Белок а Staphylococcus aureus как фактор, участвующий в обмене катионов металлов и способствующий формированию противовоспалительного микроокружения бактерий

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

7. Balaian E., Schuster C., Schonefeldt C., Germing U., Haase D., Tuve S. et al. Selective expansion of regulatory T cells during lenalido-mide treatment of myelodysplastic syndrome with isolated deletion 5q. Ann. Hematol. 2016; 95 (11): 1805-10.

8. Mailloux A.W., Sugimori C., Komrokji R.S., Yang L., Maciejewski J.P., Sekeres M.A. et al. Expansion of effector memory regulatory T cells represents a novel prognostic factor in lower risk myelodysplas-tic syndrome. J. Immunol. 2012; 189(6): 3198-208.

9. Sakaguchi S., Yamaguchi T., Nomura T., Ono M. Regulatory T cells and immune tolerance. Cell. 2008; 133(5): 775-87.

10. Smith E.L., Finney H.M., Nesbitt A.M., Ramsdell F., Robinson M.K. Splice variants of human FOXP3 are functional inhibitors of human CD4+ T-cell activation. Immunology. 2006; 119(2): 203-11.

11. Kaur G., Goodall J.C., Jarvis L.B., Hill Gaston J.S. Characterisation of Foxp3 splice variants in human CD4+ and CD8+ T cells - Identification of Foxp3delta7 in human regulatory T cells. Mol. Immunol. 2010; 48(1-3): 321-32.

12. Chae W.J., Henegariu O., Lee S.K., Bothwell A.L. The mutant leu-cine-zipper domain impairs both dimerization and suppressive function of Foxp3 in T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006; 103(25): 9631-6.

13. Du J., Huang C., Zhou B., Ziegler S.F. Isoform-specific inhibition of ROR alpha-mediated transcriptional activation by human FOXP3. J. Immunol. 2008; 180(7): 4785-92.

14. Ichiyama K., Yoshida H., Wakabayashi Y., Chinen T., Saeki K. et al. Foxp3 inhibits RORgammat-mediated IL-17A mRNA transcription

through direct interaction with RORgammat. J. Biol. Chem. 2008; 283(25): 17003-8.

15. Mailer R.K., Falk K., Rotzschke O. Absence of leucine zipper in the natural FOXP3Delta2Delta7 isoform does not affect dimeriza-tion but abrogates suppressive capacity. PLoS One. 2009; 4(7): e6104.

16. Magg T., Mannert J., Ellwart J.W., Schmid I., Albert M.H. Subcel-lular localization of FOXP3 in human regulatory and nonregulatory T cells. Eur. J. Immunol. 2012; 42(6): 1627-38.

17. Zheng Y., Josefowicz S.Z., Kas A., Chu T.T., Gavin M.A., Rudensky A.Y. Genome-wide analysis of Foxp3 target genes in developing and mature regulatory T cells. Nature. 2007; 445(7130): 936-40.

18. Mitin A.N., Litvina M.M., Sharova N.I., Selivanenko V.T., Marta-kov M.A., Latyshev S.V. Yarilin A.A. FOXP3 expression and its isoform ratio during T cells differentiation. Immunologiya. 2012; 33

19. Mitin A.N., Litvina M.M., Mitina T.A., Golenkov A.K., Yarilin A.A. Flow cytometry analysis of FOXP3 and its isoforms expression by CD4+ T cells from peripheral blood in various forms of multiple myeloma. Immunologiya. 2014; 35

20. Lord J.D., Valliant-Saunders K., Hahn H., Thirlby R.C., Ziegler S.F. Paradoxically increased FOXP3+ T cells in IBD do not preferentially express the isoform of FOXP3 lacking exon 2. Dig. Dis. Sci. 2012; 57(11): 2846-55.

Поступила 18.11.17 Принята в печать 16.12.17

ИММУНОПАТОЛОГИЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ ИММУНОЛОГИЯ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018 УДК: 579.862.1:579.122].083.3

Чекнёв С.Б., Вострова Е.И., Сарычева М.А., Ефремова И.Е., Бабаянц А.А.

БЕЛОК А STAPHYLOCOCCUS AUREUS КАК ФАКТОР, УЧАСТВУЮЩИЙ В ОБМЕНЕ КАТИОНОВ МЕТАЛЛОВ И СПОСОБСТВУЮЩИЙ ФОРМИРОВАНИЮ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОГО МИКРООКРУЖЕНИЯ БАКТЕРИЙ

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, 123098, Москва, Россия

Показано, что белок А S.aureus хелатирует катионы металлов и снижает в 1,3 - 1,66 раза (р < 0,001 - 0,05) выработку клетками периферической крови человека интерлейкина-1р (ИЛ-1Р), ИЛ-6, ИЛ-10 и фактора некроза опухоли а, которая индуцируется катионами меди и цинка. Обсуждается способность белка А S.aureus реализовать противовоспалительные свойства и участвовать в формировании благоприятных условий для персистенции бактерий в организме хозяина.

Ключевые слова: белок А S.aureus; обмен металлом; воспаление.

Для цитирования: Чекнёв С.Б., Вострова Е.И., Сарычева М.А., Ефремова И.Е., Бабаянц А.А. Белок А Staphylococcus aureus как фактор, участвующий в обмене катионов металлов и способствующий формированию противовоспалительного микроокружения бактерий. Иммунология. 2018; 39(2-3): 128-133. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-2-3-128-133

Cheknev S.B., Vostrova E.I., Sarycheva M.A., Efremova I.E., Babajanz A.A.

STAPHYLOCOCCUS AUREUS PROTEIN A AS FACTOR INVOLVED IN METAL EXCHANGE AND INDUCING FORMATION OF ANTI-INFLAMMATORY MICROENVIRONMENT OF THE BACTERIA

N.F.Gamaleya National Research Centre for Epidemiology and Microbiology of the Ministry of Health of the Russian Federation, 123098, Moscow, Russia

It has been shown that S.aureus protein A bound metal ions and 1.3-1.66 times (p<0.001-0.05) reduced production by human peripheral blood cells of interleukin-1p (IL-1P), IL-6, IL-10 and tumor necrosis factor а which was induced with copper or zinc ions. S.aureus protein A capability of exerting anti-inflammatory properties and of promoting formation of favorable state for bacterial persistence within the host was discussed.

Для корреспонденции: Чекнёв Сергей Борисович, д-р мед наук, E-mail: cheknev@gamaleya.org.

ORIGINAL ARTICLE

Keywords: S.aureus protein A; metal exchange; inflammation.

For citation: Cheknev S.B., Vostrova E.I., Sarycheva M.A., Efremova I.E., Babajanz A.A. Staphylococcus aureus protein A as factor involved in metal exchange and inducing formation of anti-inflammatory microenvironment of the bacteria. Immu-nologiya. 2018; 39(2-3): 128-133. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-2-3-128-133

For correspondence: Cheknev Sergey Borisovich, Dr. Med. Sci., E-mail: cheknev@gamaleya.org.

conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Acknowledgments. The study had no sponsorship.

Received 19.02.18 Accepted 16.04.18

Взаимодействие патогенных и условно патогенных бактерий с клетками организма хозяина во многом описывается в контексте конкуренции за катионы металлов, в процессе которой бактериальная клетка получает возможность потреблять биологически доступные катионы, необходимые для обеспечения её жизнедеятельности, тогда как эукариоти-ческие клетки в локальном окружении утрачивают возможность реализации метаболических процессов, замкнутых на участие катионов металлов, и, следовательно, испытывают недостаточность функций, характеризующихся металлоза-висимостью [1 - 5].

К числу иммунных функций, которые могут ослабляться в результате захвата бактериями определенного количества катионов металлов, правомерно относить синтез иммуноак-тивных цитокинов, пролиферацию лимфоцитов и прохождение отдельных стадий их дифференцировки, распознавание и связывание мишеней, реализацию межклеточных взаимодействий, цитотоксическую активность [6 - 10].

Наряду с действием специфических высокоаффинных переносчиков, доставляющих металл внутрь бактериальной клетки [3, 8, 11 - 13], дефицит катионов в микроокружении лимфоцита может возникать как следствие хелати-рования металла связывающими сайтами поверхностных бактериальных белков, не реализующих специфичности по отношению к конкретным биохимическим процессам [14 - 16].

Эффективность такого хелатирования, конечно, не может превосходить потенциал действия специфических переносчиков, располагающих высокими константами связывания катионов. В то же время, сама полианионная природа белковых макромолекул создаёт условия для привлечения катионов на взаимодействие [15, 17, 18], а пространственная упаковка ряда белков (например, у-глобулиновой фракции) характеризуется наличием неполностью упорядоченных внутримолекулярных компартментов, способных принять погружённый металл в поле тропных к нему ли-гандов [19-21]. Это позволяет предполагать, что даже при относительно невысоких (как у у-глобулинов) константах связывания металла эффективность его хелатирования, оцениваемая по факту захвата катионов, может оказаться сопоставимой с действием специфических переносчиков [14, 15, 18].

Предшествующими исследованиями установлено, что катионы меди и цинка выступают индукторами выработки цитокинов клетками моноцитарно-макрофагального ряда [10, 22, 23]. Хелатирование металлов в микроокружении может существенно ослаблять или полностью исключать их индуцирующее воздействие, значительно снижая тем самым воспалительный ответ, запуск которого связан с индукцией синтетических процессов в моноцитах, макрофагах и дендритных клетках [9, 22, 24].

Целью работы явилась оценка выработки клетками периферической крови (КПК) человека интерлейкина-ф (ИЛ-ф), ИЛ-6, ИЛ-10 и фактора некроза опухоли а (ФНО-а) в присутствии катионов меди и цинка, взаимодействующих с белком А S.aureus.

Материалы и методы

Индукцию цитокинов в суспензиях клеток, полученных разведением проб цельной периферической венозной крови человека (106 клеток в 1 мл), проводили в полной питательной среде, приготовленной на основе среды RPMI-1640 (ПанЭко), дополненной двумя процентами плазмы донорской крови, L-глутамином (из комплекта к флакону среды), гентамицином (20 ЕД/мл) и гепарином (до 5,0 ЕД/мл), в течение 24, 48 и 72 ч при 37 °С во влажной атмосфере, содержавшей 5% СО2. Использовали пластиковые плоскодонные 24-луночные планшеты (Costar).

Образцы белка А S.aureus (Sigma), взаимодействующего с катионами меди и цинка в 0,15 М растворе NaCl (рН 7,21-7,30), применяли в конечной концентрации 0,14 мкг/ мл, подобранной, как и концентрации катионов металлов, на основании результатов предшествующих исследований. Для получения 2,2 нг/мл катионов меди использовали водный сульфат CuSO4 x 5H2O (Merck), для получения 1,0 нг/мл катионов цинка - хлорид ZnCl2 (Chemapol) в 0,15 М растворе NaCl (pH 7,21 - 7,30). Взаимодействие проводили в течение 30 мин. при 37 °С в стеклянных центрифужных пробирках с периодическим тщательным, но аккуратным перемешиванием.

Контрольные образцы белка А (не содержавшие солей меди или цинка) дополняли по объёму необходимым количеством 0,15 М раствора NaCl (pH 7,21 - 7,30) и инкубировали в тех же условиях, что и опытные. Аналогично, необходимое количество 0,15 М раствора NaCl вносили в контрольную суспензию КПК человека в условиях индукции цитокинов.

Стандартными индукторами выработки цитокинов служили: вирус болезни Ньюкасла (ВБН) в дозе 10 ЦПД на клетку и фитогемагглютинин Р (ФГА, Difco, 1,0 мкг/мл).

Содержание ИЛ-ф, ИЛ-6, ФНО-а и ИЛ-10 в супернатан-тах индуцированных КПК определяли методом ИФА с использованием микропланшетного спектрофотометра Epoch (BioTek). Наборы для ИФА (ЗАО «Вектор-Бест») применяли, согласно инструкции фирмы-производителя, с дополнительными технологическими контролями.

Каждый образец полученных супернатантов тестировали в двух различных разведениях исходного материала, приготовленных с использованием питательной среды RPMI-1640 (Gibco). Каждое разведение каждого образца и всех использованных контролей экспериментальной системы (ВБН, ФГА, спонтанная продукция цитокинов КПК) тестировали не менее чем в двух параллельных лунках микропланшетов. В тексте и на рис. 1-4 представлены результаты, полученные с применением следующих разведений образцов индуцированных цитокинов: ИЛ-ф - 1/10, ИЛ-6 - 1/50, ФНО-а - 1/2, ИЛ-10 - неразведённый образец.

Спектрофотометрическое исследование белка А S.aureus, взаимодействующего в 0,15 М растворе NaCl (рН 7,25) с катионами цинка, осуществляли в ультрафиолете (УФ-свете) в диапазоне длин волн от 190 до 320 нм, в автоматическом режиме, с шагом 0,1 нм, с использованием дифференцирующего спектрофотометра Shimadzu UV-1800. Подобранные на основании результатов предшествующих исследований концентрации составляли: белка А - 200 мкг/мл, цинка - 1,0 мкг/мл.

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Необходимое для получения искомой концентрации металла количество водного сульфата цинка ZnSO4 x 7H2O (Донецкий завод химреактивов) в 0,15 М растворе NaCl (рН 7,25) вносили в пробы белка А S.aureus (Sigma), приготовленные в объёме 5,0 мл 0,15 М раствора NaCl, и инкубировали в течение 1 ч при 37 °С в стеклянных центрифужных пробирках. Контрольные (не содержащие катионов цинка) пробы дополняли по объёму необходимым количеством 0,15 М раствора NaCl (рН 7,25) и инкубировали в тех же условиях, что и опытные.

Кислотность растворов контролировали с помощью базового электронного рН-метра Sartorius PB-11, укомплектованного электродом Sartorius PY-P11.

При математической обработке результатов достоверность различия средних величин устанавливали с помощью /-критерия Стъюдента.

результаты и обсуждение

Как показано на рис. 1, катионы меди и цинка индуцируют выработку КПК человека ИЛ-ф, повышая содержание цитокина в культуральной жидкости клеток, в сравнении с неиндуцированными КПК в 2,13 раза (р < 0,001), и в 1,64 раза (р < 0,001) соответственно. В присутствии белка А S.aureus эффекты катионов меди и цинка ослабляются в 1,66 раза (р < 0,001) и в 1,5 раза (р < 0,001) соответственно (см. рис. 1). Выраженным действием на КПК человека, вырабатывающие ИЛ-ф, белок А не обладает (см. рис. 1).

Из данных, представленных на рис. 2, следует, что катионы цинка индуцируют выработку КПК человека ИЛ-6, повышая содержание цитокина в культуральной жидкости клеток, в сравнении с неиндуцированными КПК, в 1,49 раза (р < 0,001). Катионы меди не реализуют при этом индуцирующего потенциала в отношении продуцентов ИЛ-6 (см. рис. 2).

2,75 2,50 2,25 2,00 1,75 1,50 1,25 1,00 0,75 0,50 0,25 0,00

3 4

5 6

Рис. 2. Выработка ИЛ-6 КПК человека в присутствии катионов меди и цинка, взаимодействующих с белком А S.aureus (М ± т, п = 8). Индукция в течение 72 ч.

По оси ординат: концентрация ИЛ-6, нг/мл: 1 - катионы цинка, 2 - цинк с белком А, 3 - катионы меди, 4 - медь с белком А, 5 - контрольные КПК,

6 - КПК с белком А.

Примечание: концентрации: цинка (1 и 2) - 1,0 нг/мл; меди (3 и 4) -2,2 нг/мл; белка А (2, 4 и 6) - 0,14 мкг/мл; *р < 0,002, **р < 0,001 по сравнению с катионами меди (3) и цинка (1) или контрольными КПК (5).

250 г

200

150

100

50

50,0 г

40,0

30,0

20,0

10,0

0,0

1 2

3 4

5 6

1 2

3 4

5 6

Рис. 1. Выработка ИЛ-1Р КПК человека в присутствии катионов меди и цинка, взаимодействующих с белком А S.aureus (М ± т, п = 8). Индукция в течение 24 ч.

По оси ординат: концентрация ИЛ-1р, пг/мл.: 1 - катионы цинка, 2 -цинк с белком А, 3 - катионы меди, 4 - медь с белком А, 5 - контрольные КПК, 6 - КПК с белком А.

Примечание: концентрации: цинка (1 и 2) - 1,0 нг/мл; меди (3 и 4) -2,2 нг/мл; белка А (2, 4 и 6) - 0,14 мкг/мл; *р < 0,02, **р < 0,001 по сравнению с катионами меди (3) и цинка (1) или контрольными КПК (5).

Рис. 3. Выработка ФНО-а КПК человека в присутствии катионов меди и цинка, взаимодействующих с белком А S.aureus (М ± т, п = 4). Индукция в течение 24 ч.

По оси ординат: концентрация ФНО-а, пг/мл: 1 - катионы цинка, 2 -цинк с белком А, 3 - катионы меди, 4 - медь с белком А, 5 - контрольные КПК, 6 - КПК с белком А.

Примечание: концентрации: цинка (1 и 2) - 1,0 нг/мл; меди (3 и 4) -2,2 нг/мл; белка А (2, 4 и 6) - 0,14 мкг/мл; *р < 0,05, **р < 0,002 по сравнению с катионами меди (3) и цинка (1) или контрольными КПК (5).

2

0

ORIGINAL ARTICLE

50,0

40,0

30,0

20,0

10,0

0,0

Ш

1 2

3 4

5 6

Рис. 4. Выработка ИЛ-10 КПК человека в присутствии катионов меди и цинка, взаимодействующих с белком А S.aureus (М ± т, п = 8). Индукция в течение 72 ч.

По оси ординат: концентрация ИЛ-10, пг/мл.: 1 - катионы цинка, 2 -цинк с белком А, 3 - катионы меди, 4 - медь с белком А, 5 - контрольные КПК, 6 - КПК с белком А.

Примечание: концентрации: цинка (1 и 2) - 1,0 нг/мл; меди (3 и 4) -2,2 нг/мл; белка А (2, 4 и 6) - 0,14 мкг/мл; *р < 0,001 по сравнению с катионами меди (3) и цинка (1) или контрольными КПК (5).

В присутствии белка А S.aureus эффекты катионов цинка ослабляются в 1,3 раза (р < 0,001) (см. рис. 2). Одновременно, в отношении активности КПК человека в присутствии катионов меди и спонтанной продукции ИЛ-6 белок А S.aureus проявляет тенденцию к снижению показателя на 8,3% (р < 0,002) и на 12,5% (р < 0,002), соответственно (см. рис. 2).

Как видно на рис. 3, катионы цинка и меди индуцируют выработку КПК человека ФНО-а, повышая содержание ци-токина в культуральной жидкости клеток, в сравнении с не-индуцированными КПК в 1,55 раза (р < 0,01) и в 1,21 раза (р < 0,1), соответственно. Белок А S.aureus ослабляет эффекты катионов цинка и меди в 1,58 раза (р < 0,002) и в 1,3 раза (р < 0,05), соответственно, возвращая выработку ФНО-а на уровень спонтанной продукции КПК человека (рис. 3).

В присутствии катионов цинка, в сравнении со спонтанной продукцией в 2,77 раза (р<0,001) усиливается выработка КПК человека ИЛ-10. Белок А S.aureus в 1,38 раза (р<0,001) ослабляет индуцирующие эффекты катионов цинка, не влияет на КПК человека, спонтанно продуцирующие ИЛ-10, и в 1,66 раза (р<0,001) снижает активность продуцентов ИЛ-10 в присутствии катионов меди (рис. 4).

Результаты спектрофотометрического исследования обнаруживают компактизацию молекул белка А S.aureus, взаимодействующего в растворе с катионами цинка (рис. 5). По всей длинноволновой полосе поглощения белка отмечается эффект гипохромии, выраженность которой в диапазоне длин волн от 270 до 280 нм составляет от 7,1 до 8,2%, а с учётом построения базовой линии спектрофотометра по уровню оптической плотности 0,04 ед. - от 11,9 до 13,8%. При этом спектры контрольного и опытного белков характеризуются максимумом поглощения, который обнаруживается при длине волны 275 нм и определяется наличием в составе первичной последовательности белка А S.aureus четырех аминокислотных остатков тирозина (см. рис. 5).

Динамическое наблюдение показывает, что компактизо-ванное катионами цинка конформационное состояние белка А S.aureus можно описывать в контексте пространственно-временной стабильности, поскольку оно сохраняется по истечении срока в четверо суток хранения при 4 °С, лишь с некоторым снижением выраженности эффекта гипохромии - до 4,5 - 5,4% в диапазоне длин волн от 270 до 280 нм, а с учётом особенностей построения базовой линии - до 8,2 -9,6% (данные графически не представлены).

Понятно, что если бы взаимодействие белка А S.aureus с катионами цинка оптически характеризовалось обнаружением и закреплением гиперхромных эффектов, их можно было бы связывать с экспонированием во внемолекулярное пространство боковых аминокислотных хромофоров, скрытых в на-тивной конформации белковой молекулы и разворачиваемых в раствор катионами металла, присоединяемыми на внешние участки молекулы белка [19, 20]. При этом структура макромолекулы, как и доступность катионов для более мощных хелаторов, аранжирующих мембрану клеток-эффекторов, ответственных за выработку иммуноактивных цитокинов, не претерпевали бы существенных изменений. Синтетические процессы, обеспечивающие инициацию и динамику воспалительного ответа, могли бы значимо не меняться.

Отмеченная на рис. 5 гипохромия, напротив, служит свидетельством и реализуется как проявление компактизации молекулы белка, обусловливаемой встраиванием металла во внутримолекулярные компартменты, повышением степени упорядоченности внутримолекулярных структур, подворачиванием части боковых аминокислотных хромофоров внутрь макромолекулы [19, 25]. Встроенный в поле тропных к нему лигандов металл выводится из активных обменных процессов, пул лабильных, доступных клеткам-эффекторам катионов истощается, индукционные сигналы обнаруживают выраженные тенденции к снижению (см. рис. 1-4).

0,20 0,18 0,16 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00

_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_

240 250 260 270 280 290 300 310 320

Рис. 5. Спектры поглощения в УФ-свете образцов контрольного белка А S.aureus (1) и белка А S.aureus, взаимодействующего с катионами цинка (2).

По оси абсцисс: длина волны, нм; по оси ординат: оптическая плотность, ед. Белка А - 200 мкг/мл, цинка - 1,0 мкг/мл. Представлены обобщённые результаты двух полных независимых постановок.

2

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Результат представляется достаточно неожиданным, поскольку известная структура белка А S.aureus не предполагает возможность активного хелатирования катионов металлов на внутримолекулярные сайты связывания [26, 27]. В современной научной периодике белок А S.aureus не описан в контексте неполной внутренней упорядоченности (неполной свёрнутости), не располагает в составе первичной последовательности остатками цистеина и внутрицепьевыми дис-ульфидными связями, не содержит участков с существенно сниженной компактностью упаковки [26, 27].

В то же время белок отличают: высокая степень асимметрии молекулы [26]; необычный состав (до 50% правоза-крученной а-спирали) и необычные по внутренней вязкости гидродинамические свойства [26]; антипараллельный ход значительных по протяжённости участков полипептидной цепи, которая поперечно замыкается, в том числе посредством связей с пептидогликанами бактериальной стенки и образует две близкие по структуре субъединицы [26, 27]. Белок А функционирует в качестве Fc-рецептора (FcR), способного связывать до двух или четырёх молекул IgG или IgM антител [28 - 30]. Сказанное формирует основу и одновременно выступает проявлением структурно-функциональной пластичности молекулы, для которой частичная внутренняя неупорядоченность с необходимостью определяет условия выполнения функций FcR [21, 31, 32].

Но тогда становится ясно, что в зависимости от условий локального окружения белок будет реализовать различные варианты динамически меняющегося конформационного состояния с транзиторным экспонированием недоступных катионам в нативной конформации макромолекулы внутренних сайтов связывания [33]. Присоединение металла на такие участки с последующим погружением внутрь молекулы белка и сопутствующей компактизацией белковой структуры становится событием, описываемым с известной вероятностью и определённым вкладом в изменение вектора транспорта и обмена катионов в микроокружении клеток-эффекторов [14, 15, 17].

Снижение в результате хелатирования катионов металлов потока индуцируемых ими сигналов, запускающих в клетках моноцитарно-макрофагального ряда активную продукцию ИЛ-ф, ИЛ-6, ФНО-а и ИЛ-10, т. е. цитокинов инициальной и продуктивной фазы воспалительного ответа, видится не описанным ранее механизмом формирования бактериями S.aureus благоприятных для их персистенции условий микроокружения в организме хозяина [24]. Известно, что функционирование белка А в качестве FcR ориентирует активные центры взаимодействующих с ним антител от поверхности бактериальной клетки и маскирует бактерии S.aureus под собственные клетки макроорганизма [28 - 30], а запуск альтернативного пути активации системы комплемента снижает опсонизацию S.aureus в отсутствие интактного классического пути [29, 34]. Снижение посредством хелатирования металлов воспалительного ответа клеток-эффекторов может существенно усиливать реализацию механизмов защиты S.aureus от воздействия про-тективных факторов макроорганизма [24, 30].

При этом до трети синтезируемого S.aureus белка А выделяется во внешнюю по отношению к клетке среду [35, 36]. Это происходит в динамике логарифмической и стационарной фазы роста культуры вне формирования ковалентной связи с пептидогликанами клеточной стенки. Причина - недостаточная активность сортазы А, расщепление под действием которой характеристического С-концевого участка способствует ковалентному присоединению белка А к пептидогликанам стенки бактерии [30]. Указанная связь может разрушаться в результате воздействия протеолитических ферментов поверхности с высокой амидазной, муреингидролазной и муро-эндопептидазной активностью [27]. Образование свободной, растворимой формы белка А S.aureus связывают с естественными процессами активации, сопровождающими отдельные

стадии деления и дифференцировки бактериальной клетки, с процессами спонтанного или индуцированного бактериолиза, а также катаболитного расщепления поверхностных белков, усиливающегося в условиях воспаления [27, 35, 36]. Сказанное позволяет описывать хелатирование металла белком А 8мигеш в контексте дистантных по отношению к клетке бактерии событий, подтверждающих системность реализации механизмов защиты бактериальной популяции, которая, в свою очередь, после отщепления с поверхности бактерий белка А вступает на путь активации [28].

Если предположить, что экспрессия активной формы со-ртазы А регулируется собственно бактериальным транскрип-томом [30], то ускользание S.aureus от иммунного надзора в организме хозяина транспонируется из конститутивных характеристик бактерий этого вида, связанных с особенностями функционирования поверхности, покрытой по FcR обратно ориентированными антителами (отсутствие классического пути активации системы комплемента [29], снижение опсони-зации [34], ингибирование фагоцитоза [30]) в процесс активного приспособления к условиям макроорганизма, существенно повышающий вирулентность возбудителя [24, 29, 30].

Определяясь во внеклеточном пространстве [27, 35, 36], белок А ^З.аигеш хелатирует катионы металлов и снижает возможность индукции ими выработки ИЛ-ф, ИЛ-6 и ФНО-а (см. рис. 1 - 3), в отсутствие которых не индуцируется фагоцитоз, ответствующий в динамике воспалительного ответа за элиминацию бактерий [24]. Баланс про- и антивоспалительных реакций в патобиозе ^З.аигеш смещается в сторону ослабления воспаления [24], что способствует повышению толерантности организма хозяина, облегчает колонизацию бактериями слизистых оболочек и прилежащих тканей, формирует возможность активной персистенции на фоне дефицита металлозависимых иммунных реакций [24].

С позиций физической химии биологических систем синтез белка А S.aureus на поверхность клеточной стенки или во внеклеточное пространство в виде частично несвёрнутой макромолекулы создаёт ряд преимуществ, обеспечивающих эффективность его функционирования в качестве FcR, с одной стороны, и в качестве партнёра по взаимодействию с другими макромолекулами или катионами металлов, - с другой.

Из положений биологии неструктурности следует, что такие соединения обретают больший радиус захвата специфического связывающего сайта, большую конформационную свободу и более высокую связывающую способность [37]. Они также реализуют более высокую скорость связывания на больших расстояниях при невысоких константах [31]. Синтез таких соединений позволяет продуценту (в данном случае - бактериям S.aureus) обеспечивать возможность быстрого и точного ответа клетки на меняющиеся условия окружения [32].

Располагая намного более высокой пластичностью и реализуя более выраженную, чем компактизованные структуры, динамику [33], неполностью свёрнутые белки активно хе-латируют металл, который выступает фактором их сворачивания, компактизации и стабилизации в нативное, наиболее энергетически выгодное состояние [14, 17, 18] и действует как посредник в реализации межмолекулярных взаимодействий, не осуществляемых в отсутствие доступных белку катионов [15].

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

литература

17. Волькенштейн М.В. О структуре и динамике белков. Молек. биология. 1991; 25 (4): 883-925. 19. Чекнёв С.Б., Бабаева Е.Е., Голуб А.Е., Денисова Е.А., Воробьё-

ва УА. Эффекты меди и цинка при связывании с человеческим сывороточным у-глобулином. Мед. иммунология. 2006; 8 (5-6): 615-22.

20. Чекнёв С.Б., Ефремова И.Е., Денисова Е.А., Юшковец Е.Н. Им-муноферментный анализ модифицированного катионами металлов у-глобулина на низких концентрациях образцов. Росс. имму-нол. журнал. 2008; 2(11), 1: 55-62.

23. Чекнёв С.Б., Сарычева М.А., Мездрохина А.С., Бабаянц А.А. Металлокомплексы у-глобулина в регуляции выработки клетками крови человека моноцитарного хемотаксического протеина МСР-1.Иммунология. 2016; 37 (3): 150-5.

25. Чекнёв С.Б., Денисова Е.А., Бабаева Е.Е., Воробьёва У.А., Мон-гуш Э.М. Конформационное состояние и антигенные характеристики у-глобулина человека, модифицированного связыванием катионов меди и цинка. Иммунология. 2007; 28 (5): 274-80.

28. Тотолян А.А., Бурова Л.А. Fc-рецепторные белки Streptococcus pyogenes и патогенез постинфекционных осложнений. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиологии. 2014; (3): 78-90.

31. Сердюк И.Н. Структурированные белки и белки с внутренней неупорядоченностью. Молек. биология. 2007; 41 (2): 297-313.

33. Ламба Я., Пол С., Хасиджа В., Аггарвал Р., Шодхури Т.К. Наблюдение за путями сворачивания и разворачивания белка через изменения поверхностной гидрофобности с использованием флуоресцентной спектроскопии и спектроскопии кругового дихроизма. Биохимия. 2009; 74 (4): 486-92.

35. Акатов А.К., Зуева В.С. Стафилококки. М.: Медицина; 1983.

references

1. Botella H., Stadthagen G., Lugo-Villarino G., de Chastellier C., Ney-rolles O. Metallobiology of host-pathogen interactions: an intoxicating new insight. Trends Microbiol. 2012; 20 (3): 106-12.

2. Corbin B.D., Seeley E.H., Raab A., Feldmann J., Miller M.R., Torres V.J. et al. Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses. Science. 2008; 319 (Feb. 15): 962-5.

3. Hood M.I., Skaar E.P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Rev. Microbiology. 2012; 10: 525-37.

4. Samanovic M.I., Ding C., Thiele D.J., Darwin K.H. Copper in microbial pathogenesis: medding with the metal. Cell Host and Microbe. 2012; 11: 106-15.

5. Shafeeq S., Kuipers O.P., Kloosterman T.G. The role of zinc in the interplay between pathogenic streptococci and their hosts. Molec. Microbiol. 2013; 88 (6): 1047-57.

6. Overbeck S., Rink L., Haase H. Modulating the immune response by oral zinc supplementation: a single approach for multiple diseases. Arch. Immunol. Ther. Exp. 2008; 56: 15-30.

7. Percival S.S. Copper and immunity. Amer. J. Clin. Nutrition. 1998; 67 (5, Suppl.): 1064-8.

8. Rink L., Haase H. Zinc homeostasis and immunity. Trends Immunol. 2007; 28 (1): 1-4.

9. Rink L., Kirchner H. Zinc-altered immune function and cytokine production. J. Nutrition. 2000; 130 (Suppl. 5): 1407-11.

10. Vasto S., Mocchegiani E., Candore G., Listi F., Colonna-Romano G., Lio D., Malavolta M., Giacconi R., Cipriano C., Caruso C. Inflammation, genes and zinc in ageing and age-related diseases. Biogeron-tology. 2006; 7: 315-27.

11. Bayle L., Chimalapati S., Schoehn G., Brown J., Vernet T., Durmort C. Zinc uptake by Streptococcus pneumoniae depends on both AdcA and AdcAII and is essential for normal bacterial morphology and virulence. Molec. Microbiol. 2011; 82 (4): 904-16.

12. Natori Y., Nanamiya H., Akanuma G., Kasono S., Kudo T., Ochi K., Kawa-

mura F. A fail-safe system for the ribosome under zinc-limiting conditions in Bacillus subtilis. Molec. Mocrobiol. 2007; 63 (1): 294-307.

13. Yamamoto K., Ishihama A. Transcriptional response of Escherichia coli to external zinc. J. Bacteriol. 2005; 187 (18): 6333-40.

14. Berg J.M. Zinc fingers and other metal-binding domains. Elements for interactions between macromolecules. J. Biol. Chemistry. 1990; 265 (12): 6513-6.

15. Lu Y. Metal ions as matchmakers for proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010; 107 (5): 1811-2.

16. Nies D.H. Microbial heavy-metal resistance. Appl. Microbiol. Bio-technol. 1999; 51: 730-50.

ORIGINAL ARTICLE

17. Volkenstein M.V. On the structure and dynamics of proteins. Molec. Biology (Moscow). 1991; 25 (4): 883-925.

18. Dill K.A., MacCallum J.L. The protein-folding problem, 50 years on. Science. 2012; 338 (Nov. 23): 1042-6.

19. Cheknev S.B., Babaeva E.E., Golub A.E., Denisova E.A., Vorobieva U.A. The effects of copper and zinc ions during their binding with human serum y-globulin. Med. Immunologiya. 2006; 8

20. Cheknev S.B., Efremova I.E., Denisova E.N., Yushkovets E.N. Immuno-enzyme analysis of the y-globulin which has bound metal ions, at the low samples concentrations. Rossiyskiy immunologicheskiy zhurnal. 2008; 2

21. Siberil S., Menez R., Jorieux S., de Romeuf C., Bourel D., Fridman W.-H., Ducancel F., Stura E.A., Teillaud J.-L. Effect of zinc on human IgG1 and its FcyR interactions. Immunol. Letters. 2012; 143: 60-9.

22. Cheknev S.B., Apresova M.A., Moryakova N.A., Efremova I.E., Mezdrokhina A.S., Piskovskaya L.S., Babajanz A.A. Production of the growth factors GM-CSF, G-CSF, and VEGF by human peripheral blood cells induced with metal complexes of human serum y-globulin formed with copper or zinc ions. Mediators of Inflammation. 2014; 2014: art.ID518625, 8 p.

23. Cheknev S.B., Sarycheva M.A., Mezdrokhina A.S., Babayants A.A. The y-globulin metal complexes in regulation of the production by human blood cells of monocyte chemoattractant protein MCP-1. Immunologiya. 2016; 37 (3): 150-5.

24. Peres A.G., Stegen C., Li J., Xu A.Q., Levast B., Surette M.G., Cousineau B., Desrosiers M., Madrenas J. Uncoupling of pro- and anti-inflammatory properties of Staphylococcus aureus. Infect. Immunity. 2015; 83 (4): 1587-97.

25. Cheknev S.B., Denisova E.A., Babaeva E.E., Vorobieva U.A., Mongush E.M. Conformational state and antigen characteristics of human y-globulin modified by binding the copper and zinc ions. Immunologiya. 2007; 28

26. Sjoholm I. Protein A from Staphylococcus aureus. Spectropolarimetric and spectrophotometric studies. Eur. J. Biochem. 1975; 51: 55-61.

27. Sjoquist J., Meloun B., Hjelm H. Protein A isolated from Staphylococcus aureus after digestion with lysostaphin. Eur. J. Biochem. 1972; 29: 572-8.

28. Totolyan A.A., Burova L.A. Fc-receptor proteins of Streptococcus pyogenes and pathogenesis of post-infection complications. Zh. Mikrobiol.

29. Foster T.J., Geoghegan J.A., Ganesh V.K., Hook M. Adhesion, invasion and evasion: the many functions of the surface proteins of Staphylococcus aureus. Nat. Rev. Microbiol. 2014; 12: 49-62.

30. O'Halloran D.P., Wynne K., Geoghegan J.A. Protein A is released into the Staphylococcus aureus culture supernatant with an unprocessed sorting signal. Infect. Immunity. 2015; 83 (4): 1598-609.

31. Serdiuk I.N. The structured proteins and intrinsically unstructured proteins. Molek. Biologiya. 2007; 41

32. Wright P.E., Dyson H.J. Intrinsically unstructured proteins: re-assessing the protein structure-function paradigm. J. Molec. Biology. 1999; 293 (2): 321-31.

33. Lamba Y., Pol S., Khasidzha B., Aggarval R., Shodhury T.K. Study of the ways of folding and defolding proteins through changes in the surface hydrophobility with use of fluorescent spectroscopy and spectroscopy of circle dichroism. Biokhimiya. 2009; 74

34. Spika J.S., Verbrugh H.A., Verhoef J. Protein A effect on alternative pathway complement activation and opsonization of Staphylococcus aureus. Infect. Immunity. 1981; 34 (2): 455-60.

35. Akatov A.K., Zueva V.S. Staphylococcus. [Stafilokokki]. Мoscow: Meditsina; 1983.

36. Jiraviriyakul A. Detection of Staphylococcal protein A (SpA) in culture medium for developing sortase inhibitor screening method. Int. J. Pharm. Biol. Sci. 2012; 2 (2): 218-24.

37. Shoemaker B.A., Portman J.J., Wolynes P.G. Speeding molecular recognition by using the folding funnel: the fly-casting mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000; 97 (16): 8868-73.

Поступила 19.02.18 Принята в печать 16.04.18