ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЛАКТОБАКТЕРИЙ
CULTURE MEDIUM FOR CULTIVATION OF LACTIC BACTERIA

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии, а именно к получению питательных сред для культивирования лактобактерий, и может быть использовано для производства пробиотических препаратов.
Известна питательная среда МРС, которая является классической для культивирования лактобактерий (Квасников Е.И., Нестеренко О.А. Молочнокислые бактерии и пути их использования. - М.: Наука, 1975. - С.64). Она включает, масс.%:
Дрожжевой экстракт
0,5
Мясной экстракт
1,0
Пептон
1,0
Глюкоза
2,0
Лимоннокислый аммоний
0,2
Уксуснокислый натрий
0,5
Твин-80
0,1
Фосфорнокислый калий однозамещенный
0,2
Сернокислый магний
0,02
Сернокислый марганец
0,005
Вода
остальное
9
Среда обладает основными ростовыми свойствами, необходимыми для лактобактерий, но недостатком данной среды является труднодоступность и многочисленность компонентов, кроме того, она не позволяет получить достаточно высокую (свыше 10 КОЕ/мл) плотность роста лактобактерий.
Известна питательная среда для выделения лактобактерий (заявка №2012154888/10), включающая капустный отвар, глюкозу, агар, молочную сыворотку, дрожжевой аутолизат и уксусную кислоту при следующем соотношении компонентов, масс.%:
Молочная сыворотка
9-10,0
Дрожжевой аутолизат
9-10,0
Глюкоза
1,9-2,0
Уксусная кислота 70%
0,14-0,16
Агар
1,8-2,0
Капустный отвар
остальное
Недостатком данной среды является то обстоятельство, что она предназначена только для выделения лактобактерий из различного материала, однако она не позволяет получить значительную биомассу бактерий, а следовательно, не может быть использована для производства пробиотических препаратов.
Описана питательная среда, которая является наиболее близкой по сути предлагаемому изобретению и поэтому взята авторами за прототип, она включает отвар капусты - 500,0 мл, куда добавлены натрий фософорнокислый - 2,0 г, магний сернокислый - 1,0 г, пептон - 5,0 г, глюкоза - 10,0 г, лимоннокислый натрий - 10,0 г. При этом отвар капусты готовят следующим образом: 500,0 г свежей капусты кипятят 30 мин в 1 л водопроводной воды. В полученный отвар добавляют ингредиенты и стерилизуют (Дзержинская И.С. Питательные среды для выделения и культивирования микроорганизмов: Учебное пособие. - Астрахань: Издательство АГТУ, - 2008. - 236 с.).
Техническим результатом заявляемого изобретения является создание доступной, экономичной и легко воспроизводимой в любой микробиологической лаборатории питательной среды для культивирования лактобактерий.
Технический результат достигается тем, что получена питательная среда для культивирования лактобактерий, включающая отвар капусты, глюкозу и дополнительные источники питания, отличается тем, что в качестве дополнительных источников питания содержит кислотный гидролизат крови убойных животных, дрожжевой аутолизат и молочную сыворотку при следующем соотношении компонентов, масс.%:
Кислотный гидролизат крови
убойных животных
9,0-10,0
Дрожжевой аутолизат
9,0-10,0
Молочная сыворотка
9,0-10,0
Глюкоза
1,9-2,0
Отвар капусты
остальное
Позитивное влияние дрожжевого аутолизата и сывороточных белков молока на рост лактобактерий и буферные свойства среды известно и широко используется в микробиологии и биотехнологии. Обоснованием ввода в питательную среду для культивирования лактобактерий кислотного гидролизата крови убойных животных является его химический состав, который включает заменимые и незаменимые аминокислоты и минералы в органической форме. В аминокислотный состав кислотного гидролизата крови входят (г/л): аспарагиновая аминокислота - 1,55-2,61, глутаминовая аминокислота - 2,46-3,43, серин - 1,24-1,62, глицин - 1,0-1,33, гистидин - 0,81-1,42, треонин - 2,10-3,38, аланин - 2,48-3,09, пролин - 0,57-0,69, аргинин - 1,74-2,05, тирозин - 0,16-0,68, метионин - 0,11-0,27, валин - 1,08-1,58, изолейцин - 0,77-1,20, лейцин - 1,77-2,48, фенилаланин - 1,55-1,94, лизин - 2,29-2,78. В минеральный состав кислотного гидролизата крови входят (мг/л): кальций - 500-700, магний - 130-200, железо - 80-125, цинк - 27-40, марганец - 0,6-1,7, медь - 0,53-0,8, кобальт - 0,10-0,17, селен - 0,008-0,01, йод - 0,0006-0,001. Использование кислотного гидролизата крови в составе питательной среды для лактобактерий исключает дополнительный ввод различных аминокислот и солей микро- и макроэлементов.
Сочетание в предлагаемой питательной среде компонентов растительного и животного происхождения за счет наличия всех необходимых питательных и стимулирующих ингредиентов обеспечивает высокую скорость роста лактобактерий и значительное накопление их биомассы в течение 24 ч. Предлагаемую питательную среду готовят следующим образом. Кислотный гидролизат крови предварительно раскисляют с помощью 10% раствора гидроксида натрия до pH 6,7-6,9, после чего добавляют в него дрожжевой аутолизат, молочную сыворотку, глюкозу и доводят объем до 100% отваром капусты. Полученную смесь нагревают до кипения, кипятят 5-7 минут, при необходимости доводят pH до 6,7-6,9, фильтруют через бумажный фильтр, разливают по флаконам и стерилизуют автоклавированием, получая питательную среду для культивирования лактобактерий со следующим соотношением компонентов, масс.%:
Кислотный гидролизат крови
убойных животных
9,0-10,0
Дрожжевой аутолизат
9,0-10,0
Молочная сыворотка
9,0-10,0
Глюкоза
1,9-2,0
Отвар капусты
остальное
По сравнению с прототипом предлагаемая среда обогащена гидролизатом крови, дрожжевым аутолизатом и молочной сывороткой, что значительно улучшает ее ростовые свойства и обеспечивает высокую скорость роста лактобактерий и накопление их биомассы.
Ниже приведены примеры обоснования соотношения компонентов питательной среды для культивирования лактобактерий и ее сравнительную эффективность.
9
Пример 1. В качестве тест-объекта использовали Lactobacillus plantarum, выделенный из кишечного тракта теленка. Данный изолят культивировали на питательной среде следующего состава, масс %: кислотный гидролизат крови убойных животных 7,0, дрожжевой аутолизат 7,0, молочная сыворотка 7,0, глюкоза 1,7, отвар капусты - остальное. Посевная доза составляла 1000 клеток. Через 24 ч культивирования при 37°C концентрация бактерии составила 3,1×10 КОЕ/мл.
9
Пример 2. В качестве тест-объекта использовали Lactobacillus plantarum, выделенный из кишечного тракта теленка. Данный изолят культивировали на питательной среде следующего состава, масс %: кислотный гидролизат крови убойных животных 8,0, дрожжевой аутолизат 8,0, молочная сыворотка 8,0, глюкоза 1,8, отвар капусты - остальное. Посевная доза составляла 1000 клеток. Через 24 ч культивирования при 37°C концентрация бактерии составила 9,6×0 КОЕ/мл.
10
Пример 3. В качестве тест-объекта использовали Lactobacillus plantarum, выделенный из кишечного тракта теленка. Данный изолят культивировали на питательной среде следующего состава, масс %: кислотный гидролизат крови убойных животных 9,0, дрожжевой аутолизат 9,0, молочная сыворотка 9,0, глюкоза 1,9, отвар капусты - остальное. Посевная доза составляла 1000 клеток. Через 24 ч культивирования при 37°C концентрация бактерии составила 5,5×10 КОЕ/мл.
10
Пример 4. В качестве тест-объекта использовали Lactobacillus plantarum, выделенный из кишечного тракта теленка. Данный изолят культивировали на питательной среде следующего состава, масс %: кислотный гидролизат крови убойных животных 10,0, дрожжевой аутолизат 10,0, молочная сыворотка 10,0, глюкоза 2,0, отвар капусты - остальное. Посевная доза составляла 1000 клеток. Через 24 ч культивирования при 37°C концентрация бактерии составила 9,1×10 КОЕ/мл.
10
Пример 5. В качестве тест-объекта использовали Lactobacillus plantarum, выделенный из кишечного тракта теленка. Данный изолят культивировали на питательной среде следующего состава, масс %: кислотный гидролизат крови убойных животных 11,0, дрожжевой аутолизат 11,0, молочная сыворотка 11,0, глюкоза 2,1, отвар капусты - остальное. Посевная доза составляла 1000 клеток. Через 24 ч культивирования при 37°C концентрация бактерии составила 6,4×10 КОЕ/мл.
10
Пример 6. В качестве тест-объекта использовали изолят Lactobacillus plantarum, выделенный из кишечного тракта теленка. Данный изолят культивировали на питательной среде следующего состава, масс %: кислотный гидролизат крови убойных животных 12,0, дрожжевой аутолизат 12,0, молочная сыворотка 12,0, глюкоза 2,2, отвар капусты - остальное. Посевная доза составляла 1000 клеток. Через 24 ч культивирования при 37°C концентрация бактерии составила 7,9×10 КОЕ/мл.
Таким образом, результаты исследований позволили выявить оптимальные варианты соотношения компонентов питательной среды, обеспечивающие высокий выход биомассы лактобактерий при минимальных затратах - это среда, приготовленная по примерам 3 и 4.
Пример 7. Готовят питательную среду по примеру 3 и 4, а также среду-прототип, в которые вносят Lactobacillus plantarum в количестве 1000 клеток. Через 6, 12 и 24 ч из культуральных сред отбирают пробы для определения численности лактобактерий и pH среды. Результаты опыта представлены в таблице. Из данной таблицы видно, что заявляемая среда, приготовленная по примерам 3 и 4, превосходит по ростовым свойствам прототип, т.к. она спустя 12-24 ч содержала в 100-1000 раз больше клеток лактобактерий, чем прототип. Кроме того, заявляемая среда обладает большей буферностью, чем прототип, поскольку в ней при значительно большей численности лактобактерий значение pH только на 0,4 единицы было ниже. Этот показатель авторы также считают позитивным, т.к. резкое повышение кислотности среды приводит к быстрой гибели лактобактерий.
Таким образом, предлагаемая питательная среда обеспечивает интенсивный рост лактобактерий и накопление биомассы, а следовательно, может быть использована в исследовательских целях и для создания пробиотических препаратов.