ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА КОМПОНЕНТОВ СЫВОРОТКИ
SEPARATION AND PURIFICATION OF WHEY COMPONENTS

Настоящее изобретение относится к способу выделения и очистки компонентов сыворотки, в частности, но не исключительно, выделенных из сывороточного пермеата, в особенности выделения сиалиллактозы, а конкретно, 3'-сиалиллактозы (по-другому обозначаемой как 3'-SL или 3-SL или 3-штрих).
Производство сыра в общем случае включает коагуляцию молочного белка (казеина) для отделения в нижнем слое сухих веществ молока и молочного жира в молочный/сырный сгусток либо при воздействии ферментов на молоко, либо в результате уменьшения значения рН молока при использовании надлежащей кислоты. После этого данный молочный/сырный сгусток уплотняют для выделения жидкой фракции, известной как сырная сыворотка. Сырная сыворотка содержит сухие вещества молока, которые не удерживаются в молочном сгустке, в частности сахариды и растворимые белки молока. Сыворотка составляет 80-90% от общего объема молока, использующегося в способе изготовления сыра, и содержит более чем половину сухих веществ из исходного цельного молока, в том числе 20% белка и основную часть лактозы, и характеризуется очень высоким уровнем содержания органических веществ.
Утилизация сыворотки всегда представляла собой проблему для молочной промышленности вследствие своего высокого уровня содержания органических веществ. В настоящее время можно извлекать растворимые белки из сыворотки и извлекать пользу от лактозы, и очевидной является желательность извлечения по возможности большего органического содержимого для уменьшения загрузки органических веществ в отходящий поток и получения большей прибыли от сыворотки. Основные усилия компании по изготовлению сыра прикладывают к разработке вариантов использования данного продукта.
В промышленности обычной практикой стало проведение для сыворотки ультрафильтрации (УФ) в целях получения белкового концентрата и сывороточного пермеата. Белковый концентрат нашел области применения в животных кормах. удобрениях, при ферментации и в качестве пищевого наполнителя. Однако пермеат, обогащенный лактозой, зачастую остается отходом производства вследствие невозможности удовлетворительного выделения и очистки индивидуальных компонентов пермеата, которые сделали бы их подходящими для последующего использования.
Пермеат, обогащенный лактозой, включает различные олигосахариды, такие как 3'-сиалиллактозу. Как было обнаружено, она имеет ценную область применения, например, в фармацевтике и в сфере детского питания, но компонент необходимо получать в достаточно чистой форме.
В патенте US 6323008 (Pelletier) предлагаются способы получения сиалилолигосахаридов из молочных источников и потоков технологических отходов от изготовления сыра с применением каталитической активности α(2-3)транс-сиалидаз для использования высоких концентраций лактозы и сиалозидов, которые естественным образом встречаются в отходах от изготовления сыра, в целях стимулирования прохождения ферментативного синтеза α(2-3)сиалиллактозы. Сиалиллактозу, полученную благодаря данному ферментативному воздействию, очищают в результате прохождения смеси через катионообменную смолу, а после этого через сильноосновную анионообменную смолу. Сиалиллактоза захватывается на анионообменной смоле и извлекается при использовании надлежащего раствора. Данный способ действительно очищает сиалиллактозу, но ему свойственен недостаток, заключающийся в удалении катионной смолой только некоторых катионов, при этом оставшиеся положительно заряженные частицы образуют соль с сиалиллактозой. После этого требуется сильнощелочная анионообменная смола для расщепления соли и обеспечения связывания сиалиллактозы со смолой. Однако количество сиалиллактозы, которое фактически связывается с колонкой, будет зависеть от количества других анионов, присутствующих в отходах, в сопоставлении с количеством сиалиллактозы, и поэтому потребуется очистка извлеченного материала, который будет обогащен другими анионами.
Задача настоящего изобретения заключается в предложении способа выделения и очистки компонентов сыворотки, в особенности 3'-сиалиллактозы, в частности, но не исключительно, из сывороточного пермеата, который устраняет или, по меньшей мере, смягчает влияние вышеупомянутых недостатков.
В соответствии с этим, первый аспект настоящего изобретения предлагает способ выделения и/или очистки желательного компонента сыворотки, такого как 3'-сиалиллактоза, от сыворотки, включающий стадии:
контактирование сыворотки с, по меньшей мере, одной группой ионообменных смол, которая включает первую катионообменную смолу, первую анионообменную смолу, вторую катионообменную смолу и вторую анионообменную смолу, для деминерализации сыворотки;
контактирование этой деминерализованной сыворотки с двумя дополнительными или последними ионообменными смолами, включающими сильнокислотную катионообменную и последующую слабоосновную анионообменную смолу, где желаемый компонент захватывается на анионообменной смоле; и
извлечение желаемого компонента из конечной анионообменной смолы при использовании надлежащего элюента.
В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения исходную сыворотку перед контактированием с ионообменными смолами подвергают ультрафильтрации, при этом стадия ультрафильтрации обеспечивает получение белкового концентрата и сывороточного пермеата, где для контактирования с ионообменными смолами вводят сывороточный пермеат. Однако для способа могут быть использованы исходная сыворотка или деминерализованная сыворотка.
Желательный компонент предпочтительно представляет собой 3'-сиалиллактозу. Другие компоненты могут включать 6'-сиалиллактозу и/или другие анионные олигосахариды, присутствующие в пермеате.
Предпочтительно первой катионообменной смолой является слабокислотная катионообменная смола. Предпочтительно, чтобы второй катионообменной смолой была бы сильнокислотная катионообменная смола. В случае второй катионообменной смолы в виде слабокислотной катионообменной смолы значение рН материала, поступающего в смолу, должно выдерживаться на уровне, больше чем рН 5, предпочтительно больше чем рН 5,5.
Предпочтительно первая и вторая основные анионообменные смолы включают слабоосновные анионообменные смолы.
Второй аспект настоящего изобретения относится к желательному компоненту, в частности 3'-сиалиллактозе, выделенному и очищенному от сыворотки в соответствии со способом первого аспекта настоящего изобретения.
Подвергнутый ультрафильтрации (УФ) сывороточный пермеат может быть непосредственно пропущен через ионообменные смолы, или для оптимизации рентабельности и/или технической эффективности он может быть подвергнут воздействию стадии полной или более предпочтительно неполной предварительной деминерализации при использовании технологии, такой как диализ, электродиализ, нанофильтрация или любая комбинация из вышеупомянутых вариантов.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения УФ-сывороточный пермеат концентрируют при использовании нанофильтрации перед контактированием концентрированного материала с группой смол, определенной в первом аспекте настоящего изобретения. В данном варианте осуществления концентрированный материал, предпочтительно, контактирует с двумя группами смол, то естьпервой группой, образованной слабокислотной катионообменной смолой, основной анионообменной смолой, сильнокислотной катионообменной смолой, основной анионообменной смолой, а после этого второй группой, образованной слабокислотной катионообменной смолой, основной анионообменной смолой, сильнокислотной катионообменной смолой, основной анионообменной смолой. Основная анионообменная смола может быть сильнощелочной или слабоосновной, но предпочтительно является слабоосновной для сведения к минимуму потерь и оптимизации извлечения.
Пермеат может быть подвергнут неполной деминерализации в результате электродиализа. После этого его пропускают через группу из катионообменных и анионообменных смол для обеспечения полной очистки и последующего связывания 3-SL на конечной анионообменной смоле.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения перед контактированием с группой смол, соответствующей первому аспекту настоящего изобретения, относительный уровень содержания 3'-SL в концентрированном УФ-сывороточном пермеате может быть увеличен при использовании ион-проникающей хроматографии (или ион-эксклюзионной хроматографии). Предпочтительно ион-проникающую хроматографию проводят при повышенной температуре, предпочтительно равной, по меньшей мере, 50°С, предпочтительно находящейся в диапазоне от 50°С до 80°С. Извлеченный материал включает первую фракцию, содержащую заряженные молекулы, включающие 3'-сиалиллактозу, с последующей второй фракцией, содержащей незаряженные молекулы, такие как лактоза. После этого первая фракция, содержащая 3'-сиалиллактозу, контактирует с группой смол при захватывании 3'-сиалиллактозы на анионообменной смоле.
Смола для хроматографического разделения предпочтительно представляет собой CR1310K, что поставляет компания Rohm & Haas. Однако существуют и другие подходящие смолы. Примеры включают нижеследующее, но не ограничиваются только этим: CR1310Ca и Na или CR1320Ca, К или Na, DOWEX Monosphere 99Ca/320 от компании Dow или Diaion UBK530 от компании Mitsubishi или PCR145K от компании Purolite.
3'-сиалиллактозу элюируют из анионообменной смолы при использовании надлежащим образом разбавленного раствора либо щелочи, либо соли, либо буферных растворов, либо кислоты. Используемая щелочь включает гидроксид аммония, NaOH, КОН; раствор соли включает NaCl, KCl, хлорид аммония, ацетат аммония, формиат аммония, карбонат аммония и тому подобное; а кислоты включают разбавленные HCl, уксусную кислоту, муравьиную кислоту, и/или имеют место буферы, содержащие достаточное количество противоионов для эффективного элюирования 3'-сиалиллактозы из анионообменной смолы, или надлежащие смеси вышеупомянутых вариантов. Однако предпочтительной является аммониевая соль, поскольку таковые имеют тенденцию к летучести.
3'-сиалиллактоза, извлеченная при использовании надлежащих основания или соли из анионообменной смолы, может быть подвергнута удалению солей при использовании обессоливающей смолы, такой как Sephadex G25. Например, извлеченный продукт может быть концентрирован до ~ 20-30% сухих веществ нанофильтрацией, и получающийся в результате материал подвергают хроматографии на Sephadex G25 (или других таких обессоливающих смолах, доступных на рынке). Первый извлеченный материал представляет собой 3'-сиалиллактозу совместно с некоторыми более крупными молекулами, а после этого более мелкие молекулы, такие как небелковый азот и соли. В случае использования раствора, содержащего крупные ионы, такие как в случае ацетата, формиата и тому подобного, удаление данных молекул на Sephadex G25 или эквивалентной ей смоле в определенном смысле является неудовлетворительным. Тем не менее, степень чистоты может быть улучшена путем регулирования глубины слоя смолы и расхода. В таком случае можно выбрать удаление примесей, используя надлежащую анионообменную смолу (сильнощелочной или слабоосновной анионообменной смолы), а после этого слабокислотную катионообменную смолу для доведения значения рН до нейтрального. Соль также может быть удалена путем диафильтрации, нанофильтрации, электродиализа, диализа или использования других технологий.
Очищенный извлеченный материал может быть дополнительно концентрирован нанофильтрацией и/или упариванием, а предпочтительно высушен до получения белого продукта.
В способе настоящего изобретения могут быть использованы любые подходящие сильно- и слабокислотные катионообменные и сильно- и слабоосновные анионообменные смолы. Первой слабокислотной катионообменной смолой предпочтительно является полиакриловая слабокислотная катионобменная смола, предпочтительно та, которую поставляют под торговым наименованием IMAC HP336. Альтернативные полиакриловые слабокислотные катионообменные смолы включают PWC11, что поставляет компания Rohm and Haas, DOWEX MAC-3, что поставляет компания Dow, или Diaion WK10 и WK40, что поставляет компания Mitsubishi. Первой слабоосновной анионообменной смолой предпочтительно является акриловая слабоосновная анионообменная смола, предпочтительно та, которую поставляют под торговым наименованием FPA55. Альтернативные акриловые слабоосновные анионообменные смолы включают Diaion WA10, WA20, WA21J и WA30, что поставляет компания Mitsubishi, или А847 или PFA847, что поставляет компания Purolite. Также могут быть использованы и стирольные слабоосновные анионообменные смолы. Использованы могут быть также и сильноосновные анионообменные смолы, но это в результате может привести к увеличенному использованию регенерирующих агентов для последующей очистки смол.
Второй сильнокислотной катионообменной смолой предпочтительно является сильнокислотная катионобменная смола на основе стирола-DVB, более предпочтительно та, которую продают под торговым наименованием HP 1110. Альтернативные сильнокислотные катионообменные смолы включают FPC23, что поставляет компания Rohm and Haas, DOWEX 88, DOWEX 88 MB, DOWEX Monosphere 88, что поставляет компания Dow, Diaion SK1B, SK104, SK110, SK112, SKI 16, PK208, PK212, PK216, PK220, PK228 или НРК25, что поставляет компания Mitsubishi, или PFC100 или PFC150, что поставляет компания Purolite.
Второй слабоосновной анионообменной смолой предпочтительно является слабоосновная анионообменная смола на основе стирола-DVB, более предпочтительно та, которую продают под торговьм наименованием FPA51. Альтернативные слабоосновные анионообменные смолы включают DOWEX 66, DOWEX Monosphere 66 или DOWEX Monosphere 77, что поставляет компания Dow, или Diaion WA10, WA20, WA21J и WA30, что поставляет компания Mitsubishi.
Слабоосновные анионообменные смолы могут быть заменены сильноосновными анионообменными смолами, хотя слабоосновные анионообменные смолы являются предпочтительными. Такие смолы включают нижеследующее, но не ограничиваются только этим: FPA42, FPA90 от компании Rohm & Haas; А600, А400Е, А420 и А850 от компании Purolite и Dowex A, Dowex I, Dowex 22, Dowex SAR от компании Dow Chemical Co..
В одном дополнительном аспекте настоящее изобретение также предлагает способ получения молочного продукта, обогащенного желательным компонентом сыворотки, где данный способ включает получение желательного компонента сыворотки в соответствии со способом первого аспекта настоящего изобретения. Желательный компонент сыворотки необязательно может представлять собой 3'-сиалиллактозу, и способ необязательно может быть предназначен для получения молочного продукта, обогащенного 3'-сиалиллактозой. Необязательно молочным продуктом является молоко, может быть использован любой молочный продукт, обогащенный желательным компонентом сыворотки. Молочный продукт, обогащенный желательным компонентом сыворотки, может быть получен путем взаимодействия извлеченного желательного компонента с потоком молочного продукта. Извлеченный желательный компонент и поток молочного продукта в каждом случае независимо могут представлять собой жидкость или твердое вещество. Необязательно извлеченный желательный компонент и поток молочного продукта в каждом случае независимо представляют собой жидкость. Необязательно способ получения молочного продукта включает дополнительную стадию концентрирования молочного продукта. Стадия концентрирования может включать любой один вариант или комбинацию вариантов, выбираемых из нанофильтрации, упаривания и сушки молочного продукта.
Далее изобретение только в порядке примера будет более конкретно описано на прилагаемых примерах, в числе которых в примере 1 описывается непосредственное выделение 3'-сиалиллактозы из УФ-сывороточного пермеата при использовании способа настоящего изобретения; в примере 2 описывается выделение 3'-сиалиллактозы из концентрированного УФ-сывороточного пермеата при использовании способа настоящего изобретения, где УФ-сывороточный пермеат сначала концентрируют при использовании нанофильтрации; а в примерах с 3 по 7 описывается выделение сиалиллактозы из концентрированного УФ-сывороточного пермеата при использовании способа настоящего изобретения, где УФ-сывороточный пермеат сначала концентрируют при использовании нанофильтрации, а после этого ион-проникающей хроматографии; и со ссылкой на прилагаемые чертежи, в числе которых:
Фигура 1 представляет собой блок-схему, иллюстрирующую стадии, включенные в способ примера 1;
Фигура 2 представляет собой блок-схему, иллюстрирующую стадии, включенные в способ примера 2; и
Фигура 3 представляет собой блок-схему, иллюстрирующую стадии, включенные в способ примера 3.
Пример 1
Основной стадией в настоящем изобретении для всех примеров является стадия ультрафильтрации (УФ), при которой удаляют основную долю белка в сырной сыворотке. Стадия УФ может включать получение концентрата сывороточного белка (КСБ) 35, 60, 80 и 85. Побочный продукт данного способа представляет собой сывороточный пермеат, содержащий ~ от 4 до 7% сухих веществ, которые образуют приблизительно от 90 до 95% лактозы, от 1 до 5% белка (небелкового азота и собственно белка), от 4 до 7% золы и от 0,05 до 0,25% 3'-сиалиллактозы (3-SL). В определенные периоды года доля 3-SL может быть значительно большей, доходящей вплоть до 0,5 мас.% сухих веществ.
В настоящем примере УФ-пермеат непосредственно контактирует с группой смол, а 3-SL в итоге захватывался на анионообменной смоле. Стадии суммарно представлены на фигуре 1 прилагаемых чертежей.
1035 литров потока УФ-сывороточного пермеата при ~ 5% сухих веществ и ~ 60 ч./млн 3'-SL непосредственно контактировала с группой следующих смол путем прокачивания через них в колонках с диаметром 200 мм:
- 15 литров IMAC HP336 (полиакриловая слабокислотная катионобменная смола);
- 22 литра FPA55 (акриловая слабоосновная анионообменная смола);
- 23 литра HP 1110 (сильнокислотная катионобменная смола на основе стирола-DVB);
- 23 литра FPA51 (слабоосновная анионообменная смола на основе стирола- DVB);
- 17 литров HP 1110 (сильнокислотная катионобменная смола на основе стирола-DVB);
- 17 литров FPA51 (слабоосновная анионообменная смола на основе стирола-DVB).
3-SL захватывался на последней анионообменной смоле, для которой проводили элюирование 28 литрами 4,4%-ного гидроксида аммония с последующими 50 литрами деминерализованной воды. Извлеченный материал содержал приблизительно от 6 до 15 мас.% 3'-сиалиллактозы. Затем он контактировал с 30 литрами IMAC HP336 (полиакриловой слабокислотной катионообменной смолы), а после этого с 23 литрами FPA51 (слабоосновной анионообменной смолы на основе стирола-DVB) для удаления избыточного аммиака и доведения значения рН конечного продукта до величины в диапазоне от 7 до 9,5.
Полученный в результате продукт содержал исключительно высокочистую форму 3'-сиалиллактозы в области от 12 до 50 мас.% сухих веществ. Зольность конечного материала составляла <10%, остальное представлял собой белок. Приблизительно от 20 до 50% белковой ценности представлял собой небелковый азот. Таким образом, в данном примере пермеат контактировал непосредственно путем прокачивания 3-SL при фиксированном расходе через группу следующих смол: катионобменная смола - анионообменная смола - катионобменная смола - анионообменная смола - катионобменная смола - анионообменная смола. Это делает возможным удаление нежелательных и создающих помехи молекул, что после этого в результате приводит к специфическому захватыванию 3-SL в колонке с последней анионообменной смолой. Говоря конкретно, наилучшие результаты при максимальном извлечении 3-SL давала следующая группа:
- Слабокислотная катионобменная смола - слабоосновная анионообменная смола - сильнокислотная катионобменная смола - слабоосновная анионообменная смола - сильнокислотная катионобменная смола - слабоосновная анионообменная смола.
3-SL захватывалась в колонке с последней анионообменной смолой совместно с небольшим количеством белка (собственно белка + небелкового азота) и некоторыми анионами. После этого 3-SL элюируют при использовании гидроксида аммония (успешно также может быть использована и соль, образованная из хлористоводородной кислоты и аммония, калия, натрия, магния или кальция или их комбинаций).
В случае чрезмерно большого падения давления на слоях в надлежащем положении может быть использована буферная емкость для сбора обработанного пермеата, который после этого прокачивают через оставшиеся колонки.
Затем извлеченную 3-SL для удаления солей очищали на катионообменной смоле с последующей анионообменной смолой. В альтернативном варианте соль может быть удалена в результате диафильтрации, НФ, электродиализа, диализа или использования других технологий. Одно дополнительное преимущество использования технологии ионообменных смол заключается в удалении также и определенного нежелательного небелкового азота.
Полученный в результате материал характеризуется уровнем содержания 3-SL в диапазоне от 7 до 42 мас.% 3-SL, который может быть концентрирован при использовании НФ и/или упаривания, а в заключении высушен до получения белого продукта, имеющего очень высокую концентрацию 3-SL.
Захватывание 3'-SL из пермеата на конечной слабоосновной анионообменной смоле было близко к 100% при элюировании от 85 до 100% всей адсорбированной 3'-SL. В вышеупомянутом способе для специалиста в области технологии ионообменных смол допустимой является возможность рассмотрения изменения концентрации или объема или и концентрации, и объема гидроксида аммония для оптимизации извлечения и, тем самым, получения наивысшей степени чистоты с ухудшением или без ухудшения выхода. В качестве предварительной стадии также можно выбрать и элюирование некоторых нежелательных материалов из анионообменной смолы путем использования пониженной концентрации гидроксида аммония, а после этого элюирования при оптимальной концентрации гидроксида аммония для получения наивысших степени чистоты и выхода 3-SL.
Пример 2
Сывороточный пермеат опять подвергали воздействию стадии ультрафильтрации (УФ), как и в приведенном выше примере 1. После этого УФ-пермеат концентрировали до уровня содержания сухих веществ 30% нанофильтрацией (НФ), а концентрированный материал контактировал с группой смол в соответствии с настоящим изобретением, где 3-SL в итоге захватывалась на анионообменной смоле. Стадии суммарно представлены на фигуре 2 прилагаемых чертежей.
УФ-пермеат концентрировали путем нанофильтрации для получения НФ-ретентата, содержащего ~ от 15 до 25% сухих веществ и от 186 до 208 ч./млн 3'-сиалиллактозы. 2500 мл вышеупомянутого НФ-ретентата пропускали через группу следующих смол путем прокачивания через них в колонках с диаметром 25 мм:
- 120 мл IMAC HP336 (полиакриловая слабокислотная катионобменная смола);
- 180 мл FPA55 (акриловая слабоосновная анионообменная смола);
- 180 мл HP 1110 (сильнокислотная катионобменная смола на основе стирола-DVB);
- 180 мл FPA51 (слабоосновная анионообменная смола на основе стирола-DVB);
- 100 мл IMAC HP336 (полиакриловая слабокислотная катионобменная смола);
- 150 мл FPA55 (акриловая слабоосновная анионообменная смола);
- 150 мл HP 1110 (сильнокислотная катионобменная смола на основе стирола-DVB);
- 150 мл FPA51 (слабоосновная анионообменная смола на основе стирола-DVB).
Опять-таки во избежание появления проблем с потерей давления после четвертой колонки успешно использовали буферную емкость.
3-SL захватывалась на последней анионообменной смоле, для которой проводили элюирование при помощи 180 мл 4,4%-ного гидроксида аммония, а после этого 300 мл деминерализованной воды. Извлеченный материал содержал приблизительно от 6 до 18 мас.% 3'-сиалиллактозы. Затем он контактировал с 250 мл IMAC HP336 (полиакриловой слабокислотной катионообменной смолы), а после этого со 120 мл FPA51 (слабоосновной анионообменной смолы на основе стирола-DVB) для удаления избыточного аммиака и доведения значения рН конечного продукта до величины в диапазоне от 7 до 9,5. Полученный в результате продукт содержал исключительно высокочистую форму 3'-сиалиллактозы в области от 20 до 50 мас.% сухих веществ. Зольность конечного материала составляла <10%, остальное представлял собой белок. Приблизительно от 20 до 50% белковой ценности представлял собой небелковый азот.
Пример 3
Сывороточный пермеат опять подвергали воздействию стадии ультрафильтрации, описывавшейся в отношении примеров 1 и 2. После этого УФ-пермеат концентрировали до уровня содержания сухих веществ в диапазоне от 20 до 30% (предпочтительно 25%) нанофильтрацией, а затем пермеат подвергали ион-проникающей хроматографии (по-другому называемой ион-эксклюзионной хроматографией) при повышенной температуре в диапазоне от 50 до 80°С. Извлеченный материал разделяли на две фракции - начальную фракцию, содержащую заряженные молекулы, которые включали основную долю белка (в том числе небелковый азот), минералы и 3-SL, с последующей фракцией, содержащей незаряженные молекулы, такие как лактоза. После этого начальная фракция, содержащая 3-SL, контактировала с группой смол, продемонстрированной в примере 1, и 3-SL в итоге захватывалась на анионообменной смоле. Стадии суммарно представлены на фигуре 3 прилагаемых чертежей.
Говоря более подробно, стадия ион-проникающей хроматографии включала использование хроматографической колонки, содержащей 630 литров CR1310K для получения высоты слоя в 3 метра и прокалиброванной технологической водой. Согласно оценке рабочая температура находилась в диапазоне от + 4 до 75°С при получении наилучших результатов при повышенных температурах. УФ-пермеат концентрировали путем нанофильтрации для получения НФ-ретентата, содержащего ~ от 22 до 25% сухих веществ и от 118 до 304 ч./млн (в среднем 220 ч./млн) 3'-сиалиллактозы. После этого данный материал подвергали воздействию способа ион-эксклюзионной хроматографии путем прокачивания подвергнутого нанофильтрации материала через слой ион-эксклюзионной смолы с последующим введением воды. Для достижения оптимальных результатов соотношение между количествами смолы и загрузки НФ-ретентата за один цикл выдерживали на уровне 1: 0,1 с последующим введением воды в количестве 0,9 насыпного объема (где 1 насыпной объем = общий объем смолы, а именно, равный 650 литров). Согласно оценке имел место постоянный расход в диапазоне от 0,3 до 0,86 насыпной объем/час. Вариация расхода не оказывала какого-либо значительного воздействия на природу полученной хроматограммы. Извлеченный материал разделяли на две фракции - начальную фракцию, содержащую 3'-сиалиллактозу совместно с минералами и белком (включающим небелковый азот), и последующую вторую фракцию, содержащую почти чистую форму лактозы. Результирующий объем обогащенной 3'-сиалиллактозой фракции, полученной за один цикл, составлял 135 литров. Уровень содержания сухих веществ варьировался в диапазоне от 0,5 до 1%, а уровень содержания 3'-сиалиллактозы находился в диапазоне от 0,5 до 1,3 мас.% сухих веществ. Извлечение 3'-сиалиллактозы находилось в диапазоне от 80 до 100% при среднем извлечении 85% в ходе более чем 95 циклов операции.
После этого 950 литров фракции, обогащенной по 3-SL, пропускали через группу следующих смол:
- 15 литров IMAC HP336 (полиакриловая слабокислотная катионобменная смола);
- 22 литра FPA55 (акриловая слабоосновная анионообменная смола);
- 17 литров HP 1110 (сильнокислотная катионобменная смола на основе стирола-DVB);
- 17 литров FPA51 (слабоосновная анионообменная смола на основе стирола-DVB).
3-SL захватывалась на последней анионообменной смоле, для которой проводили элюирование 28 литрами 4,4%-ного аммония с последующими 50 литрами деминерализованной воды. Извлеченный материал содержал приблизительно от 6 до 15 мас.% 3'-сиалиллактозы. После этого он контактировал с 30 литрами IMAC HP336 (полиакриловой слабокислотной катионообменной смолы), а после этого с 23 литрами FPA51 (слабоосновной анионообменной смолы на основе стирола-DVB) для удаления избыточного аммиака и доведения значения рН конечного продукта до величины в диапазоне от 7 до 9,5. Полученный в результате продукт, характеризующийся уровнем содержания сухих веществ в диапазоне от 0,3 до 1%, содержал 3'-сиалиллактозу в области от 0,5 до 3 мас.% сухих веществ. Зольность конечного материала составляла <10%, уровень содержания лактозы находился в диапазоне от 30 до 50%, остальное представлял собой белок. Приблизительно от 20 до 50% белковой ценности представлял собой небелковый азот.
Пример 4
В альтернативном способе 1600 литров обогащенной по 3-SL фракции, полученной путем проведения стадии нанофильтрации и ион-проникающей хроматографии, описывавшейся в примере 3, контактировали с группой следующих смол путем прокачивания через них в колонках с диаметром 200 мм:
- 15 литров IMAC HP336 (полиакриловая слабокислотная катионобменная смола);
- 22 литра FPA55 (акриловая слабоосновная анионообменная смола);
- 17 литров HP 1110 (сильнокислотная катионобменная смола на основе стирола-DVB);
- 17 литров FPA51 (слабоосновная анионообменная смола на основе стирола-DVB);
- 17 литров HP 1110 (сильнокислотная катионобменная смола на основе стирола-DVB);
- 17 литров FPA51 (слабоосновная анионообменная смола на основе стирола-DVB).
3-SL захватывалась на последней анионообменной смоле, для которой проводили элюирование 28 литрами 4,4%-ного гидроксида аммония с последующими 50 литрами деминерализованной воды. Извлеченный материал содержал приблизительно от 6 до 15 мас.% 3'-сиалиллактозы. После этого он контактировал с 30 литрами IMAC HP336 (полиакриловой слабокислотной катионообменной смолы), а после этого с 23 литрами FPA51 (слабоосновной анионообменной смолы на основе стирола-DVB) для удаления избыточного аммиака и доведения значения рН конечного продукта до величины в диапазоне от 7 до 9,5. Получающийся в результате продукт содержал очень высокую концентрацию очищенной 3'-сиалиллактозы в области от 20 до 70 мас.% сухих веществ. Зольность конечного материала составляла <10%, остальное представлял собой белок. Приблизительно от 15 до 30% белковой ценности представлял собой небелковый азот.
Пример 5
Сывороточный пермеат опять подвергали воздействию стадии ультрафильтрации, описывавшейся в отношении примеров 1 и 2. УФ-пермеат контактировал с группой смол на двух фазах в соответствии с настоящим изобретением, где 3-SL в итоге захватывалась на анионообменной смоле. Стадии представляют собой вариант тех, которые суммарно представлены на фигуре 1 прилагаемых чертежей.
Использовали УФ-пермеат, содержащий от 2 до 6% сухих веществ и от 30 до 80 ч./млн 3'-сиалиллактозы.
На фазе I настоящего примера определенное количество вышеупомянутого УФ-ретентата пропускали через группу следующих смол путем прокачивания через них в колонках с диаметром 200 мм:
- 15 литров IMAC HP336 (полиакриловая слабокислотная катионобменная смола);
- 22 литра FPA55 (акриловая слабоосновная анионообменная смола);
- 17 литров HP 1110 (сильнокислотная катионобменная смола на основе стирола-DVB);
- 17 литров FPA51 (слабоосновная анионообменная смола на основе стирола-DVB).
Уровень пропускания для загрузки УФ-ретентата определили как точку, в которой проводимость отходящего потока достигала приблизительно от 300 до 400 микросименсов. Три последовательных повторения вышеупомянутой методики в результате приводили к загрузкам ретентата в 610 литров, 650 литров и 600 литров, соответственно. Интересующий продукт (ретентат), содержащий деминерализованную 3'-SL, пропускаемую через вышеупомянутые четыре колонки со смолами, вытесняли 100 литрами технологической воды, что приводило к получению 684 литров, 724 литров и 674 литров продукта фазы I при трех описывавшихся выше последовательных повторениях.
После этого на фазе II настоящего примера 800 литров извлеченного материала фазы I контактировали с 17 литрами HP 1110 (сильнокислотной катионообменной смолы на основе стирола-DVB) с последующими 17 литрами FPA51 (слабоосновной анионообменной смолы на основе стирола-DVB). Интересующий продукт, содержащий очищенную 3'-SL, захватывался на последней смоле и элюировался из нее 20 литрами 1%-ного хлорида калия с последующими 45 литрами технологической воды.
В двух повторениях фазы II получали общее количество 120 литров извлеченного продукта. После этого его подвергали нанофильтрации с последующей диафильтрацией до получения 7,3 литра ретентата. Данный продукт содержал 27 мас.% сухих веществ 3'-сиалиллактозы.
После сублимационной сушки 2,96 литра подвергнутого нанофильтрации и диафильтрации продукта приводили к получению 420 г высушенного продукта, содержащего 30 мас.% сухих веществ 3'-SL. Зольность конечного материала составляла 16%, белок составлял 30%, при этом 2% белковой ценности представлял собой небелковый азот.
Пример 6
В еще одном способе обогащенную 3-SL фракцию со стадии ион-эксклюзионной хроматографии, описывавшейся в примере 3, концентрировали до уровня содержания сухих веществ ~ 12% путем нанофильтрации. 15 мл данного материала подвергали хроматографии на 150 мл Sephadex G25 до получения конечного продукта, который содержал 3-SL в количестве в диапазоне от 4 до 6 мас.% сухих веществ. Извлечение составило ~ 98%. Могут быть использованы любая насыпная обессоливающая смола, такая как Toyopearl HW40 или Bio-Gel P-4 или Bio-Gel P-6 или любые другие такие обессоливающие смолы, в том числе Sephadex G10, которые доступны на рынке. Как проиллюстрировано в представленных выше примерах, способ выделения настоящего изобретения по существу включает пропускание материала пермеата (неподвергнутого обработке УФ-пермеата в случае примера 1, подвергнутого нанофильтрации пермеата в случае примера 2 или подвергнутого ион-эксклюзионной хроматографии материала в случае примеров от 3 до 6) через следующие смолы:
- Слабокислотная катионобменная смола (например, Imac HP 336 или WK 40);
- Слабо- или сильнощелочная анионообменная смола (например, FPA55 или FPA42);
- Сильнокислотная катионобменная смола (например, Imac HP 1110 или FPC23);
- Слабо- или сильнощелочная анионообменная смола (например, FPA51, FPA55 или FPA42).
Это обеспечивает очистку материала пермеата. После очистки 3-SL может быть абсорбирована на надлежащей анионообменной смоле (в одном предпочтительном варианте осуществления это была FPA51, поскольку это обеспечивало наилучшее извлечение). Материал перед анионообменной смолой может быть пропущен через катионообменную смолу для обеспечения захватывания всего количества 3'-SL на анионообменной смоле. Использование сильнощелочной анионообменной смолы в присутствии или в отсутствии катионообменной смолы перед нею в результате также приводило бы к захватыванию 3'-SL на смоле, но это потребовало бы большей концентрации элюирующих сред. Элюирования из смолы добивались при использовании гидроксида аммония, хлорида кальция, NaCl и KCl или их комбинации.
Пример 7
В еще одной последовательности экспериментов, проведенных в соответствии с теми же самыми положениями, что и в примере 5, извлеченную фракцию 3'-сиалиллактозы разбивали на различные фракции, и фракцию 100%-ной чистой 3'-сиалиллактозы получали при пониженном выходе 19-20%.
Фракция может быть подвергнута непосредственно сублимационной сушке или распылительной сушке после концентрирования сухих веществ надлежащим способом.
Принцип, сопутствующий способу настоящего изобретения, заключается в удалении нежелательных и/или создающих помехи отрицательно заряженных молекул до уровня, который достаточен для обеспечения предпочтительного прикрепления 3-SL к анионообменной смоле (FPA51). Для обеспечения наличия у 3-SL отрицательного заряда перед тем, как она сможет быть захвачена на анионообменной смоле, существенными являются катионообменные смолы.
Как можно предполагать, 3-SL захватывалась бы на любой анионообменной смоле после удаления положительно заряженных молекул при использовании любой сильнокислотной катионообменной смолы. Но, как это ни удивительно, по-видимому, это не так, что предполагает наличие между 3'-SL и смолой очень слабой связи, которая легко разрушается в присутствии любых конкурирующих анионных веществ. Существенным является наличие всех четырех смол в вышеупомянутой группе. В случае использования в качестве исходного материала подвергнутого нанофильтрации пермеата (см. Пример 2) исключительно желательным является наличие вышеупомянутых четырех смол плюс еще раз этих же четырех смол для захватывания 3-SL в последней колонке, содержащей слабоосновную анионообменную смолу.
+
3-SL в своей чистой и нативной форме существует в виде очень слабо отрицательно заряженной молекулы. Анионообменная смола может захватывать 3-SL только в случае удаления почти всех катионных частиц, за исключением ионов Н, и удаления основного количества конкурирующих анионов. Способ настоящего изобретения имеет своей задачей получение очищенной формы 3-SL при варьировании концентрации где-то в диапазоне от 3 до 60 мас.% сухих веществ. Этого добиться непросто. Первая слабокислотная катионобменная смола удаляет основное количество двухвалентных катионов, таких как Са и Mg, и в меньшей степени Na и К, которые присутствуют в сыворотке, а также в определенных аминокислотах и белках. Вторая смола - слабоосновная анионообменная смола - захватывает некоторые отрицательно заряженные молекулы, такие как хлориды, фосфаты и сульфаты, и в некоторой степени цитраты, лактаты и отрицательно заряженные аминокислоты и белок. Третьей смолой является сильнокислотная катионобменная смола, которая после этого захватывает почти все оставшиеся катионы. Четвертой смолой является слабоосновная анионообменная смола, которая предпочтительно захватывает любые оставшиеся анионы в сопоставлении с 3-SL. Для обеспечения минимального захватывания 3-SL в данной колонке предпочтительно завершить процесс таким образом, чтобы любое количество 3-SL, захваченное на четвертой смоле, было бы селективно вытеснено конкурирующими анионами. Сразу после очистки (или >90%-ной деминерализации) материала он может быть направлен через сильнокислотную катионообменную смолу для очистки практически от всех оставшихся катионов, что, тем самым, обеспечит существование 3-SL в ее нативном или свободном состоянии (наиболее вероятно в виде «H-3-SL»). После этого слабый анион в своей -ОН-форме будет легко вступать в реакцию с «H-3-SL» (Н вступает в реакцию с ОН с образованием воды), и теперь отрицательно заряженная 3-SL легко будет захватываться на слабоосновной анионообменной смоле.
Как с ясностью следует из вышеизложенного, перед контактированием материала, содержащего 3'-SL, со смолами предпочтительно следует уменьшить ионную загрузку в смолах согласно технологиям, выбираемым из группы, такой как диализ, электродиализ, диафильтрация и тому подобное. Это улучшило бы емкость смол при загрузке, но не изменило бы основополагающий принцип выделения интересующего олигосахарида.
2
Во всех случаях последней смолой является слабоосновная анионообменная смола, хотя технически сильнощелочная анионообменная смола при захватывании 3-SL работала бы так же хорошо. Однако элюирование из сильнощелочной анионообменной смолы является более трудным в сравнении с тем, что имеет место для слабоосновной анионообменной смолы. Предпочтительной является соль хлористо-водородной кислоты, такая как KCl, NaCl или CaCl или их комбинация. Другие летучие соли включали бы гидроксид аммония, ацетат аммония, формиат аммония, муравьиную кислоту, уксусную кислоту и тому подобное.
2
2
После извлечения из колонки с анионообменной смолой материал контактирует со слабокислотной катионообменной смолой для удаления аммиака и/или Са в случае CaCl или К в случае использования KCl, а после этого со слабоосновной анионообменной смолой, такой как FPA51, для доведения значения рН обратно до нейтральной точки, а в случае использования KCl или CaCl для удаления избыточных хлоридов. В альтернативном варианте материал может быть подвергнут нанофильтрации и/или диафильтрации для достижения желательных целевых технических характеристик продукта.
Специалист в соответствующей области техники также может использовать методику получения сечений фракций элюирования, содержащих 3'-сиалиллактозу, для получения, тем самым, 100%-ной степени чистоты желательного продукта, хотя и при ухудшенном выходе.
Несмотря на ограничение примеров, иллюстрирующих способ, материалом 3'-SL в пермеате присутствуют и другие интересующие компоненты, такие как белки, аминокислоты и другие олигосахариды, которые могут быть успешно выделены при использовании того же самого рабочего принципа, что и описывавшийся в данном описании изобретения. Кроме того, благодаря варьированию концентрации элюирующих растворов специалист в области технологии ионообменных смол может увеличить степень чистоты в результате селективного фракционирования адсорбированного материала из смолы.