были также высокоустойчивы к ципрофлоксацину, аминогликозидам и ко-тримоксазолу, но сохраняли чувствительность к тигециклину и полимиксину.

Продукция карбапенемаз NDM-1 была также выявлена у двух изолятов Acinetobacter genomo-species 13. Эти изоляты были высокоустойчивы к цефалоспоринам (МПК>64,0 мкг/мл) и карбапе-немам (МПК>16,0 мкг/мл), демонстрировали умеренное снижение чувствительности к ципро-флоксацину, в то же время они сохраняли чувствительность к аминогликозидам, ко-тримоксазо-лу, полимиксину и тигециклину.

Два изолята Enterobacter cloacae, продуцирующие карбапенемазы VI M-4, демонстрировали высокий уровень устойчивости к цефалоспори-нам и азтреонаму (МПК>64,0 мкг/мл) и невысокий уровень устойчивости к карбапенемам (МПК 0,5—4,0 мкг/мл). Оба изолята демонстрировали синергизм цефепима и клавулановой кислоты (снижение МПК более чем в 4 раза), при отсутствии синергизма цефтазидима с клавулановой кислотой. Наиболее вероятным объяснением такого фенотипа может быть наличие у изолята бета-лактамаз расширенного спектра класса А, а также бета-лактамаз класса С (плаз-мидных либо хромосомных гиперпродуцентов). Оба изолята были также высокоустойчивы к ци-профлоксацину и аминогликозидам, демонстрировали незначительное снижение чувствительности к ко-тримоксазолу, но сохраняли чувствительность к полимиксину и тигециклину.

Карбапенемазы КРС-2 продуцировали два изолятов K.pneumoniae и один — E.cloacae. Изоляты K.pneumoniae, продуцирующие КРС-2, быши высокоустойчивы ко всем беталактамам, ципро-флоксацину и ко-тримоксазолу, но несколько различались по другим признакам. Одни изолят был устойчив к полимиксину и гентамицину, а другой сохранял чувствительность к этим антибиотикам. Оба изолята быши чувствительны к тигециклину и амикацину. Изолят E.cloacae прояв-

МПК антибиотиков основных групп в отношении грамотрицательных бактерий, продуцирующих различные карбапенемазы

№ штамма Фермент

Вид

МПК антибиотиков

микроорганизма СТХ FEP FEP\CL CAZ CAZ\CL AZT CFP\SU IMP MEM DOR CIP

GEN

AN

SXT TGC11

PB21

<2/>4 <8/>32 — <4/>16 — <4/>16 — <l/>4 <l/>4 <l/>4 <0,06/>l <4/>16 <16/>64 <2/>4 <l/>2 <2/>2

55 NDM-1 Kpn >256 128 >128 >128 >128 0,12 >128 32 >16 >16 >256 >128 >256 >32 0,25 0,03

57 NDM-1 Kpn >256 >128 >128 >128 >128 0,25 >128 >64 >16 >16 >256 >128 >256 >32 0,25 0,03

59 NDM-1 Kpn >256 128 >128 >128 >128 0,12 >128 64 >16 >16 >256 >128 >256 >32 0,25 0,06

83 NDM-1 Kpn >256 128 >128 >128 >128 0,25 >128 >64 >16 >16 >256 >128 >256 >32 0,25 0,06

28 NDM-1 Kpn >256 128 128 >128 >128 >64 >128 32 16 >16 >256 >128 >256 >32 0,25 0,015

49 NDM-1 Kpn >256 128 128 >128 >128 >64 >128 32 >16 >16 >256 >128 >256 >32 0,25 0,25

54 NDM-1 Kpn >256 >128 >128 >128 >128 >64 >128 32 >16 >16 >256 >128 >256 >32 0,25 0,03

82 NDM-1 Kpn >256 128 128 >128 >128 >64 >128 32 >16 >16 >256 >128 >256 >32 0,25 0,03

107 NDM-1 Kpn >256 128 128 >128 >128 >64 >128 32 >16 >16 >256 >128 >256 >32 0,25 0,03

112 NDM-1 Kpn >256 >128 >128 >128 >128 >64 >128 >64 >16 >16 >256 >128 >256 >32 0,25 0,25

409 NDM-1 Kpn >256 128 >128 >128 >128 >64 >128 32 >16 >16 >256 >128 >256 >32 0,25 0,015

410 NDM-1 Kpn >256 128 128 >128 >128 >64 >128 32 16 >16 >256 >128 >256 >32 0,25 0,06

416 NDM-1 Kpn >256 128 128 >128 >128 >64 >128 32 >16 >16 >256 >128 >256 >32 0,12 0,06

456 NDM-1 Kpn >256 128 >128 >128 >128 >64 >128 32 >16 >16 >256 >128 >256 32 0,12 0,015

458 NDM-1 Kpn >256 128 128 >128 >128 >64 >128 32 >16 >16 >256 >128 >256 >32 0,25 0,03

524 NDM-1 Kpn >256 >128 >128 >128 >128 >64 >128 >64 >16 >16 >256 >128 >256 >32 0,12 0,015

552 NDM-1 Kpn >256 >128 >128 >128 >128 >64 >128 32 >16 >16 >256 >128 >256 >32 0,12 0,015

N152 NDM-1 Ac,gsl3 >256 >128 >128 >128 >128 >64 >128 >64 >16 >16 2 0,5 16 0,5 0,06 0,25

N199 NDM-1 Ac,gsl3 >128 >128 64 >128 64 >64 >128 >16 >16 >16 0,5 1,0 16 1 0,06 0,25

31 VIM-4 Eel >256 >128 8 >128 >128 >64 128 4 1 4 >256 >128 >256 8 0,25 0,06

34 VIM-4 Eel >256 128 8 128 >128 >64 >128 2 0,5 2 >256 >128 >256 2 0,5 0,12

565 KPC-2 Kpn >256 >128 >128 >128 >128 >64 >128 >64 >16 >16 >256 128 1 >32 0,25 16

570 KPC-2 Kpn >256 >128 >128 >128 >128 >64 >128 >64 >16 >16 >256 0,5 16 32 0,25 0,06

566 KPC-2 Eel >256 >128 >128 128 128 >64 >128 16 8 >16 >256 64 1 >32 4 0,06

485 OXA-48 Kpn >256 >128 >128 >128 128 >64 128 8 >16 >16 >256 0,12 2 >32 0,06 0,06

¿0

0 см

1 I

0

1

s

5 о

UD

5

re

Примечание.11 — критерии CLSI отсутствуют, использованы критерии EUCAST;21 — критерии CLSI отсутствуют, использованы критерии EUCAST для колисти-на; Крп — К.pneumoniae; Ac. gs13 — Acinetobacter genomospecies 13; Eel — E.cloacae.

тойчивыми к имипенему и меропенему считаются изоляты при МПК>8 мкг/мл), но выше критерия CLSI (устойчивыми к имипенему, меропене-му и дорипенему считаются изоляты при МПК>4,0 мкг/мл).

Известно, что уровень и спектр ассоциированной резистентности у продуцентов различных карбапенемаз может существенно различаться. Среди бактерий-продуцентов, выделенных в Санкт-Петербурге, наибольшей устойчивостью характеризовались K.pneumoniae, продуцирующие металло-бета-лактамазы NDM-1. Они проявляли высокий уровень устойчивости ко всем антибиотикам, кроме полимиксина и тигецикли-на. Важно отметить высокий уровень устойчивости к карбапенемам (МПК>16,0 мкг/мл), что не позволяет рассчитывать на эффективность этих антибиотиков даже при применении в максимальных дозах. Определённый интерес представляет то, что некоторая часть изолятов сохраняла чувствительность к азтреонаму. Этот антибиотик может быть использован для лечения в случае подтверждения чувствительности возбудителя, но не для эмпирической терапии.

Другие продуценты карбапенемаз демонстрировали несколько более широкий спектр чувствительности к антибиотикам. Так, Acinetobacter genomospecies 13 в дополнение к по-лимиксину и тигециклину сохранял чувствительность к аминогликозидам и ко-тримокса-золу, а также демонстрировали невысокий уровень устойчивости к ципрофлоксацину. Продуценты металло-бета-лактамазы VIM-4 проявляли невысокий уровень устойчивости к карбапенемам (МПК>8,0 мкг/мл), что позволяет рассчитывать на определённую эффективность этих антибиотиков. Продуценты КРС-2 и ОХА-48 частично сохраняли чувствительность к аминогликозидам. В отношении одного изо-лята, продуцирующего КРС-2, умеренную активность сохранял меропенем.

ЛИТЕРАТУРА

1. Nordmann P., Naas T., Poirel L. Global spread of earbapenemase-pro-ducing Enterobacteriaceae. Emer Infect Dis 2011; 17: 1791—1798.

2. Johnson A. P., Woodford N. Global spread of antibiotic resistance: the example of New Delhi metallo-beta-lactamase (NDM)-mediated car-bapenem resistance. J Med Microbiol 2013; 62: 499—513.

3. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standard for antimicrobial susceptibility testing. Nineteenth Informational Supplement Document M100-S22. CLSI, Wayne, PA. 2012.

4. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters.Version 3.0, 2013. http://www.eucast.org.

В целом следует отметить, что наибольшую чувствительность продуценты карбапенемаз проявляли к полимиксину и тигециклину. Однако место этих антибиотиков в лечении тяжёлых инфекций, прежде всего вызванных продуцентами карбапенемаз, окончательно не определено. Так, к полимиксину проявляют природную устойчивость такие важные возбудители нозокомиальных инфекций, как Proteus mirabilis, Serratia marcescens и Morganella morganii. Серьёзной проблемой для этого антибиотика является нефротоксич-ность. Обсуждается вопрос о целесообразности применения полимиксина в комбинации с другими антибиотиками (карбапенемами, тет-рациклинами и рифампином) [6].

Для тигециклина также характерны некоторые ограничения в спектре действия (природная устойчивость Pseudomonas aeruginosa и Proteus), однако профиль безопасности намного более благоприятный, чем у полимиксина. Официально применение тигециклина разрешено при инфекциях кожи и мягкий тканей, интраабдоминальных инфекциях и внеболь-ничной пневмонии. Однако в настоящее время проводятся многочисленные исследования по применению этого антибиотика при госпитальной пневмонии, в том числе и связанной с искусственной вентиляций лёгких, инфекциях мочевыводящих путей, сепсисе, вызванном множественноустойчивыми бактериями [7].

В тех учреждениях, где карбапенемазы стали реальностью, целесообразно рассмотреть вопрос о включении тигециклина и, возможно, полимиксина в схемы эмпирической терапии тяжёлых инфекций у отдельных групп пациентов. Не исключено, что более широкое применение тигециклина несколько снизит селективный прессинг карбапенемов и приведёт к сдерживаю распространения карбапенемаз.

5. Tzouvelekis L. S., Markogiannakis A., Psichogiou M., Tassios P. T., Daikos G. L. Carbapenemases in Klebsiella pneumoniae and other Enterobacteriaceae: an evolving crisis of global dimensions. Clin Microbiol Rev 2012; 25: 682-707.

6. Biswas S, Brunel J. M, Dubus J. C, Reynaud-Gaubert M, Rolain J. M. Colistin: an update on the antibiotic of the 21st century. Expert Rev Anti Infect Ther 2012; 10: 917-934.

7. Stein G. E, Babinchak T. Tigecycline: an update.Diagn Microbiol Infect Dis 2013; 75: 331-336.