Клональное микроразмножение тополя Сибирского серебристого

СООБЩЕНИЯ

COMMUNICATIONS

УДК 582.572.2: 633.878.32

A.А. Эрст

B.Т. Бакулин

A.A. Erst V.T. Bakulin

КЛОНАЛЬНОЕ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ ТОПОЛЯ СИБИРСКОГО СЕРЕБРИСТОГО CLONAL MICROPROPAGATION OF SIBERIAN SILVER POPLAR

Аннотация. Микроразмножение тополя Сибирского серебристого проводили путем активации развития пазушных меристем. Для получения стерильного растительного материала использовали ступенчатую стерилизацию, что обеспечило 100% выход неинфицированных эксплантов. На этапе микроразмножения оптимальной оказалась среда МС, дополненная Кн 0,25 мг/л и ИУК 0,25 мг/л. Полученные микропобеги успешно укореняли на среде V> МС без регуляторов роста.

Ключевые слова: тополь Сибирский серебристый, размножение in vitro.

Summary. Siberian silver poplar was micropropagated through the activation of axillary meristems. Sterile plant material was obtained using a sterilization step, ensuring 100% uninfected explants. The best effects was obtained on medium MS, supplemented by Kn 0.25 mg / l and IAA 0.25 mg / l. Successful rooting of shoots was achieved on half-diluted MS medium without growth regulators.

Key words: Siberian silver poplar, propagation in vitro.

Представители рода тополь - Populus L. (Salicaceae) широко используются в Западной Сибири для озеленения и создания различного типа защитных насаждений. Однако ассортимент их очень беден и состоит в основном из интродуцентов. Местные виды тополя - P alba и P nigra - редко привлекаются для зеленого строительства, хотя превосходят интродуценты по зимостойкости и не уступают им по интенсивности роста. Причиной этого является трудность размножения их стеблевыми черенками. Поэтому применение альтернативных методов размножения, таких как клональное микроразмножение растений является актуальным для ценных форм сибирских видов тополя.

Опыты по размножению трудно укореняющихся видов и форм тополя методом культуры тканей начаты в прошлом столетии. Довольно успешным оказался эксперимент по размножению триплоидного сорта осины «Astria» (P trémula х P tremuloides), проведенный в Германии. Экспланты были получены от пазушных почек и верхушек порослевых побегов (Fröhlich,

1982). Положительные результаты получены по размножению осины путем стимулирования роста побегов из аксиальных почек (Chalupa, 1983). В эти же годы проведены сравнительные исследования по размножению методом культуры тканей 48 клонов P tremula, P tremuloides и их гибридов различного уровня плоидности. Было выявлено, что образование у эксплантов побегов и корней зависит от места взятия материала (почек, стебля, листьев) на дереве. Обнаружено также, что различные клоны осины обладают неодинаковой способностью регенерировать новые растения (Ahuja, 1983). Путем использования в качестве эксплантов покоящихся почек были размножены другие виды и гибриды тополя (Ahuja, 1987; Dirr, Heuser, 1987; Fröhlich, Weisgerber, 1985). Разработка методик по клональному микроразмножению тополя продолжаются до настоящего времени (Машкина и др., 2010; Agrawal, Gupta, 1991; Haapala et al., 2004; Lee-Stadelmann et al., 1989; Maheshwari, Kovalchuk, 2011; Rutledg, 1988; Ya-dav et al., 2009 и др.). Выявлены возможности размножения трудноукореняющихся тополей с

000<>><Х><>С<><Х><><Х>000<Х><>000<>><Х><><>><Х><><Х>0<><><Х><>С<>0<>><Х>000^^

Центральный сибирский ботанический сад СО РАН, ул. Золотодолинская, 101; 630090, Новосибирск, Россия; e-mail: annaerst@yandex.ru

Central Siberian Botanical Garden, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences, Zolotodolinskaya str., 101; 630090, Novosibirsk, Russia

Поступило в редакцию 13.12.2011 г.

Submitted 13.12.2011

использованием соматического эмбриогенеза (Michler, Bauer, 1991).

В целом, применение технологий клонального микроразмножения, по сравнению с традиционными методами вегетативного размножения, имеет ряд преимуществ: высокий коэффициент размножения; получение в большом количестве вегетативного потомства трудно размножающихся видов; возможность работать круглый год и планировать выпуск растений к определенному сроку; сохранение ценных генотипов растений в культуре in vitro (Высоцкий, 1986). Этот метод дает возможность получать однородное клоновое потомство от взрослых деревьев с ярко выраженными хозяйственно ценными признаками (Байбурина, 1998).

Объектом наших исследований является тополь Сибирский серебристый № 12, полученный в 1980 г. от скрещивания P alba х P bolleana (Бакулин, 1986) (рис. 1). Характеризуется быстрым ростом среди гибридов этой семьи. В 6 лет

Рис. 1. Внешний вид тополя Сибирского серебристого № 12.

высота его 7,4 м, в 20 лет - 20,6 м. Это - стройное декоративное дерево с прямым стволом и узкой кроной. Используется для озеленения. Зимостоек, относительно засухо- и газоустойчив, светолюбив. В благоприятных условиях укоренение зимних стеблевых черенков в открытом грунте максимально достигает 65% (Бакулин, 2005).

Экспериментально установлено, что в процессе вегетации листья тополя Сибирского серебристого проявляют высокую антимикробную активность (Бакулин и др., 2010). Выявлена также антимикробная активность масляных экстрактов его почек в отношении четырех штаммов микроорганизмов, являющихся возбудителями распространенных инфекционных заболеваний. Поэтому гибрид представляет интерес не только для зеленого строительства, но и как потенциальный источник сырья для получения новых антимикробных препаратов (Цыбуля и др., 2011).

Целью нашего исследования является разработка технологии клонального микроразмножения тополя Сибирского серебристого в культуре in vitro. Полученные данные приводятся впервые.

Материалы и методы. Исходным материалом служили пазушные почки одно-двухлетних побегов тополя Сибирского серебристого № 12, взятые на маточной плантации в апреле (рис. 2а).

Работу по клональному микроразмножению проводили по общепринятым методикам (Бутенко, 1964; Калинин и др., 1980).

Для получения культуры тканей и органов, свободных от инфекций, применяли ступенчатую стерилизацию. Выделенные пазушные почки с кусочком стебля стерилизовали в 10%

Рис. 2. Микроразмножение тополя Сибирского серебристого № 12: а) исходный материал - пазушные почки; б) побегообразование на среде МС + Кн 0,25 мг/л + ИУК 0,25 мг/л.

растворе Domestos (10 мин.), затем погружали почки в 70% этанол (3 сек.) и помещали в 0,1% раствор сулемы (20 мин.). По окончании стерилизации почки трижды промывали стерильной дистиллированной водой. Далее удаляли все покровные чешуи и листья, оставляя два наиболее глубоко расположенных листочка, и помещали экспланты на питательную среду.

Основной питательной средой выбрана среда Мурасиге и Скуга (МС) (Murashige, Skoog, 1962). Для индукции побегообразования испытывали следующие регуляторы роста: 6-бензи-ламинопурин (БАП) 1 мг/л, кинетин (Кн) 0,25 мг/л в сочетании с индолилуксусной кислотой (ИУК) 0,25 мг/л. Для укоренения полученных микропобегов использовали V МС.

Экспланты культивировали в следующих условиях: фотопериод - 16/8 часов свет/темнота, освещенность - 2-3 клк, температура — 24±1°С.

Результаты исследований. Применяемый режим ступенчатой поверхностной стерилизации оказался эффективным, выход жизнеспособных неинфицированных эксплантов составил 100%.

Питательная среда МС является одной из наиболее часто используемых сред при культивировании изолированных тканей и органов растений (табл.). Данная среда является хорошо сбалансированной по минеральному составу и выбрана как оптимальная для размножения in vitro многих представителей рода Populus: P xeuramericana (Agrawal, Gupta, 1991), P.xcanescens (Машкина и др., 2010), P angustifolia, P. balsamifera, P. deltoides (Maheshwari, Kovalchuk, 2011; Yadav et al., 2009).

В своей работе мы использовали среду МС, модифицированную по составу регуляторов роста. Как видно из таблицы, в среде МС содержание ауксинов преобладает над цитокининами. Такое соотношение регуляторов роста вызывает в культуре тканей и органов растений каллусооб-разование, что является нежелательным процессом при размножении ценных генотипов, так как может привести к появлению сомаклональных вариантов. При этом отмечено, что изменяя соотношение цитокинин : ауксин в сторону первого компонента, удалось получить высокие коэффициенты размножения путем прямого органогенеза для P deltoides (Yadav et al., 2009), P nigra var. betulifo-lia х P trichocarpa (Lee-Stadelmann et al., 1989).

После перенесения эксплантов тополя Сибирского серебристого на питательные среды, содержащие регуляторы роста, наблюдали распускание почек и начало их роста. Через 2 не-

дели культивирования отмечено развитие и рост дополнительных побегов, а через месяц развившиеся побеги достигали в высоту 3-3,5 см, их делили на части и пересаживали на среды для мультипликации (табл., рис. 2б). Массовое развитие побегов наблюдали на средах, содержащих по 0,25 мг/л Кн и ИУК, коэффициент размножения составил 8,4±1,2 шт./ экспл. На средах с другим цитокинином (БАП) происходило развитие всего 1-3 дополнительных побегов.

Для укоренения микропобегов применяют различные ауксины. Некоторые исследователи при работе с гибридами P.xeuramericana отмечали, что использование ауксинов, в том числе в низких концентрациях, вызывало активное каллусообразование (Agrawal, Gupta, 1991). Важным фактором успешного укоренения является и уменьшение содержания минеральных элементов питательной среды, что вызывает активацию развития корневой системы для обеспечения нормального питания растений. Кроме того, использование уменьшенной концентрации минеральных солей более целесообразно, так как на таких средах (при оптимально подобранной концентрации ауксина) не формируется каллус-ная масса на базальной части микропобега (Ве-чернина, 2004). Для эффективного укоренения полученных микропобегов тополя Сибирского серебристого достаточным оказалось использование безгормональной среды МС с уменьшенным вдвое содержанием макроэлементов. Первые корни появились через 2 недели культивирования, одновременно с развитием корневой системы наблюдали быстрый рост побега.

Заключение. Методы биотехнологии растений все шире применяются в производстве высококачественного посадочного материала хозяйственно важных растений, особенно это актуально для растений с нарушенным процессом воспроизводства (межвидовые гибриды, плохо укореняемые сорта и формы). В результате исследования разработан и оптимизирован метод клонального микроразмножения тополя Сибирского серебристого путем активации развития пазушных меристем. Для получения стерильного растительного материала использовали ступенчатую стерилизацию, что обеспечило 100% выход неинфицированных эксплантов. На этапе микроразмножения оптимальной оказалась среда МС, дополненная Кн 0,25 мг/л и ИУК 0,25 мг/л. Полученные микропобеги успешно укоре -няли на безгормональной среде с уменьшенным вдвое содержанием минеральных элементов.

Таблица

Состав сред, используемых для клонального микроразмножения тополя Сибирского серебристого

Компоненты питательной среды по МС Концентрация, мг/л Среда

для введения в культуру для мультипликации побегов для укоренения побегов

1 2

мшдаз 1650 + + +

КШ3 1900 + + + уменьшенная

СаС12 -2Н20 440 + + + вдвое концентра-

MgSO4 -7Н20 370 + + + ция макросолей

КН2Р04 170 + + +

Н3ВО3 6,2 + + + +

М^04 -4Н20 22,3 + + + +

СоС12  6Н20 0,025 + + + +

С^04  5Н20 0,025 + + + +

г^04 -7Н20 8,6 + + + +

№2Мо04 -2Н20 0,25 + + + +

К1 0,83 + + + + 1

FeSO4 -7Н20 27,8 + + + +

№2ЭДГА -2Н2О 37,3 + + + + +

Тиамин-НС1 0,1 + + +

Пиридоксин-НС1 0,5 + + + + +

Никотиновая кислота. 0,5 + + + +

Мезо-инозит 100 + + +

Глицин 2,0 + + + +

ИУК 2,0 0,25 0,25 -

Кинетин 0,2 0,25 0,25 -

БАП* - - 1,0 1

Сахароза 30000 + + + +

* - компонент среды, не входящий в пропись среды МС (Murashige, Skoog, 1962).

литература

Байбурина Р.К. Микроклональное размножение взрослых деревьев Betula pendula var. carelica Merckl. // Раст. ресурсы, 1998. - Т. 34, вып. 2. - С. 9-21.

Бакулин В.Т. Использование тополя в озеленении промышленных городов Сибири: краткий анализ проблемы // Сибирский экологический журнал, 2005. - Т. 12, № 4. - С. 563-571.

Бакулин В.Т. Новые декоративные гибриды тополя // Известия Сибирского отделения АН СССР. Серия биол. наук, 1986. - № 18, вып. 3. - С. 10-14.

Бакулин В.Т., ЧиндяеваЛ.Н., Цыбуля Н.В. Антимикробная активность листьев тополей и ив (Salicaceae) в Сибири // Проблемы региональной экологии, 2010. - № 6. - С. 60-64.

Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей в физиологии морфогенеза растений. - М., 1964. - 272 с.

Вечернина Н.А. Методы биотехнологии в селекции, размножении и сохранении генофонда растений: монография. - Барнаул, 2004. - 205 с.

Высоцкий В.А. Морфогенез и клональное микроразмножение растений // Культура клеток растений и биотехнология. - М., 1986. - С. 91-102.

Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. - Киев: Наукова думка, 1980. - 320 с.

Машкина О.С., Сиволапов А.И., Табацкая Т.М. Цитогенетическая паспортизация размноженных in vitro клонов тополя сереющего // Генетика, селекция, семеноводство и воспроизводство древесных пород: Матер. Всеросс. науч.-практ. конф., посвящ. 100-летию со дня рождения М.М. Вересина. - Воронеж, 2010. -С. 23-37.

Цыбуля В.Т., Якимова Ю.Л., Бакулин В.Т. Антимикробная активность масляных экстрактов почек некоторых видов и форм тополя // Научно-практический журнал «Вестник ИрГСХА», 2011. - Вып. 44, ч. IV. -С. 136-140.

Agrawal V., Gupta S.C. In vitro plantlet development from explants of 25-year-old trees of Populus x eurame-ricana - a hybrid poplar // Plant Science, 1991. - Vol. 78. - P. 99-105.

Ahuja M.R. In vitro propagation of poplar and aspen // Cell and tissue culture in forestry, 1987. - Vol. 3. -P. 207-223.

Ahuja M.R. Somatic cell differentiation and rapid clonal propagation of aspen // Silvae Genetica, 1983. -Vol. 3, № 3/4. - P. 131-135.

Chalupa V. Rychle vegetativni mnozeni nekterych listnatych lecnichdrevin in vitro // Lesnictvi, 1983. - Sv. 29, № 4. - S. 309-320.

DirrM.A., Heuser C.W. The reference manual of woody plant propagation: from seed to tissue culture // Varsity Press, Athens, GA, 1987. - 239 p.

Fröhlich H.J. Fortschritte bei der vegetativen Vermechrung // Forstarchiv, 1982. - Hf. 1. - S. 3-9.

Fröhlich H.J., Weisgerber H. Research on in vitro techniques within the framework of poplar breeding - results and future trends // Silvae Genetica, 1985. - Vol. 34. - P. 134-137.

Haapala T., Pakkanen A., Pulkkinen P. Variation in survival and growth of cuttings in two clonal propagation methods for hybrid aspen (Populus tremula x P tremuloides) // Forest Ecol. and Management, 2004. - Vol. 193, № 3. - P. 345-354.

Lee-Stadelmann O.Y., Lee S.W., Hackett W.P., Read P.E. The formation of adventitious buds in vitro on micro-cross sections of hybrid Populus leaf midveins // Plant Science, 1989. - Vol. 61. - P. 263-272.

Maheshwari P., Kovalchuk I. Efficient shoot regeneration from intermodal explants of Populus angustifolia, Populus balsamifera and Populus deltoides // New Biotech, 2011. - Vol. 28, № 6. - P. 778-787.

Michler C.H., Bauer E.O. High frequency somatic embryogenesis from leaf tissue of Populus spp. // Plant Science, 1991. - Vol. 77. - P. 111-118.

Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Physiol. Plant, 1962. - Vol. 15, № 2. - P. 473-497.

Rutledg G.B., Douglas G.G. Culture of meristeme tips and micropropagation of 12 commercial of Populus in vitro // Physiol. Plant, 1988. - Vol. 72, № 2. - P. 367-373.

Yadav R., Aror P., Kumar D., KatyalD., Dilbaghi N., Chaudhury A. High frequency direct plant regeneration from leaf, internode and root segments of Eastern Cottonwood (Populus deltoides) // Plant Biotech. Report, 2009. -№ 3. - P. 175-182.