Способ оценки функции тромбоцитов в цельной цитратной крови
METHOD FOR EVALUATION OF BLOOD PLATELET FUNCTION IN WHOLE CITRATED BLOOD

Изобретение относится к области медицины, а именно к гемостазиологии, и предназначено для определения степени активации тромбоцитов на момент начала исследования, их последующей адгезии, агрегации и ретракции в цельной цитратной крови в норме, при патологии, а также при моделировании патологии у мелких лабораторных животных с помощью низкочастотной пьезотромбоэластографии на аппаратно-программном комплексе для клинико-диагностических исследований реологических свойств крови АРП-01М «Меднорд». Интегральная оценка функции тромбоцитов и их взаимодействия в цельной цитратной крови с другими форменными элементами представляет собой сложную задачу ввиду необходимости использования дорогостоящих малодоступных приборов, а также необходимости определения меняющегося во времени реологического состояния образца цельной цитратной крови.
Известные наиболее близкие способы оценки функции тромбоцитов.
1. Способ оценки функции тромбоцитов с помощью импедансной агрегатометрии (https://www.rotem.de/en/methodology/impedance-aggregometry/; способ диагностики нарушений агрегации тромбоцитов при муковисцидозе у детей / Симонова О.И., Гордеева О.Б., Намазова-Баранова Л.С., Ботвиньева В.В., Горинова Ю.В., Солошенко М.А. / патент RU 2533287 C1 / 10.06.2013). Данный метод позволяет оценить функцию тромбоцитов в 150-400 мкл цельной крови с гирудином (или гепарином, или цитратом натрия) при разведении ее эквивалентным количеством 0,9% NaCl и добавлением 30-32 мкл стимулятора агрегации (растворимый рецептор тромбина - пептид-6, аденозиндифосфат (АДФ), арахидоновая кислота) через графическую регистрацию кривой изменения импеданса между двумя электродами агрегатометра, помещенными в кювету с кровью, и расчетом амплитуды на 6-й минуте (А6), угла наклона касательной к кривой и расчетом площади под ней. Общим с предложенным нами способом является возможность оценки функции тромбоцитов в цельной цитратной крови с определением силы агрегации. Отличается эта методика от предложенной нами невозможностью отдельно количественно оценить адгезию, агрегацию, ретракцию и степень активации тромбоцитов на момент начала исследования, а также самим принципом оценки функции тромбоцитов: в первом случае определяется изменение импеданса между двумя электродами при адгезии на них тромбоцитов и дальнейшей их агрегации в течение 6 минут, во втором - изменение плотности среды пьезодатчиком с частотой колебаний 2670±150 Гц, которое позволяет количественно оценить по начальному нисходящему ходу кривой степень активации тромбоцитов в пробе и по дальнейшему восходящему ходу и перегибам кривой - этап адгезии тромбоцитов на датчике и собственно этап агрегации и ретракции тромбоцитов, пока не будет исчерпан агрегационный потенциал имеющихся в пробе тромбоцитов (20-35 мин).
2. Способ оценки функции тромбоцитов с помощью тромбоэластографии или ротационной тромбоэластометрии с добавлением активатора агрегации арахидоновой кислоты и аденозиндифосфата (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1804261 /). Метод оценивает функцию тромбоцитов в образце крови с гепарином, сравнивая приращение амплитуды кривой (МА) при добавлении активаторов агрегации (АДФ) и рептилазы/ХIIIа фактора (МА АДФ) по сравнению с амплитудой кривой, полученной без добавления активаторов агрегации, а только рептилазы / XIIIa фактора (МА фибрин). Дополнительно оценивается в пробе с цитратом натрия максимально возможная амплитуда кривой при добавлении каолина (МА тромбин). Рассчитывается показатель агрегации по формуле: (МА АДФ - МА фибрин)/(МА тромбин - МА фибрин) × 100%. Общим с предложенным нами методом является принцип оценки функции тромбоцитов по изменению вязкости образца крови. Данный способ не позволяет количественно отдельно оценить степень активации тромбоцитов на момент начала исследования, адгезию, агрегацию и ретракцию тромбоцитов в цитратной крови и менее чувствителен, так как способен зафиксировать изменение вязкости только тогда, когда золь переходит в гель (после достижения точки желирования) и поэтому требует дополнительно активации свертывания каолином или рептилазой с XIIIa фактором, в то время как представленный нами метод не требует активации свертывания.
3. Способ оценки функции тромбоцитов турбидиметрическим методом (http://www.practical-haemostasis.com/Platelets/platelet_function_testing_lta.html; анализатор агрегации тромбоцитов АР 2110 / инструкция по определению агрегационной активности тромбоцитов. - Минск, 1995; http://solar-lab.ru/wp-content/uploads/2013/02/AP2110reg.jpg), ставший прототипом, при котором происходит непрерывное измерение меняющегося коэффициента светопропускания в перемешиваемой и термостатируемой плазме, богатой тромбоцитами при добавлении стимуляторов агрегации (АДФ, коллаген и др.). Данный способ схож с предложенным нами тем, что фиксирует изменение физического состояния среды с тромбоцитами и, соответственно, записывает схожую по форме кривую агрегации, на которой отдельные участки соответствуют адгезии и агрегации. Отличается способ принципом оценки, а именно определением изменения светопропускания плазмы, богатой тромбоцитами, а не ее вязкости. К недостаткам метода можно отнести невозможность отдельного количественного измерения степени активации тромбоцитов на момент начала исследования, количественной раздельной оценки адгезии, агрегации и ретракции тромбоцитов, а также неспособность оценить агрегацию в цельной цитратной крови.
Техническая задача: разработать способ количественной оценки степени активации тромбоцитов на момент начала исследования, их последующей адгезии, агрегации и ретракции, позволяющий интегрально оценить функцию тромбоцитов в цельной цитратной крови с помощью низкочастотной пьезотромбоэластографии на аппаратно-программном комплексе для клинико-диагностических исследований реологических свойств крови АРП-01М «Меднорд» при стимуляции агрегации (АДФ, коллаген) и без нее.
0
0
1
1
1
2
2
3
4
1
2
3
4
1
1
3
2
2
3
3
3
4
4
1
2
3
1
2
Поставленная задача решается следующим способом и иллюстрирована на рис. 1, рис. 2 и рис. 3. Разработанный способ не имеет аналогов и включает в себя запись кривой (1) в течение 20-35 минут с помощью аппаратно-программного комплекса для клинико-диагностических исследований реологических свойств крови АРП-01М «Меднорд» в двух образцах цитратной крови (кровь : 3,8% цитрат натрия = 9:1), забранной не более чем 60 минут назад, с добавлением стимулятора агрегации, например, АДФ в разведении 1:10 10 мкг/мл и/или коллагена 20 мг/мл, и без него с добавлением 0,9% раствора NaCl, в соотношении по объему цитратная кровь : раствор стимулятора (АДФ, коллаген) или раствор NaCl 0,9%, равному 200:200 мкл, с предварительным изменением в настройках аппарата дельты амплитуд для принятия точки максимальной на 1, а также в конечном итоге оценку четырех временных отрезков кривой: 1) от временной точки начала t с амплитудой A до наименьшей по амплитуде A точки t, определенной вручную, с расчетом индекса готовности к адгезии (ИГА) по формуле , который зависит от количества клеток в объеме крови и степени их активации на момент начала исследования, причем данный отрезок может не определяться в образце с добавлением стимулятора, когда тромбоциты уже активированы; 2) от временной точки t до наибольшей по амплитуде А (при расчете значения амплитуды A, A, А используют точку отсчета А, при расчете t, t, t - точку t, причем по достижению точки A и А может быть отсроченный подъем кривой, который необходимо учитывать при расчете, (3) t, также определенной вручную, с расчетом интенсивности адгезии (ИА) по формуле:  3) от временной точки t до наибольшей по амплитуде А точки второго изгиба (4) t, определенной вручную, с расчетом силы агрегации тромбоцитов (СА) по формуле: ; 4) от временной точки t до наибольшей по амплитуде А точки третьего изгиба (5) t, определенной вручную, с расчетом силы ретракции (CP) по формуле , суммируя показатели СА и CP, можно получить общую оценку (силу) агрегации тромбоцитов (ОСА). Более простой верификации участка АА способствует проведение касательной к кривой от точки А, от точки A и определение точки А при их пересечении. Использование АДФ в качестве стимулятора агрегации позволяет выявить патологию ретракции и особенно адгезии и агрегации, использование коллагена - патологию адгезии, агрегации и особенно ретракции, использование раствора NaCl 0,9% - спонтанную готовность к адгезии, силу адгезии, агрегации и ретракции.
Таким образом, данный способ отличается от прототипов тем, что позволяет оценить количественно степень активации тромбоцитов на момент начала исследования, количественно раздельно оценить адгезию, агрегацию и ретракцию тромбоцитов в цельной цитратной крови. Сравнивая полученные значения с референтными значениями показателей ИГА, ИА, СА, CP, ОСА со стимуляцией АДФ, коллагеном (или другим активатором) и без нее, можно судить о функциональном состоянии тромбоцитов и их способности реагировать на активирующие стимулы.
Пример: в условиях ксилазин/тилетамин/золазепам анестезии выполнен забор крови из левой сонной артерии у самца крысы линии Wistar массой 250 г в объеме 0,6 мл, кровь помещена в пробирку с 3,8% цитратом натрия в соотношении 9:1. После изменения настроек низкочастотного пьезотромбоэластографа АРП-01М «Меднорд», изложенных выше, выполнена запись кривой с добавлением АДФ, коллагена и раствора NaCl 0,9%. В течение 5 минут у крысы дополнительно осуществлялся забор 5 мл крови, что составило 30% кровопотерю со снижением систолического АД до 40 мм рт.ст. и его дальнейшим спонтанным восстановлением до 50-60 мм рт.ст. После 85 минутного периода наблюдения, осуществлялся повторный забор крови в объеме 0,6 мл в пробирку с 3,8% цитратом натрия в соотношении 9:1 и выполнялась запись кривых. Результаты представлены ниже:
NaClнорма
1
0
1
ИГА=(A-A)/t=(97-105)/0,2=-40
NaClшок
1
0
1
ИГА=(A-A)/t=(118-145)/0,5=-30
АДФнорма
1
0
1
ИГА=(A-A)/t=(105-116)/0,4=-27,5
АДФшок
1
0
1
ИГА=(A-A)/t=(143-152)/0,5=-18
коллагеннорма
1
0
1
ИГА=(A-A)/t=(103-131)/0,9=-31,1
коллаген шок
1
0
1
ИГА=(A-A)/t=(121-133)/0,6=-20
Вывод: Отмечается повышение готовности к адгезии после 85 минут шока при спонтанной и стимулированной агрегации.
NaClнорма
2
1
2
1
ИА=(A-A)/(t-t)=(104-99)/(1,2-1,0)=25
NaClшок
2
1
2
1
ИА=(A-A)/(t-t)=(122-118)/(0,6-0,5)=40
АДФнорма
2
1
2
1
ИА=(A-A)/(t-t)=(110-105)/(0,5-0,4)=50
АДФшок
2
1
2
1
ИА=(A-A)/(t-t)=(152-143)/(0,7-0,5)=45
коллагеннорма
2
1
2
1
ИА=(A-A)/(t-t)=(127-107)/(1,3-1,0)=66,6
коллагеншок
2
1
2
1
ИА=(A-A)/(t-t)=(126-121)/(0,7-0,6)=50
1
1
Вывод: При изучении спонтанной агрегации отмечается усиление интенсивности адгезии при шоке на 37,5%, при ее снижении со стимуляцией АДФ на 10% и коллагеном - на 25%, т.е. ослабевает ответ на стимуляторы агрегации. На некоторых кривых отмечался отсроченный подъем кривой, поэтому t может отличаться от t в предыдущих расчетах.
NaClнорма
2
1
3
1
3
1
2
1
СА=((А-А)+(А-А))*((t-t)-(t-t))/2=((104-99)+(165-99))*((5,4-1,0)-(1,2-1,0))/2=149,1
NaClшок
2
1
3
1
3
1
2
1
СА=((А-А)+(А-А))*((t-t)-(t-t))/2=((122-118)+(165-118))*((3,3-0,5)-(0,6-0,5))/2=68,85
АДФнорма
2
1
3
1
3
1
2
1
СА=((А-А)+(А-А))*((t-t)-(t-t))/2=((110-105)+(190-105))*((6,2-0,4)-(0,5-0,4))/2=256,5
АДФшок
2
1
3
1
3
1
2
1
СА=((А-А)+(А-А))*((t-t)-(t-t))/2=((152-143)+(207-143))*((4,1-0,5)-(0,7-0,5))/2=87,6
коллагеннорма
2
1
3
1
3
1
2
1
СА=((А-А)+(А-А))*((t-t)-(t-t))/2=((127-107)+(204-107))*((7,3-1,0)-(1,3-1,0))/2=321
коллагеншок
2
1
3
1
3
1
2
1
СА=((А-А)+(А-А))*((t-t)-(t-t))/2=((126-121)+(188-121))*((4,0-0,6)-(0,7-0,6))/2=118,8
Вывод: При шоке снижена сила агрегации без стимуляции на 46,2%, со стимуляцией АДФ на 65,85%, со стимуляцией коллагеном - на 63%
NaClнорма
3
1
4
1
4
1
3
1
СР=((А-А)+(А-А))*((t-t)-(t-t))/2=((165-99)+(235-99))*((25,5-1,0)-(5,4-1,0))=1828,1
NaClшок
3
1
4
1
4
1
3
1
СР=((А-А)+(А-А))*((t-t)-(t-t))/2=((165-118)+(215-118)*((20-0,5)-(3,3-0,5))=1130
АДФнорма
3
1
4
1
4
1
3
1
СР=((А-А)+(А-А))*((t-t)-(t-t))/2=((275-105)+(190-105))*((28,8-0,4)-(6,2-0,4))=2779,5
АДФшок
3
1
4
1
4
1
3
1
СР=((А-А)+(А-А))*((t-t)-(t-t))/2=((266-143)+(207-143))*((26,6-0,5)-(4,1-0,5))=2010,25
коллагеннорма
3
1
4
1
4
1
3
1
СР=((А-А)+(А-А))*((t-t)-(t-t))/2=((295-107)+(204-107))*((31,3-1,0)-(7,3-1,0))=3106,5
коллагеншок
3
1
4
1
4
1
3
1
СР=((А-А)+(А-А))*((t-t)-(t-t))/2=((259-121)+(188-121))*((23-0,6)-(4,0-0,6))=1824,5
Вывод: Снижена сила ретракции тромбоцитов при шоке без стимуляции на 38%, при стимуляции АДФ - на 27,7%, при стимуляции коллагеном - на 41,3%.
NaClнорма
NaClнорма
NaClнорма
ОСА=СА+СР=149,1+1828,1=1977,2
NaClшок
NaClшок
NaClшок
ОСА=СА+СР=68,85+1130=1198,85
АДФнорма
АДФнорма
АДФнорма
ОСА=СА+СР=256,5+2779,5=3036
АДФшок
АДФшок
АДФшок
ОСА=СА+СР=87,6+2010,25=2097,85
коллагеннорма
коллагеннорма
коллагеннорма
ОСА=СА+СР=321+3106,5=3427,5
коллагеншок
коллагеншок
коллагеншок
ОСА=СА+СР=188,8+1824,5=1943,3
Вывод: При шоке отмечается снижение общей силы агрегации тромбоцитов со стимуляцией АДФ на 31%, с коллагеном - на 43,3%, без стимуляции - на 39,4%.
Анализ кривых подтверждает информацию, полученную о тромбоцитах в состоянии геморрагического шока, при исследовании их функции другими методами по данным литературы http://m.circgenetics.ahajournals.org/content/7/5/615.full.
Технический результат: количественная оценка степени активации тромбоцитов на момент начала исследования, адгезии, агрегации и ретракции тромбоцитов, позволяющая интегрально оценить функцию тромбоцитов в цельной цитратной крови с помощью низкочастотной пьезотромбоэластографии на аппаратно-программном комплексе для клинико-диагностических исследований реологических свойств крови АРП-01М «Меднорд» при стимуляции агрегации (АДФ, коллаген) и без нее.