Особенности фенотипической модуляции гладких миоцитов воздухоносных путей при развитии хронических неспецифических заболеваний легких на европейском Севере

УДК 611.018.6:[616.24:616.248:616.233]

особенности фенотипической модуляции глддких миоцитов воздухоносных путей при развитии хронических неспецифических заболеваний легких на европейском севере

A. Л. Зашихин, Ю. В. Агафонов, А. О. Бармина,

B. П. Быков

Северный государственный медицинский университет, г. Архангельск

Вопрос о роли гладкой мышечной ткани (ГМТ) бронхиального дерева как важного компонента морфофункциональных механизмов, обусловливающих характер развития и тяжесть поражения при хронических заболеваниях дыхательной системы, достаточно широко обсуждается в научной печати [2, 7, 10]. Исследования последних лет продемонстрировали сложную структуру популяции гладких мышечных клеток (ГМК) в составе мышечной ткани бронхов и других висцеральных органов [1, 5, 9, 13]. При этом точки зрения авторов на оценку фенотипа лейомиоцитов и возможности его изменения при различных функциональных нагрузках крайне разнородны [10, 14].

Показано, что уровень представительства гладкой мускулатуры, а также характер ее реактивности при действии антигенных факторов и развитии патологических процессов в бронхах разных порядков существенно различаются [6, 11]. В последние годы появляется все больше работ, свидетельствующих о том, что гладкие миоциты являются активными участниками различных патологических процессов органов дыхания [8], не только вызывая изменение контрактильной функции воздухоносных путей, но и активно воздействуя на изменение состава межклеточного матрикса, что играет существенную роль в развитии процессов фиброзирования легкого [12, 15].

Проведенные ранее исследования позволили констатировать наличие нескольких субпопуляций гладких миоцитов в составе висцеральной гладкой мускулатуры различных органов [4, 9]. В настоящей работе предпринята попытка проанализировать характер изменений ультра-структурных параметров гладких миоцитов бронхов и особенностей экспрессии маркерных и фенотипических белков этими клетками при развитии хронических бронхитов.

Материал и методика

Был изучен материал, полученный при хирургических вмешательствах от 20 пациентов с хроническим обструктивным бронхитом. Для сравнения исследован материал 22 пациентов в возрасте 40—60 лет, полученный из интактных участков легких, резецированных по поводу онкологической патологии. Чтобы исключить сопутствующие хронические заболевания дыхательных путей у пациентов, при заборе материала учитывали данные анамнеза. материал для электронной микроскопии фиксировали в 2,5 % растворе глютарового альдегида на

0,1 М-фосфатном буфере с рН 7,2—7,4 в течение 2 часов и последующей фиксацией в течение 1 часа в растворе 1 % тетраокиси осмия при температуре 5 °С. Кусочки промывали в буфере, обезвоживали в спиртах с контрастированием в 70 % спирте и 1 % уранилацетате в течение 12 часов. Затем заливали в смесь эпон-аралдита, получали

Проанализирован характер изменений ультраструктурных параметров гладких миоцитов бронхов и особенностей экспрессии маркерных и фенотипических белков этими клетками при развитии хронических бронхитов. Показано, что в гладкой мышечной ткани (ГМТ) бронхов различных генераций при хроническом обструктивном бронхите не выявлено существенных изменений экспрессии исследуемых контрактильных белков гладких миоцитов. В участках легких с развитым фиброзом, десквама-цией эпителия и воспалительными инфильтратами гладкомышечный компонент бронхов характеризовался снижением реакции на десмин, гладкомышечный актин и гладкомышечный миозин. В этих зонах в ГМТ бронхиальной стенки отмечалась позитивная реакция на виментин и проколлаген 11. Изменения спектра протеинов экспрессируемых гладких мышечных клеток (ГМК) сопровождаются фенотипической трансформацией гладких миоцитов, что подтверждается результатами электронно-микроскопического анализа ГМТ. Вероятно, данная трансформация ГМК бронхов является одним из существенных компонентов развития хронических обструктивных бронхитов, обусловливающих последующее развитие фибротических процессов в легких.

Ключевые слова: гладкие миоциты, бронхи, хронический обструктивный бронхит, Европейский Север.

серийные полутонкие срезы толщиной 1—2 мкм, которые окрашивали 1 % раствором метиленового синего. После идентификации необходимых объектов блоки затачивали и прицельные ультратонкие срезы готовили на ультратоме LKB-3, контрастировали в 2,5 % растворе уранилацетата и 0,3 % растворе цитрата свинца по Рейнольдсу. Просматривали в электронных микроскопах JEM-100 CX.

Изучение экспрессии маркерных протеинов ГМК в гладкой мускулатуре бронхов при развитии хронического обструктивного бронхита проводили путем иммуноцитохимического анализа белков: гладкомышечного актина (ГМ-актин), гладкомышечного миозина (ГМ-миозин) и фенотипирующих маркерных протеинов (виментин, десмин и проколлаген 11).

Перед инкубацией в растворе первичных антител криостатные срезы на стеклах обрабатывали ацетоном при —20 °С в течение 10 минут, затем воздействовали 1 % раствором тритона X-100 в течение 15 минут и адсорбировали 5 % кроличьей сывороткой (фирма Dako) 30 минут при комнатной температуре. После каждой операции срезы отмывали стандартным раствором фосфатно-солевого буфера (фирма Sigma Immunochemicals). В качестве первичных антител использовали моноклональный мышиный иммуноглобулин G1 против десмина человека, клон D33 (фирма Dakopatts), моноклональный мышиный иммуноглобулин G против виментина, клон V9 (фирма Dako), моноклональный мышиный иммуноглобулин G2 против альфа-актина гладких мышц человека, клон 1А4 (фирма Bi0meda). Экспозицию в растворах первичных антител проводили в течение 12 часов при 4 °С. Визуализация реакции осуществлялась двумя методами: с помощью вторичных антител, конъюгированных с флуорохромами (иммунофлуоресценция), для выявления десмина, ГМ-актина и виментина, а также PAP-методом с применением диаминобензидина для выявления проколлагена 11 и ГМ-миозина.

Результаты исследования

Показано, что в ГМТ бронхов различных генераций при хроническом обструктивном бронхите не выявлено существенных изменений экспрессии исследуемых контрактильных белков гладких миоцитов. При этом отмечена более выраженная реакция на ГМ-актин в бронхиолах и респираторных отделах легкого по сравнению с крупными бронхами. В участках легких с развитым фиброзом, десквамацией эпителия и воспалительными инфильтратами гладкомышечный компонент бронхов характеризовался снижением реакции на десмин, ГМ-актин и ГМ-миозин. В этих зонах в ГМТ бронхиальной стенки отмечалась позитивная реакция на проколлаген 11 и виментин.

характер изменения спектра протеинов экспрессируемых ГМк в участках легких с выраженным фиброзом и реактивными изменениями, вероятно, обусловливает развитие обструктивных изменений воздухоносных путей. Одной из причин данного процесса может быть фенотипическая трансформация

гладких миоцитов в составе мускулатуры бронхов. Это подтверждается результатами электронно-микроскопического анализа ГМТ, свидетельствующими о наличии в гладкой мускулатуре ряда миоцитов с выраженным развитием компонентов синтетического аппарата, что позволяет рассматривать их как ГМК синтетического типа (рисунок). Наряду с этим в составе ГМТ выявляются клеточные элементы, ультра-структурные параметры которых позволяют отнести их к группе миофибробластов. Вероятно, данная фенотипическая трансформация гладких мышечных клеток бронхов является одним из существенных компонентов развития хронических обструктивных бронхитов, обусловливающих последующее развитие фибротических процессов в легких.

Таким образом, в динамике развития хронических воспалительных заболеваний легких активная роль принадлежит гладкомышечной составляющей воздухоносных путей. При этом изменяется не только уровень контрактильной активности ГМТ, но и характер морфофункциональных показателей гладких миоцитов в составе бронхов. Поскольку ультраструктурная организация и структура популяции миоцитов в бронхах

Фенотипы гладких миоцитов в мускулатуре бронхов при хроническом обструктивном бронхите: А — сократительный фенотип; Б — синтетический фенотип. Я — ядро миоцита; Мф — миофиламенты, Эр — эндоплазматический ретикулум; М — митохондрии. Ув.: 7 000 х

различного диаметра характеризуются существенными различиями [3, 14], это в значительной мере может определять характер тканевых реакций ГМТ при развитии перибронхиальных воспалительных процессов.

Список литературы

1. Ерохина В. В. Клеточная биология легких в норме и патологии / В. В. Ерохина, Л. К. Романова. — М. : Медицина, 2000.

2. Есипова И. К. Структурно-функциональные особенности крупных и мелких бронхов и различия возникающих в них воспалительных реакций / И. К. Есипова, Ю. Г. Алексеевских // Архив патологии. — 1994.

— Т. 56, № 4. — С. 6-9.

3. Зашихин А. Л. Гладкая мускулатура бронхов человека

(аспекты структурно-метаболической организации) / А. Л. Зашихин, Я. Селин, Ю. В. Агафонов, Л. А. За-островская // Морфология. — 2000. — № 1.

— С. 50-56.

4. Зашихин А. Л. Гладкая мышечная ткань бронхов (Гистогенетическая характеристика) / А. Л. Зашихин, Ю. В. Агафонов // Там же. — 1997. — Т. 3, № 1.

— С. 75-81.

5. Зашихин А. Л. Динамика популяции гладкой мышцы воздухоносных путей при изменении функциональной нагрузки легких / А. Л. Зашихин, Ю. В. Агафонов // Пульмонология. — 1994. — № 3. — С. 76-81.

6. Blaes N. Isolation of two morphologically distinct cell lines from rat arterial smooth muscle expressing high tumorigenic potentials / N. Blaes, M.-C. Bourdillon, J.-M. Daniel-Lamaziere et al. // In vitri Cell Dev. Biol.

— 1991. — Vol. 27a — P. 725-734.

7. Brown R. H. Individual airway constriction response heterogeneity to histamine assessed by high-resolution computed tomography / R. H. Brown, C. J. Herold, C. A. Hirshman et al. // J. Appl. Physiol. — 1993.

— Vol. 74. — P 2615-2620.

8. Ebina M. Cellular hypertrophy and hyperplasia of airway

smooth muscles underlying bronchial asthma: a 3-d study / M. Ebina, T. Thakahashi, T. Chiba, M. Motomiya // Am. Rev. Respir. Dis. — 1993. — Vol. 148

— P. 720-726.

9. Halayko A. J. Markers of airway smooth muscle cell phenotype/ A. J. Halayko, H. Salary, X. Ma and N. L. Stephens // Am. J. Physiol. — 1996. — Vol. 270.

— P. 1040-1051.

10. Halayko A. J. Potential role for phenotypic modulation of bronchial smooth muscle cells in chronic asthma /

A. J. Halayko and N. L. Stephens // Can. J. Physiol. Pharmacol. — 1994. — Vol. 72. — P 1448-1457.

11. Jeffery P. K. Comparative morphology of the airways in asthma and chronic obstructive pulmonary disease / P K. Jeffery // Am. J. Respir. Crit. Care Med. — 1994.

— Vol. 150 (5 Pt 2). — P. 6-9.

12. Jeffery P. K. Histological features of the airways in asthma and COPD / P K. Jeffery // Respiration. — 1992.

— Vol. 59. Suppl. 1. — P. 13-16.

13. Ma X. Detection of two clusters of mechanical properties of smooth muscle along the airway tree / X. Ma, W Li, N. L. Stephens // J. of Applied Physiology. — 1996.

— Vol. 80. N 3. — P. 857-861.

14. Neylon C. B. Different electrical responses to Vasoactive Agonists in Morphologically Distinct Smooth Muscle Cell Types / C. B. Neylon, P. V. Avdonin, R. J. Dilley et al. // Circulation Research. — 1994. — Vol. 75.

— P. 733-741.

15. Zashikhin A. Airway smooth muscle cells phenotype modulation in chronical obstructive type of lung insufficiency/ A. Zashikhin; J. Sehlin // European Respiratory Jornal. — 2003. — Vol. 22. Suppl. 45.

— P. 406.

PECULARITIES OF AIRWAY SMOOTH MYOCYTE PHENOTYPICAL MODULATION DURING CHRONIC PULMONARY DISEASES IN EUROPEAN NORTH

A. L. Zashikhin, Yu. V. Agafonov, A. O. Barmina,

V. P. Bykov

Northern State Medical University, Arkhangelsk

An ultrastructural analysis of bronchi smooth muscle and peculiarities of expression of markers and phenotypical proteins during development of chronic bronchitis has been performed. The material of identical parts of the unaffected lungs was analyzed as a control group. We have shown that there were no essential changes in contractile proteins expression in smooth muscle cells (SMC). Changes were more significant in cases of fibrosis when positive reaction to desmin, SM -actin, SM-myosin was low. In the same zones, reaction to vimentin and procollagen 11 was clearer. The observed events reflected a correlation between the myocyte contractile protein expression and the change in the SMC ultrastructure that was transformed into a synthetic type of myocyte. This phenotype transformation could be one of the remodeling machanizms during the process of fibrosis development.

Key words: smooth myocytes, bronchi, chronic obstructive bronchitis, European North.