Разработка схем стерилизации для введения овощных культур в in vitro

Известия Великолукской государственной сельскохозяйственной академии. - 2024. - N 1. -С. 25-32. - ISSN 2308-8583.

Proceedings of the State Agricultural Academy of Velikie Luki. 2024;(1):25-32. ISSN 2308-8583.

Научная статья УДК 57.085.2 EDN: KFYGXP

Разработка схем стерилизации для введения овощных

культур в in vitro

1 2 Анна Сергеевна Исаченкова , Юлия Николаевна Федорова

1 2

, Великолукская государственная сельскохозяйственная академия, Псковская область, Великие Луки, Россия

1 anna.isachenkova7 @gmail.com

2 rector@vgsa.ru

Аннотация. В настоящее время установлено, что в селекции возникают трудности в отборе и сохранении ценных форм из-за высокой гибели зародышей на ранних стадиях развития. Это затягивает процесс получения нужных признаков. Поэтому использование современных методов в биотехнологиях становится необходимостью для быстрого и эффективного изучения сортов и гибридов, сделав их более высокопродуктивными и устойчивыми к биотическим и абиотическим факторам.

В статье проводится изучение некоторых методов обработки, таких как химический и термический (22 оС с увеличением температуры на 0,1 °C в течение 5 дней) методы. В опыте использовался химический метод с выбором стерилизующих агентов: спирт 95%, белизна, дистиллированная автоклавированная вода, моющее средство, натрий хлорид и цефотаксим. Объектами опыта являлись скороспелый сорт гороха Амброзия и среднеранний сорт перца Калифорнийское чудо. Исследования показали, что схемы стерилизации №1 и №2 обеспечивают самую высокую выживаемость эксплантов гороха - 70% и 50%, перца - 70% и 60%. Это свидетельствует о том, что эти схемы являются наиболее эффективными для стерилизации и обеспечивают высокое здоровье эксплантов.

Важно отметить, что контрольная группа без применения схемы стерилизации имеет самый низкий процент выживаемости эксплантов (20%). Это подчеркивает необходимость правильного подхода к стерилизации, чтобы обеспечить высокие показатели здоровья экс-плантов.

На основании результатов опыта, рекомендуется использовать схемы стерилизации №1 и №2 для обеспечения высокой выживаемости и здоровья эксплантов.

Ключевые слова: in vitro, стерилизация, горох (лат. pisum), перец (лат. piper), цефо-таксим, натрия хлорид

Для цитирования: Исаченкова А. С., Федорова Ю. Н. Разработка схем стерилизации для введения овощных культур в in vitro // Известия Великолукской государственной сельскохозяйственной академии. - 2024. - N 1. - С. 25-32. - https://elibrary.ru/kfygxp.

© Исаченкова А. С., Федорова Ю. Н., 2024

Original article

Development of Sterilization Patterns for Introduction of Vegetable Crops in vitro

1 2 Anna S. Isachenkova , Yulia N. Fedorova

1 2

, State Agricultural Academy of Velikie Luki, Pskov region, Velikie Luki, Russia

1 anna.isachenkova7 @gmail.com

2 rector@vgsa.ru

Abstract. Currently, it has been established that in selection, difficulties arise in the choice and preservation of valuable forms due to the high death of germs in the early stages of development. This delays the process of obtaining the necessary features. Therefore, the use of modern methods in biotechnology is becoming necessary for the rapid and effective study of varieties and hybrids, making them more productive and resistant to biotic and abiotic factors.

The article examines some processing methods, such as chemical and thermal (22 °C with an increase in temperature by 0.1 °C for 5 days) methods. The experiment used a chemical method with sterilizing agents such as 95% alcohol, whiteness stuff, distilled autoclaved water, detergent, sodium chloride and cefotaxime. The objects of the experiment were the early-maturity variety of Ambrosia peas and the medium-early variety of California miracle pepper. Research has shown that sterilization schemes No. 1 and No. 2 provide the highest survival rate of pea explants - 70% and 50%, pepper - 70% and 60%. This shows that these patterns are the most effective for sterilization and they ensure high explant health.

It is important to note that the control group without the use of a sterilization scheme has the lowest percentage of explant survival (20%). This streses the need for a proper sterilization approach to ensure high explant health.

As a result, based on the results of the experiment, it is recommended to use sterilization schemes No. 1 and No. 2 to ensure high survival and health of explants.

Keywords: in vitro, sterilization, peas (Latin Pisum), pepper (Latin Piper), cefotaxime, sodium chloride

For citation: Isachenkova A. S., Fedorova Yu. N. Development of Sterilization Patterns for Introduction of Vegetable Crops in vitro. Proceedings of the State Agricultural Academy of Velikie Luki. 2024;(1):25-32. (In Russ.). https://elibrary.ru/kfygxp.

Введение

Известно, что с каждым годом в науке приобретают большое значение инновационные направления. Разрабатывают новые способы производства высококачественного материала, которые считаются эффективными в микрокло-нальном размножении, так как процесс размножения увеличивается в сотни раз по сравнению с использованием менее эффективных методов.

В настоящее время установлено, что в селекции возникают трудности в отборе и сохранении ценных форм из-за высокой гибели зародышей на ранних стадиях развития. Это затягивает процесс получения нужных признаков. Поэтому использование современных методов в биотехнологиях становится необходимостью для быстрого и эффективного изучения сортов и гибридов, сделав их более высокопродуктивными и устойчивыми к биотическим и абиотическим факторам.

Исходя из этого, все более становится актуальным потребность в совершенствовании различных методов биотехнологий, благодаря которым можно сохранить в культуре ценные селекционные материалы [1, 2].

Успешное введение исходного материала в культуру in vitro зависит от качества стерилизации, что является важным фактором в добротном проведении процесса. Для стерилизации растительного материала применяют широкий спектр химических препаратов. Выбор химических препаратов зависит от некоторых факторов, например, размера исходного материала и толщины кожицы семян.

Стерилизация включает в себя удаление любых микробов или патогенов, которые могут присутствовать на растительном сырье. Стерилизацию можно проводить различными методами: химическая обработка, термическая обработка и облучение.

Химическая обработка растительного сырья включает использование различных химикатов для стерилизации и дезинфекции. Некоторые из наиболее распространенных используемых препаратов - гипохлорит натрия (активный ингредиент в хлорной отбеливательной жидкости), перекись водорода (Н2О2), этанол и другие химические вещества [3].

Термическая обработка растительного сырья имеет несколько целей. Она позволяет уничтожить патогенные микроорганизмы, вредные семена и насекомых, а также усилить сохранность продукта. При подвергании растительного сырья высоким температурам, происходит разрушение клеточных структур, что ведет к легкому извлечению полезных веществ и улучшению их усвояемости [3].

Лучевая обработка растительного сырья при помощи ионизирующего излучения, такого как гамма-лучи, применяется для стерилизации и дезинфекции. Этот метод позволяет уничтожить микроорганизмы, паразитов и насекомых, сохраняя при этом питательные вещества, вкус и внешний вид продукта [3].

В опыте использовались семена гороха и перца - обе культуры содержат в себе большое количество витаминов, богаты углеводами, пищевыми волокнами, микроэлементами, в том числе характеризуются высоким содержанием железа, цинка и кальция [2, 4].

Помимо этого в перце содержатся лекарственные вещества, которые помогают при нарушении обмена веществ, понижают артериальное давление, действуют на деятельность эндокринных желез и незаменимы при кровопоте-рях [4, 5].

Цель данной работы: разработать схему стерилизации для введения в культуру in vitro гороха и перца.

Задачи:

- подобрать оптимальные концентрации стерилизующих агентов для изучаемых культур;

- разработать схему стерилизации для гороха и перца для максимального выхода растений in vitro.

Материалы и методы

Исследования проводились в 2024 году в лаборатории микроклонального размножения ФГБОУ ВО Великолукская ГСХА. Объекты исследования - скороспелый сорт гороха Амброзия и среднеранний сорт перца Калифорнийское чудо. Культивирование исходного материала осуществляется на питательной среде Мурасига и Скуга [3, 6].

Были использованы термический метод обработки (22 оС с увеличением температуры на 0,1 ^ в течение 5 дней) и химический метод с выбором стерилизующих агентов, учитывались рекомендации и материалы, а также возможные риски и ограничения, связанные с использованием химических элементов. Кроме того, важно учитывать их эффективность в отношении определенных микроорганизмов, которые требуется уничтожить [1, 7].

В качестве стерилизующих агентов использовали:

1. Спирт 95%: широко используется для дезинфекции поверхностей и инструментов. Он эффективен против большинства бактерий, вирусов и грибков, но не оказывает действия на спорообразующие микроорганизмы. Спирт также может быть использован для рассола или консервации тканей.

2. Белизна: используется для отбеливания и дезинфекции. Она эффективна против многих бактерий, вирусов и грибков. Однако она может быть агрессивной по отношению к нежным тканям, поэтому нужно учитывать ее концентрацию и длительность воздействия.

3. Дистиллированная автоклавированная вода: используется для промывания инструментов и поверхностей, обеззараживания ран и ухода за кожей. Вода без минералов и микроорганизмов считается одним из наиболее незагрязненных и безопасных методов стерилизации.

4. Моющее средство: используется для удаления загрязнений и дезинфекции поверхностей. В зависимости от типа моющего средства оно может быть эффективным против различных микроорганизмов.

5. Антибиотик цефотаксим: используется для профилактики и лечения бактериальных инфекций. В зависимости от типа инфекции и дозировки он может быть использован как стерилизующий агент при внутреннем заражении.

6. Натрия хлорид: используется для промывания ран, глаз и ухода за кожей. Он не является сильным стерилизующим агентом, но может помочь в очищении, исключении наличия микроорганизмов.

Важно помнить, что выбор и использование стерилизующих агентов должны осуществляться в соответствии с рекомендациями специалистов, чтобы гарантировать эффективность и безопасность процедуры стерилизации [8, 9].

Процесс стерилизации проводился по этапам: исходный материал погружали в стерилизующие агенты, выдерживая время экспозиции, после промывания в емкости с дистиллированной водой с 3-кратной повторностью также выдерживая время экспозиции, указанное в таблице 1. После стерилизации исходный материал помещали в чашки Петри на прорастание.

Таблица 1 - Схема опыта

№ п/п Состав Время экспозиции Повторность, раз

1. Спирт; 1 мин. 1

Контроль 2. Промыв в дистиллированной авто-клавированной воде. 30 мин. 3

1. Спирт; 30 с 1

№1* 2. Дистиллированная автоклавированная вода + белизна 1: 1 + капля моющего средства; 5 мин. 1

3. Промыв в дистиллированной авто-клавированной воде 15 мин. 3

1. Спирт; 1 мин. 1

№2* 2. Дистиллированная автоклавированная вода + белизна 1:1 + капля 7 мин. 1

моющего средства;

3. Промыв в дистиллированной авто-клавированной воде 21 мин. 3

1. Спирт; 2 мин. 1

№3 2. Дистиллированная автоклавированная вода + белизна 1:1 + капля 15 мин. 1

моющего средства;

3. Промыв в дистиллированной авто-клавированной воде 30 мин. 3

1. Спирт; 1 мин. 1

№4 2. Дистиллированная автоклавированная вода + №С1 1:1 + капля мою- 10 мин. 1

щего средства;

3. Промыв в дистиллированной авто-клавированной воде. 30 мин. 3

1. Спирт; 1 мин. 1

№5 2. Дистиллированная автоклавированная вода + белизна 1:1 + капля 10 мин. 1

моющего средства;

3. Промыв в дистиллированной авто-клавированной воде 45 мин. 3

1. Спирт; 1 мин. 1

2. Дистиллированная автоклавированная вода + белизна 1: 1 8 мин. 1

№6 + капля моющего средства;

3. Промыв в дистиллированной авто-клавированной воде + цефотаксим пропорция 1:0,01 30 мин. 3

Примечание: * - вариант с лучшим результатом

Следующим этапом работы была пересадка эксплантов в пробирки для дальнейшего наблюдения и фиксирования полученных результатов.

Было взято по 10 семян на каждый вариант стерилизации, после которой они помещены в чашку Петри для прорастания, затем эксплантаты были помещены в пробирки с питательной средой (Мурасига и Скуга).

Результаты и обсуждение

Состояние семян гороха и перца в зависимости от способа стерилизации представлено в таблицах 2, 3.

Таблица 2 - Состояние семян гороха

№ Регенерированные, шт. Развитые эксплан-

п/п всего здоровые (в среднем) ты, шт.

Контроль 10 2 0

1* 10 7 7

2* 10 5 5

3 10 4 4

4 10 4 3

5 10 4 2

6 10 3 0

НСРо.5 1,52

Примечание: * - вариант с лучшим результатом

Таким образом, из проведенных схем стерилизации семян гороха только схемы №1 и №2 дали положительные результаты. Схема №1 показала выживаемость 7 из 10, а схема №2 - выживаемость 5 из 10. Однако контрольная схема не привела к каким-либо заметным результатам. Все остальные схемы стерилизации не дали удовлетворительных результатов.

Таблица 3 - Состояние семян перца

№ Регенерированные, шт. Развитые эксплан-

п/п всего здоровые (в среднем) ты, шт.

Контроль 10 2 0

1* 10 7 7

2* 10 6 6

3 10 2 1

4 10 3 2

5 10 3 3

6 10 2 0

НСРо.5 0,95

Примечание: * - вариант с лучшим результатом

Из проведенных схем стерилизации семян перца только схемы №1 и №2 дали положительные результаты. Схема №1 показала выживаемость 7 из 10, а схема №2 - выживаемость 6 из 10. Контрольная схема не привела к каким-либо заметным результатам. Все остальные схемы стерилизации не дали удовлетворительных результатов.

Заключение

Из результатов опыта по введению культур гороха и перца in vitro можно сделать следующие выводы:

1. Схемы стерилизации №1 и №2 обеспечивают наивысшую выживаемость эксплантов гороха - 70% и 50%, перца - 70% и 60%. Это говорит о том, что эти схемы являются наиболее эффективными для стерилизации и обеспечения высоких показателей здоровых эксплантов.

2. Схемы стерилизации №3, №4 и №5 несут некоторый риск для здоровья эксплантов, так как показывают более низкую выживаемость и меньшее количество здоровых эксплантов гороха - 40, 30, 20%, перца - 10, 20, 30%. Это может быть связано с усиленным воздействием на экспланты при этих схемах стерилизации.

3. Контрольная группа без применения схемы стерилизации имеет самый низкий процент выживаемости эксплантов - 20%. Это означает, что использование схемы стерилизации важно для обеспечения более высокой выживаемости эксплантов.

В целом схемы стерилизации №1 и №2 являются наиболее эффективными для обеих культур, а схемы №3, №4 и №5 имеют некоторые недостатки. Необходимо провести дальнейшие исследования с целью оптимизации схем стерилизации повышения выживаемости и здоровья эксплантов.

Список источников

1. Ермоленко Н. П., Синица И. Н., Кулинкович Е. Н. Особенности введения в культуру in vitro гороха посевного с целью последующего микроклонального размножения // Земледелие и селекция в Беларуси. - 2020. - № 56. - С. 388-394.

2. Сащенко М. Н., Подвигина О. А. Особенности развития растений гороха при микро-клональном размножении в условиях культуры in vitro // Вестник Алтайского ГАУ. - 2014. -№ 6 (116). - С. 24-29.

3. Murashige T. A., Skoog F. Revised Medium for Rapid Growth and Bio-assays with Tobacco Tissue Cultures // Physiol Plant. - 1962. - № 15 (3). - P. 473-497.

4. Бондарев Н. И., Решетняк О. В., Носов A. M. Влияние фотопериода и интенсивности облучения на развитие побегов Stevia rebaudiana Bertoni in vitro и синтез в них стевиол гли-козидов // Известия ТСХА. - 2008. - №4. - С. 102-107. - URL: https://cyberleninka.ru/article/n/vliyanie-fotoperioda-i-intensivnosti-oblucheniya-na-razvitie-pobegov-stevia-rebaudiana-bertoni-in-vitro-i-sintez-v-nih-steviol-glikozidov (дата обращения: 13.03.2024).

5. Karthik A. Handling & Sterilization of Plant Material // Tutorialspoint.com : [site]. - URL: https://www.tutorialspoint.com/handling-and-sterilization-of-plant-material (дата обращения: 13.03.2024).

6. Антипова Н. Ю. Диетические и лекарственные свойства перца сладкого // Международный журнал гуманитарных и естественных наук. - 2021. - № 8-1. - С. 81-84. - URL: https://cyberleninka.rU/article/n/dieticheskie-i-lekarstvennye-svoystva-pertsa-sladkogo (дата обращения: 13.03.2024).

7. Жужжалова Т. П., Сащенко М. Н. Особенности вегетативного размножения гороха в культуре in vitro // Научные ведомости. - 2011. - Вып. 15/2, № 9 (104). - С. 140-144.

8. Бутенко Р. Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. -М.: Наука, 1964. - 270 с.

9. Зотиков, В. И., Вилюнов С. Д. Современная селекция зернобобовых и крупяных культур в России // Вавиловский журнал генетики и селекции. - 2021. - № 25 (4). - С. 381-387.

References

1. Ermolenko N. P., Sinicza I. N., Kulinkovich E. N. Osobennosti vvedeniya v kuPturu in vitro goroxa posevnogo s cePyu posleduyushhego mikroklonaPnogo razmnozheniya // Zemledelie i selekciya v Belarusi. - 2020. - № 56. - S. 388-394.

2. Sashhenko M. N., Podvigina O. A. Osobennosti razvitiya rastenij goroxa pri mikroklonaPnom razmnozhenii v usloviyax kuPtury4 in vitro // Vestnik Altajskogo GAU. - 2014. -№ 6 (116). - S. 24-29.

3. Murashige T. A., Skoog F. Revised Medium for Rapid Growth and Bio-assays with Tobacco Tissue Cultures // Physiol Plant. - 1962. - № 15 (3). - P. 473-497.

4. Bondarev N. I., Reshetnyak O. V., Nosov A. M. Vliyanie fotoperioda i intensivnosti oblu-cheniya na razvitie pobegov Stevia rebaudiana Bertoni in vitro i sintez v nix steviol glikozidov // Izvestiya TSXA. - 2008. - №4. - S. 102-107. - URL: https://cyberleninka.ru/article/n/vliyanie-fotoperioda-i-intensivnosti-oblucheniya-na-razvitie-pobegov-stevia-rebaudiana-bertoni-in-vitro-i-sintez-v-nih-steviol-glikozidov (data obrashheniya: 13.03.2024).

5. Karthik A. Handling & Sterilization of Plant Material // Tutorialspoint.com : [site]. - URL: https://www.tutorialspoint.com/handling-and-sterilization-of-plant-material (data obrashheniya: 13.03.2024).

6. Antipova N. Yu. Dieticheskie i lekarstvenny'e svojstva percza sladkogo // Mezhdunarodny'j zhurnal gumanitarny'x i estestvenny'x nauk. - 2021. - № 8-1. - S. 81-84. - URL: https://cyberleninka.ru/article/n/dieticheskie-i-lekarstvennye-svoystva-pertsa-sladkogo (data obrashheniya: 13.03.2024).

7. Zhuzhzhalova T. P., Sashhenko M. N. Osobennosti vegetativnogo razmnozheniya goroxa v kuPture in vitro // Nauchny'e vedomosti. - 2011. - Vy> 15/2, № 9 (104). - S. 140-144.

8. Butenko R. G. KuPtura izolirovanny'x tkanej i fiziologiya morfogeneza rastenij. - M.: Nau-ka, 1964. - 270 c.

9. Zotikov, V. I., Vilyunov S. D. Sovremennaya selekciya zernobobovy'x i krupyany'x kuPtur v Rossii // Vavilovskij zhurnal genetiki i selekcii. - 2021. - № 25 (4). - S. 381-387.

Информация об авторах

А. С. Исаченкова - магистрант;

Ю. Н. Федорова - доктор сельскохозяйственных наук, профессор.

Information about the authors

A. S. Isachenkova - undergraduate student;

Yu. N. Fedorova - Doctor of Agricultural Sciences, Professor.

Статья поступила в редакцию 18.03.2024; одобрена после рецензирования 19.03.2024; принята к публикации 26.03.2024.

The article was submitted 18.03.2024; approved after reviewing 19.03.2024; accepted for publication 26.03.2024.