Недеструктивный способ оценки цитотоксичности наночастиц с использованием микроводоросли Dunaliella salina в качестве биосенсора
NON-DESTRUCTIVE METHOD OF ASSESSING CYTOTOXICITY OF NANOPARTICLES USING A MICROALGA DUNALIELLA SALINA AS A BIOSENSOR

Изобретение относится к области экологической токсикологии и биотехнологии и предназначено для экспресс-оценки цитотоксичности наночастиц различного состава и строения, а также веществ, используемых при их синтезе.
Ежегодно, по оценке ряда исследователей, производится более 75000 тонн различных наночастиц [1]. В связи с этим оценка биобезопасности наноматериалов для здоровья человека и окружающей среды представляется важной задачей. Сложность характеристики их биосовместимости связана с несколькими аспектами. Во-первых, наночастицы вследствие своих физико-химических свойств могут вносить изменения в системы стандартных токсикологических тестов, искажая результаты анализа [2]. Во-вторых, интенсивное развитие технологий синтеза наночастиц требует разработки оперативных методов оценки их токсичности, поскольку использование лабораторных животных для этих целей требует много времени на проведение экспериментов. Необходимым является создание клеточных диагностических тест-систем для предварительной оценки токсичности наночастиц с дальнейшей характеристикой безопасности отдельных материалов в условиях in vivo [3].
Известен способ определения токсичности материалов, в основе которого лежит оценка изменения интенсивности люминесценции генно-инженерного штамма бактерий при воздействии токсикантов, которая регистрируется прибором «Биотокс» [4]. Недостатком данного способа является его непригодность для оценки токсичности люминесцирующих наноматериалов (квантовые точки, флуоресцирующие золотые нанокластеры), так как есть большая вероятность получения ложноотрицательных результатов. Это связано с тем, что данные частицы могут вносить значительный вклад в регистрируемый оптический сигнал. Одним из недостатков также следует считать высокую стоимость производства данного биосенсора из-за использования дорогостоящего процесса лиофилизации.
Известен способ оценки влияния наночастиц бентонита на мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки и мононуклеарные клетки- лимфоциты [5]. По завершению инкубации наночастиц с клетками методом проточной цитофлуориметрии определяют влияние наночастиц на производство активных форм кислорода, образование апоптотических и некротических клеток, функции митохондрий, состояние лизосомального аппарата. Полученные результаты сравнивают с соответствующими показателями контрольных образцов исследуемых клеток.
Известен также способ оценки влияния золотых наночастиц с размером от 2 до 200 нм на клетки Т-лимфобластного лейкоза человека линии Джуркат на основе измерения уровня экспрессии различных генов: Smad, NFKBIB, RNPS1, ACIN1, RAD21, Myc, MycN, Mxd [6].
Данные технические решения предполагают использование клеток животных и человека в качестве тест-объектов при оценке токсичности наночастиц. Токсикологические тесты на животных клетках являются первой линией методов, используемых для оценки потенциальной биобезопасности наночастиц для человеческого организма. Недостаткам данных тестов являются: сложность поддержания культур, высокие требованиями к квалификации оператора, необходимость оборудования специальных помещений для культивирования клеток и высокая стоимостью оборудования.
В свою очередь одноклеточные водоросли являются очень удобными объектами для биотестирования, поскольку обладают высокой чувствительностью к токсикантам и простотой поддержания культур. Их культивирование не требует больших временных и денежных затрат.
Известен способ оценки токсичности наночастиц сульфида цинка с использованием красной микроводоросли Porhyridium cruentum в качестве биосенсора [7]. В качестве критерия токсичности используется содержание малонового диальдегида, которое оценивается в биомассе микроводорослей фотометрически. Таким образом, характеризуется выраженность окислительного стресса в клетках.  Недостатком данного способа является его трудоемкость, необходимость деструкции клеток и экстракции из них малонового диальдегида, что сопряжено со значительными затратами времени и использованием дополнительных реактивов: трихлоруксусной и тиобарбитуровой кислот.
Известен способ оценки цитотоксичности нанопорошков и изделий из наноматериалов по изменению оптической плотности культуры микроводоросли Chlorella vulgaris [8]. Данное техническое решение является наиболее близким аналогом настоящему изобретению. В качестве тест-функции фотометрически регистрируется содержание хлорофилла в суспензиях микроводорослей по абсолютному значению оптической плотности на 680 нм. Длительность экспозиции микроводорослей с токсикантами составляет 22 часа. Недостатком данного способа является неприменимость используемого алгоритма фотометрического мониторинга для оценки содержания хлорофилла в пробах с хромофорными наночастицами. К примеру, плазмонно-резонансные наночастицы золота и серебра могут за счет агрегации и хроматических изменений трансформировать спектр экстинкции культуры микроводорослей, искажая результаты анализа. К недостаткам способа можно отнести тот факт, что анализ проводится с использованием 50 мл колб Эрленмейера. Это существенно повышает расход токсиканта и время выполнения теста.
Недостатком вышеперечисленных способов является также неприменимость используемых в них видов микроводорослей для экстраполяции результатов токсикологического теста на клетки человека и млекопитающих. Такие микроводоросли как Porhyridium и Chlorella характеризуются наличием ригидной целлюлозной клеточной стенки, что существенным образом изменяет их отклик на воздействие наночастиц по сравнению с животными клетками [9].  Некоторые авторы полагают, что микроводоросли рода Dunaliella, вследствие отсутствия жесткой клеточной стенки, обладают сходством с животными клетками в отношении механизма взаимодействия с наноматериалами. Так, было показано, что чувствительность культур Dunaliella salina на воздействие серебряных наночастиц на порядок отличалась от культур микроводоросли Chlorella autotrophica, обладающей типичным морфологическим строением [10].
Задачей настоящего изобретения является разработка способа недеструктивной фотометрической оценки цитотоксичности наночастиц любого типа, включая хромофорные наночастицы, в формате миниатюризованного теста с использованием культур микроводоросли Dunaliella salina в качестве биосенсора.
Техническим результатом данного изобретения является повышение информативности и воспроизводимости токсикологического теста с наночастицами, упрощение аналитической процедуры, снижение расхода токсиканта и времени выполнения теста.
6
680
680
0
680
680
0
48
48
>50%
<50%
>50%
<50%
<50%
<50%,
48
>50%
<50%
>50%
<50%
Технический результат достигается благодаря тому, что способ оценки цитотоксичности наночастиц заключается в недеструктивной фотометрической оценке содержания хлорофилла в суспензиях культур микроводоросли Dunaliella salina, включающий культивирование микроводоросли Dunaliella salina с использованием питательной среды Бен-Амотца, разведение токсиканта культуральной средой Бен-Амотца, подготовка проб путём внесения культуры микроводоросли Dunaliella salina в разведенный токсикант таким образом, чтобы посевная доза составила 10 клеток/мл, триплицирование проб, инкубирование проб в течение 48 часов, фотометрическое измерение суспензий культур Dunaliella salina in vivo путём регистрации экстинкции на трех длинах волн: 640, 680 и 740 нм, вычисление высоты пика поглощения хлорофилла, расчет значения эффективности токсического действия по формуле Eff = (1 - AC / AC) × 100, где Eff- величина эффективности токсического действия, %; AC – значение величины пика поглощения хлорофилла in vivo в экспериментальной пробе; AC – значение величины пика поглощения хлорофилла in vivo в контрольной пробе, расчет значения полуэффективной концентрации токсиканта EC50 методом линейной интерполяции по формуле EC50= ((C- С) / (Eff - Eff)) Ч (50 - Eff) + Cгде EC50 – полумаксимальная эффективная концентрация токсиканта, мг/л; С – значение концентрации токсиканта, давшее более 50 % эффекта, мг/л; С – значение концентрации токсиканта, давшее менее 50 % эффекта, мг/л; Eff значение эффективности действия более 50 %; Eff– значение эффективности действия менее 50%.
Заявляемое изобретение иллюстрируется чертежами.
Фиг. 1 - Схема работы микропланшетной тест-системы.
Фиг. 2 - Спектры экстинкции суспензий D.salina, зарегистрированные через 48 часов после инкубации со стоковым раствором 3 нм фосфониевых золотых наночастиц (ФЗНЧ-3)в концентрациях 0 (1), 40 (2) и 100 (3) мг Au/л.
Фиг. 3 - Спектры экстинкции суспензий D.salina, зарегистрированные через 48 часов после инкубации со стоковым раствором 15 нм фосфониевых золотых наночастиц (ФЗНЧ-15) в концентрациях 0 (1), 40 (2) и 100 (3) мг Au/л.
Фиг. 4 - Фотометрическая оценка эффективности токсического действия ФЗНЧ-3 и ФЗНЧ-15 при 48-часовой экспозиции с культурами D.salina.
3
4
2
3
2
2
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
4
2
4
В предложенном способе оценки цитотоксичности наночастиц в качестве биосенсора используют альгологически чистые культуры микроводоросли D. salina из коллекции культур Института физиологии растений РАН. Для периодического культивирования микроводоросли культивируют в лабораторных условиях с использованием питательной среды Бен-Амотца состава: NaCl, 1,5 M; NaHCO, 50 мМ; MgSO ×7HO, 5 мМ; KNO, 5 мМ; CaCl × 2HO,0,3 мМ; KHPO × 3HO, 0,2 мМ; ЭДТА, 30 мкМ; MnSO ×5HO, 7 мкМ; FeSO, 2 мкМ; CuCl, 1 мкМ; ZnSO × 7HO, 1 мкМ; СoSO, 1 мкМ; (NH)MoO, 1 мкМ. Каждые два дня для сохранения экспоненциальной стадии роста и повышения однородности культуру пересевают на свежую среду. Для постановки токсикологического эксперимента используют только синхронизированную культуру после трех последовательных пассажей. При поддержании культуры периодически осуществляют микроскопический мониторинг ее морфофизиологических характеристик. В токсикологическом тесте следует использовать только физиологически активную культуру. Диагностические критерии такого состояния клеток следующие: эллипсоидная и яйцевидная форма клеток; высокая клеточная подвижность; распределение микроводорослей во всей толще среды; отсутствие больших скоплений клеток (пальмеллоидных образований).
6
Предложенный способ реализуется следующим образом. На первом этапе в лунках 96-луночного  полистиренового микропланшета готовят разведения токсиканта культуральной средой Бен-Амотца. Затем в лунки вносят культуру D.salina таким образом, чтобы посевная доза составила 10 клеток/мл. Каждая проба триплицируется. Конечный объем образца в лунке составляет 200 мкл.
На втором этапе микропланшет с пробами инкубируют в течение 48 часов. Культивирование осуществляют в ламинарном шкафу при постоянном освещении и температуре.
На третьем этапе после 48 – часовой экспозиции в пробах фотометрически оценивают содержание хлорофилла по высоте пика поглощения в красной спектральной области. Проводят фотометрические измерения суспензий культур D.salina in vivo, регистрируя экстинкцию на трех длинах волн: 640, 680 и 740 нм. Затем в каждой пробе вычисляют высоту пика поглощения хлорофилла, скорректированного на светорассеяние. Согласно полученным результатам, данный оптический параметр значительно коррелирует с содержанием хлорофилла в спиртовых экстрактах и количеством клеток микроводорослей [11].
680
680
740
640
740
640,
680
740
Высота пика поглощения хлорофилла в области 665-680 нм в суспензиях культур микроводорослей in vivo и экстрактах тех же культур отражает его содержание, поскольку в красной спектральной области у микроводорослей поглощает только данный пигмент. Фактором, затрудняющим интерпретацию значений высоты пика поглощения in vivo является светорассеяние, которое вносит неконтролируемый вклад в изменение значения экстинкции. Поэтому в алгоритме расчета делают коррекцию на светорассеяние.  Расчет ведут по формуле A = (E– E) – 0.6(E– E), где E E и E– усредненные значения экстинкции на длинах волн: 640, 680 и 740 нм. Таким образом, значение поглощения хлорофилла, определяемое под данному алгоритму in vivo, коррелирует со значением поглощения хлорофилла, рассчитываемым в экстрактах культур.
Высота пика поглощения хлорофилла in vivo в суспензиях культур коррелирует с количеством клеток микроводорослей, поскольку хлорофилл является основным пигментом микроводорослей и его содержание непосредственно связано с количеством их биомассы.
На основании значений поглощения хлорофилла в каждой экспериментальной пробе рассчитывают значение эффективности токсического действия по формуле:
680
680
0
Eff = (1 - AC / AC) × 100,
где
Eff- величина эффективности токсического действия, %;
680
AC – значение величины пика поглощения хлорофилла in vivo в экспериментальной пробе;
680
0
AC – значение величины пика поглощения хлорофилла in vivo в контрольной пробе.
48
Далее на основании значений эффективности токсического действия методом линейной интерполяции рассчитывают значение полуэффективной концентрации токсиканта EC50 по формуле:
48
>50%
<50%
>50%
<50%
<50%
<50%
EC50= ((C- С) / (Eff - Eff)) Ч (50 - Eff) + C,
48
>50%
<50%
>50%
<50%
где EC50 – полумаксимальная эффективная концентрация токсиканта, мг/л; С – значение концентрации токсиканта, давшее более 50 % эффекта, мг/л; С – значение концентрации токсиканта, давшее менее 50 % эффекта, мг/л; Eff значение эффективности действия более 50 %; Eff– значение эффективности действия менее 50%.
Изобретение иллюстрируется примерами.
Пример 1: Фотометрическое измерение поглощения хлорофилла в суспензиях культур D.salina
Используются следующие реагенты, расходные материалы и приборы: Накопительная 3-дневная культура микроводоросли D. salina; культуральная среда Бен-Амотца; автоматическая одноканальная пипетка на 200 мкл; плоскодонный 96-луночный планшет, планшетный спектрофотометр Spark 10M (Tecan, Австрия).
Этап 1- Приготовление серии разведений культуры D. salina
Перемешать культуру D.salina пипетированием. В лунки A1-A3 планшета одноканальной пипеткой внести по 200 мкл суспензии исходной культуры. В лунках блока B1-D3 развести исходную культуру в 2, 4 и 8 раз средой Бен-Амотца таким образом, чтобы конечный объем в каждой лунке составил 200 мкл. Каждое разведение делать в трех повторностях. Протокол разведений приведен в таблице 1.
Таблица 1.
Протокол разведений суспензий D. salina
Наименование лунок
Вносимый объём суспензии исходной  культуры D. salina, мкл
Вносимый объем культуральной среды Бен-Амотц, мкл
A1-A3
200
0
B1-B3
100
100
C1-C3
50
150
D1-D3
25
175
Этап 2- Фотометрические измерения суcпензий культур D.salina
Поместить планшет в спектрофотометр. Провести регистрацию спектров экстинкции в режиме кинетики сканирования после 7-минутной темновой паузы в диапазоне длин волн 400-800 нм с шагом 1 нм, спектральной шириной щели 3,5 нм, тремя циклами с 3-х минутным интервалом.
680
Этап 3. Расчет показателя поглощения хлорофилла A
680
680
740
640
740
640,
680
740
Для каждой длины волны вычислить среднее значение экстинкции по временам измерений.  Вычислить средние значения экстинкции по 5 длинам волн в окрестностях точек 640 нм (638,639,640,641, 642 нм), 680 нм (678,679, 680, 681, 682 нм), 740 нм (738,739,740, 741, 742 нм).  Рассчитать показатель поглощения хлорофилла по формуле: A = (E-E) -(E-E) ×0,6, где E E и E–  усредненные значения экстинкции на длинах волн: 640, 680 и 740 нм.
Пример 2: Оценка цитотоксичности 3 нм и 15 нм золотых наночастиц с использованием микропланшетной тест-системы
Используются следующие реагенты, расходные материалы и приборы: стоковый раствор 3 нм фосфониевых золотых наночастиц (ФЗНЧ-3) с конечной концентрацией 1 г Au/л, стоковый раствор 15 нм фосфониевых золотых наночастиц (ФЗНЧ-15) с конечной концентрацией 1 г Au/л, 3-дневная культура D.salina в экспоненциальной стадии роста, культуральная среда Бен-Амотца, 96-луночный плоскодонный микропланшет, планшетный спектрофотометр Spark 10M (Tecan, Австрия), ламинарный шкаф; люминесцентные лампы ЛЛ-12/16 Вт (IEK,Россия) (2 штуки), ртутный термометр.
Этап 1- Подготовка тестовой культуры D.salina к эксперименту
680
6
В 15 мл пластиковой пробирке развести накопительную 3-дневную культуру D.salina культуральной средой Бен-Амотца таким образом, чтобы показатель поглощения хлорофилла Aв нейсоставлял порядка 0,06, что соответствует числовой концентрации 2 × 10 кл/мл.
Этап 2- Приготовление концентрационных рядов токсикантов
В лунках микропланшета блока A1-H6 приготовить вертикально ориентированные концентрационные ряды токсикантов ФЗНЧ-3 и ФЗНЧ-15  диапазона: 10,20,30,40,60,80,100 мг Au/л. С этой целью сделать разведения стоковых растворов наночастиц культуральной средой Бен-Амотца и тестовой культурой микроводорослей. Каждую пробу триплицировать.   Протокол разведений токсикантов приведен в таблице 2.
Таблица 2
Протокол приготовления разведений токсикантов
Номер ряда
Добавляемый в лунку  объем стокового раствора наночастиц, мкл
Добавляемый в лунку объем культуральной среды Бен-Амотца, мкл
Добавляемый в лунку объем суспензии культуры D.salina, мкл
Конечная концентрация токсиканта в лунке, мг Au/л
A1-A6
20
80
100
100
B1-B6
16
84
100
80
C1-C6
12
88
100
60
D1-D6
8
92
100
40
E1-E6
6
94
100
30
F1-F6
4
96
100
20
G1-G6
2
98
100
10
H1-H6
0
100
100
0
Этап 3. Экспозиция клеток микроводорослей с токсикантами
-2
-1
Инкубировать микропланшет с пробами в ламинарном шкафу в течение 48 часов при постоянном освещении двумя люминесцентными лампами, создающими поток фотонов 80-100 мкмоль×м×с. Расстояние от крышки планшета до ламп должно составлять 10-11 см. Поддерживаемая температура воздуха должна составлять 23±2 °С. Мониторинг температуры осуществлять ртутным термометром, который помещается рядом с планшетом.
680
Этап 4. Фотометрические измерения суспензий D.salina и расчет значений A.
680
680
740
640
740
Поместить планшет в спектрофотометр. Провести регистрацию спектров экстинкции в режиме кинетики сканирования после 7-минутной темновой паузы в диапазоне длин волн 400-800 нм с шагом 1 нм, спектральной шириной щели 3,5 нм, тремя циклами с 3-х минутным интервалом. Рассчитать во всех пробах показатель поглощения хлорофилла по формуле: A = (E-E) -(E-E) ×0,6.
Этап 5. Расчет значений эффективности токсического действия
680
680
0
680
680
0
На основании значений показателя поглощения хлорофилла рассчитать величину эффективности токсиканта для каждой экспериментальной пробы по формуле: Eff= (1-(AC/AC)) Ч100, где Eff- величина эффективности токсического действия, %; AC – значение величины поглощения хлорофилла в экспериментальной пробе; AC – значение величины поглощения хлорофилла в контрольной пробе.
48
Этап 6. Расчет полумаксимальной эффективной концентрации токсиканта (EC50)
48
48
>50%
<50%
>50%
<50%
<50%
<50%
48
>50%
<50%
>50%
<50%
Рассчитать показатели EC50 для токсикантовв окрестностях Eff =50 по формуле: EC50=((C-С)/(Eff - Eff)) Ч (50- Eff)+C, где EC50 – полумаксимальная эффективная концентрация токсиканта, мг/л; С – значение концентрации токсиканта, давшее более 50 % эффекта, мг/л; С – значение концентрации токсиканта, давшее менее 50 % эффекта, мг/л; Eff значение эффективности действия более 50 %; Eff– значение эффективности действия менее 50%.
48
На фиг. 2 и 3 представлены изменения спектров экстинкции in vivo при инкубации культур D.salina c препаратами ФЗНЧ-3 и ФЗНЧ-15 в течение 48 часов. На фиг. 4 представлена диаграмма, отражающая фотометрическую оценку эффективности токсического действия наночастиц.  Концентрация золота 100 мг Au/л вызывает гибель всех клеток при 48-часовой экспозиции с ФЗНЧ-3, о чем свидетельствует отсутствие характеристического пика поглощения хлорофилла в красной спектральной области.  При концентрации 40 мг Au/л ФЗНЧ-15 величина пика составляет 40 ± 3 % от контрольного значения.  Рассчитанное для ФЗНЧ-3 значение EC50 составляет 25,7 ± 0,3 мг Au/л. Напротив, экспозиция культур D.salina c 15 нм фосфониевыми золотыми наночастицами не вызывала существенного токсического эффекта, поэтому рассчитать для них значение EC50 не представлялось возможным.
1. Piccinno F., Gottschalk F., Seeger S., Nowack B. Industrial production quantities and uses of ten engineered nanomaterials in Europe and the world // J. Nanopart. Res. – 2012. – V. 14. – P. 1109.
2. Selk H., Handy R.D., Fernandes T.F., Klaine S.J., Petersen E.J. Nanomaterials in the aquatic environment: A European Union –United States perspective on the status of ecotoxicity testing, research priorities and challenges ahead // Environ. Toxicol. Chem. – 2016. –V. 35. – P. 1055-1067.
3. Joris F., Manshian B.B., Peynshaert K., De Smedt S.C., Braeckmans K., Soenen S.J. Assessing nanoparticle toxicity in cell-based assays: influence of cell culture parameters and optimized models for bridging the in vitro –in vivo gap // Chem. Soc. Rev. – 2013. – V. 42. – P. 8339-8359.
4. Методика определения токсичности химических веществ, полимеров, материалов и изделий с помощью биотеста "Эколюм", MP от 15.06.2007 N 01.018-07).
5. Пат. RU 2460997 C1.
6. Пат. US № 20100279289.
7. Пат. MD № 4200B1
8. Методика определения индекса токсичности нанопорошков, изделий из наноматериалов, нанопокрытий, отходов и осадков сточных вод, содержащих наночастицы, по изменению оптической плотности тест-культуры водоросли хлорелла, от 14.05.2010, ФР 1.39.2010.09103.
2
9.  Sendra M., Yeste P.M., Moreno-Garrido I., Gatica J.M., Blasco J. CeO NPs, toxic or protective to phytoplankton? Charge of nanoparticles and cell wall as factors which cause changes in cell complexity // Sci Total Environ. – Vol. 590-591. – P. 304-315.
10.  Yue Y., Li X., Sigg L., Suter M., Pillai S., Behra R., Schirmer  K. Interaction of silver nanoparticles with algae and fish cells: a side by side comparsion // J. Nanobiotechnol. –Vol. 15. – doi: 10.1186/s12951-017-0254-9.
11.  Чумаков Д.С., Голубев А.А., Дыкман Л.А., Хлебцов Н.Г., Богатырев В.А. Оптическая оценка жизнеспособности микроводорослей Dunaliella salina при токсикологическом тестировании // Коллоидный журнал. –Т. 79, № 6. –C. 808-812.