ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И/ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ РАКА ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PANCREATIC CANCER TREATMENT AND/OR PREVENTION

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к новому применению антитела против CAPRIN-1 или его фрагмента в лекарственном средстве, таком как терапевтическое и/или профилактическое средство, против рака поджелудочной железы.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Злокачественная опухоль является основной причиной смерти. Это заболевание в настоящее время лечат в основном с помощью хирургического вмешательства в комбинации с лучевой терапией или химиотерапией. Несмотря на развитие новых хирургических способов или открытие новых средств против злокачественной опухоли в последнее время, исход существующих способов лечения злокачественных опухолей улучшился в недостаточной мере, за исключением некоторых типов злокачественных опухолей. В результате последних достижений в молекулярной биологии и иммунологии злокачественных опухолей, были идентифицированы антитела, которые специфически взаимодействуют со злокачественными опухолями, антигены злокачественных опухолей, распознаваемые цитотоксическими Т-клетками, гены, кодирующие такие антигены злокачественных опухолей, что увеличило ожидания в отношении специфической терапии злокачественной опухоли, нацеленной на антигены злокачественных опухолей (непатентный документ 1).
Для уменьшения неблагоприятных явлений терапии злокачественной опухоли, желательно, чтобы пептиды, полипептиды или белки, распознаваемые в качестве антигенов злокачественных опухолей, редко встречались в нормальных клетках, но специфически существовали в злокачественных клетках. В 1991 году, Boon et al (Ludwig Institute for Cancer Research, Belgium) выделили антиген меланомы человека MAGE 1, распознаваемый CD8-положительными Т-клетками, способом клонирования кДНК на основе экспрессии, используя линию аутологичных злокачественных клеток и Т-клетки, реактивные в отношении злокачественных опухолей (непатентный документ 2). В дальнейшем был описан способ SEREX (серологическая идентификация антигенов путем рекомбинантного клонирования на основе экспрессии), который основан на подходе клонирования генов на основе экспрессии, для идентификации опухолевых антигенов, распознаваемых антителами, продуцированными в ответ на аутологичную злокачественную опухоль in vivo у пациента со злокачественной опухолью (непатентный документ 3 и патентный документ 1). С помощью этого способа были выделены некоторые антигены злокачественных опухолей, которые редко экспрессируются в нормальных клетках, но специфически экспрессируются в злокачественных клетках (непатентные документы 4-9). Кроме того, проводятся клинические испытания клеточной терапии с использованием иммуноцитов, которые специфически взаимодействуют с антигенами злокачественных опухолей, или иммунотерапии, специфичной в отношении злокачественных опухолей, с использованием вакцин и т.п., содержащих антигены злокачественных опухолей.
В последние годы во всем мире были выпущены различные лекарственные средства на основе антител для лечения злокачественных опухолей, которые нацелены на антигенные белки на злокачественных клетках. Эти лекарственные средства привлекли внимание вследствие их определенной эффективности в качестве терапевтических средств, специфичных к злокачественной опухоли. Однако большинство антигенных белков, на которые нацелены лекарственные средства, также экспрессируется на нормальных клетках. В результате введения антител повреждаются не только злокачественные клетки, но также и нормальные клетки, экспрессирующие антигены, что является отрицательным результатом и приводит к неблагоприятным явлениям. Следовательно, можно ожидать, что если бы можно было идентифицировать антигены злокачественной опухоли, которые специфически экспрессируются на поверхности злокачественных клеток, и использовать антитела, нацеленные на такие антигены, в качестве лекарственных средств, тогда эти лекарственные средства на основе антител обеспечивали бы лечение, вызывая меньше неблагоприятных явлений. С точки зрения технических общих принципов, специалистам в данной области известно, что рак поджелудочной железы трудно лечить. Эффективное лекарственное средство, обладающее достаточными эффектами на рак поджелудочной железы, еще не было разработано.
Цитоплазматический и ассоциированный с пролиферацией белок 1 (CAPRIN-1) известен в качестве внутриклеточного белка, который экспрессируется при активации или клеточном делении покоящихся клеток и формирует внутриклеточные стрессовые гранулы с внутриклеточной РНК для участия в регуляции транспорта и трансляции мРНК. Было обнаружено, что этот белок специфически экспрессируется на поверхности злокачественных клеток, таких как клетки рака молочной железы, и, таким образом, его исследуют в качестве мишени для лекарственных средств на основе антител для лечения злокачественных опухолей (патентный документ 2). Однако в патентном документе 2, не подтверждается, что CAPRIN-1 экспрессируется на клетках рака поджелудочной железы, и ни описано, ни предложено, что CAPRIN-1 может служить в качестве антигенного белка для рака поджелудочной железы.
Список литературы
Патентная литература
Патентный документ 1: Патент США № 5698396.
Патентный документ 2: Международная публикация № WO 2010/016526.
Непатентная литература
Непатентный документ 1: Tsuyoshi Akiyoshi, "Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy", 1997, Vol. 24, p. 551-519 (Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy Publishers Inc., Japan).
Непатентный документ 2: Bruggen P. et al., Science, 254: 1643-1647 (1991).
Непатентный документ 3: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 11810-11813 (1995).
Непатентный документ 4: Int. J. Cancer, 72: 965-971 (1997).
Непатентный документ 5: Cancer Res., 58: 1034-1041 (1998).
Непатентный документ 6: Int. J. Cancer, 29: 652-658 (1998).
Непатентный документ 7: Int. J. Oncol., 14: 703-708 (1999).
Непатентный документ 8: Cancer Res., 56: 4766-4772 (1996).
Непатентный документ 9: Hum. Mol. Genet 6: 33-39 (1997).
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ПРОБЛЕМА, РЕШАЕМАЯ НАСТОЯЩИМ ИЗОБРЕТЕНИЕМ
Задачей настоящего изобретения является идентификация антигенного белка злокачественной опухоли, специфически экспрессируемого на поверхности клеток рака поджелудочной железы, и обеспечение применения антитела, нацеленного на этот белок, в качестве терапевтического и/или профилактического средства против рака поджелудочной железы.
СПОСОБЫ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМЫ
В результате тщательных исследований, авторы настоящего изобретения получили кДНК, кодирующую белок, специфически связывающийся с антителом, находящимся в сыворотке, полученной от организма, имеющего опухоль, с помощью способа SEREX, используя библиотеки кДНК, происходящей из ткани семенников собак, и сыворотки от собак со злокачественной опухолью молочной железы, а затем получили CAPRIN-1, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую любой из SEQ ID NO: 2-30 с четным номером, и большое количество антител против этих белков CAPRIN-1, исходя из полученного гена и его гомологичных генов человека, животных семейства бычьих, лошади, мыши и курицы. Далее, авторы настоящего изобретения обнаружили, что сегменты белка CAPRIN-1 специфически экспрессируются на поверхности клеток рака поджелудочной железы, и также открыли, что антитело против CAPRIN-1 повреждает клетки рака поджелудочной железы, экспрессирующие CAPRIN-1. На основании этих открытий, было осуществлено настоящее изобретение.
Таким образом, настоящее изобретение имеет следующие аспекты:
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики рака поджелудочной железы, содержащей в качестве активного ингредиента, антитело или его фрагмент, которые специфически обладают иммунологической реактивностью в отношении белка CAPRIN-1 или его фрагмента, содержащего 7-12 или более последовательно расположенных аминокислотных остатков.
В одном варианте осуществления белок CAPRIN-1 имеет аминокислотную последовательность, соответствующей любой из SEQ ID NO: 2-30 с четным номером, или аминокислотную последовательность, обладающую 80% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более, еще более предпочтительно 95% или более, еще более предпочтительно 97-99% или более идентичностью последовательности с этой аминокислотной последовательностью.
В другом варианте осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело или поликлональное антитело.
В следующем варианте осуществления антитело представляет собой антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело или полиспецифическое антитело.
В следующем варианте осуществления антитело представляет собой антитело, обладающее иммунологической реактивностью в отношении полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 273, 266, 270, 272 или 269, или аминокислотную последовательность, обладающую 80% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более, еще более предпочтительно 95% или более, еще более предпочтительно 97-99% или более идентичностью последовательности с этой аминокислотной последовательностью, или его фрагмента.
В следующем варианте осуществления антитело представляет собой любое из следующих антител (a)-(y) и обладает иммунологической реактивностью в отношении белка CAPRIN-1, или фармацевтическая композиция предназначена для лечения и/или профилактики рака поджелудочной железы и характеризуется антителом в качестве эффективного ингредиента:
(a) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области (CDR) SEQ ID NO: 37, 38 и 39 и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 41, 42 и 43;
(b) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 47, 48 и 49, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 51, 52 и 53;
(c) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 57, 58 и 59, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 61, 62 и 63;
(d) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 67, 68 и 69, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 71, 72 и 73;
(e) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 77, 78 и 79, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 81, 82 и 83;
(f) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 87, 88 и 89, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 91, 92 и 93;
(g) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 97, 98 и 99, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 101, 102 и 103;
(h) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 107, 108 и 109, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 111, 112 и 113;
(i) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 117, 118 и 119, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 121, 122 и 123;
(j) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 127, 128 и 129, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 121, 122 и 123;
(k) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 132, 133 и 134, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 136, 137 и 138;
(l) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 142, 143 и 144, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 146, 147 и 148;
(m) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 142, 143 и 144, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 152, 153 и 154;
(n) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 157, 158 и 159, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 161, 162 и 163;
(o) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 167, 168 и 169, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 171, 172 и 173;
(p) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 167, 168 и 169, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 177, 178 и 179;
(q) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 167, 168 и 169, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 182, 183 и 184;
(r) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 167, 168 и 169, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 187, 188 и 189;
(s) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 167, 168 и 169, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 192, 193 и 194;
(t) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 197, 198 и 199, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 201, 202 и 203;
(u) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 207, 208 и 209, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 211, 212 и 213;
(v) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 217, 218 и 219, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 221, 222 и 223;
(w) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 227, 228 и 229, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 231, 232 и 233;
(x) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 237, 238 и 239, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 241, 242 и 243; и
(y) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 247, 248 и 249, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 251, 252 и 253.
В следующем варианте осуществления настоящего изобретения антитело или его фрагмент конъюгированы с противоопухолевым средством.
Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической комбинации, содержащей фармацевтическую композицию по настоящему изобретению и фармацевтическую композицию, содержащую противоопухолевое средство.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения и/или профилактики рака поджелудочной железы, включающему введение фармацевтической композиции или фармацевтической комбинации по настоящему изобретению индивидууму.
Антитело против CAPRIN-1, используемое в рамках настоящего изобретения, повреждает клетки рака поджелудочной железы. Таким образом, антитело против CAPRIN-1 является пригодным для лечения и/или профилактики рака поджелудочной железы.
СПОСОБЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Антитело против белка CAPRIN-1, в частности, полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, соответствующую любой из SEQ ID NO: 2-30 с четным номером, используемое в рамках настоящего изобретения, можно оценивать в отношении его противоопухолевой активности, как описано ниже, путем исследования in vivo ингибирования роста опухоли у животного, имеющего злокачественную опухоль, или путем исследования ex vivo присутствия или отсутствия опосредуемой иммуноцитами или комплементом цитотоксической активности, проявляемой антителом против опухолевых клеток, экспрессирующих полипептид.
Нуклеотидные последовательности полинуклеотидов, кодирующих белки, состоящий из аминокислотных последовательностей, соответствующих SEQ ID NO с четными номерами (т.е. SEQ ID NO: 2, 4, 6, …, 28 и 30) среди SEQ ID NO: 2-30, представлены в SEQ ID NO с нечетными номерами (т.е. SEQ ID NO: 1, 3, 5, …, 27 и 29) среди SEQ ID NO: 1-29, соответственно.
Аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 и 14 в списке последовательностей, представляют собой аминокислотные последовательности CAPRIN-1, выделенные в качестве полипептидов, специфически связывающихся с антителами, присутствующими в сыворотке собаки, имеющей опухоль; аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 2 и 4, представляют собой аминокислотные последовательности CAPRIN-1, выделенные в качестве их гомологичных факторов (гомологов или ортологов) человека; аминокислотная последовательность, соответствующая SEQ ID NO: 16, представляет собой аминокислотную последовательность CAPRIN-1, выделенную в качестве их гомологичного фактора животных семейства бычьих; аминокислотная последовательность, соответствующая SEQ ID NO: 18, представляет собой аминокислотную последовательность CAPRIN-1, выделенную в качестве их гомологичного фактора лошади; аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 20-28, представляют собой аминокислотные последовательности CAPRIN-1, выделенные в качестве их гомологичных факторов мыши; и аминокислотная последовательность, соответствующая SEQ ID NO: 30, представляет собой аминокислотную последовательность CAPRIN-1, выделенную в качестве их гомологичного фактора курицы (см. пример 1, описанный ниже). Известно, что CAPRIN-1 экспрессируется при активации или делении покоящихся нормальных клеток.
Исследование в рамках настоящего изобретения показало, что белок CAPRIN-1 экспрессируется на поверхности клеток рака поджелудочной железы. В соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно используют антитело, связывающееся с участком в каждой молекуле белка CAPRIN-1, экспрессируемым на поверхности клеток рака поджелудочной железы. Примеры частичного пептида белка CAPRIN-1, экспрессируемого на поверхности клеток рака поджелудочной железы, включают полипептиды, каждый из которых состоит из 7-12 или более, например, 8-11 или более, последовательно расположенных аминокислотных остатков в области номеров аминокислотных остатков (а.к.) 50-98, номеров аминокислотных остатков (а.к.) 233-343, или от номера аминокислотного остатка (а.к.) 527 до C-конца аминокислотной последовательности, соответствующей любому четному числу (за исключением SEQ ID NO: 6 и 18) среди SEQ ID NO: 2-30 в списке последовательностей, и конкретно включают: аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 271 или 273 (предпочтительно, например, область аминокислотной последовательности, соответствующая SEQ ID NO: 274 или 275 в аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 273); аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 266 (предпочтительно, например, область аминокислотной последовательности, соответствующая SEQ ID NO: 267 или 268 в аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 266), 270, 272 или 269 в качестве частичного пептида белка CAPRIN-1, экспрессируемого на поверхности злокачественных клеток; и аминокислотную последовательность, обладающую 80% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более, еще более предпочтительно 95% или более, например, 96% или более, 97% или более, 98% или более, или 99% или более идентичностью последовательности с любой из указанных выше аминокислотных последовательностей. Антитело, используемое в рамках настоящего изобретения, включает все антитела, которые связываются с этими пептидами и проявляют противоопухолевую активность.
2
Антитело против CAPRIN-1, используемое в рамках настоящего изобретения, может представлять собой любой тип антитела, который проявляет противоопухолевую активность, и включает, например, моноклональные антитела, поликлональные антитела, рекомбинантные антитела, например, синтетические антитела, полиспецифические антитела (например, диантитело и триантитело), гуманизированные антитела, химерные антитела и одноцепочечные антитела (scFv), антитела человека и их фрагменты антител, например, Fab, F(ab') и Fv. Эти антитела и их фрагменты можно получать способами, в основном известными специалистам в данной области. Желательно, антитело в соответствии с настоящим изобретением представляет собой антитело, способное специфически связываться с белком CAPRIN-1, и предпочтительно представляет собой моноклональное антитело. Можно использовать поликлональное антитело при условии, что могут стабильно продуцироваться гомогенные антитела. В случае, когда индивидуумом является человек, является желательным антитело человека или гуманизированное антитело для предотвращения или подавления отторжения.
Как используют в рамках изобретения, выражение "специфическое связывание с белком CAPRIN-1" означает, что антитело специфически связывается с белком CAPRIN-1, по существу без связывания с другими белками.
Антитело, которое можно использовать в рамках настоящего изобретения, можно исследовать в отношении его противоопухолевой активности, как описано ниже, путем исследования in vivo ингибирования роста опухоли у животного, имеющего злокачественную опухоль, или путем исследования in vitro присутствия или отсутствия опосредуемой иммуноцитами или комплементом цитотоксической активности, которую проявляет антитело против опухолевых клеток, экспрессирующих полипептид.
Индивидуумом, которому проводят лечение и/или профилактику рака поджелудочной железы в соответствии с настоящим изобретением, является млекопитающее, такое как человек, домашнее животное, скот или спортивное животное, предпочтительно человек.
Далее, описано получение антигена, получение антитела и фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением.
Получение антигена для получения антител
Белки или их фрагменты, используемые в качестве сенсибилизирующих антигенов для получения антитела против CAPRIN-1, используемого в рамках настоящего изобретения, не ограничиваются видом животного, служащего их источником, включая, например, людей, собак, крупный рогатый скот, лошадей, мышей, крыс или кур. Однако, белки или их фрагменты предпочтительно выбирают, принимая во внимание их совместимость с родительскими клетками, используемыми для слияния клеток. Как правило, предпочтительными являются белки, происходящие из млекопитающих. В частности, предпочтительными являются белки, происходящие из человека. Например, если CAPRIN-1 представляет собой CAPRIN-1 человека, можно использовать белки CAPRIN-1 человека, их частичные пептиды или клетки, экспрессирующие CAPRIN-1 человека.
Нуклеотидные последовательности и аминокислотные последовательности CAPRIN-1 человека и его гомологов могут быть получены, например, путем доступа в GenBank (NCBI, USA) и с использованием алгоритма BLAST или FASTA (Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877,1993; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997).
В соответствии с настоящим изобретением, в тех случаях, когда нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 1 или 3) или аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 2 или 4) CAPRIN-1 человека используют в качестве основной последовательности, мишенями являются нуклеиновые кислоты или белки, состоящие из последовательности, на 70%-100%, предпочтительно, на 80%-100%, более предпочтительно, на 90%-100%, и, еще более предпочтительно, на 95%-100%, например, на 97%-100%, 98%-100%, 99%-100% или 99,5%-100%, идентичной нуклеотидной последовательности или аминокислотной последовательности ORF или зрелой части эталонной последовательности. Как используют в рамках изобретения, термин "% идентичность последовательностей" означает процент (%) числа идентичных аминокислот (или оснований), от общего числа аминокислот (или оснований), когда две последовательности выравнивают так, чтобы могла достигаться максимальная степень сходства или идентичность, с внесением пропусков или без него.
Фрагменты каждого белка CAPRIN-1 имеют длину в диапазоне от аминокислотной длины эпитопа (или антигенной детерминанты), который является наименьшей единицей, распознаваемой антителом, до менее чем полноразмерного белка. Эпитоп относится к полипептидному фрагменту, обладающему антигенностью или иммуногенностью у млекопитающих, предпочтительно людей. Его наименьшая единица состоит приблизительно из 7-12 аминокислотных остатков, например, 8-11 аминокислотных остатков. Его конкретные примеры включают аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 273, 266, 270, 272 или 269, и аминокислотную последовательность, обладающую 80% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более, еще предпочтительно 95% или более, еще более предпочтительно 97-99% или более идентичностью последовательности с этой аминокислотной последовательностью.
Полипептиды, содержащие указанный выше белок CAPRIN-1 человека и его частичные пептиды, могут быть синтезированы в соответствии со способами химического синтеза, такими как способ Fmoc (флуоренилметилоксикарбонил) или способ tBoc (трет-бутилоксикарбонил) (Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experimentation Course in English) 1, the Japanese Biochemical Society ed., Protein Chemistry IV, Chemical Modification and Peptide Synthesis, Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd. (Japan), 1981). Также эти пептиды могут быть синтезированы общепринятыми способами с использованием целого ряда коммерчески доступных устройств для синтеза пептидов.
Альтернативно можно получать полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, с использованием подходов генной инженерии, известных в данной области (Sambrook et al., Molecular Cloning, the 2nd edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, the 3rd edition, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons; и т.д.) и встраивать их в экспрессирующие векторы, которые затем вводят в клетки-хозяева, так чтобы клетки-хозяева продуцировали полипептиды. Таким образом, можно получать представляющие интерес полипептиды.
2+
Полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, легко могут быть получены с помощью подходов генной инженерии, известных в данной области, или общепринятых способов с использованием коммерчески доступных устройств для синтеза нуклеиновых кислот. Например, ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, можно получать с помощью ПЦР с использованием хромосомной ДНК или библиотеки кДНК человека в качестве матрицы и пары праймеров, сконструированных так, чтобы они были способны амплифицировать нуклеотидную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 1. Условия реакции для этой ПЦР могут быть определены соответствующим образом. Примеры условий могут включать, но не ограничиваются ими, 30 циклов, каждый из которых вовлекает стадии реакции, состоящие из: 94°C в течение 30 секунд (денатурация); 55°C в течение от 30 секунд до 1 минуты (отжиг); и 72°C в течение 2 минут (элонгация) с использованием термостабильной ДНК-полимеразы (например, Taq-полимераза) и Mg-содержащего буфера для ПЦР, с последующей реакцией при 72°C в течение 7 минут. Подход ПЦР, условия и т.д. описаны, например, в Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd edition, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons (в частности, глава 15).
Также можно получать соответствующие зонды или праймеры на основе информации о нуклеотидных последовательностях и аминокислотных последовательностях, соответствующих SEQ ID NO: 1-30 в списке последовательностей, представленном в настоящем описании, и использовать при скрининге, например, библиотеки кДНК человека, для выделения желаемой ДНК. Предпочтительно такую библиотеку кДНК получают из клеток, органов или тканей, экспрессирующих белки, представленные в SEQ ID NO: 2-30 с четными номерами. Примеры таких клеток или тканей включают клетки или ткани из семенников или из злокачественных опухолей, или из опухолей, таких как лейкоз, рак молочной железы, лимфома, опухоль головного мозга, рак легких, рак ободочной и прямой кишки, и рак поджелудочной железы. Эти действия, включающие получение зондов или праймеров, конструирование библиотеки кДНК, скрининг библиотеки кДНК и клонирование представляющего интерес гена, известны специалистам в данной области, и они могут быть выполнены в соответствии со способами, описанными, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989) и Ausbel et al. (ibid.). Из ДНК, полученных таким образом, можно получать ДНК, кодирующие белки CAPRIN-1 человека и их частичные пептиды.
Клетки-хозяева могут представлять собой любую клетку, способную экспрессировать указанные выше полипептиды. Примеры прокариотических клеток включают, но не ограничиваются ими, E. coli. Примеры эукариотических клеток включают, но не ограничиваясь ими: клетки млекопитающих, такие как клетки почки обезьяны COS1 и клетки яичников китайского хомячка CHO; линию клеток эмбриональной почки человека HEK293; линию клеток эмбриональной кожи мыши NIH3T3; клетки дрожжей, такие как почкующиеся дрожжи и делящиеся клетки дрожжей; клетки тутового шелкопряда; и яйцеклетки Xenopus.
В тех случаях, когда прокариотические клетки используют в качестве клеток-хозяев, используемый экспрессирующий вектор имеет ориджин, который позволяет репликацию в прокариотических клетках, промотор, участок связывания с рибосомой, участок множественного клонирования, терминатор, ген устойчивости к лекарственному средству, ген ауксотрофной комплементарности и т.п. Примеры экспрессирующих векторов для E. coli могут включать серию pUC, pBluescript II, экспрессирующие системы pET и экспрессирующие системы pGEX. ДНК, кодирующую указанные выше полипептиды, можно встраивать в такие экспрессирующие векторы, которыми затем трансформируют прокариотические клетки-хозяева, а затем полученные трансформанты культивируют так, чтобы полипептиды, кодируемые этими ДНК, экспрессировались в прокариотических клетках-хозяевах. При этом полипептиды могут быть экспрессированы в качестве белков, слитых с другими белками.
6
10
В тех случаях, когда в качестве клеток-хозяев используют эукариотические клетки, в качестве экспрессирующих векторов используют экспрессирующие векторы для эукариотических клеток, имеющие промотор, область сплайсинга, участок добавления поли(А) и т.п. Примеры таких экспрессирующих векторов включают pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV, pRS, pcDNA3 и pYES2. Аналогично тому, как описано выше, ДНК, кодирующую указанные выше полипептиды, можно встраивать в такие экспрессирующие векторы, которыми затем трансформируют эукариотические клетки-хозяева, а затем полученные трансформанты культивируют так, чтобы в эукариотических клетках-хозяевах экспрессировались полипептиды, кодируемые этими ДНК. В тех случаях, когда используют экспрессирующие векторы, такие как pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1 или pEGFP-C1, полипептиды могут быть экспрессированы в качестве различных слитых белков, меченных His-меткой (например, (His)-(His)), FLAG-меткой, myc-меткой, HA-меткой, GFP и т.п.
Экспрессирующие векторы можно вводить в клетки-хозяева с использованием хорошо известных способов, таких как электропорация, способ с использованием фосфата кальция, способ с использованием липосом, способ с использованием DEAE декстрана, микроинъекция, инфицирование вирусом, липофекция и связывание с пептидом, проникающим через клеточную мембрану.
Представляющий интерес полипептид можно выделять и очищать из клеток-хозяев с помощью комбинации методик разделения, известных в данной области. Их примеры включают, но не ограничиваются ими, обработку денатурирующим веществом (например, мочевина) или поверхностно-активным веществом, обработку ультразвуком, ферментативное расщепление, высаливание, фракционирование растворителем и преципитацию, диализ, центрифугирование, ультрафильтрацию, гель-фильтрацию, SDS-PAGE, изоэлектрофокусирующий электрофорез, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, аффинную хроматографию и обращено-фазовую хроматографию.
Структура антитела
В основном, антитела представляют собой гетеромультимерные гликопротеины, каждый из которых содержит по меньшей мере две тяжелые цепи и две легкие цепи. Антитела, за исключением IgM, являются гетеротетрамерными гликопротеинами размером приблизительно 150 кДа, каждый из которых содержит две идентичные легкие (L) цепи и две идентичные тяжелые (H) цепи. Обычно, каждая легкая цепь соединена с тяжелой цепью посредством одной ковалентной дисульфидной связи, хотя количество дисульфидных связей между тяжелыми цепями варьирует среди различных изотипов иммуноглобулинов. Каждая тяжелая цепь и легкая цепь также имеет внутрицепочечную дисульфидную связь. Каждая тяжелая цепь имеет вариабельный домен (область VH) на одном конце, за которым следует несколько последовательно расположенных константных областей. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен (область VL) на одном конце и имеет одну константную область на другом конце. Константная область легкой цепи расположена параллельно первой константной области тяжелой цепи, в то время как вариабельный домен легкой цепи расположен параллельно вариабельному домену тяжелой цепи. Конкретные области вариабельного домена антитела, которые называются "определяющими комплементарность областями (CDR)", демонстрируют специфическую вариабельность и придают антителу специфичность связывания. Относительно консервативные участки в вариабельной области называются "каркасными областями (FR)". Каждый полный вариабельный домен тяжелой цепи и легкой цепи содержит четыре FR, соединенные друг с другом посредством трех CDR. Эти три CDR обозначаются как CDRH1, CDRH2 и CDRH3, соответственно, в указанном порядке от N-конца тяжелой цепи. Аналогично, в легкой цепи CDR обозначаются как CDRL1, CDRL2 и CDRL3. CDRH3 наиболее важна для специфичности связывания антитела с его антигеном. Кроме того, CDR в каждой цепи удерживаются вблизи друг от друга FR областями, и они вносят вклад в формирование антигенсвязывающего центра в антителе вместе с CDR на другой цепи. Константные области непосредственно не вносят вклад в связывание антитела с антигеном, однако они проявляют различные эффекторные функции, например, вовлечение в антителозависимую клеточноопросредованную цитотоксичность (ADCC), фагоцитоз, опосредуемый связыванием с Fcγ-рецептором, период полужизни/скорость выведения через неонатальный Fc рецептор (FcRn), и комплементзависимую цитотоксичность (CDC) через компонент C1q в каскаде реакций системы комплемента.
Получение антитела
Антитело против CAPRIN-1 в соответствии с настоящим изобретением означает антитело, обладающее иммунологической реактивностью в отношении полноразмерного белка CAPRIN-1 или его фрагмента.
Как используют в рамках изобретения, "иммунологическая реактивность" означает свойство антитела связываться с антигеном CAPRIN-1 in vivo. Путем такого связывания антитело проявляет функцию повреждения (например, уничтожения, подавления или регрессии) опухоли. В частности, тип антитела, используемого в рамках настоящего изобретения, не ограничен при условии, что антитело может повреждать рак поджелудочной железы в результате связывания с белком CAPRIN-1.
2
1
2
3
4
1
2
Примеры антитела включают моноклональные антитела, поликлональные антитела, синтетические антитела, полиспецифические антитела, антитела человека, гуманизированные антитела, химерные антитела, одноцепочечные антитела и фрагменты антител (например, Fab, F(ab') и Fv). Также антитело представляет собой любой класс молекулы иммуноглобулина, например, IgG, IgE, IgM, IgA, IgD или IgY, или любой подкласс, например, IgG, IgG, IgG, IgG, IgA или IgA.
Кроме того, антитело может быть модифицировано ацетилированием, формилированием, амидированием, фосфорилированием, пегилированием и т.п., в дополнение к гликозилированию.
Далее описаны примеры получения различных антител.
Когда антитело по настоящему изобретению представляет собой моноклональное антитело, например, белок CAPRIN-1, клетки рака поджелудочной железы, экспрессирующие CAPRIN-1, или их клеточную линию (например, Capan-2), вводят каждой мыши для иммунизации. Из этих мышей извлекают селезенку. После выделения клеток селезенки клетки подвергают слиянию с клетками миеломы мыши. Из полученных слитых клеток (гибридом) отбирают клоны, продуцирующие антитела, обладающие эффектом ингибирования роста злокачественных клеток (гибридомы). Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, обладающие эффектом ингибирования роста злокачественных клеток, выделяют и культивируют. Представляющее интерес антитело можно получать путем очистки из культурального супернатанта в соответствии с общим способом аффинной очистки.
Гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело, можно получать, например, следующим образом: сначала животных иммунизируют сенсибилизирующим антигеном способом, известным в данной области. Этот способ иммунизации обычно включает внутрибрюшинную или подкожную инъекцию сенсибилизирующих антигенов млекопитающим. В частности, сенсибилизирующие антигены разбавляют или суспендируют в PBS (фосфатно-буферный солевой раствор), физиологическом растворе и т.п. до получения в результате подходящего количества, а затем смешивают, если желательно, с соответствующим количеством общепринятого адъюванта, например, полного адъюванта Фрейнда. После эмульгирования полученную эмульсию вводят каждому млекопитающему несколько раз каждые от 4 до 21 суток. Альтернативно для иммунизации сенсибилизирующими антигенами можно использовать подходящий носитель.
После подтверждения увеличения уровня желаемого антитела в сыворотке млекопитающего, иммунизированного таким образом, иммуноциты собирают от млекопитающего и подвергают слиянию клеток. Предпочтительные примеры иммуноцитов, в частности, включают клетки селезенки.
В качестве родительских клеток-партнеров, подлежащих слиянию с иммуноцитами, используют клетки миеломы млекопитающих. В качестве клеток миеломы предпочтительно используют различные клеточные линии, известные в данной области, например, P3U1 (P3-X63Ag8U1), P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976). 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), и R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133).
Слияние клеток между иммуноцитами и клетками миеломы можно проводить в основном в соответствии со способом, известным в данной области, например, способом Kohler и Milstein et al. (Kohler, G. and Milstein, C. Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).
Более конкретно, слияние клеток проводят, например, в присутствии фактора, стимулирующего слияние клеток, в общепринятой питательной среде. Например, в качестве фактора, стимулирующего слияние клеток, используют полиэтиленгликоль (PEG) и вирус Сендай (японский гемагглютинирующий вирус (HVJ)). При желании, для повышения эффективности слияния можно дополнительно добавлять вспомогательное вещество, такое как диметилсульфоксид.
Соотношение между иммуноцитами и используемыми клетками миеломы может быть выбрано произвольно. Например, количество иммуноцитов предпочтительно выбирают так, чтобы оно превышало количество клеток миеломы в 1-10 раз. Примеры среды, которую можно использовать для слияния клеток, включают среду RPMI1640 и среду MEM, пригодные для роста линий клеток миеломы, а также другие общепринятые среды, используемые для этого типа клеточной культуры. Далее, в комбинации с этими клетками можно использовать добавку на основе сыворотки, такую как эмбриональная сыворотка теленка (FCS).
Для слияния клеток иммуноциты и клетки миеломы хорошо перемешивают в заранее определенном количестве среды. Обычно к смеси добавляют раствор PEG (средняя молекулярная масса приблизительно от 1000 до 6000), предварительно нагретый приблизительно до 37°C, в концентрации от 30% до 60% (масс./об.), и перемешивают с ним для формирования представляющих интерес гибридом. После этого осуществляют повторяющиеся действия, состоящие в последовательном добавлении соответствующей среды и удалении супернатанта посредством центрифугирования для удаления агентов слияния клеток и т.п., которые не являются благоприятными для роста гибридом.
Полученные таким образом гибридомы культивируют в общепринятой селективной среде, например, среде HAT (среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин) для селекции. Культивирование в среде HAT продолжают в течение периода времени (как правило, от нескольких суток до нескольких недель), достаточного для гибели клеток (неслитых клеток), отличных от представляющих интерес гибридом. Далее, проводят скрининг гибридом, продуцирующих представляющее интерес антитело, и клонирование в качестве единичных клонов общепринятым способом лимитирующих разведений.
В дополнение к такому получению гибридом путем иммунизации не являющихся человеком животных антигенами, гибридомы, продуцирующие антитела человека, обладающие желаемой активностью (например, активность ингибирования роста клеток), можно получать путем сенсибилизации лимфоцитов человека, например, инфицированных вирусом EB лимфоцитов человека, белками, экспрессирующими белок клетками или их лизатами in vitro, и слияния сенсибилизированных лимфоцитов с происходящими из человека клетками миеломы, способными постоянно делиться, например, U266 (номер доступа № TIB196).
Гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело, полученные таким образом, можно субкультивировать в общепринятой среде и также можно хранить в жидком азоте в течение длительного периода времени.
В частности, желаемые антигены или клетки, экспрессирующие желаемые антигены, используют в качестве сенсибилизирующих антигенов при иммунизации в соответствии с общепринятым способом иммунизации. Полученные иммуноциты подвергают слиянию с родительскими клетками, известными в данной области, в соответствии с общепринятым способом слияния клеток. Клетки (гибридомы), продуцирующие моноклональное антитело, можно подвергать скринингу общепринятым способом скрининга для получения представляющих интерес антител.
Другим примером антитела, которое можно использовать в рамках настоящего изобретения, является поликлональное антитело. Поликлональное антитело можно получать, например, следующим образом:
Получают сыворотку небольших животных, таких как мыши, мыши, продуцирующие антитела человека, или кролики, иммунизированные природным белком CAPRIN-1 или рекомбинантным белком CAPRIN-1, экспрессируемым в качестве слитого белка с GST и т.п. в микроорганизмах, таких как E. coli, или его частичными пептидами. Эту сыворотку очищают с использованием, например, преципитацией с сульфатом аммония, колонок с белком A или белком G, ионообменной хроматографии с DEAE, или аффинных колонок, с которыми связаны белки CAPRIN-1 или синтетические пептиды, получая представляющее интерес поликлональное антитело. В примерах, описанных ниже, были получены поликлональные антитела кролика против белка CAPRIN-1, и было подтверждено, что они обладают противоопухолевым эффектом.
В этом контексте, например, мыши KM (Kirin Pharma Co., Ltd./Medarex) или мыши XenoMouse (Amgen Inc.) известны в качестве мышей, продуцирующих антитела человека (например, международные публикации № WO 02/43478 и WO 02/092812). Из крови таких мышей, иммунизированных белками CAPRIN-1 или их фрагментами, можно получить полные поликлональные антитела человека. Альтернативно из мышей, иммунизированных таким образом, можно выделять клетки селезенки и подвергать слиянию с клетками миеломы. Таким образом, можно получать моноклональные антитела человека.
Антигены можно получать, например, способом с использованием клеток животных (публикация патента Японии (Kohyo) № 2007-530068 A (2007)) или способом с использованием бакуловируса (например, международная публикация № WO 98/46777). Антигены, обладающие низкой иммуногенностью, могут быть связаны с иммуногенными макромолекулами, такими как альбумин, для иммунизации.
Альтернативно, можно использовать рекомбинантные антитела, которые получают с использованием технологии рекомбинации генов, которая включает клонирование генов антител из гибридом; встраивание генов антител в соответствующие векторы; и введение векторов в хозяев (см., например, Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). В частности, кДНК вариабельной области (V-область) антитела синтезируют из мРНК гибридом с использованием обратной транскриптазы. После получения ДНК, кодирующей представляющие интерес V-области, ДНК лигируют с ДНК, кодирующей желаемые константные области антитела (C-области). Полученные в результате продукты лигирования встраивают в экспрессирующие векторы. Альтернативно, ДНК, кодирующие V-область антитела, можно встраивать в экспрессирующие векторы, содержащие ДНК С-области антитела. Эти ДНК встраивают в экспрессирующие векторы таким образом, чтобы они экспрессировались под контролем областей контроля экспрессии, например, энхансера или промотора. Далее, клетки-хозяева можно трансформировать полученными экспрессирующими векторами и позволять им экспрессировать антитела.
Антитело против CAPRIN-1, используемое в рамках настоящего изобретения, предпочтительно представляет собой моноклональное антитело. Альтернативно антитело против CAPRIN-1 по настоящему изобретению может представлять собой поликлональное антитело, полученное способами генетической инженерии антитело (химерное антитело, гуманизированное антитело и т.д.) и т.п.
Моноклональное антитело включает моноклональные антитела человека, моноклональные антитела не являющихся человеком животных (например, моноклональные антитела мыши, крысы, кролика и курицы) и т.п. Моноклональное антитело можно получать путем культивирования гибридом, полученных слиянием клеток селезенки не являющихся человеком млекопитающих (например, мышей, или мышей, продуцирующих антитела человека), иммунизированных белком CAPRIN-1, и клеток миеломы. В разделе "Примеры", представленном ниже, описано, что были получены моноклональные антитела, и было подтверждено, что они обладают эффектом на рак поджелудочной железы. Каждое из этих моноклональных антител содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 135, 145, 160, 170, 200, 210, 220, 230, 240 или 250, и вариабельную область легкой цепи (VL), имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 139, 149, 155, 164, 174, 180, 185, 190, 195, 204, 214, 224, 234, 244 или 254, где VH-область содержит CDR1, соответствующую аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 132, 142, 157, 167, 197, 207, 217, 227, 237 или 247, CDR2, соответствующую аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 38, 48, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 133, 143, 158, 168, 198, 208, 218, 228, 238 или 248, и CDR3, соответствующую аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 134, 144, 159, 169, 199, 209, 219, 229, 239 или 249, и VL-область содержит CDR1, соответствующую аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, 136, 146, 152, 161, 171, 177, 182, 187, 192, 201, 211, 221, 231, 241 или 251, CDR2, соответствующую аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 137, 147, 153, 162, 172, 178, 183, 188, 193, 202, 212, 222, 232, 242 или 252, и CDR3, соответствующую аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123, 138, 148, 154, 163, 173, 179, 184, 189, 194, 203, 213, 223, 233, 243 или 253.
Химерное антитело представляет собой антитело, полученное из комбинации последовательностей, происходящих из различных животных, и представляет собой, например, антитело, состоящее из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей антител мыши и константных областей тяжелых и легких цепей антител человека. Химерное антитело можно получать с использованием способа, известного в данной области, который вовлекает, например: лигирование ДНК, кодирующих V-области антитела, с ДНК, кодирующими C-области антител человека; включение полученных продуктов лигирования в экспрессирующие векторы; и введения векторов в хозяев, так чтобы продуцировались антитела.
Поликлональное антитело включает антитела, полученные из животных, продуцирующих антитела человека (например, мышей), иммунизированных белком CAPRIN-1.
Гуманизированное антитело, также называемое реконструированным антителом человека, представляет собой антитело, полученное способами инженерии. Гуманизированное антитело конструируют путем пересадки CDR антитела, происходящего из иммунизированного животного, в определяющие комплементарность области антитела человека. Общий подход рекомбинации генов для этого также известен.
В частности, последовательность ДНК, сконструированную таким образом, чтобы связать CDR антител мыши с каркасными областями (FR) антитела человека, синтезируют с помощью ПЦР с использованием нескольких олигонуклеотидов, полученных таким образом, чтобы они имели концевые части, перекрывающиеся друг с другом. Полученные ДНК лигируют с ДНК, кодирующими константные области антител человека. Затем полученные продукты лигирования встраивают в экспрессирующие векторы, которые затем вводят в хозяев для продукции антител с целью получения представляющего интерес антитела (см. публикацию патентной заявки Европы № EP 239400 и международную публикацию № WO 96/02576). FR антитела человека, соединенные через CDR, выбирают так, чтобы определяющие комплементарность области образовывали подходящий антигенсвязывающий центр. При необходимости, аминокислоты в каркасных областях вариабельных областей антитела могут быть заменены таким образом, чтобы CDR в полученном в реконструированном антителе человека образовывали соответствующий антигенсвязывающий центр (Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53: 851-856). Кроме того, эти каркасные области могут быть заменены каркасными областями, происходящими из различных антител человека (см. международную публикацию № WO 99/51743).
Каркасные области антитела человека, соединенные через CDR, выбирают так, чтобы определяющие комплементарность области образовывали подходящий антигенсвязывающий центр. При необходимости, аминокислоты в каркасных областях вариабельных областей антитела могут быть заменены таким образом, чтобы определяющие комплементарность области полученного реконструированного антитела человека образовывали соответствующие антигенсвязывающие центры (Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53: 851-856).
Аминокислоты в вариабельных областях (например, FR) или константных областях химерного антитела или гуманизированного антитела, полученного таким образом, можно заменять, например, другими аминокислотами.
Аминокислотная замена представляет собой замену, например, менее 15, менее 10, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее, или 2 или менее аминокислот, предпочтительно, от 1 до 5 аминокислот, и более предпочтительно, 1 или 2 аминокислот. Антитело с заменой должно быть функционально эквивалентным антителу без замены. Замена предпочтительно представляет собой консервативную аминокислотную замену, которая представляет собой замену между аминокислотами, имеющими сходные свойства, такие как заряд, боковые цепи, полярность и ароматичность. С точки зрения сходства свойств аминокислоты могут быть подразделены, например, на: основные аминокислоты (аргинин, лизин и гистидин); кислые аминокислоты (аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота); незаряженные полярные аминокислоты (глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, цистеин и тирозин); неполярные аминокислоты (лейцин, изолейцин, аланин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин); аминокислоты с разветвленной цепью (лейцин, валин, изолейцин); и ароматические аминокислоты (фенилаланин, тирозин, триптофан и гистидин).
Примеры модифицированных антител могут включать антитела, связанные с различными молекулами, такими как полиэтиленгликоль (PEG). В модифицированном антителе, используемом в рамках настоящего изобретения, вещество, подлежащее присоединению, не ограничено. Для получения такого модифицированного антитела, полученное антитело может быть химически модифицированным. Способ для этого уже разработан в данной области.
В этом контексте, выражение "функционально эквивалентный" означает, что рассматриваемое антитело обладает биологической или биохимической активностью, сходной с активностью антитела, используемого в рамках настоящего изобретения, в частности, рассматриваемое антитело обладает функцией повреждения опухоли и по существу не вызывает отторжения при применении, например, у человека. Примеры такой активности могут включать активность ингибирования роста клеток и активность связывания.
Способ получения полипептида, функционально эквивалентного определенному полипептиду, который включает внесение мутации в полипептид, хорошо известен специалистам в данной области. Например, специалисты в данной области могут соответствующим образом вносить мутацию в антитело, используемое в рамках настоящего изобретения, с использованием сайт-направленного мутагенеза (Hashimoto-Gotoh, T. et al., (1995) Gene 152, 271-275; Zoller, MJ., и Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W. et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer, W. и Fritz, HJ., (1987) Methods Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, TA., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492; и Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766) и т.п., тем самым получая антитело, функционально эквивалентное антителу по настоящему изобретению.
Антитело, которое распознает эпитоп белка CAPRIN-1, распознаваемый каждым антителом против CAPRIN-1, описанным выше, можно получать способом, в основном известным специалистам в данной области. Например, антитело можно получать способом, который включает определение эпитопа белка CAPRIN-1, распознаваемого антителом против CAPRIN-1, общепринятым способом (например, картирование эпитопа), и получение антитела с использованием полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, содержащуюся в эпитопе, в качестве иммуногена, или способа, который вовлекает определение эпитопа антитела, полученного общепринятым способом, и селекцию антитела, которое распознает тот же эпитоп, что и у антитела против CAPRIN-1. Как используют в рамках изобретения, "эпитоп" относится к полипептидному фрагменту, обладающему антигенностью или иммуногенностью у млекопитающих, предпочтительно людей. Его наименьшая единица состоит приблизительно из 7-12 аминокислот, предпочтительно 8-11 аминокислот.
on
off
7
-1
8
-1
8
-1
9
-1
9
-1
10
-1
10
-1
11
-1
11
-1
12
-1
13
-1
Антитело, используемое в рамках настоящего изобретения, имеет константу аффинности Ka (k/k) предпочтительно по меньшей мере 10 M, по меньшей мере 10 M, по меньшей мере 5×10 M, по меньшей мере 10 M, по меньшей мере 5×10 M, по меньшей мере 10 M, по меньшей мере 5×10 M, по меньшей мере 10 M, по меньшей мере 5×10 M, по меньшей мере 10 M, или по меньшей мере 10 M.
Антитело, используемое в рамках настоящего изобретения, может быть конъюгировано с противоопухолевым средством. Конъюгацию антитела с противоопухолевым средством можно проводить через спейсер, имеющий группу (например, сукцинимидильную группу, формильную группу, 2-пиридилдитиогруппу, малеимидильную группу, алкоксикарбонильную группу или гидроксигруппу), взаимодействующую с аминогруппой, карбоксильной группой, гидроксигруппой, тиольной группой и т.п.
Примеры противоопухолевого средства включают следующие противоопухолевые средства, общеизвестные из литературы, и т.д.: паклитаксел, доксорубицин, даунорубицин, циклофосфамид, метотрексат, 5-фторурацил, тиотепа, бусульфан, импросульфан, пипосульфан, бензодопа, карбоквон, метуредопа, уредопа, алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид, триметилолмеламин, буллатацин, буллатицинон, каптотецин, бриостатин, каллистатин, криптофицин 1, криптофицин 8, доластатин, дуокармицин, элеутеробин, панкратистатин, саркодиктин, спонгистатин, хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, меклоретамин, меклоретамин оксид гидрохлорид, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урацил мустард, кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин, калихеамицин, динемицин, клодронат, эсперамицин, аклациномицин, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицин, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицин, дактиномицин, деторбицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, адриамицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марселломицин, митомицин C, микофеноловую кислоту, ногаламицин, оливомицин, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин, деноптерин, птероптерин, триметрексат, флударабин, 6-меркаптопурин, триамиприн, тиогуанин, анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидеоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, андрогены (например калустерон, дромостанолон пропионат, эпитиостанол, мепитиостан и тестолактон), аминоглютетимид, митотан, трилостан, фролиновая кислота, ацеглатон, альдофосфамид гликозид, аминолевулиновая кислота, енилурацил, амсакрин, бестрабуцил, бисантрен, эдатраксат, дефофамин, демеколцин, диазиквон, элфорнитин, эллиптиум ацетат, эпотилон, этоглюцин, лентинан, лонидамин, маитансин, ансамитоцин, митогуазон, митоксантрон, мопиданмол, нитраерин, пентостатин, фенамет, пирарубицин, лозоксантрон, подофиллиновая кислота, 2-этилгидразид, прокарбазин, разоксан, ризоксин, шизофиллан, спирогерманий, тенуазониевую кислоту, триазиквон, роридин A, ангуидин, уретан, виндезин, дакарбазин, манномустин, митобронитол, митолактол, пипоброман, гацитозин, доцетаксел, хлорамбуцил, гемцитабин, 6-тиогуанин, меркаптопурин, цисплатин, оксалиплатин, карбоплатин, винбластин, этопозид, ифосфамид, митоксантрон, винкристин, винорелбин, новантрон, тенипозид, эдатрексат, дауномицин, аминоптерин, кселода, ибандронат, иринотекан, ингибитор топоизомеразы, дифторметилорнитин (DMFO), ретиноевую кислоту, капецитабин и их фармацевтически приемлемые соли (известные в данной области) и производные (известные в данной области).
Альтернативно антитело по настоящему изобретению можно вводить в комбинации с противоопухолевым средством для достижения более высокого терапевтического эффекта. Этот подход является адаптируемым для пациента со злокачественной опухолью, экспрессирующей CAPRIN-1, либо до, либо после хирургической операции. Этот подход можно применять, в частности, после хирургической операции для экспрессирующей CAPRIN-1 злокачественной опухоли, которую традиционно лечат противоопухолевым средством отдельно, для обеспечения более высокой профилактики рецидива злокачественной опухоли и продления времени выживания.
Примеры противоопухолевых средств, используемых для комбинированного введения с антителом по настоящему изобретению, включают следующие противоопухолевые средства, общеизвестные из литературы, и т.д.: паклитаксел, доксорубицин, даунорубицин, циклофосфамид, метотрексат, 5-фторурацил, тиотепа, бусульфан, импросульфан, пипосульфан, бензодопа, карбоквон, метуредопа, уредопа, алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид, триметилoлoмеламин, буллатацин, буллатацинон, камптотецин, бриостатин, каллистатин, криптофицин 1, криптофицин 8, доластатин, дуокармицин, элеутеробин, панкриастатин, саркодиктиин, спонгистатин, хлорамбуцил, хлолрнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, мехлорэтамин оксид гидрохлорид, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднемустин, трофосфамид, урацил мустард, кармустин, хлорзотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин, калихеамицин, динемицин, клодронат, эсперамицин, аклациномицин, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицин, cактиномицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицин, дактиномицин, деторбицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, адриамицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марселломицин, митомицин C, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицин, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин, деноптерин, птероптерин, триметрексат, флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин, анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, калустерон, дромостанолон пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон, аминоглутетимид, митотан, трилостан, фролиновая кислота, ацеглатон, альдофосфамид гликозид, аминолевулиновая кислота, энилурацил, амсакрин, бестрабуцил, бисантрен, эдатраксат, дефофамин, демекольцин, диазиквон, эльфорнитин, эллиптиний ацетат, эпотилон, этоглуцид, лентинан, лонидамин, майтанзин, ансамитоцин, митогуазон, митоксантрон, мопиданмол, нитраэрин, пентостатин, фенамет, пирарубицин, лозоксантрон, подофиллиновая кислота, 2-этилгидразид, прокарбазин, разоксан, ризоксин, шизофиллан, спирогерманий, тенуазоновая кислота, триазиквон, роридин A, ангвидин, уретан, виндезин, дакарбазин, манномустин, митобронитол, митолактол, пипоброман, гацитозин, доцетаксел, хлорамбуцил, гемцитабин, 6-тиогуанин, меркаптопурин, цисплатин, оксалиплатин, карбоплатин, винбластин, этопозид, ифосфамид, митоксантрон, винкристин, винорелбин, новантрон, тенипозид, эдатрексат, дауномицин, аминоптерин, кселода, ибандронат, иринотекан, ингибиторы топоизомеразы, дифторметилорнитин (DMFO), ретиноевая кислота, капецитабин и их фармацевтически приемлемые соли (известные в данной области) и производные (известные в данной области). Среди этих противоопухолевых средств особенно предпочтительно используют циклофосфамид, паклитаксел, доцетаксел или винорелбин.
211
131
125
90
186
188
153
212
32
175
176
Альтернативно, антитело, используемое в рамках настоящего изобретения, может быть связано с радиоактивным изотопом, общеизвестным из литературы, и т.д., таким как At, I, I, Y, Re, Re, Sm, Bi, P, Lu, или Lu. Желательно, используют радиоактивные изотопы, эффективные для лечения или диагностики опухоли.
Антитело, используемое в рамках настоящего изобретения, представляет собой антитело, обладающее иммунологической реактивностью в отношении CAPRIN-1 или антитело, специфично связывающееся с CAPRIN-1, и оно проявляет цитотоксическую активность или эффект ингибирования роста опухоли в отношении рака поджелудочной железы. Антитело должно иметь структуру, которая дает возможность полностью или почти полностью избежать реакции отторжения у реципиентных животных. Примеры таких антител включают антитела человека, гуманизированные антитела, химерные антитела (например, химерные антитела человека-мыши), одноцепочечные антитела и полиспецифические антитела (например, диантитело и триантитело), когда реципиентными животными являются люди. Эти антитела имеют вариабельные области тяжелой и легкой цепей, происходящие из антитела человека, или имеют вариабельные области тяжелой и легкой цепей с определяющими комплементарность областями (CDR1, CDR2 и CDR3), происходящими из антитела не являющегося человеком животного, и каркасными областями, происходящими из антитела человека. Альтернативно эти антитела представляют собой рекомбинантные антитела, имеющие вариабельные области тяжелой и легкой цепей, происходящие из антитела не являющегося человеком животного, и константные области тяжелой и легкой цепей, происходящие из антитела человека. Антитело по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой первые два из этих антител.
Такие рекомбинантные антитела можно получать следующим образом: ДНК, кодирующие моноклональные антитела (например, моноклональные антитела человека, мыши, крысы, кролика и курицы) против CAPRIN-1 человека, клонируют из антителопродуцирующих клеток, таких как гибридомы, и используют в качестве матриц для получения ДНК, кодирующей вариабельные области легкой и тяжелой цепей антител, способом ОТ-ПЦР и т.п. Соответствующие последовательности вариабельных областей легкой и тяжелой цепей и соответствующие последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 в каждой области определяют с помощью системы нумерации Kabat EU (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)).
Такую ДНК, кодирующую каждую вариабельную область, или ДНК, кодирующую каждую CDR, получают с использованием технологии рекомбинации генов (Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) или устройства для синтеза ДНК. В этом контексте, гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела человека, можно получать путем иммунизации животных, продуцирующих антитела человека (например, мышей), посредством CAPRIN-1 человека, а затем слияния клеток селезенки, извлеченных из иммунизированных животных, с клетками миеломы. Помимо этого, при необходимости, ДНК, кодирующие вариабельные и константные области легкой или тяжелой цепей антитела человека, получают с использованием способов генной инженерии или устройства для синтеза ДНК.
Для гуманизированного антитела можно получать ДНК, в которых последовательности, кодирующие CDR в ДНК, кодирующих вариабельные области легкой или тяжелой цепей, происходящие из антитела человека, заменены на соответствующие кодирующие последовательности CDR антитела, происходящего из не являющегося человеком животного (например, мыши, крысы или курицы), и лигировать с ДНК, кодирующими происходящие из антител человека константные области легкой или тяжелой цепей, с получением ДНК, кодирующей гуманизированное антитело.
Для химерного антитела, ДНК, кодирующие вариабельные области легкой или тяжелой цепей антитела, происходящего из не являющегося человеком животного (например, мыши, крысы или курицы), можно лигировать с ДНК, кодирующими константные области, происходящие из легкой или тяжелой цепей антитела человека, с получением ДНК, кодирующей химерное антитело.
4
3
Одноцепочечное антитело относится к антителу, содержащему вариабельные области тяжелой и легкой цепей, линейно связанные друг с другом через линкер. ДНК, кодирующую одноцепочечное антитело, можно получать путем лигирования ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи, ДНК, кодирующей линкер, и ДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи. В этом контексте вариабельные области как тяжелых, так и легких цепей происходят из антитела человека или происходят из антитела человека, имеющего CDR, замененные на CDR антитела, происходящего из не являющегося человеком животного (например, мыши, крысы или курицы). Линкер состоит из 12-19 аминокислот. Его примеры включают (GS) из 15 аминокислот (G.B. Kim et al., Protein Engineering Design and Selection 2007, 20 (9): 425-432).
Биспецифическое антитело (диантитело) относится к антителу, способному специфически связываться с двумя различными эпитопами. ДНК, кодирующую биспецифическое антитело, можно получать путем лигирования, например, ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи A, ДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи B, ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи B, и ДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи A, в указанном порядке (при условии, что ДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи B, и ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи B, лигированы через ДНК, кодирующую линкер, как описано выше). В этом контексте, все из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей происходят из антитела человека или происходят из антитела человека, имеющего CDR, замененные на CDR антитела, происходящего из не являющегося человеком животного (например, мыши, крысы или курицы).
Полученные таким образом рекомбинантные ДНК можно встраивать в один или несколько подходящих векторов, которые затем вводят в клетки-хозяева (например, клетки млекопитающих, клетки дрожжей и клетки насекомых), так чтобы ДНК (ко)экспрессировались, продуцируя рекомбинантные антитела (P.J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY, P. Shepherd and C. Dean., Monoclonal Antibodies, 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS; и J.W. Goding., Monoclonal Antibodies: principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS).
Примеры антитела по настоящему изобретению, полученного любым из способов, описанных выше, включают следующие антитела (a)-(y):
(a) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области (CDR) SEQ ID NO: 37, 38 и 39, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 41, 42 и 43 (например, антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 40 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 44);
(b) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 47, 48 и 49, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 51, 52 и 53 (например, антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 50 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 54);
(c) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 57, 58 и 59, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 61, 62 и 63 (например, антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 60 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 64);
(d) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 67, 68 и 69, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 71, 72 и 73 (например, антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 70 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 74);
(e) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 77, 78 и 79, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 81, 82 и 83 (например, антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 80 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 84);
(f) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 87, 88 и 89, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 91, 92 и 93 (например, антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 90 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 94);
(g) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 97, 98 и 99, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 101, 102 и 103 (например, антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 100 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 104);
(h) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 107, 108 и 109, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 111, 112 и 113 (например, антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 110 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 114);
(i) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 117, 118 и 119, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 121, 122 и 123 (например, антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 120 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 124);
(j) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 127, 128 и 129, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 121, 122 и 123 (например, антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 130 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 124);
(k) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 132, 133 и 134, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 136, 137 и 138 (например, антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 135 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 139);
(l) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 142, 143 и 144, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 146, 147 и 148 (например, антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 145 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 149);
(m) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 142, 143 и 144, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 152, 153 и 154 (например, антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 145 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 155);
(n) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 157, 158 и 159, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 161, 162 и 163 (например, антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 160 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 164);
(o) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 167, 168 и 169, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 171, 172 и 173 (например, антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 170 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 174);
(p) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 167, 168 и 169, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 177, 178 и 179 (например, антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 170 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 180);
(q) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 167, 168 и 169, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 182, 183 и 184 (например, антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 170 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 185);
(r) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 167, 168 и 169, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 187, 188 и 189 (например, антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 170 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 190);
(s) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 167, 168 и 169, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 192, 193 и 194 (например, антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 170 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 195);
(t) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 197, 198 и 199, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 201, 202 и 203 (например, антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 200 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 204);
(u) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 207, 208 и 209, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 211, 212 и 213 (например, антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 210 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 214);
(v) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 217, 218 и 219, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 221, 222 и 223 (например, антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 220 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 224);
(w) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 227, 228 и 229, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 231, 232 и 233 (например, антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 230 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 234);
(x) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 237, 238 и 239, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 241, 242 и 243 (например, антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 240 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 244);
(y) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 247, 248 и 249, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 251, 252 и 253 (например, антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 250 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 254).
В этом контексте аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 67, 68 и 69, SEQ ID NO: 77, 78 и 79, SEQ ID NO: 87, 88 и 89, SEQ ID NO: 97, 98 и 99, SEQ ID NO: 107, 108 и 109, SEQ ID NO: 117, 118 и 119, SEQ ID NO: 127, 128 и 129, SEQ ID NO: 132, 133 и 134, SEQ ID NO: 142, 143 и 144, SEQ ID NO: 157, 158 и 159, SEQ ID NO: 167, 168 и 169, SEQ ID NO: 167, 168 и 169, SEQ ID NO: 197, 198 и 199, SEQ ID NO: 207, 208 и 209, SEQ ID NO: 217, 218 и 219, SEQ ID NO: 227, 228 и 229, SEQ ID NO: 237, 238 и 239, SEQ ID NO: 247, 248 и 249, соответствуют CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, вариабельной области тяжелой цепи антитела мыши. Аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 71, 72 и 73, SEQ ID NO: 81, 82 и 83, SEQ ID NO: 91, 92 и 93, SEQ ID NO: 101, 102 и 103, SEQ ID NO: 111, 112 и 113, SEQ ID NO: 121, 122 и 123, SEQ ID NO: 136, 137 и 138, SEQ ID NO: 146, 147 и 148, SEQ ID NO: 152, 153 и 154, SEQ ID NO: 161, 162 и 163, SEQ ID NO: 171, 172 и 173, SEQ ID NO: 177, 178 и 179, SEQ ID NO: 182, 183 и 184, SEQ ID NO: 187, 188 и 189, SEQ ID NO: 192, 193 и 194, SEQ ID NO: 201, 202 и 203, SEQ ID NO: 211, 212 и 213, SEQ ID NO: 221, 222 и 223, SEQ ID NO: 231, 232 и 233, SEQ ID NO: 241, 242 и 243, SEQ ID NO: 251, 252 и 253, соответствуют CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, вариабельной области легкой цепи антитела мыши.
Также, аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 37, 38 и 39, SEQ ID NO: 47, 48 и 49 или SEQ ID NO: 57, 58 и 59 соответствуют CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, вариабельной области тяжелой цепи антитела курицы. Аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 41, 42 и 43, SEQ ID NO: 51, 52 и 53 или SEQ ID NO: 61, 62 и 63, соответствуют CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, вариабельной области легкой цепи антитела курицы.
Примеры гуманизированного антитела, химерного антитела, одноцепочечного антитела или полиспецифического антитела, используемых в рамках настоящего изобретения, включают следующие антитела, где антитело (a) выше используют в качестве примера:
(i) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 37, 38 и 39, и аминокислотные последовательности каркасных областей, происходящих из антител человека, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 41, 42 и 43, и аминокислотные последовательности каркасных областей, происходящих из антител человека;
(ii) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 37, 38 и 39, и аминокислотные последовательности каркасных областей, происходящих из антител человека, константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, происходящую из антитела человека, вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 41, 42 и 43, и аминокислотные последовательности каркасных областей, происходящих из антител человека, и константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, происходящую из антитела человека;
(iii) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40, константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, происходящую из антитела человека, вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44, и константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, происходящую из антитела человека.
1
2
3
4
Последовательности константных и вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепей антитела человека доступны, например, от NCBI (USA; GenBank, UniGene, и т.д.). Например, могут быть приведены следующие последовательности: последовательность с номером доступа № J00228 для константной области тяжелой цепи IgG человека; последовательность с номером доступа № J00230 для константной области тяжелой цепи IgG человека; последовательность с номером доступа № X03604 для константной области тяжелой цепи IgG человека; последовательность с номером доступа № K01316 для константной области тяжелой цепи IgG человека; последовательности с номерами доступа № V00557, X64135 и X64133 для константной области легкой цепи κ человека; и последовательности с номерами доступа № X64132 и X64134 для константной области легкой цепи λ человека.
Предпочтительно, эти антитела обладают цитотоксической активностью и, тем самым, могут проявлять противоопухолевый эффект.
Представленные выше конкретные последовательности вариабельных областей и CDR тяжелой и легкой цепей в каждом антителе предоставлены только для иллюстративных целей. Антитело по настоящему изобретению не должно ограничиваться конкретными последовательностями. Гибридомы, способные продуцировать антитела человека против CAPRIN-1 человека или антитела не являющегося человеком животного (например, антитела мыши), отличные от антител, описанных выше, получают, и моноклональные антитела, продуцированные гибридомами, выделяют и оценивают как являющиеся (или не являющиеся) представляющими интерес антителами, с иммунологической активностью связывания с CAPRIN-1 человека и цитотоксической активностью в качестве показателей. Тем самым идентифицируют представляющие интерес гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело. Затем из гибридом получают ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей в представляющих интерес антителах, и секвенируют, как описано выше. ДНК используют для получения различных антител.
Антитело, используемое в рамках настоящего изобретения, может представлять собой любое из антител (i)-(iii), и т.д., имеющее замену(ы), делецию(и) или вставку(и) одной или нескольких (предпочтительно 1 или 2) аминокислот, в частности, в последовательности каркасной области и/или последовательности константной области, при условии, что антитело обладает такой специфичностью, что оно может специфично распознавать CAPRIN-1. В этом контексте термин "несколько" означает от 2 до 5, предпочтительно 2 или 3.
Противоопухолевый эффект антитела против CAPRIN-1, используемого в рамках настоящего изобретения, в отношении клеток рака поджелудочной железы экспрессирующих CAPRIN-1, по-видимому, обуславливается следующим механизмом:
опосредуемая эффекторными клетками антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) и комплементзависимая цитотоксичность (CDC) против клеток, экспрессирующих CAPRIN-1.
Таким образом, антитело против CAPRIN-1, используемое в рамках настоящего изобретения, можно оценивать в отношении его активности путем определения in vitro активности ADCC или активности CDC против клеток рака поджелудочной железы, экспрессирующих CAPRIN-1, как конкретно показано ниже в примерах.
Антитело против CAPRIN-1, используемое в рамках настоящего изобретения, связывается с белками CAPRIN-1 на клетках рака поджелудочной железы и проявляет противоопухолевый эффект через свою активность. Таким образом, антитело против CAPRIN-1 по настоящему изобретению, предположительно, является пригодным для лечения или профилактики рака поджелудочной железы. В частности, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики рака поджелудочной железы, содержащей антитело против CAPRIN-1 в качестве активного ингредиента. Антитело против CAPRIN-1, используемое в целях введения в организм человека (антительная терапия) предпочтительно представляет собой антитело человека или гуманизированное антитело для снижения иммуногенности.
7
-1
8
-1
8
-1
9
-1
9
-1
10
-1
10
-1
11
-1
11
-1
12
-1
13
-1
Антитело CAPRIN-1 с более высокой аффинностью связывания с белком CAPRIN-1 на поверхности клеток рака поджелудочной железы, проявляет более высокую противоопухолевую активность. Таким образом, можно было бы ожидать более высокого противоопухолевого эффекта, если бы можно было получить антитело против CAPRIN-1, обладающее высокой аффинностью связывания с белком CAPRIN-1. Такое антитело является адаптируемым к фармацевтической композиции, предназначенной для лечения и/или профилактики рака поджелудочной железы. Желательно, такая высокая аффинность связывания предпочтительно составляет по меньшей мере 10 M, по меньшей мере 10 M, по меньшей мере 5×10 M, по меньшей мере 10 M, по меньшей мере 5×10 M, по меньшей мере 10 M, по меньшей мере 5×10 M, по меньшей мере 10 M, по меньшей мере 5×10 M, по меньшей мере 10 M, или по меньшей мере 10 M, в значениях константы ассоциации (константа аффинности) Ka (kon/koff), как описано выше.
Связывание с экспрессирующими антиген клетками
Способность антитела связываться с CAPRIN-1 можно определять с использованием анализа связывания с использованием, например, ELISA, вестерн-блоттинга, иммунофлуоресценции и проточной цитометрии, как описано в разделе "Примеры".
Иммуногистохимическое окрашивание
Антитело, которое распознает CAPRIN-1, можно исследовать на его реактивность в отношении CAPRIN-1 с помощью иммуногистохимического способа, хорошо известного специалистам в данной области, с использованием замороженного среза ткани, фиксированного параформальдегидом или ацетоном, или заключенного в парафин среза ткани, фиксированного параформальдегидом, полученного от пациента во время хирургической операции или от животного с ксенотрансплантированной тканью, которому была инокулирована клеточная линия, экспрессирующая CAPRIN-1 либо самопроизвольно, либо после трансфекции.
Для иммуногистохимического окрашивания, антитело, реактивное в отношении CAPRIN-1, можно окрашивать различными способами. Например, антитело можно визуализировать путем взаимодействия с конъюгированным с пероксидазой хрена антителом козы против антител мыши или антителом козы против антител кролика.
Фармацевтическая композиция
Мишень для фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики рака поджелудочной железы по настоящему изобретению конкретно не ограничена, при условии, что этой мишенью является злокачественная опухоль (клетка) поджелудочной железы, экспрессирующая ген CAPRIN-1.
Термины "опухоль" и "злокачественная опухоль", используемые в контексте настоящего изобретения, относятся к злокачественному новообразованию и их используют взаимозаменяемо.
Рак поджелудочной железы, на который нацелено настоящее изобретение, представляет собой рак поджелудочной железы, экспрессирующий ген, кодирующий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 2-30 с четным номером или их частичную последовательность, состоящую из 7-12 или более последовательно расположенных аминокислот.
Примеры рака поджелудочной железы включают, но не ограничиваясь ими, протоковую карциному поджелудочной железы, инвазивную протоковую карциному поджелудочной железы, аденокарциному поджелудочной железы, карциному ацинарных клеток, железисто-плоскоклеточную карциному, гигантоклеточную опухоль, внутрипротоковое папиллярно-муцинозное новообразование (IPMN), муцинозное кистозное новообразование (MCN), панкреатобластому, серозную цистаденокарциному, солидную псевдопапиллярную опухоль (SPT), гастриномы (синдром Золлингера-Эллисона), глюкагономы, инсулиному, множественное эндокринное новообразование 1 типа (MEN1) (синдром Вермера), опухоль нефункциональных островковых клеток, соматостатиномы и ВИПомы.
Реципиентными животными являются млекопитающие, например, млекопитающие, включающие приматов, домашних животных, скот и спортивных животных, и особенно предпочтительно люди, собаки и кошки.
В случае использования антитела по настоящему изобретению в качестве фармацевтической композиции, фармацевтическая композиция может быть составлена способом, общеизвестным специалистам в данной области. Например, фармацевтическую композицию можно использовать в форме парентеральной инъекции асептического раствора или суспензии с водой или любой другой фармацевтически приемлемой жидкостью. Например, фармацевтическую композицию можно составлять с антителом, которое смешивают в единичную дозированную форму, требуемую для общепринятой фармацевтической практики, в соответствующей комбинации с фармакологически приемлемыми носителями или средами, в частности, стерилизованной водой, физиологическим солевым раствором, растительным маслом, эмульгатором, суспендирующим веществом, поверхностно-активным веществом, стабилизатором, вкусовой добавкой, эксципиентом, носителем, консервантом, связующим веществом и т.д. Количество активного ингредиента в таком препарате определяют так, чтобы можно было достигнуть соответствующей дозы в назначенном диапазоне.
Асептическую композицию для инъекции можно составлять в соответствии с общей фармацевтической практикой с использованием носителя, такого как дистиллированная вода для инъекций.
Примеры водных растворов для инъекции включают физиологический раствор, изотоничные растворы, содержащие глюкозу и другие адъюванты, такие как D-сорбит, D-манноза, D-маннитол и хлорид натрия. Эти растворы можно использовать в комбинации с соответствующим солюбилизатором, например, спиртом (в частности этанол) или полиспиртом (например, пропиленгликоль и полиэтиленгликоль), или неионным поверхностно-активным веществом, например, полисорбатом 80 (TM) или HCO-60.
Примеры масляных растворов включают кунжутное масло и соевое масло. Эти растворы можно использовать в комбинации с солюбилизатором, таким как бензилбензоат или бензиловый спирт. Кроме того, растворы можно смешивать с буфером (например, фосфатный солевой буфер и натрий-ацетатный буферный раствор), смягчающим средством (например, прокаин гидрохлорид), стабилизатором (например, бензиловый спирт и фенол) и антиоксидантом. Инъецируемыми растворами, полученными таким образом, обычно заполняют подходящие ампулы.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению вводят перорально или парентерально, предпочтительно парентерально. Конкретные примеры ее дозированных форм включают инъекции, средства для интраназального введения, средства для транспульмонального введения, и средства для чрескожного введения. Примеры инъекций включают внутривенную инъекцию, внутримышечную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию и подкожную инъекцию, посредством которых фармацевтическую композицию можно вводить системно или локально.
Также способ введения можно соответствующим образом выбирать, в зависимости от возраста, массы тела, пола, симптомов и т.д. пациента. Дозу фармацевтической композиции, содержащей антитело или полинуклеотид, кодирующий антитело, можно выбирать из диапазона, например, от 0,0001 до 1000 мг/кг массы тела на дозу. Альтернативно дозу можно выбирать из диапазона, например, от 0,001 до 100000 мг/организм пациента, хотя доза не обязательно ограничивается этими числами. Хотя доза и способ введения варьируют, в зависимости от массы тела, возраста, пола, симптомов и т.д. пациента, специалисты в данной области могут соответствующим образом выбирать дозу и способ.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить индивидууму для лечения и/или профилактики рака поджелудочной железы.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, включающему введение фармацевтической композиции по настоящему изобретению в комбинации с противоопухолевым средством, как проиллюстрировано выше, или фармацевтической композиции, содержащей противоопухолевое средство, исследуемому индивидууму. Антитело или его фрагмент по настоящему изобретению можно вводить одновременно с противоопухолевым средством или отдельно от него, исследуемому индивидууму. В случае введения этих фармацевтических композиций по отдельности, любое из них можно вводить первым или последующим. Интервалы между их введением, дозы, пути введения и количество доз могут быть соответствующим образом выбраны специалистом. Дозированные формы отдельных лекарственных средств, подлежащих одновременному введению, также включают, например, фармацевтические композиции, каждая из которых составлена путем смешения антитела или его фрагмента по настоящему изобретению и противоопухолевого средства в фармацевтически приемлемом носителе (или среде). Представленное выше описание о назначении, составлении, путях введения, дозах, злокачественной опухоли и т.д. в отношении фармацевтических композиций и дозированных форм, содержащих антитело по настоящему изобретению, также применимы к любой из описанных выше фармацевтических композиций и дозированных форм, содержащих противоопухолевое средство. Таким образом, настоящее изобретение также относится к фармацевтической комбинации (также называемой "фармацевтическим набором") для лечения и/или профилактики рака поджелудочной железы, содержащей фармацевтическую композицию по настоящему изобретению и фармацевтическую композицию, содержащую противоопухолевое средство, как проиллюстрировано выше.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики рака поджелудочной железы, содержащей антитело по настоящему изобретению или его фрагмент и противоопухолевое средство вместе с фармакологически приемлемым носителем.
Альтернативно, противоопухолевое средство может быть конъюгировано с антителом по настоящему изобретению или его фрагментом. Полученный конъюгат можно смешивать с фармакологически приемлемым носителем (или средой), как описано выше, и составлять в фармацевтическую композицию.
Примеры
Далее настоящее изобретение описано конкретно с помощью примеров. Однако предполагается, что объем настоящего изобретения не ограничивается этими конкретными примерами.
[Пример 1] Идентификация антигенного белка рака поджелудочной железы способом SEREX
(1) Получение библиотеки кДНК
Тотальную РНК экстрагировали из ткани семенников здоровой собаки способом с использованием кислого гуанидия-фенола-хлороформа. Поли-A РНК очищали с использованием набора для очистки мРНК Oligotex-dT30 (изготавливаемый Takara Shuzo Co., Ltd.) в соответствии с протоколом, прилагаемым к набору.
5
Полученную таким образом мРНК (5 мкг) использовали для синтеза фаговой библиотеки кДНК семенника собаки. Эту фаговую библиотеку кДНК получали с использованием наборов для синтеза кДНК ZAP-cDNA Synthesis Kit и ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit (изготавливаемые Stratagene Corp.) в соответствии с протоколами, прилагаемыми к наборам. Полученная фаговая библиотека кДНК имела размер 7,73×10 б.о.е./мл.
(2) Скрининг библиотеки кДНК с использованием сыворотки
Полученную таким образом фаговую библиотеку кДНК семенников собаки использовали для иммунного скрининга. В частности, хозяев E. coli (XL1-Blue MRF') инфицировали фагами на агарозном планшете NZY (φ90 × 15 мм) с получением 2210 клонов. Хозяев культивировали при 42°C в течение 3-4 часов, чтобы образовались бляшки. Чашку покрывали нитроцеллюлозной мембраной (Hybond C Extra: изготавливаемая GE HealthCare Bio-Sciences Ltd.), пропитанной IPTG (изопропил-β-D-тиогалактозид) при 37°C в течение 4 часов для индукции и экспрессии белка для переноса белков на мембрану. Затем мембрану извлекали, погружали в TBS (10 мМ трис-HCl, 150 мМ NaCl, pH 7,5), содержавший 0,5% сухого обезжиренного молока, и встряхивали в течение ночи при 4°C, чтобы подавить неспецифичную реакцию. Этот фильтр подвергали взаимодействию с разбавленной в 500 раз сывороткой больной собаки при комнатной температуре в течение 2-3 часов.
3
Указанная выше сыворотка больной собаки представляла собой сыворотку, полученную от собаки, страдающей раком молочной железы. Сыворотку хранили при -80°C и затем подвергали предварительной обработке непосредственно перед использованием. Предварительную обработку сыворотки осуществляли следующим способом: хозяев Escherichia coli (XL1-Blure MRF’) инфицировали фагами λ ZAP Express, не имеющими вставки чужеродного гена, а затем культивировали в течение ночи на чашке со средой NZY при 37°C. Затем в чашку добавляли 0,2 М буфер NaHCO (pH 8,3), содержавший 0,5 М NaCl. Чашку оставляли стоять при 4°C в течение 15 часов. Затем супернатант собирали в виде экстракта Escherichia coli/фага. Затем собранный экстракт Escherichia coli/фага наносили на NHS-колонку (изготавливаемую GE HealthCare Bio-Sciences Ltd.), чтобы иммобилизовать на нее происходящий из Escherichia coli/фага белок. На эту колонку с иммобилизованным белком наносили сыворотку больной собаки и подвергали взаимодействию с ней. Антитела адсорбировались на E. coli и из сыворотки выделяли фаги. Фракцию сыворотки, которая прошла через колонку, разбавляли в 500 раз TBS, содержавшим 0,5% сухое обезжиренное молоко. Это разведение использовали в качестве материала для иммунологического скрининга.
4
Мембрану, на которую с помощью блоттинга переносили обработанную таким образом сыворотку и слитые белки, промывали четыре раза TBS-T (0,05% твин 20/TBS), а затем подвергали взаимодействию при комнатной температуре в течение 1 часа с вторичными антителами козы против IgG собаки (h+I козы против IgG собаки, конъюгированное с HRP; изготавливаемое BETHYL Laboratories, Inc.), разбавленными в 5000 раз TBS, содержавшим 0,5% сухое обезжиренное молоко, с последующим выявлением посредством ферментативной цветовой реакции с использованием исходного раствора NBT/BCIP (изготавливаемый Roche Diagnostics K.K.). Колонии, соответствующие участкам положительной цветовой реакции, собирали из чашки с NZY-агарозой (φ90×15 мм) и лизировали в 500 мкл буферного раствора SM (100 мМ NaCl, 10 мМ MgClSO, 50 мМ tris-HCl, 0,01% желатин, pH 7,5). Вторичный скрининг и третичный скрининг проводили аналогично тому, как описано выше, до тех пор, пока не получали единичные положительные по цветовой реакции колонии. Таким образом, был проведен скрининг 30940 фаговых клонов, реактивных в отношении IgG в сыворотке. Затем было выделено 5 положительных клонов.
(3) Поиск гомологии для выделенного гена антигена
Для проведения анализа нуклеотидной последовательности этих пяти положительных клонов, выделенных таким образом, проводили преобразование фаговых векторов в плазмидные векторы. В частности, 200 мкл раствора с хозяевами E. coli (XL1-Blue MRF'), приготовленного так, чтобы поглощение при OD600 составляло 1,0, смешивали с 250 мкл раствора с очищенным фагом и, кроме того, с 1 мкл хелперного фага ExAssist (изготавливаемый Stratagene Corp.), с последующим взаимодействием при 37°C в течение 15 минут. Затем к реакционной смеси добавляли 3 мл среды LB. Хозяев культивировали при 37°C в течение 2,5-3 часов, сразу после этого инкубировали в течение 20 минут на водяной бане при 70°C, а затем центрифугировали при 1000×g при 4°C в течение 15 минут для выделения супернатанта в качестве раствора с фагмидой. Затем, 200 мкл раствора с хозяевами E. coli (SOLR) с фагмидой, приготовленного таким образом, чтобы поглощение при OD600 составляло 1,0, смешивали с 10 мкл раствора с очищенным фагом, с последующим взаимодействием при 37°C в течение 15 минут. 50 мкл реакционной смеси инокулировали на среду с LB-агаром, содержавшую ампициллин (конечная концентрация: 50 мкг/мл) и культивировали в течение ночи при 37°C. Собирали единичную колонию трансформированных SOLR и культивировали при 37°C в среде LB, содержавшей ампициллин (конечная концентрация: 50 мкг/мл). Затем, плазмидные ДНК, имеющие представляющие интерес вставки, очищали с использованием набора QIAGEN Plasmid Miniprep Kit (изготавливаемый Qiagen N.V.).
Полноразмерные последовательности вставок в очищенных плазмидах анализировали способом опосредуемой праймерами "прогулки" с использованием праймера T3, соответствующего SEQ ID NO: 31, и праймера T7, соответствующего SEQ ID NO: 32. Этот анализ с использованием секвенирования обеспечил последовательности генов, соответствующие SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11 и 13. В результате проведения поиска гомологии с известными генами с использованием нуклеотидных последовательностей этих генов и аминокислотных последовательностей (SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 и 14), кодируемых ими, и программы для гомологии BLAST Search (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), было выявлено, что все из полученных пяти генов представляют собой гены, кодирующие CAPRIN-1. Идентичность последовательностей среди этих пяти генов составляла 100% для их нуклеотидных последовательностей в областях, транслируемых в белки, и 99% для их аминокислотных последовательностей. Идентичность последовательностей этих генов с генами, кодирующими гомологичные факторы человека, составляла 94% для их нуклеотидных последовательностей в областях, транслируемых в белки, и 98% для их аминокислотных последовательностей. Нуклеотидные последовательности гомологичных факторов человека соответствуют SEQ ID NO: 1 и 3 и их аминокислотные последовательности соответствуют SEQ ID NO: 2 и 4. Также, идентичность последовательностей полученных генов собаки с геном, кодирующим гомологичный фактор животных семейства бычьих, составляла 94% для их нуклеотидных последовательностей в областях, транслируемых в белки, и 97% для их аминокислотных последовательностей. Нуклеотидная последовательность гомологичного фактора животных семейства бычьих соответствует SEQ ID NO: 15 и его аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 16. В этом контексте, идентичность последовательностей между генами, кодирующими гомологичные факторы человека, и геном, кодирующим гомологичный фактор животных семейства бычьих, составила 94% для их нуклеотидных последовательностей в областях, транслируемых в белки, и от 93 до 97% для их аминокислотных последовательностей. Идентичность последовательностей полученных генов собаки с геном, кодирующим гомологичный фактор лошади, составляла 93% для их нуклеотидных последовательностей в областях, транслируемых в белки, и 97% для их аминокислотных последовательностей. Нуклеотидная последовательность гомологичного фактора лошади соответствует SEQ ID NO: 17 и его аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 18. В этом контексте, идентичность последовательностей между генами, кодирующими гомологичные факторы человека, и геном, кодирующим гомологичный фактор лошади, составляла 93% для их нуклеотидных последовательностей в областях, транслируемых в белки, и 96% для их аминокислотных последовательностей. Идентичность последовательностей полученных генов собаки с генами, кодирующими гомологичные факторы мыши, составляла от 87 до 89% для их нуклеотидных последовательностей в областях, транслируемых в белки, и от 95 до 97% для их аминокислотных последовательностей. Нуклеотидные последовательности гомологичных факторов мыши соответствуют SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25 и 27, и их аминокислотные последовательности соответствуют SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26 и 28. В этом контексте, идентичность последовательностей между генами, кодирующими гомологичные факторы человека, и генами, кодирующими гомологичные факторы мыши, составляла от 89 до 91% для их нуклеотидных последовательностей в областях, транслируемых в белки, и от 95 до 96% для их аминокислотных последовательностей. Идентичность последовательностей полученных генов собаки с геном, кодирующим гомологичный фактор курицы, составила 82% для их нуклеотидных последовательностей в областях, транслируемых в белки, и 87% для их аминокислотных последовательностей. Нуклеотидная последовательность гомологичного фактора курицы соответствует SEQ ID NO: 29, и его аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 30. В этом контексте, идентичность последовательностей между генами, кодирующими гомологичные факторы человека, и геном, кодирующим гомологичный фактор курицы, составляла от 81 до 82% для их нуклеотидных последовательностей в областях, транслируемых в белки, и 86% для их аминокислотных последовательностей.
(4) Анализ экспрессии гена CAPRIN-1 в клетках рака поджелудочной железы человека
6
Полученные таким образом гены исследовали в отношении их экспрессии в четырех различных клеточных линиях рака поджелудочной железы человека (Capan-2, MIAPaCa-2, PANC-1 и BxPC-3) способом ОТ-ПЦР. Реакцию обратной транскрипции проводили следующим образом: тотальные РНК экстрагировали из 50-100 мг каждой ткани и 5-10 × 10 клеток каждой клеточной линии с использованием реагента TRIZOL (изготавливаемый Invitrogen Corp.) в соответствии с протоколом, прилагаемым к нему. Из тотальных РНК синтезировали кДНК с использованием системы для синтеза первой цепи Superscript для ОТ-ПЦР (изготавливаемая Invitrogen Corp.) в соответствии с протоколом, прилагаемым к ней. Реакцию ПЦР проводили следующим образом с использованием праймеров (SEQ ID NO: 33 и 34), специфичных к полученным генам: ПЦР проводили посредством 30 повторяющихся циклов, каждый из которых включает 94°C в течение 30 секунд, 60°C в течение 30 секунд и 72°C в течение 30 секунд, с использованием термоциклера (изготавливаемый Bio-Rad Laboratories, Inc.) и реакционного раствора с общим количеством, доведенным до 25 мкл добавлением 0,25 мкл образца, полученного реакцией обратной транскрипции, и каждого реагента, и прилагаемого буфера (2 мкМ каждого из праймеров, 0,2 мМ каждого из dNTP и 0,65 Е ExTaq-полимеразы (изготавливаемая Takara Shuzo Co., Ltd.)). Описанные выше специфичные к гену праймеры конструировали так, чтобы амплифицировалась область нуклеотидов с номерами 698-1124 в нуклеотидной последовательности (ген CAPRIN-1 человека) SEQ ID NO: 1. Также использовали праймеры, специфичные к GAPDH (SEQ ID NO: 35 и 36), в качестве сравнительного контроля. В результате, экспрессия гена была подтверждена во всех клеточных линиях рака поджелудочной железы человека.
[Пример 2] Получение поликлонального антитела против CAPRIN-1 человека
1 мг рекомбинантного белка CAPRIN-1 человека, полученного согласно примеру 3 WO 2010/016526, смешивали с равным объемом раствора неполного адъюванта Фрейнда (IFA). Эту смесь подкожно вводили каждому кролику четыре раза каждые две недели. Затем, проводили взятие крови для получения антисыворотки, содержащей поликлональные антитела. Эту антисыворотку далее очищали с использованием белка G-носителя (изготавливаемый GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.) с получением поликлональных антител против CAPRIN-1. Кроме того, сыворотку кролика, которому не вводили антиген, очищали с использованием белка G-носителя аналогично тому, как описано выше, и использовали в качестве контрольных антител.
[Пример 3] Анализ экспрессии белка CAPRIN-1 в раке поджелудочной железы человека
(1) Анализ экспрессии белка CAPRIN-1 на клетках рака поджелудочной железы человека
6
Четыре клеточных линии рака поджелудочной железы человека (Capan-2, MIAPaCa-2, PANC-1 и BxPC-3), для которых было подтверждено, что они обладают экспрессией гена CAPRIN-1, исследовали в отношении экспрессии на их клеточной поверхности белка CAPRIN-1. 10 клеток каждой клеточной линии рака поджелудочной железы человека, для которых таким образом было подтверждено, что они обладают экспрессией гена, центрифугировали в 1,5-мл микроцентрифужной пробирке. Добавляли 2 мкг (5 мкл) поликлональных антител против CAPRIN-1, полученных согласно примеру 2. Смесь супспендировали в PBS, содержавшем 95 мкл 0,1% эмбриональной телячьей сыворотки, а затем оставляли стоять в течение 1 часа на льду. После промывания PBS полученную суспензию суспендировали в PBS, содержавшем 5 мкл меченных FITC антител козы против IgG кролика (изготавливаемые Santa Cruz Biotechnology, Inc.) и 95 мкл 0,1% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и оставляли стоять в течение 1 часа на льду. После промывания PBS измеряли интенсивность флуоресценции с использованием FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). С другой стороны, описанные выше действия, проводили с использованием контрольных антител, полученных согласно примеру 2, вместо поликлональных антител против CAPRIN-1, для получения контроля. В результате, все из клеток рака поджелудочной железы, к которым были добавлены поликлональные антитела против CAPRIN-1 человека, проявляли интенсивность флуоресценции, по меньшей мере на 20% более высокую, чем контроль. Это продемонстрировало, что белки CAPRIN-1 экспрессируются на поверхности клеточной мембраны клеточных линий рака поджелудочной железы человека. Указанную выше степень усиления интенсивности флуоресценции представляли как степень увеличения средней интенсивности флуоресценции (MFI) в каждой клеточной линии, и ее вычисляли по следующей формуле:
Степень повышения интенсивности флуоресценции (степень усиления интенсивности флуоресценции) (%) = ((MFI клеток, прореагировавших с антителом против CAPRIN-1) - (контрольная MFI)) / (контрольная MFI) × 100.
(2) Экспрессия белка CAPRIN-1 в ткани рака поджелудочной железы человека
40 образцов ткани рака поджелудочной железы в виде набора заключенных в парафин тканей рака поджелудочной железы человека (изготавливаемый US Biomax, Inc.) использовали для иммуногистохимического окрашивания. Набор тканей рака поджелудочной железы человека обрабатывали при 60°C в течение 3 часов, а затем помещали в бутылку для окрашивания, заполненную ксилолом, и проводили замену ксилола свежим ксилолом три раза каждые 5 минут. Далее проводили сходное действие с использованием этанола и PBS-T вместо ксилола. Набор тканей рака поджелудочной железы человека помещали в бутылку для окрашивания, заполненную 10 мМ цитратным буферным раствором (pH 6,0), содержавшим 0,05% Tween 20, обрабатывали 125°C в течение 5 минут, а затем оставляли стоять при комнатной температуре в течение 40 минут или более. Излишнюю воду вокруг каждого среза вытирали с помощью Kimwipe. Срез на предметном стекле обводили с помощью ручки Dako, и капельно добавляли соответствующее количество блокирующего пероксидазу реагента (изготавливаемый Dako Japan Inc.). Предметное стекло оставляли стоять при комнатной температуре в течение 5 минут, а затем помещали в бутылку для окрашивания, заполненную PBS-T, и замену PBS-T свежим PBS-T повторяли три раза каждые 5 минут. Наносили раствор PBS-T, содержавший 10% FBS, в качестве блокирующего раствора, и предметное стекло оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 часа во влажной камере. Поликлональные антитела против CAPRIN-1, полученные согласно примеру 2, приготавливали в виде раствора 10 мкг/мл с раствором PBS-T, содержавшим 5% FBS, и этот раствор наносили на предметное стекло. Предметное стекло оставляли стоять в течение ночи при 4°C во влажной камере и промывали PBS-T в течение 10 минут три раза. Затем капельно добавляли соответствующее количество меченного пероксидазой конъюгированного с полимером антитела (изготавливаемое Dako Japan Inc.) и предметное стекло оставляли стоять при комнатной температуре в течение 30 минут во влажной камере. После промывания PBS-T в течение 10 минут три раза на него наносили раствор для окрашивания DAB (изготавливаемый Dako Japan Inc.) и предметное стекло оставляли стоять при комнатной температуре в течение приблизительно 10 минут. Затем раствор для окрашивания удаляли и предметное стекло промывали PBS-T в течение 10 минут три раза, а затем промывали дистиллированной водой, помещали в 70%, 80%, 90%, 95% и 100% растворы этанола в указанном порядке на 1 минуту на раствор, а затем оставляли стоять в течение ночи в ксилоле. Предметное стекло извлекали и помещали в среду для заливки Glycergel (изготавливаемая Dako Japan Inc.), а затем проводили наблюдение. В результате была подтверждена высокая экспрессия CAPRIN-1 в 36 (90%) всего из 40 образцов ткани рака поджелудочной железы.
[Пример 4] Противоопухолевый эффект (активность ADCC) поликлонального антитела против CAPRIN-1 в отношении клеток рака поджелудочной железы
6
3
5
3
*
2
Антитело против CAPRIN-1 исследовали в отношении его способности повреждать клетки рака поджелудочной железы, экспрессирующие CAPRIN-1. Для этой оценки использовали поликлональные антитела против CAPRIN-1 человека, полученные согласно примеру 2. 10 клеток каждой из клеточных линий рака поджелудочной железы человека Capan-2 и MIAPaCa-2, для которых было подтверждено, что они обладают экспрессией CAPRIN-1, собирали в 50-мл центрифужную пробирку, в которую затем добавляли 100 мкКи хрома 51, а затем проводили инкубацию при 37°C в течение 2 часов. Затем клетки промывали три раза средой RPMI1640, содержавшей 10% эмбриональную телячью сыворотку, и добавляли при плотности 10 клеток/лунка в 96-луночный планшет с V-образным дном. Добавляли поликлональные антитела против CAPRIN-1 человека в концентрации 1 мкг/лунка. Далее добавляли лимфоциты, выделенные из периферической крови человека, при плотности 2×10 клеток/лунка и культивировали при 37°C в течение 4 часов в условиях 5% CO. После культивирования в культуральном супернатанте измеряли количество хрома (Cr) 51, высвободившегося из поврежденных опухолевых клеток, для вычисления активности ADCC поликлональных антител против CAPRIN-1 человека в отношении каждой клеточной линии рака поджелудочной железы. В результате, было подтверждено, что добавление поликлональных антител против CAPRIN-1 человека обеспечивает активность ADCC, составляющую 14% и 11%, в отношении Capan-2 и MIAPaCa-2, соответственно, в то время как сходные действия обеспечили активность ADCC менее 0,7% в отношении как Capan-2, так и MIAPaCa-2, при использовании контрольных антител, полученных из периферической крови иммунизированного антигеном кролика, и обеспечили активность ADCC менее 0,5% даже в отсутствие антител. Эти результаты продемонстрировали, что антитело против CAPRIN-1 может повреждать клетки рака поджелудочной железы, экспрессирующие CAPRIN-1, через его активность ADCC. Эти результаты, касающиеся цитотоксической активности, были получены путем: смешения антитела против CAPRIN-1, используемого в рамках настоящего изобретения, лимфоцитов и 10 опухолевых клеток с включенным хромом 51, как описано выше: культивирования клеток в течение 4 часов; измерения после культивирования количества хрома 51, высвободившегося в среду; и вычисления цитотоксической активности в отношении опухолевых клеток по следующей формуле:
*
Формула: Цитотоксическая активность (%) = Количество хрома 51, высвободившегося из опухолевых клеток, дополненных антителом против CAPRIN-1, и лимфоцитов / Количество хрома 51, высвободившегося из опухолевых клеток, дополненных 1н хлористоводородной кислотой × 100.
[Пример 5] Получение моноклональных антител мыши и курицы против CAPRIN-1
2
100 мкг рекомбинантных белков CAPRIN-1 человека, полученных согласно примеру 2, смешивали с равным количеством адъюванта MPL+TDM (изготавливаемый Sigma-Aldrich Corp.). Эту смесь использовали в качестве антигенного раствора для мышей. Антигенный раствор вводили внутрибрюшинно каждой мыши Balb/c в возрасте 6 недель (поставляемые Japan SLC Inc.). Затем проводили 3 и 24 вспомогательных введений раз в 1 неделю для завершения иммунизации. Через трое суток после последней инъекции селезенку каждой мыши извлекали и растирали между двумя стерильными предметными стеклами. Процессы промывания PBS(-) (изготавливаемый Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) и удаления супернатанта центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 минут повторяли три раза с получением клеток селезенки. Полученные клетки селезенки смешивали с клетками миеломы мыши SP2/0 (приобретенными от ATCC) в соотношении 10:1. 200 мкл среды RPMI1640, содержавшей 10% FBS, нагревали до 37°C и смешивали с 800 мкл PEG1500 (изготавливаемый Boehringer Ingelheim GmbH), и полученный таким образом раствор PEG добавляли к клеточной смеси, которую затем оставляли стоять в течение 5 минут для слияния клеток. После удаления супернатанта путем центрифугирования при 1700 об/мин в течение 5 минут, клетки суспендировали в 150 мл среды RPMI1640, содержавшей 15% FBS, дополненной 2% эквивалентом раствора HAT (изготавливаемый Life Technologies, Inc./Gibco) (селективная среда HAT). Эту суспензию инокулировали в пятнадцать 96-луночных планшетов (изготавливаемые Thermo Fisher Scientific Inc./Nunc) в концентрации 100 мкл/лунка. Клетки селезенки и клетки миеломы подвергали слиянию путем культивирования при 37°C в течение 7 суток в условиях 5% CO с получением гибридом.
Полученные гибридомы подвергали скринингу, где в качестве показателя использовали аффинность связывания антител, продуцируемых гибридомами, в отношении белка CAPRIN-1. 1 мкг/мл раствора белка CAPRIN-1, полученного согласно примеру 2, добавляли в 96-луночный планшет в концентрации 100 мкл/лунка и оставляли стоять при 4°C в течение 18 часов. Каждую лунку промывали три раза PBS-T. Затем к нему добавляли 0,5% раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA) (изготавливаемый Sigma-Aldrich Corp.) в концентрации 400 мкл/лунка и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 3 часов. Раствор в каждой лунке отбрасывали и каждую лунку промывали три раза 400 мкл PBS-T. Затем в лунку добавляли культуральный супернатант каждой гибридомы, полученной как описано выше, в концентрации 100 мкл/лунка, и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 2 часов. Каждую лунку промывали три раза PBS-T. Затем в лунку добавляли меченные HRP антитела против IgG мыши (H+L) (изготавливаемые Invitrogen Corp.), разбавленные в 5000 раз PBS, в концентрации 100 мкл/лунка и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 часа. Каждую лукну промывали три раза PBS-T. Затем добавляли раствор субстрата TMB (изготавливаемый Thermo Fisher Scientific Inc.) в концентрации 100 мкл/лунка и оставляли стоять в течение 15-30 минут для обеспечения цветовой реакции. После развития цвета реакцию останавливали добавлением 1н серной кислоты в концентрации 100 мкл/лунка. Поглощение измеряли при 450 нм и 595 нм с использованием абсорбционного спектрометра. В результате было выбрано несколько гибридом, продуцирующих антитела, обладающих высоким поглощением.
Выбранные гибридомы добавляли в 96-луночный планшет с плотностью 0,5 клеток/лунка и культивировали в планшете. Через одну неделю наблюдали гибридомы, образующие единичные колонии в лунках. Клетки в этих лунках далее культивировали и клонированные гибридомы подвергали скринингу, где в качестве показателя использовали аффинность связывания антител, продуцируемых гибридомами, в отношении белка CAPRIN-1. 1 мкг/мл раствора белка CAPRIN-1, полученных согласно примеру 2, добавляли в 96-луночный планшет в концентрации 100 мкл/лунка и оставляли стоять при 4°C в течение 18 часов. Каждую лунку промывали три раза PBS-T. Затем в лунку добавляли 0,5% раствор BSA в концентрации 400 мкл/лунка и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 3 часов. Раствор в каждой лунке отбрасывали и каждую лунку промывали три раза 400 мкл PBS-T. Затем в лунку добавляли культуральный супернатант каждой гибридомы, полученной, как описано выше, в концентрации 100 мкл/лунка и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 2 часов. Каждую лунку промывали три раза PBS-T. Затем в лунку добавляли меченные HRP антитела против IgG мыши (H+L) (изготавливаемые Invitrogen Corp.), разбавленные в 5000 раз PBS в концентрации 100 мкл/лунка и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 часа. Каждую лунку промывали три раза PBS-T. Затем добавляли раствор субстрата TMB (Thermo Fisher Scientific Inc.) в концентрации 100 мкл/лунка и оставляли стоять в течение 15-30 минут для обеспечения цветовой реакции. После развития цвета реакцию завершали добавлением 1н серной кислоты в концентрации 100 мкл/лунка. Поглощение измеряли при 450 нм и 595 нм с использованием абсорбционного спектрометра. В результате было получено 150 линий гибридом, продуцирующих моноклональные антитела мыши, реактивные в отношении белков CAPRIN-1.
6
Далее эти моноклональные антитела мыши подвергали скринингу в отношении антител, реактивных в отношении поверхности злокачественных клеток, экспрессирующих CAPRIN-1. В частности, 10 клеток клеточной линии рака молочной железы человека MDA-MB-231V центрифугировали в 1,5-мл микроцентрифужной пробирке. Добавляли 100 мкл культурального супернатанта каждой гибридомы, полученной, как описано выше, и оставляли стоять в течение 1 часа на льду. После промывания PBS добавляли меченные FITC антитела козы против IgG мыши (изготавливаемые Invitrogen Corp.), разбавленные в 500 раз с помощью PBS, содержащего 0,1%, и оставляли стоять в течение 1 часа на льду. После промывания PBS интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company). С другой стороны, то же действие, что описано выше, проводили с использованием сыворотки каждой мыши Balb/c в возрасте 6 недель, которой не проводили введение, разбавленной в 500 раз средой для культивирования гибридом, вместо антител, для получения контроля. В результате было отобрано 22 моноклональных антитела (моноклональные антитела мыши #1-#22), обладающих более высокой интенсивностью флуоресценции, чем у контроля, т.е. реактивных в отношении поверхности клеток рака молочной железы.
2
Для получения моноклональных антител курицы, 300 мкг антигенных белков (CAPRIN-1 человека) (SEQ ID NO: 2), полученных согласно примеру 2, смешивали с равным количеством полного адъюванта Фрейнда. Эту смесь использовали в качестве раствора антигена для кур. Этот раствор антигена внутрибрюшинно вводили каждой из кур в возрасте 7 недель. Затем проводили 7 вспомогательных введений каждые 4 недели для завершения иммунизации. Через четверо суток после последнего введения селезенку каждой курицы извлекали и растирали между двумя стерилизованными предметными стеклами. Промывание PBS(-) (изготовленный Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) и удаление супернатанта центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 минут повторяли три раза для получения клеток селезенки. Полученные клетки селезенки смешивали с клетками миеломы курицы с дефектом легкой цепи, полученными из кур путем трансформации с использованием вируса ретикулоэндотелиоза птиц, в соотношении 5:1. 200 мкл среды IMDM, содержавшей 10% FBS, нагревали до 37°C и смешивали с 800 мкл PEG1500 (изготавливаемый Boehringer Ingelheim GmbH), и PEG, полученный таким образом, добавляли к клеточной смеси, которую затем оставляли стоять в течение 5 минут для слияния клеток. После удаления супернатанта центрифугированием при 1700 об/мин в течение 5 минут, клетки суспендировали в 300 мл среды IMDM, содержавшей 10% FBS, дополненной 2% эквивалентом раствора HAT (изготовленный Life Technologies, Inc./Gibco) (селективная среда HAT). Эту суспензию высевали в тридцать 96-луночных планшетов (изготовленные Thermo Fisher Scientific Inc./Nunc) в концентрации 100 мкл/лунка. Клетки селезенки и клетки миеломы курицы подвергали слиянию путем культивирования при 37°C в течение 7 суток в условиях 5% CO, с получением гибридом.
Полученные гибридомы подвергали скринингу, где в качестве показателя использовали аффинность связывания антител, продуцируемых гибридомами, в отношении белка CAPRIN-1. 1 мкг/мл раствора белка CAPRIN-1, полученного согласно примеру 2, добавляли в 96-луночный планшет в концентрации 100 мкл/лунка и оставляли стоять при 4°C в течение 18 часов. Каждую лунку промывали три раза PBS-T. Затем к нему добавляли 0,5% раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA) (изготавливаемый Sigma-Aldrich Corp.) в концентрации 400 мкл/лунка и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 3 часов. Раствор в каждой лунке отбрасывали и каждую лунку промывали три раза 400 мкл PBS-T. Затем в лунку добавляли культуральный супернатант каждой гибридомы, полученной как описано выше, в концентрации 100 мкл/лунка, и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 2 часов. Каждую лунку промывали три раза PBS-T. Затем в лунку добавляли меченные HRP антитела против IgY курицы (изготавливаемые Sigma-Aldrich Corp.), разбавленные в 5000 раз PBS, в концентрации 100 мкл/лунка и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 часа. Каждую лукну промывали три раза PBS-T. Затем добавляли раствор субстрата TMB (изготавливаемый Thermo Fisher Scientific Inc.) в концентрации 100 мкл/лунка и оставляли стоять в течение 15-30 минут для обеспечения цветовой реакции. После развития окраски реакцию останавливали добавлением 1н серной кислоты в концентрации 100 мкл/лунка. Поглощение измеряли при 450 нм и 595 нм с использованием абсорбционного спектрометра. В результате было выбрано несколько гибридом, продуцирующих антитела, обладающих высоким поглощением.
Выбранные гибридомы добавляли в 96-луночный планшет с плотностью 0,5 клеток/лунка и культивировали в планшете. Через одну неделю наблюдали гибридомы, образующие единичные колонии в лунках. Клетки в этих лунках далее культивировали и клонированные гибридомы подвергали скринингу, где в качестве показателя использовали аффинность связывания антител, продуцируемых гибридомами, в отношении белка CAPRIN-1. 1 мкг/мл раствора белка CAPRIN-1, добавляли в 96-луночный планшет в концентрации 100 мкл/лунка и оставляли стоять при 4°C в течение 18 часов. Каждую лунку промывали три раза PBS-T. Затем в лунку добавляли 0,5% раствор BSA в концентрации 400 мкл/лунка и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 3 часов. Раствор в каждой лунке отбрасывали и каждую лунку промывали три раза 400 мкл PBS-T. Затем в лунку добавляли культуральный супернатант каждой гибридомы, полученной, как описано выше, в концентрации 100 мкл/лунка и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 2 часов. Каждую лунку промывали три раза PBS-T. Затем в лунку добавляли меченные HRP антитела против IgY курицы (изготавливаемые Sigma-Aldrich Corp.), разбавленные в 5000 раз PBS в концентрации 100 мкл/лунка и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 часа. Каждую лунку промывали три раза PBS-T. Затем добавляли раствор субстрата TMB (изготавливаемый Thermo Fisher Scientific Inc.) в концентрации 100 мкл/лунка и оставляли стоять в течение 15-30 минут для обеспечения цветовой реакции. После развития цвета реакцию завершали добавлением 1н серной кислоты в концентрации 100 мкл/лунка. Поглощение измеряли при 450 нм и 595 нм с использованием абсорбционного спектрометра. В результате было получено несколько линий гибридом, продуцирующих моноклональные антитела, реактивные в отношении белков CAPRIN-1.
6
Далее эти моноклональные антитела подвергали скринингу в отношении антител, реактивных в отношении поверхности злокачественных клеток, экспрессирующих CAPRIN-1. В частности, 5×10 клеток клеточной линии рака молочной железы человека MDA-MB-231V центрифугировали в 1,5-мл микроцентрифужной пробирке. Добавляли 100 мкл культурального супернатанта каждой гибридомы, полученной, как описано выше, и оставляли стоять в течение 1 часа на льду. После промывания PBS добавляли меченные FITC антитела козы против IgG курицы (H+L) (изготавливаемые SouthernBiotech), разбавленные в 30 раз с помощью PBS, содержащего 0,1% FBS, и оставляли стоять в течение 1 часа на льду. После промывания PBS интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). С другой стороны, то же действие, что описано выше, проводили с использованием среды для культивирования гибридом, чтобы получить контрольный образец. В результате было отобрано 3 моноклональных антитела (моноклональные антитела курицы #1, #2 и #3), обладающих более высокой интенсивностью флуоресценции, чем у контроля, т.е. реактивных в отношении поверхности клеток рака молочной железы, экспрессирующих CAPRIN-1.
[Пример 6] Охарактеризация выбранного антитела
(1) Клонирование гена вариабельной области моноклонального антитела против CAPRIN-1
Из линий гибридом, продуцирующих каждое из 22 моноклональных антител мыши и 3 моноклональных антител курицы, выбранных согласно примеру 5, экстрагировали мРНК. Гены вариабельных областей тяжелой цепи (VH) и вариабельных областей легкой цепи (VL) всех моноклональных антител против CAPRIN-1 получали способом ОТ-ПЦР с использованием праймеров, специфичных к последовательностям, происходящим из FR1 и FR4 мыши, для гибридом, продуцирующих моноклональные антитела мыши, и праймеров, специфичных к последовательностям, происходящим из FR1 и FR4 курицы, для гибридом, продуцирующих моноклональные антитела курицы. Для секвенирования эти гены клонировали в векторы pCR2.1 (изготавливаемые Invitrogen Corp.).
(1)-1 ОТ-ПЦР
6
мРНК получали из 10 клеток каждой линии гибридомы, продуцирующей моноклональное антитело мыши, с использованием набора для микроочистки мРНК (изготавливаемый GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.) и подвергали обратной транскрипции с использованием набора для синтеза 1 цепи SuperScript II (изготавливаемый Invitrogen Corp.) для синтеза кДНК. Эти методики выполняли в соответствии с протоколом, прилагаемым к набору. С использованием полученных кДНК способом ПЦР амплифицировали гены антител. Праймер, специфичный к последовательности FR1 тяжелой цепи мыши (SEQ ID NO: 257), и праймер, специфичный к последовательности FR4 тяжелой цепи мыши (SEQ ID NO: 258), использовали для получения генов VH-областей. Также использовали праймер, специфичный к последовательности FR1 легкой цепи мыши (SEQ ID NO: 259), и праймер, специфичный к FR4 легкой цепи мыши (SEQ ID NO: 260), для получения генов VL-областей. Эти праймеры были сконструированы в соответствии с Jones, S.T. and Bending, M.M. Bio/Technology 9, 88-89 (1991). В ПЦР использовали Ex Taq (изготавливаемая Takara Bio Inc.). Образец кДНК добавляли к 5 мкл 10 × буфера EX Taq, 4 мкл смеси dNTP (2,5 мМ), 2 мкл каждого из праймеров (1,0 мкМ) и 0,25 мкл Ex Taq (5 Е/мкл) и общее количество раствора доводили до 50 мкл стерилизованной водой. После обработки при 94°C в течение 2 минут, проводили ПЦР в условиях 30 циклов, каждый из которых включал денатурацию при 94°C в течение 1 минуты, отжиг при 58°C в течение 30 секунд и реакцию элонгации при 72°C в течение 1 минуты.
6
Также экстрагировали тотальную РНК из 10 клеток каждой линии гибридомы, продуцирующей моноклональное антитело курицы, с использованием набора для выделения высокочистой РНК (изготавливаемый Roche Diagnostics K.K.). Затем синтезировали кДНК с использованием набора для синтеза 1 цепи кДНК PrimeScript II (изготавливаемый Takara Bio Inc.). Эти методики выполняли в соответствии с протоколом, прилагаемым к каждому набору. Гены вариабельных областей тяжелой и легкой цепи антител курицы амплифицировали по отдельности способом ПЦР согласно общепринятому способу с синтезированными кДНК в качестве матриц с использованием ДНК-полимеразы KOD-Plus-DNA Polymerase (изготавливаемая Toyobo Co., Ltd.). Праймер, специфичный к последовательности FR1 тяжелой цепи курицы, и праймер, специфичный к последовательности FR4 тяжелой цепи курицы, использовали для получения генов VH-областей антител курицы. Также праймер, специфичный к последовательности FR1 легкой цепи курицы, и праймер, специфичный к последовательности FR4 легкой цепи курицы, использовали для получения генов VL-областей.
(1)-2 Клонирование
Каждый продукт ПЦР, полученный, как описано выше, подвергали электрофорезу на агарозном геле. Для каждой из VH- и VL-областей вырезали полосы ДНК. Каждый фрагмент ДНК очищали с использованием набора для очистки из геля QIAquick (изготавливаемый Qiagen N.V.) в соответствии с протоколом, прилагаемым к нему. Каждую ДНК, очищенную таким образом, клонировали в вектор pCR2.1 с использованием набора для клонирования TA (изготавливаемый Invitrogen Corp.). Компетентные клетки DH5a (изготавливаемые Toyobo Co., Ltd.) трансформировали лигированным вектором в соответствии со стандартным способом. Десять клонов каждого трансформанта культивировали в течение ночи при 37°C в среде, содержавшей 100 мкг/мл ампициллина. Затем каждую плазмидную ДНК очищали с использованием набора Qiaspin Miniprep kit (изготавливаемый Qiagen N.V.).
(1)-3 Секвенирование
Гены VH- и VL-областей в каждой плазмиде, полученной, как описано выше, секвенировали с использованием прямого праймера M13 (SEQ ID NO: 261) и обратного праймера M13 (SEQ ID NO: 262), флуоресцентного секвенатора (секвенатор ДНК 3130XL, изготавливаемый Applied Biosystems, Inc.) и набора для секвенирования BigDye Terminator Ver 3.1 Cycle Sequencing Kit (изготавливаемый Applied Biosystems, Inc.) в соответствии с протоколами, прилагаемыми к ним. В результате была определена последовательность каждого гена и аминокислотная последовательность, кодируемая им.
В частности, каждое из этих моноклональных антител содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40 (SEQ ID NO: 45), SEQ ID NO: 50 (SEQ ID NO: 55), SEQ ID NO: 60 (SEQ ID NO: 65), SEQ ID NO: 70 (SEQ ID NO: 75), SEQ ID NO: 80 (SEQ ID NO: 85), SEQ ID NO: 90 (SEQ ID NO: 95), SEQ ID NO: 100 (SEQ ID NO: 105), SEQ ID NO: 110 (SEQ ID NO: 115), SEQ ID NO: 120 (SEQ ID NO: 125), SEQ ID NO: 130 (SEQ ID NO: 131), SEQ ID NO: 135 (SEQ ID NO: 140), SEQ ID NO: 145 (SEQ ID NO: 150), SEQ ID NO: 160 (SEQ ID NO: 165), SEQ ID NO: 170 (SEQ ID NO: 175), SEQ ID NO: 200 (SEQ ID NO: 205), SEQ ID NO: 210 (SEQ ID NO: 215), SEQ ID NO: 220 (SEQ ID NO: 225), SEQ ID NO: 230 (SEQ ID NO: 235), SEQ ID NO: 240 (SEQ ID NO: 245) или SEQ ID NO: 250 (SEQ ID NO: 255) (SEQ ID NO в скобках соответствует последовательности гена), и вариабельную область легкой цепи (VL), имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44 (SEQ ID NO: 46), SEQ ID NO: 54 (SEQ ID NO: 56), SEQ ID NO: 64 (SEQ ID NO: 66), SEQ ID NO: 74 (SEQ ID NO: 76), SEQ ID NO: 84 (SEQ ID NO: 86), SEQ ID NO: 94 (SEQ ID NO: 96), SEQ ID NO: 104 (SEQ ID NO: 106), SEQ ID NO: 114 (SEQ ID NO: 116), SEQ ID NO: 124 (SEQ ID NO: 126), SEQ ID NO: 139 (SEQ ID NO: 141), SEQ ID NO: 149 (SEQ ID NO: 151), SEQ ID NO: 155 (SEQ ID NO: 156), SEQ ID NO: 164 (SEQ ID NO: 166), SEQ ID NO: 174 (SEQ ID NO: 176), SEQ ID NO: 180 (SEQ ID NO: 181), SEQ ID NO: 185 (SEQ ID NO: 186), SEQ ID NO: 190 (SEQ ID NO: 191), SEQ ID NO: 195 (SEQ ID NO: 196), SEQ ID NO: 204 (SEQ ID NO: 206), SEQ ID NO: 214 (SEQ ID NO: 216), SEQ ID NO: 224 (SEQ ID NO: 226), SEQ ID NO: 234 (SEQ ID NO: 236), SEQ ID NO: 244 (SEQ ID NO: 246) или SEQ ID NO: 254 (SEQ ID NO: 256) (SEQ ID NO в скобках соответствует последовательности гена), где VH-область содержит CDR1, соответствующую аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 237 или SEQ ID NO: 247, CDR2 соответствующую аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 238 или SEQ ID NO: 248, и CDR3, соответствующую аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 239 или SEQ ID NO: 249, и VL-область содержит CDR1, соответствующую аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 241 или SEQ ID NO: 251, CDR2, соответствующую аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 242 или SEQ ID NO: 252, и CDR3, соответствующую аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 243 или SEQ ID NO: 253.
Аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи полученных моноклональных антител соответствуют SEQ ID NO: 40, 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 240 и SEQ ID NO: 250. Аминокислотные последовательности их вариабельных областей легкой цепи соответствуют SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 244 и SEQ ID NO: 254.
В частности, моноклональное антитело мыши #1 содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 70 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 74; #2 содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 80 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 84; #3 содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 90 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 94; #4 содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 100 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 104; #5 содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 110 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 114; #6 содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 120 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 124; #7 содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 130 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 124; #8 содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 135 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 139; #9 содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 145 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 149; #10 содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 145 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 155; #11 содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 160 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 164; #12 содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 170 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 174; #13 содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 170 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 180; #14 содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 170 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 185; #15 содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 170 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 190; #16 содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 170 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 195; #17 содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 200 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 204; #18 содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 210 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 214; #19 содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 220 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 224; #20 содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 230 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 234; #21 содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 240 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 244; #22 содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 250 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 254.
Аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи полученных моноклональных антител курицы соответствуют SEQ ID NO: 40, 50 и 60. Аминокислотные последовательности их вариабельных областей легкой цепи соответствуют SEQ ID NO: 44, 54 и 64.
В частности, моноклональное антитело курицы #1 содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 40 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 44, где вариабельная область тяжелой цепи имеет CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 37, 38 и 39, соответственно, и вариабельная область легкой цепи имеет CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 41, 42 и 43, соответственно; моноклональное антитело курицы #2 содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 50 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 54, где вариабельная область тяжелой цепи имеет CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 47, 48 и 49, соответственно, и вариабельная область легкой цепи имеет CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 51, 52 и 53, соответственно; и моноклональное антитело курицы #3 содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 60 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 64, где вариабельная область тяжелой цепи имеет CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 57, 58 и 59, соответственно и вариабельная область легкой цепи имеет CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 61, 62 и 63, соответственно.
(2) Получение химерного рекомбинантного антитела человека курицы и химерного антитела мыши-курицы
1
1
Фрагмент амплификации гена вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 40) моноклонального антитела курицы #1, полученного согласно предшествующему разделу (1), обрабатывали на обоих концах ферментами рестрикции, а затем очищали и встраивали в соответствии с общепринятым способом в вектор pcDNA4/myc-His (изготавливаемый Invitrogen Corp.), уже имеющий вставки генов лидерной последовательности, происходящей из антитела курицы, содержащей SEQ ID NO: 263, и константной области H-цепи IgG человека, содержащей SEQ ID NO: 264. Также фрагмент амплификации гена вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 44) моноклонального антитела курицы #1, обрабатывали на обоих концах ферментами рестрикции, а затем очищали и встраивали в соответствии с общепринятым способом в вектор pcDNA3.1/myc-His (изготавливаемый Invitrogen Corp.), уже имеющий вставки генов лидерной последовательности, происходящей из антитела курицы, содержащей SEQ ID NO: 263, и константной области L-цепи IgG человека, содержащей SEQ ID NO: 265.
5
Далее, рекомбинантный вектор, имеющий вставку гена вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 40) моноклонального антитела курицы #1, и рекомбинантный вектор, имеющий вставку гена вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 44) моноклонального антитела курицы #1, вводили в клетки CHO-K1 (полученные от Riken Cell Bank). В частности, 2×10 клеток CHO-K1 культивировали в среде Хэма F12 (изготавливаемая Invitrogen Corp.), содержащей 1 мл 10% FBS на ячейку культурального планшета с 12 ячейками, и промывали PBS(-). Затем добавляли свежую среду Хэма F12, содержавшую 1 мл 10% FBS на ячейку. 250 нг каждого из векторов, лизированных в 30 мкл OptiMEM (изготавливаемая Invitrogen Corp.), смешивали с 30 мкл реагента для трансфекции Polyfect (изготавливаемый Qiagen N.V.), и эту смесь добавляли в каждую ячейку. Клетки CHO-K1, котрансфицированные рекомбинантными векторами, культивировали в среде Хэма F12, содержавшей 10% добавку FBS с 200 мкг/мл зеоцина (изготавливаемый Invitrogen Corp.) и 200 мкг/мл генетицина (изготавливаемый Roche Diagnostics), а затем высевали в 96-луночный планшет при плотности 0,5 клеток/лунка для получения клеточной линии, стабильно продуцирующей химерное антитело человека-курицы #1 (#1), имеющее вариабельные области моноклонального антитела курицы #1. Также получали клеточные линии, стабильно продуцирующие химерное антитело человека-курицы #2 (#2) или химерное антитело человека-курицы #3 (#3) аналогично тому, как описано выше в отношении моноклональных антител курицы #2 и #3.
2
5
Каждую полученную клеточную линию культивировали в течение 5 суток в 150-см колбе в количестве 5×10 клеток/мл в 30 мл бессывороточной среды OptiCHO (изготавливаемая Invitrogen Corp.) с получением культуральных супернатантов, содержащих #1, #2 или #3.
1
1
Аналогично, фрагмент амплификации гена вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 40) моноклонального антитела курицы #1 обрабатывали на обоих концах ферментами рестрикции, а затем очищали и встраивали в соответствии с общепринятым способом в вектор pcDNA4/myc-His (изготавливаемый Invitrogen Corp.), уже имеющий вставки генов лидерной последовательности, происходящей из антитела курицы, и константной области H-цепи IgG мыши. Также, фрагмент амплификации гена вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 44) моноклонального антитела курицы #1 обрабатывали на обоих концах ферментами рестрикции, а затем очищали и встраивали в соответствии с общепринятым способом в вектор pcDNA3.1/myc-His (изготавливаемый Invitrogen Corp.), уже имеющий вставки генов лидерной последовательности, происходящей из антитела курицы, и константной области L-цепи IgG мыши. Эти рекомбинантные векторы вводили в клетки CHO-K1 аналогично тому, как описано выше, с получением клеточной линии, стабильно продуцирующей химерное антитело мыши-курицы #1, имеющее вариабельные области моноклонального антитела курицы #1. Также получали клеточные линии, стабильно продуцирующие химерное антитело мыши-курицы #2 (#2) или химерное антитело мыши-курицы #3 (#3) аналогично тому, как описано выше в отношении моноклональных антител курицы #2 и #3.
2
5
Каждую полученную клеточную линию культивировали в течение 5 суток в 150-см колбе в количестве 5×10 клеток/мл в 30 мл бессывороточной среды OptiCHO (изготавливаемая Invitrogen Corp.) с получением культуральных супернатантов, содержащих химерное антитело мыши-курицы #1, химерное антитело мыши-курицы #2 или химерное антитело мыши-курицы #3.
(3) Экспрессия CAPRIN-1 на поверхности клеток рака поджелудочной железы с использованием полученного моноклонального антитела
6
Далее четыре клеточных линии рака поджелудочной железы (Capan-2, MIAPaCa-2, PANC-1 и BxPC-3), для которых было подтверждено, что они обладают экспрессией гена CAPRIN-1, исследовали в отношении экспрессии на их клеточной поверхности белка CAPRIN-1. 10 клеток каждой клеточной линии центрифугировали в каждой 1,5-мл микроцентрифужной пробирки. Реактивные в отношении поверхности злокачественных клеток моноклональные антитела мыши #1-#22 против CAPRIN-1, полученные согласно 4, и культуральный супернатант (100 мкл), содержащий химерное антитело мыши-курицы #1, #2 или #3 против CAPRIN-1, полученное согласно предшествующему разделу (2), по отдельности добавляли в пробирки и оставляли стоять в течение 1 часа на льду. После промывания PBS клетки суспендировали в меченных FITC антителах козы против IgG мыши (изготавливаемые Invitrogen Corp.), разбавленных в 500 раз PBS, содержащим 0,1% FBS, и оставляли стоять в течение 1 часа на льду. После промывания PBS измеряли интенсивность флуоресценции с использованием FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). С другой стороны, те же действия, которые описаны выше, проводили с использованием изотипических контрольных антител вместо моноклональных антител мыши #1-#22 против CAPRIN-1 и культурального супернатанта, содержащего химерное антитело мыши-курицы #1, #2 или #3, для получения контроля. В результате все клетки, к которым добавляли любое из моноклональных антител #1-#22 и химерных антител мыши-курицы #1, #2 и #3, имели интенсивность флуоресценции, по меньшей мере на 20% более высокую, чем контроль. В качестве конкретного примера, все из Capan-2, MIAPaCa-2, PANC-1 и BxPC-3, к которым добавляли химерное антитело мыши-курицы #1, проявляли увеличение интенсивности флуоресценции, составляющее 200% или более. Это продемонстрировало, что белок CAPRIN-1 экспрессируется на поверхности клеточной мембраны клеточных линий рака поджелудочной железы человека. Указанная выше степень усиления интенсивности флуоресценции представлена в качестве степени повышения средней интенсивности флуоресценции (MFI) в каждой клеточной линии, и ее вычисляли по следующей формуле.
Степень повышения интенсивности флуоресценции (степень усиления интенсивности флуоресценции) (%) = ((MFI клеток, прореагировавших с антителом против CAPRIN-1 человека) - (контрольная MFI)) / (контрольная MFI) × 100.
(4) Противоопухолевый эффект (активность ADCC) антитела против CAPRIN-1 на клетки рака рак поджелудочной железы человека
6
3
5
3
*
2
Среди антител, полученных, как описано выше, химерное антитело человека-курицы #1 использовали для оценки его цитотоксической активности (активность ADCC) в отношении клеток рака поджелудочной железы человека. Культуральный супернатант, содержащий химерное антитело человека-курицы #1, полученный согласно абзацу (2), очищали с использованием Hitrap Protein A Sepharose FF (изготавливаемая GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.). После замены на PBS(-) раствор фильтровали через 0,22-мкм фильтр (изготавливаемый Millipore Corp.). Полученное антитело использовали для анализа активности. 10 клеток каждой из клеточных линий рака поджелудочной железы человека MIAPaCa-2 и Capan-2 собирали в 50-мл центрифужную пробирку, в которую затем добавляли 100 мкКи хрома 51, а затем инкубировали при 37°C в течение 2 часов. Затем клетки промывали три раза средой RPMI 1640, содержавшей 10% FBS, и добавляли при плотности 2 × 10 клеток/лунка в 96-луночный планшет с V-образным дном для получения клеток-мишеней. Добавляли полученное антитело в концентрации 1,2 мкг/лунка. Клеточную популяцию, содержащую NK-клетки, выделяли из лимфоцитов периферической крови человека с использованием следующего подхода: мононуклеарные клетки периферической крови человека подвергали взаимодействию с меченными флуоресцентным красителем FITC антителами (антитело против CD3 человека, антитело против CD20 человека, антитело против CD19 человека, антитело против CD11c человека, и антитело против HLA-DR человека (Becton, and Dickinson and Company)). Клеточную популяцию, содержавшую NK-клетки, не окрашенные антителами, отделяли с использованием клеточного сортера (FACS Vantage SE (Becton, and Dickinson and Company)) или набора для выделения NK-клеток человека (изготавливаемый Miltenyi Biotec K.K.). Полученную клеточную популяцию, содержащую NK-клетки, добавляли в планшет при плотности 2×10 клеток/лунка и культивировали при 37°C в течение 4 часов в условиях 5% CO. После культивирования в культуральном супернатанте измеряли количество хрома (Cr) 51, высвободившегося из поврежденных опухолевых клеток, для вычисления активности ADCC антитела против CAPRIN-1 в отношении клеток рака поджелудочной железы. В результате, химерное антитело человека-курицы #1 проявляло цитотоксическую активность, составляющую 32%, в отношении MIAPaCa-2, в то время как при использовании моноклональных антител, реактивных в отношении самого белка CAPRIN-1, но не реактивных в отношении поверхности злокачественных клеток, или в отсутствие антител, была получена цитотоксическая активность, составляющая менее 5%. Также, химерное антитело человека-курицы #1 проявляло цитотоксическая активность, составляющую 20% или более, в отношении Capan-2, в то время как при использовании моноклональных антител, реактивных в отношении самого белка CAPRIN-1, но не реактивных в отношении поверхности злокачественных клеток, или в отсутствие антител, была получена цитотоксическая активность, составляющая менее 5%. Моноклональные антитела мыши #1-#22 против CAPRIN-1, химерное антитело человека-курицы #2 и химерное антитело человека-курицы #3 также исследовали в отношении их цитотоксической активности против MIAPaCa-2 и Capan-2 аналогично тому, как описано выше. В результате, эти антитела проявляли цитотоксическую активность, составляющую 10% или более, в отношении обеих клеточных линий рака поджелудочной железы, в то время как при использовании моноклональных антител, реактивных в отношении самого белка CAPRIN-1, но не реактивных в отношении поверхности злокачественных клеток, или в отсутствие антител, была получена цитотоксическая активность, составляющая менее 5%. Эти результаты продемонстрировали, что полученные моноклональные антитела против CAPRIN-1 повреждают злокачественные клетки, экспрессирующие CAPRIN-1, через их активность ADCC. Эти результаты в отношении цитотоксической активности были получены путем: смешения антитела против CAPRIN-1, используемого в рамках настоящего изобретения, клеточной популяции, содержащей NK-клетки человека, и 2×10 опухолевых клеток с включенным хромом 51, как описано выше; культивирования клеток в течение 4 часов; измерения после культивирования количества хрома 51, высвободившегося в среду; и вычисления цитотоксической активности в отношении опухолевых клеток по следующей формуле:
*
Формула: Цитотоксическая активность (%) = Количество хрома 51, высвободившегося из опухолевых клеток, дополненных антителом против CAPRIN-1, и клеточной популяции, содержащей NK-клетки человека / Количество хрома 51, высвободившегося из опухолевых клеток, дополненных 1н хлористоводородной кислотой × 100.
[Пример 7] Противоопухолевый эффект моноклонального антитела против CAPRIN-1 у мышей in vivo
Далее полученные моноклональные антитела против CAPRIN-1 (химерное антитело человека-курицы #1) оценивали в отношении их противоопухолевых эффектов на мышей, имеющих злокачественную опухоль, in vivo. Каждое используемое антитело очищали на колонке из культурального супернатанта аналогично тому, как описано выше.
6
Моноклональные антитела против CAPRIN-1 исследовали в отношении их противоопухолевых эффектов с использованием мышей Balb/c nude, имеющих злокачественную опухоль, которым была трансплантирована клеточная линия рака поджелудочной железы человека Capan-2, экспрессирующая CAPRIN-1. 5×10 клеток Capan-2 (приобретенных ATCC) на мышь подкожно трансплантировали в брюшную полость 6 мышей Balb/c nude (полученных от Japan SLC, Inc.) и выращивали до тех пор, пока размер опухоли не составлял приблизительно 5 мм в диаметре. Каждое моноклональное антитело против CAPRIN-1 внутрибрюшинно вводили в дозе 200 мкг (200 мкл)/мышь 3 из этих мышей, имеющих злокачественную опухоль. Затем, антитело внутрибрюшинно вводили мышам, имеющим злокачественную опухоль, в той же дозе, как указано выше, два раза в неделю. Размер опухоли измеряли каждые сутки и проводили наблюдение противоопухолевого эффекта. С другой стороны, оставшимся 3 мышам, имеющим злокачественную опухоль, которых в свою очередь использовали в качестве контрольной группы, вместо антитела вводили PBS(-). В результате в группах, в которых вводили моноклональные антитела мыши #1-#22 против CAPRIN-1, опухоль регрессировала до 84% (объем опухоли в контрольной группе был определен как 100%) на 27 сутки после начала введения антитела. Кроме того, рост опухоли снизился до 75% на 35 сутки. Химерные антитела человека-курицы #1, #2 и #3 также оценивали аналогично тому, как описано выше. В результате, во всех случаях рост опухоли снизился до 80% на 27 сутки после начала введения антитела. Эти результаты продемонстрировали, что полученные антитела против CAPRIN-1 обладают противоопухолевым эффектом in vivo на клетки рака поджелудочной железы человека, экспрессирующие CAPRIN-1. Размер опухоли вычисляли в единицах объема по формуле 0,5 × (наибольшая ось × наименьшая ось × наименьшая ось).
[Пример 8] Идентификация пептида в белке CAPRIN-1, с которым связывается антитело против CAPRIN-1, реактивное в отношении поверхности злокачественных клеток
Моноклональные антитела #12-#22 против CAPRIN-1, реактивные в отношении поверхности злокачественных клеток, полученные, как описано выше, использовали для идентификации частичных последовательностей в белках CAPRIN-1, распознаваемых ими.
Сначала, DTT (изготавливаемый Sigma-Aldrich Corp./Fluka) добавляли в конечной концентрации 10 мМ к 100 мкл раствора 1 мкг/мкл, содержавшего рекомбинантный белок CAPRIN-1, растворенный в PBS, и подвергали реакции при 95°C в течение 5 минут для восстановления дисульфидных связей в белках CAPRIN-1. Далее добавляли 20 мМ (конечная концентрация) йодацетамид (изготавливаемый Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), а затем проводили реакцию алкилирование тиольных групп при 37°C в течение 30 минут в условиях затемнения. К 40 мкг полученных восстановленных алкилированных белков CAPRIN-1 добавляли 50 мкг каждого из моноклональных антител #12-#22 против CAPRIN-1. Общее количество каждой смеси доводили до 1 мл с помощью 20 мМ фосфатного буферного раствора (pH 7,0). Полученную смесь подвергали реакции в течение ночи при 4°C при перемешивании путем взбалтывания.
Далее, в каждую реакционную смесь добавляли трипсин (изготавливаемый Promega K.K.) в конечной концентрации 0,2 мкг и подвергали реакции при 37°C в течение 1 часа, 2 часов, 4 часов и 12 часов. Затем реакционную смесь смешивали со стеклянными гранулами с белком A (изготавливаемые GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.), заранее блокированными PBS, содержащим 1% BSA (изготавливаемый Sigma-Aldrich Corp.) и промытыми PBS, 1 мМ карбонатом кальция и буферным раствором NP-40 (20 мМ фосфатный буферный раствор (pH 7,4), 5 мМ EDTA, 150 мМ NaCl, 1% NP-40) и подвергали реакции в течение 30 минут.
Каждый реакционный раствор промывали 25 мМ аммоний-карбонатным буферным раствором (pH 8,0), с последующим элюированием комплексов антиген-антитело с использованием 100 мкл 0,1% муравьиной кислоты. Элюат анализировали с помощью LC-MS с использованием Q-TOF Premier (изготовленный Waters-MicroMass). Этот анализ проводили в соответствии с протоколом, прилагаемым к устройству.
В результате был идентифицирован полипептид SEQ ID NO: 273 в качестве частичной последовательности CAPRIN-1, распознаваемый всеми из моноклональных антител #12-#22 против CAPRIN-1. В полипептиде SEQ ID NO: 273 был идентифицирован пептид SEQ ID NO: 274 в качестве частичной последовательности, распознаваемой моноклональными антителами #13-#16, #17-#19 и #21. Далее было обнаружено, что в качестве его частичной пептидной последовательности, пептид SEQ ID NO: 275 распознавался моноклональными антителами #13-#16.
Также химерное моноклональное антитело человека-курицы #1, химерное моноклональное антитело человека курицы #3 и моноклональные антитела мыши #1, #2, #3, #4, #5, #6, #7, #8, #9, #10 и #11 использовали для идентификации эпитопных пептидов в белке CAPRIN-1, распознаваемых ими. Было синтезировано 93 пептида-кандидата, состоящих из 12-16 аминокислот аминокислотной последовательности белка CAPRIN-1 человека, и каждый из них растворяли в DMSO в концентрации 1 мг/мл.
Каждый пептид растворяли в концентрации 30 мкг/мл в 0,1 M натрий-карбонатном буферном растворе (pH 9,6). Раствор добавляли в 96-луночный планшет (изготавливаемый Thermo Fisher Scientific Inc./Nunc, продукт №: 436006) в концентрации 100 мкл/лунка и оставляли стоять в течение ночи при 4°C. Раствор в каждой лунки удаляли и добавляли 10 мМ этаноламин/0,1 M натрий-карбонатный буферный раствор (PH 9,6) в концентрации 200 мкл/лунка и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем, раствор в каждой лунке удаляли и каждую лунку промывали два раза PBS, содержащим 0,5% Tween 20 (PBST), с получением планшета с иммобилизованным пептидом.
В каждый планшет, полученный таким образом, добавляли клеточный культуральный супернатант, содержавший химерное моноклональное антитело человека-курицы #1 (#1), химерное моноклональное антитело человека-курицы #3 (#3) или моноклональное антитело мыши (#1, #2, #3, #4, #5, #6, #7, #8, #9, #10 или #11) в концентрации 50 мкл/лунка. После встряхивания при комнатной температуре в течение 1 часа раствор в каждой лунке удаляли и каждую лунку промывали три раза PBST. Далее раствор вторичного антитела, содержащий меченные HRP антитела против IgG человека (изготавливаемые Invitrogen Corp.), разбавленные в 3000-4000 раз PBST, добавляли в концентрации 50 мкл/лунка в лунки с химерным моноклональным антителом человека-курицы, в то время как раствор вторичного антитела, содержащий меченные HRP антитела против IgG мыши (изготавливаемые Invitrogen Corp.), разбавленные в 3000-4000 раз PBST, добавляли в концентрации 50 мкл/лунка в лунки с моноклональным антителом мыши. Затем раствор в каждой лунке удаляли и каждую лунку шесть раз промывали PBST.
Добавляли раствор субстрата TMB (изготавливаемый Thermo Fisher Scientific Inc.) в концентрации 100 мкл/лунка и оставляли стоять в течение 15-30 минут для обеспечения цветовой реакции. После развития цвета реакцию завершали добавлением 1н серной кислоты в концентрации 100 мкл/лунка. Поглощение измеряли при 450 нм и 595 нм с использованием абсорбционного спектрометра. В результате полипептид SEQ ID NO: 266 был идентифицирован как частичная последовательность CAPRIN-1, распознаваемая всеми из химерного моноклонального антитела человека-курицы #1 против CAPRIN-1 и моноклональных антител #1-#5 против CAPRIN-1. В полипептиде SEQ ID NO: 266, пептид SEQ ID NO: 267 был идентифицирован в качестве частичной последовательности, распознаваемой химерным моноклональным антителом человека-курицы #1 и моноклональными антителами мыши #3 и #4. В полипептиде SEQ ID NO: 266, пептид SEQ ID NO: 268 был идентифицирован в качестве частичной последовательности, распознаваемой моноклональными антителами мыши #1, #2 и #5. Таким образом, было выявлено, что полипептид SEQ ID NO: 266 содержит эпитопную область для химерного моноклонального антитела человека-курицы #1 и моноклональных антител мыши #1, #2, #3, #4 и #5 против CAPRIN-1. Также, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 270, был идентифицирован в качестве частичной последовательности CAPRIN-1, распознаваемой всеми из моноклональных антител #6, #7 и #8 против CAPRIN-1. Таким образом, было выявлено, что полипептид SEQ ID NO: 270 содержит эпитопную область для антител #6, #7 и #8 против CAPRIN-1. Кроме того, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 272, был идентифицирован в качестве частичной последовательности CAPRIN-1, распознаваемой всеми из моноклональных антител #9, #10 и #11 против CAPRIN-1. Таким образом, было обнаружено, что полипептид SEQ ID NO: 272 содержит эпитопную область для антител #9, #10 и #11 против CAPRIN-1. Кроме того, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 269, был идентифицирован в качестве частичной последовательности CAPRIN-1, распознаваемой химерным моноклональным антителом человека-курицы #3. Таким образом, было обнаружено, что полипептид SEQ ID NO: 269 содержит эпитопную область для химерного моноклонального антитела человека-курицы #3.
ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ
Антитело по настоящему изобретению является пригодным для лечения и/или профилактики рака поджелудочной железы.
Все публикации, патенты и патентные заявки, цитированные в настоящем описании, включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.
СВОБОДНЫЙ ТЕКСТ СПИСКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
SEQ ID NO: 31-36, 130 и 257-262: Праймеры.