СПОСОБЫ СЕЛЕКЦИИ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫЙ БЕЛОК
METHODS FOR SELECTING EUKARYOTIC CELLS, EXPRESSING HETEROLOGOUS PROTEIN

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к новому способу селекции эукариотических клеток-хозяев, в частности клеток-хозяев млекопитающих, экспрессирующих целевой продукт. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу эффективного получения целевого продукта на высоком уровне.
Предпосылки создания изобретения
Способность клонировать и экспрессировать в больших количествах целевые продукты, например рекомбинантные пептиды и белки, приобрела особенно важное значение. Способность получения белков с высокой степенью очистки имеет важное значение в фармацевтической промышленности и биотехнологии, например, для получения белковых фармацевтических средств, а также при проведении фундаментальных исследований, например, по кристаллизации белков при выявлении их трехмерной структуры. Белки, которые трудно получить в большом количестве, могут быть подвергнуты сверхэкспрессии в клетке-хозяине, а затем выделены и очищены.
Выбор системы экспрессии для получения рекомбинантных белков зависит от многих факторов, включая особенности роста клеток, уровни экспрессии, внеклеточную и внутриклеточную экспрессию, посттрансляционные модификации и биологическое действие целевого белка, а также результаты регуляции и экономические соображения, связанные с получением белков терапевтического назначения. Принципиальные преимущества клеток млекопитающих относительно других систем экспрессии, например, бактерий или грибов, заключаются в способности производить должную укладку белка, сложное N-связанное гликозилирование и аутентичное O-связанное гликозилирование, а также широкий спектр других посттрансляционных модификаций. Благодаря описанным преимуществам эукариотические клетки, и особенно клетки млекопитающих, в настоящее время являются системой экспрессии для получения сложных терапевтических белков, например моноклональных антител, причем такая система экспрессии является системой выбора.
Наиболее общий подход к получению клеток-хозяев с высоким уровнем экспрессии (также называемых высокоэффективными продуцентами) заключается в выработке соответствующего вектора экспрессии для экспрессии целевого продукта на первой стадии. Вектор экспрессии вызывает экспрессию полинуклеотида, кодирующего целевой продукт, в клетке-хозяине и обеспечивает по меньшей мере один селективный маркер для получения линии рекомбинантных клеток. Основные элементы векторов экспрессии млекопитающих обычно включают конститутивный или индуцибельный промотор, способный к интенсивной транскрипции; сигналы оптимизированного процессинга иРНК и трансляции, которые обычно включают последовательность Kozak, кодон терминации трансляции, сигналы расщепления иРНК и полиаденилирования, терминатор транскрипции и селективные маркеры для получения стабильных линий клеток и для генной амплификации; кроме того, прокариотическое начало репликации и селективные маркеры для размножения вектора в бактериях могут быть обеспечены вектором экспрессии.
В предшествующие годы исследования были сосредоточены на конструировании улучшенных векторов для генной экспрессии в клетках-хозяевах. Однако, несмотря на изобилие доступных векторов, интенсивное получение на высоком уровне полипептида/белка в клетках млекопитающих по-прежнему осложнено.
Один из применяемых методов получения линий высокопродуктивных клеток, экспрессирующих на высоком уровне целевой продукт, заключается в стабильной трансфекции клеток-хозяев. Однако стабильная интеграция в геном происходит редко, и только небольшая клеточная субпопуляция стабильно трансфецированных клеток представлена высокопродуктивными клетками. Соответственно осуществление такого отбора осложнено.
Селективные маркеры и системы селекции широко используют в генной инженерии, методах рекомбинации ДНК и в выработке рекомбинантных продуктов для получения клеток-хозяев, экспрессирующих целевой продукт на высоком уровне. Соответствующие системы также применимы для создания и идентификации стабильно трансфецированных клонов. Главная цель применения соответствующих селективных маркеров и систем отбора заключается в интродукции селективного гена, который под воздействием селективных условий роста позволяет идентифицировать клетки, способные к выработке на высоком уровне интродуцированного селективного маркера и соответственно рекомбинантного целевого продукта. Повышение уровня экспрессии продукта может быть достигнуто, например, амплификацией гена с применением линии клеток, например, дефицитных по ферменту, например, по дигидрофолатредуктазе (ДГФР) или глутаминсинтетазе (ГС), вместе с векторами экспрессии, содержащими гены, кодирующие такие селективные маркерные ферменты и агенты, например, метотрексат (МТК), который ингибирует ДГФР, и метионин сульфоксамин (МСА), который ингибирует ГС.
Одна из известных систем отбора, которую обычно используют в предшествующем уровне техники, представляет систему отбора дигидрофолатредуктазы/МТК. Дигидрофолатредуктаза (ДГФР) катализирует НАДФ - зависимое восстановление дигидрофолиевой кислоты до тетрагидрофолиевой кислоты (ТГФ). Затем ТГФ внутренне конвертирует в 10-формил-ДГФ и 5,10-метилен-ДГФ, которые используются в биосинтезе de novo пуринов и тимидилата, соответственно. ДГФ представляет побочный продукт каталитического действия тимидилатсинтазы (ТС), которая катализирует конверсию дезоксиуридинмонофосфата (дУМФ) в дезокситимидин монофосфат (дТМФ) в ходе 5,10-метилен-ТГФ-зависимой реакции. Таким образом, ДГФР принципиально важен для рециклирования кофакторов ТГФ, существенных для биосинтеза пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, которые необходимы для репликации ДНК. Таким образом, клетки (например, клетки СНО), которые утратили ген ДГФР (т.е. за счет направленной делеции в геноме), могут применяться в качестве реципиентов для трансфекции гена ДГФР в среде, не содержащей нуклеотидов. После трансфекции клетки могут подвергаться воздействию постепенно повышающихся концентраций антифолата МТК, наиболее сильного ингибитора ДГФР (Kd=1 пМ), тем самым заставляя клетки вырабатывать повышенные уровни ДГФР. После многочисленных кругов отбора селективный маркер ДГФР часто подвергается существенной амплификации. Кроме того, более чувствительные мутантные формы соответствующих селективных маркеров могут применяться вместе с клетками-хозяевами дикого типа. В другом варианте мутантный мышиный фермент ДГФР с большей устойчивостью, т.е. менее чувствительный к МТК, или другие мутантные формы ДГФР также активно использовались в качестве доминантного селективного маркера, который заметно повышает приобретенный высокий уровень устойчивости к МТК в трансфецированных клетках. Однако главный недостаток системы отбора ДГФР/МТК, используемой в предшествующем уровне техники, заключается в том, что такой метод использует мутагенный цитотоксический агент, МТК, который может в особенно высоких концентрациях изменить генотип реципиентных клеток. Это часто приводит к популяциям МТК-устойчивых клеток, у которых пет экспрессии целевого гена-мишени из-за утраты функциональных мутаций, например, в восстановленном переносчике фолата (ВПФ)/или утраты экспрессии гена ВПФ, причем в обоих случаях упраздняется потребление МТК. Однако необходимы повышенные/высокие концентрации МТК для достижения достаточно строгих условий отбора для выделения клеток-хозяев, вырабатывающих целевой продукт на достаточно высоком уровне.
Становится очевидным, что система отбора высокой точности имеет принципиальное значение для обогащения высокопродуцирующих клеток из популяции трансфецированных клеток. Чем выше точность системы отбора, тем ниже число низкоактивных продуцентов после процесса отбора и выше вероятность обнаружения очень редких чрезвычайно продуктивных клонов в трансфецированной популяции клеток.
Таким образом, задача, решаемая в настоящем изобретении, заключалась в разработке системы строгого отбора клеток-хозяев, вырабатывающих целевой продукт на высоком уровне, а также способов получения целевого продукта на достаточно высоком уровне. В частности, настоящее изобретение предусматривает систему строгого отбора, которая требует меньших количеств токсических агентов, в частности МТК. Кроме того, задача, решаемая в настоящем изобретении, заключалась в разработке способа получения целевого продукта на высоком уровне продуктивности.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к системе отбора для отбора клеток-хозяев, экспрессирующих на высоком уровне целевой продукт, и к получению соответствующих продуктов, в частности, полипептидов, например, антител.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу отбора по меньшей мере одной эукариотической клетки-хозяина, экспрессирующей целевой продукт, который включает по меньшей мере следующие стадии:
(а) получения множества эукариотических клеток-хозяев, жизнеспособность которых зависит от потребления фолата, причем указанные эукариотические клетки-хозяева включают по меньшей мере
(i) интродуцированный полинуклеотид, кодирующий целевой продукт, и
(ii) интродуцированный полинуклеотид, кодирующий фермент ДГФР,
(б) культивирования указанного множества эукариотических клеток-хозяев в селективной культуральной среде, включающей по меньшей мере ингибитор ДГФР и фолат в предельно допустимой концентрации, и
(в) отбора по меньшей мере одной эукариотической клетки-хозяина, экспрессирующей целевой продукт.
Настоящее изобретение также относится к способу получения целевого продукта, включающему культивирование клетки-хозяина, выбранной согласно настоящему изобретению, в таких условиях, которые допускают экспрессию целевого продукта.
В настоящем изобретении также предусмотрена селективная культуральная среда, включающая по меньшей мере ингибитор ДГФР и фолат в предельно допустимой концентрации, которая может применяться в способе отбора по настоящему изобретению. Понятие «селективная культуральная среда» означает среду для культивирования клеток, применимую для отбора клеток-хозяев.
Другие объекты, свойства, преимущества и признаки настоящего описания могут стать ясны специалистам в данной области из последующего описания и прилагаемой формулы изобретения. Однако следует учитывать, что последующее описание, прилагаемая формула изобретения и конкретные примеры, хотя и указывают на предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, приводятся только в качестве иллюстрации. Различные изменения и модификации в рамках охвата настоящего изобретения и в духе настоящего изобретения станут легко понятны специалистам в данной области после ознакомления с последующим описанием.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к системе отбора, в которой используют ДГФР в качестве селективного маркера, которая нуждается в пониженной концентрации токсических агентов, например, антифолата МТК, но по-прежнему обеспечивает строгие селективные условия, достаточные для выявления высокопродуктивных клеток-хозяев.
Один из объектов настоящего изобретения представляет способ отбора по меньшей мере одной эукариотической клетки-хозяина, экспрессирующей целевой продукт, включающий по меньшей мере следующие стадии:
(а) получения множества эукариотических клеток-хозяев, жизнеспособность которых зависит от потребления фолата, причем указанные эукариотические клетки-хозяева включают по меньшей мере
(i) интродуцированный полинуклеотид, кодирующий целевой продукт, и
(ii) интродуцированный полинуклеотид, кодирующий фермент ДГФР,
(б) культивирования указанного множества эукариотических клеток-хозяев в селективной культуральной среде, включающей по меньшей мере ингибитор ДГФР и фолат в предельно допустимой концентрации,
(в) отбор по меньшей мере одной эукариотической клетки-хозяина, экспрессирующей целевой продукт.
Понятие «полинуклеотид» означает полимер из нуклеотидов, которые обычно связаны друг с другом через дезоксирибозу или рибозу, и является ДНК или РНК в зависимости от контекста. Понятие «полинуклеотид» не подразумевает каких-либо ограничений по размеру, а также охватывает полинуклеотиды, включающие модификации, в частности модифицированные нуклеотиды.
Понятие «целевой продукт» означает продукт, экспрессируемый в указанной клетке-хозяине. Целевой продукт может быть, например, полипептидом или полинуклеотидом, например, РНК. Предпочтительно целевой продукт является полипептидом, в частности молекулой иммуноглобулина. Другие примеры целевых продуктов подробно описаны ниже.
Понятие «интродуцированный полинуклеотид» означает последовательность полинуклеотида, интродуцированную в клетку-хозяина, например, с помощью методов рекомбинации, например, трансфекции. Клетка-хозяин может включать или не включать эндогенный полинуклеотид, который соответственно является идентичным интродуцированному полинуклеотиду. Интродукция может быть достигнута, например, трансфекцией соответствующего вектора, который может интегрировать в геном клетки-хозяина (стабильная трансфекция). Соответствующие векторы экспрессии, допускающие интродукцию полинуклеотидов в клетку-хозяина, подробно описаны выше. В случае неинсертированной в геном гетерологичной нуклеиновой кислоты гетерологичная нуклеиновая кислота может быть утрачена на более поздней стадии, например, если клетка претерпевает митоз (временная трансфекция). Соответствующие векторы также могут поддерживаться в клетке-хозяине без интеграции в геном, например, путем эписомальной репликации. Однако в предшествующем уровне техники также известны другие методы интродукции полинуклеотида в клетку-хозяина, которые подробно описаны ниже.
Понятие «ингибитор ДГФР» означает соединение, которое ингибирует действие дигидрофолатредуктазы (ДГФР). Соответствующий ингибитор может, например, конкурировать с субстратом ДГФР за связывание с ДГФР. Соответствующие ингибиторы ДГФР являются, например, антифолатами, например, метотрексатом (МТК). К другим примерам относятся, но ими не ограничиваются, триметрексат глюкуронат (нейтрексин), триметоприм, пириметамин и пеметрексед.
Понятие «отбор» или «селекция» в контексте настоящего изобретения, в частности, относится к способу применения селективного отбора и селективных культуральных условий для отбора и соответственно получения клеток-хозяев, которые содержат инкорпорированный вектор или комбинацию векторов по настоящему изобретению. Таким образом, успешно трансфецированные клетки-хозяева могут быть выделены из популяции трансфецированных клеток-хозяев и/или обогащены в такой популяции.
Клетки-хозяева, в которые не был включен вектор или комбинация векторов по настоящему изобретению, предпочтительно погибают или отстают в росте в селективных культуральных условиях по сравнению с клетками-хозяевами, в которые были успешно инкорпорированы вектор или комбинация векторов по настоящему изобретению. Во время отбора клетки-хозяева, в которые были успешно инкорпорированы вектор или комбинация векторов по настоящему изобретению, могут быть обогащены в качестве совокупности трансфецированных клеток-хозяев из популяции трансфецированных клеток-хозяев. Отдельные клетки-хозяева также могут быть выделены из популяции трансфецированных клеток-хозяев во время отбора (например, селекции клонов). Соответствующие варианты осуществления методов отбора для получения успешно трансфецированных клеток-хозяев (например, сортировка методом FACS или методом серийных разведений) известны в предшествующем уровне техники и соответственно не требуют подробного описания.
Понятие «предельно допустимая концентрация фолата» относится к концентрации фолатов в селективной культуральной среде, которая обеспечивает селективное давление на клетку-хозяина. Соответственно фолаты не включают в селективную культуральную среду в избытке, тем самым обеспечивая селективное давление на клетки-хозяева. Фолат, включенный в селективную культуральную среду в предельно допустимой концентрации, может потребляться и процессироваться клеткой-хозяином. Фолаты и, в частности, производные фолата, которые не могут процессироваться клеткой-хозяином, не могут участвовать в селективном давлении и, соответственно, не влияют на предельно допустимую концентрацию. Соответствующие диапазоны концентраций описаны ниже.
Понятие «полипептид» относится к молекуле, представляющей полимер из аминокислот, связанных друг с другом пептидной связью (связями). К полипептидам относятся полипептиды какой-либо длины, в том числе белки (например, содержащие более 50 аминокислот) и пептиды (например, содержащие более 2-49 аминокислот). К полипептидам относятся белки и/или пептиды какого-либо действия или биологической активности. Соответствующие примеры приведены ниже.
Неожиданно было обнаружено, что система отбора для получения рекомбинантных эукариотических клеток, способных вырабатывать целевой продукт, может быть основана на ограниченной доступности фолатов в селективной культуральной среде вместе с применением ДГФР в качестве селективного маркера. Система имеет широкое применение, т.е. она применима к эукариотическим клеткам-хозяевам, жизнеспособность которых зависит от потребления фолата. Выше было описано, что в предшествующем уровне техники были вынуждены использовать довольно высокие концентрации антифолата/МТК для того, чтобы достичь достаточно высокого давления на амплификацию гена и соответственно для достижения повышения продуктивности целевого продукта. Это является недостатком, поскольку антифолаты, например, МТК, токсичны и могут генетически изменить клетку-хозяина. Подход по настоящему изобретению, основанный на комбинированном применении селективного маркера ДГФР при предельно допустимой концентрации фолатов в селективной культуральной среде, обладает преимуществом, поскольку точность отбора существенно повышена даже при низких концентрациях ингибитора ДГФР. Таким образом, при использовании системы отбора по настоящему изобретению получают высокоэффективные продуценты даже при низких концентрациях ингибитора ДГФР (например, МТК) в селективной культуральной среде. Таким образом, требуются низкие концентрации ингибитора ДГФР и соответственно низкие концентрации токсического агента при использовании подходов, изложенных в настоящем изобретении, по сравнению с подходами в предшествующем уровне техники для обеспечения строгих условий отбора, которые позволяют идентифицировать клоны высокопродуктивных клеток. Из-за уникальной конструкции обеспечивается очень строгая система отбора, позволяющая обогащать высокопродуктивные клетки из популяции трансфецированных клеток-хозяев. Такая высокая строгость системы отбора по настоящему изобретению снижает число низко активных продуцентов в популяции после отбора в популяции и повышает вероятность обнаружения очень редких чрезвычайно высокопродуктивных клонов.
Селективная культуральная среда может включать один или несколько типов фолата. Фолат по настоящему изобретению может, например, быть окисленным фолатом (т.е. фолиевой кислотой), или восстановленным фолатом, или их производным. В общем фолат может применяться в настоящем применении до тех пор, пока такой фолат может быть в состоянии поступать в эукариотические клетку, предпочтительно с помощью функционального связанного с мембраной рецептора фолата. Окисленный фолат, т.е. фолиевая кислота, а также восстановленные производные фолиевой кислоты, называемые восстановленными фолатами или тетрагидрофолатами (ТГФ), представляют группу витаминов В-9, которые являются важными кофакторами и/или коферментами биосинтеза пуринов, тимидилата и определенных аминокислот в эукариотических клетках, в частности в клетках млекопитающих. Кофакторы ТГФ являются особенно принципиальными для репликации ДНК и соответственно клеточной пролиферации. Конкретно кофакторы ТГФ функционируют в качестве доноров одноуглеродных блоков в сериях взаимосвязанных метаболических путей, вовлеченных de novo в биосинтез пуринов и тимидилата, аминокислот, а также в метаболизм метильной группы, включая метилирование островков CpG в ДНК. Конкретно кофакторы ТГФ, включающие 10-формил-ТГФ (10-СНО-ТГФ), включают одноуглеродные блоки в две ключевые de novo реакции формилтрансферазы, вовлеченные de novo в биосинтез пуринов. Предпочтительным примером окисленного фолата является фолиевая кислота. Предпочтительными примерами восстановленных фолатов являются 5-метил-тетрагидрофолиевая кислота, 5-формил-тетрагидрофолиевая кислота, 10-формил-тетрагидрофолиевая кислота и 5,10-метилен-тетрагидрофолиевая кислота.
Концентрация фолата в селективной среде зависит, в частности, от применяемых эукариотических клеток-хозяев. Применимой является концентрация фолата 500 нМ или менее, 250 нМ или менее, 150 нМ или менее, 100 нМ или менее, 75 нМ или менее, 50 нМ или менее, 25 нМ или менее, 15 нМ или менее или даже 10 нМ или менее, например, 7,5 нМ или менее. К соответствующим диапазонам относятся 0,1-500 нМ, 0,1-250 нМ, 5 или 10-250 нМ, предпочтительно 1-150 нМ, 5 или 10-150 нМ, 1-100 нМ, 5 или 10-100 нМ и более предпочтительны 1-50 нМ, 2,5-50 нМ, 10-50 нМ или 12,5-50 нМ. Такие концентрации особенно применимы при использовании в качестве фолата фолиевой кислоты.
Соответствующие концентрации являются предельно допустимыми концентрациями с точки зрения настоящего изобретения и таким образом применимы для обеспечения селективного давления на клетки-хозяева. Снижение концентрации обеспечивает селективное давление до тех пор, пока клетки остаются жизнеспособными. Описанные диапазоны концентраций особенно применимы для использования клеток СНО в качестве клеток-хозяев.
Концентрация ингибитора ДГФР, используемая в селективной культуралыюй среде, также зависит от применяемой эукариотической клетки-хозяина. Концентрация ингибитора ДГФР 500 нМ или менее, 400 нМ или менее, 300 нМ или менее, 250 нМ или менее, 200 нМ или менее, 150 нМ или менее полезна в том случае, если поддерживающая концентрация ингибитора ДГФР в селективной среде понижена. Однако предпочтительно селективная среда включает по меньшей мере 10 нМ ингибитора ДГФР. Предпочтительные концентрации антифолата, предпочтительно МТК, составляют 1-500 нМ, предпочтительно 10-200 нМ, 10-150 нМ и более предпочтительно 10-100 нМ. Соответствующие концентрации в селективной культуральной среде особенно применимы для клеток СНО.
Предпочтительные концентрации и диапазоны концентраций фолата и антифолата, описанные выше, могут комбинироваться друг с другом. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения применяют селективную культуральную среду, которая включает ингибитор ДГФР, предпочтительно МТК, в концентрации 200 нМ или менее, предпочтительно 150 нМ или менее, предпочтительно 100 нМ или менее, и фолат, предпочтительно фолиевую кислоту, в концентрации менее 100 нМ, предпочтительно менее 75 нМ. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения фолат в концентрации 12,5-50 нМ применяют в концентрации с антифолатом в концентрации 10-100 нМ. Предпочтительно в качестве фолата и антифолата применяют фолиевую кислоту и МТК.
Допустимые концентрации фолиевой кислоты и МТК могут зависеть друг от друга; предпочтительная комбинация состоит из фолиевой кислоты в концентрации 2,5-75 нМ, 2,5-50 нМ или 12,5-50 нМ в сочетании с МТК в концентрации 10-500 нМ, предпочтительно 10-100 нМ. Такие концентрации особенно предпочтительны при применении клеток ДГФР+(плюс).
Описанные выше концентрации особенно применимы для суспензии линий быстро растущих клеток, которые обладают предпочтительным фенотипом для коммерческого получения линий клеток. Однако разные линии клеток могут обладать разными потребностями в потреблении фолиевой кислоты. Кроме того, предельные/селективные концентрации могут варьировать в зависимости от применяемого фолата, соответственно антифолата. Таким образом, предельно допустимые концентрации фолата, особенно фолиевой кислоты, и антифолата, особенно МТК, а также соответствующие соотношения фолиевой кислоты к МТК, могут быть разными для разных линий клеток. Однако соответствующие концентрации могут быть легко экспериментально определены специалистом.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клетки-хозяева предварительно культивируют в культуральной среде без фолата или в культуральной среде, включающей предельно допустимую концентрацию фолата перед трансфекцией и/или отбором. Соответствующие предельно допустимые концентрации фолата описаны выше. Предпочтительно указанная культуральная среда для предварительного культивирования клеток-хозяев включает фолаты, в частности фолиевую кислоту, в концентрации 50 нМ или менее.
-
+
Экспрессия инкорпорированного селективного маркера ДГФР обеспечивает селективное преимущество при селективных культуральных условиях клеткам-хозяевам. Например, клетки-хозяева (например, клетки СНО), утратившие ген ДГФР (например, путем нацеленной геномной делеции, также называемые клетками-хозяевами ДГФР), могут применяться в качестве реципиентов для трансфекции гена ДГФР в качестве гена селективного маркера в среде, не содержащей нуклеотидов. Однако также возможно применение клеток-хозяев, которые экспрессируют эндогенно ДГФР (клетки-хозяева ДГФР (плюс)) при проведении отбора ДГФР, если применяют соответствующие селективные культуральные условия. После трансфекции полинуклеотидами по настоящему изобретению клетки могут быть подвергнуты воздействию постепенно повышающихся концентраций ингибиторов ДГФР. Одним из примеров ингибиторов ДГФР являются антифолаты, например МТК, который представляет мощный ингибитор ДГФР (Kd=1 пМ). Содержание в среде антифолата, например, МТК, заставляет клетки вырабатывать повышенные уровни ДГФР для выживания. При многих кругах отбора селективный маркер ДГФР часто претерпевает существенную генную амплификацию для достижения этого.
Из предшествующего уровня техники известно несколько соответствующих генов ДГФР, которые могут применяться вместе с настоящим изобретением. ДГФР может быть ферментом ДГФР дикого типа или его функциональным вариантом или производным. К понятию «вариант» или «производное» относятся ферменты ДГФР, имеющие один или несколько изменений в аминокислотных последовательностях (например, делеций, замещений или добавлений), касающихся аминокислотной последовательности соответствующего фермента ДГФР, гибридные белки, включающие фермент ДГФР или его функциональный фрагмент, и ферменты ДГФР, которые были модифицированы для обеспечения дополнительной структуры и/или функции, а также функциональные фрагменты указанных соединений, которые по-прежнему обладают по меньшей мере одной функцией фермента ДГФР. Могут применяться ферменты/варианты ДГФР в качестве селективного маркера, которые более или менее чувствительны к МТК по сравнению с ферментом ДГФР дикого типа. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения используемый фермент ДГФР более чувствителен к антифолатам, например, МТК, чем соответствующий фермент дикого типа ДГФР и/или фермент ДГФР, эндогенно экспрессированный клеткой-хозяином в случае, если экспрессия происходит. Фермент ДГФР может быть получен от какого-либо вида до тех пор, пока он будет функциональным в рамках настоящего изобретения, т.е. совместимым с используемой клеткой-хозяином. Например, мутантный ДГФР мыши с существенной устойчивостью к МТК широко применялся в качестве доминантного селективного маркера, который явно повышает приобретение высокого уровня МТК-резистентности в клетках-трансфектантах. Предпочтительно используют фермент ДГФР, который менее восприимчив и, таким образом, менее чувствителен к ингибитору ДГФР, например, МТК, чем фермент ДГФР, эндогенно экспрессируемый в клетке-хозяине ДГФР (плюс).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения интрон или его фрагмент помещен с 3'-конца открытой рамки считывания гена ДГФР. Это оказывает благоприятное воздействие на степень экспрессии/амплификации конструкции. Интрон, используемый в кассетах экспрессии ДГФР, приводит к меньшему нефункциональному варианту гена ДГФР (Grillari и др., J. Biotechnol. 87, 2001, сс.59-65). В результате уровень экспрессии гена ДГФР снижается и может таким образом дополнительно повысить точность системы отбора. Соответственно клетка-хозяин может включать интродуцированный полинуклеотид, кодирующий фермент ДГФР, который включает интрон, локализованный с 3'-конца кодирующей последовательности ДГФР. Другие методы, применяющие интрон для снижения уровня экспрессии гена ДГФР, описаны в EP 0724639 и также могут применяться.
В отличие от большинства прокариот, растений и грибов, которые синтезируют свои собственные фолаты, млекопитающие и другие виды эукариот не имеют биосинтеза кофактора ТГФ и, следовательно, должны получать их из экзогенных источников, обычно из культуральной среды. В настоящее время известны три независимые транспортные системы для опосредования потребления фолатов и антифолатов клетками млекопитающих, а именно восстановленный переносчик фолата (ВПФ); протонсопряженный переносчик фолата (ПСПФ, также обозначаемый SLC46A) и рецепторы фолата (РФ).
+
Эукариотическую клетку-хозяина предпочтительно выбирают из группы, состоящей из клеток млекопитающего, насекомых, растений и грибов. Клетки грибов и растительные клетки могут быть прототрофами по фалату (т.е. такие клетки могут автономно синтезировать собственные фолаты, необходимые для выживаемости клеток, т.е. для роста и пролиферации клеток). Настоящее изобретение особенно предусматривает такие грибные и растительные клетки, которые являются ауксотрофами по фолатам или могут стать таковыми. Они могут сформироваться, например, в результате генетических манипуляций, т.е. над теми клетками, которые в настоящее время не могут синтезировать достаточных количеств фолатов, требуемых для жизнеспособности клеток. Например, способность таких грибных или растительных клеток эндогенно синтезировать фолаты, например, по соответствующему метаболическому пути, может быть инактивирована, например, за счет разрушения гена или генного сайленсинга соответствующих генов-мишеней или подавления ключевых ферментов и др. Предпочтительно клетки-хозяева являются клетками млекопитающих. Указанные клетки млекопитающих могут быть выбраны из группы, включающей клетки грызунов, клетки человека и клетки обезьян. Особенно предпочтительны клетки грызунов, предпочтительно выбранные из группы, состоящей из клеток СНО, клеток ВНК, клеток NSO, фибробластов мыши ЗТЗ и клеток SP2/0. Наиболее предпочтительными клетками грызунов являются клетки СНО. Также предпочтительны клетки человека, которые предпочтительно выбраны из группы, состоящей из клеток НЕК293, клеток MCF-7, клеток PerС6 и клеток HeLa. Также предпочтительны клетки обезьян, которые предпочтительно выбраны из группы, состоящей из клеток COS-1, COS-7 и клеток Vero. Клеткой-хозяином предпочтительно является клетка ДГФР (плюс), особенно клетка ДГФР(плюс) СНО.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий целевой продукт, и полинуклеотид, кодирующий фермент ДГФР, интодуцированы с помощью по меньшей мере одного вектора экспрессии. Соответствующие методы интродукции соответствующего вектора экспрессии описаны ниже и включают, например, трансфекцию.
Понятие «вектор экспрессии» по настоящему изобретению относится к полинуклеотиду, способному нести по меньшей мере один фрагмент чужеродной нуклеиновой кислоты. Вектор функционирует в качестве молекулярного носителя, доставляющего фрагменты соответствующих полинуклеотидов нуклеиновых кислот в клетку-хозяина. Он включает по меньшей мере одну кассету экспрессии, включающую регуляторные последовательности для надлежащей экспрессии инкорпорированного в него полинуклеотида. Полинуклеотиды (например, кодирующие целевой продукт или селективные маркеры) могут быть инсертированы в кассету (кассеты) экспрессии вектора экспрессии для экспрессии с него. Вектор экспрессии по настоящему изобретению может быть в кольцевой или линеаризованной форме. Понятие «вектор экспрессии» также включает искусственные хромосомы или близкие соответствующие полинуклеотиды, допускающие перенос фрагментов чужеродной нуклеиновой кислоты.
Полинуклеотид, кодирующий целевой продукт, и полинуклеотид, кодирующий фермент ДГФР, может быть локализован на одном и том же или на разных векторах экспрессии. Применение вектора экспрессии, несущего оба полинуклеотида, обладает преимуществом, заключающимся в том, что только один вектор экспрессии требуется интродуцировать в клетку-хозяина. Кроме того, в особенности при создании линии со стабильной экспрессией, более вероятно, что полинуклеотиды интегрированы в геном вместе и, соответственно, экспрессируются с близким выходом. Однако также возможно в рамках охвата настоящего изобретения применение комбинации по меньшей мере двух векторов экспрессии для трансфекции, причем соответствующие полинуклеотиды локализованы в разных векторах экспрессии. Указанную комбинацию векторов экспрессии затем трансфецируют в клетку-хозяина.
Эукариотическая клетка-хозяин может включать по меньшей мере один дополнительный интродуцированный полинуклеотид, кодирующий другой целевой продукт. Такой вариант осуществления настоящего изобретения особенно применим для экспрессии молекул иммуноглобулина. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин включает по меньшей мере два интродуцированных полинуклеотида, каждый из которых кодирует целевой продукт, причем по меньшей мере один полинуклеотид кодирует тяжелую цепь молекулы иммуноглобулина или ее функциональный фрагмент, а другой полинуклеотид кодирует легкую цепь молекулы иммуноглобулина или ее функциональный фрагмент. Соответствующие полинуклеотиды могут быть интродуцированы с помощью соответствующего вектора экспрессии. Указанные полипуклеотиды, кодирующие тяжелую и легкую цепи молекулы иммуноглобулина (или ее функциональный фрагмент), могут быть локализованы на одном и том же или на разных векторах экспрессии при использовании комбинации по меньшей мере двух векторов экспрессии.
Клетка-хозяин и соответственно вектор экспрессии для интродукции полинуклеотидов в указанную клетку-хозяина могут дополнительно включать один или несколько дополнительных полинуклеотидов, кодирующих один или несколько дополнительных селективных маркеров. Соответственно в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения совместный отбор, в котором применяют систему по настоящему изобретению вместе с одной или несколькими другими системами отбора (например, системами отбора по устойчивости к антибиотикам, например, neo/G418), может применяться для дополнительного улучшения процесса. Помимо других дополнительных селективных эукариотических маркеров, допускающих отбор эукариотических клеток-маркеров, также могут применяться прокариотические селективные маркеры, которые допускают отбор в эукариотических клетках-хозяевах. Примерами соответствующих прокариотических селективных маркеров являются маркеры, которые обеспечивают устойчивость к антибиотикам, например, к ампициллину, канамицину, тетрациклину и/или хлорамфениколу.
Векторы, применяемые для интродукции полинуклеотидов в клетки-хозяева, обычно содержат элементы контроля транскрипции, применимые для стимуляции транскрипции, например, промоторы, энхансеры, сигналы полиаденилирования, сигналы временной остановки или терминации транскрипции в качестве элемента кассеты экспрессии. Если требуемым продуктом является белок, соответствующие элементы контроля трансляции предпочтительно включены в вектор и оперативно связаны с полинуклеотидами, подвергаемыми экспрессии, например, 5'-нетранслируемые области, приводящие к 5'-кэповым структурам, применимым для рекрутинга рибосом и стоп-кодонов для терминации процесса трансляции. В частности, полинуклеотид, выступающий в качестве генов селективных маркеров, а также полинуклеотид, кодирующий целевой продукт, могут транскрибироваться под контролем элементов транскрипции, содержащихся в соответствующих промоторах. Получаемые в результате транскрипты генов селективных маркеров и транскрипты целевого продукта несут функциональные элементы трансляции, которые содействуют получению существенных уровней экспрессии белка (т.е. трансляции) и правильной терминации трансляции. Функциональный элемент экспрессии, способный должным образом индуцировать экспрессию инкорпорированного полинуклеотида, также относится к используемому в настоящем изобретении понятию «кассета экспрессии».
Вектор экспрессии или комбинация векторов экспрессии по настоящему изобретению, применяемые для интродукции полинуклеотидов в эукариотические клетки-хозяева, могут включать по меньшей мере один промотор и/или промотор/энхансер в качестве элемента кассеты экспрессии. Хотя физические границы между такими двумя контрольными элементами не всегда ясны, понятие «промотор» обычно относится к сайту молекулы нуклеиновой кислоты, с которым связывается РНК-полимераза и/или какие-либо ассоциированные факторы и с которого начинается транскрипция. Энхансеры усиливают действие промотора во времени и в пространстве. Многие промоторы проявляют действие по индукции транскрипции в широком диапазоне типов клеток. Промоторы могут быть поделены на два класса - те, которые действуют конститутивно, и те, которые регулируются путем индукции или дерепрессии. Оба класса применимы для способов по настоящему изобретению. Промоторы, применяемые для получения на высоком уровне полипептидов в клетках млекопитающих, должны быть сильными и предпочтительно действующими в широком диапазоне типов клеток.
К сильным конститутивным промоторам, которые индуцируют экспрессию в клетках многих типов, относятся, но ими не ограничиваются, главный поздний промотор аденовируса, предранний промотор цитомегаловируса человека, промотор SV40 и вируса саркомы Рауша, а также промотор 3-фосфоглицераткиназы мыши EFla. Хорошие результаты получают с вектором экспрессии по настоящему изобретению, если применяют промотор и/или энхарсер из CMV и/или SV40. Промоторы транскрипции могут быть выбраны из группы, состоящей из промотора SV40, промотора CMV, промотора EF1 альфа, промотора RSV, промотора BROAD3, промотора мыши rosa26, промотора pCEFL и промотора β-актина.
Предпочтительно полинуклеотид, кодирующий целевой продукт, и полинуклеотид, кодирующий фермент ДГФР, находятся под контролем разных промоторов транскрипции. В целом промотор, способный к индукции экспрессии, в частности транскрипции, необходимых полинуклеотидов в эукариотической клетке-хозяине, могут быть применимы. Другие промоторы транскрипции, индуцирующие экспрессию с полинуклеотидов, могут быть теми же или отличными.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения применяют более сильный промотор и/или энхансер для индукции экспрессии полинуклеотида, кодирующего целевой продукт, чем для индукции экспрессии полинуклеотида, кодирующего фермент ДГФР и/или дополнительные селективные маркеры, если они имеются. При такой сборке вырабатывается больше транскрипта для целевого продукта, чем для селективных маркеров. Это является преимуществом, поскольку выработка целевого продукта доминирует над выработкой селективных маркеров, поскольку способность отдельных клеток вырабатывать гетерологичные продукты не ограничена и таким образом может сосредотачиваться на целевом продукте. Кроме того, процесс отбора происходит только на исходных стадиях создания линии экспрессирующих клеток, которая затем постоянно вырабатывает целевой продукт. Таким образом, преимущество заключается в сосредоточении ресурсов клеток на экспрессии/выработке целевого продукта. Кроме того, использование менее строгого промотора для экспрессии селективного маркера (маркеров), в частности ДГФР, дополнительно повышает селективное давление и таким образом позволяет применять пониженные концентрации ингибиторов ДГФР в селективной культуральной среде.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения промотором, индуцирующим экспрессию полинуклеотида, кодирующего целевой продукт, является промотор CMV, и промотором, индуцирующим экспрессию полипуклеотида, кодирующего фермент ДГФР, является промотор SV40. Известно, что промотор CMV является одним из самых сильных промоторов, доступных для экспрессии в клетках млекопитающих, который приводит к очень хорошей степени экспрессии. Полагают, что он может дать намного больше транскрипта, чем промотор SV40.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения полицуклеотид, кодирующий целевой продукт, и полинуклеотид, кодирующий фермент ДГФР, находятся под контролем того же промотора транскрипции и таким образом экспрессируются с одной кассеты экспрессии. Соответствующие промоторы описаны выше. В таком варианте осуществления настоящего изобретения один длинный транскрипт получают с соответствующей кассеты экспрессии, которая находится под контролем указанного промотора транскрипции. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения по меньшей мере один элемент IRES функционально локализован между полинуклеотидом, кодирующим целевой продукт и/или полинуклеотидом, кодирующим фермент ДГФР. Таким образом гарантируется, что с указанного транскрипта получают раздельные продукты трансляции.
Кассета экспрессии может включать соответствующий сайт терминации транскрипции. По мере продолжения транскрипции с расположенного выше по цепи промотора через вторую единицу транскрипции он может ингибировать функцию расположенного ниже по цепи промотора, этот феномен называется окклюзией промотора или интерференцией транскрипции. Это явление описано и для прокариот, и для эукариот. Правильное размещение сигналов терминации транскрипции между двумя единицами транскрипции может предотвратить окклюзию промотора. Сайты терминации транскрипции описаны и показано, что их включение в векторы экспрессии оказывает множественные полезные воздействия на генную экспрессию.
Применяемая клетка-хозяин является эукариотической, особенно принадлежащей млекопитающему. Большинство возникающих эукариотических иРНК имеет поли-А хвост с 3'-конца, который добавляется во время сложного процесса, включающего расщепление первичного транскрипта и связанную с ним реакцию полиаденилирования. Поли-А хвост полезен для стабильности и перемещаемости иРНК. Поэтому кассеты экспрессии для экспрессии полинуклеотидов, кодирующих целевой продукт и фермент ДГФР, обычно включают сайт полиаденилирования для терминации транскрипции и полиаденилирования. Имеется несколько эффективных сигналов поли-А, которые могут применяться в векторах экспрессии млекопитающих, в том числе производные от бычьего гормона роста (bovine growth hormone - bgh), бета-глобина мыши, единиц ранней транскрипции SV40 и гена тимидинкиназы вируса Herpes simplex. Однако также известны синтетические сайты полиаденилирования (см., например, вектор экспрессии pCI-neo фирмы Promega, который обоснован Levitt и др., 1989, Genes Dev. 3(7), 1989, cc.1019-1025). Сайт полиаденилирования может быть выбран из группы, состоящей из сайта поли-А SV40, например, позднего и раннего сайта поли-А SV40 (см., например, плазмиду pSV2-ДГФР по описанию Subramani и др., Mol.Cell. Biol., 1981, сс.854-864), синтетического сайта поли-А (см., например, вектор экспрессии pCI-neo фирмы Promega, основанный на работе Levitt и др.. Genes Dev. 3 (7), 1989, сс.1019-1025) и сайта поли-А bgh (bovine growth hormone - бычьего гормона роста).
Кроме того, кассета экспрессии, включающая полинуклеотид, кодирующий целевой продукт, и полинуклеотид, кодирующий фермент ДГФР, может включать по меньшей мере один интрон. Такой вариант осуществления настоящего изобретения особенно применим, когда клетку-хозяина млекопитающего применяют для экспрессии. Большинство генов высших эукариот содержит интроны, которые удаляют во время процессинга РНК. Соответствующие конструкции экспрессируются более эффективно в трансгенных системах, чем идентичные конструкции, утратившие интроны. Обычно интроны помещают с 5'-конца открытой рамки считывания, но они также могут быть помещены с 3'-конца. Соответственно интрон может быть включен в кассету (кассеты) экспрессии для повышения степени экспрессии. Указанный интрон может быть локализован между элементом (элементами) промотора или промотора/энхансера и 5'-концом открытой рамки считывания экспрессируемого полинуклеотида. В данной области известно несколько соответствующих интронов, которые могут применяться в рамках настоящего изобретения.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения интроном, применяемым в кассетах экспрессии для экспрессии целевого продукта, является синтетический интрон, например, интрон SIS или RK. Интрон RK является сильным синтетическим интроном, который предпочтительно помещен перед стартовым кодоном ATG целевого гена. Интрон RK состоит из сайта сплайсирования интрона донора промотора CMV и сайта сплайсирования акцептора вариабельной области тяжелой цепи IgG мыши (см., например. Baton и др., Biochemistry 25, 1986, cc.8343-8347, Neuberger и др., ЕМВО J. 2(8), 1983, cc.1373-1378; он может быть получен из вектора pRK-5 (фирма BD PharMingen)).
Вектор экспрессии, включающий полинуклеотиды и/или кассеты экспрессии согласно описанному выше, может быть трансфецирован в клетку-хозяина в свойственной ему кольцевой форме. Суперскрученные молекулы вектора обычно могут быть конвертированы в линейные молекулы в ядре из-за действия эндо- и экзонуклеаз. Однако линеаризация вектора экспрессии перед трансфекцией часто улучшает эффективность стабильной трансфекции. Точка линеаризации также может контролироваться, если вектор экспрессии линеаризуют перед трансфекцией. Соответственно в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вектор экспрессии или комбинация по меньшей мере двух векторов экспрессии включает по меньшей мере один предопределенный сайт рестрикции, который может применяться для линеаризации вектора (векторов) перед трансфекцией. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения сайт линеаризации собран таким образом, что при линеаризации полинуклеотид, кодирующий фермент ДГФР, локализован с 5'-конца полинуклеотида, кодирующего целевой продукт. Такая сборка полезна для генной амплификации. В том случае, когда дополнительно применяют прокариотический селективный маркер, полипуклеотид, кодирующий указанный прокариотический маркер, локализован с 3'-конца полинуклеотида, кодирующего целевой продукт. В этом случае прокариотический ген селективного маркера расположен с 3'-конца и таким образом находится «за пределами» частей «млекопитающего» нуклеиновой кислоты линеаризованного вектора. Такая сборка предпочтительна, поскольку прокариотические гены по-видимому не являются полезными для экспрессии в клетках млекопитающих, поскольку прокариотические последовательности могут привести к повышенному метилированию или другим эффектам сайленсинга в клетках млекопитающих.
Полинуклеотид, кодирующий целевой продукт, и полинуклеотид, кодирующий фермент ДГФР, предпочтительно стабильно интродуцированы в указанную клетку-хозяина. Стабильная интродукция, соответственно трансфекция, полезна для создания линий экспрессирующих клеток и особенно для крупномасштабного и соответственно промышленного получения целевого продукта.
В предшествующем уровне техники известно несколько соответствующих способов интродукции полинуклеотидов и векторов экспрессии в эукариотические клетки-хозяева, включая клетки-хозяева млекопитающих. К соответствующим способам относятся, но ими не ограничиваются, трансфекция с фосфатом кальция, электропорация, липофекция, перенос генов биолистикой и на основе полимера. Помимо традиционных методов, основанных на случайной интеграции, также могут применяться подходы на основе рекомбинации для трансфекции полинуклеотида, кодирующего целевой продукт, и полинуклеотидов, кодирующих фермент ДГФР в геном клетки-хозяина. Такие методы рекомбинации могут включать применение сайтспецифичных рекомбиназ типа Cre, Flp или ФС31 (см., например, Oumard и др, Cytotechnology, 50, 2006, cc.93-108), которые могут опосредовать направленную инсерцию трансгенов. В другом варианте механизм гомологичной рекомбинации может применяться для инсерции указанных полинуклеотидов (рассмотрена в обзоре Sorrell и др, Biotechnology Advances, 23, 2005, cc.431-469). Инсерция гена на основе рекомбинации позволяет минимизировать число элементов для минимизации числа элементов, включаемых в гетеологичную нуклеиновую кислоту, которую переносят/интродуцируют в клетку-хозяина. Например, может быть применен локус инсерции, который уже обеспечивает промотор и поли-А сайт (экзогенный или эндогенный) таким образом, что только остающиеся элементы (например, полинуклеотид, кодирующий целевой продукт, и полинуклеотид, кодирующий фермент ДГФР) должны быть перенесены/трансфецированы в клетку-хозяина. Варианты осуществления соответствующего вектора экспрессии или комбинации векторов экспрессии по настоящему изобретению, а также соответствующих клеток-хозяев, подробно описаны выше; см. приведенное выше описание.
В том случае, когда применяют дополнительный селективный маркер помимо фермента ДГФР, могут использоваться селективные условия для указанного селективного маркера до применения селективных условий для фермента ДГФР. Например, в случае применения гена неомицин-фосфотрансферазы (neo) в качестве дополнительного селективного маркера клетки могут выращиваться сначала в среде, например, содержащей антибиотик G418 для отбора клеток, в которые инкорпорирован вектор (векторы) экспрессии по настоящему изобретению.
Стратегия настоящего изобретения по применению предельно допустимой концентрации фолата в селективной культуральной среде помимо селективного маркера ДГФР обладает преимуществом, заключающимся в том, что добиваются очень жестких условий даже при использовании пониженных концентраций ингибитора ДГФР. Продуктивность популяции клеток, переживших такие новые условия отбора, резко повышается. Примеры показали, что клетки-хозяева, полученные после способа отбора, вырабатывают целевой продукт на высоком уровне. Средняя продуктивность отдельных клеток-хозяев также повышается. Таким образом, улучшаются шансы обнаружения высокопродуктивных клонов при меньших усилиях по скринингу. Таким образом, система отбора по настоящему изобретению превосходит системы отбора, известные из предшествующего уровня техники. В частности, получают клетки-хозяева, которые обладают повышенной продуктивностью по сравнению с применением только соответствующих селективных маркеров. Таким образом, из-за повышенной жесткости условий отбора процедуру отбора оптимизируют.
Клетки, полученные в результате процедуры строгого скрининга/отбора по настоящему изобретению, могут быть выделены и могут быть обогащены относительно не подвергнутых отбору клеток в первоначальной клеточной популяции. Их могут выделять и культивировать в качестве отдельных клеток. Они также могут применяться в одном или нескольких дополнительных кругах отбора, необязательно для дополнительного качественного или количественного анализа, или могут применяться, например, для создания линии клеток для получения белка. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения обогащенная популяция продуцирующих клеток-хозяев, выбранных согласно описанному выше, непосредственно используют в качестве популяции для получения целевого полипептида на высоком уровне. Предпочтительно отбирают клетку-хозяина, которая стабильно экспрессирует целевой продукт. Преимущества стабильной трансфекции/экспрессии подробно описаны выше. См. приведенное выше описание.
Также предусмотрен способ получения целевого продукта, включающий по меньшей мере следующие стадии:
(а) приготовления селективной среды по настоящему изобретению для отбора по меньшей мере одной эукариотической клетки-хозяина, экспрессирующей целевой продукт, и
(б) культивирования по меньшей мере одной отобранной эукариотической клетки-хозяина в условиях, допускающих экспрессию целевого продукта.
Поскольку способ отбора по настоящему изобретению позволяет идентифицировать клоны высокопродуктивных клеток, указанная система отбора представляет важную неотъемлемую часть процесса получения. Экспрессированный целевой продукт может быть получен путем разрушения клеток-хозяев. Полипептиды также могут экспрессироваться, например, секретироваться, в культуральную среду и могут быть выделены из нее. Также возможны комбинации соответствующих способов. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанные клетки-хозяева культивируют в условиях, исключающих наличие сыворотки.
Таким образом, продукты, в частности полипептиды, могут быть выработаны и эффективно получены/выделены с высоким уровнем продуктивности. Полученный продукт также может быть подвергнут стадиям дополнительного процессинга, например, очистке и/или модификации. Соответственно, способ получения целевого продукта может включать по меньшей мере одну из следующих стадий:
- выделения целевого продукта из указанной среды для культивирования клеток и/или из указанных клеток-хозяев; и/или
- процессинга выделенного целевого продукта.
Целевой продукт, например, полипептид, выработанный по настоящему изобретению, может быть выделен и необязательно дополнительно процессирован, например, дополнительно очищен, выделен и/или модифицирован способами, известными в данной области. Например, продукт может быть выделен из питательной среды обычными процедурами, включая, но ими не ограничиваясь, центрифугирование, фильтрацию, ультрафильтрацию, экстракцию или осаждение. Очистка может быть выполнена различными процедурами, известными в данной области, включая, но ими не ограничиваясь, хроматографию (например, ионообменную, аффинную, гидрофобную хроматографию, хроматофокусирование и эксклюзионную хроматографию), электрофорез (например, препаративное изоэлектрофокусирование), специфическую растворимость (например, осаждение сульфатом аммония) или экстракцию.
Целевой продукт может быть каким-либо биологическим продуктом, который может быть получен транскрипцией, трансляцией или в результате какого-либо другого события по экспрессии генетической информации, кодируемой указанным полинуклеотидом. В связи с этим продукт будет продуктом экспрессии. Целевой продукт может быть выделен из группы, состоящей из полипептидов, нуклеиновых кислот, в частности РНК или ДНК. Продукт может быть фармацевтически или терапевтически действующим соединением или инструментом исследования для использования в анализах и др. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения продуктом является полипептид, предпочтительно фармацевтически или терапевтически действующий полипептид, или являющийся инструментом исследования для использования в диагностике или в других исследованиях и др. Полипептид соответственно не ограничивается каким-либо определенным белком или группой белков, но, напротив, может быть каким-либо белком какого-либо размера, функции или происхождения, который требуется выделить и/или экспрессировать методами, описанными в настоящем изобретении. Таким образом, несколько разных целевых полипептидов может быть экспрессировано/выработано. Выше было отмечено, что понятие «полипептиды» включает белки и/или пептиды какого-либо действия или какой-либо биологической активности, включая, например, полипептиды биологического действия, например, ферментативные белки или пептиды (например, протеазы, киназы, фосфатазы), рецепторные белки или пептиды, транспортные белки или пептиды, бактерицидные белки и/или эндотоксинсвязывающие белки, структурные белки или пептиды, иммунные полипептиды, токсины, антибиотики, гормоны, факторы роста, вакцины или др. Указанный полипептид может быть выбран из группы, состоящей из пептидных гормонов, интерлейкинов, активаторов тканевого плазминогена, цитокинов, иммуноглобулинов, в частности антител или функциональных фрагментов антител или их вариантов. В наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения полипептидом является молекула иммуноглобулина или антитело, или его функциональный вариант, например, химерный, или частично или полностью гуманизированное антитело. Такое антитело может быть диагностическим антителом, или фармацевтически или терапевтически действующим антителом.
Также предусматривают продукт, полученный способом по настоящему изобретению, согласно описанному выше и в формуле настоящего изобретения. Указанный продукт предпочтительно является полипептидом, в частности , молекулой иммуноглобулина или его функциональным фрагментом.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения также предусмотрена селективная культуральная среда, включающая фолат в предельно допустимой концентрации и по меньшей мере один ингибитор ДГФР. Предпочтительно указанная селективная культуральная среда обладает одним или несколькими из следующих свойств:
(а) включает фолат, предпочтительно фолиевую кислоту, в концентрации, выбранной из следующих концентраций:
(аа) 500 нМ или менее;
(бб) 250 нМ или менее;
(вв) 150 нМ или менее;
(гг) 100 нМ или менее;
(д) 75 нМ или менее;
(ее) 50 нМ или менее;
(жж) 25 нМ или менее, и/или
(зз) 15 нМ или менее;
и/или
(б) включает фолат, предпочтительно фолиевую кислоту, в диапазоне концентраций, выбранном из следующих диапазонов:
(аа) 0,1-500 нМ;
(бб) 0,1-250 нМ, предпочтительно 2,5-250 нМ или 5 или 10-250нМ;
(вв) 0,1-150 нМ, предпочтительно 2,5-150 нМ или 5 или 10-150 нМ;
(гг) 1-100 нМ; предпочтительно 2,5-100 нМ или 5 или 10-100 нМ;
(дд) 1-75 нМ; предпочтительно 2,5-75 нМ или 5 или 10-75 нМ;
(ее) 1-50 нМ;
(жж) 2,5-50 нМ;
и/или
(зз) 12,5-50 нМ
и/или
(в) включает ингибитор ДГФР, который предпочтительно представляет антифолат, в концентрации, выбранной из концентраций:
(аа) 500 нМ или менее;
(бб) 400 нМ или менее;
(вв) 300 нМ или менее;
(гг) 250 нМ или менее;
(дд) 200 нМ или менее;
(ее) 150 нМ или менее; и/или
(жж) 100 нМ или менее;
и/или
(г) включает ингибитор ДГФР, который предпочтительно представляет антифолат, более предпочтительно МТК, в концентрации, выбранной из концентраций:
(аа) 1-500 нМ;
(бб) 10-200 нМ;
(вв) 10-150 нМ; и/или
(гг) 10-100 нМ.
Указанные концентрации и диапазоны концентраций для фолата и ингибитора ДГФР могут комбинироваться друг с другом. Преимущества и дополнительные предпочтительные варианты осуществления, касающиеся диапазонов концентраций и соответствующих вариантов осуществления фолатов и антифолатов в селективной культуральной среде, были подробно отмечены выше вместе со способом отбора по настоящему изобретению; см. приведенное выше описание. Указанная селективная культуральная среда может применяться вместе с системой отбора по настоящему изобретению.
Полное содержание текстов и документов, упоминаемых в настоящем изобретении, включены в него в виде ссылки и таким образом формируют часть настоящего описания.
Приводимые ниже примеры являются иллюстрацией настоящего изобретения и никоим образом не ограничивают области его охвата. В частности, настоящие примеры относятся к предпочтительным вариантам осуществления настоящего изобретения.
Примеры
В целом соответствующие материалы, например, реагенты, знакомы специалистам, коммерчески доступны и могут применяться в соответствии с инструкциями производителя. Эксперименты проводят согласно описанию.
Эксперимент по трансфекции в клетки СНО проводят, используя вектор экспрессии, содержащий кассеты экспрессии для экспрессии моноклонального антитела в качестве целевого продукта. В качестве селективных маркеров ген устойчивости к антибиотику G418 (NEO) и ген ДГФР содержатся в векторе экспрессии в разных кассетах экспрессии. Этот эксперимент показывает, что отбор при пониженных количествах МТК при низком содержании фолиевой кислоты приводит к выработке клеточных популяций с высоким уровнем продуктивности. В качестве контроля применяют стандартные условия отбора для ДГФР, в которых применяют повышенные концентрации МТК и фолиевую кислоту в неограниченных количествах.
Пример I. ДГФР и предельно допустимые концентрации фолиевой кислоты
1.1. Вектор экспрессии
Вектор экспрессии является вектором экспрессии млекопитающего, включающий следующие принципиально важные элементы, которые собраны в той же ориентации на векторе экспрессии:
Промотор/энхансер CMV
Интрон
Полинуклеотид, кодирующий легкую цепь антитела
Сайт множественного клонирования
Сайт поли-А SV40
Промотор/энхансер CMV
Интрон
Полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь антитела
Сайт множественного клонирования
Сайт поли-А SV40
Промотор/энхансер SV40
Неомицин фосфотрансфераза (neo)
Сайт поли-А (синтетический)
Ген устойчивости к ампициллину
Промотор SV40
Мутантный ген ДГФР менее чувствителен к МТК по сравнению с ДГФР дикого типа
Интрон
Сайт поли-А
1.2. Трансфекция и селекция клеток СНО
Культивирование клеток, трансфекцию и скрининг проводят в качалочных колбах, используя суспензию растущих клеток СНО в культуральной среде, соответствующей клеткам СНО, без фетальной сыворотки теленка (ФСТ). Клетки трансфецируют вектором экспрессии путем электропорации. Для снижения внутриклеточных запасов фолиевой кислоты в клетках-хозяевах и для предупреждения одновременного переноса фолиевой кислоты из среды предварительного культивирования в селективную среду клетки пересевают в среду без фолиевой кислоты или в среду с пониженным содержанием фолиевой кислоты (например, 50 нМ) перед трансфекцией и отбором. В зависимости от жизнеспособности клеток первую стадию отбора начинают через 24-48 ч после трансфекции путем добавления к клеткам селективной культуральной среды с добавлением G418 и МТК. На первой стадии отбора исследуют три разные концентрации МТК (2,5, 5 и 10 нМ) и три разные концентрации фолиевой кислоты (12,5, 25 и 50 нМ). В качестве контроля используют культуральную среду, включающую фолиевую кислоту в концентрации, не являющейся предельно допустимой концентрации, а именно 11,3 мкМ, которая соответствует стандартной концентрации в культуралыюй среде.
После восстановления жизнеспособности клеток примерно до 80%, проводят вторую стадию отбора путем пассирования клеток на среду без G418, содержащую то же количество фолиевой кислоты, что и на первой стадии отбора, но в 10 раз больше МТК (т.е. 25, 50 и 100 нМ). В случае контрольных культуральных условий к клеткам добавляют 500 нМ МТК.
1.3. Определение совокупной продуктивности
Продуктивность отобранных популяций клеток анализируют после первой и конечной стадий отбора через выросшие периодические культуры в качалочных колбах в среде, содержащей неограниченные количества фолиевой кислоты (11,3 мкМ) без G418, но с МТК в той же концентрации, что и соответствующая селективная среда.
2
5
Периодические культуры высевают в качалочные колбы емкостью 250 мл с рабочим объемом 50 мл и культивируют в качалочной камере (без увлажнения) при 150 об/мин в атмосфере 10% CO. Жизнеспособность клеток в начале исследования составляет > 90%. Плотность клеток при засеве обычно составляет примерно 2×10 клеток/мл. Титр определяют на 13 сутки. Титры антител в супернатанте культуры клеток определяют методом ВЭЖХ с белком-А на 13 сутки после начала культивирования.
1.4. Результаты
Для оценки строгости отбора ДГФР/МТК при ограниченных концентрациях фолиевой кислоты в настоящем примере I проводят трансфекцию вектора экспрессии ДГФР для экспрессии моноклонального антитела. Вектор также содержит ген устойчивости к G418 (см. выше). Сначала трансфецированные клетки отбирают добавлением G418 и разных концентраций МТК при разных концентрациях фолиевой кислоты. Первая стадия отбора должна способствовать уничтожению нетрансфецированных клеток и параллельно заставлять клетки потреблять запасы внутриклеточной фолиевой кислоты до более строгих условий, применяемых па второй стадии отбора. При таких условиях все трансфецированные клеточные популяции обычно восстанавливают и продуктивность оценивают согласно описанному выше. В табл. 1 суммированы полученные результаты по продуктивности.
Таблица 1
Результаты продуктивности клеточных популяций после первой стадии отбора
Селективная среда
Продуктивность моноклонального антитела (мг/л)
I. Серии исследований без МТК и при низких концентрациях фолиевой кислоты (ФК) (12,5 нМ, 25 нМ и 50 нМ)
+0,8 г/л G418
16
+12,5 нМ ФК
+без МТК
+0,8 г/л G418
12
+25 нМ ФК
+без МТК
+0,8 г/л G418
17
+50 нМ ФК
+без МТК
II. Серии исследований при низкой концентрации МТК (2,5 нМ) и низких концентрациях фолиевой кислоты (ФК) (12,5 нМ, 25нМ и 50 нМ)
+0,8 г/л G418
12
+12,5 нМ ФК
+2,5 нМ МТК
+0,8 г/л G418
17
+25 нМ ФК
+2,5 нМ МТК
+0,8 г/л G418
11
+50 нМ ФК
+2,5 нМ МТК
III. Серии исследований при низкой концентрации МТК (5 нМ) и низких концентрациях фолиевой кислоты (ФК) (12,5 нМ, 25нМ и 50 нМ)
+0,8 г/л G418
12
+12,5 нМ ФК
+5 нМ МТК
+0,8 г/л G418
+25 нМ ФК
+5 нМ МТК
33
+0,8 г/л G418
16
+50 нМ ФК
+5 нМ МТК
IV. Серии исследований при низкой концентрации МТК (10 нМ) и низких концентрациях фолиевой кислоты (ФК)
Селективная среда
Продуктивность моноклонального антитела (мг/л)
(12,5 нМ, 25нМ и 50 нМ)
+0,8 г/л G418
205
+12,5 нМ ФК
+10 нМ МТК
+0,8 г/л G418
30
+25 нМ ФК
+10 нМ МТК
+0,8 г/л G418
23
+50 нМ ФК
+10 нМ МТК
V. Серии исследований при концентрации фолиевой кислоты (ФК), не являющейся предельно допустимой (11,3 мкМ), и при разных концентрациях МТК (0, 2, 2,5, 5 и 10 нМ)
+0,8 г/л G418
16
+11,3 мкМ ФК
+без МТК
+0,8 г/л G418
11
+11,3 мкМ ФК
+2,5 нМ МТК
+0,8 г/л G418
16
+11,3 мкМ ФК
+5 нМ МТК
+0,8 г/л G418
11
+11,3 мкМ ФК
+10 нМ МТК
Трансфецированные клетки, отобранные на среде с G418 и МТК, содержащей разные концентрации фолиевой кислоты, исследуют в периодических культурах в качалочных колбах. На 13 сутки культивирования получают образцы культуральной среды и исследуют содержание антител методом ВЭЖХ с белком-А.
Результаты показывают, что все популяции клеток вырабатывают антитела. Добавление менее 10 нМ МТК не проявляет большего воздействия на клетки даже при низких концентрациях фолиевой кислоты. Концентрация выработанного антитела сравнима с таковой при отборе в отсутствии МТК. Однако при использовании 10 нМ МТК на первой стадии отбора продуктивность клеток при низких концентрациях фолиевой кислоты существенно повышается способом, зависящим от концентрации. После отбора при наименьшей концентрации фолиевой кислоты (12,5 нМ) и 10 нМ МТК установлено, что продуктивность клеток более чем в 10 раз выше по сравнению со средой со стандартной концентрацией фолиевой кислоты.
Для дополнительного повышения строгости отбора следующая стадия заключается в удалении G418, но в 10-кратном повышении МТХ в культуральной среде, хотя сохраняется концентрация фолиевой кислоты, применяемая на первой стадии отбора. В случае контроля добавляют МТХ в высокой концентрации, что характерно для предшествующего уровня техники, в данном случае в концентрации 500 нМ. При таких условиях жизнеспособность клеток многих трансфецированных популяций резко падает и остается на низких уровнях, причем не все из них могут быть восстановлены. Популяции клеток, которые могут быть выделены, дополнительно размножают и исследуют их продуктивность (табл. 2).
Таблица 2
Продуктивность клеточных популяций после второй стадии отбора
Селективная среда
Продуктивность моноклонального антитела (мг/л)
Серии исследований при концентрации МТК 10 нМ и при концентрациях фолиевой кислоты (ФК) (12,5 нМ, 25 нМ и 50 нМ)
+без G418
Не выделено
+12,5 нМ ФК
+10 нМ МТК
+без G418
19
+25 нМ ФК
+10 нМ МТК
+без G418
15
+50 нМ ФК
+10 нМ МТК
Серии исследований при концентрации МТК 25 нМ и при концентрациях фолиевой кислоты (ФК) (12,5 нМ, 25 нМ и 50 нМ)
+без G418
Не выделено
+12,5 нМ ФК
+25 нМ МТК
+без G418
Не выделено
+25 нМ ФК
+25 нМ МТК
Селективная среда
Продуктивность моноклонального антитела (мг/л)
+без G418
20
+50 нМ ФК
+25 нМ МТК
Серии исследований при концентрации МТК 50 нМ и при низких концентрациях фолиевой кислоты (ФК) (12,5 нМ, 25 нМ и 50 нМ)
+без G418
Не выделено
+12,5 нМ ФК
+50 нМ МТК
+без G418
Не выделено
+25 нМ ФК
+50 нМ МТК
+без G418
20
+50 нМ ФК
+50 нМ МТК
Серии исследований при концентрации МТК 100 нМ и при концентрациях фолиевой кислоты (ФК) (12,5 нМ, 25 нМ и 50 нМ)
+без G418
277
+12,5 нМ ФК
+100 нМ МТК
+без G418
131
+25 нМ ФК
+100 нМ МТК
+без G418
15
+50 нМ ФК
+100 нМ МТК
Серии исследований при концентрации фолиевой кислоты (ФК), не являющейся предельно допустимой (11,3 мкМ), и при концентрации МТК 500 нМ
+без G418
31
+11,3 мкМ ФК
+500 нМ МТК
+без G418
26
+11,3 мкМ ФК
+500 нМ МТК
+без G418
21
+11,3 мкМ ФК
+500 нМ МТК
+без G418
+11,3 мкМ ФК
+500 нМ МТК
25
Популяции клеток, отобранные на G418 и МТК, отбирают дополнительно путем повышения концентрации МТК. Восстановленные популяции исследуют в периодической культуре в качалочных колбах. К 13 суткам культивирования образцы культуральной среды отбирают и исследуют на содержание антитела методом ВЭЖХ с белком-А.
Продуктивность контрольных клеточных популяций (500 нМ МТК, 11,3 мкМ ФК) после такой стадии отбора повышается примерно до 25-30 мг/л. Преимущества не наблюдают при концентрациях МТК ниже 100 нМ. Однако при использовании 100 нМ МТК в комбинации с низким содержанием фолиевой кислоты (12,5 или 25 нМ) продуктивность повышается до 277 мг/л и таким образом в 10 раз выше, чем в контроле, даже при низких концентрациях МТК, используемых для амплификации/отбора.
Таким образом, используя ДГФР в качестве селективного маркера в комбинации с предельно допустимой концентрацией фолиевой кислоты в селективной среде, получают клетки, которые в селективной среде вырабатывают на высоком уровне в результате сверхэкспрессии целевой белок даже при низких концентрациях ингибитора ДГФР. Результаты также показывают, что такая комбинация превосходит обычные системы отбора (например, ДГФР/0418, используя стандартную концентрацию фолиевой кислоты в селективной среде).
Пример II. Крупномасштабная выработка полипептидов с помощью трансфецированных клеток СНО
Получение полипептидов в большом масштабе может быть выполнено, например, в волновом биореакторе, стеклянном биореакторе или в биореакторе из нержавеющей стали. Для этой цели клетки размножают, обычно начиная с единственной замороженной ампулы, например, ампулы от фирмы Master Cell Bank. Клетки оттаивают и размножают на протяжении нескольких стадий. Биореакторы разного масштаба засевают соответствующим количеством клеток. Плотность клеток может быть повышена путем добавления в биореактор питательных растворов и добавок. Клетки сохраняют в высокой степени жизнеспособными на протяжении более длительного периода. Концентрации продукта в реакторе, варьирующие от нескольких сотен миллиграмм в литре до нескольких грамм в литре, достигают при крупномасштабном процессе. Очистка могут проводить стандартными хроматографическими методами, к которым могут относиться аффинная хроматография, ионная хроматография, стадии гидрофобного взаимодействия или эксклюзионной хроматографии. Размер биореактора в конечном итоге может быть увеличен до объема нескольких тысяч литров (также см., например, F.Wurm, Nature Biotechnology, 22 (11), 2004, сс.1393-1398).