СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ГИДРОДИНАМИКИ У БОЛЬНЫХ ПЕРВИЧНОЙ ОТКРЫТОУГОЛЬНОЙ ГЛАУКОМОЙ
METHOD OF PREDICTING HYDRODYNAMICS RATIO IN PATIENTS WITH PRIMARY OPEN ANGLE GLAUCOMA

Способ прогнозирования показателей гидродинамики у больных первичной открытоугольной глаукомой
Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования показателей гидродинамики у больных первичной открытоугольной глаукомой.
Первичная открытоугольная глаукома (далее ПОУГ) - это хроническое заболевание глаз, которое характеризуется постоянным или периодическим повышением внутриглазного давления (далее ВГД), сопровождается прогрессирующей оптической нейропатией, проявляющейся атрофией зрительного нерва с характерными изменениями поля зрения [Егоров E.А. Глаукома. Национальное руководство /под ред. E.А. Егорова. - М.: ГЭОТАР-Медиа. - 2013. - 824 с.]. В настоящее время по данным ВОЗ в мире около 68 млн человек страдает глаукомой. Число ослепших вследствие глаукомы составляет 5,2 - 9,1 млн человек, и их число неуклонно увеличивается [Pascolini, D. Global estimates of visual impairment: 2010 /Pascolini D., Mariotti S.P. //British Journal of Ophthalmology. - 2012. - Vol.96. - no. 5. - P. 614-618].
ПОУГ является мультифакториальным заболеванием [Banerjee D. Comprehensive analysis of myocilin variants in east Indian POAG patients /Banerjee D., Bhattacharjee А., Ponda А., Ray K. //Molecular Vision. - 2012. Vol.18. - P. 1548-1557], в этиопатогенезе которого важная роль принадлежит факторам роста (далее ФР), регулирующим продукцию внеклеточного матрикса, участвующим в процессах репарации, влияющим на ангиогенез, пролиферацию и апоптоз клеток [Fingert J. Primary open-angle glaucoma genes /Fingert J.H. //Eye. - 2011. Vol.25. - no. 5. - P. 587-595].
3
3
Одними из значимых факторов, характеризующих развитие и прогрессирование ПОУГ, являются показатели гидродинамики глаз: истинное ВГД (мм рт. ст.) и коэффициент легкости оттока внутриглазной жидкости (мм/мин/мм рт. ст.). Статистическая норма истинного ВГД составляет от 10 до 21 мм рт. ст., коэффициент легкости оттока варьирует от 0,16 до 0,48 мм/мин/мм рт. ст. При прогрессировании глаукомы изменения показателей гидродинамики позволяют установить причину и степень снижения секреции водянистой влаги в глазу, а также определить эффективность проведенного лечения и при необходимости изменить лечебную тактику [Егоров E.А. Национальное руководство по глаукоме (путеводитель) для поликлинических врачей /Под ред. E.А. Егорова, Ю.С. Астахова, А.Г. Щуко.- М., 2008.- 136 с.].
Инсулиноподобный фактор роста-1 IGF-1 - один из важнейших членов семейства инсулиноподобных ФР, осуществляющих регуляцию процессов роста, дифференцировки, развития клеток и тканей. IGF-1 состоит из 70 аминокислот в одной цепочке с тремя внутримолекулярными дисульфидными мостиками. Также этот белок играет активную роль в процессах старения организма. Молекулярная масса IGF-1 7,6 кДа [Cаppolа А. Insulin-like growth factor I and interleukin-6 contribute synergistically to disability and mortality in older women /Cаppolа А., Xue Q., Ferrucci L. et аl. //J. Clin. Endocrinol. Metab. - 2003. - Vol.88. №5. - P. 2019-2025].
Ген IGF-1 включает шесть экзонов, локализован на длинном плече хромосомы 12 человека [Zhang H. Insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1) inhibit breast cancer cell motility /Zhang H., Yee D. //Cancer Res. - 2002. - Vol.62. - P. 4369-4375].
IGF-1 и его рецептор IGFR-1 регулируют процессы роста и дифференцировки в эпителиоцитах роговицы и хрусталика, стекловидном теле, клетках сетчатки [Ko J. IGF-1 released by corneal epithelial cells induces up-regulation of N-cadherin in corneal fibroblasts. /Ko J., Yanai R., Nishida T. //J. Cell. Physiol. - 2009. - Vol. 221(1). - P. 254-261].
Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2014 гг. Анализ документов производился по направлению: способ прогнозирования показателей гидродинамики у больных первичной открытоугольной глаукомой.
Источники информации: сайты Федерального института промышленной собственности http://fips.ru.
В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования показателей гидродинамики у больных первичной открытоугольной глаукомой.
Задачей настоящего исследования является создание способа прогнозирования показателей гидродинамики у больных первичной открытоугольной глаукомой.
Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки показателей гидродинамики у больных первичной открытоугольной глаукомой, для индивидуумов русской национальности, являющихся уроженцами Центрального Черноземья России, на основе данных о генетическом полиморфизме IGF-1 c.-1410T>C (rs 35767).
В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования показателей гидродинамики у больных первичной открытоугольной глаукомой, включающий:
• выделение ДНК из периферической венозной крови;
• анализ полиморфизма гена IGF-1 c.-1410T>C (rs 35767);
• прогнозирование в случае выявления генотипов СС и ТС IGF-1 неблагоприятных показателей гидродинамики у больных первичной открытоугольной глаукомой: высокие значения истинного ВГД и низкие показатели коэффициента легкости оттока внутриглазной жидкости;
• прогнозирование в случае выявления генотипа ТТ IGF-1 благоприятных показателей гидродинамики у больных первичной открытоугольной глаукомой.
Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза показателей гидродинамики у больных первичной открытоугольной глаукомой по данным о генетических вариантах локуса IGF-1 c.-1410T>C (rs 35767).
Изобретение охарактеризовано на следующих фигурах.
На фиг. 1 представлена дискриминация аллелей по локусу IGF-1 c.-1410T>C (rs 35767), где - СC IGF-1, - TТ IGF-1, - ТС IGF-1, - отрицательный контроль.
На фиг. 2 указан показатель истинного ВГД у больных ПОУГ в зависимости от генетических вариантов локуса IGF-1 c.-1410T>C (rs 35767).
На фиг. 3 показано значение коэффициента легкости оттока внутриглазной жидкости у больных ПОУГ в зависимости от генетических вариантов локуса IGF-1 c.-1410T>C (rs 35767).
На фиг. 1 две полосы, вертикальная и горизонтальная, делят график на четыре секции: одна для каждого гомозиготного состояния, одна для гетерозиготного состояния и секция без реакции. Присвоение генотипов неизвестным образцам определяется вычерчиванием уровня относительной флуоресценции (далее УОФ) для одного флуорофора на оси x, относительно УОФ для другого флуорофора на оси y на диаграмме дискриминации аллелей. Зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю Т, зонд с красителем FAM - аллелю С.
• Если значения УОФ неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и правее вертикальной полосы, генотип гетерозиготен (СТ).
• Если значения УОФ неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и левее вертикальной полосы, генотип гомозиготен по аллелю Т (УОФ аллеля Т отложены по оси y).
• Если значения УОФ неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и правее вертикальной, генотип гомозиготен по аллелю С (УОФ аллеля С отложены по оси x).
• Если значения УОФ неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и левее вертикальной, определение генотипа невозможно: в данном случае неопределенный образец - отрицательный контроль.
Способ осуществляют следующим образом.
2
ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови индивидуумов в 2 этапа. На первом этапе 4 мл крови смешивают с лизирующим буфером, в котором содержится 320 г сахарозы, 1% тритон Х - 100, 5 мл MgCl, 10 мл трис - HCl (pH 7,6), центрифугируют 20 минут при температуре 4ºС на 4000 об/мин. Далее добавляют 4 мл ЭДТА - Soline, 400 мкл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют в течение 16 часов при 40ºС.
º
На втором этапе из уже очищенного лизата производят экстракцию ДНК равными долями фенола, фенол-хлороформа, хлороформа и центрифугируют в течение 10 минут при 4000 об/мин. После центрифугирования водный слой удаляют и добавляют два объема охлажденного этанола 96%. Полученную ДНК растворяют в деионизованной, бидистиллированной воде, хранят при температуре -20С и в дальнейшем используют для проведения полимеразной цепной реакции (далее ПЦР).
Анализ генетического полиморфизма IGF-1 c.-1410T>C осуществляют методом ПЦР синтеза ДНК, которую проводят на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, USA) с использованием олигонуклеотидных зондов и праймеров для ПЦР фирмы «Синтол». Генотипирование осуществляют с использованием программного обеспечения «CFX Manager™».
Возможность использования предложенного способа для оценки показателей гидродинамики у больных первичной открытоугольной глаукомой подтверждает анализ результатов наблюдений 252 больных (450 глаз) ПОУГ и 191 человек (382 глаза) контрольной группы. Формирование выборок больных и контроль осуществлялись на базе офтальмологического отделения Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа и медицинского центра микрохирургии глаза ООО «Ковчег».
Исследуемые группы были сформированы из индивидуумов русской национальности, являющихся уроженцами Центрального Черноземья РФ и не имеющих родства между собой. В группу больных включались пациенты с ранее установленным или впервые выявленным диагнозом ПОУГ, подтвержденным клиническими, инструментальными и лабораторными методами обследования. С целью получения сведений о гидродинамике проводили тонографию - исследования на электронном тонографе. Определяли основные показатели гидродинамики глаза: истинное внутриглазное давление и коэффициент легкости оттока внутриглазной жидкости.
Группа контроля была сформирована из индивидуумов, не имеющих острых и хронических заболеваний глаз, у которых отсутствовали какие-либо признаки глаукомы, а также они не имели тяжелых соматических патологий, в том числе приводящих к поражениям глаз.
Типирование молекулярно-генетических маркеров осуществлялось в лаборатории «Молекулярной генетики человека» медицинского института Белгородского государственного национального исследовательского университета.
Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы «STATISTICA 6.0».
2
Выявление ассоциаций генетических вариантов анализируемого локуса с показателями гидродинамики проводили с помощью таблиц сопряженности 2х2, на основе вычисления критерия χ (хи-квадрат) с поправкой Йетса на непрерывность.
cor
bonf
Характер ассоциаций различных аллелей и генотипов с показателями гидродинамики оценивали при помощи показателя отношения шансов (OR) [Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA /О. Ю. Реброва. - [3-е изд.]. - Москва: Медиа Сфера, 2006. - 305 с.]. При проведении множественных сравнений использовали поправку Бонферрони - производили перерасчет уровня значимости р для множественных парных сравнений по формуле: р=р×n, где р - полученный уровень статистической значимости, n - количество парных сравнений. За статистически значимый уровень принимали р≤ 0,05.
Распределение показателей гидродинамики ПОУГ в исследуемой выборке не соответствовало закону нормального распределения (критерий Шапиро-Уилка W=0,97 при p<0,05), поэтому для его характеристики использовалась медиана и интерквартильный размах, сравнительная оценка проводилась с помощью непараметрического метода Манна-Уитни [Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA /О.Ю. Реброва. - [3-е изд.]. - Москва: Медиа Сфера, 2006. - 305 с.]. При этом анализе группа гетерозигот присоединялась к той группе гомозигот, у которой отсутствовали различия значений медиан и интерквартильных интервалов от гетерозиготных носителей или они были наименьшими.
3
3
Установлено, что индивидуумы с генотипом СС и ТС по локусу IGF-1 (rs 35767) имели повышенное значение истинного ВГД (22,3 мм рт. ст.) в сравнении с индивидуумами с генотипом TТ IGF-1 (rs 35767) - 19,7 мм рт. ст. и низкий показатель коэффициента легкости оттока внутриглазной жидкости 0,15 мм/мин/мм рт. ст. против 0,20 мм/мин/мм рт. ст. соответственно (фиг. 2-3). Единицей измерения являлся глаз, данные различия статистически достоверны (p=0,04; p=0,02).
Таким образом, индивидуумы с генотипами СС и ТС IGF-1 (rs 35767) ассоциированы высокими значениями истинного ВГД и низкими показателями коэффициента легкости оттока внутриглазной жидкости и могут служить генетическими маркерами неблагоприятного течения глаукоматозного процесса.
Пример, подтверждающий осуществимость предложенного изобретения.
3
• Генотипы СС IGF-1 и ТС IGF-1 были обнаружены у пациента А. больного ПОУГ. Исследования подтвердили неблагоприятный прогноз: высокое значение истинного ВГД - 25,3 мм рт. ст. и низкий показатель коэффициента легкости оттока внутриглазной жидкости - 0,09 мм/мин/мм рт. ст. При дальнейшем динамическом наблюдении этого пациента было определено ухудшение зрительных функций.
3
• У индивидуума Б., страдающего первичной открытоугольной глаукомой, выявлен генотип ТТ IGF-1. Установлены следующие показатели гидродинамики: показатель истинного ВГД - 18,5 мм рт. ст. и коэффициент легкости оттока внутриглазной жидкости - 0,17 мм/мин./мм рт. ст. При дальнейшем динамическом наблюдении этого пациента была отмечена стабилизация глаукоматозного процесса.
Использование данного способа позволяет прогнозировать показатели гидродинамики у больных первичной открытоугольной глаукомой, являющихся уроженцами Центрального Черноземья России, что будет способствовать более эффективной реализации лечебных мероприятий по предупреждению прогрессирования глаукомной оптической нейропатии.