МИКРОЧАСТИЦЫ ДИКЕТОПИПЕРАЗИНА С ОПРЕДЕЛЕННЫМ СОДЕРЖАНИЕМ ИЗОМЕРОВ
DIKETOPIPERAZIN MICROPARTICLES WITH PARTICULAR AMOUNT OF ISOMERS

ПЕРКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной патентной заявки Соединенных Штатов 35 U.S.C. §119(e) с серийным No. 61/186779, поданной 12 июня 2009 года, содержание которой включено в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
В настоящем документе описаны композиции и микрочастицы фумарил дикетопиперазина (FDKP) с содержанием определенного транс-изомера, составляющим от приблизительно 45% до приблизительно 65%. Микрочастицы FDKP можно использовать в качестве системы доставки лекарственных средств или активных средств при лечении заболевания или нарушения, например, эндокринного происхождения, включая диабет и ожирение.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Доставка лекарственных средств в течение многих лет представляла собой важнейшую проблему, особенно в случаях, когда соединение, подлежащее доставке, нестабильно в условиях желудочно-кишечного тракта при пероральном введении субъекту перед достижением органа-мишени. Например, во многих случаях пероральная доставка лекарственных средств является предпочтительной, особенно в отношении легкости введения, соблюдения пациентом схемы лечения и пониженной стоимости. Однако многие соединения являются неэффективными или проявляют низкую или переменную эффективность при пероральном введении. Предполагают, что это происходит потому, что лекарственные средства нестабильны в условиях пищеварительного тракта, или потому, что они неэффективно всасываются.
Вследствие проблем, связанных с пероральной доставкой лекарственного средства, рассматривали доставку лекарственного средства к легким. Например, лекарственные средства, доставляемые в легкие, как правило, оказывают воздействие на ткань легких, например, вазодилаторы, поверхностно-активные вещества, химиотерапевтические средства или вакцины от гриппа или других респираторных заболеваний. Другие лекарственные средства, включая нуклеотидные лекарственные средства, доставляли в легкие потому, что они предоставляют ткань, особенно подходящую для лечения, например, в генной терапии кистозного фиброза, где ретровирусные векторы, экспрессирующие дефектную аденозин деаминазу, доставляют в легкие.
Также можно осуществлять доставку лекарственного средства в легкие для средств, имеющих общее действие. Преимущества легких при доставке средств общего действия включают большую площадь поверхности и легкость всасывания в поверхность слизистой оболочки легкого. Проблема всех этих форм легочной доставки лекарственного средства заключается в сложности доставки лекарственных средств в легкие из-за трудности прохождения лекарственными средствами всех естественных барьеров, таких как ресничные клетки, выстилающие трахею, и трудности доставки неизменного объема и массы лекарственного средства.
Таким образом, существует необходимость улучшения легочной доставки лекарственных средств.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение предоставляет системы, микрочастицы и способы, обеспечивающие улучшенную доставку лекарственных средств к легким. Варианты осуществления, описываемые в настоящем документе, обеспечивают улучшенную доставку посредством предоставления микрочастиц дикетопиперазина с определенным содержанием изомера. В частности, микрочастицы дикетопиперазина в качестве примера представлены соединением фумарил дикетопиперазин (FDKP) с содержанием транс-изомера, составляющим от приблизительно 45% до приблизительно 65%. Микрочастицы FDKP с содержанием транс-изомера, находящимся в данном диапазоне, демонстрируют характеристики, благоприятные для доставки лекарственного средства к легким, такие как улучшенные аэродинамические характеристики.
Один из вариантов осуществления, описываемых в настоящем документе, включает микрочастицы FDKP с содержанием транс-изомера, составляющим от приблизительно 45% до приблизительно 65%. В других вариантах осуществления микрочастиц FDKP содержание транс-изомера может составлять от приблизительно 50% до приблизительно 65%, от приблизительно 52% до 62%, или от приблизительно 53% до приблизительно 65%. В другом варианте осуществления микрочастиц FDKP содержание транс-изомера составляет от приблизительно 53% до приблизительно 63%.
В другом варианте осуществления микрочастицы FDKP включают лекарственное средство или активное средство. В различных вариантах осуществления микрочастиц FDKP лекарственное средство может представлять собой, например, пептид, включая инсулин, глюкагоноподобный пептид-1 (GLP-1), глюкагон, экзендин, паратиреоидный гормон, кальцитонин, оксинтомодулин и т.п. В другом варианте осуществления микрочастиц FDKP содержание пептида может варьировать в зависимости от последующих условий обработки. В конкретном примере можно получать микрочастицы FDKP с содержанием лекарственного средства/пептида, которое может варьировать в зависимости от целевой дозы или дозы, подлежащей доставке. Например, если лекарственное средство представляет собой инсулин, содержание инсулина может составлять от приблизительно 3 Ед/мг до приблизительно 4 Ед/мг в порошке, содержащем микрочастицы.
Варианты осуществления, описываемые в настоящем документе, также включают сухие порошки, содержащие микрочастицы. В одном из вариантов осуществления сухие порошки содержат микрочастицы FDKP с содержанием транс-изомера, составляющим от приблизительно 45% до приблизительно 65%. В других вариантах осуществления сухих порошков содержание транс-изомера в микрочастицах FDKP может составлять от приблизительно 50% до приблизительно 65%, от приблизительно 52% до 62% или от приблизительно 53% до приблизительно 65%. В другом варианте осуществления сухих порошков, содержащих микрочастицы FDKP, содержание транс-изомера составляет от приблизительно 53% до приблизительно 63%.
В другом варианте осуществления сухих порошков микрочастицы FDKP содержат лекарственное средство. В другом варианте осуществления сухих порошков лекарственные средства представляют собой пептиды различного молекулярного размера или массы, включая инсулин, глюкагоноподобный пептид-1, глюкагон, экзендин, паратиреоидный гормон, кальцитонин, оксинтомодулин и т.п. В одном из вариантов осуществления сухих порошков, где содержание транс-изомера фумарил дикетопиперазина варьирует от 45% до 65% и лекарственное средство представляет собой инсулин, содержание инсулина в микрочастицах FDKP составляет от приблизительно 3 Ед/мг до приблизительно 4 Ед/мг. В определенных вариантах осуществления лекарственное средство адсорбируется на поверхностях микрочастиц.
Дальнейшие варианты осуществления относятся к системам доставки лекарственного средства, включающим ингалятор, порционный контейнер для сухого порошкового лекарственного средства, например, картридж, и порошок, содержащий описываемые в настоящем документе микрочастицы и активное средство. В одном из вариантов осуществления система доставки для применения с сухими порошками включает ингаляционную систему, содержащую ингалятор с высоким сопротивлением и имеющий воздуховоды, которые вносят вклад в высокое сопротивление идущему через воздуховоды воздушному потоку для деагломерации и распыления порошка. В одном из вариантов осуществления сопротивление ингаляционной системы составляет, например, от приблизительно 0,065 до приблизительно 0,200 (νkPa)/литр в минуту. В определенных вариантах осуществления сухие порошки можно эффективно доставлять путем ингаляции с применением системы ингаляции, где максимальный градиент давления при ингаляции может варьировать от приблизительно 2 до приблизительно 20 кПа, создавая суммарный максимум скорости потока, составляющий от приблизительно 7 до 70 литров в минуту. В определенных вариантах осуществления ингаляционная система настроена для предоставления однократной дозы путем высвобождения порошка из ингалятора в виде непрерывного потока или в виде одного или нескольких выбросов порошка, доставляемого пациенту. В некоторых вариантах осуществления, раскрытых в настоящем документе, ингаляционная система для сухого порошка характеризуется заданным балансом массового расхода в ингаляторе. Например, баланс расхода, составляющий от приблизительно 10% до 70% от общего расхода, выбрасывающийся из ингалятора и доставляемый пациенту, доставляется из одного или нескольких дозирующих устройств, в которых воздушный поток проходит через участки, содержащие порошковый состав, и где приблизительно от 30% до 90% воздушного потока создается за счет других воздуховодов ингалятора. Кроме того, обходный поток, или поток, который не входит не выходит в участок, содержащий порошок, такой как картридж, может соединяться с потоком, выходящим из дозирующего устройства в ингаляторе для разрежения, ускорения и конечной деагломерации свободнотекучего порошка перед выходом из мундштука ингалятора. В одном из вариантов осуществления скорость потока находится в диапазоне приблизительно от 7 до 70 литров в минуту, в результате чего более 75% содержимого контейнера или картриджа распределяется по утфельным массам от 1 до 30 мг. В определенных вариантах осуществления ингаляционная система, как описано выше, может выбрасывать вдыхаемую фракцию/порцию дозы порошка с процентным содержанием в одной вдыхаемой дозе, составляющим более 40%, более 50%, более 60% или более 70%.
В конкретных вариантах осуществления ингаляционная система включает ингалятор сухого порошка, где в состав сухого порошка входят микрочастицы фумарил дикетопиперазина с содержанием транс-изомера FDKP, составляющим от 45% до 65%, и одно или более активных средств. В некоторых аспектах этого варианта осуществления ингаляционной системы сухой порошок предоставляют в картридже, содержащей стандартную дозу. Альтернативно, сухой порошок можно предварительно загружать в ингалятор. В этом варианте осуществления структурная конфигурация ингаляционной системы позволяет деагломерационному механизму ингалятора образовывать вдыхаемые фракции, составляющие более 50%; это означает, что более половины порошка, содержащегося в ингаляторе (картридже), выбрасывается в виде частиц менее чем 5,8 мкм. Во время дозирования ингаляторы могут выбрасывать более 85% порошкового лекарственного средства, содержащегося в контейнере. В определенных вариантах осуществления ингаляторы могут выбрасывать более 85% порошкового лекарственного средства, содержащегося в одной ингаляционной дозе. В одном из вариантов осуществления ингаляторы могут выбрасывать более 90% содержимого картриджа или содержимого контейнера за менее чем 3 секунды при градиенте давлений, составляющем от 2 до 5 кПа с утфельной массой, достигающей 30 мг.
Варианты осуществления, описываемые в настоящем документе, также включают способы. В одном из вариантов осуществления способ лечения эндокринного заболевания или нарушения включает введение нуждающемуся в нем субъекту сухого порошкового состава, содержащего микрочастицы FDKP с содержанием транс-изомера FDKP, составляющим от приблизительно 45% до приблизительно 65%, и лекарственное средство, подходящее для лечения указанного заболевания или нарушения. Один из вариантов осуществления включает способ лечения связанных с инсулином нарушений, включающий введение нуждающемуся в нем индивидууму сухого порошка, содержащего описанные выше микрочастицы FDKP. Способ включает введение субъекту сухого порошкового состава, включающего микрочастицы фумарил дикетопиперазина с содержанием транс-изомера, находящегося в диапазоне приблизительно от 45% до 65% или от приблизительно 45% до приблизительно 63%. В различных вариантах осуществления связанное с инсулином нарушение может, в частности, включать или исключать любое или все заболевания из группы, включающей предиабет, сахарный диабет 1 типа (фаза медового месяца, фаза после медового месяца или обе фазы), сахарный диабет 2 типа, гестационный диабет, гипогликемию, гипергликемию, резистентность к инсулину, секреторные нарушения, нарушение ранней фазы выбросы инсулина, нарушение функций панкреатических β-клеток, гибель панкреатических β-клеток и нарушение обмена веществ. В одном из вариантов осуществления сухой порошок содержит инсулин. В других вариантах осуществления сухой порошок содержит глюкагон, экзендин или GLP-1.
Другой вариант осуществления, описываемый в настоящем документе, включает способ получения микрочастиц, подходящих для легочного введения в виде сухого порошка, включающий: а) получение соединения FDKP с содержанием транс-изомера, составляющим от приблизительно 45% до приблизительно 65%; б) определение содержания транс-изомера в соединении FDKP с тем, чтобы убедиться, что содержание транс-изомера находится в диапазоне от приблизительно 45% до приблизительно 65%; в) растворение соединения FDKP по этапу б) в растворе с основным pH с получением раствора FDKP; г) получение раствора летучей кислоты и д) смешивание раствора FDKP с раствором летучей кислоты в мешалке с большими сдвиговыми усилиями с получением микрочастиц. В одном из вариантов осуществления этап определения содержания транс-изомера в соединении FDKP проводят с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). В альтернативных вариантах осуществления содержание изомера определяют после формирования частиц.
В другом варианте осуществления раскрыт способ получения дикетопиперазина с содержанием транс-изомера, составляющим от приблизительно 45% до приблизительно 65%, где способ включает: получение дикетопиперазина, содержащего группу сложного эфира; омыление группы сложного эфира дикетопиперазина в смеси воды и водорастворимого растворителя при основном pH; и перекристаллизацию дикетопиперазина в реакционной смеси, содержащей трифторуксусную кислоту и ледяную кислоту в суммарном соотношении, находящемся в диапазоне от приблизительно 0,4 до приблизительно 0,7, соответственно. В этом и других вариантах осуществления реакционную смесь на этапе перекристаллизации выдерживают в течение периода от приблизительно 4 часов или более 4 часов.
В одном из вариантов осуществления способа получения водорастворимый растворитель представляет собой спирт, включая метанол, этанол или изопропанол. Также можно использовать другие растворители, такие как тетрагидрофуран, диоксан, ацетон и ацетонитрил. В этом и других вариантах осуществления способ дополнительно включает этап определения содержания транс-изомера дикетопиперазина.
В конкретном варианте осуществления в способе получения дикетопиперазина с содержанием транс-изомера, составляющим от приблизительно 45% до приблизительно 65%, применяют дикетопиперазин с формулой 2,5-дикето-3,6-бис(N-X-4-аминобутил)пиперазин, где X выбран из группы, состоящей из фумарила, сукцинила, малеила и глутарила. В примере осуществления формула дикетопиперазина представляет собой 2,5-дикето-3,6-бис(N-фумарил-4-аминобутил)пиперазин.
В конкретных вариантах осуществления способ получения соединения DKP с содержанием транс-изомера DKP, находящемся в диапазоне от приблизительно 45% до приблизительно 65%, включает реакцию омыления и реакцию перекристаллизации. В одном из вариантов осуществления способ включает реакцию омыления соединения дикетопиперазина, содержащего защитную группу сложного эфира, включая сложный эфир алкила, такой как сложный эфир этила или сложный эфир метила. В одном из вариантов осуществления этап получения соединения FDKP с содержанием транс-изомера, составляющим от приблизительно 45% до приблизительно 65%, включает омыление сложного эфира FDKP в растворителе, таком как растворитель на водной основе, и добавление основания. В конкретном варианте осуществления способ включает растворение DKP, такого как этиловый сложный эфир фумарил дикетопиперазина в растворителе, таком как вода:метанол в соотношении от 1:1 до приблизительно 3:1, соответственно. В других вариантах осуществления можно использовать другие водорастворимые растворители, включая другие спирты, тетрагидрофуран, диоксан, ацетон, ацетонитрил и т.п. В одном из вариантов осуществления растворитель может содержать только воду. В этом и других вариантах осуществления реакция омыления дополнительно включает добавление раствора, содержащего гидроксид натрия; выдерживание реакционной смеси при температуре, составляющей от приблизительно 20°C до приблизительно 60°C или до температуры кипения с обратным холодильником; фильтрование реакционной смеси для получения фильтрата; добавление кислотного раствора к фильтрату и сбор твердого вещества, полученного путем фильтрации, и промывание твердого вещества FDKP. Твердый материал затем можно изучать с определением содержания транс-изомера в образовавшихся частицах FDKP.
В конкретном варианте осуществления способ включает перекристаллизацию вещества FDKP, включающую нагревание суспензии FDKP в трифторуксусной кислоте до температуры, составляющей от приблизительно 40°C до приблизительно 85°C в течение от приблизительно 1 минуты до приблизительно 2 часов и охлаждение реакции; добавление ледяной уксусной кислоты к раствору и охлаждение суспензии в течение от приблизительно 1 до приблизительно 24 часов при приблизительно 20°C. В одном из вариантов осуществления стадия кристаллизации включает проведение реакции при температуре кристаллизации в диапазоне от приблизительно 15°C до приблизительно 25°C, в течение от приблизительно 1 часа до приблизительно 6,5 часов в раствор, содержащем трифторуксусную кислоту:ледяную уксусную кислоту, соответственно, в соотношении, составляющем от приблизительно 0,4 до приблизительно 0,7. В этом варианте осуществления способ дополнительно включает промывание реакционной смеси ледяной уксусной кислотой и снижение температуры реакции со скоростью от приблизительно 7°C до приблизительно 10°C в час. Для получения вещества FDKP с желаемым содержанием транс-изомера можно использовать другие скорости охлаждения.
Другой вариант осуществления, описываемый в настоящем документе, включает способ доставки инсулина нуждающемуся в нем пациенту, включающий введение сухого порошка, содержащего микрочастицы дикетопиперазина, описываемые в настоящем документе, глубоко в легкое путем ингаляции сухого порошка пациенту. В аспектах этого варианта осуществления приведены конкретные характеристики ингаляционной системы.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Приведенные ниже чертежи составляют часть настоящего изобретения и включены для дальнейшей иллюстрации конкретных аспектов примеров, описываемых в настоящем документе. Изобретение можно лучше понять посредством обращения к одному или нескольким этих чертежей в сочетании с подробным описанием конкретных вариантов осуществления, приведенных в настоящем документе.
Фиг.1 иллюстрирует аэродинамические характеристики порошка как функцию % содержания транс-изомера;
Фиг.2 иллюстрирует этапы способа получения, которые можно регулировать с получением FDKP с содержанием транс-изомера, составляющим от приблизительно 45 до приблизительно 65%;
Фиг.3 иллюстрирует % содержание транс-изомера как функцию медленного добавления NaOH во время этапа омыления из способа получения, проиллюстрированного на фиг.2;
Фиг.4 иллюстрирует % содержание транс-изомера после перекристаллизации трифторуксусной кислоты (TFA) с применением быстрого охлаждения;
Фиг.5 иллюстрирует схему способа получения покрытых инсулином микрочастиц FDKP с содержанием транс-изомера, составляющим от приблизительно 45% до приблизительно 65%; и
Фиг.6 иллюстрирует способ определения содержания транс-изомера с применением метода поверхностного отклика.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Как указано, доставка лекарственного средства к легким имеет множество преимуществ. Однако вследствие проблем транспортировки лекарственных средств через естественные физические барьеры с сохранением неизменного объема и массы лекарственного средства доставка лекарственных средств в легкие является трудной. В настоящем документе описаны дикетопиперазины с определенным содержанием транс-изомера, микрочастицы как средства доставки лекарственного средства, способы получения микрочастиц и способы лечения с применением микрочастиц.
Как применяют в настоящем документе, термин "микрочастица" относится к частице с диаметром, составляющим от приблизительно 0,5 до приблизительно 1000 мкм, независимо от точной наружной или внутренней структуры. Микрочастицы с диаметром, составляющим от приблизительно 0,5 до приблизительно 10 микрон, могут достигать легких, успешно проходя через большую часть естественных физических барьеров. Диаметр, составляющий менее чем приблизительно 10 микрон, необходим для прохождения поворота гортани, а диаметр, составляющий приблизительно 0,5 микрон или более, необходим для предотвращения выдыхания частиц. Для достижения глубокой части легкого (или альвеолярного участка), где, как полагают, происходит большая часть эффективного всасывания, предпочтительно максимизировать соотношение частиц, содержащихся во "вдыхаемой фракции" (RF), которые, как правило, представляют собой частицы с аэродинамическим диаметром, составляющим от приблизительно 0,5 до приблизительно 5,7 микрон, хотя некоторые ссылки указывают несколько другие диапазоны, что показано с применением стандартных способов, например, каскадного импактора Андерсена. Для измерения аэродинамического размера частиц можно использовать другие импакторы, такие как NEXT GENERATION IMPACTOR™ (NGI™, MSP Corporation), для которого вдыхаемая фракция определяется равным аэродинамическим размером, например <6,4 мкм. В некоторых вариантах осуществления для определения размера частиц применяют, например, лазерный дифракционный анализатор, раскрытый в Патентной заявке США с серийным № 12/727179, поданной 18 марта 2010 года, которая в полном объеме включена в настоящий документ из-за ее относящихся к теме указаний, где для оценки рабочих характеристик ингаляционной системы измеряют объемный средний геометрический диаметр (VMGD) частиц. Например, в различных вариантах осуществления выброс из картриджа, составляющий ≥80%, 85% или 90%, и VMGD испускаемых частиц, составляющий ≤12,5 мкм, ≤7,0 мкм или ≤4,8 мкм, могут указывать на прогрессивно улучшающиеся аэродинамические характеристики. Варианты осуществления, описываемые в настоящем документе, показывают, что микрочастицы FDKP с содержанием транс-изомера, составляющим от приблизительно 45% до приблизительно 65%, демонстрируют характеристики, благоприятные для доставки лекарственных средств в легкие, такие как улучшенные аэродинамические характеристики.
Вдыхаемая фракция в загрузке (RF/загрузка) отражает % порошка в дозе, которая испускается из ингалятора при высвобождении загруженного в качестве дозы порошка и подходит для вдыхания, т.е. процент испускаемых частиц из загруженной дозы, которые характеризуются размерами, подходящими для легочной доставки, что является мерой аэродинамических характеристик микрочастиц. Как описано в настоящем документе, значение RF/загрузка, составляющее 40% или более 40%, указывает на приемлемые аэродинамические характеристики. В определенных вариантах осуществления, описываемых в настоящем документе, вдыхаемая фракция в загрузке может составлять более 50%. В примере осуществления вдыхаемая фракция в загрузке может достигать приблизительно 80%, где приблизительно 80% испускаемых частиц загрузки характеризуется размерами <5,8 мкм, что показано с применением стандартных методик.
Как применяют в настоящем документе, термин "сухой порошок" относится к мелкодисперсной композиции, которая не суспендирована или не растворена в распыляющем веществе, носителе или другой жидкости. Это не подразумевает обязательное полное отсутствие молекул воды.
Следует понимать, что конкретные значения RF/загрузка могут зависеть от ингалятора, применяемого для доставки порошка. Порошки, как правило, склонны к агломерации и кристаллизации микрочастиц DKP с формированием особенно вязких порошков. Одной из функций ингалятора сухого порошка является деагломерация порошка с тем, чтобы получившиеся частицы содержали вдыхаемую фракцию, подходящую для доставки дозы путем ингаляции. Однако деагломерация вязких порошков является, как правило, неполной, в результате чего распределение размеров частиц, наблюдаемое при изучении вдыхаемой фракции при доставке с применением ингалятора, не совпадает с распределением размеров первичных частиц, что означает, что картина распределения сдвигается в сторону более крупных частиц. Ингаляторы различаются по своей эффективности деагломерации и, таким образом, различается также абсолютное значение RF/загрузка, наблюдаемое при применении разных ингаляторов. Однако оптимальное значение RF/загрузка как функции содержания изомера совпадает для всех ингаляторов.
Как применяют в настоящем документе, термин "приблизительно" означает, что значение включает стандартное отклонение измерения для устройства или способа, применяемого для определения значения.
Дикетопиперазины
1
2
1
2
1
2
1
2
Один класс средств доставки лекарственного средства, который применяли для преодоления проблем в области фармацевтики, таких как нестабильность лекарственного средства и/или низкая всасываемость, представляет собой 2,5-дикетопиперазины. 2,5-дикетопиперазины представлены соединением с общей формулой 1, приведенной ниже, где E и E независимо представляют собой N или более конкретно NH. В других вариантах осуществления Eи/или E независимо представляют собой кислород или азот, так что если один из заместителей E и E представляет собой кислород, а другой представляет собой азот, формула образует дикетоморфолин, а если оба заместителя E и E представляют собой кислород, формула образует дикетодиоксан.
1
2
Показано, что эти 2,5-дикетопиперазины эффективны при доставке лекарственного средства, особенно те, которые несут кислотные группы R и R, как описано в, например, патентах США №№ 5352461 под названием "Self Assembling Diketopiperazine Drug Delivery System"; 5503852 под названием "Method For Making Self-Assembling Diketopiperazine Drug Delivery System"; 6071497 под названием "Microparticles For Lung Delivery Comprising Diketopiperazine" и 6331318 под названием "Carbon-Substituted Diketopiperazine Delivery System," каждый из которых включен в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме для всего, что относится к дикетопиперазинам и дикетопиперазин-обусловленной доставке лекарственного средства. Из дикетопиперазинов можно получать микрочастицы, включающие лекарственное средство, или микрочастицы, на которых можно адсорбировать лекарственное средство. Комбинация лекарственного средства и дикетопиперазина может придавать лекарственному средству повышенную стабильность и/или улучшенные характеристики всасывания. Эти микрочастицы можно вводить различными способами введения. В виде сухих порошков эти микрочастицы можно доставлять путем ингаляции в определенные участки дыхательной системы, включая легкие.
Такие микрочастицы, как правило, получают посредством основанного на pH осаждения свободной кислоты (или основания), которое приводит к формированию самоагрегированных микрочастиц, состоящих из агрегированных кристаллических пластинок. Стабильность частиц можно увеличивать небольшими количествами поверхностно-активного вещества, такого как полисорбат-80, в растворе DKP, из которого осаждаются частицы (см., например, Патентную публикацию США № 2007/0059373 под названием "Method of drug formulation based on increasing the affinity of crystalline microparticle surfaces for active agents", включенную в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме для всего, что относится к получению и дозировке микрочастиц DKP и состоящих из них сухих порошков). В конце растворитель можно удалять с получением сухого порошка. Соответствующие способы удаления растворителя включают лиофилизацию и сушку распылением (см. например Патентную публикацию США № 2007/0196503 под названием "A method for improving the pharmaceutic properties of microparticles comprising diketopiperazine and an active agent" и патент США № 6444226 под названием "Purification and stabilization of peptide and protein pharmaceutical agents", каждый из которых включен в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме для всего, что относится к получению и дозировке DKP микрочастиц DKP и состоящих из них сухих порошков). Микрочастицы, описываемые в настоящем документе, отличаются от микрочастиц, состоящих из солей DKP. Такие частицы, как правило, получают (в отличие от сухих) путем сушки распылением, приводящей к получению гранул и/или сплющенных гранул некристаллической соли (в отличие от свободной кислоты или основания), так что они представляют собой химически, физически и морфологически отличные структуры. Настоящее изобретение относится к FDKP, под которым понимают свободную кислоту или растворенные анионы.
Способы получения дикетопиперазинов описаны в, например, Katchalski, et al., J. Amer. Chem. Soc. 68, 879-880 (1946) и Kopple, et al., J. Org. Chem. 33(2), 862-864 (1968), которые включены в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме. 2,5-дикето-3,6-ди(аминобутил)пиперазин (Katchalski et al. ссылаются на него как на лизин ангидрид) также можно получать путем циклодимеризации N-е-P-L-лизина в жидкий фенол, так же, как в способе Kopple, с последующим удалением защитных (P)-групп с применением соответствующих реагентов и условий. Например, CBz-защитные группы можно удалять с применением 4,3 M HBr в уксусной кислоте. Этот способ может быть предпочтительным, поскольку в нем применяют коммерчески доступное исходное вещество, он включает условия реакции, которые, как сообщают, сохраняют стереохимические характеристики исходных веществ в продукте, и все его этапы можно легко применить в производственных масштабах. Способы получения дикетопиперазинов также раскрыты в патенте США № 7709639 под названием "Catalysis of Diketopiperazine Synthesis," который также включен посредством ссылки в настоящий документ для всего, что относится к тому же.
Фумарил дикетопиперазин (2,5-дикето-3,6-бис(N-фумарил-4-аминобутил)пиперазин; FDKP) представляет собой предпочтительный дикетопиперазин для применения в легких:
FDKP предоставляет удобную структуру микрочастиц благодаря тому, что он характеризуется низкой растворимостью в кислоте, но легко растворяется при нейтральном или основном pH. Эти свойства позволяют FDKP кристаллизоваться, а кристаллам самоагрегироваться с формированием микрочастиц в кислотных условиях. Частицы легко растворяются при физиологических условиях, где pH нейтрален. Как указано, микрочастицы с диаметром, составляющим от приблизительно 0,5 до приблизительно 10 микрон, могут достигать легких, успешно проходя через большую часть физиологических барьеров. Частицы таких размеров можно легко получить из FDKP.
FDKP содержит два ассиметричных центра в кольце дикетопиперазина. FDKP получают в виде смеси геометрических изомеров, которые обозначают как "цис-FDKP" и "транс-FDKP" согласно расположению боковых цепей относительно центрального "кольца" дикетопиперазина. R, R и S, S энантиомеры содержат "боковые ручки" пропенила(амидобутила), отходящие от одной и той же плоской стороны кольца дикетопиперазина (A и B ниже) и, таким образом, обозначаются как цис-изомеры, тогда как соединение R, S содержит "боковые ручки", отходящие от противоположных плоских сторон кольца дикетопиперазина (C ниже), и обозначается как транс-изомер.
Порошки из микрочастиц FDKP с приемлемыми аэродинамическими характеристиками, как показано с применением RF/загрузка, с умеренно эффективными ингаляторами, такими как ингалятор MEDTONE, раскрытый в патенте США № 7464706 под названием "Unit Dose Cartridge and Dry Powder Inhaler", включенном в настоящий документ в качестве ссылки для всего, что относится к тому же, получали из FDKP с содержанием транс-изомера, находящимся в диапазоне от приблизительно 45 до приблизительно 65%. Частицы с содержанием изомера, находящимся в этом диапазоне, также являются эффективными при применении с высокоэффективными ингаляторами, такими как раскрытые в Патентной заявке США № 12/484125 под названием "A Dry Powder Inhaler and System for Drug Delivery", поданной 12 июня 2009 года, и Патентной заявке США № 12/717884 под названием "Improved Dry Powder Drug Delivery System", поданной 4 марта 2010 года, сущность которой включена в настоящий документ в качестве ссылки для всего, что относится к тому же. Порошки, содержащие микрочастицы с содержанием транс-FDKP, составляющим более 65%, имеют более низкие и вариабельные значения RF/загрузка (фиг.1). Обогащенные транс-изомером микрочастицы FDKP характеризуются измененной структурой, а также приводят к образованию вязкой суспензии, неудобной в применении.
В других экспериментах, проведенных при условиях, сравнимых с условиями, указанными на фиг.1, значение RF/загрузка микрочастиц, полученных из FDKP, обогащенного транс-изомером приблизительно на 95%, и инсулина, составляло приблизительно 24%, тогда как значение RF/загрузка контрольных образцов с содержанием транс-изомера, составляющим приблизительно 59%, и с равным содержанием инсулина, составляло приблизительно 49-52% (данные не показаны). Таким образом, порошок из микрочастиц FDKP с содержанием транс-изомера, составляющим от приблизительно 45% до приблизительно 65%, предоставляет порошок с приемлемыми аэродинамическими характеристиками. В других вариантах осуществления содержание транс-изомера FDKP составляет от приблизительно 50% до приблизительно 65%, от приблизительно 52% до приблизительно 62% или от приблизительно 53% до приблизительно 63% (см. фиг.1).
На основании изложенного выше, желательно получать порошки из микрочастиц с содержанием транс-изомера, находящимся в диапазоне от приблизительно 45% до приблизительно 65%. Таким образом, настоящее изобретение устанавливает, что содержание транс-изомера влияет на аэродинамические характеристики микрочастиц FDKP, чего не ожидалось ранее. Однако раскрыто, что повышенную стабильность можно достигать посредством внимательного контроля содержания изомера в FDKP, использованном для получения микрочастиц FDKP. На фиг.1 жирная изогнутая линия обозначает ожидаемые значения RF/загрузка, а пунктирная изогнутая линия обозначает односторонний 95% доверительный интервал получения подходящих значений RF/загрузка. Вертикальные пунктирные линии обозначают границы содержания транс-изомера для одного примера осуществления, описываемого в настоящем документе.
Соотношение цис/транс-изомеров FDKP устанавливают во время этапов получения, приведенных на фиг.2. Фиг.2 иллюстрирует этапы способа получения, которые можно регулировать с получением FDKP с содержанием транс-изомера, составляющим от приблизительно 45% до приблизительно 65%. В способе получения существует несколько параметров и/или этапов реакции получения FDKP, включая омыление и перекристаллизацию, которые можно регулировать с получением намеченного или желаемого соотношения изомеров. Например, конкретные параметры реакций, включая температуру, время реакции и тип применяемых растворителей или co-растворителей, можно регулировать с получением продукта с желаемым или намеченным содержанием транс-изомера.
Контроль нижнего предела диапазона содержания транс-изомера FDKP
Нижний предел содержания транс-изомера регулируют, подвергая кольцо DKP воздействию сильного основания. В одном этапе получения этиловые защитные группы удаляют омылением с применением гидроксида натрия. Эти основные условия также вызывают эпимеризацию кольца между изомерами, как показано ниже, независимо от того, какой изомер находится в избытке. Например, добавление основания к реакции, содержащей исходное соединение, включающее, например, 95% транс-изомера, может привести к получению вещества FDKP, состоящего из смеси с содержанием приблизительно 50/50 цис- и транс-изомеров (фиг.3). Помимо основного pH, на регуляцию формирования содержания транс-изомера также могут влиять другие факторы, включая концентрацию растворителей и co-растворителей, время воздействия и температуру реакции.
Контроль верхнего предела диапазона содержания транс-изомера FDKP
Разница растворимости изомеров влияет на содержание изомера FDKP. Например, FDKP можно перекристаллизовывать из трифторуксусной кислоты (TFA) и ледяной уксусной кислоты (GAA). Транс-FDKP по сравнению с цис-FDKP хуже растворяется в этой системе растворителей. Таким образом, условия, благоприятствующие селективному осаждению менее растворимого транс-изомера, можно использовать для повышения содержания транс-изомера в конечном продукте. Такие условия включают сокращенное время перекристаллизации, добавление антирастворителя при низкой температуре и/или быстрое охлаждение смесью трифторуксусной кислоты и ледяной уксусной кислоты (TFA-GAA) (фиг.4). Следует понимать, что увеличение содержания транс-изомера такими способами дает остаточный раствор FDKP, обогащенный цис-изомерами.
Таблица 1Примеры диапазонов получения
Параметр
Рабочий диапазон
Соотношение TFA/GAA*
0,67±0,05
Время кристаллизации (ч)
6±0,5
Температура кристаллизации (°C)
15-25
Охлаждение после добавления GAA (°C /ч)
7-10
*Обозначает трифторуксусную кислоту:ледяную уксусную кислоту
Получение микрочастиц с содержанием изомера, составляющим от приблизительно 45% до приблизительно 65%, предоставляет микрочастицы с благоприятными аэродинамическими характеристиками.
Выбор и добавление активных средств
При условии, что микрочастицы, описываемые в настоящем документе, сохраняют требуемое содержание изомера, они могут приобретать другие дополнительные характеристики, благоприятные для доставки в легкое и/или всасывания лекарственного средства. Патент США № 6428771 под названием "Method for Drug Delivery to the Pulmonary System" описывает доставку частиц DKP к легкому и включен в настоящий документ в качестве ссылки для всего, что относится к тому же. Патент США № 6444226 под названием "Purification and Stabilization of Peptide and Protein Pharmaceutical Agents" описывает эффективные способы адсорбции лекарственных средств на поверхность микрочастиц и также включен в настоящий документ в качестве ссылки для всего, что относится к тому же. Свойства поверхности микрочастиц можно изменять для получения желаемых характеристик, как описано в Патентной заявке США № 11/532063 под названием "Method of Drug Formulation based on Increasing the Affinity of Crystalline Microparticle Surfaces for Active Agents", включенной в настоящий документ в качестве ссылки для всего, что относится к тому же. Патентная заявка США № 11/532065 под названием "Method of Drug Formation based on Increasing the Affinity of Active Agents for Crystalline Microparticle Surfaces" описывает способы активации адсорбции активных средств на микрочастицы. Патентная заявка США № 11/532065 также включена в настоящий документ в качестве ссылки для всего, что относится к тому же.
2
Микрочастицы, описываемые в настоящем документе, могут включать одно или несколько активных средств. Как применяют в настоящем документе, "активное средство", которое используют взаимозаменяемо с "лекарственным средством", относится к фармацевтическим веществам, включая низкомолекулярные фармацевтические препараты, биопрепараты и биоактивные средства. Активные средства могут иметь природное, рекомбинантное или синтетическое происхождение и включать белки, полипептиды, пептиды, нуклеиновые кислоты, органические макромолекулы, синтетические органические соединения, полисахариды и другие сахара, жирные кислоты, и липиды, и антитела и их фрагменты, включая в качестве неограничивающих примеров гуманизированные или химерные антитела, F(ab), F(ab), отдельное одноцепочечное антитело или слитое с другими полипептидами или терапевтические или диагностические моноклональные антитела к антигенам злокачественных опухолей. Активные средства могут характеризоваться рядом свойств биологической активности и входить в ряд классов, таких как вазоактивные средства, нейроактивные средства, гормоны, антикоагулянты, иммуномодулирующие средства, цитотоксические средства, антибиотики, антивирусные средства, антигены, возбудители инфекции, воспалительные медиаторы, гормоны и антигены клеточной поверхности. Более конкретно, активные средства могут включать в качестве неограничивающих примеров цитокины, липокины, энкефалины, алкины, циклоспорины, антитела анти-IL-8, антагонисты IL-8, включая ABX-IL-8; простагландины, включая ПГ-12, блокаторы рецепторов LTB, включая LY2931 1, BIIL 284 и CP105696; триптаны, такие как суматриптан и пальмитолеат, инсулин и его аналоги, гормон роста и его аналоги, паратиреоидный гормон (PTH) и его аналоги, паратгормон-связанный пептид (PTHrP), грелин, обестатин, энтеростатин, гранулоцит-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), амилин, аналоги амилина, глюкагоноподобный пептид 1 (GLP-1 ), техасский красный, клопидогрель, PPACK (D-фенилаланил-L-пролил-L-аргинин хлорметил кетон), оксинтомодулин (OXM), пептид YY(3-36) (PYY), адипонектин, холецистокинин (CCK), секретин, гастрин, глюкагон, мотилин, соматостатин, мозговой натрийуретический пептид (BNP), предсердный натрийуретический пептид (ANP), IGF-1, фактор, высвобождающий гормон роста (GHRF), антагонист рецептора предшественника интегрина бета-4 (ITB4), ноцицептин, ноцистатин, орфанин FQ2, кальцитонин, CGRP, ангиотензин, субстанция P, нейрокинин A, панкреатический полипептид, нейропептид Y, дельта-сон индуцирующий пептид и вазоактивный интестинальный пептид.
Содержание лекарственного средства, подлежащего доставке на микрочастицах, полученных из FDKP и характеризующихся содержанием транс-изомера, составляющего от 45% до 65%, как правило, составляет более 0,01%. В одном из вариантов осуществления содержание лекарственного средства, подлежащего доставке на микрочастицах, характеризующимися указанным выше содержанием транс-изомера, может варьировать от приблизительно 0,01% до приблизительно 20%, что характерно для пептидов, таких как инсулин. Например, если лекарственное средство представляет собой инсулин, настоящие микрочастицы, как правило, содержат 3-4 Ед/мг (от приблизительно 10 до 15%) инсулина. В определенных вариантах осуществления содержание лекарственного средства в частицах может варьировать в зависимости от формы и размера лекарственного средства, подлежащего доставке.
Получение микрочастиц
В одном из вариантов осуществления, описываемых в настоящем документе, раскрыт способ получения, который можно использовать для получения микрочастиц FDKP с содержанием транс-изомера, составляющим от приблизительно 45% до приблизительно 65%, и содержащих инсулин.
2
2
На фиг.5 представлено схематическое изображение способа получения микрочастиц FDKP, содержащих инсулин. В сущности, применение мешалки с большими сдвиговыми усилиями с двойным питание, например, раскрытой в Предварительной Патентной заявке США с серийным № 61/257311, поданной 2 ноября 2009 года, сущность которой включена в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме, равные массы растворов приблизительно 10,5% масс. уксусной кислоты и приблизительно 2,5% масс. FDKP при приблизительно 16°C ± приблизительно 2°C (таблицы 2 и 3) можно подавать при 2000 фунт/дюйм через 0,001-дюйм отверстие. Осадок можно собирать в емкость с деионизированной (DI) водой приблизительно равной массы и температуры. Конечная суспензия содержит приблизительно 0,8% твердой фазы. Осадок можно концентрировать и промывать с применением тангенциальной поточной фильтрации. Осадок можно сначала концентрировать до приблизительно 4% твердой фазы, затем промывать деионизированной водой. Суспензию можно в конце концентрировать до приблизительно 10% твердой фазы относительно исходной массы FDKP. В концентрированной суспензии можно оценивать содержание твердой фазы путем высушивания в печи.
Основной раствор концентрированного инсулина можно получать из 1 части инсулина и 9 частей приблизительно 2% масс. уксусной кислоты. Раствор инсулина можно гравиметрически добавлять к суспензии для получения суспензии приблизительно 11,4% масс. Инсулин-содержащую суспензию можно мешать в течение, по меньшей мере, приблизительно 15 минут, и затем титровать от приблизительно 14 до приблизительно 15% масс. водного аммиака до pH, составляющего приблизительно 4,5 от исходного pH, составляющего приблизительно 3,5. Суспензию можно быстро замораживать в жидком азоте с применением криогранулятора с получением гранул, например, как описано в Предварительной Патентной заявке США с серийным № 61/257385, поданной 2 ноября 2009 года, сущность которой включена в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме, и лиофилизировать с получением массы инсулин-содержащих микрочастиц FDKP с % содержанием транс-изомера, составляющим от приблизительно 45% до 65%. Чистые микрочастицы FDKP можно получать аналогичным способом, исключая добавление инсулина и этапы установления pH.
Таблица 210,5% Раствор уксусной кислоты
Компонент
Масс.%
Деионизированная вода
89,00
GAA
10,50
10% полисорбат 80
0,50
0,2 мкм фильтрование
Таблица 32,5% раствор FDKP
Компонент
Масс.%
Деионизированная вода
95,40
FDKP
2,50
NH<sub>4</sub>OH
1,60
10% полисорбат 80
0,50
0,2 мкм фильтрование
Как применяют в настоящем документе, "растворитель" относится к жидкой среде, в которой "плавают" активное средство и микрочастицы. Следует понимать, что в растворе необязательно должны находиться все компоненты. Во многих случаях термин можно использовать для обозначения жидкой среды, в которой суспендированы микрочастицы.
Как видно из приведенного выше изобретения, микрочастицы из вариантов осуществления, описываемых в настоящем документе, могут характеризоваться многими различными формами и включать много различных лекарственных средств или активных средств. Общее свойство всех этих вариантов осуществления, однако, заключается в том, что полученные микрочастицы характеризуются содержанием транс-изомера, составляющим от приблизительно 45% до приблизительно 65%.
ПРИМЕРЫ
Следующие примеры приведены для иллюстрации вариантов осуществления раскрытых микрочастиц. Специалисты в данной области понимают, что способы, раскрытые в приведенных ниже примерах, иллюстрируют способы, раскрытые автором изобретения для применения в практическом осуществлении настоящего изобретения, и, таким образом, могут рассматриваться как представляющие собой предпочтительные способы их осуществления. Однако в свете настоящего изобретения специалисты в данной области должны понимать, что в раскрытые конкретные варианты осуществления можно вносить многие изменения, сохраняя сходный или такой же результат без отклонения от объема изобретения.
ПРИМЕР 1
I. Связь между содержанием транс-изомера и RF/загрузка
4
Микрочастицы получали из FDKP и инсулина. FDKP растворяли в водном NHOH с получением раствора. Сырьевой поток этого раствора объединяли с сырьевым потоком водного раствора HOAc в мешалке с большими сдвиговыми усилиями с получением водной суспензии микрочастиц.
4
3
Сырьевой раствор FDKP получали из приблизительно 2,5% масс. FDKP, приблизительно 1,6% масс. концентрированного NHOH (от приблизительно 28 до приблизительно 30% масс. NH) и приблизительно 0,05% масс. полисорбата 80. Сырьевой раствор уксусной кислоты получали с применением приблизительно 10,5% масс. GAA и приблизительно 0,05% масс. полисорбата 80. Перед применением оба сырьевых раствора фильтровали через мембрану приблизительно 0,2 мкм.
2
2
Равные количества (по массе) каждого сырьевого раствора прокачивали через DUAL-FEED SONOLATOR™, оборудованный #5 отверстием (0,0011 дюйм). Меньший насос устанавливали на 50% для одинаковых скоростей каждого сырьевого потока, а давление потока составляло приблизительно 2000 фунт/дюйм. Принимающая емкость содержала деионизированную (DI) воду, масса которой была равна массе каждого сырьевого раствора (например, 4 кг сырьевого раствора FDKP и 4 кг сырьевого раствора HOAc прокачивали через SONOLATOR™ в принимающую емкость, содержащую 4 кг DI-воды).
2
Полученную суспензию концентрировали и промывали тангенциальной поточной фильтрацией с применением 0,2 m PES мембраны. Суспензии сначала концентрировали до приблизительно 4% твердой фазы, затем проводили диафильтрацию DI-водой и наконец концентрировали до приблизительно 16% номинального содержания твердой фазы. Реальный процент твердой фазы в промытой суспензии определяли способом "потери массы при сушке".
Основные растворы инсулина получали с содержанием приблизительно 10% масс. инсулина (непосредственно при получении) в растворителе, содержащем приблизительно 2% масс. HOAc в DI-воде и профильтрованного в стерильных условиях. Перед применением основной раствор фильтровали через 0,22 мкм фильтр. В зависимости от содержания твердой фазы в суспензии к перемешанной суспензии добавляли соответствующее количество основного раствора. Полученную смесь микрочастиц/инсулина затем доводили от pH, составляющего приблизительно 3,6, до pH, составляющего приблизительно 4,5, с применением раствора гидроксида аммония.
Суспензию микрочастиц/инсулина затем гранулировали (криогранулировали) быстрой заморозкой в жидком азоте. Ледяные гранулы лиофилизировали с получением сухого порошка.
Вдыхаемая фракция в загрузке (RF/загрузка) сыпучего порошка представляет собой меру аэродинамического микрораспределения размера частиц и определяется измерением на каскадном импакторе Андерсена. Для получения значений RF/загрузка картриджи заполняют сыпучим порошком и распыляют посредством ингалятора MEDTONE при 30 л/мин. Порошок, собранный на каждом этапе применения ингалятора, взвешивают, и итоговый собранный порошок нормируют к общему количеству, заполняющему картриджи. Соответственно, значение RF/загрузка представляет собой значение, полученное на этих этапах применения импактора, представляющее собой массу вдыхаемой фракции, деленную на массу порошка, загруженного в картриджи.
Как показано на фиг.1, порошки FDKP с приемлемыми аэродинамическими характеристиками, измеренными как RF/загрузка, получали из FDKP с содержанием транс-изомера до 45% (фиг.1). Порошки, содержащие более 65% транс-FDKP, демонстрировали более низкие и более вариабельные RF/загрузка.
Исследования показали диапазон содержания транс-изомера, обеспечивающий благоприятные аэродинамические характеристики. Следующие разделы описывают эксперименты, проведенные для оценки условий получения, которые обеспечивают определенное содержание изомера.
II. Растворители для омыления
Эксперименты проводили для оценки воздействия, при его наличии, условий омыления на содержание транс-изомера FDKP (фиг.2). Смесь диэтилового сложного эфира FDKP (Соединение 004) и 590 мл реакционного растворителя (см. таблицу 5) нагревали до приблизительно 57°C. После реакции температуру стабилизировали и с применением капельной воронки капельно добавляли приблизительно 50% раствора NaOH в течение приблизительно 60 минут. Реакцию проводили в течение приблизительно 30 минут после окончания добавления NaOH и затем фильтровали с удалением любых непрореагировавших твердых веществ. Фильтрат подкисляли уксусной кислотой до pH, составлявшего приблизительно 5, и полученную твердую фазу отделяли фильтрацией, промывали водой и ацетоном, высушивали в вакуумной печи и изучали с применением ВЭЖХ для определения содержания цис- и транс-изомеров.
Таким образом, оценивали пять различных систем растворителей в диапазоне от водных (таблица 4, A) до органических (таблица 4, E). В основном, данные, представленные в таблице 4, показывают, что система растворителей, применяемая в экспериментах A, B и C, приводила к получению FDKP с приемлемым содержанием транс-изомера.
Таблица 4Влияние соотношения вода:метанол в растворителе на этапе 5 на содержание изомера FDKP
ID образца
Соотношение вода:метанол (об.:об.)
% транс-FDKP
A
4:0
51
B
3:1
53
C
2:2
55
D
1:3
78
E
0:4
33
III. Условия перекристаллизации
FDKP можно перекристаллизовывать из смеси TFA (растворитель)/GAA (анти-растворитель) (фиг.2; этап 6). Регулируемые параметры оценивали с тем, чтобы охарактеризовать процесс перекристаллизации и его воздействие на содержание изомера FDKP. В основном, реакции перекристаллизации с высоким выходом давали FDKP с желаемым содержанием транс-изомера. Реакции перекристаллизации с низким выходом приводили к повышению содержания транс-изомера, поскольку цис-изомер характеризуется более высокой растворимостью в системе растворителей для перекристаллизации.
В реактор загружали необработанный FDKP (приблизительно 75 г) и TFA (приблизительно 250 мл.) и начинали встряхивание. Суспензию нагревали до температуры кипения с обратным холодильником (от приблизительно 80°C до приблизительно 85°C) и выдерживали в течение приблизительно 10 минут или до тех пор, пока не растворялась твердая фаза. Смесь охлаждали до приблизительно 60°C. К раствору добавляли ледяную уксусную кислоту (приблизительно 375 мл.). Смесь охлаждали и выдерживали как минимум в течение приблизительно 6 часов при от приблизительно 10°C до приблизительно 20°C. Осажденный продукт фильтровали и промывали GAA (3 X приблизительно 100 мл), ацетоном (3 X приблизительно 100 мл.) и водой (1 X приблизительно 100 мл). Продукт сушили при приблизительно 55°C в вакууме (от приблизительно 22 до приблизительно 25 д.рт.ст.) в течение от приблизительно 12 до приблизительно 18 часов.
Вначале тестировали четыре фактора, включая количество растворителя, количество анти-растворителя, время кристаллизации и температуру кристаллизации. Количество растворителя, составляющее приблизительно 2,68 или приблизительно 3,34 мл/г FDKP, обеспечивало приемлемый % транс-изомера FDKP. При приблизительно 6,68 мл растворителя/г FDKP получали неприемлемо высокое содержание транс-изомера. Количество анти-растворителя значительно не влияло на % содержания транс-изомера FDKP до 5,0 мл/г FDKP. Уменьшение количества анти-растворителя в контрольном количестве по существу предоставляло % транс-FDKP выше желаемого диапазона.
В экспериментах с высоким выходом время кристаллизации значительно не влияло на % содержание транс-изомера FDKP до приблизительно 6 или 24 часов. Содержание изомера (% транс-изомера FDKP) выходит за пределы приблизительно диапазона от 45 до приблизительно 65% при тестированных высокой (35°C) и низкой (0°C) температурах температуры.
Последующие эксперименты подтвердили эти результаты. На фиг.6 показана поверхность, иллюстрирующая содержание изомера FDKP, измеренное как % транс-FDKP, как функция соотношения растворитель:анти-растворитель (TFA:GAA) и температуры кристаллизации. За пределами диапазона, рассмотренного в этих экспериментах, значения % транс-FDKP варьировали от 59-75%. Результаты предполагают, что транс-изомер FDKP находится в пределах желаемого диапазона при низком соотношении растворителя (0,43) и высокой температуры кристаллизации (25°C). Ожидаемые значения % транс-изомера FDKP на этом участке реакционной поверхности составляли 58-60%. Эти наблюдения предполагают, что применение температуры кристаллизации, составляющей 25°C, может быть эффективным.
ПРИМЕР 2
Измерение транс-изомера FDKP
Соотношение цис/транс-изомеров FDKP определяли с применением ВЭЖХ. Образец FDKP получали при концентрации, составляющей ~0,15 мг/мл в 0,1M аммоний-формиатном буфере. Клетки образца разрушали ультразвуком и переносили на ВЭЖХ в пробирке для анализа. Вводимый объем составлял 20 мкл. В течение времени удержания, составлявшего 31,7 и 33,3 минут (цис- и транс-FDKP, соответственно), проводили наблюдения с применением следующих параметров ВЭЖХ:
Колонка: Phenomenex LUNA Фенил-Гексил
Размер частиц: 3 мм
Длина колонки: 15 см
Внутренний диаметр колонки: 3,0 мм
Подвижная фаза A: вода/трифторуксусная кислота, 1000:1 (об.:об.)
Подвижная фаза B: метанол/тетрагидрофуран/трифторуксусная кислота, 900:100:1 (об.:об.:об.)
Вводимый объем: 20 мкл
Скорость потока: 0,3 мл в минуту
Время хроматографирования: 90 мин
Температура колонки: 30±3°C
Температура образца: 8±3°C
Детектор: УФ 254 нм
Таблица 5Градиент элюирования образца FDKP:
Время (мин)
% А
% B
Скорость потока (мл/мин)
Комментарий
0
95
5
0,3
Начальные условия
75
53,5
46,5
0,3
Линейный градиент
76
20
80
0,3
Изократическая фаза
77
95
5
0,3
Возвращение к начальным условиям
90
95
5
0,3
Повторное уравновешивание
ПРИМЕР 3
Изучение геометрического размера частиц полученных составов посредством оценки объемного среднего геометрического диаметра (VMGD)
Лазерная дифракция сухих порошковых составов, испускаемых ингаляторами для сухого порошка, представляет собой обычный способ оценки уровня деагломераци порошка. Способ позволяет определить геометрический размер, а не аэродинамический размер, что происходит при стандартных производственных способах осаждения. Как правило, геометрический размер испускаемого порошка включает объемное распределение, которое характеризуется средним размером частиц, VMGD. Важно, что геометрические размеры испускаемых частиц определяют с более высоким разрешением по сравнению с аэродинамическими размерами, полученными способами осаждения. Меньшие размеры являются предпочтительными и приводят к большему сходству отдельных частиц, доставляемых к дыхательному тракту. Таким образом, разницу ингаляторов в способности к деагломерации и общей эффективности можно легко преодолеть посредством дифракции. В этих экспериментах ингаляторы тестировали посредством лазерной дифракции при давлениях, аналогичных реальным дыхательным способностям пациента, для определения эффективности ингаляционной системы в деагломерации порошковых составов. Конкретно, составы включали вязкие порошки дикетопиперазина, покрытые активным инсулином или без него. Эти порошковые составы характеризовались специфическими площадями поверхности, соотношением изомеров и индексами Карра. В таблице 6 показаны VMGD и эффективность опустошения контейнера во время тестирования. Порошки FDKP характеризовались приблизительным индексом Карра, составляющим 50, а порошок TI характеризовался приблизительным индексом Карра, составляющим 40.
Таблица 6
Ингаляционнаясистема
порошок
% транс
SSA
Снижение давления (кПа)
Размер образца
% CE
VMGD (микрон)
DPI 2
FDKP
56
55
4
15
92,5
6,800
Med Tone
FDKP
56
55
4
30
89,5
21,2000
DPI 2
FDKP + активный
56
45
4
30
98,0
4,020
DPI 2
FDKP + активный
56
45
4
20
97,0
3,700
DPI 2
FDKP + активный
56
45
4
20
98,4
3,935
DPI 2
FDKP + активный
56
45
4
20
97,8
4,400
Med Tone
FDKP + активный
56
45
4
10
86,1
9,280
Med Tone
FDKP + активный
56
45
4
10
92,3
10,676
DPI 2
FDKP + активный
56
45
2
7
92,9
4,364
DPI 2
FDKP + активный
56
45
2
7
95,1
4,680
DPI 2
FDKP + активный
56
45
4
7
97,0
3,973
DPI 2
FDKP + активный
56
45
4
7
95,5
4,250
DPI 2
FDKP + активный
56
56
4
10
99,6
6,254
DPI 2
FDKP + активный
56
14
4
10
85,5
4,037
Med Tone
FDKP + активный
56
56
4
20
89,7
12,045
Med Tone
FDKP + активный
56
14
4
20
37,9
10,776
DPI 2
FDKP + активный
54
50
4
10
97,1
4,417
DPI 2
FDKP + активный
54
44
4
10
96,0
4,189
DPI 2
FDKP + активный
56
35
4
10
92,0
3,235
DPI 2
FDKP + активный
50
34
4
10
93,2
5,611
DPI 2
FDKP + активный
66
33
4
10
79,0
4,678
DPI 2
FDKP + активный
45
42
4
10
93,2
5,610
DPI 2
FDKP + активный
56
9
4
10
78,9
5,860
2
Данные, представленные в таблице 6, показывают улучшение деагломерации порошка в ингаляторах, определенных как DPI 2, по сравнению с ингаляционной системой MEDTONE. Составы дикетопиперазина с площадью поверхности, находящейся в диапазоне от 14-56 м/г, продемонстрировали эффективность испускания в избытке 85% и VMGD менее чем 7 микрон. Также, составы с содержанием транс-изомера, находящимся в диапазоне от 45-66%, демонстрировали повышенную эффективность по сравнению с образцовым устройством. Однако, стоит заметить, что даже с более эффективным ингалятором при содержании транс-изомера, составлявшем 66%, наблюдалось уменьшение опустошения картриджа, указывающее на ухудшение (снижение) аэродинамических характеристик, когда содержание транс-изомера выходило за пределы диапазонов, описываемых в настоящем документе. Наконец, показано, что эффективность ингаляционной системы с составами, характеризовавшимися индексом Карра, составлявшими 40-50, также увеличивалась по сравнению с образцовым устройством. Во всех случаях указанные значения VMGD были ниже 7 микрон.
Если не указано иначе, все числа, обозначающие количества ингредиентов, свойства, такие как молекулярная масса, условия реакции и т.д., применяемые в описании и формуле изобретения, следует понимать как измененные во всех случаях термином "приблизительно." Таким образом, если не указано иначе, численные параметры, указанные в следующем описании и прилагаемой формуле изобретения, представляют собой приближенные величины, которые могут варьировать в зависимости от желаемых свойств, предоставление которых является целью настоящего изобретения. Как минимум, и не в качестве попытки ограничить изобретение учением об эквивалентах объемом формулы изобретения, каждый численный параметр необходимо, по меньшей мере, понимать в свете числа указанных значащих цифр и посредством применения обычных способов округления. Несмотря на то, что численные диапазоны и указанные параметры представляют собой приближенные величины, численные значения, указанные в конкретных примерах, определяют по возможности наиболее точно. Любое численное значение, однако, по определению содержат определенные ошибки, неизбежно возникающие из-за стандартного отклонения, наблюдаемого в соответствующих опытных измерениях.
Формы единственного и множественного числа и сходные обозначения в контексте описания изобретения (особенно в контексте приведенной ниже формулы изобретения) следует понимать как охватывающие единственное и множественное число, если в настоящем документе не указано иначе или если контекст явно этому не противоречит. Перечисление диапазонов значений в настоящем документе предназначено для способа условного обозначения, относящегося конкретно к каждому отдельному значению, попадающему в этот диапазон. Если в настоящем документе не указано иначе, каждое отдельное значение включено в описание изобретения, как если бы оно было отдельно указано в настоящем документе. Все способы, описываемые в настоящем документе, можно выполнять в любом подходящем порядке, если в настоящем документе не указано иначе или если контекст явно этому не противоречит. Применение всех и любых примеров, или примеров (например, "такой как"), предоставленных в настоящем документе, предназначено для того, чтобы лучше осветить изобретение, и не ограничивает объем изобретения. Ни одно выражение в описании изобретения не следует понимать как указывающее на любой незаявленный элемент, необходимый для применения изобретения.
Применение термина "или" в формуле изобретения обозначает "и/или", если ясно не указано на обозначение только альтернатив или если альтернативы не являются взаимоисключающими, хотя изобретение поддерживает определение, которое относится только к альтернативам и "и/или".
Классификацию альтернативных элементов или вариантов осуществления описываемого в настоящем документе изобретения не следует понимать как ограничения. Каждый член группы может относится к и указываться отдельно или в любой комбинации с другими членами группы или другими элементами, представленными в настоящем документе. Ожидают, что один или несколько членов группы могут быть включены в, или исключены из группы, по причине удобства и/или патентоспособности. Когда происходит такое включение или исключение, описание в настоящем документе рассматривают как включающее модифицированную таким образом группу, чтобы выполнить письменное описание всех групп Маркуша, используемых в прилагаемой формуле изобретения.
Предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения описаны в настоящем документе, включая лучшие варианты осуществления изобретения, известные авторам изобретения. Конечно, вариации этих предпочтительных вариантов осуществления будут очевидны специалистам в данной области при чтении приведенного выше описания. Автор изобретения ожидает, что специалисты в данных областях будут применять такие вариации при необходимости, и авторы изобретения предназначают изобретение для применения в форме, отличной от конкретно описанной в настоящем документе. Таким образом, это изобретение включает все модификации и эквиваленты предметов изобретения, перечисленных в формуле изобретения, приведенной ниже, в соответствии с законом. Кроме того, любое сочетание приведенных выше элементов во всех возможных вариациях охвачено изобретением, если в настоящем документе не указано иначе или если контекст явно этому не противоречит.
Конкретные варианты осуществления, описываемые в настоящем документе, могут быть далее ограничены в формуле изобретения с применением выражений "состоящий из" или "состоящий преимущественно из". При применении в формуле изобретения, указанный или добавленный посредством изменения, переходный термин "состоящий из" не включает любой элемент, этап или ингредиент, не указанный в формуле изобретения. Переходный термин "состоящий преимущественно из" ограничивает объем пункта формулы изобретения до конкретных веществ или этапов и тех, которые не влияют существенно на основные и новые характеристики). Приведенные варианты осуществления изобретения по сути или прямо описаны и предоставлены в настоящем документе.
Кроме того, на всем протяжении этого документа приведены многочисленные ссылки на патенты и печатные публикации. Каждая из приведенных выше ссылок и печатных публикаций отдельно включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.
Кроме того, следует понимать, что варианты осуществления описываемого в настоящем документе изобретения представляют собой иллюстрации способов по настоящему изобретению. Другие модификации, которые можно применять, входят в объем изобретения. Таким образом, в качестве примера, но не для ограничения, альтернативные варианты по настоящему изобретению можно применять в соответствии со сведениями, приведенными в настоящем документе. Таким образом, настоящее изобретение не ограничено точно указанными и описанными сведениями.