Применение АВ(1\/)-сыворотки для наращивания мультипотентных мезенхимных стромальных клеток человека

хвостовой части эпидидимиса по методике Е.К. Мило-ванова в модификации Г.И. Егоровой.

Сравнительный анализ полученных данных показал, что у животных опытной группы в динамике происходит улучшение всех изученных показателей. В частности, на 7 сут. после введения ММСК, концентрация сперматозоидов составила 56,3+5,1 (млн/мл), на 14 сут. — 70,5+5,5 (р<0,05), на 21 ^97,0+5,3, что статистически значимо выше, чем на 7-и и 14-е сут. В группе негативного контроля были выявлены следующие показатели: концентрация сперматозоидов на 7 сут. — 39,6+6,2, на 14 сут. - 41,3+5,9, на 21 - 43,6+5,7. В группе интактных животных, данный показатель был стабилен на протяжении всего времени эксперимента

+

Доля активно-подвижных сперматозоидов у живот-

+

++ товерны, р<0,05). У животных группы негативного контроля процент активно-подвижных сперматозоидов

+

++

+

Доля аномальных форм сперматозоидов в опытной группе животных изменялся по срокам наблюдения — + + +

В группе негативного контроля процент аномальных

+

++

+

Полученные в эксперименте результаты позволяют нам сделать следующие выводы.

1. Применение ММСК при нарушениях сперматогенеза, обусловленного хронической алкогольной интоксикацией, стабилизирует основные показатели сперматогенеза, начиная с 7 сут. после внутрибрюшинного введения.

2. Двукратное увеличение числа сперматозоидов на 21 сут. после внутрибрюшинной инъекции ММСК, вероятно, обусловлено высоким биостимулирующим воздействием введённых клеточных компонентов.

В.Л. Зорин 1 а, А.И. Зорина 1, В.Р. Черкасов 1,

Б.П. Копнин 1 а, Р.В Деев 1, А.И. Неробеев 3,

А.В. Аликова 3, А.В. Шейн 4, С.В. Донецкая 5 Применение аутогенных дермальных фибробластов человека для коррекции возрастных и других изменений кожи

1 ОАО «Институт стволовых клеток человека», Москва, Россия

2 НИИ Канцерогенеза РОНЦ им Н.Н. Блохина РАМН, Москва, Россия

3ЦНИИС и ЧЛХ Росмедтехнологий, Москва, Россия

4 Клиника эстетической медицины «Ланцет», Москва, Россия

5 Клиника эстетической медицины «Лете Артис», Москва, Россия V.L. Zorin, A.I. Zorina, V.R. Cherkasov, B.P. Kopnin,

R.V. Deev, A.I. Nerobeev, A.V. Alikova, A.V. Shein,

S.V. Donetskaya

Using autogenous human skin fibroblasts to correct skin age-related and diverse alterations

Согласно современным представлениям, дермаль-ные фибробласты — основной клеточный компонент кожи — не только продуцируют и организуют экстрацел-люлярный матрикс дермы, но также взаимодействуют друг с другом и другими типами клеток. Играя ключевую роль в физиологии кожи и, благодаря своим уникальным свойствам, фибробласты, по мнению ведущих

специалистов, являются центром тканевой и органной физиологии кожи.

Культивированные дермальные аутофибробласты, используемые в качестве интрадермально инъецируемой живой системы, позволяют эффективно восстанавливать дерму, измененную в результате хронологического и фото-старения, а также постакне-рубцов. Проведенные многочисленные (как отечественные, так и зарубежные) клинические исследования продемонстрировали безопасность и эффективность применения такой системы.

Институтом стволовых клеток человека (ИСКЧ) разработана и зарегистрирована в Росздравнадзоре инновационная медицинская технология выделения, наращивания, хранения и применения аутогеных дермальных фибробластов для коррекции возрастных изменений кожи и рубцов.

В настоящее время «ИСКЧ» совместно с «ЦНИИС и ЧЛХ» и клиниками эстетической медицины «Ланцет» и «Леге Артис» проводит дополнительные клинические исследования по применению культивированных аутофибробластов для коррекции дефектов кожи. Работа проводится в соответствии с зарегистрированной Росздравнадзором медицинской технологией и решением Этического комитета и Ученого совета ЦНИИС и ЧЛХ. В исследовании участвуют 17 пациентов в возрасте 45432 лет.

Основная цель исследований: получение объективных знаний о качественных изменениях, происходящих в коже после интрадермальной трансплантации культивированных аутогенных фибробластов. Применение морфо-функциональных методов оценки культур фибробластов и современных инструментальных функциональных методов исследования кожи до и после интрадермального введения аутофибробластов, наряду с морфологическим методом исследования биоптатов кожи, позволит в динамике на протяжении не менее 2-х лет получить объективные сведения о происходящих в коже изменениях.

Доклад содержит результаты 1-го этапа клинических исследований (через месяц после курса интрадермальной трансплантации аутофибробластов, состоящего из 2 процедур).

С.И. Игнатенко, С.М. Космачева, Н.В. Петевка,

М.П. Потапнев

Применение АВ(1У)-сыворотки для наращивания мультипотентных мезенхимных стромальных клеток человека

Республиканский научно-практический центр гематологии и трансфузиологии, Минск, Беларусь 4kosmacheva@mail.ru

S.l. Ihnatsenko, S.M. Kasmachova, N.V. Petyovka,

M.P. Patapneu

Use human AB serum for expansion multipotential mesenchymal stem cells

Масштабирование применения мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга (ММСК) в клинике требует подбора оптимальных условий культивирования с целью наращивания в культуре необходимого количества клеток для проведения клеточной терапии. Чаще всего для наращивания ММСК человека используется эмбриональная сыворотка коров, которая является источником ксеногенных антигенов и может быть причиной иммунологических

реакций. В настоящее время отмечается тенденция к внедрению протоколов культивирования ММСК, основанных на замене ксеногенной сыворотки человеческой.

Цель работы — доказать возможность эффективной экспансии ММСК при использовании АВ(1У)-сы-воротки человека для культивирования in vitro.

Материал и методы. АВ(1У)-сыворотка получена от здоровых доноров крови (пул от 21 донора).

Протокол 1 (контрольный вариант). Мононуклеары, полученные из пунктата костного мозга центрифугированием на градиенте плотности фиколл-верографин, высевали в культуральные флаконы Т25 (Sarstedt, Германия) в концентрации 0,5 млн/см2 в полной питательной среде (ППС): —-МЕМ с глутамаксом (Invitrogen, GIBCO, США), 5% АВ (1У)-сыворотки, пенициллин/ стрептомицин и помещали в С02 инкубатор при 37°С на 48 ч. Затем удаляли неадгезировавшиеся клетки и проводили замену среды. При достижении 80—90% конфлюентности клетки снимали с подложки 0,25% раствором трипсин-ЗДТА. Полученную первичную культуру высаживали во флаконы в концентрации 5 тыс/см2 и инкубировали в С02 инкубаторе до достижения 80— 90% конфлюентности. Таким способом провели три пассажа. Замену среды проводили каждые сут.

Протокол 2 отличался от контрольного получением первичной культуры и посевной концентрацией при пассажах. Пунктат костного мозга разводили средой —-МЕМ без сыворотки в соотношении 1:4, вносили в культуральные флаконы. Через 48 ч удаляли неадгезировавшиеся клетки и далее вели культуру в ППС по протоколу 1. При пассажах использовали посевную концентрация 1 тыс/см2.

Протокол 3. Получение первичной культуры, наращивание и пассажирование ММСК проводились по регламенту протокола 1 с заменой ППС на среду следующего состава: среда для культуры клеток IMDM (Invitrogen, GIBCO, США), сыворотка крови группы АВ(IV) 5%, 10~4 М 2-меркаптоэтанола, пенициллин/ стрептомицин.

Результаты. Исследование каждого протокола проведены на трех образцах костного мозга со значениями теста КОЕ-Ф 25,0; 4,7и 11,3 колонии на 1x10s мононуклеаров.

Получение первичной культуры ММСК из цельного костного мозга было менее эффективно по сравнению с получением клеток из популяции выделенных мононуклеаров. Добавление в среду культивирования 2-меркаптоэтанола стимулировало пролиферацию ММСК — количество клеток в первичной культуре в 2,3 раза превышало значения контрольного протокола. Период наращивания первичной культуры был одинаковым и составлял 10—11 сут.

В дальнейшем, при пассировании клеток в посевной концентрации 1 тыс/см2, была установлена наиболее высокая пролиферативная активность ММСК на протяжении всего периода субкультивирования, что позволило получить количество клеток, значительно превышающее контрольные показатели. Напротив, клетки в среде IMDM с 2-меркаптоэтанолом демонстрировали слабую пролиферативную активность. Всего за 3 пассажа из 1 мл костного мозга по протоколу 1 xx xx xx ния клеток относительно первоначально внесенного количества КОЕ-Ф

x

xx раза. Продолжительность наращивания культуры составила 29; 31; 31 сут.

Число удвоения клеток культуры было самым высоким в период первого пассажа и постепенно снижалось к третьему пассажу. При этом число генераций ММСК, высеваемых в концентрации 1 тыс/см2, на первом и третьем пассажах в 2,6 раза превосходило значения контрольного протокола, а число генераций культуры ММСК по протоколу 3 было ниже контроля в 2,2 и 3,6 раза соответственно. Общее число генераций ММСК в течение 3-х пассажей по протоколам 1, 2 и 3 составило 12,3; 16,3; 9,7.

Таким образом, проведенные исследования показали, что применение 5% сыворотки АВ(IV) в качестве добавки к питательной среде, позволяет получить количество ММСК, необходимое для клинических целей. Оптимальными условиями для наращивания ММСК являются: получение первичной культуры из суспензии мононуклеаров, применение полной пита—

+

Т.С. Йылмаз, А.А. Гумерова, А.П. Киясов,

А.В. Табанакова, Д.И. Андреева, И.М. Газизов,

М.С. Калигин

Участие гемопоэтических С034(+)-клеток в репаративной регенерации почки

ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет», Казань, Россия tsmetannikova@yandex.ru

T.S. Yilmaz, А.А. Gumerova, А.Р. Kiassov, A.V. Tabanakova,

.I. Andreeva, I.M. Gazizov, M.S. Kaligin

Study of CD34-positive haematopoietic cells in kidney

regeneration

Проблема хронического гломерулонефрита (ХГН) занимает одно из центральных мест в нефрологии. Актуальность этого заболевания обусловлена его высокой распространенностью, поражением в основном работоспособной части населения и неизбежным развитием хронической почечной недостаточности. Кроме того, крайне проблематичной остается терапия ХГН. Так, медикаментозное лечение малоэффективно и сопряжено с многочисленными побочными эффектами, гемодиализ является лишь методом паллиативной терапии, а трансплантация почки часто невозможна. В связи с этим необходимым является поиск новых методов лечения, одним из которых может стать клеточная терапия с использованием гемопоэтических стволовых клеток (ГСК).

К сожалению, на сегодняшний день ничего не известно об участии ГСК в регенерации клубочков при ХГН, и соответственно, чтобы установить целесообразность трансплантации ГСК при ХГН, необходимо получить ответ на этот вопрос. Кроме того, перед тем как трансплантировать стволовые клетки с целью лечения какого-либо заболевания, необходимо знать, как ведут они себя в здоровой почке, мигрируют ли трансплантированные клетки в почку, и если мигрируют, то в какие отделы встраиваются.

Цель исследования: изучить возможность участия гемопоэтических С034( + )-клеток в процессах восстановления клубочков у больных ХГН, а также хоуминг и дифференцировку трансплантированных мононуклеаров пуповинной крови человека в интактных почках крыс.