Кинетика деградации антипролиферативного полимерного покрытия стентов в условиях in viтrо

№ 2 (10), 2015

Естественные науки. Биология

УДК 577.033

О. Д. Любченко, А. Д. Кручинина, А. Н. Шатров

КИНЕТИКА ДЕГРАДАЦИИ АНТИПРОЛИФЕРАТИВНОГО ПОЛИМЕРНОГО ПОКРЫТИЯ СТЕНТОВ В УСЛОВИЯХ IN VITRO

Аннотация.

Актуальность и цели. Исследование направлено на изучение кинетики деградации полимерного покрытия сиролимус-элюирующих стентов толщиной 20 мкм на основе полилактид-ко-гликолида с соотношением сополимеров 50:50.

Материалы и методы. При создании антипролиферативного покрытия стентов использовали полилактид-ко-гликолид в качестве матрицы для лекарственного вещества и сиролимус в качестве активной субстанции. При моделировании процесса деградации покрытия концентрацию сиролимуса в растворе определяли спектрофотометрически каждые 48 ч. Оценку скорости деградации полимера проводили по уменьшению характеристической вязкости материала и измерению содержания лактата в буферном растворе еженедельно.

Результаты. Результаты экспериментов по определению концентрации лактата в буферном растворе и определению характеристической вязкости растворов полимерного покрытия в динамике деградации коррелируют между собой. Выявлено, что скорость разрушения полимерного покрытия толщиной 20 мкм совпадает с необходимой для снижения риска рестеноза скоростью высвобождения сиролимуса.

Выводы. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о достаточном уровне локального высвобождения лекарственного препарата для предотвращения рестеноза в ранний постимплантационный период.

Ключевые слова: деградация, сиролимус, стент, антипролиферативное покрытие, полилактид-ко-гликолид, лактат, характеристическая вязкость.

O. D. Lyubchenko, А. D. Kruchinina, A. N. Shatrov

KINETICS OF DEGRADATION OF ANTIPROLIFERATIVE POLYMER COATING OF STENTS IN VITRO

Abstract.

Background. The study is aimed at investigation of the kinetics of degradation of the polymer coating of sirolimus-eluting stents with thickness of 20 microns on the basis polylactid-co-glicolid with copolymers ratio 50:50.

Materials and methods. When developing of the antiproliferative stent coatings, polylactid-co-glycolid was used as a matrix for the drug and Sirolimus as an active substance. When modeling the process of coating degradation, sirolimus concentration in the solution was determined spectrophotometrically every 48 hours. Evaluation of the degradation rate of the polymer was carried out through a decrease of characteristic viscosity of the material and a content of lactate in the buffer solution weekly.

Results. The experimental results of determination of the lactate concentration in the buffer solution and the characteristic viscosity of the polymer coating solutions are correlated in the dynamics of degradation. It has been discovered that the breakdown rate of the polymer coating corresponds to the required release rate of siroli-mus to reduce the risk of restenosis.

Conclusions. Consequently, the results testify to a sufficient level of local drug release to prevent restenosis in the early postimplantation period.

Natural Sciences. Biology

55

Известия высших учебных заведений. Поволжский регион

Key words: degradation, sirolimus, stent, antiproliferative coating, polylactid-co-glycolid, lactate, intrinsic viscosity.

Введение

Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смерти во всем мире [1]. В связи с этим большое внимание уделяется вопросам профилактики, ранней диагностики и лечения данных патологий.

Стентирование успешно применяют в лечении поражений коронарных сосудов различной сложности. Однако метод не обладает абсолютной эффективностью, риск развития отдаленного рестеноза (повторного сужения просвета сосуда) достаточно высок [2]. Появление в клинической практике коронарных стентов с лекарственным покрытием значительно улучшило результаты эндоваскулярных вмешательств, снизив потребности в повторных операциях [3].

Положительный эффект связан с уменьшением пролиферации клеток интимы сосуда в острый период развития рестеноза под действием лекарственного препарата, высвобождающегося при деструкции полимера [4]. Для снижения гиперплазии эндотелия обычно применяют сиролимус, эверолимус, заторолимус и биолимус [5].

В качестве полимерной матрицы при создании антипролиферативного покрытия используют биодеградируемые материалы на основе молочной и гликолевой кислот, конечные продукты деградации которых являются обычными метаболитами клеток и не оказывают токсического воздействия на организм [6].

Для снижения риска поздних тромбозов, вызываемых адгезией компонентов крови на полимерной матрице, должно происходить полное растворение покрытия по завершении необходимого периода действия препарата. Следовательно, скорость деградации покрытия должна совпадать со скоростью высвобождения сиролимуса для исключения его влияния на процесс эн-дотелизации стента.

Таким образом, целью данной работы было изучение кинетики деградации полимерного покрытия сиролимус-элюирующих коронарных стентов на основе полилактид-ко-гликолида с соотношением сополимеров 50:50.

1. Материалы и методы исследования

Все этапы работы проходили в соответствии с ГОСТ Р ИСО 10993 «Оценка биологического действия медицинских изделий» [7]. Стандарты серии ИСО 10993 являются руководящими документами для прогнозирования и исследования биологического действия медицинских изделий на стадии выбора материалов, предназначенных для их изготовления, а также для исследований готовых изделий.

Одним из методов, рекомендуемых соответствующим стандартом, является тест in vitro на биодеградацию испытуемого материала в результате воздействия биологической среды. Особенно важен данный тест для полимерных материалов, поскольку выделяющиеся из них мономеры способны оказывать побочные эффекты на клеточные системы, особенно при длительном контакте с биологическими жидкостями и тканями.

56

University proceedings. Volga region

№ 2 (10), 2015

Естественные науки. Биология

Материалом данного исследования являлось сиролимус-содержащее полимерное покрытие толщиной 20 мкм, изготовленное из 1 %-го раствора полилактид-ко-гликолида 50:50 (Mr 30-60 кДа, характеристическая вязкость 0,55-0,75 дл/г) в хлороформе.

Для изучения процессов растворения и резорбции тестируемых материалов in vitro в качестве модельной биологической жидкости использовался фосфатный буфер (рН = 7,4) [8]. Образцы выдерживались в растворе с добавлением азида натрия при 37 °С в течение 8 недель. Замену буфера производили каждые 48 ч.

Содержание сиролимуса в буферном растворе определяли спектрофотометрически при длине волны 278 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см [9].

Оценку скорости деградации полимера проводили по изменению характеристической вязкости растворенного покрытия [10]. Образцы высушивались до достижения постоянной массы, из них готовили 0,1 %-й раствор в хлороформе, который подвергался дальнейшему исследованию.

Оценку степени деградации покрытия проводили с помощью измерения содержания лактата в буферном растворе колориметрическим методом с использованием клинического набора компании «Ольвекс-Диагностикум». Метод основан на реакции ферментативного окисления лактата до пирувата. Образующаяся при этом перекись водорода при участии пероксидазы способствует окислительному азосочетанию 4-аминоантипирина и 4-хлорфенола с образованием окрашенного соединения. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию молочной кислоты в исследуемой пробе и определяется фотометрически на длине волны 500 нм [11].

Статистическую обработку полученных данных проводили с привлечением t-критерия Стьюдента. Различия считались статистически значимыми при уровне достоверности р < 0,05 [12].

2. Результаты исследования и их обсуждение

Данные о высвобождении сиролимуса в буферный раствор при деградации полимерного покрытия в условиях in vitro представлены на рис. 1.

Рис. 1. Содержание сиролимуса в фосфатном буферном растворе в динамике 2-месячной деградации антипролиферативного покрытия

Natural Sciences. Biology

57

Известия высших учебных заведений. Поволжский регион

В течение первого месяца исследования суммарный выход препарата составил примерно 70 % от первоначального содержания, что является достаточным для снижения темпов пролиферации гладкомышечных клеток интимы сосуда в первый месяц после имплантации.

В ходе исследования было отмечено неравномерное высвобождение препарата в буферный раствор. Первоначальный повышенный выход си-ролимуса объясняется его смыванием с верхнего слоя покрытия, а дальнейшая динамика процесса обусловлена механизмами деградации самого полимера.

Деградация полилактид-ко-гликолида in vitro в водных растворах происходит в результате объемного гидролиза сложноэфирных связей полимерных цепей. Вместе с этим увеличивается выход препарата в буферный раствор. На конечном этапе деградации покрытия скорость выхода препарата в раствор снижается, что связано с изменениями в структуре полимера.

Разрушение покрытия сопровождается уменьшением молекулярной массы полимера и, как следствие, уменьшением характеристической вязкости [13]. Данные об изменении характеристической вязкости материала при деградации полимерного покрытия в условиях in vitro представлены на рис. 2.

Рис. 2. Характеристическая вязкость раствора полимера в динамике 7-недельной деградации антипролиферативного покрытия

В ходе эксперимента было выявлено линейное уменьшение характеристической вязкости материала в течение 6 недель, после чего процесс замедлился. После 7 недель деградации характеристическая вязкость снизилась до 0,1 дл/г, что явилось причиной прекращения эксперимента [8]. Выявленная закономерность разрушения антипролиферативного полимерного покрытия в условиях in vitro позволяет сделать вывод о его полной резорбции в течение двух месяцев.

Данные о содержании лактата в буферном растворе при деградации полимерного покрытия в условиях in vitro представлены на рис. 3.

58

University proceedings. Volga region

№ 2 (10), 2015

Естественные науки. Биология

Рис. 3. Содержание лактата в фосфатном буферном растворе в динамике 2-месячной деградации антипролиферативного покрытия

В ходе исследования содержания лактата в буферном растворе был выявлен экспоненциальный характер выхода мономера. По-видимому, процесс деградации полимера можно разделить на две фазы. В течение первой гидролиз эфирных связей протекает в аморфных областях, при этом в растворе оказывается незначительное количество лактата. Во второй фазе разрушения происходят в кристаллических областях, что сопровождается увеличением количества выделяемого лактата.

Заключение

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о достаточном уровне локального высвобождения лекарственного препарата для предотвращения рестеноза в ранний постимплантационный период, а само покрытие должно полностью резорбироваться в течение двух месяцев.

Список литературы

1. Оганов, Р. Г. Смертность от сердечно-сосудистых и других хронических неинфекционных заболеваний среди трудоспособного населения России / Р. Г. Оганов, Г. Я. Масленникова // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2002. -Т. 3. - С. 4-8.

2. Erbel, R. Coronary-artery stenting compared with balloon angioplasty for restenosis after initial balloon angioplasty. Restenosis Stent Study Group / R. Erbel, M. Haude,

H. W. Hopp, D. Franzen, H. J. Rupprecht, B. Heublein, K. Fischer, P. de Jaegere, P. Serruys, W. Rutsch, P. Probst // N. Engl. J. Med. - 1998. - Vol. 339, № 23. -P. 1672-1678.

3. Бокерия, Л. А. Руководство по рентгенэндоваскулярной хирургии сердца и сосудов / Л. А. Бокерия, Б. Г. Алекян. - 2013. - Т. 3. - 598 c.

4. Katz, G. Drug-eluting stents: the past, present, and future / G. Katz, B. Harchandani, B. Shah // Curr Atheroscler Rep. - 2015. - Vol. 17, № 3. - Р. 485-488.

Natural Sciences. Biology

59

Известия высших учебных заведений. Поволжский регион

5. Claessen, B. E. Clinical studies with sirolimus, zotarolimus, everolimus, and bioli-mus A9 drug-eluting stent systems / B. E. Claessen, J. P. Henriques, G. D. Dangas // Curr Pharm Des. - 2010. - Vol. 16, № 36. - Р. 4012-4024.

6. Севастьянов, В. И. Биосовместимые материалы / В. И. Севастьянов, М. П. Кирпичников. - М. : Мед. информ. агентство, 2011. - 544 с.

7. ГОСТ Р ИСО 10993-2011. Оценка биологического действия медицинских изделий. - М. : Стандартинформ, 2013. - 14 с.

8. ГОСТ Р ИСО 13781-2011. Смолы и отформованные элементы на основе поли (L-лактида) для хирургических имплантатов. Исследование деградации методом in vitro. - М. : Стандартинформ, 2011. - 12 с.

9. Xu, Q. A. Analytical methods for therapeutic drug monitoring and toxicology /

Q. A. Xu, T. L. Madden // John Wiley & Sons. - 2011. - 576 с.

10. ГОСТ 18249-72. Пластмассы. Метод определения вязкости разбавленных растворов полимеров. - М. : Изд-во стандартов, 2000. - 7 с.

11. Тиц, Н. У. Энциклопедия клинических лабораторных тестов / Н. У. Тиц. - М. : Лабинформ, 1997. - 960 с.

12. Лакин, Г. Ф. Биометрия / Г. Ф. Лакин. - М. : Высш. шк., 1990. - 350 с.

13. Wei, Z. Preparation and in-vitro degradation of polylactide and poly(L-lactide-co-glycolide / Z. Wei, L. Liu, M. Zhang, F. Yang, M. Qi // Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi. - 2008. - Vol. 25, № 1. - Р. 122-126.

References

1. Oganov R. G., Maslennikova G. Ya. Kardiovaskulyarnaya terapiya i profilaktika [Cardiovascular therapy and prophylaxis]. 2002, vol. 3, pp. 4-8.

2. Erbel R., Haude M., Hopp H. W., Franzen D., Rupprecht H. J., Heublein B., Fischer K., P. de Jaegere, Serruys P., Rutsch W., Probst P. N. Engl. J. Med. 1998, vol. 339, no. 23, pp. 1672-1678.

3. Bokeriya L. A., Alekyan B. G. Rukovodstvo po rentgenendovaskulyarnoy khirurgii serdtsa i sosudov [Guide on X-ray endovascular surgery of heart and vessels]. 2013, vol. 3, 598 p.

4. Katz G., Harchandani B., Shah B. Curr Atheroscler Rep. 2015, vol. 17, no. 3, pp. 485-488.

5. Claessen B. E., Henriques J. P., Dangas G. D. Curr Pharm Des. 2010, vol. 16, no. 36, pp. 4012-4024.

6. Sevast'yanov V. I., Kirpichnikov M. P. Biosovmestimye materialy [Biocompatible materials]. Moscow: Med. inform. agentstvo, 2011, 544 p.

7. GOST R ISO 10993-2011. Otsenka biologicheskogo deystviya meditsinskikh izdeliy [Standard GOST R ISO 10993-2011. Estimation of biological activity of medical products]. Moscow: Standartinform, 2013, 14 p.

8. GOST R ISO 13781-2011. Smoly i otformovannye elementy na osnove poli (L-laktida) dlya khirurgicheskikh implantatov. Issledovanie degradatsii metodom in vitro [Standard GOST R ISO 13781-2011. Resins and shaped elements poly-L-lactide for surgical implants. Degradation research in vitro]. Moscow: Standartinform, 2011, 12 p.

9. Xu Q. A., Madden T. L. John Wiley & Sons. 2011, 576 p.

10. GOST 18249-72. Plastmassy. Metod opredeleniya vyazkosti razbavlennykh rastvorov polimerov [Standard GOST 18249-72. Plastics. Method of viscosity determination for solution-diluted polymers]. Moscow: Izd-vo standartov, 2000, 7 p.

11. Tits N. U. Entsiklopediya klinicheskikh laboratornykh testov [Encyclopedia of clinical laboratory tests]. Moscow: Labinform, 1997, 960 p.

12. Lakin G. F. Biometriya [Biometrics]. Moscow: Vyssh. shk., 1990, 350 p.

13. Wei Z., Liu L., Zhang M., Yang F., Qi M. Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi. 2008, vol. 25, no. 1, pp. 122-126.

60

University proceedings. Volga region

№ 2 (10), 2015

Естественные науки. Биология

Любченко Олеся Дмитриевна аспирант, Пензенский государственный университет

E-mail: filology@inbox.ru

Кручинина Анастасия Дмитриевна аспирант, ассистент, кафедра общей биологии и биохимии, Пензенский государственный университет

E-mail: a.d.kruchinina@mail.ru

Шатров Алексей Николаевич Управляющий ООО «НаноМед»

E-mail: nanomed_penza@mail.ru

Lyubchenko Olesya Dmitrievna Postgraduate student, Penza State University

Kruchinina Anastasya Dmitrievna

Postgraduate student, assistant, sub-department of general biology and biochemistry, Penza State University

Shatrov Alexey Nikolaevich

Chief executive officer “NanoMed, Ltd”

УДК 577.033 Любченко, О. Д.

Кинетика деградации антипролиферативного полимерного покрытия стентов в условиях in vitro / О. Д. Любченко, А. Д. Кручинина,

А. Н. Шатров // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Естественные науки. - 2015. - № 2 (10). - С. 55-61.

Natural Sciences. Biology

61