ВЫСОКОАФФИННЫЕ АНТИТЕЛА К GD2
HIGH-AFFINITY ANTI-GD2 ANTIBODIES

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
В соответствии с § 119(e) раздела 35 Кодекса США (35 U.S.C.) по настоящей заявке испрашивается приоритет на основании предварительной патентной заявки США с порядковым номером 61/801287, поданной 15 марта 2013 г., полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
В настоящей спецификации приводятся ссылки на список последовательностей, представленный в электронной форме в виде ascii.txt файла под названием «2003080-0638_ST25» 14 марта 2014 г. Файл был создан 12 марта 2014 г. и имеет размер 94 кб.
ВВЕДЕНИЕ
Терапия моноклональными антителами (моАт) является общепринятым методом лечения рака, пять моАт получили одобрение FDA для использования в лечении солидных опухолей у взрослых, включая колоректальный рак и рак молочной железы, немелкоклеточный рак легкого, плоскоклеточную карциному и меланому (Boyiadzis et al., 2008, Expert Opin Biol Ther 8, 1151-8; Yan et al., 2008, Cancer J 14, 178-83).
Среди прочего, настоящее изобретение приводит к пониманию того, что терапия моАт используется в недостаточной степени для лечения рака у детей. В отличие от химиотерапии или облучения, терапия моАт не является миелосупрессивной и генотоксичной, она, как правило, связана с небольшой долговременной токсичностью. Эти соображения являются принципиальными в случае детей. Что еще более важно, моАт эффективны против раковых метастазов в крови, костном мозге и костях, как правило, имеющих место при нейробластоме (НБ) высокого риска. Фармакокинетика и токсичность человеческих или гуманизированных IgG1 антител, как класса соединений, были подробно изучены. Кроме того, антитела могут быть нагружены полезными цитотоксическими средствами, либо иммунного происхождения, либо радиоизотопами или ферментами, что увеличивает возможности таргетированной терапии.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к описанным в настоящем документе агентам на основе антител, которые связываются с GD2 и являются вариантами эталонного антитела 3F8 в том, что они содержат одну или более определенных структурных особенностей, отсутствующих в эталонном антителе 3F8. В некоторых вариантах осуществления предложенные агенты на основе антител демонстрируют повышенную стабильность и/или сниженную иммуногенность относительно в остальном идентичного антитела 3F8, лишенного одной или более структурных особенностей, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления предложенные агенты на основе антител полезны в медицинской практике, например, при диагностировании и/или лечении НБ. В некоторых вариантах осуществления предложенные агенты на основе антител связаны с, содержат и/или доставляют одну или более полезных нагрузок (например, детектируемую полезную нагрузку и/или терапевтическую полезную нагрузку). Различные методики идентификации, характеризации, получения и/или применения таких агентов на основе антител также включены в настоящее изобретение.
В данной заявке специально описаны высокоаффинные антитела к GD2 с новым каркасом hu3F8, hu3F8V5, который сконструирован так, чтобы иметь сниженную иммуногенность, но повышенную стабильность. Антитела hu3F8V5 сконструированы путем оптимизации структуры каркаса hu3F8V1 (описанных в in WO 2011/160119 и Cheung et al., 2012, Oncoimmunology 1: 477-486) с помощью вычислительных методов для уменьшения иммуногенности. Во-первых, последовательности тяжелой цепи и легкой цепи hu3F8V1 сравнивали с человеческими последовательностями зародышевой линии humIGHV199 и humIGKV025, соответственно (база данных EMBL). Молекулярное моделирование с использованием силовых полей CHARMm (CHemistry at Harvard Molecular mechanics) (B. R. Brooks et al., J. Comp. Chem. 30, 1545-1615 (2009)) выполняли для каждой потенциальной гуманизирующей мутации на основе кристаллической структуры мышиного 3F8 (регистрационный номер в базе данных белков 3VFG) для определения того, является ли мутация структурно пермиссивной. Кроме того, T-клеточные эпитопы MHC класса II в hu3F8V1 были идентифицированы с использованием метода NN-выравнивания в базе данных иммунных эпитопов и сведены к минимуму, исходя из структурно пермиссивных мутаций. На основе компьютерной модели кристаллической структуры стыковки GD2 с 3F8 (построенной с использованием программного обеспечения CDOCKER и Discovery Studio, Accelrys, San Diega, CA) остатки CDR, которые на модели непосредственно не взаимодействовали с антигеном GD2, были выбраны для мутаций гуманизации.
Девять точечных мутаций были внесены в hu3F8V1 для получения hu3F8V5 (смотри таблицу 2) в попытке снижения потенциальной иммуногенности. Установлено, что все девять мутаций являются структурно пермиссивными в компьютерной модели связывания 3F8 с его антигеном GD2. Все мутации включали замену остатков мышиной последовательности, оставшихся при гуманизации на 3F8, на последовательности зародышевой линии человека. (LC: K24R, LC: S56T, LC: V58I, HC: I20L, HC: M92V) включали каркасные остатки. Кроме того, авторы изобретения обнаружили 4 мутации в CDR H2 (HC: A62S, HC: F63V, HC: M64K, HC: S56G), которые приводили к удалению сильного T-клеточного эпитопа, что определяли in silico методами. Авторы изобретения были удивлены, что их компьютерная модель 3F8, связанного с GD2, допускала предполагаемые мутации в области CDR, поскольку для специалистов в данной области гуманизация антитела с помощью методов пересадки для изменения остатков CDR является необычной.
Для выполнения созревания аффинности с помощью методов дрожжевого дисплея, авторы изобретения сначала синтезировали новое биотинилированное производное GD2 для использования в отборе. Ранее они потерпели неудачу при использовании стандартного биотинилированного антигена GD2 (полученного от Консорциума по функциональной гликомике). Новое синтетическое азидо-производное GD2 (фигура 2) получали путем слияния с ПЭГ-спейсером для наблюдения за GD2 во время проточной цитометрии. С использованием этого нового аналога авторы изобретения отобрали 2 мутации из произвольно выбранной библиотеки hu3F8 scFv, экспонированных на поверхности дрожжевых клеток, которые приводили к усилению связывания с синтетическим аналогом GD2. Первая представляла собой LC: D32H, находящуюся на CDR L1, и вторая представляла собой LC: E1K в остатке каркаса. Две мутации (LC: E1K и LC: D32H) были протестированы в рекомбинантно экспрессированных конструктах hu3F8V1 scFv и hu3F8V5 scFv, и аффинности связывания для природного GD2 были измерены с использованием анализа Biacore. На основании результатов структурного моделирования все hu3F8 scFv были получены в формате VL-VH, поскольку это делает возможным менее ограниченный доступ к антигенсвязывающему карману. Это отличается от большинства обычных scFv, которые сконструированы в формате VH-VL. Несколько вариантов также были протестированы в формате полноразмерного IgG1.
Таким образом, настоящее изобретение относится к новым высокоаффинным агентам на основе антител к GD2, включая интактные антитела, одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv) и другие форматы, имеющие определенные структурные особенности (мутации относительно 3F8 и/или hu3F8V1), которые приводят к уменьшению иммуногенности и увеличению аффинности антитела для GD2.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к новому каркасу для антитела к GD2 3F8, а именно hu3F8V5, имеющему определенные структурные особенности (мутации относительно 3F8 и/или hu3F8V1), приводящие к уменьшению его иммуногенности и удалению T-клеточного эпитопа.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к агентам на основе антител к GD2 с повышенной аффинностью для GD2, имеющим определенные структурные особенности в легкой цепи (LC), D32H, находящейся на CDR L1, и E1K в каркасном остатке.
Также предложены агенты на основе антител к GD2 с определенной структурной особенностью в тяжелой цепи (HV), G54I.
Агенты на основе антител по настоящему изобретению могут иметь одну структурную особенность, описанную выше, или две структурные особенности в любом сочетании, в виде двойных особенностей, или более двух структурных особенностей в любом сочетании, в виде тройных особенностей. В некоторых вариантах осуществления эти структурные особенности могут быть внесены в любую форму антитела 3F8, например, в hu3F8V1, или в сочетании с другими структурными особенностями, уже присутствующими в молекуле 3F8 для аналогичных или альтернативных целей, например, hu3F8V5. Хотя в настоящем документе описаны антитела и одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), имеющие эти структурные особенности как в hu3F8V1, так и в hu3F8V5, понятно, что мутации могут быть введены в любую последовательность антитела 3F8 для придания повышенной аффинности.
В одном варианте осуществления изобретение относится к антителу к GD2 3F8, имеющему легкую цепь (LC) с одной структурной особенностью, либо E1K, либо D32H, или двумя структурными особенностями, E1K и D32H, и/или тяжелую цепь (HC) со структурной особенностью G54I, а также композициям антитела, гликоформам антитела, антителам с повышенной стабильностью, антителам с усиленным связыванием с Fc-рецепторами, антителам с повышенной аффинностью к GD2, биспецифическим антителам, сконструированным для экспрессии второго отдельного сайта связывания, или биспецифическому проводнику T-клеток (bispecific T-cell engager), или к использованию Fv-фрагментов любого из антител по настоящему изобретению в модульной конструкции IgG для биспецифических, биспецифических антител с тандемными scFv, которые взаимодействуют с T-клетками (BiTE), триспецифических или мультиспецифических антител. Такие антитела и кодирующие или комплементарные нуклеиновые кислоты, векторы, клетки-хозяева, композиции, препараты, устройства, относящиеся к делу трансгенные животные, трансгенные растения, а также способы их получения и применения, описанные и включенные в настоящий документ, в сочетании с тем, что известно в данной области, являются частью настоящего изобретения. Удивительно, что hu3F8, имеющее любое сочетание структурных особенностей E1K, D32H и G54I, демонстрирует значительно более высокую аффинность в отношении GD2 и значительно более высокие активности PMN-ADCC и PBMC-ADCC, чем родительский вариант hu3F8V1, при низкой комплемент-опосредованной цитотоксичности (CMC). Низкая CMC является желательной, поскольку считается, что она опосредует болевой побочный эффект, связанный с анти-GD2 иммунотерапией. Это превосходство постоянно наблюдали в анализах ADCC независимо от доноров или от того, использовали ли в качестве киллеров клетки NK92, трансфицированные CD16 или CD32 человека. Это было важно, поскольку ADCC, в целом, является проверенным механизмом для противоопухолевых эффектов моАт у пациентов.
В одном варианте осуществления изобретение относится к агенту на основе антитела 3F8, содержащему легкую цепь и тяжелую цепь на основе hu3F8V1 или hu3F8V5, но отличающемуся наличием одной или более структурных особенностей, описанных в настоящем документе, при этом указанный агент на основе антитела связывает с высокой аффинностью GD2 и опосредует желаемый эффект, например, ингибирование роста клеток in vitro, блокирование болевых побочных эффектов, вызванных терапией с использованием антитела к GD2, в числе прочего.
В одном аспекте агент на основе антитела по изобретению включает hu3F8V1 IgG с одиночной структурной особенностью, описанной в настоящем документе, например, hu3F8V1-E1K, hu3F8V1-D32H, hu3F8V1-G54I; hu3F8V1 IgG с двойной структурной особенностью, описанной в настоящем документе, например, hu3F8V1-E1KD32H, hu3F8V1-E1KG54I и hu3F8V1-D32HG54I; hu3F8V1 IgG с тройной структурной особенностью, описанной в настоящем документе, например, hu3F8V1-E1KD32HG54I; hu3F8V5 IgG; hu3F8V5 IgG с одиночной структурной особенностью, описанной в настоящем документе, например, hu3F8V5-E1K, hu3F8V5-D32H, hu3F8V5-G54I; hu3F8V5 IgG с двойной структурной особенностью, описанной в настоящем документе, например, hu3F8V5-E1KD32H, hu3F8V5-E1KG54I и hu3F8V5-D32HG54I; и hu3F8V5 IgG с тройной структурной особенностью, описанной в настоящем документе, например, hu3F8V5-E1KD32HG54I.
2
Изобретение также относится к фрагментам или производным такого антитела, например, одной или более частям цепи антитела, таким как константная, соединительная, D-сегмент или вариабельная области тяжелой цепи, или константная, соединительная или вариабельная области легкой цепи. Антитела могут относиться к любому классу, например, IgG, IgM или IgA, или любому подклассу, например, IgG1, IgG2a, IgG4 и другим подклассам, известным в данной области. Антитела, полезные по настоящему изобретению, также включают антигенсвязывающие фрагменты антител по настоящему изобретению, включая, но не ограничиваясь ими, Fab, Fab' и F(ab'), Fd, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), одноцепочечные антитела, дисульфид-связанные или дисульфид-стабилизированные Fvs (sdFv или dsFv).
Одноцепочечные вариабельные фрагменты по настоящему изобретению включают hu3F8V1-E1K scFv, hu3F8V1-D32H scFv, hu3F8V1-G54I scFv; hu3F8V1 scFv с двойной структурной особенностью, описанной в настоящем документе, например, hu3F8V1-E1KD32H scFv, hu3F8V1-E1KG54I scFv и hu3F8V1-D32HG54I scFv; hu3F8V1 scFv с тройной структурной особенностью, описанной в настоящем документе, например, hu3F8V1-E1KD32HG54I scFv; hu3F8V5 scFv; hu3F8V5 scFv с одиночной структурной особенностью, описанной в настоящем документе, например, hu3F8V5-E1K scFv, hu3F8V5-D32H scFv, hu3F8V5-G54I scFv; hu3F8V5 scFv с двойной структурной особенностью, описанной в настоящем документе, например, hu3F8V5-E1KD32H scFv, hu3F8V5-E1KG54I scFv и hu3F8V5-D32HG54I scFv; hu3F8V5 scFv с тройной структурной особенностью, описанной в настоящем документе, например, hu3F8V5-E1KD32HG54I scFv, а также их сочетания.
Изобретение также включает однодоменные антитела, содержащие либо VL, либо VH домен. Кроме того, антитела могут быть получены любым способом, например, методом фагового дисплея, или произведены в любом организме, яйце или линии клеток, включая клетки бактерий, насекомых, дрожжей (грибков), млекопитающих или другой тип клеток или линию клеток, которые продуцируют антитела с желаемыми характеристиками, например, гуманизированные антитела. Антитела также могут быть образованы путем объединения Fab-части и Fc-области из разных видов, или путем сохранения определяющих комплементарность областей и изменения каркасных областей на каркасные области из других видов.
Предпочтительные антитела к GD2 по настоящему изобретению содержат любую из следующих пептидных последовательностей:
hu3F8V1 легкая цепь со структурной особенностью D32H, обозначенная SEQ ID NO: 1,
hu3F8V1 легкая цепь со структурной особенностью E1K, обозначенная SEQ ID NO: 2,
hu3F8V1 легкая цепь с двойной структурной особенностью, D32H и E1K, обозначенная SEQ ID NO: 3,
hu3F8V1 тяжелая цепь со структурной особенностью G54I, обозначенная SEQ ID NO: 4,
hu3F8V5 тяжелая цепь гамма 1, обозначенная SEQ ID NO: 5,
hu3F8V5 легкая цепь каппа, обозначенная SEQ ID NO: 6,
hu3F8V5 легкая цепь со структурной особенностью D32H, обозначенная SEQ ID NO: 7,
hu3F8V5 легкая цепь со структурной особенностью E1K, обозначенная SEQ ID NO: 8,
hu3F8V5 легкая цепь с двойной структурной особенностью E1K и D32H, обозначенная SEQ ID NO: 9,
hu3F8V5 тяжелая цепь со структурной особенностью G54I, обозначенная SEQ ID NO: 10,
hu3F8V1 одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), имеющий вариабельную область легкой цепи со структурной особенностью D32H, обозначенный SEQ ID NO: 11,
hu3F8V1 scFv, имеющий вариабельную область легкой цепи со структурной особенностью D32H и вариабельную область тяжелой цепи со структурной особенностью G54I, обозначенный SEQ ID NO: 12,
hu3F8V1 scFv, имеющий вариабельную область легкой цепи со структурной особенностью E1K, обозначенный SEQ ID NO: 13,
hu3F8V1 scFv, имеющий вариабельную область легкой цепи со структурной особенностью E1K и вариабельную область тяжелой цепи со структурной особенностью G54I, обозначенный SEQ ID NO: 14,
hu3F8V1 scFv, имеющий вариабельную область легкой цепи с двойной структурной особенностью E1K и D32H, обозначенный SEQ ID NO: 15,
hu3F8V1 scFv, имеющий вариабельную область легкой цепи с двойной структурной особенностью E1K и D32H и вариабельную область тяжелой цепи со структурной особенностью G54I, обозначенный SEQ ID NO: 16,
hu3F8V1 scFv, имеющий вариабельную область тяжелой цепи со структурной особенностью G54I, обозначенный SEQ ID NO: 17
hu3F8V5 scFv, обозначенный SEQ ID NO: 18,
hu3F8V5 scFv, имеющий вариабельную область легкой цепи со структурной особенностью D32H, обозначенный SEQ ID NO: 19,
hu3F8V5 scFv, имеющий вариабельную область тяжелой цепи со структурной особенностью G54I, обозначенный SEQ ID NO: 20.
hu3F8V5 scFv, имеющий вариабельную область легкой цепи со структурной особенностью D32H и вариабельную область тяжелой цепи со структурной особенностью G54I, обозначенный SEQ ID NO: 21,
hu3F8V5 scFv, имеющий вариабельную область легкой цепи со структурной особенностью E1K, обозначенный SEQ ID NO: 22,
hu3F8V5 scFv, имеющий вариабельную область легкой цепи со структурной особенностью E1K и вариабельную область тяжелой цепи со структурной особенностью G54I, обозначенный SEQ ID NO: 23,
hu3F8V5 scFv, имеющий вариабельную область легкой цепи с двойной структурной особенностью E1K и D32H, обозначенный SEQ ID NO: 24, и
hu3F8V5 scFv, имеющий вариабельную область легкой цепи с двойной структурной особенностью E1K и D32H и вариабельную область тяжелой цепи со структурной особенностью G54I, обозначенный SEQ ID NO: 25.
В другом варианте осуществления одноцепочечные вариабельные фрагменты, описанные выше, могут быть связаны, с использованием или без использования линкеров или спейсеров, с другими scFv, имеющими специфичность для другого антигена, с получением двухвалентных или биспецифических антител к GD2. Например, последовательность scFv для huOKT3 с линкером и спейсером, обозначенная SEQ ID NO: 26, или без спейсера, обозначенная SEQ ID NO: 27, может происходить из любой из последовательностей scFv, приведенных в SEQ ID NOs: 11-25. Альтернативно, последовательность scFv для C825, анти-DOTA, обозначенная SEQ ID NO: 28, может происходить из любой из последовательностей scFv, приведенных в SEQ ID NOs: 11-25. Некоторые примеры биспецифических антител включают последовательности:
hu3F8V1 scFv-линкер-huOKT3 scFv со спейсером ADTKGP, обозначенную SEQ ID NO: 29,
hu3F8V1 scFv-линкер-huOKT3 scFv без спейсера, обозначенную SEQ ID NO: 30, и
hu3F8V1 scFv-C825 scFv, обозначенную SEQ ID NO: 31.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложенные агенты на основе антител могут быть дополнительно модифицированы углеводной композицией, например, для усиления эффекторной функции, с конкретной тройной особенностью остатков DEL (S239D/A330L/I332E) в тяжелой цепи hu3F8V1, одной или более структурными особенностями в тяжелой цепи и/или на границе раздела VH-VL Ala43Ser для повышения стабильности, и/или и того и другого.
Предпочтительными агентами на основе антител по настоящему изобретению являются такие, которые связывают GD2 человека и выполняют нужную функцию, то есть, эффекторную функцию, блокирование боли или ингибирование роста клеток. Некоторые репрезентативные методы определения специфичности и аффинности моноклональных антител путем конкурентного ингибирования можно найти в сборнике Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988), содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки. По меньшей мере одно антитело по изобретению связывает по меньшей мере один указанный эпитоп, специфичный для человеческого GD2, субъединицу, фрагмент, часть или любое их сочетание. Эпитоп может включать по меньшей мере одну антителосвязывающую область, при этом эпитоп предпочтительно состоит из по меньшей мере 1-5 остатков сахара или церамида по меньшей мере одной части GD2.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к по меньшей мере одному выделенному антителу к GD2 hu3F8 по настоящему изобретению, содержащему любую из LC или HV, имеющих любые из структурных особенностей, указанных в настоящем документе, в любом сочетании, и кодирующим их последовательностям нуклеиновой кислоты, где:
hu3F8V1 легкая цепь с одиночной структурной особенностью D32H закодирована полинуклеотидом, обозначенным SEQ ID NO: 32,
hu3F8V1 легкая цепь с двойной структурной особенностью E1K и D32H закодирована полинуклеотидом, обозначенным SEQ ID NO: 33,
hu3F8V5 тяжелая цепь закодирована полинуклеотидом, обозначенным SEQ ID NO: 34,
hu3F8V5 легкая цепь закодирована полинуклеотидом, обозначенным SEQ ID NO: 35,
hu3F8V5 легкая цепь с одиночной структурной особенностью D32H закодирована полинуклеотидом, обозначенным SEQ ID NO: 36,
hu3F8V5 легкая цепь с двойной структурной особенностью E1K и D32H закодирована полинуклеотидом, обозначенным SEQ ID NO: 37,
hu3F8V5 тяжелая цепь с одиночной структурной особенностью G54I закодирована полинуклеотидом, обозначенным SEQ ID NO: 38,
hu3F8V1 scFv с одиночной структурной особенностью D32H в области легкой цепи закодирована полинуклеотидом, обозначенным SEQ ID NO: 39,
hu3F8V1 scFv с двойной структурной особенностью E1K и D32H в области легкой цепи закодирована полинуклеотидом, обозначенным SEQ ID NO: 40,
hu3F8V1 scFv с тройной структурной особенностью E1K и D32H в области легкой цепи и структурной особенностью G54I в области тяжелой цепи закодирована полинуклеотидом, обозначенным SEQ ID NO: 41,
hu3F8V5 scFv закодирована полинуклеотидом, обозначенным SEQ ID NO: 42,
hu3F8V5 scFv с одиночной структурной особенностью D32H в области легкой цепи закодирована полинуклеотидом, обозначенным SEQ ID NO: 43,
hu3F8V5 scFv с двойной структурной особенностью E1K и D32H в области легкой цепи закодирована полинуклеотидом, обозначенным SEQ ID NO: 44, и
hu3F8V5 scFv с тройной структурной особенностью E1K и D32H в области легкой цепи и G54I в области тяжелой цепи закодирована полинуклеотидом, обозначенным SEQ ID NO: 45.
В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к диагностическому/обнаруживающему или терапевтическому иммуноконъюгату, содержащему компонент антитела, который содержит любые из моАт 3F8 или их фрагментов по настоящему изобретению, или слитый белок антитела или его фрагмента, который содержит любые из антител 3F8 или их фрагментов по настоящему изобретению, при этом компонент антитела связан с по меньшей мере одним диагностическим/обнаруживающим средством или по меньшей мере одним терапевтическим средством.
В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к терапевтическому иммуноконъюгату, содержащему терапевтическое средство, например, выбранное из группы, состоящей из радиоактивного изотопа, бора, атомов гадолиния или урана, иммуномодулятора, такого как цитокин, фактора роста стволовых клеток, лимфотоксина, такого как фактор некроза опухолей (TNF), гемопоэтического фактора, такого как интерлейкин (IL), колониестимулирующего фактора (CSF), такого как гранулоцит-колониестимулирующий фактор (G-CSF) или гранулоцит-макрофаг-колониестимулирующий фактор (GM-CSF)), интерферона (IFN), такого как интерфероны-альфа, -бета или -гамма, и фактора роста стволовых клеток, гемопоэтического фактора, эритропоэтина, тромбопоэтина, антитела, гормона, антагониста гормона, фермента, ингибитора фермента, фотоактивного терапевтического средства, цитотоксического терапевтического средства, такого как антимитотические, алкилирующие средства, антиметаболита, ингибирующего ангиогенез средства, апоптического средства, алкалоида, COX-2-ингибирующего средства и антибиотика, цитотоксического токсина, такого как растительные, микробные и животные токсины, а также их синтетических вариантов, ингибитора ангиогенеза, другого антитела, а также их сочетаний.
В некоторых аспектах настоящее изобретение также относится к мультивалентному, мультиспецифическому антителу или его фрагменту, содержащему один или более антигенсвязывающих сайтов, имеющих аффинность в отношении антигена, узнаваемого антителом 3F8, и один или более связывающих гаптен сайтов, имеющих аффинность в отношении эпитопов или гаптенов помимо GD2. В одном варианте осуществления мультивалентное, мультиспецифическое антитело или его фрагмент содержит диагностическое/обнаруживающее или терапевтическое средство.
В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способу доставки диагностического/обнаруживающего средства, терапевтического средства или их сочетаний к мишени, включающему: (i) введение субъекту мультивалентного, мультиспецифического антитела или его фрагмента по настоящему изобретению; (ii) ожидание в течение достаточного количества времени, чтобы некоторое количество не связывающегося белка вышло из кровотока субъекта; и (iii) введение указанному субъекту молекулы носителя, содержащей диагностическое/обнаруживающее средство, терапевтическое средство или их сочетание, которая связывается с сайтом связывания указанного антитела. В некоторых вариантах осуществления диагностическое/обнаруживающее средство или терапевтическое средство выбрано из группы, включающей изотопы, красители, хромогены, контрастные вещества, лекарственные средства, токсины, цитокины, ферменты, ингибиторы ферментов, гормоны, антагонисты гормонов, факторы роста, радиоактивные изотопы, металлы, липосомы, наночастицы, РНК, ДНК, а также их сочетания. Вторая специфичность также включает гаптен(ы), конъюгированные с любым из группы описанных средств. Эти гаптены включают, но не ограничиваются ими, биотин и его производные, DOTA и его производные, DTPA и его производные, флуоресцеин и его производные, гистамин и его производные, дефероксамин и его производные.
В любом из способов по настоящему изобретению субъект предпочтительно является млекопитающим, таким как человек или животное-компаньон.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложен способ лечения или выявления пораженных тканей у субъекта, включающий: (A) введение указанному субъекту биспецифического антитела или фрагмента антитела, имеющего по меньшей мере одно плечо, которое специфически связывает ассоциированный с пораженной тканью маркер, и по меньшей мере одно другое плечо, которое специфически связывает таргетируемый конъюгат, при этом указанный ассоциированный с пораженной тканью маркер представляет собой антиген, узнаваемый моАт 3F8; (B) необязательно, введение указанному субъекту очищающей композиции, чтобы указанная композиция вывела не локализованные антитела или фрагменты антител из системы кровообращения; и (C) введение указанному субъекту первого таргетируемого конъюгата, содержащего часть носителя, которая содержит или несет по меньшей мере один эпитоп, узнаваемый указанным по меньшей мере одним другим плечом указанного биспецифического антитела или фрагмента антитела, и одно или более конъюгированных терапевтических или диагностических средств. Предпочтительно, по меньшей мере одно плечо, которое специфически связывает ткань-мишень, представляет собой антитело к GD2 или фрагмент антитела к GD2 по настоящему изобретению.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
В некоторых аспектах, настоящее изобретение относится к способу обнаружения или лечения опухолей, экспрессирующих антиген, узнаваемый моАт 3F8 у млекопитающего, включающему: (A) введение эффективного количества биспецифического антитела или фрагмента антитела, имеющего по меньшей мере одно плечо, которое специфически связывается с тканью-мишенью, и по меньшей мере одно другое плечо, которое специфически связывает таргетируемый конъюгат, при этом указанное одно плечо, которое специфически связывается с тканью-мишенью, представляет собой антитело 3F8 по настоящему изобретению или его фрагмент; и (B) введение таргетируемого конъюгата. Таргетируемый конъюгат можно выбирать из группы, состоящей из (i) DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH; (ii) Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH; (iii) DOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Asp-D-Lys(HSG)-NH; (iv) DOTA-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH; (v) DOTA-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH; (vi) DOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH; (vii) DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH; (viii) Ac-D-Phe-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-NH; (ix) Ac-D-Phe-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH; (x) Ac-D-Phe-D-Lys(Bz-DTPA)-D-Tyr-D-Lys(Bz-DTPA)-NH; (xi) Ac-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH; (xii) DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH; (xiii) (Tscg-Cys)-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(DOTA)-NH; (xiv) Tscg-D-Cys-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH; (xv) (Tscg-Cys)-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH; (xvi) Ac-D-Cys-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Ala-D-Lys(DOTA)-D-Cys-NH; (xvii) Ac-D-Cys-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH; (xviii) Ac-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH; (xix) Ac-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH; флуоресцеин и его производные; десферриоксамин и его производные.
2
2
В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способу таргетинга, включающему: (A) введение инъекцией субъекту, который нуждается в такой процедуре, F(ab) или F(ab') фрагмента биспецифического антитела, или одноцепочечного Fv-фрагмента, при этом биспецифическое антитело или фрагмент имеет первый связывающий сайт антитела, который специфически связывается с антигеном, узнаваемым моАт 3F8 по настоящему изобретению, и имеет второй связывающий сайт антитела, который специфически связывается с гаптеном, и предоставление возможности фрагменту антитела прочно связываться в сайтах-мишенях; (B) необязательно, выведение не связавшихся с мишенью фрагментов антитела с использованием очищающего средства, если биспецифический фрагмент в значительной степени не выводится из системы кровообращения в течение примерно 24 часов после инъекции, и введение инъекцией модифицированного гаптеном декстрана или дендримеров, или полимеров, которые быстро выводят не связавшееся с мишенью антитело или фрагменты в печень для деградации; (C) обнаружение присутствия гаптена методом ядерной томографии или обнаружение на малом расстоянии повышенных уровней прикрепленной метки в сайтах-мишенях с использованием сканеров или зондов в течение нескольких часов после первой инъекции, и проведение указанной процедуры, при этом указанное обнаружение осуществляют без использования контрастного вещества или субтракционного вещества. В предпочтительном варианте осуществления гаптен метят диагностическим/обнаруживающим радиоизотопом, средством, улучшающим качество МРТ-изображения, флуоресцентной меткой или хемилюминесцентной меткой. Флуоресцентные метки могут включать родамин, флуоресцеин, ренографин, флуоресцеина изотиоцианат, фикоэритрин, фикоцианин, аллофикоцианин, офтальдегид и флуорескамин. Хемилюминесцентные метки могут включать люминол, изолюминол, ароматический сложный эфир акридиния, имидазол, соль акридиния и оксалат сложного эфира. Средства, улучшающие качество МРТ-изображения, включают гадолиний и ферромагнитные вещества. Визуализация локализации комплекса антитело-гаптен позволяет обнаруживать интактные клетки опухолей, несущие GD2, что имеет важное значение для оценки стадии распространения опухоли, измерять ответ опухоли на лечение, выявлять ранний рецидив и наблюдать за развитием опухоли. Обнаружение локализации комплекса антитело-гаптен во время операции позволяет точно локализовать опухоль и выявлять скрытые зоны распространения заболевания, что способствует полной хирургической резекции, как части лечебной противораковой терапии.
Настоящее изобретение также относится к мультивалентному, мультиспецифическому антителу или его фрагменту, содержащему один или более антигенсвязывающих сайтов, имеющих аффинность в отношении антигена, узнаваемого антителом 3F8, и один или более связывающих гаптен сайтов, имеющих аффинность в отношении эпитопов или гаптенов на клетках (лимфоцитах, клетках-естественных киллерах, нейтрофилах, миелоидных клетках, стволовых клетках, нейральных стволовых клетках, мезенхимальных стволовых клетках, лейкозных клетках, цитотоксических лимфоцитах и B-лимфоцитах). Эти биспецифические антитела или фрагменты можно вводить различными путями введения, включая внутривенный, интратекальный и внутриопухолевый пути введения, млекопитающим, включая людей, для направления эндогенных клеток или экзогенных введенных инфузией клеток на участки или ткани, или клетки, несущие антиген GD2. Альтернативно, клетки можно вооружать ex vivo с использованием этих биспецифических антител или фрагментов перед введением млекопитающим, включая людей.
Настоящее изобретение также относится к применению последовательностей 3F8 или его фрагментов для создания химерных поверхностных рецепторов, специфичных для GD2, с использованием генетических методов для перенаправления клеток (лимфоцитов, клеток-естественных киллеров, нейтрофилов, миелоидных клеток, стволовых клеток, нейральных стволовых клеток, мезенхимальных стволовых клеток, лейкозных клеток, цитотоксических лимфоцитов и B-лимфоцитов) на несущие GD2 ткани, органы или опухоли, как для диагностических, так и терапевтических вариантов применения.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к выделенным молекулам нуклеиновой кислоты, содержащим, комплементарным или гибридизующимся с полинуклеотидом, кодирующим вышеуказанные специфические антитела к GD2, содержащие по меньшей мере одну его указанную последовательность, домен, часть или вариант.
Кроме того, настоящее изобретение относится к рекомбинантным векторам, содержащим указанные молекулы нуклеиновой кислоты антитела к GD2, клеткам-хозяевам, содержащим такие нуклеиновые кислоты и/или рекомбинантные векторы, а также к способам получения и/или применения таких нуклеиновых кислот антитела, векторов и/или клеток-хозяев. Таким образом, изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей по меньшей мере одно выделенное антитело к GD2 млекопитающего или его фрагмент; выделенному нуклеиново-кислотному вектору, содержащему выделенную нуклеиновую кислоту, и/или прокариотической или эукариотической клетке-хозяину, содержащей выделенную нуклеиновую кислоту. Клетка-хозяин, необязательно, может представлять собой по меньшей мере одну клетку, выбранную из клеток COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, CHO-S, DG44, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, миеломы или лимфомы, или любую производную, иммортализованную или трансформированную клетку из них. Также предложен способ получения по меньшей мере одного антитела к GD2, включающий трансляцию кодирующей антитело нуклеиновой кислоты в условиях in vitro, in vivo или in situ так, что антитело экспрессируется в поддающихся обнаружению или извлечению количествах, включая способы, в которых используют векторы, позволяющие амплифицировать экспрессию белка с использованием отбора клеток на рост и выживание под контролем метаболических путей или ферментов, включающих, но не ограничивающихся ими, dhfr (дигидрофолатредуктазу) или GS (глютамин синтетазу).
Настоящее изобретение также относится к по меньшей мере одному способу экспрессии по меньшей мере одного вышеуказанного антитела к GD2 в клетке-хозяине, включающему культивирование клетки-хозяина, описанной в настоящем документе, в условиях, в которых по меньшей мере одно антитело к GD2 экспрессируется в поддающихся обнаружению или извлечению количествах.
Настоящее изобретение также относится к по меньшей мере одной композиции, содержащей (a) выделенную кодирующую антитело к GD2 нуклеиновую кислоту и/или антитело, описанное в настоящем документе; и (b) подходящий носитель или разбавитель. Носитель или разбавитель может, необязательно, быть фармацевтически приемлемым, аналогично известным носителям или разбавителям. Кроме того, композиция может, необязательно, содержать по меньшей мере одно дополнительное соединение, белок или композицию. В некоторых из таких композиций химерные или гуманизированные антитела конъюгированы с цитотоксическим средством (то есть, средством, которое снижает жизнеспособность и/или функции клетки), таким как цитотоксическое терапевтическое средство, токсин или радиоактивный изотоп.
Кроме того, настоящее изобретение относится к по меньшей мере одному включающему антитело к GD2 способу или композиции для введения терапевтически эффективного количества с целью модулирования или лечения по меньшей мере одного связанного с GD2 состояния в клетке, ткани, органе, организме животного или пациента, и/или до, после или во время соответствующего состояния, как известно в данной области и/или как описано в настоящем документе. Таким образом, изобретение относится к способу диагностирования или лечения связанного с GD2 состояния в клетке, ткани, органе или организме животного, включающему создание контакта или введение композиции, содержащей эффективное количество по меньшей мере одного выделенного антитела к GD2 или его фрагмента по изобретению в клетку, ткань, орган или организм животного. Кроме того, способ может, необязательно, включать использование эффективного количества 0,001-50 мг/килограмм антитела к GD2 по изобретению для клеток, ткани, органа или организма животного. Кроме того, способ может, необязательно, включать создание контакта или введение по меньшей мере одним способом введения, выбранным из парентерального, подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрисуставного, внутрибронхиального, внутрибрюшинного, интракапсулярного, внутрихрящевого, внутриполостного, внутриклеточного, внутримозжечкового, интрацеребровентрикулярного, внутрикишечного, интрацервикального, внутрижелудочного, внутрипеченочного, интрамиокардиального, внутрикостного, внутритазового, интраперикардиального, внутрибрюшинного, интраплеврального, интрапростатического, внутрилегочного, интраректального, внутрипочечного, интраретинального, интраспинального, интратекального, через резервуар Оммайя, интравитреального, внутриглазного, внутрисуставного, интраторакального, внутриматочного, внутрипузырного, болюсного, вагинального, ректального, трансбуккального, подъязычного, интраназального или чрескожного введения. Кроме того, способ может, необязательно, включать введение до, одновременно или после создания контакта или введения антитела, по меньшей мере одной композиции, содержащей эффективное количество по меньшей мере одного соединения или белка, или клетки, выбранных из по меньшей мере одного из детектируемой метки или репортера, антагониста TNF, противоревматического препарата, мышечного релаксанта, наркотика, нестероидного противовоспалительного терапевтического средства (НПВС), анальгетика, анестетика, седативного препарата, местного анестетика, блокатора нервно-мышечного проведения, противомикробного препарата, антипсориазного препарата, кортикостероида, анаболического стероида, эритропоэтина, препарата для иммунизации, иммуноглобулина, антитела или полученного из антитела конъюгата, иммуносупрессора, гормона роста, терапевтического средства гормонозаместительной терапии, радиофармацевтического средства, антидепрессанта, антипсихотического препарата, стимулятора, лекарства от астмы, бета-агониста, ингаляционного стероида, адреналина или его аналогов, цитотоксического или другого противоракового средства, антиметаболита, такого как метотрексат, антипролиферативного средства, цитокина, интерлейкина, факторов роста, антагониста цитокина и анти-TNFα, лейкоцитов, T-клеток, LAK-клеток, TIL-клеток, клеток-естественных киллеров (NK), моноцитов, NKT-клеток, генетически измененных T-клеток или NK-клеток, или моноцитов или гранулоцитов.
Кроме того, настоящее изобретение относится к по меньшей мере одному способу, включающему антитело к GD2, для диагностирования по меньшей мере одного связанного с GD2 состояния в клетке, ткани, органе, организме животного или пациента, и/или до, после или во время соответствующего состояния, как известно в данной области и/или как описано в настоящем документе.
Настоящее изобретение также относится к по меньшей мере одной композиции, устройству и/или способу доставки для диагностирования по меньшей мере одного состояния с помощью антитела к GD2 по настоящему изобретению.
Также предложена композиция, содержащая по меньшей мере одно выделенное гуманизированное антитело к GD2 по настоящему изобретению и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Кроме того, композиция может, необязательно, содержать эффективное количество по меньшей мере одного соединения или белка, выбранного из по меньшей мере одного из детектируемой метки или репортера, цитотоксического или другого противоракового средства, антиметаболита, такого как метотрексат, антипролиферативного средства, цитокина или антагониста цитокина, антагониста TNF, противоревматического препарата, мышечного релаксанта, наркотика, нестероидного противовоспалительного терапевтического средства (НПВС), анальгетика, анестетика, седативного препарата, местного анестетика, блокатора нервно-мышечного проведения, противомикробного препарата, антипсориазного препарата, кортикостероида, анаболического стероида, эритропоэтина, препарата для иммунизации, иммуноглобулина, иммуносупрессора, гормона роста, терапевтического средства гормонозаместительной терапии, радиофармацевтического средства, антидепрессанта, антипсихотического препарата, стимулятора, лекарства от астмы, бета-агониста, ингаляционного стероида, адреналина или его аналога.
Также предложено медицинское устройство, включающее по меньшей мере одно выделенное антитело к GD2 млекопитающего по изобретению, при этом устройство подходит для создания контакта или введения по меньшей мере одного антитела к GD2 по меньшей мере одним способом введения, выбранным из парентерального, подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрисуставного, внутрибронхиального, внутрибрюшинного, интракапсулярного, внутрихрящевого, внутриполостного, внутриклеточного, внутримозжечкового, интрацеребровентрикулярного, интратекального, через резервуар Оммайя, интравитреального, внутриглазного, внутрикишечного, интрацервикального, внутрижелудочного, внутрипеченочного, интрамиокардиального, внутрикостного, внутритазового, интраперикардиального, внутрибрюшинного, интраплеврального, интрапростатического, внутрилегочного, интраректального, внутрипочечного, интраретинального, интраспинального, внутрисуставного, интраторакального, внутриматочного, внутрипузырного, болюсного, вагинального, ректального, трансбуккального, подъязычного, интраназального или чрескожного введения.
В следующем аспекте изобретение относится к набору, включающему по меньшей мере одно химерное или гуманизированное антитело к GD2 или фрагмент по изобретению в лиофилизированной форме в первом контейнере и, необязательно, второй контейнер, содержащий стерильную воду, стерильную забуференную воду или по меньшей мере один консервант, выбранный из группы, состоящей из фенола, м-крезола, п-крезола, о-крезола, хлоркрезола, бензилового спирта, фенилртутного нитрита, феноксиэтанола, формальдегида, хлорбутанола, хлорида магния, алкилпарабена, бензалкония хлорида, бензэтония хлорида, натрия дегидроацетата и тимеросала, маннита, сахарозы, маннозы, других сахаров, твина 80, или их смеси в водном разбавителе. В одном аспекте в наборе концентрацию антитела к GD2 или его указанной части или варианта в первом контейнере восстанавливают до концентрации от примерно 0,1 мг/мл до примерно 500 мг/мл с помощью содержимого второго контейнера. В другом аспекте второй контейнер дополнительно содержит изотоническое средство. В другом аспекте второй контейнер дополнительно содержит физиологически приемлемый буфер. В одном аспекте изобретение относится к способу лечения по меньшей мере одного связанного с GD2 состояния, включающему введение пациенту, который нуждается в этом, препарата, предоставленного в наборе и восстановленного перед введением.
Также предложено изделие для фармацевтического или диагностического использования применительно к людям, включающее упаковочный материал и контейнер, содержащий раствор или лиофилизированную форму по меньшей мере одного выделенного химерного или гуманизированного антитела к GD2 по настоящему изобретению. Изделие может, необязательно, включать контейнер в качестве компонента устройства или системы доставки для парентерального, подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрисуставного, внутрибронхиального, внутрибрюшинного, интракапсулярного, внутрихрящевого, внутриполостного, внутриклеточного, внутримозжечкового, интрацеребровентрикулярного, интратекального, через резервуар Оммайя, интравитреального, внутриглазного, внутрикишечного, интрацервикального, внутрижелудочного, внутрипеченочного, интрамиокардиального, внутрикостного, внутритазового, интраперикардиального, внутрибрюшинного, интраплеврального, интрапростатического, внутрилегочного, интраректального, внутрипочечного, интраретинального, интраспинального, внутрисуставного, интраторакального, внутриматочного, внутрипузырного, болюсного, вагинального, ректального, трансбуккального, подъязычного, интраназального или чрескожного введения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Включенные в настоящий документ чертежи, состоящие из следующих фигур, предназначены исключительно для иллюстративных целей, а не для ограничения изобретения.
На фигуре 1 показана интенсивность окрашивания опухолей различных типов с помощью hu3F8V1 scFv.
На фигуре 2 приведена химическая структура конъюгата биотин-ПЭГ-GD2, полученного из азидо-GD2-олигосахарида в результате реакции с биотин-(ПЭГ)4-алкином с использованием Click Chemistry.
На фигуре 3 приведены сенсограммы Biacore скоростей диссоциации для иллюстративных hu3F8V1 IgG.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НЕКОТОРЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Некоторые определения
В следующем далее описании широко используется ряд терминов, используемых в технологии рекомбинантной ДНК и иммунологии. Для того чтобы обеспечить более четкое и полное понимание спецификации и формулы изобретения, включая объем изобретения, обозначенный такими терминами, приведены следующие определения.
Взрослый: Используемый в настоящем документе термин «взрослый» относится к человеку в возрасте восемнадцати лет или старше. Масса тела взрослых людей может варьироваться в широких пределах, как правило, находясь в диапазоне от 90 фунтов до 250 фунтов.
Аффинность: Как известно в данной области, «аффинность» является мерой прочности связывания, с которой конкретный лиганд (например, антитело) связывается со своим партнером (например, эпитопом). Аффинность можно измерять различными способами.
2
Аминокислота: Используемый в настоящем документе термин «аминокислота» в самом широком смысле относится к любому соединению и/или веществу, которое может быть включено в полипептидную цепь. В некоторых вариантах осуществления аминокислота имеет общую структуру HN-C(H)(R)-COOH. В некоторых вариантах осуществления аминокислота представляет собой природную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления аминокислота представляет собой синтетическую аминокислоту; в некоторых вариантах осуществления аминокислота представляет собой D-аминокислоту; в некоторых вариантах осуществления аминокислота представляет собой L-аминокислоту. «Стандартная аминокислота» означает любую из двадцати стандартных L-аминокислот, обычно встречающихся в природных пептидах. «Нестандартная аминокислота» означает любую аминокислоту, отличную от стандартной аминокислоты, независимо от того, получена ли она синтетическим путем или из природного источника. Используемый в настоящем документе термин «синтетическая аминокислота» охватывает химически модифицированные аминокислоты, включая, но не ограничиваясь ими, соли, аминокислотные производные (такие как амиды) и/или заместители. Аминокислоты, включая карбокси- и/или аминоконцевые аминокислоты в пептидах, могут быть модифицированы путем метилирования, амидирования, ацетилирования, защитных групп и/или замены другими химическими группами, которые могут изменять период полураспада пептида в системе кровообращения без отрицательного влияния на его активность. Аминокислоты могут участвовать в образовании дисульфидной связи. Аминокислоты могут содержать одну или более посттрансляционных модификаций, таких как связь с одним или более химическими фрагментами (например, метильными группами, ацетатными группами, ацетильными группами, фосфатными группами, формильными фрагментами, изопреноидными группами, сульфатными группами, полиэтиленгликольными фрагментами, липидными фрагментами, углеводными фрагментами, фрагментами биотина и так далее). Термин «аминокислота» используется взаимозаменяемо с термином «аминокислотный остаток» и может означать свободную аминокислоту и/или аминокислотный остаток пептида. Из контекста, в котором используется термин, будет понятно, относится ли он к свободной аминокислоте или остатку пептида.
Животное: Используемый в настоящем документе термин «животное» относится к любому члену царства животных. В некоторых вариантах осуществления термин «животное» относится к людям любого пола и на любой стадии развития. В некоторых вариантах осуществления термин «животное» относится к животным, отличным от людей, на любой стадии развития. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, представляет собой млекопитающее (например, грызуна, мышь, крысу, кролика, обезьяну, собаку, кошку, овцу, крупный рогатый скот, приматов и/или свинью). В некоторых вариантах осуществления животные включают, но не ограничиваются ими, млекопитающих, птиц, рептилий, амфибий, рыб, насекомых и/или червей. В конкретных вариантах осуществления животное подвержено инфекции DV. В некоторых вариантах осуществления животное может представлять собой трансгенное животное, генетически измененное животное и/или клон.
2
Антитело: Термин «антитело» является признанным в данной области термином и должен включать молекулы или активные фрагменты молекул, которые связывают известные антигены. Примеры активных фрагментов молекул, которые связывают известные антигены, включают Fab и F(ab') фрагменты. Эти активные фрагменты можно получать из антитела по настоящему изобретению с помощью ряда методик. Например, очищенные моноклональные антитела можно расщеплять ферментом, таким как пепсин, и подвергать ВЭЖХ гель-фильтрации. Затем соответствующую фракцию, содержащую Fab-фрагменты, можно собирать и концентрировать фильтрованием через мембрану, и тому подобное. Для более подробного описания общих методов выделения активных фрагментов антител смотри, например, Khaw, B.A. et al. J. Nucl. Med. 23: 1011-1019 (1982). Термин «антитело» также включает биспецифические и химерные антитела, а также другие возможные форматы.
В некоторых вариантах осуществления антитело, описанное в настоящем документе, представляет собой или содержит полноразмерную молекулу иммуноглобулина (например, IgG антитело) или иммунологически активную (то есть, специфически связывающую) часть молекулы иммуноглобулина, такую как фрагмент антитела.
2
2
Фрагмент антитела представляет собой часть антитела, такую как F(ab'), F(ab), Fab', Fab, Fv, sFv и тому подобное. Независимо от структуры, фрагмент антитела связывает тот же антиген, который узнается интактным антителом. Например, фрагмент моноклонального антитела 3F8 связывает эпитоп, узнаваемый 3F8. Термин «фрагмент антитела» также включает любой синтетический или генно-инженерный белок, содержащий антигенсвязывающие структуры и действующий подобно антителу путем связывания со специфическим антигеном, с образованием комплекса. Например, фрагменты антител включают выделенные фрагменты, состоящие из вариабельных областей, например, «Fv» фрагменты, состоящие из вариабельных областей тяжелой или легкой цепей, рекомбинантные одноцепочечные полипептидные молекулы, в которых вариабельные области легкой и тяжелой цепей соединены пептидным линкером («scFv белки»), и минимальные единицы распознавания, состоящие из аминокислотных остатков, которые представляют собой или имитируют гипервариабельную область.
Например, в некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела содержит одну или более, и в некоторых вариантах осуществления все, из определяющих комплементарность областей (CDR), присутствующих в тяжелой или легкой цепи родительского антитела. В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела дополнительно включает последовательность, смежную с CDR. В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела включает последовательность, идентичную части родительского интактного антитела; в некоторых вариантах осуществления часть включает 1, 2 или 3 CDR; в некоторых вариантах осуществления часть соответствует полноразмерной цепи. В некоторых вариантах осуществления часть имеет длину по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50 или более аминокислот.
Термин «моноклональные антитело» является признанным в данной области термином. Моноклональные антитела представляют собой моноспецифические антитела, которые являются одинаковыми, поскольку они продуцируются иммунными клетками одного типа, являющимися клонами уникальной родительской клетки.
Различные методы существуют в данной области для получения моноклональных антител. Например, моноклональные антитела можно получать методами рекомбинантной ДНК, такими как те, которые описаны в патенте США № 4816567. В данном контексте, термин «моноклональные антитело» означает антитело, полученное из одного эукариотического, фагового или прокариотического клона. ДНК, кодирующую моноклональные антитела по изобретению, можно легко выделять и секвенировать с использованием общепринятых методов (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи мышиных антител, или такие цепи из человеческих, гуманизированных антител или других источников). После выделения ДНК можно помещать в экспрессионные векторы, которые затем вводят трансформацией в клетки-хозяева, такие как клетки NS0, обезьяньи клетки COS, клетки яичника китайского хомячка (CHO), дрожжевые клетки, клетки водорослей, яйца или клетки миеломы, которые без этого не продуцируют белок иммуноглобулина, чтобы моноклональные антитела синтезировались в рекомбинантных клетках-хозяевах. ДНК также можно модифицировать, например, путем замены кодирующими последовательностями для константных доменов тяжелой и легкой цепей человеческого антитела гомологичных последовательностей антитела нужных видов (патент США № 4816567, Morrison et al., выше) или путем ковалентного присоединения к кодирующей последовательности иммуноглобулина всей или части кодирующей последовательности для не-иммуноглобулинового полипептида. Такой не-иммуноглобулиновый полипептид может заменять константные домены антитела по изобретению или может заменять вариабельные домены одного антигенсвязывающего сайта антитела по изобретению для получения химерного двухвалентного антитела.
В некоторых вариантах осуществления «агент на основе антитела» представляет собой или содержит антитело или его фрагмент, или агент, который содержит или состоит из такого антитела или его фрагмента.
Сопоставимые: Термин «сопоставимые» используют в настоящем документе для описания двух (или более) совокупностей условий или обстоятельств, которые являются достаточно сходными между собой, чтобы можно было сравнивать полученные результаты или наблюдаемые явления. В некоторых вариантах осуществления сопоставимые совокупности условий или обстоятельств характеризуются множеством по существу идентичных характеристик и одной или небольшим количеством различающихся характеристик. Специалистам в данной области будет понятно, что совокупности условий сопоставимы друг с другом, когда они характеризуются достаточным количеством и типом по существу идентичных характеристик, чтобы сделать обоснованный вывод о том, что различия в полученных результатах или наблюдаемых явлениях при разных совокупностях условий или обстоятельств вызваны или обусловлены различиями в тех характеристиках, которые варьируются.
Соответствующие: Используемый в настоящем документе термин «соответствующие» часто используют для обозначения положения/наименования аминокислотного остатка в интересующем полипептиде. Специалистам будет понятно, что в целях упрощения остатки в полипептиде часто обозначают, используя каноническую систему нумерации, основанную на эталонном родственном полипептиде, так что аминокислота, «соответствующая» остатку в положении 190, например, не обязательно должна быть фактически 190-й аминокислотой в конкретной аминокислотной цепи, но скорее соответствует остатку, находящемуся в положении 190 в эталонном полипептиде; специалист в данной области легко поймет, как определять «соответствующие» аминокислоты.
Лекарственная форма: Используемые в настоящем документе термины «лекарственная форма» и «стандартная лекарственная форма» означают физически дискретную единицу терапевтического белка (например, антитела) для пациента, получающего лечение. Каждая единица содержит заранее определенное количество активного материала, рассчитанное для достижения желаемого терапевтического эффекта. Следует понимать, однако, что общая доза композиции будет определена лечащим врачом в рамках обоснованного медицинского заключения.
Режим дозирования: Используемый в настоящем документе термин «режим дозирования» (или «терапевтический режим») представляет собой совокупность стандартных доз (как правило, более одной), которые вводят субъекту в отдельности, как правило, через определенные интервалы времени. В некоторых вариантах осуществления конкретное терапевтическое средство имеет рекомендованный режим дозирования, который может включать одну или более доз. В некоторых вариантах осуществления режим дозирования включает несколько доз, введение каждой из которых выполняют через равные интервалы времени; в некоторых вариантах осуществления режим дозирования включает несколько доз, и по меньшей мере два разных интервала времени разделяют введение отдельных доз. В некоторых вариантах осуществления все дозы в режиме дозирования являются одинаковыми в количественном выражении. В некоторых вариантах осуществления разные дозы в режиме дозирования отличаются в количественном выражении. В некоторых вариантах осуществления режим дозирования включает первую дозу с одним количеством дозы, за которой следует одна или более дополнительных доз со вторым количеством дозы, отличающимся от первого количества дозы. В некоторых вариантах осуществления режим дозирования включает первую дозу с первым количеством дозы, за которой следует одна или более дополнительных доз со вторым количеством дозы, таким же, что и первое количество дозы.
Эпитоп: Термин «эпитоп» является признанным в данной области. Специалисты в данной области определяют его как область антигена или антигенов, которая взаимодействует с антителом. Эпитоп пептидного или белкового или сахарного антигена может быть линейным или конформационным, или может быть образован смежными или несмежными аминокислотными и/или сахарными остатками последовательностей антигена. Молекула GD2, как и многие углеводы, содержит множество эпитопов. Специалистам в данной области будет понятно, что в некоторых вариантах осуществления предложенные агенты на основе антител могут связывать (например, перекрестно реагировать) варианты их целевых эпитопов, например, которые могут содержать замены, модификации, добавления, делеции или химические миметики одного или более аминокислотных или сахарных остатков. Такие вариантные эпитопы и их применение, наряду с предложенными агентами на основе антител, входят в объем настоящего изобретения. Антиидиотипические антитела представляют собой вариант осуществления настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные или сахарные эпитопы, или пептидомиметики/химические соединения, или антиидиотипические антитела являются удобным инструментом, например, для элюирования GD2 с моАт или моАт с GD2 на иммуноаффинных колонках. Может быть возможным дальнейшее укорочение этих эпитопов.
Идентичность: Используемый в настоящем документе термин «идентичность» относится к общему сходству между полимерными молекулами, например, между молекулами нуклеиновой кислоты (например, молекулами ДНК и/или молекулами РНК) и/или между полипептидными молекулами. Расчет процента идентичности двух нуклеотидных последовательностей, например, можно производить путем выравнивания двух последовательностей с целью оптимального сравнения (например, можно вносить разрывы в одну или обе из первой и второй нуклеотидных последовательностей для оптимального выравнивания, и неидентичными последовательностями можно пренебрегать для целей сравнения). В конкретных вариантах осуществления длина последовательности, выравниваемой для целей сравнения, составляет по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, или практически 100% от длины эталонной последовательности. Затем сравнивают нуклеотиды в соответствующих нуклеотидных положениях. Если положение в первой последовательности занято тем же нуклеотидом, что и соответствующее положение во второй последовательности, то молекулы идентичны по этому положению. Процент идентичности между двумя последовательностями зависит от числа идентичных положений между последовательностями, принимая во внимание количество разрывов и длину каждого разрыва, который необходимо вносить для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями можно выполнять с помощью математического алгоритма. Например, процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями можно определять, используя алгоритм Майерса-Миллера (CABIOS, 1989, 4: 11-17), который включен в программу ALIGN (версия 2.0) с использованием таблицы весов замен остатков PAM120, штрафа за длину разрыва 12 и штрафа за внесение разрыва 4. Альтернативно, процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательности можно определять с помощью программы GAP в пакете программ GCG, используя матрицу NWSgapdna.CMP.
Выделенные: Используемый в настоящем документе термин «выделенные» относится к веществу и/или структурной единице, которые были (1) отделены от по меньшей мере некоторых компонентов, с которыми они были связаны во время исходного продуцирования (или в природе и/или в экспериментальных условиях), и/или (2) произведены, получены и/или изготовлены рукой человека. Выделенные вещества и/или структурные единицы могут быть отделены от примерно 10%, примерно 20%, примерно 30%, примерно 40%, примерно 50%, примерно 60%, примерно 70%, примерно 80%, примерно 90%, примерно 91%, примерно 92%, примерно 93%, примерно 94%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98%, примерно 99%, или более чем примерно 99% других компонентов, с которыми они изначально были связаны. В некоторых вариантах осуществления выделенные вещества являются на примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 91%, примерно 92%, примерно 93%, примерно 94%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98%, примерно 99%, или более чем примерно 99% чистыми. При использовании в настоящем документе вещество является «чистым», если оно практически свободно от других компонентов. При использовании в настоящем документе расчет процента чистоты выделенных веществ и/или структурных единиц не должен включать наполнители (например, буфер, растворитель, воду и так далее).
Голые: В некоторых вариантах осуществления агент на основе антитела может быть назван «голым», если он не конъюгирован с полезной нагрузкой (например, диагностическим или терапевтическим средством). Такие голые агенты на основе антител полезны в различных контекстах, в том числе и потому, что Fc часть молекулы антитела обеспечивает эффекторные функции, такие как фиксация комплемента и ADCC (антителозависимая клеточная цитотоксичность), которые могут запускать механизмы, приводящие к лизису клеток. Голые антитела включают как поликлональные, так и моноклональные антитела, а также некоторые рекомбинантные антитела, такие как химерные, гуманизированные или человеческие антитела. Тем не менее, возможно, что Fc часть не нужна для терапевтической функции, антитело скорее оказывает свой терапевтический эффект с помощью других механизмов, таких как индукция покоя клеточного цикла и апоптоз. В этом случае голые антитела также включают неконъюгированные фрагменты антител, определенные выше.
Химерные: «Химерное» антитело представляет собой рекомбинантный белок, содержащий вариабельные домены, включая определяющие комплементарность области (CDR) антитела, происходящие из антитела одних видов, предпочтительно антитела грызунов, в то время как константные домены молекулы антитела происходят из константных доменов человеческого антитела. Для ветеринарного применения константные домены химерного антитела могут быть получены из константных доменов других видов, например, кошки или собаки.
Гуманизированные: «Гуманизированное» антитело представляет собой рекомбинантный белок, в котором CDR из антитела от одного вида, например, антитела грызунов, перенены из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей антитела грызунов в вариабельные домены тяжелой и легкой цепей антитела человека. Константные домены молекулы антитела происходят из константных доменов человеческого антитела.
Человеческие: Термин «человеческие» часто используют для обозначения антител, полученных от трансгенных мышей, которые были «генетически модифицированы» для продуцирования специфических человеческих антител в ответ на иммунизацию антигеном. В таком методе элементы локуса тяжелой и легкой цепи антитела человека вводят линейным мышам, которые происходят из линий мышей с эмбриональными стволовыми клетками, содержащими целевые нарушения эндогенных локусов тяжелой цепи и легкой цепи. Трансгенные мыши могут синтезировать человеческие антитела, специфичные для человеческих антигенов, и мышей можно использовать для получения секретирующих человеческие антитела гибридом. Методы получения человеческих антител от трансгенных мышей описаны в Green et al., Nature Genet. 7: 13 (1994), Lonberg et al., Nature 368: 856 (1994) и Taylor et al., Int. Immun. 6: 579 (1994). Полностью человеческое антитело можно также конструировать методами генетической или хромосомной трансфекции, а также с помощью технологии фагового дисплея, все из которых известны в данной области. Смотри, например, McCafferty et al., Nature 348: 552-553 (1990) для информации о получении человеческих антител и их фрагментов in vitro из репертуаров генов вариабельных доменов иммуноглобулинов от иммунизированных доноров. В этом методе гены вариабельных доменов антитела клонируют в рамке считывания с геном или основного, или малого белка оболочки нитчатого бактериофага, и они экспонируются в виде функциональных фрагментов антител на поверхности фаговой частицы. Поскольку частица нитчатого бактериофага содержит копию одноцепочечной ДНК генома фага, отбор, основанный на функциональных свойствах антитела, также приводит к отбору гена, кодирующего антитело, проявляющее эти свойства. Таким образом, фаг имитирует некоторые из свойств В-клетки. Фаговый дисплей можно выполнять в различных форматах, для соответствующего обзора смотри, например, Johnson and Chiswell, Current Opinion in Structural Biology 3: 5564-571 (1993).
Человеческие антитела также можно получать с помощью активированных in vitro B-клеток. Смотри патенты США №№ 5567610 и 5229275, полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.
Терапевтическое средство: Терапевтическое средство представляет собой соединение, которое при введении в конкретном режиме, как правило, приводит к достижению желаемого терапевтического результата. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство можно вводить отдельно, одновременно или последовательно с молекулой антитела или в виде конъюгата с молекулой антитела, то есть, антителом или фрагментом, или субфрагментом антитела, и оно полезно для лечения заболевания. Примеры лекарственных средств включают антитела, фрагменты антител, лекарственные средства, токсины, нуклеазы, гормоны, иммуномодуляторы, хелаторы, соединения бора, фотоактивные средства или красители и радиоизотопы.
223
Диагностическое средство: Диагностическое средство представляет собой соединение, которое можно обнаруживать после введения. В некоторых вариантах осуществления диагностическое средство вводят в виде конъюгата с молекулой антитела, то есть, антителом или фрагментом, или субфрагментом антитела, и оно полезно для диагностирования или выявления заболевания за счет локализации клеток, содержащих антиген. Полезные диагностические средства включают, но не ограничиваются ими, радиоизотопы, красители (например, с комплексом биотин-стрептавидин), контрастные вещества, флуоресцентные соединения или молекулы и усилители (например, парамагнитные ионы) для магнитно-резонансной томографии (МРТ). В патенте США № 6331175 описан метод МРТ и получение антител, конъюгированных с усилителем для МРТ, и полное содержание данного патента включено в настоящий документ посредством ссылки. Предпочтительно, диагностические средства выбирают из группы, состоящей из радиоизотопов, усилителей для использования в магнитно-резонансной томографии и флуоресцентных соединений. В некоторых вариантах осуществления диагностическое средство может содержать радиоактивную или нерадиоактивную метку, контрастное вещество (например, для магнитно-резонансной томографии, компьютерной томографии или ультразвукового исследования), и радиоактивная метка может представлять собой гамма-, бета-, альфа-, оже-электрон- или позитрон-излучающий изотоп. Для того чтобы нагрузить компонент антитела радиоактивными металлами или парамагнитными ионами, может потребоваться проводить реакцию его с реагентом, имеющим длинный «хвост», к которому присоединены несколько хелатирующих групп для связывания ионов. Такой «хвост» может представлять собой полимер, такой как полилизин, полисахарид или другая дериватизированная или поддающаяся дериватизации цепь, имеющая боковые группы, с которыми могут быть связаны хелатирующие группы, такие как, например, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), диэтилентриаминпентауксусная кислота (ДТПА), порфирины, полиамины, краун-эфиры, бис-тиосемикарбазоны, полиоксимы и тому подобные группы, которые, как известно, можно использовать для этой цели. Хелаты можно связывать с антителами, используя стандартные химические методы. Хелат, как правило, связывают с антителом с помощью группы, которая позволяет образовывать связь с молекулой с минимальной потерей иммунореактивности и минимальной агрегацией и/или внутренней сшивкой; другие, более необычные методы и реагенты для конъюгирования хелатов с антителами раскрыты в патенте США № 4824659, выданном Hawthorne и озаглавленном «Antibody Conjugates», выпущенном 25 апреля 1989 г., полное содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки. Особенно полезные металл-хелатные сочетания включают 2-бензил-ДТПА и его монометильные и циклогексильные аналоги, используемые с диагностическими изотопами для радио-визуализации. Те же хелаты в виде комплексов с нерадиоактивными металлами, такими как марганец, железо и гадолиний, полезны для МРТ при использовании с антителами по изобретению. Макроциклические хелаты, такие как NOTA, DOTA и TETA, можно использовать с различными металлами и радиоактивными металлами, особенно с радиоактивными изотопами галлия, иттрия и меди, соответственно. Такие металл-хелатные комплексы можно делать очень стабильными за счет точного подбора размера кольца для интересующего металла. Другие кольцеобразные хелаты, такие как макроциклические полиэфиры, которые представляют интерес с точки зрения стабильного связывания радионуклидов, например, Ra для RAIT, входят в объем изобретения.
Иммуноконъюгат: «Иммуноконъюгат» представляет собой конъюгат (то есть наличие ковалентной связи) компонента антитела с полезной нагрузкой (например, терапевтическим или диагностическим средством).
Иммуномодулятор: «Иммуномодулятор» представляет собой средство, которое, в случае его присутствия, как правило, стимулирует иммунные клетки к пролиферации или активации в каскадных реакциях иммунного ответа, например, макрофаги, B-клетки и/или T-клетки. Примером иммуномодулятора, описанного в настоящем документе, является цитокин. Как понятно для специалиста в данной области, некоторые интерлейкины и интерфероны являются примерами цитокинов, стимулирующих пролиферацию T-клеток или других иммунных клеток.
Экспрессионный вектор: «Экспрессионный вектор» представляет собой молекулу ДНК, содержащую ген, который экспрессируется в клетке-хозяине. Как правило, экспрессия гена находится под контролем определенных регуляторных элементов, включая конститутивные или индуцируемые промоторы, тканеспецифические регуляторные элементы и энхансеры. В этом случае говорят, что ген «функционально связан» с регуляторными элементами.
Клетка-хозяин: Рекомбинантная «клетка-хозяин» может быть любой прокариотической или эукариотической клеткой, которая содержит либо клонирующий вектор, либо экспрессионный вектор. Этот термин также включает такие прокариотические или эукариотические клетки, а также трансгенных животных, которые были генетически модифицированы для содержания клонированного гена(ов) в хромосоме или геноме клетки-хозяина или клеток хозяина.
Мутант: Используемый в настоящем документе термин «мутант» относится к соединению, которое имеет значительную структурную идентичность с эталонным соединением, но отличается структурно от эталонного соединения наличием или количеством одного или более химических фрагментов при сравнении с эталонным соединением. Во многих вариантах осуществления мутант также отличается функционально от своего эталонного соединения. Как правило, решение о том, может ли конкретное соединение по праву считаться «мутантом» эталонного соединения, основано на степени его структурного сходства с эталонным соединением. Как понимают специалисты в данной области, любое биологическое или химическое эталонное соединение имеет определенные характерные структурные элементы. Мутант, по определению, является отдельным химическим соединением, которое разделяет один или более из таких характерных структурных элементов. В качестве лишь нескольких примеров, малая молекула может иметь характерный структурный элемент ядра (например, макроциклическое ядро) и/или один или более характерных боковых фрагментов, таким образом, мутант малой молекулы представляет собой молекулу, которая имеет такой же структурный элемент ядра и характерные боковые фрагменты, но отличается одним из боковых фрагментов и/или типами имеющихся связей (одиночные против двойных, E против Z, и так далее) в составе ядра; полипептид может иметь характерный элемент последовательности, состоящий из множества аминокислот, занимающих определенные положения относительно друг друга в линейном или трехмерном пространстве и/или участвующих в выполнении конкретной биологической функции; нуклеиновая кислота может иметь характерный элемент последовательности, состоящий из множества нуклеотидных остатков, занимающих определенные положения относительно друг друга в линейном или трехмерном пространстве. Например, мутантный полипептид может отличаться от эталонного полипептида за счет одного или более различий в аминокислотной последовательности и/или одного или более различий в химических фрагментах (например, углеводах, липидах и так далее), ковалентно присоединенных к полипептидному каркасу. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид имеет общую идентичность последовательности с эталонным полипептидом, составляющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% или 99%. Альтернативно или дополнительно, в некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид не разделяет по меньшей мере один характерный элемент последовательности с эталонным полипептидом. В некоторых вариантах осуществления эталонный полипептид обладает одним или более видами биологической активности. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид разделяет один или более видов биологической активности эталонного полипептида. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид лишен одного или более из видов биологической активности эталонного полипептида. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид имеет сниженный уровень одного или более из видов биологической активности по сравнению с эталонным полипептидом.
Мультиспецифические: «Мультиспецифическое» антитело представляет собой антитело, которое может связываться одновременно с по меньшей мере двумя мишенями, имеющими разную структуру, например, двумя разными антигенами, двумя разными эпитопами на одном и том же антигене или гаптеном и антигеном или эпитопом. Одна специфичность может быть, например, для антигена или эпитопа B-клетки, T-клетки, миелоидной, плазматической или тучной клетки. Другая специфичность может быть для другого антигена на клетке того же типа, например, CD20, CD19, CD21, CD23, CD46, CD80, HLA-DR, CD74 или CD22 на B-клетках. Мультиспецифические, мультивалентные антитела представляют собой конструкты, имеющие более одного сайта связывания, и сайты связывания имеют разную специфичность. Например, биспецифическое диатело, в котором один сайт связывания реагирует с одним антигеном и другой сайт - с другим антигеном.
Биспецифические: «Биспецифическое» антитело представляет собой антитело, которое может связываться одновременно с двумя мишенями, имеющими разную структуру. Биспецифические антитела (бсАт) и биспецифические фрагменты антител (бсFab) имеют по меньшей мере одно плечо, которое специфически связывается, например, с GD2, и по меньшей мере одно плечо, которое специфически связывается с таргетируемым конъюгатом, несущим терапевтическое или диагностическое средство. Различные биспецифические слитые белки можно получать методами молекулярной инженерии. В одном варианте биспецифический слитый белок является двухвалентным, состоящим, например, из scFv с одним сайтом связывания для одного антигена и Fab-фрагмента с одним сайтом связывания для второго антигена. В другом варианте биспецифический слитый белок является четырехвалентным, состоящим, например, из IgG с двумя сайтами связывания для одного антигена и двумя идентичными scFv для второго антигена.
С помощью разработанных в последнее время методов получения биспецифических моАт можно получать сконструированные рекомбинантные моАт, которые имеют дополнительные остатки цистеина, так что они могут иметь более прочные сшивки, чем иммуноглобулины обычных изотипов. Смотри, например, FitzGerald et al., Protein Eng. 10(10): 1221-1225, 1997. Другой подход заключается в конструировании рекомбинантных слитых белков, объединяющих два или более различных сегментов одноцепочечных антител или фрагментов антитела с нужными двойными специфичностями. Смотри, например, Coloma et al., Nature Biotech. 15: 159-163, 1997. Различные биспецифические слитые белки можно получать методами молекулярной инженерии.
Биспецифические слитые белки, объединяющие два или более разных одноцепочечных антител или фрагментов антител, получают аналогичным образом. Можно использовать рекомбинантные методы для получения различных слитых белков. В некоторых вариантах осуществления гибкий линкер соединяет scFv с константной областью тяжелой цепи антитела 3F8. Альтернативно, scFv может быть связан с константной областью легкой цепи другого гуманизированного антитела. Соответствующие последовательности линкера, необходимые для связывания в одной рамке считывания тяжелой цепи Fd с scFv, вводят в VL и Vкаппа домены при помощи реакций ПЦР. Фрагмент ДНК, кодирующий scFv, затем лигируют в промежуточный вектор, содержащий последовательность ДНК, кодирующую домен CH1. Полученный конструкт scFv-CH1 вырезают и лигируют в вектор, содержащий последовательность ДНК, кодирующую VH-область антитела hu3F8. Полученный вектор можно использовать для трансфицирования соответствующей клетки-хозяина, такой как клетка млекопитающего, для экспрессии биспецифического слитого белка.
В некоторых вариантах осуществления антитела hu3F8 и их фрагменты по настоящему изобретению также можно использовать для получения функциональных биспецифических одноцепочечных антител (боцАт) (bscAb), также называемых диателами, и их можно продуцировать в клетках млекопитающих с использованием рекомбинантных методов. Смотри, например, публикацию Mack et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 92: 7021-7025, 1995, содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки. Например, боцАт получают путем соединения двух одноцепочечных Fv-фрагментов через глицин-сериновый линкер с использованием рекомбинантных методов. V-домены легкой цепи и V-домены тяжелой цепи двух интересующих антител выделяют с использованием стандартных методов ПЦР, известных в данной области. Биспецифические одноцепочечные антитела и биспецифические слитые белки включены в объем настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления конечной целью применения биспецифических диател, описанных в настоящем документе, является предварительный таргетинг GD2-положительных клеток для последующей специфической доставки диагностических/обнаруживающих или лекарственных средств. Эти диатела избирательно связываются с целевыми антигенами с повышенной аффинностью и более продолжительным временем нахождения в нужном участке. Кроме того, не связанные с антигеном диатела быстро выводятся из организма и их воздействие на нормальные ткани сведено к минимуму. В некоторых конкретных вариантах осуществления диатела, используемые по настоящему изобретению, могут содержать или быть конъюгированы с одним или более диагностическими/обнаруживающими и/или лекарственными средствами, такими как, например, изотопы, лекарственные средства, токсины, цитокины, гормоны, факторы роста, конъюгаты, радиоактивные изотопы и металлы. Например, металл гадолиний используют для магнитно-резонансной томографии (МРТ). Радиоактивные изотопы также можно использовать в качестве диагностических и лекарственных средств (либо с диателами, либо иным образом), особенно те, которые находятся в энергетическом диапазоне от 60 до 4000 кэВ.
Таргетируемый конструкт может иметь разнообразную структуру, но его выбирают не только, чтобы избежать вызывания иммунных ответов, но и для быстрого in vivo клиренса при использовании в методе таргетинга с помощью бсАт. Гидрофобные агенты лучше всего вызывают сильные иммунные ответы, при том что гидрофильные агенты являются предпочтительными для быстрого in vivo клиренса; таким образом, должен быть соблюден баланс между гидрофобными и гидрофильными компонентами. Это достигается частично за счет использования гидрофильных хелаторов для компенсации характерной гидрофобности многих органических фрагментов. Кроме того, можно выбирать субъединицы таргетируемого конструкта, которые имеют противоположные свойства растворимости, например, пептиды, содержащие аминокислоты, некоторые из которых являются гидрофобными и некоторые из которых являются гидрофильными. Помимо пептидов можно использовать углеводы.
Пептид: Можно использовать пептиды, имеющие всего два аминокислотных остатка, предпочтительно от двух до десяти остатков, в некоторых вариантах осуществления также связанные с другими фрагментами, такими как хелаторы.
Полипептид: Термин «полипептид» используют в настоящем документе в качестве общего термина для обозначения природных белков, фрагментов или аналогов полипептидной последовательности. Таким образом, природные белковые фрагменты и аналоги являются видами рода полипептидов. Полипептиды по изобретению содержат молекулы тяжелой цепи иммуноглобулина, представленные SEQ ID NOS: 4, 5, 10, и молекулы легкой цепи иммуноглобулина, представленные SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 6, 7, 8, 9, а также молекулы антитела, образованные сочетаниями, включающими молекулы тяжелой цепи иммуноглобулина с молекулами легкой цепи иммуноглобулина, такими как молекулы легкой цепи каппа иммуноглобулина, и наоборот, а также их фрагменты и аналоги.
Линкер: В некоторых вариантах осуществления «линкер», используемый в конъюгате, должен иметь низкую молекулярную массу в сравнении с конъюгатом, предпочтительно иметь молекулярную массу менее 50000 дальтон, и предпочтительно менее чем примерно 20000 дальтон, 10000 дальтон или 5000 дальтон, включая ионы металлов, которые могут быть в хелатах. В некоторых вариантах осуществления наличие гидрофильных хелатных фрагментов на фрагментах линкера может способствовать быстрому in vivo клиренсу. Помимо гидрофильности хелаторы можно выбирать за их способность к связыванию металлов, и можно заменять, поскольку, по меньшей мере для тех линкеров, эпитоп бсАт которых является частью пептида или представляет собой нехелатный химический гаптен, узнавание металл-хелатного комплекса больше не является проблемой.
Мутант: Используемый в настоящем документе термин «мутант» относится к соединению, которое имеет значительную структурную идентичность с эталонным соединением, но отличается структурно от эталонного соединения наличием или количеством одного или более химических фрагментов при сравнении с эталонным соединением. Во многих вариантах осуществления мутант также отличается функционально от своего эталонного соединения. Как правило, решение о том, может ли конкретное соединение по праву считаться «мутантом» эталонного соединения, основано на степени его структурного сходства с эталонным соединением. Как понимают специалисты в данной области, любое биологическое или химическое эталонное соединение имеет определенные характерные структурные элементы. Мутант, по определению, является отдельным химическим соединением, которое разделяет один или более из таких характерных структурных элементов. В качестве лишь нескольких примеров, малая молекула может иметь характерный структурный элемент ядра (например, макроциклическое ядро) и/или один или более характерных боковых фрагментов, таким образом, мутант малой молекулы представляет собой молекулу, которая имеет такой же структурный элемент ядра и характерные боковые фрагменты, но отличается одним из боковых фрагментов и/или типами имеющихся связей (одиночные против двойных, E против Z, и так далее) в составе ядра; полипептид может иметь характерный элемент последовательности, состоящий из множества аминокислот, занимающих определенные положения относительно друг друга в линейном или трехмерном пространстве и/или участвующих в выполнении конкретной биологической функции; нуклеиновая кислота может иметь характерный элемент последовательности, состоящий из множества нуклеотидных остатков, занимающих определенные положения относительно друг друга в линейном или трехмерном пространстве. Например, мутантный полипептид может отличаться от эталонного полипептида за счет одного или более различий в аминокислотной последовательности и/или одного или более различий в химических фрагментах (например, углеводах, липидах и так далее), ковалентно присоединенных к полипептидному каркасу. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид имеет общую идентичность последовательности с эталонным полипептидом, составляющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% или 99%. Альтернативно или дополнительно, в некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид не разделяет по меньшей мере один характерный элемент последовательности с эталонным полипептидом. В некоторых вариантах осуществления эталонный полипептид обладает одним или более видами биологической активности. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид разделяет один или более видов биологической активности эталонного полипептида. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид лишен одного или более из видов биологической активности эталонного полипептида. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид имеет сниженный уровень одного или более из видов биологической активности по сравнению с эталонным полипептидом.
Хелатор: Хелатор, такой как DTPA, DOTA, TETA или NOTA, можно использовать в самых разных случаях для включения в конъюгаты. Те же хелаторы в комплексе с нерадиоактивными металлами, такими как Mn, Fe и Gd, можно использовать для МРТ вместе с бсАт по изобретению. Макроциклические хелаторы, такие как NOTA (1,4,7-триазациклононан-N,N',N''-триуксусная кислота), DOTA и TETA (п-бромацетамидобензилтетраэтиламинтетрауксусная кислота), можно использовать с различными металлами и радиоактивными металлами, особенно с радиоактивными изотопами Ga, Y и Cu, соответственно.
Конъюгат: В некоторых вариантах осуществления предложенные агенты на основе антител используют в конъюгатах. В некоторых конкретных вариантах осуществления можно получать конъюгаты с хелатором, таким как DTPA, DOTA, TETA или NOTA, или подходящим пептидом, с которым связана поддающаяся обнаружению метка, например, флуоресцентная молекула или цитотоксическое средство, такое как тяжелый металл или радиоактивный изотоп. Например, терапевтически полезный иммуноконъюгат можно получать путем конъюгирования фотоактивного средства или красителя со слитым белком антитела. Флуоресцентные композиции, такие как флуорохром и другие хромогены, или красители, такие как порфирины, чувствительные к видимому свету, были использованы для обнаружения и лечения лезий путем направления подходящего света на лезии. В терапии это получило название «фотооблучение», «фототерапия» или «фотодинамическая терапия» (Jori et al. (eds.), PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES (Libreria Progetto 1985), van den Bergh, Chem. Britain 22: 430 (1986)). Кроме того, для проведения фототерапии моноклональные антитела соединяют с фотоактивированными красителями. Mew et al., J. Immunol. 130: 1473 (1983), те же авторы, Cancer Res. 45: 4380 (1985), Oseroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8744 (1986), те же авторы, Photochem. Photobiol. 46: 83 (1987); Hasan et al., Prog. Clin. Biol. Res. 288: 471 (1989), Tatsuta et al., Lasers Surg. Med. 9: 422 (1989), Pelegrin et al., Cancer 67: 2529 (1991). Однако эти ранние исследования не включали использование эндоскопической терапии, особенно с применением фрагментов или субфрагментов антител. Таким образом, по настоящему изобретению предусмотрено терапевтическое применение иммуноконъюгатов, содержащих фотоактивные средства или красители.
Предотвращать: Используемые в настоящем документе термины «предотвращать», «предотвращающий» и «предотвращение» относятся к предотвращению рецидива или начала проявления одного или более симптомов заболевания у субъекта в результате введения профилактического или терапевтического средства.
Сочетание: Используемый в настоящем документе термин «в сочетании» означает использование более чем одного профилактического и/или терапевтического средства. Использование термина «в сочетании» не ограничивает порядок, в котором профилактические и/или терапевтические средства вводят субъекту, страдающему заболеванием. Первое профилактическое или терапевтическое средство можно вводить до (например, за 5 минут, 15 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа, 96 часов, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 8 недель или 12 недель), одновременно или после (например, через 5 минут, 15 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа, 96 часов, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 8 недель или 12 недель) введения второго профилактического или терапевтического средства субъекту, страдающему заболеванием.
Эффекторная функция: Используемый в настоящем документе термин «эффекторная функция» означает биохимическое событие, которое возникает вследствие взаимодействия Fc-области антитела с Fc-рецептором или лигандом. Эффекторные функции включают, но не ограничиваются ими, антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC), антителозависимый клеточноопосредованный фагоцитоз (ADCP) и комплемент-опосредованную цитотоксичность (CMC). Эффекторные функции включают как те, которые осуществляются после связывания антигена, так и те, которые осуществляются независимо от связывания антигена.
Эффекторная клетка: Используемый в настоящем документе термин «эффекторная клетка» означает клетку иммунной системы, которая экспрессирует один или более Fc-рецепторов и опосредует одну или более эффекторных функций. Эффекторные клетки включают, но не ограничиваются ими, моноциты, макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки, эозинофилы, тучные клетки, тромбоциты, большие гранулярные лимфоциты, клетки Лангерганса, клетки-естественные киллеры (NK), T-лимфоциты, B-лимфоциты, и могут быть из любого организма, включая, но не ограничиваясь ими, людей, мышей, крыс, кроликов и обезьян.
Fc-лиганд: Используемый в настоящем документе термин «Fc-лиганд» означает молекулу, предпочтительно полипептид, из любого организма, которая связывается с Fc-областью антитела, с образованием комплекса Fc-лиганд. Fc-лиганды включают, но не ограничиваются ими, FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16A), FcγRIIIB (CD16B), FcγRI (CD64), FcεRII (CD23), FcRn, C1q, C3, стафилококковый белок A, стрептококковый белок G и вирусный FcγR. Fc-лиганды могут включать неизвестные пока молекулы, которые связывают Fc.
Производное: Используемый в настоящем документе термин «производное» в контексте полипептидов или белков означает полипептид или белок, содержащий аминокислотную последовательность, которая была изменена в результате замен, делеций или добавлений аминокислотных остатков. Используемый в настоящем документе термин «производное» также означает полипептид или белок, который был модифицирован, например, путем ковалентного присоединения молекулы любого типа к полипептиду или белку. Например, но не в качестве ограничения, антитело может быть модифицировано, например, путем гликозилирования, ацетилирования, пегилирования, фосфорилирования, амидирования, дериватизации при помощи известных защитных/блокирующих групп, протеолитического расщепления, связи с клеточным лигандом или другим белком и так далее. Производное полипептида или белка можно получать путем химической модификации с использованием методов, известных специалистам в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, специфическое химическое расщепление, ацетилирование, формилирование, метаболический синтез туникамицина и так далее. Кроме того, производное полипептида или производное белка обладает функцией, аналогичной или идентичной функции полипептида или белка, из которого оно было получено.
Фрагмент: Используемый в настоящем документе термин «фрагмент» означает пептид или полипептид, содержащий аминокислотную последовательность из по меньшей мере 5 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 10 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 15 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 20 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 25 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 40 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 50 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 60 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 70 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 80 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 90 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 100 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 125 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 150 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 175 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 200 смежных аминокислотных остатков или по меньшей мере 250 смежных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности другого полипептида. В конкретном варианте осуществления фрагмент полипептида сохраняет по меньшей мере одну функцию полипептида.
Эффективное количество: Используемый в настоящем документе термин «эффективное количество» означает количество конкретного соединения, конъюгата или композиции, которое является необходимым или достаточным для реализации желаемого биологического эффекта. Эффективное количество конкретного соединения, конъюгата или композиции в соответствии со способами по настоящему изобретению должно представлять собой количество, которое позволяет добиться выбранного результата, и определение такого количества является рутинной процедурой для специалиста в данной области при использовании анализов, которые известны в данной области и/или которые описаны в настоящем документе, без необходимости чрезмерного экспериментирования. Например, эффективное количество для лечения или предотвращения раковых метастазов может представлять собой количество, необходимое для предотвращения миграции и инвазии клеток опухоли через базальную мембрану или через эндотелиальный слой in vivo. Термин также является синонимом термина «достаточное количество». Эффективное количество для любого конкретного применения может варьироваться в зависимости от таких факторов, как заболевание, нарушение или состояние, которое подвергают лечению, конкретная композиция, которую вводят, путь введения, размеры субъекта и/или степень тяжести заболевания или состояния. Специалист в данной области может определять эмпирически эффективное количество конкретного соединения, конъюгата или композиции по настоящему изобретению в соответствии с указаниями, приведенными в настоящем документе, без необходимости чрезмерного экспериментирования.
Примерно: При использовании в настоящем документе в связи с измеряемым количеством термин «примерно» относится к нормальной вариации в этом измеряемом количестве, которую мог бы ожидать специалист в данной области, проводящий измерение с уровнем тщательности, соответствующим цели измерения и точности используемого измерительного оборудования. Если не указано иное, «примерно» означает вариацию +/-10% от указанной величины.
Выделенные: Определение «выделенный» полипептид или его фрагмент, вариант или производное означает полипептид, который находится не в своем природном окружении. Никакого конкретного уровня чистоты не требуется. Например, выделенный полипептид можно удалять из его естественного или природного окружения. Полученные рекомбинантными методами полипептиды и белки, экспрессированные в клетках-хозяевах, считаются выделенными для целей изобретения, так же как и нативные или рекомбинантные полипептиды, которые были отделены, фракционированы, либо частично или в значительной степени очищены любым подходящим методом.
Малая молекула: Как правило, «малая молекула» представляет собой молекулу, которая имеет размер менее чем примерно 5 килодальтон (кД). В некоторых вариантах осуществления малая молекула имеет размер менее чем примерно 4 кД, 3 кД, примерно 2 кД или примерно 1 кД. В некоторых вариантах осуществления малая молекула имеет размер менее чем примерно 800 дальтон (Д), примерно 600 Д, примерно 500 Д, примерно 400 Д, примерно 300 Д, примерно 200 Д или примерно 100 Д. В некоторых вариантах осуществления малая молекула составляет менее чем примерно 2000 г/моль, менее чем примерно 1500 г/моль, менее чем примерно 1000 г/моль, менее чем примерно 800 г/моль или менее чем примерно 500 г/моль. В некоторых вариантах осуществления малые молекулы не являются полимерными. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения малые молекулы не являются белками, полипептидами, олигопептидами, пептидами, полинуклеотидами, олигонуклеотидами, полисахаридами, гликопротеинами, протеогликанами и так далее.
В значительной степени: Используемый в настоящем документе термин «в значительной степени» относится к качественному состоянию, отличающемуся полной или почти полной мерой или степенью какой-либо интересующей характеристики или свойства. Специалист в области биологии понимает, что биологические и химические явления редко, если вообще когда-либо, доходят до завершения и/или продолжаются до завершения, или достигают, или избегают абсолютного результата. Термин «в значительной степени», таким образом, используют в настоящем документе, чтобы передать потенциальную незавершенность, присущую многим биологическим и химическим явлениям.
Терапевтически эффективное количество: Используемый в настоящем документе термин «терапевтически эффективное количество» означает количество терапевтического белка, которое позволяет достичь терапевтического эффекта у получающего лечение субъекта с разумным соотношением польза/риск, применимым к любому медицинскому лечению. Терапевтический эффект может быть объективным (то есть, измеримым с помощью какого-либо теста или маркера) или субъективным (то есть, субъект проявляет признаки или чувствует эффект). В частности, «терапевтически эффективное количество» означает количество терапевтического белка или композиции, эффективное для лечения, облегчения или предотвращения нужного заболевания или состояния, или для проявления поддающегося обнаружению терапевтического или профилактического эффекта, такого как ослабление симптомов, связанных с заболеванием, предотвращение или отсрочка начала заболевания и/или снижение степени тяжести или частоты проявления симптомов заболевания. Терапевтически эффективное количество, как правило, вводят в режиме дозирования, который может включать несколько стандартных доз. Для любого конкретного терапевтического белка терапевтически эффективное количество (и/или соответствующая стандартная доза в рамках эффективного режима дозирования) может варьироваться, например, в зависимости от пути введения, от сочетания с другими фармацевтическими средствами. Кроме того, конкретное терапевтически эффективное количество (и/или стандартная доза) для любого конкретного пациента может зависеть от различных факторов, включая заболевание, которое подвергают лечению, и степень тяжести заболевания; активность конкретного используемого фармацевтического средства; конкретную используемую композицию; возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и рацион пациента; время введения, путь введения и/или скорость выведения или метаболизм конкретного используемого слитого белка; продолжительность лечения; и тому подобные факторы, как хорошо известно в области медицины.
Лечение: Используемые в настоящем документе термины «лечение», «лечить», «подвергающийся лечению» или «лечащий» относятся к профилактике и/или терапии, в частности, если цель заключается в предотвращении или замедлении (уменьшении) нежелательного физиологического изменения или заболевания, например, прогрессирования рассеянного склероза. Полезные или желаемые клинические результаты включают, но не ограничиваются ими, ослабление симптомов, снижение степени тяжести заболевания, состояние стабилизации (то есть, отсутствие ухудшения) заболевания, отсрочку или замедление прогрессирования заболевания, ослабление или временное облегчение болезненного состояния и ремиссию (частичную или полную), поддающуюся или не поддающуюся обнаружению. «Лечение» также может означать продление выживания по сравнению с ожидаемым сроком выживания без получения лечения. Нуждающиеся в лечении включают тех, кто уже имеет патологическое состояние или заболевание, а также тех, кто предрасположен к развитию патологического состояния или заболевания, или тех, у кого патологическое состояние или заболевание должно быть предотвращено. «Субъект» или «индивидуум» или «животное» или «пациент» или «млекопитающее» означает субъекта, в частности, млекопитающего субъекта, для которого желательно диагностирование, прогнозирование или терапия. Млекопитающие субъекты включают людей и других приматов, домашних животных, сельскохозяйственных животных, а также животных в зоопарке, спортивных животных или домашних питомцев, таких как собаки, кошки, морские свинки, кролики, крысы, мыши, лошади, крупный рогатый скот, коровы и тому подобное.
Стандартная доза: Используемый в настоящем документе термин «стандартная доза» означает количество, введенное в виде одной дозы и/или в физически дискретной единице фармацевтической композиции. Во многих вариантах осуществления стандартная доза содержит заранее определенное количество активного средства. В некоторых вариантах осуществления стандартная доза содержит всю разовую дозу средства. В некоторых вариантах осуществления более чем одну стандартную дозу вводят для достижения всей разовой дозы. В некоторых вариантах осуществления необходимо или ожидается, что будет необходимо, введение нескольких стандартных доз для достижения желаемого эффекта. Стандартная доза может представлять собой, например, объем жидкости (например, приемлемого носителя), содержащий заранее определенное количество одного или более терапевтических средств, заранее определенное количество одного или более терапевтических средств в твердой форме, препарат замедленного высвобождения или устройство доставки терапевтического средства, содержащее заранее определенное количество одного или более терапевтических средств, и так далее. Следует иметь в виду, что стандартная доза может присутствовать в препарате, который включает любые из множества компонентов в дополнение к терапевтическому средству(ам). Например, приемлемые носители (например, фармацевтически приемлемые носители), разбавители, стабилизаторы, буферы, консерванты и так далее, могут быть включены, как описано ниже. Специалистам в данной области будет понятно, что во многих вариантах осуществления общая необходимая суточная доза конкретного терапевтического средства может представлять собой часть или несколько стандартных доз, и будет определяться, например, лечащим врачом в рамках здравого медицинского суждения. В некоторых вариантах осуществления уровень конкретной эффективной дозы для любого конкретного субъекта или организма может зависеть от различных факторов, включая заболевание, которое подвергают лечению, и степень тяжести заболевания; активность конкретного используемого активного соединения; конкретную используемую композицию; возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и рацион пациента; время введения и скорость выведения конкретного используемого активного соединения; продолжительность лечения; лекарственные средства и/или дополнительные методы лечения, используемые в сочетании или случайно с конкретным используемым соединением(ями), и тому подобные факторы, хорошо известные в области медицины.
Нейробластома
Нейробластома (НБ) является наиболее распространенной экстракраниальной солидной опухолью у детей. В ~50% случаев стратегии лечения должны быть направлены на устранение как массы мягкой ткани, так и метастазов в костном мозге (КМ). Интенсивная высокодозная химиотерапия повышает резектабельность опухоли, и послеоперационные облучение снижает риск рецидива в зоне первичной опухоли до <10% (Kushner et al., 2001, J Clin Oncol 19, 2821-8). Однако поражение КМ, о чем свидетельствуют гистологические исследования или сканирование с использованием метаиодбензилгуанидина (MIBG), часто сохраняется и приводит к летальному исходу (Matthay et al., 2003, J Clin Oncol 21, 2486-91; Schmidt et al., 2008, Eur J Cancer 44, 1552-8). Кроме того, обычным является рецидив с остеомедуллярным поражением, несмотря на достижение почти полной ремиссии после индукционной терапии. Попытки интенсификации лечения приводили как к острым, так и долговременным побочным эффектам, все из которых представляли серьезную угрозу для молодых пациентов. Существует нехватка новых перспективных средств лечения, и на сегодняшний день лишь немногие, если вообще таковые имеются, малые молекулы, специфичные для мишеней/путей, показали серьезный клинический результат у пациентов с НБ, хотя перспективные результаты продолжают накапливаться. При показателе эффективности лечения <30% на пределе токсичности у пациентов с 4 стадией опухоли, диагностированных в возрасте >18 месяцев, существуют значительные возможности для усовершенствования (Pearson et al., 2008, Lancet Oncol 9, 247-56).
Настоящее изобретение опирается на признание того, что некоторые факторы делают НБ хорошо подходящей для таргетированной иммунотерапии моАт. Во-первых, моАт опосредует высокоэффективную антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) для НБ в присутствии человеческих лейкоцитов. Во-вторых, моАт индуцирует комплемент-опосредованную цитотоксичность (CMC) для клеток НБ, которые лишены стимулятора гемолиза CD55 (Cheung et al., 1988, J Clin Invest 81, 1122-8) и гомологичного фактора рестрикции CD59 (Chen et al., 2000, Cancer Res 60, 3013-8). Отложение комплемента на клетках НБ усиливает ADCC через активацию рецептора iC3b на нейтрофилах (Kushner and Cheung, 1992, Blood 79, 1484-90, Metelitsa et al., 2002, Blood 99, 4166-73), имеющую место даже после высокодозной или миелоаблативной химиотерапия плюс трансплантация стволовых клеток, при наличии колониестимулирующих факторов (Mackall, CL, 2000, Stem Cells 18, 10-8). В-третьих, использование интенсивной химиотерапии (стандартное лечение для НБ) для достижения клинической ремиссии вызывает длительную лимфопению и иммуносупрессию (Mackall et al., 2000, Blood 96, 754-762), так что пациенты с меньшей вероятностью будут отторгать мышиные, химерные или гуманизированные моАт (Kushner et al., 2007, Pediatr Blood Cancer 48, 430-4).
Эталонные антитела к GD2
GD2 представляет собой дисиалоганглиозид, присутствующий в изобилии на опухолях нейроэктодермального происхождения, включая нейробластому и меланому, с очень ограниченной экспрессией в нормальных тканях. По меньшей мере два семейства антител к GD2 были протестированы клинически для лечения НБ, а именно, 3F8 (Cheung et al., 1985, Cancer Res 45, 2642-9) и 14.18 (Mujoo et al., 1989, Cancer Res 49, 2857-61).
Химерное антитело ch14.18 состоит из вариабельной области мышиного моАт 14.18 и константных областей человеческого IgG1-K (Gillies et al., 1989, J Immunol Methods 125, 191-202). Оно демонстрирует ADCC и CMC клеток НБ и меланомы in vivo (Barker et al., 1991, Cancer Res 51, 144-9, Barker and Reisfeld, 1993, Cancer Res. 52, 362-7, Mueller et al., 1990, PNAS USA 87, 5702-05). С учетом обнадеживающих клинических результатов в фазе I испытаний, ch14.18 было протестировано в большом исследовании фазы II в качестве консолидирующей терапии для НБ 4 стадии (исследования German НБ90 и НБ97). Для 166 пациентов в возрасте >12 месяцев на момент постановки диагноза, даже хотя безрецидивная выживаемость (БРВ) была сходной у пациентов, получавших ch14.18, в сравнении с пациентами, получавшими поддерживающую химиотерапию, показатели общей выживаемости (ОВ) были улучшены, и частота КМ рецидивов снижалась у пациентов, получавших лечение ch14.18 (Simon et al., 2004, J Clin Oncol 22, 3549-57).
В 2001 г. Группа по изучению детских онкологических заболеваний (Children's Oncology Group (COG)) инициировала рандомизированное клиническое испытание фазы III для изучения эффективности сочетания ch14.18 с GMCSF и IL-2 для предотвращения рецидива НБ у пациентов в полной ремиссии (ПР) после аутологичной трансплантации стволовых клеток (АТСК) (ClinicalTrials.gov NCT00026312) (Gilman et al., J Clin Oncol 27: 85-91, 2009), в котором было достигнуто значительное улучшение показателей выживаемости без прогрессирования (ВБП) и ОВ через 2 года (Yu et al., N Engl J Med 363: 1324-1334, 2010).
3F8, мышиное IgG3 моАт, специфичное для GD2, индуцирует гибель клеток и опосредует эффективные ADCC и CMC против клеток НБ in vitro (Cheung et al., 2007, выше). Среди пациентов с химиорезистентным поражением костного мозга, несмотря на интенсивную индукцию высокими дозами плюс агрессивный спасательный режим, 80% достигали ремиссии КМ обычно после 1-2 циклов 5-дневного введения антитела плюс терапия GM-CSF (Kushner et al., 2007, Proc Amer Soc Clin Oncol 25, 526s). Учитывая активность m3F8 против химиорезистентного поражения костного мозга, m3F8 использовали более расширенно для пациентов в их первой ремиссии с обнадеживающими результатами. Эти показатели благоприятных клинических исходов у детей могут быть улучшены, если m3F8 применять в качестве поддерживающей терапии в течение первых 3-5 лет высокого риска рецидива. Однако иммунная реакция человека против антитела мыши (HAMA) является ограничивающим фактором, когда иммунная система восстанавливается после завершения курса химиотерапии. Одной из стратегий для уменьшения HAMA является химеризация или гуманизация 3F8.
D
off
Авторы изобретения ранее описывали конструирование и выделение гуманизированного 3F8 (hu3F8-IgG1 H1L1, далее по тексту hu3F8V1) (описано в WO 2011/160119 и публикации Cheung et al., 2012, Oncoimmunology 1: 477-486, полное содержание обеих публикаций включено в настоящий документ посредством ссылки). Эти антитела были получены с использованием стандартных рекомбинантных методов и отобраны на высокую экспрессию с использованием линии клеток CHO-DG44 в бессывороточной среде. При измерении методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием систем Biacore, гуманизированные 3F8 сохраняли величину K, аналогичную таковой у m3F8. В отличие от других антител к GD2, hu3F8V1 имели в значительной степени более низкое значение k, что приводило к более медленному вымыванию in vitro. Аналогично m3F8, гуманизированные 3F8 ингибировали рост клеток in vitro, что нетипично для других антител к GD2. Как ADCC мононуклеарных клеток крови (PBMC), так и ADCC нейтрофилов (PMN) в случае hu3F8V1 были выше (от 10 до >1000 раз), чем эти показатели в случае m3F8, при этом величина CMC была ниже. Это превосходство постоянно наблюдали в анализах ADCC, независимо от доноров или от того, были ли использованы в качестве киллеров клетки NK92, трансфицированные CD16 или CD32 человека. Hu3F8V1 демонстрировали превосходный противоопухолевый эффект против ксенотрансплантатов НБ в сравнении с m3F8.
Предложенные агенты на основе антител
Настоящее изобретение опирается на признание того, что для повышения терапевтической эффективности необходимы новые гуманизированные формы антитела с повышенной аффинностью. Настоящее изобретение опирается на признание того, что было бы желательно разработать антитела (или другие агенты на основе антител), которые являются вариантами 3F8 и/или hu3F8V1. Настоящее изобретение, в частности, относится к таким антителам и агентам на основе антител. То есть настоящее изобретение относится к различным агентам на основе антител, которые имеют значительную структурную идентичность с 3F8 и/или с hu3F8V1 и, кроме того, обладают улучшенными функциональными характеристиками (например, стабильностью и/или аффинностью, или специфичностью) в сравнении с 3F8 и/или с hu3F8V1. В предпочтительном конкретном варианте осуществления изобретение относится к молекуле, содержащей вариантную Fc-область, при этом указанная вариантная Fc-область содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию по сравнению с Fc-областью дикого типа, так что указанная молекула имеет измененную аффинность для FcγR, при условии, что указанная вариантная Fc-область не имеет замену в положениях, которые находятся в прямом контакте с FcγR, исходя из данных кристаллографического и структурного анализа взаимодействий Fc-FcγR, таких как те, что описаны в публикации Sondermann et al., 2000 (Nature, 406: 267-273, полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки). Примерами положений в составе Fc-области, которые находятся в прямом контакте с FcγR, являются аминокислоты 234-239 (шарнирная область), аминокислоты 265-269 (B/C петля), аминокислоты 297-299 (C'/E петля) и аминокислоты 327-332 (F/G петля). В некоторых вариантах осуществления молекулы по изобретению, содержащие вариантные Fc-области, имеют модификацию по меньшей мере одного остатка, находящегося в прямом контакте с FcγR, исходя из данных кристаллографического и структурного анализа.
Один аспект изобретения относится к антителу hu3F8 с измененной аффинностью для активирующих и/или ингибирующих рецепторов, имеющему вариантные Fc-области с одной или более аминокислотными модификациями, при этом указанные одна или более аминокислотные модификации представляют собой замену в положении 239 на аспарагиновую кислоту, в положении 330 на лейцин и в положении 332 на глютаминовую кислоту.
Изобретение относится к молекулам, содержащим вариантную Fc-область с добавлениями, делециями и/или заменами одной или более аминокислот в Fc-области антитела по настоящему изобретению относительно Fc-области эталонного антитела (например, эталонного антитела 3F8), например, с целью изменения эффекторной функции, либо увеличения или уменьшения аффинности предложенной Fc в отношении FcR. Получение и использование таких вариантных Fc-областей находится в пределах компетенции специалиста в данной области, с учетом руководящих указаний, приведенных в настоящем документе. Таким образом, изобретение относится к молекулам, содержащим вариантные Fc-области, которые связываются с повышенной аффинностью с одним или более FcγR. Такие молекулы предпочтительно опосредуют эффекторную функцию более эффективно, как описано ниже.
В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к молекулам, содержащим вариантную Fc-область, которая связывается с одним или более FcγR с пониженной аффинностью по сравнению с аффинностью Fc-области эталонного антитела (например, эталонного антитела 3F8). Ослабление или устранение эффекторной функции бывает желательным в некоторых случаях, например, в случае антител, механизм действия которых включает блокирование или антагонизм, но не уничтожение клеток, несущих целевой антиген. Ослабление или устранение эффекторной функции было бы желательным в случаях аутоиммунного заболевания, где можно было бы блокировать активирующие FcγR рецепторы в эффекторных клетках (функция этого типа присутствовала бы в клетках-хозяевах). Как правило, усиленная эффекторная функция была бы направлена на опухолевые и чужеродные клетки.
В конкретных вариантах осуществления варианты Fc по настоящему изобретению можно комбинировать с другими модификациями Fc, включая, но не ограничиваясь ими, модификации, которые изменяют эффекторную функцию. Изобретение включает комбинирование варианта Fc по изобретению с другими модификациями Fc для создания аддитивных, синергетических или новых свойств в антителах или слитых Fc-белках. Предпочтительно, варианты Fc по изобретению усиливают фенотип модификации, с которой их комбинируют. Например, если вариант Fc по изобретению комбинируют с мутантом, который, как известно, связывает FcγRIIIA с более высокой аффинностью, чем сопоставимая молекула, содержащая Fc-область дикого типа, комбинация с мутантом по изобретению приводит к большему кратному увеличению аффинности FcγRIIIA.
В некоторых вариантах осуществления варианты Fc по настоящему изобретению включены в агент на основе антитела (например, антитело или слитый Fc-белок), который содержит одну или более сконструированных гликоформ, то есть, углеводную композицию, ковалентно связанную с молекулой, содержащей Fc-область, при этом указанная углеводная композиция отличается химически от таковой в родительской молекуле, содержащей Fc-область.
Изобретение относится к антителам с модифицированными сайтами гликозилирования, предпочтительно без изменения функциональности антитела, например, активности связывания GD2. Используемый в настоящем документе термин «сайты гликозилирования» включает любую специфическую аминокислотную последовательность в антителе, с которым олигосахарид (то есть углевод, содержащий два или более простых сахаров, связанных вместе) будет специфически и ковалентно связываться. Олигосахаридные боковые цепи, как правило, связаны с каркасом антитела через либо N-, либо O-связи. N-связанное гликозилирование означает присоединение олигосахаридного фрагмента к боковой цепи остатка аспарагина. O-связанное гликозилирование означает присоединение олигосахаридного фрагмента к гидроксиаминокислоте, например, серину, треонину. Fc-гликоформа, hu3F8-H1L1-IgG1n, лишенная определенных олигосахаридов, включая фукозу и концевой N-ацетилглюкозамин, была получена в специальных клетках CHO и демонстрировала усиленную эффекторную функцию ADCC.
В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам модифицирования углеводного состава антитела по изобретению путем добавления или делеции сайта гликозилирования. Способы модифицирования углеводного состава антител хорошо известны в данной области и включены в изобретение, смотри, например, патент США № 6218149, EP 0 359 096 B1, патентную публикацию США № US 2002/0028486, WO 03/035835, патентную публикацию США № 2003/0115614, патент США № 6218149, патент США № 6472511, полное содержание всех из которых включено в настоящий документ посредством ссылки. В других вариантах осуществления изобретение относится к способам модифицирования углеводного состава антитела по изобретению за счет делеции одного или более эндогенных углеводных фрагментов антитела. В конкретном варианте осуществления изобретение относится к элиминации сайта гликозилирования Fc-области антитела путем модифицирования положения 297 с аспарагина на аланин.
Сконструированные гликоформы могут быть полезны для различных целей, включая, но не ограничиваясь ими, усиление или ослабление эффекторной функции. Сконструированные гликоформы можно получать любым методом, известным специалисту в данной области, например, с использованием сконструированных или вариантных экспрессионных штаммов, путем совместной экспрессии с одним или более ферментами, например, DIN-ацетилглюкозаминилтрансферазой III (GnTI11), путем экспрессии молекулы, содержащей Fc-область, в различных организмах или линиях клеток из различных организмов, или путем модификации углевода(ов) после того, как молекула, содержащая Fc-область, была экспрессирована. Методы получения сконструированных гликоформ известны в данной области и включают, но не ограничиваются ими, те, которые описаны в Umana et al., 1999, Nat. Biotechnol 17: 176-180, Davies et al., 20017 Biotechnol Bioeng 74: 288-294, Shields et al., 2002, J Biol Chem 277: 26733-26740, Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278: 3466-3473), патенте США № 6602684, патентной публикации США с серийным № 10/277370, патентной публикации США с серийным № 10/113929, PCT WO 00/61739A1, PCT WO 01/292246A1, PCT WO 02/311140A1, PCT WO 02/30954A1; технологию POTILLEGENT™ (Biowa, Inc. Princeton, N.J.), инженерную технологию гликозилирования GLYCOMAB™ (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland), полное содержание всех литературных источников включено в настоящий документ посредством ссылки. Смотри, например, WO 00061739, EA 01229125, US 20030115614, Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49, полное содержание каждого из которых включено в настоящий документ посредством ссылки.
В качестве полипептидов по настоящему изобретению также включены фрагменты, производные, аналоги или варианты вышеуказанных полипептидов, а также любые их сочетания. Термины «фрагмент», «вариант», «производное» и «аналог» при использовании применительно к антителам к GD2 или полипептидам антитела включают любые полипептиды, которые сохраняют по меньшей мере некоторые из антигенсвязывающих свойств соответствующего нативного антитела или полипептида, то есть те полипептиды, которые сохраняют способность связываться с одним или более эпитопами на GD2.
Фрагменты полипептидов по настоящему изобретению включают протеолитические фрагменты, а также делеционные фрагменты, в дополнение к специфическим фрагментам антител, описанным в другом разделе настоящего документа.
Варианты антител к GD2 и полипептидов антител, полезных по настоящему изобретению, включают фрагменты, описанные выше, а также полипептиды с измененными аминокислотными последовательностями вследствие аминокислотных замен, делеций или вставок. Варианты могут быть природными или неприродными. Неприродные варианты можно получать с использованием известных в данной области методов мутагенеза или неприродных аминокислот. Вариантные полипептиды могут содержать консервативные или неконсервативные аминокислотные замены, делеции или добавления.
Производные антител к GD2 и полипептидов антител, полезных по настоящему изобретению, представляют собой полипептиды, которые были изменены так, чтобы иметь дополнительные характеристики, не встречающиеся в природных полипептидах. Примеры включают слитые белки. Вариантные полипептиды также могут называться в настоящем документе «полипептидными аналогами». Используемый в настоящем документе термин «производное» антитела к GD2 или полипептида антитела означает конкретный полипептид, имеющий один или более остатков, химически дериватизированных за счет реакции функциональной боковой группы. В качестве «производных» также включены такие пептиды, которые содержат одно или более природных аминокислотных производных двадцати стандартных аминокислот. Например, 4-гидроксипролин может заменять пролин, 5-гидроксилизин может заменять лизин, 3-метилгистидин может заменять гистидин, гомосерин может заменять серин и орнитин может заменять лизин.
В некоторых вариантах осуществления предложенные агенты на основе антител проявляют функциональные свойства, описанные ниже в разделе «Примеры» настоящего документа. Например, в некоторых вариантах осуществления предложенные агенты демонстрируют улучшенное связывание по сравнению с родительским антителом 3F8 и/или его гуманизированным вариантом (например, hu3F8V1). Иллюстративные гуманизированные варианты включают те, которые имеют одну или более структурных особенностей, описанных в настоящем документе. В некоторых конкретных вариантах осуществления структурная особенность включает одну или более аминокислотных замен, которые соответствуют последовательности, которая находится в каркасной области последовательности вариабельной области иммуноглобулина человека. В некоторых конкретных вариантах осуществления структурная особенность включает одну или более аминокислотных замен, которые соответствуют последовательности, которая находится в CDR-области последовательности вариабельной области иммуноглобулина человека. В некоторых конкретных вариантах осуществления структурная особенность включает одну или более аминокислотных замен, которые приводят к уменьшению иммуногенности предложенного агента по сравнению с родительским антителом. В некоторых конкретных вариантах осуществления структурная особенность включает одну или более аминокислотных замен, которые приводят к уменьшению, усовершенствованию или элиминации T-клеточного эпитопа предложенного агента по сравнению с родительским антителом. В некоторых вариантах осуществления предложенные агенты имеют структурную особенность, которая включает особенности, приведенные в таблице 2.
В некоторых вариантах осуществления предложенные агенты на основе антител связываются с GD2 с аффинностью, превышающей по меньшей мере на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или более аффинность другого антитела, связывающего GD2. В некоторых вариантах осуществления предложенные агенты на основе антител связывают GD2 с аффинностью, превышающей по меньшей мере 2-кратно, по меньшей мере 3-кратно, по меньшей мере 4-кратно, по меньшей мере 5-кратно, по меньшей мере 6-кратно, по меньшей мере 7-кратно, по меньшей мере 8-кратно, по меньшей мере 9-кратно, по меньшей мере 10-кратно, по меньшей мере 11-кратно, по меньшей мере 12-кратно, по меньшей мере 13-кратно, по меньшей мере 14-кратно, по меньшей мере 15-кратно, по меньшей мере 16-кратно, по меньшей мере 17-кратно, по меньшей мере 18-кратно, по меньшей мере 19-кратно, или по меньшей мере 20-кратно аффинность другого антитела для GD2. В некоторых вариантах осуществления предложенные агенты на основе антител связывают GD2 с аффинностью, превышающей более чем 20-кратно, более чем 30-кратно, более чем 40-кратно, более чем 50-кратно, более чем 60-кратно, более чем 70-кратно, более чем 80-кратно, более чем 90-кратно или более чем 100-кратно аффинность другого антитела, связывающего GD2. В некоторых вариантах осуществления предложенные агенты на основе антител демонстрируют аффинности связывания для других ганглиозидов, таких как, например, GD1b, которые находятся в пределах 2, в пределах 3, в пределах 4, в пределах 5, в пределах 6, в пределах 7, в пределах 8, в пределах 9 или в пределах 10-кратной разницы аффинности друг от друга.
50
50
50
50
В некоторых вариантах осуществления предложенные агенты на основе антител демонстрируют относительную эффективность (например, отношение EC3F8/EC антитела или EC hu3F8V1/EC антитела) в анализе ADCC или CMC в пределах диапазона, описанного и/или приведенного в качестве примера в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления предложенные агенты на основе антител демонстрируют относительную эффективность, кратную по меньшей мере 1,0, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 2,0, по меньшей мере 2,5, по меньшей мере 3,0, по меньшей мере 3,5, по меньшей мере 4,0, по меньшей мере 4,5, по меньшей мере 5,0, по меньшей мере 5,5, по меньшей мере 6,0, по меньшей мере 6,5, по меньшей мере 7,0, по меньшей мере 7,5, по меньшей мере 8,0, по меньшей мере 8,5, по меньшей мере 9,0, по меньшей мере 9,5, по меньшей мере 10,0, по меньшей мере 10,5, по меньшей мере 11,0, по меньшей мере 11,5, по меньшей мере 12,0, по меньшей мере 12,5, по меньшей мере 13,0, по меньшей мере 13,5, по меньшей мере 14,0, по меньшей мере 14,5, по меньшей мере 15,0, по меньшей мере 15,5, по меньшей мере 16,0, по меньшей мере 16,5, по меньшей мере 17,0, по меньшей мере 17,5, по меньшей мере 18,0, по меньшей мере 18,5, по меньшей мере 19,0, по меньшей мере 19,5, по меньшей мере 20,0, по меньшей мере 20,5, по меньшей мере 21,0, по меньшей мере 21,5, по меньшей мере 22,0, по меньшей мере 22,5, по меньшей мере 23,0, по меньшей мере 23,5, по меньшей мере 24,0, по меньшей мере 24,5, по меньшей мере 25,0, по меньшей мере 25,5, по меньшей мере 26,0, по меньшей мере 26,5, по меньшей мере 27,0, по меньшей мере 27,5, по меньшей мере 28,0, по меньшей мере 28,5, по меньшей мере 29,0, по меньшей мере 29,5 или по меньшей мере 30,0, в сравнении с родительским антителом, связывающим GD2.
D
D
D
D
В некоторых вариантах осуществления предложенные агенты на основе антител демонстрируют связывание с GD2 с величиной K (нМ), составляющей менее чем 100 нМ, менее чем 90 нМ, менее чем 80 M, менее чем 70 нМ, менее чем 60 нМ, менее чем 50 нМ, менее чем 40 нМ, менее чем 30 нМ, менее чем 20 нМ или менее чем 10 нМ. В некоторых конкретных вариантах осуществления предложенные агенты на основе антител демонстрируют связывание с GD2 с величиной K (нМ), составляющей менее чем 9 нМ, менее чем 8 нМ, менее чем 7 нМ, менее чем 6 нМ, менее чем 5 нМ, менее чем 4 нМ, менее чем 3 нМ, менее чем 2 нМ или менее чем 1 нМ. В некоторых конкретных вариантах осуществления предложенные агенты на основе антител демонстрируют связывание с GD2 с величиной K (нМ), составляющей примерно 0,2 нМ, примерно 0,3 нМ, примерно 0,4 нМ, примерно 0,5 нМ, примерно 0,6 нМ, примерно 0,7 нМ, примерно 0,8 нМ, примерно 0,9 нМ, примерно 1,0 нМ, примерно 1,1 нМ, примерно 1,2 нМ, примерно 1,3 нМ, примерно 1,4 нМ, примерно 1,5 нМ, примерно 1,6 нМ, примерно 1,7 нМ, примерно 1,8 нМ, примерно 1,9 нМ, примерно 2,0 нМ, примерно 2,1 нМ, примерно 2,2 нМ, примерно 2,3 нМ, примерно 2,4 нМ, примерно 2,5 нМ, примерно 2,6 нМ, примерно 2,7 нМ, примерно 2,8 нМ, примерно 2,9 нМ или примерно 3,0 нМ. В некоторых конкретных вариантах осуществления предложенные агенты на основе антител демонстрируют связывание с GD2 с величиной K (нМ), составляющей примерно 1 нМ, примерно 2 нМ, примерно 3 нМ, примерно 4 нМ, примерно 5 нМ, примерно 6 нМ, примерно 7 нМ, примерно 8 нМ или примерно 9 нМ.
off
off
off
-1
-4
-1
-4
-1
-1
-4
-1
-4
-1
-4
-1
-4
-1
-4
-1
-4
-1
-4
-1
-4
-1
-4
-1
-4
-1
-4
-1
-4
-1
-4
-1
-4
-1
-4
-1
-4
-1
-4
-1
-4
-1
-4
-1
-1
-4
-1
-4
-1
-4
-1
-4
-1
-4 s-1
В некоторых вариантах осуществления предложенные агенты на основе антител демонстрируют связывание с GD2 с величиной K (с), имеющей нижний предел примерно 2,0x10 с и верхний предел примерно 20,0x10 с. В некоторых вариантах осуществления предложенные агенты на основе антител демонстрируют связывание с GD2 с величиной K (с), нижний предел которой выбран из группы, состоящей из 2×10 с, 3×10 с, 4×10 с, 5×10 с, 6×10 с, 7×10 с, 8×10 с, 9×10 с или более, и верхний предел которой выше, чем нижний предел, и выбран из группы, состоящей из 10×10 с, 11×10 с, 12×10 с, 13×10 с, 14×10 с, 15×10 с, 16×10 с, 17×10 с, 18×10 с, 19×10 с, 20x10 с или более. В некоторых конкретных вариантах осуществления предложенные агенты на основе антител демонстрируют связывание с GD2 с величиной K (с), составляющий примерно 2,9×10 с, 5,1×10 с, 6,9×10 с, 8,8×10 с или 18,5×10.
Гуманизированное агенты на основе антител
В одном варианте осуществления антитела, предложенные по настоящему изобретению, представляют собой моноклональные антитела, которые в предпочтительном варианте осуществления представляют собой гуманизированные варианты родственного антитела к GD2, происходящего из других видов. Гуманизированное антитело представляет собой антитело, полученное по технологии рекомбинантной ДНК, в котором некоторые или все из аминокислот легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина человека, которые не нужны для связывания антигена (например, константные области и каркасные области вариабельных доменов) используют для замены соответствующих аминокислот из легкой или тяжелой цепи родственного, не принадлежащего человеку антитела. В качестве примера, гуманизированный вариант мышиного антитела для конкретного антигена имеет на обеих из его тяжелой и легкой цепей (1) константные области человеческого антитела, (2) каркасные области из вариабельных доменов человеческого антитела и (3) CDR из мышиного антитела. При необходимости, один или более остатков в каркасных областях человеческого антитела можно заменять на остатки в соответствующих положениях в мышином антителе так, чтобы сохранить аффинность связывания гуманизированного антитела с антигеном. Это изменение иногда называют «обратной мутацией». Аналогично, можно осуществлять прямые мутации для возвращения к мышиной последовательности по нужной причине, например, для стабильности или аффинности в отношении антигена. Например, для hu3F8-H1L1 (или hu3F8V1) обратные мутации были необходимы в 19 положениях в последовательности тяжелой цепи и 17 положениях в легкой цепи для сохранения in vitro аффинности связывания. Гуманизированные антитела, как правило, с меньшей вероятностью будут вызвать иммунный ответ у человека по сравнению с химерными человеческими антителами, поскольку первые содержат значительно меньше компонентов, не принадлежащих человеку.
Соответствующие методы получения гуманизированных антител по настоящему изобретению описаны, например, в Winter, EP 0 239 400, Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986), Riechmann et al., Nature 332: 323-327 (1988), Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988), Queen et al., Proc. Nat. Acad. ScL USA 86: 10029 (1989), патенте США 6180370 и Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sd. USA 86: 3833 (1989), полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки. Как правило, трансплантацию мышиных (или других, отличных от человеческих) CDR на человеческое антитело осуществляют следующим образом. Молекулы кДНК, кодирующие вариабельные домены тяжелой и легкой цепи выделяют из гибридомы. Последовательности ДНК вариабельных доменов, включая CDR, определяют путем секвенирования. Молекулы ДНК, кодирующие CDR, встраивают в соответствующие области кодирующих последовательностей вариабельных доменов тяжелой или легкой цепи человеческого антитела, присоединенных к генным сегментам константной области нужного изотипа (например, γ1 для CH и κ для CL) антитела человека, синтезируя ген. Гены гуманизированных тяжелых и легких цепей совместно экспрессируют в клетках-хозяевах млекопитающих (например, клетках CHO или NSO), получая растворимое гуманизированное антитело. Для облегчения крупномасштабного производства антител часто бывает желательно выбирать экспрессирующие на высоком уровне клетки с использованием гена DHFR или гена GS в линии клеток-продуцентов. Эти линии клеток-продуцентов культивируют в биореакторах или половолоконной системе культивирования, или с использованием технологии WAVE для получения больших объемов растворимого антитела или для получения трансгенных млекопитающих (например, коз, коров или овец), которые секретируют антитело в молоко (смотри, например, патент США 5827690).
С использованием описанных выше подходов были получены гуманизированные и химерные варианты антитела 3F8. Молекулы кДНК, кодирующие вариабельные области легкой и тяжелой цепей мышиного антитела 3F8, использовали для конструирования векторов для экспрессии химерных мышиных-человеческих антител, в которых вариабельные области мышиного антитела 3F8 были связаны с константными областями человеческого IgG1 (для тяжелой цепи) и каппа-цепи человека (для легкой цепи), как описано ранее. Кроме того, были созданы новые формы hu3F8 с вариантным гликозилированием для усиления связывания с Fc-рецептором и увеличения аффинности в отношении антигена.
Для получения гуманизированных антител 3F8 человеческие акцепторные каркасные домены были выбраны по гомологии с последовательностями зародышевой линии человека. С использованием этих выбранных человеческих акцепторных каркасных последовательностей были спроектированы вариабельные домены легкой и тяжелой цепи и несколько вариантов/версий каждого из них были созданы и экспрессированы, как описано ниже в разделе «Примеры».
Полностью человеческие антитела особенно желательны для терапевтического лечения пациентов-людей. Человеческие антитела можно получать множеством методов, известных в данной области, включая методы фагового дисплея, описанные выше, с использованием библиотек антител, полученных из последовательностей иммуноглобулинов человека. Смотри также, патенты США №№ 4444887 и 4716111 и PCT публикации WO 98/46645, WO 98/60433, WO 98/24893, WO 98/16664, WO 96/34096, WO 96/33735 и WO 91/10741, полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки. Методы, описанные в публикациях Cole et al., и Boerder et al., также можно использовать для получения человеческих моноклональных антител (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Riss, (1985) и Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95, (1991)).
Человеческие антитела, полученные с использованием других методик, но сохраняющие вариабельные области антитела к GD2 по настоящему изобретению, являются частью данного изобретения. Человеческие антитела также можно получать с использованием трансгенных мышей, которые неспособны экспрессировать функциональные эндогенные мышиные иммуноглобулины, но которые могут экспрессировать гены человеческих иммуноглобулинов. Например, комплексы генов тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов человека можно вводить произвольно или при помощи гомологичной рекомбинации в мышиные эмбриональные стволовые клетки. Альтернативно, человеческие гены вариабельной области, константной области и D-сегмента можно вводить в мышиные эмбриональные стволовые клетки в дополнение к генам тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов человека. Гены тяжелых и легких цепей мышиных иммуноглобулинов можно делать нефункциональными отдельно или одновременно с введением локусов человеческих иммуноглобулинов путем гомологичной рекомбинации. В частности, гомозиготная делеция JH-области предотвращает продуцирование эндогенных антител. Модифицированные эмбриональные стволовые клетки наращивают и вводят микроинъекцией в бластоцисты для получения химерных мышей. Затем химерных мышей скрещивают для получения гомозиготного потомства, которое экспрессирует человеческие антитела. Трансгенных мышей иммунизируют в обычном режиме выбранным антигеном, например, всем или частью полипептида по изобретению. Моноклональные антитела, направленные против антигена, можно получать от иммунизированных трансгенных мышей с использованием общепринятой технологии гибридом. Трансгены человеческих иммуноглобулинов, находящиеся в организме трансгенных мышей, реаранжируются в процессе B-клеточной дифференциации и впоследствии подвергаются переключению классов иммуноглобулинов и соматической мутации. Таким образом, с использованием этой методики можно получать терапевтически полезные IgG, IgA, IgM и IgE антитела. Для обзора данной технологии получения человеческих антител, смотри Lonberg and Huszar, Int. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995). Для получения подробной информации о данной технологии получения человеческих антител и человеческих моноклональных антител, а также протоколов для получения таких антител, смотри, например, PCT публикации WO 98/24893, WO 92/01047, WO 96/34096, WO 96/33735, Европейский патент № 0 598 877, патенты США №№ 5413923, 5625126, 5633425, 5569825, 5661016, 5545806, 5814318, 5886793, 5916771 и 5939598, полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки. Кроме того, таким компаниям, как Abgenix, Inc. (Freemont, Calif.), Genpharm (San Jose, Calif.) и Medarex, Inc. (Princeton, N.J.), можно сделать заказ на получение человеческих антител, направленных против выбранного антигена, с использованием технологии, аналогичной той, которая описана выше.
Кроме того, человеческие моАт можно получать путем иммунизации мышей, которым были трансплантированы лейкоциты периферической крови человека, спленоциты или клетки костного мозга (например, метод Trioma компании XTL). Полностью человеческие антитела, узнающие выбранный эпитоп, можно получать с использованием метода, называемого «направленной селекцией». В этом подходе выбранное моноклональные антитело, отличное от человеческого, например, мышиное антитело, используют для направления селекции полностью человеческого антитела, узнающего тот же эпитоп (Jespers et al., Bio/technology 12: 899-903 (1988)).
Используемые в настоящем документе термины «антитело к GD2», «часть антитела к GD2» или «фрагмент антитела к GD2», и/или «вариант антитела к GD2» и тому подобное включают любой белок или пептид, содержащий молекулу, которая содержит по меньшей мере часть молекулы иммуноглобулина, содержащую по меньшей мере одну определяющую комплементарность область (CDR) тяжелой или легкой цепи, или ее лигандсвязывающую часть, полученную из любого из моноклональных антител, описанных в настоящем документе, в сочетании с вариабельной областью тяжелой цепи или легкой цепи, константной областью тяжелой цепи или легкой цепи, каркасной областью или любой ее частью не мышиного происхождения, предпочтительно человеческого происхождения, которые могут быть включены в антитело по настоящему изобретению. Альтернативно, термин «антитело к GD2» должен означать все вместе или в отдельности антитела hu3F8V1 IgG с одиночной мутацией, например, hu3F8V1-E1K, hu3F8V1-D32H, hu3F8V1-G54I; hu3F8V1 IgG с двойной мутацией, например, hu3F8V1-E1KD32H, hu3F8V1-E1KG54I и hu3F8V1-D32HG54I; hu3F8V1 IgG с тройной мутацией, например, hu3F8V1-E1KD32HG54I; hu3F8V5 IgG; hu3F8V5 IgG с одиночной мутацией, например, hu3F8V5-E1K, hu3F8V5-D32H, hu3F8V5-G54I; hu3F8V5 IgG с двойной мутацией, например, hu3F8V5-E1KD32H, hu3F8V5-E1KG54I и hu3F8V5-D32HG54I; и hu3F8V5 IgG с тройной мутацией, например, hu3F8V5-E1KD32HG54I, а также их сочетания, а также их фрагменты и области, такие как одноцепочечные вариабельные фрагменты по настоящему изобретению, включая hu3F8V1-E1K scFv, hu3F8V1-D32H scFv, hu3F8V1-G54I scFv; hu3F8V1 scFv с двойной мутацией, например, hu3F8V1-E1KD32H scFv, hu3F8V1-E1KG54I scFv и hu3F8V1-D32HG54I scFv; hu3F8V1 scFv с тройной мутацией, например, hu3F8V1-E1KD32HG54I scFv; hu3F8V5 scFv; hu3F8V5 scFv с одиночной мутацией, например, hu3F8V5-E1K scFv, hu3F8V5-D32H scFv, hu3F8V5-G54I scFv; hu3F8V5 scFv с двойной мутацией, например, hu3F8V5-E1KD32H scFv, hu3F8V5-E1KG54I scFv и hu3F8V5-D32HG54I scFv; hu3F8V5 scFv с тройной мутацией, например, hu3F8V5-E1KD32HG54I scFv, а также их сочетания. Такое антитело способно модулировать, снижать, противодействовать, ослаблять, уменьшать, блокировать, ингибировать, отменять и/или препятствовать функции по меньшей мере одной клетки in vitro, in situ и/или in vivo, при этом указанная клетка экспрессирует GD2. В качестве неограничивающего примера, соответствующее антитело к GD2, определенная его часть или вариант по настоящему изобретению может связываться с высокой аффинностью с эпитопом человеческого GD2.
2
Термин «антитело» должен, кроме того, охватывать антитела, их расщепленные фрагменты, определенные части и варианты, включая миметики антител или части антител, которые имитируют структуру и/или функцию антитела или его определенного фрагмента или части, включая одноцепочечные антитела и их фрагменты, каждый из которых содержит по меньшей мере одну область CDR, происходящую из антитела к GD2. Функциональные фрагменты включают антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с GD2 млекопитающих. Например, фрагменты антител, способные к связыванию с GD2 или его частями, включая, но без ограничения, фрагменты Fab (например, результат расщепления папаином), Fab' (например, результат расщепления пепсином и частичного восстановления) и F(ab') (например, результат расщепления пепсином), facb (например, результат расщепления плазмином), pFc' (например, результат расщепления пепсином или плазмином), Fd (например, результат расщепления пепсином, частичного восстановления и реагрегации), Fv или scFv (например, полученные молекулярно-биологическими методами), входят в объем изобретения (смотри, например, Colligan, Immunology, выше).
2
Фрагменты антител можно получать путем ферментативного расщепления, синтетическими или рекомбинантными методами, известными в данной области и/или описанными в настоящем документе. Антитела также можно получать в виде различных укороченных форм с использованием генов антител, в которых один или более стоп-кодонов были вставлены выше естественного сайта остановки. Например, комбинированный ген, кодирующий часть тяжелой цепи F(ab'), можно проектировать для включения последовательностей ДНК, кодирующих домен CH1 и/или шарнирную область тяжелой цепи. Различные части антител можно соединять вместе химически, используя общепринятые методы, или можно получать в виде сплошного белка, используя методы генетической инженерии.
Используемые в настоящем документе термины «химерные» антитела или «гуманизированные» антитела или «CDR-привитые» антитела включают любые сочетания описанных в настоящем документе антитела к GD2, или любые CDR, полученные из них, в сочетании с одним или более белками или пептидами, полученными из не-мышиного, предпочтительно, человеческого антитела. В соответствии с изобретением, химерные или гуманизированные антитела включают те, в которых CDR происходят из одного или более антител к GD2, описанных в настоящем документе, и по меньшей мере часть или остаток антитела происходит из одного или более человеческих антител. Таким образом, человеческая часть антитела может включать каркас, CL, CH домены (например, CH1, CH2, CH3), шарнир, (VL, VH) области, которые являются практически неиммуногенными у человека. Области антитела, происходящие из человеческих антител, не обязательно должны иметь 100% идентичности с человеческими антителами. В предпочтительном варианте осуществления максимально возможное число человеческих аминокислотных остатков сохраняют для того, чтобы иммуногенность была незначительной, однако человеческие остатки можно модифицировать при необходимости для поддержания антигенсвязывающего сайта, образованного CDR, хотя в то же время степень гуманизации антитела максимально увеличивают. Такие изменения или вариации, необязательно и предпочтительно, приводят к сохранению или уменьшению иммуногенности у человека или других видов, по сравнению с не модифицированными антителами. Следует отметить, что гуманизированное антитело можно получать с использованием животного, не являющегося человеком, или прокариотической или эукариотической клетки, которая способна экспрессировать гены функционально реаранжированного человеческого иммуноглобулина (например, тяжелой цепи и/или легкой цепи). Кроме того, если антитело представляет собой одноцепочечное антитело, оно может содержать пептид линкера, который не встречается в природных человеческих антителах. Например, Fv может содержать пептид линкера, например, длиной от двух до примерно двадцати остатков глицина или другой аминокислоты, предпочтительно 8-15 остатков глицина или другой аминокислоты, который соединяет вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи. Считается, что такие пептиды линкеров имеют человеческое происхождение.
Гуманизацию антитела можно осуществлять, например, синтезируя комбинаторную библиотеку, содержащую шесть CDR целевого моноклонального антитела, не принадлежащего человеку, слитые в рамке считывания с пулом отдельных человеческих каркасных областей. Можно использовать библиотеку человеческих каркасных областей, которая содержит гены, репрезентативные для всех известных генов тяжелой и легкой цепей зародышевой линии человека. Затем можно проводить скрининг полученных комбинаторных библиотек на связывание с интересующими антигенами. Такой подход может позволить проводить отбор наиболее удачных сочетаний полностью человеческих каркасных областей с точки зрения сохранения активности связывания родительского антитела. Затем гуманизированные антитела можно дополнительно оптимизировать различными методами.
Гуманизацию антитела можно использовать для преобразования антител мыши или другого вида, отличного от человека, в «полностью человеческие» антитела. Полученное антитело содержит только человеческую последовательность и совсем не содержит последовательности антител мыши или другого вида, отличного от человека, при этом сохраняя такую же аффинность связывания и специфичность, что и исходное антитело.
Для полноразмерных молекул антитела гены иммуноглобулинов можно получать из геномной ДНК или мРНК гибридомных линий клеток. Тяжелые и легкие цепи антитела клонируют в систему вектора для клеток млекопитающих. Сборку документируют, используя анализ двухцепочечной последовательности. Конструкт антитела может быть экспрессирован в другой линии клеток-хозяев человека или другого млекопитающего. Затем конструкт можно валидировать при помощи анализов временной трансфекции и вестерн-блот анализа экспрессированного интересующего антитела. Стабильные линии клеток с самой высокой продуктивностью можно выделять и подвергать скринингу с использованием методов быстрого анализа.
По меньшей мере одно антитело к GD2 по настоящему изобретению может, необязательно, продуцироваться линией клеток, смешанной линией клеток, иммортализованными клетками или клональной популяцией иммортализованных клеток, как хорошо известно в данной области. Смотри, например, Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2001), Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.sup.nd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001), Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001), полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.
В соответствии с одним подходом, гибридому получают путем слияния соответствующей иммортализованной линии клеток (например, линии клеток миеломы, такой как, но не ограничиваясь ими, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L.5,>243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A) или тому подобной, или гетеромиелом, продуктов их слияния, или любой клетки или полученной из нее слитой клетки, или любой другой подходящей линии клеток, известной в данной области, смотри, например, www.atcc.org, www.lifetech.com., и тому подобное, с продуцирующими антитело клетками, такими как, но не ограничиваясь ими, выделенные или клонированные клетки селезенки, клетки периферической крови, лимфатических узлов, миндалин, или другие иммунные или B-клетки, или любые другие клетки, экспрессирующие константные или вариабельные, или каркасные, или CDR последовательности тяжелой или легкой цепи, либо в виде эндогенной, либо гетерологичной нуклеиновой кислоты, рекомбинантной или эндогенной, последовательности вирусов, бактерий, водорослей, прокариотов, амфибий, насекомых, рептилий, рыб, млекопитающих, грызунов, лошадей, овец, коз, приматов, эукариотов, геномной ДНК, кДНК, рДНК, митохондриальной ДНК или РНК, хлоропластной ДНК или РНК, гяРНК, мРНК, тРНК, одно-, двух- или трехцепочечной, гибридизованной, и тому подобной или любые их сочетания. Смотри, например, публикации Ausubel, выше, и Colligan, Immunology, выше, глава 2, полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.
Любую другую подходящую клетку-хозяина также можно использовать для экспрессии гетерологичной или эндогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело, его определенный фрагмент или вариант по настоящему изобретению. Слитые клетки (гибридомы) или рекомбинантные клетки можно выделять с использованием селективных условий культивирования или других подходящих известных методов и клонировать методом серийных разведений или сортировки клеток или другими известными методами. Клетки, продуцирующие антитела с нужной специфичностью, можно отбирать с помощью соответствующего анализа (например, ELISA).
Антитела по настоящему изобретению также можно получать с использованием по меньшей мере одной кодирующей антитело к GD2 нуклеиновой кислоты для создания трансгенных животных или млекопитающих, таких как козы, коровы, лошади, овцы и тому подобное, которые продуцируют такие антитела в молоко. Таких животных можно получать с использованием известных методов. Смотри, например, но без ограничения, патенты США №№ 5827690, 5849992, 4873316, 5849992, 5994616, 5565362, 5304489 и тому подобное, полное содержание каждого из которых включено в настоящий документ посредством ссылки.
Кроме того, антитела по настоящему изобретению можно получать с использованием по меньшей мере одной кодирующей антитело к GD2 нуклеиновой кислоты для создания трансгенных растений и культивируемых клеток растений (например, но без ограничения, табака и кукурузы), которые продуцируют такие антитела, их определенные части или варианты в частях растения или в культивируемых полученных из них клетках. В качестве неограничивающего примера, трансгенные листья табака, экспрессирующие рекомбинантные белки, были успешно использованы для получения больших количеств рекомбинантных белков, например, с использованием индуцируемого промотора. Смотри, например, публикацию Cramer et al., Curr. Top. Microbol. Immunol. 240: 95-118 (1999) и приведенные в ней ссылки. Кроме того, трансгенную кукурузу использовали для производства в промышленных масштабах белков млекопитающих, имеющих биологическую активность, эквивалентную активности белков, продуцируемых в других рекомбинантных системах или очищенных из природных источников. Смотри, например, публикацию Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. 464: 127-147 (1999) и приведенные в ней ссылки. Антитела, в том числе фрагменты антител, такие как одноцепочечные антитела (scFv), также были получены в больших количествах из семян трансгенных растений, включая семена табака и клубни картофеля. Смотри, например, публикацию Conrad et al., Plant Mol. Biol. 38: 101-109 (1998) и приведенные в ней ссылки. Таким образом, антитела по настоящему изобретению также можно получать известными методами с использованием трансгенных растений. Смотри также, например, Fischer et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 30: 99-108 (октябрь 1999 г.), Ma et al., Trends Biotechnol. 13: 522-7 (1995), Ma et al., Plant Physiol. 109: 341-6 (1995), Whitelam et al., Biochem Soc. Trans. 22: 940-944 (1994), а также приведенные в них ссылки. Содержание каждого из приведенных выше литературных источников включено в настоящий документ посредством ссылки.
Антитело к GD2 можно извлекать и очищать из рекомбинантных клеточных культур хорошо известными методами, включая, но не ограничиваясь ими, очистку с помощью белка A, очистку с помощью белка G, осаждение сульфатом аммония или этанолом, экстракцию кислотой, анионо- или катионообменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, хроматографию гидрофобного взаимодействия, аффинную хроматографию, хроматографию на гидроксилапатите и хроматографию с использованием лектина. Высокоэффективную жидкостную хроматографию («ВЭЖХ») также можно использовать для очистки. Смотри, например, Colligan, Current Protocols in Immunology, или Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001), например, главы 1, 4, 6, 8, 9, и 10, полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.
Антитела по настоящему изобретению включают очищенные природные продукты, продукты, полученные химическими методами синтеза, и продукты, полученные рекомбинантными методами из эукариотических хозяев, включая, например, клетки дрожжей, высших растений, насекомых и млекопитающих. В зависимости от хозяина, используемого в процедуре получения рекомбинантным методом, антитело по настоящему изобретению может быть гликозилированным или может быть не гликозилированным, при этом гликозилированное является предпочтительным. Такие методы описаны во многих стандартных лабораторных руководствах, таких как Sambrook, выше, разделы 17,37-17,42, Ausubel, выше, главы 10, 12, 13, 16, 18 и 20, Colligan, Protein Science, выше, главы 12-14, полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.
Очищенные антитела могут быть охарактеризованы, например, методами ELISA, ELISPOT, проточной цитометрии, иммуноцитологии, анализом BIACORE™, SAPIDYNE, KINEXA™, анализом кинетического исключения, SDS-ПААГ и вестерн-блоттингом или ВЭЖХ-анализом, а также с помощью целого ряда других анализов, описанных в настоящем документе.
Типичный экспрессионный вектор млекопитающих содержит по меньшей мере один элемент промотора, который опосредует инициацию транскрипции мРНК, кодирующую антитело последовательность и сигналы, необходимые для терминации транскрипции и полиаденилирования транскрипта. Дополнительные элементы включают энхансеры, последовательности Kozak и промежуточные последовательности, фланкированные донорскими и акцепторными сайтами для сплайсинга РНК. Высокоэффективной транскрипции можно добиваться при использовании ранних и поздних промоторов из SV40, длинных концевых повторов (LTRS) из ретровирусов, например, RSV, HTLVI, HIVI и раннего промотора цитомегаловируса (CMV). Однако также можно использовать клеточные элементы (например, промотор актина человека). Подходящие экспрессионные векторы для использования на практике настоящего изобретения включают, например, такие векторы, как pIRES1neo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN или pLNCX (Clonetech Labs, Palo Alto, Calif.), pcDNA3.1 (+/-),pcDNA/Zeo (+/-) или pcDNA3.1/Hygro (+/-) (Invitrogen), PSVL и PMSG (Pharmacia, Uppsala, Sweden), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) и pBC12MI (ATCC 67109). Клетки-хозяева млекопитающих, которые можно использовать, включают человеческие клетки Hela 293, H9 и Jurkat, мышиные клетки NIH3T3 и C127, клетки Cos 1, Cos 7 и CV 1, клетки перепела QC1-3, мышиные L-клетки и клетки яичника китайского хомячка (CHO).
Альтернативно, ген может быть экспрессирован в стабильной линии клеток, которые содержат данный ген, интегрированный в хромосому. Совместная трансфекция с селективным маркером, таким как DHFR, GPT, неомицин или гигромицин, позволяет идентифицировать и выделять трансфицированные клетки.
Трансфицированный ген также можно амплифицировать для экспрессии больших количеств закодированного антитела. Маркер DHFR (дигидрофолатредуктаза) полезен для создания линий клеток, которые несут несколько сотен или даже несколько тысяч копий интересующего гена. Другим полезным селективным маркером является фермент глютамин синтетаза (GS) (Murphy, et al., Biochem. J. 227: 277-279 (1991), Bebbington, et al., Bio/Technology 10: 169-175 (1992)). Используя такие маркеры, клетки млекопитающих выращивают в селективной среде и отбирают клетки с наиболее высокой устойчивостью. Такие линии клеток содержат амплифицированный ген(ы), интегрированный в хромосому. Клетки яичника китайского хомячка (CHO) и NSO часто используют для продуцирования антител.
В соответствии с настоящим изобретением, антитела к GD2 включают любое из антител hu3F8V1-E1K, hu3F8V1-D32H, hu3F8V1-G54I; hu3F8V1 с двойной мутацией, например, hu3F8V1-E1KD32H, hu3F8V1-E1KG54I и hu3F8V1-D32HG54I; hu3F8V1 с тройной мутацией, например, hu3F8V1-E1KD32HG54I; hu3F8V5 IgG; hu3F8V5 с одиночной мутацией, например, hu3F8V5-E1K, hu3F8V5-D32H, hu3F8V5-G54I; hu3F8V5 с двойной мутацией, например, hu3F8V5-E1KD32H, hu3F8V5-E1KG54I и hu3F8V5-D32HG54I; и hu3F8V5 IgG с тройной мутацией, например, hu3F8V5-E1KD32HG54I, или антитело, в котором вариабельная область или CDR происходят из любого из антител hu3F8V1-E1K, hu3F8V1-D32H, hu3F8V1-G54I; hu3F8V1 с двойной мутацией, например, hu3F8V1-E1KD32H, hu3F8V1-E1KG54I и hu3F8V1-D32HG54I; hu3F8V1 с тройной мутацией, например, hu3F8V1-E1KD32HG54I; hu3F8V5 IgG; hu3F8V5 с одиночной мутацией, например, hu3F8V5-E1K, hu3F8V5-D32H, hu3F8V5-G54I; hu3F8V5 с двойной мутацией, например, hu3F8V5-E1KD32H, hu3F8V5-E1KG54I и hu3F8V5-D32HG54I; и hu3F8V5 с тройной мутацией, например, hu3F8V5-E1KD32HG54I, а каркасные и константные области антитела происходят из одного или более человеческих антител. Вариабельная область или CDR, происходящие из антитела, предпочтительно имеют от примерно 90% до примерно 100% идентичности с вариабельной областью или CDR любого из hu3F8V1-E1K, hu3F8V1-D32H, hu3F8V1-G54I; hu3F8V1 с двойной мутацией, например, hu3F8V1-E1KD32H, hu3F8V1-E1KG54I и hu3F8V1-D32HG54I; hu3F8V1 с тройной мутацией, например, hu3F8V1-E1KD32HG54I; hu3F8V5; hu3F8V5 с одиночной мутацией, например, hu3F8V5-E1K, hu3F8V5-D32H, hu3F8V5-G54I; hu3F8V5 с двойной мутацией, например, hu3F8V5-E1KD32H, hu3F8V5-E1KG54I и hu3F8V5-D32HG54I; и hu3F8V5 с тройной мутацией, например, hu3F8V5-E1KD32HG54I, хотя любая и все модификации, включая замены, вставки и делеции, либо вследствие естественной мутации, либо в результате вмешательства человека, предусмотрены по изобретению при условии, что антитело сохраняет способность связываться с GD2. Области химерных, гуманизированных или CDR-привитых антител, которые происходят из человеческих антител, не обязательно должны иметь 100% идентичности с человеческими антителами. В предпочтительном варианте осуществления сохраняют максимально возможное количество человеческих аминокислотных остатков, чтобы добиться незначительной иммуногенности, однако в соответствии с настоящим изобретением человеческие остатки, в частности остатки каркасной области, заменяют при необходимости и как описано ниже в настоящем документе. Такие модификации, которые описаны в настоящем документе, необходимы для поддержания антигенсвязывающего сайта, образованного CDR, хотя в то же время степень гуманизации антитела максимально увеличивают.
Аминокислотные последовательности, которые являются в значительной степени такими же, как последовательности, описанные в настоящем документе, включают последовательности, содержащие консервативные аминокислотные замены, а также аминокислотные делеции и/или вставки. Консервативная аминокислотная замена означает замену первой аминокислоты второй аминокислотой, которая имеет химические и/или физические свойства (например, заряд, структуру, полярность, гидрофобность/гидрофильность), аналогичные свойствам первой аминокислоты. Консервативные замены включают замену одной аминокислоты на другую в пределах следующих групп: лизин (K), аргинин (R) и гистидин (H); аспартат (D) и глутамат (E); аспарагин (N), глютамин (Q), серин (S), треонин (T), тирозин (Y), K, R, H, D и E; аланин (A), валин (V), лейцин (L), изолейцин (I), пролин (P), фенилаланин (F), триптофан (W), метионин (M), цистеин (C) и глицин (G); F, W и Y; C, S и T.
Безусловно, число аминокислотных замен, которые будет выполнять квалифицированный специалист, зависит от многих факторов, включая те, которые описаны выше. Вообще говоря, число аминокислотных замен, вставок или делеций для любого конкретного антитела к GD2, фрагмента или варианта будет составлять не более 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, например, 1-30 или любой диапазон или значение в этих пределах, как указано в настоящем документе.
Аминокислоты в антителе к GD2 по настоящему изобретению, которые необходимы для функции, можно идентифицировать методами, известными в данной области, такими как сайт-направленный мутагенез или аланин-сканирующий мутагенез (например, Ausubel, выше, главы 8, 15, Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085 (1989)). Последний метод заключается во внесении одиночных мутаций на остаток аланина в каждый остаток в молекуле. Полученные мутантные молекулы затем тестируют на биологическую активность, такую как, но без ограничения, по меньшей мере связывание с GD2. Сайты, которые имеют решающее значение для связывания антитела, также можно определять структурным анализом, таким как кристаллизация, ядерный магнитный резонанс или фотоаффинное мечение (Smith, et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904 (1992) и de Vos, et al., Science 255: 306-312 (1992)).
Необязательно, антитело к GD2 может дополнительно содержать по меньшей мере один полипептид из 70-100% смежных аминокислот CDR, происходящий из по меньшей мере одной из последовательностей, описанных в настоящем документе.
В одном варианте осуществления аминокислотная последовательность цепи иммуноглобулина или ее части (например, вариабельной области, CDR) имеет примерно 70-100% идентичности (например, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 или любой диапазон или значение в этих пределах) с аминокислотной последовательностью по меньшей мере одной последовательности в таблицах 1-4.
Иллюстративные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи приведены в настоящем документе. Антитела по настоящему изобретению или их указанные варианты могут содержать любое число смежных аминокислотных остатков из антитела по настоящему изобретению, при этом данное число выбирают из группы целочисленных значений, состоящей из 10-100% от числа смежных остатков в антителе к GD2. Необязательно, эта подпоследовательность смежных аминокислот имеет длину по меньшей мере примерно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 или более аминокислот, или любой диапазон, или любое число в этих пределах. Кроме того, число таких подпоследовательностей может быть любым целочисленным значением, выбранным из группы, состоящей из значений от 1 до 20, например, по меньшей мере 2, 3, 4 или 5.
th
В соответствии с настоящим изобретением, нуклеотидные последовательности приведены в SEQ ID NOs: 32-45, и выведенные аминокислотные последовательности антитела к GD2 приведены в SEQ ID NOs: 1-31. Каждая из вариабельных областей тяжелой и легкой цепи содержит три CDR, которые совместно образуют антигенсвязывающий сайт. Три CDR окружены четырьмя каркасными областями, основная функция которых состоит в поддержании CDR. Последовательности CDR в составе последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепей можно идентифицировать путем выполняемого с помощью компьютера выравнивания в соответствии с публикацией Kabat et al. (1987) в Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4 ed., United States Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, Washington, D.C., или путем молекулярного моделирования вариабельных областей, например, с использованием программы ENCAD, описанной в публикации Levitt (1983) J. Mol. Biol. 168: 595.
Человеческие гены, кодирующие константные (C) области гуманизированных антител, фрагментов и областей по настоящему изобретению, можно получать из библиотеки генов эмбриональной печени человека известными методами. Гены C-областей человека can можно получать из любой человеческой клетки, включая те, которые экспрессируют и продуцируют человеческие иммуноглобулины. Человеческая CH-область может происходить из любого из известных классов или изотипов человеческих H-цепей, включая гамма, мю, альфа, дельта, эпсилон, а также их подтипы, такие как G1, G2, G3 и G4. Поскольку изотип H-цепи отвечает за различные эффекторные функции антитела, выбор CH-области будет определяться желаемыми эффекторными функциями, такими как фиксация комплемента или активность в антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). Предпочтительно, CH-область происходит из гамма-1 (IgG1) или гамма-4 (IgG4).
Человеческая CL-область может происходить из любого изотипа, каппа или лямбда, предпочтительно каппа, человеческой L-цепи.
Гены, кодирующие C-области человеческого иммуноглобулина, получают из человеческих клеток стандартными методами клонирования (Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.sup.nd Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) и Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology (1987-1993)). Гены человеческой C-области можно получать из известных клонов, содержащих гены, представляющие два класса L-цепей, пять классов H-цепей и их подклассы.
Последовательности вариабельных областей антитела могут быть модифицированы за счет вставок, замен и делеций до тех пор, пока антитело сохраняет способность связываться с GD2 человека. Специалист в данной области может убедиться в сохранении этой активности, выполняя функциональные анализы, описанные ниже в настоящем документе. Вариабельные области могут иметь, например, от примерно 50% до примерно 100% гомологии с вариабельными областями, приведенными ниже. В предпочтительном варианте осуществления вариабельные области антитела имеют от примерно 80% до примерно 100% гомологии с вариабельными областями, приведенными ниже. В более предпочтительном варианте осуществления вариабельные области имеют от примерно 90% до примерно 100% гомологии с вариабельными областями, приведенными ниже.
В одном конкретном аспекте предпочтительные моноклональные антитела к GD2 по изобретению содержат вариабельные области легкой цепи, имеющие 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологии аминокислотной последовательности с последовательностями, приведенными в настоящем документе, и дополнительно содержат вариабельные области тяжелой цепи, имеющие 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологии аминокислотной последовательности с последовательностями, приведенными в настоящем документе.
Предпочтительно, антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела или его определенная часть или вариант по настоящему изобретению связывает GD2 человека и, таким образом, частично или в значительной степени нейтрализует один белок или фрагмент GD2, и тем самым ингибирует активности, опосредуемые через GD2. Используемый в настоящем документе термин «нейтрализующее антитело» означает антитело, которое способно ингибировать зависимую от GD2 активность примерно на 20-120%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или более, в зависимости от анализа. Способность антитела к GD2 ингибировать зависимую от GD2 активность предпочтительно оценивают в по меньшей мере одном соответствующем анализе, описанном в настоящем документе и/или известном в данной области.
Как указано, изобретение также относится к антителам, антигенсвязывающим фрагментам, цепям иммуноглобулина и CDR, содержащим аминокислоты в последовательности, которая в значительной степени является такой же, что и аминокислотная последовательность, описанная в настоящем документе. Такие антитела к GD2 могут содержать одну или более аминокислотных замен, делеций или добавлений, либо вследствие естественной мутации, либо в результате вмешательства человека, как указано в настоящем документе. Предпочтительно, такие антитела или антигенсвязывающие фрагменты и антитела, содержащие такие цепи или CDR, могут связывать GD2 человека с высокой аффинностью.
Как будет понятно специалистам в данной области, настоящее изобретение включает по меньшей мере одно биологически активное антитело по настоящему изобретению. Биологически активные антитела имеют специфическую активность, составляющую по меньшей мере 20%, 30% или 40%, и предпочтительно по меньшей мере 50%, 60% или 70%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 80%, 90% или 95%-100% от активности нативного (не синтетического), эндогенного или родственного и известного антитела. Методы анализа и количественного определения ферментативной активности и субстратной специфичности хорошо известны специалистам в данной области.
В другом аспекте изобретение относится к человеческим антителам и антигенсвязывающим фрагментам, описанным в настоящем документе, которые модифицированы путем ковалентного присоединения органического фрагмента. Такая модификация может приводить к получению антитела или антигенсвязывающего фрагмента с улучшенными фармакокинетическими свойствами (например, увеличенным периодом полураспада в сыворотке in vivo). Органический фрагмент может представлять собой линейную или разветвленную гидрофильную полимерную группу, группу жирной кислоты или группу сложного эфира жирной кислоты. В конкретных вариантах осуществления гидрофильная полимерная группа может иметь молекулярную массу от примерно 800 до примерно 120000 дальтон и может представлять собой полиалкангликоль (например, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полипропиленгликоль (ППГ)), углеводный полимер, аминокислотный полимер или поливинилпирролидон, а группа жирной кислоты или сложного эфира жирной кислоты может содержать от примерно восьми до примерно сорока атомов углерода.
Модифицированные антитела и антигенсвязывающие фрагменты по изобретению могут содержать один или более органических фрагментов, которые ковалентно связаны, непосредственно или косвенно, с антителом. Каждый органический фрагмент, который связан с антителом или антигенсвязывающим фрагментом по изобретению, может независимо представлять собой гидрофильную полимерную группу, группу жирной кислоты или группу сложного эфира жирной кислоты. Используемый в настоящем документе термин «жирная кислота» охватывает монокарбоновые кислоты и дикарбоновые кислоты. Используемый в настоящем документе термин «гидрофильная полимерная группа» означает органический полимер, который лучше растворяется в воде, чем в октане, например, полилизин. Таким образом, антитело, модифицированное путем ковалентного присоединения полилизина, входит в объем изобретения. Гидрофильные полимеры, подходящие для модифицирования антител по изобретению, могут быть линейными или разветвленными и включают, например, полиалкангликоли (например, ПЭГ, монометоксиполиэтиленгликоль (мПЭГ), ППГ и тому подобное), углеводы (например, декстран, целлюлозу, олигосахариды, полисахариды и тому подобное), полимеры гидрофильных аминокислот (например, полилизин, полиаргинин, полиаспартат и тому подобное), полиалканоксиды (например, полиэтиленоксид, полипропиленоксид и тому подобное) и поливинилпирролидон. Предпочтительно, гидрофильный полимер, модифицирующий антитело по изобретению, имеет молекулярную массу от примерно 800 до примерно 150000 дальтон в виде отдельного молекулярного фрагмента. Например, можно использовать ПЭГ 5000 и ПЭГ 20000, в которых индекс соответствует средней молекулярной массе полимера в Да. Гидрофильная полимерная группа может быть замещена группами C1-6 алкила, жирной кислоты или сложного эфира жирной кислоты. Гидрофильные полимеры, замещенные группой жирной кислоты или сложного эфира жирной кислоты, можно получать, используя соответствующие методы. Например, полимер, содержащий аминогруппу, можно связывать с карбоксилатом жирной кислоты или сложного эфира жирной кислоты, и активированный карбоксилат (например, активированный N,N-карбонилдиимидазолом) на жирной кислоте или сложном эфире жирной кислоты можно связывать с гидроксильной группой на полимере.
Жирные кислоты и сложные эфиры жирных кислот, подходящие для модифицирования антител по изобретению, могут быть насыщенными или могут содержать одну или более единиц ненасыщенности. Жирные кислоты, подходящие для модифицирования антител по изобретению, включают, например, н-додеканоат, н-тетрадеканоат, н-октадеканоат, н-эйкозаноат, н-докозаноат, н-триаконтаноат, н-тетраконтаноат, цис-.дельта.9-октадеканоат, полностью цис-.дельта.5,8,11,14-эйкозатетраэноат, октандиовую кислоту, тетрадекандиовую кислоту, октадекандиовую кислоту, докозандиовую кислоту и тому подобное. Подходящие сложные эфиры жирных кислот включают моноэфиры дикарбоновых кислот, которые содержат линейную или разветвленную низшую алкильную группу. Низшая алкильная группа может содержать от одного до примерно двенадцати, предпочтительно от одного до примерно шести атомов углерода.
2
3
Модифицированные человеческие антитела и антигенсвязывающие фрагменты можно получать с использованием соответствующих методов, например, с помощью реакции с одним или более модифицирующими агентами. Используемый в настоящем документе термин «модифицирующий агент» означает соответствующую органическую группу (например, гидрофильный полимер, жирную кислоту, сложный эфир жирной кислоты), которая содержит активирующую группу. «Активирующая группа» представляет собой химический фрагмент или функциональную группу, которая может в соответствующих условиях вступать в реакцию со второй химической группой, таким образом, образуя ковалентную связь между модифицирующим агентом и второй химической группой. Например, аминореактивные активирующие группы включают электрофильные группы, такие как тозилат, мезилат, галоген (хлор, бром, фтор, иод), N-гидроксисукцинимидильные сложные эфиры (NHS) и тому подобное. Активирующие группы, которые могут вступать в реакцию с тиолами, включают, например, малеинимид, иодацетил, акрилолил, пиридилдисульфиды, 5-тиол-2-нитробензойную кислоту-тиол (TНБ-тиол) и тому подобное. Альдегидную функциональную группу можно связывать с амин- или гидразид-содержащими молекулами, и азидная группа может вступать в реакцию с трехвалентной фосфорной группой, с образованием фосфорамидатных или фосфоримидных связей. Соответствующие методы введения активирующих групп в молекулы известны в данной области (смотри, например, Hernanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Calif. (1996)). Активирующая группа может быть связана с органической группой (например, гидрофильным полимером, жирной кислотой, сложным эфиром жирной кислоты) непосредственно или через фрагмент линкера, например, двухвалентную C1-C12 группу, в которой один или более атомов углерода могут быть заменены гетероатомом, таким как кислород, азот или сера. Подходящие фрагменты линкера включают, например, тетраэтиленгликоль, --(CH)--, --NH--. Модифицирующие агенты, содержащие фрагмент линкера, можно получать, например, путем реакции моно-Boc-алкилдиамина (например, моно-Boc-этилендиамина, моно-Boc-диаминогексана) с жирной кислотой в присутствии 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC), с образованием амидной связи между свободным амином и карбоксилатом жирной кислоты. Защитную группу Boc можно удалять с продукта путем обработки трифторуксусной кислотой (ТФУ), оставляя незащищенным первичный амин, который может связываться с другим карбоксилатом, как описано, или может вступать в реакцию с малеиновым ангидридом, и полученный продукт циклизуется, с образованием активированного малеимидо-производного жирной кислоты. (Смотри, например, Thompson, et al., WO 92/16221, полное содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки).
Модифицированные антитела по изобретению можно получать путем реакции человеческого антитела или антигенсвязывающего фрагмента с модифицирующим агентом. Например, органические фрагменты можно связывать с антителом не сайт-специфическим образом, используя аминореактивный модифицирующий агент, например, NHS сложный эфир ПЭГ. Модифицированные человеческие антитела или антигенсвязывающие фрагменты также можно получать путем восстановления дисульфидных связей (например, внутрицепочечных дисульфидных связей) в антителе или антигенсвязывающем фрагменте. Затем можно проводить реакцию восстановленного антитела или антигенсвязывающего фрагмента с тиол-реактивным модифицирующим агентом для получения модифицированного антитела по изобретению. Модифицированные человеческие антитела и антигенсвязывающие фрагменты, содержащие органический фрагмент, который связан со специфическими сайтами антитела по настоящему изобретению, можно получать с использованием соответствующих методов, таких как обратный протеолиз (Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3: 147-153 (1992), Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5: 411-417 (1994), Kumaran et al., Protein Sci. 6(10): 2233-2241 (1997), Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(1): 59-68 (1996), Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56(4): 456-463 (1997)), а также методов, описанных в публикации Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Calif. (1996).
D
Антитела по изобретению могут связывать GD2 человека с самыми разными величинами аффинности (K), как показано ниже.
Аффинность или авидность антитела в отношении антигена можно определять экспериментально с использованием любого подходящего метода (смотри, например, Berzofsky, et al., «Antibody-Antigen Interactions» In Fundamental Immunology, Paul, W.E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984), Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992), а также методы, описанные в настоящем документе). Измеренная аффинность конкретного взаимодействия антитело-антиген может различаться при измерении в различных условиях (например, концентрация соли, pH). Таким образом, измерения аффинности и других параметров связывания антигена предпочтительно проводить со стандартизированными растворами антитела и антигена, а также стандартизированным буфером, таким как буфер, описанный в настоящем документе.
Антитела к GD2, используемые в способах и композициях по настоящему изобретению, характеризуются связыванием с GD2 и предпочтительно отличаются низкой токсичностью. В частности, антитело, указанный фрагмент или вариант по изобретению, в которых отдельные компоненты, такие как вариабельная область, константная область и каркас, отдельно и/или коллективно, необязательно и предпочтительно обладают низкой иммуногенностью, полезны по настоящему изобретению. Антитела, которые можно использовать по изобретению, необязательно, характеризуются способностью лечить пациентов в течение длительных периодов времени с измеримым ослаблением симптомов и низкой и/или приемлемой токсичностью. Низкая или приемлемая иммуногенность и/или высокая аффинность, а также другие подходящие свойства, могут вносить вклад в достижение терапевтических результатов. В настоящем документе «низкая иммуногенность» означает вызывание существенных HAHA, HACA или HAMA ответов у менее чем примерно 75%, или предпочтительно менее чем примерно 50% пациентов, получающих лечение, и/или выработку низкого титра антител у пациентов, получающих лечение (публикация Elliott et al., Lancet 344: 1125-1127 (1994), полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки).
Также можно использовать биспецифические, гетероспецифические, гетероконъюгированные или аналогичные антитела, которые представляют собой моноклональные гуманизированные антитела, имеющие специфичности в отношении по меньшей мере двух разных антигенов. В данном случае, одна из специфичностей связывания предназначена для по меньшей мере одного белка GD2, а другая специфичность предназначена для любого другого антигена. Способы получения биспецифических антител известны в данной области. Традиционно, рекомбинантное получение биспецифических антител основано на совместной экспрессии двух пар тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулина, при этом две тяжелые цепи имеют разные специфичности (Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)). Вследствие случайного ассортимента тяжелых и легких цепей иммуноглобулина, эти гибридомы (квадромы) продуцируют потенциальную смесь из 10 различных молекул антитела, из которых только одна имеет правильную биспецифическую структуру. Очистка правильной молекулы, которую, как правило, выполняют методами аффинной хроматографии, является довольно трудоемкой процедурой с низкими выходами продукта. Аналогичные методы описаны, например, в WO 93/08829, патентах США №№ 6210668, 6193967, 6132992, 6106833, 6060285, 6037453, 6010902, 5989530, 5959084, 5959083, 5932448, 5833985, 5821333, 5807706, 5643759, 5601819, 5582996, 5496549, 4676980, WO 91/00360, WO 92/00373, EP 03089, Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991), Suresh et al., Methods in Enzymology 121: 210 (1986), Chan and Carter, 2010, Nature Rev. 10, 301-316, Weiner et al., 2010, Nature Rev. 10, 317-327, полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.
В некоторых вариантах осуществления антитела, которые связываются с GD2, можно использовать в неконъюгированной форме. В других вариантах осуществления антитела, которые связываются с GD2, могут быть конъюгированы, например, с детектируемой меткой, терапевтическим средством, пролекарством или изотопом.
В некоторых способах по изобретению, описанных более подробно ниже, таких как способы обнаружения экспрессии GD2 в клетках или тканях в качестве меры метастатического потенциала клеток опухолей или в качестве способа идентификации in situ карцином (например, DCIS или LCIS) в тканях, антитела к GD2 конъюгированы с одной или более детектируемыми метками. В таких вариантах применения антитела можно метить для детекции путем ковалентного или нековалентного присоединения хромогенной, ферментной, радиоизотопной, изотопной, флуоресцентной, токсичной, хемилюминесцентной метки, контрастного вещества для ядерного магнитного резонанса или другой метки.
Примеры подходящих хромогенных меток включают диаминобензидин и 4-гидроксиазобензол-2-карбоновую кислоту.
Примеры подходящих ферментных меток включают малатдегидрогеназу, стафилококковую нуклеазу, Δ-5-стероид-изомеразу, дрожжевую алкогольдегидрогеназу, α-глицерофосфатдегидрогеназу, триозофосфатизомеразу, пероксидазу, щелочную фосфатазу, аспарагиназу, глюкозооксидазу, β-галактозидазу, рибонуклеазу, уриназу, каталазу, глюкоза-6-фосфатдегидрогеназу, глюкоамилазу и ацетилхолинэстеразу.
3
111
125
131
32
35
14
51
57
58
59
75
152
90
67
217
211
212
47
109
111
125
131
111
Примеры подходящих радиоизотопных меток включают H, In, I, I, P, S, C, Cr, To, Co, Fe, Se, Eu, Y, Cu, Ci, At, Pb, Sc, Pd и так далее. In является предпочтительным изотопом в случае использования in vivo визуализации, поскольку в этом случае удается избежать проблемы дегалогенирования I или I-меченых GD2-связывающих антител в печени. Кроме того, этот радионуклеотид имеет более благоприятную энергию гамма-излучения для визуализации (Perkins et al., Eur. J. Nucl. Med. 70: 296-301 (1985), Carasquillo et al., J. Nucl. Med. 25: 281-287 (1987)). Например, для In, связанного с моноклональными антителами при помощи 1-(P-изотиоцианатбензил)-DPTA, показано слабое поглощение в неопухолевых тканях, в частности, печени, и таким образом, повышается специфичность локализации опухоли (Esteban et al., J. Nucl. Med. 28: 861-870 (1987)).
157
55
162
52
56
Примеры подходящих нерадиоактивных изотопных меток включают Gd, Mn, Dy, Tr и Fe.
152
Примеры подходящих флуоресцентных меток включают Eu метку, флуоресцеиновую метку, изотиоцианатную метку, родаминовую метку, фикоэритриновую метку, фикоцианиновую метку, аллофикоцианиновую метку, метку зеленого флуоресцентного белка (GFP), o-фтальдегидную метку и флуорескаминовую метку.
Примеры подходящих токсичных меток включают дифтерийный токсин, рицин и холерный токсин.
Примеры хемилюминесцентных меток включают люминольную метку, изолюминольную метку, метку ароматического сложного эфира акридиния, имидазольную метку, метку соли акридиния, метку сложного эфира оксалата, люцифериновую метку, люциферазную метку и эквориновую метку.
Примеры контрастных веществ для ядерного магнитного резонанса включают ядра тяжелых металлов, таких как Gd, Mn и железо.
Типичные методы связывания описанных выше меток с антителами к GD2 описаны в Kennedy et al., Clin. CMm. Acta 70: 1-31 (1976) и Schurs et al., Clin. CMm. Acta 81: 1-40 (1977). Методами связывания, упомянутыми в последней публикации, являются глутаральдегидный метод, периодатный метод, дималеинимидный метод, метод с использованием м-малеимидобензил-N-гидрокси-сукцинимидного эфира, все из которых включены в настоящий документ посредством ссылки.
Для использования в определенных терапевтических подходах по изобретению, таких как абляция остаточных клеток опухолей после операции или профилактика метастазов, антитела к GD2 можно конъюгировать с одним или более лекарственными средствами, пролекарствами или изотопами. Предпочтительные такие конъюгаты содержат один или более лигандов, например, одно или более из антител или их фрагментов, производных или вариантов, которые связываются с GD2, конъюгированных с одним или более цитотоксическими средствами; такие конъюгаты полезны в способах лечения и профилактики метастазирования опухолей, предложенных по изобретению. В соответствии с некоторыми такими вариантами осуществления изобретения антитело к GD2 конъюгировано с цитотоксическим средством. Цитотоксические, например, химиотерапевтические средства, которые можно использовать для получения конъюгатов антитело к GD2-цитотоксическое средство, хорошо известны в данной области и включают, но не ограничиваются ими, цисплатин, карбоплатин, оксалиплатин, паклитаксел, мелфалан, доксорубицин, метотрексат, 5-фторурацил, этопозид, мехлорэтамин, циклофосфамид, блеомицин, яды для микротрубочек и аноновые ацетогенины. Другие химиотерапевтические средства, подходящие для использования по данному аспекту изобретения, хорошо известны и будут знакомы специалисту в данной области.
3
Использование конъюгатов одного или более антител к GD2 и одного или более низкомолекулярных токсинов, таких как калихеамицин, майтанзин (патент США № 5208020), трихотецен и CC1065, также предусмотрено в настоящем документе. В одном варианте осуществления изобретения антитело к GD2 конъюгировано с одной или более молекулами майтанзина (например, от примерно 1 до примерно 10 молекул майтанзина на антитело к GD2). Майтанзин может, например, превращаться в May-SS-Me, который может восстанавливаться до May-SH и вступать в реакцию с модифицированным антителом к GD2 (Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)), с образованием конъюгата майтанзиноид-антитело к GD2.
Альтернативно, антитело к GD2 можно конъюгировать с одной или более молекулами калихеамицина. Члены семейства калихеамициновых антибиотиков в субпикомолярных концентрациях способны создавать двухцепочечные разрывы в ДНК. Структурные аналоги калихеамицина, которые можно использовать, описаны в Hinman et al. Cancer Research 53: 3336-3342 (1993) и Lode et al. Cancer Research 58: 2925- 2928 (1998).
Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые можно использовать для получения конъюгатов с одним или более антителами к GD2, включают A-цепь дифтерийного токсина, несвязывающиеся активные фрагменты дифтерийного токсина, A-цепь экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), A-цепь рицина, A-цепь абрина, A-цепь модецина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, диантиновые белки, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор из Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор из Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены. Смотри, например, WO 93/21232, опубликованный на английском языке 28 октября 1993 г., полное содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки. Майтанзиноиды также можно конъюгировать с одним или более антителами к GD2.
Кроме того, по настоящему изобретению предусмотрено антитело к GD2, конъюгированное с соединением, имеющим нуклеолитическую активность (например, рибонуклеазой или ДНК-эндонуклеазой, такой как дезоксирибонуклеаза; ДНКаза).
Иллюстративные альтернативные форматы
В некоторых конкретных вариантах осуществления предложенные агенты на основе антител к GD2 или их последовательности используют в мультиспецифических (например, биспецифических) форматах. В некоторых вариантах осуществления биспецифическое моАт может состоять из двойных вариабельных доменов, с одним доменом, имеющим анти-3F8 вариабельный домен, и другим доменом, выбранным из группы, состоящей из анти-OKT3 для перенаправления T-клеток на опухоли для цитотоксического уничтожения, или DOTA-металла, C8.2.5 для многоступенчатого претаргетинга, или CD137 клона 35 для ADCC с scFv к 41BB в качестве агониста, или с CD137, 41BBL для ADC с 41BBL в качестве агониста. Результатом мутации N297A в домене CH2 является aгликозилирование, приводящее к отсутствию связывания FcR или C1q. Аминокислотная последовательность (hu3F8V1-scFv)-(huOKT3-scFv) с линкером и спейсером приведена в SEQ ID NO: 29, и без спейсера в SEQ ID NO: 30. Аминокислотная последовательность (hu3F8V1 scFv)-(C8.2.5-scFv) (на основании Orcutt et al., 2010, Protein Eng Design and Selection 23, 221) приведена в SEQ ID NO: 31.
Биспецифическое антитело (к GD2 и к DOTA) можно использовать в первом этапе многоступенчатого претаргетинга, с последующим клиренсом из крови с использованием DOTA(металл)-декстрана в качестве очищающего агента, и третьим этапом введения DOTA(металл)-конъюгированных терапевтических средств, таких как DOTA(металл)-радиоактивный металл, DOTA(металл)-наночастицы, DOTA(металл)-липосомы, DOTA(металл)-лекарственные средства, DOTA(металл)-ДНК, DOTA(металл)-РНК и DOTA(металл)-токсины. Поскольку C8.2.5 имеет разные аффинности для каждого типа комплексов DOTA-металл, аффинность претаргетированного C8.2.5 для очищающего агента и DOTA-лиганда можно точно контролировать.
Аминокислотную последовательность hu3F8 и его вариантов, представленных в настоящем документе, можно использовать для конструирования химерного антигенного рецептора (CAR), как это ранее было сделано для другого антитела к GD2 (Krause et al., 1998, J Exp Med 188, 619-626). CAR-стратегия ретаргетинга иммунных эффекторных клеток не зависит от взаимодействия MHC-пептид-TCR и позволяет клеткам реагировать с самыми разными антигенами клеточной поверхности (Davies and Maher, 2010, Achivum immunologiae et therapiae experimentalis 58, 165-178). Несколько методов было использовано в дизайне CAR, в большинстве из них использовали антигенсвязывающий домен моноклонального антитела в форме одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv) для узнавания антигена. Изначально T-клеточные активирующие рецепторы были взяты из исследований, в которых исследователи выясняли роль цепи CD3ζ (Irving and Weiss, 1991, Cell 64, 891-901, Romeo et al., 1992, Cell 68, 889-897). В последующих исследованиях интересующие scFv были слиты с цепью CD3ζ (Eshhar et al., 1993, PNAS USA 90, 720-724) или FcεRIγ (Weijtens et al., 1996, J Immunol 157, 836-843), и в обоих случаях было показано, что их достаточно для активации T-клеток. Хотя это заложило основу для конструирования CAR, встраивание костимулирующих молекул стали использовать после того, как было обнаружено, что первое поколение CAR было способно индуцировать T-клеточную пролиферацию только на протяжении 2-3 делений клеток, после чего быстро следовала гибель клеток (Gong et al., 1999, Neoplasia 1, 123-127). Путем экспрессии CD80 на целевой клетке опухоли исследователи смогли показать, что CAR-экспрессирующие клетки могут быть повторно стимулированы, что приводит к дальнейшему увеличению числа T-клеток. Первые CAR, в которые были включены костимулирующие молекулы CD28 наряду с цепью CD3ζ, продемонстрировали значительно улучшенные показатели по сравнению с теми случаями, когда была экспрессирована только цепь CD3ζ (Krause et al., 1998, выше, Haynes et al., 2002, Blood 100, 3155-3163, Maher et al., 2002, Nature Biotech 20, 70-75); сюда входило увеличение абсолютного числа T-клеток, а также увеличение продукции IL-2. Вслед за этим несколько других групп начали использовать другие костимулирующие молекулы, либо в сочетании только с CD3ζ, либо в сочетании как с CD3ζ, так и с CD28. Эти дополнительные сигнальные молекулы включают 4-1BB (Wang et al., 2007, Human Gene Ther 18, 712-725, Brentjens et al., 2007, Clin Cncer Res 13, 5426-5432, Imai et al., 2004, Leukemia 18, 676-684, Finney et al., 2004, J Immunol 172, 104-113), DAP10 (Brentjens et al., 2007, выше), OX40 (Brentjens et al., 2007, выше, Finney et al., 2004, выше, Wilkie et al., 2008, J Immunol 180, 4901-4909, Nguyen and Geiger, 2003, Gene Therapy 10, 594-604, Pule et al., 2005, Mol Ther 12, 933-941) и ICOS (Finney et al., 2004, выше) и были использованы в контексте T-клеток, а также NK-клеток (Daldrup-Link et al., 2005, Eropean radiology 15, 4-13, Imai and Campana, 2004, J Biol Reg Homeostatic Ag 18, 62-71, Roberts et al., 1998, J Immunol 375-384, Kruschinski et al., 2008, PNAS USA 105, 17481-17486, Pegram et al., 2008, J Immunol 181, 3449-3455). Хотя CAR первого поколения являются единственными, которые были протестированы в клинических испытаниях до настоящего времени, сравнительные исследования как in vitro, так и in vivo, продемонстрировали очевидное превосходство CAR второго и третьего поколения (Haynes et al., 2002, выше, Brentjens et al., 2007, выше, Teng et al., 2004, Human Gene Ther 15, 699-708, Haynes et al., 2002, J Immunol 169, 5780-5786, Kowolik et al., 2006, Cancer Res 66, 10995-11004, Loskog et al., 2006, Leukemia 20, 1819-1928, Moeller et al., 2004, Cancer Gene Therapy 11, 371-379, Vera et al., 2006, Blood 108, 3890-3897).
В настоящее время большинство исследователей используют смесь периферических T-клеток человека, однако другие исследователи недавно начали использовать EBV-специфические T-клетки (Rossig et al., 2002, Blood 99, 2009-2016), лимфоидные клетки-предшественники (Zakrzewski et al., 2006, Nature Med 12, 1039-1047, Zakrzewski et al., 2008, Nature Biotech 26, 453-461) и нефракционированные клетки костного мозга (Papapetrou et al., 2009, J Clin Invest 119, 157-168, Wang et al., 1998, Nature Med 4, 168-172). Киллерные лейкозные линии клеток (например, NK92, NK92MI, KHYG-1), которые являются цитолитическими и легко культивируемыми, также могут являться постоянным источником CAR-экспрессирующих эффекторных клеток для доклинических и клинических испытаний. NK92MI представляет собой линию NK-клеток человека, происходящую из неходжскинской лимфомы и трансдуцированную кДНК человеческого IL-2; предыдущие исследования показали их сильную цитотоксическую способность в мышиных моделях (Tam et al., 1999, J Hematol 8, 281-290, Korbelik and Sun, 2001, Inter J Cancer 93, 269-274). Кроме того, клетки NK92 также были использованы в клинических условиях, и была доказана их безопасность в ряде исследований фазы I у пациентов с почечноклеточным раком и меланомой (Arai et al., 2008, Cytotherapy 10, 625-632). Из-за легкости их поддержания in vitro и относительно короткого времени удвоения, эти клетки являются идеальными эффекторами для различных анализов на цитотоксичность с целью тестирования разных подходов таргетинга. При том что использование исходной IL-2-зависимой линии клеток NK92 продемонстрировало их минимальную токсичность как у мышей, так и у человека, IL-2-трансдуцированные клетки NK92MI могут иметь более высокий лейкозогенный потенциал. Один способ, с помощью которого исследователи пытаются избегать лейкозогенеза у мышей SCID при использовании клеток NK92, заключается в облучении эффекторов дозой 3000 сГр перед инокуляцией. В фазе I клинических испытаний этого достаточно для предотвращения неконтролируемой пролиферации клеток NK92MI в организме пациента с иммунной недостаточностью. Альтернативный механизм безопасности заключается в использовании генов самоубийства. Одним из обычных примеров является использование гена герпесвирусной тимидинкиназы, который действует, уничтожая клетку, экспрессирующую ген, при введении ацикловира или ганцикловира (Helene et al., 1997, J Immunol 5079-5082).
Нуклеиновые кислоты
В данной заявке описаны нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелых и легких цепей моАт по изобретению. Изобретение также относится к полинуклеотидам, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело по изобретению и его фрагменты. Изобретение также охватывает полинуклеотиды, которые гибридизуются в строгих или менее строгих условиях гибридизации с полинуклеотидами, кодирующими антитело по настоящему изобретению.
Полинуклеотиды в настоящее время можно получать любым методом, известным в данной области. Например, если нуклеотидная последовательность антитела известна, полинуклеотид, кодирующий антитело, можно собирать из химически синтезированных олигонуклеотидов (например, как описано в Kutmeier et al., BioTechniques 17: 242 (1994)), что, вкратце, включает синтез перекрывающихся олигонуклеотидов, содержащих части последовательности, кодирующей антитело, отжиг и лигирование этих олигонуклеотидов, с последующей амплификацией лигированных олигонуклеотидов с помощью ПЦР.
Альтернативно, полинуклеотид, кодирующий антитело, можно получать из нуклеиновой кислоты из подходящего источника. Если клон, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую конкретное антитело, недоступен, но последовательность молекулы антитела известна, нуклеиновую кислоту, кодирующую иммуноглобулин, можно химически синтезировать или получать из соответствующего источника (например, кДНК библиотеки антител или кДНК, из которой получена библиотека, или нуклеиновой кислоты, предпочтительно поли A+ РНК, выделенной из любой ткани или клеток, экспрессирующих антитело, например, клеток гибридомы, выбранной для экспрессии антитела по изобретению) методом ПЦР-амплификации с использованием синтетических праймеров, гибридизуемых с 3' и 5'-концами последовательности, или путем клонирования с использованием олигонуклеотидного зонда, специфичного для конкретной последовательности гена, для идентификации, например, кДНК клона из кДНК библиотеки, кодирующего антитело. Амплифицированные нуклеиновые кислоты, полученные методом ПЦР, затем можно клонировать в реплицируемые клонирующие векторы с использованием любого метода, хорошо известного в данной области.
После того, как нуклеотидная последовательность и соответствующая аминокислотная последовательность антитела определены, можно производить манипуляции с нуклеотидной последовательностью антитела, используя методы, хорошо известные в данной области для манипуляций с нуклеотидными последовательностями, например, технологии рекомбинантной ДНК, сайт-направленный мутагенез, ПЦР и так далее (смотри, например, методы, описанные в Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. и Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки), для получения антител, имеющих отличающуюся аминокислотную последовательность, например, для создания аминокислотных замен, делеций и/или вставок.
Молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению могут быть в форме РНК, например, мРНК, гяРНК, тРНК, или любой другой форме, или в форме ДНК, включая, но не ограничиваясь ими, кДНК и геномную ДНК, полученную путем клонирования или полученную синтетическими методами, или любым их сочетанием. ДНК может быть трехцепочечной, двухцепочечной или одноцепочечной, или представлять собой любое их сочетание. Любая часть по меньшей мере одной цепи ДНК или РНК может быть кодирующей цепью, также известной как смысловая цепь, или может быть некодирующей цепью, также известной как антисмысловая цепь.
Выделенные молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению могут включать молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие открытую рамку считывания (ORF), необязательно с одним или более интронами, например, но без ограничения, по меньшей мере одной определенной части по меньшей мере одной CDR, такой как CDR1, CDR2 и/или CDR3, по меньшей мере одной тяжелой цепи или легкой цепи; молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие кодирующую последовательность для антитела к GD2 или вариабельной области; и молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие нуклеотидную последовательность, в значительной степени отличающуюся от тех, которые описаны выше, но которая, в силу вырожденности генетического кода, все еще кодирует по меньшей мере одно антитело к GD2, как описано в настоящем документе и/или как известно в данной области.
Настоящее изобретение относится к выделенным нуклеиновым кислотам, которые гибридизуются в избирательных условиях гибридизации с полинуклеотидом, раскрытым в настоящем документе. Таким образом, полинуклеотиды данного варианта осуществления можно использовать для выделения, обнаружения и/или количественного определения нуклеиновых кислот, содержащих такие полинуклеотиды. Например, полинуклеотиды по настоящему изобретению можно использовать для идентификации, выделения или амплификации частичных или полноразмерных клонов в депонированной библиотеке. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды представляют собой геномные или кДНК последовательности, выделенные или, иначе, комплементарные кДНК из библиотеки нуклеиновых кислот человека или других млекопитающих.
Как правило, нуклеиновые кислоты могут содержать последовательности в дополнение к полинуклеотиду по настоящему изобретению. Например, сайт множественного клонирования, содержащий один или более сайтов рестрикции эндонуклеазы, можно вставлять в нуклеиновую кислоту для облегчения выделения полинуклеотида. Кроме того, транслируемые последовательности можно вставлять для облегчения выделения транслированного полинуклеотида по настоящему изобретению. Например, последовательность гексагистидинового маркера представляет собой удобное средство для очистки белков по настоящему изобретению. Нуклеиновая кислота по настоящему изобретению, за исключением кодирующей последовательности, необязательно, представляет собой вектор, адаптер или линкер для клонирования и/или экспрессии полинуклеотида по настоящему изобретению.
Дополнительные последовательности можно добавлять к таким последовательностям клонирования и/или экспрессии с целью оптимизации их функции в клонировании и/или экспрессии, для облегчения выделения полинуклеотида или для усовершенствования процесса введения полинуклеотида в клетку. Использование клонирующих векторов, экспрессионных векторов, адаптеров и линкеров хорошо известно в данной области. (Смотри, например, Ausubel, выше, или Sambrook, выше).
Вектор, содержащий любую из вышеописанных выделенных или очищенных молекул нуклеиновой кислоты или ее фрагментов, также предложен по настоящему изобретению. Любую из вышеописанных молекул нуклеиновой кислоты или ее фрагментов можно клонировать в любой подходящий вектор и можно использовать для трансформации или трансфекции любого подходящего хозяина. Выбор векторов и методов их конструирования хорошо понятен специалистам в данной области, как правило, соответствующую информацию можно найти в технических руководствах (смотри, как правило, «Recombinant DNA Part D», Methods in Enzymology, Vol. 153, Wu и Grossman, eds., Academic Press (1987)). Желательно, чтобы вектор содержал регуляторные последовательности, такие как кодоны инициации и терминации транскрипции и трансляции, которые являются специфичными для определенного типа хозяина (например, бактерии, грибка, растения или животного), в которого предстоит вводить вектор, подходящие и с учетом того, является ли вектор молекулой ДНК или РНК. Предпочтительно, вектор содержит регуляторные последовательности, которые специфичны для рода, к которому относится хозяин. Наиболее предпочтительно, вектор содержит регуляторные последовательности, которые специфичны для вида, к которому относится хозяин.
В дополнение к системе репликации и вставленной нуклеиновой кислоте конструкт может содержать один или более маркерных генов, которые позволяют отбирать трансформированных или трансфицированных хозяев. Маркерные гены включают гены устойчивости к биоцидам, например, устойчивости к антибиотикам, тяжелым металлам и так далее, комплементации в ауксотрофном хозяине для обеспечения прототрофии, и тому подобное.
Соответствующие векторы включают те, которые разработаны для репродукции и роста или для экспрессии, либо и того, и другого. Например, клонирующий вектор выбирают из группы, состоящей из векторов серии pUC, серии pBluescript (Stratagene, LaJolla, Calif.), серии pET (Novagen, Madison, Wis.), серии pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) и серии pEX (Clontech, Palo Alto, Calif.). Также можно использовать векторы на основе бактериофагов, такие как λGT10, λGT11, λZapII (Stratagene), λEMBL4 и λNM1149. Примеры растительных экспрессионных векторов включают pBI110, pBI101,2, pBI101,3, pBI121 и pBIN19 (Clontech). Примеры животных экспрессионных векторов включают pEUK-C1, pMAM и pMAMneo (Clontech). Систему клонирования TOPO (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) также можно использовать в соответствии с рекомендациями производителя.
Экспрессионный вектор может содержать естественный или не естественный промотор, функционально связанный с выделенной или очищенной молекулой нуклеиновой кислоты, описанной выше. Выбор промоторов, например, сильных, слабых, индуцируемых, тканеспецифичных и специфичных для стадии развития, находится в пределах компетенции специалистов в данной области. Аналогично, соединение молекулы нуклеиновой кислоты или ее фрагментов, описанных выше, с промотором также находится в пределах компетенции специалистов в данной области.
nd
Подходящие вирусные векторы включают, например, ретровирусные векторы, векторы на основе парвовируса, например, векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV), AAV-аденовирусные химерные векторы и векторы на основе аденовируса, а также лентивирусные векторы, такие как векторы на основе вируса простого герпеса (HSV). Эти вирусные векторы можно получать с использованием стандартных методов рекомбинантной ДНК, описанных, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2 edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates и John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994).
Ретровирусные векторы получают из ретровируса. Ретровирус представляет собой РНК вирус, способный инфицировать множество различных клеток-хозяев. При инфицировании ретровирусный геном интегрируется в геном его клетки-хозяина и реплицируется вместе с ДНК клетки-хозяина, при этом постоянно продуцируя вирусную РНК и любую нуклеотидную последовательность, встроенную в ретровирусный геном. Таким образом, с помощью ретровируса достигается долговременная экспрессия терапевтического фактора(ов). Ретровирусы, предназначенные для использования в генной терапии, являются относительно непатогенными, хотя существуют и патогенные ретровирусы. При использовании патогенных ретровирусов, например, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) или лимфотропных T-клеточных вирусов человека (HTLV), необходимо принимать меры для изменения вирусного генома, чтобы исключить токсичность для хозяина. Кроме того, ретровирусный вектор может быть изменен для получения дефектного по репликации вируса. Таким образом, ретровирусные векторы считаются особенно подходящими для стабильного переноса генов in vivo. Лентивирусные векторы, такие как векторы на основе ВИЧ, являются примерами ретровирусных векторов, используемых для доставки генов. В отличие от других ретровирусов, векторы на основе ВИЧ, как известно, включают свои гены-пассажиры в неделящиеся клетки и, таким образом, могут быть полезны в лечении персистентных форм заболевания.
Необязательно, выделенная или очищенная молекула нуклеиновой кислоты или ее фрагмент при связывании с другой молекулой нуклеиновой кислоты может кодировать слитый белок. Получение слитых белков находится в пределах компетенции специалиста в данной области и может включать использование ферментов рестрикции или методов рекомбинационного клонирования (смотри, например, Gateway.TM. (Invitrogen)). Смотри также патент США № 5314995.
В свете вышеизложенного, настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей вышеописанную выделенную или очищенную молекулу нуклеиновой кислоты, необязательно, в форме вектора. Композиция может содержать и другие компоненты, как описано далее в настоящем документе.
211
131
125
90
186
188
153
212
32
Также можно использовать изотопы для получения конъюгированного с радиоактивным изотопом антитела к GD2 для использования в терапевтических способах по изобретению. Примеры включают At, I, I, Y, Re, Re, Sm, Bi, P и радиоактивные изотопы Lu.
14
Конъюгаты антитела к GD2 и цитотоксических средств можно получать с использованием различных бифункциональных белок-связывающих агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитиол)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат, иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат-HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин рицин можно получать, как описано в публикации Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). C-меченая 1-изотиоцианатбензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA) является иллюстративным хелатообразующим агентом для конъюгирования радионуклеотида с антителом к GD2. Смотри WO 94/11026. Линкер может быть «расщепляемым линкером», облегчающим высвобождение цитотоксического терапевтического средства в клетке. Например, можно использовать кислотно-лабильной линкер, чувствительный к пептидазе линкер, диметиловый линкер или дисульфид-содержащий линкер (Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)).
Альтернативно, слитый белок, содержащий лиганд антитело к GD2 и цитотоксическое средство, можно получать, например, рекомбинантными методами или пептидным синтезом.
Композиции
Композиции антитела к GD2 по настоящему изобретению включают любое подходящее и эффективное количество композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один агент на основе антитела к GD2, для использования в доставке предложенного агента на основе антитела в клетку, ткань, орган, организм животного или пациента, который нуждается в таком модулировании, лечении или терапии.
Настоящее изобретение также относится к по меньшей мере одной композиции антитела к GD2, содержащей по меньшей мере одно, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть или более антител к GD2, описанных в настоящем документе и/или известных в данной области, которые предоставляются в неприродный композиции, смеси или форме. Такие композиции включают неприродные композиции, содержащие по меньшей мере один или два полноразмерных, укороченных с C- и/или N-конца варианта, домена, фрагмента или определенных варианта аминокислотной последовательности антитела к GD2, выбранной из группы, состоящей из 70-100% смежных аминокислот из CDR областей антител, описанных в настоящем документе, или их определенных фрагментов, доменов или вариантов. Предпочтительные композиции антитела к GD2 содержат по меньшей мере один или два полноразмерных варианта, фрагмента, домена или варианта, например, по меньшей мере одну из содержащих CDR или LBR области последовательностей антитела к GD2, описанных в настоящем документе. Более предпочтительные композиции содержат 40-99% по меньшей мере одной последовательности, содержащей 70-100% CDR-области антитела к GD2, описанного в настоящем документе. Процентное содержание таких композиций представлено по массе, объему, концентрации, молярности или моляльности жидких или сухих растворов, смесей, суспензий, эмульсий или коллоидов, известных в данной области или описанных в настоящем документе.
th
Соединения, композиции или сочетания антител к GD2 по настоящему изобретению могут дополнительно содержать по меньшей мере одно из любого подходящего вспомогательного вещества, такого как, но не ограничиваясь ими, разбавитель, связующее вещество, стабилизатор, буферы, соли, липофильные растворители, консервант, адъювант или тому подобное. Фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества являются предпочтительными. Неограничивающие примеры и способы получения таких стерильных растворов хорошо известны в данной области, например, но не ограничиваясь ими, те, которые описаны в Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 Edition, Mack Publishing Co. (Easton, Pa.) 1990. Можно, как правило, выбирать фармацевтически приемлемые носители, которые подходят для способа введения, растворимости и/или стабильности композиции антитела к GD2, фрагмента или варианта, известные в данной области или описанные в настоящем документе.
Фармацевтические эксципиенты и добавки, полезные в настоящей композиции, включают, но не ограничиваются ими, белки, пептиды, аминокислоты, липиды и углеводы (например, сахара, включая моносахариды, ди-, три-, тетра- и олигосахариды, дериватизированные сахара, такие как альдиты, альдоновые кислоты, эстерифицированные сахара и тому подобное, а также полисахариды или сахарные полимеры), которые могут присутствовать отдельно или в сочетании, составляя отдельно или сочетании 1-99,99% по массе или объему. Иллюстративные белковые эксципиенты включают сывороточный альбумин, такой как человеческий сывороточный альбумин (ЧСА), рекомбинантный человеческий альбумин (рЧА), желатин, казеин и тому подобное. Репрезентативные аминокислоты/компоненты антитела, которые также могут обладать буферной способностью, включают аланин, глицин, аргинин, бетаин, гистидин, глютаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, цистеин, лизин, лейцин, изолейцин, валин, метионин, фенилаланин, аспартам, и тому подобное. Одной из предпочтительных аминокислот является глицин.
Углеводные эксципиенты, подходящие для использования по изобретению, включают, например, моносахариды, такие как фруктоза, мальтоза, галактоза, глюкоза, D-манноза, сорбоза и тому подобное; дисахариды, такие как лактоза, сахароза, трегалоза, целлобиоза и тому подобное; полисахариды, такие как рафиноза, мелизитоза, мальтодекстрины, декстраны, крахмалы и тому подобное; и альдиты, такие как маннит, ксилит, мальтит, лактит, ксилит, сорбит (глюцит), миоинозитол и тому подобное. Предпочтительными углеводными эксципиентами для использования по настоящему изобретению являются маннит, трегалоза и рафиноза.
Композиции антитела к GD2 могут также включать буфер или pH-регулирующее средство; как правило, буфер представляет собой соль, полученную из органической кислоты или основания. Репрезентативные буферы включают соли органических кислот, такие как соли лимонной кислоты, аскорбиновой кислоты, глюконовой кислоты, угольной кислоты, виннокаменной кислоты, янтарной кислоты, уксусной кислоты или фталевой кислоты; трис, трометамина гидрохлорид или фосфатные буферы. Предпочтительными буферами для использования в настоящих композициях являются соли органических кислот, такие как цитрат.
Кроме того, композиции антитела к GD2 по изобретению могут содержать полимерные эксципиенты/добавки, такие как поливинилпирролидоны, фиколлы (полимерный сахар), декстраты (например, циклодекстрины, такие как 2-гидроксипропил-β-циклодекстрин), полиэтиленгликоли, ароматизаторы, противомикробные средства, подсластители, антиоксиданты, антистатики, сурфактанты (например, полисорбаты, такие как «TWEEN 20» и «TWEEN 80»), липиды (например, фосфолипиды, жирные кислоты), стероиды (например, холестерин) и хелаторы (например, ЭДТА).
Эти и другие известные фармацевтические эксципиенты и/или добавки, подходящие для использования в композициях антитела к GD2, его частей или вариантов по изобретению, известны в данной области, например, перечислены в «Remington: The Science & Practice of Pharmacy», 19th ed., Williams & Williams, (1995), и в «Physician's Desk Reference», 52nd ed., Medical Economics, Montvale, N.J. (1998), полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки. Предпочтительными носителями или эксципиентами являются углеводы (например, сахариды и альдиты) и буферы (например, цитрат) или полимерные вещества.
Как было отмечено выше, изобретение относится к стабильным препаратам, которые предпочтительно представляют собой фосфатный буфер с солевым раствором или выбранной солью, а также к консервированным растворам и препаратам, содержащим консервант, а также многофункциональным консервированным препаратам, подходящим для фармацевтического или ветеринарного применения, содержащим по меньшей мере одно антитело к GD2 в фармацевтически приемлемом препарате. Консервированные препараты содержат по меньшей мере один известный консервант или, необязательно, выбранный из группы, состоящей из по меньшей мере одного фенола, м-крезола, п-крезола, о-крезола, хлоркрезола, бензилового спирта, фенилртутного нитрита, феноксиэтанола, формальдегида, хлорбутанола, хлорида магния (например, гексагидрата), алкилпарабена (метила, этила, пропила, бутила и тому подобного), бензалкония хлорида, бензэтония хлорида, натрия дегидроацетата и тимеросала, или их смесей в водном разбавителе. Как известно в данной области, можно использовать любую подходящую концентрацию, например, 0,001-5%, или любой диапазон или значение в этих пределах, например, но без ограничения, 0,001, 0,003, 0,005, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,3, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, или любой диапазон или значение в этих пределах. Неограничивающие примеры включают: без консерванта, 0,1-2% м-крезол (например, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,1-3% бензиловый спирт (например, 0,5, 0,9, 1,1, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5%), 0,001-0,5% тимеросал (например, 0,005, 0,01), 0,001-2,0% фенол (например, 0,05, 0,25, 0,28, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,0005-1,0% алкилпарабен(ы) (например, 0,00075, 0,0009, 0,001, 0,002, 0,005, 0,0075, 0,009, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,75, 0,9, 1,0%) и тому подобное.
Как указано выше, изобретение относится к изделию, включающему упаковочный материал и по меньшей мере один флакон, содержащий раствор по меньшей мере одного антитела к GD2 с предписанными буферами и/или консервантами, необязательно, в водном разбавителе, при этом указанный упаковочный материал содержит этикетку, в которой указано, что такой раствор можно хранить в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 часов или более. Кроме того, изобретение относится к изделию, включающему упаковочный материал, первый флакон, содержащий лиофилизированное по меньшей мере одно антитело к GD2, и второй флакон, содержащий водный разбавитель из предписанного буфера или консерванта, при этом указанный упаковочный материал содержит этикетку, которая инструктирует пациента восстанавливать по меньшей мере одно антитело к GD2 в водном разбавителе для получения раствора, который можно хранить на протяжении двадцати четырех часов или более.
Диапазон количеств по меньшей мере одного антитела к GD2 в препарате по настоящему изобретению включает количества, получаемые после восстановления, в случае влажной/сухой системы, соответствующие концентрациям от примерно 1,0 микрограмма/мл до примерно 1000 мг/мл, хотя можно использовать более низкие или высокие концентрации в зависимости от намеченной среды для доставки, например, концентрация препарата в растворах будет отличаться от концентрации в чрескожном пластыре, а также в случае доставки в легкие, через слизистую оболочку или с помощью осмоса или микронасоса.
Кроме того, предпочтительно, если водный разбавитель, необязательно, содержит фармацевтически приемлемый консервант. Предпочтительные консерванты включают те, которые выбраны из группы, состоящей из фенола, м-крезола, п-крезола, о-крезола, хлоркрезола, бензилового спирта, алкилпарабена (метила, этила, пропила, бутила и тому подобного), бензалкония хлорида, бензэтония хлорида, натрия дегидроацетата и тимеросала, или их смесей. Концентрация консерванта, используемого в препарате, представляет собой концентрацию, достаточную для обеспечения антимикробного действия. Такие концентрации зависят от выбранного консерванта и легко могут быть определены специалистом в данной области.
В разбавитель, необязательно и предпочтительно, можно добавлять и другие эксципиенты, например, изотонические средства, буферы, антиоксиданты, консерванты, усилители. Изотоническое средство, такое как глицерин, обычно используют в известных концентрациях. Физиологически переносимый буфер предпочтительно добавляют для обеспечения лучшего контроля pH. Препараты могут иметь широкий диапазон значений pH, например, от примерно pH 4 до примерно pH 10, и предпочтительный диапазон составляет от примерно pH 5 до примерно pH 9, и наиболее предпочтительный диапазон составляет от примерно 6,0 до примерно 8,0. Предпочтительно, препараты по настоящему изобретению имеют значение pH от примерно 6,8 до примерно 7,8. Предпочтительные буферы включают фосфатные буферы, наиболее предпочтительно фосфат натрия, особенно фосфатно-солевой буфер (PBS).

Другие добавки, такие как фармацевтически приемлемые солюбилизаторы, например, Tween 20 (полиоксиэтилен (20) сорбитан монолаурат), Tween 40 (полиоксиэтилен (20) сорбитан монопальмитат), Tween 80 (полиоксиэтилен (20) сорбитан моноолеат), плюроник F68 (блок-сополимеры полиоксиэтилена и полиоксипропилена) и ПЭГ (полиэтиленгликоль) или неионные сурфактанты, такие как полисорбат 20 или 80, или полоксамер 184 или 188, PLURONIC полиолы, другие блок-coполимеры и хелаторы, такие как ЭДТА и ЭГТА, необязательно, можно добавлять к препаратам или композициям для уменьшения агрегации. Эти добавки особенно полезны, если для введения препарата используют насос или пластиковый контейнер. Присутствие фармацевтически приемлемого сурфактанта снижает предрасположенность белка к агрегации.
Препараты по настоящему изобретению можно получать методом, который включает смешивание по меньшей мере одного антитела к GD2 и консерванта, выбранного из группы, состоящей из фенола, м-крезола, п-крезола, о-крезола, хлоркрезола, бензилового спирта, алкилпарабена (метила, этила, пропила, бутила и тому подобного), бензалкония хлорида, бензэтония хлорида, натрия дегидроацетата и тимеросала или их смесей в водном разбавителе. Смешивание по меньшей мере одного антитела к GD2 и консерванта в водном разбавителе осуществляют с использованием общепринятых процедур растворения и смешивания. Для получения соответствующего препарата, например, отмеренное количество по меньшей мере одного антитела к GD2 в буферном растворе объединяют с нужным консервантом в буферном растворе в количествах, достаточных для обеспечения нужных концентраций белка и консерванта. Вариации этого процесса известны специалистам в данной области. Например, порядок, в котором добавляют компоненты, используются ли дополнительные добавки, температура и pH, при которых готовят препарат, все являются факторами, которые можно оптимизировать в соответствии с используемыми концентрациями и способами введения.
Заявленные препараты можно предоставлять пациентам в виде прозрачных растворов или в виде двух флаконов, включающих флакон с лиофилизированным по меньшей мере одним антителом к GD2, которое восстанавливают с использованием второго флакона, содержащего воду, консервант и/или эксципиенты, предпочтительно, фосфатный буфер и/или солевой раствор и выбранную соль в водном разбавителе. Как одиночный флакон с раствором, так и набор из двух флаконов, в случае которого необходимо восстановление, могут быть использованы много раз и их может хватить для одного или нескольких циклов лечения пациента и, таким образом, может быть обеспечен более удобный режим, чем тот, который используют в настоящее время.
Настоящие заявленные изделия используют для введения на протяжении периода времени от одного момента до двадцати четырех часов или более. Соответственно, настоящие заявленные изделия имеют значительные преимущества для пациента. Препараты по изобретению, необязательно, могут безопасно храниться при температурах от примерно 2°C до примерно 40°C и сохранять биологическую активность белка в течение длительных периодов времени, таким образом, на этикетке упаковки может быть указано, что раствор можно хранить и/или использовать на протяжении 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 или 96 часов или более. При использовании консервированного разбавителя срок хранения, указанный на такой этикетке, может составлять вплоть до 1-12 месяцев, полугода, полутора лет и/или двух лет.
Растворы по меньшей мере одного антитела к GD2 по изобретению можно получать способом, который включает смешивание по меньшей мере одного антитела с водным разбавителем. Смешивание выполняют с использованием обычных процедур растворения и смешивания. Для получения соответствующего разбавления, например, отмеренное количество по меньшей мере одного антитела объединяют с водой или буфером в количествах, достаточных для достижения нужных концентраций белка и, необязательно, консерванта или буфера. Вариации этого процесса известны специалистам в данной области. Например, порядок, в котором добавляют компоненты, используются ли дополнительные добавки, температура и pH, при которых готовят препарат, все являются факторами, которые можно оптимизировать в соответствии с используемыми концентрациями и способами введения.
Заявленные препараты можно предоставлять пациентам в виде прозрачных растворов или в виде двух флаконов, включающих флакон с лиофилизированным по меньшей мере одним антителом к GD2, которое восстанавливают с использованием второго флакона, содержащего водный разбавитель. Как одиночный флакон с раствором, так и набор из двух флаконов, в случае которого необходимо восстановление, могут быть использованы много раз и их может хватить для одного или нескольких циклов лечения пациента и, таким образом, может быть обеспечен более удобный режим, чем тот, который используют в настоящее время.
Заявленные препараты можно предоставлять пациентам не напрямую, путем поставок в аптеки, клиники или другие подобные учреждения или организации прозрачных растворов или набора из двух флаконов, включающего флакон с лиофилизированным по меньшей мере одним антителом к GD2, которое восстанавливают с использованием второго флакона, содержащего водный разбавитель. В этом случае прозрачный раствор может иметь объем до одного литра или даже больше и содержаться в большом резервуаре, из которого меньшие по объему порции раствора по меньшей мере одного антитела можно отбирать один или несколько раз для переноса в меньшие по размеру флаконы, которые из аптеки или клиники будут переданы клиентам и/или пациентам.

Признанные устройства, представляющие собой системы из таких одиночных флаконов, включают устройства в виде ручки-инжектора для доставки растворов, такие как BD Pens, BD AUTOJECTOR, HUMAJECT, например, изготовленные или разработанные компанией Becton Dickensen (Franklin Lakes, N.J.), Disetronic (Burgdorf, Switzerland; Bioject, Portland, Oreg.; National Medical Products, Weston Medical (Peterborough, UK), Medi-Ject Corp (Minneapolis, Minn.). Признанные устройства, представляющие собой системы из двух флаконов, включают устройства в виде ручки-инжектора для восстановления лиофилизированного терапевтического средства в картридже для доставки восстановленного раствора, такие как HUMATROPEN.
Настоящие заявленные препараты включают упаковочный материал. Упаковочный материал обеспечивает, в дополнение к информации, соответствующей требованиям регулирующих органов, условия, в которых препарат может быть использован. Упаковочный материал по настоящему изобретению содержит инструкции для пациента по восстановлению по меньшей мере одного антитела к GD2 в водном разбавителе для получения раствора и по использованию раствора в течение 2-24 часов или более в случае влажного/сухого препарата в двух флаконах. В случае препарата в одном флаконе на этикетке указано, что такой раствор можно использовать в течение 2-24 часов или более. Настоящие заявленные препараты подходят для фармацевтического применения для людей.
Препараты по настоящему изобретению можно получать методом, который включает смешивание по меньшей мере одного антитела к GD2 и выбранного буфера, предпочтительно фосфатного буфера, содержащего солевой раствор или выбранную соль. Смешивание по меньшей мере одного антитела и буфера в водном разбавителе выполняют с использованием обычных процедур растворения и смешивания. Для получения соответствующего препарата, например, отмеренное количество по меньшей мере одного антитела в воде или буфере объединяют с нужным буферным агентом в воде в количествах, достаточных для обеспечения нужных концентраций белка и буфера. Вариации этого процесса известны специалистам в данной области. Например, порядок, в котором добавляют компоненты, используются ли дополнительные добавки, температура и pH, при которых готовят препарат, все являются факторами, которые можно оптимизировать в соответствии с используемыми концентрациями и способами введения.
Заявленные стабильные или консервированные препараты можно предоставлять пациентам в виде прозрачных растворов или в виде двух флаконов, включающих флакон с лиофилизированным по меньшей мере одним антителом к GD2, которое восстанавливают с использованием второго флакона, содержащего консервант или буфер и эксципиенты в водном разбавителе. Как одиночный флакон с раствором, так и набор из двух флаконов, в случае которого необходимо восстановление, могут быть использованы много раз и их может хватить для одного или нескольких циклов лечения пациента и, таким образом, может быть обеспечен более удобный режим, чем тот, который используют в настоящее время.
По меньшей мере одно антитело к GD2 либо в стабильных или представленных препаратах, либо в растворах, описанных в настоящем документе, можно вводить пациенту в соответствии с настоящим изобретением, используя множество различных способов доставки, включая п/к или в/м инъекцию; чрескожный, легочный, трансмукозальный пути введения, имплантат, осмотический насос, картридж, микронасос или другие средства, признанные специалистами в данной области и хорошо известные в данной области.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтические композиции, содержащие антитело к GD2 по изобретению, облегчают введение гуманизированных антител в организм, предпочтительно животного, предпочтительно млекопитающего. Конкретные млекопитающие включают крупный рогатый скот, собак, лошадей, кошек, овец и свиней, приматов, отличных от человека, и людей. Люди являются особенно предпочтительными.
Лекарственные формы (композиция), подходящие для внутреннего введения, как правило, содержат от примерно 0,1 миллиграмма до примерно 500 миллиграммов активного ингредиента на единицу или контейнер. В этих фармацевтических композициях активный ингредиент, как правило, будет присутствовать в количестве примерно 0,5-99,999% по массе, в расчете на общую массу композиции.
Для парентерального введения антитело можно формулировать в виде раствора, суспензии, эмульсии или лиофилизированного порошка в смеси с, или в комплекте с отдельно предоставленным, фармацевтически приемлемым парентеральным растворителем. Примерами таких растворителей являются вода, солевой раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы и 1-10% человеческий сывороточный альбумин. Также можно использовать липосомы и неводные носители, такие как жирные масла. Растворитель или лиофилизированный порошок может содержать добавки, которые поддерживают изотоничность (например, хлорид натрия, маннит) и химическую стабильность (например, буферы и консерванты). Препарат стерилизуют известными или подходящими методами.
Подходящие фармацевтические носители описаны в последнем издании сборника Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, стандартной справочной литературе в данной области.
Препараты для парентерального введения могут содержать в качестве обычных эксципиентов стерильную воду или солевой раствор, полиалкиленгликоли, такие как полиэтиленгликоль, масла растительного происхождения, гидрогенизированные нафталины и тому подобное. Водные или масляные суспензии для инъекции можно получать известными методами с использованием соответствующего эмульгатора или увлажнителя и суспендирующего вещества. Средства для инъекции могут представлять собой нетоксичный, вводимый не пероральным путем разбавитель, такой как водный раствор или стерильный инъекционный раствор или суспензия в растворителе. В качестве приемлемого растворителя или среды допустимо использовать воду, раствор Рингера, изотонический солевой раствор и так далее; в качестве обычного растворителя или суспендирующего растворителя можно использовать стерильное нелетучее масло. Для этих целей можно использовать нелетучее масло и жирную кислоту любого типа, включая природные или синтетические, или полусинтетические жирные масла или жирные кислоты; природные или синтетические, или полусинтетические моно- или ди- или триглицериды. Парентеральное введение известно в данной области и включает, но не ограничивается ими, обычные инъекции, введение безыгольным инъектором для введения препарата под давлением, описанным в патенте США № 5851198, и введение лазерным перфораторным устройством, описанным в патенте США № 5839446, полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.
Комбинированная терапия
nd
В некоторых вариантах осуществления предложенные антитело к GD2 вводят, необязательно, в сочетании с по меньшей мере одним средством, выбранным из по меньшей мере одного антагониста TNF (например, но без ограничения, антитела к TNF или его фрагмента, растворимого рецептора TNF или его фрагмента, их слитых белков или низкомолекулярного антагониста TNF), противоревматического средства (например, метотрексата, ауранофина, ауротиоглюкозы, азатиоприна, этанерцепта, ауротиомалата натрия, гидроксихлорохина сульфата, лефлуномида, сульфасалзина), мышечного релаксанта, наркотика, нестероидного противовоспалительного терапевтического средства (НПВС), анальгетика, анестетика, седативного препарата, местного анестетика, блокатора нервно-мышечного проведения, противомикробного препарата (например, аминогликозида, противогрибкового средства, противопаразитарного средства, противовирусного средства, карбапенема, цефалоспорина, фторхинолона, макролида, пенициллина, сульфонамида, тетрациклина, других противомикробных препаратов), антипсориазного препарата, кортикостероида, анаболического стероида, антидиабетического препарата, минерала, питательного вещества, тиреоидного гормона, витамина, связанного с кальцием гормона, антидиарейного средства, противокашлевого средства, противорвотного средства, противоязвенного средства, слабительного, антикоагулянта, эритропоэтина (например, эпоэтина альфа), филграстима (например, G-CSF, нейпогена), сарграмостима (GM-CSF, лейкина), препарата для иммунизации, иммуноглобулина, иммуносупрессора (например, базиликсимаба, циклоспорина, даклизумаба), гормона роста, терапевтического средства гормонозаместительной терапии, модулятора рецептора эстрогена, мидриатического средства, циклоплегического средства, алкилирующего средства, антиметаболита, ингибитора митоза, радиофармацевтического средства, антидепрессанта, противоманиакального средства, антипсихотического препарата, анксиолитика, снотворного средства, симпатомиметика, стимулятора, донепезила, такрина, лекарства от астмы, бета-агониста, ингаляционного стероида, ингибитора лейкотриенов, метилксантина, кромолина, адреналина или аналога, дорназы альфа (пульмозима), цитокина или антагониста цитокина, а также средств клеточной терапии. Неограничивающие примеры таких цитокинов включают, но не ограничиваются ими, любые из IL-1-IL-34. Подходящие дозировки хорошо известны в данной области. Смотри, например, Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2 Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, Calif. (2000), полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.
rd
nd
rd
th
Такие противораковые или противомикробные препараты могут также включать молекулы токсинов, которые ассоциируют, связывают, совместно формулируют или совместно вводят с по меньшей мере одним антителом по настоящему изобретению. Токсин может, необязательно, действовать, избирательно уничтожая патологическую клетку или ткань. Патологическая клетка может быть раковой или другой клеткой. Такие токсины могут включать, но не ограничиваются ими, очищенный или рекомбинантный токсин или фрагмент токсина, содержащий по меньшей мере один функциональный цитотоксический домен токсина, например, выбранного по меньшей мере из рицина, дифтерийного токсина, токсина яда или бактериального токсина. Термин «токсин» включает как эндотоксины, так и экзотоксины, продуцируемые любыми природными, мутантными или рекомбинантными бактериями или вирусами, которые могут вызывать любое патологическое состояние у человека и других млекопитающих, включая токсический шок, который может приводить к смерти. Такие токсины могут включать, но не ограничиваются ими, термолабильный энтеротоксин (LT), термостабильный энтеротоксин (ST) энтеротоксигенной E. coli, цитотоксин Shigella, энтеротоксины Aeromonas, токсин-1 синдрома токсического шока (TSST-1), стафилококковый энтеротоксин A (SEA), B (SEB) или C (SEC), стрептококковые энтеротоксины и тому подобное. Такие бактерии включают, но не ограничиваются ими, штаммы вида энтеротоксигенной E. coli (ETEC), энтерогеморрагической E. coli (например, штаммы серотипа 0157:H7), вид Staphylococcus (например, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes), вид Shigella (например, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii и Shigella sonnei), вид Salmonella (например, Salmonella typhi, Salmonella cholera-suis, Salmonella enteritidis), вид Clostridium (например, Clostridium perfringens, Clostridium dificile, Clostridium botulinum), вид Camphlobacter (например, Camphlobacter jejuni, Camphlobacter fetus), вид Heliobacter (например, Heliobacter pylori), вид Aeromonas (например, Aeromonas sobria, Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae), Plesiomonas shigelloides, Yersina enterocolitica, вид Vibrios (например, Vibrios cholerae, Vibrios parahemolyticus), вид Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa и Streptococci. Смотри, например, Stein, ed., INTERNAL MEDICINE, 3 ed., pp. 1-13, Little, Brown and Co., Boston, (1990), Evans et al., eds., Bacterial Infections of Humans: Epidemiology and Control, 2 Ed., pp. 239-254, Plenum Medical Book Co., New York (1991), Mandell et al., Principles and Practice of Infectious Diseases, 3 Ed., Churchill Livingstone, N.Y. (1990), Berkow et al., eds., The Merck Manual, 16 edition, Merck и Co., Rahway, N.J., 1992, Wood et al., FEMS Microbiology Immunology, 76: 121-134 (1991), Marrack et al., Science, 248: 705-711 (1990), полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.
Получение
По меньшей мере одно антитело к GD2, используемое в соответствии с настоящим изобретением, может быть получено рекомбинантными методами, в том числе, из клетки млекопитающего или трансгенных препаратов, или может быть очищено из других биологических источников, описанных в настоящем документе или известных в данной области.
Кроме того, в свете вышеизложенного, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей вышеописанную выделенную или очищенную молекулу нуклеиновой кислоты, необязательно, в форме вектора. Наиболее предпочтительно, чтобы клетки по настоящему изобретению экспрессировали вектор таким образом, чтобы олигонуклеотид или его фрагмент эффективно транскрибировался бы и транслировался бы клеткой. Примеры клеток включают, но не ограничиваются ими, человеческую клетку, человеческую линию клеток, E. coli (например, E. coli TB-1, TG-2, DH5α, XL-Blue MRF' (Stratagene), SA2821 и Y1090), B. subtilis, P. aerugenosa, S. cerevisiae, N. crassa, клетки насекомых (например, Sf9, Ea4) и другие клетки, описанные далее в настоящем документе. Клетка-хозяин может присутствовать в организме хозяина, который может быть животным, таким как млекопитающее, в частности, человек.
В конкретном варианте осуществления, используя рутинные методы рекомбинантной ДНК, одну или более из CDR, описанных в настоящем документе, можно вводить в состав каркасных областей. Каркасные области могут быть природными или консенсусными каркасными областями, и предпочтительно, каркасными областями иммуноглобулина человека (смотри, например, Chothia et al., J. Mol. Biol. 278: 457-479 (1998) для списка каркасных областей иммуноглобулинов человека). Предпочтительно, полинуклеотид, полученный путем объединения каркасных областей и CDR, кодирует антитело, которое специфически связывает GD2. Одну или более аминокислотных замен можно осуществлять в каркасных областях, и предпочтительно, аминокислотные замены приводят к улучшению связывания антитела с его антигеном. Кроме того, такие методы можно использовать для осуществления аминокислотных замен или делеций одного или более остатков цистеина вариабельной области, участвующих в образовании внутрицепочечной дисульфидной связи, для получения молекул антитела, лишенных одной или более внутрицепочечных дисульфидных связей. Другие изменения в полинуклеотиде входят в объем настоящего изобретения и находятся в пределах компетенции специалиста в данной области.
Варианты применения
Высокоаффинное нейтрализующее химерное или человеческое антитело к GD2 желательно использовать для лечения заболеваний, при которых экспрессируется GD2, например, GD2 экспрессируется в >50% случаев меланомы (Zhang et al., 1997, Int. J. Cancer. 73, 42-49), 88% случаев остеосаркомы (Heiner et al., 1987, Cancer Res. 47, 5377-5388) и 93% случаев саркомы мягких тканей, включая липосаркому, фибросаркому, злокачественную фиброзную гистиоцитому, лейомиосаркому и веретеноклеточную саркому (Chang et al., 1992, Cancer 70, 633-638), а также опухоли мозга (Longee et al., 1991, Acta Neuropathol. 82, 45-54). Антитела к GD2 были протестированы в лечении пациентов с меланомой (Saleh et al., 1992, Hum. Antibodies Hybridomas 3, 19-24, Cheung et al., 1987, J. Clin. Oncol. 5, 1430-1440, Choi et al., 2006, Cancer Immunol. Immunother. 55, 761-774), саркомой (Choi et al., 2006, выше, Yeh et al., 1992, The fifth Asia and Oceania Congress of Nuclear Medicine and Biology Proceedings, p. 104), мелкоклеточным раком легкого (Grant et al., 1996, Eur. J. Nucl. Med. 23, 145-149), опухолями мозга (Arbit et al., 1995, Eur. J. Nucl. Med. 22, 419-426) путем в/в инъекции, а также в компартментальной терапии с использованием резервуаров Оммайя (Kramer et al., 2007, J. Clin. Oncol. 25, 5465-5470). GD2 также является опухолевой мишенью для ретинобластомы (Chantada et al., 2006, J. Pediatr. Hematol. Oncol. 28, 369-373) и инфицированных HTLV-1 T-клеточных лейкозных клеток (Furukawa et al., 1993, PNAS USA 90, 1972-1976). В одном предпочтительном аспекте антитело к GD2 по изобретению можно использовать для лечения нейробластомы. Антитела к GD2 или их производные можно использовать либо в качестве отдельного средства, либо в сочетании с другими терапевтическими средствами. Кроме того, эти мАт можно использовать в качестве хемосенсибилизатора, таким образом, их использование позволит увеличить терапевтическую эффективность цитотоксических средств. Эти антитела можно использовать в качестве радиосенсибилизатора, таким образом, их использование позволит увеличить эффективность облучения. Их также можно использовать в сочетании с другими иммуномодуляторами для лечения опухолей, такими как IL-2, IL-12 и/или IFN-альфа. Кроме того, антитела к GD2 можно использовать в сочетании с другими моноклональными антителами, такими как антитела к TNF-альфа, IL-12/IL-23, IL-2, рецептор GpIIb/IIIa, CD52, CD20, белки RSV, рецептор HER2/neu и тому подобное; а также одобренными для коммерческого производства антителами, включая ритуксан, герцептин, милотарг, кампат, зевалин, бексар, эрбитукс, авастин и вектибикс.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу модулирования или лечения по меньшей мере одного связанного с GD2 заболевания в клетке, ткани, органе, организме животного или пациента, как известно в данной области или как описано в настоящем документе, с использованием по меньшей мере одного антитела к GD2 по настоящему изобретению.
Испытания адоптивной иммунотерапии в 1986 г. с использованием лимфокин-активированных клеток-киллеров (LAK) и инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TIL) продемонстрировали наличие случайных опухолевых ответов у пациентов. Инфузии донорских лимфоцитов имели еще больший успех у пациентов с хроническим миелогенным лейкозом после трансплантации аллогенных стволовых клеток или у пациентов с посттрансплантационным EBV-ассоциированным лимфопролиферативным заболеванием (PTLD). Что касается солидных опухолей, CTL успешно применяли в лечении злокачественной меланомы во время фазы лимфопении, вызванной высокодозной химиотерапией. Биспецифические антитела получают путем слияния двух гибридом для создания гибридных молекул иммуноглобулинов с двумя сайтами связывания. Антитела не только связывают опухоли с T-клетками; они связываются с CD3 на T-клетках и инициируют активацию каскада реакций. Таким путем основанная на TCR цитотоксичность перенаправляется на нужные опухолевые мишени в обход ограничений МНС. Снабжение поликлонально активированных T-клеток (ATC) антителами к CD3 × антителами к TAA (антитело бсАт или BiTE) сочетает специфичность таргетинга моАт (например, hu3F8, где TAA представляет собой GD2) с не ограниченной MHC перфорин/гранзим-опосредованной цитотоксичностью T-клеток. Антителами бсАт или BiTE можно снабжать ex vivo размноженные активированные T-клетки перед инфузией пациенту. Такая стратегия превращает каждую ATC в специфическую CTL (Thakur and Lum, 2010, Curr Opin Mol Ther 12, 340-349, Grabert et al., 2006, Clin Cancer Res 12, 569-576).
Опухоли избегают Т-клеток с помощью ряда механизмов: за счет низкой или отсутствующей экспрессии MHC (например, при НБ), нарушения T-клеточной сигнализации, сниженной презентации опухолевых пептидов на MHC, отсутствия костимулирующих молекул, и индукции регуляторных T-клеток, которые ингибируют CTL и гуморальные ответы. Поскольку уничтожение, осуществляемое вооруженными бсАт или BiTE ATC, не ограничено MHC, такая стратегия должна преодолевать некоторые из этих опухолевых механизмов избегания. Опухоли секретируют TGF-β, приводящий к переключению T-клеточного иммунного ответа на Th2-тип, снижению секреции интерлейкина 2 (IL-2) и IFN-γ, и в то же время к увеличению секреции IL-10 и IL-6, все это ведет к подавлению иммунитета. T-клетки, перенаправленные за счет бсАт или BiTE, способны обходить эти негативные эффекты регуляторных цитокинов, поскольку вооруженные ATC лизируют опухоли-мишени независимым от IL-2 образом. Пациенты, получающие лечение вооруженными бсАт или BiTE T-клетками, направленными на их опухоли, имеют повышенные уровни TNF-α и IFN-γ, которые должны переключать T-клетки на ответ Th1-типа. Кроме того, цитотоксические T-клетки осуществляют уничтожение посредством их Fas-лиганда (FasL), который связывает Fas-рецепторы (CD95) на клетках опухолей. К сожалению, FasL на опухолевых клетках может также индуцировать апоптоз T-клеток. Стимуляция TCR через CD3-каскад защищает CD8+ клетки от CD95-опосредованного самоуничтожения. Вооруженные ATC устойчивы к CD95-индуцированной гибели клеток за счет связывания TCR с бсАт или BiTE. Способность T-клеток к серийному уничтожению, то есть, одна T-клетка последовательно уничтожает опухолевые мишени, пролиферирует во время этого процесса и переходит в лимфатические сосуды и мягкие ткани, увеличивает шансы захвата клеток НБ в то время, когда они метастазируют из пространства костного мозга, образуя опухолевые массы. Последние исследования с использованием таргетинга злокачественных опухолей человека при помощи бсАт или BiTE показали обнадеживающие результаты.
Существует все больше свидетельств, в частности, полученных при анализе пациентов, получавших трансплантаты аллогенных гемопоэтических клеток, в пользу потенциальной возможности T-клеток подавлять или уничтожать лимфомы и некоторые формы лейкоза (O'reilly et al., 2010, Semin Immunol 22, 162-172). Тем не менее нет никаких убедительных данных, подтверждающих роль Т-клеток в лечении солидных опухолей у детей. Это согласуется с тем фактом, что некоторые из этих опухолей либо не экспрессируют унаследованные аллели HLA класса I или II (например, нейробластома) (Raffaghello et al., 2005, Oncogene 24, 4634-4644, Wolfl et al., 2005, Cancer Immunol Immunother 54, 400-406), либо экспрессируют только аллели класса I и на низких уровнях (например, рабдомиосаркомы) (Prados et al., 2006, Neoplasma 53, 226-231). Более того, экспрессия очень важных костимулирующих молекул, таких как B7.1 и ICAM-1, часто является очень низкой или не поддается обнаружению. В результате способность таких опухолей вызывать T-клеточные ответы является низкой и потенциальная возможность эффекторных T-клеток связываться с опухолями через T-клеточный рецептор путем связывания опухолевых антигенов, представленных аллелями HLA, ограничена. Кроме того, в наиболее эффективных методах лечения, используемых в настоящее время для лечения нейробластомы, рабдомиосаркомы, саркомы Юинга и десмопластических мелкокруглоклеточных опухолей, используют иммуносупрессивные алкилирующие средства, в частности, циклофосфамид, в дозах, которые вызывают сильную T-лимфопению. Бифункциональные антитела делают возможным направленное связывание T-клеток и использование их эффекторных функций за счет не ограниченной HLA CD3-опосредованной активации, а не их антигенспецифичных HLA-ограниченных TCR. Исследования некоторых бифункциональных моноклональных антител, специфичных для CD3 и опухолевых антигенов, таких как CD-19, HER-2 NEU или CEA, продемонстрировали способность таких антител связывать цитотоксические T-клетки с клетками опухолей, экспрессирующими другой целевой антиген (Bargou et al., 2008, Science 321, 974-977, Topp et al., 2009, Blood (ASH Annual Meeting Abstracts) 114, 840, Kiewe et al., 2006, Clin Cancer Res 12, 3085-3091, Lutterbuese et al., 2009, J Immnother 32, 341-352). После связывания обоих рецепторов антитела цитотоксический T-клеточный ответ инициируется против клеток опухолей. T-клеточный ответ включает образование цитотоксического синапса между T-клеточным рецептором и клеткой опухоли, а также индукцию опосредованного перфорином и гранзимом апоптоза клеток опухоли (Offner et al., 2006, Mol Immunol 43, 763-771, Brischwein et al., 2006, Mol Immunol 43, 1129-1143). Связывание CD3 также приводит к активации T-клеток, индуцируя пролиферацию и производство эффекторных цитокинов, которые потенцируют противоопухолевый эффект (Brischwein et al., 2006, выше, Brischwein et al., 2007, J Immunother 30, 798-807). Поразительно, что в активированных T-клетках стимулируется продукция антиапоптозного белка c-FLIP, который защищает их от цитотоксических эффектов TNF и Fas-лиганда, которые образуются в процессе активации T-клеток (Dreir et al., 2002, Int J Cancer 100, 690-697). В результате Т-клеточный ответ усиливается. Как следствие, пикограммовые уровни бифункционального антитела могут демонстрировать значительные противоопухолевые эффекты in vitro (Lutterbuese et al., 2009, выше, Brandl et al., 2007, Cancer Immunol Immunother 56, 1551-1563) и in vivo, как показали доклинические испытания на животных моделях и особенно результаты начальных клинических испытаний CD3/CD19 биспецифических антител в лечении B-клеточных лимфом и ALL (Topp et al., 2009, выше, Kiewe et al., 2006, выше). Была выдвинута гипотеза о том, что индуцированные Т-клеточные ответы могут также приводить к рекрутингу необученных T-клеток и стимулировать образование опухолеспецифических Т-клеток в зонах опухолей (Koehne et al., 2002, Blood 99, 1730-1740). Биспецифические антитела также можно использовать для перенаправления других эффекторных клеток, помимо T-лимфоцитов. Эти эффекторные клетки, включая NK-клетки, B-лимфоциты, дендритные клетки, моноциты, макрофаги, нейтрофилы, мезенхимальные стволовые клетки, нейральные стволовые клетки и другие стволовые клетки, направляются на клетки, ткани или органы, которые экспрессируют GD2. Если ткань является опухолевой тканью, эти эффекторные клетки можно использовать для уничтожения или депонирования белков (например, цитокинов, антител, ферментов или токсинов), радиоактивных изотопов для диагностики или для терапии. Если ткань является тканью нормального органа, эффекторные клетки можно аналогичным образом использовать для доставки белков или изотопов для диагностики или для терапии.
Настоящее изобретение относится к способу модулирования или лечения по меньшей мере одного злокачественного заболевания в клетке, ткани, органе, организме животного или пациента, включая но без ограничения, по меньшей мере одно из следующих заболеваний: множественная миелома, лейкоз, острый лейкоз, острый лимфобластный лейкоз (ALL), B-клеточный, T-клеточный или FAB ALL, острый миелоидный лейкоз (AML), хронический миелоцитарный лейкоз (CML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), волосатоклеточный лейкоз, миелодиспластический синдром (MDS), лимфома, болезнь Ходжкина, злокачественная лимфома, неходжскинская лимфома, лимфома Беркитта, множественная миелома, саркома Капоши, колоректальная карцинома, почечноклеточный рак, панкреатическая карцинома, карцинома предстательной железы, назофарингеальная карцинома, злокачественный гистиоцитоз, паранеопластический синдром/гиперкальциемия при злокачественных новообразованиях, солидные опухоли, аденокарцины, саркомы, злокачественная меланома, гемангиома, метастатическое заболевание, связанная с раком костная резорбция, связанная с раком боль в костях; подавления метастазов рака; уменьшения кахексии при раке и лечения воспалительных заболеваний, таких как мезангиальный пролиферативный гломерулонефрит и тому подобное. Такой способ, необязательно, может быть комбинированным, например, до, одновременно или после введения такого антитела к GD2 можно использовать радиотерапию, антиангиогенное средство, химиотерапевтическое средство, ингибитор фарнезилтрансферазы или тому подобное.
th
th
Настоящее изобретение также относится к способу модулирования или лечения по меньшей мере одного опосредованного GD2 связанного с иммунитетом заболевания в клетке, ткани, органе, организме животного или пациента, включая но без ограничения, по меньшей мере одно из следующих заболеваний: ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит с генерализованным началом, псориатический артрит, анкилозирующий спондилит, язвенная болезнь желудка, серонегативные артропатии, остеоартрит, воспалительное заболевание кишечника, язвенный колит, системная красная волчанка, антифосфолипидный синдром, иридоциклит/увеит/неврит зрительного нерва, идиопатический пульмонарный фиброз, системный васкулит/гранулематоз Вегенера, саркоидоз, орхит/обратная процедура вазэктомии, аллергические/атопические заболевания, астма, аллергический ринит, экзема, аллергический контактный дерматит, аллергический конъюнктивит, аллергический пневмонит, трансплантат, отторжение трансплантатов органов, реакция трансплантат против хозяина, синдром системного воспалительного ответа, септический синдром, грамположительный сепсис, грамотрицательный сепсис, негативный при культивировании сепсис, грибковый сепсис, нейтропеническая лихорадка, уросепсис, менингококкемия, травма/кровоизлияние, ожоги, воздействие ионизирующего излучения, острый панкреатит, респираторный дистресс-синдром взрослых, ревматоидный артрит, индуцированный алкоголем гепатит, хронические воспалительные патологии, саркоидоз, болезнь Крона, серповидноклеточная анемия, диабет, нефроз, атопические заболевания, реакции гиперчувствительности, аллергический ринит, сенная лихорадка, круглогодичный ринит, конъюнктивит, эндометриоз, астма, крапивница, системная анафилаксия, дерматит, пернициозная анемия, гемолитическое заболевание, тромбоцитопения, отторжение трансплантата любого органа или ткани, отторжение трансплантата почки, отторжение трансплантата сердца, отторжение трансплантата печени, отторжение трансплантата поджелудочной железы, отторжение трансплантата легкого, отторжение трансплантата костного мозга (BMT), отторжение аллотрансплантата кожи, отторжение трансплантата хряща, отторжение трансплантата кости, отторжение трансплантата тонкого кишечника, отторжение имплантата зародышевого тимуса, отторжение трансплантата паращитовидной железы, отторжение ксенотрансплантата любого органа или ткани, отторжение аллотрансплантата, антирецепторные реакции гиперчувствительности, болезнь Грэйвса, болезнь Рейно, инсулинорезистентный диабет типа В, астма, миастения, антителоопосредованная цитотоксичность, реакции гиперчувствительности III типа, системная красная волчанка, синдром POEMS (полиневропатия, органомегалия, эндокринопатия, моноклональная гаммопатия и синдром изменения кожи), полиневропатия, органомегалия, эндокринопатия, моноклональная гаммопатия, синдром изменения кожи, антифосфолипидный синдром, пемфигус, склеродермия, смешанные заболевания соединительной ткани, идиопатическая болезнь Аддисона, сахарный диабет, хронический активный гепатит, первичный билиарный цирроз, витилиго, васкулит, постинфарктный кардиотомический синдром, гиперчувствительность IV типа, контактный дерматит, аллергический пневмонит, отторжение аллотрансплантата, гранулемы, вызванные внутриклеточными микроорганизмами, лекарственная чувствительность, метаболический/идиопатический синдром, болезнь Вильсона, гемохроматоз, недостаточность альфа-1-антитрипсина, диабетическая ретинопатия, тиреоидит Хашимото, остеопороз, супрессия гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы, первичный билиарный цирроз, тиреоидит, энцефаломиелит, кахексия, кистозный фиброз, неонатальное хроническое заболевание легких, хроническое обструктивное заболевание легких (COPD), семейный гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз, дерматологические состояния, псориаз, алопеция, нефротический синдром, нефрит, гломерулярный нефрит, острая почечная недостаточность, гемодиализ, уремия, токсичность, преэклампсия, OKT3 терапия, анти-CD3 терапия, цитокиновая терапия, химиотерапия, радиотерапия (например, включая, но не ограничиваясь ими, астению, анемию, кахексию и тому подобное), хроническая интоксикация салицилатами, апноэ сна, ожирение, сердечная недостаточность, синусит, воспалительное заболевание кишечника, и тому подобное. Смотри, например, the Merck Manual, 12-17Editions, Merck & Company, Rahway, N.J. (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), Pharmacotherapy Handbook, Wells et al., eds., Second Edition, Appleton и Lange, Stamford, Conn. (1998, 2000), полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.
Настоящее изобретение также относится к способу модулирования или лечения по меньшей мере одного инфекционного заболевания в клетке, ткани, органе, организме животного или пациента, включая но без ограничения, по меньшей мере одно из следующих заболеваний: острая или хроническая бактериальная инфекция, острые и хронические паразитарные или инфекционные процессы, включая бактериальную, вирусную и грибковую инфекцию, ВИЧ-инфекция/ВИЧ-невропатия, менингит, гепатит (A, B или C, или тому подобное), септический артрит, перитонит, пневмония, эпиглоттит, E. coli 0157:h7, гемолитический уремический синдром/тромболитическая тромбоцитопеническая пурпура, малярия, геморрагическая лихорадка денге, лейшманиоз, лепра, синдром токсического шока, стрептококковый миозит, газовая гангрена, микобактериальный туберкулез, инфекция микобактерий группы MAI, пневмоцистная пневмония, воспалительные заболевания тазовых органов, орхит/эпидидимит, легионеллы, болезнь Лайма, грипп A, вирус Эпштейна-Барр, вирус-ассоциированный гемофагоцитарный синдром, вирусный энцефалит/асептический менингит и тому подобное.
Любой из таких способов может, необязательно, включать введение эффективного количества по меньшей мере одной композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно антитело к GD2, в клетку, ткань, орган, организм животного или пациента, который нуждается в такой модуляции, лечении или терапии.
nd
Любой способ по настоящему изобретению может включать введение эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно антитело к GD2, в клетку, ткань, орган, организм животного или пациента, который нуждается в такой модуляции, лечении или терапии. Такой способ, кроме того, может, необязательно, включать совместное введение или комбинированную терапию для лечения таких иммунных заболеваний или злокачественных заболеваний, при которой введение указанного по меньшей мере одного антитела к GD2, его определенной части или варианта, дополнительно включает введение до, одновременно и/или после, по меньшей мере одного средства, выбранного из по меньшей мере одного антагониста TNF (например, но без ограничения, антитела к TNF или его фрагмента, растворимого рецептора TNF или его фрагмента, их слитых белков или низкомолекулярного антагониста TNF), антитела к IL-18 или его фрагмента, низкомолекулярного антагониста IL-18 или белка, связывающего рецептор IL-18, антитела к IL-1 (включая как IL-1 альфа, так и IL-1 бета) или его фрагмента, растворимого антагониста рецептора IL-1, противоревматического средства (например, метотрексата, ауранофина, ауротиоглюкозы, азатиоприна, этанерцепта, ауротиомалата натрия, гидроксихлорохина сульфата, лефлуномида, сульфасалзина), радиотерапии, антиангиогенного средства, химиотерапевтического средства, талидомидa, мышечного релаксанта, наркотика, нестероидного противовоспалительного терапевтического средства (НПВС), анальгетика, анестетика, седативного препарата, местного анестетика, блокатора нервно-мышечного проведения, противомикробного препарата (например, аминогликозида, противогрибкового средства, противопаразитарного средства, противовирусного средства, карбапенема, цефалоспорина, фторхинолона, макролида, пенициллина, сульфонамида, тетрациклина, других противомикробных препаратов), антипсориазного препарата, кортикостероида, анаболического стероида, антидиабетического препарата, минерала, питательного вещества, тиреоидного гормона, витамина, связанного с кальцием гормона, эритропоэтина (например, эпоэтина альфа), филграстима (например, G-CSF, нейпогена), сарграмостима (GM-CSF, лейкина), препарата для иммунизации, иммуноглобулина, иммуносупрессора (например, базиликсимаба, циклоспорина, даклизумаба), гормона роста, терапевтического средства гормонозаместительной терапии, модулятора рецептора эстрогена, мидриатического средства, циклоплегического средства, алкилирующего средства, антиметаболита, ингибитора митоза, радиофармацевтического средства, антидепрессанта, противоманиакального средства, антипсихотического препарата, анксиолитика, снотворного средства, симпатомиметика, стимулятора, донепезила, такрина, лекарства от астмы, бета-агониста, ингаляционного стероида, ингибитора лейкотриенов, метилксантина, кромолина, адреналина или аналога, дорназы альфа (пульмозима), цитокина или антагониста цитокина. Соответствующие дозировки хорошо известны в данной области. Смотри, например, Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2 Edition, Appleton и Lange, Stamford, Conn. (2000), PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, Calif. (2000), полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.
Антагонисты TNF, подходящие для композиций, комбинированной терапии, совместного введения, устройств и/или способов по настоящему изобретению (дополнительно включающих введение по меньшей мере одного антитела, его определенной части и варианта по настоящему изобретению), включают, но не ограничиваются ими, антитела к TNF, их антигенсвязывающие фрагменты и рецепторные молекулы, которые специфически связывают TNF; соединения, которые предотвращают и/или ингибируют синтез TNF, высвобождение TNF или его действие на целевые клетки, такие как талидомид, тенидап, ингибиторы фосфодиэстеразы (например, пентоксифиллин и ролипрам), агонисты рецептора аденозина A2b и усилители рецептора аденозина A2b; соединения, предотвращающие и/или ингибирующие сигнализацию рецептора TNF, такие как ингибиторы митоген-активированной протеинкиназы (MAP); соединения, блокирующие и/или ингибирующие расщепление мембранной формы TNF, такие как ингибиторы металлопротеиназы; соединения, блокирующие и/или ингибирующие активность TNF, такие как ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента (ACE) (например, каптоприл), а также соединения, блокирующие и/или ингибирующие продуцирование и/или синтез TNF, такие как ингибиторы MAP-киназы.
Любой способ по настоящему изобретению может включать способ лечения опосредованного GD2 заболевания или заболевания, характеризующегося экспрессией GD2, включающий введение эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно антитело к GD2, в клетку, ткань, орган, организм животного или пациента, который нуждается в такой модуляции, лечении или терапии. Такой способ, кроме того, может, необязательно, включать совместное введение или комбинированную терапию для лечения таких иммунных заболеваний, при которой введение указанного по меньшей мере одного антитела к GD2, его определенной части или варианта, дополнительно включает введение до, одновременно и/или после, по меньшей мере одного средства, описанного выше.
Как правило, лечение патологических состояний осуществляют путем введения эффективного количества, или дозы, композиции по меньшей мере одного антитела к GD2, которое в общей сложности, в среднем находится в диапазоне от по меньшей мере примерно 0,01 до 500 миллиграмм по меньшей мере одного антитела к GD2 на килограмм массы тела пациента на дозу, и предпочтительно от по меньшей мере примерно 0,1 до 100 миллиграмм антитела/килограмм массы тела пациента для однократного или многократного введения, в зависимости от специфической активности композиции. Альтернативно, эффективная сывороточная концентрация может составлять 0,1-5000 мкг/мл сыворотки для однократного или многократного введения. Подходящие дозы известны практикующим врачам и, конечно, будут зависеть от состояния конкретного заболевания, специфической активности вводимой композиции и конкретного пациента, получающего лечение; в некоторых случаях для достижения желаемого терапевтического количества может быть необходимым повторное введение, то есть, повторные отдельные введения конкретной контролируемой или отмеренной дозы, при этом отдельные введения повторяют до достижения нужной суточной дозы или эффекта.
Предпочтительные дозы могут, необязательно, включать 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 и/или 100-500 мг/кг/введение, или любой диапазон, значение или его часть, или до достижения сывороточной концентрации, составляющей 0,1, 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5, 2,9, 3,0, 3,5, 3,9, 4,0, 4,5, 4,9, 5,0, 5,5, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 20, 12,5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14,0, 14,5, 4,9, 5,0, 5,5, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 12, 12,5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14, 14,5, 15, 15,5, 15,9, 1,6, 16,5, 16,9, 17, 17,5, 17,9, 18, 18,5, 18,9, 19, 19,5, 19,9, 20, 20,5, 20,9, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500 и/или 5000 мкг/мл сывороточной концентрации для однократного или многократного введения, или любой диапазон, значение или его часть.
Альтернативно, вводимая доза может варьироваться в зависимости от известных факторов, таких как фармакодинамические характеристики конкретного средства, а также способ и путь его введения; возраст, состояние здоровья и масса тела реципиента; природа и степень выраженности симптомов, вид сопутствующего лечения, частота лечения и желаемый эффект. Как правило, доза активного ингредиента может составлять от примерно 0,1 до 100 миллиграмм на килограмм массы тела. Обычно доза 0,1-50, и предпочтительно, 0,1-10 миллиграмм на килограмм массы тела на одно введение или в форме замедленного высвобождения бывает эффективной для получения желаемых результатов.
В качестве неограничивающего примера, лечение людей или животных может заключаться в разовом или периодическом введении по меньшей мере одного антитела по настоящему изобретению в дозе 0,1-100 мг/кг, например, 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мг/кг в сутки, по меньшей мере в один из дней 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40, или, альтернативно или дополнительно, по меньшей мере в одну из недель 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 или 52, или, альтернативно или дополнительно, по меньшей мере в один из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 лет, или любое их сочетание, с использованием однократной инфузии или повторных доз.
Кроме того, изобретение относится к введению по меньшей мере одного антитела к GD2 парентеральным, подкожным, внутримышечным, внутривенным, внутрисуставным, внутрибронхиальным, внутрибрюшинным, интракапсулярным, внутрихрящевым, внутриполостным, внутриклеточным, внутримозжечковым, интрацеребровентрикулярным, интратекальным, через резервуар Оммайя, внутриглазным, интравитреальным, внутрикишечным, интрацервикальным, внутрижелудочным, внутрипеченочным, интрамиокардиальным, внутрикостным, внутритазовым, интраперикардиальным, внутрибрюшинным, интраплевральным, интрапростатическим, внутрилегочным, интраректальным, внутрипочечным, интраретинальным, интраспинальным, внутрисуставным, интраторакальным, внутриматочным, внутрипузырным, болюсным, вагинальным, ректальным, трансбуккальным, подъязычным, интраназальным или чрескожным путем введения. По меньшей мере одну композицию антитела к GD2 можно получать для парентерального (подкожного, внутримышечного или внутривенного) или любого другого введения, в частности, в форме жидких растворов или суспензий; для вагинального или ректального введения, в частности, в полутвердых формах, таких как, но не ограничиваясь ими, кремы и суппозитории; для трансбуккального или подъязычного введения, например, но без ограничения, в форме таблеток или капсул; или для интраназального введения, например, но без ограничения, в форме порошков, капель в нос или аэрозолей, или определенных средств; или для чрескожного введения, например, но без ограничения, в форме геля, мази, лосьона, суспензии или пластыря с химическими усилителями, такими как диметилсульфоксид, чтобы либо модифицировать структуру кожи, либо увеличить концентрацию терапевтического средства в чрескожном пластыре (Junginger, et al. In «Drug Permeation Enhancement»; Hsieh, D.S., Eds., pp. 59-90, Marcel Dekker, Inc. New York 1994, полное содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки), или для введения с окислителями, которые позволяют наносить препараты, содержащие белки и пептиды, на кожу (WO 98/53847), или для введения путем применения электрических полей для создания временных транспортных путей, такого как электропорация, или для введения путем увеличения проходимости заряженных лекарственных средств через кожу, например, ионтофорезом, или для введения путем применения ультразвука, например, сонофореза (патенты США №№ 4309989 и 4767402) (полное содержание всех публикаций и патентов включено в настоящий документ посредством ссылки).

Для легочного введения, предпочтительно, по меньшей мере одна композиция антитела к GD2 доставляется с размером частиц, эффективным для достижения нижних дыхательных путей легких или пазух. В соответствии с изобретением, по меньшей мере одно антитело к GD2 можно доставлять с помощью любого из множества устройств для ингаляции или назальной доставки, известных в данной области для введения терапевтического средства путем ингаляции. Эти устройства, способные обеспечивать отложение аэрозолизированных препаратов в носовых пазухах или альвеолах пациента, включают дозирующие ингаляторы, небулайзеры, распылители сухого порошка, спреи и тому подобное. Другие устройства, подходящие для легочного или назального введения антител, также известны в данной области. Во всех таких устройствах можно использовать препараты, подходящие для аэрозольного введения антитела. Такие аэрозоли могут быть получены из любых растворов (как водных, так и неводных) или твердых частиц. В дозирующих ингаляторах, таких как дозирующий ингалятор Ventolin, как правило, используют пропеллент, и их необходимо приводить в действие во время вдоха (смотри, например, WO 94/16970, WO 98/35888). Ингаляторы сухого порошка, такие как TURBUHALER™ (Astra), ROTAHALER (Glaxo), DISKUS(Glaxo), устройства, продаваемые компанией Inhale Therapeutics, например, приводятся в действие вдыханием смешанного порошка (патент США № 4668218 Astra, EP 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, патент США № 5458135 Inhale, WO 94/06498 Fisons, полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки). Небулайзеры, такие как небулайзер ULTRAVENT (Mallinckrodt) и небулайзер ACORN II (Marquest Medical Products) (патент США № 5404871 Aradigm, WO 97/22376), полное содержание вышеуказанных патентов включено в настоящий документ посредством ссылки, производят аэрозоли из растворов, в то время как дозирующие ингаляторы, ингаляторы сухого порошка, и так далее, генерируют аэрозоли с мелкими частицами. Эти конкретные примеры коммерчески доступных ингаляционных устройств являются репрезентативными устройствами, подходящими для использования на практике настоящего изобретения, и не должны ограничивать объем изобретения. Предпочтительно, композиция, содержащая по меньшей мере одно антитело к GD2, доставляется ингалятором сухого порошка или спреем. Есть несколько желательных особенностей ингаляционного устройства для введения по меньшей мере одного антитела по настоящему изобретению. Например, доставка с помощью ингаляционного устройства преимущественно является надежной, воспроизводимой и точной. Ингаляционное устройство может, необязательно, доставлять мелкие сухие частицы, например, размером менее чем примерно 10 мкм, предпочтительно примерно 1-5 мкм, для возможности легкого вдыхания.
Спрей, содержащий композицию белка антитела к GD2, можно получать, пропуская суспензию или раствор по меньшей мере одного антитела к GD2 через сопло под давлением. Размер и конфигурация сопла, прилагаемое давление и скорость подачи жидкости можно выбирать для достижения желаемого выхода и размера частиц. Можно производить электрораспыление, например, используя электрическое поле в сочетании с подачей через капилляры или сопло. Предпочтительно, частицы композиции по меньшей мере одного белка антитела к GD2, доставляемого распылителем, имеют размер частиц менее чем примерно 10 мкм, предпочтительно в диапазоне от примерно 1 мкм до примерно 5 мкм, и наиболее предпочтительно от примерно 2 мкм до примерно 3 мкм.
Препараты композиции по меньшей мере одного белка антитела к GD2, подходящие для использования с распылителем, как правило, содержат композицию белка антитела в водном растворе в концентрации от примерно 0,1 мг до примерно 100 мг композиции по меньшей мере одного белка антитела к GD2 на мл раствора, или мг/грамм, или любой диапазон или значение в этом промежутке, например, но без ограничения, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мг/мл или мг/грамм. Препарат может содержать такие вещества, как эксципиент, буфер, изотоническое средство, консервант, сурфактант и, предпочтительно, цинк. Препарат также может содержать эксципиент или средство для стабилизации композиции белка антитела, такое как буфер, восстанавливающий агент, объемный белок или углевод. Объемные белки, полезные для формулирования композиции белка антитела, включают альбумин, протамин или тому подобное. Типичные углеводы, полезные для формулирования композиции белка антитела, включают сахарозу, маннит, лактозу, трегалозу, глюкозу или тому подобное. Препарат композиции белка антитела может также содержать сурфактант, который может уменьшать или предотвращать индуцированную поверхностью агрегацию в композиции белка антитела, вызванную распылением раствора при образовании аэрозоля. Можно использовать различные общепринятые сурфактанты, такие как сложные эфиры полиоксиэтилена и жирных кислот и спирты, а также полиоксиэтиленовые эфиры сорбита и жирных кислот. Количества будут, как правило, находиться в диапазоне от 0,001 до 14% по массе от массы препарата. Особенно предпочтительными сурфактантами для целей данного изобретения являются моноолеат полиоксиэтиленсорбитана, полисорбат 80, полисорбат 20 или тому подобное. Дополнительные средства, известные в данной области для формулирования белков, таких как антитела к GD2 или их определенные части или варианты, также можно включать в препарат.
Композицию белка антитела можно вводить при помощи небулайзера, такого как струйный небулайзер или ультразвуковой небулайзер. Как правило, в струйном небулайзере источник сжатого воздуха используется для создания высокоскоростной струи воздуха через отверстие. При выходе газа за пределы сопла создается область низкого давления, которая выводит раствор композиции белка антитела через капиллярную трубку, соединенную с резервуаром для жидкости. Поток жидкости из капиллярной трубки разбивается на нестабильные нити и капли на выходе из трубки, создавая аэрозоль. Различные конфигурации, скорости потока и типы турбулизаторов потока можно использовать для достижения желательных характеристик конкретного струйного небулайзера. В ультразвуковом небулайзере используется высокочастотная электрическая энергия для создания колебательной механической энергии, как правило, с использованием пьезоэлектрического преобразователя. Эта энергия передается композиции белка антитела либо непосредственно, либо через связующую жидкость, создавая аэрозоль, содержащий композицию белка антитела. Предпочтительно, частицы композиции белка антитела, доставляемой небулайзером, имеют размер менее чем примерно 10 мкм, предпочтительно в диапазоне от примерно 1 мкм до примерно 5 мкм, и наиболее предпочтительно от примерно 2 мкм до примерно 3 мкм.
Препараты по меньшей мере одного антитела к GD2, подходящие для использования с небулайзером, либо струйным, либо ультразвуковым, как правило, имеют концентрацию от примерно 0,1 мг до примерно 100 мг по меньшей мере одного белка антитела к GD2 на мл раствора. Препарат может содержать такие средства, как эксципиент, буфер, изотоническое средство, консервант, сурфактант и, предпочтительно, цинк. Препарат также может содержать эксципиент или средство для стабилизации композиции по меньшей мере одного белка антитела к GD2, такое как буфер, восстанавливающий агент, объемный белок или углевод. Объемные белки, полезные для формулирования композиции белка антитела, включают альбумин, протамин или тому подобное. Типичные углеводы, полезные для формулирования композиции белка антитела, включают сахарозу, маннит, лактозу, трегалозу, глюкозу или тому подобное. Препарат по меньшей мере одного антитела к GD2 может также содержать сурфактант, который может уменьшать или предотвращать индуцированную поверхностью агрегацию в композиции белка антитела, вызванную распылением раствора при образовании аэрозоля. Можно использовать различные общепринятые сурфактанты, такие как сложные эфиры полиоксиэтилена и жирных кислот и спирты, а также полиоксиэтиленовые эфиры сорбита и жирных кислот. Количества будут, как правило, находиться в диапазоне от 0,001 до 14% по массе от массы препарата. Особенно предпочтительными сурфактантами для целей данного изобретения являются моноолеат полиоксиэтиленсорбитана, полисорбат 80, полисорбат 20 или тому подобное. Дополнительные средства, известные в данной области для формулирования белков, таких как антитела к GD2 или их определенные части или варианты, также можно включать в препарат.
В дозирующем ингаляторе (MDI) пропеллент, по меньшей мере одно антитело к GD2 и любые эксципиенты или другие добавки содержатся в контейнере в виде смеси, содержащей сжиженный сжатый газ. Приведение в действие дозировочного клапана высвобождает смесь в виде аэрозоля, предпочтительно содержащего частицы с диапазоном размеров менее чем примерно 10 мкм, предпочтительно от примерно 1 мкм до примерно 5 мкм, и наиболее предпочтительно от примерно 2 мкм до примерно 3 мкм. Желаемые размеры частиц аэрозоля можно получать за счет использования препарата композиции белка антитела, полученного различными способами, известными специалистам в данной области, включая размол на струйной мельнице, распылительную сушку, конденсацию в критической точке или тому подобное. Предпочтительные дозирующие ингаляторы включают те, которые производятся 3M или Glaxo и в которых используется гидрофторуглеродный пропеллент.
Препараты по меньшей мере одного антитела к GD2 для использования с дозирующим ингалятором, как правило, содержат тонкоизмельченный порошок, содержащий по меньшей мере одно антитело к IL-6 в виде суспензии в неводной среде, например, суспендированное в пропелленте с помощью сурфактанта. Пропеллент может представлять собой любой общепринятый материал, используемый для этой цели, такой как хлорфторуглерод, гидрохлорфторуглерод, гидрофторуглерод или углеводород, включая трихлорфторметан, дихлордифторметан, дихлортетрафторэтанол и 1,1,1,2-тетрафторэтан, HFA-134a (гидрофторалкан-134a), HFA-227 (гидрофторалкан-227), или тому подобное. Предпочтительно, пропеллент представляет собой гидрофторуглерод. Сурфактант можно выбирать для стабилизации по меньшей мере одного антитела к GD2 в виде суспензии в пропелленте, для защиты активного агента против химической деградации, и тому подобного. Подходящие сурфактанты включают сорбитан триолеат, соевый лецитин, олеиновую кислоту или тому подобное. В некоторых случаях предпочтительными являются аэрозольные растворы, в которых использован такой растворитель, как этанол. Дополнительные средства, известные в данной области для формулирования белков, также можно включать в препарат.
Специалисты в данной области поймут, что способы по настоящему изобретению можно осуществлять путем легочного введения композиции по меньшей мере одного антитела к GD2 с помощью устройств, не описанных в настоящем документе.
Препараты для перорального введения рассчитаны на совместное введение с адъювантами (например, резорцинолами и неионными сурфактантами, такими как полиоксиэтиленолеиловый эфир и н-гексадецилполиэтиленовый эфир) для искусственного увеличения проницаемости стенок кишечника, а также на совместное введение с ингибиторами ферментов (например, ингибиторами панкреатического трипсина, диизопропилфторфосфатом (DFF) и тразилолом) для ингибирования ферментативной деградации. Активный компонент твердой лекарственной формы для перорального введения можно смешивать с по меньшей мере одной добавкой, включая сахарозу, лактозу, целлюлозу, маннит, трегалозу, рафинозу, мальтит, декстран, крахмалы, агар, аргинаты, хитины, хитозаны, пектины, трагакантовую камедь, гуммиарабик, желатин, коллаген, казеин, альбумин, синтетический или полусинтетический полимер, а также глицерид. Такие лекарственные формы также могут содержать добавки другого типа(ов), например, неактивный разбавитель, смазывающее вещество, такое как стеарат магния, парабен, консервант, такой как сорбиновая кислота, аскорбиновая кислота, альфа-токоферол, антиоксидант, такой как цистеин, дезинтегрирующее вещество, связующее вещество, загуститель, буферное средство, подсластитель, ароматизатор, отдушку и так далее.
Таблетки и пилюли можно дополнительно обрабатывать для получения препаратов с энтеросолюбильным покрытием. Жидкие препараты для перорального введения включают эмульсию, сироп, эликсир, суспензию и раствор, пригодные для медицинского применения. Такие препараты могут содержать неактивные разбавители, обычно используемые в указанной области, например, воду. Липосомы также были описаны в качестве систем доставки терапевтического средства для инсулина и гепарина (патент США № 4239754). В последнее время для доставки фармацевтических препаратов были использованы микросферы из искусственных полимеров смешанных аминокислот (протеноидов) (патент США № 4925673). Кроме того, в данной области известны соединения-носители, описанные в патенте США № 5879681 и патенте США № 55871753, используемые для доставки биологически активных средств перорально.
Для абсорбции через слизистые поверхности, композиции и способы введения по меньшей мере одного антитела к GD2 включают эмульсию, содержащую множество субмикронных частиц, мукоадгезивную макромолекулу, биоактивный пептид и водную непрерывную фазу, которая способствует абсорбции через слизистые поверхности за счет обеспечения мукоадгезии частиц эмульсии (патент США № 5514670). Пути введения через слизистые поверхности, подходящие для нанесения эмульсии по настоящему изобретению, могут включать, роговичный, конъюнктивный, трансбуккальный, подъязычный, назальный, вагинальный, легочный, желудочный, кишечный и ректальный пути введения. Препараты для вагинального или ректального введения, например суппозитории, могут содержать в качестве эксципиентов, например, полиалкиленгликоли, вазелин, масло какао и тому подобное. Препараты для интраназального введения могут быть твердыми и содержать в качестве эксципиентов, например, лактозу, или могут быть водными или масляными растворами для закапывания в нос. Для трансбуккального введения эксципиенты включают сахара, стеарат кальция, стеарат магния, прежелатинизированный крахмал, и тому подобное (патент США № 5849695).
Для чрескожного введения по меньшей мере одно антитело к GD2 инкапсулируют в устройстве доставки, таком как липосома или полимерная наночастица, микрочастица, микрокапсула или микросфера (коллективно называемые микрочастицами, если не указано иное). Известен целый ряд подходящих устройств, включая микрочастицы, сделанные из синтетических полимеров, таких как полигидроксикислоты, например, полимолочная кислота, полигликолевая кислота и их сополимеры, полиортоэфиры, полиангидриды и полифосфазены, а также природных полимеров, таких как коллаген, полиаминокислоты, альбумин и другие белки, альгинат и другие полисахариды, а также их сочетания (патент США № 5814599).
Иногда бывает желательной доставка соединений по настоящему изобретению субъекту в течение продолжительного периода времени, например, в течение периодов от одной недели до одного года или более, после однократного введения. Можно использовать различные лекарственные формы замедленного высвобождения, депо или имплантаты. Например, лекарственная форма может содержать фармацевтически приемлемую нетоксичную соль соединения, которая имеет низкую степень растворимости в жидкостях организма, например, (a) кислотно-аддитивную соль с многоосновной кислотой, такой как фосфорная кислота, серная кислота, лимонная кислота, виннокаменная кислота, дубильная кислота, памовая кислота, альгиновая кислота, полиглютаминовая кислота, нафталин моно- или дисульфоновые кислоты, полигалактуроновая кислота, и тому подобное; (b) соль с поливалентным катионом металла, такого как цинк, кальций, висмут, барий, магний, алюминий, медь, кобальт, никель, кадмий и тому подобное, или с органическим катионом, образованным, например, из N,N'-дибензилэтилендиамина или этилендиамина; или (c) сочетания (a) и (b, например, соль таннат цинка. Кроме того, соединения по настоящему изобретению или, предпочтительно, относительно нерастворимую соль, такую как те, которые были описаны выше, можно формулировать в виде геля, например, геля моностеарата алюминия, например, с кунжутным маслом, подходящим для инъекции. Особенно предпочтительными солями являются соли цинка, соли танната цинка, памоатные соли и тому подобное. Другой тип препарата, депо медленного высвобождения для инъекции, будет содержать соединение или соль, диспергированные для инкапсуляции в медленно распадающемся нетоксичном, не антигенном полимере, таком как полимер полимолочной кислоты/полигликолевой кислоты, например, описанный в патенте США № 3773919. Соединения или, предпочтительно, относительно нерастворимые соли, такие как те, которые описаны выше, также можно формулировать в силастиковых гранулах с холестериновой матрицей, в частности, для использования у животных. В литературе известны и другие препараты замедленного высвобождения, депо или имплантаты, например, газовые или жидкие липосомы (патент США № 5770222 и «Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems», J.R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1978).
Содержание всех литературных источников (включая литературные ссылки, выданные патенты, опубликованные патентные заявки и одновременно находящиеся на рассмотрении патентные заявки), цитированных в тексте данной заявки, специально включено в настоящий документ посредством ссылки.
Другие характерные особенности изобретения станут очевидными в ходе следующих далее описаний иллюстративных вариантов осуществления, которые приведены для иллюстрации изобретения и не предназначены для его ограничения.
ПРИМЕРЫ
Далее изобретение проиллюстрировано с помощью следующих неограничивающих примеров. Эти примеры приведены с целью облегчения понимания изобретения, но не задуманы и не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения каким-либо образом. Примеры не включают подробное описание общепринятых методов, которые должны быть хорошо известны обычным специалистам в данной области (методики молекулярного клонирования и так далее). Если не указано иное, части являются частями по массе, молекулярная масса представляет собой среднюю молекулярную массу, температура указана в градусах по Цельсию и давление соответствует атмосферному или примерно атмосферному.
Очистка мышиного антитела 3F8 и получение Fab-фрагментов
Мышиное моАтк GD2 3F8 (IgG3) очищали из концентрированного супернатанта гибридомы, как описано ранее (Cheung et al., 1985, Cancer Res 45, 2642-2649). Fab-фрагменты антитела m3F8 получали путем расщепления папаином с использованием стандартного набора для получения Fab (Pierce Biotechnology, Rockford, IL).
Кристаллизация и сбор данных
Очищенный Fab-фрагмент 3F8 концентрировали до 12 мг/мл в 20 мМ HEPES pH 6,5 и кристаллизовали в висячей капле путем диффузии паров при температуре 16°C против резервуара, содержащего Hampton Index реагент D7, содержащий 0,1 M бис-трис, pH 6,5, 25% ПЭГ 3350 (Hampton Research, Aliso Viejo, CA). Капля была образована путем смешивания 1 мкл раствора белка и 1 мкл раствора из резервуара. Кристаллы были защищены криопротектором, содержащим 25% глицерина, 0,1 M бис-трис, pH 6,5, 25% ПЭГ 3350. Данные получали на приборе Argonne Advanced Photon Source beamline 24IDC. Кристаллы принадлежали к пространственной группе C2, и дифракционная картина от кристаллов имела разрешение 1,65 .
Определение структуры и уточнение
Структуру Fab решали путем молекулярной замены с моделью поиска PDB вводом данных 2AJU, используя Phaser (CCP4 модуль) (Mccoy, et al., 2007, J Appl. Crystallogr 40, 658-674). Лучшую модель молекулярной замены уточняли с использованием Refmac5 (Murshudov et al., 1997, Acta Crystallogr D 53, 240-255), подбор вручную производили с O (Bailey, S., 1994, Acta Crystallogr D 50, 760-763), добавляя растворитель с Arp-Warp (Lamzin and Wildon, 1993, Acta Crystallogr D 49, 129-147). Конечная модель включала две полипептидные цепи m3F8 Fab и 585 молекул растворителя. Конечная модель была депонирована в базе данных белков (регистрационный код 3VFG).
Моделирование методом молекулярного докинга и in silico мутагенез
GLIDE докинг выполняли с использованием платформы Schrodinger Suite 2009 platform (Schrödinger, New York, NY). Силовые поля OPLS использовали для параметризации белков и лигандов. Лучшие положения лиганда были сгруппированы в пределах среднеквадратичного отклонения в 2,0  и оценены при помощи GlideScore. CDOCKER докинг и измерения энергии взаимодействия проводили с использованием Discovery Studio 3.0 (Accelrys, San Diego, CA). Силовые поля CHARMm использовали для параметризации белков и лигандов. Лучшие положения лиганда были сгруппированы в пределах среднеквадратичного отклонения в 2,0  и оценены при помощи CDOCKER Interaction Energy. Для всех исследований докинга с участием GD2 церамидный «хвост» заменяли на метильную группу (данные не представлены). Докинг-моделирование проводили в условиях жесткой конструкции, когда лиганды в конформациях были состыкованы с белками/антителами с использованием жестких боковых цепей. Энергия окончательных состыкованных комплексов была сведена к минимуму при помощи CHARMm с использованием алгоритма Smart Minimizer в программе Discovery Studio 3.0 (Accelrys, San Diego, CA). In silico мутагенез выполняли путем расчета свободной энергии связывания состыкованной модели антитело:антиген с использованием силовых полей CHARMm и протокола расчета энергии мутации Calculate Mutation Energy protocol в программе Discovery Studio 3.0 (Accelrys, San Diego, CA).
Рендеринг изображений
Изображения молекулярной структуры визуализировали с использованием Pymol (Schrödinger, New York, NY) для исследований докинга, или с использованием Discovery Studio 3.0 (Accelrys, San Diego, CA) для электростатического потенциала поверхностей.
Моделирование области экспонированной гидрофобной поверхности
Антигенсвязывающий сайт моАт 3F8 и моАт 3F8 H:Gly54Ile моделировали в программе Discovery Studio 3.0 (Accelrys, San Diego, CA). Экспонированные гидрофобные поверхности были воспроизведены с использованием алгоритма Spatial Aggregation Propensity, разработанного Chennamsetty с соавтрами (Chennamsetty et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106, 11937-99842), с помощью которого участки эффективной динамично экспонированной гидрофобности на поверхности белка подсчитываются и окрашиваются в красный цвет.
Культура клеток
2
Линия клеток LAN-1 нейробластомы человека была предоставлена Dr. Robert Seeger (Children's Hospital of Los Angeles). Линии клеток M14 и OCM-1 меланомы получены от Dr. David Cobrinik (Children's Hospital of Los Angeles). Клетки всех линий выращивали в среде F10 RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Hyclone, South Logan, UT), 2 мМ глютамина, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина в инкубаторе с 5% CO при 37°C.
Конструирование hu3F8 и вариантов
Гены гуманизированного 3F8 синтезировали для клеток CHO (Blue Heron Biotechnology или Genscript), как описано ранее (Cheung et al., 2012, Oncoimmunology 1, 477-486). С использованием вектора bluescript (Eureka, CA) эти гены тяжелой и легкой цепи hu3F8 трансфицировали в клетки DG44 и проводили отбор с помощью G418 (InVitrogen, CA).
Очистка антител
Клетки линий-продуцентов Hu3F8 и химерного 3F8 культивировали в бессывороточной среде Opticho (InVitrogen) и зрелый супернатант собирали, как описано ранее (Cheung et al., 2012, выше). Аффинную колонку с белком A предварительно уравновешивали 25 мМ натрий-цитратным буфером с 0,15 M NaCl, pH 8,2. Связанные hu3F8 элюировали 0,1 M буфером лимонная кислота/цитрат натрия, pH 3,9 и подщелачивали (в соотношении 1:10 по объему) 25 мМ цитратом натрия, pH 8,5. Антитела пропускали через мембрану Sartobind-Q и концентрировали до концентрации 5-10 мг/мл в 25 мМ цитрате натрия, 0,15 M NaCl, pH 8,2.
Количественное определение связывания GD2 методами ELISA и проточной цитометрии
2
4
Анализ ELISA выполняли, как описано ранее (Cheung et al., 2012, выше). Микропланшеты для титрования покрывали GD2 в количестве 20 нг на лунку. 150 мкл на лунку 0,5% БСА в PBS (разбавитель) добавляли в каждый планшет по меньшей мере на 30 минут при температуре окружающей среды для блокирования сайтов неспецифического связывания. 100 мкл стандартного раствора и образцов (разбавленных 2-кратно) добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 2,5 ч при 37°C. После промывания планшетов PBS, 100 мкл антител козы против IgG человека (H+L) (Jackson Research Laboratory), разбавленных 1:3500 в разбавителе, добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 1 ч при 4°C. В анализе ELISA цветная реакция развивалась при использовании хромогена OPD (Sigma) с субстратом пероксидом водорода в течение 30 минут при температуре окружающей среды в темноте. Реакцию останавливали 5 Н HSO и оптическую плотность (OD) определяли на планшетном ридере для ELISA MRX (Dynex) при длине волны 490 нм.
6
6
Для определения сохранения связывания моАт с содержащими антиген клетками антитела инкубировали с клетками меланомы M14 и последовательно отмывали. Клетки первоначально собирали в количестве 1×10 клеток в круглодонную пробирку, центрифугировали, промывали PBS и ресуспендировали в 100 мкл PBS в пробирке для анализа. Клетки инкубировали с моАт hu3F8 или hu3F8-Ile ((1 мкг моАт/1×10 клеток) в течение 30 минут при 4°C. Затем клетки последовательно несколько раз промывали, используя 5 мл PBS с 3 мМ ЭДТА, после чего осаждали, отбрасывали супернатант и ресуспендировали. Каждый раз последовательно промывая, образцы инкубировали с R-фикоэритрином (R-PE), конъюгированным с антителами против IgG человека, специфичным для Fcγ фрагмента вторичным антителом (Jackson ImmunoResearch) в течение 30 минут при 4°С в темноте, промывали и затем анализировали методом проточной цитометрии на приборе BD FACS Calibur. Образцы готовили в тройном повторе.
51
Антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (ADCC), определяемая по высвобождению хрома
51
Анализы ADCC выполняли с использованием клеток NK-92MI, стабильно трансфицированных человеческим CD16 рецептором для Fc, как описано ранее (Cheung et al., 2012, выше). Клетки-мишени LAN1-1, M14, OCM-1, U2OS, CRL1427, NCI-H345 снимали с подложки с помощью 2 мМ ЭДТА в PBS без Ca2+, Mg2+ и промывали в F10 перед радиоактивным мечением Cr для анализов ADCC.
Статистический анализ
Построение кривых и статистический анализ выполняли с использованием программы GraphPad Prism 5.0. Критерий Стьюдента использовали для расчетов статистической достоверности.
ПРИМЕР 1
In silico сканирующий мутагенез модели 3F8:GD2
In silico сканирующий мутагенез выполняли, выбрав 12 остатков, которые непосредственно взаимодействовали с GD2 в модели докинга 3F8:GD2 (L:Tyr37, L:Lys55, L:Val99, L:Leu102, H:Gly40, H:Tyr31, H:Asn32, H:Asn34, H:Ser56, H:Ser58, H:Gly97 и H:Met98), и анализировали эффект одиночных точечных мутаций для всех положений в каждом сайте. Энергия моделей была сведена к минимуму с использованием силовых полей CHARMm, затем были проанализированы изменения в энергии взаимодействия (электростатической, ван-дер-Ваальса, энтропийной). Наилучшие мутации приведены в таблице 1. Установлено, что только 4 мутации приводят к увеличению энергии взаимодействия связанного комплекса более чем на 1 ккал/моль (таблица 1). Только одна точечная мутация, как было предсказано по взвешенной энергии мутации -8 ккал/моль, приводит к значительно более высокой энергии связывания (H:Gly54Ile). Большая часть этого увеличения энергии взаимодействия являлась следствием увеличения ван-дер-ваальсовых сил контакта с антигеном. Также были рассчитаны на компьютере эффекты двойных точечных и тройных точечных мутаций с вовлечением 12 взаимодействующих остатков, но, как было установлено, никакое дополнительное сочетание мутаций не приводило к увеличению энергии взаимодействия. В таблице 1 приведены результаты in silico сканирующего мутагенеза остатков CDR, которые непосредственно взаимодействуют со связанным антигеном GD2. Значения энергии приведены в размерности ккал/моль.
ТАБЛИЦА 1
Остаток
Мутация
В-д-в силы
Электростатическиесилы
Энтро-пийныесилы
Взвешенная энергия мутации
Эффект мутации
HC:GLY54
ILE
-18,84
0,21
0,19
-8,23
стабили-зация
HC:GLY103
LEU
-5,39
0,23
-0,07
-2,38
стабили-зация
HC:GLY103
TRP
-4,44
0,23
-0,01
-1,9
стабили-зация
HC:GLY55
THR
-2,96
0,07
-0,1
-1,38
стабили-зация
Анализ антигенсвязывающего сайта 3F8 и 3F8-Ile (H:Gly54Ile)
Одиночная точечная мутация, определенная при моделировании методом in silico сканирующего мутагенеза (H:Gly54Ile, названная 3F8-Ile), была смоделирована в антигенсвязывающем сайте 3F8 (данные не представлены). Вследствие гидрофобной природы мутации H:Gly54Ile, был проведен анализ гидрофобности антигенсвязывающего сайта с использованием алгоритма Spatial Aggregation Propensity (Материалы и Методы), который позволяет определять меру экспонированных для растворителя гидрофобных участков. МоАт 3F8 имеет гидрофобный участок в сайте связывания GD2, который сконцентрирован вокруг H:Ile56 (данные не представлены). H:Ile56 выступает из связывающей полости и может помогать антителу взаимодействовать с мембранной поверхностью, окружающей головную группу GD2. Замена H:Gly54 на Ile приводит к увеличению площади экспонированной гидрофобной поверхности антигенсвязывающего сайта, а также к увеличению ван-дер-ваальсовых сил контакта с GD2 в модели докинга (данные не представлены).
Способности hu3F8 и hu3F8-Ile H:Gly54Ile к связыванию и уничтожению клеток опухолей
50
Для проверки того, увеличивает ли мутация H:Gly54Ile аффинность для GD2 и ADCC клеток опухолей, генно-инженерными методами была введена мутация в описанное выше гуманизированное антитело 3F8 (hu3F8) (Cheung et al., 2012, выше). Hu3F8 является менее иммуногенным, чем мышиное антитело 3F8, сохраняет структурные особенности мышиного 3F8, обнаруженные в данном исследовании, и в настоящее время проходит фазу I клинических испытаний. Антитела hu3F8 и hu3F8 H:Gly54Ile (hu3F8-Ile) были сконструированы, экспрессированы, очищены и протестированы на связывание GD2 и ADCC. Анализы ELISA на GD2 показали, что hu3F8-Ile демонстрировало незначительное возрастание эффективности связывания относительно hu3F8 (EC связывания GD2: hu3F8 48±13 нг/мл, hu3F8-Ile 38±11 нг/мл) (данные не представлены). Для тестирования авидности этих антител для связывания GD2 в его естественном окружении на поверхности клеток опухолей был поставлен эксперимент с отмыванием, когда антитела, связанные с поверхностью M14, линии GD2(+) клеток меланомы, подвергали последовательным циклам промывания PBS-ЭДТА (смотри Материалы и Методы). Hu3F8-Ile проявляли большую способность к сопротивлению смыву с клеток опухолей (t1/2 для hu3F8-Ile = 3 промывания, t1/2 для hu3F8=2 промывания) (данные не представлены). Установлено, что никакая другая мутация не усиливает связывание антигена.
Затем hu3F8 и hu3F8-Ile были проанализированы на их способность опосредовать ADCC клеток нейробластомы LAN-1 в присутствии линии клеток естественных киллеров NK-92MI, трансфицированных человеческим CD16 рецептором для Fc (данные не представлены). Hu3F8-Ile последовательно демонстрировало ~9-кратное увеличение эффективности цитотоксичности по сравнению с hu3F8 (IC50 уничтожения клеток: hu3F8 1,35±0,15 нг/мл, hu3F8-Ile 0,15±0,01 нг/мл). Также наблюдали 6-7-кратное увеличение эффективности ADCC против клеток меланомы M14 и OCM-1 (IC50 уничтожения клеток M14: hu3F8 25±2,2 нг/мл, hu3F8-Ile 3,7±1,1 нг/мл; IC50 уничтожения клеток OCM-1: hu3F8 8,5±0,8 нг/мл, hu3F8-Ile 1,5±0,1 нг/мл). Это увеличение эффективности ADCC для hu3F8-Ile относительно hu3F8 было очень значимым (p<0,001).
Для дальнейшей оптимизации потенциальной клинической эффективности гуманизированных 3F8, авторы изобретения использовали высокопроизводительный in silico сканирующий мутагенез на ключевых взаимодействующих остатках в модели докинга 3F8:GD2. Авторы изобретения идентифицировали одиночную точечную мутацию (H:Gly54Ile), которая приводила к незначительному увеличению аффинности связывания в анализах GD2-ELISA и увеличению способности hu3F8-Ile сохранять связывание с GD2 на поверхности клетки. Более поразительно, авторы изобретения показали, что антитело hu3F8 демонстрировало ~6-9-кратное возрастание ADCC GD2-положительных линий клеток опухолей, включая нейробластому, меланому, остеосаркому и мелкоклеточный рак легкого. Характер мутации H:Gly54Ile таков, что она приводит к увеличению площади экспонированной гидрофобной поверхности в антигенсвязывающем сайте. Поскольку GD2 погружен в поверхность мембраны за счет церамидного фрагмента, добавление остатка Ile в антигенсвязывающий сайт может потенцировать ADCC за счет усиления способности моАт 3F8 оставаться связанным с поверхностью мембраны, что наблюдали в экспериментах с промыванием клеток.
Углеводные антигены играют важную роль в некоторых биологических путях. Разработка антител для таргетинга углеводов важна для исследований бактерий, опухолей, групп крови, межклеточных адгезионных взаимодействий, рецепторов вирусов, гормонов и токсинов, а также гликозилирования рекомбинантных белков (Heimburg-Molinaro and Rittenhouse-Olson, 2009, Methods Mol. Biol. 534,341-357). Поскольку иммунный ответ на сахариды не зависит от T-клеток, антитела, вырабатываемые против углеводных антигенов, часто представляют собой низкоаффинные IgM антитела (Heimburg-Molinaro and Rittenhouse-Olson, 2009, выше). Для получения высокоаффинных антител для терапевтического применения, как в случае иммунотерапии рака, часто бывает необходимо применять методы созревания аффинности для повышения терапевтического эффекта. Традиционные методы созревания аффинности антитела, такие как дрожжевой/фаговый/рибосомный дисплей, основаны на ПЦР с пониженной точностью, которая не может обеспечить полный диапазон разнообразия для каждой из аминокислот в CDR антитела. В данном исследовании авторы изобретения показали, что in silico сканирующий мутагенез можно использовать, даже если недоступна структура совместного комплекса в высоком разрешении. Кроме того, авторы изобретения продемонстрировали, что незначительное увеличение аффинности может повышать функциональные свойства моАт 3F8 для терапевтического таргетинга на опухолевый антиген GD2. Хотя ожидается, что усиление ADCC приведет к повышению эффективности, это еще предстоит доказать в будущем клиническом испытании с участием пациентов. Использование таких in silico методов может обеспечить ценное дополнение к традиционным экспериментальным методам разработки следующего поколения моАт для диагностики или лечения не только рака, но и других заболеваний человека, в которых углеводные эпитопы являются мишенями для терапевтических средств.
Разработка нового каркаса для hu3F8 ver5
Структуру каркаса hu3F8 V1 (WO 2011/160119, Cheung et al., 2012, выше) оптимизировали для снижения иммуногенности, используя вычислительные методы. Во-первых, последовательности тяжелой цепи и легкой цепи hu3F8V1 сравнивали с последовательностями зародышевой линии человека humIGHV199 и humIGKV025, соответственно (база данных EMBL, www.vbase2.org). Молекулярное моделирование с использованием силовых полей CHARMm (CHemistry at Harvard Molecular mechanics) (Brooks et al., 2009, J. Comp. Chem. 30, 1545-1615) использовали для каждой потенциальной гуманизирующей мутации, исходя из кристаллической структуры мышиного 3F8 (регистрационный код 3VFG в базе данных белков, http://www.pdb.org), для определения того, является ли мутация структурно пермиссивной. Кроме того, T-клеточные эпитопы MHC класса II в hu3F8V1 были идентифицированы с использованием метода NN-выравнивания в базе данных иммунных эпитопов (http://www.iedb.org/) и сведены к минимуму на основании структурно пермиссивных мутаций. На основе компьютерной модели кристаллической структуры стыковки GD2 с 3F8 (построенной с использованием программного обеспечения CDOCKER и Discovery Studio, Accelrys, San Diega, CA) остатки CDR, которые на модели непосредственно не взаимодействовали с антигеном GD2, были выбраны для мутаций гуманизации.
Выбор мутантов hu3F8 из дрожжевых библиотек
9
8
7
Использовали методологию получения и выделения высокоаффинных мутантов, описанную в литературе (Zhao et al., Mol. Cancer Ther. 2011, 10, 1677-1685). Перед отбором методом FACS дрожжевые клетки (1×10) инкубировали с 10 мкг GD2-конъюгированных магнитных гранул в течение 1 часа при комнатной температуре в PBSA буфере (0,1% БСА в PBS), с последующим разделением на магнитной подставке. Выделенные гранулы промывали 3 раза PBSA буфером, помещали в 10 мл среды SDCAA (синтетическая декстроза, казаминокислоты) и выращивали в течение ночи в шейкере при 250 об/мин и температуре 30°C. Дрожжевые клетки, извлеченные с магнитных гранул, индуцировали в среде SG/RCAA (синтетические галактоза, рафиноза, казаминокислоты) в течение 18 ч при температуре 20°C с встряхиванием при 250 об/мин. Примерно 1×10 дрожжевых клеток осаждали, промывали дважды PBSA буфером и ресуспендировали в 1 мл PBSA буфера с биотинилированными GD2 и мышиным антителом к c-myc (Invitrogen) в разведении 1:100. После инкубации дрожжевые клетки промывали 3 раза и затем ресуспендировали в 1 мл PBSA буфера. К дрожжевым клеткам добавляли в разведении 1:100 конъюгированный с R-фикоэритрином стрептавидин (Invitrogen) и конъюгированное с Alexa Fluor 488 антитело козы против IgG мыши (Invitrogen), инкубировали при 4°C в течение 30 минут и вновь промывали 3 раза PBSA буфером, затем ресуспендировали в PBSA буфере для сортировки. Ворота сортировки были определены для отбора только популяции клеток с высоким антигенсвязывающими сигналами. Собранные клетки культивировали в течение ночи в среде SDCAA при температуре 30°C и индуцировали в SG/RCAA для следующего раунда сортировки. Для следующих трех отборов примерно 1-2×10 дрожжевых клеток использовали для окрашивания биотинилированными IGF-1, соответственно. Дрожжевые плазмиды выделяли с использованием набора Zymoprep yeast Plasmid Miniprep II Kit (Zymo Research) в соответствии с инструкциями производителя и использовали в качестве матриц для конструирования библиотеки. Плазмиды после 4го раунда выделяли, секвенировали и характеризовали.
Экспрессия hu3F8 scFv и IgG1
ScFv были экспрессированы и очищены, как описано ранее (Zhao et al., 2011, выше). Клетки HB2151 трансформировали плазмидой pComb3x, содержащей последовательности scFv. Одиночные свежие колонии инокулировали в среду 2YT, содержащую 100 мкг/мл ампициллина и 0,2% глюкозы. Культуру индуцировали изопропил-L-тио-h-D-галактопиранозидом (конечная концентрация 0,5 мМ). После роста в течение ночи при 30°C бактерии центрифугировали при 5,000×g в течение 15 минут. Растворимые scFv высвобождали из периплазмы, инкубируя при 30°C в течение 30 минут. Прозрачный супернатант отбирали для очистки на колонке Ni-NTA. Рекомбинантные scFv имели FLAG и His метки. Экспрессию IgG осуществляли в суспензии клеток CHO, как описано ранее (Cheung et al., 2012, выше). Проводили временную экспрессию hu3F8 V5 IgG, используя клетки HEK293 (Invitrogen Freestyle Expression system). IgG очищали на колонке с белком G.
ELISA
Для изучения перекрестной реактивности с другими ганглиозидами, GD2, GD1a и GD1b наносили на поливиниловые микропланшеты для титрования в количестве 20 нг на лунку в 90% этаноле. После высушивания на воздухе лунки блокировали 0,5% раствором БСА в PBS в объеме 150 мкл на лунку в течение 1 ч при комнатной температуре. Антитела добавляли в тройном повторе при концентрации 1 мг/мл (100 мл на лунку) в 0,5% БСА. После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре и промывания PBS добавляли конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) антитела козы против IgG человека в разведении 1:5000 в случае IgG антител или HRP-конъюгированные антитела козы против Flag IgG в разведении 1:5000 в случае scFv антител. После инкубации в течение 1 ч при 4°C и последующего промывания проводили цветную реакцию, и OD определяли с использованием планшетного ридера для ELISA при длине волны 490 нм.
Определение аффинности методом поверхностного плазмонного резонанса
Аффинность измеряли с использованием Biacore T100. Вкратце, ганглиозиды непосредственно иммобилизовали на сенсорном чипе CM5 за счет гидрофобного взаимодействия. На контрольной поверхности иммобилизовали GM1. На активной поверхности иммобилизовали GD2 и GM1 в соотношении 1:1 или только GD1b. Разбавленную смесь GD2 и GM1 (50 мкг/мл) или GD1b (300 мкл) инжектировали при скорости потока 15 мкл/мин в течение 20 минут. Затем интенсивно промывали 10 мМ NaOH (как правило, пять промываний по 20 мкл при скорости потока 5 мкл/мин) до получения стабильной базовой линии.
Анализ комплемент-опосредованной цитотоксичности (CMC)
2
2
2
Антитела тестировали в отношении их прямого эффекта на рост и выживание клеток опухоли в отсутствие сыворотки крови человека или эффекторных клеток человека. Опухоли-мишени были диссоциированы с помощью 2 мМ ЭДТА или трипсин-ЭДТА, промыты и высажены в 96-леночные плоскодонные планшеты с сывороткой человека. После инкубации в течение 24 ч в инкубаторе с 5% CO при 37°C антитела в возрастающих концентрациях в среде F10 добавляли в каждую лунку. В контрольные лунки добавляли только F10. После инкубации в течение 4 ч при 37°С в атмосфере с 5% CO, реагент WST-8 (Cayman Chemical Co.) добавляли в каждую лунку и инкубировали в темноте в CO-инкубаторе при 37°С в течение 2-6 часов. OD определяли при длине волны 450 нм и 690 нм с использованием планшетного ридера для ELISA. Анализ WST-8 валидировали путем прямого подсчета клеток с использованием трипанового синего (Sigma) или Beckman Coulter Counter (Beckman Coulter).
51
Антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (ADCC), определяемая по высвобождению хрома
51
6
51
2
Клетки-мишени снимали с подложки с помощью 2 мМ ЭДТА в PBS без Ca2+, Mg2+ и промывали в F10. Плотность антигена оценивали с использованием гранул Quantum Simply Cellular anti-Mouse IgG beads в соответствии с инструкциями производителя (Bangs Laboratories, Inc.). Для анализа цитотоксичности 100 мкКи Cr инкубировали с 10 клеток-мишеней в конечном объеме 250 мкл и инкубировали в течение 1 ч при 37°С с осторожным ресуспендированием осадка с 15-минутными интервалами. Затем клетки промывали, ресуспендировали в 250 мкл F10 и инкубировали в течение 30 минут при 37°C. После промывания клетки подсчитывали, определяли их жизнеспособность с помощью трипанового синего и быстро вывевали в 96-луночные круглодонные планшеты. Периферическую кровь здоровых добровольцев собирали в гепаринизированные пробирки. Кровь смешивали с 3% раствором декстрана в PBS и выдерживали при комнатной температуре в течение 20 минут для осаждения эритроцитов. Затем лейкоциты центрифугировали в градиенте фиколла и отделяли мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) для PBMC-ADCC. Клетки промывали в F10, подсчитывали и определяли жизнеспособность. PBMC-ADCC выполняли в присутствии 10 Ед/мл IL-2. Антитела разбавляли в F10 10-кратными разведениями, начиная с концентрации 1 мкг/мл. Планшеты инкубировали в инкубаторе с 5% CO при 37°C в течение 4 часов. Супернатант с Cr, высвобожденным при ADCC, собирали для подсчета гамма-излучения. Полное высвобождение с использованием 10% додецилсульфата натрия (SDS) и фоновое спонтанное высвобождение определяли только для F10 без эффекторов. Как правило, использовали соотношение эффектор:мишень (E:T), равное 50:1. Аналогично, анализы ADCC проводили с использованием клеток NK-92MI, стабильно трансфицированных рецепторами человека CD16 или CD32 для Fc. В отличие от ситуации с PBMC, цитокины не были нужны для анализа. Соотношение E:T поддерживали на уровне 20:1.
Иммуногистохимия (ИГХ)
Опухоли и нормальные ткани получали в Мемориальном онкологическом центре Слоана-Кеттеринга с одобрения институционального наблюдательного совета. Срезы толщиной пять-семь микрометров из быстрозамороженных тканей фиксировали в ацетоне в течение 30 минут при -20°C. Эндогенную биотин-связывающую активность блокировали последовательной обработкой авидином и биотином (набор Vector avidin-biotin blocking kit; Invitrogen), каждый раз в течение 20 минут. Срезы инкубировали с 3 мкг/мл scFv-Flag при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывания срезы инкубировали с HRP-конъюгированными антителами к Flag в течение 30 минут при комнатной температуре и затем инкубировали с 3,3-диаминобензидином в течение 5 минут. Также проводили окрашивание H&E.
ПРИМЕР 2
Конструирование hu3F8V5
Девять точечных мутаций вводили в hu3F8 V1, получая hu3F8 V5 (смотри таблицу 2) в попытке снижения потенциальной иммуногенности. Установлено, что все девять мутаций были структурно пермиссивными в соответствии с компьютерной моделью связывания 3F8 с его антигеном GD2. Все мутации включали изменение остатков мышиного антитела, оставшихся после гуманизации на 3F8, на остатки последовательностей зародышевой линии человека. Пять из мутаций (LC:K24R, LC:S56T, LC:V58I, HC:I20L, HC:M92V) затрагивали каркасные остатки. Кроме того, авторы изобретения обнаружили 4 мутации в CDR H2 (HC:A62S, HC:F63V, HC:M64K, HC:S56G), которые приводили к удалению сильного T-клеточного эпитопа, что определяли in silico методами. Хотя для специалистов в данной области гуманизация антитела с помощью методов пересадки для изменения остатков CDR является необычной, компьютерная модель авторов изобретения для 3F8, связанного с GD2, позволила им создать эти дополнительные гуманизирующие мутации.
Созревание аффинности hu3F8
Для осуществления созревания аффинности на основе методов дрожжевого дисплея авторы изобретения синтезировали новое биотинилированное производное GD2 для использования в отборе. Ранее авторы изобретения потерпели неудачу при использовании стандартного биотинилированного антигена GD2. Используя синтетическое азидо-производное GD2 (фигура 2), они провели слияние его с ПЭГ-спейсером (смотри пример 7 ниже). С использованием этого нового аналога GD2 авторы изобретения отобрали 2 мутанта из произвольной библиотеки hu3F8 ScFv, экспонированных на поверхности дрожжей, которые демонстрировали усиленное связывание с синтетическим аналогом GD2. Первый имел мутацию LC:D32H, которая находилась на CDR L1, и второй имел мутацию LC:E1K, которая имела место в каркасном остатке.
Две мутации (LC:E1K и LC:D32H) были протестированы в рекомбинантно экспрессированных конструктах hu3F8V1 ScFv и hu3F8V5 ScFv, и аффинности связывания для природного GD2 были измерены в анализе Biacore. На основании структурного моделирования все hu3F8 scFv были созданы в формате VL-VH, поскольку он делает возможным менее ограниченный доступ к антигенсвязывающему карману. В этом заключалось отличие от большинства обычных scFv, которые сконструированы в формате VH-VL. Несколько вариантов также были протестированы в формате полноразмерного IgG1. В таблице 2 приведен дизайн hu3F8V5.
ТАБЛИЦА 2
Мутация в hu3F8V1 для получения hu3F8V5
Локализация
Обоснование
LC: K24R
Каркас
Гуманизирующая мутация
LC: S56T
Каркас
Гуманизирующая мутация
LC: V58I
Каркас
Гуманизирующая мутация,Стабилизирует структуру
HC: I20L
Каркас
Гуманизирующая мутация
HC: A62S
CDR H2
Гуманизирующая мутация,уменьшает T-клеточный эпитоп
HC: F63V
CDR H2
Гуманизирующая мутация,уменьшает T-клеточный эпитоп
HC: M64K
CDR H2
Гуманизирующая мутация,уменьшает T-клеточный эпитоп
HC: S65G
CDR H2
Гуманизирующая мутация,уменьшает T-клеточный эпитоп
HC: M92V
Каркас
Гуманизирующая мутация,Стабилизирует структуру
ПРИМЕР 3
Аффинности связывания
D
Аффинности связывания вариантов hu3F8, протестированных в формате scFv (смотри таблицу 3), отличались рядом интересных особенностей. Во-первых, hu3F8V5, которое было сконструировано только для снижения иммуногенности по сравнению с hu3F8V1, имело немного более сильную аффинность связывания с GD2, чем hu3F8V1. Две мутации созревания аффинности (LC:E1K и LC:D32H) при раздельной экспрессии приводили к усилению связывания с GD2. При совместной экспрессии в формате либо hu3F8V1, либо hu3F8V5 scFv, наблюдали более значительное возрастание аффинности связывания (в 7-12 раз ниже K). Когда двойную мутацию (LC:E1K+LC:D32H) объединяли с HC:G54I (на основании in silico моделирования, эталон исходная родительская форма), аффинность связывания не была такой сильной, как в случае только двойной мутации, но все еще превышала аффинность hu3F8V1. Показано, что hu3F8 G54I имело 7-10-кратное усиление ADCC в отношении GD2-положительных клеток опухолевых линий.
Аффинности связывания для вариантов hu3F8 в формате полноразмерного IgG1 приведены в таблице 4. Аналогично данным для scFv, двойная мутация LC:E1K+LC:D32H приводила к более высокой аффинности, чем одиночная мутация LC:D32H, в обоих форматах hu3F8 V1 и hu3F8 V5. Общее усиление за счет двойной мутации LC:E1K+LC:D32H в сравнении с родительской формой составляло 8-10 раз в обоих форматах, hu3F8 V1 и hu3F8 V5. Вклад мутации LC:E1K в усиление связывания был неожиданным, поскольку этот остаток не является каноническим остатком CDR. Прямое сравнение аффинностей связывания hu3F8 V1 с hu3F8 V5 IgG конструктами было невозможно выполнить, поскольку конструкты hu3F8 V5 были временно экспрессированы в клетках HEK 293 и могли иметь измененные структурные свойства, которые могли влиять на связывание. В таблице 3 приведены аффинности связывания hu3F8 scFv с GD2, измеренные с помощью Biacore. В таблице 4 приведены аффинности связывания hu3F8 IgG с GD2, измеренные с помощью Biacore.
ТАБЛИЦА 3
Антитело
K<sub>D</sub> (M)
нМ
hu3F8V1 scFv
3,05E-08
31
hu3F8V5 scFv
2,37E-08
24
hu3F8V1 E1K scFv
1,15E-08
12
hu3F8V1 D32H scFv
7,84E-09
8
hu3F8V5 D32H scFv
5,52E-09
6
hu3F8V1 E1K D32H scFv
3,71E-09
4
hu3F8V5 E1K D32H scFv
1,96E-09
2
hu3F8V1 E1K D32H G54I scFv
6,89E-09
7
hu3F8V1 ScFv - huOKT3 ScFv биспецифическое
8,86E-09
9
ТАБЛИЦА 4
Антитело
K<sub>D</sub> (M)
нМ
hu3F8V1 IgG
2,983E-9
3
hu3F8V1 D32H IgG
4,965E-10
0,5
hu3F8V1 E1K D32H IgG
2,696E-10
0,3
hu3F8V5 IgG*
1,32E-08
13
hu3F8V5 D32H IgG*
2,36E-09
2,4
hu3F8V5 E1K D32H IgG*
8,57E-10
1,6
*временно экспрессированные в клетках HEK293, могут отличаться по гликозилированию при стабильной экспрессии в клетках CHO.
ПРИМЕР 4
Перекрестная реактивность с другими ганглиозидами
В исследованиях перекрестной реактивности (таблица 5, и данные не представлены), все варианты hu3F8 имели сопоставимую перекрестную реактивность с GD1b (ганглиозид, также присутствующий на клетках опухоли нейробластомы) и никакой существенно перекрестной реактивности с другими протестированными ганглиозидами (GD1a, GD1b, GD3), что свидетельствует о том, что варианты hu3F8 сохраняют ту же специфичность, что и родительские hu3F8V1. В таблице 5 приведены аффинности связывания hu3F8 IgG с GD1b, измеренные с помощью Biacore.
ТАБЛИЦА 5
Антитело
K<sub>D</sub> (M)
нМ
hu3F8 V1 IgG
9,30E-08
93
hu3F8 V1 D32H IgG
8,74E-08
87
hu3F8 V1 E1K D32H IgG
8,36E-08
84
ПРИМЕР 5
Эффективность антител в ADCC и CMC
IgG1 антитела к GD2 сравнивали в анализах ADCC с использованием PBMC (мононуклеарных клеток периферической крови) или NK92-CD16 (CD16-положительных культивируемых NK-клеток) в качестве эффекторов и клеток нейробластомы LAN-1 в качестве мишеней (данные не представлены). Эффективность ADCC этих антител рассчитывали как отношение (EC50 для 3F8)/(EC50 для моАт). Относительно родительских hu3F8 V1 IgG, hu3F8 V1 LC:D32H и hu 3F8 V1 LC:E1K+LC:D32H демонстрировали ~20-кратно усиленную активность в PBMC-ADCC и 7-кратно усиленную активность в NK92-CD16-ADCC (смотри таблицу 6). В таблице 6 приведены результаты анализов ADCC с использованием hu3F8V1 IgG.
ТАБЛИЦА 6
PBMC
NK92-CD16
Антитело
EC<sub>50</sub> (мкг/мл)
Относи-тельная эффектив-ность*
Антитело
EC<sub>50</sub> (мкг/мл)
Относи-тельная эффектив-ность*
hu3F8 V1
0,00021
1,00
hu3F8 V1
0,002
1,00
hu3F8 V1 D32H
0,00003
7,00
hu3F8 V1 D32H
0,0001
20,00
hu3F8 V1 E1K D32H
0,00003
7,00
hu3F8 V1 E1K D32H
0,0001
20,00
* hu3F8 V1 использовали в качестве эталона
Те же антитела тестировали на их способность индуцировать CMC с использованием сыворотки человека в качестве эффекторов и клеток LAN-1 в качестве мишеней. (Таблица 7, и данные не представлены). Вариант hu3F8 V1 LC:D32H продемонстрировал небольшое увеличение в CMC, в то время как hu3F8 V1 LC:E1K+LC:D32H продемонстрировал такую же степень CMC, что и родительские hu3F8 V1. Относительно низкая активация комплемента желательна, поскольку считается, что активация комплемента опосредует болевой побочный эффект, связанный с анти-GD2 иммунотерапией. В таблице 7 приведены результаты анализа CMC с hu3F8V1 IgG.
ТАБЛИЦА 7
Антитело
EC<sub>50</sub> (мкг/мл)
Относительная эффективность*
hu3F8 V1
0,03
1,00
hu3F8 V1 D32H
0,011
2,73
hu3F8 V1 E1K D32H
0,029
1,03
*hu3F8V1 использовали в качестве эталона
ПРИМЕР 6
Иммуногистохимия нормальных тканей и опухолей
ScFv версии hu3F8 V1, hu3F8 V1 LC:D32H и hu3F8 LC:E1K+LC:D32H тестировали на тканевую специфичность ИГХ методами на опухолях человека нейробластоме, остеосаркоме, рабдомиосаркоме, саркоме Юинга, десмопластических мелкокруглоклеточных опухолях, а также нормальных тканях человека (смотри фигуру 1). Также тестировали двенадцать нормальных тканей (смотри таблицу 8). Лобная доля, варолиев мост, мозжечок и спинной мозг, все имели положительное окрашивание при использовании обоих клонов со зрелой аффинностью (hu3F8 V1 LC:D32H и hu3F8 LC:E1K+LC:D32H), но не родительского клона (hu3F8 V1), как и ожидалось, поскольку, как известно, GD2 присутствует на нейрональных тканях. При рассмотрении результатов ИГХ образцов различных опухолей, видно, что клоны со зрелой аффинностью (hu3F8 V1 LC:D32H и hu3F8 LC:E1K+LC:D32H) имели более высокий уровень окрашивания на GD2-положительные опухоли по сравнению с родительским антителом (hu3F8 V1). В таблице 8 показана степень окрашивания тканей с использованием hu3F8V1 scFv.
ТАБЛИЦА 8
Ткань
V1
V1 D32H
V1 E1K D32H
НБ 4 стадии
4
4
4
Подвздошная кишка
0
0
0
Скелетная мышца
0
0
0
Мозжечок
0
1
1
Лобная доля
0
1
1
Варолиев мост
0
1
1
Желудок
0
0
0
Спинной мозг
0
1
1
Легкое
0
0
0
Селезенка
0
0
0
Щитовидная железа
0
0
0
Почка
0
0
0
Семенники
0
0
0
Концентрация scFv составляет 3 мкг/мл; НБ, нейробластома; степень окрашивания определяли как 0, 1 (слабое, гетерогенное окрашивание мембран), 2 (слабое, гомогенное окрашивание мембран), 3 (сильное, гетерогенное окрашивание мембран) и 4 (сильное, гомогенное окрашивание мембран).
ПРИМЕР 7
Биотинилирование GD2
Для мелкомасштабных реакций проводили реакцию 100 мкг GD2-азидо и 50 мкг DBCO-ПЭГ4-биотина (Click Chemistry Tools) в 25 мкл воды в течение ночи при 4°C с осторожным вращением. На следующий день избыток DBCO-ПЭГ4-биотина инактивировали добавлением 30 мкг азидо-ПЭГ-азидо (Click Chemistry Tools) и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Продукт разбавляли для достижения концентрации 0,5 мг/мл и хранили при температуре -80°C.
FACS анализ
6
Дрожжевые клетки, экспонирующие hu3F8 scFv, культивировали и индуцировали для FACS анализа. Дрожжевые клетки (1×10) инкубировали с 2 мкг/мл биотинилированным GD2-азидо-ПЭГ4-биотином или GD2-биотином мышиным антителом к c-myc в разведении 1:100 в течение 30 минут на льду в PBS/0,1% БСА буфере. После одного промывания клетки инкубировали с разведенными 1:50 R-фикоэритрин-конъюгированным стрептавидином и Alexa Fluor 488-конъюгированным антителом козы против иммуноглобулинов мыши в течение 30 минут на льду, затем вновь промывали и ресуспендировали в 0,5 мл PBSA буфера. Анализ проводили с использованием BD Bioscience FACS.
Результаты
Дрожжевые клетки, экспонирующие hu3F8 scFv с cmyc-меткой на клеточной поверхности, использовали для связывания конъюгатов GD2 с биотином с ПЭГ-спейсером или без него. В анализе методом проточной цитометрии экспрессию и связывание с GD2 hu3F8 scFv отмеряли по оси X и Y, соответственно. Авторы изобретения обнаружили, что наличие ПЭГ4-спейсера необходимо для наблюдения GD2 в анализе методом проточной цитометрии, при сравнении с GD2 без спейсера (данные не представлены). На фигуре 2 представлена химическая структура биотин-ПЭГ-GD2.
ПРИМЕР 8
Измерение скоростей диссоциации моАт методом поверхностного плазмонного резонанса
Скорости диссоциации hu3F8 IgG с мутациями, усиливающими аффинность, измеряли методом поверхностного плазмонного резонанса (Biacore T100) с использованием модели высокой плотности GD2.
Вкратце, ганглиозиды непосредственно иммобилизовали на сенсорном чипе CM5 за счет гидрофобного взаимодействия. На контрольной поверхности иммобилизовали GM1. На активной поверхности иммобилизовали чистый GD2. GD2 (50 мкг/мл) инжектировали (300 мкл) при скорости потока 15 мкл/мин в течение 20 минут. Затем интенсивно промывали 10 мМ NaOH (как правило, пять промываний по 20 мкл со скоростью потока 5 мкл/мин) до получения стабильной базовой линии. Результаты приведены в таблице 9 и на фигуре 3.
ТАБЛИЦА 9
Антитело
K<sub>off</sub> (с<sup>-1</sup>)
Кратность изменения относительно hu3F8V1
hu3F8V1 D32H G54I
2,9×10<sup>-4</sup>
-6,4
hu3F8V1 E1K D32H
5,1×10<sup>-4</sup>
-3,6
hu3F8V1 D32H
6,9×10<sup>-4</sup>
-2,7
hu3F8V1 E1K D32H G54I
8,8×10<sup>-4</sup>
-2,1
hu3F8V1
18,5×10<sup>-4</sup>
1
Как показано в таблице 9 и на фигуре 3, двойные мутанты hu3F8 (hu3F8V1 LC:D32H HC:G54I и hu3F8V1 LC:E1K LC:D32H) продемонстрировали самые низкие скорости диссоциации, которые были в 3,6-6,4 раз ниже, чем у hu3F8V1. Одиночный мутант (hu3F8 V1 LC:D32H) и тройной мутант (hu3F8V1 LC:E1K LC:D32H HC:G54I) демонстрировали в 2,7 и 2,1 раза более низкую скорость диссоциации, соответственно.
Эффективность антитела в ADCC с дополнительными линиями опухолевых клеток
IgG1 антитела к GD2 сравнивали в анализе ADCC с использованием клеток NK92-CD16 (CD16-положительных культивируемых NK-клеток) в качестве эффекторов и клеток либо нейробластомы IMR-32, либо меланомы M14, в качестве мишеней (как описано выше). Эффективность ADCC рассчитывали как отношение EC50 hu3F8V1/EC50 антитела. Результаты приведены в таблице 10.
ТАБЛИЦА 10
Мишень: IMR-32
Мишень: M14
Антитело
EC<sub>50</sub> (мкг/мл)
Относительная эффективность
EC<sub>50</sub> (мкг/мл)
Относительная эффективность
hu3F8V1 E1K D32H
0,0005
140,0
0,0001
25,0
hu3F8V1 D32H G54I
0,0007
100,0
0,00011
22,7
hu3F8V1D32H
0,0028
25,0
0,0005
5,0
hu3F8V1 E1K D32H G54I
0,0045
15,6
0,0007
3,6
hu3F8V1
0,07
1,0
0,0025
1,0
Результаты показывают, что по сравнению с родительскими hu3F8 V1 IgG двойные мутанты (hu3F8V1 LC:D32H HC:G54I и hu3F8V1 LC:E1K) демонстрировали 100-140-кратное возрастание ADCC клеток IMR-32 и 22-25-кратное возрастание ADCC клеток M14. Одиночный мутант (hu3F8V1 LC:D32H) демонстрировал 25-кратное возрастание ADCC клеток IMR-32 и 5-кратное возрастание ADCC клеток M14. Тройной мутант (hu3F8V1 LC:E1K LC:D32H HC:G54I) демонстрировал 15,6-кратное возрастание ADCC клеток IMR-32 и 3,6-кратное возрастание ADCC клеток M14.