СРЕДСТВО, СПОСОБСТВУЮЩЕЕ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКА BCL-2, СРЕДСТВО, ИНГИБИРУЮЩЕЕ АПОПТОЗ, И СРЕДСТВО, ПРЕДОТВРАЩАЮЩЕЕ ПОВРЕЖДЕНИЕ ДНК ЭПИДЕРМАЛЬНЫХ КЛЕТОК УЛЬТРАФИОЛЕТОМ
PREPARATION CONTRIBUTING TO PROTEIN BCL-2 EXPRESSION, APOPTOSIS-INHIBITING MEDICATION AND MEDICATION PREVENTING DAMAGE TO EPIDERMAL CELL DNA BY ULTRAVIOLET IRRADIATION

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение имеет отношение к средству, способствующему экспрессии белка BCL-2, средству, ингибирующему апоптоз, и средству, предотвращающему повреждение ДНК эпидермальных клеток ультрафиолетом в клетках кожи и др.
Уровень техники
Солодка (лакрица), которая хорошо известна как неочищенное лекарственное средство, применяется для получения лекарств или как сырье для подсластителей, а также применяется в качестве ингредиента в наносимых на кожу препаратах типа косметики. Кроме того, известно, что экстракт листьев солодки, получаемый при их экстракции такими водосодержащими растворителями, как вода и водный раствор спирта, обладает действием, способствующим выработке коллагена фибробластами кожи.
При этом экстракт солодки способствует образованию волокон коллагена в коже, сохраняя упругость кожи, и предотвращает старение кожи по механизму удерживания влаги коллагеном (патентный документ 1).
Кроме того, известно и то, что экстракт солодки ингибирует образование меланина, вырабатываемого в коже при повреждении ультрафиолетом, и способствует выведению меланина, при этом экстракт солодки известен как косметическое средство для кожи, которое получают путем экстракции корней и корневища солодки водой, фильтрования экстракта, использования собранного нерастворимого в воде остатка при экстракции водой в качестве сырьевого материала, а продукта спиртовой экстракции - в качестве активного ингредиента (патентный документ 2).
Далее, авторам настоящего изобретения из предшествующего уровня техники известен наружный препарат для отбеливания кожи, в котором чистота отбеливающего ингредиента, содержащегося в солодке, повышается при очистке, в частности, тщательно отбираются другие отбеливающие ингредиенты, чем ликвиритин, то есть отбеливающий эффект усиливается под действием другой активности, чем активность ингибитора тирозиназ (патентный документ 3).
Между тем, при гибели клеток кожи или других клеток жизненным феноменом является апоптоз, который становится причиной ряда заболеваний, причем, в отличие от некроза, симптомы заболевания прогрессируют, что именуется запрограммированной клеточной смертью. По этой причине требуется способ коррекции апоптоза, сопровождающего заболевания, и ведется разработка медикаментов.
Например, хорошо известно, что апоптоз индуцируется и в нормальных клетках при радиоактивном облучении кожи при лечении раковых заболеваний или при регулярном облучении кожи интенсивным солнечным светом, содержащим ультрафиолетовое излучение.
Поскольку предполагается, что если удастся подавить (ингибировать) такой апоптоз нормальных клеток и клеток пораженных тканей, то это будет содействовать терапевтическому эффекту или обычной стратегии профилактики ультрафиолетового облучения, то ведется разработка средств, ингибирующих апоптоз.
Примеры генов, ингибирующих апоптоз, включают BCL-xL, BCL-2, BCL-w и IAP.
Из них ген BCL-2 находится на хромосоме 18q21.3 и называется "BCL" потому, что первоначально он был обнаружен при фолликулярной лимфоме (В-клеточная лимфома/лейкемия), а кодируемый этим геном белок в 26 кД именуется "белком BCL-2".
Белок BCL-2 экспрессируется в цитоплазме (включая периферическую часть ядерной мембраны), присутствует на внешней поверхности мембран митохондрий в нормальных клетках и действует как фактор, подавляющий апоптоз, в частности, он наблюдается не только при такой патологии, как опухолевые клетки, но и в нервной системе, слизистой кишечника и базальном слое эпидермиса в нормальных клетках.
Ген BCL-2 необходим для поддержания пигментных стволовых клеток, причем известно, что вследствие его дефекта происходит осветление волос. При этом пигментные стволовые клетки фолликула растут вместе со зрелыми пигментными клетками, вырабатывающими меланин, однако, согласно экспериментальным данным на BCL-2-дефектных мышах, ген BCL-2 необходим для существования в тот момент, когда меланобласты, локализованные там в процессе онтогенеза, входят в состояние покоя в виде пигментных стволовых клеток.
Известно, что у мышей, дефектных по гену BCL-2, вследствие апоптоза меланоцитов наблюдается усиление апоптоза в ряде тканей, таких как нервная система, лимфоциты и тонкий кишечник, и такой симптом, как почечная недостаточность, а также осветление волос на теле, при этом известно, что функция BCL-2 важна для сохранности этих тканей и клеток (Патентный документ 4).
В норме BCL-2 экспрессируется во многих тканях организма и играет в них физиологическую роль поддержания длительной жизни клеток. Известно, что есть типы клеток, существование которых регулируется BCL-2, - это клетки "памяти", образующиеся при иммунизации, и стволовые клетки, которые становятся всасывающими (absorptive) клетками, присутствующими в лимфоцитах, мозге, мышцах и многих типах нейронов в периферических нервах, контролирующих функцию органов, костном мозге, коже и внутри желудочно-кишечного тракта (Патентный документ 5).
Патентный документ 1: JP-A No.2000-191498 бюллетень (пункт 1).
Патентный документ 2: JP-A No.10-194959 (параграф 0005, параграф 0014).
Патентный документ 3: JP-A No.2006-028157 бюллетень (параграф 0016).
Патентный документ 4: JP-A No.2002-080382 бюллетень.
Патентный документ 5: JP-A No.2003-176236 бюллетень.
Раскрытие изобретения
Проблемы, решаемые изобретением
В связи с вышеприведенным экстрактом солодки нет никаких данных относительно его способности экспрессировать белок BCL-2 или способности ингибировать апоптоз, тогда как отбеливающее действие и предотвращение старения, известные по Патентным документам 1-3, обусловлены действием, способствующим выработке коллагена и ингибированию продукции меланина в живых клетках, в отличие от антиапоптозного действия, обусловленного экспрессией белка BCL-2 (в дальнейшем приводится сокращенно как экспрессия BCL-2 или, в некоторых случаях, экспрессирование BCL-2).
Как описано выше, у методики использования водного экстракта солодки имеется та проблема, что способность экспрессировать белок BCL-2 и ингибировать аномальный апоптоз эпидермальных клеток, поврежденных ультрафиолетовым излучением или чем-то подобным, не установлена технически.
Поэтому целью настоящего изобретения является получение средства, способствующего экспрессии белка BCL-2, средства, ингибирующего апоптоз, и средства, предотвращающего повреждение ДНК эпидермальных клеток ультрафиолетом, которое решает вышеупомянутые проблемы, усиливает экспрессию белка BCL-2 в клетках, а также ингибирует апоптоз клеток, содержащих ДНК, прямо или косвенно поврежденную ультрафиолетовым излучением или чем-то подобным, усиливает способность клеток к восстановлению ткани, может быть добавлено в целый ряд лекарственных препаратов и, как можно ожидать, будет широко применяться.
Решение проблем
Средство настоящего изобретения, способствующее экспрессии белка BCL-2, и средство, ингибирующее апоптоз, было открыто авторами настоящего изобретения благодаря тому, что на основе описанного ниже экспериментального метода и его результатов была открыта пролиферация эпидермальных клеток (PCNA), экспрессия: BCL-2 и способность ингибировать апоптоз эпидермальных клеток, соответственно, причем это средство ослабляет повреждение ДНК эпидермальных клеток, вызванное воздействием ультрафиолета, более того, оно не влияет аномально или отрицательно на нормальные клетки кожи.
Таким образом, в настоящем изобретении вышеупомянутые проблемы были решены путем выбора средства, способствующего экспрессии белка BCL-2, средства, ингибирующего апоптоз, или средства, предотвращающего повреждение ДНК эпидермальных клеток ультрафиолетом, содержащего растворимый в воде и этаноле экстракт солодки в качестве активного ингредиента.
Экстракт солодки, принятый в качестве активного ингредиента в настоящем изобретении, является безвредным и безопасным по отношению к эпидермальным клеткам, то есть он не влияет существенно на пролиферативную способность клеток и апоптоз в нормальных эпидермальных клетках, и даже при добавлении в косметическое средство или тому подобное не оказывает заметного влияния на ингибирование апоптоза в нормальных эпидермальных клетках.
Таким образом, при предшествующем способе применения в косметике солодка не использовалась активно в качестве средства, экспрессирующего белок BCL-2, средства, ингибирующего апоптоз, или средства, предотвращающего повреждение ДНК эпидермальных клеток ультрафиолетом, а ее действие не было установлено с уверенностью.
В то же время у тех клеток, у которых повреждение ДНК вызвано облучением ультрафиолетом, средство, экспрессирующее белок BCL-2, средство, ингибирующее, апоптоз, или средство, предотвращающее повреждение ДНК эпидермальных клеток ультрафиолетом, значительно усиливает пролиферацию эпидермальных клеток для восстановления ткани, экспрессию BCL-2, который является ингибирующим апоптоз фактором, и ингибирует образование димеров тимина, которые повреждают ДНК.
Способность предотвращать повреждение ДНК эпидермальных клеток также видна из того, что появление положительных на димеры Т-Т клеток значительно уменьшается в получавшей обработку группе по сравнению с группой без обработки, как видно из табл.3, приведенной ниже.
Такое средство, экспрессирующее белок BCL-2, средство, ингибирующее апоптоз, или средство, предотвращающее повреждение ДНК, является эффективным для эпидермальных клеток, предотвращает повреждение ДНК эпидермальных клеток, способствует экспрессии белка BCL-2 и ингибирует апоптоз.
Как описано выше, предполагается, что средство, способствующее экспрессии белка BCL-2 в коже, действует на пигментные стволовые клетки таким образом, что ген BCL-2 включается в нужный для существования пигментных стволовых клеток момент, в результате чего при сохранении пигментных стволовых клеток вырабатывается меланин в эпидермальных клетках и предотвращается физиологическое обесцвечивание волос, сопровождающее старение.
Кроме того, средство настоящего изобретения, способствующее экспрессии белка BCL-2, может применяться в различных лекарственных формах, в которых проявляется улучшение при экспрессии белка посредством гена BCL-2 в различных тканях и клетках человека и животных, причем средство имеет многоцелевые свойства, так что оно может применяться, к примеру, при терапии органов, для улучшения различных симптомов за счет более продолжительной жизни целого ряда клеток, включая стволовые клетки, для поддержания здоровья, косметического улучшения кожи и волос и других различных назначений.
Преимущества изобретения
Поскольку настоящим изобретением предусмотрено средство, способствующее экспрессии белка BCL-2, или средство, ингибирующее апоптоз, которое содержит растворимый в воде и этаноле экстракт солодки в качестве активного ингредиента, то его преимущество состоит в том, что оно является средством, экспрессирующим белок BCL-2, средством, ингибирующим апоптоз, или средством для предотвращения повреждения ДНК эпидермальных клеток ультрафиолетом, которое ингибирует апоптоз клеток, содержащих ДНК, прямо или косвенно поврежденную ультрафиолетовым излучением или чем-то подобным, усиливает способность клеток к восстановлению ткани, добавляется в различные лекарственные препараты и, как можно ожидать, будет широко применяться.
Кроме того, средство настоящего изобретения, способствующее экспрессии белка BCL-2, имеет еще и то преимущество, что оно также обладает эффектом продления жизни других соматических клеток, чем клетки кожи, и обладает эффектом улучшения здоровья в зависимости от локализации таких клеток.
Осуществление изобретения
Солодка, используемая в настоящем изобретении, является лекарственным сырьем, которое получают при высушивании солодки - мотылькового лекарственного растения, выращиваемого в Испании, Сибири и Китае, для увеличения способности к длительному хранению, а данное растение (или родственный ему вид) имеет научное название Glycyrrhiza uralensis Pischer или Glycyrrhiza glabra 1 вариант glandulifera Reg. et Herd. Материал, полученный при измельчении или размалывании в порошок предпочтительно корней или корневищ (также называемых ползучими побегами или столоном) растений с удаленной корой или кожурой, или материал, полученный при экстрагировании их водой или спиртом или другими водными растворителями, можно использовать в качестве материала для экстракции активного ингредиента. Безопасность обычного экстракта солодки хорошо известна.
Для экстракции активного ингредиента в настоящем изобретении используется растворитель, которым является вода (которая может быть нейтральной, умеренно кислой или умеренно щелочной) или же водный растворитель для экстракции, в котором вода является основным компонентом, а в него могут быть добавлены и другие растворители (которые могут быть органическими растворителями), так что можно выбрать водный раствор, содержащий спирт. Примеры спиртов включают хорошо известные спиртовые растворители, такие как метанол, этанол, изопропанол и n-бутанол. Кроме того, все активные ингредиенты, экстрагируемые этими растворителями, будут растворимы в воде и этаноле (этиловом спирте).
Предпочтительно процедура экстракции таким водным растворителем проводится в состоянии теплой воды или горячей воды для того, чтобы усилить эффективность экстракции. Когда процедура экстракции проводится, в частности, при 100°C или выше, предпочтительно от 100 до 130°C, то эффективно экстрагируются ингредиенты, годные для экспрессии белка BCL-2, ингибирования апоптоза или предотвращения повреждения ДНК эпидермальных клеток ультрафиолетом.
Предпочтительно на стадии экстракции раствор экстракта фильтруется с помощью такого адсорбента, как активированный уголь, или подвергается разделению на жидкую и твердую фазы, используя различия в удельной массе между твердым веществом и жидкостью или различия в скорости осаждения под действием силы тяжести или центробежной силы, чтобы удалить взвешенные вещества.
В качестве адсорбента можно использовать вещество, образующее такую границу раздела, которая вызывает сильную положительную адсорбцию, как-то активированный уголь, а полученную при этом прозрачную жидкость предпочтительно концентрируют и затем опять разбавляют водой или этанолом, а нерастворимые вещества, полученные при концентрировании, отделяют и удаляют фильтрованием, при этом получается более полная очистка. Примеры адсорбентов включают синтетические адсорбенты (органические адсорбенты), наряду с неорганическими адсорбентами, состоящими из пористого материала типа активированного угля.
Примеры неорганических адсорбентов включают оксиды металлов, продукты восстановления металлов и гидроксиды металлов, как-то активный оксид алюминия, силикагель и оксид титана, глинистые минералы, как-то бентонит и кислая глина, и гидросиликаты, обладающие свойством отслоения, как-то диатомитовая земля и тальк.
При использовании активированного угля не требуется особенно строгий выбор качества материала, при этом активированный уголь из древесного угля, бамбука и пальмовой шелухи как исходных материалов обладает хорошей эффективностью адсорбирования взвешенных веществ, состоящих из мелких частиц, и он является предпочтительным.
Синтетические адсорбенты состоят из частиц, сделанных из ионообменной смолы, в которой образуются мелкие непрерывные поры до самой сердцевины частиц, и они включают ароматические сшитые пористые полимеры на основе стирола, замещенные ароматические адсорбенты, в которых атом брома связан с ароматическим ядром ароматического полимера, и акриловые гидрофильные адсорбенты с остовом из полимера сложного эфира метакриловой кислоты.
В качестве способа разделения на жидкую и твердую фазы и для других операций с целью удаления взвешенных веществ, как описано выше, можно выбрать способ, при котором экстракционный раствор пропускают через резервуар типа колонки, заполненной частицами активированного угля, либо в экстракционный раствор с перемешиванием добавляют порошок активированного угля (при необходимости и вспомогательный фильтрующий материал типа талька) и фильтруют смесь через фильтр, улавливающий частицы порошка активированного угля, как-то фильтровальную бумагу или матерчатый фильтр, и дополнительно еще центрифугируют, а также можно выбрать хорошо известные способы отделения жидкости по различиям в скорости осаждения.
В качестве операции концентрирования водного экстракта можно выбрать такие хорошо известные способы концентрирования, как действие пониженного давления или концентрирование нагреванием. Степень концентрирования предпочтительно составляет от 2 до 100 раз, в частности от 5 до 50 раз, обычно предпочтительным является концентрирование в 10 раз.
Предпочтительно полученный концентрат опять разбавляют вышеприведенным жидким растворителем для водной экстракции или равноценным ему водосодержащим растворителем. Вовсе не обязательно как-то ограничивать степень разбавления, но полагаем, что предпочтительна такая степень разбавления, при которой объем восстанавливается до объема перед концентрированием, а степень разбавления составляет от 2 до 100 раз. Предпочтительно повторяют две или несколько стадий, выполняя операции концентрирования и разбавления в одну стадию.
Для того чтобы дополнительно очистить полученную при этом жидкость, в качестве растворителя для экстракции после концентрирования нужно предпочтительно использовать абсолютный спирт с концентрацией этанола в 99,5% или больше.
Для получения кожного препарата для наружного применения полученный при разделении жидкости и твердого вещества ингредиент, растворимый в этиловом спирте, либо смешивают с основой для кожного наружного препарата, обладающей хорошей адгезионной способностью в отношении кожи и имеющей подходящую гидрофильность/липофильность, либо раствор экстракта смешивают с такой основой, как крем, мазь или лосьон, при этом ингредиент получается в виде препарата, который можно наносить на кожу.
Лекарственные формы средства настоящего изобретения, способствующего экспрессии белка BCL-2, средства, ингибирующего апоптоз, и средства, предотвращающего повреждение ДНК эпидермальных клеток ультрафиолетом, никак не ограничиваются, но, к примеру, можно выбрать форму, хорошо известную в качестве препарата для наружного применения, причем предпочтительным является заключение в такую лекарственную форму, которая легко наносится на кожу, как-то водорастворимая жидкость, лосьон, мазь или порошок.
Наряду с применением в качестве косметики средство настоящего изобретения, способствующее экспрессии белка BCL-2, также может быть заключено в лекарственные формы медикаментов и квазилекарственных препаратов, как-то формы для инъекции, ингаляции, для приема внутрь, свечи и мази, а также его можно применять, смешивая с хорошо известными ингредиентами, которые обычно используются в таких препаратах.
Как описано ниже, предпочтительно активный ингредиент из растворимого в воде и этаноле экстракта солодки в качестве средства, способствующего экспрессии белка BCL-2, средства, ингибирующего апоптоз, и средства, предотвращающего повреждение ДНК эпидермальных клеток ультрафиолетом, смешивают таким образом, что конечная концентрация в наносимой на кожу лекарственной форме составляет от 0,1 до 10% при выражении ее в % массы смеси в пересчете на сухое вещество (сухую массу).
ПРИМЕРЫ
Способ получения раствора экстракта солодки (Т)
1) К 200 кг нарезанной солодки уральской (Glycyrrhiza uralensis Fischer) добавляли воду (2000 л), экстрагировали при 95°C в течение 2,5 часов, раствор экстракта фильтровали через сито с виброгасителем (300 меш, из нержавеющей стали). Полученный экстракционный фильтрат концентрировали (температура жидкости 60°C или меньше, при пониженном давлении), а концентрат (исходный раствор для сушки распылением) высушивали распылением, получая высушенный экстракт. Его пропускали через сито (60 меш, из нержавеющей стали), получая сухой экстракт солодки с выходом 20 кг (Т origin).
2) К 20 кг сухого экстракта Glycyrrhiza walensis Fischer (T origin), полученного на стадии 1, добавляли этанол фармакопейного качества (100 л), перемешивали смесь в течение 6 часов и фильтровали через фильтровальную бумагу №2.
3) К фильтрату добавляли этанол фармакопейного качества до объема 100 л, туда же добавляли 4,5 кг активированного угля (порошок, Shirasagi KL), перемешивали смесь в течение 3 часов и фильтровали через фильтровальную бумагу №2. Эту стадию повторяли 3 раза.
4) К фильтрату, полученному на стадии 3, добавляли этанол фармакопейного качества до объема 100 л, который концентрировали (50°С или меньше, при пониженном давлении) до объема 10 л. Затем туда же добавляли 400 г активированного угля (порошок, Shirasagi KL), перемешивали смесь в течение 2 часов и фильтровали через фильтровальную бумагу №2. Эту стадию повторяли 6 раз.
5) К фильтрату, полученному на стадии 4, добавляли этанол фармакопейного качества до объема 10 л, который концентрировали до объема 2 л. Туда же добавляли 1 л этанола фармакопейного качества и 100 г активированного угля (порошок, Shirasagi KL), перемешивали смесь в течение 3 часов и фильтровали через фильтровальную бумагу №2.
6) К фильтрату, полученному на стадии 5, добавляли этанол фармакопейного качества до объема 2 л, туда же добавляли 100 г активированного угля (порошок, Shirasagi KL), перемешивали смесь в течение 3 часов и фильтровали через фильтровальную бумагу №2.
7) К фильтрату, полученному на стадии 6, добавляли этанол фармакопейного качества до объема 2 л, после чего фильтровали через фильтровальную бумагу №5.
8) Фильтрат, полученный на стадии 7, упаривали (40°C или меньше, при пониженном давлении) досуха, туда же добавляли 300 мл воды, а затем экстрагировали (со встряхиванием при комнатной температуре) и фильтровали через фильтровальную бумагу №5. Эту стадию повторяли 3 раза.
9) Фильтрат, полученный на стадии 8, доводили до 1 л.
Фильтрат (250 мл), полученный на стадии 9, нагревали до 95-110°С при кипячении в горячей воде, получая концентрат (37,1 г), в который добавляли 1 л 99,5% абсолютного спирта (Konishi Co., Ltd.), собирали растворимые в этаноле фракции, которые нагревали при 95-110°С, получая концентрат (21,5 г). В него добавляли 50 мл очищенной воды и 50 г активированного угля (фирмы Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; активированный уголь в порошке), перемешивали смесь и в то же время добавляли 75 г талька (фирмы Maruishi Pharmaceutical Co., Ltd.), дополнительно перемешивали смесь и фильтровали через фильтровальную бумагу. Полученный фильтрат нагревали при 95-110°С, получая концентрат (14,7 г), в который добавляли 400 мл 99,5% абсолютного спирта (Konishi Co., Ltd.), собирали растворимые в этаноле фракции, которые нагревали при 95-110°С, получая концентрат (11,7 г), в который добавляли 50 мл очищенной воды и 30 г активированного угля (фирмы Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; активированный уголь в порошке), перемешивали смесь и в то же время добавляли 50 г талька (фирмы Maruishi Pharmaceutical Co., Ltd.), а затем дополнительно перемешивали. После этого смесь фильтровали через фильтровальную бумагу, полученный фильтрат нагревали при 95-110°С, получая концентрат (8,6 г), в который добавляли 400 мл 99,5% абсолютного спирта (Konishi Co., Ltd.), собирали растворимые в этаноле фракции, которые нагревали при 95-110°С, получая концентрат (5,2 г). К 2,0 г этого концентрата добавляли очищенную воду до 60 г, которые использовали в качестве образца экстракта.
В отношении активного ингредиента экстракта солодки полагаем, что он будет эффективным для получения эффекта настоящего изобретения, если конечный концентрат (5,2 г) будет контактировать с кожей в интервале концентраций от 0,1 до 10% масс., в пересчете на сухое вещество в смеси.
Способ оценки: эксперимент 1
1) 4-недельным самцам мышей C56BL6 (Japan SLC, Inc.) давали освоиться в течение 1 недели, выбривали шерсть и разбивали их на группы. Экспериментальная группа состояла из 5 групп с первой по пятую, по 15 мышей на группу.
Первая группа (Сравнительный пример): нанесение PBS до и после облучения ультрафиолетом.
Вторая группа (Пример): нанесение образца до облучения ультрафиолетом.
Третья группа (Пример): нанесение образца после облучения ультрафиолетом.
Четвертая группа (Пример): нанесение образца экстракта до и после облучения ультрафиолетом.
Пятая группа (Сравнительный пример): только бритье.
2) Образец экстракта хранили при 4°С и доводили до комнатной температуры перед нанесением.
3) При облучении ультрафиолетом использовали ультрафиолетовое излучение полного диапазона длин волн (UV-A, -В, -С), чтобы вызвать острое повреждение кожи ультрафиолетом, при этом образец экстракта наносили на кожу мышей за 24 часа до облучения ультрафиолетом или сразу же после облучения и исследовали изменения при остром поражении ультрафиолетом.
2
4) Участок для бритья представляет собой квадрат размером 2 см с центром на пересечении между нижним краем ребер грудных позвонков и позвоночником, а его площадь составляет 4 см. Брили электрической бритвой (National), а лезвия не использовали.
2
2
5) Облучение ультрафиолетом проводилось в течение 1,5 минут при интенсивности излучения 11 мВт/см (на расстоянии 5 см) с помощью прибора, вырабатывающего ультрафиолет (XX-15BLB, UVP Co., Tokyo, Japan). При этом доза облучения ультрафиолетом составляла 1,0 Дж/см.
6) При облучении мышей анестезировали нембуталом (мг/мышь, внутривенная инъекция), после чего фиксировали конечности клейкой лентой для сохранения лежачего положения во время облучения.
7) На выбритый участок наносили образец экстракта (200 мкл) целиком с помощью ватного тампона, давая ему высохнуть.
8) Через 24 часа после облучения ультрафиолетом мышей забивали смещением шейных позвонков, а кожу выбритого участка, включая окружающую невыбритую часть, отделяли по фасции, растягивали на резиновой пластинке и фиксировали 10% формалином в течение 24 часов.
9) В качестве среза кожи из центральной части образца вырезали ткань шириной 4 мм, заключали ее в парафин и делали тонкие срезы образца толщиной 3 мкм.
10) На тонких срезах образцов проводили окрашивание ядер гематоксилином (далее приводится сокращенно как окрашивание НЕ) и иммунологическое окрашивание.
11) Для иммунологического окрашивания использовали следующие антитела, причем активацию антигена и разведение выполняли, как указано ниже в таблице. Для разведения и отмывки использовали буфер Optimax Wash Buffer (Biogenex).
Название антигена
Клон
Обработка
Концентрация
PCNA (Dako)
РС10
Лимонная кислота-MW
1/50
BCL-2 (Dako)
Пепсин
1/100
ss-ДНК (IBL)
Пепсин
1/200
Димер Т-Т (получено в дар)
Пепсин
1/200
12) Методика иммунологического окрашивания имеет следующий вид:
1. Депарафинизация, добавление воды
2. Активация антигена
2
2
3. Обработка 0,3% HO в метаноле
4. Обработка первичными антителами
5. Отмывка
6. Обработка вторичными антителами
7. Отмывка
8. Проявление окраски с помощью DAB
9. Окрашивание ядер гематоксилином
10. Заливка.
13) При оценке тканевой патологии по окрашиванию НЕ получали подтверждение токсикологической патологии от дипломированного врача.
14) Определение при иммунологическом окрашивании:
(1) В отношении PCNA, ssДНК и димеров Т-Т под микроскопом исследовали 500 клеток, включая все слои эпидермальных клеток, при этом клетки, дающие положительный результат в ядрах, определялись как положительные.
В этой связи PCNA (ядерный антиген пролиферирующих клеток) отражает пролиферативную способность клеток, он относительно стабилен на всем протяжении клеточного цикла, стабилен на очень низком уровне в непролиферирующих клетках, но быстро возрастает, когда они вступают в цикл клеточного деления, поэтому он становится меткой, отражающей переход от непролиферирующей популяции клеток к пролиферирующей популяции клеток.
(2) В отношении BCL-2 участок образца, проявляющий более сильную иммунологическую реакцию по сравнению с экспрессией BCL-2 в невыбритом участке кожи образца (не подвергавшемся облучению ультрафиолетом), определялся как положительный. Случай, когда интенсивность окрашивания была меньше, чем у необлученной части эпидермиса, определялся как отрицательный, одинаковая степень окрашивания до 2 раз или меньше определялась как положительная, а 2-кратная или больше определялась как сильно положительная.
Результаты эксперимента
Результаты в отношении морфологических изменений по данным вышеприведенных экспериментальных методов представлены в табл.1. При этом проводили морфологическое исследование влияния образца экстракта на изменения в эпидермальных клетках при облучении ультрафиолетом кожи мышей.
Таблица 1
Группа
Обработка
Слои эпидермальных клеток
Инфильтрация воспалительных клеток
Первая
до и после УФ (PBS)
3,6±1,8
++
Вторая
до УФ (образец)
4,2±2,0
+
Третья
после УФ (образец)
7,8±3,3
+
Четвертая
до и после УФ (образец)
8,6±3,5
±
Пятая
только бритье
3,1±1,2
-
*PBS = физраствор на фосфатном буфере
Как видно из результатов, приведенных в табл.1, нормальный эпидермис мыши состоит из одного слоя клеток базального слоя и одного-двух слоев шиповатого слоя. В пятой группе (только бритье) эти нормальные показатели сохранялись, а воспалительные клетки не выявлялись.
В первой группе (облучение + обработка PBS) сохранялось основное строение эпидермиса и не отмечалось явного появления эрозии и некроза эпидермальных клеток. Однако наблюдалась умеренная инфильтрацмя воспалительных клеток из поверхностного слоя эпидермиса внутрь эпидермиса, и это рассматривали как воспалительное изменение, сопровождающее облучение ультрафиолетом.
Во второй группе (облучение + нанесение образца до облучения) не наблюдалось морфологических изменений в эпидермисе, а инфильтрация воспалительных клеток была слабее, чем в первой группе.
В третьей группе (облучение + нанесение образца после облучения) и четвертой группе (облучение + нанесение образца до и после облучения) эпидермис был утолщен до 8-10 слоев, главным образом из-за увеличения шиповатого слоя, однако у составляющих клеток не отмечалось атипии, и строение ткани тоже сохранялось. Инфильтрация воспалительных клеток была слабее, чем в первой группе (облучение + обработка PBS),
Кроме того, что касается инфильтрации воспалительных клеток, то, поскольку она отмечалась и в первой группе (облучение + обработка PBS), полагаем, что инфильтрация воспалительных клеток представляет собой воспалительную реакцию при повреждении клеток вследствие облучения ультрафиолетом. С другой стороны, инфильтрация воспалительных клеток уменьшалась в группах с нанесением образца, в частности в третьей группе и четвертой группе, в которых нанесение осуществлялось после облучения, что свидетельствует о том, что при нанесении образца подавляется воспаление.
В отношении пролиферативной способности эпидермальных клеток исследовали влияние образца на изменения пролиферативной способности клеток и апоптоз в эпидермальных клетках при облучении кожи мышей ультрафиолетом. При этом пролиферативную способность эпидермальных клеток исследовали по числу PCNA-положительных клеток при иммунологическом окрашивании.
В отношении апоптоза эпидермальных клеток определяли частоту положительных клеток, содержащих фрагментированную ДНК (апоптозные клетки в %), методом иммунологического окрашивания одноцепочечной ДНК (ssДНК), при этом результаты представлены в табл.2.
Таблица 2
Группа
Обработка
PCNA-меченные клетки (%)
Апоптозные клетки (%)
Первая
до и после УФ (PBS)
14±5
32±12
Вторая
до УФ (образец)
13±4
24±8
Третья
после УФ (образец)
15±6
6±6
Четвертая
до и после УФ (образец)
17±6
4±4
Пятая
только бритье
6±4
3±2
*PBS = физраствор на фосфатном буфере
Как видно из приведенных в табл.2 результатов по PCNA-положительным клеткам, в пятой группе (только бритье) PCNA-меченные клетки отмечены только в базальном слое, а их частота составляла 6±4%. В противоположность этому, в первой группе (облучение + обработка PBS), второй группе (облучение + нанесение образца до облучения), третьей группе (облучение + нанесение образца после облучения) и четвертой группе (облучение + нанесение образца до и после облучения), в которых проводилось облучение ультрафиолетом, частота PCNA-положительных клеток составляла 14±5%, 13±4%, 15±6% и 17±6%, соответственно, при этом отмечалось значимое различие между пятой группой (только бритье) и другими группами (Р<0,001). Однако в группах со второй по четвертую, в которых наносили образец, отмечалось аналогичное возрастание PCNA-положительных клеток относительно первой группы, в которой не проводилось нанесение образца, поэтому полагаем, что при облучении ультрафиолетом в любом случае возникает клеточная реакция восстановления ткани от повреждения клеток.
В отношении апоптоза эпидермальных клеток в пятой группе (только бритье) наблюдалось небольшое число ssДНК-положительных клеток в шиповатом слое, а именно 3±2%. Наоборот, в первой группе (облучение + обработка PBS), в которой проводилось облучение ультрафиолетом, ssДНК-положительные клетки составляли 32±12%, что является высокой частотой.
С другой стороны, во второй группе (облучение + нанесение образца до облучения), в которой образец наносили до облучения, частота ssДНК-положительных апоптозных клеток составляла 24±8%, что значительно выше, чем в пятой группе в качестве необлученного контроля.
Кроме того, в третьей группе (облучение + нанесение образца после облучения) и четвертой группе (облучение + нанесение образца до и после облучения), в которых образец наносили после облучения, частота ssДНК-положительных апоптозных клеток составляла 6±6% и 4±4%, соответственно, что значительно меньше, чем в первой группе (облучение + обработка PBS) и второй группе (облучение + нанесение образца до облучения), но не отмечалось значимых различий относительно пятой группы (только бритье).
Обобщая эти результаты, в третьей и четвертой группах, в которых образец экстракта наносили после облучения, апоптоз эпидермальных клеток подавлялся, поэтому полагаем, что эти реактивные изменения пролиферативных свойств оказывали синергическое действие, вследствие чего наблюдалось утолщение эпидермиса.
Далее, в отношении экспрессии BCL-2 в эпидермальных клетках исследовали влияние образца на изменения в эпидермальных клетках при облучении ультрафиолетом кожи мышей в отношении экспрессии BCL-2 и повреждения ДНК ультрафиолетом, при этом экспрессию BCL-2, которая общепризнана как фактор подавления апоптоза, исследовали методом иммунологического окрашивания, а результаты представлены в табл.3.
Таблица 3
Группа
Обработка
Экспрессия BCL-2
Положительные на димер Т-Т клетки (%)
Первая
до и после УФ (PBS)
слабая
16±8
Вторая
до УФ (образец)
++
9±6
Третья
после УФ (образец)
+++
4±4
Четвертая
до и после УФ (образец)
+++
4±3
Пятая
только бритье
слабая
0
*PBS = физраствор на фосфатном буфере
Экспрессия BCL-2 была очень слабой в базальном слое в пятой группе (только бритье). Слабая экспрессия в базальном слое также наблюдалась в первой группе (облучение + обработка PBS), в которой проводилось облучение ультрафиолетом, но четкого различия относительно пятой группы не отмечалось.
С другой стороны, во второй группе (облучение + нанесение образца до облучения), в которой образец наносили до облучения, экспрессия BCL-2 была положительной, причем как интенсивность экспрессии, так и число положительных клеток были значительно выше, чем в пятой группе в качестве контроля и в первой группе только с облучением. В противоположность этому, в третьей группе (облучение + нанесение образца после облучения) и четвертой группе (облучение + нанесение образца до и после облучения), в которых образец наносили после облучения, экспрессия BCL-2 была сильно положительной в обоих случаях, и отмечались четкие различия между первой группой (облучение + обработка PBS), второй группой (облучение + нанесение образца до облучения) и пятой группой (только бритье).
В отношении повреждения ДНК в эпидермальных клетках вследствие облучения ультрафиолетом, поскольку известно, что образование димеров тимина (димеров Т-Т) во внутриядерной ДНК вызывается ультрафиолетовым излучением, в частности, в области излучения высокой энергии UV-C, то исследовали образование димеров Т-Т после облучения с помощью антител против димера Т-Т.
В пятой группе (только бритье) вообще не было отмечено положительных на димеры Т-Т клеток. Наоборот, в первой группе (облучение + обработка PBS), в которой проводилось облучение ультрафиолетом, положительные клетки встречались с высокой частотой, а именно 16±8%.
С другой стороны, во второй группе (облучение + нанесение образца до облучения), в которой образец наносили до облучения, частота клеток с димерами Т-Т составляла 9±6%, что значительно выше, чем в пятой группе в качестве контроля без облучения.
В противоположность этому, в третьей группе (облучение + нанесение образца после облучения) и четвертой группе (облучение + нанесение образца до и после облучения), в которых образец наносили после облучения, частота клеток с Т-Т димером составляла 4±4% и 4±3%, соответственно, что значительно меньше, чем в первой группе (облучение + обработка PBS) и второй группе (облучение + нанесение образца до облучения), но не наблюдалось значимых различий относительно пятой группы (только бритье).
Из вышеизложенного следует, что при нанесении образца происходит значительная экспрессия BCL-2, а повреждение ДНК вследствие облучения ультрафиолетом ингибируется (в частности, при нанесении образца после облучения ультрафиолетом). Кроме того, поскольку BCL-2 не обладает эффектом ингибирования повреждения ДНК, полагаем, что нанесение образца способствует экспрессии BCL-2 и оказывает эффект ингибирования повреждения ДНК по отдельности.
Итак, повреждение ДНК в эпидермисе вследствие образования димеров Т-Т было вызвано облучением ультрафиолетом, при этом подтверждается, что по этой причине индуцируется апоптоз, а пролиферативная способность возрастает в качестве восстановительной реакции.
С другой стороны, в третьей группе и четвертой группе, в которых образец наносили после облучения, наблюдалось ингибирование апоптоза, которое, как полагаем, было вызвано усилением экспрессии BCL-2, обладающего антиапоптозным действием, и сокращением димеров Т-Т. В противоположность этому, пролиферативная способность эпидермиса возрастала, как и в группе без нанесения образца, поэтому полагаем, что морфологические изменения проявляются в способности эпидермиса к гиперплазии, то есть утолщению.
Во второй группе, в которой образец наносили до облучения, значение находилось между значением третьей группы с нанесением только после облучения и значением пятой группы с облучением без нанесения. Кроме того, в четвертой группе, в которой нанесение проводили до и после облучения, не отмечалось аддитивного эффекта по сравнению с третьей группой. В качестве причины этого предполагается неполное введение из-за того, к примеру, что субъекты удаляли образец после нанесения, слизывая его, а также предполагается, что действие на эпидермис остается слабым в отсутствие стимуляции.
Эксперимент по оценке 2. Влияние образца на нормальную кожу
В эксперименте 1 исследовали влияние образца па кожу в стрессовом состоянии облучения ультрафиолетом, но для того, чтобы увидеть действие образца без стресса, образец наносили на кожу, которая подвергалась только бритью. Изменения при сравнительно продолжительном непрерывном применении образца по методике нанесения образца 3 раза в неделю на протяжении 4 недель оценивали морфологическими методами и методом иммунологического окрашивания из эксперимента 1.
Экспериментальный метод
1) 4-недельным самцам мышей C56BL6 (Japan SLC, Inc.) давали освоиться в течение 1 недели и разбивали их на группы после бритья. Экспериментальная группа состояла из 2 групп - группы с нанесением образца и группы с нанесением PBS, по 15 мышей на группу.
Первая группа (Сравнительный пример): нанесение PBS.
Вторая группа (Пример): нанесение образца.
2) Образец экстракта хранили при 4°С и доводили до комнатной температуры перед нанесением.
2
3) Участок для бритья представляет собой квадрат размером 2 см с центром на пересечении между нижним краем ребер грудных позвонков и позвоночником, а его площадь составляет 4 см. Брили электрической бритвой (National), а лезвия не использовали.
4) На выбритый участок наносили образец экстракта (200 мкл) целиком с помощью ватного тампона, давая ему высохнуть.
5) Мышей забивали смещением шейных позвонков, а кожу выбритого участка, включая окружающую невыбритую часть, отделяли по фасции, растягивали на резиновой пластинке и фиксировали 10% формалином в течение 24 часов.
6) В качестве среза кожи из центральной части образца вырезали ткань шириной 4 мм, заключали ее в парафин и делали тонкие срезы образца толщиной 3 мкм.
7) На тонких срезах образцов проводили окрашивание НЕ и иммунологическое окрашивание.
8) При иммунологическом окрашивании проводили такое же исследование, как и в эксперименте 1.
9) Методика иммунологического окрашивания была такой же, как в эксперименте 1.
10) При оценке тканевой патологии по окрашиванию НЕ получали подтверждение токсикологической патологии от дипломированного врача.
11) Определение при иммунологическом окрашивании проводили так же, как и в эксперименте 1.
Результаты эксперимента
В отношении морфологических изменений проводили морфологическое исследование влияния образца экстракта на изменения в эпидермальных клетках нормальной кожи мышей, а результаты представлены в табл.4.
Таблица 4
Группа
Обработка
Слои эпидермальных клеток
Инфильтрация воспалительных клеток
Первая
нанесение PBS
13±4
-
Вторая
нанесение образца
13±4
-
1) Морфологические изменения
При сравнении группы с нанесением образца и группы с нанесением PBS в качестве контроля не наблюдалось различий в морфологии эпидермиса, а сохранялось нормальное строение. В группе с нанесением образца не наблюдалось гиперплазии и гиперкератоза эпидермиса, а также не отмечалось воспалительных изменений типа инфильтрации воспалительных клеток.
2) Пролиферативная способность эпидермальных клеток
Частота PCNA-положительных клеток в первой группе (нанесение PBS) и второй группе (нанесение образца) составляла 6±4% и 5±4%, соответственно, и не отмечалось значимых различий. Эти значения были такими же, как в пятой группе (только бритье) из эксперимента 1, поэтому полагаем, что нанесение образца не вызывает значительных изменений пролиферативной способности клеток в отсутствие облучения ультрафиолетом.
3) В отношении апоптоза эпидермальных клеток исследовали влияние образца экстракта на пролиферацию и апоптоз клеток нормальной кожи, а результаты представлены в табл.5.
Таблица 5
Группа
Обработка
PCNA-меченные клетки (%)
Апоптозные клетки (%)
Первая
нанесение PBS
6±4
8±5
Вторая
нанесение образца
5±4
4±4
Как видно из приведенных в табл.5 результатов, частота ssДНК-положительных апоптозных клеток в первой группе (нанесение PBS) и второй группе (нанесение образца) составляла ±5% и 4±4%, соответственно, и между ними не отмечалось различий. Кроме того, данное значение эквивалентно значению в пятой группе (только бритье), поэтому полагаем, что нанесение образца не вызывает значительных изменений для апоптоза в отсутствие облучения ультрафиолетом.
В отношении экспрессии BCL-2 в эпидермальных клетках исследовали влияние образца экстракта на нормальную кожу в плане экспрессии BCL-2 и повреждения ДНК ультрафиолетом (образования димеров Т-Т), а результаты представлены в табл.6.
Таблица 6
Группа
Обработка
Экспрессия BCL-2
Положительные на димер Т-Т клетки (%)
Первая
нанесение PBS
слабая
0
Вторая
нанесение образца
+
0
Как видно из приведенных в табл.6 результатов, отмечается небольшое повышение экспрессии BCL-2 в группе с нанесением образца по сравнению с группой нанесения PBS в качестве контроля, но повышение экспрессии BCL-2 было очень небольшим по сравнению с группой нанесения образца после облучения ультрафиолетом из эксперимента 1, что соответствует отсутствию заметных изменений частоты апоптоза.
Что касается образования димеров Т-Т в эпидермальных клетках, то ни в одной группе не отмечалось образования димеров Т-Т в эпидермисе в отсутствие облучения ультрафиолетом.
Как видно из вышеприведенных результатов, установлено, что образцы экстракта способствуют экспрессии белка BCL-2 в эпидермальных клетках живого организма и ингибируют апоптоз. Кроме того, в Примерах уменьшалось содержание димеров Т-Т в эпидермальных клетках, подвергавшихся облучению ультрафиолетом, что свидетельствует о том, что предотвращается повреждение ДНК при облучении ультрафиолетом.