Закономерности соматического мутагенеза у ликвидаторов аварии на ЧАЭС в отдаленные сроки после радиационного воздействия

Закономерности соматического мутагенеза у ликвидаторов аварии на ЧАЭС в отдаленные сроки после радиационного воздействия

Замулаева И.А., Орлова Н.В., Смирнова С.Г.,

Селиванова Е.И., Ткаченко Н.П., Саенко А.С.

ГУ - Медицинский радиологический научный центр РАМН, Обнинск

У ликвидаторов аварии на ЧАЭС после облучения в дозах до 0,25 Гр и контрольных лиц проведен анализ частоты соматических клеток, несущих генные мутации по локусам глико-форина А (GPA) и Т-клеточного рецептора (TCR); у этих же лиц изучена эффективность элиминации поврежденных клеток путем апоптоза и проведено сопоставление этого показателя с частотой мутантных клеток в TCR-локусе. В работе выявлены следующие закономерности соматического мутагенеза в отдаленные сроки после облучения в малых дозах: повышение средней частоты TCR-мутантных лимфоцитов и сохранение на уровне контроля количества мутантных гемопоэтических клеток стволового типа, о котором судили по количеству GPA (ЫО)-вариантных эритроцитов; отсутствие монотонной зависимости частоты TCR-мутантных клеток от дозы радиационного воздействия; сохранение эффекта (повышенной частоты TCR-мутантных лимфоцитов) на стабильном уровне в течение 9-17 лет после радиационного воздействия; проявление указанного эффекта только у части облученных лиц. Результаты исследования апоптотической гибели поврежденных клеток свидетельствуют о важной роли этого процесса как механизма поддержания генетической стабильности на уровне клеточных популяций. Однако повышение частоты TCR-мутантных клеток у обследованных ликвидаторов в большинстве случаев не связано со снижением эффективности этого процесса.

Введение

Исследование генетических эффектов радиационного воздействия в малых дозах является актуальной проблемой радиобиологии, вызывающей многочисленные дискуссии специалистов. Одно из центральных мест в этой дискуссии занимает оценка возможных изменений генетического материала соматических клеток человека в отдаленные сроки после облучения. Ряд данных, полученных, главным образом в условиях in vitro, указывает на возможность возникновения нестабильности генома потомков облученных клеток [1-3]. Имеются основания полагать, что этот феномен проявляется и в соматических клетках человека in vivo [4, 5]. Исследование этой проблемы представляет особый интерес (как в теоретическом, так и в практическом отношении) в связи с тем, что изменения генетического материала соматических клеток являются главной причиной злокачественной трансформации, обусловливающей канцерогенные эффекты радиационного воздействия [6, 7]. Подавляющая часть исследований нестабильности генома человека in vivo выполнена с помощью цитогенетического анализа структурных мутаций. Генные мутации изучены значительно хуже, несмотря на то, что они позволяют зарегистрировать и количественно оценить небольшие по размеру изменения генетического материала, которые превалируют в отдаленные сроки после радиационного воздействия, как показывают исследования нестабильности генома в культурах облученных клеток [2, 3, 8].

Ранее мы показали увеличение частоты мутантных клеток по локусу Т-клеточного рецептора (TCR) у ликвидаторов аварии на ЧАЭС через 9-11 лет после облучения в дозах до 0,25 Гр по сравнению с контрольным уровнем у необлученных лиц [9]. Данная работа посвящена дальнейшему изучению закономерностей и механизмов радиационного мутагенеза в различных соматических клетках в отдаленные сроки после облучения. В частности, основываясь на данных литературы о разной эффективности репарации повреждений ДНК и уровня апоптотической гибели в высоко- и низкодифференцированных клетках человека [10, 11], можно было предположить, что количество радиационно индуцированных изменений генетического материала в таких клетках также различается. Для проверки этого предположения в данной работе проведен сравнительный анализ генных мутаций по TCR- и GPA-локусам, которые возникают, как принято считать, в зрелых лимфоцитах и гемопоэтических клетках стволового типа соответственно. Кроме того, несомненный интерес представляла оценка стабильности обнаруженных нами ранее изменений по TCR-локусу. По современным представлениям о радиационном мутагенезе, повышенная частота мутантных клеток в отдаленные сроки после облучения может быть обусловлена как высокой частотой мутаций вследствие нестабильности генома, возникшей у потомков облученных клеток, так и нарушением механизмов элиминации клеток с поврежденной ДНК. В данной работе исследована реальность второго объяснения. С этой целью проведено, во-первых, изучение эффективности элиминации поврежденных клеток путем апоптоза у ликвидаторов на ЧАЭС и контрольных лиц; во-вторых, сопоставление этого показателя с частотой TCR-мутантных клеток у одних и тех же лиц.

Материалы и методы

Обследованы лица, принимавшие участие в ликвидации аварии на ЧАЭС в 1986-1988 гг. и подвергшиеся радиационному воздействию в дозах до 0,25 Гр (согласно данным дозиметрической службы «Укрытие»). Средняя доза облучения составила 0,13 Гр. Объектом исследования являлись образцы периферической крови указанных лиц. У ликвидаторов аварии исследована частота клеток с мутациями по GPA- и TCR-локусам, а также апоптотическая гибель лимфоцитов, индуцированная действием у-излучения in vitro в разных дозах. У части лиц проведено одновременное определение указанных показателей. В качестве контроля были использованы образцы крови лиц сходного возраста, не имевших зарегистрированного контакта с генотоксическими воздействиями, в том числе ионизирующими излучениями.

Определение генных мутаций по TCR- локусу

TCR-метод основан на использовании моноклональных антител, меченных разными флуорохромами, к CD3 и CD4-антигенам. Как известно, на поверхности Т-лимфоцитов экспрессирован комплекс Т-клеточного рецептора и CD3-антигена. Так как TCR-гены функционально гемизиготны, на поверхности лимфоцитов представлены продукты только

одного аллеля. Мутация в функционирующем аллеле приводит к тому, что CD3 комплекс не экспрессируется на поверхности Т-лимфоцита. Частоту мутантных клеток определяют с помощью проточной цитометрии как отношение числа клеток с фенотипом СD3-CD4+ к числу СD3+СD4+клеток. В данной работе была использована методика, разработанная Kyoizumi S. et al. [12], с некоторыми модификациями, как подробно описано нами ранее [13].

В период с 1995 по 2003 гг. (т.е. спустя 9-17 лет после радиационного воздействия) с помощью TCR-метода обследовано 184 ликвидатора чернобыльской аварии и 126 контрольных лиц сходного возраста.

Определение генных мутаций по GPA-локусу

Для проведения анализа пригодны образцы крови только гетерозиготных по этому локусу доноров, которые составляют около 50 % популяции. На поверхности эритроцитов гетерозиготных доноров представлены обе аллельные формы гликофорина А-M и N. В настоящее время разработаны методы получения антител к указанным формам гликофорина А и последующего их выявления с помощью флуоресцентных красителей. Принято считать, что мутации в генах, кодирующих гликофорин А, приводят к потере представительства соответствующего гликопротеина на поверхности эритроцитов, если соответствующая мутация произошла в низкодифференцированных клетках-предшественниках эритроцитов до начала экспрессии гликофорина. В случае мутации N-аллеля на поверхности клетки будет обнаруживаться только гликофорин M и наоборот. Проточно-цитометрический анализ позволяет идентифицировать эритроциты, потерявшие способность связывать одно из антител вследствие мутации в соответствующем аллеле гена, и, таким образом, оценивать частоту вариантных/мутантных клеток. В данной работе использовался так называемый BR-6 метод, позволяющий определять частоту NО-вариантных эритроцитов вследствие потери экспрессии М-формы гликофорина А. Подробное описание методики приведено в работах [13, 14].

В период с 1994 по 2003 гг. частота GPA ^0)-вариантных эритроцитов определена у 71 ликвидатора аварии на ЧАЭС и 33 контрольных лиц сходного возраста.

Определение апоптотической гибели лимфоцитов после радиационного воздействия in vitro

Метод основан на том, что в клетках, подвергающихся апоптотической гибели, появляется фрагментированная ДНК, которая удаляется из клеток путем экстракции раствором НС1. Затем оставшуюся в клетках ДНК окрашивают иодистым пропидием и определяют поклеточное содержание ДНК. Апоптотическую гибель клеток оценивают по доле клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК, как подробно описано ранее [15].

В данной работе выделенные с помощью центрифугирования лимфоциты культивировали в течение 24 ч в полной среде RPMI-1640 («Панэко», РФ), затем подвергали радиационному воздействию у-излучения 60Со в разных дозах (0,5-5 Гр) при мощности дозы 0,5 Гр/мин, культивировали еще 24 ч, фиксировали в 70 % этаноле, обрабатывали 0,6 М HCl,

окрашивали раствором иодистого пропидия (Sigma, США) в конечной концентрации 50 мкг/мл. С помощью проточной цитометрии анализировали поклеточное содержание ДНК и определяли долю клеток без признаков апоптотической гибели.

По графику зависимости этого показателя от дозы облучения вычисляли уравнение линейной регрессии: ln(P)=a+bD, где D - доза, Гр; Р - доля клеток без признаков апоптоза при облучении в соответствующей дозе; a и b - коэффициенты уравнения регрессии, определяемые методом наименьших квадратов. Значение коэффициента /Ь/ характеризует способность облучения вызывать апоптоз лимфоцитов через 24 часа инкубации в питательной среде. Параметры линейной регрессии были вычислены отдельно для каждого из 38 обследованных ликвидаторов и 24 контрольных лиц.

Статистическая обработка

Статистическая обработка выполнена с помощью программы Origin («MicroCal Software», США). Исследованные показатели соматического мутагенеза в группах обследованных лиц сравнивали по i-критериям Стьюдента и Манн-Уитни. Сопоставление частоты TCR-мутантных лимфоцитов и апоптотической гибели клеток проводили по критерию Фишера. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Частота клеток с мутациями по TCR-локусу определена у ликвидаторов аварии на ЧАЭС через 9-17 лет после радиационного воздействия. Средняя частота (±SD) TCR-мутантных клеток составила в группе ликвидаторов (4,8±2,9)-10-4, в контрольной группе - (3,8±1,4) 10-4 (рис. 1). Расчеты по критериям Манн-Уитни и Стьюдента свидетельствуют о статистически значимом увеличении частоты TCR-мутантных клеток в группе ликвидаторов по сравнению с контролем (p<0,01). У 31 из 184 (16,8 %) ликвидаторов отмечена повышенная частота TCR-мутантных клеток, превышающая 95 % доверительный интервал, установленный для данной контрольной группы, т.е. выше 6,610-4. Если лиц с повышенными частотами исключить из группы ликвидаторов и контрольной группы, то среднее значение частоты TCR-мутантных клеток составит (3,8±1,2)10-4 и (3,6±1,3)10-4 соответственно (p>0,05 по любому критерию). Следовательно, повышение частоты TCR-мутантных клеток в общей группе ликвидаторов объясняется наличием лиц с высокими значениями этого показателя.

Далее был проведен анализ стабильности полученных результатов во времени. При этом использовали два подхода. Во-первых, проведено сравнение частоты TCR-мутантных клеток в подгруппах ликвидаторов, обследованных через 9-11, 12-14 и 15-17 лет после радиационного воздействия, с контрольным уровнем. Установлено, что средняя частота мутантных клеток в указанных подгруппах ликвидаторов выше в 1,4, 1,3 и 1,4 раза соответственно, чем в группах контрольных лиц сходного возраста, обследованных в то же самое время, т.е. в течение 19951997, 1998-2000, 2001-2003 гг. Количество лиц с повышенными частотами TCR-мутантных

клеток было также примерно одинаково в подгруппах ликвидаторов, обследованных в разные сроки после облучения, и составило 16,8, 15,3 и 21,6 % соответственно.

20 -

Ц

О

со

Б

ф

т

Ц

О

15 -

10 -

5 -

-ДІ

Р

рн п

Контрольные доноры N=126

4 6

10

12

14

16

18

20

0

0

2

8

30 5 25 ло20

ш

Ез 15

т 10

ло 5 К

0

Ликвидаторы аварии на ЧАЭС N=184

іШйр гнгн ірії

ІЕ^------------,171 І71

10

12

14

16

18

20

Частота ЇСЯ мутантных клеток, х10"

0

2

4

6

8

Рис. 1. Распределение частоты ТСЯ-мутантных клеток у ликвидаторов аварии

на ЧАЭС и контрольных лиц.

Во-вторых, проанализировано возможное изменение частоты ТСЯ-мутантных клеток на индивидуальном уровне по результатам многократного обследования одних и тех же лиц на протяжении 9 лет. Установлено, что у большинства ликвидаторов частота мутантных клеток не изменялась или несколько увеличивалась (рис. 2).

]увеличение со временем ]сохранение на одном уровне ] уменьшение со временем ] разнонаправленные изменения

Рис. 2. Результаты многократного исследования частоты ТСЯ-мутантных клеток у ликвидаторов аварии на ЧАЭС: распределение обследованных лиц по характеру изменений изучаемого показателя соматического мутагенеза.

Таким образом, выполненный двумя способами анализ возможных изменений частоты ТСЯ-мутантных клеток у ликвидаторов чернобыльской аварии со временем после воздействия свидетельствует о стабильности изучаемого показателя соматического мутагенеза в течение 9-17 лет после облучения.

Установлено отсутствие монотонной зависимости частоты ТСЯ-мутантных клеток от дозы облучения ликвидаторов (рис. 3).

о

X

и!

ся

+і

7-

5-

га

н

ОС

О

га

н

о

I—

0 га т к к

1

ч:

ф

а.

О

2-

N=15

р=0,001

N=35

р=0,02

N=22 р=0,11

N=17

р=0,31

N=29

р=0,01

Контрольный 3 диапазон

0,01-0,05 0,06-0,10

0,16-0,20 0,21-0,25

0,11-0,15 Доза, Гр

Рис. 3. Средняя частота ТСЯ-мутантных клеток в подгруппах ликвидаторов чернобыльской аварии, подвергшихся радиационному воздействию в различных дозах.

8

6

4

3

0-

С нашей точки зрения, результаты ТСЯ-обследования ликвидаторов аварии на ЧАЭС (через много лет после прекращения радиационного воздействия) допускают достаточно однозначную интерпретацию. Учитывая:

1) особенности формирования ТСЯ-мутаций, выявляемых с помощью использованного метода, в популяции лимфоцитов, прошедших дифференцировку в тимусе [16],

2) данные о достаточно быстрой элиминации клеток с радиационно индуцированными ТСЯ-мутациями вследствие естественного обновления популяции зрелых лимфоцитов [17, 18],

3) продолжительность времени, прошедшего с момента облучения (9-17 лет),

4) несоответствие очень высокой частоты мутантных клеток, обнаруженной у части ликвидаторов, и дозы воздействия,

можно сделать заключение, что повышение частоты ТСЯ-мутантных клеток у ликвидаторов не является следствием непосредственного действия радиации на лимфоциты во время облучения. По всей видимости, наблюдаемые нами ТСЯ-мутантные клетки сформированы с1е поуо в отдаленные сроки после воздействия вследствие нестабильности генома, возникшей под действием ионизирующего излучения у потомков облученных клеток.

Средняя (±SE) частота клеток с мутациями по GPA-локусу у ликвидаторов не отличалась статистически значимо от таковой в контрольной группе: 21,3 (±2,8)-10-6 и 18,8 (±2,7)-10-6 соответственно. Сходные результаты были получены группами исследователей из США, России и стран Балтии [19, 20]. У 16 ликвидаторов проведено одновременное определение частоты клеток с мутациями по локусам GPA и TCR. Установлено отсутствие корреляции данных двух методов (r=0,03). Считают, что мутации, выявляемые с помощью GPA-метода, формируются в клетках стволового типа и способны длительное время (более 40 лет) сохраняться в организме [21, 22]. Поэтому можно полагать, что количество мутаций, индуцированных прямым действием радиации во время ликвидации аварии, по всей видимости, было невелико, в связи с чем частота клеток с мутациями по GPA-локусу не отличается от контрольного уровня. Отсутствие корреляции данных двух методов позволяет также полагать, что процессы, благодаря которым увеличивается частота TCR-мутантных клеток, происходят в отдаленные сроки после облучения и не затрагивают клетки стволового типа. Вероятно, наблюдаемый нами селективный эффект действия радиации на разные популяции клеток можно объяснить (хотя бы частично) разной эффективностью систем поддержания генетической стабильности, включающих репарацию повреждений ДНК, индукцию апоптоза и т.д., в клетках с разной степенью дифференцировки [10, 11, 23, 24].

Получены данные об уровне апоптоза лимфоцитов, радиационно индуцированного in vitro, у 38 ликвидаторов аварии на ЧАЭС и 24 контрольных лиц (табл. 1). Среднее значение коэффициента /Ь/, отражающего эффективность апоптотической элиминации поврежденных клеток, в группе ликвидаторов статистически значимо не отличалось от такового в контрольной группе (р=0,2). Далее было проведено сопоставление коэффициента /Ь/ с частотой TCR-мутантных клеток у ликвидаторов. Данные лица были поделены на две группы в зависимости от значения коэффициента /Ь/. В результате сравнительного анализа установлено, что из 7 ликвидаторов с самой низкой величиной /Ь/ у пяти наблюдаются повышенные частоты мутантных клеток (табл. 2). Повышенные частоты мутантных клеток встречаются статистически значимо чаще среди лиц с низким уровнем апоптоза клеток в ответ на радиационное повреждение, чем с более высоким. Таким образом, наши результаты отражают общие биологические закономерности и согласуются с представлениями о важной роли апоптоза как механизма поддержания генетической стабильности клеточных популяций. В то же время следует отметить, что из 12 ликвидаторов с высокой частотой TCR-мутантных клеток низкий уровень апоптоза отмечался только у пяти. Таким образом, у большинства ликвидаторов повышение частоты лимфоцитов с указанными генными мутациями не связано со снижением апоптотической элиминации поврежденных клеток, а обусловлено другими причинами, что еще раз подтверждает сделанное нами заключение об индукции генетической нестабильности в этих клетках.

Таблица 1

Значение коэффициента /Ь/ у ликвидаторов аварии на ЧАЭС и контрольных лиц

Обследованные лица Число лиц Диапазон коэффициента /Ö/-10-2 Среднее значение ± SD коэффициента /Ö/-10'2 Р

Группа ликвидаторов 38 0,1-23,0 6,9 ± 4,4 0 2

Группа контрольных лиц 24 4,1-20,0 8,2 ± 3,2

Таблица 2

Сопоставление частоты TCR-мутантных клеток и апоптотической гибели лимфоцитов, радиационно-индуцированной in vitro, у ликвидаторов аварии на ЧАЭС

Абсолютное значение коэффициента /b/- 10-2 Частота мутантных клеток (х10-4) Р

более 7,0 менее 7,0

Более 3,0 7 24 0,02

Менее 3,0 5 2

* В таблице указано число обследованных лиц.

Работа выполнена при частичной поддержке РФФИ и администрации Калужской области (грант № 02-04-96032).

Литература

1. Grosovsky A.J., Parks K.K., Giver C.R. et al. //Molecular and Cellular Biology. - 1996. - V. 16, N 11. - P. 6252-6262.

2. Little J.B. //Int. J. Radiat. Biol. - 1998. - V. 74, N 6. - P.663-671.

3. Harms-Ringdahl M. //Mutat. Res. - 1998. - V. 404. - P. 27-33.

4. Воробцова И.Е. Влияние облучения родителей на физиологическую полноценность и риск канцерогенеза у потомства первого поколения организмов разных видов: Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. -Ленинград: Центральный научно-исследовательский рентгенорадиологический институт, 1988.

5. Воробцова И.Е., Воробьева М.В., Богомазова А.Н. и др. //Радиац. биология. Радиоэкология. -1995. - Т. 35, Вып. 5. - С. 630-635.

6. Hagmar L., Brogger A., HansteenI.L. et al. //Cancer Research. - 1994. - V. 54. - P. 2919-2922.

7. Ullrich R.L., Ponnaiya B. //Int. J. Radiat. Biol. - 1998. - V. 74, N 6. - P. 747- 754.

8. Пелевина И.И., Готлиб В.Я., Кудряшова О.В. и др. //Радиац. биология. Радиоэкология. - 1996. - Т. 36, Вып. 4. - С. 546-560.

9. Саенко А.С., Замулаева И.А., Смирнова С.Г. и др. //Радиац. биология. Радиоэкология. - 1998. - Т. 38, № 2. - С. 181-185.

10. Buschfort-Papewalis C., Moritz T., Liedert B. et al. //Blood. - 2002. - V. 100, N 3. - P. 845-853.

11. Josefsen D., Myklebust J.H., Lynch D.H. et al. //Exp. Hematology. - 1999. - V. 27, N 9. - P. 1451-1459.

12. Kyoizumi S., Umeki S., Akiyama M. et al. //Mutat. Res. - 1992. - V. 265, N 2. - P. 173-180.

13. Саенко А.С., Замулаева И.А., Смирнова С.Г. и др. //Радиац. биология. Радиоэкология. - 1998. - Т. 38, № 2. - С. 171-180.

14. Langlois R.G., Nisbet B.A., Bigbee W.L. et al. //Cytometry. - 1990. - V. 11, N 4. - P. 513-521.

15. Орлова Н.В., Смирнова С.Г., Замулаева И.А. и др. //Радиац. биология. Радиоэкология. - 2001. - Т. 41, № 4. - С. 366-372.

16. Kyoizumi S., Akiyama M., Hirai Y. et al. //J. Exp. Med. - 1990. - V. 171, N 6. - P. 1981-1999.

17. Akiyama M., Kusunoki Y., Umeki S. et al. //Radiation Research: A Twentieth-Century Perspective. Vol. II: Congress Proceedings /Ed. by Dewey W.C. et al. - Academic Press, Inc., 1992. - P. 177-182.

18. Umeki S., Kusunoki Y., Endo K. et al. //Proc. Int. Conf. Rad. Effects and Protection, Mito, Japan, Japan Atomic Energy Research Institute, Tokyo, 1992. - P. 151-154.

19. Jones I.M., Galick H., Kato P. et al. //Radiat. Res. - 2002. - V. 158, N 4. - P. 424-442.

20. Bigbee W.L., Jensen R.H., Veidebaum T. et al. //Radiat. Res. - 1997. - V. 147, N 2. - P. 215-224.

21. Саенко А.С., Замулаева И.А. //Радиац. биология. Радиоэкология. - 2000. - Т. 40, № 5. - С. 549-553.

22. Nakamura N., Umeki S., Hirai Y. et al. //New horizons in biological dosimetry. - Wiley-Liess, Inc., 1991. - P. 341-350.

23. Kolesnikova A.I., Konoplyannikov A.G., Hendry J.H. //Radiat. Res. - 1995. - V. 144, N 3. - P. 342-345.

24. Myllyperkio M.H., Vilpo J.A. //Mutat. Res. - 1999. - V. 425, N 1. - P. 169-176.

Regularities of somatic mutagenesis in the Chernobyl clean-up workers in long dates after irradiation

Zamulaeva I.A., Orlova N.V., Smirnova S.G., Selivanova E.I., Tkachenko N.P., Saenko A.S.

Medical Radiological Research Center of RAMS, Obninsk

Frequency of somatic cells with gene mutations at glycophorin A (GPA) and T-cell receptor (TCR) loci was determined in the Chernobyl clean-up workers exposed to radiation with doses up to 0.25 Gy and control persons. The effectiveness of damaged cell apoptotic elimination in these persons was studied and compared with TCR-mutant cell frequency. The following regularities of somatic mutagenesis were determined 9-17 years after low dose irradiation: elevation of average frequency of TCR-mutant lymphocytes as compared with that in control group and maintenance of GPA (NO)-variant erythrocyte frequency at the control level; the absence of monotonic dependence between TCR-mutant cell frequency and the irradiation dose; preservation of stable effect (increased frequency of TCR-mutant lymphocytes) during 9-17 years after exposure; manifestation of the effect only in part of irradiated persons. The investigation of damaged cell apoptotic death testify about importance of this process as the mechanism for maintenance of genetic stability at the level of cell population. However, in most cases, elevation of TCR-mutant cell frequency in examined clean-up workers was not associated with decreasing efficiency of apoptotic elimination of damaged cells.