Способ дифференциальной диагностики начальной меланомы цилиохориоидальной локализации и хронического иридоциклита
METHOD FOR DIFFERENTIAL DIAGNOSIS OF INITIAL MELANOMA OF CILIOCHOROIDAL LOCALIZATION AND CHRONIC IRIDOCYCLITIS

Изобретение относится к медицине, а именно, к офтальмологии и предназначено для проведения дифференциальной диагностики начальной меланомы цилиохориоидальной локализации и хронического иридоциклита.
Увеальная меланома (УМ) - злокачественная опухоль сосудистой оболочки с доказанным метастатическим потенциалом и разнонаправленными иммунными сдвигами [Char D.H., Christiansen М., Stein P. Immunology of melanoma. Jap. J. Ophthalmol. 1978; 22(3): 396-400., Бровкина А.Ф., Панова И.E., Саакян С.В. Офтальмоонкология: новое за последние два десятилетия. Вестник офтальмологии. 2014; 130(6): 13-19]. Около 90% опухолей локализуется в хориоидее, 6% - в цилиарном теле, 4% - в радужке [Shields C.L., Kaliki S., Furuta M. et al. Clinical spectrum and prognosis of uveal melanoma based on age at presentation in 8,033 cases. Retina. 2012; 32(7): 1363-1372].
Хронический иридоциклит - воспалительное заболевание радужки и цилиарного тела, протекающее со слабовыраженной симптоматикой, часто без выраженного болевого синдрома и заметной перикорнеальной инъекцией [Кацнельсон Л.А., Танковский В.Э. Увеиты (клиника, лечение). М.: 4-й филиал Воениздата; 1998.]. Среди факторов, способствующих развитию заболевания, выделяют два основных - инфекционный фактор и снижение местной резистентности [Копаева В.Г. Глазные болезни. М.: Медицина, 2002. С. 200-244].
Далеко не всегда удается провести дифференциальную диагностику опухолевого и хронического воспалительного процесса [Bhagat S., Ramaesh K., Wharton S.B., Dhillon В. Spontaneous acute scleritis and scleral necrosis in choroidal malignant melanoma. Eye. 1999; 13: 793-795. doi: 10.1038/eye.1999.233] на основании только клинической картины и данных инструментальных методов обследования.
Полиморфизм клинической картины с возможным сочетанием микст-инфекции, очаговой, гранулематозной формы хронического иридоциклита обуславливает сходство его с УМ, что составляет проблему дифференциальной диагностики этих двух заболеваний [Катаргина Л.А., Хватова А.В. Эндогенные увеиты у детей и подростков. М.: Медицина; 2000.69-75, Lodhi S.A., Saifuddin K., Devulapally S. Inflammatory choroidal neovascular membrane after healed tuberculous choroidal granuloma. GMS Ophthalmol Cases. 2017; 7: Doc06. doi: 10.3205/oc000057.]. По данным Ocular Oncology Service из 400 больных, обратившихся с диагнозом увеальная меланома, в 6 (1,5%) случаях выявлен склерит [Shields J.A., Augsburger J.J., Brown G.C., Stephens R.F. The differential diagnosis of posterior uveal melanoma. Ophthalmology. 1980; 87(6): 518-22.].
Анализ инфекционного статуса, являющегося диагностическим методом выбора воспалительных заболеваний глазного дна в активной стадии может в ряде случаев помочь в установлении этиологии заболевания. Однако верификация этиологического фактора при хронических воспалительных процессах сосудистой оболочки глаза затруднена в связи с невозможностью во всех случаях выявления активации инфекционных агентов [Baumal C.R., Levin A.V., Read S.E. Cytomegalovirus retinitis in immunosuppressed children. Am. J. Ophthalmol. 1999; 127(5): P. 550-8. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/S0002-9394(99)00031-8].
Возникновение, рост новообразований напрямую или опосредованно связан с иммунным дисбалансом в организме [Oliva М., Rullan A.J., Piulats J.M. Uveal melanoma as a target for immune-therapy. Ann Transl Med 2016; 4(9): 172. doi: 10.21037/atm.2016.05.04., Niederkorn J.Y. Immune escape mechanisms of intraocular tumors. Prog Retin Eye Res 2009; 28: 329-47].
Как установлено в последние годы, помимо адаптивного иммунитета (индукции, пролиферации эффекторных и регуляторных антигенспецифичных Т-клеток) важную роль в противоопухолевой защите играет звено неспецифической (врожденный иммунитет) системы иммунной защиты, реализуемое главным образом, посредством NK-лимфоцитов (от англ. natural killers - натуральные убийцы) [Bronkhorst IH, Vu ТН, Jordanova ES, et al. Different subsets of tumor-infiltrating lymphocytes correlate with macrophage influx and monosomy 3 in uveal melanoma. Invest Ophthalmol Vis Sci 2012; 53: 5370-8., Whelchel J.C., Farah S.E., Mc Lean I.W., et al. Immunohistochemistry of infiltrating lymphocytes in uveal malignant melanoma. Invest Ophthalmol Vis Sci 1993; 34: 2603-6.].
NK-клетки - большие гранулярные лимфоциты, обладающие цитотоксичностью против опухолевых клеток и клеток, зараженных вирусами. NK-лимфоциты не проходят дифференцировку в тимусе, они выходят из костного мозга в кровь и затем мигрируют в ткани, где осуществляют «иммунный надзор», проявляя естественную цитотоксичность, которая особенно важна для защиты организма от вирусов и опухолей [Immunobiology 7 РВ (Janeway's Immunobiology) Garland Science; 7 edition 2007].
Натуральные киллеры не имеют рецепторов Т- и В-лимфоцитов, и обычно несут своей поверхности молекулы CD16 и CD56, которые используются в настоящее время в качестве их основных маркеров [William S. Natural Killer Cells and Natural Killer T Cells. Arthritis & Rheumatism. 2000. 43, 6: 1204-1217.].
Основная функция NK-лимфоцитов - уничтожение клеток организма, не несущих на своей поверхности молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС) и, таким образом, недоступных для действия основного компонента противовирусного иммунитета - Т-киллеров. Уменьшение количества белков МНС на поверхности клетки может быть следствием трансформации клетки в опухолевую или действия вирусов, таких как: папилломавирус и ВИЧ [Roitt I., Brostoff J., Male D. Immunology 6th ed., St. Louis: Mosby. 2001: 480].
Изменение количества циркулирующих NK-клеток вплоть до отсутствия и снижения их функциональной активности, часто связаны с острой и хронической вирусной инфекцией, аутоиммунными заболеваниями, онкопатологией, иммунодефицитными и психическими синдромами [Caligiuri М. Human natural killer cells. / Blood. 2008; 112: 461-469].
Благодаря способности распознавать измененные собственные клетки организма натуральные киллеры играют одну из ключевых ролей в осуществлении противоопухолевого надзора [Mistry A.R.,  С.А. Regulation of ligands for the activating receptor nkg2d. Immunology. 2007; 121(4): 439-47. doi: 10.1111/j.1365-2567.2007.02652.x.].
Известны способы дифференциальной диагностики меланомы сосудистой оболочки на ранних стадиях ее развития и других заболеваний той же локализации (RU 2303951 «Способ дифференциальной диагностики начальной меланомы и прогрессирующего невуса хориоидеи парамакулярной локализации» и RU 2622380 «Способ дифференциальной диагностики начальной увеальной меланомы и отграниченной гемангиомы хориоидеи с помощью оптической когерентной томографии-ангиографии»). Эти способы показывают морфометрические и васкулярные изменения области патологического процесса. Однако при периферической локализации эти исследования провести невозможно. В этой связи встал вопрос о поиске альтернативных способов дифференциальной диагностики начальной стадии меланомы сосудистой оболочки периферической локализации.
Задачей настоящего изобретения является разработка способа дифференциальной диагностики начальной меланомы цилиохориоидальной локализации и хронического иридоциклита на основе эхографического измерения цилиохориоидальной области и определения относительного количества NK-клеток - натуральных киллеров (фенотип CD16+CD56+) в периферической крови.
Техническим результатом предлагаемого способа является выбор своевременного, адекватного лечения меланомы цилиохориоидальной локализации и хронического иридоциклита.
Технический результат достигается за счет подсчета относительного количества натуральных киллеров CD16+CD56+ в периферической крови и эхографического измерения цилиохориоидальной области при начальной меланоме цилиохориоидальной локализации и хроническом иридоциклите.
Обследовано 35 пациентов с начальной меланомой цилиохориоидальной локализацией (17 женщин и 13 мужчин; средний возраст 53,7±12,2 года) и 38 больных (18 женщин и 20 мужчин; средний возраст 48,9±11,4 года) с хроническим иридоциклитом. Стадию УМ определяли по проминенции и диаметру основания с помощью эхографического исследования.
Относительное число натуральных киллеров (CD16+ CD56+) крови при начальной меланоме цилиохориоидальной локализации оказалось достоверно выше 16,5%, p<0,05 по сравнению с таковым у здоровых доноров. Эхографически отмечали локальное утолщение цилиохориоидальной области от 1 мм и более.
При хроническом иридоциклите обнаружено, наоборот, снижение относительного содержания натуральных киллеров (CD16+ CD56+) ниже 8,2%, p<0,05. Эхографически отмечали локальное утолщении цилиохориоидальной области менее 1 мм.
Целым рядом лабораторных специалистов принят термин формирования «серой зоны» патологического процесса, то есть состояния, при котором нельзя подтвердить или опровергнуть его наличие [Черешнев В.А., Гусев Е.Ю. Иммунологические и патофизиологические механизмы системного воспаления. Медицинская иммунология. 2012; 14(1-2): 9-20.]. Кроме того, существует мнение, что «серая зона» - это диапазон, в который с равной вероятностью могут попадать как положительные, так и отрицательные значения показателей определяемого аналита [Иммунохимический анализ в КДЛ. Под ред. Долгова В.В., Триада, М., 2015; Лабораторная диагностика инфекционных болезней. Справочник. БИНОМ, М., 2014.].
У всех пациентов с опухолью нами отмечено повышение уровня иммунных НК-клеток CD16+ CD56+ выше 16,5%, а при воспалении - ниже 8,2%. Промежуточный цифровой диапазон между этими двумя значениями не выявлялся у обследуемых пациентов; в том случае, если показатели больных определяются в этом пределе, их следует отнести к «серой зоне», то есть неопределенному результату, не позволяющему установить какой-либо диагноз.
Способ осуществляют следующим образом.
У пациента с неподтвержденным диагнозом определяют величину локального эхографического утолщения цилиохориоидальной области и относительное число натуральных киллеров CD16+CD56+ в периферической крови. При величине локального эхографического утолщения цилиохориоидальной области на величину 1 мм и более, относительном числе натуральных киллеров CD16+CD56+ более 16% устанавливают диагноз начальной меланомы цилиохориоидальной локализации. Локальном эхографическом утолщении цилиохориоидальной области величиной менее 1 мм, относительном числе натуральных киллеров CD16+CD56+ менее 8,2% - хронический иридоциклит.
Материалом исследования иммунологических показателей служили пробы цельной крови, взятой из локтевой вены натощак в утренние часы (с 9.00-10.00 ч) при помощи вакуумных систем в пробирки Vacuette с антикоагулянтом К3EDTA. Иммунофенотипирование проводили методом проточной лазерной цитофлуориметрии с использованием системы моноклональных антител Multitest 6-Color TBNK Reagent в пробирках BD Tru Count (Becton Dickinson, США), цитометре BD FACSCanto II (Becton Dickinson, США).
Лизис эритроцитов и фиксацию лейкоцитов производили с помощью лизирующего раствора BD FACS ТМ Lysing Solution (Becton Dickinson, США). Относительное содержание популяций и субпопуляций лимфоцитов определяли в программе Canto (Becton Dickinson, США), с выделением анализируемого региона по общей популяции, экспрессирующей CD45+ антиген и по гранулярности клеток (CD45+PerCP-Cy5,5*/SSC); использовались меченые флуорохромами антитела к CD16+/56+(PE),, позволяющие дифференцировать NK-клетки (CD16+CD56+).
Эхографически отмечали локальное утолщение цилиохориоидальной области от 1 и более мм при начальной меланоме цилиохориоидальной локализации и менее 1 мм при хроническом иридоциклите. Относительное число натуральных киллеров CD16+ CD56+ крови при начальной меланоме цилиохориоидальной локализации достоверно повышалось более 16%, при хроническом иридоциклите обнаружено их снижение менее 8,2%, что позволяло провести дифференциальную диагностику. После этого решали вопрос о тактике лечения пациентов.
Пример 1. Пациент У., 46 лет обратился с жалобами на периодическое покраснение правого глаза.
Проведенные офтальмологические исследования:
Тонометрия: ВГД OD - 17 мм. рт. ст., OS - 17 мм. рт. ст.
Биомикроскопия: OD - локальная смешанная инъекция сосудов конъюнктивы по меридианам с 7 до 10 часов, распространяющаяся от лимба, отделяемого нет. Расширение эписклеральных сосудов по меридианам с 7 до 10 часов. Роговица - отек периферических отделов по меридианам с 7 до 10 часов. Передняя камера средней глубины, влага прозрачна. Радужка - стушеванность контура крипт по меридианам с 7 до 10 часов. Зрачок округлой формы, реакция зрачка на свет живая, пигментная кайма сохранена. Хрусталик - помутнение под задней капсулой. Стекловидное тело - нитчатая деструкция.
Прямая офтальмоскопия (осмотр с трехзеркальной линзой Гольдмана):
На глазном дне - ДЗН бледно-розовый, границы четкие. В макулярной зоне рефлекс четкий. На крайней периферии по меридианам с 7 до 10 часов определяется сероватый фокус с неровными, нечеткими границами, неровной поверхностью.
OS - конъюнктива спокойна. Роговица - прозрачная. Передняя камера средней глубины, влага прозрачна. Радужка - структурна. Зрачок округлой формы, реакция зрачка на свет живая, пигментная кайма сохранена. Хрусталик - помутнение под задней капсулой. Стекловидное тело - нитчатая деструкция.
Прямая офтальмоскопия (осмотр с трехзеркальной линзой Гольдмана):
На глазном дне - ДЗН бледно-розовый, границы четкие. В макулярной зоне рефлекс четкий. На периферии без очаговой патологии.
Ультразвуковая биомикроскопия:
OD - проминирующий фокус 0,9 мм,
OS - «+» - ткань не определяется.
Взята цельная кровь из локтевой вены натощак в утренние часы (с 9.00-10.00 ч) при помощи вакуумных систем в пробирки Vacuette с антикоагулянтом К3EDTA. Иммунофенотипирование проведено методом проточной лазерной цитофлуориметрии на цитометре BD FACSCanto II (Becton Dickinson, США) с использованием системы моноклональных антител Multitest 6-Color TBNK Reagent в пробирках BD TruCount (Becton Dickinson, США). Лизис эритроцитов и фиксацию лейкоцитов осуществлялись с помощью лизирующего раствора BD FACSTM Lysing Solution (Becton Dickinson, США).
В периферической крови обнаружено пониженное относительное количество натуральных киллеров CD16+CD56+ - 7,2%, что в совокупности с эхографическими данными свидетельствовало о хроническом иридоциклите.
Проведено комплексное противовоспалительное лечение.
В течение регулярного наблюдения 1 раз в 3 месяца в течение 2 лет у пациента не отмечалось отрицательной динамики в виде эхографического увеличения размеров проминирующего очага на глазном дне, относительное содержание в периферической крови натуральных киллеров CD16+CD56+ - оставалось 7,2%, что свидетельствовало о хроническом течении иридоциклита и отсутствии опухоли. Это подтверждает правильность диагноза на основе эхографического исследования и подсчета относительного содержания в периферической крови натуральных киллеров CD16+CD56+.
Пример 2. Пациент М., 42 года обратился с жалобами на периодическое покраснение левого глаза.
Проведенные офтальмологические исследования:
Тонометрия: ВГД OD - 18 мм. рт. ст., OS - 18 мм. рт. ст.
Биомикроскопия: OS - локальная смешанная инъекция сосудов конъюнктивы по меридианам с 4 до 6 часов, распространяющаяся от лимба, отделяемого нет. Расширение эписклеральных сосудов по меридианам с 4 до 6 часов. Роговица - отек периферических отделов по меридианам с 4 до 6 часов. Передняя камера средней глубины, влага прозрачна. Радужка - стушеванность контура крипт по меридианам с 4 до 6 часов. Зрачок округлой формы, реакция зрачка на свет живая, пигментная кайма сохранена. Хрусталик - помутнение под задней капсулой. Стекловидное тело - нитчатая деструкция.
Прямая офтальмоскопия (осмотр с трехзеркальной линзой Гольдмана):
На глазном дне - ДЗН бледно-розовый, границы четкие. В макулярной зоне рефлекс четкий. На крайней периферии по меридианам с 4 до 6 часов определяется сероватый фокус с неровными, нечеткими границами, неровной поверхностью.
OD - конъюнктива спокойна. Роговица - прозрачная. Передняя камера средней глубины, влага прозрачна. Радужка - структурна. Зрачок округлой формы, реакция зрачка на свет живая, пигментная кайма сохранена. Хрусталик - помутнение под задней капсулой. Стекловидное тело - нитчатая деструкция.
Прямая офтальмоскопия (осмотр с трехзеркальной линзой Гольдмана):
На глазном дне - ДЗН бледно-розовый, границы четкие. В макулярной зоне рефлекс четкий. На периферии без очаговой патологии.
Ультразвуковая биомикроскопия:
OS - проминирующий фокус 1,4 мм,
OD - «+» - ткань не определяется.
Взята цельная кровь из локтевой вены натощак в утренние часы (с 9.00-10.00 ч) при помощи вакуумных систем в пробирки Vacuette с антикоагулянтом К3EDTA. Иммунофенотипирование проводили методом проточной лазерной цитофлуориметрии на цитометре BD FACSCanto II (Becton Dickinson, США) с использованием системы моноклональных антител Multitest 6-Color TBNK Reagent в пробирках BD TruCount (Becton Dickinson, США). Лизис эритроцитов и фиксацию лейкоцитов производили с помощью лизирующего раствора BD FACSTM Lysing Solution (Becton Dickinson, США). Относительное и абсолютное содержание популяций и субпопуляций лимфоцитов определяли в программе Canto (Becton Dickinson, США).
В периферической крови обнаружено повышенное относительное количество натуральных киллеров CD16+CD56+ - 19,0% что в совокупности с эхографическими данными свидетельствовало о начальной меланоме хориоидеи.
Проведена брахитерапия.
В течение регулярного наблюдения 1 раз в 3 месяца в течение 2 лет у пациента отмечалось уменьшение эхографических размеров проминирующего очага с формированием хориоретинального рубца, относительное содержание в периферической крови натуральных киллеров CD16+CD56+ - составило 10,1%, что свидетельствовало о разрушении опухоли. Это подтверждает правильность диагноза на основе эхографического исследования и подсчета относительного содержания в периферической крови натуральных киллеров CD16+CD56+.
Таким образом, способ позволяет провести дифференциальную диагностику начальной меланомы цилиохориоидальной локализации и хронического иридоциклита с целью планирования адекватного лечения.