Гуманизированное моноклональное антитело, специфичное к синдекану-1
HUMANIZED MONOCLONAL ANTIBODY SPECIFIC TO SYNDECAN-1

Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к иммунологии, биотехнологии и медицине, а именно к области противоопухолевых лекарственных препаратов на основе моноклональных антител, и может быть использовано в медицине для лечения онкологических заболеваний.
Предшествующий уровень техники
Онкологические заболевания стоят на втором месте по смертности в мире после сердечно-сосудистых заболеваний [http://www.who.int/healthinfo/EN_WHS2012_Full.pdf]. За последние 10 лет число заболевших онкологическими заболеваниями, по разным данным, возросло на 15%. Ежегодно в России регистрируется более 490 тысяч новых пациентов, 2,5 миллиона находятся под наблюдением и более 290 тысяч больных ежегодно умирает от различных форм рака. Ввиду этого целесообразны разработка и создание безопасных, эффективных и доступных противоопухолевых препаратов.
Одним из типов противоопухолевых препаратов являются продукты биотехнологического синтеза - моноклональные антитела (MAb). Известен ряд фармакологических решений, в их числе MAb к рецептору эпидермального фактора роста, вазоэндотелиальному фактору роста, которые имеют доказанное значение для жизнедеятельности опухолевых клеток и малозначимы для функционирования нормальных клеток различных тканей организма [Жуков Н.В., Тюляндин С.А. Целевая терапия в лечении солидных опухолей; практика противоречит теории / Биохимия 2008, Т. 73, вып. 5, с 751-768].
В настоящее время в мире зарегистрировано и производится около десяти противоопухолевых препаратов на основе моноклональных антител, в частности, Ритуксимаб (MAb к рецептору CD20), Трастузумаб (мишенью является рецептор HER2neu), Бевацизумаб (VEGF), Цетуксимаб и Панитумумаб (EGFR). Зарегистрированных препаратов, мишенью которых является поверхностный антиген синдекан-1 (CD138), в настоящее время не существует.
Белок синдекан-1 (CD138) [Wijdenes J, Dore JM, Clement С, Vermot-Desroches С (2003). "CD138". J. Biol. Regul. Homeost. Agents 16(2): 152-5] является перспективной мишенью противоопухолевой терапии моноклональными антителами: доказана важная роль данной молекулы в жизнедеятельности опухолевых клеток и показана ее малая значимость для функционирования нормальных клеток различных тканей организма [Guo P. et al. Expression of legumain correlates with prognosis and metastasis in gastric carcinoma // PloS One. 2013. Vol. 8, №9. P. e73090].
Данная молекула обеспечивает межклеточные взаимодействия и взаимодействия между клетками и матриксом, адгезию и миграцию. Гиперэкспрессия CD138 была продемонстрирована в большинстве (около 90%) клеток различных опухолей, включая рак молочной железы, толстой кишки и желудка, предстательной железы и других эпителиальных злокачественных опухолей [Rousseau et al. EJNMMI Research 2011, Bayer-Garner I.B., Sanderson R.D., Dhodapkar M.V. et al. Syndecan-1 (CD138) immunoreactivity in bone marrow biopsies of multiple myeloma: shed syndecan-1 accumulates in fibrotic regions. Mod Pathol 2001; 14: 1052-8]. Также описано такое явление, как потеря синдекана-1 с поверхности миеломных клеток с накоплением его в строме, как правило, в участках фиброза [Байков В.В.. Трудности морфологической диагностики множественной миеломы. Москва, Онкогематология 2'2007, стр. 10-15]. Показано, что при потере синдекана-1 миеломные клетки вступают в TRAIL - индуцированный апоптоз [Wu YH, Yang CY, Chien WL, Lin KI, Lai MZ. Removal of syndecan-1 promotes TRAIL-induced apoptosis in myeloma cells. J Immunol. 2012 Mar 15; 188(6): 2914-21. Epub 2012 Feb 3]. Функционально синдекан-1 связан со способностью опухолевых клеток к инвазивному росту и метастазированию. В аспекте лечения злокачественных опухолей активность CD138 сопряжена с теми свойствами опухолевых клеток, которые практически не поддаются существующей терапии.
Показана локализация CD138 на поверхности опухолевых клеток в форме, доступной для узнавания антителами [Wu В. с соавторами в 2010]. Более того, имеются данные об эффективности вакцинации с использованием в качестве антигена CD138 [Вае J, Tai YT, Anderson KC, Munshi NC. 2011].
H
L
H
L
Известны мышиные антитела к синдекану-1 - В-В4 (IgG1) [Wijdenes J., Vooijs W.C., Clement С. et al. A plasmacyte selective monoclonal antibody (B-B4) recognizes syndecan-1. Br J Haematol 1996; 94: 318-23], B-B2 (IgG2b), а также химерные [Байков B.B.., 2007, Ковригина A.M., Пробатова Н.А. Дифференциальная диагностика неходжкинских В-клеточных лимфом Москва, Онкогематология 2'2007, стр. 6] - MI15 (IgG1κ) и конъюгаты таковых с метками [ClinicalTrials.gov identifier: NCT01296204, Gattei V, Godeas С, Degan М, Rossi FM, Aldinucci D, Pinto A. Characterization of anti-CD138 monoclonal antibodies as tools for investigating the molecular polymorphism of syndecan-1 in human lymphoma cells. Br J Haematol. 1999 Jan; 104(1): 152-62]. Такие соединения используют в исследовательских или диагностических целях, причем антитело выполняет лишь функцию нацеливания [Байков В.В., 2007, Ковригина A.M., 2007]. Цитотоксическую функцию выполняют эффекторные молекулы, как правило, конъюгированные с антителом [WO 2009080832 (A1), WO 2009080830 (A1), WO 2010128087 (А2)]. Мышиные и кроличьи MAb иммунная система человека воспринимает как чужеродные, за счет различий в константной части антител (C, C), и запускает против них иммунный ответ. Для применения у людей разрабатывают химерные антитела, константная часть которых - человека, а вариабельная (V, V) - мыши. С использованием данной модификации удается получить более безопасные MAb. Так, известно химерное моноклональное антитело к CD138 подкласса IgG4 [WO 2009080829 (A1)], которое авторы предлагаемого изобретения считают прототипом. Однако данное MAb обеспечивает лишь нацеливание цитотоксического агента, конъюгированного с ним (DM4).
Известен ряд изобретений, в которых имеется упоминание об антителах к CD138, однако структура таких антител не приведена. Известно антитело против CD138 человека, имеющее модификацию гликозилирования, получаемое с использованием клетки, экспрессирующей по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую (1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазу III (GnT III), а также по меньшей мере одну трансфецированную нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело против CD138 человека, однако аминокислотные и/или нуклеотидные последовательности данного антитела не приведены, структура данного антитела не охарактеризована [RU 2321630 C2]. Известен вариант изобретения, при котором антитело против CD138 вводится совместно с конъюгатом anti-Trop-2 антитела и химиотерапевтического агента, либо конъюгатом антитела к муцину или его антиген-связывающего фрагмента и радионуклида для лечения рака поджелудочной железы [US 2014044640 (A1)]. Известен конъюгат антитела, связывающегося с CD138, и анти-CD74 антитела [US 2014056917 A1], и молекулы SN38 [US 2014058067 (A1)], в том числе ее фрагментов, в составе биспецифической антительной конструкции [US 2014086832 (A1)]. Известна и композиция, содержащая область якоря, способного связываться с плазматической клеткой, и связывающий специфические антитела плазматических клеток участок, связанный с областью якоря, в составе конструкции может быть антитело, способное связываться с синдеканом-1 [WO 2014037519 (А2)].
H
L
Известно рекомбинантное антитело к синдекану-1 (OC-46F2), созданное в результате in vitro селекции библиотеки для фагового дисплея (ETH-2-Gold) человеческих антител на клетках меланомы человека и дальнейшей экспрессии полученных генов в клетках млекопитающих [Orecchia Ρ, Conte R, Balza Ε, Petretto A, Mauri Ρ, Mingan MC, Carnemolla В.A novel human anti-syndecan-1 antibody inhibits vascular maturation and tumour growth in melanoma. Eur J Cancer. 2013 May; 49(8):2022-33. doi: 10.1016/j.ejca. 2012.12.019. Epub 2013 Jan 24]. Показано, что данное антитело ингибирует созревание сосудов и опухолевый рост в экспериментальной модели человеческой меланомы (на мышах), а также эффективно в терапевтическом плане в отношении экспериментальной модели человеческой карциномы рака яичника. OC-46F2 представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) - гибридный белок из вариабельных фрагментов тяжелой (V) и легкой (V - лямбда) цепи иммуноглобулинов, соединенных коротким линкерным пептидом. Данное соединение не содержит константные фрагменты антитела, что затрудняет формирование адекватного иммунного ответа, связанного с использованием антител, - вариабельные фрагменты молекулы обеспечивают только связывание с антигеном, что обуславливает показанное авторами сдерживающее действие. Однако для элиминации опухоли в данном случае необходимо использование дополнительных действующих веществ, возможно, создание конъюгатов.
Таким образом, описанные на сегодняшний день мышиные антитела к CD138 непригодны для применения у людей ввиду высокой иммуногенности, их используют для лабораторных целей, химерные MAb не обладают самостоятельным терапевтическим действием - их используют только в качестве нацеливающего агента, а также могут быть иммуногенны. Нельзя исключать и индивидуальную реакцию пациента на то или иное MAb. Кроме того, действующий агент, который нацеливают с использованием антитела, или продукты его распада, могут являться стрессорным фактором для организма, ввиду их структуры, возможности и периода распада данного вещества, характера соединений, на которое он распадается. Точная структура природных моноклональных антител человека к синдекану-1 не установлена.
Учитывая функциональную роль синдекана-1 в инвазивном росте и метастазировании опухолей, создание более эффективных и безопасных антител к нему, является актуальной задачей.
Данная задача решена предложенным изобретением, лишенным недостатков аналогов.
Технический результат от использования предлагаемого антитела к CD138 выражается, как минимум, в увеличении спектра МАЬ, в том числе к CD138, используемых в терапии опухолевых заболеваний, что позволяет проводить им лечение при индивидуальной непереносимости или плохой переносимости аналогов.
Технический результат выражается в увеличении эффективности антитела к CD138. Указанный технический результат достигается сообщением самостоятельной противоопухолевой активности, благодаря использованию рассчитанного и созданного авторами предлагаемого антитела изотипа IgG4, представленного определенной комбинацией описанных последовательностей цепей антитела, полученных авторами изобретения, а также увеличением аффинности к антигену, также благодаря использованию предлагаемого антитела, в том числе благодаря гуманизации антитела: использование каркасных участков человеческого антитела позволяет более точно сориентировать гипервариабельные участки, что увеличивает соответствие эпитопа и паратопа и, соответственно, аффинность. Сообщение самостоятельной противоопухолевой активности в одном из вариантов изобретения достигается также тем, что в константный фрагмент тяжелой цепи антитела типа IgG4 введены участки цепей IgG3, опосредующие высокую антитело- и комплемент-зависимую цитотоксичность последнего, в результате такое антитело обладает повышенным цитотоксическим действием при связывании с CD138. Указанный технический результат при использовании такого варианта изобретения достигается также увеличением срока полужизни антитела, что достигается введением аминокислотных замен на С-конце константной части тяжелой цепи. Это позволяет достигать более длительного эффекта, использовать меньшую дозировку, осуществлять меньшее количество введений антитела, что также может позволить снизить стоимость лечения.
Технический результат от использования предлагаемого антитела к CD138 также выражается в увеличении безопасности противоопухолевого средства. Указанный технический результат достигается уменьшением иммуногенности, за счет гуманизации антитела, а также тем, что действующим веществом является сама молекула моноклонального антитела - по природе белок, который впоследствии деградирует до аминокислот, т.е. при его использовании исключаются какие-либо последствия возможного невыведения из организма в течение какого-либо времени действующего агента (химического вещества небелковой природы) либо продуктов его распада, в результате уменьшается стрессорное воздействие на организм противоопухолевого препарата.
Также техническим результатом является увеличение эффективности, упрощение и ускорение производства, что позволяет снизить его стоимость, который достигается получением высокого уровня экспрессии антитела в клетках млекопитающих за короткий срок, за счет кодонной оптимизации кодирующих последовательностей, а также введенной сигнальной секреторной последовательности на N-конце тяжелой и легкой цепи.
Сущность изобретения
Задачей данного изобретения являлось создание эффективного и безопасного универсального противоопухолевого агента, производство которого эффективное, быстрое и простое. Данная задача решена предложенным гуманизированным моноклональным антителом, специфичным к синдекану-1, приемлемым для терапии опухолевых заболеваний, обладающим высокой аффинностью к антигену, к CD138, самостоятельной противоопухолевой активностью, а также низкой иммуногенностью; действующим веществом является сама молекула моноклонального антитела, по природе белок, которую можно получать в больших количествах за короткий промежуток времени в клетках млекопитающих. В одном из вариантов изобретения данная задача также решается тем, что предложенное моноклональное антитело, специфичное к синдекану-1, обладает повышенной цитотоксичностью, а также длительным периодом полужизни.
Указанные свойства полученного антитела подтверждены результатами научных исследований, приведенными в примерах, и обусловлены его структурой, выраженной в использовании рассчитанных и созданных авторами изобретения цепей антитела, их определенной комбинации, а также структурой кодирующих последовательностей.
Предложено моноклональное антитело, специфичное к синдекану-1, изотипа IgG4, тяжелая цепь которого охарактеризована аминокислотной последовательностью (а.п.) SEQ ID NO: 1, легкая цепь охарактеризована а.п. SEQ ID NO: 7 либо тяжелая цепь охарактеризована а.п. SEQ ID NO: 5, легкая цепь охарактеризована а.п. SEQ ID NO: 3 либо SEQ ID NO: 7, антитело используют в качестве действующего вещества для терапии опухолевых заболеваний. Также предложено моноклональное антитело, специфичное к синдекану-1, изотипа IgG4, в константном фрагменте тяжелой цепи которого содержатся участки IgG3, а также аминокислотные замены на С-конце, для увеличения времени полужизни, тяжелая цепь которого охарактеризована а.п. SEQ ID NO: 9, легкая цепь - каппа и охарактеризована а.п. SEQ ID NO: 7 либо тяжелая цепь охарактеризована а.п. SEQ ID NO: 11, легкая цепь - SEQ ID NO: 3 либо SEQ ID NO: 7, антитело используют в качестве действующего вещества для терапии опухолевых заболеваний. Также предложены полинуклеотиды, кодирующие цепи моноклонального антитела, специфичного к синдекану-1, представленные а.п. SEQ ID NO: 5, либо SEQ ID NO: 7, либо SEQ ID NO: 9, либо SEQ ID NO: 11, кодонно оптимизированные для экспрессии в клетках продуцента. Для экспрессии в клетках млекопитающего каждый полинуклеотид дополнительно содержит фрагмент, кодирующий сигнальную секреторную последовательность, на N-конце, отщепляющуюся при секреции из клеток продуцентов, кодонно оптимизирован для экспрессии в клетках млекопитающего и представлен SEQ ID NO: 6, либо SEQ ID NO: 8, либо SEQ ID NO: 10, либо SEQ ID NO: 12.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1, 4, 7 приведены кривые выживаемости Каплана-Майера.
На фиг. 2, 5, 8 приведен средний рост опухоли по группам, ± SEM, с первого дня.
На фиг. 3, 6, 9 приведено изменение средней массы тела в группе, BW, в процентном соотношении, ± SEM, с первого дня.
На всех фигурах: 1 - контроль, 4 - паклитаксел, на фиг. 1-3, для А549: 2 - Mab4, 3 - Mab6, на фиг. 4-6, для Colo 205: 2 - Mab2, 3 - Mab3, на фиг. 7-9, для РС3, 2 - Mab1, 3 - Mab5.
Примеры осуществления изобретения
Пример 1. Получение MAb к синдекану-1
1.1. Получение синдекана-1
Ген, кодирующий синдекан-1, был синтезирован посредством химико-ферментативного синтеза [Young L, Dong Q., Two step total gene synthesis method. Nucleic Acid Research: 32, e59, 2004] двуступенчатым методом. Полученный ген был клонирован в векторе pET151/D-TOPO, которым впоследствии трансформировали клетки E. coli BL21(DE3)Star. Проводили ферментацию штамма-продуцента, выделяли рекомбинантный белок. Проводили очистку синдекана-1 с помощью металлохелатной хроматографии.
Препарат рекомбинантного белка имел чистоту 98% и был использован для получения гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела мыши к синдекану-1 и тестирования полученных моноклональных антител.
1.2. Иммунизация мышей линии Balb/c синдеканом-1
Была проведена иммунизация мышей линии Balb/c, в качестве антигена использовали очищенный рекомбинантный белок синдекан-1. При первичной иммунизации мышам вводили подкожно 50 мкг антигена в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ). Через 28 дней анализировали уровень иммунного ответа на введенный антиген, оценивая титр специфичных сывороточных антител с помощью иммунноферментного анализа (ИФА). Животным с максимальным значением иммунного ответа повторно вводили подкожно 30 мкг антигена в неполном адъюванте Фрейнда (НАФ) и оценивали уровень вторичного иммунного ответа через 21 день, затем за 4-5 дней до проведения соматической гибридизации вводили 30 мкг антигена в физиологическом растворе (ФР) внутрибрюшинно.
1.3. Получение гибридом, синтезирующих моноклональные антитела, специфичные к синдекану-1
В качестве партнеров по слиянию использовали спленоциты иммунизированных мышей с титром сывороточных антител к белку синдекан-1 примерно 1:30000 и клетки мышиной миеломы sp2/0-Ag14 (АТСС, CRL-1581) в соотношении 2:1. Гибридизацию проводили с использованием раствора полиэтиленгликоля (Sigma) в соответствии со стандартной методикой. Селекцию стабильных гибридных клеток проводили путем культивирования на среде IMDM (Iscove-s Modified Dulbecco Medium, Sigma), содержащей 10% сыворотки FCI (HyClone) и HAT (Gibco). Отбор клонов гибридных клеток, секретирующих антитела, специфичные к заданным антигенам, проводили с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). В результате первичного скрининга было отобрано 10 клонов гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела к синдекану-1. После проведения пяти клонирований было получено 4 стабильных продуцирующих клона. Из каждой из клеточных линий была выделена мРНК, кодирующая тяжелые и легкие цепи антитела к синдекану-1.
1.4. Дизайн гуманизированного антитела к синдекану-1
6
Из стабильных клонов гибридных клеток, продуцирующих мышиные моноклональные антитела к синдекану-1, была выделена РНК с использованием набора «TRI Reagent» (Sigma, США), по инструкции изготовителя. На 5-10×10 клеток использовали 1 мл лизирующего раствора «TRI Reagent». Синтез кДНК проводили с помощью набора «Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit» (Fermentas, Литва).
Амплификацию генов, кодирующих вариабельные фрагменты мышиных антител, проводили методом ПЦР с использованием 5' вырожденных праймеров для отжига на неизвестных VH и VL участках и синтезированной кДНК в качестве матрицы. Наработку фрагментов ДНК для клонирования проводили методом ПЦР с использованием высокоточной, термоустойчивой ДНК-полимеразы Pfx. Полученные ПЦР-продукты были клонированы в векторе pGMT-easy с использованием набора «Fast Ligation Kit» (Fermentas) и секвенированы ферментативным методом по Сенгеру. Было выявлено, что гибридома 1 и гибридома 2 синтезируют различающиеся MAb, которые использовали для получения моноклонального антитела по изобретению.
Результаты секвенирования были использованы для получения гуманизированного моноклонального антитела.
Гуманизацию антитела проводили методом переноса выявленных (вычисленных с использованием компьютерных алгоритмов на полученных нуклеотидных последовательностях) гипервариабельных участков (CDR) вариабельного фрагмента мышиных антител, отвечающих за комплементарность антигену, на вариабельный фрагмент человека, помещали CDR между сответствующими каркасными участками, по результатам анализа баз данных и биоинформатического моделирования структурного сходства (аналогии) между антителами. Полученные гуманизированные антитела обладают специфичностью материнского мышиного антитела, но повышенной аффинностью, за счет более подходящего пространственного расположения CDR, обусловленного каркасными участками.
Для молекулярной графики использовали программы: Insight II; Accelrys, СА. Моделирование конформационной гомологии между донорным мышиным антителом и человеческим акцепторным антителом проводили с использованием WAM (http://antibody.bath.ac.uk), SWISS-MODEL (http://www.expasy.org), INSIGHT-HOMOLOGY (Accelrys), COMPOSER (Tripos, МО) и GCG Wisconsin Package. Последовательности вариабельных фрагментов мышиных антител были аннотированы и пронумерованы с использованием баз данных Kabat и Chothia.
H
L
H
L
Информация о структуре вариабельных фрагментов учитывается в нумерации, разработанной Chothia [Chothia С, Lesk AM. Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J Mol Biol. 1987 Aug 20; 196(4): 901-17], однако в данной нумерации не рассматриваются остатки аминокислот в вариабельных фрагментах антител. В соответствии с указанными выше данными для нумерации и аннотирования вариабельных фрагментов использовался модифицированный Kabat и Chothia алгоритм Abhinandan KR и Martin AC [Abhinandan KR and Martin AC. Analysis and Prediction of VH/VL Packing in Antibodies, Protein Engineering Design and Selection. 2010, Abhinandan KR, Martin AC. Analysis and improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibody variable domains. Mol Immunol. 2008 Aug; 45(14): 3832-9]. При нумерации при этом учитывались не только исправленные данные множественных выравниваний последовательностей антител по Kabat и данные о структуре CDR по Chothia с учетом структуры FR, но и данные о V/V углах складывания в донорных и акцепторных антителах. Для автоматического аннотирования использовались программы с интерактивным web-интерфейсом: SeqTest (AbCheck) http://www.bioinf.org.uk/abs/seqtest.html, Abnum http://www.bioinf.org.uk/abs/abnum/, ручная корректировка и проверка проводились с использованием локальной версии базы данных Kabat http://www.kabatdatabase.com/index.html и программы KabatMan http://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html, средств IMGT http://imgt.cines.fr/ и данных множественного выравнивания последовательностей вариабельных фрагментов антител с использованием MUSCULE http://www.ebi.ac.uk/Tools/muscle/index.html и пакета программ FASTA http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml, структуры которых представлены в PDB на 2012 год, а также разработанных авторами изобретения нескольких Perl скриптов для автоматизации анализа данных. V/V углы складывания были рассчитаны и предсказаны, исходя из алгоритма, предложенного Abhinandan [Abhinandan K.R., 2010]. Все необходимые расчеты, связанные с моделированием структуры белковых молекул, проводили с использованием Modeller и Swiss-Model.
Следующим шагом в гуманизации антитела был выбор акцепторных вариабельных фрагментов антител человека для переноса. Правильный выбор акцепторного антитела человека практически на 100% гарантирует успешную гуманизацию антител, с Kd, достаточной для высокопрочного связывания с антигеном. С использованием методов молекулярного моделирования и описанных выше подходов были построены структурные модели вариабельных фрагментов выявленных мышиных моноклональных антител против синдекана-1. С использованием полученных трехмерных моделей были определены наиболее гомологичные (особенно по ключевым позициям) последовательности акцепторных антител человека, при этом использовались только антитела со значением коэффициента «человечности» Н>1 (что потенциально может уменьшить НАНА ответ). На основании полученных моделей рассчитали аминокислотные последовательности вариабельных фрагментов тяжелых и легких (каппа) цепей антител.
1.5. Получение моноклональных антител к синдекану-1
Соединили а.п. константного и вычисленного вариабельного фрагмента тяжелой цепи в одну а.п. (SEQ ID NO: 5 - соответственно гибридоме 1). Соединили последовательности константного и вычисленного вариабельного фрагмента легкой каппа цепи в одну а.п. (SEQ ID NO: 7 - соответственно гибридоме 2).
Дополнительно были сконструированы химерные тяжелая цепь для полученной гибридомы 2 и легкая цепь - для гибридомы 1. Соединили а.п. мышиного вариабельного и человеческого константного фрагмента тяжелой цепи в одну а.п. (SEQ ID NO: 1 - соответственно гибридоме 2). Соединили а.п. мышиного вариабельного и человеческого константного фрагмента легкой каппа цепи в одну а.п. (SEQ ID NO: 3 - соответственно гибридоме 1).
Перевели полученные а.п. в нуклеотидные, дополнительно добавив фрагмент на N-конце, кодирующий сигнальную секреторную последовательность, отщепляющуюся при секреции из клеток продуцентов, и проведя кодонную оптимизацию для увеличения продукции данных антител в клетках млекопитающих (СНО) с помощью программы на сайте http://www.encorbio.com/protocols/Codon.htm.
В результате был получен окончательный вариант нуклеотидных последовательностей (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8), кодирующих цепи моноклональных антител к синдекану-1 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7), которые затем синтезировали с использованием химического синтеза.
Также получали модифицированные для увеличения активности антитела. Для этого в константный фрагмент тяжелой цепи вводили участки IgG3, который обладает самой высокой степенью активации системы комплемента из всех изотипов, а также высокой аффинностью по отношению к связыванию с Fc рецептором фагоцитирующих клеток, в структуру константного фрагмента IgG4. Также ввели аминокислотные замены в область С-конца константного фрагмента IgG4 для увеличения периода полужизни антитела.
Соединили последовательности вычисленных вариабельного и константного фрагмента тяжелой цепи в одну а.п. (SEQ ID NO: 9- соответственно гибридоме 1).
Такой вариант тяжелой цепи получили и на основе химерной тяжелой цепи, созданной на основе мышиной, полученной из гибридомы 2, соединив а.п. мышиного вариабельного и вычисленного человеческого константного фрагмента тяжелой цепи в одну а.п. (SEQ ID NO: 11).
Перевели полученные а.п. в нуклеотидные, дополнительно добавив фрагмент на N-конце, кодирующий сигнальную секреторную последовательность, отщепляющуюся при секреции из клеток продуцентов, и проведя кодонную оптимизацию для увеличения продукции данных антител в клетках млекопитающих (СНО) с помощью программы на сайте http://www.encorbio.com/protocols/Codon.htm.
В результате был получен окончательный вариант нуклеотидных последовательностей (SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12), кодирующих тяжелые цепи моноклональных антител к синдекану-1 с IgG4-IgG3 шифтом (SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11), которые затем синтезировали с использованием химического синтеза.
Синтезированные фрагменты клонировали в плазмидный вектор pUC57 для наработки, затем переклонировали в вектор pcDNA3.1+ для трансфекции клеток млекопитающих.
Далее создавали клетки-продуценты моноклональных антител к синдекану-1. Авторами настоящего изобретения было принято оригинальное решение создать продуценты антител, не только полученных на основе гибридом 1 и 2, но также созданных комбинацией рассчитанных тяжелых и легких цепей.
Проводили трансфекцию компетентных клеток млекопитающих (СНО) двумя созданными плазмидными ДНК, каждая несла, соответственно, кодонно оптимизированный для экспрессии в клетках млекопитающих полинуклеотид, кодирующий тяжелую, либо легкую цепь антитела, с секреторной последовательностью.
4
2
2
2
4
2
Трансфекцию клеток млекопитающих созданными плазмидами проводили методом кальций-фосфатного осаждения. Клетки млекопитающих (СНО) высевали в 12-луночные планшеты (Costar, США) с плотностью посева 5×10 кл/см. На следующий день для синхронизации клеточных делений культуральную среду заменяли. Через три часа к клеткам добавляли плазмидную ДНК, осажденную фосфатом кальция. Для приготовления осадка 250 мкл раствора, содержащего 50 мкг ДНК в 250 мМ CaCl, медленно смешивали с 250 мкл раствора (1,64% NaCl, 1,13% HEPES рН 7,12 и 0,04% NaHPO). После 24 часов инкубации при 37°С в атмосфере 5% СО среду заменяли на аналогичную, но содержащую 2 антибиотика 80 мкг/мл зеоцин и 2 мкг/мл бластицидин S для селекции клонов, содержащих обе трансформированные плазмиды и, следовательно, синтезирующих полноразмерные моноклональные антитела, селекцию проводили в течение 20 суток, в лунках, содержащих живые клетки, меняли среду (при этом предыдущую культуральную среду не выливали, а использовали для определения количества секретируемых антител методом ИФА), а еще через сутки клетки снимали с подложки и проводили анализ на экспрессию трансформированных генов. Анализ эффективности трансфекции проводили на проточном цитофлуориметре EPICS XL Beckman Coulter (Beckman Coulter, США).
Уровень моноклональных антител в культуральной среде полученных стабильных трансфектом линии СНО оценивали с использованием стандартного твердофазного ИФА.
7
7
7
7
В результате 7 клонирований были получены стабильные трансфектомы СНО, которые накапливали для криоконсервирования и наработки опытной партии антител. Продуктивность созданных трансфектом СНО, синтезирующих антитела к синдекану-1 на основе SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 7 (далее - Mab2), а также SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 3 (далее - Mab1) составила порядка 550 мкг/10 клеток/день. Продуктивность созданных трансфектом СНО, синтезирующих антитела к синдекану-1 на основе SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 3 (далее - Mab3), а также SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 7 (далее - Mab4) составила порядка 650 мкг/10 клеток/день, на основе SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 3 (далее - Mab7), а также SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 7 (далее - Mab6) - порядка 650 мкг/10 клеток/день. Продуктивность созданных трансфектом СНО, синтезирующих антитела к синдекану-1 на основе SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 7 (далее - Mab5) составила порядка 700 мкг/10 клеток/день.
Моноклональные антитела согласно изобретению возможно получать с использованием также других клеток млекопитающих, например, HEK293, COS.
1.6. Культивирование клеток-продуцентов моноклональных антител к синдекану-1
4
2
Культивирование клеток-продуцентов осуществляли с использованием биореактора BIOSTAT Bplus и автоклавированной среды IMDM с добавлением 45 г DFBS (0,5%) и 25,8 г (100 мМ) сульфата цинка семиводного (ZnSO×7НО) на 9 л среды. Задавали рабочий режим: температура 37°С, рН 6,9-7,2, концентрация кислорода 50% насыщения воздуха. После достижения заданного режима производили засев биореактора, для чего в асептичных условиях в него вводили посевной материал. Время культивирования составляло 3 суток.
По окончании культивирования культуральную жидкость фильтровали через стерильную капсулу «Sartopure» («Sartorius», Германия), с диаметром пор 1,2 мкм, со
скоростью 1 л/мин. Затем осветленную жидкость концентрировали на системе Viva Flow 200 («Sartorius», Германия) с использованием фильтра на 50 кДа. Концентрирование проводили до достижения общего объема - 200 мл.
1.7. Очистка полученных моноклональных антител к синдекану-1
Хроматографическую очистку проводили в два этапа, с использованием стерильных растворов. На первом этапе использовали систему BioLogic DuoFlow Pathfinder (Bio-Rad) с автоматическим коллектором фракций BioFracT и полупрепаративную хроматографическую колонку YMC TriArt, 250×4,6 мм, сорбент С18. Перед началом работы колонку уравновешивали с помощью 200 мл буфера (1 кг воды для инъекций и 1 г кислоты трифторуксусной) в ручном режиме через насос хроматографа на скорости 2 мл/мин.
Подготовленный материал в объеме 200 мл вносили в хроматограф через насос хроматографа на скорости 0,5 мл/мин. Элюцию производили буфером (2 кг ацетонитрила, 2 г кислоты трифторуксусной) со скоростью 0,5 мл в минуту. Собирали фракцию в максимуме поглощения при 260 нм. Объем фракции составил примерно 500 мл.
Второй этап очистки выполняли с использованием гель-хроматографической колонки BioSil SEC 125-5, 300×7,8 мм. Предварительно колонку уравновешивали 0,02 М PBS-буфером. Полученный материал вносили в хроматограф через насос хроматографа на скорости 0,5 мл/мин. Элюцию производили буфером (0,6 М раствор NaCl) с градиентом концентрации от 0,1 до 0,6 М. Собирали фракцию, имеющую поглощение при А280 нм не менее 3,4 оптических единиц. Фракцию собирали во флаконы. Объем получаемого раствора составил примерно 1 л с концентрацией антитела 2-4 мг на 1 мл.
Было проведено измерение Kd полученных антител методом ИФА по Скетчарду.
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
Для антитела, охарактеризованного а.п. SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 3 (Mabl), Кд=8,5*10. Для антитела, охарактеризованного а.п. SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 7 (Mab2), Кд=7,8*10. Для антитела, охарактеризованного а.п. SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 3 (Mab3), Кд=7,0*10, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 7 (Mab4) - 6,7*10. Для антитела, охарактеризованного а.п. SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 3 (Mab7), Кд=6,0*10, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 7 (Mab6) - 6,9*10. Для антитела, охарактеризованного а.п. SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 7 (Mab5), Кд=5,0*10.
Таким образом, созданные антитела обладают аффинностью, достаточной для эффективного связывания с антигеном.
Пример 2. Изучение противоопухолевого эффекта моноклональных антител к синдекану-1
Исследование противоопухолевой активности созданных антител проводили с использованием ксенографтных моделей опухолей человека на мышах линии BALB/c NUDE. В каждой опухолевой модели исследовали два-три типа полученных моноклональных антител к синдекану-1.
Мыши
Для исследования использовали бестимусных мышей линии BALB/c NUDE женского пола. Животных содержали на диете NIH 31 Modified and Irradiated Lab Diet, давали воду ad libitum. Животных содержали при 12-часовом световом цикле при 20-22°С и 40-60% влажности.
3
Объем опухоли рассчитывали по формуле w2*l/2, где w = ширина и l = длина опухоли, в мм. Вес опухоли оценивали при принятии, что 1 мг эквивалентен 1 мм объема опухоли.
Терпевтический агент и способ введения
Испытуемые антитела содержались в стоковом растворе с концентрацией 2,5 мг/мл раствора и хранились при 4°С в защищенном от света месте. Растворы дозировали по 0,5 мг/животное, в фиксированном объеме 0,2 мл/животное. Растворы хранили также при 4°С в недоступном для света месте.
Паклитаксел (Лот CP2N10007) был приобретен в виде сухого порошка (Fort Worth, Техас). Исходный раствор паклитаксела (30 мг/мл) - в 50% -ном этаноле: 50% Cremophor EL готовили и хранили при комнатной температуре в защищенном от света месте. При каждом дозировании аликвоту стокового раствора паклитаксела разбавляли 5% раствором декстрозы в воде (D5W) с получением растворе паклитаксела 3,0 мг/мл в носителе, состоящем из 5%-ного этанола: 5% Cremophor EL: 90% D5W. Таким образом, доза составила 30 мг/кг в объеме введения 10 мл/кг.
PBS ("носитель") был использован для введения в контрольной группе.
Носитель и антитела вводили внутрибрюшинно два раза в неделю в течение четырех недель. Паклитаксел вводили внутривенно через день до достижения в общей сложности пяти доз. Группе 1 вводили носитель, данная группа служила в качестве ориентира для приживления и прогрессии опухоли, а также контроля для анализа задержки опухолевого роста (TGD).
Оценка результатов исследования
10
Каждое животное было умерщвлено, когда опухоль достигала конечной точки объема. Время до конечной точки (ТТЕ) для каждой мыши было рассчитано по формуле (log (endpoint volume) - b)/m, где b - отрезок прямой, m представляет собой наклон линии, полученной линейной регрессией логарифмического преобразования набора данных по росту опухоли. Набор данных состоит из первого исследования, в котором превышен изучаемый конечный объем, и трех последовательных исследований, которые непосредственно предшествовали достижению объема конечной точки. Любое животное, в котором не удалось достичь конечной точки, было умерщвлено в конце исследования, и данному животному присвоено значение ТТЕ, равное ТТЕ в последний день исследования. В случаях, когда лог-преобразованный рассчитанный ТТЕ предшествовал дню до достижения конечной точки или превышал день достижения объема опухоли конечной точки, была применена линейная интерполяция, для приближения ТТЕ. Любому животному, о котором определили, что оно умерло от связанных с лечением (TR) причин, было присвоено значение, равное ТТЕ дня смерти. Любое животное, которое умерло от причин, не связанных с лечением, NTR, было исключено из анализа.
Результат лечения оценивали по задержке роста опухоли (TGD), который был определен как увеличение медианного ТТЕ у группы, подверженной лечению, по сравнению с контрольной группой, TGD=Τ-С, в днях, либо как процент от медианного ТТЕ в контрольной группе, % TGD=(T-C)*100/C, где Τ - медианное ТТЕ для группы лечения, С - медианное ТТЕ для контрольной группы.
Токсичность
Мышей часто осматривали для оценки здоровья и явных признаков каких-либо неблагоприятных побочных эффектов TR. Контролировали индивидуальную потерю массы тела по протоколу, и любое животное, вес которого превысил лимиты приемлемого снижения массы тела, было подвергнуто эвтаназии. Если средний вес тела у группы восстанавливался, дозирование возобновляли в этой группе, но в более низкой дозе или при менее частом графике введения. Приемлемая токсичность была определена как средняя потеря веса по группе BW меньше, чем на 20% в течение исследования и не более одной TR смерти среди десяти животных на лечении или 10%. Любой режим дозирования, приводящий к большей токсичности, рассматривался выше максимальной переносимой дозы (MTD). Смерть была классифицирована как TR, если была обусловлена побочными эффектами лечения, засвидетельствованными клиническими признаками и/или аутопсией, или также могла быть классифицирована как TR, если произошла из-за неизвестных причин во время периода дозирования или в течение 14 дней после последнего введения. Смерть была классифицирована как NTR, если были доказательства того, что смерть была связана с опухолевой моделью и не связана с лечением.
Статистический и графический анализ
Для статистических и графических анализов использовали Prism 6.05 (GraphPad) для ОС Windows. Выживаемость анализировали по методу Каплана-Мейера, на основе значений ТТЕ. Тесты логарифмический ранговый критерий (Mantel-Cox) и Gehan-Breslow-Wilcoxon определяли значение разницы между общим опытом выживаемости (кривые выживаемости) двух групп, на основе значений ТТЕ. Для исследования Каплан-Мейера и статистических тестов использовали одни и те же наборы данных и исключали каких-либо животных, которые были записаны как умершие NTR. Двусторонние статистические анализы не были скорректированы для множественных сравнений и были проведены при Ρ=0,05.
Поскольку статистические тесты оценивают достоверность и не обеспечивают оценку размера разницы между группами, все уровни значимости описаны либо как достоверные или не достоверные. Кривые роста опухолей были усечены после двух TR смертей, которые произошли в одной группе. Изменение средней массы тела в группе в течение иследования было графически обозначено как процентное изменение, ±SEM, с первого дня. Рост опухоли и кривые изменения BW были усечены после того, как половина мышей в группе выходила из исследования.
2.1. Исследование эффективности гуманизированных моноклональных антител к синдекану-1 (Mab4, Mab6) с использованием линии клеток А549
Возраст мышей составлял 11 недель на первый день эксперимента, вес - 18,4-25,6 г.
2
7
7
3
Ксенотрансплантаты были созданы с использованием клеток немелкоклеточной карциномы легкого человека (А549), культивируемых в среде F12 Хэма, модифицированной Kaighn, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 единиц/мл пенициллина G, 100 мкг/мл стрептомицина сульфата, 2 мМ глутамина, 1 мМ пирувата натрия, и 25 мкг/мл гентамицина. Клетки культивировали в колбах для культивирования клеток ткани в увлажненном инкубаторе при 37°С, в атмосфере 5% СО и 95% воздуха. Опухолевые клетки А549, используемые для имплантации, собирали в процессе роста в лог-фазе и ресуспендировали в 50% матриксе Матригель (BD Biosciences) в фосфатном буферном солевом растворе (PBS) при концентрации 5×10клеток/мл. Каждой мыши в опыте вводили подкожно в правый бок 1×10 клеток А549 (0,2 мл клеточной суспензии), и рост опухоли контролировали, когда средний размер подходил к целевому диапазону от 150 до 220 мм. Опухоли были измерены в двух измерениях с использованием инструмента, их объем был рассчитан.
3
3
Через двадцать четыре дня после имплантации опухолевых клеток, на 1 день исследования, животные были разделены на 4 группы (по 10 животных в группе), с индивидуальным объемом опухоли 126-221 мм, и средним объемом опухоли по группе 185-186 мм. Опухоли измеряли два раза в неделю в течение первых 45 дней исследования и дополнительно в день 54.
3
Точкой задержки роста опухоли считали объем 800 мм либо 54 день экперимента в зависимости от того, что наступит ранее.
Результаты исследования приведены на фиг. 1-3.
2.2. Исследование эффективности моноклональных антител к синдекану-1 (Mab2, Mab3) с использованием линии клеток Colo205
Возраст мышей составлял 9 недель на первый день эксперимента, вес - 17,8-23,8 г.
2
Ксенотрансплантаты были созданы с использованием клеток аденокарциономы ободочной кишки человека (Colo 205), культивируемых в среде RPMI 1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 10 мМ HEPES, 0,075% бикарбоната натрия, 100 единиц/мл пенициллина G, 100 мкг/мл сульфата стрептомицина и 25 мкг/мл гентамицина. Клетки культивировали в колбах для культивирования клеток ткани в увлажненном инкубаторе при 37°С, в атмосфере 5% СО и 95% воздуха.
6
6
3
Опухолевые клетки Colo 205, используемые для имплантации, собирали в процессе роста в лог-фазе и ресуспендировали в 50% матриксе Матригель (BD Biosciences) в фосфатном буферном солевом растворе (PBS) при концентрации 5×10 клеток/мл. Каждой мыши в опыте вводили подкожно в правый бок 1×10 клеток Colo 205 (0,2 мл клеточной суспензии), и рост опухоли контролировали, когда средний размер подходил к целевому диапазону от 100 до 150 мм. Опухоли были измерены в двух измерениях с использованием инструмента и был рассчитан объем опухоли.
3
3
Через десять дней после имплантации опухолевых клеток, на 1 день исследования, животные были разделены на 4 группы (по 10 животных в группе) с индивидуальным объемом опухоли 88-162 мм и средним объемом опухоли по группе 123-127 мм. Опухоли измеряли два раза в неделю в течение первых 60 дней исследования и дополнительно в дни 65 и 75.
3
Точкой задержки роста опухоли считали объем 1500 мм, либо 75 день эксперимента, в зависимости от того, что наступит ранее.
Результаты эксперимента приведены на Фиг. 4-6.
В группе паклитоксела выявлена связанная с лечением смерть на 11 день эксперимента.
2.3. Исследование эффективности гуманизированных моноклональных антител к синдекану-1 (Mab1, Mab5) с использованием линии клеток РС3
Возраст мышей составлял 11 недель на первый день эксперимента, вес - 19,1-26,4 г.
3
3
Ксенотрансплантаты были созданы с использованием клеток андроген-независимой опухолевой линии РСЗ, происходящей из опухоли предстательной железы человека с метастазами в кости, отображающей морфологию плохо дифференцированной аденокарциномы. Опухоли, используемые в настоящем исследовании, поддерживали серийным приживлением у самок голых мышей. Для инициации опухолевого роста фрагмент размером 1 мм вводили подкожно в правый бок каждого животного. Опухоли были измерены в двух измерениях с использованием инструмента, когда их объем достигал 100-150 мм.
3
3
Через двадцать шесть дней после имплантации опухолевых клеток, на 1 день исследования, животные были разделены на 4 группы (по 10 животных в группе) с индивидуальным объемом опухоли 63-196 мм и средним объемом опухоли по группе 119-120 мм. Опухоли измеряли два раза в неделю в течение первых 45 дней исследования и дополнительно на 53 день.
3
Точкой задержки роста опухоли считали объем 1500 мм либо 53 день эксперимента в зависимости от того, что наступит ранее.
Результаты эксперимента приведены на Фиг. 7-9.
Анализируемые антитела (Mab4 и Mab6, Mab2 и Mab3, Mab1 и Mab5) продемонстрировали статистически значимую эффективность, по сравнению с контрольной группой, по всем исследованным показателям, сравнимую с таковой паклитаксела, а также отсутствие побочных эффектов, что говорит также о безопасности данных агентов. Анализ Маb7 выявил схожие показатели с таковыми Mab6.