СПОСОБ КОРРЕКЦИИ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ ПРЕПАРАТОМ ФОСФОГЛИВ ЛИОФИЛИЗАТ ПРИ L-NAME ИНДУЦИРОВАННОМ ДЕФИЦИТЕ ОКСИДА АЗОТА
METHOD FOR CORRECTION OF ENDOTHELIAL DYSFUNCTION WITH PREPARATION PHOSPHOGLIV LYOPHILIZATE IN L-NAME INDUCED NITROGEN OXIDE DEFICIENCY

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной кардиофармакологии.
Наиболее близким к заявленному решению является способ восстановления эндотелий зависимой холинергический релаксации грудной аорты спонтанно гипертензивных крыс с помощью фосфолипидных везикул (липосом), описанный A.I.Soloviev, A.V.Stefanov, O.V.Bazilyuk, V.F.Sagach в статье «Phospholipid vesicles (liposomes) restore endothelium-dependent cholinergic relaxation in thoracic aorta from spontaneously hypertensive rats» в J Hypertens. 1993, Jun; 11(6): 623-7, который заключается в том, что фосфолипидные липосомы в концентрации 100-125 мкг/мл восстанавливают эндотелийзависимую холинергическую релаксацию грудной аорты спонтанно гипертензивных крыс, нормализуют синтез и секрецию эндотелиального релаксирующего фактора, способствуют коррекции эндотелиальной функции поврежденных клеток эндотелия.
Основным недостатком способа является недостаточная биодоступность суспензии фосфолипидных липосом и риск их поглощения клетками ретикулоэндотелиальной системы, снижающие способность липосом достигать определенных тканей-мишеней. Поэтому с целью активации коррекции эндотелиальной дисфункции целесообразно применение препарата фосфоглив лиофилизат на основе фосфолипида и глицирата, восстанавливающего целостность и функцию поврежденных эндотелиальных клеток. Оптимальным решением для получения препарата фосфоглив лиофилизат было использование глицирата не только в качестве фармацевтической субстанции, но и как детергента, способствующего получению стабильных наночастиц, способных встраиваться в мембраны эндотелиальных клеток и эффективно восстанавливать активность мембранных ферментных систем и эндотелиальную функцию.
Техническим результатом изобретения является способ коррекции эндотелиальной дисфункции, включающий использование препарата фосфоглив лиофилизат. Перед введением животным содержимое одного флакона (2,5 г лиофилизата, в том числе фосфолипид в количестве 0,5 г и глицират в количестве 0,2 г) растворяли в 10 мл воды для инъекций. При расчете доз использовался коэффициент межвидового пересчета доз с человека на экспериментальное животное с учетом массы тела (Уланова И.П. и др., 1968 год).
Технический результат достигается тем, что на фоне моделирования эндотелиальной дисфункции в эксперименте путем внутрибрюшинного введения лабораторному животному в течение 7 суток блокатора синтеза NO N-нитро-аргинин-метолового эфира (L-NAME) в дозе 25 мг/кг, проводится ее коррекция внутрибрюшинным введением препарата фосфоглив лиофилизат в дозе 5,0 мл/кг и 0,5 мл/кг (для приготовления раствора содержимое одного флакона, т.е. 2,5 г лиофилизата, растворяют в 10 мл воды для инъекций) однократно в сутки.
СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ СЛЕДУЮЩИМ ОБРАЗОМ
Опыты проводят на белых крысах самцах линии Wistar массой 200-250 г. N-нитро-L-аргинин метиловый эфир (L-NAME) вводится внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг/сут. На 7 день от начала эксперимента под наркозом (этаминал-натрия 50 мг/кг) вводят катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей артериального давления (АД), болюсное введение фармакологических агентов осуществляют в правую бедренную вену. Показатели гемодинамики: систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряют непрерывно посредством датчика и компьютерной программы "Bioshell". Функциональные пробы: эндотелийзависимая вазодилатация (ЭЗВ)- внутривенное введение ацетилхолина (АХ) в дозе 40 мкг/кг, эндотелийнезависимая вазодилатация (ЭНЗВ) - внутривенное введение нитропруссида натрия (НП) в дозе 30 мкг/кг.
При статистической обработке данных рассчитывали среднее значение, величину стандартного отклонения. Различия считали достоверными при р<0,05.
Пример конкретного выполнения.
Болюсное внутривенное введение АХ в течение 3-5 сек приводило к резкому падению артериального давления, достигающего пика у интактных животных для систолического давления (САД) 84,3±4,4, для диастолического давления (ДАД) - 38,7±2,8 и для среднего артериального давления (СрАД) 53,9±2,7 мм рт. ст., при этом в течение первых 2-3 сек развивалась резкая брадикардия до 130-150 ударов в минуту. Восстановление АД происходило в среднем за 42,2±0,8 сек после нормализации сердечного ритма. ЭНЗВ также характеризовалась снижением САД до 83,0±3,7, ДАД до 42,1±4,4 и СрАД до 55,7±3,5 мм рт.ст. с последующим полным восстановлением в среднем в течение 45,1±1,0 сек. Блокада NO-синтазы с помощью длительного ежедневного в течение 7-суток внутрибрюшинного введения L-NAME (N-нитро-L-аргинин метиловый эфир в дозе 25 мг/кг) вызывала артериальную гипертензию (САД - 190,3±6,7, ДАД - 145,0±3,9, СрАД - 160,1±4,6 мм рт.ст.) и приводила к меньшему снижению показателей АД после введения АХ (САД до 110,6±5,2, ДАД до 82,8±6,6, СрАД до 92,1±6,1 мм рт.ст.) и НП (САД до 88,7±4,7, ДАД до 50,8±4,2 и СрАД до 63,4±4,1 мм рт.ст.) по сравнению с интактными животными.
Одновременное введение L-NAME и препарата фосфоглив лиофилизат в дозе 5,0 мл/кг и 0,5 мл/кг (для приготовления раствора 2,5 г лиофилизата растворяли в 10 мл воды для инъекций) внутрибрюшинно не приводило к снижению показателей исходных значений АД и составляло соответственно (САД - 181,0±10,5 и 203,2±11,3, ДАД - 138,3±7,8 и 157,4±8,4 мм рт.ст.) по сравнению с группой нелеченых животных (таблица 1.).
Таблица 1.Динамика показателей АД и ЧСС при моделировании дефицита оксида азота и коррекции эндотелиальной дисфункции препаратом фосфоглив (лиофилизат) на основе фосфолипида и глицирата.
Группы животных
Функциональные пробы
САД, мм рт.ст.
ДАД, мм рт.ст.
ЧСС, уд. в мин
Интактные
Исходные
137,7±3,7<sup>у</sup>
101,9±4,3<sup>у</sup>
420,0±9,0
ЭЗВ с АХ
84,3±4,5<sup>у</sup>
38,7±2,8<sup>у</sup>
416,0±14,0
ЭНЗВ с НП
83,0±3,7
42,1±4,4
415,0±10,0
Получавшие L-NAME (25 мг/кг)
Исходные
190,3±6,7<sup>*</sup>
145,0±3,9<sup>*</sup>
428,0±11,0
ЭЗВ с АХ
110,6±5,2<sup>*</sup>
82,8±6,6<sup>*</sup>
426,0±14,0
ЭНЗВ с НП
88,7±4,7
50,8±4,2
426,0±13,0
L-NAME (25 мг/кг)+ фосфоглив лиофилизат (5,0 мл/кг)
Исходные
181,0±10,5<sup>*</sup>
138,3±7,8*
364,6±9,6<sup>*у</sup>
ЭЗВ с АХ
95,0±3,2
58,9±4,0<sup>*у</sup>
360,0±9,3<sup>*У</sup>
ЭНЗВ с НП
94,6±4,9
47,8±4,0
375,1±10,2<sup>у</sup>
L-NAME (25 мг/кг)+ фосфоглив лиофилизат (0,5 мл/кг)
Исходные
203,2±11,3<sup>*</sup>
157,4±8,4*
391,3±4,9<sup>у</sup>
ЭЗВ с АХ
108,0±5,1
65,1±3,8*
378,1±4,2У
ЭНЗВ с НП
120,7±4,2<sup>*У</sup>
67,8±7,8
392,5±8,4
* - р<0,05 в сравнении с группой интактных
<sup>у</sup> - р<0,05 в сравнении с группой L-NAME
Принципиальная разница в ЭЗВ и ЭНЗВ у интактных животных и животных, получавших внутрибрюшинно ингибитор NO-синтазы, L-NAME закономерно привела к необходимости введения специального показателя, коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), характеризующего степень эндотелиальной дисфункции и являющегося отношением площади треугольника над трендом реакции восстановления АД в ответ на введение НП к площади треугольника над трендом реакции восстановления АД в ответ на введение АХ.
Рассчитывали это отношение у каждого животного интактной группы и животных после моделирования блокады NO-синтазы и получили разницу данного показателя в 5 раз - соответственно 1,1 у интактных и 5,4 у животных, получавших L-NAME.
Таким образом, для дальнейшей оценки влияния АХ и НП при ЭЗВ и ЭНЗВ было использовано это отношение как показатель коррекции эндотелиальной дисфункции. Так, в группах, которые на фоне введения ингибитора NO-синтазы L-NAME получали препарат фосфоглив лиофилизат в дозе 5,0 мл/кг и 0,5 мл/кг (для приготовления раствора содержимое одного флакона, т.е. 2,5 г лиофилизата, растворяли в 10 мл воды для инъекций), КЭД был равен соответственно 3,1±0,4 и 2,9±0,5, т.е. ниже, чем этот показатель в группе нелеченых животных (таблица 2).
Таблица 2.Показатели, отражающие коррекцию эндотелиальной дисфункции на фоне введения L-NAME, препаратом фосфоглив лиофилизат на основе фосфолипида и глицирата.
Группы животных
Функциональные пробы
Прирост падения сосудистой реакции по СрАД (мм рт.ст.)
Время сосудистой реакции (сек)
Площадь сосудистой реакции (усл. ед)
Отношение площадей сосудистой реакции НП к АХ
Интактные
АХ
59,9±2,9
42,2±0,8<sup>у</sup>
1268,0±74,8<sup>у</sup>
1,1±0,1<sup>у</sup>
НП
61,0±3,0<sup>у</sup>
45,1±1,0<sup>у</sup>
1375,3±93,7<sup>у</sup>
L-NAME
АХ
68,0±4,1
20,0±1,4<sup>*</sup>
695,3±87,6<sup>*</sup>
5,4±0,6<sup>*</sup>
НП
98,0±2,0<sup>*</sup>
67,4±1,4<sup>*</sup>
3322,7±116,7<sup>*</sup>
L-NAME + фосфоглив лиофилизат (5,0 мл/кг)
АХ
81,6±6,1<sup>*</sup>
42,0±4,1<sup>у</sup>
1710,8±231,7<sup>У</sup>
3,1±0,4<sup>*У</sup>
НП
97,0±7,0<sup>*</sup>
101,8±6,8<sup>*У</sup>
4975,5±578,8<sup>*у</sup>
L-NAME + фосфоглив лиофилизат (0,5 мл/кг)
АХ
93,3±7,2<sup>*у</sup>
49,0±5.7<sup>у</sup>
2347,0±352,7<sup>*у</sup>
2,9±0,5<sup>*у</sup>
НП
86,0±6,0<sup>*</sup>
136,6±12,3<sup>*у</sup>
5783,7±560,0<sup>*у</sup>
* - р<0,05 в сравнении с группой интактных
<sup>у</sup> - р<0,05 в сравнении с группой L-NAME
Таким образом, препарат фосфоглив лиофилизат в дозе 5,0 мл/кг и 0,5 мл/кг (для приготовления раствора содержимое одного флакона, т.е. 2,5 г лиофилизата, растворяют в 10 мл воды для инъекций) при введении внутрибрюшинно однократно в сутки предотвращает развитие эндотелиальной дисфункции при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота в эксперименте.