РАСТЕНИЯ РОДА EUSTOMA С ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МУЖСКОЙ СТЕРИЛЬНОСТЬЮ И СПОСОБ ИХ ВЫВЕДЕНИЯ
PLANTS OF GENUS EUSTOMA WITH CYTOPLASMIC MALE STERILITY AND METHOD OF THEIR INTRODUCTION

Область техники
Настоящее изобретение относится к новым растениям рода Eustoma, имеющим цитоплазматическую мужскую стерильность, и к способу их выведения. Более конкретно настоящее изобретение относится к новым растениям рода Eustoma, имеющим цитоплазматическую мужскую стерильность, причем у растений Eustoma по существу отсутствует функция производства пыльцы вследствие недостаточного формирования тычинок или пыльцы, и к способу их выведения.
Предпосылки создания изобретения
Eustoma представляет собой общее название для самоопыляющихся, размножающихся семенами растений рода Eustoma из семейства Gentianaceae и в природе произрастающих в регионе от южных областей Северной Америки до северных областей Центральной Америки. Эти растения включают в себя два вида: (1) Eustoma grandiflorum (английское название: горечавка луговая, бывшее научное название Е. russellianum (Hook) G. Don ex Sweet или Lisianth(i)us russellianus Hook.) и (2) Eustoma exaltatum (английское название горечавка болотная или горечавка малая, бывшее научное название E. selenifolium Salisb.). Эти растения также общеизвестны как Lisianthus. В 1835 году аборигенный вид был завезен в Шотландию и назван Lisianthus russellianus Hook. Растения были завезены в Японию в 1930-х годах и с тех пор активно разводились, в основном на срезку или в качестве горшечных растений. В основном в таком разведении используется Eustoma grandiflorum.
Растения рода Eustoma известны как цветочные и декоративные растения с высокими декоративными и рыночными качествами. В частности, были созданы сорта с различными характеристиками в качестве цветочных сортов на срезку, и эти сорта Eustoma считаются одними из основных видов, выращиваемых на срезку (см. непатентную литературу 1).
Обычно в основной массе садоводческих культур используются растения первого поколения (F1), превосходящие по характеристикам своих родителей вследствие эффекта гетерозиса. Среди сортов Eustoma, высоко востребованных в качестве цветов на срезку, также превалируют сорта первого поколения, потому что это обеспечивает растениям устойчивость к заболеваниям или высокое качество.
Для эффективного посева в растениеводстве селекционеры обязаны поставлять семена высокого качества. Производство семян сортов первого поколения, во-первых, предполагает ручную эмаскуляцию материнского родительского растения с последующим опылением рыльца эмаскулированного материнского родительского растения пыльцой отцовского родительского растения.
Период, когда цветок материнского родительского растения может быть успешно эмаскулирован, обычно ограничен стадией непосредственно перед цветением, а также, как правило, зависит от погодных условий. Поэтому эмаскуляция представляет собой проблемную операцию из-за сложности предсказания возможного периода эмаскуляции. Поскольку эта операция выполняется вручную, то пыльца, которая остается вследствие неполной эмаскуляции, может привести к появлению нежелательных семян, полученных в результате самоопыления. Загрязнение такими семенами приводит к нежелательному снижению качества семян. По этим причинам необходима разработка способа получения семян Eustoma с использованием мужской стерильности, который исключает необходимость ручной эмаскуляции материнского родительского растения.
Известны карликовые растения Lisianthus, трансформированные переносом гена rolC с использованием Agrobacterium rhizogenes, (непатентная литература 2), которые согласно публикациям имеют небольшие цветы и теряют фертильность пыльцы одновременно с исчезновением апикального доминирования (rolC-синдром). Методика из непатентной литературы 2 применялась в раскрытом способе для получения сорта F1 с использованием растений Lisianthus, имеющего мужскую стерильность, причем сорт размножается регенерацией придаточных побегов (патентная литература 1). Однако сорт F1, полученный по этому способу, обладает нежелательными характеристиками. Поэтому способ не может использоваться для разведения сортов цветов на срезку, которые должны иметь товарные вид или высоту растений.
Цитоплазматическая мужская стерильность (CMS), один из видов мужского бесплодия, является цитоплазматически наследуемой. Скрещивание линии с цитоплазматической мужской стерильностью с линией с мужской фертильностью обеспечивает семена высокого качества. Кроме того, линию с цитоплазматической мужской стерильностью можно скрещивать с базовой линией, имеющей такой же ядерный геном, как и линия с цитоплазматической мужской стерильностью, и нормальную цитоплазму, чтобы, таким образом, легко поддерживать и размножать линию. Следовательно, такой способ получения семян сорта первого поколения с использованием цитоплазматической мужской стерильности является очень удобным и используется для большого числа основных садовых культур. Тем не менее, до сих пор не был опубликован способ получения Eustoma с цитоплазматический мужской стерильностью, несмотря на востребованность способа получения семян Eustoma с использованием мужской стерильности. Соответственно в производстве семян сортов F1 Eustoma все еще осуществляется получение семян, требующее эмаскуляции вследствие отсутствия системы получения семян с использованием промышленных линий с мужской стерильностью.
Кроме того, также востребованы хорошие сроки хранения цветов, которые обеспечивают увеличение времени, во время которого цветок является декоративным элементом, что является результатом отложенного увядания лепестков. Примеры причин увядания лепестков включают опыление и образование этилена, вызванное повреждением на рыльце или рыльца пестика (непатентная литература 3).
Eustoma, имеющая деформированный пестик, рыльце которого остается закрытым, таким образом предотвращая опыление и отложенное увядание цветков, известна как сорт Eustoma, имеющий хороший срок хранения цветов (патентный документ 2).
Увеличение срока хранения цветов потребовало выведения линии, имеющей короткие нити тычинок, или использования линии растений, имеющих измененную структуру органов, чтобы предотвратить опыление его собственного рыльца физически, как в случае указанного выше деформированного пестика.
Одним из востребованных условий для цветов и декоративных растений высокой рыночной стоимости является предупреждение выброса пыльцы. Однако все существующие сорта Eustoma имеют тычинки, которые производят пыльцу и, следовательно, вызывают, например, выброс пыльцы, что является нежелательным вследствие загрязнения лепестков или одежды.
Хотя проблемы, связанные со сроками хранения цветов и т. д., могут быть решены с использованием мужской стерильности без изменения полезных свойств, до сих пор не были разработаны такие растения, как промышленные растения Eustoma с мужской стерильностью.
Список цитируемой литературы
Патентная литература
Патентная литература 1. Патент Японии, опубликованный под № 9-107829.
Патентная литература 2. Патент Японии № 4133011.
Непатентная литература
Непатентная литература 1. Nogyo Gijutsu Taikei (Agricultural Technology System (in Japanese)), Flowers and Ornamental Plants, Vol. 8, addendum, No. 6, p. 387-395, 2004, issued by Rural Culture Association Japan.
Непатентная литература 2. The Tissue Culture (in Japanese), Vol. 19, No. 2, p. 50-55, 1993, New Science Co., Ltd.
Непатентная литература 3. Jissen Kaki Engei Gijutsu (Actual Practice of Ornament Horticultural Techniques (in Japanese)), Cultivation Management and Blooming Adjustment of Lisianthus, 2003, issued by Seibundo Shinkosha Publishing Co., Ltd.
Непатентная литература 4. E. S. Mousavi, M. Behbahani, E. Hadavi, S. M. Miri (2012), CALLUS INDUCTION AND PLANT REGENERATION IN LISIANTHUS (EUSTOMA GRANDIFLORIUM), ANNIVERSARY EDITION TRAKIA JOURNAL OF SCIENCES, Vol. 10, No. 1, pp. 22-25.
Непатентная литература 5. J. Duminil, M.-H. PEMONGE and R. J. PETIT (2002), Molecular Ecology Notes, vol. 2, p. 428-430 "A set of 35 consensus primer pairs amplifying genes and introns of plant mitochondrial DNA".
Краткое описание сущности изобретения
Проблема, на которую направлено изобретение
В свете проблем, таких как трудновыполнимая эмаскуляция при производстве семян F1 обычных сортов Eustoma, проблема ухудшения качества семян и проблема сроков хранения цветов или выброса пыльцы, описанных выше, настоящее изобретение предлагает новые растения Eustoma, имеющие цитоплазматическую мужскую стерильность, и способ их получения.
Способ решения проблемы
Для достижения поставленной цели авторы изобретения провели тщательные исследования, и в результате которых изобрели способ разведения, который включает получение нового растения Eustoma, имеющего цитоплазматическую мужскую стерильность, разведение линии Eustoma, имеющей цитоплазматическую мужскую стерильность, и получение сорта первого поколения с использованием Eustoma с цитоплазматической мужской стерильностью.
В частности, настоящее изобретение относится к новым растениям Eustoma, имеющим цитоплазматическую мужскую стерильность, и способу их выведения. Более предпочтительно настоящее изобретение относится к новым растениям рода Eustoma, имеющим цитоплазматическую мужскую стерильность, причем растения рода Eustoma по существу не обладают функцией производства пыльцы вследствие недостаточного формирования тычинок или пыльцы, и к способу их выведения.
В частности, настоящее изобретение предлагает следующее (1)-(34):
(1) Растение Eustoma, имеющее цитоплазматическую мужскую стерильность, или его потомство.
(2) Растение Eustoma или его потомство по п. (1), причем Eustoma или его потомство имеет нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1 или 2.
(3) Растение Eustoma или его потомство по пп. (1) или (2), причем Eustoma или его потомство являются растениями с мужской цитоплазматической стерильностью, полученными в результате перекрестного опыления, чьим материнским родителем является растение Eustoma, имеющее нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1 или 2, и чьим отцовским родителем является произвольное растение Eustoma.
(4) Растение Eustoma или его потомство по любому из пп. (1)-(3), причем растение Eustoma или его потомство являются растениями с мужской цитоплазматической стерильностью, полученными в результате перекрестного опыления, чьим материнским родителем является растение Eustoma, имеющее нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1 или 2, и чьим отцовским родителем является E. grandiflorum.
(5) Часть организма растения Eustoma или его потомства по любому из пп. (1)-(4).
(6) Семя растения Eustoma или его потомства по любому из пп. (1)-(4).
(7) Каллус, содержащий клетки растения Eustoma или его потомства по любому из пп. (1)-(4).
(8) Растение Eustoma, выращенное из каллуса по п. (7) и размноженное бесполым образом с помощью культуры тканей, или его потомство.
(9) Часть организма растения Eustoma или его потомства по п. (8).
(10) Способ получения растения Eustoma, которое выращено из каллуса по п. (7) и размножено бесполым образом с помощью культуры тканей.
(11) Цитоплазма, содержащаяся в растении Eustoma или его потомстве по любому из пп. (1)-(4) и (8), части организма растения по любому из пп. (5) и (9), семени по п. (6) или каллусе по п. (7).
(12) Митохондрии, содержащиеся в растении Eustoma или его потомстве по любому из пп. (1)-(4) и (8), части организма растения по любому из пп. (5) и (9), семени по п. (6) или каллусе по п. (7).
(13) Растение Eustoma, имеющее цитоплазматическую мужскую стерильность, которое обозначено регистрационным номером FERM BP-11506, или его потомство.
(14) Часть организма растения Eustoma или его потомства по п. (13).
(15) Семя растения Eustoma или его потомства по п. (13).
(16) Цитоплазма, содержащаяся в растении Eustoma или его потомстве по п. (13), части организма растения по п. (14) или семени по п. (15).
(17) Митохондрии, содержащиеся в растении Eustoma или его потомстве по п. (13), части организма растения по п. (14) или семени по п. (15).
(18) Каллус растения Eustoma, имеющего цитоплазматическую мужскую стерильность, который обозначен регистрационным номером FERM BP-11507.
(19) Растение Eustoma, которое выращено из каллуса по п. (18) и размножено бесполым образом с помощью культуры тканей, или его потомство.
(20) Часть организма растения Eustoma или его потомства по п. (19).
(21) Способ получения растения Eustoma, которое выращено из каллуса по п. (18) и размножено бесполым путем с помощью культуры тканей.
(22) Цитоплазма, содержащаяся в каллусе по п. (18), растении Eustoma или его потомстве по п. (19), или части организма растения по п. (20).
(23) Митохондрии, содержащиеся в каллусе по п. (18), растении Eustoma или его потомстве по п. (19), или части организма растения по п. (20).
(24) Способ получения семян первого поколения, включающий скрещивание растения Eustoma или его потомства по любому из пп. (1)-(4) и (8) в качестве материнского родительского растения с растением Eustoma, способным скрещиваться с материнским родительским растением в качестве отцовского родительского растения, и получение семян первого поколения от материнского родительского растения, скрещенного таким образом.
(25) Способ получения семян первого поколения, включающий скрещивание растения Eustoma или его потомства по п. (13) в качестве материнского родительского растения с растением Eustoma, способным скрещиваться с материнским родительским растением в качестве отцовского родительского растения, и получение семян первого поколения от материнского родительского растения, скрещенного таким образом.
(26) Способ получения семян первого поколения, включающий скрещивание растения Eustoma, регенерированного из каллуса по п. (18), или его потомства в качестве материнского родительского растения с растением Eustoma, способным скрещиваться с материнским родительским растением в качестве отцовского родительского растения, и получение семян первого поколения от материнского родительского растения, скрещенного таким образом.
(27) Семя первого поколения, полученное способом по любому из пп. (24)-(26).
(28) Растение первого поколения, выращенное из семени первого поколения по п. (27).
(29) Способ получения растения Eustoma, включающий последовательное возвратное скрещивание растения Eustoma, имеющего нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1 или 2, в своей цитоплазме, с растением Eustoma, имеющим полезный признак, для того чтобы получить растение Eustoma, которое имеет полезный признак и обладает цитоплазматической мужской стерильностью.
(30) Способ получения растения Eustoma, включающий последовательное возвратное скрещивание растения Eustoma, имеющего цитоплазматическую мужскую стерильность, которое обозначено регистрационным номером FERM BP-11506, или его потомства с растением Eustoma, имеющим полезный признак, для того чтобы получить растение Eustoma, которое имеет полезный признак и обладает цитоплазматической мужской стерильностью.
(31) Способ получения растения Eustoma, включающий последовательное возвратное скрещивание растения Eustoma, которое выращено из каллуса растения Eustoma, имеющего цитоплазматическую мужскую стерильность, который обозначен регистрационным номером FERM BP-11507, и размножено бесполым путем в культуре тканей, или его потомства с растением Eustoma, имеющим полезный признак, для того чтобы получить растение Eustoma, которое имеет полезный признак и обладает цитоплазматической мужской стерильностью.
(32) Способ получения растения Eustoma по любому из пп. (29)-(31), причем растение Eustoma, имеющее полезный признак, получено из E. grandiflorum.
(33) Растение Eustoma, полученное способом по любому из пп. (29)-(32), или его потомство.
(34) Часть организма растения Eustoma или его потомства по п. (33).
Полезные эффекты изобретения
Использование нового растения Eustoma, имеющего цитоплазматическую мужскую стерильность, предложенного в настоящем изобретении, позволяет выведение растения Eustoma и его сорта F1 с превосходной семенной продуктивностью, сроком хранения цветов и/или декоративными характеристиками и получение высококачественных семян его сорта F1.
Краткое описание чертежей
Фигура 1. На фигуре 1 показано растение Eustoma с мужской цитоплазматической стерильностью по настоящему изобретению и растение Eustoma с мужской фертильностью. На фигуре 1(А) показана линия, имеющая мужскую фертильность, на фигурах 1(В) и 1(С) показана линия с цитоплазматической мужской стерильностью, имеющая неполноценно развитые тычинки. На фигуре 1(D) показана линия с цитоплазматической мужской стерильностью, не имеющая тычинок.
Фигура 2. На фигуре 2 показаны результаты электрофореза после ПЦР с использованием в качестве матриц тотальной ДНК из линии Eustoma с цитоплазматической мужской стерильностью (SSE-CMS цитоплазма: дорожка 1), диких видов Eustoma (дорожки 2-8), содержащихся в Sakata Seed Corporation, и культурных сортов Eustoma (дорожки 9-15), выведенных Sakata Seed Corporation. В дорожке М нанесен эталонный маркер молекулярных весов. На фигуре 2(А) показаны результаты, полученные с использованием маркера 1, который является маркером, специфичным для SSE-CMS линии Eustoma. На фигуре 2(В) показаны результаты, полученные с использованием маркера 2, который является маркером, специфичным для SSE-CMS линии Eustoma. На фигуре 2(С) показаны результаты, полученные с использованием nad5/4-5, который является маркером, общим для всех растений Eustoma.
Фигура 3. На фигуре 3 показана нуклеотидная последовательность маркера 1 и маркера 2.
Описание вариантов осуществления изобретения
Далее настоящее изобретение будет описано подробно.
1. Растения Eustoma с мужской стерильностью
Способ выведения растений Eustoma, имеющих мужскую стерильность, по настоящему изобретению включает скрининг гибридов растений Eustoma на растения Eustoma, имеющие цитоплазматическую мужскую стерильность.
«Растение Eustoma» или «Eustoma» по настоящему изобретению относится к растению рода Eustoma из семейства Gentianaceae. Это растение является садовой культурой, общеизвестной в Японии как Lisianthus.
Цветки, в том числе цветки Eustoma, обычно имеют чашелистики и лепестки, среди которых находятся тычинки и пестики. Типичные тычинки состоят из содержащих пыльцу пыльников и тычиночных нитей. «Мужская стерильность» по настоящему изобретению относится к состоянию, когда недостаточно развитые тычинки не могут в достаточной степени производить пыльцу. Мужская стерильность проявляется, но не ограничивается этим, например, у растений Eustoma, не имеющих тычинок или имеющих несовершенно развитые тычинки (фигура 1). «Цитоплазматическая мужская стерильность» относится к признаку мужской стерильности, наследуемому по материнской линии, с использованием гена из цитоплазматической органеллы.
В настоящем изобретении «потомство растения Eustoma, имеющего цитоплазматическую мужскую стерильность» означает растение Eustoma следующего или более позднего поколения, которое получается при скрещивании женского родительского растения (материнского родительского растения) Eustoma, имеющего цитоплазматическую мужскую стерильность, с мужским родительским растением (отцовским родительским растением) Eustoma, способным скрещиваться с ним, и обладает наследуемой по материнской линии мужской стерильностью. В настоящем изобретении «часть организма растения» включает одну или несколько клеток растения или цитоплазму одной или нескольких клеток растения и, в частности, означает любое из органов или тканей, таких как цветки, листья, стебли и корни, клетки (включая протопласты, полученные из клеток) или цитоплазму из этих органов или тканей, и популяцию клеток или цитоплазм.
В настоящем описании объем выражения «растение Eustoma, которое обозначено регистрационным номером FERM BP-11506» также включает в себя растения, которые имеют признак цитоплазматической мужской стерильности и, по существу, эквивалентны указанному растению. В частности, объем выражения «растение Eustoma, которое обозначено регистрационным номером FERM BP-11506» также включает в себя, например, мутанты или генетические рекомбинанты растения Eustoma, обозначенного регистрационным номером FERM BP-11506, пока мутанты или генетические рекомбинанты сохраняют цитоплазматическую мужскую стерильность.
В настоящем описании объем выражения «каллус растения Eustoma, который обозначен регистрационным номером FERM BP-11507» также включает каллус, из которого регенерируются растения, имеющие признак цитоплазматической мужской стерильности, и который по существу эквивалентен указанному каллусу. В частности, объем выражения «каллус растения Eustoma, который обозначен регистрационным номером FERM BP-11507» также включает в себя, например, мутанты или генетические рекомбинанты, полученные из каллуса растения Eustoma, который обозначен регистрационным номером FERM ВР-11507, и каллусы, полученные из мутантов или генетических рекомбинантов (сохраняющих цитоплазматическую мужскую стерильность) растения Eustoma, которое обозначено регистрационным номером FERM BP-11506, пока регенерированные из них растения сохраняют цитоплазматическую мужскую стерильность.
Eustoma с цитоплазматической мужской стерильностью по настоящему изобретению имеет следующие признаки:
(1) Эта линия устраняет необходимость эмаскуляции материнских родительских растений для получения сорта первого поколения и, следовательно, позволяет экономически эффективное производство семян.
(2) Скрещивание этой линии с линией, имеющей мужскую фертильность, обеспечивает высококачественные семена благодаря мужской стерильности.
(3) Эта линия может быть скрещена с исходной линией, имеющей такой же ядерный геном, как данная линия, и нормальную цитоплазму, чтобы, таким образом, легко поддерживать и размножать линию.
(4) В этой линии, которая свободна от самоопыления, может подавляться старение цветков, вызванное опылением, что в результате дает хороший срок хранения цветов.
(5) Эта линия не имеет пыльцы и поэтому не загрязняет лепестки или одежду в результате выброса пыльцы.
2. Способ получения Eustoma с цитоплазматической мужской стерильностью
Способ получения Eustoma с цитоплазматической мужской стерильностью по настоящему изобретению включает в себя скрещивание диких видов растений Eustoma в качестве женского родительского растения с Eustoma grandiflorum в качестве мужского родительского растения, поиск в потомстве индивидуальных представителей, которые проявляют мужскую стерильность. Индивидуальные растения, не имеющие тычинок или имеющие несовершенно развитые тычинки, проверяются в качестве растений, которые проявляют мужскую стерильность. Для дальнейшего подтверждения того, что мужская стерильность является цитоплазматически наследуемой характеристикой, индивидуальные растения возвратно скрещивают с линией Eustoma с мужской фертильностью и подтверждают, что их дочерние растения проявляют мужскую стерильность.
3. Способ получения семян первого поколения
Растения Eustoma с цитоплазматической мужской стерильностью, полученные способом по настоящему изобретению, могут быть последовательно возвратно скрещены с растениями Eustoma, имеющими предпочтительную характеристику, чтобы тем самым получить предпочтительную линию, имеющую цитоплазматическую мужскую стерильность в виде потомства. Эта предпочтительная линия, имеющая цитоплазматическую мужскую стерильность, может использоваться в качестве материнского родительского растения для получения семян первого поколения (семян F1).
4. Тест на срок хранения цветов
Растения Eustoma с цитоплазматической мужской стерильностью по настоящему изобретению могут оцениваться по своему сроку хранения цветов, как показано ниже. В настоящем описании «срок хранения цветов» означает «продолжительность цветения». Соответственно «хороший срок хранения цветов» означает «относительно длительный период от начала до конца цветения». Является ли период цветения Eustoma относительно длинным, определяется сравнительной оценкой множества соответствующих индивидуальных представителей нормальных растений Eustoma с мужской фертильностью и растений Eustoma с цитоплазматической мужской стерильностью, выращенных в одинаковых условиях окружающей среды.
В качестве примера теста на срок хранения цветов позже будет описан способ оценки срока хранения срезанных цветов. В этом способе в качестве тестируемых материалов сначала получают соответствующее число нормальных индивидуальных растений Eustoma с мужской фертильностью и индивидуальных растений Eustoma с мужской стерильностью, культивируемых в одинаковых условиях. Цветки этих индивидуальных растений Eustoma собирают почти одновременно в день цветения (день, когда наблюдается открытие лепестков) на ножках. Ножки оставляют одинаковой длины (например, приблизительно от 4 до 6 см). Затем унифицированные тестируемые материалы оставляют стоять в комнате с регулируемой температурой, имеющей постоянную температуру (предпочтительно от 18 до 22°С), постоянную влажность (предпочтительно от 55 до 65%) и 12-часовые световые/12-часовые темновые циклы, так чтобы срезанные концы их стеблей были погружены в воду. Наблюдают за изменением внешнего вида цветов.
«Начало цветения» определяется как время, когда раскрылись лепестки. «Конец цветения» определяют по внешнему виду лепестков (сморщивание или увядание лепестков), чтобы измерить период цветения каждого цветка (период от начала цветения до конца цветения). Можно определить и сравнить средние значения соответствующих измеренных периодов цветения для нормальных индивидуальных растений с мужской фертильностью и индивидуальных растений с мужской стерильностью для оценки срока хранения цветов растений Eustoma с мужской стерильностью по настоящему изобретению.
5. Разработка молекулярных маркеров для определения отличий в цитоплазме
Митохондриальные геномные последовательности сравнивали между линией Eustoma с цитоплазматической мужской стерильностью, полученной по настоящему изобретению, и обычным известным растением Eustoma. Можно идентифицировать область, специфичную для линии Eustoma с цитоплазматической мужской стерильностью, чтобы таким образом получить молекулярный маркер, служащий в качестве отличительного фактора. Молекулярный маркер можно обнаружить в соответствии со способом, хорошо известным специалистам в данной области техники, таким как ПЦР. Использование молекулярного маркера может продемонстрировать, что линия Eustoma с цитоплазматической мужской стерильностью по настоящему изобретению точно отличается не только по морфологическому признаку, но и по молекулярно-биологическому признаку от общеизвестных растений Eustoma.
В качестве молекулярных маркеров для распознавания линии Eustoma с цитоплазматической мужской стерильностью по настоящему изобретению могут использоваться нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO: 1 и 2. В альтернативном варианте линию Eustoma, имеющую нуклеотидную последовательность, полученную из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1 или 2, путем делеции, замещения или добавления одного или нескольких оснований, также можно рассматривать как, по существу, такую же линию, как линия Eustoma с цитоплазматической мужской стерильностью по настоящему изобретению, пока нуклеотидная последовательность амплифицируется и обнаруживается так же, как и нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 1 или 2. Например, нуклеотидная последовательность, имеющая 80%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95% или еще больше % гомологии с нуклеотидной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1 или 2, может использоваться в качестве молекулярного маркера для обнаружения линии Eustoma с цитоплазматической мужской стерильностью.
6. Индукция каллуса, размножение и повторная дифференцировка линии Eustoma с цитоплазматической мужской стерильностью
Линию Eustoma с цитоплазматической мужской стерильностью, полученную с помощью настоящего изобретения, можно размножать бесполым путем в культуре тканей. Линию Eustoma с цитоплазматической мужской стерильностью можно размножать бесполым путем, например, способом индукции каллуса и повторной дифференцировки, раскрытым в непатентной литературе 4.
В частности, поверхность диска из листа растения линии Eustoma с цитоплазматической мужской стерильностью, выращенного в теплице, стерилизуют, а затем помещают в среду для индукции каллуса и культивируют, чтобы индуцировать образование каллуса. Затем образовавшийся каллус переносят в среду для повторной дифференцировки и культивируют, чтобы индуцировать образование ростка. Затем образовавшийся росток переносят в среду для укоренения, чтобы индуцировать образование корней. Таким образом регенерируют растение. Специалисты в данной области техники могут надлежащим образом подобрать условия культивирования для индукции каллуса, размножения и повторной дифференцировки в соответствии с методикой, известной в данной области.
Содержание всех патентов и ссылок, явно указанных в данном описании, полностью включены в него путем ссылки. Кроме того, полное содержание, описанное в спецификации и чертежах японской патентной заявки № 2012-213296 (поданной 27 сентября 2012), на основании которой испрашивается приоритет настоящей заявки, включено в данное описание путем ссылки.
Примеры
Настоящее изобретение будет описано более конкретно со ссылкой на примеры ниже. Однако настоящее изобретение никаким образом не ограничено этими примерами.
Пример 1. Получение нового растения Eustoma, имеющего мужскую стерильность
Растение Eustoma, имеющее мужскую стерильность по настоящему изобретению, было получено в научно-исследовательской станции Мисато из Sakata Seed Corporation путем скрининга гибридов между нативным растением Eustoma неизвестного вида, ввезенного из Соединенных Штатов Америки, и Eustoma grandiflorum.
Процесс выведения растения Eustoma по настоящему изобретению
Для получения семян F1 в общей сложности приблизительно 60 наборов гибридов были ранее получены между дюжиной линий нативных растений Eustoma неизвестного вида, содержащихся в Sakata Seed Corporation, и родительскими линиями (E. grandiflorum) различного происхождения, также содержащихся в Sakata Seed Corporation. Эти семена F1 высевали и проверяли фенотипы растений F1. Затем проводили скрининг F1-популяций, чтобы получить два или три индивидуальных растения, с которыми затем проводили широкомасштабное скрещивание для получения дочерних семян (далее именуемых «F2-поколение»).
Семена F2-поколения были посеяны, и примерно от 50 до 100 индивидуальных растений были выращены. Были проверены фенотипические признаки для F2-популяций. В результате в большинстве F2-популяций наблюдалось разделение по диаметрам, цветам и типам цветков и раннему цветению. Среди этих популяций F2-популяция, полученная из семян F1 (далее называемая набор А), полученных скрещиванием нативного растения Eustoma Е-1 неопознанного вида, содержащегося в Sakata Seed Corporation, в качестве женского родительского растения с родительской линией G1 (E. grandiflorum) в качестве мужского родительского растения, неожиданно дала множество индивидуальных растений, которые проявляли признаки мужской стерильности, что ранее была неизвестно для растений Eustoma. Из этих растений было выбрано одно, которое скрещивали с 4 родительскими линиями G-2, G-3, G-4 и G-5, содержащимися в Sakata Seed Corporation, в качестве отцовских родительских растений для получения семян (поколения F2BC1, указываемые как наборы В, С, D и Е соответственно). Поколения указаны как ВС1, BC2 и т. д., в соответствии с числом возвратных скрещиваний E. grandiflorum с CMS-линией (с цитоплазматической мужской стерильностью) во избежание путаницы.
Эти семена (поколения F2BC1) высевали и проверяли характеристики 12 индивидуальных растений на линию. В результате, все линии и индивидуальные растения имели признак мужской стерильности, выраженный отсутствием тычинок или недостаточно развитыми тычинками. Четыре индивидуальных растения поколения F2BC1, полученных из набора С (далее указаны как ms-1), два индивидуальных растения поколения F2BC1, полученных из набора D (далее указаны как ms-2), три и четыре индивидуальных растения поколения F2BC1, полученных из набора Е (в дальнейшем указаны как ms-3 и ms-4), были отобраны и скрещены с отцовскими родительскими растениями, т. е. родительскими линиями G-3 и G-6 для ms-1, родительскими линиями G-4 и G-7 для ms-2, родительскими линиями G-5 и G-8 для ms-3 и родительскими линиями G-5 и G-9 для ms-4, чтобы получить их соответствующие семена (поколения F2BC2).
Семена (поколения F2BC2) высевали, и проверяли фенотипические признаки потомства. В результате, дочерние популяции линий, полученных скрещиванием ms-1 с G-3 и G-6, включали некоторые отдельные растения с мужской стерильностью, имеющие недостаточно развитые тычинки, в то время как другие комбинации проявляли признак мужской стерильности, выраженный отсутствием тычинок. Эти индивидуальные растения с мужской стерильностью скрещивали примерно с сотней родительских линий, чтобы получить семена (поколения F2BC3).
Семена (поколения F2BC3) высевали и исследовали фенотипические признаки потомства. В результате было подтверждено, что потомство имеет признак мужской стерильности. Это показывает, что была успешно получена линия с цитоплазматической мужской стерильностью, стабильно наследуемой по материнской линии. Поэтому ее цитоплазма была названа цитоплазмой SSE-CMS. Семена F2BC1, проявляющие стабильную цитоплазматическую мужскую стерильность, были депонированы на международное хранение в Национальный институт технологии и оценки (NITE), Международный депозитарий запатентованных организмов (Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan) 20 июля 2012 года (номер, выданный депоненту для идентификации: 08P-81S; регистрационный номер FERM BP-11506).
Пример 2. Подтверждение воспроизводимости мужской стерильности
Для того чтобы подтвердить стабильное появление признака мужской стерильности, растения Eustoma скрещивали в качестве женского родительского растения с родительской линией G-10 (E. grandiflorum) в качестве мужского родительского растения, получая семена F1 (далее называемые набором F). Высевали семена наборов А и F, и 6 индивидуальных растений на набор отбирали и подвергали широкомасштабному скрещиванию. В результате, индивидуальные растения, полученные из набора А, давали семена поколения F2 с выходом 0,22 г на 56 стручков, в то время как индивидуальные растения, полученные из набора F, давали семена поколения F2 с выходом 0,47 г на 59 стручков. Семена поколения F2 для каждого набора высевали и оценивали процент появления мужских стерильных растений. В результате, 19 из 92 индивидуальных растений поколения F2, полученных из набора А, и 14 из 88 растений поколения F2, полученных из набора F, проявляли признак мужской стерильности.
Эти результаты показали, что признак мужской стерильности возникает стабильно.
Пример 3. Тестирование сорта Eustoma, имеющего мужскую стерильность, на срок хранения цветов
Линии с мужской стерильностью и фертильные линии проверяли в тесте на срок хранения цветов.
(1) Тестируемые материалы
В качестве тестируемых материалов были использованы два типа растений Eustoma: растения F1 Eustoma с нормальной мужской фертильностью и растения F1 Eustoma с цитоплазматической мужской стерильностью. Цветы (которые все по внешнему виду начали цветение) этих двух типов Eustoma собирали с поля для выращивания Eustoma, сохраняя их ножки. Ножки подравнивали до длины 4 см. Рыльца растений Eustoma с мужской фертильностью опыляли вручную пыльцой, предполагая, что эти растения будут перевозиться. Кроме того, растения Eustoma с цитоплазматической мужской стерильностью опыляли или не опыляли вручную пыльцой линии с мужской фертильностью, и оба эти варианта включали в тест.
(2) Способ тестирования
Тестирование на срок хранения цветов проводили с каждым тестируемым материалом, помещенным в пробирку, заполненную водопроводной водой, в термостатируемой комнате, имеющей температуру 20°С, при влажности 60% (±5%) и 12-часовых циклах включений-выключений обычной люминесцентной лампы (I-line White Rapid 40W). В ходе этого теста воду не меняли, так как не наблюдалось загрязнения и т. п. воды.
(3) Оценка и определения
«Начало цветения» определяют как время, когда раскрылись лепестки. «Конец цветения» определяет селекционер по внешнему виду лепестков (сморщивание или увядание лепестков).
(4) Результаты тестирования
Растения Eustoma с цитоплазматической мужской стерильностью, опыленные пыльцой фертильной линии не сильно отличались по сроку хранения цветов от растений Eustoma с мужской фертильностью. Это свидетельствует о том, что условия теста представляли собой условия, в которых генотип используемой линии не влияет на срок хранения цветов. Поскольку растения Eustoma с цитоплазматический мужской стерильностью не производят пыльцу, срок хранения их цветков был в среднем как минимум на 7 дней больше, чем у линии с мужской фертильностью (таблица 1).
Таблица 1Тестирование на срок хранения цветов
Материал
Способ обработки
Число индивидуальных растений в конце цветения
Через 4 дня
Через 5 дней
Через 6 дней
Через 7 дней
Через 8 дней
Через 9 дней
Через 10 дней
Через 11 дней
Линия с мужской фертильностью
Ручное опыление
12
17
15
9
5
2
1
Линия с мужской стерильностью
Ручное опыление пыльцой от фертильной линии
3
11
14
10
11
8
3
Линия с мужской стерильностью
Без опыления
3
3
4
6
7
Материал
Способ обработки
Число индивидуальных растений в конце цветения
Общее число проанализированных растений
Среднее число дней до конца цветения
Через 12 дней
Через 13 дней
Через 14 дней
Через 15 дней
Через 16 дней
Через 17 дней
Через 18 дней
Линия с мужской фертильностью
Ручное опыление
61
5,8
Линия с мужской стерильностью
Ручное опыление пыльцой от фертильной линии
60
6,9
Линия с мужской стерильностью
Без опыления
6
8
5
5
2
4
7
60
12,8
Пример 4. Разработка молекулярных маркеров для распознавания SSE-CMS линии Eustoma
SSE-CMS линия Eustoma, полученная с помощью настоящего изобретения, проявляет фенотипический признак, который не найден в обычных культурных сортах или диких видах. Одновременно был получен молекулярный маркер для распознавания SSE-CMS линии Eustoma, чтобы продемонстрировать, что эта линия отличается от общеизвестных растений Eustoma также с точки зрения молекулярной биологии.
Консенсусные праймеры для митохондриальной ДНК, описанные в непатентной литературе 5, использовались для проведения ПЦР-анализа SSE-CMS линии Eustoma и обычной линии Eustoma в качестве матриц. В результате были обнаружены маркеры, отличающиеся по размерам амплифицированных фрагментов ДНК. Из числа таких полиморфных маркеров были отобраны два типа маркеров, а именно nad4L/orf25 и nad7/4-5, и проанализированы нуклеотидные последовательности амплифицированных фрагментов. В результате были определены области, специфичные для SSE-CMS линии Eustoma. Для того чтобы использовать эти области в качестве отличительных факторов, были разработаны праймеры, представленные в таблице 2, и проводили ПЦР-анализ (30 повторяющихся циклов, каждый включающий тепловую денатурацию при 94°С в течение 1 минуты, отжиг при 65°С в течение 1 минуты и реакцию удлинения при 72°С в течение 1 минуты). В результате были успешно разработаны 2 типа молекулярных маркеров, «Маркер 1» и «Маркер 2», которые давали амплификацию фрагментов ДНК только на SSE-CMS линии Eustoma. Маркер 1 представляет собой маркер, который позволяет амплификацию ДНК-фрагмента длиной 323 п. о., представленного SEQ ID NO: 1, с использованием праймеров orf25-F и orf25-R (фигура 3). Маркер 2 представляет собой маркер, который позволяет амплификацию ДНК-фрагмента длиной 492 п. о., представленного SEQ ID NO: 2, с использованием праймеров nad7-F и nad7-R (фигура 3).
Маркеры, полученные с помощью описанного выше подхода, были использованы для проведения ПЦР-теста с использованием в качестве матриц 190 существующих линий Eustoma (E. grandiflorum), выведенных Sakata Seed Corporation, и 34 линий диких видов Eustoma, содержащихся Sakata Seed Corporation. В результате было подтверждено, что линией, несущей эти два типа нуклеотидных последовательностей, является только SSE-CMS линия Eustoma. Часть результатов теста показана на фигуре 2. Эксперименты на фигурах 2(А)-2(С) проводились при следующих условиях:
фигура 2(А): Маркер 1: Маркер, специфичный для SSE-CMS линии Eustoma.
Нуклеотидную последовательность (323 п. о.), представленную SEQ ID NO: 1, амплифицировали с помощью ПЦР (30 повторяющихся циклов, каждый включающий тепловую денатурацию при 94°С в течение 1 минуты, отжиг при 65°С в течение 1 минуты и реакцию удлинения при 72°С в течение 1 минуты) с использованием праймеров orf25-F и orf25-R.
Фигура 2(В): Маркер 2: Маркер, специфичный для SSE-CMS линии Eustoma.
Нуклеотидную последовательность (492 п. о.), представленную SEQ ID NO: 2, амплифицировали с помощью ПЦР (30 повторяющихся циклов, каждый включающий тепловую денатурацию при 94°С в течение 1 минуты, отжиг при 65°С в течение 1 минуты и реакцию удлинения при 72°С в течение 1 минуты) с использованием праймеров nad7-F и nad7-R.
Фигура 2(C): nad5/4-5: Маркер, общий для всех растений Eustoma
Фрагменты ДНК размером приблизительно 1,5 т. п. н. амплифицировали на всех линиях с помощью ПЦР (30 повторяющихся циклов, каждый включающий тепловую денатурацию при 94°С в течение 1 минуты, отжиг при 50°С в течение 1 минуты и реакцию удлинения при 72°С в течение 1 минуты) с использованием праймеров nad5/4 и nad5/5.
Таким образом, было показано, что SSE-CMS линия Eustoma, полученная по настоящему изобретению, отличается от общеизвестных растений Eustoma.
Таблица 2
Таблица 2Праймеры, используемые в настоящем изобретении, и их нуклеотидные последовательности
<img file="00000001.jpg" he="98" wi="160" img-content="undefined" img-format="jpg" />
Пример 5. Индукция каллуса, рост и повторная дифференцировка SSE-CMS линии Eustoma
Для размножения бесполым путем с помощью культуры тканей SSE-CMS-линии Eustoma, полученной по настоящему изобретению, собирали диски из листьев растений SSE-CMS-линии Eustoma, выращенных в теплице. Поверхность листовых дисков стерилизовали в течение 10 минут с использованием 1%-го раствора гипохлорита натрия и промывали стерильной водой. Стерилизованный листовой диск помещали в среду MS с добавлением 1,5 мг/л НАА для индукции каллуса. Каллус переносили в среду B5 с добавлением 0,5 мг/л GA3 и 1,5 мг/л BA для индукции образования ростка. Образовавшийся росток переносили в среду В5 без растительных гормонов для укоренения регенерированного растения, которое затем было подтверждено, как имеющее мужскую стерильность.
Каллус, полученный описанным выше способом, был депонирован в Национальный институт технологии и оценки (NITE), Международный депозитарий запатентованных организмов (Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan) 26 июля 2012 года (номер, выданный депоненту для идентификации: 12S-134C; регистрационный номер FERM BP-11507).
Промышленная применимость
Использование нового растения Eustoma, имеющего цитоплазматическую мужскую стерильность, предложенного в настоящем изобретении, позволяет выведение растений Eustoma и их сортов F1 с превосходной семенной продуктивностью, сроком хранения цветов и/или декоративными характеристиками и получение высококачественных семян его сорта F1.
Список последовательностей
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Sakata Seed Corporation
Eustoma
<120>  Растения  с цитоплазматической мужской стерильностью и способ
их создания
<130>  PS38-9001WO
<150>  JP2012-213296
<151>  2012-09-27
<160>  12
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  323
<212>  ДНК
<213>  Неизвестная
<220>
<223>  Маркер 1
<400>  1
ctactgaatc caagcgagtg gaatacttgg agcgagcgag gagcgagtgg aatacttgga       60
gcgagcgagg agcgagtgga atacttggag cgagcgagga gcgagtggaa tacttggagc      120
gagcgaggag cgagtggaat gaacgaaaaa cctaagaaaa tcaacttcaa tcagtgagct      180
agatgagaaa ggagactgaa gaaactgaaa gagtagtagg aggatgaaaa aggaagcaag      240
tggagtagga gcgaacgtgg gagtaggaaa cccgcttcct ttcttaccct aaacccactt      300
cctttctcgc ccagctctac cta                                              323
<210>  2
<211>  492
<212>  ДНК
<213>  Неизвестная
<220>
<223>  Маркер 2
<400>  2
aaccactaac accttcctcg ttggggctcc gtgcactggg aaaacgctaa cgcgacgttt       60
ttaactagag ttacaaagct ccaataaggt atcgagaggg ctatcatcga gaggaagcga      120
gttccatact tgaaacgagc atgggagcga gcggagtact ttcagcgagc ctaaaaagcg      180
agttccatac tcccatgttc gctccaggtg ttccgctcac ttggaacgaa aaacctaaga      240
aaatcaactt caatcagtga gctagatgag aaaggagact gaatcaacat caagagtagt      300
aggtttgaga ggatgagaag gtaaccgaag aaaagaaaaa aaatcagtga gctagatgag      360
aattaggaaa agagacttga tcttattcaa tcagtgatga gaaaggagca agtggagaat      420
caacataaat cgaagtagag tgagctagat gagaaaggag actgaagaaa cttcaagata      480
cgtagataga gc                                                          492
<210>  3
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  3
ctactgaatc caagcgagtg g                                                 21
<210>  4
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  4
taggtagagc tgggcgagaa                                                   20
<210>  5
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  5
aaccactaac accttcctcg t                                                 21
<210>  6
<211>  26
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  6
gctctatcta cgtatcttga agtttc                                            26
<210>  7
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  7
ctgtyttttc gcacttaggc                                                   20
<210>  8
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  8
gtccgrggta ctattgctgt                                                   20
<210>  9
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  9
tgtcctccat cacgatvtcg                                                   20
<210>  10
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  10
ccaaattctc ctttaggtgc                                                   20
<210>  11
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  11
ccaatttttg ggccaattcc                                                   20
<210>  12
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  12
cattgcaaag gcataatgat                                                   20