БЕТА-КАЗЕИН А2 И УМЕНЬШЕНИЕ ИЛИ ПРЕДОТВРАЩЕНИЕ СИМПТОМОВ НЕПЕРЕНОСИМОСТИ ЛАКТОЗЫ
A2 BETA-CASEIN AND REDUCTION OR PREVENTION OF SYMPTOMS OF LACTOSE INTOLERANCE

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к применению молочного белка бета-казеина А2 для уменьшения или предотвращения симптомов непереносимости лактозы. В частности, настоящее изобретение относится к продуктам питания, полученным из молока. Заявитель обнаружил, что потребление молока и молочных продуктов, которые содержат высокие уровни белка бета-казеина А2 и избегание потребления молока и молочных продуктов, содержащих бета-казеин А1, целесообразно для уменьшения или предотвращения симптомов непереносимости лактозы. Примечательно, что положительный эффект является немедленным (острым) и дополнительно способствует (после воздействия бета-казеина А1) предотвращению или уменьшению симптомов непереносимости лактозы при воздействии лактозы в будущем.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Непереносимость лактозы обычно относится к нарушению способности переваривать лактозу. Лактоза представляет собой дисахарид, содержащий моносахариды галактозу и глюкозу. Лактоза содержится в молоке и молочных продуктах питания, полученных из молока. В человеческом молоке содержится приблизительно 9% лактозы, тогда как в непроцессированном коровьем молоке содержится приблизительно 4.7% лактозы. Молоко коз, буйволов и овец также содержит лактозу в диапазоне 4.5-5.0%. Переваривание лактозы представляет собой гидролиз (или расщепление) лактозы на глюкозу и галактозу с помощью фермента лактаза.
Лица, страдающие непереносимостью лактозы, не имеют достаточного уровня лактазы в пищеварительной системе. Лактоза не может проникать через стенки тонкой кишки в кровь и, следовательно, не расщепившись лактазой, без изменений попадает в толстую кишку. Бактериальная ферментация лактозы в толстой кишке продуцирует большое количество газа. Дополнительно, неиспользованные углеводы и продукты ферментации повышают осмотическое давление толстой кишки, вызывая повышенный приток воды в кишечник. Таким образом, непереносимость лактозы, может вызвать целый ряд симптомов, включая вздутие живота и спазмы, метеоризм, диарею, тошноту, урчание желудка, или даже рвоту. Эти симптомы обычно возникают примерно от 30 минут до 2 часов после потребления лактозы.
Изначально детеныши млекопитающих вырабатывают лактазу, однако выработка лактазы, как правило, прекращается после прекращения грудного вскармливания. Тем не менее, у некоторых представителей населения выработалась персистенция лактазы, когда выработка лактазы продолжается в зрелом возрасте. Предполагается, что степень персистенции лактазы у разных представителей населения является результатом естественного отбора в пользу тех культур, в которых молочные продукты являются источником пищи.
Непереносимость лактозы не является абсолютной, так как количество лактозы, которое может усваиваться, варьируется от человека к человеку. В общем, человек с непереносимостью лактозы должен, путем проб и ошибок, определить, количество лактозы, которое он способен усвоить. Это обычно делается путем контроля уровня лактозы в рационе или избегания рационов с лактозой в целом. В некоторых случаях, могут быть использованы ферментативные лактазные пищевые добавки. Могут быть использованы молоко и производные молока на растительной основе, так как они, по своей сути, не содержат лактозы, например, соевое молоко, рисовое молоко, миндальное молоко, кокосовое молоко, овсяное молоко, конопляное молоко и арахисовое молоко. Существует также много продуктов, не содержащих лактозы или с пониженным содержанием лактозы. Несмотря на наличие таких продуктов, избегание молока или молочных продуктов в рационе питания часто бывает затруднительно.
Связь между потреблением молока (и других молочных продуктов) и симптомами непереносимости лактозы хорошо известна. Тем не менее, в отсутствие конкретного медицинского диагноза непереносимости лактозы, многие люди ошибочно предполагают наличие у себя непереносимости лактозы, потому что они связывают симптомы, от которых они страдают, с потреблением молока или других молочных продуктов. В действительности, симптомы могут быть вызваны другими компонентами молока, усугубляющими, в иных случаях, незначительные или незаметные эффекты. Белки представляют собой пример компонента, который может вызвать или усугубить такие симптомы.
Молоко, в основном коровье молоко, потребляемое населением по всему миру, является основным источникам белка в рационе человека. Коровье молоко обычно содержит около 30 г белка на литр. Наибольшую часть (80%) этих белков составляют казенны, из них 37% приходится на долю бета-казеинов. В последние два десятилетия растет число доказательств причастности казеинов, особенно бета-казеинов к ряду заболеваний.
Бета-казеины можно подразделить на бета-казеин А1 и бета-казеин А2. Эти два белка являются преобладающими бета-казеинами в молоке, потребляемом большинством населения. Бета-казеин А1 отличается от бета-казеина А2 одной аминокислотой. Аминокислота гистидин расположена в 67 позиции 209 аминокислотной последовательности бета-казеина А1, в то время как в той же позиции у бета-казеина А2 расположен пролин. Однако, это различие в одной аминокислоте крайне важно для ферментативного расщепления бета-казеинов в кишечнике. Наличие гистидина в позиции 67 позволяет белковому фрагменту, содержащему 7 аминокислот, известному как бета-казоморфин-7 (БКМ-7), образовываться при ферментативном расщеплении. Таким образом, БКМ-7 представляет собой продукт расщепления бета-казеина А1. В случае бета-казеина А2, позицию 67 занимает пролин, что препятствует расщеплению аминокислотной связи в этом месте. Таким образом, БКМ-7 не представляет собой продукт расщепления бета-казеина А2.
Другие варианты бета-казеинов, такие как бета-казеины В и С, также имеют гистидин в 67 позиции, а другие варианты, такие как A3, D и Е, имеют пролин в позиции 67. Однако эти варианты можно найти только в очень малых количествах или вообще не найти в молоке коров европейского происхождения. Таким образом, в контексте настоящего изобретения, термин бета-казеин А1 относится к любому бета-казеину, имеющему гистидин в 67 позиции, а термин бета-казеин А2 относится к любому бета-казеину, имеющему пролин в 67 позиции.
БКМ-7 представляет собой опиоидный пептид и потенциально может активировать опиоидные рецепторы по всему телу. БКМ-7 имеет способность проникать через стенку желудочно-кишечного тракта и попадать в кровоток, что позволяет ему оказывать влияние на системную и клеточную активность с помощью опиоидных рецепторов. Заявитель и другие установили связь между потреблением бета-казеина А1 в молоке и молочных продуктах и случаями определенных заболеваний, включая диабет I типа (WO 1996/014577), ишемическую болезнь сердца (WO 1996/036239) и неврологические нарушения (WO 2002/019832).
Было предположено, что БКМ-7 также может оказывать влияние на пищеварительную функцию. Сообщалось, что опиоидные рецепторы играют важную роль в регулировании желудочно-кишечной функции, включая регулирование моторики желудочно-кишечного тракта, выработку слизи и выработку гормонов (например, Mihatsch, W.A, et at, Biol. Neonate, 2005, 87(3): 160-3). Считается, что казенны, найденные в молоке, связаны с ингибированием моторики желудочно-кишечного тракта, что может привести к запорам (Gunn T.R. and Stunzer D., NZ Med. J., 1986, 99(813):843-6), также исследования казоморфинов и их синтетических производных показывают, что БКМ-7 способствует этому опосредованному опиоидными рецепторами эффекту. (Charlin V. et at, Rev. Med. Chit, 1992, 120(6):666-9). Однако, несмотря на имеющиеся данные in vitro о связи между казоморфинами и временем пассажа по кишечнику, очевидно, что этот эффект не обязательно может быть экстраполирован на in vivo эффект в организме человека. Например, по меньшей мере одно исследование смогло продемонстрировать отсутствие связи между потреблением бета-казеина А1 или бета-казеина А2 и запором (Crowley, Е.Т., Nutrients, 2013, 5, 253-266). Дополнительно, было показано, что БКМ-7 стимулирует выработку слизи через опосредованные пути д-опиоидного рецептора (Zoghbi, S., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 2006, 290(6):G1105-13), и снижает интенсивность пролиферации собственной пластинки лимфоцитов (Elitsur, Y. and Luk, G.D., Clin. Exp.Immunol., 1991, 85(3):493-7), которые являются клетками связанными с иммунной системой. Согласно последним данным, бета-казеин А1, вызывает воспаление тканей желудочно-кишечноготракта (Ul Haq, M.R., et at, Eur. J. Nutr., 2013; Barnett, M.P.G., et at, Int. J. Food Sci. Nutr., 2014). Было продемонстрировано, что воспаление, индуцированное производным от бета-казеина А1, БКМ-7 оказывает даунстрим воздействие на эпигенетические модификации ДНК и последующую экспрессию генов пораженной ткани (Trivedi, M.S., et at, J. Nut. Bio., 2014).
Приведенные выше данные показывают наличие связи между казеинами и казоморфинами (включая БКМ-7) и пищеварительной функцией. Эти данные основаны на исследованиях с применением молочных белков или казеинов в целом, либо на исследованиях с применением самого БКМ-7. Тем не менее, на сегодняшний день, не было ни одной публикации непосредственно связывающей потребление бета-казеина А1 с воспалением кишечника. Кроме того, поступали казуистические сообщения от потребителей, относящиеся к улучшению пищеварительной функции после употребления молока с высоким содержанием бета-казеина А2 (и наоборот с низким содержанием казеина А2), но они не являются научными фактами и неспецифичны по причине какого-либо улучшения функции. Помимо того, существует также много казуистических сообщений об отсутствии эффекта улучшения при употреблении такого молока. Эти сообщения противоречивы в том, что они включают данные о непрерывном эффекте на пищеварение от запора вплоть до диареи. Нельзя с уверенностью сделать выводы из казуистических сообщений, в частности, в случае пищевых продуктов и физиологических функций, где число переменных, которые могут повлиять на результаты, очень велико.
В данный момент Заявитель располагает убедительными научными доказательствами прямой связи между потреблением бета-казеина А1 и симптомами непереносимости лактозы. Учитывая множество факторов в рационе человека, которые могут повлиять на здоровье кишечника, и то, что молоко и молочные продукты содержат широкий спектр белковых компонентов и других компонентов, получение заявителем данных о четкой прямой связи между бета-казеином А1 и симптомами непереносимости лактозы является неожиданным. Важно отметить, что Заявитель обнаружил доказательства не только острой и нежелательной реакции на потребление бета-казеина А1, но также продолжительной (после воздействия бета-казеина А1 или БКМ-7) реакции на потребление бета-казеина А1, и наступающая в результате выработка БКМ-7, может индуцировать генетические изменения у животного, что приводит к снижению уровня лактазы и следовательно к увеличению вероятности возникновения симптомов непереносимости лактозы при воздействии лактозы в будущем.
Поэтому задачей изобретения является создание способа уменьшения или предотвращения симптомов непереносимости лактозы, или по меньшей мере предложение полезной альтернативы существующим методам.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Согласно первому аспекту настоящего изобретения предложено применение композиции для предотвращения или уменьшения симптомов непереносимости лактозы у животного, где композиция содержит бета-казеин, и где бета-казеин содержит по меньшей мере 75% по массе бета-казеина А2.
Согласно второму аспекту настоящего изобретения предложена композиция для предотвращения или уменьшения симптомов непереносимости лактозы у животного, где композиция содержит бета-казеин и где бета-казеин содержит по меньшей мере 75% по массе бета-казеина А2.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложено применение молока для получения композиции для предотвращения или уменьшения симптомов непереносимости лактозы у животного, где молоко содержит бета-казеин и где бета-казеин содержит по меньшей мере 75% по массе бета-казеина А2.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложено применение бета-казеина А2 в изготовлении композиции для предотвращения или уменьшения симптомов непереносимости лактозы у животного, где композиция содержит, по меньшей мере, 75% по массе бета-казеина А2. Бета-казеин А2, предпочтительно, представляет собой компонент молока. Молоко, предпочтительно, является коровьим молоком.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ предотвращения или уменьшения симптомов непереносимости лактозы у животного, включающий потребление животным композиции, содержащей бета-казеин, или обеспечение животного композицией для употребления, где бета-казеин содержит по меньшей мере 75% по массе бета-казеина А2.
Количество бета-казеина А2-может быть любым количеством в диапазоне от 75% до 100% по массе бета-казеина, например, по меньшей мере, 90% или даже 100%.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, композиция представляет собой молоко или молочный продукт.Молоко может быть сухим молоком или жидким молоком. Молочный продукт может быть сливками, йогуртом, творогом, сыром, маслом, мороженым или любым другим молочным продуктом.
Симптомами непереносимости лактозы могут быть, хотя и не ограничиваются ими, вздутие живота и спазмы, метеоризм, диарея, тошнота, урчание желудка и рвота.
Реакцией на потребление композиции животным может быть острая реакция и может дополнительно быть вызвана предрасположенность у животного к предотвращению или уменьшению симптомов непереносимости лактозы при воздействии лактозы в будущем.
Согласно большинству вариантов реализации настоящего изобретения, животное представляет собой человека. Тем не менее, согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения, животным может быть собака, кошка или любое другое домашнее животное, корм которого обогащен молоком.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На Фиг. 1 показаны времена желудочно-кишечного пассажа у крыс, получавших корм по рациону Примера 1.
На Фиг. 2 показана активность лактазы в двенадцатиперстной кишке у крыс, получавших корм по рациону Примера 1.
На Фиг. 3 показана, активность миелопероксидазы в толстой кишке у крыс, получавших корм по рациону Примера 1.
На Фиг. 4 показано накопление цистеина в нервных и ЖК эпителиальных клетках в зависимости от концентрации морфина и БКМ-7.
На Фиг. 5 показано накопление цистеина в нервных клетках и ЖК эпителиальных клетках в зависимости от времени.
На Фиг. 6 показано участие ц-опиоидного рецептора в опосредовании эффектов БКМ-7 и морфина на накопление цистеина.
На Фиг. 7 показаны воздействия БКМ-7 и морфина на уровни цистеина, GSH/GSSG и SAM/SAH с течением времени.
На Фиг. 8 и 9 показано влияние БКМ-7 на метилирование CpG в генах, вовлеченных в метаболизм лактозы и синтез лактозы.
На Фиг. 10 показаны уровни гена LCT, кодирующего лактазу, в тонкой кишке NOD мышей, получавших с кормом бета-казеин А1 или бета-казеин А2 в течение 10 и 20 недель.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей белок бета-казеин и ее применению для уменьшения или предотвращения симптомов непереносимости лактозы. Важно отметить, что бета-казеин представляет собой А2 вариант бета-казеина, или составляет по меньшей мере 75% по массе от общего количества вариантов бета-казеина, присутствующих в композиции. Важность преобладания А2 варианта в композиции связана с тем, что Заявитель показал, что существует прямая связь между А1 вариантом и симптомами непереносимости лактозы в организме человека. Заявитель также показал, что присутствие молочного белка, содержащего высокие уровни варианта А2 в двенадцатиперстной кишке успешно стимулирует активность лактазы. Таким образом, можно ожидать улучшения здоровья кишечника, если избегать потребления варианта А1, и вместо него потреблять вариант А2.
В настоящей заявке термин "симптомы непереносимости лактозы" относится к любому одному или более из ряда симптомов, который включает вздутие живота и спазмы, метеоризм, диарею, тошноту, урчание живота и рвоту, причем симптомы могут быть острыми, временными или хроническими.
В настоящей заявке термин "острый", относится, если не указано иное, к периоду времени с момента потребления бета-казеина А1 до выхода бета-казеина А1 или БКМ-7 из кишечника (обычно 8-20 часов после потребления).
Поскольку основным, если не единственным источником бета-казеина в пищевом рационе большинства населенияявляется молоко или продукты, полученные из молока, и поскольку большинство потребляемого молока содержит смесь только А1 и А2 вариантов бета-казеина, потребление молока (или продуктов, изготовленных из такого молока), имеющих высокое содержание А2 варианта, будет обязательно означать, что потребление А1 варианта является низким. Исходя из этого, если единственный пищевой источник бета-казеина содержит только А2 вариант, то потребление с пищей А1 варианта исключено и можно ожидать, что неблагоприятные симптомы непереносимости лактозы, возникающие от потребления бета-казеина А1, также будут устранены.
Соответсвенно, изобретение согласно настоящей заявке основано на уменьшении бета-казеина А1 или исключении его из рациона, и увеличении бета-казеина А2, и это достигается за счет обеспечения того, что бета-казеин в пищевых композициях, включающих бета-казеин, особенно молоко и молочные продукты, представляет собой преимущественно или даже исключительно бета-казеин А2.
В идеале, 100% бета-казеина в композиции представляет собой бета-казеин А2. Таким образом полное исключение бета-казеина А1, максимально увеличивает пользу для здоровья за счет уменьшения или устранения симптомов непереносимости лактозы. Тем не менее, симптомы могут быть уменьшены в любой композиции, где бета-казеин преимущественно является бета-казеином А2, например, составляет любое количество между 75% по массе до 100%, в том числе, но не ограничиваясь 80%, 90%, 95%, 98% и 99% по массе.
Композиция настоящего изобретения обычно представляет собой молоко, но может быть любым продуктом, полученным из молока, таким как крем, йогурт, творог, сыр, масло или мороженое. Композиция также может представлять собой немолочный продукт, содержащий бета-казеин, полученный из молока. Композиция может представлять собой сам бета-казеин, или быть получена из бета-казеина, где бета-казеин может быть в твердой форме, такой как порошок, гранулы или в форме твердого осадка.
В то время как молоко может быть получено от любого млекопитающего, включая людей, коз, свиней и буйволов, согласно предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения молоко представляет собой коровье молоко.
Молоко может быть в виде свежего молока, сухого молока, жидкого молока, восстановленного из сухого, обезжиренного молока, гомогенизированного молока, сгущенного молока, концентрированного молока, пастеризованного молока или непастеризованного молока, или любого другого вида молока.
Композиция настоящего изобретения пригодна для потребления в первую очередь людьми, но следует понимать, что польза для здоровья также актуальна и для некоторых других животных, такие как кошки, собаки и другие домашние животные.
Обоснование настоящего изобретения приведено в экспериментах, описанных в Примерах.
Пример 1 описывает метод кормления крыс в исследованиях Примеров с 2 по 4. Рационы кормления показаны в Таблице 1. Рацион на А1 молоке основан на рецептуре, где все бета-казеины в рационе являются бета-казеинами А1. Рацион на А2 молоке основан на рецептуре, где все бета-казеины в рационе являются бета-казеинами А2. Контрольный рацион основан на рецептуре, где источником белка является яичный белок.
Пример 2 описывает исследование времени пассажа через желудочно-кишечный тракт (ЖКТВ) у крыс, получавших корм по различным рационам Примера 1. Диоксид титана (Ti02), используемый в качестве индикатора, вводили перорально животным после 12 часового кормления. Восстановление ТЮ2 показано на Фиг. 1 как % восстановления в зависимости от времени (часы). Крысы, получавшие корм по рациону А1 демонстрировали задержку пассажа по сравнению с крысами, получавшими корм по рациону А2, причем обе группы демонстрировали задержку по сравнению с крысами получавшими корм по контрольному рациону. Это согласуется с тем, что бета-казеин А1, имеет более высокую общую опиоидную активность, чем бета-казеин А2 за счет высвобождения БКМ-7. Симптомы непереносимости лактозы связаны с бактериальной ферментацией лактозы в кишечнике. Численность бактерий во время ферментации увеличивается экпоненциально по отношению к ЖКТВ. Таким образом, если время пассажа по ЖКТ уменьшается в два раза, то степень ферментации и, следовательно, проявление симптомов непереносимости лактозы будет увеличиваться в четыре раза.
Таким образом, Пример 2 доказывает, что рацион, содержащий бета-казеин А1, по сравнению с рационом, содержащим бета-казеин А2, с большей вероятностью будет способствовать задержке во времени пассажа через ЖКТ и приведет к симптомам непереносимости лактозы.
Пример 3 показывает, что активность лактазы в двенадцатиперстной кишке после острого (кратковременного) кормления (через 12 часов) сильно повышена по сравнению с хроническим кормлением (через 60 часов) у крыс, получавших 100% А2 рацион, а не 100% А1 рацион. Это означает, что бета-казеин А2, и молоко или молочные продукты, содержащие бета-казеин А2, могут быть использованы для стимуляции здоровой желудочно-кишечной функции и переваривания лактозы в рационе или для облегчения или устранения симптомов непереносимости лактозы, испытываемых при потреблении молока и молочных продуктов. Считается, что рационы, содержащие бета-казеин А2 стимулируют секрецию или активность лактазы, а рационы, содержащие бета-казеин А1 - нет.Вероятнее всего это объясняется различным действием продуктов расщепления бета-казеина А1 и бета-казеина А2 на воспаление тканей и функцию после стимуляции секреции фермента болюсом (разовой дозой) молочного белка, поступающего в тонкую кишку.
Пример 4 относится к влиянию рациона с бета-казеином А1 и бета-казеином А2 на миелопероксидазную (МПО) активность в толстой кишке крыс. МПО активность является маркером воспаления (Krawisz, et al., Gastroenterology, 1984, 87(6): 1344-1350 and Dommels, Y.E.M., et al., Genes Nutr., 2007, 2(2):209-223). Было установлено, что при кормлении крыс бета-казеином А1 МПО активность в толстой кишке возрастает по сравнению с тем, когда крыс кормили бета-казеином А2, что указывает на повышение уровня клеток нейтрофилов у крыс, которых кормили бета-казеином А1, что в свою очередь является показателем воспалительной реакции. Данный эффект не наблюдали у крыс, получавших налоксон (известный антагонист опиоидного рецептора), это показывает, что данный эффект осоредован взаимодействием БКМ-7 с ц-опиоидными рецепторами. Воспаление толстой кишки вызывает повышенную восприимчивость или чувствительность к симптомам непереносимости лактозы.
Пример 5 показывает, что БКМ-7 может ингибировать накопление цистеина в зависимости от концентрации. Морфин демонстрировал более высокую эффективность, чем БКМ-7 со значениями IC50 равными 0.16 и 1.31 нМ (соответственно) в нервных клетках, и значениями IC50 равными 6.38 и 15.95 нМ (соответственно) в эпителиальных клетках кишечника (Фиг. 4). Ингибирование накопления цистеина в полной мере развивалось через 30 мин и сохранялось на протяжении 48 часов воздействия морфина или БКМ-7 (Фиг. 5). Это указывает на долгосрочный хронический эффект на накопление цистеина после однократного воздействия БКМ-7. Блокада в присутствии селективного ц-антагониста, а не дельта опиоидного рецептора, показала, что эти эффекты были опосредованы ц-опиоидными рецепторами.
Сообщалось, что пептиды, полученные с пищей, изменяют окислительно-восстановительный метаболизм, включая уровни глутатиона, который может регулировать уровни S-аденозилметионина (SAM) в клетках. SAM является универсальным донором метальных групп для опосредования изменений метилирования ДНК. Эти изменения являются частью эпигенетической регуляторной памяти и могут регулировать уровни экспрессии генов для поддержания гомеостаза. Важно отметить, что эти изменения могут быть весьма стабильными и иметь потенциал для препятствования экспрессии/репрессии генов и, следовательно, постоянно изменять уровни генов. Таким образом, уровни глутатиона могут воздействовать на пути, в которых гены играют важную роль, такие как путь синтеза и метаболизма лактозы. Следовательно, эпигенетические изменения, вызванные БКМ-7, посредством окислительно-восстановительного сигнального пути могут влиять на регуляторные гены, ответственные за синтез и метаболизм лактозы и, следовательно, влиять на уровень лактозы в организме.
Организм приспособлен к тому, чтобы поглотить, усвоить, удалить, или сохранить определенный общий уровень лактозы. Если уровень лактозы меняется под влиянием БКМ-7, способность организма регулировать уровень лактозы может быть сатурирована и, следовательно, могут быть индуцированы даунстрим патофизиологические субклинические или клинические эффекты.
Пример 6 показывает, что БКМ-7 и морфин вызывают зависимое от времени снижение уровней цистеина и глутатиона(С8Н). Внутриклеточные уровни цистеина в нервных клетках и окислительно-восстановительный статус клеток, (выраженный отношением GSH/GSSG глутатиона (GSH) к его окисленной форме - дисульфиду nryTaTHOHa(GSSG), также снижались (Фиг. 6), указывая на возможность состояния окислительного стресса. Дополнительно, способность к метилированию (выраженная отношением SAM/SAH, также зависела от воздействия БКМ-7 в различные моменты времени (Фиг. 7). Следовательно, БКМ-7 вызывает снижение основных внутриклеточных антиоксидантных уровней, особенно уровней глутатиона. Известно, что сниженные уровни GSH индуцируют модификации хроматина через сигнальные пути оксидативного стресса путем регулирования уровней SAM.
Пример 7 исследует уровни метилирования ДНК, индуцированного БКМ-7. Фиг. 8 показывает изменения метилирования ДНК в гене МПО, одном из генов, ответственных за опосредование воспалительной реакции под влиянием БКМ-7. Показано, что изменения в окислительно-восстановительном статусе вызывают долгосрочные изменения в эпигенетическом статусе воспалительных генов. Это эквивалентно памяти молекулярных повреждений, потенциально способствуя долгосрочным хроническим воспалительным изменениям и воспалительным реакциям на непереносимость лактозы. Таким образом, БКМ-7 не только изменяет МПО активность, как показали исследования с кормлением по рациону с бета-казеином А1, но также изменяет эпигенетический статус гена МПО и, следовательно, имеет непрерывное и долгосрочное влияние на синтез и метаболизм лактозы. Даунстрим эффекты измененных уровней лактозы могут включать желудочную дисфункцию и проблемы с пищеварением. Как показано на Фиг. 9, БКМ-7 изменяет эпигенетический статус ферментов, таких как лактазы, которые участвуют в метаболизме и деградации лактозы. Это может привести к накопленным уровням лактозы и регулируемым концентрациям лактозы, которые могут быть переносимы или не переносимы в зависимости от индивидуальных особенностей. Если они непереносимы, то можно ожидать изменений желудочно-кишечной функции и воспаление кишечника.
БКМ-7 также влияет на ферменты, участвующие в пищеварительной функции, как показано в Таблице 4. B4GALT2, LGALS12 и B4GALT1 представляют собой гены, которые кодируют ферменты, участвующие в метаболизме галактозы. Галактоза является важным промежуточным продуктом в синтезе лактозы. Точно так же, гены GKN1, GALK2, GALR2, GALT и GALR1 кодируют ферменты, которые участвуют в регуляции уровня галактозы и, следовательно, косвенно регулируют уровни лактозы. Изменения в активности этих ферментов могут косвенно привести к изменениям уровней лактозы.
БКМ-7 изменяет ферментативную активность этих ферментов, регулируя эпигенетический статус данных генов. Это обеспечивается путем механистического регулирования окислительно-восстановительного статуса. Эти изменения в конечном итоге искажают уровни лактозы, не только в острой стадии, но также могут иметь долгосрочный эффект из-за эпигенетических изменений, которые, могут быть переданы даже следующему поколению.
БКМ-7 не только опосредует изменения в синтезе и метаболизме лактозы, но также может регулировать активность и уровни ферментов, участвующих в пищеварительных процессах и функции кишечника. Показано, что гены ферментов, таких как холецистокинин, мотилин, секретаза и окситоцин имеют измененный эпигенетический статус, под воздействием БКМ-7. Это непосредственно влияет на желудочно-кишечные функции и способность к пищеварению человека. Таким образом, БКМ-7 будет способствовать возникновению симптомов измененной перистальтики кишечника, нарушений пищеварительной системы, метеоризма и диареи, все из которых являются симптомами непереносимости лактозы.
Даунстрим эффекты эпигенетических изменений на уровнях ферментов лактаз были дополнительно подтверждены исследованием уровней мРНК с помощью количественной ПЦР (Пример 8). NOD мыши получали корм по рациону, обогащенному бета-казеином А1 или бета-казеином А2 после отлучения от матери. После умерщвления, образцы кишечника вырезали и собирали. РНК выделяли из этих образцов и ПЦР проводили с использованием праймеров, специфичных для фермента лактазы в тонкой кишке. Как показано на Фиг 10, уровни мРНК ферментов лактаз были выше в тонкой кишке у мышей, получавших рацион с бета-казеином А2 в течение 10 и 20 недель, по сравнению с уровнями мРНК лактаз в тонком кишечнике у мышей, получавших корм по рациону с бета-казеином А1, в те же периоды времени. У имеющих более высокие уровни фермента лактазы мышей, получавших корм с бета-казеином А2, лактоза была бы удалена из пищеварительной системы, с сохранением только определенного доступного уровня лактозы. Следовательно, не появилось бы симптомов, связанных с непереносимостью лактозы. В противоположность этому, у имеющих более низкие уровни мРНК лактазы в тонком кишечнике мышей, получавших рацион с бета-казеином А1, могло бы произойти накопление более высоких уровней лактозы, и, следовательно, могли бы появиться симптомы непереносимости лактозы.
Настоящие исследования впервые представляют четкое научное доказательство связи между потреблением бета-казеина А1 и симптомами непереносимости лактозы, и также указывают на то, что потребление бета-казеина А2 (по сравнению с потреблением бета-казеина А1) способствует предотвращению или уменьшению симптомов непереносимости лактозы при воздействии лактозы в будущем.
Предшествующие неубедительные и противоречивые казуистические сообщения, и исследования, относящиеся скорее к БКМ-7 (чем к самому по себе бета-казеину А1), приводили к путанице среди специалистов в данной области, и, согласно многим предположениям, такая связь отсутствовала. Благодаря открытию Заявителя предложено альтернативное потенциальное решение проблемы, от которой пострадало множество людей, рассматривающих себя как имеющих непереносимость лактозы, то есть избегание бета-казеина А1 в рационе. Это может быть достигнуто с помощью получения молока, имеющего в своем составе преимущественно бета-казеин А2, и получения продуктов на основе такого молока, и обеспечение доступности такого молока и таких продуктов, с целью уменьшения или предотвращения симптомов непереносимости лактозы.
Молоко коров может быть проверено на относительные пропорции бета-казеина А1 и бета-казеина А2. Альтернативно, коровы могут быть генетически проверены на их способность продуцировать молоко, содержащее бета-казеин А1 или бета-казеин А2, или их комбинацию. Эти методы хорошо известны.
Настоящее изобретение имеет существенные преимущества по сравнению с существующими способами предотвращения симптомов непереносимости лактозы. Большинство существующих методов основаны на изменениях рациона питания, многие из которых часто малоуспешны или безуспешны. Настоящее изобретение предлагает решение, которое сравнительно легко осуществить, т.е. избегание молока и молочных продуктов, содержащих бета-казеин А1 и обеспечение того, чтобы молоко и молочные продукты, присутствующие в рационе, содержали бета-казеин, преимущественно являющийся бета-казеином А2, предпочтительно, на 100% являющийся бета-казеином А2. Настоящее изобретение не предполагает необходимости в массированной модификации рациона питания, такой как избегание молочных продуктов питания или других распространенных продуктов питания.
Любые ссылки на документы известного уровня техники в этом описании не следует рассматривать как признание факта, что такой известный уровень техники широко известен и формирует часть общих знаний в данной области.
В данной заявке слова "содержит", "содержащий", и подобные слова не следует интерпретировать в исключительном или исчерпывающем смысле. Другими словами, они предназначены для обозначения "в том числе", но не ограничиваются ими.
Далее настоящее изобретение описано со ссылками на следующие Примеры. Следует иметь в виду, что Примеры являются чисто иллюстративными и не ограничивают настоящее изобретение каким-либо образом.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Метод кормления
Были использованы семьдесят два отлученных от матери (четырехнедельных) самца крыс линии Вистар (Wistar). После 7-дневного периода акклиматизации на контрольном рационе, крыс кормили в течение 12 или 60 часов в соответствии с одним из трех рационов: 100% А1 рацион, 100% А2 рацион, контрольный рацион (п=6 на кормление). Белковые компоненты рационов были получены из обезжиренного молока (для А1 и А2 рационов) и яичного белка (для немолочного белкового контрольного рациона), и были сбалансированы по энергетической ценности и композиции макроэлементов (Таблица 1).
За пятнадцать минут до окончания периода времени, крысы получали или налоксон или физиологический раствор (контроль) путем внутрибрюшинной инъекции, а затем перорально, через желудочный зонд получали неусваиваемый индикатор, диоксид титана.
Образцы кала и мочи отбирали в 7 временных точках в течение следующих 24 часов, и хранили при -20°С (кал) или при -80°С (моча) до момента анализа.
Пример 2: Время пассажа по желудочно-кишечному тракту
2
Время пассажа по желудочно-кишечному тракту (ЖКТВ) было измерено у крыс, получавших корм по рациону Примера 1. Диоксид титана (Ti02) был использован в качестве индикатора, введенного перорально животным после 12 часового кормления по 100% рациону Al, 100% рациону А2, или по контрольному рациону. Результаты показаны в Таблице 2 и на Фиг. 1. Данные восстановления представлены как % восстановления TiO в зависимости от времени (часы). Крысы, получавшие корм по рациону А1 демонстрировали задержку пассажа по сравнению с крысами, получавшими корм по рациону А2, причем обе группы демонстрировали задержку по сравнению с крысами, получавшими корм по контрольному рациону.
Пример 3 Активность лактазы
Замороженные перетертые в порошок образцы двенадцатиперстной кишки гомогенизировали в ледяной деионизованной воде (1:5 масс/объем), затем центрифугировали при 2200g в течение 30 мин при 4. Супернатант собирали и разводили (1:25) деионизованной водой. Образцы инкубировали с лактозой, и высвободившуюся глюкозу выявляли с помощью набора Glucose-Oxidase Kit (Sigma) и измеряли на микропланшетном ридере. Таблица 3 и Фиг. 2 показывают результаты измерения активности лактазы в двенадцатиперстной кишке у крыс, получавших корм в краткосрочном (остром) режиме (12 часов), и у крыс, получавших корм в хроническом режиме (60 часов). Активность лактазы в двенадцатиперстной кишке была повышена у крыс с острым кормлением по рациону А2, по сравнению с крысами с хроническим кормлением по рациону А2, и по сравнению с крысами с острым кормлением по рациону А1 и крысами с хроническим кормлением по рациону А1.
Пример 4: Активность миелопероксидазы
Активность миелопероксидазы (МПО) в ткани толстой кишки у крыс, получавших корм по рациону Примера 1, измеряли с помощью разработанного метода (Grisham, М.В., et al., Methods Enzymol., 1990, 186:729-742). Ткань толстой кишки (50 мг) гомогенизировали, разделяли центрифугированием, разрушали с помощью ультразвукового зонда и подвергали циклу замораживания-оттаивания.
2
2
Эндогенная МПО катализирует НО-зависимое окисление 3,3',5,5'-тетраметил-бензидинового субстрата, измеряемое колориметрически при длине волны 562 нм. Активность МПО нормализовали с помощью бицинхониновой кислоты (БХК) (Smith, Р.K., et al., Anal. Biochem., 1985, 150(1):76-85) для этого же гомогената. Результаты показаны на Фиг. 3. По сравнению с животными, получавшими корм А1, животные, получавшие корм А2, демонстрировали значительно более низкий уровень активности после острого (кратковременного) кормления. Этот эффект был устойчивым и дополнительно возрастал при хроническом кормлении, и был полностью обратим при пероральном введении налоксона.
Пример 5: Влияние БКМ-7 на накопление цистеина
35
35
35
Анализ накопления радиоактивного [S]-цистеина проводили на эпителиальных клетках кишечника Сасо-2 и нервных клетках в присутствии БКМ-7, высвободившегося из бета-казеина Al, и сравнивали с необработанными контрольными клетками, а также с клетками, обработанными морфином (прототипным агонистом опиоидного рецептора). Предварительную обработку в клетках проводили в различные временные точки 30 мин, 4 ч, 24 ч 48 ч, как было описано ранее (Trivedi М., et al.; Mol. Pharm., 2014). Нервные клетки человека SH-SY5Y и эпителиальные клетки кишечника Сасо-2 высевали в шестилуночные планшеты, предварительно обрабатывали препаратами и инкубировали в течение различных отрезков времени перед измерением накопления. Среды отсасывали, и клетки промывали 600 мкл HBSS при 37°С. Нерадиоактивный HBSS отсасывали, заменяли на 600 мкл 37°С HBSS, содержащий [8]-цистеин (1 мкКи/1 мл), 10 мкМ немеченого цистеина и 100 мкМ DTT, и клетки инкубировали в течение 5 мин. Смесь [S]-4HCTemr/HBSS отсасывали и обработку прекращали двумя промывками ледяным HBSS.
Затем клетки лизировали 600 мкл dH20, соскабливали, собирали в 1,5 мл микроцентрифужные пробирки и обрабатывали ультразвуком в течение 10 с. 100 мкл каждого образца делили на аликвоты для белкового анализа. 200 мкл каждого образца (в трех экземплярах) разносили на аликвоты в сцинтилляционные флаконы с 4 мл сцинтилляционной жидкости, перемешивали и измеряли радиоактивность (нормализованную на содержание белка). Дополнительно влияние морфина и БКМ-7 на накопление цистеина было также охарактеризовано в присутствии D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Arg-Thr-Pen-Thr (СТАР), селективного ц-антагониста, и дельта антагониста нальтриндола (NTI). Результаты показаны на Фиг. 4, 5 и 6. Символ * на этих Фигурах обозначает статистически значимое различие (р<0.05) при сравнении с необработанным контролем, и каждый символ # обозначает статистически значимое различие (р<0.005) при сравнении с необработанным контролем.
Пример 6: Влияние БКМ-7 на уровни GSH и SAM
2
2
В этом примере исследовали, может ли снижение поглощения цистеина, как наблюдали в Примере 5, привести к изменению GSH и повлиять на уровни антиоксидантов. Внутриклеточные уровни GSH измеряли с БКМ-7, а также с морфином в различные временные точки (30 мин, 4 ч, 24 ч) с использованием ВЭЖХ высокоэффективной жидкостной хроматографии и метода детекции электрохимического градиента, использованного ранее (Hodgson et al., J. Alzh. Dis. 2013, Trivedi M., et al., Mol. Pharm. 2014). Нервные клетки SH-SY5Y выращивали до конфлуентности в среде α-МЕМ. Среду отсасывали, и клетки дважды промывали 1 мл ледяного HBSS. HBSS отсасывали, и добавляли к клеткам 0.6 мл ледяной dHO. Клетки соскребали с флакона/чашки и суспендировали в dHO. Суспензию клеток обрабатывали ультразвуком в течение 15 с. на льду, и 100 мкл суспензии использовали для определения содержания белка. Оставшийся лизат переносили в микроцентрифужную пробирку и к нему добавляли равный объем 0.4 Н перхлорной кислоты с последующим инкубированием на льду в течение 5 мин. Образцы центрифугировали при 5000×g, и супернатант переносили в новые микроцентрифужные пробирки. 100 мкл образца переносили в коническую виалку микро-автосамплера и хранили при 4°С в охлаждающем поддоне автосамплера. 10 мкл этой пробы инъецировали в систему ВЭЖХ.
Разделение метаболитов окислительно-восстановительного пути и пути метилирования осуществляли с использованием аналитической колонки Agilent Eclipse, XDB-C8 (3×150 мм; 3.5 мкм) и защитной колонки Agilent Eclipse, XDB-C8 (4.6×12.5 мм; 5 мкм). Были использованы две подвижные фазы: Подвижная фаза А представляла собой 0% ацетонитрил, 25 мМ фосфат натрия, 1.4 мМ 1-октансульфоновую кислоту, доведенную до рН 2.65 фосфорной кислотой. Подвижная фаза В представляла собой 50% ацетонитрил. Скорость потока была первоначально установлена на уровне 0,6 мл/мин, и был использован ступенчатый градиент: 0-9 мин 0% В, 9-19 мин 50% В, 19-30 мин 50% В. Колонку затем уравновешивали 5% В в течение 12 мин до следующего запуска. Температуру поддерживали на уровне 27°С. Был использован электрохимический детектор ESA CoulArray с аналитическими ячейками BDD модели 5040 и рабочий потенциал был установлен на уровне 1500 мВ. Концентрации образцов были определены из площадей пиков метаболитов с использованием стандартных калибровочных кривых и программного обеспечения ESA, прилагаемого к ВЭЖХ. Концентрации образцов были нормализованы на содержание белка. В некоторых случаях образцы разводили в подвижной фазе в нужном количестве или вводили до 50 мкл образца для обеспечения того, чтобы уровни тиола были в пределах стандартной кривой. Результаты показаны на Фиг. 7.
Пример 7: Влияние БКМ-7 на уровни метилирования ДНК
Уровни глобального метилирования ДНК, индуцированного БКМ-7, были исследованы с помощью секвенирования генома, обогащенного белком с метил-CpG-связывающим доменом (MBD, methyl-CpG binding domain), (MBD-секвенирования), как описано ранее (Trivedi М., et al., Mol. Pharm. 2014), в то время как данные микроматричного анализа трансляции мРНК были получены с использованием микрочипов Agilent V3 на необработанных контрольных клетках SH-SY5Y и клетках, обработанных в течение 4 часов 1 мкМ БКМ-7.
Геномную ДНК экстрагировали из образцов набором Easy DNA kit (Invitrogen К1800-01) с использованием соответствующего протокола для клеточных линий. Фрагментацию ДНК выполняли на приборе Covaris S2 со следующими настройками: рабочий цикл 10%, интенсивность 5, 200 циклов на разрыв в течение 200 сек. Были получены фрагменты, имеющие среднюю длину 200 п.о. Режим питания представлял собой режим качания частоты, температура 6-8°С, уровень воды 12. Максимум 5 мкг было добавлено к 130 мкл трис-ЭДТА в микропробирку с AFA (Adaptive Focused Acoustics) усилителем. Для образцов с введением меньшего количества ДНК (до 500 нг), ДНК разводили в соотношении 1:5 в Tris-ЭДТА. ДНК с введением 5-3 мкг анализировали на биоанализаторе Agilent 2100 с использованием набора для анализа ДНК DNA 1000 Kit. ДНК с введением ниже 3 мкг концентрировали в роторном испарителе до 25 мкл и проверяли распределение фрагментов на ДНК-чипе с высокой чувствительностью. Захват метилированной ДНК осуществляли с использованием набора MethylCap (Diagenode, Belgium). Выход был обычно между 0.5 и 8 нг от общей захваченной ДНК. Фрагменты были последовательно секвенированы с помощью секвенатора Illumina Genome Analyzer П. Концентрации фрагментированной и захваченной ДНК были определены на ридере для считывания многолуночных планшетов Fluostar Optima с набором для количественного определения двухцепочечной ДНК Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen P7589) при длине волны 480/520 нм.
Для приготовления библиотеки ДНК был использован набор DNA Sample Prep Master Mix Set 1 (NEB E6040) в комбинации с набором Multiplexing Sample Preparation Oligo Kit (96 samples, Illumina PE-400-1001). Вся фрагментированная ДНК была использована в соответствии с протоколами NEB (New England Biolabs) с использованием адаптеров для мультиплексирования образцов, предусмотренных в наборе Multiplexing Sample Preparation Oligo Kit. Отбор фрагментов нужного размера из библиотеки проводили в 2% агарозном геле (Low Range Ultra Agarose, Biorad 161-3107). Использовали маркер размеров 1 Кб Plus ladder (Invitrogen 10787-018), и проводили электрофорез при 120 В в течение 2 часов. Фрагменты размером 300 п. о. +/- 50 п. о. вырезали и элюировали на колонке из набора Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen 28704) и элюировали в 23 мкл ЕВ.
Протокол амплификации библиотеки одновременно с ее индексированием для платформы Illumina был использован со следующими изменениями: использовали 22 мкл ДНК и осуществляли 21 цикл. Образец очищали на колонке для очистки продуктов ПЦР Qiaquick PCR Purification column (Qiagen 28101) и элюировали в 50 мкл ЕВ, разводили в соотношении 1: 5, концентрировали в роторном испарителе до 10 мкл. 1 мкл наносили на высокочувствительный ДНК-чип от Agilent 2100, и концентрацию определяли путем анализа шмера на Agilent 2100. Образцы разбавляли до концентрации 10 нМ. После денатурации с NaOH образцы разбавляли до концентрации 16 пМ. Подготовку ячейки для парно-концевых (Paired-End) прочтений осуществляли в соответствии с руководством пользователя для Cluster Station. Секвенирование проводили в соответствии с руководством пользователя для секвенатора HiSeq (проведение мультиплексного парноконцевого прочтения) с 2×51 циклов для парно-концевых прочтений.
Полногеномное секвенирование ДНК методом MBD-seq выявило транскрипты с дифференциально метилированными промоторами (ДМТ), которые были определены методом оценки доли ложноположительных результатов (FDR, false discovery rate)<0.1 и ANOVA с последующим апостериорным t-критерием Стьюдента (р<0.05). Транскрипты включают оба гена и некодирующие РНК, которые были дифференциально метилированы/транскрибированы. Эпигенетические изменения, а также изменения транскрипции, вызванные БКМ-7 в конкретных биологических или функционально соответствующих путях, были оценены с помощью анализа Ingenuity Pathway Analysis (IPA), и были определены пути, оказывающие наибольшее действие. Результаты показаны в Таблице 4. Согласно данным, изменения в эпигенетическом статусе генов, ответственных за метаболизм лактозы и синтез лактозы, также происходят под действием БКМ-7, как показано на Фиг. 8 и 9.
Пример 8: Влияние БКМ-7 на уровни лактазы в тонкой кишке
NOD мышей (самцов и самок) с момента отлучения от матери переводили на рацион, обогащенный бета-казеином А1 или молочным белком А2. Эти рационы были разработаны компанией Specialty Feeds Pty. Ltd. (Australia) для обеспечения адекватного состава и питательности. Когорты мышей (n=10) из каждого пола и рациона были умерщвлены в 10 недель или в 20 недель. Во время вскрытия отбирали образцы ткани и хранили при -80°С в растворе для стабилизации РНК RNAlater™. 40 NOD мышей были вовлечены в это исследование: 10 в группе (самец/самка: А1/А2).
2
РНК из культуры клеток для анализа транскрипции РНК выделяли с использованием набора RNAqueous-4PCR от Ambion (Austin, ТХ). Процедура была аналогичной описанной в протоколе производителя. Выделенную РНК обрабатывали ДНКазой, чтобы очистить РНК, затем определяли концентрацию РНК с помощью спектрофотометра ND-1000 NanoDrop.Синтезировали кДНК, как описано ранее, с использованием набора first-strand cDNA synthesis от компании Roche (Indianapolis, IN). РНК (1 мг), смесь дНТФ (1 мМ), случайные гексамерные праймеры (60 мм), сверхчистую HO класса для молекулярной биологии добавляли до конечного объема пробы 13 мл.
Каждый образец денатурировали при 65°С в течение 5 минут и затем помещали на лед. Добавляли Transcriptor РТ (20 единиц/мл) (Roche), ингибитор широкого спектра РНКаз Protector RNase inhibitor (40 ед/мл) (Roche), буфер 5 Transcriptor Reverse Transcriptase Reaction Buffer (Roche), и сверхчистую H20 класса для молекулярной биологии, и конечный объем доводили до 20 мл. Затем инкубировали в машине РТС Thermocycler (MJ Research, St. Bruno, QC, Canada) при 25°C в течение 10 минут и при 55°С в течение 30 минут. Наконец, ингибировали фермент обратную транскриптазу путем инкубации при 85°С в течение 5 минут.
Количественную ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) проводили на трех образцах с использованием qRT-PCR анализатора LightCycler 480 компании Roche (Trivedi et al., Mol. Pharmcol., 2014). qRT-PCR проводили с использованием 5 мл кДНК-матрицы, 10 мМ смыслового и антисмыслового праймеров, 10 мл смеси для проведения ПЦР SYBR Green I Master от Roche, а также dH20, в конечном объеме 20 мл. Для этой цели использовали следующие праймеры: прямой 5'-GGAGTGTCACCCACAGACAG-3' и обратный 5'-GAACACAAGCTACACGGGG А-3'. ПЦР проводили по следующей программе: инкубирование в течение 5 минут при 95°С, а затем 45 циклов 95°С - 10 секунд, 60°С- 20 секунд и 72°С - 30 секунд, а затем один цикл 95°С - 5 секунд, при 65°С - 1 минута, и 97°С для кривой плавления с последующим охлаждением при температуре 40°С в течение 90 секунд. Использовали контроль без кДНК-матрицы, и получали кривые диссоциации для определения неспецифических продуктов, и нормализовали их, чтобы избежать неспецифической амплификации. Данные анализировали с использованием количественного метода ddCt (Roche) и нормализовали на уровни бета-актина. Результаты показаны на Фиг. 10.
Несмотря на то, что изобретение было описано в виде примера, следует понимать, что варианты и модификации могут быть сделаны без отступления от сущности и объема изобретения, как определено в формуле изобретения. Кроме того, если существуют известные эквиваленты специфических особенностей, такие эквиваленты включены как если бы конкретно упоминались в данном описании.