МИКРОНОСИТЕЛЬ ДЛЯ КЛЕТОК НА ОСНОВЕ НАТУРАЛЬНОГО ШЕЛКА И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
MICROS-CARRIER FOR CELLS BASED ON NATURAL SILK AND A METHOD FOR PRODUCTION THEREOF

Группа изобретений относится к области регенеративной медицины и тканевой инженерии, может быть использована для получения микроносителей для культивирования клеток и/или для доставки клеток в область повреждения ткани для восстановления поврежденных тканей и органов.
Известен микроноситель, представляющий собой упругоэластичную двухкомпонентную массу, полученную из двух источников коллагена, содержащий в составе компонент в виде микросфер размером 100-300 мкм (RU 2249462, С1).
Недостатки этого микроносителя заключаются в том, что он представляет собой неоднородную двухкомпонентную систему в виде геля, содержащего микросферы с малым диапазоном размера, что значительно сужает сферу применения подобных носителей. Кроме того, при его получении используются токсичные реагенты (такие как 0,3 М уксусная кислота) и специфические животные источники коллагена, а в ходе получения невозможно задавать форму и размер микроносителя для конкретной задачи.
Известен способ получения микроносителей, включающий в себя получение трехмерных матриксов на основе фиброина шелка путем замораживания-оттаивания смеси водного раствора фиброина шелка с ДМСО с последующим криоизмельчением трехмерных матриксов с помощью диспергатора (RU 2644633, С1).
Недостатки этого способа заключаются в его низкой производительности, большом количестве манипуляций с исходным материалом, многостадийности способа получения, что влечет за собой значительные временные затраты на изготовление микроносителя, а также в том, что при получении данного микроносителя используется токсичный реагент - ДМСО.
Техническая проблема заключается в получении калиброванных биосовместимых носителей для клеток при минимальном воздействии на исходный материал за короткое время.
Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в получении биосовместимых носителей для клеток регулируемого размера и формы без использования токсичных реагентов и значительных временных затрат.
Сущность изобретения заключается в следующем.
Технический результат достигается тем, что микроноситель для культивирования клеток и/или для доставки клеток в область повреждения ткани представляет собой измельченные волокна фиброина шелка тутового шелкопряда Bombyx mori длиной от 2 мкм до 2 мм и диаметром от 2 мкм до 1 мм.
Существует вариант, в котором в качестве источника волокон фиброина шелка используют коконы, и/или нити, и/или ткани из натурального шелка тутового шелкопряда Bombyx mori.
Предлагается также способ получения данного микроносителя для культивирования клеток и/или для доставки клеток в область повреждения ткани, в котором волокна фиброина шелка тутового шелкопряда Bombyx mori измельчают, получая частицы длиной от 2 мкм до 2 мм и диаметром от 2 мкм до 1 мм.
Существует вариант получения данного микроносителя, в котором в качестве источника волокон фиброина шелка используют коконы, и/или нити, и/или ткани из натурального шелка тутового шелкопряда Bombyx mori.
Существует также вариант, в котором перед измельчением производят отмывание волокон фиброина шелка водным раствором бикарбоната натрия с концентрацией 1-3 мг/мл в течение 30-60 минут при температуре 60-100°С, а затем производят их отмывание дистиллированной водой в течение 12-60 часов.
Существует вариант, в котором измельчение волокон производят в гомогенизаторе, или при помощи ступки и пестика, или при помощи микротома.
Существует вариант, в котором перед измельчением волокна замораживают в жидком азоте.
Существует вариант, в котором перед замораживанием волокна инкубируют в 3-30% водном растворе глицерина в течение 5-120 мин.
Существует вариант, в котором после измельчения волокон их обрабатывают раствором, по меньшей мере, одного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, путем инкубации в растворе этого вещества.
Существует вариант, в котором обработку волокон после измельчения проводят при перемешивании со скоростью 100-800 об\мин.
Изобретения поясняются следующими фигурами.
На фиг. 1 представлено изображение микроносителя на основе фиброина шелка из коконов тутового шелкопряда Bombyx mori, полученного при криоизмельчении. Изображение получено методом сканирующей электронной микроскопии, увеличение х700.
На фиг. 2 представлено изображение микроносителя на основе фиброина шелка из нитей шелка тутового шелкопряда Bombyx mori, полученного при помощи микротома. Изображение получено методом сканирующей электронной микроскопии, увеличение х1500.
На фиг. 3 представлены изображения микроносителей на основе фиброина шелка из коконов тутового шелкопряда Bombyx mori, полученных при криоизмельчении, с культивированными мышиными фибробластами линии 3Т3, окрашенными флуоресцентным красителем DAPI. Изображение получено методом световой микроскопии, увеличение х100, изображение на фиг. 3А получено в режиме «просвет», изображение на фиг. 3Б получено в режиме флуоресцентной микроскопии с использованием фильтра DAPI.
2
На фиг. 4 представлены изображения микроносителей на основе фиброина шелка ткани из натурального шелка тутового шелкопряда Bombyx mori плотностью 15 гр/м, полученных при криоизмельчении, с культивированными мышиными фибробластами линии 3Т3, окрашенными флуоресцентным красителем DAPI. Изображение получено методом световой микроскопии в режиме флуоресцентной микроскопии с использованием фильтра DAPI, увеличение х100.
На фиг. 3Б и 4 мышиные фибробласты 3Т3 обозначены позицией 1, волокна микроносителя - позицией 2.
Способ получения микроносителей реализуется следующим образом.
В одном из вариантов микроноситель для культивирования клеток и/или для доставки клеток в область повреждения ткани представляет собой измельченные волокна фиброина шелка тутового шелкопряда Bombyx mori длиной от 2 мкм до 2 мм и диаметром от 2 мкм до 1 мм.
Кроме этого существует вариант, в котором в качестве источника волокон фиброина шелка используют коконы, и/или нити, и/или ткани из натурального шелка тутового шелкопряда Bombyx mori.
Кроме этого существует вариант, в котором волокна фиброина шелка тутового шелкопряда Bombyx mori измельчают, получая частицы длиной от 2 мкм до 2 мм и диаметром от 2 мкм до 1 мм.
Кроме этого существует вариант, в котором в качестве источника волокон фиброина шелка используют коконы, и/или нити, и/или ткани из натурального шелка тутового шелкопряда Bombyx mori.
Кроме этого существует вариант, в котором перед измельчением производят отмывание волокон фиброина шелка водным раствором бикарбоната натрия с концентрацией 1-3 мг/мл в течение 30-60 минут при температуре 60-100°С, а затем производят их отмывание дистиллированной водой в течение 12-60 часов. Для этого волокна фиброина шелка помещают в пробирку с дистиллированной водой. Указанный температурный режим поддерживают с помощью термостата в течение указанного времени.
Кроме этого существует вариант, в котором измельчение волокон производят в гомогенизаторе, или при помощи ступки и пестика, или при помощи микротома. Для измельчения в гомогенизаторе волокна помещают в гомогенизатор и измельчают при 15000-25000 об/мин в течение 1-15 минут до указанного размера. Для измельчения при помощи ступки и пестика волокна помещают в ступку и измельчают пестиком до указанного размера. Для измельчения при помощи микротома волокна обезвоживают и обезжиривают с помощью гистологической проводки с этиловым спиртом и ксилолом, затем пропитывают парафином, заключают в парафин и измельчают на микротоме до указанного размера.
Кроме этого существует вариант, в котором перед измельчением волокна замораживают в жидком азоте. Для этого волокна помещают в жидкий азот до полного замерзания.
Кроме этого существует вариант, в котором перед замораживанием волокна инкубируют в 3-30% водном растворе глицерина в течение 5-120 мин. Для этого волокна помещают в пробирку с 3-30% водным раствором глицерина и инкубируют в течение указанного времени.
Кроме этого существует вариант, в котором после измельчения волокон их обрабатывают раствором, по меньшей мере, одного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, путем инкубации в растворе этого вещества. Для этого волокна помещают в пробирку с раствором этого вещества, например, фибронектина, желатина, коллагена и инкубируют. Длительность инкубации зависит от конкретного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего и от его концентрации.
Например, для раствора фибронектина с концентрацией 10 мкг/мл время инкубации составляет 12 часов, для раствора желатина с концентрацией 10 мг/мл время инкубации составляет 2 часа, для раствора коллагена с концентрацией 20 мг/мл время инкубации составляет 4 часа.
Кроме этого существует вариант, в котором обработку волокон после измельчения, по меньшей мере, одним веществом, способствующим адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, путем инкубации в растворе этого вещества проводят при перемешивании со скоростью 100-800 об/мин. Для этого волокна помещают в пробирку с раствором этого вещества (например, фибронектина, желатина, коллагена) и инкубируют в течение указанного времени (например, для раствора фибронектина с концентрацией 10 мкг/мл время инкубации составляет 12 часов, для раствора желатина с концентрацией 10 мг/мл время инкубации составляет 2 часа, для раствора коллагена с концентрацией 20 мг/мл время инкубации составляет 4 часа) при перемешивании, например, на магнитной мешалке или лабораторном шейкере.
В качестве примера реализации предлагаемого способа представлены изображения микроносителей, полученные методом сканирующей электронной микроскопии.
Микроноситель на фиг. 1 получали следующим образом. В качестве источника волокон фиброина шелка тутового шелкопряда Bombyx mori использовали коконы тутового шелкопряда Bombyx mori. Волокна кокона предварительно были отмыты водным раствором бикарбоната натрия с концентрацией 2,5 мг/мл при температуре 100°С, а затем отмыты дистиллированной водой в течение 60 минут и высушены на воздухе при комнатной температуре. Далее волокна помещали в 10% водный раствор глицерина, инкубировали 30 минут и замораживали в жидком азоте. В данном примере волокна измельчали при помощи ступки и пестика до размера частиц 100-2000 мкм.
Микроноситель на фиг. 2 получали следующим образом. В качестве источника фиброина шелка тутового шелкопряда Bombyx mori использовали нити шелка диаметром 4-0 (Моснитки, Россия). Нити предварительно были отмыты водным раствором бикарбоната натрия с концентрацией 2,5 мг\мл при температуре 100°С, а затем отмыты дистиллированной водой в течение 60 минут и высушены на воздухе при комнатной температуре. Далее нити заключали в парафин, после чего получали срезы образца на микротоме. В данном примере толщина среза составляла 40 мкм. Затем срезы помещали в пробирку и отмывали от парафина путем 10 последовательных инкубаций в ксилоле по 10 минут, а затем переводили в 96% этанол. В данном примере средняя длина частиц составила 2-100 мкм.
Микроноситель на фиг. 3 получали следующим образом. В качестве источника волокон фиброина шелка тутового шелкопряда Bombyx mori использовали коконы тутового шелкопряда Bombyx mori. Волокна кокона предварительно были отмыты водным раствором бикарбоната натрия с концентрацией 1 мг\мл при температуре 60°С, а затем отмыты дистиллированной водой в течение 12 часов и высушены на воздухе при комнатной температуре. Далее волокна помещали в 3% водный раствор глицерина, инкубировали 120 минут и замораживали в жидком азоте, после чего волокна измельчали при помощи ступки и пестика до размера частиц 20-500 мкм. Культивирование клеток на микроносителе проводили следующим образом. Полученный микроноситель отмывали от глицерина путем инкубации в пяти сменах дистиллированной воды по 20 минут каждая при комнатной температуре, затем стерилизовали в 70% этаноле и отмывали от этанола в трех сменах фосфатно-солевого буфера рН 7,4 по 15 минут каждая при комнатной температуре. Затем микроноситель помещали в среду инкубации на 30 минут. Мышиные фибробласты 3Т3, культивированные в чашках Петри в термостате при температуре 37°С и 5% углекислого газа, снимали с поверхности чашек Петри при помощи раствора трипсина-Версена, после чего ресуспендировали в среде инкубации и центрифугировали в течение 5 минут при 900 g. Осадок, содержащий мышиные фибробласты 3Т3, ресуспендировали в среде инкубации из расчета 1500 клеток/мл. Полученную суспензию смешивали с микроносителем в объемном соотношении 1:1 и инкубировали в термостате при температуре 37°С и 5% углекислого газа в течение 24 часов. После этого для регистрации ядер клеток, адгезированных на микроносителе, в суспензию вносили водный раствор флуоресцентного красителя DAPI в концентрации 2 мкг/мл и инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 5 минут. Затем микроноситель отмывали от несвязавшегося красителя трехкратной сменой фосфатно-солевого буфера рН 7,4 по 5 минут каждая при комнатной температуре. На Фиг. 3Б показано, что мышиные фибробласты 3Т3 (1) адгезировали на волокна (2). Возможность использования микроносителя для доставки клеток проверяли в модельной системе. Мышиные фибробласты 3Т3 в количестве 10000 клеток вносили в чашку Петри и инкубировали в термостате при температуре 37°С и 5% углекислого газа в течение 72 часов. Затем в эти чашки Петри вносили полученный микроноситель с адгезированными мышиными фибробластами 3Т3 из расчета 500 мкл суспензии микроносителя на чашку Петри для доставки клеток.
2
Микроноситель на фиг. 4 получали следующим образом. В качестве источника волокон фиброина шелка тутового шелкопряда Bombyx mori использовали ткань из натурального шелка тутового шелкопряда Bombyx mori плотностью 15 гр/м. Ткань предварительно была отмыта водным раствором бикарбоната натрия с концентрацией 3 мг\мл при температуре 100°С, а затем отмыта дистиллированной водой в течение 60 часов и высушена на воздухе при комнатной температуре. Далее ткань помещали в 30% водный раствор глицерина, инкубировали 5 минут и замораживали в жидком азоте, после чего ткань измельчали при помощи ступки и пестика до размера частиц 20-500 мкм. Культивирование клеток на полученном микроносителе проводили следующим образом. Полученный микроноситель отмывали от глицерина путем инкубации в пяти сменах дистиллированной воды по 20 минут каждая при комнатной температуре, затем стерилизовали в 70% этаноле и отмывали от этанола в трех сменах фосфатно-солевого буфера рН 7,4 по 15 минут каждая при комнатной температуре. Затем микроноситель помещали в среду инкубации на 30 минут. Мышиные фибробласты 3Т3, культивированные в чашках Петри в термостате при температуре 37°С и 5% углекислого газа снимали с поверхности чашек Петри при помощи раствора трипсина-Версена, после чего ресуспендировали в среде инкубации и центрифугировали в течение 5 минут при 900 g. Осадок, содержащий мышиные фибробласты 3Т3, ресуспендировали в среде инкубации из расчета 1500 клеток/мл. Полученную суспензию смешивали с микроносителем в объемном соотношении 1:1 и инкубировали в термостате при температуре 37°С и 5% углекислого газа в течение 24 часов. После этого для регистрации ядер клеток, адгезированных на микроносителе, в суспензию вносили водный раствор флуоресцентного красителя DAPI в концентрации 2 мкг/мл и инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 5 минут. Затем микроноситель отмывали от несвязавшегося красителя трехкратной сменой фосфатно-солевого буфера рН 7,4 по 5 минут каждая при комнатной температуре. На Фиг. 4 показано, что мышиные фибробласты 3Т3 (1) адгезировали на волокна (2). Возможность использования микроносителя для доставки клеток проверяли в модельной системе. Мышиные фибробласты 3Т3 в количестве 10000 клеток вносили в чашку Петри и инкубировали в термостате при температуре 37°С и 5% углекислого газа в течение 72 часов. Затем в эти чашки Петри вносили полученный микроноситель с адгезированными мышиными фибробластами 3Т3 из расчета 500 мкл суспензии микроносителя на чашку Петри для доставки клеток.