Показатели неспецифического иммунитета при воздействии фемтосекундного лазерного излучения на начальной стадии рака шейки матки

УДК 612

ПОКАЗАТЕЛИ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО ИММУНИТЕТА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ФЕМТОСЕКУНДНОГО ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА НАЧАЛЬНОЙ СТАДИИ РАКА ШЕЙКИ МАТКИ

© 2012 Т.В. Абакумова, И.И. Антонеева, С.О. Генинг

Ульяновский государственный университет

Поступила в редакцию 20.11.2012

Для оценки морфофункционального состояния нейтрофильных лейкоцитов использовали периферическую кровь 35 женщин с первичным раком шейки матки Ia стадии. Исследована фагоцитарная активность, уровень миелопероксидазы и катионных белков, жесткость мембраны нейтрофилов периферической крови больных до и после воздействия фемтосекундного лазерного излучения in vitro. Выявлено волнообразное и дозозависимое изменение исследуемых показателей после воздействия плотностью потока энергии - 0,27 Дж/см2 и 0,96 Дж/см2.

Ключевые слова: рак шейки матки, нейтрофильные лейкоциты, фемтосекундное лазерное излучение.

На сегодня показана возможность модуляции иммунных реакций, в частности, функционального состояния нейтрофилов периферической крови (Нф), под влияние лазерного излучения [2]. В литературе представлены результаты изучения влияния на Нф низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) [4, 8]. При этом обнаружены разнонаправленные эффекты. Лазеры с высокоинтенсивным излучением (ВИЛИ), в основном, используют в хирургии. Однако, на сегодня отсутствует адекватное экспериментальное обоснование применяемых доз воздействия ВИЛИ. Особый интерес представляют высокоинтенсивные фемтосекундные лазеры, преимуществами которых являются малая длительность импульса, высокая пиковая и малая средняя мощности.

Рак шейки матки (РШМ) занимает в мире первое место среди всех злокачественных новообразований женских половых органов [1]. Изучение возможностей модуляции иммунных реакций организма на различных клинических стадиях заболевания позволит разработать эффективные схемы иммунотерапии.

В соответствии с вышеизложенным, целью исследования было изучение морфофункцио-нального состояния Нф больных на начальной стадии РШМ после фемтосекундного лазерного излучения (ФСЛИ).

Материалы и методы исследования. Объектом исследования явились Нф периферической

Абакумова Татьяна Владимировна, кандидат биологических наук, доцент кафедры физиологии и патофизиологии. E-mail: taty-abakumova@yandex.ru.

Антонеева Инна Ивановна, доктор медицинских наук, профессор кафедры онкологии и лучевой диагностики. E-mail: Naum-53@yandex.ru. Генинг Снежанна Олеговна, студентка.

крови 35 первичных больных (28—45 лет) на начальной стадии РШМ (1а стадии заболевания по FIGO). Контрольную группу составили практически здоровые женщины (n=35) в возрасте 1845 лет.

Нф, выделенные из венозной крови на двойном слое фиколла/урографина (1,117 и 1,077 г/ см3), облучали в пластиковых кюветах высотой 1 см интенсивностью - 4,5 мВт/см2 и 1,6 мВт/см2 фемтосекундным лазером, который является совместной уникальной разработкой НЦВО РАН и Ульяновского государственного университета, с характеристиками: длительность импульса — 100-10-15; средняя мощность — 1,26 ± 2%мВт; пиковая мощность — 6кВт; длина волны — 1,55 мкм.

Для определения фагоцитарной активности вычисляли следующие показатели фагоцитоза: фагоцитарное число (ФЧ) по Райту, и фагоцитарный индекс (ФИ) по Гамбургеру, интегральный фагоцитарный индекс (ИФИ), опсоничес-кий индекс поглощения (ОИП) [7]. Кроме того, в Нф цитохимически определяли активность мие-лопероксидазы (МПО), уровень катионных белков (КБ), долю активных нейтрофилов в спонтанном варианте НСТ-теста [3]. Результаты выражали в виде среднего цитохимического коэффициента (СЦК).

Для оценки жесткости мембраны Нф использован метод сканирующей зондовой микроскопии (SolverPro NT-MDT, г.Зеленоград, Россия). Использовались фирменные кремниевые зонды с жесткостью 0,2 N/m, радиус закругления кончика зонда составлял примерно 50 nm. Нф, фиксированные глутаровым альдегидом, сканировались в полуконтактном режиме. Ригидность мембран оценивалась по модулю Юнга, который рассчитывали согласно теории Герца [6].

Известия Самарского научного центра Российской академии наук, т. 14, №4(4), 2012

Для выявления различий между данными, полученными в эксперименте и контрольной группе, применялся непараметрический и-кри-терий Манна-Уитни (81а1а 6.0). Статистически достоверными считались данные при рJ0,05.

Результаты. В результате проведенных нами исследований установлено, что относительное количество Нф при РШМ 1а статистически значимо увеличивается относительно контроля (61,7±2,91 % против 55,9±4,40 %). При этом абсолютное количество Нф крови женщин при РШМ на 1а стадии снижается в 2 раза по сравнению с таковым у практически здоровых женщин (3,5±0,52 х109/л против 6,4±0,68 х109/л). В Нф крови женщин при РШМ ИФИ составляет 0,62 ед., что заметно ниже по сравнению с таковым у практически здоровых женщин (0,81 ед.) (табл.1).

Результаты изучения ферментов кислородза-висимой и анаэробной активности Нф представлены в табл.1. Установлено, что в Нф больных РШМ увеличивается количество активированных Нф в спонтанном НСТ-тесте и активность МПО по сравнению с Нф доноров.

Результаты оценки влияния ФСЛИ на фагоцитарную активность Нф доноров представлены на рис. 1.

ФЧ Нф периферической крови практически

здоровых женщин снижается при влиянии ФСЛИ средней интенсивности в 0,27 Дж/см2 (1,41±0,083 против 1,97±0,174 ус.ед. в контроле), 2,70 Дж/см2 (1,46±0,028 против 1,97±0,174 ус.ед. в контроле) и 0,96 Дж/см2 (1,33±0,071 против 1,97±0,174 ус.ед. в контроле). При этом ИФИ в Нф крови здоровых женщин при облучении средней интенсивности 0,27 и 0,96 Дж/см2 составляет 0,52, а при 2,7 мДж/см2 - 0,68 (рис. 1).

Таким образом, ФСЛИ дозозависимо снижает ФЧ Нф доноров и волнообразно дозозависи-мо изменяет ФИ и ИФИ этих Нф, сохраняя их в пределах коридора нормы. Результаты изучения показателей фагоцитоза у Нф больных РШМ после ФСЛИ представлены на рис. 2.

Как следует из приведенных данных, наиболее значимые колебания показателей фагоцитоза имели место при дозах ФСЛИ 0,27 Дж/см2, при которых ФИ, ФЧ и ИФИ в Нф снижаются по сравнению с необлученными клетками больных РШМ, и доза 0,10 Дж/см2, при которой ФИ, ФЧ и ИФИ возрастают. ОИП возрастает при всех использованных дозах ФСЛИ. При анализе влияния ФСЛИ на активность ферментов аэробной и кислороднезависимой бактерицидности Нф установлено, что активность МПО Нф здоровых женщин статистически значимо возрастает при

Таблица 1. Функциональное состояние Нф здоровых женщин и при РШМ 1а стадии

Исследуемая ФИ, % ФЧ, ус.ед. МПО, СЦК НСТ-тест КБ,

группа СЦК

Здоровые 41,20 1,97 1,56 1,06 1,79

женщины ±6,437 ±0,174 ±0,169 ±0,177 ±0,124

РШМ 40,38 1,54 2,05 1,40 1,80

1а стадия ±5,375 ±0,079 ±0,139* ±0,175* ±0,063

Примечание: * - данные статистически значимо отличаются от аналогичных в группе контроля

Рис. 1. Изменение фагоцитарной активности нейтрофилов в крови здоровых женщин после воздействия фемтосекундного лазерного излучения различной интенсивности

Рис. 2. Изменение фагоцитарной активности нейтрофилов в крови больных раком шейки матки на 1а стадии после воздействия фемтосекундного лазерного излучения различной интенсивности (ИФИ - интегральный фагоцитарный индекс, ФИ - фагоцитарный индекс, ФЧ - фагоцитарное число,

ОИП - опсонический индекс поглощения)

облучении дозой 0,29 Дж/см2, 0,81 Дж/см2 и 1,35 Дж/см2. При этом увеличивается количество НСТ-положительных Нф при облучении 0,10 Дж/см2 и 2,70 Дж/см2. Уровень КБ в Нф, облученные дозой 0,10 Дж/см2, 0,27 Дж/см2, 0,29 Дж/ см2 и 2,7 Дж/см2 (рис. 3).

У больных РШМ 1а стадии снижается количество НСТ-положительных Нф при облучении 0,96 Дж/см2 (1,08±0,153 СЦК против 1,40±0,175 СЦК в необлученных Нф). Уровень КБ и активность МПО изменяется волнообразно в преде-

лах коридора нормы. При оценке влияния ФСЛИ на Нф больных РШМ было установлено изменение ригидности в зависимости от интенсивности излучения (табл. 2).

Данные, представленные в табл.2, позволяют предполагать значимое увеличение ригидности Нф доноров при всех использованных дозах ФСЛИ. При ФСЛИ Нф пациенток с РШМ 1а ригидность клеток значимо снижалась при низких (0,10-0,27 Дж/см2) и высоких (1,35-2,70 Дж/ см2) дозах облучения.

Рис. 3. Изменение бактерицидной активности нейтрофилов здоровых женщин после воздействия фемтосекундного лазерного излучения различной интенсивности

Известия Самарского научного центра Российской академии наук, т. 14, №°4(4), 2012

Таблица 2. Показатели ригидности мембраны Нф крови после ФСЛИ различной интенсивности in vitro

Ригидность, Па Контроль Средняя доза облучения

0,10 0,27 0,29 0,48 0,81 0,96 1,35 2,70

Здоровые женщины 360,8 ±14,1 515,9±14 ,96* 561,7±2 2,88* 481,6±1 9,32* 382,0±1 7,72 569,6±2 2,62* 937,4±3 3,09* 550,1±2 9,95* 496,3±2 6,43*

РШМ Ia 314,8 ±23,00 216,7±18 ,11* 197,9±1 0,34* 274,8±2 3,60 295,7±2 3,32 340,8±3 4,25 296,9±1 7,05 200,8±9 ,34* 192,8±1 0,6*

Примечание: * - данные статистически значимо отличаются от аналогичных в контроле

ВЫВОДЫ

1. При РШМ на начальной стадии снижается абсолютное количество Нф и их фагоцитарная активность неизменной бактерицидной активности.

2. ФСЛИ волнообразно и дозозависимо изменяет фагоцитарную активность и бактерицид-ность Нф доноров при значимом их снижении после воздействия доз 0,27 Дж/см2 и 0,96 Дж/см2.

3. Доза ФСЛИ 0,10 Дж/см2 праймирует Нф на начальной стадии РШМ; повышение дозы до

0.27 Дж/см2 снижает в этих Нф фагоцитарную активность.

4. При облучении Нф больных РШМ ФСЛИ in vitro жесткость мембраны снижается, а у Нф крови здоровых женщин повышается.

Работа поддержана гос. заданием Минобрна-уки РФ и грантом Президента РФ.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Вирусно-бактериальная природа дисплазии и рака

шейки матки / М.С. Афанасьев, В.А. Алешкин, С.С.

Афанасьев // Вестник РАМН. 2004. №6. С.35-40.

2. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на иммунологическую реактивность организма / И.И. Долгушин, О.А. Гизингер, К.Г. Ишпахтин // ВНМТ. 2008. Т. XV. № 2. С. 95-97.

3. Карпищенко А.И. Медицинские лабораторные технологии (справочник). С-Пб.: Интермедика, 1999. 656 с.

4. Использование метода сканирующей зондовой микроскопии для исследования морфологических параметров нейтрофильных гранулоцитов / С.Н. Плес-кова, М.Б. Звонкова, Ю.Ю. Гущина // Морфология. 2005. Т.127, №1. С.60-62.

5. Рудик Д.В., Тихомирова Е.И. Методы изучения процесса фагоцитоза и функционально-метаболического состояния фагоцитирующих клеток. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2006. 112 с.

6. Monitoring of the effect of low-intensity laser radiation with constant pulse generation on neutrophil granulocytes in vitro / I.I. Dolgushin, V.A. Markova, O.A. Gizinger // Bull Exp Biol Med. 2010. Vol.150. №2. Р.222-224.

7. Siposan D.G., Lukacs A. Relative variation to received dose of some erythrocytic and leukocytic indices of human blood as a result of low-level laser radiation : an in vitro study // J.Clin.Laser Med.Surg. 2001. Vol. 19. № 2. P. 89-103.

8. Weiderpass E. Hormonal risk factors of cancer in human point of cancer epidemiologist // Proc. of International ^^ere^e «Hormonal cancerogenesis». SPb, 2000. P.22-23.

INDEXES OF NONSPECIFIC IMMUNITY IN CASE OF INFLUENCE OF A FEMTOSEKOND LASER RADIATION ON INITIAL STAGE OF CERVICAL CANCER

© 2012 T.V. Abakumova, I.I. Antoneeva, S.O. Geninmk

Ulyanovsk State University

For an assessment of a morphofunctional condition of neutrophil leukocytes used peripheral blood of 35 women with primary cancer of a neck of a uterus of Ia of a stage. Phagocytic activity, level myeloperoxidase and cationic protein, rigidity of a membrane of neutrophils of peripheral blood of patients before impact of femtosecond laser radiation of in vitro is investigated. Wavy and dose-dependently change of studied indicators after influence in density of a stream of energy - 0,27 J/cm2 and 0,96 J/cm2 is revealed. Key words: cervical cancer, neutrophil leukocytes, femtosecond laser radiation.

Tatyana Abakumova, Candidate of Biology, Associate Professor at the physiology and pathophysiology Department. E-mail: taty-abakumova@yandex.ru

Inna Antoneeva, Doctor of Medicine, Professor at the Oncology and Ray Diagnostics Department. E-mail: Naum-53@yandex.ru Snezhanna Gening, Student.