УЛЬТРАЯРКИЕ ДИМЕРНЫЕ ИЛИ ПОЛИМЕРНЫЕ КРАСИТЕЛИ
ULTRA-BRIGHT DIMER OR POLYMER DYES

Область техники
Настоящее изобретение в целом относится к димерным и полимерным флуоресцентным или цветным красителям, и к способам их получения и использования в различных аналитических методах.
Описание предшествующего уровня техники
Известно, что флуоресцентные и/или цветные красители особенно подходят для применений, в которых желателен высокочувствительный детектирующий реагент. Красители, которые способны предпочтительно метить конкретный ингредиент или компонент в образце, дают возможность исследователю определять присутствие, количество и/или локализацию этого конкретного ингредиента или компонента. Кроме того, можно осуществлять мониторинг специфических систем в отношении их пространственного и временного распределения в различных средах.
Флуоресцентные и колориметрические методы чрезвычайно распространены в химии и биологии. Эти методы дают полезную информацию о наличии, структуре, расстоянии, ориентации, комплексообразовании и/или локализации для биомолекул. Кроме того, методы с разрешением по времени все чаще используются в измерениях динамики и кинетики. В результате, разработано много стратегий флуоресцентного или цветного мечения биомолекул, таких как нуклеиновые кислоты и белки. Поскольку анализ биомолекул обычно происходит в водной среде, основное внимание уделяется разработке и использованию водорастворимых красителей.
Желательно использовать интенсивно флуоресцентные или цветные красители, поскольку использование таких красителей увеличивает отношение сигнал/шум и дает другие связанные с ними преимущества. В связи с этим, предпринимались попытки увеличить сигнал от известных флуоресцентных и/или цветных фрагментов. Например, димерные и полимерные соединения, содержащие два или более флуоресцентных и/или цветных фрагмента, были получены в ожидании того, что такие соединения будут давать более яркие красители. Однако в результате внутримолекулярного тушения флуоресценции известные димерные и полимерные красители не достигли желаемого увеличения яркости.
Таким образом, в данной области техники существует потребность в водорастворимых красителях, имеющих повышенную молярную яркость. В идеальном варианте, такие красители и биомаркеры должны быть интенсивно окрашенными или флуоресцентными и должны быть доступными в широком диапазоне цветов и при различных длинах волн флуоресценции. Настоящее изобретение удовлетворяет эту потребность и обеспечивает дополнительные связанные с ним преимущества.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Вкратце, варианты осуществления настоящего изобретения в целом относятся к соединениям, подходящим для использования в качестве водорастворимых, флуоресцентных и/или цветных красителей и/или зондов, которые дают возможность визуальной детекции молекул аналита, таких как биомолекулы, а также к реагентам для их получения. Также описаны способы визуальной детекции молекул аналита с использованием красителей.
Водорастворимые, флуоресцентные или цветные красители вариантов осуществления изобретения являются интенсивно окрашенными и/или флуоресцентными и могут быть легко обнаружены при визуальном исследовании или другими способами. В некоторых вариантах осуществления соединения могут наблюдаться без предшествующего облучения или химической или ферментативной активации. С помощью соответствующего выбора красителя, как описано в данном документе, могут быть получены визуально детектируемые молекулы аналита различных цветов.
В одном варианте осуществления предложены соединения, имеющие следующую структуру (I):
(I)
1
2
3
4
5
1
2
3
4
или их стереоизомер, таутомер или соль, где R, R, R, R, R, L, L, L, L, M, m и n являются такими, как определено в настоящем описании. Соединения структуры (I) находят применение в ряде областей, включая использование в качестве флуоресцентных и/или цветных красителей в различных аналитических методах.
В другом варианте осуществления предложен способ окрашивания образца, причем способ включает добавление в указанный образец соединения структуры (I) в количестве, достаточном для получения оптического отклика, когда указанный образец облучают с соответствующей длиной волны.
В еще одних вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает способ визуальной детекции молекулы аналита, включающий:
(a) обеспечение соединения (I); и
(b) детектирование соединения по его визуальным свойствам.
Другие раскрываемые способы включают способ визуальной детекции биомолекулы, причем способ включает:
(а) смешивание соединения структуры (I) с одной или несколькими биомолекулами; и
(b) детектирование соединения по его визуальным свойствам.
Другие варианты осуществления относятся к композиции, содержащей соединение структуры (I) и одну или несколько биомолекул. Также предложено использование таких композиций в аналитических методах для детектирования одной или нескольких биомолекул.
В некоторых других вариантах осуществления предложено соединение структуры (II):
(II)
1
2
3
4
5
1a
2
3
4
или его стереоизомер, соль или таутомер, где R, R, R, R, R, L, L, L, L, A, G, m и n являются такими, как определено в данном описании. Соединения структуры (II) находят применение в ряде областей, включая использование в качестве интермедиатов для получения флуоресцентных и/или цветных красителей структуры (I).
В еще одних вариантах осуществления предложен способ мечения молекулы аналита, включающий:
2
3
(а) смешивание соединения структуры (II), где R или R представляет собой Q или линкер, содержащий ковалентную связь с Q, с молекулой аналита;
(b) образование конъюгата соединения и молекулы аналита; и
1b
2
3
1b
(c) взаимодействие конъюгата с соединением формулы M-L-G', благодаря чему образуется по меньшей мере одна ковалентная связь в результате реакции G и G', где R, R, Q, G и M-L-G' являются такими, как определено в данном описании.
В некоторых других вариантах осуществления предложен способ мечения молекулы аналита, включающий:
2
3
1b
(а) смешивание соединения структуры (II), где R или R представляет собой Q или линкер, содержащий ковалентную связь с Q, с соединением формулы M-L-G', благодаря чему образуется по меньшей мере одна ковалентная связь путем реакции G и G'; и
2
3
1b
(b) взаимодействие продукта стадии (a) с молекулой аналита, в результате чего образуется конъюгат продукта стадии (a) и молекулы аналита, где R, R, Q, G и M-L-G' являются такими, как определено в данном описании.
1b
1b
В еще одних вариантах осуществления предложен способ получения соединения структуры (I), включающий: смешивание соединения структуры (II) с соединением формулы M-L-G', благодаря чему образуется по меньшей мере одна ковалентная связь путем реакции G и G', где G и M-L-G' являются такими, как определено в данном описании.
Эти и другие аспекты изобретения станут очевидными при обращении к следующему ниже подробному описанию.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фигурах одинаковые ссылочные позиции обозначают аналогичные элементы. Размеры и относительные положения элементов на фигурах необязательно приводятся в масштабе, и некоторые из этих элементов произвольно увеличены и расположены для улучшения читаемости фигуры. Кроме того, конкретные формы элементов в том виде, в котором они изображены, не предназначены для передачи какой-либо информации относительно фактической формы конкретных элементов, и были выбраны исключительно для облегчения распознавания на фигурах.
На фиг.1 представлены спектры флуоресценции для 3-мерных, 5-мерных и 10-мерных соединений кумариновых красителей.
На фиг.2 представлены спектры флуоресценции для 3-мерных, 5-мерных и 10-мерных соединений флуоресцеиновых красителей.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
В следующем ниже описании некоторые конкретные подробности изложены для обеспечения полного понимания различных вариантов осуществления изобретения. Однако специалисту в данной области будет понятно, что изобретение может быть осуществлено и без этих подробностей.
Если из контекста не следует иное, во всем описании и формуле настоящего изобретения слово «содержать» и его варианты, такие как «содержит» и «содержащий», должны быть истолкованы в широком, охватывающем смысле, т.е. как «включающие без ограничения».
Ссылка во всем данном описании на «один вариант осуществления» или «вариант осуществления» означает, что конкретный признак, структура или характеристика, описанные в связи с вариантом осуществления, включены по меньшей мере в один из вариантов осуществления по настоящему изобретению. Соответственно, фразы «в одном варианте осуществления» или «в варианте осуществления», присутствующие в различных местах данного описания, не обязательно относятся все к одному и тому же варианту осуществления. Кроме того, конкретные признаки, структуры или характеристики могут быть объединены любым подходящим образом в одном или нескольких вариантах осуществления.
2
«Амино» относится к группе -NH.
2
«Карбокси» относится к группе -COH.
«Циано» относится к группе -CN.
«Формил» относится к группе -C(=O)H.
«Гидрокси» или «гидроксил» относится к группе -OH.
«Имино» относится к группе =NH.
2
«Нитро» относится к группе -NO.
«Оксо» относится к группе-заместителю =O.
«Сульфгидрил» относится к группе -SH.
«Тиоксо» относится к группе =S.
1
12
1
8
1
6
«Алкил» относится к группе с прямой или разветвленной углеводородной цепью, состоящей исключительно из атомов углерода и водорода, не содержащей ненасыщенности, имеющей от 1 до 12 атомов углерода (C-C алкил), от 1 до 8 атомов углерода (C-C алкил) или от 1 до 6 атомов углерода (C-C алкил), и которая присоединена к остальной части молекулы одинарной связью, как например, метил, этил, н-пропил, 1-метилэтил (изопропил), н-бутил, н-пентил, 1,1-диметилэтил (т-бутил), 3-метилгексил, 2-метилгексил, и тому подобное. Если в данном описании специально не указано иное, алкильные группы являются необязательно замещенными.
«Алкилен» или «алкиленовая цепь» относится к линейной или разветвленной двухвалентной углеводородной цепи, связывающей остальную часть молекулы с радикальной группой, состоящей исключительно из углерода и водорода, не содержащей ненасыщенности и имеющей от 1 до 12 атомов углерода, как например, метилен, этилен, пропилен, н-бутилен, этенилен, пропенилен, н-бутенилен, пропинилен, н-бутинилен и тому подобное. Алкиленовая цепь присоединена к остальной части молекулы через одинарную связь и к радикальной группе через одинарную связь. Местами присоединения алкиленовой цепи к остальной части молекулы и к радикальной группе могут быть один атом углерода или любые два атома углерода внутри цепи. Если в данном описании специально не указано иное, алкилен является необязательно замещенным.
«Алкенилен» или «алкениленовая цепь» относится к линейной или разветвленной двухвалентной углеводородной цепи, связывающей остальную часть молекулы с радикальной группой, состоящей исключительно из углерода и водорода, содержащей по меньшей мере одну двойную углерод-углеродную связь и имеющей от 2 до 12 атомов углерода, как например, этенилен, пропенилен, н-бутенилен и тому подобное. Алкениленовая цепь присоединена к остальной части молекулы через одинарную связь и к радикальной группе через двойную связь или одинарную связь. Местами присоединения алкениленовой цепи к остальной части молекулы и к радикальной группе могут быть один атом углерода или любые два атома углерода внутри цепи. Если в данном описании специально не указано иное, алкенилен является необязательно замещенным.
«Алкинилен» или «алкиниленовая цепь» относится к линейной или разветвленной двухвалентной углеводородной цепи, связывающей остальную часть молекулы с радикальной группой, состоящей исключительно из углерода и водорода, содержащей по меньшей мере одну тройную углерод-углеродную связь и имеющей от 2 до 12 атомов углерода, как например, этенилен, пропенилен, н-бутенилен и тому подобное. Алкиниленовая цепь присоединена к остальной части молекулы через одинарную связь и к радикальной группе через двойную связь или одинарную связь. Местами присоединения алкиниленовой цепи к остальной части молекулы и к радикальной группе могут быть один атом углерода или любые два атома углерода внутри цепи. Если в данном описании специально не указано иное, алкинилен является необязательно замещенным.
a
b
c
a
b
c
«Простой алкилэфир» относится к любой алкильной группе, определенной выше, в которой по меньшей мере одна углерод-углеродная связь заменена углерод-кислородной связью. Углерод-кислородная связь может находиться на терминальном конце (как в алкоксигруппе) или же углерод-кислородная связь может быть внутренней (т.е. С-О-С). Простые алкилэфиры включают по меньшей мере одну углерод-кислородную связь, но могут включать более одной. Например, полиэтиленгликоль (PEG) входит в значение простого алкилэфира. Если в данном описании специально не указано иное, простая алкилэфирная группа является необязательно замещенной. Например, в некоторых вариантах осуществления простой алкилэфир замещен спиртом или -OP(=R)(R)R, где каждый из R, R и R является таким, как определено для соединений структуры (I).
a
a
«Алкокси» относится к группе формулы -OR, где R представляет собой алкильную группу, как определено выше, содержащую от 1 до 12 атомов углерода. Если в данном описании специально не указано иное, алкоксигруппа является необязательно замещенной.
«Гетероалкилен» относится к алкиленовой группе, как определено выше, содержащей по меньшей мере один гетероатом (например, N, O, P или S) внутри алкиленовой цепи или на конце алкиленовой цепи. В некоторых вариантах осуществления гетероатом находится внутри алкиленовой цепи (т.е. гетероалкилен содержит по меньшей мере одну связь углерод-гетероатом-углерод). В других вариантах осуществления гетероатом находится на конце алкилена и, таким образом, служит для присоединения алкилена к остальной части молекулы (например, M1-H-A-М2, где M1 и М2 представляют собой части молекулы, H представляет собой гетероатом, и А представляет собой алкилен). Если в данном описании специально не указано иное, гетероалкиленовая группа является необязательно замещенной. Приводимая в качестве примера гетероалкиленовая линкерная группа показана ниже:
«C-линкер»
Мультимеры указанного выше С-линкера включены в различные варианты осуществления гетероалкиленовых линкеров.
«Гетероалкенилен» представляет собой гетероалкилен, как определено выше, содержащий по меньшей мере одну двойную углерод-углеродную связь. Если в данном описании специально не указано иное, гетероалкениленовая группа является необязательно замещенной.
«Гетероалкинилен» представляет собой гетероалкилен, содержащий по меньшей мере одну тройную углерод-углеродную связь. Если в данном описании специально не указано иное, гетероалкиниленовая группа является необязательно замещенной.
-
-
Выражение «гетероатомный» по отношению к «гетероатомному линкеру» относится к линкерной группе, состоящей из одного или более гетероатомов. Приводимые в качестве примера гетероатомные линкеры включают одиночные атомы, выбранные из группы, состоящей из O, N, P и S, и несколько гетероатомов, например, линкер, имеющий формулу -P(O)(=O)O- или -OP(O)(=O)O-, и мультимеры и их сочетания.
a
b
a
c
b
c
c
-
-
+
«Фосфат» относится к группе -OP(=O)(R)R, где R представляет собой ОН, О или OR; и R представляет собой ОН, О, OR, тиофосфатную группу или дополнительную фосфатную группу, где R представляет собой противоион (например, Na и тому подобное).
a
b
a
c
b
c
-
+
«Фосфоалкил» относится к группе -OP(=O)(R)R, где R представляет собой ОН, О или OR; и R представляет собой -Оалкил, при этом R представляет собой противоион (например, Na и тому подобное). Если в данном описании специально не указано иное, фосфоалкильная группа является необязательно замещенной. Например, в некоторых вариантах осуществления -Оалкильный фрагмент в фосфоалкильной группе необязательно замещен одним или несколькими из гидроксила, амино, сульфгидрила, фосфата, тиофосфата, фосфоалкила, тиофосфоалкила, простого фосфоалкилэфира или простого тиофосфоалкилэфира.
a
b
a
c
b
c
-
+
«Простой фосфоалкилэфир» относится к группе -OP(=O)(R)R, где R представляет собой ОН, О или OR; и R представляет собой простой -Оалкилэфир, при этом R представляет собой противоион (например, Na и тому подобное). Если в данном описании специально не указано иное, простая фосфоалкилэфирная группа является необязательно замещенной. Например, в некоторых вариантах осуществления -Оалкилэфирный фрагмент в простой фосфоалкилэфирной группе необязательно замещен одним или несколькими из гидроксила, амино, сульфгидрила, фосфата, тиофосфата, фосфоалкила, тиофосфоалкила, простого фосфоалкилэфира или простого тиофосфоалкилэфира.
a
b
c
a
b
d
d
с
d
d
d
a
b
d
c
d
-
-
-
-
+
-
-
«Тиофосфат» относится к группе -OP(=R)(R)R, где R представляет собой О или S, R представляет собой OH, O, S, OR или SR; и R представляет собой OH, SH, O, S, OR, SR, фосфатную группу или дополнительную тиофосфатную группу, где R представляет собой противоион (например, Na и тому подобное) и при условии, что: i) R представляет собой S; ii) R представляет собой S или SR; iii) R представляет собой SH, S или SR; или iv) сочетание i), ii) и/или iii).
a
b
c
a
b
d
d
c
d
a
b
d
a
b
d
-
-
+
-
-
«Тиофосфоалкил» относится к группе -OP(=R)(R)R, где R представляет собой О или S, R представляет собой OH, O, S, OR или SR; и R представляет собой -Оалкил, при этом R представляет собой противоион (например, Na и тому подобное), и при условии, что: i) R представляет собой S; ii) R представляет собой S или SR; или iii) R представляет собой S, и R представляет собой S или SR. Если в данном описании специально не указано иное, тиофосфоалкильная группа является необязательно замещенной. Например, в некоторых вариантах осуществления -Оалкильный фрагмент в тиофосфоалкильной группе необязательно замещен одним или несколькими из гидроксила, амино, сульфгидрила, фосфата, тиофосфата, фосфоалкила, тиофосфоалкила, простого фосфоалкилэфира или простого тиофосфоалкилэфира.
a
b
c
a
b
d
d
c
d
a
b
d
a
b
d
-
-
+
-
-
«Простой тиофосфоалкилэфир» относится к группе -OP(=R)(R)R, где R представляет собой О или S, R представляет собой OH, O, S, OR или SR; и R представляет собой простой -Оалкилэфир, при этом R представляет собой противоион (например, Na и тому подобное), и при условии, что: i) R представляет собой S; ii) R представляет собой S или SR; или iii) R представляет собой S, и R представляет собой S или SR. Если в данном описании специально не указано иное, простая тиофосфоалкилэфирная группа является необязательно замещенной. Например, в некоторых вариантах осуществления -Оалкилэфирный фрагмент в тиофосфоалкильной группе необязательно замещен одним или несколькими из гидроксила, амино, сульфгидрила, фосфата, тиофосфата, фосфоалкила, тиофосфоалкила, простого фосфоалкилэфира или простого тиофосфоалкилэфира.
«Карбоциклический» относится к стабильному 3-18-членному ароматическому или неароматическому кольцу, содержащему от 3 до 18 атомов углерода. Если в данном описании специально не указано иное, карбоциклическое кольцо может быть моноциклической, бициклической, трициклической или тетрациклической кольцевой системой, которая может включать в себя конденсированные или мостиковые кольцевые системы и может быть частично или полностью насыщенной. Неароматические карбоциклильные радикалы включают циклоалкил, тогда как ароматические карбоциклильные радикалы включают арил. Если в данном описании специально не указано иное, карбоциклическая группа является необязательно замещенной.
«Циклоалкил» относится к стабильному неароматическому моноциклическому или полициклическому карбоциклическому кольцу, которое может включать в себя конденсированные или мостиковые кольцевые системы, имеющие от 3 до 15 атомов углерода, предпочтительно имеющие от 3 до 10 атомов углерода, и которое является насыщенным или ненасыщенным и присоединено к остальной части молекулы одинарной связью. Моноциклические циклоалкилы включают, например, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил и циклооктил. Полициклические циклоалкилы включают, например, адамантил, норборнил, декалинил, 7,7-диметилбицикло[2.2.1]гептанил и тому подобное. Если в данном описании специально не указано иное, циклоалкильная группа является необязательно замещенной.
«Арил» относится к кольцевой системе, содержащей по меньшей мере одно карбоциклическое ароматическое кольцо. В некоторых вариантах осуществления арил содержит от 6 до 18 атомов углерода. Арильное кольцо может быть моноциклической, бициклической, трициклической или тетрациклической кольцевой системой, которая может включать в себя конденсированные или мостиковые кольцевые системы. Арилы включают, без ограничения, арилы, полученные из ацеантрилена, аценафтилена, ацефенантрилена, антрацена, азулена, бензола, хризена, флуорантена, флуорена, ассим-индацена, симм-индацена, индана, индена, нафталина, феналена, фенантрена, плейадена, пирена и трифенилена. Если в данном описании специально не указано иное, арильная группа является необязательно замещенной.
«Гетероциклический» относится к стабильному 3-18-членному ароматическому или неароматическому кольцу, содержащему от 1 до 12 атомов углерода и от 1 до 6 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из азота, кислорода и серы. Если в данном описании специально не указано иное, гетероциклическое кольцо может быть моноциклической, бициклической, трициклической или тетрациклической кольцевой системой, которая может включать в себя конденсированные или мостиковые кольцевые системы; и атомы азота, углерода или серы в гетероциклическом кольце могут быть необязательно окислены; атом азота может быть необязательно кватернизирован; и гетероциклическое кольцо может быть частично или полностью насыщенным. Примеры ароматических гетероциклических колец перечислены ниже в определении гетероарилов (т.е. гетероарил является подгруппой гетероциклических колец). Примеры неароматических гетероциклических колец включают, без ограничения, диоксоланил, тиенил[1,3]дитианил, декагидроизохинолил,имидазолинил, имидазолидинил, изотиазолидинил, изоксазолидинил, морфолинил, октагидроиндолил, октагидроизоиндолил, 2-оксопиперазинил, 2-оксопиперидинил, 2-оксопирролидинил, оксазолидинил, пиперидинил, пиперазинил, 4-пиперидонил, пирролидинил, пиразолидинил, пиразолопиримидинил, хинуклидинил, тиазолидинил, тетрагидрофурил, триоксанил, тритианил, триазинанил, тетрагидропиранил, тиоморфолинил, тиаморфолинил, 1-оксотиоморфолинил, и 1,1-диоксотиоморфолинил. Если в данном описании специально не указано иное, гетероциклическая группа является необязательно замещенной.
«Гетероарил» относится к 5-14-членной кольцевой системе, содержащей от 1 до 13 атомов углерода, от 1 до 6 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из азота, кислорода и серы, и по меньшей мере одно ароматическое кольцо. Для целей некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения, гетероарильный радикал может быть моноциклической, бициклической, трициклической или тетрациклической кольцевой системой, которая может включать в себя конденсированные или мостиковые кольцевые системы; и атомы азота, углерода или серы в гетероарильном радикале могут быть необязательно окислены; атом азота может быть необязательно кватернизирован. Примеры включают, без ограничения, азепинил, акридинил, бензимидазолил, бензтиазолил, бензиндолил, бензодиоксолил, бензофуранил, бензоксазолил, бензотиазолил, бензотиадиазолил, бензо[b][1,4]диоксепинил, 1,4-бензодиоксанил, бензонафтофуранил, бензоксазолил, бензодиоксолил, бензодиоксинил, бензопиранил, бензопиранонил, бензофуранил, бензофуранонил, бензотиенил (бензотиофенил), бензотриазолил, бензo[4,6]имидазо[1,2-a]пиридинил, бензоксазолинонил, бензимидазолтионил, карбазолил, циннолинил, дибензофуранил, дибензотиофенил, фуранил, фуранонил, изотиазолил, имидазолил, индазолил, индолил, индазолил, изоиндолил, индолинил, изоиндолинил, изохинолил, индолизинил, изоксазолил, нафтиридинил, оксадиазолил, 2-оксоазепинил, оксазолил, оксиранил, 1-оксидопиридинил, 1-оксидопиримидинил, 1-оксидопиразинил, 1-оксидопиридазинил, 1-фенил 1H-пирролил, феназинил, фенотиазинил, феноксазинил, фталазинил, птеридинил, птеридинонил, пуринил, пирролил, пиразолил, пиридинил, пиридинонил, пиразинил, пиримидинил, пиримидинонил, пиридазинил, пирролил, пиридо[2,3-д]пиримидинонил, хиназолинил, хиназолинонил, хиноксалинил, хиноксалинонил, хинолинил, изохинолинил, тетрагидрохинолинил, тиазолил, тиадиазолил, тиено[3,2-д]пиримидин-4-онил, тиено[2,3-д]пиримидин-4-онил, триазолил, тетразолил, триазинил, и тиофенил (т.е. тиенил). Если в данном описании специально не указано иное, гетероарильная группа является необязательно замещенной.
«Конденсированный» относится к кольцевой системе, содержащей, по меньшей мере, два кольца, при этом два кольца имеют по меньшей мере один общий кольцевой атом, например, два общих кольцевых атома. Когда конденсированное кольцо представляет собой гетероциклильное кольцо или гетероарильное кольцо, общим кольцевым атомом (атомами) может быть углерод или азот. Конденсированные кольца включают бициклические, трициклические, тетрациклические и тому подобное.
,
,
N
N-
N
N
g
h
g
h
g
g
h
g
h
g
2
h
g
h
g
g
g
2
g
2
g
2
g
2
g
2
g
h
g
g
g
h
2
2
g
2
2
g
h
g
h
Термин «замещенный», используемый в настоящем документе, означает любую из вышеуказанных групп (напримералкил, алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, гетероалкенилен, гетероалкинилен, алкокси, простой алкилэфир, фосфоалкил, простой фосфоалкилэфир, тиофосфоалкил, простой тиофосфоалкилэфир, карбоциклик, циклоалкил, арил, гетероциклик и/или гетероарил), в которой по меньшей мере один атом водорода (например 1, 2, 3 или все атомы водорода) заменен связью с неводородными атомами, такими как, без ограничения: атом галогена, такой как F, Cl, Br и I; атом кислорода в группах, таких как гидроксильные группы, алкоксигруппы и сложноэфирные группы; атом серы в группах, таких как тиольные группы, тиоалкильные группы, сульфоновые группы, сульфонильные группы и сульфоксидные группы; атом азота в группах, таких как амины, амиды, алкиламины, диалкиламины, ариламины, алкилариламины, диариламины, N-оксиды, имиды и енамины; атом кремния в группах, таких как триалкилсилильные группы, диалкиларилсилильные группы, алкилдиарилсилильные группы и триарилсилильные группы; и другие гетероатомы в различных других группах. «Замещенный» также означает любую из указанных выше групп, в которых один или более атомов водорода заменены связью более высокого порядка (например, двойной или тройной связью) с гетероатомом, таким как кислород в оксо, карбонильной, карбоксильной и сложноэфирной группах; и азот в таких группах, как имины, оксимы, гидразоны и нитрилы. Например, «замещенный» включает любую из перечисленных выше групп, в которой один или более атомов водорода заменены на NRR, NRC(=O)R, NRC(=O)NRR, NRC(=O)OR, NRSOR, OC(=O)NRR, OR, SR, SOR, SOR, OSOR, SOOR, =NSOR и SONRR. «Замещенный» также означает любую из указанных выше групп, в которых один или более атомов водорода заменены на C(=O)R, C(=O)OR, C(=O)NRR, CHSOR, CHSONRR. В приведенном выше описании R и R являются одинаковыми или различными и независимо друг от друга представляют водород, алкил, алкокси, алкиламино, тиоалкил, арил, аралкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, галогеналкил, гетероциклил, -гетероциклил, гетероциклилалкил, гетероарил, гетероарил и/или гетероарилалкил. «Замещенный» также означает любую из указанных выше групп, в которых один или более атомов водорода заменены связью с амино, циано, гидроксильной, имино, нитро, оксо, тиоксо, галогеновой, алкильной, алкокси, алкиламино, тиоалкильной, арильной, аралкильной, циклоалкильной, циклоалкилалкильной, галогеналкильной, гетероциклильной, -гетероциклильной, гетероциклилалкильной, гетероарильной, -гетероарильной и/или гетероарилалкильной группой. В дополнение к этому, каждый из перечисленных выше заместителей также может быть необязательно замещен одним или более из указанных выше заместителей.
«Конъюгирование» относится к перекрыванию одной р-орбитали с другой р-орбиталью через промежуточную сигма-связь. Конъюгирование может происходить в циклических или ациклических соединениях. «Степень конъюгирования» относится к перекрыванию по меньшей мере одной р-орбитали с другой р-орбиталью через промежуточную сигма-связь. Например, 1,3-бутадиен имеет одну степень конъюгирования, тогда как бензол и другие ароматические соединения обычно имеют несколько степеней конъюгирования. Флуоресцентные и цветные соединения обычно имеют по меньшей мере одну степень конъюгирования.
«Флуоресцентный» относится к молекуле, которая способна поглощать свет определенной частоты и излучать свет другой частоты. Флуоресценция хорошо известна специалистам в данной области техники.
«Цветной» относится к молекуле, которая поглощает свет в цветном спектре (т.е. красном, желтом, синем и тому подобное).
«Линкер» относится к непрерывной цепи по меньшей мере одного атома, такого как углерод, кислород, азот, сера, фосфор и их сочетания, которая соединяет часть молекулы с другой частью этой же самой молекулы или с другой молекулой, фрагментом или твердым носителем (например, микрочастицей). Линкеры могут соединять молекулу с помощью ковалентной связи или других механизмов взаимодействий, таких как образование ионных или водородных связей.
Термин «биомолекула» относится к любому из множества биологических материалов, включая нуклеиновые кислоты, углеводы, аминокислоты, полипептиды, гликопротеины, гормоны, аптамеры и их смеси. Более конкретно, этот термин включает, без ограничения, РНК, ДНК, олигонуклеотиды, модифицированные или дериватизированные нуклеотиды, ферменты, рецепторы, прионы, лиганды рецепторов (включая гормоны), антитела, антигены и токсины, а также бактерии, вирусы, клетки крови и клетки тканей. Визуально детектируемые биомолекулы по изобретению (например, соединения структуры (I), имеющие связанную с ними биомолекулу) получают, как описано далее, путем контактирования биомолекулы с соединением, имеющим реакционноспособную группу, которая позволяет присоединять биомолекулу к соединению через любой доступный атом или функциональную группу, такую как, амино, гидрокси, карбоксильная или сульфгидрильная группа на биомолекуле.
«Реакционноспособная группа» представляет собой фрагмент, способный реагировать со вторыми реакционноспособными группами (например, «комплементарной реакционноспособной группой») с образованием одной или более ковалентных связей, например, путем реакции замещения, окисления, восстановления, присоединения или циклоприсоединения. Приводимые в качестве примера реакционноспособные группы приводятся в таблице 1, и включают, например, нуклеофилы, электрофилы, диены, диенофилы, альдегид, оксим, гидразон, алкин, амин, азид, ацилазид, ацилгалогенид, нитрил, нитрон, сульфгидрил, дисульфид, сульфонилгалогенид, изотиоцианат, сложный имидоэфир, активированный сложный эфир, кетон, α,β-ненасыщенный карбонил, алкен, малеимид, α-галогенимид, эпоксид, азиридин, тетразин, тетразол, фосфин, биотин, тииран и тому подобное.
-1
-1
Термины «видимый» и «визуально детектируемый» используются в настоящем документе для обозначения веществ, которые можно наблюдать при визуальном исследовании, без предшествующего облучения или химической или ферментативной активации. Такие визуально детектируемые вещества поглощают и излучают свет в области спектра в диапазоне от примерно 300 нм до примерно 900 нм. Предпочтительно такие вещества интенсивно окрашены, предпочтительно имеют молярный коэффициент экстинкции по меньшей мере примерно 40000, более предпочтительно по меньшей мере примерно 50000, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 60000, даже еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 70000, и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 80000 Мсм. Соединения по изобретению могут быть детектированы путем наблюдения невооруженным глазом или с помощью оптического детектирующего устройства, включая, без ограничения, абсорбционные спектрофотометры, просвечивающие микроскопы, цифровые камеры и сканеры. Визуально детектируемые вещества не ограничиваются веществами, которые излучают и/или поглощают свет в видимом спектре. Вещества, которые излучают и/или поглощают свет в ультрафиолетовой (УФ) области (от примерно 10 нм до примерно 400 нм), инфракрасной (ИК) области (от примерно 700 нм до примерно 1 мм), и вещества, излучающие и/или поглощающие в других областях электромагнитного спектра, также входят в объем термина «визуально детектируемые» вещества.
Для целей вариантов осуществления изобретения термин «фотостабильный видимый краситель» относится к химическому фрагменту, который является визуально детектируемым, как определено выше, и не подвергается существенному изменению или разложению под воздействием света. Предпочтительно, фотостабильный видимый краситель не проявляет существенного обесцвечивания или разложения после воздействия света в течение, по меньшей мере, одного часа. Более предпочтительно, видимый краситель стабилен после воздействия света в течение по меньшей мере 12 ч, еще более предпочтительно по меньшей мере 24 ч, еще более предпочтительно по меньшей мере одной недели и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, одного месяца. Неограничивающие примеры фотостабильных видимых красителей, подходящих для использования в соединениях и способах изобретения, включают азокрасители, тиоиндиговые красители, хинакридоновые пигменты, диоксазин, фталоцианин, перинон, дикетопирролопиррол, хинофталон и триарилкарбоний.
Используемый в настоящем документе термин «производное перилена» подразумевает включение любого замещенного перилена, который является визуально детектируемым. Однако этот термин не предполагает включения самого перилена. Термины «производное антрацена», «производное нафталина» и «производное пирена» используются аналогично. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления производное (например, производное перилена, пирена, антрацена или нафталина) представляет собой имидное, бисимидное или гидразаимидное производное перилена, антрацена, нафталина или пирена.
Визуально детектируемые молекулы различных вариантов осуществления изобретения подходят для широкого спектра аналитических применений, таких как биохимические и биомедицинские применения, в которых необходимо определить присутствие, локализацию или количество конкретного аналита (например, биомолекулы). В связи с этим, в другом аспекте изобретение предлагает способ визуальной детекции биомолекулы, включающий: (а) обеспечение биологической системы с визуально детектируемой биомолекулой, содержащей соединение структуры (I), связанное с биомолекулой; и (b) детектирование биомолекулы по ее видимым свойствам. Для целей изобретения фраза «детектирование биомолекулы по ее видимым свойствам» означает, что биомолекула, без облучения или химической или ферментативной активации, наблюдается невооруженным глазом, или с помощью оптического детектирующего устройства, включая, без ограничения, абсорбционные спектрофотометры, просвечивающие микроскопы, цифровые камеры и сканеры. Денситометр может использоваться для количественной оценки присутствующей визуально детектируемой биомолекулы. Например, относительное количество биомолекулы в двух образцах можно определить путем измерения относительной оптической плотности. Если известна стехиометрия молекул красителя на одну биомолекулу и известен коэффициент экстинкции молекулы красителя, тогда абсолютная концентрация биомолекулы также может быть определена по измерению оптической плотности. Используемый в настоящем документе термин «биологическая система» используется для обозначения любого раствора или смеси, содержащих одну или несколько биомолекул в дополнение к визуально детектируемой биомолекуле. Неограничивающие примеры таких биологических систем включают клетки, клеточные экстракты, образцы тканей, электрофоретические гели, смеси для анализа и реакционные смеси для гибридизации.
«Твердый носитель» относится к любому твердому субстрату, известному в данной области техники для твердофазного носителя молекул, например, «микрочастица» относится к любому из ряда мелких частиц, пригодных для присоединения к соединениям изобретения, включая, без ограничения, стеклянные гранулы, магнитные гранулы, полимерные гранулы, неполимерные гранулы и тому подобное. В некоторых вариантах осуществления изобретения микрочастицы включают полистирольные гранулы.
«Фрагмент спаривания оснований» относится к гетероциклическому фрагменту, способному к гибридизации с комплементарным гетероциклическим фрагментом посредством водородных связей (например, спаривание оснований по Уотсону-Крику). Фрагменты спаривания оснований включают основания природного и не природного происхождения. Неограничивающие примеры фрагментов спаривания оснований представляют собой основания РНК и ДНК, такие как аденозин, гуанозин, тимидин, цитозин и уридин, и их аналоги.
2
3
11
13
14
13
15
15
17
18
31
32
35
18
36
123
125
Также подразумевается, что варианты осуществления изобретения, описанные в настоящем документе, охватывают все соединения структуры (I) или (II), которые являются изотопно-меченными путем замещения одного или более атомов на атом, имеющий другую атомную массу или массовое число. Примеры изотопов, которые могут быть включены в описанные соединения, включают изотопы водорода, углерода, азота, кислорода, фосфора, фтора, хлора и йода, такие как H, H, C,C, C, N,N, O, O, O, P, P, S, F, Cl, I и I, соответственно.
Изотопно-меченные соединения структуры (I), (II) обычно могут быть получены традиционными методами, известными специалистам в данной области техники, или способами, аналогичными описанным ниже способам, и в следующих примерах с использованием соответствующего изотопно-меченного реагента вместо немеченного реагента, применявшегося ранее.
«Стабильное соединение» и «стабильная структура» означают соединение, которое является достаточно прочным, чтобы выдерживать выделение из реакционной смеси до пригодной к использованию степени чистоты и для включения в эффективный терапевтический препарат.
«Необязательный» или «необязательно» означает, что описываемое далее событие или обстоятельства могут происходить или могут и не происходить, и что описание включает примеры, где указанное событие или обстоятельство происходит, и примеры, где оно не происходит. Например, «необязательно замещенный алкил» означает, что алкильная группа может быть или может и не быть замещена, и что описание включает в себя как замещенные алкильные группы, так и алкильные группы, не имеющие замещения.
«Соль» включает как кислотно-, так и основно-аддитивные соли.
«Кислотно-аддитивная соль» относится к таким солям, которые образованы с неорганическими кислотами, такими как, без ограничения, соляная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота и тому подобное; и органическими кислотами, такими как, без ограничения, уксусная кислота, 2,2-дихлоруксусная кислота, адипиновая кислота, альгиновая кислота, аскорбиновая кислота, аспарагиновая кислота, бензолсульфоновая кислота, бензойная кислота, 4-ацетамидобензойная кислота, камфорная кислота, камфоро-10-сульфоновая кислота, каприновая кислота, капроновая кислота, каприловая кислота, угольная кислота, коричная кислота, лимонная кислота, цикламовая кислота, додецилсерная кислота, этан-1,2-дисульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, 2-гидроксиэтансульфоновая кислота, муравьиная кислота, фумаровая кислота, галактаровая кислота, гентизиновая кислота, глюкогептоновая кислота, глюконовая кислота, глюкуроновая кислота, глутаминовая кислота, глутаровая кислота, 2-оксоглутаровая кислота, глицерофосфорная кислота, гликолевая кислота, гиппуровая кислота, изомасляная кислота, молочная кислота, лактобионовая кислота, лауриновая кислота, малеиновая кислота, яблочная кислота, малоновая кислота, миндальная кислота, метансульфоновая кислота, муциновая кислота, нафталин-1,5-дисульфоновая кислота, нафталин-2-сульфоновая кислота, 1-гидрокси-2-нафтойная кислота, никотиновая кислота, олеиновая кислота, оротовая кислота, щавелевая кислота, пальмитиновая кислота, памовая кислота, пропионовая кислота, пироглутаминовая кислота, пировиноградная кислота, салициловая кислота, 4-аминосалициловая кислота, себациновая кислота, стеариновая кислота, янтарная кислота, винная кислота, тиоциановая кислота, п-толуолсульфоновая кислота, трифторуксусная кислота, ундециленовая кислота, и тому подобное.
N
«Основно-аддитивная соль» относится к солям, которые получены добавлением неорганического основания или органического основания к свободной кислоте. Соли, полученные из неорганических оснований, включают, без ограничения, соли натрия, калия, лития, аммония, кальция, магния, железа, цинка, меди, марганца, алюминия, и тому подобные. Соли, полученные из органических оснований, включают, без ограничения, соли первичных, вторичных и третичных аминов, замещенных аминов, в том числе природных замещенных аминов, циклических аминов и основных ионообменных смол, таких как аммиак, изопропиламин, триметиламин, диэтиламин, триэтиламин, трипропиламин, диэтаноламин, этаноламин, динол, 2-диметиламиноэтанол, 2-диэтиламиноэтанол, дициклогексиламин, лизин, аргинин, гистидин, кофеин, прокаин, гидрабамин, холин, бетаин, бенетамин, бензатин, этилендиамин, глюкозамин, метилглюкамин, теобромин, триэтаноламин, трометамин, пурины, пиперазин, пиперидин, -этилпиперидин, полиаминные смолы, и тому подобное. Особенно предпочтительными органическими основаниями являются изопропиламин, диэтиламин, этаноламин, триметиламин, дициклогексиламин, холин и кофеин.
Кристаллизация может приводить к получению сольватов соединений, описанных в настоящей заявке. Варианты осуществления настоящего изобретения включают все сольваты описанных соединений. Используемый в настоящем документе термин «сольват» относится к комплексу, который содержит одну или несколько молекул соединения по изобретению вместе с одной или несколькими молекулами растворителя. Растворителем может быть вода, и в этом случае сольват может представлять собой гидрат. В качестве альтернативы, растворителем может быть органический растворитель. Таким образом, соединения настоящего изобретения могут существовать в виде гидрата, включая моногидрат, дигидрат, полугидрат, полуторагидрат, тригидрат, тетрагидрат и тому подобное, а также в виде соответствующих сольватированных форм. Соединения по изобретению могут быть истинными сольватами, тогда как в других случаях соединения по изобретению могут просто сохранять дополнительную воду или другой растворитель, или быть смесью воды и некоторого количества дополнительного растворителя.
R
S
R
S
Варианты осуществления соединений по изобретению (например, соединений структуры I или II) или их солей, таутомеров или сольватов могут включать один или несколько асимметричных центров и могут, таким образом, образовывать энантиомеры, диастереомеры и другие стереоизомерные формы, которые могут быть определены в терминах абсолютной стереохимии как ()- или ()-, или как (D)- или (L)- для аминокислот. Варианты осуществления настоящего изобретения предполагают включение всех таких возможных изомеров, а также их рацемических и оптически чистых форм. Оптически активные (+) и (-), ()- и ()-, или (D)- и (L)-изомеры могут быть получены с использованием хиральных синтонов или хиральных реагентов, или выделены с помощью традиционных методов, например, хроматографии и фракционной кристаллизации. Традиционные методы получения/выделения отдельных энантиомеров включают хиральный синтез из подходящего оптически чистого предшественника или разделение рацемата (или рацемата соли или производного) используя, например, хиральную жидкостную хроматографию высокого давления (HPLC, ВЭЖХ). Когда описанные здесь соединения содержат олефиновые двойные связи или другие центры геометрической асимметрии, и если не указано иное, подразумевается, что соединения включают как Е, так и Z геометрические изомеры. Аналогичным образом, также подразумевается, что должны быть включены все таутомерные формы.
«Стереоизомер» относится к соединению, состоящему из тех же атомов, связанных такими же связями, но имеющему другие трехмерные структуры, которые не являются взаимозаменяемыми. Настоящее изобретение предусматривает разные стереоизомеры и их смеси и включает «энантиомеры», что относится к двум стереоизомерам, молекулы которых являются несовместимыми при наложении зеркальными изображениями друг друга.
«Таутомер» относится к протонному сдвигу от одного атома молекулы к другому атому этой же самой молекулы. Настоящее изобретение включает таутомеры любых указанных соединений. Различные таутомерные формы соединений могут быть легко получены специалистами в данной области.
Используемые здесь химические названия и структурные схемы являются модифицированной формой номенклатурной системы IUPAC, полученными при помощи программного обеспечения ACD/Name Version 9.07 и/или программы присваивания названий ChemDraw Ultra Version 11.0 (CambridgeSoft). Также используются общепринятые названия, известные специалистам в данной области техники.
Как отмечалось выше, в одном варианте осуществления настоящего изобретения предложены соединения, подходящие в качестве флуоресцентных и/или цветных красителей в различных аналитических методах. В других вариантах осуществления предложены соединения, подходящие в качестве синтетических интермедиатов для получения соединений, используемых в качестве флуоресцентных и/или цветных красителей. В общих чертах варианты осуществления настоящего изобретения относятся к димерам и более высокомолекулярным полимерам флуоресцентных и/или цветных фрагментов. Флуоресцентные и/или цветные фрагменты связаны фосфорсодержащей связью. Не желая быть связанными теорией, полагают, что линкер способствует сохранению достаточного пространственного расстояния между флуоресцентными и/или цветными фрагментами, благодаря чему внутримолекулярное тушение уменьшается и/или полностью исчезает, что приводит к образованию соединения красителя, имеющего высокую молярную «яркость» (например, высокую флуоресцентную эмиссию).
Соответственно, в некоторых вариантах осуществления соединения имеют следующую структуру (А):
(A)
1
2
3
1
2
3
где L представляет собой фосфорсодержащую связь, достаточную для поддержания пространственного разделения между одной или более (например, каждой) М-группой, благодаря чему внутримолекулярное тушение уменьшается или полностью исчезает, и R, R, R, L, L, L и n являются такими, как определено для структуры (I).
В других вариантах осуществления предложено соединение, имеющее следующую структуру (I):
(I)
или его стереоизомер, соль или таутомер, где:
M в каждом случае независимо представляет собой фрагмент, имеющий две или более двойные углерод-углеродные связи и по меньшей мере одну степень конъюгирования;
1
L в каждом случае независимо представляет собой линкер, содержащий функциональную группу, способную к образованию путем реакции двух комплементарных реакционноспособных групп;
2
3
L и L в каждом случае независимо представляют собой необязательный алкиленовый, алкениленовый, алкиниленовый, гетероалкиленовый, гетероалкениленовый, гетероалкиниленовый или гетероатомный линкер;
4
L в каждом случае независимо представляет собой алкиленовый, алкениленовый, алкиниленовый, гетероалкиленовый, гетероалкениленовый или гетероалкиниленовый линкер;
1
R в каждом случае независимо представляет собой H, алкил или алкокси;
2
3
-
-
-
-
a
b
c
a
b
d
d
c
d
d
d
каждый из R и R независимо представляет собой H, OH, SH, алкил, алкокси, простой алкилэфир, -OP(=R)(R)R, Q, линкер, содержащий ковалентную связь с Q, линкер, содержащий ковалентную связь с молекулой аналита, линкер, содержащий ковалентную связь с твердым носителем, или линкер, содержащий ковалентную связь с другим соединением структуры (I), где: R представляет собой O или S; R представляет собой OH, SH, O, S, OR или SR; R представляет собой OH, SH, O, S, OR, SR, алкил, алкокси, простой алкилэфир, простой алкоксиалкилэфир, фосфат, тиофосфат, фосфоалкил, тиофосфоалкил, простой фосфоалкилэфир или простой тиофосфоалкилэфир; и R представляет собой противоион;
4
-
-
d
d
R в каждом случае независимо представляет собой OH, SH, O, S, OR или SR;
5
R в каждом случае независимо представляет собой оксо, тиоксо или отсутствует;
Q в каждом случае независимо представляет собой фрагмент, содержащий реакционноспособную группу, способную образовывать ковалентную связь с молекулой аналита, твердым носителем или комплементарной реакционноспособной группой Q';
m в каждом случае независимо представляет собой целое число, равное нулю или большее; и
n является целым числом, равным единице или большим.
В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере в одном случае, m представляет собой целое число, равное единице или большее. В других вариантах осуществления, по меньшей мере в одном случае, m представляет собой целое число, равное двум или большее. В еще одних вариантах осуществления, по меньшей мере в одном случае, m представляет собой целое число, равное трем или большее. В еще одних вариантах осуществления, по меньшей мере в одном случае, m представляет собой целое число, равное четырем или большее. В еще одних вариантах осуществления, по меньшей мере в одном случае, m представляет собой целое число, равное пяти или большее.
1
2
3
c
1
2
3
4
Различные линкеры и заместители (например, M, Q, R, R, R, R L, L, L и L) в соединении структуры (I) необязательно замещены еще одним заместителем. Например, в некоторых вариантах осуществления необязательный заместитель выбирают, чтобы оптимизировать растворимость в воде или другое свойство соединения структуры (I). В некоторых вариантах осуществления, каждый алкил, алкокси, простой алкилэфир, простой алкоксиалкилэфир, фосфоалкил, тиофосфоалкил, простой фосфоалкилэфир и простой тиофосфоалкилэфир в соединении структуры (I) необязательно замещен еще одним заместителем, выбранным из группы, состоящей из гидроксила, алкокси, простого алкилэфира, простого алкоксиалкилэфира, сульфгидрила, амино, алкиламино, карбоксила, фосфата, тиофосфата, фосфоалкила, тиофосфоалкила, простого фосфоалкилэфира и простого тиофосфоалкилэфира.
1
1
Линкер L может использоваться в качестве места присоединения фрагмента M к остальной части соединения. Например, в некоторых вариантах осуществления получают синтетический предшественник соединения структуры (I), и фрагмент М присоединяют к синтетическому предшественнику с использованием любого числа простых способов, известных в данной области техники, например, способов, называемых «клик-химия» («click-chemistry»). C этой целью может быть использована любая реакция, которая является быстрой и по существу необратимой, для присоединения М к синтетическому предшественнику с образованием соединения структуры (I). Приводимые в качестве примера реакции включают катализируемую медью реакцию азида и алкина с образованием триазола (реакция Хьюсгена 1,3-диполярного циклоприсоединения), реакцию диена и диенофила (Дильса-Альдера), нитрон-алкиновое циклоприсоединение, облегченное напряжением, реакцию напряженного алкена с азидом, тетразином или тетразолом, [3+2]-циклоприсоединение алкена и азида, реакцию Дильса-Альдера алкена и тетразина с обратными электронными требованиями, фотореакцию алкена и тетразола и различные реакции замещения, такие как замещение удаляемой группы путем нуклеофильной атаки на электрофильный атом. В некоторых вариантах осуществления реакция с образованием L может осуществляться в водной среде.
1
1
Соответственно, в некоторых вариантах осуществления L представляет собой функциональную группу, которая является продуктом одной из приведенных выше «клик-реакций». В разных вариантах осуществления, для по меньшей мере одного случая L, функциональная группа может быть образована путем реакции функциональной группы, представляющей собой альдегид, оксим, гидразон, алкин, амин, азид, ацилазид, ацилгалогенид, нитрил, нитрон, сульфгидрил, дисульфид, сульфонилгалогенид, изотиоцианат, сложный имидоэфир, активированный сложный эфир, кетон, α,β-ненасыщенный карбонил, алкен, малеимид, α-галогенимид, эпоксид, азиридин, тетразин, тетразол, фосфин, биотин или тииран, с комплементарной реакционноспособной группой.
1
В других вариантах осуществления, для по меньшей мере одного случая L, функциональная группа может быть образована реакцией алкина и азида.
1
1
1
В дополнительных вариантах осуществления, для по меньшей мере одного случая L, функциональная группа включает алкеновую, сложноэфирную, амидную, группу сложного тиоэфира, дисульфидную, карбоциклическую, гетероциклическую или гетероарильную группу. В некоторых более специфичных вариантах осуществления, для по меньшей мере одного случая L, L представляет собой линкер, содержащий триазолильную функциональную группу.
1
1
В еще одних вариантах осуществления, для по меньшей мере одного случая L, L-M имеет следующую структуру:
1a
1b
где каждый из L и L независимо представляет собой необязательный линкер.
1
1
В других вариантах осуществления, для по меньшей мере одного случая L, L-M имеет следующую структуру:
1a
1b
где каждый из L и L независимо представляет собой необязательный линкер.
Соответственно, в некоторых вариантах осуществления соединение имеет следующую структуру (IA):
(IA)
где:
1a
1b
L и L в каждом случае независимо представляют собой необязательные линкеры; и
1
2
3
4
x, x, x и x в каждом случае независимо представляют собой целое число от 0 до 6.
В различных вариантах осуществления соединение имеет следующую структуру (IB):
(IB)
где:
1a
1b
L и L в каждом случае независимо представляют собой необязательные линкеры; и
1
2
3
4
x, x, x и x в каждом случае независимо представляют собой целое число от 0 до 6.
1a
1b
1a
1b
В изложенных выше различных вариантах осуществления, L или L, или оба из них отсутствуют. В других вариантах осуществления, L или L, или оба из них присутствуют.
1a
1b
1a
1b
В некоторых вариантах осуществления каждый из L и L, если присутствуют, независимо представляют собой алкилен или гетероалкилен. Например, в некоторых вариантах осуществления, L и L, если присутствуют, независимо имеют одну из следующих структур:
;  или .
2
3
4
4
1
6
2
6
2
6
1
6
2
6
2
6
В дополнительных вариантах осуществления, L, L и L в каждом случае независимо представляют собой C-C алкилен, C-C алкенилен или C-C алкинилен. В других вариантах осуществления L в каждом случае независимо представляет собой C-C алкилен, C-C алкенилен или C-C алкинилен. Например, в некоторых вариантах осуществления соединение имеет следующую структуру (IС):
(IC)
где:
1
2
3
4
x, x, x и x в каждом случае независимо представляют собой целое число от 0 до 6; и
y в каждом случае независимо представляет собой целое число от 1 до 6.
1
В некоторых вариантах осуществления структуры (IC), L в каждом случае независимо содержит триазолильную функциональную группу. В других вариантах осуществления (IС) y равно 2 для каждого целочисленного значения m.
3
4
1
2
5
6
2
4
3
В некоторых вариантах осуществления соединения структуры (IC), x и x равны 2 в каждом случае. В других вариантах осуществления каждый из x, x, x и xравен 1 в каждом случае. В других вариантах осуществления каждый из x и x равен 0, и x равен 1.
4
-
-
-
d
d
d
В еще одних вариантах осуществления любого из приведенных выше соединений структуры (I), R в каждом случае независимо представляет собой OH, O или OR. Следует отметить, что «OR» и «SR» используются для обозначения O и S, ассоциированных с катионом. Например, фосфатная группа динатриевой соли может быть представлена как:
,
d
+
где R является натрием (Na).
5
В других вариантах осуществления любого из соединений структуры (I), R в каждом случае представляет собой оксо.
В еще одних вариантах осуществления соединение имеет одну из следующих структур (ID) или (IE):
или
(ID)
.
(IE)
1
В некоторых специфичных вариантах осуществления (ID) и (IE), L в каждом случае независимо содержит триазолильную функциональную группу.
1
В некоторых других вариантах осуществления любого из перечисленных выше соединений, R представляет собой Н.
2
3
2
3
2
3
a
b
c
a
b
c
В других различных вариантах осуществления каждый из R и Rнезависимо представляет собой OH или -OP(=R)(R)R. В некоторых других вариантах осуществления R или R представляет собой OH или -OP(=R)(R)R, и другой из R или R представляет собой Q или линкер, содержащий ковалентную связь с Q.
2
3
В еще одних вариантах осуществления Q в каждом случае независимо представляет собой фрагмент, содержащий реакционноспособную группу, способную образовывать ковалентную связь с молекулой аналита или твердым носителем. В других вариантах осуществления Q в каждом случае независимо представляет собой фрагмент, содержащий реакционноспособную группу, способную образовывать ковалентную связь с комплементарной реакционноспособной группой Q'. Например, в некоторых вариантах осуществления Q' присутствует в другом соединении структуры (I) (например, в положении R или R), и Q и Q' содержат комплементарные реакционноспособные группы, благодаря чему реакция соединения структуры (I) и другого соединения структуры (I) приводит к ковалентно связанному димеру соединения структуры (I). Мультимерные соединения структуры (I) также могут быть получены аналогичным образом и включены в объем вариантов осуществления изобретения.
Тип Q-группы и возможность присоединения Q-группы к остальной части соединения структуры (I) не имеет ограничений, при условии, что Q содержит фрагмент, имеющий соответствующую реакционную способность для образования желаемой связи.
В некоторых вариантах осуществления Q представляет собой фрагмент, который не подвержен гидролизу в водных условиях, но является достаточно реакционноспособным для образования связи с соответствующей группой на молекуле аналита или твердом носителе (например, амина, азида или алкина).
Некоторые варианты осуществления соединений структуры (I) включают Q-группы, обычно используемые в области биоконъюгирования. Например, в некоторых вариантах осуществления Q содержит нуклеофильную реакционноспособную группу, электрофильную реакционноспособную группу или реакционноспособную группу циклоприсоединения. В некоторых более специфичных вариантах осуществления Q содержит сульфгидрильную, дисульфидную, активированную сложноэфирную, изотиоцианатную, азидную, алкиновую, алкеновую, диеновую, диенофильную, галогенангидридную, сульфонилгалогенидную, фосфиновую, α-галогенамидную, биотиновую, амино или малеимидную функциональную группу. В некоторых вариантах осуществления, активированный сложный эфир представляет собой N-сукцинимидный сложный эфир, сложный имидоэфир или сложный полифторфенильный эфир. В других вариантах осуществления алкин представляет собой алкилазид или ацилазид.
Приводимые в качестве примера Q-фрагменты представлены в таблице I ниже.
Таблица 1. Примеры Q-фрагментов
Структура
Класс
<img file="00000016.jpg" he="9" wi="12" img-content="undefined" img-format="jpg" />
сульфгидрил
<img file="00000017.jpg" he="9" wi="26" img-content="undefined" img-format="jpg" />
изотиоцианат
<img file="00000018.jpg" he="16" wi="21" img-content="undefined" img-format="jpg" />
сложный имидоэфир
<img file="00000019.jpg" he="23" wi="30" img-content="undefined" img-format="jpg" />
ацилазид
<img file="00000020.jpg" he="34" wi="41" img-content="undefined" img-format="jpg" />
активированный сложный эфир
<img file="00000021.jpg" he="34" wi="41" img-content="undefined" img-format="jpg" />
активированный сложный эфир
<img file="00000022.jpg" he="27" wi="47" img-content="undefined" img-format="jpg" />
активированный сложный эфир
<img file="00000023.jpg" he="28" wi="78" img-content="undefined" img-format="jpg" />
активированный сложный эфир
<img file="00000024.jpg" he="27" wi="33" img-content="undefined" img-format="jpg" />
активированный сложный эфир
<img file="00000025.jpg" he="30" wi="38" img-content="undefined" img-format="jpg" />
активированный сложный эфир
<img file="00000026.jpg" he="24" wi="18" img-content="undefined" img-format="jpg" />
сульфонилгалогенид
<img file="00000027.jpg" he="30" wi="20" img-content="undefined" img-format="jpg" />
малеимид
<img file="00000028.jpg" he="32" wi="59" img-content="undefined" img-format="jpg" />
малеимид
<img file="00000029.jpg" he="20" wi="29" img-content="undefined" img-format="jpg" />
α-галогенимид
<img file="00000030.jpg" he="18" wi="35" img-content="undefined" img-format="jpg" />
дисульфид
<img file="00000031.jpg" he="34" wi="47" img-content="undefined" img-format="jpg" />
фосфин
<img file="00000032.jpg" he="9" wi="12" img-content="undefined" img-format="jpg" />
азид
<img file="00000033.jpg" he="9" wi="17" img-content="undefined" img-format="jpg" />
алкин
<img file="00000034.jpg" he="34" wi="23" img-content="undefined" img-format="jpg" />
биотин
<img file="00000035.jpg" he="17" wi="14" img-content="undefined" img-format="jpg" />
диен
<img file="00000036.jpg" he="9" wi="17" img-content="undefined" img-format="jpg" />
алкен/диенофил
<img file="00000037.jpg" he="22" wi="44" img-content="undefined" img-format="jpg" />
алкен/диенофил
-NH<sub>2</sub>
амино
Следует отметить, что в некоторых вариантах осуществления, в которых Q представляет собой SH, SH-фрагмент будет иметь тенденцию образовывать дисульфидные связи с другой сульфгидрильной группой на другом соединении структуры (I). Соответственно, некоторые варианты осуществления включают соединения структуры (I), которые находятся в форме дисульфидных димеров, причем дисульфидная связь получена из SH Q-групп.
2
3
2
3
a
b
c
В некоторых других вариантах осуществления один из R или R представляет собой OH или -OP(=R)(R)R, и другой из R или R представляет собой линкер, содержащий ковалентную связь с молекулой аналита, или линкер, содержащий ковалентную связь с твердым носителем. Например, в некоторых вариантах осуществления молекула аналита представляет собой нуклеиновую кислоту, аминокислоту или ее полимер. В других вариантах осуществления молекула аналита представляет собой фермент, рецептор, лиганд рецептора, антитело, гликопротеин, аптамер или прион. В еще одних вариантах осуществления твердый носитель представляет собой полимерную гранулу или неполимерную гранулу.
Значение m представляет собой другую переменную, которая может быть выбрана на основе желаемой интенсивности флуоресценции и/или цвета. В некоторых вариантах осуществления m в каждом случае независимо представляет собой целое число от 1 до 10, от 3 до 10 или от 7 до 9. В других вариантах осуществления m в каждом случае независимо представляет собой целое число от 1 до 5, например 1, 2, 3, 4 или 5. В других вариантах осуществления m в каждом случае независимо представляет собой целое число от 5 до 10, например, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. В других вариантах осуществления m в каждом случае представляет собой целое число, равное единице или большее. Например, в некоторых вариантах осуществления m в каждом случае представляет собой целое число, равное двум или более, или трем или более.
Интенсивность флуоресценции также можно регулировать путем выбора различных значений n. В некоторых вариантах осуществления n является целым числом от 1 до 100. В других вариантах осуществления n является целым числом от 1 до 10. В некоторых вариантах осуществления n равно 1.
М выбирают на основе желаемых оптических свойств, например, на основе желаемого цвета и/или длины волны флуоресцентного излучения. В некоторых вариантах осуществления М является одинаковым в каждом случае; однако важно отметить, что в каждом случае M не обязательно должно быть тем же самым M, и некоторые варианты осуществления включают соединения, в которых М не является одинаковым в каждом случае. Например, в некоторых вариантах осуществления каждое M не является одинаковым, и различные М-фрагменты выбирают таким образом, чтобы они имели поглощение и/или эмиссию для использования в методах резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET). Например, в таких вариантах осуществления различные М-фрагменты выбираются таким образом, что поглощение излучения на одной длине волны вызывает эмиссию излучения на другой длине волны по механизму FRET. Приводимые в качестве примера M-фрагменты могут быть подходящим образом выбраны специалистом исходя из желаемого конечного использования. Приводимые в качестве примера М-фрагменты для FRET-методов включают красители флуоресцеин и 5-TAMRA (сложный сукцинимидиловый эфир 5-карбокситетраметилродамина).
M может быть присоединен к остальной части молекулы из любого положения (т.е. атома) на M. Специалисту в данной области будет известен способ присоединения M к остальной части молекулы. Примеры способов включают «клик-реакции», описанные в настоящей заявке.

В некоторых вариантах осуществления М представляет собой флуоресцентный или цветной фрагмент. Может использоваться любой флуоресцентный и/или цветной фрагмент, например, известные в области техники и обычно используемые в колориметрических, УФ- и/или флуоресцентных анализах. Примеры M-фрагментов, которые могут использоваться в разных вариантах осуществления изобретения включают, без ограничения: производные ксантена (например, флуоресцеин, родамин, Oregon Green, эозин или Texas Red); производные цианина (например, цианин, индокарбоцианин, оксакарбоцианин, тиакарбоцианин или мероцианин); производные скварена и замещенные в кольце скварены, включая красители Seta, SeTau и Square; и производные нафталина (например, дансилированные и продановые производные); производные кумарина; производные оксадиазола (например, пиридилоксазол, нитробензоксадиазол или бензоксадиазол); производные антрацена (например, антрахиноны, включая DRAQ5, DRAQ7 и CyTRAK Orange); производные пирена, такие как каскадный синий; производные оксазина (например, Nile red, Nile blue, крезиловый фиолетовый, оксазин 170); производные акридина (например, профлавин, акридиновый оранжевый, акридиновый желтый); производные арилметина: аурамин, кристаллический фиолетовый, малахитовый зеленый; и производные тетрапиррола (например, порфин, фталоцианин или билирубин). Другие примеры М-фрагментов включают: цианиновые красители, ксантатные красители (например, Hex, Vic, Nedd, Joe или Tet); Yakima Yellow; красители Redmond Red; Tamra; Texas Red и Alexa Fluor.
В еще одних вариантах осуществления любого из перечисленного выше, M содержит три или более арильных или гетероарильных кольца или их сочетания, например, четыре или более арильных или гетероарильных кольца, или их сочетания, или даже пять или более арильных или гетероарильных колец, или их сочетания. В некоторых вариантах осуществления М содержит шесть арильных или гетероарильных колец или их сочетания. В других вариантах осуществления кольца конденсированы. Например, в некоторых вариантах осуществления М содержит три или более конденсированных кольца, четыре или более конденсированных кольца, пять или более конденсированных колец или даже шесть или более конденсированных колец.
В некоторых вариантах осуществления М является циклическим. Например, в некоторых вариантах осуществления М является карбоциклическим. В другом варианте осуществления М является гетероциклическим. В еще одних приведенных выше вариантах осуществления М в каждом случае независимо содержит арильный фрагмент. В некоторых из этих вариантов осуществления арильный фрагмент является полициклическим. В других более специфичных примерах арильный фрагмент представляет собой конденсированный полициклический арильный фрагмент, например, который может содержать по меньшей мере 3, по меньшей мере 4 или даже более 4 арильных колец.
В других вариантах осуществления любого из приведенных выше соединений структуры (I), M в каждом случае независимо содержит, по меньшей мере, один гетероатом. Например, в некоторых вариантах осуществления гетероатом представляет собой азот, кислород или серу.
В еще одних вариантах осуществления любого из указанного выше, М в каждом случае независимо содержит по меньшей мере один заместитель. Например, в некоторых вариантах осуществления заместитель представляет собой фтор-, хлор-, бром-, йод-, амино, алкиламино, ариламино, гидрокси, сульфгидрильную, алкокси, арилокси, фенильную, арильную, метильную, этильную, пропильную, бутильную, изопропильную, трет-бутильную, карбокси, сульфонатную, амидную или формильную группу.
В некоторых даже еще более специфичных вариантах осуществления приведенного выше, M в каждом случае независимо представляет собой диметиламиностильбеновый, хинакридоновый, фторфенилдиметил-BODIPY-, his-фторфенил-BODIPY-, акридиновый, терриленовый, гексафенильный, порфириновый, бензопиреновый, (фторфенил-диметил-дифторбор-диаза-индацен)фенильный, (бис-фторфенил-дифторбор-диаза-индацен)фенильный, кватерфенильный, бибензотиазольный, тербензотиазольный, бинафтильный, биантрацильный, сквареновый, скварилиевый, 9,10-этинилантраценовый или тернафтильный фрагмент. В других вариантах осуществления M в каждом случае независимо представляет собой п-терфенил, перилен, азобензол, феназин, фенантролин, акридин, тиоксантрен, хризен, рубрен, коронен, цианин, периленимид, или периленамид или их производное.В еще одних вариантах осуществления M в каждом случае независимо представляет собой краситель кумарин, краситель резоруфин, краситель на основе дифторида дипиррометенбора, краситель бипиридил рутения, краситель с переносом энергии, краситель тиазоловый оранжевый, полиметиновый или N-арил-1,8-нафталимидный краситель.
В еще одних вариантах осуществления любого из указанного выше, М в каждом случае является одинаковым. В других вариантах осуществления каждое M является различным. В еще одних вариантах осуществления одно или более М являются одинаковыми, и одно или более М являются различными.
В некоторых вариантах осуществления М представляет собой пирен, перилен, периленмоноимид или 6-FAM, или их производное. В некоторых других вариантах осуществления М имеет одну из следующих структур:
;;;;;  или .
В некоторых специфичных вариантах осуществления соединение структуры (I) представляет собой соединение, выбранное из таблицы 2.
Таблица 2. Примеры соединений структуры I
Наименование
Структура
I-1
<img file="00000045.jpg" he="34" wi="134" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-2
<img file="00000046.jpg" he="34" wi="134" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-3
<img file="00000047.jpg" he="34" wi="134" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-4
<img file="00000048.jpg" he="34" wi="134" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-5
<img file="00000049.jpg" he="34" wi="134" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-6
<img file="00000050.jpg" he="34" wi="134" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-7
<img file="00000051.jpg" he="34" wi="134" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-8
<img file="00000052.jpg" he="34" wi="134" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-9
<img file="00000053.jpg" he="34" wi="134" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-10
<img file="00000054.jpg" he="34" wi="134" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-11
<img file="00000055.jpg" he="34" wi="134" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-12
<img file="00000056.jpg" he="24" wi="133" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-13
<img file="00000057.jpg" he="24" wi="134" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-14
<img file="00000058.jpg" he="46" wi="132" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-15
<img file="00000059.jpg" he="46" wi="132" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-16
<img file="00000060.jpg" he="46" wi="132" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-17
<img file="00000061.jpg" he="46" wi="133" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-18
<img file="00000062.jpg" he="46" wi="132" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-19
<img file="00000063.jpg" he="46" wi="132" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-20
<img file="00000064.jpg" he="46" wi="132" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-21
<img file="00000065.jpg" he="46" wi="133" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-22
<img file="00000066.jpg" he="46" wi="132" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-23
<img file="00000067.jpg" he="34" wi="130" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-24
<img file="00000068.jpg" he="34" wi="130" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-25
<img file="00000069.jpg" he="34" wi="129" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-26
<img file="00000070.jpg" he="34" wi="130" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-27
<img file="00000071.jpg" he="34" wi="129" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-28
<img file="00000072.jpg" he="34" wi="130" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-29
<img file="00000073.jpg" he="34" wi="130" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-30
<img file="00000074.jpg" he="34" wi="130" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-31
<img file="00000075.jpg" he="40" wi="129" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-32
<img file="00000076.jpg" he="40" wi="129" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-33
<img file="00000077.jpg" he="40" wi="129" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-34
<img file="00000078.jpg" he="40" wi="129" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-35
<img file="00000079.jpg" he="34" wi="130" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-36
<img file="00000080.jpg" he="34" wi="130" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-37
<img file="00000081.jpg" he="34" wi="130" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-38
<img file="00000082.jpg" he="34" wi="130" img-content="undefined" img-format="jpg" />
Как используется в таблице 2 и во всей заявке, F, E и Y относятся к флуоресцеиновым, периленовым и пиреновым фрагментам, соответственно, и имеют следующие структуры:
(F);  (Е) и  (Y)
1
1
L в соединениях таблицы 2 является таким, как определено в данном описании для любого соединения структуры (I). В некоторых специфичных вариантах осуществления, L в соединениях таблицы 1 представляет собой фрагмент, содержащий триазолильную группу, причем триазолильная группа образована реакцией алкина и азида.
Описанные здесь соединения красителей являются «регулируемыми», это означает, что при правильном выборе переменных в любом из перечисленных выше соединений, специалист в данной области может получить соединение, имеющее желаемую и/или предварительно заданную молярную флуоресценцию (молярную яркость). Регулируемость соединений позволяет пользователю легко получить соединения, имеющие желаемую флуоресценцию и/или цвет, для использования в конкретном анализе или для идентификации конкретного интересующего аналита. Хотя все переменные могут оказывать влияние на молярную флуоресценцию соединений, считается, что правильный выбор M, m и n играет важную роль в молярной флуоресценции соединений. Соответственно, в одном варианте осуществления предложен способ получения соединения, имеющего желаемую молярную флуоресценцию, причем способ включает выбор М-фрагмента, имеющего известную флуоресценцию, получение соединения структуры (I), содержащего M-фрагмент, и выбор соответствующих переменных для m и n для достижения желаемой молярной флуоресценции.
Молярная флуоресценция в некоторых вариантах осуществления может быть выражена через кратное увеличение или уменьшение по сравнению с флуоресцентной эмиссией исходного флуорофора (например, мономера). В некоторых вариантах осуществления молярная флуоресценция настоящих соединений составляет 1,1×, 1,5×, 2×, 3×, 4×, 5×, 6×, 7×, 8×, 9×, 10× или даже выше относительно исходного флуорофора. Различные варианты осуществления включают получение соединений, имеющих желаемое кратное увеличение во флуоресценции относительно исходного флуорофора путем правильного выбора m и n.
-
2-
3
Для простоты иллюстрации различные соединения, содержащие фосфорные фрагменты (например, фосфат и тому подобное), изображены в анионном состоянии (например, OPO(OH)O, -OPO). Специалисту в данной области будет понятно, что заряд зависит от рН, и незаряженные (например, протонированные или солевые, например, натриевые или другие катионные) формы также включены в объем вариантов осуществления изобретения.
Композиции, содержащие любое из указанных выше соединений и одну или более молекул аналита (например, биомолекул), предложены в различных других вариантах осуществления. В некоторых вариантах осуществления также предусмотрено использование таких композиций в аналитических методах для детектирования одной или более молекул аналита.
2
3
2
3
a
b
c
В еще одних вариантах осуществления соединения могут использоваться в различных аналитических методах. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретение предлагает способ окрашивания образца, причем способ включает добавление к указанному образцу соединения структуры (I), например, где один из R или R представляет собой линкер, содержащий ковалентную связь с молекулой аналита (например, биомолекулой) или микрочастицей, и другой из R или R представляет собой H, OH, алкил, алкокси, простой алкилэфир или -OP(=R)(R)R, в количестве, достаточном для получения оптического отклика, когда указанный образец облучают с соответствующей длиной волны.
2
В некоторых вариантах осуществления приведенных выше способов R представляет собой линкер, содержащий ковалентную связь с молекулой аналита, такой как биомолекула. Например, такой как нуклеиновая кислота, аминокислота или ее полимер (например, полинуклеотид или полипептид). В еще одних вариантах осуществления биомолекула представляет собой фермент, рецептор, лиганд рецептора, антитело, гликопротеин, аптамер или прион.
2
В еще одних вариантах осуществления приведенного выше способа R представляет собой линкер, содержащий ковалентную связь с твердым носителем, таким как микрочастица. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения микрочастица представляет собой полимерную гранулу или неполимерную гранулу.
В еще одних вариантах осуществления указанный оптический отклик представляет собой флуоресцентный отклик.
В других вариантах осуществления указанный образец содержит клетки, и некоторые варианты осуществления также включают наблюдение указанных клеток с помощью проточной цитометрии.
В еще одних вариантах осуществления способ дополнительно включает в себя дифференцирование флуоресцентного отклика от отклика второго флуорофора, имеющего детектируемо отличающиеся оптические свойства.
В других вариантах осуществления изобретение предлагает способ визуальной детекции молекулы аналита, такой как биомолекула, включающий:
2
3
2
3
a
b
c
(a) обеспечение соединения структуры (I), например, в котором один из R или R представляет собой линкер, содержащий ковалентную связь с молекулой аналита, и другой из R или R представляет собой H, OH, алкил, алкокси, простой алкилэфир или -OP(=R)(R)R; и
(b) детектирование соединения по его визуальным свойствам.
В некоторых вариантах осуществления молекула аналита представляет собой нуклеиновую кислоту, аминокислоту или ее полимер (например, полинуклеотид или полипептид). В еще одних вариантах осуществления молекула аналита представляет собой фермент, рецептор, лиганд рецептора, антитело, гликопротеин, аптамер или прион.
В других вариантах осуществления предложен способ визуальной детекции молекулы аналита, такой как биомолекула, причем способ включает в себя:
(а) смешивание любого из указанных выше соединений с одной или несколькими молекулами аналита; и
(b) детектирование соединения по его визуальным свойствам.
В других вариантах осуществления предложен способ визуальной детекции молекулы аналита, причем способ включает в себя:
2
3
(а) смешивание соединения по п.1 формулы изобретения, где R или R представляет собой Q или линкер, содержащий ковалентную связь с Q, с молекулой аналита;
(b) образование конъюгата соединения и молекулы аналита; и
(с) детектирование конъюгата по его визуальным свойствам.
В некоторых других вариантах осуществления соединения структуры (I) могут быть использованы в различных целях для анализа клеток. Например, с помощью проточной цитометрии эти соединения могут использоваться для отделения мертвых клеток от жизнеспособных, оценки здоровья клеток (например, некротическая/ранняя апоптотическая/поздняя апоптотическая/живая клетка), отслеживания плоидности и митоза в течение клеточного цикла и определения различных состояний пролиферации клеток. Не ограничиваясь конкретной теорией, предполагается, что варианты осуществления соединений структуры (I) преимущественно связываются с положительно заряженными фрагментами. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления соединения могут использоваться в способах определения присутствия неинтактных клеток, например, некротических клеток. Например, присутствие некротических клеток можно определить путем смешивания образца, содержащего клетки, с соединением структуры (I), и анализа смеси проточной цитометрией. Соединение структуры (I) связывается с некротическими клетками, и, соответственно, его присутствие обнаруживается в условиях проточной цитометрии. В отличие от других окрашивающих реагентов, требующих, чтобы реакционноспособная аминогруппа связывалась с некротическими клетками, варианты осуществления способов окрашивания с использованием соединений структуры (I) не требуют не содержащего белка инкубационного буфера, и таким образом, данные способы являются более эффективными для осуществления, чем соответствующие известные способы.
В разных других вариантах осуществления, соединения могут быть использованы в родственных способах для определения присутствия положительно заряженных фрагментов в интактных или неинтактных клетках, апоптотических тел, деполяризованных мембран и/или проницаемых мембран.
В дополнение к указанным выше способам, варианты осуществления соединений структуры (I) находят применение в различных дисциплинах и способах, включая, без ограничения: визуализацию в эндоскопических процедурах для идентификации раковых и других тканей; идентификацию некротической ткани путем преимущественного связывания соединений с мертвыми клетками; одноклеточные и/или одномолекулярные аналитические методы, например, детекция полинуклеотидов с малой амплификацией или без нее; визуализацию рака, например, путем конъюгирования соединения структуры (I) с антителом или сахаром, или другим фрагментом, который предпочтительно связывает раковые клетки; визуализацию в хирургических процедурах; связывание гистонов для идентификации различных заболеваний; доставку лекарственного средства, например, путем замены М-фрагмента в соединении структуры (I) активным лекарственным фрагментом; и/или в контрастных веществах при лечении зубов и других процедурах, например, при предпочтительном связывании соединения структуры (I) с различной флорой и/или организмами.
1
2
3
4
5
1
2
3
4
1
2
3
4
5
1
2
3
4
Подразумевается, что любой вариант осуществления соединений структуры (I), как описано выше, и любой конкретный выбор, описанный здесь для переменных R, R, R, R, R, L, L, L, L, M, m и/или n в соединениях структуры (I), как описано выше, может быть независимо объединен с другими вариантами осуществления и/или переменными соединений структуры (I) для получения вариантов осуществления изобретения, не описанных специально выше. Кроме того, в случае, если список вариантов выбора указывается для какой-либо конкретной переменной R, R, R, R, R, L, L, L, L, M, m и/или n в конкретном варианте осуществления и/или пункте формулы изобретения, подразумевается, что каждый индивидуальный выбор может быть исключен из конкретного варианта осуществления и/или пункта формулы изобретения, и что оставшийся список вариантов выбора будет считаться находящимся в пределах объема изобретения.
Подразумевается, что в настоящем описании комбинации заместителей и/или переменных отображенной формулы допустимы только в том случае, если такие комбинации приводят к образованию стабильных соединений.
Protective Groups in Organic Synthesis
Специалистам в данной области также будет понятно, что в описанном здесь способе функциональные группы соединений-интермедиатов могут нуждаться в защите подходящими защитными группами. Такие функциональные группы включают гидрокси, амино, меркапто и карбоновую кислоту. Подходящие защитные группы для гидрокси включают триалкилсилил или диарилалкилсилил (например, трет-бутилдиметилсилил, трет-бутилдифенилсилил или триметилсилил), тетрагидропиранил, бензил и тому подобное. Подходящие защитные группы для амино, амидино и гуанидино включают трет-бутоксикарбонил, бензилоксикарбонил и тому подобное. Подходящие защитные группы для меркапто включают C(O) Rʺ (где Rʺ представляет собой алкил, арил или арилалкил), п-метоксибензил, тритил и тому подобное. Подходящие защитные группы для карбоновой кислоты включают алкиловые, ариловые или аралкиловые сложные эфиры. Защитные группы могут быть добавлены или удалены в соответствии со стандартными методами, которые известны специалистам в данной области техники и описаны в данном документе. Использование защитных групп подробно описано в публикации Green, T.W. и P.G.M. Wutz,  (1999), 3rd Ed., Wiley. Как понятно специалисту в данной области, защитная группа может также представлять собой полимерную смолу, такую как смола Ванга, смола Ринка или 2-хлортритилхлоридная смола.
Кроме того, все соединения по изобретению, которые существуют в форме свободного основания или кислоты, могут быть превращены в их соли путем обработки подходящим неорганическим или органическим основанием или кислотой способами, известными специалисту. Соли соединений по изобретению могут быть превращены в форму их свободного основания или кислоты с помощью стандартных методов.
Следующие ниже схемы реакций иллюстрируют примеры способов получения соединений данного изобретения. Понятно, что специалист в данной области может получить эти соединения аналогичными способами или путем комбинирования других способов, известных специалисту. Предполагается также, что специалист в данной области сможет получить способом, аналогичным описанному ниже, другие соединения структуры (I), конкретно не проиллюстрированные ниже, используя соответствующие исходные компоненты и изменяя по мере необходимости параметры синтеза. Как правило, исходные компоненты могут быть получены из таких источников, как Sigma Aldrich, Lancaster Synthesis, Inc., Maybridge, Matrix Scientific, TCI и Fluorochem USA, и т.д., или синтезированы согласно источникам, известным специалистам в данной области техники (см., например, Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 5th edition (Wiley, December 2000)), или получены, как описано в данном изобретении.
Схема реакции I
1
1
2
3
2
3
a
b
Схема реакции I иллюстрирует пример способа получения интермедиатов, подходящих для получения соединений структуры (I). Как показано на схеме реакции I, где R, L, L, L, G и M являются такими, как определено выше, и R и R являются такими, как определено выше, или являются их защищенными вариантами, соединение структуры , которое может быть приобретено или получено хорошо известными методами, вступает в реакцию с M-G' с образованием соединений структуры . Здесь G и G' представляют собой функциональные группы, имеющие дополнительную реакционную способность (т.е. функциональные группы, которые реагируют с образованием ковалентной связи). G' может быть присоединена к М как боковая группа или может быть частью основной цепи M. G может быть любым числом функциональных групп, описанных в данном документе, таких как алкин, и G' может быть любым числом функциональных групп, таких как, например, азид.
b
с
Соединение структуры (I) может быть получено из структуры  по реакции в хорошо известных условиях автоматизированного синтеза ДНК с фосфорамидитным соединением, имеющим следующую структуру ():
,
c
()
b
b
где L независимо представляет собой необязательный линкер, за которой следует реакция с другим соединением структуры . Мультимерные соединения структуры (I) получают путем реакции желаемого числа соединений структуры последовательно с соответствующим фосфорамидитным реагентом в условиях синтеза ДНК.
d,
В качестве альтернативы, соединения структуры (I) получают сначала путем синтеза димерного или олигомерного соединения, имеющего следующую структуру  при типичных условиях синтеза ДНК:
d
()
1a
2
3
1
2
3
1b
1b
d
где G, L, L, L, R, R, R и n являются такими, как определено в данном описании для соединений структуры (II), и затем проводят реакцию соединения структуры  с M-L-G', где M, L и G' определены здесь для соединений структуры (II) и родственных способов.
2
3
b
d
Способы синтеза ДНК хорошо известны в данной области техники. Вкратце, две спиртовые группы, например R и R в интермедиатах  или  выше, функционализируют с помощью диметокситритильной (DMT) группы и 2-цианоэтил-N,N-диизопропиламинофосфорамидитной группы, соответственно. Фосфорамидитная группа связывается со спиртовой группой, как правило, в присутствии активатора, такого как тетразол, с последующим окислением атома фосфора йодом. Диметокситритильная группа может быть удалена с помощью кислоты (например, хлоруксусной кислоты), оставляя открытым свободный спирт, который может взаимодействовать с фосфорамидитной группой. 2-цианоэтильная группа может быть удалена после олигомеризации путем обработки водным раствором аммиака.
3
2
Получение фосфорамидитов, используемых в способах олигомеризации, также хорошо известно в данной области. Например, первичный спирт (например, R) может быть защищен как DMT-группа по реакции с DMT-Cl. Вторичный спирт (например, R) затем функционализируют в качестве фосфорамидита реакцией с соответствующим реагентом, таким как 2-цианоэтил-N,N-диизопропилхлорофосфорамидит. Способы получения фосфорамидитов и их олигомеризации хорошо известны в данной области и описаны более подробно в примерах.
b
Соединения структуры (I) получают олигомеризацией интермедиата  в соответствии с хорошо известным фосфорамидитным методом химического синтеза, описанным выше. Желаемое число m и n повторяющихся звеньев включается в молекулу путем повторения фосфорамидитного присоединения желаемое число раз. Следует отметить, что соединения структуры (II), описанные ниже, могут быть получены аналогичными способами.
В различных других вариантах осуществления предложены соединения, подходящие для получения соединений структуры (I). Соединения могут быть получены, как описано выше, в форме мономера, димера и/или олигомера, и после этого М-фрагмент ковалентно присоединяется к соединению путем любого числа методик синтеза (например, описанных выше «клик-реакций»), с образованием соединения структуры (I). Соответственно, в различных вариантах осуществления предложено соединение, имеющее следующую структуру (II):
(II)
или его стереоизомер, соль или таутомер, где:
G в каждом случае независимо представляет собой фрагмент, содержащий реакционноспособную группу, способную образовывать ковалентную связь с комплементарной реакционноспособной группой;
1a
2
3
L, L и L в каждом случае независимо представляют собой необязательный алкиленовый, алкениленовый, алкиниленовый, гетероалкиленовый, гетероалкениленовый, гетероалкиниленовый или гетероатомный линкер;
4
L в каждом случае независимо представляет собой алкиленовый, алкениленовый, алкиниленовый, гетероалкиленовый, гетероалкениленовый или гетероалкиниленовый линкер;
1
R в каждом случае независимо представляет собой H, алкил или алкокси;
2
3
-
-
-
-
a
b
c
a
b
d
d
c
d
d
d
каждый из R и R независимо представляет собой H, OH, SH, алкил, алкокси, простой алкилэфир, -OP(=R)(R)R, Q, линкер, содержащий ковалентную связь с Q, линкер, содержащий ковалентную связь с молекулой аналита, линкер, содержащий ковалентную связь с твердым носителем, или линкер, содержащий ковалентную связь с другим соединением структуры (II), где: R представляет собой O или S; R представляет собой OH, SH, O, S, OR или SR; R представляет собой OH, SH, O, S, OR, SR, алкил, алкокси, простой алкилэфир, простой алкоксиалкилэфир, фосфат, тиофосфат, фосфоалкил, тиофосфоалкил, простой фосфоалкилэфир или простой тиофосфоалкилэфир; и R представляет собой противоион;
4
-
-
d
d
R в каждом случае независимо представляет собой OH, SH, O, S, OR или SR;
5
R в каждом случае независимо представляет собой оксо, тиоксо или отсутствует;
Q в каждом случае независимо представляет собой фрагмент, содержащий реакционноспособную группу, способную образовывать ковалентную связь с молекулой аналита, твердым носителем или комплементарной реакционноспособной группой Q';
m в каждом случае независимо представляет собой целое число, равное нулю или большее; и
n является целым числом, равным единице или большим.
В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере в одном случае, m представляет собой целое число, равное единице или большее. В других вариантах осуществления, по меньшей мере в одном случае, m представляет собой целое число, равное двум или большее. В еще одних вариантах осуществления, по меньшей мере в одном случае, m представляет собой целое число, равное трем или большее.
G-фрагмент в соединении структуры (II) может быть выбран из любого фрагмента, содержащего группу, имеющую группу с подходящей реакционной способностью для образования ковалентной связи с комплементарной группой на М-фрагменте. В иллюстративных вариантах осуществления G фрагмент может быть выбран из любого из описанных в данном документе Q-фрагментов, включая конкретные примеры, приведенные в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления G в каждом случае независимо содержит фрагмент, подходящий для реакций, включающих: катализируемую медью реакцию азида и алкина с образованием триазола (реакция Хьюсгена 1,3-диполярного циклоприсоединения), реакцию диена и диенофила (Дильса-Альдера), нитрон-алкиновое циклоприсоединение, облегченное напряжением, реакцию напряженного алкена с азидом, тетразином или тетразолом, [3+2]-циклоприсоединение алкена и азида, реакцию Дильса-Альдера алкена и тетразина с обратными электронными требованиями, фотореакцию алкена и тетразола и различные реакции замещения, такие как замещение удаляемой группы путем нуклеофильной атаки на электрофильный атом.
В некоторых вариантах осуществления G в каждом случае независимо представляет собой фрагмент, содержащий функциональную группу, представляющую собой альдегид, оксим, гидразон, алкин, амин, азид, ацилазид, ацилгалогенид, нитрил, нитрон, сульфгидрил, дисульфид, сульфонилгалогенид, изотиоцианат, сложный имидоэфир, активированный сложный эфир, кетон, α,β-ненасыщенный карбонил, алкен, малеимид, α-галогенимид, эпоксид, азиридин, тетразин, тетразол, фосфин, биотин или тииран.
В других вариантах осуществления G включает в каждом случае независимо алкиновую или азидную группу. В разных вариантах осуществления G в каждом случае независимо включает реакционноспособную группу, способную образовывать функциональную группу, содержащую алкен, сложный эфир, амид, сложный тиоэфир, дисульфид, карбоциклическую, гетероциклическую или гетероарильную группу после реакции с комплементарной реакционноспособной группой. Например, в некоторых вариантах осуществления гетероарил представляет собой триазолил.
В некоторых вариантах осуществления соединение имеет следующую структуру (IIA):
(IIA)
где:
1a
1b
L и L в каждом случае независимо представляют собой необязательные линкеры; и
1
2
3
4
x, x, x и x в каждом случае независимо представляют собой целое число от 0 до 6.
1a
1a
1a
1a
В некоторых специфичных вариантах осуществления (II) и (IIа), каждый L отсутствует. В других вариантах осуществления каждый L присутствует. Например, в некоторых вариантах осуществления L в каждом случае независимо представляет собой гетероалкилен. В других вариантах осуществления L имеет следующую структуру:
.
2
3
4
4
1
6
2
6
2
6
1
6
2
6
2
6
В разных других вариантах осуществления соединения структуры (II), L, L, L в каждом случае независимо представляют собой C-C алкилен, C-C алкенилен или C-C алкинилен. В некоторых других вариантах осуществления, L в каждом случае независимо представляет собой C-C алкилен, C-C алкенилен или C-C алкинилен.
В других вариантах осуществления соединение имеет следующую структуру (IIВ):
(IIB)
где:
1
2
3
4
x, x, x и x в каждом случае независимо представляют собой целое число от 0 до 6; и
y является целым числом от 1 до 6.
В любом другом из приведенных выше вариантов осуществления соединения (II) G в каждом случае независимо представляет собой  или .
3
4
1
2
5
6
В разных вариантах осуществления соединения структуры (IIа), x и x равны 2 в каждом случае. В других вариантах осуществления каждый из x, x, x и xравен 1 в каждом случае. В других вариантах осуществления, y равно 2 для каждого целочисленного значения m.
4
-
5
d
В других вариантах осуществления, R в каждом случае независимо представляет собой OH, O или OR, и в других вариантах осуществления R представляет собой в каждом случае оксо.
В некоторых других вариантах осуществления соединение имеет одну из следующих структур (ID) или (IE):
или
(IID)
.
(IIE)
В некоторых вариантах осуществления любого из приведенных выше соединений структуры (II) G в каждом случае независимо представляет собой  или .
1
В некоторых других вариантах осуществления любого из перечисленных выше соединений структуры (II), R представляет собой H.
2
3
2
3
2
3
a
b
c
a
b
c
В других различных вариантах осуществления соединений структуры (II), каждый из R и Rнезависимо представляет собой OH или -OP(=R)(R)R. В некоторых других вариантах осуществления R или R представляет собой OH или -OP(=R)(R)R, и другой из R или R представляет собой Q или линкер, содержащий ковалентную связь с Q.
2
3
В еще одних вариантах осуществления соединений структуры (II) Q в каждом случае независимо представляет собой фрагмент, содержащий реакционноспособную группу, способную образовывать ковалентную связь с молекулой аналита или твердым носителем. В других вариантах осуществления Q в каждом случае независимо представляет собой фрагмент, содержащий реакционноспособную группу, способную образовывать ковалентную связь с комплементарной реакционноспособной группой Q'. Например, в некоторых вариантах осуществления Q' присутствует в другом соединении структуры (II) (например, в положении R или R), и Q и Q' содержат комплементарные реакционноспособные группы, благодаря чему реакция соединения структуры (II) и другого соединения структуры (II) приводит к ковалентно связанному димеру соединения структуры (II). Мультимерные соединения структуры (II) также могут быть получены аналогичным образом и включены в объем вариантов осуществления изобретения.
Тип Q-группы и возможность присоединения Q-группы к остальной части соединения структуры (II) не имеет ограничений, при условии, что Q содержит фрагмент, имеющий соответствующую реакционную способность для образования желаемой связи.
В некоторых вариантах осуществления соединений структуры (II), Q представляет собой фрагмент, который не подвержен гидролизу в водных условиях, но является достаточно реакционноспособным для образования связи с соответствующей группой на молекуле аналита или твердом носителе (например, амина, азида или алкина).
Некоторые варианты осуществления соединений структуры (II) включают Q-группы, обычно используемые в области биоконъюгирования. Например, в некоторых вариантах осуществления Q содержит нуклеофильную реакционноспособную группу, электрофильную реакционноспособную группу или реакционноспособную группу циклоприсоединения. В некоторых более специфичных вариантах осуществления Q содержит сульфгидрильную, дисульфидную, активированную сложноэфирную, изотиоцианатную, азидную, алкиновую, алкеновую, диеновую, диенофильную, галогенангидридную, сульфонилгалогенидную, фосфиновую, α-галогенамидную, биотиновую, амино или малеимидную функциональную группу. В некоторых вариантах осуществления, активированный сложный эфир представляет собой N-сукцинимидный сложный эфир, сложный имидоэфир или сложный полифторфенильный эфир. В других вариантах осуществления алкин представляет собой алкилазид или ацилазид.
Приводимые в качестве примера Q-фрагменты для соединений структуры (II) приведены в таблице I выше.
Как и в случае соединений структуры (I), в некоторых вариантах осуществления соединений структуры (II), где Q представляет собой SH, SH-фрагмент будет иметь тенденцию образовывать дисульфидные связи с другой сульфгидрильной группой на другом соединении структуры (II). Соответственно, некоторые варианты осуществления включают соединения структуры (II), которые находятся в форме дисульфидных димеров, причем дисульфидная связь получена из SH Q-групп.
2
3
2
3
a
b
c
В некоторых других вариантах осуществления соединений структуры (II) один из R или R представляет собой OH или -OP(=R)(R)R, и другой из R или R представляет собой линкер, содержащий ковалентную связь с молекулой аналита, или линкер, содержащий ковалентную связь с твердым носителем. Например, в некоторых вариантах осуществления молекула аналита представляет собой нуклеиновую кислоту, аминокислоту или ее полимер. В других вариантах осуществления молекула аналита представляет собой фермент, рецептор, лиганд рецептора, антитело, гликопротеин, аптамер или прион. В еще одних вариантах осуществления твердый носитель представляет собой полимерную гранулу или неполимерную гранулу.
В других вариантах осуществления соединений структуры (II) m в каждом случае независимо представляет собой целое число от 1 до 10, от 3 до 10 или от 7 до 9. В других вариантах осуществления m в каждом случае независимо представляет собой целое число от 1 до 5. В других вариантах осуществления m в каждом случае представляет собой целое число, равное единице или большее. Например, в некоторых вариантах осуществления m в каждом случае представляет собой целое число, равное двум или более, или трем или более.
В еще одних вариантах осуществления соединений структуры (II) n является целым числом от 1 до 100. Например, в некоторых вариантах осуществления n является целым числом от 1 до 10.
В других вариантах осуществления соединение структуры (II) выбирают из таблицы 3.
Таблица 3. Примеры соединений структуры (II)
Наименование
Структура
II-1
<img file="00000096.jpg" he="34" wi="134" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-2
<img file="00000097.jpg" he="34" wi="134" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-3
<img file="00000098.jpg" he="34" wi="134" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-4
<img file="00000099.jpg" he="34" wi="134" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-5
<img file="00000100.jpg" he="34" wi="134" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-6
<img file="00000101.jpg" he="34" wi="134" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-7
<img file="00000102.jpg" he="34" wi="134" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-8
<img file="00000103.jpg" he="25" wi="135" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-9
<img file="00000104.jpg" he="25" wi="136" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-10
<img file="00000105.jpg" he="46" wi="132" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-11
<img file="00000106.jpg" he="46" wi="132" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-12
<img file="00000107.jpg" he="46" wi="132" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-13
<img file="00000108.jpg" he="46" wi="133" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-14
<img file="00000109.jpg" he="46" wi="132" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-15
<img file="00000110.jpg" he="46" wi="132" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-16
<img file="00000111.jpg" he="46" wi="132" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-17
<img file="00000112.jpg" he="46" wi="133" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-18
<img file="00000113.jpg" he="46" wi="132" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-19
<img file="00000114.jpg" he="46" wi="132" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-20
<img file="00000109.jpg" he="46" wi="132" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-21
<img file="00000115.jpg" he="46" wi="132" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-22
<img file="00000116.jpg" he="46" wi="132" img-content="undefined" img-format="jpg" />
Соединения структуры (II) могут использоваться в различных способах, например, в вариантах осуществления предложен способ мечения молекулы аналита, причем способ включает:
2
3
(а) смешивание любого из описанных соединений структуры (I), где R или R представляет собой Q или линкер, содержащий ковалентную связь с Q, с молекулой аналита;
(b) образование конъюгата соединения и молекулы аналита; и
1b
(c) взаимодействие конъюгата с соединением формулы M-L-G', благодаря чему образуется по меньшей мере одна ковалентная связь по реакции по меньшей мере одного G и по меньшей мере одного G',
где:
M представляет собой фрагмент, имеющий две или более двойные углерод-углеродные связи и по меньшей мере одну степень конъюгирования;
1b
L представляет собой необязательный алкиленовый, гетероалкиленовый или гетероатомный линкер; и
G' представляет собой реакционноспособную группу, комплементарную G.
Другой вариант осуществления представляет собой способ мечения молекулы аналита, причем способ включает:
2
3
1b
(а) смешивание любого из соединений структуры (II), описанных здесь, где R или R представляет собой Q или линкер, содержащий ковалентную связь с Q, с соединением формулы M-L-G', благодаря чему образуется по меньшей мере одна ковалентная связь путем реакции G и G'; и
(b) взаимодействие продукта стадии (a) с молекулой аналита, в результате чего образуется конъюгат продукта стадии (a) и молекулы аналита,
где:
M представляет собой фрагмент, имеющий две или более двойные углерод-углеродные связи и по меньшей мере одну степень конъюгирования;
1b
L представляет собой необязательный алкиленовый, гетероалкиленовый или гетероатомный линкер; и
G' представляет собой реакционноспособную группу, комплементарную G.
1b
Кроме того, как отмечалось выше, соединение структуры (II) можно использовать для получения соединений структуры (I). Соответственно, в одном варианте осуществления предложен способ получения соединения структуры (I), включающий смешивание соединения структуры (II) с соединением формулы M-L-G', благодаря чему образуется по меньшей мере одна ковалентная связь путем реакции G и G'; где:
M представляет собой фрагмент, имеющий две или более двойные углерод-углеродные связи и по меньшей мере одну степень конъюгирования;
1b
L представляет собой необязательный алкиленовый, гетероалкиленовый или гетероатомный линкер; и
G' представляет собой реакционноспособную группу, комплементарную G.
Следующие примеры приведены с целью иллюстрации, а не ограничения.
ПРИМЕРЫ
Общие методы
1
1
Спектры H-ЯМР получали на спектрометре JEOL при 400 МГц. H спектры соотносили с ТМС. Анализ ВЭЖХ с обращенной фазой проводили с использованием системы ВЭЖХ Waters Acquity с колонкой Acquity BEH-C18 2,1 мм × 50 мм, поддерживаемой при 45°С. Масс-спектральный анализ проводили в системе Waters/Micromass Quattro Micro MS/MS (в режиме «MS only») с использованием программного обеспечения для сбора данных MassLynx 4.1. Подвижная фаза, используемая для ЖХ/МС, представляла собой 100 мМ 1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропанол (HFIP) в 8,6 мМ триэтиламине (TEA), pH 8. Фосфорамидиты и молекулы предшественников также анализировали с использованием системы ВЭЖХ Waters Acquity с колонкой Acquity BEH-C18 2,1 мм × 50 мм, поддерживаемой при 45°С, применяя градиент подвижной фазы ацетонитрил/вода. Молекулярные массы для мономерных интермедиатов были получены с использованием ионизации, усиленной инфузионным введением катиона тропилия, на системе Waters/Micromass Quattro Micro MS/MS (в режиме «MS only»). Эксклюзионную хроматографию (SEC) проводили с использованием аналитической колонки Superdex 200 5/150 GL. Использовали изократическое элюирование PBS-буфером со скоростью потока 0,25 мл/мин, с суммарным временем анализа 17,5 мин. Детектирование осуществляли при 494 нм, 405 нм, 280 нм и 260 нм. Фракции продуктов собирали вручную, объединяли в течение последовательных циклов. Лиофилизировали и восстанавливали в 100 мкл воды. Измерения оптической плотности проводили на спектрофотометре Nanodrop 2000, Thermo Scientific. Измерения флуоресценции осуществляли на флуороспектрометре Nanodrop 3300, Thermo Scientific.
Все реакции проводили в высушенной в сушильном шкафу стеклянной посуде в атмосфере азота, если не указано иное. Коммерчески доступные реагенты для синтеза ДНК приобретали у Glen Research (Sterling, VA). Безводный пиридин, толуол, дихлорметан, диизопропилэтиламин, триэтиламин, уксусную кислоту, пиридин и ТГФ приобретали у Aldrich. Все другие химические реагенты приобретали у Aldrich или TCI и использовали в исходном виде, без дополнительной очистки.
Твердофазный синтез
Все соединения структуры (I) синтезировали на ДНК-синтезаторе ABI 394, используя стандартные методики фосфорамидитного присоединения. Цикл сборки цепей для синтеза олигонуклеотидных фосфорамидитов был следующим: (i) детритилирование, 3% трихлоруксусная кислота в дихлорметане, 1 мин; (ii) присоединение, 0,1 М фосфорамидит и 0,45 М тетразол в ацетонитриле, 10 мин; (iii) кэппирование, 0,5 М уксусный ангидрид в ТГФ/лутидине, 1/1 об./об., 15 с; (iv) окисление, 0,1 М йод в смеси ТГФ/пиридин/вода, 10/10/1 об./об./об., 30 с.
После осуществления химических стадий в цикле следовала промывка ацетонитрилом и продувка сухим аргоном в течение 0,2 -0,4 мин. Отщепление от носителя и удаление основания и фосфороамидитных защитных групп осуществляли обработкой аммиаком в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем соединения анализировали с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой, как описано выше.
Соединения синтезировались на ДНК/РНК-синтезаторе 394 Applied Biosystems или на GE AKTÄ 10 OligoPilot в масштабе 1 мкмоль или 10 мкмоль и имели 3'-фосфатную группу. Соединения синтезировали непосредственно на CPG-гранулах или на твердом полистирольном носителе. Соединения синтезировали в 3'-5' направлении с использованием стандартных методов твердофазного синтеза ДНК. В методах присоединения использовались стандартные условия синтеза с β-цианоэтилфосфорамидитом. Все фосфорамидитные мономеры растворяли в смеси ацетонитрил/дихлорметан (0,1 М растворы) и добавляли друг за другом, используя следующие циклы синтеза: 1) удаление 5'-диметокситритильной защитной группы дихлоруксусной кислотой в толуоле, 2) присоединение следующего фосфорамидита с активатором в ацетонитриле, 3) окисление с использованием смеси йод/пиридин/вода, и 4) кэппирование уксусным ангидридом/1-метилимидазолом/ацетонитрилом. Удлиняемый алкин (соединение 9 или Glen Research 10-1992) фосфорамидит (100 мг) растворяли в безводном ацетонитриле (700 мкл) и дихлорметане (300 мкл). В колбу добавляли несколько молекулярных сит и помещали в атмосферу аргона. Использовали секвенатор, как описано выше. Цикл синтеза повторяли до тех пор, пока не была собрана 5'-олигофторозидная конструкция. По окончании сборки цепи монометокситритильную (ММТ) группу или диметокситритильную (DMT) группу удаляли с помощью дихлоруксусной кислоты в дихлорметане или дихлоруксусной кислоты в толуоле. Соединения отщепляли от твердого носителя с использованием концентрированного водного гидроксида аммония при комнатной температуре в течение 2-4 ч. Продукт концентрировали под вакуумом, и колонку Sephadex G-25 использовали для выделения основного продукта. Анализ проводили ОФ-ВЭЖХ методом в сочетании с использованием масс-спектрометра для определения молекулярной массы.
ПРИМЕР 1
Получение азидосоединения флуоресцеина (FAM)
В 250 мл круглодонную колбу с магнитной мешалкой и капельной воронкой помещали FAM-NHS сложный эфир 2 (2,24 г). В колбу добавляли дихлорметан (35 мл), начинали перемешивание, колбу помещали в атмосферу азота и охлаждали на льду. В отдельном химическом стакане 2-(2-аминоэтокси)этанол (420 мкл) растворяли в дихлорметане (35 мл), метаноле (7 мл) и триэтиламине (1,5 мл) и полученный раствор загружали в капельную воронку. Раствор амина добавляли по каплям к сложному NHS-эфиру в течение 30 мин. Конечный раствор перемешивали в течение 1 ч при 0°С, колбу извлекали из бани со льдом и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакционную смесь концентрировали и неочищенный продукт очищали хроматографией на силикагеле. Фракции продукта анализировали с помощью ТСХ и ЖХ/МС и объединяли с получением 1,6 г (72%).
В 250 мл круглодонную колбу с магнитной мешалкой помещали FAM-спирт 3 (1,5 г) и хлороформ (25 мл). К этому раствору добавляли пиридин (470 мкл) и п-толуолсульфонилхлорид (691 мг). Смесь перемешивали в течение 24 ч, после чего ТСХ указывала на то, что реакция была неполной, добавляли дополнительный п-толуолсульфонилхлорид (1,4 г) и пиридин (1,5 мл) и смесь перемешивали в течение дополнительных 24 ч. ТСХ реакционной смеси после 48 ч показывала, что реакция была завершена. Смесь выливали в насыщенный раствор бикарбоната натрия (200 мл) и дихлорметана (100 мл) в экстракционной воронке и разделяли. Органический слой сохраняли и водный слой экстрагировали дихлорметаном (100 мл) еще два раза. Органические слои объединяли и сушили сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Неочищенный продукт очищали хроматографией на силикагеле. Фракции продукта идентифицировали с помощью ТСХ и объединяли с получением желаемого тозилата 4 (1,8 г).
В 200 мл круглодонную колбу с магнитной мешалкой помещали FAM-тозилат 4 (1,8 г) и добавляли ДМФА (15 мл), и смесь перемешивали для осуществления растворения. К смеси добавляли азид натрия (830 мг) и смесь нагревали до 50°С и перемешивали в течение ночи. Смесь выливали в 100 мМ лимонную кислоту (150 мл) и этилацетат (150 мл) в экстракционной воронке. Слои разделяли и органический слой сохраняли. Водный слой экстрагировали этилацетатом еще два раза. Органические слои объединяли и сушили над сульфатом натрия. Раствор фильтровали и концентрировали путем ротационного выпаривания. Неочищенное масло очищали хроматографией на силикагеле, фракции продукта идентифицировали с помощью ТСХ и объединяли. Продукт концентрировали под вакуумом с получением целевого FAM-азида 5 в виде оранжевого твердого вещества (0,82 г). ЖХМС показал соответствие целевому продукту.
ПРИМЕР 2
Синтез алкин фосфорамидита
В 500 мл круглодонную колбу, снабженную капельной воронкой и магнитной мешалкой, помещали пропаргилхлорформиат (1,3 мл) в дихлорметане (75 мл). Колбу продували азотом. В отдельный химический стакан помещали аминоспирт 6 (2,0 г) в дихлорметане (60 мл), метаноле (10 мл) и триэтиламине (1,4 мл). В капельную воронку загружали раствор аминоспирта и добавляли по каплям в течение 30 мин. Колбу перемешивали в течение 2 ч, после чего ТСХ указывала на то, что реакция была завершена. Реакционную смесь концентрировали на роторном испарителе и далее сушили под высоким вакуумом и использовали непосредственно на следующей стадии.
В 500 мл круглодонную колбу с магнитной мешалкой помещали карбамат 7 (~3,1 г). В колбу добавляли пиридин (270 мл) и начинали перемешивание. После растворения карбамата раствор помещали на лед и перемешивали в течение 15 мин в атмосфере азота. Диметокситритилхлорид (5,9 г) добавляли в колбу с помощью насыпной воронки одной порцией. Колбу повторно продували азотом и перемешивали при 0°C в течение 1 ч. Колбу извлекали со льда и перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Добавляли метанол (10 мл) и смесь перемешивали в течение 10 мин. Смесь концентрировали на роторном испарителе и очищали хроматографией на силикагеле. Фракцию продукта определяли с помощью ТСХ, объединяли и концентрировали до конечного масла с получением монозащищенного диола 8 (3,3 г).
В 100 мл круглодонную колбу с магнитной мешалкой помещали монозащищенный диол 8 (500 мг) и дихлорметан (5 мл). Смесь перемешивали до растворения исходного материала. Диизопропилэтиламин (600 мг) и 2-цианоэтил-N,N-диизопропилхлорфосфорамидит (440 мг) добавляли по каплям, одновременно в разных шприцах. Смесь перемешивали в течение 1 ч, после чего ТСХ указывала на то, что реакция была завершена. Материал выливали в раствор бикарбоната натрия, экстрагировали дихлорметаном. Органический слой сушили сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением масла. Дополнительную очистку осуществляли хроматографией на силикагеле, с использованием дихлорметана с 5% триэтиламином. Фракции продукта идентифицировали с помощью ТСХ, объединяли и концентрировали. Конечный продукт выделяли в виде прозрачного масла (670 мг).
ПРИМЕР 3
Получение и характеристика олигомерных красителей
3-, 5- и 10-мерные полиалкиновые олигомеры получали из фосфорамидита примера 2. Репрезентативный 3-мерный краситель получали следующим образом.
В 500 мкл микроцентрифужную пробирку помещали раствор фосфатного буфера (31,5 мкл, 150 мМ, pH=7,4). К этому добавляли раствор азида кумарина (22,5 мкл, 10 мМ в ДМСО) и раствор полиалкина (7,5 мкл, 1 мМ в воде). В отдельную 200 мкл микроцентрифужную пробирку помещали раствор сульфата меди (3,0 мкл, 50 мМ), раствор трис-(3-гидроксипропилтриазолилметил) амина (THPTA, 3,0 мкл, 100 мМ) и раствор аскорбата натрия (7,5 мкл, 100 мМ). Раствор меди перемешивали и все содержимое добавляли в пробирку с азидом кумарина/полиалкином. Реакционную смесь перемешивали и оставляли для инкубации в течение ночи при комнатной температуре. Смесь разбавляли водой (75 мкл) и очищали с помощью эксклюзионной хроматографии (Superdex 200 5/150 GL, изократическое элюирование PBS, 0,25 мл/мин, детектирование при 405 нМ и 260 нМ).
3-, 5- и 10-мерные красители с кумариновым или флуоресцеиновым фрагментом получали аналогичным образом.
Спектры флуоресценции кумарин- и флуоресцеинсодержащих соединений были определены и представлены на фиг.1 и фиг.2, соответственно. Данные показывают увеличение флуоресценции с увеличением числа алкиновых реакционноспособных центров, что указывает на то, что азид связывается с алкином с образованием соединения структуры (I).
Все патенты США, публикации патентных заявок США, патентные заявки США, иностранные патенты, заявки на иностранные патенты и непатентные публикации, упомянутые в данном описании, включены в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме, в той степени, в которой это не противоречит настоящему описанию.
Исходя из вышеизложенного, понятно, что хотя конкретные варианты осуществления изобретения были описаны в данном документе для целей иллюстрации, возможно внесение различных модификаций, без отклонения от сущности и объема изобретения. Соответственно, изобретение ничем не ограничено, кроме прилагаемой формулы изобретения.