Способ прогнозирования риска снижения эффективности антиагрегантной терапии
METHOD FOR PREDICTION OF ANTIPLATELET THERAPY EFFICIENCY REDUCTION RISK

Изобретение относится к области медицины, а именно к кардиологии, и может быть использовано для определения тактики антиагрегантной терапии у больных ишемической болезнью сердца после стентирования коронарных артерий.
Успешность лечения ишемической болезни сердца (ИБС) в значительной степени определяется поддержанием адекватного коронарного кровотока, в том числе путем проведения стентирования коронарных артерий (СКА) [1]. Сохранение положительных результатов после СКА зависит от профилактики последующих тромботических осложнений. С этой целью пациентам назначают антиагрегантную терапию, включающую клопидогрел и препараты ацетилсалициловой кислоты (АСК). Однако у части пациентов такая антиагрегантная терапия может быть не эффективной [2]. Причиной этого является индивидуальная чувствительность к препаратам. Для ее учета проводят специальный лабораторный тест.
Известен способ определения индивидуальной эффективности клопидогрела и препаратов ацетилсалициловой кислоты по результатам агрегометрии [3]. Этот способ предполагает лабораторное определение агрегации тромбоцитов, в ответ на действие различных индукторов. Недостатком способа является то, что он не позволяет прогнозировать риск снижения эффективности антиагрегантной терапии [4].
В проанализированной патентной и научной литературе адекватного прототипа не обнаружено.Таким образом, создание способа прогнозирования риска снижения эффективности антиагрегантов после СКА является весьма актуальным.
Задачей изобретения является создание способа, позволяющего прогнозировать риск снижения эффективности антиагрегантной терапии клопидогрелем и препаратами АСК у больных ИБС, подвергшихся стентированию коронарных артерий.
Поставленную задачу решают следующим образом.
В условиях стационара на фоне приема клопидогрела и аспирина пациенту выполняют лабораторный тест индуцированной агрегации тромбоцитов. Если на основании результатов теста выявляется резистентность к используемым препаратам, то лечащий врач осуществляет подбор адекватной антиагрегантной терапии в соответствии с принятыми рекомендациями. В случаях, когда антиагрегантная терапия блокирует реактивность тромбоцитов, пациентам выполняют исследование полиморфизма Т-786С гена NOS3. При обнаружении у пациента носительства генотипа 786СС гена NOS3 прогнозируют повышенный риск снижения эффективности антиагрегантов и формирования к ним резистентности. Такие пациенты нуждаются в более тщательном наблюдении для своевременной коррекции терапии.
Известно, что процесс тромбообразования определяется и состоянием эндотелия сосудов. В реализации функций эндотелия важную роль играет оксид азота (NO), который не только участвует в процессах релаксации и снижении миграции и пролиферации гладкомышечных клеток, но и ингибировании адгезии тромбоцитов и лейкоцитов к эндотелию, замедлении образования артериальных тромбов. В то же время в результате снижения синтеза NO эндотелий может менять свой антитромботический потенциал на тромбогенный [5]. Синтез NO регулируется через изменение экспрессии или активности эндотелиальной NO-синтазы 3 типа, кодируемой геном NOS3. Мутация Т-786С в промоторной области гена NOS3 приводит к пониженной транскрипции гена, что, в свою очередь, определяет недостаток наработки эндотелиальной NO-синтазы и является причиной снижения синтеза и высвобождения NO и дисфункции эндотелия [6].
Нами впервые выявлено сопряжение полиморфизма Т-786С гена NOS3 с риском снижения эффективности клопидогрела и препаратов АСК. Установлено, что у больных ИБС, являющихся носителями аллеля -786С полиморфизма Т-786С гена NOS3 прогнозируется высокий риск снижения эффективности антиагрегантных препаратов - клопидогрела и АСК.
Признаки, характеризующие изобретение, проявили в заявляемой совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и не являющиеся очевидными для специалиста. Идентичной совокупности признаков не обнаружено при изучении патентной и научно-медицинской литературы.
Данное изобретение может быть использовано в практическом здравоохранении для прогнозирования риска снижения эффективности антиагрегантной терапии у больных ИБС, в том числе пациентов, подвергшихся стентированию коронарных артерий и своевременной коррекции проводимой терапии.
Исходя из вышеизложенного, следует считать предлагаемый способ соответствующим условиям патентоспособности: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».
Способ осуществляют следующим образом.
У пациента с диагнозом ИБС, планируемого к эндоваскулярному вмешательству, забирают 2 мл венозной крови в вакутейнер с ЭДТА. Из полученного биологического материала, стандартным методом выделения ДНК. В образцах ДНК определяют полиморфизм Т-786С гена NOS3. При выявлении у пациента носительства генотипа -786СС гена NOS3 прогнозируется повышенный риск сниженной эффективности клопидогрела и препаратов АСК.
Способ апробирован при наблюдении за 222 пациентами с диагнозом хроническая ишемическая болезнь сердца в форме стенокардии напряжения и перенесенного инфаркта миокарда (ИМ) давностью не менее 6 месяцев, направленных на стентирование коронарных артерий. Тест индуцированной агрегации тромбоцитов с АДФ в концентрации 2,5 и 5,0 мкМ (оценка эффективности клопидогрела) и эпинефрином в концентрации 0,2 мкМ (оценка эффективности препаратов АСК) проводили с использованием оригинальных реактивов на агрегометре AggRAM™ (Helena Laboratories, Великобритания). До проведения теста агрегации тромбоцитов пациенты получали клопидогрел в суммарной дозе 300 мг и препараты АСК. Когда степень агрегации превышала 68%, диагностировали лабораторную резистентность к препарату. Пациенту, в условиях стационара, подбирают адекватную антиагрегантную терапию в соответствии с принятыми рекомендациями. При агрегации в пределах от 45 до 68% делали заключение о недостаточной эффективности клопидогрела или препарата АСК. При степени агрегации менее 45% эффективность клопидогрела или препарата АСК считалась нормальной.
Из лейкоцитов венозной крови пациентов выделяли ДНК стандартным методом с осаждением изопропанолом с последующей отмывкой 70% этанолом. Полиморфные варианты Т-786С гена NOS3 определили путем аллель-специфичной ПЦР с помощью коммерческого набора «SNP-экспресс» (НПФ «Литех», Россия). Детекцию продуктов ПЦР проводили электрофоретическим методом в 3% агарозном геле, содержащем 1 мкг/мл бромистого этидия. Сравнительный анализ частоты случаев отсутствия эффекта, сниженной и нормальной эффективности клопидогрела и препараты АСК, а также степени агрегации тромбоцитов между носителями генотипов -786ТТ, -786ТС, -786СС гена NOS3 осуществляли с помощью теста Крускала-Уолиса с поправкой Бонферрони для анализа количественных данных; с помощью критерия χ2 Пирсона и Ζ test для сравнения дискретных величин. Вероятность снижения эффективности клопидогрела и препараты АСК оценивали на основе расчета показателя отношения шансов (OR). Уровень значимости был принят за p<0,05.
Согласно данным в таблице 1, среди носителей гомозиготного генотипа -786СС достоверно чаще встречались случаи не эффективности клопидогрела и препаратов АСК, чем среди носителей других генотипов. Для аллеля -786С, показатель OR к клопидогрелу составил 2,23 [95% CI: 1,07-4,66] (р=0,030), а препаратам АСК - 2,05 [95% CI: 1,07-3,91] (р=0,029).
Результаты теста индуцированной агрегации тромбоцитов, отраженные в таблице 2, демонстрируют у носителей генотипа -786СС наибольшую степень агрегации в ответ на АДФ в концентрации 2,5 мкМ (р=0,046) и на эпинефрин (р=0,007) по сравнению с носителями других генотипов. Такой результат свидетельствует о повышенном риске неэффективного использования клопидогрела и препаратов АСК у лиц, являющихся носителями аллеля 786С.
Эффективность оценки полиморфизма Т-786С гена NOS3 для определения риска снижения эффективности клопидогрела и препаратов ацетилсалициловой кислоты у больных ИБС с стентированием коронарных артерий показана на клинических примерах.
Пример 1. Пациент Г., муж., 54 года, диагноз - ИБС, перенесенный ИМ в возрасте 53 лет. При эндоваскулярном вмешательстве имплантировано 2 стента с лекарственным покрытием. Проведен тест индуцированной агрегации тромбоцитов на фоне приема клопидогрела в дозе 75 мг (суммарная доза перед проведением теста - 300 мг) и ацетилсалициловой кислоты в дозе 75 мг. Степень агрегации тромбоцитов в ответ на АДФ 5,0 мкМ составила 80,0%, в ответ на эпинефрин - 90,0%. Имела место лабораторная резистентность к клопидогрелу и ацетилсалициловой кислоте. Вместо клопидогрела пациенту был назначен тикагрелор. Проведен повторный тест агрегации тромбоцитов после нагрузочной дозы тикагрелора 180 мг. Степень агрегации с АДФ составила 40,4%, с эпинефрином - 48,2%. Пациенту рекомендовано принимать тикагрелор вместо клопидогрела.
Пример 2. Пациент М., муж., 61 год, диагноз - ИБС, стенокардия ФК 3, перенесенный ИМ в возрасте 53 лет. При эндоваскулярном вмешательстве имплантирован 1 стент с лекарственным покрытием. Проведен тест индуцированной агрегации тромбоцитов на фоне приема клопидогрела в дозе 75 мг (суммарная доза перед проведением теста - 300 мг) и ацетилсалициловой кислоты в дозе 100 мг. Степень агрегации тромбоцитов в ответ на АДФ 2,5 мкМ была 41,3%, на АДФ 5,0 мкМ - 65,3%. Имела место сниженная эффективность клопидогрела. Степень агрегации в ответ на эпинефрин составила 85,2%. Имела место нечувствительность к ацетилсалициловой кислоте. Проведен повторный тест агрегации тромбоцитов после дополнительной нагрузочной дозы клопидогрела 300 мг (суммарная доза - 600 мг). Степень агрегации тромбоцитов в ответ на АДФ 2,5 мкМ составила 34,9%, на АДФ 5,0 мкМ - 45,1% (нормальная эффективность клопидогрела), на эпинефрин - 77,4% (нечувствительность к ацетилсалициловой кислоте). У пациента выполнен анализ полиморфизма Т-786С гена NOS3. Выявлен генотип 786СС. При наличии данного полиморфного варианта прогнозируется высокий риск снижения эффективности клопидогрела и препаратов ацетилсалициловой кислоты. Через неделю после выполнения стентирования проведен повторный тест АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов. Был получен тот же результат, что и при пробе в ответ на нагрузочную дозу 600 мг клопидогрела. Рекомендовано оценивать эффективность антиагрегантной терапии каждые 2 месяца для своевременного выявления снижения чувствительности к клопидогрелу и коррекции терапии. Через 2 месяца при проведении теста АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов выявлено снижение эффективности клопидогрела. Рекомендовано сменить клопидогрел на тикагрелор.
Пример 3. Пациент 3., муж., 42 года, диагноз - ИБС, стенокардия ФК 2, перенесенный ИМ в возрасте 41 год. При эндоваскулярном вмешательстве имплантирован 1 стент с лекарственным покрытием. Проведен тест индуцированной агрегации тромбоцитов на фоне приема клопидогрела в дозе 75 мг (суммарная доза перед проведением теста - 300 мг) и ацетилсалициловой кислоты в дозе 75 мг. Степень агрегации тромбоцитов в ответ на АДФ 2,5 мкМ была 16,6%, на АДФ 5,0 мкМ - 27,7%. Клопидогрел эффективно подавлял агрегационную активность тромбоцитов. Степень агрегации в ответ на эпинефрин составила 67,5%. Имела место сниженная эффективность ацетилсалициловой кислоты. У пациента выполнен анализ полиморфизма Т-786С гена NOS3. Выявлен геторозиготный генотип 786ТС. Наличие этого генотипа не ассоциировано с риском снижения эффективности ацетилсалициловой кислоты и клопидогрела. Пациенту рекомендовано принимать клопидогрел. Последующее, в течение 6 месяцев, наблюдение за пациентом, не выявило изменений в эффективности клопидогрела.
Таким образом, предлагаемое изобретение может быть использовано в клинической практике при оценке риска формирования резистентности к антиагрегантным препаратам, что позволит своевременно скорректировать антиагрегантную терапию у больных ИБС, после стентирования коронарных артерий, что позволит своевременно скорректировать проводимую терапию и повысить качество лечения.
Литература
1. Савченко А.П., Черкавская О.В., Руденко Б.А., Болотов П.А. Интервенционная кардиология. Коронарная ангиография и стентирование / А.П. Савченко и др. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. - 448 с.
2. Медикаментозное сопровождение чрескожного коронарного вмешательства / под редакцией В.И. Ганюкова, А.В. Протопопова. - Новосибирск: Изд-во «АРЕАЛ», 2014. - 252 с.
3. Современная агрегометрия в оценке эффективности двойной антитромботической терапии у пациентов с сахарным диабетом, перенесших эндоваскулярное лечение / И.З. Бондаренко, И.А. Ширшина, М.В. Шестакова, В.Ю. Калашников, Л.Д. Чиркова, А.В. Ильин // ЭФ. Эндокринология. - 2012. - №2. - С. 47-53.
4. Грацианский Н.А. Антитромбоцитарная терапия при коронарной болезни сердца. Некоторые проблемы и достижения / Н.А. Грацианский // Атеротромбоз. - 2010. - №1. - С. 2-54.
5. Березовская Г.А. Рестеноз и тромбоз внутри стента: патогенетические механизмы развития и прогностические маркеры / Г.А. Березовская, В.И. Ганюков, М.А. Карпенко // Российский кардиологический журнал. - 2012. - Т. 98, №6. - С. 91-95.
6. Т-786С mutation in the 5c-flanking region of the endothelial nitric oxide synthase gene is associated with coronary spasm / M. Nakayama, H. Yasue, M. Yoshimura, Y. Shimasaki, K. Kugiyama, H. Ogawa, T. Motoyama, Y. Saito, Y. Ogawa, Y. Miyamoto, K. Nakao // Circulation. - 1999. - Vol. 99. - P. 2864-2870.