Способ прогнозирования риска развития ишемического инсульта с учетом генетических факторов
METHOD FOR PREDICTING THE RISK OF DEVELOPING AN ISCHEMIC STROKE, TAKING INTO ACCOUNT GENETIC FACTORS

Изобретение относится к области медицинской диагностики и может быть использовано для прогнозирования риска развития ишемического инсульта.
В настоящее время инсульт занимает первые позиции по заболеваемости, инвалидизации и смертности как в нашей стране, так и в мире, поэтому исследование молекулярно-генетических механизмов предрасположения к данному заболеванию остается актуальной проблемой современной генетики человека [Хронические сосудистые заболевания головного мозга [текст] / А.С. Кадыков, Л.С. Манвелов, Н.В. Шахпаронова // М.: ГЭОТАР-Медиа. – 2013. – 232 с.]. В этиологии инсульта существенна генетическая компонента, однако до настоящего времени весь спектр генов, связанных с его развитием, не определен. Установлено, что с развитием ишемического инсульта связаны гены системы гемостаза, системы окиси азота, программированной клеточной гибели, а также гены матриксных металлопротеиназ (ММР) [Генетический взгляд на феномен сочетанной патологии у человека [Текст]/ В. П. Пузырев // Медицинская генетика. – 2008. – Т. 7. – № 9. – С. 3-9]. Матриксные металлопротеиназы являются эндопептидазами, отвечающими за протеолитическое расщепление всех компонентов внеклеточного матрикса и участвующими в развитии таких патологических состояний, как эссенциальная гипертензия, артрит, атеросклероз, рост и метастазирование опухолей [Матриксные металлопротеиназы и сердечно-сосудистые заболевания [Текст] / А.А. Турна, Р.Т. Тогузов // Артериальная гипертензия. – 2009. – №5. – С. 532-538; Diverse roles of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in neuroinflammation and cerebral ischemia [Tехt] / E. Candelario-Jalil, Y. Yang, G. A. Rosenberg // Neuroscience – 2012. – №158 (3). – Р. 983-994].
Значительная распространенность и высокая смертность в результате осложнений данного заболевания определяют необходимость выделения критериев индивидуального прогнозирования риска развития ишемического инсульта на основании изучения полиморфных вариантов генов-кандидатов.
Матриксная металлопротеиназа 3 (ММP-3) является представителем подсемейства стромелизинов и отвечает за гидролитическое расщепление фибронектина [Matrix Metalloproteinases in Lung: Multiple, Multifarious, and Multifaceted [Tехt] / K.J. Greenlee, Z. Werb, F. Kheradmand // Physiological Reviews. – 2011. – №87 (1). – Р. 69-98]. Цитогенетическое расположение гена, кодирующего ММP-3 – 11q22.2. Китайскими учеными установлено, что полиморфизм rs3025058 гена ММP-3, представляющий собой вставку дополнительного аденина в положении -1612,  ассоциирован с развитием острых нарушений мозгового кровообращения [Аssоciаtiоn оf Mаtrix Metаllорrоteinаse-1 аnd Mаtrix Metаllорrоteinаse-3 Gene Vаriаnts with Ischemic Strоke аnd Its Subtурe [Text] / X.У. Huаng, L.У. Hаn, X.D. Huаng [et аl.] // J. Strоke Cerebrоvаsc. Dis. – 2017. – Vоl. 26, № 2. – Р. 368-375].
Матриксная металлопротеиназа 7 (ММP-7) является представителем подсемейства матрилизинов и отвечает за протеолиз коллагена, фибронектина, желатинов, эластина и других компонентов внеклеточного матрикса [Allele-Specific Regulation of Matrix Metalloproteinase-7 Promoter Activity Is Associated With Coronary Artery Luminal Dimensions Among Hypercholesterolemic Patients [Text] / S. Jormsjö, C. Whatling, D.H. Walter [et аl.] // Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. – 2011. – Vоl. 21. – Р. 1834-1839]. Цитогенетическое расположение гена, кодирующего ММP-7 – 11q22.2, в его промоторной области находится полиморфизм rs11568818 ММP-7, представляющий собой замену аденина на гуанин в позиции -181. Установлено, что данный полиморфизм ассоциирован с развитием сосудистых катастроф в китайской популяции [Association between matrix metalloproteinase family gene polymorphisms and ischemic stroke: a meta-analysis [Text] / D. Wen, X. Du, S.P. Nie [et аl.] // Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. – 2014. – Vоl. 28. – Р. 1832-1837].
Исследования вовлеченности генов матриксных металлопротеиназ в формирование предрасположенности к инсульту в России единичны и фрагментарны, а данных о роли генетических вариантов rs3025058 MMР-3 и rs11568818 MMР-7 в развитии ишемического инсульта нет совсем.
В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования риска развития ишемического инсульта с учетом генетических данных о сочетаниях генетических полиморфизмов rs3025058 MMР-3 и rs11568818 MMР-7.
Из области техники известен «Способ прогнозирования развития острого ишемического инсульта» по Патенту РФ №2012134988 от 20.02.2014. Способ включает учет показателей ферментов антиокислительной защиты в периферической крови, при этом в качестве ферментов антиокислительной защиты определяют каталазу, пероксидазу и показатель перекисного окисления липидов. При увеличении показателей пероксидазы и перекисной резистентности эритроцитов и снижении показателя каталазы более чем на 70% от референтных значений судят о высоком риске развития ишемического инсульта. Однако данный способ не является достаточно информативным, так как не включает генетические маркеры и применим только на клиническом этапе, что исключает раннюю диагностику и проведение профилактических мероприятий по предотвращению развития инсульта.
За прототип выбран Патент РФ № 2422523 от 22.04.2010 «Аллель SNP41 гена PDE4D, его применение для прогнозирования индивидуальной предрасположенности к инсульту в русской популяции, применение молекулярно-генетического маркера индивидуальной предрасположенности к инсульту и способ прогнозирования индивидуальной предрасположенности к инсульту». Способ включает анализ полиморфизма гена PDE4D на наличие аллеля А SNP41 и в случае выявления наличия указанного варианта аллеля прогноз предрасположенности к инсульту в русской популяции. Данный способ разработан для выявления риска развития инсульта по результатам генетического тестирования по локусу гена PDE4D. Аллель A SNP41 гена PDE4D применяется в качестве диагностического маркера при оценке высокой индивидуальной предрасположенности к инсульту в русской популяции. Изобретение позволяет диагностировать предрасположенность к инсульту в русской популяции и своевременно назначать соответствующие медикаменты. Недостатком указанного способа является использование в качестве маркера только одного генетического полиморфизма, что снижает статистическую мощность проведенного исследования.
Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов диагностики, а именно создание способа прогнозирования развития ишемического инсульта на основе комбинации генов матриксных металлопротеиназ.
Технический результат использования изобретения – получение критериев оценки риска развития ишемического инсульта у лиц русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья на основе данных о сочетаниях генетических вариантов локусов rs3025058 MMР-3 и rs11568818 MMР-7.
Поставленная задача решается предложенным способом, включающим:
- выделение ДНК из периферической венозной крови лиц русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья;
- анализ полиморфизмов генов матриксных металлопротеиназ rs3025058 MMР-3 и rs11568818 MMР-7;
- прогнозирование высокого риска развития ишемического инсульта при выявлении сочетания генотипа 6А/6А по локусу rs3025058 MMР-3 с генотипом АА по локусу rs11568818 MMР-7.
Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза риска развития ишемического инсульта по наличию сочетания генетических вариантов полиморфных маркеров матриксных металлопротеиназ rs3025058 MMР-3 и rs11568818 MMР-7.
2
Выделение геномной ДНК из периферической крови осуществляют методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew, 1984) в два этапа. На первом этапе к 4 мл крови с ЭДТА добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5мМ MgCl, 10мМ трис-HCl (pH 7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4ºС, 4000 об/мин в течение 20 мин. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН 8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37ºС в течение 16 часов.
На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 мин. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. После лиофилизации полученную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -200°С. Выделенную ДНК используют для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.
2
2
Для исследования полиморфизма rs3025058 ММP-3 используют наборы 2,5х реакционной смеси для проведения ПЦР-РВ в объеме 25 мкл на 1 образец, включающие 2,5х реакционную смесь (2,5х ПЦР буфер: (KСl, ТрисHСl (рH 8,8), 6,25 мМ MgСl), SynTаq ДНК-полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты, глицерол, Twееn 20) в объеме 10 мкл, 25мМ MgСl в объеме 1,5 мкл, ddH2О  (деионизированная вода), по 10 пкмоль каждого праймера и по 5 пкмоль каждого зонда. При проведении ПЦР в амплификаторе с флуоресцентной детекцией (на амплификаторе CFX96) генотипирование осуществляют методом TagMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции). Для rs3025058 ММP-3 зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю 6A, зонд с красителем FAM – аллелю 5А (фиг. 1).
2
Анализ полиморфизма rs11568818 MMР-7 проводят методом ПЦР синтеза ДНК на амплификаторе СFX96 (Bio-Rad) с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров и зондов с последующим анализом полиморфизма методом дискриминации аллелей. Реакционная смесь объемом 25 мкл включает: 67 мМ трис-HCl (pH 8,8), 2,5 мМ MgCl, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 5 пкмоль каждого зонда, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (5 мин при 95°С) выполняют 40 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров – 1 мин при t=54°С; денатурация – 15 сек при t=95°С. При проведении ПЦР в амплификаторе (CFX96) с флуоресцентной детекцией генотипирование осуществляют методом TagMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции). Для rs11568818 MMР-7 зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю А, зонд с красителем FAM – аллелю G (фиг.2).
Выделенную ДНК подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров [Еlеvаtеd MMР-8 аnd dесrеаsеd myеlореrохidаsе соnсеntrаtiоns аssосiаtе signifiсаntly with thе risk fоr аthеrоsсlеrоsis disеаsе аnd аbdоminаl аоrtiс аnеurysm [Tехt] / Р. Рrаdhаn-Раlikhе, Р. Vikаtmаа, T. Lаjunеn [еt аl.] // Sсаnd. J. Immunоl. – 2010. – Vоl. 72, № 2. – Р. 150-157.].
Изобретение характеризуется фиг. 1-3:
Фиг. 1. Дискриминации аллелей методом детекции TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени полиморфизма rs3025058 ММP-3, где   - 5А/5А,    - 6А/6А,    - 5А/6А,  - отрицательный контроль.
Фиг. 2. Дискриминации аллелей методом детекции TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени полиморфизма rs11568818 MMР-7, где   - GG,    - AA,    - AG,  - отрицательный контроль.
Фиг. 3. Диаграмма взаимодействий локусов матриксных металлопротеиназ в двухлокусной модели при формировании инсульта, полученная методом GMDR с коррекцией на коварианты, где столбики слева соответствуют группе больных, столбики справа соответствуют контрольной группе.
Генотипирование полиморфизмов rs3025058 MMР-3 и rs11568818 MMР-7 осуществляют методом детекции TagMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени.
Анализ ассоциаций сочетаний генетических вариантов ММР с ишемическим инсультом проводят с помощью методов MDR (Multifactor Dimensionality Reduction) и его модификации GMDR (Generalized Multifactor Dimensionality Reduction) с использованием соответствующего программного обеспечения (MDR версии 3.0.2, http://www.epistasis.org/ mdr.html, и GMDR версии 0.9, http://www.ssg.uab.edu/gmdr/) (фиг. 3). В основе использованных методов лежит общий принцип выявления переменной, содержащей информацию о нескольких локусах, и формирование кластеров, содержащих комбинации генотипов высокого и низкого риска развития изучаемой патологии.
Возможность использования предложенного способа для оценки риска возникновения и развития ишемического инсульта подтверждает анализ результатов наблюдений 303 пациентов с инсультом и 527 индивидуумов контрольной группы. Общий объем исследуемой выборки составил 830 человек. Средний возраст пациентов с инсультом составил 59,58±8,21 лет, а средний возраст представителей контрольной группы – 58,81±7,74 лет. В группе больных с инсультом оказались 201 мужчина и 102 женщины, а в контрольной группе – 322 мужчины и 205 женщин. В исследуемые выборки включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья России и не имеющие родства между собой. Группа больных с инсультом и контрольная группа полностью сопоставимы по возрасту, полу, месту рождения и национальности.
Все клинические и клинико-лабораторные исследования проводили на базе неврологического и кардиологического отделений Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа, с информированного согласия пациентов на использование материалов лечебно-диагностических мероприятий, проводимых за период госпитализации и после нее для научно-исследовательских целей. В работе использовалась анкета-опросник, включающая антропометрические, социально-демографические показатели, а также сведения о наличии у респондентов средовых факторов риска инсульта, таких как курение, злоупотребление алкоголем, низкий уровень физической активности, особенности питания, стрессовые ситуации [Полоников, А.В. и др., 2013]. Полученные материалы протоколировали по стандартам этического комитета Российской Федерации.
Анализ ассоциаций сочетаний генетических вариантов с ишемическим инсультом проводили с помощью методов MDR (Multifactor Dimensionality Reduction) и его модификации GMDR (Generalized Multifactor Dimensionality Reduction) с использованием соответствующего программного обеспечения (MDR версии 3.0.2, http://www.epistasis.org/ mdr.html, и GMDR версии 0.9, http://www.ssg.uab.edu/gmdr/), с коррекцией на индекс массы тела, уровни холестерина, триглицеридов, липопротеидов низкой плотности, липопротеидов высокой плотности, курение, злоупотребление алкоголем, частые стрессовые ситуации. Для валидации полученных результатов проводили пермутационный тест – выполнено 1000 пермутаций при 10 кросс-валидациях, что обеспечивает рperm<0,001
Установлены особенности «генетической конституции» больных с ишемическим инсультом на основе комбинаций генов матриксных металлопротеиназ. Выявлена комбинация, являющаяся значимым предиктором риска развития ишемического инсульта: сочетание генотипа 6А/6А rs3025058 MMР-3 с генотипом АА rs11568818 MMР-7 наблюдается у 12,21% пациентов с инсультом и у 7,59% индивидуумов контрольной группы (Х2=4,06, р=0,04). Таким образом, наличие данного сочетания является фактором риска развития ишемического инсульта (ОR=1,67, 95% СI 1,01-2,74) независимо от влияния средовых факторов ишемического инсульта.
В качестве примеров конкретного применения разработанного способа приведено обследование добровольцев русской национальности, являющихся жителями Центрального Черноземья и не являющихся родственниками между собой: проведено генетическое обследование по локусам rs3025058 MMР-3 и rs11568818 MMР-7.
Пример 1. У пациента С. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров было выявлено, что генотип мужчины по локусу rs3025058 MMР-3 – 6А/6А, генотип по локусу rs11568818 MMР-7 – АА. Сочетание генотипа 6А/6А (rs3025058 MMР-3) и генотипа АА (rs11568818 MMР-7) позволило отнести пациента в группу больных с высоким риском развития ишемического инсульта. Дальнейшее наблюдение и результаты ультразвукового дуплексного сканирования (УЗДС) выявили у пациента окклюзивное заболевание сонных артерий (нарушение мозгового кровоснабжения), что подтвердило высокий риск развития инсульта по ишемическому типу.
Пример 2. У пациентки Н. произведен забор венозной крови, при генотипировании ДНК-маркеров выявлено, что ее генотип по локусу rs3025058 MMР-3 – 6А/6А, генотип по локусу rs11568818 MMР-7 – GG. По данным генотипирования пациентка Н. не включается в группу больных с высоким риском развития инсульта. При дальнейшем наблюдении не было зафиксировано нарушений мозгового кровообращения.
Пример 3. У пациента Ф. после забора венозной крови из локтевой вены и последующего генотипирования выявлен генотип 5А/5А по локусу rs3025058 MMР-3 и генотип АА по локусу rs11568818 MMР-7. По данным генотипирования пациент Ф. не включается в группу больных с высоким риском развития ишемического инсульта. Дальнейшее обследование показало, что мозговое кровообращение пациента Ф. соответствует норме.
Применение данного способа позволит на доклиническом этапе формировать среди пациентов группы риска и своевременно реализовывать в этих группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития ишемического инсульта.