УСТРОЙСТВО ДЛЯ АНАЛИЗА БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ
DEVICE TO ANALYSE BIOLOGICAL FLUID

Изобретение относится к области исследования или анализа материалов с использованием оптических средств и может быть использовано для определения компонентов биологических жидкостей, а именно - плазмы и сыворотки крови, в частности, определения концентрации С-реактивного белка, концентрации тромбоцитов и показателей плазменного гемостаза.
Анализ состава плазмы (сыворотки) крови является основой для диагностики многих заболеваний, а также исследования действия фармакологических препаратов.
С-реактивный белок (С-РБ) - естественный компонент плазмы крови человека. Характерной особенностью С-РБ является резкое увеличение в крови его концентрации в ответ на целый ряд факторов, таких как воспаление, инфекция, травма, некроз, опухолевый рост, приводящих в итоге к тканевому повреждению. Поэтому тест на определение С-РБ является одним из основных для оценки состояния пациентов с различными воспалительными заболеваниями.
Современные схемы и способы лабораторной диагностики патологий системы гемостаза, как правило, включают оценку двух его звеньев - сосудисто-тромбоцитарного и плазменного (коагуляционного). Анализ показателей гемостаза необходим для профилактики и лечения целого ряда заболеваний, включая сердечнососудистые заболевания.
Перечень известных количественных иммунохимических методов определения С-РБ, представлен в таблице 1 (Ким С.В., Юдин К.Б., Трунова Л.А. // Лабор. дело. - 1990. - №9. - С.45-48).
Известные методы определения концентрации С-РБ в биологических жидкостях
Метод
Чувствительность
Время анализа
ЭИД
6 мг/л
5-22 ч
РИД
2-3 мг/л
24-48 ч
ФИА
20 мкг/л
12 ч
РЭИД
10 мкг/л
9 дней
ИФА
4-8 мкг/л
12-16 ч
РИА
3 мкг/л
24 ч
ЛА + ИНМ
30-50 мкг/л
0,5-1 ч
ИНМ
1-2 мг/л
0,25-3 ч
ЭИД - электроиммунодиффузия, РИД - радиальная иммунодиффузия, ФИА - флуоресцентно-иммунный анализ, РЭИД - радиоэлектроиммунодиффузия, ИФА - иммуноферментный анализ, РИА - радиоиммунный анализ, ЛА + ИНМ - латексная агглютинация с учетом результатов реакции иммунонефелометрии, ИНМ - иммунонефелометрия,
Существенным недостатком большинства из перечисленных в таблице 1 методов определения С-РБ (кроме последнего) - является большая длительность проведения анализов (от 1 ч до 9 дней), что ограничивает их применение в практике, в т.ч. в практике неотложной медицинской помощи (неонатальная инфекция, инфаркт миокарда и др.).
Известны оптические иммунохимические количественные лабораторные методы определения С-РБ - иммунонефелометрический (на основе регистрации рассеянного частицами пробы светового излучения) и иммунотурбидиметрический (регистрация прошедшего через пробу излучения) с временем определения менее 15 мин и чувствительностью до 0,4 мг/л (Gill С.W. An evaluation of a C-reactive protein assay using a rate immunonephelometric procedure / C.W. Gill, W.S. Bush, W.M. Burleigh, C.L. Fischer // Amer. J. Clin. Pathol. - 1981. - Vol.75. - P.50-55.); (Schwartz M.A. Development and performance of a fully automated method for assay of C-reactive protein in the аса Discrete clinical analyzer / M.A. Schwartz, R.S. Schifreen, E. Gorman [et al.] // Clin. Chem. - 1988. - Vol.34, №8. - P.1646).
Однако достигнутая чувствительность недостаточна для медицинской практики (используемые методы должны позволять точно измерять концентрацию С-РБ в пределах от 0,15 до 10 мг/л (Whicher J. Markers of the acute phase response in cardiovascular disease: an update / J. Whicher, N. Rifai, L.M. Biasucci // Clin. Chem. Lab. Med. - 2001. - Vol.39. - P.1054-1064).
Известны устройство (DE, патент 3127560 G01N 33/86, 1993) и устройство (RU, патент 2172483, МПК, 6 G01N 21/85, 2001), позволяющие определять параметры гемостаза турбидиметрическим методом: по изменениям светопропускания освещаемой источником света кюветы с пробой и магнитной мешалкой.
Недостатком этих устройств следует признать недостаточную чувствительность турбидиметрического метода, что обусловлено сложностью регистрации малых изменений светопропускания на фоне сильной засветки приемного устройства световым потоком, проходящим через кювету с пробой. Вследствие этого для увеличения чувствительности необходимо увеличивать путь взаимодействия света в кювете с пробой, что влечет за собой наряду с конструктивными осложнениями и увеличение объема исследуемой пробы.
Известно устройство (Affolter H., Platsches A., 'Rheoptical shape analysis of human blood platelets', Thromb Haemostas, 1982 v.48 (2), P.204-207) для определения параметров тромбоцитарного гемостаза, реализующее нефелометрический способ регистрации оптического сигнала о взаимодействии излучения с исследуемой пробой плазмы крови, включающее нефелометр с кюветным отделением и измерительным узлом, регистрирующим интенсивность светорассеяния в 40° угле.
Недостатком данного устройства является его недостаточная чувствительность (в частности, из-за большого угла наблюдения светорассеяния).
Известно нефелометрическое устройство, принятое за прототип (RU, патент 2343456 C1, МПК, G01N 21/47, G01N 33/49, 2009 «Устройство для определения агрегационной способности тромбоцитов и свертываемости крови»), содержащее размещаемую в термостатирующем блоке оптически прозрачную кювету с магнитной мешалкой и пробой с исследуемой плазмой крови, источник оптического излучения, освещающий кювету по нормали к ее поверхности и приемник света. При этом нормаль к чувствительной площадке приемника света и оптическая ось источника излучения составляют некоторый минимальный угол α, достаточный для того, чтобы проходящий через кювету световой поток не попадал на светочувствительную площадку приемника, регистрирующего рассеянное излучение.
Основным недостатком устройства, принятого за прототип, является не использованные возможности повышения чувствительности нефелометрического способа регистрации оптического излучения при его сочетании с турбидиметрическим способом.
Другим недостатком устройства - прототипа является использование в блоке перемешивания пробы магнитной мешалки, включающей в себя намагниченный шарик в кювете и - под ней - электродвигатель с постоянным магнитом на его оси. Использование шариков в кюветах сокращает производительность устройства (требуется дополнительное время для их раскладки), а применение электродвигателя сокращает ресурс устройства.
Техническая задача, решаемая посредством настоящего изобретения, - разработка устройства, позволяющего проводить быстро и с высокой точностью определение концентрации С-РБ и - после вызова соответствующих программ - концентрации тромбоцитов и показателей плазменного гемостаза (концентрация фибриногена, протромбиновое отношение, международное нормализованное отношение - MHO, АЧТВ, внутренние и внешние факторы свертывания и другие).
Технический результат, получаемый в результате реализации изобретения, состоит в повышении чувствительности и достоверности определения показаний плазменного гемостаза и концентрации как тромбоцитов, так и С-РБ, в том числе и в пробах с предельно низкой его концентрацией в диапазоне 0,1…0,5 мг/л, что необходимо, в частности, для неонатальной медицинской практики.
Для получения указанного технического результата предложено использовать устройство для анализа биологической жидкости для последовательного определения концентрации С-РБ, концентрации тромбоцитов и показателей плазменного гемостаза, включающее в себя комбинацию нефелометрического и турбидиметрического устройств регистрации оптического излучения, обеспечивающую повышение чувствительности каждого из этих устройств.
Разработанное устройство для анализа биологической жидкости путем определения концентрации С-РБ, концентрации тромбоцитов и показателей плазменного гемостаза содержит установленную в термостатирующем блоке оптически прозрачную кювету, источник оптического излучения, освещающий кювету, фотоприемное устройство и средство перемешивания пробы в кювете. Кроме того, оно дополнительно содержит два фотоприемных устройства, все фотоприемные устройства установлены вокруг продольной оси кюветы под разными углами α к оптической оси излучателя, причем нормаль к чувствительной площадке первого из них совпадает с оптической осью источника излучения, а нормали к чувствительным площадкам других фотоприемных устройств расположены под углами 30° и 90° соответственно к оптической оси излучателя, при этом выход первого фотоприемного устройства подключен к входу регулируемого блока питания источника излучения, первый выход регулируемого блока питания подключен к входу источника излучения, а второй его выход - к входу аналогово-цифрового преобразователя, при этом, второй и третий фотоприемные устройства также подключены к входам аналогово-цифрового преобразователя, выход которого подключен к регистрирующему блоку.
Средство перемешивания пробы, представляющее собой магнитодинамическое устройство, может быть выполнено следующим образом. Кювету с пробой своим дном устанавливают в изготовленную из магнитомягкого железа чашечку, выполняющую роль магнитного якоря в переменном магнитном поле устройства с электромагнитными катушками в количестве не менее двух, при этом верхняя часть кюветы закреплена в измерительной ячейке с использованием резинового кольца. В результате, верхняя часть кюветы остается практически неподвижной, в то время как ее дно колеблется с частотой электромагнитного поля между его полюсами, что обеспечивает перемешивание жидкости в кювете. При этом, возникающую за счет колебаний кюветы незначительную модуляцию проходящего через кювету оптического излучения (на частоте электромагнитного поля) убирают посредством программного обеспечения при обработке результатов измерений.
Регистрирующий блок представляет собой персональный компьютер, принтер, самописец или любое другое регистрирующее устройство.
В предпочтительном варианте реализации разработанное устройство содержит размещаемую в термостатирующем блоке оптически прозрачную кювету, предназначенную для размещения пробы исследуемой плазмы (сыворотки) крови, источник оптического излучения, освещающий кювету по нормали к ее поверхности, и три фотоприемных устройств (ФПУ). При этом нормаль к чувствительной площадке одного из них (ФПУ турбидиметра) совпадает с оптической осью источника излучения, а нормали к чувствительным площадкам нефелометрических ФПУ и оптическая ось источника излучения составляют определенные углы α в диапазоне 20°-90° в зависимости от размера определяемых частиц. При этом мощность источника излучения на оптическом входе ФПУ турбидиметра поддерживают постоянной в течении всего времени измерений посредством использования цепи обратной отрицательной связи между выходом ФПУ турбидиметра и управляющим входом регулируемого блока питания источника излучения. Регистрируемым информационным сигналом турбидиметра в этом случае является не интенсивность прошедшего через кювету света, а сила тока, проходящего через источник светового излучения, что существенно повышает чувствительность турбидиметрического метода определения параметров плазменного гемостаза, при этом появляется возможность работы с реагентами повышенной мутности, каковыми зачастую являются отечественные реагенты.
Использование нефелометра в сочетании с таким турбидиметром ведет к существенному повышению и его чувствительности при определении С-реактивного белка. Это обусловлено тем, что в результате иммунохимической реакции, инициируемой в пробе плазмы или сыворотки крови - при введении в нее соответствующего реагента (в процессе определения С-реактивного белка) - в кювете с пробой появляются рассеивающие излучение частицы (связанные антигены пробы с антителами реагента). Возникающее из-за этого снижение интенсивности проходящего через пробу излучения компенсируют (в каждый момент времени) увеличением мощности источника излучения благодаря использованию упомянутой выше цепи обратной отрицательной связи (между выходом ФПУ турбидиметра и управляющим входом регулируемого блока питания источника излучения установлено фотоприемное устройство). При этом возрастает и рассеянное излучение, регистрируемое нефелометрическим ФПУ, что и обеспечивает увеличение чувствительности нефелометра при регистрации малых концентраций С-реактивного белка.
В качестве источника излучения в устройстве могут быть использованы либо лазерный модуль, либо галогеновая лампа с блоком фокусировки и фильтрации излучения. При этом в том и другом случае вход излучателя подключают к выходу регулируемого блока питания, на вход которого подают электрический сигнал с выхода ФПУ турбидиметра. Выходы других приемников света подключают к входам АЦП, являющимся входным элементом регистрирующего устройства. Выходы АЦП подключают к персональному компьютеру (ПК) через интерфейс USB 2.0. ПК управляет в диалоговом режиме процессами измерения и определения требуемых параметров. Устройство может дополнительно содержать средство индикации информации на бумажный, магнитный или оптический носитель.
В устройстве используют кювету с круговым поперечным сечением, причем размер внутреннего диаметра кюветы выбирают исходя из условий оптимальной геометрии прохождении через пробу светового пучка и достаточного (для достижения требуемой чувствительности) пути взаимодействия света с пробой - предпочтительно 10 мм. Возможно использование как наливной, так и проточной кювет.
Для перемешивания пробы в кювете в предлагаемом устройстве используют магнитодинамическое средство, перемешивающее пробу бесконтактным магнитодинамическим способом - без шариков или других мешалок в кювете, для чего кювета с пробой своим дном устанавливают в изготовленную из магнитомягкого железа чашечку, выполняющую роль магнитного якоря в переменном магнитном поле устройства с электромагнитными катушками в количестве не менее двух, при этом верхняя часть кюветы закреплена в измерительной ячейке с использованием резинового кольца и остается практически неподвижной, в то время как ее дно колеблется с частотой электромагнитного поля между его полюсами, что обеспечивает перемешивание жидкости в кювете.
На фиг.1 приведена функциональная схема (в предпочтительном варианте реализации) измерительного узла устройства. Функциональная схема включает в себя фрагмент оптической схемы устройства в поперечном (относительно кюветы) сечении на уровне оптической оси излучателя.
Устройство объединено блоком (узлом) 1 с ячейкой 2 для кюветы 3 и отверстиями (не показаны) для прохождения световых пучков. Блок предпочтительно выполнен из металла. Нагреватель 4, управляемый термостабилизирующим устройством 5, установлен на боковой грани блока 1. Снизу блока 1, под дном кюветы размещено магнитодинамическое устройство 6, перемешивающее пробу бесконтактным способом (без шариков или других мешалок в кювете). Вход устройства 6 подключен к первому выходу АЦП 13.
В центральной части блока 1 размещен источник лазерного излучения - лазерный модуль 7, создающий световой пучок 8. ФПУ 9, 10 и 11 (на основе кремниевых фотодиодов) также закреплены на блоке 1. При этом нормаль к чувствительной площадке ФПУ 9 совпадает с осью пучка излучения 8, а нормали к чувствительным площадкам ФПУ 10 и 11 составляют с осью светового пучка 8 углы соответственно 30° и 90°. Выход ФПУ 9 подключен к входу управляемого блока питания 12 лазерного источника излучения 7. Первый выход блока питания 12 подключен к источнику излучения 7, а второй - к первому входу АЦП 13. Выход ФПУ 10 подключен ко второму входу АЦП 13, а выход ФПУ 11 - к третьему входу АЦП 13. Второй выход АЦП 13 и четвертый его вход подключены через интерфейс USB 2.0 к ПК 14 с подключенным к нему печатающим устройством 15.
ФПУ 9 является одним из основных элементов цепи обратной отрицательной связи между выходом ФПУ турбидиметра и управляющим входом регулируемого блока питания источника излучения. Регистрируемым информационным сигналом турбидиметра в этом случае является не интенсивность прошедшего через кювету света (нет прямого соединения с элементом 13 - АЦП, вместо этого есть связь ФПУ 9 с АЦП через посредство элемента 12).
В этом случае регистрируемым информационным сигналом турбидиметра является сила тока, проходящего через источник светового излучения, что существенно повышает чувствительность как турбидиметрического метода определения параметров плазменного гемостаза (в конечном итоге посредством ФПУ 9), так и нефелометрического метода определения С-реактивного белка посредством ФПУ 11 и концентрации тромбоцитов посредством ФПУ 10.
Используемое программное обеспечение устройства обеспечивает его работу в трех, активируемых с использованием ПК, режимах: «Определение концентрации С-реактивного белка», «Определение концентрации тромбоцитов» и «Определение показателей плазменного гемостаза».
В режиме работы «Определение концентрации С-реактивного белка» устройство работает следующим образом.
В цилиндрическую, выполненную из прозрачного полистирола кювету 3 помещают пробу плазмы (сыворотки) крови, подготовленную согласно методике гематологического анализа (см., например, «Инструкция по применению набора реагентов для определения концентрации С-реактивного белка в сыворотке и плазме крови», фирма ЗАО «ДИАКОН-ДС», г.Москва). Затем кювету 3 помещают в ячейку 2 и инкубируют пробу при температуре 37±1°С посредством нагревателя 4 и термостатирующего устройства 5 в течении запрограммированного времени инкубации. Включают устройство 6, перемешивающее бесконтактным способом пробу в кювете 3. Направляют на кювету 3 оптическое излучение от источника 7. По окончании времени инкубации подключают - через элемент 13 - выход элемента 11 к входу устройства 14 и помещают в кювету 3 порцию (не показано) стартового реагента. Регистрируют посредством элемента 11 уровень рассеянного излучения, обусловленного появлением в пробе рассеивающих излучение частиц (за счет иммунохимической реакции плазмы (сыворотки) крови с реагентом). С использованием устройства 14 рассчитывают концентрацию С-реактивного белка на основе заложенной ранее в память устройства 14 калибровочной зависимости уровня сигнала на выходе элемента 11 от концентрации С-реактивного белка (калибровку устройства - с использованием нескольких разведении стандартного калибровочного раствора С-реактивного белка, например, фирмы ЗАО «ДИАКОН-ДС», г.Москва, - проводят перед каждой серией измерений). Результаты расчета выводят на монитор ПК (14) или на подключенное к ПК печатающее устройство 15.
В режиме работы «Определение концентрации тромбоцитов» устройство работает следующим образом.
3
В цилиндрическую, выполненную из прозрачного полистирола кювету 3 помещают пробу плазмы крови, подготовленную согласно методике агрегометрического анализа (см., например, Пособие по изучению адгезивно-агрегационной активности тромбоцитов, НПО «Ренам», М., 2004). Затем кювету 3 помещают в ячейку 2 и инкубируют пробу при температуре 37±1°С посредством нагревателя 4 и термостатирующего устройства 5 в течении запрограммированного времени инкубации. Включают устройство 6, перемешивающее бесконтактным способом пробу в кювете 3. Направляют на кювету 3 оптическое излучение от источника 7. По окончании времени инкубации подключают - через элемент 13 - выход элемента 10 к входу устройства 14. Регистрируют посредством элемента 10 уровень рассеянного излучения. С использованием устройства 14 рассчитывают концентрацию тромбоцитов на основе заложенной ранее в память устройства 14 калибровочной зависимости уровня сигнала на выходе элемента 10 от числа тромбоцитов в калибровочных растворах - разведениях суспензии с фиксированным числом тромбоцитов, например, «Фиксированные человеческие тромбоциты, лиофильно высушенные», с концентрацией порядка 300·10 тромбоцитов/мкл (набор реагентов для определения фактора Виллебранда, НПО «Ренам», г.Москва), Результаты расчета выводят на монитор ПК 14 или на подключенное к ПК печатающее устройство 15.
В режиме «Определение показателей плазменного гемостаза» устройство работает следующим образом.
В цилиндрическую, выполненную из прозрачного полистирола кювету 3 помещают пробу плазмы крови, подготовленную согласно методике коагулологического анализа (см., например, Пособие для врачей-лаборантов по диагностическим методам определения гемоглобина и параметров свертывающей системы, НПО «Ренам», г.Москва, 1998). Затем кювету 3 помещают в ячейку 2 и инкубируют пробу при температуре 37±1°С посредством нагревателя 4 термостатирующего устройства 5 в течении запрограммированного времени инкубации. Включают устройство 6, перемешивающее бесконтактным способом пробу в кювете 3. Направляют на кювету 3 оптическое излучение от источника 7. По окончании времени инкубации подключают - через элемент 13 - выход элемента 12 к входу устройства 14 и помещают в кювету 3 порцию (не показано) стартового реагента. Регистрируют посредством элемента 12 два импульса, обусловленных двумя изменениями интенсивности светорассеяния - при падении в пробу порции стартового реагента и - при появлении в пробе сгустков или нитей фибрина. Посредством устройства 14 первоначально рассчитывают интервал времени между двумя импульсами, а затем проводят расчет требуемых показателей плазменного гемостаза. Необходимые для расчета калибровочные значения и константы вводят в устройство 14 в процессе диалога «оператор-ПК». Результаты расчета выводят на монитор ПК (14) или на подключенное к ПК печатающее устройство 15.
Использование предлагаемого устройства в медицинской практике для диагностики гематологических заболеваний позволяет измерять с высокой точностью концентрацию С-реактивного белка, в том числе и в пробах с предельно низкой его концентрацией в диапазоне 0,1…0,5 мг/л, что необходимо, в частности, для диагностики здоровья новорожденных.
9
Преимуществом устройства является также возможности его использования (посредством вызова соответствующих программ) для целей: определения показателей плазменного гемостаза, а также - определения концентрации тромбоцитов, включая патологически низкие (30-100)·10 тр/л, что необходимо при диагностике врожденных патологий тромбоцитарного звена гемостаза (тромбостения, тромбопатия).
Следующим преимуществом предлагаемого устройства является использование в нем бесконтактного магнитодинамического перемешивания жидкостной пробы, что повышает производительность устройства (исключается процедура раскладки в кюветы шариков или других мешалок) и его ресурс - за счет отказа от использования в перемешивающем устройстве электродвигателя.