Амплификатор ДНК с регистрацией результатов в режиме реального времени

Полезная модель относится к измерительной технике и может быть использована в медицине, биологии и биотехнологии.
В последние десятилетия анализ нуклеиновых кислот методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) стал одним из основных подходов в молекулярной диагностике благодаря возможности проводить специфичную амплификацию нуклеиновых кислот и распознавать чужеродную ДНК или патогены в чрезвычайно низких концентрациях. Этот метод хорошо поддается автоматизации, благодаря чему широко применяется в клинической диагностике, контроле продуктов питания, биологической безопасности (ПЦР «в реальном времени» / Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю., и др.; под ред. д.б.н. Д.В. Ребрикова; предисл. Л.А. Остермана и акад. РАН и РАСХН Е.Д. Свердлова. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. - 215 с: ил. ISBN 978-5-94774-927-4).
Описаны различные конструкции устройств для проведения ПЦР и методы анализа данных ПЦР (Ребриков Д.В., Трофимов Д.Ю. ПЦР «в реальном времени»: подходы к анализу данных // Прикладная биохимия и микробиология. - 2006, - Т. 42, №5. - С. 520-528,). Так, известны амплификаторы ДНК с регистрацией в реальном масштабе времени (Reat-Time PCR Cyclers) (RU2304277 C1, Алексеев Я.И. и др., 10.08.2007; RU2418289 С1, ИАП РАН, 10.05.2011; RU2666209 С2, ИАП РАН, 06.09.2018). Устройства содержат термоциклер с теплопроводящим элементом, термокрышкой, устройством автоматического управления температурным режимом. Оптическая система для передачи света из пробирок состоит из галогенной лампы, двух двухлинзовых конденсоров, между линзами которых установлены интерференционные светофильтры возбуждения и эмиссии, световодного жгута и многоканального фотоприемника.
Для одновременного определения нескольких патогенов в ходе одной реакции был разработан мультиплексный ПНР-анализ (Е. М. Elnifro, P. Е. Klapper, Multiplex PCR: Optimization and Application in Diagnostic Virology, Clin Microbiol Rev. 2000, Oct;13(4):559-70). В этом случае специфичная амплификация нескольких нуклеиновых кислот происходит одновременно, а каждый из определяемых видов помечается своим флуоресцентным красителем. Для регистрации флуоресцентных сигналов на нескольких длинах волн в коммерческих ПЦР-анализаторах, как правило, применяются оптические схемы, содержащие механическую систему смены интерференционных светофильтров перед детектором.
В процессе функционирования устройств определения ПЦР «в реальном времени» проводится стандартизация результатов (RU 2294532 С1, "Научно-производственная фирма ДНК-Технология", 27.02.2007). Для каждой из реакционных смесей определяют калибровочный коэффициент за счет измерения при двух разных температурах интенсивности флуоресцентного излучения, испускаемого калибровочным веществом, обладающим зависимостью интенсивности флуоресценции от температуры и добавленным в каждую реакционную смесь до начала реакции в равных конечных концентрациях. Указанный коэффициент используют для коррекции данных об увеличении интенсивности флуоресцентного излучения при накоплении продукта ПЦР.
Наиболее близким к патентуемому устройству является амплификатор по патенту RU 2640186 С2, ИАП РАН, 26.12.2017, который содержит термоциклер, включающий теплопроводящий элемент со средствами размещения реакционных смесей, средства автоматического управления температурным режимом, оптическую систему, включающую источник излучения и приемник излучения, микропроцессорный блок обработки сигналов и управления. Однако конструкция недостаточно компактна и сложна.
Настоящая полезная модель направлена на расширение номенклатуры аппаратуры для анализа ПЦР, совмещающих в себе функции прецизионного программируемого термоциклера, и системы детекции, позволяющей регистрировать флуоресценцию реакционной смеси в рабочей зоне картриджа непосредственно в ходе ПЦР.
Патентуемый амплификатор ДНК с регистрацией результатов в режиме реального времени содержит термоциклер, включающий теплопроводящий элемент со средствами размещения реакционных смесей, средства автоматического управления температурным режимом, оптическую систему, включающую источник излучения и приемник излучения, микропроцессорный блок обработки сигналов и управления.
Отличие состоит в следующем.
Средство размещения реакционных смесей выполнено в виде плоского картриджа, при этом амплификатор дополнительно содержит систему автоматического прижима упомянутого картриджа к теплопроводящему элементу и оптической системе.
Источник излучения выполнен в виде светодиодов на длины волн 470 нм и 600 нм, а в качестве приемника флуоресцентного излучения использован оптический мультиспектральный сенсор, выполненный из восьми фотодиодов, содержащих попарно спектральные фильтры на длины волн 520 нм, 560 нм, 610 нм и 680 нм, выбранные из условия детектирования четырех флуоресцентных меток-красителей, и образующих четыре канала детекции флуоресценции, причем микропроцессорный блок дополнительно содержит модуль подавления перекрестных помех в упомянутых каналах детекции флуоресценции.
Амплификатор может характеризоваться тем, что усилие прижима упомянутого плоского картриджа к теплопроводящему элементу и оптической системе составляет 50 Н, а также тем, что микропроцессорный блок обработки сигналов и управления включает сенсорный дисплей.
Технический результат - расширение номенклатуры аппаратуры для анализа ПЦР при обеспечении идентифицировать до 4 патогенов в одной ПЦР-смеси в среднем за 30 мин. в концентрациях от 100 молекул в пробе.
Существо полезной модели поясняется на фигурах, где:
фиг. 1 - блок-схема амплификатора;
фиг. 2 - спектры фосфоресценции красителей;
фиг. 3-6 - фотографии с экрана дисплея к примерам.
На фиг. 1 представлена блок-схема амплификатора. Амплификатор в реализованном варианте содержит оптическую систему - блок 1, включающий источник 11 излучения и приемник 12 излучения.
Средство размещения реакционных смесей выполнено в виде плоского картриджа 2 для образца. Амплификатор содержит систему 21 загрузки и автоматического прижима картриджа 2 к теплопроводящему элементу термоциклера 3 и оптической системе - блоку 1.
Оптическая система - блок 1, система 21 загрузки и автоматического прижима картриджа 2, а также термоциклер 3 связаны двухсторонними шинами обмена информацией и управления с микропроцессорным блоком 4 обработки сигналов и управления и сенсорным дисплеем 5.
Источник 11 излучения выполнен в виде светодиодов на длины волн 470 нм и 600 нм. В качестве приемника 12 флуоресцентного излучения использован оптический мультиспектральный сенсор, выполненный из восьми фотодиодов, содержащих попарно спектральные фильтры на длины волн 520 нм, 560 нм, 610 нм и 680 нм, выбранные из условия детектирования четырех флуоресцентных меток-красителей, и образующих четыре канала детекции флуоресценции. Микропроцессорный блок Дополнительно содержит модуль 41 подавления перекрестных помех в упомянутых каналах детекции флуоресценции.
Усилие прижима упомянутого плоского картриджа 2 к теплопроводящему элементу термоциклера 3 и оптической системе - блоку 1 - составляет 50 Н.
Модуль 41 подавления перекрестных помех функционирует следующим образом.
На графике фиг. 2 видно, что правая часть эмиссионного спектрального диапазона у красителя FAM частично попадает на эмиссионный спектральный диапазон HEX и ROX. При этом правая часть HEX частично налагается на спектральный диапазон ROX и отчасти на FAM. Если ПЦР смесь поставить только на канал FAM, а регистрацию осуществлять только на каналы HEX и ROX, то в этих каналах также вырастут ПЦР кривые из-за попадания эмиссионного спектра FAM на спектральные диапазоны HEX и ROX. Если не устранить эти ПЦР кривые, то наблюдается ложноположительный результат в каналах HEX и ROX.
Для учета перекрестных помех в каналах проводится калибровка на флуоресцентных красителях (калибраторах) FAM, HEX и ROX (100 мкМ, производство ДНК-Технология), определяется взаимное влияние каналов. Красители разбавлены до концентраций 1 мкМ, 0,1 мкМ и 0,01 мкМ.
Реальные показатели FAM, HEX и ROX рассчитываются по формулам в модуле 41:
F = (Fs × (kHh × kRr - kHr × kRh) - kFh × kRr × Hs + kFh × kHr × Rs) / (kFf × kHh × kRr - kFf × kHr × kRh + kFh × kHr × kRf - kFh × kRr × kHf)
Н = (kRr × Hs - kRr × kHf × F - kHr × Rs + kHr × kRf × F) / (kHh × kRr - kHr × kRh)
R = (Rs - kRf × F - kRh × H) / kRr,
где: F, H, R - реальные показатели FAM, HEX и ROX;
kFf - коэффициент засветки FAM в канал FAM;
kFh - коэффициент засветки HEX в канал FAM;
kHf - коэффициент засветки FAM в канал HEX;
kHh - коэффициент засветки HEX в канал HEX;
kHr - коэффициент засветки ROX в канал HEX;
kRf - коэффициент засветки FAM в канал ROX;
kRh - коэффициент засветки HEX в канал ROX;
kRr - коэффициент засветки ROX в канал ROX.
На фиг. 3 и 4 показан пример успешного функционирования алгоритма модуля 41, когда используется ПЦР смесь только на канал FAM (фиг. 3). Видно, что выросли три ПЦР кривые, а не одна. После использования алгоритма по устранению перекрестных помех, осталась только одна ПЦР кривая на канале FAM (фиг. 4).
На фиг. 5 и 6 показан пример, когда используется ПЦР смесь на каналах FAM и HEX. На фиг. 5 видно, что выросли три ПЦР кривые, а не две. После использования алгоритма по устранению перекрестных помех остались две ПЦР кривые на каналах FAM и HEX (фиг. 6).
Амплификатор ДНК с регистрацией результатов в режиме реального времени «Индикатор-БИО» представляет собой единый конструкционный узел, опорным элементом которого является алюминиевое основание, на которое последовательно закреплены все основные узлы прибора и корпус.
В нижней части прибора расположены система термоциклирования и модуль управления электропитанием. В средней части расположены система подачи картриджа в виде лотка, система автоматического прижима картриджа, система детекции флуоресценции. В верхней части расположены управляющий микрокомпьютер, печатная плата управления оптической системой, жидкокристаллический дисплей, а также USB-совместимое устройство вывода данных. Габариты сенсора 9×9 мм приемника 12 излучения позволяют построить оптическую систему прибора достаточно компактной, а отсутствие механических частей повышает надежность и срок службы прибора.
Амплификатор функционирует следующим образом.
Система загрузки картриджа имеет лоток, в который сверху опускается картридж. Лоток вручную по специальным направляющим задвигается внутрь прибора, при этом торец лотка закрывает внешнее отверстие, что препятствует попаданию паразитной внешней засветки в оптическую систему прибора.
Линейный актуатор с выдвижным штоком системы автоматического прижима картриджа прижимает оптическую систему прибора к картриджу с заданным усилием в 50 Н. Данное усилие обеспечивает плотную фиксацию картриджа внутри прибора, что позволяет выдерживать давление паров, образующихся внутри ячейки, а также обеспечивает необходимую плотность прилегания картриджа к системе термоциклирования.
Далее, работа амплификатора ДНК осуществляется известным образом.
Испытания амплификатора ДНК с регистрацией результатов в режиме реального времени «Индикатор-БИО» (технические условия РЭ 9443-004-46482062-2019) показало достижение технического результата: расширение номенклатуры аппаратуры для анализа ПЦР при обеспечении высоких эксплуатационных характеристик.