СПОСОБ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ВИНОГРАДА IN VITRO
METHOD OF CLONAL MICROPROPAGATION OF GRAPE IN VITRO

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к способам размножения растений, и может быть использовано в виноградарстве для ускоренного размножения перспективных сортов винограда.
Известны различные способы с использованием, в основном, природных биологически активных соединений, таких как гиберреллины, цитокинины, ауксины, брассиностероиды. Однако одни из них являются дорогостоящими, другие не нашли широкого применения из-за недостаточной стабильности, нерастворимости в воде или высокой токсичности (ауксины). Поэтому создание способов получения посадочного материала с использованием дешевых, нетоксичных, хорошо растворимых в воде химических препаратов, действующих, как и фитогормоны в сверхмалых концентрациях, является актуальной задачей.
Известен способ клонального микроразмножения растений, включающий введение в питательную среду цитокининов [Методические рекомендации по клональному микроразмножению винограда. Ялта, 1986, с.25-29]. Недостатком его является большая трудоемкость процессов, связанная с частой пересадкой эксплантов, слабой их укореняемостью, возможностью нарушения генетической стабильности размножаемых растений.
Известен способ клонального микроразмножения винограда in vitro, включающий микрочеренкование пробирочных растений и высадку их на питательную среду Мурасиге и Скуга [Клональное микроразмножение и оздоровление посадочного материала винограда для создания из него сортовых маточников интенсивного типа. Рекомендации. М., 1992, с.12-13]. Недостатком этого метода является его ограниченная эффективность вследствие стрессовых условий для микрочеренков in vitro, ингибирования ростовых процессов эксплантов токсическими веществами, выделяемыми ими в питательную среду. Повторное субкультивирование ухудшает их состояние, снижает выход микрочеренков.
-7
-10
Известен способ оптимизации клонального микроразмножения винограда in vitro [RU 2264706 C2, опубл. 27.11.2005, Бюл. №33] - прототип. Способ включает микрочеренкование пробирочных растений и высадку их на жидкую питательную среду с уменьшенным количеством микроэлементов и витаминов с добавлением в ее состав индолилуксусной кислоты 0,1-0,3 мг/л и препарата Эмистим в концентрации 10-10%. Недостатком прототипа является использование дорогого препарата Эмистим, представляющего собой композицию ростовых веществ цитокининовой и гиббереллиновой природы, выделенных из корней женьшеня. Препарат используется вместе с индолилуксусной кислотой, также являющейся росторегулирующим препаратом.
Использование жидкой питательной среды так же усложняет процесс и снижает скорость высадки и приживаемость микрочеренков. Кроме того, при появлении бактериальной инфекции на жидкой питательной среде её трудно заметить, пока она не разовьётся в значительной степени и не приведет к гибели микрочеренка или даже растения.
Для получения хорошего, устойчивого посадочного материала элитных сортов винограда, необходимо использование высокоэффективных и дешевых регуляторов роста растений.
Задача изобретения - расширение арсенала известных способов клонального микроразмножения винограда in vitro, позволяющих улучшить приживаемость микрочеренков, регенерацию растений и их качественные показатели.
Технический результат заключается в действии синтетического росторегулирующего препарата Мелафена при клональном микроразмножении винограда in vitro.
-7
-11
Технический результат достигается заявляемым способом клонального микроразмножения винограда in vitro, включающим микрочеренкование пробирочных растений, высадку их на питательную среду в присутствии росторегулирующих веществ, в качестве которых используют препарат Мелафен в концентрации 10-10%.
Мелафен представляет собой меламиновую соль бис(оксиметил)фосфиновой кислоты общей формулы:
50
Препарат растворим в воде, малотоксичен (его LД 2000 мг/кг - для мышей и 6000 мг/кг - для крыс). Растворы Мелафена стабильны при хранении годами.
Полученные на разнообразных культурах (зерновых, кормовых и овощных) экспериментальные данные позволили заключить, что Мелафен, как и фитогормоны, обладает полифункциональностью действия. Направленность физиолого-биохимических изменений в растениях под влиянием препарата подобна действию цитокининов на энергетический и метаболический обмен растений [Фаттахов С.Г., Лосева Н.Л., Коновалов А.И., и др. Влияние мелафена на рост и энергетические процессы растительной клетки // ДАН. 2004, Т.394, №1, С.127-129; Костин В.И., Костин О.В., Исайчев В.А. Состояние исследований и перспективы применения регулятора роста «Мелафен» в сельском хозяйстве и биотехнологии. Казань, 2006, С.26-34].
Мелафен, как и цитокинины, участвует в регуляции физиологических процессов в течение всего онтогенеза, в регуляции обмена веществ закончивших рост органов, повышает содержание пигментов, увеличивает интенсивность фотосинтеза, повышает скорость фотофосфорилирования, улучшает энергетический обмен растения [RU 2158735 C1, опубл. 10.11.2000 г. Бюл. №31].
Мелафен действует в чрезвычайно малых концентрациях, что делает его экологически безвредным. Его синтез прост, что обуславливает его дешевизну по сравнению с препаратами подобного назначения.
Известно влияние Мелафена на энергию прорастания и всхожесть семян, повышение урожайности и качества продукции зерновых [RU 2158735 C1, опубл. 10.11.2000 г. Бюл. №31; RU 2390984 C1, опубл. 10.06.2010, Бюл. №16; RU 2354106 C2, опубл. 10.05.2009, Бюл. №13].
Известно применение Мелафена в биотехнологии, а именно в способах получения алкалоидов при выращивании культуры клеток ткани, например, Раувольфии змеиной Rauwolfia Serpentina Benth [RU 2394100 C2, опубл. 10.07.2010, Бюл. №19; RU 2174555 C1, опубл. 10.10.2001 г.; RU 2323972 C1, опубл. 10.05.2008, Бюл. №13].
Однако возможность использования Мелафена при клональном микроразмножении винограда на этапе микрочеренкования неизвестна.
Новым в заявляемом способе является, то, что микрочеренки высаживают на питательную среду, содержащую синтетический росторегулирующий препарат Мелафен.
Заявляемый способ осуществляют следующим образом.
Готовят питательную среду Мурасиге и Скуга следующего состава:
Макроэлементы, мг/л:
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub> аммоний азотнокислый
138.0
KNO<sub>3</sub> калий азотнокислый
950.0
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O магний сернокислый 7-водный
185.0
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> калий фосфорнокислый однозамещенный
68.0
CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O кальций хлористый 2-водный
296.0
Микроэлементы, мг/л:
H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub> борная кислота
6.2
MnSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O марганец сернокислый 4-водный
22.3
CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O медь сернокислая 5-водный
0.025
CoCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O кобальт хлористый 6-водный
0.025
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O цинк сернокислый 4-водный
8.6
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O натрий молибденовокислый 2-0.025
0.3
KJ калий йодистый
0.9
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O хелат железа: железо сернокислое 7-водное
27.8
Na<sub>2</sub>ЭДТА трилон Б
37.3
Витамины, мг/л
мезоинозит
50.0
Тиамин HCl
0.2
а также
Индолилуксусная кислота (ИУК), мг/л
0.1
Сахароза (г/л)
30.0
Агар-агар(г/л)
7.5
-7
-11
В состав среды добавляют препарат Мелафен в концентрациях 10-10%.
pH среды перед автоклавированием - 5.7-5.9.
Пробирки с питательной средой закрывают фольгой, помещают в штатив, который закрывают целлофаном, обвязывают шпагатом и автоклавируют в автоклаве ГК-100-3.
Отбирают растения винограда, регенерированные из апикальных меристем размером 0,1-0,2 мм и размноженные в культуре in vitro. Микрочеренкование осуществляют в операционной комнате в ламинарном боксе «Фортран». Побеги, имеющие 8-10 междоузлий, помещают на стерильную чашку Петри, разрезают на микрочеренки, имеющие глазок с листом. Длина микрочеренка - 10-12 мм, 2 мм над глазком, остальные - под глазком, Полученные микрочеренки высаживают в пробирки на твердую питательную среду.
Культивирование осуществляют в культуральной комнате при освещенности 2,0-3,0 тыс. люксов, фотопериоде - 16 часов, температуре 25-27±2°C, влажности воздуха 70-75%.
-7
-9
-11
Наблюдение за ростом растений проводили при клональном микроразмножении сортов винограда Цимладар, Пухляковский и Варюшкин с использованием Мелафена в концентрациях 10, 10, 10% в течение 3-х месяцев. Концентрации Мелафена определены ранее опытным путем для каждого размножаемого сорта.
Состав питательной среды, условия высадки и культивирование микрочеренков как в контроле, так и в опытных вариантах были одинаковыми за исключением того, что в контроле в питательной среде отсутствовал препарат Мелафен.
-7
-9
-11
-7
-9
Получены четкие данные о положительном влиянии препарата Мелафен на клональное микроразмножение винограда сорта Цимладар (таблица 1). При концентрациях 10, 10, 10% отмечено улучшение всех качественных показателей растений уже через 23 дня культивирования. Лучшие результаты получены при концентрации 10%. Несколько хуже показатели в варианте с концентрацией 10%. Дальнейшее уменьшение положительного эффекта отмечено при минимальной концентрации препарата. Особо следует отметить увеличение скорости роста в 1,6 раза по сравнению с контролем, а также корнеобразования, роста и облиственности растений, благодаря чему повышается готовность растений к адаптации в нестерильных условиях, эффективность клонального микроразмножения и конечный выход растений.
-7
-9
-11
При дальнейшем культивировании (48 дней) скорость роста замедляется, но превосходит контрольный вариант в 1,2 раза; сохраняются преимущества препарата Мелафен по всем показателям роста при концентрациях 10, 10, 10%.
При изучении действия препарата Мелафен на сортах Пухляковский и Варюшкин (таблицы 2, 3) таких четких данных не получено, но прослеживается тенденция улучшения качественных характеристик оздоровленных растений под влиянием регулятора роста Мелафен.
-9
-11
-11
-7
-11
-11
-9
-11
Результаты, представленные в таблице 2, полученные при культивировании в течение 30 и 60 дней сорта Пухляковский, демонстрируют улучшение приживаемости растений при всех исследуемых концентрациях, увеличение длины корней при концентрациях 10, 10%, ризогенной зоны при концентрации 10%, высоты и облиствленности при концентрациях 10, 10% (30 дней культивирования), а при более продолжительном культивировании (60 дней) - увеличение высоты и длины корней при всех концентрациях, ризогенной зоны при концентрации 10%, облиственности при концентрациях 10, 10%.
-7
-9
-9
Данные таблицы 3 - сорт - Варюшкин демонстрируют увеличение длины корней и ризогенной зоны при всех концентрациях через 20 дней культивирования, через 54 дня культивирования увеличение облиствленности, числа корней и ризогенной зоны при концентрациях 10, 10%, а также улучшение приживаемости по сравнению с контролем при концентрации 10%.
-11
Результаты окончательного учета, проведенного через 3 месяца после посева на сорте Пухляковский, подтвердили положительное влияние препарата Мелафен на ростовые процессы полученных мериклонов (таблица 4) при концентрации 10%. Увеличение длины (47,0 см против 41,1 см в контроле) и числа (4,7 шт., в контроле 3,8 шт.) корней, ризогенной зоны (220, 9 см, в контроле 156,2 см), длины (15,9 см, в контроле 15,4 см) и веса (0,06 мг, в контроле 0,05 мг) побегов, числа листьев (15,9 шт., в контроле 12,1 шт.) свидетельствует об эффективности указанной концентрации. Высокий коэффициент полярности указывает на преимущественное развитие корневой системы при этой концентрации.
Результаты таблиц 1-4 демонстрируют, что применение препарата Мелафен в качестве регулятора роста способствует улучшению морфогенеза растений в культуре in vitro и повышению эффективности клонального микроразмножения винограда за счет улучшения скорости роста на первом этапе культивирования и качественных характеристик растений.
-7
Сравнение влияния препаратов Эмистим (прототип) и Мелафен, взятых в концентрации 10% на эффективность клонального микроразмножения винограда in vitro на 50-й день культивирования на примере сорта Цимладар приведены в таблице 5. Из результатов таблицы видно, что основные качественные показатели растений, в частности длина корней, величина ризогенной зоны, скорость роста, коэффициент полярности, высота растений и выход растений при использовании препарата Мелафен значительно лучше.
Таким образом, применение препарата Мелафен в качестве регулятора роста позволило увеличить приживаемость и развитие микрочеренков, сократить в среднем в 1,5-3 раза цикл развития микрочеренков, регенерацию их в растения; у регенерированных растений улучшить корнеобразование и развитие ризогенной зоны, рост и облиственность побегов, готовность растений к адаптации в нестерильные условия, выход растений с улучшенными качественными показателями и, в целом, повысить эффективность клонального микроразмножения винограда.
-7
-9
Необходимо отметить, что Мелафен проявляет неожиданное, неочевидное действие, выражающееся в улучшении качественных показателей растений при повторном субкультивировании, то есть имеет место «последействие» Мелафена. Оно выражается в том, что растения, выращенные на питательной среде с добавлением препарата Мелафен, которые были вновь расчеренкованы и высажены на питательную среду без Мелафена (осуществлено второе субкультивирование), также проявляют улучшенные качественные показатели. Проверка последействия Мелафена дала неожиданный четко выраженный результат (таблица 6). У растений, которые были выращены на питательной среде с Мелафеном в концентрациях 10, 10%, при повторной пересадке на свежую питательную среду без Мелафена отмечено улучшение корнеобразования и ростовых процессов. Длина ризогенной зоны увеличилась в 1,4-2,5 раза, высота растений в 1,3 раза, увеличилась скорость роста. Всё это способствовало тому, что растения через 47 дней по своим параметрам были готовы к адаптации, то есть имело место ускорение микроразмножения и, в целом, повышение эффективности клонального микроразмножения. Это делает возможным применение Мелафена не при каждом субкультивировании, а через раз: первое субкультивирование - питательная среда (ПС) + Мелафен, второе субкультивирование - ПС без Мелафена и т.д. Улучшение качественных характеристик растений способствует процессу адаптации (более высокий выход адаптированных растений) с хорошим состоянием растений. Крепкие, прямостоячие, хорошо облиственные побеги с темно-зелеными листьями способствуют быстрой адаптации растений к условиям открытого грунта при закладке базисных маточников.
-5
-7
-8
-9
Также было проведено исследование клонального микроразмножения винограда in vitro на примере сорта Баклановский с использованием питательной среды Мурасига и Скуга, содержащей препарат Мелафен в концентрациях 10, 10, 10, 10 без индолилуксусной кислоты (ИУК), где препарат Мелафен в вышеуказанных концентрациях был использован в качестве единственного росторегулирующего вещества. Индолилуксусная кислота в концентрации 0,1 мг/л без добавления препарата Мелафена в составе питательной среды Мурасига и Скуга являлась контролем. Результаты показали, что в контроле ризогенная зона достигает 7,7 см, а с Мелафеном в качестве единственного росторегулирующего вещества, - 9,0 см. Учет осуществляли через 40 дней. Через 70 дней учета ризогенная зона растений составила 12,1 см в присутствии Мелафена и 10,7 см в контроле. Высота и облиственность растений в обоих случаях были одинаковыми.
Это свидетельствует о возможности применения препарата Мелафен при клональном микроразмножении винограда in vitro и без индолилуксусной кислоты в питательной среде.
-7
-11
Таким образом, предложен новый способ клонального микроразмножения винограда in vitro с использованием нетоксичного, устойчивого во времени, водорастворимого, синтетического росторегулирующего препарата Мелафен, эффективного в концентрации 10-10%.
Использование предлагаемого способа позволяет увеличить выход растений за счет более эффективной приживаемости микрочеренков, регенерации растений и улучшения их качественных показателей. Учитывая низкую себестоимость препарата и высокий оказываемый эффект, применение заявляемого способа экономически обосновано.
Таблица 1
Влияние препарата Мелафен на показатели клонального микроразмножения винограда сорта Цимладар, 2013 г.
Концентрации Мелафена, %
Приживаемость, %
Корни, шт.
Высота, см
Листьев, шт.
Скорость роста, см/сутки
число, шт.
длина, см
ризогенная зона, см
23 дня культивирования
Контроль
96,4
3,0
3,0
9,0
2,7
3,0
0,12
10<sup>-5</sup>
78,6
3,3
2,6
8,4
2,9
3,0
0,13
10<sup>-7</sup>
100,0
4,6
5,9
27,4
4,4
4,3
0,19
10<sup>-9</sup>
100,0
4,3
3,6
15,2
4,3
3,8
0,19
10<sup>-11</sup>
100,0
3,1
3,6
11,1
4,3
3,8
0,19
48 дней культивирования
Контроль
92,9
4,9
4,2
20,3
8,9
7,2
0,19
10<sup>-5</sup>
71,4
4,2
4,7
19,7
9,2
7,8
0,19
10<sup>-7</sup>
100,0
5,5
5,8
31,9
10,6
8,9
0,22
10<sup>-9</sup>
100,0
4,6
5,5
25,6
10,5
9,0
0,22
10<sup>-11</sup>
100,0
4,4
4,2
18,5
10,0
9,7
0,20
Таблица 2
Влияние препарата Мелафен на показатели клонального микроразмножения винограда сорта Пухляковский, 2013 г.
Концентрации Мелафена, %
Приживаемость, %
Корни
Высота, см
Листьев, шт.
Скорость роста, см/сутки
Число, шт.
длина, см
ризогенная зона, см
30 дней культивирования
Контроль
92,9
3,5
4,5
16,0
5,9
5,6
0,19
10<sup>-5</sup>
100,0
2,3
4,7
10,8
5,9
5,8
0,20
10<sup>-7</sup>
96,4
3,5
4,3
15,1
6,1
5,8
0,20
10<sup>-9</sup>
100,0
2,5
5,5
13,8
5,7
5,6
0,20
10<sup>-11</sup>
96,4
3,3
5,4
17,8
6,1
5,8
0,20
60 дней культивирования
Контроль
92,9
4,2
5,4
22,7
12,0
12,4
0,20
10<sup>-3</sup>
100,0
3,1
5,6
17,3
12,2
12,6
0,20
10<sup>-7</sup>
92,9
3,7
5,5
20,3
12,7
12,2
0,21
10<sup>-9</sup>
100,0
3,3
5,7
18,8
12,3
12,8
0,20
10<sup>-11</sup>
96,4
3,4
6,7
22,8
12,0
12,9
0,20
Таблица 3
Влияние препарата Мелафен на показатели клонального микроразмножения винограда сорта Варюшкин, 2013 г.
Концентрации Мелафена, %
Приживаемость, %
Корни
Высота, см
Листьев, шт.
Скорость роста, см/сутки
число, шт.
длина, см
ризогенная зона, см
20 дней культивирования
Контроль
100,0
4,0
2,3
9,5
3,2
2,9
0,17
10<sup>-5</sup>
96,4
3,8
2,7
10,2
2,9
2,4
0,15
10<sup>-7</sup>
100,0
4,0
2,7
10,8
2,8
2,8
0,15
10<sup>-9</sup>
100,0
4,1
2,5
10,2
2,5
2,7
0,13
10<sup>-11</sup>
100,0
2,9
3,4
9,9
2,7
2,8
0,14
54 дней культивирования
Контроль
96,4
4,4
4,2
18,9
11,2
8,4
0,21
10<sup>-5</sup>
96,4
4,0
4,2
17,0
9,6
8,9
0,18
10<sup>-7</sup>
96,4
5,2
3,9
20,3
10,1
9,5
0,19
10<sup>-9</sup>
100,0
4,7
4,1
19,2
9,9
8,6
0,18
10<sup>-11</sup>
92,9
3,6
5,1
18,3
8,9
8,1
0,16
Таблица 4
Состояние растений винограда сорта Пухляковский после 3-х месяцев культивирования на питательной среде с препаратом Мелафен, 2013 г.
Концентрации Мелафена, %
Корни
Побег
Листья
Коэффициент полярности
число, шт.
длина, см
ризогенная зона, см
длина, см
вес, мг
число, шт.
площадь, см
вес, мг
Контроль
3,8
41,1
156,2
15,4
0,05
12,1
35,4
0,05
10,1
10<sup>-5</sup>
2,9
32,4
93,9
15,4
0,04
12,8
38,6
0,04
6,1
10<sup>-7</sup>
2,7
35,0
94,5
15,1
0,05
13,2
31,8
0,05
6,2
10<sup>-9</sup>
2,7
32,2
86,9
16,2
0,05
14,5
29,8
0,04
5,3
10<sup>-11</sup>
4,7
47,0
220,9
15,9
0,06
15,9
32,7
0,05
13,8
Таблица 5
Влияние препарата Мелафен на эффективность клонального микроразмножения оздоровленных растений винограда сорта Цимладар, 2013 г.
Показатели
Заявленное техническое решение, концентрация Мелафена 10<sup>-7</sup>%
Прототип, концентрация Эмистима 10<sup>-7</sup>%
50 дней культивирования
Число корней, штук
5,5
8,3
Длина корней, см
5,8
2,2
Величина ризогенной зоны, см
31,9
18,2
Скорость роста см/сутки
0,22
0,18
Коэффициент полярности
3,0
2,0
Высота растений, см
10,6
9,2
Число листьев, шт.
8,9
6,9
Выход растений, %
100,0
87,8
Таблица 6
Последействие препарата Мелафен на показатели клонального микроразмножения винограда сорта Пухляковский, 2013 г.
Концентрации Мелафена, %
Корни
Высота растений, см
Скорость роста, см/день
Коэффициент полярности
число, шт.
длина, см
ризогенная зона, см
47 дней культивирования
Контроль
4,6
3,3
15,0
6,0
0,12
2,5
10<sup>-5</sup>
4,4
3,1
14,0
5,7
0,12
2,4
10<sup>-7</sup>
5,0
5,3
26,5
7,6
0,16
3,4
10<sup>-9</sup>
5,4
6,3
34,1
7,6
0,16
4,5