Получение мутантной альфа-галактозидазы с увеличенной термостабильностью

Вестник ДВО РАН. 2015. № 6

Слепченко Любовь Васильевна

Окончила Дальневосточный федеральный университет в 2013 г. по специальности «химия». С 2011 г. работает в лаборатории морской биохимии Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН. С отличием защитила две курсовые и дипломную работу под руководством к.б.н. Л.А. Балабановой. По окончании университета поступила в аспирантуру ТИБОХ ДВО РАН и продолжает научные исследования в той же лаборатории. Научные руководители -В.А. Рассказов и Л.А. Балабанова.

Основное направление диссертационной работы - изучение рекомбинантных О-гликозидгидролаз морских бактерий, трансформирующих групповую специфичность крови А и В. За время работы в лаборатории освоила методы генной инженерии, молекулярной биологии, микробиологии. Является соавтором двух статей, опубликованных за рубежом.

УДК 577.2

Л.В. СЛЕПЧЕНКО

Получение мутантной альфа-галактозидазы с увеличенной термостабильностью

На основе анализа теоретической трехмерной структуры альфа-галактозидазы морской бактерии Pseudoalteromonas sp. КММ 701 предсказаны точечные мутации аминокислотных остатков для получения более термостабильных форм фермента методом ПЦР-опосредованного сайт-направленного мутагенеза. Получена мутантная альфа-галактозидаза с аминокислотной заменой C493N в активном центре с увеличенной на 15 % термостабильностью по сравнению с диким типом фермента.

Ключевые слова: рекомбинантный белок, сайт-направленный мутагенез, термостабильность.

Producing mutant alfa-galactosidase with increased thermal stability. L.V. SLEPCHENKO (G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS, Vladivostok).

By analyzing the three-dimensional structure of alpha-galactosidase from marine bacterium Pseudoalteromonas sp. KMM 701, the point mutations of amino acid residues of the enzyme for obtaining more thermostable enzyme modifications were predicted by PCR-mediated site-directed mutagenesis. The mutant alpha-galactosidase with amino acid substitution C493N in the active center has thermal stability increased by 15 % as compared with the wild type of enzyme.

Key words: recombinant protein, site-specific mutagenesis, thermal stability.

СЛЕПЧЕНКО Любовь Васильевна - аспирант (Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Еляко-ва ДВО РАН, Владивосток). E-mail: Lubov99d@mail.ru

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты № 13-04-00806; 15-04-08654), научного фонда ДВФУ (проект № 14-08-01-11_и).

В последнее время все большее внимание исследователей привлекают живые организмы, адаптированные к холоду, вследствие их способности синтезировать высокоэффективные ферменты с уникальной специфичностью, функционирующие при очень низких температурах окружающей среды. Несмотря на чрезвычайно широкое распространение и разнообразие, психрофилы сравнительно мало изучены. Благодаря повышенной каталитической эффективности, адаптированные к пониженным температурам ферменты рассматриваются в качестве ценных инструментов для биотехнологических целей, медицинской и пищевой промышленности. Помимо практической значимости психрофиль-ных ферментов следует отметить важность изучения структурных основ повышенной каталитической эффективности ферментов организмов, обитающих при пониженных температурах [5]. В этом смысле чрезвычайно большой интерес представляют ферменты морских бактерий, в частности альфа-галактозидазы, которые катализируют гидролиз альфа-О-гликозидной связи между остатками галактозы, расположенными на невосста-навливающих концах олиго- и полисахаридов, таких как мелибиоза, раффиноза, стахиоза, вербаскоза и галактоманнаны, а также на невосстанавливающих концах олигосахаридных цепей гликопротеинов и гликолипидов [1, 2]. Фермент участвует в удалении токсичных накоплений и в гидролизе фенольных гликозидов, обеспечивающих контроль роста растений. У человека альфа-галактозидазы обнаружены в плаценте, селезенке, плазме крови и печени. Было установлено, что клетки крови и костный мозг человека и некоторых животных также содержат альфа-галактозидазу. У человека и животных альфа-галактозида-зы вовлечены в процесс гидролиза галактолипидов. Накопление гликосфинголипидов с терминальным альфа-связанным остатком галактозы на стенках сосудов и в различных органах коррелирует с тяжелой патологией - болезнью Фабри. Альфа-галактозидазы также могут выполнять синтетическую функцию, поскольку катализируют реакцию транс-гликозилирования [2]. Альфа-галактозидазы, которые инактивируют серологическую активность эритроцитов крови группы В, превращая ее в «универсальную» донорскую кровь группы О, - относительно редкие ферменты. Донорская кровь группы O используется в чрезвычайных ситуациях, особенно в случаях, когда необходима кровь необычных или редких фенотипов, когда невозможно по ряду причин определить группу крови реципиента, для педиатрических переливаний, а также в условиях дефицита здоровых доноров. На сегодняшний день в трансфузионной медицине все еще существует проблема наличия качественной донорской крови в необходимом количестве. Несмотря на появление методик ферментативного получения донорской крови, такая кровь не может широко использоваться в клинической практике по причине отсутствия требуемых параметров у ферментных препаратов [1].

Альфа-галактозидаза из морской бактерии Pseudoalteromonas sp. КММ 701, действующая при нейтральных значениях рН, может быть предложена для конверсии эритроцитов крови группы В в эритроциты крови группы О в биотехнологии получения «универсальной» донорской крови. В настоящее время изучено действие рекомбинантного аналога этого фермента на эритроциты человека, в несколько раз превышающее эффективность предложенной для этих целей альфа-галактозидазы из зеленых зерен кофе, проведены структурные исследования методами моделирования пространственной структуры альфа-галактозидазы из морской бактерии Pseudoalteromonas sp. КММ 701 [2-4].

Также с помощью ген-специфических синтетических олигонуклеотидов были получены генетические конструкции, несущие ген альфа-галактозидазы из морской бактерии Pseudoalteromonas sp. КММ 701, рекомбинантные штаммы Escherichia coli - продуценты рекомбинантной альфа-галактозидазы a-PsGal [3].

Для выявления структурных особенностей термолабильной альфа-галактозидазы морской бактерии Pseudoalteromonas sp. КММ 701 (a-PsGal), приведших к холодовому адаптивному изменению функциональности молекулы, была проведена идентификация аминокислотных остатков в структурно-гомологичных участках более термостабильных гомологов. Для этого использован сервер PopMuSiC 2.1 (Prediction of protein mutant

stability changes), который по аминокислотной последовательности может предсказать, какая аминокислотная замена приведет к получению более термостабильных мутантов путем сайт-направленной эволюции. Программа дала оценку изменению вклада специфических мутаций в суммарную свободную энергию с точки зрения относительной термо-динамичекой стабильности всей структуры белка термолабильной a-PsGal. Для получения термостабильных мутантов a-PsGal были выбраны варианты единичных и двойных аминокислотных замен, дающих наименьшую внутримолекулярную энергию связывания a-PsGal. Также с помощью программы MOE 2012 v.6 было использовано выравнивание аминокислотных последовательностей a-PsGal и единственного ближайшего гомолога из Lactobacillus acidophilus NCFM (PDB code:2XN2), имеющего установленную кристаллическую структуру с высоким рентгенографическим разрешением среди гликозидаз семейства GH36. В соответствии с сопоставленными результатами были получены генно-инженерные конструкции мутантов a-PsGal с одиночными заменами: C493N, F148P, Y304D, C217E, W170A - и двойные мутанты: F531P/F532G, V500E/L505P (рис. 1, см. вклейку). Замены аминокислотных остатков вводили в два геноспецифических праймера (прямой и обратный), комплементарные участку запланированной мутации. Далее мутантные гены a-PsGal получали методом полимеразной цепной реакции для лигирования в плазмиду pET40 b+ с использованием геноспецифичных праймеров на начало и конец гена дикого типа a-PsGal, как описано ранее [3].

Для экспрессии гена, кодирующего мутантную a-PsGal, плазмиду, несущую ее ген, трансформировали в компетентные клетки E. coli штамма Rosetta (DE3) и наращивали ночную культуру рекомбинантного штамма. Культуру клеток каждого рекомбинантного штамма иннокулировали в 0,4 мл среды LB, содержащей 25 мкг/мл канамицина, и растили в течение 12 ч при температуре 37 оС и перемешивании 200 об/мин. Ночную культуру иннокулировали в 20 мл среды LB с добавлением канамицина (25 мкг/мл) и наращивали при 37 0С на шейкере при 200 об/мин до оптической плотности ОЭ600 = 0,6-0,8, затем добавляли индуктор экспрессии - изопропил^-В-1-тиогалактопиранозид до конечной концентрации 0,2 мМ. После этого клетки культивировали на шейкере при 250 об/мин в течение 12 ч при 16 0C. После проведения экспрессии клетки каждого рекомбинантного штамма центрифугировали со скоростью 4000 об/мин в течение 15 мин при 8 0C. Осадок промывали несколько раз в 20 мл 20мМ натрий-фосфатного буфера (NaH2PO4 х H2O), затем суспендировали и дезинтегрировали с частотой 22 кГц (при токе 0,4 А) 5 раз по 40 с на ледяной бане с 10-секундным перерывом на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН 2Т (1985 г.). Гомогенат центрифугировали при 5000 об/мин в течение 30 мин. Супернатант использовали для определения термостабильности ферментов. Для этого ферменты инкубировали в течение 1ч при 40 °С, отбирая аликвоту каждые 10 мин. Остаточную активность измеряли путем добавления 5 мкл образца белкового раствора в 200 мкл буфера, содержащего 0,02 М NаH2PO4, 0,1 М NaCl (pH = 7,7) и 0,2 mM коммерческого хромоген-ного субстрата - р-нитрофенил-альфа-Э-галактопиранозида. Реакцию останавливали добавлением 0,2 мл 1 M Na2CO3

В результате экспрессии полученных генно-инженерных конструкций у 70 % мутант-ных белков не выявлено альфа-галактозидазной активности. Другие мутантные белки имели более низкую ферментативную активность и термостабильность по сравнению с диким типом a-PsGal. Лишь в одном мутанте замещение остатка цистеина на аспарагин (C493N) привело к увеличению термостабильности a-PsGal на 15 % (рис. 2). Однако увеличение термостабильности привело к значительному снижению ферментативной активности a-PsGal.

Неактивные мутанты a-PsGal E337A, D450A и D515A подтвердили расположение предсказанных каталитических остатков E337 и D515 и нуклеофильного остатка D450 в активном центре галактозидазы. Однако анализ 3Э-структуры a-PsGal, построенной на основе модели прототипа из L. acidophilus, показал, что все остальные использованные в эксперименте замены аминокислотных остатков, приводящие к потере ферментативной

К статье: Л.В. Слепченко «Получение мутантной альфа-галактозидазы с увеличенной термостабильностью»

Рис. 1. Компьютерная модель пространственной структуры субъединицы а-Р^а1 с выделенными аминокислотными остатками в местах мутаций

активности, локализовались в петлях и альфа-спиралях, нарушая, вероятно, какие-то внутримолекулярные функциональные контакты, обеспечивающие подвижность участков молекулы, важных для конформационной пластичности фермента в момент катализа.

Таким образом, искусственное увеличение термостабильности молекулы психрофильного фермента по тому же принципу, который существует в структурной организации мезофильных и термостабильных гомологов, ведет к ограничению созданных природой вариантов его активной конформации, что неизбежно отражается на общей скорости каталитической реакции. Мы предполагаем, что увеличение во много тысяч раз значения константы k отражающей число оборотов фермента в единицу времени, а также эффективности (kcat / Км) психрофильных ферментов по сравнению с их более термостабильными гомологами является сопутствующим эффектом появления в ходе эволюции более динамичной структуры, обусловленной необходимостью приспособления к функционированию в условиях существования в холодном климате.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бакунина И.Ю. О-Гликозидгидролазы морских бактерий: дис. ... д-ра хим. наук / Тихоокеан. ин-т биоорган. химии ДВО РАН. Владивосток, 2011. 275 с.

2. Bakunina I.Y., Balabanova L.A., Pennacchio A., Trincone A. Hooked on a-D-galactosidases: from biomedicine to enzymatic synthesis // Crit. Rev. Biotechnol. [Epub ahead of print.] 2014. doi:10.3109/07388551.2014.949618.

3. Bakunina I.Y., Balabanova L.A., Golotin V.A., Slepchenko L.V., Isakov V.V., Rasskazov V.A. Stereochemical course of hydrolytic reaction catalyzed by alpha-galactosidase from cold adaptable marine bacterium of genus Pseudo-alteromonas // Front. Chem. 2014. Vol. 2, N 89. P. [1-6]. doi:10.3389/fchem.2014.00089.

4. Balabanova L.A., Bakunina I.Y., Nedashkovskaya O.I., Makarenkova I.D., Zaporozhets T.S., Besednova N.N., Zvyagintseva T.N., Rasskazov V.A. Molecular characterization and therapeutic potential of a marine bacterium Pseudo-alteromonas sp. KMM 701 a-galactosidase // Mar. Biotechnol. 2010. Vol. 12. P. 111-120.

5. Rina M., Pozidis C., Mavromatis K., Tzanodaskalaki M., Kokkinidis M., Bouriotis V. Alkaline phosphatase from the Antarctic strain TAB5. Properties and psychrophilic adaptations // Eur. J. Biochem. 2000. Vol. 267. P. 1230-1238.

О Л » SO 40 «a IB я

i|l ' . Mllll

Рис. 2. Термостабильность мутанта a-PsGal C493N относительно немутантной формы a-PsGal