СПОСОБ ОЦЕНКИ СНИЖЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ЭСТРАДИОЛА В СВЯЗИ СО СНИЖЕНИЕМ СОДЕРЖАНИЯ АНДРОСТЕНДИОНА В СИНЦИТИОТРОФОБЛАСТЕ ПЛАЦЕНТЫ НА ФОНЕ ОБОСТРЕНИЯ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ НА ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ БЕРЕМЕННОСТИ
METHOD OF EVALUATING REDUCTION OF AMOUNT OF OESTRADIOL IN CONNECTION WITH REDUCTION OF CONTENT OF ANDROSTENEDIONE IN PLACENTAL PLASMODIOTROPHOBLAST ACCOMPANYING AGGRAVATED CYTOMEGALOVIRUS INFECTION IN THIRD TRIMESTER OF PREGNANCY

1. Цель изобретения - оценить характер влияния цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации на содержание андростендиона в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты, влияющего на количество эстрадиола в гомогенате плаценты роженицы, приводящей к нарушению формирования фетоплацентарной системы и развития плода в период гестации.
2. Изобретение относится к медицине, а именно к разработке способа определения снижения содержания андростендиона в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты, влияющего на снижение количества эстрадиола в гомогенате плаценты роженицы при обострении цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре беременности.
3. Раскрытие изобретения
Во время беременности образуется большое количество эстрогенов, необходимых для функционального созревания плаценты и плода. Эстрадиол влияет на эндотелий сосудов плаценты через увеличение продукции вазодилататоров, параллельно препятствуя действию традиционных вазоконстрикторов [5]. Он также регулируют развитие надпочечников, легких, почек, печени, костной ткани и яичника плода в конце беременности [2, 6]. Снижение количества эстрадиола окажет влияние на развитие плода.
Биосинтез эстрадиола проходит в фетоплацентарном комплексе через образование ряда промежуточных веществ, включая андрогены - одним из которых является андростендион. В плаценте основное количество андростендиона превращается в эстрон и далее в эстрадиол [8]. Поэтому уменьшение количества андростендиона приведет к нарушению формирования эстрадиола в фетоплацентарной системе, оказывающее влияние на развитие плода.
4. Новая техническая задача
Определить количество эстрадиола в зависимости от уровня содержания андростендиона в синцитиотрофобласте ворсинок при обострении цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации с целью оценки характера состояния фетоплацентарного барьера во время беременности, от чего зависит нормальное развитие плода.
5. В доступной литературе имеются упоминания об изучении содержания в плаценте либо эстрадиола [4], либо андростендиона [3, 7] с использованием радиоактивных веществ. Существуют совместные исследования андростендиона и эстрадиола при физиологической беременности, выполняемые биохимическими методами в плазме периферической крови [9]. Недостатком вышеупомянутых методов является необходимость дорогостоящей регистрирующей аппаратуры и реактивов: радиоактивных веществ, имеющих короткий срок хранения; соблюдение усиленных мер по технике безопасности, связанных с радиационным риском для персонала и окружающей среды. Биохимические методы не дают представления о месте локализации вещества.
В отличие от вышеприведенных прототипов в данной работе имеются существенные отличия: 1. Изменения содержания эстрадиола и андростендиона происходят под влиянием обострения цитомегаловирусной инфекции во время беременности. 2. Анализ содержания андростендиона проводится с помощью гистохимической реакции в синцитиотрофобласте плаценты роженицы, в качестве субстрата используется андростендион.
6. Осуществление изобретения
6.1. Обследованы 38 беременных женщин 18-25 лет с обострением хронической цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации, контрольную группу составили 30 беременных женщин с хронической цитомегаловирусной инфекцией в латентной стадии. У беременных женщин симптоматически цитомегаловирусная инфекция проявлялась в виде острого респираторного заболевания, сопровождающегося ринофарингитом. Клинический диагноз (обострение хронической цитомегаловирусной инфекции) устанавливается по результатам комплексного исследования периферической крови на наличие ДНК цитомегаловируса (ЦМВ), JgM или увеличение титра антител JgG в парных сыворотках (в 4 раза и более) в динамике через 10 суток, а также индекса авидности (более 65%). Исследования проводят с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с участием человека» с поправками 2008 г. и правилами клинической практики в РФ, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г.
6.2. Верификацию ЦМВ, определение типоспецифических антител, индекса авидности осуществляют методами ИФА на спектрофотометре «Stat Fax-2100» с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), ДНК ЦМВ выявляют методами ПЦР на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).
+
6.3. Активность андростендиондегидрогеназы гистохимически определяют на криостатных срезах свежезамороженной нефиксированной ткани плаценты следующим методом. Метод основан на восстановлении соли тетразолия в формазан электронами, акцептируемыми от субстрата через кофермент НАДФ [1]. Субстратом служит 2 мМ раствор андростендиона «Sigma» (США). Для его приготовления 6 мг 4-андростен-3,17-диона растворяют в 10 мл N,N-диметилформамида. Инкубационный раствор готовится на основе 0,1 М фосфатного буфера рН 7,2-7,4 с добавлением нитросинего тетразолия фирмы «ICN Biomedicals)) (США) в конечной концентрации 5 мМоль, НАДФ фирмы «Applichem» (Германия) - 1 мМоль.
Состав инкубационной среды:
0,1 М фосфатный буфер рН 7,2-7,4 - 1 мл;
нитросиний тетразолий - 1 мг;
+
НАДФ - 1 мг;
2 мМ раствор андростендиона - 0,1 мл.
6.4. В 1 мл инкубационного раствора помещают свежеприготовленные срезы ткани. Инкубацию проводят при 37°С в течение 30 минут. По окончании инкубации срезы промывают дистиллированной водой, фиксируют в 10%-м нейтральном формалине при комнатной температуре, вновь промывают дистиллированной водой, подсушивают и заключают в глицерин-желатин. Контрольные срезы инкубировали в среде, содержащей вместо раствора андростендиона адекватное количество фосфатного буфера. Полученные гистологические препараты изучают цитофотометрическим компьютерным методом с помощью программы Scion (США) на цифровом микроскопе MEIJI (Япония).
6.5. Содержание эстрадиола в плацентарном гомогенате исследовали методом иммуноферментного анализа, используя наборы фирмы «DRG» (США) на спектрофотометре «StatFax 2100» (США).
1
2
6.6. Статистический анализ и обработка данных проводится с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0». Характеристика вариационных рядов: средняя арифметическая (М), стандартная ошибка (m), коэффициент вариации 95%, доверительный интервал для средних значений М±m, где t определялось по таблице граничных значений критерия Стьюдента при доверительном уровне 95% и числе степеней свободы F=n+n-2. Для определения достоверности различий используется непарный параметрический критерий Стьюдента. Принимаются во внимание р<0,05; 0,01; 0,001. Для определения достоверности различий в случае негауссовых распределений - непараметрические критерии Колмогорова-Смирнова и Манна-Уитни.
7. Полученные данные
В процессе исследования получены следующие результаты. На гистохимических препаратах плаценты беременных, перенесших обострение хронической цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации, при регистрации роста титра антител класса G к цитомегаловирусу до 1:1600 отмечается снижение активности реакции, отражающей содержание андростендиона до 32,1±2,88 усл. ед. (контроль - 54,2±4,31 усл. ед.) (фигура 1, 2). Одновременно, в гомогенате плаценты роженицы содержание эстрадиола составляет 18443,2±117,53 пмоль/л (контроль - 28977,7±158,13 пмоль/л). Таким образом, снижение содержания андростендиона в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты при нарастании титра антител класса G к цитомегаловирусу 1:1600 приводит к (указывает на) уменьшению содержания эстрадиола в гомогенате плаценты, что создает угрозу нарушения формирования фетоплацентарной системы и развития плода в период гестации.
На фигуре 1 изображена гистохимическая реакция на андростендиондегидрогеназу в плаценте роженицы, перенесшей на третьем триместре гестации обострение цитомегаловирусной инфекции с титром антител класса G 1:1600. Отмечается снижение активности гистохимической реакции до 32,1±2,88 усл. ед. Увеличение - 10×40.
На фигуре 2 изображена гистохимическая реакция на андростендиондегидрогеназу в плаценте роженицы, не болевшей на всем протяжении гестации. Интенсивность гистохимической реакции - 54,2±4,31 усл. ед. Увеличение - 10×40.
8. Литература
1. Лойда З., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы: пер. с англ. М.: Мир, 1982. 272 с.
2. Albrecht E.D., Рере G.J. Central integrative role of oestrogen in modulating the communication between the placenta and fetus that results in primate fetal-placental development // Placenta. 1999. Vol. 20, Is. 2. P. 129-139.
3. Hähnel M.E., Martin J.D., Michael C.A., Hähnel R. Metabolism of androstenedione by placental microsomes in pregnancy hypertension // Clin. Chim. Acta. 1989. Vol. 81, №1. P. 103-108.
4. Lenz Т., Sealey J.E., August P., James G.D., Laragh J.H. Tissue levels of active and total renin, angiotensinogen, human chorionic gonadotropin, estradiol, and progesterone in human placentas from different methods of delivery // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1989. Vol. 69, №1. p. 31-37.
5. Miller V.M., Duckles S.P. Vascular Actions of Estrogens: Functional Implications // Pharmacol. Rev. 2008. Vol. 60, №2. P. 210-241.
6. Pepe G.J., Albrecht E.D. Central integrative role of oestrogen in the regulation of placental steroidogenic maturation and the development of the fetal pituitary-adrenocortical axis in the baboon // Hum. Reprod. Update. 1998. Vol. 4, №4. P. 406-419.
7. Rahman S.A., Hingorani V., Laumas K.R. Biosynthesis of oestrogens and their inter-conversion in human placentae from normal and toxaemic pregnancies // Clin. Endocrinol. (Oxf). 1975. Vol. 4, №4. P. 333-341.
8. Strauss J.F., Martinez F., Kiriakidou M. Placental steroid hormone synthesis: unique features and unanswered questions // Biol. Reprod. 1996 Vol. 54, №2. P. 303-311.
9. Yu H.K., Cabalum Т., Jansen C.A., Buster J.E., Nathanielsz P.W. Androstenedione, testosterone, and estradiol concentrations in fetal and maternal plasma in late pregnancy in the sheep // Endocrinology. 1983. Vol. 113, №6. P. 2216-2220.