СЛОЖНЫЕ ЭФИРЫ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ С РЕИНОМ, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ЭТИ ЭФИРЫ
ESTERS OF HYALURONIC ACID WITH RHEIN, METHOD OF PREPARING SAID ESTERS AND COMPOSITION CONTAINING SAID ESTERS

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к сложным эфирам гиалуроновой кислоты (НА) с реином, более конкретно к соединению на основе гиалуроновой кислоты, где спиртовые группы гиалуроновой кислоты эстерифицированы реином, к способу получения упомянутого соединения и к фармацевтической композиции, содержащей упомянутое соединение.
Уровень техники
Реином называется алкалоид, получаемый из александрийского листа (сенны), обладающий противовоспалительными и тканезащитными свойствами.
Реин (химическое название 4,5-дигидрокси-9,10-дигидро-9,10-диоксо-2-антраценкарбоновая кислота) имеет общую формулу (I)
где R=H.
Это вещество вводят в организм пероральным путем, обычно в форме диацетилреина - производного вышеприведенной общей формулы (I), где каждая группа R является ацетилом, которое обладает повышенной биодоступностью и применяется, в основном, при лечении воспалений суставов.
Однако как реин, так и диацетилреин обладают недостатком, заключающемся в значительном слабительном действии, которое может приводить даже к диарее и, таким образом, обуславливает неприемлемость этого средства для пожилых или ослабленных пациентов.
Кроме того, вследствие нерастворимости реина и диацетилреина в воде этого побочного эффекта не удается избежать при введении этих активных веществ парентеральным или внутрисуставным путем.
Гиалуроновая кислота является природным мукополисахаридом, состоящим из чередующихся звеньев D-глюкуроновой кислоты и N-ацетилглюкозамина, как показано в общем виде на нижеприведенной схеме:
6
которые образуют линейную цепь с молекулярной массой до 13×10 дальтон.
Гиалуроновая кислота присутствует во всех мягких тканях организма и во многих биологических жидкостях, например в синовиальной жидкости суставов и в стекловидном теле глаза.
Гиалуроновая кислота в кислотной или солевой формах применяется для многих клинических целей.
В частности, она с большим успехом применяется при воспалениях суставов, при этом ее вводят путем инфильтрации непосредственно в сустав, и ее действие основано на двойном механизме: с одной стороны, на ослаблении воспаления сустава и, с другой стороны, на повышении вязкости синовиальной жидкости, которое благоприятно воздействует на хрящ, смазка которого в результате улучшается.
Гиалуроновая кислота может применяться также в офтальмологии, где ее использование основано на ее защитных и противовоспалительных свойствах, и для восстановления тканей вследствие ее анаболически-реконструктивного действия на хрящевые ткани и на кожу.
Однако, как известно, гиалуроновая кислота подвержена разложению.
Имеются сведения, что разложение гиалуроновой кислоты является следствием гидролиза, зависящего от рН и концентрации катионов [см., например, Uchiyama Н. et al. J. Biol. Chem, 1990; 265: 7753-7759; Tokita Y. and Okamoto A., Polymer Degr. and Stab. 1995; 48: 269-273; Hawkins C.L. and Davies M.J. Free Rad. Biol. Med. 1998; 24: 1396-1410; Schiller J. et al. Current Med. Chem. 2003; 10: 2123-2145].
После обширных исследований авторы настоящего изобретения установили, что гиалуроновая кислота, в которой спиртовые группы эстерифицированы реином, неожиданно приобретает повышенную стабильность по сравнению с гиалуроновой кислотой и, кроме того, обладает повышенной фармакологической активностью по сравнению с той, которая наблюдается для гиалуроновой кислоты и реина, применяемых по отдельности.
Кроме того, авторы настоящего изобретения установили, что гиалуроновая кислота, в которой спиртовые группы эстерифицированы реином, может быть успешно применена путем местного введения, тем самым устраняются недостатки, связанные с пероральным применением реина.
Настоящее изобретение основано на этих результатах.
Раскрытие изобретения
Согласно первому аспекту, настоящее изобретение относится к соединению на основе гиалуроновой кислоты, где спиртовые группы гиалуроновой кислоты эстерифицированы реином, в свободном виде или в форме производного либо соли, которое не только обладает повышенной стабильностью по сравнению с гиалуроновой кислотой, но также обладает повышенной фармакологической активностью по сравнению с той, которая наблюдается для гиалуроновой кислоты и реина, применяемых по отдельности, и которое, кроме того, может применяться путем местного введения с устранением таким образом недостатков, связанных с пероральным применением реина.
Согласно второму аспекту, настоящее изобретение относится к способу получения соединения по первому аспекту или его соли, который включает проведение реакции хлорангидрида кислоты реина в свободном виде или в форме производного с гиалуроновой кислотой.
Согласно третьему аспекту, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей соединение по первому аспекту или его соль в сочетании с соответствующими наполнителями и/или разбавителями.
Согласно дальнейшим аспектам, настоящее изобретение относится к лекарственному продукту или к лечебному устройству для применения в медицине или ветеринарии, образованному композицией по третьему аспекту, и к применению соединения или его соли по первому аспекту для приготовления лекарственного средства для лечения воспалительных заболеваний или для восстановления тканей, или для приготовления биоактивных материалов.
Другие преимущества настоящего изобретения будут ясны из нижеприведенного подробного описания.
Краткое описание чертежей
1
На фиг.1 представлен спектр Н-ЯМР реина, полученного путем омыления соединения HA-Re по настоящему изобретению.
На фиг.2 представлен ИК-спектр реина, полученного путем омыления соединения HA-Re no настоящему изобретению.
На фиг.3 представлен анализ реина, полученного путем омыления соединения HA-Re по настоящему изобретению, методом ВЭЖХ-МС.
На фиг.4 представлены результаты, полученные в экспериментах методом RT-PCR по сопоставлению эффекта гаалуроновой кислоты в фармакологической концентрации с эффектом соединения HA-Re по настоящему изобретению в тех же концентрациях.
На фиг.5 представлены результаты, полученные в экспериментах методом RT-PCR по сопоставлению эффекта реина в фармакологической дозе с эффектом соединения HA-Re по настоящему изобретению в аналогичной дозе.
13
На фиг.6 представлен спектр С-ЯМР соединения HA-Re по настоящему изобретению.
1
На фиг.7 представлен спектр Н-ЯМР соединения HA-Re по настоящему изобретению.
Осуществление изобретения
Ниже настоящее изобретение описано более подробно.
Настоящее изобретение предлагает соединение на основе гаалуроновой кислоты, где спиртовые группы гаалуроновой кислоты эстерифицированы реином, в свободном виде или в форме производного либо соли.
В настоящем описании соединение по настоящему изобретению обозначается также как «соединение HA-Re».
Следует иметь в виду, что в настоящем описании и в формуле изобретения термин «реин» означает реин в свободном виде или в форме производного.
Соли соединения HA-Re по настоящему изобретению включают предпочтительно фармацевтически приемлемые соли, например натриевую соль, калиевую соль, магниевую соль, кальциевую соль или иные обычные фармацевтически приемлемые соли, более предпочтительно натриевую соль.
Согласно настоящему изобретению, термин «форма производного соединения» реина охватывает любое производное соединение реина, фармакологически активное in vivo, и в котором кислотная группа реина доступна для образования сложноэфирной связи с гидроксильными группами гаалуроновой кислоты.
Предпочтение отдается производным соединениям реина, которые обеспечивают доступность упомянутого антрахинона in vivo.
Примеры реина в форме производных соединений по настоящему изобретению включают реин, представленный нижеприведенной формулой
где каждый из заместителей R независимо от другого является любой соответствующей группой защиты гидроксила, предпочтительно ацильной группой, неограничительными примерами которой являются ацетил, пропионил, бутирил или пивалоил.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения реин используют в форме производного, более предпочтительно в форме диацетилреина.
Согласно настоящему изобретению, реином предпочтительно эстерифицировано не менее 5% поддающихся эстерификации спиртовых групп гиалуроновой кислоты, более предпочтительно от 5% до 50%, еще более предпочтительно от 5% до 20%.
Особое предпочтение отдается соединению, где реином эстерифицировано 10% поддающихся эстерификации спиртовых групп гиалуроновой кислоты.
Упомянутое соединение HA-Re можно получить способом по настоящему изобретению, который включает проведение реакции хлорангидрида реина с гиалуроновой кислотой, предпочтительно в таком количестве, что процентное отношение между количеством миллимолей хлорангидрида реина и количеством миллиэквивалентов поддающихся эстерификации спиртовых групп гиалуроновой кислоты превышает 5%, более предпочтительно составляет от 5% до 50%, еще более предпочтительно составляет от 5% до 20% и в особо предпочтительном варианте равно 10%.
При разработке способа учитывался выбор растворителей в зависимости от приемлемости их остаточных количеств (ICH - Международная конференция по гармонизации технических требований для регистрации лекарственных средств для применения в медицине).
Предпочтительно вышеупомянутый способ по настоящему изобретению включает следующие стадии:
a) приготовление суспензии гиалуроновой кислоты в апротонном неполярном растворителе;
b) добавление хлорангидрида реина, растворенного в минимальном количестве апротонного неполярного растворителя, и акцептора водородных ионов;
c) выдерживание смеси при перемешивании и нагревании с обратным холодильником в течение времени, достаточного для прохождения реакции эстерификации; и
d) выпаривание растворителя.
Примерами апротонных неполярных растворителей, которые могут быть использованы на стадии а), являются циклогексан, тетрагидрофуран, толуол, дихлорметан, н-гексан, более предпочтительно применение циклогексана.
Выбор апротонного неполярного растворителя, который может быть использован для растворения хлорангидрида реина, не является ограничительным требованием, но предпочтительно выбирается тот же растворитель, который используется на стадии а).
3
Примерами акцепторов водородных ионов, которые могут быть добавлены на стадии b), являются пиридин, триэтиламин, более предпочтительно применение EtN.
Время выдерживания смеси при нагревании с обратным холодильником не является ограничительным требованием, но предпочтительно должно составлять не менее 20 ч.
Гиалуроновая кислота, которая может быть использована для получения соединения HA-Re по настоящему изобретению, предпочтительно имеет молекулярную массу от 500000 Да до 3000000 Да, более предпочтительно приблизительно 600000 Да.
Молекулярную массу гиалуроновой кислоты можно определить известным способом, например с помощью гель-проникающей хроматографии (GPC).
Гиалуроновую кислоту, которая может быть использована для получения соединения HA-Re по настоящему изобретению, можно приобрести на рынке (например, продукт фирмы Fidia Farmaceutici SpA - Abano T. PD) либо получить, например, путем экстракции из петушиных гребней, ферментации бактерий, имеющих муциновый слой, или иными известными способами (cf. Proteoglycan Protocols, Humana Press, R.V.Iozzo, Ed., Totowa 2001).
Хлорангидрид реина, который может быть использован для получения соединения HA-Re по настоящему изобретению, можно получить по способу, включающему следующие стадии:
a') приготовление суспензии реина в апротонном неполярном растворителе;
2
2
b') добавление SOCl в таком количестве, чтобы молярное отношение SOCl к реину превышало 10;
с') выдерживание смеси при перемешивании и нагревании с обратным холодильником в инертной атмосфере в течение времени, достаточного для образования хлорангидрида реина; и
2
d') удаление растворителя и избытка не вступившего в реакцию SOCl путем дистилляции.
2
2
Примерами апротонных неполярных растворителей, которые могут быть использованы на стадии а'), являются циклогексан, тетрагидрофуран, толуол, дихлорметан, и-гексан, предпочтительно применение хлорсодержащего растворителя, более предпочтительно CHCl.
Время выдерживания смеси при нагревании с обратным холодильником на стадии с') не является ограничительным требованием, но предпочтительно должно составлять не менее 3 ч.
Реин в свободном виде или в форме производного соединения, который может быть использован на стадии а') для получения хлорангидрида реина, можно приобрести на рынке (например, продукт фирмы Aldrich) или синтезировать по известным методикам (см. Nawa H. et al., J. Org. Chem. 1961; 26:979-981 и ссылки, указанные в этой работе; Smith C.W. et al. Tetrahedron Lett. 1993; 34; 7447-7450; Gallagher P.T. et al. Tetrahedron Lett 1994; 35:289-292).
В соответствии с одним особо предпочтительным вариантом применения соединение HA-Re по настоящему изобретению, полученное по способу в соответствии с настоящим изобретением, подвергают очистке.
Эту очистку предпочтительно выполняют с применением диализной мембраны.
В этом случае, как будет описано в нижеприведенных примерах, предпочтение отдается применению имеющейся на рынке диализной мембраны под торговым наименованием "Slide-A-Lyzer 3.5K" (производитель фирма Pierce, Rockfbrd, IL, USA) согласно инструкциям производителя.
Как уже указывалось выше, соединение HA-Re по настоящему изобретению обладает преимуществом высокой стабильности, будучи устойчивым в течение не менее 36 месяцев при температуре 4±0,5°С в водном растворе, предпочтительно буферированном при рН 7,4, например в солевом растворе с фосфатным буфером, приготовленном согласно Итальянской фармакопее (Official Italian Pharmacopoeia, XI edition).
Соединение HA-Re по настоящему изобретению обладает противовоспалительным, заживляющим, реконструктивным и анаболическим свойствами в отношении кожи и хрящевой ткани.
Таким образом, настоящее изобретение относится также к фармацевтической композиции, включающей соединение HA-Re по настоящему изобретению в сочетании с приемлемыми наполнителями и/или разбавителями.
В частности, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть лечебным приспособлением и/или лекарственным продуктом для применения в медицине или ветеринарии.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению предпочтительно имеет состав, пригодный для местно-регионарного применения.
Особо предпочтительной фармацевтической композицией по настоящему изобретению является композиция, пригодная для применения путем внутрисуставной инфильтрации, путем введения в глаз, например в форме глазных капель и глазных мазей, и путем местного введения.
Композиция по настоящему изобретению предпочтительно имеет форму водной дисперсии.
Внешней фазой упомянутой дисперсии предпочтительно является буферный раствор, имеющий физиологическое значение рН, более предпочтительно рН 7,4, например солевой раствор с фосфатным буфером, приготовленный согласно Итальянской фармакопее (Official Italian Pharmacopoeia, XI edition).
В соответствии с одним особо предпочтительным применением, соединение HA-Re или его соль по настоящему изобретению присутствует в фармацевтической композиции по настоящему изобретению в концентрации в пределах от 0,5% до 2% массы на объем, предпочтительно в концентрации 1% массы на объем.
Еще одним объектом настоящего изобретения является применение соединения HA-Re или его соли по настоящему изобретению для приготовления лекарственного средства для лечения воспалительных заболеваний, предпочтительно в том числе воспалительных заболеваний суставов, в частности остеоартрита и ревматоидного артрита.
Еще одним объектом настоящего изобретения является применение соединения HA-Re или его соли по настоящему изобретению для приготовления лекарственного средства для восстановления тканей, при котором упомянутыми тканями являются хрящ или кожа.
Кроме того, соединение HA-Re или его соль по настоящему изобретению можно использовать для приготовления биоактивных материалов, например марли для лечения ран или ожогов и матриц для выращивания клеток, предназначенных для лечения ожогов и для имплантаций.
Настоящее изобретение более подробно иллюстрируется нижеприведенными экспериментальными примерами, а также фигурами.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Получение хлорангидрида реина
2
2
2
2
2
2
2
4
Реин (продукт фирмы Aldrich) (21,5 мг, 0,075 ммоль) загружали в круглодонную колбу вместимостью 50 мл и добавляли в колбу CHCl (15 мл). Суспензия приобретала оранжевый цвет. Затем к суспензии добавляли SOCl (0,5 мл, 6,9 ммоль). Реакцию проводили при перемешивании и нагревании с обратным холодильником (50°С) в инертной атмосфере (N). Выдерживали реакционную смесь при нагревании с обратным холодильником в течение 3 ч, при этом раствор приобретал светлый оранжево-желтый цвет. С целью удаления CHCl и избытка не вступившего в реакцию SOCl к смеси добавляли толуол (приблизительно 5 мл) и смесь перегоняли при 500 мм рт.ст., что соответствует 6,6×10 Па, не менее 4 раз, получая 23 мг неочищенного хлорангидрида реина (выход количественный). Продукт был идентифицирован путем ТСХ (элюент этилацетат).
Пример 2
Получение соединения HA-Re
-4
4
2
2
3
2
Гиалуроновую кислоту (продукт фирмы Fidia Farmaceutici SpA - Abano T. PD; средняя молекулярная масса приблизительно 600000 Да) (277,3 мг, 4,6×10 ммоль; соответствует 0,75 мэкв поддающихся эстерификации первичных спиртовых групп) суспендировали в циклогексане (20 мл). Добавляли хлорангидрид реина, полученный, как описано в Примере 1 (21,5 мг, 0,075 ммоль), растворенный в минимальном количестве CHCl. Затем добавляли EtN (3 мл). Суспензия приобретала красный цвет. Реакцию проводили при перемешивании и нагревании с обратным холодильником (70°С) в инертной атмосфере (N). Через непродолжительное время суспензия приобретала красно-оранжевый цвет, который приблизительно через 3 ч становился темнее. Через 20 ч реакцию прекращали и растворитель выпаривали досуха под пониженным давлением (650 мм рт.ст., что соответствует 8,7×10 Па), получая соединение HA-Re в виде светло-желтого осадка.
Пример 3
Очистка соединения HA-Re
a) Подготовка пробы
К соединению HA-Re (0,1019 г), полученному, как описано в примере 2, прибавляли солевой раствор с фосфатным буфером (рН 7,4; 5 мл). Получали двухфазную систему, где раствор приобретал оранжево-желтый цвет, тогда как остаток представлял собой массу желатинообразной консистенции желто-коричневого цвета. После выдерживания в течение не менее 24 ч получали вязкую коллоидную систему коричневого цвета.
b) Очистка
Диализную мембрану «Slide-A-Lyzer 3.5K» (производитель фирма Pierce, Rockford, IL, USA) гидратировали по соответствующей методике в солевом растворе с фосфатным буфером (рН 7,4). Согласно инструкциям производителя, добавляли соответствующее количество соединения HA-Re, подлежащего очистке. Диализ проводили в течение 2 ч относительно фосфатного буфера (рН 7,4) (буферный раствор приобретал желтоватый цвет уже через 20 мин). Эту операцию повторяли не менее 3 раз до достижения бесцветности буферного раствора, контролируя отсутствие поглощения в видимой области спектра. Очищенное соединение HA-Re извлекали из мембраны путем диализа. Чистота полученного таким образом соединения HA-Re составляла 99,8%.
Пример 4
Анализ соединения HA-Re по настоящему изобретению
1) Испытание с применением UV-VIS спектрофотометра
-5
-3
2
Концентрацию реина в очищенном соединении HA-Re, полученном, как описано в примере 3, определяли путем измерения спектрофотометрического сигнала на длине волны 430 нм, используя «грубую» градуировку в диапазоне 10-10 (R=0,9999). Эта длина волны была выбрана в связи с тем, что гиалуроновая кислота поглощает в УФ области, что затрудняет количественное определение реина. На основании спектрофотометрических измерений найдено, что выход по реакции эстерификации в пересчете на реин составляет 58%.
В примере 2 количество реина, используемого при реакции, было выбрано с расчетом на эстерификацию максимум 10% эстерифицируемых первичных спиртовых групп гиалуроновой кислоты. Поскольку выход по реакции эстерификации в пересчете на реин составляет 58%, долю эстерифицируемых спиртовых групп гиалуроновой кислоты можно оценить как 5,8%.
1
2) Н-ЯМР анализ
1
1
Спектр Н-ЯМР соединения HA-Re, полученного в примере 2, получали в дейтерированном буферном растворе, используя спектрометр Varian VRX300. Однако при интерпретации этого спектра возникали затруднения, поскольку доля реина, реагирующего с гиалуроновой кислотой, оказалась недостаточной для идентификации ароматического цикла. Поэтому, с учетом низкой растворимости реина в водной среде и обратимости реакции эстерификации, было проведено омыление, т.е. основный гидролиз, с целью получения реина из соединения HA-Re. Продукт омыления был осажден. Спектр Н-ЯМР продукта гидролиза был получен в диметилсульфоксиде (ДМСО) на спектрометре Varian VRX300. Полученный спектр, представленный на фиг.1, полностью совпадает со спектром реина.
3) ИК-анализ
Был получен ИК-спектр продукта, полученного при омылении соединения HA-Re по настоящему изобретению, в среде нуджола (Nujol) с использованием системы аппаратуры ВХ FT-IR (Perkin-Elmer). Как видно из фиг.2, полученный спектр совпадает со спектром чистого реина.
4) ВЭЖХ-МС
Анализ продукта омыления соединения HA-Re по настоящему изобретению методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС) проводили на установке Agilent 1100, комплект LC/MSD, с использованием в качестве подвижной фазы метанольно-водной смеси (80:20), содержащей 2,5% муравьиной кислоты, при скорости потока 0,8 мл/мин. Как видно из фиг.3, масса продукта соответствует массе реина.
Пример 5
Определение технологических характеристик соединения HA-Re по настоящему изобретению
1) Определение стойкости к гидролизу
Соединение HA-Re по настоящему изобретению, полученное, как описано в Примере 2, и не очищенное путем диализа, хранили в течение более 6 месяцев в сухом состоянии во флаконах в темноте при температуре окружающей среды (22°С). Затем этот образец очищали посредством диализа, как описано в примере 3, и определяли концентрацию реина, используя UV-VIS спектрофотометр. Найденная концентрация равнялась концентрации, определенной в свежесинтезированном продукте. Таким образом, результаты эксперимента свидетельствуют об отсутствии разложения в сухом состоянии. Кроме того, соединение HA-Re по настоящему изобретению, полученное, как описано в примере 2, и очищенное путем диализа, как описано в примере 3, хранили в течение 6 месяцев в 2% растворе фосфатного буфера при рН 7,4 во флаконах в темноте при температуре 4°С. Обнаружено присутствие посторонних веществ в образце вследствие использования нестерильного материала и неиспользования консервантов. Затем образец вновь подвергали диализу по методу, описанному в примере 3, при продолжительности диализа не менее 4 суток. При испытании методом UV-VIS спектрометрии не удалось обнаружить выделение реина в различные буферные растворы, использованные для диализа. Таким образом, и в этом случае подтверждена химическая стойкость соединения, поскольку отщепления реина от соединения HA-Re не обнаружено, по крайней мере в количествах, обнаруживаемых современными аналитическими методами. Таким образом, гидролитическое разложение не наблюдалось даже в растворе.
Полученные результаты позволяют утверждать, что соединение HA-Re по настоящему изобретению устойчиво в течение не менее 24 месяцев в условиях охлаждения (при 4±0,5°С) в водном растворе. Это утверждение основано на отсутствии какого-либо заметного гидролитического разложения.
2
Кроме того, с целью исключения возможности гидролитического разложения гиалуроновой кислоты в процессе реакции эстерификации реином был выполнен холостой эксперимент по проведению такой реакции. Конкретно, были использованы те же условия, что при проведении конденсации реина с гиалуроновой кислотой, но в отсутствие упомянутого реина. В частности, гиалуроновую кислоту (100 мг) добавляли к смеси циклогексана (10 мл), дихлорметана (1 мл) и триэтиламина (1 мл) и полученную смесь нагревали с обратным холодильником (70°С) в инертной атмосфере (N) в течение 24 ч; по истечении этого времени растворители удаляли из реакционной смеси в атмосфере азота. Полученное вещество имело значительно меньшую растворимость в воде, чем гиалуроновая кислота в природном состоянии, характеризовалось неопределимой вязкостью дисперсии через 24 ч. Это означает, что деполимеризацию можно исключить из рассмотрения, так как она должна была бы привести к увеличению растворимости в воде и, таким образом, к понижению вязкости.
Наконец, была проверена стойкость к гидролизу очищенного соединения HA-Re по настоящему изобретению, полученного, как описано в примере 3, в процессе стерилизации. Как указано выше, было обнаружено, что вследствие использования нестерильного материала и неиспользования консервантов в пробах соединения по настоящему изобретению возможно присутствие посторонних веществ. Конкретно, был приготовлен 1% раствор соединения HA-Re по настоящему изобретению, очищенного с применением диализной мембраны, в солевом растворе с фосфатным буфером при рН 7,4. С учетом экспериментальных данных, свидетельствующих о термочувствительности молекулы гиалуроновой кислоты (Biomaterials 23 (2002), 4503-4513), полученный таким образом образец стерилизовали с применением насыщенного пара под давлением в автоклаве при 121°С в течение 20 мин. Затем образец вновь подвергали диализу с применением мембраны с целью определения присутствия реина в диализированной жидкости; следов реина не обнаружено. Эти результаты позволяют заключить, что упомянутый образец стоек к гидролизу при тепловой стерилизации.
2) Анализ реологических характеристик и пригодности для впрыскивания
Анализировалась пригодность соединения HA-Re по настоящему изобретению для впрыскивания по сравнению как с низкомолекулярной, так и высокомолекулярной гиалуроновой кислотой.
Конкретно, были приготовлены три следующих образца:
a) 1% (массы на объем) высокомолекулярной гиалуроновой кислоты (средняя молекулярная масса приблизительно 1200000) в солевом растворе с фосфатным буфером, рН 7,4;
b) 1% (массы на объем) низкомолекулярной гиалуроновой кислоты (средняя молекулярная масса приблизительно 600000) в солевом растворе с фосфатным буфером, рН 7,4;
c) 1% (массы на объем) соединения HA-Re по настоящему изобретению в солевом растворе с фосфатным буфером, рН 7,4.
Определяли вязкость образцов с применением вискозиметра VISCOSIMATE MODEL VM-10A (стеклянная пробирка; 3 мл; при отсутствии перемешивания; температура 20±0,2°С), причем получали следующие результаты:
a) η=78,4 мПа × с;
и) η=64,8 мПа × с;
с) η=47,9 мПа × с.
Полученные результаты свидетельствуют, что соединение HA-Re по настоящему изобретению более пригодно для впрыскивания, чем высокомолекулярная и низкомолекулярная гиалуроновые кислоты в природном состоянии. Это связано с тем, что 1% (массы на объем) раствор соединения HA-Re по настоящему изобретению имеет более низкую вязкость по сравнению с 1% (массы на объем) раствором низкомолекулярной гиалуроновой кислоты, который, в свою очередь, имеет более низкую вязкость, чем 1% (массы на объем) раствор высокомолекулярной гиалуроновой кислоты.
Понижение вязкости, которое наблюдалось ранее и свидетельствовало об отсутствии реакции деполимеризации гиалуроновой кислоты после реакции эстерификации, можно объяснить ковалентным характером взаимодействия между реином и гиалуроновой кислотой.
Пример 6
Определение фармакологической активности соединения HA-Re по настоящему изобретению in vitro
3
У пяти пациентов (3 мужчин и 2 женщин, средний возраст 59,3+5,1 лет) во время хирургических операций по поводу травматических переломов тазобедренного сустава или бедра были взяты нормальные биопсии хряща. У пациентов, отобранных для исследования, отсутствовали биохимические или клинические признаки воспаления или заболевания суставов, и хрящевая ткань была нормальной как на макроскопическом, так и на микроскопическом уровне. Хрящевые пробы отбирали в стерильных условиях и немедленно обрабатывали для выделения хондроцитов. Пробы вначале очищали от остатков мышечной, соединительной или субхондральной костной ткани, затем измельчали до размера кусков 1-3 мм и промывали солевым раствором с фосфатным буфером, рН 7,2 (PBS). Затем выделяли отдельные хондроциты путем многократной ферментации продолжительностью 60-75 мин при 37°С в присутствии 0,25% трипсина, 400 Ед/мл коллагеназы I, 1000 Ед/мл коллагеназы II и 1 мг/мл гиалуронидазы. Клетки собирали, обильно промывали PBS и высевали при высокой плотности на 35-миллиметровые пластины (45×10 клеток на
2
см). Культуры выращивали в модифицированной по Куну (Coon) среде F12 Хема (Ham) с добавкой 10% сыворотки плода коровы (FCS) (производитель Mascia Brunelli, Milano, Italy). Поддержание фенотипа хондроцитов контролировали путем детектирования коллагена типа II после пепсиновой ферментации надосадочного слоя культуры. Жизнеспособность клеток определяли путем пробы на эксклюзию трипанового синего. Через регулярные промежутки времени определяли дупликацию клеток путем трипсинизации культуры и определения количества клеток. Эксперименты по стимулированию выполняли после достижения слияния первичных культур (пассаж 0). Затем клетки культивировали в течение 2 суток в присутствии аскорбиновой кислоты (50 мкг/мл) и после этого инкубировали в течение 20 ч в отсутствие или в присутствии рекомбинантного интерлейкина-1β человека (rh IL-1β) (5 нг/мл), с добавкой или без добавки гиалуроновой кислоты (НА), соединения по настоящему изобретению (HA-Re) или реина в различных концентрациях.
Согласно имеющимся сведениям, как гиалуроновая кислота, так и реин оказывают целебное действие при остеоартрите вследствие их способности ингибировать активность металлопротеаз (ММР), принимающих участие в катаболизме хряща.
С целью исследования влияния различных соединений на экспрессию ММР в хондроцитах человека мы провели испытания PCR в реальном времени (RT-PCR). Полное извлечение ДНК из культивированных хондроцитов человека производили тризолом (Trizol, продукт фирмы Gibco BRL) согласно инструкциям производителя. Цепи кДНК синтезировали, используя набор для синтеза Superscript First-Strand (продукт фирмы Gibco BRL) с 1 мкг суммы ДНК. Праймеры были следующими:
ММР-1 (коллагеназа):
смысловая последовательность 5'-CTGAAGGTGATGAAGCAGCC-3';
антисмысловая последовательность 5'-AGTCCAAGAGAATGGCCGAG-3' (величина фрагмента 428 п.н.);
ММР-3 (стромелизин):
смысловая последовательность 5'-CCTCTGATGGCCCAGAATTGA-3', антисмысловая последовательность 5'-GAAATTGGCCACTCCCTGGGT-3' (величина фрагмента 440 п.н.);
Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH):
смысловая последовательность 5'-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3';
антисмысловая последовательность 5'-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCA (величина фрагмента 598 п.н.).
Амплификацию проводили при 60-64°С в течение 45 циклов в термоциклирующем приборе iCycler (производитель фирма Bio-Rad Hercules, CA) и данные анализировали с применением программного обеспечения iCycler iQ Optical System. Относительную экспрессию в каждой пробе рассчитывали математическим методом, основанным на эффективности PCR в реальном времени, используя в качестве эталонов мРНК GAPDH. Для всех проб выполняли по три параллельных испытания. После 45 циклов амплификации автоматически рассчитывались пороговые значения циклов и количество исходной кДНК в фемтограммах (фг) рассчитывали из стандартной кривой, охватывающей четыре порядка величины. Стандартные кривые для ММР и GAPDH охватывали диапазон от 1 фг до 1000 фг на объем реакционной смеси 25 мкл. Рассчитывали отношения ММР к исходному количеству GAPDH. Статистические разности результатов между различными экспериментальными переменными и соответствующими контрольными веществами анализировали с использованием t-критерия Стьюдента.
Результаты, полученные в экспериментах RT-PCR, представлены на фиг.4 и фиг.5.
Для всех проб выполняли по три параллельных испытания. В каждом эксперименте изменение экспрессии мРНК GAPDH выражено как кратное по сравнению с экспрессией в необработанных клетках. Показаны средние значения и стандартные отклонения для трех экспериментов. Для определения значимости эффектов различных обработок применялся парный t-тест по Стьюденту. Представлены также статистические разности между обработанными и контрольными пробами: *-р<0,01; **-р<0,001 (тест по Стьюденту).
Обработка IL-1 приводила к резкому увеличению экспрессии как ММР-1, так и ММР-3 в соответствии с литературными данными. В экспериментах, представленных на фиг.4, эффект НА в фармакологической концентрации, обычно указываемой в литературе (1 мг/мл), сопоставлен с эффектом HA-Re (соединения по настоящему изобретению) в той же концентрации (1 мг/мл). Аналогичные результаты были получены в диапазоне концентраций НА 0,1-1,5 мг/мл. Действие НА в фармакологической дозе (1 мг/мл) на человеческие хондроциты обеспечивает значительное ингибирование индуцирования ММР-1 и ММР-2 под влиянием IL-1 (фиг.4А и фиг.4В). Аналогичные дозы соединения HA-Re no настоящему изобретению неожиданно вызывали еще более сильный защитный эффект, при этом экспрессия ММР понижалась до базового уровня, несмотря на действие IL-1. На фиг.5 показаны результаты экспериментов, в которых влияние реина в фармакологической дозе (10 мкМ) сопоставлялось с эффектом аналогичной дозы HA-Re. Они также указывают, что соединение HA-Re по настоящему изобретению более эффективно в отношении угнетения экспрессии ММР, индуцируемой IL-1, по сравнению с реином.
Пример 7
Был проведен дополнительный синтез соединения HA-Re по настоящему изобретению по методике, описанной в Примере 2, с той разницей, что для синтеза использовали 20 мг гиалуроновой кислоты и 23 мг хлорангидрида реина, что соответствовало стехиометрическому соотношению реина и гиалуроновой кислоты в пересчете на первичные спиртовые группы гиалуроновой кислоты.
13
-1
На фиг.6 представлен спектр С-ЯМР полученного таким образом соединения HA-Re по настоящему изобретению, на котором ясно виден характерный пик при 175 млн, присущий сложноэфирным функциональным группам.
1
-1
-1
На фиг.7 представлен спектр Н-ЯМР полученного таким образом соединения HA-Re по настоящему изобретению, на котором ясно видны характерные пики между 7 млн и 8 млн, присущие ароматическим циклам реина.
Таким образом, из этих двух спектров ЯМР ясно видно, что в соединении HA-Re по настоящему изобретению спиртовые группы гиалуроновой кислоты эстерифицированы реином.