СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ЯГЕЛЬ-М, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫМ ДЕЙСТВИЕМ
METHOD FOR MAKING PREPARATION OF JAGEL-M WITH ANTITUBERCULOUS ACTION

Изобретение относится к биофармацевтической промышленности, а именно к производству биопрепаратов противотуберкулезного действия. Использование механохимической технологии в технологическом цикле производства антибактериального препарата из слоевищ лишайников на стадии обработки сухого сырья и последующая водно-спиртовая экстракция позволяют выделять более полную группу природных веществ антибиотического действия (ПВАД).
Лишайники из рода кладина (Cladonia) - лекарственные растения, используемые в народной медицине для лечения многих заболеваний. В слоевищах лишайников содержится до 80% углеводов, половина которых представлена гомополисахаридом лихенином, а также изолехинином, обладающими как иммуномодулирующими, противоопухолевыми, так и гепатопротекторными свойствами
Известно об использовании лишайников в качестве антибиотического средства. Так, противомикробная антибиотическая активность в отношении стафилококков, стрептококков, кислоустойчивых микроорганизмов, грибов, простейших и вирусов обусловлена наличием в слоевищах лишайниковых кислот [Галицкий Л.А. и др. // Пробл. туб. - 1997. - №4. - С.35-38], прежде всего, усниновой кислоты (рис.) и ее производных [Горшкова Р.П. и др. // Биоорган. химия. - 1997. - Т.23, №2. - С.1324-1328].
Рис. Общая формула усниновых кислот.
Полученная из лишайников усниновая кислота в виде уснината натрия была предложена под названием «Бинан» для медицинского использования и применялась в качестве наружного средства для лечения ран, ожогов, трещин и в гинекологии. С появлением синтетических и полусинтетических антибиотиков препарат был снят с производства [Телятьев В.В. Полезные растения Центральной Сибири. - Иркутск. - 1987. - С.21-22].
Наиболее близким аналогом к предлагаемому изобретению (прототипом) является противотуберкулезный препарат с широким спектром фармакологического действия «Ислацет» (сухой экстракт из слоевищ цетрарии исландской), обладающий общеукрепляющим, противовоспалительным, противомикробным, антигипоксическим, иммуномодулирующим, гепатопротекторным, антиоксидантным действием [Витовская М.Л. и др. Роль ислацета (экстракта из слоевищ цетрарии исландской) в комплексной терапии экспериментального туберкулеза // Проблемы туберкулеза и болезней легких: ежемесячный научно-практический журнал /Российское общество фтизиатров (М). - 2005. - N11. - С.44-47; Пат.№2203081 РФ Препарат ислацет для профилактики и лечения туберкулеза и способ его получения./ Лесиовская Е.Е. и др.}.
Техническим эффектом изобретения является антибактериальное действие препарата ЯГЕЛЬ-М, характеризующееся повышенной активностью в отношении патогенных микроорганизмов, в первую очередь, микобактерий (туберкулезная палочка).
Эффект достигается тем, что использование механохимической обработки лишайникового сырья в присутствии щелочи приводит к переводу водонерастворимых флавоноидов группы усниновых и других лишайниковых кислот в растворимое состояние.
Сущность изобретения состоит в том, что предэкстракционная обработка сухих слоевищ лишайников с помощью механохимической технологии с добавлением сухой щелочи позволяет выделять более полную группу ПВАД благодаря переходу плохо растворимых в воде и водно-спиртовых смесях ароматических фенолов (рис.) в хорошо растворимые феноляты. Этим обеспечивается максимальное извлечение всего структурного спектра действующих веществ, что также не позволяет формироваться реакции устойчивости микроорганизмов к данному антибиотическому комплексу.
Изобретение может быть реализовано следующим образом.
Высушенные слоевища лишайников рода кладины {Cladonid} подвергают механохимической обработке на шаровой мельнице (например, АГО-2) в присутствии твердой щелочи натрия при 1500 об/мин. Полученную сухую смесь настаивают на 40%-ной водно-спиртовой смеси в течение 7 суток, раствор отделяют от осадка центрифугированием (фильтрацией под давлением) и нейтрализуют до pH 6,9-7,0 лимонной кислотой.
Антибактериальное действие препарата ЯГЕЛЬ-М в отношении условно-патогенных, патогенных микроорганизмов и микобактерий туберкулеза (МБТ) доказано в экспериментах на культурах бактериальных штаммов и беспородных белых мышах по стандартным методикам.
Исследовали влияние
- комплекса лишайниковых ПВАД на культуры бактериальных штаммов восьми условно-патогенных и патогенных микроорганизмов;
- экстракта из слоевищ лишайников на биологические свойства МБТ in vitro, в том числе обладающих лекарственной устойчивостью к противотуберкулезным препаратам (ПТП);
- комплекса лишайниковых ПВАД на течение экспериментального туберкулеза у беспородных белых мышей.
Проведены сравнительные исследования антибактериального действия 40% водно-спиртового экстракта из слоевищ лишайников - без предварительной механохимической обработки (экстракт №1) и препарата ЯГЕЛЬ-М (табл.1).
Показана полная лизирующая способность препарата ЯГЕЛЬ-М в отношении восьми условно-патогенных и патогенных бактериальных штаммов, включая Staphylococus aureus, Klebsiella pneumonia, гемолитическую E.coli и других (табл.1), тогда как экстракт №1 показал высокую эффективность только в отношении Proteus vulgaris. В остальных случаях отмечена, либо едва заметная попытка к лизису, либо микроорганизмы лизировались частично.
В целях изучения антибактериального действия экстрактов лишайников №1 и препарата ЯГЕЛЬ-М на биологические свойства МБТ проведено экспериментальное исследование на клинических штаммах МБТ №691, чувствительный к ПТП, и №742 устойчивый к стрептомицину в концентрации 25 мкг/мл, изониазиду в концентрации 1 мкг/мл, рифампицину 80 мкг/мл (табл.2 и 3).
Определение активности антибактериального действия испытуемых экстрактов лишайника проводили методом серийных разведений на плотных питательных средах в соотношении от 1:1 до 1:512. В качестве питательной среды применяли традиционные питательные яичные среды для выращивания МБТ - Финн-2 (Ф-2). Эффективность антибактериального действия экстрактов лишайников определяли сроками появления первичного, интенсивного и массивности роста культур МБТ.
При действии экстракта №1 на клинические штаммы №691 и 742 в разведениях 1:1, 1:2 и 1:4 отмечалось отсутствие роста микобактерий на средах (бактерицидное действие). В разведении 1:8 происходит задержка начального и интенсивного роста по сравнению с контрольным посевом. Разведение 1:16 оказывает на МБТ умеренное бактериостатическое действие (табл.2 и 3).
Препарат ЯГЕЛЬ-М в разведениях 1:1, 1:2 и 1:4 также оказывает бактерицидное действие на МБТ клинического штамма №691 (табл.4). Разведение 1:8 оказывает бактериостатическое действие. Слабое бактериостатическое действие оказывают разведения 1:16 и 1:32 с задержкой начального и интенсивного роста на 6 дней и ростом до 100 КОЕ по сравнению с контролем. Бактерицидное действие препарата ЯГЕЛЬ-М на клинический штамм №742 наблюдалось в разведениях 1:1, 1:2, 1:4 и 1:8. Начиная с разведения 1:16, происходит задержка начального и интенсивного роста МБТ на 7 и 6 дней соответственно со скудным ростом до 20 КОЕ. Следовательно, препарат ЯГЕЛЬ-М в разведении 1:16 оказывает выраженное бактериостатическое действие на МБТ (табл.5).
Определение специфической активности экстрактов на течение экспериментального туберкулеза проводили на 18 беспородных белых мышах массой 13-16 г, полученных из вивария Якутской республиканской ветеринарно-испытательной лаборатории. Мышей заражали введением под кожу спины взвеси (0,1 мг бактериальной массы в 0,5 мл физиологического раствора) трехнедельной культуры клинического штамма МБТ №238 с множественной лекарственной устойчивостью. Изучаемые экстракты вводили мышам внутрь со дня их заражения.
Все экспериментальные животные были разделены на следующие группы по 6 особей в каждой группе: 1-я группа - зараженные животные (контроль заражения) не получающие лечение; 2-я группа - зараженные животные, получающие экстракт лишайника №1 в разведении 1:8; 3-я группа - зараженные животные, получающие препарат ЯГЕЛЬ-М в разведении 1:8. Продолжительность эксперимента составляла 2,5 месяца, выживших к этому сроку животных умерщвляли.
Основными показателями резистентности животного к туберкулезу являются срок выживаемости после инфицирования и общее состояние животных.
Летальность мышей 1-й группы (контроль заражения), не получавших лечение, составила за период эксперимента 100%. Гибель мышей наблюдалась в сроки от 20 до 73 дней, при этом средняя продолжительность жизни составила 39 дней, что говорит о высокой вирулентности использованной культуры МБТ. Общая потеря массы тела в этой группе составила 32%. У мышей 2-й группы летальность за период эксперимента составила 50% при средней продолжительности жизни 51,5 дня. Общая потеря массы тела в этой группе составила 8%. У мышей 3-й группы, получавших препарат ЯГЕЛЬ-М, летальность составила за период эксперимента 16,6% (в течение эксперимента погибла 1 мышка на 73-й день эксперимента). Общая масса тела животных в этой группе возросла на 2,5 г (на 16-19%).
Таким образом, продемонстрирована очень высокая эффективность препарата ЯГЕЛЬ-М в отношении условно-патогенных и патогенных бактериальных штаммов, включая Staphylococus aureus, Klebsiella pneumonia, гемолитическую E.coli, Salmonella enteridis и др., причем даже их лекарственно устойчивых форм, а также в отношении штаммов микобактерий, чувствительных и устойчивых к противотуберкулезным препаратам. Установлена высокая антимикобактериальная активность препарата ЯГЕЛЬ-М при использовании в лечении экспериментального туберкулеза in vivo, выразившаяся в резком снижении тяжести течения инфекции у мышей, зараженных МБТ.