Регуляция пролиферации и апоптоза опухолевых клеток свободными радикалами

РЕГУЛЯЦИЯ ПРОЛИФЕРАЦИИ И АПОПТОЗА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК СВОБОДНЫМИ РАДИКАЛАМИ

И.В. Кондакова, ГВ. Какурина, Л.П. Смирнова, Е.В. Борунов

НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН

Исследовано влияние соединений, генерирующих кислородные радикалы, а именно супероксидного анион-радикала и органических пероксидных радикалов, на пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток in vitro. Показана концентрационная зависимость действия свободных радикалов, которая выражалась в ингибировании синтеза ДНК и индукции апоп-тоза клеток карциномы Эрлиха при действии соединений в высоких дозах (10"5 М - 10'|3М) и в стимуляции пролиферативных процессов при снижении концентрации менее 1016 М. Одним из возможных механизмов снижения концентрации действующих агентов до их поступления в клетки является экстраклеточная продукция глутатионпероксидазы и низкомолекулярных соединений небелковой природы, обладающих антирадикальной активностью. Важную роль во внутриклеточном поддержании уровня свободнорадикального окисления играют антиоксидантные ферменты, активность которых снижается в фазе активной пролиферации опухолевых клеток и возрастает при переходе к фазе медленного стационарного роста.

REGULATION OF TUMOR CELL PROLIFERATION AND APOPTOSIS BY FREE RADICALS

I.V. Kondakova, G.V. Kakurina, L.P. Smirnova, E.V. Borunov

Cancer Research Institute, Tomsk

It has been studied the influence of oxygen raical generating compounds including superoxide anion radical and organic peroxic radicals on proliferation and apoptosis of tumor cells in vitro. These compouns dose-dependently supressed DNA synthesis and induced apoptosis of Ehrlich carcinoma cells in high concentration (10"5 M to 10'3M) and stimulated proliferation when the concentration was lower 10'6 M. One of the possible mechanismes of acting agent content decrease before their entrance into the cells is the extracellular production of glutathion peroxidase and low-molecular antiradical substances. Antioxidant enzymes play an important role in intracellular maintenance of free radical oxidation level. Their activities were decreased during the phase of active proliferation and increased when the cells passed to a phase of slow stationary growth.

Интерес к исследованию клеточных и молекулярных механизмов регуляции

пролиферации и апоптоза обусловлен

участием этих процессов в развитии различных патологических состояний,

среди которых важное место занимают злокачественные новообразования. В последнее время достигнуты значительные успехи в исследовании роли молекул различных классов в регуляции роста и гибели клеток. Регулятор-ные молекулы, прежде всего цитокины, вступают во взаимодействие со специфическими рецепторами, активируют сигнальные пути и обеспечивают развитие того или иного процесса. Внутриклеточное образование и элиминация прооксидантов и антиоксидантов (редокс-потен-циал клетки) являются важным звеном в путях передачи как пролиферативных, так и апопто-тических сигналов, поскольку активность многих транскипционных факторов (с-Бо8, с-1ип, АР-1 и др.) и компонентов киназных каскадов

зависит от состояния 8—Н-групп [2]. Предполагается, что действие активизированных кислородных метаболитов (АКМ) на клетки зависит от их концентрации. Известно, что супероксид-ный радикал и перекись водорода в низких концентрациях стимулируют деление клеток [1]. Антиоксидантные ферменты (АОФ), контролируя концентрацию радикалов, могут выступать в ка- I честве регуляторов пролиферации [4]. Кроме того, данные многих исследований свидетельствуют о том, что АКМ играют важную роль в механизмах развития апоптоза, а факторы химической и физической природы, которые при действии на клетки вызывают окислительный стресс, являются его индукторами [2]. Однако в настоящее время не известны концентрационные зависимости действия АКМ, определяющие переход пролиферативной активности к индукции апоптотической гибели клеток и регуляторные механизмы, влияющие на конечный эффект.

СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2005. №1

Регуляция пролиферации и апоптоза опухолевых клеток свободными радикалами

—------------------------------------------------------------------------------------ 59

Целью настоящей работы явилось изучение влияния активированных кислородных метаболитов в различных концентрациях на пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток и механизмы, регулирующие уровень свободных радикалов в клетках.

Материалы и методы

В работе использовали асцитные мышиные опухоли: карциному Эрлиха, лимфому EL-4, мастоцитому Р-815, а также солидную форму карциномы Эрлиха. Синтез ДНК в опухолевых клетках изучали по включению меченого радионуклидами предшественника синтеза нуклеиновых кислот [3Н]-тимидина (Изотоп) в ДНК. Уровень индукции апоптоза оценивали по методу [5], характеризующему степень расщепления хроматина в клетках. Кинетика разложения шдропероксида третичного бутила (ГПТБ) в суспензии клеток исследовалась хемилюминес-центным методом. Антирадикальную активность определяли хемилюминесцентным методом с использованием азо-бис-изобутиронитрила в качестве генератора пероксидных радикалов. Активность АОФ (супероксиддисмутазы, катала-зы, глутатионпероксидазы, глутатионтрансфера-зы) определяли спектрофотометрическими методами. Статистическая обработка результатов осуществлялась с применением непараметрического критерия Билкоксона—Манна—Уитни.

Результаты и обсуждение

Свободнорадикальное воздействие на опухолевые клетки индуцировали добавлением в среду инкубации /#А>«да?-бутилгидропероксида (ГПТБ), 2,2'азо-бис(2-амидинопропана) (АБАП), разлагающихся с образованием пероксидов, и ферментативной системы ксантин-кантинокси-даза, генерирующей супероксидный анион-радикал. Супероксидный радикал, АБАП и ГПТБ в высоких концентрациях оказывали на популяции экспериментальных клеточных линий ци-тотоксическое действие, которое выражалось в угнетении скорости синтеза ДНК (рис. 1). При уменьшении концентрации окислительных агентов в среде инкубации, начиная с концентрации

5 нМ для ГПТБ и 100 мкМ для АБАП, происходило снижение цитотоксического действия, не-

посредственно переходящего в стимуляцию включения рЩ-тимидина в клетки.

Результаты исследования влияния окислительных агентов на апоптоз клеток карциномы Эрлиха показали, что ГПТБ, как более токсичное соединение, оказывал выраженное влияние на индукцию программируемой клеточной гибели начиная с концентрации 0,1 мкМ (рис.2). Для АБАП такая концентрация составила 5 мМ. Сопоставление влияния соединений, генерирующих свободные радикалы, на пролиферацию и апоптоз показало, что ГПТБ в концентрациях, индуцирующих апоптоз выше контр ольных значений, существенно ингибируетпролифера-тивные процессы, тогда как увеличение индукции апоптоза АБАП в концентрации 10 мМ не связано с ингибированием пролиферации.

Пока остаётся непонятным, с помощью каких механизмов осуществляется переключение между регуляторными путями, индуцирующими развитие либо пролиферативных процессов, либо апоптоза. Получены данные о том, что причиной повышенного включения тимидина в ДНК и роста пролиферативной активности клеток под действием липидных пероксидов в низких концентрациях (1 мкМ и ниже) является увеличение экспрессии циклина Б1, циклинза-висимой киназы 4 и фосфорилирование рети-нобластомного белка, что способствует переходу клеток из фаз 00 и 0А в фазу 8, во время которой происходит синтез ДНК [3]. Повышение концентрации липидных перекисей и времени воздействия приводило к окислительному по-

Вюиочение [ ГЦ-тимвднна,

% к контролю

200 -

0,0001 0,001 0,005 0,01 0,05 0,1 0,5 1

Концентрация, шМ

Рис. 1. Влияние АБАП

СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2005. №1

% расщепления хроматина

2

0.01 0.5 1 5 10

Концентрация, мМ

% расщепления хромшина 20

0,001 0,01 0,1 1 10 Кошсшрация. мкМ

Рис. 2. Влияние 2,2’азо-бис(2-амилинопропан)а (а) и гилропероксила третичного бутила (б) на расщепление хроматина в клетках карциномы Эрлиха: 1- контроль,

2 -АБАП, 3 - ГТТГБ вреждению ДНК и остановке митоза в фазе 00/0), что способствовало прекращению роста клеточной популяции и индукции в них апоп-тоза. Таким образом, становится очевидным, что снижение действующей концентрации экзогенных окислительных агентов на самых ранних этапах их взаимодействия с клетками является важным как для сохранения жизнеспособности, так и для усиления пролиферативной активности, что является обязательным условием опухолевого роста. Многие экзогенные факторы могут приводить к развитию окислительного стресса в клетках, поэтому вполне вероятно формирование экстраклеточного уровня защиты от свободнорадикального воздействия. При добавлении экзогенного ГПТБ была выявлена экстрацеллюляр-ная продукция веществ, принимающих участие в метаболизме гидропероксидов. Обнаружено, что супернатанты клеточных суспензий всех исследуемых опухолевых линий, а именно лим-фомы БЬ-4, мастоцитомы Р-815 и

карциномы Эрлиха, обладали способностью значительно снижать содержание ГПТБ в инкубационной среде. Осаждение белков супернатантов трих-лоруксусной кислотой приводило к полному исчезновению этого эффекта. Этот факт свидетельствует о возможном наличии в супернатан-тах клеток фермента, способного разлагать органические пероксиды. Измерение активности ан-тиоксидантных ферментов во внеклеточной жидкости показало присутствие глутатионперок-сидазы (табл. 1). В то же время активностей ка-талазы и супероксиддисмутазы не обнаружено. Добавление супернатантов опухолевых клеток к системе, стабильно генерирующей пероксира-дикалы при термическом разложении 2,2-азо-бис-изобутиронирила, приводило к снижению скорости радикалообразования, что указывает на наличие веществ, обладающих выраженной антирадикальной активностью (табл. 1). Обработка супернатантов трихлоруксусной кислотой уменьшала их антирадикальную активность в различной степени, что

Таблица 1

Антирадикальная и глутатионпероксидазная активность в супернатантах асцитных мышиных опухолевых клеток

Асцитная опухоль Антирадикальная активность. уел. ел. х 105 Активность глутатионнсроксидазы, мкмоль КАПРН/ыкг белка

Контроль Трихлорукоусная кислота

Лимфома НЬ-4 Мастоцнтома Р-815 Карцинома Эрлиха 1,7*0,08 2,1 ±0,09 1.9±0.1 0,83±0,04 2,1 ±0,06 1,6±0,05 10.85±0,89 2,08*0,14 8.67*0,37

свидетельствует о наличии в них низкомолекулярных компонентов, обладающих способностью тушить пероксирадикалы. Таким образом, первоначальная быстрая утилизация гидропероксидов в суспензиях опухолевых клеток, вероятно, связана с экстрацел-люлярной продукцией белков, обладающих глу-татионпероксидазной активностью, и низкомолекулярных соединений с выраженной антирадикальной активностью. Это свидетельствует о возможности снижения концентрации окисли-

Регуляция пролиферации и апоптоза опухолевых клеток свободными радикалами

Таблица 2

Зависимость активности антиоксидантных ферментов от фазы и формы роста

Фазы роста

Фсрмскты Логарифмическая Стационарная

Асішт Солид Асцит Солид

сод 8,91±2,3 23,6*4,1* 16,78*3,9 106,88*17,1*

Ьпіш 1,68*0.6 12,97*3,7* 1,44*0,5 6,31*0,9

КО 12,78*3,8 7,9*3,2 2,39*0,6 5,63*1,6*

m 29,69*4,3 44,9*8,6* 48,91*5,1 51,86*4,9

ГР 29,32*4.1 35,4*4,3 26,7±4,3 26,03*3,7

п 88,03*18,7 102,55*23,9 142,85*19,8 138,35*20,5

Щюжаниг. * - значимость различий между солил !|М и гамтной формами роста, р<0,01.

-тельных агентов ещё до их поступления в опухолевые клетки и о существовании экстраклеточного уровня защиты опухолевых клеток от целительного воздействия, что в первую очередь является важным условием защиты опухолевых клеток от апоптоза, а во-вторых, может стимулировать их пролиферацию. Одним из

внутриклеточных механизмов ни редокс-потенциала клеток является активность антиоксидантных ферментов, которые, контролируя концентрацию

супероксидного радикала и других активированных кислородных

метаболитов, могут выступать в качестве эмуляторов пролиферативной активности кле-: [1,4]. В настоящей работе проведено исследование, подтверждающее гипотезу

об участии антиоксидантных ферментов в регуляции пролиферации опухолевых клеток, которое включало в себя изучение активности антиоксидантных ферментов в тханях с различной выраженностью пролиферативных процессов.

Проводилось изучение активности

ферментов, влияющих на содержание активных форм кислорода-

супероксиддисмутазы (СОЛ), каталазы, ксантиноксидазы, и ферментов, утилизирующих пероксиды -

глтутатионредуктазы, глутати-

трансферазы и глутатионредуктазы. Измене-1я в активности СОД и каталазы в процессе

61

роста опухоли в солидной и асцитной форме представлены в табл. 2. Исследования показали тесную взаимосвязь между активностями ферментов и пролиферативными процессами в опухолевых тканях. По-видимому, опухолевые клетки в период активного деления, которое характеризует логарифмическую фазу роста, нуждаются в супероксидном радикале, о чем свидетельствует максимум активности ксантиноксидазы.

В более быстро растущей асцитной форме карциномы Эрлиха активность этого фермента заметно выше. Пик активности СОД и глутати-онзависимых ферментов в обеих формах опухолей в стационарной фазе роста свидетельствует об увеличении утилизации супероксидного радикала и липидных пероксидов при снижении скорости пролиферативных процессов.

Таким образом, свободные радикалы играют важную физиологическую роль, и к числу их биологических эффектов относится регуляция пролиферации и апоптотической гибели. При злокачественной трансформации происходит приспособление данных механизмов для обеспечения максимальной способности к выживанию и росту опухолевых клеток с помощью способности опухолевых клеток экстрацеллю-лярно разлагать экзогенные гидропероксиды и регулировать

внутриклеточный уровень свободных радикалов антиоксидантными ферментами.

ЛИТЕРАТУРА

1. Burdon R.H. Superoxide and hydrogen peroxide in relation to mammalian cell proliferation // Free Radical Biol. Med. 1995. Vol. 18. P. 775-794.

2. Droge W. Free radicals in the physiological control of cell ruction// Physiol. Rev. 2001. Vol.82. P. 47-95.

3. Gotoh Y., Noda Т., Iwakiri R., et al. Lipid peroxide-induced redox imbalance differentiatelly mediates CaCo-2 cell proliferation and growth arrest // Cell Prolif. 2002. Vol. 35.

P. 221-235.

4. Oberley Т., SchuetzJ., OberleyL. Antioxidant enzyme levels as a function of growth state in cell culture // Free Radical Biol. Med. 1995. Vol. 19. P. 53-65.

5. Orlov S.N., Dam T. V., Tremblay let al. Apoptosis in vascular smooth muscle cells: Role of cell shrinkage //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. Vol. 221. P. 708-715.

Поступила 20.12.04