Неинвазивная диагностика резус<принадлежности плода по крови матери на ранних сроках беременности

НЕИНВАЗИВНАЯ ДИАГНОСТИКА РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ПЛОДА ПО КРОВИ МАТЕРИ НА РАННИХ СРОКАХ БЕРЕМЕННОСТИ

Н.И. Федорова, Н.К. Тетруашвили, Л.З. Файзуллин, В.Н. Карнаухов, Д.В. Амбрумянц, В.М. Сидельникова,

Г.Т. Сухих

ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова Росмедтехнологий» ул. академика Опарина, 4, Москва, Россия, 117997

Целью проведенного исследования явилось неинвазивное определение резус-фактора плода у резус-отрицательных беременных женщин в сроках от 13 до 20 недель. Произведено исследование плазмы периферической крови 74 женщин, определение RhD гена плода осуществляли с помощью метода ПЦР в реальном времени. Согласно полученным результатам в 43 случаях кровь плода была определена как резус-положительная и во всех наблюдениях этот результат подтвердился после обследования крови новорожденного в иммунологическом тесте (специфичность 100%). В 31 наблюдении кровь плодов была определена как резус-отрицательная и после родов у 30 новорожденных этот результат подтвердился при обследовании крови иммунологическим методом (чувствительность — 96,8%). Таким образом, предложенная технология позволяет неинвазивным способом устанавливать резус-принадлежность плода, что дает возможность снизить затраты на ведение беременности, избежать многократного определения резус-антител, не проводить профилактику резус-иммунизации. У резус-сенсибилизированных женщин применение этой технологии позволяет на ранних сроках оценить риск развития резус-конфликта, своевременно начать проведение лечебно-профилактических мероприятий, а в случае резус-отрицательной принадлежности крови плода избежать инвазивных процедур.

Иммунологическая несовместимость плода и матери по резус-фактору является основной причиной гемолитической болезни новорожденного [1, 2, 7]. До 95% всех клинически значимых случаев гемолитической болезни плода обусловлены несовместимостью по Rh-фактору. Сенсибилизация резус-отрицательной матери резус-положительными эритроцитами плода в 1% случаев может происходить в процессе беременности и в 10% случаев — после родов при поступлении плодовой крови в материнский кровоток [2, 7]. У Rh-отрицательной женщины при беременности от резус-положительного мужчины в 55—60% случаев плод является резус-положительным. В связи с тем, что из резус-положительных мужчин 60% являются гетерозиготными, а 40% — гомозиготны по резус-фактору, согласно акушерским рекомендациям беременность резус-отрицательной женщины от резус-положительного мужчины следует вести как беременность резус-положительным плодом [3, 7]. Для предотвращения резус-сенсибилизации матери используют анти-резус-иммуноглобулины. В настоящее время в мире принята тактика введения анти-резус-иммуноглобулинов всем резус-отрицательным женщинам при резус-положительной крови супруга с 28 по 34 неделю беременности [1,

2, 7], что позволяет снизить риск иммунизации на 80%. В то же время при наличии резус-отрицательного плода эта профилактическая мера, связанная с введением белкового препарата (анти-КЪоф) иммуноглобулина), является бесполезным, небезопасным и дорогостоящим мероприятием.

В этой связи пренатальное определение резус-фактора плода неинвазивным методом позволит избежать ненужного медикаментозного лечения при наличии резус-отрицательного плода и назначать профилактическое введение анти-КЬоф) иммуноглобулина только при положительной резус-принадлежности плода [8].

Другим клиническим аспектом является необходимость определения резус-фактора плода у женщин с наличием резус-иммунизации в течение предыдущих беременностей и высоким титром антител, которые являются анамнестическими. В такой ситуации титр резус-антител не может быть критерием тяжести гемолитической болезни плода, более того, он может нарастать даже при отрицательной резус-принадлежности плода в течение данной беременности. Определение резус D гена в таком случае является исключительно важным, так как помогает избежать инвазивных процедур (амниоцентеза, кордоцентеза) для оценки степени тяжести гемолитической болезни плода при высоких титрах антител и отрицательном резус-факторе плода.

В настоящее время в мировой науке предпринимаются попытки определения в крови матери ДНК эмбрионального и фетального происхождения [5, 6]. Так как в геноме резус-отрицательных людей полностью отсутствует участок ДНК с геном для RhD-антигена, выявление в крови резус-отрицательной беременной этой ДНК однозначно указывает на резус-положительную кровь плода.

Цель проведенного исследования: определить возможность неинвазивного определения резус-фактора плода у резус-отрицательных беременных женщин в сроках от 13 до 20 недель.

Материалы и методы. Материалом для исследования служила плазма периферической крови 74 беременных с резус-отрицательной кровью в сроках геста-ции от 13 до 20 недель.

В исследование вошли первобеременные женщины с отсутствием резус-иммунизации (51,4%), повторнобеременные женщины без резус-иммунизации (35,1%) и сенсибилизированные женщины с рождением ребенка с гемолитической болезнью различной степени выраженности (13,5%). Определение RhD гена проводили с помощью метода ПЦР в реальном времени. В качестве праймеров использовали: левый — (F-1): 5'-CCTCTCACTGTTGCCTGCATT-3'; правый — (F-2): 5'-AGT GCC TGC GCG AAC ATT-3'. В качестве зонда использовали зонд 5'-(Fam)-tacgtgagaaacgctcatgacagc-(BHQ1)-3'. Для оценки специфичности определения резус-принадлежности крови методом ПЦР были исследованы 75 образцов донорской крови, резус-принадлежность которых была установлена предварительно иммунологическим методом с использованием гелевых планшет DG Gel ABO/Rh (2D) (GRIFOLS, Испания).

Результаты исследования и их обсуждение. Был определен порог чувствительности выявления ДНК гена RhD, для чего использовались различные раз-

Федорова Н.И. и др. Неинвазивная диагностика резус-принадлежности плода по крови матери...

ведения очищенной ДНК резус-положительного человека с известной ее концентрацией. Результаты, представленные на рис. 1, показывают, что минимальное количество ДНК, которое давало положительный результат на ген RhD, составило 9 пикограмм ДНК, или 2,4 генома в реакционной пробирке, что соответствует 108 пикограмм ДНК, или 33,8 генома на 1 мл крови (рис. 1).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Рис. 1. Амплификация гена RhD на ДНК человека:

1 и 2 — соответственно, контрольные резус-положительная и резус-отрицательная ДНК;

3—12 — резус-положительная ДНК, внесенная в реакционную пробирку в количестве,

4 4 3 3 2 2

соответственно, 610 , 210 , 6,710 , 2,210 , 7,410 , 2,410 , 81, 27, 9 и 3 пикограммы; 13 — маркер молекулярного веса ДНК

Для оценки специфичности определения резус-принадлежности крови методом ПЦР были исследованы 75 образцов донорской крови, резус-принадлежность которых была установлена предварительно иммунологическим методом. Все 43 резус-положительных образцов крови показали положительный результат и при исследовании методом ПЦР. Из 32 образцов резус-отрицательной крови методом ПЦР в 31-м образце также был получен резус-отрицательный результат, а в 1-м — резус-положительный, что соответствует специфичности по отрицательным пробам 98,9%.

Определение эффективности установления резус-принадлежности крови плода по периферической крови матери методом ПЦР проводилось путем обследования 74 беременных с резус-отрицательной кровью. Из них у 43 кровь плода была определена как резус-положительная, и во всех случаях этот результат подтвердился после обследования крови новорожденного в иммунологическом тесте с использованием гелевых планшет DG Gel ABO/Rh (специфичность 100%).

В 31-м случае методом ПЦР кровь плодов была определена как резус-отрицательная и после родов у 30 новорожденных этот результат подтвердился при обследовании крови иммунологическим методом (чувствительность — 96,8%). В одном случае у новорожденного при иммунологическом исследовании кровь

оказалась резус-отрицательная. При повторном исследовании крови этого новорожденного методом ПЦР вновь был получен положительный результат на наличие ДНК гена RhD. По-видимому, в данном случае мы имеем дело с так называемым «слабым» резус-геном, который встречается среди резус-отрицательных женщин в европейской и российской популяциях с частотой 4—5% [4]. Выводы.

Таким образом, предложенная технология позволяет неинвазивным способом с высокой чувствительностью и специфичностью устанавливать резус-принадлежность плода, используя для исследования плазму периферической крови резус-отрицательной женщины в сроках гестации более 13 недель. Кроме того, определение у пациенток резус-отрицательной принадлежности крови плодов позволяет снизить затраты на ведение беременности, избежать многократного определения резус-антител, не проводить профилактику резус-иммунизации. У резус-сенсиби-лизированных женщин применение этой технологии позволяет на ранних геста-ционных сроках оценить риск развития резус-конфликта, своевременно начать проведение лечебно-профилактических мероприятий, а в случае резус-отрицательной принадлежности крови плода избежать инвазивных процедур и оптимизировать ведение беременности.

ЛИТЕРАТУРА

[1] Радзинский В.Е. Руководство к практическим занятиям по акушерству: учеб. пособие / В.Е. Радзинский [и др.]. — М.: Мед. информ. агентство, 2004. — 576 с.

[2] Сидельникова В.М. Гемолитическая болезнь плода и новорожденного / В.М. Сидельни-кова, А.Г. Антонов. — М.: Триада-Х, 2004. — 576 с.

[3] American College of Obstetricians and Gynecologists. Management of alloimmunization during pregnancy. ACOG practice bulletin no. 75, American College of Obstetricians and Gynecologists, Washington, DC. — 2006.

[4] Bianchi D.W. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal Rhesus D: ready for Prime(r) Time / D.W. Bianchi, N.D. Avent, J.M. Costa, C.E. van der Schoot // Obstet. Gynecol. — 2005. — Vol. 106. — № 4. — P. 682—683.

[5] Chitty L.S. SAFE — the Special Non-invasive Advances in Fetal and Neonatal Evaluation Network: aims and achievements / L.S. Chitty, C.E. van der Schoot, S. Hahn // Prenat. Diagn. — 2008. — Vol. 28. — № 2. — P. 83—88.

[6] Hahn S, Recent progress in non-invasive prenatal diagnosis / S. Hahn, X.Y. Zhong, W. Holzgreve // Semin. Fetal. Neonatal. Med. — 2008. — Vol. 13. — № 2. — P. 57—62.

[7] Protocols for High-Risk Pregnancies — Edited by J.T. Queenan, J.C. Hobbins, C.Y. Spong — 4-th Edition — 2005 — 736 p.

[8] Wright C.F. The use of cell-free fetal nucleic acids in maternal blood for non-invasive prenatal diagnosis / C.F. Wright, H. Burton // Hum. Reprod. Update. — 2009. — Vol. 15. — № 1. — P. 139—151.

Федорова Н.И. и др. Неинвазивная диагностика резус-принадлежности плода по крови матери.

NON-INVASIVE PRENATAL DIAGNOSIS: DETECTION RHESUS FACTOR STATUS IN MATERNAL BLOOD OF RHESUS NEGATIVE WOMEN IN EARLY PREGNANCY

N.I. Fedorova, N.K. Tetruashvili, L.Z. Faizullin, V.N. Carnaukchov, D.V. Ambrumianz, V.M. Sidelnikova,

G.T. Sukhikh

Scientific Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology of Federal Agency for High Technologic Medical Aid Oparina str., ap. 4, Moscow, Russia, 117997

The objective of the study was non-invasive prenatal detection fetal rhesus factor status in blood of rhesus negative women during 13—20 weeks of pregnancy. Cell-free fetal DNA were detected in the maternal blood of 74 pregnant women using molecular techniques (real time PCR method). In 43 cases fetal rhesus factor was positive, and these results were confirmed after delivery in all cases (specificity 100%). In 31 cases rhesus factor status was detected as negative, in 30 cases results were confirmed (sensitivity — 96,8%). If future large scale trials are successful it could result in significant savings in the use of anti-D and a reduction in hospital visits for many RhD-negative women. For the clinical management of the pregnancies of alloimmunized women, the development non-invasive detection fetal rhesus factor status makes it possible to evaluate risk of hemolytic disease of the newborn and to avoid invasive procedures in cases of rhesus negative fetuses.