УНИВЕРСАЛЬНАЯ ОПТИЧЕСКИ ПРОЗРАЧНАЯ ПЛАСТИНА ДЛЯ СНИЖЕНИЯ ЗАПОТЕВАНИЯ ЗАПЕЧАТАННЫХ ПЛАНШЕТОВ

Полезная модель относится к области прикладных исследований с помощью планшетных ридеров, включая спектрофотометрические, спектрофлуориметрические и люминесцентные исследования и предназначена для снижения запотевания поверхности крышек или пленки, используемых для запечатывания планшетов, например, 96- или 384-луночных, что необходимо для точного измерения спектров поглощения или излучения образцов в лунках.
Одной из задач современных исследований и определений различных аналитов является повышение производительности. Очень перспективными являются исследования, в ходе которых о концентрации определенных аналитов можно судить по изменению окраски реакционной смеси или уровню флуоресцентного сигнала, образцов помещенные в лунки планшетов. Это позволяет повысить производительность проведения исследований, как за счет увеличения количества одновременно исследуемых образцов, так и за счет ускорения процедуры детекции оптического сигнала. При этом проведение многих химических и ферментативных реакций требует дополнительного нагрева реакционной смеси, а учитывая, что для снижения контаминации образцов и удобства обращения с ними планшеты обычно запечатывают либо путем накрывания крышками, либо путем заклеивания специальными пленками, что приводит к запотеванию областей над поверхностью лунок из-за частичного испарения образцов, которая наблюдается даже при температурах ниже кипения, и их дальнейшей конденсации, снижая эффективность считывания оптического сигнала и ухудшая воспроизводимость результатов. Единственным способом избавиться от образовавшегося конденсата перед сканированием планшета является удаление пленки или крышки, однако это может привести к кросс-контаминации образцов, а также крайне нежелательно при анализе опасных образцов (например, с едкими и летучими химическими соединениями или при анализе различных заболеваний). Таким образом, решаемая задача является актуальной для промышленного применения в планшетных спектрофотометрах, спектрофлуориметрах и люменометрах.
Наиболее распространенным подходом для снижения запотевания элементов, через поверхность которых происходит считывание оптического сигнала, является применение антизапотевающих покрытий на основе гидрофобных или гидрофильных соединений. Так в патенте [1], описана система для оптического наблюдения, в которой окуляры покрыты двумя противозапотевающими слоями, которые представляют собой композицию из неорганического алкоголята или полимера с ОН радикалами из неорганического алкоголята толщиной от 0,5 до 10 мкм. Известное решение обладает следующими недостатками: во-первых, данный слой может разрушаться под действием агрессивных химических элементов и вносить изменение в эффективность протекания реакции в реакционной среде, во-вторых, оно имеет ограниченную антизапотевающую способность. Кроме того, данное покрытие может способствовать нежелательному отражению оптического сигнала, снижая эффективность его детекции, а также его нанесение на поверхность крышки планшета усложняет технологию ее изготовления и повышает ее себестоимость.
Аналогичный подход описан в патенте [2]. В нем описана высокопроизводительная система для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР), в которой индивидуальные лунки, в которых проходит ПНР, образованы микрофлюидной системой, которая помещена между двумя пластинами, причем поверхность пластины, которая находится со стороны оптической системы, покрыта гидрофильным или гидрофобным покрытием для снижения запотевания. Этот подход также обладает всеми означенными недостатками выше описанного решения, а также не может применяться для планшетных ридеров.
Также для устранения эффекта запотевания применяются нагревающие элементы. Например, в патенте [3], в котором описывается оптическая система, для детекции загрязнений и неровностей на прозрачных подложках используется нагревающий элемент, который может быстро нагреть поверхность линз для удаления запотевания. При этом к недостаткам данного решения относится то, что этот нагревательный элемент расположен в корпусе прибора и нагревает все его элементы, что применительно к конструкции планшетных ридеров будет оказывать негативный эффект на чувствительные к теплу элементы, например, светочувствительную матрицу, которая, как правило наоборот, требует дополнительного охлаждения. Кроме того, данное решение несовместимо с планшетными ридерами, так как не обеспечивает направленного нагревания только крышки планшета, а также не всегда может физически в нем поместиться. Кроме того, установка подобного нагревательного элемента требует для своей установки разборки планшетного ридера, что может повлечь нарушения в его работе.
Проблема испарения и конденсации образцов особенно остро стоит в приборах для проведения реал-тайм ПЦР, где температура реакционной смеси может составлять 95°С. В таких приборах реакция проходит в герметично закрытых планшетах, а детекция происходит через крышку планшета. В патенте [4], для решения проблемы испарения и конденсации жидкости на поверхности крышки планшета, используется нагревательная крышка, которая выполняет прижимную функцию, дополнительно закупоривая планшеты, а также нагревательную функцию, которая препятствует конденсации образца и запотеванию крышки планшета. Для считывания оптического сигнала крышка может содержать сквозные отверстия, количество которых может быть 96, 384 или равняться количеству лунок в планшете. Отверстия могут быть круглыми, квадратными или прямоугольными и обеспечивать прохождение оптического сигнала в одну или, например, четыре лунки планшета, обеспечивая универсальность для 96- и 384-луночного планшета. К недостаткам известного решения стоит отнести то, что данная крышка должна точно позиционироваться относительно плоскости планшета, чтобы отверстия находились непосредственно над лунками, не препятствуя считыванию оптического сигнала. Кроме того, так как фактически нагреваемая область не соприкасается с поверхностью крышки планшета, расположенной над лункой, где и происходит испарение, приходится сильнее ее разогревать для препятствия запотеванию, что также может негативно сказываться на остальных элементах планшетного ридера, например, на его светочувствительной матрице. Также, для установки подобной крышки требуется разборка планшетного ридера, что может повлечь нарушения в его работе.
Ближайший аналог предлагаемому нами техническому решению для снижения запотевания крышек планшетов для применения в планшетных ридерах не обнаружен.
Технический результат предлагаемой полезной модели заключается в создании универсальной оптически прозрачной пластины для снижения запотевания запечатанных планшетов, позволяющей повысить точность и чувствительность проведения спектрофотометрических, люминесцентных и спектрофлуориметрических измерений, а также улучшить воспроизводимость результатов измерений, за счет снижения конденсации паров жидкости на поверхности крышки/пленки планшета и препятствовать ее запотеванию, которая может применяться с широким спектром планшетных ридеров, и не требует их разборки или изменения конструкции для ее установки.
Технический результат достигается тем, что применена универсальная оптически прозрачная пластина для снижения запотевания запечатанных планшетов, состоящая из оптически прозрачной плоской подложки, линейные размеры которой соответствуют размеру и форме планшета, поверхность которой покрыта слоем оптически прозрачного материала, обладающего возможностью нагрева под действием электрического тока, а также электродов для обеспечения возможности соединения с блоком контроля напряжения.
Возможен первый частный случай, когда в качестве материала оптически прозрачной плоской подложки применяют стекло, полиимид, диоксид кремния или полистирол.
Возможен второй частный случай, в котором толщина оптически прозрачной плоской подложки составляет от 0,5 до 3 мм.
Возможен третий частный случай, когда в качестве слоя оптически прозрачного материала, обладающего возможностью нагрева под действием электрического тока, применяют оксид индия-олова, легированный фтором оксид олова, легированный алюминием оксид цинка, углеродные нанотрубки, графен, металлические наностержни, электропроводящие полимеры или их комбинации.
Возможен четвертый частный случай, в котором толщина слоя оптически прозрачного материала, обладающего возможностью нагрева под действием электрического тока, составляет от 2 нм до 200 мкм.
Возможен пятый частный случай, когда температура подогреваемой пластины может быть задана в диапазоне от 0,1 до 105°С выше температуры окружающей среды.
Благодаря оптической прозрачности предлагаемой пластины, не требуется ее точное позиционирование относительно лунок планшета, что делает ее совместимой как со стандартными планшетами на 96 или 384 лунки, так и с другими менее распространенными форматами планшетов. Благодаря малой толщине (0,5-3 мм) пластина может быть беспрепятственно помещена на крышку или пленку, использованную для запечатывания планшета, а затем вместе с планшетом загружена в планшетный ридер для инкубации или анализа оптического сигнала. Слои оптически прозрачных материалов, обладающих возможностью нагрева под действием электрического тока, обладают различными коэффициентами поглощения в заданных диапазонах длин волн, а для подачи на них напряжения используются токопроводящие электроды, расположенные по торцам пластины. Для подачи напряжения и контроля температуры пластины применен блок контроля напряжения, который может питаться как от сети переменного тока, так и, например, от USB разъема компьютера, что позволит регулировать температуру прогрева пластины как механическим путем (реостатом), так и программным заданием напряжения с компьютера. Кроме того, стоит отметить, что благодаря прилеганию ко всей поверхности крышки планшета и соответственно эффективной теплопередаче, а также малой теплоемкости подогреваемой пластины (за счет материала ее изготовления и толщины порядка 0,5-3 мм), она не вызывает дополнительного перегрева компонентов планшетного ридера. При подаче напряжения на контакты оптически прозрачной подогреваемой пластины, она начинает разогреваться и прогревать поверхность крышки планшета или использованной для запечатывания пленки. Благодаря оптической прозрачности подложки пластины и слоя материала, способного к нагреву под действием электрического тока, сканирование оптического сигнала лунок планшета можно проводить без удаления пластины, что позволяет не только повысить удобство проведения эксперимента, но и сократить время его проведения.
На фиг. 1 представлена принципиальная схема, иллюстрирующая конкретный пример оптически прозрачной подогреваемой пластины, совместимой с планшетными ридерами. На фиг. 1 цифрами обозначены следующие элементы: оптически прозрачная плоская подложка - 1; слой оптически прозрачного материала - 2, электроды для соединения с блоком контроля напряжения - 3, блок контроля напряжения - 4.
Функционирование оптически прозрачной подогреваемой пластины, совместимой с планшетными ридерами, раскрывается на нижеследующих примерах, для чего была изготовлена универсальная оптически прозрачная пластина. Известным способом была изготовлена оптически прозрачная плоская подложка из стекла размером 123 × 81 × 1 мм (дл. × шир. × толщ.), со скошенными углами (скос под 45° отступив на 3 мм от угла). На нее известным способом был нанесен слой оксида олова, легированный фтором (500 нм), и слой оксида цинка, легированный алюминием (200 нм). Определенная известным способом оптическая прозрачность данной подогреваемой пластины составляет около 90% в диапазоне длин волн от 400 до 800 нм. В качестве электродов использовалась медная пленка, закрепленная по краям подогреваемой пластины с помощью токопроводящего клея. Напряжение, подаваемое на прозрачную подогреваемую пластину, контролировалось с помощью реостата.
Пример 1.
В лунки A1-D12 двух обычных 96-луночных планшетов вносили по 200 мкл водного раствора (2,5 г/л) кумасси бриллиантовый синий. В лунки Е1, F1, G1 и H1 обоих планшетов вносили по 200 мкл кумасси с концентрацией 4 г/л, в лунки Е2, F2, G2 и Н2 вносили по 200 мкл кумасси с концентрацией 2 г/л и так далее двойными разведениями до концентрации 0,003906 г/л в лунки E11, F11, G11 и H11. В лунки Е12, F12, G12 и Н12 обоих планшетов внесли по 200 мкл воды. Контрольный и опытный планшеты накрыли крышками, при этом на опытный планшет поместили прозрачную подогреваемую пластину, а на контрольный нет. Температуру платины установили на +40°С, относительно температуры окружающей среды. Оба планшета поместили в термостат, поддерживающий внутреннюю температуру +50°С, на 1 час. Спустя 1 час оба планшета извлекли из термостата, при этом на крышке контрольного планшета были видны следы испарения и конденсации жидкости, и провели сканирование оптической плотности, при длине волны 465 нм, в каждой из лунок опытного и контрольного планшета с помощью планшетного ридера, не снимая предлагаемой пластины с поверхности крышки опытного планшета. В результате анализа оптической плотности лунок A1-D12 обнаружено, что среднее значение оптической плотности в контрольном планшете составляет 0,188 оптических единиц (ОЕ), разброс между максимальным и минимальным значением составлял 0,045 ОЕ, а среднеквадратичное отклонение (СКО) равно 0,0189 ОЕ, при этом в опытном планшете среднее значение составляет 0,191 ОЕ, разброс между максимумом и минимумом составлял 0,012 ОЕ, а СКО - 0,0025 ОЕ. Приведенные значения были нормированы на оптическую плотность в лунках Е12, F12, G12 и H12, для каждого из планшетов. Это показывает, что применение предлагаемой подогреваемой пластины позволяет повысить точность определения оптического сигнала, снизить погрешность и улучшить воспроизводимость результатов. Анализ оптической плотности в лунках Е1-Н12 показывает, что в контрольном планшете прибор перестает детектировать статистически значимое различие оптических плотностей между лунками с водой и кумасси при концентрациях ниже 0,0625 г/л, в то время как в опытном планшете статистически значимое различие между лунками с водой и кумасси наблюдается вплоть до концентрации 0,015625 г/л, что указывает на то, что снижение запотевания крышки планшета позволяет статистически достоверно детектировать меньшие оптические плотности, а, следовательно, позволяет повысить чувствительность.
Пример 2.
Отдельно стоит обратить внимание, как применение предлагаемой пластины позволяет расширить область применения планшетных ридеров. Так недавно разработанная технология петлевой изотермической амплификации позволяет амплифицировать фрагменты ДНК при стационарном поддержании температуры +65°С в течение 0,5-1 часа. При этом из-за очень высоких рисков контаминации планшеты, как правило, запечатанные прозрачными пленками, нельзя распечатывать. В процессе инкубирования, при повышенных температурах, жидкость из образца частично испаряется и конденсируется на поверхности пленки, препятствуя нормальному считыванию оптического сигнала. Конечно, подобные реакции петлевой изотермической амплификации можно проводить и анализировать в реал-тайм амплификаторах, однако они весьма дороги.
Нами известным способом была проведена реакция изотермической амплификации в термостате при температуре +65°С в течение 1 часа в двух планшетах, герметично запечатанных прозрачной пленкой. Во все использованные лунки планшетов (А1-А12) было помещено по 150 мкл одинаковой предварительно подготовленной смеси для амплификации. Поверхность первого планшета (контрольного) в ходе амплификации не накрывалась предлагаемой пластиной, поверхность второго планшета (опытный) - была накрыта пластиной, температура которой поддерживалась на 40°С выше температуры окружающей среды. По завершении инкубации оптический сигнал от флуоресцентных зондов, примененных в процессе амплификации, был проанализирован в контрольном и опытном образцах. В результате установлено, что среднее значение детектированной флуоресценции в контрольном планшете 4769 относительных единиц флуоресценции (ОЕЦ), (СКО - 613 ОЕЦ), а в опытном 6113 ОЕЦ, (СКО - 198 ОЕЦ). Проведенный эксперимент демонстрирует, что использование обычных флуоресцентных планшетных ридеров для анализа результатов петлевой изотермической амплификации, возможно только при решении проблемы конденсации образцов на поверхности запечатанных планшетов, так как в противном случае не удается получить достоверных результатов измерения флуоресцентного сигнала с малой погрешностью.
Таким образом, предложенная универсальная оптически прозрачная пластина для снижения запотевания запечатанных планшетов, совместимая с планшетными ридерами, позволяет повысить чувствительность, точность и воспроизводимость спектрофотометрических, спектрофлуориметрических и люминесцентных исследований с помощью планшетных ридеров за счет снижения эффективности конденсации растворов на поверхности крышки или адгезивной пленки, которые используются для запечатывания планшетов. Благодаря малой (порядка 0,5-3 мм) толщине она совместима с большинством планшетных ридеров и не препятствует загрузке планшета.
Источники информации
1. Keiji Ohta-ku Ikemori, Keiji Ohta-ku Ohtaka. Optical observation system and optical device using the same. Патент DE 69813119 T2.
2. John Linton, Arrin Katz, Colin Brenan, Karl Yoder, Robert Hess, Leila Hasan, Robert Ellis, Tanya Kanigan, Kristine Friesen, Thomas Morrison, Javier Garcia. Thermal Cycling Apparatus and Method. Патент US 20140179566 Al.
3. Jacques Sabater, Loan My Leba. Detection detector on the surface of a transparent plate. Патент FR 2788131 Al.
4. Yong Chu, Jeffrey Marks, Jacob Freudenthal, Mingsong Chen, Tiong Han Toh, Mauro Aguanno, Lik Seng Lau, Lian Seng Loh, Kok Siong Teo, Zeng Wei Chu, Xin Mathers, Michael Uy, Huei Steven Yeo, Kuan Moon Boo, Way Xuang Lee, Chin Yong Koo, Wei Fuh Teo, Soo Yong Lau, Hon Siu Shin, Zeqi Tan, Thomas Wessel, David Woo. Системы и способы для биологического анализа. Патент RU 2702577 С2.