СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ "СУХОЙ" ФОРМЫ ВОЗРАСТНОЙ МАКУЛЯРНОЙ ДЕГЕНЕРАЦИИ
METHOD OF TREATING "DRY" FORM OF AGE-RELATED MACULAR DEGENERATION

Изобретение относится к медицине, а точнее к офтальмологии, и может быть использовано для лечения «сухой» формы возрастной макулярной дегенерации.
Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) - одно из самых распространенных и малоизученных глазных заболеваний является основной причиной полной потери зрения у людей старше 60 лет в индустриально развитых странах. По данным Всемирной организации здравоохранения 25-30 миллионов человек в мире страдают ВМД. Ввиду постоянного старения общества ВМД является одной из серьезных медицинских и социальных проблем. Наиболее распространенной клинической формой ВМД является неэкссудативная или «сухая» форма, встречающаяся в 90% случаев и характеризующаяся медленным прогрессирующим снижением зрения (Т.Н.Киселева, Г.С.Полунин, Э.Г.Елисеева и др. Современные аспекты патогенеза и клиники возрастной макулярной дегенерации. // Офтальмология. - 2005. - Т.2. - №1).
Существующие методы лечения «сухой» формы возрастной макулярной дегенерации (Киселева Т.Н., Лагутина Ю.М., Кравчук Е.А. и др. Комплексное лечение возрастной макулярной дегенерации с применением препарата Фезам.//Офтальмология. - 2005. - N 2. - С.63-67) отличаются непродолжительностью достигаемого эффекта.
Одним из перспективных методов лечения дистрофической патологии сетчатки может явиться применение мезенхимальных стволовых клеток (МСК), однако такие методы еще недостаточно разработаны.
Стволовые клетки обладают рядом существенных достоинств: могут обеспечивать регенерацию поврежденных участков через продукцию различных факторов роста и ключевых метаболитов; способны разворачивать программы пролиферации и дифференцировки, восполняя тем самым недостаток активно работающих клеток; могут интегрироваться в патологически измененные участки сетчатки и образовывать клетки с ретинальным фенотипом. В офтальмологии терапевтический потенциал стволовых клеток изучался на животных с наследственной ретинальной патологией, близкой к пигментному ретиниту человека (Lund et al. Subretinal transplantation of genetically modified human cell lines attenuates loss of visual function in dystrophic rats // PNAS. - 2001. - V.98. - N.17. P.9942-9947; Rander et al. Light-driven retinal ganglion cell responses in blind rd mice after neuronal transplantation // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 2001. - V.42. - P.1057-1065; Woch et al., 2001; Sagdullaev et al. Retinal transplantation-induced recovery of retinotectal visual function in rodent model of retinitis pigmentosa // Invest. Ophthal. Vis. Sci - 2003. - V.44. - P.1686-1695).
Хотя мезенхимальные стволовые клетки взрослого организма обладают более ограниченным потенциалом дифференцировки, чем эмбриональные стволовые клетки, получаемые при культивировании клеток бластоцисты, их применение более безопасно. Кроме того, с точки зрения этики, они являются более приемлемым для клинического использования материалом.
Существенной проблемой клеточной терапии является направленная доставка стволовых клеток к патологическому очагу и удержание их в нем в течение времени, необходимого для достижения лечебного эффекта.
Задачей изобретения является повышение эффективности лечения возрастной макулярной дегенерации.
Техническим результатом является улучшение или стабилизация зрительных функций. Технический результат достигается за счет того, что:
1. Экстрасклеральное размещение магнитного имплантата в проекции макулярной зоны позволяет улучшить микроциркуляцию и трофику тканей.
2. Магнитоориентационное воздействие постоянного магнитного поля (Белый Ю.А., Терещенко А.В., Хорошилова-Маслова И.П. и др. Экспериментальное обоснование применения полимерных эластичных магнитных имплантатов в хирургическом лечении центральных хориоретинальных дистрофий.//Офтальмохирургия. - 2003. - №2. - С.10-13) имплантата способствует упорядочению и восстановлению нарушенных межклеточных взаимодействий.
3. Транспупиллярное лазерное облучение макулярной области сетчатки низкоинтенсивным лазерным излучением способствует усилению миркоциркуляции в облучаемой зоне.
4. Внутривенное (системное) введение аутологичных культивированных МСК костного мозга пациента сопровождается их избирательной адгезией в патологическом очаге, что способствует активации репаративных процессов за счет размножения и дифференцировки трансплантированных и резидентных стволовых клеток.
Возможность подобных процессов для эмбриональных стволовых клеток и для стволовых клеток взрослого организма показана в экспериментах на животных (Lamba D.A., Karl M.O., Ware СВ., Reh T.A. Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells // PNAS, 2006, v.103, n.34, pp.12769-12774. Meyer J.S., Katz M.L., Maruniak J.A., Kirk M.D. Embrionic stem cell-derived neural progenitors incorporate into degenerating retina and enhance survival of host photoreceptora // Stem Cells, 2006, v.24, n. 2, pp.274-283. Fiedlander M. Fibosis and diseases of the eye // J. Clin. Invest., 2007, v.117, n.3, pp.576- 586), хотя многие из механизмов реализации терапевтического эффекта изучены не до конца.
5. Используют МСК, меченные магнитными микрочастицами, в комбинации с экстрасклеральной имплантацией в проекции макулярной зоны магнитного материала с индукцией постоянного магнитного поля 3 мТл, с многополюсным реверсивным намагничиванием, что обеспечивает удержание МСК в патологическом очаге в течение времени, необходимого для достижения лечебного эффекта, за счет взаимодействия магнитных полей микрочастиц и магнитного материала экстрасклерального имплантата.
Способ осуществляется следующим образом.
На предварительном этапе, за 2 недели до внутривенного введения МСК, экстрасклерально имплантируют магнитный имплантат в проекции макулярной области.
Магнитный имплантат выполнен из эластичного биоустойчивого полимера, например, на основе полиорганосилоксана или силиконового каучука, покрытого гидрогелевым материалом, в форме плоской прямоугольной пластины длиной 20 мм, шириной 8 мм, толщиной 2 мм с одним закругленным концом. Внутри имплантата со стороны закругленного конца размещена плоская вставка, например, в форме эллипса или прямоугольника из магнитного материала, например, системы самарий-кобальт или ниодим-железо-бор с индукцией постоянного магнитного поля 3 мТл с многополюсным реверсивным намагничиванием. Площадь магнитной вставки составляет 1/3 от площади имплантата. Толщина магнитной вставки - 1 мм. Намагничивание магнитного материала вставки может быть произведено, например, как описано в патенте РФ №2187162.
Магнитный имплантат имплантируют экстрасклерально следующим образом. В верхненаружном квадранте в 4 мм от лимба выполняют разрез конъюнктивы длиной 6 мм концентрично лимбу и с помощью шпателя формируют туннель в субтеноновом пространстве по направлению к заднему полюсу глаза. В туннель вводят магнитный имплантат, при этом с помощью шпателя производят склерокомпрессию для локализации положения имплантата при постоянном контроле с помощью бинокулярного офтальмоскопа. Проксимальный конец имплантата фиксируют к склере в экваториальной области двумя узловыми швами. Конъюнктиву ушивают непрерывным швом. Удаляют магнитный имплантат через 3 недели после имплантации.
Через 2 недели после экстрасклеральной имплантации магнитного имплантата пациенту внутривенно вводят МСК собственного костного мозга, меченные магнитными микрочастицами. При этом за 2 часа до введения МСК выполняют облучение макулярной области сетчатки низкоинтенсивным лазерным излучением с длиной волны 632-633 нм, мощностью 10 мВт, диаметр пятна лазерного излучения - 4 мм, общее время облучения - 5 минут.
2
6
7
2
2
7
Для получения клеток костного мозга с целью последующего культивирования МСК, содержащихся в костномозговой популяции, пациентам под местной новокаиновой анестезией проводят пункцию грудины или подвздошной кости и извлекают в строго стерильных условиях примерно 1 мл костного мозга, который помещают в пробирки с раствором гепарина (100 ЕД/мл пунктата). После отстаивания эритроцитов в течение 1-2 часов при комнатой температуре супернатант отсасывают пастеровской пипеткой, выделенные клетки отмывают в среде 199, центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин, осадок ресуспендируют в ростовой среде. В качестве ростовой среды используют среду RPMI-1640, содержащую пенициллин (100 ЕД/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L-глютамин 2 мМ, 20% эмбриональную телячью сыворотку. Культивирование проводят в стерильных пластиковых флаконах Карреля с площадью дна 25 см, в которые вносят 5×10-10 клеток костного мозга в 8 мл ростовой среды. Флаконы продувают газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха, и помещают их в обычный термостат 37°С. Продувание флаконов такой газовой смесью проводят каждый раз, когда меняют среду или пересевают клетки в новые культуральные флаконы. При достижении сливного (конфлюентного) монослоя клетки пересевают с использованием 0,25% раствора трипсина в новые флаконы вначале с той же площадью дна (25 см), а впоследствии при нарастании клеточной массы - в большие культуральные флаконы с площадью дна 175 см. Такой метод позволяет к концу 5-6 недели от начала культивирования клеток добиться получения популяции аутологичных МСК пациента в количестве (1-2)×10 клеток, необходимых для трансплантации в организм донора исходного костного мозга.
7
Для внутривенного введения используют 1/3 часть полученных МСК ((0,33-0,66)×10 клеток), которые метят магнитными микрочастицами.
2
Метку МСК магнитными микрочастицами (⌀ 0,96 мкм) выполняют известным способом, например, как описано в: [Кониева А.А., Холоденко И.В., Шрагина О.А. и др. Функциональная оценка мезенхимальных стволовых клеток, меченных магнитными микрочастицами, in vitro и анализ их распределения в организме после трансплантации. // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2010. - №3. - С.147-152]. По достижении 80-90% конфлюентности к культуре МСК добавляют суспензию магнитных частиц. Клетки инкубируют с частицами 24 ч в СО-инкубаторе. После инкубации культуральную среду меняют. Эффективность мечения МСК магнитными частицами по данной технологии составляет порядка 90%.
Полученные МСК, меченные магнитными микрочастицами, взвешивают в 100 мл стерильного физиологического раствора с прибавлением гепарина в концентрации 10 ЕД/мл. Полученную клеточную суспензию используют для постановки капельницы, продолжительность введения клеток - 30-40 мин.
Изобретение поясняется следующими данными.
Под наблюдением находилось 3 пациента (3 глаза) с «сухой» формой ВМД в возрасте от 64 до 75 лет. Острота зрения до лечения у пациентов варьировала от 0,08 до 0,12.
Пациенты были пролечены по предложенному способу.
Через 12 месяцев после проведенного лечения у пациентов наблюдали следующие результаты терапии. Во всех случаях острота зрения повысилась (на 0,15, 0,2 и 0,32 соответственно), отмечено повышение фовеальной светочувствительности сетчатки по данным компьютерной периметрии, а также увеличение амплитуды а-волны и б-волны по данным макулярной электроретинограммы, которое свидетельствовало о повышении функциональной активности сетчатки. При исследовании гемодинамики у всех пациентов отмечалось увеличение средней скорости кровотока в глазничной артерии, центральной артерии сетчатки и в задних коротких цилиарных артериях.
Полученные результаты оставались стабильными в течение всего периода наблюдения. Сроки наблюдения соствляют от 12 до 36 месяцев.
Таким образом, предложенный способ обеспечивает улучшение или стабилизацию зрительных функций у пациентов с «сухой» формой возрастной макулярной дегенерации.