МЕТОДЫ УЛУЧШЕНИЯ КЛОНАЛЬНОСТИ ПОЛИНУКЛЕОТИДНОГО КЛАСТЕРА

1. Способ амплификации нуклеиновых кислот, включающий (а) получение реагента для амплификации, содержащего
(i) массив сайтов амплификации,
где сайты амплификации содержат две популяции нуклеиновых кислот для захвата, каждая из которых включает последовательность для захвата,
где первая популяция включает первую последовательность для захвата, а вторая популяция содержит вторую последовательность для захвата, и
(ii) раствор, содержащий множество различных модифицированных двухцепочечных нуклеиновых кислот-мишеней,
где различные модифицированные нуклеиновые кислоты-мишени содержат на 3'-конце первую универсальную связывающую последовательность для захвата, имеющую меньшую аффинность к первой последовательности для захвата, чем первая универсальная связывающая последовательность для захвата, которая на 100% комплементарна первой последовательности для захвата; и
(b) реакцию взаимодействия реагента для амплификации с образованием множества сайтов амплификации, каждый из которых содержит клональную популяцию ампликонов из отдельной нуклеиновой кислоты-мишени из раствора.
2. Способ амплификации нуклеиновых кислот, включающий:
(а) получение реагента для амплификации, содержащего:
(i) массив сайтов амплификации,
где сайты амплификации содержат две популяции нуклеиновых кислот для захвата, каждая из которых включает последовательность для захвата,
где первая популяция включает первую последовательность для захвата, а вторая популяция содержит вторую последовательность для захвата, и
(ii) раствор, содержащий множество различных модифицированных нуклеиновых кислот-мишеней,
где различные модифицированные нуклеиновые кислоты-мишени содержат на 3'-конце первую универсальную связывающую последовательность для захвата, имеющую меньшую аффинность к первой последовательности для захвата, чем первая универсальная связывающая последовательность для захвата, которая на 100% комплементарна первой последовательности для захвата; и
(b) реакцию взаимодействия реагента для амплификации с образованием множества сайтов амплификации, каждый из которых содержит клональную популяцию ампликонов из отдельной нуклеиновой кислоты-мишени из раствора, где реакция взаимодействия включает:
(i) получение первого ампликона из отдельной нуклеиновой кислоты-мишени, который переносится в каждый из сайтов амплификации,
(ii) получение последующих ампликонов из отдельной нуклеиновой кислоты-мишени, которая переносится в каждый из сайтов амплификации или из первого ампликона,
где средняя скорость, с которой последующие ампликоны продуцируются в сайтах амплификации, меньше, чем средняя скорость, с которой первый ампликон продуцируется в сайтах амплификации.
3. Способ определения последовательностей нуклеиновых кислот, включающий осуществление процедуры секвенирования, которая позволяет детектировать явно клональную популяцию ампликонов в каждом из множества сайтов ампликонов на массиве, где указанный массив получают способом, включающим
(а) получение реагента для амплификации, содержащего
(i) множество сайтов амплификации,
где сайты амплификации содержат две популяции нуклеиновых кислот для захвата, каждая из которых включает последовательность для захвата,
где первая популяция включает первую последовательность для захвата, а вторая популяция содержит вторую последовательность для захвата, и
(ii) раствор, содержащий множество различных модифицированных двухцепочечных нуклеиновых кислот-мишеней,
где различные модифицированные нуклеиновые кислоты-мишени содержат на 3'-конце первую универсальную связывающую последовательность для захвата, имеющую меньшую аффинность к первой последовательности для захвата, чем первая универсальная связывающая последовательность для захвата, которая на 100% комплементарна первой последовательности для захвата; и
(b) реакцию взаимодействия реагента для амплификации.
4. Способ по пп. 1, 2 или 3, где количество различных модифицированных нуклеиновых кислот-мишеней в растворе превышает количество сайтов амплификации в массиве,
где различные модифицированные нуклеиновые кислоты-мишени имеют жидкостной доступ ко множеству сайтов амплификации, и
где каждый из сайтов амплификации содержит емкость для нескольких нуклеиновых кислот во множестве различных нуклеиновых кислот.
5. Способ по п. 1, где реакция включает одновременно:
(i) перенос различных модифицированных нуклеиновых кислот-мишеней в сайты амплификации со средней скоростью переноса, и
(ii) амплификацию нуклеиновых кислот-мишеней, которые находятся в сайтах амплификации, со средней скоростью амплификации, где средняя скорость амплификации меньше средней скорости переноса.
6. Способ по п. 3, где множество различных модифицированных нуклеиновых кислот-мишеней в растворе имеет концентрацию, которая приводит к одновременному:
(i) переносу различных модифицированных нуклеиновых кислот-мишеней из раствора к сайтам амплификации,
(ii) амплификации нуклеиновых кислот-мишеней, которые находятся в сайтах амплификации, со скоростью амплификации для получения массива сайтов ампликонов, каждый из которых составляет явно клональную популяцию ампликонов.
7. Способ по любому из пп. 1-3, где первая универсальная связывающая последовательность для захвата менее, чем на 100% комплементарна первой последовательности для захвата.
8. Способ по п. 7, где первая универсальная связывающая последовательность для захвата содержит 1, 2 или 3 нуклеотида, которые не комплементарны первой последовательности для захвата.
9. Способ по п. 7, где различные модифицированные нуклеиновые кислоты-мишени содержат гетерогенную популяцию первых универсальных связывающих последовательностей для захвата, где гетерогенная популяция включает отдельные первые универсальные связывающие последовательности для захвата, имеющие (i) 1, 2 или 3 нуклеотида, которые не комплементарны первой последовательности для захвата, или (ii) на 100% комплементарны первой последовательности для захвата.
10. Способ по п. 9, где члены гетерогенной популяции, имеющие 100% комплементарность с первой последовательностью для захвата, присутствуют в большем количестве, чем другие члены гетерогенной популяции.
11. Способ по любому из пп. 1-3, где первая универсальная связывающая последовательность для захвата имеет длину, которая меньше длины первой последовательности для захвата.
12. Способ по п. 11, где первая универсальная связывающая последовательность для захвата имеет длину, которая на 1-12 нуклеотидов меньше длины первой последовательности для захвата.
13. Способ по п. 11, где различные модифицированные нуклеиновые кислоты-мишени содержат гетерогенную популяцию первых универсальных связывающих последовательностей для захвата, где гетерогенная популяция включает отдельные первые универсальные связывающие последовательности для захвата, имеющие длину на 1-12 нуклеотидов меньше, чем длина первой последовательности для захвата.
14. Способ по п. 9, где гетерогенная популяция дополнительно содержит отдельные первые универсальные связывающие последовательности для захвата, имеющие (iii) длину, которая меньше длины первой последовательности для захвата.
15. Способ по п. 14, где отдельные первые универсальные связывающие последовательности для захвата имеют длину, которая на 1-12 нуклеотидов меньше длины первой последовательности для захвата.
16. Способ по п. 14, в котором отдельные члены гетерогенной популяции, имеющие длину, меньшую, чем длина первой последовательности для захвата, содержат 1, 2 или 3 нуклеотида, которые не являются комплементарными последовательности первой последовательности для захвата или на 100% комплементарны последовательности первой последовательности для захвата.
17. Способ по любому из пп. 1-3, где различные модифицированные нуклеиновые кислоты-мишени содержат на 5'-конце вторую универсальную связывающую последовательность для захвата, имеющую комплемент, который обладает меньшей аффинностью ко второй последовательности для захвата, чем вторая универсальная связывающая последовательность для захвата, имеющая комплемент, который на 100% комплементарен второй последовательности для захвата.
18. Способ по п. 17, где комплемент второй универсальной связывающей последовательности для захвата менее, чем на 100% комплементарен второй последовательности для захвата.
19. Способ по п. 18, где комплемент второй универсальной связывающей последовательности для захвата включает 1, 2 или 3 нуклеотида, которые не комплементарны второй последовательности для захвата.
20. Способ по п. 18, где различные модифицированные нуклеиновые кислоты-мишени содержат гетерогенную популяцию вторых универсальных связывающих последовательностей для захвата, где гетерогенная популяция включает отдельные вторые универсальные связывающие последовательности для захвата, содержащие комплемент, имеющий (i) 1, 2 или 3 нуклеотида, которые не комплементарны второй последовательности для захвата, или (ii) на 100% комплементарен второй последовательности для захвата.
21. Способ по п. 20, где члены гетерогенной популяции, содержащие комплемент, имеющий 100% комплементарность со второй последовательностью для захвата, присутствуют в большем количестве, чем другие члены гетерогенной популяции.
22. Способ по любому из пп. 1-3, где вторая универсальная связывающая последовательность для захвата имеет длину, которая меньше длины второй последовательности для захвата.
23. Способ по п. 22, где вторая универсальная связывающая последовательность для захвата имеет длину, которая на 1-12 нуклеотидов меньше длины второй последовательности для захвата.
24. Способ по п. 22, где различные модифицированные нуклеиновые кислоты-мишени содержат гетерогенную популяцию вторых универсальных связывающих последовательностей для захвата, где гетерогенная популяция включает отдельные вторые универсальные связывающие последовательности для захвата, длина которых на 1-12 нуклеотидов меньше длины второй последовательности для захвата.
25. Способ по п. 20, где гетерогенная популяция дополнительно содержит отдельные вторые универсальные связывающие последовательности для захвата, имеющие (iii) длину, которая меньше длины второй последовательности для захвата.
26. Способ по п. 25, где отдельные вторые универсальные связывающие последовательности для захвата имеют длину, которая на 1-12 нуклеотидов меньше длины второй последовательности для захвата.
27. Способ по п. 26, где отдельные члены гетерогенной популяции, имеющие длину, меньшую, чем длина второй последовательности для захвата, содержат комплемент, включающий 1, 2 или 3 нуклеотида, которые не комплементарны последовательности второй последовательности для захвата, или на 100% комплементарны последовательности второй последовательности для захвата.
28. Способ по любому из пп. 1-3, где нуклеиновая кислота-мишень представляет собой ДНК.
29. Способ по любому из пп. 1-3, где массив сайтов амплификации содержит массив элементов на поверхности.
30. Способ по п. 29, где площадь каждого из элементов больше, чем диаметр вытесненного объема нуклеиновых кислот-мишеней, которые переносятся в сайты амплификации.
31. Способ по п. 30, где элементы не являются смежными и разделены промежуточными областями на поверхности, на которой отсутствуют агенты для захвата.
32. Способ по п. 29, где каждый из элементов содержит сферу, лунку, канал, гребень, выступ или их комбинацию.
33. Способ по любому из пп. 1-3, где массив сайтов амплификации содержит сферы в растворе или сферы на поверхности.
34. Способ по любому из пп. 1-3, где амплификация нуклеиновых кислот-мишеней, которые переносятся в сайты амплификации, происходит изотермически.
35. Способ по любому из пп. 1-3, где амплификация различных модифицированных нуклеиновых кислот-мишеней, которые переносятся в сайты амплификации, не включает цикл денатурации.
36. Способ по любому из пп. 1-3, где множество сайтов амплификации, которые составляют клональную популяцию ампликонов, превышает 40% от всех сайтов амплификации, для которых различные модифицированные нуклеиновые кислоты-мишени имели жидкостной доступ во время стадии (b).
37. Способ по любому из пп. 1-3, где достаточное количество ампликонов продуцируется из отдельных нуклеиновых кислот-мишеней в отдельных сайтах амплификации, соответственно, для заполнения емкости соответствующего сайта амплификации во время стадии (b).
38. Способ по п. 37, где скорость, с которой продуцируемые ампликоны заполняют емкость соответствующего сайта амплификации, меньше скорости, с которой отдельные нуклеиновые кислоты-мишени переносятся в отдельные сайты амплификации, соответственно.
39. Способ по любому из пп. 1-3, где перенос включает пассивную диффузию.
40. Способ по любому из пп. 1-3, где реагент для амплификации дополнительно содержит полимеразу и рекомбиназу.
41. Способ создания библиотеки, включающий:
получение раствора из множества двухцепочечных нуклеиновых кислот-мишеней;
лигирование универсального адаптера с обоими концами двухцепочечных нуклеиновых кислот-мишеней с образованием первого множества модифицированных нуклеиновых кислот-мишеней,
где каждая из модифицированных нуклеиновых кислот-мишеней включает нуклеиновую кислоту-мишень, фланкированную универсальным адаптером,
где универсальный адаптер включает (i) область двухцепочечной нуклеиновой кислоты и (ii) область одноцепочечных некомплементарных цепей нуклеиновой кислоты, содержащих универсальную связывающую последовательность для захвата на 3'-конце,
где универсальная связывающая последовательность для захвата включает гетерогенную популяцию, и
где лигирование приводит к ковалентному связыванию области двухцепочечной нуклеиновой кислоты универсального адаптера с каждым концом двухцепочечных фрагментов-мишеней.
42. Способ по п. 41, где члены гетерогенной популяции универсальных связывающих последовательностей для захвата на 3'-конце отличаются друг от друга 1, 2 или 3 нуклеотидами.
43. Способ по п. 41, где члены гетерогенной популяции универсальных связывающих последовательностей для захвата на 3'-конце имеют длины, которые отличаются друг от друга 1-12 нуклеотидами.
44. Способ по п. 41, где члены гетерогенной популяции универсальных связывающих последовательностей для захвата на 3'-конце отличаются друг от друга 1, 2 или 3 нуклеотидами, отличаются друг от друга 1-12 нуклеотидами или их комбинацией.
45. Способ по п. 41, где область одноцепочечных некомплементарных цепей нуклеиновой кислоты содержит вторую универсальную связывающую последовательность для захвата на 5'-конце.
46. Способ по п. 41, где члены гетерогенной популяции вторых универсальных связывающих последовательностей для захвата на 5'-конце отличаются друг от друга 1, 2 или 3 нуклеотидами.
47. Способ по п. 41, где члены гетерогенной популяции вторых универсальных связывающих последовательностей для захвата на 5'-конце имеют длины, которые отличаются друг от друга 1-12 нуклеотидами.
48. Способ по п. 41, где члены гетерогенной популяции вторых универсальных связывающих последовательностей для захвата на 5'-конце отличаются друг от друга 1, 2 или 3 нуклеотидами, отличаются от друг друга 1-12 нуклеотидами или их комбинацией.
49. Композиция, содержащая массив сайтов амплификации и по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту-мишень, связанную с сайтом амплификации,
где сайты амплификации содержат две популяции нуклеиновых кислот для захвата, где каждая популяция включает последовательность для захвата,
где первая популяция содержит первую последовательность для захвата, а вторая популяция содержит вторую последовательность для захвата,
где нуклеиновая кислота-мишень содержит на 3'-конце первую универсальную связывающую последовательность для захвата, имеющую меньшую аффинность к первой последовательности для захвата, чем первая универсальная связывающая последовательность для захвата, которая на 100% комплементарна первой последовательности для захвата,
где универсальная связывающая последовательность для захвата нуклеиновой кислоты-мишени гибридизуется с первой последовательностью для захвата.
50. Композиция по п. 49, где первая универсальная связывающая последовательность для захвата менее, чем на 100% комплементарна первой последовательности для захвата.
51. Композиция по п. 49, где первая универсальная связывающая последовательность для захвата содержит 1, 2 или 3 нуклеотида, которые не комплементарны первой последовательности для захвата.
52. Композиция по п. 49, где по меньшей мере 30% сайтов амплификации массива занято по меньшей мере одной нуклеиновой кислотой-мишенью.
53. Композиция по п. 52, где первая универсальная связывающая последовательность для захвата включает гетерогенную популяцию, где гетерогенная популяция включает отдельные первые универсальные связывающие последовательности для захвата, имеющие (i) 1, 2 или 3 нуклеотида, которые не комплементарны первой последовательности для захвата, или (ii) на 100% комплементарны первой последовательности для захвата, и где члены гетерогенной популяции связаны с различными сайтами амплификации.
54. Композиция по п. 53, где члены гетерогенной популяции, имеющие 100% комплементарность с первой последовательностью для захвата, присутствуют в большем количестве, чем другие члены гетерогенной популяции.
55. Композиция по п. 49, где вторая универсальная связывающая последовательность для захвата имеет длину, которая меньше длины второй последовательности для захвата.
56. Композиция по п. 55, где вторая универсальная связывающая последовательность для захвата имеет длину, которая на 1-12 нуклеотидов меньше длины второй последовательности для захвата.
57. Композиция по п. 56, где композиция содержит множество различных нуклеиновых кислот-мишеней, где различные нуклеиновые кислоты-мишени содержат гетерогенную популяцию первых универсальных связывающих последовательностей для захвата, и где гетерогенная популяция включает отдельные первые универсальные связывающие последовательности для захвата, имеющие длину на 1-12 нуклеотидов меньше, чем длина первой последовательности для захвата.
58. Композиция по п. 53, где гетерогенная популяция дополнительно содержит отдельные первые универсальные связывающие последовательности для захвата, имеющие (iii) длину, которая меньше длины первой последовательности для захвата.
59. Композиция по п. 58, где отдельные первые универсальные связывающие последовательности для захвата, имеющие укороченную длину, имеют длину, которая на 1-12 нуклеотидов меньше длины первой последовательности для захвата.
60. Композиция по п. 58, где отдельные члены гетерогенной популяции, имеющие укороченную длину, содержат 1, 2 или 3 нуклеотида, которые не комплементарны последовательности первой последовательности для захвата, или на 100% комплементарны последовательности первой последовательности для захвата.
61. Композиция по п. 49, где композиция содержит множество различных нуклеиновых кислот-мишеней, где различные нуклеиновые кислоты-мишени содержат на 5'-конце вторую универсальную связывающую последовательность для захвата, имеющую комплемент, который обладает меньшей аффинностью ко второй последовательности для захвата, чем вторая универсальная связывающая последовательность для захвата, имеющая комплемент, который на 100% комплементарен второй последовательности для захвата.
62. Композиция по п. 61, где комплемент второй универсальной связывающей последовательности для захвата менее, чем на 100% комплементарен второй последовательности для захвата.
63. Композиция по п. 62, где комплемент второй универсальной связывающей последовательности для захвата включает 1, 2 или 3 нуклеотида, которые не комплементарны второй последовательности для захвата.
64. Композиция по п. 62, где композиция содержит множество различных нуклеиновых кислот-мишеней, где различные нуклеиновые кислоты-мишени содержат гетерогенную популяцию вторых универсальных связывающих последовательностей для захвата, где гетерогенная популяция включает отдельные вторые универсальные связывающие последовательности для захвата, включающие комплемент, содержащий (i) 1, 2 или 3 нуклеотида, которые не комплементарны второй последовательности для захвата, или (ii) на 100% комплементарен второй последовательностью для захвата.
65. Композиция по п. 62, где члены гетерогенной популяции, содержащие комплемент, который на 100% комплементарен второй последовательности для захвата, присутствуют в большем количестве, чем другие члены гетерогенной популяции.
66. Композиция по п. 49, где нуклеиновая кислота-мишень содержит на 5'-конце вторую универсальную связывающую последовательность для захвата, имеющую длину, которая меньше длины второй последовательности для захвата.
67. Композиция по п. 66, где вторая универсальная связывающая последовательность для захвата имеет длину, которая на 1-12 нуклеотидов меньше длины второй последовательности для захвата.
68. Композиция по п. 66, где композиция содержит множество различных нуклеиновых кислот-мишеней, где различные нуклеиновые кислоты-мишени содержат гетерогенную популяцию вторых универсальных связывающих последовательностей для захвата, где гетерогенная популяция включает отдельные вторые универсальные связывающие последовательности для захвата, имеющие длину, которая на 1-12 нуклеотидов меньше, чем длина второй последовательности для захвата.
69. Композиция по п. 64, где гетерогенная популяция дополнительно содержит отдельные вторые универсальные связывающие последовательности для захвата, имеющие (iii) длину, которая меньше длины второй последовательности для захвата.
70. Композиция по п. 69, где отдельные вторые универсальные связывающие последовательности для захвата имеют длину, которая на 1-12 нуклеотидов меньше длины второй последовательности для захвата.
71. Композиция по п. 70, где отдельные члены гетерогенной популяции, имеющие длину, меньшую, чем длина второй последовательности для захвата, содержат комплемент, включающий 1, 2 или 3 нуклеотида, которые не комплементарны последовательности второй последовательности для захвата или на 100% комплементарны последовательности второй последовательности для захвата.
72. Композиция по п. 49, где нуклеиновая кислота-мишень представляет собой ДНК.