ПРИМЕНЕНИЕ VX 745 ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ АТРОФИИ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ ПРИ ИХ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ РАЗГРУЗКЕ
USE OF VX 745 TO PREVENT SKELETAL MUSCLE ATROPHY WITH FUNCTIONAL DISCHARGE

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к медицине (более точно - травматологии, космической медицине, а также к физиологии) и может найти применение при устранении негативного последствия гипокинезии или гравитационной разгрузки.
Уровень техники
Скелетная мышца обладает пластичностью и способна отвечать на состояние функциональной разгрузки (вызванные иммобилизацией, микрогравитацией, длительным постельным режимом, или повреждением нерва и др.) атрофией, снижением диаметра мышечных волокон, содержанием белка, снижением силы и увеличением утомляемости (Baldwin KM1, Haddad F.. Skeletal muscle plasticity: cellular and molecular responses to altered physical activity paradigms. Am J Phys Med Rehabil. 2002 Nov; 81(11 Suppl):S40-51; Fitts RH, Riley DR, Widrick JJ. Physiology of a microgravity environment invited review: microgravity and skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 2000 Aug; 89(2):823-39. Review;  Hoppeler H. Molecular basis of skeletal muscle plasticity--from gene to form and function. Rev Physiol Biochem Pharmacol. 2003; 146:159-216. Epub 2003 Jan 14. Review). Наиболее интенсивно используемая модель для исследования функциональной разгрузки мышц - вывешивание задних конечностей крыс.Ускоренное снижение мышечной массы (атрофия) связано с увеличением белковой деградации и/или снижением белкового синтеза (Glass DJ (2003) Signalling pathways that mediate skeletal muscle hypertrophy and atrophy. Nat Cell Biol 5:87-90.doi: 10.1038/ncb0203-87; Bodine SC, Baehr LM. Skeletal muscle atrophy and the E3 ubiquitin ligases MuRFl and MAFbx/atrogin-1. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2014 Sep 15; 307(6):E469-84. doi: 10.1152/ajpendo.00204.2014. Epub 2014 Aug 5. Review; Jackman RW, Kandarian SC. The molecular basis of skeletal muscle atrophy. Am J Physiol Cell Physiol. 2004 Oct; 287(4):C834-43. Review). Проведенные ранее исследования показали, что отдельные сигнальные пути и транскрипционные факторы вносят 20-25% вклад в регулирование процесса атрофии мышцы при ее разгрузке. Была определена часть недостающих звеньев, контролирующих этот процесс. Однако для разработки способа предотвращения развития атрофического процесса необходимо было выявить фундаментальные механизмы его инициирования. Именно ранние этапы развития атрофии изучены хуже всего. Известно, что активация МАР-киназного пути ведет к фосфорилированию цитоплазматических и/или ядерных белков и этот сигнальный путь участвует в регуляции мышечной массы. Однако механизм его работы до сих пор оставался непонятен.
В результате проведенных исследований было обнаружено, что ингибирование р38 MAPK с помощью специфического ингибитора VX 745 (нефламопимод, (5-(2,6-Dichlorophenyl)-2-(2,4-difluorophenylthio)-6H-pyrimido[l,6-b]pyridazin-6-one)) в течение трехсуточного вывешивания крыс Wistar ведет к предотвращению развития атрофии m.soleus, предотвращению увеличения экспрессии Е3-лигазы MuRF-1, уровня кальпаина-1 и снижает уровень убиквитированных белков. Таким образом, заявляемое изобретение основано на применении VX 745 для предотвращения атрофии скелетных мышц при их функциональной разгрузке.
Из уровня техники известно применение аналогов ингибитора р38 MAPK для лечения ревматоидного артрита, астмы и хронических легочных обструктивных заболеваний. 1. VX745 применялся в течение 3х недель в дозе 4,5 мг/кг дважды в день мышам. Получили повышение когнитивных возможностей. (John J. Alam, Selective Brain-Targeted Antagonism of p38 MAPKα Reduces Hippocampal IL-1β Levels and Improves Morris Water Maze Performance in Aged Rats, Journal of Alzheimer's Disease 48 (2015) 219-227, DOI 10.3233/JAD-150277); 2. Ингибиторы p38 MAPK используются для лечения ревматоидного артрита. Различные препараты приведены в обзоре (Genovese МС. Inhibition of р38: has the fat lady sung? Arthritis Rheum. 2009 Feb; 60(2):317-20. doi: 10.1002/art.24264). Один из препаратов pamapimod (RO4402257); 3. Препараты SB-203580 и VX-745 (ингибиторы p38 MAPK) использовались для лечения остеоартрита в модельном эксперименте на крысах. (Brown KK1, Heitmeyer SA, Hookfin ЕВ, Hsieh L, Buchalova M, Taiwo YO, Janusz MJ. P38 MAP kinase inhibitors as potential therapeutics for the treatment of joint degeneration and pain associated with osteoarthritis. J Inflamm (Lond). 2008 Dec 4; 5:22. doi: 10.1186/1476-9255-5-22).
Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ профилактики деструкции цитоскелетных белков скелетных мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной разгрузкой, путем введения фармакологического препарата, в качестве которого используют вводят L-аргинин. L-аргинин вводят в количестве, обеспечивающем снижение синтеза мРНК Е3 лигаз, участвующих в протеасомной деградации белка (патент на изобретение RU 2444354, 10.03.2012). Однако предотвращение атрофии скелетных мышц при функциональной разгрузке происходит через 2 недели после введения аминокислоты. L-аргинина.
Раскрытие изобретения
Технической проблемой, решаемой настоящим изобретением, является отсутствие эффективных средств профилактики атрофии, развивающейся при гипокинезии, иммобилизации конечности, космическом полете.
Техническим результатом заявленного изобретения является повышение эффективности предотвращения атрофии путем предотвращения увеличения уровня Е3-лигазы MuRF1, снижения убиквитинирования белков и уровня кальпаина-1 в результате того, что при гипокинезии блокируется фосфорилирование р38 MAPK. Преимуществом препарата VX 745 перед известными является то, что он предотвращает развитие атрофии за очень короткий срок воздействия (3 дня функциональной разгрузки мышц) при начале его введения сразу после начала воздействия (гипокинезии, иммобилизации конечности, космическом полете).
Технический результат достигается за счет предотвращения атрофии скелетных мышц при их функциональной разгрузке путем воздействия на организм фактора, снижающего фосфорилирование р38 MAPK (митоген активируемой протеин киназы) в мышцах, в качестве которого используется введение VX 745, который дополнительно снижает в мышцах содержание убиквитинированых белков, их протеолиз (из-за снижения уровня кальпаина-1), снижает уровень Е3-лигаз (MuRF1).
Из уровня техники не известно применение ингибитора р38 MAPK VX745 для профилактики атрофии скелетных мышц при их функциональной разгрузке. Известно использование VX745 (и его аналогов) для лечения артрита, при этом препарат с этой целью обычно применяется в дозах, в несколько раз превышающих использованную в эксперименте для профилактики атрофии скелетных мышц.
Известно, что активация МАР-киназного пути ведет к фосфорилированию цитоплазматических и/или ядерных белков и этот сигнальный путь участвует в регуляции различных процессов в клетке. р38 MAPK - (митоген активированная протеинкиназа) принадлежит к МАР-киназному пути. В клетке известны три основные МАР-киназы, которые активируются фосфорилированием: это р38 MAPK, ERK (extracellular signal-related kinase) и JNK (c-Jun NH2-terminal kinase). В целом известно, что р38 МАР-киназный сигнальный путь запускает процессы транскрипции и регулирует клеточную подвижность. Его поведение при функциональной разгрузке мышц не исследовано. Активацию р38 MAPK наряду с атрофией мышц при вывешивании крыс отмечали Hilder T.L., и др., 2005, Dupont Е. и др. 2010 (Hilder TL, Baer LA, Fuller PM, Fuller CA, Grindeland RE, Wade CE, Graves LM. Insulin-independent pathways mediating glucose uptake in hindlimb-suspended skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 2005 Dec; 99(6):2181-8. Epub 2005 Aug 11; Dupont E, Cieniewski-Bernard C, Bastide B, Stevens L. Electrostimulation during hindlimb unloading modulates PI3K-AKT downstream targets without preventing soleus atrophy and restores slow phenotype through ERK. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2011 Feb; 300(2):R408-17. doi: 10.1152/ajpregu.00793.2009). Последние отмечали, что увеличение активности  MAPK в клетке ведет к фосфорилированию цитоплазматических и/или ядерных белков, а МАР-киназный путь частично ответственен за регуляцию процессов пролиферации и дифференциации модулированием генной экспрессии. Эти авторы полагали, что увеличение фосфорилирования р38 MAPK после 14-дневного вывешивания крыс может быть связано с изменением миозинового фенотипа и регулированием экспрессии тяжелых цепей миозина. Li Y.P. и соавторы в 2005 обнаружили, что р38 активируется при разгрузке мышц и инициирует процесс деградации белка (Li YP, Chen Y, John J, Moylan J, Jin B, Mann DL, Reid MB. TNF-alpha acts via p38 MAPK to stimulate expression of the ubiquitin ligase atrogin1/MAFbx in skeletal muscle. FASEB J. 2005 Mar; 19(3):362-70). Наоборот, ингибирование работы p38 в культуре миотуб С2С12 с помощью SB203580 или куркумина вело к снижению убиквитин-конъюгатной активности. В то же время, само по себе убиквитирование некоторых белков не означает автоматически, что в мышце должна произойти атрофия. Убиквитинированию могут подвергаться и минорные белки, не являющиеся критичными для изменения мышечной массы. Таким образом, р38 MAPK способна регулировать активность убиквитин-протеасомного сигнального пути, однако эта ее функция при разгрузке мышц не изучалась. В проведенных ранее исследованиях было отмечено увеличение содержания р38 MAPK на более поздних этапах развития атрофии, которое не ассоциировалось с регуляцией работы убиквитин-протеасомной системы. Всего в мышце содержится более 650 Е3-убиквитин лигаз, но при разгрузке экспрессия в мышце существенно увеличивается только двух из них: MuRF1 и atrogen-1, которые наиболее активно запускают процесс деградации белков. В то же время, не любой распад некоторых белков должен обязательно сопровождаться выраженным атрофическим процессом.
По итогам проведения исследования нами обнаружено, что пик экспрессии Е3-лигаз наблюдается к 3-му дню вывешивания крыс, а также ингибирование р38 MAPK препаратом VX745 на раннем сроке функциональной разгрузки мышц ведет к предотвращению их атрофии и одновременному снижению экспрессии важных компонентов сигнальных путей, регулирующих атрофические процессы: убиквитина, MuRF-1, кальпаина-1.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется графиками.
На фиг. 1 представлен уровень фосорилирования pP38MAPK в m.soleus у вывешенных (В) и вывешенных с введением VX 745 крыс, который оценивали относительно его уровня в контрольной группе (К). Результаты представлены в виде средней и стандартной ошибки; * - достоверные отличия от контроля, Р≤0.05; # - достоверные отличия от контроля, Р≤0.05.
На фиг. 2 представлено содержание мРНК Е3-убиквитинлигазы MuRF-1 в m.soleus у вывешенных (В) и вывешенных с введением VX 745 оценивали относительно контрольного (К) уровня. Результаты представлены в виде медианы и интерквартильной широты (0,25-0,75). * - достоверные отличия от контроля, Р≤0.05; # - достоверные отличия от вывешивания, Р≤0.05.
На фиг. 3 представлено содержание мРНК кальпаина-1 в m.soleus у вывешенных (В) и вывешенных с введением VX 745 оценивали относительно контрольного (К) уровня. Результаты представлены в виде медианы и интерквартильной широты (0,25-0,75). * - достоверные отличия от контроля, Р≤0.05; # - достоверные отличия от вывешивания, Р≤0.05.
На фиг. 4 представлено содержание мРНК убиквитина в m.soleus у вывешенных (В) и вывешенных с введением VX 745 оценивали относительно контрольного (К) уровня. Результаты представлены в виде медианы и интерквартильной широты (0,25-0,75). * - достоверные отличия от контроля, Р≤0.05; # - достоверные отличия от вывешивания, Р≤0.05.
Осуществление изобретения
Ниже представлено детальное описание возможности осуществления изобретение с достижением заявляемого технического результата.
Материалы, подтверждающие воспроизводимость способа.
21 самец крыс Wistar были разделены на 3 группы по 7 животных в каждой. Одна группа служила интактным контролем (группа К, вес крыс 192±8 г., вес m.soleus 83±4 мг), вторую группу подвергали вывешиванию под углом 45° в течение 3-х дней таким образом, чтобы передние лапы опирались на землю, а задние ее не касались (группа В, вес крыс 187±10 г, вес m.soleus 72±2 мг), третьей группе вывешенных по такой же методике крыс вводили перорально препарат VX 745 (10 мг/кг/день) (группа VX 745, вес крыс 196±5, вес m.soleus 84±2 мг). Дозы введения препарата и его содержание в различных тканях у крыс были исследованы ранее. VX 745 - сильно действующий и селективный ингибитор р38-МАР-киназы (IC50: 10 nM); который в 1000 раз превосходит по силе связывания с АТФ-связывающим сайтом этой киназы, чем с какими-либо другими сайтами. Это современный ингибитор, который не обладает побочными эффектами и цитотоксичностью. Новизна работы заключается в том, что до сих пор не был использован подход ингибирования фосфорилирования р38 MAPK для предотвращения атрофии скелетных мышц при их функциональной разгрузке. После окончания эксперимента животных забивали сверхдозой нембутала, m.soleus замораживали в жидком азоте, а затем использовали для выявления отдельных белков методом вестерн-блота и выявления мРНК методом ПЦР в реальном времени.
Функциональная разгрузка была смоделирована на крысах с помощью вывешивания по методике Ильина Новикова в модификации Морей-Холтон. Вывешивание является наиболее распространенной моделью для изучения эффектов функциональной разгрузки мышцы. Согласно методике вывешивания Ильина-Новикова (Novikov VE, Ilyin ЕА. Age-related reactions of rat bones to their unloading. Aviat Space Environ Med. 1981 Sep; 52(9):551-3) животное в специальных мягких шинках подвешивается таким образом, чтобы передние конечности опирались на пол, а задние его не касались. При этом животные сохраняют возможность перемещаться по клетке в любом направлении, получают воду и корм без ограничений. Данная модель также широко используется для моделирования космического полета и микрогравитации, т.к. она отражает некоторые аспекты этого воздействия и вызывает схожие признаки мышечной атрофии, которые наблюдаются, как у животных, так и у человека при космическом полете (Morey-Holton Е.R., Globus R.К. (2002). Hindlimb unloading rodent model: technical aspects. J. Appl. Physiol. (1985) 92, 1367-1377. 10.1152/japplphysiol.00969.2001).
Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ).
Выявление белков проведено с использованием современной системы электрофореза фирмы Bio-Rad и блотинга Trans-Blot Turbo Transfer System с использованием системы детекции и анализа изображения. С каждой пробы m.soleus сделаны срезы толщиной 20 мкм (10-15 мг) на микротоме-криостате фирмы Leica Microsystems (Германия) и немедленно прогомогенизированы в течение 25 минут в 100 мкл лизирующего буфера RIPA (Santa-Cruz, USA), содержащего 50 mM Tris (рН 7.4), 150 mM NaCl, 0.1% Triton Х-100, 0.1% SDS, 5 mM EDTA (рН 8.0) 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1 мМ Na3VO4, 1 mM PMSF, апротинин (10 μg/ml), леупептин (10 μg/ml), пепстатин А (10 μg/ml), протеазный ингибиторный коктейль (Santa-Cruz, USA) и фосфотазный ингибиторный коктейль (Santa-Cruz, USA), либо 50 мМ NaF и 50 мМ бета-глицерофосфат. Затем образцы центрифугированы при 20000xg в течение 15 минут. Часть супернатанта отобрана для определения концентрации общего белка с помощью реактива Бредфорда (Bio-Rad Laboratories, США). Пробы для нанесения разведены в 2х-кратном Laemly буфере для образцов (5,4 мМ Tris-HCl (рН 6,8), 4%-ный Ds-Na, 20%-ный глицерин, 10%-ный β-меркаптоэтанол, 0,02%-ный бромфеноловый синий).
Электрофорез проводился в 10%-ном разделяющем ПААГ (0,2%-ный метилбисакриламид, 0,1%-ный Ds-Na, 375 мМ Tris-HCl (рН 8,8), 0,05%-ный персульфат аммония, 0,1%-ный ТЕМЕД) и в 5%-ном концентрирующем ПААГ (0,2%-ный метилбисакриламид, 0,1%-ный Ds-Na, 125 мМ Tris-HCl (рН 6,8), 0,05%-ный аммоний персульфат, 0,1%-ный ТЕМЕД). Для проведения электрофореза использован трис-глициновый буфер (192 мМ Tris-глицин (рН 8,6), 0,1%-ный Ds-Na). Образцы загружались из расчета 20 мкг общего белка в каждой пробе на дорожку и нормировались относительно уровня GAPDH, содержащегося в той же пробе. Электрофорез проводился при 15 мА на гель в мини-системе («Bio-Rad Laboratories») при комнатной температуре.
Вестернблоттинг
Электроперенос белков проводился в буфере (25 мМ Tris (рН 8,3), 192 мМ глицин, 20%-ный метанол, 0,04%-ный Ds-Na) на нитроцеллюлозную мембрану при 100 V при температуре 4°С в системе mini Trans-Blot («Bio-Rad Laboratories») в течение 2 часов. После электропереноса мембраны инкубируются в течение 5 мин в 0,3%-ом растворе Ponceau Red в 5%-ой уксусной кислоте, затем отмываются в PST (Биолот) с 0,1%-ный Tween20 (PBST) до появления четких белковых полос на блоте. Этот этап проводился для контроля эффективности переноса; а также для того, чтобы убедиться, что количества общего белка, внесенного в каждую дорожку, было одинаковым. Мембраны блокируются в растворе 5%-ого сухого молока («Bio-Rad Laboratories») в PBST 1 час при комнатной температуре, затем помещаются в раствор первичных антител на ночь на +4°С.
Для выявления белковых полос используются первичные антитела к соответствующим белкам. Затем мембрана отмывается от первичных антител в PBST 3 раза по 5 минут на шейкере и инкубируется 1 час с вторичными антителами. Потом мембрана отмывается от вторичных антител в PBST 3 раза по 5 минут на шейкере. Выявление проводится с помощью Immun-Star HRP substrate (Bio-Rad Laboratories, США), хемилюминисцентный сигнал будет детектироваться с помощью сканера C-DiGit Blot Scanner (LI-COR, США). Белковые полосы проанализированы с использованием Image Studio Software (LI-COR).
Анализ экспрессии генов.
Для определения уровня экспрессии мРНК MuRF1 и atrogen-1 РНК была экстрагирована при помощи RNeasy Micro Kit (QIAGEN, Germany) методом. Проведена обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция в реальном времени с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green I. Измерения проведены с помощью детектирующего амплификатора iQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, США) для выявления изменений в экспрессии мРНК компонентов систем протеолиза. ДНК-электрофорез в агарозном геле с последующим секвенированием выполнены для контроля специфичности сконструированных праймеров и продуктов ПЦР.
Статистическая обработка данных производилась с помощью программы REST 2009 v.2.0.12, находящейся в свободном доступе, и Microsoft Office Excel. Достоверность отличий между группами определялась с помощью U-критерия Манна-Уитни. U-критерий был выбран в связи с тем, что количество повторов в выборках не превышало 10.
Статистическая обработка данных.
Все данные приводились как М±m, где М - среднее арифметическое значение; m - стандартная ошибка среднего значения. Статистическая обработка данных производилась с помощью программы Origin Pro v.8.0 SR5. Все выборки были проверены на принадлежность к нормально распределенной совокупности. Достоверность отличий между группами определялась с помощью двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим вычислением значения критерия Ньюмена-Кейлса для множественных сравнений.
Результаты.
В группе с введением препарата (VX 745) атрофии m.soleus не обнаружено (вес мышцы был 84±2 мг), в то время как в группе без введения препарата (В) вес m.soleus крысы был снижен относительно группы контроля на 13,5% (72±2 против 83±4 мг, р<0,05).
Уровень фософрилирования р38 MAPK в группе VX 745 не отличался от контрольного значения, тогда как в группе В он был существенно снижен (р<0,05), фиг. 1.
Величины экспрессии мРНК Е3-лигазы MuRF-1 и кальпаина-1 были существенно повышены в группе без введения препарата (р<0,05), в то время, как в группе с вывешиванием крыс и введением ингибитора VX 745 они не отличалась от контроля, и были существенно ниже, чем в группе В (р<0,05), фиг. 2, 3.
Уровень экспрессии убиквитина в группе вывешенных животных (В) существенно превышал таковой как группы контроля, так и группы с ингибированием VX 745 (р<0,05)., фиг. 4.
Таким образом было показано, что ингибитор VX 745 предотвращает увеличение уровня фосфорилирования р38 MAPK (фиг. 1) в группе вывешенных животных с введением препарата. Это свидетельствует о том, что используемый препарат работает специфично. Впервые была показана возможность регулирования р38 MAPK атрофических процессов в мышце путем снижения экспрессии в ней Е3-лигазы MuRF-1, кальпаина-1 и убиквитина.
Преимуществом препарата VX 745 перед известными является то, что он предотвращает развитие атрофии за очень короткий срок воздействия (3 дня функциональной разгрузки мышц).