СОЕДИНЕНИЯ И КОМПОЗИЦИИ В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕИНКИНАЗЫ
COMPOUNDS AND COMPOSITIONS AS PROTEIN KINASE INHIBITORS

Ссылка на родственную (предварительную) заявку
Данная заявка испрашивает более ранний приоритет, основанный на предварительной заявке США сер. Номер 60/662330, зарегистрированной 15 марта 2005 г. Полное описание этой заявки включено в описание настоящей заявки в виде ссылки в полном объеме.
Предпосылки создания изобретения
Область изобретения
В изобретении предлагается новый класс соединений, фармацевтические композиции, включающие такие соединения и способы применения таких соединений для лечения или профилактики заболеваний или нарушений, ассоциированных с аномальной или нарушенной активностью киназ, прежде всего заболеваний или нарушений, которые ассоциированы с аномальной активацией киназ Аbl, Всr-Аbl, ВМХ, ВТК, СНК2, c-RAF, CSK, c-SRC, Fes, FGFR3, F1t3, IKKα, IKKβ, JNK2α2, Lck, Met, MKK4, MKK6, MCST2, NEK2, p70S6K, PDGFRβ, PKA, PKBα, PKD2, Rsk1, SAPK2α, SAPK2β, SAPK3, SGK, Tie2 и TrkB.
Предпосылки создания изобретения
Протеинкиназы представляют собой большое семейство белков, которые играют центральную роль в регуляции многих клеточных процессов и контроля клеточной функции. Неполный перечень таких киназ включает, без ограничения перечисленным, рецепторные тирозинкиназы, такие как рецепторная киназа фактора роста тромбоцитов (PDGF-R), рецептор фактора роста нервной ткани, trkB, Met и рецептор фактора роста фибробластов, FGFR3; нерецепторные тирозинкиназы, такие как Аb1 и гибридная киназа BCR-Ab1, Lck, Csk, Fes, Bmx и c-src, и серин/треонинкиназы, такие как c-RAF, sgk, киназы MAP (например, MKK4, МКК6 и т.п.) и SAPK2α, SAPK2β и SAPK3. Нарушенная киназная активность наблюдается при многих патологических состояниях, включающих доброкачественные и злокачественные пролиферативные нарушения, а также заболевания, связанные с нарушенной активацией иммунной и нервной систем.
Новые соединения по настоящему изобретению ингибируют активность одной или более протеинкиназ и, следовательно, могут использоваться для лечения киназа-ассоциированных заболеваний.
Краткое описание сущности изобретения
Одним объектом настоящего изобретения являются соединения формулы I:
где n выбирают из 0, 1, 2, 3, 4,
1
3
3
1
4
1
4
1
4
1
4
6
12
5
8
3
12
3
8
5
6
5
1
4
6
1
4
6
12
3
1
4
1
4
1
4
1
4)
Z выбирают из N, C(O) и СR, где R выбирают из группы, включающей водород, галоген, С-Салкил, С-Салкокси, галоген(С-С)алкил, галоген(С-С)алкокси, С-С арил, С-С гетероарил, С-С циклоалкил, С-С гетероциклоалкил и NRR, где R независимо выбирают из группы, включающей водород и С-С алкил, а R выбирают из группы, включающей водород, С-Салкил и С-С арил, причем любой арил, гетероарил, циклоалкил или гетероциклоалкил R необязательно замещен 1-3 заместителями, независимо выбранными из группы, включающей водород, галоген, С-Салкил, С-Салкокси, галоген(С-С)алкил и галоген(С-Салкокси,
2
4
4
1
4
1
4
1
4
1
4
6
12
5
8
3
12
3
8
5
5
1
2
5
1
4
4
1
4
1
4
1
4
1
4
Z выбирают из группы, включающей N и CR, где R выбирают из группы, включающей водород, галоген, С-С алкил, С-С алкокси, галоген(С-С) алкил, галоген (С-С) алкокси, С-С арил, C-C гетероарил, С-Сциклоалкил, С-Сгетероциклоалкил и NRR, причем связь между Z и Zвыбирают из простой и двойной связи, R независимо выбирают из группы, включающей водород и С-Салкил, а любой арил, гетероарил, циклоалкил или гетероциклоалкил R необязательно замещен 1-3 заместителями, независимо выбранными из группы, включающей водород, галоген, С-Салкил, С-С алкокси, галоген(С-С)алкил и галоген(С-С)алкокси,
1
1
4
1
4
R выбирают из группы, включающей галоген, С-С алкил, С-С алкокси,
2
5
5
6
5
6
5
6
5
0-2
6
0-2
5
6
5
6
5
1
4
6
1
4
6
12
5
8
3
12
3
8
6
1
4
1
4
R выбирают из группы, включающей NRС(O)NRR, NRС(O)R, C(O)NRR, NRS(O)R, S(O)NRR и NRR, причем R независимо выбирают из группы, включающей водород и С-С алкил, a R выбирают из группы, включающей водород, С-С алкил, С-С арил, С-С гетероарил, С-С циклоалкил и С-Сгетероциклоалкил, причем любой арил, гетероарил, циклоалкил и гетероциклоалкил R необязательно замещен 1-3 заместителями, независимо выбранными из группы, включающей галоген, циано, нитро, галоген (С-С)алкил, галоген(С-С)алкокси,
5
12
0
4
3
12
0
4
6
1
4
3
12
С-Сгетероарил(С-С)алкил и С-С гетероциклоалкил(С-С)алкил, причем любой гетероарильный или гетероциклоалкильный заместитель Rнеобязательно замещен заместителем, независимо выбранным из группы, включающей С-С алкил и С-Сгетероциклоалкил,
и N-оксиды, пролекарства, замещенные производные, индивидуальные изомеры и смеси изомеров, фармацевтически приемлемые соли и сольваты (например, гидраты) таких соединений.
Вторым объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая соединение формулы I или его N-оксид, индивидуальные изомеры и смеси изомеров или фармацевтически приемлемую соль в смеси с одним или более пригодными эксципиентами.
Третьим объектом настоящего изобретения является способ лечения заболевания у животного, при котором ингбирование киназной активности, прежде всего активности киназ Аb1, Всr-Аb1, ВМХ, ВТК, СНК2, c-RAF, CSK, с-SRC, Fes, FGFR3, F1t3, IKKα, IKKβ, JNK2α2, Lck, Met, MKK4, MKK6, MCST2, NEK2, p70S6K, PDGFRβ, PKA, PKBα, PKD2, Rsk1, SAPK2α, SAPK2β, SAPK3, SGK, Tie2 и/или TrkB, предотвращает, подавляет или смягчает патологические состояния и/или симтомы заболевания, причем указанный способ включает введение животному терапевтически эффективного количества соединения формулы I или его N-оксида, индивидуальных изомеров и смеси изомеров или фармацевтически приемлемой соли.
Четвертым объектом настоящего изобретения является применение соединения формулы I для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания у животного, при котором киназная активность, прежде всего активность Аb1, Всr-Аb1, ВМХ, ВТК, СНК2, c-RAF, CSK, c-SRC, Fes, FGFR3, F1t3, IKKα, IKKβ, JNK2α2, Lck, Met, MKK4, MKK6, MCST2, NEK2, p70S6K, PDGFRβ, PKA, PKBα, PKD2, Rsk1, SAPK2α, SAPK2β, SAPK3, SGK, Tie2 и/или TrkB, вносит вклад в развитие патологического состояния и/или его симптомов.
Пятым объектом настоящего изобретения является способ получения соединений формулы I и их N-оксидов, пролекарств, замещенных производных, индивидуальных изомеров и смесей изомеров и фармацевтически приемлемых солей.
Подробное описание изобретения
Определения (терминов)
1
4
"Алкил" в качестве группы или структурного элемента других групп, например галогеналкил и галогеналкокси, означает углеводородный остаток с прямой или разветвленной цепью. С-С алкокси включает метокси, этокси и т.п. Галогеналкил включает трифторметил, пентафторэтил и т.п.
"Арил" означает моноциклическую или конденсированную бициклическую ароматическую систему, содержащую в цикле от шести до десяти атомов углерода. Например, арил означает фенил или нафтил, предпочтительно фенил. "Арилен" означает двухвалентный радикал, образованный арильной группой.
5
10
"Гетероарил" имеет значения, указанные выше для группы арил, где один иди более атомов углерода в цикле заменены гетероатомом. Например, С-Сгетероарил включает пиридил, индолил, индазолил, хиноксалинил, хинолинил, бензофуранил, бензопиранил, бензотиопиранил, бензо[1,3]диоксол, имидазолил, бензимидазолил, пиримидинил, фуранил, оксазолил, изоксазолил, триазолил, тетразолил, пиразолил, тиенил и т.п.
3
10
"Циклоалкил" означает насыщенную или частично ненасыщенную моноциклическую конденсированную бициклическую или связанную мостиковой связью полициклическую систему, содержащую в цикле указанное количество атомов. Например, С-С циклоалкил включает циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и т.п.
"Гетероциклоалкил" означает циклоалкил, указанный в описании заявки, в котором один или более атомов углерода в цикле заменены группой, выбранной из -O-,
2
1
4
3
8
-N=, -NR-, -С(O)-, -S-, -S(O) - или -S(O)-, где R означает водород, С-Салкил или аминозащитную группу. Например, при описании соединений, указанных в заявке, С-С гетероциклоалкил включает морфолино, пирролидинил, пирролидинил-2-он, пиперазинил, пиперидинил, пиперидинилон, 1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]дец-8-ил и т.п.
"Галоген" предпочтительно означает хлор или фтор, а также бром или иод.
Термин "мутантные формы BCR-Abl" означает замену одного или более аминокислотных остатков в последовательности киназы дикого типа. В настоящее время описано более 22 мутаций, наиболее распространенными из которых являются G250E, E255V, Т3151, F317L и М351Т. Если не указано иное, ВсR-АB1 означает дикие и мутантные формы фермента.
"Лечение" означает способ снижения или ослабления интенсивности заболевания и/или сопутствующих ему симптомов.
Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения
Гибридный белок BCR-Аbl образуется в результате взаимной транслокации, которая гибридизует протоонкоген Аbl с геном Всr. Затем BCR-Аbl трансформирует В-клетки благодаря увеличению митогенной активности. Такое увеличение активности приводит к снижению чувствительности к апоптозу, а также к изменению адгезии и хоминга клеток-предшественников CML (хронического миелолейкоза). В настоящем изобретении предлагаются соединения, композиции и способы лечения заболевания, ассоциированного с киназой, прежде всего заболеваний, ассоциированных с киназой Abl, ВсR-Аbl, ВМХ, ВТК, СНК2, c-RAF, CSK, c-SRC, Fes, FGFR3, F1t3, IKKα, IKKβ, JNK2α2, Lck, Met, MKK4, MKK6, MCST2, NEK2, p70S6K, PDGFRβ, PKA, PKBα, PKD2, Rsk1, SAPK2α, SAPK2β, SAPK3, SGK, Tie2 и TrkB. Например, лейкоз и другие пролиферативные заболевания, ассоциированные с Всr-Аb1, можно лечить при ингибировании киназы Всr-Аb1 дикого типа и ее мутантных форм.
В одном варианте соединений формулы I
n выбирают из 1, 2, 3 и 4,
1
Z выбирают из N, С(O) и СН,
2
4
4
1
2
Z выбирают из N и СR, где R выбирают из группы, включающей водород и галоген, а связь между Z и Z выбирают из простой связи или двойной связи,
1
1
4
1
4
R выбирают из групп С-С алкил и С-С алкокси, а
2
5
6
5
6
5
6
5
1
4
6
1
4
6
12
6
1
4
5
12
0
4
3
12
0
4
6
1
4
3
12
R выбирают из группы, включающей NRC(O)R, C(O)NRR и NRR, где Rнезависимо выбирают из группы, включающей водород и С-С алкил, а Rвыбирают из группы, включающей водород, С-С алкил и С-С арил, причем любой арил R необязательно замещен 1-3 радикалами, независимо выбранными из группы, включающей галоген (С-С) алкил, С-С гетероарил (С-С)алкил и С-С гетероциклоалкил (С-С) алкил, причем любые гетероарильные или гетероциклоалкильные заместители Rнеобязательно замещены радикалом, независимо выбранным из групп С-Салкил и С-С гетероциклоалкил.
В другом варианте некоторые предпочтительные соединения выбирают из группы, включающей N-{3-[1-(3-бром-1Н-пиразоло[3,4-(d]пиримидин-4-ил)-1Н-имидазол-2-иламино]-4-метилфенил}-3-трифторметилбензамид, 4-метил-N-[3-(4-метилимидазол-1-ил)-5-трифторметилфенил]-3-[1-(9Н-пурин-6-ил)-1Н-имидазол-2-иламино]бензамид, 4-метил-N-[3-(4-метилимидазол-1-ил)-5-трифторметилфенил]-3-[1-(1Н-пиразоло[3,4-d]пиримидин-4-ил)-1Н-имидазол-2-иламино]бензамид, N-{4-мeтил-3-[1-(6-oкco-6,7-дигидpo-5H-пиppoлo[2,3-d]пиpимидин-4-ил)-1H-имидaзoл-2-илaминo]фeнил}-3-тpифтopмeтилбeнзaмид, N-{4-метил-3-[1-(9Н-пурин-6-ил)-1Н-имидазол-2-иламино]фенил}-3-трифторметилбензамид и N-{4-метил-3-[1-(1Н-пиразоло[3,4-(d]пиримидин-4-ил)-1Н-имидазол-2-иламино]фенил}-3-трифторметилбензамид.
Другим вариантом изобретения являются соединения формулы Iа
1
в котором R выбирают из групп метил и метокси,
2
6
6
6
6
6
6
R выбирают из группы, включающей NHC(O)R, C(O)NHR и NHR, где Rвыбирают из группы, включающей водород, метил и фенил, причем любой фенил R необязательно замещен 1-3 радикалами, независимо выбранными из группы, включающей трифторметил, имидазолил, пиперидинил, пиперазинил и пиперазинилметил, причем любые гетероарильные или гетероциклоалкильные заместители R необязательно замещены радикалом, независимо выбранным из группы, включающей метил, этил и пирролидинил.
Предпочтительные соединения выбирают из группы, включающей 4-метил-N-[4-(2-метилимидазол-1-ил)-3-трифторметилфенил]-3-[1-(7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-ил)-1Н-имидазол-2-иламино]бензамид, 3-(4-метилимидазол-1-ил)-N-{4-метил-3-[1-(7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-ил)-1Н-имидазол-2-иламино]фенил}-5-трифторметилбензамид, 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-{4-метил-3-[1-(7Н-пирроло[2,3- d]пиримидин-4-ил)-1Н-имидазол-2-иламино]фенил}-3- трифторметилбензамид, 3-(4-этилпиперазин-1-илметил)-N-{4-мeтил-3-[1-(7H-пиppoлo[2,3-d]пиpимидин-4-ил)-1H-имидaзoл-2-иламино]фенил}-5-трифторметил6ензамид, N-{4-метил-3-[1-(7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-ил)-1Н-имидазол-2-иламино]фенил}-3-(4-пирролидин-1-илпиперидин-1-ил)-5-трифторметилбензамид, 3-метокси-N-[4-(2-метилимидазол-1-ил)-3-трифторметилфенил]-5-[1-(7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-ил)-1Н-имидазол-2-иламино]бензамид, 3-(4-метилимидазол-1-ил)-N-{4-метил-3-[1-(7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-ил)-1Н-имидазол-2-иламино]фенил}-5-трифторметилбензамид, 4-метил-N-[3-(4-метилимидазол-1-ил)-5-трифторметилфенил]-3-[1-(7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-ил)-1Н-имидазол-2-иламино]бензамид, N-[4-(4-этилпиперазин-1-илметил)-3-трифторметилфенил]-3-метокси-5-[1-(7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-ил)-1Н-имидазол-2-иламино]бензамид, N-[4-(4-этилпиперазин-1-илметил)-3-трифторметилфенил]-4-метил-3-[1-(7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-ил)-1Н-имидазол-2-иламино]бензамид, 3-(4-этилпиперазин-1-ил)-N-{4-метил-3-[1-(7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-ил)-1Н-имидазол-2-иламино] фенил}-5-трифторметил-бензамид, 3-[1-(5-фтор-7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-ил)-1Н-имидазол-2-иламино]-4-метил-N-(3-трифторметилфенил)бензамид, N-{4-метил-3-[1-(7Н-пирроло[2,3-d]пиpимидин-4-ил)-lH-имидaзoл-2-илaминo]фeнил}-3-тpифтopмeтилбeнзaмид, 4-метил-N-[4-(2-метилимидазол-1-ил)-3-трифторметилфенил]-3-[1-(7Н-пиppoлo[2,3-d]пиpимидин-4-ил)-1H-имидaзoл-2-илaминo]бeнзaмид, N-{3-[1-(5-хлор-7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-ил)-1Н-имидазол-2-иламино]-4-метилфенил}-3-трифторметилбензамид, N-{4-метил-3-[1-(7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-ил)-1Н-имидазол-2-иламино]фенил}бензамид, N-{4-метил-3-[1-(7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-ил)-1Н-имидазол-2-иламино]фенил}ацетамид, 4-метил-N3-[1-(7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-ил)-1Н-имидазол-2-ил]бензол-1,3-диамин и 3-(4-метилпиперазин-1-ил)-N-{4-метил-3-[1-(7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-ил)-1Н-имидазол-2-иламино]фенил}-5-трифторметилбензамид.
Другие предпочтительные соединения по изобретению подробно описаны в примерах и приведены ниже в таблице 1.
Фармакология и промышленная применимость
Соединения по изобретению модулируют активность киназ и как таковые используются для лечения заболеваний или нарушений, при которых киназы принимают участие в развитии патологии и/или симптомов заболевания. Примеры киназ, которые ингибируются соединениями и композициями, описанными в данном контексте и для подавления которых используются методы, описанные в данном контексте, включают, без ограничения перечисленным, Abl, Всr-Аbl (дикий тип и мутантные формы), ВМХ, ВТК, СНК2, c-RAF, CSK, c-SRC, Fes, FGFR3, F1t3, IKKα, IKKβ, JNK2α2, Lck, Met, MKK4, MKK6, MCST2, NEK2, p70S6K, PDGFRβ, PKA, PKBβ, PKD2, Rsk1, SAPK2α, SAPK2β, SAPK3, SGK, Tie2 и TrkB.
Тирозинкиназа Абельсона (т.е. Abl, c-Abl) принимает участие в регуляции клеточного цикла, в клеточном ответе на генотоксический стресс и в передаче информации о клеточном окружении через интегриновый сигнал. Таким образом белок Аb1 выполняет сложную функцию в качестве клеточного модуля, который интегрирует сигналы от различных межклеточных и внутриклеточных источников, что оказывает влияние на развитие клеточного цикла и апоптоза. Тирозинкиназа Абельсона включает подтипы, такие как химерный гибридный белок (онкопротеин) BCR-Аbl с разрегулированной тирозинкиназной активностью или v-Abl. BCR-Abl играет решающую роль в патогенезе в 95% случаев хронического миелогенного лейкоза (CML) и в 10% случаев острого лимфолейкоза STI-571 (Gleevec) является ингибитором онкогенной тирозинкиназы BCR-Abl и используется при лечении хронического миелоидного лейкоза (CML). Однако у некоторых пациентов на стадии бластного криза CML наблюдается устойчивость к STI-571 из-за мутаций в киназс BCR-Abl. К настоящему времени идентифицировано 22 мутации, наиболее распространенными из которых являются G250E, E255V, Т3151, F317L и М351Т.
Соединения по настоящему изобретению ингибируют киназу аb1, прежде всего киназу v-abl. Соединения по настоящему изобретению также ингибируют киназу BCR-Abl дикого типа и мутантные формы киназы BCR-Abl и, следовательно, пригодны для лечения Всr-аbl-позитивного рака и опухолевых заболеваний, таких как лейкоз (прежде всего хронический миелоидный лейкоз и острый лимфолейкоз, развитие которых сопровождается, прежде всего, апоптотическим механизмом действия), а также оказывают действие на подгруппу лейкозных стволовых клеток и могут использоваться для очистки этих клеток in vitro после их удаления из организма (например, при удалении костного мозга) и реплантации популяции клеток, очищенных от опухолевых клеток (например, реплантации очищенных клеток костного мозга).
Сигнальный путь Ras-Raf-MEK-ERK опосредует клеточный ответ на ростовые сигналы. Ras мутирован в онкогенную форму в ~15% случаев рака человека. Семейство Raf относится к семейству серин/треонинпротеинкиназ и включает три члена семейства A-Raf, B-Raf и c-Raf (или Raf-1). Исследование Raf как мишени лекарственных средств направлено на изучение действия Raf как подавляющего эффектора на Ras. Однако последние результаты свидетельствуют о том, что B-Raf выполняет важную функцию в образования некоторых опухолей без обязательного участия активированной аллели Ras (Nature, 417, 949-954 (1 июля 2002). Мутации B-Raf, прежде всего, обнаружены в большинстве злокачественных меланом.
Существующие методы лечения меланомы характеризуются недостаточной эффективностью, прежде всего на поздней стадии заболевания. Соединения по настоящему изобретению ингибируют также клеточные процессы с участием киназы b-Raf и представляют собой новый терапевтический подход к лечению рака человека, прежде всего меланомы.
Соединения по настоящему изобретению, кроме того, ингибируют клеточные процессы с участием киназы c-Raf. c-Raf активируется онкогеном ras, который мутирован при многих видах рака человека. Следовательно, ингибирование киназной активности c-Raf представляет собой перспективный способ предотвращения роста опухоли, опосредованного геном ras (Campbell S.L., Oncogene, 17, 1395 (1998)).
PDGF (фактор роста тромбоцитов) представляет собой очень распространенный ростовой фактор, который играет важную роль как в процессе нормального роста, так и в патологической клеточной пролиферации, например, которая наблюдается при онкогенезе и при заболеваниях гладкомышечных клеток кровеносных сосудов, например при атеросклерозе и тромбозе. Соединения по изобретению ингибируют активность рецептора PDGF (PDGFR) и, следовательно, могут использоваться при лечении опухолевых заболеваний, таких как глиома, саркома, рак предстательной железы и рак ободочной кишки, молочной железы и яичника.
Соединения по настоящему изобретению можно использовать не только в качестве подавляющих опухоль агентов, например при мелкоклеточном раке легких, но и в качестве средств лечения незлокачественных пролиферативных нарушений, таких как атеросклероз, тромбоз, псориаз, склеродерма и фиброз, а также для защиты стволовых клеток, например для защиты от гемотоксического действия химиотерапевтических агентов, таких как 5-фторурацил, и лечения астмы. Соединения по изобретению прежде всего можно использовать для лечения заболеваний, которые чувствительны к ингибированию рецепторной киназы PDGF.
Соединения по настоящему изобретению оказывают благоприятное действие при лечении нарушений, возникающих в результате трансплантации, например аллогенной трансплантации, прежде всего при отторжении тканей, таких как, прежде всего облитерирующий бронхиолит (OВ), т.е. хроническое отторжение аллогенных трансплантатов легкого. В отличие от пациентов, не страдающих от ОВ, у пациентов с диагнозом ОВ часто наблюдается повышенная концентрация PDGF в бронхоальвеолярной промывной жидкости.
Соединения по настоящему изобретению также являются эффективными при заболеваниях, ассоциированных с миграцией и пролиферацией гладкомышечных клеток сосудов (при которых PDGF и PDGF-R часто играют заметную роль), таких как рестеноз и атеросклероз. Такое воздействие и его последующее влияние на пролиферацию и миграцию гладкомышечных клеток сосудов in vitro и in vivo можно продемонстрировать при введении соединений по настоящему изобретению, а также при исследовании их воздействия на утолщение внутренней интимы сосудов после механического повреждения in vivo.
Семейство trk нейтрофиновых рецепторов (trkA, trkB, trkC) стимулирует выживание, рост и дифференциацию нейронных и ненейронных тканей. Белок TrkB экспрессируется в клетках нейроэндокринного типа в тонкой кишке и ободочной кишке, в α-клетках поджелудочной железы, в моноцитах и макрофагах лимфатических узлов и селезенки и в гранулярных слоях эпидермиса (Shibayama и Koizumi, 1996). Экспрессия белка TrkB ассоциируется с неблагоприятной прогрессией опухолей Вильямса и нейробластомы. Более того, TkrB экспресеируется в злокачественных клетках предстательной железы, но не обнаруживается в нормальных клетках. Сигнальный путь подавления рецепторов trk включает каскад активации МАРК с участием Shc, активированного генами Ras, ERK-1 и ERK-2, и пути передачи сигнала PLC-γ (Sugimoto и др., 2001).
Киназа c-Src передает онкогенные сигналы многих рецепторов. Например, сверхэкспрессия EGFR или HER2/neu в опухолях приводит к конститутивной активации c-src, что является характеристикой злокачественных клеток, но не наблюдается в нормальных клетках. С другой стороны, мыши с дефицитом экспрессии c-src представляют собой фенотип с «мраморной болезнью», что свидетельствует о ключевой роли c-src в функционировании остеокластов и возможном участии в развитии ассоциированных нарушений.
Киназа семейства Tec, Bmx, нерецепторная протеинтирозинкиназа, контролирует пролиферацию эпителиальных опухолевых клеток молочной железы.
Установлено, что рецептор 3 фактора роста фибробластов обладает отрицательным регуляторным действием на рост костной ткани и подавляет пролиферацию хондроцитов. Летальная дисплазия вызывается различными мутациями в рецепторе 3 фактора роста фибробластов, а одна мутация, TDII FGFR3, обладает конститутивной тирозинкиназной активностью, которая активирует фактор транскрипции Stat1, что приводит к экспрессии ингибитора клеточного цикла, остановке роста и аномальному развитию костной ткани (Su и др.. Nature, 386, 288-292 (1997)). Кроме того, FGFR3 в большинстве случаев экспрессируется в опухолях типа множественной миеломы. Ингибиторы активности FGFR3 можно использовать для лечения воспалительных или аутоиммунных заболеваний, опосредованных Т-клетками, включающих, без ограничения перечисленным, ревматоидный артрит (RA), коллагеновый артрит II, рассеянный склероз (МС:), системную красную волчанку (SLE), псориаз, юношеский диабет, болезнь Шенгрена, заболевание щитовидной железы, саркоидоз, аутоиммунный увеит, воспалительное заболевание кишечника (болезнь Крона и язвенный колит), глютеновую болезнь и тяжелую псевдопаралитическую миастению.
Активность сывороточной и глюкокортикоид-регулируемой киназы (SGK) коррелирует с активностями возбужденных ионных каналов, прежде всего активностью натриевых и/или калиевых каналов, и соединения по изобретению можно использовать для лечения гипертензии.
В работах Lin и др., J. CHn. Invest. 100, 8, 2072-2078 (1997) и Р. Lin, PNAS, 95, 8829-8834 (1998) описано подавление роста опухоли и васкуляризации, а также снижение метастазирования в легких при аденовирусных инфекциях или при инъекциях внеклеточного домена Tie-2 (Tek) в модели опухоли молочной железы и модели ксенотрансплантата меланомы. Ингибиторы Tie2 можно использовать в случаях, при которых наблюдается аномальная неоваскуляризация (например, при диабетической ретинопатии, хроническом воспалении, псориазе, саркоме Капоши, хронической неоваскуляризации при дегенерации желтого пятна, ревматоидном артрите, детской гемангиоме и раке).
Lck принимает участие в передаче сигнала Т-клетками. У мышей с отсутствием гена Lck наблюдается низкий уровень тимоцитов. Функция Lck в качестве положительного активатора передачи сигнала Т-клетками свидетельствует о том, что ингибиторы Lck можно использовать для лечения аутоиммунного заболевания, такого как ревматоидный артрит.
JNK и другие МАРК принимают участие в индукции клеточного ответа на рак, тромбин-индуцированную агрегацию тромбоцитов, на нарушения типа иммунодефицита, аутоиммунные заболевания, гибель клеток, аллергию, остеопороз и болезнь сердца. Терапевтические мишени, связанные с активацией пути JNK, включают хронический миелогенный лейкоз (CML), ревматоидный артрит, астму, остеоартрит, ишемию, рак и нейродегенеративные заболевания. В связи с активацией JNK, ассоциированной с заболеванием печени или приступами печеночной ишемии, соединения по изобретению можно также использовать для лечения различных нарушений функции печени. Сообщается также об участии JNK в развитии сердечно-сосудистого заболевания, такого как инфаркт миокарда или застойная сердечная недостаточность, а также установлено, что JNK опосрсдует гипертрофические ответные реакции на различные формы сердечного стресса. Установлено, что каскад JNK принимает участие в активации Т-клеток, включая активацию промотора IL-2. Таким образом, ингибиторы JNK могут оказывать лечебное действие при коррекции патологических ответных иммунных реакций. Установлена также роль активации JNK при развитии различных видов рака, что свидетельствует о возможности эффективного использования ингибиторов JNK для лечения рака. Например, конститутивно активируемая JNK ассоциируется с онкогенезом, опосредованным HTLV-1 (Oncogene, 13, 135-142 (1996)]. JNK принимает участие в развитии саркомы Капоши (KS). Пролиферативное действие других цитокинов, принимающих участие в пролиферации KS, таких как эндотелиальный фактор роста сосудов (VEGF), IL-6 и TNFα, также может оказаться опосредованным JNK. Кроме того, регуляция гена c-jun в клетках р210, трансформированных BCR-ABL, соответствует активности JNK, что свидетельствует о возможности применения ингибиторов JNK при лечении хронического миелогенного лейкоза (CML) (Blood 92, 2450-2460 (1998)).
Принято считать, что некоторые аномальные пролиферативные состояния ассоциированы с экспрессией raf и, следовательно, чувствительны к ингибированию экспрессии raf. Аномально высокие уровни экспрессии белка raf также связаны с трансформацией и аномальной пролиферацией клеток. Предполагается также, что указанные аномальные пролиферативные состояния чувствительны к ингибированию экспрессии raf. Например, предполагается, что экспрессия белка c-raf играет роль в аномальной клеточной пролиферации, поскольку сообщается, что 60% всех клеточных линий карциномы легкого обычно экспрессируют высокий уровень мРНК и белка c-raf. Другими примерами аномальных пролиферативных состояний являются гиперпролиферативные нарушения, такие как рак, опухоли, гиперплазия, фиброз легких, ангиогенез, псориаз, атеросклероз и пролиферация гладкомышечных клеток кровеносных сосудов, такие как стеноз или рестеноз после пластической операции на сосудах. Клеточный сигнальный путь, частью которого является raf, также принимает участие в воспалительных нарушениях, характеризующихся пролиферацией Т-клеток (активация и рост Т-клеток), таких, например, как отторжение тканевого трансплантата, эндотоксиновый шок и гломерулярный нефрит.
Стресс-активируемые протеинкиназы (SAPK) представляют собой семейство протеинкиназ, которые принимают участие на предпоследней стадии пути передачи сигнала, при этом происходит активация фактора транскрипции с-jun и экспрессия генов, регулируемых c-jun. Прежде всего, c-jun принимает участие в транскрипции генов, которые кодируют белки, связанные с репарацией ДНК, поврежденной вследствие генотоксического действия. Следовательно, агенты, которые ингибируют активность SAPK в клетке, предотвращают репарацию ДНК и сенсибилизируют клетку к агентам, которые индуцируют повреждение ДНК или ингибируют синтез ДНК и индуцируют апоптоз клетки, или к агентам, которые ингибируют клеточную пролиферацию.
Митоген-активируемые протеинкиназы (МАРК) являются членами консервативных путей передачи сигнала, которые активируют факторы транскрипции, факторы трансляции и другие молекулы-мишени в ответ на различные внеклеточные сигналы. МАРК активируются митоген-активируемыми протеинкиназами (МКК) за счет двойного фосфорилирования последовательности Thr-X-Tyr. У высших эукариотов физиологическая роль передачи сигнала МАРК коррелирует с клеточными процессами, такими как пролиферация, онкогенез, развитие и дифференциация. Соответственно способность регулировать передачу сигнала по указанным путям (прежде всего с участием МКК4 и МКК6) можно использовать при разработке способов лечения и профилактики заболеваний человека, ассоциированных с передачей сигнала МАРК, таких как воспалительные заболевания, аутоиммунные заболевания и рак.
Семейство протенкиназ рибосомального белка S6 человека включает по меньшей мере 8 членов (RSK1, RSK2, RSK3, RSK4, MCSK1, MCSK2, p70S6K и p70S6 Kb). Протенкиназы рибосомального белка S6 выполняют важные плеотропные функции, в том числе играют ключевую роль в регуляции трансляции мРНК при биосинтезе белка (Eur. J. Biochem., 267(21), 6321-6330 (2000, ноябрь); Exp Cell Res., 253 (1), 100-109 (1999, 25 ноября); Mol Cell Endocrinol., 151(l-2), 65-77 (1999, 25 мая)). Кроме того, фосфорилирование рибосомального белка S6 киназой p70S6 связано с регуляцией клеточной подвижности (Immunol. Cell Biol., 78(4), 447-451 (2000, август)) и клеточного роста (Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 65, 101-127 (2000)), и, следовательно, является важным фактором при метастазировании опухоли, иммунном ответе и репарации ткани, а также при других патологических состояниях.
Киназы SAPK (называемые также "N-концевые киназы jun" или "JNK") представляют собой семейство протеинкиназ, которые принимают участие на предпоследней стадии пути передачи сигнала, при этом происходит активация фактора транскрипции c-jun и экспрессия генов, регулируемых c-jun. Киназа с-jun принимает участие прежде всего в транскрипции генов, которые кодируют белки, связанные с репарацией ДНК, поврежденной вследствие генотоксического действия. Агенты, которые ингибируют активность SAPK в клетке, предотвращают репарацию ДНК и сенсибилизируют клетку к таким терапевтическим противоопухолевым агентам, которые оказывают действие за счет индукции повреждения ДНК.
ВТК играют важную роль в развитии аутоиммунного и/или воспалительного заболевания, такого как системная красная волчанка (SLE), ревматоидный артрит, рассеянный васкулит, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (IТР), тяжелая псевдопаралитическая миастения и астма. Благодаря участию ВТК в активации В-клеток ингибиторы ВТК можно использовать для подавления патогенных состояний, опосредованных В-клетками, таких как продуцирование аутоантител, и при лечении лимфомы В-клеток и лейкоза.
СНК2 является киназой контрольных точек семейства серин/треонинпротеинкиназ и принимает участие в механизме контроля повреждений ДНК, таких как повреждения, вызванные мутагенами окружающей среды и эндогенными видами активного кислорода. В результате ее можно использовать в качестве супрессора опухоли и мишени при онкотерапии.
CSK влияет на метастазирующую активность опухолевых клеток, прежде всего рака ободочной кишки.
Fes является нерецепторной протеинтирозинкиназой, которая принимает участие в ряде путей передачи сигнала с участием цитокинов, а также дифференциации миелоидных клеток. Fes является также ключевым компонентом в механизме дифференциации гранулоцитов.
Рецепторная тирозинкиназа F1t3 принимает участие в развитии лейкоза и миелодиспластического синдрома. Приблизительно 25% клеток лейкоза AML экспрессируют конститутивно активную форму аутофосфорилированной тирозинкиназы (ф)FLT3 на клеточной поверхности. Активность ф-FLT3 обеспечивает рост и выживание предпочтительно лейкозных клеток. Пациентов с острым лейкозом, у которых лейкозные клетки экспрессируют киназу ф-FLT3, в основном характеризуют неблагоприятным клиническим прогнозом. Ингибирование киназы ф-FLT3 индуцирует апоптоз (программируемую гибель клеток) лейкозных клеток.
Ингибиторы IККα и IKKβ (1 и 2) являются лекарственными средствами для лечения заболеваний, включающих ревматоидный артрит, отторжение трансплантата, воспалительное заболевание кишечника, остеоартрит, астму, хроническое обструктивное заболевание легких, атеросклероз, псориаз, рассеянный склероз, инсульт, системную красную волчанку, болезнь Альцгеймера, ишемию головного мозга, травматическое повреждение мозга, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, субарахноидальное кровоизлияние и другие заболевания или нарушения, ассоциированные с избыточным продуцированием воспалительных медиаторов в головном мозге и центральной нервной системе.
Met ассоциируется с большинством типов основных раков человека, и экспрессия этого фермента часто коррелирует с неблагоприятным прогнозом и метастазированием. Ингибиторы Met являются лекарственными средствами для лечения заболеваний, включающих различные виды рака, такие как рак легких, NSCLC (немелкоклеточный рак легких), рак костной ткани, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы и шеи, кожная и внутриглазная меланома, рак матки, рак яичника, ректальный рак, рак анальной области, рак желудка, рак ободочной кишки, рак молочной железы, гинекологические опухоли (например, саркома матки, карцинома маточных труб, карцинома эндометрия, карцинома шейки матки, карцинома влагалища или карцинома вульвы), болезнь Ходжкина, рак пищевода, рак тонкой кишки, рак эндокринной системы (например, рак щитовидной железы, паратиреоидный рак или рак надпочечников), саркомы мягких тканей, рак мочеиспускательного канала, рак пениса, рак предстательной железы, хронический или острый лейкоз, детские солидные опухоли, лимфоцитарные лимформы, рак мочевого пузыря, рак почек или мочеточника (например, почечно-клеточный рак, карцинома почечного пелвиса), детские злокачественные заболевания, опухоли центральной нервной системы (например, первичная лимфома ЦНС, опухоли позвоночника, глиома мозгового ствола или гипофизарная аденома), рак крови, такой как острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз и т.п., язва пищевода Баррета (предраковый синдром), неопластическое заболевание кожи, псориаз, грибовидные микозы и доброкачественная гипертрофия предстательной железы, заболевания, ассоциированные с диабетом, такие как диабетическая ретинопатия, ретинальная ишемия и ретинальная неоваскуляризация, цирроз печени, сердечно-сосудистые заболевания, такие как атеросклероз, иммунологические заболевания, такие как аутоиммунное заболевание и почечное заболевание. Предпочтительно заболевание означает рак, такой как острый миелоидный лейкоз и колорсктальный рак.
Nima-ассоциированная киназа 2 (Nek2) является протеинкиназой, регулирующей клеточный цикл, причем фермент локализуется в центросоме и обладает максимальной активностью на стадии митоза. Функциональные исследования свидетельствуют об участии Nek2 в регуляции разделения центросомы и образовании веретена. Повышенное содержание белка Nek2 (в 2-5 раз) наблюдается в клеточных линиях, полученных из некоторых опухолей человека, таких как рак шейки матки, яичника, предстательной железы и прежде всего рака молочной железы.
Заболевания или состояния, опосредованные p70S6K, включают, без ограничения перечисленным, пролиферативные нарушения, такие как рак и туберозный склероз.
В соответствии с вышеизложенным в настоящем изобретении предлагается также способ профилактики или лечения любых заболеваний или нарушений, указанных выше, у субъекта, который нуждается в таком лечении, причем указанный способ заключается в том, что указанному субъекту вводят терапевтически эффективное количество (см. ниже в разделе Способы введения и фармацевтические композиции) соединения формулы 1 или его фармацевтически приемлемой соли. При любом вышеуказанном применении требуемые дозы могут изменяться в зависимости от способа введения, конкретного состояния, подлежащего лечению, и ожидаемого действия.
Способы введения и фармацевтические композиции
В общем случае соединения по изобретению вводят в терапевтически эффективных количествах любыми обычными и приемлемыми известными способами, отдельно или в комбинации с одним или более терапевтическими агентами. Терапевтически эффективное количество может изменяться в зависимости от тяжести заболевания, возраста и относительного состояния здоровья субъекта, активности используемого соединения и других факторов. В общем случае удовлетворительные результаты достигаются при системном введении суточных доз от приблизительно 0,03 до 2,5 мг/кг массы тела. Для более крупного млекопитающего, например человека, назначаемая суточная доза составляет от приблизительно 0,5 мг до приблизительно 100 мг, которую можно вводить, например, раздельными дозами до четырех раз в сутки или в виде формы с замедленным высвобождением. Пригодные стандартные лекарственные формы для перорального введения включают от приблизительно 1 до 50 мг активного ингредиента.
Соединения по изобретению можно вводить в виде фармацевтических композиций любым приемлемым способом, прежде всего пероральным способом, например, в форме таблеток или капсул, парентеральным способом, например, в форме инъекционных растворов или суспензий, местным способом, например, в форме лосьонов, гелей, мазей или кремов, или назальным способом или в форме суппозиториев. Фармацевтические композиции, включающие соединение по настоящему изобретению в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли в смеси по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем, получают обычным способом с использованием обычных методов смешивания, гранулирования или нанесения покрытия. Например, пероральные композиции могут представлять собой таблетки или желатиновые капсулы, включающие активный ингредиент в смеси с а) разбавителями, например, лактозой, декстрозой, сахарозой, маннитом, сорбитом, целлюлозой и/или глицином, б) замасливателями, например диоксидом кремния, тальком, стеариновой кислотой, ее кальциевой или магниевой солью и/или полиэтиленгликолем, а таблетки могут также включать в) связующие агенты, например силикат магния/алюминия, крахмальную пасту, желатин, трагакант, метилцеллюлозу, Na-соль карбоксиметилцеллюлозы и/или поливинилпирролидон, и при необходимости г) дезинтегрирующие агенты, например крахмалы, агар, альгиновую кислоту или ее натриевую соль, или шипучие смеси, и/или д) абсорбенты, красители, ароматизаторы и подсластители. Инъекционные композиции могут представлять собой водные изотонические растворы или суспензии, а суппозитории получают из жировых эмульсий или суспензий. Композиции можно стерилизовать и/или они могут содержать адъюванты, такие как консервирующие, стабилизирующие, смачивающие или эмульгирующие агенты, способствующие растворению агенты, соли для регуляции осмотического давления и/или буферные вещества. Кроме того, они могут содержать другие терапевтически ценные соединения. Пригодные составы для чрескожного применения включают эффективное количество соединения по настоящему изобретению в смеси с носителем. Носитель может включать абсорбируемые фармакологически приемлемые растворители для обеспечения всасывания через кожу пациента. Например, системы для чрескожного введения представляют собой повязку, включающую основу, резервуар, содержащий соединение необязательно в смеси с носителем, необязательно мембрану, регулирующую доставку соединения к поверхности кожи с заданной скоростью в течение продолжительного времени, и слой, обеспечивающий удерживание устройства на поверхности кожи. Можно также использовать матричные чрескожные составы. Пригодные составы для местного нанесения, например на кожу и в глаза, предпочтительно представляют собой водные растворы, мази, кремы или гели, известные в данной области. Такие составы могут содержать солюбилизирующие, стабилизирующие, тонизирующие агенты, буферные вещества и консерванты.
Соединения по изобретению можно вводить в терапевтически эффективных количествах в комбинации с одним или более терапевтическим агентом (фармацевтические комбинации). Например, синергетическое действие достигается при использовании комбинации с другими иммуномодулирующими или противовоспалительными веществами, например при использовании в комбинации с циклоспорином, рапамицином или аскомицином, или их иммунодепрессантными аналогами, например циклоспорином А (СsА), циклоспорином G, FK-506, рапамицином, или аналогичными соединениями, кортикостероидами, циклофосфамидом, азатиоприном, метотрексатом, бреквинаром, лефлуномидом, мизорибином, микофеноловой кислотой, микофенолятом мофетила, 15-дезоксиспергуалином, иммунодепрессантными антителами, прежде всего моноклональными антителами к рецепторам лейкоцитов, например МНС, CD2, CD3, CD4, CD7, CD25, CD28, В7, CD45, CD58 или их лигандам, или другими иммуномодулирующими соединениями, такими как CTLA41g. Если соединения по изобретению вводят совместно с другими терапевтически активными агентами, дозы совместно вводимых соединений варьируют в зависимости от типа совместно используемого лекарственного средства, от конкретного лекарственного средства, от состояния, подлежащего лечению и т.п.
Кроме того, изобретение относится к фармацевтическим комбинациям, например набору, включающему а) первый агент, который представляет собой соединение по изобретению, указанное выше, в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли, и б) по меньшей мере один второй агент. Набор включает инструкции по введению лекарственных средств.
Термины "совместное введение" или "комбинированное введение" или аналогичные термины, используемые в описании, означают введение выбранных терапевтических агентов одному пациенту, а также курс лечения, согласно которому агенты необязательно вводятся одновременно и одним и тем же способом.
Термин "фармацевтическая комбинация", используемый в описании заявки, означает продукт, который образуется при смешивании или комбинировании более одного активного ингредиента и включает фиксированные и нефиксированные комбинации активных ингредиентов. Термин "фиксированная комбинация" означает, что активные ингредиенты, например соединение формулы I и сопутствующий агент, вводятся пациенту одновременно в форме одного продукта или дозы. Термин "нефиксированные комбинации" означает, что активные ингредиенты, например соединение формулы I и сопутствующий агент, вводятся пациенту раздельно, одновременно, вместе или последовательно, без ограничений по времени, причем такое введение обеспечивает достижение терапевтически эффективного уровня двух соединений в организме пациента. Последнее относится также к комбинированному лечению растворами, например к введению трех или более активных ингредиентов.
Способы получения соединений по изобретению
Настоящее изобретение включает также способы получения соединений по изобретению. В описанных реакциях необходимо защищать реакционноспособные функциональные группы, например гидрокси, амино, имино, тио или карбоксигруппы, если они должны присутствовать в конечном продукте. Введение защитных групп позволяет исключить участие таких функциональных групп в проводимых реакциях. Соответствующие защитные группы используются в соответствии с принятой практикой, например, см. T.W.
Greene и Р. G.M. Wuts, "Protective Groups in Organic Chemistry", John Wiley and Sons(1991).
Соединения формулы I получают, как показано на схеме 1:
Схема 1
1
2
1
2
3
На схеме 1 n, Z, Z, R и R имеют значения, указанные в разделе Краткое описание сущности изобретения. Соединение формулы I получают при взаимодействии соединения формулы 2 с соединением формулы 3 в присутствии пригодной кислоты (например, МеSОН, TsOH и т.п.) и соответствующего растворителя (например, ДМСО, диоксан и т.п.). Реакцию проводят при температуре от приблизительно 100°С до приблизительно 150°С в течение приблизительно 24 ч до завершения реакции.
2
5
6
Соединения формулы I, в которых R означает -NRC(O)R, получают как показано на схеме 2:
Схема 2
1
2
1
5
6
2
5
6
На схеме 2 n, Z, Z, R, R и R имеют значения, указанные в разделе Краткое описание сущности изобретения. Соединение формулы I получают при взаимодействии соединения формулы 4 с соединением формулы 5 в присутствии пригодного конденсирующего реагента (например, HATU и т.п.), соответствующего растворителя (например, ДМФА, ТГФ или т.п.) и соответствующего основания (например, DIEA, ТЭА и т.п.). Реакцию проводят при температуре от приблизительно 0°С до приблизительно 50°С в течение приблизительно 20 ч до завершения реакции. Соединения формулы I, в которых R означает -C(O)NRR, получают по аналогичной реакции из соответствующих исходных материалов.
2
5
2
6
Соединения формулы I, в которых R означает -NRS(O)R получают, как показано на схеме 3:
Схема 3
1
2
1
5
6
На схеме 3 n, Z, Z, R, R и R имеют значения, указанные в разделе Краткое описание сущности изобретения. Соединение формулы I получают при взаимодействии соединения формулы 4 с соединением формулы 6 в присутствии соответствующего растворителя (например, ДМФА, ТГФ или т.п.) и пригодного основания (например, DIEA, ТЭА и т.п.). Реакцию проводят при температуре от приблизительно 0°С до приблизительно 50°С в течение приблизительно 20 ч до завершения реакции.
2
5
5
6
Соединения формулы I, в которых R означает -NRC(O)NRR, получают как показано на схеме 4:
Схема 4
1
2
1
5
6
На схеме 4 n, Z, Z, R, R и R имеют значения, указанные в разделе Краткое описание сущности изобретения. Соединение формулы I получают при взаимодействии соединения формулы 4 с соединением формулы 7 в присутствии соответствующего растворителя (например, ДМФА, ТГФ или т.п.) и пригодного основания (например, DIEA, ТЭА и т.п.). Реакцию проводят при температуре от приблизительно 0°С до приблизительно 50°С в течение приблизительно 20 ч до завершения реакции.
Подробные примеры синтеза соединения формулы I приводятся ниже в разделе Примеры.
Дополнительные способы получения соединений по изобретению
Соединение по изобретению можно получить в виде фармацевтически приемлемой кислотно-аддитивной соли по реакции свободного основания соединения с фармацевтически приемлемой неорганической или органической кислотой. В другом варианте фармацевтически приемлемую основно-аддитивную соль соединения по изобретению можно получить по реакции свободной кислоты соединения с фармацевтически приемлемым неорганическим или органическим основанием.
В другом варианте соли соединений по изобретению можно получить с использованием солей исходных материалов или промежуточных соединений.
Свободные кислоты или свободные основания соединений по изобретению получают из соответствующих основно-аддитивной соли или кислотно-аддитивной соли соответственно. Например, соединение по изобретению в форме кислотно-аддитивной соли можно превратить в соответствующее свободное основание при обработке соответствующим основанием (например, раствором гидроксида аммония, гидроксида натрия и т.п.). Соединение по изобретению в форме основно-аддитивной соли можно превратить в соответствующую свободную кислоту при обработке соответствующей кислотой (например, соляной кислотой и т.п.).
Соединения по изобретению в неокисленной форме можно получить из N-оксидов соединений по изобретению при обработке восстанавливающим агентом (например, серой, диоксидом серы, трифенилфосфином, боргидридом лития, боргидридом натрия, трихлоридом фосфора, трибромидом фосфора или т.п.) в пригодном инертном органическом растворителе (например, ацетонитриле, этаноле, водном диоксане или т.п.) при температуре от 0°С до 80°С.
Пролекарство соединений по изобретению получают известными методами (например, см. Saulnier и др., Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 4, 1985 (1994)). Например, соответствующие пролекарства можно получить при взаимодействии немодифицированного соединения по изобретению с пригодным карбамилирующим агентом (например, 1,1-ацилоксиалкилкарбонилхлоридом, пара-нитрофенилкарбонатом или т.п.).
Соединения по изобретению, содержащие защитные группы, можно получить известными методами. Подробное описание методик введения защитных групп и их удаления можно найти в монографии T.W. Greene, "Protecting Groups in Organic Chemistry", 3 изд., John Wiley и Sons, Inc. (1999).
Соединения по изобретению можно получить, в том числе способом по изобретению, в виде сольватов (например, гидратов). Гидраты соединений по настоящему изобретению получают при перекристаллизации из смеси вода/органический растворитель, такой как диоксан, тетрагидрофуран или метанол.
Соединения по изобретению можно получить в виде индивидуальных стереоизомеров при взаимодействии рацемической смеси соединения с оптически активным разделяющим агентом с образованием пары диастереоизомерных соединений, разделении диастереомеров и выделении оптически чистых энантиомеров. Хотя разделение энантиомеров проводят с использованием ковалентных диастереомерных производных соединений по изобретению, предпочтительными являются диссоциирующие комплексы (например, кристаллические диастереомерные соли). Диастереомеры обладают разными физическими свойствами (например, температурой плавления, температурой кипения, растворимостью, реакционноспособностью и т.п.) и благодаря этому их можно разделить простыми методами. Диастереомеры разделяют хроматографией или предпочтительно по методике, основанной на различии в растворимости. Затем оптически чистый энантиомер выделяют с использованием разделяющего агента любым способом, исключающим рацемизацию. Более подробное описание методик, используемых для разделения стереоизомеров соединений, присутствующих в виде рацемических смесей, можно найти в монографии Jean Jacques, Andre Cottet, Samue! H. Wilen, "Enantiomers, Racemates and Resolutions", John Wiley And Sons, Inc. (1981). В итоге соединения формулы I можно получить способом, который заключается в том, что:
(а) проводят реакцию, как показано на схемах 1, 2, 3 и 4, и
(б) необязательно превращают соединения по изобретению в фармацевтически приемлемую соль,
(в) необязательно превращают соль соединения по изобретению в несолевую (свободную) форму,
(г) необязательно превращают неокисленную форму соединения по изобретению в фармацевтически приемлемый N-оксид,
д) необязательно превращают N-оксид соединения по изобретению в его неокисленную форму,
(е) необязательно выделяют индивидуальный изомер соединения по изобретению из смеси изомеров,
(ж) необязательно превращают немодифицированное соединение по изобретению в фармацевтически приемлемое пролекарство, и
(з) необязательно превращают пролекарство соединения в немодифицированную форму.
Получение исходных материалов подробно не описано, поскольку соединения известны или их можно получить известными методами, или как описано ниже в разделе Примеры.
Для специалиста в данной области представляется очевидным, что вышеуказанные синтезы и модификации приводятся для иллюстрации методов получения соединения по настоящему изобретению и что их можно получить с использованием других известных методов.
Примеры
Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами, не огранивающими его объем:
Пример 1
4-Метил-N-[4-(2-метилимидазол-1-ил)-3-трифторметилфенил]-3-[1-(7Н-пирроло[2.3-d]пиримидин-4-ил)-1Н-имидазол-2-иламино]бензамид
2
4
В раствор 6-хлордиазапурина (2,0 г, 13 ммолей, 1,0 экв.) в дихлорметане (65 мл) добавляли триэтиламин (1,98 мл, 14,3 ммоля, 1,1 экв.) и 4-диметиламинопиридин (в качестве катализатора). В реакционную смесь добавляли порциями тозилхлорид (2,55 г, 13,4 ммоля, 1,03 экв.) и перемешивали в течение 30 мин. Реакционную смесь распределяли между дихлорметаном и водой. Органический слой отделяли и водный слой экстрагировали дихлорметаном. Объединенные органические экстракты промывали водой, сушили над NaSO, фильтровали и концентрировали, при этом получали 4-хлор-7-(толуол-4-сульфонил)-7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин, который использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
2
4
В раствор 2-хлор-1Н-имидазола (252 мг, 2,47 ммоля) в ДМСО (10 мл) при КТ добавляли NaH (60% дисперсия в минеральном масле, 94 мг, 2,35 ммоля) перемешивали в течение 30 мин и добавляли 4-хлор-7-(толуол-4-сульфонил)-7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин (691 мг, 2,25 ммоля). Колбу закрывали и нагревали при 80°С в течение 1 ч. Реакционную смесь охлаждали до КТ, нейтрализовали добавлением насыщенного раствора хлорида аммония и дважды экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические слои промывали солевым раствором, сушили над NaSO, фильтровали и концентрировали. Продукт очищали хроматографией на колонке с силикагелем (элюент: градиент этилацетат/гексан, от 5% до 50%), при этом получали 4-(2-хлоримидазол-1-ил)-7-(толуол-4-сульфонил)-7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин. МС: m/z 374,00 (M+1).
1
3
Н-ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 8,99 (s, 1Н), 8,15 (d, 2H, J 8,0 Гц), 7,88 (d, 1H, J 8,4 Гц), 7,36-7,38 (m, 3Н), 7,16 (d, 1H, J 2,0 Гц), 6,70 (d, 1H, J 8,0 Гц), 2,43 (s, 3Н).
Смесь 4-(2-хлоримидазол-1-ил)-7-(толуол-4-сульфонил)-7Н-пирроло[2,3-d]пиpимидинa (393 мг, 1,05 ммоля), TBAF (1 M раствор в ТГФ, 1,58 мл, 1,58 ммоля) в ТГФ (16 мл) перемешивали при 60°С в течение ночи. Реакционную смесь охлаждали до КТ и концентрировали. Продукт очищали ОФЖХ/МС, при этом получали 4-(2-хлоримидазол-1-ил)-7Н-пирроло[2,3-с1]пиримидин. МС: m/z 219,9 (М+1).
1
6
Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d): δ 12,67 (s, 1Н), 8,83 (s, 1H), 7,81 (d, 1H, J 1,6 Гц), 7,78 (t, 1H, J 1,9 Гц), 7,20 (d, 1H, J 1,6 Гц), 6,59 (dd, 1H, J 2,8, 1,6 Гц).
3
Раствор 4-(2-хлоримидазол-1-ил)-7Н-пирроло[2,3-d]пиримидина (21,6 мг, 0,098 ммоля), 3-амино-4-метил-N-[4-(2-метилимидазол-1-ил)-3-трифторметилфенил]бензамида (37 мг, 0,098 ммоля) и МеSОН (12,76 мкл, 0,197 ммоля) в 1,3-диметил-2-имидазолидиноне (0,5 мл) перемешивали и нагревали при 80°С в течение 36 ч. Реакционную смесь охлаждали до КТ и очищали ОФ-ЖХ/МС, при этом получали указанное в заголовке соединение. МС: m/z 558,2 (М+1).
1
6
Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d): δ 12,73 (s, 1H), 11,45 (s, 1H), 10,88 (s, 1 H), 8,98 (s, 1 H), 8,83 (s,l H), 8,54 (d, 1H, J 1,9 Гц), 8,36 (dd, 1H, J 1,6, 8,8 Гц), 7,95 (d, 1H, J 1,9 Гц), 7,92 (s, 1H), 7,86 (d, 1H, J 8,8 Гц), 7,81 (d, 1H, J 2,4 Гц), 7,79 (t, 1H, J 2,8 Гц), 7,65 (d, 1H, J 7,8 Гц), 7,48 (d, 1H, J 8,0 Гц), 7,12-7,09 (m, 2H), 2,50 (s, 3H), 2,40 (s, 3H).
Пример 2
3-(4-Метилимидазол-1-ил)-N-{4-метил-3-[1-(7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-у1)-1Н-имидазол-2-иламино]фенил}-5-трифторметилбензамид
f
В раствор диэтилацеталя аминоацетальдегида (13,16 г, 99 ммолей) в эфире (35 мл) при КТ добавляли суспензию CNBr (10,47 г, 99 ммолей) в гексане (35 мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Твердое вещество отделяли фильтрованием и промывали эфиром. Объединенные фильтраты концентрировали и очищали хроматографией на колонке с силикагелем (элюент: градиент дихлорметан до МеОН (4%)/дихлорметан), при этом получали N-(2,2-диэтоксиэтил)карбодиимид. R: 2,70, (элюент: 4% МеОН/дихлорметан, проявление: 10% раствор фосфорномолибденовой кислоты в этаноле).
1
3
Н-ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 4,58 (t, J 5,2 Гц, 1Н), 3,77-3,69 (m, 2H), 3,65 (ушир. s, 1Н), 3,60-3,52 (m, 2H), 3,16 (t, J 5,6 Гц, 1Н), 1,23 (t, 6H, J 6,8 Гц).
2
2
В раствор 4-метил-3-нитроанилина (15,86 г, 104 ммоля), пиридина (17,0 мл, 208 ммолей) в СНСl (150 мл) при 0°С добавляли по каплям бензоилхлорид (13,30 мл, 114 ммолей) и перемешивали при КТ в течение 2 ч. Смесь концентрировали, остаток промывали насыщенным раствором карбоната натрия, водой и этиловым эфиром, при этом получали требуемое соединение, которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. МС: m/z 257,3 (M+1).
1
6
Н-ЯМР (600 МГц, ацетон-d): δ 9,85 (s, 1Н), 8,61 (s, 1Н), 8,05 -8,02 (m, 3H), 7,60 (t, 1Н, J 7,2 Гц), 7,53 (t, 2H, J 7,2 Гц), 7,46 (d, 1Н, J 7,8 Гц), 2,54 (s, 3H).
2
Указанное выше соединение растворяли в этаноле (250 мл) и гидрировали в присутствии палладия (10 мас.% на влажном активированном угле, тип Degussa, 5 г) в аппарате Парра, при давлении Н 20-30 фунт/кв. дюйм, в течение 16 ч. Реакционную смесь фильтровали через целит и промывали этанолом. Объединенный фильтрат и промывные фракции концентрировали, при этом получали N-(3-амино-4-метилфенил)бензамид, который использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. МС: m/z 227,3 (M+1).
1
6
Н-ЯМР (600 МГц, ацетон-d): δ 9,40 (s, 0,4H), 9,23 (s, 0,6H), 7,96 (t, 2H, J 7,8 Гц), 7,55-7,52 (m, 1Н), 7,49 (d, 1H, J 7,2 Гц), 7,47 (d, 1Н, J 7,2 Гц), 7,37 (d, 0,4H. J 8,4 Гц), 7,31 (s, 0,6H), 7,17 (s, 0,4H), 7,11 (d, 0,4H, J 8,4 Гц), 7,95 (d, 0,6H, J 8,4 Гц), 7,91 (d, 0,6H, J 8,4 Гц), 4,44 (ушир. s, 1,2H), 2,90 (ушир. s, 0,8H), 2,11 (s, 1.8Н), 1,98 (s, 1,2H).
2
2
2
4
2
2
2
2
Смесь N-(2,2-диэтоксиэтил)карбодиимида (10,38 г, 65,6 ммоля), 3-амино-4-метилфенил]бензамида (7,42 г, 32,8 ммоля), метансульфоновой кислоты (3,20 мл, 49,3 ммоля) в этаноле (200 мл) кипятили с обратным холодильником в течение 19 ч. Затем смесь концентрировали, остаток растворяли в 6 н. НС1 (30 мл), перемешивали в течение ночи, при 0°С нейтрализовали добавлением 25% раствора NaOH до рН 6, а затем подщелачивали добавлением насыщенного раствора карбоната натрия до рН 11. Смесь перемешивали в течение 30 мин и экстрагировали 10% раствором этанола в СНСl. Объединенные органические слои сушили над NaSO, фильтровали, концентрировали и высушивали в вакууме. Остаток растирали в CHCl (50 мл), твердое вещество отделяли фильтрованием, промывали СНС1 и высушивали, при этом получали N-[3-(1H-имидазол-2-иламино)-4-метилфенил]бензамид в виде твердого вещества белого цвета. МС: m/z 293,4 (M+l).
1
6
Н-ЯМР (600 МГц, ДМСО-d): δ 10,79 (s, 1Н), 10,11 (s, 1H), 8,00 (d, 1H, J 2,4 Гц), 7,94 (d, 2H, J 7,2 Гц), 7,60 (s, 1H), 7,56 (t, 1H, J 7,2 Гц), 7,49 (t, 2H, J 7,2 Гц), 7,25 (dd, 1H, J 2,4, 8,4 Гц), 7,04 (d, 1H, J 7,8 Гц), 6,80 (ушир.s, 1H), 6,65 (ушир. s, 1H), 2,20 (s, 3H).
Смесь N-[3-(1Н-имидазол-2-иламино)-4-метилфенил]бензамида (627 мг, 2,14 ммоля), 4-хлор-7-(толуол-4-сульфонил)-7Н-пиррол[2,3-d]пиримидина (600 мг, 1,95 ммоля), DIEA (1,02 мл, 5,86 ммоля) в 1,3-диметил-2-имидазолидиноне (2,0 мл) нагревали при 120°С в течение 8 ч. Реакционную смесь охлаждали до КТ и добавляли воду. Твердое вещество отделяли фильтрованием, промывали водой, высушивали и использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. Твердое вещество растворяли в ТГФ (30 мл) и добавляли TBAF (1M в ТГФ, 3,0 мл, 3,0 ммоля) и реакционную смесь нагревали при 60°С в течение 16 ч. Реакционную смесь охлаждали до КТ, удаляли ТГФ и добавляли воду. Твердое вещество отделяли фильтрованием, промывали метанолом и высушивали, при этом получали N-{4-метил-3-[1-(7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-ил)-1Н-имидазол-2-иламино]фенил}6ензамид, который использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. МС: m/z 410,1 (M+1).
1
6
Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d): δ 12,63 (s, 1H), 11,23 (s, 1H), 10,25 (s, 1H), 8,82 (d, 1H, J 2,0 Гц), 8,80 (s, 1H), 7,99 (d, 2H, J 7,2 Гц), 7,86 (d, 1H, J 2,8 Гц), 7,74 (t, 1H, J 3,2 Гц), 7,60 -7,56 (m, 1H), 7,52 (t, 2H, J 7,6 Гц), 7,36 (dd, 1H, J 8,0, 1,9 Гц), 7,18 (d, 1H, J 1,8 Гц), 7,06 (m, 1H), 6,99 (d, 1H, J 2,4 Гц), 2,40 (s, 3H).
Смесь N-{4-метил-3-[1-(7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-ил)-1Н-имидазол-2-иламино] фенил}бензамида (470 мг) и 6 н. НСl (20 мл) нагревали при 80°С в течение ночи. Реакционную смесь охлаждали до КТ, твердое вещество отделяли фильтрованием, фильтрат концентрировали и подщелачивали добавлением раствора карбоната натрия. Твердое вещество отделяли фильтрованием, промывали водой и высушивали, при этом получали 4-метил-N-[1-(7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-ил)-1Н-имидазол-2-ил]бензол-1,3-диамин, который использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. МС: m/z 306,1 (M+1).
3
В раствор 4-метил-N-[1-(7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-ил)-1Н-имидазол-2-ил]бензол-1,3-диамина (15,0 мг, 0,049 ммоля), 3-(4-метилимидазол-1-ил)-5-трифторметилбензойной кислоты (16,0 мг, 0,059 ммоля), DIEA (35 мкл, 0,20 ммоля) в ДМФА (2 мл) добавляли HATU (21 мг, 0,055 ммоля). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч и растворитель удаляли в вакууме. Остаток растворяли в ДМСО (1 мл). Полученный раствор очищали ОФ-ЖХВР, при этом получали 3-(4-метилимидазол-1-ил)-N-{4-метил-3-[1-(7Н-пирроло[2,3-(1]пиримидин-4-ил)-1Н-имидазол-2-иламино]фенил}-5-трифторметилбензамид. МС: m/z 558,2 (M+1).
1
6
Н-ЯМР (600 МГц, ДМСО-d): δ 12,73 (s, 1Н), 11,32 (s, 1H), 10,67 (s, 1H), 9,60 (s, 1H), 8,82 (s, 1H), 8,64-8,56 (m, 2H), 8,46 (s, 1H), 8,43 (s, 1H), 8,17 (s, 1H), 7,93 (d, 1H, J 2,8 Гц), 7,79 (t, 1H, J 3,2 Гц), 7,52 (d, 1H, J 8,0 Гц), 7,30 (d, 1H, J 8,0 Гц), 7,11 (s, 1H), 7,07 (m, 1H), 2,39 (s, 3H), 2,36 (s, 3H).
Методы анализа
Соединения по настоящему изобретению анализировали по их способности селективно ингибировать пролиферацию клеток 32D, экспрессирующих BCR-Abl (32D-p210), в сравнении с исходными клетками 32D. Для соединений, селективно ингибирующих пролиферацию этих клеток, трансформированных BCR-Аbl, определяли антипролиферативную активность в отношении клеток Ва/F3, экспрессирующих дикий тип или мутантные формы Всr-аbl. Кроме того, соединения анализировали по их способности ингибировать киназы FGFR3, b-RAF, Аbl, ВМХ, ВТК, СНК2, c-RAF, CSK, c-SRC, Fes, F1t3, IKKα, IKKβ, JNK2α2, Lck, Met, MKK4, MKK6, MCST2, NEK2, p70S6K, PDGFRα, PKA, PKBβ, PKD2, Rsk1, SAPK2α, SAPK2β, SAPK3, SGK, Tie2 и TrkB.
Ингибирование BCR-Abl-зависимой клеточной пролиферации (экспресс-анализ)
Для анализа использовали линию клеток мыши, которые представляли собой гемопоэтические клетки-предшественники линии 32D, трансформированные кДНК BCR-Abl (32D-p210). Указанные клетки культивировали в среде RPMI/10% эмбриональная телячья сыворотка (RPMI/FCS), содержащей пенициллин (50 мкг/мл), стрептомицин (50 мкг/мл) и L-глутамин (200 мМ). Нетрансформированные клетки 32D культивировали в аналогичных условиях при добавлении среды, содержащей 15% WEHI в качестве источника IL3.
2
ТМ
Суспензию клеток 32D или 32D-p210 высевали в 384-луночные микропланшеты Грейнера (черные) с плотностью 5000 клеток в лунке в 50 мкл среды. В каждую лунку добавляли по 50 нл раствора анализируемого соединения (1 мМ исходный раствор в ДМСО) (включая STI571 в качестве положительного контроля). Клетки инкубировали при 37°С в течение 72 ч в атмосфере 5% СО, в каждую лунку добавляли по 10 мкл 60% раствора реагента Alamar Blue (фирма Tek diagnostics) и клетки инкубировали в течение еще 24 ч. Интенсивность флуоресценции (возбуждение при 530 нм, испускание при 580 нм) измеряли с использованием системы Acquest (фирма Molecular Devices).
Ингибирование BCR-Abl-зависимой клеточной пролиферации
2
50
Клетки 32D-p210 высевали в 96-луночные ТС планшеты с плотностью 15000 клеток в лунке. В каждую лунку добавляли по 50 мкл раствора анализируемого соединения при двукратном серийном разведении (Смаке составляет 40 мкМ) (включая STI571 в качестве положительного контроля). Клетки инкубировали при 37°С в течение 48 ч в атмосфере 5% СO, в каждую лунку добавляли по 15 мкл раствора МТТ (фирма Promega) и клетки инкубировали в течение еще 5 ч. Оптическую плотность при 570 нм измеряли спектрофотометрией и по графику зависимости доза/ответ определяли величины IC, т.е. концентрацию соединения, обеспечивающую 50% ингибирование.
Действие на клеточный цикл
2
Клетки 32D и 32D-p210 высевали в 6-луночные ТС планшеты с плотностью 2,5×10 клеток в лунке в 5 мл среды и добавляли анализируемое соединение при концентрации 1 или 10 мкМ (включая STI571 в качестве контроля). Затем клетки инкубировали при 37°С в течение 24 ч или 48 ч в атмосфере 5% СO. Клеточную суспензию (2 мл) промывали ФСБ, фиксировали в 70% EtOH в течение 1 ч и обрабатывали ФБС/ЭДТА/РНКаза А в течение 30 мин. Затем добавляли иодид пропидия (Cf 10 мкг/мл) и измеряли интенсивность флуоресценции проточной цитометрией с использованием системы FACScalibur (фирма BD Biosciences). Анализируемые соединения по настоящему изобретению проявляли апоптотическое действие на клетки 32D-p210, но не вызывали апоптоза в исходных клетках 32D.
Действие на аутофосфорилирование клеточного белка BCR-Аbl
5
ТМ
макс
2
Аутофосфорилирование BCR-Аbl определяли методом ИФА с захватом антигена в присутствии иммобилизованных антител, специфичных к с-ab1, и антител к фосфотирозину. Клетки 32D-p210 высевали в 96-луночные ТС планшеты с плотностью 2×10 клеток в лунке в 50 мкл среды. В каждую лунку добавляли по 50 мкл раствора анализируемого соединения при двукратном серийном разведении (С составляет 10 мкМ) (включая STI571 в качестве положительного контроля). Клетки инкубировали при 37°С в течение 90 мин в атмосфере 5% CO. Затем клетки обрабатывали в течение 1 ч на ледяной бане 150 мкл буферного раствора для лизиса (50 мМ трис-HCl, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, 1 мМ EGTA и 1% NP-40), содержащего ингибиторы протеаз и фосфатазы. 50 мкл Клеточного лизата добавляли в 96-луночные планшеты (optiplates), предварительно покрытые специфичными антителами анти-аb1 и обработанные блокирующим раствором. Планшеты инкубировали при 4°С в течение 4 ч, промывали буферным раствором TBS/твин 20, добавляли 50 мкл раствора конъюгата щелочной фосфатазы с антителами к фосфотирозину и планшет инкубировали при 4°С в течение ночи. Планшет промывали буферным раствором TBS/твин 20, добавляли 90 мкл люминесцентного субстрата и измеряли люминесценцию с использованием системы Acquest (фирма Molecular Devices). Анализируемые соединения по изобретению, которые ингибируют пролиферацию клеток, экспрессирующих BCR-Abl, ингибируют аутофосфорилирование клеточного BCR-Abl дозозависимым способом.
Действие на пролиферацию клеток, экспрессирующих мутантные формы Bcr-abl
50
Для соединений по изобретению определяли антипролиферативную активность в отношении клеток Ba/F3, экспрессирующих BCR-Аbl дикого типа или его мутантные формы (G250E, E255V, Т3151, F317L, М351Т), которые обладают устойчивостью или пониженной чувствительностью к STI571. Антипролиферативное действие указанных соединений на клетки, экспрессирующие мутантный BCR-Abl, и на нетрансформированные клетки анализировали при концентрациях 10, 3,3, 1,1 и 0,37 мкМ, как описано выше (в среде, не содержащей IL3). Величины IC для соединений, не обладающих токсичностью в отношении нетрансформированных клеток, определяли по графику зависимости доза/ответ, как описано выше.
FGFR3 (ферментативный анализ)
2
2
3
4
50
50
Анализ киназной активности очищенного FGFR3 (фирма Upstate) проводили в конечном объеме 10 мкл, содержащем 0,25 мкг/мл фермента в киназном буферном растворе (30 мМ трис-HCl, рН 7,5, 15 мМ MgCl, 4,5 мМ MnCl, 15 мкМ NaVO и 50 мкг/мл БСА), субстраты (5 мкг/мл биотин-поли-EY(Glu, Туг) (фирма CIS-US, Inc.) и 3 мкМ АТФ). Анализ проводили с использованием двух растворов: первый раствор (5 мкл), содержащий фермент FGFR3 в киназном буферном растворе, добавляли в 384-луночные планшеты ProxiPlate) (фирма Perkm-Elmer), в каждую лунку добавляли 50 нл раствора соединений в ДМСО, а затем 5 мкл второго раствора, содержащего субстрат (поли-EY) и АТФ в киназном буферном растворе. Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч, реакцию останавливали добавлением 10 мкл смеси HTRF для проявления, содержащей 30 мМ трис-HCl, рН 7,5, 0,5 М KF, 50 мМ ETDA, 0,2 мг/мл БСА, 15 мкг/мл стрептавидин-ХL665 (фирма CIS-US, Inc.) и 150 нг/мл конъюгата криптата и антифосфотирозиновых антител (фирма CIS-US, Inc.). Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч для образования комплекса стрептавидин/биотин, сигналы флуоресценции с разрешением по времени регистрировали на флуориметре Analyst GT (фирма Molecular Devices Corp.). Величины IС рассчитывали методом линейной регрессии по проценту ингибирования каждым соединением при 12 концентрациях (разведение 1:3 исходного раствора с концентрацией от 50 мкМ до 0,28 нМ). По данным указанного анализа соединения по изобретению обладают величинами IС в интервале от 10 нМ до 2 мкМ.
FGFR3 (анализ в культуре клеток)
50
Соединения по изобретению анализировали по способности ингибировать пролиферацию трансформированных клеток Ba/F3-TEL-FGFR3, которая является зависимой от активности клеточной киназы FGFR3. Клетки Ba/F3-TEL-FGFR3 культивировали в суспензии в среде RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, до концентрации 800000 клеток/мл. Клетки высевали в 384-луночные планшеты с плотностью 5000 клеток/в лунке в 50 мкл культуральной среды. Соединения по изобретению растворяли и разбавляли диметилсульфоксидом (ДМСО). Получали 12 растворов в ДМСО при серийном разведении 1:3 при концентрации обычно от 10 мМ до 0,05 мкМ. В лунки с клетками добавляли по 50 нл разбавленных растворов соединений и инкубировали в течение 48 ч в инкубаторе для клеточных культур. Затем в лунки добавляли реагент AlamarBIue) (фирма TREK Diagnostic SysteMCS) до конечной концентрации 10%, который используется для регистрации восстанавливающей среды, создаваемой пролиферирующими клетками. Смесь инкубировали при 37°С в инкубаторе для клеточных культур в течение еще 4 ч и определяли интенсивность флуоресценции восстановленного AlamarBIue) (возбуждение при 530 нм, испускание при 580 нм) на флуориметре Analyst GT (фирма Molecular Devices Corp.). Величины IC рассчитывали методом линейной регрессии по проценту ингибирования каждым соединением при 12 концентрациях.
FLT3 и PDGFRβ (анализ в культуре клеток)
Действие соединений по изобретению на клеточную активность (активность в клетках) FLT3 и PDGFRβ оценивали с использованием методов, описанных выше, для определения клеточной активности FGFR3, при этом вместо клеток Ba/F3-TEL-FGFR3 использовали клетки Ba/F3-FLT3-ITD и Ba/F3-Tel-PDGFRβ соответственно.
b-Raf (ферментативный анализ)
Соединения по изобретению анализировали по способности ингибировать активность b-Raf. Анализ проводили в 384-луночных планшетах MaxiSorp (фирма NUNC) с черными стенками и прозрачным дном. Субстрат IкBα разбавляли в DPBS (1:750) и в каждую лунку добавляли по 15 мкл. Планшеты инкубировали при 4°С в течение ночи и трижды промывали TBST (25 мМ трис, рН 8,0, 150 мМ NaCl и 0,05% твин-20) с использованием устройства для промывки планшетов EMBLA. Планшеты блокировали реагентом Superblock (15 мкл/лунка) в течение 3 ч при комнатной температуре, трижды промывали TBST и планшет сушили постукиванием. Затем в каждую лунку добавляли буферный раствор для анализа, содержащий 20 мкМ АТФ (10 мкл) и 100 нл или 500 нл раствора соединения. B-Raf разбавляли в буферном растворе для анализа (1 мкл в 25 мкл) и в каждую лунку добавляли по 10 мкл разбавленного раствора b-Raf (0,4 мкг/лунка). Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 2,5 ч. Киназную реакцию останавливали при шестикратной промывке планшета раствором TBST. Антитела фосф-IкВα (Ser 32/36) разбавляли в реагенте Superblock (1:10000) и в каждую лунку добавляли по 15 мкл. Планшеты инкубировали при 4°С в течение ночи и шестикратно промывали раствором TBST. Конъюгат АР и IgG (антимышиный, козий) разбавляли в реагенте Superblock (1:1500) и в каждую лунку добавляли по 15 мкл. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч и шестикратно промывании раствором TBST. В каждую лунку добавляли по 15 мкл флуоресцентного субстрата Attophos АР (фирма Promega) и планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин. Планшеты анализировали на планшет-ридере Acquest или Analyst GТ с использованием программы для анализа интенсивности флуоресценции (возбуждение при 455 нм, излучение при 580 нм).
b-Raf (анализ в культуре клеток)
Соединения по изобретению анализировали с использованием клеток A375 по способности ингибировать фосфорилирование МЕК. Клетки линии А375 (АТСС) были получены от пациента с меланомой человека и содержали мутацию V599E в гене B-Raf. Уровень фосфорилированного МЕК повышался за счет мутации B-Raf. Субконфлюентные и конфлюэнтные клетки A375 инкубировали в присутствии соединений в течение 2 ч при 37°С в бессывороточной среде. Клетки однократно промывали холодным ФСБ и лизировали в буферном растворе для лизиса, содержащем 1% тритона X100. После центрифугирования супернатанты анализировали электрофорезом в ДДС-ПААГ и переносили на нитроцеллюлозные мембраны. Затем мембраны анализировали методом вестерн-блоттинг с использованием антител анти-фосфо-МЕК (сер. №217/221, фирма Cell Signaling). Количество фосфорилированного МЕК регистрировали по интенсивности зон фосфо-МЕК на нитроцеллюлозных мембранах.
TM
Радиоферментный анализ при связывании субстрата на фильтре с использованием набора «Upstate KinaseProfiler»
TM
32
32
2
g
2
Соединения по изобретению анализировали по их способности ингибировать активность индивидуальных членов киназной панели, включающей, без ограничения перечисленным, киназы Abl, BMX, ВТК, СНК2, c-RAF, CSK, c-SRC, Fes, FGFR3, F1t3, IKKα, IKKβ, JNK2α2, Lck, Met, MKK4, MKK6, MCST2, NEK2, p70S6K, PDGFRβ, PKA, PKBα, PKD2, Rsk1, SAPK2α, SAPK2β, SAPK3, SGK, Tie2 и/или TrkB. Соединения анализировали при двойном повторе с конечной концентрацией 10 мкМ по следующей общей методике. При этом состав киназного буферного раствора и субстраты варьируют при анализе различных киназ, включенных в набор "Upstate KinaseProfiIer". Киназный буферный раствор (2,5 мкл, 10x, содержащий при необходимости MnCl), активную киназу (0,001-0,01 ед., 2,5 мкл), специфический пептид или поли(Glu-4-Tyr) (5-500 мкМ или 0,01 мг/мл) в киназном буферном растворе и киназный буферный раствор (50 мкМ, 5 мкл) смешивали в пробирке эппендорф на ледяной бане. Затем добавляли смесь Mg/АТФ (10 мкл, 67,5 (или 33,75) мМ MCl, 450 (или 225) мкМ АТФ и 1 мкКи/мкл [γ- P]-АТФ (3000 Ки/ммоль)) и реакционную смесь инкубировали при приблизительно 30°С в течение приблизительно 10 мин. Реакционную смесь (20 мкл) наносили на квадратные кусочки бумаги Р81 (фосфоцеллюлоза, 2 см × 2 см, в случае положительно заряженного пептидного субстрата) или ватман №1 (в случае пептидного субстрата поли(Glu4-Tyr). Квадратики четырехкратно промывали (каждый раз в течение 5 мин) 0,75% фосфорной кислотой, однократно ацетоном (в течение 5 мин), переносили в сцинтилляционный флакон, добавляли 5 мл сцинтилляционной жидкости и измеряли включение фосфора Р (распл. в мин) в пептидный субстрат на счетчике Beckman. Для каждой реакции рассчитывали процент ингибирования.
50
-10
-5
Соединения формулы I, в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли проявляют ценные фармакологические свойства, например, как показано при испытаниях in vitro, описанных в тексте заявки. Например, соединения формулы I предпочтительно характеризуются величинами IC в интервале от 1×10 до 1×10 М, предпочтительно менее 500 нМ, 250 нМ, 100 нМ и 50 нМ в отношении BCR-Аb1 дикого типа и мутантных форм G250E, E255V, Т3151, F317L и М351Т. Соединения формулы I предпочтительно при концентрации 10 мкМ, предпочтительно ингибируют более 50%, предпочтительно более приблизительно 70% активности киназ Ab1, BMX, ВТК, СНК2, c-RAF, CSK, c-SRC, Fes, FGFR3, Flt3, IKKα, IKKβ, JNK2α2, Lck, Met, MKK4, MKK6, MCST2, NEK2, p70S6K, PDGFRβ, PKA, PKBα, PKD2, Rsk1, SAPK2α, SAPK2β, SAPK3, SGK, Tie2 и/или TrkB.
Например, 3-(4-метилимидазол-1-ил)-N-{4-метил-3-[1-(7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-ил)-1Н-имидазол-2-иламино]фенил}-5-трифторметилбензамид (пример 2):
50
a) характеризуется величинами IC<0,5 нМ, 56 нМ, 43 нМ, 63 нМ, <0,5 нМ и <0,5 нМ в отношении киназы дикого типа и мутантных форм G250E, E255V, Т3151, F317L и М351Т Всr-аb1 соответственно,
50
b) характеризуется величинами IС 2 нМ и 32 нМ в отношении b-RAF (по данным ферментативного анализа и анализа на клеточной культуре соответственно),
50
c) характеризуется величиной IС 4 нМ в отношении PDGFRp (анализ на клеточной культуре), и
d) при концентрации 10 мкМ ингибирует следующие киназы, как указано в скобках (в %, например, 100% означает полное ингибирование, 0% означает отсутствие ингибирования): Аb1 (99%), Всr-Аb1 (99%), BMX (99%), ВТК (99%), c-RAF (98%), CSK (97%), c-SRC (100%), Fes (71%), FGFR3 (89%), Lck (99%), МКК6 (99%), p70S6K (86%), PDGFRβ (83%), Rsk1 (88%), SAPK2α (97%), Tie2 (99%)и TrkB(100%).
50
Например, N-[4-(4-этилпипepазин-l-илмeтил)-3-тpифтopмeтилфeнил]-3-мeтокси-5-[l-(7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-ил)-1H-имидазол-2-иламино]бензамид (соединение 9 в таблице 1) характеризуется величинами IС4 нМ и 40 нМ в отношении FGFR3 (по данным ферментативного анализа и анализа на клеточной культуре соответственно).
Подразумевается, что примеры и варианты осуществления изобретения приводятся для иллюстрации, а их различные модификации или изменения будут предложены специалистом в данной области в пределах сущности и объема указанной заявки и прилагаемых пунктов формулы изобретения. Все публикации, патенты и заявки, цитированные в описании, включены в описание в качестве ссылки в полном объеме.