ВЫБОР АГЕНТОВ, МОДУЛИРУЮЩИХ ГАСТРОИНТЕСТИНАЛЬНУЮ БОЛЬ
SELECTING AGENTS MODULATING GASTROINTESTINAL PAIN

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение в первую очередь относится к модулированию гастроинтестинальной боли и в частности к выбору агентов, таких как молочнокислые бактерии, способных модулировать гастроинтестинальную боль, и к применению данных агентов.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Гастроинтестинальная боль является симптомом многих патологических состояний, заболеваний и расстройств, связанных с желудочно-кишечным трактом. Функциональная абдоминальная боль относится к рецидивирующей абдоминальной боли. У подавляющего большинства пациентов с рецидивирующей абдоминальной болью имеет место «функциональная» или «неорганическая» боль, что означает, что боль не вызвана соматическими нарушениями. Ряд расстройств моторики также связаны с болью и запором или поносом. Термин применяют для описания ряда расстройств, при которых кишка не развивалась правильно или потеряла свою способность координировать мышечную активность вследствие ряда причин.
Данные расстройства могут проявляться различными путями и включают, но без ограничения, следующее:
Вздутие живота
Рецидивирующую непроходимость
Абдоминальную колику
Запор
Гастроэзофагеальную рефлюксную болезнь
Некупируемую, рецидивирующую рвоту
Понос
Синдром раздраженной кишки (IBS)
Воспалительное заболевание кишечника
Недержание кала
Колику грудного ребенка
Частую рецидивирующую абдоминальную боль (FRAP)
Срыгивание
Непереносимость пищевых продуктов
В широком смысле, любое значительное изменение в пассаже пищи и секреции в пищеварительный тракт может подразумевать нарушение моторики кишечника и представляет собой тип расстройств, часто связанное с гастроинтестинальной болью.
Собственные координированные движения желудка и кишечника необходимы, чтобы переваривать и продвигать кишечное содержимое по пищеварительному тракту. Модели сокращения и расслабления, необходимых для правильной моторики желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), являются сложными и задействуют нервы и мускулатуру стенок ЖКТ. Ежедневно в любое время на моторику ЖКТ может воздействовать множество факторов, например, физические упражнения и эмоциональный дистресс. У новорожденных детей в ЖКТ должна развиваться сложная система моторики. Нарушение функции желудочно-кишечной моторики часто связано с гастроинтестинальной болью.
Старение, деменция, инсульт, болезнь Паркинсона, повреждения спинного мозга, разрывы стенок прямой кишки в родах, диабет, хирургические осложнения и нейромышечные расстройства, например, тяжелая псевдопаралитическая миастения, могут вызвать расстройства моторики, связанные с болью.
Синдром раздраженной кишки (IBS), наиболее часто диагностируемое расстройство моторики кишечника и гастроинтестинальной боли, подразумевает заболевание толстой кишки в течение десятилетий, но исследование моторики ЖКТ продемонстрировало, что лежащие в основе нарушения моторики могут также возникать в тонкой кишке. IBS часто может сопровождаться гастроинтестинальной болью, и было показано, что иммунореактивность TRPV1 у пациентов IBS значительно повышена (Akbar, Yiangou et al, Gut 2008).
Запор, часто связанный с гастроинтестинальной болью, является наиболее распространенной жалобой со стороны пищеварительного тракта в Соединенных Штатах, но несмотря на свою частоту, часто остается нераспознанным до тех пор, пока у пациента не разовьются вторичные нарушения, такие как аноректальные расстройства или дивертикулярная болезнь. Как отмечалось выше, гастроинтестинальная боль является частым симптомом запора.
Запор является довольно распространенным явлением во время беременности. Мышечные сокращения, которые в норме перемещают пищу по кишечнику, замедляются из-за более высоких уровней гормона прогестерона и, возможно, избыточного железа, принимаемого в виде витаминов для беременных. Это часто также сопровождается абдоминальной болью в нижних отделах живота.
Запор также связан со старшим возрастом, и так называемый «стареющий кишечник» часто обнаруживают у людей преимущественно старше 70 лет и в учреждениях постоянного ухода.
На другом конце спектра возрастных расстройств моторики кишечника постоянный или чрезмерный плач от колики грудного ребенка является одной из самых мучительных проблем грудного возраста. Это является мучительным для младенца, для родителей и задействует работников здравоохранения. Колика часто начинается и заканчивается внезапно.
Гипермоторика кишечника на фоне предполагаемого нарушения вегетативной регуляции предложена в качестве одной из этиологий колики. Многие из механизмов, которые регулируют моторику, у детей грудного возраста являются незрелыми. Незрелость данных механизмов может приводить к повышенной чувствительности к непереносимости пищи. Таким образом, колика может представлять собой основное клиническое проявление в субпопуляции детей грудного возраста, у которых нарушена функция созревания в одном или более аспектов регуляции моторики и часто приводящее к гастроинтестинальной боли у младенца.
Расстройства моторики кишечника накладываются на патологические сокращения кишечника, часто связанные с гастроинтестинальной болью, существует много различных видов лечения и рекомендаций для различных расстройств, некоторые из которых работают лучше, чем многие другие.
Таким образом, существует всеобщая потребность в разрешении конкретных проблем относительно ряда расстройств моторики, а именно болевых расстройств; Как наилучшим образом подобрать агенты для предотвращения или уменьшения гастроинтестинальной боли?
2+
Транзиторный рецепторный потенциал по ванилоиду 1 (TRPV1) представляет собой проницаемый для Ca катионный канал, экспрессируемый, например, в периферической нервной системе (ПНС), центральной нервной системе (ЦНС), дыхательной системе и желудочно-кишечном тракте. TRPV1 активируется физическими и химическими стимулами, например, температурой, изменением pH и капсаицином, и играет важнейшую роль в распознавании ноцицептивной и термической воспалительной боли. В желудочно-кишечном тракте иммунореактивность к TRPV1 может, например, обнаружена в висцеральных чувствительных афферентах, и TRPV1-клетки передают, например, ощущение боли в желудке в более высоко расположенные центры головного мозга. Как предполагается, TRPV1 задействован при некоторых патологических состояниях желудочно-кишечного тракта, которые связаны с болевыми ощущениями, и было показано, что иммунореактивность к TRPV1 значительно повышена, например, при IBS (Akbar, Yiangou et al, Gut 2008). В качестве примера этого, пациенты с диагностированным активным воспалительным заболеванием кишечника демонстрируют значительно повышенную иммунореактивность к TRPV1 в нервных волокнах толстой кишки (Wang, Miyares and Ahern, 2005 J. Physiol.).
Несмотря на предположение, что TRPV1 является потенциальной мишенью для разработки лекарственных препаратов для лечения различных модальностей боли, повсеместная экспрессия рецептора может приводить к нежелательным явлениям, ограничивающим применение системных антагонистов TRPV1 в лечении гастроинтестинальной боли. В частности, в результате пониженного высвобождения вазоактивного пептида придание рецептору свойств антагониста потенциально может приводить к сердечно-сосудистым осложнениям.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Общей задачей является нахождение агентов, пригодных для уменьшения или предотвращения гастроинтестинальной боли.
Конкретная задача состоит в предоставлении способа для выбора агентов, предпочтительно штаммов бактерий и, более предпочтительно, молочнокислых бактерий, эффективных в уменьшении или предотвращении гастроинтестинальной боли.
Данные и другие цели достигаются вариантами осуществления, как раскрыто в данной заявке.
Аспект вариантов осуществления относится к способу для выбора агента, эффективного в уменьшении или предотвращении гастроинтестинальной боли у человека. Способ включает выбор агента, способного уменьшать спонтанную и/или индуцированную активацию транзиторного рецепторного потенциала по ванилоиду 1 (TRPV1).
Другой аспект вариантов осуществления относится к агенту, выбранному посредством определенного выше способа.
Дополнительный аспект вариантов осуществления относится к агенту, получаемому посредством определенного выше способа выбора для применения с целью уменьшения или предотвращения гастроинтестинальной боли у человека.
Дополнительный аспект вариантов осуществления относится к композиции, содержащей агент, получаемый посредством определенного выше способа выбора, и по меньшей мере один дополнительный компонент, выбранный из группы, состоящей из фармацевтически приемлемого носителя, фармацевтически приемлемого разбавителя, фармацевтически приемлемого эксципиента, пищевого продукта, биологически активной пищевой добавки и другого превентивного или терапевтического агента.
Родственный аспект вариантов осуществления определяет агент, по определению выше, или композицию, по определению выше, для применения с целью уменьшения или предотвращения гастроинтестинальной боли у человека.
Другой родственный аспект вариантов осуществления определяет применение агента, получаемого посредством определенного выше или по определению выше способа выбора, или композиции, по определению выше, для изготовления лекарственного средства, пищевого продукта или биологически активной пищевой добавки для уменьшения или предотвращения гастроинтестинальной боли у человека.
Дополнительный аспект вариантов осуществления относится к способу уменьшения или предотвращения гастроинтестинальной боли у человека. Способ включает введение эффективного количества агента, получаемого посредством определенного выше способа выбора или по определению выше, или композиции, по определению выше, человеку.
Настоящие варианты осуществления предоставляют эффективную методику, которую можно применять для выбора или идентификации агентов, в частности штаммов бактерий, таких как молочнокислые бактерии, которые можно применять для уменьшения или предотвращения гастроинтестинальной боли у больных, предпочтительно у больных людей, страдающих от расстройства или заболевания, вызванного или связанного с гастроинтестинальной болью.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Варианты осуществления, вместе с его дополнительными целями и преимуществами, могут быть лучше всего понятны посредством ссылки на следующее описание, взятое вместе с сопровождающими фигурами, на которых:
8
9
9
Фигура 1 показывает спонтанную активацию брыжеечных множественных нейронов после добавления 1×10 единиц (КОЕ)/мл DSM 17938 (A), 1×10 КОЕ/мл DSM 17938 (B), разведенной (1:5) кондиционированной среды DSM 17938 (C), 1×10 КОЕ/мл γ-облученного DSM 17938 (D) и только разведенной среды (1:5) (E) (Критерии Уилкоксона).
9
Фигура 2 показывает действие DSM 17938 на частоту спонтанной активации спинномозговых афферентов. A) Частота активации множественных нейронов снизилась, когда в просвет добавили 1×10 КОЕ/мл DSM 17938 (Критерий Уилкоксона). B) Левая панель, активация спинномозговых одиночных нейронов уменьшалась посредством DSM 17938 (Критерий Уилкоксона). C) Верхние панели, типичные следы спонтанного разряда множественных нейронов до и после добавления DSM 17938; нижние панели, наложенные формы волн одного единственного нейрона, которые возникали во время, обозначенное «o» в верхних следах.
50
50
50
9
9
P
P
n
Фигура 3 показывает, что DSM 17938 противодействует возбудительному ответу спинномозговых волокон посредством добавления капсаицина к серозному суперфузату. A) Кривая зависимости «доза-эффект» капсаицина у 113 спинномозговых отдельных одиночных нейронов нанесена на график () и сопровождена трехпараметрическим логистическим уравнением, EC=200 нМ. Max=238±27%; при этом на график дополнительно нанесли дополнительную кривую зависимости «доза-эффект» 116 волокон для капсаицина в присутствии 1×10 КОЕ/мл DSM 17938 (), и сопроводили таким же логистическим уравнением, для которого EC=500 нМ и Max=129±17% (=0,7 и =0,004 для различий между EC и Max соответственно, F-критерий по дополнительной сумме квадратов). B) Суммарные диаграммы разброса со средними и стандартными ошибками средних значений, показывающие, как ответы одиночных нейронов менялись с растущими дозами капсаицина при отсутствии или наличии 1×10 КОЕ/мл DSM. () обозначает соотношение одиночных нейронов для каждой группы.
9
Фигура 4 показывает, что DSM 17938 или антагонист TRPV1 уменьшает индуцируемый растяжением возбудительный ответ в спинномозговых одиночных нейронах. A) Графики рассеяния, показывающие, что добавление 1×10 DSM 17938 в просвет уменьшает повышение частоты активации спинномозговых одиночных нейронов, спровоцированное растущим внутрипросветным давлением до 48 гПа. B) Добавление 10 мкм антагониста TRPV1 6-иодонордигидрокапсаицина в просвет имитирует действие добавления DSM 17938 (Критерии Уилкоксона).
2+
2+
9
2+
2+
0
0
P
Фигура 5 показывает, что DSM 17938 уменьшает индуцируемый капсаицином подъем Ca в соматических нейронах задних корешков спинного мозга. A) 1 мкм капсаицина вызывал повышение поступления Ca в нейронах DRG, которое дозозависимо снижалось под действием внутрипросветного DSM 17938 и не изменялось под действием 1×10 КОЕ/мл JB-1. B) Сводный график, показывающий, как соотношение (F/F) максимальной Ca флуоресценции (F), вызванной капсаицином, к исходной Ca флуоресценции (F) меняется в зависимости от концентрации DSM 17938 или JB-1. (Значения, критерий множественного сравнения Бонферрони).
P
P
Фигура 6 показывает, что на 9 день кормления DSM 17938 уменьшалась брадикардия, вызванная растяжением желудка. A) Итоговые значения для процентного снижения частоты сердечных сокращений в покое, вызванного растяжением желудка 40 и 60 мм рт. ст. (Значения, критерий Стьюдента для одной выборки). B) Сводные графики, показывающие, как частота сердечных сокращений в покое изменяется с течением времени в ответ на растяжение желудка 60 мм рт. ст. (=0,01, двухфакторный дисперсионный анализ).
9
Фигура 7 показывает, что кондиционированная среда DSM 17938 имитировала DSM 17938, индуцируя снижение возбуждающего действия капсаицина на спинномозговые афференты. Сводный график, показывающий увеличение частоты активации одиночных нейронов спинномозговых волокон, индуцируемой 1 мкм капсаицина в контрольных условиях, с кондиционированной средой DSM 17938 (1:5) или с 1×10 КОЕ/мл DSM 17938 (P=0,02, однофакторный дисперсионный анализ; апостериорные значения P, критерий множественного сравнения Хольма-Сидака).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Для облегчения понимания изобретения ниже определен ряд терминов.
«Гастроинтестинальная боль», также именуемая желудочно-кишечной болью, обозначает боль в желудочно-кишечном тракте больного. Данная гастроинтестинальная боль часто вызвана или связана, т.е. является симптомом или болезненным компонентом ряда заболеваний и расстройств, как правило, желудочно-кишечного тракта. Гастроинтестинальная боль включает генерализованную боль в желудочно-кишечном тракте, часто обозначающую генерализованную гастроинтестинальную боль в данной области, боль, связанную с расстройствами моторики кишечника, боль в результате воспалительных заболеваний кишечника и синдрома раздраженной кишки, боль в желудке, генерализованную абдоминальную боль, висцеральную боль, функциональную абдоминальную боль, частую рецидивирующую абдоминальную боль и боль при других функциональных желудочно-кишечных расстройствах.
«Функциональная абдоминальная боль» относится к рецидивирующей абдоминальной боли. Подавляющее большинство пациентов с рецидивирующей абдоминальной болью имеют «функциональную» или «неорганическую» боль, означающую, что боль не вызвана физическими нарушениями.
«Расстройства моторики кишечника» применяют для описания ряда расстройств, при которых кишка не развивалась правильно или потеряла свою способность координировать мышечную активность вследствие ряда причин. Данные расстройства могут проявляться различными путями, и включают, но без ограничения, следующее:
• Вздутие живота
• Рецидивирующую непроходимость
• Абдоминальную колику
• Запор
• Гастроэзофагеальную рефлюксную болезнь
• Некупируемую, рецидивирующую рвоту
• Понос
• Синдром раздраженной кишки (IBS)
• Воспалительное заболевание кишечника
• Недержание кала
• Колику грудного ребенка
• Частую рецидивирующую абдоминальную боль (FRAP)
• Срыгивание
• Непереносимость пищевых продуктов
В широком смысле, любое значительное изменение в пассаже пищи и секреции в пищеварительный тракт может подразумевать нарушение моторики кишечника и представляет собой тип расстройств, часто связанное с гастроинтестинальной болью.
«Боль в желудке» представляет собой собирательный термин, применяемый для описания боли или дискомфорта в верхних отделах живота.
В варианте осуществления причина боли в желудке выбрана из группы, включающей, например, состоящей из, неязвенной диспепсии, пептической язвы, гастроэзофагеальной рефлюксной болезни и гастрита.
В конкретном варианте осуществления причиной боли в желудке является неязвенная диспепсия и/или гастрит.
Как используется в данной заявке, термин «частота активации» применяют для измерения последовательностей сенсорных спайков в головной мозг.
Как используется в данной заявке, термин «внутрипросветное пиковое давление» (PPr) основывается на регистрации внутрипросветного давления, где изменения внутрипросветного давления измеряют в срединной точке продольной оси сегмента кишки. Сигнал давления анализируют, и внутрипросветное пиковое давление (PPr) идентифицируют и измеряют.
Как используется в данной заявке, термин «частота мигрирующего моторного комплекса» (частота MMC) рассчитывается путем подсчета количества темных полос MC на пространственно-временных картах.
Как используется в данной заявке, термин «скорость мигрирующего моторного комплекса» (скорость MMC) измеряется из наклона (наклонов) каждой полосы на пространственно-временной карте, генерируемой мигрирующими моторными комплексами.
Как используется в данной заявке, термин «агент» применяют для обозначения любого вещества или материала, включая цельные клетки; микроорганизмы; кондиционированную среду; белки, пептиды, ферменты и/или молекулы, получаемые из данной кондиционированной среды; белков, пептидов, ферментов и/или молекул, секретируемых или получаемых из цельных клеток или микроорганизмов; или другого биологического или химического материала, который можно применять для модулирования гастроинтестинальной боли в желудочно-кишечном тракте млекопитающего. Примером предпочтительных агентов являются штаммы бактерий, например, штаммы пробиотических бактерий, и в частности штаммы молочнокислых бактерий. Другим примером предпочтительного агента является кондиционированная среда из штаммов бактерий, например, штаммов пробиотических бактерий, и в частности штаммов молочнокислых бактерий.
Кондиционированная среда, иногда также именуемая кондиционированная питательная среда, представляет собой (питательную) среду, в которой клетки культивируют в течение периода времени. Клетки, культивируемые в среде, «кондиционируют» среду посредством высвобождения или выработки ряда компонентов или молекул, таких как белки, пептиды, ферменты, цитокины, хемокины, химические вещества, и т.д.
Начинают признавать, что кишечные микроорганизмы посылают сигналы в головной мозг в качестве части так называемой оси микробиота-кишечник-мозг. Однако известно очень мало о роли кишечной микробиоты в развитии и функционировании нервной системы. В настоящее время лишь очень немного известно о количественном характере нервного сигнала, передаваемого от кишечника к центральной нервной системе.
Одиночные чувствительные нейроны, включая таковые среди волокон блуждающего нерва, ретранслируют непрерывные физические стимулы в виде упорядоченной последовательности спайков, которые кодируют природу и интенсивность стимула. В дополнение к этому, стимулы могут быть представлены в коде популяции, определяемом количеством активных волокон в пучке. Вся информация, достигающая головного мозга через первичные афференты, должна кодироваться языком последовательности нейронных спайков. Вследствие этого, знание, как на последовательности сенсорных спайков воздействует ряд агентов, таких как симбионты, пробиотические штаммы и различные вещества, дает возможность авторам изобретения идентифицировать новые благотворные кишечные микроорганизмы и их активные молекулы посредством их воздействия на первичную афферентную активацию, а также новые лекарственные препараты и другие соединения, которые могут различным образом вмешиваться в данную сигнальную систему, в частности посредством модулирования активации TRPV1.
Способ вариантов осуществления в данной заявке используется для выбора агента для применения с целью уменьшения или предотвращения гастроинтестинальной боли посредством ингибирования передачи сигналов через TRPV1-рецептор. Способ вариантов осуществления таким образом можно применять для оценки агентов, которые могут быть потенциально эффективны в предотвращении гастроинтестинальной боли и/или эффективны в уменьшении, подавлении или лечении гастроинтестинальной боли. Таким образом, способ можно применять для идентификации эффективных агентов, способных модулировать гастроинтестинальную боль, связанную с периферической (энтеральной) и/или центральной нервной системой.
Таким образом, аспект вариантов осуществления относится к способу для выбора агента, эффективного, т.е. для применения, для уменьшения или предотвращения гастроинтестинальной боли у человека. Способ включает выбор агента, способного уменьшать спонтанную и/или индуцированную активацию транзиторного рецепторного потенциала по ванилоиду 1 (TRPV1).
Варианты осуществления таким образом основываются на применении сигнального пути TRPV1 в качестве инструмента выбора при идентификации агентов, которые являются эффективными при модулировании, в частности предотвращении или уменьшении, таком как подавление или лечение, гастроинтестинальной боли у больных, страдающих от заболеваний или расстройств, включающих или вызывающих данную гастроинтестинальную боль, и которые можно обозначить гастроинтестинальные болевые заболевания или расстройства.
in vitro
ex vivo,
Способ вариантов осуществления, как правило, выполняется  или  как дополнительно раскрыто в данной заявке. Однако агент предпочтительно способен уменьшать спонтанный и/или индуцировать активацию TRPV1 у больного при введении больному.
Способ вариантов осуществления можно, таким образом, применять для поиска пригодных агентов для уменьшения или предотвращения гастроинтестинальной боли при различных гастроинтестинальных болевых расстройствах и заболеваниях. Агенты выбирают для воздействия на активацию TRPV1 больного благоприятным способом с целью модулирования, т.е. предпочтительно предотвращения, уменьшения или лечения гастроинтестинальной боли.
В варианте осуществления расстройство или заболевание, связанное с гастроинтестинальной болью, подлежащее предотвращению или лечению агентом, выбранным посредством способа, представляет собой гастроинтестинальное болевое расстройство или заболевание.
В варианте осуществления гастроинтестинальная боль представляет собой боль в желудке.
В варианте осуществления гастроинтестинальная боль представляет собой висцеральную боль.
В варианте осуществления гастроинтестинальная боль может присутствовать у человека, страдающего от колики.
В варианте осуществления гастроинтестинальная боль может присутствовать у человека, страдающего от синдрома раздраженной кишки (IBS).
В варианте осуществления гастроинтестинальная боль может присутствовать у человека, страдающего от запора. Гастроинтестинальная боль может присутствовать у больных, страдающих расстройствами моторики кишечника, по определению выше.
Таким образом, в варианте осуществления больной страдает нарушением моторики кишечника, ассоциированной с гастроинтестинальной болью.
Способ вариантов осуществления основывается на неожиданном открытии, что гастроинтестинальная боль, включающая боль, связанную с различными патологическими состояниями и расстройствами, такими как расстройства моторики, и проявляющаяся центрально или периферически, связана с активацией TRPV1, которую можно модулировать посредством ранее неизвестных агентов, таких как молочнокислые бактерии.
Одним видом гастроинтестинальной боли является висцеральная боль, которая является результатом активации ноцицепторов внутренних органов брюшной полости (органов). Висцеральные структуры являются высоко чувствительными к вздутию (растяжению), ишемии и воспалению, но относительно нечувствительны к другим стимулам, которые в норме вызывают боль. Висцеральная боль является диффузной, трудной для локализации и часто связана с отдаленной, обычно поверхностной, структурой. Она может сопровождаться симптомами, такими как тошнота, рвота, изменениями показателей жизненно-важных функций, а также эмоциональными проявлениями. Боль можно описать как тошнотворную, глубокую, сжимающую и ноющую. Отчетливые структурные нарушения или биохимические нарушения объясняют данный тип боли лишь у части пациентов. Данные заболевания иногда относят в группу желудочно-кишечных нейромышечных заболеваний (GINMD). Люди могут также испытывать висцеральную боль, часто весьма интенсивную по природе, без какой-либо очевидной структурной, биохимической или патогистологической причины для данных симптомов.
Ноцицептор представляет собой чувствительный рецептор, который реагирует на потенциально повреждающие стимулы, посылая потенциалы действия специфическим ноцицептивным нейронам (Aδ или C), которые передаются переднебоковым трактам спинного мозга (плюс малой вагусной проекции) и затем к таламусу и прозэнцефалон, включая островковую и поясную кору. Особенно важным для восприятия боли, происходящей от патологии кишечника, является активация болевых сообщений из кишечника к центральной нервной системе по внешним первичным аффрерентным волокнам, которые идут в мезентериальных афферентных нервных пучках.
Способ можно применять для отбора агентов с целью выбора агентов с желаемыми свойствами, например, уменьшение активации TRPV1, для применения с целью уменьшения или предотвращения гастроинтестинальной боли. Подлежащий измерению в способе параметр, т.е. спонтанную и/или индуцированную активацию TRPV1, можно наблюдать в динамике и определять в различных моделях и системах. Используя данную информациию, можно получить профиль, полезный для определения подробного и возможно детализированного действия, которое конкретные агенты оказывают на передачу болевых сигналов при гастроинтестинальной боли.
in vivo
Другие параметры, которые можно измерить в способе, включают общую передачу болевых сигналов, импульсную активность нервов, например, анализ брыжеечного нервного пучка, и, возможно, применение различных моделей гастроинтестинальной боли.
В варианте осуществления активацию TRPV1 измеряют в клетках, экспрессирующих TRPV1, таких как нейроны спинномозговых ганглиев (DRG), CaCo2 клетки или другая стандартная кишечная эпителиальная клеточная линия человека. Можно измерить как спонтанную активацию TRPV1, так и активацию TRPV1 после индуцирования, например, капсаицином, изменением pH или температуры. В целом, согласно вариантам осуществления, для измерения активации TRPV1 можно применять любую клетку или ткань, которая экспрессирует TRPV1.
Таким образом, в варианте осуществления способ включает контактирование клетки, экспрессирующей TRPV1, с агентом, подлежащим исследованию. Способ также включает измерение спонтанной и/или индуцированной активации TRPV1 в клетке вслед за, т.е. после, контактированием клетки с агентом, подлежащим исследованию. Способ дополнительно включает сравнение измеренной спонтанной и/или индуцированной активации TRPV1 с контрольной активацией TRPV1. В данном варианте осуществления способ дополнительно включает выбор агента, подлежащего исследованию, в качестве агента, эффективного для уменьшения или предотвращения гастроинтестинальной боли, если измеренная спонтанная и/или индуцированная активация TRPV1 меньше контрольной активации TRPV1.
Контрольную активацию TRPV1 можно определять в соответствии с различными вариантами осуществления. Например, активацию TRPV1 можно было бы определить заранее и определять у экспрессирующих TRPV1 клеток с уровнем активации, который представляет нормальную или исходную активацию, соответствующую, например, по существу отсутствию гастроинтестинальной боли.
Однако предпочтительный вариант осуществления определения контрольной активации TRPV1 предназначен для применения клетки, экспрессирующей TRPV1, в качестве внутреннего контрольного образца. Следовательно, в варианте осуществления способ включает измерение спонтанной и/или индуцированной активации TRPV1 в клетке перед контактированием клетки с агентом, подлежащим исследованию. Способ также включает определение контрольной активации TRPV1, основываясь на спонтанной и/или индуцированной активации TRPV1, измеренной в клетке перед контактированием клетки с агентом, подлежащим исследованию.
При данном подходе измерения спонтанной и/или индуцированной активации TRPV1 вследствие этого предпочтительно выполняют дважды: перед контактированием клетки с агентом, подлежащим исследованию, и после контактирования клетки с агентом, подлежащим исследованию.
В качестве альтернативы, измерения спонтанной и/или индуцированной активации TRPV1 могут быть выполнены в двух параллельных экспериментах: один эксперимент, в котором клетка контактировала с агентом, подлежащим исследованию, и один контрольный эксперимент, в котором клетка не контактировала с агентом. Клетки, используемые в двух экспериментах, в таком случае являются такого же типа, как и нейроны DRG, клетки CaCo2 или другая стандартная кишечная эпителиальная клеточная линия человека. Спонтанную и/или индуцированную активацию TRPV1 измеряют в обоих экспериментах и затем сравнивают друг с другом.
ex vivo
Клетка, подлежащая применению в способе, может представлять собой любую клетку, экспрессирующую TRPV1, включая, без ограничения, препараты , клеточные линии, экспрессирующие TRPV1, такие как кишечные эпителиальные клеточные линии человека, экспрессирующие TRPV1, и зародышевые клетки, экспрессирующие TRPV1.
Измеренную спонтанную и/или индуцированную активацию TRPV1 и контрольную активацию TRPV1 в целом можно выражать в виде соответствующего значения параметра или критерия, включая значение, представляющее уровень спонтанной и/или индуцированной активации TRPV1.
В варианте осуществления для анализа активации TRPV1 применяют зародышевые клетки, такие как, например, нейроны спинномозговых ганглиев (DRG).
В другом варианте осуществления для анализа активации TRPV1 применяют клеточные линии, экспрессирующие TRPV1, такие как CaCo2 или другая стандартная кишечная эпителиальная клеточная линия человека.
В других вариантах осуществления для анализа активации TRPV1 применяют имеющиеся в продаже клеточные линии, экспрессирующие TRPV1, см., например, cat: no CT6105 от Chantest.
Также возможно использовать клетки репортерных генов, также обозначаемые репортерные клетки в данной области, которые можно применять для динамического наблюдения и измерения экспрессии TRPV1 и/или спонтанной и/или индуцированной активации TRPV1.
in vivo
Для исследования активации TRPV1 можно применять несколько различных способов, включая, но без ограничения, функциональный анализ, использующий, например, поступление кальция, индуцированное, например, капсаицином и/или его предотвращение посредством агента в клетках, экспрессирующих TRPV1, и частоты активации брыжеечных нервных пучков, спонтанной и/или индуцируемой, например, капсаицином. В другом варианте осуществления для анализа активации TRPV1 можно применять функциональную оценку регулируемой температурой работы ионных каналов с применением прибора ПЦР в режиме реального времени, как описано у Reubish, Emerling et al., BioTechniques 2009. В другом варианте осуществления для исследования активации TRPV1 можно применять репортерную мышь для TRPV1-канала. Ряд моделей  также можно применять для анализа действия на боль в изобретении. Данные способы включают, например, растяжение желудка и действие на частоту сердечных сокращений (см. Пример 3) и модели колоректального растяжения.
2+
2+
2+
Следовательно, в варианте осуществления способ включает измерение поступления Ca в клетку, индуцируемого капсаицином или другим веществом, способным включать активацию TRPV1, например, аналогом капсаицина, или другими веществами, способными активировать TRPV1. Также для индуцирования активации TRPV1 можно применять воздействие на клетку выбранных физических состояний, включая изменение pH или температуры. Таким образом, воздействие на клетку кислого pH, щелочного pH и/или нагревания (повышенных температур, как правило, выше приблизительно 42°C) может индуцировать активацию TRPV1. В данном варианте осуществления поступление Ca в клетку, экспрессирующую TRPV1, таким образом применяют в качестве параметра, отображающего активацию TRPV1. Снижение активации TRPV1, и в частности снижение pH-индуцируемой, индуцируемой нагреванием и/или капсаицин-индуцируемой активации TRPV1 можно затем измерить в виде снижения поступления Ca. В другом варианте осуществления способ включает измерение регулируемой температурой работы ионных каналов в клетке. В данном варианте осуществления регулируемую температурой работу ионных каналов в клетке, экспрессирующей TRPV1, применяют в качестве параметра, отображающего активацию TRPV1. Регулируемая температурой работа ионных каналов может быть спонтанной или индуцируемой, такая как индуцируемая повышенной температурой. Снижение активации TRPV1 может быть измерено в виде снижения регулируемой температурой работы ионных каналов в клетке.
ex vivo
В варианте осуществления активацию TRPV1 измеряют, применяя эксперименты на брыжеечном афферентном нервном пучке. Таким образом, другим параметром, который можно измерить, является частота спонтанной и/или индуцируемой, например, капсаицином, изменением рН или нагреванием, активации брыжеечных афферентных нервных пучков. Данную методику можно применять для определения изменений возбудимости брыжеечных нервных волокон, индуцируемых различными агентами, подлежащих исследованию. В варианте осуществления желудочно-кишечный сегмент иссекают с аркадой брыжейки или без нее, содержащей нервный пучок, иннервирующий сегмент, состоящий как из спинномозговых, так и вагусных волокон для регистрации данных нервного пучка  (см. Пример 1).
ex vivo
В некоторых вариантах осуществления является важной региональная специфичность желудочно-кишечного тракта. Соответствующие сегменты для анализа брыжеечных нервов способа предпочтительно включает соответствующий нервный пучок для обеспечения возможности измерения активации афферентного брыжеечного нерва. Это может быть удобно предоставлено посредством наличия желудочно-кишечного сегмента с прикрепленной брыжеечной тканью (см. Пример 1). Таким образом, данный вариант осуществления удобно осуществляется на сегментах  от соответствующего экспериментального животного, например, на желудочно-кишечных сегментах мыши (например, сегменты ободочной или тощей кишки мыши). Способность проводить сравнение действия агента на тонкую в сравнении с толстой кишкой могло бы быть преимущественным, в частности, в зависимости от расстройства кишечной моторики, подлежащего лечению, и его клинической стадии и симптомов, при этом могло бы быть благотворным лечение, которое является специфичным для отдельной области, например, специфичным для либо тонкой, либо толстой кишки.
В варианте осуществления проанализирован спинальный траффик афферентного брыжеечного нерва для конкретных и выбранных частей кишки. Неожиданно было обнаружено, что различные агенты, такие как молочнокислые бактерии, способны воздействовать или модулировать сигнальные системы гастроинтестинальной боли в одной части, но не в другой части ЖКТ, и через различные нервные пути, такие как вагусный, или для висцеральной боли через спинномозговые ганглии.
ex vivo
ex vivo
ex vivo
Таким образом, в варианте осуществления способ включает контактирование желудочно-кишечного сегмента  с прикрепленной брыжеечной тканью с агентом, подлежащим исследованию. Способ также включает измерение спонтанной и/или индуцируемой активации брыжеечных афферентов в желудочно-кишечном сегменте  после контактирования желудочно-кишечного сегмента  с агентом, подлежащим исследованию. Способ дополнительно включает сравнение измеренной спонтанной и/или индуцируемой активации брыжеечных афферентов с контрольной активацией брыжеечных афферентов. В данном варианте осуществления способ дополнительно включает выбор агента, подлежащего исследованию в качестве агента, эффективного для уменьшения или предотвращения гастроинтестинальной боли, если измеренная спонтанная и/или индуцируемая активация брыжеечных афферентов ниже контрольной активации брыжеечных афферентов.
ex vivo
ex vivo
ex vivo
ex vivo
ex vivo
Контрольную активацию брыжеечных афферентов можно определить, как обсуждалось в вышеизложенном применении желудочно-кишечного сегмента  в качестве внутреннего контроля. В данном случае способ включает измерение спонтанной и/или индуцируемой активации брыжеечных афферентов в желудочно-кишечном сегменте  перед контактированием желудочно-кишечного сегмента  с агентом, подлежащим исследованию. Способ также включает определение контрольной активации брыжеечных афферентов на основе спонтанной и/или индуцируемой активации брыжеечных афферентов, измеренной в желудочно-кишечном сегменте  перед контактированием желудочно-кишечной сегмента  с агентом, подлежащим исследованию.
ex vivo
ex vivo
В качестве альтерантивы могут быть проведены два параллельных эксперимента. В одном из них гастроинтестинальный сегмент контактирует с агентом, подлежащим исследованию, а в другом, контрольном эксперименте, гастроинтестинальный сегмент не контактирует с агентом. В обоих экспериментах измеряют и сравнивают друг с другом спонтанную и/или индуцируемую активацию брыжеечных афферентов.
Анализ одного или более из данных параметров выше приведет к способу выбора агентов, эффективных для уменьшения или предотвращения гастроинтестинальной боли.
ex vivo
ex vivo
ex vivo
В конкретном варианте осуществления желудочно-кишечный сегмент выбирают из сегмента ободочной или тощей кишки. В данном случае способ включает контактирование сегмента ободочной или тощей кишки  с прикрепленной брыжеечной тканью с агентом, подлежащим исследованию.
Примеры соответствующих способов и устройство для анализа спонтанной и/или индуцированной активации TRPV1 описаны в Примерах и Фигурах.
Таким образом, в предпочтительных способах представленный анализ предоставит данные о спонтанной и/или индуцированной активации TRPV1. Анализ одного или нескольких из данных параметров приведет к предпочтительному способу выбора агентов, эффективных для уменьшения и/или предотвращения гастроинтестинальной боли.
Способ вариантов осуществления можно, таким образом, применять для поиска агентов, пригодных для лечения, предотвращения и/или уменьшения гастроинтестинальной боли, посредством применения модели в данной заявке.
Представленный способ будет предоставлять данные о спонтанной и/или индуцированной активации TRPV1 с применением различных моделей. Анализ данного параметра приведет к способу выбора агентов, эффективных для уменьшения или предотвращения гастроинтестинальной боли.
В варианте осуществления способ анализирует действие агента на активацию TRPV1 (спонтанной и/или индуцируемой, например, капсаицином, изменением рН и/или нагреванием и ее предотвращение посредством агента) и может таким образом использоваться в качестве считывания передачи сигнала гастроинтестинальной боли, т.е. имеет ли агент с большой вероятностью действие на гастроинтестинальную боль, например, висцеральную боль, или не имеет. Повышение или отсутствие выраженного действия на спонтанную или индуцируемую (например, капсаицином, изменением рН и/или нагреванием) активность TRPV1 указывает на агент, который с большой вероятностью приведет к усилению гастроинтестинальной боли или отсутствию выраженного действия на гастроинтестинальную боль, соответственно, тогда как уменьшение спонтанной и/или индуцируемой (например, капсаицином, изменением рН и/или нагреванием) активности TRPV1 указывает на агент, который уменьшит гастроинтестинальную боль. Таким образом, предпочтительными агентами являются агенты, которые приводят к уменьшению спонтанной и/или индуцируемой (например, капсаицином) активности TRPV1.
В другом варианте осуществления способ анализирует действие агента на активность TRPV1 посредством анализа спонтанной и/или индуцируемой (например, капсаицином, изменением рН и/или нагреванием) активации брыжеечного афферентного нерва (передачу болевых сигналов) и, таким образом, может применяться в качестве считывания гастроинтестинальной боли, т.е. имеет ли агент с большой вероятностью действие на гастроинтестинальную боль, например, висцеральную боль, или не имеет. Повышение или отсутствие выраженного действия на активацию афферентного нерва указывает на агент, который с большой вероятностью приведет к усилению гастроинтестинальной боли или или отсутствию выраженного действия на гастроинтестинальную боль, соответственно, тогда как уменьшение активации афферентного нерва указывает на агент, который уменьшит гастроинтестинальную боль. Таким образом, предпочтительными агентами являются агенты, которые приводят к уменьшению активации афферентного нерва, например, уменьшению спонтанной и/или индуцируемой частоты активации афферентных нервных пучков.
Агент, подлежащий исследованию, добавляют к выбранной системе для анализа активности TRPV1 любым подходящим способом. С целью анализа действия агента на передачу болевого сигнала способы являются удобно осуществляемыми при наличии и отсутствии агента. Например, этап способа осуществляется до и после применения агента. Таким образом, в данных способах действие агента сравнивают с соответствующим контролем, например, результаты в присутствии исследуемого агента сравнивают с результатами при отсутствии исследуемого агента, например, результаты только с буферным раствором по сравнению с буферным раствором плюс агент.
ex vivo
in vitro
Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что определенные штаммы молочнокислых бактерий, например, DSM 17938, могут снижать активацию TRPV1 в различных моделях  и  (см. Пример 1 и 2). Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления агент представляет собой бактериальный штамм, более предпочтительно молочнокислые бактерии. Таким образом, способ вариантов осуществления можно преимущественно применять для исследования ряда молочнокислых бактерий с целью идентификации и выбора одного или более штаммов молочнокислых бактерий, которые являются эффективными для уменьшения или предотвращения гастроинтестинальной боли у человека, как определено способом в отношении способности уменьшать спонтанную и/или индуцируемую активацию TRPV1.
Другим аспектом вариантов осуществления является агент, выбранный посредством способа вариантов осуществления, т.е. получаемый посредством способа выбора.
Предпочтительный агент представляет собой микроорганизм, более предпочтительно бактериальный штамм, предпочтительно молочнокислые бактерии, включая их части и метаболиты.
Другой предпочтительный агент представляет собой кондиционированную среду из данного микроорганизма.
Родственный аспект вариантов осуществления определяет агент, получаемый посредством способа выбора вариантов осуществления для применения с целью уменьшения или предотвращения гастроинтестинальной боли у человека.
В конкретном варианте осуществления агент получают посредством способа выбора вариантов осуществления, способных уменьшать спонтанную и/или индуцируемую активацию RPTV1 для применения с целью уменьшения или предотвращения гастроинтестинальной боли у человека.
in vitro,
В варианте осуществления для уменьшения или предотвращения гастроинтестинальной боли будет выбран агент, который предпочтительно действует, чтобы уменьшить передачу болевого сигнала, что оценивают посредством динамического наблюдения за действием агента на спонтанную и/или индуцируемую активацию TRPV1. Данный агент будет предпочтительно действовать, чтобы снизить или уменьшить активацию TRPV1 в нейронах DRG или других TRPV1-экспрессирующих клетках или ткани. Предпочтительно агент будет действовать, чтобы уменьшить спонтанную и/или индуцируемую (например, капсаицином, изменением рН и/или нагреванием) активность TRPV1, используя различные системы или модели  включая но без ограничения, первичные клетки и клеточные линии, экспрессирующие TRPV1-рецептор, как обсуждалось ранее.
В варианте осуществления будет выбран агент, который предпочтительно действует, чтобы снизить или уменьшить активацию TRPV1 в брыжеечных афферентных нервных пучках. Агент будет действовать, чтобы уменьшить частоту спонтанной и/или индуцируемой (например, капсаицином, изменением рН и/или нагреванием) активации брыжеечных афферентных нервных пучков.
Из вышеуказанного ясно, что способ вариантов осуществления можно также применять для отбора или идентификации агентов, которые не подходят для лечения гастроинтестинальной боли, например, агентов, которые не обладают благотворным действием на уменьшение передачи болевого сигнала. В частности, маловероятно, что такие агенты, которые не демонстрируют действие на данный параметр, являются пригодными для уменьшения или предотвращения гастроинтестинальной боли. В дополнение, маловероятно, что такие агенты, которые обладают действием на усиление передачи болевого сигнала, как оценено посредством повышения спонтанной и/или индуцируемой активности TRPV1, являются пригодными уменьшения или предотвращения гастроинтестинальной боли.
Дополнительный аспект вариантов осуществления относится к композиции, содержащей агент, выбранный посредством способа вариантов осуществления, и по меньшей мере один дополнительный компонент. Таким образом, по меньшей мере один дополнительный компонент предпочтительно выбран из группы, состоящей из фармацевтически приемлемого носителя, фармацевтически приемлемого разбавителя, фармацевтически приемлемого эксципиента, пищевого продукта, биологически активной пищевой добавки и другого превентивного или терапевтического агента.
Таким образом, вариант осуществления относится к композиции, содержащей агент, получаемый посредством способа выбора вариантов осуществления, и по меньшей мере один дополнительной компонент, выбранный из группы, состоящей из фармацевтически приемлемого носителя, фармацевтически приемлемого разбавителя, фармацевтически приемлемого эксципиента, пищевого продукта, биологически активной пищевой добавки и другого превентивного или терапевтического агента для применения с целью уменьшения или предотвращения гастроинтестинальной боли у человека.
По меньшей мере один дополнительный компонент можно вводить вместе с агентом, выбранным согласно вариантам осуществления, или можно вводить раздельно. В дополнение, по меньшей мере один дополнительный компонент можно вводить одновременно с агентом, выбранным согласно вариантам осуществления, или в разные временные точки. Квалифицированный специалист в данной области может легко определить пригодные режимы введения и время введения в зависимости от дополнительного рассматриваемого компонента.
В варианте осуществления по меньшей мере один дополнительный компонент представляет собй любой подходящий нутритивный компонент, например, пищевой продукт или биологически активную пищевую добавку.
В варианте осуществления другой превентивный или терапевтический агент может представлять собой любой дополнительный агент, который является пригодным для предотвращения или уменьшения, такого как лечение, рассматриваемой гастроинтестинальной боли.
В другом варианте осуществления другой превентивный или терапевтический агент представляет собой агент, способный влиять на желудочно-кишечную моторику и/или перемешивание. Другой превентивный или терапевтический агент тогда предпочтительно способен модулировать (увеличивать или уменьшать, в зависимости от патологического состояния, подлежащего лечению, как известно в данной области и описано ниже) желудочно-кишечной моторикиу и/или перемешивание.
В дополнительном варианте осуществления агент вариантов осуществления может иметь двойное воздействие, т.е. обладать действием как на гастроинтестинальную боль, так и на желудочно-кишечную моторику и/или перемешивание.
Агент, выбранный в соответствии с настоящими вариантами осуществления с целью являться эффективным для уменьшения или предотвращения гастроинтестинальной боли, может также являться объектом другого или дополнительного анализа или способа выбора с целью определения, является ли агент дополнительно эффективным при модулировании желудочно-кишечной моторики и/или перемешивания. Данный агент может являться интересным для предотвращения или лечения, например, расстройства моторики, поскольку он направлен как на гастроинтестинальную боль, так и на изменение моторики в совокупности. Способы анализа моторики и/или перемешивания являются известными в данной области. Параметры, подлежащие анализу, включают, но без ограничения, частоту MMC, скорость MMC, внутрипросветное давление, такое как PPr, и другие функциональные модели.
При анализе моторики изменения желудочно-кишечной моторики, индуцируемые агентом, можно, например, определить как изменение паттерна моторики или амплитуд сокращения. Некоторые агенты вообще не будут обладать действием. Агент, который может усилить желудочно-кишечную моторику, например, посредством повышения частоты MMC и/или скорости MMC и/или внутрипросветного давления, такого как PPr, с большой вероятностью будет пригодным для лечения расстройств, связанных с гастроинтестинальной болью, при которых преимущественным является усиление пропульсивной моторики по пищеварительной трубке, таких как запор и колика.
В качестве альтерантивы, например, если расстройство кишечной моторики, подлежащее лечению, представляет собой расстройство, при котором необходимо увеличить время транзита материала по кишечнику, например, расстройства, задействующие быстрый пассаж, такие как IBS или понос, когда исследуемый агент в дополнение к своему действию на модулирование гастроинтестинальной боли будет действовать с целью уменьшения желудочно-кишечной моторики, например, посредством снижения частоты MMC или скорости MMC или внутрипросветного давления, например, PPr. Предпочтительные агенты будут уменьшать по меньшей мере скорость MMC. Предпочтительные агенты будут уменьшать два или более из данных параметров, например, будут уменьшать скорость MMC и частоту MMC или будут уменьшать частоту MMC и внутрипросветное давление (например, PPr) или будут уменьшать скорость MMC и внутрипросветное давление (например, PPr). Наиболее предпочтительные агенты будут уменьшать все данные параметры, например, будут уменьшать частоту MMC, скорость MMC и внутрипросветное давление (например, PPr). Анализ моторики может быть оценен на соответствующем желудочно-кишечном сегменте от тонкой или толстой кишки, например, сегменте тощей кишки для тонкой кишки или сегмента ободочной кишки для толстой кишки. В некоторых вариантах осуществления применение сегментов толстой кишки, например, ободочной кишки, является предпочтительным.
Дополнительный аспект вариантов осуществления относится к агенту, выбранному посредством способа вариантов осуществления, или композиции, по определению выше, для применения с целью уменьшения или предотвращения гастроинтестинальной боли у человека.
Родственный аспект вариантов осуществления определяет применение агента, выбранного посредством способа вариантов осуществления, например, получаемого посредством способа выбора согласно вариантам осуществления, или композиции, по определению выше, для изготовления лекарственного средства, пищевого продукта или биологически активной пищевой добавки для уменьшения или предотвращения гастроинтестинальной боли у человека.
Другой родственный аспект вариантов осуществления определяет способ уменьшения или предотвращения гастроинтестинальной боли у человека. Способ включает введение эффективного количества агента, выбранного посредством способа вариантов осуществления, например, получаемого посредством способа выбора согласно вариантам осуществления, или композиции, по определению выше, человеку.
Lactobacillus reuteri
Lactobacillus reuteri,
В варианте осуществления данных аспектов агент представляет собой бактериальный штамм, предпочтительно штамм молочнокислых бактерий и более предпочтительно штамм , такой как бактериальный штамм, способный уменьшать спонтанную и/или индуцируемую активацию TRPV1, предпочтительно штамм молочнокислых бактерий, способных уменьшать спонтанную и/или индуцируемую активацию TRPV1, и более предпочтительно штамм  способный уменьшать спонтанную и/или индуцируемую активацию TRPV1.
Lactobacillus reuteri
Lactobacillus reuteri
Lactobacillus reuteri,
Lactobacillus reuteri
В варианте осуществления данных аспектов агент представляет собой предпочтительно DSM 17938. В другом варианте осуществления агент представляет собой другой штамм молочнокислых бактерий, т.е. агент представляет собой штамм молочнокислых бактерий, не являющийся DSM 17938, предпочтительно штамм  не являющийся DSM 17938.
Lactobacillus reuteri
Lactobacillus reuteri,
В варианте осуществления данных аспектов агент представляет собой кондиционированную среду из бактериального штамма, предпочтительно из штамма молочнокислых бактерий, и более предпочтительно их штамма, такую как кондиционированная среда из бактериального штамма, способного уменьшать спонтанную и/или индуцируемую активацию TRPV1, предпочтительно из штамма молочнокислых бактерий, способных уменьшать спонтанную и/или индуцируемую активацию TRPV1, и более предпочтительно из штамма  способного уменьшать спонтанную и/или индуцируемую активацию TRPV1.
Lactobacillus reuteri
Lactobacillus reuteri,
Lactobacillus reuteri
Lactobacillus reuteri
Lactobacillus reuteri
В варианте осуществления агент представляет собой кондиционированную среду от штамма молочнокислых бактерий, предпочтительно из DSM 17938 или штамма  не являющегося DSM 17938. Среда, применяемая для данной кондиционированной среды, может представлять собой любую среду, подходящую для культивирования штамма молочнокислых бактерий, известную в данной области. В варианте осуществления среду MRS (de Man, Rogosa & Sharpe) применяют в качестве исходного материала для изготовления кондиционированной среды из штамма молочнокислых бактерий, предпочтительно из  DSM 17938. В варианте осуществления изобретения кондиционированную среду из штамма молочнокислых бактерий, предпочтительно из DSM 17938, лиофилизируют перед введением или применением в виде композиции.
Lactobacillus reuteri
В другом варианте осуществления один или несколько компонентов кондиционированной среды из штамма молочнокислых бактерий, предпочтительно из DSM 17938, выделяют и вводят больному в виде очищенных и/или обогащенных компонентов в форме подходящей композиции. Примеры данных компонентов включают белки, пептиды, ферменты и другие молекулы, предпочтительно выделяемые штаммом молочнокислых бактерий в среду. Также данные компоненты, выделенные непосредственно из штамма молочнокислых бактерий, можно применять согласно вариантам осуществления.
Соответствующий способ введения и лекарственную форму агента или композиции выбирают в зависимости от локализации заболевания. Предпочтительным способом введения является пероральный, однако, в равной степени для некоторых видов лечения будут пригодны внутривенная или внутримышечная инъекция.
Соответствующие дозы агента или композиции могут быть легко выбраны или определены квалифицированным специалистом в данной области в зависимости от расстройства, подлежащего лечению, способа введения и предполагаемой лекарственной формы.
В одном варианте осуществления TRPV1-рецептор модулируют локально, например, посредством применения перорально вводимых молочнокислых бактерий, которые могут селективно модулировать активацию TRPV1 в ЖКТ, у человека, страдающего от гастроинтестинальной боли, и таким образом минимизируя любые неблагоприятные эффекты у указанного больного. Можно полагать, что данный предпочтительный путь введения агента, в частности штамма молочнокислых бактерий, выбранного посредством способа вариантов осуществления, будет главным образом локально воздействовать на активацию TRPV1, т.е. в пределах желудочно-кишечного тракта. Таким образом, тогда агент будет обладать благотворным действием с целью предотвращения или уменьшения гастроинтестинальной боли, минимизируя при этом любое нежелательное модулирование TRPV1 за пределами желудочно-кишечного тракта.
В способах и применениях настоящих вариантов осуществления, описанных в данной заявке, термины «повышать», «уменьшать», «снижать» и т.д. относятся к измеряемому изменению уровней, предпочтительно значительному изменению уровней, более предпочтительно статистически значимому изменению, предпочтительно со значением вероятности ≤0,05.
Предпочтительными больными являются млекопитающие, более предпочтительно люди.
Там, где расстройство кишечной моторики, связанное с гастроинтестинальной болью, подлежащее лечению, представляет собой запор, тогда предпочтительными больными являются пожилые пациенты или беременные женщины. Под пожилым пациентом обычно следует понимать пациента в возрасте 70 лет или старше.
Там, где расстройство кишечной моторики, связанное с гастроинтестинальной болью, подлежащее лечению, представляет собой колику, предпочтительно это будет колика грудного ребенка.
Применение агентов, предпочтительно штаммов молочнокислых бактерий, выбранных в соответствии со способом вариантов осуществления, включает уменьшение, предотвращение или облегчение рассматриваемого расстройства или симптомов расстройства (например, может привести к модулированию симптомов заболевания). Данное уменьшение, предотвращение или облегчение расстройства или его симптомов можно измерить посредством любого соответствующего анализа.
Целью варианта осуществления является поиск агентов, таких как молочнокислые бактерии, включая их части и метаболиты, такие как присутствующие или выделенные из кондиционированной среды, пригодные для лечения, уменьшения, предотвращения или модулирования гастроинтестинальной боли, например, при специфических расстройствах моторики и/или других гастроинтестинальных болевых расстройств/заболеваний, посредством применения модели в данной заявке, основываясь на действии агента на спонтанную и/или индуцируемую активность TRPV1.
В варианте осуществления целью является подбор бактериального пробиотического штамма, такого как штамм молочнокислых бактерий, который может являться эффективным для предотвращения или уменьшения гастроинтестинальной боли, связанной с запором, у людей, особенно пожилых больных или беременных женщин.
В варианте осуществления целью является подбор агента, например, штамм молочнокислых бактерий, который может являться эффективным для предотвращения или уменьшения гастроинтестинальной боли, связанной с коликой грудного ребенка.
В варианте осуществления целью является подбор агента, например, штамма молочнокислых бактерий, который может являться эффективным для предотвращения или уменьшения симптомов гастроинтестинальной боли, связанной с синдромом раздраженной кишки (IBS).
Представлены следующие примеры вариантов осуществления, которые не подразумевают ограничение применением вариантов осуществления в данной заявке, но подробно показывают практические примеры, как можно применять изобретение. Пример 1 относится к эксперименту на брыжеечном нервном пучке, показывающему, что DSM 17938 подавляет частоту активации брыжеечного нерва. Пример 2 показывает, что DSM 17938 блокирует индуцируемое капсаицином поступление кальция в первичные культуры DRG. Пример 3 демонстрирует, что DSM 17938 подавляет замедление частоты сердечных сокращений, вызванное растяжением желудка.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1
Эксперименты на брыжеечном нервном пучке
Внеклеточная регистрация данных
ex vivo
Взрослые самцы швейцарских мышей Вебстер (20-30 г) были закуплены у Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Мышей умертвили посредством цервикальной дислокации. Все последующие процедуры проходили .
3
2
4
4
2
2
2
Сегменты дистальной части тощей кишки (~2,5 см) с прикрепленной брыжеечной тканью извлекали из только что убитых животных и помещали в чашку Петри, покрытую Силгардом, заполненную буфером Кребса (в мМ): 118 NaCl, 4,8 KCl, 25 NaHCO, 1,0 NaHPO, 1,2 MgSO, 11,1 глюкозы и 2,5 CaCl, вспененным карбогеном (95% O - 5% CO). Проксимальный и дистальный концы каждого сегмента канюлировали пластмассовыми трубками и опорожняли. Ткань прикалывали к Силгарду и выделяли брыжеечный нервный пучок. Чашку Петри помещали на столик инвертированного микроскопа, и через просвет самотеком при 0,5-1 мл/мин пропускали оксигенированный раствор Кребса или раствор Кребса с дополнительными компонентами (Perez-Burgos A., Wang B et al., American journal of physiology Gastrointestinal and liver physiology 2013;304:G211-20). Через серозный компартмент отдельно пропускали струю предварительно нагретого (34°C) раствора Кребса при 3-5 мл/мин. Нервный пучок осторожно втягивали в стеклянную пипетку, прикрепленную к держателю электрода патч-клэмп (CV-7B; Molecular Devices, Sunnyvale, CA), и проводили внеклеточную регистрацию данных нерва с применением усилителя Multi-Clamp 700B и преобразователь сигнала Digidata 1440A (Molecular Devices). Электрические сигналы фильтровали с помощью полосно-пропускающих фильтров при 0,1-2 кГц, дискретизировали при 20 кГц и сохраняли в персональном компьютере, задействуя программное обеспечение pClamp 10 (Molecular Devices). Повторяемые растяжения сегментов производили посредством нарастающего внутрипросветного давления выше 2 гПа. К раствору Кребса, протекающему по просвету, применяли механизм с постоянным гравитационным давлением, равным 48 гПа, и давление повышали посредством закрытия отводящей трубки в течение 1 мин до максимум 3 следующих друг за другом растяжений. Сегменты оставляли в покое в течение 9 мин между растяжениями. Конститутивную электрическую активность множественных нейронов регистрировали при отсутствии положительного внутрипросветного давления.
Ваготомия
Поддиафрагмальную ваготомию проводили, как описано ранее (van der Kleij H, O’Mahony C et al. American journal of physiology Regulatory, integrative and comparative physiology 2008;295:R1131-7). Животным позволяли восстановиться в течение 10-14 дней перед взятием тощей кишки и брыжеечной ткани для электрофизиологических экспериментов. Ложные ваготомии выполнили 3 животным. После операции ежедневно измеряли массу тела и общее состояние здоровья мышей. Авторы изобретения не обнаружили очевидных признаков выраженных различий в наборе массы через 1 неделю после операции ни у ваготомированных, ни у ложнооперированных животных (данные не показаны). Всех ваготомированных мышей исследовали на полноту выполнения процедуры посредством регистрации после каждого эксперимента ответов на нанесение холецистокинина (CCK) на серозную оболочку. Ваготомия считали эффективной, только если CCK не повышал частоту активации брыжеечного нерва (Perez-Burgos A., Wang B et al., American journal of physiology Gastrointestinal and liver physiology 2013;304:G211-20).
Лекарственные препараты и бактерии
Lactobacillus
rhamnosus
DSM 17938 были безвозмездно предоставлены BioGaia AB (Stockholm, Sweden), тогда как JB-1 были взяты из запасов Brian-Body Institute McMaster University (Ontario, Canada). Все процедуры были такими, как описано ранее (Kunze WA, Mao YK et al., Journal of cellular и molecular medicine 2009;13:2261-70, Ma X, Mao YK et al., American journal of physiology Gastrointestinal and liver physiology 2009;296:G868-75, Wang B, Mao YK, FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology 2010;24:4078-88). Количества бактерий определяли визуально, а жизнеспособность проверяли после посева в чашки с питательной агаровой средой. Бактерии из замороженных запасов подвергали оттаиванию, центрифугировали при 2000 об/мин в течение 15 мин и осадок суспендировали в растворе Кребса и вновь центрифугировали и ресуспендировали. Перед применением бактерии разбавляли до рабочих концентраций раствором Кребса. Сульфатированный холецистокинин (25-33) (CCK) был получен от AnaSpec (Fremont, CA); никардипин, капсаицин и 6-иодонордигидрокапсаицин от Sigma-Aldrich и ω-конотоксин GVIA (ω-Cg-GVIA) и ω-конотоксин MVIIC (ω-Cg-MVIIC) от Alomone Labs (Jerusalem, Israel). 6-иодонордигидрокапсаицин и CCK растворяли в DMSO; капсаицин растворяли в этаноле, чтобы сделать аликвоты базового раствора. В день эксперимента аликвоты разбавляли раствором Кребса до рабочих концентраций с итоговыми концентрациями DMSO и этанола, составляющими ≤0,01% и ≤0,1%, соответственно.
Анализ данных в автономном режиме
Частоты спонтанной активации множественных и одиночных нейронов измеряли, применяя программное обеспечение Clampfit 10.2 (Molecular Devices) и Origin 8.5 (Northampton, MA).
Регистрацию спайков множественных и одиночных нейронов в повседневной практике применяли, чтобы определить изменения частот активации волокон брыжеечного нерва, индуцируемые воздействием на кишку различных стимулов или фармакологических агентов (Perez-Burgos A., Wang B et al., American journal of physiology Gastrointestinal and liver physiology 2013;304:G211-20). Расчет времени спайков при регистрации множественных нейронов определяли, используя модуль обнаружения пика от Clampfit, а среднюю частоту активации рассчитывали, исходя из интервалов между спайками. Из сигнала множественных нейронов выделили одиночные нейроны посредством совпадения формы спайков, используя инструмент выявления модели формы спайков от Clampfit (компьютеризированный анализ формы волны). После прохождения алгоритма выявления модели распознавание спайков одиночных нейронов всегда проверяли с помощью визуального осмотра и отбраковывали случаи несовпадающих спайков (<0,2%) (Perez-Burgos A., Wang B et al., American journal of physiology Gastrointestinal and liver physiology 2013;304:G211-20).
Статистические данные
N
n
Y
LogEC50-
X
Данные выражали в виде средних ± СО, причем относится к общему количеству сегментов тощей кишки, с которых проводилась регистрация, а  относится к показателю активности единичных волокон, выделенному из регистрации данных множественных нейронов. Авторы изобретения максимально выделили 6 одиночных нейронов из каждой регистрации данных множественных нейронов. Для сравнения парных или непарных данных применяли критерий Вилкоксона или критерий Стьюдента для одной выборки, соответственно; для сравнения множества групп применяли однофакторный и двухфакторный дисперсионный анализ с апостериорным критерием Бонферрони, соответственно. Так как между одним препаратом и другим в нейронной активности множественных нейронов могут существовать большие отклонения спонтанной активности, сравнения были парными, при этом проводили регистрацию данных до и после лечения, когда каждый нервный пучок служил в качестве своего собственного контроля для достоверности существенных изменений каждой обработки или лекарственной дозы. Процентное значение повышения активации выше исходной частоты в зависимости от концентрации капсаицина (при наличии или отсутствии бактерий) наносили на график, и его дополняли логистическим уравнением доза-эффект [= Bottom + (Top - Bottom/1 + 10)]. Параметры, описывающие логистическую подгонку, сравнивали, используя F-критерий по дополнительной сумме квадратов. Все статистические тесты проводили, используя программное обеспечение Prism 5.0 (программное обеспечение GraphPad, San Diego, CA).
Действие DSM 17938 на спонтанную частоту активации брыжеечного нерва
9
8
N
P
N
P
Полостной DSM 17938 воздействовал на спонтанный разряд множественных нейронов брыжеечного нерва (Perez-Burgos A., Wang B et al., American journal of physiology Gastrointestinal and liver physiology 2013;304:G211-20). 1×10 КОЕ/мл внутрипросветного DSM 17938 вызывал уменьшение спонтанной частоты активации множественных нейронов на 22% от 36,3±8,4 до 28,2±7,2 Гц (=7, =0,02, Фигура 1A); DSM 17938 при 1×10 КОЕ/мл изменял спонтанный разряд на 19% от 21,6±5,1 до 17,6±6 Гц, =6, =0,09, Фигура 1B). Кондиционированная среда DSM 17938 (1:5) также уменьшала спонтанный разряд на 37% от 22,6±4,2 до 14,17±2,4 Гц (N=7, P=0,03, Фигура 1C). Однако убитый γ-излучением DSM 17938 или один лишь бульон не снижал афферентную возбудимость: с 17,84±5,3 до 18,25±4,1 Гц (N=6, P=0,84), и с 20,48±1,6 до 21,49±2,8 Гц (N=6, P=0,10) соответственно (Фигуры 1D-E).
Ваготомия и мышечный паралич не подавляют уменьшение посредством DSM 17938 спонтанной активации брыжеечного нерва
9
2+
N=
P=
N=
P=
P
N=
P=
Авторы изобретения исследовали, было ли действие DSM 17938 1×10 КОЕ/мл на спонтанный разряд нейтрализовано предыдущей ваготомией. Для того, чтобы контролировать возможное непосредственное действие DSM 17938 на гладкомышечные клетки, авторы изобретения добавили сюда и во все последующие эксперименты по спонтанной активации блокатор Ca каналов L-типа никардипин (3 мкМ), который подавляет мышечные сокращения. Таким образом, после ваготомии и добавления никардипина DSM 17938 уменьшал частоту активации множественных нейронов на 18% с 16,72±1,9 до 13,77±1,9 Гц (17, 0,001, Фигура 2A, 2C). Затем данные от ваготомированных животных и парализованных мышц анализировали по отношению к частоте активации одиночных нейронов. DSM 17938 уменьшал частоту активации одиночных нейронов на 19% с 0,36±0,05 до 0,29±0,03 Гц (30, 0,02, Фигура 2B, 2C); в данных волокнах большинство (20/30) продемонстрировало уменьшение частоты на 36% с 0,42±0,06 до 0,27±0,04 Гц (<0,0001), но меньшая фракция оставшихся волокон повышала свою частоту активации на 29% с 0,24±0,04 до 0,31±0,06 Гц (10/30, 0,006).
DSM 17938 снижал частоту активации спинномозговых одиночных нейронов и ответ на капсаицин посредством неконкурентного частичного антагонизма TRPV1-рецепторов
9
LogEC50-X
2+
N
Y
P=
P=
N=
N=
P=
Авторы изобретения исследовали, может ли DSM 17938 модифицировать индуцируемое капсаицином увеличение частоты активации возбуждения одиночных нейронов в ткани, взятой у предварительно ваготомированных мышей. Капсаицин, нанесенный на серозный компартмент, повышал спонтанную частоту активации множественных и одиночных нейронов, с началом латентных периодов, составляющих ~60 с, и дозозависимым образом. Учитывая, что чувствительные к капсаицину TRPV1-рецепторы теряют чувствительность, и что последующее применение агониста может вызвать уменьшенное действие, авторы изобретения изучили ответы на диапазон доз капсаицина (100 нМ-100 мкМ) в отдельных сегментах тощей кишки. Авторы изобретения сделали это с 20-минутным предварительным внутрипросветным введением DSM 17938 1×10 КОЕ/мл и без него (=25 для каждой кривой, 5 сегментов на каждую концентрацию; для каждого сегмента проанализированы ~6 спинномозговых одиночных нейронов). Процент повышения частоты активации в зависимости от концентрации капсаицина или концентрации капсаицина плюс DSM 17938 были нанесены на график и сопровождались трехпараметрическим логистическим уравнением формы =Bottom + (Top-Bottom)/(1+10). EC50 для одного капсаицина составила 200 нМ по сравнению с 500 нМ для капсаицина в присутствии DSM 17938 (0,71). Максимальный ответ (Top), полученный с капсаицином, составил 238,4±27,5% vs. 129±17%, полученного с капсаицином плюс DSM 17938 (0,004, Фигура 3A). Согласуясь с предыдущими сообщениями, некоторые спинномозговые волокна не возбуждались капсаицином. Авторы изобретения проверили, может ли капсаицин непосредственно возбуждать спинномозговые волокна, или зависит ли возбуждение от интрамуральной синаптической передачи от энтеральных нейронов к внутриганглионарным спинномозговым окончаниям. Авторы изобретения добавили 1 мкМ капсаицина на серозный компартмент после блокирования интрамуральной синаптической передачи посредством добавления 500 нМ каждого из Ca блокаторов ω-Cg-GVIA и ω-Cg-MVIIC. Интрамуральный синаптический блок не уменьшал индуцируемое капсаицином возбуждение, которое составило 187,5±42,9% (17) при отсутствии конотоксинов и 219,1±72,6 (12) в их присутствии (0,947, Фигура 3B). Авторы изобретения пришли к заключению, что действие DSM 17938 на спинномозговые афференты не влияет на интрамуральную синаптическую передачу.
Действие кондиционированноой среды DSM 17938, содержащей продукты высвобождения бактерий DSM 17938, уменьшает действие капсаицина на спинномозговые волокна
9
Авторы изобретения исследовали на брыжеечных афферентах, лежат ли в основе антагонизма к TRPV1 бактериальные продукты DSM 17938. Мишенью DSM 17938 в брыжеечных афферентах являлись преимущественно спинномозговые волокна, учитывая, что процент индуцируемого DSM 17938 уменьшения спонтанный частоты активации был весьма схож с предварительной ваготомией и без нее (18% и 22%, соответственно); затем авторы изобретения ввели 1 мкМ капсаицина в неваготомированные брыжеечные волокна, которые получили предварительное внутрипросветное введение кондиционированной среды DSM 17938 в течение 20 мин. Кондиционированная среда DSM 17938 (1:5) замедляла повышение индуцируемой капсаицином частоты активации (%) на одиночных брыжеечных волокнах с 187,5±43% (контрольная группа, N=17) до 74,89±22% (N=14) и была сходна с процентом повышения, индуцируемой капсаицином, на спинномозговых волокнах с 1×10 КОЕ/мл DSM 17938 лечения (80,29±22%, N=17) (P=0,02, однофакторный дисперсионный анализ; Фигура 7).
Антагонизм DSM 17938 или TRPV1 уменьшал индуцируемую растяжением активацию
ое
N=
P=
N=
P=
N=
P=
N=
P
В отсутствии никардипина для обеспечения мышечного сокращения авторы изобретения зарегистрировали частоту активации множественных и одиночных нейронов волокон, предположительно, являющихся ноцицепторами (Grundy D, Gut 2004;53 Suppl 2:ii5-8). Авторы изобретения исследовали, может ли DSM 17938 уменьшать их возбудительный ответ, спровоцированный растущим внутрипросветным давлением до ноцицептивной интенсивности, составляющей 48 гПа (36 мм рт. ст.) (Perez-Burgos A., Wang B et al., American journal of physiology Gastrointestinal and liver physiology 2013;304:G211-20). Первый ответ данных волокон на растяжение кишки является в целом выше, чем полученный с последующим растяжением, но остается постоянным вплоть до 3 дополнительных растяжений (Perez-Burgos A., Wang B et al., American journal of physiology Gastrointestinal and liver physiology 2013;304:G211-20). Авторы изобретения таким образом использовали 2 из 3 следующих друг за другом растяжений для сравнения. Активация множественных нейронов составила 111,5±16,7 Гц во время растяжения, но после добавления DSM 17938 в течение 20 мин растяжение усилило активацию лишь до 86,5±10,6 Гц (5, 0,31). Частота активации спинномозгового одиночных нейронов составила 3,01±0,44 Гц во время растяжения, но в присутствии DSM 17938 активация составила 1,71±0,16 во время растяжения (28, 0,008, Фигура 4A). Частота активации перед растяжением составляла 0,31±0,05 для контроля и 0,25±0,07 Гц для добавления DSM 17938 (28, 0,053, Фигура 4A). Антагонист TRPV1 6-иодонордигидрокапсаицин (10 мкМ) имитирует действие DSM 17938 на ответ одиночных нейронов посредством уменьшения ответа на растяжение с 3,26±0,73 до 2,23±0,50 Гц (13, =0,0002, Критерий Уилкоксона, Фигура 4B при отсутствии никардипина).
ПРИМЕР 2
DSM 17938 блокирует индуцируемое капсаицином увеличение Ca
в первичных культурах нейронов DRG
2+
Первичные культуры спинномозговых ганглиев (DRG)
Позвоночный столб отделили от тела, перенесли в лабораторный стакан, содержащий ледяной раствор Кребса, и продольно рассекли. DRG выделили и собрали от грудопоясничных уровней. Целые DRG дважды промыли средой Лейбовица L-15 (GIBCO, Gaithersburg, MD) и инкубировали в течение 40 мин в коллагеназе 1 типа при 1 мг/мл (Sigma-Aldrich; Oakville, ON, Canada) и 0,5 мл трипсина (0,25%, GIBCO) в 20 мл L-15 при 37°C. После дополнительного добавления 5 мл L-15, содержащей 10% фетальную бычью сыворотку (FBS, GIBCO), ганглии центрифугировали в течение 5 мин при 1000 об/мин, затем дважды промывали питательной средой (L-15, содержащей 10% FBS, 1% пенициллина/стрепотмицина/глутамина, 1% HEPES и 1% пирувата Na). DRG помещали в 2 мл питательной среды и 10 раз растирали. Затем ганглии центрифугировали в течение 10 с при 500 об/мин, а супернатант переносили в стерильную пробирку. Их ресуспендировали в 2 мл питательной среды, повторно растирали дор тех пор, пока объем перенесенного супернатанта не составил 10 мл, центрифугировали в течение 5 мин при 1000 об/мин, и итоговый осадок ресуспендировали в 3 мл питательной среды. Нейроны наносили на 3 чашки Петри со стеклянным дном, покрытым поли-d-лизином (MatTek, Ashland, MA). Через 30 мин в каждую чашку дополнительно добавляли 1,5 мл питательной среды и целиком инкубировали в течение 24 ч при 37°C с карбогеном.
Визуализация Ca
2+
2+
2+
0
0
Нейроны DRG поместили в плексигласовую чашку для регистрации и загрузили индикатор Ca Fluo-4-AM (8 мкМ), разведенный в растворе Кребса с 0,1% плюрониловой кислотой (в DMSO) при 37°C в течение 60 мин. Чашку помещали в отделение для регистрации и заливали свежим раствором Кребса (~34°C) на 15 мин, чтобы вымыть краситель. Клетки рассматривали в инвертированном микроскопе (Nikon eclipse TE 2000-S, Melville, NY) и получали изображение, используя камеру Rolera-XR (Surrey, BC, Canada). Интенсивность флуоресценции в отдельных нейронах регистрировали с помощью программного обеспечения Simple PCI 6 (Compix Inc, Imaging systems, Sewickley, PA). Лекарственные препараты доставляли посредством микропипетки, прикрепленной к импульсному распылителю с электронным регулированием давления (Picospritzer II; General Valve, Fairfield, NJ) с кончиком <100 мкМ из клетки. Изображения, зарегистрированные при 0,9 кадров/с, сохраняли на локальном жестком диске. Файлы изображений анализировали в автономном режиме, используя программное обеспечение Image J (NIH, USA, http://imagej.nih.gov/ij). Увеличение Fluo-4 Ca при введении капсаицина измеряли в виде соотношения (F/F) интенсивности флуоресценции после капсаицина (F), разделенную на интенсивность до капсаицина (F). Бактериями и лекарственными препаратами манипулировали, как в Примере 1.
Результаты
Lactobacillus rhamnosus
N=
2+
2+
2+
9
8
8.5
9
2+
0
0
.
Специфичность действия DSM 17938 на спинномозговые нейроны дополнительно исследовали путем исследования способности бактерий подавлять ответ TRPV1-рецептора на капсаицин. В данные эксперименты также включили JB-1. JB-1 (), как ранее было продемонстрировано, уменьшает боль и активирующий разряд одиночных волокон DRG, индуцируемые растяжением желудка (Duncker et al., The Journal of Nutrition 2011). Поскольку открытие TRPV1-каналов повышает концентрацию внутриклеточного Ca, авторы изобретения использовали визуализацию Ca первичной культуры нейронов DRG для данных экспериментов. Распыление 1 мкМ капсаицина на нейроны DRG вызывало повышение внутриклеточного Ca в течение ~30 с (Фигура 5A). Поскольку у TRPV1-канала может уменьшаться чувствительность с повторным воздействием лиганда, авторы изобретения лишь однократно вводили капсаицин в каждую чашку для культивирования. Затем за 30 мин перед введением капсаицина авторы изобретения добавили либо DSM 17938, либо JB-1. DSM 17938 при 1×10 КОЕ/мл снижал коэффициент роста флуоресценции с 2,36±0,31 (контрольная группа, 14) до 1,25±0,04 F/F.Но 1×10 КОЕ/мл DSM 17938 изменило F/Fдо 2,67±0,35, а 1×10 КОЕ/мл DSM 17938 до 2,07±0,27. Добавление 1×10 КОЕ/мл JB-1 имело небольшое действие и изменило соотношение F/F0 до 2,48±0,19 (N=9), которое является сходным с соотношением, полученным с одним капсаицином (Фигура 5B). Данные результаты демонстрируют, что DSM 17938 может блокировать повышение Ca, индуцируемое капсаицином, в первичных культурах нейронов DRG
ПРИМЕР 3
DSM 17938 подавляет замедление частоты сердечных сокращений, вызванное растяжением желудка
9
Всего 17 крыс разделили на 2 группы. По прибытии крысам давали акклиматизироваться в течение 1 недели с последующей обработкой в течение 1 недели (10 мин/сут) для минимизации действия стресса во время экспериментов. Крыс кормили через желудочный зонд в течение 9 дней либо с 0,2 мл (1×10 КОЕ/мл) живого DSM 17938 в растворе Кребса, либо только раствором Кребса в качестве контроля (носитель). Способы растяжения желудка опубликованы ранее (Tougas, Wang, American Journal of Physiology 1999;277:R272-8). Кратко, крысы голодали в течение ночи, были интраперитонеально анестезированы смесью кетамина гидрохлорида (75 мг/кг массы тела) и ксилазина (10 мг/кг массы тела). При необходимости давали поддерживающую анестезию. После срединной лапаротомии устройство для растяжения, состоящее из шаровидного желудочного баллона (внутренний диаметр 2 см), прикрепленного к тефлоновому катетеру (20 см), вставляли в желудок через маленький разрез в проксимальной части двенадцатиперстной кишки и соединяли с системой баростат (Distender, G&J Electronic, Toronto, Canada). Ответ сердца измеряли, раздувая при этом баллон воздухом до давления, составляющего 40 и 60 мм рт.ст. в течение 60 м. Для восстановления после каждого растяжения давали десять минут отдыха. Во избежание возможных компенсаторных механизмов каждой крысе наносили только одну серию растяжений, и после измерения крыс умерщвляли до возвращения в сознание. Непрерывную регистрацию частоты сердечных сокращений выполняли посредством электрокардиограммы с поверхности тела, состоящей из 3 игольчатых электродов, наложенных на левую и правую передние конечности и правую заднюю конечность. Сигнал усиливали и регистрировали на персональном компьютере, используя коммерческую программу сбора данных (Experimenter’s Workbench, DataWave Technologies, Loveland, CO). Частоту сердечных сокращений измеряли в течение 60 с до, во время и после каждого растяжения всего в течение 180 с. Регистрация частоты сердечных сокращений (HR) перед каждым растяжением позволяла корректировать возможные исходные изменения вследствие различий в уровнях анестезии и обеспечивала, что ответ любой частоты сердечных сокращений может быть связан с растяжением. Для контроля действия растяжения желудка на протяжении времени данные были представлены в виде среднего изменения от HR в покое (100%=покой), используя среднюю HR, зарегистрированную в период 10 с во время растяжения (10, 20, 30, 40, 50, и 60 с). Группы сравнивали, используя средние изменения HR (процент HR в покое) у всех крыс той же группы во время 60 с каждого растяжения (40 и 60 мм рт.ст.). Бактериями и лекарственными препаратами манипулировали, как в Примере 1.
Результаты
P=
N=
P=
Уменьшение частоты сердечных сокращений, вызванное 40 мм рт.ст., введение DSM 17938 через желудочный зонд не изменяло (0,121, Фигура 6A) (8 и 9 с носителем и DSM 17938, соответственно). Раздувание до 60 мм рт.ст. снижало частоту сердечных сокращений в течение 10 с, которое сохранялось в течение 30 с во время растяжения (Фигура 6B). Введение DSM 17938 через желудочный зонд в течение 9 дн. до исследования смягчало ответ на 60 мм рт.ст. (0,028, критерий Стьюдента для одной выборки, Фигура 6A, 6B). Податливость желудка (объем/давление) не отличалась у животных, обработанных носителем и DSM 17938, для давления растяжения желудка, составляющего 40 или 60 мм рт.ст. (данные не показаны). Данные результаты демонстрируют антиноцицептивное действие бактерий.