ЭФФЕКТИВНЫЕ ВИРУСОПОДОБНЫЕ ЧАСТИЦЫ (VLPS) ГРИППА
EFFECTIVE INFLUENZA VLPS

Уровень техники
Вирус гриппа является членом семейства Orthomyxoviridae (см. обзор Murphy and Webster, 1996). Существуют три подтипа вирусов гриппа, обозначенные A, B и C. Вирион гриппа содержит сегментированный геном отрицательно-смысловой РНК. Вирион гриппа включает следующие белки: гемагглютинин (HA), нейраминидазу (NA), матричный (М1), белок протонного ионного канала (M2), нуклеопротеин (NP), основный белок полимеразы 1 (PB1), основный белок полимеразы 2 (PB2), кислотный белок полимеразы (PA) и неструктурный белок 2 (NS2). HA, NA, М1 и M2 являются мебраносвязанными, в то время как NP, PB1, PB2, PA и NS2 представляют собой белки, связанные c нуклеокапсидом. NS1 является единственным неструктурным белком, не связанным с частицами вириона, но специфичным для зараженных гриппом клеток. Белок М1 является самым распространенным белком в частицах гриппа. Белки HA и NA представляют собой гликопротеины капсулы, ответственные за прикрепление вируса и за проникновение вирусных частиц в клетку, и являются источниками основных иммунодоминантных эпитопов для нейтрализации вируса и защитного иммунитета. Белки HA и NA считают самыми важными компонентами для профилактических вакцин против гриппа.
2
Инфекция вирусом гриппа инициируется присоединением поверхностного белка HA вириона к клеточному рецептору, содержащему сиаловую кислоту (гликопротеины и гликолипиды). Белок NA служит посредником в процессинге рецептора сиаловой кислоты, и проникновение вируса в клетку зависит от HA-зависимого эндоцитоза, опосредованного рецептором. На кислотной границе интернализированных эндосом, содержащих вирион гриппа, белок HA претерпевает конформационные изменения, которые приводят к слиянию вирусной и клеточной мембран и декапсидации вируса и опосредованному M2 высвобождению белков М1 из связанных с нуклеокапсидом рибонуклеопротеинов (RNPs), которые мигрируют в ядро клетки для синтеза вирусной РНК. Антитела к белкам HA предотвращают вирусную инфекцию путем нейтрализации инфекционности вируса, в то время как антитела к белкам NA опосредуют свое действие на ранних этапах репликации вируса.
Вакцины инактивированных вирусов гриппа A и B в настоящее время разрешены для парентерального введения. Эти трехвалентные вакцины получены в аллантоисной полости куриных яиц с эмбрионом, очищены с помощью зонального центрифугирования или колоночной хроматографии, инактивированы формалином или β-пропиолактоном и составлены в виде смеси двух штаммов типа A и типа B вирусов гриппа, циркулирующих среди населения в течение данного года. Доступные коммерческие вакцины гриппа представляют собой вирусные вакцины целого вируса (WV) или субвириона (SV; разделенный или очищенный поверхностный антиген). Вакцина WV содержит интактные инактивированные вирионы. Вакцины SV, обрабатываемые растворителями такими, как три-н-бутилфосфат (Flu-Shield, Wyeth-Lederle), содержат почти все вирусные структурные белки и некоторые из капсул вируса. Вакцины SV, солюбилизированные с помощью Triton X-100 (Fluzone, Connaught; Fluvirin, Evans), преимущественно содержат скопления мономеров HA, NA и NP, хотя присутствуют остаточные количества других структурных белков вируса. Недавно перспективная холодовая живая аттенюированная вакцина против вируса гриппа (FluMist, MedImmune) получила одобрение FDA на рынке для коммерческого использования как вакцина, доставляемая интраназально, показанная для активной иммунизации и профилактики заболевания, вызванного вирусами гриппа A и B у здоровых детей и подростков в возрасте 5-17 лет и у здоровых взрослых в возрасте 18-49 лет.
Несколько рекомбинантных продуктов разрабатывали как кандидаты рекомбинантных вакцин против гриппа. Эти подходы направлены на экспрессию, выработку и очистку белков HA и NA гриппа типа А, включая экспрессию этих белков с применением клеток насекомого, инфицированных бакуловирусом (Crawford и др., 1999; Johansson, 1999; Treanor и др., 1996), вирусных векторов (Pushko и др., 1997; Berglund и др., 1999) и конструкции вакцины ДНК (Olsen и др., 1997).
Crawford и др. (1999) продемонстрировали, что HA гриппа, экспрессированный в клетках насекомого, инфицированных бакуловирусом, может предотвращать смертельное заболевание гриппа, вызванное птичьими подтипами гриппа H5 и H7. В то же время, другая группа продемонстрировала, что экспрессированные бакуловирусом белки HA и NA гриппа индуцируют иммунные ответы у животных до индукции обычной вакциной (Johansson и др., 1999). Иммуногенность и эффективность экспрессированного бакуловирусом гемагглютинина вируса лошадиного гриппа сравнивали с гомологичным кандидатом вакцины ДНК (Olsen и др., 1997). Вместе эти данные продемонстрировали, что может стать причиной перспективы высокой степени защиты против вируса гриппа с помощью рекомбинантных белков HA или NA с применением различных экспериментальных подходов и в различных моделях на животных.
Lakey и др. (1996) показали, что полученная из бакуловируса вакцина HA гриппа была хорошо переносимой и иммуногенной у людей добровольцев в Фазе I исследования безопасности увеличения дозы. Однако результаты исследований Фазы II, проводимых на нескольких относящийся к течению болезни участках у людей добровольцев, вакцинированных несколькими дозами вакцин гриппа, состоявших из белков HA и/или NA, показали, что вакцины белка с рекомбинантными субъединицами не вызывали защитного иммунитета [G. Smith, Protein Sciences; M. Perdue, USDA, Personal Communications]. Эти результаты показали, что для появления нейтрализирующих антител и защитного иммунитета были важны конформационные эпитопы, выявленные на поверхности пепломеров HA и NA инфекционных вирионов.
+
+
Множество исследований было выполнено в отношении включения других белков гриппа в кандидаты рекомбинантных вакцин против гриппа, включая эксперименты, включающие нуклеопротеин гриппа, NP, один или в сочетании с белком М1 (Ulmer и др., 1993; Ulmer и др., 1998; Zhou и др., 1995; Tsui и др., 1998). Эти кандидаты вакцин, которые были составлены из квазиинвариантных внутренних белков вириона, вызвали иммунитет широкого спектра, который был прежде всего клеточным (и CD4 и CD8 памяти Т-клеток). Эти эксперименты включали использование ДНК или вирусных генетических векторов. Были необходимы относительно большие количества вводимой ДНК, поскольку результаты экспериментов с более низкими дозами ДНК не выявляли защиты, либо выявляли слабую защиту (Chen и др., 1998). Следовательно, могут потребоваться дополнительные предклиническое и клиническое исследования для оценки безопасности эффективности и устойчивости таких подходов на основе ДНК, включающих NP и М1 гриппа.
В недавнее время при попытке разработки более эффективных вакцин против гриппа использовали разделенные белки в виде носителей эпитопов белка M2 гриппа. Основанием для разработки вакцины, основанной на M2, было то, что в экспериментальном исследовании защитный иммунитет против гриппа вызывали белки M2 (Slepushkin и др., 1995). Neirynck и др. (1999) использовали трансмембранный домен M2 длиной в 23 аминокислоты в качестве партнера амино-концевого слияния с антигеном ядра вируса гепатита B (HBcAg) для экспонирования эпитопа (эпитопов) M2 на поверхности капсид-подобных частиц HBcAg. Однако, несмотря на то, что как полный белок M2, так и M2-HBcAg VLP индуцировали детектируемые антитела и защиту у мышей, было маловероятно, что будущие вакцины гриппа будут основаны исключительно на белке M2, поскольку белок M2 присутствовал с низким числом копий на каждый вирион, был слабо антигенным, не мог индуцировать антитела, которые связывали свободные вирионы гриппа и не мог блокировать прикрепление вируса к рецепторам клетки (то есть нейтрализовывать вирус).
Так как предыдущее исследование показало, что поверхностные гликопротеины гриппа, HA и NA, являются первичными мишенями для того, чтобы вызвать защитный иммунитет против вируса гриппа и что М1 обеспечивает устойчивую мишень для клеточного иммунитета к гриппу, новый кандидат вакцины может включать эти вирусные антигены в виде белковых макромолекулярных частиц таких, как вирусоподобные частицы (VLPs). Дополнительно, частица с этими антигенами гриппа может демонстрировать конформационные эпитопы, которые вызывают нейтрализирующие антитела к множеству штаммов вирусов гриппа.
Несколько исследований продемонстрировали, что рекомбинантные белки гриппа могли самоорганизоваться в VLPs в клеточной культуре с применением плазмид экспрессии млекопитающих или бакуловирусных векторов (Gomez-Puertas и др., 1999; Neumann и др., 2000; Latham и Galarza, 2001). Gomez-Puertas и др. (1999) продемонстрировали, что эффективное формирование VLP гриппа зависит от уровней экспрессии вирусных белков. Neumann и др. (2000) создали систему экспрессии млекопитающих на основе плазмиды для получения инфекционных частиц, подобных вирусу гриппа, полностью из клонированных кДНК. Latham и Galarza (2001) сообщали о формировании VLPs гриппа в клетках насекомого, зараженных рекомбинантным бакуловирусом, совместно экспрессирующих гены HA, NA, М1 и M2. Эти исследования продемонстрировали, что белки вириона гриппа могут самоорганизовываться при совместной экспрессии в эукариотических клетках.
Сущность изобретения
В соответствии с настоящим изобретением представлены макромолекулярные белковые структуры, которые содержат кодирующие последовательности вируса птичьего гриппа типа H9N2 для белков HA (инвентарный номер GenBank AJ404626), NA (инвентарный номер GenBank AJ404629), М1 (инвентарный номер GenBank AJ278646), M2 (инвентарный номер GenBank AF255363) и NP (инвентарный номер GenBank AF255742) и которые содержат кодирующие последовательности вируса гриппа человека типа H3N2 для HA (инвентарный номер GenBank AJ311466) и для NA (инвентарный номер GenBank AJ291403). Геномная РНК, кодирующая эти гены вируса гриппа, может быть выделена из изолятов вируса гриппа или из тканей зараженных гриппом организмов. Каждая из этих кодирующих последовательностей из одного или различных штаммов или типов вируса гриппа клонируется ниже (в положении даунстрим) промоторов транскрипции в векторах экспрессии и экспрессируется в клетках.
Таким образом, изобретение обеспечивает макромолекулярную белковую структуру, содержащую (a) белок М1 первого вируса гриппа и (b) дополнительный структурный белок, который может включать белок М1 второго или следующего вируса гриппа; белок HA первого, второго или следующего вируса гриппа; белок NA первого, второго или следующего вируса гриппа и белок M2 первого, второго или следующего вируса гриппа. Если дополнительный структурный белок не от белка М1 второго или следующего вируса гриппа, то включены оба или все члены группы, например белки M2 первого и второго вируса гриппа. По существу обеспечивается функциональная структура белка гриппа, включая субвирусную частицу, VLP или капсомерную структуру, или его часть, вакцину, мультивалентную вакцину и их смеси, главным образом, состоящие из структурных белков вируса гриппа, полученных способом в соответствии с изобретением. В особенно предпочтительном варианте выполнения макромолекулярная белковая структура гриппа включает белки вируса гриппа HA, NA и М1, которые являются продуктами экспрессии генов вируса гриппа, клонированных как синтетические фрагменты от вируса дикого типа.
Макромолекулярная белковая структура может также включать дополнительный структурный белок, например нуклеопротеин (NP), мембранные белки других видов вирусов, не являющихся вирусами гриппа, и мембранный белок не из вируса гриппа, которые получены из птиц или млекопитающих и различных подтипов вируса гриппа, включая вирусы гриппа подтипов A и B. Изобретение может включать химерную макромолекулярную белковую структуру, которая включает часть, по меньшей мере, одного белка, содержащего фрагмент, не продуцируемый вирусом гриппа.
Профилактику гриппа можно проводить путем обеспечения макромолекулярной белковой структуры, которая может быть самоорганизована в клетке-хозяине из рекомбинантной конструкции. Макромолекулярная белковая структура в соответствии с изобретением способна самоорганизовываться в гомотипические или гетеротипические вирусоподобные частицы (VLPs), которые демонстрируют конформационные эпитопы на белки HA и NA, которые вызывают нейтрализирующие антитела, являющиеся защитными. Состав может представлять собой состав вакцины, который также содержит носитель или разбавитель и/или адъювант. Эффективные VLPs гриппа вызывают нейтрализирующие антитела против одного или более штаммов или типов вируса гриппа в зависимости от того, содержат ли эффективные VLPs гриппа белки HA и/или белки NA от одного или более штаммов или типов вируса. Вакцина может включать белки вируса гриппа, которые являются белками вируса гриппа дикого типа. Предпочтительно, структурные белки, содержащие VLP гриппа или ее часть, можно получить из различных штаммов вирусов гриппа дикого типа. Вакцины гриппа можно вводить людям или животным для вызывания защитного иммунитета против одного или более штаммов или типов вируса гриппа.
Макромолекулярные белковые структуры в соответствии с изобретением могут демонстрировать активность гемагглютинина и/или активность нейраминидазы.
Изобретение обеспечивает способ выработки VLP, полученной из гриппа путем создания рекомбинантной конструкции, которая кодирует структурные гены гриппа, включая М1, HA, и, по меньшей мере, один структурный белок, полученный из вируса гриппа. Рекомбинантную конструкцию используют для трансфекции, инфекции или трансформации подходящей клетки-хозяина рекомбинантным бакуловирусом. Клетку-хозяина культивируют при условиях, допускающих экспрессию М1, HA и, по меньшей мере, одного структурного белка, полученного из вируса гриппа, и VLP формируется в клетке-хозяине. Собирают среды инфицированных клеток, содержащие эффективную VLP гриппа и очищают VLP. Изобретение также описывает дополнительный этап cовместной трансфекции, cовместной инфекции или совместной трансформации клетки-хозяина второй рекомбинантной конструкцией, которая кодирует второй белок гриппа, включая, таким образом, второй белок гриппа в VLP. Такие структурные белки можно получить из вируса гриппа, включая NA, M2 и NP, и, по меньшей мере, один структурный белок получают от птиц или млекопитающих. Структурный белок может представлять собой вирусы гриппа подтипов A и B. В соответствии с изобретением клетка-хозяин может представлять собой эукариотическую клетку. Кроме того, VLP может представлять собой химерную VLP.
Изобретение также описывает способ получения лекарственного вещества, содержащего VLP гриппа, путем введения рекомбинантных конструкций, кодирующих гены вируса гриппа, в клетки-хозяева и обеспечения самосборки рекомбинантных белков вируса гриппа, в эффективную гомотипическую или гетеротипическую VLP в клетках. VLP гриппа выделяют и очищают, и получают вещество лекарственного средства, содержащее VLP гриппа. Лекарственное вещество может дополнительно включать адъювант. Кроме того, изобретение обеспечивает способ получения продукта лекарственного средства путем смешивания такого лекарственного вещества, содержащего VLP гриппа, с липидной везикулой, например неионной липидной везикулой. Таким образом, эффективные гомотипические или гетеротипические VLPs могут формироваться в виде частиц в капсулах из зараженных клеток. Сформированные VLPs гриппа можно выделить и очистить с помощью ультрацентрифугирования или колоночной хроматографии в виде лекарственных веществ и приготовить без добавок или с адъювантами такими, как Novasomes, продукт Novavax, Inc., в виде лекарственных продуктов таких, как вакцины. Novasomes, которые обеспечивают усиление иммунологического действия, дополнительно описаны в Патенте США № 4911928, включенного сюда в виде ссылки.
Изобретение обеспечивает способ обнаружения гуморального иммунитета к гриппу у позвоночного путем обеспечения тестового реактива, включающего эффективное для обнаружения антитела количество белка вируса гриппа, имеющего, по меньшей мере, один конформационный эпитоп макромолекулярной структуры вируса гриппа. Тестовый реактив вводят в контакт с образцом физической жидкости позвоночного, которого обследуют на грипп. Антителам, специфичным к вирусу гриппа, содержавшимся в образце, позволяют связаться с конформационным эпитопом макромолекулярной структуры вируса гриппа для образования комплексов антиген-антитело. Данные комплексы отделяют от несвязанных комплексов и вводят в контакт со связывающим иммуноглобулин агентом, меченным детектируемой меткой. Определяют количество связывающего иммуноглобулин агента, меченного детектируемой меткой, который связан с комплексом.
Вирус гриппа можно обнаружить в образце от животного или человека, с подозрением на заражение вирусом, путем обеспечения антител, которые содержат метку, вырабатывающую детектируемый сигнал, или которые присоединены к меченному для детекции реактиву, обладающих специфичностью, по меньшей мере, к одному конформационному эпитопу частицы вируса гриппа. Образец вводят в контакт с антителами, и антителам позволяют связаться с вирусом гриппа. Наличие вируса гриппа в образце определяют посредством детектируемой метки.
Изобретение обеспечивает способы лечения, профилактики и выработки защитного иммунного ответа путем введения позвоночному эффективного количества композиции в соответствии с изобретением.
В качестве альтернативы, лекарственное вещество VLP гриппа можно готовить в виде лабораторных реактивов, используемых для исследований структуры вируса гриппа и клинических диагностических проб. Изобретение также обеспечивает набор для лечения от вируса гриппа путем введения эффективного количества композиции в соответствии с изобретением и инструкцией по применению.
Краткое описание графического материала
На фиг.1 показана нуклеотидная последовательность гена нейраминидазы (NA) вируса птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (SEQ ID NO: 1).
На фиг.2 показана нуклеотидная последовательность гена гемагглютинина (HA) вируса птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (SEQ ID NO: 2).
На фиг.3 показана нуклеотидная последовательность гена матричного белка М1 (М1) вируса птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (SEQ ID NO: 3).
На фиг.4 показаны векторы переноса для конструкции рекомбинантных бакуловирусов для экспрессии белков птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) HA, NA и М1. На фиг.4А показан вектор переноса для экспрессии отдельных генов, и на фиг.4B показан вектор переноса для мультиэкспрессии генов.
На фиг.5 показана экспрессия белков вируса птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) HA, NA и М1 в клетках Sf-9S.
На фиг.6 показана очистка VLPs птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) способом градиента плотности сахарозы.
На фиг.7 показано обнаружение белка вируса гриппа с помощью гель-фильтрационной хроматографии. Антитела, используемые в анализах Вестерн-блоттинга, следующие: (A) анти-H9N2 кролика; (b) анти-М1 мыши; и (C) анти-BACgp64 мыши.
На фиг.8 показано обнаружение белков птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2), включая подвирусные частицы, VLP и комплексы VLP с помощью электронной микроскопии.
На фиг.9 показана активность гемагглютинации очищенных VLPs птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2).
На фиг.10 показана активность нейраминидазы очищенных VLPs птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2).
На фиг.11 показана таблица иммунизации и отбора проб для изучения иммуногенности рекомбинантного гриппа с очищенными VLPs птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) у мышей.
На фиг.12 показаны результаты изучения иммуногенности у мышей, иммунизированных рекомбинантным гриппом H9N2 VLPs. На фиг.12A показана сыворотка от мышей BALB/c, иммунизированных рекомбинантными VLPs, состоящими из белков HA, NA и М1 от вируса птичьего гриппа типа A/H9N2/Hong Kong/1073/99. На фиг.12B показана сыворотка от новозеландских белых кроликов, иммунизированных инактивированным вирусом птичьего гриппа типа H9N2, подвергнутая реакции с Вестерн-блоттингами, содержащими инактивированный вирус птичьего гриппа типа H9N2 (дорожки 1 и 3) или адаптированный к холоду вирус птичьего гриппа типа H9N2 (дорожки 2 и 4).
Подробное описание изобретения
r
6
6
Используемый в настоящем изобретении термин "бакуловирус", также известный как baculoviridae, относится к семейству инкапсулированных ДНК вирусов членистоногих, члены которого могут использоваться в качестве векторов экспрессии для получения рекомбинантных белков в клеточных культурах. Вирион содержит один или более нуклеокапсид в форме стержня, содержащий молекулу кольцевой суперскрученной двухспиральной ДНК (M 54×10-154×10). Вирус, используемый в качестве вектора, по существу представляет собой вирус ядерного полиэдроза (NVP) Autographa californica. Экспрессия введенных генов находится под контролем сильного промотора, который обычно регулирует экспрессию компонента полиэдрического белка крупного ядерного включения в зараженных клетках, в которое встроены вирусы.
Используемый в настоящем изобретении термин "полученный из" относится к происхождению или источнику и может включать встречающиеся в природе, рекомбинантные, неочищенные, или очищенные молекулы. Белки и молекулы в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены из молекул гриппа или молекул, не относящихся к вирусу гриппа.
Используемый в настоящем изобретении термин белок "первого" вируса гриппа, то есть, белок М1 первого вируса гриппа, относится к белку такому, как М1, HA, NA и M2, полученному из специфического штамма вируса гриппа. Штамм или тип первого вируса гриппа отличается от штамма или типа белка второго вируса гриппа. Таким образом, белок "второго" вируса гриппа, то есть, белок М1 второго вируса гриппа, относится к белку такому, как М1, HA, NA и M2, полученному из второго штамма вируса гриппа, который представляет собой штамм или тип, отличный от белка первого вируса гриппа.
Используемый в настоящем изобретении термин "активность гемагглютинина" относится к способности белков, содержащих HA, VLPs или их части, связывать и агглютинировать красные кровяные клетки (эритроциты).
Используемый в настоящем изобретении термин "активность нейраминидазы" относится к ферментативной активности белков, содержащих NA, VLPs или их части, для отщепления остатков сиаловой кислоты от субстратов, включая белки, такие как фетуин.
Используемый в настоящем изобретении термин "гетеротипический" относится к одному или более различным типам или штаммам вируса.
Используемый в настоящем изобретении термин "гомотипический" относится к одному типу или штамму вируса.
Используемый в настоящем изобретении термин "макромолекулярная белковая структура" относится к конструкции или организации одного или более белков.
Используемый в настоящем изобретении термин "мультивалентная" вакцина относится к вакцине против множества типов или штаммов вируса гриппа.
Используемый настоящем изобретении термин "не относящийся к гриппу" относится к белку или молекуле, которая получена не из вируса гриппа.
патогенов
антител
Вакцину
гриппу
Используемый в настоящем изобретении термин "вакцина" относится к приготовлению умерщвленных или ослабленных , или получаемых антигенных детерминант, которые используются для индуцирования формирования  или иммунитета против инфекционного агента.  назначают для обеспечения иммунитета к заболеванию, например к , которое вызвано вирусами гриппа. Настоящее изобретение обеспечивает вакцинные составы, которые являются иммуногенными и обеспечивают защиту.
Грипп остается повсеместно распространенной проблемой общественного здравоохранения, несмотря на наличие специфических инактивированных вирусных вакцин, которые эффективны на 60-80%, при оптимальных условиях. Если данные вакцины эффективны, то болезнь обычно предотвращается путем предупреждения вирусной инфекции. Нарушение работы вакцины может возникать в результате накопления отклонений антигенов (антигенная изменчивость и антигенный дрейф). Например, вирус птичьего гриппа типа H9N2 распространялся совместно с вирусом гриппа человека типа A Sydney/97 H3N2 у свиней и приводил к генетической рекомбинации и появлению новых штаммов вируса гриппа человека с потенциалом пандемии (Peiris и др., 2001). В случае такой антигенной изменчивости маловероятно, что существующие вакцины обеспечили бы подобающую защиту.
Другой причиной недостаточности программ вакцинирования против гриппа является относительно недолговременное сохранение иммунитета, вызываемого существующими вакцинами. Дополнительная недостаточность мер по контролю за гриппом отражает ограниченное применение существующие вакцин из-за реактогенности вакцин и побочных эффектов у маленьких детей, пожилых и людей с аллергиями к компонентам яиц, которые используют в производстве коммерчески лицензированных вакцин инактивированных вирусов гриппа.
Дополнительно, инактивированные вакцины вируса гриппа часто не содержат или содержат измененные конформационные эпитопы HA и NA, которые вызывают нейтрализующие антитела и играют главную роль в защите от заболевания. Таким образом, инактивированные вирусные вакцины, так же как некоторые рекомбинантные белковые вакцины мономерной субъединицы гриппа, обеспечивают неадекватную защиту. С другой стороны, макромолекулярные белковые структуры такие, как капсомеры, субвирусные частицы и/или VLPs, включают множественные копии нативных белков, демонстрируют конформационные эпитопы, которые являются предпочтительными для оптимальной иммуногенности вакцины.
Настоящее изобретение описывает клонирование генов HA, NA и М1 вируса птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) в одиночном бакуловирусном векторе экспрессии отдельно или в тандеме и выработку кандидатов вакцины против гриппа или реактивов, состоящих из рекомбинантных структурных белков гриппа, которые самоорганизуются в эффективные и иммуногенные гомотипические макромолекулярные белковые структуры, включая субвирусные частицы гриппа и VLP гриппа, в инфицированных бакуловирусом клетках насекомого.
Настоящее изобретение дополнительно описывает клонирование генов HA, NA, М1, M2 и NP вируса гриппа человека A/Sydney/5/94 (H3N2) в бакуловирусных векторах экспрессии и выработку кандидатов вакцины против гриппа или реактивов, состоящих из структурных белков гриппа, которые самоорганизуются в эффективные и иммуногенные гомотипические макромолекулярные белковые структуры, включая субвирусные частицы гриппа и
VLP гриппа, в инфицированных бакуловирусом клетках насекомого.
Кроме того, настоящее изобретение описывает клонирование гена HA вируса гриппа человека A/Sydney/5/94 (H3N2) и генов HA, NA и М1 птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) в единичном бакуловирусном векторе экспрессии в тандеме и выработку кандидатов вакцины против гриппа или реактивов, состоящих из структурных белков гриппа, которые самоорганизуются в эффективные и иммуногенные гетеротипические макромолекулярные белковые структуры, включая субвирусные частицы гриппа и VLP гриппа, в инфицированных бакуловирусом клетках насекомого.
Данное изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими примерами, которые не следует рассматривать как ограничение. Содержание всех ссылок, патентов и опубликованных заявок на патент, приводимых на всем протяжении данного изобретения, а также чертежи и список последовательностей включены здесь в качестве ссылочного материала.
ЧАСТНЫЕ ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1
Материалы и Способы
Ac
Гены вируса птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) HA, NA и М1 экспрессировали в клетках Spodoptera frugiperda (линия клеток Sf-9S; ATCC PTA 4047) с применением бакуловирусной бакмидной системы экспрессии. Гены HA, NA и М1 синтезировали с помощью обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (PCR) с применением РНК, выделенной из вируса птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (фиг.1, 2 и 3). Для обратной транскрипции и PCR использовали олигонуклеотидные праймеры, специфичные к генам вируса птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) HA, NA и М1 (Таблица 1). Копии кДНК этих генов первоначально клонировали в бактериальный вектор субклонирования, pCR2.1TOPO. Гены HA, NA и М1 из получающихся трех плазмид на основе pCR2.1TOPO вставляли ниже промоторов полиэдрина MNPV в бакуловирусном векторе переноса pFastBac1 (InVitrogen), что приводило к трем плазмидам на основе pFastBac1: pHA, pNA и pM1, экспрессирующим данные гены вируса гриппа соответственно. Затем создавали отдельную плазмиду pHAM на основе pFastBac1, кодирующую гены HA и М1, каждый ниже отдельного промотора полиэдрина (фиг.4). Определяли нуклеотидную последовательность гена NA с соседними 5'- и 3'- областями в плазмиде pNA (SEQ ID NO:1) (фиг.1). Одновременно определяли также нуклеотидные последовательности генов HA и М1 с соседними областями с применением плазмиды pHAM (SEQ ID NOS:2 и 3) (фиг.2 и 3).
Наконец, фрагмент рестрикции ДНК из плазмиды pHAM, кодирующей кассеты экспрессии HA и М1, клонировали в плазмиду pNA. В результате этого получилась плазмида pNAHAM, кодирующая гены вируса птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) HA, NA и М1 (фиг.4).
Плазмиду pNAHAM использовали для создания рекомбинантного бакуловируса, содержащего гены вируса гриппа NA, HA и М1, интегрированные в геном, каждый ниже отдельного бакуловирусного промотора полиэдрина. Инфекция пермиссивных клеток Sf-9S насекомого получающимся рекомбинантным бакуловирусом привела к совместной экспрессии этих трех генов гриппа в каждой клетке Sf-9S, зараженной таким рекомбинантным бакуловирусом.
Результаты
Продукты экспрессии в зараженных клетках Sf-9S контролировали через 72 часа после инфекции (p.i.) с помощью анализа SDS-PAGE, окрашивания белков кумасси синим, и вестерн-иммуноблот-анализа с применением HA- и M1-специфичных антител (фиг.5). Вестерн-иммуноблот-анализ выполняли с применением антитела кролика, выработанного против вируса гриппа типа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (CDC, Atlanta, Georgia, USA), или моноклонального антитела мыши к белку М1 гриппа (Serotec, UK). Белки HA, NA и М1 ожидаемых молекулярных весов (64 кДа, 60 кДа, и 31 кДа соответственно) были обнаружены с помощью вестерн-иммуноблот-анализа. По сравнению с количеством HA белка, обнаруженного в этой пробе, белок NA показал более низкую реакционную способность с сывороткой кролика к вирусу гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2). Объяснение количества поддающегося обнаружению белка NA включало более низкие уровни экспрессии белка NA из клеток Sf-9S, инфицированными рекомбинантным бакуловирусом, по сравнению с белком HA, более низкую реакционную способность NA с данной сывороткой в условиях денатурации в пробе вестерн-иммуноблота (в силу устранения важных эпитопов NA в ходе гель-электрофореза связывания с мембраной), более низкую авидность NA-антитела по сравнению с HA-антителом или более низкую численность NA-антител в сыворотке.
Культуральную среду от клеток Sf-9S, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом, экспрессирующим белки HA, NA и М1 A/Hong Kong/1073/99 (H9N2), также исследовали на белки гриппа. Очищенные супернатанты культуры подвергали ультрацентрифугированию при 27 000 об/мин для концентрирования высокомолекулярных белковых комплексов вируса гриппа таких, как субвирусные частицы, VLP, комплексы VLP, и, возможно, другие самоорганизовавшиеся частицы, состоящие из белков гриппа HA, NA и М1. Белковые продукты из осадка ресуспендировали в забуференном фосфатным буфером солевом растворе (PBS, pH 7,2) и дополнительно очищали ультрацентрифугированием в прерывистых шаговых 20-60% градиентах сахарозы. Собирали фракции из градиентов сахарозы и анализировали с помощью анализа SDS-PAGE, вестерн-иммуноблот-анализа и электронной микроскопии.
Белки HA и М1 гриппа ожидаемых молекулярных весов обнаруживали в множестве фракций градиента плотности сахарозы с помощью окрашивания кумасси синим и вестерн-иммуноблот-анализа (фиг.6). Это говорит о том, что вирусные белки гриппа от зараженных клеток Sf-9S агрегируют в комплексы с высоким молекулярным весом такие, как капсомеры, субвирусные частицы, VLP и/или комплексы VLP. Белки NA, не смотря на несовместное обнаружение с помощью окрашивания кумасси синим и вестерн-иммуноблот-анализа, что вероятно было из-за неспособности сыворотки кролика против гриппа распознать денатурированный белок NA в пробе вестерн-иммуноблота, были совместно обнаружены в пробе ферментативной активности нейраминидазы (фиг.10).
Наличие высокомолекулярных VLPs было подтверждено гельфильтрационной хроматографией. Аликвоту от фракций градиента плотности сахарозы, содержащую вирусные белки гриппа, загрузили в колонку Сефарозы CL-4B для фракционирования, основанного на массе. Колонку откалибровали декстраном синим 2000, декстраном желтым и витамином В12 (Amersham Pharmacia) с допустимыми молекулярными весами 2 000 000, 20 000, и 1 357 дальтон соответственно и определили пустой объем колонки. Как ожидалось, высокомолекулярные вирусные белки гриппа мигрировали в пустой объем колонки, что характеризовало макромолекулярные белки такие, как вирусные частицы. Фракции проанализировали с помощью вестерн-иммуноблот-анализа для обнаружения белков гриппа и бакуловирусов. Например, белки М1 обнаружили во фракциях пустого объема, которые также содержали белки бакуловируса (фиг.7).
Морфологию VLPs гриппа и белков во фракциях градиента сахарозы выясняли с помощью электронной микроскопии. Для электронной микроскопии с негативным окрашиванием белки гриппа от двух фракций градиента плотности сахарозы фиксировали 2% глютаральдегидом в PBS, pH 7,2. Электронномикроскопическое исследование негативно-окрашенных образцов выявило наличие макромолекулярных белковых комплексов или VLPs в обеих фракциях. Данные VLPs демонстрировали различные размеры, включая диаметры приблизительно 60 и 80 нм, и морфологию (сферы). Также обнаруживали более крупные комплексы обоих типов частиц, а также частицы в форме стержня (фиг.8). Все наблюдаемые макромолекулярные структуры содержали выступы (пепломеры) на поверхности, которые являются характеристичными для вирусов гриппа. Поскольку по размеру и виду 80 нм частицы были сходны с частицами вируса гриппа дикого типа, эти структуры, вероятно, представляли собой VLPs, которые обладают отдельными сходствами с вирионами гриппа дикого типа, включая сходную геометрию частицы, архитектуру, число триангуляции, симметрию и другие характеристики. Более мелкие частицы с размером приблизительно 60 нм могут представлять собой субвирусные частицы, которые отличаются от VLPs как морфологически, так и структурно. О схожем феномене рекомбинантных макромолекулярных белков различных размеров и морфологии также сообщали для других вирусов. Например, рекомбинантный основной антиген (HBcAg) вируса гепатита B формирует частицы различных размеров, которые имеют различную архитектуру и число триангуляции T=4 и T=3 соответственно (Crowther и др., 1994).
Для того, чтобы охарактеризовать функциональные свойства очищенных VLPs гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2), образцы протестировали в пробе гемагглютинации (фиг.9) и пробе фермента нейраминидазы (фиг.10). Для пробы гемагглютинации 2-кратные разбавления очищенных VLPs гриппа смешивали с 0,6% эритроцитов морской свинки и культивировали при 4°C в течение 1 часа или 16 часов. Степень гемагглютинации исследовали визуально и определяли самое высокое разбавление рекомбинантных белков гриппа, способных агглютинировать эритроциты (фиг.9). Более того, множество фракций от градиента плотности сахарозы показали гемагглютинирующую активность, что говорило о присутствии множества макромолекулярных и мономерных форм белков гриппа. Самый высокий обнаруженный титр составлял 1:4000. В контрольном опыте вирус гриппа дикого типа A/Shangdong демонстрировал титр 1:2000. Проба гемагглютинации показала, что рекомбинантные VLPs, состоящие из белков HA, NA и М1 вируса гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2), были функционально активны. Это говорило о том, что компоновка, конформация и сворачивание белков субъединицы HA в VLPs были подобны или идентичны таковым из вируса гриппа дикого типа.
Кроме того, пробу фермента нейраминидазы выполняли на образцах очищенных VLPs H9N2. Величину активности нейраминидазы во фракциях градиента плотности сахарозы определяли с применением фетуина в качестве субстрата. В нейраминидазной пробе нейраминидаза отщепляла сиаловую кислоту от молекул субстрата с высвобождением сиаловой кислоты для измерения. Мышьяковистокислый реактив добавляли для остановки ферментативной активности. Количество высвобожденной сиаловой кислоты определяли химически с помощью тиобарбитуровой кислоты, которая создает розовое окрашивание, пропорциональное количеству свободной сиаловой кислоты. Величину цвета (хромофора) измеряли спектрофотометрически при длине волны 549 нм. С применением этого способа активность нейраминидазы обнаружили во фракциях градиента сахарозы, содержащих VLPs грипп (фиг.10). Как и ожидалось, активность наблюдалась в нескольких фракциях, с двумя пиковыми фракциями. В качестве положительного контроля использовали вирус гриппа дикого типа. Вирус гриппа дикого типа продемострировал ферментативную активность нейраминидазы, сопоставимую с таковой для очищенных VLPs гриппа. Эти сведения подтверждали результаты с HA в отношении конформации белков и говорили о том, что очищенные VLPs вирус гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) были функционально схожими с вирусом гриппа дикого типа.
Результаты описанных выше анализов и проб указывали на то, что экспрессия белков HA, NA и М1 гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) была достаточной для самоорганизации и транспорта эффективных VLPs из зараженных бакуловирусом клеток насекомого. Поскольку данные VLPs гриппа представляли собой самоорганизованные структурные белки гриппа и демонстрировали функциональные и биохимические свойства, сходные с таковыми из вируса гриппа дикого типа, данные VLPs гриппа сохраняли важные структурные конформации, включая поверхностные эпитопы, необходимые для эффективных вакцин гриппа.
ПРИМЕР 2: RT-PCR клонирование генов вируса птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99
Целью настоящего изобретения является обеспечение синтетических последовательностей нуклеиновой кислоты, способных управлять продуцированием рекомбинантных белков вируса гриппа. Такие синтетические последовательности нуклеиновой кислоты получали с помощью способов обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (PCR) с применением естественной геномной РНК вируса гриппа, выделенной из вируса. Для цели данной заявки последовательность нуклеиновой кислоты обозначает РНК, ДНК, кДНК или любой их синтетический вариант, кодирующий белок.
Вирус птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) предоставлен доктором К. Subbarao (Centers for Disease Control, Atlanta, GA, USA). Вирусную геномную РНК выделяли способом кислотно-фенольной экстракции РНК при условиях сдерживания распространения болезни с 3 Уровнем Биологической безопасности (BSL3) в CDC с применением реактива Trizol LS (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Молекулы кДНК вирусных РНК получали с помощью обратной транскрипции с применением обратной транскриптазы MuLV (InVitrogen) и PCR с применением олигонуклеотидных праймеров, специфичных к белкам HA, NA и М1 и ДНК полимеразы Taq I (InVitrogen) (Таблица 1). Фрагменты PCR клонировали в бактериальном векторе субклонирования, pCR2.1TOPO (InVitrogen), между сайтами Eco RI, которые привели к трем рекомбинантным плазмидам, содержащим кДНК клоны HA, NA и М1.
ПРИМЕР 3: RT-PCR клонирование генов вируса гриппа человека A/Sydney/5/94 (H3N2)
Вирус гриппа A/Sydney/5/94 (H3N2) был получен от доктора М. Massare (Novavax, Inc, Rockville, MD). Вирусную геномную РНК выделяли способом кислотно-фенольной экстракции РНК при условиях сдерживания распространения болезни BSL2 в Novavax, Inc. с применением реактива Trizol LS (Invitrogen). Молекулы кДНК вирусных РНК получали с помощью обратной транскрипции и PCR с применением олигонуклеотидных праймеров, специфичных к белкам HA, NA, М1, M2 и NP (Таблица 2). Фрагменты PCR клонировали в бактериальный вектор субклонирования, pCR2.1TOPO, между сайтами Eco RI, которые привели к пяти рекомбинантным плазмидам, содержащим кДНК клоны HA, NA, М1, M2 и NP.
ПРИМЕР 4: Клонирование вирусных кДНК птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99 в бакуловирусные векторы переноса
Из плазмид на основе pCR2.1TOPO в бакуловирусный вектор переноса pFastBac1 (InVitrogen) субклонировали гены HA, NA или М1 в полиэдрическом локусе и сайтах Tn7 att ниже промотора полиэдрина бакуловируса и выше (в положении апстрим) сигнальной последовательности полиаденилирования. Вирусные гены лигировали с помошью T4 ДНК лигазы. Для гена HA фрагмент ДНК Bam HI-Kpn I из pCR2.1TOPO-HA вставляли в плазмидную ДНК pFastBac1, расщепленную с помощью Bam HI-Kpn I. Для гена NA фрагмент ДНК Eco RI из pCR2.1TOPO-NA вставляли в плазмидную ДНК pFastBac1, расщепленную с помощью Eco RI. Для гена M1 фрагмент ДНК Eco RI из pCR2.1TOPO-M1 вставляли в плазмидную ДНК pFastBac1, расщепленную с помощью Eco RI. Компетентные бактерии E. coli DH5α (InVitrogen) трансформировали с помощью этих реакций лигирования ДНК, получали трансформированные колонии и выделяли бактериальные клоны. Получающиеся плазмиды на основе pFastBac1, pFastBac1-HA, pFastBac1-NA и pFastBac1-hM1 характеризовали с помощью картирования с ферментом рестрикции на агарозных гелях (фиг.4A). Нуклеотидные последовательности, показанные на фиг.1-3, из клонированных генов определяли с помощью автоматизированного секвенирования ДНК. Анализ последовательности ДНК показал, что клонированные гены HA, NA и М1 гриппа были идентичны ранее опубликованным нуклеотидным последовательностям для этих генов [гены NA, HA и М1 гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (инвентарные номера GenBank AJ404629, AI404626 и AJ278646 соответственно)].
ПРИМЕР 5: Клонирование вирусных кДНК гриппа человека A/Sydney/5/94 в бакуловирусные векторы переноса
Из плазмид на основе pCR2.1TOPO в бакуловирусный вектор переноса pFastBac1 (InVitrogen) субклонировали гены HA, NA, М1, M2 и NP в полиэдрическом локусе и сайтах Tn7 att ниже промотора полиэдрина бакуловируса и выше сигнальной последовательности полиаденилирования. Вирусные гены лигировали с помощью T4 ДНК лигазы. Для гена HA фрагмент ДНК Bam HI-Kpn I из pCR2.1TOPO-hHA3 вставляли в плазмидную ДНК pFastBac1, расщепленную с помощью Bam HI-Kpn I. Для гена NA фрагмент ДНК Eco RI из pCR2.1TOPO-hNA вставляли в плазмидную ДНК pFastBac1, расщепленную с помощью Eco RI. Для гена M1 фрагмент ДНК Eco RI из pCR2.1TOPO-hM1 вставляли в плазмидную ДНК pFastBac1, расщепленную с помощью Eco RI. Для гена M2 фрагмент ДНК Eco RI из pCR2.1TOPO-hM2 вставляли в плазмидную ДНК pFastBac1, расщепленную с помощью Eco RI. Для гена NP фрагмент ДНК Eco RI из pCR2.1TOPO-hNP вставляли в плазмидную ДНК pFastBac1, расщепленную с помощью Eco RI. Компетентные бактерии E. coli DH5α (InVitrogen) трансформировали с помощью этих реакций лигирования ДНК, получали трансформированные колонии и выделяли бактериальные клоны. Получающиеся плазмиды на основе pFastBac1, pFastBac1-hHA3, pFastBac1-hNA2, pFastBac1-hM1, pFastBac1-hM2 и pFastBac1-hNP характеризовали с помощью картирования с ферментом рестрикции на агарозных гелях. Нуклеотидные последовательности клонированных генов определяли с помощью автоматизированного секвенирования ДНК. Анализ последовательности ДНК показал, что клонированные гены HA, NA, М1, M2 и NP гриппа были идентичны ранее опубликованным нуклеотидным последовательностям для этих генов.
ПРИМЕР 6: Конструирование мультигенных бакуловирусных векторов переноса, кодирующих множество вирусных генов птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99
Для конструирования бакмидных векторов переноса на основе pFastBac1, экспрессирующих множество вирусных генов гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2), сначала клонировали фрагмент ДНК Sna BI-HPA I из плазмиды pFastBac1-M1, содержащей ген М1 в сайт Hpa I pFastBac1-HA. Это приводило к плазмиде pFastBac1-HAM, кодирующей гены HA и М1 в независимых кассетах экспрессии, экспрессируемые под контролем отдельных промоторов полиэдрина.
В итоге фрагмент ДНК Sna BI-Avr II из pFastBac1-HAM, содержащей кассеты экспрессии HA и М1, переносили в плазмидную ДНК pFastBac1-NA, расщепленную с помощью HpaI-Avr. Это приводило к плазмиде pFastBac1-NAHAM, кодирующей три независимые кассеты экспрессии для экспрессии генов HA, NA и М1 гриппа, экспрессируемых под контролем отдельных промоторов полиэдрина (фиг.4B).
В другом примере ген H3 из pFastBac1-hHA3 (см. Пример 5) клонировали в pFastBac1-NAHAM в качестве четвертого гена вируса гриппа для экспрессии и выработки гетеротипического гриппа VLPs.
ПРИМЕР
7: Создание мультигенного рекомбинантного бакуловируса, кодирующего гены NA, HA и М1 вируса птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99 в клетках насекомого
Получающийся мультигенный бакмидный вектор переноса pFastBac1-NAHAM, использовали для создания мультигенного рекомбинантного бакуловируса, кодирующего гены HA, MA и М1 птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) для экспрессии в клетках насекомого. Рекомбинантные бакмидные ДНК получали с помощью сайт-специфичной рекомбинации в последовательностях ДНК полиэдрина и Tn7 att между ДНК pFastBac1-NAHAM и бакуловирусным геномом AcMNPC, содержащимися в компетентных клетках E. coli DH10BAC (InVitrogen) (фиг.4B). Рекомбинантную бакмидную ДНК выделяли способом mini-prep плазмидной ДНК и трансфицировали в клетки Sf-9s с применением катионного липида CELLFECTIN (InVitrogen). После трансфекции рекомбинантные бакуловирусы выделяли, очищали методом бляшкообразования и амплифицировали в клетках Sf-9S насекомого. Запас вирусов приготовили в клетках Sf-9S насекомого и характеризовали по экспрессии продуктов генов HA, NA и М1 вируса птичьего гриппа. Получающийся рекомбинантный бакуловирус обозначили как bNAHAM-H9N2.
ПРИМЕР 8: Экспрессия рекомбинантных белков птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99 в клетках насекомого
6
Клетки Sf-9S насекомого, поддерживаемые в виде суспензионных культур в колбах аппарата для встряхивания при 28°C в бессывороточной среде (HyQ SFM, HyClone, Ogden, UT) инфицировали рекомбинантным бакуловирусом, bNAHAM-H9N2 при плотности клеток 2×10 клеток/мл, при кратности инфекции (MOI) 3 бляшкообразующих единицы на клетку. Вирусную инфекцию проводили в течение 72 часов для обеспечения экспрессии белков гриппа. Экспрессия белков птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) HA и М1 в зараженных клетках насекомого была подтверждена с помощью SDS-PAGE и вестерн-иммуноблот-анализов. Анализ SDS-PAGE выполняли в 4-12% линейном градиенте гелей NuPAGE (Invitrogen) в восстанавливающих и денатурирующих условиях. Первичные антитела в вестерн-иммуноблот-анализе представляли собой поликлональную антисыворотку кролика против птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2), полученную от CDC, и моноклональную мышиную антисыворотку к белку М1 гриппа (Serotec, UK). Вторичные антитела для вестерн-иммуноблот-анализа представляли собой конъюгированную щелочной фосфатазой антисыворотку козьего IgG против IgG кролика или мыши (H+L) (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD, USA). Результаты этих анализов (фиг.5) показали, что белки HA и М1 экспрессировались в инфицированных бакуловирусом клетках насекомого.
ПРИМЕР 9: Очистка рекомбинантных вирусоподобных частиц и макромолекулярных белковых комплексов птичьего гриппа H9N2
Супернатанты культуры (200 мл) от клеток Sf-9S насекомого, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом bNAHAM-H9N2, которые экспрессировали продукты генов HA, NA и М1 птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2), собирали центрифугированием с низкой скоростью. Супернатанты культуры очищали центрифугированием в ультрацентрифуге Sorval RR-5B в течение 1 часа при 10 000g и 4°C с применением ротора GS-3. Вирус и VLPs выделяли из очищенных супернатантов культуры центрифугированием в ультрацентрифуге Sorval OTD-65 в течение 3 часов при 27000 об/мин и 4°C с применением бакет-ротора Sorval TH-641. Осадок вируса ресуспендировали в 1 мл PBS (pH 7,2), загружали в 20-60% (вес/об) прерывистый шаговый градиент сахарозы и растворяли центрифугированием в ультрацентрифуге Sorval OTD-65 в течение 16 часов при 27000 об/мин и 4єC с применением ротора Sorval TH-641. Фракции (0,5 мл) собирали из верхней части градиента сахарозы.
Белки гриппа во фракциях градиента сахарозы анализировали с помощью SDS-PAGE и вестерн-иммуноблот-анализов, как описано выше в примере 6. Белки HA и М1 нашли в тех же фракциях градиента сахарозы (фиг.6), что и показанные вестерн-блот-анализом, что говорило о том, что белки HA и М1 были связаны в виде макромолекулярных белковых комплексов. Также белки HA и М1 обнаруживали во фракциях по всему градиенту сахарозы, что говорило о том, что эти рекомбинантные вирусные белки были связаны с макромолекулярными белковыми комплексами с различными плотностью и составом.
ПРИМЕР 10: Анализ рекомбинантных VLPs и белков птичьего гриппа H9N2 с помощью гельфильтрационнной хроматографии
Белковые макромолекулы такие, как VLPs и мономерные белки, по-разному мигрируют в колонках гельфильтрационной или эксклюзионной хроматографии в зависмости от их массы, размера и формы. Для того, чтобы определить, были ли рекомбинантные белки гриппа из фракций градиента сахарозы мономерными белками или макромолекулярными белковыми комплексами такими, как VLPs, приготовили хроматографическую колонку (7 мм×140 мм) со слоем ионита с CL-4B сефарозой (Amersham) в объеме 14 мл. Колонку для эксклюзионной хроматографии уравновешивали PBS и калибровали декстраном синим 2000, декстраном желтым и витамином В12 (Amersham Pharmacia) с допустимыми молекулярными весами 2000000; 20000 и 1357 соответственно с тем, чтобы установить пустой объем колонки. Декстран синий 2000 элюировал из колонки в пустой объем (фракция 6 мл). Как и ожидалось, комплексы рекомбинантных белков гриппа также элюировали из колонки в пустой объем (фракция 6 мл). Этот результат служил характеристикой макромолекулярного белкового комплекса с высоким молекулярным весом таким, как VLPs. Вирусные белки во фракциях колонки обнаруживали с помощью вестерн-иммуноблот-анализа, как описано выше в примере 6. Белки М1 обнаруживали во фракциях пустого объема (фиг.7). Как и ожидалось, бакуловирусные белки также были в пустом объеме.
ПРИМЕР 11: Электронная микроскопия рекомбинантных VLPs гриппа
Чтобы определить, обладали ли макромолекулярные белковые комплексные соединения, выделенные на градиентах сахарозы и содержащие рекомбинантные белки птичьего гриппа, морфологией, сходной с вирионами гриппа, проводили электронномикроскопическое исследование негативно-окрашенных образцов. Рекомбинантные белковые комплексы птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) концентрировали и очищали от супернатантов культуры с помощью ультрацентрифугирования на прерывистых градиентах сахарозы, как описано в примере 7. Аликвоты фракций градиента сахарозы обрабатывали 2% глютаральдегидом в PBS, pH 7,2, абсорбировали на свежие разряженные покрытые углеродом пластиковые сетки и промывали дистиллированной водой. Образцы окрашивали 2% фосфовольфраматом натрия, pH 6,5 и исследовали с применением просвечивающего электронного микроскопа (Philips). Электронные микрофотографии негативно-контрастированных образцов рекомбинантных белковых комплексов птичьего гриппа H9N2 от двух фракций градиента сахарозы демонстрировали сферические частицы и частицы в форме стержня (фиг.8) от двух фракций градиента сахарозы. Частицы обладали различными размерами (60 и 80 нм) и морфологией. Также были обнаружены более крупные комплексы обоих типов частиц, а также частицы в форме стержня (фиг.8). Все наблюдаемые структуры белковых комплексов демонстрировали похожие на выступы поверхностные проекции, напоминающие пепломеры HA и NA вируса гриппа. Поскольку по размеру и виду 80 нм частицы были сходны с частицами вируса гриппа дикого типа, эти структуры, вероятно, представляли собой инкапсулированные VLPs гриппа. Более мелкие частицы с размером приблизительно 60 нм могут представлять собой субвирусные частицы, которые отличаются от VLPs как морфологически, так и структурно.
ПРИМЕР 12: Анализ функциональных характеристик белков гриппа с помощью пробы гемагглютинации
Для того, чтобы определить, обладали ли очищенные VLPs и белки гриппа функциональными активностями такими, как гемагглютинация и активность нейраминидазы, которые характерны для вируса гриппа, очищенные VLPs и белки гриппа тестировали в пробах гемагглютинации и нейраминидазы.
Для пробы гемагглютинации, готовили ряд 2-кратных разбавлений фракций градиента сахарозы, содержащих VLPs гриппа или положительный контроль дикого типа вируса гриппа типа A. Затем их смешивали с 0,6% эритроцитов морской свинки в PBS (pH 7,2) и культивировали при 4°C в течение 1-16 часов. В качестве отрицательного контроля использовали PBS. Степень гемагглютинации исследовали визуально и определяли самое высокое разбавление фракции, способной агглютинировать красные кровяные клетки морской свинки (фиг.9). Самый высокий обнаруженный титр для очищенных VLPs и белков гриппа составлял 1:4000, что было больше чем титр, показанный контролем гриппа дикого типа, который составлял 1:2000.
ПРИМЕР 13: Анализ функциональных характеристик белков гриппа с помощью пробы нейраминидазы
Величину активности нейраминидазы во фракциях градиента сахарозы, содержащих VLP гриппа, определяли с помощью нейраминидазной пробы. В этой пробе NA (фермент) действовал на субстрат (фетуин) и высвобождал сиаловую кислоту. Мышьяковистокислый реактив добавляли для остановки ферментативной активности. Количество высвобожденной сиаловой кислоты определяли химически с помощью тиобарбитуровой кислоты, которая создает розовое окрашивание, пропорциональное количеству свободной сиаловой кислоты. Уровень цвета (хромофора) измеряли в спектрофотометре при длине волны 549 нм. Данные, изображенные на фиг.8, продемонстрировали, что значительное количество сиаловой кислоты было произведено фракциями градиентов сахарозы, содержащими VLP, и что эти фракции соответствовали фракциям, демонстрирующим активность гемагглютинации.
ПРИМЕР 13: Иммунизация мышей BALB/c эффективными гомотипическими рекомбинантными VLPs гриппа H9N2
Иммуногенность рекомбинантного гриппа VLPs устанавливали с помощью иммунизации мышей с последующим вестерн-блот-анализом иммунных сывороток. Рекомбинантные VLPs (1 мкг/инъекция), состоящие из вирусных белков HA, NA и М1 из вируса птичьего гриппа типа A/Honk Kong/1073/99 и очищенные на градиентах сахарозы, подкожно инокулировали в область дельтовидной мышцы десяти (10) самок мышей BALB/c в день 0 и в день 28 (фиг.11). PBS (pH 7,2) вводили аналогичным образом в качестве отрицательного контроля пяти (5) мышам. У мышей отбирали пробы из надглазничной впадины в день 1 (предварительный отбор проб), в день 27 (первичный отбор проб) и в день 54 (вторичный отбор проб). Сыворотки собирали из проб крови после свертывания в течение ночи и центрифугирования.
Для вестерн-блот анализа, 200 нг инактивированного вируса птичьего гриппа типа H9N2, или адаптированного к холоду вируса птичьего гриппа типа H9N2, а также окрашенных с помощью See Blue Plus 2 белковых стандартов (InVitrogen), денатурировали (95°C, 5 минут) и подвергали электрофорезу в восстановленных условиях (10 мМ β-меркаптоэтанол) на гелях NuPAGE (InVitrogen) с 4-12% градиентом полиакриламида в буфере MES при 172 вольтах до тех пор, пока не исчезал краситель-"свидетель" бромфенол синий. Для белковых гелей электрофорированные белки визуализировали с помощью окрашивания реактивом коллоидного кумасси синего (InVitrogen). Белки переносили из геля на нитроцеллюлозные мембраны в метаноле в соответствии со стандартной процедурой вестерн-блоттинга. Сыворотки от VLP-иммунизированных мышей и кроликов, иммунизированных инактивированным вирусом птичьего гриппа H9N2 (сыворотка положительного контроля), разбавляли 1:25 и 1:100 соответственно в растворе PBS (pH 7,2) и использовали в качестве первичного антитела. Мембраны, связавшие белок, которые блокировали 5% казеином, подвергали реакции с первичной антисывороткой в течение 60 минут при комнатной температуре с постоянным встряхиванием. После промывания мембран с первичным антителом с забуференным фосфатом солевым раствором, содержащим Tween 20, вторичную антисыворотку [конъюгат козьего анти-мышиного IgG и щелочной фосфатазы (1:10000), или коньюгат козьего анти-кроличьего IgG и щелочной фосфатазы (1:10000)] подвергали реакции в течение 60 минут с мембраной. После промывания мембран с вторичным антителом с забуференным фосфатом солевым раствором, содержащим Tween 20, белки, связывающие антитела на мембранах, визуализировали путем обработки хромогенным субстратом таким, как NBT/BCIP (InVitrogen).
Результаты вестерн-блот-анализа (фиг.12) состояли в том, что белки с молекулярными весами, схожими с вирусными белками HA и М1 (75 и 30 кДа, соответственно), связывались с сыворотками положительного контроля (фиг.12B) и сывороткой от мышей, иммунизированных рекомбинантными VLPs гриппа H9N2 (фиг.12A). Эти результаты указывали на то, что рекомбинантные VLPs гриппа H9N2 в чистом виде были иммуногенными для мышей при данном пути назначения.
Следующие ссылки включены в настоящем изобретении в качестве ссылочного материала:
Berglund, P., Fleeton, M. N., Smerdou, C. and Liljestrom, P. (1999). Immunization with recombinant Semliki Forest virus induces protection against influenza challenge in mice.
Vaccine
17
, 497-507.
Vaccine
15
Cox, J.C. and Coulter, A.R. (1997). Adjuvants - a classification and review of their modes of action. , 248-256.
Vaccine
17
Crawford, J., Wilkinson, В., Vosnesensky, A., Smith, G., Garcia, M., Stone, H. and Perdue, M.L. (1999). Baculovirus-derived hemagglutinin vaccines protect against lethal influenza infections by avian H5 and H7 subtypes. , 2265-2274.
17
Crowther R.A., Kiselev N.A., Bottcher B., Berriman J.A., Borisova G.P., Ose V., Pumpens P. (1994). Three-dimensional structure of hepatitis В virus core particles determined by electron cryomicroscopy. Cell , 943-50.
J. Gen. Virol
80
Gomez-Puertas, P., Mena, I, Castillo, M., Vivo, A., Perez-Pastrana, E., and Portela, A. (1999). Efficient formation of influenza virus-like particles: dependence on the expression levels of viral proteins. , 1635-1645.
Vaccine
17
Johansson, B.E. (1999). Immunization with influenza A virus hemagglutinin and neuraminidase produced in recombinant baculovirus results in a balanced and broadened immune response superior to conventional vaccine. , 2073-2080.
J
Infect. Dis.
174,
Lakey, D.L., Treanor, J.J., Betts, B.F., Smith, G.E., Thompson, J., Sannella, E., Reed, G., Wilkinson, B.E., and Wright, P.E. (1996) Recombinant baculovirus influenza A hemagglutinin vaccines are well tolerated and immunogenic in healthy adults.. 838-841.
J.Virol.
75
Latham, Т., and Galarza, J.M. (2001). Formation of wild-type and chimeric influenza virus-like particles following simultaneous expression of only four structural proteins. , 6154-6165.
J.Virol.
70
Mena, L., Vivo, A., Perez, E., and Portela, A. (1996). Rescue of a synthetic chloramphenicol acetyltransferase RNA into influenza-like particles obtained from recombinant plasmids. , 5016-5024.
Murphy, B.R., and Webster, R.G. (1996). Orthomyxoviruses. In "Virology" (D. M. К. В. N. Fields, P.M. Howley, Eds.) Vol. 1, pp. 1397-1445. Lippincott-Raven, Philadelphia.
J
Virol.
74,
Neumann, G., Watanabe, Т., and Kawaoka, Y. (2000). Plasmid-driven formation of influenza virus-like particles. . 547-551.
Vaccine
15
Olsen, С.W., McGregor, M.W., Dybdahl-Sissoko, N., Schram, B. R., Nelson, K.M., Lunn, D.P., Macklin, M.D., and Swain, W.F. (1997). Immunogenicity and efficacy of baculovirus-expressed and DNA-based equine influenza virus hemagglutinin vaccines in mice. , 1149-1156.
J. Virol.
75
Peiris, J.S., Guan, Y., Markwell, D., Ghose, P., Webster, R.G., and Shortridge, K.F. (2001). Cocirculation of avian H9N2 and contemporary "human" H3N2 influenza A viruses in pigs in southwestern China: potential for genetic reassortment? , 9679-9686.
In:
Pumpens, P., and Grens, E. (2003). Artificial genes for chimeric virus-like particles. "Artificial DNA" (Khudyakov, Y.E. and Fields, H.A., Eds.) pp. 249-327. CRC Press, New York.
in vivo. Virology
239
Pushko, P., Parker, M., Ludwig, G.V., Davis, N.L., Johnston, R.E., and Smith, J.F. (1997). Replicon-helper systems from attenuated Venezuelan equine encephalitis virus: expression of heterologous genes in vitro and immunization against heterologous pathogens , 389-401.
Vaccine
13
Slepushkin, V.A., Katz, J.M., Black, R.A., Gamble, W.C. Rota, P.A., and Cox, N.J. (1995). Protection of mice against influenza A virus challenged by vaccination with baculovirus-expressed M2 protein. , 1399-1402.
J.Infect, Dis.
173
Treanor, J.J., Berts, R.F., Smith, G.E., Anderson, E.L., Hackett, С.S., Wilkinson, В.Е., Belshe, R.В., and Powers, D.C. (1996). Evaluation of a recombinant hemagglutinin expressed in insect cells as an influenza vaccine in young and elderly adults. , 1467-1470.
J. Virol.
72
Tsuji, M., et al. (1998). Recombinant Sindbis viruses expressing a cytotoxic T-lymphocyte epitope of a malaria parasite or of influenza virus elicit protection against the corresponding pathogen in mice. ,6907-6910.
Science
259
Ulmer, J. В., et al. (1993). Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein. , 1745-1749.
J. Virol.
72
Ulmer, J.В., et al. (1998). Protective CD4+ and CD8+ T cells against influenza virus induced by vaccination with nucleoprotein DNA. , 5648-5653.
J. Virol.
76
Watanabe, Т., Watanabe, S., Neumann, G., and Kawaoka, Y. (2002) Immunogenicity and protective efficacy of replication-incompetent influenza virus-like particles. , 767-773.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
92
Zhou, X., et al. (1995). Generation of cytotoxic and humoral immune responses by non-replicative recombinant Semliki Forest virus. , 3009-3013.
Специалистам в данной области известно или они смогут установить с применением не более, чем обычных экспериментов, множество эквивалентов конкретным вариантам выполнения изобретения, описанного здесь. Предполагается, что такие эквиваленты охватываются следующей формулой изобретения.