Биотестирование токсичности вод по скорости поглощения дафниями микроводорослей, регистрируемых с помощью флуоресценции хлорофилла

ЭКОЛОГИЯ

УДК 581.132

БИОТЕСТИРОВАНИЕ ТОКСИЧНОСТИ ВОД ПО СКОРОСТИ ПОГЛОЩЕНИЯ ДАФНИЯМИ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ, РЕГИСТРИРУЕМЫХ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ХЛОРОФИЛЛА

Д.Н. Маторин, Л.Б. Братковская, О.В. Яковлева, П.С. Венедиктов

Исследована возможность использования параметров флуоресценции для определения изменения концентрации в среде микроводорослей при изучении питания Daphnia magna. На основе изучения влияния различных химических веществ на скорость питания рачка предложен чувствительный токсикологический экспресс-тест.

Ключевые слова: Daphnia magna, флуоресценция хлорофилла, биотестирование, экология.

Дафниевый тест, основанный на оценке выживаемости, плодовитости и качества потомства в исследуемых пробах воды, относится к числу основных при нормировании качества природных и сточных вод во многих странах мира (и8. ЕРА, 1994). Это связано с тем, что дафнии являются важнейшей составной частью пресноводного зоопланктона, имеют короткий жизненный цикл, легко культивируются в лабораторных условиях и обладают высокой чувствительностью к токсикантам различной природы (Филенко, 1988; Филенко и др., 2004). В нашей стране дафниевый тест стандартизирован и является основным при установлении ПДК для рыбохозяйственных водоемов (Руководство..., 2002). В работах (Цвылев, Соколова, 1986; Маторин и др., 1990) было показано, что одной из первичных реакций дафний на действие токсикантов является изменение активности их питания, происходящее задолго до возможной гибели тест-объекта.

Как и большинство планктонных ракообразных, дафнии по типу питания относятся к фильтрато-рам. Процесс питания связан с непрерывным колебательным движением грудных ножек, имеющих с внутренней стороны множество тонких щетинок, прилегающих плотно друг к другу и образующих фильтр, служащий для удержания взвешенных в воде частиц. Значительную часть потребляемой дафниями пищи, помимо простейших, бактерий и детрита, составляют планктонные микроводоросли (Су-щеня, 1975).

Одним из высокочувствительных методов слежения за концентрацией клеток водорослей является метод быстрой флуоресценции хлорофилла (Маторин, Венедиктов, 1990). Интенсивность постоянной флуоресценции Бо с высоким коэффициентом корреляции соответствует суммарному со-

держанию пигментов при низком уровне возбуждения фотосинтетического аппарата фитопланктона, и коррелирует с обилием клеток водорослей (Ma-torin et al., 2004). Это позволяет после калибровки по выходу постоянной флуоресценции (Fo) быстро и с низкой трудоемкостью (1—2 мин) определить концентрацию водорослей в пробе в диапазоне от 1 тыс. кл./мл до 10 млн кл./мл. В настоящее время для этих целей возможно использование различных флуорометров, разработанных на кафедре биофизики МГУ, а также другими фирмами.

В данной статье приводятся результаты исследований основных особенностей питания дафний в норме и при действии токсических веществ, полученных с использованием флуоресцентных методов. Обоснованы некоторые практические рекомендации по использованию скорости фильтрации у дафний в качестве чувствительного показателя токсического действия загрязнителей.

Материалы и методы исследования

В качестве тест-объектов использовали лабораторные культуры ветвистоусых рачков-фильтра-торов Daphnia magna, выращиваемые по общепринятой в гидробиологической практике методике (Филенко и др., 2004). Кормом для дафний служила культура зеленой водоросли Chlorella vulgaris, которую выращивали в культиваторах при t = 24° на 18%-й среде Успенского при освещенности 30 мкЕ м-2 • с-1 в области ФАР люминесцентными лампами дневного света. Перед опытами водоросли выращивали в течение суток. Плотность культуры соответствовала 300 тыс. кл./мл. В опытах использовали хлореллу в экспоненциальной фазе роста, предварительно освободив от культуральной среды (центрифугирование).

О выедании клеток хлореллы дафниями судили по уменьшению выхода постоянной флуоресценции (Fo), прямо пропорциональной концентрации клеток водоросли в среде. Измерение параметров флуоресценции хлорофилла в суспензии водорослей проводили на импульсном флуорометре, созданном на кафедре биофизики биологического факультета МГУ и предназначенном для измерения сильно разбавленных суспензий микроводорослей. Некоторые эксперименты проводили на лабораторном флуорометре Токси-PAM (Heinz Walz GmbH, Германия). В токсикологических опытах использовали следующие токсиканты: метилртуть (MeHg), сульфат меди (CUSO4 • 5H2O), трипропилоловохло-рид (ТПОХ) (C3H7)3SnCl, сульфат цинка (ZnSO4), хлорид свинца (PbCl2), калий двуххромовокислый (К2СГ2О7), диурон (3,4-дихлорфенил)-1,1-диметил-мочевина). Все опыты делали в трех повторностях.

Результаты и их обсуждение

После добавления хлореллы в сосуд с дафниями наблюдалось уменьшение сигнала флуоресценции в процессе выедания клеток водорослей (рис. 1). При концентрациях хлореллы ниже 300 тыс. кл./мл этот процесс происходил по экспоненте. Концентрацию клеток хлореллы (Ct) в каждый момент времени t можно рассчитать по формуле: Ct = = Co • exp (—k • t) [1], где Co — концентрация хлореллы в начальный момент времени, k — константа скорости уменьшения концентрации водорослей в пробе. Мгновенная скорость уменьшения концентрации водорослей (при t стремящемся к нулю) будет равна: dC/dt = —Co • k. Учитывая, что k = ln (C/Co) • t-1 [2], а dC/dt Co = dV/dt • V [3], где V — общий объем пробы с дафниями, dV/dt — мгновенная скорость фильтрации дафний (обозначим ее как F) и при условии неизменности F с те-

Время, ч

Рис. 1. Влияние солей метилртути в концентрации 10-7 М на скорость питания дафний (перед измерением дафнии 1 ч инкубировались с солями метилртути).

1 — контроль; 2 — в присутствии токсиканта

чением времени, находим, что средняя скорость фильтрации одной дафнии в пробе: F = ln (Q/Co) х х V/n • t [3], где n — количество дафний в пробе. Величина F, или скорость фильтрации, выражается в миллилитрах на дафнию в час (мл/даф. ч) и обозначает объем профильтрованной дафнией воды в пробе в течение часа. В дальнейших экспериментах мы использовали формулу [3] для оценки активности питания дафний.

С увеличением линейных размеров тела (L, мм) скорость фильтрации у дафний возрастает. Зависимость F от L описывалась уравнением F = 0,32 х х L1,83, r = 0,94, Р 0,05. Скорость фильтрации у взрослых особей (5—6 мм) достигала 8—10 мл/ч на дафнию при средних значениях 6—7 мл/ч или 150—200 мл/сут. Высокий уровень разброса F (CV = = 57%), характерный для взрослых дафний, снижает их значимость для использования в токсикологических экспериментах, поскольку требует большего количества повторов для получения достоверных результатов. Уже однодневная (L = 1 мм) молодь дафний способна питаться водорослями. Скорость фильтрации у однодневной молоди не превышала 0,3 мл/ч и так же характеризовалась значительным разбросом (CV = 42%). Наиболее стабильна F (CV = = 21%) была у молодых дафний средних размеров (L = 3,5—4 мм, 6—8 дневные особи). Средняя величина F у них составляла 3,5—4 мл/ч. Снижение F у таких дафний до 2—2,5 мл/ч и ниже свидетельствует о неблагоприятных условиях культивирования. Таким образом, дафнии средних размеров (3,5—4 мм) были использованы для проведения всех последующих экспериментов.

Оптимальная плотность посадки дафний (V/n) — 4—5 мл на дафнию для часового периода кормления (20—25 мл на 5 дафний) — может быть рассчитана из формулы [3] при условии, что дафнии, имея F = 4 мл/даф. ч, выедают 60—70% водорослей в пробе за 1 ч.

Зависимость F от продолжительности голодания дафний показана на рис. 2. В первые сутки голодания F достигала максимального уровня и стабилизировалась (CV = 21%). Дальнейшее голодание (до 3 сут) не влияло на F. К концу 5-х сут F падало до 0 и дафнии погибали. Таким образом, для получения максимальной F и ее стабилизации перед началом опытов следует выдерживать дафний в течение суток в исследуемых пробах воды без добавления корма.

Скорость фильтрации у дафний зависела от концентрации пищи. При концентрациях водорослей в пробе ниже 5—3 тыс. кл./мл дафнии практически не питались. Частота движения фильтровального аппарата при этом не отличалась от обычной и составляла около 200 циклов в минуту. Если предположить, что средняя скорость фильтрации на дафнию остается равной 4 мл/ч (0,3 микролитра за 1 цикл), то при концентрации водорослей

4,5-

**

4,0-

иГ 3,5 -

3,0-

2,5-

2,0-

1,5-

1,0-

0,5-

0 1 2 3 4 5

Сут

Рис. 2. Зависимость скорости фильтрации F (мл/ч) у дафнии от продолжительности их голодания перед опытом

3—5 тыс. кл./мл дафния за каждый цикл движения фильтровального аппарата отфильтровывает 1—2 клетки хлореллы, которые она может терять, и пищевого комка не образуется. Неспособность дафний удовлетворять свои пищевые потребности при концентрациях водорослей ниже 5 тыс. кл./мл отмечалась в работах других авторов (Филенко и др., 2004). В диапазоне концентраций водорослей от 30 до 300 тыс. кл./мл скорость фильтрации остается на постоянном уровне. В указанном диапазоне плотности количество потребляемых дафнией клеток за время t (обозначим как К) возрастает линейно при увеличении концентрации. Максимальные К для каждой концентрации водорослей можно рассчитать по формуле: К = Ф 535 v  С [4], где Ф — количество циклов фильтровального аппарата за t, v — объем воды, фильтруемый дафниями за один цикл, С — концентрация клеток водорослей в пробе. Поскольку водоросли извлекаются дафниями из постоянного объема воды с постоянной скоростью, т.е. ФУу = const, то, исходя из формулы [4], количество отфильтрованной пищи с ростом ее концентрации в указанных пределах возрастает линейно.

С увеличением плотности водорослей от 300 тыс. кл./мл и выше величина F снижалась, но изменений в интенсивности работы фильтровального аппарата, по крайней мере в течение первых 1—2 ч, не наблюдалось. Снижение F было пропорционально увеличению концентрации водорослей. Количество потребляемых клеток достигало при этом максимального уровня и в дальнейшем независимо от увеличения плотности оставалась неизменной — около 800 тыс. кл./даф. в час. Отсюда следует, что при концентрациях пищи, больших некоторой максимальной (Стах), дафнии, будучи не в состоянии обрабатывать за время t больше клеток, чем Ктах, теряют "лишние" отфильтрованные частицы обратно во внешнюю среду. Для водорослей

с концентраций выше Стах значение изменяется по формуле К = Ф  V  С — Р [5], где Р — количество теряемых дафниями клеток водорослей за время 1 и Р = КУ(С  Стах/Стах). Поскольку при высоких концентрациях пищи дафнии выедают постоянное количество клеток в равные промежутки времени, уменьшение сигнала флуоресценции с течением времени происходит практически линейно. При концентрациях пищи выше 2 млн. кл./мл происходит засорение фильтровального аппарата дафний водорослями и гибель особей с течением времени. Исходя из представленных данных, мы выбрали оптимальную концентрацию водорослей хлореллы для проведения экспериментов по кормлению дафний, которая должна составлять 100 тыс. кл./мл, приходящуюся примерно на середину диапазона концентраций, при которых Б имеет постоянную величину.

Факторы среды (температура, рН, содержание кислорода и т.д.) при инкубировании дафний в опытах должны быть теми же, что и при культивировании рачков. При кормлении дафний в ходе экспериментов следует избегать попадания на пробы интенсивного света, поскольку это может повлиять на выход флуоресценции водорослей. Дафнии очень чувствительны к механическим повреждениям, поэтому при пересаживании их в пробы с исследуемой водой требуется осторожность. При соблюдении указанных в данном разделе условий скорость фильтрации у дафний, рассчитываемая по предложенной формуле [3], может быть использована в качестве одного из наиболее чувствительных показателей состояния дафний в токсикологических экспериментах.

Одной из первичных реакций дафний на токсическое воздействие было снижение скорости фильтрации (Б) и соответственно уменьшение количества съедаемых за время 1 водорослей (К) (рис. 1 и 3). Визуальные наблюдения за интоксицированными дафниями показали, что снижение Б в целом соответствовало уменьшению частоты движения фильтровального аппарата, но строгой корреляции между этими параметрами не было. При действии высоких концентраций токсикантов, полностью подавлявших Б (дафнии прекращали питаться), движение грудных ножек замедлялось, как правило, не более чем в 3—4 раза. Некоторые токсиканты, например ТПОХ, наоборот, стимулировали движение грудных ножек, но, независимо от этого, Б у дафний снижалось. Такие токсиканты, как цинк и свинец, несколько уменьшали амплитуду движения грудных ножек (широту захвата) без изменения частоты движения, но Б могла снижаться значительно. Степень несоответствия между изменениями работы фильтровального аппарата и Б возрастала с повышением концентрации корма в пробе при действии всех исследованных нами токсикантов. Отсюда можно предположить, что действие токсических

Рис. 3. Действие трипропилоловохлорида

веществ на Б и К могло быть связано не только с ингибированием процессов захвата пищи (уменьшение Ф и/или V ), но и со снижением эффективности ее обработки, т.е. снижением максимального количества водорослей, которое интоксицирован-ные дафнии способны съедать за определенное время при соответствующем увеличении количества теряемых водорослей. Таким образом, в результате интоксикации снижаются потребности дафний в пище, что проявляется в уменьшении количества съедаемых дафниями клеток водорослей в единицу времени и, следовательно, Б может служить мерой пищевой активности рачков.

Динамика действия токсикантов (на примере ТПОХ) на выживаемость и Б у дафний в опытах длительностью до 20 сут показана на рис. 3. Видно, что достоверное ингибирование Б при действии веществ в концентрациях, токсичность которых подтверждается гибелью дафний при их длительном инкубировании с токсикантами, обнаруживалось уже в первые сутки эксперимента. В дальнейшем Б имела сложную динамику, характеризующуюся периодами спадов и подъемов. Но в целом во всех случаях проявлялась отчетливая тенденция к снижению скорости фильтрации с течением времени. Подавление Б у дафний на 80—100% наблюдалось, как правило, за 1—4 сут перед гибелью (в зависимости от природы вещества и его концентрации).

На основании экспериментов с различными токсикантами была сделана попытка установить взаимосвязь между степенью ингибирования Б у дафний в суточных экспериментах и временем наступления гибели половины особей (ЬТ50) в длительных экспериментах (рис. 4). Некоторая корреляция между подавлением Б на начальных стадиях интоксикации и ЬТ50, определяемой по совокупным результатам опытов с токсикантами различной при-

роды, не было обнаружено. Показанная зависимость свидетельствует о возможности некоторой предварительной оценки токсичности пробы. При подавлении Б у дафний более чем на 70% от контроля в первые сутки опыта ЬТ50 не превышает 5 сут, что характеризует пробу как обладающую острым токсическим действием на рачков (Филенко и др., 2004). Если Б у дафний в первые сутки опыта подавляется не более, чем на 50—60%, то проба острым токсическим действием не обладает, но оказывает хроническое действие на дафний, при этом ЬТ50 составляет от 5—6 сут до 20 сут и более. Следует отметить, что отсутствие эффекта у дафний в опыте или стимулирование Б в первые сутки эксперимента хотя и указывает на то, что проба не обладает острым токсическим действием на дафний, тем не менее не свидетельствует о ее полной безопасности. Для получения более определенного результата необходимо ставить более продолжительные эксперименты.

Эксперименты с различными токсикантами показали, что максимальные концентрации веществ, не вызывавшие достоверного ингибирования Б в суточных опытах были близки к наиболее строгим ПДК, установленным для этих веществ (таблица). Из таблицы и рис. 5, на котором представлены результаты пробит-анализа (Жмур, 1997) токсического действия некоторых веществ на исследуемый параметр, видно, что дафнии обладали высокой чувствительностью к большинству использованных ток-

Рис. 4. Связь между временем гибели 50% дафний при действии токсикантов и скоростью фильтрации Б (мл/ч) (% от контроля) через сутки после добавления токсикантов

Рис. 5. Результаты пробит-анализа токсического действия указанных веществ на активность питания дафний. Длительность опытов — 1 сут

сикантов. Представленные данные указывают на эффективность предлагаемого теста и возможность его применения для решения ряда практических задач, связанных с оперативным контролем токсичности природных и антропогенных вод.

Максимальные концентрации исследованных веществ, не оказывавшие действия на скорость фильтрации у дафний в суточных экспериментах

Токсикант Концентрация (мкг/л) ПДК для рыб. хоз. вод.

Ртуть 0,3 0,1

Медь 5 1

Свинец 10 100

Бихромат калия 40 —

Цинк 10 10

ТПОХ 2—3 1

Заключение

Таким образом, описанная выше методика оценки токсичности вод по скорости поглощения водорослей регистрировавшаяся флуоресцентным методом обеспечивает выполнение биотестирования с высокой достоверностью (Маторин, 2007). Максимальные концентрации веществ, обнаруживаемые данным методом в суточных опытах, были близки к ПДК для рыбохозяйственных водоемов, установ-

ленным для этих веществ. Важно отметить, что параллельно на той же флуоресцентной аппаратуре возможна оценка влияния токсических веществ на фотосинтетическую активность микроводорослей. С использованием обоих методов нами проведено исследование детоксицирую-щих свойств гуминовых веществ различного генезиса по отношению к тяжелым металлам, гербицидам и ПАУ (Регштоуа й а1., 2001а, Ь; Уиёоу е! а1., 2005). Таким образом, появляется возможность на одном приборе определять токсичность воды сразу для двух важнейших компонентов водных экосистем — микроводорослей, являющихся первичными продуцентами органического вещества, и планктонных ракообразных, основных потребителей этого вещества, являющихся в свою очередь пищей для рыб и других организмов более высоких трофических уровней.

Комплексный биотест с использованием водорослей и дафний может быть внедрен в сети экологического мониторинга для контроля токсичности водных стоков предприятий, для входного контроля токсичности сточных вод, поступающих на биологическую очистку, для контроля качества очистки, для периодического обследования состояния загрязнения отдельных экологически неблагополучных водоемов. Конечной целью внедрения методов биотестирования должно стать создание автоматических станций биомониторинга качества воды. На кафедре биофизики МГУ разрабатывается портативный тестер-флуорометр для биотестирования и оценки состояния микроводорослей в условиях загрязнений. Аппаратура апробирована в работах по мониторингу на р. Москва, оз. Иссык-Куль, при индикации загрязнений остатками диоксинов в заливе Нячанг (Южный Вьетнам).

Авторы благодарят В.А. Осипова за помощь в подготовке рукописи.

* * *

Работа проводилась при финансовой поддержке грантов Минобрнауки РНП.2.1.1.1699 и 2008-02-1,2-03-12.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Жмур Н.С. 1997. Государственный и производст- Маторин Д.Н., Вавилин Д.В., Вене-

венный контроль токсичности вод методами биотестиро- диктов П.С. 1990. О возможности использования вания в России. М.

флуоресцентных методов для изучения питания ракообразных // Биол. науки. 1. С. 147—152.

Маторин Д.Н. Венедиктов П.С. 1990. Люминесценция хлорофилла в культурах микроводорослей и природных популяциях фитопланктона // Итоги науки и техн. ВИНИТИ. Сер. Биофизика. 40. 49—100.

Маторин Д.Н. 2007. Оценка токсичности вод по скорости поглощения дафниями микроводорослей, регистрируемых с помощью флуоресценция хлорофилла // Биоиндикация и биотестирование / Под ред. О.П. Мелехова, Е.И. Егорова. М. С. 253—255.

Руководство по определению методом биотестирования токсичности вод, донных отложений, загрязняющих веществ и буровых растворов. 2002. М.

Сущеня Л.М. 1975. Количественные закономерности питания ракообразных. Минск.

Филенко О.Ф. 1988. Водная токсикология. Черноголовка.

Филенко О.Ф., Исакова Е.Ф., Черно-мордина А.В. 2004. Особенности действия бихро-мата калия на генерации и модельные популяции низших ракообразных // Актуальные проблемы водной токсикологии / Под ред. Б.А. Флерова. Борок. С. 176—194.

Цвылев О.П., Соколова С.А. 1986. Трофическая активность планктонных фитофагов — оперативный чувствительный индикатор качества водной среды // Вопросы сравнительной физиологии и разработки теоретических основ биотестирования. Ярославль. С. 11—13.

Matorin D.N., Antal T.K., Ostrowska M., Rubin A.B., Ficek D., Majchhrowski R. 2004. Chlorophyll fluorometry as a method for studying light absorption by photosynthetic pigments in marine algae // Oceanologia. 46. N 4. С. 519—531.

Perminova I.V., G r e c h i s h c h e v a N.Yu., Kovalevskii D.V., Kudryavtsev A.V., Pet-rosyan V.S., Matorin D.N. 2001a. Quantification and prediction of the detoxifying effects of humic substances related to their chemical binding to polycyclic aromatic hydrocarbons // Environ. Toxicol. Chem. 35. P. 3841—3848.

Perminova I.V., Gretschishcheva N.Yu., Petrosyan V.S., Anisimova M.A., Kuli-kova N.A., Lebedeva G.F., Matorin D.N. 2001b. Impact of humic substances on toxicity of polycyclic aromatic hydrocarbons and herbicides // Humic Substances and Chemical Contaminants / Eds. C.E. Clapp, N. Senesi. St Paul, USA. P. 276—287.

US. EPA. 10-Day Chronic—Daphnia magna or Daphnia pulex; SOP N 2028; 1994. Available from: http://www.ert.org/ products/2028.PDF.

Yudov M.V., Zhilin D.M., PankovaA.P., Rusanov A.G., Perminova I.V., Petrosyan V.S., Matorin D.N. 2005. Synthesis, metal-binding properties and detoxifying ability of sulphona-ted humic acids. Chapter 24 // Use of Humic Substances to Remediate Polluted Environments: From Theory to Practice / Eds. I.V. Perminova et al. Springer, Netherlands. P. 485—498.

Поступила в редакцию 05.02.08

BIOTESTING OF TOXICNESS OF WATERS ON SPEED OF ABSORPTION OF MICROALGAE DAPHNIA REGISTERED BY FLUORESCENCE OF CHLOROPHYLL

D.N. Matorin, L.B. Bratkovskaya, O.V. Yakovleva, P.S. Venediktov

The possibility to use the fluorescence parameters for determination of the concentration changes algae in media studying the filtration feeding of Daphnia magna has been investigated. On the basis of experiments studying the influence of different toxic substances on Daphnia magna feeding behaviour a sensitive toxicological express test has been proposed.

Key words: Daphnia magna, fluorescence of chlorophyll, biotesting, ecology.

Сведения об авторах

Маторин Дмитрий Николаевич — докт. биол. наук, проф., вед. науч. сотр. кафедры биофизики биологического факультета МГУ. Тел.: (495)939-39-68; e-mail: matorin@biophys.msu.ru

Братковская Любовь Борисовна — канд. биол. наук, вед. науч. сотр. кафедры гидробиологии биологического факультета МГУ. Тел.: (495)939-25-73.

Яковлева Ольга Валентиновна — канд. физ.-мат. наук, ст. науч. сотр. кафедры биофизики биологического факультета МГУ. Тел.: (495)939-11-16; e-mail: oyalov@biophys.msu.ru

Венедиктов Павел Сергеевич — докт. биол. наук, проф., вед. науч. сотр. кафедры биофизики биологического факультета МГУ. Тел.: (495)939-39-68; e-mail: psven@rambler.ru