НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ И ФЛУОРЕСЦЕНТНОМЕЧЕНОГО ЗОНДА ДЛЯ ВИДОСПЕЦИФИЧНОЙ ЭКСПРЕСС-ИДЕНТИФИКАЦИИ РНК ВИРУСА МАЧУПО МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ
SET OF OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS AND FLUORESCENTLY LABELLED PROBE FOR SPECIES-SPECIFIC EXPRESS-IDENTIFICATION OF RNA OF MACHUPO VIRUS BY METHOD OF POLYMERASE CHAIN REACTION IN REAL TIME

Изобретение относится к наборам олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентномеченого зонда для видоспецифичной экспресс-идентификации РНК вируса Мачупо методом полимеразной цепной реакции в реальном времени и может быть использовано в медицинской практике для выявления генетического материала вируса Мачупо в клинических или секционных образцах для уточнения диагноза, а также для решения научно-исследовательских задач по изучению свойств вируса Мачупо, созданию диагностических, профилактических или лечебных препаратов против вируса Мачупо. Использование специфичных праймеров и зондов позволяет выявлять генетический материал вируса Мачупо в исследуемых образцах методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.
Arenavirus
Arenaviridae
.
Вирус Мачупо является представителем рода  семейства  (http://www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp?version=2011) Вирусный геном сегментирован (L- и S-сегменты) и представлен одноцепочечной РНК.
Вирус Мачупо является возбудителем Боливийской геморрагической лихорадки - острого инфекционного заболевания, характеризующегося природной очаговостью; аспирационным (воздушно-пылевой путь), фекально-оральным и контактным механизмами передачи возбудителя; тяжелым течением с общеинтоксикационным синдромом, экзантемой, геморрагическим синдромом, поражением сердечно-сосудистой и нервной системы.
Calomys callosus
Эндемичной территорией для вируса Мачупо являются сельскохозяйственные районы на северо-востоке Боливии и севере Парагвая. Вспышки заболевания регистрируются с 1959 года с интервалом в несколько лет. Последняя крупная вспышка (более 200 заболевших) произошла в 2008 году [Aguilar P.V., Camargo W., Vargas J. et al. Reemergence of Bolivian hemorrhagic fever, 2007-2008. // Emerg. Infect. Dis. - 2009. - 15(9). - P.1526-28]. Переносчиком вируса Мачупо и источником заражения для человека являются грызуны . Люди инфицируются в результате контактов с инфицированными животными, их экскрементами и мочой, содержащими вирус. Заболевание регистрируется чаще у жителей сельских районов. Кроме этого возможна вторичная передача вируса Мачупо от человека человеку [Charrel R.N., Lamballerie X. Arenaviruses other than Lassa virus. // Antiviral Research. - 2003. - 57(1-2). - P.89-100].
Летальность при заболевании боливийской геморрагической лихорадкой составляет примерно 20 % [Bradfute S.B., Stuthman K.S., Shurtleff A.C., Bavari S. A STAT-1 knockout mouse model for Machupo virus pathogenesis. // Virol. J. - 2011. - 8:300. - doi: 10.1186/1743-422X-8-300].
Актуальность своевременной диагностики лихорадки Мачупо в странах, не являющихся эндемичными территориями, связана с возможностью завоза этой инфекции из Южной Америки.
Известна тест-система для раннего выявления заболевания, вызываемого вирусом Мачупо, на основе метода ИФА с возможностью определения наличия специфических иммуноглобулинов класса М [ S.,  H.,  T. et al. Serological Assays Based on Recombinant Viral Proteins for the Diagnosis of Arenavirus Hemorrhagic Fevers // Viruses. - 2012. - 4(10). - P.2097-114].
Однако иммуноглобулины класса М появляются на 10-20 сут после заражения, что приводит к поздней диагностики заболевания.
Известны наборы праймеров для флуоресцентной количественной ПЦР-диагностики вируса Мачупо (патент Китая № CN101805802, МПК C12Q1/68; C12Q1/70; G01N21/64, опубл. 2010-08-18). Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является методом ранней диагностики аренавирусных инфекций и позволяет обнаруживать РНК вируса Мачупо с первых дней появления клинических признаков.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является ПЦР тест-система для выявления РНК вируса Мачупо методом обратной транскрипции в режиме реального времени. [Vieth S., Drosten Ch., Charrel R., et al. Establishment of conventional and fluorescence resonance energy transfer-based real-time PCR assays for detection of pathogenic New World arenaviruses // J. Clin. Virol. - 2005. - 32. - P.229-35].
50
Однако чувствительность тест-систем выше приведенного аналога и прототипа составляла около 50 ТЦД/реакцию, а аналитическая чувствительность - около 100 геномных эквивалентов/реакцию.
Техническим результатом изобретения является разработка более чувствительного  набора специфичных олигонуклеотидных праймеров и зонда для выявления генетического материала вируса Мачупо в клинических образцах и биологических жидкостях, образцах внешней среды и других вируссодержащих пробах (культуральная вируссодержащая жидкость и др.) методом ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.
Указанный технический результат достигается тем, что набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентномеченого зонда для видоспецифичной экспресс-идентификации РНК вируса Мачупо методом полимеразной цепной реакции в реальном времени включает последовательности олигонуклеотидов,  видоспецифичные для вируса Мачупо и имеющие следующую структуру:
внешний:
5΄→3΄  5΄ TCCTCYTCACCCCTTTTGTTCTTTCT 3΄
внутренний:
5΄→3΄  5΄ CGCACAGTGGATCCTAGGCA 3΄
зонд:
R6G - TGAGTCCACCGRAAGCTGGGRATYTCYTT - BHQ1
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами. На фиг.1 и 2 представлены кривые флуоресценции на канале R6G/Yellow (530 nm/555 nm) амплификатора Rotor Gene 6000.
В приложении приведены олигонуклеотидные последовательности, видоспецифичные РНК вируса Мачупо.
Методика получения набора праймеров и зонда. Диагностические праймеры и флуоресцентно-меченый зонд конструировались для участка S-сегмента генома вируса Мачупо и оптимизации концентраций компонентов реакционной смеси и условий проведения ПЦР. Для контроля амплификации были получены рекомбинантные плазмиды, несущие вирусспецифический участок ДНК-матрицы.
На начальном этапе был проведен анализ нуклеотидных последовательностей геномов вируса Мачупо, имеющихся в базе данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), и определены консервативные участки. В качестве мишени для диагностических праймеров и зонда был выбран находящийся в S-сегменте вирусного генома участок гена N, кодирующего нуклеокапсидный белок.
Анализ свойств олигонуклеотидных праймеров и зондов проводился с использованием программы Vector NTI 9.0.0 (InforMax).
Для идентификации генетического материала вируса Мачупо методом ПЦР в реальном времени были подобраны праймеры и зонд, представленные ниже:
F/MACHV
TCCTCYTCACCCCTTTTGTTCTTTCT
R/MACHV
CGCACAGTGGATCCTAGGCA
Z/MACHV
(R6G)-TGAGTCCACCGRAAGCTGGGRATYTCYTT-(BHQ1)
Пример 1. Проверка аналитической чувствительности набора праймеров и зондов.
Для контроля амплификации были получены положительные контрольные образцы (ПКО), представляющие собой рекомбинантные плазмиды, несущие вирусспецифические вставки, являющиеся матрицей для амплификации вирусспецефических ДНК-фрагментов.
Для проведения ПЦР в режиме реального времени, в качестве анализируемых образцов использовали рекомбинантную плазмидную ДНК, включающую вставку ДНК, соответствующую детектируемому участку генома вируса Мачупо.
Условия проведения амплификации оптимизировались по следующим параметрам: концентрация ионов магния в реакционной смеси; концентрация праймеров и зонда в реакционной смеси; температура отжига праймеров.
Для определения аналитической чувствительности из концентрированного раствора плазмидной ДНК были приготовлены последовательные 10-кратные разведения. Определение концентрации ДНК  осуществляли при помощи флуориметра QUBIT (Invitrogen, США) и наборов реагентов того же производителя.
ПЦР в режиме реального времени для детекции генетического материала вируса Мачупо проводили в приборе Rotor Gene 6000 (Corbett Research, Австралия), детекцию результатов амплификации (рисунок 1) осуществляли по каналу R6G/Yellow (530 nm/555 nm).
Минимальное количество ДНК-матриц, детектируемое в ПЦР после оптимизации условий проведения реакции, выраженное в ГЭ (геномных эквивалентах), составило 10 ГЭ в образце.
10
9
8
7
6
5
4
3
2
На фиг.1 представлены кривые флуоресценции на канале R6G/Yellow (530 nm/555 nm) амплификатора Rotor Gene 6000 (Corbett Research, Австралия). Стрелкой обозначена кривая флуоресценции, соответствующая ПКО. Обозанчение образцов, содержащих разные концентрации ДНК-матрицы: 1 - 10 ГЭ; 2 - 10 ГЭ; 3 - 10 ГЭ; 4 - 10 ГЭ; 5 - 10 ГЭ; 6 - 10 ГЭ; 7 - 10 ГЭ; 8 - 10 ГЭ; 9 - 10 ГЭ; 10 - 10 ГЭ в образце.
Пример 2. Определение РНК вируса Мачупо в вируссодержащих образцах.
5
Для проверки специфичности использовали культуральную вируссодержащую жидкость (КВЖ) с титром вируса Мачупо 4,2 × 10БОЕ/мл. Для проведения реакции использовали 20 мкл КВЖ.
Инактивацию образцов и выделение РНК проводили в условиях, регламентированных Методическими указаниями МУ 1.3. 2569 -09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности».
Процедуру выделения РНК из исследуемого материала проводили с использованием набора реагентов «Рибо-сорб» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) в соответствии с инструкцией по применению.
Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием набора реагентов «Реверта-L» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) в соответствии с инструкцией по применению.
ПЦР в режиме реального времени проводили в реакционной смеси следующего состава (на 1 исследование):
кДНК
5 мкл
10×Taq буфер без Mg<sup>2+</sup>
3 мкл
100 mM раствор MgCl<sub>2</sub>
1 мкл
5 mM раствор dNTP
1 мкл
Смесь праймеров и зондов (по 2 о.е. каждого)
по 1 мкл каждого
Smart Taq DNA-Полимераза 5 ед/ мкл
0,3 мкл
Вода для ПЦР
до 30 мкл общего объема
ПЦР в режиме реального времени и регистрацию результатов проводили в приборе Rotor Gene 6000 (Corbett Research, Австралия) по следующей программе, представленной в таблице 1.
Таблица 1. Программа проведения ПЦР
Температура (<sup>о</sup>С)
Время (минуты:секунды)
Количество циклов
95
05:00
1
95
00:10
45
54
00:20
72
00:20
Измерение флуоресценции осуществляли при температуре 54 С на канале R6G/Yellow.
Результаты интерпретировали на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов.
На фиг 2 приведены кривые флуоресценции образцов, содержащих вирус Мачупо, на канале R6G/Yellow (530 nm/555 nm) амплификатора Rotor Gene 6000 (Corbett Research, Австралия), из которых видно, что используемые праймеры и зонд выявляли РНК вируса Мачупо в образце, кривая накопления флуоресценции имела характерную «сигмовидную» форму и пересекала пороговую линию при значение Ct  не больше 10.
Таким образом, минимальное количество РНК вируса, детектируемое в ПЦР после оптимизации условий проведения реакции, выраженное в ГЭ (геномных эквивалентах), составило 10 ГЭ в образце, вследствие чего чувствительность заявляемых праймеров значительно выше прототипа.
Приложение
<110>  Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный
научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"» (ФБУН
ГНЦ ВБ "Вектор")
<120>  Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентномеченого зонда для видоспецифичной экспресс-идентификации РНК вируса Мачупо методом полимеразной цепной реакции в реальном времени
<210>  1
<223>  Последовательности олигонуклеотидов видоспецифические к вирусу Мачупо,
<400>  1   для выявленя РНК вируса Мачупо:
внешний:
5΄→3΄  5΄ TCCTCYTCACCCCTTTTGTTCTTTCT 3΄                      (26 н)
внутренний:
5΄→3΄  5΄ CGCACAGTGGATCCTAGGCA 3΄                                   (20 н)
зонд:
R6G - TGAGTCCACCGRAAGCTGGGRATYTCYTT - BHQ1       (29 н)