Амилоид в биопленках бактерий при муковисцидозе

Микробиология

Амилоид в биопленках бактерий при муковисцидозе

В.В. Тец, Н.К. Артеменко, М.Ф. Вечерковская, Г.В. Тец

В составе матрикса бактериальных биопленок обнаружены амилоид и амилоидоподобные белки, которые придают биопленкам прочность, устойчивость к смыванию и обладают токсическим действием. Целью работы было выявление амилоида у бактерий, выделенных у больных муковисцидозом. Результаты исследования свидетельствуют о том, что среди возбудителей респираторных инфекций при муковисцидозе имеется много штаммов, вырабатывающих большое количество амилоида, который накапливается в матриксе их биопленок. Полученные данные позволяют предположить участие бактериального амилоида в формировании патологических изменений при хронической респираторной инфекции у больных муковисцидозом.

Ключевые слова: муковисцидоз, бактериальные биопленки, матрикс биопленок, бактериальный амилоид.

Введение

Бактерии, вызывающие заболевания дыхательной системы, имеют различные факторы вирулентности с определенными механизмами патологического воздействия на организм человека. С открытием жизни бактерий в составе биопленок в поле зрения оказались неизвестные ранее компоненты этих сообществ - матрикс и поверхностная оболочка [1].

Матрикс биопленок содержит белки, липиды, полисахариды и нуклеиновые кислоты, обеспечивающие формирование внутренней среды и условий существования бактериальных сообществ. В составе матрикса обнаружены р-амилоид и амилоидоподобные белки, связанные с поверхностью бактерий, которые придают биопленкам прочность и устойчивость к смыванию [2-4].

Бактериальный р-амилоид, связанный с поверхностью бактерий и по структуре, и по функциям, очень похож на р-амилоид, обнаруженный при нейродегенеративных заболеваниях [5]. Предполагается, что бактериальный р-амилоид

ФГБОУ ВО "Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова" МЗ РФ.

Виктор Вениаминович Тец - докт. мед. наук, профессор, зав. кафедрой микробиологии и вирусологии. Наталия Константиновна Артеменко - канд. мед. наук, доцент кафедры микробиологии и вирусологии. Мария Федоровна Вечерковская - канд. мед. наук, доцент кафедры микробиологии и вирусологии. Георгий Викторович Тец - канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаборатории иммунологии Научно-исследовательского центра.

Контактная информация: Тец Виктор Вениаминович, vtetzv@yahoo.com

может играть роль в развитии болезни Альцгей-мера [6]. Структура бактериального ß-амилоида обеспечивает ему некоторые свойства прионов, в том числе устойчивость к действию протеаз и температуры [4, 7].

ß-амилоид обнаружен у различных бактерий: Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Mycobacterium tuberculosis, Xant-homonas axonopodis, среди которых есть возбудители заболеваний дыхательной системы [8].

Среди возбудителей заболеваний дыхательной системы внимание привлекли бактерии рода Pseudomonas, выделенные у пациентов с вну-трибольничной пневмонией. Установлено, что пациенты, которые выздоравливают от пневмонии, после выписки из стационара впоследствии имеют повышенные показатели смертности. Повреждение органов в течение нескольких месяцев после выздоровления от пневмонии связывают с токсическим действием бактериального ß-амилоида, который за счет устойчивости в организме оказывает длительное патологическое воздействие. Этот токсин содержится в брон-хоальвеолярном лаваже и вызывает гибель эн-дотелиальных клеток и нейронов, а также отек изолированного легкого [9]. Выявлено также, что амилоид может формировать олигомеры, повреждающие мембраны [10]. Такая форма токсического воздействия наблюдается у Klebsiella pneumoniae, которые вырабатывают амилоидо-подобный белок Microcin E492, индуцирующий лизис клеток [11].

Рассматривается связь бактериальных ами-лоидоподобных белков c возникновением и развитием амилоидоза [12]. Вторичный амилоидоз сопровождает различные хронические заболевания человека, в том числе туберкулез и сифилис. Муковисцидоз также может осложняться вторичным амилоидозом [13]. Вместе с тем наличие амилоида у бактерий, играющих важную патогенетическую роль при муковисцидозе, остается практически неизученным.

Целью работы было выявление амилоида у патогенов, выделенных у больных муковисцидозом.

Материал и методы

Материалом для исследования служили бактерии, выделенные из мокроты пациентов с пневмонией (n = 14) и муковисцидозом (n = 20) в клинике Первого Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова. Время между забором материала и включением его в исследование не превышало 4 ч с условиями хранения при 4°С.

Изученные штаммы бактерий: Lactobacillus VT-16-957 sp. nov., Acinetobacter VT-16-958 sp. nov., Chryseobacterium VT-16-960 sp. nov., Paenibacillus VT-16-972 sp. nov., Stenotrophomonas VT-16-974 sp. nov., Stenotrophomonas maltophilia VT-16-590, Proteus VT-16-970 sp. nov., Streptococcus VT-16-975 sp. nov., Streptococcus oralis/mitis VT-690, Pseudomonas aeruginosa VT-16-973, VT-16-974, VT-16-975, VT-16-976, VT-16-977, VT-16-881, VT-16-882, Klebsiella pneumoniae VT-16-981, VT-16 982, VT-16-983, VT-16-984, VT-16-985, VT-16-791, VT-16-972, VT-16-973, Escherichia coli VT-16 990, VT-16-991, VT-16-992, VT-16-993, VT-490, VT-16-491, Proteus mirabilis VT-16-690.

Питательные среды: жидкие и агаризо-ванные колумбийская и Лурия-Бертани среды (Oxoid, Великобритания) с добавкой эритроцитов барана, тест система "ВыборАнтибиотика" ("Новые Антибиотики", Россия).

Идентификация бактерий. Биохимическую активность бактерий оценивали на анализаторе Vitek 2 (bioMerieux, Франция), протеом бактериальной клетки исследовали при помощи масс-спектрометрии MALDI TOF/TOF с идентификацией относительно MALDI Biotyper database (Bruker Taxonomy tree) (Bruker Corporation, США) согласно инструкции изготовителя.

Секвенирование гена 16S рибосомальной РНК проводили при помощи набора BigDye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems, США) и автоматического секвена-тора ABI Prism Genetic Analyzer 3730xl (Applied Biosystems, США). Анализ полученных резуль-

татов проводили с использованием базы данных NCBI 16S rRNA/WGS/Reference genomic sequences/nuc leotide collection.

Выявление штаммов, вырабатывающих амилоид. Бактерии выращивали на колумбийском агаре или агаре Лурия-Бертани с добавлением конго красного в конечной концентрации 20 мкг/мл [14].

Получение и изучение биопленок. Биопленки выращивали на дне лунок пластиковых 96-луночных планшетов (Sarstedt, Германия). В лунки вносили по 0,1 мл бульонной культуры бактерий (5 х 107 колониеобразующих единиц (КОЕ)), выращивали 48 ч при 37°С. Для оценки состояния биопленок жидкое содержимое лунок удаляли, промывали троекратно фосфатным буфером с рН 7,2-7,4, добавляли раствор конго красного (25 мкг/мл) в течение 15 мин, промывали троекратно фосфатным буфером, добавляли 200 мкл воды и учитывали результаты на ридере Stat Fax 2100 (Awareness Technology, США) при длине волны 570 нм.

Количество амилоида рассчитывали как увеличение оптической плотности матрикса после окрашивания конго красным по сравнению с неокрашенным, выраженное в процентах.

Выживаемость бактерий определяли по числу КОЕ. С этой целью биопленки удаляли со стенок лунок, из полученной взвеси готовили ряд двукратных разведений и высевали на агаризован-ную среду.

Результаты и обсуждение

В работе использованы штаммы, выделенные у больных с диагнозами муковисцидоза и пневмонии. Для сравнения использовали материал от больных пневмонией. Изученные штаммы получены в виде чистых культур из бактерий, выросших в системе "ВыборАнтибиотика". В ходе идентификации выделенных бактерий по морфологическим признакам, биохимической активности, протеомному составу, а также по данным сиквенса гена, кодирующего 16S ри-босомальную ДНК, было установлено, что часть из них представлена ранее неизвестными видами. Всего у больных муковисцидозом протестировано 25 бактерий, из которых к новым видам, подлежащим дальнейшей идентификации, принадлежит 7 штаммов: Lactobacillus spp., Acinetobacter spp., Chryseobacterium spp., Paenibacillus spp., Stenotrophomonas spp., Proteus spp., Streptococcus spp. Остальные выделенные нами и использованные в работе штаммы включали Pseudomonas aeruginosa - 5 штаммов, Klebsiella pneumoniae - 3 штамма, Escherichia coli - 4 штамма, Stenotrophomonas maltophilia - 1 штамм,

Накопление амилоида в бактериальных биопленках: а - высокий уровень; б - средний уровень; в - низкий уровень. Окрашивание конго красным.

Proteus mirabilis - 1 штамм. У больных с диагнозом пневмонии были исследованы 3 штамма Klebsiella pneumoniae, 2 штамма Pseudomonas aeruginosa, 2 штамма Escherichia coli и 1 штамм Streptococcus oralis/mitis. После роста на среде с конго красным сообщества большинства изученных штаммов имели интенсивное окрашивание, характерное для комплекса амилоида с указанным красителем [14, 15]. Некоторые изученные штаммы вырабатывают мало р-амилоида, и их сообщества на агаризованной среде были слабо окрашены (рисунок).

Среди 25 изученных полностью и частично идентифицированных штаммов, выделенных у больных муковисцидозом, 20 штаммов (80%) вырабатывали большое количество амилоида, и их колонии были интенсивно окрашены. Среди группы сравнения - штаммов, полученных от больных пневмонией, преобладали бактерии, вырабатывающие среднее количество Р-амилоида. Среди использованных штаммов они составили 20%.

Количество р-амилоида в бактериальных биопленках определяли в 48-часовых сообществах, полученных in vitro. В матриксе биопленок количество р-амилоида (конгосвязывающих белков) варьировало от 0 до 70-80% от общей оптической плотности. По этому признаку все бактерии можно было разделить на три группы: 1-я группа (низкий уровень р-амилоида) содержала от 0 до 10% конгосвязывающих белков от оптической плотности матрикса биопленок, 2-я (средний уровень) - от 10 до 30% и 3-я (высокий уровень) - 30-50% и более. Среди изученных нами штаммов высокий уровень р-амилоида был выявлен в матриксе биопленок бактерий при му-ковисцидозе - примерно у 30% штаммов и средний уровень - у 40%. Самое высокое содержание Р-амилоида определено у штаммов E. coli (3 штамма), Stenotrophomonas spp. и P. aeruginosa. Среди бактерий, выделенных у больных пневмонией, высокий уровень р-амилоида был выявлен у 1 штамма P. aeruginosa и средний - у 1 штамма E. coli.

Результаты исследования свидетельствуют о том, что среди возбудителей инфекций при муко-

висцидозе имеется много штаммов, вырабатывающих р-амилоид. Очевидно, что р-амилоид этих бактерий кроме функций укрепления биопленок может оказывать токсическое действие на клетки как минимум дыхательного эпителия [3, 9]. Токсическое действие амилоида E. coli связывают и с генерализацией уроинфекций [16, 17]. Кроме того, особенности строения р-амилоида, определяющие сходство с прионами, позволяют предполагать его возможное участие в нарушении функций иммунной системы и развитии вторичного амилоидоза [7, 17].

Полученные данные указывают на необходимость изучения роли р-амилоида и амилоидопо-добных белков матрикса бактериальных биопленок в формировании патологических изменений при хронической инфекции дыхательной системы у больных муковисцидозом.

Выводы

Среди известных и малоизвестных бактерий, выделенных у больных муковисцидозом, имеется много штаммов, вырабатывающих большое количество р-амилоида.

Выработка р-амилоида этими штаммами указывает на наличие неизученного пока пути патологического воздействия бактерий на организм человека при муковисцидозе.

Список литературы

1. Tetz V.V., Korobov V.P., Artemenko N.K., Lemkina L.M., Panjukova N.U., Tetz G.V. Extracellular phospholipids of isolated bacterial communities. Biofilms 2004; 1: 149-155.

2. Schwartz K., Syed A.K., Stephenson R.E., Rickard A.H., Boles B.R. Functional amyloids composed of phenol soluble modulins stabilize Staphylococcus aureus biofilms. PLoS Pathog 2012; 8(6): e1002744.

3. Zeng G., Vad B.S., Dueholm M.S., Christiansen G., Nilsson M., Tolker-Nielsen T., Nielsen P.H., Meyer R.L., Otzen D.E. Functional bacterial amyloid increases Pseudomonas biofilm hydro-phobicity and stiffness. Front Microbiol 2015; 6: 1099.

4. Zhou Y., Blanco L.P., Smith D.R., Chapman M.R. Bacterial amyloids. Methods Mol Biol 2012; 849: 303-320.

5. Villar-Piqué A.,Ventura S. Modeling amyloids in bacteria. Microb Cell Fact 2012; 11: 166.

6. Hill J.M., Lukiw W.J. Microbial-generated amyloids and Alzheimer's disease (AD). Front Aging Neurosci 2015; 7: 9.

7. Schwartz K., Boles B.R. Microbial amyloids - functions and interactions within the host. Curr Opin Microbiol 2013; 16(1): 93-99.

8. Romero D., Kolter R. Functional amyloids in bacteria. Int Mic-robiol 2014; 17(2): 65-73.

9. Lin M.T., Balczon R., Morrow K.A., Wagener B.M., Pittet J.F., Stevens T. Pseudomonas aeruginosa-induced pulmonary endothelial amyloid proteins impair long-term plasticity. FASEB J 2017; 31(1 Suppl. 1): S3.

10. Glabe C.G., Kayed R. Common structure and toxic function of amyloid oligomers implies a common mechanism of pathogen-esis. Neurology 2006; 66(2 Suppl. 1): S74-S78.

11. Shahnawaz M., Soto C. Microcin amyloid fibrils A are reservoir of toxic oligomeric species. J Biol Chem 2012; 287(15): 11665-11676.

12. Lundmark K., Westermark G.T., Olsen A., Westermark P. Protein fibrils in nature can enhance amyloid protein A amyloidosis in mice: cross-seeding as a disease mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A 2005; 102(17): 6098-6102.

13. Mc Laughlin A.M., Crotty T.B., Egan J.J., Watson A.J., Gallagher C.G. Amyloidosis in cystic fibrosis: a case series. J Cyst Fibros 2006: 5(1): 59-61.

14. Reichhardt C., Jacobson A.N., Maher M.C., Uang J., McCrate O.A., Eckart M., Cegelski L. Congo red interactions with curli-producing E. coli and native curli amyloid fibers. PLoS ONE 2015; 10(10): e0140388.

15. Chen S.G., Stribinskis V., Rane M.J., Demuth D.R., Gozal E., Roberts A.M., Jagadapillai R., Liu R., Choe K., Shivaku-mar B., Son F., Jin S., Kerber R., Adame A., Masliah E., Friedland R.P. Exposure to the functional bacterial amyloid protein curli enhances alpha-synuclein aggregation in aged Fischer 344 rats and Caenorhabditis elegans. Sci Rep 2016; 6: 34477.

16. Hung C., Marschall J., Burnham C.A., Byun A.S., Henderson J.P. The bacterial amyloid curli is associated with urinary source bloodstream infection. PLoS ONE 2014; 9(1): e86009.

17. Gebbink M.F., Claessen D., Bouma B., Dijkhuizen L., Wösten H.A. Amyloids - a functional coat for microorganisms. Nat Rev Microbiol 2005; 3(4): 333-341.

Amyloid in Bacterial Biofilms in Patients with Cystic Fibrosis

V.V. Tets, N.K. Artemenko, M.F. Vecherkovskaya, and G.V. Tets

Amyloid and amyloid-like proteins were found in matrix of bacterial biofilms. They give biofilms strength, resistance to flushing and have toxic effect. The study was aimed to identify amyloid in bacteria isolated from patients with cystic fibrosis. The study showed that many strains of pathogens causing respiratory infections in patients with cystic fibrosis produced a large amount of amyloid accumulating in biofilm matrix. The results suggest the involvement of bacterial amyloid in pathological changes in patients with cystic fibrosis and chronic respiratory infections. Key words: cystic fibrosis, bacterial biofilms, biofilm matrix, bacterial amyloid.