ЛЕЧЕНИЕ РАКОВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПРИ ПОМОЩИ КОМБИНАЦИИ ТАКСАНОВ И 13-ДЕЗОКСИАНТРАЦИКЛИНОВ
CANCER THERAPY BY COMBINATION OF TAXANES AND 13-DEOXYANTRACYCLINES

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к лечению раковых заболеваний путем введения таксана, в частности паклитаксела или доцетаксела, и 13-дезоксиантрациклина. Настоящее изобретение обеспечивает улучшенное противоопухолевое действие, не сопровождаемое возникновением кумулятивной необратимой кардиотоксичности. Настоящее изобретение относится также к композициям, содержащим таксан и 13-дезоксиантрациклин.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
2
2
Наиболее широко известными антрациклиновыми препаратами для лечения раковых заболеваний являются доксорубицин и даунорубицин, которые содержат 13-кетогруппу. Доксорубицин, предложенный в патенте США №3590028, имеет широкий спектр применений для лечения раковых заболеваний и применяется для лечения лейкозов, лимфом и солидных опухолей. Даунорубицин, предложенный в патенте США №3616242, используют для лечения острых лейкозов. Однако применение этих препаратов ограничено вследствие серьезного побочного действия в виде кардиотоксичности, в связи с чем общая доза препарата, которую можно вводить пациенту, не должна превышать 550 мг/М (Е.А.Lefrak et al., Cancer, 32:302, 1973) При этом даже при применении указанной рекомендованной максимальной общей кумулятивной дозы (от 430 до 650 мг/М) или дозы, близкой к указанной, у 60% пациентов возникают значительные и устойчивые нарушения деятельности сердца, а у 14% развивается застойная сердечная недостаточность. (A.Dresdale et al, Cancer, 52:51, 1983). Таким образом, хотя указанные препараты подходят для подавления роста злокачественных опухолей, пациент может умереть от застойной сердечной недостаточности, обусловленной серьезным побочным эффектом этих препаратов в виде кардиотоксичности.
Установлено также, что кардиотоксичность указанных антрациклинов обусловлена метаболическим восстановлением 13-кетогруппы до метаболита, представляющего собой 13-дигидроспирт (P.S.Mushlin et al, Fed. Proc, 45:809, 1986). В тест-системах, где не происходит заметного метаболического превращения доксорубицина в 13-дигидроспиртовой метаболит (доксорубицинол), значительных кардиотоксических эффектов не наблюдалось (P.S.Mushlin et al., Fed. Proc., 44:1274, 1985, R.D.Olson et al., Fed. Proc., 45:809, 1986). Напротив, 13-дигидрометаболиты, доксорубицинол и даунорубицинол, приводили к появлению кардиотоксичности в аналогичных тест-системах при относительно низких концентрациях (1-2 микрограмма/мл, R.D.Olson et al., Proceed. Am. Assoc. Cancer Res., 26:227, 1985, R.D.Olson et al., Proceed Am. Assoc. Cancer Res. 28:441, 1987).
Если доксорубицин присутствует в тест-системах даже в течение коротких периодов времени, происходит метаболическое превращение с образованием 13-дигидро-метаболита в количестве, достаточном для начала развития кардиотоксичности (L.Rossini et al., Arch. Toxicol. Suppl., 9:474, 1986, M. Del Tocca et al., Pharmacol. Res. Commun, 17:1073, 1985). Таким образом, были получены значимые доказательства того, что кардиотоксичность таких препаратов, как доксорубицин и даунорубицин, обусловлена сильным кардиотоксическим действием их 13-дигидрометаболитов (Р.Mushlin et al., FASEB Journal, 2-А1133, 1988, R. Boucek et al, J. Biol. Chem., 262:15851, 1987, и R.Olson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85:3585, 1988, Forrest GL, et al., Cancer Res 60:5158, 2000).
Известно, что доксорубицин в сочетании с таксанами, в частности, с паклитакселом, обеспечивает усиленный противораковый эффект при лечении рака молочной железы по сравнению с действием каждого из этих препаратов в отдельности. Показатель противораковой эффективности применяемого отдельно доксорубицина при лечении рака молочной железы составляет от 35 до 50%. В случае применяемого в отдельности паклитаксела указанная эффективность составляет от 32 до 62%. Однако, при применении этих двух препаратов в комбинации может обеспечиваться эффективность от 83 до 94% (Gianni L. et al., J Clin Oncol. 13:2688, 1995. Dombernowsk, P et al., Seminars in Oncology 23 23, 1996). Тем не менее, применение комбинации паклитаксела и доксорубицина может приводить к возникновению застойной сердечной недостаточности у 18-20% пациентов (Gianni L. et al., J Clin Oncol. 132688, 1995, и Dombernowsk, P et al., Seminars in Oncology 23:23, 1996). Паклитаксел усиливает кардиотоксичность доксорубицина, что ограничивает или исключает применение антрациклинов в комбинации с таксанами. Частоту возникновения застойной сердечной недостаточности можно ограничить, снижая дозу доксорубицина (Giordano SH et al., Clin Cancer Res 8:3360, 2002), однако при этом может также снижаться и эффективность указанной комбинации (Sparano JA et al., J Cin Oncoi 17: 3828, 1999, Valero V. et al., Semi Oncol 28:15. 2001). Кроме того, даже низкие дозы доксорубицина в комбинации с паклитакселом приводят к возникновению кардиотоксичности, что подтверждается снижением фракции выброса левого желудочка (Sparano JA et al., J Cin Oncol 17: 3828, 1999).
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении предложены пути решения проблем, связанных с применением способов, известных из уровня техники, а также комбинированный способ лечения раковых заболеваний, включающий применение некоторых антрациклинов, которые при применении в комбинации с таксанами не приводят к возникновению кардиотоксичности или по меньшей мере вызывают значительно меньшую кардиотоксичность, что позволяет избежать неприемлемого риска развития застойной сердечной недостаточности. Это, в свою очередь, обеспечивает значительно более высокую эффективность лечения раковых заболеваний, включая рак молочной железы, по сравнению с существующими способами лечения.
Настоящее изобретение относится к способу лечения рака, включающему введение млекопитающему, в том числе человеку, нуждающемуся в соответствующем лечении, терапевтически эффективного количества 13-дезоксиантрациклина следующей формулы:
где
1
2
3
каждый из R R и R в отдельности представляет собой Н или ОН,
4
R представляет собой Н, ОН, алкил или O-алкил,
5
R представляет собой О или NH, и
6
R представляет собой остаток сахаров;
фармацевтически приемлемых солей или пролекарств указанного соединения и их смесей,
и терапевтически эффективного количества таксана.
Способ согласно настоящему изобретению можно реализовать путем введения 13-дезоксиантрациклина и таксана одновременно, раздельно в любом порядке, последовательно в любом порядке или непрерывно один за другим в любом порядке для обеспечения противоракового действия.
Другой аспект настоящего изобретения относится к композиции, обеспечивающей противораковый, противоопухолевый и/или антибластомный эффект, подходящей для лечения раковых заболеваний. Композиции согласно настоящему изобретению содержат соединение 13-дезоксиантрациклина формулы X:
где
1
2
3
каждый из R R и R в отдельности представляет собой Н или ОН,
4
R представляет собой Н, ОН, алкил или O-алкил,
5
R представляет собой О или NH, и
6
R представляет собой остаток сахаров,
фармацевтически приемлемые соли указанного соединения и пролекарства указанного соединения,
и соединение таксана, в частности паклитаксел или доцетаксел.
Другие задачи и достоинства настоящего изобретения станут очевидными для специалистов в данной области техники из следующего подробного описания, где с целью иллюстрации приведены только предпочтительные варианты реализации настоящего изобретения. Следует понимать, что настоящее изобретение включает и другие варианты реализации, при этом различные возможные модификации также находятся в рамках настоящего изобретения. Соответственно, настоящее описание следует рассматривать в качестве иллюстративного, но не как ограничительного.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигуры 1 и 2 иллюстрируют зависимость доза - ответ в отношении подавления роста клеток MCF-7 для паклитаксела, взятого в отдельности, и в присутствии концентраций IC30 доксорубицина, даунорубицина или соединений 13-дезоксиантрациклина согласно настоящему изобретению.
Фигуры 3 и 4 иллюстрируют зависимость доза - ответ в отношении подавления роста клеток мышиного лейкоза Р388 для паклитаксела, взятого в отдельности, и в присутствии концентраций IC10 доксорубицина, даунорубицина или соединений 13-дезоксиантрациклина согласно настоящему изобретению.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ РЕАЛИЗАЦИИ
Далее приведено подробное описание некоторых вариантов реализации настоящего изобретения. Однако следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретными композициями и комбинациями соединений, указанными в прилагаемых примерах и экспериментальной части, но включает и другие возможные варианты реализации и может быть реализовано различными способами.
Соединения 13-дезоксиантрациклина, используемые согласно настоящему изобретению, отвечают формуле X:
где
1
2
3
каждый из R R и R в отдельности представляет собой Н или ОН,
4
R представляет собой Н, ОН, алкил или O-алкил,
5
R представляет собой О или NH, и
6
R представляет собой остаток сахаров,
а также включают фармацевтически приемлемые соли и пролекарства указанных соединений.
Наиболее типичными остатками сахаров являются даунозамин, эпидаунозамин или сахар на основе рамнозы. Наиболее типичными 13-дезокси-соединениями являются 13-дезоксидоксорубицин, 13-дезоксидаунорубицин, 13-дезоксикарминомицин, 13-дезоксиэпирубицин, 13-дезоксиидарубицин, 13-дезоксианнамицин и их 5-иминоаналоги.
Комбинированная терапия согласно настоящему изобретению включает также применение таксана. Наиболее типичными таксанами являются паклитаксел и доцетаксел и их фармацевтически приемлемые соли и пролекарства.
2
2
2
2
2
Соединения согласно настоящему изобретению могут образовывать пролекарства по гидроксильной или аминной функциональным группам с помощью алкокси, аминокислотных и других групп в качестве фрагментов, образующих пролекарства. Так, например, гидроксиметил в положении 4 может образовывать моно-, ди- или трифосфаты, которые, в свою очередь, могут образовывать пролекарства. Гидроксильные и гидроксиметильные группы можно превращать в -ОСНР(O)(ОН) и пролекарства на основе фосфонатов. Атом кислорода в составе гидроксиметила может быть превращен в СН, а затем в CHP(O)(OH) и в пролекарства.
Пролекарственные формы соединений с различными азотсодержащими функциональными группами (амино, гидроксиамино, амидной и т.п.) могут включать следующие типы производных, в которых каждая из групп R может индивидуально представлять собой водород, замещенную или незамещенную алкильную, арильную, алкенильную, алкинильную, гетероциклильную, алкиларильную, аралкильную, аралкенильную, аралкинильную, циклоалкильную или циклоалкенильную группы, как определено выше:
(а) карбоксамиды, -NHC(O)R,
(б) карбаматы, -NHC(O)OR,
(в) (ацилокси)алкилкарбаматы, NHC(O)OROC(O)R,
2
(г) основания Шиффа, -N=CR,
2
2
(д) основания Манниха (из карбоксимидных соединений), RCONHCHNR.
Получение таких пролекарственных производных обсуждается в различных литературных источниках (например, Alexander et at. J. Med. Chem 1988, 31, 318, Aligas-Martin et al., PCT WO pp/41531, p.30). При получении указанных производных азотсодержащая функциональная группа, подвергаемая превращению, представляет собой один или несколько атомов азота в составе соединения согласно изобретению.
2
Пролекарственные формы соединений с карбоксильной группой согласно настоящему изобретению включают сложные эфиры (-COR), где группа R соответствует любому спирту, способному высвобождаться в организме в результате процессов ферментации или гидролиза с обеспечением фармацевтически приемлемых содержаний. Другое пролекарство, которое получают из соединения согласно изобретению, находящегося в форме карбоновой кислоты, может представлять собой четвертичную соль вида:
структура которой описана Bodor et al. J. Med. Chem. 1980, 23, 469.
Фармацевтически приемлемые соли соединений согласно настоящему изобретению включают соли фармацевтически приемлемых неорганических или органических кислот. Примеры подходящих кислот включают соляную, бромистоводородную, серную, азотную, хлорную, фумаровую, малеиновую, фосфорную, гликолевую, молочную, салициловую, янтарную, толуол-п-сульфоновую, винную, уксусную, лимонную, метансульфоновую, муравьиную, бензойную, малоновую, нафталин-2-сульфоновую и бензолсульфоновую кислоты. Соли, полученные из соответствующих оснований, включают соли щелочных металлов, в частности, натриевые и аммониевые.
Недавно было установлено, что 13-дезоксиформы доксорубицина, даунорубицина или других аналогичных антрациклинов не подвергаются метаболическому превращению в кардиотоксические 13-дигидро-формы и, таким образом, не вызывают кумулятивной необратимой кардиотоксичности; см., в частности, WO 99/08687, патенты США 5948896 и 5942605 и PCT/US99/04704, содержание которых включено в данное описание посредством ссылки. До настоящего времени не было известно, обладают ли такие антрациклиновые противораковые агенты усиленным или даже синергическим противораковым эффектом в комбинации с таксанами.
При этом IC50 паклитаксела, взятого в отдельности, для подавления роста клеток MCF-7 опухоли молочной железы человека составляет 221 нМ. В присутствии небольших ингибирующих количеств 13-дезоксиантрациклинов согласно настоящему изобретению IC50 паклитаксела уменьшается до 0.55-11 нМ. Паклитаксел, взятый в отдельности, не оказывает ингибирующего действия на рост клеток Р388 мышиного лейкоза, однако в присутствии небольших ингибирующих количеств 13-дезоксиантрациклинов IC50 паклитаксела составляет от 13 до 20 нМ. В случае нераковых клеток Н9с2 крыс небольшие ингибирующие рост количества паклитаксела (IC10) обеспечивают снижение IC50 13-дезоксидоксорубицина с 700 нМ до 400 нМ, снижение IC50 13-дезокси-5-иминодоксорубицина с 1500 нМ до 210 нМ, однако, не приводит к снижению IC50 доксорубицина, которая остается равной 210 нМ. 13-дезоксиантрациклины согласно настоящему изобретению в комбинации с таксанами обладают улучшенным чрезвычайно сильным противораковым, противоопухолевым и/или антибластомным эффектом.
Настоящее изобретение обеспечивает повышение противораковой, противоопухолевой и/или антибластомной эффективности таксанов за счет применения низких доз 13-дезоксиантрациклинов согласно настоящему изобретению. Кроме того, композиции согласно настоящему изобретению, содержащие таксан и 13-дезоксиантрациклин, не являются кардиотоксичными или обладают значительно сниженной кардиотоксичностью. Согласно настоящему изобретению применение комбинации таксана и 13-дезоксиантрациклина обеспечивает эффективное лечение при уменьшенных дозах по сравнению с теми, которые требуются в случае применения каждого из указанных лекарственных препаратов в отдельности.
Кроме того, применение таксана в сочетании с 13-дезоксиантрациклином обеспечивает большую безопасность лечения и меньшую токсичность применяемых препаратов по сравнению с применением каждого из указанных препаратов в отдельности. Важно отметить, что 13-дезоксиантрациклин и таксан можно применять одновременно, раздельно или последовательно.
Кроме того, способ лечения согласно настоящему изобретению с применением комбинации 13-дезоксиантрациклинов и таксанов эффективен в отношении раковых заболеваний, опухолей и/или новообразований, что позволяет применять его в ходе всех типов терапии, направленной на лечение рака, неоплазм или опухолей, включая лейкоз, меланому, опухоли печени, молочной железы, яичников, простаты, желудка, поджелудочной железы, легкого, почки, толстой кишки и центральной нервной системы. Настоящее изобретение обеспечивает способ подавления роста раковых опухолей, опухолей и/или неоплазм у млекопитающих, включая человека.
Типичная композиция, комбинация, смесь или препарат на основе составляющих согласно настоящему изобретению представляет собой соединение формулы Х в сочетании с паклитакселом или доцетакселом. Более типичная композиция, комбинация, смесь или препарат представляет собой 13-дезоксиантрациклин, который выбирают из группы, включающей 13-дезоксидоксорубицин, 13-дезоксидаунорубицин, 13-дезоксиэпирубицин, 13-дезоксиидарубицин, 13-дезоксианнамицин, 13-дезоксикарминомицин, 13-дезоксиамрубицин и 5-иминоаналоги указанных соединений, в сочетании с паклитакселом или доцетакселом.
Компоненты указанной композиции, комбинации, смеси или препарата можно вводить пациенту одновременно, раздельно, последовательно или непрерывно один за другим. Указанные компоненты можно вводить пациенту любым способом, приемлемым с медицинской точки зрения, в том числе перорально, парентерально, топически или путем имплантации. Пероральный способ включает введение компонентов композиций, комбинаций, смесей или препаратов в форме таблеток, капсул, лепешек, суспензий, растворов, эмульсий, порошков, сиропов и т.п. Предпочтительным является парентеральный способ введения.
Фактический способ и порядок введения компонентов может изменяться в зависимости от конкретного применяемого фармацевтического состава на основе 13-дезоксиантрациклина формулы X, конкретного применяемого фармацевтического состава на основе таксана, конкретного ракового заболевания, подвергаемого лечению, степени тяжести заболевания, подвергаемого лечению, и конкретного пациента, подвергаемого лечению. Диапазон дозировок вводимых компонентов может изменяться в зависимости от возраста, состояния, пола пациента и стадии заболевания и могут быть определены специалистом в данной области техники.
Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению содержит 13-дезоксиантрациклин формулы X, смешанный с таксаном в фармацевтически приемлемом носителе или наполнителе. Предложенные фармацевтические композиции подходят для противораковой терапии.
Фармацевтически приемлемые носители или наполнители хорошо известны специалистам в области получения фармацевтических композиций, комбинаций, смесей и препаратов на основе соединений. Фармацевтически приемлемый носитель представляет собой один или несколько совместимых твердых или жидких наполнителей, разбавителей или инкапсулирующих веществ, которые подходят для введения млекопитающим, включая человека. Фармацевтические композиции, комбинации, смеси и препараты, подходящие для парентерального введения, получают в стерильной форме, которая может представлять собой стерильный раствор или суспензию в приемлемом разбавителе или растворителе.
Содержание активного ингредиента в фармацевтической композиции может изменяться в широких пределах в зависимости от многих факторов, в частности, от способа введения и носителя. Согласно настоящему изобретению фармацевтическая композиция может содержать примерно от 0.1 до 1000 мг 13-дезоксиантрациклинов формулы Х и примерно от 0.1 до 1000 мг таксана.
2
2
2
2
2
2
2
2
Согласно способу, предложенному в настоящем изобретении, 13-дезоксиантрациклин формулы Х вводят пациенту, который в этом нуждается, в количестве от примерно 0.1 мг/м площади поверхности тела до примерно 1000 мг/м площади поверхности тела, более типично - от примерно 10 мг/м площади поверхности тела до примерно 500 мг/м площади поверхности тела, и более типично - парентеральным способом. Согласно настоящему изобретению таксан вводят пациенту, который в этом нуждается, в количестве примерно от 0.1 мг/мдо примерно 1000 мг/м, более типично - примерно от 10 мг/м до примерно 500 мг/м, и более типично - парентеральным способом. 13-дезоксиантрациклин и таксан можно вводить совместно в составе единой композиции, смеси или препарата или раздельно в любом порядке, последовательно в любом порядке или непрерывно один за другим в любом порядке. В случае, если указанные соединения вводят не одновременно, то второе из соединений обычно вводят в течение 72 часов после введения первого соединения.
Противораковое терапевтическое действие таксана существенно усиливается за счет 13-дезоксиантрациклина формулы Х без повышения токсичности, в частности, вследствие синергизма между таксаном и 13-дезоксиантрациклином. Дозы таксана и 13-дезоксиантрациклина можно вводить с требуемой частотой. Фактический способ и порядок введения изменяются в зависимости от конкретной рецептуры, композиции, комбинации, смеси или препарата, конкретного ракового заболевания и конкретного пациента, подвергаемого лечению.
Усиленное действие комбинации 13-дезоксиантрациклина с таксаном согласно настоящему изобретению показано на примерах следующих испытаний, приведенных для иллюстрации настоящего изобретения и не являющихся ограничивающими.
Противораковое действие 13-дезоксиантрациклинов
Противораковую активность доксорубицина (соединение I), 13-дезоксидоксорубицина (соединение II) и 5-имино-13-дезоксидоксорубицина (соединение III) исследовали in vivo на модели мышиного лейкоза, используя мышей линии CD2F1, которым путем инъекции вводили клетки Р388 (полученные от мышей лейкозные раковые клетки). Группам мышей CD2F1 интраперитонеально (intraperitoneally, ip) вводили 1 миллион клеток Р388. В каждой группе было по 10 мышей. Первой группе вводили доксорубицин в количестве 0.8 мг/кг ip последовательно в течение 9 дней с 1 по 9 день опыта. 13-дезоксидоксорубицин, 1.6 мг/кг ip, и 5-имино-13-дезоксидоксорубицин, 3 2 мг/кг ip, вводили в таком же режиме, что и доксорубицин. Контрольной группе вводили носитель. Для каждой группы рассчитывали среднее время выживания. Активность соединения выражали как величину длительного выживания (prolonged survival) (время среднего выживания опытной группы, деленное на время среднего выживания контрольной группы, умноженное на 100, Т/С, %). Результаты представлены в таблице 1. Доксорубицин оказывает противоопухолевое действие, что подтверждается значительным 147%-ным увеличением среднего времени выживания. 13-дезоксидоксорубицин и 5-имино-13-дезоксидоксорубицин также обеспечивают значительное увеличение среднего времени выживания, незначительно отличающееся от увеличения, обеспечиваемого доксорубицином. Результаты данных исследований подтверждают, что 13-дезоксиантрациклины обладают противораковым действием, аналогичным действию доксорубицина, хотя и при других дозах
ТАБЛИЦА 1
Противораковое действие доксорубицина и 13-дезоксиантрациклинов на примере мышей с мышиным лейкозом Р388 (Т/С = среднее время выживания опытной группы мышей, деленное на среднее время выживания контрольной группы мышей; Х100, n=10)
Группа
Доза, мг/кг/день
Среднее время выживания, дни
Т/С, %
Контрольная
0
19
100
Доксорубицин (I)
0.8
28
147*
Соединение II
1.6
27
142*
Соединение III
3.2
27
142*
*р<0.05 относительно контрольной группы
Определение кардиотоксичности 13-дезоксиантрациклинов
Двадцать четыре новозеландских белых кролика весом 3.0 кг одной возрастной категории случайным образом разделили на четыре группы (N=6 кроликов/группу) Животным в группах постоянно вводили доксорубицин, 13-дезоксидоксорубицин (II), 5-имино-13-дезоксидоксорубицин (III) или носитель (0.9% NaCl). Дозированные количества лекарственного препарата или носителя вводили внутривенно в ушную вену два раза в неделю. Пробы сыворотки и крови брали еженедельно. Кроме того, еженедельно или 1 раз в две недели снимали эхокардиограмму в М-режиме для определения фракции укорочения левого желудочка (left ventricular fractional shortening, LVFS) для оценки сердечной функции. Ежедневно измеряли потребление пищи и один раз в неделю измеряли вес тела. Кролики контрольной группы получали пищу в таком же количестве, что и кролики, которым вводили доксорубицин (одинаковое кормление). После умерщвления кроликов получали образцы верхушки и свободной стенки левого желудочка, которые хранили в 10% буферном растворе на основе формалина до проведения гистологического анализа и анализа методом оптической микроскопии. Кроме того, получали образцы ткани левого желудочка, чтобы оценить содержание антрациклинов и метаболитов в сердце. Кроликов умерщвляли при появлении проявлений кардиотоксичности (LVFS<30% или уменьшении LVFS на 10% единиц, т.е. с 42% до 32% LVFS), проявлений токсичности, представляющей собой угрозу для жизни или приводящей к истощению (т.е. тяжелой миелосупрессии или мукозите) или через 13 недель после начала опыта.
Оптимальные противоопухолевые дозы 13-дезоксидоксорубицина равны примерно удвоенной дозе доксорубицина, а 5-имино-13-дезоксидоксорубицина - примерно семикратной оптимальной дозе доксорубицина. Таким образом, дозы 13-дезоксидоксорубицина и 6-имино-13-дезоксидоксорубицина равны удвоенной (для 13-дезоксидоксорубицина) и семикратной (для 5-имино-13-дезоксидоксорубицина) кумулятивной кардиотоксической дозе доксорубицина (17.5 мг/кг). Доксорубицин вводили по 1.25 мг/кг два раза в неделю в течение 7 недель (кумулятивная доза 17.5 мг/кг), а 13-дезоксидоксорубицин вводили по 2 мг/кг два раза в неделю в течение 10 недель (кумулятивная доза 40 мг/кг), а 5-имино-13-деоксидоксорубицин вводили по 5 мг/кг два раза в неделю в течение 12 недель (кумулятивная доза 120 мг/кг).
После умерщвления животных удаляли сердце и брали пробы двух типов ткани сердца - верхушки желудочка и свободной стенки левого желудочка, которые хранили в 10% формалине. Образцы каждой ткани обрабатывали тремя различными красителями: гематоксилином-эозином (Н&Е), толуидиновым синим и трихромом. Затем проводили балльную оценку тканей (вслепую), используя модификацию шкалы Биллингэма (Billmgham). Шкала баллов составляла от 0 до 4, при этом 0=повреждению клеток или ткани <10%, 1 = повреждению 10%-19% клеток или ткани, 2 = повреждению 20%-29% клеток или ткани, 3 = повреждению 30%-39% клеток или ткани и 4 = повреждению 40% или более клеток или ткани. Верхушку желудочка и свободную стенку левого желудочка анализировали отдельно. Для каждой ткани оценивали в баллах мононуклеарную инфильтрацию, фиброз и цитоплазматическую вакуолизацию. Таким образом, для каждого кролика оценивали шесть показателей: три для верхушки желудочка (мононуклеарная инфильтрация, фиброз и цитоплазматическая вакуолизация) и три для свободной стенки левого желудочка (мононуклеарная инфильтрация, фиброз и цитоплазматическая вакуолизация). Каждый показатель получали с применением всех трех красителей. Шесть показателей для каждого кролика усредняли, получая единый общий показатель для каждого кролика, а затем полученные показатели усредняли для каждой опытной группы.
После умерщвления животных извлекали также левое предсердие, делили его пополам и исследовали обе половины для оценки сердечной функции in vitro на бане для обработки срезов тканей (tissue bath), где постнагрузка и преднагрузка оставались постоянными на протяжении всего исследования. Сократительную способность сердца измеряли в виде максимальной скорости развития усилия (dF/dt) в ответ на сокращения, индуцированные электрической стимуляцией через точечные электроды, расположенные в основании каждого препарата мышечной ткани.
Результаты этих исследований представлены в таблице 2. Доксорубицин вызывает статистически значимое уменьшение фракции укорочения левого желудочка (fractional shortening, FS%) по сравнению с контрольной группой, которой вводили носитель, и двумя другими опытными группами, подвергаемыми лечению. Соединения II и III не вызывали изменения фракции укорочения левого желудочка. Все три лекарственных препарата в одинаковой степени обеспечивали уменьшение гематокрита по сравнению с контрольной группой. Согласно результатам исследований, проводимых in vitro на умерщвленных животных, доксорубицин обеспечивал значительное снижение сократительной способности миокарда изолированного предсердия (dF/dt) по сравнению с контрольной группой и двумя другими опытными группами. Соединения II и III не вызывали изменения сократительной способности миокарда. Аналогичным образом, доксорубицин вызывал значительное увеличение гистопатологических нарушений по сравнению с контрольной группой и двумя другими опытными группами, в то время как соединения II и III не вызывали гистопатологических нарушений. Полученные результаты показывают, что доксорубицин при хроническом введении вызывает тяжелую кардиотоксичность у кроликов, в то время как соединения II и III в данном исследовании не вызывали кардиотоксичности при введении доз, сопоставимых с дозами доксорубицина. Предполагается, что указанное отсутствие кардиотоксичности у соединений II и III обусловлено отсутствием 13-кетогруппы и пониженным образованием спиртового метаболита.
Комбинация паклитаксела с 13-дезоксиантрациклинами
Ингибирующее действие доксорубицина (I), 13-дезоксидоксорубицина (II), 5-имино-13-дезоксидоксорубицина (III), даунорубицина (IV), 13-дезоксидаунорубицина (V) и 6-имино-13-дезоксидаунорубицина (VI) в отношении роста опухолевых клеток MCF-7 молочной железы человека и клеток Р388 мышиного лейкоза определяли in vitro. Линии клеток MCF-7 и Р388, используемые в настоящих исследованиях, культивировали и хранили в соответствии с протоколом Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection, ATCC). Среда для MCF-7 представляла собой минимальную эссенциальную среду Игла (ЕМЕМ, Eagle Minimum Essential Medium, ATCC), a среда для Р388 - среду Игла, модифицированную по способу Дульбекко (Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM, ATCC).
ТАБЛИЦА 2
Отсутствие кардиотоксических эффектов у кроликов, подвергавшихся лечению в постоянном режиме 13-дезоксиантрациклинами (указанные величины представляют собой средние значения ± стандартная ошибка (SE), n=6)
Контрольная группа
Доксорубицин (I)
Соединение (II)
Соединение (III)
до
после
до
после
до
после
до
после
FS%
37.5±0.3
36.8±1.2
37.1±0.4
27.4*±1.8
38.1±0.7
37.4±1.0
37.3±1.1
35.6±0.7
НСТ %
34.4±0.4
38.7±0.6
35.0±0.5
27.5*±1.4
35.0±0.7
23.8*±2.0
34.4±0.7
33.3*±1.0
dF/dt г/с, 3 Гц
29.1±4.3
15.1*±1.8
24.4±1.0
30.2±0.7
Оценка гистопатологии
0.97±0.2
1.81±0.4
0.97±0.1
064±0.2
*р<0.05 относительно контрольной группы, +р<0.05 относительно соединения I и II, до = до лечения, после = после введения препарата.
2
6
Рабочую среду для клеток MCF-7 и Р388 получали путем добавления 50 мл фетальной бычьей сыворотки (fetal bovine serum, FBS, MCF-7) или 50 мл лошадиной сыворотки (АТСС, Р388) к 450 мл среды ЕМЕМ (MCF-7) или DMEM (Р388). Кроме того, в DMEM (Р388) добавляли 4.5 г/л глюкозы (Sigma). Пять миллилитров пенициллина/стрептомицина (Penecillin/Streptomycin, P/S, Gibco) добавляли в рабочую среду MCF-7 и Р388. Клетки выращивали при 37°С в 5% CO в течение 1 недели, а затем добавляли 25 мл свежей среды. Клетки пассировали когда их плотность достигала 1-2×10 клеток/мл путем переноса в новую колбу, содержащую свежую среду.
Соблюдая стерильность, клетки MCF-7 собирали из колб Т-75, удаляя и отбрасывая культуральную среду. 5 мл 0.25% раствора трипсина в этилендиаминтетрауксусной кислоте (Trypsin-EDTA) (Sigma) добавили в каждую колбу, чтобы отделить клетки. Колбу поместили в термостат на 5-10 минут, чтобы обеспечить диспергирование. Добавили 10 мл полной питательной среды и декантировали жидкость непосредственно в пробирки объемом 50 мл, которые центрифугировали в течение 10 минут при ускорении 200 g. Клетки Р388 собирали путем прямого декантирования в пробирки объемом 50 мл и центрифугирования в течение 10 минут при ускорении 200 g. Осадок (MCF-7 и Р388) повторно суспендировали в 5 мл и клетки диспергировали, осторожно пропуская через иглу толщиной 18 гейдж, присоединенную к шприцу. Затем подсчитывали количество клеток при помощи гемоцитометра и разбавляли средой до плотности 150000 клеток/мл. Разбавленные клетки переносили при помощи пипетки в планшеты с 96 лунками при концентрации 15000 клеток/лунка в 100 мкл. Планшеты закрывали и инкубировали при 37°С в течение 48 часов.
Антрациклины и паклитаксел разбавляли в специфичных по отношению к клеткам бессывороточных средах. Аликвоты 50 мкл лекарственных препаратов с соответствующими концентрациями добавляли во все лунки и выращивали клетки в течение 24 часов в присутствии указанных лекарственных препаратов (антрациклины/паклитаксел). Меченный тритием тимидин (ICN) разбавляли бессывороточными специфичными по отношению к клеткам средами до концентрации 1 мккюри/50 мкл. Во все лунки, используемые для анализа, быстро добавляли аликвоты по 50 мкл среды, содержащей меченный тритием тимидин. После 4-часовой выдержки в присутствии изотопа определяли содержание меченного тритием тимидина в ДНК путем гипотонического лизиса клеток с использованием деионизованной воды и сбора клеточного осадка на фильтрах Whatman GF-C, используя коллектор клеток Brandel. Перед сбором клеток MCF-7 среду удаляли аспирацией и в каждую лунку добавляли по 150 мкл 0 25% Trypsin-EDTA, чтобы отделить клетки. После высыхания фильтров их помещали в сцинтилляционные флаконы объемом 7 мл, содержащие 5 мл сцинтилляционного коктейля, и проводили подсчет с помощью сцинтилляционного счетчика. В ходе предварительных опытов определяли концентрации антрациклинов, вызывающие 30% ингибирование роста (ингибирующая концентрация 30, IC30) клеток MCF-7 и 10% ингибирование роста (IC10) клеток Р388. Результаты представлены в таблицах 3 и 4.
ТАБЛИЦА 3
IC30 доксорубицина, даунорубицина и 13-дезоксиантрациклинов, обеспечивающая ингибирование роста опухолевых клеток MCF-7 молочной железы человека
IC30, нМ
Доксорубицин
100
Соединение II
450
Соединение III
750
Даунорубицин (IV)
750
Соединение V
645
Соединение VI
875
ТАБЛИЦА 4
IС10 доксорубицина, даунорубицина и 13-дезоксиантрациклинов, обеспечивающая ингибирование роста клеток MCF-7 мышиного лейкоза
IC10, нМ
Доксорубицин
250
Соединение II
1100
Соединение III
3500
Даунорубицин (IV)
300
Соединение V
700
Соединение VI
1700
Зависимость ответной реакции в отношении ингибирования роста клеток MCF-7 от дозы для паклитаксела, взятого в отдельности, и в присутствии концентраций IC30 доксорубицина, даунорубицина или соединений II, III, V или VI показаны на фигурах 1 и 2. На основании этих кривых зависимости доза - ответ рассчитаны значения IC50 для паклитаксела, которые представлены в таблице 5.
ТАБЛИЦА 5
Концентрации IС50 (нМ) паклитаксела, обеспечивающие ингибирование роста опухолевых клеток MCF-7 молочной железы человека в присутствии доксорубицина, даунорубицина или 13-дезоксиантрациклинов при концентрациях IC30. Значения представляют собой среднюю величину ± стандартная ошибка, n=3
IC50 (нМ) паклитаксела
Паклитаксел
221±8
Паклитаксел + доксорубицин (I)
78±6<sup>*</sup>
Паклитаксел + соединение II
11±9<sup>*,X</sup>
Паклитаксел + соединение III
1±0<sup>*,X</sup>
Паклитаксел + даунорубицин (IV)
0.6±0<sup>*,X</sup>
Паклитаксел + соединение V
0.55±0<sup>*,x</sup>
Паклитаксел + Соединение VI
0.75<sup>*,x</sup>
*р<0.05 относительно паклитаксела, <sup>X</sup>p<0.05 относительно паклитаксел + доксорубицин
Доксорубицин в 2.8 раз увеличивает активность паклитаксела в отношении ингибирования роста раковых клеток. Соединение II вызывает аналогичное увеличение в 20 раз, а соединение III - в 220 раз. Даунорубицин, а также соединения V и VI вызывают увеличение роста ингибирующей активности паклитаксела в 295-400 раз. По сравнению с другими соединениями доксорубицин обладает относительно слабой способностью усиливать ингибирующую способность паклитаксела в отношении роста раковых клеток.
Зависимость ответной реакции от дозы при ингибировании роста клеток Р388 мышиного лейкоза паклитакселом, взятым в отдельности, и в присутствии концентраций IC10 доксорубицина, даунорубицина или соединений II, III, V или VI показаны на фигурах 3 и 4. На основании этих кривых зависимости доза - ответ рассчитаны значения IC50 для паклитаксела, которые представлены в таблице 6.
ТАБЛИЦА 6
Концентрации IC50 (нМ) паклитаксела, обеспечивающая ингибирование роста клеток Р388 мышиного лейкоза в присутствии доксорубицина, даунорубицина или 13-дезоксиантрациклинов при концентрациях IC10. Значения представляют собой среднюю величину ± стандартная ошибка, n=3
IC50 (нМ) паклитаксела
Пакпитаксел
не активен
Паклитаксел + доксорубицин (I)
16±0.58
Паклитаксел + соединение II
16±0.50
Паклитаксел + соединение III
20±0.67
Паклитаксел + даунорубицин (IV)
916±83*
Паклитаксел + соединение V
13±0
Паклитаксел + соединение VI
14±0.83
*р<0.05 относительно соединений I, II, IV, V и VI
Паклитаксел в отдельности не проявляет активности в отношении клеток Р388 и не вызывает ингибирования их роста. Однако в присутствии антрациклинов паклитаксел становится сильным ингибитором роста. Паклитаксел активен при низких значениях концентрации, находящихся наномолярной области, в присутствии всех антрациклинов за исключением даунорубицина, в присутствии которого паклитаксел активен при высоких значениях концентрации, находящихся в наномолярной области.
Усиленный эффект имеет в тех случаях, когда фармакологический эффект от введения комбинации двух лекарственных препаратов превышает аддитивный эффект от введения двух указанных лекарственных препаратов по отдельности. Допустим, например, доза первого лекарственного препарата, обеспечивающего 30%-ную ответную реакцию, составляет 100 единиц, а доза второго лекарственного препарата, обеспечивающего 30%-ную реакцию, составляет 10 единиц. Если 100 единиц первого лекарственного препарата плюс 10 единиц второго лекарственного препарата вызывают 60%-ную ответную реакцию, то имеет место аддитивный эффект двух указанных лекарственных препаратов. Однако, если 100 единиц первого препарата плюс 10 единиц второго препарата вызывают 90%-ную ответную реакцию, то имеет место синергический или супераддитивный эффект двух указанных лекарственных препаратов. Паклитаксел при концентрациях в клетках MCF7, не оказывающих ингибирующего действия на рост клеток (1-50 нМ), обеспечивает 50%-95% ингибирование роста в присутствии 13-дезоксиантрациклинов согласно настоящему изобретению при концентрациях указанных 13-дезоксиантрациклинов, обеспечивающих лишь 30%-ное ингибирование роста. Аналогично этому паклитаксел, который не оказывает ингибрующего действия на рост клеток Р388 при концентрациях до 2000 нМ, вызывает 65% - 95%-ное ингибирование роста в присутствии 13-дезоксиантрациклинов согласно настоящему изобретению при их концентрациях, обеспечивающих лишь 10%-ное ингибирование роста. Таким образом, 13-дезоксиантрациклины согласно настоящему изобретению, усиливая действие паклитаксела или действуя синергически, образуют с паклитакселом высокоактивную и эффективную композицию, комбинацию, смесь или препарат для подавления роста раковых клеток.
Приведенное выше описание ограничивается рассмотрением отдельных конкретных вариантов реализации настоящего изобретения. Однако следует понимать, что специалистом в данной области техники могут быть внесены различные изменения и осуществлены различные модификации предложенных вариантов реализации изобретения с использованием некоторых или всех преимуществ настоящего изобретения, при этом такие измененные или модифицированные варианты реализации также будут находиться в рамках настоящего изобретения. Так, например, в случае нераковых клеток Н9с2 крыс небольшие ингибирующие количества паклитаксела (IC10) снижают IC50 13-дезоксидоксорубицина с 700 нМ до 400 нМ, снижают IC50 13-дезокси-5-иминодоксорубицина с 1500 нМ до 210 нМ, однако не снижают концентрацию IC50 доксорубицина, которая остается равной 210 нМ. Таким образом, таксаны повышают активность 13-дезоксиантрациклинов. Соответствующие модификации и адаптации ряда условий и параметров, которые обычно используются в клинической терапии и являются очевидными для специалистов в данной области техники, также находятся в рамках настоящего изобретения.
Приведенное выше описание иллюстрирует и поясняет суть настоящего изобретения. При этом в настоящем описании приведены только предпочтительные варианты реализации изобретения, однако, как указано выше, следует понимать, что настоящее изобретение также включает различные другие комбинации, модификации и условия и может подвергаться изменениям или модификациям в пределах общей концепции изобретения, изложенной в настоящем описании, в соответствии с вышеуказанными положениями и/или на основании опыта и знаний специалиста в данной области техники. Описанные выше варианты реализации изобретения также предназначены для пояснения наилучших вариантов реализации, известных заявителю, и обеспечить возможность применения тех или иных вариантов реализации настоящего изобретения с возможными модификациями другими специалистами в данной области техники. Соответственно, изобретение не ограничивается конкретными вариантами реализации, представленными в настоящем описании. Кроме того, предполагается, что прилагаемая формула изобретения включает альтернативные варианты реализации изобретения.
Все публикации и заявки на патент, упоминаемые в настоящем описании, включены в него посредством ссылки аналогично тому, как если бы это было указано для каждой конкретной публикации и заявки на патент.