Новые функции опухолевого супрессора р53: контроль клеточной архитектуры, адгезии и движения клеток

Б. П. Копнин

НОВЫЕ ФУНКЦИИ ОПУХОЛЕВОГО СУПРЕССОРА р53: КОНТРОЛЬ КЛЕТОЧНОЙ АРХИТЕКТУРЫ, АДГЕЗИИ И ДВИЖЕНИЯ КЛЕТОК

НИИ канцерогенеза ГУРОНЦим. И. Н. Блохина РАМН, Москва

Дисфункция р53 является наиболее универсальным молекулярным изменением в опухолях человека. Мутации и другие аномалии, приводящие к полной или частичной потере биохимических активностей р53, характерны для большинства новообразований более 60 разных типов. Предполагается, что онкогенный потенциал нарушений функции р53 связан с прекращением выполнения им своих охранных функций, которые заключаются в его способности вызывать при повреждениях ДНК и ряде других аномалий остановку клеточного цикла или апоптоз, предотвращая таким образом накопление в организме потенциально опасных клеток. В последние годы накапливаются данные, что р53 может выполнять и другие физиологические функции. В настоящей \/ статье дан обзор работ, описывающих две неизвестные ранее функции р5 3: а) воздействие на морфологию, адгезию и двигательную способность клеток; б) отслеживание и выбраковка клеток с различными изменениями клеточной архитектуры.

Ключевые слова: опухолевый супрессор р53, клеточный цикл, миграция клеток.

р53 dysfunction is the most universal molecular alteration in human cancer. p53 gene mutations and other abnormalities causing complete or partial loss of its function are characteristic of 60 different types of tumors. It is generally believed that carcinogenic potential of p53 inactivation is due to abrogation of its safeguard activity which implies the prevention of accumulation in the organism of potentially dangerous cells by inducing in them cell cycle arrest and/or apoptosis. Recent studies indicate however that p53 probably possesses some additional physiological functions. The paper reviews the data concerning two novel p53 functions: (i) regulation of cell moiphology, adhesion and migration; and, (ii) negative control of proliferation of cells with various alterations of cell architecture.

Keywords: p53 tumor supressor, cell cycle, cell migration.

Дисфункция р53 является наиболее универсальным молекулярным изменением в опухолях человека. Мутации и другие аномалии, приводящие к полной или частичной потере биохимических активностей р53, характерны для большинства новообразований более 60 разных типов. Предполагается, что онкогенный потенциал нарушений функции р53 связан, в первую очередь, с прекращением выполнения им своих охранных функций. Действительно, этот белок рассматривается как центральный компонент механизма, предотвращающего накопление в организме нежелательных клеток. Алгоритм работы этого механизма следующий: в ответ на самые разные повреждающие и стрессовые воздействия происходят посттрансляционные модификации белковых молекул р53 (фосфорилирование и ацетилирование определенных аминокислотных остатков) и образование так называемой «стрессовой» формы р53, обладающей большей

© Копнин Б. П., 2003 УДК 57б.З/.7:616-006-092.4/.9

стабильностью (т. е. увеличивается время жизни и содержание белка в клетке) и способностью сильно повышать транскрипцию генов, контролирующих клеточный цикл (p21WAFi/CIPI, 14-З-Зсти др.) и апоптоз (ВАХ, PUMA, р53-А1Р1, FAS, Killer/Dr5 и др.) [8; 9; 15]. Такая активация р53 приводит, в зависимости от клеточного контекста, либо к остановке клеточного цикла в G1- и 02-фазах, либо к гибели клеток (рис. 1). В результате организм освобождается от поврежденных и потенциально опасных клеток, способных дать развитие опухоли [8; 9; 15].

Наряду с этим было показано, что так называемая «латентная» форма р53 не инертна, а выполняет другие физиологические функции. Из них лучше всего изучены участие р53 в подавлении репликации в клетке вирусных ДНК и в процессах репарации ДНК [1; 8]. Причем переход р53 в «стрессовую» форму уменьшает его способность репариро-вать повреждения ДНК [1].

В 1997 г. в исследовании, проведенном нами в сотрудничестве с Ю. М. Васильевым и его ученицей Н. А. Глушанковой,

Активация чекпойнтов, остановка клеточного цикла

Рисунок 1. Функции «латентной» и «стрессовой» форм р53.

было обнаружено, что экспрессия экзогенного р53 может модулировать выраженность признаков морфологической трансформации клеток, вызываемой активацией онкогена Ras [5]. Эта находка дала толчок для серии работ, позволивших выявить неизвестные ранее функции р53: а) воздействие на морфологию, адгезию и двигательную способность клеток; б) отслеживание и выбраковку клеток с различными изменениями клеточной архитектуры. Были охарактеризованы и механизмы реализации данных функций р53. Ниже дан краткий обзор результатов этих исследований.

Воздействие р53 и его гомолога р73 на ламеллоподиальную активность и миграцию клеток

Изменение уровня экспрессии р53 вызывает существенные модификации морфологии клеток и их способности к направленному движению. Вначале А. Александрова и соавт. [2] показали, что в отсутствие стресса гиперэкспрессия экзогенного человеческого р53 ведет лишь к незначительному замедлению скорости пролиферации мышиных иммортализованных фибробластов линии 10(1), но зато индуцирует в них комплекс морфологических изменений, заключающийся в уменьшении площади клеток, снижении числа и размера фокальных контактов, приобретении более вытянутой формы и изменениях актинового цитоскелета (утончение пучков микрофиламентов, уменьшение их количества и размера). Прижизненная видеомикроскопия таких клеток выявила увеличение ламеллопо-диальной активности на ведущем крае клетки [2].

Дальнейшее исследование этого феномена, проведенное А. Саблиной и соавт. [12], показало, что воздействие на морфологию и движение клеток оказывают не только повышенное содержание экзогенного р53, но и физиологические концентрации эндогенного р53. Данный эффект проявлялся во всех исследованных типах клеток: нормальных человеческих кожных фибробластах, клетках рака легкого и толстой кишки, нормальных мышиных легочных фибробластах,

кератиноцитах, макрофагах. Гомозиготный нокаут гена р53 или подавление его экспрессии с помощью малых специфических шпилечных РНК вызывали уменьшение их способности мигрировать в рану in vitro и/или через фильтры с диаметром пор 8 мкм.

Интересно, что воздействие на морфологию и движение клеток оказывает так называемая «латентная» форма р53. Об этом свидетельствует 2 группы фактов: 1) условия эксперимента (нанесение раны в культуре клеток или их помещение на фильтры) не приводили к повышению транскрипционной активности р53; 2) функциональная активность р53 в мигрировавших клетках не повышалась [12]. С другой стороны, переход р53 в «стрессовую» форму при воздействии алкилиру-ющего соединения этилметансульфоната или при гипоксии ’ не вызывал существенного изменения миграционной способности клеток [12]. По-видимому, и «латентная», и различные «стрессовые» формы р53 (посттрансляционные модификации р53 при повреждениях ДНК и гипоксии отличаются [7]) примерно в одинаковой степени способны модулировать морфологию и движение клеток (рис. 1).

При изучении механизма воздействия р53 на двигательную способность клеток было установлено, что ключевым его элементом является модификация функциональной активности белка Racl, представителя Rho-семейства малых ГТФаз. Этот белок ответственен за протрузию ламеллоподий и направленное движение клетки [3]. Нокаут гена р53 не приводит к изменению синтеза и содержания белка Racl в клетке, но резко уменьшает его ГТФ-связанную, функционально активную фракцию [12]. Интересно, что потеря экспрессии р53 не сопровождалась при этом изменениями функциональной активности других представителей семейства малых ГТФаз — белков Rho и Cdc42 [12], контролирующих соответственно сборку сократимых актин-миозиновых филаментов, так называемых стресс-фибрилл и поддержание полярности клеток [3].

Поскольку критическую роль в регуляции функциональной активности Racl играют белки GEF, многие из которых в свою очередь контролируются фосфоинозитид-3-киназой (PI3K) [3], было исследовано влияние р53 на экспрессию и функциональную активность PI3K. Эти эксперименты показали, что нокаут гена р53 не вызывает изменения экспрессии обеих субъединиц PI3K — р85 и pi 10, но существенно снижает ее энзиматическую активность, выражающуюся в способности фосфорилировать фосфатидилинозитолы и генерировать молекулы (PIP2, PIP3), осуществляющие позитивную регуляцию функциональной активности белка Racl. С другой стороны, подавление активности PI3K с помощью вортман-нина нивелировало разницу в миграционной способности р53-позитивных и р53-негативных клеток. Таким образом, было установлено, что р53 стимулирует миграцию клеток, активируя сигнальный путь PI3K/Racl [12].

Каким же образом р53 регулирует активность этого сигнального пути? Эксперименты, в которых, в частности, использовались среды, кондиционированные клетками, отличающимися между собой по экспрессии в них р53, показали, что р53 воздействует на двигательную способность клеток не путем повышения синтеза и/или секреции мотогенных факторов, а за счет модуляции проведения сигнала от их рецепторов

Рецепторы

митогенов/мотогенов

р53/р73

Р13К

I

Яас1

!

Псевдоподиальная активность, движение клетки

Рисунок 2. Сигнальный путь, ответственный за способность р53 и его гомолога р73 воздействовать на подвижность клеток.

к РБК/Идс! [12] (рис. 2). Действительно, при воздействии одинаковых концентраций ЕОР или сыворотки, содержащей смесь митогенных/мотогенных факторов, содержание ГТФ-связанного Р.ас1 в р53-негативных клетках значительно ниже, чем в их аналогах, экспрессирующих р53. При этом важно подчеркнуть, что снижается эффективность сигнализации не от одного, а по крайней мере от нескольких рецепторов. Об этом свидетельствует, например, тот факт, что АО1478, ингибитор рецептора ЕО^ во-первых, вызывал лишь частичное снижение разницы в миграционной способности р53-пози-тивных и р53-негативных эпителиальных клеток НСТ116, а во-вторых, совершенно не воздействовал на различия в миграционной способности макрофагов, которые, как известно, не экспрессируют рецепторы ЕОР [12].

Интересно, что способность р53 модулировать сигнализацию от рецепторов митогенов/мотогенов к Р13К/]1ас1 зависит от его транскрипционной функции. Мутанты р53, утратившие способность трансактивировать гены-мишени, не влияют и на ламеллоподиальную активность клеток и их миграцию [2; 12]. Среди генов-мишеней р53 большую группу составляют гены, продукты которых регулируют морфологию, адгезию и движение клеток. Так, р53 повышает экспрессию рецепторов ЕОД НОР/ЭР гладкомышечного а-актина и, наоборот, репрессирует гены фибронектина, металлопро-теиназы-2 и др. Следует подчеркнуть, что анализ профиля генной экспрессии с помощью биомикрочипов показал, что набор генов, регулируемых р53, несколько меняется в зависимости от типа клеток [4; 6; 19; 20]. При этом вызываемые экспрессией р53 изменения транскрипции некоторых из этих генов могут вести не к стимуляции, а к ингибированию миграционной способности клеток. Поэтому в некоторых клеточных контекстах повышение экспрессии р53 может вызывать парадоксальный эффект — повышение ламеллоподи-альной активности, которое сопровождается не стимуляцией, а подавлением миграции клеток. Такой эффект наблюдался, в частности, в мышиных фибробластах с гиперэкспрессией экзогенного р53, в которых, вследствие подавления продукции

фибронектина, происходило резкое снижение способности клеток образовывать адгезионные контакты с субстратом. В результате они начинали «скользить» и «буксовать», что препятствовало их направленному движению [2].

Многие из р53-регулируемых генов являются одновременно транскрипционными мишенями и недавно открытых структурных гомологов р53 — белков рбЗ и р73 [4], физиологические функции которых отличаются от тех, которые выполняет р53 [17; 18]. В связи с этим представлялось интересным выяснить, способны ли гомологи р53, в частности р73, воздействовать подобно р53 на активность сигнального пути Р13К/Кас1 и миграционную способность клеток. Использование ретровирусных конструкций, экспрессирующих р73а или его транскрипционно-неактивный мутант, позволило показать, что трансактивационное действие р73 вызывает те же эффекты, что и экспрессия р53, а'именно увеличение функциональной активности белка 11ас1 и повышение способности клеток мигрировать через фильтры. Вероятно, эта активность р53 и р73 унаследована ими от более древнего общего эволюционного предшественника [12].

Какова же физиологическая роль способности р53 и/или его гомологов регулировать миграцию клеток? Можно было предположить, что за счет такой активности р53 участвует в процессе заживления ран, способствуя ремоделированию тканей. В пользу этого мог свидетельствовать тот факт, что в ранах кожи у мышей уровень экспрессии р53 в базальных слоях эпидермиса повышается [12]. Однако статистически достоверных различий в скорости зарастания кожных ран у контрольных мышей и мышей с гомозиготным нокаутом гена р53 выявлено не было, хотя при инактивации р53 наблюдалось чуть более медленное их заживление [12]. Отсутствие четкого влияния нокаута р53 на скорость заживления ран может быть объяснено существованием по меньшей мере двух компенсаторных механизмов: а) повышением функциональной активности гомолога р53 — белка р73, который, как известно, находится под негативным контролем р53 [12]; б) ускорением размножения клеток при инактивации р53, что может в какой-то степени компенсировать замедление заживления ран вследствие ингибирования миграции клеток. Поэтому для выяснения роли р53 в ремоделировании тканей при заживлении ран необходимы дальнейшие исследования.

Не исключено, что способность р53 и его гомологов стимулировать миграцию клеток вовлечена в регуляцию и других физиологических процессов, таких, например, как воспаление или морфогенез в эмбриональном развитии. Так, р53 наряду с его гомологами регулирует гены, контролирующие миграцию клеток нервного гребня, и его нокаут нередко сопровождается дефектами закрытия нервной трубки [19]. Примечательно также, что нокаут гена р73 вызывает как дефекты воспалительных реакций, так и значительные нарушения нейрогенеза, в частности формирования гиппокампа [17; 18]. Представляют интерес и онкологические аспекты этой неизвестной ранее активности опухолевого супрессора р53. Действительно, опухолевые клетки, как правило, обладают повышенной двигательной активностью, несмотря на потерю или нарушение функции в них р53. Поэтому в дальнейшем предстоит выяснить, каким образом в этих случаях компенсируется утрата р53-зависимого механизма усиления мотогенных сигналов.

Участие р53 в предотвращении размножения клеток с измененной архитектурой

Другой неканонической функцией р53 является его способность осуществлять негативный контроль размножения клеток с измененной морфологией и/или адгезией. Было обнаружено, что к функциональной активации р53 с последующей остановкой клеточного цикла в С1 могут приводить вызываемая колцемидом деполимеризация микротрубочек [11, 13], индуцируемая цитохалазином Д дезинтеграция системы актиновых микрофиламентов [10] и увеличение в клетке числа ядер [14] (рис. 3).

Исследование сигнальных путей, ответственных за реализацию этих функций р53, показало, что сигналом к активации р53 при разрушении тубулинового цитоскелета является рост фокальных контактов. Он вызывает активацию сигнального пути интегрины—11аГ— МАР-киназы [13], а повышение активности МАР-киназ, приводит как к фосфорилированию р53 по серину в 15 положении [13], так и к увеличению экспрессии белка АД что вызывает стабилизацию белка р53 [8; 9]. В результате в клетках с разрушенными микротрубочками повышаются содержание и функциональная активность р53 [13]. На ключевую роль сигнального пути интегри н ы/ЯаГ/М АР-киназы в такой активации р53 указывает тот факт, что его ингибирование на разных этажах передачи сигнала отменяет активацию р53 (рис. 4). Действительно, и блокирование активации интегринов (помещение клеток на поли-Ь-лизин), и введение в клетки доминантно-негативного мутанта (Яа(-С4), и обработка клеток ингибитором МАР-киназы МЕК1 (РО 098059) вызывали отмену функциональной активации р53 и вызываемой ею остановки клеток в 01-фазе клеточного цикла [11; 13].

Следует отметить, активация р53 в ответ на разрушение системы микротрубочек происходит не во всех, а только в некоторых типах клеток. Так, она наблюдается в человеческих и крысиных фибробластах, но не в эпителиоцитах, где деполимеризация микротрубочек не вызывает активации МАР-киназ [13]. Не происходит активации р53 и в мышиных эмбриональных фибробластах, где обработка колцемидом вызывает не длительную активацию МАР-киназ ЕЯК1 и ЕЯК2, как это наблюдается в фибробластах человека и

Оксидативный стресс, Повреждения гипоксия, гипотермия ДНК

и гипертермия .

\ 1

Активация р53

/ I

Деполимеризация Дезорганизация Увеличение

микротрубочек, рост актинового цитоскелета числа ядер

фокальных контактов

Изменения клеточной архитектуры

Рисунок 3. Факторы, приводящие к активации р53.

Активация онкогенов, вирусная инфекция

Дезорганизация Деполимеризация Увеличение

актинового цитоскелета микротрубочек, рост числа ядер

(цитохалазин Д) фокальных контактов

Поли-Ь-лизин

Интегрины

Рисунок 4. Сигнальные пути, ответственные за активацию р53 в клетках с измененной архитектурой.

крысы, а лишь кратковременную экспрессию их активированных форм [13].

Активация Яа^БЯК сигнального пути ответственна также и за повышение функциональной активности р53 в многоядерных клетках. Причем, такая активация р53 находится в прямой зависимости от числа ядер: чем больше их количество, тем выше способность р53 трансактивировать экспрессию генов-мишеней, в частности р21тр|/с1р1 [14]. Трансдукция доминантно-негативного мутанта ЯаГ или обработка многоядерных клеток ингибитором МЕК1 отменяют активацию в них р53 [14]. Пока неясно, каким образом увеличение числа ядер приводит к активации Яа^ Поскольку многоядерность вызывает увеличение распластывания клеток и рост фокальных контактов, представляется вероятным, что и в этом случае активация сигнального пути ЯаГ— ЕЯК—р53 является следствием стимуляции сигнализации от интегринов. Это предположение нуждается в прямой экспериментальной проверке.

В отличие от нарушения системы микротрубочек и муль-тинуклеации, дезинтеграция системы актиновых микрофиламентов не вызывает увеличения активности МАР-киназ ЕЯК1 и ЕЯК2. Естественно в связи с этим, что ингибитор МЕК1 не подавляет активации р53 в клетках, обработанных цитохалазином Д [14]. Не исключено, что активация р53 при разрушении актинового цитоскелета является следствием освобождения заякоренных на нем киназ, таких, например, как БАР-киназа и ЛЧК, каждая из которых, как показано в ряде исследований, способна индуцировать каскад событий, приводящий к посттрансляционным модификациям и функциональной активации р53.

В чем заключается биологический смысл активации р53 при вышеуказанных изменениях клеточной архитектуры? Он, по-видимому, двоякий. Во-первых, таким путем предотвращается накопление в организме клеток с измененным числом хромосом или плоидностью. Действительно, разрушение микротрубочек веретена деления, образование микроядер или дезинтеграция системы микрофиламентов

с последующим нарушением цитокинеза могут приводить к возникновению полиплоидных и анеуплоидных клеток, а ге-тероплоидия, как известно, может увеличивать вероятность неопластической трансформации. Поэтому активация р53 и индукция либо остановки пролиферации, либо апоптоза в клетках, в которых впоследствии могут возникнуть изменения числа хромосом, является, очевидно, важным механизмом, защищающим организм от размножения в нем генетически измененных клеточных клонов.

Во-вторых, не исключено, что активация р53 при мульти-нуклеации или изменениях взаимодействия с внеклеточным матриксом является частью нормальных дифференцировоч-ных программ, обеспечивающих одновременно и остановку пролиферации, и индукцию экспрессии белков дифферен-цировочного репертуара, находящихся под транскрипционным контролем р53 и/или .его гомологов. Так, например, слияние миобластов и образование многоядерной миотруб-ки сопровождается повышением содержания р53 и экспрессии р53-респонсивного гена мышечной креатин-киназы — важного компонента мышечной дифференцировки [16]. Хочется надеяться, что дальнейшее исследование неканонических функций опухолевого супрессора р53 принесет немало новых открытий.

ЛИТЕРА ТУРА

1. Albrechtsen N., Dornreiter L, Grosse F., Kim E., Wiesmuller L., Deppert W. Maintenance of genomic integrity by p53: complementary roles for activated and non-activated p53 // Oncogene. — 1999. — Vol. 18. —

P. 7706-7717.

2. Alexandrova A., Ivanov V.A., Chumakov P., KopninB., VasilievJ. Changes in p53 expression in mouse fibroblasts can modify motility and extracellular matrix organization 11 Oncogene. — 2000. — Vol. 19. —

P. 826—830.

3. Etienne-Manneville S., Hall A. Rho GTPases in cell biology // Nature. —

2002. -Vol. 420. - P. 629-635.

4. Fontemaggi G., Kela I., Amariglio N., Rechavi G., Krishnamurthy I, Strano S., Sacchi A., Givol D., Blandino G. Identification of direct p73 target genes combining DNA microarray and chromatin immunopre-cipitation analyses //J. Biol. Chem. — 2002. — \fal. 277. — P. 43 359— 43 368.

5. Gloushankova N., Ossovskaya V.A., VasilievJ., Chumakov P., KopninB. Changes in p53 expression can modify cell shape of ras-transformed fibroblasts and epitheliocytes // Oncogene. — 1997. — Vol. 15. —

P. 2985-2989.

6. Kannan K., Amariglio N., Rechavi G., Jakob-Hirsch J., Kela I., Kaminski N., GetzG., DomanyE., Givol D. DNA microarrays identification of primary and secondary target genes regulated by p53 // Oncogene. - 2001. - Vol. 20. — P. 2225-2234.

7. Koumenis C., Alarcon R., Hammond E., Sutphin P., Hoffinan W., Murphy M., Derr J., Taya Y., Lowe S. W., Kastan M., Giaccia A. Regulation of p53 by hypoxia: dissociation of transcriptional repression and apoptosis from p53~dependent transactivation I I Mol. Cell. Biol. - 2001. - Vol. 21. - P. 1297-1310.

8. Oren M. Decision making by p53: life, death and cancer I I Cell Death Differ. - 2003. - Vol. 10. - P. 431-442.

9. Prives C., Hall P. A. The p53 pathway 11 J. Pathol. — 1999. — Vol. 187. — P. 112-126.

10. Rubtsova S. N., Kondratov R. V., Kopnin P. B., Chumakov P. M.,

Kopnin B. P., Vasiliev J. M. Disruption of actin microfilaments by cytochalasin D leads to activation of p53 // FEBS Lett. — 1998. —

Vol. 430. - P. 353-357.

11. Sablina A., Agapova L., Chumakov P., KopninB. p53 does not control the spindle assembly checkpoint but mediates G1 arrest in response to disruption of microtubule system // Cell Biology International. —

1999. - Vol. 23. - P. 323-334.

12. Sablina A. A., Chumakov P. M., Kopnin B. P. Tumor-suppressor p53 and its homologue p73a affect cell migration // J. Biol. Chem. —

2003. - Vol. 278. - P. 27 362-27 371.

13. Sablina A. A., Chumakov P. M., Levine A. J., Kopnin B. P. p53 activation in response to microtubule disruption is mediated by integrin-Erk signaling // Oncogene. — 2001. — Vol. 20. — P. 899—909.

14. Sablina A. A., Ilyinskaya G. V, Rubtsova S, N., Agapova L. S., Kopnin B. P. Activation of p53-mediated cell cycle checkpoint in response to micronuclei formation // J. Cell Sci. — 1998. — Vol. 111. — P. 977—984.

15. Sionov R. V., Haupt Y. The cellular response to p53: the decision between life and death//Oncogene. — 1999. —Vol. 18. — P. 6145—6157.

16. Tamir Y., Bengal E. p53 protein is activated during muscle differentiation and participates with MyoD in the transcription of muscle creatine kinase gene // Oncogene. — 1998. — Vol. 17. — P. 347—356.

17. Yang A., Kaghad M., Caput D., McKeon F. On the shoulders of giants: p63, p73 and the rise of p53 // Trends Genet. — 2002. — Vol. 18. —

P. 90-95.

18. Yang A., McKeon F. p63 and p73: p53 mimics, menaces and more // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. - 2000. - Vol. 1. - P. 199-207.

19. Yoon H., Liyanarachchi S., WrightF. A., DavuluriR., Lockman J. C., de la ChapelleA., Pellegata N. S. Gene expression profiling of isogenic cells with different TP53 gene dosage reveals numerous genes that are affected by TP53 dosage and identifies CSPG2 as a direct target of p53 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2002. - Vol. 99. - P. 15 632-15 637.

20. Zhao R. , Gish K., Murphy M., Yin Y., Notterman D., Hoffman W. H., Tom E., Mack D. H., Levine A. J. Analysis of p53-regulated gene expression patterns using oligonucleotide arrays // Genes Dev. — 2000. —

Vol. 14. - P. 981-993.