СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕСПЕРИДИНА МЕТОДОМ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ
METHOD FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF HESPEREDIN USING DIFFERENTIAL VOLTAMMETRY METHOD

28
34
15
Изобретение относится к области аналитической химии, в частности к инверсионному вольтамперометрическому способу определения флавоноида гесперидина, который представляет собой 3',5,7 - Trihydroxy - 4' -methoxyflavanone - 7 - rhamnoglucoside (CHO):
Гесперидин относится к флавоноидам и обладает антигистаминным, противовоспалительным и противоотечным действием, стабилизирует клеточные мембраны, снижает проницаемость капилляров, обладает антиоксидантным действием, тормозит процесс старения кожи, клеток. Определение макроколичеств важно для оценки его содержания в продуктах растительного происхождения и биологически активных добавках. Это, в свою очередь, предъявляет повышенные требования к контролю за качеством лекарственных средств и совершенствованию методов количественного определения флавоноидов. Важной проблемой остается разработка новых, более чувствительных и селективных методов их анализа.
-5
В прототипе описан способ определения гесперидина методом проточно-инжекционной адсорбционной инверсионной вольтамперометрии [G.J.Volikakis, C.E. Efstathiou. Determination of rutin and other flavonoids by flow-injection/adsorptive stripping voltammetry using nujol-graphite and diphenylether-graphite paste electrodes//Talanta - 2000. - V.51. - №4. - p.775-785]. В качестве рабочих электродов были использованы два типа пастовых электродов: дифенилэфирграфитовый и нуйолграфитовый. В качестве фона применяли раствор Бриттона - Робинсона (рН 5,0). Потенциал электролиза проводили при потенциале +0,2 В, время накопления 60-120 с. Для увеличения чувствительности применяли метод смены среды. Мешает определению мочевая кислота, которая способна накапливаться на применяемых видах электродов. Мешающее влияние аскорбиновой кислоты, присутствующей в биологических образцах, особо сильно проявляется на дифенилэфирграфитовом электроде. В предлагаемом способе определения гесперидина недопустимо применение концентраций больше 10 моль/л, а также электроды требуют дополнительной химической и механической предобработки перед каждым определением, вследствие чего увеличивается суммарное время анализа.
Задачей заявленного изобретения является расширение диапазона определяемых концентраций и экспрессности определения гесперидина методом дифференциальной вольтамперометрии.
Поставленная задача достигается тем, что способ количественного определения гесперидина включает перевод гесперидина из пробы в раствор и вольтамперометрическое определение с использованием индикаторного стеклоуглеродного электрода. При этом накопление гесперидина в перемешиваемом растворе проводят в течение 60-120 с при потенциале электролиза (-0,6÷-0,8) В относительного насыщенного хлоридсеребряного электрода на фоне 0,1 н. раствора двузамещенного гидрофосфата натрия с последующей регистрацией анодных пиков в дифференциальном режиме съемки вольтамперограмм при скорости развертки потенциала 20÷30 мВ/с и концентрацию гесперидина определяют по высоте пика в диапазоне потенциалов от 0,35 до 0,45 В методом добавок аттестованных смесей.
В предлагаемом способе установлена способность гесперидина окисляться на различных типах графитовых электродов. В качестве индикаторных электродов применяли СУ и графитовый (Г) электрод, пропитанный полиэтиленом в вакууме (в прототипе применяли пастовые угольные электроды: дифенилэфирграфито-пастовый, нуйолграфито-пастовый). Использование в прототипе пастового электрода требует постоянного обновления его поверхности перед каждым анализом, что неудобно при проведении серийных анализов.
Применение графитовых электродов обусловлено высокой химической и электрохимической устойчивостью графита, широкой областью рабочих потенциалов, как в водных, так и в неводных средах, а также простотой механического обновления поверхности и требованиями техники безопасности. Способность к окислению гесперидина зависит от материала электрода и состояния его поверхности. Максимальное значение регистрируемого тока с использованием Г электрода ниже (примерно на 20-30%). Для определения гесперидина использовали «игольчатые» по форме индикаторные электроды, после предварительного электрохимического модифицирования их поверхности. Это приводит к снижению нижней границы определяемых содержаний, улучшению воспроизводимости вольтамперометрических измерений и экспрессности анализа.
Предварительные исследования показали, что электроокисление гесперидина осложнено как адсорбцией, так, возможно, и дополнительными химическими стадиями и представляет сложный диффузионно-контролируемый процесс с участием более одного электрона.
В прототипе описано использование в качестве фона раствор Бриттона-Робинсона (рН 5).
-5
5
-5
-4
r
Предлагаемый в заявленном изобретении фон 0,1 н. раствора двузамещенного гидрофосфата натрия позволяет определить гесперидин на уровне 10÷10 M с хорошей воспроизводимостью. Относительное стандартное отклонение (S) равно 0,15 при регистрации анодных пиков для диапазонов концентраций 1·10÷1·10 моль/л.
н
-5
-5
-6
-5
5
3
5
Фон 0,1 н. раствора двузамещенного гидрофосфата натрия подобран экспериментально. Абсолютной новизной является экспериментально установленный диапазон рН от 8,0 до 9,0. Минимально определяемая концентрация гесперидина (С) 10 моль/л. Минимально определяемая концентрация гесперидина на указанных фонах в прототипе 10÷10 моль/л. Авторами статьи (прототип) отмечена невозможность использования предлагаемых пастовых электродов при высоких концентрациях гесперидина (больше 10), в то время как применение стеклоуглеродного электрода в подобранных экспериментально условиях позволяет определять более высокие концентрации (10 моль/л), что делает возможным применение разработанного способа для определения гесперидина в биологически активных добавках, где его содержание достаточно велико (10÷10 М).
э
э
-5
Другим отличительным признаком являются установленные условия электрохимического накопления: потенциал электролиза Е=(-0,6÷-0,8) В. Опытные данные показали зависимость тока окисления гесперидина от Е. Использование предварительного электролиза при подобранных значениях потенциала позволяет регистрировать вольтамперограммы с четко выраженным максимумом. Это дает возможность повысить точность и селективность способа и экспрессно определять концентрации гесперидина до 10 моль/л.
э
э
э
Оптимальное время предварительного электролиза (τ) составляет 60÷120 с. При τ меньше 60 с снижается чувствительность определения и увеличивается ошибка определения; величина тока достигала максимального значения при τ равном 60÷120 с.
Важным для определения гесперидина методом дифференциальной ВА является выбор скорости развертки потенциала. Оптимальной является скорость 20÷30 мВ/с. Увеличение скорости развертки потенциала более 30 мВ/с увеличивает чувствительность, но при этом растет остаточный ток и уменьшается разрешающая способность метода. Использование скорости менее 30 мВ/с снижает величину анодного тока и понижает чувствительность определения. В прототипе скорость развертки равна 20÷40 мВ/с.
-9
-10
-8
-10
-7
Нижняя граница определяемых содержаний гесперидина зависит от режима съемки вольтамперных кривых. Использование режима дифференцирования позволяет фиксировать четкие пики даже при очень низких концентрациях (10÷10) моль/л, что повышает чувствительность определения. При линейном наложении потенциала в интегральном режиме определение концентраций гесперидина на уровне (10÷10) моль/л практически невозможно из-за большого значения остаточного тока, что приводит к нечеткой волне окисления, а минимально определяемая концентрация составляет 10 моль/л. Поэтому для количественного химического анализа рекомендован дифференциальный режим съемки вольтамперограмм. В прототипе использован вариант дифференциальной вольтамперометрии.
min,p
-5
-5
5
Установленные условия проведения электродного процесса позволили количественно определять гесперидин на основе реакции электроокисления. Для повышения чувствительности определения использовали предварительное концентрирование флавоноида на поверхности СУ электрода. Предлагаемый вольтамперометрический способ позволил существенно улучшить метрологические характеристики анализа гесперидина; чувствительность определения (C=0,8·10 моль/л). Диапазон определяемых концентраций 1,2·10÷2,0·10 моль/л.
Измерения проводили на компьютеризованных вольтамперометрических анализаторах СТА (ООО «ИТМ», г.Томск).
1
2
6
Определению не мешают вещества, присутствие которых возможно в биологических объектах: водорастворимые витамины групп В (B, B, В), аскорбиновая, мочевая кислоты в соизмеримых количествах. Состав матрицы лекарственного препарата «Кордис» практически не оказывает влияния на ток окисления гесперидина, поэтому предварительное выделение флавоноида из матрицы проводили в «мягких» условиях: без нагревания и применения кислот.
-5
-4
Пример 1. Определение содержания гесперидина на уровне (10÷10) моль/л.
э
э
нач
э
э
э
э
-5
-9
-5
В кварцевый стаканчик емкостью 20 мл наливают 20 мл 0,1 н. раствора двузамещенного фосфорнокислого натрия. Удаляют из раствора кислород струей очищенного азота с содержанием кислорода менее 0,001% в течение трех минут. Не прекращая перемешивания, проводят электролиз раствора при условии: Е=-0,7 В, τ=120 с. Отключают газ и фиксируют анодную дифференциальную вольтамперограмму при скорости развертки потенциала 30 мВ/с, начиная с потенциала Е=0,0 В. Отсутствие пиков свидетельствует о чистоте фона. Затем добавляют несколько капель объемом 0,01 мл аттестованной смеси гесперидина 10 моль/л, перемешивают раствор 10 с и проводят электрохимическое концентрирование осадка при Е=-0,7 В, τ=120 с. Съемку вольтамперограммы начинают с потенциала 0,0В. Пик для указанной концентрации вещества регистрируют в диапазоне потенциалов от 0,35 до 0,45 В (нас.х.э) при чувствительности прибора (0,5÷1)·10 А/мм. Проводят разметку вольтамперограмм, средняя высота анодного пика составляет 0,34 мкА. В стаканчик с анализируемым раствором с помощью пипетки или дозатора вносят добавку аттестованной смеси гесперидина в объеме 0,01 мл концентрацией 10 моль/л. Проводят электрохимическое концентрирование осадка при Е=-0,7 В, τ=120 с. Съемку вольтамперограммы начинают с потенциала 0,0 В. Пик регистрируют в диапазоне потенциалов от 0,35 до 0,45 В (нас.х.э). Измеряют высоты анодных пиков гесперидина, средняя высота пика составляет 0,69 мкА.
Расчет содержания гесперидина в анализируемой пробе проводится по формуле (1):
i
где X - содержание компонента в анализируемой пробе, моль/л;
AC
3
С - концентрация аттестованной смеси компонента, из которой делается добавка к анализируемой пробе, мг/дм;
AC
V - объем добавки АС компонента, мл;
1
I - величина максимального катодного тока компонента в анализируемой пробе, А или мм;
2
I - величина максимального катодного тока компонента в пробе с добавкой АС, А или мм;
V - объем анализируемой пробы, мл (в случае когда проба берется в твердом виде, расчет концентрации ведут по этой же формуле, заменяя объем на массу);
пр
V - объем раствора подготовленной пробы, мл;
ал
V - объем аликвоты раствора пробы, взятой для ВА измерения, мл.
Пример 2. Определение содержания гесперидина в биологически активной добавке «Кордис».
2
4
э
э
В стаканчик для вольтамперометрических измерений вносят 20 мл 0,1 н. NaHPO и удаляют кислород из раствора пропусканием газообразного азота в течение трех минут. Не прекращая перемешивание, проводят электролиз раствора при условии Е=-0,7 В, τ=120 с. Отключают газ и регистрируют вольтамперограмму фона в диапазоне потенциалов от 0,0 до 0,65 В (нас.х.э). Отсутствие пиков на вольтамперограмме в области потенциалов 0,35÷0,45 В свидетельствует о чистоте фонового электролита и полягрографического стаканчика.
-8
При анализе порошка, содержащего гесперидин берут навеску пробы 0,003 г, вносят в колбу вместимостью 50 мл, растворяют навеску пробы в 10 мл 96-% этилового спирта и приливают 5 мл спирта. Через 30 минут раствор отфильтровывают через бумажный фильтр. Затем 0,1 мл полученного фильтрата вносят в кварцевый стаканчик с фоновым раствором. Электронакопление и регистрацию аналитического сигнала проводят в тех же условиях. Анодный пик гесперидина фиксируют в диапазоне 0,35÷0,45 В на СУ электроде при чувствительности прибора (1÷5)·10 А/мм в дифференциальном режиме съемки вольтамперограмм. Массовую концентрацию гесперидина в пробе оценивают методом добавок аттестованных смесей, измеряя высоту анодных пиков. Расчет концентрации гесперидина проводится по формуле 1.
I<sub>1</sub>, мкА
I<sub>2</sub>, мкА
V<sub>пр</sub>, мл
m, г
V<sub>ал</sub>, мл
V<sub>ст</sub>, мл
С<sub>ст</sub>, мг/л
X<sub>i</sub>, мг/кг
1,23
2,56
15
0,003
0,1
0,01
50
23120,3±6936,1
Время анализа одной пробы с учетом времени пробоподготовки занимает около 40 минут.
Таким образом, впервые установлена способность количественного химического анализа гесперидина по пикам окисления его на СУ «игольчатом» электрохимически модифицированном электроде (в прототипе количественное определение гесперидина проводят на нуйолграфито-пастовом и дифенилэфирграфито-пастовом электроде).
-5
Анализ характеристик количественного химического определения гесперидина по предлагаемому способу свидетельствует о чувствительности определения (диапазон измеряемых концентраций значительно шире, чем описанный в прототипе). Предел обнаружения определяемых содержаний равен 0,8·10 моль/л.
Условия, используемые в прототипе, не позволяют контролировать большие концентрации гесперидина.
2
5
-3
-5
3
Предложенный способ прост, не требует большого количества реактивов и трудозатрат и может быть приемлем в любой химической лаборатории, имеющей полярограф, особенно в настоящее время, когда налажен выпуск отечественной и зарубежной электроаппаратуры с контрольным управлением и обработкой данных (анализаторы типа СТА, ТА и др.). Предложенный способ может быть использован в фармакокинетических и фармацевтических исследованиях, пищевой промышленности, для разработки методик анализа гесперидина и родственных ему соединений в сложных многокомпонентных биосистемах (кровь, моча). Благодаря широкому диапазону определяемых концентраций данный способ определения гесперидина позволяет применять его для широкого числа объектов: как для биологически активных добавок, где его содержание 10÷10 моль/л, так и для биологических объектов, где его определение проводится на уровне 10÷10 моль/л. Определение концентраций в диапазоне 10÷10 моль/л важно для пищевой промышленности, так как по содержанию гесперидина в апельсиновом соке определяют фальсификацию продукции.