СПОСОБ ЭКСТРАКЦИИ КОМПОНЕНТОВ ИЗ КУЛЬТУРЫ ДРОЖЖЕВЫХ КЛЕТОК
METHOD OF EXTRACTING COMPONENTS FROM CULTURE OF YEAST CELLS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к способу экстракции компонентов из культуры дрожжевых клеток при участии фосфолипазы.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Дрожжевые культуры используются в качестве источника для экстракции нескольких компонентов. Термин «дрожжевой экстракт» обычно используют в отношении концентрата растворимого материала, полученного из дрожжевых клеток, которые подвергли гидролизу клеточного материала, главным образом, белков, растворимых углеводов и нуклеиновых кислот. Дрожжевые клетки также могут быть использованы в качестве источника определенных самостоятельных компонентов, которые экстрагируют и очищают из дрожжевых клеток. Эти компоненты могут продуцироваться рассматриваемыми дрожжами естественным образом или могут продуцироваться дрожжевыми клетками после генетической манипуляции. Как при продукции дрожжевого экстракта, так и при очистке определенных компонентов из культур дрожжевых клеток существует желание повысить выход интересуемого продукта для большей экономии продукции. Получение дрожжевых экстрактов описывается на страницах 240-251 Nagodawithana (1995) Savory Flavours, Esteekay Associates, Inc., Wisconsin, USA.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы изобретения обнаружили, что обработка культуры дрожжевых клеток фосфолипазой способствует экстракции компонентов из культуры. Соответственно, настоящее изобретение относится к способу экстракции одного или нескольких компонентов из дрожжей, включающему: i) обработку дрожжевых клеток фосфолипазой; и ii) выделение желаемого одного или нескольких компонентов из обработанных дрожжевых клеток. В других аспектах изобретение относится к способу получения дрожжевого экстракта и использования очищенной фосфолипазы для экстракции одного или нескольких компонентов из культуры дрожжевых клеток.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Дрожжи
Используемой в способе по изобретению культурой дрожжевых клеток может быть культура любых дрожжей, например, штамм рода Saccharomyces, например, S. cerevisiae, S. uvarum; штамм рода Kluyveromyces, например, K. fragilis и K. marxianus; или штамм рода Candida, например, C. utilis. Культура дрожжевых клеток может быть отобрана по признаку продукции одного или нескольких желаемых компонентов и/или может быть генетически модифицирована для продукции одного или нескольких конкретных компонентов и/или для повышения выхода одного или нескольких конкретных компонентов. Способы генетической модификации дрожжевых клеток, например, путем инсерции ДНК, кодирующей желаемый белковый компонент, хорошо известны в данной области. Культуру дрожжевых клеток перед тем как подвергнуть ее способу по изобретению, можно размножить в условиях, благоприятных для роста клеточной культуры и/или благоприятных для продукции одного или нескольких желаемых компонентов с высоким выходом.
Экстрагируемый компонент
Экстрагируемый способом по изобретению из дрожжей компонент может представлять собой любой компонент, естественным образом продуцируемый дрожжами, или любой компонент, продуцируемый дрожжами, которые генетически модифицировали для продукции желаемого компонента. К компонентам, которые продуцируют в дрожжах, относятся, например, ферменты; витамины, например, В1, В6 и В12; антибиотики; астаксантин; полигидроксиалканоаты; ликопин; бета-каротин; сывороточный альбумин человека; гамма-дельталактон; и цис-3-гексанол. В одном из вариантов осуществления изобретения экстрагируемый из дрожжей компонент представляет собой белок, в частности, фермент, например, лактазу. В другом варианте осуществления изобретения экстрагируемый из дрожжей компонент представляет собой небелковый компонент, например углевод. В одном из вариантов осуществления изобретения один или несколько экстрагируемых компонентов представляют собой дрожжевой экстракт, как описано ниже.
Выделение
Согласно изобретению один или несколько желаемых компонентов выделяют из культуры дрожжевых клеток после обработки фосфолипазой. Выделение можно осуществить любым известным в данной области способом, зависящим от конкретных одного или нескольких выделяемых компонентов. Выделение можно осуществить, например, с помощью центрифугирования; фильтрации, например, микрофильтрации или ультрафильтрации; хроматографических методик, например, гель-хроматографии, ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии, хроматографии гидрофобного взаимодействия; и/или преципитации, например, добавлением соли, такой как, например, сульфат аммония. Выделение можно осуществить путем сочетания нескольких методик выделения, например, для удаления фрагментов клеточной стенки можно использовать центрифугирование, а для выделения одного или нескольких конкретных компонентов могут быть последовательно использованы одна или несколько хроматографических методик.
Для облегчения выделения перед выделением дрожжевые клетки могут быть подвергнуты способам разрушения дрожжевых клеток, например, гомогенизации и/или добавлению одного или нескольких компонентов, которые облегчают разрушение клеток, например, хлорида натрия, этилацетата или изопропанола.
Способ по изобретению может способствовать выделению одного или нескольких желаемых компонентов из дрожжевой культуры, например, путем снижения количества отделенного материала, который необходимо удалить. Способ также может повысить выход одного или нескольких желаемых компонентов по сравнению с подобными способами экстракции, не включающими обработку фосфолипазой.
Гидролиз
В одном из вариантов осуществления изобретения культуру дрожжевых клеток подвергают гидролизу белка перед, после или во время обработки фосфолипазой. Гидролиз белка можно осуществить любым известным в данной области способом, например, с помощью протеолитических ферментов. Протеолитическими ферментами могут быть, например, протеолитические ферменты, присутствующие в дрожжевых клетках и высвобождающиеся, например, путем механического разрушения клеток, плазмолизом или аутолизом. В культуру дрожжевых клеток также могут быть добавлены один или несколько очищенных протеолитических ферментов. Гидролиз можно осуществить, как описано ниже в разделе о дрожжевых экстрактах.
Дрожжевой экстракт
В одном из вариантов осуществления изобретения один или несколько экстрагируемых компонентов представляют собой дрожжевой экстракт. Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретение относится к способу получения дрожжевого экстракта, включающему: i) обработку дрожжевых клеток очищенной фосфолипазой; и ii) гидролиз белка обработанных дрожжевых клеток; и iii) удаление компонентов дрожжевых клеток; где стадию ii) проводят перед, после или во время стадии i).
Дрожжевой экстракт представляет собой концентрат растворимого вещества, полученного из культур дрожжевых клеток после гидролиза клеточного материала, преимущественно белков, растворимых углеводов и нуклеиновых кислот. Дрожжевые экстракты можно использовать в пищевой промышленности в качестве ароматизаторов/ усилителей запаха, а также в стимуляции микробного роста в промышленных ферментерах. Ценность дрожжевых экстрактов в большой степени зависит от количества белка в экстракте, существует, таким образом, желание достигнуть максимально возможного выхода белка. Сырой материал для продукции дрожжевых экстрактов может представлять собой любую культуру дрожжевых клеток из любого источника. Как правило, сырой материал представляет собой либо культуру дрожжевых клеток, выращенную специально для продукции экстракта дрожжевых клеток, либо отработанные пивные дрожжи, которые отбрасываются пивоварами после использования в приготовлении пива. Получение дрожжевого экстракта хорошо известно в данной области. К культурам дрожжей, используемым для получения дрожжевого экстракта, относятся, например, штаммы рода Saccharomyces, например, S. cerevisiae, S. uvarum; штамм рода Kluyveromyces, например, K. fragilis и K. marxianus, и штаммы рода Candida, например, C. utilis. При использовании отработанных пивных дрожжей перед получением экстракта из них часто устраняют горечь, чтобы удалить горький привкус, например, отмывкой при значениях рН 8-9.
Гидролиз, как правило, осуществляют в виде аутолизиса, при котором для разрушения клеток и гидролиза компонентов клетки используют собственные гидролитические ферменты дрожжевых клеток. В процессе аутолиза чтобы достичь гибели дрожжевых клеток без инактивации внутренних ферментов, обычно контролируют значение рН и температуру. Аутолиз можно проводить, например, при значении рН 7 при 55-60°С в течение 20 часов. Специалист может менять значение рН и температуру подходящим образом для конкретной культуры дрожжей и желаемых вкусовых характеристик. Значения рН и температуры также могут влиять на выход полученного экстракта. Степень аутолиза можно оценить, например, с помощью отношения аминного азота (AN) к количеству общего азота (TN) в аутолизате. Для сильно аутолизованных сред соотношение AN/TN обычно составляет 0,4-0,5.
Для облегчения гидролиза могут быть добавлены один или несколько гидролитических ферментов. Для повышения степени гидролиза белков наиболее распространенным является добавление протеазы. Можно использовать любую протеазу, активную в конкретных условиях, зависящих от желаемых характеристик продукта. Используемая протеаза может быть, например, животного, растительного или микробного происхождения, например, полученной из бактерии или гриба. К протеазам, которые могут быть добавлены, относятся папаин, субтилизин, например, субтилизин Carlsberg, или протеазы грибов, например, полученные из штамма рода Aspergillus, например, A. oryzae. К примерам коммерческих протеаз, которые можно использовать в способе по изобретению, относятся Alcalase и Flavourzyme, обе можно получить от производителя Novozymes A/S, Bagsværd, Denmark. В одном из вариантов осуществления изобретения для облегчения гидролиза белка добавляют одну или несколько очищенных протеаз.
Гидролиз также может быть получен плазмолизом, при котором добавляют соединение, например хлорид натрия, этилацетат или изопропанол, которое индуцирует гибель и разрушение клеток, что приводит к высвобождению внутренних гидролитических ферментов. Аутолиз и плазмолиз можно сочетать, например, добавляя в среду хлорид натрия после проведения процесса аутолиза в течение определенного периода времени.
Для получения гидролиза компонентов дрожжевых клеток также можно использовать кислотный гидролиз. Кислотный гидролиз может быть осуществлен, например, добавлением к дрожжевой культуре соляной кислоты, как правило, дрожжевая культура должна находиться в форме суспензии с концентрацией твердой фазы 65-80%. Гидролиз часто осуществляют при повышенных температурах, например, вплоть до около 100°С, и он может быть проведен, например, в испарителе с падающей пленкой. После достижения необходимого уровня аминного азота гидролизат можно отьюстировать до желаемого значения рН, например, рН 5-7, как правило, гидроксидом натрия.
После гидролиза для получения дрожжевого экстракта лишние компоненты, обычно не гидролизованные фрагменты клеток, удаляют путем выделения. Выделение можно осуществить любым подходящим способом, известным в данной области, обычно центрифугированием и/или фильтрацией. Экстракт может быть подвергнут пастеризации для уничтожения любых растительных клеток, инактивации ферментов и предотвращения роста микробиологических контаминантов. Экстракт, как правило, необходимо сконцентрировать, например, испарением в испарителе с падающей пленкой. Для получения порошка дрожжевого экстракта концентрат также можно высушить, например, сушкой с распылением или сушкой в барабанной сушилке. Конечный продукт, как правило, продается в виде жидкости, пасты или порошка.
Фосфолипаза
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
К фосфолипазе, используемой в способе по настоящему изобретению, относятся фосфолипаза А, фосфолипаза А, фосфолипаза В, фосфолипаза С и фосфолипаза D и любое их сочетание. В способе по изобретению культуру дрожжевых клеток обрабатывают фосфолипазой, например, единственной фосфолипазой; двумя или несколькими фосфолипазами, например, двумя фосфолипазами, включая без ограничения обработку обоими типами А и В; обоими типами Аи А; обоими типами Аи В; обоими типами Аи В; обоими типами Аи С; обоими типами Аи С; или обработку двумя или несколькими различными фосфолипазами одного и того же типа. Включается также обработка одним типом фосфолипазы, таким как А, А, В, С или D.
Фосфолипазная активность может обеспечиваться ферментами, обладающими и другими видами активностей, такими как, например, липаза с фосфолипазной активностью. Фосфолипазной активностью может обладать, например, липаза с побочной фосфолипазной активностью. В других вариантах осуществления изобретения фосфолипазная ферментная активность создается ферментом, обладающим по существу лишь фосфолипазной активностью и в котором фосфолипазная ферментная активность не является побочной активностью.
1
В соответствии со стандартной ЕС-классификацией ферментов фосфолипазу А определяют как ЕС 3.1.1.32.
1
Официальное название: Фосфолипаза А.
Катализируемая реакция:
фосфатидилхолин+вода⇔2-ацилглицерофосфохолин+анион жирной кислоты.
Примечание: обладает более широкой специфичностью, чем ЕС 3.1.1.4.
2
В соответствии со стандартной ЕС-классификацией ферментов фосфолипазу А определяют как ЕС 3.1.1.4.
2
Официальное название: Фосфолипаза А.
Альтернативные названия: фосфатидилхолин 2-ацилгидролаза, лецитиназа а; фосфатидаза; или фосфатидолипаза.
Катализируемая реакция:
фосфатидилхолин+вода⇔1-ацилглицерофосфохолин+анион жирной кислоты.
Примечание: также влияет на фосфатидилэтаноламин, холин-плазмалоген и фосфатиды, удаляя жирную кислоту, присоединенную во 2-позиции.
В соответствии со стандартной ЕС-классификацией ферментов фосфолипазу В определяют как ЕС 3.1.1.5.
Официальное название: лизофосфолипаза.
Альтернативные названия: лецитиназа b; лизолецитиназа; фосфолипаза В; или PLB.
Катализируемая реакция:
2-лизофосфатидилхолин+вода ⇔ глицерофосфохолин+анион жирной кислоты.
В соответствии со стандартной ЕС-классификацией ферментов фосфолипазу С определяют как ЕС 3.1.4.3.
Фосфолипаза С гидролизует фосфатную связь фосфатидилхолина и других глицерофосфолипидов, например, фосфатидилэтаноламина, приводя к образованию диацилглицерина; этот фермент также будет гидролизовать фосфатные связи сфингомиелина, кардиолипина, холин-плазмалогена и церамид фосфолипидов.
Реакция с фосфатидилхолином:
фосфатидилхолин+вода⇔1,2-диацилглицерин+фосфат холина.
В соответствии со стандартной ЕС-классификацией ферментов фосфолипазу D определяют как ЕС 3.1.4.4.
Фосфолипаза D гидролизует фосфатные связи фосфолипидов и сфингомиелина с образованием соответствующей фосфатидной кислоты.
Реакция с фосфатидилхолином: фосфатидилхолин+вода ⇔ холин+фосфатидат.
Фосфолипаза А
1
2
Активность фосфолипазы А, включая фосфолипазу А, фосфолипазу А и их сочетания, может быть получена с помощью ферментов, обладающих равным образом и другими активностями, таких как, например, липаза с активностью фосфолипазы А. Активностью фосфолипазы А может обладать, например, липаза с побочной фосфолипазной активностью. В других вариантах осуществления изобретения ферментная активность фосфолипазы А обеспечивается ферментом, обладающим по существу лишь активностью фосфолипазы А и в котором ферментная активность фосфолипазы А не является побочной активностью.
Фосфолипаза А может иметь любое происхождение, например, быть животного происхождения (такой как, например, от млекопитающих), например, из поджелудочной железы (например, поджелудочной железы быка или свиньи), или змеиного яда или пчелиного яда. Альтернативно, фосфолипаза А может иметь микробное происхождение, например, из гифомицетов, дрожжей или бактерий, таких как род или вид Aspergillus, например, A. niger; Dictyostelium, например, D. Discoideum; Mucor, например, M. javanicus, M. mucedo, M. subtilissimus; Neurospora, например, N. crassa; Rhizomucor, например, R. pusillus; Rhizopus, например, R. arrhizus, R. japonicus, R. stolonifer; Sclerotinia, например, S. libertiana; Trichophyton, например, T. rubrum; Whetzelinia, например, W. sclerotiorum; Bacillus, например, B. megaterium, B. subtilis; Citrobacter, например, C. freundii; Enterobacter, например, E. aerogenes, E. cloacae Edwardsiella, E. tarda; Erwinia, например, E. herbicola; Escherichia, например, E.coli; Klebsiella, например, K. pneumoniae; Proteus, например, P. vulgaris; Providencia, например, P. stuartii; Salmonella, например, S. typhimurium; Serratia, например, S. liquefasciens, S. marcescens; Shigella, например, S. flexneri; Streptomyces, например, S. violaceoruber; Yersinia, например, Y. enterocolitica. Таким образом, фосфолипаза А может быть получена из грибов, например, из класса Pyrenomycetes, например, рода Fusarium, например, штамма F. culmorum, F. heterosporum, F. solani или штамма F. oxysporum. Фосфолипаза А также может быть получена из штамма гифомицетов, принадлежащего к роду Aspergillus, такого как штамм Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus niger или Aspergillus oryzae. Предпочтительную фосфолипазу А получают из штамма рода Fusarium, в частности F. venenatum или F. oxysporum, например, из штамма DSM2672, как описано в WO 98/26057, главным образом, в пункте 36 формулы изобретения и SEQ ID NO. 2 заявки WO 98/26057. Другой предпочтительной фосфолипазой А является PLA2 из рода Streptomyces, такая как, например, PLA2 из S. violaceoruber. В дополнительных вариантах осуществления фосфолипаза представляет собой фосфолипазу, описанную в WO 00/32758 (Novozymes A/S, Denmark).
Активность фосфолипазы типа А может быть выражена, например, в единицах лецитазы (LEU). Фосфолипазную активность в единицах лецитазы определяют относительно стандарта фосфолипазы, используя в качестве субстрата лецитин. Фосфолипаза А катализирует гидролиз лецитина до лизолецитина и свободной жирной кислоты. Освобожденную жирную кислоту титруют 0,1 N раствором гидроксида натрия в стандартных условиях (рН 8,00; 40,00°С ±0,5). Активность фосфолипазы А определяют как степень потребления гидроксида натрия в процессе нейтрализации жирной кислоты и выражают в единицах лецитазы (LEU) относительно лецитазного (фосфолипазного) стандарта (доступен от производителя Novozymes A/S, Bagsværd, Denmark). 1 LEU определяют как количество фермента, которое в стандартных условиях (рН 8,00; 40,00°С ±0,5) приводит к той же степени потребления гидроксида натрия (мкмоль/мин), что и лецитазный стандарт, разведенный до условной активности 1 LEU/г.
Фосфолипаза В
Под термином «фосфолипаза В», использованным в данном документе в связи с ферментом по изобретению, понимают фермент с активностью фосфолипазы В.
Активность фосфолипазы В можно получить с помощью ферментов, обладающих равным образом и другими активностями, такими как, например, липаза с активностью фосфолипазы В. Активность фосфолипазы В можно получить, например, от липазы с побочной активностью фосфолипазы В. В других вариантах осуществления изобретения ферментная активность фосфолипазы В обеспечивается ферментом, обладающим по существу лишь активностью фосфолипазы В и в котором ферментная активность фосфолипазы В не является побочной активностью. В одном из вариантов осуществления изобретения фосфолипаза В не представляет собой липаз, обладающих побочной активностью фосфолипазы В, как определено в WO 98/26057.
Фосфолипаза В может быть получена из любого источника, например, быть животного происхождения (такой как, например, от млекопитающих), например, из печени (например, печени крысы). Альтернативно, фосфолипаза В может быть микробного происхождения, например, из гифомицетов, дрожжей или бактерий, таких как род или вид Aspergillus, например, A. foetidus, A. fumigatus, A. nidulans, A. niger, A. oryzae; Botrytis, например, B. cinerea; Candida, например, C. albicans; Cryptococcus, например, C. neoformans, Escherichia, например, E. coli, Fusarium, например, F. sporotrichioides, F. venenatum, F. verticillioides; Hyphozyma; Kluyveromyces, например, K. lactis; Magnaporte, например, M. grisea; Metarhizium, например, M. anisopliae; Mycosphaerella, например, M. graminicola; Neurospora, например, N. crassa; Penicillium, например, P. notatum; Saccharomyces, например, S. cerevisiae; Schizosaccharomyces, например, S. pombe; Torulaspora, например, T. delbrueckii; Vibrio; например, V. cholerae. Предпочтительную фосфолипазу В получают из штамма рода Aspergillus, в частности, фосфолипазу LLPL-1 или LLPL-2 из A. niger, например, содержащуюся в клонах Escherichia coli DSM 13003 или DSM 13004, или фосфолипазу LLPL-1 или LLPL-2 из A. oryzae, например, содержащуюся в клонах E. coli DSM 13082 или DSM 13083, как описано в WO 01/27251, конкретно в пункте 1 формулы изобретения и SEQ ID NOs. 2, 4, 6 или 8 заявки WO 01/27251.
Фосфолипаза С
Активность фосфолипазы С может быть получена с помощью ферментов, обладающих равным образом и другими активностями, таких как, например, липаза с активностью фосфолипазы С или фосфатаза с активностью фосфолипазы С. Активность фосфолипазы С может исходить, например, от липазы с побочной активностью фосфолипазы С. В других вариантах осуществления изобретения ферментная активность фосфолипазы С обеспечивается ферментом, обладающим по существу лишь активностью фосфолипазы С и в котором ферментная активность фосфолипазы С не является побочной активностью.
Фосфолипаза С может быть получена из любого источника, например, быть животного происхождения, например, от млекопитающего, растительного происхождения или микробного происхождения, например, из грибов или бактерий, например, из штамма рода Mycobacterium, например, M. tuberculosis или M. bovis; штамма рода Bacillus, например, B. cereus; штамма рода Clostridium, например, C. bifermentans, C. haemolyticum, C. novyi, C. sordellii или C. perfringens; штамма рода Listeria, например, L. monocytogenes; штамма рода Pseudomonas, например, P. aeruginosa; или штамма рода Staphylococcus, например, S. aureus; или штамма рода Burkholderia, например, B. pseudomallei.
Фосфолипаза D
Активность фосфолипазы D может быть получена с помощью ферментов, обладающих равным образом и другими активностями, таких как, например, липаза с активностью фосфолипазы D, фосфатаза с активностью фосфолипазы D или холинэстераза с активностью фосфолипазы D. Активность фосфолипазы D может исходить, например, от липазы с побочной активностью фосфолипазы D. В других вариантах осуществления изобретения ферментная активность фосфолипазы D обеспечивается ферментом, обладающим по существу лишь активностью фосфолипазы D и в котором ферментная активность фосфолипазы D не является побочной активностью.
Фосфолипаза D может происходить из любого источника, например, быть животного происхождения, например, от млекопитающего, например, от мыши, крысы или китайского хомячка; растительного происхождения, например, из капусты, кукурузы, риса, касторового боба, табака, коровьего гороха или Arabidopsis thaliana; или микробного происхождения, например, бактериального происхождения, например, из штамма рода Corynebacterium, например, C. pseudotuberculosis, C.ulcerans или C. haemolyticum; или грибкового происхождения, например, из штамма рода Streptomyces, например, S. antibioticus или S. chromofuscus; штамма рода Trichoderma, например, T. reesei; штамма рода Saccharomyces, например, S. cerevisiae; или штамма рода Aspergillus, например, A. oryzae, A. niger, A. nidulans или A. fumigatus.
Источники фермента и формулировка
Фосфолипаза, использованная в способе по изобретению, может быть получена или доступна из любого упомянутого в данном документе источника. Термин «полученный» в этом контексте означает, что фермент может быть выделен из организма, в котором он присутствует исходно, т.е. вид аминокислотной последовательности фермента идентичен исходному ферменту. Термин «полученный» также означает, что ферменты можно продуцировать с помощью рекомбинантных технологий в организме-хозяине, причем фермент, полученный посредством рекомбинаций, либо имеет вид, идентичный нативному ферменту, либо имеет модифицированную аминокислотную последовательность, например, имеет одну или несколько аминокислот, которые являются удаленными, вставленными и/или замещенными, т.е. фермент, полученный посредством рекомбинаций, является мутантом и/или фрагментом исходной аминокислотной последовательности. В понятие нативного фермента включаются природные варианты. Более того, термин «полученный» включает ферменты, продуцированные искусственным способом, например, пептидным синтезом. Термин «полученный» также охватывает ферменты, которые модифицировали, например, путем гликозилирования, фосфорилирования и т.д. либо in vivo, либо in vitro. Термин «доступный» в этом контексте означает, что фермент имеет аминокислотную последовательность, идентичную нативному ферменту. Термин охватывает фермент, который выделили из организма, в котором он присутствует исходно, или из организма того же или другого типа, в котором его экспрессировали с помощью рекомбинантных технологий, или ферменты, продуцированные искусственным образом, например, пептидным синтезом. В отношении фермента, полученного рекомбинантным способом, термины «доступный» и «полученный» относятся к виду фермента, а не к виду организма-хозяина, в котором его получают рекомбинантным способом.
Соответственно, фосфолипаза может быть получена из микроорганизма с использованием любой подходящей техники. Например, ферментный препарат фосфолипазы может быть получен путем культивирования подходящего микроорганизма и последующего выделения препарата фосфолипазы из полученного ферментационного бульона или микроорганизма способами, известными в данной области. Фосфолипаза также может быть получена с использованием технологии рекомбинантных ДНК. Такой способ обычно включает культивирование клетки-хозяина, трансформированной рекомбинантным ДНК-вектором, содержащим последовательность ДНК, кодирующую рассматриваемую фосфолипазу и последовательность ДНК, функционально связанную с соответствующим сигналом экспрессии так, что он способен экспрессировать фосфолипазу в культуральной среде в условиях, позволяющих экспрессию фермента и получение фермента из культуры. Последовательность ДНК также может быть встроена в геном клетки-хозяина. Последовательность ДНК может быть геномной, кДНК или искусственно синтезированной или представлять собой любые их сочетания, и может быть выделена или синтезирована в соответствии со способами, известными в данной области.
TM
Подходящие фосфолипазы являются коммерчески доступными. К примерам коммерческих ферментов относятся, например, Lecitase (Novozymes A/S, Bagsværd, Denmark), YieldMAX (Novozymes A/S, Bagsværd, Denmark и Chr. Hansen S/S, Hørsholm, Denmark), Lysomax (Genencor International, Inc., Palo Alto, California) или Purifine (Diversa Corp., San Diego, California). Подходящая фосфолипаза В представляет собой, например, фосфолипазу LLPL-2 из Aspergillus niger, которую можно получить рекомбинантными технологиями в A. niger, как описано в WO 01/27251.
В способе по изобретению фосфолипаза представляет собой очищенную фосфолипазу. Термин «очищенный» в рамках изобретения включает ферментные препараты фосфолипазы, в которых были удалены компоненты организма, из которого ее получают. Термин «очищенный» также включает белок фермента фосфолипазы, свободный от компонентов исходного организма, из которого его получают, что также называют «фактически чистая» фосфолипаза, термин может преимущественно относиться к фосфолипазам, которые встречаются в природе и которые не модифицировали генетически, например, делецией, заменой или инсерцией одного или нескольких аминокислотных остатков.
Соответственно, фосфолипаза является очищенной, то есть в ней присутствуют лишь минорные количества других белков. Выражение «другие белки» относится, в частности, к другим ферментам. Термин «очищенная» в рамках изобретения также относится к удалению других компонентов, в особенности других белков и, что особенно важно, других ферментов, присутствующих в клетке источника фосфолипазы. Фосфолипаза может быть «по существу чистой», т.е. свободной от других компонентов организма, из которого она получена, т.е., например, организма-хозяина в отношении фосфолипазы, получаемой с помощью рекомбинантных техник. Предпочтительно ферменты являются по меньшей мере на 75% (по массе) чистыми, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или даже по меньшей мере на 95% чистыми. В еще более предпочтительном варианте осуществления фосфолипаза является по меньшей мере на 98% чистым препаратом белка-фермента.
Термин «фосфолипаза» включает любые вспомогательные компоненты, которые могут быть необходимы для каталитической активности фермента, такие как, например, подходящий акцептор или кофактор, которые могут или не могут присутствовать в реакционной системе в природе.
Фосфолипаза может находиться в любой форме, подходящей для рассматриваемого использования, такой как, например, сухой порошок или гранулят, непылящий гранулят, жидкость, стабилизированная жидкость или защищенный фермент. Грануляты могут быть получены, например, как описано в US 4106991 и US 4661452 и при желании могут быть покрыты способами, известными в данной области. Жидкие ферментные препараты могут быть стабилизированы, например, добавлением стабилизаторов, таких как сахар, сахарный спирт или другой полиол, молочная кислота или другая органическая кислота, в соответствии с установленными способами. Защищенные ферменты могут быть получены по способу, описанному в ЕР 238216.
Обработка фосфолипазой
В соответствии с изобретением дрожжевые клетки обрабатывают очищенной фосфолипазой. Обработку можно провести любым подходящим способом, например, добавлением фосфолипазы к культуре дрожжевых клеток. При обработке фосфолипазой культура дрожжевых клеток может быть, например, суспендирована в воде. Обработку фосфолипазой можно провести перед, после или одновременно с гидролизом белка культуры дрожжевых клеток.
Подходящие условия для осуществления обработки фосфолипазой специалист может найти среди принятых способов, известных в данной области, для оптимизации ферментативных реакций. Специалист должен знать, как подобрать параметры, такие как рН, температура и количество фосфолипазы для достижения желаемых результатов. В одном из вариантов осуществления изобретения обработку фосфолипазой проводят при значениях рН от рН 2 до рН 10, например, от рН 3 до рН 9, от рН 2 до рН 6, или от рН 4 до рН 6. Количество фосфолипазы, используемой в способе по изобретению, может зависеть от активности конкретной фосфолипазы. При использовании фосфолипазы А количество фосфолипазы может находиться, например, в интервале от 0,001 до 1 мг ферментного белка/г сухого вещества, например, от 0,005 до 0,1 мг ферментного белка/г сухого вещества. В одном из вариантов осуществления изобретения фосфолипазу добавляют в количестве, достаточном для достижения повышенного выхода одного или нескольких экстрагируемых компонентов по сравнению с аналогичным процессом экстракции, при котором обработку фосфолипазой не проводят. Выход может быть увеличен, например по меньшей мере на 1%, например по меньшей мере на 2%, по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10% или по меньшей мере на 20%.
1
В одном из вариантов осуществления изобретение относится к применению очищенной фосфолипазы, например, фосфолипазы А, для экстракции одного или нескольких компонентов из культуры дрожжевых клеток.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Saccharomyces cerevisia
Объединенную культуру дрожжевых клеток  смешивали с деионизованной водой до получения 14% содержания сухого вещества и перемешивали с помощью магнитной мешалки в течение 60 мин при комнатной температуре. Количество азота в этой дрожжевой смеси определяли способом окисления на анализаторе Leco FP-528. Взвешиванием определяют сухой остаток в дрожжевой смеси (после высушивания при 105°С). Дрожжевую смесь нагревали до 55°С и доводили значение рН 4N раствором NaOH до 6,5. Образцы обрабатывали 0,25% (по массе сухого вещества дрожжевых клеток) раствором фосфолипазы (Lecitase Ultra, 10 кLU/г Novozymes A/S, Denmark) и/или 0,5% (по массе сухого вещества дрожжевых клеток) раствором протеолитического фермента (Alcalase 2,4L, Novozymes A/S, Denmark). Ферменты добавляли к дрожжевой смеси после десятиминутного предварительного нагрева при 55°С. Контрольный образец (blank) ферментом не обрабатывали. Аутолизис осуществляли в течение 22 часов при 55°С при перемешивании с использованием магнита. Образцы объемом 20 мл вынимали и взвешивали точное количество. Образцы инактивировали при 85°С в течение 10 мин. После инактивации образцы центрифугировали в течение 10 мин при 3500 об/мин, используя центрифугу Multifuge 3S-R фирмы Heraeus. После декантации взвешивали количество экстракта. Путем взвешивания (после высушивания при 105°С) в экстракте измеряли сухой осадок. Количество азота в экстракте определяли способом окисления на анализаторе Leco FP-528. Количество белка рассчитывали как 6,25-кратное количество азота. Свободный аминный азот определяли, используя способ ОРА (о-фталдиальдегид). На основании указанных выше измерений рассчитывали следующие показатели:
Выход экстракта (%)=(масса экстракта в граммах после центрифугирования)/(масса дрожжевой смеси в граммах перед центрифугированием)*100
Выход белка (%)=(масса экстракта в граммах после центрифугирования* Содержание белка в экстракте)/(масса дрожжевой смеси в граммах перед центрифугированием* содержание белка в дрожжевой смеси)*100
Степень гидролиза=(Количество расщепленных пептидных связей/общее количество пептидных связей)*100=(h/htot)*100,
где h выражается как функция мэкв NH2 серина: h=(NH2 серина -0,4)/1; и htot=7,8. NH2 серина определяли, измеряя поглощение при 340 нм относительно стандарта серина, содержащего 100 мг/л.
Результаты, основанные на двукратных определениях, представлены в Таблице 1
Таблица 1
Фермент
Выход белка (%)
Выход экстракта (%)
Степень гидролиза
Blank
21,2
62,1
33,9
0,5% алкалаза 2,4L
59,2
60,9
66,9
0,25% лецитаза ультра
21,8
61,8
35,7
0,5% алкалаза 2,4L0,25% лецитаза ультра
67,4
66,8
61,1
Пример 2
Дрожжевой экстракт получали тем же способом, как и в Примере 1, за исключением того, что использовали отличную фосфолипазу (YieldMax, Chr. Hansen A/S и Novozymes A/S, Denmark) и ферментную обработку осуществляли при 40°С и значении рН 6,0. Результаты представлены в Таблице 2 (однократные определения).
Таблица 2
Фермент
Выход белка (%)
Выход экстракта (%)
Степень гидролиза
Blank
13,9
64,0
36,6
0,5% алкалаза 2,4L
15,2
64,7
41,5
0,5% YieldMax
13,4
63,7
37,3
0,5% алкалаза 2,4L0,5% YieldMax
24,0
64,4
29,6
Пример 3
Saccharomyces cerevisia
Объединенную культуру дрожжевых клеток  смешивали с деионизованной водой до получения 14% содержания сухого вещества и перемешивали с помощью магнитной мешалки в течение 60 мин при комнатной температуре. Количество азота в этой дрожжевой смеси определяли способом окисления на анализаторе Leco FP-528. Взвешиванием определяли сухой остаток в дрожжевой смеси (после высушивания при 105°С). Дрожжевую смесь нагревали до 55°С и либо использовали при природном значении рН (около 5-5,3), либо рН доводили 4N раствором NaOH до значения 5,8. Образцы обрабатывали 0,25% (по массе сухого вещества дрожжевых клеток) раствором фосфолипазы (Lecitase Ultra, 10 кLU/г Novozymes A/S, Denmark) и/или 0,3% (по массе сухого вещества дрожжевых клеток) раствором протеолитического фермента (Papain, Pang Bo Biological Co. Ltd). Ферменты добавляли к дрожжевой смеси после десятиминутного предварительного нагрева при 55°С. Контрольный образец (blank) ферментом не обрабатывали. Аутолизис осуществляли в течение 22 часов при 55°С при перемешивании с использованием магнита. Образцы объемом 30 мл вынимали и взвешивали точное количество. Образцы инактивировали при 85°С в течение 10 мин. После инактивации образцы центрифугировали в течение 10 мин при 3500 об/мин, используя Multifuge 3S-R фирмы Heraeus. Анализ экстрактов описан в Примере 1. Мутность определяли, используя нефелометр 2100AN фирмы HACH.
Результаты, основанные на двукратных определениях, показаны в Таблице 3.
Таблица 3
Фермент
Значение рН в гидролизате
Выход белка (%)
Выход экстракта (%)
Степень гидролиза
Мутность (NTU)
Контроль
5
47,2
66,7
48,6
3820
0,25% лецитаза ультра
5
52,5
65,9
45,9
1421
Контроль с приведенным значением рН
5,8
24,8
64,5
44,3
1579
0,25% лецитаза ультра
5,8
26,1
64,6
47,93
1449
0,3% папаин
5,8
63,5
68,8
71,8
2179
0,3% папаин и 0,25% лецитаза ультра
5,8
66,5
67,3
67,8
157