СЕНСИБИЛИЗАТОР ДЛЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОГО РАЗРУШЕНИЯ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК
SENSITIZER FOR PHOTODYNAMIC DESTRUCTION OF TUMOR CELLS

Изобретение относится к фармацевтической химии и онкологии, а именно к соединениям для фотодинамического разрушения злокачественных клеток.
A61K31/40,
С09В47/00
60
38
4
12
4
Известен сенсибилизатор для фотодинамического разрушения клеток злокачественных новообразований [RU 2071320 C1, МПК (1995.01)  (1995.01), опубл. 10.01.1997], который представляет собой сульфированный тетрафенилтетрабензопорфин общей формулы СНNOS, оказывающий терапевтический эффект при облучении криптоновым лазером с длиной волны 675 нм в течение 15 минут.
A61K31/409, A61K9/10, A61N5/067, A61P35/00, C07D487/22, B82B1/00
38
46
6
6
Известен фотосенсибилизатор  [RU 2411943 C2, МПК (2006.01) , опубл. 20.10.2010], представляющий собой наноструктурированную водную дисперсию на основе производного бактериохлорина p, который представляет собой метиловый эфир O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина p CHNO. Наноструктурированная водная дисперсия представляет собой липосомальную дисперсию на основе лецитина и холестерина, а метиловый эфир O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р включен в липидный бислой липосом. Терапевтический эффект реализуется при облучении патологического участка оптическим излучением в спектральном диапазоне 790-810 нм.
A61K31/40, A61K41/00, A61P35/00, A61P31/04
Известен фотосенсибилизатор для лечения онкологических заболеваний, который содержит соль хлорин е6, N-метил-D-глюкамином (меглумин) и L-лизин в мольных соотношениях 1:2:1 [RU 2646477 C1, МПК (2006.01) , опубл. 05.03.2018], проявляющий активность под воздействием лазера с длиной волны 662 нм.
Техническим результатом изобретения является расширение арсенала средств для фотодинамического разрушения опухолевых клеток.
В качестве сенсибилизатора для фотодинамического разрушения опухолевых клеток предлагается 1-(1-(4-нитрофенил)этил)-2,4,6-трифенил-1,4-дигидро-1,2,4,5-тетразин-3(2H)-он со структурной формулой:
На фиг. 1 показана жизнеспособность опухолевых клеток после фотодинамического воздействия в присутствии фотосенсибилизатора.
Для получения предложенного сенсибилизатора в двугорлую круглодонную колбу объемом 100 мл внесли 76 мг обескислороженной суспензии порошка меди и 86 мг бромида меди (I) в 30 мл бензола, а затем добавили 125 мкл N,N,N′,N′′,N′′-пентаметилдиэтилентриамина. К полученной смеси добавили обескислороженный раствор, полученный растворением 327 мг 1,3,5-трифенилвердазильного радикала и 276 мг 1-(1-бромоэтил)-4-нитробензола в 20 мл бензола.
Полученную реакционную массу кипятили 8 часов с обратным холодильником Димрота в атмосфере аргона, который подавали из линии Шленка. После охлаждения на воздухе до комнатной температуры полученную реакционную массу пропустили через 3 см слоя силикагеля, а затем силикагель дополнительно промыли 15 мл бензола для полного переноса продукта в маточник. Полученный маточный раствор упарилив вакууме в круглодонной колбе с помощью ротационного испарителя до 3-4 мл итогового раствора. После этого в колбу с концентрированным раствором добавили 50 мл гексана для осаждения продукта. Выпавший продукт отфильтровали на фильтре Шотта, присоединенного к колбе Бунзена под абсолютным давлением 800 мбар, промыли гексаном 100 мл и сушили на воздухе в темноте.
28
23
5
3.
В результате получили продукт массой 382 мг (что составило 80% от теоретического выхода), который представляет собой кристаллическое вещество бледно-желтого цвета с формулой CHNO
Оценку фотосенсибилизирующих свойств заявляемого соединения проводили по уровню жизнеспособности опухолевой клеточной культуры при световом воздействии с длиной волны 395-410 нм.
В качестве тестовой клеточной линии использовали опухолевую культуру клеток MCF-7 (адгезивная линия рака молочной железы человека). Клетки засевали в 96-луночный планшет в концентрации 5000 клеток в лунке в полной питательной среде DMEM/F12 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и смеси антибиотиков (пенициллин 50 ед/мл и стрептомицин 50 мкг/мл). Далее клетки инкубировали в течение 24 часов при 37°С в среде 5% углекислого газа. После адгезии клеток и микроскопического подтверждения жизнеспособности культуры, клетки использовали для оценки фотосенсибилизирующих свойств. Для этого готовили серию из 6 полных питательных сред DMEM/F12 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, смеси антибиотиков (пенициллин 50 ед/мл и стрептомицин 50 мкг/мл) и предложенного сенсибилизатора. Концентрация сенсибилизатора в среде была 50, 25, 12, 6, 3 и 1,5 мкг/мл.
в
2
Питательную среду в лунках заменили на приготовленные среды, содержащие сенсибилизатор в соответствующих концентрациях. В качестве контрольной группы использовали лунки с опухолевыми клетками, в которых среду меняли на среду, не содержащую сенсибилизатор. После этого планшет подвергали световому воздействию течение 20 минут. Источник излучения: светодиодная матрица, состоящая из 5 столбцов по 7 светодиодов в столбце с расстояниями между диодами 18 мм в рядах и столбцах, сила света каждого диода 1 Кд, диапазон излучения 395-410 нм. Расстояние от светодиода до лунки с опухолевыми клетками – 2 см. После облучения планшеты помещали в СО инкубатор при 37°С в среде 5% углекислого газа на 48 часов. Далее проводили оценку жизнеспособности опухолевых клеток с помощью МТТ-теста.
2
Для МТТ-теста из каждой лунки удаляли питательную среду и вносили 100 мкл раствора MTT-реагента (бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия) в питательной среде, затем планшеты помещали в СО инкубатор при 37°С на 4 часа. После этого из планшетов снова удаляли среду, и в каждую лунку для растворения образовавшихся кристаллов формазана было добавлено по 100 мкл диметилсульфоксида. После этого проводили оценку оптической плотности образцов с помощью микропланшетного ридера (MULTISCAN FC) при длине волны 570 нм.
Жизнеспособность клеток рассчитывали по формуле:
обр
пуст
контр
пуст
жизнеспособность, % = ((ОП– ОП)/(ОП– ОП)) ⋅ 100,
обр
где ОП– средняя оптическая плотность образцов с внесенным сенсибилизатором;
пуст
ОП – средняя оптическая плотность среды без опухолевых клеток;
контр
ОП– средняя оптическая плотность опухолевых клеток, не подвергавшихся воздействию сенсибилизатора.
Результаты определения уровня жизнеспособности культуры клеток MCF-7 после фотодинамического воздействия с использованием предложенного сенсибилизатора и контрольной группы представлены на фиг. 1.
Наблюдается дозозависимое снижение жизнеспособности опухолевых клеток при воздействии облучения в присутствии сенсибилизатора. Процент жизнеспособных клеток после фотодинамического воздействия с сенсибилизаторомв концентрациях 50-1,5 мкг/мл статистически значимо ниже уровня контроля (p<0,001).