ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ФЛАГЕЛЛИНА
Escherichia coli BACTERIA STRAIN - PRODUCER OF RECOMBINANT FLAGELLIN

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии получения рекомбинантного флагеллина с помощью штамма бактерий Escherichia coli.
Бактериальный белок флагеллин является эффективным стимулятором иммунной системы. Взаимодействуя с клеточным рецептором TLR-5, который экспрессируется на поверхности клеток эпителия, эндотелия сосудов, нейтрофилов, моноцитов, дендритных клеток и Т-лимфоцитов, флагеллин вызывает быструю продукцию клетками противовоспалительных цитокинов и хемакинов, активирующих иммунные клетки и привлекающих их к месту внедрения патогена. Особую роль в развитии иммунного ответа играет взаимодействие флагеллина с TLR-5 дендритных клеток, стимулирующее созревание дендритных клеток, выражающееся, в частности, в экспрессии на их поверхности CD80, CD86, MHCII. Стимулированные флагеллином дендритные клетки усиленно продуцируют TNF-α, IL-8, IL-1β, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, RANTES. Показано, что дендритные клетки, стимулированные флагеллингом, в свою очередь, стимулируют пролиферацию Т-клеток и продукцию ими интерферона-γ. Активация флагеллином моноцитов и макрофагов также усиливает иммунный ответ посредством стимулирования фагоцитоза.
-10
Иммуностимулирующее действие флагеллина проявляется как при его системном введении, так и при воздействии на слизистые оболочки. Взаимодействие с рецептором TLR-5 высокоспецифично и происходит при низких концентрациях флагеллина - до 8,5×10 М. Кроме того, поскольку TLR-5 расположен на поверхности клеток, взаимодействие с ним флагеллина не требует предварительного фагоцитоза, чем объясняется быстрота реакции клеток на флагеллин.
Известен ряд патентов, где флагеллин используется в качестве адъюванта при иммунизации против ряда патогенов, в том числе белка, слитого с целевым антигеном в единую полипептидную цепь [WO 2006078657, WO 2011028875], в виде смеси с целевым иммуногеном [EA 201001820] или в виде вирусоподобных частиц, содержащих флагеллин и целевой антиген [US 201205082, WO 2009128949].
Известен патент, где флагеллин может использоваться в качестве иммуностимулятора и иммуномодулятора для лечения заболеваний, связанным с хронической бактериальной инфекцией [WO 2007098371].
Известно также антиапоптотическое действие флагеллина, которое позволило использовать его в качестве радиопротектора и хемопротектора [EA 010291, WO 2009102818].
Недостатком данной технологии является недостаточная эффективность рекомбинантного флагеллина, а также высокая себестоимость флагеллина, связанная с его низким выходом.
Известна технология получения рекомбинантного флагеллина, где предложено его получение из Flic Salmonella entericf Serovar Typhimurium ATCC 14028 [заявка EA 201001820, 2010]. Недостаток данного метода получения флагеллина заключается в необходимости работы с культурой Salmonella, что требует повышенных мер безопасности, увеличивает объем финансовых затрат и времени на получение флагеллина.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является разработка авторов [Матюнина Е.А. и др. «Получение рекомбинантного белка FliC в клетках Е. coli»<URL: http://shmain.ru/nauchnye-stati/matyunina-e-a-al-shexadat-r-i-duxovlinov-i-v-poluchenie-rekombinantnogo-belka-flic-v-kletkax-e-coli.html>, где показана возможность получения флагеллина из Е. coli, однако дальнейшие проведенные авторами испытания показали, что он является денатурированным и поэтому неактивным, что вызвало необходимость проведения дополнительных работ, приведших к созданию настоящего изобретения.
Для устранения всех этих недостатков существует необходимость в бактериальных продуцентах, обеспечивающих высокий уровень продукции высокоактивного флагеллина.
Задачей, решаемой авторами, являлось создание технологии, позволяющей получать активный рекомбинантный флагеллин (с удельной активностью не менее 106 Единиц активности/мг), и повышение выхода продукции.
Технический результат был достигнут созданием штамма Escherichia coli BL21[DE3]pET151FliC - продуцента высокоактивного рекомбинантного флагеллина, полученного трансформацией культуры клеток E. coli BL21[DE3] (Invitrogen, США, генотип F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm rne131 (DE3) рекомбинантной плазмидной ДНК pET151FliC, созданной in vitro и содержащей ген рекомбинантного флагеллина fliC, вектор pET151FliC, кодирующий биологически активный флагеллин Salmonella typhymurium Т10 по Seq ID No 3.
Полученный штамм E.coli BL21[DE3]pET151FliC депонирован во Всероссийскую коллекцию промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика под № В-11369 от 30.10.2012.
Штамм E. coli ВКПМ № В-11369 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физико-биохимическими свойствами:
Культурально-морфологические особенности штамма: грамотрицательные прямые палочки, размером 1,1-1,5×2,0-3,0 мкм, одиночные, спор и капсул не образуют. Каталазоположительные. Оксидазоотрицательные. Факультативные анаэробы. Клетки хорошо растут на простых питательных средах, содержащих и не содержащих ампициллин, например, на среде LB. На агаризованной среде - колонии гладкие, круглые, слабо выпуклые, с ровным краем. В жидких средах образуют равномерную светорассеивающую суспензию, при хранении без перемешивания оседают на дно. Клетки растут в интервале температур от 8°C до 43°C, интервал для культивирования - 28-38°C, оптимум роста при 37°C. Интервал pH 5-7. Катализируют D-глюкозу и некоторые другие углеводы с образованием кислоты и газа, не сбраживают галактозу. Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная, не образуют H2S, гидролизуют мочевину.
Характеристики полезного вещества, синтезируемого штаммом: Рекомбинантный белок - флагеллин, длиной 528 аминокислотных остатков, состоящий из флагеллина FliC Salmonella typhimurium T10 (495 амк) и служебной последовательности длиной 33 аминокислоты
Активность штамма
Продуктивность штамма - рекомбинантный флагеллин составляет не менее 37% белка клеточного лизата при культивировании в условиях индукции.
Криоконсервация. В запаянных ампулах, штамм, лиофильно-высушенный в среде, содержащей на 30 мл воды - 5 г сахарозы, 1,5 г желатина, хранится при комнатной температуре в течении 20 лет.
Культивирование штамма: культивирование при температуре 28-38°С в термостате или качалке, в агаризованной (2% агара) или жидкой LB-среде соответственно. Селективные условия - добавление 100 мкг/мл ампициллина.
Ферментация: ферментацию ведут в жидкой среде PYP-5052, содержащей 0,2% лактозы, с добавлением 100 мкг/мл ампициллина, при перемешивании и аэрировании, при температуре 28-38°С в течение 18 часов.
На фиг.1 приведены электрофореграммы лизатов клеток Escherichia coli ВКПМ № В-11369 при культивировании в условиях индукции синтеза белка лактозой и без индукции, где 1-белковый маркер молекулярного веса, кДа; 2-лизат клеток штамма Е.coli ВКПМ № В-11369 индукции экспрессии 0,2% лактозой; 3-лизат клеток штамма Е.coli ВКПМ № В-11369 без индукции экспрессии 0,2% лактозой.
Сущность изобретения поясняется следующими конкретными примерами использования штамма Е.coli ВКПМ № В-11369.
Пример 1. Создание генетической конструкции, обеспечивающей синтез рекомбинантного флагеллина в клетках Е.coli.
Методом полимеразной цепной реакции с использованием специфических праймеров FliC-For (SEQ ID NO 1) и FliC-Rev (SEQ ID NO 2) на матрице геномной ДНК вакцинного штамма Salmonella typhimurium T10 (RU2192886) был амплифицирован ген fliC, кодирующий флагеллин, который далее был сшит с вектором рЕТ151. Последовательность нуклеотидов полученного гена совпадает с последовательностью флагеллина FliC (флагеллина фазы 1) Salmonella enterica serovar Typhimurium, имеющейся в GeneBank (BAA02846.1) Полученный ген был вставлен в экспрессионный вектор рЕТ151 с получением экспрессионной плазмиды pET151FliC.
Плазмида рЕТ151 FliC обеспечивает синтез в клетках Escherichia coli полноразмерного бактериального флагеллина, дополнительно содержащего с N-конца служебную последовательность длиной 33 аминокислоты, которая обеспечивает высокоэффективную инициацию синтеза белка рибосомами Е.coli, содержит участок, состоящий из 6-ти остатков гистидина (гистидиновый таг), предназначенную для последующей очистки рекомбинантного флагеллина с помощью металлохелатной хроматографии, сайт узнавания антителом V5, а также сайт гидролиза протеиназой TEV, позволяющий при необходимости удалить большую часть служебной последовательности обработкой очищенного рекомбинантного флагеллина вышеназванной протеиназой с последующим повторным циклом металлохелатной хроматографии. Последовательность нуклеотидов искусственного гена, кодирующего рекомбинантный флагеллин, представлена в SEQ ID No 3.
Пример 2. Получение штамма-продуцента рекомбинантного флагеллина и исследование его продуктивности.
Полученной плазмидой pET151FliC были трансформированы клетки Escherichia coli штамма BL21[DE3]Star, содержащие в своем геноме ген, кодирующий полимеразу фага Т7 под контролем бактериального промотора, индуцируемого лактозой. Кроме того, они не содержат протеазу Ion и несут мутацию в гене, кодирующем протеазу OmpT. Отсутствие этих двух протеаз уменьшает деградацию гетерологичных белков. Данный штамм содержит также мутацию в гене rne, кодирующий рибонуклеазу Е, что приводит к увеличению стабильности мРНК в клетке и, как следствие, к повышению продукции клетками данного штамма рекомбинантного белка.
В результате был получен штамм E.coli ВКПМ № В-11369 - продуцент бактериального белка FliC.
Для поддержания полученного штамма-продуцента белка FliC использовали плотную агаризованную LB-среду, содержащую 100 мкг/мл ампициллина и 1% глюкозы.
600
Продуктивность полученного штамма-продуцента изучали путем культивирования клеток в среде PYP-5052 с 0,2% лактозой, в термостатированной качалке роторного типа при температуре 37°С, скорости вращения платформы 250 об/мин в течение 18 часов. Оптическая плотность (ОП) культуры после окончания культивирования составила 7 О.Е. В качестве контроля использовали неиндуцированную культуру (без добавления лактозы). Образцы биомассы клеток лизировали и анализировали методом диск-электрофореза в ПААГе в денатурирующих условиях с последующей денситометрией.
Результат представлен на фиг.1.
Как видно из фиг.1, индукция лактозой культуры клеток E.coli ВКПМ № В-11369 приводит к синтезу белка с молекулярным весом примерно 57 килодальтон, что соответствует ожидаемому молекулярному весу для рекомбинантного флагеллина. Анализ денситограммы полиакриламидного геля, представленного на фиг.1, выполненный с помощью программы TotalLab, показал, что рекомбинантный флагеллин составляет 37% общего белка клеточного лизата.
Пример 3. Очистка рекомбинантного флагеллина и изучение его биологической активности.
Рекомбинантный флагеллин очищали из клеточных лизатов методом металлохелатной хроматографии с последующим диализом. Чистота выделенного флагеллина составила не менее 97% по результатам электрофореза в полиакриламидном геле с последующей денситометрией.
4
2
2
Биологическая активность рекомбинантного флагеллина оценивалась в тесте, основанном на способности клеток линии А-549 секретировать интерлейкин-8 при добавлении в культуральную среду флагеллина. Для постановки теста клетки линии А-549 вносили в количестве 5×10 на лунку в 96-луночную плоскодонную культуральную плату («Costar») в 100 мкл среды DMEM/F12 с 10% фетальной сыворотки. Плату инкубировали 24 часа в инкубаторе при 37°С в атмосфере 5% CO в условиях абсолютной влажности. За время инкубации клетки в плате образовывали плотный монослой. Далее к клеткам добавляли исследуемые препараты флагеллина в различных концентрациях в объеме 100 мкл в культуральной среде (не менее 3 параллельных лунок для каждой концентрации). Затем плату инкубировали еще 24 часа в СО-инкубаторе и собирали супернатанты, в которых определяли концентрацию ИЛ-8 с помощью коммерческого набора на основе твердофазного иммуноферментного анализа (ООО «Цитокин»).
Результаты двух экспериментов по определению биологической активности рекомбинантного флагеллина представлены в таблицах 1 и 2.
Таблица 1
Определение активности рекомбинантного флагеллина в эксперименте 1
Концентрация рекомбинантного флагеллина, нг/мл
Концентрация ИЛ-8 в супернатантах, пг/мл (среднее ± станд. отклонение)
100
3799±590
20
5368±715
4
5119±370
0,8
1567±266
0,16
442±115
0,032
161±69
0,0064
77±2
Контроль
98±31
Таблица 2
Определение активности рекомбинантного флагеллина в эксперименте 2
Концентрация рекомбинантного флагеллина, нг/мл
Концентрация ИЛ-8 в супернатантах, пг/мл (среднее ± станд. отклонение)
10
5658±957
2
4470±950
0,4
795±34
0,08
202±30
0,016
114±19
0,0032
74±38
0,00064
94±7
Контроль
104±13
Из таблиц 1 и 2 следует, что рекомбинантный флагеллин, продуцируемый клетками штамма E.coli ВКПМ № В-11369, обладает биологической активностью и дозозависимо усиливает продукцию ИЛ-8 клетками А549, 50% эффективная доза для рекомбинантного флагеллина составляет примерно 10 нг/мл.
Преимуществом штамма E.coli ВКПМ № В-11369 является высокая биологическая активность в качестве адъюванта.