БИФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ БЕЛКИ, КОМБИНИРУЮЩИЕ БЛОКАДУ КОНТРОЛЬНОЙ ТОЧКИ, ДЛЯ ТАРГЕТНОЙ ТЕРАПИИ
BIFUNCTIONAL PROTEINS COMBINING CHECKPOINT BLOCKADE FOR TARGETED THERAPY

Область техники, к которой относится настоящее изобретение
[0001] Настоящее изобретение относится к антителу. Более конкретно настоящее изобретение относится к антителу для лечения рака.
Уровень техники настоящего изобретения
[0002] Двумя основными типами лимфоцитов человека являются Т-лимфоциты (происходят из тимуса) и В-лимфоциты (происходят из костного мозга). Эти клетки происходят из гемопоэтических стволовых клеток в костном мозге и печени плода, которые коммитированы на лимфоидный путь развития. Потомки этих стволовых клеток идут различными путями, созревая либо в В-, либо в Т-лимфоциты. Развитие В-лимфоцитов человека происходит полностью в костном мозге. С другой стороны, Т-клетки развиваются из незрелых предшественников, которые покидают костный мозг и достигают через кровоток тимуса, где они пролиферируют и дифференцируются в зрелые Т-лимфоциты.
[0003] Т-клетки
+
[0004] Т-клетки являются наиболее распространенными (приблизительно 75% лимфоцитов крови) и мощными клетками-киллерами иммунной системы. Роль эффекторных Т-клеток в противоопухолевом иммунном ответе полностью подтверждена in vitro исследованиями и наблюдением, что высокая инфильтрация Т-клеток CD8 в некоторых типах опухолей коррелирует с благоприятным клиническим прогностическим фактором (Fridman et al., 2012). Активация эффекторных интактных Т-клеток требует как минимум трех дополнительных сигналов: (i) взаимодействие TCR-CD3/Ag-MHC с помощью корецепторов (CD4 или CD8); (ii) связывание костимулирующих молекул, таких как CD80 или CD86, с CD28, CD40/CD40L; и (iii) вспомогательные молекулы, такие как цитокины.
[0005] Костимуляция Т-клеток или обеспечение их двумя различными сигналами является широко распространенной моделью лимфоцитарной активации покоящихся Т-лимфоцитов антигенпрезентирующими клетками (АРС) (Lafferty and Cunningham, 1975). Данная модель также обеспечивает способность отличать свое от чужого и иммунную толерантность (Bretscher and Cohn, 1970; Bretscher, 1999; Jenkins and Schwartz, 1987). Трансдукция первичного сигнала или антигенспецифичного сигнала осуществляется через Т-клеточный рецептор (TCR) после распознавания чужеродного антигенного пептида, презентируемого в контексте главного комплекса гистосовместимости (МНС). Вторичный или костимулирующий сигнал доставляется к Т-клеткам костимулирующими молекулами, экспрессируемыми на антигенпрезентирующих клетках (АРС), и индуцирует Т-клетки для стимулирования клональной экспансии, секреции цитокинов и эффекторной функции (Lenschow et al., Ann. Rev. Immunol. 14: 233 (1996). В отсутствие костимуляции Т-клетки могут становиться невосприимчивыми к антигенной стимуляции, не обеспечивают формирование эффективного иммунного ответа и также могут приводить к истощению или толерантности к чужеродным антигенам.
[0006] Белок иммунной контрольной точки PD-L1
[0007] Иммунные контрольные точки относятся к группе ингибирующих и стимулирующих путей, в основном инициируемых взаимодействием лиганд-рецептор, подключающим иммунную систему, в частности Т-клеточный иммунитет, для поддержания аутотолерантности и модуляции продолжительности и амплитуды физиологических реакций в периферических тканях для того, чтобы минимизировать коллатеральные повреждения ткани в нормальных условиях (Pardoll, 2012). Опухолевые клетки используют определенные пути контрольных точек в качестве основного механизма иммуннорезистентности. Например, лиганд белка запрограммированной смерти клетки 1, PD-L1, обычно активируется на поверхности опухолевых клеток рака человека. Взаимодействие PD-L1 с его рецептором PD-1, экспрессируемым на инфильтрующих опухоль лимфоцитах (TIL), особенно на Т-клетках, ингибирует локальный Т-клеточный ответ для того, чтобы избежать иммунного надзора (Liang et al., 2006; Sznol and Chen, 2013). Таким образом, ингибирование иммуноподавляющих сигналов на раковые клетки или прямая агонистическая стимуляция Т-клеток приводит к сильному устойчивому противоопухолевому иммунному ответу и/или индуцирует его. Недавние клинические исследования убедительно показали, что блокада белков иммунной контрольной точки с помощью антител или модулирование растворимыми лигандами или рецепторами являются наиболее многообещающими подходами к активации терапевтического противоопухолевого иммунитета (Topalian et al., 2014). В настоящее время антитела анти-PD-1 и анти-CTLA-4 (цитотоксический Т-лимфоцит-ассоциированный антиген-4) одобрены FDA для лечения заболеваний, таких как меланома.
[0008] Ангиогенез и домен ингибирования VEGF (VID)
[0009] Ангиогенез, образование новых кровеносных сосудов из уже существующих кровеносных сосудов, является нормальным и жизненно важным процессом, вовлеченным в развитие плода и восстановление тканей. Процесс в значительной степени регулируется как ангиогенными, так и антиангиогенными факторами и включает миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток, созревание и ремоделирование сосудов, а также деградацию внеклеточного матрикса. Хотя это важный процесс для нормального роста и развития, ангиогенез также играет ключевую роль в росте опухоли. Опухолям требуется сосудистое снабжение для роста, и оно может быть достигнуто посредством экспрессии проангиогенных факторов роста, включая члены семейства лигандов фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) (Hicklin and Ellis, 2005). Когда VEGF и другие факторы роста эндотелия связываются с их рецепторами на эндотелиальных клетках, происходит инициация сигналов внутри этих клеток, что способствует росту и жизнеспособности новых кровеносных сосудов. Блокирование активности VEGF с помощью специфического к VEGF антитела (Авастин), растворимых рецепторов VEGF (афлиберцепт) или ингибиторов активности тирозинкиназы VEGF (сунитиниб) представляют собой стратегии, которые были использованы для лечения нарушений опухолевого или ангиогенного типа, таких как AMD.
[0010] Биспецифическое/бифункциональное антитело
[0011] Идея использования биспецифических антител для эффективного перенацеливания эффекторных иммунных клеток на опухолевые клетки возникла в 1980-х годах (Karpovsky et al., 1984; Perez et al., 1985; Staerz et al., 1985). Биспецифические скаффолды в общем классифицируют на две основные группы с различными фармакокинетическими свойствами на основании отсутствия или присутствия Fc-фрагмента, а именно IgG-подобные молекулы и небольшие рекомбинантные биспецифические форматы, большинство из которых происходит из одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv). Благодаря своему компактному размеру фрагменты антител обычно проникают в опухоли более эффективно, чем IgG-подобные молекулы, но это преимущество ослабляется коротким периодом полужизни в сыворотке (несколько часов), ограничивающим их общее поглощение опухолью и время пребывания (Goldenberg et al., 2007). Напротив, присутствие Fc-фрагмента, который связывается с неонатальными Fc-рецепторами, обеспечивает длительный период полужизни в сыворотке (>10 дней) для IgG-подобных форматов, способствуя поглощению и удержанию опухолью, но ограничивая проникновение в опухоль.
[0012] Недавние исследования выявили терапевтическую эффективность иммунотерапии, класса терапий рака, в котором для разрушения раковых клеток используют собственную иммунную систему пациента. Присутствие внутри опухоли семейства молекул негативной регуляции, в общем известных как «ингибиторы контрольных точек», может ингибировать функцию подавления противоопухолевого иммунитета Т-клеток. Ингибиторы контрольных точек, таких как CTLA-4 и PD-1, ослабляют пролиферацию Т-клеток и продукцию цитокинов. Нацеленная блокада CTLA-4 или PD-1 антагонистическими моноклональными антителами (mAb) высвобождает «тормоза» Т-клеток с усилением противоопухолевого иммунитета. Кроме того, в недавних исследованиях сообщалось о связи между путями PD-L1 или PD-L2/PD-1 и проангиогенными генами, включая факторы, индуцируемые гипоксией, (HIF) и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) в случае некоторых злокачественных новообразований, таких как классическая лимфома Ходжкина (cHL) (Koh et al., 2017) и глиома (Xue et al., 2017). Koh et al подтвердили положительную корреляцию между PD-L1, VEGF или MVD. Их результаты предоставили доказательство, подтверждающее новые терапевтические подходы, включающие комбинации анти-PD-L1/PD-1 и анти-VEGF терапии в дополнение к существующей в настоящее время стандартной схеме лечения cHL (Koh et al., 2017). Для VEGF также доказана его способность нарушать ключевую стадию в противораковом иммунном цикле, а именно инфильтрацию Т-клеток в опухоль (Kim and Chen, 2016; Terme et al., 2012). Нацеливание на VEGF может способствовать восстановлению части противоракового иммунного цикла посредством увеличения инфильтрации Т-клеток в микроокружение опухоли (Hughes et al., 2016; Terme et al., 2012; Wallin et al., 2016). Ингибирование пути VEGF может привести к усиленной экспрессии молекул клеточной адгезии на эндотелиальных клетках, что приводит к увеличению внутриопухолевых Т-клеток с получением микроокружения опухоли с иммунным воспалением.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
[0013] Задача настоящего изобретения состояла в исследовании биспецифического антитела в целях иммуномодуляции и ингибирования ангиогенеза для лечения пациентов, страдающих раком, при этом были исследованы такие виды рака как рак предстательной железы, рак легкого, NSCLC, меланома, лимфома, рак молочной железы, рак головы и шеи, RCC или рак яичников.
[0014] Настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу или его антигенсвязывающей части, содержащему по меньшей мере одну полипептидную цепь, где полипептидная цепь содержит домен связывания, связывающий белок клеточной поверхности, и домен ингибирования фактора роста эндотелия сосудов (VEGF).
[0015] Согласно одному варианту осуществления белок клеточной поверхности содержит лиганд белка запрограммированной смерти клетки 1 (PD-L1), белок запрограммированной смерти клетки 1 (PD-1), рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), рецептор 2 эпидермального фактора роста человека (HER2), цитотоксический Т-лимфоцит-ассоциированный антиген 4 (CTLA-4), ген активации лимфоцитов 3 (LAG3), В- и Т-лимфоцитарный аттенюатор (BTLA), ОХ40 (кластер дифференцировки 134, CD134), CD27, CD28, член 9 суперсемейства факторов некроза опухоли (TNFRSF9 или CD137), индуцируемый Т-клеточный ко-стимулятор (ICOS или CD278), CD40, или их комбинацию.
[0016] Согласно одному варианту осуществления домен связывания связывается с PD-L1, и домен связывания содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, на по меньшей мере приблизительно 80% гомологичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO. 4 и 6, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, на по меньшей мере приблизительно 80% гомологичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислот 1-111 последовательности SEQ ID NO. 3 и аминокислот 1-110 последовательности SEQ ID NO. 5.
[0017] Согласно одному варианту осуществления домен ингибирования VEGF происходит из рецептора 1 VEGF человека (VEGFR-1) или рецептора 2 VEGF человека (VEGFR-2).
[0018] Согласно одному варианту осуществления домен ингибирования VEGF, содержит аминокислотную последовательность, на по меньшей мере приблизительно 80% гомологичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO. 1, 2, 9, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 и их комбинации.
[0019] Согласно одному варианту осуществления биспецифическое антитело или его антигенсвязывающая часть дополнительно содержит Fc-домен и Fab-фрагмент, соединенный с N-концом Fc-домена, причем Fab-фрагмент содержит домен связывания, где домен ингибирования VEGF соединен с С-концом Fc-домена.
[0020] Согласно одному варианту осуществления биспецифическое антитело или его антигенсвязывающая часть дополнительно содержит линкер между Fc-доменом и доменом ингибирования VEGF.
[0021] Согласно одному варианту осуществления биспецифическое антитело содержит аминокислотную последовательность, как изложено в SEQ ID NO. 12 или 13.
[0022] Согласно одному варианту осуществления биспецифическое антитело или его антигенсвязывающая часть содержит одну пару полипептидных цепей.
[0023] Согласно одному варианту осуществления биспецифическое антитело представляет собой антитело IgG, IgE, IgM, IgD, IgA или IgY.
[0024] Согласно одному варианту осуществления биспецифическое антитело представляет собой антитело IgG.
[0025] Согласно одному варианту осуществления антитело IgG представляет собой антитело IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.
[0026] Согласно одному варианту осуществления антитело IgG1 представляет собой антитело IgG1 с пониженной антителозависимой опосредованной клеткой цитотоксичностью.
[0027] Согласно одному варианту осуществления биспецифическое антитело представляет собой антитело человека.
[0028] Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей биспецифическое антитело или его антигенсвязывающую часть, как указано выше, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.
[0029] Настоящее изобретение также относится к конъюгату антитела и лекарственного средства, содержащему терапевтическое средство и биспецифическое антитело или антигенсвязывающую часть, связывающую PD-L1, и/или домен ингибирования VEGF, где терапевтическое средство ковалентно конъюгировано с антителом или антигенсвязывающей частью посредством линкера.
[0030] Согласно одному варианту осуществления биспецифическое антитело или антигенсвязывающая часть выбраны из биспецифического антитела или антигенсвязывающей части, как указано выше.
[0031] Настоящее изобретение также относится к способу лечения рака, причем способ предусматривает введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества биспецифического антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, как указано выше.
[0032] Согласно одному варианту осуществления рак выбран из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака легкого, немелкоклеточного рака легкого (NSCLC), меланомы, лимфомы, рака молочной железы, рака головы и шеи, почечно-клеточного рака (RCC) и рака яичников.
[0033] Согласно одному варианту осуществления эффективное количество составляет от 0,001 мкг/кг до 250 мг/кг.
[0034] Настоящее изобретение также относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело или его антигенсвязывающую часть, как указано выше.
[0035] Настоящее изобретение также относится к способу диагностики рака у субъекта, предусматривающему: (а) взятие образца биологической жидкости организма или образца клеток у субъекта; (b) ведение образца биологической жидкости организма или образца клеток в контакт с одним или несколькими антителами, которые могут обнаруживать экспрессию панели раковых маркеров, выбранных из группы, состоящей из PD-L1 и VEGF; (с) оценку связывания одного или нескольких антител с образцом клеток или образцом; и (d) оценку статуса рака у субъекта при анализе посредством измерения и сравнения уровня связывания антитела с нормальным контролем с определением присутствия рака у субъекта.
[0036] Настоящее изобретение также относится к способу оценки риска развития рака у субъекта, или способу скрининга рака у субъекта, предусматривающему: (а) взятие образца биологической жидкости организма или образца клеток у субъекта; (b) ведение образца биологической жидкости организма или образца клеток в контакт с одним или несколькими антителами, которые могут обнаруживать экспрессию панели раковых маркеров, выбранных из группы, состоящей из PD-L1 и VEGF; (с) оценку связывания одного или нескольких антител с образцом клеток или образцом биологической жидкости организма; и (d) оценку статуса рака у субъекта при анализе посредством измерения и сравнения уровня связывания антитела с нормальным контролем с определением есть ли у субъекта риск развития рака.
Краткое описание чертежей
[0037] Настоящее изобретение может стать понятным в более полной степени при изучении последующего подробного описания вариантов осуществления со ссылкой на приложенные чертежи, описанные далее.
[0038] На фиг. 1 показан иммунные контрольные точки, модулирующие Т-клеточный иммунитет.Для конструирования бифункционального слитого белка в зависимости от применений могут быть использованы либо агонистические, либо антагонистические антитела против контрольных точек, такие как анти-ICOS, анти-CD28, анти-ОХ40 и анти-CD27, или анти-PD-1, анти-CTLA4, анти-LAG3, анти-BTLA.
[0039] На фиг. 2А и 2В показан скрининг фаговых клонов посредством прямого анализа ELISA для рекомбинантного PD-L1.
[0040] На фиг. 3 показаны очищенные антитела-лидеры для PD-L1 согласно SDS-PAGE с невосстанавливающим реагентом для определения целостности и чистоты.
450
[0041] На фиг. 4 показаны примеры активности прямого связывания с лигандом очищенных белков против иммунной контрольной точки и анти-PD-L1 антител-лидеров против PD-L1. Лунки, предварительно покрытые лигандом, сначала инкубировали с различными концентрациями антител-лидеров, как указано. Связанные белки затем обнаруживали с помощью Fab-специфического, конъюгированного с HRP антитела козы против IgG человека, и полученные значения OD наносили на график.
[0042] На фиг. 5 показан поточный анализ с использованием экспрессирующих PD-L1 клеток 293. Экспрессирующие PD-L1 клетки HEK293 сначала инкубировали с очищенными антителами-лидерами, и связанные антитела обнаруживали с помощью конъюгированного с А1еха-488 антитела козы против IgG человека (H+L) с последующим анализом клеточным сортером с активацией флуоресценции (FACS).
[0043] На фиг. 6 показана блокада взаимодействия PD-1/PD-L1 очищенными анти-PD-L1 антителами. Очищенные антитела, как указано, наносили с биотинилированным PD-L1-Fc на предварительно покрытый PD-1/His 96-луночный планшет для оценки активности ингибирования взаимодействия PD-1/PD-L1. Связывание рекомбинантного PD-L1-Fc с рекомбинантным PD-1 обнаруживали с помощью стрептавидина-HRP и анализа ELISA.
[0044] На фиг. 7А и 7В показаны анти-PD-L1 антитела-лидеры с 1 или 10 мкг/мл стимуляторов продукции IL-2 и/или IFN-γ в анализе смешанной реакцией лимфоцитов (MLR) через 3 дня (фиг. 7А) или 5 дней (фиг. 7В) после обработки антителами.
[0045] На фиг. 8 показана структура тяжелой цепи антитела, Fc-слитой с доменом ингибирования VEGF (VID) из рецептора VEGF.
[0046] На фиг. 9 показаны примеры анализа в полиакриламидном геле биспецифических антител антитела против иммунной контрольной точки-VID. Было показано, что очищенные слитые белки, анти-PD-L1-VID биспецифические антитела, имеют молекулярную массу приблизительно 220 кДа (невосстановленные), и слияние тяжелой цепи составляет приблизительно 85 кДа, а легкая цепь составляет приблизительно 25 кДа (восстановленная) в обоих слияниях антител. М является маркером, полоса 1 показывает невосстановленное анти-PD-L1-VID/eIgG1, полоса 2 показывает восстановленное анти-PD-L1-VID/eIgG1, полоса 3 показывает невосстановленное анти-PD-L1-VID/IgG4, и полоса 2 показывает восстановленное анти-PD-L1-VID/IgG4. Загрузка каждой полосы составляет 3 мкг.
[0047] На фиг. 10А и 10В показана чистота очищенных от клеток HEK93 биспецифических антител анти-PD-L1-VID/IgG4 (фиг. 10А) и анти-PD-L1-VID/eIgG1 (фиг. 10В) посредством анализа SEC-ВЭЖХ.
165
450
[0048] На фиг. 11А и 11В показаны примеры активности связывания PD-L1 (фиг. 11А) и VEGF (фиг. 11В) очищенных биспецифических анти-PD-L1-VID антител с помощью прямого анализа ELISA. Лунки, предварительно покрытые лигандом, сначала инкубировали с различными концентрациями тестируемых образцов, как указано. Связанные антитела затем обнаруживали с использованием Fc или F(ab')2 специфического, конъюгированного с HRP антитела козы против IgG человека, и полученные значения OD наносили на график.
165
165
165
50
[0049] На фиг. 12 показано ингибирование VEGF-стимулированной пролиферации HUVEC посредством очищенных биспецифических антител анти-PD-L1-VTD. VEGF предварительно инкубировали с тестируемыми образцами, как указано, в течение одного дня, а затем применяли для клеток HUVEC для мониторинга VEGF-стимулированной пролиферации клеток HUVEC. Через 3 дня культивирования пролиферацию клеток определяли посредством реагента MTS (Promega). Значения поглощения наносили на график относительно концентрации антител тестируемого образца, и определяли концентрацию, при которой пролиферация клеток была ингибирована на 50% (IC).
[0050] На фиг. 13А и 13В показано, что биспецифическое антитело синергически стимулирует активацию Т-клеток для продукции IL-2 (фиг. 13А) и IFN-γ (фиг. 13В) в анализе смешанной реакцией лимфоцитов (MLR) через 3 или 5 дней после обработки изотопическим IgG, эталонным антителом (MPDL3280A) или анти-PD-L1-VID/eIgG1 биспецифическим антителом.
165
[0051] На фиг. 14А, 14В и 14С показана in vitro стабильность в сыворотке анти-PD-L1-VID/eIgG1 биспецифического антитела из разных видов (фиг. 14А: сыворотка человека; фиг. 14 В: мышиная сыворотка; фиг. 14С: сыворотка яванских макак). Очищенное антитело инкубировали в сыворотке (15 мкг/мл) из разных видов, как указано, при 37°С, в течение 1, 2, 3, 5, 7 и 14 дней. После инкубации собранные образцы подвергали сэндвич-варианту анализа ELISA с определением относительной активности связывания для PD-L1 и VEGF. Значения периода полужизни наносили на график относительно концентрации биспецифического антитело в сыворотке.

[0052] На фиг. 15А приведен график, показывающий влияние обработки анти-PD-L1-VID/eIgG1 биспецифическим антителом и обработки моноклональным антителом на рост опухоли РС-3 у мышей Fox Chase SCIDBeige. На фиг.15 В показано, что размер опухоли при обработке биспецифическим антителом значительно меньше, чем при обработке изотопом или эталонным антителом на 35 день после инокуляции.
[0053] На фиг. 16А, 16В и 16С показано, что анти-PD-L1-VID антитела сохраняют свою антигенсвязывающую специфичность по сравнению с одним анти-PD-L1 в IFN-γ-стимулированных А549 клетках (фиг. 16A), NCI-H292 клетках (фиг. 16В) или клетках 293 со стабильной экспрессией PD-L1 (фиг. 16С); MFI означает средою интенсивность флуоресценции.
Подробное раскрытие настоящего изобретения
[0054] Далее приводится подробное описание вариантов осуществления настоящего изобретения, примеры которых проиллюстрированы на приложенных чертежах. Везде, где возможно, одни и те же ссылочные позиции используются на чертежах и в описании для обозначения одинаковых или похожих частей.
[0055] В настоящей заявке описаны экспрессия, очистка и свойства бифункциональных белков с выделенным функциональным доменом ингибирования VEGF для С-конца Fc-домена антител против белка иммунной контрольной точки. Эти белки взаимодействуют с соответствующей им контрольной точкой-мишенью и должны передавать ингибирующий сигнал для модуляции Т-клеточного иммунитета и одновременно нейтрализовать VEGF-индуцированный ангиогенез. Компоненты Fc-слитых белков согласно настоящему изобретению все имеют человеческое происхождение и, таким образом, как ожидается, являются неиммуногенными и могут использоваться в качестве терапевтических средств для человека.
[0056] Биспецифические молекулы, такие как биспецифические антитела (BsAbs), обеспечивают средство одновременного нацеливания нескольких эпитопов на одну и ту же молекулярную мишень или разные мишени с помощью одного терапевтического средства. В качестве противораковых терапевтических средств они обладают потенциалом обеспечения новых или более сильных активностей, снижения стоимости продуктов и облегчения разработки новых схем лечения в отличие от смеси двух моноклональных антител (Chames and Baty, 2009; Hollander, 2009; Thakur and Lum, 2010). Недавно катумаксомаб, трифункциональное биспецифическое антитело, нацеленное на адгезивную молекулу эпителиальных клеток человека (ЕрСАМ) и CD3, продемонстрировало явное клиническое преимущество у пациентов с перитонеальным карциноматозом при эпителиальном раке (Heiss et al., 2010), и биспецифическое антитело-рекрутер Т-клеток (BiTE) с двойной специфичностью к CD19 и CD3 также продемонстрировало стимулирующую клиническую активность у пациентов с гематологическими злокачественными опухолями с экспрессией CD19 (Bargou et al., 2008). Несмотря на большой интерес к разработке биспецифических молекул в качестве средств для лечения рака, технические трудности в производстве стабильных и активных биспецифических молекул в прошлом затрудняли клиническую оценку большинства биспецифических форматов. Для многих сконструированных форматов антител, в том числе IgG-подобного биспецифического антитела, стабильность или растворимость были неблагоприятными (Bargou et al., 2008; Demarest and Glaser, 2008; Lu et al., 2005). Кроме того, было предпринято несколько стратегий для повышения качества продукта и in vivo стабильности биспецифических молекул, включая ПЭГилирование, конъюгирование с человеческим сывороточным альбумином и Fc-инженерию (Muller et al., 2007; Ridgway et al., 1996).
Биспецифические антитела общей формы, описанные выше, имеют преимущество, заключающееся в том, что нуклеотидная последовательность, кодирующая два V-домена, один линкер или один спейсер могут быть включены в подходящий организм-хозяин для экспрессии под контролем одного промотора. Это увеличивает гибкость, с которой эти конструкции могут быть разработаны, а также степень контроля экспериментатором в ходе их получения. Кроме того, Fc в IgG является еще одним привлекательным скаффолдом для разработки новых терапевтических средств, поскольку он содержит все функции антител, кроме способности связывания. Fc-инженерия важна для повышения эффективности биспецифических антител. Следовательно, конформацию на основе IgG используют в настоящем изобретении для двух независимых мишеней на иммунных клетках или проангиогенных белках при лечении рака.
[0057] Нацеливание на белки иммунной контрольной точки является перспективным подходом для активации противоопухолевого иммунитета. Блокаторы белков иммунной контрольной точки, таких как PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3 и т.д., в настоящее время проходят клиническую оценку (фиг. 1). На основании предварительных данных для блокаторов белков иммунной контрольной точки было показано, что они способны повысить противоопухолевый иммунитет с потенциалом вызова длительных клинических реакций. Однако, несмотря на замечательную клиническую эффективность этих средств для ряда злокачественных новообразований, стало очевидно, что они не являются достаточно активными для многих пациентов. Многочисленные дополнительные иммуномодулирующие пути, а также ингибирующие факторы, экспрессируемые или секретируемые миелоидными и стромальными клетками в микроокружении опухоли, являются потенциальными мишенями для синергизма с блокадой иммунных контрольных точек. Таким образом, комбинирование с противоопухолевой терапией или терапией на основе биспецифического антитела было необходимо для достижения полной ремиссии и излечения пациентов, страдающих раком. Между тем, уже известно, что нацеливание на VEGF снижает ангиогенез в опухоли (Hicklin and Ellis, 2005) и может способствовать восстановлению части противоракового иммунного цикла посредством увеличения инфильтрации Т-клеток в микроокружение опухоли (Hughes et al., 2016; Terme et al., 2012; Wallin et al., 2016).
[0058] Домен связывания внеклеточного лиганда (SEQ ID NO. 1 и 2) рецептора VEGF человека способен связываться с лигандом VEGF и содержит один или несколько Ig-подобных доменов D1-D7 (Таблица 1) одного или нескольких рецепторов VEGF. Предпочтительно, домен связывания внеклеточного лиганда рецептора VEGF содержит Ig-подобный домен D2 первого рецептора VEGF и Ig-подобный домен D3 второго рецептора VEGF, где первый и второй рецепторы VEGF являются одинаковыми или различными рецепторами VEGF. Согласно настоящему изобретению домен ингибирования VEGF (VID), домен связывания внеклеточного лиганда рецептора VEGF, содержащий Ig-подобный домен D2 рецептора VEGFR1 и Ig-подобный домен D3 рецептора VEGFR2, блокируют VEGF и уменьшают ангиогенез.
[0059] Согласно некоторым вариантам осуществления домен ингибирования VEGF содержит аминокислотную последовательность, на по меньшей мере приблизительно 80% гомологичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO. 1, 2, 9, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 и их комбинации. В некоторых примерах домен ингибирования VEGF содержит аминокислотную последовательность, на по меньшей мере приблизительно 85%, 90% или 95% гомологичную аминокислотной последовательности, как указано выше.
[0060] В настоящей заявке описана конструкция, экспрессия и свойства антитела против белка иммунной контрольной точки, Fc-слитого с доменом ингибирования VEGF (VID) из рецептора VEGF человека. Расположенное на N-конце анти-PD-L1 антитело в слитых конструкциях должно позволять расширять мощность слитых белков за пределы иммунопотенциирующего агента, если партнер слияния заменен другими иммунными контрольными точками, как например анти-CTLA-4, анти-CD3, анти-ОХ40 антитела, или нацеленной на клеточную поверхность молекулой, как например, анти-EGFR, анти-HER2, анти-СD40 антитела.
[0061] Настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу или его антигенсвязывающей части, содержащему домен связывания, связывающий белок клеточной поверхности, и домен ингибирования фактора роста эндотелия сосудов (VEGF). Согласно некоторым вариантам осуществления домен связывания, связывающийся с PD-L1, содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи. Вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, на по меньшей мере приблизительно 80% гомологичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO. 4 и 6. В некоторых примерах вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, на по меньшей мере приблизительно 85%, 90% или 95% гомологичную аминокислотной последовательности, как указано выше. Вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, на по меньшей мере приблизительно 80% гомологичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислот 1-111 последовательности SEQ ID NO. 3 и аминокислот 1-110 последовательности SEQ ID NO. 5. В некоторых примерах вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, на по меньшей мере приблизительно 85%, 90% или 95% гомологичную аминокислотной последовательности как указано выше.
[0062] Получение антитела из библиотеки OmniMab
450
[0063] Для получения терапевтических антител против PD-L1 проводили отборы с помощью фагемидной библиотеки OmniMab. Фагемидная библиотека создана АР Biosciences Inc. (APBio Inc.) из коллекции В-клеток более ста здоровых доноров. Фаги для 1-го раунда пэннинга были произведены компанией Hyperphage (M13K07ΔρIII, Progen, Heidelberg, Germany). Твердофазный пэннинг и клеточный пэннинг против PD-L1 применяли для отбора PD-L1-специфического связующего и выделения из библиотеки OmniMab. Твердофазный пэннинг проводили с использованием рекомбинантного человеческого PD-L1-Fc (APBio Inc.) в первом раунде отбора, а затем клетки HEK293, экспрессирующие PD-L1, использовали для двух дополнительных раундов обогащения. После трех раундов отбора PD-L1-специфические связующие подвергали скринингу и выделяли прямым анализом ELISA с соответствующим рекомбинантным белком (фиг.n2А и 2В). Предварительно нанесенные в виде покрытия рекомбинантные белки PD-L1-Fc блотировали супернатантом, содержащим выявленные фаги, в течение 1 часа и трижды промывали PBS, содержащим 0,1% Твин-20. Связанные фаги обнаруживали с помощью конъюгированного с HRP антитела против М13 (Roche), и субстрат ТМВ использовали для развития сигнала. Показания OD записывали. Положительные связующие выделяли и подвергали секвенированию для подтверждения последовательности и различия тяжелой цепи и легкой цепи. Вариабельная область тяжелой цепи и легкой цепи, специфичная для PD-L1, была описана от SEQ ID NO. 3 до SEQ ID NO. 6, где SEQ ID NO. 3 представляет собой легкую цепь клона 6 PD-L1, SEQ ID NO. 4 представляет собой вариабельную область тяжелой цепи клона 6 PD-L1, SEQ ID NO. 5 представляет собой легкую цепь клона 32 PD-L1, SEQ ID NO. 6 представляет собой вариабельную область тяжелой цепи клона 32 PD-L1. Как показано на фиг. 2А и 2В, было выделено несколько клонов, и известно, что они распознаются специфически соответствующим антигеном по сравнению с отрицательным контролем.
[0064] Субклонирование и экспрессия/очистка выбранного PD-L1-специфического связующего в виде IgG формата
[0065] Для того, чтобы облегчить быстрый скрининг специфического связующего с функциональностью активации Т-клеток, тяжелые цепи и легкие цепи положительных в анализе ELISA связующих в отношении PD-L1 затем амплифицировали, расщепляли и субклонировали в IgG-специализированный экспрессионный вектор APBio, несущий константную область IgG4 (SEQ ID NO. 7). После подтверждения последовательности затем получали плазмиды и трансфицировали их в клетки HEK293 для экспрессии антитела с помощью реагента для трансфекции 293-фектин (Invitrogen). Через 4 дня культивирования антитело, секретированное в бессывороточную среду, аффинно очищали от супернатанта культуры с помощью хроматографии с применением белка G. Затем очищенное антитело концентрировали с последующим диализом в буфере PBS. Конечную концентрацию диализированного белка определяли с помощью спектрофотометра NanoDrop2000, а чистоту и целостность определяли с помощью электрофореза белков в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) без восстанавливающего реагента, как показано на фиг. 3. Целостность различных очищенных антител-лидеров является нормальной в клетках HEK293, такой же как у эталонного антитела, MPDL3280A.
[0066] Определение активности связывания для PD-L1-специфических IgG-лидеров посредством прямого анализа ELISA
[0067] Очищенные антитела-лидеры против PD-L1 (анти-PD-L1 антитела-лидеры) затем применяли для определения свойств связывания посредством ELISA на человеческом PD-L1-Fc при прямой схеме нанесения. На фиг.4 показан результат связывания посредством анализа ELISA для анти-PD-L1 антител. Для PD-L1-специфических антител большинство лидеров показали сходную или лучшую активность связывания по сравнению с эталонным антителом (эталонное антитело MPDL3280A, Roche).
[0068] Очищенную химеру PD-L1 и Fc из IgG1 человека (PD-L1-Fc, APBio) подвергали диализу в фосфатно-солевом буфере (PBS), доводили до 1 мг/мл и затем разбавляли с помощью PBS до конечной концентрации 1 мкг/мл. На 96-луночные планшеты Nunc-Immuno Maxisorp наносили 0,1 мл на лунку рекомбинантной химеры PD-L1-Fc, оставляя пустые лунки для контролей неспецифического связывания, и инкубировали при 4°С всю ночь. Раствор химеры PD-L1-Fc удаляли, и планшеты трижды промывали с помощью 0,4 мл промывочного буфера (0,1% Твин-20 в PBS). 0,4 мл блокирующего буфера (5% сухого молока с низким содержанием жира в PBS) добавляли во все лунки и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа при перемешивании. Блокирующий буфер удаляли, и планшеты трижды промывали с помощью 0,4 мл промывочного буфера. Серийные разведения тестируемых анти-PD-L1 антител получали в PBS и добавляли 0,1 мл разбавленного антитела на лунку. Планшеты инкубировали 1 час при комнатной температуре. Раствор антител удаляли, и планшеты трижды промывали с помощью 0,4 мл промывочного буфера на лунку. F(ab')2 специфическое F(ab')2 антитело козы к IgG человека, меченое пероксидазой хрена, (Jackson Immunoresearch #109-036-097) разводили до 1:2000 с помощью PBS и добавляли в количестве 0,1 мл на лунку. Планшеты инкубировали 1 час при комнатной температуре и промывали с применением 0,4 мл промывочного буфера на лунку. Добавляли 0,1 мл реагента ТМВ (Invitrogen) и инкубировали в течение от 1 до 5 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 0,05 мл 1 Н HCl, и измеряли оптическую плотность при 450 нм на спектрометре Bio-Tek Spectra. Вычисленная ЕС50 для анти-PD-L1 антител-лидеров по отношению к PD-L1 показала, что большинство лидеров обладают хорошей активностью связывания, такой же как у MPDL3280A (эталонное антитело) при прямом анализе ELISA (фиг. 4).
[0069] Определение активности связывания для PD-L1-специфических IgG-лидеров посредством анализа FACS
[0070] Очищенные антитела-лидеры (анти-PD-L1 антитела-лидеры) также применяли для проточной цитометрии для определения и сравнения активности связывания с PD-L1, экспрессируемым клетками HEK293. На фиг. 5 показана активность связывания соответствующих антител-лидеров, как определено посредством FACS с клетками HEK293, стабильно экспрессирующими PD-L1.
[0071] В ходе анализа FACS клеток 293, стабильно экспрессирующих PD-L1, окрашенных анти-PD-L1 антителами-лидерами, для исследования активности связывания с PD-L1 клетки со стабильной экспрессией инкубировали с 1 мкг/мл очищенных анти-PD-L1 антител-лидеров, эталонным антителом (эталонное антитело MPDL3280A) или изотипическим антителом в качестве отрицательного контроля на льду в течение 1 часа. Клетки трижды промывали 1×PBS и затем инкубировали с Аlеха-488-конъюгированным антителом козы против IgG человека (H+L) (Invitrogen Inc.) на льду в течение еще 1 часа. После окрашивания клетки трижды промывали 1×PBS, ресуспендировали в 1×PBS/2% FBS перед анализом посредством FACS Calibur (BD Biosciences, Inc.) и FlowJo (TreeStar, LLC). Как показано на фиг. 5 большинство анти-PD-L1 антител-лидеров обладают хорошей активностью связывания, такой же как у эталонного антитела. Это указывает на то, что фаговые клоны, выбранные из библиотеки OmniMab, действительно распознают интактный PD-L1 в клетках.
[0072] Конкурентное связывание с лигандом (анализ ELISA)
[0073] Антитела-лидеры показали селективность и аффинность связывания при анализе анти-PD-L1 антител-лидеров согласно настоящему изобретению в отношении их способности блокировать связывание PD-L1 с PD-1.
[0074] Антитела протестировали на их способность блокировать связывание химеры PD-L1-Fc человека (PD-L1-Fc) с рекомбинантным человеческим PD-1/His (hPD-1/His) с помощью анализа ELISA. Очищенный рекомбинантный hPD-1/His (APBio) подвергали диализу до 1 мг/мл в PBS и затем конъюгировали с биотином (Abcam). На 96-луночный паштет Nunc Maxisorp наносили 250 нг hPD-1/His на лунку в PBS на всю ночь. Раствор hPD-1/His удаляли, и планшеты трижды промывали с помощью 0,4 мл промывочного буфера (0,1% Твин-20 в PBS). 0,4 мл блокирующего буфера (5% сухого молока с низким содержанием жира в PBS) добавляли во все лунки и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа при перемешивании. Во время стадии блокирования сток-растворы антител разводили в диапазоне от 200 нМ до 0 нМ в PBS при 2-х кратным серийным разведением. Очищенную рекомбинантную химеру биотинилированный PD-L1-Fc разводили до 4 мкг/мл в PBS. Планшеты с нанесенным PD-1/His трижды промывали с помощью 0,2 мл промывочного буфера (0,1% Tween 20 в PBS). 60 мкл разведений антител (анти-PD-L1 антитела-лидеры или эталонное антитело MPDL3280A) добавляли по одному с 60 мкл химеры биотинилированный PD-L1-Fc и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Планшеты промывали, как описано ранее. Стрептавидин-HRP разводили 1: 2000 в PBS, 100 мкл полученного раствора добавляли в лунки промытого планшета и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Планшеты промывали, как описано ранее, в каждую лунку добавляли 100 мкл раствора субстрата ТМВ и инкубировали в течение 10 минут. Реакцию останавливали с помощью 50 мкл 1H HCl и измеряли оптическую плотность при 450 нм, используя ридер Bio-Tek, результаты показаны на фиг.6. Показано, что частичные антитела-лидеры ингибируют взаимодействие между PD-1-PD-L1 при конкурентном анализе связывания ELISA. Большинство антител-лидеров показали блокирующую активность, подобную блокирующей активности эталонного антитела (эталонное антитело MPDL3280A).
[0075] Усиленная стимуляция Т-клеточной активации анти-PD-L1 антителами посредством ингибирования взаимодействия PD-1 с лигандом PD-L1
[0076] Сигнальный путь PD-1 ингибирует умеренные TCR/CD28 костимулирующие сигналы, причем сначала снижается продукция цитокинов без уменьшения пролиферации Т-клеток. Поскольку TCR/CD28 костимулирующие сигналы ослабевают, путь PD-1 доминирует, причем значительное снижение продукции цитокинов сопровождается снижением пролиферации. Соответственно проводят реакции смешанных лимфоцитов (MLR) для того, чтобы подтвердить, что человеческие антитела согласно настоящему изобретению усиливают активацию Т-клеток при ингибировании PD-1 посредством ингибирования взаимодействия с PD-L1.
[0077] Моноциты из цельной крови человека обогащали посредством коктейля для обогащения моноцитами человека RosetteSep™ (кат.№15068) и культивировали в среде для дифференцировки, RPMI 1640 с 10% FBS, 100 нг/мл (1000 Ед/мл) GM-CSF, 100 нг/мл (500 Ед/мл), в течение 6 дней. Дифференцированные дендритные клетки (DC) из моноцитов проверяли с помощью DC-SIGN-PE, анти-CD14 антитела, конъюгированного с FITC, анти-CD83 антитела, конъюгированного с РЕ, или анти-CD80 антитела, конъюгированного с FITC, чтобы подтвердить дифференциацию, и использовали для клеток АРС в реакциях MLR.
+
+
+
[0078] Аллогенные Т-клетки CD4 из цельной крови человека выделяли с помощью коктейля для обогащения Т-клетками человека CD4 RosetteSep ™ (кат. №15062). Чистоту Т-клеток CD4+ проверяли с помощью анти-CD4 антитела, конъюгированного с АРС, чтобы убедиться, что чистота составляет более 95%, а затем метили с помощью 1 мкМ CFSE (набор CellTraceTM CFSE для пролиферации клеток, Life technologies, кат.№С34554) для анализа пролиферации Т-клеток. Меченые Т-клетки CD4использовали для совместного культивирования с незрелыми DC с различными антителами-лидерами, как указано, в течение 3 и 5 дней, чтобы увидеть могут ли антитела-лидеры восстанавливать активацию Т-клеток путем блокирования взаимодействия между PD-1 и PD-L1. После 3 и 5 дней инкубации супернатант собирали для количественного определения цитокинов, таких как IL-2 и IFN-γ, с помощью ELISA. Предполагается, что добавление анти-PD-L1 антител-лидеров (клоны 6, 32, 28, 51, 64, 27 и 37) к культурам незрелых дендритных клеток плюс аллогенных Т-клеток приводит к увеличению пролиферации Т-клеток и продукции цитокинов, по сравнению с культурами, обработанными изотипическим IgG (изо №1, №2), и результаты показаны на фиг. 7А и 7В. Продукция IL-2 и IFN-γ значительно возрастает в реакциях MLR по сравнению с обработкой изотипическим антителом через 3 дня (фиг. 7А) или 5 дней (фиг. 7В) после обработки антителом, особенно для клона 6 анти-PD-L1 антитела. Увеличение цитокинов остается очевидным через 5 дней после обработки антителами и подобно эталонному антителу (этал.) MPDL3280A. Это указывает на то, что клон 6 анти-PD-L1 антитела должен быть одним из потенциальных лидеров для получения биспецифического антитела.
[0079] Конструкция, экспрессия и очистка анти-PD-L1-VID антитела
[0080] Поскольку биспецифическое антитело конструируют как слитый белок на основе IgG с доменом ингибирования VEGF, клону 6 анти-PD-L1 антитела придают форму IgG, с другой стороны, домен связывания VEGF, D1 и D2, в рецепторе VEGF сливают с С-концом области Fc в клоне 6 анти-PD-L1 антитела. Поскольку изотип Fc или сконструированный Fc важен для повышения эффективности или продукции биспецифических антител в клетках млекопитающих, два разных изотипа Fc, IgG4 (SEQ ID NO. 7) и сконструированный IgG1 (eIgG1, снижение антителозависимой опосредованной клеткой цитотоксичности (ADCC), SEQ ID NO. 8) были использованы для биспецифического конструирования. Конструирование биспецифического анти-PD-L1 антитела, Fc-слитого с VID (SEQ ID NO. 9), изображено на фиг. 8. Короткий гибкий пептидный линкер (GGGGS)3 (SEQ ID NO. 10) был размещен между, например, С-концом тяжелой цепи анти-PD-L1 антитела Fc-области (SEQ ID NO. 4) и N-концевым модулем VID для обеспечения правильного сворачивания и минимизации стерических затруднений. Кодирующие последовательности тяжелой цепи анти-PD-L1-VID для IgG4 и eIGg1 показаны в SEQ ID NO. 12 и NO. 13. В сконструированные Fc-слитые с антителом белки вводили сигнальный пептид (SEQ ID NO: 11) и экспрессировали посредством клеток млекопитающих, и очищали от супернатанта трансфицированной клеточной культуры с помощью одноступенчатой хроматографии с применением белка G. Как показано на фиг. 9, чистота более 95% может быть получена в одностадийном способе очистки и показывает, что очищенные слитые белки имеют правильную молекулярную массу (Mw=220 кДа). Поскольку низкая чистота или степень извлечения являются основной проблемой для получения биспецифического антитела или слитого белка с точки зрения показателя производства «химические свойства, процесс производства и контроль качества» (CMC), оба очищенных биспецифических антитела также наносили на колонку для эксклюзии по размеру (SEC) с высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) для оценки чистоты биспецифических антител (фиг. 10А и 10В). Оба биспецифических антитела, либо анти-PD-L1-VID/IgG4 (фиг. 10А), либо анти-PD-L1-VID/eIgG1 (фиг. 10В), показали чистоту выше 99% в анализе SEC-ВЭЖХ. Это подразумевало, что формат может быть легко обработан с точки зрения показателя CMC и обеспечивает хороший показатель при дальнейшей разработке.
[0081] На фиг. 8 показана структура антитела против иммунной контрольной точки, Fc-терминально слитого с VID. Согласно определенным вариантам осуществления антителом могут быть ингибирующие антитела против иммунной контрольной точки, такие как анти-PD-L1, анти-PD-1, анти-CTLA4, анти-LAG3 и т.д., или стимулирующие антитела, такие как анти-CD28, анти-CD137, анти-CD27, анти-ICOS и т.д., или рецептор/антиген клеточной поверхности, такой как HER2, EGFR и т.д. Для получения биспецифического антитела линкер помещают между Fc антитела и VID.
165
[0082] Аффинность связывания слитых белков с PD-L1 и VEGF
165
[0083] Для измерения аффинности связывания биспецифических антител с PD-L1 или VEGF, вариантом сплайсинга VEGF-A, проводили прямой иммуноферментный анализ связывания (ELISA). Рекомбинантный VEGF-захватывающий белок (VEGFR-Fc) и клон 6 родительского анти-PD-L1 антитела использовали в качестве положительного контроля 1 для PD-L1 и VEGF, соответственно. VEGFR-Fc, афлиберцепт, представляет собой растворимый рецептор VEG, который был сконструирован для терапевтического применения и в настоящее время одобрен Управлением США по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) для лечения возрастной дегенерации макулы (AMD). VEGFR-Fc содержит второй Ig-подобный домен (D2) VEGFR1, слитый с третьим Ig-подобным доменом (D3) рецептора VEGFR2, слитый с Fc областью IgG1 человека (Holash et al., 2002).
165
[0084] 100 мкл покрывающего раствора (1 мкг/мл VEGF в фосфатно-солевом буфере (PBS), рН 7,2) добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета ELISA, и планшет инкубировали всю ночь при 4°С. Лунки дважды промывали с помощью 400 мкл PBS буфера, и избыток жидкости аккуратно удалили бумажным полотенцем. 400 мкл блокирующего раствора (5% обезжиренного молока без содержания жира в PBS) добавляли в каждую лунку, и планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Лунки дважды промывали с помощью PBS буфера. Образцы биспецифического антитела и контрольные образцы серийно разводили трехкратно в блокирующем растворе, причем самая высокая концентрация белка составляет 100 нМ. 100 мкл серийно разведенных образцов добавляли в каждую лунку. Планшет покрывали и инкубировали на планшетном шейкере (приблизительно 100 оборотов в минуту) в течение 1 часа при комнатной температуре. Лунки трижды промывали промывочным буфером (0,05% Твин-20 в PBS). В каждую лунку добавляли 100 мкл разведенных 1: 2500 в блокирующем растворе Fc-специфических антител козы против IgG человека, конъюгированных с пероксидазой хрена. Планшеты закрывали и инкубировали на планшетном шейкере в течение 1 часа при комнатной температуре. Планшеты промывали три раза промывочным буфером. 100 мкл субстрата ТМВ добавляли в каждую лунку, и планшеты инкубировали в течение 3-5 минут для обеспечения реакции. Чтобы остановить реакцию 100 мкл стоп-раствора (1H HCl) добавляли в каждую лунку. Оптическую плотность (OD) каждой лунки определяли с использованием планшетного ридера для ELISA (Bio-Tek) при длине волны поглощения 450 нм. Поглощение наносили на график относительно концентрации белка для слитого белка или контроля и определяли концентрацию, при которой сигнал составлял половину максимальной эффективной концентрации (ЕС50). Между тем, активность связывания PD-L1 для обоих биспецифических антител также определяли по аналогичному сценарию, как описано выше, за исключением того, что связанные биспецифические антитела обнаруживали с помощью F(ab')2-специфического F(ab')2 антитела козы против IgG человека, конъюгированного с пероксидазой хрена.
[0085] Как показывают данные, приведенные на фиг. 11А, аффинность связывания, выраженная в виде значения ЕС50, составляла 0,075 как для анти-PD-L1-VID/IgG4 антител, так и для анти-PD-L1-VID/eIgG1 антител в отношении рекомбинантного белка PD-L1. Оба биспецифических антитела обладают сравнительной активностью связывания, такой же как у положительного контроля клона 6 анти- PD-L1 антитела (0,1 нМ). Между тем, результат был также зарегистрирован для испытания активности связывания с VEGF. Как показывают данные, приведенные на фиг. 11В, оба биспецифических антитела показали сходную активность связывания с VEGF по сравнению с положительным контролем, VEGFR-Fc (афлиберцепт). Для обоих биспецифических антителах нет влияния ни на активность связывания с PD-L1, ни на активность связывания с VEGF.
[0086] Ингибирование пролиферации HUVEC анти-PD-L1-VID биспецифическими антителами
165
165
2
[0087] Анализ пролиферации эндотелиальных клеток вены пуповины человека (HUVEC) проводили с целью тестирования функциональности биспецифического антитела согласно настоящему изобретению. VEGFR-Fc применяли в качестве положительного контроля, как описано выше. 100 мкл покрывающего раствора (1% желатина в дважды дистиллированной воде) добавляли в каждую лунку 96- луночного планшета ELISA, и планшет инкубировали в течение 2 часов или всю ночь при 37°С. Лунки дважды промывали с помощью PBS буфера. 3500 клеток HUVEC в среде для роста эндотелиальных клеток добавляли в каждую лунку, и планшет инкубировали всю ночь при 37°С. Образец, как указано, разводили в буфере для анализа (среда-199 1× соли Эрле, 10% фетальной бычьей сыворотки, 10 мМ HEPES, 1× антибиотик/противогрибковое средство), причем самая высокая концентрация белка составляла 30 нМ. Образцы смешивали с VEGF (8 нг/мл), и смеси инкубировали всю ночь при комнатной температуре. Затем лунки промывали с 200 мкл PBS. 100 мкл смеси VEGF/о6разец добавляли в каждую лунку, и планшеты инкубировали в течение 72 часов при 37°С с 5% СО. После инкубации 10 мкл реагента обнаружения MTS (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолия)+феназинметосульфат в дистиллированном PBS) добавляли в каждую лунку, и планшеты инкубировали при 37°С в течение 2,5 часов. Значение OD для каждой лунки определяли с применением планшетного ридера для ELISA (Bio-Tek) при длине волны поглощения 490 нм. Значения поглощения наносили на график относительно концентрации белка тестируемого образца, и определяли концентрацию, при которой происходит ингибирование пролиферации на 50% (IC50). Ингибирование пролиферации клеток (IC50) определили при от 0,1070 до 0,1233 нМ тестируемых слитых белков согласно настоящему изобретению. Одно из биспецифических антител, анти-PD-L1-VID/eIgG1, показало лучшее ингибирование, чем другое биспецифическое антитело, анти-PD-L1-VID/IgG4 (фиг. 12, 0,1070 нМ по сравнению с 0,1233 нМ). Значение IC50 анти-PD-L1-VID/eIgG1 является хорошим, таким же как у положительного контроля VEGFR-Fc (0,1072 нМ).
[0088] Усиленная стимуляция активации Т-клеток анти-PD-L1-VID/eIgG1 биспецифическими антителами-лидерами в реакциях MLR
[0089] Определяли антагонистическую функциональность биспецифического антитела при усилении активации Т-клеток посредством ингибирования взаимодействия между PD-1 hPD-L1. Биспецифические антитела-лидеры, анти-PD-L1-VID/eIgG1 антитело, применяли в MLR, как описано выше. Продукцию IL-2 и IFN-γ затем регистрировали через 3 или 5 дней после обработки антителами. Моно- или биспецифическое антитело применяли в равной моли для сравнения антагонистической функциональности в усилении активации Т-клеток, а изотипический IgG использовали в качестве отрицательного контроля. Как показывают данные, приведенные на фиг. 13А и 13В, анти-PD-L1-VID/eIgG1 антитело показало значительную индукцию IL2 через 3 дня после обработки, которая упала через 5 дней после обработки. Профиль продукции цитокинов очень схож с эталонным антителом MPDL3280A. Между тем, также происходит усиление индукции и накопления IFN-γ при обработке биспецифическими антителами-лидерами через 3 или 5 дней после обработки. Это указывает на то, что анти-PD-L1-VID/eIgG1 биспецифическое антитело также обладает антагонистической функциональностью при активации Т-клеток, такой же как эталонное антитело, без потери каких-либо активностей согласно настоящему изобретению.
[0090] In vitro стабильность в сыворотке анти-PD-L1-VID/eIgG1 биспецифического антитела
165
165
[0091] Очищенное анти-PD-L1-VID/eIgG1 антитело инкубировали с сывороткой (15 мкг/мл) из разных видов, как указано, при 37°С на водяной бане. Образцы сыворотки, содержащие очищенные биспецифические антитела, отбирали в разные моменты времени вплоть до 14 дней. Концентрации биспецифического антитела в образцах сыворотки определяли с помощью сэндвич-варианта анализа ELISA, как показано ниже. Предварительно покрытые VEGF (1 мкг/мл) лунки инкубировали с титрованными для калибровочной кривой концентрациями очищенного анти-PD-L1-VID/eIgG1 биспецифического антитела с вычислением концентрации антител в сыворотке (свежий препарат, день 0). Собранные в разные моменты времени образцы также наносили на предварительно покрытые VEGF лунки для обнаружения. После промывания с применением 0,1% Твин-20 в PBS интактные и связанные антитела обнаруживали посредством биотинилированного PD-L1-Fc и HRP-конъюгированного стрептавидина до появления цвета. Концентрацию антител в сыворотке вычисляли методом интерполяции, а затем значения периода полужизни антител наносили на график, как показано на фиг. 14А, 14В и 14С. Период полужизни анти-PD-L1-VID/eIgG1 превышает 8 дней в сыворотке яванских макак (8,6 дня), мышей (9,2 дня) или человека (11,9 дня). Длительный период полужизни может обеспечить гибкость использования биспецифического антитело с меньшей частотой введения при исследовании на животных или в клинических испытаниях в будущем.
[0092] Противоопухолевая активность биспецифического антитела (in vivo модель)
[0093] Отсутствие перекрестной реактивности в отношении PD-L1 грызунов у биспецифических антителах препятствовало использованию стандартных мышиной сингенной модели опухоли или человеческой ксенотрансплантатной модели опухоли для оценки эффективности антител против опухолей человека. Соответственно, новая мышиная ксеногенная модель опухоли huPBL-SCID-Bg была создана с использованием мыши SCID-Bg (CB.17/Icr.Cg PkrdcscidLystbg/CrI), которая несет мутацию (Bg) отсутствия мышиных Т- и В-лимфоцитов и функциональных NK клеток. Противоопухолевую эффективность биспецифических антител оценивали с применением этой модели, как описано далее.
6
6
[0094] Клетки предстательной железы человека РС-3 получали в American Туре Culture Collection и культивировали в RPMI-1640 (Invitrogen) с L-глютамином, пируватом натрия, пенициллином/стрептомицином и 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS, Gibco кат. №10437). Клетки выращивали до слияния в колбах Falcon Т-150. Затем клетки трипсинизировали (Трипсин 0,25% -EDTA; Invitrogen), и рост масштабировали до достаточного количества клеток для инокуляции. Лимфоциты периферической крови (РВМС) выделяли из гепаринизированной крови с использованием Lymphoprep™ в соответствии с протоколом производителя (STEMCELL Technologies Inc.). Подсчитанные клеточные суспензии объединяли таким образом, чтобы каждая мышь получала инъекцию 0,75×10 РВМС и 3×10 опухолевых клеток за одну болюсную инъекцию 0,1 мл в PBS. Для того, чтобы облегчить рост опухолевых клеток у мышей, еще 0,1 мл матригеля затем смешивали с объединенной клеточной суспензией и затем немедленно инъецировали подготовленным мышам.
3
2
3
3
3
[0095] Каждой мыши подкожно инъецировали объем 0,2 мл объединенной клеточной суспензии в правый бок животного. После инокуляции в течение 7 дней образуется солидная опухоль, которая достигает приблизительно ~ 100 мм, и биспецифическое антитело (10 мг/кг) или контрольное антитело вводят дважды в неделю в течение трех-четырех недель с помощью внутрибрюшинной инъекции (т.е. внутрибрюшинно). Измерение опухоли производили с помощью штангенциркуля Pressier два раза в неделю, а также регистрировали введение тестируемого образца в ходе экспериментов и массы тела. Объем опухоли рассчитывали с использованием следующего вычисления: длина × ширина × 0,44 = объем (мм) и наносили на график на фиг. 15А. Мышей удаляли из исследования в том случае, если объем опухоли достигал 2000 мм, или животное теряло 20% массы тела до прекращения эксперимента. Подобные результаты наблюдали, когда опухоли измеряли на 7 день после инокуляции, и животных рандомизировали в соответствии с объемом опухоли. Для исследования на животных каждая группа включала 6 мышей. Как следует из данных, приведенных на фиг. 15А, биспецифическое антитело показало значительную противоопухолевую эффективность на ксенотрансплантированной РС-3 мышиной модели. Размер опухоли меньше через 18 дней после инокуляции опухоли, также как для эталонного антитела PD-L1, и продолжает уменьшаться ниже 200 мм. На фиг. 15В показано, что при обработке биспецифическим антителом размера опухоли значительно меньше, чем при обработке изотипическим или эталонным антителом на 35 день после инокуляции. Это указывает на то, что анти-PD-L1-VID/eIgG1 антитела обладают синергическим эффектом противоопухолевой активности у животных. Ксенотрансплантированной РС-3 мышиная модель предварительно продемонстрировала противоопухолевое действие биспецифического антитела и показала его потенциал в качестве терапевтического лекарственного средства в будущем.
[0096] В совокупности эти результаты показали, что биспецифическое антитело поддерживает его блокирование иммунной контрольной точки в отношении сигнала PD-1/PD-L1 и нейтрализует проангиогенный белок VEGF. Исследования для дальнейшего изучения биологической активности этих белков продолжают с использованием подходящей животной модели, такой как РС-3 опухоль в гуманизированной модели NOD.Cg-Prkdcscid I12rgtmIwjI/SzJ (NSG).
[0097] Fc-область в соответствии с настоящим изобретением может быть образована любыми изотипами, подклассами, аллотипами или сконструированными мутантами иммуноглобулина, как например, Fc-фрагмент (фрагменты) типа «выступ и впадина».
[0098] Примеры
[0099] В приведенном ниже примере описано получение моноклональных антител, подходящих для терапевтических целей, нацеленных на человеческий PD-L1 и VEGF. Композитные нейтрализованные домены человека против PD-L1 и VEGF человека были получены из клона 6 анти-PD-L1 антитела и VEGF-захватывающего домена из рецепторов VEGF человека, соответственно. Сегменты последовательности V-области человека были получены из баз данных неродственных последовательностей антител человека (зародышевой и не зародышевой линии).
[00100] Пример 1. Получение антител IgG, которые связываются с PD-L1 и VEGF
[00101] Определенные антитела согласно настоящему изобретению были изначально получены из Fab-фрагментов, связанных с PD-L1 человека. Fab-фрагменты выбирали из фаг-дисплейной библиотеки, библиотеки фагемид OmniMab, после чередующегося пэннинга в отношении соответствующих Fc-слитых белков (PD-L1-Fc) и клеток, экспрессирующих соответствующий белок человека (PD-L1). После прямого скрининга ELISA положительные клоны затем секвенировали в отношении тяжелой цепи и легкой цепи. Эти Fab-фрагменты включали те, которые обозначены как «OM-PD-L1-6» и «OM-PD-L1-32» и т.д. для PD-L1. Анти- PD-L1 антитела PD-L1-клон 6 и PD-L1-клон 32, раскрытые в настоящей заявке, были получены из "OM-PD-L1-6" и "OM-PD-L1-32" в клетках HEK293 или клетках CHO-S. И биспецифическое антитело, нацеленное на PD-L1 и VEGF одновременно, было сконструировано как анти- PD-L1-VID антитело (домен ингибирования VEGF). Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи и вариабельного домен тяжелой цепи данного Fab-фрагмента идентичны аминокислотной последовательности вариабельного домена легкой цепи и вариабельного домена тяжелой цепи, соответственно.
[00102] Пример 2. In vitro связывание анти-PD-L1-VID биспецифического антитела с его соответствующей мишенью
165
[00103] Анти-PD-L1-VID биспецифическое антитело было сконструировано, как показа фиг. 8 и экспрессировалось клетками HEK293 или клетками CHO-S. Среду, содержащую биспецифическое антитело, аффинно очищали от супернатанта культуры посредством хроматографии с применением белка G. Очищенное антитело затем концентрировали, с последующим диализом в PBS буфере и анализировали посредством SDS-PAGE, как показано на фиг. 9. Для исследования прямого связывания очищенных слитых белков с PD-L1 или VEGF посредством ELISA, 100 нг/лунка рекомбинантного PD-L1 наносили на 96-луночный планшет ELISA. Различные концентрации очищенных анти-PD-L1-VID антител затем добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 1 часа. После промывки разведенный 1: 5000 анти-Fab или анти-Fc HRP конъюгат (Jackson Immunochemicals) добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение еще одного часа. После окончательной промывки добавляли субстрат ТМВ (Invitrogen Inc.) и измеряли поглощение OD при 450 нм. Данные анализировали с помощью подбора сигмоидальной кривой с использованием GraphPad Prism 5, и вычисляли ЕС50.
[00104] Пример 3. Антигенсвязывающая специфичность анти-PD-L1-VID согласно анализу FACS
[00105] Для того, чтобы протестировать специфичность связывания анти-PD-L1-VID антител клетки 293 со стабильной экспрессией PD-L1 (человеческие эмбриональные клетки почек), IFN-γ- стимулированные А549 (карцинома легкого) или NCI-H292 (мукоэпидермоидная карцинома легких) окрашивали 3-х кратным серийным разведением из 30 нМ анти-PD-L1-VID антитела в течение 1 часа на льду, а затем трижды промывали с применением 1×PBS. Связанные слитые белки антител обнаруживали с использованием антитела козы против IgG человека (H+L), конъюгированного с Аlеха-488, с последующим анализом FACS. Изотипическое антитело использовали в качестве отрицательного контроля для теста. Результаты показали, что анти-PD-L1-VID антитело сохраняет свою антигенсвязывающую специфичность по сравнению с антителом только против PD-L1 (фиг. 16А, 16В и 16С).
[00106] Пример 4. In vitro иммуномодулирующий эффект анти-PD-L1-VID биспецифического антитела
[00107] Для того, чтобы измерить способность анти-PD-L1-VID антител модулировать чувствительность Т-клеток, очищенные Т-клетки культивировали с аллогенными дендритными клетками, полученными культивированием моноцитов в GM-CSF и IL-4 в течение нескольких дней. Параллельные планшеты были установлены для сбора супернатантов на день 3 и день 5 для измерения IL-2 и IFN-γ, соответственно, с использованием коммерческого набора ELISA. Гуманизированное анти-PD-L1 антитело MPDL3280A (Genentech/Roche) получали собственными силами и использовали в качестве положительного контроля. Как показывают данные, приведенные на фиг. 13А и 13В, продукция IL2 и IFN-γ сильно повышена при обработке биспецифическим антителом, также как эталонным антителом через 3 или 5 дней после обработки антителом. Выявлено, что биспецифическое антитело все еще обладает способностью ингибировать взаимодействие PD-1/PD-L1 между Т-клетками и дендритными клетками, активируя активность Т-клеток.
[00108] Пример 5. Увеличение лейкоцитов человека, вызванное биспецифическими антителами in vivo
[00109] Отсутствие обнаруживаемой перекрестной реактивности анти-PD-L1 антитела с мышиным PD-L1 и потребность в наличии иммунных клеток человека требовали разработки моделей для функциональной оценки in vivo биспецифических антител. Мыши с генетическим фоном NOD, несущие мутацию тяжелого комбинированного иммунодефицита (SCID) и дефицит в общей гамма-цепи рецептора IL-2 (обычно называемый NSG), способны поддерживать приживление большого количества лейкоцитов периферической крови человека (huPBL) и поддерживать приживление в течение по меньшей мере 30 дней (King et al., 2008). Эту мышиную модель, также известную как модель huPBL-NSG, использовали для оценки функционального эффекта in vivo системного введения антител на иммунные клетки человека.
+
[00110] В частности, 6 миллионов свежевыделенных РВМС человека адоптивно переносили путем внутривенной инъекции мышам huPBL-NSG. Через девять дней после инъекций РВМС животным вводили 1 мг/кг только моно-антитела, только биспецифического антитела или только антитела изотипического контроля посредством внутрибрюшинной инъекции. На 24-28 день после ксенотрансплантации РВМС, РВМС окрашивали анти-CD45 антителами человека и мыши, оцениваемыми с помощью проточной цитометрии. Прямой и боковой профили светорассеяния были использованы для определения лимфоцитарных ворот.Биспецифические антитела были способны усилить увеличение лейкоцитов человека, о чем свидетельствует увеличение доли клеток CD45 человека в периферической крови ксенотрансплантированных мышей. Для каждой группы число мышей составляло n≥6 мышей.
[00111] Пример 6. Ингибирование роста опухолевых клеток РС-3 или А498 в huPBL-NSG посредством анти-PD-L1-VID/eIgG1 антитела
#

6
[00112] PD-L1-положительную клеточную линию рака предстательной железы человека, РС-3 (АТСС CRL-1435) или клеточную линию рака почки А498 (АТСС НТВ-44™) можно использовать для создания ксенотрансплантатных моделей на мышах huPBL-NSG. Для образования опухоли 3×10 клеток РС-3 (или клеток А498) на мышь инъецировали подкожно мышам huPBL-NSG, как описано выше. Для того, чтобы оценить ингибирующее влияние на рост опухоли, различные концентрации от 0,1 до 3 мг/кг анти-PD-L1-VID/eIgG1 антитела, эталонного антитела или изотипического антитела вводили внутривенно два раза в неделю в течение 4 недель мышам через 14 дней после имплантации опухолевых клеток. Рост опухоли измеряли два раза в неделю до 5 недель, как описано для мышиной модели Fox Chase SCIDBeige.
[00113] Пример 7. Фармакокинетическая оценка анти-PD-L1-VID/eIgG1 на мышах и макаках
[00114] От 10 мг/кг до 40 мг/кг бифункциональных белков анти-PD-L1-VID/eIgG1 вводили мышам или макакам посредством подкожной инъекции или внутривенной инъекции. Образцы сыворотки отбирали в разные моменты времени после инъекции вплоть до 15 дней. Концентрации Fc-слитого белка в образцах сыворотки определяли с помощью сэндвич-варианта анализа ELISA.
[00115] Хотя настоящее изобретение было описано с помощью примера (примеров) и с точки зрения предпочтительного варианта (вариантов) осуществления, необходимо понимать, что раскрытие не ограничено ими. Напротив, предполагается, что оно охватывает различные модификации и подобные средства и методики, и, следовательно, объем прилагаемой формулы изобретения должен соответствовать самой широкой интерпретации, с тем чтобы охватывать все такие модификации и подобные средства и методики.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОЛСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  АП Биосайнсес, Инк.
<120>  БИФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ БЕЛКИ, КОМБИНИРУЮЩИЕ БЛОКАДУ КОНТРОЛЬНОЙ ТОЧКИ,
ДЛЯ ТАРГЕТНОЙ ТЕРАПИИ
<130>  9022-1900530
<140>  PCT/US2019/019786
<141>  2019-02-27
<150>  US 62/636,825
<151>  2018-02-28
<160>  27
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  732
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  1
Ser Lys Leu Lys Asp Pro Glu Leu Ser Leu Lys Gly Thr Gln His Ile
1               5                   10                  15
Met Gln Ala Gly Gln Thr Leu His Leu Gln Cys Arg Gly Glu Ala Ala
20                  25                  30
His Lys Trp Ser Leu Pro Glu Met Val Ser Lys Glu Ser Glu Arg Leu
35                  40                  45
Ser Ile Thr Lys Ser Ala Cys Gly Arg Asn Gly Lys Gln Phe Cys Ser
50                  55                  60
Thr Leu Thr Leu Asn Thr Ala Gln Ala Asn His Thr Gly Phe Tyr Ser
65                  70                  75                  80
Cys Lys Tyr Leu Ala Val Pro Thr Ser Lys Lys Lys Glu Thr Glu Ser
85                  90                  95
Ala Ile Tyr Ile Phe Ile Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met
100                 105                 110
Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu
115                 120                 125
Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys
130                 135                 140
Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp
145                 150                 155                 160
Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile
165                 170                 175
Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr
180                 185                 190
Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Gln Ile
195                 200                 205
Ser Thr Pro Arg Pro Val Lys Leu Leu Arg Gly His Thr Leu Val Leu
210                 215                 220
Asn Cys Thr Ala Thr Thr Pro Leu Asn Thr Arg Val Gln Met Thr Trp
225                 230                 235                 240
Ser Tyr Pro Asp Glu Lys Asn Lys Arg Ala Ser Val Arg Arg Arg Ile
245                 250                 255
Asp Gln Ser Asn Ser His Ala Asn Ile Phe Tyr Ser Val Leu Thr Ile
260                 265                 270
Asp Lys Met Gln Asn Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Thr Cys Arg Val Arg
275                 280                 285
Ser Gly Pro Ser Phe Lys Ser Val Asn Thr Ser Val His Ile Tyr Asp
290                 295                 300
Lys Ala Phe Ile Thr Val Lys His Arg Lys Gln Gln Val Leu Glu Thr
305                 310                 315                 320
Val Ala Gly Lys Arg Ser Tyr Arg Leu Ser Met Lys Val Lys Ala Phe
325                 330                 335
Pro Ser Pro Glu Val Val Trp Leu Lys Asp Gly Leu Pro Ala Thr Glu
340                 345                 350
Lys Ser Ala Arg Tyr Leu Thr Arg Gly Tyr Ser Leu Ile Ile Lys Asp
355                 360                 365
Val Thr Glu Glu Asp Ala Gly Asn Tyr Thr Ile Leu Leu Ser Ile Lys
370                 375                 380
Gln Ser Asn Val Phe Lys Asn Leu Thr Ala Thr Leu Ile Val Asn Val
385                 390                 395                 400
Lys Pro Gln Ile Tyr Glu Lys Ala Val Ser Ser Phe Pro Asp Pro Ala
405                 410                 415
Leu Tyr Pro Leu Gly Ser Arg Gln Ile Leu Thr Cys Thr Ala Tyr Gly
420                 425                 430
Ile Pro Gln Pro Thr Ile Lys Trp Phe Trp His Pro Cys Asn His Asn
435                 440                 445
His Ser Glu Ala Arg Cys Asp Phe Cys Ser Asn Asn Glu Glu Ser Phe
450                 455                 460
Ile Leu Asp Ala Asp Ser Asn Met Gly Asn Arg Ile Glu Ser Ile Thr
465                 470                 475                 480
Gln Arg Met Ala Ile Ile Glu Gly Lys Asn Lys Met Ala Ser Thr Leu
485                 490                 495
Val Val Ala Asp Ser Arg Ile Ser Gly Ile Tyr Ile Cys Ile Ala Ser
500                 505                 510
Asn Lys Val Gly Thr Val Gly Arg Asn Ile Ser Phe Tyr Ile Thr Asp
515                 520                 525
Val Pro Asn Gly Phe His Val Asn Leu Glu Lys Met Pro Thr Glu Gly
530                 535                 540
Glu Asp Leu Lys Leu Ser Cys Thr Val Asn Lys Phe Leu Tyr Arg Asp
545                 550                 555                 560
Val Thr Trp Ile Leu Leu Arg Thr Val Asn Asn Arg Thr Met His Tyr
565                 570                 575
Ser Ile Ser Lys Gln Lys Met Ala Ile Thr Lys Glu His Ser Ile Thr
580                 585                 590
Leu Asn Leu Thr Ile Met Asn Val Ser Leu Gln Asp Ser Gly Thr Tyr
595                 600                 605
Ala Cys Arg Ala Arg Asn Val Tyr Thr Gly Glu Glu Ile Leu Gln Lys
610                 615                 620
Lys Glu Ile Thr Ile Arg Asp Gln Glu Ala Pro Tyr Leu Leu Arg Asn
625                 630                 635                 640
Leu Ser Asp His Thr Val Ala Ile Ser Ser Ser Thr Thr Leu Asp Cys
645                 650                 655
His Ala Asn Gly Val Pro Glu Pro Gln Ile Thr Trp Phe Lys Asn Asn
660                 665                 670
His Lys Ile Gln Gln Glu Pro Gly Ile Ile Leu Gly Pro Gly Ser Ser
675                 680                 685
Thr Leu Phe Ile Glu Arg Val Thr Glu Glu Asp Glu Gly Val Tyr His
690                 695                 700
Cys Lys Ala Thr Asn Gln Lys Gly Ser Val Glu Ser Ser Ala Tyr Leu
705                 710                 715                 720
Thr Val Gln Gly Thr Ser Asp Lys Ser Asn Leu Glu
725                 730
<210>  2
<211>  745
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  2
Ala Ser Val Gly Leu Pro Ser Val Ser Leu Asp Leu Pro Arg Leu Ser
1               5                   10                  15
Ile Gln Lys Asp Ile Leu Thr Ile Lys Ala Asn Thr Thr Leu Gln Ile
20                  25                  30
Thr Cys Arg Gly Gln Arg Asp Leu Asp Trp Leu Trp Pro Asn Asn Gln
35                  40                  45
Ser Gly Ser Glu Gln Arg Val Glu Val Thr Glu Cys Ser Asp Gly Leu
50                  55                  60
Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ile Pro Lys Val Ile Gly Asn Asp Thr Gly
65                  70                  75                  80
Ala Tyr Lys Cys Phe Tyr Arg Glu Thr Asp Leu Ala Ser Val Ile Tyr
85                  90                  95
Val Tyr Val Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser Val Ser Asp
100                 105                 110
Gln His Gly Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys Thr Val Val
115                 120                 125
Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser Leu Cys Ala
130                 135                 140
Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg Ile Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile Ser Tyr Ala
165                 170                 175
Gly Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser Tyr Gln Ser
180                 185                 190
Ile Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val Val
195                 200                 205
Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val
210                 215                 220
Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn
225                 230                 235                 240
Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg
245                 250                 255
Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr
260                 265                 270
Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys
275                 280                 285
Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg
290                 295                 300
Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met Glu Ser Leu
305                 310                 315                 320
Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala Lys Tyr Leu
325                 330                 335
Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly Ile Pro Leu
340                 345                 350
Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr Ile Met Glu
355                 360                 365
Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu Thr Asn Pro
370                 375                 380
Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val Val Tyr Val
385                 390                 395                 400
Pro Pro Gln Ile Gly Glu Lys Ser Leu Ile Ser Pro Val Asp Ser Tyr
405                 410                 415
Gln Tyr Gly Thr Thr Gln Thr Leu Thr Cys Thr Val Tyr Ala Ile Pro
420                 425                 430
Pro Pro His His Ile His Trp Tyr Trp Gln Leu Glu Glu Glu Cys Ala
435                 440                 445
Asn Glu Pro Ser Gln Ala Val Ser Val Thr Asn Pro Tyr Pro Cys Glu
450                 455                 460
Glu Trp Arg Ser Val Glu Asp Phe Gln Gly Gly Asn Lys Ile Glu Val
465                 470                 475                 480
Asn Lys Asn Gln Phe Ala Leu Ile Glu Gly Lys Asn Lys Thr Val Ser
485                 490                 495
Thr Leu Val Ile Gln Ala Ala Asn Val Ser Ala Leu Tyr Lys Cys Glu
500                 505                 510
Ala Val Asn Lys Val Gly Arg Gly Glu Arg Val Ile Ser Phe His Val
515                 520                 525
Thr Arg Gly Pro Glu Ile Thr Leu Gln Pro Asp Met Gln Pro Thr Glu
530                 535                 540
Gln Glu Ser Val Ser Leu Trp Cys Thr Ala Asp Arg Ser Thr Phe Glu
545                 550                 555                 560
Asn Leu Thr Trp Tyr Lys Leu Gly Pro Gln Pro Leu Pro Ile His Val
565                 570                 575
Gly Glu Leu Pro Thr Pro Val Cys Lys Asn Leu Asp Thr Leu Trp Lys
580                 585                 590
Leu Asn Ala Thr Met Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asp Ile Leu Ile Met
595                 600                 605
Glu Leu Lys Asn Ala Ser Leu Gln Asp Gln Gly Asp Tyr Val Cys Leu
610                 615                 620
Ala Gln Asp Arg Lys Thr Lys Lys Arg His Cys Val Val Arg Gln Leu
625                 630                 635                 640
Thr Val Leu Glu Arg Val Ala Pro Thr Ile Thr Gly Asn Leu Glu Asn
645                 650                 655
Gln Thr Thr Ser Ile Gly Glu Ser Ile Glu Val Ser Cys Thr Ala Ser
660                 665                 670
Gly Asn Pro Pro Pro Gln Ile Met Trp Phe Lys Asp Asn Glu Thr Leu
675                 680                 685
Val Glu Asp Ser Gly Ile Val Leu Lys Asp Gly Asn Arg Asn Leu Thr
690                 695                 700
Ile Arg Arg Val Arg Lys Glu Asp Glu Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala
705                 710                 715                 720
Cys Ser Val Leu Gly Cys Ala Lys Val Glu Ala Phe Phe Ile Ile Glu
725                 730                 735
Gly Ala Gln Glu Lys Thr Asn Leu Glu
740                 745
<210>  3
<211>  217
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  3
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20                  25                  30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu
85                  90                  95
Asn Ala Trp Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100                 105                 110
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115                 120                 125
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
130                 135                 140
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
165                 170                 175
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
180                 185                 190
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
195                 200                 205
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210                 215
<210>  4
<211>  118
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  4
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Arg Arg Tyr
20                  25                  30
Ser Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Val Phe Gly Ala Ala Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Phe Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Leu Ser Gly Asp Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  5
<211>  216
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  5
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ser Tyr
20                  25                  30
Asn Ser Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Val Ile Tyr Glu Val Ala Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85                  90                  95
Ser Thr Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100                 105                 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115                 120                 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130                 135                 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
145                 150                 155                 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165                 170                 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180                 185                 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195                 200                 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210                 215
<210>  6
<211>  121
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Lys Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Val Val Pro Gly Tyr Ser Tyr Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  7
<211>  328
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  7
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275                 280                 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly
325
<210>  8
<211>  329
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  константный домен тяжелой цепи сконструированного IgG1 (eIgG1)
<400>  8
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165                 170                 175
Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn
195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225                 230                 235                 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210>  9
<211>  205
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  9
Gly Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1               5                   10                  15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20                  25                  30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35                  40                  45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50                  55                  60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65                  70                  75                  80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85                  90                  95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100                 105                 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115                 120                 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130                 135                 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145                 150                 155                 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165                 170                 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180                 185                 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
195                 200                 205
<210>  10
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  пептидный линкер
<400>  10
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
<210>  11
<211>  20
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  сигнальный пептид
<400>  11
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1               5                   10                  15
Gly Ser Thr Gly
20
<210>  12
<211>  666
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  анти-PD-L1-клон 6 тяжелая цепь-VID/IgG4 биспецифическое антитело
<400>  12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Arg Arg Tyr
20                  25                  30
Ser Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Val Phe Gly Ala Ala Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Phe Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Leu Ser Gly Asp Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
210                 215                 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245                 250                 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260                 265                 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275                 280                 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290                 295                 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305                 310                 315                 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325                 330                 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340                 345                 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355                 360                 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370                 375                 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405                 410                 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420                 425                 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly
435                 440                 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asp Thr
450                 455                 460
Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His
465                 470                 475                 480
Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro
485                 490                 495
Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro
500                 505                 510
Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser
515                 520                 525
Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val
530                 535                 540
Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn
545                 550                 555                 560
Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser
565                 570                 575
Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn
580                 585                 590
Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His
595                 600                 605
Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met
610                 615                 620
Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp
625                 630                 635                 640
Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys
645                 650                 655
Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
660                 665
<210>  13
<211>  669
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  анти-PD-L1-клон 6 тяжелая цепь-VID/eIgG1 биспецифическое антитело
<400>  13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Arg Arg Tyr
20                  25                  30
Ser Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Val Phe Gly Ala Ala Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Phe Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Leu Ser Gly Asp Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210                 215                 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225                 230                 235                 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245                 250                 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260                 265                 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275                 280                 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val
290                 295                 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305                 310                 315                 320
Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325                 330                 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340                 345                 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355                 360                 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370                 375                 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385                 390                 395                 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405                 410                 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420                 425                 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly
435                 440                 445
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
450                 455                 460
Gly Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
465                 470                 475                 480
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
485                 490                 495
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
500                 505                 510
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
515                 520                 525
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
530                 535                 540
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
545                 550                 555                 560
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
565                 570                 575
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
580                 585                 590
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
595                 600                 605
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
610                 615                 620
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
625                 630                 635                 640
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
645                 650                 655
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
660                 665
<210>  14
<211>  49
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  14
Pro Glu Leu Ser Leu Lys Gly Thr Gln His Ile Met Gln Ala Gly Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu His Leu Gln Cys Arg Gly Glu Ala Ala His Lys Trp Ser Leu
20                  25                  30
Pro Glu Met Val Ser Lys Glu Ser Glu Arg Leu Ser Ile Thr Lys Ser
35                  40                  45
Ala
<210>  15
<211>  64
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  15
Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr
1               5                   10                  15
Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys
20                  25                  30
Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr
35                  40                  45
Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His
50                  55                  60
<210>  16
<211>  98
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  16
Ile Asp Val Gln Ile Ser Thr Pro Arg Pro Val Lys Leu Leu Arg Gly
1               5                   10                  15
His Thr Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Thr Thr Pro Leu Asn Thr Arg
20                  25                  30
Val Gln Met Thr Trp Ser Tyr Pro Asp Glu Lys Asn Lys Arg Ala Ser
35                  40                  45
Val Arg Arg Arg Ile Asp Gln Ser Asn Ser His Ala Asn Ile Phe Tyr
50                  55                  60
Ser Val Leu Thr Ile Asp Lys Met Gln Asn Lys Asp Lys Gly Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Thr Cys Arg Val Arg Ser Gly Pro Ser Phe Lys Ser Val Asn Thr Ser
85                  90                  95
Val His
<210>  17
<211>  87
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  17
Thr Val Lys His Arg Lys Gln Gln Val Leu Glu Thr Val Ala Gly Lys
1               5                   10                  15
Arg Ser Tyr Arg Leu Ser Met Lys Val Lys Ala Phe Pro Ser Pro Glu
20                  25                  30
Val Val Trp Leu Lys Asp Gly Leu Pro Ala Thr Glu Lys Ser Ala Arg
35                  40                  45
Tyr Leu Thr Arg Gly Tyr Ser Leu Ile Ile Lys Asp Val Thr Glu Glu
50                  55                  60
Asp Ala Gly Asn Tyr Thr Ile Leu Leu Ser Ile Lys Gln Ser Asn Val
65                  70                  75                  80
Phe Lys Asn Leu Thr Ala Thr
85
<210>  18
<211>  126
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  18
Pro Gln Ile Tyr Glu Lys Ala Val Ser Ser Phe Pro Asp Pro Ala Leu
1               5                   10                  15
Tyr Pro Leu Gly Ser Arg Gln Ile Leu Thr Cys Thr Ala Tyr Gly Ile
20                  25                  30
Pro Gln Pro Thr Ile Lys Trp Phe Trp His Pro Cys Asn His Asn His
35                  40                  45
Ser Glu Ala Arg Cys Asp Phe Cys Ser Asn Asn Glu Glu Ser Phe Ile
50                  55                  60
Leu Asp Ala Asp Ser Asn Met Gly Asn Arg Ile Glu Ser Ile Thr Gln
65                  70                  75                  80
Arg Met Ala Ile Ile Glu Gly Lys Asn Lys Met Ala Ser Thr Leu Val
85                  90                  95
Val Ala Asp Ser Arg Ile Ser Gly Ile Tyr Ile Cys Ile Ala Ser Asn
100                 105                 110
Lys Val Gly Thr Val Gly Arg Asn Ile Ser Phe Tyr Ile Thr
115                 120                 125
<210>  19
<211>  94
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  19
Pro Asn Gly Phe His Val Asn Leu Glu Lys Met Pro Thr Glu Gly Glu
1               5                   10                  15
Asp Leu Lys Leu Ser Cys Thr Val Asn Lys Phe Leu Tyr Arg Asp Val
20                  25                  30
Thr Trp Ile Leu Leu Arg Thr Val Asn Asn Arg Thr Met His Tyr Ser
35                  40                  45
Ile Ser Lys Gln Lys Met Ala Ile Thr Lys Glu His Ser Ile Thr Leu
50                  55                  60
Asn Leu Thr Ile Met Asn Val Ser Leu Gln Asp Ser Gly Thr Tyr Ala
65                  70                  75                  80
Cys Arg Ala Arg Asn Val Tyr Thr Gly Glu Glu Ile Leu Gln
85                  90
<210>  20
<211>  87
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  20
Pro Tyr Leu Leu Arg Asn Leu Ser Asp His Thr Val Ala Ile Ser Ser
1               5                   10                  15
Ser Thr Thr Leu Asp Cys His Ala Asn Gly Val Pro Glu Pro Gln Ile
20                  25                  30
Thr Trp Phe Lys Asn Asn His Lys Ile Gln Gln Glu Pro Gly Ile Ile
35                  40                  45
Leu Gly Pro Gly Ser Ser Thr Leu Phe Ile Glu Arg Val Thr Glu Glu
50                  55                  60
Asp Glu Gly Val Tyr His Cys Lys Ala Thr Asn Gln Lys Gly Ser Val
65                  70                  75                  80
Glu Ser Ser Ala Tyr Leu Thr
85
<210>  21
<211>  65
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  21
Asn Thr Thr Leu Gln Ile Thr Cys Arg Gly Gln Arg Asp Leu Asp Trp
1               5                   10                  15
Leu Trp Pro Asn Asn Gln Ser Gly Ser Glu Gln Arg Val Glu Val Thr
20                  25                  30
Glu Cys Ser Asp Gly Leu Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ile Pro Lys Val
35                  40                  45
Ile Gly Asn Asp Thr Gly Ala Tyr Lys Cys Phe Tyr Arg Glu Thr Asp
50                  55                  60
Leu
65
<210>  22
<211>  67
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  22
Asn Lys Asn Lys Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn
1               5                   10                  15
Leu Asn Val Ser Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro
20                  25                  30
Asp Gly Asn Arg Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro
35                  40                  45
Ser Tyr Met Ile Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile
50                  55                  60
Asn Asp Glu
65
<210>  23
<211>  97
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  23
Tyr Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly
20                  25                  30
Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys
35                  40                  45
Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys
50                  55                  60
Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser
85                  90                  95
Thr
<210>  24
<211>  86
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  24
Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met Glu Ser Leu Val Glu Ala Thr Val
1               5                   10                  15
Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro Pro Pro
20                  25                  30
Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly Ile Pro Leu Glu Ser Asn His Thr
35                  40                  45
Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr Ile Met Glu Val Ser Glu Arg Asp
50                  55                  60
Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu Thr Asn Pro Ile Ser Lys Glu Lys
65                  70                  75                  80
Gln Ser His Val Val Ser
85
<210>  25
<211>  128
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  25
Pro Gln Ile Gly Glu Lys Ser Leu Ile Ser Pro Val Asp Ser Tyr Gln
1               5                   10                  15
Tyr Gly Thr Thr Gln Thr Leu Thr Cys Thr Val Tyr Ala Ile Pro Pro
20                  25                  30
Pro His His Ile His Trp Tyr Trp Gln Leu Glu Glu Glu Cys Ala Asn
35                  40                  45
Glu Pro Ser Gln Ala Val Ser Val Thr Asn Pro Tyr Pro Cys Glu Glu
50                  55                  60
Trp Arg Ser Val Glu Asp Phe Gln Gly Gly Asn Lys Ile Glu Val Asn
65                  70                  75                  80
Lys Asn Gln Phe Ala Leu Ile Glu Gly Lys Asn Lys Thr Val Ser Thr
85                  90                  95
Leu Val Ile Gln Ala Ala Asn Val Ser Ala Leu Tyr Lys Cys Glu Ala
100                 105                 110
Val Asn Lys Val Gly Arg Gly Glu Arg Val Ile Ser Phe His Val Thr
115                 120                 125
<210>  26
<211>  110
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  26
Pro Glu Ile Thr Leu Gln Pro Asp Met Gln Pro Thr Glu Gln Glu Ser
1               5                   10                  15
Val Ser Leu Trp Cys Thr Ala Asp Arg Ser Thr Phe Glu Asn Leu Thr
20                  25                  30
Trp Tyr Lys Leu Gly Pro Gln Pro Leu Pro Ile His Val Gly Glu Leu
35                  40                  45
Pro Thr Pro Val Cys Lys Asn Leu Asp Thr Leu Trp Lys Leu Asn Ala
50                  55                  60
Thr Met Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asp Ile Leu Ile Met Glu Leu Lys
65                  70                  75                  80
Asn Ala Ser Leu Gln Asp Gln Gly Asp Tyr Val Cys Leu Ala Gln Asp
85                  90                  95
Arg Lys Thr Lys Lys Arg His Cys Val Val Arg Gln Leu Thr
100                 105                 110
<210>  27
<211>  87
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  27
Pro Thr Ile Thr Gly Asn Leu Glu Asn Gln Thr Thr Ser Ile Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Ile Glu Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Asn Pro Pro Pro Gln Ile
20                  25                  30
Met Trp Phe Lys Asp Asn Glu Thr Leu Val Glu Asp Ser Gly Ile Val
35                  40                  45
Leu Lys Asp Gly Asn Arg Asn Leu Thr Ile Arg Arg Val Arg Lys Glu
50                  55                  60
Asp Glu Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Cys Ser Val Leu Gly Cys Ala
65                  70                  75                  80
Lys Val Glu Ala Phe Phe Ile
85
<---