СПОСОБ ОЦЕНКИ ПОВРЕЖДАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ГЕРПЕС-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ НА РАЗВИТИЕ АПОПТОЗА В ЯДРАХ СИМПЛАСТА ВОРСИНОК ПЛАЦЕНТЫ У БЕРЕМЕННЫХ
METHOD OF ASSESSMENT OF HERPESVIRUS INFECTION EFFECT ON APOPTOSIS DEVELOPMENT IN SYMPLAST NUCLEI OF PLACENTAL STEMS OF PREGNANT WOMEN

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для оценки повреждающего действия герпес-вирусной инфекции на развитие апоптоза в ядрах симпласта ворсинок плаценты у беременных.
При вспышке герпес-вирусной инфекции вирусные тельца проникают в симпласт ворсинок плаценты, вызывая тяжелые метаболические повреждения. Однако в доступной литературе мы не могли найти данных, отмечающих формирование апоптоза в ядрах симпласта ворсинок плаценты при герпес-вирусной инфекции. Таким образом, недостатком существующих в настоящее время методов оценки повреждения ворсинок плаценты при герпес-вирусной инфекции является отсутствие методов учета числа ядер симпласта ворсинок, подвергающихся апоптозу. В предлагаемом способе степень повреждения ядер симпласта ворсинок плаценты беременной рассматривается в зависимости от степени тяжести герпесной инфекции.
Предложенный способ осуществляется следующим образом
Исследовались плаценты после родов у 20 беременных, перенесших вспышку герпес-вирусной инфекции в третьем триместре с титром антител к вирусу простого герпеса 1:6400 (герпесная инфекция средней тяжести), и у 20 беременных, перенесших вспышку герпес-вирусной инфекции в третьем триместре с титром антител к вирусу герпеса 1:12800 (герпесная инфекция тяжелой формы).
Морфологическая классификация апоптоза проводилась на парафиновых срезах плаценты по метке повреждающихся концов фрагментов ДНК in situ (ISEL - метод) [1, 2, 3]. Срезы после дегидратации в дистиллированной воде в течение 30 мин инкубируют в 3%-ном растворе перекиси водорода и отмывают 0,15 М забуференным солевым раствором (PBS) (0,15 М Nad на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,5). Затем срезы инкубируют в смеси 0,3 М Nad и 30 мМ цитрата натрия (рН 7,0; 80°С, 20 мин) и отмывают в 0,15 М PBS. После чего срезы инкубируют в растворе проназы при комнатной температуре в течение 30 мин (Calbiochem; 1 мг/мл на 0,15 М PBS). Отмывают в 0,15 М PBS и буфером А (50 мМ трис-гидрохлорид, 5 мМ хлорид магния, 10 мМ (β-меркаптоэтанол и 0,005%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА), (рН 7,5).
Последовательно инкубируют (18°С, 2 час) в смеси из 4 нуклеотидов (0,01 мМ dATF, dCTF, dGTF; "Promega Madison WI, 0,001 мМ biotin-II-dUTP, "Sigma") и ДНК полимеразе-1 Е coli (20 ед/мл; "Promega"), приготовленной на буфере А. Затем отмывают буфером А, а вслед за ним 0,5 М PBS (0,5 М NaCl на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,5).
Окончательно срезы инкубируют с конъюгатом пероксидазы (Vectastam Elite ABC Kit-Vector, Burliname, СА), разведенным 1:25 0,5 М PBS, в который введены 1% БСА (бычьего сывороточного альбумина) и 0,5% твин-20, и в течение 10 мин окрашивают 0,04%-ным раствором ДАБ (3,3-диаминобензидин тетрахлорид) на 0,05 М трис-буфере рН 7,5 и перекиси водорода в конечной концентрации 0,015% из 30%-ного раствора. Промывают дистиллированной водой, обезвоживают и заключают в бальзам.
Метод обладает высокой чувствительностью даже для ядер, которые только начинают запрограммированную гибель (чертеж). С помощью этого метода можно увидеть конденсацию хроматина, плотно прилегающего к ядерной оболочке. Титр антител к вирусу герпеса определялся методом иммуноферментного анализа на спектрофотометре "Stat-Fax-2100" (USA). Подсчет ядер, находившихся в состоянии апоптоза, проводился на 100 концевых ворсинках плаценты в каждом отдельно взятом случае. В подсчет на 100 ворсинок отбиралось 2000 ядер. Подсчет показал, что при легкой степени тяжести герпес-вирусной инфекции число ядер, находящихся в состоянии апоптоза, насчитывалось от 0-1% (титр антител - 1:6400), а при тяжелой форме - 2-3% (титр антител - 1:12800).
Литература
1. Погорелов В.М. и Козинец Г.И. Морфология апоптоза при нормальном и злокачественном гемопоэзе. Гематол. и трансфузиол., 1995, т.43, №5, с.21-24.
2. Malorni W., Fais S. et Fiorentini C. Morphological aspects of apoptosis. Lab. Virology, Istituto Superiore di Sanita, Italy, E-mail: Malorni (α), 00161, p.1-23.
3. Pollack M., Phaneut S., Dirks A. et Leeuwenburgh C. The role of apoptosis in the normal aging brain, skeletal muscle and heart. Ann. N.Y.Acad. Sci., 2002, vol.959, p.93-107.