Получение иммунных сывороток для серодиагностики инфекционного гепатита собак

Урюмцева Т.И. Получение иммунных сывороток для серодиагностики инфекционного гепатита собак // Электронный научно-методический журнал Омского ГАУ. - 2019. - №1 (16) январь - март. -URL http://e-journal.omgau.rU/images/issues/2019/1/00701.pdf. - ISSN 2413-4066

УДК 619:616.981.3+576.858:615.37

Урюмцева Татьяна Игоревна

канд. вет. наук, доцент

Инновационный Евразийский университет, г. Павлодар vbh2@mail.ru

Получение иммунных сывороток для серодиагностики инфекционного гепатита

собак

Аннотация. Повсеместное распространение инфекционного гепатита собак диктует необходимость разработки новых методов и совершенствования существующих методов лабораторной диагностики данного заболевания. Применение комплекса различных методов диагностики обеспечивает постановку диагноза на инфекционный гепатит при любой форме заболевания и на любой стадии, даже в случае смешанных инфекций, а также дифференцировать его от парвовирусного энтерита, чумы и других сходных с инфекционным гепатитом собак заболеваний.

Эффективность методов диагностики во многом зависит от активности и специфичности диагностических препаратов, в том числе диагностических сывороток.

Разработанная схема приготовления диагностической сыворотки против инфекционного гепатита собак и выделения из неё иммуноглобулиновой фракции для сенсибилизации носителя для реакции агглютинации латекса позволяет получить антительные препараты с активностью в реакции диффузионной преципитации 1:4 - 1:8, реакции связывания комплемента 1:8 - 1:16. Полученные данным способом гипер иммунные сыворотки могут быть с успехом использованы при получении диагностических препаратов направленных на выявление вирусспецифического антигена в пробах органов и тканей, фекалий и смывов из ротовой и носовой полостей больных и павших животных.

Ключевые слова: инфекционный гепатит собак, гипериммунизация, диагностикум, реакция преципитации, реакция связывания комплемента.

Введение

Инфекционный гепатит собак имеет широкое распространение в Казахстане и России, зарегистрирован во многих странах мира. В условиях мегаполисов болезнь поражает собак различных пород и возрастов, но наиболее часто заболевают щенки в возрасте 2-6 месяцев [7,9,10].

Решающее значение в диагностике придается лабораторным исследованиям, при которых необходимо исключить чуму, лептоспироз, бешенство, сальмонеллез, токсоплазмоз, авитаминоз В1, алиментарные интоксикации, а также парвовирусный энтерит собак [1]. Использование для диагностики любого инфекционного заболевания специфических средств и методов всегда является предпочтительнее гетерологичных диагностических препаратов.

Эффективность методов диагностики во многом зависит от активности и специфичности диагностических препаратов, в том числе диагностических сывороток. Использование для этих целей сывороток крови животных - реконвалесцентов имеет существенный недостаток - в таких сыворотках титр антител различен и колеблется в

зависимости от степени проявления клинических признаков заболевания у животных -продуцентов. Поэтому разработка схем получения, очистки и использования гипериммуных сывороток в тест-системах для диагностики инфекционного гепатита собак весьма актуальна.

По литературным данным известно, что для гипериммунизации применяют органотканевые или культуральные антигены вирусов. [3,4,5,8].

Успех гипериммунизации животных-продуцентов во многом зависит не только от тщательного их подбора, качества антигена и адъювантных веществ, но и от правильно выбранной схемы гипериммунизации, правильной технологии выполнения этих схем иммунизации, а также технологии кровопускания и обескровливания продуцентов в конце их эксплуатации. [2,6]

Цель исследования- разработка способа получения иммунных сывороток пригодных для использования в тест-системах для диагностики инфекционного гепатита собак.

Материалы и методы

В качестве объекта для иммунизации использовали щенков беспородных собак в возрасте 2-3 месяцев и помесных кроликов в возрасте 3 месяцев. Перед введением в опыт у животных проверяли пробы сыворотки на отсутствие вируснейтрализующих антител против вирусов чумы и парвовирусного энтерита. Перед началом цикла гипериммунизации животных за 21 день вакцинировали против инфекционного гепатита.

Для установления титра специфических антител производили забор крови у животных-продуцентов на 7, 14, 21, 28 и 35 сутки с момента начала гипериммунизации, выделяли сыворотку крови и оценивали её на преципитирующую и комплементфиксирующую активность.

При постановке реакции связывания комплемента (РСК) и реакции диффузионной преципитации (РДП) использовали набор нормальных, гомо- и гетерологичных культуральных и органотканевых антигенов. Данные реакции использовали при оценке специфичности полученных гипериммунных сывороток.

Гама-глобулиновую фракцию выделяли из полученных гипериммунных сывороток методом ступенчатого многократного осаждения альбумина и иммунных глобулинов различными концентрациями охлаждённого этилового спирта

Для выделения гамма-глобулиновой фракции производили высаливание насыщенным раствором сульфата аммония полученных гипериммунных сывороток.

Концентрацию белка в растворах иммунноглобулинов определяли фотометрически. Оптическая плотность препарата измерялась на спектрофотометре при длине волны 280 нм. Для разведения испытуемых препаратов использовали бидистиллированную воду.

Результаты исследований

Динамику нарастания антител у животных-продуцентов сывороток отслеживали на 7, 14, 21, 28 и 35 сутки с момента начала цикла гипериммунизации. Производили оценку выделенной сыворотки на комплементфиксирующую и преципитирующую активность.

На рисунке 1 демонстрируется степень прироста уровня антител в организме гипериммунизированных животных-продуцентов на 7, 14, 21, 28 и 35 сутки с момента начала гипериммунизации.

52

50

48

46

44

42

40

38

36

34

§32 н

рЕ 30 га 28 ¿26 5^24 1-22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

7 14 21 28 35

Дни после начала гипериммунизации, суток

0

---♦— П кр --П щ

-А-К кр ---К---К щ

Рис. 1. Уровень антител в сыворотках крови гипериммунизированных животных-продуцентов: П - Преципитирующие антитела; К - Комплементсвязывающие антитела; Кр -сыворотка получена на кроликах; Щ - сыворотка получена на щенках собак.

Как видно из данных, представленных на рисунке 1, средние значения титров антител гипериммунизированных кроликов уступают таковым у гипериммунизированных щенков собак. В связи с чем, дальнейшие исследования осуществляли с сыворотками крови, полученными путём гипериммунизации щенков собак.

Происходит постепенное нарастание титра преципитирующих и комплементсвязывающих антител против вируса инфекционного гепатита собак уже после

первой иммунизации. Последующее введение вируссодержащего материала ведет к повышению и достижению максимума на 8-12 сутки после последнего введения антигена. Далее титры антител снижаются.

В ходе исследований также установлено, что серологическая активность полученных сывороток напрямую зависит от вида использованного вируссодержащего материала в ходе гипериммунизации.

Наиболее высокие титры антител выявлены в сыворотках крови щенков собак, при гипериммунизации которых был использован органотканевой материал. Значение титров этих сывороток оказались выше титров антител в сыворотках крови животных-продуцентов, которых иммунизировали культуральным антигеном, в РСК- в 2 раза, а в РДП в 3-4 раза.

Результаты проверки полученных гипериммунных сывороток на активность представлены в таблице 1.

Таблица 1

Серологическая активность сывороток, полученных по различным схемам гипериммунизации животных, Р < 0,05

№ схемы Вид животного и характер материала К-во ж-ных Средние геометрические титры антител

РСК РДП

Щенки 8

1 Культуральный 1:28±6 1:3,2±0,9

2 Органотканевой 1:57±13 1:14±4

Кролики 5

3 Культуральный 1:6,8±2,6 1:3,7±0,7

4 Органотканевой 1:12,2±4,4 1:3,6±0,7

Полученные гипераммунные сыворотки проверяли на специфичность путем постановки реакции длительного связывания комплемента (РДСК) и реакции диффузионной преципитации, используя наборы нормальных, гомо- и гетерологичных культуральных и органотканевых антигенов. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2

Результаты проверки сывороток крови гипериммунизированных собак на

специфичность

Гипериммунизация Гипериммунизация

Антигены К-во проб культуральным антигеном органотканевым антигеном

РДСК РДП РДСК РДП

ОРГАНОТКАНЕВЫЕ

Инфекционный гепатит собак 10 + + + +

Чума плотоядных 10 - - - -

Парвовирусный энтерит плотоядных 10 - - - -

Аденовирусная инфекция КРС II 10 + +/- + +

серотипа

Органы здоровой собаки 4 - - - -

Органы здоровой лисы 3 - - - -

КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ

Инфекционный гепатит собак 4 + + + +

Аденовирусная инфекция КРС II 4 + + + +

серотипа

Чума плотоядных 4 + + - -

Чума КРС 4 + + - -

Антиген культуральный нормальный 8 + + - -

Примечание: + - положительный результат;

- - отрицательный результат.

Данные представленные в таблице 2 свидетельствуют о высокой степени специфичности с гетерологичными препаратами, сывороток, полученных при гипериммунизации щенков-собак органотканевым материалом. Положительные результаты были получены с антигенами родственных аденовирусов.

При использовании для гипериммунизации щенков собак культурального антигена получены сыворотки с выраженной неспецифической активностью при постановке серологических реакций с гетерологичными и нормальными антигенами культурального происхождения. Предполагаем, что антигены, использованные для гипериммунизации были недостаточно очищены от балластных белков, которые после введения в организм животных-продуцентов, также, как и вирусный антиген, индуцировали синтез преципитирующих и комплементсвязывающих антител.

Учитывая специфичность и менее выраженную серологическую активность сывороток крови полученных при гипериммунизации щенков собак культуральным антигеном, дальнейшие исследования было решено проводить с сыворотками крови полученными путем гипериммунизации щенков собак органотканевым материалом.

Так как чувствительность и специфичность твёрдофазовых методов исследования зависят от чистоты сенситина, для приготовления антительных иммуносорбентов используют гамма-глобулины, выделенные из иммунных сывороток иммунных асцитных жидкостей и моноклональных антител различными методами. При использовании с этой целью глобулиновых фракций достигается концентрация активных белков в единице объёма, что ведёт к повышению чувствительности полученного диагностикума, а удаление альбумина и микроглобулинов способствует повышению его специфичности.

Было получено 2 серии иммунного гамма-глобулина из сыворотки крови гипериммунизированных щенков собак, полученных методом ступенчатого многократного осаждения альбумина и иммунных глобулинов различными концентрациями охлаждённого этилового спирта. Вместе с этим, параллельно, из полученных гипериммунных сывороток получали препараты гамма-глобулинов путём высаливания насыщенным раствором сульфата аммония методами осаждения риванолом и 50% раствором полиэтиленгликоля м.в. 6000.

Электрофоретический анализ полученных препаратов гамма-глобулинов показал, что при спиртовом методе содержится чистая иммуноглобулиновая фракция с незначительной примесью посторонних белков.

Чтобы оценить качество препаратов гаммма-глобулинов полученных различными способами, их проверяли на комплементфиксирующую и преципитирующую активность. Для сравнения параллельно исследовали исходные сыворотки крови животных-продуцентов.

Результаты проверки проб каждой серии иммунных глобулинов в соответствующей реакции представлены в таблице 3.

Таблица 3

Сравнительная оценка серологической активности гипериммунной сыворотки и выделенных из нее иммуноглобулинов, п = 5

животное продуцент метод выделения Серологическая активность

гамма-глобулина сыво ротки

РСК РДП РСК РДП

Щенки собак спиртовый 1:3,7±0,4 1:22±9 1:57±13 1:14±4

солевой 1:22±7 1:16±4 1:57±13 1:14±4

полиэтиленгликолем 1:49±11 1:4,4±0,7 1:57±13 1:14±4

риванолом 1:54±11 1:2,9±0,4 1:57±13 1:14±4

При спиртовом методе выделения иммуноглобулинов, их преципитирующая активность в 2-4 раза выше, чем в исходных сыворотках. Это может быть объяснено тем, что

в процессе обработки гипериммунной сыворотки происходит концентрирование иммуноглобулинов.

Гамма-глобулины полученные методом осаждения сульфатом аммония в РДП в агаровом геле практически не отличаются от результатов определения серологической активности исходных сывороток. Гамма-глобулины, которые были получены методом осаждения риванолом и полиэтиленгликолем, показали снижение преципитирующей активности по сравнению с исходными сыворотками в 4-8 раз, при сохранении активности комплементсвязывающих антител.

Сенсибилизирующая ценность у препаратов электрофоретически чистого иммуноглобулина, выделенного спиртовым методом при отсутствии комплементфиксирующей активности, не снижается.

В последующих исследованиях было установлено, что отсутствие комплементфиксирующей активности у препаратов электрофоретически чистого иммуноглобулина, выделенного спиртовым методом, не снижает его сенсибилизирующей ценности и последующей активности антительных диагностикумов для реакции агглютинации микродисперсии. Определяющим показателем пригодности иммуноглобулина для сенсибилизации в этом случае служила преципитирующая активность препарата.

Заключение

Анализ результатов исследования гамма-глобулиновых фракций, полученных разными методами, показывает, что спиртовый метод осаждения позволяет получать препараты с высокой степенью очистки без последующей обработки и значительной активностью в РДП и отсутствием комплементфиксирующей активности, тогда как препараты, полученные с применением сульфата аммония, ПЭГа и риванола, имеют значительную примесь посторонних белковых фракций и обладают относительно невысокой преципитирующей активностью. Полученные данным способом гипериммунные сыворотки могут быть с успехом использованы при получении диагностических препаратов направленных на выявление вирусспецифического антигена в пробах органов и тканей, фекалий и смывов из ротовой и носовой полостей больных и павших животных.

Ссылки на источники

1. Белов А.Д., Данилов Е.П., Дукур И.И. и др. Болезни собак. М.: Агропромиздат, 1990. - 368с.

2. Биотехнология: Учебник / И.В. Тихонов, Е.А. Рубан, Т.Н. Грязнева и др.; Под ред. акад. РАСХН Е.С. Воронина. - СПб: ГИОРД, 2005. - 792 с.

3. Герасимов В.В., Равилов Р.Х., Гумеров В.Г., Уразов Н.Г., Хаертынов К.С. Специфический гамма-глобулин против чумы плотоядных (технические условия). / Утверждены ГУВ Кабмина РТ 28.02.94.

4. Захарова Е.Д. Серологическая диагностика инфекционного гепатита собак: автореф. дис. на соиск. учен. степ. канд. вет. наук : 16.00.03 / Захарова Елена Дмитриевна; Всероссийский НИИ контроля, стандартизации и сертификации вет. препаратов.- Москва, 1993.- 20 с.

5. Звягин И.В. Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов. Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности. Экспресс-информация. - № 7. - М., 1978. - С. 3-18.

6. Исхаков, Г.М. Разработка иммуноглобулина против хламидиоза плотоядных животных: автореф. дис. канд. вет. наук.-Казань, 2004.- 26 с.

7. Китаев Н.С., Петрова О.Г. Эпизоотологические особенности инфекционного гепатита собак в условиях г. Екатеринбурга II Аграрный вестник Урала. - Екатеринбург, 2010. - № 11-2 (77). - С. 25.

8. Самуйленко А.Я., Рубан Е.А., Еремец В.И., Гринь С.А., Клюкина В.И., Люлькова Л.С., Матвеева И.Н., Павленко В.С., Лехошерстова С.В. Современные биотехнологические процессы и иммунологические методы при промышленном производстве ветеринарных

препаратов (диагностикумов). Материалы Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов».-Щелково-2007. с. 5-6.

9. Уколова М.В. Гепатиты собак в условиях мегаполиса (этиология, патогенез, особенности распространения, терапия): дис. канд. вет. наук. - М., 2005. -148 с.

10. Хожаева И.Г. Чума и парвовирусный энтерит собак в условиях крупного промышленного города: эпизоотология, клиника, иммунология и меры борьбы: автореф. дис. канд. вет. наук. - Алматы, 2001 - 21 с.

Tatyana Uryumtseva

Candidate of Veterinary Sciences, Associate Professor Innovative University of Eurasia, Pavlodar vbh2@mail.ru

Production of Immune Serum for Serodiagnosis of Infectious Canine Hepatitis

Abstract. Omnipresent dispersion of infectious canine hepatitis dictates the necessity of developing new methods and improving existing methods of laboratory diagnosis of this disease. The use of a complex of various diagnostics methods provides diagnosis of infectious hepatitis at any form and any stage of the disease, even in the case of mixed infections, also it allows to differentiate infectious hepatitis from parvovirus enteritis, plague and other diseases, which are similar to infectious canine hepatitis.

The efficiency of diagnostics methods mostly depends from activity and specificity of diagnostic preparations, including diagnostic serum.

The developed scheme of preparing of diagnostic serum against infectious canine hepatitis and isolating the immunoglobulin fraction from it for sensitization the carrier for the latex agglutination reaction allows to get antibody preparations with activity in the diffusion precipitation reaction of 1:4-1:8, complement fixation test 1:8-1:16. Hyperimmune serum obtained by this method can be successfully used in getting diagnostic preparations, which are aimed to detect a virus-specific antigen in samples of organs and tissues, feces and washouts from the oral and nasal cavities of sick and dead animals.

Keywords: infectious canine hepatitis, hyperimmunization, diagnostics, precipitation reaction, complement fixation test.