КОЛОНИЕОБРАЗУЮЩИЕ ГЕМАНГИОКЛЕТКИ И НЕПРИЖИВАЮЩИЕСЯ ГЕМАНГИОКЛЕТКИ

1. Способ получения и выращивания колониеобразующих гемангиоклеток человека in vitro, включающий стадии:
(a) культивирования клеточной культуры, содержащей плюрипотентные стволовые клетки человека, в бессывороточной среде в присутствии по меньшей мере одного фактора роста в количестве, достаточном для индуцирования дифференцировки указанных плюрипотентных стволовых клеток в эмбриоидные тельца; и
(b) добавления по меньшей мере двух факторов роста к указанной культуре, содержащей эмбриоидные тельца, и продолжения культивирования указанной культуры в бессывороточной среде, где указанный фактор роста присутствует в количестве, достаточном для выращивания колониеобразующих гемангиоклеток человека в указанной культуре эмбриоидных телец,
в котором указанные плюрипотентные стволовые клетки, эмбриоидные тельца и колониеобразующие гемангиоклетки выращивают в бессывороточной среде на стадиях (а) и (b) указанного способа, и
в котором указанные по меньшей мере два фактора роста на стадии (b) включают ВМР4 и VEGF.
2. Способ получения и выращивания колониеобразующих гемангиоклеток человека in vitro, включающий стадии:
(а) культивирования клеточной культуры, содержащей плюрипотентные стволовые клетки человека, в бессывороточной среде в присутствии по меньшей мере одного фактора роста в количестве, достаточном для индуцирования дифференцировки указанных плюрипотентных стволовых клеток в эмбриоидные тельца; и
(b) добавления по меньшей мере двух факторов роста к указанной культуре, содержащей эмбриоидные тельца, и продолжения культивирования указанной культуры в бессывороточной среде, где указанный фактор роста присутствует в количестве, достаточном для выращивания колониеобразующих гемангиоклеток человека в указанной культуре эмбриоидных телец,
(c) дезагрегирования указанных эмбриоидных телец до отдельных клеток;
(d) добавления по меньшей мере одного фактора роста к указанной культуре, содержащей указанные отдельные клетки, и продолжения культивирования указанной культуры в бессывороточной среде, где указанный фактор роста присутствует в количестве, достаточном для выращивания колониеобразующих гемангиоклеток человека в указанной культуре, содержащей указанные отдельные клетки,
в котором указанные плюрипотентные стволовые клетки, эмбриоидные тельца и колониеобразующие гемангиоклетки выращивают в бессывороточной среде на стадиях (а)-(d) указанного способа, и
в котором указанные по меньшей мере два фактора роста на стадии (b) включают ВМР4 и VEGF.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что указанная плюрипотентная стволовая клетка представляет собой эмбриональную стволовую клетку.
4. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что указанный фактор роста представляет собой белок, который содержит белок гомеобокса или его функциональный вариант или активный вариант.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанный белок гомеобокса содержит белок НОХВ4 или его функциональный вариант или активный вариант.
6. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанный фактор роста добавляют к указанной культуре на стадии (b) многократно на протяжении стадии (b).
7. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанный фактор роста добавляют к указанным культурам на стадиях (b) и (d) многократно на протяжении стадий (b) и (d).
8. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанный белок добавляют раз в сутки.
9. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанный белок добавляют через сутки.
10. Выделенная колониеобразующая гемангиоклетка, полученная способом по п.1.
11. Выделенная колониеобразующая гемангиоклетка, полученная способом по п.2.
12. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный фактор роста выбран из группы, состоящей из фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), морфогенетических белков кости (BMP), фактора роста стволовых клеток (SCF), Flt-3L (FL), тромбопоэтина (ТРО) и эритропоэтина (ЕРО).
13. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанный фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF) или морфогенетический белок кости (BMP), или оба, добавляют на стадии (а) в период 0-48 ч клеточной культуры.
14. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанный фактор роста стволовых клеток (SCF), Flt-3L (FL) или тромбопоэтин (ТРО), или любую их комбинацию, добавляют к указанной культуре в период 48-72 ч от начала стадии (а).
15. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанный фактор роста добавляют на стадии (b) в период 48-72 ч от начала стадии (а).
16. Способ по п.5, отличающийся тем, что указанный фактор роста добавляют на стадии культивирования (b) в период 48-72 ч от начала стадии (а).
17. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию добавления эритропоэтина (ЕРО) на стадии (b).
18. Способ по п.2, дополнительно включающий стадию добавления эритропоэтина (ЕРО) на стадиях (b) и (d.).
19. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию очищения указанных колониеобразующих гемангиоклеток человека из указанной культуры.
20. Способ по п.19, отличающийся тем, что указанная стадия очистки указанных колониеобразующих гемангиоклеток включает стадию использования иммуноаффинной хроматографии на колонке с анти-С071 антителом.
21. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию выделения указанных колониеобразующих гемангиоклеток человека из указанной культуры.
22. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанная стадия выделения указанных колониеобразующих гемангиоклеток включает стадию выделения указанных колониеобразующих гемангиоклеток по размеру и/или по морфологии.
23. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанный фактор роста представляет собой слитый белок, содержащий НОХВ4 и домен белковой трансдукции (PTD).
24. Способ по п.23, отличающийся тем, что указанный PTD и указанный НОХВ4 конъюгированы с помощью линкера.
25. Способ по п.23, отличающийся тем, что указанный домен белковой трансдукции (PTD) представляет собой ТАТ-белок, его функциональный вариант или активный фрагмент.
26. Способ по п.5, отличающийся тем, что указанный НОХВ4 представляет собой НОХВ4 млекопитающего.
27. Способ по п.26, отличающийся тем, что указанный НОХВ4 млекопитающего представляет собой НОХВ4 мыши или человека.
28. Способ по п.27, отличающийся тем, что указанный НОХВ4 млекопитающего представляет собой НОХВ4 человека.
29. Способ по п.5, отличающийся тем, что указанный НОХВ4 содержит полноразмерный белок.
30. Способ по п.29, отличающийся тем, что указанный НОХВ4 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3.
31. Способ по п.23, отличающийся тем, что указанный PTD содержит одну или несколько копий полипептида ТАТ с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14.
32. Способ по п.25, отличающийся тем, что указанный ТАТ-белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14.
33. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанную клеточную культуру, содержащую плюрипотентные стволовые клетки человека, получают из библиотеки эмбриональных стволовых клеток человека, где указанная библиотека эмбриональных стволовых клеток человека включает стволовые клетки, каждая из которых является гемизиготнй или гомозиготной по меньшей мере по одному МНС аллелю, присутствующему в человеческой популяции, причем каждый член указанной библиотеки стволовых клеток является гемизиготным или гомозиготным по другому набору МНС аллелей по отношению к остальным членам библиотеки, где указанный способ создает библиотеку колониеобразующих гемангиоклеток, каждая из которых является гемизиготной или гомозиготной по меньшей мере по одному МНС аллелю, присутствующему в человеческой популяции, причем каждый член указанной библиотеки стволовых клеток является гемизиготным или гомозиготным по другому набору МНС аллелей по отношению к остальным членам библиотеки.
34. Способ по п.33, отличающийся тем, что указанная библиотека эмбриональных стволовых клеток человека включает стволовые клетки, являющиеся гемизиготными или гомозиготными по всем МНС аллелям, присутствующим в человеческой популяции, причем указанный способ создает библиотеку колониеобразующих гемангиоклеток, содержащую колониеобразующие гемангиоклетки, являющиеся гемизиготными или гомозиготными по всем МНС аллелям, присутствующим в человеческой популяции.
35. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию культивирования указанных колониеобразующих гемангиоклеток человека в условиях, пригодных для индуцирования дифференцировки указанных колониеобразующих гемангиоклеток человека в гематопоэтические стволовые клетки человека.
36. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию культивирования указанных колониеобразующих гемангиоклеток человека в условиях, пригодных для индуцирования дифференцировки указанных колониеобразующих гемангиоклеток человека в эндотелиальные клетки человека.
37. Способ по п.35, отличающийся тем, что указанное условие включает культивирование указанных колониеобразующих гемангиоклеток человека на культуральных планшетах, покрытых фибронектином.
6
38. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная культура содержит по меньшей мере 1×10 колониеобразующих гемангиоклеток человека.
6
6
6
39. Способ по п.32, отличающийся тем, что указанная культура содержит количество, выбранное из группы, состоящей из по меньшей мере 2×10 колониеобразующих гемангиоклеток человека, по меньшей мере 3×10 колониеобразующих гемангиоклеток человека и по меньшей мере 4×10 колониеобразующих гемангиоклеток человека.
40. Колониеобразующая гемангиоклетка человека, полученная способом по пп.1, 2, 17 или 18.
6
41. Раствор колониеобразующих гемангиоклеток человека, содержащий по меньшей мере 1×10 колониеобразующих гемангиоклеток человека.
42. Раствор по п.41, являющийся пригодным для инъецирования субъекту.
43. Раствор по п.41, являющийся пригодным для замораживания.
6
6
6
44. Раствор по п.41, содержащий по меньшей мере 2×10 колониеобразующих гемангиоклеток человека, по меньшей мере 3×10 колониеобразующих гемангиоклеток человека или по меньшей мере 4×10 колониеобразующих гемангиоклеток человека.
45. Раствор по п.41, отличающийся тем, что указанные колониеобразующие гемангиоклетки человека способны к дифференцировке в по меньшей мере гематопоэтические или эндотелиальные клетки.
46. Применение раствора по любому из пп.41-45 для производства лекарственных средств для лечения заболевания, лечение которого может проводиться путем введения колониеобразующих гемангиоклеток, гематопоэтических клеток или эндотелиальных клеток.
47. Способ введения колониеобразующих гемангиоклеток человека нуждающемуся в этом пациенту, включающий стадии:
(a) отбора нуждающегося в этом пациента;
(b) обеспечения колониеобразующих гемангиоклеток человека, полученных способом по любому из пп.1-39;
(c) введения некоторых или всех указанных колониеобразующих гемангиоклеток человека указанному пациенту.
48. Способ по п.47, отличающийся тем, что указанные колониеобразующие гемангиоклетки получают путем культивирования без фидерных клеток.
49. Способ по п.48, отличающийся тем, что указанные колониеобразующие гемангиоклетки человека присутствуют в количестве от 10000 до 4 миллионов клеток.
50. Способ введения гематопоэтических стволовых клеток человека нуждающемуся в этом пациенту, включающий стадии:
(a) отбора нуждающегося в этом пациента;
(b) обеспечения колониеобразующих гемангиоклеток человека, полученных способом по любому из пп.1-39;
(c) дифференцировки указанных колониеобразующих гемангиоклеток человека в гематопоэтические стволовые клетки человека; и
(d) введение некоторых или всех указанных гематопоэтических стволовых клеток человека указанному пациенту.
51. Способ по п.50, отличающийся тем, что указанные колониеобразующие гемангиоклетки получают путем культивирования без фидерных клеток.
52. Способ по п.51, отличающийся тем, что указанные колониеобразующие гемангиоклетки человека присутствуют в количестве от 10000 до 4 миллионов клеток.
53. Способ введения эндотелиальных клеток человека нуждающемуся в этом пациенту, включающий стадии:
(a) отбора нуждающегося в этом пациента;
(b) обеспечения колониеобразующих гемангиоклеток человека, полученных способом по любому из пп.1-39;
(c) дифференцировки указанных колониеобразующих гемангиоклеток человека в эндотелиальные клетки человека; и
(d) введения некоторых или всех указанных эндотелиальных клеток человека указанному пациенту.
54. Способ по п.53, отличающийся тем, что указанные колониеобразующие гемангиоклетки получают путем культивирования без фидерных клеток.
55. Способ по п.54, отличающийся тем, что указанные колониеобразующие гемангиоклетки человека присутствуют в количестве от 10000 до 4 миллионов клеток.
56. Способ лечения нарушения гематопоэтических стволовых клеток у нуждающегося в этом пациента, включающий стадии:
(a) отбора нуждающегося в этом пациента;
(b) обеспечения колониеобразующих гемангиоклеток человека, полученных способом по любому из пп.1-39;
(c) дифференцировки указанных колониеобразующих гемангиоклеток человека в гематопоэтические стволовые клетки человека; и
(d) введения некоторых или всех указанных гематопоэтических стволовых клеток человека указанному пациенту.
57. Способ по п.56, отличающийся тем, что указанные колониеобразующие гемангиоклетки получают путем культивирования без фидерных клеток.
58. Способ по п.57, отличающийся тем, что указанные колониеобразующие гемангиоклетки человека присутствуют в количестве от 10000 до 4 миллионов клеток.
59. Способ лечения нарушения эндотелиальных клеток у нуждающегося в этом пациента, включающий стадии:
(a) отбора нуждающегося в этом пациента;
(b) обеспечение колониеобразующих гемангиоклеток человека, полученных способом по любому из пп.1-39;
(c) дифференцировки указанных колониеобразующих гемангиоклеток человека в эндотелиальные клетки человека; и
(d) введения некоторых или всех указанных эндотелиальных клеток человека указанному пациенту.
60. Способ по п.59, отличающийся тем, что указанные колониеобразующие гемангиоклетки получают путем культивирования без фидерных клеток.
61. Способ по п.60, отличающийся тем, что указанные колониеобразующие гемангиоклетки человека присутствуют в количестве от 10000 до 4 миллионов клеток.
62. Способ по любому из пп.56-61, отличающийся тем, что указанное нарушение эндотелиальных клеток выбрано из группы, состоящей из инфаркта миокарда, инсульта, атеросклероза и ишемии.
63. Способ по п.62, отличающийся тем, что указанная ишемия имеет место в головном мозгу, конечностях, сердце, легких, коже и глазах.
64. Способ получения гематопоэтических стволовых клеток человека in vitro, включающий стадии:
(a) обеспечения колониеобразующих гемангиоклеток человека, полученных способом по любому из пп.1-39; и
(b) выращивания указанных колониеобразующих гемангиоклеток человека в условиях, пригодных для индуцирования дифференцировки указанных колониеобразующих гемангиоклеток человека в гематопоэтические стволовые клетки человека.
65. Гематопоэтическая стволовая клетка человека, полученная способом по п.64.
66. Способ получения эндотелиальных клеток человека in vitro, включающий стадии:
(а) обеспечения колониеобразующих гемангиоклеток человека, полученных способом по любому из пп.1-39; и
(b) выращивания указанных колониеобразующих гемангиоклеток человека в условиях, пригодных для индуцирования дифференцировки указанных колониеобразующих гемангиоклеток человека в эндотелиальные клетки человека.
67. Эндотелиальная клетка человека, полученная способом по п.66.
68. Библиотека колониеобразующих гемангиоклеток человека, полученных способом по любому из п.33 или 34.
69. Способ лечения пациента, нуждающегося в лечении, включающий введение гематопоэтических стволовых клеток человека или эндотелиальных клеток человека указанному пациенту, включающий стадии:
(a) отбора указанного пациента;
(b) идентификации белков МНС, экспрессируемых на поверхности указанных клеток пациента;
(c) получения библиотеки колониеобразующих гемангиоклеток человека по п.68;
(d) отбора колониеобразующих гемангиоклеток человека, совместимых с указанными белками МНС пациента на указанных клетках пациента;
(e) дифференцировки указанных колониеобразующих гемангиоклеток человека, идентифицированных на стадии (а), в гематопоэтические стволовые клетки человека, эндотелиальные клетки, или оба вида клеток, в зависимости от необходимости;
(f) введения некоторых или всех из указанных гематопоэтических стволовых клеток человека, эндотелиальных клеток, или обоих видов клеток со стадии (е), указанному пациенту.
70. Способ по п.69, отличающийся тем, что указанный способ осуществляют в региональном центре.
71. Способ по п.70, отличающийся тем, что указанный региональный центр является госпиталем.
72. Способ выращивания (размножения) колониеобразующих гемангиоклеток, включающий выращивание колониеобразующих гемангиоклеток млекопитающего в бессывороточной среде в присутствии белка, содержащего ВМР4 и VEGF или их функциональные эквиваленты или активные фрагменты, в количестве, достаточном для поддержания пролиферации указанных колониеобразующих гемангиоклеток.
73. Способ по п.72, отличающийся тем, что указанные колониеобразующие гемангиоклетки обогащают, очищают или выделяют из пуповинной крови, периферической крови или костного мозга.
74. Способ по п.72, отличающийся тем, что указанные колониеобразующие гемангиоклетки представляют собой колониеобразующие гемангиоклетки человека.
6
75. Способ по п.72, отличающийся тем, что указанные колониеобразующие гемангиоклетки выращивают in vitro для получения по меньшей мере 1×10 колониеобразующих гемангиоклеток.
76. Способ по п.72, отличающийся тем, что указанная бессывороточная среда дополнительно содержит белок гомеобокса, его функциональный эквивалент или активный фрагмент.
77. Способ по п.76, отличающийся тем, что белок гомеобокса, его функциональный эквивалент или активный фрагмент представляет собой белок НОХВ4 или его функциональный эквивалент или активный фрагмент.
78. Способ по п.77, отличающийся тем, что указанный НОХВ4 представляет собой НОХВ4 млекопитающего.
79. Способ по п.78, отличающийся тем, что указанный НОХВ4 млекопитающего представляет собой НОХВ4 мыши или человека.
80. Способ по п.79, отличающийся тем, что указанный НОХВ4 млекопитающего представляет собой НОХВ4 человека.
81. Способ по п.77, отличающийся тем, что указанный НОХВ4 содержит полноразмерный белок.
82. Способ по п.77, отличающийся тем, что указанный НОХВ4 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3.
83. Способ по п.72, отличающийся тем, что указанная бессывороточная среда дополнительно содержит слитый белок, содержащий НОХВ4 и домен белковой трансдукции (PTD).
84. Способ по п.83, отличающийся тем, что указанный домен белковой трансдукции (PTD) представляет собой ТАТ-белок, его функциональный вариант или активный фрагмент.
85. Способ по п.84, отличающийся тем, что указанный TAT-белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14.
86. Способ по п.83, отличающийся тем, что указанный PTD содержит одну или несколько копий полипептида ТАТ с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14.
87. Способ индукции толерантности у человека-реципиента к донорскому аллотрансплантату, включающий стадии:
(а) введения реципиенту агента, ингибирующего ко-стимуляцию Т-клеток;
(b) введения реципиенту колониеобразующих гемангиоклеток человека, полученных способом по п.1, где указанные колониеобразующие гемангиоклетки являются совместимыми по отношению к донору, и
(c) имплантации аллотрансплантата реципиенту, где указанные колониеобразующие гемангиоклетки человека индуцируют у реципиента толерантность к аллотрансплантату.
88. Способ по п.87, отличающийся тем, что агент, ингибирующий ко-стимуляцию Т-клеток, представляет собой агент, ингибирующий взаимодействие лиганд CD40-CD40.
89. Способ по п.87, дополнительно включающий стадию введения агента, ингибирующего взаимодействие CD28-B7.
90. Способ по любому из пп.87-89, не включающий стадию облучения вилочковой железы или истощения или инактивации Т-клеток.
91. Способ по любому из пп.87-89, дополнительно включающий стадию проведения облучения вилочковой железы у реципиента.
92. Способ по любому из пп.87-89, дополнительно включающий стадию проведения лечения реципиента с целью истощения или инактивации Т-клеток.
93. Способ по любому из пп.87-89, дополнительно включающий стадии проведения облучения вилочковой железы у реципиента и лечения, истощающего или инактивирующего Т-клетки.
94. Способ индукции толерантности у человека-реципиента к донорскому аллотрансплантату, включающий стадии:
(a) создания тимусного пространства у реципиента;
(b) истощения или инактивации у реципиента реактивных по отношению к донору Т-клеток;
(с) введения реципиенту колониеобразующих гемангиоклеток человека, получаемых способом по п.1, где указанные колониеобразующие гемангиоклетки являются совместимыми по отношению к донору, и
(d) имплантации аллотрансплантата реципиенту,
где указанные колониеобразующие гемангиоклетки человека индуцируют у реципиента толерантность к аллотрансплантату.
95. Способ по п.94, отличающийся тем, что указанное тимусное пространство создают путем проведения реципиенту по меньшей мере одного вида лечения, выбранного из группы, состоящей из облучения вилочковой железы, стероидов, кортикостероидов, бреквинара и иммуннодепрессивного химического вещества или лекарственного средства.
96. Способ по п.94, отличающийся тем, что указанное тимусное пространство создают путем проведения облучения вилочковой железы реципиента.
97. Способ по п.94, отличающийся тем, что указанное тимусное пространство создают путем введения реципиенту иммуннодепрессивного химического вещества или лекарственного средства.
98. Способ по п.94, отличающийся тем, что указанное тимусное пространство создают путем введения реципиенту циклоспорина.
99. Способ по п.87 или 94, отличающийся тем, что осуществляют многократное введение колониеобразующих гемангиоклеток реципиенту.
100. Способ по п.87 или 94, отличающийся тем, что указанную толерантность индуцируют в отсутствие гематопоэтического пространства, создаваемого облучением всего организма.
101. Способ по п.87 или 94, отличающийся тем, что указанные колониеобразующие гемангиоклетки человека и указанный аллотрансплантат получают от одного и того же донора.
102. Способ по п.87 или 94, отличающийся тем, что указанные колониеобразующие гемангиоклетки человека и указанный аллотрансплантат получают от разных доноров.
103. Неприживающаяся гемангиоклетка человека, способная дифференцироваться с получением по меньшей мере одного или нескольких гематопоэтических клеточных типов, причем гемангиоклетка не обладает способностью приживляться и репопулировать костный мозг у хозяина.
104. Неприживающаяся гемангиоклетка по п.103, отличающаяся тем, что гемангиоклетка экспрессирует некоторые, но не все белки, характеризующие колониеобразующие гемангиоклетки человека, обладающие способностью приживляться и репопулировать костный мозг у хозяина.
105. Неприживающаяся гемангиоклетка по п.103, отличающаяся тем, что гемангиоклетка имеет одну или несколько характеристик колониеобразующих гемангиоклеток человека, обладающих способностью приживляться и репопулировать костный мозг у хозяина.
106. Неприживающаяся гемангиоклетка по п.103, отличающаяся тем, что гемангиоклетка слабо прилипает к другим гемангиоклеткам.
107. Неприживающаяся гемангиоклетка по п.104, отличающаяся тем, что гемангиоклетка человека не экспрессирует один или несколько белков, выбранных из CD34, CD31, KDR и CD133.
108. Неприживающаяся гемангиоклетка по п.104, отличающаяся тем, что гемангиоклетка человека экспрессирует белки LMO2 и GATA2.
109. Клеточная культура, содержащая не приживающие с я гемангиоклетки человека, дифференцированные из полученных из эмбрионов клеток, где неприживающиеся гемангиоклетки могут дифференцироваться, с получением по меньшей мере одного или нескольких гематопоэтических клеточных типов, и где гемангиоклетки не обладают способностью приживляться и репопулировать костный мозг у хозяина.
110. Клеточная культура, содержащая неприживающиеся гемангиоклетки человека, дифференцированные из полученных из эмбрионов клеток, где неприживающиеся гемангиоклетки могут дифференцироваться, с получением по меньшей мере одного или нескольких гематопоэтических клеточных типов, и где гемангиоклетки не обладают способностью приживляться и репопулировать костный мозг у хозяина.
111. Клеточная культура по п.109 или 110, отличающаяся тем, что неприживающиеся гемангиоклетки экспрессируют некоторые, но не все белки, характеризующие колониеобразующие гемангиоклетки человека, обладающие способностью приживляться и репопулировать костный мозг у хозяина.
112. Клеточная культура по п.109 или 110, отличающаяся тем, что неприживающиеся гемангиоклетки имеют одну или несколько характеристик колониеобразующих гемангиоклеток человека, обладающих способностью приживляться и репопулировать костный мозг у хозяина.
113. Клеточная культура по п.109 или 110, отличающаяся тем, что гемангиоклетка слабо прилипает к другим гемангиоклеткам.
114. Клеточная культура по п.111, отличающаяся тем, что гемангиоклетка человека не экспрессирует один или несколько белков, выбранных из CD34, CD31, KDR и CD133.
115. Клеточная культура по п.111, отличающаяся тем, что гемангиоклетка человека экспрессирует белки LMO2 и GATA2.
116. Клеточная культура, содержащая гематопоэтические клетки, дифференцированные из неприживающихся гемангиоклеток по любому из пп.103-108.
6
6
6
6
117. Раствор неприживающихся гемангиоклеток человека, содержащий по меньшей мере 1×10 неприживающихся гемангиоклеток человека, по меньшей мере 2×10 неприживающихся гемангиоклеток человека, по меньшей мере 3×10 неприживающихся гемангиоклеток человека или по меньшей мере 4×10 неприживающихся гемангиоклеток человека.
118. Раствор по п.117, отличающийся тем, что неприживающиеся гемангиоклетки человека могут дифференцироваться, с получением по меньшей мере одного или нескольких гематопоэтических клеточных типов, и неприживающиеся гемангиоклетки не обладают способностью приживляться и репопулировать костный мозг у хозяина.
119. Раствор по п.118, отличающийся тем, что неприживающаяся гемангиоклетка экспрессирует некоторые, но не все белки, характеризующие колониеобразующие гемангиоклетки человека, обладающие способностью приживляться и репопулировать костный мозг у хозяина.
120. Раствор по п.118, отличающийся тем, что неприживающаяся гемангиоклетка имеет одну или несколько характеристик колониеобразующих гемангиоклеток человека, обладающих способностью приживляться и репопулировать костный мозг у хозяина.
121. Раствор по п.118, отличающийся тем, что гемангиоклетка слабо прилипает к другим гемангиоклеткам.
122. Раствор по п.119, отличающийся тем, что гемангиоклетка человека не экспрессирует один или несколько белков, выбранных из CD34, CD31, KDR и CD133.
123. Раствор по п.119, отличающийся тем, что гемангиоклетка человека экспрессирует белки LMO2 и GATA2.
124. Раствор по любому из пп.117-123, являющийся пригодным для инъецирования субъекту или пригодным для замораживания.
125. Применение раствора по любому из пп.117-123 для производства лекарственного средства для лечения заболевания, лечение которого может проводиться путем введения неприживающихся гемангиоклеток или гематопоэтических клеток.
126. Фармацевтический препарат, содержащий по существу очищенную популяцию неприживающихся гемангиоклеток человека, которая может дифференцироваться с получением по меньшей мере одного или нескольких гематопоэтических клеточных типов, где гемангиоклетка не обладает способностью приживляться и репопулировать костный мозг у хозяина.
127. Фармацевтический препарат по п.126, отличающийся тем, что неприживающаяся гемангиоклетка экспрессирует некоторые, но не все белки, характеризующие колониеобразующие гемангиоклетки человека, обладающие способностью приживляться и репопулировать костный мозг у хозяина.
128. Фармацевтический препарат по п.126, отличающийся тем, что неприживающаяся гемангиоклетка имеет одну или несколько характеристик колониеобразующих гемангиоклеток человека, обладающих способностью приживляться и репопулировать костный мозг у хозяина.
129. Фармацевтический препарат по п.126, отличающийся тем, что гемангиоклетка слабо прилипает к другим гемангиоклеткам.
130. Фармацевтический препарат по п.127, отличающийся тем, что гемангиоклетка человека не экспрессирует один или несколько белков, выбранных из CD34, CD31, KDR и CD133.
131. Фармацевтический препарат по п.127, отличающийся тем, что гемангиоклетка человека экспрессирует белки LMO2 и GATA2.
6
132. Фармацевтический препарат по любому из пп.126-131, содержащий по меньшей мере 1×10 неприживающихся гемангиоклеток человека.
6
133. Фармацевтический препарат по п.132, содержащий по меньшей мере 5×10 неприживающихся гемангиоклеток человека.
134. Криоконсервированный препарат неприживающихся гемангиоклеток человека по любому из пп.1-108.
6
6
6
6
6
135. Криоконсервированный препарат по п.134, содержащий по меньшей мере 1×10 неприживающихся гемангиоклеток человека, по меньшей мере 2×10 неприживающихся гемангиоклеток человека, по меньшей мере 3×10 неприживающихся гемангиоклеток человека, по меньшей мере 4×10 неприживающихся гемангиоклеток человека или по меньшей мере 5×10 неприживающихся гемангиоклеток человека.
136. Способ получения и выращивания (размножения) неприживающихся гемангиоклеток человека in vitro, включающий стадии:
(a) культивирования клеточной культуры, содержащей плюрипотентные стволовые клетки человека, в бессывороточной среде в присутствии по меньшей мере одного фактора роста в количестве, достаточном для индуцирования дифференцировки указанных плюрипотентных стволовых клеток в эмбриоидные тельца; и
(b) добавления по меньшей мере одного фактора роста к указанной культуре, содержащей эмбриоидные тельца, и продолжения культивирования указанной культуры в бессывороточной среде,
в котором указанный фактор роста присутствует в количестве, достаточном для выращивания неприживающихся гемангиоклеток человека в указанной культуре эмбриоидных телец,
в котором указанные эмбриоидные тельца культивируют в течение 10-13 дней, и
в котором указанные плюрипотентные стволовые клетки, эмбриоидные тельца и неприживающиеся гемангиоклетки выращивают в бессывороточной среде на стадиях (а) и (b) указанного способа.
137. Способ получения и выращивания (размножения) неприживающихся гемангиоклеток человека in vitro, включающий стадии:
(a) культивирования клеточной культуры, содержащей плюрипотентные стволовые клетки человека, в бессывороточной среде в присутствии по меньшей мере одного фактора роста в количестве, достаточном для индуцирования дифференцировки указанных плюрипотентных стволовых клеток в эмбриоидные тельца; и
(b) добавления по меньшей мере одного фактора роста к указанной культуре, содержащей эмбриоидные тельца, и продолжения культивирования указанной культуры в бессывороточной среде, где указанный фактор роста присутствует в количестве, достаточном для выращивания неприживающихся гемангиоклеток человека в указанной культуре эмбриоидных телец,
(c) дезагрегирования указанных эмбриоидных телец до отдельных клеток;
(d) добавления по меньшей мере одного фактора роста к указанной культуре, содержащей указанные отдельные клетки, и продолжения культивирования указанной культуры в бессывороточной среде, где указанный фактор роста присутствует в количестве, достаточном для выращивания неприживающихся гемангиоклеток человека в указанной культуре, содержащей указанные отдельные клетки,
в котором указанную культуру отдельных клеток культивируют в течение 10-13 дней, и
в котором указанные плюрипотентные стволовые клетки, эмбриоидные тельца и неприживающиеся гемангиоклетки выращивают в бессывороточной среде на стадиях (a)-(d) указанного способа.
138. Способ по п.136 или 137, отличающийся тем, что указанная плюрипотентная стволовая клетка представляет собой эмбриональную стволовую клетку.
139. Способ по п.136 или 137, отличающийся тем, что указанный фактор роста представляет собой белок, содержащий белок гомеобокса или его функциональный вариант или активный вариант.
140. Способ по п.139, отличающийся тем, что указанный белок гомеобокса содержит белок НОХВ4 или его функциональный вариант или активный вариант.
141. Способ по п.136, отличающийся тем, что указанный фактор роста выбран из группы, состоящей из фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), морфогенетических белков кости (BMP), фактора роста стволовых клеток (SCF), Flt-3L (FL), тромбопоэтина (ТРО) и эритропоэтина (ЕРО).
142. Способ по п.141, отличающийся тем, что указанный фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF) или морфогенетический белок кости (BMP), или оба, добавляют на стадии (а) в период 0-48 ч клеточной культуры.
143. Способ по п.141, отличающийся тем, что указанный фактор роста стволовых клеток (SCF), Flt-3L (FL) или тромбопоэтин (ТРО) или любую их комбинацию, добавляют к указанной культуре в период 48-72 часов от начала стадии (а).
144. Способ по п.139, отличающийся тем, что указанный фактор роста добавляют на стадии (b) в период 48-72 ч от начала стадии (а).
145. Способ по п.136, дополнительно включающий стадию добавления эритропоэтина (ЕРО) на стадии (b).
146. Способ по п.137, дополнительно включающий стадию добавления эритропоэтина (ЕРО) на стадиях (b) и (d).
147. Способ по п.136, дополнительно включающий стадию очистки неприживающихся гемангиоклеток человека из указанной культуры.
148. Способ по п.136, дополнительно включающий стадию выделения неприживающихся гемангиоклеток человека из указанной культуры.
149. Способ по п.139, отличающийся тем, что указанный фактор роста представляет собой слитый белок, содержащий НОХВ4 и домен белковой трансдукции (PTD).
150. Способ по п.149, отличающийся тем, что указанный PTD и указанный НОХВ4 конъюгированы с помощью линкера.
151. Способ по п.149, отличающийся тем, что указанный домен белковой трансдукции (PTD) представляет собой ТАТ-белок, его функциональный вариант или активный фрагмент.
152. Способ по п.149, отличающийся тем, что указанный НОХВ4 представляет собой НОХВ4 млекопитающего.
153. Способ по п.152, отличающийся тем, что указанный НОХВ4 млекопитающего представляет собой НОХВ4 мыши или человека.
154. Способ по п.140, отличающийся тем, что указанный НОХВ4 содержит полноразмерный белок.
155. Способ по п.136, дополнительно включающий стадию культивирования указанных неприживающихся гемангиоклеток в условиях, пригодных для индуцирования дифференцировки указанных неприживающихся гемангиоклеток в гематопоэтические стволовые клетки человека.
6
6
6
6
156. Способ по п.136, отличающийся тем, что указанная культура содержит по меньшей мере 1×10 неприживающихся гемангиоклеток человека, по меньшей мере 2×10 неприживающихся гемангиоклеток человека, по меньшей мере 3×10 неприживающихся гемангиоклеток человека или по меньшей мере 4×10 неприживающихся гемангиоклеток человека.
157. Неприживающаяся гемангиоклетка человека, полученная способом по пп.136, 137, 145 или 146.
158. Способ получения гематопоэтических стволовых клеток человека in vitro, включающий стадии:
(a) обеспечения неприживающихся гемангиоклеток человека, полученных способом по любому из пп.136-146; и
(b) выращивания указанных неприживающихся гемангиоклеток человека в условиях, пригодных для индуцирования дифференцировки указанных неприживающихся гемангиоклеток человека в гематопоэтические стволовые клетки человека.
159. Гематопоэтическая стволовая клетка человека, полученная способом по п.158.
160. Способ введения неприживающихся гемангиоклеток человека нуждающемуся в этом пациенту, включающий стадии:
(a) отбора нуждающегося в этом пациента;
(b) обеспечения неприживающихся гемангиоклеток человека, полученных способом по любому из пп.136-146;
(c) введения некоторых или всех указанных неприживающихся гемангиоклеток человека указанному пациенту.
161. Способ введения неприживающихся гемангиоклеток человека нуждающемуся в этом пациенту, включающий стадии:
(a) отбора нуждающегося в этом пациента;
(b) обеспечения неприживающихся гемангиоклеток человека в количестве по меньшей мере 10000 клеток;
(c) введения некоторых или всех указанных неприживающихся гемангиоклеток человека указанному пациенту.
162. Способ по п.161, отличающийся тем, что указанные неприживающиеся гемангиоклетки человека присутствуют в количестве от 10000 до 4 миллионов клеток.
163. Способ введения гематопоэтических стволовых клеток человека нуждающемуся в этом пациенту, включающий стадии:
(a) отбора нуждающегося в этом пациента;
(b) обеспечения неприживающихся гемангиоклеток человека, полученных способом по любому из пп.136-146;
(c) дифференцировки указанных неприживающихся гемангиоклеток человека в гематопоэтические стволовые клетки человека; и
(d) введения некоторых или всех указанных гематопоэтических стволовых клеток человека указанному пациенту.
164. Способ введения гематопоэтических стволовых клеток человека нуждающемуся в этом пациенту, включающий стадии:
(a) отбора нуждающегося в этом пациента;
(b) обеспечения неприживающихся гемангиоклеток человека в количестве по меньшей мере 10000 клеток;
(c) дифференцировки указанных неприживающихся гемангиоклеток человека в гематопоэтические стволовые клетки человека; и
(d) введения некоторых или всех указанных гематопоэтических стволовых клеток человека указанному пациенту.
165. Способ по п.164, отличающийся тем, что указанные неприживающиеся гемангиоклетки человека присутствуют в количестве от 10000 до 4 миллионов клеток.
166. Способ лечения нарушения гематопоэтических стволовых клеток у нуждающегося в этом пациента, включающий стадии:
(a) отбора нуждающегося в этом пациента;
(b) обеспечения неприживающихся гемангиоклеток человека, полученных способом по любому из пп.136-146;
(c) дифференцировки указанных неприживающихся гемангиоклеток человека в гематопоэтические стволовые клетки человека; и
(d) введения некоторых или всех указанных гематопоэтических стволовых клеток человека указанному пациенту.
167. Способ лечения нарушения гематопоэтических стволовых клеток у нуждающегося в этом пациента, включающий стадии:
(a) отбора нуждающегося в этом пациента;
(b) обеспечения неприживающихся гемангиоклеток человека в количестве по меньшей мере 10000 клеток;
(c) дифференцировки указанных неприживающихся гемангиоклеток человека в гематопоэтические стволовые клетки человека; и
(d) введения некоторых или всех указанных гематопоэтических стволовых клеток человека указанному пациенту.
168. Способ по п.167, отличающийся тем, что указанные неприживающиеся гемангиоклетки человека присутствуют в количестве от 10000 до 4 миллионов клеток.
169. Способ получения дифференцированных гематопоэтических клеток из неприживающихся гемангиоклеток in vitro, включающий стадии:
(a) получения неприживающихся гемангиоклеток человека; и
(b) дифференцировки указанных неприживающихся гемангиоклеток в дифференцированные гематопоэтические клетки.
170. Дифференцированная гематопоэтическая клетка, полученная способом по п.169.
171. Способ проведения переливаний крови с использованием гематопоэтических клеток, дифференцированных in vitro из неприживающихся гемангиоклеток человека, включающий стадии:
(a) получения неприживающихся гемангиоклеток человека;
(b) дифференцировки указанных неприживающихся гемангиоклеток в дифференцированные гематопоэтические клетки; и
(c) проведения переливаний крови с указанными дифференцированными гематопоэтическими клетками.
172. Способ получения дифференцированных гематопоэтических клеток из неприживающихся гемангиоклеток in vitro, включающий стадии:
(a) получения неприживающихся гемангиоклеток человека, полученных способом по любому из пп.136-146; и
(b) дифференцировки указанных неприживающихся гемангиоклеток в дифференцированные гематопоэтические клетки.
173. Дифференцированная гематопоэтическая клетка, полученная способом по п.172.
174. Способ проведения переливаний крови с использованием гематопоэтических клеток, дифференцированных in vitro из неприживающихся гемангиоклеток человека, включающий стадии:
(a) получения неприживающихся гемангиоклеток человека, полученных способом по любому из пп.136-146;
(b) дифференцировки указанных неприживающихся гемангиоклеток в дифференцированные гематопоэтические клетки; и
(c) проведения переливаний крови с указанными дифференцированными гематопоэтическими клетками.
175. Способ по пп.1, 2, 17 или 18, отличающийся тем, что плюрипотентная стволовая клетка представляет собой индуцированную плюрипотентную стволовую клетку (iPSC), и
указанную iPSC пассируют с трипсином,
указанную iPSC поддерживают с мышиными эмбриональными фибробластами (MEF) или поддерживают без фидерного слоя, и/или
добавляют Y-27632 к бессывороточной среде для эмбриоидных телец и/или среде для дифференцировки.
176. Способ по п.64, отличающийся тем, что плюрипотентная стволовая клетка представляет собой индуцированную плюрипотентную стволовую клетку (iPSC), и
указанную iPSC пассируют с трипсином,
указанную iPSC поддерживают с мышиными эмбриональными фибробластами (MEF) или поддерживают без фидерного слоя, и/или
добавляют Y-27632 к бессывороточной среде для эмбриоидных телец и/или среде для дифференцировки.
177. Способ по п.66, отличающийся тем, что плюрипотентная стволовая клетка представляет собой индуцированную плюрипотентную стволовую клетку (iPSC), и
указанную iPSC пассируют с трипсином,
указанную iPSC поддерживают с мышиными эмбриональными фибробластами (MEF) или поддерживают без фидерного слоя, и/или
добавляют Y-27632 к бессывороточной среде для эмбриоидных телец и/или среде для дифференцировки.
178. Способ по пп.136, 137, 145 или 146, отличающийся тем, что плюрипотентная стволовая клетка представляет собой индуцированную плюрипотентную стволовую клетку (iPSC), и
указанную iPSC пассируют с трипсином,
указанную iPSC поддерживают с мышиными эмбриональными фибробластами (MEF) или поддерживают без фидерного слоя, и/или
добавляют Y-27632 к бессывороточной среде для эмбриоидных телец и/или среде для дифференцировки.
179. Способ по п.158, отличающийся тем, что плюрипотентная стволовая клетка представляет собой индуцированную плюрипотентную стволовую клетку (iPSC), и
указанную iPSC пассируют с трипсином,
указанную iPSC поддерживают с мышиными эмбриональными фибробластами (MEF) или поддерживают без фидерного слоя, и/или
добавляют Y-27632 к бессывороточной среде для эмбриоидных телец и/или среде для дифференцировки.
180. Способ по п.169, отличающийся тем, что плюрипотентная стволовая клетка представляет собой индуцированную плюрипотентную стволовую клетку (iPSC), и
указанную iPSC пассируют с трипсином,
указанную iPSC поддерживают с мышиными эмбриональными фибробластами (MEF) или поддерживают без фидерного слоя, и/или
добавляют Y-27632 к бессывороточной среде для эмбриоидных телец и/или среде для дифференцировки.
181. Способ по п.172, отличающийся тем, что плюрипотентная стволовая клетка представляет собой индуцированную плюрипотентную стволовую клетку (iPSC), и
указанную iPSC пассируют с трипсином,
указанную iPSC поддерживают с мышиными эмбриональными фибробластами (MEF) или поддерживают без фидерного слоя, и/или
добавляют Y-27632 к бессывороточной среде для эмбриоидных телец и/или среде для дифференцировки.