Количественный и функциональный дефект регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+ у больных рассеянным склерозом

НЕВРОЛОГИЯ

Количественный и функциональный дефект регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+ у больных рассеянным склерозом

Д.Д.Елисеева1, И.А.Завалишин1, С.Н.Быковская2

1Научный центр неврологии РАМН, 6-е неврологическое отделение, Москва (зав. отделением - проф. ИА.Завалишин);

2Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова, отдел клеточных технологий и регенеративной медицины, Москва

Целью исследования было изучение роли регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+ (Трег) в развитии аутоиммунных нарушений при рассеянном склерозе и определение взаимосвязи количественного и функционального дефекта этих клеток с клинической картиной заболевания. Методом проточной флоуцитометрии исследован иммунофенотип периферической крови 52 больных рассеянным склерозом. Продемонстрировано снижение количества и функциональной активности Трегв периферической крови больных рассеянным склерозом в стадии обострения и увеличение их содержания при ремиссии заболевания. Отмечена зависимость длительности аутоиммунного процесса и степени тяжести рассеянного склероза от количества Трег. Показана важная роль Трег в процессах поддержания иммунологической толерантности при рассеянном склерозе.

Ключевые слова: рассеянный склероз, аутоиммунный процесс, регуляторные Т-клетки

Quantitative and functional defects in regulatory T-cells CD4+CD25+Foxp3+ in patients with multiple sclerosis

D.D.Eliseeva1, I.A.Zavalishin1, S.N.Bykovskaia2

Research Center of Neurology of RAMS, 6-th Neurological Department, Moscow

(Head of the Department - Prof. I.A.Zavalishin);

2N.I.Pirogov Russian National Research Medical University,

Department of Cell Technologies and Regenerative Medicine, Moscow

The aim of the study was to examine the role of regulatory T-cells CD4+CD25+Foxp3+ (Treg) in the development of autoimmune disorders at multiple sclerosis and determination of the relationship of quantitative and functional deficiency of these cells with clinical picture of the disease. Immunophenotype of peripheral blood of 52 patients with multiple sclerosis was investigated by flowcytometry. The study demonstrated reduction in the number and functional activity of Treg in peripheral blood of multiple sclerosis patients at the acute stage and increase of their content in remission. Dependence of the duration of the autoimmune process and severity of multiple sclerosis on the number of Treg was marked. It was shown the important role of Treg in the maintenance of immunological tolerance at multiple sclerosis. Key words: multiple sclerosis, an autoimmune process, regulatory T-cells

Рассеянный склероз (РС) - хроническое воспалительное демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы (ЦНС). Оно возникает вследствие активации аутореактивных Т-клеток, специфичных против компонентов миелина, что приводит к повреждению миелиновой оболочки, олигодендроцитов и аксонов [1]. РС относится к аутоиммунным заболеваниям, в основе патогенеза которых

Для корреспонденции:

Елисеева Дарья Дмитриевна, врач-невролог, аспирант 6-го неврологического отделения Научного центра неврологии РАМН Адрес: 125367, Москва, Волоколамское ш., 80 Телефон: (495) 490-2410 E-mail: delis.82@mail.ru

Статья поступила 09.03.2011 г., принята к печати 26.10.2011 г.

лежит генетически детерминированное нарушение иммунитета [2]. По современным представлениям, развитие аутоиммунных заболеваний связано с нарушением супрессорных механизмов, которые контролируют толерантность Т- и В-лимфоцитов к аутоантигенам.

Ключевую роль в механизмах иммуносупрессии играют регуляторные Т-клетки с фенотипом С04+С025+Рохр3+ (Трег). В норме Трег составляют 5-10% общего числа С04+ Т-клеток в периферической крови и лимфоидных тканях. Трег созревают в тимусе и на 3-4 день неонатального развития расселяются в кровь и периферические лимфоид-ные органы [3]. Трег играют важную роль в развитии различных типов иммунного ответа, включая иммунитет к аутоантигенам, трансплантатам, аллергенам, опухолям и инфекциям [4].

У больных аутоиммунными заболеваниями выявлено значительное снижение количества Трег и нарушение их функции. Дефект Трег показан у больных системной красной волчанкой, сахарным диабетом 1 типа, болезнью Крона, псориазом, ревматоидным артритом [5, 6].

В настоящее время является актуальным изучение роли Трег в развитии аутоиммунных нарушений при РС и определение взаимосвязи количественного и функционального дефекта этих клеток с клинической картиной заболевания.

Пациенты и методы

В работе представлены результаты определения количества Трег в периферической крови 52 больных РС. Из них 19 пациентов изучены в динамике, как в стадии обострения, так и в стадии ремиссии. У всех больных РС была детально изучена клиническая картина заболевания с использованием данных анамнеза, неврологического и соматического статуса, проведена магнитно-резонансная томография (МРТ) головного и/или спинного мозга. Все пациенты, включенные в исследование, имели достоверный диагноз РС, согласно диагностическим критериям McDonald (пересмотр 2010 г.) [7]. Тяжесть неврологического дефицита оценивали с использованием расширенной шкалы инвалидизации The Expanded Disability Status Scale (EDSS). Контрольная группа состояла из 21 здорового донора, которые были сопоставимы с больными PC по возрасту и полу.

Определение иммунного статуса методом проточной ци-тометрии проводили с использованием набора реагентов: четырехцветные антитела CD3 FITC/CD8 PE/CD45 PerCP/ /CD4 APC; CD3 FITC/CD16+56 PE/CD45 PerCP/CD19 APC и лизирующий раствор.

Отбор крови производили из вены утром в пробирки с антикоагулянтом ЭДТА. Кровь с антикоагулянтом хранили в темноте при комнатной температуре (от 20 до 25°С) и подвергали первичной обработке и окрашиванию в течение 24 ч с момента забора, затем проводили анализ не позднее 24 ч после окрашивания.

На первом этапе исследования в цельной крови окрашивали лимфоциты соответствующими антителами (CD3/ /CD8/CD45/CD4 и CD3/CD16+56/CD45/CD19) с их последующим лизированием согласно протоколу. После инкубирования образцов измеряли иммунный статус на проточном цитометре.

Обнаружение Т-регуляторных лимфоцитов CD4+CD25+Foxр3+ проводили методом проточной цитоме-трии с использованием антител к Foxр3.

Вначале выделяли лимфоциты из цельной крови согласно протоколу исследования. Выделенные и отмытые лимфоциты помещали в раствор Хенкса и проводили их подсчет в камере Горяева.

Далее в выделенных лимфоцитах (106) окрашивали Т-регуляторные лимфоциты CD4+CD25+Foxр3+ согласно протоколу исследования, которое включало поверхностное окрашивание клеток с антителами CD4 и CD25 и внутриклеточное окрашивание антителами анти-Foxр3.

Количественное измерение Т-регуляторных лимфоцитов CD4+CD25+Foxр3+ проводили на проточном цитометре.

Метод определения супрессорной активности регулятор-ных Т-клеток С04+С025+РохрЭ+ в смешанной культуре лимфоцитов (MLR) включал в себя: выделение субпопуляций регуляторных и эффекторных Т-лимфоцитов и антиген-презентирующих клеток (АПК), окраску эффекторных Т-лимфоцитов витальным красителем карбоксифлуоресце-ин сукцинимидиловым эфиром (CFSE) и их пролиферацию в смешанной культуре лимфоцитов, которую оценивали по редукции внутриклеточного красителя CFSE методом проточной цитофлуориметрии.

На первом этапе исследования из цельной крови выделяли фракцию мононуклеарных клеток. Далее проводили сепарацию субпопуляции CD4+ Т-лимфоцитов из суспензии выделенных мононуклеарных клеток на колонках, находящихся в магнитном поле согласно протоколу (Myltenyi Biotec, Germany). Затем проводили окрашивание клеток CD4+/CD4+CD25- с их последующим осаждением и 30-40 мин инкубацией в ^2-инкубаторе.

Следующим этапом работы было определение супрессорной активности регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxр3+ в смешанной культуре лимфоцитов. Для чего в 96-луночные культуральные планшеты добавляли равное количество эффекторных (CD4+CD25-) и регуляторных (CD4+CD25+Foxp3+) выделенных Т-лимфоцитов, а также антиген-презентирующие клетки. Кроме того, ставили позитивный (эффекторные клетки и АПК) и негативный (только эффекторные клетки) контроли. Для активации лимфоцитов в каждую лунку добавляли анти-CD3 молекулы, объем лунок доводили до 200 мкл добавлением среды RPM. В ее состав входили 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% раствора антибиотика (пенициллин-стрептомицина). Клетки инкубировали в СО2-инкубаторе 3-5 дней.

Далее проводили измерения на проточном цитометре. Перед анализом клетки инкубировали с анти-CD4 антителами, коньюгированными с флуорохромом FITC, и отмывали.

Результаты представлены как индекс пролиферации (PI) -соотношение суммы событий в каждом поколении и вычисленного количества исходных родительских клеток (подсчитывали как остаток от деления числа событий в каждом поколении на 2 в степени, соответствующей номеру поколения).

R-, PI опыт — PI негатив j ллл/

= 1 - ™--х 100%,

Pin

, - PL

где Р1опыт - смешанная культура лимфоцитов (эффекторные клетки, АПК и регуляторные Т-клетки С04+С025+Рохр3+); Р1негатив - эффекторные клетки; Р1пози™в - эффекторные клетки и АПК.

Статистическую обработку проводили с использованием программы «Statsoft 31а11в11са V. 6.0». Достоверность получаемых различий оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни (сопоставление двух независимых групп данных по количественным признакам в случае распределений, отличных от нормальных). Достоверными считали различия при р < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Для оценки уровня Трег в периферической крови больных РС, исследовали количество Трег методом проточной цитоме-

Количественный и функциональный дефект регуляторных Т-клеток Сй4+СР25+Рохр3+ у больных рассеянным склерозом

трии и сравнивали содержание этих клеток в группе больных и доноров. В ходе исследования получено, что количество Трег в крови больных РС составило 1,33 ± 0,95%, а у доноров в среднем - 3,43 ± 1,6%. Это указывает на достоверно значимое снижение (р < 0,005) количества этих клеток у больных РС.

В стадии ремиссии неврологический дефицит полностью или частично регрессирует. Поэтому группа больных была обследована как в ремиссии, так и в стадии обострения РС. В среднем у больных, включенных в исследование, число Трег в стадии обострения составило 0,91 ± 0,56%, а в стадии ремиссии увеличилось до 2,21 ± 1,72%. Несмотря на то, что данный результат приближается к показателям здоровых доноров, сохраняется статистически значимое снижение (р < 0,005) количества Трег у больных РС в ремиссии.

Далее было проведено сопоставление между показателями тяжести заболевания и уровнем Трег в крови больных РС. Результаты продемонстрировали очевидную обратную зависимость (г = -0,717) между количеством Трег и степенью неврологического дефицита по шкале БОББ. Данная корреляционная зависимость свидетельствует о том, что нарастание выраженности неврологической симптоматики сопровождает повышение активности аутореактивных Т-клеток и, как следствие, снижение количества Трег.

Корреляционный анализ между длительностью заболевания и количественным содержанием Трег также выявил обратную зависимость (г = -0,647), свидетельствующую, что чем больше длительность заболевания, тем ниже количество Трег. Установлено, что у лиц, страдающих РС меньше 36 мес, количество Трег составило 1,97 ± 0,9%, в то время как у пациентов, страдающих РС более 36 мес, - 0,73 ± 0,4% (р < 0,05).

Следующим этапом исследования была оценка супрес-сорной активности, выраженная в способности Трег подавлять эффекторные функции СО4+ Т-клеток (в тесте смешанной культуры лимфоцитов) у больных РС на разных стадиях заболевания. Получено, что супрессорная активность Трег у больных в стадии ремиссии составляет 55,94 ± 7,76%, в стадии обострения - 65,20 ± 4,92%, в то время как у здоровых доноров - 86,92 ± 4,41%. Таким образом, наблюдали достоверное снижение (р < 0,05) функциональной активности Трег у больных РС как в стадии обострения, так и в стадии ремиссии при сравнении с группой здоровых доноров. Статистически значимого отличия су-прессорной фунуции Трег на разных стадиях аутоиммунного процесса при РС не получено.

Для активации и пролиферации Трег также важную роль играет интерлейкин-2 (ИЛ-2) в связи с постоянной высокой интенсивностью экспрессии СО25+ (альфа-цепи рецептора ИЛ-2) на их мембране. Помимо этого, супрессорный механизм Трег осуществляется за счет экспрессии широкого спектра других маркеров. Основными из них являются ци-тотоксический Т-лимфоцит-ассоциированный протеин-4 (С^А-4), мембранно-связанный трансформирующий фактор роста бета (ТФРр). Предполагают, что они опосредуют супрессорный эффект Трег через межклеточные контакты с отвечающими на антиген Т- и В-клетками. Ингибиторный эффект Трег может быть также опосредован и цитокинами, в частности ИЛ-10 [8]. В активации, дифференцировке и функ-

циональной активности Трег важное участие принимает ядерный фактор транскрипции, связанный с Х-хромосомой (Бохр3) [9]. У больных аутоиммунными заболеваниями, включая рассеянный склероз, наблюдается дефект функции гена Бохр3, в результате чего снижено общее количество Трег и подавлена их супрессорная активность [10].

В результате проведенного исследования получено, что в крови больных РС более чем в 2 раза снижено количество Трег по сравнению с группой здоровых лиц. Функциональная активность Трег клеток, выделенных из периферической крови больных, также существенно снижена. Полученные результаты подтверждают данные других авторов [11, 12]. Однако, целый ряд исследователей считают, что у больных РС нарушена только функция, а не количественное содержание Трег [10, 13, 14], опираясь на данные анализа Трег без учета стадии, степени тяжести и длительности РС. Напротив, приведенные нами данные получены у группы больных, обследованных как в стадии обострения, так и в стадии ремиссии. В результате показано, что в стадии обострения количество Трег значительно снижено, тогда как в стадии ремиссии их содержание увеличивается. По данным Venken К., 2008, уменьшение количества и функциональной активности Трег связано со снижением уровня экспрессии гена Бохр3, в стадии же ремиссии этот уровень возрастает, происходит активация и увеличение числа Трег, и, как следствие, подавление пролиферации СО4+ и СО8+ Т-клеток [12].

Нами впервые установлена значимая корреляция между низким количеством Трег и степенью тяжести РС. Вероятно, она связана с активацией патологического процесса и срывом механизмов иммунологической толерантности, обеспечиваемых Трег. В свою очередь, это приводит к большей распространенности воспалительного процесса в ЦНС и проявляется нарастанием неврологического дефицита у пациентов.

Отмечено, что чем больше времени прошло от начала заболевания, тем ниже уровень Трег. Снижение уровня и функции Трег у больных РС отражает активацию аутоиммунного процесса в обострении болезни вследствие нарушения баланса между аутоагрессивными Т-клетками и Трег [15]. По мнению авторов, увеличение длительности аутоиммунного процесса при РС и, соответственно, наличие у пациентов большего количества обострений за всю историю заболевания приводит к истощению регуляторных механизмов и к количественному и функциональному дефициту Трег у данной категории больных.

Заключение

Полученные данные показывают снижение количества и функциональной активности регуляторных Т-клеток СО4+СО25+Бохр3+ (Трег) у больных рассеянным склерозом на разных стадиях аутоиммунного процесса при данном заболевании, что имеет непосредственную связь с тяжестью де-миелинизирующего процесса и его длительностью. Выявленное увеличение содержания Трег у больных рассеянным склерозом в стадии ремиссии свидетельствует о том, что данные клетки играют роль в поддержании иммунологической толерантности. Исходя из этого, проведенное иссле-

дование количества Трег в крови больных рассеянным склерозом и определение супрессорной активности может служить дополнительным лабораторным тестом определения степени активности патологического процесса при данном заболевании.

Литература

1. Гусев Е.И., Бойко А.Н., Завалишин И.А. Эпидемиологическое исследование рассеянного склероза: Метод. рекоменд. МЗ РФ №2003/82. М., 2003. С.80.

2. Fletcher J.M., Lalor S.J., Sweeney C.M. et al. T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis // Clin. Exp. Immunol. 2010. V.162. №1. P.1-11.

3. Sakaguchi S., Ono M., Setoguchi R. et al. Foxp3+CD4+CD25+ natural regulatory T cells in dominant self-tolerance and autoimmune diseases // J. Immunol. 2006. V.212. P.8-27.

4. Насонов Е.Л., Быковская С.Н. Т-регуляторные клетки при аутоиммунных ревматических заболеваниях // Вестн. РАМН. 2006. №9-10. С.74-82.

5. Dejaco C., Duftner C., Grubeck-Loebenstein B., Schirmer M. Imbalance of regulatory T cells in human autoimmune diseases // Immunology. 2006. V.117. №3. P.289-300.

6. Lyssik E.Y., Torgashina A.V., Soloviev S.K. et al. Reduced number and function of CD4+CD25highFoxp3 regulatory T cells in patient with systemic lupus erythematosus // Adv. Exp. Med. Biol. 2007. V.601. P.113-119.

7. Polman C.H., Reingold S.C., Banwell B. et al. Diagnostic criteria for multiple sclerosis: 2010 revisions to the McDonald criteria // Ann. Neurol. 2011. V.69. №2. P.92-302.

8. Nakamura K., Kitani A., Strober W. Cell contact-dependent immunosuppression by CD4+CD25+ regulatory T cells is mediated by cell surface-bound transforming growth factor beta // J. Exp. Med. 2001. V.194. P.629-644.

9. Jiang S., Lechler R.I., He X.S., Huang J.F. Regulatory T cells and transplantation tolerance // Hum. Immunol. 2006. V.67. №10. P.765-776.

10. Feger U. HLA-G expression defines a novel regulatory T-cell subset present in human peripheral blood and sites of inflammation // Blood. 2007. V.110. P.568-577.

11. Saresella M., Marventano I., Longhi R. et al. CD4+CD25+FoxP3+PD1- regulatory T cells in acute and stable relapsing-remitting multiple sclerosis and their modulation by therapy // FASEB J. 2008. V.22. №10. P.3500-3508.

12. Venken K. Compromised CD4+ CD25 high regulatory T-cell function in patients with relapsing-remitting multiple sclerosis is correlated with a reduced frequency of FOXP3-positive cells and reduced FOXP3 expression at the single-cell level // Immunology. 2008. V.123. P.79-89.

13. Haas J., Hug A., Viehover A. et al. Reduced suppressive effect of CD4+CD25 high regulatory T cells on the T cell immune response against myelin oligodendrocyte glycoprotein in patients with multiple sclerosis // Eur. J. Immunol. 2005. V.35. P.3343-3352.

14. Viglietta V., Baercher-Allan C., Weiner H.L., Haefer D.A. Human CD4+CD25+ regulatory T cells // J. Exp. Med. 2004. V.199. №7. P.971-972.

15. Wan Y.Y., Flavell R.A. Regulatory T-cell functions are subverted and converted owing to attenuated Foxp3 expression // Nature. 2007. V.445. P.766-770.

Информация об авторах:

Завалишин Игорь Алексеевич, доктор медицинских наук,

профессор, заведующий 6-м неврологическим отделением

Научного центра неврологии РАМН

Адрес: 125367, Москва, Волоколамское ш., 80

Телефон: (495) 490-2155

E-mail: neurology@mail.ru

Быковская Светлана Нюневна, доктор медицинских наук, профессор, заведующая отделом клеточных технологий и регенеративной медицины Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И.Пирогова

Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1 Телефон: (495) 343-1444 E-mail: sbykovk@mail.ru

СТРАНИЧКА УЧЕНОГО СОВЕТА РНИМУ ИМ. Н.И.ПИРОГОВА

Информация о защитах диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздравсоцразвития России

Автор Тема Специальность

Рунихин Александр Изучение механизма действия простагландинов 14.03.03 - патологическая физиология

Юрьевич конкурентных групп

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова» Минздравсоцразвития России и НИИ клинической кардиологии им. АЛ.Мясникова Российского кардиологического научно-производственного комплекса Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. Научный консультант - д.м.н., проф. Г.В.Порядин. Защита состоится 26.12.2011 г. в 14.00 на заседании диссертационного совета Д 208.072.05 (117997, Москва, ул. Островитянова, 1; тел. для справок: 434-84-64).

Меликян Элина Качество жизни больных эпилепсией 14.01.11 - нервные болезни

Герасимовна

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова» Минздравсоцразвития России. Научный консультант - д.м.н., проф. А.Б.Гехт. Защита состоится 30.01.2012 г. в 14.00 на заседании диссертационного совета Д 208.072.09 (117997, Москва, ул. Островитянова, 1; тел. для справок: 434-84-64).