ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТАГОНИСТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ БЕТА7 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
HUMANISED ANTI-BETA 7 ANTAGONISTIC ANTIBODIES AND USE THEREOF

В данной заявке, которая не является предварительной заявкой, поданной согласно 37 CFR § 1.53(b)(1), испрашивается приоритет в соответствии с 35 USC § 119(e) на основании предварительной заявки США №60/607377, поданной 3 сентября 2004, полное содержание которой включено в данное описание в качестве ссылки.
Область техники
Настоящее изобретение в основном относится к области молекулярной биологии и регуляции факторов роста. Более конкретно, данное изобретение относится к модуляторам биологической активности интегринов, содержащих субъединицу бета7, а также к применению таких модуляторов.
Предпосылки создания изобретения
Интегрины представляют собой α/β-гетеродимерные рецепторы клеточной поверхности, участвующие в ряде клеточных процессов, от клеточной адгезии до регуляции генов (Hynes, R.O., Cell, 1992, 69:11-25; and Hemler, M.E., Annu. Rev. Immunol., 1990, 8:365-368). Некоторые интегрины участвуют в патологических процессах и вызывают большой интерес как потенциальные мишени для разрабатываемых лекарственных средств (Sharar, S.R. et al., Springer Semin. Immunopathol., 1995, 16:359-378). Интегрины участвуют в иммунологических процессах, таких как транспорт, адгезия и инфильтрация лейкоцитов при воспалительном ответе (Nakajima, H. et al., J. Exp.Med., 1994, 179:1145-1154). Адгезивные свойства клеток регулируются путем изменения экспрессии интегринов, причем в разных воспалительных ответах участвуют разные интегрины. Butcher, E.C. et al., Science, 1996, 272:60-66. Интегрины бета7 (т.е. альфа4бета7 (α4β7) и альфаЕбета7 (αEβ7)) экспрессируются преимущественно на моноцитах, лимфоцитах, эозинофилах, базофилах и макрофагах, но не на нейтрофилах. Elices, M.J. et al., Cell, 1990, 60:577-584. Основными лигандами интегрина α4β7 являются эндотелиальные поверхностные белки, к которым относятся молекулы клеточной адгезии - мукозные адрессины (MAdCAM) и молекулы адгезии сосудистых клеток (VCAM-I) (Makarem, R. et al., J. Biol. Chem., 1994, 269:4005-4011). Связывание α4β7 с MAdCAM и/или VCAM, экспрессирующимися на наружных эндотелиальных венулах (HEV) в участках воспаления, приводит к прочной адгезии лейкоцитов к эндотелию, с последующим проникновением в воспаленную ткань (Chuluyan, H.E. et al., Springer Semin. Immunopathol., 1995, 16:391-404). Основным лигандом интегрина αEβ7 является поверхностный белок внутриэпителиальных лимфоцитов (IEL) E-кадгерин, который обеспечивает прилипание αEβ7-несущей клетки к эпителиальным лимфоцитам. Показано, что моноклональные антитела против α4β7, MAdCAM или VCAM являются эффективными модуляторами хронических воспалительных заболеваний у животных моделей, таких как астма (Laberge, S. et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 1995, 151:822-829), ревматоидный артрит (RA; Barbadillo, C. et al., Springer Semin. ImmunopathoL, 1995, 16:375-379), колит (Viney et al, J. Immunol., 1996, 157: 2488-2497) и воспалительное заболевание кишечника (IBD; Podalski, D.K., N. Eng. J. Med., 1991, 325:928-937; Powrie, F. et al., Ther. Immunol., 1995, 2:115-123). Показано, что моноклональные антитела против субъединицы бета7 связываются с данной субъединицей интегринов (Tidswell, M. et al. (1997) J. Immunol. 159:1497-1505), однако поскольку эти антитела не являются человеческими или гуманизированными, они не могут иметь клинического применения.
Существует потребность в высокоспецифических соединениях, таких как гуманизированные антитела или их связывающие фрагменты, которые способны ингибировать взаимодействие между интегрином альфа4бета7 и его лигандами MAdCAM и/или VCAM, а также взаимодействие между интегрином альфаЕбета7 и его лигандом E-кадгерином. Такие соединения можно использовать для лечения хронических воспалительных заболеваний, таких как астма, болезнь Крона, язвенный колит, диабет, осложнения при трансплантации органов и заболевания, связанные с аллотрансплантацией.
Все упоминаемые ссылки, в том числе патентные заявки и публикации, включены в данное описание в качестве ссылки во всей полноте.
Описание изобретения
Данное изобретение частично основано на идентификации ряда антагонистов биологических путей, в которых участвуют бета7-содержащие интегрины и которые в большинстве случаев относятся к биологическим/клеточным процессам, представляющим собой важные и перспективные терапевтические мишени. Такие биологические процессы включают в себя, без ограничения, воспаление, в частности хронические воспалительные заболевания, такие как астма, аллергия, IBD, диабет, заболевания, связанные с трансплантацией, и реакции "трансплантат против хозяина". В данном изобретении предложены композиции и способы, направленные на ингибирование клеточной адгезии и/или клеточного рекрутинга, опосредованных интегрином бета7, которое включает в себя, без ограничения, ингибирование связывания MAdCAM и VCAM-1 с внеклеточным фрагментом интегрина альфа4бета7 и ингибирование взаимодействия E-кадгерина с интегрином альфаЕбета7. Как описано в данном документе, на основе антагонистов согласно изобретению можно получить важные терапевтические и диагностические средства, направленные на патологические состояния, связанные с аномальной или нежелательной передачей сигнала, опосредованной интегрином бета7. Соответственно, в данном изобретении предложены способы, композиции, наборы и промышленные изделия, направленные на модуляцию интегрин бета7-опосредованных путей, включающую в себя модулирование связывания MAdCAM-альфа4бета7 и рекрутинга лейкоцитов в эпителий желудочно-кишечного тракта при аллергии, астме, IBD (такой как болезнь крона и язвенный колит), диабете, воспалении, сопровождающем трансплантацию, реакции "трансплантант против хозяина" и/или нарушениях при аллотрансплантации, а также при других биологических/физиологических процессах, опосредованных интегрином бета7.
В одном аспекте настоящего изобретения предложены терапевтические средства против бета7, подходящие для терапевтического применения и способные воздействовать на различные нарушения интегрин бета7-опосредованного пути. Например, в одном воплощении данного изобретения предложено гуманизированное антитело против бета7, где антитело в виде фрагмента Fab обладает практически таким же сродством связывания с человеческим бета7, как и у мышиного фрагмента Fab, включающего в себя, содержащего или в основном содержащего последовательности вариабельных доменов легкой цепи и тяжелой цепи, как изображено на фиг.1A и 1B, или на фиг.9A и 9B. В другом воплощении данного изобретения предложено гуманизированное антитело против бета7, где сродство связывания антитела в виде фрагмента Fab с человеческим бета7 по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 7 раз или по меньшей мере в 10 раз ниже, чем сродство связывания мышиного или крысиного фрагмента Fab, включающего в себя, содержащего или в основном содержащего последовательности вариабельных доменов легкой цепи и тяжелой цепи, как изображено на фиг.1A и 1B или на фиг.9A и 9B. Альтернативно, гуманизированное антитело против бета7 или его фрагмент, связывающий бета7, согласно изобретению обладает моновалентным сродством к человеческому бета7, причем данное сродство по существу равно моновалентному сродству или превышает моновалентное сродство к человеческому бета7 антитела, содержащего вариабельные последовательности легкой цепи и тяжелой цепи, как изображено на фиг.1A (SEQ ID NO: 10) и/или фиг.1B (SEQ ID NO: 11), или на фиг.9A (SEQ ID NO: 12), и/или на фиг.9B (SEQ ID NO: 13). Сродство антитела или его связывающего фрагмента с высокой аффинностью в отношении человеческого бета7 по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 100 раз, по меньшей мере в 500 раз, по меньшей мере в 1000 раз, по меньшей мере в 5000 раз или по меньшей мере в 10000 раз выше, чем сродство антитела, содержащего последовательности легкой цепи и тяжелой цепи, как изображено на фиг.1A (SEQ ID NO: 10) и/или фиг.1B (SEQ ID NO: 11), или на фиг.9A (SEQ ID NO: 12) и/или фиг.9B (SEQ ID NO: 13).
В другом воплощении данное изобретение связано с гуманизированным антителом против бета7, где антитело в виде фрагмента Fab обладает сродством связывания с человеческим бета7, которое, например, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 7 раз, по меньшей мере в 9 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 15 раз, по меньшей мере в 20 раз или по меньшей мере в 100 раз выше, чем сродство связывания фрагмента Fab грызунов (таких, как крысы или мыши), включающего в себя, содержащего или в основном содержащего последовательности вариабельных доменов легкой цепи и тяжелой цепи, как изображено на фиг.1A и фиг.1B соответственно. В одном воплощении указанный фрагмент Fab грызунов обладает сродством связывания фрагмента Fab, содержащего последовательности вариабельных доменов крысиного антитела FIB504.64, полученного с использованием гибридомной клеточной линии, депонированной в Американской коллекции типовых культур под номером ATCC HB-293. В следующем воплощении гуманизированный фрагмент Fab согласно изобретению обладает сродством связывания фрагмента Fab, содержащего последовательности вариабельных доменов, полученные из гуманизированных антител против бета7 согласно изобретению. В данной области хорошо известно, что сродство связывания лиганда с рецептором можно определить с помощью разных анализов и выразить в виде ряда количественных значений. Соответственно, в одном воплощении сродство связывания выражают в виде значений Kd и подразумевают собственное сродство связывания (например, с минимизированной авидностью). В основном и предпочтительно сродство связывания измеряют in vitro, в бесклеточной среде или в среде, содержащей клетки. Как описано в данном документе, степень различия в сродстве связывания можно количественно выразить в виде отношения значения сродства связывания гуманизированного антитела в виде Fab к значению сродства связывания Fab антитела отнесения/сравнения (например, мышиного антитела, содержащего донорные последовательности гипервариабельных участков), где значения сродства связывания определяют в одинаковых условиях. Так, в одном воплощении степень различия сродства связывания определяют как отношение значений Kd гуманизированного антитела в виде Fab и указанного Fab антитела отнесения/сравнения. Для измерения сродства связывания можно использовать любые известные в данной области анализы, в том числе описанные в данном документе, например, Biacore (Biacore International Ab, Uppsala, Sweden) и ELISA.
Разные аспекты и воплощения антагонистического антитела против бета7 согласно изобретению отражены в возможных пунктах формулы изобретения:
1. Антитело, представляющее собой антитело против бета7 или его бета7-связывающий фрагмент, которое включает в себя
(a) по меньшей мере одну, две, три, четыре или пять последовательностей гипервариабельных участков (HVR), выбранных из группы, состоящей из
(i) HVR-L1, содержащего последовательность A1-A11, где A1-A11 означает RASESVDTYLH (SEQ ID NO: 1)
(ii) HVR-L2, содержащего последовательность B1-B8, где B1-B8 означает KYASQSIS (SEQ ID NO: 2)
(iii) HVR-L3, содержащего последовательность C1-C9, где C1-C9 означает QQGNSLPNT (SEQ ID NO: 3)
(iv) HVR-H1, содержащего последовательность D1-D10, где D1-D10 означает GFFITNNYWG (SEQ ID NO: 4)
(v) HVR-H2, содержащего последовательность E1-E17, где E1-E17 означает GYISYSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 5); и
(vi) HVR-H3, содержащего последовательность F2-F11, где F2-F11 означает MTGSSGYFDF (SEQ ID NO: 6).
В воплощении полипептида или антитела по п.1 полипептид или антитело содержит по меньшей мере один вариант HVR, где вариантная последовательность HVR включает в себя по меньшей мере один остаток по меньшей мере одной из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9. В другом воплощении п.1 или п.2 данное изобретение включает в себя антитело против бета7 или его бета7-связывающий фрагмент, содержащий один, два, три, четыре, пять или шесть гипервариабельных участков (HVR), выбранных из группы, состоящей из HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3,
где (i) HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность RASESVDTYLH (SEQ ID NO: 1); RASESVDSLLH (SEQ ID NO: 7), RASESVDTLLH (SEQ ID NO: 8) или RASESVDDLLH (SEQ ID NO: 9);
(ii) HVR-L2 содержит аминокислотную последовательность KYASQSIS (SEQ ID NO: 2), RYASQSIS (SEQ ID NO: 67) или XYASQSIS (SEQ ID NO: 68, где X означает любую аминокислоту),
(iii) HVR-L3 содержит QQGNSLPNT (SEQ ID NO: 3),
(iv) HVR-H1 содержит аминокислотную последовательность GFFITNNYWG (SEQ ID NO: 4),
(v) HVR-H2 содержит аминокислотную последовательность GYISYSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 5) и
(vi) HVR-H3 содержит аминокислотную последовательность MTGSSGYFDF (SEQ ID NO: 6) или RTGSSGYFDF (SEQ ID NO: 66) в относительных положениях F2-F11; или данный участок содержит аминокислотную последовательность F1-F11, где F1-F11 означает AMTGSSGYFDF (SEQ ID NO: 63), ARTGSSGYFDF (SEQ ID NO: 64) или AQTGSSGYFDF (SEQ ID NO: 65).
В следующем воплощении п.1 или в любом из его воплощений данное изобретение связано с антителом против бета7 или его бета7-связывающим фрагментом, которое содержит один, два, три, четыре, пять или шесть гипервариабельных участков (HVR), выбранных из группы, состоящей из HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3,
где (i) HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность A1-A11, где A1-A11 означает RASESVDTYLH (SEQ ID NO: 1); RASESVDSLLH (SEQ ID NO: 7), RASESVDTLLH (SEQ ID NO: 8) или RASESVDDLLH (SEQ ID NO: 9), или вариант SEQ ID NO: 1, 7, 8 или 9, где аминокислота A2 выбрана из группы, состоящей из A, G, S, T и V, и/или аминокислота A3 выбрана из группы, состоящей из S, G, I, K, N, P, Q, R и T, и/или A4 выбрана из группы, состоящей из E, V, Q, A, D, G, H, I, K, L, N и R, и/или аминокислота A5 выбрана из группы, состоящей из S, Y, A, D, G, H, I, K, N, P, R, T и V, и/или аминокислота A6 выбрана из группы, состоящей из V, R, I, A, G, K, L, M и Q, и/или аминокислота A7 выбрана из группы, состоящей из D, V, S, A, E, G, H, I, K, L, N, P, S и T, и/или аминокислота A8 выбрана из группы, состоящей из D, G, N, E, T, P и S, и/или аминокислота A9 выбрана из группы, состоящей из L, Y, I и M, и/или аминокислота A10 выбрана из группы, состоящей из L, A, I, M и V, и/или аминокислота A11 выбрана из группы, состоящей из H, Y, F и S;
(ii) HVR-L2 содержит аминокислотную последовательность B1-B8, где B1-B8 означает KYASQSIS (SEQ ID NO: 2), RYASQSIS (SEQ ID NO: 67) или XYASQSIS (SEQ ID NO: 68, где X означает любую аминокислоту), или вариант SEQ ID NO: 2, 67 или 68, где аминокислота B1 выбрана из группы, состоящей из K, R, N, V, A, F, Q, H, P, I, L, Y и X (где X означает любую аминокислоту), и/или аминокислота B4 выбрана из группы, состоящей из S и D, и/или аминокислота B5 выбрана из группы, состоящей из Q и S, и/или аминокислота B6 выбрана из группы, состоящей из S, D, L и R, и/или аминокислота B7 выбрана из группы, состоящей из I, V, E и K;
(iii) HVR-L3 содержит аминокислотную последовательность C1-C9, где C1-C9 означает QQGNSLPNT (SEQ ID NO: 3) или вариант SEQ ID NO: 3, где аминокислота С8 выбрана из группы, состоящей из N, V, W, Y, R, S, T, A, F, H, I, L, M и Y;
(iv) HVR-H1 содержит аминокислотную последовательность D1-D10, где D1-D10 означает GFFITNNYWG (SEQ ID NO: 4),
(v) HVR-H2 содержит аминокислотную последовательность E1-E17, где E1-E17 означает GYISYSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 5) или вариант SEQ ID NO: 5, где аминокислота Е2 выбрана из группы, состоящей из Y, F, V и D, и/или аминокислота Е6 выбрана из группы, состоящей из S и G, и/или аминокислота Е10 выбрана из группы, состоящей из S и Y, и/или аминокислота Е12 выбрана из группы, состоящей из N, T, A и D, и/или аминокислота Е13 выбрана из группы, состоящей из P, H, D и A, и/или аминокислота Е15 выбрана из группы, состоящей из L и V, и/или аминокислота Е17 выбрана из группы, состоящей из S и G, и
(vi) HVR-H3 содержит аминокислотную последовательность F2-F11, где F2-F11 означает MTGSSGYFDF (SEQ ID NO: 6) или RTGSSGYFDF (SEQ ID NO: 66); или содержит аминокислотную последовательность F1-F11, где F1-F11 означает AMTGSSGYFDF (SEQ ID NO: 63), ARTGSSGYFDF (SEQ ID NO: 64) или AQTGSSGYFDF (SEQ ID NO: 65), или вариант SEQ ID NO: 6, 63, 64, 65 или 66, где аминокислота F2 представляет собой R, M, A, E, G, Q, S, и/или аминокислота F11 выбрана из группы, состоящей из F и Y.
В одном из воплощений п.1 или в любом антителе согласно изобретению аминокислота в положении 71 (по системе нумерации Кабат) каркасного участка тяжелой цепи выбрана из группы, состоящей из R, A и T, и/или аминокислота в положении 73 (по системе нумерации Кабат) каркасного участка тяжелой цепи выбрана из группы, состоящей из N и T, и/или аминокислота в положении 78 (по системе нумерации Кабат) каркасного участка тяжелой цепи выбрана из группы, состоящей из F, A и L.
В одном воплощении п.1 или в любом антителе согласно изобретению HVR-L1 антитела согласно изобретению содержит последовательность SEQ ID NO: 1. В одном воплощении HVR-L2 антитела согласно изобретению содержит последовательность SEQ ID NO: 2. В одном воплощении HVR-L3 антитела согласно изобретению содержит последовательность SEQ ID NO: 3. В одном воплощении HVR-H1 антитела согласно изобретению содержит последовательность SEQ ID NO: 4. В одном воплощении HVR-H2 антитела согласно изобретению содержит последовательность SEQ ID NO: 5. В одном воплощении HVR-H3 антитела согласно изобретению содержит последовательности SEQ ID NO: 6 или 66 в относительных положениях F2-F11, или SEQ ID NO: 63, 64 или 65 в относительных положениях F1-F11. В одном воплощении HVR-L1 содержит RASESVDSLLH (SEQ ID NO: 7). В одном воплощении HVR-L1 содержит RASESVDTLLH (SEQ ID NO: 8). В одном воплощении HVR-L1 содержит RASESVDDLLH (SEQ ID NO: 9). В одном воплощении антитело согласно изобретению, содержащее указанные последовательности (как здесь указано в сочетании), является гуманизированным или человеческим.
В одном аспекте данного изобретения предложено антитело, содержащее один, два, три, четыре, пять или шесть HVR, где каждый HVR включает в себя, содержит или преимущественно содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9, и где SEQ ID NO: 1, 7, 8 или 9 соответствуют HVR-L1, SEQ ID NO: 2 соответствует HVR-L2, SEQ ID NO: 3 соответствует HVR-L3, SEQ ID NO: 4 соответствует HVR-H1, SEQ ID NO: 5 соответствует HVR-H2, а SEQ ID NO: 6 соответствует HVR-H3. В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, которые имеют последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 и 6 соответственно. В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, которые имеют последовательности SEQ ID NO: 7, 2, 3, 4, 5 и 6 соответственно. В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, которые имеют последовательности SEQ ID NO: 8, 2, 3, 4, 5 и 6 соответственно. В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, которые имеют последовательности SEQ ID NO: 9, 2, 3, 4, 5 и 6 соответственно. В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, которые имеют последовательности SEQ ID NO: 9, 2, 3, 4, 5 и 66, или SEQ ID NO: 9, 2, 3, 4, 5, 63, или SEQ ID NO: 9, 2, 3, 4, 5, 64, или SEQ ID NO: 9, 2, 3, 4, 5 и 65, или SEQ ID NO: 9, 67, 3, 4, 5, 64, или SEQ ID NO: 9, 68, 3, 4, 5, 64.
Вариантные HVR, входящие в состав антитела согласно изобретению, могут содержать модификации одного или нескольких остатков, кроме того, HVR и/или каркасные участки могут быть гуманизированными. Воплощения согласно изобретению, несущие модификации в HVR и/или каркасном участке, включают в себя, без ограничения, нижеследующие возможные пункты формулы изобретения:
2. Антитело по п.1 или любое из его воплощений, где A8 в вариантном HVR-L1 означает S, D или T, а A9 означает L.
3. Антитело по п.1 или любое из его воплощений, где антитело является гуманизированным.
4. Антитело по п.1 или любое из его воплощений, где по меньшей мере часть каркасной последовательности представляет собой консенсусную последовательность человеческого каркасного участка.
5. Антитело по п.1 или любое из его воплощений, где указанная модификация представляет собой замену, вставку или делецию.
6. Антитело по п.1 или любое из его воплощений, где вариант HVR-L1 содержит 1-10 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) замен в любом сочетании следующих положений: A2 (G, S, T или V); A3 (G, I, K, N, P, Q, R или T), A4 (A, D, G, H, I, K, L, N, Q, R или V), A5 ( A, D, G, H, I, K, N, P, R, T, V или Y), A6 (A, G, I, K, L, M, Q или R), A7 (A, E, G, H, I, K, L, N, P, S, T или V), A8 (S, D, E, G, P или N) и A9 (L, I или M), A10 (A, I, M или V) и A11 (F, S или Y).
7. Антитело по п.1 или любое из его воплощений, где вариант HVR-L2 содержит 1-4 (1, 2, 3 или 4) замен в любом сочетании следующих положений: B1 (N), B5 (S), B6 (R или L) и B7 (T, E, K или V).
8. Антитело по п.1 или любое из его воплощений, где вариант HVR-L3 содержит по меньшей мере одну замену в положении C8 (W, Y, R, S, A, F, H, I, L, M, N, T или V).
9. Антитело по п.1 или любое из его воплощений, где вариант HVR-H2 содержит 1-7 (1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7) замен в любом сочетании следующих положений: E2 (V, D или F), E6 (G), E10 (Y), E12 (A, D или T), E13 (D, A или H), E15 (V), E17 (G).
10. Антитело по п.1 или любое из его воплощений, где вариант HVR-H3 содержит 1 или 2 замены в любом сочетании следующих положений: F2 (A, E, G, Q, R или S) и F11 (Y).
11. Антитело по п.1 или любое из его воплощений, которое содержит HVR-L1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 7.
12. Антитело по п.1 или любое из его воплощений, которое содержит HVR-L1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 8.
13. Антитело по п.1 или любое из его воплощений, которое содержит HVR-L1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 9.
14. Антитело по любому из п.п.11-13, тяжелая цепь которого содержит консенсусную последовательность каркасного участка человеческой тяжелой цепи подгруппы III, несущую замену в положении 71, 73 и/или 78.
15. Антитело по п.14, где указанная замена включает в себя R71A, N73T и/или N78A.
16. Антитело по п.1 или любое из его воплощений, которое содержит HVR-L3, имеющий последовательность SEQ ID NO: 3.
17. Антитело по п.1 или любое из его воплощений, где A8 в вариантном HVR-L1 означает S.
18. Антитело по п.1 или любое из его воплощений, где A8 в вариантном HVR-L1 означает D.
19. Антитело по п.1 или любое из его воплощений, где A9 в вариантном HVR-L1 означает L.
20. Антитело по п.1 или любое из его воплощений, где между последовательностями E1-E17 и F1-F11 находится последовательность каркасного участка HFR3-1-HFR3-31, и где HFR3-6 означает A или R, HFR3-8 означает N или T, а HFR3-13 означает L, или A, или F.
21. Гуманизированное антитело против бета7, где моновалентное сродство антитела к человеческому бета7 по существу идентично моновалентному сродству крысиного антитела, содержащего вариабельную последовательность легкой цепи и тяжелой цепи, как изображено на фиг.9.
22. Гуманизированное антитело против бета7, где моновалентное сродство антитела к человеческому бета7 по меньшей мере в 3 раза выше, чем моновалентное сродство крысиного антитела, содержащего вариабельную последовательность легкой цепи и тяжелой цепи, как изображено на фиг.9.
23. Гуманизированное антитело по п.21 или 22, где крысиное антитело получают с использованием гибридомной клеточной линии, депонированной в Американской коллекции типовых культур под номером ATCC HB-293.
24. Антитело по любому из п.п.21-23, где сродство связывания выражают в виде значения Kd.
25. Антитело по любому из п.п.21-24, где сродство связывания измеряют методом Biacore™ или радиоиммуного анализа.
26. Антитело по п.1, содержащее консенсусную последовательность каркасного участка человеческой легкой цепи κ подгруппы I.
27. Антитело по п.1, содержащее консенсусную последовательность каркасного участка человеческой тяжелой цепи подгруппы III.
28. Антитело по п.27, где последовательность каркасного участка содержит замену в положении 71, 73 и/или 78.
29. Антитело по п.28, где указанная замена включает в себя R71A, N73T и/или N78A, или где заменяемой аминокислотой в положении 71 является R или A, и/или аминокислотная замена в положении 78 включает в себя N или T, и/или аминокислотная замена в положении 78 включает в себя L, или A, или F.
30. Антитело по п.28, где указанная замена включает в себя L78F, или A78F, или A78L, или L78A.
31. Способ ингибирования взаимодействия субъединицы бета7 человеческого интегрина со второй субъединицей интегрина и/или лигандом путем приведения в контакт антитела по любому из п.п.1-30 со второй субъединицей интегрина и/или лигандом.
32. Способ по п.31, где вторая субъединица интегрина представляет собой альфа4-субъединицу интегрина, и где лиганд представляет собой MAdCAM, VCAM или фибронектин.
33. Способ по п.32, где альфа4-субъединица интегрина является человеческой.
34. Способ по п.33, где лиганд является человеческим.
35. Способ по п.32, где вторая субъединица интегрина представляет собой альфаЕ-субъединицу интегрина, и где лиганд представляет собой E-кадгерин.
36. Способ по п.35, где альфаЕ-субъединица интегрина является человеческой.
37. Способ по п.36, где лиганд является человеческим.
38. Способ по п.31, где ингибирование уменьшает или облегчает симптомы заболевания, выбранного из воспаления, астмы, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, язвенного колита, диабета, воспаления, сопровождающего трансплантацию органов, реакции "трансплантат против хозяина" и воспаления, связанного с нарушениями при аллотрансплантации.
Другие воплощения согласно изобретению включают в себя, без ограничения, нижеследующие.
В одном воплощении HVR-L1 представляет собой SEQ ID NO: 1, 7, 8 или 9, или HVR-L1 представляет собой вариант SEQ ID NO: 1, 7, 8, или 9, который содержит 1-10 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) замен в относительных положениях A1-A11 с любым сочетанием следующих положений: A2 (A, G, S, T или V); A3 (S, G, I, K, N, P, Q, R или T), A4 (E, A, D, G, H, I, K, L, N, Q, R или V), A5 (S, A, D, G, H, I, K, N, P, R, T, V или Y), A6 (V, A, G, I, K, L, M, Q или R), A7 (D, A, E, G, H, I, K, L, N, P, S, T или V), A8 (T, S, D, E, G, P или N) и A9 (Y, L, I или M), A10 (L, A, I, M или V) и A11 (H, F, S или Y). В одном воплощении HVR-L2 представляет собой SEQ ID NO: 2, 67 или 68, или HVR-L2 представляет собой вариант SEQ ID NO: 2, 67, или 68, причем данный вариант HVR-L2 содержит 1-4 (1, 2, 3, 4 или 5) замен в относительных положениях B1-B8 с любым сочетанием следующих положений: B1 (K, R, N, V, A, F, Q, H, P, I, L, Y или X (где X означает любую аминокислоту)), B4 (S), B5 (Q или S), B6 (S, R или L) и B7 (I, T, E, K или V). В одном воплощении HVR-L3 представляет собой SEQ ID NO: 3, или HVR-L3 представляет собой вариант SEQ ID NO: 3, который содержит, по меньшей мере, одну замену в относительных положениях C1-C8, например, в положении C8 (W, Y, R, S, A, F, H, I, L, M, N, T или V). В одном воплощении HVR-H1 представляет собой SEQ ID NO: 4. В одном воплощении HVR-H2 представляет собой SEQ ID NO: 5, или HVR-H2 представляет собой вариант SEQ ID NO: 5, причем данный вариант HVR-H2 содержит 1-7 (1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7) замен в относительных положениях E1-E17 с любым сочетанием следующих положений: E2 (Y1 V, D или F), E6 (S или G), E10 (S или Y), E12 (N, A, D или T), E13 (P, D, A или H), E15 (L или V), E17 (S или G). В одном воплощении HVR-H3 представляет собой SEQ ID NO: 6, 63, 64, 65 или 66, или HVR-H3 представляет собой вариант SEQ ID NO: 6, 63, 64, 65 или 66, который содержит 1 или 2 замены в относительных положениях F1-F11 в случае SEQ ID NO: 63, 64 и 65, или в относительных положениях F2-F11 в случае SEQ ID NO: 6 и 66, с любым сочетанием следующих положений: F2 (M, A, E, G, Q, R или S) и F11 (F или Y). Буква (буквы) в скобках после каждого положения указывает пример замены (т.е. замещения) аминокислоты на консенсусную или другую аминокислоту, очевидный для специалиста в данной области, а пригодность других аминокислот для замен в контексте данного описания можно определить в рабочем порядке с помощью методов, известных в данной области и/или описанных в данном документе.
В одном воплощении HVR-L1 содержит последовательность SEQ ID NO: 1. В одном воплощении A8 в вариантном HVR-L1 означает D. В одном воплощении A8 в вариантном HVR-L1 означает S. В одном воплощении A9 в вариантном HVR-L1 означает L. В одном воплощении A8 в вариантном HVR-L1 означает D, а A9 в вариантном HVR-L1 означает L. В одном воплощении A8 в вариантном HVR-L1 означает S, а A9 в вариантном HVR-L1 означает L. В некоторых воплощениях согласно изобретению указанные варианты относятся к HVR-L1, а HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3 включают в себя или содержат, или преимущественно содержат последовательности SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 и 6 соответственно. В некоторых воплощениях HVR-H3 включает в себя, или содержит, или преимущественно содержит SEQ ID NO: 6 или 66 (в относительных положениях F2-F11), или SEQ ID NO: 63 или 64 или 65 (в относительных положениях F1-F11).
В одном воплощении A8 в вариантном HVR-L1 означает I, а A9 в вариантном HVR-L1 означает L, данный вариант также относится к HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, причем каждый HVR включает в себя, содержит или преимущественно содержит SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 и 6 соответственно.
В одном воплощении A8, A9 и A10 в вариантном HVR-L1 означают D, L и V, соответственно данный вариант также относится к HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, причем каждый HVR включает в себя, содержит или преимущественно содержит SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 и 6 соответственно.
В одном воплощении A8 и A9 в вариантном HVR-L1 означают N и L, соответственно данный вариант также относится к HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, причем каждый HVR включает в себя, содержит или преимущественно содержит SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 и 6 соответственно.
В одном воплощении A8 и A9 в вариантном HVR-L1 означают P и L соответственно, а B6 и B7 в вариантном HVR-L2 означают R и T соответственно, данный вариант также относится к HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, причем каждый HVR включает в себя, содержит или преимущественно содержит SEQ ID NO: 3, 4, 5 и 6 соответственно.
В одном воплощении A2, A4, A8, A9 и A10 в вариантном HVR-L1 означают S, D, S, L и V соответственно, данный вариант также относится к HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, причем каждый HVR включает в себя, содержит или преимущественно содержит SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 и 6 соответственно.
В одном воплощении A5 и A9 в вариантном HVR-L1 означают D и T соответственно, данный вариант также относится к HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, причем каждый HVR включает в себя, содержит или преимущественно содержит SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 и 6 соответственно.
В одном воплощении A5 и A9 в вариантном HVR-L1 означают N и L соответственно, данный вариант также относится к HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, причем каждый HVR включает в себя, содержит или преимущественно содержит SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 и 6 соответственно.
В одном воплощении A9 в вариантном HVR-L1 означает L, данный вариант также относится к HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, причем каждый HVR включает в себя, содержит или преимущественно содержит SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 и 6.
В одном воплощении данного изобретения антитело или полипептид, связывающий бета7, содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, причем каждый HVR включает в себя, содержит или преимущественно содержит SEQ ID NO: 9, 2, 3, 4, 5 и 64 соответственно. В другом воплощении каждый HVR включает в себя, содержит или преимущественно содержит SEQ ID NO: 9, 67, 3, 4, 5 и 64. В другом воплощении каждый HVR включает в себя, содержит или преимущественно содержит SEQ ID NO: 9, 68, 3, 4, 5 и 64. В другом воплощении каждый HVR включает в себя, содержит или преимущественно содержит SEQ ID NO: 9, 2 или 67, или 68, 3, 4, 5 и 66.
В некоторых воплощениях вариантные антитела с указанными вариантами HVR-L1 также содержат HVR-L2, HVR-L3, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, каждый из которых имеет последовательность, описанную соответственно в SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 и 6. Если вариант антитела содержит HVR-L1 A8(P) и A9(L) и HVR-L2 B6(R) и B7(T), в некоторых воплощениях указанный HVR-L1, HVR-L2-вариант также содержит HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, каждый из которых имеет последовательность, описанную соответственно в SEQ ID NO: 3, 4, 5 и 6.
В некоторых воплощениях указанные антитела дополнительно содержат консенсусную последовательность человеческой тяжелой цепи подгруппы III. В одном воплощении данных антител консенсусная последовательность каркасного участка содержит замену в положении 71, 73 и/или 78. В некоторых воплощениях указанных антител в положении 71 находится A, в положении 73 находится T, и/или в положении 78 находится A. В одном воплощении указанные антитела дополнительно содержат консенсусную последовательность каркасного участка человеческой легкой цепи κI.
В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит HVR-L1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1. В одном воплощении, вариантное антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-L1, где A10 означает V. В одном воплощении указанное вариантное антитело дополнительно содержит HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, каждый из которых имеет последовательность, описанную соответственно в SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 и 6. В некоторых воплощениях указанные антитела дополнительно содержат консенсусную последовательность каркасного участка человеческой тяжелой цепи подгруппы III. В одном воплощении данных антител консенсусная последовательность каркасного участка содержит замену в положении 71, 73 и/или 78. В некоторых воплощениях данных антител в положении 71 находится A, в положении 73 находится T и/или в положении 78 находится A. В одном воплощении данных антител, указанные антитела дополнительно содержат консенсусную последовательность каркасного участка человеческой легкой цепи κI.
В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит HVR-L3, имеющий последовательность SEQ ID NO: 3. В одном воплощении вариантное антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-L3, где C8 означает L. В одном воплощении указанное вариантное антитело дополнительно содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, каждый из которых имеет последовательность, описанную соответственно в SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5 и 6. В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-L3, где C8 означает W. В одном воплощении указанное вариантное антитело дополнительно содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, каждый из которых имеет последовательность, описанную соответственно в SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5 и 6. В одном воплощении HVR-L1 имеет последовательность SEQ ID NO: 7, 8 или 9. В некоторых воплощениях указанные антитела дополнительно содержат консенсусную последовательность каркасного участка человеческой тяжелой цепи подгруппы III. В одном воплощении данных антител консенсусная последовательность каркасного участка содержит замену в положении 71, 73 и/или 78. В некоторых воплощениях данных антител в положении 71 находится A, в положении 73 находится T, и/или в положении 78 находится A. В одном воплощении данных антител указанные антитела дополнительно содержат консенсусную последовательность каркасного участка человеческой легкой цепи κI.
В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит HVR-H3, имеющий последовательность SEQ ID NO: 6. В одном воплощении вариант указанного антитела содержит вариантный HVR-H3, где F1 означает Q. В одном воплощении указанное вариантное антитело дополнительно содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 и HVR-H2, каждый из которых имеет последовательность, описанную соответственно в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 и 5. В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-H3, где F1 означает R. В одном воплощении указанное вариантное антитело дополнительно содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 и HVR-H2, каждый из которых имеет последовательность, описанную соответственно в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 и 5. В одном воплощении HVR-L1 имеет последовательность SEQ ID NO: 7, 8 или 9. В некоторых воплощениях указанные антитела дополнительно содержат консенсусную последовательность каркасного участка человеческой тяжелой цепи подгруппы III. В одном воплощении данных антител консенсусная последовательность каркасного участка содержит замену в положении 71, 73 и/или 78. В некоторых воплощениях данных антител в положении 71 находится A, в положении 73 находится T, и/или в положении 78 находится A. В одном воплощении указанные антитела дополнительно содержат консенсусную последовательность каркасного участка человеческой легкой цепи κI.
В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит HVR-L1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1. В одном воплощении антитело содержит вариант HVR-L1, где A4 означает Q. В одном воплощении указанное вариантное антитело дополнительно содержит HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, каждый из которых имеет последовательность, описанную соответственно в SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 и 6. В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-L1, где A6 означает I. В одном воплощении указанное вариантное антитело дополнительно содержит HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, каждый из которых имеет последовательность, описанную соответственно в SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 и 6. В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-L1, где A7 означает S. В одном воплощении указанное вариантное антитело дополнительно содержит HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, каждый из которых имеет последовательность, описанную соответственно в SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 и 6. В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-L1, где A8 означает D или N. В одном воплощении указанное вариантное антитело дополнительно содержит HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, каждый из которых имеет последовательность, описанную соответственно в SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 и 6. В некоторых воплощениях указанные антитела дополнительно содержат консенсусную последовательность каркасного участка тяжелой цепи человеческой подгруппы III. В одном воплощении данных антител консенсусная последовательность каркасного участка содержит замену в положении 71, 73 и/или 78. В некоторых воплощениях данных антител в положении 71 находится A, в положении 73 находится T и/или в положении 78 находится A. В одном воплощении указанные антитела дополнительно содержат консенсусную последовательность каркасного участка человеческой легкой цепи κI.
В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит HVR-L2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 2. В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-L2, где B1 означает N. В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-L2, где B5 означает S. В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-L2, где B6 означает L. В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-L2, где B7 означает V. В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-L2, где B7 означает E или K. В некоторых воплощениях указанное вариантное антитело дополнительно содержит HVR-L1, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, каждый из которых имеет последовательность, описанную соответственно в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 5 и 6. В некоторых воплощениях HVR-L1 имеет последовательность SEQ ID NO: 7, 8 или 9. В некоторых воплощениях указанные антитела дополнительно содержат консенсусную последовательность каркасного участка человеческой тяжелой цепи подгруппы III. В одном воплощении данных антител консенсусная последовательность каркасного участка содержит замену в положении 71, 73 и/или 78. В некоторых воплощениях данных антител в положении 71 находится A, в положении 73 находится T и/или в положении 78 находится A. В одном воплощении указанные антитела дополнительно содержат консенсусную последовательность каркасного участка человеческой легкой цепи κI.
В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит HVR-L3, имеющий последовательность SEQ ID NO: 3. В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-L3, где C8 означает W, Y, R или S. В некоторых воплощениях указанное вариантное антитело дополнительно содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, каждый из которых имеет последовательность, описанную соответственно в SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5 и 6. В некоторых воплощениях HVR-L1 содержит SEQ ID NO: 7, 8 или 9. В некоторых воплощениях указанные антитела дополнительно содержат консенсусную последовательность каркасного участка человеческой тяжелой цепи подгруппы III. В одном воплощении данных антител консенсусная последовательность каркасного участка содержит замену в положении 71, 73 и/или 78. В некоторых воплощениях данных антител в положении 71 находится A, в положении 73 находится T и/или в положении 78 находится A. В одном воплощении указанные антитела дополнительно содержат консенсусную последовательность каркасного участка человеческой легкой цепи κI.
В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит HVR-H2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 5. В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-H2, где E2 означает F. В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-H2, где E2 означает V или D. В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-H2, где E6 означает G. В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-H2, где E10 означает Y. В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-H2, где E12 означает A, D или T. В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-H2, где E13 означает D, A или N. В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-H2, где E15 означает V. В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-H2, где E17 означает G. В некоторых воплощениях указанное вариантное антитело дополнительно содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 и HVR-H3, каждый из которых имеет последовательность, описанную соответственно в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 и 6. В некоторых воплощениях HVR-L1 имеет последовательность SEQ ID NO: 7, 8 или 9. В некоторых воплощениях указанные антитела дополнительно содержат консенсусную последовательность каркасного участка человеческой тяжелой цепи подгруппы III. В одном воплощении данных антител консенсусная последовательность каркасного участка содержит замену в положении 71, 73 и/или 78. В некоторых воплощениях данных антител в положении 71 находится A, в положении 73 находится T и/или в положении 78 находится A. В одном воплощении указанные антитела дополнительно содержат консенсусную последовательность каркасного участка человеческой легкой цепи κI.
В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит HVR-H3, имеющий последовательность SEQ ID NO: 6. В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-H3, где F11 означает Y. В некоторых воплощениях указанное вариантное антитело дополнительно содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 и HVR-H3, каждый из которых имеет последовательность, описанную соответственно в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 и 6. В некоторых воплощениях HVR-L1 содержит SEQ ID NO: 7, 8 или 9. В некоторых воплощениях указанные антитела дополнительно содержат консенсусную последовательность каркасного участка человеческой тяжелой цепи подгруппы III. В одном воплощении данных антител консенсусная последовательность каркасного участка содержит замену в положении 71, 73 и/или 78. В некоторых воплощениях данных антител в положении 71 находится A, в положении 73 находится T и/или в положении 78 находится A. В одном воплощении указанные антитела дополнительно содержат консенсусную последовательность каркасного участка человеческой легкой цепи κI.
В некоторых воплощениях указанные антитела дополнительно содержат консенсусную последовательность каркасного участка человеческой тяжелой цепи подгруппы III. В одном воплощении данных антител консенсусная последовательность каркасного участка содержит замену в положении 71, 73 и/или 78. В некоторых воплощениях данных антител в положении 71 находится A, в положении 73 находится T и/или в положении 78 находится A. В одном воплощении указанные антитела дополнительно содержат консенсусную последовательность каркасного участка человеческой легкой цепи κI.
Терапевтическое средство, предназначенное для применения у субъекта-хозяина, предпочтительно вызывает небольшой иммуногенный ответ или не вызывает иммуногенного ответа у указанного хозяина. В одном воплощении данного изобретения предлагается такое средство. Например, в одном воплощении данного изобретения предлагается гуманизированное антитело, которое вызывает и/или предположительно способно вызвать у субъекта ответ, связанный с образованием человеческих антител против антител грызунов (такой как ответ на мышиные или крысиные антитела), или человеческих антител против человеческих антител, на значительно более низком уровне, чем антитело, содержащее последовательность SEQ ID NO: 10 и/или 11 (фиг.1A и 1B) или SEQ ID NO: 12 и/или 13 (фиг.9A и 9B, где приведены крысиные аминокислотные последовательности Fib504 против мышиных антител). В другом примере в данном изобретении предложено гуманизированное антитело, которое вызывает и/или предположительно способно вызвать ответ, связанный с образованием человеческих антител против антител грызунов (таких как человеческие антитела против мышиных (HAMA) или крысиных антител), или человеческих антител против человеческих антител (HAHA).
Вариабельный домен тяжелой и/или легкой цепи гуманизированного антитела согласно изобретению может содержать одну или несколько человеческих и/или человеческих консенсусных последовательностей участков, отличных от гипервариабельных (например, каркасного участка). В некоторых воплощениях человеческие и/или человеческие консенсусные последовательности участков, отличных от гипервариабельных, содержат одну или несколько модификаций. В одном воплощении вариабельный домен тяжелой цепи антитела согласно изобретению содержит человеческую консенсусную последовательность каркасного участка, которая в одном воплощении представляет собой консенсусную последовательность каркасного участка подгруппы III. В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит вариантную консенсусную последовательность каркасного участка подгруппы III, модифицированную по меньшей мере по одному аминокислотному положению. Например, в одном воплощении вариантная подгруппа III в консенсусной последовательности каркасного участка может содержать замену в одном или нескольких из положений 71, 73, 78 и/или 94. В одном воплощении указанная замена представляет собой R71A, N73T, L78A и/или R94M в любом сочетании.
Как известно в данной области и как более подробно описано ниже, аминокислотные положения/границы гипервариабельного участка антитела могут варьировать, в зависимости от контекста и разных параметров, известных в данной области (как описано ниже). Некоторые положения в вариабельном домене могут рассматриваться как гибридные гипервариабельные положения, которые по одним критериям находятся внутри гипервариабельного участка, а по другим критериям - вне гипервариабельного участка. Одно или несколько из данных положений можно обнаружить в расширенных гипервариабельных участках (как подробно описано ниже). Данное изобретение связано с антителами, содержащими модификации в указанных гибридных гипервариабельных положениях. В одном воплощении указанные гибридные гипервариабельные положения включают в себя одно или несколько из положений 26-30, 33-35B, 47-49, 49, 57-65, 93, 94 и 102 в вариабельном домене тяжелой цепи. В одном воплощении указанные гибридные гипервариабельные положения включают в себя одно или несколько из положений 24-29, 35-36, 46-49, 49, 56 и 97 в вариабельном домене легкой цепи. В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит вариант человеческой консенсусной последовательности подгруппы каркасного участка, модифицированного по одному или нескольким гибридным гипервариабельным положениям. В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий вариант консенсусной последовательности человеческого каркасного участка подгруппы III, модифицированного по одному или нескольким положениям из 28-35, 49, 50, 52a, 53, 54, 58-61, 63, 65, 94 и 102. В одном воплощении антитело содержит замену T28F, F29I, S30T, S31N, Y32N, A33Y, M34W и S35G. В одном воплощении антитело содержит замену S49G. В одном воплощении антитело содержит замену V50F, или V50D, или V50Y. В одном воплощении антитело содержит замену G53Y. В одном воплощении антитело содержит замену G54S. В одном воплощении антитело содержит замену Y58S. В одном воплощении антитело содержит замену A60N, или A60D, или A60T. В одном воплощении антитело содержит замену D61P, или D61A, или D61H. В одном воплощении антитело содержит замену V63L. В одном воплощении антитело содержит замену G65S. В одном воплощении антитело содержит замену R94M. В одном воплощении антитело содержит замену R94A, или R94E, или R94G, или R94Q, или R94S. В одном воплощении антитело содержит замену G95T. В одном воплощении антитело содержит одну или несколько замен в положениях 28-35, 49, 50, 52a, 53, 54, 58-61, 63, 65, 94 и 102, кроме того, оно дополнительно содержит одну или несколько замен в положениях R71A, или N73T, или L78A, или L78F. В одном воплощении антитело содержит замену Y102F. Как показано на фиг.1В, данные замены присутствуют в HVR-H1, HVR-H2 и/или HVR-H3 тяжелой цепи.
В одном воплощении антитело согласно изобретению включает в себя вариабельный домен легкой цепи, содержащий консенсусную последовательность человеческого каркасного участка подгруппы I, модифицированного по одному или нескольким из положений 27, 29-31, 33, 34, 49, 50, 53-55, 91 и 96. В одном воплощении антитело содержит замену Q27E. В одном воплощении антитело содержит замену I29V. В одном воплощении антитело содержит замену S30D. В одном воплощении антитело содержит замену N31T, или N31S, или N31D. В одном воплощении антитело содержит замену Y32L. В одном воплощении антитело содержит замену A34H. В одном воплощении антитело содержит замену Y49K. В одном воплощении антитело содержит замену A50Y. В одном воплощении антитело содержит замену S53Q. В одном воплощении антитело содержит замену L54S. В одном воплощении антитело содержит замену E55I или E55V. В одном воплощении антитело содержит замену Y91G. В одном воплощении антитело содержит замену W96N или W96L. В одном воплощении антитело содержит замену A25S. В одном воплощении антитело содержит замену в положении A25 на G, S, T или V. В одном воплощении антитело содержит модификацию, выбранную из одной или нескольких из нижеследующих групп замен. Например, в одном воплощении антитело содержит замену S26 на G, I, K, N, P, Q или T. В одном воплощении антитело содержит замену Q27 на E, A, D, G, H, I, K, L, N, Q, R или V. В одном воплощении антитело содержит замену S28 на A, D, G, H, I, K, N, P, R, T, V или Y. В одном воплощении антитело содержит замену 129 на V, A, G, K, L, M, Q или R. В одном воплощении антитело содержит замену S30 на D, A, E, G, H, I, K, L, N, P, S, T или V. В одном воплощении антитело содержит замену N31 на D, T, E или G. В одном воплощении антитело содержит замену Y32 на L, I или M. В одном воплощении антитело содержит замену L33 на A, I, M или V. В одном воплощении антитело содержит замену A34 на H, F, Y или S. В одном воплощении антитело содержит замену Y49 на K или N. В одном воплощении антитело содержит замену A50Y. В одном воплощении антитело содержит замену S53Q. В одном воплощении антитело содержит замену L54S. В одном воплощении антитело содержит замену E55 на V, I или K. В одном воплощении антитело содержит замену Y91G. В одном воплощении антитело содержит замену W96 на N, L, W, Y, R, S, A, F, H, I, M, N, R, S, T, V или Y. Как показано на фиг.1А, данные замены присутствуют в HVR-L1, HVR-L2 и/или HVR-L3 легкой цепи.
Антитело согласно изобретению может содержать любые подходящие человеческие или человеческие консенсусные последовательности каркасных участков легкой цепи, при условии, что антитело обладает желательными биологическими свойствами (например, желательным сродством связывания). В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит по меньшей мере часть последовательности (или всю последовательность) каркасного участка человеческой легкой цепи κ. В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит по меньшей мере часть консенсусной последовательности (или всю последовательность) человеческого каркасного участка κ подгруппы I.
В одном воплощении антитело согласно изобретению включает в себя вариабельный домен тяжелой и/или легкой цепи, содержащий последовательности каркасных участков, описанные в SEQ ID NO: 34-41 и показанные на фиг.1, 7 и 8, при условии, что положения 49 легкой цепи и 94 тяжелой цепи входят в расширенные HVR, и при условии, что в упомянутом положении 49 находится K, а в упомянутом положении 94 предпочтительно, но не обязательно, находится M и может находиться R.
Антагонисты согласно изобретению можно использовать для модуляции одного или нескольких аспектов бета7-ассоциированных эффектов, включающих в себя, без ограничения, соединение с альфа4-субъединицей интегрина, соединение с субъединицей альфаЕ интегрина, связывание интегрина альфа4бета7 с MAdCAM, VCAM-1 или фибронектином и связывание интегрина альфаЕбета7 с E-кадгерином. Данные эффекты можно модулировать посредством любых биологически приемлемых механизмов, которые включают в себя нарушение связывания лиганда с субъединицей бета7, или с димерным интегрином альфа4бета7 или альфаЕбета7, и/или путем нарушения соединения субъединиц альфа и бета, при котором происходит ингибирование образования димерного интегрина. Соответственно, в одном воплощении данное изобретение предлагает антагонистическое антитело против бета7, которое ингибирует связывание альфа4 с бета7. В одном воплощении антагонистическое антитело против бета7 согласно изобретению нарушает связывание альфа4бета7 с MAdCAM. В одном воплощении антагонистическое антитело против бета7 согласно изобретению нарушает связывание альфа4бета7 с VCAM-1. В одном воплощении антагонистическое антитело против бета7 согласно изобретению нарушает связывание альфа4бета7 с фибронектином. В одном воплощении антагонистическое антитело против бета7 согласно изобретению нарушает связывание бета7 с альфаЕ. В одном воплощении антагонистическое антитело против бета7 согласно изобретению нарушает связывание интегрина альфаЕбета7 с E-кадгерином. Нарушение может быть непосредственным или косвенным. Например, антагонистическое антитело против бета7 может связываться с бета7 по последовательности участка димеризации альфа4бета7 или альфаЕбета7 и посредством этого ингибировать взаимодействие субъединиц интегрина и образование димера интегрина. В другом примере антагонистическое антитело против бета7 может связываться с последовательностью лиганд-связывающего домена субъединицы бета7 и посредством этого ингибировать взаимодействие указанного связывающего домена с его партнером по связыванию (таким, как фибронектин, VCAM и/или MAdCAM для интегрина альфа4бета7; или E-кадгерин для интегрина альфаЕбета7). В другом примере антагонистическое антитело против бета7 может связываться с последовательностью, которая не принадлежит домену димеризации субъединиц интегрина или лиганд-связывающему домену, но где связывание указанного антагонистического антитела против бета7 приводит к нарушению способности домена бета7 взаимодействовать с его партнером по связыванию (таким, как субъединица интегрина альфа4 или альфаЕ и/или лиганд, такой как фибронектин, VCAM, MAdCAM или E-кадгерин). В одном воплощении антагонистическое антитело согласно изобретению связывается с бета7 (например, с внеклеточным доменом) и при этом нарушается димеризация бета7 с субъединицей альфа4 или альфаЕ. В одном воплощении антагонистическое антитело согласно изобретению связывается с бета7 и при этом способность бета7 и/или интегрина альфа4бета7 и/или альфаЕбета7 связывать соответствующий лиганд или лиганды снижается. Например, в одном воплощении данное изобретение предлагает антагонистическое антитело, которое при связывании с молекулой бета7 ингибирует димеризацию указанной молекулы. В одном воплощении антагонистическое антитело против бета7 согласно изобретению специфически связывается с последовательностью лиганд-связывающего домена бета7. В одном воплощении антагонистическое антитело против бета7 согласно изобретению специфически связывается с последовательностью лиганд-связывающего домена бета7 так, что при этом нарушается связывание лиганда (т.е. фибронектина, VCAM и/или MAdCAM) с интегрином альфа4бета7. В одном воплощении антагонистическое антитело против бета7 согласно изобретению специфически связывается с последовательностью лиганд-связывающего домена бета7 так, что при этом нарушается связывание лиганда (т.е. E-кадгерина) с интегрином альфаЕбета7.
В одном воплощении антагонистическое антитело согласно изобретению нарушает димеризацию бета7, включающую в себя гетеродимеризацию (т.е. димеризацию бета7 с молекулой субъединицы интегрина альфа4 или альфаЕ).
В одном воплощении антагонистическое антитело согласно изобретению связывается с эпитопом субъединицы интегрина бета7, который содержит аминокислоты 176-237. В другом воплощении антагонистическое антитело согласно изобретению связывается с эпитопом интегрина бета7, который по существу совпадает с эпитопом Fib504.64 (ATCC HB-293). Связывание с эпитопом анализируют стандартными методами, включающими в себя, без ограничения, конкурентный анализ связывания.
В одном аспекте данного изобретения предложено антитело, содержащее одну или сочетание двух, трех, четырех, пяти или всех последовательностей HVR, приведенных в таблице аминокислотных замен на фиг.13.
Терапевтическое средство, предназначенное для применения у субъекта-хозяина, предпочтительно вызывает небольшой иммуногенный ответ или не вызывает иммуногенного ответа у указанного хозяина. В одном воплощении данное изобретение предлагает такое средство. Например, в одном воплощении данного изобретения предложено гуманизированное антитело, которое вызывает и/или предположительно способно вызвать у субъекта ответ, связанный с образованием человеческих антител против крысиных антител, или человеческих антител против мышиных антител, или человеческих антител против человеческих антител, на значительно более низком уровне, чем антитело, содержащее последовательность SEQ ID NO: 10, 11, 12 и/или SEQ ID NO: 13 (крысиное антитело против мышиного антитела Fib504 (ATCC HB-293) фиг.1 и 9). В другом примере данного изобретения предложено гуманизированное антитело, которое вызывает и/или предположительно способно вызвать ответ, связанный с образованием человеческих антител против мышиных антител, человеческих антител против крысиных антител, или человеческих антител против человеческих антител.
Вариабельный домен тяжелой и/или легкой цепи гуманизированного антитела согласно изобретению может содержать одну или несколько человеческих и/или человеческих консенсусных последовательностей участков, отличных от гипервариабельных (например, каркасного участка). В некоторых воплощениях человеческие и/или человеческие консенсусные последовательности участков, отличных от гипервариабельных, содержат одну или несколько дополнительных модификаций. В одном воплощении вариабельный домен тяжелой цепи антитела согласно изобретению содержит человеческую консенсусную последовательность каркасного участка, которая в одном воплощении представляет собой консенсусную последовательность каркасного участка подгруппы III. В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит вариантную консенсусную последовательность каркасного участка подгруппы III, модифицированную по меньшей мере по одному аминокислотному положению. Например, в одном воплощении вариантная консенсусная последовательность каркасного участка подгруппы III может содержать замену в одном или нескольких из положений 71, 73, 78 и/или 94, хотя положение 94 является частью расширенного гипервариабельного участка тяжелой цепи H3 согласно изобретению. В одном воплощении указанная замена представляет собой R71A, N73T, L78A и/или R94M в любом сочетании.
Антитело согласно изобретению может содержать любые подходящие человеческие или человеческие консенсусные последовательности каркасных участков легкой цепи при условии, что антитело обладает желательными биологическими свойствами (например, желательным сродством связывания). В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит по меньшей мере часть последовательности (или всю последовательность) каркасного участка человеческой легкой цепи κ. В одном воплощении антитело согласно изобретению содержит по меньшей мере часть консенсусной последовательности (или всю последовательность) человеческого каркасного участка κ подгруппы I.
Антагонисты согласно изобретению можно использовать для модуляции одного или нескольких аспектов бета7-ассоциированных эффектов. Например, антагонистическое антитело против бета7 может связываться с бета7 по последовательности участка димеризации альфа4бета7 или альфаЕбета7 и посредством этого ингибировать взаимодействие субъединиц интегрина и образование димера интегрина. В другом примере антагонистическое антитело против бета7 может связываться с последовательностью лиганд-связывающего домена субъединицы бета7 и посредством этого ингибировать взаимодействие указанного связывающего домена с его партнером по связыванию (таким, как фибронектин, VCAM и/или MAdCAM для интегрина альфа4бета7; или E-кадгерин для интегрина альфаЕбета7). В другом примере антагонистическое антитело против бета7 может связываться с последовательностью, которая не принадлежит домену димеризации субъединиц интегрина или лиганд-связывающему домену, но где связывание указанного антагонистического антитела против бета7 приводит к нарушению способности домена бета7 взаимодействовать с его партнером по связыванию (таким, как субъединица интегрина альфа4 или альфаЕ, и/или лиганд, такой как фибронектин, VCAM, MAdCAM или E-кадгерин). В одном воплощении антагонистическое антитело согласно изобретению связывается с бета7 (например, с внеклеточным доменом) и при этом нарушается димеризация бета7 с субъединицей альфа4 или альфаЕ. В одном воплощении антагонистическое антитело согласно изобретению связывается с бета7 и при этом способность бета7 и/или интегрина альфа4бета7 и/или альфаЕбета7 связывать соответствующий лиганд или лиганды снижается. Например, в одном воплощении данного изобретения предлагается антагонистическое антитело, которое при связывании с молекулой бета7 ингибирует димеризацию указанной молекулы. В одном воплощении антагонистическое антитело против бета7 согласно изобретению специфически связывается с последовательностью лиганд-связывающего домена бета7. В одном воплощении антагонистическое антитело против бета7 согласно изобретению специфически связывается с последовательностью лиганд-связывающего домена бета7 так, что при этом нарушается связывание лиганда (т.е. фибронектина, VCAM и/или MAdCAM) с интегрином альфа4бета7. В одном воплощении антагонистическое антитело против бета7 согласно изобретению специфически связывается с последовательностью лиганд-связывающего домена бета7 так, что при этом нарушается связывание лиганда (т.е. , E-кадгерина) с интегрином альфаЕбета7.
В одном воплощении антагонистическое антитело согласно изобретению нарушает димеризацию бета7, включающую в себя гетеродимеризацию (т.е. димеризацию бета7 с молекулой субъединицы интегрина альфа4 или альфаЕ).
В некоторых случаях предпочтительным является антагонистическое антитело против бета7, которое не препятствует связыванию лиганда (такого как фибронектин, VCAM, MAdCAM или альфаЕ) с субъединицей бета7, как частью интегрина, или с интегрином альфа4бета7 или альфаЕбета7 в виде димера. Соответственно, в одном воплощении данное изобретение предлагает антитело, которое не связывается с участком связывания фибронектина, VCAM, MAdCAM или E-кадгерина на бета7, а ингибирует взаимодействие субъединицы бета7 и субъединицы альфа (такой как субъединица интегрина альфа4 или альфаЕ), препятствуя образованию биологически активного интегрина. В одном примере антагонистическое антитело согласно изобретению можно использовать в сочетании с одним или несколькими другими антагонистами, где антагонисты направлены на другие процессы и/или функции пути интегрина бета7. Таким образом, в одном воплощении антагонистическое антитело против бета7 согласно изобретению связывается с эпитопом на бета7, отличающимся от эпитопа, связываемого другим антагонистом интегрина бета7 или интегрина альфа/бета (таким, как антитело против альфа4бета7, включающее в себя моноклональное антитело, или антитело, такое как гуманизированное антитело или моноклональное антитело, полученное из мышиного антитела, и/или имеющее такие же или по существу такие же характеристики связывания или специфичность, как и антитело, полученное из мышиного антитела).
В одном воплощении данного изобретения предложено антагонистическое антитело против бета7, которое нарушает мультимеризацию бета7-альфа4 или -альфаЕ с образованием соответствующего интегрина, и, кроме того, подавляет связывание лиганда. Например, антагонистическое антитело согласно изобретению, которое ингибирует димеризацию бета7 с субъединицей интегрина альфа4 или альфаЕ, также может обладать способностью конкурировать с лигандом за связывание с бета7 или с димерным интегрином (например, оно может препятствовать связыванию фибронектина, VCAM, и/или MAdCAM с бета7 и/или альфа4бета7; или оно может препятствовать связыванию E-кадгерина с бета7 или альфаЕбета7).
В одном воплощении антагонистического антитела против бета7 согласно изобретению связывание антагониста с бета7 ингибирует клеточную адгезию, активированную связыванием лиганда. В другом воплощении антагонистического антитела против бета7 согласно изобретению связывание антагониста с бета7 в клетке ингибирует рекрутинг клетки к клеткам и/или тканям, в которых экспрессируется бета7-содержащий интегрин.
В одном воплощении антагонистическое антитело против бета7 согласно изобретению специфически связывает, по меньшей мере, часть аминокислот 176-250 (необязательно аминокислоты 176-237) внеклеточного домена бета7 (см. Tidswell, M. et al. (1997) J. Immunol. 159: 1497-1505) или его варианта и уменьшает или блокирует связывание лигандов MAdCAM, VCAM-1, фибронектина и/или E-кадгерина. В одном воплощении такое блокирование связывания лиганда снижает или предотвращает адгезию клетки, экспрессирующей лиганд, к клетке, экспрессирующей бета7-содержащий интегрин. В одном воплощении антагонистическое антитело согласно изобретению специфически связывает аминокислотную последовательность бета7, содержащую остатки 176-237. В одном воплощении антагонистическое антитело согласно изобретению специфически связывает конформационный эпитоп, образованный частью, по меньшей мере, одной последовательности, выбранной из группы, состоящей из остатков 176-237 бета7. В одном воплощении антагонистическое антитело согласно изобретению специфически связывает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% идентична или подобна аминокислотной последовательности остатков 176-237 или остатков l76-250 человеческой бета7. В одном воплощении антагонистическое антитело против бета7 согласно изобретению связывает такой же эпитоп, как и антитело против бета7 Fib504, полученное с использованием гибридомы ATCC HB-293.
В одном аспекте данного изобретения предложены композиции, содержащие одно или несколько антагонистических антител согласно изобретению и носитель. В одном воплощении носитель является фармацевтически приемлемым.
В одном аспекте данного изобретения предлагаются нуклеиновые кислоты, кодирующие антагонистическое антитело против бета7 согласно изобретению.
В одном аспекте данного изобретения предложены векторы, содержащие нуклеиновую кислоту согласно изобретению.
В одном аспекте данного изобретения предложены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту или вектор согласно изобретению. Вектор может быть любого типа, например он может представлять собой рекомбинантный вектор, такой как вектор экспрессии. В качестве клеток-хозяев можно использовать любые из ряда клеток-хозяев. В одном воплощении клетка-хозяин представляет собой прокариотическую клетку, например E.coli. В одном воплощении клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, например клетку млекопитающего, такую, как клетка яичника китайского хомячка (CHO).
В одном аспекте данное изобретение предлагает способы получения антагониста согласно изобретению. Например, данное изобретение предлагает способ получения антагонистического антитела против бета7 (к которому, как определено в данном описании, относится и полноразмерное антитело и его фрагменты), упомянутый способ включает в себя экспрессию в подходящей клетке-хозяине рекомбинатного вектора согласно изобретению, кодирующего указанное антитело (или его фрагмент), и выделение указанного антитела.
В одном аспекте данного изобретения предложено готовое изделие, включающее в себя контейнер; и композицию, содержащуюся в контейнере, где композиция содержит одно или несколько антагонистических антител против бета7 согласно изобретению. В одном воплощении композиция содержит нуклеиновую кислоту согласно изобретению. В одном воплощении композиция, содержащая антагонистическое антитело, дополнительно содержит носитель, который в некоторых воплощениях является фармацевтически приемлемым. В одном воплощении готовое изделие согласно изобретению дополнительно содержит инструкции по введению композиции (например, антагонистического антитела) субъекту.
В одном аспекте данного изобретения предложен набор, включающий в себя первый контейнер, содержащий композицию, в состав которой входит одно или несколько антагонистических антител против бета7 согласно изобретению; и второй контейнер, содержащий буфер. В одном воплощении буфер является фармацевтически приемлемым. В одном воплощении композиция, содержащая антагонистическое антитело, дополнительно содержит носитель, который в некоторых воплощениях является фармацевтически приемлемым. В одном воплощении набор дополнительно содержит инструкции по введению композиции (например, антагонистического антитела) субъекту.
Экспрессия бета7-интегринов и их лигандов в болезненном состоянии изменяется. [Экспрессия MAdCAM-1 - ионного канала эндотелия - увеличивается в участках воспаленной слизистой оболочки у пациентов с воспалительным заболеванием кишечника (UC и CD), а в собственной пластинке толстой кишки UC и CD пациентов также наблюдается повышенное содержание клеток CD3+ и a4b7+ по сравнению с контролями IBS (см. Souza H., et al., Gut 45:856 (1999)]. Обнаружено, что при заболеваниях печени экспрессия MAdCAM-1 связана с воспалением портального тракта и может играть роль в рекрутинге лимфоцитов альфа4бета7+ в печень при воспалении. (Hillan, K., et al., Liver. 19(6):509-18 (1999)). MAdCAM-1 на клетках сосудов печени обеспечивает адгезию лимфоцитов a4b7+ у пациентов с IBD и первичным склерозирующим холангитом. Адгезия ингибируется антителами против MAdCAM-1, против альфа4бета7 или против альфа4. (Grant AJ. et al., Hepatology. 33(5): 1065-72 (2001)). MAdCAM-1, VCAM-1 и E-кадгерин экспрессируются на эндотелиальных клетках мозга и/или на клетках микрососудов в воспаленном участке центральной нервной системы. Бета7-интегрины участвуют в демиелинизирующем заболевании ЦНС (Kanwar et al., J. Neuroimmunology 103, 146 (2000)). Экспрессия альфа4бета7 значительно выше в LPL CD, чем в контрольных образцах и у пациентов с UC (Oshitani, N. et al., International Journal of Molecule Medicine 12, 715-719 (2003)). IEL у CD-пациентов могут находиться в хронически стимулированном состоянии и рекрутироваться из периферической системы (Meresse, B., et al., Человеческой Immunology, 62, 694-700 (2001)). При заболевании печени человека альфаЕбета7-T-клетки (CD4+ и CD8+) предпочтительно аккумулируются в печени человека, где E-кадгерин экспрессируется на гепатоцитах и эпителиальных клетках желчных протоков (Shimizu, Y., et al., Journal of Hepatology 39, 918-924 (2003)). При хроническом панкреатите Т-клетки CD8+CD103+, аналогичные внутриэпителиальным лимфоцитам кишечника, инфильтрируют поджелудочную железу при хроническом панкреатите (Matthias, P., et al., Am J Gastroenterol 93:2141-2147 (1998)). Повышающая регуляция альфаЕбета7 обнаружена у пациентов, страдающих системной красной волчанкой со специфическим включением эпителия (Pang et al., Arthritis & Rheumatism 41: 1456-1463 (1998)). При синдроме Шегрена T-клетки CD8+ альфаЕбета7+ прилипают к ацинозным эпителиальным клеткам и убивают их, идуцируя апоптоз (Kroneld et al., Scand J Rheumatol 27:215-218, 1998). Интегрин альфа4бета7 и альфаЕбета7 участвует в эпидермотропизме T-клеток при воспалении кожи и вносит вклад в отторжение кожного аллотрансплантата (Sun et al., Transplantation 74, 1202, 2002). Teraki and Shiohara продемонстрировали предпочтительную экспрессию интегрина aEb7 на T-клетках CD8+ в псориатическом эпидермисе (Teraki and Shiohara, Br. J. Dermatology 147, 1118, 2002). При астме, COPD и у нормальных субъектов Т-лимфоциты мокроты представляют собой активированные IEL (CD69+ CD103+) (Leckie et. al., Thorax 58, 23, 2003). CTL CD103+ (aEb7+) накапливаются в эпителии трансплантата при клиническом отторжении аллотрансплантата почки (Hadley et al., Transplantation 72, 1548, 2001)]. Таким образом, в одном из аспектов данное изобретение связано с применением антагонистического антитела против бета7 согласно изобретению для ингибирования взаимодействия интегрин бета7-лиганд, с уменьшением или облегчением симптомов заболевания, такого как одно или несколько из описанных выше болезненных состояний. В одном воплощении антитело согласно изобретению используют для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения и/или профилактики заболевания, такого как воспалительное заболевание, включающее в себя, без ограничения, воспалительное заболевание кишечника (такое как болезнь Крона и язвенный колит), воспалительное заболевание печени, воспаление ЦНС, хронический панкреатит, системную красную волчанку, синдром Шегрена, псориаз и воспаление кожи, астму, хроническое обструктивное заболевание легких (COPD), интерстициальный легочный процесс, аллергию, аутоиммунное заболевание, отторжение трансплантата, отторжение почечного трансплантата, реакция "трансплантант против хозяина", диабет и рак.
В одном аспекте данное изобретение предложено применение нуклеиновой кислоты согласно изобретению для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики такого заболевания, как иммунное (например, аутоиммунное или воспалительное) нарушение, включающее в себя, без ограничения, воспалительное заболевание кишечника (такое как болезнь Крона или язвенный колит) и аллергическую реакцию (например, заболевания респираторной системы, кожи, суставов, аллергическая астма, а также заболевания других органов, вызванные аллергической реакцией, опосредованной бета7-содержащим интегрином).
В одном аспекте данное изобретение связано с применением экспрессирующего вектора согласно изобретению для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики такого заболевания, как иммунное (например, аутоиммунное или воспалительное) нарушение, включающее в себя, без ограничения, воспалительное заболевание кишечника (такое как болезнь Крона или язвенный колит) и аллергическую реакцию (например, заболевания респираторной системы, кожи, суставов и других органов, вызванные аллергической реакцией, опосредованной бета7-содержащим интегрином).
В одном аспекте данного изобретения предложено применение клетки-хозяина согласно изобретению для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики такого заболевания, как иммунное (например, аутоиммунное или воспалительное) нарушение, включающее в себя, без ограничения, воспалительное заболевание кишечника (такое, как болезнь Крона или язвенный колит) и аллергическую реакцию (например, заболевания респираторной системы, кожи, суставов и других органов, вызванные аллергической реакцией, опосредованной бета7-содержащим интегрином).
В одном аспекте данного изобретения предложено применение готового изделия согласно изобретению для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики такого заболевания, как иммунное (например, аутоиммунное или воспалительное) нарушение, включающее в себя, без ограничения, воспалительное заболевание кишечника (такое, как болезнь Крона или язвенный колит) и аллергическую реакцию (например, заболевания респираторной системы, кожи, суставов и других органов, вызванные аллергической реакцией, опосредованной бета7-содержащим интегрином).
В одном аспекте данного изобретения предложено применение набора согласно изобретению для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики такого заболевания, как иммунное (например, аутоиммунное или воспалительное) нарушение, включающее в себя, без ограничения, воспалительное заболевание кишечника (такое, как болезнь Крона или язвенный колит) и аллергическую реакцию (например, заболевания респираторной системы, кожи, суставов и других органов, вызванные аллергической реакцией, опосредованной бета7-содержащим интегрином).
Данное изобретение предлагает способы и композиции, применяющиеся для модулирования болезненных состояний, связанных с нарушением регуляции межклеточного взаимодействия, опосредованного интегрином бета7. Интегрины бета7 участвуют в разных биологических и физиологических процессах, таких как, например, воспалительные нарушения и аллергические реакции. Таким образом, в одном аспекте данное изобретение предлагает способ, включающий в себя введение субъекту антитела согласно изобретению.
В одном аспекте данное изобретение предлагает способ подавления воспаления, опосредованного интегрином бета7. Указанный способ включает в себя приведение в контакт клетки или ткани с эффективным количеством антитела согласно изобретению, в результате чего происходит ингибирование взаимодействия и связывания лимфоцита или B-клетки с клеткой, экспрессирующей интегрин бета7.
В одном аспекте данное изобретение предлагает способ лечения патологического состояния, связанного с нарушением регуляции связывания интегрина бета7 у субъекта. Указанный способ включает в себя введение субъекту эффективного количества антитела согласно изобретению, оказывающего благотворное действие на упомянутое состояние.
В одном аспекте данное изобретение предлагает способ ингибирования связывания лимфоцита, экспрессирующего лиганд интегрина бета7 (например, клетки, экспрессирующей MAdCAM, VCAM, E-кадгерин или фибронектин), с клеткой, экспрессирующей интегрин бета7 (такой, как интегрин альфа4бета7 или альфаЕбета7). Данный способ включает в себя приведение в контакт указанной клетки с антителом согласно изобретению и посредством этого ингибирование или предотвращение адгезии клеток и уменьшение воспалительной реакции.
В одном аспекте данное изобретение предлагает способ лечения или профилактики воспалительного заболевания, связанного с повышенной экспрессией или активностью интегрина бета7, или увеличением взаимодействия интегрина бета7 на одной клетке и рецептором интегрина бета7 на другой клетке, указанный способ включает в себя введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества антитела согласно изобретению, что обеспечивает эффективное лечение или профилактику указанного воспалительного заболевания. В одном воплощении упомянутое воспалительное заболевание представляет собой воспалительное заболевание кишечника (IBD). В другом воплощении упомянутое воспалительное заболевание представляет собой аллергическую реакцию.
Способы согласно изобретению можно использовать для воздействия на любое подходящее патологическое состояние, например на клетки и/или ткани, в которых наблюдается нарушение регуляции пути, опосредуемого связыванием интегрина бета7. Интегрины бета7 экспрессируются в основном на лейкоцитах (Tidswell, M. et al. (1997) выше). В одном воплощении способ согласно изобретению направлен на лейкоциты и предотвращает связывание с клетками, экспрессирующими лиганд интегрина бета7. Например, в соответствии с данным изобретением, антагонистическое антитело против бета7 препятствует связыванию внутриэпителиального лимфоцита, экспрессирующего E-кадгерин, с альфаЕбета7-экспрессирующей клеткой. Антагонистическое антитело против бета7 согласно изобретению препятствует связыванию клеток, экспрессирующих MAdCAM, VCAM-1 или фибронектин, с лейкоцитами, экспрессирующими альфа4бета7.
Способы согласно изобретению также могут включать в себя другие стадии обработки. Например, в одном воплощении способ дополнительно включает в себя стадию, где клетку-мишень и/или ткань-мишень (например, эндотелиальную клетку выстилки кишечника) подвергают воздействию антитела против TNF или низкомолекулярного терапевтического средства, включающего в себя, без ограничения, соединения 5-ASA.
Как описано в данном документе, интегрины бета7 опосредуют важные биологические процессы, нарушение регуляции которых приводит к возникновению ряда патологических состояний. Соответственно, в одном воплощении способов согласно изобретению клетка, на которую направлен способ (например, эндотелиальная клетка), представляет собой клетку, адгезия которой к клетке, экспрессирующей лиганд интегрина бета7 (где клетка может представлять собой, без ограничения, лимфоцит, а лиганд может представлять собой MAdCAM, VCAM или E-кадгерин), нарушена, подавлена или предотвращена по сравнению с адгезией в отсутствии антагонистического антитела против бета7 согласно изобретению. В одном воплощении способ согласно изобретению ингибирует хоминг лимфоцитов, и в результате этого - воспаление в участке экспрессии интегрина бета7. Например, после контактирования с антагонистом согласно изобретению может нарушаться способность клетки прилипать к клетке, экспрессирующей лиганд интегрина бета7.
Краткое описание рисунков
На фиг.1A и 1B приведен сравнительный анализ первичных последовательностей вариабельных участков легких и тяжелых цепей для следующих участков: человеческой консенсусной последовательности легкой цепи подгруппы каппа I (фиг.1A, SEQ ID NO: 23), человеческой консенсусной последовательности тяжелой цепи подгруппы III (фиг.1B, SEQ ID NO: 24), вариабельного участка легкой цепи крысиного антитела против мышиного антитела бета7 (Fib504) (Фиг.1A, SEQ ID NO: 10), вариабельного участка тяжелой цепи крысиного антитела против мышиного антитела бета7 (Fib504) (фиг.1B, SEQ ID NO: 11), а также вариантов гуманизированного антитела: вариабельного участка легкой цепи гуманизированного hu504Kgraft (фиг.1A, SEQ ID NO: 25), вариабельного участка тяжелой цепи гуманизированного hu504Kgraft (фиг.1B, SEQ ID NO: 26), вариант hu504.5 (аминокислотные изменения по сравнению с гуманизированным hu504Kgraft указаны на фиг.1A (легкая цепь) и фиг.1B (тяжелая цепь) для вариантов hu504.5, hu504.16 и hu504.32). Другие аминокислотные замены в HVR-H1 и HVR-H2 hu504Kgraft, приводящие к образованию антител, связывающих бета7, показаны на фиг.1C.
На фиг.2A и 2B изображена полноразмерная последовательность человеческой консенсусной последовательности легкой цепи подгруппы III (фиг.2A, SEQ ID NO: 27) и тяжелой цепи (фиг.2B, SEQ ID NO: 28). HVR подчеркнуты.
На фиг.3A и 3B изображена полноразмерная последовательность гуманизированного 504graft, содержащего гипервариабельные участки крысиного Fib504 (как описано в данном документе), привитые на консенсусную последовательность человеческой легкой цепи каппа I (фиг.3A, SEQ ID NO: 29) и на консенсусную последовательность человеческой тяжелой цепи подгруппы III (фиг.3B, SEQ ID NO: 30). HVR подчеркнуты.
На фиг.4A и 4B изображена полноразмерная последовательность гуманизированного 504Kgraft, где в положении 49 легкой цепи компонента hu504graft осуществлена замена Y49K. Последовательность легкой цепи hu504Kgraft приведена в SEQ ID NO: 31, а последовательность тяжелой цепи hu504Kgraft приведена в SEQ ID NO: 30. HVR подчеркнуты.
На фиг.5A и 5B изображена полноразмерная последовательность гуманизированного hu504K-RFgraft, где в положениях 71 и 78 тяжелой цепи hu504graft осуществлены замены A71R и A78F по сравнению с последовательностью hu504Kgraft. Последовательность легкой цепи hu504K-RFgraft приведена в SEQ ID NO: 31, а последовательность тяжелой цепи hu504K-RFgraft приведена в SEQ ID NO: 32. HVR подчеркнуты.
На фиг.6A и 6B изображена полноразмерная последовательность варианта hu504.32, содержащего тяжелую цепь hu504K-RFgraft (SEQ ID NO: 32) и замены T31D и Y32L в легкой цепи hu504Kgraft (SEQ ID NO: 33). HVR подчеркнуты.
На фиг.7A-7B и на фиг.8A-8B приведены примеры акцепторных человеческих консенсусных последовательностей каркасных участков, используемых при осуществлении настоящего изобретения, с нижеследующими кодовыми обозначениями последовательностей.
Консенсусные последовательности каркасных областей вариабельных участков легких цепей (VL) (фиг.7A,B)
консенсусная последовательность каркасного участка человеческого VL каппа подгруппы I (SEQ ID NO: 14)
консенсусная последовательность каркасного участка человеческого VL каппа подгруппы I минус расширенный HVR-L2 (SEQ ID NO: 15)
консенсусная последовательность каркасного участка человеческого VL каппа подгруппы II (SEQ ID NO: 16)
консенсусная последовательность каркасного участка человеческого VL каппа подгруппы III (SEQ ID NO: 17)
консенсусная последовательность каркасного участка человеческого VL каппа подгруппы IV (SEQ ID NO: 18)
Заштрихованные участки соответствуют HVR легкой цепи (обозначенные L1, L2 и L3).
Консенсусные последовательности каркасных областей вариабельных участков тяжелых цепей (VH) (фиг.8A,B)
консенсусная последовательность каркасного участка человеческого VH подгруппы I минус CDR Kabat (SEQ ID NO: 19)
консенсусная последовательность каркасного участка человеческого VH подгруппы I минус расширенные гипервариабельные участки (SEQ ID NO: 20-22)
консенсусная последовательность каркасного участка человеческого VH подгруппы II минус CDR Kabat (SEQ ID NO: 48)
консенсусная последовательность каркасного участка человеческого VH подгруппы II минус расширенные гипервариабельные участки (SEQ ID NO: 49-51)
консенсусная последовательность каркасного участка человеческого VH подгруппы III минус CDR Kabat (SEQ ID NO: 52)
консенсусная последовательность каркасного участка человеческого VH подгруппы III минус расширенные гипервариабельные участки (SEQ ID NO: 53-55)
акцепторный каркасный участок человеческого VH минус CDR Kabat (SEQ ID NO: 56)
акцепторный каркасный участок человеческого VH минус расширенные гипервариабельные участки (SEQ ID NO: 57-58)
акцепторный 2 каркасный участок человеческого VH минус CDR Kabat (SEQ ID NO: 59)
акцепторный 2 каркасный участок человеческого VH минус расширенные гипервариабельные участки (SEQ ID NO: 60-62)
На фиг.9A и 9B изображена аминокислотная последовательность вариабельных цепей крысиного антитела Fib504 против мышиного интегрина бета7, полученного с использованием гибридомы ATCC HB-293. HVR подчеркнуты. Вариабельный участок легкой цепи изображен на фиг.9A (SEQ ID NO: 12), а вариабельный участок тяжелой цепи изображен на фиг.9B (SEQ ID NO: 13).
На фиг.10A показаны аминокислотные положения в тяжелых цепях разных консенсусных последовательностей (hu подгруппы I-III). Консенсусная последовательность, используемая для получения антитела против HER2 Herceptin, крысиный Fib504 и каркасные участки hu504-RL и hu504-RF описаны в примерах, приведенных в данном документе. На фиг.10B приведена гистограмма, демонстрирующая относительное связывание альфа4бета7 с антителом hu504graft и антителом hu504Kgraft как функцию модификаций каркасного участка "RL" или "RF", как описано в примере 1.
Фиг.11A-11C. На фиг.11A показана таблица, в которой приведены изменения HVR, полученные в процессе аффинного созревания с использованием ограниченного диапазона аминокислотных замен в варианте hu504.16. Результаты получены с использованием библиотек индивидуально модифицированных HVR варианта hu504.16, как описано в примере 2 данного документа. Сокращенные названия аминокислот в рамках означают аминокислоты, которые наиболее часто встречаются в бета7-связывающих антителах (антитела, отобранные с использованием фагов). На фиг.11B и 11C представлены гистограммы результатов, приведенных на фиг.11A, которые указывают число и тип аминокислотных замен в варианте hu504.16 (легкая цепь, фиг.11B; тяжелая цепь, фиг.11C), детектируемых с помощью методов мутагенеза и селекции, описанных в примере 2.
На фиг.12 показана таблица, в которой приведены результаты аффинного созревания, полученные с использованием широкого диапазона возможных аминокислотных замен в HVR варианта hu504.32, как описано в примере 2. В рамках указаны аминокислоты, которые наиболее часто встречаются в антителах, детектируемых как бета7-связывающие антитела с помощью методов мутагенеза и селекции, описанных в примере 2.
На фиг.13А и 13В изображены последовательности HVR крысиного антитела Fib504 против мышиного антитела (ATCC-293) и человеческой консенсусной последовательности (левые колонки). Примеры аминокислотных замен, обнаруживаемых в каждом положении HVR (без ограничения) с помощью анализов, описанных в примерах (аминокислотные замены обнаруживают с помощью мягкой аминокислотной рандомизации, широкого сканирования аминокислотных замен и ограниченного сканирования аминокислотных замен), показаны справа (способ модификации HVR с целью гуманизации, применимый к вариантам настоящего изобретения, можно найти в заявке США №60/545840, поданной 19 февраля 2004 г.).
50
90
На фиг.14 представлен типичный график зависимости активности Fib504 и вариантного антитела, связывающегося с MAdCAM, от концентрации антитела, который получают по способу, описанному в примере 3. Для всех антител определяют значения IC и IC.
На фиг.15А и 15В изображены аминокислотные последовательности HVR легкой и тяжелой цепи антитела 504.32R против бета7, где для шести HVR антитела указаны положения по системе нумерации Кабат и относительной системе нумерации (A-F). Также указаны аминокислоты в положениях 71, 73 и 78 участка FR3 тяжелой цепи. Для многих положений HVR или участка FR3 тяжелой цепи указаны используемые аминокислотные замены.
На фиг.16 показаны гистограммы, демонстрирующие относительную способность антител 504.32M и 504.32R блокировать хоминг меченных радиоактивными изотопами T-клеток в толстую кишку мыши с воспалительным заболеванием кишечника.
Способы осуществления изобретения
Данное изобретение предлагает способы, композиции, наборы и готовые изделия для идентификации и/или применения ингибиторов сигнального пути бета7.
Указанные способы, композиции, наборы и готовые изделия подробно описаны в данном документе.
Общие способы
При осуществлении настоящего изобретения, если не указано иначе, используют традиционные методы молекулярной биологии (в том числе рекомбинантные технологии), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, известные специалистам в данной области. Такие методы подробно описаны в литературе, например в "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", второе издание (Sambrook et al., 1989); "Oligonucltotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, и периодические дополнения); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., ed., 1994); "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988); "Phage Display: A Laboratory Manual" (Barbas et al., 2001).
Определения
Под термином "субъединица бета7" или "субъединица β7" подразумевается субъединица β7 человеческого интегрина (Erle et al., (1991) J. Biol. Chem. 266: 11009-11016). Субъединица бета7 связана с субъединицей интегрина альфа4, такой как человеческая субъединица α4 (Kilger and Holzmann (1995) J. Mol. Biol. 73:347-354). Интегрин альфа4бета7 экспрессируется на большинстве зрелых лимфоцитов, а также на небольшой популяции тимоцитов, на клетках костного мозга и на тучных клетках. (Kilshaw and Murant (1991) Eur. J. Immunol. 21: 2591-2597; Gurish et al., (1992) 149: 1964-1972; и Shaw, S.K. and Brenner, M.B. (1995) Semin. Immunol. 7:335). Субъединица бета7 также связана с субъедининцей альфаЕ, такой как субъединица альфаЕ человеческого интегрина (Cepek, K.L, et al. (1993) J. Immunol. 150: 3459). Интегрин альфаЕбета7 экспрессируется на лимфоцитах эпителия кишечника (ilEL) (Cepek, K.L. (1993) выше). Субъединица бета7, связывающаяся с гуманизированным антителом против бета7 согласно изобретению, может иметь природное происхождение, она может быть растворимой или локализованной на поверхности клетки.
Под термином "субъединица альфаЕ", или "субъединица альфаЕ интегрина", или "субъединица αE", или "субъединица αE интегрина", или "CD103" подразумевается субъединица интегрина, связанная с интегрином бета7, экспрессирующимся на внутриэпителиальных лимфоцитах, причем данный интегрин альфаЕбета7 опосредует связывание iELs с клетками кишечного эпителия, экспрессирующими E-кадгерин (Cepek, K.L. et al. (1993) J. Immunol. 150: 3459; Shaw, S.K. and Brenner, M.B. (1995) Semin. Immunol. 7: 335).
Термины "MAdCAM" или "MAdCAM-1" в контексте настоящего изобретения используют как взаимозаменяемые для обозначения белка молекулы клеточной адгезии - мукозного адрессина-1, который представляет собой одноцепочечный полипептид, содержащий короткий цитоплазматический хвост, трансмембранный участок и внеклеточную последовательность, состоящую из трех иммуноглобулин-подобных доменов. Были клонированы кДНК мышиного MAdCAM-1, человеческого MAdCAM-1 и MAdCAM-1 макаки (Briskin, et al, (1993) Nature, 363: 461-464; Shyjan et al., (1996) J. Immunol. 156:2851-2857).
Термин "VCAM-1", или "молекула адгезии сосудистых клеток-1", или "CD106" относится к лиганду альфа4бета7 и альфа4beta1, который экспрессируется на активированных эндотелиальных клетках и играет важную роль во взаимодействиях эндотелиальных клеток с лейкоцитами, таких как связывание и перемещение лейкоцитов в процессе воспаления.
Термин "E-кадгерин" относится к члену семейства кадгеринов, который экспрессируется на эпителиальных клетках. E-кадгерин является лигандом интегрина альфаЕбета7 и опосредует связывание альфаЕбета7, экспрессирующегося на iEL, с эпителиальными клетками кишечника, хотя его роль в хоминге лимфоцитов пока неясна. Экспрессия E-кадгерина повышается под действием TGF-бета1.
Термин "фибронектин" относится к фибронектину, который участвует в восстановлении ткани, эмбриогенезе, свертывании крови и миграции/адгезии клеток. Он служит связующим средством в ECM (внеклеточном матриксе) и в виде димера присутствует в плазме (плазматический фибронектин). Плазматическая форма синтезируется гепатоцитами, а ECM форма продуцируется фибробластами, хондроцитами, эндотелиальными клетками, макрофагами, а также некоторыми эпителиальными клетками. В данном контексте он взаимодействует с интегрином альфа4бета7 и опосредует события хоминга или адгезии лимфоцитов. ECM форма фибронектина выполняет роль основной адгезивной молекулы клеток, обеспечивая прилипание клеток к коллагеновым или протеогликановым субстратам. Фибронектин также может участвовать в организации взаимодействия клеток с ECM путем связывания с разными компонентами внеклеточного матрикса и с мембраносвязанными рецепторами фибронектина на клеточных поверхностях. Наконец, фибронектин играет важную роль в событиях, связанных с миграцией клеток в процессе эмбриогенеза.
"Желудочно-кишечные воспалительные заболевания" представляют собой группу хронических заболеваний, которые вызывают воспаление и/или образование язвы в мембране слизистой оболочки. Данные заболевания включают в себя, например, воспалительное заболевание кишечника (например, болезнь Крона, язвенный колит, неопределяемый колит и инфекционный колит), мукозит (например, мукозит ротовой полости, желудочно-кишечный мукозит, назальный мукозит и проктит), некротический энтероколит и эзофагит.
Термин "воспалительное заболевание кишечника" или "IBD" используется в данном описании на равных основаниях в отношении заболеваний кишечника, которые вызывают воспаление и/или образование язвы и включают в себя, без ограничения, болезнь Крона и язвенный колит.
"Болезнь Крона (CD)" или "язвенный колит (UC)" представляют собой хронические воспалительные заболевания кишечника неизвестной этиологии. Болезнь Крона, в отличие от язвенного колита, может поражать любые части кишечника. Наиболее заметным признаком болезни Крона является гранулярное, красно-фиолетовое отечное утолщение стенки кишечника. С развитием воспаления данные гранулемы зачастую утрачивают четко обозначенные границы и сливаются с окружающей тканью. Преобладающими клиническими признаками данного заболевания являются диарея и непроходимость кишечника. Как и язвенный колит, болезнь Крона может быть непрерывной или рецидивирующей, легкой или тяжелой, но в отличие от язвенного колита болезнь Крона не лечится резекцией пораженного участка кишечника. Для большинства пациентов с болезнью Крона требуется хирургическое вмешательство по некоторым участкам, но после этого обычно наблюдается рецидив и требуется непрерывное медицинское лечение.
Болезнь Крона может поражать любые участки пищеварительного тракта от рта до ануса, хотя обычно она встречается в подвздошно-ободочном, тонком или толстом-аноректальном кишечнике. Гистологически заболевание проявляется в виде непрерывных гранулем, криптогенных абсцессов, трещин и афтозных язв. Воспалительный инфильтрат представляет собой смесь лимфоцитов (как T, так и B клеток), плазматических клеток, макрофагов и нейтрофилов. Наблюдается непропорциональное увеличение IgM- и IgG-секретирующих плазматических клеток, макрофагов и нейтрофилов.
Для лечения умеренно активной болезни Крона толстой кишки используют противовоспалительные лекарственные средства сульфазалазин и 5-аминосалициловую кислоту (5-ASA), которые также назначают для поддержания ремиссии данного заболевания. Для лечения перианального заболевания особенно пригодны метроидазол и ципрофлоксацин, которые по эффективности подобны сульфазалазину. В более тяжелых случаях эффективны кортикостероиды, которые позволяют лечить активные обострения и даже поддерживать ремиссию. Азатиоприн и 6-меркаптопурин являются эффективными для пациентов, требующих регулярного введения кортикостероидов. Данные лекарственные средства также можно использовать для длительной профилактики. К сожалению, у некоторых пациентов действие наступает с очень большой отсрочкой (до шести месяцев).
Для облегчения симптомов у некоторых пациентов также можно использовать противодиарейные средства. Диетотерапия или элементная диета могут улучшать питательный статус пациентов и вызывать симптоматическое улучшение острого заболевания, однако они не приводят к длительной клинической ремиссии. Для лечения вторичного чрезмерного развития микрофлоры в тонком кишечнике и пиогенных осложнений используют антибиотики.
"Язвенный колит (UC)" поражает тонкий кишечник. Заболевание может быть непрерывным или рецидивирующим, легким или тяжелым. К ранним патологическим изменением относится воспалительная инфильтрация с образованием абсцесса в основании либеркюновой крипты. Слияние данных растянутых и разрыхленных криптов способствует отделению вышележащей слизистой оболочки от кровоснабжения, приводя к образованию язвы. Симптомы данного заболевания включают в себя спазмы, боли в нижней части живота, ректальное кровотечение и частые, рыхлые испражнения, состоящие в основном из крови, гноя и слизи с небольшим количеством фекальных частиц. В случае острого, тяжелого или хронического непрерывного язвенного колита может потребоваться тотальная колэктомия.
Клинические признаки UC сильно варьируют, они могут развиваться постепенно или резко, и могут включать в себя диарею, тенезм и рецидивирующее ректальное кровотечение. При скоротечном включении всей толстой кишки может развиться токсический мегаколон, угрожающей состоянию жизни. Не связанные с кишечником проявления включают в себя артрит, гнойную гангрену, увеит и нодозную эритему.
Для лечения UC в легких случаях используют сульфазалазин и родственные салицилатсодержащие лекарственные средства, а в тяжелых случаях - кортикостероидные средства. Иногда, особенно, если заболевание ограничено дистальным кишечником, эффективно местное введение салицилатов или кортикостероидов, которое сопровождается более низкими побочными эффектами, чем системное введение. Иногда показана поддерживающая терапия, такая как введение железа и противодиарейных средств. В стойких случаях с кортикостероидной зависимостью иногда также назначают азатиоприн, 6-меркаптопурин и метотрексат.
Термин "модификация" аминокислотного остатка/положения в данном описании относится к изменению первичной аминокислотной последовательности по сравнению с исходной аминокислотной последовательностью, где изменение включает в себя изменение указанных аминокислотных остатков/положений. Например, типичные модификации включают в себя замену остатка (в определенном положении) на другую аминокислоту (например, консервативную или неконсервативную замену), вставку одной или нескольких (обычно меньше 5 или 3) аминокислот в участке, примыкающем к указанному остатку/положению, и делецию указанного остатка/положения. Термин "замена аминокислоты", или его вариант относится к замещению существующего аминокислотного остатка в известной (исходной) аминокислотной последовательности другим аминокислотным остатком. Обычно и предпочтительно модификация приводит к изменению, по меньшей мере, одной физикобиохимической активности вариантного полипептида по сравнению с полипептидом, содержащим исходную (или "дикого типа") аминокислотную последовательность. Например, в случае антитела, изменяемая физикобиохимическая активность может представлять собой сродство связывания, способность к связыванию и/или эффект, оказываемый на молекулу-мишень посредством связывания.
Термин "аминокислота" в объеме настоящего изобретения используется в самом широком смысле и включает в себя природные Lα-аминокислоты или их остатки. В данном описании для обозначения аминокислот используют традиционные одно- или трехбуквенные сокращенные названия (Lehninger, A.L., Biochemistry, 2d ed., pp.71-92, (Worth Publishers, New York, New York, 1975). Данный термин включает в себя D-аминокислоты, а также химически модифицированные аминокислоты, например аналоги аминокислот, природные аминокислоты, которые обычно не входят в состав белков, такие как норлейцин, и химически синтезированные соединения, свойства которых позволяют специалистам в данной области характеризовать их как аминокислоты. Например, в определение аминокислоты входят аналоги или миметики фенилаланина или пролина, которые обеспечивают такое же конформационное ограничение пептидных соединений, как и природные Phe или Pro. Такие аналоги и миметики в данном описании называют "функциональными эквивалентами" аминокислот. Другие примеры аминокислот перечислены в публикации Roberts and Vellaccio, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Gross and Meiehofer, Eds., Vol.5, p.341 (Academic Press, Inc., New York, New York, 1983), которая включена в данное описание в качестве ссылки. Иногда для обозначения аминокислот используют однобуквенные обозначения, которые можно найти в соответствующей литературе (см., например, Alberts, B. et al. Molecular Biology of the Cell, 3rd ed., Garland Publishing, Inc. 1994, page 57).
"Выделенное" антитело представляет собой антитело, которое было идентифицировано и извлечено из его природной среды, или отделено от компонентов его природного окружения. Нежелательными компонентами его природного окружения являются вещества, которые создают помехи при диагностическом или терапевтическом применении антитела, они могут включать в себя ферменты, гормоны и другие белковые и небелковые растворимые вещества. В предпочтительных воплощениях антитело очищают (1) до получения чистоты, составляющей более 95% по массе антитела, что определяют по методу Лоури, наиболее предпочтительно, более 99% по массе, (2) до степени, достаточной для получения, по меньшей мере, 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с помощью секвенатора с вращающейся чашкой, или (3) до гомогенности по данным анализа SDS-PAGE в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с окрашиванием Кумасси синим или, предпочтительно, серебром. Выделенное антитело включает в себя антитело in situ в рекомбинантных клетках, если по меньшей мере один компонент природного окружения антитела не присутствует. Однако обычно выделенное антитело получают после по меньшей мере одной стадии очистки.
Термин "нумерация остатка вариабельного домена по системе Кабат" или "нумерация аминокислотных положений по системе Кабат" и его варианты относится к системе нумерации, используемой для вариабельных доменов тяжелой или легкой цепи при компиляции антител в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). При использовании данной системы нумерации реальная линейная аминокислотная последовательность может содержать меньше или больше аминокислот, в зависимости от того, происходит ли укорачивание FR или CDR вариабельного домена, или вставка в FR или CDR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может содержать вставку одной аминокислоты (остаток 52a по системе Кабат) после остатка 52 H2 и вставку нескольких остатков (например, остатки 82a, 82b и 82c по системе Кабат) после остатка 82 FR тяжелой цепи. Остатки данного антитела можно пронумеровать по системе Кабат путем сравнения гомологичных участков первичных последовательностей данного антитела и "стандартной" последовательности, пронумерованной по системе Кабат.
Фраза "по существу подобный" или "практически одинаковый" в данном описании относится к достаточно высокой степени подобия двух численных значений (как правило, одно связано с антителом согласно изобретению, а другое связано со стандартным антителом/антителом сравнения), так что специалист в данной области может считать разницу между двумя значениями маленькой или не имеющей биологической и/или статистической значимости в контексте биологической характеристики, определяющейся указанными значениями (например, значениями Kd). Различие между двумя указанными значениями предпочтительно составляет менее чем приблизительно 50%, предпочтительно менее чем приблизительно 40%, предпочтительно менее чем приблизительно 30%, предпочтительно менее чем приблизительно 20%, предпочтительно менее чем приблизительно 10% от значения, полученного для стандартного антитела/антитела сравнения.
Термин "сродство связывания", как правило, относится к силе суммы всех нековалентных взаимодействий, происходящих между участком связывания молекулы (например, антитела) и ее партнером по связыванию (например, антигеном). Если не указано иначе, в данном описании термин "сродство связывания" относится к собственному сродству связывания, которое отражает взаимодействие между членами связывающейся пары (например, антителом и антигеном) 1:1. Сродство молекулы X к ее партнеру Y, как правило, можно оценить с помощью константы диссоциации (Kd). Сродство можно измерить традиционными методами, известными в данной области, в том числе описанными в данном документе. Антитела с низким сродством обычно связывают антиген медленно, а образовавшийся комплекс имеет тенденцию легко диссоциировать, тогда как антитела с высоким сродством обычно связывают антиген быстрее, а образовавшийся комплекс имеет тенденцию дольше оставаться в связанном состоянии. В данной области известен ряд способов измерения сродства связывания, каждый из которых можно использовать в целях настоящего изобретения. Конкретные иллюстративные воплощения описаны ниже.
125
125
6
-1
-1
on
off
off
on
В одном воплощении "Kd" или "значение Kd" в соответствии с данным изобретением измеряют с помощью анализа связывания антигена, меченного радиоактивным изотопом (RIA), который проводят с использованием Fab-версии целевого антитела и его антигена, как описано в нижеследующем анализе, где сродство связывания Fab к антигену измеряют в растворе путем уравновешивания Fab с минимальной концентрацией (I)-меченного антигена в присутствии серии титрующих растворов немеченного антигена, затем связанный антиген улавливают с помощью планшета, покрытого антителами против Fab (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881). Чтобы установить условия анализа микротитровальные планшеты (Dynex) покрывают в течение ночи раствором (5 мкг/мл) улавливающего антитела против Fab (Cappel Labs) в 50 мМ растворе карбоната натрия (pH 9,6) и затем блокируют 2% раствором (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина в PBS в течение от двух до пяти часов при комнатной температуре (приблизительно 23°C). В неадсорбирующем планшете (Nunc #269620) смешивают 100 пМ или 26 пМ [I]-антигена и серийные разбавления целевого Fab (например, по способу, используемому для анализа антитела против VEGF, Fab-12, Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). Затем целевое Fab инкубируют в течение ночи; однако инкубацию можно продолжать в течение более длительного периода времени (например, 65 часов), чтобы гарантировать достижение равновесия. Затем смеси переносят в планшет для улавливания и инкубируют при комнатной температуре (например, в течение одного часа). Затем раствор удаляют и планшет промывают восемь раз 0,1% раствором твина-20 в PBS. После высыхания планшетов добавляют сцинтиллятор в количестве 150 мкл/лунку (MicroScint-20; Packard) и считают планшеты на гамма-счетчике Topcount (Packard) в течение десяти минут. При проведении анализа конкурентного связывания для каждого Fab выбирают такие концентрации, которые обеспечивают связывание, не превышающее 20% от максимального связывания. В соответствии с другим воплощением Kd или значение Kd измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием BIAcore™-2000 или BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) и чипов CM5 с иммобилизованным антигеном при ~10 единицах ответа (RU) и 25°C. Коротко говоря, биосенсорные чипы с карбоксиметилированным декстраном (CM5, BIAcore Inc.) активируют гидрохлоридом N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями поставщика. Антиген разбавляют 10 мМ раствором ацетата натрия, pH 4,8, до 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) и затем вводят его со скоростью потока 5 мкл/минуту до достижения приблизительно 10 единиц ответа (RU) связанного белка. Чтобы блокировать непрореагировавшие группы, после ввода антигена вводят 1M этаноламин. Для измерения кинетических параметров вводят двухкратные серийные разбавления Fab (от 0,78 нМ до 500 нМ) в PBS, содержащем 0,05% твин-20 (PBST) при 25°C со скоростью потока приблизительно 25 мкл/мин. Скорость ассоциации (k) и скорость диссоциации (k) рассчитывают, используя простую модель связывания Ленгмюра один к одному (программное обеспечение для обработки данных BIAcore, версия 3.2) путем одновременного подгона сенсограмм ассоциации и диссоциации. Равновесную константу диссоциации рассчитывают как отношение k/k. См., например, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Biol 293: 865-881. Однако, если on-скорость, определенная с помощью упомянутого выше метода поверхностного плазмонного резонанса, превышает 10 M S, то данную скорость можно определить методом тушения флуоресценции, который позволяет измерять увеличение или уменьшение интенсивности эмиссии флуоресценции (длина волны возбуждения 295 нм; длина волны эмиссии 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25°C и концентрации антитела против антигена 20 нМ (форма Fab) в PBS, pH 7,2, в присутствии увеличивающихся концентраций антигена, определяемых с помощью спектрометра, такого как спектрофотометр с остановленным потоком (Aviv Instruments) или спектрофотометр SLM-Aminco серии 8000 (ThermoSpectronic) с кюветой, оборудованной мешалкой.
on
on
off
off
on
on
off
off
on
6
-1
-1
125
125
6
-1
-1
"on-скорость", или "скорость ассоциации", или "ассоциативную скорость", или "k", в соответствии с данным изобретением можно определять с помощью описанного выше метода поверхностного плазмонного резонанса с использованием BlAcore™-2000 или BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) и чипов CM5 с иммобилизованным антигеном при ~10 единицах ответа (RU) и 25°C. Коротко говоря, биосенсорные чипы с карбоксиметилированным декстраном (CM5, BIAcore Inc.) активируют гидрохлоридом N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями поставщика. Антиген разбавляют 10 мМ раствором ацетата натрия, pH 4,8, до 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) и затем вводят его со скоростью потока 5 мкл/минуту до достижения приблизительно 10 единиц ответа (RU) связанного белка. Чтобы блокировать непрореагировавшие группы, после ввода антигена вводят 1M этаноламин. Для измерения кинетических параметров вводят двухкратные серийные разбавления Fab (от 0,78 нМ до 500 нМ) в PBS, содержащем 0,05% твин-20 (PBST) при 25°C со скоростью потока приблизительно 25 мкл/мин. Скорость ассоциации (k) и скорость диссоциации (k) рассчитывают, используя простую модель связывания Ленгмюра один к одному (программное обеспечение для обработки данных BIAcore, версия 3.2) путем одновременного подгона сенсограмм ассоциации и диссоциации. Равновесную константу диссоциации рассчитывают как отношение k/k. См., например, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Biol 293: 865-881. Однако, если on-скорость, определенная с помощью упомянутого выше метода поверхностного плазмонного резонанса, превышает 10 M S, то данную скорость предпочтительно определяют методом тушения флуоресценции, который позволяет измерять увеличение или уменьшение интенсивности эмиссии флуоресценции (длина волны возбуждения 295 нм; длина волны эмиссии 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25°C и концентрации антитела против антигена 20 нМ (форма Fab) в PBS, pH 7,2, в присутствии увеличивающихся концентраций антигена, определяемых с помощью спектрометра, такого, как спектрофотометр с остановленным потоком (Aviv Instruments) или спектрофотометр SLM-Aminco серии 8000 (ThermoSpectronic) с кюветой, оборудованной мешалкой. "Kd" или "значение Kd" в соответствии с данным изобретением измеряют с помощью анализа связывания антигена, меченного радиоактивным изотопом (RIA), который проводят с использованием Fab-версии целевого антитела и его антигена, как описано в нижеследующем анализе, где сродство связывания Fab к антигену измеряют в растворе путем уравновешивания Fab с минимальной концентрацией (I)-меченного антигена в присутствии серии титрующих растворов немеченного антигена, затем связанный антиген улавливают с помощью планшета, покрытого антителами против Fab (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881). Чтобы установить условия анализа, микротитровальные планшеты (Dynex) покрывают в течение ночи раствором (5 мкг/мл) улавливающего антитела против Fab (Cappel Labs) в 50 мМ растворе карбоната натрия (pH 9,6) и затем блокируют 2% раствором (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина в PBS в течение от двух до пяти часов при комнатной температуре (приблизительно 23°C). В неадсорбирующем планшете (Nunc #269620) смешивают 100 пМ или 26 пМ [I]-антигена и серийные разбавления целевого Fab (например, по способу, используемому для анализа антитела против VEGF, Fab-12, Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). Затем целевое Fab инкубируют в течение ночи; однако инкубацию можно продолжать в течение более длительного периода времени (например, 65 часов), чтобы гарантировать достижение равновесия. Затем смеси переносят в планшет для улавливания и инкубируют при комнатной температуре в течение одного часа. Затем раствор удаляют и планшет промывают восемь раз 0,1% раствором твина-20 в PBS. После высыхания планшетов добавляют сцинтиллятор в количестве 150 мкл/лунку (MicroScint-20; Packard) и считают планшеты на гамма-счетчике Topcount (Packard) в течение десяти минут. При проведении анализа конкурентного связывания для каждого Fab выбирают такие концентрации, которые обеспечивают связывание, не превышающее 20% от максимального связывания. В соответствии с другим воплощением Kd или значение Kd измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием BIAcore™-2000 или BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) и чипов CM5 с иммобилизованным антигеном при ~10 единицах ответа (RU) и 25°C. Коротко говоря, биосенсорные чипы с карбоксиметилированным декстраном (CM5, BIAcore Inc.) активируют гидрохлоридом N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями поставщика. Антиген разбавляют 10 мМ раствором ацетата натрия, pH 4,8, до 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) и затем вводят его со скоростью потока 5 мкл/минуту до достижения приблизительно 10 единиц ответа (RU) связанного белка. Чтобы блокировать непрореагировавшие группы, после ввода антигена вводят 1M этаноламин. Для измерения кинетических параметров вводят двухкратные серийные разбавления Fab (от 0,78 нМ до 500 нМ) в PBS, содержащем 0,05% твин-20 (PBST), при 25°C со скоростью потока приблизительно 25 мкл/мин. Скорость ассоциации (k) и скорость диссоциации (k) рассчитывают, используя простую модель связывания Ленгмюра один к одному (программное обеспечение для обработки данных BIAcore, версия 3.2) путем одновременного подгона сенсограмм ассоциации и диссоциации. Равновесную константу диссоциации рассчитывают как отношение k/k. См., например, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Biol 293: 865-881. Однако, если on-скорость, определенная с помощью упомянутого выше метода поверхностного плазмонного резонанса, превышает 10 M S, то данную скорость можно определить методом тушения флуоресценции, который позволяет измерять увеличение или уменьшение интенсивности эмиссии флуоресценции (длина волны возбуждения 295 нм; длина волны эмиссии 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25°C и концентрации антитела против антигена 20 нМ (форма Fab) в PBS, pH 7,2, в присутствии увеличивающихся концентраций антигена, определяемых с помощью спектрометра, такого как спектрофотометр с остановленным потоком (Aviv Instruments) или спектрофотометр SLM-Aminco серии 8000 (ThermoSpectronic) с кюветой, оборудованной мешалкой.
on
on
off
off
on
6
-1
-1
В одном воплощении "on-скорость", или "скорость ассоциации", или "ассоциативную скорость", или "k", в соответствии с данным изобретением можно определять с помощью описанного выше метода поверхностного плазмонного резонанса с использованием BIAcore™-2000 или BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) и чипов CM5 с иммобилизованным антигеном при ~10 единицах ответа (RU) и 25°C. Коротко говоря, биосенсорные чипы с карбоксиметилированным декстраном (CM5, BIAcore Inc.) активируют гидрохлоридом N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями поставщика. Антиген разбавляют 10 мМ раствором ацетата натрия, pH 4,8, до 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) и затем вводят его со скоростью потока 5 мкл/минуту до достижения приблизительно 10 единиц ответа (RU) связанного белка. Чтобы блокировать непрореагировавшие группы, после ввода антигена вводят 1M этаноламин. Для измерения кинетических параметров вводят двухкратные серийные разбавления Fab (от 0,78 нМ до 500 нМ) в PBS, содержащем 0,05% твин-20 (PBST) при 25°C со скоростью потока приблизительно 25 мкл/мин. Скорость ассоциации (k) и скорость диссоциации (k) рассчитывают, используя простую модель связывания Ленгмюра один к одному (программное обеспечение для обработки данных BIAcore, версия 3.2) путем одновременного подгона сенсограмм ассоциации и диссоциации. Равновесную константу диссоциации рассчитывают как отношение k/k. См., например, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Biol 293: 865-881. Однако, если on-скорость, определенная с помощью упомянутого выше метода поверхностного плазмонного резонанса, превышает 10 M S, то данную скорость предпочтительно определяют методом тушения флуоресценции, который позволяет измерять увеличение или уменьшение интенсивности эмиссии флуоресценции (длина волны возбуждения 295 нм; длина волны эмиссии 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25°C и концентрации антитела против антигена 20 нМ (форма Fab) в PBS, pH 7,2, в присутствии увеличивающихся концентраций антигена, определяемых с помощью спектрометра, такого, как спектрофотометр с остановленным потоком (Aviv Instruments) или спектрофотометр SLM-Aminco серии 8000 (ThermoSpectronic) с кюветой, оборудованной мешалкой.
Фраза "существенно уменьшенный" или "по существу отличающийся" в данном описании относится к достаточно высокой степени различия двух численных значений (как правило, одно связано с антителом согласно изобретению, а другое связано со стандартным антителом/антителом сравнения), так что специалист в данной области может считать разницу между двумя значениями статистически значимой в контексте биологической характеристики, определяющейся указанными значениями (например, значениями Kd, ответом HAMA). Различие между двумя указанными значениями предпочтительно составляет больше чем приблизительно 10%, предпочтительно больше чем приблизительно 20%, предпочтительно больше чем приблизительно 30%, предпочтительно больше чем приблизительно 40%, предпочтительно больше чем приблизительно 50% от значения, полученного для стандартного антитела/антитела сравнения.
"Процент идентичности (%) аминокислотной последовательности" в применении к пептидной или полипептидной последовательности определяют как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, идентичных аминокислотным остаткам в идентифицированной пептидной или полипептидной последовательности, путем выравнивания последовательностей и, при необходимости, введения гэпов для получения максимального процента идентичности последовательности, причем консервативные замены не считают частью идентичности последовательности. Выравнивание последовательностей с целью определения процента идентичности аминокислотной последовательности можно осуществить разными способами, известными в данной области, например с помощью широко доступного программного обеспечения, такого, как BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить параметры, подходящие для проведения выравнивания, в том числе любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Однако в целях настоящего изобретения значения % идентичности аминокислотных последовательностей получают с помощью компьютерной программы для сравнения последовательностей ALIGN-2, где исходный код программы ALIGN-2 приведен ниже в таблице A. Компьютерная программа для сравнения последовательностей ALIGN-2 разработана Genentech, Inc., а исходный код, приведенный ниже в таблице A, зарегистрирован с сопровождающей документацией в ведомстве по охране авторских прав США, Washington D.C., 20559, под номером TXU510087. Программа ALIGN-2 поставляется Genentech, Inc., South San Francisco, California, или ее можно скомпилировать из исходного кода, приведенного ниже на фиг.8. Программу ALIGN-2 можно скомпилировать для применения на операционной системе UNIX, предпочтительно цифровой UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей определяются программой ALIGN-2 и не изменяются.
Если ALIGN-2 используется для сравнения аминокислотных последовательностей, % идентичности некоторой аминокислотной последовательности A и некоторой аминокислотной последовательности B, или по сравнению с некоторой аминокислотной последовательностью B (или иначе можно сказать, что некоторая аминокислотная последовательность A содержит определенный % идентичности аминокислотной последовательности по сравнению с некоторой аминокислотной последовательностью B, или по отношению к некоторой аминокислотной последовательности B), рассчитывают следующим образом:
100 × X/Y,
где X означает число аминокислотных остатков последовательности А, которые программа для сравнения последовательностей ALIGN-2 идентифицирует как идентичные соответствующим остаткам последовательности B, и где Y означает общее число аминокислотных остатков последовательности B. Следует учитывать, что если длина аминокислотной последовательности A не равна длине аминокислотной последовательности B, % идентичности аминокислотной последовательности A по отношению к B не равен % идентичности аминокислотной последовательности B по отношению к A.
Если не указано иначе, все значения % идентичности аминокислотной последовательности, используемые в данном описании, получают по способу, описанному в предыдущем параграфе с использованием компьютерной программы ALIGN-2.
Таблица A
Термин "вектор" в данном описании относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной переносить связанную с ней другую нуклеиновую кислоту. Одним типом вектора является "плазмида", представляющая собой циклическую двухцепочечную петлю ДНК, в которую можно лигировать другие сегменты ДНК. Другим типом вектора является фаговый вектор. Другим типом вектора является вирусный вектор, где другие сегменты ДНК можно лигировать в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, содержащие бактериальные ориджины репликации, и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) после введения в клетку-хозяина могут встраиваться в геном данной клетки и в результате реплицироваться наряду с геномом хозяина. Кроме того, некоторые векторы способны управлять экспрессией генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы в данном описании называют "рекомбинантные векторы экспрессии" (или просто "рекомбинантные векторы"). Как правило, в качестве векторов экспрессии в методах рекомбинантных ДНК зачастую используют плазмиды. В настоящем описании термины "плазмида" и "вектор" могут использоваться как взаимозаменяемые, поскольку плазмида представляет собой наиболее часто используемый тип вектора.
Термины "полинуклеотид" или "нуклеиновая кислота", используемые в данном описании как взаимозаменяемые, относятся к полимерным нуклеотидам любой длины и включают в себя ДНК и РНК. Нуклеотиды могут представлять собой дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды, модифицированные нуклеотиды или основания и/или их аналоги, или любой субстрат, который может быть включен в полимер с помощью ДНК- или РНК-полимеразы или в результате реакции синтеза. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. Если модификация нуклеотидной структуры имеет место, она может быть введена до или после сборки полимера. В последовательность нуклеотидов могут быть включены ненуклеотидные компоненты. Полинуклеотид можно дополнительно модифицировать после синтеза, например, путем конъюгации с меткой. Другие типы модификаций включают в себя, например, "кэпирование", замену одного или нескольких природных нуклеотидов на аналог, межнуклеотидные модификации, такие как, например, модификации, связанные с образованием связи, не несущей заряда (например, метилфосфонаты, фосфотриэфиры, фосфоамидаты, карбаматы и др.), и связи, несущей заряд (например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и др.), модификации, содержащие дополнительные фрагменты, такие как, например, белки (например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды, поли-L-лизин и др.), модификации, содержащие интеркалирующие агенты (например, акридин, псорален и др.), модификации, содержащие хелатирующие агенты (например, металлы, радиоактивные металлы, бор, окисляющие металлы и др.), модификации, содержащие алкилирующие агенты, модификации, содержащие модифицированные связи (например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и др.), а также немодифицированные формы полинуклеотидов. Кроме того, все гидроксильные группы, обычно присутствующие в сахарах, могут быть замещены, например, фосфонатными группами, фосфатными группами, они также могут быть защищены стандартными защитными группами или активированы для образования связей с другими нуклеотидами, или они могут участвовать в конъюгации с твердыми или полутвердыми носителями. 5'- и 3'-концевые группы OH могут быть фосфорилированными или они могут быть замещены аминами или органическими кэпирующими фрагментами, содержащими от 1 до 20 атомов углерода. Другие гидроксильные группы тоже можно дериватизировать с получением стандартных защитных групп. Полинуклеотиды также могут содержать аналогичные формы рибозных или дезоксирибозных сахаров, которые широко известны в данной области и включают в себя, например, 2'-O-метил-, 2'-O-аллил, 2'-фтор- или 2'-азидо-рибозу, карбоциклические аналоги сахаров, альфа-аномерные сахара, эпимерные сахара, такие как арабиноза, ксилоза или ликсоза, пиранозные сахара, фуранозные сахара, седогептулозу, ациклические аналоги и абазические нуклеозидные аналоги, такие как метилрибозид. Одну или несколько фосфодиэфирных связей можно заменить альтернативными связывающими группами. Такие альтернативные связывающие группы включают в себя, без ограничения, воплощения, в которых фосфат заменен на P(О)S("тиоат"), P(S)S("дитиоат"), "(O)NR.sub.2("амидат"), P(O)R, P(O)OR', CO или CH.sub.2("формацеталь"), где каждый R или R' независимо означает H или замещенный или незамещенный алкил (1-20 C), необязательно содержащий простую эфирную связь (-O-), арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или аралдил. Не все связи в полинуклеотиде должны быть идентичными. Вышесказанное применимо ко всем полинуклеотидам, упоминаемым в данном документе, в том числе РНК и ДНК.
Термин "олигонуклеотид" в данном описании, как правило, относится к коротким, обычно одноцепочечным и синтетическим полинуклеотидам, которые зачастую, но необязательно, имеют длину менее чем приблизительно в 200 нуклеотидов. Термины "олигонуклеотид" и "полинуклеотид" не являются взаимно исключающими. Все сказанное выше в отношении полинуклеотидов равным образом и полностью применимо к олигонуклеотидам.
Термины "антитело" и "иммуноглобулин" используются как взаимозаменяемые в самом широком смысле и включают в себя моноклональные антитела (например, полноразмерные или интактные моноклональные антитела), поликлональные антитела, поливалентные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела, если они обладают желательной биологической активностью), данные термины также могут включать в себя некоторые фрагменты антител (как подробно описано в данном документе). Антитело может быть человеческим, гуманизированным и/или аффинно-зрелым.
"Фрагменты антител" содержат только часть интактного антитела, которая предпочтительно сохраняет, по меньшей мере, одну функцию, предпочтительно большую часть функций или все функции, выполняемые данной частью, когда она входит в состав интактного антитела. В одном воплощении фрагмент антитела содержит антигенсвязывающий участок интактного антитела и, следовательно, сохраняет способность связывать антиген. В другом воплощении фрагмент антитела, например, который содержит участок Fc, сохраняет, по меньшей мере, одну из биологических функций, обычно выполняемых участком Fc, когда он является частью интактного антитела, таких как связывание FcRn, модулирование периода полужизни антитела, функция ADCC и связывание комплемента. В одном воплощении фрагмент антитела представляет собой моновалентное антитело, которое имеет по существу такой же период полужизни in vivo, как и интактное антитело. Например, такой фрагмент антитела может содержать антигенсвязывающее плечо, соединенное с последовательностью Fc, способной придавать данному фрагменту стабильность in vivo.
Термин "моноклональное антитело" в данном описании относится к антителу, полученному из практически гомогенной популяции антител, т.е. отдельные антитела, составляющие данную популяцию, являются идентичными за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в минорных количествах. Моноклональные антитела обладают высокой специфичностью против одного антигена. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно содержат разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной антигенной детерминанты.
Моноклональные антитела в данном описании отдельно включают в себя "химерные" антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям антитела, полученного из конкретных видов или принадлежащего к конкретному классу или подклассу антител, тогда как другая часть цепи (цепей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям антитела, полученного из других видов или принадлежащего к другому классу или подклассу антител, данный термин также включает в себя фрагменты таких антител, если они сохраняют желательную биологическую активность (патент США №4816567; и Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 81: 6851-6855 (1984)).
"Гуманизированные" формы нечеловеческих (например, мышиных) антител представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность нечеловеческого иммуноглобулина. Главным образом, гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (реципиентные антитела), где остатки гипервариабельного участка реципиента заменяют на остатки гипервариабельного участка вида, отличного от человека (донорное антитело), такого как мышь, крыса, кролик или отличный от человека примат, который имеет желательную специфичность, сродство и антигенсвязывающую емкость. В некоторых случаях остатки каркасного участка (FR) человеческого иммуноглобулина заменяют на соответствующие нечеловеческие остатки. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, не присутствующие в реципиентном антителе или в донорном антителе. Такие модификации осуществляют для дополнительного улучшения свойств антитела. Как правило, гуманизированное антитело содержит практически все из по меньшей мере одного, обычно двух, вариабельных доменов, в которых все или практически все гипервариабельные петли соответствуют участкам нечеловеческого иммуноглобулина, а все или практически все FR имеют последовательность человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело также может необязательно содержать по меньшей мере часть константного участка иммуноглобулина (Fc), обычно человеческого иммуноглобулина. Более детальные подробности можно найти в Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332: 323-329 (1988); и Presta, Curr. Op.Struct. Biol. 2: 593-596 (1992). См. также следующие обзорные статьи и приведенные в них ссылки: Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op.Biotech. 5: 428-433 (1994).
Термин "антиген" относится к идентифицированному антигену, с которым избирательно связывается антитело. Целевой антиген может представлять собой полипептид, углевод, нуклеиновую кислоту, липид, гаптен или другое природное или синтетическое соединение. Предпочтительно целевой антиген представляет собой полипептид. "Акцепторный человеческий каркасный участок", используемый в настоящем изобретении, представляет собой каркасный участок, содержащий аминокислотную последовательность каркасного участка VL или VH, полученную из каркасного участка человеческого иммуноглобулина или из консенсусного человеческого каркасного участка. Акцепторный человеческий каркасный участок, "полученный из" каркасного участка человеческого иммуноглобулина или из консенсусного человеческого каркасного участка, может иметь такую же аминокислотную последовательность, как и эти участки, или он может содержать изменения в исходной аминокислотной последовательности. Если изменения исходных аминокислот имеют место, предпочтительно присутствует не более 5, предпочтительно 4 или менее или 3 или менее, изменений исходных аминокислот. Если изменения исходных аминокислот присутствуют в VH, предпочтительно данные изменения имеют место только в трех, двух или одном из положений 71H, 73H и 78H; например, аминокислотные остатки в данных положениях могут представлять собой 71A, 73T и/или 78A. В одном воплощении последовательность акцепторного человеческого каркасного участка VL идентична последовательности каркасного участка VL человеческого иммуноглобулина или человеческой консенсусной последовательности каркасного участка.
"Человеческий консенсусный каркасный участок" представляет собой каркасный участок, который содержит аминокислотные остатки, наиболее часто встречающиеся в совокупности последовательностей каркасных участков VL или VH человеческих иммуноглобулинов. Как правило, совокупность последовательностей VL или VH человеческих иммуноглобулинов относится к подгруппе последовательностей вариабельного домена. Обычно подгруппа последовательностей представляет собой подгруппу, описанную в Kabat et al. В одном воплощении, в случае VL, подгруппа представляет собой подгруппу каппа I, описанную в Kabat et al. В одном воплощении, в случае VH, подгруппа представляет собой подгруппу III, описанную в Kabat et al.
"Консенсусный каркасный участок VL подгруппы I" включает в себя консенсусную последовательность, полученную из аминокислотных последовательностей вариабельной легкой цепи каппа подгруппы I, Kabat et al. В одном воплощении консенсусная аминокислотная последовательность каркасного участка VL подгруппы I содержит по меньшей мере частично или полностью каждую из нижеследующих последовательностей:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 34)-L1-WYQQKPGKAPKLLI (SEQ ID NO: 35)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 36)-L3-FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 37).
"Консенсусный каркасный участок VH подгруппы III" содержит консенсусную последовательность, полученную из аминокислотных последовательностей вариабельных участков тяжелой цепи подгруппы III, Kabat et al. В одном воплощении аминокислотная последовательность консенсусного каркасного участка VH подгруппы III содержит по меньшей мере частично или полностью каждую из нижеследующих последовательностей: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 38)-H1-WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 39)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO: 40)-H3-WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 41).
"Немодифицированный человеческий каркасный участок" представляет собой человеческий каркасный участок, который имеет такую же аминокислотную последовательность, как и акцепторный человеческий каркасный участок, который, например, не содержит замен человеческих аминокислот на нечеловеческие.
Термин "измененный гипервариабельный участок" в данном описании относится к гипервариабельному участку, содержащему одну или несколько (например, от одной до приблизительно 16) аминокислотных замен.
Термин "немодифицированный гипервариабельный участок" в данном описании относится к гипервариабельному участку, содержащему такую же аминокислотную последовательность, что и нечеловеческое антитело, из которого ее получают, т.е. данная последовательность не содержит аминокислотных замен.
Термин "гипервариабельный участок", "HVR" или "HV", в данном описании относится к участкам вариабельного домена антитела, последовательности которых являются гипервариабельными и/или образуют определяемые структурой петли. Обычно антитела содержат шесть гипервариабельных участков; три в VH (H1, H2, H3) и три в VL (L1, L2, L3). Понятие числа границ гипервариабельных участков используется и входит в объем данного описания. Наиболее широко используются гипервариабельные участки Kabat (CDR), основанные на вариабельности последовательности (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Расположение структурных петель описано Chothia (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Гипервариабельные участки AbM представляют собой нечно среднее между CDR Кабат и структурными петлями Chothia и используются в программе для моделирования Oxford Molecular's AbM. "Контактные" гипервариабельные участки определяют на основе анализа доступных комплексных кристаллических структур. Остатки из указанных гипервариабельных участков приведены ниже.
Таблица 1
Петля
Кабат
AbM
Chothia
Контактные
L1
L24-L34
L24-L34
L26-L32
L30-L36
L2
L50-L56
L50-L56
L50-L52
L46-L55
L3
L89-L97
L89-L97
L91-L96
L89-L96
H1Нумерация по Кабату
Н31-Н35В
Н26-Н35В
Н26-Н32
Н30-Н35В
H1 нумерацияПо Chothia
Н31-Н35
Н26-Н35
Н26-Н32
Н30-Н35
Н2
Н50-Н65
Н50-Н58
Н53-Н55
Н47-Н58
Н3
Н95-Н102
Н95-Н102
Н96-Н101
Н93-Н101
Гипервариабельные участки могут включать в себя следующие "расширенные гипервариабельные участки": 24-36 или 24-34 (L1), 46-56, или 49-56, или 50-56, или 52-56 (L2), и 89-97 (L3) в VL и 26-35 (H1), 50-65 или 49-65 (H2), и 93-102, 94-102 или 95-102 (H3) в VH. Остатки вариабельного домена нумеруют по системе Кабат (Kabat et al., выше) для каждого из указанных определений.
В данном описании остатками "каркасного участка" или "FR" считаются остатки вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельного участка.
"Человеческое антитело" представляет собой антитело, которое имеет аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности антитела, продуцируемого человеком и/или полученного с использованием методов получения человеческих антител, описанных в данном документе. В данное определение человеческого антитела не входит гуманизированное антитело, содержащее нечеловеческие антигенсвязывающие остатки.
Термин "афинное созревание" антитела относится к одному или нескольким изменениям в одном или нескольких CDR, которые приводят к повышению сродства антитела к антигену по сравнению с исходным антителом, которое не содержит таких изменений. Предпочтительные аффинно-зрелые антитела имеют наномолярное или даже пикомолярное сродство к антигену-мишени. Аффинно-зрелые антитела получают с помощью известных в данной области способов. Marks et al. Bio/Technology 10: 779-783 (1992) описывают созревание аффинности в результате перетасовки VH и VL доменов. Неспецифический мутагенез остатков CDR и/или каркасного участка описан в: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); and Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).
"Блокирующее" антитело или "антагонистическое" антитело представляет собой антитело, которое ингибирует или снижает биологическую активность связываемого им антигена. Предпочтительные блокирующие или антагонистические антитела по существу или полностью ингибируют биологическую активность антигена.
Термин "агонистическое антитело" в данном описании относится к антителу, которое имитирует, по меньшей мере, одну из функциональных активностей целевого полипептида.
"Нарушение" представляет собой любое состояние, улучшающееся в результате лечения с использованием вещества/молекулы или способа согласно изобретению. Данный термин включает в себя хронические и острые нарушения или заболевания, в том числе патологические состояния, которые провоцируют развитие у млекопитающего рассматриваемого нарушения. Неограничивающие примеры нарушений, которые можно лечить с помощью способов согласно изобретению, включают в себя злокачественные и доброкачественные опухоли; злокачественные заболевания, отличные от лейкоза, и опухоли лимфатических узлов; нейронные, глиальные, астроцитальные нарушения, заболевания гипоталамуса и других желез внутренней секреции, макрофагальные, эпителиальные, стромальные и бластоцелевые нарушения; а также воспалительные, иммунологические и другие, связанные с ангиогенезом, нарушения.
Термин "заболевание, связанное с иммунной системой" относится к заболеванию, при котором компонент иммунной системы млекопитающего вызывает, опосредует или иначе вносит вклад в болезненное состояние млекопитающего. Данный термин также включает в себя заболевания, при которых стимуляция или введение в действие иммунного ответа оказывает благоприятный эффект на развитие заболевания. В объем данного термина входят опосредуемые иммунной системой воспалительные заболевания, не опосредуемые иммунной системой воспалительные заболевания, инфекционные заболевания, иммунодефицитные заболевания, неоплазия и др.
Примеры связанных с иммунной системой и воспалительных заболеваний, некоторые из которых опосредуются иммунными или Т-клетками, которые можно лечить с помощью способов согласно изобретению, включают в себя системную красную волчанку, ревматоидный артрит, ювенильный хронический артрит, спондилоартропати, системный склероз (склеродермия), идиопатические воспалительные миопатии (дерматомиозит, полимиозит), синдром Шегрена, системный васкулит, саркоидоз, аутоиммунную гемолитическую анемию (иммунная панцитопения, ночная пароксизмальная гемоглобинурия), аутоиммунную тромбоцитопению (идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, опосредованная иммунной системой тромбоцитопения), тиреоидит (диффузный токсический зоб, тиреоидит Хашимото, ювенильный лимфоцитарный тиреоидит, атрофический тиреоидит), сахарный диабет, опосредованное иммунной системой заболевание почек (гломерулонефрит, тубулоинтерстициальный нефрит), демиелинизирующие заболевания центральной и периферической нервных систем, такие как рассеянный склероз, идиопатическая демиелинизирующая полиневропатия или синдром Гийена-Барре и хроническая воспалительная демиелинизирующая полиневропатия, гепатобилиарные заболевания, такие как инфекционный гепатит (гепатит A, B, C, D, E и другие негепатотропные вирусы), аутоиммунный хронический активный гепатит, первичный билиарный цирроз печени, гранулематозный гепатит и склерозирующий холангит, воспалительные заболевания кишечника (язвенный колит: болезнь Крона), глютензависимую энтеропатию и болезнь Уиппла, аутоиммунные или опосредуемые иммунной системой заболевания кожи, в том числе буллезные заболевания кожи, полиморфная эритема и контактный дерматит, псориаз, аллергические заболевания, такие как астма, аллергический ринит, атопический дерматит, повышенная чувствительность к пище и крапивница, иммунологические заболевания легких, такие как эозинофильная пневмония, идиопатический фиброз легких и гиперчувствительный пневмонит, заболевания, связанные с трансплантацией, в том числе отторжение трансплантата и реакция "трансплантат против хозяина". Инфекционные заболевания, в том числе вирусные заболевания, такие как СПИД (инфекция ВИЧ), гепатит A, B, C, D и E, герпес и др., бактериальные инфекции, грибковые инфекции, протозойные инфекции и паразитарные инфекции.
Термины "аутоиммунное нарушение" или "аутоиммунное заболевание" в данном описании используются как взаимозаменяемые и относятся к незлокачественному заболеванию или нарушению, направленному против собственных тканей субъекта. Описанные в данном документе аутоимунные заболевания не включают в себя злокачественные или раковые заболевания или состояния, в частности они не включают в себя B-клеточную лимфому, острый лимфобластный лейкоз (ALL), хронический лимфолейкоз (CLL), волосатоклеточный лейкоз и хронический лейкоз миелобластов. Примеры аутоиммунных заболеваний или нарушений включают в себя, без ограничения, воспалительные ответы, такие как воспалительные заболевания кожи, в том числе псориаз и дерматит (например, атопический дерматит); системная склеродермия и склероз; ответы, связанные с воспалительным заболеванием кишечника (таким как болезнь Крона и язвенный колит); синдром дыхательной недостаточности (в том числе синдром расстройства дыхания у взрослых; ARDS); дерматит; менингит; энцефалит; увеит; колит; гломерулонефрит; аллергические состояния, такие как экзема и астма, и другие состояния, включающие в себя инфильтрацию Т-клеток и хронические воспалительные ответы; атеросклероз; недостаточная адгезия лейкоцитов; ревматоидный артрит; системная красная волчанка (SLE); сахарный диабет (например, сахарный диабет типа I или инсулин-зависимый сахарный диабет); рассеянный склероз; синдром Рейно; аутоиммунный тиреоидит; аллергический энцефаломиелит; синдром Шергена; ювенильный диабет; и иммунные ответы, связанные с острой гиперчувствительностью замедленного типа, опосредуемой цитокинами и Т-лимфоцитами, обычно присутствующими при туберкулезе, саркоидозе, полимиозите, гранулематозе и васкулите; пернициозная анемия (болезнь Аддисона); заболевания, связанные с диапедезом лейкоцитов; воспалительные нарушения центральной нервной системы (ЦНС); синдром поражения нескольких органов; гемолитическая анемия (включающая в себя, без ограничения, криоглобулинемию или позитивную анемию Кумбса); миастению gravis; заболевания, опосредованные комплексом антиген-антитело; заболевание, направленное против клубочковой базальной мембраны; антифосфолипидный синдром; аллергический неврит; болезнь Грейвса; миастенический синдром Ламберта-Этона; пемфигоидная пузырчатка; пемфигус; аутоиммунные полиэндокринные синдромы; болезнь Рейтера; синдром ограниченной подвижности; болезнь Бехета; гигантоклеточный артериит; нефрит, опосредованный иммунными комплексами; IgA-нефропатия; IgM-полиневропатия; иммунная тромбоцитопеническая пурпура (ITP) или аутоиммунная тромбоцитопения и др.
Термин "желудочно-кишечные воспалительные заболевания" относится к группе хронических заболеваний, которые вызвают воспаление и/или изъязвление слизистой мембраны. Как таковой данный термин включает в себя воспалительное заболевание кишечника (например, болезнь Крона, язвенный колит, колит неясного происхождения и инфекционный колит), мукозит (например, мукозит полости рта, мукозит желудочно-кишечного тракта, назальный мукозит и проктит), некротический энтероколит и эзофагит.
Термины "клеточно-пролиферативное нарушение" и "пролиферативное нарушение" отностяся к нарушениям, связанным с некоторыми отклонениями в клеточной пролиферации. В одном воплощении клеточно-пролиферативным нарушением является рак.
Термин "опухоль" в данном описании относится к любому росту или пролиферации неопластических клеток как злокачественному, так и доброкачественному, а также ко всем предраковым и раковым клеткам и тканям. Термины "рак", "раковый", "клеточно-пролиферативное нарушение", "пролиферативное нарушение" и "опухоль" в данном описании не считаются взаимно исключающими.
Термины "рак" и "раковый" относятся к физиологическому состоянию млекопитающего или описывают физиологическое состояние млекопитающего, характеризующееся нерегулируемым ростом/пролиферацией клеток. Примеры рака включают в себя, без ограничения, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких раковых заболеваний включают в себя плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого, плоскоклеточный рак легкого, рак брюшной полости, печеночно-клеточный рак, рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиобластома, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак ободочной и прямой кишки, карцинома эндометрия или матки, карцинома слюнных желез, рак почек, рак печени, рак предстательной железы, рак женских наружных половых органов, рак щитовидной железы, карцинома печени и различные типы рака головы и шеи.
Нарушение регуляции ангиогенеза может приводить к разным нарушениям, которые можно лечить с помощью композиций и способов согласно изобретению. Данные нарушения включают в себя как неопухолевые, так и опухолевые состояния. Опухолевые состояния включают в себя, без ограничения, описанные выше заболевания. Неопухолевые состояния включают в себя, без ограничения, такие состояния, как нежелательная или аберрантная гипертрофия, артрит, ревматоидный артрит (RA), псориаз, псориатические бляшки, саркоидоз, атеросклероз, атеросклеротические бляшки, диабетические и другие пролиферативные ретинопатии, в том числе ретинопатия преждевременного развития, ретролентальная фиброплазия, реваскулярная глаукома, возрастная дегенерация желтого пятна, диабетический отек желтого пятна, реваскуляризация роговицы, реваскуляризация трансплантата роговицы, отторжение трансплантата роговицы, реваскуляризация сетчатки/сосудистой оболочки глаза, реваскуляризация угла (покраснение радужки), заболевание глаза, связанное с реваскуляризацией, сосудистый рестеноз, артериовенозный дефект (AVM), менингиома, гемангиома, ангиофиброма, гиперплазия щитовидной железы (включая диффузный токсический зоб), трансплантация роговой оболочки и других тканей, хроническое воспаление, воспаление легких, острое повреждение легких/синдром острой дыхательной недостаточности, сепсис, первичная легочная гипертония, злокачественные легочные выпоты, отек мозга (например, связанный с острым инсультом/закрытой травмой черепа/травмой), синовиальное воспаление, формирование паннуса при RA, оссифицирующий миозит, гипертрофический остеогенез, остеоартрит (ОА), рефракторный асцит, синдром поликистоза яичников, эндометриоз, жидкостные заболевания 3-го диапазона (панкреатит, синдром межфасциального пространства, ожоги, заболевания кишечника), фибромиомы матки, преждевременные роды, хроническое воспаление, такое как IBD (болезнь Крона и язвенный колит), отторжение почечного аллотрансплантата, воспалительное заболевание кишечника, нефротический синдром, нежелательный или аберрантный рост массы ткани (нераковый), гемартрозы, гипертрофические рубцы, замедление роста волос, синдром Ослера-Вебера, ретролентальная фиброплазия пиогенной гранулемы, склеродермия, трахома, адгезия сосудов, синовит, дерматит, преэклампсия, асциты, перикардиальный выпот (например, связанный с перикардитом) и плевральный выпот.
В данном описании термин "лечение" относится к клиническому вмешательству с целью изменения естественного процесса у субъекта или в клетке, подлежащих лечению, причем лечение можно проводить либо для профилактики, либо при клинической патологии. Желательные эффекты лечения включают в себя предотвращение возникновения или рецидива заболевания, улучшение симптомов, уменьшение прямых или косвенных патологических последствий заболевания, предотвращение метастазирования, снижение скорости развития заболевания, улучшение или временное облегчение болезненного состояния, а также ремиссию или улучшение прогноза. В некоторых воплощениях антитела согласно изобретению используют для замедления развития заболевания или нарушения.
Термин "эффективное количество" относится к количеству, эффективному для достижения желательного терапевтического или профилактического результата в течение требуемого периода времени и при использовании необходимого дозировочного режима.
Термин "терапевтически эффективное количество" вещества/молекулы, агониста или антагониста, согласно изобретению может варьировать в зависимости от таких факторов, как состояние заболевания, возраст, пол и масса субъекта, а также способность вещества/молекулы, агониста или антагониста, вызывать у субъекта желательный эффект. Терапевтически эффективное количество - это также количество, при котором терапевтически благоприятные эффекты, вызываемые веществом/молекулой, агонистом или антагонистом, преобладают над токсичными или вредными эффектами. Поскольку профилактическую дозу вводят субъекту до возникновения заболевания или на ранней стадии заболевания профилактически эффективное количество чаще всего, но не всегда, ниже терапевтически эффективного количества.
211
131
125
90
186
188
153
212
32
Термин "цитотоксическое средство" в данном описании относится к веществу, которое подавляет или прекращает функционирование клеток и/или разрушает клетки. Подразумевается, что данный термин включает в себя радиоактивные изотопы (например, At, I, I, Y, Re, Re, Sm, Bi, P и радиоактивные изотопы Lu), хемиотерапевтические вещества, например метотрексат, адриамицин, алкалоиды барвинка (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мелфалан, митомицин C, хлорамбуцил, даунорубицин или другие интеркалирующие агенты, ферменты и их фрагменты, такие как нуклеолитические ферменты, антибиотики и токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, в том числе их фрагменты и/или варианты, а также различные противоопухолевые и противораковые средства, раскрытые ниже. Другие цитотоксические средства описаны ниже. Средство, уничтожающее опухолевые клетки, вызывает деструкцию опухолевых клеток.
"Химиотерапевтическое средство" представляет собой соединение, используемое для лечения рака. Примеры химиотерапевтических средств включают в себя алкилирующие средства, такие как тиотепа и циклофосфамид CYTOXAN; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбохон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, в том числе алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; ацетогенины (особенно буллатацин и буллатацинон); дельта-9-тетрагидроканнабинол (дронабинол, MARINOL); бета-лапахон; лапахол; колхицины; бетулиновая кислота; камптотецин (в том числе синтетический аналог топотекана (HYCAMTIN), CPT-11 (иринотекан, CAMPTOSAR), ацетилкамтотецин, скополектин и 9-аминокамптотецин); бриостатин; каллистатин; CC-1065 (в том числе его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); подофиллотоксин; подофиллиновая кислота; тенипозид; криптофицины (в частности, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (в том числе его синтетические аналоги KW-2189 и CB1-TM1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлоретамин, гидрохлорид оксида мехлоретамина, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урацилиприт; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимустин; антибиотики, такие как энедииновые антибиотики (например, калихеамицин, особенно калихеамицин гаммаII и калихеамицин омегаII (см., например, Agnew, Chem Int. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); динемицин, в том числе динемицин A; эсперамицин; а также неокарзиностатиновый хромофор и родственные хромопротеину энедииновые антибиотические хромофоры) аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторабицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, ADRIAMYCIN доксорубицин (в том числе морфолинодоксорубицин, цианоморфолинодоксорубицин, 2-пирролинодоксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин C, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, геламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калюстерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антигормоны надпочечников, такие как аминоглютетимид, митотан, трилостан; компенсаторы фолевой кислоты, такие как фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамида гликозид; аминолевулиновая кислота; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазихон; элфорнитин; эллиптиния ацетат; эпотилон; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидаинин; майтанзиноиды, такие как майтанзин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK (JHS Natural Products, Eugene, OR); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновая кислота; триазихон; 2,2',2''-трихлортриэтиламин; трихотецены (особенно, токсин T-2, верракурин A, роридин A и ангуидин); уретан; виндесин (ELDISINE, FILDESIN); дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид ("Ara-C"); тиотепа; таксоиды, например паклитаксел TAXOL (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), не содержащая кремофора композиция паклитаксела из наночастиц на основе альбумина ABRAXANE™ (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), доксетаксел TAXOTERE (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); хлоранбуцил; гемцитабин (GEMZAR(R)); 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин (VELBAN); платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин (ONCOVIN); оксалиплатин; лейкововин; винорелбин (NAVELBINE); новантрон; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; ибандронат; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; капецитабин (XELODA); фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные приведенных выше соединений; а также сочетания двух или более из приведенных выше соединений, такие как CHOP, аббревиатура сочетанной терапии циклофосфамида, доксорубицина, винкристина и преднизолона, и FOLFOX, аббревиатура режима лечения оксалиплатином (ELOXATIN™) в сочетании с 5-FU и лейкововином.
В данное определение также включены антигормональные средства, которые регулируют, снижают, уменьшают, блокируют или ингибируют эффекты гормонов, способных стимулировать рост опухоли, данные средства зачастую применяются для системного введения или по всему организму. Они могут представлять собой сами гормоны. Примеры включают в себя антиэстрогены и селективные модуляторы рецепторов эстрогенов (SERM), в том числе, например, тамоксифен (включая тамоксифен NOLVADEX), ралоксифен EVISTA, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен FARESTON; антипрогестероны; понижающие регуляторы рецептора эстрогенов (ERD); средства, подавляющие или прекращающие функционирование яичников, например агонисты рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона (LHRH), такие как LUPRON и лейпролид ацетат ELIGARD, гозерелин ацетат, бузерелин ацетат и триптерелин; другие антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид и бикалутамид; и ингибиторы ароматазы, которые ингибируют фермент ароматазу, ингибирующий продукцию эстрогенов в надпочечных железах, такие как, например, 4(5)-имидазолы, аминоглютетимид, мегестрол ацетат MEGASE, эксеместан AROMASIN, форместан, фадрозол, ворозол RIVISOR, летрозол FEMARA и анастрозол ARIMIDEX. Кроме того, такое определение химиотерапевтических средств включает в себя бифосфонаты, такие как клодронат (например, BONEFOS или OSTAC), этидронат DIDROCAL, NE-58095, золедроновая кислота/золедронат ZOMETA, алендронат FOSAMAX, памидронат AREDIA, тилудронат SKELID или ризедронат ACTONEL; а также троксацитабин (цитозиновый аналог 1,3-диоксоланового нуклеозида); антисмысловые олигонуклеотиды, особенно нуклеозиды, ингибирующие экспрессию генов в сигнальных путях, участвующих в абберантной пролиферации клеток, такие как, например, PKC-альфа, Raf, H-Ras и рецептор эпидермального фактора роста (EGF-R); вакцины, такие как вакцина THERATOPE и вакцины генной терапии, например вакцина ALLOVECTIN, вакцина LEUVECTIN и вакцина VAXID; ингибитор топоизомеразы 1 LURTOTECAN; ABARELI rmRH; лапатиниб дитозилат (двойной низкомолекулярный ингибитор тирозин киназы ErbB-2 и EGFR, также известный как GW572016); а также фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные всех вышеперечисленных соединений.
Термин "средство, ингибирующее рост" в данном описании относится к соединениям или композициям, ингибирующим рост клеток, который не зависит от бета7-активации, либо in vitro, либо in vivo. Таким образом, средством, ингибирующим рост, может быть вещество, способное значительно снижать процент бета7-зависимых клеток в S-фазе. Примеры средств, ингибирующих рост, включают в себя средства, блокирующие развитие клеточного цикла (в период, отличный от S-фазы), такие как средства, прерывающие фазы G1 и M. Классические блокаторы M-фазы включают в себя алкалоиды барвинка (винкристин и винбластин), таксаны и ингибиторы топоизомеразы II, такие как доксорубицин, эпирубицин, даунорубицин, этопозид и блеомицин. Средства, прерывающие фазу G1 и, в качестве побочного эффекта, фазу S, включают в себя, например, ДНК-алкилирующие средства, такие как тамоксифен, преднизон, дакарбазин, мехлоретамин, цисплатин, метотрексат, 5-фторурацил и ara-C. Дополнительную информацию можно найти в The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especially p.13. Таксаны (паклитаксел и доцетаксел) представляют собой противораковые препараты, которые получают из тисового дерева. Доцетаксел (TAXOTERE, Rhone-Poulenc Rorer), получаемый из тиса европейского, представляет собой полусинтетический аналог паклитаксела (TAXOL, Bristol-Myers Squibb). Паклитаксел и доцетаксел активируют сборку микротрубочек из димеров тубулина и стабилизируют микротрубочки путем предотвращения деполимеризации, что приводит к ингибированию митоза в клетках.
"Доксорубицин" представляет собой антрациклиновый антибиотик. Полное химическое название доксорубицина - (8S-цис)-10-[(3-амино-2,3,6-тридезокси-α-L-ликсо-гексапиранозил)окси]-7,8,9,10-тетрагидро-6,8,11-тригидрокси-8-(гидроксиацетил)-1-метокси-5,12-нафтацендион.
Соединения, которые можно использовать в сочетанной терапии вместе с антагонистическим антителом против бета7, согласно изобретению включают в себя антитела (включающие в себя, без ограничения, другие антагонистические антитела против бета7 (Fib 21, 22, 27, 30 (Tidswell, M. (1997) выше) или их гуманизированные производные), антитела против альфа4 (такие как ANTEGEN), антитела против TNF (REMICADE)) или небелковые соединения, включающие в себя, без ограничения, соединения 5-ASA ASACOL, PENTASA™, ROWASA™, COLAZAL™, и другие соединения, такие как пуринетол, и стероиды, такие как преднизон. В одном воплощении данное изобретение охватывает способ лечения пациента, такого как человек, антагонистическим антителом против бета7 согласно изобретению отдельно или в сочетании со вторым соединением, которое используют для лечения воспаления. В одном воплощении второе соединение выбранно из группы, состоящей из Fib 21, 22, 27, 30, или их гуманизированных производных, антитела против альфа4, ANTEGEN, антитела против TNF, REMICADE, соединений 5-ASA, ASACOL, PENTASA™, ROWASA™, COLAZAL™, пуринетола, стероидов и преднизона. В одном воплощении согласно изобретению введение антагонистического антитела против бета7 согласно изобретению позволяет значительно снизить дозу второго соединения. В одном воплощении указанное снижение дозы второго соединения составляет по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%. В одном воплощении согласно изобретению сочетание антитела согласно изобретению с пониженной дозой второго соединения облегчает симптомы пациента практически в той же или в более высокой степени, что и введение одного второго соединения.
Получение вариантного антитела, вызывающего пониженный ответ HAMA или совсем не вызывающего данного ответа
Снижение или устранение ответа HAMA (образование человеческих антител против мышиных (также справедливо в отношении человеческих антител против крысиных или человеческих антител против человеческих)) является важным аспектом клинической разработки подходящих терапевтических средств. См., например, Khaxzaeli et al., J. Natl. Cancer Inst. (1988), 80: 937; Jaffers et al., Transplantation (1986), 41: 572; Shawler et al., J. Immunol. (1985), 135: 1530; Sears et al., J. Biol. Response Mod. (1984), 3: 138; Miller et al., Blood (1983), 62: 988; Hakimi et al., J. Immunol. (1991), 147: 1352; Reichmann et al., Nature (1988), 332: 323; Junghans et al., Cancer Res. (1990), 50: 1495. Как указано в настоящем описании, данное изобретение предлагает антитела, гуманизированные с целью уменьшения или устранения ответа HAMA. С помощью известных в данной области способов (некоторые из них описаны ниже) можно также получить варианты указанных антител.
Например, как указано в данном описании, аминокислотная последовательность антитела может служить исходной (родительской) последовательностью для дериватизации каркасного участка и/или гипервариабельной последовательности (гипервариабельных последовательностей). Выбранную последовательность каркасного участка, к которой присоединяют исходную гипервариабельную последовательность, в данном описании называют акцепторным человеческим каркасным участком. Хотя можно использовать акцепторные человеческие каркасные участки из человеческого иммуноглобулина или полученные из человеческого иммуноглобулина (участков VL и/или VH иммуноглобулина), предпочтительно используют акцепторные человеческие каркасные участки из человеческой консенсусной последовательности каркасного участка или полученные из такой последовательности, поскольку было показано, что такие каркасные участки вызывают минимальный иммунный ответ или совсем не вызывают иммунного ответа у человека.
Если акцепторную последовательность получают из человеческого иммуноглобулина, можно необязательно использовать человеческую последовательность каркасного участка, которую выбирают на основе гомологии с донорной последовательностью каркасного участка путем сравнения первичных последовательностей донорного каркасного участка и разных человеческих каркасных участков из коллекции человеческих последовательностей каркасных участков с выбором последовательности каркасного участка, обладающего максимальной гомологией по отношению к акцепторной последовательности.
В одном воплощении используют человеческие консенсусные каркасные участки или полученные из консенсусных последовательностей каркасных участков VH подгруппы III и/или VL каппа подгруппы I.
Таким образом, акцепторный человеческий каркасный участок VH может содержать одну, две, три или все из приведенных ниже последовательностей каркасных участков:
FR1 содержит EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 38),
FR2 содержит WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 39),
FR3 содержит RFTISX1DX2SKNTX3YLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO: 42), где X1 означает A или R, X2 означает T или N, а X3 означает A, L или F,
FR4 содержит WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 41).
Примеры консенсусных каркасных участков VH включают в себя:
консенсусную последовательность каркасного участка человеческого VH подгруппы I минус CDR Kabat (SEQ ID NO: 19);
консенсусную последовательность каркасного участка человеческого VH подгруппы I минус расширенные гипервариабельные участки (SEQ ID NO: 20-22);
консенсусную последовательность каркасного участка человеческого VH подгруппы II минус CDR Kabat (SEQ ID NO: 48);
консенсусную последовательность каркасного участка человеческого VH подгруппы II минус расширенные гипервариабельные участки (SEQ ID NO: 49-51);
консенсусную последовательность каркасного участка человеческого VH подгруппы III минус CDR Kabat (SEQ ID NO: 52);
консенсусную последовательность каркасного участка человеческого VH подгруппы III минус расширенные гипервариабельные участки (SEQ ID NO: 53-55);
акцепторный каркасный участок человеческого VH минус CDR Kabat (SEQ ID NO: 56);
акцепторный каркасный участок человеческого VH минус расширенные гипервариабельные участки (SEQ ID NO: 57-58);
акцепторный 2 каркасный участок человеческого VH минус CDR Kabat (SEQ ID NO: 59) или
акцепторный 2 каркасный участок человеческого VH минус расширенные гипервариабельные участки (SEQ ID NO: 60-62).
В одном воплощении акцепторный человеческий каркасный участок VH содержит одну, две, три или все из приведенных ниже последовательностей каркасных участков:
FR1 содержит EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 38),
FR2 содержит WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 39),
FR3 содержит RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO:
43), RFTISRDTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO: 44),
RFTISRDTSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO: 45),
RFTISADTSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO: 46),
FR4 содержит WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 41).
Акцепторный человеческий каркасный участок VL содержит одну, две, три или все из приведенных ниже последовательностей каркасных участков:
FR1 содержит DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 34),
FR2 содержит WYQQKPGKAPKLLI (SEQ ID NO: 35),
FR3 содержит GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 36),
FR4 содержит FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 37).
Примеры консенсусных каркасных участков VL включают в себя:
консенсусный каркасный участок человеческого VL каппа подгруппы I (SEQ ID NO: 14);
консенсусный каркасный участок человеческого VL каппа подгруппы I (расширенный HVR-L2) (SEQ ID NO: 15);
консенсусный каркасный участок человеческого VL каппа подгруппы II (SEQ ID NO: 16);
консенсусный каркасный участок человеческого VL каппа подгруппы III (SEQ ID NO: 17) или
консенсусный каркасный участок человеческого VL каппа подгруппы IV (SEQ ID NO: 18).
Хотя акцепторная последовательность может быть идентична последовательности выбранного человеческого каркасного участка, полученного либо из человеческого иммуноглобулина, либо из человеческого консенсусного каркасного участка, в настоящем изобретении допускается, что в акцепторной последовательности могут уже присутствовать аминокислотные замены по сравнению с последовательностью человеческого иммуноглобулина или с последовательностью человеческого консенсусного каркасного участка. Данные уже существующие замены предпочтительно присутствуют в минимальном количестве; обычно отличие от последовательности человеческого иммуноглобулина или от последовательности человеческого консенсусного каркасного участка составляет четыре аминокислоты, три аминокислоты, две аминокислоты или одну аминокислоту.
Остатки гипервариабельного участка нечеловеческого антитела вводят в акцепторные человеческие каркасные участки VL и/или VH. Например, можно ввести остатки, соответствующие остаткам CDR Kabat, остаткам гипервариабельной петли Chothia, остаткам Abm и/или контактным остаткам. Необязательно вводят следующие остатки расширения гипервариабельного участка: 24-34 (L1), 49-56 (L2) и 89-97 (L3), 26-35 (H1), 50-65 или 49-65 (H2) и 93-102, 94-102 или 95-102 (H3).
Хотя в данном документе описано "введение" остатков гипервариабельного участка, следует понимать, что его можно осуществлять разными способами, например можно получить нуклеиновую кислоту, кодирующую целевую аминокислотную последовательность, путем мутации нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность мышиного вариабельного домена, так, чтобы остатки кодируемого данной нуклеиновой кислотой каркасного участка изменились на остатки акцепторного человеческого каркасного участка, или путем мутации нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность человеческого вариабельного домена, так, чтобы остатки гипервариабельного домена изменились на нечеловеческие остатки, или путем синтеза нуклеиновой кислоты, кодирующей целевую последовательность, и др.
В приведенных в данном описании примерах варианты с привитым гипервариабельным участком получают путем мутагенеза нуклеиновой кислоты, кодирующей человеческие акцепторные последовательности, по методу Кункеля с использованием отдельного олигонуклеотида для каждого гипервариабельного участка. Kunkel et al, Methods Enzymol. 154: 367-382 (1987). Чтобы скорректировать и подправить взаимодействия гипервариабельный участок-антиген, в каркасный участок и/или в гипервариабельный участок традиционными методами можно ввести соответствующие замены.
Метод фагового (фагмидного) дисплея (также называемого в некоторых аспектах данного описания фаговый дисплей) можно использовать как удобный и быстрый способ получения и скрининга библиотеки разных потенциальных вариантных антител, полученной путем рандомизации последовательности. Однако специалистам в данной области известны и другие способы получения и скрининга измененных антител.
Метод фагового (фагмидного) дисплея является эффективным инструментом для получения и селекции новых белков, связывающихся с лигандом, таким как антиген. Применение методов фагового (фагмидного) дисплея позволяет получать большие библиотеки вариантов белков, которые можно легко сортировать по последовательностям, которые с высоким сродством связываются с молекулой-мишенью. Нуклеиновые кислоты, кодирующие вариантные полипептиды, обычно гибридизуют с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей белок вирусной оболочки, такой как ген белка III или ген белка VIII. Разработаны моновалентные системы фагмидных дисплеев, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей белок или полипептид, гибридизована с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент белка гена III (Bass, S., Proteins, 8: 309 (1990); Lowman and Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3: 205 (1991)). В моновалентной системе фагмидного дисплея гибридный ген экспрессируется на низком уровне, при этом ген III дикого типа тоже экспрессируется с синтезом белков, поэтому сохраняется инфицирующая способность. Способы получения пептидных библиотек и скрининга данных библиотек раскрыты во многих патентах (например, патент США №5723286, патент США №5432018, патент США №5580717, патент США №5427908 и патент США №5498530).
Библиотеки антител или антигенсвязывающих полипептидов получают разными способами, включающими в себя изменение одного гена путем вставки случайных последовательностей ДНК или путем клонирования семейства родственных генов. Способы получения антител или антигенсвязывающих фрагментов с использованием фаговых (фагмидных) дисплеев описаны в патентах США №№5750373, 5733743, 5837242, 5969108, 6172197, 5580717 и 5658727. Затем библиотеку подвергают скринингу на экспрессию антител или антигенсвязывающих белков с желательными характеристиками.
Способы замены определенных аминокислот через изменения нуклеиновой матрицы хорошо известны в данной области и некоторые из них описаны в данном документе. Например, остатки гипервариабельного участка можно заменять по методу Кункеля. См., например, Kunkel et al., Methods Enzymol. 154: 367-382 (1987).
Последовательность олигонуклеотида содержит один или несколько наборов желательных кодонов, кодирующих изменяемые остатки гипервариабельного участка. Набор кодонов представляет собой ряд разных последовательностей нуклеотидных триплетов, используемых для кодирования желательных вариантных аминокислот. Наборы кодонов могут быть представлены символами, означающими отдельные нуклеотиды или эквимолярные смеси нуклеотидов, как показано ниже в соответствии с системой IUB.
Сокращения по системе IUB
G - Гуанин
A - Аденин
T - Тимин
C - Цитозин
R - (A или G)
Y - (C или T)
M - (A или C)
K - (G или T)
S - (C или G)
W - (A или T)
H - (A, или C, или T)
B - (C, или G, или T)
V - (A, или C, или G)
D - (A, или G, или T)H
N - (A, или C, или G, или T)
Например, в наборе кодонов DVK D может означать нуклеотиды A, или G, или T; V может означать A, или G, или C; а K может означать G или T. Данный набор кодонов может содержать 18 разных кодонов и может кодировать аминокислоты Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly и Cys.
Наборы олигонуклеотидов или праймеров можно синтезировать стандартными методами. Например, методом твердофазного синтеза можно синтезировать набор олигонуклеотидов, который включает в себя последовательности, содержащие все возможные при заданном наборе кодонов сочетания нуклеотидных триплетов, и который кодирует желательную совокупность аминокислот. В данной области хорошо известен метод синтеза олигонуклеотидов с использованием заданной "вырожденности" нуклеотидов по определенным положениям. Такие наборы олигонуклеотидов, содержащих определенные наборы кодонов, можно синтезировать с помощью коммерческих синтезаторов нуклеиновых кислот (поставляемых, например, Applied Biosystems, Foster City, CA) или их можно получить от коммерческих поставщиков (например, от Life Technologies, Rockville, MD). Следовательно, набор олигонуклеотидов, синтезированных с конкретным набором кодонов, обычно содержит совокупность олигонуклеотидов с разными последовательностями, причем различия определяются набором кодонов в полной последовательности. В соответствии с данным изобретением олигонуклеотиды имеют последовательности, которые способны гибридизоваться с нуклеиновой матрицей вариабельного домена, и, кроме того, в целях клонирования могут содержать участки ферментативной рестрикции.
В одном способе нуклеотидные последовательности, кодирующие вариантные аминокислоты, можно получить путем опосредованного олигонуклеотидами мутагенеза. Данный метод хорошо известен в данной области и описан Zoller et al. Nucleic Acids Res. 10: 6487-6504 (1987). Коротко говоря, нуклеотидные последовательности, кодирующие вариантные аминокислоты, получают путем гибридизации набора олигонуклеотидов, кодирующих желательный набор кодонов, с матрицей ДНК, где матрица представляет собой одноцепочечную плазмиду, содержащую последовательность нуклеотидной матрицы вариабельного участка. После гибридизации с помощью ДНК-полимеразы синтезируют полноразмерную вторую комплементарную цепь матрицы, которая в результате будет содержать олигонуклеотидный праймер и будет содержать совокупность кодонов, обусловленную набором олигонуклеотидов.
Как правило, используют олигонуклеотиды, содержащие, по меньшей мере, 25 нуклеотидов в длину. Оптимальный олигонуклеотид содержит от 12 до 15 нуклеотидов, полностью комплементарных матрице, с любой стороны нуклеотида (нуклеотидов), кодирующего (кодирующих) мутацию (мутации). Это гарантирует, что олигонуклеотид будет соответствующим образом гибридизоваться с одноцепочечной молекулой матрицы ДНК. Олигонуклеотиды можно легко синтезировать с помощью известных в данной области методов, таких как описанные Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 5765 (1978).
Матрицу ДНК получают с использованием векторов, которые получают либо из бактериофагальных векторов M13 (можно использовать коммерчески доступные векторы M13mp18 и M13mp19), либо из векторов, которые содержат ориджин репликации одноцепочечного фага, как описано Viera et al., Meth. Enzymol., 153: 3 (1987). Таким образом, ДНК, подлежащую мутагенезу, можно ввставить в один из данных векторов с получением одноцепочечной матрицы. Получение одноцепочечной матрицы описано в разделах 4.21-4.41 приведенной выше публикации Sambrook et al.
Чтобы изменить природную последовательность ДНК, олигонуклеотид гибридизуют с одноцепочечной матрицей в подходящих условиях гибридизации. Затем добавляют ДНК-полимеризующий фермент, как правило ДНК-полимеразу T7 или фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I, и синтезируют комплементарную цепь матрицы, используя олигонуклеотид в качестве затравки для синтеза. Таким образом получают гетеродуплексную молекулу ДНК, одна цепь которой кодирует мутантную форму гена 1, а другая цепь (исходная матрица) кодирует природную, неизмененную последовательность гена 1. Затем подходящую клетку-хозяина, как правило прокариотическую, такую как E.coli JM101, трансформируют полученной гетеродуплексной молекулой. После выращивания клетки помещают на агарозные чашки и подвергают скринингу с использованием олигонуклеотидного праймера, меченного радиоактивным 32-фосфатом, на присутствие бактериальных колоний, содержащих мутантную ДНК.
Описанный выше способ можно модифицировать так, чтобы получить гомодуплексную молекулу плазмиды, обе цепи которой содержат мутацию(и). Модифицировать способ можно следующим образом: одноцепочечный олигонуклеотид отжигают с одноцепочечной матрицей, как описано выше. Смесь трех дезоксирибонуклеотидов, дезоксирибоаденозина (dATP), дезоксирибогуанозина (dGTP) и дезоксириботимидина (dTT), объединяют с модифицированным тиодезоксирибоцитозином, называемым dCTP-(aS) (который можно получить от Amersham). Данную смесь добавляют к комплексу матрица-олигонуклеотид. После добавления к данной смеси ДНК-полимеразы образуется цепь ДНК, идентичная матрице, за исключением мутантных оснований. Кроме того, полученная новая цепь ДНК содержит dCTP-(aS) вместо dCTP, что защищает ее от расщепления эндонуклеазой. После разрезания матричной цепи двухцепочечного гетеродуплекса соответствующим ферментом рестрикции цепь матрицы можно расщепить нуклеазой ExoIII или другой подходящей нуклеазой после участка, который содержит сайт(ы), подлежащий мутагенезу. Затем реакцию останавливают и получают молекулу, которая только частично является одноцепочечной. Затем в присутствии всех четырех дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, АТФ и ДНК-лигазы с помощью ДНК-полимеразы получают полный двухцепочечный гомодуплекс ДНК. Полученную гомодуплексную молекулу можно использовать для трансформации подходящей клетки-хозяина.
Как указано ранее, последовательность набора олигонуклеотидов имеет достаточную длину, чтобы гибридизоваться с нуклеотидной матрицей и также может, но не обязательно, содержать участки рестрикции. Матрицу ДНК получают с использованием векторов, которые получают либо из бактериофагальных векторов M13 (можно использовать коммерчески доступные векторы M13mp18 и M13mp19), либо из векторов, которые содержат ориджин репликации одноцепочечного фага, как описано Viera et al., Meth. Enzymol., 153: 3 (1987). Таким образом, ДНК, подлежащую мутагенезу, можно вставить в один из данных векторов с получением одноцепочечной матрицы. Получение одноцепочечной матрицы описано в разделах 4.21-4.41 приведенной выше публикации Sambrook et al.
В соответствии с другим способом библиотеку можно получить путем использования наборов олигонуклеотидов выше и ниже по ходу считывания, причем каждый набор содержит совокупность олигонуклеотидов с разными последовательностями, которые определяются наборами кодонов в последовательности олигонуклеотида. Наборы олигонуклеотидов выше и ниже по ходу считывания наряду с последовательностью матрицы нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельный домен, используют в полимеразной цепной реакции с получением "библиотеки" продуктов ПЦР. Продукты ПЦР можно назвать "нуклеотидные кассеты", поскольку их можно гибридизовать, используя известные методы молекулярной биологии, с другими родственными или неродственными нуклеотидными последовательностями, например, кодирующими белки вирусной оболочки и димеризующиеся домены.
Последовательность праймеров ПЦР включает в себя один или несколько наборов желательных кодонов в доступных для растворителя и сильно варьирующих положениях гипервариабельного участка. Как описано выше, набор кодонов представляет собой набор последовательностей разных нуклеотидных триплетов, кодирующих желательные вариантные аминокислоты.
Антитела, выбранные с использованием подходящих стадий скрининга/селекции и, следовательно, удовлетворяющие желательным критериям, можно выделить и клонировать с помощью стандартных рекомбинантных методов.
Векторы, клетки-хозяева и рекомбинантные методы
Чтобы получить антитело согласно изобретению с помощью рекомбинантных методов, выделяют кодирующую его нуклеиновую кислоту и вставляют ее в вектор, способный к репликации, с целью последующих клонирования (амплификации ДНК) или экспрессии. ДНК, кодирующую антитело, можно легко выделить и секвенировать с помощью традиционных методов (например, путем применения олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антител). Многие векторы являются коммерчески доступными. Выбор вектора, в частности, зависит от используемой клетки-хозяина. Как правило, предпочтительные клетки-хозяева могут представлять собой либо прокариотические, либо эукариотические клетки (обычно, клетки млекопитающих).
Получение антител с использованием прокариотических клеток-хозяев
Векторная конструкция
Полинуклеотидные последовательности, кодирующие полипептидные компоненты антитела согласно изобретению, можно получить с помощью стандартных рекомбинантных методов. Желательные полинуклеотидные последовательности можно выделить из клеток, продуцирующих антитело, таких как гибридомные клетки, и затем секвенировать. Альтернативно, полинуклеотиды можно синтезировать с помощью нуклеотидного синтезатора или методов ПЦР. Полученные последовательности, кодирующие полипептиды, вставляют в рекомбинантный вектор, способный к репликации и экспрессии гетерологичных полинуклеотидов в прокариотических хозяевах. В целях настоящего изобретения можно использовать разные коммерчески доступные и известные в данной области векторы. Выбор подходящего вектора в основном зависит от размера нуклеиновых кислот, вставляемых в вектор, и от конкретной клетки-хозяина, трансформируемой вектором. Каждый вектор содержит разные компоненты, обеспечивающие выполнение его функции (амплификация или экспрессия гетерологичного полинуклеотида или и то, и другое) и совместимость с конкретной клеткой-хозяином, в которой он находится. Компоненты вектора обычно включают в себя, без ограничения, ориджин репликации, ген маркера селекции, промотор, участок связывания рибосомы (RBS), сигнальную последовательность, вставку гетерологичной нуклеиновой кислоты и последовательность терминации транскрипции.
Как правило, плазмидные векторы, содержащие репликон и контролирующие последовательности, полученные из видов, совместимых с клеткой-хозяином, можно использовать для трансформации данных клеток. Обычно вектор содержит ориджин репликации и маркировочные последовательности, помогающие проводить фенотипическую селекцию трансформированных клеток. Например, E.coli обычно трансформируют pBR322, плазмидой, полученной из разновидностей E.coli. pBR322 содержит гены, кодирующие устойчивость к ампициллину (Amp) и тетрациклину (Tet), которые позволяют легко идентифицировать трансформированные клетки. pBR322, ее производные, или другие микробные плазмиды, или бактериофаг могут также содержать или после соответствующей модификации могут содержать промоторы, которые могут использоваться микроорганизмом для экспрессии эндогенных белков. Примеры производных pBR322, используемые для экспрессии конкретных антител, подробно описаны в Carter et al., патент США №5648237.
Кроме того, фаговые векторы, содержащие репликон и контролирующие последовательности, совместимые с микроорганизмом-хозяином, можно использовать для трансформации данных хозяев. Например, на основе бактериофага, такого как λGEM.TM.-11, можно получить рекомбинантный вектор, используемый для трансформации таких клеток-хозяев, как E.coli LE392.
Вектор экспрессии согласно изобретению может содержать более двух пар промотор-цистрон, кодирующих каждый из полипептидных компонентов. Промотор представляет собой нетранслируемую регуляторную последовательность, расположенную выше (5') цистрона и модулирующую его экспрессию. Прокариотические промоторы обычно подразделяют на два класса, индуцируемые и конститутивные. Индуцируемый промотор представляет собой промотор, который инициирует увеличение уровня транскрипции цистрона под его контролем в ответ на изменение состояния культуры, например изменение количества питательного вещества или изменение температуры.
Известно большое число промоторов, распознаваемых рядом потенциальных клеток-хозяев. Выбранный промотор можно функционально связать с ДНК цистрона, кодирующего легкую или тяжелую цепь, путем вырезания промотора из ДНК-источника с помощью фермента рестрикции и вставки выделенной последовательности промотора в вектор согласно изобретению. Для непосредственной амплификации и/или экспрессии целевых генов можно использовать как нативные промоторы, так и многочисленные гетерологичные промоторы. В некоторых воплощениях используют гетерологичные промоторы, поскольку они обычно обеспечивают более высокий уровень транскрипции и более высокий выход экспрессируемого целевого гена по сравнению с нативным промотором целевого полипептида.
Промоторы, подходящие для применения в прокариотических хозяевах, включают в себя промотор PhoA, промоторные системы β-галактамазы и лактозы, промоторную систему триптофана (trp), а также гибридные промоторы, такие как промотор tac или trc. Однако можно использовать и другие промоторы, способные функционировать в бактериях (такие как другие известные бактериальные или фаговые промоторы). Нуклеотидные последовательности таких промоторов опубликованы, что помогает опытным специалистам функционально соединять их с цистронами, кодирующими целевые легкие и тяжелые цепи (Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269), с использованием линкеров или адапторов, обеспечивающих необходимые участки рестрикции.
В одном аспекте согласно изобретению каждый цистрон в рекомбинантном векторе содержит компонент сигнальной последовательности секреции, который управляет перемещением экспрессируемых полипептидов через мембрану. Как правило, сигнальная последовательность может представлять собой компонент вектора или она может представлять собой часть ДНК, кодирующей целевой полипептид, которая вставлена в вектор. Сигнальная последовательность, используеая в целях согласно изобретению, должна распознаваться клеткой-хозяином и подвергаться процессингу (т.е. расщепляться сигнальной пептидазой) в данной клетке. В случае прокариотических клеток-хозяев, которые не распознают последовательности, нативные по отношению к гетерологичным полипептидам, и не осуществляют их процессинга, данную сигнальную последовательность заменяют на прокариотическую сигнальную последовательность, выбранную, например, из группы, состоящей из лидерных последовательностей щелочной фосфатазы, пенициллиназы, Ipp или термостабильного энтеротоксина II (STII), LamB, PhoE, Pe1B, OmpA и MBP. В одном воплощении согласно изобретению сигнальные последовательности, используемые в обоих цистронах системы экспрессии, представляют собой сигнальные последовательности STII или их варианты.
В другом аспекте продукция иммуноглобулинов в соответствии с данным изобретением может происходить в цитоплазме клетки-хозяина, и, следовательно, присутствие сигнальной последовательности в каждом цистроне не требуется. В данном случае экспрессируются легкие и тяжелые цепи иммуноглобулинов, затем происходит их укладка и сборка с образованием в цитоплазме функциональных иммуноглобулинов. В цитоплазме некоторых штаммов-хозяев (например, штаммов trxB' E.coli) существуют условия, способствующие образованию дисульфидных связей, которые обеспечивают правильную сборку и укладку экспрессируемых субъединиц белка. Proba and Pluckthun Gene, 159: 203 (1995).
Настоящее изобретение предлагает систему экспрессии, в которой количественное соотношение экспрессируемых полипептидных компонентов можно модулировать с целью максимизации выхода секретируемых и правильно собранных антител согласно изобретению. Такую модуляцию осуществляют по меньшей мере частично путем одновременной модуляции интенсивности трансляции полипептидных компонентов.
Один из методов модуляции интенсивности трансляции описан в Simmons et al., патент США №5840523. В данном методе используют варианты участка инициации трансляции (TIR) в пределах цистрона. Для заданного TIR можно создать ряд вариантов аминокислотных или нуклеотидных последовательностей, обеспечивающих разную интенсивность трансляции, и затем выбрать значение данного фактора, соответствующее желательному уровню экспрессии конкретной цепи. Варианты TIR можно получить методом традиционного мутагенеза с изменением кодона, приводящим к изменению аминокислотной последовательности, хотя в нуклеотидной последовательности предпочтительны "молчащие" изменения. Изменения в TIR могут включать в себя, например, количественные или пространственные изменения последовательности Shine-Dalgarno, наряду с изменениями в сигнальной последовательности. Один из способов получения мутантной сигнальной последовательности заключается в получении "банка кодонов" в начале кодирующей последовательности, который не изменяет аминокислотная последовательность сигнальной последовательности (т.е. изменения являются "молчащими"). Этого добиваются путем изменения третьего нуклеотидного положения в каждом кодоне; кроме того, некоторые аминокислоты, такие как лейцин, серин и аргинин, имеют несколько первых и вторых положений, что может создавать осложнения при получении банка. Данный метод мутагенеза подробно описан в Yansura et al. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzyniol. 4: 151-158.
Предпочтительно, получают набор векторов с диапазоном TIR-интенсивности для каждого цистрона, входящего в состав векторов. Данный ограниченный набор позволяет сравнивать уровни экспрессии каждой цепи, а также выход целевых продуктов-антител при разных сочетаниях TIR-интенсивности. TIR-интенсивность можно определить путем количественного измерения уровня экспрессии репортерного гена, как подробно описано в Simmons et al., патент США №5840523. В зависимости от результатов сравнения интенсивности трансляции, выбирают желательные конкретные TIR, которые вводят в состав векторных конструкций экспрессии согласно изобретению.
R
λ
Прокариотические клетки-хозяева, подходящие для экспрессии антител согласно изобретению, включают в себя Archaebacteria и Eubacteria, такие как грамотрицательные или грамположительные организмы. Примеры пригодных к использованию бактерий включают в себя Escherichia (например, E.coli), Bacilli (например, B. subtilis), Enterobacteria, Pseudomonas species (например, P.aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla или Paracoccus. В одном воплощении используют грамотрицательные клетки. В одном воплощении согласно изобретению в качестве хозяев используют клетки E.coli. Примеры штаммов E.coli включают в себя штамм W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, Vol.2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp.1190-1219; ATCC №27325) и его производные, в том числе штамм 33D3, содержащий генотип W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kan (патент США №5639635). Также можно использовать другие штаммы и их производные, такие как E.coli 294 (ATCC 31446), E.coli B, E.coli 1776 (ATCC 31537) и E.coli RV308 (ATCC 31608). Данные примеры являются скорее иллюстративными, чем ограничивающими. Способы получения производных любого из вышеуказанных штаммов, имеющих определенные генотипы, известны в данной области и описаны, например, в Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990). Как правило, необходимо выбрать подходящие бактерии с учетом способности репликона к воспроизведению в клетке бактерии. Например, разновидности E.coli, Serratia или Salmonella можно успешно использовать в качестве хозяев, если в качестве репликона используют хорошо известные плазмиды, такие как pBR322, pBR325, pACYC177 или pKN410. Обычно клетки-хозяева секретируют минимальные количества протеолитических ферментов и в состав культуральной среды желательно ввести дополнительные ингибиторы протеаз.
Получение антител
Клетки-хозяева трансформируют указанными выше векторами экспрессии и культивируют в традиционной питательной среде, модифицированной таким образом, чтобы обеспечить индуцирование промоторов, отбор трансформированных клеток или амплификацию генов, кодирующих целевые последовательности.
Трансформация представляет собой введение ДНК в прокариотического хозяина так, чтобы ДНК была способна к репликации либо в виде внехромосомного элемента, либо в виде элемента, интегрированного в хромосому. Трансформацию проводят с помощью стандартных методов, подходящих для выбранной клетки-хозяина. Бактериальные клетки со значительным барьером клеточной оболочки обычно обрабатывают кальцием в виде хлорида кальция. В другом методе трансформации используют полиэтиленгликоль/ДМСО. Кроме того, для трансформации используют метод электропорации.
Прокариотические клетки, используемые для получения полипептидов согласно изобретению, выращивают в среде, известной в данной области и подходящей для культивирования выбранных клеток-хозяев. Примеры подходящих сред включают в себя бульон Луриа (LB), содержащий необходимые питательные добавки. В некоторых воплощениях среда также содержит средство, облегчающее селекцию, выбранное в зависимости от конструкции вектора экспрессии, данное средство обеспечивает селективный рост прокариотических клеток, содержащих вектор экспрессии. Например, в среду, используемую для выращивания клеток, экспрессирующих ген устойчивости к ампициллину, добавляют ампициллин.
Любые необходимые добавки, помимо углерода, азота и источников неорганического фосфата, также можно включить в состав среды в подходящих концентрациях по отдельности или в смеси с другой добавкой или средой, такой как комплексный источник азота. Культуральная среда может необязательно содержать один или несколько восстанавливающих агентов, выбранных из группы, состоящей из глутатиона, цистеина, цистамина, тиогликолята, дитиоэритритола и дитиотреитола.
Прокариотические клетки-хозяева культивируют при подходящей температуре. Например, температура, предпочтительная для роста E.coli, варьирует приблизительно от 20°C до 39°C, более предпочтительно приблизительно от 25°C до 37°C, еще более предпочтительно она составляет приблизительно 30°C. pH среды может иметь любое значение в интервале приблизительно от 5 до 9 и зависит, в основном, от вида организма-хозяина. В случае E.coli pH предпочтительно находится в интервале приблизительно от 6,8 до 7,4, более предпочтительно он равен приблизительно 7,0.
Если в векторе экспрессии согласно изобретению используют индуцируемый промотор, экспрессию белка индуцируют в условиях, подходящих для активации промотора. В одном аспекте согласно изобретению для регулирования транскрипции полипептидов используют промоторы PhoA. Соответственно, чтобы индуцировать транскрипцию, трансформированные клетки-хозяева культивируют в ограниченной по фосфату среде. Предпочтительно, в качестве ограниченной по фосфату среды используют среду C.R.A.P (см., например, Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263: 133-147). Как известно в данной области, можно использовать ряд других индуцирующих факторов, в зависимости от применяемой векторной конструкции.
В одном воплощении экспрессируемые полипептиды настоящего изобретения секретируются в периплазму клетки-хозяева и извлекаются из нее. Извлечение белка обычно включает в себя разрушение микроорганизма, как правило, с помощью таких способов, как осмотический шок, обработка ультразвуком или лизис. После разрушения клеточные обломки или целые клетки можно удалить центрифугированием или фильтрацией. Белки можно дополнительно очистить, например, путем хроматографии на аффинной смоле. Альтернативно, белки можно транспортировать в культуральную среду и извлекать из нее. Клетки можно удалить из культуры, а культуральный супернатант отфильтровать и концентрировать с последующей очисткой полученных белков. Экспрессированные полипептиды также можно выделить и идентифицировать с помощью широко известных методов, таких как электрофорез в полиакриламидном геле (PAGE) и вестерн-блоттинг.
В одном аспекте согласно изобретению антитело получают в большом количестве с помощью процесса ферментации. Для получения рекомбинантных белков можно использовать различные методы крупномасштабной периодической ферментации с подпиткой. Емкость крупномасштабной ферментации составляет, по меньшей мере, 1000 литров, предпочтительно приблизительно от 1000 до 100000 литров. В таких ферментаторах для распределения кислорода и питательных веществ, особенно глюкозы (преимущественный источник углерода/энергии), используют лопастные мешалки. Мелкомасштабную ферментацию обычно проводят в ферментаторе, объемная вместимомть которого не превышает приблизительно 100 литров и может варьировать приблизительно от 1 литра до 100 литров.
550
В процессе ферментации индукцию экспрессии белка обычно начинают после того, как клетки в подходящих условиях достигнут желательной плотности, например соответствующей значению OD приблизительно 180-220, в данном состоянии клетки находятся в ранней фазе стационарной численности. Как известно в данной области и описано выше, в зависимости от используемой конструкции вектора можно использовать разные индуцирующие факторы. Перед индукцией клетки можно выращивать в течение более короткого периода времени. Обычно клетки индуцируют в течение приблизительно 12-50 часов, хотя можно использовать более длительную или более краткую индукцию.
Условия ферментации можно модифицировать с целью улучшения выхода продукта и качества полипептидов согласно изобретению. Например, чтобы повысить правильность сборки и укладки секретируемых полипептидов-антител, можно осуществить одновременную трансформацию прокариотических клеток-хозяев другими векторами, обеспечивающими сверхэкспрессию белков-шаперонов, таких как белки Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD и/или DsbG) или FkpA (пептидилпролил-цис, транс-изомераза с шаперонной активностью). Было показано, что белки-шапероны способствуют правильной сборке и увеличивают растворимость гетерологичных белков, продуцируемых в бактериальных клетках-хозяевах. Chen et al. (1999) J. Bio. Chem. 274:19601-19605; Georgiou et al., патент США №6083715; Georgiou et al., патент США №6027888; Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105; Ramm and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210.
Чтобы минимизировать протеолиз гетерологичных белков (особенно чувствительных к протеолизу), в целях настоящего изобретения можно использовать штаммы-хозяева с дефицитом протеолитических ферментов. Например, штаммы клеток-хозяев можно модифицировать посредством мутации (мутаций) генов, кодирующих известные бактериальные протеазы, такие как протеаза III, OmpT, DegP, Tsp, протеаза I, протеаза Mi, протеаза V, протеаза VI, и их сочетаний. Некоторые дефицитные по протеазе штаммы E.coli являются коммерчески доступными и описаны, например, в Joly et al. (1998), выше; Georgiou et al., патент США №5264365; Georgiou et al., патент США №5508192; Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996).
В одном воплощении в системе экспрессии согласно изобретению в качестве клеток-хозяев используют штаммы E.coli с дефицитом протеолитических ферментов, трансформированные плазмидами, обеспечивающими сверхэкспрессию одного или нескольких шаперонных белков.
Очистка антител
В одном воплощении белок-антитело, полученный по способу согласно изобретению, дополнительно очищают с получением практически гомогенных препаратов, которые можно использовать в других анализах и для других целей. Очистку белков можно проводить стандартными методами, известными в данной области. Нижеследующие процедуры являются примерами подходящих методов очистки: фракционирование на иммуноаффинных или ионообменных колонках, осаждение этанолом, ВЭЖХ на обращенной фазе, хроматография на силикагеле или на катионообменной смоле, такой как DEAE, хроматофокусирование, SDS-PAGE, осаждение сульфатом аммония и гель-фильтрация с использованием, например, сефадекса G-75.
В одном аспекте для иммуноаффинной очистки полноразмерных антител согласно изобретению используют белок A, иммобилизованный на твердой фазе. Белок A представляет собой белок клеточной стенки Staphylococcus aureas размером 41 кДа, который с высоким сродством связывается с Fc-участком антитела. Lindmark et al. (1983) J. Immunol. Meth. 62: 1-13. Твердая фаза, на которой иммобилизуют белок A, предпочтительно представляет собой колонку с поверхностью из стекла или оксида кремния, более предпочтительно стеклянную колонку с определенным размером пор или колонку с кремниевой кислотой. В некоторых применениях для предотвращения неспецифического связывания примесей колонку покрывают таким реагентом, как глицерин.
На первой стадии очистки препарат, полученный в результате культивирования клеток по описанному выше способу, наносят на твердую фазу с иммобилизованным белком А, при этом происходит специфическое связывание указанного антитела с белком A. Затем твердую фазу промывают, чтобы удалить неспецифически связанные примеси. Наконец, указанное антитело извлекают с твердой фазы путем элюирования.
Получение антител с использованием эукариотических клеток-хозяев
Компоненты вектора обычно включают в себя, без ограничения, один или несколько из следующих элементов: сигнальной последовательности, ориджина репликации, одного или нескольких маркерных генов, энхансерного элемента, промотора и последовательности терминации транскрипции.
(i) Сигнальная последовательность
Вектор, используемый в эукариотических клетках-хозяевах, также может содержать элемент, кодирующий сигнальную последовательность, или другой полипептид, содержащий специфический участок расщепления на N-конце описываемого зрелого белка или полипептида. Предпочтительно выбирают такую гетерологичную сигнальную последовательность, которая может распознаваться клеткой-хозяином и подвергаться процессингу (т.е. расщепляться сигнальной пептидазой) в такой клетке. В случае экспрессии в клетках млекопитающих можно использовать коммерчески доступные сигнальные последовательности млекопитающих и вирусные секреторные лидерные последовательности, например сигнальную последовательность gD вируса простого герпеса.
ДНК, кодирующую такой участок-предшественник, лигируют в одной рамке считывания с ДНК, кодирующей антитело.
(ii) Ориджин репликации
Как правило, ориджин репликации не является обязательным компонентом для векторов экспрессии млекопитающих. Например, ориджин репликации SV40 зачастую используют только потому, что он содержит ранний промотор.
(iii) Ген, облегчающий селекцию
Векторы экспрессии и клонирования могут содержать ген селекции, также называемый маркером селекции. Как правило, гены селекции кодируют белки, которые (a) придают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, таким как ампициллин, неомицин, метотрексат или тетрациклин, (b) дополняют ауксотрофные дефициты, если это нужно, или (c) поставляют важные питательные вещества, отсутствующие в комплексной среде.
В одном способе селекции используют средство, останавливающее рост клетки-хозяина. Клетки, трансформированные гетерологичным геном, продуцируют белок, придающий устойчивость к указанному средству, и, следовательно, выживают в условиях селекции. В такой доминантной селекции в качестве указанного средства используют, например, неомицин, микофеноловую кислоту и гидромицин.
Другими примерами подходящих маркеров селекции являются соединения, облегчающие идентификацию клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, такие как DHFR, тимидинкиназа, металлотионеин-I и -II, предпочтительно гены металлотионеина приматов, аденозиндеаминазы, орнитиндекарбоксилазы и др.
Например, клетки, трансформированные геном селекции DHFR, идентифицируют вначале путем культивирования всех трансформантов в питательной среде, содержащей метотрексат (Mtx), конкурентный антагонист DHFR. При применении DHFR дикого типа в качестве подходящей клетки-хозяина используют клеточную линию яичников китайского хомячка (CHO) с дефицитом по активности DHFR (например, ATCC CRL-9096).
Альтернативно, клетки-хозяева (особенно, хозяева дикого типа, которые содержат эндогенный DHFR) трансформируют или одновременно трансформируют последовательностями, кодирующими антитела, белок DHFR дикого типа и другие маркеры селекции дикого типа, такие как аминогликозид-3'-фосфотрансфераза (APH), могут быть выбраны в процессе клеточного роста в среде, содержащей агент селекции, такой как аминогликозидный антибиотик, например канамицин, неомицин или G418. См. патент США №4965199.
(iv) Промотор
Векторы экспрессии и клонирования обычно содержат промотор, распознаваемый организмом-хозяином и функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид антитела. Промоторные последовательности эукариотов известны. Практически все гены эукариотов содержат AT-обогащенный участок, расположенный приблизительно на 25-30 оснований выше участка инициации транскрипции. Во многих генах на 70-80 оснований выше начала транскрипции обнаружена другая последовательность, участок CNCAAT, где N может означать любой нуклеотид. На 3'-конце большинства эукариотических генов находится последовательность AATAAA, которая может служить сигнальной при добавлении хвоста поли-A к 3'-концу кодирующей последовательности. Все указанные последовательности соответствующим образом вставляют в эукариотические векторы экспрессии.
Транскрипция полипептида антитела по векторной матрице в клетках-хозяевах млекопитающих регулируется, например, промоторами, полученными из геномов таких вирусов, как вирус полиомы, вирус птичьей оспы, аденовирус (такой как аденовирус 2), вирус папилломы крупного рогатого скота, вирус саркомы птиц, цитомегаловирус, ретровирус, вирус гепатита B и вакуолизирующий обезьяний вирус 40 (SV40), из гетерологичных промоторов млекопитающих, например промотора актина или промотора иммуноглобулина, из промоторов белков теплового шока, при условии, что такие промоторы совместимы с системами клеток-хозяев.
Ранние и поздние промоторы вируса SV40 обычно получают в виде фрагментов рестрикции SV40, которые также содержат ориджин репликации вируса SV40. Непосредственный ранний промотор человеческого цитомегаловируса обычно получают в виде фрагмента рестрикции HindIII E. Система экспрессии ДНК в хозяевах-млекопитающих с использованием в качестве вектора вируса папилломы крупного рогатого скота описана в патенте США №4419446. Модификация данной системы описана в патенте США №4601978. Экспрессия кДНК человеческого β-интерферона в мышиных клетках под контролем промотора тимидинкиназы из вируса простого герпеса описана в Reyes et al, Nature 297: 598-601 (1982). Альтернативно, в качестве промотора можно использовать длинный концевой повтор вируса саркомы Рауса.
(v) Энхансерный элемент
Транскрипция ДНК, кодирующей полипептид антитела согласно изобретению, в высших эукариотах зачастую увеличивается в результате вставки в вектор энхансерной последовательности. В настоящее время известно много энхансерных последовательностей из генов млекопитающих (генов глобина, эластазы, альбумина, α-фетопротеина и инсулина). Однако чаще всего используют энхансеры из вирусов эукариотических клеток. Примеры включают в себя энхансер SV40 на поздней стороне ориджина репликации (100-270 п.о.), энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы на поздней стороне ориджина репликации и энхансеры аденовирусов. Энхансеры, усиливающие активацию эукариотических промоторов, описаны также в Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982). В векторе энхансер можно соединить с последовательностью, кодирующей полипептид антитела по 5'- или 3'-положению, однако предпочтительно его размещают с 5'-стороны от промотора.
(vi) Участок терминации транскрипции
Кроме того, векторы экспрессии, используемые в эукариотических клетках-хозяевах, обычно содержат последовательности, необходимые для терминации транскрипции и для стабилизации мРНК. Такие последовательности обычно находятся в 5'-, иногда в 3'-, нетранслируемых участках эукариотических или вирусных ДНК или кДНК. Данные участки содержат нуклеотидные сегменты, транскрибируемые как фрагменты полиаденилирования из нетранслируемой области мРНК, кодирующей антитело. В качестве участка терминации транскрипции можно использовать, например, участок полиаденилирования бычьего гормона роста. См. WO94/11026 и описанный в нем вектор экспрессии.
(vii) Селекция и трансформация клеток-хозяев
Клетки-хозяева, подходящие для клонирования или экспрессии ДНК в векторах, описанных в данном документе, включают в себя описанные здесь клетки высших эукариотов, в том числе клетки-хозяева позвоночных. Размножение клеток позвоночных в культуре (в культуре ткани) стало рутинной процедурой. Примерами клеточных линий млекопитающих, используемых в качестве хозяев, являются клеточная линия почек обезьян CV1, трансформированная SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); клеточная линия почек человеческого эмбриона (293 или 293-клетки, субклонированные в суспензионной культуре, Graham et at., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); клетки почек детенышей хомяка (BHK, ATCC CCL 10); клетки яичника китайского хомячка ADHFR (CHO, Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 77:4216 (1980)); мышиные клетки Сертоли (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); клетки почек обезьян (CV1 ATCC CCL 70); клетки почек африканской зеленой мартышки (VERO-76, ATCC CRL-1587); клетки карциномы шейки матки человека (HELA, ATCC CCL 2); клетки почек собаки (MDCK, ATCC CCL 34); клетки печени крупного рогатого скота, крыс (BRL 3A, ATCC CRL 1442); клетки легкого человека (W138, ATCC CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, HB 8065); клетки опухоли мышиной молочной железы (MMT 060562, ATCC CCL51); клетки TRI (Mather et al., Annals NY. Acad. Sci 383:44-68 (1982)); клетки MRC 5; клетки FS4 и линия клеток гепатомы человека (Hep G2).
Клетки-хозяева трансформируют описанными выше векторами экспрессии или клонирования, обеспечивающими продукцию антитела, и культивируют в подходящей питательной среде, которую модифицируют так, чтобы обеспечить индукцию промоторов, селекцию трансформантов или амплификацию генов, кодирующих целевые последовательности.
(viii) Культивирование клеток-хозяев
Клетки-хозяева, используемые для получения антитела согласно изобретению, можно культивировать в разных средах. Для культивирования клеток-хозяев можно использовать коммерчески доступные среды, такие как Ham's F10 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), минимальная поддерживающая среда ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) и модифицированная по способу Дульбекко среда Игла ((DMEM), Sigma). Кроме того, в качестве питательной среды для клеток-хозяев можно использовать среды, описанные в Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem 102:255 (1980), патентах США №№4767704; 4657866; 4927762; 4560655; или 5122469; WO 90/03430; WO 87/00195; или в патенте США Re. 30985. В любую из указанных сред можно при необходимости добавить гормоны и/или другие факторы роста (такие как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), соли (такие как хлорид натрия, кальция, магния и фосфат), буферы (такие как HEPES), нуклеотиды (такие как аденозин и тимидин), антибиотики (такие как лекарственное средство GENTAMYCIN™), следовые элементы (неорганические соединения, конечные концентрации которых обычно находятся в микромолярном диапазоне), а также глюкозу или эквивалентный источник энергии. В состав среды могут входить любые другие необходимые добавки в соответствующих концентрациях, известных специалистам в данной области. Культивирование проводят в условиях (температура, pH и т.п.), ранее используемых для клеток-хозяев, выбранных для экспрессии, и известных рядовому специалисту в данной области.
(ix) Очистка антитела
Антитело, получаемое с помощью рекомбинантных методов, может находиться внутри клетки или сразу секретироваться в среду. Если антитело находится внутри клетки, на первой стадии удаляют обломки клеток, или клетки-хозяева, или фрагменты, образовавшиеся в результате лизиса, например, путем центрифугирования или ультрафильтрации. Если антитело секретируется в среду, супернатанты таких систем экспрессии, как правило, сначала концентрируют, используя коммерчески доступный фильтр для концентрирования белков, например фильтр для ультрафильтрации Amicon или Millipore Pellicon. На всех предыдущих стадиях можно использовать ингибиторы протеаз, такие как PMSF, чтобы ингибировать протеолиз, и антибиотики, чтобы предотвращать рост посторонних организмов.
Полученный из клеток препарат антитела можно очистить, например, методами гидроксиапатитовой хроматографии, гель-электрофореза, диализа и аффинной хроматографии, причем предпочтительным методом очистки является аффинная хроматография. Возможность использования белка A в качестве аффинного лиганда зависит от вида и изотипа Fc-домена иммуноглобулина, присутствующего в антителе. Белок A можно использовать для очистки антитела на основе человеческих тяжелых цепей γ1, γ2 или γ4 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). В случае мышиных изотипов и человеческой цепи γ3 рекомендуется использовать белок G (Guss et at., EMBO J. 5:15671575 (1986)). Чаще всего аффинный лиганд присоединяют к агарозе, но можно использовать и другие носители. Механически стабильные носители, такие как стекло с определенным размером пор или поли(стиролдивинил)бензол, обеспечивают более высокую скорость потока и более короткое время проведения процесса, чем агароза. Если антитело содержит домен CH3, для очистки можно использовать смолу Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ). В зависимости от извлекаемого антитела можно использовать другие методы очистки белков, такие как фракционирование на ионнообменной колонке, осаждение этанолом, ВЭЖХ на обращенной фазе, хроматография на оксиде кремния, хроматография на SEPHAROSE™, содержащей гепарин, хроматография на анионо- или катионообменной смоле (такой как колонка с полиаспарагиновой кислотой), хроматофокусирование, SDS-PAGE и осаждение сульфатом аммония.
После предварительной стадии (стадий) очистки смесь, содержащую целевое антитело и примеси, можно подвергнуть гидрофобной хроматографии при низких значениях pH с использованием буфера для элюирования, имеющего pH в интервале приблизительно от 2,5 до 4,5 и, предпочтительно, низкие концентрации солей (например, концентрация соли может составлять приблизительно от 0 до 0,25M).
Анализы активности
Физические/химические свойства и биологические функции антител настоящего изобретения можно анализировать разными способами, известными в данной области.
После очистки иммуноглобулины можно охарактеризовать с помощью ряда анализов, включающих в себя, без ограничения, N-концевое секвенирование, аминокислотный анализ, неденатурирующую гельпроникающую высокоэффективную жидкостную хроматографию (HPLC), масс-спектрометрию, ионообменную хроматографию и расщепление папаином.
В некоторых воплощениях согласно изобретению анализируют биологическую активность иммуноглобулинов, полученных по описанному в данном документе способу. В некоторых воплощениях анализируют антигенсвязывающую активность иммуноглобулинов настоящего изобретения. Применимые для настоящего изобретения и известные в данной области методы анализа связывания антигена включают в себя, без ограничения, все непосредственные или конкурентные анализы связывания с помощью таких методов, как вестерн-блоттинг, радиоиммунологический анализ, ELISA (иммуноферментный твердофазный анализ), иммунологический "сэндвич"-анализ, иммунопреципитация, флуоресцентные иммунологические анализы и иммунологические анализы с применением белка A. Пример анализа связывания антигена приведен ниже в разделе "Примеры".
В одном воплощении настоящее изобретение предлагает измененное антитело, обладающее некоторыми, но не всеми, эффекторными функциями, что делает его желательным кандидатом для многих применений, в которых имеет значение период полужизни антитела in vivo, а некоторые эффекторные функции (такие как связывание комплемента и ADCC) являются ненужными или вредными. В некоторых воплощениях измеряют Fc-активность полученного иммуноглобулина, чтобы удостовериться, что сохраняются только желательные свойства. Снижение/уменьшение активности CDC и/или ADCC можно определить с помощью анализов цитотоксичности in vitro и/или in vivo. Например, с помощью анализов связывания рецептора Fc (FcR) можно подтвердить, что антитело утратило способность к связыванию FcγR (и, следовательно, по всей вероятности, утратило активность ADCC), но сохранило способность связывать FcRn. Основные клетки, опосредующие ADCC, NK-клетки, экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR на гематопоэтических клетках показана в таблице 3 на странице 464 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Пример in vitro анализа ADCC-активности целевой молекулы описан в патенте США №5500362 или 5821337. Используемые в таких анализах эффекторные клетки включают в себя мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) и натуральные киллеры (NK). Альтернативно или кроме того, ADCC-активность целевой молекулы можно определить in vivo, например, на животной модели, такой как описанная в Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998). С помощью анализа связывания C1q также можно подтвердить, что антитело неспособно связывать C1q и, следовательно, утратило CDC-активность. Активацию комплемента можно оценить, например, с помощью анализа CDC, например, по способу, описанному в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). Анализ связывания FcRn и определение значений клиренса/периода полужизни in vivo можно проводить с помощью известных в данной области методов, например, описанных в разделе "Примеры".
Гуманизированные антитела
Настоящее изобретение охватывает гуманизированные антитела. В данной области известны разные способы гуманизации нечеловеческих антител. Например, в гуманизированное антитело можно ввести один или несколько аминокислотных остатков из нечеловеческой последовательности. Данные нечеловеческие аминокислотные остатки часто называют "импортными" остатками, которые обычно берут из "импортного" вариабельного домена. Гуманизацию преимущественно проводят по способу Винтера с соавторами (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536) путем замены последовательностей гипервариабельного участка на соответствующие последовательности человеческого антитела. Соответственно, такие "гуманизированные" антитела представляют собой химерные антитела (патент США №4816567), в которых фрагмент, существенно меньший, чем интактный человеческий вариабельный домен, заменен на соответствующую последовательность отличных от человека видов. На практике гуманизированные антитела обычно представляют собой человеческие антитела, в которых несколько остатков гипервариабельного участка и, возможно, несколько остатков FR заменены на остатки из аналогичных участков антитела грызуна.
Выбор человеческих вариабельных доменов как легкой, так и тяжелой цепи, используемых для получения гуманизированного антитела, очень важен для снижения антигенности. Используя так называемый метод "наилучшего соответствия", последовательность вариабельного домена антитела грызуна подвергают скринингу против целой библиотеки известных последовательностей человеческого вариабельного домена. Затем человеческую последовательность, которая лучше всего соответствует последовательности грызуна, используют в качестве человеческого каркасного участка гуманизированного антитела (Sims et al. (1993) J. Immunol 151:2296; Chothia et al. (1987) J. Mol Biol. 196:901. В другом способе используют конкретный каркасный участок, полученный из консенсусной последовательности всех человеческих антител, содержащих легкие или тяжелые цепи определенной подгруппы. Один и тот же каркасный участок можно использовать для получения разных гуманизированных антител (Carter et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:4285; Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623.
Также важно, чтобы гуманизированное антитело сохраняло высокое сродство к антигену и другие желательные биологические свойства. Для достижения данной цели, в соответствии с одним способом, гуманизированные антитела получают путем анализа исходной последовательности и различных концептуальных гуманизированных продуктов с использованием трехмерных моделей исходной и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов широко доступны и известны специалистам в данной области. Доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и показывают возможные трехмерные конформации конкретных кандидатных последовательностей иммуноглобулинов. Данные изображения позволяют анализировать вероятную роль остатков в функционировании кандидатной иммуноглобулиновой последовательности, т.е. выявлять остатки, которые влияют на способность кандидатного иммуноглобулина связывать антиген. С помощью данного способа можно выбрать и объединить остатки FR из реципиентной и импортной последовательности, обеспечивающие получение антитела с желательной характеристикой, такой как повышенное сродство к антигену-мишени (антигенам-мишеням). Как правило, остатки гипервариабельного участка непосредственно и наиболее сильно влияют на связывание с антигеном.
Варианты антител
В одном аспекте данное изобретение предлагает фрагмент антитела, содержащий модификации в пограничной области полипептидов Fc, включая участок Fc, где модификации облегчают и/или обеспечивают гетеродимеризацию. Данные модификации включают в себя создание выступа на первом полипептиде Fc и полости на втором полипептиде Fc, причем выступ может располагаться в полости таким образом, что при этом инициируется образование комплекса первого и второго полипептидов Fc. Способы получения антитела с данными модификациями известны в данной области, например, их описание можно найти в патенте США №5731168.
В некоторых воплощениях рассматриваются модификации аминокислотной последовательности описанных в данном документе антител. Например, иногда желательно повысить сродство связывания и/или улучшить другие биологические свойства антитела. Варианты аминокислотной последовательности антитела получают путем введения соответствующих нуклеотидных изменений в нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, или путем пептидного синтеза. Такие модификации включают в себя, например, делеции, и/или инсерции, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Для получения конечной конструкции можно использовать любые сочетания делеции, инсерции и замены, при условии, что конечная конструкция обладает желательным характеристиками. Аминокислотные изменения можно вводить в аминокислотную последовательность антитела во время получения последовательности.
Способ идентификации предпочтительных для мутагенеза остатков или участков антитела называют "мутагенез со сканированием по аланину", его описание можно найти в Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. В данном способе идентифицируют остаток или группу целевых остатков (например, заряженные остатки, такие как arg, asp, his, lys и glu) и заменяют их на нейтральные или отрицательно заряженные аминокислоты (наиболее предпочтительно, аланин или полиаланин), что сказывается на взаимодействии аминокислот с антигеном. Затем аминокислотные положения, обладающие функциональной чувствительностью к заменам, усовершенствуют, вводя дополнительные или другие варианты в данных участках. Таким образом, в то время, как участок введения вариации аминокислотной последовательности предварительно идентифицирован, природу мутации как таковую не нужно определять заранее. Например, для анализа мутации по заданному положению проводят ala-сканирование или случайный мутагенез по целевому кодону или участку и экспрессированные иммуноглобулины подвергают скринингу на желательную активность.
Инсерции аминокислотной последовательности включают в себя амино- и/или карбоксиконцевые вставки одного остатка или полипептидов длиной в несколько сотен или более остатков, а также вставки одного или нескольких аминокислотных остатков внутри последовательности. Примеры концевых инсерций включают в себя антитело с N-концевым метиониновым остатком или антитело, сопряженное с цитотоксичным полипептидом. Другие инсерционные варианты молекулы антитела включают в себя гибрид антитела по N- или C-концу с ферментом (например, ADEPT) или полипептидом, который повышает период полужизни антитела в сыворотке.
Другим типом вариантов является вариант с аминокислотной заменой. Данный вариант включает в себя молекулу антитела, в которой один аминокислотный остаток заменен на другой. Участки, вызывающие наибольший интерес с точки зрения заместительного мутагенеза, включают в себя гипервариабельные участки, однако также рассматриваются изменения в FR. Консервативные замены приведены в таблице 2 под заголовком "предпочтительные замены". Если такие замены приводят к изменению биологической активности, то можно вводить более значительные замены, указанные в таблице 2 под заголовком "типовые замены" или более подробно описанные ниже со ссылкой на классы аминокислот, с последующим скринингом антител.
Таблица 2
<b>Исходный остаток</b>
<b>Типовые замены</b>
<b>Предпочтительные замены</b>
Ala(A)
Val; Leu; Ile
Val
Arg(R)
Lys; Gln; Asn
Lys
Asn(N)
Gln; His; Asp; Lys; Arg
Gln
Asp(D)
Glu; Asn
Glu
Cys(C)
Ser; Ala
Ser
Gln(Q)
Asn; Glu
Asn
Glu(E)
Asp; Gln
Asp
Gly(G)
Ala
Ala
His(H)
Asn; Gln; Lys; Arg
Arg
Ile(I)
Leu; Val; Met; Ala;Phe; Норлейцин
Leu
Leu(L)
Норлейцин; Ile; Val;Met; Ala; Phe
Ile
Lys(K)
Arg; Gln; Asn
Arg
Met(M)
Leu; Phe; Ile
Leu
Phe(F)
Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr
Tyr
Pro(P)
Ala
Ala
Ser(S)
Thr
Thr
Thr(T)
Val; Ser
Ser
Trp(W)
Tyr; Phe
Tyr
Tyr(Y)
Trp; Phe; Thr; Ser
Phe
Val(V)
Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Норлейцин
Leu
Существенных изменений биологических свойств антитела достигают путем выбора замен, оказывающих значительное влияние на (a) структуру полипептидного скелета в области замены, например, имеющую складчатую или спиральную конформацию, (b) заряд или гидрофобность молекулы в заданном участке или (c) объем боковой цепи. В зависимости от свойств боковых цепей аминокислоты можно подразделить на следующие классы (A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp.73-75, Worth Publishers, New York (1975)):
(1) неполярные: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M);
(2) незаряженные полярные: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q);
(3) кислые: Asp (D), Glu (E);
(4) основные: Lys (K), Arg (R), His(H).
Альтернативно, в зависимости от общих свойств боковых цепей природные остатки можно подразделить на следующие классы:
(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) кислые: Asp, Glu;
(4) основные: His, Lys, Arg;
(5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: Gly, Pro;
(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.
Неконсервативные замены относятся к замене остатка одного из указанных классов на остаток другого класса. Такую замену участков также можно проводить в участках консервативных замен или, более предпочтительно, в оставшихся (неконсервативных) участках.
Один тип заместительного варианта включает в себя замещение одного или нескольких остатков гипервариабельного участка исходного антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела). Как правило, полученный вариант(ы), выбранный для дальнейшего усовершенствования, имеет улучшенные биологические свойства по сравнению с исходным антителом, из которого он получен. Традиционный способ получения таких заместительных вариантов включает в себя аффинное созревание с использованием фагового дисплея. Коротко говоря, несколько положений гипервариабельного участка (например, 6-7 положений) подвергают мутагенезу с получением всех возможных аминокислотных замен по каждому положению. Полученные в результате антитела выставляются из нитевидных фаговых частиц в виде гибридов с генным продуктом III M13, содержащимся в каждой частице. Затем с помощью описанных здесь способов анализируют биологическую активность (например, сродство связывания) вариантов, представленных в фаговом дисплее. Чтобы идентифицировать положения гипервариабельного участка, по которым будет проводиться модификация, с помощью аланин-сканирующего мутагенеза определяют остатки гипервариабельного участка, оказывающие значительное влияние на связывание антигена. Альтернативно или дополнительно, точки контакта антитела с антигеном можно идентифицировать путем анализа кристаллической структуры комплекса антиген-антитело. Участки таких точек контакта, а также примыкающие к ним участки являются кандидатами на проведение замены с помощью способов, описанных в данном документе. Коллекцию полученных вариантов подвергают скринингу по описанному в данном документе способу и антитела, которые по результатам одного или нескольких подходящих анализов обладают лучшими свойствами, выбирают для дальнейшей разработки.
Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие варианты аминокислотной последовательности антитела, получают разными способами, известными в данной области. Данные способы включают в себя, без ограничения, выделение из природного источника (в случае природных вариантов аминокислотной последовательности) или получение путем олигонуклеотид-опосредованного (или сайт-специфического) мутагенеза, ПЦР-мутагенеза и кассетного мутагенеза полученной ранее вариантной или невариантной версии антитела.
Вариантный участок Fc также можно получить путем изменения одной или нескольких аминокислот в участке Fc. Вариантный участок Fc может содержать последовательность человеческого участка Fc (например, участка Fc человеческого IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), модифицированную (например, путем введения замены) по одному или нескольким аминокислотным положениям, включая положение шарнирного цистеина.
В соответствии с данным описанием и принципами, принятыми в данной области, считается, что в некоторых воплощениях антитело, используемое в способах согласно изобретению, может содержать одно или несколько изменений по сравнению с аналогом дикого типа, например, в участке Fc. Тем не менее, указанные антитела сохраняют практически все свойства, необходимые для терапевтического применения, присутствующие у их аналога дикого типа. Например, предполагается, что в участке Fc могут быть сделаны изменения, которые приводят к изменению (т.е. повышению или снижению) связывания C1q и/или комплементзависимой цитотоксичности (CDC), например, как описано в WO 99/51642. Другие примеры вариантов участка Fc описаны в Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988); патенте США №5648260; патенте США №5624821 и WO 94/29351.
Иммуноконъюгаты
Данное изобретение также относится к иммуноконъюгатам или конъюгатам антитело-лекарственное средство (ADC), которые представляют собой конъюгат антитела с цитотоксическим средством, таким как химиотерапевтическое вещество, лекарственное средство, ингибитор роста, токсин (например, ферментативно активный токсин бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения или его фрагменты), или радиоактивный изотоп (т.е. радиоактивный конъюгат).
Применение конъюгатов антитело-лекарственное средство для локальной доставки цитотоксических или цитостатических средств, т.е. средств, уничтожающих опухолевые клетки или подавляющих рост таких клеток, при лечении рака (Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172; патент США №4975278) теоретически позволяет осуществлять направленную доставку лекарственного фрагмента к опухолям и накапливать его внутри клеток, в тех случаях, когда системное введение таких лекарственных средств в неконъюгированном виде может оказывать неприемлемое токсическое воздействие на нормальные клетки наряду с опухолевыми клетками, подлежащими уничтожению (Baldwin et al., (1986) Lancet pp.(Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Антитело Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibody '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp.475-506). Таким образом достигается максимальная эффективность при минимальной токсичности. В данных способах применяются как поликлональные, так и моноклональные антитела (Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87). Используемые в указанных способах лекарственные средства включают в себя дауномицин, доксорубицин, метотрексат и виндесин (Rowland et al., (1986) supra). Токсины, используемые в конъюгатах антитело-токсин включают в себя бактериальные токсины, такие как дифтерийный токсин, растительные токсины, такие как рицин, низкомолекулярные токсины, такие как гелданамицин (Mandler et al (2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), майтанзиноиды (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623) и калихеамицин (Lode et al (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al (1993) Cancer Res. 53:3336-3342). Токсины могут оказывать цитотоксическое и цитостатическое действие посредством механизмов, включающих в себя связывание тубулина, связывание ДНК или ингибирование топоизомеразы. Некоторые цитотоксичные средства могут потерять активность или стать менее активными после конъюгирования с крупными антителами или белковыми лигандами рецепторов.
111
90
ZEVALIN (ибритумомад тиуксетан, Biogen/Idec) представляет собой конъюгат антитело-радиоактивный изотоп, состоящий из мышиного моноклонального антитела IgG1 каппа, направленного против антигена CD20, обнаруженного на поверхности нормальных и злокачественных B-лимфоцитов, и радиоактивного изотопа In или Y, связанных через хелатообразующий линкер тиомочевину (Wiseman et al. (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77; Wiseman et al. (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69). Хотя активность ZEVALIN направлена против B-клеточной неходжкинской лимфомы (NHL), ее введение у большинства пациентов вызывает тяжелую и продолжительную цитопению. MYLOTARG™ (гемтузумаб озогамицин, Wyeth Pharmaceuticals), конъюгат антитело-лекарственное средство, состоящий из антитела huCD33, соединенного с калихеамицином, утвержден в 2000 г. для лечения острого миелолейкоза путем инъекции (Drugs of the Future (2000) 25(7):686; патенты США №№4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001). Кантузумаб мертансин (Immunogen, Inc.), конъюгат антитело-лекарственное средство, состоящий из антитела huC242, соединенного через дисульфидный линкер SPP с фрагментом майтанзиноидного лекарственного средства, DM1, поступил в фазу II испытаний лекарственных средств против раковых заболеваний, сопровождающихся экспрессией CanAg, таких как рак толстой кишки, поджелудочной железы, желудка и других органов. MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologies, Immunogen Inc.), конъюгат антитело-лекарственное средство, состоящий из моноклонального антитела против специфического мембранного антигена простаты (PSMA), соединенного с фрагментом майтанзиноидного лекарственного средства, DM1, разрабатывается как потенциальное средство для лечения опухолей простаты. Ауристатиновые пептиды, ауристатин E (AE), монометилауристатин E (MMAE) и синтетические аналоги доластатина, конъюгированные с химерными моноклональными антителами cBR96 (специфичными к антигену Lewis Y, присутствующему при карциномах) и cAC10 (специфичными к антигену CD30, присутствующему при злокачественных заболеваниях крови) (Doronina et al. (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784; and Francisco, et al. (2003) Blood, 102, 1458-1465), находятся в стадии терапевтической разработки. Другие соединения, используемые в качестве конъюгированных цитотоксичных средств, включают в себя, без ограничения, ауристатин E (AE), MMAF (вариант ауристатина E (MMAE), содержащий фенилаланин на C-конце молекулы) и AEVB (ауристатин E валерилбензилгидразон, чувствительный к кислотам линкер на C-конце AE). Линкеры, используемые в конъюгатах для соединения лекарственного средства с антителом, включают в себя, без ограничения, MC (малеимидокапроил), Val Cit (валин-цитруллин, дипептидный участок расщепляемого протеазами линкера), цитруллин (2-амино-5-уреидопентановая кислота), PAB (п-аминобензилкарбамоил, "самоуничтожающийся" фрагмент линкера), Me (N-метил-валин-цитруллин, в котором линкерная пептидная связь модифицирована, чтобы предотвратить ее расщепление катепсином B), MC(PEG)6-OH (малеимидокапроил-полиэтиленгликоль, присоединенный к цистеиновым остаткам антитела), SPP (N-сукцинимидил 4-(2-пиридилтио)пентаноат) и SMCC (N-сукцинимидил 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат). Перечисленные и другие пригодные к применению конъюгаты лекарственных средств, а также способы их получения раскрыты, например, в Doronina, S.O. et al., Nature Biotechnology 21:778-794 (2003), включенной в данное описание в качестве ссылки во всей полноте. Особенно предпочтительные линкерные молекулы включают в себя, например, N-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) (см., например, Carlsson et al., Biochem. J., 173, 723-737 (1978)), N-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)бутаноат (SPDB) (см., например, патент США №4563304), N-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)пентаноат (SPP) (см., например, CAS с регистрационным номером 341498-08-6), N-сукцинимидил 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC) (см., например, Yoshitake et al., Eur. J. Biochem., 101, 395-399 (1979)) и N-сукцинимидил 4-метил-4-[2-(5-нитропиридил)дитио]пентаноат (SMNP) (см., например, патент США №4563304).
212
131
131
90
186
Химиотерапевтические средства, используемые для получения таких иммуноконъюгатов, описаны выше. Пригодные для применения ферментативно активные токсины и их фрагменты включают в себя А-цепь дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, А-цепь экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), А-цепь рицина, А-цепь абрина, А-цепь модецина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантина, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор момордики харантии, курцин, кротин, ингибитор sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены. Для получения конъюгатов антител, содержащих радиоактивные изотопы, можно использовать ряд радионуклидов. Примеры таких радионуклидов включают в себя Bi, I, In, Y и Re. Конъюгаты антитела и цитотоксического средства получают с использованием ряда бифункциональных реагентов для сшивки белков, таких как N-сукцинимидил-3-(2-[пиридилдитиол]пропионат (SPDP)), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCl), активированные сложные эфиры (такие как дисукцинимидил суберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидо-соединения (такие как бис(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат), и бифункциональные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, рициновый иммунотоксин можно получить по способу, описанному в Vitetta et al, Science, 238: 1098 (1987). Меченная углеродом-14 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA) является примером хелатирующего средства, используемого для получения конъюгатов радионуклида с антителом. См. WO 94/11026.
В данном описании также рассматриваются конъюгаты антитела с одним или несколькими низкомолекулярными токсинами, такими как калихеамицин, майтанзиноиды, трихотецен и CC1065, а также с прозводными данных токсинов, обладающими токсической актиностью.
Майтанзин и майтанзиноиды
В одном воплощении антитело (полноразмерное или фрагменты) согласно изобретению конъюгируют с одной или несколькими майтанзиноидными молекулами.
Майтанзиноиды представляют собой ингибиторы митоза, которые действуют посредством ингибирования полимеризации тубулина. Майтанзин впервые был выделен из восточно-африканского кустарника Maytenus serrata (патент США №3896111). Затем было обнаружено, что некоторые микробы тоже продуцируют майтанзиноиды, такие как майтанзинол и C-3 сложные эфиры майтанзинола (патент США №4151042). Синтетический майтанзинол, а также его производные и аналоги раскрыты, например, в патентах США №№4137230; 4248870; 4256746; 4260608; 4265814; 4294757; 4307016; 4308268; 4308269; 4309428; 4313946; 4315929; 4317821; 4322348; 4331598; 4361650; 4364866; 4424219; 4450254; 4362663 и 4371533, описание которых специально включено в данный документ в качестве ссылки.
Конъюгаты майтанзиноид-антитело
5
Чтобы улучшить терапевтические показатели майтанзина и майтанзиноидов, их конъюгируют с антителами, специфически связывающимися с антигенами опухолевых клеток. Иммуноконъюгаты, содержащие майтанзиноиды, и их терапевтическое применение раскрыты, например, в патентах США №№5208020, 5416064 и в европейском патенте EP 0425235 B1, описание которых специально включено в данный документ в качестве ссылки. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623 (1996) описывают иммуноконъюгаты, содержащие майтанзиноид DM1, соединенный с моноклональным антителом C242, направленным против рака ободочной и прямой кишки человека. Данный конъюгат является высокотоксичным по отношению к культуре клеток рака ободочной и прямой кишки человека и демонстрирует противоопухолевую активность при анализе опухолевого роста in vivo. Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992) описывают иммуноконъюгаты, в которых майтанзиноид конъюгируют через дисульфидный линкер с мышиным антителом А7, связывающимся с антигеном клеточной линии рака ободочной и прямой кишки человека, или с другим мышиным моноклональным антителом TA.1, которое связывается с онкогеном HER-2/neu. Цитотоксичность конъюгата TA.1-майтанзиноид анализируют in vitro на линии клеток рака молочной железы человека SK-BR-3, которые экспрессируют 3×10 поверхностных антигенов HER-2 на клетку. Уровень цитотоксичности конъюгата, содержащего лекарственное средство, достигает уровня цитотоксичности свободного майтанзиноидного средства, причем данный уровень можно повысить путем увеличения числа майтанзиноидных молекул на одну молекулу антитела. Конъюгат A7-майтанзиноид обладает низкой системной цитотоксичностью у мышей.
Конъюгаты антитело-майтанзиноид (иммуноконъюгаты)
Конъюгаты антитело-майтанзиноид получают путем химического присоединения антитела к молекуле майтанзиноида без существенного снижения биологической активности антитела или молекулы майтанзиноида. Показано, что конъюгат, содержащий в среднем 3-4 молекулы майтанзиноида на молекулу антитела, эффективно повышает цитотоксичность целевых клеток и при этом не оказывает негативного влияния на функцию и растворимость антитела, хотя предположительно даже одна молекула токсина на антитело повышает цитотоксичность оголенного антитела. Майтанзиноиды хорошо известны в данной области, их можно синтезировать с помощью хорошо известных способов или выделить из природных источников. Подходящие майтанзиноиды раскрыты, например, в патенте США №5208020 и в других патентах и непатентных публикациях, приведенных выше. Предпочтительными майтанзиноидами являются майтанзинол и аналоги майтанзинола, модифицированные по ароматическому циклу или по другим положениям молекулы майтанзинола, такие как различные сложные эфиры майтанзинола.
В данной области известно много линкерных групп, используемых для получения конъюгатов антитело-майтанзиноид, включающих в себя, например, раскрытые в патенте США №5208020 или в патенте EP 0425235 B1 и в Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992). Линкерные группы включают в себя дисульфидные группы, тиоэфирные группы, кислотолабильные группы, фотолабильные группы, чувствительные к пептидазе группы или чувствительные к эстеразе группы, как описано в вышеуказанных патентах, причем предпочтительны дисульфидные и тиоэфирные группы.
Конъюгаты антитела и майтанзиноида можно получить с использованием ряда бифункциональных реагентов для сшивания белков, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат, иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCl), активированные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидо-соединения (такие как бис(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бифункциональные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Особенно предпочтительные конденсирующие агенты включают в себя N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 [1978]) и N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноат (SPP), обеспечивающие образование дисульфидной связи.
Линкер можно присоединить к молекуле майтанзиноида по разным положениям, в зависимости от типа связи. Например, сложноэфирную связь можно получить путем взаимодействия с гидроксильной группой с использованием традиционных методов конденсации. Данную реакцию можно проводить по положению C-3, содержащему гидроксильную группу, по положению C-14, модифицированному гидроксиметилом, по положению C-15, модифицированному гидроксильной группой, и по положению C-20, содержащему гидроксильную группу. В предпочтительном воплощении образование связи происходит по положению C-3 майтанзинола или аналога майтанзинола.
Калихеамицин
1
2
3
1
1
I
I
I
I
I
Другие представляющие интерес иммуноконъюгаты содержат антитело, конъюгированное с одной или несколькими молекулами калихеамицина. Антибиотики калихеамицинового семейства способны вызвать разрыв двухцепочечной ДНК в концентрациях, близких к пикомолярным. Получение конъюгатов калихеамицинового семейства описано в патентах США 5712374, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001, 5877296 (все они принадлежат компании American Cyanamid). Пригодные к использованию структурные аналоги калихеамицина включают в себя, без ограничения, γ , α , α , N-ацетил-γ , PSAG и Θ  (Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58: 2925-2928 (1998) и вышеуказанные патенты США, принадлежащие American Cyanamid). Другим противоопухолевым средством, которое можно конъюгировать с антителом, является QFA, представляющий собой антифолат. И калихеамицин, и QFA действуют внутри клетки и с трудом проникают через цитоплазматическую мембрану. Следовательно, проникновение данных средств внутрь клеток в результате опосредованной антителом интернализации сильно повышает их цитотоксические эффекты.
Другие цитотоксические средства
Другие противоопухолевые средства, которые можно конъюгировать с антителом согласно изобретению, включают в себя BCNU, стрептозоицин, винкристин и 5-фторурацил, семейство средств, известных под общим названием комплекс LL-E33288 и описанных в патентах США 5053394, 5770710, а также эсперамицины (патент США 5877296).
Также можно использовать ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые включают в себя A-цепь дифтерийного токсина, несвязывающие фрагменты дифтерийного токсина, А-цепь экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), А-цепь рицина, А-цепь абрина, А-цепь модецина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантина, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор момордики харантии, курцин, кротин, ингибитор sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены. См., например, WO 93/21232, опубликованный 28 октября 1993 г.
Настоящее изобретение также включает в себя иммуноконъюгат, образованный антителом и соединением с нуклеолитической активностью (например, рибонуклеазой или ДНК-эндонуклеазой, такой как дезоксирибонуклеаза; ДНК-аза).
211
131
125
90
186
188
153
212
32
212
99m
123
Селективного разрушения опухоли можно достичь с помощью антитела, содержащего высокорадиоактивный атом. Для получения радиоактивных конъюгатов антитела можно использовать ряд радиоактивных изотопов. Примеры таких изотопов включают в себя At, I, I, Y, Re, Re, Sm, Bi, P, Pb и радиоактивные изотопы Lu. Если конъюгат используется для детекции, он может содержать радиоактивный атом, используемый для сцинтиграфических исследований, например tc или I, или спиновую метку, используемую для визуализации методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (также известного как магнитно-резонансная томография, МРТ), такую как иод-123, иод-131, индий-111, фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец или железо.
99m
123
186
188
111
Радиоактивные или другие метки можно вводить в состав конъюгата с помощью известных способов. Например, пептид можно получить путем биосинтеза или его можно синтезировать путем химического аминокислотного синтеза с использованием подходящих аминокислотных предшественников, например, содержащих фтор-19 вместо водорода. Метки, такие как tc или I, Re, Re и In, можно присоединить к пептиду через остаток цистеина. Иттрий-90 можно присоединить через остаток лизина. Иод-123 можно вводить с помощью метода IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57). Другие методы подробно описаны в "Monoclonal Antibody in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989).
Конъюгаты антитела с цитотоксическим средством можно получить с помощью ряда бифункциональных реагентов для сшивания белков, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат, иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCl), активированные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидо-соединения (такие как бис(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бифункциональные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, рициновый иммунотоксин можно получить по способу, описанному в Vitetta et al, Science, 238: 1098 (1987). Меченная углеродом-14 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA) является примером хелатирующего средства, используемого для получения конъюгатов радионуклида с антителом. См. WO94/11026. Линкер может представлять собой "расщепляемый линкер", облегчающий высвобождение цитотоксического средства в клетке. Например, можно использовать чувствительный к кислотам линкер, чувствительный к пептидазам линкер, фотолабильный линкер, диметиловый линкер или дисульфидсодержащий линкер (Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992); патент США №5208020).
Соединения согласно изобретению особо включают в себя, без ограничения, ADC, полученные с использованием поперечно-сшивающих реагентов: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC и сульфо-SMPB, а также SVSB (сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоат), которые являются коммерчески доступными (их можно получить, например, от Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A). См. стр. 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog.
Получение конъюгатов антитело-лекарственное средство
В конъюгатах антитело-лекарственное средство (ADC) согласно изобретению антитело (Ab) соединено с одним или несколькими фрагментами лекарственного средства (D), например приблизительно с 1-20 фрагментами лекарственного средства на молекулу антитела, через линкер (L). ADC формулы I можно получить разными способами с использованием реакций органической химии, условий и реагентов, известных специалистам в данной области, которые включают в себя (1) взаимодействие нуклеофильной группы антитела с бивалентным линкерным реагентом с получением Ab-L посредством образования ковалентной связи с последующим взаимодействием с фрагментом лекарственного средства D и (2) взаимодействие нуклеофильной группы фрагмента лекарственного средства с бивалентным линкерным реагентом с получением D-L посредством образования ковалентной связи с последующим взаимодействием с нуклеофильной группой антитела.
Ab-(L-D)<sub>р</sub>
I
Нуклеофильные группы на антителе включают в себя, без ограничения, (i) N-концевые аминогруппы, (ii) аминогруппы боковых цепей, например, лизина, (iii) тиольные группы боковых цепей, например, цистеина, и (iv) гидроксильные группы или аминогруппы сахаров, если антитело гликозилировано. Аминогруппы, тиольные группы и гидроксильные группы являются нуклеофильными и могут взаимодействовать с образованием ковалентных связей с электрофильными группами на линкерных фрагментах и линкерных реагентах, включающих в себя (i) активированные эфиры, такие как сложные эфиры NHS, сложные эфиры HOBt, галогенформаты и галогенангидриды кислот; (ii) алкил- и бензил-галогениды, такие как галогенацетамиды; (iii) альдегиды, кетоны, карбоксильные группы и малеимидные группы. Некоторые антитела содержат способные к восстановлению межцепные дисульфиды, т.е. цистеиновые мостики. Антитела, способные взаимодействовать с линкерными реагентами, можно получить путем обработки восстанавливающим средством, таким как DTT (дитиотреитол). В таком случае каждый цистеиновый мостик теоретически образует два реакционноспособных тиольных нуклеофила. Другие нуклеофильные группы можно ввести в антитела посредством взаимодействия лизиновых остатков с 2-иминотиоланом (реагент Трота) с превращением аминогруппы в тиольную.
Конъюгаты антитело-лекарственное средство согласно изобретению также можно получить путем введения в молекулу антитела электрофильных фрагментов, которые могут взаимодействовать с нуклеофильными заместителями на линкерном реагенте или лекарственном средстве. Сахара гликозилированного антитела можно окислить, например, периодатными окисляющими реагентами с получением альдегидных или кетоновых групп, которые могут взаимодействовать с аминогруппой линкерных реагентов или фрагментов лекарственного средства. Полученные иминогруппы шиффова основания могут образовывать стабильную связь или они могут быть восстановлены, например, боргидридсодержащими реагентами с образованием стабильных аминовых связей. В одном воплощении взаимодействие углеводного фрагмента гликозилированного антитела с галактозооксидазой или метапериодатом натрия может приводить к образованию карбонильных (альдегидных и кетоновых) групп в молекуле белка, которые могут взаимодействовать с соответствующими группами на лекарственном средстве (Hermanson, Bioconiugate Techniques). В другом воплощении белки, содержащие N-концевые остатки серина или треонина, могут взаимодействовать с метапериодатом натрия с образованием альдегида вместо первой аминокислоты (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3: 138-146; US 5362852). Такой альдегид может взаимодействовать с нуклеофилом фрагмента лекарственного средства или линкера.
Подобным образом, нуклеофильные группы на лекарственном фрагменте включают в себя, без ограничения, амин, тиол, гидроксил, гидразид, оксим, гидразин, тиосемикарбазон, гидразинкарбоксилат и арилгидразидные группы, способные взаимодействовать с образованием ковалентных связей с электрофильными группами на линкерных фрагментах и линкерных реагентах, включающих в себя (i) активированные эфиры, такие как сложные эфиры NHS, сложные эфиры HOBt, галогенформаты и галогенангидриды кислот; (ii) алкил- и бензилгалогениды, такие как галогенацетамиды; (iii) альдегиды, кетоны, карбоксильные группы и малеимидные группы.
Альтернативно, гибридный белок, содержащий антитело и цитотоксическое средство, можно получить, например, рекомбинатными методами или путем пептидного синтеза. Молекула ДНК может содержать соответствующие участки, кодирующие две части конъюгата, которые примыкают друг к другу или разделены участком, кодирующим линкерный пептид, который не оказывает неблагоприятного влияния на желательные свойства конъюгата.
В другом воплощении антитело можно конъюгировать с "рецептором" (таким как стрептавидин) для предварительного мечения опухоли, где конъюгат антитело-рецептор вводят пациенту, затем несвязанный конъюгат удаляют из кровотока с использованием выводящего реагента, после чего вводят "лиганд" (например, авидин), конъюгированный с цитотоксическим средством (например, радиоактивным нуклеотидом).
Производные антител
Антитела настоящего изобретения также можно модифицировать путем введения дополнительных небелковых фрагментов, известных в данной области и легко доступных. Предпочтительно, фрагменты, подходящие для дериватизации антитела, представляют собой водорастворимые полимеры. Неограничивающие примеры водорастворимых полимеров включают в себя, без ограничения, полиэтиленгликоль (PEG), сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (либо гомополимеры, либо статистические сополимеры), а также декстран или поли(н-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры пропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси. Пропиональдегид полиэтиленгликоля может иметь преимущество при применении в производстве благодаря стабильности в воде. Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Число полимеров, присоединенных к антителу, может варьировать, и если присоединено более одного полимера, они могут иметь одинаковые или разные молекулы. Как правило, число и/или тип полимеров, используемых для дериватизации, определяют в зависимости от таких факторов, как, в числе прочих, конкретные свойства или функции улучшаемого антитела, а также от того, будет ли производное антитела использоваться для лечения в определенных условиях, и др.
Фармацевтические композиции
Терапевтические композиции, содержащие антитело согласно изобретению, получают для хранения путем смешивания антитела, обладающего желательной степенью чистоты, с необязательными физиологически приемлемыми носителями, наполнителями или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), в виде водных растворов, а также в виде лиофилизированных или других высушенных композиций. Приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиента в используемых дозах и концентрациях и включают в себя буферы, например, содержащие фосфат, цитрат, гистидин и другие органические кислоты; антиоксиданты, в том числе аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензиламмония хлорид; гексаметония хлорид; бензалкония хлорид, бензетония хлорид; феноловый, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (менее 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, в том числе глюкоза, манноза или декстрины; хелатирующие средства, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, Zn-белковые комплексы) и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (PEG).
Композиция, описанная в данном документе, также может содержать несколько активных соединений, если это необходимо при конкретном диагнозе, предпочтительно такие соединения обладают взаимодополняющей активностью и не оказывают неблагоприятного эффекта друг на друга. Такие молекулы присутствуют в композиции в количествах, эффективных для предполагаемого применения.
Активные ингредиенты также можно заключить в микрокапсулу, полученную, например, с помощью методов коацервации или путем межфазной полимеризации, например, в гидроксиметилцеллюлозную или желатиновую микрокапсулу и в поли(метилметакрилатную) микрокапсулу, соответственно, также можно использовать коллоидные системы доставки лекарственных средств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или макроэмульсии. Такие методы описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
Композиции, используемые для введения in vivo, должны быть стерильными. Стерилизацию можно проводить путем фильтрации через мембраны для стерилизации фильтрацией.
Можно получить препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают в себя полупроницаемые матрицы из твердых гидрофодных полимеров, содержащие иммуноглобулин согласно изобретению, данные матрицы находятся в виде частиц определенной формы, например, пленок или микрокапсул. Примеры матриц, обеспечивающих замедленное высвобождение, включают в себя сложные полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поли(виниловый спирт)), полилактиды (патент США №3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ-этил-L-глутамата, недеградируемый этиленвинилацетат, деградируемые сополимеры молочной и гликолевой кислот, такие как LUPRON DEPOT™ (пригодные для введения микросферы, состоящие из сополимера молочной и гликолевой кислот и лейпролидацетата), и поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту. Хотя полимеры, такие как этиленвинилацетат и сополимер молочной и гликолевой кислот, могут высвобождать молекулы в течение более чем 100 дней, некоторые гидрогели высвобождают белки в течение более коротких периодов времени. Если заключенные в капсулу иммуноглобулины остаются в организме в течение длительного времени, они могут денатурировать или агрегировать в результате воздействия влаги при 37°C, что приводит к утрате биологической активности и, возможно, к изменению иммуногенности. Для стабилизации антител можно разработать рациональные стратегии с учетом механизма процесса. Например, если агрегация протекает посредством образования межмолекулярных связей S-S в результате тиодисульфидного взаимодействия, стабилизацию можно проводить путем модификации сульфгидрильных остатков, лиофилизации из кислых растворов, контролирования содержания влаги, использования соответствуюших добавок и разработки особых композиций на основе полимерных матриц.
Применение
Антитело согласно изобретению можно использовать, например, в способах лечения in vitro, ex vivo и in vivo. Антитела согласно изобретению можно использовать как антагонисты для частичной или полной блокады конкретной активности антигена in vitro, ex vivo и/или in vivo. Более того, по меньшей мере, некоторые из антител согласно изобретению способны нейтрализовать активность антигена из других видов. Антитела согласно изобретению также можно использовать для ингибирования конкретной активности антигена, например, в клеточной культуре, содержащей антиген, или у людей или других млекопитающих (таких как шимпанзе, павиан, мартышка, яванский макак и макака-резус, свинья или мышь), содержащих антиген, с которым антитело согласно изобретению дает перекрестную реакцию. В одном воплощении антитело согласно изобретению можно использовать для ингибирования активности антигена путем приведения в контакт антитела с антигеном так, чтобы происходило ингибирование активности антигена. Предпочтительно антиген представляет собой молекулу человеческого белка.
В одном воплощении антитело согласно изобретению можно использовать в способе ингибирования антигена у субъекта, страдающиего от заболевания, при котором активность антигена является вредной, данный способ включает в себя введение субъекту антитела согласно изобретению для ингибирования активности антигена. Предпочтительно антиген представляет собой молекулу человеческого белка, а субъект представляет собой человека. Альтернативно, субъект может представлять собой млекопитающее, экспрессирующее антиген, с которым связывается антитело согласно изобретению. Кроме того, субъект может представлять собой млекопитающее, содержащее экзогенный антиген (например, в результате введения антигена или путем экспрессии трансгена, кодирующего антиген). Антитело согласно изобретению можно вводить человеку с терапевтическими целями. Кроме того, антитело согласно изобретению можно вводить отличному от человека млекопитающему, экспрессирующему антиген, с которым данный иммуноглобулин дает перекрестную реакцию (например, примату, свинье или мыши) для лечения, или чтобы получить животную модель человеческого заболевания. В последнем случае полученные животные модели можно использовать для оценки терапевтической эффективности антитела согласно изобретению (например, для определения доз и периода введения лекарственного средства). Блокирующие антитела согласно изобретению, которые можно использовать в терапевтических целях, включают в себя, без ограничения, антитела против HER2, антитела против VEGF, антитела против IgE, антитела против CD11, антитела против интерферона и антитела против тканевого фактора. Антитела согласно изобретению можно использовать для лечения, ингибирования, замедления развития, предотвращения/отсрочивания рецидива, улучшения или профилактики заболеваний, нарушений или состояний, связанных с аномальной экспрессией и/или активностью одной или нескольких молекул антигена, которые включают в себя, без ограничения, злокачественные и доброкачественные опухоли; нелейкемические и лимфоидные злокачественные заболевания; нейронные, глиальные, астроцитальные нарушения, заболевания гипоталамуса и других желез внутренней секреции, макрофагальные, эпителиальные, стромальные и бластоцелевые нарушения; а также воспалительные, связанные с ангиогенезом и иммунологические нарушения.
В одном аспекте блокирующее антитело согласно изобретению специфично к лиганду-антигену и ингибирует активность антигена путем блокирования взаимодействия лиганд-рецептор или препятствования такому взаимодействию, в котором участвует лиганд-антиген, и в результате этого ингибирования соответствующего сигнального пути и других молекулярных или клеточных событий. Данное изобретение также предлагает рецептор-специфичные антитела, которые могут не предотвращать связывание лиганда, а препятствовать активации рецептора и посредством этого ингибировать любые ответы, которые обычно инициируются в результате связывания лиганда. Данное изобретение также охватывает антитела, которые связываются предпочтительно или исключительно с комплексами лиганд-рецептор. Антитело согласно изобретению также может действовать как агонист рецептора конкретного антигена, и, как таковое, оно может потенцировать, усиливать или активировать все функции, запускаемые лиганд-опосредованной активацией рецептора, или часть данных функций.
В некоторых воплощениях иммуноконъюгат, содержащий антитело, конъюгированное с цитотоксическим средством, вводят пациенту. В некоторых воплощениях происходит интернализация иммуноконъюгата и/или антигена, с которым иммуноконъюгат связывается, клетками, что приводит к повышению терапевтической эффективности иммуноконъюгата при уничтожении клеток-мишеней, против которых он направлен. В одном воплощении действие цитотоксического средства направлено на нуклеиновую кислоту или против нуклеиновой кислоты, присутствующей в клетке-мишени. Примеры таких цитотоксических средств включают в себя любые указанные в данном описании химиотерапевтические средства (такие как майтанзиноид или калихеамицин), радиоактивные изотопы и рибонуклеазу или ДНК-эндонуклеазу.
В способах лечения антитела согласно изобретению можно использовать по отдельности или в сочетании с другими композициями. Например, антитело согласно изобретению можно вводить вместе с другим антителом, химиотерапевтическим средством (средствами) (в том числе смесями химиотерапевтических средств), другим цитотоксическим средством (средствами), антиангиогенным средством (средствами), цитокинами и/или ингибиторами роста. Если антитело согласно изобретению ингибирует опухолевый рост, то иногда желательно объединить его с одним или несколькими другими терапевтическими средствами, также ингибирующими рост опухоли. Например, в схеме лечения антитело согласно изобретению можно объединить с антителом против VEGF (например, AVASTIN) и/или антителами против ErbB (например, антителом против HER2 HERCEPTIN), например, при лечении любого из заболеваний, описанных в данном документе, включая рак ободочной и прямой кишки, метастатический рак молочной железы и рак почки. Альтернативно или дополнительно, пациент может получать сочетанную лучевую терапию (например, внешнее облучение или терапию с использованием средства, меченного радиоактивным изотопом, такого как антитело). Такие указанные выше сочетанные способы лечения включают в себя совместное введение (где два или более средств входят в состав одной или разных композиций) и раздельное введение, при котором антитело согласно изобретению вводят до и/или после введения одного или нескольких вспомогательных лекарственных средств.
Антитело согласно изобретению (и вспомогательное лекарственное средство) вводят с помощью любого из подходящих способов, включающих в себя парентеральное, подкожное, внутрибрюшинное, внутрилегочное и интраназальное введение, а также, если требуется местная обработка, введение внутрь пораженных тканей. Парентеральное введение включает в себя внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Кроме того, антитело можно вводить путем импульсной инфузии, в частности, с понижением дозы антитела. Введение дозы можно осуществлять любым подходящим способом, например путем инъекции, такой как внутривенная или подкожная инъекция, причем данный способ отчасти зависит от того, является ли введение кратким или длительным.
Композицию антитела согласно изобретению получают, разделяют на дозы и вводят, используя способы, широко используемые в медицинской практике. При этом следует учитывать такие факторы, как конкретное заболевание, подлежащее лечению, вид млекопитающего, подлежащего лечению, клиническое состояние конкретного пациента, причина заболевания, участок, в который доставляется средство, способ введения, режим введения, а также другие факторы, известные специалистам в области медицины. В состав композиции, содержащей антитело, можно при желании ввести одно или несколько средств, используемых в настоящее время для профилактики или лечения обсуждаемого заболевания, хотя это и не обязательно. Эффективное количество такого вспомогательного средства зависит от количества антитела согласно изобретению, присутствующего в композиции, типа заболевания или способа лечения, а также от других факторов, перечисленных выше. Данные вспомогательные средства обычно вводят с помощью описанных выше способов и в указанных выше дозах или в дозах, составляющих от 1 до 99% от используемых ранее.
В случае профилактики или лечении заболевания подходящая дозировка антитела согласно изобретению (при использовании антитела отдельно или в сочетании с другими средствами, такими как химиотерапевтические средства) зависит от вида заболевания, подлежащего лечению, типа антитела, тяжести и течения заболевания, от того, вводят ли антитело в профилактических или терапевтических целях, от предыдущего способа лечения, истории болезни пациента и ответа на антитело, а также от индивидуального мнения лечащего врача. Антитело можно вводить пациенту однократно или в течение ряда курсов. В зависимости от типа и тяжести заболевания в качестве подходящей начальной дозы пациенту можно ввести приблизительно от 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,1-10 мг/кг) антитела, например, путем одного или нескольких отдельных введений или путем непрерывного вливания. Как правило, дневная доза варьирует в интервале приблизительно от 1 мкг/кг до 100 мг/кг или больше, в зависимости от указанных выше факторов. В случае многократного введения в течение нескольких дней или дольше в зависимости от состояния лечение продолжают до желательного подавления наблюдающихся симптомов заболевания. Типичная доза антитела обычно находится в интервале приблизительно от 0,05 мг/кг до 10 мг/кг. Таким образом, пациенту можно ввести одну или несколько доз, составляющих приблизительно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг или 10 мг/кг (или любое их сочетание). Такие дозы можно вводить периодически, например каждую неделю или каждые три недели (например, так, чтобы пациент получил приблизительно от двух до двадцати, например приблизительно шесть, доз антитела). Вначале можно ввести повышенную ударную дозу и затем одну или несколько более низких доз. Типичный дозировочный режим включает в себя введение начальной ударной дозы, составляющей приблизительно 4 мг/кг, и затем еженедельное введение поддерживающей дозы антитела, составляющей приблизительно 2 мг/кг. Однако можно использовать другие дозировочные режимы. Результаты данного способа лечения можно отслеживать с помощью традиционных методов и анализов.
Готовые изделия
В другом аспекте данного изобретения предлагается готовое изделие, содержащее вещества, используемые для лечения, профилактики и/или диагностики описанных выше нарушений. Готовое изделие включает в себя контейнер и этикетку или вкладыш, находящийся внутри упаковки или прикрепленный к контейнеру. Подходящие контейнеры включают в себя, например, бутылки, флаконы, шприцы и др. Контейнеры могут быть получены из разных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию, которая сама по себе или после объединения с другой композицией является эффективным средством для лечения, профилактики и/или диагностики состояния, и может иметь отверстие для стерильного введения (например, контейнер может представлять собой мешок для внутривенного раствора или флакон, имеющий крышку, которую можно проткнуть иглой для подкожной инъекции). По меньшей мере одно активное средство в композиции представляет собой антитело согласно изобретению. На этикетке или вкладыше в упаковку указано, что композиция предназначена для лечения определенного состояния, такого как рак. Кроме того, готовое изделие может включать в себя (a) первый контейнер, содержащий композицию, где композиция содержит антитело согласно изобретению; и (b) второй контейнер, содержащий композицию, где композиция содержит другое цитотоксическое средство. Готовое изделие в данном воплощении настоящего изобретения может дополнительно содержать вкладыш в упаковку, на котором указано, что первую и вторую композиции антител можно использовать для лечения конкретного состояния, например рака. Альтернативно или дополнительно, готовое изделие может дополнительно включать в себя второй (или третий) контейнер, содержащий фармацевтически приемлеый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (BWFI), забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Он может дополнительно содержать другие вещества, желательные с точки зрения поставщика и потребителя, в том числе другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.
Ниже приведены примеры способов и композиций согласно изобретению. Следует понимать, что на основе приведенного выше общего описания можно осуществить и разные другие воплощения.
ПРИМЕРЫ
В приведенных примерах описано получение гуманизированного антитела против бета7 из крысиного антитела против мышиных антител, которое связывается с субъединицей бета7 интегрина альфа4бета7.
Пример 1:
Гуманизация антагонистического антитела против бета7
Материалы и методы
Остатки нумеруют по системе Кабат (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Используют однобуквенные обозначения аминокислот. Вырожденность ДНК означают с использованием кода IUB (N = A/C/G/T, D = A/G/T, V = A/C/G, B= C/G/T, H= A/C/T, K = G/T, M = A/C, R = A/G, S=G/C, W= A/T, Y = C/T).
Непосредственная прививка гипервариабельных участков на акцепторный консенсусный человеческий каркасный участок
В данной работе используют фагмиду pVO350-2b, которая представляет собой моновалентный дисплей-вектор Fab-g3, содержащий 2 открытые рамки считывания под контролем промотора phoA, практически такой, как описанный в Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93. Первая открытая рамка считывания включает в себя сигнальную последовательность stII, соединенную с доменами VL и CH1 акцепторной легкой цепи, а вторая включает в себя сигнальную последовательность stII, соединенную с доменами VH и CH1 акцепторной тяжелой цепи, и затем процессированную форму минорного белка фаговой оболочки P3 (Lowman, H. et al. (1990) Biochemistry 30:10832).
Первичную последовательность доменов VL и VH крысиного Fib504 (антитело FIB504.64, полученное с использованием гибридомы ATCC HB-293, Американская коллекция типовых культур (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, USA) сравнивают с последовательностями человеческого консенсусного домена каппа I (huKI) и человеческого консенсусного домена VH подгруппы III (huIII). Для прививки гипервариабельных участков (HVR) используют следующие каркасные участки: HuKI используют для каркасного участка вариабельного домена легкой цепи (см. фиг.1A и 7). Для каркасного участка вариабельного домена тяжелой цепи, акцепторного каркасного участка VH, можно использовать модифицированный человеческий консенсусный домен VH подгруппы III (humIII), который отличается от последовательности humIII по 3 положениям: R71A, N73T и L78A (см. Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992)) (см. фиг.1B). При получении антитела согласно изобретению вставку 504K-RF также получают из модифицированного человеческого консенсусного домена VH подгруппы III путем осуществления следующих аминокислотных замен: A71R и A78F.
Гипервариабельные участки из крысиного антитела Fib504 (полученного с использованием гибридомы ATCC HB-293) с помощью методов генной инженерии вставляют в акцепторный человеческий консенсусный каркасный участок VH подгруппы III с получением непосредственно привитого участка HVR (Fib504graft) (см. фиг.1B). В домене VL на человеческий консенсусный акцепторный huKI прививают участки крысиного Fib504, содержащие следующие положения: 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) (Фиг.1A), в домене VH прививают участки, содержащие положения 26-35 (H1), 49-65 (H2) и 94-102 (H3) (фиг.1B). Кроме того, конструируют вторую вставку HVR, Fib504Kgraft, которую также включают в HVR, положение 49 VL, в соответствии с расширенным определением L2 (см. MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)). В результате анализа кристаллической структуры комплекса антитела с антигеном MacCallum et al. обнаружили, что положение 49 легкой цепи и положения 49 и 94 тяжелой цепи являются частью контактного участка антигена и, следовательно, данные положения включены в определения HVR-L2, HVR-H2 и HVR-H3 гуманизированного антитела против бета7, описанного в данном документе.
Варианты, содержащие непосредственно привитые участки, получают путем мутагенеза Кункеля (Kunkel et al. (1987), выше) с использованием отдельного олигонуклеотида для каждого гипервариабельного участка. Нужные клоны определяют методом секвенирования ДНК.
Мягкая рандомизация гипервариабельных участков
Процесс "мягкой рандомизации" (см. заявку США № 60/545840) относится к процедуре мутагенеза отклонений (biased mutagenesis) в выбранной белковой последовательности, такой как гипервариабельный участок антитела. Данный способ позволяет сохранить отклонение (bias) в последовательностях мышиных, крысиных или других исходных гипервариабельных участков при введении приблизительно 10-50 процентов мутаций по каждому выбранному положению. Данный метод позволяет повысить продуктивность используемого скрининга библиотеки и избежать изменения антигенного эпитопа, распознаваемого антителом. В соответствии с данным методом мягкой рандомизации, изменяют последовательность каждого гипервариабельного участка с использованием стратегии, которая позволяет сохранять отклонения по отношению к последовательности мышиного гипервариабельного участка. Для этого используют метод синтеза отравленных олигонуклеотидов, впервые описанный Gallop et al., J. Med. Chem. 37: 1233-1251 (1994). Однако можно использовать и другие методы, позволяющие сохранять отклонение по отношению к остаткам нечеловеческих гипервариабельных участков, такие как ошибочно направленная ПЦР, перетасовки ДНК и др.
Если в соответствии с используемым в данном описании способом мутации подвергается определенное положение гипервариабельного участка, кодон, кодирующий аминокислоту дикого типа, отравляют смесью (например, смесью 70-10-10-10) нуклеотидов и в результате получают мутации в 50 процентах случаев по каждому выбранному положению гипервариабельного участка. Для этого кодон, кодирующий подвергающуюся мутагенезу аминокислоту дикого типа из гипервариабельного участка, синтезируют, используя смесь с низким уровнем примеси трех других нуклеотидов, такую как смесь нуклеотидов 70-10-10-10. Таким образом, например, в случае мягкой рандомизации PRO (CCG), первое синтезированное положение представляет собой смесь 70% C и 10% каждого из G, T и A; второе положение представляет собой смесь 70% C и 10% каждого из A, G и T; а третье положение представляет собой смесь 70% G и 10% каждого из A, C и T. Следует понимать, что отклонение можно увеличить или уменьшить в зависимости от кодона, синтезируемого в данном положении, числа кодонов, кодирующих конкретную аминокислоту, и степени отравления олигонуклеотида нуклеотидным составом синтетической смеси.
Полученные в результате мягкой рандомизации олигонуклеотиды можно вставить после мышиной, крысиной или другой исходной последовательности гипервариабельного участка, данные олигонуклеотиды окружают такие участки, полученные путем непосредственной вставки гипервариабельных участков. Необязательно два аминокислотных положения в начале H2 и H3 домена VH могут иметь ограничение по вариабельности: кодон RGC можно использовать для кодирования в положении 49 A, G, S или T, а кодон AKG можно использовать для кодирования в положении 94 M или R.
Получение фаговых библиотек
2
2
2
Пулы рандомизированных олигонуклеотидов, сконструированные для каждого гипервариабельного участка, фосфорилируют отдельно в шести реакционных смесях объемом 20 мкл, каждая из которых содержит 660 нг олигонуклеотида, 50 мМ трис, pH 7,5, 10 мМ MgCl, 1 мМ АТФ, 20 мМ DTT и 5 ед. полинуклеотидкиназы, в течение 1 ч при 37°C. Затем шесть фосфорилированных олигонуклеотидных пулов объединяют с 20 мкг матрицы Кункеля в 500 мкл раствора, содержащего 50 мМ трис, pH 7,5, 10 мМ MgCl, при соотношении олигонуклеотида к матрице 3:1. Смесь подвергают отжигу при 90°C в течение 4 мин, при 50°C в течение 5 мин и затем охлаждают на льду. Чтобы предотвратить избыточную денатурацию отожженной ДНК, излишний неотожженный олигонуклеотид удаляют, используя набор для ПЦР-очистки QIAQUICK™ (Qiagen kit 28106, Qiagen, Valencia, CA) и модифицированный метод очистки. К 500 мкл отожженной смеси добавляют 150 мкл буфера PB, Qiagen, и смесь распределяют между 2 колонками с оксидом кремния. Каждую колонку промывают 750 мкл буфера PE, Qiagen, сушат методом экстрацентрифугирования (extra spin) и затем элюируют 110 мкл смеси, содержащей 10 мМ трис, 1 мМ EDTA, pH 8. После этого отожженную и очищенную матрицу (220 мкл) дополняют путем добавления 1 мкл 100 мМ АТФ, 10 мкл 25 мМ dNTP (25 мМ каждого из dATP, dCTP, dGTP и dTTP), 15 мкл 100 мМ DTT, 25 мкл буфера 10× TM (0,5 M трис, pH 7,5, 0,1 M MgCl), 2400 ед. лигазы T4 и 30 ед. полимеразы в течение 3 ч при комнатной температуре.
Дополненный продукт анализируют на трис-ацетат-EDTA/агарозных гелях (Sidhu et al:, Methods in Enzymology 328:333-363 (2000)). Обычно наблюдается три полосы: нижняя полоса соответствует правильно дополненному и лигированному продукту, средняя полоса соответствует дополненному, но нелигированному продукту, а верхняя полоса соответствует смещенной цепи. Верхняя полоса соответствует продукту, полученному в результате побочной активности, свойственной полимеразе T7, образования которого трудно избежать (Lechner et al., J. Biol. Chem. 258: 11174-11184 (1983)); однако данная полоса трансформируется в 30 раз менее эффективно, чем нижняя полоса, и обычно вносит низкий вклад в получаемую библиотеку. Продукт, соответствующий средней полосе, образуется в результате отсутствия 5'-фосфата, необходимого для конечной реакции лигирования; данный продукт трансфоримруется эффективно и дает в основном последовательность дикого типа.
9
Затем дополненный продукт очищают и методом электропорации вводят в клетки SS320, которые выращивают в присутствии хелперного фага M13/KO7, как описано Sidhu et al, Methods in Enzymology 328: 333-363 (2000). Размер библиотек варьирует в интервале 1-2×10 в зависимости от клона. Чтобы оценить качество библиотеки, проводят секвенирование произвольных клонов из исходных библиотек.
Селекция фагов
2
2
2
Полноразмерный человеческий интегрин альфа4бета7 экспрессируют в клетках 293 (Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)), очищают методом аффинной хроматографии с использованием Fib504 и используют в качестве мишени при селекции фагов. Чтобы провести иммобилизацию интегрина на микротитровальных планшетах MaxiSorp(TM) (Nalge Nunc, Rochester, NY), добавляют 100 мкл раствора человеческого интегрина альфа4бета7 с концентрацией 5 мкг/мл в смеси, содержащей 150 мМ NaCl, 50 мМ трис, pH 7,5, 2 мМ CaCl, 2 мМ MgCl и 2 мМ MnCl (TBSM), в течение ночи при 4°C. Лунки блокируют в течение 1 ч с помощью TBSM, содержащего 1% БСА. В первом цикле селекции используют 8 лунок, покрытых мишенью; для успешного проведения циклов селекции используют лунки, однократно покрытые мишенью. Фаг собирают из культурального супернатанта и суспендируют в TBSM, содержащем 1% БСА и 0,05% TWEEN™ 20 (TBSMBT). После инкубации с лунками в течение 2 ч несвязанный фаг удаляют путем обильного промывания TBS, содержащего 0,05% TWEEN 20 (TBST). Связанный фаг элюируют путем инкубации лунок со 100 мМ HCl в течение 30 мин. Фаг амплифицируют, используя клетки Top10 и хелперный фаг M13/KO7, и выращивают в течение ночи при 37°C в 2YT, в присутствии 50 мкг/мл карбанациллина. Чтобы оценить обогащение, титры фага, элюированного с лунок, покрытых мишенью, сравнивают с титрами фага, извлеченного из лунок, не покрытых мишенью. После четырех циклов селекции анализируют последовательность произвольно выбранных клонов.
Получение Fab и определение сродства
Чтобы экспрессировать Fab для измерения сродства, стоп-кодон вводят в вектор фагового дисплея между последовательностью, кодирующей тяжелую цепь, и g3. Полученные клоны используют для трансформации клеток E.coli 34B8, которые выращивают в среде AP5 при 30°C (Presta, L. et al., Cancer Res. 57: 4593-4599 (1997)). Клетки собирают центрифугированием, суспендируют в смеси, содержащей 10 мМ трис, 1 мМ EDTA, pH 8, и разрушают с помощью микрофлюидизатора. Fab очищают методом аффинной хроматографии с использованием белка G.
on
off
Сродство определяют методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием BIAcore™-3000 (Biacore, Piscataway, NJ). Варианты Fab гуманизированного Fib504 иммобилизуют в 10 мМ ацетатном буфере, pH 4,5 (в интервале от 250 до 1500 единиц ответа (RU)) на сенсорном чипе CM5 и вводят 2-кратные разведения человеческого интегрина альфа4бета7 (от 1,5 до 770 нМ) в TBSM, содержащем 2% н-октилглюкозида. Каждый образец анализируют, используя 5-минутный интервал ассоциации и 5-60-минутный интервал диссоциации. После каждого ввода чип регенерируют с помощью трех 1-минутных введений 8 M мочевины. Ответ по связыванию корректируют путем вычитания RU из "пустого" потока клеток. Для анализа кинетики используют модель Ленгмюра 1:1 с одновременным подгоном k и k.
Результаты и обсуждение
Гуманизация крысиного Fib504
Используемый для гуманизации человеческий акцепторный каркасный участок, который получают на основе каркасного участка, используемого для HERCEPTIN, состоит из консенсусного человеческого домена VL подгруппы каппа I (huKI) и варианта консенсусного человеческого домена VH подгруппы III (humIII). Указанный вариант домена VH содержит 3 замены по сравнению с человеческой консенсусной последовательностью: R71A, N73T и L78A. Последовательности доменов VL и VH крысиного Fib504 сравнивают с последовательностями доменов человеческих цепей подгруппы каппа I и подгруппы III; каждый гипервариабельный участок (HVR) идентифицируют и прививают на человеческий акцепторный каркасный участок с получением вставки HVR (504graft), которая обнаруживается на фаговом дисплее в виде Fab (фиг.1A и 1B).
В результате анализа доступных кристаллических структур комплексов антитела с антигеном MacCallum et al. (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)) предложены определения HVR на основе остатков вариабельного домена, которые часто контактируют с антигенами. Так, положения 49G и 94M тяжелой цепи входят в состав вставки HVR Fib504 (фиг.1B). Кроме того, получают вторую вставку HVR, Fib504Kgraft, которая содержит положение 49K легкой цепи, поскольку данное положение также входит в контактное определение HVR-L2 и может участвовать в создании контакта с антигеном (Фиг.1A). Если вставку Fib504 или Fib504K фиксируют на фаговом дисплее и анализируют на связывание с иммобилизованным альфа4бета7, связывание не наблюдается.
Библиотеки получают с использованием вставок HVR как в Fib504, так и в Fib504-K, где все участки HVR были одновременно подвергнуты мягкой рандомизации. Каждую библиотеку вставок HVR сортируют против иммобилизованного альфа4бета7 в течение 4 циклов селекции. Обогащение не наблюдается, а клоны, отобранные для анализа последовательности ДНК, содержат только случайные изменения последовательности, направленные на 6 участков HVR.
Две другие последовательности каркасных участков VH, "RL" и "RF", используемые как акцепторные каркасные участки, содержат замены в положениях 71 и 78. Аминокислоту в положении 71 заменяют на аргинин, как в человеческой консенсусной последовательности подгруппы III, а аминокислоту в положении 78 заменяют на лейцин, как в человеческой консенсусной последовательности подгруппы III (акцепторный каркасный участок "RL"), или на фенилаланин, как в человеческой консенсусной последовательности подгруппы II и в последовательности каркасного участка VH крысиного Fib504 (акцепторный каркасный участок "RF") (фиг.10A). Если вставку Fib504 или Fib504K в акцепторный каркасный участок "RL" (Fib504-RL и Fib504K-RL) или "RF" (Fib504-RF и Fib504K-RF) фиксируют на фаговом дисплее и анализируют на связывание с иммобилизованным альфа4бета7, специфическое связывание фага наблюдается только в случае вставки Fib504K с использованием каркасного участка "RF" (фиг.10B). Умеренное связывание фага вставкой Fib504-RF по сравнению с другими вставками, не содержащими Y49K (легкая цепь) и L78F (тяжелая цепь), указывает на значимость данных положений при выборе используемого акцепторного каркасного участка.
Библиотеки получают по описанному выше способу, используя стратегию мягкой рандомизации одновременно по всем 6 HVR для вставок Fib504K-RL и Fib504K-RF, и затем сортируют против иммобилизованного альфа4бета7 в течение 4 циклов селекции, как описано выше. Обогащение наблюдается только для библиотеки, полученной на основе вставки Fib504K-RF. Клоны, полученные после 4 цикла селекции библиотеки Fib504K-RF, отбирают для анализа последовательности, в результате которого обнаруживают аминокислотные изменения, направленные на HVR-L1. Большинство клонов содержит замену Y32L; кроме того, аминокислота в положении 31 часто заменяется на D, S, P или N (фиг.1C). Помимо исходной вставки, Fib504K-RF, 3 клона экспрессируют и очищают в виде белков Fab, которые анализируют с использованием Biacore, как описано выше. Клоны hu504-5, hu504-16 и hu504-32 (варианты SEQ ID NO: 1, содержащие замены T31S и Y32L (вариант hu504.5), Y32L (вариант hu504.16) или T31D и Y32L (вариант hu504.32); см. фиг.1C) гораздо лучше связывают альфа4бета7, чем вставка Fib504K-RF, и обладают таким же или более высоким сродством к альфа4бета7, как и Fab химерного Fib504. Результаты анализа Biacore приведены ниже в таблице 3 и показывают, что полученные в результате селекции варианты раскрытых в данном описании HVR и/или каркасных участков антагонистических антител против альфа4бета7 обладают более высоким сродством, чем исходное антитело. Приведенные в таблице 3 результаты показывают, что гуманизированный вариант 504.32 демонстрирует наиболее высокое сродство по сравнению с исходным крысиным антителом, поскольку связывается с альфа4бета7 в 3 раза прочнее.
Таблица 3
Fab(Анализ BIAcore™)
Сродство к альфа4бета7(нМ)
Fib504
11
Вариант 504.5
9
Вариант 504.16
23
Вариант 504.32
3
Приведенные в таблице 3 результаты также показывают, что реконструирование HVR-L1 может привести к восстановлению высокого сродства к связыванию антигена. В частности, среди разных клонов чаще всего встречается мутация Y32L. Другие изменения в положении 31, а также ряд других замен в последовательности HVR-H1 являются допустимыми и могут обеспечивать дополнительное улучшение. Полученные результаты показывают, что существует много изменений последовательности, которые приводят к улучшению сродства участка Fib504, привитого на человеческий каркасный участок, и обеспечивают сродство, которое идентично сродству исходного крысиного антитела или превышает его.
Таким образом, на основе вставки 6 HVR крысиного Fib504 в человеческий акцепторный каркас получают расширение HVR-L2 с включением положения 49 (лизин), расширение HVR-H2 с включением положения 49 (глицин) и расширение HVR-94 с включением положения 94 (метионин), а также аминокислотные изменения в положении 32 VHR-L1 (где L или I заменяют на Y) и, необязательно, в положении 31 VHR-L1 (где T заменяют, например, на D или S). Приемлемые аминокислотные замены в каркасном участке осуществляют в положениях 71 (A71R) и 78 (L78F) домена VH. Такие аминокислотные замены приводят к получению полностью человеческого антитела, варианта hu504.32, например, с 3-кратным увеличением сродства связывания к интегрину альфа4бета7. Кроме того, было показано, что полученные в результате селекции гуманизированные антитела настоящего изобретения обладают биологической активностью, по меньшей мере, сравнимой с биологической активностью исходного крысиного антитела Fib504 (см. пример 3 данного описания).
Пример 2
Другие гуманизированные варианты HVR Fib504
Аминокислотные последовательности HVR гуманизированного варианта Fib504.32 дополнительно модифицируют с получением других вариантов, обладающих антагонистической активностью по отношению к субъединице интегрина бета7 и/или к интегринам, содержащим субъединицу бета7.
Получение библиотеки широкого аминокислотного сканирования
Библиотеку для сканирования положений выбранных HVR по другим аминокислотным остаткам, которые могут приводить к получению бета7-связывающих вариантов вариантного hu504.32, получают с использованием 3 олигонуклеотидов: 504-L1, сконструированного так, чтобы достичь мягкой рандомизации фрагмента HVR-L1 с отклонением по отношению к последовательности HVR-L1 hu504.32 (т.е. последовательность ASESVDDLLH (SEQ ID NO: 47, относительные положения A2-A11) была мягко рандомизирована по описанному выше способу); и HVR-L3 504-N96 и HVR-H3 504-M94, которые получают путем введения NNS в положении 96 легкой цепи HVR-L3 и в положении 94 тяжелой цепи HVR-H3, обеспечивая таким образом присутствие всех 20 аминокислот в данных положениях. С использованием трех указанных олигонуклеотидов получают библиотеку широкого аминокислотного сканирования по описанному выше способу, используя матрицу, содержащую три стоп-кодона в легкой цепи (положения 31 и 32 в HVR-L1 и положение 96 в HVR-L3) и 1 стоп-кодон в тяжелой цепи (положение 94 в HVR-H3).
Широкое аминокислотное сканирование hu504-32
Чтобы более полно исследовать предпочтительные последовательности, разрешенные в HVR-L1, а также чтобы повысить стабильность 504-32, авторы настоящего изобретения создали фаговую библиотеку, которая a) содержит мягко рандомизированный HVR-L1 504-32 в участке, в котором происходят изменения (т.е. ASESVDDLLH (SEQ ID NO: 47, относительные положения A2-A11) в процессе гуманизации (фиг.1C)), и b) обеспечивает присутствие всех возможных аминокислот в положении N96 HVR-L3 и в положении M94 HVR-H3. После 4 циклов селекции против иммобилизованного полноразмерного человеческого интегрина альфа4бета7, как описано выше, 96 произвольных клонов отбирают для анализа последовательности. Частота встречаемости аминокислот в каждом положении в библиотеке широкого аминокислотного сканирования позволяет сделать вывод, что последовательность HVR-L1, присутствующая в hu504-32, и метионин в положении 94 тяжелой цепи являются оптимальными для высокого сродства связывания (фиг.12). Наиболее предпочтительные аминокислоты, определенные в результате селекции вариантов, начиная с варианта 504.32 (фиг.12) выделены желтым. Наоборот, хотя в положении 96 легкой цепи hu504-32 присутствует аспарагин, высокая частота встречаемости лейцина в данном положении позволяет предположить, что мутация N96L может дополнительно улучшить сродство гуманизированных вариантов Fib504 к альфа4бета7 и, кроме того, она также может устранить любые проблемы, связанные с возможностью деамидирования по данному положению. На фиг.12 приведена информация о ряде аминокислотных замен, которые, по всей вероятности, являются приемлемыми для большинства положений, не вызывая снижения сродства. Например, чтобы исключить окисление M94 в HVR-H3, глутамин или аргинин, видимо, должны быть заменены.
Получение библиотек ограниченного аминокислотного сканирования
Получают шесть библиотек ограниченного аминокислотного сканирования с использованием шести разных матриц Кункеля, каждая из которых содержит один стоп-кодон в одном из шести HVR. Каждую библиотеку получают с использованием одного олигонуклеотида, кодирующего один HVR, и с применением кодонов, приведенных на фиг.11A (колонка "кодон"), приводящих к изменению аминокислотных остатков, с последующим тестированием на связывание с бета7 или альфа4бета7. Такие же методы используют для изменения аминокислотных остатков антитела против бета7 и анализа их связывания с интегринами альфаЕбета7.
Ограниченное аминокислотное сканирование hu504-32
Ограниченное аминокислотное сканирование hu504-16 предпринимают для того, чтобы еще больше увеличить сходство hu504-16 и человеческой консенсусной последовательности легкой и тяжелой цепи и идентифицировать с помощью данного способа минимальные элементы последовательности крысиного Fib504, необходимые для связывания. Получают шесть библиотек, направленных на такие положения в каждом HVR, которые различаются у hu504-16 и человеческих консенсусных последовательностей легкой цепи каппа I или тяжелой цепи подгруппы III (фиг.1A и 1B); в данных положениях библиотеки может присутствовать крысиная или человеческая аминокислота (фиг.11A). Чтобы обеспечить кодирование обоих аминокислот, в процессе олигонуклеотидного синтеза и мутагенеза в некоторых случаях вводят другие аминокислоты (см. "кодируемые аминокислоты", фиг.11A). Селекцию библиотек ограниченного аминокислотного сканирования проводят против иммобилизованного полноразмерного человеческого интегрина альфа4бета7, как описано выше, и после 3 цикла приблизительно 32 произвольных клона из каждой библиотеки секвенируют. Частота встречаемости каждой аминокислоты по каждому положению приведена на фиг.11B и 11C.
Подобно широкому аминокислотному сканированию, ограниченное аминокислотное сканирование также дает информацию об изменениях, приемлемых для многих положений гуманизированного Fib504. Однако, в отличие от широкого аминокислотного сканирования, вариабельность, допустимая по каждому рандомизированному положению, при ограниченном аминокислотном сканировании сводится к паре аминокислот. Таким образом, отсутствие какой-либо из наблюдаемых замен в заданном положении не означает, что данный остаток не может быть изменен, а высокая частота встречаемости любой конкретной аминокислоты в заданном положении не свидетельствует о том, что такая аминокислота обязательно является наилучшим решением для получения высокого сродства.
В некоторых положениях (положения 27, 29, 30, 53, 54 легкой цепи и 50, 54, 58, 60, 61 и 65 тяжелой цепи) человеческая консенсусная аминокислота присутствует достаточно часто и это позволяет предположить, что обратная мутация к человеческой консенсусной аминокислоте не приводит к сильному изменению связывания с человеческим альфа4бета7. Фактически в положении 54 легкой цепи (в HVR-L2) человеческая консенсусная аминокислота присутствует чаще, чем аминокислота из крысиного Fib504, а значит данное изменение в 504-32 приводит к получению пригодного к использованию бета7-связывающего антитела.
Кроме того, в некоторых положениях полученной библиотеки чаще оказываются аминокислоты, которые не присутствуют ни в человеческой консенсусной последовательности, ни в крысином Fib504, данные аминокислоты предоставляют потенциальные замены, которые могут повысить сродство гуманизированных вариантов Fib504. Указанные замены включают в себя, без ограничения, D30A и I55V в легкой цепи и Y50F в тяжелой цепи. Результаты анализа 2 таких библиотек показывают, что для многих положений HVR возможны другие аминокислотные замены с сохранением сравнимой биологической активности.
Данные по наблюдаемым аминокислотным изменениям приведены на фигурах 13 и 15. На фигуре 15 показаны разные аминокислоты, используемые в каждом из положений CDR вариантных антител согласно изобретению, пронумерованных с помощью системы Кабат или относительной системы нумерации. Каждое дополнительное антитело, относящееся к вариантам, изображенным на фигурах 13 и 15, представляет собой воплощение согласно изобретению.
Пример 3
Анализы клеточной адгезии
Способность некоторых гуманизированных вариантов Fib504 согласно изобретению связывать лиганды, экспрессируемые на клеточной поверхности, тестируют путем анализа клеточной адгезии. Связывание с альфа4бета7 и с другим интегрином бета7, альфаЕбета7, анализируют по способности гуманизированных вариантов препятствовать связыванию интегрина с его природным рецептором. Подобным образом анализируют связывание гуманизированных вариантов Fib504 только с субъединицей бета7, экспрессируемой на клеточной поверхности. Методы и результаты описаны ниже.
Продукция IgG
Гуманизированные варианты IgG Fib 504 транзиторно экспрессируют в клетках 293 (Graham et al. (1977) supra), используя отдельные векторы для легкой и тяжелой цепи. Векторы конструируют путем субклонирования вариабельных доменов легкой или тяжелой цепи в подходящих векторах экспрессии для каждой из легкой и тяжелой цепи. Супернатант 1,1 л клеточной культуры CHO, содержащий гуманизированный вариант Fib504, фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм на новую колонку HiTrap Protein A HP column (Amersham/Pharmacia) объемом 1 мл, уравновешенную буфером A (10 мМ трис, pH 7,5, 150 мМ NaCl). Образцы наносят со скоростью 0,8 мл/мин, в течение ночи, при 4°C. Затем каждую колонку промывают и уравновешивают 30 мл буфера A. Антитело элюируют при комнатной температуре путем хроматографии на FPLC (жидкостной хроматограф быстрого разрешения) (Amersham/Pharmacia) с использованием линейного градиента буфера B (100 мМ глицин, pH 3,0) от 0 до 100%, в течение 14 мин со скоростью 1 мл/мин. Полученные фракции объемом 1 мл сразу нейтрализуют путем добавления 75 мкл 1 M триса, pH 8. Элюируемый белок детектируют по поглощению при 280 нм, фракции пика объединяют и обессоливают в PBS на одноразовых колонках для гель-фильтрации PD10 с сефадексом G-25 (Amersham/Pharmacia). Белок детектируют по оптической плотности при 280 нм и фракции пика объединяют. Раствор антитела в PBS фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранят при 4°C. Концентрации полученных очищенных антител определяют с помощью аминокислотного анализа как среднее от двух отдельных измерений.
Мечение BCECF
6
6
В каждом из анализов, представленных в данном примере 3, клетки метят с помощью нижеследующего метода. Все клетки, используемые для анализа адгезии, метят 10 мкМ раствором ацетоксиметилового эфира 2',7'-бис-(2-карбоксилэтил)-5-(и-6)-карбоксифлюоресцеина (BCECF) в среде RPMI 1640, содержащей 10% FBS, в случае клеток RPMI8866 и клеток 38C13, трансфицированных субъединицей бета7 (клетки 38C13бета7), и в смеси F-12:DMEM (50:50), содержащей 10% FBS, в случае клеток 293, трансфицированных альфаЕбета7 (клетки альфаЕбета7-293). Клетки метят в течение 30 минут и промывают два раза средой для анализа. Плотность клеток доводят до 3×10 клеток на мл в случае клеток RPMI8866 и 38C13бета7 и до 2,2×10 клеток на мл в случае клеток альфаЕбета7-293.
Гуманизированные варианты Fib504 нарушают связывание альфа4бета7 с MAdCAM
Адгезия клеток RPMI8866/MAdCAM-1-Ig
50
50
50
90
90
50
Клетки RPMI8866 экспрессируют альфа4бета7 на поверхности (Roswell Park Memorial Institute, Buffalo, NY). Гуманизированные варианты Fib504 (варианты hu504) приводят в контакт со смесью клеток RMPI8866 и MAdCAM, гидридизованным с IgG, нанесенным на твердый носитель. Чтобы измерить концентрации гуманизированных вариантов Fib504, вызывающие 50% ингибирование (IC) связывания клеток RPMI8866 с MAdCAM-1, 96-луночные планшеты покрывают Nunc Maxisorp™, 2 мкг/мл в PBS, и 100 мкл/лунку MAdCAM-1-Ig (Genentech, Inc., Ig в гибриде с MAdCAM-1 означает участок Fc) в течение ночи при 4°C. Затем планшеты блокируют путем инкубации с 200 мкл/лунку раствора БСА, 5 мг/мл, в течение одного часа при комнатной температуре, после чего в каждую лунку добавляют 50 мкл растворов гуманизированных вариантов Fib504 в среде для анализа (среда RPMI 1640, Hyclone, Logan Utah, USA, содержащая 5 мг/мл БСА), 150000 BCECF-меченых клеток (BCECF, Molecular Probes, Eugene, OR) в 50 мкл среды для анализа и инкубируют в течение 15 минут при 37°C. Лунки промывают два раза 150 мкл среды для анализа, чтобы удалить несвязанные клетки. Связанные клетки солюбилизируют путем добавления 100 мкл 0,1% SDS в 50 мМ трис/HCl, pH 7,5. Количество флуоресцентной метки, высвобождаемой лизированными клетками, измеряют с помощью SPECTRAmax GEMINI™ (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) при длине волны возбуждения 485 нм и длине волны испускания 530 нм. Значения флуоресценции анализируют как функцию от концентрации гуманизированных вариантов Fib504, добавляемых в каждом анализе, с использованием четырехфакторного нелинейного приближения по методу наименьших квадратов и получают значения IC для каждого гуманизированного варианта Fib504, используемого в данном анализе. Значения IC и IC определяют с использованием четырехфакторного приближения. На фиг.14 приведен типичный график, полученный с использованием результатов анализа. Значения IC и IC для каждого тестируемого варианта приведены ниже в таблице 4.
Таблица 4Связывание антитела с человеческим MAdCAM-1
Анализируемое антитело:варианты Fib504 и hu504
IC<sub>50</sub> (нМ)эксп.1/эксп.2*
IC<sub>90</sub> (нМ)эксп.1/эксп.2*
Крысиное Fib504
0,098/0,197
0,483/0,703
Вариант hu504.5
0,067/0,248
0,361/0,880
Вариант hu504.16
0,0768/0,206
0,244/0,551
Вариант hu504.32
0,036/0,119
0,150/0,396
6B11(неблокирующий контроль)
>100
>100
* эксп.1/эксп.2 означает среднее значение от повторяющихся анализов.
Гуманизированный вариант Fib504 нарушает связывание альфа4бета7 с VCAM
Адгезия клеток RPMI8866/7dVCAM-1
50
Анализ RPMI8866/7dVCAM-1 проводят по способу, используемому для анализа RPMI8866/MAdCAM-1-Ig, за исключением того, что для покрытия планшетов используют 7dVCAM-1 (ADP5, R&D Systems, Minneapolis, MN) в концентрации 2 мкг/мл. Результаты анализируют, как описано выше для анализа связывания MAdCAM. Значения IC для каждого из тестируемых вариантов приведены ниже в таблице 5.
Таблица 5Связывание антитела с человеческим VCAM
Анализируемое антитело:варианты Fib504 и hu504
IC<sub>50</sub> (нМ)эксп.1/эксп.2*
IC<sub>90</sub> (нМ)эксп.1/эксп.2*
Крысиное Fib504
0,107/0,193
0,396/0,580
Вариант hu504.5
0,088/0,270
0,396/0,726
Вариант hu504.16
0,098/0,223
0,261/0,774
Вариант hu504.32
0,059/0,110
0,183/0,337
6B11(неблокирующий контроль)
>100
>100
* эксп.1/эксп.2 означает среднее значение от повторяющихся анализов.
Гуманизированный вариант Fib504 нарушает связывание альфаЕбета7 с человеческим E-кадгерином
Адгезия клеток
-293/huE-кадгерин
альфаЕбета7
Клетки 293 (Graham et al. (1977) supra) трансфицируют альфаЕ и бета7 (Genentech, Inc.). Анализ проводят по способу, используемому для анализа RPMI8866/MAdCAM-1-Ig, за исключением того, что для покрытия планшетов используют huE-кадгерин (648-EC, R&D Systems, Minneapolis, MN) в концентрации 2 мкг/мл. Затем планшеты блокируют путем инкубации с 5 мг/мл БСА, как указано выше, после чего в каждую лунку добавляют 50 мкл вариантов FIB504 в среде для анализа (F-12:DMEM (50:50), содержащая 5 мг/мл БСА), 110000 BCECF-меченых клеток в 50 мкл среды для анализа и инкубируют в течение 15 минут при 37°C. Лунки промывают два раза 150 мкл среды для анализа, измеряют количество флуоресцентной метки, высвобождаемой лизированными клетками, и результаты анализируют, как описано выше. Результаты анализа, полученные от трех экспериментов, приведены ниже в таблице 6.
Таблица 6Связывание антитела с человеческим E-кадгерином
Анализируемое антитело:варианты Fib504 и hu504
IC<sub>50</sub> (нМ)
IC<sub>90</sub> (нМ)
Крысиное Fib504
2,047/7,89/4,19
8,80/24,5/9,95
Вариант hu504.5
2,132/10,18/4,77
7,99/28,7/10,19
Вариант hu504.16
1,957/10,05/4,58
7,07/33,7/13,51
Вариант hu504.32
1,814/6,99/3,47
8,8/24,5/11,73
6B11(неблокирующий контроль)
>100/>100/>100
>100/>100/>100
Гуманизированный вариант Fib504 нарушает связывание бета7 с MAdCAM
Анализ клеточной адгезии 38C13бета7/muMAdCAM-1-Ig
50
90
Анализ 38C13бета7/muMAdCAM-1-Ig проводят по способу, используемому для анализа RPMI8866/MAdCAM-1-Ig, за исключением того, что для покрытия планшетов используют muMAdCAM-1-Ig (Genentech, Inc.) в концентрации 2 мкг/мл. Клетки мышиной лимфомы 38C13 альфа4+ (Crowe, D.T. et al., J. Biol. Chem. 269:14411-14418 (1994)) трансфицируют ДНК, кодирующей интегрин бета7, так, чтобы альфа4бета7 экспрессировался на поверхности клеток. Способность вариантов антитела нарушать взаимодействие альфа4бета7, ассоциированного с клеточной мембраной, с MAdCAM анализируют по описанному выше способу. Результаты анализов приведены в таблице 7 (показаны значения IC и IC, полученные от 2 экспериментов).
Таблица 7Активность вариантных антител hu504 в отношении клеток, экспрессирующих 38C13-бета7Связывание с мышиным MAdCAM
Анализируемое антитело:варианты Fib504 и hu504
IC<sub>50</sub> (нМ)
IC<sub>90</sub> (нМ)
Крысиное Fib504
0,682/0,306
2,869/1,51
Вариант hu504.5
0,8587/0,466
2,322/2,61
Вариант hu504.16
0,998/0,610
3,717/4,08
Вариант hu504.32
0,718/0,458
4,08/1,51
Гуманизированный вариант Fib504 нарушает связывание бета7 с мышиным VCAM
Анализ клеточной адгезии 38C13бета7/muVCAM-1-Ig
50
90
Анализ 38C13бета7/muVCAM-1-Ig проводят по способу, используемому ранее для анализа связывания мышиного MAdCAM-1-Ig с клетками RPMI8866, за исключением того, что для покрытия планшетов используют VCAM-1-Ig (Genentech, Inc.) в концентрации 2 мкг/мл. Результаты анализов приведены в таблице 8 (показаны значения IC и IC, полученные от 2 экспериментов).
Таблица 8Активность вариантных антител hu504 в отношении клеток, экспрессирующих 38C13-бета7Связывание с мышиным VCAM-1-Ig
Анализируемое антитело:варианты Fib504 и hu504
IC<sub>50</sub> (нМ)
IC<sub>90</sub> (нМ)
Крысиное Fib504
0,845/0,447
2,903/2,30
Вариант hu504.5
0,763/0,407
3,074/2,30
Вариант hu504.16
0,835/0,584
2,857/1,84
Вариант hu504.32
0,562/0,330
2,004/1,84
Результаты анализов связывания гуманизированного варианта Fib504 показывают, что гуманизированное антитело согласно изобретению связывается со своей мишенью - субъединицей интегрина бета7, а также с интегринами альфа4бета7 и альфаЕбета7, со сродством, которое приблизительно идентично сродству исходного крысиного антитела, а в некоторых воплощениях превышает его. Таким образом, гуманизированное антитело против бета7 согласно данному изобретению можно использовать в способах лечения, направленных против интегрина бета7, особенно для лечения человека.
Сравнительная активность вариантов hu504.32 согласно изобретению
Способность разных аминокислотных вариантов антитела hu504.32 ингибировать связывание бета7-содержащего рецептора с его лигандом тестируют путем анализа адгезии человеческих и мышиных клеток с помощью способов, описанных в данном документе для анализа клеточной адгезии. Анализ RPMI8866/MAdCAM-1-Fc проводят по описанному выше способу. Для анализа альфаЕбета7-293/huE-кадгерина используют модифицированный способ с применением человеческого E-кадгерина-Fc в качестве лиганда (человеческий E-кадгерин-Fc, 648-EC, R&D Systems, Minneapolis, MN). Также анализируют сравнительную способность вариантов hu504.32 ингибировать взаимодействие человеческого фибронектина (huFN40) с человеческим рецептором альфа4бета7 на клетках PRMI8866. Анализ RPMI8866/hu фибронектина (huFN40) в данном исследовании проводят по способу, используемому для анализа RPMI8866/MAdCAM-1-Ig, раскрытому в данном описании, за исключением того, что для покрытия планшетов используют фрагмент человеческого фибронектина альфа размером 40 кДа, полученный в результате обработки химотрипсином (F1903, Chemicon International, Temecula, CA), в концентрации 2 мкг/мл.
Анализируют способность вариантов hu504.32 ингибировать взаимодействие мышиных бета7-содержащих рецепторов с мышиным MAdCAM-1 или мышиным VCAM-1. Варианты hu504.32 ингибируют взаимодействие гибридов мышиный MAdCAM-1-Fc и мышиный VCAM-1-Fc с клетками мышиной лимфомы альфа4+, экспрессирующими мышиную субъединицу бета7 (клетки 38C13бета7). Анализы клеточной адгезии с использованием мышиных MAdCAM-1-Fc и VCAM-1-Fc проводят по способу, описанному выше для человеческих MAdCAM и VCAM. Если лиганды гибридизуют с Fc-участками, рецепторы Fc на клетках блокируют с помощью 0,5 мкг антитела против CD16/32 (антитело против рецептора Fcγ III/II, № по каталогу 553142, BD Biosciences, San Jose, CA) на миллион клеток в течение 5 минут при комнатной температуре. В каждую лунку добавляют 150000 меченых клеток в 50 мкл среды для анализа и инкубируют в течение 13 минут при 37°C. Лунки промывают и с помощью описанного выше способа измеряют количество флуоресцентной метки, высвобождаемой из лизированных клеток. При анализе адгезии человеческих клеток в качестве контрольного антитела используют мышиное моноклональное антитело против человеческого сывороточного альбумина, 6B11 (№ по каталогу ab 10244, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA). При анализе адгезии мышиных клеток в качестве контрольного антитела используют крысиное антитело против мышиного интегрина бета7, M293 (BD Biosciences, San Jose, CA), которое не конкурирует с лигандом или с Fib504 за связывание с интегрином бета7.
Результаты анализов адгезии человеческих и мышиных клеток с тройными повторами представлены в таблицах 9 и 10, соответственно.
Таблица 9Активность вариантных антител hu504.32 в анализе адгезии человеческих клеток
Вариант антитела
IC50Средн. значение <u>+</u> SD
RPMI8866/huMAdCAM-1-Fc
RPMI8866/hu7dVCAM-1
αEβ7-293/huE-кадгерин-Fc
RPMI8866/huFN40
hu504.32
0,088±0,035
0,101±0,021
3,970±1,664
0,100±0,046
hu504.32M94Q
0,090±0,045
0,111±0,035
4,130±1,212
0,124±0,056
hu504.32M94R
0,075±0,034
0,089±0,009
3,963±1,776
0,119±0,056
Контроль (6В11)
>100
>100
>100
>100
Таблица 10Активность вариантных антител hu504.32 в анализе адгезии мышиных клеток
Вариант антитела
IC50Средн. Значение <u>+</u> SD
38C13бета7/muMAdCAM-1-Fc
38C13бета7/mu7dVCAM-1-Fc
hu504.32
0,270±0,041
0,228±0,065
hu504.32M94Q
0,370±0,102
0,264±0,083
hu504.32M94R
0,391±0,112
0,228±0,081
Контроль (M293)
>100
>100
Антитело hu504.32 содержит метионин в положении 94 тяжелой цепи CDR3. Варианты M94Q (или hu504.32Q) и M94R (или hu504.32R) содержат глутамин или аргинин, соответственно, в положении 94 варианта антитела hu504.32. Антитела hu504.32M, Q и R значительно уменьшают взаимодействие рецептора интегрина бета7 с лигандом во всех анализах и, следовательно, являются мощными ингибиторами бета7-опосредованной клеточной адгезии.
Активность антитела hu504.32R in vivo
+
+
5
+
Анализируют способность варианта антитела hu504.32R уменьшать взаимодействие рецептора интегрина бета7 с лигандом in vivo и снижать рекрутинг лимфоцитов в воспаленную толстую кишку in vivo у мышиной модели воспалительного заболевания кишечника. Мышей BALB/c и мышей CB 17 SCID получают от Charles River Laboratories International, Inc. (Wilmington, MA, USA). Мышей с колитом SCID, содержащих Т-клетки, обогащенные CD4CD45Rb, получают путем выделения Т-клеток, обогащенных CD4CD45Rb, из донорных мышей BALB/c с последующим внутривенным введением 3×10 клеток в 100 мкл PBS. Контрольные мыши SCID не получают Т-клеток, обогащенных CD4CD45Rb. Считают, что у CD4+-преобразованных мышей, удовлетворяющих критериям набора в экспериментальную группу, то есть имеющих потерю массы 10% по сравнению с исходным уровнем или 15% по сравнению с максимальным уровнем на 4 неделе, индуцируется воспалительное заболевание кишечника, таких мышей отбирают для обработки.
51
51
6
51
В день обработки тестируемыми антителами собирают клетки мезентериального лимфатического узла (MLN) мышей BALB/c и метят радиоактивным изотопом Cr. Обработка включает в себя предварительное внутривенное введение антитела против GP120, антитела против бета7 hu504.32, антитела против бета7 hu504.32R, не содержащего антитела (контроль), 200 мкг/100 мкл PBS. Через тридцать минут после введения антитела вводят Cr-меченые клетки MLN, 4×10 клеток/100 мкл. Через один час после введения меченых клеток мышей подвергают эйтаназии, собирают селезенку, толстую кишку и пейеровы бляшки, взвешивают их и определяют суммарное количество Cr в каждом органе. На фиг.16 приведена гистограмма результатов анализов, демонстрирующая относительную способность антитела блокировать хоминг меченных радиоактивным изотопом T-клеток в толстую кишку мышей, страдающих от воспалительного заболевания кишечника. Антитела против бета7 hu504.32 и hu504.32R ингибируют хоминг T-клеток в воспаленную толстую кишку по сравнению с отрицательным контролем, антителом против GP120. Все антитела имеют одинаковое распределение в селезенке. Таким образом, антитела против бета7 hu504.32 и hu504.32R эффективно ингибируют хоминг T-клеток в воспаленную толстую кишку in vivo.
Гликирование антитела не влияет на способность варианта hu504.32R блокировать связывание MAdCAM-1 с рецептором альфа4бета7.
Гликирование, неферментативное гликозилирование белков, может оказывать влияние на взаимодействие антитела с лигандом (см., например, Kennedy, D.M. et al., Clin Exp Immunol. 98(2):245-51 (1994)).
Гликирование лизина в положении 49 504.32R
Гликирование лизина в положении 49 легкой цепи варианта hu504.32R (относительное положение B1 HVR-L2) наблюдается, но не оказывает значительного влияния на способность варианта антитела блокировать связывание MAdCAM-1 с клетками RPMI8866, экспрессирующими рецептор альфа4бета7. Гликирование и его уровень определяют методами стандартной масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (ESI-MS) и боронатной аффинной хроматографии. Описание метода боронатной аффинной ВЭЖХ, использумого для анализа гликирования, можно найти, например, в Quan CP.et al., Analytical Chemistry 71(20): 4445-4454 (1999) и в Li Y.C. et al., J. Chromatography A, 909: 137-145 (2001). Анализ клеточной адгезии проводят по способу, раскрытому в данном описании для анализа клеточной адгезии RPMI8866/MAdCAM-1-Fc. В альтернативных воплощениях согласно изобретению гликирование в положении 49 снижается или не происходит, если в положении 49 находится аминокислота, отличная от лизина. Данное изобретение охватывает полипептиды или антитела, содержащие в положении 49 (относительное положение B1 HVR-L2) любую из аминокислот A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y, где каждая буква означает аминокислоту в соответствии со стандартной однобуквенной системой обозначения аминокислот. Альтернативно, аминокислота в положении 49 легкой цепи варианта 504.32R (или другого варианта 504) может быть выбрана из группы, состоящей из R, N, V, A, F, Q, H, P, I или L. Аминокислоту в положении 49 выбирают, например, путем дисплея (получения фаговой библиотеки) Fab hu504.32R на фаге (варианте) и отдельно путем замены кодонов, кодирующих все 20 природных аминокислот, в участке, кодирующем положение 49. Экспрессируемые фагом варианты hu504.32R, измененные по положению 49, тестируют на связывание с интегрином бета7 и/или с рецептором, содержащим интегрин бета7, таким как рецепторы альфа4бета7 или альфаЕбета7. Варианты, которые связываются с интегрином бета7 или рецепторами альфа4бета7 или альфаЕбета7, подвергают дальнейшему скринингу на способность ингибировать связывание рецептора интегрина бета7 с лигандом и на эффективность in vivo, как описано в данном документе. С помощью стандартных методов мутагенеза в положении 49 можно осуществить замену на альтернативную природную или неприродную аминокислоту и затем провести тестирование полученных антител путем анализа клеточной адгезии и анализов in vivo, описанных в данном документе. Альтернативно, аминокислота в положении 49 легкой цепи представляет собой аминокислоту, отличную от лизина (K), а аминокислоты в любом другом положении (или в любых других положениях) HVR или каркасного участка легкой цепи и/или тяжелой цепи подвергают заменам и затем проводят селекцию варианта бета7-связывающего полипептида или антитела, обладающего сродством связывания, биологической активностью in vitro и in vivo, фармакокинетикой, характеристиками выведения лекарственного средства и иммуногенностью, позволяющими уменьшить воспаление путем снижения биологической активности интегрина бета7. Мутагенез и селекцию такого варианта полипептида или антитела проводят с помощью способов, раскрытых в данном описании, и в соответствии с другими стандартными методами. Такой вариант бета7-связывающего полипептида или антитела обладает сродством к интегрину бета7, которое в 10000 раз, в 1000 раз, альтернативно в 100 раз, альтернативно в 10 раз, альтернативно в 5 раз, альтернативно в 2 раза превышает сродство связывания раскрытых в данном описании гуманизированных вариантов Fib504.
С помощью приведенного выше описания специалист в данной области может осуществить настоящее изобретение. Объем настоящего изобретения не ограничивается данным описанием, поскольку описанные воплощения предназначаются только для иллюстрации некоторых аспектов согласно изобретению и любые функционально-эквивалентные воплощения входят в объем согласно изобретению. Изложенный в данном документе материал исключает допущение, что приведенное описание недостаточно для реализации какого-либо аспекта согласно изобретению, включая наилучший способ его осуществления, кроме того, данное описание не следует понимать как ограничение объема формулы изобретения приведенными конкретными примерами. Фактически на основе приведенного выше описания специалисты в данной области могут осуществить, помимо показанных и описанных в данном документе, разные другие модификации согласно изобретению, которые также входят в объем прилагающейся формулы изобретения.