Неомитилан - новый иммуномодулятор из мидии Crenomytilus grayanus

STUDY ON IMMUNE-RESPONSE MODULATING AND MEMBRANE-ACTING EFFECTS OF CAROTENOIDS DERIVED FROM THE TUNIC OF ASCIDIA HALOCYNTHIA AURANTIUM

E.S. Motorya1, T.N. Pivnenko1, A.K. Gazha2, L.A. Ivanushko2,

V.N. Vorontsov3, N.M. Sanina3

1 TINRO-Centre

Summary — The paper discusses immune-response modulating and membrane-acting effects of carotenoids derived from the Halocynthia aurantium ascidia tunic and gives consideration to 12 components, among which xanthophylls are dominant. These are: astaxanthin, alloxantin, diatoxanthine, halocynthi-

axanthine, fucoxanthinol, and methylxanthine. Halocynthiax-anthine is peculiar to this form and used to identify halocynthi-axanthine-based drugs. Original patented method has allowed to derive oily extract from the ascidian tunic registered as dietary supplement. As shown, this medication induces bactericidal and phagocytic activities of neutrophils, antioxygenic properties of blood serum, inhibits peroxidation, and produces anti-inflammatory and hemostimulating effects. The ascidian tunic carotenoids have membrane-acting properties and capability to be bound together with phospholipids and stabilize membrane structure. The findings allow recommending the dietary supplement “Ascidian-Derived Oily Extract” for advanced clinical testing.

Key words: ascidia, carotenoids, functional activity of neutrophils, membrane-acting effects.

Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 28—32.

УДК 615.37:577.114:[615.324:594.124]

И.В. Чикаловец1, В.И. Молчанова1, Д.Л. Аминин1, О.В. Черников1, Е.А. Пислягин2, П.А. Лукьянов1

1 Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН (690022, г. Владивосток, пр-т 100 лет Владивостоку, 159),

2 Дальневосточный государственный университет

НЕОМИТИЛАН - НОВЫЙ ИММУНОМОДУЛЯТОР ИЗ МИДИИ СИЕЫОМУГ^ GRAYANUS

Ключевые слова: полисахариды, беспозвоночные, иммуномодулирующая активность.

Исследована иммуномодулирующая и противовоспалительная активность неомитилана — полисахарида из мидии ^emmyH^ grayаnus. В отличие от ранее выделенного из этой же мидии полисахарида — митилана, неомитилан не проявляет аллергизирующих свойств, т.к. содержит не более 1,5% белка. В эксперименте показано, что неомитилан на 25—30% усиливает фагоцитарную активность макрофагов in vitro и более чем в 2 раза по сравнению с митиланом повышает активность лизосомальных ферментов макрофагов и стимулирует формирование активных форм кислорода. При этом, так же как и митилан, неомитилан не обладает токсическими свойствами in vivo и не проявляет цито-токсической активности in vitro. Установлено, что неоми-тилан способен снижать уровень перекисного окисления липидов и активность нитроксидсинтазы. Сделан вывод, что митилан вследствие описанных свойств может служить основой для получения лекарственных препаратов.

Поиск регуляторов иммунных процессов привлекает в последние десятилетия пристальное внимание большого числа исследователей. Вещества, оказывающие регулирующее влияние на иммунную систему, получили общее название иммуномодуляторов. К ним относятся различные химические соединения, важное место среди них принадлежит биоглика-нам — полисахаридам и гликоконъюгатам природного происхождения. В качестве иммуномодулятора из различных видов мидий, обитающих в Японском и Черном морях, ранее нами был выделен биогли-кан — митилан, исследованы его физико-химические и биологические свойства [2]. Однако присутствие потенциально аллергогенной белковой компоненты (3—8%) ограничивает использование этого биоглика-на в качестве медицинского препарата.

Чикаловец Ирина Владимировна — канд. хим. наук, старший научный сотрудник ТИБОХ ДВО РАН; тел.: 8 (4232) 31-07-19; e-mail: ivchik6@mail.ru.

Целью настоящей работы явился сравнительный анализ биологической активности неомитилана (белковая компонента не более 1,5%) и митилана, выделенных из мидии Crenomytilus grayanus.

Материал и методы. Использовались первичные культуры клеток млекопитающих и техники молекулярных флуоресцентных зондов. Эксперименты выполнены на мышах линий CD-1 (весом 19—21 г), СВА (самки весом 19—21 г) и Balb/С (весом 18—20 г). Мыши содержались в стандартных условиях вивария ТИБОХ ДВО РАН с соблюдением правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей.

Для определения острой токсичности раствор неомитилана в дистиллированной воде в различных концентрациях вводили внутрибрюшинно в объеме

0,5 мл на животное (по 5 мышей в каждой группе). Наблюдение и оценка токсического эффекта проводились в течение 12 дней.

Для определения цитотоксической активности in vitro получали лимфоциты из селезенки мышей линии CD-1 [9]. В лунки 96-луночного планшета вносили по 20 мкл неомитилана в разных концентрациях и по 200 мкл суспензии спленоцитов (2—5х106 клеток/мл) и инкубировали 1 час при 37°С. Затем в каждую лунку добавляли по 10 мкл раствора флуоресце-индиацетата (50 мкг/мл) в диметилсульфоксиде и снова инкубировали 15 мин при 37°С. Клетки облучали светом с длиной волны Aex=485 нм, флуоресценцию регистрировали при Aem=518 нм. Измерение проводили с помощью флуоресцентного планшетного фотометра Fluoroskan Ascent (Thermo Labsystems, Финляндия). Все эксперименты повторяли дважды.

За 100% принимали флуоресценцию лунок, в которые вместо исследуемого вещества добавляли по 20 мкл физраствора.

Для определения лизосомальной активности в брюшинную полость мышей линии СВА вводили тестируемые препараты в концентрации 300 мкг на особь: 3 мыши — митилан, 3 мыши — неомитилан и 3 мыши — физраствор (контроль). Через 4 дня по методу Р. Адамса [1] получали макрофаги из перитонеальной жидкости и помещали их в специальные камеры для анализа изображений. На клеточный монослой наносили 200 мкл раствора флуоресцентного зонда (акридиновый оранжевый, 10 мкМ конечная концентрация) в физиологическом растворе и оставляли камеры в термостате при 37°С на 30 мин, после чего клетки трижды отмывали физраствором. Затем камеры монтировали на предметном столе флуоресцентного микроцитометра Axiovert 200 (Zeiss, Германия) и проводили измерение интенсивности флуоресценции клеток с использованием системы регистрации флуоресцентного изображения (Cairn Research Ltd., Англия). Клетки облучали светом длиной волны Xex=488 нм, флуоресценцию регистрировали при X =520 нм.

em

Интенсивность флуоресценции 300 случайно выбранных изображений и оценку лизосомальной активности в клетках осуществляли инструментальными средствами программы AQM Advance 6 (Kinetic Imaging Ltd., Англия). Все эксперименты выполняли трижды. Лизосомальную активность рассчитывали, принимая за 100% активность макрофагов контрольной группы.

Для определения активных форм кислорода (АФК) иммунизацию мышей тест-препаратами и получение макрофагов проводили как в предыдущем эксперименте. На клеточный монослой наносили 200 мкл раствора флуоресцентного зонда (дихлорофлуо-ресцеин-диацетат, 10 мкМ конечная концентрация) в физрастворе и оставляли в термостате при 37°С на 10 мин. Затем монослой трижды отмывали физраствором, после чего камеры монтировали на предметном столе флуоресцентного микроцитометра и проводили измерение интенсивности флуоресценции клеток. За 100% принимали количество АФК, продуцируемое макрофагами контрольной группы.

Определение фагоцитарной активности клеток, обработанных тестируемыми веществами, проводили в соответствии с общепринятой методикой [6]. Для оценки интенсивности фагоцитоза и реакции внутриклеточного киллинга использовали бактерии Staphylococcus aureus, меченные флуоресцеин-изо-тиоцианатом. Анализ фагоцитарной активности перитонеальных мышиных макрофагов проводили согласно протоколу компании «Молекуляр Пробс» [12]. Макрофаги получали из перитонеальной жидкости мышей линий Balb/С [1]. Клеточный монослой снимали с поверхности чашек с помощью

скрепера. Рабочая концентрация составляла 2—5х 106 кл./мл. Тестируемые вещества анализировались в различных концентрациях: 1 мг/мл, 100 мкг/мл, 10 мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,1 мкг/мл в 4 повторах для каждой концентрации.

Влияние неомитилана на активность нитроксид-синтазы и процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в легких изучали на трех курящих добровольцах после ингаляции 3 и 10 мг неомитилана на человека однократно. После ингаляции 5 мл соответствующего раствора с помощью ультразвукового ингалятора «Ротор» (Ротор, Барнаул) определяли уровень нитрит-иона и малонового диальдегида (МДА) в конденсате выдыхаемого воздуха (КВВ) в течение первых суток [4].

Изучение аллергизирующих свойств неомитилана и митилана проводили в соответствии с общепринятой методикой [5]. Для оценки реакции гиперчувствительности замедленного типа 30 мышей линии СВА (по 10 животных в группе) сенсибилизировали однократно подкожно (в основание хвоста) эмульсией тест-препаратов в полном адъюванте Фрейнда (1:1) в объеме 60 мкл (300 мкг на мышь). Для приготовления эмульсии использовали физраствор. Животным контрольной группы вводили вместо препарата 60 мкл адъюванта с физраствором. На 5-е сутки в подушечку правой лапки мышей вводили 50 мкл раствора тестируемых веществ на физрастворе в дозе 300 мкг на особь. Контрольным животным вводили физиологический раствор в аналогичном объеме. Через 24 часа регистрировали ответ путем определения диаметра правой («опытной») и левой («контрольной») лап. Индекс реакции выражали в процентах прироста диаметра.

Для оценки аллергических реакций немедленного типа выполняли конъюнктивальную пробу. Мышей линии СВА однократно сенсибилизировали путем внутрибрюшинного введения тест-препаратов в дозе 300 мкг на особь. В каждой группе было по 6 животных. Для постановки пробы 1 каплю водного раствора исследуемых веществ (300 мкг) вводили глазной пипеткой под верхнее веко мыши. Через 15 мин учитывали реакцию и оценивали ее визуально по четырехбалльной шкале.

Статистическую обработку данных выполняли с помощью программы SigmaPlot 3.02 (Jandel Corporation, США).

Результаты исследования. Наблюдение в течение 12 дней позволило установить, что неомитилан нетоксичен для мышей при внутрибрюшинном введении в дозах от 78,1 до 2500 мг/кг. При действии нео-митилана на спленоциты жизнеспособность клеток изменялась в зависимости от концентрации препарата в пределах 75,4—100%, что является допустимым в экспериментах in vitro. Следовательно, неомитилан не демонстрировал цитотоксической активности в широком диапазоне доз — от 0,97 до 1000 мкг/мл.

Таблица 1

Влияние неомитилана и митилана на лизосомальную активность перитонеальных макрофагов

Группа Кол-во животных Активность1, %

Контроль 3 100,00

Митилан 3 142,16+3,67

Неомитилан 3 304,26+3,91

1 m±SE — средняя и стандартная ошибка средней.

Таблица 2

Определение влияния неомитилана и митилана на формирование АФК

Группа Кол-во животных АФК1, %

Контроль 3 100,00

Митилан 3 200,11+4,95

Неомитилан 3 148,15+5,86

1 m+SE — средняя и стандартная ошибка.

Установлено статистически достоверное увеличение лизосомальной активности перитонеальных макрофагов мышей на 4-й день после инъекции тест-препаратов в дозе 300 мкг на особь. Под действием митилана лизосомальная активность увеличивалась примерно на 40% по сравнению с контролем. В случае использования неомитилана в той же дозе лизосомаль-ная активность макрофагов увеличивалась примерно в 3 раза по сравнению с активностью макрофагов контрольных мышей и более чем в 2 раза по сравнению с активностью под действием митилана (табл. 1).

При внутрибрюшинной инъекции митилана и не-омитилана в дозе 300 мкг на особь наблюдалось статистически достоверное увеличение АФК по сравнению с контролем в 2 и в 1,5 раза соответственно (табл. 2).

Показано, что тестируемые соединения способны стимулировать фагоцитоз перитонеальных мышиных макрофагов in vitro. Максимальная стимулирующая концентрация была 10 мкг/мл, при которой за 2 часа инкубации происходила стимуляция фагоцитоза на 25—30%. При исследовании противовоспалительных свойств неомитилана у всех курящих добровольцев, у которых вследствие патогенного воздействия табачного дыма повышен уровень ПОЛ и активности нитрок-сидсинтазы в среднем в 2—2,5 раза по сравнению с некурящими, в течение первых 3—5 часов после ингаляции неомитилана наблюдалось достоверное снижение уровня этих показателей в КВВ. Так, концентрация нитрит-иона уменьшалась на 35 и 75% и уровень МДА снижался на 40 и 70% соответственно. Эффект регистрировался и к концу первых суток после ингаляции неомитилана. Следует отметить, что неомитилан при ингаляционном введении не обладает пирогенным эффектом, колебания температуры тела добровольцев не превышали физиологических значений.

Результаты определения аллергических свойств свидетельствуют о том, что неомитилан в исследуе-

Таблица 3

Влияние неомитилана и митилана на гиперергическую реакцию замедленного типа

Группа Кол-во животных Диаметр лапы, мм с, к е К

контрольной опытной

Контроль 10 1,9500+0,0522 2,1200+0,0998 8,7

Митилан 10 2,1700+0,0955 3,1900+0,1386! 47,1

Неомитилан 10 2,1800+0,1052 2,2700+0,1309 4,12

1 Разница с контролем статистически значима.

мой дозе практически не влиял на выраженность ги-перергии замедленного типа у мышей, в то время как митилан достоверно увеличивал ее индекс на 47,1% (табл. 3). При конъюнктивальной пробе исследуемые биогликаны практически не оказывали никакого влияния на аллергическую реакцию немедленного типа.

Обсуждение полученных данных. Одним из проявлений иммуномодулирующей активности биологически активных веществ является их влияние на функции фагоцитирующих клеток и, в частности, на лизосомальную активность макрофагов [8]. Изучение иммуномодулирующих свойств неомитилана показало, что он индуцирует более высокую лизосомальную активность, чем другие полисахариды. Растительные биогликаны из Acanthopanax sessiliflorus и Angelica sinensis (Oliv.) Diels увеличивают активность лизосо-мальных ферментов не более чем на 230% [11, 14], в то время как неомитилан — на 304%. Эти полисахариды не являются гомогликанами и имеют в-гликозидную связь. В литературе имеются противоречивые данные относительно того, какие структурные компоненты (полисахарид или белок) ответственны за проявление активности. Так, японскими авторами при исследовании гликогенов (1,4; 1,6-а^-глюканов), выделенных различными способами из морского гребешка, сделано заключение о том, что тонкая структура углеводной составляющей имеет определяющее значение в стимуляции иммунной системы [13]. В противоположность этим данным показано, что наличие белковой компоненты в 1,4; 1,6-а^-глюканах, выделенных из морского моллюска Ruditapes philippinarum, усиливает их антиопухолевое и иммуномодулирующее действие [15]. В экспериментах по изучению влияния неомитилана и митилана, являющихся гликогеноподобными 1,4; 1,6-а^-глюканами, на лизосомальную активность перитонеальных макрофагов показано, что неомити-лан, содержащий не более 1,5% белка, проявляет более высокую активность по сравнению с митиланом, содержание белка в котором может колебаться от 3 до 8%. Однако способность неомитилана к генерации АФК перитонеальными мышиными макрофагами несколько ниже.

В последнее время большое внимание уделяется исследованию КВВ. На сегодняшний день становится

очевидным, что состав конденсата отражает биохимические и воспалительные процессы в дыхательной системе. Известно, что показателями воспалительных процессов в организме являются повышенные уровни пероксида водорода, монооксида углерода и усиление интенсивности свободнорадикальных реакций ПОЛ. Конечные продукты окисления приводят к образованию биологически активных альдегидов, в частности, МДА, которые участвуют в дальнейших процессах воспаления. Последний является прогностически значимой величиной при изучении ПОЛ [3]. Кроме того, проявления воспалительных процессов в организме связаны с уровнем метаболитов оксида азота. Оксид азота продуцируется при участии конституционной нитроксидсинтазы эндотелия сосудов, нейронов, эпителиальных клеток, а также индуцибельной нитроксидсинтазой [7]. Нами показано, что уровни метаболитов оксида азота и МДА в КВВ у курящих людей значительно понижались в зависимости от концентрации ингалируемого неомитилана. По данным литературы, полисахарид, выделенный из Tinospora cordifolia, также снижает уровень ПОЛ, повышенный под действием фотовозбуждения [10].

При оценке аллергизирующих свойств биоглика-нов показано, что неомитилан не обладает провоспа-лительным действием, так как не влияет на выраженность реакции гиперчувствительности замедленного типа и аллергическую реакцию немедленного типа у мышей, в то время как митилан, не оказывая никакого влияния на аллергическую реакцию немедленного типа, существенно увеличивает выраженность гипе-рергии замедленного типа.

Таким образом, неомитилан, обладая иммуномодулирующими и противовоспалительными свойствами, может служить основой для получения лекарственных препаратов, так как в отличие от митилана, благодаря низкому содержанию белковой составляющей, не вызывает аллергических реакций.

Работа выполнена по теме «Разработка способа включения биологически активных субстанций и биологически активных добавок к пище в молекулярно кап-сулированные формы, обеспечивающие повышение их биодоступности и биоэффективности» в рамках государственного контракта № 02.522.11.2013.

Литература

1. Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков. М.: Мир, 1983. 264 с.

2. Запорожец Т.С., Беседнова Н.Н., Молчанова В.И. и др. Сравнительная характеристика иммуномодулирующей активности биогликанов морского происхождения //Антибиотики и химиотерапия. 2001. Т. 46, № 7. С. 6—10.

3. Кокосов А.Н., Гольденберг Ю.М., Мищенко В.П. Перекис-ное окисление липидов и гемостаз на этапах формирования хронического бронхита и бронхиальной астмы //Пульмонология. 1995. № 1. С. 38—40.

4. Корякова А.Г., Кулакова Н.В., Кобелев С.С. и др. Биохимическая оценка эффективности липосомных форм феноте-рола //Хим. фарм. журн. 2000. № 6. С. 3—5.

5. Методические указания по оценке аллергизирующих свойств фармакологических веществ: руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Любимов Б.И., Коваленко Л.П., Федосеева В.Н. и др. М., 2000. С. 25—32.

6. Методические указания по изучению иммунотропной активности фармакологических веществ: руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Хаитов Р.М., Гущин И.С., Пинегин Б.В. и др. М., 2000. С. 257—263.

7. Смирнов А.С., Таганович А.Д. Определение уровня NO2-/ NO3- в концентрате выдыхаемого воздуха. Восстановление нитратов цинком // Биомед. химия. 2006. Т. 52, № 1. С. 101-107.

8. Фрейдлин И.С., Тотолян А.А. Клетки иммунной системы. СПб. : Наука, 2001. 390 с.

9. Фрешни Р. Культура животных клеток. Методы. М.: Мир, 1989. 320 с.

10. Desai V.R., Kamat J.P, Sainis K.B. An immunomodulator from Tinospora cordifolia with antioxidant activity in cell-free systems // Proc. Indian Acad. Sci. (Chem. Sci.). 2002. Vol. 114, No. 6. P. 713-719.

11. Jeong S.C., Jeong Y.T., Yang B.K. et.al. Chemical characteristics and immuno-stimulatingproperties of biopolymers extracted from Acanthopanax sessiliflorus // J. Biochem. Mol. Biol. 2006. Vol. 39. P. 84-90.

12. Molecular Probes protocol for the Vybrant Phagocytosis Assay Kit // Haugland R.P. Handbook of fluorescent probes and research products. 9h Edition, J. Gregory ed., Molecular Probes Inc., 2002.

13. Takaya Y., Uchisawa H., Ichinohe H. et. al. Antitumor glycogen from scallops and the interrelationship of structure and antitumor activity // J. Mar. Biotechnol. 1998. Vol. 6. P. 208-213.

14. Yang X., Zhao Y., Wang H. et al. Macrophage Activation by an Acidic Polysaccharide Isolated from Angelica Sinensis (Oliv.) Diels// J. Biochem. Mol. Biol. 2007. Vol. 40, No. 5. P. 636-643.

15. Zhang L., Liu W., Han B. et al. Isolation and characterization of antitumor polysaccharides from the marine mollusk Rudi-tapes philippinarum // Eur. Food Res. Technol. 2008. Vol. 227. P. 103-110.

Поступила в редакцию 08.04.2009.

NEOMYTHILANE AS NEW CRENOMYTILUS GRAYANUS MUSSEL-DERIVED IMMUNE-RESPONSE MODULATING AGENT I.V. Chikalovets1, V.I. Molchanova1, D.L. Aminin1,

O.V. Chernikov1, E.A. Pislyagin2, P.A. Lukianov1 1 Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS (159, 100-Anniversary Av. Vladivostok 690022 Russia), 2 Far Eastern National University (8, Sukhanov St. Vladivostok 690950 Russia) Summary — The authors present their study into immune-re-sponse modulating and anti-inflammatory activities of neo-mythilane that is a derivative from the mussels Crenomytilus gray-anus. Unlike the early mussel-derived polysaccharide mythilane, this product appears not to exhibit allergenic properties because it contains 1.5% of protein, at the most. The in vitro experiments show neomythilane potentiating the macrophage phagocytic activity by 25—30% and increasing activity of macrophage lysosomal enzymes more than two times, and inducing generation of active oxygen forms, as compared to mythilane. In this regard, both mythilane and neomythilane have no toxic properties in vivo, without exhibiting cytotoxic activity in vitro. As determined, neomythilane is capable of reducing lipid peroxidation and ni-troxide synthase activities. This allows to consider mythilane as a basis for producing medicines.

Key words: polysaccharides, invertebrates, immune-response modulating activities.

Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 32—35.