СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДНК ИЗ МОЛОК ЛОСОСЕВЫХ РЫБ
METHOD TO PRODUCE DNA FROM SALMON ROE

Изобретение относится к технологии получения биологически активных веществ и может быть использовано в биотехнологии, а полученный продукт - в пищевой промышленности в качестве сырья при производстве биологически активных добавок к пище и специализированных пищевых продуктов, в парфюмерно-косметической промышленности в качестве биологически активной добавки в составе кремов, масок, лосьонов и других косметических средств, в научно-исследовательской практике.
5
5
5
5
Известен способ получения порошка натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты из молок рыб (1), предусматривающий гомогенизацию молок рыб, отделение осадка, обработку детергентом и концентрированным солевым раствором, воздействие ультразвуком с использованием при этом типового озвучивающего оборудования и условий, обеспечивающих получение ДНК с молекулярной массой от 0,6×10 до 1,5×10 Да, отделение белка и детергента либо фильтрованием через кизельгур и последующей тонкой фильтрацией, либо микрофильтрацией через фильтры с диаметром пор от 0,4 до 1,2 мкм, концентрирование фильтрата на ультрафильтрационном модуле при давлении 0,1-0,8 атм, его диафильтрацию и повторную обработку ультразвуком в условиях, обеспечивающих получение ДНК с молекулярной массой от 2,5×10 до 6,0×10 Да, осаждение ДНК из раствора этиловым спиртом и высушивание осадка до постоянного веса.
Описан также способ выделения дезоксирибонуклеиновых кислот (2), включающий адсорбцию дезоксирибонуклеиновых кислот на силикатном сорбенте в присутствии хаотропного агента, отделение и промывку сорбента с последующей элюцией нуклеиновых кислот с сорбента.
Известен способ получения нуклеопротеинового комплекса (3) который включает измельчение рыбных молок, обработку его 7-10%-ным раствором хлорида натрия в течение 2,5-3,5 часов при температуре кипения, отделение экстракта ДНК от плотной части, ультрафильтрацию с концентрированием экстракта до содержания сухих веществ 1,8-3%, сушку препарата, обработку его этанолом при 40-50°С, сушку на воздухе. Выход ДНК составляет 4,5-6,0%, содержание ДНК в препарате - не менее 65%.
Известен способ выделения натриевой соли ДНК из тканей животного происхождения (4). Способ включает измельчение и гомогенизацию в цитратно-солевом растворе (ССЦ), трехкратную промывку ядерного материала ССЦ. Затем отмытый ядерный материал помещают в реактор с ССЦ и 6% раствором додецилсульфата натрия в 45% этиловом спирте, нагревают до 60°С, добавляют равный объем 5М хлористого натрия, перемешивают, охлаждают до 12-16°С, обрабатывают реакционную массу ультразвуком, отделяют раствор ДНК от осадка балластных веществ фильтрацией реакционной массы через кизельгур на нутч-фильтре; концентрируют фильтрат на мембране с размером пор 0,45 мкм (потери ДНК при этом 3%), отмывают концентрат диафильтрацией на этой же мембране до отрицательной реакции на белок в пермеате.
Основным недостатком известных способов является то, что они предполагают использование этанола, являющегося социально опасным продуктом, требуют использования оборудования, в пожаро- и взрывобезопасном исполнении, а также наличия лицензии у производителя, на осуществление работ с применением этанола.
2
В качестве прототипа выбран способ производства натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты из животного сырья и установка для его осуществления (5), включающий измельчение животного сырья (молоки осетровых рыб, селезенка, эритроциты цыпленка и т.д.) и гомогенизацию в цитратно-солевом растворе, обработку гомогената детергентом и концентрированным раствором хлористого натрия при повышенной температуре, обработку реакционной смеси после предварительного формирования из нее слоя определенной толщины в течение 10-80 минут ультразвуком с частотой 8-35 кГц и интенсивностью 0,2-2,0 Вт/см, смешивание «озвученной» массы с кизельгуром в соотношении соответственно 5:1-25:1 (объем/масс), отделение жидкой фазы фильтрованием и концентрирование барофильтрацией, осаждение Na-соли ДНК из концентрата этиловым спиртом, высушивание осадка при 20-60°С. Масштабирование процесса осуществляется благодаря созданию и использованию новой промышленной установки.
Недостатком известного способа является трудоемкость и продолжительность технологического процесса выделения ДНК, наличие двух этапов обработки ультразвуком в вертикальной герметичной ячейке при непрерывном прокачивании раствора перистальтическим насосом, что приводит к значительному снижению производительности процесса и усложнению его масштабирования, а также использование больших количеств необходимых реагентов, в том числе этилового спирта.
Целью заявленного изобретения является разработка способа получения ДНК из молок лососевых рыб, отличающегося увеличением выхода готовой продукции с более высоким содержанием ДНК, снижению стоимости продукта за счет уменьшения количества стадий технологического процесса и возможности его масштабирования за счет использования типового промышленного оборудования.
Для осуществления поставленной задачи производили размораживание сырья из молок лососевых рыб, его измельчение, гидролиз протеолитическим ферментом трипсином, отделение балластных белков и липидов методом центрифугирования, фильтрацию полученной смеси через бельтинг-ткань, лиофилизацию или распылительное высушивание раствора ДНК.
Полученный продукт характеризуется следующими показателями:
внешний вид - аморфный порошок;
цвет - от белого до светло-коричневого;
запах - свойственный данному продукту с рыбным оттенком;
массовая доля влаги, не более - 8%;
массовая доля основного вещества (ДНК), не менее - 65%.
Идентификацию состава получаемого готового продукта и содержание в нем ДНК определяли спектрофотометрическим методом.
Способ осуществляют следующим образом:
Пример 1. Получение ДНК при оптимальном соотношении исходного сырья и трипсина.
40 кг дефростированных молок лососевых рыб измельчают на коллоидной мельнице, обрабатывают водным раствором ферментного препарата трипсина при следующем соотношении компонентов (масс.%): молоки лососевых рыб: вода: трипсин, как 40:59,88:0,12 в течение 3 часов при 45°С.
Водородный показатель рН полученной реакционной смеси (измельченные молоки лососевых рыб и вода) соответствовал оптимуму действия трипсина (рН 8-9)
Полученный гидролизат, для удаления балластных белков и липидов, центрифугируют на проточной центрифуге (15000об./мин.), фильтруют через бельтинг-ткань и подвергают лиофильной или распылительной сушке.
Выход готовой продукции составляет 16,0-18,0% от количества используемого сырья, при содержании ДНК в готовой продукции не менее 65%.
Пример 2. Получение ДНК при минимальном количественном соотношении исходного сырья и трипсина осуществляется аналогично примеру 1, только с минимальным количественным соотношением компонентов, а именно молоки лососевых рыб: вода: трипсин, как 40:59,96:0,04.
Выход готовой продукции составляет 14,0-16,0% от количества используемого сырья, при содержании ДНК в готовой продукции не менее 64,0%.
Пример 3. Получение ДНК при максимальном количественном соотношении исходного сырья и трипсина осуществляется аналогично примеру 1, только с максимальным количественным соотношением компонентов, а именно молоки лососевых рыб: вода: трипсин, как 40:59,8:0,2.
Выход готовой продукции составляет 17,0-18,0% от количества используемого сырья, при содержании ДНК в готовой продукции не менее 65,0%.
Пример 4. Получение ДНК при нижеминимальном количественном соотношении исходного сырья и трипсина осуществляется аналогично примеру 1, только с нижеминимальным количественным соотношением компонентов, а именно молоки лососевых рыб: вода: трипсин, как 40:59,98:0,02.
Выход готовой продукции составляет 10,0-14,0% от количества используемого сырья, при содержании ДНК в готовой продукции не менее 62,0%.
Пример 5. Получение ДНК при вышемаксимальном количественном соотношении исходного сырья и трипсина осуществляется аналогично примеру 1, только с вышемаксимальным количественным соотношением компонентов, а именно молоки лососевых рыб: вода: трипсин, как 40:59,78:0,22.
Выход готовой продукции составляет 17,0-18,0% от количества используемого сырья, при содержании ДНК в готовой продукции не менее 65,0%.
Сравнительные данные по выходу готовой продукции и содержанию в ней основного вещества (ДНК) в зависимости от соотношения компонентов реакционной смеси (молоки лососевых рыб: вода: трипсин) приведены в таблице.
Номер примера
Соотношение компонентов реакционной смеси (молоки лососевых рыб: вода: трипсин)
Выход готовой продукции, %, не менее
Содержание ДНК в готовой продукции, %, не менее
1.
40:59,88:0,12
16,0-18,0
65,0
2.
40:59,96:0,04
14,0-16,0
64,0
3.
40:59,8:0,20
17,0-18,0
65,0
4.
40:59,98:0,02
10,0-14,0
62,0
5.
40:59,78:0,22
17,0-18,0
65,0
Таким образом, увеличение добавления фермента трипсина свыше 0,22 масс.% не приводит к увеличению выхода готовой продукции и содержанию в ней основного вещества и, следовательно, экономически нецелесообразно.
Источники информации, приятные во внимание при экспертизе.
1. Патент RU №2041885 С1, C07H 21/04, C12N 15/10, 20.08.1995
2. Патент RU №2232768 С2, C07H 21/04, 20.07.2004
3. Патент RU №2122856 С1, A61K 35/60, 10.12.1998
4. Патент RU №2017496, A61K 35/60, C07H 21/04, 15.08.1998
5. Патент RU №2005724 C1, C07H 21/04, C12P 19/34, C12M 3/00,
15.01.1994 (прототип)