СЛОЖНЫЕ ЭФИРЫ ПЕНТАМИДИН-АМИДОКСИМ КИСЛОТ КАК ПРОЛЕКАРСТВА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
ESTERS OF PENTAMIDINE-AMIDOXIME ACIDS AS PRODRUGS AND THEIR APPLICATION AS MEDICINAL AGENTS

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к пролекарственным производным пентамидина, их применению для лечения и/или профилактики заболеваний, в частности опухолевых заболеваний и рака, а также лейшманиоза, трипаносомоза, пневмоцистной пневмонии (РсР), а также малярии.
Уровень техники
Пентамидин является антипаразитарным и антимикробным активным соединением, применение которого признано при лечении трипаносомоза, лейшманиоза, а также пневмоцистной пневмонии (РсР). Из-за двух сильно основных амидиновых функциональных групп соединение заряжается в физиологических условиях и не будет абсорбироваться организмом после перорального введения. Это является причиной того, почему соединение необходимо вводить парентерально, например внутримышечным, внутривенным способом или путем ингаляции. В данном контексте следует иметь в виду, что большинство упомянутых выше инфекционных заболеваний, вызванных патогенными микроорганизмами, имеет место в тропических и субтропических странах, где медицинская помощь часто является недостаточной. Поэтому в таких странах сложные формы применения, которые представлены внутривенным применением и ингаляцией, делают безопасную лекарственную терапию затруднительной. По этой причине разработка перорально биодоступного пролекарства пентамидина имеет громадное значение для того, чтобы решительно улучшить выбор лечения. Другим отрицательным аспектом является отсутствие возможности пентамидина проходить в ЦНС, приводящее к тому, что пентамидин является эффективным только на ранней стадии трипаносомоза (африканская сонная болезнь), а не в менингоэнцефалитной фазе, в которой патогенные микроорганизмы проникают в ЦНС.
1, 2
3
Другой возможной областью применения пентамидина является противораковая терапия. Ингибирующее действие пентамидина на эндо-, экзонуклеазы исследуется на протяжении последних лет. Первые клинические исследования уже показали обнадеживающие результаты при лечении рака молочной железы и толстой кишки. В таком случае применение перорально биодоступного пролекарства пентамидина также имеет очень большое значение.
4
5
6
7, 8
По таким причинам проводятся многочисленные испытания для того, чтобы улучшить как биодоступность, так и прохождение ЦНС. В предыдущих исследованиях пентамидин переводят в пентамидина диамидоксим меньшей основности, что ведет к значительному повышению лиофильности. Так как амидоксимы являются незаряженными в физиологических условиях, абсорбция таких соединений из желудочно-кишечного тракта существенно выше. Заметное восстановление амидоксимов до фармакологически активных амидинов смогли показать впервые в 1988 году на основе модельного соединения бензамидоксима. Позднее принцип перенесли на пентамидин, посредством чего получили пентамидина моноамидоксим и пентамидина диамидоксим (3). В исследованиях на животных оба соединения показали низкую биодоступность и хорошую способность активироваться до пентамидина активной формы. Между тем ферментная система, ответственная за восстановление, может быть идентифицирована как до сих пор неизвестная молибденсодержащая система, которую называют mARC (митохондриальный восстанавливающий амидоксимы компонент).
9
10-12
Для того чтобы оптимизировать как фармакокинетический профиль для улучшения биодоступности, так и способность проходить в ЦНС, разрабатывают другие пролекарства. С N,N-бис(ацетокси)пентамидином получают соединение, которое имеет отчетливо повышенную лиофильность по сравнению с другими пролекарствами пентамидина. Такое пролекарство также могло показать пероральную биодоступность в исследованиях на крысах, а также на свиньях. Недостатком N,N-бис(ацетокси)пентамидина является очень низкая растворимость в воде, с одной стороны, с другой стороны, установленная биодоступность является очень низкой и прохождение в ЦНС нельзя подтвердить. Подобные подходы привели к разработке N,N'-бис(метокси)пентамидина, который подобно N,N'-бис(ацетокси)пентамидину имеет очень низкую растворимость в воде. Другими принципами пролекарства, которые перенесены на пентамидин, являются гидроксилирование до N,N'-бис(дигидрокси)пентамидина и конъюгация с аминокислотами (в частности, валином) до N,N'-бис(валокси)пентамидина. Следует в итоге отметить, что на сегодняшний день не разработано пролекарство пентамидина, которое оптимально удовлетворяет требуемым критериям (хорошая пероральная биодоступность, прохождение в ЦНС и хорошая растворимость).
В свете вышеописанного настоящее изобретение имеет в основе задачу получения пролекарств пентамидина, которые обладают улучшенными свойствами по сравнению с известными пролекарствами пентамидина.
Раскрытие изобретения
Упомянутая задача решается согласно изобретению с помощью соединения формулы (I)
,
в которой n равно 1-10, а также его фармацевтически приемлемых производных.
В предпочтительном воплощении n в формуле (I) равен 2.
В другом предпочтительном воплощении n в формуле (I) равен 3. В другом предпочтительном воплощении n в формуле (I) равен 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10.
В частности, N,N'-бис(сукцинилокси)пентамидин (1) явно превосходит описанные до этого пролекарства пентамидина. В частности, установлено значительное улучшение растворимости, которая является весьма критичным параметром других пролекарств пентамидина. Такая улучшенная растворимость положительно влияет на фармакокинетическое поведение вещества, так как свойства хорошей растворимости составляют важный параметр при всасывании лекарственных веществ.
Кроме того, настоящее изобретение также относится к солям, сольватам и сольватам солей упомянутых соединений формулы (I).
Кроме того, настоящее изобретение относится к упомянутым соединениям формулы (I) для лечения и/или профилактики заболеваний.
В предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к упомянутым соединениям для применения при лечении и/или профилактике онкологических заболеваний и опухолевых заболеваний любого патогенеза.
В другом предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к упомянутым соединениям для применения при лечении и/или профилактике лейшманиоза, трипаносомоза и/или пневмоцистной пневмонии (РсР).
В другом предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к упомянутым соединениям для применения при лечении и/или профилактике малярии.
Кроме того, настоящее изобретение относится к лекарственному средству, включающему по меньшей мере одно из упомянутых соединений формулы (I), в соответствующем случае в комбинации с одним или несколькими инертными нетоксичными фармацевтически приемлемыми эксципиентами.
Настоящее изобретение также относится к лекарственному средству, включающему по меньшей мере одно из упомянутых соединений формулы (I) в комбинации с одним или несколькими другими активными средствами.
Кроме того, настоящее изобретение также относится к лекарственному средству для перорального или парентерального применения.
Кроме того, настоящее изобретение относится к лекарственному средству для лечения и/или профилактики онкологических заболеваний и опухолевых заболеваний.
Настоящее изобретение также относится к лекарственному средству, описанному выше, которое представляет собой энтеральный препарат.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения и/или профилактики опухолевых заболеваний у людей или животных с использованием по меньшей мере одного из упомянутых соединений формулы (I) или одного из упомянутых лекарственных средств.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения и/или профилактики лейшманиоза, трипаносомоза и/или пневмоцистной пневмонии (РсР).
Настоящее изобретение также относится к способу получения такого соединения, какое описано выше, по которому амидоксим формулы (А)
взаимодействием с ангидридом дикарбоновой кислоты формулы (В)
,
в которой n равно 1-10,
превращают в соединение формулы С
11
Другим разработанным принципом пролекарства является сочетание амидоксимов с дикарбоновыми кислотами, описанное в заявках на патент WO 2009095499 и DE 102008007381. Соответствующие пролекарства пентамидина разработаны со ссылкой на эти исследования. Полученные соединения подробно характеризуются и проверяются в отношении их биодоступности. Исследования авторов показали, что производные дикарбоновых кислот и пентамидина являются особенно подходящими пролекарствами пентамидина, которые, кроме превосходной растворимости, также обладают хорошей пероральной биодоступностью после перорального применения. Сравнительные анализы с использованием других пролекарств пентамидина показывают в данном случае превосходство N,N'-бис(сукцинилокси)пентамидина (1) над пролекарствами пентамидина, описанными до настоящего времени.
Осуществление изобретения
Терапевтическое применение пентамидина до настоящего времени весьма ограничено из-за недостаточной пероральной биодоступности. В частности, в слаборазвитых странах третьего мира разработка перорально доступного лекарственного вещества составляет значительный прогресс в фармакотерапии, так как позволяет избежать сложных и опасных внутривенных применений. Кроме того, на сегодня выбор лечения, в частности, трипаносомоза, пневмоцистной пневмонии и заражений лейшманиозом, является неудовлетворительным. По этой причине данное изобретение фокусируется на разработке перорально биодоступного пролекарства пентамидина.
3
Кроме того, перорально приемлемое пролекарство пентамидина может приобрести существенное значение в противораковой терапии. Пентамидин в настоящее время проверяют в клинических исследованиях против различных видов рака (карциномы молочной железы и толстой кишки). Первые клинические исследования уже показали обнадеживающие результаты. В данном случае новые пролекарства пентамидина также могут найти применение и улучшить лечение как раз в комбинации с другими противораковыми активными средствами.
Новые пролекарства пентамидина в рамках настоящего изобретения получены соединением пентамидина диамидоксима (3) с дикарбоновыми кислотами. Полученные соединения всесторонне характеризуются in vitro и in vivo, при этом они показывают превосходную растворимость, а также хорошую биодоступность. Кроме того, сравнительный анализ с использованием различных пролекарств пентамидина показывает превосходство заново разработанного N,N'-бис(сукцинилокси)пентамидина (1) над пролекарствами пентамидина, описанными до настоящего времени.
Синтез
Пролекарства (1, 2) получают из пентамидина диамидоксима (3) и соответствующего ангидрида (янтарного, соответственно глутарового, ангидрида). Исходное соединение греют в сухом ацетоне при температуре образования флегмы в течение 4 часов, добавляя янтарный ангидрид (см. фигуру 1). Последующее кипячение в толуоле и прямая фильтрация позволяют выделить вещества 1 и 2 и получить нужные соединения в аналитически чистой форме.
Устойчивость
Анализ показывает, что соединение 1 устойчиво в нейтральном и слабощелочном интервале pH, следовательно от pH 7,4 до pH 9,9. В кислой среде при pH 2,0 соединения быстро расщепляются гидролитически (фигуры 2, 3).
В анализах показано, что N,N'-бис(сукцинилокси)пентамидин (1) гидролизуется в водной среде до моносукцинилпентамидина и пентамидина диамидоксима (3). В то время как такой гидролиз протекает при pH 7,4 и pH 9,0 только в незначительной степени, он заметно протекает при pH 2,0 в плазме человека, а также мыши. Быстрый гидролиз N,N'-бис(сукцинилокси)пентамидина (1) при pH 2,0 (см. фигуры 2, 3) после перорального применения должен привести к быстрому гидролизу пролекарства до пентамидина диамидоксима (3) в желудке в кислой среде. Но так как основная часть всасывания в желудочно-кишечном тракте происходит только в верхних отделах тонкой кишки, следует направлять усилия на энтеральный препарат такого пролекарства. В таком случае пролекарство будет выходить из кислой среды желудка неповрежденным и может быть абсорбировано позднее в тонкой кишке. Следовательно, неустойчивость при pH 2,0 не следует классифицировать как проблему для дальнейшего применения в качестве лекарственного вещества.
Растворимость
N,N'-Бис(сукцинилокси)пентамидин (1) обладает очень хорошей растворимостью в интервале pH от 7,4 до 9,0 (см. таблицу 1). Растворимость в кислой среде (pH 2,0) нельзя охарактеризовать точно из-за гидролиза в такой среде, как описано ранее. Однако эксперименты показывают, что в данном случае растворимость также находится в мМ интервале.
Таблица 1 показывает растворимость N,N'-бис(сукцинилокси)пентамидина (1) в сравнении с другими пролекарствами пентамидина. Из приведенных данных становится ясно, что производное дикарбоновой кислоты (1) является соединением с самой лучшей растворимостью. Только пентамидина монооксид также растворяется в мМ интервале при нейтральном и слабощелочном значении pH. Однако данное соединение еще обладает свободной амидиновой функциональной группой, которая оказывает весьма неблагоприятное действие на пероральную биодоступность. Такие превосходные свойства растворимости способствуют дальнейшему применению в качестве лекарственного вещества, так как достаточная растворимость является основным предварительным требованием для достаточной пероральной абсорбции. Кроме того, хорошая растворимость N,N'-бис(сукцинилокси)пентамидина (1) также делает возможными парентеральные формы применения, такие как инъекции или инфузии.
Связывание белков
Анализы на связывание белков показывают, что данное соединение, связывая плазменные белки, убирает 97% всех предполагаемых для связывания белков. Установленное связывание белков находится в интервале, который описан также для других пролекарств пентамидина и таким образом не является недостатком при сравнении с другими пролекарствами.
Концепция пролекарства
Сама концепция пролекарства, на которой основаны соединения по изобретению, описана в заявках на патент WO 2009095499 и DE 102008007381.
Активация пролекарства по изобретению протекает с помощью эстераз и ферментной системы mARC и, следовательно, не зависит от цитохромных ферментов Р450. Участие ферментов Р450 всегда несет опасность взаимодействий, которые не описаны авторами в селективном механизме активации. Цитохромные ферменты Р450 принимают участие в метаболизме многих лекарственных веществ. Если принимают несколько лекарственных веществ, которые метаболизируются с помощью ферментной системы, замедление разложения лекарственных веществ может являться результатом клинически релевантного побочного действия.
Активация in vitro
Проведенные исследования активации in vitro показывают превосходную степень активации N,N'-бис(сукцинилокси)пентамидина (1) (таблица 2). Инкубация с карбоксилэстеразами из печени свиньи приводит к быстрой активации N,N'-бис(сукцинилокси)пентамидина (1) (см. фигуру 4). Примерно 90% используемого субстрата активируются так быстро, как после инкубации за время 60 мин. Такой результат показывает, что первая стадия активации N,N'-бис(сукцинилокси)пентамидина (1) до диамидоксима протекает с превосходной скоростью.
Восстановление пентамидина можно обнаружить при инкубации с субклеточными ферментными препаратами (таблица 2). Вообще, источники ферментов свиного происхождения являются более активными, чем человеческие источники, - факт, который можно объяснить способом получения ферментных препаратов. Следует принять во внимание, что обработка органов человека более проблематична, поскольку начальные количества очень небольшие. Кроме того, свиные органы, как правило, происходят от здоровых животных, в то время как образцы тканей человека в большинстве случаев берутся у больных раком после резекции органа, что объясняет сравнительно низкие скорости конверсии при использовании препаратов ферментов человека.
В итоге можно утверждать, что N,N'-бис(сукцинилокси)пентамидин (1) является подходящим пролекарством пентамидина. Данное исследование вообще показывает, что происходит биоактивация пролекарств до активного соединения. Можно ожидать, что скорости конверсии in vivo будут явно выше, так как требуемые ферменты доступны в больших количествах.
Пероральная биодоступность
Пероральную биодоступность N,N'-бис(сукцинилокси)пентамидина (1) можно показать в исследованиях, проводимых на животных. После перорального введения пролекарства уровни пентамидина в плазме нельзя обнаружить - факт, который можно объяснить тенденцией к высокому накоплению пентамидина в органах. Анализ образцов органов показывает, что N,N'-бис(сукцинилокси)пентамидин (1) перорально доступен. После перорального введения пролекарства релевантные концентрации можно идентифицировать во всех проверяемых органах (печень, почки, легкие, сердце, головной мозг и селезенка). Наивысшие концентрации во всех случаях обнаруживаются в почках и печени (фигура 5). Концентрации в селезенке, сердце, головном мозгу и легких являются явно более низкими. Относительная пероральная биодоступность может быть определена, в зависимости от органа, как составляющая до 98% (таблица 3).
50
50
50
13-16
В итоге данные показывают превосходную применимость принципа пролекарства по изобретению для пентамидина. Концентрации пентамидина, обнаруживаемые в органах, находятся в интервале, который делает возможной терапию заражений трипаносомами (IC; 0,8-3,2 нМ), лейшманиозом (IC: 820-2590 нМ), а также плазмодиями (IC: 35-129 нМ).
Выводы
Вновь разработанные пролекарства являются перорально биодоступными пролекарствами пентамидина. Используемый принцип пролекарства приводит к значительному улучшению растворимости, которая является весьма критичным параметром других пролекарств пентамидина. Улучшенная растворимость положительно влияет на фармакокинетическое поведение вещества, так как свойства хорошей растворимости являются важным параметром при абсорбции лекарственных веществ, в частности, в желудочно-кишечном тракте.
За исключением кислотного интервала pH соединение (1) обладает хорошей химической устойчивостью. Заметный гидролиз в кислой среде является условием того, что пролекарство, когда его вводят перорально, следует вводить в виде энтерального препарата с тем, чтобы предотвратить преждевременный гидролиз в желудке.
Анализы на биоактивацию in vitro показывают быструю и обширную активацию пролекарства до пентамидина. Активация протекает независимо от цитохромных ферментов Р450 и, следовательно, не включает опасность взаимодействий.
Хорошую пероральную биодоступность также можно подтвердить экспериментально в последующих исследованиях, проводимых на животных. Содержание пентамидина, обнаруживаемое в органах, находится в интервале, который обеспечивает эффективность в отношении заражений трипаносомами, лейшманиозом и плазмодиями.
Как итог, производные дикарбоновых кислот пентамидина являются превосходными пролекарствами, которые располагают превосходными физико-химическими параметрами и обладают хорошей пероральной биодоступностью. Благодаря таким свойствам они явно превосходят другие пролекарства пентамидина. Применение возможно как в противораковой терапии, так и при лечении заражений трипаносомами, лейшманиозом и пневмоцистной пневмонии.
Краткое описание чертежей
Фигура 1. Схема синтеза пролекарств пентамидина.
Фигура 2. Устойчивость N,N'-бис(сукцинилокси)пентамидина (1) при различных значениях pH в плазме крысы, соответственно человека, а также при инкубации с эстеразой.
Фигура 3. Устойчивость N,N'-бис(сукцинилокси)пентамидина (1) при различных значениях pH в плазме крысы, соответственно человека.
Фигура 4. Активация N,N'-бис(сукцинилокси)пентамидина (1) эстеразами.
Фигура 5. Содержание пентамидина в органах после п.о. применения (1) (50 мг/кг) пентамидина и N,N'-бис(сукцинилокси)пентамидина (1). Показаны средние значения у всех подопытных крыс.
Материалы и способы: примеры воплощений
Синтез
4,4'-Пентаметилендиоксибис[N-(карбоксипропионилокси)]бензамидин (N,N'-бис(сукцинилокси)пентамидин) (1)
Растворяют 1 г пентамидина диамидоксима в 250 мл ацетона и добавляют 540 мг янтарного ангидрида. Смесь перемешивают при кипячении с обратным холодильником в течение 4 час. Затем растворитель удаляют в вакууме и остаток кристаллизуют из толуола.
Выход 68%.
Температура плавления 141°C.
ИК (KBr):
~
-1
ν= 3478, 3348, 2940, 2870, 1732, 1698, 1612, 1472, 1250 см
1
6
Н ЯМР (ДМСО-d):
2
2
2
2
2
2
с
с
3
3
3
3
δ/м.д. (TMS) = 1,59 (м, 2Н, CH), 1,79 (кв, 4Н, J=6,7 Гц, CH), 2,52 (т, 4Н, J=6,6 Гц, CH), 2,68 (т, 4Н, J=6,6 Гц, CH), 4,04 (т, 4Н, J=6,5 Гц, O-CH), 6,63 (с, 4Н, NH), 6,99 (м, 4Н, AA'BB', Ar-H), 7,65 (м, 4Н, AA'BB', Ar-H), 12,18 (ушс, 2Н, COOH).
13
6
С-ЯМР (ДМСО-d):
2
2
2
2
2
2
δ/м.д. (TMS) = 22,1 (CH), 27,9 (CH), 28,3 (CH), 28,8 (CH), 67,5 (O-CH), 113,9 (ArCH), 123,5 (ArC), 128,1 (ArCH), 156,2 (ArC), 160,3 (C-NH), 170,2 (COOR), 173,5 (COOH).
MC (ESI) m/z:
+
+
+
+
+
2
4
4
3
4
4
3
2
573 [M+H], 555 [М-HO+H], 473 [M-CHO+H], 455 [M-CHO-HO+H], 373 [DAO+H], 178.
27
32
4
10
Элементный анализ CHNO (молекулярная масса 572,56):
вычислено: C 56,64, H 5,63, N 9,79;
найдено: C 56,85, H 6,01, N 9,60.
4,4'-Пентаметилендиоксибис[N-(карбоксибутионилокси)]бензамидин (N,N'-бис(глутарилокси)пентамидин) (2)
Растворяют 1 г пентамидина диамидоксима в 250 мл ацетона и добавляют 616 мг глутарового ангидрида. Смесь перемешивают при кипячении с обратным холодильником в течение 4 час. Затем растворитель удаляют в вакууме и остаток кристаллизуют из толуола.
Выход 80%.
Температура плавления 155°C.
ИК (KBr):
~
-1
ν = 3495, 3350, 2950, 2874, 1747, 1700, 1619, 1520, 14225, 1258 см
1
6
Н ЯМР (ДМСО-d):
2
2
2
2
2
2
3
3
3
δ/м.д. (TMS) = 1,59 (м, 2Н, CH), 1,81 (м, 8Н, CH), 2,29 (т, 4Н, J=7,4 Гц, CH), 2,49 (т, 4Н, J=7,1 Гц, CH), 4,04 (т, 4Н, J=6,4 Гц, O-CH), 6,63 (с, 4Н, NH), 6,98 (м, 4Н, AA'BB', Ar-H), 7,65 (м, 4Н, AA'BB', Ar-H), 12,05 (с, 2Н, COOH).
13
6
С-ЯМР (ДМСО-d):
2
2
2
2
2
2
2
δ/м.д. (TMS) = 19,9 (CH), 22,1 (CH), 28,3 (CH), 31,6 (CH), 32,8 (CH), 67,5 (O-CH), 114,1 (ArCH), 123,5 (ArC), 128,1 (ArCH), 156,1 (ArC), 160,3 (C-NH), 170,6 (COOR), 173,9 (COOH).
MC (ESI) m/z:
+
601 [M+H], 169.
29
36
4
10
Элементный анализ CHNO (молекулярная масса 600,62):
вычислено: C 57,99, H 6,04, N 9,33;
найдено: C 58,05, H 6,24, N 9,72.
Альтернативный синтез N,N'-бис(сукцинилокси)пентамидина (1) и N,N'-бис(глутарилокси)пентамидина (2)
Пролекарства (1, 2) получают из пентамидина диамидоксима (3) и соответствующего ангидрида (янтарного, соответственно глутарового, ангидирида).
Для получения пролекарства (1) пентамидина диамидоксим (3) растворяют в этаноле и к раствору по каплям добавляют десятикратный избыток янтарного ангидрида, растворенного в дихлорметане. Смесь кипятят с обратным холодильником в течение четырех часов, охлаждают до комнатной температуры, образовавшееся выпавшее в осадок вещество отфильтровывают и затем несколько раз промывают дихлорметаном. Соединение (1) можно получить чистым для анализа с очень хорошим выходом. Для получения пролекарства (2) исходное соединение греют в течение 4 час в сухом ацетоне при температуре образования флегмы, в то же время добавляя глутаровый ангидрид (см. схему 1). Путем последующего кипячения в толуоле и прямой фильтрации можно выделить получить соединение (2) чистым для анализа.
Характеризация пролекарств пентамидина
Анализы на устойчивость N,N'-бис(сукцинилокси)пентамидина (1)
Для анализов на устойчивость получают 0,1 мМ раствор N,N'-бис(сукцинилокси)пентамидина (1) в смеси 50 мМ калий-фосфатный буфер/ДМСО (90/10 об./об.). Проводят анализ при значениях pH 2,0, 7,4 и 9,0. Берут один образец и сразу же анализируют ВЭЖХ каждые 15 мин на протяжении периода 150 мин.
Другие анализы проводят с плазмой человека и крысы. Смешивают 900 мкл плазмы со 100 мкл 2 мМ раствора N,N'-бис(сукцинилокси)пентамидина (1). Таким образом, конечная концентрация N,N'-бис(сукцинилокси)пентамидина (1) составляет 0,2 мМ. Образцы инкубируют при 37°C при встряхивании на водяной бане и берут пробы через 0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105 и 120 мин. С этой целью в каждом случае отбирают 100 мкл и смешивают со 100 мкл ацетонитрила. Образцы встряхивают, центрифугируют в течение 5 мин и супернатант анализируют ВЭЖХ.
Кроме того, проводят инкубации с карбоксилэстеразой из печени свиньи. С этой целью N,N'-бис(сукцинилокси)пентамидин (1) инкубируют в концентрации 0,1 мМ с 1Е эстеразы в 250 мкл 50 мМ фосфатного буфера, pH 7,4, при 37°C в течение 60 мин. С интервалами 15 мин, каждый, образцы анализируют ВЭЖХ.
Анализы на устойчивость выполняют методом ВЭЖХ в условиях, описанных далее.
Система ВЭЖХ
Система ВЭЖХ Waters Alliance™ с разделительным модулем Waters e2695 XC, детектор с фотодиодной матрицей Waters 2998 и программа Empower™ 2 imaging and evaluation.
Неподвижная фаза
Synergi Max-RP 80A (Phenomenex, 250×4,6 мм; 4 мкм) с предколонкой Phenomenex C18 (4×3,0 мм)
Подвижная фаза
А 45% 20 мМ фосфатного буфера, pH 7,0;
В 55% метанола.
Детекция
210-400 нм (260 нм)
Скорость потока
1,0 мл/мин
Время прогона
12 мин
Температура
25°C
колонки
Объем впрыска
10 мкл
Время
N,N'-бис(сукцинилокси)пентамидин (1): 3,2±0,1 мин;
удерживания:
сукцинилоксипентамидин: 4,8±0,1 мин;пентамидина диамидоксим (3): 8,1±0,2 мин.
Растворимость N,N'-бис(сукцинилокси)пентамидина (1)
Количество соединения, которое нерастворимо в 100 мкл, суспендируют в 50 мМ фосфатном буфере (pH 7,4, соответственно рН 9,0) и встряхивают в течение 20 мин. Затем нерастворившуюся часть удаляют центрифугированием (12000 об/мин) и образцы сразу же анализируют ВЭЖХ. Оценку растворимости получают через калибровку N,N'-бис(сукцинилокси)пентамидина (1) в ДМСО. Соединение хорошо растворяется (7,5 мМ) при физиологическом значении pH 7,4. Растворимость еще улучшается, когда повышают величину pH (см. таблицу 1).
Проверяют различные другие пролекарства пентамидина путем сравнения, с тем чтобы лучше оценить растворимость по сравнению с производными, описанными ранее. Растворимость определяют аналогично способу, описанному для соединения (1).
Определение связывания белка N,N'-бис(сукцинилокси)пентамидином (1). Связывание плазменных белков определяют при трех различных концентрациях (10, 20 и 50 мкМ). В качестве растворов белков используют 4% раствор альбумина. В каждом случае к 450 мкл раствора белка добавляют пипеткой 50 мкл в 10 раз более концентрированного раствора вещества. Инкубацию проводят в течение 15 мин при встряхивании на водяной бане при 37°C. Затем образцы переносят в установки для ультрафильтрации (Vivaspin 500, отсекается 10 кД) и центрифугируют в течение 15 мин при 10000 об/мин. Фильтрат анализируют ВЭЖХ. Кроме того, для каждой концентрации осуществляют контроль, который не смешивают с белком или не центрифугируют. Другой контроль без добавления белка, который однако центрифугируют на установке для ультрафильтрации, показывает, что пролекарства не удерживаются мембраной, и служит для подтверждения методологии.
Анализ образца показывает связывание белков соединением (1) 97,1±1,2%.
Анализ биоактивации N,N'-бис(сукцинилокси)пентамидина (1)
Выяснение активации пролекарства с использованием различных субклеточных ферментных систем
Активацию пролекарства определяют in vitro с помощью субклеточных ферментных препаратов. В качестве ферментных препаратов используют супернатанты 9000xg, микросомы и митохондрии тканей печени и почек человека и свиньи. Загрузки для инкубации состоят из 500 мМ пролекарства, 1 мМ NADH, 1E эстеразы и 0,3 мг ферментного препарата, растворенных в 150 мкл 100 мМ фосфатного буфера, pH 6,3.
Инкубацию проводят в течение 20 мин при встряхивании на водяной бане при 37°C.
Инкубацию заканчивают, добавляя 150 мкл ацетонитрила. Затем образцы встряхивают течение 10 мин и выпавший в осадок белок удаляют центрифугированием при 1000 об/мин в течение 15 мин. Супернатант анализируют ВЭЖХ. Идентифицированные скорости конверсии указывают в таблице 2.
Кроме того, выполняют инкубации с использованием 1 Е карбоксилэстеразы из печени свиньи. С этой целью соединение инкубируют в течение 60 мин в концентрации 500 мкМ с 1 Е эстеразы в 250 мкл 50 мМ фосфатного буфера, pH 7,4. Инкубации заканчивают, добавляя 250 мкл ацетонитрила. Инкубации с использованием карбоксилэстераз из печени свиньи приводят к быстрой активации N,N'-бис(сукцинилокси)пентамидина (1) (см. фигуру 4). После времени инкубации 60 мин активируется уже примерно 90% используемого субстрата. Такой результат показывает, что первая стадия активации N,N'-бис(сукцинилокси)пентамидина (1) до диамидоксима протекает с высокой скоростью.
Метод ВЭЖХ для определения пентамидина
Система ВЭЖХ
Система ВЭЖХ Waters Alliance с разделительным модулем Waters e2695 XC, детектор с фотодиодной матрицей Waters 2998 и программа Empower 2
Колонка
LiChroCart LiChrospher 60 RP-select В, 125×4 мм, 5 мкм
Поток
1 мл/мин
Элюент
52% смеси 20 мМ хлорида тетраметиламмония / 10 мМ
октилсульфоната, pH 3,0,
48% МеОН.
Время прогона
15 мин
Детекция
260 нм
Объем впрыска
20 мкл
Время удерживания пентамидина 10,7±0,4 мин.
Пероральная биодоступность (исследование на животных)
Пентамидин вводят внутривенно 10 крысам в концентрации 10 мг/кг. N,N'-Бис(сукцинилокси)пентамидин (1) в концентрации 50 мг/кг в виде суспензии с аравийской камедью (10% мас./об.) вводят через зонд каждой из 10 крыс. При получении суспензии используют 100 мМ калий-фосфатный буфер, pH 9,0, с тем, чтобы предотвратить расщепление эфира янтарной кислоты в кислой среде желудка. Кроме того, 3 крысам дают пентамидин в дозировке 50 мг/кг через зонд для того, чтобы определить пероральную биодоступность его активной формы.
После внутривенного введения берут образцы плазмы через 5, 10, 40, 75, 150 и 300 мин, после перорального введения соответственно через 20, 40, 60, 90, 120, 240 и 360 мин. С этой целью берут 300 мкл цельной крови с использованием инсулинового шприца и переносят в сенсибилизированные ЭДТК микрокюветы СВ 300 (Sarstedt, Nümbrecht). После каждого отбора образец смывают 100 мкл 0,9% физиологического раствора соответственно с раствором гепарина (250 МЕ/мл) с интервалом 60 мин. Образец крови недолго встряхивают и помещают на лед до центрифугирования (4°C; 14000 об/мин; 10 мин). Далее образцы хранят при -80°C.
Убой совершают гильотинной декапитацией через 6 часов после введения лекарственного средства. Затем извлекают органы. Все органы очищают и замораживают в 2-метилбутане, охлажденном на сухом льду. Извлекают печень, почки, легкие, селезенку, сердце и головной мозг.
Получение образцов
1. Образцы плазмы
Образцы плазмы размораживают при комнатной температуре. В каждом случае готовят 65 мкл ацетонитрила и пипеткой добавляют 65 мкл образцов плазмы. Затем образцы встряхивают в течение 45 мин. Образцы центрифугируют при 10000 об/мин в течение 15 мин и супернатант переносят в пробирки для ВЭЖХ. В каждом случае для анализов ВЭЖХ используют 35 мкл.
Калибровку и анализы на извлечение пентамидина выполняют в фосфатном буфере, pH 7,4, соответственно с крысиной плазмой, с тем чтобы образцы плазмы оценить количественно.
2. Образцы органов
Органы размораживают при комнатной температуре и взвешивают. В зависимости от органа получают различные количества тканей. Примерно 1000 мг используют в случае образцов печени; примерно 500 мг в случае всех других органов. Органы измельчают в фаянсовой посуде. С этой целью каждую взвешенную ткань измельчают с 1 мкл бидистиллированной воды в течение 5 мин. Затем фаянсовый сосуд в каждом случае ополаскивают 1 мл бидистиллированной воды. Образцы переносят в реакционные сосуды, и для того, чтобы осадить белки, добавляют такой же объем ацетонитрила. Образцы встряхивают в течение 45 мин и затем центрифугируют при 12000 об/мин в течение 15 мин. Супернатант переносят в стеклянные пузырьки и концентрируют в сжатом воздухе. Остаток промывают 500 мкл ацетонитрила, повторно центрифугируют и добавляют супернатант к остальным образцам. Остаток отбрасывают. После концентрирования в сжатом воздухе образцы сушат вымораживанием в течение ночи.
Растворение образцов осуществляют с 400 мкл смеси метанола и бидистиллированной воды (50/50). Образцы встряхивают при комнатной температуре в течение 1,5 часов и затем остаток удаляют центрифугированием (15000 об/мин, 15 мин). Концентрацию пентамидина определяют из супернатанта методом ВЭЖХ.
Результаты исследования на животных
Анализ образцов плазмы после внутривенного введения пентамидина показывает детектируемые уровни в течение всего периода в 300 мин. После перорального введения пролекарства концентрации пентамидина в плазме определить нельзя. Такое явление известно для производных пентамидина, так как они имеют склонность накапливаться в тканях до весьма выраженной степени. Следовательно, прямое вычисление биодоступности по концентрации в плазме выполнить нельзя. Поэтому для определения относительной биодоступности используют концентрации пентамидина в проверяемых органах.
Оценка образцов органов и биодоступности
Анализ обработанных образцов дает детектируемое содержание пентамидина во всех проверяемых органах с наивысшими концентрациями в печени и почках. Концентрации в легких, селезенке и сердце явно ниже. Наименьшие концентрации пентамидина обнаруживают в головном мозгу. Результаты суммируются в таблице 5.
Пероральную биодоступность соединения, как правило, определяют по концентрациям в плазме после перорального и внутривенного применения соединения. Однако из-за высокого связывания белка пентамидином и его выраженной склонности накапливаться в тканях определить концентрации в плазме после перорального применения пролекарства пентамидина нельзя. Поэтому для вычисления относительной биодоступности используют обнаруженное содержание в проверяемых органах (печень, почки, легкие, селезенка, сердце, головной мозг), а не концентрации в плазме. Относительную биодоступность пролекарства пентамидина можно вычислить через сравнение после внутривенного применения активной формы и перорального применения пролекарства. При вычислении принимают в расчет различные дозировки. Относительная биодоступность показана в таблице 3. Наивысшую биодоступность 98% идентифицируют в печени. Биодоступность в других тканях явно ниже. Высокую биодоступность в печени можно объяснить биоактивацией пролекарства. Она преимущественно происходит в печени, что объясняет сравнительно высокие концентрации в этом органе. Концентрация в головном мозгу очень низкая, что указывает на прохождение пролекарством гематоэнцефалического барьера только в очень малой степени.
Условия анализа ВЭЖХ
Для анализа образцов органов и плазмы после внутривенного применения пентамидина используют указанные далее условия анализа ВЭЖХ.
Система ВЭЖХ
Автоматический пробоотборник Waters 717plus, регулятор Waters 600, насос Waters 600, двух-λ абсорбционный детектор Waters 2487 и программа
EZChrom Elite Client/Server imaging and evaluation (версия 2.8.3)
Неподвижная фаза
Superspher 60 RP-select В (250×3 мм); предколонкаMerck LiChrospher 60 RP-select В (4×4 мм, 5 мкм)
Подвижная фаза
40% метанола,
60% ТФКО,1%, pH 2,5.
Детекция
λ<sub>Ex</sub>=275 нм; λ<sub>Em</sub>=340 нм
Скорость потока
0,32 мл/мин
Время прогона
35 мин
Объем впрыска
35 мкл
Время удерживания
пентамидина 22,4±1,2 мин
Для анализа образцов органов и плазмы после перорального применения пролекарства пентамидина используют указанные далее условия анализа ВЭЖХ.
Система ВЭЖХ
Система ВЭЖХ Waters Alliance™ с разделительным модулем Waters е2695 ХС, детектор с фотодиодной матрицей Waters 2998 и программа Empower™ 2 imaging and evaluation
Неподвижная фаза
Superspher 60 RP-select В (250×3 мм); предколонка Merck LiChrospher 60 RP-select В (4×4 мм, 5 мкм)
Подвижная фаза
40% метанола,
60% ТФКО, 1%, pH 2,5.
Детекция
210-300 нм (260 нм)
Скорость потока
0,32 мл/мин
Время прогона
35 мин
Объем впрыска
35 мкл
Время удерживания
диамидоксима 20,0±0,3 мин,
моноамидоксима 22,5±0,4 мин,
пентамидина 24,7±0,5 мин.
Устойчивость при хранении
Образцы хранят при комнатной температуре и при 70°C определенный период времени и проверяют, анализируя пролекарство (1) на устойчивость при хранении. Период хранения образцов составляет 6 месяцев в случае комнатной температуры, 7 дней в случае 70°C. Содержание пролекарства (1) определяют ВЭЖХ. С этой целью образцы растворяют в смеси равных частей метанола и фосфатного буфера (20 мМ, pH 7,4) и сразу же измеряют. Метод ВЭЖХ соответствует методу, описанному в разделе «Характеризация пролекарств».
Можно видеть, что пролекарство (1) показывает весьма высокую устойчивость в пределах периода проверки при комнатной температуре и при 70°C (см. таблицы 3, 4 и фигуры 6, 7). Кроме пролекарства (1) обнаруживают сукцинилоксипентамидин и пентамидина диамидоксим (3).
Результаты по устойчивости при хранении, приведенные в таблицах 4 и 5, показаны в графической форме на фигурах 6 и 7.
Список ссылок
1. Chow Т.Y., Alaoui-Jamali M.A., Yeh C., Yuen L., Griller D. The DNA double-stranded break repair protein endo-exonuclease as a therapeutic target for cancer. Mol. Cancer Ther., 2004, 3, 911-9.
2. Pharma O. Inhibitors of Endo-Exonuclease activity for treating cancer. 2001.
3. Pharma O. Pentamidine Combinations for Treating Cancer. 2010.
4. Clement В. Reduction of N-hydroxylated compounds: amidoximes (N-hydroxyamidines) as pro-drugs of amidines. Drug Metab. Rev., 2002, 34, 565-79.
5. Clement В., Schmitt S., Zimmermann M. Enzymatic reduction of benzamidoxime to benzamidine. Arch. Pharm. (Weinheim), 1988, 321, 955-6.
6. Clement В., Immel M., Terlinden R., Wingen F.J. Reduction of amidoxime derivatives to pentamidine in vivo. Arch. Pharm. (Weinheim), 1992, 325, 61-2.
7. Havemeyer A., Bittner F., Wollers S., Mendel R., Kunze Т., Clement B. Identification of the missing component in the mitochondrial benzamidoxime prodrug-converting system as a novel molybdenum enzyme. J. Biol. Chem., 2006, 281, 34796-802.
8. Gruenewald S., Wahl В., Bittner F., Hungeling H., Kanzow S., Kotthaus J., Schwering U., Mendel R.R., Clement B. The fourth molybdenum containing enzyme mARC: cloning and involvement in the activation of N-hydroxylated prodrugs. J. Med. Chem., 2008, 51, 8173-7.
9. Clement В.; Burenheide A.; Rieckert W.; Schwarz J. Diacetyldiamidoximeester of pentamidine, a prodrug for treatment of protozoal diseases: synthesis, in vitro and in vivo biotransformation. Chem Med Chem 2006, 1, 1260-7.
10. Clement В.R., С. Improvement of the bioavailability of active substances having an amidine function in medicaments. 2008.
11. Clement B.R., C., Hungeling H. Use of amidoxime carboxylic acid esters and N-hydroxyguanidine carboxylic acid esters for producing prodrugs. 2009.
12. Reeh C., Wundt J., Clement B. N,N'-dihydroxyamidines: a new prodrug principle to improve the oral bioavailability of amidines. J. Med. Chem., 2007, 50, 6730-4.
13. Arafa R.K., Brun R., Wenzler Т., Tanious F.A., Wilson W.D., Stephens С.Е., Boykin D.W. Synthesis, DNA affinity, and antiprotozoal activity of fused ring dicationic compounds and their prodrugs. J. Med. Chem., 2005, 48, 5480-8.
14. Brendle J.J., Outlaw A., Kumar A., Boykin D.W., Patrick D.A., Tidwell R.R., Werbovetz K.A. Antileishmanial activities of several classes of aromatic dications. Antimicrob. Agents Chemother., 2002, 46, 797-807.
15. Donkor I.O., Huang Т.L., Tao В., Rattendi D., Lane S., Vargas M., Goldberg В., Bacchi C. Trypanocidal activity of conformationally restricted pentamidine congeners. J. Med. Chem., 2003, 46, 1041-8.
16. Ismail M.A., Brun R., Wenzler Т., Tanious F.A., Wilson W.D., Boykin D.W. Dicationic biphenyl benzimidazole derivatives as antiprotozoal agents. Bioorg. Med. Chem., 2004, 12, 5405-13.