Высокопроизводительный скрининг соединений, модулирующих экспрессию клеточных макромолекул
HIGH-EFFICIENCY SCREENING COMPOUNDS MODULATING EXPRESSION OF CELL MACROMOLECULES

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
В данной заявке заявлен приоритет предварительной заявки США 61/472,962, озаглавленной "Высокопроизводительный скрининг соединений, модулирующих уровни клеточных макромолекул", поданной 8 апреля 2011 года, которая включена в данную заявку посредством ссылки во всей своей полноте.
Область изобретения
Воплощения относятся к способам количественного определения специфических клеточных компонентов ("мишеней") посредством анализа, основанного на FRET (резонансный перенос энергии флуоресценции), который не требует ни присоединения мишеней к твердой фазе, ни отделения мишени от избыточных реагентов, что делает его пригодным для высокопроизводительного скрининга.
Предшествующий уровень техники
Количественное определение специфической макромолекулы ("мишени"), особенно в присутствии других компонентов, в частности специфического белка на клеточной поверхности, в смеси белков, в клеточном гомогенате, обычно выполняют с использованием антитела, которое специфично узнает мишень. Как правило, белковую смесь сначала иммобилизуют на носителе, например посредством адсорбции или ковалентной связи с мембраной или пластмассовой поверхностью или поверхностью подложки, к которой присоединено специфическое к данной мишени антитело ("иммобилизованное антитело"), и подвергают воздействию мишень-специфического антитела ("первичного антитела", отличного от иммобилизованного антитела, если его использовали). По истечении подходящего времени реакции избыток первичного антитела удаляли посредством многократных промывок и количество связанного антитела определяли с помощью одного из нескольких способов. Например, первичное антитело может быть ковалентно связано с флуоресцентной меткой и может быть обнаружено путем измерения интенсивности флуоресценции; альтернативно, "вторичное" антитело (маркированное меткой, такой как флуоресцентный краситель или фермент), направленное против первичного антитела, можно использовать для количественного определения. Имеется много разных подходов к определению количества первичного антитела, но общим для всех них является требование, чтобы любое первичное или вторичное антитело, которое не связано с мишенью, было полностью удалено, так как оно будет вызывать сигнал, неотличимый от сигнала специфично связанного антитела. Поскольку высокопроизводительный скрининг не допускает стадии промывки, вышеприведенные подходы не применимы.
Краткое изложение сущности изобретения
Этот раздел представляет собой краткое изложение изобретения для того, чтобы кратко указать сущность и практическую значимость изобретения. Предполагается понимание того, что его не следует использовать для интерпретации или ограничения объема или значения формулы изобретения.
Воплощения направлены на способ скрининга, в частности на высокопроизводительный режим, в гомогенном растворе соединений, модулирующих экспрессию специфической макромолекулы, "мишени", включающей, но без ограничения ими, специфический белок или нуклеиновую кислоту. В предпочтительном воплощении по меньшей мере два мишень-специфических лиганда, обеспечивающих возможность FRET, направлены против по меньшей мере двух специфических разных сайтов на макромолекуле, при этом один лиганд соединен по меньшей мере с одним флуорофором-донором, а другой по меньшей мере с одним флуорофором-акцептором. Примеры лигандов, обеспечивающих возможность FRET, включают, без ограничения ими: антитела, миметики антител, пептоиды, пептидные или нуклеиновокислотные аптамеры. Эти воплощения делают возможным высокопроизводительный скрининг соединений, способных модифицировать количества специфической макромолекулы в биологическом образце.
Другие аспекты описаны ниже.
Краткое описание графических материалов
На Фиг.1A-1B представлены диаграммы, демонстрирующие определение PrP (прионный белок) на поверхности живых клеток LD9 с использованием анализа определения PrP в 96-луночном формате. PrP-нокаутные клетки (КО), у которых отсутствует экспрессия PrP, использовали в качестве отрицательного контроля. Уровни PrP представлены в виде [Дельта F%], представляющего собой значение, полученное в результате логометрического измерения сигнала HTRF (гомогенной флуоресценции с разрешением по времени), соответствующего обнаружению PrP. Фиг.1A: определение PrP в зависимости от количества клеток и влияние обработки брефелдином A (BFA). Z' является статистическим параметром измерения качества анализа (Z'>0,5 считается прекрасным анализом). Z' анализа составлял 0,7 при использовании 20K или 40K клеток LD9 и 0,8 для 80K клеток LD9. Фиг.1B: определение PrP после обработки клеток LD9 увеличивающимися дозами BFA в течение 24 часов; 4 и 8 мкг/мл снижают сигнал PrP до уровня фона. Показаны три повтора. На Фиг.1C показано, что ни одна из исследованных доз BFA не была токсичной для клеток LD9. Жизнеспособность клеток измеряли, используя GLO люминесцентный анализ (Promega), в одиночном анализе.
3
3
4
4
На Фиг.2 представлена диаграмма, показывающая определение PrP на поверхности живых клеток LD9 с использованием анализа определения PrP, описанного в 384-луночном формате. DMSO представляет собой растворитель, используемый в большинстве библиотек скрининга малых молекул, и используется в качестве контроля в скрининге планшетов. Следовательно, Z' рассчитывают, используя LD9+DMSO в качестве контроля для самого высокого сигнала PrP, LD9+BFA в качестве контроля для самого низкого сигнала PrP. Z' анализа составлял 0,4, 0,6, 0,8 и 2,7 для 10, 5×10, 10 и 2×10 клеток LD9 соответственно. Каждая точка была выполнена в трех повторах.
На Фиг.3 представлена диаграмма, показывающая результаты предварительного скрининга коллекции лекарственных средств США с использованием первичного скринингового анализа. Показаны данные только для наиболее подходящих (hit) кандидатов (выбранных с использованием 50%-ного снижения экспрессии PrP на клеточной поверхности в качестве порога). Верхние панели показывают экспрессию PrP на поверхности клеток LD9 после обработки в течение 24 часов соединениями, указанными на абсциссе. Уровень PrP выражают, как процент от DMSO-контроля. Каждый подвергнутый скринингу планшет показан, как отдельная панель. DMSO-контроль для каждого планшета показан фиолетовым цветом. BFA-контроль снижает PrP клеточной поверхности до уровня фона (0% экспрессии PrP). Z' составлял 0,7 для всех четырех планшетов. Нижние панели показывают жизнеспособность клеток LD9, обработанных соединениями в течение 24 часов при дозе скрининга. Жизнеспособность клеток измеряли при помощи анализа обратного скрининга авторов изобретения с использованием набора CELLTITER-GLO. Девять соединений продемонстрировали токсичность менее 10% и были выбраны в качестве наиболее подходящих.
На Фиг.4A-4D показано снижение PrP на клеточной поверхности при помощи одного из этих наиболее подходящих средств, Такролимуса, подтвержденное вторичным скринингом на клетках N2a. PrP был помечен на поверхности живых клеток при +4°C моноклональным антителом D18 и зафиксирован с помощью 4% PFA (параформальдегида) перед добавлением меченного Alexa-488 вторичного антитела. Фиг.4A, 4B: микроскопический анализ клеток N2a, обработанных DMSO (левая картинка) и Такролимусом (правая картинка). Количественное определение проводили с помощью проточной цитометрии (Фиг.4C) и анализатора IN Cell Analyzer 1000 с использованием программного обеспечения Developer (Фиг.4D). Ключ для Фиг.4C: красный: PrP-сигнал отрицательного контроля (только вторичные антитела); синий: PrP-сигнал для положительного контроля (клетки, обработанные DMSO); зеленый и оранжевый: анализ в двух параллелях PrP-сигнала для клеток, обработанных тремя разными дозами Такролимуса, указанными на панелях.
На Фиг.5A-5B представлены диаграммы, показывающие снижение PrP на клеточной поверхности двумя другими наиболее подходящими средствами, лазалоцидом натрия и астемизолом, подтвержденное посредством вторичного скрининга на клетках N2a. Мечение PrP и количественную оценку с помощью IN Cell Analyzer выполняли, как описано для Фиг.4A-4D.
200
200
-3
-4
-4
-3
На Фиг.6 показан вторичный анализ, использованный для определения приоритетности наиболее подходящих средств, снижающих экспрессию PrP на клеточной поверхности. На графиках показано число инфицированных клеток (обнаруженных как пятна посредством клеточного анализа скрепи - SCA) в зависимости от числа клеток. Голубые линии: необработанные клетки; красные линии: клетки, обработанные 1 мкг/мл PIPLC (фосфатидилинозитол-специфическая фосфолипаза C) (в течение времени, указанного на каждой панели). Значение "RI" определяют, как величину, обратную числу клеток, необходимому для получения 200 пятен. RI для контроля PK1 [RML] в 26 часов составляет 3,3×10 и для PIPLC-обработанных PK1 [RML] составляет 5×10. Следовательно, PIPLC вызывает 85%-ное ингибирование инфекции (1-[5×10/3,3×10]×100).
-4
Sc
На Фиг.7A и 7B показано, что Такролимус (Тас) и Астемизол (Ast), два соединения, подвергнутых скринингу с использованием описанного здесь способа, которые снижают количества PrP на поверхности клеток, как показано на Фиг.4A-4D и 5A-5B, блокируют инфекцию клеток нейробластомы PK1 прионами RML и 22L. PK1 клетки предварительно обрабатывали в течение 3 суток указанными дозами лекарственных средств и инфицировали прионами RML (Фиг.7A) или 22L (Фиг.7B) с использованием 10 разведения гомогената мозга из RML- или 22L-инфицированной мыши. Лечение продолжалось в течение 12 суток после инфицирования. Клетки анализировали посредством вестерн блоттинга в отношении устойчивого к протеиназе K PrP (признака прионной инфекции) через 9 и 18 суток после инфицирования (то есть за 3 суток до и через 6 суток после прекращения лечения). PPS (пентозанполисульфат), лекарственное средство, которое предупреждает прионную инфекцию, использовали в дозе 10 мкг/мл в качестве положительного контроля для определения эффективности лечения. CTRL: необработанные клетки. И астемизол и такролимус блокируют прионную инфекцию, и после прекращения лечения не происходило возобновления инфекции.
На Фиг.8A-8E показана токсичность олигомеров Aβ для клеток нейробластомы человека, ограниченных клетками, экспрессирующими PrP. Фиг.8A, 8C: необработанные клетки. Фиг.8B, 8D: клетки, подвергнутые воздействию олигомеров Aβ42 в течение 4 суток (100 мкг/мл). На Фиг.8B представлена вакуолизация и потеря клеток. На Фиг.8E представлены три повтора вестерн-блоттинг анализа, показывающие экспрессию PrP только в клетках SK-NSH.
Подробное описание изобретения
Воплощения относятся к способам эффективного скрининга, идентификации и количественного определения образцов, содержащих молекулы-мишени для применения в анализах высокопроизводительного скрининга (HTS). В частности, описанные здесь анализы не требуют ни стадий промывки, ни присоединения молекул-мишеней к твердым подложкам. Таким образом, мишени могут быть проанализированы в условиях, в которых они сохраняют свою естественную, in vivo, конформацию. Могут быть идентифицированы новые соединения или новые применения известных соединений, которые влияют на уровень клеточных макромолекул.
Настоящее изобретение описано со ссылкой на прилагаемые Фигуры, где одинаковые ссылочные цифры использованы на всех Фигурах для обозначения аналогичных или эквивалентных элементов. Фигуры выполнены не в масштабе и представлены только для иллюстрации настоящего изобретения. Некоторые аспекты изобретения описаны ниже со ссылкой на прилагаемые для иллюстрации примеры. Следует понимать, что многочисленные конкретные детали, взаимоотношения и способы изложены для обеспечения полного понимания настоящего изобретения. Специалист в данной области техники, однако, легко поймет, что изобретение может быть осуществлено на практике без одной или нескольких конкретных деталей или с помощью других способов. Настоящее изобретение не ограничено показанным порядком действий или событий, поскольку некоторые действия могут происходить в другом порядке и/или одновременно с другими действиями или событиями. Кроме того, не все проиллюстрированные действия или события необходимы для реализации методологии в соответствии с настоящим изобретением.
Воплощения настоящего изобретения могут быть осуществлены на практике без представления теоретических аспектов. Кроме того, теоретические аспекты представлены с пониманием того, что заявители не стремятся быть связанными представленной теорией.
Если не указано иное, все термины (включая технические и научные термины), используемые здесь, имеют значение, обычно понимаемое специалистом в области техники, к которой относится данное изобретение. Кроме того, следует понимать, что термины, которые определены в обычно используемых словарях, следует интерпретировать, как имеющие значение, соответствующее их значению в контексте релевантной области техники, и их не следует интерпретировать в идеализированном или чрезмерно формальном смысле, если здесь это явно не определено.
Определения
Используемая здесь терминология предназначена только для описания конкретных воплощений, но не для ограничения изобретения. При использовании здесь предполагается, что формы единственного числа "a", "an" и "the" включают формы множественного числа, если из контекста явно не следует иное. Кроме того, в тех случаях, когда термины "включающий", "включает", "имеющий", "имеет", "с" или их варианты используются либо в подробном описании изобретения и/или в формуле изобретения, предполагается, что эти термины являются инклюзивными в степени, подобной термину "содержащий".
Подразумевается, что при использовании здесь термины "содержащий", "содержит" или "содержали" и их варианты, в отношении определенных или описанных элементов объекта, композиции, устройства, способа, процесса, системы и т.д. являются инклюзивными или неисчерпывающими, допускающими дополнительные элементы, тем самым указывая, что определенный или описываемый объект, композиция, устройство, способ, процесс, система и т.д. включает эти указанные элементы - или, при необходимости, их эквиваленты - и, что другие элементы могут быть включены и все еще подпадают под объем/определение указанного объекта, композиции, устройства, способа, процесса, системы и т.д.
Термин "примерно" или "приблизительно" означает в пределах приемлемого диапазона ошибки для конкретного значения, как определено специалистом в данной области, что зависит отчасти от того, как измеряется или определяется это значение, то есть от ограничений системы измерения. Например, "примерно" может означать в пределах 1 или более 1 стандартного отклонения при осуществлении на практике в данной области. Альтернативно, "примерно" может означать диапазон вплоть до 20%, предпочтительно вплоть до 10%, более предпочтительно вплоть до 5% и еще более предпочтительно вплоть до 1% от данного значения. Альтернативно, в частности в отношении биологических систем или процессов, этот термин может означать в пределах порядка величины, предпочтительно в пределах 5-кратного, и более предпочтительно в пределах 2-кратного значения. Когда в заявке и формуле изобретения описаны конкретные значения, то, если не указано иное, следует считать, что термин "примерно" означает "в пределах приемлемого диапазона ошибки для конкретного значения".
Термины "специфическое связывание" или "специфично связывающийся", используемые в отношении взаимодействия белка и антитела или альтернативного каркасного белка или пептоида или аптамеров, означает, что взаимодействие зависит от присутствия определенной структуры (то есть антигенной детерминанты или эпитопа) на белке; другими словами антитело распознает и связывается с определенной белковой структурой, а не с белками в целом. Таким образом, антитело, которое "специфично связывается с" или является "специфическим в отношении" конкретного полипептида или эпитопа на конкретном полипептиде, представляет собой антитело, которое связывается с этим конкретным полипептидом или эпитопом на конкретном полипептиде без существенного связывания с любым другим полипептидом или эпитопом полипептида.
2
Термин "лиганд" включает любое соединение, композицию или молекулу, способную специфично или по существу специфично (то есть с ограниченной перекрестной реактивностью) связывать другое соединение или молекулу, которые в случае иммунного распознавания содержат эпитоп. Во многих случаях лигандами являются антитела, такие как поликлональные или моноклональные антитела. "Лиганды" также включают производные или аналоги антител, включая, без ограничения: Fv-фрагменты; одноцепочечные Fv-(scFv) фрагменты; Fab'-фрагменты; Р(ab')-фрагменты; гуманизированные антитела и фрагменты антител; верблюжьи антитела и фрагменты антител; и поливалентные варианты вышеупомянутых. Поливалентные связывающие реагенты также могут быть использованы в подходящих случаях, включающих, без ограничения ими: моноспецифические или биспецифические антитела, такие как дисульфид-стабилизированные Fv-фрагменты, scFv-тандемы ((scFv)фрагменты), диатела, триатела или тетратела, которые, как правило, представляют собой ковалентно связанные или иным образом стабилизированные (то есть стабилизированные с помощью лейциновой "застежки" или спирали) scFv-фрагменты. "Лиганды" также включают пептоиды, пептидные или нуклеиновокислотные аптамеры или миметики антител, такие как DARPins (сконструированный белок с анкириновым повтором), молекулы аффител, аффилины, аффитины, антикалины, авимеры, финомеры, пептиды с доменом Куница и монотела.
"Метка" или "детектируемая метка" представляет собой композицию, обнаруживаемую с использованием спектроскопических, фотохимических, биохимических, иммунохимических или химических средств. Например, полезные метки включают молекулы, меченные радиоизотопом, флуорофоры, люминесцентные соединения, электроноплотные реагенты, ферменты (например, обычно используемые в ELISA), биотин, дигоксигенин или гаптены и белки, которые могут быть сделаны обнаруживаемыми, например, путем включения метки в пептид или использования для обнаружения антител, специфично реагирующих с пептидом.
Термин "флуорофор" включает любое соединение, композицию или молекулу, способную излучать свет в ответ на облучение. Во многих случаях флуорофоры излучают свет в видимой области света. В других случаях флуорофоры могут излучать свет в невидимых областях света, таких как ультрафиолетовая, близкая к ультрафиолетовой, близкая к инфракрасной и инфракрасная. Например, и без ограничения ими, примеры флуорофоров включают: квантовые точки; наночастицы; флуоресцентные белки, такие как зеленый флуоресцентный белок и желтый флуоресцентный белок; гем-содержащие белки или их производные; хромофоры на основе карбоцианина, такие как IRDye 800CW, Cy 3 и Cy 5; хромофоры на основе кумарина, такие как (7-диэтиламино-3-(4'-малеимидилфенил)-4-метилкумарин) (СРМ); хромофоры на основе фтора, такие как флуоресцеин, флуоресцеина изотиоцианат (FITC); и многочисленные хромофоры ALEXA FLUOR™ и биоконъюгаты ALEXA FLUOR™, которые поглощают в видимой области и ближней инфракрасной области спектра. Излучение флуорофоров может быть обнаружено посредством целого ряда методов, включая, но не ограничиваясь ими, флуоресцентную спектроскопию, флуоресцентную микроскопию, флуориметры, флуоресцентные планшетные ридеры, анализ с помощью инфракрасного сканера, лазерную сканирующую конфокальную микроскопию, автоматизированное конфокальное наносканирование, лазерную спектрофотометрию, клеточную сортировку с активацией флуоресценции (FACS), анализаторы изображений и флуоресцентные сканеры (например гель/мембранные сканеры).
При использовании здесь термин "хромофор" относится к заместителю, который с другим хромофором может быть использован для передачи энергии (например FRET-анализа).
Термин "хемилюминесцентное соединение" включает любое соединение, композицию или молекулу, способную излучать свет в ответ на химическую реакцию. "Биолюминесцентное соединение" относится к природной форме хемилюминесцентного соединения. Примеры хемилюминесцентных соединений включают: люцигенин, люминол. Примеры биолюминесцентных соединений включают: луциферины, коэлентеразины. Излучение хемилюминесцентных соединений может быть обнаружено посредством люминометров или сканирующих спектрометров.
Используемый здесь термин "люминесцентный компонент" или "люминесцентное соединение" относится к компоненту, способному поглощать энергию, такую как электрическая (например электро-люминесценция), химическая (например хемилюминесценция) или акустическая энергия, с последующим излучением по меньшей мере некоторой части энергии в виде света в течение некоторого времени. Используемый здесь термин "компонент" включает отдельные соединения, молекулы, биолюминесцентные белки и макромолекулярные комплексы или смеси люминесцентных и нелюминесцентных соединений или молекул, которые действуют с испусканием света.
Используемые здесь "биологические образцы" включают твердые образцы и образцы жидкостей организма. Биологические образцы, используемые в настоящем изобретении, могут включать клетки, белковые или мембранные экстракты клеток, кровь или биологические жидкости, такие как асцитная жидкость или жидкость мозга (например спинномозговая жидкость). Примеры твердых биологических образцов включают, но не ограничиваются ими, образцы, взятые из тканей центральной нервной системы, кости, молочной железы, почки, шейки матки, эндометрия, головы/шеи, желчного пузыря, околоушной железы, предстательной железы, гипофиза, мышцы, пищевода, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, печени, селезенки, поджелудочной железы, щитовидной железы, сердца, легких, мочевого пузыря, жировой ткани, лимфатических узлов, матки, яичников, надпочечника, яичек, миндалин, тимуса и кожи, или образцы, взятые из опухолей. Примеры "образцов жидкости организма" включают, но не ограничиваются ими, кровь, сыворотку, сперму, секрет простаты, семенную жидкость, мочу, кал, слюну, мокроту, слизь, костный мозг, лимфу и слезы.
Термин "высокопроизводительный скрининг" или "HTS" относится к способу использования разных технологий и дисциплин, например оптики, химии, биологии или анализа изображений, позволяющему осуществить быстрое, высокопараллельное биологическое исследование и поиск новых лекарственных средств. В данной области известны HTS-способы и их, как правило, выполняют на многолуночных планшетах с автоматизированным устройством обработки жидкости и обнаружения; однако предусматривается, что способы по изобретению могут быть осуществлены на практике в микропанельной или в микрожидкостной системе.
Используемый здесь термин "библиотека" или "библиотека лекарственных средств" относится к множеству химических молекул (исследуемое соединение), множеству нуклеиновых кислот, множеству пептидов или множеству белков, органических или неорганических соединений, синтетических молекул, природных молекул или их комбинациям.
Используемый здесь термин "мишень" или "молекула-мишень" относится к любому типу обнаруживаемых или характеризуемых молекул или структур. Молекула может быть внутриклеточной молекулой, такой как, например, нуклеиновокислотные последовательности, пептиды, структуры (например внутриклеточные мембраны, рибосомы и т.д.), поверхностные молекулы (например рецепторы), внеклеточные молекулы, например цитокины, ферменты, вирусные частицы, организмы, биологические образцы и тому подобное.
Используемый здесь термин "набор" относится к любой системе транспортировки для доставки веществ. В контексте анализов реакции, такие системы доставки включают в себя системы, которые позволяют хранить, транспортировать или доставлять реагенты для реакции (например олигонуклеотиды, ферменты и т.п. в подходящих контейнерах) и/или вспомогательные материалы (например буферы, письменные инструкции для проведения анализа и т.д.) из одного места в другое. Например, наборы включают одно или более вложений (например контейнеров), содержащих соответствующие реагенты для реакции и/или вспомогательные материалы. Используемый здесь термин "разделенный набор" относится к системам доставки, содержащим два или более отдельных контейнеров, каждый из которых содержит часть компонентов всего набора. Контейнеры могут быть доставлены предполагаемому получателю вместе или по отдельности. Например, первый контейнер может содержать фермент для использования в анализе, в то время как второй контейнер содержит олигонуклеотиды. Предполагается, что термин "разделенный набор" охватывает наборы, содержащие компоненты, специфичные к анализируемому веществу (ASR), регулируемые разделом 520(e) федерального закона о пищевых продуктах, лекарственных средствах и парфюмерно-косметических товарах (Federal Food, Drug and Cosmetic Act), но не ограничен ими. Действительно, любая система доставки, содержащая два или более отдельных контейнера, каждый из которых содержит часть от всех компонентов набора, включена в термин "разделенный набор". Напротив, "комбинированный набор" относится к системе доставки, содержащей все компоненты для анализа реакции в одном контейнере (например в одной коробке содержится каждый из нужных компонентов). Термин "набор" включает как разделенные, так и комбинированные наборы.
Описание анализа
В предпочтительном воплощении образец, содержащий белок или нужную молекулу для скринирования ("мишень") помещают в емкость. В одном воплощении мишень представляет собой известную молекулу, например, когда осуществляют скрининг специфической молекулы, являющейся диагностической для заболевания или расстройства, или идентифицирует субъектов, которые имеют риску развития заболевания или расстройства, или при скрининге соединения, которое может модифицировать количество ассоциированной с заболеванием молекулы.
Представлен пример анализа, который предназначен для иллюстрации и не должен рассматриваться, как ограничивающий. Например, добавляют в сосуд первый лиганд, который связан с флуорофором-донором и второй лиганд, который связан с флуорофором-акцептором. Каждый из лигандов связывается со специфическим и определенным сайтом на той же молекуле-мишени. Образец, содержащий мишень, связанную с лигандами, облучают при длине волны, оптимальной для возбуждения флуорофора-донора. Измеряют интенсивность света, излучаемого флуорофором-акцептором, в результате его возбуждения энергией, передаваемой от флуорофора-донора (резонансный перенос энергии флуоресценции Ферстера (FRET)). Расстояние между флуорофором-донором и флуорофором-акцептором определено, как равное или меньшее чем расстояние, определенное радиусом Ферстера.
Образцы могут быть идентифицированы и/или количественно оценены с помощью любого полезного метода флуоресцентного обнаружения, такого как флуориметры, флуориметры с временным разрешением, флуоресцентная микроскопия, флуоресцентные планшетные ридеры, анализ с помощью инфракрасного сканера, спектрофотометры, клеточная сортировка с активацией флуоресценции (FACS) и флуоресцентные сканеры (например гель/мембранные сканеры). Хотя образцы могут быть проанализированы с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, автоматизированного конфокального наносканирования или микропланшетного спектрофлуориметра, способ может быть легко адаптирован к другим устройствам (например клеточной сортировке FACS) для применения в других областях. FRET может быть определен прямо или косвенно. Прямое определение FRET выполняют путем возбуждения донора (СРМ) и обнаружения сигнала, излучаемого акцептором (FITC или Alexa488). Используемый здесь термин "сигнал" означает любое обнаруживаемое событие (прямое или косвенное), свидетельствующее о FRET и включает, без ограничения им, излучение фотона. FRET обнаруживают косвенно, используя метод, описанный Карповой и сотрудниками (Т.S. Karpova et al. JMicrosc 209, 56-70, 2003).
Используемый здесь термин "анализ" в единственном или множественном числе не следует неправильно истолковывать или ограничивать, как направленный только на один анализ с конкретными стадиями, но он также включает, без ограничения, любые дополнительные стадии, вещества, различные повторы, альтернативы и т.д., которые также могут быть использованы. Таким образом, если термин "анализ" использован в единственном числе, то это всего лишь в иллюстративных целях.
В предпочтительном воплощении анализ не включает промывание между стадиями. В одном аспекте стадии промывания не включены до и/или после добавления лигандов в сосуды. Недостатком имеющихся в настоящее время анализов является то, что из-за необходимости прочной связи мишени с носителем возникают две основные проблемы: (а) связывание может быть неполным, эффективность связывания может различаться для отдельных конформаций или форм мишени, или связывание мишени с носителем может скрывать до неизвестной степени доступность сайта для узнавания первичным антителом, (б) требование, чтобы излишек антитела (как вторичного, так и/или первичного) был удален насколько возможно полностью, требует повторных промываний, что являются трудоемким и требует много времени и, в некоторых случаях, невыполнимо. В частности, в высокопроизводительных анализах, где десятки или сотни тысяч образцов подвергают скринингу в 384 или 1536-луночных планшетах, процедуры промывания не могут быть выполнены.
Осуществляемые здесь анализы избавлены от необходимости присоединения мишени к носителю и стадии промывки. В одном воплощении в анализе используется метод резонансного переноса энергии Ферстера или FRET, процесс, в котором флуорофор ("донор"), который может быть возбужден светом и может передавать возбуждение второму флуорофору ("акцептору"), если, и только если, они находятся достаточно близко, то есть в пределах расстояния порядка 100 Å или меньше, определяемого радиусом Ферстера. Дополнительные подробности FRET-анализов приведены ниже. Хотя FRET используют в качестве иллюстративного примера, анализы, описанные здесь, не ограничены анализами, основанными на FRET. Например, анализ, в котором используется биолюминесцентный белок, такой как люцифераза, для возбуждения ближайшего флуорофора (BRET), как правило флуоресцентный белок (Xu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(1), 151-6). Другой альтернативный анализ представляет собой люминесцентную кислород-канилирующую химию (Ullman et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(12), 5426-30), где индуцируемая светом система образования синглетного кислорода передает синглетный кислород находящейся вблизи хемилюминесцентной системы.
В одном воплощении, донорные и акцепторные флуорофоры (обнаруживаемая метка/обнаруживаемые молекулы) присоединены к двум отдельным лигандам, например антителам, которые могут специфично связываться с разными сайтами одной и той же мишени. Когда лиганды, несущие донорный и акцепторный флуорофор, соответственно, связываются с той же молекулой-мишенью и при этом становятся достаточно близкими друг другу, облучение образца при длине волны, которая обеспечивает возбуждение донора, приводит к испусканию излучения акцептором. Лиганды, которые не связаны с той же мишенью, не вызывают увеличения FRET и, следовательно, нет необходимости в их удалении перед измерением испускаемого излучения. Так как мишень не адсорбирована и не связана с носителем, она полностью доступна для взаимодействия с лигандами.
В одном воплощении способ обнаружения и количественного определения специфической молекулы-мишени в образце включает скрининг образца, содержащего специфическую молекулу-мишень в высокопроизводительном скрининговом анализе, включающем стадии: (1) добавления первого и второго лиганда, каждый из которых имеет первую и вторую детектируемую метку, (2) связывания каждого из этих первого и второго лиганда с отдельными и специфическими сайтами на специфической молекуле-мишени, где скрининг-анализ не включает стадию (3) промывания и обнаружение излучения света, когда первый и второй лиганды специфично связываются со специфической молекулой-мишенью. Предпочтительно, обнаруживаемая метка включает: флуорофоры, люминесцентные молекулы, ферменты или радионуклиды. В некоторых воплощениях свет включает: флуоресценцию, хемилюминесценцию или биолюминесценцию.
В некоторых воплощениях анализ представляет собой высокопроизводительный скрининг-анализ, который включает резонансный перенос энергии Ферстера (FRET), резонансный перенос энергии биолюминесценции (BRET) или флуоресцентный поляризационный анализ.
2
2
В одном воплощении лиганды включают: полипептиды, такие как антитела или фрагменты антител, несущие сайты распознавания эпитопа, такие как Fab-, Fab'-, F(ab')-фрагменты, Fv-фрагменты, одноцепочечные антитела, миметики антител (такие как DARPins, молекулы аффител, аффилины, аффитины, антикалины, авимеры, финомеры, пептиды с доменом Куница и монотела), пептоиды, аптамеры и тому подобное. В одном воплощении первый и второй лиганды относятся к одному и тому же типу молекулы. В другом воплощении, первый и второй лиганды относятся к разным типам молекул. В некоторых воплощениях первый или второй лиганды включают: антитела, фрагменты антител, Fv-фрагменты; одноцепочечные Fv(scFv)-фрагменты; Fab'-фрагменты; F(ab')-фрагменты, гуманизированные антитела и фрагменты антител; верблюдизированные антитела и фрагменты антител, человеческие антитела и фрагменты антител, моноспецифические или биспецифические антитела, дисульфид-стабилизированные Fv-фрагменты, scFv-тандемы ((scFv) фрагменты), диатела, триатела или тетратела, пептоиды, пептидные или нуклеиновокислотные аптамеры, миметики антител или их комбинации. В других воплощениях первый и второй лиганды включают: полипептид, антитела, фрагменты антител, миметики антител, одноцепочечные антитела, нуклеиновые кислоты, аптамер, пептоид или сахарную группировку или их комбинации. В некоторых воплощениях первый и второй лиганды представляют собой пептидные или нуклеиновокислотные аптамеры. В других воплощениях первый и второй лиганды представляют собой сахарные группировки, включающие гликозаминогликаны, гепарансульфаты или хондроитинсульфаты.
В некоторых воплощениях эти способы используются для обнаружения и количественного определения специфической молекулы в образце. В таких воплощениях способ количественного определения специфической молекулы, например белка, в образце, включает стадии: помещения образца, содержащего специфическую молекулу-мишень, в сосуд, позволяющий облучать образец при длине волны, подходящей для возбуждения флуорофора-донора и измерять флуоресценцию флуорофора-акцептора посредством высокопроизводительного анализа; добавление первого лиганда, который связывается со специфическим сайтом на молекуле-мишени, где первый лиганд связан с первым флуорофором ("флуорофором-донором"); добавление второго лиганда, который связывается со специфическим сайтом на той же молекуле-мишени, отличным от того, с которым связывается первый лиганд, где второй лиганд связан со вторым флуорофором ("флуорофором-акцептором"); исключение стадий промывания между каждой из стадий; облучение образца, содержащего молекулу-мишень, связанную с лигандами при длине волны, оптимальной для возбуждения флуорофора-донора и измерение интенсивности света, испускаемого флуорофором-акцептором.
В одном воплощении интенсивность испускаемого света измеряли посредством флуорометрии с временным разрешением. В воплощениях возбуждение передается флуорофору-акцептору, когда флуорофор-акцептор находится на расстоянии от флуорофора-донора равном или меньше расстояния, определяемого радиусом Ферстера.
В воплощениях мишень присутствует в образце, включающем: жидкость, полужидкость, гель, биологический образец, интактную клетку, пермеабилизованную клетку, разрушенную клетку, клеточный гомогенат, мембрану или клеточную органеллу.
В других воплощениях лиганды связаны с обнаруживаемой меткой (обнаруживаемой молекулой) либо непосредственно, либо посредством подходящего линкера. Настоящее изобретение не ограничивается какой-либо конкретной линкерной группой. Действительно, предполагаются разнообразные линкерные группы, подходящие линкеры могут включать, но не ограничены ими, алкильные группы, простой эфир, полиэфир, алкил-амидный линкер, пептидный линкер, полипептидный линкер, модифицированный пептидный или полипептидный линкер, пептидную нуклеиновую кислоту (PNA), поли(этиленгликолевый) (PEG) линкер, стрептавидин-биотиновый или авидин-биотиновый линкер, полиаминокислоты (например полилизин), функционализованные PEG, полисахариды, гликозаминогликаны, дендритные полимеры, полимеры PEG-хелатирующий агент, олигонуклеотидный линкер, производные фосфолипидов, алкенильные цепи, алкинильные цепи, дисульфид или их комбинацию.
В другом предпочтительном воплощении обнаруживаемая метка связана с лигандом посредством химической связи или нековалентно, посредством ионных, Ван-дер-Ваальсовых, электростатических или водородных связей.
50
50
Существуют различные способы, которые специалист может осуществить для идентификации различных лигандов или комбинаций лигандов. В одном примере лучший анализ пары лигандов осуществляли, как описано в разделе "Примеры" ниже. В кратком изложении, для выбора лучших соединений из наиболее подходящих соединений, полученных во время первичного скрининга, можно использовать следующую стратегию: (1). Выбор соединений, оказывающих наибольший эффект.(2). Выбор соединений, оказывающих эффект при наиболее низкой концентрации и обладающих наименьшей токсичностью в отношении клеток. С этой целью EC и TC могут быть определены с помощью любого из анализов, обычно используемых специалистами в данной области. (3). Выбор соединений, демонстрирующих самую высокую специфичность к молекуле. Хотя для достижения хорошего терапевтического индекса не требуется полная специфичность соединения, она может быть использована в качестве критерия для выбора соединения. (4). Выбор соединений, демонстрирующих самый высокий уровень нужного свойства или терапевтического потенциала, которые могут быть определены. "Терапевтический потенциал" (или "лечение") зависит от состояния, подвергаемого лечению. Например, антивирусное средство ингибирует вирусную инфекцию посредством ингибирования репликации или замедления развития вируса и т.д. Можно использовать любой желательный выходной параметр. "Эффектом" будет являться тип параметра, в отношении которого специалист подвергает соединения скринингу. Он включает, например, активность, функцию, экспрессию и т.д. молекулы-мишени. Таким образом, например, если специалист в данной области подвергает соединения скринингу в отношении ингибирующего действия на определенную молекулу-мишень, тогда используемыми параметрами могут быть профили экспрессии, если молекулой-мишенью является пептидная нуклеиновая кислота, и т.д. В других случаях это может быть активность, например, если это фермент. В других случаях это может быть рецептор и измеряемым эффектом будет модуляция передачи сигнала, или поверхностная экспрессия, или конформационное изменение. В других случаях тестируемое соединение или терапевтический агент-кандидат могут оказывать влияние на образование или свойства (например конформацию или аффинность связывания) между молекулой-мишенью и ее партнером по связыванию. В других случаях соединение или тестируемый агент могут оказывать действие на вторичную и третичную структуру молекулы-мишени. В других случаях, тестируемый агент может ингибировать функцию молекулы-мишени. Таким образом, измеряемые эффекты ограничены только воображением пользователя.
В некоторых воплощениях предложены способы идентификации эффектов соединения, которое модулирует молекулу-мишень, включающие: (а) получение молекулы-мишени, меченной первым хромофором в первом положении; (б) возбуждение хромофора; и (в) измерение времени жизни флуоресценции первого хромофора; где различие между временем жизни флуоресценции в присутствии тестируемого соединения и временем жизни флуоресценции в отсутствии тестируемого соединения указывает на то, что тестируемое соединение модулирует молекулу-мишень таким образом, что меняется время жизни флуоресценции хромофора. В одном воплощении молекулу-мишень также метят вторым хромофором во втором положении, где второе положение отличается от первого положения и, где хромофоры можно использовать для передачи энергии.
В некоторых воплощениях предложены способы идентификации эффектов соединения, модулирующего молекулу-мишень, включающие: (а) представление молекулы-мишени, меченной первым хромофором в первом положении и вторым хромофором во втором положении, где второе положение отличается от первого положения и где первый и второй хромофоры можно использовать для передачи энергии; (б) возбуждение либо первого, либо второго хромофора; и (в) измерение FRET между хромофорами; где различие между FRET в присутствии тестируемого соединения и FRET в отсутствии тестируемого соединения указывает на то, что тестируемое соединение оказывает нужное действие таким образом, что передача энергии между двумя хромофорами меняется.
В другом предпочтительном воплощении лиганды ковалентно связаны, соединены, присоединены, слиты или иным образом приведены в контакт с подходящим донорным или акцепторным флуорофором.
В другом предпочтительном воплощении тип исследуемой молекулы-мишени, которая может быть проанализирована, не ограничен ее формой, структурой и средой, в которой она анализируется. Например, молекула-мишень может быть: в растворе в свободном состоянии, частью интактной клетки, пермеабилизованной клетки, разрушенной клетки, клеточного гомогената, мембраны, клеточной органеллы, присоединена к сферическим гранулам, присоединена или связана с наночастицами, липидами, колонками, полимерами, пластиком, стеклом и тому подобным. В некоторых аспектах образец свободно плавает и не прикреплен к поверхности кюветы или сосуда. Примеры типов молекул включают, без ограничения ими: белок, пептид, полипептид, нуклеиновую кислоту, полинуклеотид, олигонуклеотид, пептидную нуклеиновую кислоту, гликопротеин, углевод, органическую или неорганическую молекулу, выделенную природную молекулу, синтетическую молекулу, малые молекулы, или их комбинацию.
В других воплощениях молекула-мишень может быть прикреплена к липиду или клеточной мембране. Липиды, подходящие для способов и наборов, предложенных здесь, могут быть любыми липидами или их комбинацией в различных соотношениях, способных образовывать мембрану и известных в данной области. В некоторых воплощениях липиды являются природными. В некоторых воплощениях липиды являются синтетическими. В некоторых воплощениях липиды представляют собой один или более из ацилов жирных кислот, глицеролипидов, глицерофосфолипидов, сфинголипидов, сахаролипидов, поликетидов, стероидных липидов, пренольных липидов и их производных. В некоторых воплощениях, липиды представляют собой один или более из липидов на основе холина (например фосфатидилхолин (PC)), липидов на основе этаноламина (например фосфатидилэтаноламин (PE)), липидов на основе серина (например фосфатидилсерин), липидов на основе глицерина (например фосфатидилглицерин), липидов на основе холестерина, долихолов, сфинголипидов (таких как сфингозин, ганглиозид или фитосфингозин), липидов на основе инозитола (например фосфатидилинозитола), кардиолипина, фосфатидной кислоты, лизофосфатидов (например лизофосфатиды), гидрогенизированных фосфолипидов и их производных.
4
В некоторых воплощениях, липиды представляют собой один или более из PC, диолеоилфосфатидилхолина (DOPC), димиристоилфосфатидилхолина (DMPC), дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC), дистеароилфосфатидилхолина (DSPC), пальмитоилолеоилфосфатидилхолина (POPC), 2-диолеоил-3-сукцинил-sn-глицеринхолинового эфир (DOSC), PE (фосфатидилэтаноламина), диолеоилфосфатидилэтаноламина (DOPE), димиристоилфосфатидилэтаноламина (DMPE), дипальмитоилфосфатидилэтаноламина (DPPE), диолеоилфосфатидилсерина (DOPS), дипальмитоилфосфатидилсерина (DPPS), диолеоилфосфатидилглицерина (DOPG), дипальмитоилфосфатидилглицерина (DPPG), сфингомиелина (SM), додецилсульфата натрия (SDS), холестерина (CHOL), холестерина гемисукцината (CHEMS), холестерин-(3-имидазол-1-ил-пропи)карбамата (CHIM), диацилглицеролгемисукцината (DG-Succ), сульфата холестерина (Chol-SO), диметилдиоктадециламмония бромида (DDAB), диолеоилфосфатидной кислоты (DOPA), 1,2-диолеоилоксипропил-3-диметилгидроксиэтиламмония хлорида (DORI), 11,2-диолеоил-3-триметиламмония пропана (DOTAP), N-(1-(2,3-диолеоилокси)-пропил)-N,N,N-триэтиламмония хлорида (DOTMA), 1,2-димиристилоксипропил-3-диметилгидроксиэтиламмония бромида (DMRIE), 1,2-диолеоил-3-диметиламмония пропана (DODAP), N,N-диолеил-N,N-диметиламмония хлорида (DODAC), 1,2-диолеоил-3-диметил-гидроксиэтиламмония бромида (DORIE), N-(1-(2,3-диолеилокси)-пропил)-N-(2-(сперминкарбоксамидо)этил)-N,N-диметиламмония трифторацетата (DOSPA), 1-(2-(олеилокси)этил)-2-олеил-3-(2-гидроксиэтил)имидазолия хлорида (DOTIM), N-(триметиламмонийацетил)-дидодецил-D-глутамата хлорида (TMAG), N,N-ди-n-гексадецил-N,N-дигидроксиэтиламмония бромида (DHMHAC), N,N-ди-n-гексадецил-N-метил-N-(2-гидроксиэтил)аммония хлорида (DHDEAB), N,N-миристоил-N-(1-гидроксипроп-2-ил)-N-метиламмония хлорида (DMHMAC), 1,2-диолеоил-3-(4'-триметиламмонио)бутаноил-sn-глицерина (DOTB), междисциплинарных синтетических амфифилов (SAINT липидов), 4-(2,3-бис-ацилоксил-пропил)-1-метил-1H-имидазол (DOIM), 2,3-бис-пальмитоил-пропил-пиридин-4-ил-амина (DPAPy), 3-бета-(N-(N9,N9-диметиламиноэтан)карбамоил)холестерина (DC-Chol), 3-бета-(N-(N9,N9-триметиламиноэтан)карбамоил)холестерина (TC-Chol), 3-бета-(N-(N,N'-диметиламиноэтан)-карбамоил)холестерина (DAC-Chol), цетилтриметиламмония бромида (СТАВ), катионных кардиолипинов (например (1,3-бис-(1,2-бис-тетрадецилокси-пропил-3-диметилэтоксиаммония бромида)-пропан-2-ол) (NEOPHECTIN™), N-гистидинил-холестерина гемисукцината (HistChol), 4-(2-аминоэтил)-морфолино-холестерина гемисукцината (MoChol), гистаминил-холестерина гемисукцината (HisChol) и их производного.
12
8
Растворителями, пригодными для способов и наборов по настоящему изобретению, может быть любой известный в данной области растворитель, способный облегчить солюбилизацию липидов. В некоторых воплощениях растворитель представляет собой один или более из метанола, этанола, ацетонитрила и хлороформа. В одном воплощении растворитель представляет собой метанол. В другом воплощении растворитель представляет собой этанол. В еще одном воплощении растворитель представляет собой ацетонитрил. В еще одном воплощении растворитель представляет собой хлороформ. В некоторых воплощениях растворитель представляет собой водный раствор, содержащий один или более амфифильных детергентов. Примеры таких детергентов включают, но не ограничиваются ими, оксилглюкозид, монододециловый эфир октаэтиленгликоля (CE), додецилфосфохолин и дезоксихолат.
Молекулы-мишени: Ниже приведен неполный список клеточных макромолекул, которые представляют собой терапевтические мишени (также упоминаемые здесь как "молекулы-мишени") для HTS-поиска лекарственных средств с использованием способов, описанных здесь. Мишени отвечают условиям того, что изменения их количеств оказывает терапевтический эффект в контексте конкретного заболевания и что они не являются жизненно важными для хозяина или их количество может быть уменьшено или увеличено без ущерба для хозяина. Примеры включают без ограничения ими: белок-предшественник амилоида (APP), белок-предшественник токсичных Aβ-агрегатов, обнаруженных при болезни Альцгеймера; мутированный APP, ответственный за семейную болезнь Альцгеймера; BACE-1, фермент расщепления β-сайта APP, который является одним из двух ферментов, приводящих к образованию токсичных Aβ-агрегатов; Tau, другой ключевой токсичный белок, вовлеченный в патологию болезни Альцгеймера и наследственные формы лобно-височной деменции; α-синуклеин, который, при сверхэкспрессии и/или агрегации, вызывает болезнь Паркинсона и другие заболевания, известные под общим названием синуклеопатии; мутированная SOD1 (супероксиддисмутаза 1), ответственная за семейный амиотрофический боковой склероз (ALS); мутированный гентингтин, ответственный за наследственное неврологическое расстройство - болезнь Гентингтона; вирусные рецепторы или корецепторы, такие как HIV (вирус иммунодефицита человека)-корецептор CCR5, который, как было показано, не функционируют у людей, естественно защищенных от HIV-инфекции; маркеры опухолевых клеток, которые связаны с инвазивностью и метастатическим потенциалом опухоли; инсулиновый рецептор, даун-регуляция которого вызывает диабет второго типа; хемокиновые или цитокиновые рецепторы; ферменты убиквитинового пути; ферментативные маркеры и подобное.
В некоторых воплощениях нужные молекулы-мишени представляют собой нуклеиновые кислоты, последовательности мишеней-кандидатов сначала используют для поиска в нескольких базах данных, в которые занесены, например, SNP (единичные нуклеотидные полиморфизмы), последовательности которых регулируют экспрессию или функцию кодируемого продукта и т.д. Целевые базы данных включают базу данных NCBI's dbSNP, UK's HGBASE SNP, базу данных SNP Consortium и базу данных Japanese Millenium Project's SNP.
В некоторых воплощениях после поиска в dbSNP, производят поиск в базах данных локусов гена (например Locus Link). LocusLink предоставляет единый поисковый интерфейс рекомендованной последовательности и описательной информации о генетических локусах. В нем содержится информация об официальном условном обозначении, альтернативных названиях, учетных номерах, фенотипах, ЕС номерах, MIM номерах, UniGene кластерах, гомологии, расположении на карте, белковых доменах и соответствующих веб-сайтах. Выходная информация из LocusLink включает учетный номер LocusLink (LocusID), номер контига генома (NT#) NCBI (Национальный центр биотехнологической информации), номер референсной мРНК (NM#), варианты сайта сплайсинга референсной мРНК (ХМ#), номер референсного белка (NP#), учетный номер OMIM (Менделеевская Наследственность Человека Онлайн) и учетный номер Unigene (HS#).
В других воплощениях можно производить поиск по базам данных ассоциированных заболевании для идентификации потенциальных молекул-мишеней. После поиска в LocusLink полученную информацию используют для поиска в базах данных ассоциированных заболеваний. В некоторых воплощениях производят поиск в HUGO Mutation Database Initiative, которая содержит совокупность ссылок на базы данных SNP/мутаций для конкретных заболеваний или генов.
В некоторых воплощениях производят поиск в базе данных OMIM. OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) представляет собой каталог человеческих генов и генетических расстройств, разработанных NCBI, Национальным центром биотехнологической информации, для всемирной компьютерной сети. Эта база данных содержит текстовую информацию и ссылки. Выходные данные OMIM включают модифицированный учетный номер, где несколько SNPs ассоциированы с генетическим расстройством. Номер аннотирован, чтобы обозначать наличие нескольких SNPs, ассоциированных с данным генетическим расстройством.
В некоторых воплощениях после поисков в dbSNP, программное обеспечение (например, включающее, но не ограничивающееся, UniGene) используют для разделения результатов поиска на ген-ориентированные кластеры (например ген-ориентированный кластерный анализ). UniGene представляет собой систему автоматического разделения последовательностей GenBank в неизбыточную совокупность ген-ориентированных кластеров. Каждый UniGene-кластер содержит последовательности, которые представляют уникальный ген, а также связанную информацию, такую как типы тканей, в которых этот ген экспрессируется и локализацию на карте. В дополнение к последовательностям хорошо описанных генов, сотни тысяч последовательностей новых маркеров экспрессированных последовательностей (EST) включены в UniGene. В настоящее время были обработаны последовательности человека, крысы, мыши, данио и коровы.
В некоторых воплощениях последовательности-мишени используют для поиска в базах данных геномов (например включающих, но не ограниченных ими, Golden Path Database в Калифорнийском университете в Санта-Крусе (UCSC) и GenBank). Поиск в базе данных GoldenPath осуществляют посредством BLAST с использованием последовательности в формате FASTA или, используя RS#, полученный из dbSNP. Поиск в GenBank осуществляют посредством BLAST, используя маскированную последовательность в формате FASTA. В некоторых воплощениях поиски в GoldenPath и GenBank выполняют одновременно с поисками в TSC и dbSNP. В некоторых воплощениях поиски приводят к идентификации соответствующего гена. Результат поиска в GenBank включает учетный номер GenBank. Результат поиска в обеих базах данных включает номера доступа контига. Таким образом, существует много способов, посредством которых специалист в данной области может идентифицировать потенциальную мишень в дополнение к молекуле-мишени, требующейся пользователю.
Другие молекулы-мишени могут быть выбраны, например, с помощью терапии, основанной на стероидных гормонах. В таких случаях, например, сульфатация вовлечена в регулировании уровня эстрогена в опухолях молочной железы, а также уровня андрогенов в опухолях простаты. Наличие надежных HTS-анализов стероидного сульфатирования может стать важным дополнением к арсеналу молекулярных средств, находящихся в распоряжении фармацевтических групп, сосредоточенных на трансдукции стероидного сигнала.
Модуляцию нейростероидов исследуют как новый фармакологический подход к контролированию баланса возбуждения нейронов (Malayev A. et al., Br JPharmacol, 2002, 135:901-9; Maurice T. et al. Brain Res Brain Res Rev, 2001, 37:116-32; Park-Chung M. et al., Brain Res, 1999, 830:72-87). Способы, охваченные настоящим изобретением, соответственно, могут ускорить эти попытки путем обеспечения возможности легкого скрининга эндогенных и синтетических нейростероидов для сульфоконъюгации, обеспечивая ценную информацию для фундаментальной биологии, а также предоставляя инструмент идентификации и оптимизации главной молекулы. На необходимость улучшенных молекулярных инструментов указывает то, что уже имеется значительный неорганизованный рынок DHEA в качестве "антивозрастной" пищевой добавки, претендующей на облегчение возрастной немощи и потери памяти (Salek F.S. et al. J Clin Pharmacol, 2002, 42).
В другом примере способы, воплощенные в настоящем изобретении, могут подходящим образом идентифицировать мишени для лекарственных средств в отношении сульфата холестерина в регуляции оттока холестерина, агрегации тромбоцитов и развития кожи в лечении сердечно-сосудистого заболевания и, возможно, некоторых форм рака кожи. В этом случае сульфотрансфераза может стать мишенью лекарственных средств и может возникнуть необходимость идентификации молекул, которые избирательно ингибируют эту изоформу.
В другом примере молекула-мишень может быть молекулой, вовлеченной в метаболизм лекарственного средства. Проблемы, связанные с метаболизмом лекарственных средств, такие как образование токсичных метаболитов и неблагоприятная фармакокинетика, являются причиной неудач почти половины из всех лекарственных средств-кандидатов во время клинических испытаний. Все крупные фармацевтические компании признали необходимость рассмотрения фармакокинетических и фармакогеномных последствий на ранних стадиях процесса поиска лекарственных средств, что говорит о незамедлительной потребности в высокопроизводительных in vitro способах оценки метаболизма лекарственных средств. Помимо Р450-зависимого окисления, глюкуронидация, по-видимому, является наиболее важным путем печеночного метаболизма лекарственных средств. Глюкуронидация ликвидирует или активирует широкий спектр лекарственных средств, включающий нестероидные противовоспалительные средства, опиоиды, антигистаминные препараты, нейролептики и антидепрессанты (Meech R. and Mackenzie P.I. Clin Exp Pharmacol Physiol, 1997, 24:907-15; Radominska-Pandya A. et al. DrugMetab Rev, 1999, 31:817-99). Несмотря на их важность, широкая и перекрывающаяся субстратная специфичность печеночных UDP(уридин-5-дифосфат)-глюкуронозилтрансфераз (UGT), катализирующих глюкуронидацию, остается плохо изученной из-за отсутствия гибких способов анализа in vitro.
В другом примере молекула-мишень может представлять собой протеинкиназу или ее субстрат. Имеется более чем 400 разных киназ, кодируемых человеческим геномом; выяснение их роли в заболевании и идентификация селективных ингибиторов представляет собой главную фармацевтическую задачу. Неправильное функционирование киназ связано со всеми наиболее важными терапевтическими областями, включая рак, сердечно-сосудистые заболевания, воспаление, нейродегенеративные заболевания и нарушения обмена веществ. Кроме того, клиническое признание киназ в качестве мишеней лекарственных средств было недавно продемонстрировано в случае Герцептина и Гливека, которые ингибируют аберрантные тирозинкиназы, способствующие раку молочной железы и лейкемии, соответственно. Воплощения этих способов позволят ускорить работы по определению субстратной специфичности киназ и идентифицировать новые ингибиторы путем предоставления универсального каталитического анализа, который можно использовать с любой киназой и с любым акцепторным субстратом.
Протеинкиназы представляют собой большое разнообразное семейство с ключевой ролью в трансдукции сигнала. Протеинкиназы, которые катализируют перенос концевой фосфатной группы от АТР (аденозинтрифосфат) или GTP (гуанозинтрифосфат) к остаткам серина, треонина или тирозина акцепторных белков, являются одним из самых крупных белковых семейств в геноме человека. В широком смысле они могут быть разделены на серин/треонин- или тирозинкиназы и растворимые ферменты или трансмембранные рецепторы. В последнем и наиболее полном геномном анализе были идентифицированы 428 человеческих киназ, которые включают восемь различных гомологичных групп, которые также отражают различия в субстратной специфичности, структуре/локализации и/или способе регулирования (Hanks, S.K., Genome Biol, 2003, 4:111). Например, в настоящее время идентифицированы 84 члена группы тирозинкиназ, которая включает как трансмембранные рецепторы факторов роста, такие как EGFR (рецептор эпидермального фактора роста) и PDGFR (рецептор тромбоцитарного фактора роста), так и растворимые ферменты, такие как Src-киназы, в настоящее время идентифицирован 61 член группы киназ, зависимых от циклических нуклеотидов, ser/thr киназы, которые включают липидозависимые киназы - изоформы PKC и в настоящее время идентифицированы 45 членов "STE" группы, которая включает компоненты митогенного МАР-киназного сигнального пути.
Киназы представляют собой повсеместно распространенные регуляторы внутриклеточных путей передачи сигналов и как таковые попали под пристальное внимание фармацевтических компаний, занимающихся поиском более селективной терапии широкого спектра заболеваний и расстройств; в отношении приоритезации фармацевтическими компаниями они уступают только рецепторам, сопряженным с G-белком (Cohen, P., Nat Rev Drug Discov, 2002, 1:309-15). Внутриклеточные мишени для фосфорилирования включают другие киназы, транскрипционные факторы, структурные белки, такие как актин и тубулин, ферменты, вовлеченные в репликацию и транскрипцию ДНК и трансляцию белка, и метаболические ферменты (Cohen, P., Trends Biochem Sci, 2000, 25:596-601). Фосфорилирование может вызвать изменения в каталитической активности, специфичности, стабильности, локализации белка и его ассоциации с другими биомолекулами. Одновременное фосфорилирование многих сайтов на белке с различными функциональными последствиями является общим и основным в интеграции сигнальных путей.
Каждая киназа может фосфорилировать один или более белков-мишеней, иногда во многих сайтах, а также автофосфорилироваться в рамках одного или более регуляторных доменов, контролирующих каталитическую активность или взаимодействие с другими биомолекулами. Определение функциональных последствий профилей клеточного фосфорилирования для нормального и болезненных состояний является важной инициативой протеомики. Однако, для того, чтобы использовать эти знания для решения, на какие киназы следует нацелить поиск новых лекарственные средства, также следует определить их специфичность к акцепторным субстратам. Киназы узнают специфические линейные последовательности своих белков-мишеней, которые часто находятся в бета-изгибах. В общем случае, сайт фосфорилирования определяют аминокислоты, которые фланкируют фосфорилированный остаток на 3-5 остатков с каждой стороны. База данных PhosphoBase, в которой собраны известные сайты киназного фосфорилирования, содержит записи о 133 человеческих киназах, что составляет менее трети всех киназ. Более того, большинство, если не все из этих профилей специфичности являются неполными, так как они показывают только один или два пептида, которые были идентифицированы как субстраты для каждой киназы. Несмотря на значительное перекрывание субстратной специфичности среди родственных киназ, нет консенсусной последовательности, которую фосфорилирует большое количество киназ.
Биологическое обоснование для нацеливания киназ для вмешательства в раковые заболевания является слишком пространным для того, чтобы попытаться дать общее представление здесь. Тем не менее одной из доминирующих тем является вовлечение многих киназ в контролирование тонкого равновесия между скоростью клеточного деления (продвижение по клеточному циклу), клеточным ростом (массой) и запрограммированной клеточной гибелью (апоптозом), который нарушен при всех раковых заболеваниях. Тирозинкиназы рецептора фактора роста (RTK) представляют собой трансмембранные белки, которые передают сигналы пептидных ростовых факторов, находящихся вне клетки, внутриклеточным путям, что ведет к активации про-ростовых и антиапоптотических генов. Большинство из пятидесяти восьми RTK у людей являются доминирующими онкогенами, это означает, что аберрантная активация или сверхэкспрессия приводит к злокачественному фенотипу клеток. Не удивительно, что тирозинкиназы, активно преследуемые как мишени противораковых лекарственных средств, а также малыми молекулами и ингибиторами моноклональных антител - GLEEVEC (Гливек) и HERCEPTIN (Герцептин) соответственно - были клинически утверждены. Нисходящая передача сигнала от рецепторов фактора роста происходит многими путями с участием как ser/thr, так и тирозинкиназ. Одной из доминирующих киназ является митоген-активируемый протеинкиназный (MAPK) путь, который включает Raf- и MEK-киназы; ингибиторы всех этих киназ в настоящее время проходят клинические испытания (Dancey, J. and Sausville, E.A., Nat Rev Drug Discov, 2003, 2:296-313). Растворимые тирозинкиназы, особенно 11 онкогенов, которые составляют семейство Src, также преобразуют митогенные сигналы, инициированные RTK и являются мишенью для фармацевтических компаний (Warmuth M. et al. Curr Pharm Des, 2003, 9:2043-59). После митогенных сигналов RTK, инициирующих вступление клетки в фазу G1, продвижение по клеточному циклу регулируется последовательной активацией фазо-специфических киназ, ассоциированных с белками циклина. Циклин-зависимые киназы представляют еще одну важную группу киназ, которые преследуются фармацевтическими компаниями в надежде ингибировать пролиферацию злокачественных клеток (Elsayed, Y.А. and Sausville, E.A., Oncologist, 2001, 6:517-37).
Таким образом, воплощенные здесь анализы можно использовать для скрининга библиотек лекарственных средств в отношении ингибиторов или активаторов протеинкиназ. Также полезен скрининг пептидов или белков в качестве акцепторных субстратов для киназ. В этих применениях он будет иметь значительные преимущества перед другими способами, такие как универсальный характер анализа, упрощенный однородный анализ, отсутствие радиоактивности и возможность количественно определить обороты фермента.
В зависимости от молекулы-мишени, исследуемым соединением, идентифицированным способами, воплощенными здесь, будет такое соединение, которое полезно при лечении таких заболеваний или расстройств, в которых молекула-мишень играет какую-то роль или непосредственно вносит вклад в такое заболевание или расстройство.
Резонансного перенос энергии Ферстера (FRET): FRET представляет собой безызлучательный процесс, в котором энергия передается от возбужденной молекулы донора молекуле акцептора. Безызлучательная передача энергии представляет собой квантово-механический процесс, посредством которого энергия возбужденного состояния одного флуорофора передается без фактического излучения фотонов второму флуорофору. Принципы квантовой физики рассматриваются в Jovin and Jovin, 1989, Cell Structure and Function by Microspectrofluorometry, eds. E. Kohen and J.G. Hirschberg, Academic Press. В кратком изложении, флуорофор поглощает световую энергию при характерной длине волны. Эта длина волны также известна, как длина волны возбуждения. При FRET, поглощенная флуорофором энергия далее передается посредством безызлучательного процесса второму флуорофору. Первый флуорофор обычно называется донором (D) и имеет большую энергию возбужденного состояния, чем второй флуорофор, называемый акцептором (А).
Критические особенности данного процесса заключаются в том, чтобы спектр излучения донорного флуорофора перекрывался со спектром возбуждения акцептора и чтобы донор и акцептор находились достаточно близко. Расстояние между D и A должно быть достаточно малым, чтобы позволить безызлучательную передачу энергии между флуорофорами. Поскольку скорость передачи энергии обратно пропорциональна шестой степени расстояния между донором и акцептором, эффективность переноса энергии чрезвычайно чувствительна к изменениям расстояния. Считается, что передача энергии происходит с определяемой эффективностью в диапазоне расстояния 1-10 нм, но для оптимальных результатов составляет обычно 4-6 нм. Диапазон расстояний, в котором безызлучательная передача энергии является эффективной, также зависит от многих других факторов, в том числе квантового выхода флуоресценции от донора, коэффициента экстинкции акцептора, степени перекрывания их соответствующих спектров, показателя преломления среды и относительной ориентации переходных моментов этих двух флуорофоров.
Флуоресцентные донорные и соответствующие акцепторные группировки, как правило, выбирают для (а) высокой эффективности передачи энергии Ферстера; (б) большого конечного сдвига Стокса (>100 нм); (в) сдвига излучения, насколько возможно, в красную область видимого спектра (>600 нм); и (г) сдвига излучения до более высокой длины волны, чем рамановское флуоресцентное излучение воды, вызванное возбуждением при длине волны возбуждения донора. Например, донорная флуоресцентная группировка может быть выбрана так, чтобы она имела максимум возбуждения вблизи линии излучения лазера (например, Гелий-Кадмий 442 нм или Аргон 488 нм), высокий коэффициент экстинкции, высокий квантовый выход и хорошее перекрывание ее флуоресцентного излучения со спектром возбуждения соответствующей акцепторной флуоресцентной группировки. Соответствующая акцепторная флуоресцентная группировка может быть выбрана так, чтобы она имела высокий коэффициент экстинкции, высокий квантовый выход, хорошее перекрывание ее возбуждения с излучением донорной флуоресцентной группировки и излучение в красной области видимого спектра (>600 нм).
Специалисту понятно, что многие молекулы флуорофоров подходят для FRET. Флуорофор представляет собой флуоресцентный компонент или функциональную группу, связанную с молекулой. Флуорофор может представлять собой флуоресцентную молекулу, светящуюся сферообразную гранулу, светящуюся липосому, квантовую точку ("QD"), флуоресцентную или фосфоресцирующую наночастицу ("NP"), флуоресцентную латексную частицу или микрогранулу. Флуоресцентная молекула может представлять собой флуоресцеин, карбоксифлуоресцеин и другие производные флуоресцеина, родамин и его производные или любой другой светящийся объект, способным образовывать ковалентную связь с лигандом.
В одном воплощении в качестве флуорофоров используются флуоресцентные белки. Множество флуорофоров доступно и может найти применение в способах, описанных здесь, например и без ограничения ими: ALEXA Fluors (Molecular Probes/lnvitrogen) и DYLIGHT Fluors (Thermo Fisher Scientific). Эти флуорофоры имеют спектр излучения, который охватывает широкий диапазон, включая ультрафиолетовый, ближний ультрафиолетовый, видимый, ближний инфракрасный и инфракрасный диапазоны. Типичные донорные флуоресцентные группировки, которые можно использовать с различными акцепторными флуоресцентными группировками в FRET-технологии, включают флуоресцеин, Люцифер Желтый, В-фикоэритрин, 9-акридинизотиоцианат, Люцифер Желтый VS, 4-ацетамидо-4'-изотиоцианатостилбен-2,2'-дисульфоновую кислоту, 7-диэтиламино-3-(4'-изотиоцианатофенил)-4-метилкумарин, сукцинимидил-1-пиренбутират и производные 4-ацетамидо-4'-изотиоцианатостилбен-2-,2'-дисульфоновой кислоты, хелаты лантанидных ионов (например европия, диспрозия, самария или тербия). Типичные акцепторные флуоресцентные группировки, в зависимости от используемых донорных флуоресцентных группировок, включают LC-Red 640, LC-Red 705, Су5, Су5.5, лиссамин-родамин В сульфонилхлорид, тетраметилродамина изотиоцианат, родамин х изотиоцианат, эритрозина изотиоцианат, флуоресцеин, диэтилентриамина пентаацетат, аллофикоцианин, XL665, d2. Донорные и акцепторные группировки можно получить, например, от Molecular Probes (Junction City, Oreg.) или Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.).
Некоторые природные аминокислоты, такие как триптофан, являются флуоресцентными. Аминокислоты также могут быть дериватизированы, например посредством связывания флуоресцентной группы с аминокислотой (такого как связывание AEDANS с Cys), для создания флуорофорной пары для FRET. Пару AEDANS-Cys обычно используют для обнаружения конформационного изменения и взаимодействий белка. Некоторые другие формы флуоресцентных групп использовали для модификации аминокислот и генерирования FRET в рамках белковых фрагментов (например 2,4-динитрофенил-лизин с S-(N-[4-метил-7-диметиламино-кумарин-3-ил]-карбоксамидометил)-цистеин-е-).
В другом воплощении, которое особенно подходит для использования в живых клетках, в качестве флуорофоров используют зеленый флуоресцентный белок (GFP) и его различные мутантные варианты. Также можно использовать красные флуоресцентные белки, такие как DsRed (Clontech), имеющие максимум возбуждения при 558 нм и максимум излучения при 583. Примеры флуоресцентных белков можно найти в общедоступных базах данных Genbank и SwissPro.
FRET между двумя разными флуорофорами можно анализировать несколькими методами: наблюдая за изменением цвета флуоресценции, измеряя продолжительность флуоресценции донора, определяя изменения при фотообесцвечивании либо донора, либо акцептора. Независимо от подхода, в большинстве этих анализов совместно используются общие свойства приборов. Примерами являются En Vision Plate Reader (Molecular Devices), ViewLux ultraHTS Microplate Imager (PerkinElmer), OPTIMA Microplate Readers, FLUOstar и POLARstar (BMG Labtech). Предпочтительно измерения выполняют с помощью флуорометрии с временным разрешением.
FRET между двумя разными флуорофорами можно анализировать посредством высокопроизводительного клеточного скрининга с использованием прибора, который обнаруживает изменения флуоресценции в клетках или, в частности, в субклеточной локализации. Примерами таких приборов являются INCell Analyzer (GE Healthcare), ImageXpress Micro High Content Screening System (Molecular Devices), Opera, Operetta (PerkinElmer), Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader (Thermo Scientific).
2
Вместо того чтобы вызывать безызлучательную передачу энергии флуорофору-акцептору путем облучения флуорофора-донора, можно достичь безызлучательной передачи энергии от донорного фермента комплементарному акцепторному флуорофору после окисления субстрата. Такой процесс называется биолюминесцентной резонансной передачей энергии (BRET). Примерами ферментов-доноров являются люцифераза или экворин, субстратами могут быть люциферин или коэлентеразин, а флуорофором-акцептором может быть GFP, YFP, EGFP, GFP или GFP 10 (Pfleger K. et al. Nature Protocols, 2006, 1, 337-345). BRET может быть определен с использованием люминометра или сканирующего спектрометра.
Воплощения изобретения также направлены на различные FRET-анализы, такие как, например: стационарный FRET, продолжительность флуоресценции, FRET с временным разрешением, внутримолекулярный FRET или межмолекулярный FRET. Примером внутримолекулярного FRET является FRET между двумя хромофорами, меченными в пределах одной молекулы (например для идентификации конформационных изменений посредством молекулы). В некоторых воплощениях внутримолекулярный FRET молекулы может быть измерен в отсутствие любых других молекул. В некоторых воплощениях внутримолекулярный FRET может быть измерен в присутствии одного или более взаимодействующих белков (например любого лиганд-рецепторного взаимодействия).
FRET, как предлагается здесь, также может быть определен межмолекулярно, например между двумя или более хромофорами, меченными в двух или более разных молекулах.
C+
C-
C+
C-
C+
C-
C+
C-
Фактор Z' используют для оценки качества анализа на всем его протяжении (Zhang JH et al. JBiomol Screen. 1999; 4(2):67-73). Фактор Z' совмещает динамический диапазон анализируемого сигнала (разность между средним от положительных контролей и средним от отрицательных контролей) и статистическую изменчивость сигналов, и диапазоны от 0 (низкое качество) до 1 (высокое качество). Чем выше значение Z', тем больше надежность анализа, при этом значения, равные или превышающие 0,5, указывают на отличный анализ. Z'=1-[3×(SD+SD)/(Mean-Mean)], где SD = стандартное отклонение положительного контроля (максимальный сигнал); SD = стандартное отклонение отрицательного контроля (минимальный сигнал); Mean = среднее значение положительного контроля; Mean = среднее значение отрицательного контроля.
Контейнеры для образцов: Хотя воплощения изобретения описаны выше для кюветы, они эффективны во многих конфигурациях сосудов, контейнеров или резервуаров. Таким образом, анализы могут быть выполнены в пробирке, флаконе, лотке, проточной кювете, кассете, картридже, микрожидкостном чипе и любых других подобных типах контейнеров. В других воплощениях контейнер может быть изготовлен из множества материалов любой формы и любого типа. Следовательно, этот формат анализа также может быть применен к уплощенной пластмассовой или стеклянной кассете или картриджу, в которых анализируемые компоненты можно протаскивать магнитным способом вдоль канала или траектории при помощи внешнего магнита. Таким образом, предусмотрено несколько воплощений или конфигураций сосуда для анализа, включая кюветы, имеющие полупрозрачные или открытые площади поверхности, проницаемые для облучения при длине волны возбуждения, для того чтобы провести флуоресцентный анализ. Например, полупрозрачная поверхность кюветы может быть выполнена в виде квадратного, прямоугольного, круглого, овального или плоского контейнера, сферических гранул, флакона, пробирки, цилиндра, кассеты или картриджа. Предпочтительным воплощением является многослойный титрационный микропланшет.
В воплощениях сосуд включает: кювету, многолуночный планшет, пробирку, колбу, лоток, шарики, флакон, кассету, проточную кювету, картридж, микрожидкостной чип или их комбинацию, которые позволяют осуществить облучение при длине волны флуорофора-донора и измерение при длине волны флуорофора-акцептора.
В воплощениях способы и анализы, описанные здесь, представлены в формате высокопроизводительного скринингового анализа. Преимущества таких форматов вполне понятны, например скрининг большого количества образцов, взятых у пациентов, в диагностических или прогностических целях, скрининг в отношении новых лекарственных средств, исследование и подобное.
Потенциальные/Исследуемые агенты:
Потенциальные агенты включают многочисленные химические классы, хотя обычно они представляют органические соединения, включающие небольшие органические соединения, нуклеиновые кислоты, включая олигонуклеотиды и пептиды. Небольшие органические соединения соответственно могут иметь, например, молекулярную массу более чем примерно 40 или 50, но менее чем примерно 2500. Потенциальные агенты могут содержать функциональные химические группы, которые взаимодействуют с белками и/или ДНК.
Потенциальные агенты можно получить из широкого ряда источников, включающих библиотеки синтетических или природных соединений. Например, многочисленные средства доступны для случайного и направленного синтеза широко ряда органических соединений и биомолекул, включая экспрессию рандомизированных олигонуклеотидов. Альтернативно, доступны и могут быть легко получены библиотеки природных соединений в форме, например, бактериальных, грибных и животных экстрактов.
Химические библиотеки: Разработки в комбинаторной химии позволяют осуществить быстрый и экономичный синтез от сотен до тысяч отдельных соединений. Эти соединения, как правило, организованы в среднего размера библиотеки малых молекул, предназначенные для эффективного скрининга. Комбинаторные способы можно использовать для создания объективных библиотек, подходящих для идентификации новых соединений. Кроме того, могут быть созданы более мелкие и менее разнообразные библиотеки, происходящие от единственного исходного соединения с ранее определенной биологической активностью. В любом случае отсутствие эффективных систем скрининга специфических целевых терапевтически релевантных биологических молекул, продуцируемых посредством комбинаторной химии, таких как ингибиторы важных ферментов, препятствует оптимальному использованию этих ресурсов.
Комбинаторная химическая библиотека представляет собой коллекцию разнообразных химических соединений, полученных посредством химического или биологического синтеза, посредством комбинирования нескольких химических "структурных элементов", таких как реагенты. Например, линейная комбинаторная химическая библиотека, такая как полипептидная библиотека, формируется путем комбинирования некоторого множества строительных блоков (аминокислот) в большое число комбинаций и, потенциально, любым возможным образом для данной длины соединения (то есть числа аминокислот в полипептидном соединении). Миллионы химических соединений могут быть синтезированы посредством такого комбинаторного смешивания химических структурных элементов.
"Библиотека" может содержать от 2 до 50000000 различных соединений. Предпочтительно, библиотека содержит по меньшей мере 48 различных соединений, предпочтительно 96 или более различных соединений, более предпочтительно 384 или более различных соединений, более предпочтительно 10000 или более различных соединений, предпочтительно более чем 100000 различных соединений и наиболее предпочтительно более чем 1000000 различных соединений. Под термином "различный" подразумевается, что более 50% соединений в библиотеке имеют химические структуры, которые не идентичны любому другому члену этой библиотеки. Предпочтительно, если более 75% соединений в библиотеке имеют химические структуры неидентичные любому другому соединению коллекции, более предпочтительно, если более чем 90%, и наиболее предпочтительно, если более чем примерно 99%.
Получение комбинаторных химических библиотек хорошо известно специалистам в данной области. Обзоры можно посмотреть в Thompson et al. Synthesis and application of small molecule libraries, Chem Rev 96:555-600, 1996; Kenan et al. Exploring molecular diversity with combinatorial shape libraries, Trends Biochem Sci 19:57-64, 1994; Janda, Tagged versus untagged libraries: methods for the generation and screening of combinatorial chemical libraries, Proc Natl Acad Sci USA. 91:10779-85, 1994; Lebl et al. One-bead-one-structure combinatorial libraries, Biopolymers 37:177-98, 1995; Eichler et al. Peptide, peptidomimetic, and organic synthetic combinatorial libraries, MedRes Rev. 15:481-96, 1995; Chabala, Solid-phase combinatorial chemistry and novel tagging methods for identifying leads, Curr Opin Biotechnol. 6:632-9, 1995; Dolle, Discovery of enzyme inhibitors through combinatorial chemistry, Mol Divers. 2:223-36, 1997; Fauchere et al. Peptide and nonpeptide lead discovery using robotically synthesized soluble libraries, Can J. Physiol Pharmacol. 75:683-9, 1997; Eichler et al. Generation and utilization of synthetic combinatorial libraries, Mol Med Today 1: 174-80, 1995; and Kay et al. Identification of enzyme inhibitors from phage-displayed combinatorial peptide libraries, Comb Chem High Throughput Screen 4:535-43, 2001.
Также для получения химически разнообразных библиотек можно использовать другие химические структуры. Такие химические структуры включают, без ограничения ими, пептоиды (публикация PCT WO 91/19735); кодируемые пептиды (публикация РСТ WO 93/20242); неупорядоченные биоолигомеры (публикация РСТ WO 92/00091); бензодиазепины (патент США 5288514); диверсомеры, такие как гидантоины, бензодиазепины и дипептиды (Hobbs et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 90:6909-6913(1993)); винилогические полипептиды (Hagihara et al. J. Amer. Chem. Soc. 114:6568 (1992)); непептидные пептидомиметики с бета-D-глюкозным каркасом (Hirschmann et al. J. Amer. Chem. Soc, 114:9217-9218 (1992)); аналоговый органический синтез библиотек малых соединений (Chen et al. J. Amer. Chem. Soc, 116:2661 (1994)); олигокарбаматы (Cho et al. Science, 261:1303 (1993)); и/или пептидилфосфонаты (Campbell et al. J. Org. Chem. 59:658 (1994)); библиотеки нуклеиновых кислот (см., Ausubel, Berger and Sambrook, выше); библиотеки пептидных нуклеиновых кислот (см., например, патент США 5539083); библиотеки антител (см., например, Vaughn et al. Nature Biotechnology, 14(3):309-314 (1996) и PCT/US96/10287); библиотеки углеводов (см., например, Liang et al. Science, 274:1520-1522 (1996) и патент США 5593853); библиотеки малых органических молекул (см., например, бензодиазепины, Baum С&Е News, January 18, page 33 (1993); изопреноиды (патент США 5569588); тиазолидиноны и метатиазаноны (патент США 5549974); пирролидины (патенты США 5525735 и 5519134); морфолино-соединения (патент США 5506337); бензодиазепины (патент США 5288514); и тому подобное.
Устройства для получения комбинаторных библиотек имеются в продаже (см., например, 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem. Tech, Louisville Ky., Symphony, Rainin, Woburn, Mass., 433A Applied Biosystems, Foster City, Calif, 9050 Plus, Millipore, Bedford, Mass.). Кроме того, многочисленные комбинаторные библиотеки сами по себе имеются в продаже (см., например, ComGenex, Princeton, N.J., Asinex, Moscow, Ru, Tripos, Inc., St. Louis, Mo., ChemStar, Ltd., Moscow, RU, 3D Pharmaceuticals, Exton, Pa., Martek Bio sciences, Columbia, Md., etc.).
Скрининговые анализы по изобретению соответственно включают и воплощают животные модели, клеточные системы и неклеточные системы. Идентифицированные гены, варианты, фрагменты или их олигопептиды используют для идентификации агентов, представляющих терапевтический интерес, например посредством скрининга библиотек соединений или иным образом идентифицированных соединений, представляющих интерес, любым из множества способов скрининга лекарственных средств или анализа. Ген, аллель, фрагмент или его олигопептид, используемые в таком скрининге, могут находиться свободно в растворе, могут быть прикрепленными к твердой подложке, удерживаться на клеточной поверхности или быть локализованным внутри клетки. Измерения выполняются, как подробно описано в представленном ниже разделе Примеры.
В некоторых воплощениях способ идентификации потенциальных терапевтических агентов включает скрининг образца, содержащего специфическую молекулу-мишень в высокопроизводительном скрининговом анализе, включающий стадии: (1) добавления первого и второго лиганда, каждый из которых имеет первую и вторую детектируемую метку, (2) связывания каждого из первого и второго лигандов с отдельными и специфическими сайтами на специфической молекуле-мишени, где из скринингового анализа исключена стадия (3) промывания; и обнаружение излучения света, когда первый и второй лиганды специфично связаны со специфической молекулой-мишенью.
В другом предпочтительном воплощении способ идентификации терапевтических агентов включает приведение в контакт: (1) молекулы-мишени с возможным терапевтическим агентом; определение (1) модулирует ли агент функцию пептида или взаимодействие пептида с молекулой-партнером; или (2) модулирует ли агент экспрессию и/или функцию нуклеиновокислотной последовательности-мишени, измеренную при помощи анализов излучения света, воплощенных здесь.
В другом предпочтительном воплощении способ идентификации потенциальных терапевтических агентов для лечения заболевания включает культивирование выделенной клетки, экспрессирующей молекулу-мишень, введение потенциального терапевтического агента к культивируемой клетке; соотнесение экспрессии, активности и/или функции молекул-мишеней в присутствии или отсутствии потенциального терапевтического агента по сравнению с контрольными клетками, где лекарственное средство идентифицируют по нужным результатам лечения. Например, лекарственное средство, которое модулирует экспрессию молекулы-мишени, при этом уровни экспрессии являются ответственными за болезненное состояние, или молекула-мишень модулирует активность другой молекулы, находящейся выше или ниже в метаболическом пути. В других примерах в анализах измеряют киназную активность. В других примерах в анализе измеряют связывание партнеров.
Другой подходящий способ диагностики и обнаружения потенциального лекарственного средства включает приведение исследуемого образца в контакт с клеткой, экспрессирующей молекулу-мишень, и обнаружение взаимодействия тестируемого агента с молекулой-мишенью, аллелем или его фрагментом, или продукт экспрессии молекулы-мишени, ее аллеля или фрагмента.
В другом предпочтительном воплощении клетки пациента выделяют и приводят в контакт с потенциальной терапевтической молекулой. Гены, их продукты экспрессии контролируют, чтобы определить какие гены или продукты экспрессии регулируются лекарственным средством.
Высокопроизводительный скрининг
Воплощенные здесь анализы являются пригодными для скрининга лекарственного средства в высокопроизводительном скрининге соединений, обладающих подходящей аффинностью связывания с интересующим белком (см., например, Geysen et al. 1984, заявка PCT WO 84/03564). В этом способе большое число разных небольших тестируемых соединений синтезируют на твердом субстрате. Тестируемые соединения подвергают взаимодействию с идентифицированными генами или их фрагментами и промывают. Связанные молекулы затем определяют посредством воплощенных здесь способов. Альтернативно, для захвата пептида и иммобилизации его на твердой подложке могут быть использованы не-нейтрализующие антитела.
Способы скрининга согласно изобретению включают использование скрининговых анализов для идентификации, из библиотеки различных молекул, одного или нескольких соединений, обладающих нужной активностью. "Скрининговый анализ" представляет собой селективный анализ, предназначенный для идентификации, выделения и/или определения структуры соединений, имеющих предварительно выбранную активность, внутри некоторой совокупности. Под "идентификацией" подразумевается, что соединение, имеющее нужную активность, выделяют, определяют его химическую структуру (включая, без ограничения, определение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей нуклеиновых кислот и полипептидов соответственно) и, дополнительно или альтернативно, очищают соединения, имеющие выбранную активность). Биохимические и биологические анализы предназначены для тестирования в отношении активности в широком ряде систем, варьирующихся от белок-белковых взаимодействий, ферментативного катализа, связывания малых молекул с белком, до клеточных функций. Такие анализы включают автоматизированные, полуавтоматизированные и HTS (высокопроизводительные скрининговые) анализы.
В HTS-способах много дискретных соединений предпочтительно тестируют параллельно посредством роботизированного, автоматического или полуавтоматического способов, так что большое количество тестируемых соединений подвергаются скринингу в отношении нужной активности одновременно или почти одновременно. Можно анализировать и скринировать вплоть до примерно 6000-20000, и даже вплоть до примерно 100000-1000000 разных соединений в сутки, используя интегрированные системы по изобретению.
Как правило, в HTS молекулы-мишени вводят или культивируют вместе с выделенными клетками с модулированными рецепторами, включая соответствующие контроли.
В одном воплощении скрининг включает приведение каждой культуры клеток в контакт с разнообразной библиотекой соединений, некоторые из которых представляют собой лиганды мишени, в условиях, когда могут образоваться комплексы между мишенью и лигандами, и идентификация, какие соединения из библиотек присутствуют в таких комплексах. В другой неограничивающей методике скрининг включает приведение фермента-мишени в контакт с разнообразной библиотекой соединений, некоторые из который являются ингибиторами (или активаторами) этой мишени, в условиях, когда продукт или реагент реакции катализируемый ферментом продуцирует детектируемый сигнал. В последней методике ингибиторы фермента-мишени уменьшают сигнал от детектируемого продукта или увеличивают сигнал от детектируемого реагента (или наоборот для активаторов).
Раскрытые здесь способы можно использовать для скрининга множества тестируемых соединений. В некоторых воплощениях множество тестируемых соединений содержит от 1 до 200000 тестируемых соединении, от 1 до 100000 тестируемых соединений, от 1 до 1000 тестируемых соединений, между 1 и 100 тестируемых соединений или между 1 и 10 тестируемых соединений. В некоторых воплощениях тестируемые соединения представлены библиотеками соединений, или имеющимися, или не имеющимися в продаже, с использованием способов комбинаторной химии. В некоторых воплощениях библиотеки соединений иммобилизованы на твердом носителе.
Как обсуждается выше, мишень может присутствовать в любом субстрате, и параметрами анализа можно манипулировать или их оптимизировать для каждого типа субстрата. Например, если мишень находится на поверхности или в клетке, или секретируется клеткой, будут определены следующие параметры: оптимальная клеточная линия, плотность клеток, культуральная среда, концентрация сыворотки, конечные объемы реагентов, время инкубации с соединением (например 12, 24 или 36 часов). Если мишень находится в бесклеточном растворе, может быть определен оптимальный состав раствора, а также диапазон концентраций положительного контрольного стандарта. Другими параметрами, которые могут быть определены, являются концентрации лиганда, температура инкубации и время инкубации лигандов (например 1-4 часа). Настройку считывающего инструмента, например флуориметра с временным разрешением, оптимизировали в отношении диапазона измерений и времени задержки, параметров возбуждения (например числа переданных вспышек), регулировки усиления и положения считывающей головки относительно приемника. Следует определить, если он имеется, подходящий фармакологический контроль.
Высокопроизводительный скрининг может быть использован для измерения действия лекарственных средств на сложные молекулярные события, такие как пути сигнальной трансдукции, а также клеточные функции, включающие, без ограничения ими, клеточную функцию, апоптоз, деление клеток, клеточную адгезию, передвижение, экзоцитоз и межклеточные коммуникации. Многоцветная флуоресценция позволяет анализировать множество мишеней и клеточных процессов на одном экране. Кросскорреляция клеточных ответов даст богатую информацию, необходимую для проверки мишени и основной оптимизации.
В другом аспекте настоящего изобретения предлагается способ анализа клеток, включающий определение совокупности областей, содержащих множество клеток, где клетки содержат одну или более флуоресцентных репортерных молекул; сканирование множества клеток в каждой из областей, содержащих клетки, с получением флуоресцентных сигналов от флуоресцентной репортерной молекулы в этих клетках; преобразование флуоресцентных сигналов в цифровые данные; и использование цифровых данных для определения распределения, окружения или активности флуоресцентной репортерной молекулы в клетках.
Микропанели: Идентификацию нуклеиновокислотных последовательностей, способных связываться с молекулой-мишенью, можно выполнить путем иммобилизации библиотеки нуклеиновых кислот на поверхности подложки, так чтобы каждая уникальная нуклеиновая кислота находилась в определенном положении с образованием панели. В общем случае, иммобилизованную библиотеку нуклеиновых кислот подвергают воздействию биомолекулы или потенциального агента в условиях, способствующих связыванию этой биомолекулы с нуклеиновыми кислотами. Нуклеиновокислотную панель затем анализируют с помощью воплощенных здесь способов для определения, какие нуклеиновокислотные последовательности связываются с биомолекулой. Предпочтительно биомолекулы несут предопределенную метку, используемую для обнаружения локализации связанных нуклеиновых кислот.
Анализ с использованием панели иммобилизованных нуклеиновокислотных последовательностей можно использовать для определения последовательности неизвестной нуклеиновой кислоты; анализа однонуклеотидного полиморфизма (SNP); анализа картин экспрессии генов из конкретных видов, ткани, клеточных типов и т.д.; идентификации генов, и т.д.
В дополнительных воплощениях олигонуклеотиды или более длинные фрагменты, полученные из любой полинуклеотидной последовательности, можно использовать в качестве мишеней в микропанели. Микропанель можно использовать для контроля идентичности и/или уровня экспрессии большого числа генов и генных транскриптов одновременно, чтобы идентифицировать гены, с которыми гены мишеней или их продукты взаимодействуют, и/или для оценки эффективности потенциальных терапевтических агентов в регулировании продуктов экспрессии генов, которые опосредуют, например, неврологические расстройства. Эту информацию можно использовать для определения функции гена, а также для разработки и контроля за активностью терапевтических агентов.
Микропанели могут быть получены, использованы и проанализированы с использованием способов, известных в данной области (см., например, Brennan et al., 1995, патент США 5474796; Schena et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 10614-10619; Baldeschweiler et al., 1995, заявка PCT WO 95/251116; Shalon et al., 1995, заявка PCT WO 95/35505; Heller et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 2150-2155; и Heller et al., 1997, патент США 5605662). В других воплощениях микропанель содержит пептиды или другие нужные молекулы, которые могут быть проанализированы для идентификации потенциального агента.
Полезность
В некоторых воплощениях анализ обеспечивает способ диагностики заболевания или расстройства, включающий скрининг биологического образца, взятого у пациента, с целью идентификации и/или количественного определения маркера или молекулы, диагностирующей конкретное заболевание или расстройство. Например, генетический маркер, белковый маркер и тому подобное.
В некоторых предпочтительных воплощениях анализ выполняют с использованием высокопроизводительного скрининга, позволяющего осуществить одновременную диагностику многих субъектов в одно и то же время.
В другом предпочтительном воплощении способ идентификации субъектов с риском развития заболевания или расстройства, включающий скрининг биологического образца, взятого у пациента, и идентификацию маркера или молекулы, диагностирующей конкретное заболевание или расстройство.
В еще одном предпочтительном воплощении способ скрининга потенциальных соединений для лечения или предупреждения заболевания или расстройства включает приведение образца в контакт с потенциальным терапевтическим агентом и измерение воздействия соединения на мишень. Например, если это клеточный продукт, такой как рецептор, соединение может регулировать экспрессию рецептора и это соединение может быть дополнительно изучено в отношении каких-либо возможных терапевтических эффектов (контролируют увеличение или уменьшение параметра, такого как, например, экспрессия, уровень окисления, апоптотические маркеры). Аномальное состояние экспрессии может быть вызвано патологией, такой как заболевание, рак, генетические дефекты и/или токсин.
Наборы и способы
В настоящем изобретении также предлагаются системы и наборы (например имеющиеся в продаже терапевтические, диагностические или исследовательские продукты, реакционные смеси и т.д.), которые содержат один или более или все компоненты, достаточные, необходимые или полезные для практического воплощения любого из способов, описанных здесь. Эти системы и наборы могут включать буферы, компоненты обнаружения/визуализации, положительные/отрицательные контрольные реагенты, инструкции, программное обеспечение, оборудование, упаковку или другие нужные компоненты.
Наборы предоставляют полезные инструменты для скрининга тестируемых соединений, способных модулировать действие соединения на молекулу-мишень. Наборы могут быть упакованы любым подходящим образом для помощи исследовательским, клиническим и испытательным лабораториям, как правило, с различными компонентами, в подходящем контейнере, вместе с инструкциями по применению.
Здесь представлены наборы для идентификации соединения, которое модулирует взаимодействие между молекулой-мишенью и агентом тестирования. В некоторых воплощениях наборы содержат (а) молекулу-мишень, меченную первым хромофором; и (б) агент тестирования, меченный вторым хромофором. В некоторых воплощениях наборы могут дополнительно содержать липиды и/или растворители. В некоторых воплощениях, наборы могут дополнительно содержать буферы и реагенты, необходимые для этой методики и инструкции по проведению анализа. В некоторых воплощениях наборы могут дополнительно содержать, если необходимо, агенты для снижения фоновых помех при тестировании, положительные и отрицательные контрольные реагенты, устройство для проведения теста и подобное.
В некоторых воплощениях способов и наборов, представленных здесь, твердофазные носители используют для очистки белков, мечения образцов или выполнения твердофазных анализов. Примеры твердых фаз, пригодных для осуществления раскрытых здесь способов, включают сферические гранулы, частицы, коллоиды, одиночные поверхности, пробирки, многолуночные планшеты, микротитрационные планшеты, предметные стекла, мембраны, гели и электроды. Когда твердофазный материал находится в виде частиц (например сферических гранул), в одном воплощении, он распределен по лункам многолуночных планшетов для обеспечения параллельной обработки твердофазных подложек.
Способы и наборы, раскрытые здесь, можно использовать в многочисленных форматах, известных в данной области. В некоторых воплощениях способы, представленные здесь, выполняют с использованием твердофазных форматов анализа. В некоторых воплощениях способы, представленные здесь, выполняют в лунке планшета с множеством лунок, такого как многолуночный планшет или многодоменный многолуночный планшет. Использование многолуночных планшетов для анализа позволяет осуществить параллельную обработку и анализ многочисленных образцов, распределенных по многочисленным лункам планшета. Многолуночные планшеты для анализа (также известные как микропланшеты или микротитровальные планшеты) могут принимать различные формы, размеры и очертания (например кругло- или плоскодонные многолуночные планшеты). Типичные форматы многолуночных планшетов, которые можно использовать в способах, представленных здесь, включают форматы на основе 96-луночных планшетов (панель лунок 12×8), 384-луночные планшеты (панель лунок 24×16), 1536-луночный планшет (панель лунок 48×32), 3456-луночные планшеты и 9600-луночные планшеты. Другие форматы, которые можно использовать в способах, представленных здесь, включают, без ограничения ими, однолуночные или многолуночные планшеты, содержащие множество доменов, кюветы, микропанели и т.д. В некоторых воплощениях планшеты имеют черные стенки и черное дно. В некоторых воплощениях планшеты имеют черные стенки и белое дно. В некоторых воплощениях планшеты имеют черные стенки и прозрачное дно для того, чтобы можно считывать со дна сигналы флуоресценции. В некоторых воплощениях планшеты выбирали с минимальной и одинаковой собственной интенсивностью флуоресценции в диапазоне используемом в способе, чтобы избежать влияния на FRET-сигналы.
В способах, представленных здесь, при выполнении в стандартизированных планшетных форматах можно использовать преимущество легкодоступного устройства для хранения и перемещения этих планшетов, а также легкодоступного устройства для быстрого дозирования жидкостей в планшеты и из планшетов (такого как роботизированный дозатор, пипетки для многолуночных планшетов и многоканальные пипетки, устройства для мойки планшетов и тому подобное).
Данное изобретение подробно описано со ссылкой на его предпочтительные воплощения. Однако следует понимать, что специалисты в данной области техники после рассмотрения настоящего описания могут вносить изменения и усовершенствования в пределах сущности и объема изобретения.
Введение композиций
Агенты, идентифицированные посредством воплощенных здесь способов, могут быть приготовлены в виде препаратов и композиции по настоящему изобретению могут быть введены вместе с одним или более дополнительными активными ингредиентами, фармацевтическими композициями или другими соединениями. Терапевтические агенты по настоящему изобретению могут быть введены животному, предпочтительно млекопитающему, наиболее предпочтительно человеку.
Фармацевтические композиции могут быть предназначены для введения пероральным (твердые или жидкие), парентеральным (внутримышечная, внутрибрюшинная, внутривенная (в.в.) или подкожная инъекция), трансдермальным (либо пассивным, либо с использованием ионофореза или электропорации), трансмукозальным и системным (назальным, вагинальным, ректальным или сублингвальным) или ингаляционным путем введения, или с использованием биоразлагаемых включений и могут быть приготовлены в лекарственных формах, подходящих для каждого пути введения.
Агенты могут быть приготовлены в виде препарата в фармацевтически приемлемых носителях или разбавителях, таких как физиологический раствор или буферный солевой раствор. Пригодные носители и разбавители могут быть выбраны, исходя из способа и пути введения и стандартной фармацевтической практики. Описание типичных фармацевтически приемлемых носителей и разбавителей, а также фармацевтических композиций можно найти в Remington Pharmaceutical Sciences, стандартном тексте в этой области, и в USP/NF (Фармакопея США/Национальный Формуляр). Другие вещества могут быть добавлены в композиции для стабилизации и/или консервации композиций.
Композиции по изобретению могут быть введены животным посредством любой обычной процедуры. Композиции могут быть введены непосредственно в целевой участок посредством, например, хирургической доставки во внутренний или внешний целевой участок или с помощью катетера в участок, доступный для кровеносных сосудов. В данной области известны другие способы доставки, например, липосомальная доставка или диффузия из устройства, импрегнированного композицией. Композиции могут быть введены в виде однократного болюса, нескольких инъекций или посредством непрерывной инфузии (например внутривенно). Для парентерального введения композиции предпочтительно готовят в стерильной апирогенной форме.
Соединения, идентифицированные посредством данного изобретения, также могут быть введены пациенту перорально, таким образом, чтобы концентрация лекарственного средства была достаточной для ингибирования резорбции кости или для достижения любого другого терапевтического показания, как описано здесь. Как правило, фармацевтическую композицию, содержащую соединение, вводят в пероральной дозе от примерно 0,1 до примерно 50 мг/кг способом, согласующимися с состоянием пациента. Предпочтительно, пероральная доза будет составлять от примерно 0,5 до примерно 20 мг/кг.
Внутривенная инфузия соединения в 5% декстрозе в воде или в нормальном физиологическом растворе, или аналогичный препарат с подходящими эксципиентами является наиболее эффективным, хотя внутримышечная болюсная инъекция также является полезной. Как правило, парентеральная доза составляет от примерно 0,01 до примерно 100 мг/кг; предпочтительно от 0,1 до 20 мг/кг, так чтобы поддерживать концентрацию лекарственного средства в плазме в концентрации, эффективной для ингибирования цистеинпротеазы. Соединения можно вводить от одного до четырех раз в сутки на таком уровне, чтобы достичь общей суточной дозы от примерно 0,4 до примерно 400 мг/кг/сутки. Точное количество соединения по изобретению, которое является терапевтически эффективным, и пути, посредством которого лучше вводить данное соединение, легко может быть определено специалистом в данной области путем сравнения уровня агента в крови с концентрацией, необходимой для терапевтического эффекта. Пролекарства соединений по настоящему изобретению могут быть получены любым подходящим способом. Для тех соединений, в которых пролекарственная группировка представлена кетонной функциональной группой, в частности кеталями и/или полуацеталями, превращение может быть осуществлено в соответствии с традиционными способами.
При введении в соответствии с настоящим изобретением соединений, производных, солей, композиций и т.п. по настоящему изобретению не ожидается никаких неприемлемых токсилогических эффектов. Соединения по данному изобретению, которые могут иметь хорошую биодоступность, могут быть испытаны в одном из нескольких биологических анализов для определения концентрации соединения, которая требуется для обеспечения данного фармакологического эффекта.
В другом предпочтительном воплощении предложены фармацевтические или ветеринарные композиции, содержащие одно или более идентифицированных соединений и фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель. Другие активные вещества также могут присутствовать, если они могут считаться приемлемыми или рекомендованными для заболевания или состояния, которое лечат или предупреждают.
Носитель или, если присутствует более одного носителя, каждый из носителей, должен(ны) быть приемлемым(и) в смысле совместимости с другими ингредиентами композиции и не вредными для реципиента.
Соединения, идентифицированные с помощью представленных здесь способов, пригодны для использования в различных системах доставки лекарственных средств, описанных выше. Кроме того, с целью увеличения времени полужизни введенного соединения в сыворотке in vivo, соединения могут быть инкапсулированы, введены в полость липосом, приготовлены в виде коллоида, или могут быть использованы другие обычные способы, которые обеспечивают пролонгированное времени полужизни соединений в сыворотки. Имеется множество способов изготовления липосом, как описано, например, в Szoka et al., патентах США 4235871, 4501728 и 4837028 каждый из которых включен в данное описание изобретения посредством ссылки. Кроме того, можно вводить лекарственное средство в системе направленной доставки лекарственного средства, например в липосоме, покрытой ткань-специфическим антителом. Липосомы будут направлены к органу и селективно захвачены им.
Композиции включают композиции, пригодные для ректального, назального, местного (включая буккальное и сублингвальное), вагинального или парентерального (включая подкожное, внутримышечное, внутривенное и внутрикожное) введения, но предпочтительно композиция представляет собой перорально вводимую композицию. Композиции могут быть удобно представлены в стандартной лекарственной форме, например в виде таблеток и капсул с замедленным высвобождением, и могут быть приготовлены любым способом, хорошо известным в фармации.
Такие способы включают стадию приведения указанного выше активного агента в контакт с носителем. В общем случае композиции готовят путем однородного и близкого объединения активного агента с жидкими носителями, или тонко измельченными твердыми носителями, или обоими, и затем, если необходимо, формования продукта.
Соединение, идентифицированное с использованием этих способов, можно приготовить в виде препарата согласно известным способам с получением фармацевтически полезных композиций, посредством чего соединение комбинируют в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. Терапевтические композиции готовят для хранения путем смешивания активного ингредиента, имеющего нужную степень чистоты, с дополнительными физиологически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), в виде лиофилизированных композиций или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях и включают буферы, такие как фосфатный, цитратный и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту; низкомолекулярные (менее чем примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон, аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; сахарные спирты, такие как маннит или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™. (ICI Americas Inc., Bridgewater, N.J.), PLURONICS™ (BASF Corporation, Mount Olive, N.J.) или PEG.
Препараты, которые предназначены для использования для введения in vivo должны быть стерильными и апирогенными. Это легко осуществить посредством фильтрации через стерильные фильтрационные мембраны до или после лиофилизации и восстановления.
Дозировки и необходимые концентрации лекарственного средства в фармацевтических композициях по настоящему изобретению можно варьировать в зависимости от предполагаемого конкретного применения. Определение подходящей дозы или пути введения находится в рамках компетенции обычного врача. Эксперименты на животных обеспечивают достоверное руководство для определения эффективных доз для лечения человека. Межвидовое масштабирование эффективных доз может быть выполнено в соответствии с принципами, изложенными в Mordenti, J. and Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" в Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp.42-96.
Композиции для перорального введения по настоящему изобретению могут быть представлены в виде: дискретных единиц, таких как капсулы, облатки или таблетки, каждая из которых содержит заранее определенное количество активного агента; в виде порошка или гранул; в виде раствора или суспензии активного агента в водной жидкости или неводной жидкости; или в виде жидкой эмульсии масло-в-воде или жидкой эмульсии вода-в-масле; или в виде болюса и т.д.
Для композиций для перорального введения (например таблеток и капсул) термин "приемлемый носитель" включает такие носители, как обычные эксципиенты, например связующие агенты, например сироп, гуммиарабик, желатин, сорбит, трагакант, поливинилпирролидон (Повидон), метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу натрия, гидроксипропилметилцеллюлозу, сахарозу и крахмал; наполнители и носители, например кукурузный крахмал, желатин, лактозу, сахарозу, микрокристаллическую целлюлозу, каолин, маннит, дикальция фосфат, натрия хлорид и альгиновую кислоту; и смазывающие вещества, такие как стеарат магния, стеарат натрия и другие стеараты металлов, стеарат глицерина, стеариновую кислоту, силиконовую жидкость, воски с тальком, масла и коллоидную двуокись кремния. Также можно использовать вкусоароматизаторы, такие как перечная мята, масло грушанки, вишневый ароматизатор и т.п. Может быть желательным добавить краситель, чтобы сделать лекарственную форму легко идентифицируемой. Таблетки также могут быть покрыты оболочкой с помощью способов, хорошо известных в данной области.
Таблетка может быть изготовлена посредством прессования или формования, возможно с одним или более вспомогательными ингредиентами. Прессованные таблетки могут быть получены посредством прессования в подходящем аппарате активного агента в легкосыпучей форме, такой как порошок или гранулы, возможно смешанного со связующим веществом, смазывающим веществом, инертным разбавителем, консервантом, поверхностно-активным или диспергирующим агентом. Формованные таблетки могут быть изготовлены посредством формования в подходящем аппарате смеси порошкообразного соединения, увлажненного инертным жидким разбавителем. Таблетки возможно могут быть покрыты оболочкой или могут иметь риски и могут быть приготовлены так, чтобы обеспечивать медленное и контролируемое высвобождение активного агента.
Другие композиции, подходящие для перорального введения, включают пастилки, содержащие активный агент в ароматизированной основе, обычно сахарозе и аравийской камеди или трагаканте; пастилки, содержащие активный агент в инертной основе, такой как желатин и глицерин, или сахароза и гуммиарабик; и жидкости для полоскания рта, содержащие активный агент в приемлемом жидком носителе
Парентеральные композиции обычно будут стерильными.
Доза: Эффективную дозу композиции по настоящему изобретению вводят субъекту, нуждающемуся в этом. "Терапевтически эффективное количество" или "терапевтическое количество" представляет собой количество терапевтической композиции, достаточное, чтобы получить измеримого ответа (например биологически или клинически значимого ответа у субъекта, которого лечат). Ответ может быть измерен разными способами, как описано выше, например, с помощью профилей цитокинов, типов клеток, молекул клеточной поверхности и т.д. Фактические уровни доз активных ингредиентов в композициях по настоящему изобретению можно варьировать так, чтобы вводить количество активного(ых) соединения(ий), которое является эффективным для достижения нужного терапевтического ответа у конкретного субъекта. Выбранный уровень дозировки будет зависеть от активности терапевтической композиции, пути введения, комбинации с другими лекарственными средствами или способами лечения, тяжести состояния, которое лечат, и состояния и предшествующей истории болезни пациента, которого лечат. Однако, в рамки компетентности в данной области входит начинать с доз соединения на уровнях ниже требуемых для достижения нужного терапевтического эффекта и постепенно увеличивать дозу вплоть до достижения нужного эффекта. Активность композиции может варьироваться и, следовательно, "эффективная для лечения доза" может варьироваться. Однако, используя способы анализа, описанные здесь, специалист в данной области техники может легко оценить активность и эффективность соединения - потенциального кандидата по настоящему раскрытому здесь изобретению и соответственно подобрать схему лечения.
Все упомянутые здесь документы включены в данное описание изобретения посредством ссылки. Все публикации и патентные документы, указанные в данной заявке, включены посредством ссылки для всех целей в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или патентный документ были указаны отдельно. Посредством цитирования различных ссылок в данном документе заявители не предполагают, что какая-либо конкретная ссылка представляет собой предшествующей уровень техники.
ПРИМЕРЫ
Хотя выше были описаны различные воплощения настоящего изобретения, следует понимать, что они были представлены только в качестве примера, а не ограничения. Следующие неограничивающие примеры иллюстрируют изобретение.
Материалы и методы
Анализ на лучшую пару лигандов. Панель лигандов, соединенных с флуоресцентным хромофором, тестировали на их способность связывать мишень на поверхности клетки или в растворе. Были отобраны лиганды, дающие устойчивый мишень-специфический сигнал. Отсутствие помех при связывании с мишенью, когда лиганды добавляли одновременно, затем проверяли при систематизированном спаривании (один меченный "связывающий" лиганд смешивали с одним немеченным "мешающим" лигандом). Окончательно анализ на лучшую пару проводили следующим образом: сигнал, генерируемый какой-либо заданной комбинацией лигандной пары (один лиганд помечен хромофором-донором, а другой хромофором-акцептором, и наоборот) измеряли при возрастающих концентрациях мишени. Оставляли пару меченных лигандов, генерирующих самый сильный сигнал.
Количественной определение рекомбинантного PrP (rPrP) в растворе: Рекомбинантный PrP добавляли в лунки микротитрационного планшета в фосфатно-солевом буфере (PBS). PrP немедленно определяли, используя PrP-специфические антитела SAF32 (аа53-93) и D18 (аа133-157), меченные донорным и акцепторным флуорофорами соответственно. Один PBS использовали в качестве контроля фонового сигнала. Для анализа данных рассчитывали соотношения (R) измерений при 665 нм (излучение акцептора) к 620 нм (излучение донора).
0/0
C+
C-
C-
C+
C-
Определение PrP на клеточной поверхности: Клетки добавляли в лунки титрационного микропланшета. Добавляли соединения из библиотеки, подвергаемой скринингу, или контроль растворителя (обычно DMSO) и клетки инкубировали в течение 24 часов. Затем определяли количество PrP, присутствующее на клеточной поверхности живых клеток. Для определения PrP на клеточной поверхности в качестве лигандов использовали антитела. Лучшей парой антител является SAF32, направленное против а.к. 53-93 (Cayman Chemical) и D18, направленное против а.к. 133-157 (Williamson R.A., J. Virol, 1998, 72 (11), 9413-18), меченные донорным и акцепторным флуорофорами, соответственно. В этом конкретном примере использовали HTRF с криптатом тербия в качестве флуорофора-донора и d2 в качестве флуорофора-акцептора. Антитела метили Cisbio. Клеточная линия PrP (КО), полученная из первичных нейронов гиппокампа PrP-ген-дефицитных мышей, служащих в качестве отрицательного контроля экспрессии PrP. Контрольные пробы состояли из культуральной среды без клеток. Для анализа данных рассчитывали соотношения (R) при 665 нм (излучение акцептора) к 620 нм (излучение донора), для коррекции неспецифического поглощения при 620 нм света анализируемой смесью. Значение для специфического сигнала образца или положительного контроля приведено в виде Delta F% = [(R-R)/R]×100, где R и R представляют собой соотношения 665/620 положительного и отрицательного контроля. Это радиометрическое измерение позволяет скорректировать флуоресцентные помехи, индуцируемые матрицей анализа или соединениями, подвергаемыми скринингу.
Клеточная линия: клетки LD9, клеточная линия фибробластов (Mahal S. et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2007; 104(52):20908-13). У этой клеточной линии присутствует уменьшенное выделение PrP в среду и, следовательно, меньший фоновый сигнал для PrP по сравнению с клетками нейробластомы.
Фармакологический контроль: Брефелдин A (BFA), соединение, которое предотвращает миграцию белков из ER (эндоплазматический ретикулюм) в аппарат Гольджи (Nebenfuhr A. et al. Plant physiology. 2002; 130:1102-8).
Другие условия анализа: Оптимальное время инкубации составляет 24 часа для соединения, 3 часа для антитела. Оптимальная концентрация антитела (обозначенная 1Х) составляет 0,33 мкг/мл (D18-d2) и 0,036 мкг/мл (SAF32-Tb).
Пример 1: Скрининг соединений
С помощью анализа, выполняемого в 384-луночном формате, скринировали коллекцию лекарственных средств США, библиотеку из 1280 соединений, содержащую главным образом одобренные FDA (Управление по контролю продуктами и лекарствами США) лекарственные средства. Библиотеку скринировали при концентрации 20 мкМ. Тридцать восемь соединений уменьшали экспрессию PrP более чем на 50%, что было выбрано как порог скрининга. Затем библиотеку подвергали обратному скринингу, используя анализ жизнеспособности клеток, для выявления токсичных соединений. Девять из 38 подходящих кандидатов демонстрировали менее чем 10% токсичность и были рассмотрены, как наиболее подходящие (Фиг.3). Следовательно, коэффициент успеха составлял 0,7%.
Для подтверждения наиболее подходящих соединений, уровни PrP на поверхности клеток измеряли независимым способом. Клетки подвергали воздействию соединений, промывали PBS, метили при +4°C моноклональным антителом D18 в течение одного часа, затем фиксировали с помощью 4% PFA, затем добавляли вторичные антитела, меченные Alexa-488, для выявления PrP-антител. Снижение PrP на клеточной поверхности можно быть затем визуализировано с помощью эпифлуоресцентного микроскопа и количественно определено либо с помощью проточной цитометрии, либо с помощью системы многопараметрического субклеточного анализа, такой как IN Cell Analyzer 1000 или 2000 (GE Lifesciences). Шесть из девяти наилучших соединений были подтверждены, демонстрируя, что в результате первичного анализа были получены наилучшие соединения, которые воспроизводимо уменьшали уровни PrP на поверхности клеток. Кроме того, поскольку конечной мишенью прионов в живом организме является мозг, важно показать активность соединений в типах клеток, близких к нервным клеткам. Все шесть соединений уменьшали уровни PrP на клетках нейробластомы (N2a). Активность такролимуса показана на Фиг.4A-4D в качестве примера. Такролимус снижал PrP на 70% при 20 мкМ в первичном анализе (на клетках LD9) и на 75 и 73% при 30 мкМ во вторичном анализе (на клетках N2a) посредством проточной цитометрии и количественного определения с помощью IN Cell analyzer соответственно.
Другими активными соединениями были астемизол, лазалоцид натрия, монензин, эметин и цетримоний. Количественное выражение снижения PrP посредством астемизола и лазалоцида натрия показано на Фиг.5A и 5B.
R
Обратный скрининг: Токсичные соединения генерируют искусственное уменьшение интенсивности PrP сигнала на поверхности клеток и исключены. Высокопроизводительный люминесцентный анализ жизнеспособности клеток CELLTITER-GLO (Promega) можно использовать для этой цели, как показано на Фиг.3. Добавление CELLTITER-GLO реагента приводит к лизису клеток и генерации люминесцентного сигнала при 610 нм, пропорционального количеству АТР, отражая количество живых клеток в культуре.
50
50
Sc
Sc
-4
Sc
Приоритизация соединений: Для выбора лучших соединений из наиболее подходящих соединений, полученных во время первичного скрининга, можно использовать следующую стратегию: (1). Выбор соединений, оказывающих наибольший эффект снижения PrP. (2). Выбор соединений, оказывающих эффект снижения PrP при самой низкой концентрации и имеющих наименьшую токсичность для нейрональных клеток. С этой целью следует определить EC и TC на клетках N2a, используя, например, анализы, описанные выше (IF и Cell Titer Glo). (3). Выбор соединений, демонстрирующих наибольшую специфичность к PrP. Хотя для соединения не требуется полная специфичность к PrP для достижения хорошего терапевтического индекса, это может быть использовано в качестве критерия для выбора соединения. Другие маркеры, экспрессируемые на поверхности нейронов, такие как, но без ограничения ими, белок-предшественник амилоида (APP) и CD24 (также называемый термостабильный антиген или нектадрин (nectadrin)) обнаруживают посредством IF, используя такую же методику, которую используют для обнаружения PrP на клеточной поверхности. После обработки клеток соединением, степень уменьшения других белков сравнивают с уменьшением PrP. (4). Выбор соединений, демонстрирующих наибольшую способность вылечивать прион-инфицированные клетки и предупреждать инфицирование клеток прионами. Выбранные соединения могут быть протестированы на их способность ингибировать репликацию прионов в прион-инфицированных клетках с использованием вестерн блоттинга или клеточного анализа скрепи (SCA) (Kloehn P.C. et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2003; 100(20):11666-71). Эти анализы обнаруживают инфицированные клетки благодаря содержанию в них PrP. Общее содержание PrP в культуре клеток можно измерить посредством вестерн блоттинга клеточных лизатов; инфицированные клетки могут быть зарегистрированы как «пятна» в SCA). На Фиг.6 показан эффект лечения RML скрепи-инфицированных PK1 клеток ферментом фосфатидилинозитол-фосфолипазой С (PIPLC), ферментом, который отщепляет GPI (гликозилфосфатидилинозитол)-прикрепленные белки, следовательно PrP, от клеточной поверхности при 1 мкг/мл, концентрации, которая удаляет приблизительно 50% PrP с поверхности белка. На Фиг.7A и 7B показано, что такролимус (Tac) и астемизол (Ast), два соединения, подвергнутых скринингу с использованием способа, описанного здесь, которые уменьшают количества PrP на клеточных поверхностях, как показано на Фиг.4A-4D и 5A-5B, блокируют инфицирование клеток нейробластомы PK1 прионами RML и 22L. Клетки PK1 предварительно обрабатывали в течение 3 суток указанными дозами лекарственных средств и инфицировали прионами RML (Фиг.7A) или 22L (Фиг.7В), используя 10 разведение гомогената мозга от RML- или 22L-инфицированных мышей. Лечение продолжалось в течение 12 суток после инфицирования. Клетки анализировали с помощью вестерн блоттинга на устойчивые к протеиназе K PrP (признак прионной инфекции) через 9 и 18 суток после инфицирования (т.е. за 3 дня до и через 6 дней после прекращения лечения). PPS (пентозанполисульфат), лекарственное средство, которое предупреждает иинфицирование прионами, использовали в дозе 10 мкг/мл в качестве положительного контроля эффективности лечения. CTRL: необработанные клетки. И астемизол и такролимус блокируют инфицирование прионами и после прекращения лечения не происходило возобновление инфекции.
Эти способы скрининга молекул, ингибирующих экспрессию PrP на поверхности клеток, имеют применения, выходящие за рамки прионных заболеваний. Действительно, было показано, что PrP опосредует Aβ-олигомер-индуцированную нейротоксичность и ухудшение памяти у трансгенных мышей с болезнью Альцгеймера (Lauren et al. Nature 2009; 457(7233):1128-32). Следовательно, соединения, снижающие количества PrP, могут предупреждать Aβ-индуцированную нейродегенерацию при болезни Альцгеймера. На Фиг 8A-8E показано, что Aβ-олигомеры токсичны для клеток SK-NSH, но не для SH-SY5Y, клеточной линии, полученной от SK-NSH, но не экспрессирующей PrP.
Хотя это изобретение было проиллюстрировано и описано в отношении к одному или более воплощениям, специалистам в данной области будут очевидны эквивалентные изменения и модификации при чтении и осмыслении данного описания и прилагаемых графических материалов. Кроме того, хотя конкретный признак изобретения может быть раскрыт в отношении только одного из нескольких воплощений, такой признак может быть объединен с одним или более другими признаками других воплощений, что может быть желательным и полезным для любого заданного и конкретного применения.
Реферат описания изобретения предоставлен, чтобы позволить читателю быстро установить сущность технического описания. Следует понимать, что он не используется для интерпретации или ограничения объема или содержания прилагаемой формулы изобретения.