ДЕТЕКЦИЯ НУКЛЕИНОВОКИСЛОТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ-МИШЕНИ В АНАЛИЗЕ С ОТСУТСТВИЕМ ГИБРИДИЗАЦИИ, ЗАВИСЯЩИМ ОТ РАСЩЕПЛЕНИЯ И УДЛИНЕНИЯ ЗОНДИРУЮЩЕГО И МЕТЯЩЕГО ОЛИГОНУКЛЕОТИДА (РТО)

1. Способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты в анализе с PCE-NH (отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения РТО), включающий:
(a) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и зондирующим и метящим олигонуклеотидом (РТО); при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РТО содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РТО;
(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РТО; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО;
(c) гибридизацию фрагмента, высвободившегося из РТО, с захватывающим и матричным олигонуклеотидом (СТО); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО;
(d) осуществление реакции удлинения с использованием продукта со стадии (с) и матричной полимеразы нуклеиновых кислот; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи, комплементарной матричному участку СТО, и образуется удлиненный дуплекс; при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется;
(e) проведение анализа плавления или анализа гибридизации для продукта со стадии (d) в диапазоне температур с гибридизующимся олигонуклеотидом (НО), содержащим гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО; при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется, и СТО и НО образуют гибрид, обеспечивая тем самым получение сигнала, указывающего на присутствие гибрида между СТО и НО; при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то образуется удлиненный дуплекс, препятствующий образованию гибрида между СТО и НО, не обеспечивая тем самым получение сигнала; при этом сигнал обеспечивается посредством (1) метки, соединенной с НО, (2) метки, соединенной с СТО, (3) метки, соединенной с НО, и метки, соединенной с СТО, или (4) интеркалирующей метки; и
(f) детекцию сигнала, указывающего на присутствие гибрида между СТО и НО; при этом присутствие гибрида между СТО и НО указывает на отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом отсутствие гибрида между СТО и НО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
2. Способ по п. 1, где стадию (d) проводят в присутствии НО; при этом (1) фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется до гибридизации НО, и/или (2) если НО гибридизуется с СТО до удлинения данного фрагмента, то удлинение фрагмента приводит к расщеплению или вытеснению НО из комплекса с СТО, тем самым образование удлиненного дуплекса препятствует образованию гибрида между СТО и НО на стадии (е) ввиду ингибирования гибридизации НО с СТО и/или расходования НО в результате расщепления.
3. Способ по п. 1, где НО или СТО имеет систему двух взаимодействующих меток, содержащую репортерную молекулу и молекулу-гаситель; при этом система двух взаимодействующих меток располагается в таком месте, что сигнал от системы двух взаимодействующих меток в случае образования гибрида между СТО и НО отличается от сигнала, поступающего от системы двух взаимодействующих меток в случае, если гибрид между СТО и НО не образуется.
4. Способ по п. 1, где НО имеет одну метку из системы двух взаимодействующих меток, содержащей репортерную молекулу и молекулу-гаситель, а СТО имеет другую метку из системы двух взаимодействующих меток; при этом система двух взаимодействующих меток располагается в таком месте, что сигнал от системы двух взаимодействующих меток в случае образования гибрида между СТО и НО отличается от сигнала, поступающего от системы двух взаимодействующих меток в случае, если гибрид между СТО и НО не образуется.
5. Способ по п. 1, который осуществляют, используя один дополнительный НО, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО, и два НО гибридизуются с СТО в непосредственной близости друг к другу; при этом один из двух НО имеет одну метку из системы двух взаимодействующих меток, содержащей репортерную молекулу и молекулу-гаситель, а другой из этих двух НО имеет другую метку из системы двух взаимодействующих меток; при этом система двух взаимодействующих меток располагается в таком месте, что сигнал от системы двух взаимодействующих меток в случае образования гибрида между СТО и двумя НО отличается от сигнала, поступающего от системы двух взаимодействующих меток в случае, если гибрид между СТО и этими двумя НО не образуется.
6. Способ по п. 1, где НО или СТО содержит одиночную метку; при этом одиночная метка располагается в таком месте, что сигнал от одиночной метки в случае образования гибрида между СТО и НО отличается от сигнала, поступающего от одиночной метки в случае, если гибрид между СТО и НО не образуется.
7. Способ по п. 1, где один из СТО и НО иммобилизован на твердой подложке или будет иммобилизован на твердой подложке перед детекцией сигнала на стадии (f), и детекцию сигнала осуществляют на твердой подложке.
8. Способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты на твердой фазе в анализе с PCE-NH (отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения РТО), включающий:
(а) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и зондирующим и метящим олигонуклеотидом (РТО); при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РТО содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РТО;
(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РТО; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО;
(c) гибридизацию фрагмента, высвободившегося из РТО, с захватывающим и матричным олигонуклеотидом (СТО); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО;
(d) осуществление реакции удлинения с использованием продукта со стадии (с) и матричной полимеразы нуклеиновых кислот; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи, комплементарной матричному участку СТО, и образуется удлиненный дуплекс; при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется;
(e) гибридизацию продукта со стадии (d) с гибридизующимся олигонуклеотидом (НО), содержащим гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО, в условиях, подходящих для гибридизации СТО с НО; при этом один из СТО и НО помечен одиночной меткой, а другой, немеченый, иммобилизован на твердой подложке или будет иммобилизован на твердой подложке перед детекцией сигнала на стадии (f); при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется, и СТО и НО образуют гибрид, обеспечивая тем самым получение сигнала от одиночной метки на твердой подложке; при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то образуется удлиненный дуплекс, препятствующий образованию гибрида между СТО и НО, не обеспечивая тем самым получение сигнала от одиночной метки на твердой подложке; и
(f) детекцию сигнала на твердой подложке с целью обнаружения гибрида между СТО и НО на твердой подложке; при этом присутствие гибрида между СТО и НО указывает на отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом отсутствие гибрида между СТО и НО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
9. Способ по п. 8, где стадию (d) проводят в присутствии НО; при этом (1) фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется до гибридизации НО, и/или (2) если НО гибридизуется с СТО до удлинения данного фрагмента, то удлинение фрагмента приводит к расщеплению или вытеснению НО из комплекса с СТО, тем самым образование удлиненного дуплекса препятствует образованию гибрида между СТО и НО на стадии (е) ввиду ингибирования гибридизации НО с СТО и/или расходования НО в результате расщепления.
10. Способ по п. 8, где (1) СТО содержит одиночную метку, а НО иммобилизован на твердой подложке или будет иммобилизован на твердой подложке перед детекцией сигнала на стадии (f), или (2) НО содержит одиночную метку, а СТО иммобилизован на твердой подложке или будет иммобилизован на твердой подложке перед детекцией сигнала на стадии (f).
11. Способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты в анализе с PCE-NH (отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения РТО), включающий:
(а) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и зондирующим и метящим олигонуклеотидом (РТО); при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РТО содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РТО;
(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РТО; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО;
(c) гибридизацию фрагмента, высвободившегося из РТО, с захватывающим и матричным олигонуклеотидом (СТО); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО;
(d) осуществление реакции удлинения с использованием продукта со стадии (с) и матричной полимеразы нуклеиновых кислот; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи, комплементарной матричному участку СТО, и образуется удлиненный дуплекс; при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется;
(e) гибридизацию продукта со стадии (d) с гибридизующимся олигонуклеотидом (НО), содержащим гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО, в условиях, подходящих для гибридизации СТО с НО; при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется, и СТО и НО образуют гибрид, обеспечивая тем самым получение первого сигнала, указывающего на присутствие гибрида между СТО и НО; при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс ингибирует гибридизацию НО с СТО, обеспечивая тем самым получение второго сигнала, указывающего на присутствие НО, не гибридизованного с СТО; при этом сигналы обеспечиваются посредством (1) метки, соединенной с НО, (2) метки, соединенной с СТО, (3) метки, соединенной с НО, и метки, соединенной с СТО, или (4) интеркалирующей метки; и
(f) детекцию первого сигнала или второго сигнала при предварительно заданной температуре, при которой гибрид между СТО и НО сохраняет свою двухцепочечную форму; при этом присутствие гибрида между СТО и НО указывает на отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом отсутствие гибрида между СТО и НО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом разница в первом сигнале и втором сигнале позволяет определить присутствие или отсутствие гибрида между СТО и НО, что указывает на присутствие или отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты.
12. Способ по п. 11, где стадию (d) осуществляют в присутствии НО; при этом (1) фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется до гибридизации НО, и/или (2) если НО гибридизуется с СТО до удлинения фрагмента, то удлинение фрагмента приводит к расщеплению или вытеснению НО из комплекса с СТО.
13. Способ по п. 11, где НО или СТО имеет систему двух взаимодействующих меток, содержащую репортерную молекулу и молекулу-гаситель; при этом система двух взаимодействующих меток располагается в таком месте, что сигнал от системы двух взаимодействующих меток в случае, когда СТО и НО ассоциированы с образованием гибрида, отличается от сигнала, поступающего от системы двух взаимодействующих меток в случае, когда СТО и НО диссоциированы друг от друга.
14. Способ по п. 11, где НО имеет одну метку из системы двух взаимодействующих меток, содержащей репортерную молекулу и молекулу-гаситель, а СТО имеет другую метку из системы двух взаимодействующих меток; при этом система двух взаимодействующих меток располагается в таком месте, что сигнал от системы двух взаимодействующих меток в случае, когда СТО и НО ассоциированы с образованием гибрида, отличается от сигнала, поступающего от системы двух взаимодействующих меток в случае, когда СТО и НО диссоциированы друг от друга.
15. Способ по п. 11, который осуществляют, используя один дополнительный НО, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО, и два НО гибридизуются с СТО в непосредственной близости друг к другу; при этом один из двух НО имеет одну метку из системы двух взаимодействующих меток, содержащей репортерную молекулу и молекулу-гаситель, а другой из этих двух НО имеет другую метку из системы двух взаимодействующих меток; при этом система двух взаимодействующих меток располагается в таком месте, что сигнал от системы двух взаимодействующих меток в случае, когда СТО и эти два НО ассоциированы с образованием гибрида, отличается от сигнала, поступающего от системы двух взаимодействующих меток в случае, когда СТО и эти два НО диссоциированы друг от друга.
16. Способ по п. 11, где НО или СТО содержит одиночную метку; при этом одиночная метка располагается в таком месте, что сигнал от одиночной метки в случае, когда СТО и НО ассоциированы с образованием гибрида, отличается от сигнала, поступающего от одиночной метки в случае, когда СТО и НО диссоциированы друг от друга.
17. Способ по п. 11, где один из СТО и НО иммобилизован на твердой подложке или будет иммобилизован на твердой подложке перед детекцией сигнала на стадии (f), и детекцию сигнала осуществляют на твердой подложке.
18. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, где НО содержит нуклеотидную последовательность, конкурирующую с фрагментом в плане гибридизации с СТО.
19. Способ по п. 18, где НО не расщепляется при участии фрагмента или продукта его удлинения.
20. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, где стадии (a)-(f) осуществляют в одном реакционном сосуде или в отдельных реакционных сосудах.
21. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, где РТО, СТО и/или НО блокированы по своему 3'-концу, чтобы препятствовать его удлинению.
22. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, где располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид представляет собой располагающийся "вверх по течению" праймер или располагающийся "вверх по течению" зонд.
23. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, где располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован достаточно близко к РТО, чтобы индуцировать расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью.
24. Способ по п. 23, где располагающийся "вверх по течению" праймер индуцирует посредством своей удлиненной цепи расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью.
25. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, где захватывающий участок СТО содержит в своей 5'-концевой части нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка РТО.
26. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, который осуществляют с использованием контрольной группы, не имеющей никакой нуклеиновокислотной последовательности-мишени или имеющей предварительно заданное количество нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
27. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, дополнительно включающий повторение всех или некоторых из стадий (a)-(f) с денатурацией между повторяющимися циклами.
28. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, который осуществляют для детекции по меньшей мере двух типов нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид включает по меньшей мере два типа олигонуклеотидов, РТО включает по меньшей мере два типа РТО, СТО включает по меньшей мере два типа СТО, и НО включает по меньшей мере два типа НО.
29. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, где располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид представляет собой располагающийся "вверх по течению" праймер, и фермент на стадии (b), обладающий 5'-нуклеазной активностью, представляет собой матричную полимеразу нуклеиновых кислот для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера.
30. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, где фермент, обладающий 5'-нуклеазной активностью, представляет собой полимеразу, обладающую 5'-нуклеазной активностью, или нуклеазу FEN (флэп-эндонуклеазу).
31. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, где нуклеиновокислотная последовательность-мишень содержит нуклеотидную вариацию.
32. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, который осуществляют в присутствии располагающегося "вниз по течению" праймера.
33. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, который осуществляют без применения располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида, и расщепление РТО на стадии (b) происходит без какого-либо участия располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида или его удлиненной цепи.
34. Набор для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты в анализе с PCE-NH (отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения РТО), содержащий:
(a) располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени;
(b) зондирующий и метящий олигонуклеотид (РТО); при этом РТО содержит (1) З'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом З'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РТО; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО;
(c) захватывающий и матричный олигонуклеотид (СТО); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи, комплементарной матричному участку СТО, и образуется удлиненный дуплекс; при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется; и
(d) гибридизующийся олигонуклеотид (НО), содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО;
при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется, и СТО и НО образуют гибрид, обеспечивая тем самым получение сигнала, указывающего на присутствие гибрида между СТО и НО; при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то образуется удлиненный дуплекс, препятствующий образованию гибрида между СТО и НО, не обеспечивая тем самым получение сигнала; при этом набор дополнительно содержит (1) метку, соединенную с НО, (2) метку, соединенную с СТО, (3) метку, соединенную с НО, и метку, соединенную с СТО, или (4) интеркалирующую метку.
35. Набор для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты на твердой фазе в анализе с PCE-NH (отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения РТО), содержащий:
(a) располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени;
(b) зондирующий и метящий олигонуклеотид (РТО); при этом РТО содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РТО; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО;
(c) захватывающий и матричный олигонуклеотид (СТО); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи, комплементарной матричному участку СТО, и образуется удлиненный дуплекс; при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется; и
(d) гибридизующийся олигонуклеотид (НО), содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО;
при этом один из СТО и НО помечен одиночной меткой, а другой, немеченый, иммобилизован на твердой подложке или будет иммобилизован на твердой подложке перед детекцией сигнала от одиночной метки; при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется, и СТО и НО образуют гибрид, обеспечивая тем самым получение сигнала от одиночной метки на твердой подложке; при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то образуется удлиненный дуплекс, препятствующий образованию гибрида между СТО и НО, не обеспечивая тем самым получение сигнала от одиночной метки на твердой подложке.
36. Набор для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты в анализе с PCE-NH (отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения РТО), содержащий:
(a) располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени;
(b) зондирующий и метящий олигонуклеотид (РТО); при этом РТО содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РТО; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО;
(c) захватывающий и матричный олигонуклеотид (СТО); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи, комплементарной матричному участку СТО, и образуется удлиненный дуплекс; при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется; и
(d) гибридизующийся олигонуклеотид (НО), содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО;
при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется, и СТО и НО образуют гибрид, обеспечивая тем самым получение первого сигнала, указывающего на присутствие гибрида между СТО и НО; при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс ингибирует гибридизацию НО с СТО, обеспечивая тем самым получение второго сигнала, указывающего на присутствие НО, не гибридизованного с СТО; при этом набор дополнительно содержит (1) метку, соединенную с НО, (2) метку, соединенную с СТО, (3) метку, соединенную с НО, и метку, соединенную с СТО, или (4) интеркалирующую метку.