СПОСОБ ДИАГНОСТИРОВАНИЯ НАРУШЕНИЯ РЕЦЕПТИВНОСТИ ЭНДОМЕТРИЯ У ПАЦИЕНТОК С МИОМОЙ МАТКИ И БЕСПЛОДИЕМ
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR DISTURBED ENDOMETRIAL RECEPTIVITY IN PATIENTS SUFFERING UTERINE MYOMA AND INFERTILITY

Список сокращений:
ЛММ - лейомиома матки
LIF - лейкемия-ингибирующий фактор
PR - прогестероновые рецепторы
ER - эстрогеновые рецепторы
ИГХ - иммуногистохимия.
Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и предназначено для диагностирования нарушения репродуктивной функции у пациенток с ЛММ.
Бесплодием страдают 55,3% женщин с миомой матки, причем на долю первичного бесплодия приходится 23,3%, вторичного 32% [1]. Согласно популяционным наблюдениям, среди женщин с первичным бесплодием ЛММ выявляют у каждой третьей, а каждая пятая женщина с ЛММ страдает бесплодием [2].
По данным литературы у страдающих бесплодием в 12-20% случаев миома матки является единственной причиной репродуктивных неудач [3].
На данный момент не существует единого мнения о влиянии миомы матки на репродуктивную функцию, малочисленны исследования, посвященные механизмам нарушения фертильности при миоме матки. Роль миомы матки в развитии бесплодия до сих пор не определена, так как известны многочисленные случаи беременности с благополучным исходом при множественной миоме матки, даже больших размеров.
Существенное значение в процессе имплантации играет то, что состояние монотонно возрастает, начиная с середины поздней секреторной фазы. LIF локализован в железистом эпителии [11]. Было показано, что экспрессия LIF достигает максимального значения в период окна имплантации [12], что позволяет отнести этот фактор к биохимическому маркеру рецептивности эндометрия [13]. Некоторые исследователи отмечают, что в эндометрии женщин с бесплодием снижена экспрессия LIF, а также было показано, что при бесплодии неясного генеза значительно снижается экспрессия LIF в среднюю секреторную фазу эндометрия [14].
Задача изобретения - повысить эффективность прогнозирования бесплодия, связанного с ЛММ, на основании определения рецептивности эндометрия в период окна имплантации посредством иммуногистохимического исследования биоптата эндометрия на 21-24 день менструального цикла (в «окно имплантации»), оценить морфологические и иммуногистохимические характеристики эндометрия: количество пиноподий, уровень соотношения экспрессии прогестероновых и эстрогеновых рецепторов в строме эндометрия, а также уровень экспрессии LIF для диагностирования нарушения фертильности, связанном с миомой матки.
Поставленная задача решается тем, что на основании определения уровня экспрессии PR и ER, а также их соотношения, определения уровня экспрессии LIF в эндометрии в период окна имплантации возможно прогнозирование нарушения фертильности, связанное с нарушением рецептивности у пациенток с миомой матки, и решения дальнейшей тактики ведения больных.
Определение рецептивности эндометрия необходимо проводить у пациенток:
1. Планирующих беременность, не предъявляющих жалобы на боли, обильные менструации, кровотечения, дизурию, запоры, имеющих миому матки, не деформирующую полость.
2. Предъявляющих жалобы на бесплодие (при неуточненной форме бесплодия - N97.9 по МКБ 10), имеющих миому матки до 5 см в диаметре, не деформирующую полость.
Практически способ осуществляется следующим образом:
Проводится оценка рецептивности эндометрия, включающая морфологическое и иммуногистохимическое исследование эндометрия на 21-24 день менструального цикла (в «окно имплантации»), оцениваются морфологические и иммуногистохимические характеристики эндометрия: при количестве пиноподий менее 35%, уровне соотношения экспрессии прогестероновых и эстрогеновых рецепторов в строме эндометрия менее 3,5, а также уровне экспрессии LIF менее 2 баллов диагностируют нарушение фертильности, связанное с миомой матки.
Материалом для проведения исследования является эндометрий. Взятие эндометрия для исследования производится путем кюретажа слизистой полости матки на 7-11 после овуляции, т.е. на 21-24 день классического 28 дневного менструального цикла. Предварительно проводят гистероскопию с целью визуальной оценки полости и слизистой оболочки матки.
Материалы биоптатов фиксируются в 10%-ном нейтральном формалине в течение 24 часов. Образцы обрабатываются по общепринятой стандартной методике и заключаются в парафин. Срезы толщиной 4 мкм готовятся на роторных микротомах и окрашиваются гематоксилином и эозином.
Исследование гистологических препаратов проводится в световом микроскопе при увеличении от х50 до х400.
Иммуногистохимическое исследование
ИГХ реакции проводится на депарафинировнных срезах толщиной 4-5 мкм по общепринятым протоколам (DAKO protocols). Для определения стероидных рецепторов используются мышиные моноклональные антитела к альфа-эстрагеновым рецепторам (ЭР) (клон 1D5 «DAKO», Дания, RTV) и прогестероновым рецепторам А (ПР) (клон 636 «DAKO», Дания; RTV). Для выявления экспрессии ЛИФ используются первичные мышиные антитела к ЛИФ (R@D Systems, USA, clone:9824).
Для анализа результатов ИГХ реакций используется метод гистологического счета H-score по формуле: HS=1а+2b+3с, где а - % слабо окрашенных клеток, b - % умеренно окрашенных клеток, с - % сильно окрашенных клеток, 1, 2, 3 - интенсивность окрашивания, выраженная в баллах. Результаты ИГХ реакции для ЛИФ оцениваются полуколичественным методом в баллах по общепринятой методике: отсутствие иммуноокрашенных клеток (-) - 0 баллов; менее 5% иммуноокрашенных клеток (j:) - 0,5 балла, менее 20% иммуноокрашенных клеток (+) - 2 балла; от 20 до 40% окрашенных клеток (++) - 4 балла; более 40% окрашенных клеток (+++) - 6 баллов.
Рассматривается также коэффициент ПР/ЭР. Соотношение ПР/ЭР расчитывается по строме, поскольку современные представления предполагают, что именно строма играет решающую роль в успешной имплантации эмбриона и последующем развитии беременности (М.Т. Mazur, 2005).
Результаты испытаний
При исследовании гистологических препаратов в световом микроскопе при увеличении ×400 проводилось изучение поверхностного эпителия эндометрия и оценка количества клеток, содержащих пиноподии (%), необходимые для успешной имплантации.
У пациенток 1 группы количество пиноподии в поверхностных клетках эпителия колебалось от 7 до 12% и в среднем составило 9,3=1,7% (рисунок 1а), тогда как у пациенток 2 группы данный показатель варьировал от 30 до 40% и в среднем составил 34,6%±3,1% (рисунок 1б). Таким образом, нами выявлена статистически значимая разница между количеством пиноподии у пациенток с бесплодием и пациенток без бесплодия на фоне миомы матки (Р<0,05).
Иммуногистохимическому исследованию подвергнут материал от 52 пациенток. Из них 25 пациенток с миомой матки и бесплодием (1 группа), 14 пациенток с миомой матки без бесплодия (2 группа). У пациенток всех групп морфологическая картина эндометрия соответствовала ранней и средней стадии фазы секреции. У пациенток 1 группы в основном наблюдалась умеренная и выраженная экспрессия PR во всех клетках эндометрия. Уровень PR в железах колебался от 30 до 220 и в среднем составил 167, 2±55,33. Уровень PR в строме колебался от 30 до 180 и в среднем составил 154,8±46,65. При исследовании уровня рецепторов эстрогена-альфа в первой группе пациенток выявлена умеренная и низкая экспрессия рецепторов. Уровень ER в железах колебался от 10 до 180 и в среднем составил 35,68±11,85. Уровень ER в строме колебался от 10 до 80 и в среднем составил 9,96±3,4.
Также оценивалось соотношение PR/ER в строме. По данным литературы в норме этот показатель должен находиться в диапазоне от 2 до 4. Соотношение PR/ER рассчитывалось по строме, учитывая современные представления о решающей роли стромы, играет решающую роль в успешной имплантации эмбриона и последующем развитии беременности.
В 1 группе пациенток (с миомой матки и бесплодием) этот показатель варьировал от 27,15 до 66,27 и в среднем составил 46,71±9,48. Этот результат обусловлен снижением уровня ER-альфа в строме.
При иммуногистохимическом исследовании уровня рецепторов стероидных гормонов в эндометрии во 2 группе (с миомой матки без бесплодия) уровень PR в железах колебался от 10 до 180 и в среднем составил 58,21±17,72. Уровень PR в строме колебался от 120 до 220 и в среднем составил 162,86±24,63. Уровень эстрогеновых рецепторов в эндометрии пациенток второй группы был выше, чем у пациенток первой группы. Так, уровень ER-альфа в железах колебался от 10 до 220 и в среднем составил 69, 29±17,43. Уровень ER-альфа в строме находился в пределах от 30 до 100 и в среднем составил 50,36±5,15. Соотношение уровней прогестероновых рецепторов и эстрогеновых рецепторов альфа по строме во второй группе в среднем составило 3,49±0,79. Таким образом, оценка состояния эндометрия пациенток 2 группы показывает, что у большинства пациенток с миомой матки без бесплодия имеются характерные для "окна имплантации" секреторные проявления, которые были обнаружены при гистологическом исследовании. При этом наблюдалась выраженная экспрессия ПР (>200 баллов), достигавшая максимальных значений в клетках стромы. Уровень ER-альфа в клетках стромы был низким, а в клетках желез умеренным (рисунок 2).
При исследовании маркера рецептивности LIF во вторую фазу менструального цикла выявлено снижение уровня LIF у пациенток с миомой матки и бесплодием.
Так, у пациенток 1 группы уровень LIF колебался от 0 до 3 и в среднем составил 1.96±0,98. Среди пациенток 2 группы уровень экспрессии LIF в эндометрии варьировал от 1 до 3 и в среднем составил 2,71±0,73. При сравнении пациенток
В обеих группах по уровню экспрессии LIF получены статистически значимые результаты. Так, при сравнении результатов 1 и 2 группы уровень LIF у пациенток с миомой матки, не страдающих бесплодием, был почти в 1,5 раза выше, чем у пациенток с бесплодием, и составил 2,71±0,73 и 1,96±0,98 соответственно (р=0,061) (рисунок 3). Нами была выявлена зависимость между количеством узлов миомы и уровнем LIF. Так, уровень LIF оказался выше у пациенток с единичными узлами миомы, при этом, чем больше миоматозных узлов, тем ниже уровень экспрессии LIF, что свидетельствует об отрицательном влиянии миомы матки на эндометрий (рисунок 4).
Нами получены данные, подтверждающие нарушение экспрессии стероидных гормонов в эндометрии у пациенток с миомой матки, страдающих бесплодием. По данным нашего исследования соотношение PR/ER-альфа у пациенток с бесплодием на фоне миомы матки в среднем составило 46,71±9,48, тогда как у пациенток с миомой матки, не страдающих бесплодием, этот показатель составил 3,49±0,79. Из вышеописанных данных следует, что причина бесплодия у пациенток с миомой матки может быть связана с нарушением экспрессии стероидных рецепторов в эндометрии.
Таким образом, нами были подтверждены данные о нарушении экспрессии стероидных гормонов в эндометрии у женщин с миомой матки, страдающих бесплодием. Проведение морфологической и иммуногистохимической оценки эндометрия у больных миомой матки позволяет выделить группу пациенток с дисбалансом экспрессии PR и ER-альфа, которым необходимо и целесообразно проведение миомэктомии даже при небольших размерах миоматозных узлов.
Ниже следует пример, который иллюстрирует способ по изобретению.
Пациентка К., 26 лет обратилась в Центр в 2010 году с жалобами на отсутствие наступления беременности в течение 2 лет регулярной половой жизни без применения контрацепции.
Клинический диагноз: Миома матки. Бесплодие I.
Заболевания у ближайших родственников: у бабушки - сахарный диабет.
Соматических заболеваний не выявлено. Общие операции отрицает.
Гинекологические заболевания: эрозия шейки матки (лазер-коагуляция в 2007 году). Миома матки с 2006 года.
Гинекологические операции: отрицает.
Менструации с 11 лет, установились сразу. Регулярные, по 4 дня, через 28 дней, умеренные, безболезненные.
Репродуктивная функция - бесплодие I (2 года). Общее количество беременностей - 0
Половая жизнь с 19 лет.
Здоровье мужа: соматически здоров, спермограмма - нормозооспермия.
История настоящего заболевания: обратилась в Центр с вышеописанными жалобами для подготовки к беременности. При обследовании выявлена миома матки. Рекомендовано оперативное лечение.
Гинекологический осмотр: наружные половые органы развиты правильно. Оволосение по женскому типу. Шейка матки цилиндрической формы, чистая. Тело матки увеличено соответственно 9-10 неделям беременности, плотное, подвижное, безболезненное при пальпации. Придатки матки с обеих сторон не увеличены, безболезненны при пальпации. Своды глубокие, безболезненные при пальпации. Выделения - светлые.
Данные УЗИ органов малого таза (от 16.04.2010) 9 д.м.ц.: тело матки размерами 3,8*4,0*3,8 см. По задней стенке визуализируется межмышечно-субсерозный миоматозный узел диаметром 3,8 см. Полость матки не расширена. Придатки матки без патологии. М-ЭХО - 0,5 см, обычной эхо-структуры.
Операция: Лапароскопия, миомэктомия без вскрытия полости матки, гистероскопия, раздельное диагностическое выскабливание эндоцервикса и слизистой полости матки.
Обнаружено: длина тела матки 6 см. Полость не увеличена, не деформирована. Эндометрий бледно-розовый, не утолщен. Трубные углы доступны осмотру, устья маточных труб свободны.
Лапароскопия: тело матки увеличено до 8-9 нед беременности, бледно-розового цвета, деформировано межмышечно-субсерозным миоматозным узлом, расположенным по задней стенке матки, диаметром 4,5 см. Придатки без патологии. Маточные трубы при хромогидротубации свободно проходимы.
Результаты патоморфологического исследования №1285 - присланные узлы - лейомиома с гиалинозом. В соскобе обрывки плоского многослойного эпителия. Количество пинопий 25%.
Иммуногистохимическое исследование: уровень PR 220%; уровень ER 30%; PR/ER 7,3; уровень LIF 1 балл (низкий).
Через год после проведенной операции наступила самостоятельная беременность, которая протекала без осложнений и завершилась оперативными родами на 38 неделе беременности. Родился здоровый ребенок, оценен по шкале Апгар 8/9 баллов. Пациентка выписана домой в удовлетворительном состоянии на 7 сутки после родов.
Пациентка Р., 39 лет обратилась в Центр с жалобами на отсутствие наступления беременности в течение 2 лет регулярной половой жизни без применения контрацепции.
Клинический диагноз: Множественная миома матки больших размеров. Бесплодие II.
Заболевания у ближайших родственников: инсульт у матери.
Соматические заболевания: аутоиммунный тиреоидит.
Общие операции: 2001 г. удаление левой доли щитовидной железы.
Гинекологические заболевания: миома матки с 2008 г.
Гинекологические операции: кесарево сечение в 1994 г. (на 38 нед беременности, мальчик 3700/54).
Менструации с 12 лет, установились сразу, регулярные по 4 дня, через 28 дней умеренные, безболезненные
Репродуктивная функция: общее количество беременностей - 1; искусственный аборт по желанию женщины - 0.
Роды I (КС в 1994 г).
Здоровье мужа 39 лет, обследован, здоров.
Половая жизнь с 20 лет.
История настоящего заболевания:
Миома матки с 2008 г., не наблюдалась, лечение не проводилось.
Гинекологический осмотр: наружные половые органы развиты правильно. Оволосение по женскому типу. Влагалище нерожавшей, слизистая не гиперемирована. Шейка матки субконической формы, чистая. Тело увеличено до 13-14 нед беременности, плотное, подвижное, безболезненное при пальпации. Придатки матки с обеих сторон не увеличены, безболезненны при пальпации. Своды глубокие, безболезненные. Выделения - светлые.
Данные УЗИ органов малого таза от 15.02.2010:
Размеры матки: длина 10,3, толщина 9,4, ширина 9,0 см. Миометрий - по задней стенке интерстициальный миоматозный узел размерами 78*65*76 мм, в дне субсерозный на тонком основании 44*27*33 мм. М-ЭХО 6 мм. Правый яичник размерами 3,1*2,9*2,0 см, левый яичник размерами 3,8*3,7*3,0 см. Заключение - множественная миома матки.
Протокол операции от 19.02.2010:
Лапароскопия, миомэктомия без вскрытия полости матки, гистероскопия, диагностическое выскабливание слизистой полости матки.
Гистероскопия: длина тела матки 10 см. Полость не увеличена, не деформирована. Слизистая не утолщена, бледно-розового цвета. Трубные углы доступны осмотру, свободны.
Лапароскопия: матка увеличена до 14-15 недель беременности, бледно-розового цвета, деформирована интрамуральным миоматозным узлом, исходящим из задней стенки диаметром 10 см, и субсерозным узлом миомы, исходящим из дна диаметром 4,0 см. Придатки матки без патологии. При хромогидротубации маточные трубы проходимы.
Результаты патоморфологического исследования №506/3326-30.
Присланные узлы представляют собой лейомиому. В соскобе слизистая стадии секреции (в отдельных участках с железами различной формы и величины). Количество пиноподий 20%.
Иммуногистохимическое исследование: уровень PR 180%; уровень ER 5%; PR/ER 36; уровень LIF 2 балл (умеренный).
Через год после проведенной операции наступила беременность после ЭКО и переноса эмбриона, которая протекала с явлениями угрозы прерывания на ранних сроках и завершилась оперативными родами на 37 неделе беременности. Родился здоровый ребенок, оценен по шкале Апгар 8/8 баллов. Пациентка выписана домой в удовлетворительном состоянии на 7 сутки после родов.
Источники информации
1. Hart R, Khalaf Y, Yeong CT, Seed P, Taylor A, Braude P 2001 A prospective controlled study of the effect of intramural uterine fibroids on the outcome of assisted conception. Hum Reprod 11. - 2411-2417.
2. В.И. Кулаков, Г.М. Савельева, Манухин И.Б. Гинекология - национальное руководство, 2009 г.
3. Вихляева Е.М. Руководство по диагностике и лечению лейомиомы матки. // М., «МЕДпресс-информ», 399 с., 2004 г.
4. The effect of intramural fibroids without uterine cavity involvement on the outcome of IVF treatment: a systematic review and meta-analysis Sesh Kamal Sunkara, Mohammed Khairy, Tarek El-Toukhy, Yacoub Khalaf and Am Coomarasamy Hum. Reprod. (2010) 25 (2): 418-429.
5. Parker WH 2007 Uterine myomas: management. Fertil Steril 88: 255-277.
6. Agajanova L, Stavreus-Evers A, Nikas Y, Hovatta O, Landgren BM. Coexpression of pinopodes and leukemia inhibitory factor, as well as its receptor, in human endometrium. Fertil Steril. 2003 Mar;79 Suppi 1:808-14.
7. Stovall D.W., Parrish S.B. Uterine leiomyomas reduce the efficacy of assisted reproduction cycles. Hum Reprod 1997; 13: 192-197.
8. Kontula K, Janne 0, Vihko R, de Jager E, de Visser J, Zeelen F. Progesterone-binding proteins: in vitro binding and biological activity of different steroidal ligands. Acta Endocrinol (Copenh). 1975 Mar; 78(3):574-92.
9. Бессмертная B.C. Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика эндометрия при бесплодии. Автореерат дисс., Москва, 2009 г.
10. Дюжева Е.В. Гормональная подготовка эндометрия у пациенток с неэффекивными попытками ЭКО в анамнезе, автореф. к дисс., 2010 г.
11. Gonzalez R.R., Rueda B.R., Ramos M.P. et al. Leptin-induced increase in leukemia inhibitory factor and its receptor by human endometrium is partially mediated by interleukin 1 receptor signaling. Endocrinology 2004; 145(8): 3850-3857.
12. Cavagna M, Mantese JC. Biomarkers ofendometrial receptivitya review. Placenta. 2003; 24(Suppl B):S39-47.
13. Архив патологии №5 2011, И.Н. Костючек, О.А. Виткина, С.В. Никитин, П.В. Кучина, Н.Н. Балашова, M.А. Клещев, Г.X. Толибова, Ю.П. Милютина, И.M. Кветной, ЭКСПРЕССИЯ РЕЦЕПТОРОВ ЭСТРОГЕНОВ И ПРОГЕСТЕРОНА В ЭНДОМЕТРИИ ФЕРТИЛЬНЫХ И БЕСПЛОДНЫХ ЖЕНЩИН.
14. Амбарцумян Э.М. Роль фактора, ингибирующего лейкемию, в репродукции человека: Обзор [Текст] / Э.М Амбарцумян, Л.М. Агаджанова // Акушерство и гинекология: Научно-практический журнал. - 2004. - №2. - С.17-21: 2 ил. - ISSN 0300-9092.