ВОЛОКНИСТЫЙ ПИЩЕВОЙ МАТЕРИАЛ
FIBROUS FOOD MATERIAL

Изобретение относится к волокнистым материалам, и, в особенности, к волокнистым пищевым материалам, способам их получения и применения указанных волокнистых материалов. По основному объекту настоящее изобретение имеет целью предложить продукты для замены мяса и рыбы из альтернативных источников белка. По другому объекту, рыхлые волокнистые частицы используют в качестве ингредиента, имеющего различные применения.
В последние десятилетия образование волокнистых пищевых текстур снискало большой интерес со стороны ученых-промышленников, а также ученых-пищевиков. Особенно важный вызов состоял в том, чтобы заменить мясные продукты продуктами из альтернативных источников белка. В целом, это подразумевает создание мясоподобных структурных и сенсорных свойств у немясных материалов на белковой основе, т.е. целью являлось использование в качестве исходных анизотропных структур из немясных источников на белковой основе при различных линейных масштабах и в различных режимах концентрации.
Исследование, проведенное на волокнистых белковых материалах, можно грубо разделить на самосборку белков в фибриллы и принудительную сборку белков в волокнистые текстуры.
Фибриллярная самосборка различных белков, таких как β-лактоглобулин, овальбумин и альбумин бычьей сыворотки, была достигнута в разбавленном и полуразбавленном режимах в жестких температурных и рН-условиях (см., например, Veerman et al., J. Rheol. 49(2) (2005) 355-368). Образованные фибриллы имели толщину порядка нм и длину порядка мкм.
Сообщалось об особом случае самосборки при образовании амилоидных фибрилл κ-казеина (Thorn et al., Biochemtry 44(51) (2005) 17027).
В отличие от самосборки, к принудительной сборке белковых растворов в более концентрированном режиме (>10 мас.% белка) традиционно подходили с использованием методик экструдирования или вытягивания в нить, хотя также были описаны другие методики.
Экструзионную тепловую обработку использовали для текстурирования белков из различных источников, таких как соевая мука, пшеница и молочные белки. Пластификация, плавление и разрушение белков происходит в цилиндре экструдера, и волокнистая текстура может быть образована, благодаря ориентированию белков в длинных охлаждающих матрицах. См. в свете этого, например, Aguilera & Stanley, Food Rev. Int. 9(4) (1993) 527-550; and Cheftel et al., Food Rev. Int. 8(2) (1992) 235-275.
В этих воплощениях величина соотношения продольного и поперечного сопротивления растяжению является - согласно Thiebaud et al. (Food Science And Technology-Lebensmittel-Wissenschaft & Technologie 29(5-6) (1996) 526-535) - показателем качества волокна. Типичные значения соотношения продольного и поперечного сопротивления растяжению составляют, например, 1-5 для волокнистых экструдатов из обезжиренной соевой муки, в зависимости от температуры цилиндра и рН (Cheftel et al., ibid.); и 1-2 для экструдатов обезжиренной соевой муки и свинины при определении путем разрезания (Liu et al.. Food Sc. Techn. Int. 11(6) (2005) 463-470).
Исследования, относящиеся к двум предыдущим абзацам, показывают, что требуются смеси из животных и растительных источников, чтобы получить приемлемую степень волокнистости.
Толстогузов (Tolstoguzov) (в: J.A.O.C.S., 70(4) (1993) 417-424) подчеркнул, что требуются несовместимые биополимеры для образования анизотропных структур во время экструдирования.
В патенте US-A-4118520 получают белковые волокна, которые содержат казеин и, по меньшей мере, один теплоотверждаемый белок, путем сухого вытягивания в нить водной смеси белков, содержащей ион кальция и фосфат-ион, при температуре ниже точки гелеобразования белковой смеси, сопровождающегося высушиванием полученных волокон.
Патент US-A-2830902 и его частичное продолжение US-A-2879163 описывают, что суспензия богатого белком сырого материала коагулирует под действием тепла с образованием белкового геля, каковому гелю придают форму путем экструдирования с использованием макаронного пресса.
В целом методика экструдирования имеет ряд недостатков, таких как использование высоких температур для денатурирования белка, что вызывает неконтролируемые химические реакции; и использование высоких поперечных усилий во время экструдирования, что может приводить к разрушению структурных элементов (см., например, Peighambardoust et al., J. Cereal Sc. 43 (2006) 183-197), даже на молекулярном уровне (см. Van den Einde et al., Polymer Degradation And Stability, 85(1) (2004) 589-594). Кроме того, в экструдерах, точно так же, как во многих других смешивающих или пластифицирующих устройствах, получают различные эффекты для физических и/или химических процессов в зависимости от местоположения в аппарате.
Ясно, что для того, чтобы получить хорошо сформированные волокнистые продукты, необходима тонкая игра на грани между разрушением и индуцированием текстуры в структурных элементах. Данное изобретение имеет целью предложить способ, который позволяет получить четко определенные волокнистые продукты.
Кроме того, продукты, полученные экструзионной тепловой обработкой, обычно нагревают при температурах выше 100°С. Такие продукты можно нагреть, но их нельзя обрабатывать на кухне с использованием методик, таких как выпекание и поджаривание, которые привели бы к эффектам, получаемым также с рыбой и мясом.
Другая методика, упомянутая здесь выше, а именно, вытягивание в нить биополимеров, основана на ориентировании макромолекул, за счет сдвига и продольного потока в матрице и во время коагуляции (см., например. Gallant et al., Food Microstructure 3 (1984) 175-183). Обычно образующиеся волокна (-100 мкм) подвергают коагуляции в банях, содержащих растворы кислоты и соли, и после этого промывают. Гидроколлоиды, такие как каррагинан (Downey & Burgess, J. Food Techn. 14(1) (1979) 21-31; Downey & Burgess, J. Food Techn. 14(1) (1979) 33-40) и альгинат (Antonov et al., Die Nahrung 29(1) (1985) 39; Suchkov et al., Nahrung-Food 24(9) (1980) 893-897 24(9) (1980) 893-897), или растительные белки, такие как соя (Suchkov et al., Nahrung-Food 32(7) (1988) 669-678) или кормовой белок (белок конского боба) (Suchkov et al., Nahrung-Food 32(7) (1988) 679-689), использовали в сочетании с казеином в двухфазной смеси для того, чтобы снизить растворимость в воде образованных волокон на основе казеина.
Патент US-A-2682466 описывает съедобные белковые волокна, изготовленные способом сухого вытягивания в нить. Сырой материал, богатый белком, растворяют в щелочной среде, и затем экструдируют в форме тонких струек в кислотно-солевую баню, в которой волокна коагулируют.
Недостатком этого способа вытягивания в нить остаются большие потоки сточной воды из коагуляционной и промывной бань. Кроме того, необходимость низкого рН и высоких концентраций соли и химических добавок для коагуляции волокон делает разработку процесса и аппарата для получения волокон, подходящих для употребления, сложной задачей. Кроме того, объединение волокон, полученных путем вытягивания в нить, в волокнистую структуру является сложным, если вообще возможным.
В Патенте NL-C-1019816 получают продукты, которые имеют целью заменить мясо и рыбу, и которые можно выпекать. Эти продукты получают из свернувшегося молока, которое смешивают с альгинатом и/или фосфатом в воде, при этом указанную смесь эмульгируют, а затем энергично перемешивают в солевом растворе. После этого полученный волокнистый продукт промывают и дополнительно удаляют воду. Описанный способ имеет недостатки, подобные тем, что описаны выше для способа вытягивания в нить.
Также в WO 2005/004624 и WO 2005/004625 гомогенные смеси белка (молочные и растительные белки соответственно) и гидроколлоида, в котором происходит преципитация при контактировании с ионами металла, имеющего заряд, по меньшей мере, +2, приводят в контакт с раствором, содержащим такие ионы металла для образования сформированных волокон, содержащих пищевые продукты.
Продукты, полученные способами двух предыдущих абзацев, приобретают структуру, основанную на желированных гидроколлоидах.
Кроме того, уровень техники включает перекрестное сшивание белков с трансглутаминазой с получением белковых продуктов для различных целей, не включая волокнистые текстуры для замены мяса или рыбы. Ссылаются на ЕР 1085023, который относится к способу частичного перекрестного сшивания белков с трансглутаминазой. Целью является предложить сшитые белки, используемые в качестве загустителей или связующих веществ в пищевых продуктах. Материал получают в реакторе с непрерывным перемешиванием или реакторе с неподвижным слоем, причем последний является предпочтительнее. Также ссылаются на ЕР 0821881, который относится к порошку молочной сыворотки, содержащему белок, используемому в пастообразной пище и эмульгированной пище. Белок молочной сыворотки реагирует в растворе с трансглутаминазой.
Другие данные из уровня техники, такие как ЕР 0340035, включают белковые микроволокнистые структуры. Способ, описанный здесь, включает растирание ксантан/белковых сложных волокон и подвергание измельченных волокон высокой сдвиговой нагрузке, таким образом, чтобы получить микроволокна. Образующийся продукт можно использовать в пищевых продуктах, например, на основе мясных компонентов. Он не имеет, сам по себе, структуру, заменяющую мясо или рыбу.
ЕР 0420165 относится к принципиально иному типу замены мяса или рыбы, а именно на основе измельченного мясного или рыбного белка, включающий способ реструктурирования белков в мышцеподобные структуры. Этот тип замены, очевидно, не является подходящим там, где желательно использование немясных источников белка. Кроме того, иные, чем глобулярные белки и казеин, оригинальные мясные белки, используемые здесь, являются волокнистыми белками, сами по себе.
Задачей настоящего изобретения является предложение способа получения структур и текстур волокнистой пищи, где проблемы, выявленные здесь выше, преодолены.
Кроме того, задачей настоящего изобретения является получение продуктов и, в особенности, твердо-мягких продуктов, имеющих внешний вид и свойства, сравнимые с характеристиками мяса и рыбы. В частности, композиция, содержащая иерархическую волокнистую структуру, является желательной.
nd
В свете этого, иерархические структуры подразумевают, что постепенно монтируются структуры все более высоких уровней организации от молекулярного до макроуровня, до тех пор, пока желаемые свойства и функции не оказываются достигнутыми. Адаптировано из: J.M.Aguilera, S.W.Stanley, (1999), Microstructural principles of food processing and engineering, 2 ed, Aspen Publishing, Inc, Gaithersburg, Maryland (ISBN 0-8342-1256-0), page 186-187.
В данном контексте, твердомягкий пищевой продукт представляет собой пищевой продукт, который, в первую очередь, характеризуется эластичной деформацией (эластичная деформация: G'>G") при прикладывании нагрузки, и для которого требуется относительно малая нагрузка, чтобы получить существенную деформацию, благодаря либо низкому модулю эластичности, либо низкому напряжению текучести. Дальнейшие подробности по поводу твердо-мягких пищевых продуктов описаны в: Р.Walstra (2003) Physical Chemistry of Foods; Chapter 17: Soft-solids; Marcel Dekker, New York, причем эта глава включена в качестве ссылки в данное описание для дальнейшего описания твердомягких пищевых продуктов.
Внешний вид и/или поведение, сравнимое с мясным и рыбным, относится, предпочтительно, как к возможности обработки во время приготовления пищи, включая поджаривание и обжаривание при перемешивании, так и к употреблению. В частности, структура по изобретению будет сокращаться при нагревании, что дает поведение, подобное тому, что имеет место в случае куриного мяса.
Более того, желательно предложить волокнистый пищевой материал, имеющий хорошие абсорбционные и адсорбционные свойства по отношению к вкусовым и ароматическим веществам, таким как пряные травы и приправы.
Другие задачи настоящего изобретения станут ясны после прочтения оставшейся части описания, включая рабочие примеры.
Задачи настоящего изобретения решаются путем использования технологии, основанной на приложении простого сдвигового потока и одновременного ферментативного перекрестного сшивания для индуцирования анизотропной волокнистой структуры в концентрированном белке, а наиболее предпочтительно, в концентрированной композиции казеината кальция, без необходимости коагуляционных бань и без необходимости прикладывать высокие температуры или высокие поперечные усилия. Кроме того, количество стадий промывания можно значительно снизить, а зачастую никаких стадий промывания не требуется вообще.
По первому объекту настоящее изобретение относится к способу получения иерархических волокнистых пищевых структур, основанному на подвергание суспензии съедобного белка простому сдвиговому потоку и ферментативному перекрестному сшиванию. Ферментативное перекрестное сшивание проводят одновременно с действием простого сдвигового потока.
Способ настоящего изобретения опирается на особый вид деформации, представляющей собой простой сдвиг. Термин "простой сдвиг" является хорошо известным в данной области и подразумевает, что поверхности материала скользят одна относительно другой только в одном направлении. В этом отношении ссылаются на C.W.Macosko, "Rheology, Principles, Measurements and Applications", VCH Publishers Inc., New York (1994), in particular pages 27-29, 40 and 70-75; причем эта ссылка включена в качестве ссылки в данное описание с целью определения понятия "простого сдвига".
Поскольку многие из приведенных выше способов современного уровня техники относятся к системам с разделенными фазами белка и полисахарида, где ориентирование в единственной фазе продиктовано или скорее зафиксировано другой фазой, настоящее изобретение охватывает ориентирование белкового материала в смеси белок/вода. Т.е. ориентирование и образование волокнистой структуры происходит в одной и той же фазе, по настоящему изобретению. Структура, полученная с помощью изобретения, не требует фиксации в отдельной матрице, как того требуют способы современного уровня техники, основанные на гелеобразовании.
плоскость
конус
В способе настоящего изобретения суспензию белка подвергают линейному сдвигу простого профиля, который может, например, быть осуществлен между плоскостью и конусом; между конусом и конусом; или в цилиндрическом, коническом и плоскостном реакторе. Пример подходящего аппарата показан на Фигуре 1, где Фигура 1а показывает фотографию устройства с камерой лабораторного уровня, а Фигура 1b представляет собой схематический рисунок сдвиговой зоны указанного аппарата. В частности, полимеры могут быть подвергнуты простому сдвигу линейного профиля путем использования в воплощении на Фигуре 1 плоскости и конуса, где угол (α составляет, например, около 105°, и α, например, 100°. Устройство сдвиговой камеры на Фигуре 1 имеет объем, примерно, 70 мл. Вращающуюся плоскость и неподвижный конус нагревают (или охлаждают) водой. Температуру материала измеряют термопарой, размещенной в конусе. Устройство присоединено к Brabender Do-Corder 330 (Brabender OHG, Duisburg, Germany) для того, чтобы сделать возможным регулирование скорости сдвига и замеры вращающего момента и температуры. Аппарат на Фигуре 1 основан на аппарате, описанном Peighambardoust et al. В: Journal of Cereal Science. 42(1) (2005) 59-68. Документ включен здесь в качестве ссылки для дальнейшего определения аппарата, подходящего для использования в настоящем изобретении.
Прилагаемые нагрузки во время сдвига не должны приводить к разрушению белков. Обычно прилагаемые нагрузки не должны превышать 25 кПа, предпочтительно, не превышать 20 кПа (рассчитано на основе спроецированного радиуса плоскости).
В этом способе простой сдвиговый поток приводит к ориентированию белков, в то время как ферментативное перекрестное сшивание приводит к отверждению.
Конечно, небольшие отклонения от простого профиля сдвигового потока, которые все же дают волокнистые материалы, также охвачены настоящим изобретением.
На основании сведений, раскрываемых настоящим изобретением, возможно, хотя не предпочтительно, осуществить простой профиль сдвигового потока в "несдвиговом оборудовании", т.е. в оборудовании, обычно не используемом для применения сдвига, таком как миксер. В таком оборудовании могут существовать домены обработки, в которых, на самом деле, происходит простой сдвиг. Если делают таким образом, следует позаботиться о том, чтобы получить - например, со стенок перемешивающего оборудования - только те порции материала, которые были объектом домена простого сдвига в несдвиговом оборудовании. Также, если используют несдвиговое оборудование, такое как миксер, порядок прибавления компонентов будет более критичным для образования волокнистых структур. В таком оборудовании, жидкие фазы (вода, масло), и ферментативный перекрестие сшивающий агент, следует добавлять до белка. Возможно, что для некоторых целей может быть достаточно материала, лишь некоторые части которого являются анизотропными (и, например, содержатся в изотропной матрице).
Стадию осуществления простого сдвига предпочтительно проводят с белковым материалом, у которого нет температуры денатурирования, таким как казеинат кальция (см. также здесь ниже), или, предпочтительно, проводят при температуре ниже, чем температура денатурирования белкового материала. Что касается простого сдвига per se, нижний предел температуры не является критичным, поскольку белковый раствор или дисперсия способна течь. Фактически, стадия умеренного нагревания приводит к более быстрому ориентированию. Температурные требования для одновременного ферментативного перекрестного сшивания могут быть более критичными. На практике, способ изобретения подходяще проводить в температурном диапазоне около 15-60°С, предпочтительно от комнатной температуры, т.е. 20-25°С, до 55°С, и, более предпочтительно, в температурном диапазоне 35-50°С.
Для способа по изобретению требуются достаточно плотные белковые растворы или дисперсии, предпочтительно, в воде или по меньшей мере в водных системах, хотя другие неденатурирующие растворители могут также быть использованы. Предпочтительно, концентрация белка составляет, по меньшей мере, 5 масс.%, предпочтительно, по меньшей мере, 10 масс.%, более предпочтительно, по меньшей мере, 15 масс.% И, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 20 масс.%, в расчете на массу всего раствора или дисперсии; в наилучших вариантах, найденных к настоящему времени, применяют, предпочтительно, по меньшей мере, 25 масс.%, и, более предпочтительно, 30 масс.% и выше белка. Верхний предел концентрации белка обусловлен тем требованием, что белковый материал должен быть достаточно подвижным, чтобы ориентироваться в среде. Это может быть легко определено специалистм, квалифицированным в данной области, на основе данной заявки. На практике содержание белка не будет выше, чем около 60 масс.%, и, предпочтительно, не выше, чем 50 масс.%.
S1
S2
2+
По предпочтительному объекту изобретения съедобный белок основан на казеине, и, в частности, на казеинах коровьего молока. Казеин коровьего молока состоит, в основном, из α-, α-, β- и κ-казеина в соотношении 4:4:2:1. Серии и треонилфосфаты α-и β-казеинов могут взаимодействовать с кальцием (Са) и другими би- и трехвалентными ионами. Благодаря этому взаимодействию, дисперсии казеината кальция содержат белковые агрегаты, которые являются сравнимыми с мицеллами казеина (~100-300 нм) в молоке; казеинат натрия имеет более открытую третичную структуру и образует белковые агрегаты размером около 50 нм.
Из-за более больших белковых агрегатов в дисперсиях казеината, содержащих бивалентные и более высоковалентные катионы, где катионы должны быть безопасны для употребления, и наиболее предпочтительно, содержащих ионы кальция, казеинаты, содержащие бивалентные и более высоковалентные катионы, являются особенно предпочтительными для использования в данном изобретении. Однако также могут быть использованы соя (дезодорированная) и другие растительные белки, получаемые из масличных семян; в целом, растительные белки, концентраты сывороточного белка (порошки КСБ), фильтраты сыворотки, молочные белки, казеины, белки картофеля, овальбумины и смеси таких белков.
Для перекрестного сшивания белка относительно большое количество типов ферментов является подходящим в принципе, таких как протеиндисульфидизомераза, сульфгидрилоксидазы, полифенолоксидазы, лизилоксидазы, пероксидазы, трансглутаминазы, грибная тирозиназа, липоксигеназы и глюкозоксидазы. Упомянутые ферменты катализируют различные реакции, и в зависимости от белков, присутствующих в исходных продуктах, подлежащих ориентированию, квалифицированный работник может выбрать подходящие ферментаты. Весьма подходящими являются трансглутаминаза, пероксидаза и глюкозоксидаза, помимо прочего из-за их доступности.
В предпочтительном воплощении, трансглутаминазу используют в качестве фермента для перекрестного сшивания белка. Два типа трансглутаминазы известны: животная и микробная. В противоположность животной трансглутаминазе, активность трансглутаминазы микробного происхождения не зависит от присутствия ионов кальция. Фермент трансглутаминаза катализирует специфические реакции перекрестного сшивания между белками. Более конкретно, глутаминовая группа одной белковой молекулы связывается путем ковалентной связи с группой лизина другой белковой молекулы, в результате чего могут быть образованы межмолекулярные связи.
Как указано, предпочтительный белок для использования в способе изобретения, основан на казеине, и, более предпочтительно, является казеинатом кальция. Казенны образуют подходящий субстрат для трансглутаминазы. Для дальнейшего описания этого фермента, ссылаются на статьи Lorenzen and Schlimme in the Bulletin of the IDF 332, pages 47-53, in Kieler Milchwirtschaftliche Forschungsberichte 49(3) 221-227 (1997), and in Nahrung-Food 42(3-4) (1998) 151-154, to Nonaka et al., J. Food Sc. 57(5) (1992) 1214, и ЕР-А-0610649. Трансглутаминаза является коммерчески доступной, помимо прочего, из Ajinomoto Co., Inc. Tokyo, Japan.
Изобретателями было найдено, что отверждение с использованием фермента перекрестного сшивания, является существенным для того, чтобы достичь образования желаемой анизотропной структуры. Волокнистые материалы, полученные по способу изобретения, показали анизотропию, как на микро-, так и на макроуровне, как можно было определить с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и механического анализа соответственно.
СЭМ выявила белковые волокна с диаметром ~100-200 нм, тогда как визуально наблюдали волокна до 1 мм.
Как простой сдвиг, так и фермент перекрестного сшивания, предпочтительно, трансглутаминаза, влияли на укрепление волокон в большой степени, тогда как механические свойства в направлении, перпендикулярном поперечному потоку, оставались постоянными.
Реологические свойства были изотропными, и на них оказывал влияние только фермент перекрестного сшивания.
После сдвиговой деформации казеината Са без трансглутаминазы, слабо анизотропная слоистая структура была обнаружена, но никакие волокна не образовывались. Как перекрестное сшивание в отсутствие сдвига, так и перекрестное сшивание во время смешивания, приводило к гелям казеината Са без какого-либо ориентирования.
Следовательно, настоящее изобретение основано на синергетическом влиянии, полученном при сочетании применения простого сдвига и перекрестного сшивания с помощью фермента. Этот эффект иллюстрирован в Таблице 2 в Примере 1 здесь ниже для казеината Са с использованием простого сдвига и трансглутаминазы (ТГА; также описываемой как Тгаза). Получены значения механических свойств при растяжении, нормализованные соответствующими величинами образцов казеината Са, так что эффект сдвига (подвергшегося сдвигу и перекрестно-сшитого казеината Са, нормализованного перекрестно-сшитым казеинатом Са в условиях неподвижности), и ТГА (подвергшегося сдвигу и перекрестно-сшитого казеината Са, нормализованные подвергшимся сдвигу казеинатом Са без ТГА) мог быть прослежен. Как сдвиг, так и ТГА, в большей степени влияли на механические свойства при растяжении в параллельном направлении, а значит, в направлении анизотропных микроструктур. Кроме того, с учетом величин нормализованного напряжения пластического течения, укрепляющий эффект сдвига (в присутствия ТГА) был почти вдвое больше, чем эффект одной ТГА.
В способе настоящего изобретения образуется слоистая структура. В частности, ферментативное перекрестное сшивание во время простого сдвига меняет морфологию белковых агрегатов на волокна.
По второму основому объекту настоящее изобретение, следовательно, относится к волокнистой иерархической съедобной белковой структуре, имеющей анизотропию на микроуровне (т.е. имеющей ориентированную структуру, при изучении морфологии с использованием СЭМ) и на макроуровне (т.е. имеющей ориентированную структуру при изучении морфологии на глаз). Анизотропию на макроуровне можно также определить с использованием испытания прочности на разрыв; для анизотропии на макроуровне различные значения прочности при растяжении получают при измерении испытуемого образца в различных направлениях.
Эти белковые структуры ведут себя как мясо и даже коричневеют при выпекании. Чтобы сделать эту коричневую окраску более ярко выраженной, можно добавить небольшую долю восстанавливающих сахаров, предпочтительно, лактозы.
По третьему основному объекту настоящее изобретение относится к рыхлым волокнистым частицам, имеющим анизотропную форму волокон, подходящим для использования в качестве ингредиента для пищевого применения. Из-за дисперсного характера эти частицы обладают эффектом увеличения вязкости. Эти частицы позволяют регулировать вязкость продукта в широких пределах, включая от очень жидких вплоть до почти твердых продуктов.
В дополнение, волокнистые частицы могут влиять на поведение потока (вязких) жидких продуктов. Анизотропный характер частиц обеспечивает дополнительный эффект для увеличения инерции систем, где такие волокна используют. Подобные эффекты применяют к более твердым системам, имеющим свойства текучести. С помощью тонкого регулирования структуры белка; т.е. путем получения структуры с более высоким или более низким количеством анизотропии на микро- или макроуровне, могут быть получены продукты, имеющие одинаковое содержание белка, которые имеют совершенно различную вязкость и/или текучесть.
Анизотропный характер дисперсной фазы может также давать возможность реализации свойства сдвигового утончения и, при желании, свойства текучести продукта. Т.е., когда густой продукт подвергают сдвигу, вязкость указанного продукта снижается. Густой продукт может становиться текучим или таким, что его можно зачерпнуть ложкой, и может затем становиться густым снова.
Как упомянуто выше в отношении "несдвигового оборудования", для некоторых применений, возможно, получать материал, в котором анизотропные части содержатся в изотропной матрице. Примером этого является также способ получения рыхлых волокон, т.е. волокон, которые не обязательно являются частью иерархической структуры, но которые значительно отделены друг от друга матрицей. Для того чтобы получить такие рыхлые волокна, представляется существенным иметь дополнительную фазу, присутствующую в суспензии, которая должна быть подвергнута сдвигу. В частности, полисахариды или белки, которые не вступают в химические связи, могут образовать рыхлые волокна. В присутствии этой дополнительной фазы устанавливаются более непрочные отношения в иерархической организации, что может закончиться образованием рыхлых волокон. Следовательно, в зависимости от присутствия другой фазы, присутствующей в суспензии, и в зависимости от параметров обработки можно получить иерархическую структуру или рыхлые волокна, или целую серую зону между рыхлыми волокнами и иерархической структурой. См. в свете этого также рабочий пример 3, здесь ниже.
Подходящими полисахаридами для использования в этом способе являются ксантан, каррагиннан, галактоманнан, гуаровая камедь, камедь актинидии аргута, камедь бобов рожкового дерева, гуммиарабик, пектин, целлюлоза, включая карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ), метилцеллюлозу (МЦ), гидроксипропилцеллюлозу (ГПЦ) и крахмалы, включая модифицированные крахмалы.
Полисахариды позволяют восстанавливать белковое содержимое в суспензии для обработки согласно изобретению и/или позволяют варьировать связность и/или тканеобразующую способность волокон и могут, в конечном счете, приводить к образованию рыхлых волокон.
Подходящие количества таких белков или полисахаридов, которые следует добавить к суспензии, обычно находятся в диапазоне от 0,01-5 масс.%, предпочтительно, 0,05-3 масс.%, более предпочтительно, 0,1-1,5 масс.% и/или количество дополнительного белка или полисахарида по отношению к массе белка, подлежащего ориентированию, составляет в пределах 1:1000-1:5, предпочтительно, 1:500-1:8, более предпочтительно, 1:100-1:10.
В предпочтительном воплощении эти волокнистые структуры получают по способу изобретения.
Более предпочтительными являются волокнистые структуры, основанные на казеинате, перекрестно-сшитом трансглутаминазой.
параллельное
перпендикулярное
параллельное
перпендикулярное
Анизотропные волокнистые образцы настоящего изобретения являются гораздо прочнее в параллельном направлении, по сравнению с перпендикулярным направлением. Это в особенности может отразиться на соотношении напряжений текучести. В предпочтительном воплощении волокнистая структура по изобретению имеет соотношение напряжений текучести σ/σ по меньшей мере, 6, предпочтительно, по меньшей мере 7 и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 8. Для казеината кальция, соотношение напряжений текучести σ/σ может подходяще составлять около 9.
Образование сдвиг-индуцированных и ферментативно-индуцированных анизотропных структур было объяснено улучшенным фазовым разделением белковых агрегатов, благодаря сдвигу и сопутствующему отверждению выстраивающихся белковых агрегатов.
Ферментативное гелеобразование казеината кальция с использованием простого сдвига и ферментативного перекрестного сшивания индуцирует образование новой волокнистой белковой структуры. Полученные микроструктурные свойства были изучены с помощью анализа методом СЭМ. Выявлены структурные характеристики при малых и больших деформациях, приводящих к желаемым линейным вязкостно-эластичным свойствам и желаемым механическим свойствам, которые будут здесь ниже описаны более подробно для структур казеината кальция, перекрестно-сшитых трансглутаминазой.
На практике, сначала раствор или дисперсия белка в подходящей среде, предпочтительно водной среде, готовят в виде премикса. Этот премикс переносят в сдвиговую камеру, и предпочтительно, нагревают до температуры между 35 и 50°С. Фермент для перекрестного сшивания либо вносят в сдвиговую камеру, либо, предпочтительно, уже в премикс, и смесь подвергают простому сдвигу. Для оптимальных результатов, т.е. для хорошо образованного поля сдвига, требуется полное заполнение сдвиговой камеры. Сдвиг должен быть достаточно значительным, чтобы осуществить ориентирование белкового материала, но не слишком большим, потому что тогда структура может разрушиться.
Согласно изобретению анизотропная волокнистая белковая структура, и предпочтительно, анизотропная структура казеината Са, образовывалась с использованием технологии, основанной на сдвиг-индуцированном образовании структуры и сопутствующем отверждении. Ферментативное перекрестное сшивание в ходе сдвига оказывается существенным для образования анизотропных структур. Простота способа, в сочетании с получением высокой анизотропии свидетельствуют о высоком потенциале технологии новых пищевых структур и их применения.
-1
Т.к. указанное перекрестное сшивание в ходе сдвига является существенным, подбор типа и активности фермента, скорости сдвига и времени обработки, для конкретного используемого белка зависят от конкретного белка. Для водной среды, содержащей 25-30 масс.% казеината кальция, например, минимальная скорость сдвига в аппарате, показанном на Фигуре 1 (см. здесь ниже), с использованием трансглутаминазы (ТГА) составляет 24 с, причем время обработки составляет между 300 и 3600 с. Оптимум температуры определяется используемым ферментом. Для ТГА это составляет около 50°С.
В рабочих примерах здесь ниже, казеинат кальция в сочетании с ТГА используют в качестве модельной системы изобретения. Показано, что после сдвига и ферментативного перекрестного сшивания с использованием ТГА образовывались анизотропные волокнистые структуры в матрице концентрированного казеината Са на макро- и микроуровне. Волокна до 1 мм наблюдали визуально, тогда как СЭМ-изображения выявили белковые волокна диаметром ~50-200 нм, которые были скомпонованы из цепочечных белковых доменов.
В отсутствие ТГА, слоистая и слабо анизотропная структура была найдена, но никаких волокон не было образовано. Перекрестное сшивание в отсутствие сдвига приводило к плотному гелю казеината Са без какого-либо ориентирования. Линейные вязкостно-эластичные (ЛВЭ, LVE) свойства показали увеличение G и уменьшение tanδ благодаря прибавлению ТГА. Эти свойства были изотропными (т.е. не зависящими от направления прилагаемого усилия).
Напротив, механические свойства при растяжении подтвердили присутствие анизотропных структур, в особенности, на основе больших различий между величинами напряжения текучести в параллельном и перпендикулярном направлении, по сравнению с прилагаемым сдвиговым потоком (см. здесь ниже). Сдвиг влиял на укрепление анизотропных волокон в большей степени, тогда как свойства в перпендикулярном направлении оставались постоянными. ТГА также значительно влияла на образование структуры в направлении сдвига.
При сдвиге концентрированной белковой дисперсии образовывалась слоистая структура, которая схематически показана на Фигуре 10. Ферментативное перекрестное сшивание в ходе сдвига изменяло морфологию белка на морфологию волокон. Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, выдвинули гипотезу, что в способе настоящего изобретения фазовое разделение белковых агрегатов на молекулярном уровне в результате сдвига приводит к сдвиг-индуцированном и ферментативно-индуцированных анизотропным структурам. Ферментативное перекрестное сшивание требуется для отверждения выстроенных белковых агрегатов, которые, возможно, смягчатся по завершении сдвига, когда никакого отверждающего агента нет.
2+
В рабочих примерах здесь ниже используют высококонцентрированную систему казеината, где агрегаты казеина плотно упакованы или находятся в сдавленном состоянии. Локальное фазовое разделение на богатую белком фазу и фазу с низким содержанием белка с низким поверхностным натяжением на границе раздела, которое могло уже присутствовать в остальной системе, было улучшено путем сдвига, приводящего к ориентированию в этих фазах. В отсутствие ТГА, комбинированное действие сдвига и взаимодействия с ионами Са приводило к образованию макроструктуры слоистого казеината Са, которая показывала анизотропное поведение в ходе испытаний на эластичность. По контрасту, на микроструктуру едва ли влиял сдвиг. Это привело бы к слоистой структуре, подобной той, что показана на Фигуре 10А. Похоже, что ориентирование в казеинате Са на микроуровне присутствовало, благодаря фазовому разделению и сдвигу, но что временная шкала используемого способа отверждения, т.е. охлаждения, была гораздо длиннее, чем время релаксации ориентированных белковых блоков. Поэтому, подвергшийся сдвигу казеинат Са не давал волокнистую структуру. В присутствии ТГА перекрестное сшивание, возможно, увеличивало размер агрегатов казеината Са, что делало их даже более чувствительными к ориентированию путем сдвига. Кроме того, в фазово-отделенной богатой белком фазе, ТГА индуцировала ковалентное связывание в направлении потока. Т.к. отверждение происходило в более короткой временной шкале, чем релаксация, волокнистая микро- и макроструктура сохранялась после завершения сдвига.
Казеинат Са и казеинат Na имеют различные физические свойства и поэтому требуются различные режимы для получения анизотропных структур. Что касается различий в сдвиг-индуцированном образовании структуры плотных дисперсий казеината, рассматривают следующую концепцию.
Мы рассматриваем плотные казеинатные дисперсии как системы, содержащие коллоидные близко упакованные мягкие сферы, и как полуразбавленные полимероподобные системы с переплетениями, которые могут быть образованы и разрушены в зависимости от времени и сдвигового потока. Сдвиг может только индуцировать образование структур в этих системах, если его эффект не может быть компенсирован подвижностью системы. Это показывает, что истинные физические свойства казеината Са являются такими, что сдвиг-индуцированное образование структуры является благоприятным в масштабах времени, в которых мы проводили изучение.
На основании результатов, полученных на основе казеината Са, будет очевидно лицу, квалифицированному в данной области, каким образом подобные, новые и пригодные анизотропные волокнистые структуры могут быть получены на основе других съедобных белков. Хотя конкретные условия могут варьироваться в зависимости от белка, квалифицированный специалист будет способен оценить, являются или нет выбранные условия подходящими для того, чтобы получить требуемую анизотропию.
Условия, которые следует принимать во внимание при обращении к изобретению по поводу любого настоящего съедобного белка, включают скорость сдвига, продолжительность сдвига, температуру, сдвиговую вязкость, противоионы, концентрацию белка, размер частиц белка, силу взаимного притягивающего взаимодействия, немонотонное поведение потока, значительные нормальные нагрузки.
Не связывая себя теорией, изобретатели отмечают, что с помощью сведений, раскрываемых изобретением, теоретические модели могут быть применены для определения условий способа. Это иллюстрировано ссылкой на Na-казеинат.
В целом, сдвиговый поток будет иметь тенденцию ориентировать структурные элементы в направлении сдвигового потока, если гидродинамические силы преобладают над Броуновским движением, что выражается числом Пекле: Macosko С.W. (1994). Rheology: Principles, measurements, and applications. New York: Wiley-VCH:
а
Радиус структурных элементов обозначают с ,
представляет собой скорость сдвига, η представляет собой вязкость (сдвига) растворов, k является константой Больцмана, а Т представляет собой температуру. Число Ре суммирует основные параметры (т.е. размер частиц и скорость сдвига), что соответствует сдвиг-индуцированному ориентированию частиц, или, в данном случае, мицеллярных белков.
Если Ре применить в качестве правила подобия для казеинатов Са- и Na-, скорость сдвига, при которой на казеинат Na будет влиять сдвиговый поток
a
a
a
a
NA
CA
NA
CA
CA
NA
-1
2
Полагая, что размер агрегатов Na-казеината  составляет в 5 раз меньше, чем размер агрегатов казеината Са  (считая  ~25 нм и  ~125 нм (De Kruif С.G. (1998). Supra-aggregates of casein micelles as prelude to coagulation. Journal Of Dairy Science, 81(11), 3019-3028. Lucey J. A., Srinivasan M., Singh H. & Munro P. A. (2000). Characterization of commercial and experimental sodium casemates by multiangle laser light scattering and size-exclusion chromatography. Journal Of Agricultural And Food Chemistry, 48(5), 1610-1616. Dickinson E., Semenova M.G., Belyakova L. E., Antipova A.S., Il′in M.M., Tsapkina E.N. & Ritzoulis, C. (2001). Analysis of light scattering data on the calcium ion sensitivity of casemate solution thermodynamics: Relationship to emulsion flocculation. Journal Of Colloid And Interface Science, 239(1), 87-97), и что существует различие, примерно в 2 раза в сдвиговой вязкости η(η≈2·η при скорости сдвига ~120 с), можно сделать вывод, что скорость сдвига, требуемая для индуцирования ориентирования составляет примерно в 2,5·10 раза больше, по сравнению с казеинатом Са.
Другой критерий для сдвиг-индуцированного ориентирования базируется на числе Деборы (De) (т.е. произведении τ и скорости сдвига), которое должно превышать величину 1:
(Forster, S., Konrad, M. & Lindner, P. (2005). Shear thinning and orientational ordering of wormlike micelles. Physical Review Letters, 94(1), 17803-17801-17804). Следующее правило подобия, включающее взаимодействие, является тогда применимым
2
При использовании числа De в качестве правила подобия для казеинатов Са и Na, также можно заключить, что скорость сдвига, необходимая для индуцирования ориентирования в казеинате Na, является на 2 порядка (10) выше, по сравнению со скоростью сдвига, необходимой для казеината Са, что находится в соответствии с предположением, основанным на числе Ре. Оба: Ре и De показывают факторы, которые являются важными для сдвиг-индуцированного образования структуры, такие как скорость сдвига, сдвиговая вязкость, размер частиц и взаимодействие белков. На эти факторы влияют и ингредиентные свойства, и обработка, что подчеркивает важность для квалифицированного лица согласовывать эти аспекты для образования структуры казеинатов. Кроме того, использование этих безразмерных чисел находится в соответствии с механистическим подходом к казеинатным системам, как, с одной стороны, к близко упакованным сферам, а с другой стороны, к переплетенным полимерным сеткам.
Специалист, квалифицированный в данной области знаний, будет осознавать важность определенных факторов, касающихся сдвиг-индуцированного образования структуры в промышленно важных материалах:
1. На образование волокна за счет сдвига и ферментативного перекрестного сшивания влияют, например, присутствующий противоион и концентрация белка для получения анизотропных структур, что затрагивает в значительной степени реологическое поведение;
2. Сдвиг-индуцированное образование структур, наиболее вероятно, происходит, если исходный материал является чувствительным к упорядочению путем сдвига. Более большие мицеллярные структурные элементы и выраженные взаимодействия притяжения в казеинате Са, по сравнению с казеинатом Na, отвечают за различия обнаруженные при образовании структуры. В целом, с помощью сведений, раскрываемых в изобретении, специалисту, квалифицированному в данной области, будет очевидно, что в зависимости от белка концентрация ионов (таких, как кальций в случае казеината кальция) тоже будет определять полученную анизотропию;
3. Представляется, что промышленно важные белковые смеси демонстрируют сходство с модельными материалами, часто используемыми для изучения сдвиг-индуцированного образования структур, как, например, сходство типов структур и реологического поведения. Основными сходствами, наблюдаемыми в поведении последних, были немонотонное поведение потока, значительные нормальные нагрузки и взаимодействие притяжения, что, к тому же показывает, что реологические измерения являются пригодными для анализа способности белков образовывать структуру. Будет понятно, с помощью сведений, раскрываемых изобретением, что такие параметры, как время релаксации и сдвиговое утончение или уплотнение, могут быть использованы для оценки, без чрезмерного экспериментирования, потенциальной годности белковой суспензии для получения иерархической волокнистой структуры согласно изобретению.
Волокнистые пищевые материалы настоящего изобретения могут содержать добавки. Таким образом, смеси могут содержать одну или более добавок, в частности одну или более добавок, выбранных из группы, состоящей из отдушек, дополнительных питательных ингредиентов, ингредиентов для пользы здоровья и красителей. Путем прибавления одного или более соответствующих приправ и/или красителей могут быть получены желаемые вкус и/или внешний вид.
Другими добавками являются, например, консерванты, для которых бензоат натрия является хорошо известным примером.
Для настоящего изобретения было найдено, что бензоат натрия является предпочтительным ингредиентом также для облегчения образования желаемых волокон. Не связывая себя теорией, изобретатели в настоящее время полагают, что добавление солей, таких как бензоат натрия, из-за увеличения ионной силы белкового раствора, способно влиять на взаимодействие белок-белок, которое влияет на термодинамику системы. В частности, в случае казеината кальция соли подходящей ионной силы способны конкурировать с казеинатом за связывание с кальцием. Таким образом, полагают, что путем частичной потери связей с кальцием, структура казеината теряет внутреннюю связность, и поэтому становится более восприимчивой к сдвигу, и лучше способной к ориентированию. И опять же, специалист, квалифицированный в данной области, будет способен подходящим прямым способом определить для данной системы белков с или без добавления солей, являются ли выбранные условия достаточными для того, чтобы получить требуемую анизотропию путем простого сдвига.
Соль, предпочтительно, содержит одновалентный катион и двухвалентный анион пищевого качества. Примеры включают соли, такие как известные при изготовлении плавленого сыра, такие как лактат натрия, цитрат натрия и фосфат натрия и другие соли, имеющие сравнимое сродство к связыванию кальция, такое, чтобы конкурировать с кальцием, связанным в белке.
Особенно подходящими являются D-лактат натрия и триполифосфат натрия. Эти соли могут быть использованы в целом в пределах от 0,1 до 10 масс.%. Предпочтительно, 0,1-4 масс.%, и, более предпочтительно, 0,1-2,5 масс.%. Казеинат натрия может быть также использован и обычно в более высоких концентрациях от 1 до 40 масс.%.
По еще одному объекту изобретения, в способе используют дополнительное присутствие жира. Когда жир присутствует в композиции, используемой в способе, жир индуцирует структуру на мезоуровне, в дополнение к анизотропии на микро- и макроуровне, что уже имело место в белково-водной системе. Жир может присутствовать в суспензии в количестве вплоть до 30 масс.%, а иногда даже выше. Предпочтительно, количество жира составляет менее чем 25 масс.%, более предпочтительно, менее чем 20 масс.%.
Подходящие жиры включают все виды растительных и животных жиров. Предпочтительные животные жиры включают молочный жир и, в особенности, жир коровьего молока. Предпочтительные растительные жиры включают жир подсолнечника, жир соевых бобов, жир семян рапса, жир зерновых и кукурузы и их смеси. В предпочтительном воплощении используют жир с большим соотношением полиненасыщенных жиров к насыщенным жирам (ПНЖ/НЖ) по сравнению с молочным жиром. Используемый жир должен быть жидким во время обработки. Использование жира в качестве второй фазы позволяет осуществлять структурирование в дополнительном диапазоне длины в иерархических белково-жировых материалах, по сравнению с однофазным белком. Одновременное ферментативное перекрестное сшивание с использованием трансглутаминазы (ТГА) позволяет фиксировать сдвиг-индуцированную структуру. В рабочих примерах эффект скорости сдвига, времени сдвига и концентрации белка показан на образовании анизотропных структур на основе казеината Са и пальмового жира путем применения простого сдвига и ферментативного перекрестного сшивания с использованием ТГА. Структуры казеинат Са-жир изучали с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (ЛСКМ) и сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Малые и большие деформации обеспечили понимание линейных вязкостно-эластичных (ЛВЭ) свойств, включая свойство ползучести, и механических свойств при растяжении, соответственно, для уникальных материалов: казеинат Са-жир.
Более подробно, для пробной системы, основанной на дисперсии казеината кальция и пальмового жира, иерархические волокнистые материалы образуются после ферментативного перекрестного сшивания при хорошо выраженной деформации. Увеличение времени сдвига влияло на переход от волокнистых материалов к нарушенным структурам, сопровождающийся синерезисом.
-1
-1
-1
Что касается влияния жира на образование структуры, отмечают, на основе СЭМ-изображения, что подвергшиеся сдвигу и перекрестно-сшитые волокнистые структуры казеината Са, содержащие жир, показывают небольшое отличие от волокнистых структур без жира. Толщина волокна, согласно оценке, была более или менее одинаковой (~100-200 нм), что находится в пределах толщины мицелл казеина. Однако, с помощью ЛСКМ, наблюдали дополнительный диапазон длин в белково-жировых материалах, где были видны пучки белка и растянутые или деформированные жировые структуры. Связи образуются только в направлении сдвигового потока, что, скорее всего, облегчается уже ориентированием белка, индуцированным сдвигом. Присутствие жира мешает образованию ковалентных связей в направлении, перпендикулярном потоку, тем самым, возможно улучшает волокнистый характер материала. Показатели механических свойств волокнистого образца, содержащего жир, были слегка выше, по сравнению с волокнистым образцом белка без жира, что предполагает укрепление структуры твердой жировой фазой. Соотношения механических свойств, измеренных параллельно и перпендикулярно сдвиговому потоку, были подобны волокнистому образцу без жира, имеющему также высокое соотношение напряжений текучести, составляющее около 8-9. В отсутствие ТГА, капли жира были больше и менее деформированы в изотропном материале казеинат Са-жир, по сравнению с жировыми каплями, присутствующими в волокнистой структуре, содержащей ТГА. В присутствии ТГА, вязкость в матрице будет возрастать с увеличением сдвигового времени, что приводит к большим вязкостным силам и, следовательно, к разрушению капли. Однако увеличение эластичности матрицы будет увеличивать удлинение дисперсной фазы, и временную ровную ориентацию по направлению потока. Соотношение вязкостей фаз также влияет на образование структуры в ходе отчетливо выраженной деформации: когда вязкость дисперсной фазы является более низкой, чем вязкость матричной фазы, что, вероятно, имеет место в ходе сдвига и перекрестного сшивания казеината Са и жира, капли будут удлиняться в ходе сдвига. Что касается влияния концентрации белка на образование структуры, отмечают, что дисперсии казеината Са содержат белковые агрегаты, которые являются сравнимыми с мицеллами казеина (~100-300 нм) в молоке. Эти структурные элементы, скорее всего, являются чувствительными к ориентированию под действием сдвига, когда гидродинамические силы преобладают. ТГА индуцирует ковалентные связи в белковой фазе, тем самым, увеличивая размер казеиновых кластеров, что увеличит их чувствительность к ориентированию под действием сдвига. На основе того факта, что после сдвига при 24 собразовывался изотропный материал, полагают, что приложенная скорость сдвига была слишком низкой для ориентирования структурных элементов, т.е. молекул казеина или, лучше, мицелл казеина, которые были перекрестно-сшиты при относительно более высокой скорости. Сдвиг при относительно высокой скорости сдвига (>120 с) требовался для ориентирования и создания волокон. Если скорость сдвига является слишком низкой, матрица белка является более вязкой, благодаря протеканию сдвигового утончения. Поэтому, наверное, образуется более редкая ковалентная сетка, которая будет быстро достигать состояния проницаемости. Сдвиг при высокой скорости сдвига (240 с) приводил к улучшенной волокнистости, что отражалось на механических свойствах. Это может быть объяснено увеличением разделения микрофаз, благодаря высокой скорости сдвига, приводящим к большему количеству волокон, и присутствием малых капель жира в тонких слоях. Резюмируя, можно сказать, что скорость сдвига, по-видимому, является существенным инструментом, влияющим на создание и степень волокнистости волокнистых материалов на основе казеината Са и жира.
s
s
s
s
-4
-4
а
Согласно изобретению соотношение между скоростью перекрестного сшивания и скоростью сдвига определяет образование волокнистых структур. Результаты этого суммированы на диаграмме (Фигура 21) для того, чтобы предоставить обзор типов структур, которые могут быть получены. На оси у скорость отверждения (r) и скорость сдвига, дающие / r /j, изображены как функция от времени процесса. В случае ферментативного перекрестного сшивания, π возрастает с увеличением [Е/Р] (Ф:Б), тогда как скорость сдвига интерпретируют как меру ориентирования. Все точки, соответствующие экспериментальным данным для материалов 30% казеинат Са-жир, показаны на диаграмме, кроме материалов 25% казеинат Са-жир, для того, чтобы исключить эффекты концентрации белка, которые влияют на [Е/Р], а также на вязкость. Ожидают, что последние эффекты являются высоко нелинейными и требуют дальнейшего исследования. На основе экспериментальных данных и теоретического рассмотрения, четыре структурных области могут быть построены на диаграмме: (1) волокнистые структуры, обозначаемые F, (2) «гранулированные» структуры, которые являются поврежденными и разрушенными структурами после чрезмерного сдвига, обозначаемые G, (3) изотропные твердые материалы, которые являются перекрестно-сшитыми до твердого состояния, но не ориентированными, обозначаемые Is, и (4) изотропное жидкие материалы, которые являются материалами, содержащими такую же консистенцию, как исходный материал, обозначаемые I1. При фиксированном соотношении [Е/Р]/ γ<6,10, три структурных перехода может происходить при увеличении времени процесса. Во-первых, образуется изотропная жидкость при малых временах процесса, когда либо γ→∞, либо [Е/Р]→0. Структурные элементы, ответственные за сдвиговое ориентирование, когда гидродинамические силы преобладают, будут выстраиваться при высоких скоростях сдвига, но будут терять свою ориентацию, если никакого отверждения не применяют. Однако, при очень низкой скорости отверждения, ориентация будет фиксироваться в течение большего необходимого времени, что приведет к образованию волокнистого материала. Этот переход показан линией а. При еще больших временах процесса выстроенная структура будет разрушена, с образованием «гранулированных» структур, сопровождающимся синерезисом, что показано линией перехода b, зависящей от времени. В определенной точке, когда скорость отверждения преобладав над скоростью сдвига ([Е/Р]/ γ>~8,10), происходит не зависящий от времени переход волокнистых материалов в изотропные твердые, что иллюстрирует линия с. Когда γ→0 или [Е/Р]→∞, также существуют три зависящих от времени перехода. В очень малых временных масштабах образуется изотропная жидкость, которая быстро преобразуется в изотропную твердую фазу с редкой высоко проницаемой сеткой (линией ). Т.к. прочность сетки возрастает с течением времени, можно ожидать переход в гранулированную область (линия b) в результате разрушения структуры. При увеличении скорости отверждения, переход от изотропного твердого к гранулированному материалу будет происходить за более короткое время, что объясняет асимптотическое поведение линии b. Аналогично, линия а также является асимптотичной по отношению к оси у. Нужно отметить, что значения [Е/Р]/γ являются произвольными и специфическими для исследуемой системы. Однако предполагают, что существование двух зависящих от времени (а, b) и одного не зависящего от времени (с) перехода, которые делят структурную диаграмму на четыре отдельных области, из которых область волокнистости является самой узкой, является характерным для способа структурирования, основанного на отчетливо выраженной текучести и отверждении. Диаграмма предлагает объяснение, почему процессы структурирования, иные, чем отчетливо выраженные процессы истечения, не приводят к высоко ориентированным и волокнистым структурам. Во время смешивания, биополимеры подвергаются относительно низкоскоростному сдвигу, а иногда сдвигу с высокими пиковыми скоростями. Благодаря внутреннему движению во время смешивания, макромолекулы непрерывно переориентируются, и в результате весь материал будет обрабатываться при этих высоких пиковых нагрузках, которые могут привести к разрушению структур. Поэтому, во время смешивания материал никогда не достигнет области волокнистости, т.к. изотропная твердая (область Is), или даже гранулированная структура (область G), будет образована быстро. Другим способом структурирования является экструдирование, во время которого биополимеры имеют тенденцию к ориентированию в щелевых матрицуах, благодаря ламинарному потоку, в то время как структуры, возможно, фиксируются дисульфидными связями и гидрофобным взаимодействием во время охлаждения. Степень волокнистости, в значительной мере, определяется скоростью охлаждения и длиной отверстия матрицы, что эквивалентно скорости отверждения и времени процесса соответственно. Об ориентировании на молекулярном уровне для экструдированных волокнистых материалов на основе белков не сообщали. Высокое давление, требуемое для проталкивания материала через матрицу, в сочетании с высокими температурами приводит к высоким сдвиговым нагрузкам на материал внутри экструдера, что приводит к сильному повреждению белка и риску синерезиса.
-1
-1
-1
Новый способ структурирования по изобретению, основанный на отчетливо выраженном сдвиговом потоке и ферментативном перекрестного сшивании, приводит к высоковолокнистым структурам на макро- и микроуровне в плотных дисперсиях казеината Са. Присутствие жира индуцировало дополнительный диапазон длин на мезоуровне, т.к. пучки (~40 мкм) белковых волокон (~100-200 нм) были разделены слоями жира и деформированными каплями жира (~10 мкм). Как время сдвига, так и скорость сдвига, сильно влияют на образование волокнистых структур. Для 30% казеината Са, волокнистые структуры наблюдали уже через 5 мин сдвига при 120 с, но разрушение волокнистой структуры наблюдали после длительного сдвига в течение 60 мин. В случае 25% казеината Са разрушение наблюдали раньше, т.к. относительная скорость перекрестного сшивания возрастала в этой системе. Низкая скорость сдвига (24 с) приводила к изотропной структуре, тогда как сдвиг с высокой скоростью сдвига (240 с) приводил к более высокой степени волокнистости. ЛВЭ-свойства и свойства ползучести дали представление о влиянии ковалентных связей, индуцированных ферментом в ходе образования структуры, независимо от их ориентации. Испытания эластичности показали, что ковалентные связи образовывались в направлении сдвигового потока.
Волокнистые структуры образуются, благодаря сочетанию свойств исходного продукта, что требуют наличие структурных элементов, которые являются ответственными за ориентирование с помощью сдвига, и вполне определенных условий процесса, подразумевающих линейный сдвиговый поток и отверждение ориентированных структур.
Изобретение будет описано более подробно, по мере обращения к следующим неограничивающим притязания примерам и фигурам.
На Фигурах:
плоскость
плоскость, проекция
конус
конус, проекция
Фигура 1 показывает устройство сдвиговой камеры. Сдвиговая камера основана на идее реометра и пилотной камере масштабного сдвига. Конический угол = 100°; угол между конусом и плоскостью (сдвиговой зоны) = 2,5°; R = 0,08508 м; R = 0,06750 м; R = 0,07638 м; R = 0,05851 м. Неподвижный конус и вращающуюся плоскость нагревают/охлаждают водой.
Фигура 2 показывает изображение подвергшегося сдвигу и перекрестно-сшитого 30% казеината Са после испытаний на эластичность (А). Заметно волокно, которое стало видимым после удлинения в ходе измерения. После суспендирования того же образца в течение 1 дня в деминерализованной воде, были видны отдельные волокна (В).
Фигура 3 показывает СЭМ-изображения поверхностей разрыва: параллельной (левая колонка; градиент скорости - плоскость сдвигового потока) и перпендикулярной (правая колонка; градиент скорости - плоскость турбулентности) сдвиговому потоку, прилагаемому в устройстве сдвиговой камеры к 30% казеинату Са и ТГА (Ф:Б=1:20) подвергшимся сдвигу при 50°С и 50 об/мин в течение 35 мин (С+TG - Сдвиг). Измерительные линейки на A3 и В3 обозначают 1 мкм.
Фигура 4 показывает СЭМ-изображения поверхностей разрыва: параллельной (левая колонка; градиент скорости - плоскость сдвигового потока) и перпендикулярной (правая колонка; градиент скорости - плоскость турбулентности) сдвиговому потоку, прилагаемому в устройстве сдвиговой камеры к 30% казеинату Са, подвергшемуся сдвигу при 50°С и 50 об/мин в течение 35 мин (С - Сдвиг).
Фигура 5 показывает СЭМ-изображения поверхностей разрыва: параллельной (левая колонка; градиент скорости - плоскость сдвигового потока) и перпендикулярной (правая колонка; градиент скорости - плоскость турбулентности) сдвиговому потоку, прилагаемому в устройстве сдвиговой камеры к 30% казеинату Са, перекрестно-сшитому с помощью ТГА (Ф:Б=1:20) в условиях неподвижности при 50°С (С+TG - Неподвижность).
Фигура 6 показывает СЭМ-изображения поверхностей разрыва в воображаемом "параллельном" (левая колонка) и "перпендикулярном" (правая колонка) направлении для 30% казеината Са и ТГА (Ф:Б=1:20), смешанных в миксере при 50°С и 50 об/мин в течение 35 мин (С+TG - mix).
Фигура 7 показывает ЛВЭ-свойства G′ (А) и tanδ (В) с 95% доверительными интервалами для различных структур 30% казеината Са. С = казеинат Са; TG=ТГА; (без) сдвига = (не)подвергшийся сдвигу в устройстве сдвиговой камеры; mix = смешано в миксере.
Фигура 8 показывает типичные кривые напряжение - деформация 30% казеината Са и ТГА (Ф:Б=1:20), подвергшихся сдвигу при 50°С и 50 об/мин в течение 35 мин (С+TG - Сдвиг), которые были растянуты в параллельном и перпендикулярном направлении по отношению к сдвиговому потоку.
Фигура 9. Эластичные свойства: напряжение текучести σ, деформация текучести ε и модуль Юнга Е с 95% доверительными интервалами для различных материалов 30% казеината Са. С = казеинат Са; TG=ТГА; (без) сдвига = (не)подвергшийся сдвигу в устройстве сдвиговой камеры; mix = смешано в миксере.
Фигура 10 показывает схематичное изображение сдвиг-индуцированной и ферментативно-индуцированной анизотропии в плотном казеинате Са: слоистая структура, наблюдаемая после сдвига в казеинате Са (А) и волокнистая структура, наблюдаемая после сдвига в казеинате Са в присутствии ТГА.
-1
-1
Фигура 11 показывает макроструктуры подвергшегося сдвигу и перекрестно-сшитого 30% казеината Са, 15% пальмового жира и ТГА(1:20): А. Волокнистая макроструктура, полученная после сдвига при 120 с в течение 30 мин; В. Разрушенная макроструктура, полученная при 120 с в течение 60 мин.
Фигура 12 показывает влияние времени сдвига на вращающий момент в ходе сдвига в устройстве сдвиговой камеры для 30% казеината Са и ТГА (1:20) (слева) и 25% казеината Са и ТГА (1:17) (справа). Все образцы содержали 15% пальмового жира. Звездочка (*) обозначает материалы, которые были неволокнистыми после сдвига. "Без TG" показывает образец 30% казеинат Са без ТГА.
Фигура 13 показывает СЭМ-изображения поверхностей разрыва: параллельной (левая колонка; градиент скорости - плоскость сдвигового потока) и перпендикулярной (правая колонка; градиент скорости - плоскость турбулентности) сдвиговому потоку, прилагаемому в устройстве сдвиговой камеры к 30% казеинату Са и 15% пальмовому жиру, перекрестно-сшитым ТГА (1:20).
-1
Фигура 14 показывает избранные ЛСКМ-изображения подвергшихся сдвигу и перекрестно-сшитых материалов: 25% и 30% казеината Са и 15% пальмового жира (ТГА 1:17 и 1:20 соответственно), полученные после сдвига за разное время при 120 с. Неперекрестно-сшитый материал 30% казеинат Са-жир также включен. Изображения были получены с поверхности турбулентность - сдвиговый поток. В. Средние кумулятивные частоты диаметров капель жира и параметра деформации D выбранных образцов казеинат Са-жир, определенные путем анализа изображений с использованием, по меньшей мере, 6 изображений при десятикратном увеличении.
Фигура 15 показывает влияние времени сдвига на ЛВЭ-свойства G′ и tanδ с 95% доверительными интервалами для 30% казеината Са и ТГА (1:20), 25% казеината Са и ТГА (1:17), и 30% казеината Са без ТГА. Все образцы содержали 15% пальмового жира. Открытые символы обозначают образцы, которые были неволокнистыми после сдвига.
Фигура 16 показывает влияние времени сдвига (А.) и скорости сдвига (В.) на нормализованные значения G', где величина G' в линейной вязкостно-эластичной (ЛВЭ) области, как функция деформации γ, измеренная с амплитудой деформации, охватывает материалы, состоящие из 30% казеината Са, 15% пальмового жира и ТГА (1:20). Нормализованные кривые являются средними по результатам двойных измерений. Образцы, обозначаемые "без TG" не были перекрестно-сшиты с использованием ТГА. Открытые символы обозначают образцы, которые были неволокнистыми после сдвига.
Фигура 17 показывает измеренные кривые ползучести для 25% и 30% казеината Са, 15% пальмового жира и ТГА (1:17 и 1:20 соответственно), полученные после различной обработки сдвигом (точки на графике). Линии представляют собой выровненные кривые с помощью 6-элементной Модели Бюргерса. Вставленный график показывает неперекрестно-сшитый, подвергшийся сдвигу казеинат Са-жир. Неволокнистые образцы обозначены звездочкой.
Фигура 18 показывает влияние времени сдвига на механические свойства при растяжении: напряжение текучести σ, деформацию текучести ε и модуль Юнга Е с 95% доверительными интервалами для 25% казеината Са и ТГА (1:17), 30% казеината Са и ТГА (1:20) или без ТГА (без TG). Все образцы содержали 15% пальмового жира. Механические свойства при растяжении измеряли параллельно и перпендикулярно сдвиговому потоку, применяемому в устройстве сдвиговой камеры.
Фигура 19 показывает влияние скорости сдвига на вращающий момент, как функцию от времени во время сдвига в устройстве сдвиговой камеры для 30% казеината Са и ТГА (1:20). Все образцы содержали 15% пальмового жира. Звездочка (*) обозначает материал, который являлся неволокнистым после сдвига.
Фигура 20 показывает влияние скорости сдвига на механические свойства при растяжении: напряжение текучести σ, деформацию текучести ε и модуль Юнга Е с 95% доверительными интервалами для 30% казеината Са с ТГА (1:20) и без ТГА (без TG). Все образцы содержали 15% пальмового жира.
Фигура 21 показывает диаграмму, основанную на соотношении скорости отверждения и скорости сдвига, как функции от времени процесса. Линии а, b и с представляют переходы в четыре структурных области: (1) изотропные жидкие материалы (II), (2) волокнистые материалы (F), (3) изотропные твердые материалы (Is) и (4) разрушенные "гранулированные" материалы (G). Кружки, треугольники и квадратики представляют волокнистые, гранулированные и изотропные материалы, соответственно, на основе 30% казеината Са, 15% пальмового жира и ТГА (1:20), полученные при различных условиях процесса.
В примерах процентные соотношения являются процентными соотношениями по массе, выведенными из общей массы композиции.
В этих примерах использованы следующие вещества:
2+
-1
Трансглутаминаза (далее, ТГА): микробная Са-независимая трансглутаминаза (белок-глутамин: амин γ-глутамилтрансфераза, ЕС 2,3,2,13), извлеченная из Streptoverticilium moberansae (1% TGA, 99% maltodextrine, ex Ajinomoto Co. Inc., Tokyo, Japan), имеющая активность 81-135 ед·г согласно инструкции изготовителя. 20% (по массе, в деминерализованной воде) раствор ТГА получали непосредственно перед серией экспериментов путем механического перемешивания при комнатной температуре в течение 1 часа;
Казеинат кальция (казеинат Са) содержал, по меньшей мере, 88% белка, согласно инструкции изготовителя (из DMV International, Veghel, The Netherlands);
Пальмовый жир получали из Barentz Raw Materials (Hoofddorp, The Netherlands). Он имеет траекторию плавления от 20°С до 37°С, подразумевающую, что жир являлся жидким во время обработки (50°С) и твердым в ходе дальнейшего анализа (20°С);
-1
Нильский Красный (72485, Sigma Aldrich), флуоресцентную краску для жира для Конфокальной Лазерной Сканирующей Микроскопии, добавляли к расплавленному пальмовому жиру в концентрации 0,1 г·л;
Диметилсульфоксид (ДМСО) и этанол, используемые для получения образцов для СЭМ, были аналитического качества (из Sigma Aldrich, Zwijndrecht, Netherlands).
В примерах данные испытаний получали с использованием следующих методов.
Сканирующая электронная микроскопия: микро- и наноструктурные аспекты материалов из казеината Са наблюдали с помощью сканирующего электронного микроскопа с полевой эмиссией (FESEM) при комнатной температуре. Сухие образцы получали, согласно модифицированному способу, описанному Muller et al. в Scanning 22 (2000) 295-303. Образцы подвергшегося сдвигу казеината Са осторожно нарезали на квадратики (<10×10 мм) и погружали в ДМСО (интервал концентраций: 15%, 30% и 50% по объему в деминерализованной воде) в течение 60 мин каждый. Избыток 50% ДМСО удаляли из образцов с помощью фильтровальной бумаги. Медленное замораживание образцов осуществляли в холодном газообразном азоте, выше жидкого азота. Затем образцы переносили в жидкий азот и получали замороженные срезы на латунном столике с помощью бритвенного лезвия (лезвийная углеродная сталь, EMS Washington USA) и молотка. Получение замороженных срезов осуществляли параллельно и перпендикулярно сдвиговому потоку, который был приложен к образцам в устройстве сдвиговой камеры (на основе плоскости сдвиговый поток - турбулентность). Образовавшиеся плоскости излома были: плоскость градиент скорости - сдвиговый поток и плоскость градиент скорости - турбулентность соответственно. Здесь эти направления и образовавшиеся плоскости излома определяют как параллельные и перпендикулярные соответственно. Смешанный образец, не имеющий никакого явного направления сдвига, обрабатывали подобным образом после определения воображаемых параллельного и перпендикулярного направлений. Все образцы казеината Са демонстрировали хрупкий излом. После получения излома образцы размораживали в 50% ДМСО в течение>60 мин, а затем регидратировали водой с помощью обратного интервала концентраций ДМСО (каждые 60 мин). Образцы дегидратировали в этаноле со ступенчато изменяющейся концентрацией (10%, 30%, 50%, 70%, 90% v/v) до 100% этанола (каждые 20 мин). Образцы в 100% этаноле высушивали в критической точке диоксидом углерода (CPD 020, из Balzers, Liechtenstein), и изучали с помощью стереомикроскопа, чтобы идентифицировать плоскость излома. Затем, образцы наклеивали на подставку для образца с использованием токопроводящего углеродного клея (Lett- С, из Neubauer Chemicalien, Germany) и покрывали с помощью распылителя 20 нм платины (JFC 1200, из JEOL, Japan). Поверхности разрыва анализировали с помощью FESEM (JEOL 6300 F, Tokyo, Japan) при комнатной температуре на рабочем расстоянии 8 мм, с SE-детектированием при 3,5-5 kV. Все изображения записывали в цифровой форме (Orion, 6 E.L.I, spri., Belgium) при скорости сканирования 100 с (полный кадр) размер 2528×2030, 8 бит.Уменьшение шума и изменение размера изображения осуществляли с помощью Adobe Phoshop CS.
max
мин
max
мин
max
мин
Конфокальная сканирующая лазерная микроскопия (ЛСКМ): мезоструктуру, определяемую как структура с промежуточным масштабом между микро- и макроуровнем, обработанных материалов казеинат Са-жир наблюдали с помощью ЛСКМ в плоскости турбулентность - сдвиговый поток. После хранения при 4°С, образцы белок-жир, извлеченные из средней части сдвиговой камеры осторожно нарезали, переносили на двухкамерные покровные стекла (из Nunc, Naperville, II, U.S.A.) и анализировали с помощью обратного LSM 510 (из Zeiss, Oberkochen, Germany). Ar-ионный лазер (488 нм) и HeNe лазер (543 нм) использовали для возбуждения образцов. Для белковой фазы применяли эмиссионный фильтр 505-530 нм, тогда как фильтр 600-650 нм использовали для жировой фазы. Изображения в цифровой форме записывали с помощью сухого объектива 10×(N.A. 0,3, zoom 2x и 4х) и масляным погружным объективом 40х (N.A. 1,3). Анализ сырых изображений (512×512 пикселей) жировой фазы осуществляли с использованием Image Toolbox of Matlab 7,0 (из The Mathworks Inc., Natick MA, U.S.A.). По меньшей мере, 6 изображений на образец полученных при десятикратном увеличении (10х) использовали для определения величины диаметра на основе площади пикселя (d=√(4π/площадь)). Также, параметр деформации D рассчитывали из длины максимальной оси (L) и минимальной длины оси (L) эллипса: (d=(L-L)/(L+L)). На основе кумулятивного распределения диаметров жировых капель и D были построены средние кумулятивные распределения.
n
1
2
2
2
3
3
1
Реологические свойства: линейные вязкостно-эластичные (ЛВЭ) свойства (G' и tanδ) определяли дважды путем испытаний амплитуд динамической осциллирующей деформации с помощью Bohlin CVO с регулируемой нагрузкой (из Bohlin Instruments Ltd., Cirencester, U.K.) при постоянной частоте 1 Hz и при температуре 20°С. Одночастотную развертку (0,01-100 Hz) осуществляли при постоянной деформации в ЛВЭ-области при 20°С. Испытания ползучести проводили дважды при 20°С при постоянном уровне нагрузки в области ЛВЭ (<350 Па). Время ползучести составляло 2000 с. Рифленые параллельные плоскости (диаметром 25 мм, шаг 2 мм) использовали для того, чтобы предотвратить скольжение. Для предотвращения испарения использовали камеру, покрывающую образец. Перед измерением, образцы оставляли на 5-15 мин, чтобы дать возможность релаксировать после нагрузок, индуцированных загрузкой образца. Полученные механические спектры анализировали по степенной зависимости, соответствующей G′-частотным кривым (G′∝ω). Кривые ползучести анализировали с помощью 6-элементной модели Бюргера, которая, как доказано, является подходящей для описания вязкостно-эластичных свойств мягких твердых материалов (см.: Edwards et al., Rheologica Acta. 40(2001)142-153). Модель содержит элемент Максвелла с двумя элементами Кельвина-Войта в серии: J(t)=1/G+(1/G)[1-exp(-tG/η]+(1/G)[1-ехр(-tG/η)]+t/η.
1
1
1
1
2
2
2
3
3
3
Мгновенная деформация J равняется 1/G, вязкостный поток представлен t/η, a остальная часть уравнения (два элемента Кельвина-Войта) обозначает замедленную деформацию. В рабочих примерах изобретатели сосредоточили внимание на J, η и временах запаздывания τ(=G/η) и τ(=G/η), чтобы провести различие между различными подвергшимися сдвигу и перекрестно-сшитыми материалами.
-1
n
деформации
деформации
Механические свойства: Анализатор Текстуры Т2 (из Stable Micro Systems Ltd., Surrey, U.K.) использовали для испытаний больших деформаций. Испытания в режиме одноосного растяжения проводили с постоянной скоростью деформации 3 мм·с при комнатной температуре в течение 2 часов после создания материалов из казеината Са. Образцы нарезали на кусочки прямоугольной формы (30×12 мм), имеющие толщину 3-5 мм (измеряют для каждого индивидуального образца). Длина части, подлежащей растяжению, составляла 15,2 мм. Были осуществлены по меньшей мере три измерения волокнистого белкового образца в каждом направлении, параллельном и перпендикулярном сдвиговому потоку (на основе плоскости сдвиговый поток -турбулентность, таким образом, образующиеся плоскости излома были теми же поверхностями, которые наблюдали методом СЭМ). Благодаря волокнистому характеру образцов, излом происходил иногда сразу, а иногда многостадийным путем, приводящим к различиям между измерениями. Деформация Хенки (ε), предел текучести при растяжении (σ) и модуль Юнга (Е) рассчитывали, как описаны Gunasekaran & Ak, (2003) Cheese Rheology and Texture, CRC Press. Наблюдаемый коэффициент деформационного упрочнения n определяли при наложении соответствующей степенной зависимости (σ=kε) на σ-ε кривую в измеряемом ε-диапазоне 30-100%. Когда n превышает величину 1, образец характеризуется деформационным упрочнением.
Пример 1
Белковый премикс (рН 6,8-7,0), состоящий из 30 масс.% казеината Са, ТГА (фермент - белок соотношение (Ф:Б) 1:20 по массе) и деминерализованной воды, получали в кухонном миксере при низкой скорости и при комнатной температуре перед обработкой. Для консервирования добавляли 1% (по массе) бензоат натрия (из Sigma Aldrich, Zwijndrecht, Netherlands).
-1
-1
-1
Белковый премикс, полученный в кухонном миксере, переносили в предварительно нагретую сдвиговую камеру (показанную на Фигуре 1 и описанную подробно в описании здесь выше), которую поддерживали при постоянной температуре 50°С. После заполнения сдвиговой камеры, смесь подвергали следующей сдвиговой обработке: 4 мин при 5 об/мин (12 с), затем с возрастанием от 5 до 50 об/мин (12-120 s) за 1 мин, и 30 мин на 50 об/мин (120 с). В случае неподвижной обработки, смесь подвергали 5 об/мин в течение 30 с, а затем сдвиговую камеру останавливали (0 об/мин) в течение 35 мин.
Далее, образец казеината Са приготовляли в резервуаре для смешивания (W-50) с элементами, вращающимися в противоположных направлениях, который был подсоединен к прибору (Do-Corder) Брабендера, на той же скорости вращения, при которой получали подвергшиеся сдвигу образцы в устройстве сдвиговой камеры.
Содержание белков в обработанных образцах определяли методом Дюма с использованием анализатора азота и белка NA2100 (из СЕ Instruments, Milan, Italy). Фактор конверсии азот-белок составлял 6,38 (см.: Grappin & Lefier, Proc. Int. Dairy Fed. Seminar (1993), Cork; and Guo et al., Int. Dairy J. 6(5) (1996) 473-483). Среднее измеренное содержание белков, которое составляло 28,43%±1,12% в 95% доверительном интервале, находилось в согласии с целевым содержанием белков 30%. Смешанные и перекрестно-сшитые образцы казеината Са имели содержание белков 35,39%, что относят на счет синерезиса.
После обработки, материал охлаждали в неподвижной сдвиговой камере примерно до 12°С в течение -10 мин с помощью водяной бани.
Смешанный материал не охлаждали, а образец сразу вынимали при 50°С.
Обработанные материалы переносили в формы, состоящие из двух квадратных параллельных пластин (100×100 мм), которые обеспечивали регулируемую высоту образца 3 мм. Часть материала использовали в течение 2 часов для дальнейшего анализа (испытания на растяжение и приготовление образца для СЭМ), а часть хранили в холодильнике при 4°С до дальнейшего анализа (содержание белков и ЛВЭ измерения).
Что касается макроструктурных объектов, отмечают, что перекрестное сшивание ТГА во время сдвига приводило к настоящим волокнистым макроструктурам, которые могли быть разорваны вдоль направления сдвигового потока. Полученные структуры были белыми и блестящими. Фигура 2 показывает подвергшийся сдвигу и перекрестно-сшитый образец белка после испытаний на растяжение, которое осуществляли в направлении, параллельном сдвиговому потоку в сдвиговой камере. Согласно оценке, индивидуальные макроскопические волокна имели типичный размер <1 мм, который можно было наблюдать после диспергирования кусочка образца в течение 1 дня в деминерализованной воде, показано на Фигуре 2В.
Сдвиг 30% казеината Са без ТГА приводил к замечательно слоистой структуре тонкого анизотропного характера. После сдвига только белковой матрицы, можно было отслаивать непрозрачные белые структуры в направлении сдвигового потока в пределах длин порядка см. казеинат Са, который был перекрестно сшит в условиях неподвижности, давал устойчивый белковый гель без какого-либо наблюдаемого ориентирования.
Наконец, нормальное смешивание казеината Са и ТГА в течение 35 мин приводило к синерезису и давало компактный белковый гель. После синерезиса, содержание белков в оставшемся образце составляло 35% вместо добавленных 30%. На основе макроструктурных наблюдений, оказалось, что сдвиг и перекрестное сшивание ТГА являются необходимыми для создания анизотропной структуры волокнистого казеината Са.
По поводу влияния сдвига и перекрестного сшивания на микроструктуру, отмечают следующее. Структуры микро- и наноуровня обработанных материалов на основе казеината Са были изучены с помощью СЭМ. Фигура 3А показывает СЭМ-изображения подвергшегося сдвигу и не подвергшегося сдвигу перекрестно-сшитого казеината Са. Сдвиг-индуцированное ориентирование было видимым в микроструктуре, параллельной сдвиговому потоку. Большая часть структуры не подвергшегося сдвигу перекрестно-сшитого белка была очень компактной, и не обнаруживала четкого ориентирования.
Подвергшиеся сдвигу и перекрестно-сшитые белковые структуры также содержали открытые пространства и пузырьки воздуха, которые дают возможность видеть волокна с четкой ориентацией.
Фигура 3А, 3 представляет пример волокон на поверхности пузырька воздуха. В некоторых случаях, ориентация волокна отклонялась из направления сдвига. Очевидно, волокна, видимые с помощью СЭМ, были совершенно другого масштаба, чем волокна, наблюдаемые визуально в макроструктуре, т.е. нанометровый масштаб против миллиметрового, что показывает иерархическую волокнистую структуру. Перпендикулярно сдвиговому потоку наблюдали два типа микроструктур, а именно сферические домены плотного белка, которые могут представлять концы волокон, и к тому же ориентированные белковые структуры (Фигура 3В). Последнее ориентирование может быть вызвано цепными белковыми частицами, или оптически обманной проекцией наблюдаемой плоскости градиент скорости - турбулентность. Однако на макроуровне ориентирование в это плоскости не наблюдали.
На основе изображения мог быть выведен типичный диаметр волокон, составлявший ~100-200 нм.
Микроструктура подвергшегося сдвигу казеината кальция без использования ТГА показала большие отличия, по сравнению с микроструктурами подвергшегося сдвигу и одновременно перекрестно-сшитого белка. На макроуровне, никаких волокон не было видно, но была образована слоистая структура, которую можно было отслаивать. На микроуровне, едва уловимая ориентация может быть прослежена на плоскости, параллельной сдвиговому потоку (Фигура 4А), которая была менее четкой для плоскости, перпендикулярной сдвиговому потоку (Фигура 4В). Белковая сетка оказалась более пористой, по сравнению с сеткой перекрестно-сшитого белка, что позволяет предположить, что в тех порах находилась свободная вода, или, что в перекрестно-сшитом материале произошло сокращение волокон. Размер белковых доменов был сравним с размером сфер, которые присутствовали в сетке перекрестно-сшитого белка (~100-200 нм).
Фигура 5 показывает СЭМ-изображения перекрестно-сшитого казеината Са в условиях неподвижности. Микроструктуры поверхностей излома, параллельных (Фигура 5А) и перпендикулярных (Фигуре 5В) воображаемому сдвиговому потоку, напоминали одна другую. Можно наблюдать компактные области (~0,5 мкм), окруженные менее компактными областями, содержащими белковые домены. В этих компактных областях могла присутствовать ТГА, и перекрестное сшивание могло иметь приводить к такой компактности, сопровождающейся выталкиванием свободной воды, приводящей к слабо набухшим и пористым белковым структурам между компактными областями.
Наконец, смешанный и перекрестно-сшитый казеинат Са давал компактную микроструктуру, состоящую из белковых сфер размером ~100 нм, показанных на Фигуре 6. Компактность можно объяснить синерезисом, который происходил во время смешивания. Никаких различий не наблюдали между случайно выбранным "параллельным" направлением и соответствующим перпендикулярным направлением.
Резюмируя, можно сказать, что в присутствии ТГА простой сдвиг индуцировал сильную анизотропию на макроуровне. Ориентирование на микроуровне также наблюдали, но это не всегда соответствовало направлению сдвигового потока. Только комбинированное действие сдвига и ТГА давало анизотропные структуры казеината Са.
Измеренными свойствами структур подвергшегося сдвигу и перекрестно-сшитого казеината Са были реологические и механические свойства. Последние выявили анизотропные свойства обработанных белковых материалов.
Фигура 7 показывает G′ и tanδ в ЛВЭ-области различных образцов казеината Са. Ферментативное перекрестное сшивание увеличивало G′, тогда как tanδ уменьшался, что является типичным для структур, где введены ковалентные связи. Никаких различий в G′ и tanδ между сдвиговой и неподвижной обработкой перекрестно-сшитого казеината Са не было найдено. Таким образом, сдвиг не влиял на образование ковалентных связей. Образцы смешанного и перекрестно-сшитого казеината Са показали более большую величину G′ и немного более низкую величину tanδ, что может быть объяснено эффективной более высокой концентрацией белка. Анизотропные характеристики подвергшегося сдвигу и перекрестно-сшитого образцов казеината Са не были обнаружены в ЛВЭ-свойствах. Только присутствие ТГА приводило к четким отличиям в G′ и tanδ. Поэтому, можно заключить, что анизотропные волокна действовали как изотропная масса в масштабе длин, где опробованы малые деформации.
Фигура 8 показывает типичные кривые напряжение-деформация для поведения при растяжении подвергшегося сдвигу и перекрестно-сшитого казеината Са в двух направлениях по отношению к сдвиговому потоку, прилагаемому к образцу во время обработки. Сразу же становится ясно, что как напряжение текучести (максимальное), так и деформация текучести в параллельном направлении, то есть в направлении волокон, были гораздо больше, по сравнению со значениями в перпендикулярном направлении. Кроме того, изгиб кривой напряжение-деформация для образца, растянутого в параллельном направлении, показал поведение деформационного упрочнения, тогда как этого не было в случае образца, растянутого в другом направлении.
Фигура 9 иллюстрирует механические свойства при растяжении: напряжение текучести ε, деформацию текучести σ и модуль Юнга Е для различных образцов казеината Са, которые были растянуты до разрыва. На основе этих механических свойств, при растяжении, сделан вывод о том, что казеинат Са, который был как перекрестно-сшитым, так и подвергшимся сдвигу, показал значительную степень анизотропии из-за больших различий между свойствами, измеренными в направлениях, параллельном и перпендикулярном сдвиговому потоку.
Подвергшийся сдвигу казеинат Са вел себя анизотропно, что является очевидным, исходя из различий в σ и ε (различие в Е было незначительным).
Перекрестно-сшитый казеинат Са в условиях неподвижности не был анизотропным, как наблюдали визуально и с помощью СЭМ (Фигура 5). Средние значения σ, ε и Е (Фигуре 9) совпадают с перпендикулярными значениями перекрестно-сшитого и подвергшегося сдвигу казеината Са, что показывает, что перекрестное сшивание в ходе сдвига также происходило в направлении, перпендикулярном сдвиговому потоку.
Смешанный и перекрестно-сшитый казеинат Са не показали никаких различий в кривых напряжение-деформация на основе измерений образцов, растянутых в параллельном и перпендикулярном направлении. Поэтому, средние значения σ, ε и Е показывают, что материал был высокоэластичным (высокое значение Е) и пластически деформируемым (высокое значение σ).
параллельное
перпендикулярное
Таблица 1 суммирует соотношения между механическими свойствами при растяжении, измеренными в направлениях: параллельном и перпендикулярном сдвиговому потоку. Как ранее показано, анизотропные волокнистые образцы были гораздо прочнее в параллельном направлении, по сравнению с перпендикулярным направлением, что в особенности, отразилось на отношении напряжений текучести σ/σ (m.e.~9). Отношения деформации текучести и модуля Юнга составляли ~2-3 для анизотропных структур казеината Са. На основе отношений значений механических свойств при растяжении подвергшийся сдвигу казеинат Са в отсутствие ТГА показал слабую анизотропию.
Таблица 1 (Отношения механических свойств при растяжении: напряжений текучести σ, деформаций текучести ε и модулей Юнга Е, измеренных параллельно и перпендикулярно сдвиговому потоку. Анизотропными образцами 30% казеината Са являются: подвергшийся сдвигу и перекрестно-сшитый казеинат Са (С+TG-сдвиг) и подвергшийся сдвигу казеинат Са (С-сдвиг))
Отношение параллельное/перпендикулярное
σ
ε
E
C+TG-сдвиг
9,23
2,60
1,88
C-сдвиг
2,27
1,79
1,13
В Таблице 2 приведены значения механических свойств при растяжении, нормализованные соответствующими значениями образцов казеината Са так, что влияние сдвига (подвергшийся сдвигу и перекрестно-сшитый казеинат Са нормализован перекрестно-сшитым казеинатом Са в условиях неподвижности), и ТГА (подвергшийся сдвигу и перекрестно-сшитый казеинат Са нормализован подвергшимся сдвигу казеинатом Са без ТГА) может быть прослежено. Как сдвиг, так и ТГА влияли на механические свойств при растяжении в параллельном направлении в значительной степени, а значит в направлении анизотропных микроструктур. Кроме того, с учетом значений нормализованного напряжения текучести, укрепляющее влияние сдвига (в присутствия ТГА) было почти вдвое больше, чем влияние только ТГА. Это может быть объяснено синергетическим эффектом сдвига и ТГА.
К сожалению, влияние сдвига в неперекрестно-сшитом казеинате Са не может быть определено, т.к. механические свойства казеината Са без сдвига и перекрестного сшивания не могут быть измерены из-за непрочной структуры. Эффекты как сдвига, так и ТГА были пренебрежимо малыми для нормализованных механических свойств при растяжении в перпендикулярном направлении, т.к. нормализованные значения были близки к 1.
Таблица 2. Нормализованные механические свойства при растяжении: напряжение текучести σ, деформация текучести ε и модуль Юнга Е, измеренные в параллельном и перпендикулярном направлении. Подвергшийся сдвигу и перекрестно-сшитый образца казеината Са (С+TG - сдвиг) был нормализован перекрестно-сшитым казеинатом Са в условиях неподвижности (С+TG - без сдвига) и подвергшимся сдвигу казеинатом Са (С - сдвиг), что привело к влиянию сдвига и ТГА соответственно.
Параллельное, нормализованные
Перпендикулярное, нормализованные
σ
ε
E
σ
ε
E
Влияние сдвига
7,74
2,59
1,58
0,84
1,00
0,84
Влияние ТГА
3,54
1,34
1,35
0,93
0,87
0,81
(Влияние сдвига=(C+TG)<sub>сдвиг</sub>/(С+TG)<sub>без сдвига</sub>; Влияние ТГА=(C+TG)<sub>сдвиг</sub>/(С)<sub>сдвиг</sub>)
Таблица 3 предлагает обзор наиболее важных макро-, микроструктурных и механических признаков обсуждаемых структур казеината Са после сдвига, смешивания или неподвижной обработки, с или без ТГА. Можно видеть, что как сдвиг, так и ферментативное перекрестного сшивание, были необходимы для образования материала волокнистого казеината Са. В Таблице 3 макро-, микроструктурные и механические объекты обозначены "макро", "микро" и "механический".
Таблица 3
Свойства
казеинат Ca
казеинат Ca+TG
Сдвиг
Макро
Слоистая
Волокна <1 мм
Микро
Почти без ориентации, белковые домены - ~60-120 нм
Волокна ~100-200 нм
Механический
Слабая анизотерапия
Сильная анизотерапия
Неподвижн.
Макро
Изотропная, зернистая*
Изотерапия
Микро
Белковые домены
~50-100 нм и лоскутки ~200-700 нм
Механический
Изотерапия
Смешивание
Макро
Волокна <1 мм
Микро
Белковые домены ~100 нм
Механический
Изотерапия
*Образец не был достаточно связным для того, чтобы осуществить СЭМ и механический анализ.
Пример 2
0
Раствор или дисперсия, содержащая белок, была получена, согласно способу, описанному в Примере 1, причем белковый премикс мог содержать либо 25%, либо 30% (по массе) казеината Са. Абсолютная концентрация фермента [Е] была одинаковой для обеих концентраций казеината Са, приводящих к соотношениям фермент: белок (Ф:Б), равным 1:20 и 1:17 для 30% и 25% растворов казеината Са соответственно.
-1
Во время обработки (50°С), Нильский красный (72485, Sigma Aldrich), флуоресцентную краску для жира для Конфокальной Лазерной Сканирующей Микроскопии, добавляли к расплавленному пальмовому жиру в концентрации 0,1 г·л. Из этого неразбавленного раствора, 15% по объему быстро смешивали вручную с соответствующим количеством белкового премикса перед тем, как перенести смесь белок - жир в устройство сдвиговой камеры.
-1
-1
Комбинированный премикс белок-жир переносили в предварительно нагретое (50°С) устройство сдвиговой камеры. После заполнения сдвиговой камеры смесь подвергали следующей сдвиговой обработке: 4 мин при 5 об/мин (12 с), затем увеличение за одну минуту от 5 об/мин до желаемой величины об/мин (10, 50 или 100 об/мин, что эквивалентно 24, 120 и 240 с соответственно) в течение установленного времени. Это установленное время будет обозначаться как время сдвига. После обработки, материал охлаждали в неподвижной сдвиговой камере до, примерно, 12°С в течение ~10 мин. Экспериментальные кривые вращающего момента калибровали по измеренной величине вращающего момента при t=0.
Обработанные материалы переносили в формы, состоящие из двух квадратных параллельных пластин (100×100 мм), которые обеспечивали регулирование высоты образца, равной 3-5 мм. Часть материала использовали в течение 2 часов для дальнейшего анализа (испытания на механические свойства при растяжении и приготовление образца для СЭМ), а часть хранили при 4°С перед дальнейшим анализом (ЛСКМ, ЛВЭ и измерения ползучести).
Условия процесса и композиция материала определяли, образовывался ли волокнистый материал из казеината Са и жира или нет. Поэтому, влияние скорости сдвига, времени сдвига и концентрации белка будет обсуждено в терминах аспектов обработки и вытекающих структурных свойств при различных масштабах длин.
Что касается влияния времени сдвига и концентрации белка на структуры казеинат Са-жир, отмечают, что только ферментативное перекрестное сшивание в сочетании со сдвигом приводило к волокнистой структуре казеинат Са-жир. Присутствие жира индуцировало анизотропию в дополнительном масштабе длин в структурах, что, тем самым, давало иерархические структуры белок-жир. Образование волокнистых структур зависело от времени, показывая постепенный переход от волокнистой структуры к разрушенной структуре, сопровождающийся синерезисом, когда определенное время сдвига превышается.
-1
Сдвиг 30% казеината Са и 15% жира в присутствия ТГА при фиксированной скорости сдвига и времени сдвига (120 с и 30 мин) приводил к волокнистой макроструктуре, показанной на Фигуре 11А. Волокнистый материал можно было легко разделить вручную (волокна <1 мм). В отличие от этого, когда казеинат Са и жир подвергали сдвигу в отсутствие ТГА, наблюдали гомогенную макроструктуру без какой-либо ориентации, индуцированной сдвиговым потоком.
-1
Фигура 12 показывает типичные кривые вращающего момента как функции (общего) времени сдвига в ходе сдвига казеината Са и жира в устройстве сдвиговой камеры. Присутствие ТГА увеличивало отклик вращающего момента, благодаря созданию ковалентных связей в белковой фазе. Измеренный вращающий момент для 25% казеината Са был слегка ниже, по сравнению с 30% казеинатом Са. Даже, хотя композиция перекрестно-сшитых образцов была подобной (30% казеината Са, 15% жира и (1:20) ТГА), кривые вращающего момента показывали некоторое изменение. Тем не менее, наблюдали четкую тенденцию: после относительно постоянной величины вращающего момента, вращающий момент внезапно возрастал и для 30% и для 25% казеината Са через 45 мин и 30 мин (общее время сдвига) соответственно, позволяя предположить радикальное изменение свойств продукта. Образцы, соответствующие этим кривым, представляли собой разрушенные структуры, и присутствовала вытесненная жидкость (синерезис) как показано на Фигуре 11В. На первый взгляд, структура не производила впечатление волокнистой, но после тщательного изучения, некоторые волокнистые кусочки все же могли наблюдать. Переход от волокнистой к разрушенной структуре является неконтролируемым моментом. Двойная сдвиговая обработка при 120 с в течение 30 мин 25% казеината Са-жира приводила к менее нарушенной макроструктуре, с четкими волокнистыми частями и лишь некоторым синерезисом.
Итак, только при особых условиях времени сдвига, в зависимости от концентрации белка, могли быть получены волокнистые структуры.
Что касается микроструктуры, СЭМ-изображения на Фигуре 13 иллюстрируют микроструктуру 30% казеината Са и жира после сдвига и перекрестного сшивания с использованием ТГА (1:20). Различия между поверхностями: параллельной (Фигура 13.А1-А2) и перпендикулярной (Фигура 13.В 1-2) сдвиговому потоку, являются весьма отчетливыми для материала, одновременно подвергшегося сдвигу и перекрестному сшиванию. Компактные волокна образовывались в направлении, параллельном сдвиговому потоку с типичным размером волокна ~100-200 нм. На открытых местах структуры или на внутренней поверхности пузырьков воздуха, волокна мог быть лучше обособлены. Направление волокон на внутренней поверхности пузырьков воздуха иногда отклонялось от направления сдвига, указывая на локальные нарушения сдвигового потока, как показано на Фигуре 13.А2. Перпендикулярно сдвиговому потоку, наблюдали некоторые частицы белка и некоторые "расплавленные" структуры (Фигура 13.В2), в которых белок, как казалось, покрыт жировой фазой. Несколько глобул жира были найдены в структуре, но в целом, лишь малое количество жира могло быть обнаружено с помощью СЭМ, что могло быть объяснено масштабом длин, наблюдаемым с помощью СЭМ (в зависимости от используемого увеличения). В дополнение, способ приготовления Образцов для СЭМ, такой как погружение структур казеинат - жир в органические жидкости (ДМСО, этанол), вызвало, возможно, потерю жира.
-1
На мезоструктурном уровне, ЛСКМ-изображения подвергшегося сдвигу и перекрестно-сшитого 30% казеината Са показывают, что присутствие жировой фазы индуцировало анизотропию в дополнительном масштабе длин, делая структуры даже более иерархическими. На Фигуре 14.A3 различимы два типа жировых структур в 30% материалах казеинат Са-жир, полученных через 30 мин сдвига при 120 с. Относительно малые и большие диспергированные капли жира наблюдали также в виде жировых слоев, вытянутых в направлении сдвига. На основе нескольких независимо обработанных образцов, можно было наблюдать, что жир, в основном, присутствовал в форме капель, но также в деформированном состоянии, учитывая значения параметра деформации (D) (Фигура 14.В3-4). Очень малые капли жира породили в определенной степени структуры в белковой фазе с ориентацией, параллельной или наклоненной под углом к направлению сдвига. Можно оценить, что типичная толщина слоя белка составляет ~40 мкм (таким образом, состоит из ~200 единичных белковых волокон), а толщина слоя жира составляет ~10 мкм.
Фигура 14.А1 показывает изотропную мезоструктуру подвергшегося сдвигу 30% казеината Са и жира без ТГА, состоящую из сплошной белковой фазы с диспергированными каплями жира. Максимальное среднее кумулятивное распределение диаметра жировых капель и параметра деформации D показывает, что без ТГА, жировые капли были больше в размере и менее деформированы, по сравнению с волокнистой структурой, содержащей ТГА (Фигура 14.В2-4).
-1
Влияние времени сдвига (15 и 30 мин) на постоянную скорость сдвига 120 с для 30% казеината Са иллюстрировано на Фигуре 14.А2-3. Через 5 и 15 мин сдвига 30% казеината Са и жира, волокнистые макроструктуры уже наблюдали визуально. Однако, кроме ориентации некоторых жировых капель, это не является очевидным из ЛСКМ-изображения, как показано для 15 мин сдвига, по сравнению с контрольным образцом, подвергшимся сдвигу в течение 30 мин. Черные области в ЛСКМ-изображении, полученные через 15 мин сдвига, показывают, что в этом образце присутствовали включения воздуха, которые также наблюдали через 5 мин сдвига. Диаметр жировых капель уменьшался с увеличением времени сдвига, тогда как D показал небольшое изменение (Фигуре 14.В1-3).
При снижении содержания белков до 25% (Ф:Б увеличивалось до 1:17), уже после 17 мин сдвига образовывалась волокнистая макроструктура, которая демонстрировала ориентирование тонкодисперсных жировых капель, как показано на Фигуре 14.А4. Капли были меньше, по сравнению с каплями в структурах с более высоким содержанием белков (Фигуре 14.В1), и никаких слоев жира не наблюдали. Итак, развитие мезожировых структур разворачивается во время узкого окна времен сдвига, т.е. между 15 и 60 мин для 30% казеината Са. Снижение концентрации белка даже уменьшает это окно времен сдвига для процесса получения волокнистых структур.
ЛВЭ-свойства (G′ и tanδ) материалов казеинат Са-жир графически изображены на Фигуре 15, в виде функции от времени сдвига. Для волокнистых структур 30% казеинат Са-жир, умеренное возрастание G′ измеряли как функцию от времени сдвига, а значит, времени реакции перекрестного сшивания. Увеличение в G′ можно объяснить увеличением ковалентных связей. Снижение содержания белков до 25% казеината Са приводило к немного более низкому значению G′ материала 25% казеинат Са-жир через 17 мин сдвига.
Структура подвергшегося сдвигу казеината Са - жир в отсутствие ТГА, который приводил к гомогенной дисперсной структуре, показывает более низкое значение G и более высокое tanδ, по сравнению с образцами перекрестно-сшитыми с помощью ТГА. Удивительно, что tanδ уже через 5 мин сдвига уменьшился до величины, которая оставались постоянной при продолжении сдвига. Это показывает, что G" возрастало быстро в течение 5 мин сдвига, а далее следовало той же тенденции, что и G'.
Таблица 4 суммирует значения n, получаемые из степенной зависимости, выровненной по кривым G′ - частота всех образцов.
Таблица 4
Значения n, полученные из степенной зависимости,соответствующей G' как функции частоты (G′∝ω<sup>n</sup>) при значениях R<sup>2</sup> для образцов казеината Са, обработанных при различных условиях. Неволокнистые образцы обозначены звездочкой.
Казеинат Са
Соотношение
Время сдвига
Скорость сдвига
n
R<sup>2</sup>
(%)
Ф:Б
(мин)
(с<sup>-1</sup>)
(из G'∝ω<sup>n</sup>)(-)
(-)
30
0
30*
120*
0,22*
0,983
0,29(ω<1Гц)
0,991
0,19(ω>1Hz)
0,996
30
1:20
5
120
0,14
0,988
30
1:20
15
120
0,13
0,965
30
1:20
30
120
0,13
0,994
25
1:17
17
120
0,13
0,988
30
1:20
30*
24*
0,15*
0,909
30
1:20
30
240
0,14
0,987
На механические спектры с точки зрения величины n почти не влияло время сдвига или скорость сдвига, и, кажется, что они зависят только от композиции материалов. Присутствие ковалентных связей в материалах влияло на крутизну кривой log-log, при сравнении перекрестно-сшитых образцов с неперекрестно-сшитым образцом 30% казеината Са, который вел себя менее подобно твердому материалу. Уже 5 мин сдвига в присутствия ТГА вызывало огромные изменения величины n материала казеинат Са-жир, по сравнению с неперекрестно-сшитым материалом.
Фигура 16А показывает влияние времени сдвига на нормализованные G` кривые, как функцию деформации, нормализованной по соответствующим значениям G' из ЛВЭ-области для образцов 30% казеинат Са-жир. Для волокнистых образцов на основе 30% казеината Са, нельзя вывести никакой четкой тенденции для предела ЛВЭ-области, как функции от времени сдвига. Неперекрестно-сшитые гомогенные образцы 30% казеината Са показали крутое снижение в нелинейном режиме, по сравнению с волокнистыми образцами, что показывает, что гомогенный материал при высоких значениях деформации претерпевал более резкие изменения, возможно, благодаря присутствию более слабых нековалентных связей.
Кривые ползучести, включающие выравнивание с использованием 6-элементной Модели Бюргерса, материалов казеинат Са-жир, показаны на Фигуре 17, которые демонстрирует типичную форму для вязкостно-эластичных материалов. Возрастание времени перекрестного сшивания, таким образом, увеличение ковалентных связей, приводило к снижению эластичной деформации, которая является обратно пропорциональной модулю эластичности. Кроме того, неперекрестно-сшитый, но подвергшийся сдвигу казеинат Са и жир имеют более вязкостные свойства, по сравнению с перекрестно-сшитыми материалами, которые показаны на вставке на Фигуре 17.
1
1
2
3
Таблица 5 суммирует подгоночные параметры J, η и времена запаздывания τ и τ из модели Бюргерса.
Таблица 5
Подгоночные параметры ползучести, включающие стандартные отклонения от 6-элементной Модели Бюргерса. Модель была приспособлена для кривых ползучести, которые были измерены при 20°С в ЛВЭ-области. Неволокнистые образцы обозначены звездочкой
Каз. Са (%)
Соотн. Ф:Б
Время сдвига,мин
γ,с<sup>-1</sup>
J<sub>1</sub>,10<sup>-5</sup> Па<sup>-1</sup>
η<sub>1</sub>,10<sup>-6</sup> Па.с
τ<sub>2</sub>(=G<sub>2</sub>/η<sub>2</sub>)
<sub>(с)</sub>
τ<sub>3</sub>(=G<sub>3</sub>/η<sub>3</sub>)
<sub>(с)</sub>
30
-
30*
20*
15,9±0,7*
0,8±0,4*
6122±8241*
127±15*
30
1:20
5
20
4,0±0,2
11,3±1,7
260±11
11±1
30
1:20
15
20
4,0±0,5
15,5±0,9
256±13
10±1
30
1:20
30
20
3,2±0,9
27,7±16
214±17
8±1
25
1:17
17
20
5,5±0,05
10,1±0,9
261±12
9±1
30
1:20
30*
24*
2,3±0,4*
29,±11,9*
210±34*
8±1*
30
1:20
30
40
3,5±0,5
26,0±6,1
200±28
8±1
1
1
1
1
2
3
2
3
2
3
Большое снижение J и времен запаздывания, и увеличение η через 5 мин сдвига и перекрестного сшивания по сравнению с неперекрестно-сшитым материалом отчетливо показывают, что присутствие ТГА оказало наибольшее влияние на параметры ползучести. Резкое снижение времен запаздывания показывает, что матрица казеината Са была быстро преобразована ферментом из более или менее вязкой белковой матрицы в эластичный материал. Присутствие ковалентных связей приводило к менее мобильным молекулам внутри структур, и большему сопротивлению потоку в больших временных масштабах, что отражено ростом η. Дальнейшее увеличение времени сдвига (реакции) имело едва уловимое влияние на снижение J, τ и τ. Нужно отметить, что параметры G, G, τ и τ, которые определяют времена запаздывания, возрастали с увеличением времени сдвига.
-1
Фигура 18 показывает механические свойства (напряжение текучести σ, деформацию текучести ε, модуль Юнга Е и коэффициент истинного деформационного упрочнения n) как функцию от времени сдвига для волокнистых 25% и 30% материалов казеинат Са-жир. Механические свойства неперекрестно-сшитого материала 30% казеинат Са-жир также включены в Фигуру 18. Уже через 5 мин сдвига при 120 с, наблюдали анизотропию в материале 30% казеинат Са-жира, т.к. механические свойства в параллельном и перпендикулярном волокнам направлении показали отличия. Далее механические свойства, измеренные в перпендикулярном направлении, оставались более или менее постоянными, как функция от времени сдвига. Это показывает что укрепление волокнистых структур через ковалентные связи происходило, в основном, в направлении потока. Анизотропия, характеризуемая напряжением текучести в параллельном направлении, возрастала радикально с увеличением времени сдвига для 30% казеината Са и жира. Механические свойства 25% казеината Са и жира, подвергшихся сдвигу в течение 17 мин, были более или менее подобны свойствам образца 30% казеината Са, который подвергали сдвигу в течение 15 мин. Неперекрестно-сшитый материал на основе 30% казеината Са и жира вел себя как изотропный материал по всем параметрам, относящимся к растяжению. Замечательно то, что механические свойства неперекрестно-сшитого изотропного материала более или менее были равны механическим свойствам волокнистых материалов, измеренным перпендикулярно сдвиговому потоку. Это к тому же подразумевает, что никакие ковалентные связи не образовывались перпендикулярно сдвиговому потоку. Модуль Юнга начинал увеличиваться через 15 мин сдвига (30% казеината Са), тогда как деформация текучести и коэффициент деформационного упрочнения увеличивался в первые 15 мин сдвига и оставались постоянными после этого. В общем, волокнистые материалы 30% казеинат Са-жир становились более пластически деформируемыми и показывали упрочнение деформации в направлении волокна (увеличение напряжения текучести и деформации текучести), тогда как они оставались хрупкими (низкое напряжение текучести и деформация текучести) в перпендикулярном направлении.
Таблица 6 суммирует влияние времени сдвига на соотношение механических свойств, измеренных в параллельном и перпендикулярном направлении волокон, что можно интерпретировать как меру качества волокна. Увеличение времени сдвига влияло на все четыре механических параметра волокнистых материалов с 30% казеината Са положительно, из которых напряжение текучести увеличивалось в наибольшей степени. Замечательно, что наибольшее соотношение напряжений текучести было найдено для волокнистой структуры с более низким содержанием белков (25% казеинат Са).
Таблица 6
Влияние времени сдвига и скорости сдвига на соотношении механических свойств при растяжении волокнистых и неволокнистых материалов казеинат Са-жир, измеренные параллельно и перпендикулярно сдвиговому потоку (при 120 с<sup>-1</sup>), прилагаемому в устройстве сдвиговой камеры. Неволокнистые образцы обозначены звездочкой.
Каз. Са%
Соотн. Ф:Б
Время сдвига, мин
Напряжен. Текучести σ<sub>//</sub>/σ<sub>⊥</sub>(-)
Деформац. текучести ε<sub>//</sub>/ε<sub>⊥</sub>(-)
Модуль Юнга E<sub>y.//</sub>/E<sub>y.⊥</sub>(-)
Каж. упрочнение деформации n<sub>8.//</sub>/n<sub>8.⊥</sub>(-)
30
-
30*
1,44*
1,29*
1,02*
1,09*
30
1:20
5
2,70
1,73
1,49
1,16
30
1:20
15
7,03
2,12
1,5
1,72
30
1:20
30
8,19
2,59
1,54
1,96
25
1:17
17
13,02
2,90
1,87
1,85
После исследования влияния времени сдвига при постоянной скорости сдвига было изучено влияние скорости сдвига при фиксированном времени сдвига равном 30 мин на образование волокнистых структур на основе 30% казеината Са, 15% жира и ТГА (1:20). Скорость сдвига оказалась параметром процесса для регулирования, как образования волокнистых структур, так и степени волокнистости.
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
Фигура 19 показывает влияние трех скоростей сдвига на вращающий момент, как функцию от времени сдвига во время обработки 30% казеината Са, жира и ТГА в сдвиговой камере. Увеличение скорости сдвига вызвано высоким откликом вращающего момента, который действовал вплоть до (общего) времени сдвига равного 25 мин. Однако, при 24 с, кривая вращающего момента внезапно возрастала, аналогично тому, что наблюдали ранее для 30 мин и 60 мин сдвига при 120 с для материалов 30% и 25% казеинат Са-жир соответственно. В двух последних случаях, нарушенные структуры и синерезис были результатом чрезмерного сдвига волокнистой структуры. После сдвига в течение 30 мин при 24 с, наблюдали изотропную макроструктуру, что сопровождалось некоторым выталкиванием жира и едва уловимым синерезисом. Возможно, при низкой скорости сдвига никакого ориентирования не было индуцировано в материале казеинат Са-жир перед его разрушением. Представляется, что внезапное увеличение измеряемых профилей вращающего момента может свидетельствовать либо о разрушении, либо об образовании изотропной структуры в ходе сдвига, с выталкиванием при этом воды или обогащенной жиром фазы. Сдвиг, как при 120 с (контрольный образец, который обсуждали ранее), так и при 240 с приводил к волокнистым материалам, из которых последние оказались качественно более волокнистыми по сравнению с первыми. При сравнении низкой и промежуточной скорости сдвига, средняя кумулятивная кривая диаметра капли для низкой скорости сдвига (24 с) показала присутствие капель жира малого размера в мезоструктуре, тогда как средние кумулятивные кривые параметра D были такими же (Фигура 14.В2-4). Мезоструктура, полученная при наивысшей скорости сдвига равной 240с, показала дисперсные структуры с редкими каплями жира, также как жировые структуры, упорядоченные в виде слоев (~10 мкм толщины) в направлении сдвигового потока. При учете всех изученных скоростей сдвига нельзя было сделать никакого четкого вывода о влиянии скорости сдвига на диаметр и D. Никаких изменений в ЛВЭ-свойствах волокнистых материалов не было обнаружено за время реакции ТГА, что позволяет предположить, что количество ковалентных связей была равным для каждой скорости сдвига. При низкой скорости сдвига полученный изотропный материал имел немного большее значение G′, что может быть объяснено присутствием более взаимосвязанной белковой сетки, т.к. не все мостиковые связи были образованы в направлении сдвигового потока. Фигура 16 В, отображающая нормализованные кривые G', как функции деформации, показывает, что предел ЛВЭ-области неволокнистого образца (24 с) был гораздо выше, по сравнению с ЛВЭ-пределом волокнистых образцов (120 и 240 с), что означает, что деформационное ограничение ЛВЭ-области может быть использовано как мера анизотропии. Скорость сдвига едва влияла на параметры ползучести, как показано в Таблице 5.
-1
-1
Фигура 20 суммирует влияние скорости сдвига на механические свойства. В общем, большие 95% доверительные интервалы можно объяснить ступенчатым и постепенным разрушением волокнистых образцов, в особенности, в параллельном волокну направлении. На основе механических свойств, измеренных параллельно и перпендикулярно сдвиговому потоку, можно заключить, что материал 30% казеинат Са-жир, полученный при низкой скорости сдвига (24 с) вел себя как изотропный материал. Модуль Юнга этого образца подтвердил, что материал был очень эластичным, по сравнению с волокнистыми материалами, созданными при высоких скоростях сдвига. Напряжение текучести, деформацию текучести и коэффициент истинного деформационного упрочнения, измеренные параллельно направлению волокон, возрастали с увеличением скорости сдвига, тогда как модуль Юнга уменьшался. Механические свойства, определенные перпендикулярно к направлению потока, слабо уменьшались с увеличением скорости сдвига при переходе от изотропных к анизотропным материалам (т.е. между 24 и 120 с). После перехода на механические свойства анизотропных материалов, определенных в направлении, перпендикулярном волокнам, почти не влияла скорость сдвига.
-1
При рассмотрении всех параметров процесса (скорости сдвига и времени сдвига) можно заключить, что все механические свойства анизотропных волокнистых материалов, измеренные перпендикулярно сдвиговому потоку, были подобными и не зависящими от обработки. Кроме того, эти механические свойства были равны свойствам изотропного неперекрестно-сшитого материала 30% казеинат Са-жир. Это подтверждает, что никакие ковалентные связи не были образованы в плоскости в турбулентность - сдвиговый поток в волокнистых материалах, чему частично мешает присутствие жира. В Таблице 7 суммированы соотношения механических свойств волокнистых материалов, измеренных в параллельном и перпендикулярном волокнам направлении. На основе эти соотношений, материал 30% казеинат Са-жир, образованный при наивысшей скорости сдвига (240 с) был наиболее волокнистым, что позволяет предположить, что скорость сдвига можно использовать для регулирования волокнистости подвергшихся сдвигу и перекрестно-сшитых материалов белок-жир.
Таблица 7
Влияние скорости сдвига на соотношение механических свойств при растяжении волокнистых и неволокнистых материалов 30% казеинат Са-жир, измеренных параллельно и перпендикулярно сдвиговому потоку, прилагаемому в устройстве сдвиговой камеры (в течение 30 мин). Неволокнистые образцы обозначены звездочкой.
Каз. Са%
Соотношение Ф:Б
Скорости сдвига, с
Напряжение текучестиσ<sub>//</sub>/σ<sub>⊥</sub>(-)
Деформацитекучестиε<sub>//</sub>/ε<sub>⊥</sub>(-)
Модуль Юнга E<sub>//</sub>/E<sub>⊥</sub>(-)
Ист. деформационное упрочнениеn<sub>//</sub>/n<sub>⊥</sub>(-)
30
1,20
24*
1,22*
1,08*
1,06*
1,09*
30
1:20
120
8,19
2,59
1,54
1,96
30
1:20
240
14,18
3,58
1,52
2,42
Пример 3. Премикс 20% казеината Са (содержащий на 100 г: 72 г деминерализованной воды, содержащий бензоат Na+0,5 г ксантана +7,5 г раствора ТГА+20 г казеината Са) содержащий 0,5% ксантана (=образец 1), получали, во-первых, смешиванием ксантана и 1% бензоата Na в деминерализованной воде в течение ~10 мин при 30-40°С, а затем в течение еще ~50 мин при комнатной температуре. Затем добавляли 20% раствор ТГА (чтобы получить конечное соотношение фермента к белку (Ф:Б), равное 1:20) к ксантановому раствору и быстро смешивали перед прибавлением этой сильно вязкой дисперсии, которая содержала несколько нерастворенных гелеобразных частиц, к белку. Также получали премикс 30% казеината Са с более низким количеством ТГА (Ф:Б=1:40) и без бензоата Na (=образец 2). Все компоненты смешивали в кухонном миксере при низкой скорости и при комнатной температуре, перед тем, как перенести премикс в предварительно нагретую сдвиговую камеру (50°С). Обе смеси подвергали сдвигу следующим образом: 4 мин при 5 об/мин, 1 мин, в течение которой количество об/мин увеличивали от 5 до 50 об/мин, и установленный отрезок времени при 50 об/мин, который составлял 34 мин для смеси 20% казеинат Са-ксантан и 15 мин для образца 30% казеината Са. После сдвига, образцы охлаждали в течение 15 мин до тех пор, пока не была достигнута температура ~12°С. Никакого анализа материала не осуществляли.
Сдвиг 20% казеинат Са-ксантан (образец 1) приводил к волокнистой макроструктуре (Фиг.22), имеющей крепкую текстуру. Сдвиг 20% казеината Са (с ТГА 1:10 и 1:20, и в присутствии жира) в отсутствие ксантана не приводил к волокнистым материалам.
Исключение малого компонента, бензоата Na и снижение ТГА (образец 2) давало изотропный материал, демонстрирующий значительный синерезис (~25% исходной массы). Материал является очень эластичным. Благодаря желтой окраске, он напоминает казеинат Na после обработки. Высокая концентрация ТГА (1:20) в отсутствие бензоата Na приводила к подобной структуре.
Пример 4. По аналогии с Примером 1 смеси казеината Са и казеината Na подвергают простому сдвигу. Результаты приведены в Таблице 8. Таблица 8 предлагает обзор смесей казеината Са и казеината Na с бензоатом Na (I~70 ммоль), анализированных с использованием реологии и в сдвиговой камере. Для удачных волокнистых образцов приведены соотношения механических свойств при растяжении.