ДИФФЕРЕНЦИРОВАНИЕ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА В ПАНКРЕАТИЧЕСКУЮ ЭНТОДЕРМУ

5
5
2
1. Способ культивирования плюрипотентных стволовых клеток, включающий высевание плюрипотентных стволовых клеток на поверхность с плотностью посева от приблизительно 0,8×10 до приблизительно 3,0×10 клеток/см.
2. Способ по п. 1, в котором плюрипотентные стволовые клетки представляют собой эмбриональные стволовые клетки.
3. Способ по п. 2, в котором эмбриональные стволовые клетки представляют собой эмбриональные стволовые клетки человека.
4. Способ по п. 1, в котором плюрипотентные стволовые клетки высевают на поверхность, содержащую Matrigel™.
5
5
2
5. Способ дифференцирования плюрипотентных стволовых клеток, включающий высевание плюрипотентных стволовых клеток на поверхность с плотностью от приблизительно 0,8×10 до приблизительно 3,0×10 клеток/см и дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму.
6. Способ по п. 5, в котором плюрипотентные стволовые клетки представляют собой эмбриональные стволовые клетки.
7. Способ по п. 6, в котором эмбриональные стволовые клетки представляют собой эмбриональные стволовые клетки человека.
8. Способ по п. 5, в котором поверхность, на которую высевают плюрипотентные стволовые клетки, содержит Matrigel™.
9. Способ по п. 5, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму, являются клетками человека.
5
5
2
10. Способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму, включающий дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму, в котором плюрипотентные стволовые клетки высевали на поверхность с плотностью посева от приблизительно 0,8×10 до приблизительно 3,0×10 клеток/см.
11. Способ по п. 10, в котором плюрипотентные стволовые клетки представляют собой эмбриональные стволовые клетки.
12. Способ по п. 11, в котором эмбриональные стволовые клетки представляют собой эмбриональные стволовые клетки человека.
13. Способ по п. 10, в котором поверхность, на которую высевают плюрипотентные стволовые клетки, содержит Matrigel™.
14. Способ по п. 10, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму, являются клетками человека.
15. Способ дифференцирования клеток, экспрессирующих маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму, включающий высевание плюрипотентных стволовых клеток на первую поверхность с плотностью посева, достаточной для максимальной эффективности дифференцирования плюрипотентных стволовых клеток; дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму; высевание клеток, экспрессирующих маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму, с плотностью посева, достаточной для максимальной эффективности дифференцирования клеток, экспрессирующих маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму; и дифференцирование клеток, экспрессирующих маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму, в клетки, экспрессирующие маркеры, указывающие на панкреатическую энтодерму.
5
5
2
16. Способ по п. 15, в котором плюрипотентные стволовые клетки высевают на первую поверхность с плотностью посева от приблизительно 0,8×10 до приблизительно 3,0×10 клеток/см.
5
5
2
17. Способ по п. 15, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму, высевают на поверхность с плотностью посева от приблизительно 1,5×10 до приблизительно 5,0×10 клеток/см.
18. Способ по п. 15, в котором плюрипотентные стволовые клетки представляют собой эмбриональные стволовые клетки.
19. Способ по п. 18, в котором эмбриональные стволовые клетки представляют собой эмбриональные стволовые клетки человека.
20. Способ по п. 15, в котором первая поверхность содержит Matrigel™.
21. Способ по п. 15, в котором вторая поверхность содержит Matrigel™.
22. Способ по п. 15, в котором первая поверхность и вторая поверхность представляют собой одну и ту же поверхность.
23. Способ по п. 15, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму, являются клетками человека.
24. Способ по п. 15, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, указывающие на панкреатическую энтодерму, являются клетками человека.
5
5
2
25. Способ дифференцирования клеток, экспрессирующих маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму, включающий дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму; и дифференцирование клеток, экспрессирующих маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму, в клетки, экспрессирующие маркеры, указывающие на панкреатическую энтодерму; при этом плюрипотентные стволовые клетки высевали на поверхность с плотностью посева от приблизительно 0,8×10 до приблизительно 3,0×10 клеток/см.
26. Способ по п. 25, в котором плюрипотентные стволовые клетки представляют собой эмбриональные стволовые клетки.
27. Способ по п. 26, в котором эмбриональные стволовые клетки представляют собой эмбриональные стволовые клетки человека.
28. Способ по п. 25, в котором поверхность содержит Matrigel™.
29. Способ по п. 25, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму, являются клетками человека.
30. Способ по п. 25, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, указывающие на панкреатическую энтодерму, являются клетками человека.
31. Способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, указывающие на панкреатическую энтодерму, включающий:
a) высевание плюрипотентных стволовых клеток на поверхность;
b) дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму; и
с) дифференцирование клеток, экспрессирующих маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму, в клетки, экспрессирующие маркеры, указывающие на панкреатическую энтодерму.
5
5
2
32. Способ по п. 31, в котором плюрипотентные стволовые клетки высевают на поверхность с плотностью посева от приблизительно 0,8×10 до приблизительно 3,0×10 клеток/см.
5
5
2
33. Способ по п. 31, дополнительно включающий стадию высевания клеток, экспрессирующих маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму, на поверхность с плотностью посева от приблизительно 1,5×10 до приблизительно 5,0×10 клеток/см.
34. Способ по п. 31, в котором плюрипотентные стволовые клетки представляют собой эмбриональные стволовые клетки.
35. Способ по п. 34, в котором эмбриональные стволовые клетки представляют собой эмбриональные стволовые клетки человека.
36. Способ по п. 31, в котором поверхность содержит Matrigel™.
37. Способ по п. 31, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму, являются клетками человека.
38. Способ по п. 31, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, указывающие на панкреатическую энтодерму, являются клетками человека.
39. Способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, указывающие на эндокринную часть поджелудочной железы, включающий:
a) высевание плюрипотентных стволовых клеток на поверхность;
b) дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму; и
с) дифференцирование клеток, экспрессирующих маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму, в клетки, экспрессирующие маркеры, указывающие на эндокринную часть поджелудочной железы.
5
5
2
40. Способ по п. 39, в котором плюрипотентные стволовые клетки высевают с плотностью посева от приблизительно 0,8×10 до приблизительно 3,0×10 клеток/см.
5
5
2
41. Способ по п. 39, дополнительно включающий стадию высевания клеток, экспрессирующих маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму, на поверхность с плотностью посева от приблизительно 1,5×10 до приблизительно 5,0×10 клеток/см.
42. Способ по п. 39, в котором плюрипотентные стволовые клетки представляют собой эмбриональные стволовые клетки.
43. Способ по п. 40, в котором эмбриональные стволовые клетки представляют собой эмбриональные стволовые клетки человека.
44. Способ по п. 39, в котором поверхность содержит Matrigel™.
45. Способ по п. 39, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму, являются клетками человека.
46. Способ по п. 39, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, указывающие на панкреатическую энтодерму, являются клетками человека.
5
2
5
2
47. Способ дифференцирования клеток, экспрессирующих маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму, включающий высевание клеток, экспрессирующих маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму, c плотностью посева от приблизительно 1,5×10 клеток/см до приблизительно 5,0×10 клеток/см; и дифференцирование клеток, экспрессирующих маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму, в клетки, экспрессирующие маркеры, указывающие на панкреатическую энтодерму.
48. Способ по п. 47, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму, являются клетками человека.
49. Способ по п. 47, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, указывающие на панкреатическую энтодерму, являются клетками человека.
5
2
5
2
50. Способ дифференцирования клеток, экспрессирующих маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму, в клетки, экспрессирующие маркеры, указывающие на эндокринную часть поджелудочной железы, включающий высевание клеток, экспрессирующих маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму, на поверхность с плотностью посева от приблизительно 1,5×10 клеток/см до приблизительно 5,0×10 клеток/см и дифференцирование клеток, экспрессирующих маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму, в клетки, экспрессирующие маркеры, указывающие на эндокринную часть поджелудочной железы.
51. Способ по п. 50, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму, являются клетками человека.
52. Способ по п. 50, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, указывающие на панкреатическую энтодерму, являются клетками человека.
5
2
53. Популяция клеток, дифференцированных in vitro из эмбриональных стволовых клеток человека, демонстрирующих падение экспрессии по меньшей мере одного маркера, который выбирают из PDX-1, NKX6.1, NGN3, NKX2.2, NeuroD и инсулина, и повышенную экспрессию ZIC1 и CDX2 по сравнению с эмбриональными стволовыми клетками человека; и при этом эмбриональные стволовые клетки человека высевают на поверхность с плотностью посева менее 5×10 клеток/см.