Активность над(ф)-зависимыхдегидрогеназ, рибосомальных белков и развитие микроциркуляторного русла в гладкомышечных опухолях матки: клинико-морфологические параллели и дифференциальная диагностика

активность над(Ф)-зависимых дегидрогеназ, рибосомальных белков и развитие микроциркуляторного русла в гладкомышечных опухолях матки: клинико-морфологические параллели и дифференциальная диагностика

А.Ф. Лазарев1, А.М. Авдалян1, И.п. Бобров1, т.Б. Климачева2, Е.в. Мищенко2

Алтайский филиал РОНц им. Н.Н. Блохина, г. Барнаул1, кафедра патологической анатомии АГМУ, г. барнаул2

Проведено гистохимическое изучение на замороженных срезах рибосомальных белков в доброкачественных и злокачественных гладкомышечных опухолях матки, методом Гомори на щелочную фосфатазу (ЩФ) определяли особенности состояния микроциркуляторного русла. Парафиновые срезы опухолей окрашивали AgNO3 по методу Y Daskal et al. (1980) и высчитывали среднее количество гранул серебра на 1 ядро миоцита. Общая метаболическая активность атипических гладкомышечных клеток сарком по содержанию НАДН2 диафоразы была выше относительно клеточных лейомиом - 81,9 ± 9,5 и 32,8 ± 3,8 соответственно. Процессы аэробного дыхания клеток по данным содержания СДГ и напряженность процессов анаэробного гликолиза в лейомиосаркоме были выше, чем в лейомиомах, - 49,9 ± 2,6 и 11,9 ± 4,5; 24,7 ± 10,3 и 15,1 ± 3,4 соответственно. Клеточные лейомиомы характеризовались интенсивным окрашиванием сосудов на щелочную фосфатазу и наличием множества истинных сосудисто-капиллярных петель, отмечалось наличие незавершенности строения некоторых петель и множество растущих новообразованных капилляров. В лейомиосаркомах нарастала интенсивность реакции на ЩФ с увеличением числа растущих капилляров. Капиллярный рисунок приобретал вид кружев. Соотношение сосудов к общему объему опухоли составило в клеточных лейомиомах 10,13 ± 1,54 %, в саркомах - 17,2 ± 2,7 %. Экспрессия рибосомальных белков по данным содержания Ag-NOR возрастала в цепочке фибромиома - простая лейомиома - клеточная лейомиома -лейомиосаркома. В клеточной лейомиоме, в высокодифференцированной и низкодифференцированной лейомиосаркоме количество гранул серебра на 1 ядро составило 6,01 ± 0,22; 12,11 ± 0,46, 18,8 ± 1,06 соответственно (р<0,05).

Ключевые слова: НАД(Ф)-зависимые диафоразы, ядрышковые организаторы, микроциркуляторное русло, лейомиома и лейомиосаркома тела матки.

ACTIVITY OF NAD (PHOSPHORUS)-DEPENDENT DEHYDROGENASES, RIBOSOMAL PROTEINS AND MICROCIRCULATION DEVELOPMENT IN SMOOTH MUSCLE TUMORS OF THE UTURUS: CLINICAL-MORPHOLOGICAL PARAMETERS AND DIFFERENTIATED DIAGNOSIS A.F. Lazarev1, A.M. Avdalyan1, I.P. Bobrov1, T.B. Klimacheva2, E.V Mischenko2 Altai Branch of the N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Barnaul1,

Pathological Anatomy Department of Altai State Medical University, Barnaul2

Histochemical study of ribosomal proteins in benign and malignant smooth-muscle tumors of the uterus was carried out. Characteristics of microcirculatory channel were defined by the Gomory method. Paraffin sections of tumors were stained with AgNO3 according to Y. Daskal et al (1980) method, and the average number of silver granules per 1 myocyte nucleus was calculated. Total metabolic activity of sarcoma atypical smooth-muscle cells with respect to the NADH2-diaphrase level was higher against cellular leiomyomas: 81.9 ± 9.5 and 32 ± 3.8, respectively. Processes of aerobic respiration by the content of SDG and intensity of anaerobic glycosis processes were significantly higher in leiomyosarcomas than in leiomyomas (49.9 ± 2.6 and 11.9 ± 4.5; 24.7 ± 10.3 and 15.1 ± 3.4, respectively). Cellular leiomyomas were characterized by intensive staining of vessels on alkaline phosphatase and the presence of multiple capillary vascular loops. There was also noted the presence of incompleteness of structure of some loops and a great deal of growing new cappilaries. For leiomyosarcomas, intensity of reaction to AP increased with increasing the number of growing capillaries. Capillary pattern got the form of laces. Percentage ratio of vessels to the total size of the tumor was 10.13 ± 1.54 % in cellular leiomyomas and 17.2 ± 2.7 % in sarcomas. Expression of ribosomal proteins according to the Ag-NOR level increased in the chain «fibrimyoma-simple leiomyoma-cellular leiomyoma-leiomyosarcoma». The quantity of silver grounds per 1 nucleus was 6.01 ± 0.22 in cellular leiomyoma, 12.11 ± 0.46 in high-grade leiomyosarcoma and 18.8 ± 1.06 in low-grade leiomyosarcoma (p<0.05).

Key words: NAD(PH)dependent dehydrogenases, nucleoar organizer, microcirculation, leiomyoma, uterine body .

Методы молекулярной биологии и меди- исследование особенностей метаболических цины все шире внедряются в клиническую процессов опухоли по данным содержания практику. Одними из таких методов являются НАД-Н2-диафоразы, сукцинатдегидрогеназы

(СДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и экспрессии рибосомальных белков. Практически все метаморфозы в гомеостазе опухолевой клетки сопровождаются изменением в метаболическом профиле, эти изменения давно привлекают внимание исследователей [6]. В то же время работы, в которых проводилась оценка взаимосвязей активности энзимов с клиникоморфологическими параметрами опухоли, немногочисленны [3]. Данных по характеристике метаболического профиля и его взаимосвязи с такими параметрами, как уровень кровоснабжения опухоли, размер опухолевого узла, гистологическое строение гладкомышечной (ГМК) опухоли тела матки, в доступной нам литературе не обнаружено.

Биотестирование функциональной активности рибосомальных белков клеток различных тканей является общепризнанной практикой. Во многом этому способствовала их отличительная способность выявляться методом серебрения ядрышек. Основными аргирофильными белками ядрышка (Ag-ОЯОР-белки), регулирующими активность рибосомальных белков, являются С23/нуклеолин и В23/нуклеофозмин [12, 13]. Экспрессия Ag-ОЯОР-белков зависит от фазы клеточного цикла, причем в Gg-периоде активность их экспрессии минимальна, а в S-фазе и G2-периоде наиболее высока, и степень этой активности зависит прежде всего от темпа роста и степени злокачественности опухоли. Поэтому исследование активности Ag-ОЯОР-белков позволяет не только выявить фракцию пролиферирующих клеток, но и оценить скорость их пролиферации [2, 5]. В то же время закономерности функционирования данных генов в гормонозависимых органах выяснены недостаточно, это же можно сказать и в отношении опухолей матки [9, 11].

Ангиогенез - это процесс формирования новых капиллярных отростков от уже существующих кровеносных сосудов, имеющих фундаментальное значение для роста и распространения опухолей. До недавнего времени основными характеристиками активности ангиогенеза при лейомиомах матки являлись суправитальное и витальное исследования капиллярной сети, ультраструктурные методы [8] и методы с применением цветового допплеров-

ского картирования скоростей кровотока [7]. В то же время показателем активности ангиогенеза ткани может быть активность Ag-ОЯОР-белков эндотелия [1]. Работ, где бы исследовалась активность Ag-ОЯОР-белков эндотелия сосудов при лейомиомах матки, нами не обнаружено. Исходя из этого, целью данной работы стало определение морфофункциональной активности по данным содержания НAД(Ф)-зависимых ферментов и Ag-ОЯОР-белков в зависимости от ангиогенеза в доброкачественных и злокачественных гладкомышечных опухолях тела матки.

Материал и методы

Исследовано 42 матки, удаленные по поводу лейомиомы. Средний возраст больных составил 47,7 ± 6,1 года. Множественная лейомиома встретилась в 79,1 %. Для исследования в таких случаях забирали самую большую и самую меньшую по размеру опухоль, всего было исследовано 84 опухоли. Гистологически выделяли простую лейомиому (фиброид -в зарубежной классификации) - 25 опухолей, простую с участками клеточной - 15 узлов, и клеточную с митотической активностью различной степени - 20 опухолей. Кроме того, в исследование вошли 5 случаев лейомиосарком тела матки (4 высокодифференцированных и 1 низкодифференцированная), а также 5 маток без патологии, удаленных по поводу выпадения матки у женщин постменопаузального возраста (не менее 20 лет менопаузы).

Материал для гистологического исследования фиксировали в 10 % нейтральном формалине. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином и пикрофуксином по Ван-Гизону. Для исследования на НAД(Ф)-зависимые дегидрогеназы на замораживающем микротоме готовили срезы толщиной 10-15 мкм. Свежезамороженные нефиксированные срезы собирали в раствор 0,85 % сахарозы, затем наклеивали на чистое. предварительно обработанное в хромпике предметное стекло, просушивали при комнатной температуре и инкубировали в субстрате соответствующего фермента: НAДН2-диафораза (IUBMB 1.6.99.1), сукцинатдегирогеназа СДГ (IUBMB 1.3.99.1) и лактатдегидрогеназа ЛДГ (IUBMB 1.1.1.27). Ядра докрашивали 0,1 %

водным раствором нильского голубого. Act™-ность ферментов в гладкомышечных клетках оценивали количественным методом Р.П. Нар-циссова, основанным на подсчете образованных в клетке видимых гранул формазана, при использовании n-нитротетразолия фиолетового [4]. Для изучения Ag-ОЯОР-белков срезы окрашивали AgNO3 по двухступенчатому методу Y. Daskal и высчитывали среднее гранул серебра на 1 ядро миоцита и эндотелиоцита в не менее чем 120 ГМК [10]. Микроциркуляторное русло исследовали на свежезамороженных нефиксированных срезах опухоли толщиной 30-40 мкм, окрашенных на щелочную фосфатазу по Го-мори ЩФ (IUBMB 3.1.3.1). Для этого высчитывали процентное соотношение сосудистого компонента на фотографиях, отснятых при увеличении х100. На фотографиях в программе Photoshop 6.0 предварительно максимально контрастировали сосуды, при необходимости их докрашивали в черный цвет, а паренхиму окрашивали в желтый цвет и затем в программе Image Tool 3.0 в полутоновом градиенте высчитывали процентное содержание черного цвета. Статистическую обработку проводили при помощи программы Statistica 6.0.

Результаты и обсуждение

В проведенном исследовании показано, что уровень метаболической активности в лейо-миомах независимо от гистологического типа был стабильно выше по отношению к неизменен ному миометрию по уровню экспрессии диафоразы с тенденцией к увеличению в лейомиосаркоме (табл. 1).

Aэробный путь метаболизма по данным содержания СДГ был самым низким в лейо-миомах с высокой степенью гиалиноза. По мере увеличения клеточности происходил и рост

активности СДГ в митохондриях. Наивысшую активность фермента цикла Кребса выявляли в лейомиосаркомах (в среднем 47,4 ± 8,9), причем на отдельных участках в низкодифференцированной лейомиосаркоме, находящихся перива-скулярно, абсолютное число гранул превышало 100. Активность ЛДГ, характеризующей темпы анаэробного гликолиза, в прилежащем миоме-трии была стабильно высокой. Самое низкое содержание фермента выявлялось в клеточной лейомиоме, а по мере уменьшения клеточно-сти и усиления гиалиноза стромы активность анаэробного гликолиза возрастала, относительно высокие показатели ЛДГ отмечались в фиброиде. В целом активность ферментов была наиболее высока в саркомах, причем наиболее достоверные отличия были обнаружены по содержанию СДГ.

При окраске нитратом серебра Аg-ОЯОР-белки определяли в виде четко видимых округлых гранул черного цвета, располагающихся внутри ядрышек гладкомышечных клеток. Количество гранул на 1 ядро миоцита неизмененного миометрия составило 3,85 ± 0,1, гранулы располагались преимущественно на периферии ядра, гранулы группировались в центре ядра. В фибромиомах, выявленных в менопазу, количество гранул было наиболее низким и составило 1,5 ± 0,3. В клеточных лейомиомах отмечали экспрессию белков с увеличением гранул серебра до 6,2 ± 0,2. Гиперэкспрессию рибосомальных белков отмечали в атипических ГМК лейомиосарком, причем по мере снижения степени дифференцировки количество гранул возрастало от 12,1 ± 0,5 при высокодифференцированных лейомиосаркомах до 27,5 ± 2,5 при низкодифференцированных саркомах. Вместе с количественными изменениями происходили и качественные реаранжировки Аg-ОЯОР-белков:

Таблица 1

Активность нАд(Ф)-зависимых дегидрогеназ и активность рибосомальных белков в гМК неизмененного миометрия и при гладкомышечных опухолях

Маркер Миомет- рий Фиброид Фиброид с участками клеточности Клеточная лейомиома Саркома

^.цт 22,8 і 1,5 36,2 і 8,1* 44,5 і 4,7 49,1 і 4,6 67,9 і 6,3*

ЛДГ 14,1 і 2,2 20,7 і 7,2* 8,1 і 3,8* 9,9 і 1,5* 37,4 і 9,5*

СДГ 18,7 і 1,2 12,1 і 2,1 15 і 2,2 17,6 і 3,3 49,9 і 3,7

Ag-ОЯОP-белки 3,85 і 0,1 1,5 і 0,03* 4,32 і 0,1 6,2 і 0,2* 12,1 і 0,5*

Примечание: * - различия статистически достоверны по сравнению с неизмененным миометрием (р<0,05).

А.ф. ЛАЗАРЕВ, А.М. АВДАЛЯН, И.П. БОБРОВ, Т.Б. КЛИМАЧЕВА, Е.В. МИЩЕНКО

44 --------------------------------------------------------------------------------

Таблица 2

зависимость метаболизма гМК от состояния ядрышковых о рганизаторов

Ag-ОЯОP-белки НAД-Н2 ЛДГ СДГ

1-3 гранулы 34,7 і 5,1* 10,3 і 2,3 10,9 і 3,2

4-6 гранул 45,4 і 11,3* 12,9 і 2,3 15,1 і 1,4

Более 6 гранул 48,8 і 10,2 6,5 і 1,8* 28,3 і 5,5

Примечание: * - различия между группами статистически значимы (р<0,05).

в саркомах они находились в центре ядра, а в миомах - преимущественно по периферии.

Пролиферативная активность, сопряженная со степенью экспрессии рибосомальных белков, также влияла на степень аэробного метаболизма: наиболее высокая степень активности окислительного фосфорилирования отмечалась при содержании более чем 6 гранул серебра на 1 ядро в ГМК лейомиомы (табл. 2). По мере снижения активности рибосомальных белков окислительный путь обмена был выражен в меньшей степени и снижался более чем на 50 %.

При высокой активности данных генов в противоположность усилению аэробного пути обмена происходило достоверное снижение анаэробного гликолиза, сопровождающееся уменьшением содержания ЛДГ.

При исследовании микроциркуляторно-го русла (МЦР) в лейомиомах с различным гистологическим строением были отмечены следующие особенности. Для фибромиом с выраженным склерозом были характерны лишь обрывки сосудов, замурованных среди фиброзной ткани, и слабая реакция эндотелия на щелочную фосфатазу. В простых лейомиомах развитие МЦР имело более выраженный характер, преобладали прекапиллярный и посткапиллярный компоненты и анастомозы между ними, истинные капиллярные петли встречались реже. Клеточные лейомиомы и саркомы характеризовались интенсивным окрашиванием эндотелия сосудов на щелочную фосфатазу и наличием множества истинных сосудисто-капиллярных петель, также отмечалась незавершенность строения некоторых петель и большое количество растущих новообразованных капилляров.

При исследовании сосудисто-паренхиматозных взаимоотношений обнаружено, что процентное соотношение сосудов от паренхимы также зависело от гистологического типа опухоли (табл. 3). Наименьшее количество сосудов обнаруживалось в фибромиомах в менопаузе - 2,29 ± 1,13 %,

наибольшее - до 14,5 ± 1,7 % - в саркомах. Количество гранул серебра на 1 ядро ГМК коррелировало с процентным содержанием сосудов в опухоли (г=0,68; р=0,0001). Содержание Ag-ОЯОР-белков в эндотелии сосудов также зависело от гистологического строения опухоли (табл. 3). Между числом гранул серебра на 1 ядро эндотелиоцита в сосудах МЦР и количеством гранул серебра на 1 ядро ГМК также была обнаружена высокая положительная корреляция (г=0,78; р=0,0001).

Таким образом, исследование метаболической активности показало, что лейомиома обладает более выраженной степенью энергетического обмена по отношению к прилежащему миометрию. По мере уменьшения клеточности опухоли и усиления фиброза отмечается заметное снижение уровня аэробного метаболизма и усиление процессов гликолиза, которое сопровождается увеличением активности ЛДГ, хотя общий уровень обмена остается значительным. Наиболее высокие показатели напряженности метаболизма ГМК наблюдали в лейомиосар-комах, причем высокая достоверность была обнаружена при анализе активности СДГ.

Уровень пролиферативной активности опухоли был взаимосвязан с экспрессией рибосо-мальных белков, которая была наиболее высока в небольших (до 2 см) клеточных лейомиомах либо фиброидах с участками клеточности. Высокий уровень экспрессии анализируемых белков был сопряжен с резким увеличением активности дегидрогеназ цикла Кребса и снижением фракций ЛДГ. Это может объясняться тем, что наиболее энергозатратный процесс в клетке - пролиферация. Поскольку экспрессия рибосомальных белков предшествует митозу, то закономерным является и повышение энзимов цикла Кребса. Интересно отметить, что в некоторых работах [10] была найдена взаимосвязь между повышением СДГ в клетках во время G1-периода клеточного цикла и последующим затем апоптозом, это говорит о том, что про-

Таблица 3

Соотношение содержания сосудов и количество Ад-ОЯОР-белков в эндотелии сосудов в гладкомышечных опухолях матки

Маркер Фиброид Простая лейомиома Клеточная лейомиома Саркома

Доля содержания тосудов 2,8 і 0,5 % 8,1 і 1,9 % 10,1 і 1,5 % 14,5 і 1,7 %

Ag-ОЯОP-белки эндотелия 2,1 і 0,2 3,7 і 0,4 4,1 і 0,4 6,0 і 0,5

цессы энергетического метаболизма важны и в процессе запрограммированной гибели клетки, тем более что в опухолевой ткани пролиферация и апоптоз взаимосвязаны.

Исследование сосудисто-паренхиматозных взаимоотношений с применением окраски на щелочную фосфатазу и серебрения Аg-ОЯОР-белков эндотелия сосудов показало ведущую роль развития МЦР в активации работы ри-босомальных белков и НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ гладкомышечной клетки при лейомиоме матки.

Таким образом, можно говорить, что изученные морфологические характеристики энергетического и белкового обмена веществ ГМК были взаимосвязаны с ангиогенезом. Данные параметры метаболизма ГМК могут лежать в основе пато- и морфогенеза лейомиомы матки и определять клинико-морфологические особенности опухоли, а также могут быть взаимосвязаны с канцерогенезом. Полученные данные могут быть использованы при дифференциальной диагностике доброкачественных и злокачественных ГМ опухолей тела матки во время проведения срочных морфологических исследований операционного материала, а также в перспективе консервативного лечения с

соответствующей коррекцией метаболического профиля и ингибированием ангиогенеза в комплексной терапии у больных лейомиомой.

ЛИТЕРAТУРA

1. Арселадзе Ю.Р. // Морфология. 2001. № 6. С. 27-29.

2. ЛазаревА.Ф., КлимачевВ.В., БобровИ.П., ЛубенниковВ.А. // Aрхив патологии. 2002. № 6. С. 30-33.

3. ЛазаревА.Ф., КлимачевВ.В.,АвдалянАМ. и др. // Вопросы онкологии. 2007. Т. 53, № 1. С. 17-20.

4. Нарциссов Р.П. // Aрхив анатомии гистологии и эмбриологии. 1969. № 5. С. 85-91.

5. Райхлин Н.Т., Букаева И.А., Пробатова Н.А., Смирнова Е.А. // Aрхив патологии. 2006. № 3. С. 47-51.

6. Райхлин Н.Т. Гистохимические методы в диагностике опухолей. М.: Медицина, 1968. 230 с.

7. Сидорова И.С. Миома матки (Современные проблемы этиологии, патогенеза, диагностики и лечения). М.: Миа, 2003. 256 с.

8. Скопичев В.Г., Савицкий Г.А. // Aкушерство и гинекология. 1992. № 2. С. 27-30.

9. BoquistL.L. // Virchows Arch. Pathol. Anat. Histopathol. 1992. Vol. 420, № 4. P. 353-358.

10. Daskal Y., Smetana K., Such H. // Exp. Cell Res. 1980. Vol. 127. P 285-291.

11. Madee P., Madej J. A., Plewka A. et al. // Pathol. Res. Pract. 2005. Vol. 201. P 587-592.

12. Sirri V, Roussel P., Gendrone M., Hernandez-Verdun D. // Cytometry. 1997. Vol. 28. P. 147-156.

13. Sirri V, Roussel P., Hernandez-Verdun D.T. // Micron. 2000. Vol. 31. P. 121-126.

Поступила 25.06.07