Тест-система "miR-M-SCREEN" для прогнозирования развития метастазов у больных колоректальным раком на основании уровня микро-РНК miR-26a и miR-143 в плазме крови
TEST SYSTEM “miR-M-SCREEN” FOR PREDICTING THE DEVELOPMENT OF METASTASES IN PATIENTS WITH COLORECTAL CANCER BASED ON THE LEVEL OF miR-26a AND miR-143 MICRO-RNA IN BLOOD PLASMA

Изобретение относится к молекулярной биологии, онкологии и биотехнологии, и может быть использовано для прогнозирования развития метастазов по уровню микро-РНК miR-26a и miR-143 в плазме крови у больных колоректальным раком.
Колоректальный рак (КРР) является гетерогенным многофакторным заболеванием, причем порядка 35% случаев обусловлено генетическими факторами, включая нестабильность генома, метилирование CpG-островков, мутации/полиморфизмы генов и изменения в экспрессии некодирующей РНК (см. M. Oines, L.M. Helsingen, M. Bretthauer, L. Emilsson. Epidemiology and risk factors of colorectal polyps. Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 2017, 31, pp. 419-424; Tang X.J., Wang W., Hann S.S. Interactions among lncRNAs, miRNAs and mRNA in colorectal cancer. Biochimie. 2019;163:58-72).
Преобразование нормальной слизистой оболочки толстой кишки в аденокарциному происходит в несколько этапов, занимающих десятилетия (см. Tang XJ, Wang W, Hann SS. Interactions among lncRNAs, miRNAs and mRNA in colorectal cancer. Biochimie. 2019;163:58-72). Хотя многочисленные методы лечения, такие как хирургия, химиотерапия, лучевая терапия, таргетная терапия и иммунотерапия, показали способность уменьшать частоту рецидивов и улучшать выживаемость пациентов, 5-летняя выживаемость больных КРР все еще остается низкой (см. R.L. Siegel, K.D. Miller, A. Jemal. Cancer statistics. CA A Cancer J. Clin. 2019, 69, pp. 7-34; W. Wang, R. Kandimalla, H. Huang, L. Zhu, Y. Li, F. Gao, A. Goel, X. Wang Molecular subtyping of colorectal cancer: recent progress, new challenges and emerging opportunities. Semin. Canc. Biol., 2019, 55, pp. 37-52). Приблизительно у 60% больных КРР диагностируются локальные или отдаленные метастазы (IV стадия заболевания (см. Siegel R., Desantis C., Jemal A. Colorectal cancer statistics, 2014. CA Cancer J. Clin. 2014;64:104-117. doi: 10.3322/caac.21220). Эти факты подчеркивают необходимость поиска новых биомаркеров, которые могут быть использованы для ранней диагностики и прогнозировании течения этого заболевания. Большое количество исследований выявило, что нкРНК играют важную роль во многих биологических процессах, и нарушение их регуляции может привести к различным заболеваниям, включая рак толстой кишки (см. M. Weng, D. Wu, C. Yang, H. Peng, G. Wang, T. Wang, X. Li Noncoding RNAs in the development, diagnosis, and prognosis of colorectal cancer Transl. Res., 2017, 181, pp. 108-120). Хорошо изученными нкРНК являются микро-РНК.
Микро-РНК - это короткие некодирующие РНК, которые регулируют экспрессию генов катализируя разрушение мРНК, либо ингибируя трансляцию мРНК в белок. Зрелая микро-РНК представляет собой одноцепочечную РНК размером порядка 22 нуклеотидов, получающуюся из первичного транскрипта. Микро-РНК являются эпигенетическими регуляторами, специфичны для определенной ткани и модулируют экспрессию генов путем взаимодействия с комплементарными нуклеотидными последовательностями мРНК-мишеней (см. Димитриади Т.А., Бурцев Д.В., Дженкова Е.А., Кутилин Д.С. МикроРНК как маркеры прогрессирования предраковых заболеваний в рак шейки матки // Современные проблемы науки и образования. 2020. № 1.;URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=29529 (дата обращения: 04.03.2020)). МикроРНК вносят значительный вклад в инициацию и развитие различных молекулярных событий, включая инициацию онкогенеза, прогрессирование и метастазирование опухолей, что делает микро-РНК потенциальными биомаркерами для оценки прогрессирования и прогноза КРР (см. Z.M. Abdelsattar, S.L. Wong, S.E. Regenbogen, D.M. Jomaa, K.M. Hardiman, S. Hendren. Colorectal cancer outcomes and treatment patterns in patients too young for average-risk screening. Cancer, 2016, 122, pp. 929-934).
Результаты множественного параллельного секвенирования 160 образцов КРР, проведенного нами ранее (см. Новикова И.А., Тимошкина Н.Н., Кутилин Д.С. Дифференциальная экспрессия микроРНК в опухолевых и нормальных тканях толстой кишки. Якутский медицинский журнал. 2020, №4. С. 74-82), а также последующая валидация этих результатов методом РТ-ПЦР в образцах плазмы крови и математический анализ (для получения надежной диагностической модели использовали LASSO-пенализованную логистическую регрессию, оптимизированную при помощи множественных перевыборочных (bootstrap) наборов данных), показали большой потенциал пар микро-РНК hsa-miR-26a-5p/hsa-miR-143-3p в разделении больных КРР на группы без метастазов и группу с отдаленным/ регионарным метастазированием. При помощи такого сочетания микро-РНК достигалась чувствительность 95% и специфичность 90% (AUC 0,98).
Анализ патентных источников показал наличие только 1 близкого по тематике к нашему изобретения - «Определение микроРНК в плазме для обнаружения ранних стадий колоректального рака» (Заявка: 2015108970, 20.10.2012, Патент RU 2 662 975 C1, опубликовано: 31.07.2018 Бюл. № 22). Данный патент описывает способ обнаружения колоректальных аденом поздней стадии у человека, включающий этапы: измерения общего профиля или уровня экспрессии одной или нескольких микроРНК, полученных из одного или нескольких биологических образцов субъекта, где по меньшей мере одна из этих микроРНК является miR18a; и сравнение общего профиля экспрессии одной или нескольких микроРНК из биологического образца от субъекта с предполагаемыми колоректальными аденомами поздней стадии с общим профилем экспрессии одной или нескольких микроРНК из биологического образца из нормального субъекта, где нормальным субъектом является здоровый человек, не страдающий от колоректальных аденом поздней стадии, и где сверхэкспрессия miR18a свидетельствует о наличии колоректальных аденом поздней стадии.
Описанный способ использует схожие с нашим принципы, но направлен на раннюю диагностику и включает иной перечень биомаркеров микро-РНК.
Анализ патентных источников (www.fips.ru) также показал отсутствие действующих патентов и заявок на патент тест-системы для прогнозирования развития метастазов у больных колоректальным раком на основании уровня микро-РНК miR-26a и miR-143 в плазме крови.
Изобретение «Тест-система «miR-M-SCREEN» для прогнозирования развития метастазов у больных колоректальным раком на основании уровня микро-РНК miR-26a и miR-143 в плазме крови» является новым, так как относительная экспрессия данных микро-РНК ранее не использовалась для заявленной в тест-системе цели, также как последовательности праймеров в составепредлагаемой тест-системы.
Целью
заявляемого изобретения является создание и внедрение новой, простой в исполнении, не дорогостоящей и точной тест-системы с уникальными высокоспецифичными последовательностями синтетических олигонуклеотидов для прогнозирования регионального и отдаленного метастазирования у пациентов с диагнозом рак толстой кишки.
miR-26a , miR-143 и
miR-7
≤
miR-26a
miR-143
miR-26a
miR-143
-3
-3
-3
-3
Сущность тест-системы заключается в том, что используют библиотеку комплементарной ДНК (кДНК), полученную на матрице тотальной РНК с помощью реакции обратной транскрипции с RT-праймерами совмещённой с реакцией полиаденилирования РНК, проводят амплификацию библиотеки кДНК с высокоспецифичными праймерами для микро-РНК , анализируют первичные данные и вычисляют коэффициенты относительной экспрессии микро-РНК miR-26a и miR-143 в плазме крови (K) (соотношение относительной экспрессии miR-26a или miR-143 относительно miR-7), сравнивают полученные значения К с интервалом прогностического коэффициента, и при значении К2,56*10 и К≤10,02*10 прогнозируют развитие метастазов (чувствительность 95%), а при значении К≥3,89*10 и К≥17,11*10 прогнозируют течение заболевания без отдаленных и регионарных метастазов (чувствительность 95%). При значениях коэффициента K между указанными интервалами считают полученный результат неопределенным.
Заявленный анализ основан на
К
=E
/E
К
=E
/E
miR
-26
a
miR
-26
a
miR
-7
miR-143
miR-143
miR-7
определении относительной экспрессии miR-26a или miR-143 в плазме крови больных КРР и последующем вычислении соотношения экспрессии этих микро-РНК относительно референса (miR-7): или.
Заявленная тест-система включает следующие приёмы:
miR-26a , miR-143 и
miR-7
получение кДНК на матрице тотальной РНК с помощью реакции обратной транскрипции с RT-праймерами совмещённой с реакцией полиаденилирования РНК, амплификацию библиотеки кДНК с высокоспецифичными праймерами для микро-РНК , анализ первичных данных и вычисление коэффициентов относительной экспрессии микро-РНК miR-26a и miR-143 в плазме крови, сравнение их значений со значениями коэффициентов экспрессии, характерными для групп пациентов с течением заболевания с метастазами и без.
тест-система
Заявленная, рассчитанная на 50 реакций, включает:
2
1.Смесь для ПЦР-РВ реакции (Mix_PCR) - 800 мкл, содержащую 1 мМ dNTPs, 6,6 мМ MgCl, 4-х кратный ПЦР-буфер с 4-кратной концентрацией красителя EvaGreen Dye.
2. ДНК-полимеразу Thermus aquaticus 5ед/мкл (Taq) - 50 мкл
3. Смесь прямого и обратного праймеров с концентрацией 1500 нМ каждого для hsa-miR-26a-5p (miR26a_MixPCR) - 430 мкл
4. Смесь прямого и обратного праймеров с концентрацией 1500 нМ каждого для hsa-miR-143-3p (miR143_MixPCR) - 430 мкл
5. Смесь прямого и обратного праймеров с концентрацией 1500 нМ каждого для hsa-miR-7-5p (miR7_MixPCR) - 860 мкл
6. Контроль реакционной смеси (стандартная кДНК с концентрацией 2 нг/мкл) - 900 мкл
7. Смесь для реакции обратной транскрипции совмещенной с полиаденилированием РНК (PolyA-RT_Mix) - 1500 мкл, содержащую 2-кратный поли(А) буфер, 20 единиц/мкл M-MuLV, 0,2 мМ dNTPs , 2 мМ АТФ, 1 единицу/мкл Poly(A)-полимеразы.
8. RT-праймер для hsa-miR-7-5p 4 мкM (RT-R) - 300 мкл
9. RT-праймер для hsa-miR-143-3p 4 мкM (RT-143) - 300 мкл
10. RT-праймер для hsa-miR-26a-5p 4 мкM (RT-26) - 300 мкл
11. NTC (контроль без матрицы, Milli-Q вода обработанная DEPC) - 1000 мкл.
2
12. Milli-Q-DEPC-HO (Milli-Q вода обработанная DEPC) - 2000 мкл
Из расчёта на одну ОТ-реакцию смесь должна содержать перечисленные выше компоненты в следующем соотношении:
10 мкл PolyA-RT_Mix + 5 мкл RT-праймера* + 5 мкл матрицы**
* - RT-праймер для miR-7, miR-143 или miR-26a
** РНК нормализованная до концентрации 200нг/мкл.
Из расчёта на одну ПЦР-РВ реакцию смесь должна содержать перечисленные выше компоненты в следующем соотношении:
6,1 мкл Mix_PCR + 0,2 мкл Taq +7,7 мкл miR26a_Mix (или miR143_MixPCR) + 6 мкл матрицы**
* - кДНК или РНК нормализованная до концентрации 2 нг/мкл, NTC или контроль реакционной смеси.
.
Для тест-системы были разработаны специфичные олигонуклеотидные прямые и обратные праймеры для hsa-miR-7-5p, hsa-miR-143-3p и hsa-miR-26a-5p Дизайн специфичных олигонуклеотидных праймеров (таблица 1) осуществлялся с использованием алгоритма Balcells I. (см. Balcells I, Cirera S, Busk PK. Specific and sensitive quantitative RT-PCR of miRNAs with DNA primers. BMC Biotechnol. 2011;11:70).
Таблица 1
Тест-система «miR-M-SCREEN» для прогнозирования развития метастазов у больных колоректальным раком на основании уровня микро-РНК miR-26a и miR-143 в плазме крови
Наименованиемикро-РНК
Последовательностьмикро-РНК
Последовательность
hsa-miR-7-5p
TGGAAGACTAGTGATTTTGTTGTT
F:CGCAGTGGAAGACTAGTGA (SEQ ID №1)R:GTCCAGT(15)AACAACA (SEQ ID №2)RT:CAGGTCCAGT(15)AA (SEQ ID №3)
hsa-miR-26a-5p
TTCAAGTAATCCAGGATAGGCT
F:GCAGTTCAAGTAATCCAGGATAG(SEQ ID №4)R:GGTCCAGT(15)AGC (SEQ ID №5)RT:CAGGTCCAGT(15)AG (SEQ ID №6)
hsa-miR-143-3p
TGAGATGAAGCACTGTAGCTC
F:CAGTGAGATGAAGCACTGTAG (SEQ ID №7)R:GGTCCAGT(15)GAG (SEQ ID №8)RT:CAGGTCCAGT(15)GA (SEQ ID №9)
Работу с тест-системой, содержащей разработанные специфичные олигонуклеотидные праймеры, осуществляют следующим образом:
2
- На первом этапе образцы крови объемом 10 мл получают путем венепункции в вакутейнеры, содержащие KЭДТА. После взятия пробирки перемешивают переворачиванием в течение 10 сек. и хранят до обработки не более 30 минут при 4°C. Для получения плазмы кровь центрифугируют при 1500 об.мин. в течение 20 минут. Бесклеточную фракцию переносят в новую пробирку и центрифугируют при 3000 об.мин. в течение 20 минут, супернатант отбирают и хранят при -80°C.
- На втором этапе препараты РНК плазмы крови получают при помощи протокола, описанного Chomczynski и Sacchi (см. Chomczynski P., Sacchi N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction : twenty-something years on // Nat. Protoc. 2006. Vol. 1, № 2. P. 581-585.). К 300 мкл плазмы последовательно прибавляют 400 мкл денатурирующего буфера (6М гуанидин-изотиоцианат, 15 мМ Трис-ацетат, рН 6,5, 1% Sarkosyl, 2% 2-меркаптоэтанол) и 70 мкл 2М ацетата натрия, pH 4.0, перемешивают. К полученной смеси добавляют 700 мкл насыщенного водой фенола и перемешивают. Для разделения водной и органической фаз прибавляют 200 мкл смеси хлороформ:изоамиловый спирт (49:1), перемешивают в течение 10 сек и инкубируют в течение 15 мин при 4°C. Затем полученную смесь центрифугируют при 10 000g в течение 15 мин при 2°С. Верхнюю водную фазу отбирают и переносят в новую пробирку. К водной фазе прибавляют равный объем этанола и наносят на колонку с фильтром из диоксида кремния (использовали колонки из набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия), РНК эффективно связывается с мембраной из диоксида кремния). Колонку дважды промывают буфером (4M гуанидин-изотиоцианат, 10 мМ трис-ацетат, 50% этанол, 1% 2-меркаптоэтанол) и центрифугируют. Затем колонку дважды промывают буфером (10 мМ трис-HCl, pH 7,5, 0,1 M NaCl, 75% этанол), центрифугируют при 400g, 1 мин. Для элюции РНК в колонку добавляют 120 мкл деионизированной воды с ингибитором РНКаз. Элюат собирают центрифугированием при 400g, 10 мин.
- На третьем этапе для выявления зрелых микро-РНК выделенную суммарную РНК подвергают реакции обратной транскрипции, которая проводится одновременно с полиаденилированием РНК, с использованием специфичных RT-праймеров (обратный праймер, который содержит олиго(dT)-последовательность и адаптерную последовательность на 5'-конце). Для обратной транскрипции используют реакционную смесь (объемом 20 мкл), содержащую 1-кратный поли(А) буфер, 10 единиц/мкл M-MuLV, 0,1 мМ dNTPs, 1 мМ АТФ, 1 мкM RT-праймера, 0,5 единиц/мкл Poly(A)-полимераза и 0,2 мкг тотальной РНК. Реакцию проводят в течение 30 мин. при 20°C, 15 мин. при 42°C, затем обратную транскриптазу инактивируютв течение 5 минут при 85°C.
2
- На четвертом этапе полученную комплементарную ДНК (кДНК) использовуют в реакциях RT-qPCR. Амплификацию проводят в 20 мкл PCR-смеси, содержащей 1x PCR-буфер, 0,25 mМ dNTPs, 2 мM MgCl, 1x EvaGreen, 1 ед.акт. Taq-DNA-полимеразы, по 500 нM прямого и обратного праймеров. Постановку RT-qPCR каждого образца проводят в трех повторах. Полученные смеси инкубируют в амплификаторе CFX 96 (Bio-Rad Laboratories, США) по следующей программе: 2 минуты 94°С, 50 циклов: денатурация при 95 °С 10 с., отжиг и элонгация - 64 °С 20 с. Результаты, соответствующие Ct>40 признаются отрицательными.
Реагенты для выделения РНК, определения концентрации РНК и кДНК, проведения электрофореза не входят в состав тест-системы.
hsa-miR-7-5p.
Для выполнения анализа необходимо провести одну реакцию обратной тракскрипции (ОТ-реакцию) совмещенной с полиаденилированием РНК и две амплификации (реакции ПЦР-РВ). В ОТ-реакции происходит наработка необходимой для ПЦР-РВ кДНК. В первой амплификации проверяется качество кДНК и чистота препарата тотальной РНК. Реакция проводится с использование смеси праймеров для Дальнейшее использование кДНК в тест-системе возможно, если соблюдаются следующие условия:
hsa-miR-7-5p
1) Ct для образца кДНК не превышает 28 цикла.
hsa-miR-7-5p
2) разница Ct между образцом кДНК и РНК должна быть не меньше 5 циклов.
hsa-miR-7-5p
3) Ct контроля реакционной смеси должно быть не выше 24 цикла
hsa-miR-7-5p
4) Ct для NTC должен отсутствовать.
Во второй амплификации определяется уровень сигналов, продуцируемых амплификатами hsa-miR-26a-5p/hsa-miR-143-3p и референсной микро-РНКв плазме крови.
Относительная экспрессия микро-РНК вычисляется следующим образом:
t
микро-РНК
- рассчитывают среднее геометрическое C по трём повторам для целевой и референсной ,
t
t
t
hsa-miR-7-5p
- далее рассчитывают величину ΔC =C(hsa-miR-26a-5p/hsa-miR-143-3p) - C()
K
1.9
-
Δ
Ct
- коэффициент относительной экспрессии () рассчитывают по формуле .
miR-26a
miR-143
miR-26a
miR-143
-3
-3
-3
-3
Далее сравнивают полученные значения К с интервалом прогностического коэффициента, и при значении К≤2,56*10 и К≤10,02*10 прогнозируют развитие метастазов (чувствительность 95%), а при значении К≥3,89*10 и К≥17,11*10 прогнозируют течение заболевания без отдаленных и регионарных метастазов (чувствительность 95%). При значениях коэффициента K между указанными интервалами считают полученный результат неопределенным.
Для доказательства прогностической ценности предлагаемой тест-системы приводится 2 выписки из историй болезни.
Больная С.,
1)  68 лет, госпитализирована в апреле 2020 г. в отделение абдоминальной онкологии №1 ФГБУ «НМИЦ онкологии» МЗ РФ с диагнозом рак толстой кишки, St III. Проведено УЗИ и СРКТ органов брюшной полости, обнаружены диффузные изменения паренхимы печени и опухоль толстой кишки.
Результаты молекулярного анализа образца плазмы крови (получена до лечения) К
=1,10*10
и К
=4,19*10
соответствуют прогностическим коэффициентам развития метастазов.
miR-26a
miR-143
-3
-3
Больной было выполнено хирургическое вмешательство согласно стандарту лечения. Послеоперационный гистологический анализ: T3aN0M0, G2 аденокарцинома, прорастанием всех слоев стенки кишки, с инвазией в серозную оболочку, линия резекции без признаков опухолевого роста. После консультации химиотерапевта показаны курсы АХТ. Состояние при выписке: удовлетворительное.
При повторном обращении через 4 месяца на СРКТ в левой доли печени подозрение на метастаз рака прямой кишки до 1 см, проведена биопсия печени. Ранее проведенный молекулярный анализ подтвержден результатами послеоперационного гистологического анализа - в печени метастаз аденокарциномы.
Больная Б.
2) , 63 года, госпитализирована в марте 2020 г. в отделение абдоминальной онкологии №1 ФГБУ «НМИЦ онкологии» МЗ РФ с диагнозом рак сигмовидной кишки, St II. Проведено УЗИ органов брюшной полости, обнаружены признаки кисты левой доли печени, диффузные изменения паренхимы печени. При колоноскопии рак сигмовидной кишки. На СРКТ киста левой доли печени до 1.5 см.
Результаты молекулярного анализа образца плазмы крови (получена до лечения) К
=5,47*10
и К
=21,09*10
соответствуют прогностическим коэффициентам течения заболевания без отдаленных и регионарных метастазов.
miR-26a
miR-143
-3
-3
Проведено хирургическое лечение - операция лапаротомия, резекция сигмовидной кишки с расширенной лимфаденэктомией. Молекулярный анализ подтвержден результатами послеоперационного гистологического анализа - T2N0M0. Гистологическое исследование: G2 аденокарцинома, метастазов нет. После консультации химиотерапевта курсы АХТ не показаны. Больная наблюдается по настоящее время без признаков рецидива и метастазов.
С помощью предлагаемой тест-системы было осуществлено прогнозирование течения заболевания у 50 пациентов с диагностированным КРР.
Технико-экономическая эффективность изобретения
. «Тест-система «miR-M-SCREEN» для прогнозирования развития метастазов у больных колоректальным раком на основании уровня микро-РНК miR-26a и miR-143 в плазме крови» позволяет с высокой точностью прогнозировать исход такого заболевания как КРР. Заявляемая тест-система, включает разработанные нами праймеры и является экономически оправданной для уточнения особенностей течения заболевания и дает возможность скорректировать тактику лечения, осуществляется в условиях стандартной лаборатории молекулярной биологии (ПЦР), без использования специального дорогостоящего оборудования; обладает высокой чувствительностью и специфичностью, относится к малоинвазивной диагностике, осуществление анализа возможно с плазмой крови и занимает не более 8 часов (с учетом подготовительных этапов), и не более 4 часов (при непосредственном использовании тест-системы).