КОМПЛЕКСНАЯ СИСТЕМА ДЛЯ СБОРА, ОБРАБОТКИ И ТРАНСПЛАНТАЦИИ КЛЕТОЧНЫХ СУБПОПУЛЯЦИЙ, ВКЛЮЧАЯ ЗРЕЛЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ, ДЛЯ РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЫ
COMPLEX SYSTEM FOR COLLECTION, PROCESSING AND TRANSPLANTATION OF CELL SUBPOPULATIONS, INCLUDING MATURE STEM CELLS, FOR REGENERATIVE MEDICINE

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к сбору, автоматизированной обработке и трансплантации клеточных субпопуляций, обнаруживаемых в костном мозге, периферической крови, пуповинной крови или жировой ткани, с целью локальной повторной инъекции этих клеток для восстановления тканей. Клеточные субпопуляции в характерном случае представляют собой зрелые стволовые клетки или тромбоциты, но в более общем случае включают в себя любые субпопуляции клеток, подобных эритроцитам и лейкоцитам. Такие процедуры можно будет осуществлять в больничных условиях или в медицинских учреждениях, не имеющих лаборатории для обработки клеток, и они смогут осуществляться техническим персоналом, не специализирующимся в данной области. Изобретение также относится к новому типу оптического сенсора для мониторинга клеточных субпопуляций, проходящих через прозрачную трубку.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Стволовые клетки определяют как клетки, которые обладают способностью к клонированию и самовосстановлению и которые дифференцируются в многочисленные клеточные линии. Хотя эмбриональные стволовые клетки происходят из эмбрионов млекопитающих на стадии бластоцисты и обладают способностью производить любую конечно дифференцированную клетку в организме, зрелые стволовые клетки являются частью тканеспецифичных клеток новорожденного организма, среди которых они помещены для дифференцировки. Зрелые стволовые клетки обладают практическими преимуществами по сравнению с эмбриональными стволовыми клетками. В отличие от последних, они не связаны с каких-либо этическими вопросами и могут быть выделены из самого пациента. Они имеются в изобилии и обнаружены в различных тканях человеческого организма. Как показано недавними исследованиями, наиболее доступные источники зрелых стволовых клеток представляют собой костный мозг, периферическую кровь, пуповинную кровь и, возможно, жировые ткани. Эти клетки способны поддерживать, производить и заменять конечно дифференцированные клетки в пределах их собственной специфической ткани вследствие физиологического оборота клеток или повреждения тканей в результате травмы. Такая способность, известная как клеточная пластичность, привела к разработке терапевтических применений, направленных на регенерацию дефектных тканей с целью восстановления физиологии и функциональности пораженного органа. Как известно уже в течение многих десятилетий, зрелые стволовые клетки могут давать начало кроветворным клеткам, но как обнаружено в последние годы, они могут также давать начало кровеносным сосудам, мышцам, кости, хрящу, коже, нейронам и т.д. Такие клетки известны как мезенхимальные стволовые клетки. Кроме того, тромбоциты, приготовленные в виде концентрата тромбоцитов, могут быть использованы для ускорения раневого заживления и, следовательно, могут играть роль в регенеративной медицине для облегчения реконструкции таких тканей, как кость, кожа или другие ткани.
Кроветворные стволовые клетки использовались в основном для трансплантации пациентам, подвергавшимся химиотерапии, для восстановления их кроветворения. Первоначально выделенные из костного мозга, они были выделены совсем недавно из периферической крови или пуповинной крови, причем эти последние обладают наиболее высокой пролиферативной способностью. Клетки для трансплантации требуют специальной обработки, такой как разделение клеток, иногда с последующими процессами селекции и/или размножения. До настоящего времени такие манипуляции проводились в хорошо оборудованных лабораториях, специализирующихся на работе с клетками, высококвалифицированным персоналом, который компетентен в клеточной биологии и гематологии. Такие манипуляции требуют трудоемких интенсивных лабораторных приготовлений, вовлекающих центрифугирование в пробирках, разделение в градиенте плотности, часто проводимых в открытой системе с риском заражения бактериями и т.д.
Новые перспективы, предложенные стволовыми клетками в области регенеративной медицины, подвергаются сомнениям в связи с практическими проблемами манипуляции с этими клетками в окружающих условиях, которые необычны для этих методик. Одной из основных проблем является отсутствие чистых помещений, делающих возможной безопасную обработку клеток. В качестве примеров можно привести области кардиологии, ортопедии и неврологии, во всех из которых экспериментируют с применением терапии на основе стволовых клеток, но при этом отсутствуют надлежащие условия для обработки клеток. Следовательно, существует потребность в простых системах, которые могут обрабатывать зрелые стволовые клетки или вообще любые клеточные субпопуляции автоматически, в закрытой системе, и быстро, чтобы обеспечить систему обработки клеток в режиме «онлайн» (on-line) у постели пациента.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В изобретении предложена система, делающая возможными выделение, сбор, обработку и трансплантацию клеточных субпопуляций, направленных на восстановление ткани в регенеративной медицине. Система согласно изобретению, как оно определено в пункте 1, включает комплект одноразовых стерильных элементов, содержащийся в упаковке, причем содержащиеся элементы предварительно соединены или включают асептические соединители, или приспособлены для создания соединений между ними асептическим образом для обеспечения функционально закрытой системы. Такая система может быть предложена на носителе, таком как лоток, который включает отдельные наборы для осуществления процедуры. Отдельные наборы могут быть предварительно соединены или могут быть снабжены асептическими соединителями для создания соединений между ними асептическим образом, или могут быть соединены с использованием стерильного соединительного устройства, такого как SCD (от англ. sterile connection device), производимого фирмой Terumo, работающего посредством сварки.
В изобретении предложена простая система для автоматизированной обработки/концентрирования клеточных субпопуляций в закрытой системе, которая может обеспечить систему обработки клеток в режиме онлайн у постели пациента. Формы осуществления изобретения изложены в зависимых пунктах формулы изобретения.
В одной форме осуществления контейнер для сбора, используемый для сбора клеточных субпопуляций от пациента, может быть сконструирован таким образом, чтобы он мог использоваться также в качестве камеры для разделения. Аналогично, резервуар (контейнер), используемый для сбора разделенных клеток, может быть сконструирован таким образом, чтобы служить в качестве контейнера для реинфузии для доставки клеток обратно пациенту. Разделение клеток может быть нацелено на сбор лейкоцитной пленки или может проводиться с использованием способа разделения на основе градиента плотности, с последующей промывкой клеток с использованием системы, описанной в ЕР-В-912250 (Claude Fell) и PCT/IB99/020523 (Biosafe). Другой способ обработки клеток заключается в применении микрошариков, покрытых моноклональными антителами, как описано в WO 03/009889 (CellGenix/Biosafe).
Комбинированное применение оптического детектора, который может измерять поглощение и отражение, обусловленные клетками, втекающими в прозрачную пробирку, позволяет собирать более точно конкретную клеточную субпопуляцию, подобную тромбоцитам, для получения концентрата тромбоцитов.
Такой концентрат тромбоцитов может быть получен в отдельной процедуре или в качестве побочного продукта во время процедуры, нацеленной на клеточную субпопуляцию. Изобретение также предполагает использование описанной системы для приготовления концентрата тромбоцитов для раздельного применения.
Таким образом, в изобретении предложена полностью интегрированная система для вмешательства у постели пациента, которая минимизирует риски заражения путем использования закрытой системы. Она предлагает высокий уровень автоматизации и не зависит от специальной квалификации в области обработки клеток. Она подходит для манипуляции с любым источником клеток (таких как зрелые стволовые клетки, тромбоциты), но особенно для получения стволовых клеток костного мозга, в аутологическом или аллогенном окружении.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Изобретение будет далее описано с помощью примера со ссылкой на сопровождающие схематические графические материалы, в которых:
На Фиг.1 представлена схема, иллюстрирующая общую структуру набора для обработки костного мозга согласно изобретению.
На Фиг.2 представлены обозначения, используемые на Фиг.3-7 для иллюстрации различных компонентов изображенных наборов согласно изобретению.
На Фиг.3А и 3Б показаны две формы осуществления набора сбора, одно без фильтровальной установки и одно с фильтровальной установкой.
На Фиг.4 показан набор для обработки, который может быть соединен асептическим соединителем с набором для сбора, как показано на Фиг.3А или Фиг.3Б, или с набором для трансплантации, как показано на Фиг.5А или 5Б.
На Фиг.5А показаны отдельные элементы набора для трансплантации, а на Фиг.5Б показана комбинация элементов, составляющих набор для трансплантации.
На Фиг.6 проиллюстрированы различные комбинации наборов, составляющих полную систему.
На Фиг.7 представлена схема неразъемного комплекта для обработки костного мозга, в котором вращаемая рабочая камера включает разделяющий шприц, который используют также для сбора и трансплантации клеток.
На Фиг.7А, 7Б и 7В показаны действующие конфигурации компонентов комплекта, представленного на Фиг.7, соответственно для сбора, обработки и трансплантации.
На Фиг.8А, 8Б и 8В показан принцип обнаружения клеток с помощью оптического линейного сенсора с использованием поглощающих и отражающих свойств данных клеток.
На Фиг.8Г показан вид сверху оптического линейного сенсора с расположением светодиода (LED) и приемных устройств.
На Фиг.9 показаны типичные выходные сигналы оптического линейного сенсора, представленного на Фиг.8.
СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к комплексной системе, делающей возможными сбор клеточных субпопуляций, их обработку/концентрирование и реинфузию продукта, обогащенного конкретной клеточной субпопуляцией, с целью восстановления или регенерации поврежденной или дефектной ткани.
Данный способ будет описан в аутологических условиях, что означает, что клетки выделяют из пациента и снова вводят тому же пациенту. Такая аутологическая обработка обычно является предпочтительной, поскольку нет иммунологической реакции или неблагоприятных эффектов вследствие несовместимости между донором и реципиентом. Однако данный принцип будет оставаться таким же и в аллогенных условиях.
Согласно современным сведениям стволовые клетки, и более конкретно - мезенхимальные стволовые клетки, обнаружены в костном мозге, хотя исследования показывают, что мезенхимальные стволовые клетки существуют также в пуповинной крови, периферической крови или даже в жировой ткани. Хотя указанный принцип может применяться также к этим различным источникам стволовых клеток, описанный в данном изобретении способ относится к обработке костного мозга.
Данный способ состоит, прежде всего, из выделения костного мозга из тазовой области под местной анестезией. Кость перфорируют, используя экстрактор костного мозга, например, типа Tyco. Костный мозг отсасывают с помощью одного или множества шприцов, которые предварительно заполнены некоторым количеством антикоагулянта, обычно гепарина или цитрат/фосфатного раствора. В характерном случае собирают объем 50 мл, но может быть и другое значение. Аспирированный костный мозг обычно переносят в поливинилхлоридный (ПВХ) пакет для сбора, либо фильтруют, либо нет, и могут поместить на мешалку. ПВХ пакет для сбора затем соединяют, используя асептические методики, предпочтительно с системой, описанной в ЕР-В-912250 и PCT/IB99/02052, и затем проводят соответственно разделение и концентрирование стволовых клеток. Могут быть использованы и другие центробежные рабочие камеры, например, где ось вращения не параллельна оси цилиндрической рабочей камеры, или с использованием мягких контейнеров.
В патентном документе ЕР-В-0912250 (C.FELL), описана система для обработки и разделения биологических жидкостей на компоненты, включающая комплект контейнеров для размещения биологической жидкости, подлежащей разделению, и разделенных компонентов и, возможно, один или более дополнительных контейнеров для вспомогательных растворов. Полая центрифужная рабочая камера вращается вокруг оси вращения путем приведения рабочей камеры в контакт с вращательным приводом. Рабочая камера имеет осевой впуск/выпуск для биологической жидкости, подлежащей обработке, и для обработанных компонентов биологической жидкости. Этот впуск/выпуск ведет в пространство разделения переменного объема, где происходит вся обработка биологической жидкости центрифугированием. Рабочая камера включает в основном цилиндрическую стенку, простирающуюся от торцевой стенки рабочей камеры. При этом эта в основном цилиндрическая стенка определяет в ней полую рабочую камеру, которая занимает полое открытое цилиндрическое пространство, расположенное соосно с осью вращения, причем осевой впуск/выпуск в указанной торцевой стенке расположен соосно со стенкой, являющейся в основном цилиндрической, для открытия в полую рабочую камеру. Рабочая камера содержит в стенке, являющейся в основном цилиндрической, коаксиальный подвижный элемент, такой как поршень. Пространство разделения переменного объема определено в верхней части рабочей камеры с помощью в основном цилиндрической стенки и с помощью коаксиального подвижного элемента, заключенного в являющейся в основном цилиндрической стенке рабочей камеры, причем осевое перемещение подвижного элемента изменяет объем пространства разделения, при этом подвижный элемент выполнен с возможностью коаксиального движения в рабочей камере для всасывания заданного количества биологической жидкости, подлежащей обработке, в пространство разделения через впуск до или во время обработки центрифугированием и для выдавливания обработанных компонентов биологической жидкости из пространства разделения через выпуск во время или после обработки центрифугированием. Предусмотрены средства для мониторинга местоположения подвижного элемента, посредством которых контролируется количество всасываемой биологической жидкости и выдавливание разделенных компонентов. Система дополнительно включает распределительный клапанный механизм для установления селективной связи между рабочей камерой и выбранными контейнерами или для установки рабочей камеры и контейнеров вне связи.
Согласно PCT/IB99/02052, такая система сконструирована для работы в режиме раздельного и нераздельного переноса, который обеспечивает более высокие возможности для применения системы, включая новые применения, которые ранее не были предусмотрены, такие как разделение кроветворных стволовых клеток и вообще лабораторная обработка. Таким образом, система может быть сконструирована так, чтобы она работала следующим образом:
- в режиме разделения жидкости могут всасываться в рабочую камеру тогда, когда камера вращается или неподвижна; жидкость, втянутая в камеру, центрифугируется и разделяется на компоненты, и разделенные компоненты выдавливаются тогда, когда камера вращается или, необязательно, когда это касается последнего разделенного компонента, когда камера является неподвижной; и
- в режиме переноса рабочая камера всасывает жидкость и выдавливает жидкость с помощью неподвижной камеры. Пусковой клапанный механизм может действовать так, чтобы обеспечивать переноса определенных количеств (доз) жидкости из одного контейнера в другой через рабочую камеру путем перемещения движущегося элемента без центрифугирования или разделения жидкости на компоненты, а средство для мониторинга положения подвижного элемента контролирует количества переносимых неразделенных жидкостей.
В новом применении согласно настоящему изобретению, в котором предпочтительно используют камеру для разделения в соответствии с ЕР-В-912250 и PCT/IB99/02052, разделение может быть нацелено на сбор лейкоцитной пленки, который делает возможным максимальное выделение стволовых клеток без определения какой-либо конкретной клеточной субпопуляции. Первоначальный продукт, источники которого описаны выше, вводят в камеру для разделения путем опускания поршня. После загрузки продукта в камеру для разделения (что определяется оптическим линейным сенсором, размещенным вблизи от входа в камеру для разделения) цикл седиментации (осаждения) обычно в течение 5-10 минут дает слой лейкоцитной пленки между плазмой и слоем эритроцитов. При выделении сначала выделяют плазму путем перемещения поршня вверх. Оптической линейный сенсор, например, сенсор, описанный со ссылкой на Фиг.8, определяет клетки, которые относятся к лейкоцитной пленке, и адаптирует различные параметры (скорость выделения, выделенный объем, скорость центрифугирования) для оптимизации выхода клеток в зависимости от желаемого объема и временных ограничений обработки. Клетки лейкоцитной пленки выделяют в предназначенный для этого пакет или флакон (в зависимости от конфигурации набора для обработки). Оставшиеся эритроциты либо выделяют в предназначенный для этого пакет, либо оставляют в камере (для экономии времени обработки). В зависимости от параметров, оптимизированных во время фазы выделения лейкоцитной пленки, последовательные циклы (цикл) седиментации/выделения, описанные выше, можно повторять. Это позволит оптимизировать характеристики выделенного объема лейкоцитной пленки в зависимости от конечного применения клеточного продукта.
Для того чтобы выбрать более конкретную клеточную субпопуляцию, принцип, описанный выше (заполнение/седиментация/выделение), может быть использован с таким же типом оптического линейного сенсора, который определяет более конкретную клеточную субпопуляцию по отражению и поглощению. Во время выделения плазмы поглощение и отражение жидкости являются очень низкими. Когда клетки начинают течь в пробирку, тогда и поглощение, и отражение вытекающего продукта увеличиваются. Отражение зависит также от типа и размера клеток. Эта зависимость позволяет отбирать конкретную клеточную субпопуляцию. В конце концов, когда концентрация клеток становится высокой, поглощение находится на максимальном уровне, и отражение больше невозможно. Это может быть использовано для определения клеточных субпопуляций, которые имеют различные размеры, таких как тромбоциты, и создания концентрата тромбоцитов.
Предпочтительный способ для проведения отбора клеточной субпопуляции состоит в применении сред градиента плотности, который нацелен более конкретно на определенную клеточную субпопуляцию. Это будет увеличивать чистоту продукта путем уменьшения загрязнения эритроцитами и другими нежелательными клеточными субпопуляциями. Среду градиента плотности выбирают согласно целевой субпопуляции. Например, для выделения мононуклеарной субпопуляции можно использовать среды на основе Ficoll™. В этом случае среду градиента плотности сначала вводят в камеру для разделения. Затем медленно вводят костный мозг путем опускания поршня, в характерном случае - при скорости 5 мл/мин, чтобы нанести клетки на слой среды градиента плотности. Эритроциты и гранулоциты будут стремиться пройти через слой среды градиента плотности, тогда как мононуклеарные клетки и тромбоциты будут оставаться сверху слоя. Когда весь объем костного мозга будет введен, как определяют с помощью оптического линейного сенсора (Фиг.8) в верхней части аппарата, поршень останавливают и начинают стадию седиментации в течение, например, 10-20 мин. Дополнительное разбавление может быть автоматически осуществлено системой после полной аспирации продукта при помощи изотонического раствора, соединенного с системой. Скорость центрифугирования может быть увеличена для уменьшения указанного времени седиментации. Затем начинают сбор путем перемещения поршня вверх. Жидкий супернатант содержит только плазму. Затем следуют первые клетки, которые являются причиной того, что трубка для слива становится непрозрачной, что определяют с помощью оптического линейного сенсора. Это инициирует сбор мононуклеарных клеток, которые включают в себя целевые стволовые клетки. После достижения объема, предварительно заданного операторным меню, или когда выходящая трубка снова становится прозрачной, сбор клеток останавливают, и оставшееся содержимое объема камеры для разделения собирают в пакет для отходов до тех пор, пока камера полностью не опорожнится. На этой стадии камеру для разделения промывают от всех оставшихся эритроцитов с помощью изотонического раствора. Собранные клетки повторно вводят в камеру для разделения с последующей или предшествующей промывкой раствором, таким как физиологический раствор с альбумином (альтернативно, может быть также использован забуференный фосфатами или другой раствор). Клетки и раствор для промывки смешивают. Поршень будет остановлен после достижения заданного объема, или когда камера полностью заполнится. Затем осуществляют новую стадию седиментации, во время которой пакет для сбора может быть промыт с использованием супернатанта, полученного во время седиментации, для удаления следовых количеств среды градиента плотности. Супернатант (состоящий из раствора для промывки и среды градиента плотности) затем выдавливают. Процесс останавливают, когда первые клетки снова появятся в выходящей трубке, или могут повторить для получения лучшей промывки. В конце клетки собирают в контейнер для сбора, который может быть специально сконструирован для облегчения дальнейшего использования собранных клеток. При необходимости камеру промывают. Такие клетки можно использовать для повторного введения в целевой орган пациента, или могут быть дополнительно подвергнуты обработке для целей селекции или размножения. Для этих целей система может ресуспендировать клетки непосредственно в желаемой культуральной среде.
Более тонкое разделение, чем использование среды градиента плотности, состоит в инкубации костного мозга в среде, которая содержит микрошарики, покрытые моноклональными антителами. Такой способ разделения описан в публикации WO 03/009889 (CellGenix/Biosafe). Процедуру осуществляют следующим образом. Продукт, содержащий микрошарики, связанные со специфическим антителом, смешивают с продуктом крови, содержащим интересующие клетки. После некоторого времени инкубации микрошарики будут прикрепляться к поверхности целевых клеток, приводя к изменению их плотности. Затем смесь вливают в камеру для разделения и начинают разделение по плотности во взвешенном состоянии, как описано в более ранних патентах. Когда седиментация завершится, супернатант удаляют из камеры в пакет для отходов, и эритроциты затем также отбрасывают. Интересующие клетки, меченные микрошариками и, следовательно, имеющие самую высокую плотность, будут последними клетками, которые покинут камеру. Они могут быть собраны в подходящий контейнер и, при необходимости, затем промыты для удаления раствора антитела.
В случае непосредственного повторного введения после осуществления обработки, собранные клетки могут быть соединены, с использованием асептических методов, с устройством, позволяющим осуществлять их трансплантацию пациенту. Для применения в кардиологии такое устройство может представлять собой балонный катетер, используемый в ангиографии, для локальной повторной инъекции этих клеток, например, в связи с лечением острого инфаркта миокарда. В этом случае повторно инъецируют количество концентрированных стволовых клеток, равное 10 мл, ступенчато по 3 мл, раздувая балон с регулярным интервалом, обеспечивающим распространение стволовых клеток. Такой способ описан Zeiher с соавт. в научной статье (TOPCARE - Circulation October 2002).
В случае сбора концентрата тромбоцитов собранные тромбоциты могут быть использованы одни или в комбинации с тромбином, возможно также полученным из плазмы пациента, с образованием тромбоцитного геля, который будет облегчать раневое заживление. Такой тромбоцитный гель содержит факторы роста, которые могут преимущественно стимулировать тканевую регенерацию либо одни, либо в сочетании со стволовыми клетками.
Весь способ может быть осуществлен у постели пациента, и поэтому считается способом в режиме онлайн, как схематично проиллюстрировано на Фиг.1. Это обеспечивает значительные преимущества в безопасности, времени доставки и реакции, и не требует какой-либо специальной квалификации в обработке клеток.
Сбор различных целевых клеточных субпопуляций может быть осуществлен во время той же процедуры сбора, но с целью применения таких клеточных субпопуляций в разные промежутки времени в процессе одной той же операции.
В изобретении предложена система или "специальная упаковка", которая уже содержит отдельные одноразовые стерильные комплекты для осуществления соответственно сбора, разделения и трансплантации. Такая упаковка может быть представлена в "блистере", имеющем 3 отделения, причем каждое содержит одноразовый комплект или набор: один набор для выделения костного мозга, один набор для разделения костного мозга, предпочтительно такого типа как система, описанная в ЕР-В-912250 и PCT/IB99/020523, и один набор для повторной инъекции клеток. Каждый комплект может иметь несколько вариантов, причем один является наиболее универсальным, представляя собой комплект для трансплантации, поскольку он зависит от целевой ткани, подлежащей лечению (например, кость, мышца, сосуд и т.д.). Отдельные конфигурации комплекта проиллюстрированы на Фиг.2-7.
Возможно, эти комплекты могут быть предварительно соединены вместе, или два из трех могут быть предварительно соединены, если, например, желательно использовать полностью закрытую систему. При отсутствии предварительного соединения практическое решение состоит в использовании специально сконструированных асептических соединителей, таких как система Medlock, предложенная PALL (ссылка ACD) и описанная в патентах US 3650093, US 5868433, US 6536805 и US 6655655, для гарантии того, что соединения осуществляются в асептических условиях, поддерживая таким образом критерии закрытой системы. Другая возможность будет состоять в том, чтобы соединить комплект с использованием стерильного соединительного устройства. Любая из описанных выше конфигураций - предварительно соединенная, или соединенная с помощью асептического соединительного устройства, или стерильного соединительного устройства - будет обеспечивать функционально закрытую систему. Такие функционально закрытые системы устраняют необходимость чистых помещений или систем с ламинарным потоком, что является очень важным преимуществом в операционной или в условиях хирургического отделения, которые обычно не оборудованы так, чтобы удовлетворять этим требованиям.
Другое усовершенствование изобретения состоит в контейнере для аспирации костного мозга, который будет действовать в качестве камеры для разделения на второй стадии, названной рабочей камерой. Ее конструкция похожа на камеру для разделения, как описано в PCT/IB99/020523, и она может быть снабжена специальной иглой для прокалывания тазовой кости. Она предварительно заполнена антикоагулянтом или может быть заполнена антикоагулянтом перед началом сбора. После прокалывания кости костный мозг отсасывают путем перемещения вниз поршня рабочей камеры, приводимого в действие ручным или электрическим источником вакуума. Затем рабочую камеру помещают в центрифугу данной установки, и комплект, состоящий из упорядоченной последовательности трубок и пакетов, соединяют с камерой. После этого может быть начато разделение согласно способу, описанному выше, с использованием, например, протокола центрифугирования лейкоцитной пленки. Другое усовершенствование изобретения состоит в сборе разделенных клеток в специальный контейнер, который может быть легко подсоединен или приспособлен к системе для реинфузии клетки обратно пациенту. Такой контейнер может представлять собой градуированный шприц, оснащенный Y-соединителем, имеющим один конец, соединенный с комплектом для разделения, и другой конец, снабженный соединителем с люэровским наконечником для последующего соединения с катетером.
На Фиг.3А показан набор для сбора без фильтра, а на Фиг.3Б - с фильтром. Набор для сбора включает все необходимое для осуществления аспирации костного мозга:
a. Точка ввода будет представлять собой, например, экстрактор костного мозга (например, TYCO типа) и в характерном случае включает иглу для пункции (прокола) кости или иглу для пункции кости или вен. Он может быть непосредственно соединен с остальным набором через запорный клапан или другой клапан.
b. Один или более шприцов (1…n), как требуется для осуществления аспирации.
c. Фильтр может быть вставлен в набор для сбора для фильтрации костного мозга после сбора, как проиллюстрировано на Фиг.3Б.
d. Собранный костный мозг (профильтрованный или непрофильтрованный) затем хранят в пакете для переноса перед обработкой.
e. Дополнительный шприц может быть использован для добавления разбавленного продукта в костный мозг и/или для промывки фильтра при необходимости.
f. Может быть использован асептический соединитель (Pall ACD или похожий).
Набор для сбора может быть, например, укомплектован следующим образом.
c
a
b
С11 Набор для сбора без фильтра  с иглой для кости , предварительно соединенной с набором для обработки. Количество X шприцов .
a
b
С12 Набор для сбора без фильтра с иглой для кости , не соединенной предварительно с набором для обработки. Количество X шприцов .
c
a
b
С21 Набор для сбора с фильтром  с иглой для кости , предварительно соединенной с набором для обработки. Количество X шприцов .
c
a
b
С22 Набор для сбора с фильтром  с иглой для кости , не соединенной предварительно с набором для обработки. Количество X шприцов .
Во всех эти конфигурациях игла для кости может быть заменена иглой для пункции вен.
На Фиг.4 показан набор для обработки, который приспособлен для соединения с ранее описанным набором для сбора через асептическое соединение.
a. Асептическое соединение может быть осуществлено через асептический соединитель (такой как Pall ACD или другие) или игольчатый соединитель в асептических условиях.
b. Необязательная капельная камера может быть использована для предотвращения пузырьков, проникающих в конвейер обработки.
c. Направление пути жидкости может быть выбрано с помощью панели запорных клапанов, на которой в этом примере размещены три запорных крана, или другой тип клапана, например, многопортовый клапан.
d. Для способа разделения используют камеру для разделения, например, описанную в ЕР-В-912250 и PCT/IB99/02052.
e. Дополнительный(е) продукт(ы) (изотонический раствор, культуральная среда и др.) вводят с помощью трубки, снабженной одним или более соединениями (игольчатые соединители и т.п. - 1…n).
f. Пакет для сопутствующих продуктов или отходов используют для ненужного продукта и ввода среды градиента плотности.
g. Выходная трубка с возможным промежуточным пакетом направляет продукт в набор для трансплантации.
h. Асептический соединитель (Pall ACD или похожий) может быть использован на этом конвейере.
Основные варианты набора для обработки включают:
Р1 набор для обработки без промежуточного пакета,
Р2 набор для обработки с промежуточным пакетом.
На Фиг.5А показаны возможные отдельные элементы набора для трансплантации, и на Фиг.5Б показана одна из возможных комбинаций элементов, составляющих набор для трансплантации. Набор для трансплантации приспособлен для соединения с описанным выше набором для обработки через асептическое соединение и будет содержать конечный продукт для трансплантации. Асептическое соединение может быть осуществлено через асептический соединитель (такой как Pall ACD или другие) или игольчатый соединитель в асептических условиях.
Набор для трансплантации может включать:
Т1 пакет
Т2 флакон для сбора
Т3 шприц
Т4 специальное устройство для трансплантации (например, катетер для инфаркта миокарда)
Т5 комбинацию Т1-Т4.
Вообще говоря, набор для трансплантации будет включать как минимум, по меньшей мере, одно специальное устройство для трансплантации Т14, которое можно комбинировать с различными комбинациями других компонентов, например, пакетом Т1 или флаконом для сбора Т12, и/или шприцом Т3.
На Фиг.6 проиллюстрированы различные комбинации для создания полной системы. Полная система может состоять, например, из любой комбинации набора для сбора (С11-С22), набора для обработки (Р1 или Р2) и набора для трансплантации (Т1-Т4), как описано выше.
b3
а
b3
b
b1
b2
b4
b1
а
c
с
b3
На Фиг.7 представлена схема неразъемного комплекта для обработки костного мозга, в котором вращаемая рабочая камера (камера для обработки) , например, описанная в ЕР-В-912250 и PCT/IB99/020523, включает разделяющий шприц, который используют также для сбора и трансплантации клеток. Набор для сбора  состоит из точки ввода, например, экстрактора костного мозга (например, типа TYCO), снабженного асептическим соединителем для соединения с рабочей камерой . Набор для обработки  включает запорный клапан , соединенный с пакетом  для промывки и с пакетом  для среды градиента плотности /отходов, а также камеру b3 для выделения/обработки/трансплантации, которая соединена асептическим соединителем с запорным клапаном , или с набором для сбора , или с набором для трансплантации . Набор для трансплантации  состоит из специального устройства для трансплантации (например, катетера для инфаркта миокарда), снабженного асептическим соединителем для соединения с рабочей камерой .
На Фиг.7А, 7Б и 7В показаны действующие конфигурации компонентов комплекта Фиг.7 соответственно для сбора, обработки и трансплантации.
b3
а
b3
На Фиг.7А рабочая камера для сбора/обработки  соединена асептическим соединителем с точкой ввода системы для сбора , так что рабочая камера служит для сбора выделенных стволовых клеток. Всасывание стволовых клеток контролируется путем смещения поршня рабочей камеры .
b3
b2
b2
b4
b3
b3
На Фиг.7Б рабочая камера для сбора/обработки  соединена своим асептическим соединителем с запорным клапаном , который селективно соединяет ее с пакетом для промывки  и с пакетом для среды градиента плотности/отходов  для описанных выше операций обработки, которые завершаются возвращением обработанных/концентрированных стволовых клеток в рабочую камеру . Поэтому рабочая камера  служит в качестве камеры для реинфузии.
b3
b1
b3
На Фиг.7В показана рабочая камера  после отсоединения от запорного клапана  набора для обработки, соединенного асептическим соединителем с устройством для трансплантации из набора для трансплантации. В этой конфигурации реинфузию обработанных стволовых клеток пациенту можно контролировать путем смещения поршня рабочей камеры для обработки/реинфузии .
b3
а
b1
с
Эта форма осуществления основана на применении асептических соединителей для селективного соединения рабочей камеры  с набором для сбора , или с остальной частью набора для обработки через запорный клапан , или с набором для трансплантации , для осуществления последующих операций сбора, обработки и реинфузии. Это обеспечивает особенно компактную систему, которая не включает каких-либо неиспользуемых элементов и удобна для применения.
На Фиг.8А, 8Б и 8В показан принцип обнаружения клеток с помощью оптического линейного сенсора LS с использованием поглощающих и отражающих свойств клеток через прозрачную пробирку. На Фиг.8А показана конфигурация пробирки, содержащей прозрачную жидкость, где свет от LS не отражается и проходит непосредственно в прямой детектор R по оси света. На Фиг.8Б показана конфигурация пробирки, содержащей клетки в суспензии в прозрачной жидкости; в этом случае свет отражается клетками в произвольных направлениях и захватывается как прямым детектором R, так и боковым детектором R, расположенным под углом примерно 90° к оси. На Фиг.8В показана конфигурация пробирки, содержащей непрозрачную жидкость, где свет не отражается. На Фиг.8Г показан вид сверху оптического линейного сенсора с местоположением светодиода (LED) и приемных устройств, в частности, показывающих положения Прямого Синего (Fсиний), Бокового Синего (Lсиний), Прямого Красного (Fкрасный) и Бокового Красного (Lкрасный) света.
На Фиг.9 показаны характерные сигналы оптического линейного сенсора, которые регистрируются от "прямых" и "боковых" сенсоров. Информация, полученная от "боковых" отраженных сигналов, может быть использована в качестве пусковых сигналов для начала или окончания сбора. Выходное значение сенсора (ось Y) представляет собой выделенный объем лейкоцитной пленки (ВС, от англоязычного "buffy-coat") в процентах от максимального уровня. Ось X содержит информацию об объеме, проходящем через пробирку (также в процентах от общего объема).
Следует понимать, что это изобретение может быть осуществлено в нескольких различных формах без отклонения от его сущности или существенных признаков. Объем изобретения определен в прилагаемой формуле изобретения, а не в конкретном описании, предшествующем ей. Поэтому подразумевается, что все формы осуществления, которые подпадают под содержание формулы изобретения, охватываются данной формулой изобретения.