КОНТРОЛИРУЕМАЯ ЭКСПРЕССИЯ ТРАНСГЕНОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-ВЕКТОРОВ С ЗАМКНУТЫМИ КОНЦАМИ (зкДНК)

1. Способ регуляции экспрессии трансгена у субъекта, включающий
а) введение субъекту достаточного количества бескапсидного ДНК-вектора с замкнутыми концами (зкДНК), содержащего кассету нуклеиновой кислоты, содержащую по меньшей мере один трансген, функционально связанный с промотором, расположенный между фланкирующими инвертированными концевыми повторами (ИКП), для экспрессии измеримого уровня трансгена, причем трансген кодирует желаемый белок для лечения заболевания; и
b) титрование зкДНК-вектора путем введения указанному субъекту по меньшей мере второй дозы указанного зкДНК-вектора, содержащего по меньшей мере один трансген, расположенный между фланкирующими ИКП, для обеспечения трансгенной экспрессии желаемого белка на предварительно заданном уровне в течение предварительно определенного периода времени, или для повышения трансгенной экспрессии желаемого белка до предварительно определенного уровня.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что проводят оценку указанного субъекта после стадии (а) для определения титрующей дозы.
3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что указанная оценка определяет состояние заболевания после стадии (а) или уровень желаемого белка, экспрессируемого у субъекта.
4. Способ регуляции экспрессии трансгена у субъекта, включающий
a) введение субъекту достаточного количества бескапсидного ДНК-вектора с замкнутыми концами (зкДНК), содержащего кассету нуклеиновой кислоты, содержащую по меньшей мере один трансген, функционально связанный с промотором, расположенный между фланкирующими инвертированными концевыми повторами (ИКП), для экспрессии измеримого уровня трансгена, причем трансген кодирует желаемый белок; и
b) введение указанному субъекту по меньшей мере второй дозы указанного зкДНК-вектора, содержащего по меньшей мере один трансген, расположенный между фланкирующими ИКП, для (i) продолжения экспрессии желаемого белка на предварительно заданном уровне в течение предварительно определенного периода времени, или (ii) модулирования экспрессии желаемого белка до предварительно определенного уровня.
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что второе введение указанного зкДНК-вектора не вызывает иммунную реакцию, достаточную для предотвращения достижения предварительно определенного уровня экспрессии желаемого белка.
6. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что указанный зкДНК-вектор вводят в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
7. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что указанное второе введение производится в момент времени, когда уровень экспрессии трансгена снижается относительно желаемого уровня.
8. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что указанное второе введение производится через по меньшей мере 90 суток после первого введения; или где введения осуществляют по периодическому графику.
9. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что указанный трансген кодирует терапевтический белок, а желаемый уровень экспрессии трансгена представляет собой терапевтически эффективное количество терапевтического белка.
10. Способ по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что выполняют по меньшей мере три введения зкДНК-вектора, и ни одно из введений не вызывает иммунный ответ на указанный зкДНК-вектор, препятствующий достижению предварительно определенного уровня экспрессии желаемого белка.
11. Способ по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что указанное второе введение предназначено для повышения уровня экспрессии желаемого белка; или где указанное второе введение предназначено для пролонгации экспрессии желаемого белка на предварительно определенном уровне экспрессии.
12. Способ по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что указанный желаемый белок представляет собой белок-ингибитор; или указанный желаемый белок заменяет дефектный белок или белок, который не экспрессируется.
13. Способ по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что указанный белок-ингибитор представляет собой антитело или слитый белок.
14. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что указанный промотор представляет собой индуцибельный или репрессируемый промотор.
15. Способ по любому из пп. 1-14, отличающийся тем, что указанный трансген находится под контролем регуляторного переключателя.
16. Способ по любому из пп. 1-15, отличающийся тем, что указанный зкДНК-вектор, который вводят в первый, второй или любой последующий момент времени, представляет собой зкДНК-вектор одного и того же типа, содержащий один и тот же трансген, или модифицированный трансген.
17. Способ по любому из пп. 1-16, отличающийся тем, что указанный второй зкДНК-вектор имеет другой промотор, функционально связанный с тем же самым трансгеном, или модифицированным трансгеном.
18. Способ по любому из пп. 1-17, отличающийся тем, что указанные две последовательности инвертированных концевых повторов (ИКП) представляют собой ИКП ААВ.
19. Способ по любому из пп. 1-18, отличающийся тем, что по меньшей мере один ИКП содержит функциональный сайт концевого разрешения и Rep-связывающий сайт.
20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что указанные ИКП ААВ представляют собой ИКП ААВ-2.
21. Способ по любому из пп. 1-20, отличающийся тем, что
указанные фланкирующие ИКП являются симметричными или асимметричными;
указанные фланкирующие ИКП являются симметричными или по существу симметричными;
указанные фланкирующие ИКП являются асимметричными; или
указанные фланкирующие ИКП принадлежат к разным вирусным серотипам.
22. Способ по любому из пп. 1-21, отличающийся тем, что один или оба указанные ИКП содержат последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO 1, 2, 5-48.
23. Способ по любому из пп. 1-22, отличающийся тем, что по меньшей мере один из указанных ИКП изменяют относительно последовательности ИКП ААВ дикого типа путем делеции, добавления или замены, которые влияют на общую трехмерную конформацию указанного ИКП.
24. Способ по любому из пп. 1-23, отличающийся тем, что один или несколько из указанных ИКП получают из серотипа ААВ, выбранного из ААВ1, ААВ2, ААВ3, ААВ4, ААВ5, ААВ6, ААВ7, ААВ8, ААВ9, ААВ10, ААВ11 и ААВ12.
25. Способ по любому из пп. 1-24, отличающийся тем, что
один или оба из указанных ИКП являются синтетическими;
один или оба указанные ИКП не относятся к дикому типу;
оба указанные ИКП не относятся к дикому типу;
один или оба указанные ИКП относятся к дикому типу; или
оба указанные ИКП относятся к дикому типу.
26. Способ по любому из пп. 1-25, отличающийся тем, что один или оба указанные ИКП модифицируют путем делеции, вставки и/или замены в по меньшей мере одной из областей ИКП, выбранных из A, A', B, B', С, С', D и D'.
27. Способ по любому из пп. 1-26, отличающийся тем, что указанная делеция, вставка и/или замена приводит к удалению всей или части структуры стебель-петля, обычно образуемой указанными областями A, A', B, B', C или C'.
28. Способ по любому из пп. 1-26, отличающийся тем, что
один или оба указанные ИКП модифицируют путем делеции, вставки и/или замены, которые приводят к удалению всей или части структуры стебель-петля, обычно образуемой областями B и B';
один или оба указанные ИКП модифицируют путем делеции, вставки и/или замены, которые приводят к удалению всей или части структуры стебель-петля, обычно образуемой областями C и C'; или
один или оба указанные ИКП модифицируют путем делеции, вставки и/или замены, которые приводят к удалению части структуры стебель-петля, обычно образуемой областями B и B', и/или части структуры стебель-петля, обычно образуемой областями C и C'.
29. Способ по любому из пп. 1-28, отличающийся тем, что один или оба указанные ИКП содержат единственную структуру стебель-петля в области, которая обычно содержит первую структуру стебель-петля, образуемую областями B и B', и вторую структуру стебель-петля, образуемую областями C и C', или один или оба указанные ИКП содержат один стебель и две петли в области, которая обычно содержит первую структуру стебель-петля, образуемую областями B и B', и вторую структуру стебель-петля, образуемую областями C и C'.
30. Способ по любому из пп. 1-29, отличающийся тем, что оба ИКП изменяют таким образом, чтобы это приводило к общей трехмерной симметрии, когда указанные ИКП инвертированы друг относительно друга.
31. Способ по любому из пп. 1-30, отличающийся тем, что по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность находится под контролем по меньшей мере одного регуляторного переключателя.
32. Способ по п. 31, отличающийся тем, что по меньшей мере один регуляторный переключатель выбран из бинарного регуляторного переключателя, низкомолекулярного регуляторного переключателя, регуляторного переключателя «с паролем», регуляторного переключателя на основе нуклеиновой кислоты, посттранскрипционного регуляторного переключателя, контролируемого излучением или контролируемого ультразвуком регуляторного переключателя, опосредованного гипоксией регуляторного переключателя, регуляторного переключателя воспалительного ответа, активируемого сдвигом регуляторного переключателя и выключателя «kill switch».
33. Способ по любому из пп. 1-32, отличающийся тем, что субъект имеет заболевание или расстройство, выбранное из ракового заболевания, аутоиммунного заболевания, нейродегенеративного расстройства, гиперхолестеринемии, острого отторжения органа, рассеянного склероза, постменопаузального остеопороза, кожных заболеваний, астмы или гемофилии.
34. Способ по п. 33, отличающийся тем, что
указанное раковое заболевание выбрано из солидной опухоли, саркомы мягких тканей, лимфомы и лейкоза;
указанное аутоиммунное заболевание выбрано из ревматоидного артрита и болезни Крона;
указанное кожное заболевание выбрано из псориаза и атопического дерматита, или
указанное нейродегенеративное расстройство представляет собой болезнь Альцгеймера.
35. Способ по п. 33, дополнительно включающий введение субъекту, в один или несколько моментов времени после второго момента времени, дозы композиции для повышения уровня экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты по сравнению с уровнем экспрессии гетерологичной нуклеиновой кислоты, достигнутым после введения композиции во второй момент времени или в предшествующий момент времени, или для повышения уровня экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты для достижения желаемого уровня экспрессии.
36. Способ по любому из пп. 1-35, отличающийся тем, что указанный трансген представляет собой генетическое лекарственное средство, выбранное из любого из нуклеиновой кислоты, ингибитора, пептида или полипептида, антитела или фрагмента антитела, слитого белка, антигена, антагониста, агониста, молекулы РНКи и т.п.
37. Способ по любому из пп. 1-36, отличающийся тем, что указанная предварительно определенная доза зкДНК-вектора, вводимая во второй или любой последующий момент времени, выбрана из
количества, которое в 2-10 раз превышает дозу композиции, вводимую в первый момент времени; или
количества, которое повышает экспрессию трансгена по меньшей мере в 3 раза, или по меньшей мере в 5 раз, или по меньшей мере в 10 раз, или в 2-15 раз, или в 2-20 раз, по сравнению с экспрессией трансгена после введения композиции в первый момент времени.
38. Способ по п. 37, отличающийся тем, что указанную предварительно определенную дозу зкДНК-вектора, вводимую во второй момент времени, определяют по дозовой зависимости между дозой зкДНК-вектора и уровнем экспрессии трансгена из зкДНК-вектора для достижения желаемого уровня экспрессии трансгена в клетке.
39. Способ по любому из пп. 37-38, отличающийся тем, что указанная предварительно определенная доза зкДНК-вектора, вводимая во второй или любой последующий момент времени, является такой же, как и доза зкДНК-вектора, вводимая в первый или любой последующий момент времени.