Разработка рекомбинантной вакцины против гриппа a(H1N1) 2009 на основе вирусоподобных наночастиц - носителей внеклеточного домена м2 белка

УДК 571.27

Разработка рекомбинантной вакцины против гриппа A(H1N1) 2009 на основе вирусоподобных наночастиц — носителей внеклеточного домена М2 белка

Р. Ю. Котляров1, В. В. Куприянов1, А. И. Мигунов2, Л. А. Степанова2, Л. М. Цыбалова2, О. И. Киселев2, Н. В. Равин1*, К. Г. Скрябин1

1 Центр «Биоинженерия» РАН, 117312, Москва, просп. 60-летия Октября, 7, корп. 1

2 ГУ НИИ гриппа СЗО РАМН, 197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 15/17 * E-mail: nravin@biengi.ac.ru

Поступила в редакцию 23.04.2010 г.

реферат Используемые в настоящее время противогриппозные вакцины основаны на получаемом в куриных эмбрионах вирусе гриппа или его компонентах. Изменчивость высокоиммуногенных поверхностных белков вируса гриппа - гемагглютинина и нейраминидазы - требует создания вакцин, соответствующих новым штаммам вируса. Альтернативой традиционным вакцинам являются рекомбинантные вакцины, основанные на отдельных белках вируса гриппа, которые могут быть получены в стандартных организмах-продуцентах. Мы сконструировали рекомбинантные наноразмерные вирусоподобные частицы на основе ядерного антигена вируса гепатита B, несущие на своей поверхности полипептид внеклеточного домена М2 белка вируса нового высокопатогенного штамма «свиного» гриппа A(H1N1) 2009. Разработаны методы получения этих вирусоподобных частиц в клетках Escherichia coli, их выделения и очистки. В результате испытаний полученных препаратов на животных показано, что М2sНВс частицы являются высокоиммуногенными и обеспечивают защиту иммунизированных мышей от летальной инфекции вирусом «свиного» гриппа.

ключевые слова грипп, вакцина, М2 белок, наночастица, НВс антиген.

список сокращений М2е - внеклеточный домен М2 белка вируса гриппа, НВс - ядерный антиген вируса гепатита B, M2sHBc - гибридный белок, включающий М2е вируса «свиного» гриппа и НВс, ПЦР - полимеразная цепная реакция, ИФА - иммуноферментный анализ, ФСБ - фосфатно-солевой буфер, ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка, ТМБ - 3,3',5,5'-тетраметилбензидин, LD50 - доза, соответствующая 50 %-ной летальности.

введение

Грипп является одним из наиболее распространенных вирусных заболеваний человека и животных. Вирусы гриппа типа А различаются по степени патогенности в отношении человека и животных. В последние годы высокопатогенные штаммы Н5Ш вызывали локальные вспышки с высокой смертностью в регионах Юго-Восточной Азии. Вирус НШ1 свиного происхождения вызвал пандемию гриппа 20092010 гг. с неожиданно высоким уровнем смертности среди людей среднего возраста и групп риска. По многим феноти-пическим свойствам и филогенетическому происхождению пандемический вирус НШ^ близок к вирусу, вызвавшему «испанку» в 1918-1920 гг., что подтверждает возможность возврата в циркуляцию среди людей вирусов с высоким потенциалом патогенности. Используемые в настоящее время противогриппозные вакцины основаны на получаемом в куриных эмбрионах вирусе гриппа или его компонентах [1]. Высокая изменчивость поверхностных белков вируса, гемагглютинина и нейраминидазы приводит к возникно-

вению нового эпидемического штамма каждые 1-2 года [2], с такой же частотой требуется изготовление стандартных штамм-специфических вакцин.

Одним из потенциальных источников антигенной изменчивости вируса гриппа человека является его рекомбинация (реассортация) с вирусами гриппа животных, которая может привести к возникновению нового высокопатогенного рекомбинантного вируса, неизвестного иммунной системе человека и потому способного вызвать пандемию. В то же время создание традиционной вакцины от нового штамма требует длительного времени (от 6 до 9 мес.), в течение которого появление нового пандемического штамма гриппа может привести к гибели миллионов людей. Как уже указывалось, таким новым высокопатогенным штаммом является вызвавший пандемию 2009 г. вирус так называемого «свиного» гриппа, относящийся, по последовательностям его гемагглютинина и нейраминидазы, к типу НШ1.

Альтернативой традиционным вакцинам являются ре-комбинантные вакцины, основанные на отдельных бел-

Таблица 1. Сравнение аминокислотных последовательностей внеклеточных доменов М2 белков различных штаммов вируса гриппа человека и животных. Отличия от консенсусной последовательности М2е «человеческого» вируса гриппа типа А подчеркнуты

Хозяин Штамм Последовательность М2е пептида

Свинья/ человек A/California/04/2009 SLLTEVETPTRSEWECRCSDSSD

Человек Консенсусная последовательность SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD

>> A/PR/8/34 SLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD

Птица A/Chicken/Kurgan/05/2005 SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD

>> A/Duck/ Potsdam1402-6/1986 SLLTEVETPTRNGWECKCSDSSD

ках вируса гриппа, которые могут быть получены в стандартных организмах-продуцентах, например бактериях или дрожжах. Использование рекомбинантных вакцин не только снимает зависимость производства от куриных эмбрионов и решает проблемы безопасности, общие для вакцин, основанных на цельном патогене [3], но и открывает возможности создания универсальных вакцин при использовании консервативных белков вируса. Более того, такой подход позволяет, с одной стороны, подготовить вакцину очень быстро или создавать вакцины, которые перекрывают антигенные свойства большинства пандемических вирусов.

В работах группы W. Fiers (University of Ghent) исследовалась возможность создания универсальной противогриппозной вакцины на основе внеклеточного домена М2 белка вируса гриппа [4, 5]. М2 является небольшим трансмембранным белком (97 а.о.), он в небольших количествах представлен в составе вириона, но эффективно экспрессирует-ся в инфицированных клетках [6, 7]. Важной особенностью М2 является его консервативность, последовательность его внеклеточного домена М2е (23 а.о.) практически неизменна у всех вирусов гриппа типа А, выделенных у человека начиная с 1933 г. [4, 8, 9]. Однако М2 обладает низкой имму-ногенностью, и при инфекции иммунный ответ против него практически не активируется [10].

Решением проблемы низкой иммуногенности М2 белка является присоединение его к наноразмерной частице-носителю. Такая нановакцина, имитируя патоген, обладает высокой иммуногенностью и эффективно распознается иммунной системой человека. В работах группы W. Fiers в качестве носителя М2е пептида использовали вирусоподобные частицы, образуемые НВс антигеном вируса гепатита B [4, 11]. Иммунизация мышей рекомбинантными М2еНВс частицами, полученными в E. coli, обеспечивала 100 %-ную защиту от летальной гриппозной инфекции [4]. Помимо НВс в качестве частиц-носителей М2е могут быть использованы вирусоподобные частицы на основе папил-ломавируса человека [12], бактериофага Qß [13], вируса мозаики папайи [14] и вируса мозаики коровьего гороха [15].

Как отмечалось выше, последовательность М2е высококонсервативна у всех штаммов вируса гриппа типа А человека, однако у штаммов животного происхождения она существенно отличается [16, 17]. Так, М2е вируса «свиного» гриппа A/California/04/2009(H1N1), вызвавшего панде-

мию 2009 г., по 4 из 23 аминокислотных остатков отличается от консенсусной последовательности М2е штаммов человека (табл. 1). Такие различия могут определять специфичность вакцин на основе М2е. В этой работе мы сконструировали рекомбинантные частицы (М2sНВс-частицы), представляющие на своей поверхности М2е пептид вируса «свиного» гриппа A/California/04/2009(H1N1), и показали, что иммунизация этими наночастицами обеспечивает 100 %-ную защиту иммунизированных мышей от летальной инфекции вирусом «свиного» гриппа А/ California/04/2009(H1N1). В то же время защита от заражения птичьим штаммом A/Duck/Potsdam1402-6/1986 или «человеческим» штаммом A/PR/8/34 оказалась лишь частичной, что свидетельствует о необходимости учета различий последовательностей М2е штаммов гриппа различного происхождения при разработке универсальных противогриппозных вакцин.

экспериментальная часть

Конструирование экспрессионного вектора pQE-M2sHBc и создание штамма-продуцента E. coli

Ген, кодирующий гибридный белок M2sHB^ синтезировали с помощью трехстадийной ПЦР. На первом этапе часть последовательности М2sНВс была получена в результате ПЦР с использованием праймеров M2F3 (С GAA TGG GAA TGC CGT TGC AGC GAT AGC AGC GAT GAC ССТ) и HBC-R2 (A GGA TCC TCA GCA AAC AAC AGT AGT CTC CGG AAG) и ДНК копии генома вируса гепатита B в качестве матрицы. На втором этапе полученный фрагмент использовали в качестве матрицы для ПЦР с прай-мерами M2sF1 (GAA ACC CCG ACC CGT AGC GAA TGG GAA TGC CGT TGC AGC) и HBC-R2. На третьем этапе полноразмерный ген М2sНВс получали в результате ПЦР-амплификации с праймерами M2sF2 (CTC ATG AGC CTG CTG ACC GAA GTG GAA ACC CCG ACC CGT AGC) и HBC-R2. Полученный фрагмент длиной 525 нт обрабатывали рестриктазами PagI и BamHI, сайты узнавания которых были введены в последовательности праймеров M2sF2 и HBC-R2 соответственно, и клонировали в экспрес-сионном векторе pQE60 (Qiagen) по сайтам NcoI и BamHI. Полученный экспрессионный вектор pQE-M2sHBc использовали в дальнейшей работе. Отсутствие обусловленных ПЦР мутаций в синтезированном гене было подтверждено с помощью секвенирования.

Таблица 2. Схема опыта по изучению иммуногенности и протективного действия кандидатной вакцины на основе М2е пептида вируса «свиного» гриппа

Группа мышей Кол-во мышей Заражение вирусом гриппа

1-я иммунизация 2-я иммунизация 3-я иммунизация A/Duck/ Potsdam/1402-6/1986 (Н5П2) A/California/ 04/2009 (H1N1) A/PR/8/34

60 мышей с 60 мышей с неполным адъю-вантом Фрейнда 50 мкг/мышь п/к 60 мышей с неполным адъювантом Фрейнда 50 мкг/ мышь п/к

Опытная (М2зНВс) 60 адъювантом TiterMax Gold Adjuvant 50 мкг/ мышь п/к* 20 мышей дозой 5 LD50 20 мышей дозой 5 LD50 10 мышей дозой 5 LD50

Контрольная (нативные мыши) 40 Физ. раствор Физ. раствор Физ. раствор 15 мышей дозой 5 LD50 15 мышей дозой 5 LD50 10 мышей дозой 5 LD50

* п/к — подкожное введение.

Для получения штамма-продуцента рекомбинантного белка M2sHBc плазмиду pQE-M2sHBc вводили в клетки E. coli штамма DLT1270 с помощью трансформации. Штамм DLT1270, являющийся производным штамма DH10B [18], содержит ген репрессора лактозного оперона lacl, интегрированный в хромосому.

Выделение и очистка M2sHBc частиц

Штамм DLT1270/pQE-M2sHBc выращивали в LB-бульоне до середины логарифмической фазы роста (OD600 = 0.5) при 37 °С, добавляли IPTG до 1 мМ и продолжали культивировать в течение 16 ч при 30 °С. Клетки штамма-продуцента после индукции осаждали центрифугированием 3000 об/мин в течение 30 мин и ресуспендировали в 50 мМ Tris-HCl-буфере рН 8.0, содержащем 0.5 М NaCl, 15 мМ ЭДТА и 20 % сахарозы из расчета 1 мл буфера на 50 мл культуральной жидкости. Клеточную суспензию обрабатывали лизоцимом (1 мг/мл) в течение 15 мин при 4 °С, затем клетки разрушали ультразвуком. К полученному лизату добавляли 1/20 объема раствора полиэти-ленгликоля (50 % вес/объем) и инкубировали 30 мин при 4 °С. Затем проводили центрифугирование в течение 10 мин при 13 000 об/мин. К супернатанту добавляли 1/5 объема насыщенного раствора сульфата аммония, перемешивали и оставляли на 30 мин при 4 °С. Образовавшийся после центрифугирования осадок белков растворяли в 1 мл того же буфера и повторно осаждали сульфатом аммония в тех же условиях. Полученный осадок растворяли в 1 мл 50 мМ Tris-HCl-буфера с рН 8.0, содержащего 0.5 М NaCl, 15 мМ ЭДТА и 20 % сахарозы. Полученный препарат M2sHВс частиц содержал, по данным SDS-PAGE, около 90 % белка M2sHВс в концентрации ~ 0.5 мг/мл.

Иммунизация мышей

Для изучения иммуногенности и протективного действия кандидатной вакцины была использована схема иммунизации с применением для первого введения вакцины адъ-юванта TiterMax Gold Adjuvant (Sigma) и последующих иммунизаций — неполного адъюванта Фрейнда (Sigma) в соответствии с их инструкцией по применению. Вторая иммунизация была проведена через три недели после первой, третья — через неделю после второй. Схема иммунизации приведена в табл. 2.

Сыворотки собирали через 2 недели после 3-й иммунизации, титры антител определяли в пуле сывороток мышей каждой группы (3-5 мышей). В качестве отрицательного контроля использовали сыворотку неиммунизирован-ных мышей, а как положительный контроль - монокло-нальные антитела к М2е пептиду штамма A/Duck/Pots-dam/1402-6/1986 (H5N2), которые были предоставлены П.Г. Свешниковым (ОАО «ВНЦМДЛ»).

Синтетические пептиды

В качестве стандартов для определения антител против М2е были использованы синтетические пептиды G-11-1 (SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD, соответствует М2е штамма A/Chicken/Kurgan/05/2005), G-19 (SLLTEVETPTRNGWECKCSDSSD, соответствует М2е штамма A/Duck/ Potsdam1402-6/1986), G-26 (SLLTEVETPTRSEWECRCSDSSD, соответствует М 2 е штамма A/Calif ornia/0 4/2009) и G18 (SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD, соответствует М2е штамма A/PR/8/34).

ИФА для определения титра специфических антител

Для проведения ИФА 96-луночные планшеты с высокой сорбционной способностью (Greiner, Германия) покрывали синтетическими пептидами G-11-1, G19, G26 и G18 в концентрации 5 мкг/мл (в карбонатном буфере, pH 9.5-9.6), выдерживали ночь при 4 0С. Планшеты обрабатывали блокирующим буфером (0.01 М ФСБ pH 7.-7.4) с 5 %-ной ЭТС в течение 1 ч при комнатной температуре, отмывали 3 раза ФСБ с твином. Пул сывороток мышей каждой группы исследовали в дубликатах. В лунки планшета добавляли 100 мкл 2-кратных разведений сывороток (начиная с 1:400) в блокирующем буфере, инкубировали 1 ч при комнатной температуре. В качестве конъюгата использовали кроличьи поликлональные антимышиные IgG (Abcam, Великобритания) в разведении 1:8000, меченные пероксидазой хрена. В качестве субстрата использовали ТМБ. Учет реакции проводили при длине волны 450 нм. За титр принимали наибольшее разведение сыворотки, при котором оптическое поглощение по крайней мере в 2 раза больше, чем оптическое поглощение сыворотки неиммунизирован-ных мышей в том же разведении.

Рис. 1. Получение и очистка М2sНВс частиц.

А - Результаты анализа белковых препаратов с помощью SDS-PAGE: 1 - маркер молекулярной массы, кДа, 2 - белковый препарат из штамма DLT1270/ pQE-M2sHBc до индукции экспрессии М2sНВс, 3 - то же, но через 16 ч после индукции экспрессии М2sНВс, 4 - очищенный препарат M2sHBc частиц.

Б - Электронно-микроскопический анализ препарата М2sНВс частиц.

100 нм

Вирусы и заражение мышей

Для заражения животных, иммунизированных канди-датными вакцинами, были использованы следующие вирусы гриппа, адаптированные к мышам: A/Duck/ Potsdam/1402-6/1986 (H5N2), A/California/04/2009 (H1N1) и A/PR/8/34 (H1N1). Вирусы вводили интрана-зально в дозе 5 LD50 по 50 мкл/мышь под легким эфирным наркозом. После заражения ежедневно наблюдали за животными. Протективное действие кандидатной вакцины оценивали с помощью двух параметров: определения динамики падения массы тела и выживаемости мышей после заражения.

результаты и обсуждение

Дизайн и получение М2sНВс наночастиц

Ядерный антиген вируса гепатита B является одним из наиболее эффективных носителей антигенных детерминант. Мономеры этого белка, состоящие из 183 а.о., собираются в икосаэдрические частицы диаметром 34 нм, состоящие из 240 субъединиц, организованных в димерные блоки [19]. Два района HBc антигена могут быть использованы

для презентации чужеродных пептидов на поверхности HBc частиц - N-конец белка и иммунодоминантная петля, расположенная между 75-м и 85-м аминокислотными остатками белка [20 - 22]. Согласно нашему опыту, введение чужеродных последовательностей в иммунодоминант-ную петлю в большинстве случаев нарушает сборку и/или растворимость частиц, поэтому для конструирования гибридного белка М2sНВс в качестве места вставки М2е пептида был использован N-конец НВс. Последовательность НВс содержит аргинин-богатый С-концевой домен, связывающий вирусную ДНК при сборке вириона, при экспрессии в E. coli этот домен связывает бактериальную РНК [23], наличие которой в препарате нежелательно. Поскольку С-концевой домен (150-183 а.о.) не требуется для сборки частиц [24], он был удален и заменен остатком цистеина, введение которого повышает стабильность НВс частиц [16]. Таким образом, сконструированный нами гибридный белок М2sНВс включал, начиная с N-конца, последовательность М2е вируса «свиного» гриппа A/California/04/2009 (H1N1), последовательность НВс антигена от 4-й до 149-й аминокислоты и С-концевой цистеин.

Ген, кодирующий гибридный белок М2sНВс, был синтезирован с помощью трехстадийной ПЦР с использованием последовательности НВс в качестве матрицы. На каждой стадии к 5'-концу синтетического гена добавлялись последовательности, кодирующие участки М2е. Полученный синтетический ген клонировали в экс-прессионном векторе pQE60 (Qiagen) под контролем промотора, индуцируемого IPTG. Гибридный белок хорошо экспрессируется в E. coli (рис. 1А) и в основном содержится в растворимой фракции. Сборка М2sНВс в вирусоподобные наночастицы была подтверждена электронно-микроскопическим анализом очищенного препарата (рис. 1Б).

Иммуногенность М2sНВс частиц

Для характеристики иммуногенности и протективного действия был проведен эксперимент по иммунизации мышей очищенным препаратом М2sНВс частиц. Опытную группу из 60 животных иммунизировали подкожно с применением для первого введения вакцины адъюванта TiterMax Gold Adjuvant (Sigma), а для двух последующих иммунизаций -неполного адъюванта Фрейнда (Sigma). Для определения иммуногенности кандидатной вакцины были исследованы сыворотки мышей через 2 недели после 1-й и после 3-й иммунизации, титры антител определяли в пуле сывороток мышей каждой группы (3-5 мышей). Для проведения ИФА использовали четыре синтетических пептида, последовательности которых соответствовали М2е вируса «свиного» гриппа A/California/04/2009, двум штаммам птичьего гриппа и штамму A/PR/8/34 человека. Полученные результаты (табл. 3) показывают, что после 3-кратной иммунизации в высоких титрах образуются сывороточные антитела изотипа IgG, связывающиеся как с синтетическим пептидом G-26 «свиного» гриппа A/California/7/2009, последовательность которого соответствовала использованному для иммунизации М2sНВс, так и с синтетическими пептидами, последовательности которых соответствуют М2е гетерологичных штаммов «птичьего» и «человеческого» гриппа.

Таблица 3. Титры IgG антител к синтетическим пептидам М2е

Образцы сыворотки Титры антител к синтетическим пептидам М2е

G-26 G-19 G-11-1 G-18

Мыши после 1-й иммунизации 1600 1600 800 800

Мыши после 3-й иммунизации 51 200 51 200 51 200 6400

Положительный контроль (моноклональные антитела к пептиду G19 — клон D2) >51200 >51200 >51 200 1600

Отрицательный контроль (сыворотка неиммунизированных мышей) <400 <400 <400 <400

Протективное действие кандидатной вакцины

Для оценки протективного действия вакцины мышей опытной и контрольной групп заражали тремя штаммами вируса гриппа, адаптированными к мышам: A/Duck/ Potsdam/1402-6/1986 (H5N2), A/California/04/2009 (H1N1) и A/PR/8/34 (H1N1). Вирусы вводили интраназально в дозе 5 LD50.

На рис. 2 показана динамика падения массы тела животных после заражения 5 LD50 вируса «свиного» гриппа А/ California/4/2009, что может являться показателем тяжести протекания заболевания. После инфицирования масса иммунизированных животных снижалась (до 90 % от начальной), но в значительно меньшей степени, чем у мышей контрольной группы (до 70 % от начального веса). Эти результаты показывают, что иммунизация кандидатной вакциной не предотвращает гриппозную инфекцию, но облегчает ее протекание.

Динамика гибели мышей после заражения различными штаммами вируса гриппа представлена на рис. 3. Полученные данные свидетельствуют о 100 %-ном протективном действии М2sНВс после трехкратной иммунизации. За весь период наблюдения все животные в этой группе остались

110

<Ш M2sHBc

и

о

70

4 6 8 10 Дни после заражения

12

14

Рис. 2. Динамика изменения массы мышей после заражения вирусом гриппа А/СаМогта/04/2009. Данные в контроле приведены для выживших мышей.

живы. В контрольной группе мышей при этих условиях заражения выжило лишь 12 % животных. Частичная защита от инфекции наблюдалась и в отношении штаммов гриппа, у которых аминокислотная последовательность М2е пептида отличается от таковой в использованном для иммунизации препарате. Так, при инфицировании мышей вирусом «птичьего» штамма A/Duck/Potsdam/1402-6/1986 наблюдали 60 %-ную выживаемость иммунизированных животных против 13 % в контрольной группе (статистическая значимость Р < 0.006, тест Фишера). При инфицировании «человеческим» гриппом A/PR/8/34 выживаемость животных составила 40 % в опытной группе и 20 % - в контрольной.

Перспективы создания универсальных противогриппозных вакцин на основе М2е

Консервативность аминокислотной последовательности М2 белка стала основой разработки противогриппозных вакцин универсального действия на его основе. Поскольку практически все выделенные из человеческой популяции вирусы гриппа типа А имеют одинаковую последовательность М2е, перспектива создания такой вакцины является реальной [5]. Однако появившиеся в последние годы штаммы животного происхождения, в частности вирус «свиного» гриппа, имеют отличия в последовательности М2е пептида, и, как показывают полученные нами результаты, эффективность М2е вакцин в отношении гетерологичных штаммов гриппа является более низкой. Одним из путей создания М2е вакцин, эффективных в отношении широкого спектра штаммов гриппа, как человека, так и животных, может стать включение в состав М2sНВс частиц нескольких копий М2е пептида, последовательности которых соответствуют различным типам М2е.

выводы

Целью данной работы являлась разработка рекомбинант-ной кандидатной вакцины против нового высокопатогенного штамма вируса гриппа типа А, «свиного» гриппа H1N1. Использованный нами подход предполагал конструирование нановакцины, в которой внеклеточный домен М2 белка вируса был представлен на поверхности вирусоподобных частиц, образованных ядерным антигеном вируса гепатита В. Полученные нами данные показывают, что гибридный белок М2sНВс эффективно экспрессируется в E. coli и собирается в наноразмерные вирусоподобные частицы. Иммунизация мышей препаратом М2sНВс частиц вызывает

0

2

Заражение вирусом A/California/04/2009 (H1N1) 100 4—•—ш—•—»—»- у.-*—*—*—*—*—*—х-

I I

0 12 3 4 5 6 7

8 9 10 11 12 13 14 Дни после заражения

Заражение вирусом A/Duck/Potsdam/1402-6/1986 (H5N2) 100

80

с о

Z

е а

m

и ж

м СО

60

40

20

контроль M2sHBc

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Дни после заражения

0

Заражение вирусом A/PR/8/34 (H1N1) 100 f——•—

.0

H с 60

о

s

е 40

а

m

и

ж

M CO 20

80

контроль M2sHBc

Рис. 3. Динамика гибели мышей, иммунизированных М2sНВс частицами, после заражения различными штаммами вируса гриппа.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Дни после заражения

0

эффективный иммунный ответ против М2е и обеспечивает формирование протективного иммунитета в отношении штамма вируса гриппа, имеющего идентичную последовательность М2е пептида. Таким образом, полученные

М2sНВс частицы могут являться основой создания реком-бинантной вакцины против современного пандемического «свиного» гриппа НШ1 и других вирусов, циркуляция которых ожидается в ближайшие годы. •

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Nicholson K., Webster R., Hay A. Textbook of Influenza. Oxford: Blackwell Science, 1998.

2. Webster R., Bean W., Gorman O., Chambers T., Kawaoka Y. // Microbiol. Rev. 1992. V 56(1). P. 152-179.

3. Webby R., Perez D., Coleman J., et al. // Lancet. 2004. V. 363. P. 1099-1103.

4. Neirynck S., Deroo T., Saelens X., et al. // Nat. Med. 1999. V. 5. P. 1157-1163.

5. Schotsaert M., De Filette M., Fiers W., Saelens X. // Expert Rev Vaccines. 2009. V. 8(4). P. 499-508.

6. Lamb R., Zebedee S., Richardson C. // Cell. 1985. V. 40. P. 627-633.

7. Pinto H., Holsinger J., Lamb A. // Cell. 1992. V. 69. P. 517-528.

8. Fiers W., De Filette M., Birkett A., Neirynck S., Min Jou W. // Virus Res. 2004. V. 103. P. 173-176.

9. Ito T., Gorman O., Kawaoka Y., Bean W., Webster R. // J. Virol. 1991. V. 65. P. 5491-5498.

10. Feng J., Zhang M., Mozdzanowska K., et al. // Virol. J. 2006. V. 3. P. 102.

11. De Filette M., Min Jou W., Birkett A., et al. // Virology. 2005. V. 337 (1). P. 149-161.

12. Ionescu R., Przysiecki C., Liang X., et al. // J. Pharm. Sci. 2006. V. 95 (1). P. 70-79.

13. Bessa J., Schmitz N., Hinton H., et al. // Eur. J. Immunol. 2008. V. 38 (1). P. 114-126.

14. Denis J., Acosta-Ramirez E., Zhao Y., et al. // Vaccine. 2008. V. 26 (2728) P. 3395-3403.

15. Мещерякова Ю.А., Эльдаров М.А., Мигунов А.И. и др. // Мол. биол. 2009. Т. 43. С. 741-750.

16. De Filette М., Fiers W., Martens W., et al. // Vaccine. 2006. V. 24 (4446) P. 6597-6601.

17. Tompkins S., Zhao Z., Lo C., et al. // Emerg. Infect. Dis. 2007. V. 13 (3). P. 426-435.

18. Grant S., Jessee J., Bloom F., Hanahan D. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. P. 4645-4649.

19. Wynne S., Crowther R., Leslie A. // Mol. Cell. 1999. V. 3. P. 771-780.

20. Kratz P., Bottcher B., Nassal M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 1915-1920.

21. Murray K., Shiau A.L. // Biol. Chem. 1999. V. 380. P. 277-283.

22. Pumpens P., Grens E. // Intervirology. 2001. V. 44. P. 98-114.

23. Wingfield P., Stahl S., Williams R., Steven A. // Biochemistry. 1995. V. 34. P. 4919- 4932.

24. Zheng J., Schodel F., Peterson D. // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 9422-9429.