СПОСОБ ОБРАБОТКИ ИМПУЛЬСНЫМ ЭЛЕКТРИЧЕСКИМ ПОЛЕМ И МОЛОЧНЫЙ ПРОДУКТ, СОДЕРЖАЩИЙ БИОАКТИВНЫЕ МОЛЕКУЛЫ, ПОЛУЧАЕМЫЕ ДАННЫМ СПОСОБОМ
METHOD OF PROCESSING BY PULSED ELECTRIC FIELD AND MILK PRODUCT CONTAINING BIOLOGICALLY ACTIVE MOLECULES, OBTAINED USING SAID METHOD

Настоящее изобретение относится к способу снижения микробной нагрузки в жидкой или вязкой композиции, который включает обработку импульсным электрическим полем (PEF).
Уровень техники и проблемы, решаемые изобретением
Микробиологическая безопасность является самым важным требованием к пищевым продуктам. Микроорганизмы, которые могут быть найдены в пищевых продуктах, могут вызывать разнообразные болезни, такие как, например, листериоз. Высокая пищевая, функциональная ценность, а также хороший вкус являются дальнейшими важными требованиями к пищевым продуктам. Традиционные способы производства и консервации гарантируют микробиологическую безопасность, но негативным образом влияют на вкус и пищевую ценность. Следовательно, необходимо разработать новые способы, чтобы привести к минимуму влияние способа на питательные и полезные для здоровья компоненты. Кроме того, требования к новым способам заключаются в том, чтобы они были экологически и экономически оправданными.
Молоко по своим питательным свойствам является ценным пищевым продуктом, содержащим кроме основных макронутриентов витамины и также биоактивные молекулы с полезными для здоровья свойствами или активностью, которые различными способами оказываются полезными для потребителя. Традиционно и в крупномасштабных способах микробиологическая безопасность молока обеспечивается термической пастеризацией или ультравысокотемпературной обработкой (UHT). Оба способа приводят к существенной деградации биоактивных молекул, которые естественным образом присутствуют в молоке, что неоднократно отмечалось в литературе. В частности, многие витамины и биологически активные белки, которые естественным образом присутствуют в молоке, чувствительны к тепловому воздействию. Кроме того, способы консервации, которые используют нагревание для консервации пищевых продуктов, неблагоприятно влияют на вкус пищи.
Таким образом, требуются новые способы, которые предпочтительно не используют нагревание для консервации. Одним из возможных способов нетермической консервации является применение импульсных электрических полей (PEF). Данный способ использует электрический ток для инактивации микроорганизмов и сохранения
микробиологической безопасности пищевых продуктов. Ингредиенты и вкус в основном не затрагиваются данным способом. Механизм, лежащий в основе способа инактивации микроорганизмов, называется электропорацией. Благодаря переменному электрическому полю высокого напряжения клеточная мембрана становится проницаемой, и в результате происходит лизис клетки.
М. Walkling-Ribeiro et al., Int. J. Food Microbiol. 144 (2011) 379-386 сравнивают и суммируют эффективность PEF-обработки, микрофильтрации и традиционной термической пастеризации на микробную инактивацию. В данной публикации не обсуждается потеря биоактивных молекул, связанная с различными обработками, и в самом деле, условия, использованные для PEF-обработки молока в данной публикации, делают маловероятным сохранение активности биоактивных молекул в ходе способа.
В патенте US 2008/0317823 предложен способ обработки под давлением биоактивной композиции в целях повышения ее сохранности (срока хранения). Способы обработки под давлением, описанные в данном документе, являются энергетически и финансово затратными. Кроме того, обработка под давлением является периодическим процессом, и было бы предпочтительно иметь непрерывную обработку для повышения микробиологической безопасности продуктов на молочной основе.
Toepfl, S., Heinz, V. und Knorr, D. (2006) описывают существующие знания в области применения технологи импульсного электрического поля для пищевой промышленности в: Pulsed Electric Field Treatment of Foods, Ed: Raso, J. und Heinz, V., p. 197-221, Elsevier, Oxford, UK.
Учитывая вышесказанное, задачей настоящего изобретения является предложить способ понижения микробной нагрузки в жидком или вязком пищевом продукте, содержащем биоактивные молекулы, одновременно сохраняя активность и функциональность биоактивных молекул, присутствующих в пищевом продукте.
Иначе говоря, задачей является предложить способ повышения или обеспечения микробиологической безопасности жидкой или вязкой композиции, содержащей биоактивные молекулы, при этом указанный способ не уменьшает или не уменьшает в значительной степени активность или содержание биоактивных молекул, присутствующих в пищевом продукте.
Задачей настоящего изобретения является, в частности, сохранить биологическую активность биоактивных молекул, которые присутствуют естественным образом в молоке. Тем не менее, количество микроорганизмов, в частности жизнеспособных микроорганизмов, которые могут присутствовать в молоке, должно быть существенно сокращено, предпочтительно ниже предела обнаружения.
Одной из задач изобретения является предложить способ нетермической пастеризации, который так же эффективен, как и термическая пастеризация, с точки зрения увеличения безопасности пищевого продукта и снижения микробного числа, но не имеет недостатков термической пастеризации. Такими недостатками являются денатурация белка и потеря биоактивных молекул, потеря биологической активности молекул, присутствующих в молоке, изменение вкуса и иногда изменение цвета.
В частности, настоящее изобретение решает проблему инактивации биологически активных компонентов в молоке в ходе термической пастеризации или консервации. Термическую пастеризацию обычно проводят с жидким молоком. Температуры составляют около 72°С в течение не менее 15 секунд выдерживания (Kessler 2006, International Dairy Federation, стр. 175), что является слишком высокой интенсивностью процесса для биологически активных компонентов, в частности биологически активных белков, таких как лактоферрин, IgA, IgG, TGF-β1 и 2.
Настоящее изобретение также решает проблему получения композиции, в частности молока, которая имеет пониженную микробную нагрузку по сравнению с необработанной композицией, или которая имеет микробную нагрузку, которая не влияет на безопасность и/или срок хранения продукта.
Изобретение также решает проблему получения жидкой или сухой форм композиций, таких как композиции на основе молока или содержащих молоко компонентов, включая сухое молоко, сухую молочную сыворотку, сухой казеин, сухой молочный протеин и тому подобное, в которых биоактивные молекулы, естественным образом присутствующие в молоке, остаются активными в сухих, в частности высушенных распылением композициях. Процессы сублимационной сушки или распылительной сушки при низких температурах могут проводиться без разрушения активности биоактивных молекул, или без ее полного разрушения.
Настоящее изобретение направлено на достижение вышеуказанных задач и обеспечивает способы, применения и композицию для получения преимуществ, изложенных выше. Задачи и проблемы, решаемые настоящим изобретением, являются частью настоящего изобретения.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение основано на обнаружении того, что обработка импульсным электрическим полем (PEF) может эффективным образом использоваться для устранения даже устойчивых штаммов микроорганизмов, которые могут быть найдены в молоке. Интересно заметить, что можно определить технологические параметры, при которых активность биоактивных молекул, естественным образом присутствующих в молоке, в частности в сыром молоке, может в значительной степени сохраняться.
Способ изобретения особенно предпочтителен по сравнению с термической пастеризацией в отношении целостности белков и активности витаминов, которые присутствуют естественным образом в молоке. Белки, содержащиеся в композиции изобретения, сохраняют в значительной степени свое нативное состояние и, таким образом, в значительной степени проявляют свою биологическую активность. Таким образом, изобретение предлагает также PEF-обработанную композицию, содержащую один или несколько определенных белков, присутствующих естественным образом в молоке, в которой значительное количество указанного белка содержится в нативной форме.
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает способ получения композиции, которая является в пищевом и/или микробиологическом отношении безопасной и которая содержит биоактивные молекулы, присутствующие в сыром молоке в активной форме, и/или которая дает преимущества для здоровья, связанные с биоактивными молекулами, присутствующими в сыром молоке.
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает способ получения композиции, которая содержит биоактивные белки, присутствующие в сыром молоке в нативной форме, и/или которое дает преимущества для здоровья, связанные с нативными белками, присутствующими в сыром молоке.
Согласно одному аспекту изобретение относится к способу повышения и/или обеспечения безопасности композиции, причем способ включает стадию подвергания указанной композиции PEF-обработке.
Согласно одному аспекту изобретение относится к способу повышения срока хранения композиции, в частности в охлажденном состоянии, причем способ включает стадию подвергания указанной композиции PEF-обработке.
Согласно одному аспекту изобретение относится к способу понижения микробной нагрузки в композиции, причем способ включает стадию подвергания указанной композиции PEF-обработке.
Согласно одному аспекту изобретение относится к способу существенного понижения микробного числа в композиции, причем способ включает стадию подвергания указанной композиции PEF-обработке.
Согласно одному аспекту изобретение относится к способу инактивации микроорганизмов в композиции в случае или в той степени, в которой они присутствуют в указанной композиции, причем способ включает стадию подвергания указанной композиции PEF-обработке. Таким образом, способ предпочтительно осуществляют в качестве меры предосторожности, даже если не ожидается, что в композиции могут присутствовать микроорганизмы, в частности патогенные микроорганизмы.
Настоящее изобретение предлагает способ понижения микробной нагрузки жидкой или вязкой композиции, содержащей один или несколько типов биоактивных молекул, встречающихся естественным образом в молоке, причем способ включает стадии подвергания указанной композиции обработке импульсным электрическим полем (PEF), в которых при указанной PEF-обработке указанная композиция подвергается воздействию удельной энергии 400 кДж на кг композиции или менее, и в которых указанная композиция подвергается воздействию PEF с напряженностью поля 10-20 кВ/см, причем PEF-обработку применяют в одной или нескольких колинеарных камерах обработки, имеющих канал, при этом композицию непрерывно направляют через канал камеры обработки, где в канале предусмотрен внутренний элемент, таким образом, что в камере обработки композицию направляют вокруг внутреннего элемента, который является инертным и неэлектропроводящим.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, обработанную импульсным электрическим полем (PEF), которая является микробиологически безопасной и которая содержит один или несколько типов биоактивных молекул, естественным образом встречающихся в молоке, при этом по меньшей мере 30% соответствующих молекул находится в активной форме. Указанные биоактивные молекулы предпочтительно выбирают из: белков, выбранных из антимикробных факторов, иммуноглобулинов, факторов роста, цитокинов и/или про/противовоспалительных факторов, хемокинов, ферментов, в том числе пищеварительных ферментов, гормонов и транспортеров, гликомакропептида, β-лактоглобулина, α-лактальбумина, белков мембран жировых глобул молока и сочетаний из двух или более вышеупомянутых веществ; одного или нескольких биоактивных липидов, которые присутствуют естественным образом в молоке, таких как бутират, сфинголипиды, фосфолипиды, мембраны жировых глобул молока, длинноцепочечные полиненасыщенные жирные кислоты; одного или нескольких витаминов, которые естественным образом присутствуют в молоке, таких, как витамин A, B1, В2, В3, В5, В6, В7, В9, В12, С, D и K; сиаловой кислоты, нуклеиновых кислот, олигосахаридов, аминокислот и; таурина, при этом указанная композиция имеет микробную нагрузку, которая в достаточной степени снижена, чтобы быть безопасной для потребления человеком, в которой по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 35%, предпочтительно по меньшей мере 40% указанных выбранных молекул присутствует в активной и/или нативной форме.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, в частности PEF-обработанной композиции, которая является безопасной в микробиологическом и/или пищевом отношении и которая содержит биоактивные молекулы, присутствующие в сыром молоке в активной форме, и/или которая создает преимущества для здоровья, связанные с биоактивными молекулами, присутствующими в сыром молоке.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, в частности PEF-обработанной композиции, которая является безопасной в микробиологическом и/или пищевом отношении и которая содержит один или несколько белков, встречающихся естественным образом в молоке, в которой по меньшей мере часть указанного белка присутствует в нативной форме, и/или где композиция обеспечивает одно или несколько преимуществ для здоровья сырого молока и/или нативных белков.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, обработанной импульсным электрическим полем (PEF), содержащую по меньшей мере один белок, имеющий последовательность аминокислот, соответствующую последовательности аминокислот белка, встречающегося естественным образом в молоке, в которой по меньшей мере 30% указанного белка присутствует в нативной форме.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к PEF-обработанной композиции, которая является микробиологически безопасной и которая содержит один или несколько белков, естественным образом встречающихся в молоке, в которой по меньшей мере 30% соответствующего белка находится в нативной форме.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, обработанной импульсным электрическим полем (PEF), содержащую один или несколько белков, обладающих биологической активностью, в которой указанная активность соответствует по меньшей мере 30% активности, обнаруживаемой в необработанном стандарте, и/или в которой по меньшей мере 30% указанного белка присутствует в нативной форме.
Способы изобретения имеют преимущество в том, что они не инактивируют или инактивируют только в сравнительно низкой степени биологические молекулы, которые присутствуют в композиции.
Дополнительные аспекты и предпочтительные варианты осуществления изобретения представлены в прилагаемой формуле изобретения и изложены более подробно в описании ниже.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 схематически показано строение или обобщенная конструкция коллинеарной камеры PEF-обработки, которая используется в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления способа изобретения.
На фиг. 2 схематически показана электрическая схема цепи, которая может использоваться для создания электрических импульсов для проведения PEF-обработки в соответствии с данным изобретением.
На фиг. 3 схематически показан пример PEF-установки для PEF-обработки жидких или вязких композиций в соответствии с изобретением.
На фиг. 4 показана пара камер обработки, используемых в PEF-установке, представленной на фиг. 2.
На фиг. 5 представлен вид сбоку коллинеарной камеры обработки, содержащей вставку в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления способа изобретения.
На фиг. 6 представлен вид в продольном разрезе камеры обработки, показанной на фиг. 5.
На фиг. 7 А и 7В показано влияние начальной температуры сырого молока и удельной энергии, примененной при PEF-обработке, на инактивацию добавленных соответственно E. coli и L. innocua. При начальной температуре 30°С для достижения инактивации необходимо меньшее количество удельной энергии.
На фиг. 8 показана PEF-инактивация микробного числа E. coli и L. innocua в инокулированном сыром молоке в зависимости удельной энергии. Температуру сырого молока приводили к 30°С перед PEF-обработкой и использовали пару коллинеарных камер обработки со вставкой, как показано на фиг. 6. На фиг. 8 показано, что при 244 кДж/кг была достигнута максимальная микробная инактивация.
На фиг. 9 А и 9В показано влияние конструкции камеры обработки и удельной энергии, примененной при PEF-обработке, на инактивацию в числах КОЕ, соответственно, E. coli и L. innocua, добавленных в сырое молоко, имеющее начальную температуру 30°С. Конструкция, использующая коллинеарную камеру обработки со вставкой «торпеда» (фиг. 6), требует меньшего количества удельной энергии для достижения инактивации.
На фиг. 10 А и В показано влияние конструкции камеры обработки и конечной температуры PEF-обработанной композиции на инактивацию в числах КОЕ, соответственно, E. coli и L. innocua, добавленных в композицию (сырое молоко). Использование коллинеарной камеры обработки со вставкой («торпеда») является наиболее предпочтительным, поскольку повышение температуры вследствие PEF-обработки остается более низким для данной микробной инактивации.
На фиг. 11 показано присутствие лактоферрина в молоке после PEF-обработки сырого молока при повышении удельной энергии. Активность/целостность биоактивных молекул (лактоферрина) измеряют методом ИФА с использованием пары антител, специфичных к нативному лактоферрину. При удельной энергии 244 кДж/кг большая часть лактоферрина по-прежнему остается нативной.
Фиг. 12 аналогична фиг. 11, с тем отличием, что биоактивной молекулой является IgA.
Фиг. 13 аналогична фиг. 11, с тем отличием, что биоактивной молекулой является IgG.
Фиг. 14 аналогична фиг. 11, с тем отличием, что биоактивной молекулой является TGF-β1.
Фиг. 15 аналогична фиг. 11, с тем отличием, что биоактивной молекулой является TGF-β2.
На фиг. 16 представлена столбчатая диаграмма, резюмирующая результаты, показанные на фиг. 10-14, полученные при PEF-обработке с удельной энергией 244 кДж/кг. Как показано, содержания определенных биоактивных молекул сравниваются с содержаниями в сыром молоке (необработанный стандарт).
5
На фиг. 17 представлены числа КОЕ молока, обработанного PEF при разных значениях удельной энергии (0 (сырое молоко), 65, 210, 244, 314 кДж/кг молока) на 0, 2, 4, 6, 8, 11 и 14 день после PEF-обработки и при хранении при 4°С. При обработке в соответствии с настоящим изобретением молоко пригодно для хранения в течение 14 суток, с числом КОЕ, остающимся существенно ниже 10 КОЕ.
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение относится к способу, включающему стадию подвергания композиции обработке одним или несколькими импульсными электрическими полями (PEF), в частности в камере обработки.
Для задач настоящего описания термин «содержащий» означает «включает среди прочего». Он не означает «состоит только из».
Композиция предпочтительно является годной к потреблению пищевой композицией, предназначенной для потребления человеком или для потребления животным. Композиция предназначена для перорального введения и/или потребления. В этом отношении композиция содержит и предпочтительно состоит из пищевых компонентов и/или веществ. Композиция таким образом предпочтительно не содержит каких-либо токсичных и/или опасных для здоровья веществ, которые не предназначены или не подходят для перорального введения человеку или животному. Композиция по настоящему изобретению является безопасной в пищевом и/или микробиологическом отношении, в частности после PEF-обработки в соответствии с изобретением.
Композиция, которая подвергается воздействию PEF-обработки, предпочтительно является жидкой или вязкой композицией. В частности, композиция предпочтительно обладает свойствами жидкостей, такими как вязкость. Композиция может, таким образом, быть суспензией, взвесью, раствором и т.п. Композиция может содержать твердые вещества, например, суспендированные и/или растворенные в композиции.
Предпочтительно, чтобы перед применением указанного способа изобретения композиция имела вязкость при комнатной температуре (25°С) менее (<) 10 Паскаль в секунду (Па·с), предпочтительно <5 Па·с, еще более предпочтительно <3 Па·с, <1 Па·с, <0,5 Па·с, <0,3 Па·с, еще более предпочтительно <0,1 Па·с, <0,05 Па·с, и наиболее предпочтительно <0,01 Па·с. Следует отметить, что изобретение особенно целесообразно применять при вязкости 0,0001-0,5 Па·с, в частности 0,001-0,1 Па·с, которая включает вязкость молока (0,0017 Па·с) и сливок. Вязкость, в частности маловязких жидкостей, имеющих вязкость в диапазоне 1-10000 мПа·с, может определяться с помощью капиллярного вискозиметра Rheotest LK (от компании Rheotest Messgeräte Medingen GmbH, Оттендорф-Окрилла, Германия), используя основной вариант комплектации без футляра термостатирования (для пива и сусла, молока, питьевого йогурта и т.д.). Используются различные капилляры, охватывающие разные диапазоны вязкости. Объем образца составляет примерно 25 мл.
В соответствии с вариантом осуществления вязкость композиции находится в диапазоне от 0,0005 до 3,5 Па·с, предпочтительно 0,001-3 Па·с, который охватывает продукты на молочной основе, такие как молоко и йогурт (0,5-3 Па·с). В соответствии с вариантом осуществления вязкость композиции находится в диапазоне от 0,001 до 1 Па·с.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит питательные вещества. Таким образом, композиция предпочтительно является питательной композицией и/или пищевой композицией.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит, состоит главным образом или состоит из одного или нескольких молочных ингредиентов. Например, композиция может содержать одно или несколько веществ, выбранных из молочного белка, молочного жира, мембран жировых глобул молока, лактозы, кроме того витамины и другие питательные вещества, содержащиеся в молоке. Например, композиция может содержать казеин и/или белок молочной сыворотки. Белок молочной сыворотки может быть сладкой или кислой сывороткой. Молочный ингредиент может присутствовать в виде порошкообразного восстановленного ингредиента, например, сухого молока, восстановленного в воде.
Жидкая или вязкая композиция, обработанная способом согласно изобретению, содержит биоактивные молекулы, которые естественным образом присутствуют в сыром молоке.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит, состоит главным образом или состоит из молока или компонента молока.
В соответствии с вариантом осуществления, композиция изобретения содержит, состоит главным образом или состоит из молочного продукта и/или продукта на молочной основе.
Композиция до и/или после осуществления способа изобретения может содержать, состоять главным образом или состоять из одного или нескольких веществ, выбранных из группы цельного молока, полуобезжиренного молока, обезжиренного молока, молозива, молока с пониженным содержанием жира, молока с низким содержанием жира, не содержащего жира молока, молочной сыворотки (молочной плазмы), например, сладкой сыворотки или кислой сыворотки, напитка на молочной основе, йогурта, замороженного йогурта, питьевого йогурта, мороженого, сливок, сливочного масла, свежего сыра, творога и сыра, порошков или иным образом высушенных форм любого из вышеупомянутых веществ, и композиций, содержащих сочетания двух или более из вышеупомянутых веществ.
В соответствии с одним из вариантов композиция до осуществления способа изобретения может содержать, состоять главным образом или состоять из одного или нескольких веществ, выбранных из группы сырого молока, цельного молока, полуобезжиренного молока, обезжиренного молока, молозива, молока с пониженным содержанием жира, молока с низким содержанием жира, не содержащего жира молока, молочной сыворотки (молочной плазмы), например сладкой сыворотки или кислой сыворотки, и сочетаний вышеупомянутых веществ.
Композиция может содержать, состоять главным образом или состоять из одного или нескольких веществ, выбранных из группы цельного молока, молока с пониженным содержанием жира, молока с низким содержанием жира, не содержащего жира молока и/или порошков любого из вышеупомянутых веществ. Цельное молоко обычно имеет содержание молочного жира от примерно 3 до 3,8 масс. %, молоко с пониженным содержанием жира - 2-3 масс. %, молоко с низким содержанием жира - 0,5-2 масс. %, не содержащее жира молоко - 0,5 масс. % или менее.
Полуобезжиренное молоко включает молоко, из которого удален весь молочный жир, и после этого добавлено требуемое или желаемое количество молочного жира. Как правило, не содержащее жира молоко является обезжиренным молоком, в то время как молоко с пониженным содержанием жира и молоко с низким содержанием жира, как правило, являются полуобезжиренным молоком. Тем не менее, для задач настоящего изобретения не исключено, что молоко с пониженным содержанием жира, молоко с низким содержанием жира и не содержащее жира молоко получают иным образом, кроме обезжиривания цельного молока.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит, состоит главным образом или состоит из сырого молока или компонента сырого молока. Например, композиция содержит цельное сырое молоко. «Сырое молоко» в целях настоящего описания представляет собой молоко, которое производится секрецией молочных желез человека или животных, в частности не относящихся к человеку млекопитающих, как описано в другом месте данного описания, при этом молоко не нагревали выше 40°С или не подвергали какой-либо обработке, которая оказывает аналогичное действие. Предпочтительно, сырое молоко представляет собой молоко, которое не подвергалось какой-либо гомогенизационной обработке. Предпочтительно, сырое молоко представляет собой молоко, которое не подвергалось какой-либо термической пастеризации и/или ультравысокотемпературной обработке (UHT).
Сырое и/или цельное молоко имеет содержание сухого вещества около 11-13,5 масс. %, например, около 12,8 масс. %. По содержанию сухого вещества содержание активных молекул на сухое вещество может быть определено исходя из содержаний, приведенных в другом месте данного описания.
Для задач настоящего описания предполагается, что сырое молоко имеет плотность 1,030 кг/л. Предполагается, что композиция перед и после PEF-обработки в соответствии с изобретением имеет одинаковый удельный вес 1,030 кг/л. При данном значении содержание биоактивных молекул на кг композиции может быть определено по значениям, указанным в единицах массы на объем (например, мг/л, мкг/л и нг/л и т.п.). Кроме того, можно определить содержание биоактивных молекул в высушенной композиции, например, в высушенной распылением порошковой композиции (см. выше содержание сухого вещества, присутствующего в молоке). Для целей настоящего описания высушенная распылением композиция на основе молочного компонента или содержащая молочный компонент (например, высушенное распылением цельное молоко), как полагают, имеет остаточную влажность около 3 масс. %. Активность воды (Aw) такой композиции, как полагают, составляет 0,2-0,3.
Предпочтительно «сырое молоко» не подвергали предварительно какой-либо обработке, направленной на понижение бактериальной нагрузки или увеличение срока хранения композиции, в том числе, например, одной или нескольким обработкам, выбранным из обработки под высоким давлением или микрофильтрации.
Выражения «сырое молоко», иногда также называемое «свежее молоко», рассматриваются и используются как равноценные для целей настоящего описания.
«Молоко» для целей настоящего описания может быть молоком, полученным от крупного рогатого скота, как, например, молоко коров, буйволиц, овец и коз, но также, например, от кобыл и верблюдиц. Изобретение также предусматривает, что композиция содержит биоактивные молекулы, которые присутствуют естественным образом в женском молоке. Возможно так же обрабатывать женское молоко в соответствии с настоящим изобретением.
Настоящее изобретение относится к способу обработки композиции, содержащей биоактивные молекулы, такие как биоактивные молекулы, встречающиеся естественным образом в молоке, как описано в другом месте данного описания.
Способ изобретения подходит для получения композиции изобретения, которая также может называться как «PEF-обработанная композиция» или «вторичная композиция». Как подробно описано в другом месте данного описания композиция изобретения может опять же быть жидкой или вязкой, или, в качестве альтернативы, может быть получена в результате дальнейшей обработки, такой как, например, сушка, в частности распылительная сушка.
Композиция перед PEF-обработкой в соответствии с изобретением может называться «первичная композиция» или «необработанный стандарт (композиция)». Например, необработанный стандарт представляет собой сырое молоко. В соответствии с вариантом осуществления «первичная композиция» не подвергалась какой-либо термической или другой обработке, направленной на снижение бактериальной нагрузки. Содержание любых определенных биоактивных молекул в «необработанном стандарте» или первичной композиции считается общим содержанием (100 масс. % или мол. %) указанных определенных молекул в композиции. В случае биологически активных белков, содержание нативного белка в упомянутой первой композиции предпочтительно считается общим содержанием (100%) указанного определенного белка.
В соответствии с вариантом осуществления композиция перед указанной PEF-обработкой является первичной композицией и/или необработанным стандартом, при этом указанная композиция после указанной PEF-обработки является вторичной композицией и/или PEF-обработанной композицией, при этом указанная PEF-обработанная композиция содержит по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 40% указанной биоактивной молекулы в активной и/или нативной форме относительно указанного необработанного стандарта. Предпочтительные типы биоактивных молекул и предпочтительные содержания указанных молекул в активной и/или нативной форме подробно описаны в другом месте данного описания.
В соответствии с вариантом осуществления композиция перед указанной PEF-обработкой является первичной композицией и/или необработанным стандартом, при этом указанная композиция после указанной PEF-обработки является вторичной композицией и/или PEF-обработанной композицией, при этом указанная PEF-обработанная композиция содержит по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 40% определенного белка в нативной форме. В качестве логического следствия композиция предпочтительно содержит относительно общего содержания указанного определенного белка и/или менее 70%, предпочтительно менее 60%, соответственно, указанного белка в денатурированной и/или деградированной форме.
В соответствии с вариантом осуществления способ изобретения направлен на уменьшение количества микроорганизмов, таких как бактерии, микобактерии и грибки, такие как дрожжевые грибки, которые могут присутствовать в сыром молоке. Выражение «уменьшение количества микроорганизмов» обычно относится к уменьшению колониеобразующих единиц (КОЕ) в случае микроорганизмов, которые могут быть культивированы на подходящей среде, например в чашках Петри. В частности, способ подходит для уменьшения количества размножающихся и/или вегетативных микроорганизмов, предпочтительно микроорганизмов, которые могут присутствовать в молоке. Таким образом, изобретение подходит для уменьшения количества микроорганизмов, которые находятся в фазе вегетативного роста, например, митоза и/или размножения в жизненном цикле микроорганизма.
Уменьшение количества микроорганизмов, присутствующих в композиции, в целом повышает устойчивость и/или срок хранения композиции. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу увеличения устойчивости композиции и/или срока хранения композиции.
Уменьшение количества микроорганизмов включает снижение числа патогенных микроорганизмов и, следовательно, изобретение также относится к способу повышения безопасности и/или пользы для здоровья композиции.
Способ настоящего изобретения имеет задачей снижение бактериальной нагрузки и нагрузки других микроорганизмов для задач обеспечения микробиологической безопасности композиции. Кроме того, способ изобретения направлен на поддержание активности здоровых биоактивных молекул, которые естественным образом содержатся в молоке, с задачей обеспечения или повышения питательной ценности, связанной с биоактивными молекулами. Таким образом, настоящее изобретение дополнительно относится к способу PEF-пастеризации, который оставляет такие биоактивные молекулы в неизмененном состоянии и/или активными по меньшей мере до некоторой степени, предпочтительно в большей степени, чем другие известные способы пастеризации.
Как правило, термин «пастеризация» может относиться к различным способам, которые инактивируют вегетативные микроорганизмы, в частности патогены, в жидком или вязком пищевом продукте. Настоящее изобретение, таким образом, можно понимать как способ пастеризации. С другой стороны, настоящее изобретение не относится к «термической пастеризации», которая является промышленным способом существующего уровня техники для уменьшения количества микроорганизмов в жидком пищевом продукте, в частности, путем только одной термической обработки.
Способ изобретения относится к обработке импульсным электрическим полем (PEF) для инактивации вегетативных микроорганизмов, в частности патогенов, и, таким образом, может также называться PEF-пастеризацией. Соответственно, способы изобретения включают стадию подвергания жидкой или вязкой композиции PEF-обработке.
При PEF-обработке композиция подвергается в камере обработки воздействию одного или нескольких электрических полей, которые поддерживаются в течении определенного периода времени (продолжительность импульса). Электрические поля обычно повторяют с определенной частотой, как подробно описано в другом месте данного описания. Сообщается, что PEF-обработка вызывает микробную инактивацию. Не желая останавливаться на теории, считается, что воздействие электрического поля приводит к изменениям в структуре мембраны микроорганизма, которые в дальнейшем приводят к образованию пор и/или повышают проницаемость мембраны. Импульсы электрических полей высокой интенсивности могут вызвать необратимую гибель микроорганизмов.
Композицию обычно подвергают воздействию PEF в камере обработки. PEF генерируют с помощью электродов, которые обычно являются частью камеры обработки или которые примыкают к камере обработки.
PEF-обработку можно проводить в различных типах камер обработки, таких как, например, камеры статической или непрерывной обработки. В соответствии с вариантом осуществления способы настоящего изобретения относятся к непрерывным способам обработки. В частности, изобретение относится к непрерывному способу уменьшения количества микроорганизмов в пищевой композиции. «Непрерывный способ» для задач настоящего описания отличается от периодического способа. В «непрерывном способе» композиция непрерывно подвергается PEF-обработке. Иначе говоря, композицию непрерывно подвергают воздействию указанной PEF-обработки. В частности, композиция непрерывно подводится и отводится из камеры PEF-обработки. В непрерывных способах по изобретению, композиция, подлежащая обработке, непрерывно перемещается в определенном направлении, например, непрерывно прокачивается через одну или несколько камер обработки.
Весь способ изобретения может быть непрерывным, включая, возможно, приведение температуры композиции к конкретным значениям с помощью нагревания и/или охлаждения, и/или необязательную стадию распылительной сушки или сублимационной сушки. В качестве альтернативы, PEF-обработка является непрерывной, в то время как другие стадии, такие как нагревание, охлаждение и распылительная сушка, если они присутствуют, могут проводиться независимо в непрерывном или периодическом режиме.
Существует несколько типов конструкций камер обработки, которые подходят для непрерывной PEF-обработки, причем камеры, как правило, отличаются по конфигурации или расположению электродов и, как следствие, распределению напряженности поля в камере обработки. Существуют линейные, коаксиальные и коллинеарные камеры непрерывной обработки.
Указанную PEF-обработку по изобретению применяют в одной или нескольких коллинеарных камерах обработки.
Общее устройство примера коллинеарных камер обработки схематически представлено на фиг. 1. В камере данного типа электроды имеют по существу полый цилиндрический внутренний канал и отделены друг от друга изолятором, который также имеет полый цилиндрический канал, так что образуется трубка, через которую композиция протекает или проходит, подвергаясь воздействию PEF-обработки. На фиг. 1 камера 1 обработки содержит внутренний канал 2, через который проходит продукт, как показано стрелкой 3, которая представляет поток продукта через камеру 1 обработки. Камера обработки содержит центральный электрод 4, который является положительным в показанном случае, и заземляющие электроды 5 и 6, которые расположены соответственно перед и после положительного электрода 4. Все электроды разделены изоляционным материалом 8. Электроды 4, 5, 6 и изолятор 8 в контакте с продуктом предпочтительно имеют полые цилиндрические внутренние стенки и образуют полый цилиндрический внутренний канал камеры 1 обработки. Линии 7 представляют электрическое поле.
Как правило, камера обработки содержит, в основном состоит или состоит из двух или более электродов и изолятора, разделяющего два или более электрода. Коллинеарная камера обработки, как правило, является полым цилиндром, полым конусом и/или трубкой, с парой кольцевых, полых конических и/или трубчатых электродов, расположенных перед или после полого цилиндрического, полого конического и/или трубчатого центрального канала, причем последний, как правило, выполнен из изолятора.
Электроды являются предпочтительно металлическими, изготовленными предпочтительно из нержавеющей стали или титана, или другого материала, который является инертным и/или который может контактировать с пищевыми продуктами и подходит для уменьшения или исключения любой электрохимической реакции на поверхности электрода, такой как электрохимическое осаждение или растворение металла. Материал электродов обычно выбирают таким образом, чтобы на электродах практически не происходило электролиза или окислительно-восстановительной реакции вообще.
Следует отметить, что композиция, которая подвергается PEF-обработке, находится в контакте с электродами.
Два электрода обычно разделены изоляционным материалом. Как правило, канал камеры обработки между электродами может быть изготовлен из указанного изоляционного материала, который предпочтительно также находится в контакте с композицией в ходе PEF-обработки. Иначе говоря, между электродами обычно существует разрыв, содержащий изолятор, через который перемещается композиция, подвергаясь воздействию электрических полей при PEF-обработке. Наличие изолятора необходимо для поддержания правильно ориентированного, эффективного электрического поля в канале камеры обработки, начинающегося от одного электрода и продолжающегося до противоположно заряженного (или не заряженного или менее заряженного) электрода.
Таким образом, электрическое поле распространяется между двумя электродами. Изолятор может быть изготовлен из изоляционного и предпочтительно инертного материала, такого как керамика или полимеры, как например, полиэтилен, политетрафторэтилен (ПТФЭ), или других изоляционных материалов.
Камеры обработки, содержащие электроды и изолятор, могут содержать конструкцию кожуха, по меньшей мере часть которой предпочтительно также изготовлена из изоляционного материала, который объединяет или стабилизирует, по меньшей мере частично дополнительные части камеры обработки, чтобы конструктивно соединить и удержать вместе различные части (электроды, изолятор камеры обработки).
В результате, коллинеарная камера обработки, включающая электроды, содержит или образует трубчатый канал, который особенно подходит для непрерывной обработки PEF. Камера обработки, таким образом, содержит впускное отверстие продукта, которое является предпочтительно круглым, и выпускное отверстие продукта, которое является предпочтительно круглым.
Предпочтительно, PEF-обработка в соответствии с настоящим изобретением задействует по меньшей мере одну, более предпочтительно по меньшей мере две камеры обработки, предпочтительно еще больше, например три, четыре, пять, шесть или более камер обработки. Если присутствует более одной камеры обработки, камеры предпочтительно соединены последовательно, так что композиции протекают или проходят указанные камеры обработки одну за другой. Наиболее предпочтительно применяют четыре камеры обработки.
Как правило, одна камера обработки характеризуется по меньшей мере двумя электродами, заряженным электродом и противоэлектродом (противоэлектрод может быть противоположно заряженным, может быть заземленным, или может иметь такой же заряд, что и заряженный электрод, но в меньшей степени, например, наполовину -заряженным электродом).
Возможно присутствие нескольких электродов, например, электродных пар, трехэлектродных систем или четырехэлектродных систем, в особенности с коллинеарными камерами обработки. В случае трехэлектродных систем электроды, например, могут быть расположены следующим образом: земля - плюс - земля (см. фиг. 1); земля - минус - земля; плюс - земля - плюс; минус - земля - минус, плюс -  (половина) плюса - плюс; минус -  (половина) минуса - минус;  минуса - минус -  минуса;  плюса - плюс -  плюса. В случае четырехэлектродной системы два одноименных электрода (например, два «плюс» электрода) могут быть или могут и не быть в механическом соединении. В первом случае обычно также существует электрическая связь, но все же они будут двумя отдельными механическими частями и будут рассматриваться как два электрода. По аналогии с вышесказанным, можно было бы использовать земля - плюс - плюс - земля; земля - минус - минус - земля, плюс - земля - земля - плюс, и тому подобное, как указано выше для трехэлектродных систем.
И в трех-, и в четырехэлектродных системах, таких как описано выше, например, могут быть две камеры обработки между электродом и соответствующим противоэлектродом.
Выражения «перед» и «после» относятся к потоку композиции через указанные камеры обработки и/или в ходе PEF-обработки, при этом «перед» относится к области ближе к началу потока композиции (или в направлении против потока композиции), тогда как «после» относится к более удаленной области в направлении потока композиции.
Выражения «перед» и «после» для задач настоящего описания используются обычным образом.
При наличии двух коллинеарных камер обработки обычно предпочтительно объединять два заряженных электрода в виде центральных электродов (например, положительно или отрицательно заряженных, предпочтительно примерно одинакового напряжения), при этом два противоэлектрода располагаются один перед и один после центрального электрода, разделенные изолятором. Инверсия также возможна (центральный заземленный или полузаряженный противоэлектрод).
В соответствии с вариантом осуществления два положительно заряженных электрода (примерно одинакового уровня напряжения) предусмотрены на переднем и заднем концах двух объединенных камер обработки, с одним или двумя противоэлектродами, предусмотренными по центру, между двумя камерами обработки.
В случае двух камер обработки, существуют, таким образом, предпочтительно три или четыре электрода, так как один или два центральных электрода функционируют в качестве противоэлектрода для двух отдельных передних и задних электродов.
Количество камер обработки и/или электродов выбирают в зависимости от требуемой PEF-обработки и/или требуемого времени пребывания в камере обработки.
В соответствии с вариантом осуществления PEF-обработку осуществляют посредством трех или четырех электродов в двух камерах обработки, или, в качестве альтернативы, посредством шести или восьми электродов в четырех камерах обработки.
В соответствии со способом изобретения PEF-обработку применяют или проводят в одной или нескольких коллинеарных камерах обработки, при этом указанные камеры обработки содержат внутреннюю часть или внутренний элемент. Внутренний элемент является инертным и неэлектропроводящим. Предпочтительно внутренняя часть или внутренний элемент не влияет или не влияет существенно, или не создает помех электрическому полю, созданному при PEF-обработке. Предпочтительно внутренний элемент выполнен из изоляционного материала, такого как полиэтилен (ПЭ), политетрафторэтилен (ПТФЭ) или керамический материал. Внутренний элемент называется внутренним элементом, поскольку он расположен внутри, т.е. внутри канала камеры обработки. Внутренний элемент таким образом находится в контакте с композицией, которая проходит через камеру обработки, и влияет на поток композиции, в частности, на направление потока и тип потока композиции.
Внутренняя часть или внутренний элемент может быть выполнен в виде жесткого и несъемного элемента, образуя одно целое с одним или несколькими другими структурными элементами камеры обработки, например, с изолятором, который разделяет электроды и/или который образует внутреннюю стенку камеры обработки между электродами.
В качестве альтернативы и предпочтительно внутренний элемент является отдельной деталью, выполненной в виде вставки, которая может быть помещена в камеру обработки и извлечена из нее, например, при разборке камеры обработки с задачей очистки. Если внутренний элемент является отдельной деталью, он может быть выполнен в виде вставки, которая является структурным элементом, который может быть вставлен в камеру обработки и который занимает определенное положение внутри камеры обработки во время использования (PEF-обработки).
Неожиданно было обнаружено, что использование внутреннего элемента в камере обработки подходит для воздействия на структуру потока и/или для уменьшения или предотвращения неоднородности электрического поля, воздействию которого подвергается композиция в камере обработки. Следует отметить, что неоднородное электрическое поле может вызывать температурные пики, которые могут повредить чувствительные к температуре компоненты композиции. Например, местные пики температуры могут вызвать денатурацию некоторых белков, приводя к изменению физических и химических свойств композиции. Таким образом, внутренний элемент предпочтительно уменьшает температурные пики в композиции, предпочтительно внутри камеры обработки.
Предполагается также, что внутренний элемент пригоден для уменьшения ламинарного потока и увеличения мутности жидкости или композиции в камере обработки. Таким образом, повышается вероятность однородной и/или регулярной обработки, и/или воздействия электрических полей в ходе PEF-обработки. Отмечено, что характеристики ламинарного потока внутри камеры обработки, как предполагается, неблагоприятны из-за различий в скорости потока и т.п., которые связаны с ламинарным потоком.
Согласно конкретному варианту осуществления указанную PEF-обработку применяют в одной или нескольких камерах обработки, имеющих практически полый цилиндрический или полый конический канал, при этом указанные камеры обработки содержат внутренний элемент, при этом указанный внутренний элемент содержит продольную, и цилиндрическую или коническую часть, и при этом указанная вставка занимает пространство указанного полого канала указанной камеры обработки.
Согласно варианту осуществления указанную PEF-обработку применяют в одной или нескольких камерах обработки, имеющих канал, при этом указанная композиция непрерывно направляется через указанный канал или указанную камеру обработки, и/или при этом внутренний элемент предусмотрен в указанном канале таким образом, что в указанной камере обработки указанная композиция направляется вокруг указанного внутреннего элемента.
Согласно варианту осуществления указанную PEF-обработку применяют в одной или нескольких камерах обработки, имеющих впускное и выпускное отверстие, при этом указанная композиция непрерывно вводится во впускное отверстие указанной камеры и непрерывно удаляется из указанной камеры обработки через указанное выпускное отверстие, и при этом указанная одна или несколько камер обработки содержат внутренний элемент, при этом указанный внутренний элемент расположен в указанной камере таким образом, что продукт направляется поблизости к внутренним стенкам в части указанной камеры, и/или при этом указанные внутренние элементы предотвращают занятие указанной композицией осевого положения внутри секции или части указанной камеры.
Внутренний элемент, таким образом, предпочтительно заставляет композицию течь вдоль кольцевого или трубчатого отверстия или пустого пространства, которое ограничено внутренними стенками полых цилиндрических электродов и изоляторов и внешними стенками цилиндрического внутреннего элемента. Хотя данная ситуация может напоминать ситуацию коаксиальных камер обработки, где один электрод, предусмотрен внутри камеры обработки, внутренний элемент данного изобретения отличается от последнего тем, что он не является электродом, но только влияет на поток продукта внутри камеры обработки.
В соответствии с вариантом осуществления, указанную PEF-обработку применяют в одной или нескольких камерах обработки, содержащих внутренний элемент, указанный внутренний элемент подходит для повышения степени турбулентности, присутствующей в указанной композиции, и/или для уменьшения ламинарного течения указанной композиции внутри указанной камеры обработки.
Внутренний элемент предпочтительно имеет продольное строение и/или предпочтительно содержит коническую или цилиндрическую часть.
Если внутренний элемент является отдельной деталью (вставка), он, предпочтительно, дополнительно включает крепление, которое позволяет стабилизировать элемент в камере обработки. Крепление может фактически находиться за пределами камеры обработки, но приводит к фиксированной, жесткой установке вставки внутри камеры обработки.
Вставка предпочтительно занимает по меньшей мере часть осевого положения в полом цилиндрическом или полом коническом канале камеры обработки.
Предпочтительно вставка является продольной и имеет ось, при этом вставка располагается по оси и/или занимает часть осевого пространства внутри камеры обработки. Предпочтительно продольная вставка расположена так, чтобы быть коаксиальной с полым цилиндрическим или полым коническим каналом камеры обработки.
Предпочтительно, вставка содержит первый и второй конец, и между указанными первым и вторым концами, - промежуточную часть. Предпочтительно, по меньшей мере один из указанных первого и второго конца содержит крепление, которое способствует прикреплению вставки в камере обработки. Если только один из концов включает указанное крепление, другой конец может быть просто плоской поверхностью или, предпочтительно, закругленной половиной или заостренным концом. Например, один конец может иметь практически форму или конфигурацию полушария.
Практически продольная часть между указанными концами внутреннего элемента предпочтительно имеет цилиндрическую и/или коническую форму, и/или может содержать комбинацию различных конических секций или конических и цилиндрических секций. В целом, центральная, промежуточная часть имеет диаметр, который меньше, чем диаметр внутреннего канала камеры обработки, так что внутренний элемент может быть помещен в канале указанной камеры обработки.
Крепежные части предпочтительно содержат части, продолжающиеся в радиальном направлении, в частности от одного конца (переднего конца или заднего конца) промежуточной части, и которые находятся в контакте в некотором положении с внутренней поверхностью стенки камеры обработки или каналом, в который композиция направляется или удаляется из камеры обработки. Например, внутренний элемент может содержать выступ или лапку, которая упирается в опорную поверхность, предусмотренную в направлении переднего или заднего конца камеры обработки.
Внутренний элемент может иметь общий вид торпеды. Предпочтительная конструкция камеры обработки, включающей внутренний элемент в виде вставки, описана в международной патентной заявке с номером РСТ/ЕР 2011/051149, от 27 января 2011 года, и опубликована как WO 2011/092247. Использование такой вставки в коллинеарной камере обработки приводило к наилучшим результатам с точки зрения уменьшения микробной нагрузки и сохранения биоактивных компонентов композиции.
Предпочтительно, внутренний диаметр внутреннего, полого цилиндрического канала камеры обработки составляет от 5 до 35 мм, предпочтительно 6-30 мм, более предпочтительно 7-25 мм, наиболее предпочтительно 9-20 мм, 9-17 мм, 9-15 мм, 9-13 мм, например, 9,5-11 мм.
В случае, если внутренний канал камеры обработки не является полым цилиндром, например, если камера обработки имеет не круглое поперечное сечение, например эллиптическое поперечное сечение, значения диаметра, указанные выше, применяются к наибольшему диаметру, отмечаемому в любом определенном положении в камере обработки. Если диаметры в камере обработки выполнены с возможностью изменения в продольном или осевом направлении (как это имеет место, например, в полых конических каналах камеры обработки), значения и диапазоны, указанные выше, относятся к значениям, которые могут отмечаться в любом положении камеры обработки. Для задач настоящего описания не является обязательным, хотя предпочтительно, чтобы эти размеры применялись ко всему каналу камеры обработки. Предпочтительно внутренний канал камеры обработки является в значительной степени или полностью полым цилиндром, так что поперечное сечение камеры обработки представляет собой кольцевой внутренний диаметр камеры обработки практически по всей длине камеры обработки.
Для задач настоящего описания камера обработки охватывает все пространство, где находится электрическое поле между парой электродов.
Значения и диапазоны, указанные выше для диаметра внутреннего канала камеры обработки, никоим образом не изменяются присутствием внутреннего элемента/структуры или твердого структурного элемента, который предусмотрен внутри камеры обработки, как определено в другом месте данного описания, хотя внутренний и/или жесткий элемент оказывает влияние, в результате которого не весь канал камеры обработки может быть занят потоком продукта или потоком композиции в камере обработки. Тот факт, что внутренний элемент занимает часть объема внутри камеры обработки, не принимается во внимание вышеуказанными значениями диаметра.
В контексте настоящего описания значения, например, технологических параметров способа изобретения могут быть указаны посредством диапазонов. Указание на диапазон в настоящем описании означает, что специфический параметр (например, внутренний диаметр камеры, удельная энергия, напряженность поля, длительность импульса и т.д.) может принимать любое из указанных конечных значений соответствующего диапазона или может принимать любое значение, которое находится внутри диапазона. Как правило, но не обязательно во всех случаях, параметр принимает практически постоянное значение из диапазона. Специалисту будет ясно, в каких случаях величина является постоянной, и в каких случаях могут быть колебания. Например, для диаметра внутреннего канала камеры обработки, поскольку речь идет о структурно неизменном в целом элементе, такой диаметр остается постоянным в определенном положении в камере обработки. Если значение параметра изменяется, предпочтительно, чтобы такие изменения оставались в значительной степени в основном внутри указанного диапазона.
В способе изобретения, импульсы электрических полей образуются на электродах, с электрическими полями, продолжающимися внутри указанных камер обработки.
Специалист в данной области знает, как создать импульсные электрические поля в камере обработки. Как правило, предпочтительна установка для образования электрических импульсов большой интенсивности, которая содержит блок питания, один или несколько конденсаторов, один или несколько транзисторов (например, биполярные транзисторы с изолированным затвором, БТИЗ) и по меньшей мере один трансформатор (например, DIL High Voltage Transformer Elcrack). В соответствии с вариантом осуществления установка для PEF-обработки изобретения содержит один или несколько охладителей и/или один или несколько нагревателей, которые подходят для регулировки температуры композиции перед или после PEF-обработок. В основном, импульсы генерируются с помощью запасания электрической энергии в конденсаторах от источника питания, допускающих испускание импульсов большой мощности. Транзисторы или другие полупроводниковые переключатели используются для периодического разряжения энергии и передачи ее в камеру обработки. Максимальный выходной ток и напряжение, а также полярность, как правило, определяются импульсным модулятором.
Как правило, PEF-установка требует охлаждения, которое может выполняться, например, с помощью масла, прокачиваемого через циркуляционный контур установки масляным насосом.
В способе настоящего изобретения жидкая и/или вязкая композиция прокачивается через одну или несколько камер обработки. Предпочтительно, композицию закачивают с противодавлением. Противодавление является предпочтительным для уменьшения риска образования воздушных пузырьков и/или для поддержания однородного потока композиции. Противодавление предпочтительно составляет от 1,1 до 4 бар (0,11-0,4 МПа), более предпочтительно от 1,3 до 3 бар (0,13-0,3 МПа), еще более предпочтительно от 1,5 до 2,5 бар (0,15-0,25 МПа), например от 1,7 до 2,3 бар (0,17-0,23 МПа), наиболее предпочтительно от 1,8 до 2,2 бар (0,18-0,22 МПа). В соответствии с вариантом осуществления противодавление составляет от 1,5 до 3 бар (0,15-0,3 МПа). Предпочтительно противодавление имеет практически постоянное значение.
На фиг. 2 показана PEF-установка с импульсным трансформатором, которая может использоваться для способа настоящего изобретения.
Технологические факторы или параметры, которые могут играть роль в целях осуществления способа настоящего изобретения, представляют собой один или несколько факторов или параметров, выбранных из примененной напряженности электрического поля, продолжительности импульса, удельной энергии, количества импульсов, типа или формы импульсов, полярности импульсов, температуры композиции перед, во время и/или после PEF-обработки, и частоты импульсов.
Настоящее изобретение основано на неожиданном обнаружении, что цели изобретения достигаются с помощью приведения одного или более из данных технологических параметров к определенным значениям. В частности, микробная нагрузка может быть существенно снижена при одновременном сохранении в неизмененном состоянии значительного количества или процентного содержания биоактивных молекул, в частности белков, присутствующих в композиции.
S
SPECIFIC
Важный технологический параметр способа изобретения является удельной энергией (W или W), которая показана в уравнении 1 ниже
PULSE
SPECIFIC
-1
В уравнении 1 W представляет собой удельную энергию в кДж (килоджоуль), приложенную электрическим полем одного импульса, f является частотой импульсов в с, и m (m с точкой сверху) является переносом массы в кг/с. Единицей измерения Wявляется кДж/кг, при этом энергия является энергией, приложенной электрическим полем, и масса является массой композиции, к которой приложена энергия.
2
Как правило, переданная энергия может определяться двумя способами: (а) путем вычисления U(t)×(It)dt, где U является напряжением, I является силой тока, t является временем. В случае нескольких импульсов n × длительность импульса дает время; и/или (b) путем вычисления E(t)*k dt, где Е является напряженностью поля, k является электропроводностью, и t является временем. Как видно из уравнения 1, для вычисления удельного потребления энергии в кДж/л или кДж/кг переданную энергию нужно разделить на объем или массовую скорость потока.
SPECIFIC
В соответствии с настоящим изобретением, удельная энергия (W), приложенная в способе изобретения, составляет предпочтительно 400 кДж на кг композиции изобретения или менее, 350 кДж/кг или менее, 350 кДж/кг или менее, 350 кДж/кг или менее, 300 кДж/кг или менее, 350 кДж/кг или менее, 340 кДж/кг или менее, 330 кДж/кг или менее, 320 кДж/кг или менее, 310 кДж/кг или менее, 300 кДж/кг или менее, 290 кДж/кг или менее, 280 кДж/кг или менее, 270 кДж/кг или менее, 260 кДж/кг или менее, или 250 кДж/кг или менее.
Предпочтительно, удельная энергия составляет 100 кДж/кг или более, 120 кДж/кг или более, 160 кДж/кг или более, 180 кДж/кг или более, 200 кДж/кг или более, 210 кДж/кг или более, или 220 кДж/кг или более.
Соответственно, удельная энергия может находиться в пределах любого диапазона, как определено вышеуказанными количествами, но предпочтительно удельная энергия составляет 150 -350 кДж/кг, 180-320 кДж/кг, предпочтительно 200 -300 кДж/кг, более предпочтительно 220-280 кДж/кг, еще более предпочтительно 240-260 кДж/кг, например, около 250 кДж/кг.
Удельная энергия каждого импульса определяется по уравнению 2 ниже
В уравнении 2 t является временем обработки (в секундах, с), U является напряжением (В) на электроде, I является электрическим током (А) и τ является продолжительностью импульса.
Другим параметром в PEF-обработке является напряженность электрического поля, которая может быть измерена в кВ/см и которая является напряженностью электрического поля, действующего на композицию в камере обработки. Напряженность электрического поля определяется как электрическая разность потенциалов (U) для двух данных электродов в пространстве, разделенных расстоянием (d) между ними, разделенных непроводящим материалом (Zhang et al., J. Food Ing. 25 (1995) 261-81)
В соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения указанная композиция подвергается воздействию электрических полей с напряженностью поля от 10 до 20 кВ/см. В соответствии с вариантом осуществления при указанной PEF-обработке указанная композиция подвергается воздействию электрических полей с напряженностью поля от 10 до 15 кВ/см. В соответствии с другими вариантами осуществления напряженность поля составляет <17, <16, <15, предпочтительно <14, наиболее предпочтительно <13 кВ/см. Предпочтительно напряженность поля составляет >10, >11, более предпочтительно >12 кВ/см, наиболее предпочтительно 12-13 кВ/см.
Следует отметить, что выражение «критическая напряженность электрического поля» представляет собой напряженность поля, которая необходима для достижения инактивации микроорганизма. Для того, чтобы ее достичь, как правило, должен быть индуцирован трансмембранный потенциал более 1 В. Критическая напряженность поля, таким образом, в целом зависит от типа клеток, формы микроорганизма, размеров микробной клетки и типа клеточной стенки микроорганизма.
Следует отметить, что продолжительность импульса влияет на параметр критической напряженности поля, так как при более продолжительных импульсах напряженность поля может быть относительно более низкой для достижения микробной инактивации.
В соответствии с вариантом осуществления изобретения продолжительность импульса при указанной PEF-обработке составляет 10 мкс или более, предпочтительно применяется 15 мкс или более.
В соответствии с вариантом осуществления изобретения длительность импульса или продолжительность импульса составляет не более 40 мкс, не более 35 мкс, не более 30 мкс, не более 27 мкс, не более 25 мкс, не более 24 мкс, не более 40 мкс, предпочтительно применяется 15 мкс или более.
В соответствии с вариантом осуществления изобретения длительность импульса или продолжительность импульса составляет от 5 до 35 мкс, например 10-30 мкс, предпочтительно 12-28 мкс, например, 14-26 мкс, более предпочтительно 16-24 мкс, например, 17-23 мкс, наиболее предпочтительно 18-22 мкс, например, 19-21 мкс, например, около 20 мкс.
Не желая останавливаться на теории, авторы настоящего изобретения полагают, что полезные эффекты настоящего изобретения могут по меньшей мере частично объясняться определенным сочетанием удельной энергии, напряженности поля и продолжительности импульса, использованных для задач настоящего изобретения, которые в частности, заключаются в том, что они приводят к инактивации микроорганизмов, которые могут присутствовать в композиции, сохраняя при этом активность биологически активных исходных компонентов, присутствующих в композиции.
SPECIFIC
В соответствии с вариантом осуществления при PEF-обработке по изобретению указанная удельная энергия (W), напряженность поля и продолжительность импульса составляют 100-400 кДж/кг, 6-30 кВ/см и 10-30 мкс соответственно, предпочтительно 150-350 кДж/кг, 7-25 кВ/см и 12-28 мкс соответственно; более предпочтительно 180-320 кДж/кг, 8-20 кВ/см и 14-26 мкс соответственно; еще более предпочтительно 200-300 кДж/кг, 9,5-14,5 кВ/см и 17-23 мкс соответственно; и наиболее предпочтительно 220-280 кДж/кг, 11-13 кВ/см, и 18-22 мкс соответственно.
SPECIFIC
Следует отметить, что значение W можно корректировать в зависимости от потока или переноса массы композиции путем изменения, например, частоты импульса,
что может быть выведено из уравнения 1 выше.
В соответствии с вариантом осуществления частота (f) составляет от 50 до 1000 Гц, например, примерно 100 Гц.
В отношении характеристик импульса следует отметить, что электрические импульсы могут быть разного типа и полярности. Импульсы могут быть экспоненциально затухающего типа, прямоугольного типа и осцилляторно-затухающего типа. Согласно предпочтительному варианту осуществления импульсы при PEF-обработке в соответствии с изобретением являются прямоугольными импульсами, которые характеризуются тем, что напряжение, использованное импульсом (или в ходе длительности импульса), остается существенно постоянным на протяжении всей продолжительности импульса.
Кроме того, импульсы могут быть биполярными или униполярными. В случае униполярных импульсов применяются заряды только одной определенной полярности (например, только положительные заряды). В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления при PEF-обработке по изобретению применяются биполярные электрические импульсы таким образом, что применяются чередующиеся импульсы положительной и отрицательной полярности. Наиболее предпочтительно применяются биполярные прямоугольные импульсы.
Не желая останавливаться на теории, делается предположение, что применение биполярных импульсов является более эффективным из-за дополнительного напряжения, которое, как полагают, индуцируется на или в клеточной мембране микроорганизмов, которые возможно присутствуют в композиции. Кроме того, применение биполярных импульсов сводит к минимуму вероятность или возникновение осаждения твердых веществ на поверхности электрода и, как следствие, неблагоприятное воздействие на однородность поля внутри камеры.
Согласно предпочтительному варианту осуществления способа изобретения при указанной PEF-обработке применяются прямоугольные электрические импульсы и/или биполярные импульсы.
Температуру композиции перед тем, как она будет подвергнута воздействию способа по изобретению и, в частности, PEF-обработки, предпочтительно доводят до определенного значения. Следует отметить, что благодаря энергии, приложенной посредством PEF-обработки, температура композиции обычно повышается. Композиция или, в более общем плане, среда, обычно нагревается в результате PEF-обработки, так что температура композиции в конце PEF-обработки обычно выше, чем температура перед PEF-обработкой. Температуру композиции предпочтительно регулируют непосредственно перед PEF-обработкой, как описано более подробно ниже и в других местах данного описания.
Температура композиции обычно играет роль в отношении как инактивации микроорганизмов, так и активности биоактивных молекул. В термических способах пастеризации высокая температура, воздействию которой подвергается молоко, отвечает, например, за потерю биологической активности биоактивных компонентов молока. С другой стороны, в отношении PEF-обработки в контексте настоящего описания, можно выбрать начальную температуру композиции таким образом, что микробная инактивация путем PEF-обработки оптимизирована, в то время как, например, биологическая активность биоактивных молекул, присутствующих естественным образом в молоке, сохраняется в большей степени, чем в случае способов термической пастеризации. Следует отметить, что PEF-обработка в соответствии с изобретением не считается способом «термической пастеризации», хотя температура композиции слегка увеличивается в ходе PEF-обработки из-за приложенной энергии. На основании конкретных экспериментов и математической дедукции на основе литературных данных (здесь не показано), авторы изобретения смогли показать, что в способе изобретения микробная инактивация по большей части происходит из-за электрических импульсов высокой интенсивности при PEF-обработке. В зависимости от технологических параметров >80%, в частности >90%, >95%, >97% и даже >99% снижения КОЕ обусловлено электрическими импульсами высокой интенсивности, и только до незначительной степени (например, примерно <20%, даже <10% и т.д.) - благодаря термической инактивации. Технологические параметры, максимально увеличивающие инактивацию за счет электрических импульсов и сводящие к минимуму термическую инактивацию, являются предпочтительными в контексте настоящего изобретения.
В способе настоящего изобретения композиция может иметь начальную и конечную температуру. Начальная температура композиции, как правило, определяется как температура композиции непосредственно перед PEF-обработкой, в частности перед входом в первую камеру обработки. Конечная температура является температурой в конце PEF-обработки, в частности температурой композиции при выходе из последней камеры обработки. Конечная температура обычно также соответствует самой высокой температуре, которую композиция приобретает в ходе PEF-обработки, поскольку сама PEF-обработка вызывает только повышение температуры композиции, а не уменьшение. Если существует последовательность камер PEF-обработки или даже пары камер обработки, можно также выделить промежуточную температуру, например, температуру между двумя последовательными камерами обработки или парами камер обработки.
Интересно, что начальная температура композиции оказывает влияние на микробную инактивацию. Не желая останавливаться на теории, делается предположение, что мембраны микроорганизмов становятся более текучими при высоких температурах. При низких температурах мембрана, как правило, является кристаллической, что может объяснять пониженную скорость инактивации при PEF-обработке. Не желая останавливаться на теории, положительное влияние более высокой начальной температуры может, таким образом, в целом быть приписано изменяющейся конформации фосфолипидного бислоя.
Настоящее изобретение по меньшей мере частично основано на обнаружении того, что существует начальная температура, которая позволяет добиться существенной микробной инактивации, при условии, что данная начальная температура композиции такова, что она не влечет за собой инактивации желательных биоактивных молекул, которые присутствуют в композиции.
Предпочтительно начальная температура композиции составляет 20-45°С, предпочтительно 24-36°С, например 25-35°С, более предпочтительно 26-34°С, 27-33°С, 28-32°С, 29-31°С, предпочтительно около 30°С. Начальная температура является температурой композиции перед входом в первую камеру PEF-обработки. Температуру можно регулировать с помощью подходящих нагревательных систем, например, в нагревательном баке, или в непрерывных способах, таких как использование теплообменников, например пластинчатых теплообменников. Регулировка температуры композиции может осуществляться периодически или непрерывно.
Как уже отмечалось в другом месте данного описания, PEF-обработка вызывает незначительное повышение температуры PEF-обработанной композиции. Следует отметить, что, несмотря на небольшое увеличение температуры благодаря PEF-обработке, температура композиции предпочтительно остается существенно ниже температур, которые используются в способах термической пастеризации. По этой причине активность биоактивных молекул можно сохранить в значительной степени.
PEF-обработка предпочтительно такова, что конечная температура композиции после PEF-обработки, например, после выхода из последней камеры обработки, составляет 64°С или менее, предпочтительно 63°С или менее, более предпочтительно 62°С или менее, наиболее предпочтительно 61°С или менее, и более предпочтительно даже ниже, например 60°С, 59°С, 58°С, 57°С, 56°С, 55°С, 54°С, 53°С, 50°С или менее. Предпочтительно данные температуры также соответствуют максимальной температуре композиции в ходе всей PEF-обработки, которую можно регулировать, как описано в данном описании.
Конечную температуру можно регулировать путем выбора параметров PEF-обработки, например, таких как конструкция камеры обработки, удельная энергия, энергия импульса, напряженность электрического поля и тому подобное. Например, использование коллинеарной камеры обработки, содержащей внутренний элемент, как описано в другом месте данного описания, неожиданно приводит к более низкой конечной температуре по сравнению со способом, в котором такой внутренний элемент отсутствует. Не желая останавливаться на теории, делается предположение, что указанный внутренний элемент улучшает однородность электрического поля, воздействию которого подвергается композиция, и поэтому сводит к минимуму повышения температуры в результате PEF-обработки.
В соответствии с вариантом осуществления способ изобретения может включать стадию конечного охлаждения, в частности остужения, для конечной стабилизации композиции. Остужение предотвращает рост микроорганизмов, которые могут не быть инактивированы, или предотвращает рост из микробных спор, которые могут присутствовать в композиции. Окончательное остужение может осуществляться до температуры 0-10°С, 1-8°С, 2-7°С, 3-6°С, например, примерно 3,5-5°С. Следует отметить, что пастеризованные продукты, в том числе термически пастеризованные продукты, как правило, требуют охлаждения в конце пастеризации. Охлаждение в конце PEF-обработки, таким образом, является конкретным вариантом осуществления способов изобретения.
В соответствии с вариантом осуществления способ изобретения включает стадию сушки, предпочтительно сублимационной сушки или распылительной сушки композиции. Композицию можно сначала охладить, как указано выше, или можно высушить непосредственно после PEF-обработки. Например, композицию можно подвергнуть распылительной сушке, как обычно происходит, но предпочтительно при низких температурах. При необходимости дополнительное сухое вещество (мальтодекстрин или другие углеводы, белки и т.д.) можно добавить к композиции перед (распылительной) сушкой. Композиция может быть направлена в башенную распылительную сушилку для распылительной сушки. Интересно, что способ (распылительной) сушки, в частности при использовании низких температур, не обязательно приводит к инактивации или денатурации биоактивных молекул, присутствующих в композиции. Например, может использоваться способ распылительной сушки, как описано в ЕР 0818529 или в документах, перечисленных в данном патентном документе. Документы, цитированные в ЕР 0818529, описывают температуры поступающего воздуха в диапазоне 100-180°С или даже до 60-165°С в способе распылительной сушки. В патенте США 5116953 описана распылительная сушка водного раствора лактоферрина (при температуре поступающего воздуха, например, 140°С), благодаря которой был получен высушенный распылением порошок лактоферрина, при этом высушенный распылением лактоферрин сохранял железосвязывающую активность лактоферрина.
Соответственно, после PEF-обработки композиция может быть охлаждена и/или высушена, например, высушена распылением.
Способ изобретения предпочтительно приводит к снижению микробного числа (КОЕ) в композиции по меньшей мере на 4 log (логарифимические единицы), предпочтительно по меньшей мере на 4,5 log, более предпочтительно по меньшей мере на 5 log, еще более предпочтительно по меньшей мере на 5,5 log, и наиболее предпочтительно на 6 log или более. Эти значения применяются к любому из видов микроорганизмов, присутствующих в композиции, и более предпочтительно ко всем из них. Более предпочтительно эти значения применяются к патогенным микроорганизмам, которые могут быть найдены в молоке.
В соответствии с вариантом осуществления PEF-обработанная композиция, получаемая способом изобретения, не содержит каких-либо обнаруживаемых вегетативных микроорганизмов.
Настоящее изобретение также относится к композиции, которая получена способами изобретения.
Соответственно, композиция изобретения, в частности композиция после обработки в соответствии со способом изобретения может быть жидкой или высушенной композицией.
Композиция предпочтительно содержит биоактивные молекулы, которые естественным образом присутствуют в сыром молоке. Композиция может содержать само сырое молоко или его фракцию, или биоактивные молекулы можно изолировать и/или отделить из сырого молока и добавить в композицию для получения композиции, которая будет подвергнута воздействию способа изобретения и/или PEF-обработке в соответствии с изобретением. Биоактивные молекулы могут быть добавлены путем добавления молочной фракции или отделенного компонента молока, содержащего биоактивные молекулы, к другой композиции, для получения композиции, которая будет подвергаться обработке по изобретению. Изобретение также охватывает возможность того, что молочную фракцию или компонент как таковые подвергают воздействию способа изобретения. Изобретение также охватывает, что композиция содержит сырое молоко, его фракцию, например, обезжиренное молоко, полуобезжиренное молоко или молочную сыворотку, к которым добавляют другие ингредиенты, например, как правило, ароматизаторы, подсластители, волокна, нутрицевтики и т.д. В данном случае композиция содержит ингредиент молока и дополнительные ингредиенты, которые не встречаются в молоке, или не встречаются в таком же количестве.
В соответствии с альтернативным вариантом осуществления композиция главным образом основана на молоке или молочной фракции, таких как раскрытые в данном описании, предпочтительно выбранных из цельного молока и молока с пониженным содержанием жира (с пониженным содержанием жира, низким содержанием жира, не содержащим жира), молочной сыворотки и молочного белка, и практически не содержит любого добавленного микро- и/или макронутриента.
В соответствии с альтернативным вариантом осуществления композиция главным образом основана на молоке или молочной фракции, таких как раскрытые в данном описании, предпочтительно упомянутых в абзаце выше, при этом композиция может содержать добавленные ароматизаторы и/или подсластители, но предпочтительно практически не содержит любых добавленных биоактивных молекул, встречающихся естественным образом в молоке, и/или практически не содержит любых добавленных биоактивных протеинов, встречающихся естественным образом в молоке.
«Практически не содержит» для задач настоящего описания означает ≤5%, предпочтительно ≤3%, более предпочтительно ≤1%, еще более предпочтительно ≤0,5% и наиболее предпочтительно полностью не содержит, при этом проценты представлены в виде процентов по массе сухого вещества композиции.
Для задач настоящего описания биоактивные молекулы являются по-прежнему активными, если они способны проявлять свою естественную функцию. Что касается биологически активных белков, - биологически активный белок больше не является активным, если он был денатурирован. Для задач настоящего описания белок считается «биоактивным», если он присутствует в своей нативной, не денатурированной форме.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит один или несколько белков или пептидов в нативной форме. «Белок» для задач настоящего изобретения представляет собой полипептид, содержащий последовательность из примерно 9 или более, предпочтительно примерно 25 или более, и наиболее предпочтительно примерно 40 или более аминокислот. Как правило, чтобы иметь возможность осуществлять свою биологическую функцию, белки сложены в одну или несколько определенных пространственных конформаций.
Как правило, антитело, например, является активным, если оно все еще способно связываться с антигеном, к которому антитело специфично. Фермент является активным, если он способен катализировать свою ферментативную реакцию. Белки, которые способны связываться с рецептором, как правило, являются активными, если они сохраняют свою способность связывания и предпочтительно активирования указанного рецептора. Является или нет белок денатурированным (не активным), как правило, можно оценить с помощью антитела, специфичного к нативному белку.
Как правило, антитело не связывается с денатурированным, не активным белком, или связывается с денатурированным белком с существенно сниженной аффинностью.
Выражение «активная молекула» для задач настоящего описания относится к биоактивной молекуле. Вместо выражения «биоактивная молекула», термин "биоактивный" (во множественном числе «биоактивные») может быть использован и рассматривается как эквивалентный в данном описании.
Для задач настоящего изобретения пригодность способа изобретения для сохранения активности биоактивных молекул может быть проверена путем добавления к композиции определенного белка, например антитела, и проверки способности антитела в композиции связываться со своим антигеном после обработки в соответствии со способом изобретения. Связывающая способность может сравниваться со связывающей способностью антитела, присутствующего в необработанном стандарте композиции, к которому добавлялось антитело в тех же самых количествах.
Для оценки присутствует ли белок в своей нативной форме, предпочтительно применяют ИФА, как описано в примерах ниже. Соответственно, используют пары антител, которые специфически связываются с нативным белком (при этом белок также может быть антителом). Сравнение содержаний обнаруживаемых ИФА биоактивных молекул в композиции перед (необработанный стандарт) и после PEF-обработки, например, позволяет определять, сколько белка сохранило целостность после PEF-обработки, данная сохраненная целостность определяется по сохранившемуся связыванию специфичных к белку антител, использованных для ИФА.
В более общем плане, содержание биоактивных молекул в композиции изобретения или в контрольной композиции можно определить с помощью принятых методов измерения биологической активности, включающих, но не ограничивающихся ВЭЖХ, анализами на основе клеток, анализами на основе ферментов, ИФА, проточной цитометрией (которая становится признанной альтернативой ИФА), радиоиммунными анализами и анализами in vivo с использованием животных моделей.
Например, принятые методы оценки количества нативного лактоферрина включают, но не ограничиваются хроматографическими методами (Palmano et al. Journal of Chromatography, 947, 307-311, 2002), иммунологическими методами, в том числе ИФА (Desmazeaud, Bulletin of International Dairy Federation vol. 284, Lactoferrin (pp. 29-42), 1993) и биосенсорными иммунологическими анализами (Indyk et al., International Dairy Journal, 15(5), 429-438, 2005). Целостность лактоферрина, иммуноглобулинов, факторов роста и других белков может быть измерена, как описано в примерах ниже.
Казеингликомакропептид (CGMP или гликомакропептид GMP, как он также может называться) высвобождается из каппа-казеина посредством стадии сычужной коагуляции казеина (под действием химозина). Он обнаруживается в сывороточной фракции, которая известна как сладкая сыворотка или сырная сыворотка. CGMP может быть извлечен и, таким образом, количественно определен с помощью анионного обмена. Он является веществом, полезным для костей.
Предпочтительный способ определения суммарного, абсолютного содержания определенного белка в соответствии с изобретением, в том числе содержания определенного белка в денатурированной и/или нативной форме, описан ниже.
Упомянутые в данном описании биоактивные молекулы могут быть выбраны независимо из нативных белков, биоактивных липидов, сиаловой кислоты, нуклеотидов, олигосахаридов, аминокислот, таурина и витаминов.
Предпочтительно, указанные биоактивные молекулы независимо выбирают из одной или нескольких групп, состоящих, например, из: одного или нескольких протеинов, которые естественным образом присутствуют в молоке; одного или нескольких липидов, которые естественным образом присутствуют в молоке; одного или нескольких витаминов, которые естественным образом присутствуют в молоке, сиаловой кислоты, нуклеотидов, олигосахаридов, аминокислот и таурина.
В соответствии с настоящим изобретением композиция изобретения содержит биоактивные вещества молока на белковой основе. В то же время способ настоящего изобретения предпочтительно не влияет, в частности на частичное или полное уменьшение активности других биоактивных молекул, таких как молекулы, которые чувствительны к температуре. В частности, композиция изобретения содержит активные витамины, которые естественным образом встречаются в молоке.
Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения указанный один или несколько типов биоактивных молекул выбирают из биоактивных белков. Указанный белок предпочтительно выбирают из антимикробных факторов, факторов роста иммуноглобулинов, цитокинов и/или про-/противовоспалительных факторов, хемокинов, ферментов, в том числе пищеварительных ферментов, белковых гормонов, транспортеров, гликомакропептида, α-лактальбумина, β-лактоглобулина, белков мембран жировых глобул молока, и сочетаний из двух или более вышеупомянутых веществ, при этом по меньшей мере 30% соответствующего белка находится в нативной форме.
Предпочтительно данные нативные белки присутствуют в PEF-обработанной композиции в относительных или абсолютных содержаниях, указанных в другом месте данного описания.
В соответствии с вариантом осуществления композиция изобретения содержит нативные антимикробные факторы, которые могут быть выбраны из группы, состоящей из иммуноглобулинов, лактоферрина, лизоцима, антимикробных пептидов, таких как β-дефензины, комплемента С3, и сочетаний из двух или более из вышеупомянутых компонентов.
Иммуноглобулины могут включать один или несколько иммуноглобулинов, выбранных из IgA, IgE, IgG и IgM в нативной форме, и сочетания двух или более из них. Сообщается, что данные иммуноглобулины находятся в коровьем молоке. Иммуноглобулины могут дополнительно включать IgD. Предпочтительно иммуноглобулины представлены IgA и IgG.
Некоторые иммуноглобулины имеют разные подтипы. Композиция изобретения может содержать один, сочетание нескольких или все подтипы данного иммуноглобулина, присутствующего естественным образом в молоке. Подтипами IgA являются IgA1 и/или IgA2. Подтипами IgG являются IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3, IgG4. Композиция может содержать один, сочетание из двух или более, или все подтипы IgA, IgG и, возможно, других IgG, в частности в нативной форме.
В соответствии с вариантом осуществления композиция изобретения содержит факторы роста в нативной форме, которые могут быть выбраны из, например, эпидермальных факторов роста (EGF), факторов роста нервов (NGF), инсулиноподобных факторов роста (IGF), трансформирующих факторов роста (TGF), фактора роста молозива коровы (BCGF), фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), гормона роста (GH), факторов роста молочной железы (MDGF), колониестимулирующего фактора макрофагов (M-CSF), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), и сочетаний из двух или более вышеупомянутых веществ.
TGF включает, в частности, TGF-β. Например, композиция изобретения содержит нативный TGF-β1 и/или нативный TGF-β2.
В соответствии с вариантом осуществления композиция изобретения содержит цитокины, хемокины в нативной форме и/или про-/противовоспалительные факторы в нативной форме, такие как факторы, которые могут быть выбраны из факторов некроза опухоли (TNF), интерлейкины (IL), такие как IL-1, -2, -4, -5, -6, -8, -10, интерферон (IFN)-γ, TGFs, α1-антитрипсин, α1-антихимотрипсин, простагландины, фактор активации тромбоцитов, белок хемотаксиса моноцитов (MCP)-1, RANTES (хемокин, экспрессируемый и секретируемый Т-клетками при активации) и сочетания двух или более из вышеупомянутых веществ.
В соответствии с вариантом осуществления композиция изобретения содержит нативные ферменты, например, активные пищеварительные ферменты, такие как ферменты, выбранные из группы амилазы, эстеразы, стимулированной желчной кислотой, липазы стимулированной желчной кислотой, липопротеинлипазы, протеаз, таких как плазмин, или активные непищеварительные ферменты, такие как ферменты, выбранные из щелочной фосфатазы, лактопероксидазы, лизоцима, и сочетания двух или более из вышеупомянутых веществ.
В соответствии с вариантом осуществления композиция изобретения содержит активные/нативные гормоны, например, гормоны, выбранные из группы инсулина, пролактина, окситоцина, ингибитора лактации по типу обратной связи (FIL), тироидных гормонов, стероидных гормонов, кортикостероидов, адренокортикотропного гормона (АСТН), бомбезина, холецистокинина, эстрогенов, гастрина, гормона, высвобождающего гормон роста (GHRH), нейротензина, паратиреоидного гормона (РТН), тестостерона, тиреостимулирующего гормона (TSH), тиролиберина (TRH), вазоактивного интестинального пептида (VIP), кальцитонина, паратиреоидного гормона, эритропоэтина и сочетаний из двух или более вышеупомянутых веществ. Предпочтительно, композиция содержит один или несколько гормонов на белковой основе в нативной форме.
В соответствии с вариантом осуществления композиция изобретения содержит активные белки-транспортеры, например, выбранные из группы лактоферрина, фолат-связывающего белка, IGF-связывающего белка, кобаламин-связывающего белка, тироксин-связывающего белка, кортикостероид-связывающего белка, витамин-связывающих белков и сочетаний из двух или более вышеупомянутых веществ.
Согласно предпочтительному варианту осуществления композиция содержит один или несколько нативных белков, выбранных из нативных иммуноглобулинов, нативного лактоферрина, нативного β-лактоглобулина, нативного α-лактальбумина и нативного TGF-β.
В соответствии с вариантом осуществления композиция изобретения содержит активные витамины. В частности, PEF-обработка композиции оказывает незначительное влияние на несколько, большинство или все витамины, которые встречаются естественным образом в молоке. Таким образом, композиция изобретения содержит водорастворимые и/или жирорастворимые витамины. Композиция предпочтительно содержит один или несколько витаминов, выбранных из группы (неполный перечень) из витамина A, D, Е, K, В1 (тиамина), В2 (рибофлавина), В3 (ниацина), В5 (пантотеновой кислоты), В6 (пиридоксина), В7 (биотина), В9 (фолата), В12 (кобаламина) и С (L-аскорбата). Предпочтительно композиция содержит водорастворимые витамины, присутствующие естественным образом в молоке, которые указаны выше, за исключением витаминов А и Е.
Витамины, указанные выше, включают все формы таких витаминов, которые могут быть адсорбированы и использованы в процессе метаболизма человека. Ссылка на витамин Е включает и предпочтительно состоит из α-токоферола и γ-токоферола; ссылка на витамин С включает аскорбиновую кислоту и дегидроаскорбиновую кислоту; витамин А относится к ретиноловым эквивалентам (RE).
В соответствии с вариантом осуществления композиция изобретения содержит по меньшей мере один белок, имеющий последовательность аминокислот, соответствующую последовательности аминокислот биоактивного белка, встречающегося естественным образом в молоке, где по меньшей мере 30% указанного белка присутствует в нативной форме. Предпочтительные количества и процентные содержания, приведенные в другом месте в данном описании в отношении конкретных биоактивных белков, применимы также к данному варианту осуществления.
Отмечается, что денатурированный белок обычно больше не обладает биологической активностью белка с исходной укладкой, находящегося в сыром молоке. Хотя денатурированный белок все еще имеет такую же аминокислотную последовательность, что и неденатурированный активный белок, антитело, специфичное к активному белку, как правило, не связывается, или связывается с существенно сниженной афинностью с денатурированным, неактивным белком. Поэтому белок может все еще присутствовать, например, в термически пастеризованной композиции, но данный белок больше не является нативным/активным.
В соответствии с вариантом осуществления композиция изобретения содержит 30% или более, предпочтительно 40%, более предпочтительно 50% или более, в частности 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более определенного белка в нативной форме относительно общего содержания указанного белка в указанной композиции.
Для задач настоящего описания процентное содержание применяется в мол. % или масс. %, поскольку процентное содержание относится к определенному белку данной молекулярной массы. Процентное содержание можно определить способами, указанными в другом месте данного описания.
Общее или абсолютное содержание любого определенного белка, в том числе денатурированного и/или деградировавшего и нативного белка в композиции, может быть определено аналитически. Предпочтительный способ, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением, основан на методе жидкостной хроматографии/высокоселективного мониторинга реакций/масс-спектрометрии (LC-HSRM-MS). Способ описан для мембран жировых глобул молока В.Y. Fong, С.S. Norris "Quantification of Milk Fat Globule Membrane Proteins Using Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry" J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 6021-6028. Данный способ может быть приспособлен к любому белку, с помощью определения определенных отщепленных пептидных последовательностей, которые могут быть получены с помощью протеаз, с последующим количественным определением данных пептидов масс-спектрометрией для определения/подсчета общего содержания определенного белка.
Таким образом, с помощью количественного определения нативного белка путем ИФА и общего белка с помощью LC-HSRM-MS, можно определить, какое процентное содержание любого определенного белка (например, лактоферрина) присутствует в данной композиции в нативной форме.
Таким образом, ИФА и LC-MS-HSRM могут совместно применяться для определения количества определенного белка в образце, тогда как ИФА подходит только для количественного определения белка в нативной форме. Поэтому, если образец композиции не содержит какого-либо денатурированного белка (например, неочищенное сырое молоко), оба способа дают сходные результаты с хорошим соответствием.
Можно также стандартизировать один метод (например, ИФА) по другому (например, LC-HSRM-MC) с помощью образца, который содержит соответствующий белок только в нативной форме. Это может способствовать снижению пределов погрешности при определении количества нативного белка в образце, который также содержит денатурированный белок.
Для задач настоящего описания процентные содержания, указанные в данном описании, могут включать пределы погрешности ≤15%, предпочтительно ≤10%, более предпочтительно ≤5%, еще более предпочтительно ≤3%, и наиболее предпочтительно ≤2%. Термины «около» и/или «практически», если не определено иное и применительно к какому-либо конкретному значению, означают ±15% от соответствующего значения, предпочтительно ±10%, более предпочтительно ±5%, еще более предпочтительно ±3%, и наиболее предпочтительно ±2%.
Для целей настоящего описания выражение «определенный белок» относится к белку с определенной аминокислотной последовательностью или принадлежащему к группе белков с очень идентичными последовательностями и аналогичными функциями. Например, все IgA, содержащиеся в образце или композиции, как правило, считаются определенным белком, но также и сумма IgA любого определенного подтипа IgA может рассматриваться как определенный белок. Предпочтительно выражение «специфичный белок» относится к белкам, которые можно определить количественно как единое целое или структурную единицу, способами, описанными в данном документе. Для иллюстрации этого предпочтительно применяют ИФА для количественной оценки всех нативных IgA, присутствующих в образце. С другой стороны, существуют и более специфические ИФА-тесты, которые дают возможность идентифицировать подтип данного семейства белков, например, подтип IgA.
В соответствии с вариантом осуществления композиция изобретения содержит активный IgA, включающий один или несколько подтипов, как указано в другом месте данного описания. Предпочтительно, композиция содержит 30% или более, предпочтительно 35%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более IgA в активной форме относительно общего IgA в композиции.
«Общий» IgA, или любой другой специфичный белок (например, IgG, лактоферрин и т.д.), означает сумму нативных и денатурированных IgA, присутствующих в композиции или образце.
Было установлено, что концентрация IgA в конкретном образце необработанного сырого молока составляла 135 мкг/мл. Композиция изобретения предпочтительно содержит нативный IgA в количестве около вышеупомянутых процентных содержаний от 135 мкг/мл.
В соответствии с вариантом осуществления композиция изобретения содержит нативный IgG, включающий один или несколько подтипов, как указано в другом месте данного описания. Предпочтительно, композиция содержит 30% или более, предпочтительно 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 90%, 95% или более IgG в нативной форме относительно общего IgG в композиции.
Было установлено, что концентрация IgG в конкретном образце сырого молока составляла 860 мкг/мл. Композиция изобретения предпочтительно содержит IgG в количестве около вышеупомянутых процентных содержаний от 860 мкг/мл.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит нативный IgE. Предпочтительно, композиция содержит 30% или более, предпочтительно 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 90%, 95% или более IgE в нативной форме относительно общего IgE в композиции.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит нативный IgM. Предпочтительно, композиция содержит 30% или более, предпочтительно 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 90%, 95% или более IgM в нативной форме относительно общего IgM в композиции.
В соответствии с вариантом осуществления композиция предпочтительно содержит нативный лактоферрин. Лактоферрин обладает противомикробными, антиоксидантными, антиканцерогенными и противовоспалительными свойствами. Предпочтительно композиция содержит 30% или более, предпочтительно 50%, 60%, 70%, 75%, 77%, 80%, 82%, 85%, 90%, 95% или более лактоферрина в нативной форме относительно общего количества лактоферрина в композиции. В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит лактоферрин, при этом по меньшей мере 75% от общего содержания лактоферрина в указанной композиции присутствует в нативной форме.
Было установлено, что концентрация лактоферрина в конкретных образцах необработанного сырого молока составляла около 150-200 мг/л. Композиция изобретения предпочтительно содержит нативный лактоферрин в количестве вышеупомянутых процентных содержаний от 150 мг/л.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит нативный лизоцим. Предпочтительно, композиция содержит 30% или более, предпочтительно 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более лизоцима в нативной форме относительно общего содержания лизоцима в композиции.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит нативный EGF. Предпочтительно композиция содержит 30% или более, предпочтительно 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более EGF в нативной форме относительно общего содержания EGF в композиции.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит нативный NGF. Предпочтительно композиция содержит 30% или более, предпочтительно 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более NGF в нативной форме относительно общего содержания NGF в композиции.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит нативный IGF. Предпочтительно композиция содержит около 30% или более, предпочтительно 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более IGF в нативной форме относительно общего содержания IGF в композиции.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит нативный TGF. Предпочтительно композиция содержит около 30% или более, предпочтительно 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более TGF, в частности TGF-β1 и/или TGF-β2, в нативной форме, относительно общего содержания TGF, в частности TGF-β1 и/или TGF-β в композиции.
Было установлено, что концентрация TGF-β1 в конкретном образце необработанного сырого молока составляла около 0,35 нг/мл. Композиция изобретения предпочтительно содержит нативный TGF-β1 в количестве около вышеупомянутых процентных содержаний от 0,35 нг/мл.
Было установлено, что концентрация TGF-β2 в конкретном образце необработанного сырого молока составляла около 40 нг/мл. Композиция изобретения предпочтительно содержит нативный TGF-β2 в количестве около вышеупомянутых процентных содержаний от 40 нг/мл.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит нативные интерлейкины. Предпочтительно композиция содержит 30% или более, предпочтительно 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более интерлейкинов в нативной форме относительно общего содержания интерлейкинов в композиции.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит нативный INF-γ. Предпочтительно композиция содержит 30% или более, предпочтительно 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более INF-γ в нативной форме относительно общего содержания INF-γ в композиции.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит нативный α1-антитрипсин. Предпочтительно композиция содержит 30% или более, предпочтительно 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более α1-антитрипсина в нативной форме относительно общего содержания α1-антитрипсина в композиции.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит нативную амилазу. Предпочтительно композиция содержит 30% или более, предпочтительно 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более амилазы в нативной форме относительно общего содержания амилазы в композиции.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит нативную эстеразу, стимулированную желчной кислотой. Предпочтительно композиция содержит 30% или более, предпочтительно 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более эстеразы, стимулированной желчной кислотой, в нативной форме относительно общего содержания в композиции эстеразы, стимулированной желчной кислотой.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит нативную липазу, стимулированную желчной кислотой. Предпочтительно композиция содержит 30% или более, предпочтительно 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более липазы, стимулированной желчной кислотой, в нативной форме относительно общего содержания в композиции липазы, стимулированной желчной кислотой.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит нативную липопротеинлипазу. Предпочтительно композиция содержит 30% или более, предпочтительно 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более липопротеинлипазы в нативной форме относительно общего содержания липопротеинлипазы в композиции.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит нативный пролактин. Предпочтительно композиция содержит 30% или более, предпочтительно 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более пролактина в нативной форме относительно общего содержания пролактина в композиции.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит нативный окситоцин. Предпочтительно композиция содержит 30% или более, предпочтительно 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более окситоцина в нативной форме относительно общего содержания окситоцина в композиции.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит нативный фолат-связывающий белок. Предпочтительно композиция содержит 50% или более, предпочтительно 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более фолат-связывающего белка в нативной форме относительно общего содержания фолат-связывающего белка в композиции.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит нативный IGF-связывающий белок. Предпочтительно композиция содержит 50% или более, предпочтительно 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более IGF-связывающего белка в нативной форме относительно общего содержания IGF-связывающего белка в композиции.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит нативный α-лактальбумин. Предпочтительно композиция содержит 50% или более, предпочтительно 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 95% или более α-лактальбумина в нативной форме относительно общего содержания α-лактальбумина в композиции.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит нативный β-лактоглобулин. Предпочтительно композиция содержит 50% или более, предпочтительно 60%, 65%о, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более β-лактоглобулина в нативной форме относительно общего содержания β-лактоглобулина в композиции.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит одно или несколько веществ, выбранных из нативного лактоферрина, нативного IgA, нативного IgG, нативного TGF-β1, нативного TGF-β2 и их сочетаний.
В соответствии с вариантом осуществления PEF-обработанная композиция изобретения содержит лактоферрин, IgA, IgG, TGF-β1 и TGF-β2 в нативной форме в содержаниях, соответствующих по меньшей мере 50% лактоферрина, по меньшей мере 30% IgA, по меньшей мере 50% IgG, по меньшей мере 50% TGF-β1, и по меньшей мере 50% TGF-β2 в нативной форме относительно общего содержания соответствующего белка в композиции.
Предпочтительно композиция содержит по меньшей мере 60%, предпочтительно 65% или более, 70% или более, 75% или более, 80% или более нативного лактоферрина, 40% или более, 45% или более, 50% или более, 55% или более, 56% или более нативного IgA; 60% или более, 65% или более, 70% или более, 77% или более, 80% или более нативного IgG; 55% или более, 60% или более, 70% или более, 75% или более, 80% или более нативного TGF-β1, и/или 60% или более, 70% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более нативного TGF-β2, при этом указанные процентные содержания относятся к общему содержанию соответствующего белка в композиции.
В соответствии с вариантом осуществления PEF-обработанная композиция содержит одно или несколько веществ, выбранных из: по меньшей мере 38 мг/л нативного лактоферрина, по меньшей мере 40,5 мкг/мл IgA, по меньшей мере 434 мкг/мл IgG, по меньшей мере 0,19 нг/мл нативного TGF-β1, и по меньшей мере 20,7 нг/мл нативного TGF-β2.
В соответствии с вариантом осуществления PEF-обработанная композиция содержит одно или несколько веществ, выбранных из: по меньшей мере 50 мг/л нативного лактоферрина, по меньшей мере 60 мкг/мл IgA, по меньшей мере 600 мкг/мл IgG, по меньшей мере 0,25 нг/мл нативного TGF-β1 и по меньшей мере 30 нг/мл нативного TGF-β2.
В соответствии с вариантом осуществления PEF-обработанная композиция содержит одно или несколько веществ, выбранных из: по меньшей мере 60 мг/л нативного лактоферрина, по меньшей мере 70 мкг/мл IgA, по меньшей мере 700 мкг/мл IgG, по меньшей мере 0,30 нг/мл нативного TGF-β1 и по меньшей мере 35 нг/мл нативного TGF-β2.
В соответствии с вариантом осуществления композиция изобретения содержит один или несколько биоактивных витаминов, выбранных из группы A, D, Е, K, B1, В2, В3, В5, В6, В7, В9, В12 и С.
В соответствии с вариантом осуществления композиция изобретения содержит витамин А. Витамин А, как правило, полностью разрушается термической пастеризацией. Предпочтительно композиция содержит 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% или более витамина А в активной форме по сравнению с необработанным стандартом.
В образце необработанного сырого молока обнаружено 300 мкг витамина А на кг (на кг сырого молока). Композиция изобретения предпочтительно содержит, в частности, если она является цельным молоком, по меньшей мере абсолютные содержания витамина А в цельном молоке, соответствующие вышеупомянутым процентным содержаниям. Иначе говоря, композиция содержит 150 мкг (50%) или более, 180 мкг (60%) или более, 210 мкг (70%) или более, 240 мкг (80%) или более, 255 мкг (85%) или более, 270 мкг (90%) или, 285 мкг (95%) или более витамина А на кг композиции.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит витамин К. Предпочтительно композиция содержит 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или более витамина К в активной форме по сравнению с необработанным стандартом. В цельном молоке обнаружено около 45 мкг витамина К на кг. Композиция изобретения предпочтительно содержит, в частности, если она является цельным молоком, по меньшей мере абсолютные содержания витамина А в цельном молоке, соответствующие вышеупомянутым процентным содержаниям (как проиллюстрировано в отношении витамина А).
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит витамин D. Предпочтительно композиция содержит 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или более витамина D в активной форме по сравнению с необработанным стандартом. Обнаружено, что цельное молоко содержит около 10 мкг витамина D на кг. Композиция изобретения предпочтительно содержит, в частности, если она является цельным молоком, по меньшей мере абсолютные содержания витамина D в цельном молоке, соответствующие вышеупомянутым процентным содержаниям.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит витамин Е. Предпочтительно композиция содержит 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 91%, 98% или 99% или более витамина Е в активной форме по сравнению с необработанным стандартом.
Поскольку витамины К D и Е являются более стабильными по отношению к воздействию температуры, разница в содержаниях этих витаминов в композиции изобретения по сравнению с термически пастеризованной композицией оказывается меньше.
Содержания водорастворимых витаминов, присутствующих в цельном молоке, практически соответствуют содержаниям, присутствующим в полуобезжиренном молоке, обезжиренном молоке, молоке с пониженным содержанием жира, молоке с низким содержанием жира или не содержащем жира молоке, так как эти витамины в значительной степени присутствуют в не содержащей жира фракции цельного молока.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит В1 (тиамин). Предпочтительно композиция содержит 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% или более витамина В1 в активной форме по сравнению с необработанным стандартом.
В образце цельного необработанного сырого молока обнаружено около 400 мкг витамина В1 на кг. Композиция изобретения предпочтительно содержит по меньшей мере абсолютные содержания витамина В1, обнаруженные в цельном молоке, соответствующие вышеупомянутым процентным содержаниям. Иначе говоря, композиция изобретения содержит 250 мкг (50%) или более, 300 мкг (60%) или более, и т.д., витамина В1.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит В2 (рибофлавин). Предпочтительно композиция содержит 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% или более витамина В2 в активной форме по сравнению с необработанным стандартом. Было обнаружено, что цельное необработанное молоко содержит около 1600 мкг витамина В2 на кг. Композиция изобретения предпочтительно содержит по меньшей мере абсолютные содержания витамина В2, обнаруженные в цельном молоке, соответствующие вышеупомянутым процентным содержаниям.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит В3 (ниацин). Предпочтительно композиция содержит 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% или более витамина В3 в активной форме по сравнению с необработанным стандартом. Было обнаружено, что цельное необработанное молоко содержит около 800 мкг витамина В3 на кг. Композиция изобретения предпочтительно содержит по меньшей мере абсолютные содержания витамина В3, обнаруженные в цельном молоке, соответствующие вышеупомянутым процентным содержаниям.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит В5 (пантотеновую кислоту). Предпочтительно композиция содержит 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% или более витамина В5 в активной форме по сравнению с необработанным стандартом. Было обнаружено, что цельное необработанное молоко содержит около 3000 мкг витамина В5 на кг. Композиция изобретения предпочтительно содержит по меньшей мере абсолютные содержания витамина В5, обнаруженные в цельном молоке, соответствующие вышеупомянутым процентным содержаниям.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит В6 (пиридоксин). Предпочтительно композиция содержит 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% или более витамина В6 в активной форме по сравнению с необработанным стандартом. Было обнаружено, что цельное необработанное молоко содержит около 400 мкг витамина В6 на кг. Композиция изобретения предпочтительно содержит по меньшей мере абсолютные содержания витамина В6, обнаруженные в цельном молоке, соответствующие вышеупомянутым процентным содержаниям.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит В7 (биотин). Предпочтительно композиция содержит 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% или более витамина В7 в активной форме по сравнению с необработанным стандартом. Было обнаружено, что цельное необработанное молоко содержит около 20 мкг витамина В7 на кг. Композиция изобретения предпочтительно содержит по меньшей мере абсолютные содержания витамина В6, обнаруженные в цельном молоке, соответствующие вышеупомянутым процентным содержаниям.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит В9 (фолат). Предпочтительно композиция содержит 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% или более витамина В9 в активной форме по сравнению с необработанным стандартом. Было обнаружено, что цельное необработанное молоко содержит около 50 мкг витамина В9 на кг. Композиция изобретения предпочтительно содержит по меньшей мере абсолютные содержания витамина В9, обнаруженные в цельном молоке, соответствующие вышеупомянутым процентным содержаниям.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит В12 (кобаламин). Предпочтительно композиция содержит 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% или более витамина В9 в активной форме по сравнению с необработанным стандартом. Цельное необработанное молоко содержит около 4 мкг витамина В12 на кг. Композиция изобретения предпочтительно содержит по меньшей мере абсолютные содержания витамина В12, обнаруженные в цельном молоке, соответствующие вышеупомянутым процентным содержаниям.
В соответствии с вариантом осуществления композиция содержит витамин С. Предпочтительно композиция содержит 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% или более витамина С в активной форме по сравнению с необработанным стандартом. Было обнаружено, что цельное необработанное молоко содержит около 10 мг витамина С на кг. Композиция изобретения предпочтительно содержит по меньшей мере абсолютные содержания витамина С, обнаруженные в цельном молоке, соответствующие вышеупомянутым процентным содержаниям.
Некоторые витамины, в частности один или несколько из витаминов А, В1, В6, В9, В12, С и тиамина, являются чувствительными к нагреванию. Как правило, по меньшей мере 10% этих витаминов теряют свою активность, например из-за разрушения в ходе стандартной UHT-обработки, например, молока или сырого молока. Витамин А особенно чувствителен к UHT или термической пастеризации, и до 100% данного витамина теряется при этих способах.
Таким образом, композиция изобретения содержит по меньшей мере 30% одного или нескольких из данных витаминов (А, В1, В6, В9, В12, С) по сравнению с необработанным стандартом, предпочтительно по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90, 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%, 97% и 98% по сравнению с необработанным стандартом. Указанные выше значения могут не применяться для витамина А, в частности, в случае, если композиция не содержит жира или имеет пониженное содержание жира.
В ходе стандартной термической пастеризации один или несколько из витаминов А, В12, С и тиамина, по меньшей мере частично теряют свою активность, например, из-за разрушения. Как правило, термическая пастеризация вызывает потерю по меньшей мере 10% данных витаминов. Композиция изобретения содержит по меньшей мере 30% одного или нескольких из этих витаминов по сравнению с необработанным стандартом, предпочтительно по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 85, 90%, 92%, 94%, 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%, 97% и 98% по сравнению с необработанным стандартом.
Если композиция, в частности необработанный стандарт является молоком, например, сырым молоком, процентные содержания витаминов и других биоактивных молекул могут использоваться для определения абсолютного содержания молекул в композиции, на основе абсолютных содержаний, приведенных в данном описании для соответствующих молекул в необработанном сыром молоке.
В соответствии с вариантом осуществления, даже если композиция не является молоком или сырым молоком, но содержит один или несколько типов описанных здесь биоактивных молекул, композиция предпочтительно содержит указанный тип молекул в абсолютных содержаниях, указанных или полученных из настоящего описания. Абсолютные содержания могут, в частности, быть получены из содержания молекул, обнаруженного в сыром молоке, и/или из процентных содержаний активных/нативных молекул, как указано в данном описании.
5
Композиция изобретения предпочтительно имеет количество жизнеспособных микроорганизмов, которое ниже, чем 10 КОЕ на грамм композиции. Что касается микробных нагрузок, которые считаются приемлемыми или могут не причинять вреда, они также упоминаются в "Verordnung über Hygiene- und Qualitätsanforderungen an Milch und Erzeugnisse auf Milchbasis (Milchverordnung)", vom 20. Juli 2000, Bundesgesetzblatt Jahrgang 2000 Teil I Nr. 26, S. 1178 vom Juli 2000, zuletzt geändert durch Bundesgesetzblatt Jahrgang 2004 Teil I Nr. 58, S. 2794 vom 12. November 2004). См., в частности, «Anlage 6», особенно раздел 3.1.1, касающийся требований к пастеризованному молоку.
5
Предпочтительно композиция имеет число КОЕ, которое ниже чем 10 КОЕ на грамм композиции спустя 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 или более дней после PEF-обработки в соответствии с настоящим изобретением. В течение данных периодов времени композицию хранили при 4°С. Количество жизнеспособных микроорганизмов определяли путем инкубации при 30°С на чашках Петри и на основе подсчета колониеобразующих единиц.
4
Предпочтительно композиция имеет число КОЕ, которое ниже чем 5×10 КОЕ на грамм композиции спустя 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 или более дней после PEF-обработки в соответствии с настоящим изобретением. В течение данных периодов времени композицию хранили при 4°С.
4
Предпочтительно композиция имеет число КОЕ, которое ниже чем 10 КОЕ на грамм композиции спустя 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 или более дней после PEF-обработки в соответствии с настоящим изобретением. В течение данных периодов времени композицию хранили при 4°С.
3
Предпочтительно композиция имеет число КОЕ, которое ниже чем 5×10 КОЕ на грамм композиции спустя 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 или более дней после PEF-обработки в соответствии с настоящим изобретением. В течение данных периодов времени композицию хранили при 4°С.
В соответствии с вариантом осуществления, композиция изобретения имеет срок хранения и/или устойчивость, которые практически идентичны устойчивости как сроку хранения другой сравниваемой композиции, обработанной с помощью термической пастеризации. В частности, срок хранения композиции в днях, при хранении при 4°С, практически такой же, как у сравниваемой термически пастеризованной композиции.
5
4
4
4
3
4
Для задач настоящего описания, композиция считается «безопасной в пищевом отношении» и/или «микробиологически безопасной», если она имеет микробное число (КОЕ) менее 10, предпочтительно менее 5×10, еще более предпочтительно менее 5×10, например, менее 10, наиболее предпочтительно менее 5×10 КОЕ/г композиции. Для того чтобы быть безопасной в пищевом и/или микробиологическом отношении, данное микробное число предпочтительно не должно превышать указанные значения в течение по меньшей мере 4 дней, предпочтительно по меньшей мере 6, 8, 10, и наиболее предпочтительно 10 дней, при хранении композиции при 4°С и после PEF-обработки в соответствии с изобретением. Предпочтительно композиция является безопасной в пищевом отношении, если после хранения в течение 10 дней при 4°С микробное число не превышает 10 КОЕ/г.
Наиболее предпочтительно, композиция является микробиологически безопасной, если она не содержит какого-либо обнаруживаемого вегетативного патогенного микроорганизма, в частности в образце 25 мл (см. «Milchverordnung» в вышеупомянутой ссылке). В соответствии с вариантом осуществления композиция не содержит каких-либо обнаруживаемых вегетативных микроорганизмов.
Электропроводность композиции изобретения составляет от 2 до 10 мСм/см, предпочтительно от 2,5 до 7,0 мСм/см, более предпочтительно от 3 до 5 мСм/см, например от 3,5 до 4,5 мСм/см, наиболее предпочтительно от 3,7 до 4,3 мСм/см, например около 4 мСм/см.
Полезные свойства биоактивных молекул, охватываемых данным описанием, в значительной степени описаны в литературе. Например, лактоферрин обладает антиоксидантными, антиканцерогенными и противовоспалительными свойствами. Например, антитела, такие как IgA и IgG, обеспечивают пассивную защиту от патогенных микроорганизмов, таких как вирусы или бактерии. Например, TGF-β важны для развития и поддержания соответствующих иммунных ответов у младенцев и могут обеспечить защиту от негативных иммунологических последствий, таких как развитие аллергии или хронические воспалительные заболевания. Например, витамины действуют как катализаторы и таким образом имеют важное значение в различных процессах организма. Например, факторы роста важны для регулирования различных клеточных процессов путем стимулирования роста клеток, пролиферации и клеточной дифференцировки. Например, цитокины, хемокины и про-/противовоспалительные факторы являются иммуномодулирующими агентами, важными для эффективного иммунитета. Например, пищеварительные ферменты важны для оптимального переваривания молока новорожденными. Например, гормоны являются мессенджером, передающим сигнал от одной клетки к другой по всему организму и, таким образом, оказывают воздействие на иммунитет, обмен веществ, развитие организма и ответные реакции на окружающие его условия. Например, транспортные белки помогают в усвоении макро- или микронутриентов эпителием.
Композиция изобретения может использоваться для лечения и/или профилактики любого заболевания или состояния, связанного или соответствующего какому-либо одному или нескольким из вышеупомянутых, или могут использоваться для укрепления здоровья в соответствии с какой-либо одной или несколькими из вышеупомянутых биологических активностей. Изобретение также относится к способу лечения, причем данный способ включает стадию введения нуждающемуся в этом индивидууму эффективного и/или достаточного количества композиции изобретения.
Примеры
В нижеследующих примерах показаны некоторые из продуктов и способы их приготовления, находящиеся в пределах объема настоящего изобретения. Они не должны рассматриваться каким-либо образом как ограничивающие изобретение. Изменения и модификации могут быть сделаны применительно к настоящему изобретению. Специалисту в данной области будут очевидны многочисленные изменения данных примеров, охватывающие широкий спектр формул, ингредиентов, обработок и смесей с задачей рациональной корректировки питательных веществ и других элементов изобретения для различных применений.
Пример 1: PEF-установка
Как показано на фиг. 2, сконструирована PEF-установка 10, содержащая блок 11 электропитания (блок электропитания DIL ELCRACK HVP-5), конденсаторы 12, транзисторы 13 (IGBT-биполярный транзистор с изолированным затвором) и трансформатор 14 (трансформатор высокого напряжения DIL ELCRACK HVP-5). Блок 11 электропитания может преобразовывать переменный ток в постоянный при промежуточном уровне напряжения для зарядки конденсаторов. Транзисторы 13 могут периодически разряжать конденсаторы и генерировать импульсный ток, определяя максимальный выходной ток. Используя несколько транзисторов, установка позволяет излучать положительные или отрицательные импульсы. Для излучения положительного импульса включают два транзистора 13, расположенные в линиях по диагонали. С помощью импульсного трансформатора уровень напряжения разрядных импульсов увеличивается, в то время как пиковый ток понижается. Установка позволяет достичь в камере 1 обработки максимального напряжения 24 кВ и максимальной силы тока 200 А. Для получения биполярных импульсов, полярность меняют после каждого импульса. Таким образом, при каждом втором импульсе расположенные по диагонали транзисторы будут включены.
Установка содержит четыре камеры обработки, в частности две пары камер обработки. Пару коллинеарных камер обработки можно видеть на фиг. 4, при этом позиция 4 представляет подачу электропитания к заряженному электроду, и позиции 6 и 5 иллюстрируют шины заземления, которые здесь расположены соответственно перед и после центрального электрода, согласно схематическому изображению фиг. 1. На фиг. 5 показана более подробно конструкция камеры 1 обработки. Можно видеть изготовленные из титана электроды 4 и 6, а также конструкцию кожуха, покрытия или корпуса 16, который изготовлен из изоляционного материала, и который может быть зажат зажимом 9 таким образом, чтобы удержать камеру обработки вместе в качестве функционального блока. Таким образом, камера обработки может быть разобрана путем отсоединения зажима 9, например, с задачей очистки. В донной части камеры 1 обработки можно видеть передний конец элемента 30 вставки, который может быть виден более подробно на фиг. 6.
На фиг. 6 показаны детали коллинеарной камеры 1 обработки, при этом ссылочные номера позиций, использованные на фиг. 5, относятся к тем же самым элементам конструкции. Два кольца 17 образуют уплотнение между двумя электродами 4, 6 и изоляционным соединителем 8. Также можно видеть внутренний элемент 30, имеющий форму, напоминающую торпеду, который занимает осевое центральное положение внутри камеры обработки и который уменьшает ламинарный поток, заставляя жидкость двигаться близко к внутренним стенкам камеры обработки, как описано в WO 2011/092247 и DE 102010001279.3, озаглавленном: «Vorrichtung und Verfahren zur Hochspannungsimpulsbehandlung im Ringspalt». Коллинеарная камера обработки фиг. 6 имеет диаметр 10 мм. Как можно видеть на фиг. 6, кожух 16 выполнен из двух отдельных изоляционных частей, которые удерживаются вместе зажимом 9. При снятии зажима 9 все отдельные части камеры обработки могут быть отделены друг от друга. В канале 2 камеры обработки, соединение и разделение двух электродов 4, 6 осуществляется с помощью изоляционного соединителя 8.
Дополнительные конструкции камеры обработки, которые были протестированы, включают коллинеарную камеру обработки, наподобие камеры на фиг. 6, но без вставки-торпеды» и с меньшим диаметром 7 мм. Также использовалась камера обработки с так называемой конструкцией концентрации поля (не показана).
Пример 2: PEF-обработка сырого молока
Для всех экспериментов сырое молоко получали от фермера возле г. Квакенбрюк, Германия. Сырое молоко наливали в резервуар 22 с двойными стенками (фиг. 3) и нагревали до нужной температуры 20°С, 25°С или 30°С, используя нагревательную баню, регулируемую при помощи нагревателя 23. Для экспериментов использовалась PEF-установка, как описано в примере 1. Скорость поступления сырого молока доводили до 30 л/ч при противодавлении 2 бар (0,2 МПа), и продолжительность импульса сохраняли постоянной в 20 мкс. Удельную энергию изменяли в зависимости от частоты импульсов (см. уравнение 1 выше). Испытания начинали с частоты 50 Гц, и частоту увеличивали поэтапно до максимальной мощности PEF-установки.
На фиг. 3 проиллюстрирована вся установка 20, которая подходит для осуществления способов изобретения, и которую использовали для настоящих примеров. PEF-установка 10 является установкой ELCRACK HVP-5, описанной в примере 1 выше. Продукт проходит через канал 24 продукта в направлении, показанном стрелками. Выход 25 предусмотрен после двух камер обработки 1. После установки 10 PEF-обработки предусмотрен охладитель 26, который позволяет понижать температуру для хранения, например, до 4°С.
Повышение температуры из-за PEF-обработки измеряли с помощью датчиков температуры (тест 735, Testo AG Sales, Ленцкирх, Германия).
Пример 3: Микробная инактивация под влиянием PEF-обработки
Escherichia coli (АТСС 35218) и Listeria innocua (DSM20649), два штамма микроорганизмов с различными свойствами заряда по Граму были выбраны для испытаний.
Бактерии группы кишечной палочки культивировали в 200 мл Tryptone Soja Broth (CM, Oxoid Limited, Гемпшир, Великобритания) при встряхивании в течение 24 часов при 37°С. После обогащения, суспензию микроорганизмов добавляли к предварительно нагретому молоку и подвергали PEF-обработке, как описано в примере 2.
Обработанные образцы разводили на селективном агаре (агар Flurocult MacCONKEY, Merck, Дармштадт, Германия). После инкубации в течение 24 часов при 37°С подсчитывали колониеобразующие единицы на грамм сырого молока (КОЕ/г).
Грамположительные L. innocua культивировали в 200 мл One Bouillon Basis (СМ1066 В; Oxoid Limited; Гэмпшир; Великобритания) в течение 24 ч при 37°С. После инокуляции и обработки образцы разводили в растворе Maximum Recovery Diluent (СМ0733; Oxoid Limited; Гэмпшир; Великобритания) и наносили на Palcam Agar Basis (СМ0877 В; Oxoid Limited; Гэмпшир; Великобритания). Инокулированные чашки Петри выдерживали в течение 48 ч при 37°С перед подсчетом колониеобразующих единиц на грамм.
Для испытания срока хранения анализировали общее количество жизнеспособных микроорганизмов. Таким образом, сырое молоко не было инокулировано какими-либо микроорганизмами. Охлажденные образцы (4°С) разводили в Maximum Recovery Diluent (СМ0733, Oxoid Limited, Гэмпшир; Великобритания) и наносили на Plate Count Agar (СМ0463 В, Oxoid Limited, Гэмпшир, Великобритания). После 3 дней хранения при 30°С можно определить общее количество жизнеспособных микроорганизмов в колониеобразующих единицах на грамм (КОЕ/г).
0
0
Результаты можно видеть на фиг. 7-10. На фиг. 7А и 7В сравнивается влияние начальной температуры сырого молока на микробную инактивацию E. coli и L. innocua, соответственно, в зависимости от примененной удельной энергии. На фиг. 7А и 7 В использовали коллинеарную камеру обработки с диаметром 10 мм, без вставки. Инактивация представлена в виде log (N/N), где N и N являются микробными числами
(КОЕ/г) после и перед обработкой, соответственно. Можно видеть, что начальная температура сырого молока оказывает влияние на степень или эффективность инактивации, при этом начальная температура 30°С приводит к наиболее значительной микробной инактивации. Вследствие этого, для всех дальнейших экспериментов начальная температура сырого молока была установлена в 30°С.
На фиг. 8 показана инактивация E. coli и L. innocua в зависимости от удельной энергии при начальной температуре сырого молока 30°С и применении двух коллинеарных камер обработки с диаметром 10 мм и торпедной вставкой. Вертикальная линия возле значения удельной энергии 244 кг/кДж показывает, что при данной величине энергии микроорганизмы инактивированы ниже предела обнаружения. Как будет видно из дальнейших примеров, значительное количество биологически активных белков остается в нативном состоянии при данной величине удельной энергии.
На фиг. 9А и 9В сравнивается влияние конструкции камеры обработки на микробную инактивацию E. coli и L. innocua, соответственно, в зависимости от удельной энергии. Можно видеть, что коллинеарная камера обработки, содержащая внутренний элемент, приводит к наиболее эффективной инактивации. Иначе говоря, последняя камера обработки требует самого низкого потребления энергии для достижения заданной инактивации. Максимальная инактивация представляет собой снижение до 5,5 log. Горизонтальная линия на графике при -5,5 log представляет предел обнаружения, который означает, что ниже данной линии жизнеспособные количества микроорганизмов больше не обнаруживаются.
На фиг. 10A и 10В показан эффект микробной инактивации (E. coli и L. innocua, соответственно), в зависимости от конечной температуры молока после PEF-обработки. Повышение температуры связано с увеличением приложенной удельной энергии. Отчетливо видно влияние конструкции камеры обработки на конечную температуру. Результаты показывают, что конечная температура не только зависит от затраченной удельной энергии, но также и от конструкции камеры обработки, и, что более низкие конечные температуры могут быть достаточными для получения существенной инактивации. Камера обработки с концентрацией поля приводит к наиболее высокой конечной температуре, поэтому в настоящем изобретении предпочтительно не использовать данный тип камеры обработки. С другой стороны, наиболее низкая конечная температура была измерена при использовании коллинеарной камеры обработки с внутренним элементом.
В табл. 1 ниже показана конечная температура PEF-обработки с удельной энергией в коллинеарной камере обработки, использующей внутренний элемент в виде вставки.
0
Следует отметить, что N является количеством клеток (КОЕ) после PEF-обработки и N является количеством клеток перед обработкой. Как можно видеть, при PEF-обработке в соответствии с изобретением достигается микробная инактивация 5 log или более.
На основании испытаний, проведенных в примерах 2-3, были установлены наиболее благоприятные условия для PEF-обработки. Установлено, что конструкция камеры обработки, приложенная удельная энергия и начальная температура оказывают влияние на результат PEF-обработки.
Исходя из этих результатов использовали 10 мм коллинеарную камеру обработки со вставкой-«торпедо», начальную температуру обычно приводили к 30°С, длительность импульса составляла 20 мкс, напряженность поля 12 кВ/см, и сырое молоко подавали со скоростью поступления 30 кг/час при противодавлении 2 бар (0,2 МПа). Данные параметры являются предпочтительными параметрами PEF-обработки.
Пример 3: Влияние PEF-обработки на значение рН, электропроводность и цвет сырого молока
Значение рН сырого молока (6,9) не менялось в результате PEF-обработки в диапазоне удельной энергии от 70 до 373 кДж/кг. Электропроводность сырого молока (3,9) оставалась неизмененной PEF-обработкой до величины удельной энергии около 309-310 кДж/кг. При более высоких значениях удельной энергии наблюдалось уменьшение электропроводности (около 3,75 при 344 кДж/кг и 3,25 при 373 кДж/кг).
Эксперименты, в которых определяли L*-фактор (осветленность/затемненность), показали, что не существует никакого заметного изменения цвета сырого молока в результате PEF-обработки при значениях удельной энергии в диапазоне от около 250 до 350 кДж/кг.
Пример 4: Влияние PEF-обработки на биологически активные вещества в сыром молоке
4.1. Материал и методы
Пять биологически активных веществ в сыром молоке анализировали с помощью использования тест-наборов ИФА. Результаты получали с помощью ИФА-ридера (EL800, Bio-Tek Instruments; Уинуски; США) и программного обеспечения KCjunior (KCjunior; Bio-Tek Instruments; Уинуски; США).
После PEF-обработки образцы были заморожены (замораживание не повлияло на содержание активных белков). Перед анализом образцы центрифугировали при 4°С и 10000 об/мин (10621 *g) в течение 10 мин. Супернатант, содержащий большую часть жира, удаляли, и жидкую фазу использовали для дальнейшего анализа. ИФА анализ проводили в соответствии с предписаниями изготовителя.
Активный лактоферрин количественно определяли с помощью ИФА теста от Bethyl Laboratories (Lactoferrin ELISA Quantitation Set; Cat. No. E10-126; Bethyl Laboratories Inc.; Монтгомери; США) и использовали требуемые растворы (ELISA stop solution, Cat. No. El15; TMB Peroxidase Substrate (Solution A+B), Cat. No. E102; Microtiter Plates, Cat. No. C3041; Bethyl Laboratories, Inc.; Монтгомери; США). Анализ проводили, как описано в инструкции к набору.
Для анализа других биологически активных веществ использовали следующие наборы ИФА:
IgA: Bovine IgA ELISA kit E11-121; Bethyl laboratories Inc.; Монтгомери; США
IgG: Bovine IgG ELISA Kit E11-118; Bethyl laboratories Inc.; Монтгомери; США
TGF-бета 1: Многовидовой TGF-бета 1 ИФА; IBT-иммунологические и биохимические тест-системы GmbH; Ройтлинген; Германия.
TGF-бета 2: Многовидовой TGF-бета 2 ИФА; IBT-иммунологические и биохимические тест-системы GmbH; Ройтлинген; Германия. Все анализы проводили в соответствии с инструкциями к наборам.
4.2. Влияние PEF-обработки на содержание лактоферрина
Проводили испытания с задачей оценки влияния PEF-обработки на содержание лактоферрина с использованием предпочтительных параметров PEF-обработки, установленных в примере 3. Для данных испытаний все технологические параметры были постоянными за исключением удельной энергии.
Как можно видеть на фиг. 11, лактоферрин чувствителен к PEF-обработке, и его содержание уменьшается с увеличением удельной энергии. Однако, при удельной энергии 244 кДж/кг (вертикальная линия на графике), которая соответствует энергии, необходимой для инактивации как Е. coli, так и L. innocua, более чем примерно 85% (64 мг/л) исходного лактоферрина (76 мг/л) все еще обнаруживалось ИФА и, следовательно, присутствовало в нативной, и следовательно, в активной форме, для задач настоящего изобретения. Содержания лактоферрина начинали уменьшаться более значительно при величинах удельной энергии выше примерно 280-300 кДж/кг.
4.3. Влияние PEF-обработки на содержание IgA
Как можно видеть на фиг. 12, после PEF-обработки при удельной энергии 244 кДж/кг (вертикальная линия на графике), которая соответствует энергии, необходимой для инактивации как Е. coli, так и L. innocua, более чем примерно 56% (77,4 мкг/мл) исходного IgA (136,3 мкг/мл) все еще обнаруживалось ИФА и, следовательно, присутствовало в нативной, и следовательно, в активной форме.
4.4. Влияние PEF-обработки на содержание IgG
Как можно видеть на фиг. 13, после PEF-обработки при удельной энергии 244 кДж/кг (вертикальная линия на графике), которая соответствует энергии, необходимой для инактивации как Е. coli, так и L. innocua, более чем примерно 80% (703 мкг/мл) исходного IgG, присутствующего в сыром молоке (868 мкг/мл), все еще обнаруживалось ИФА и, следовательно, присутствовало в нативной, и, следовательно, в активной форме.
4.5. Влияние PEF-обработки на содержание TGF-β1
Как можно видеть на фиг. 14, после PEF-обработки при удельной энергии 244 кДж/кг (вертикальная линия на графике), которая соответствует энергии, необходимой для инактивации как Е. coli, так и L. innocua, более чем примерно 89% (0,34 нг/мл) исходного TGF-β1, присутствующего в сыром молоке (0,38 нг/мл), все еще обнаруживалось ИФА и, следовательно, присутствовало в нативной, и следовательно, в активной форме. В целом, для всего диапазона удельной энергии, содержание TGF-β1 колеблется вокруг среднего значения 0,35 нг/мл. Содержание TGF-β1 существенно не меняется в результате PEF-обработки.
4.6. Влияние PEF-обработки на содержание TGF-β2
Как можно видеть на фиг. 15, содержание TGF-β2 не меняется существенно в результате PEF-обработки. После PEF-обработки при удельной энергии 244 кДж/кг (вертикальная линия на графике), которая соответствует энергии, необходимой для инактивации как Е. coli, так и L. innocua, при ИФА не обнаруживалось существенного уменьшения исходного TGF-β2, присутствующего в сыром молоке (41,4 нг/мл).
В заключение необходимо отметить, что PEF-обработка в соответствии с настоящим изобретением подходит для эффективного уменьшения микробной нагрузки в жидкой или вязкой композиции. В то же время, обработка практически не разрушает или не разрушает полностью биологически активные белки или другие молекулы, которые присутствуют естественным образом в сыром молоке. Значительные количества данных биоактивных молекул остаются нативными/активными, несмотря на PEF-обработку в соответствии с данным изобретением.
На фиг. 16 обобщаются результаты данного примера, показывающие влияние PEF-обработки, которая подходит для значительного снижения микробной нагрузки на содержание разных биоактивных молекул.
Пример 5: Срок хранения PEF-обработанной композиции
Анализировали и сравнивали срок хранения сырого молока и PEF-обработанного сырого молока (см. процедуру в примере 3).
5
Прикладывали различную удельную энергию: 0 (сырое молоко), 65, 210, 244 и 314 кДж/кг, соответственно. Результаты показаны на фиг. 17. Как можно видеть, все образцы, за исключением необработанного сырого молока и PEF-обработанного молока при 65 кДж/кг, дают количество жизнеспособных клеток ниже 10 КОЕ/г в течение срока хранения 14 дней при 4°С. Последние два образца показали высокое количество клеток после 4 дней, и, в связи с интенсивным ростом бактерий эксперимент был остановлен для данных образцов, и дальнейшее данные не приводились. Срок хранения необработанного молока и молока, обработанного при 65 кДж/кг, таким образом, составляет менее четырех дней при 4°С. Для других обработанных образцов получен срок хранения 14 дней или более при 4°С.