СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ ЭЛЕКТРОВОЗБУДИМЫХ НЕЙРОНАЛЬНЫХ КЛЕТОК
METHOD FOR STIMULATION OF ELECTROVIBRARY NEURONAL CELLS

Предлагаемое изобретение относится к исследованиям в области медицины и физиологии, касается способа стимуляции электровозбудимых нейрональных клеток, который может быть использован в электрофизиологических исследованиях для хронической электрической стимуляции электровозбудимых клеток (например, культур нейронональных клеток), выращиваемых на микроэлектродной матрице (МЭМ).
Известен макет физиологической микросенсорной системы на основе нервных клеток (RU 128761 U1, кл. G09B 23/28, опубл. 27.05.2013 г.), служащей для регистрации активности нейрональных культур. Система содержит микроскоп с помещенной в него матрицей с культурой нервных клеток, блок регистрации генерируемой нервными клетками электрической активности и генератор стимулирующих импульсов. Микроскоп выполнен с возможностью фотографической цифровой регистрации флуоресцентного свечения нервных клеток, а матрица с культурой нервных клеток связана с упомянутым блоком регистрации и генератором стимулирующих импульсов. С помощью данной системы осуществляют стимуляцию нейрональной культуры генератором стимулирующих импульсов. В качестве стимулятора используют установку производства компании Multichannel Systems (Германия). Установкой управляют посредством рабочей станции при помощи пакета программного обеспечения, обеспечивающего регистрацию электрической активности клеток, выбор электродов и управление стимуляцией, генерацию и загрузку паттернов стимуляции, а также управление термостатом, в который помещена культура клеток.
2
Недостатком указанной системы является то, что с ее помощью может быть реализована только временная стимуляция клеток в пределах 10 минут, в течение которых клеточная культура находится не в стерильных условиях и без постоянной подачи 5% СО, вследствие чего повышается риск заражения культуры клеток, снижается надежность эксперимента.
2
Известен способ стимуляции культуры нейрональных клеток, осуществляемый с помощью системы, содержащей стимулятор (Master-8, A.M.P.I., Израиль), двухстимульные изоляторы (ISO-Flex, A.M.P.I., Израиль) и чашку с нейрональной культурой, на которую выводятся два стимулирующих электрода (Chaejeong Н. et al. The control of neural cell-to-cell interactions through non-contact electrical field stimulation using graphene electrodes. Biomaterials. 32 (2011) 19-27). Электроды выполняют из графена на пленке из полиэтилентерефталата (ПЭТ пленка) и соединяют со стимулятором посредством золотых проводов. Нервные клетки культивируют в пространстве между двумя электродами, чашку с нейрональной культурой помещают в инкубатор с постоянной концентрацией СО. На время стимуляции систему устанавливают на электронный микроскоп (HRTEM; JEM 2100F, JEOL, Япония) с возможностью фотографической цифровой регистрации флуоресцентного свечения нервных клеток.
Недостатком способа является отсутствие возможности регистрации электрической активности клеток. Кроме этого, используемая система приспособлена под определенную задачу (два электрода и ограниченное пространство для посадки клеток между ними), поэтому ее использование в других экспериментах (например, для хронической стимуляции нейрональных клеток) без изменения конфигурации невозможно.
Известен способ временной стимуляции первичных фоторецепторных клеток сетчатки, осуществляемый с помощью системы, которая представляет собой два U-образных электрода (Jiani Medical Equipment Company, Китай), соединенных со стимулятором (Multichannel Systems, Германия). Электроды устанавливают в чашке с культурой клеток на время стимуляции таким образом, чтобы они не соприкасались со слоем клеток. На время стимуляции (1 час) чашку с культурой клеток помещают в стерильную влажную среду (Wen-ting Z. et al. Electrical stimulation ameliorates light-induced photoreceptor degeneration in vitro via suppressing the proinflammatory effect of microglia and enhancing the neurotrophic potential of Muller cells. Experimental Neurology. 238 (2012) 192-208).
2
Недостатками данного способа являются невозможность регистрации электрической активности клеток, появление риска заражения культуры клеток вследствие периодического помещения электродов в чашку с культурой клеток. Кроме этого, в силу отсутствия постоянной подачи СО к культуре клеток используемая система не предусмотрена для длительных экспериментов со стимуляцией.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому изобретению является способ стимуляции электровозбудимых клеток, известный из статьи «Динамика вызванной биоэлектрической активности нейрональных сетей in vitro» (Е.А. Корягина, А.С. Пимашкин, В.Б. Казанцев, И.В. Мухина, опубл. в журнале «Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского», 2011 г., №2(2), с. 254-261), принятый за ближайший аналог (прототип).
2
2
2
Способ по прототипу включает размещение культур клеток на чаше микроэлектродной матрицы, поддержание жизнеспособности культур клеток в условиях СО-инкубатора при температуре 35,5°С и газовой смеси 95% О и 5% СО, генерацию электрических сигналов с помощью стимулятора, передачу генерируемых сигналов от стимулятора к культурам клеток на микроэлектродной матрице, регистрацию спонтанной активности культур клеток. При этом используют культуры клеток гиппокампа, полученные от 18-дневных эмбрионов белых беспородных мышей. Последовательности биполярных импульсов тока амплитудой 50 мкА и длительностью 500 мкс подают на различные электроды с частотой, соизмеримой с частотой следования спонтанных пачек.
Недостатком способа по прототипу является отсутствие стерильности условий, в которых выращивается культура электровозбудимых нейрональных клеток, что в целом ухудшает физиологические условия, необходимые для ее развития, и снижает надежность эксперимента.
В задачу изобретения положено создание нового способа стимуляции электровозбудимых нейрональных клеток для формирования культуры электровозбудимых нейрональных клеток с характеристиками, близкими к характеристикам клеток живого развивающегося мозга, которую можно было бы использовать для дальнейших медицинских и научных исследований.
Техническим результатом от использования изобретения является возможность непрерывной и длительной (хронической) стимуляции культуры электровозбудимых нейрональных клеток, улучшение физиологических условий, необходимых для ее развития, повышение надежности эксперимента.
2
2
Поставленная задача достигается тем, что в способе стимуляции электровозбудимых клеток, включающем размещение культур клеток на чаше микроэлектродной матрицы, выполненной в виде массива из металлических микроэлектродов, сформированных на подложке, с контактными площадками по периметру, соединенными посредством токопроводящих дорожек с микроэлектродами, поддержание жизнеспособности культур клеток в условиях СО-инкубатора, генерацию электрических сигналов с помощью стимулятора, передачу генерируемых сигналов от стимулятора к культурам клеток на микроэлектродной матрице, регистрацию спонтанной активности культур клеток, микроэлектродную матрицу предварительно устанавливают в коннектор, помещенный в инкубатор, причем в коннекторе над микроэлектродной матрицей устанавливают плату с отверстием, с выступом, с прижимными пружинными контактами, соединенными токопроводящими дорожками таким образом, чтобы чаша с культурой клеток выступала сквозь отверстие платы, а прижимные пружинные контакты платы были расположены соосно контактным площадкам микроэлектродной матрицы с возможностью взаимодействия с ними, коннектор и микроэлектродную матрицу соединяют со стимулятором посредством шлейфа из проводных соединений, генерацию электрических сигналов осуществляют в виде последовательности, состоящей из серии 5 импульсов с межимпульсным интервалом 20 мс и интервалом между сериями 200 мс, при этом передачу генерируемых биполярных стимулов от стимулятора к культурам клеток осуществляют посредством шлейфа из проводных соединений, подключенного к разъему на выходе стимулятора с одной стороны и к внешнему разъему коннектора с другой стороны, через прижимные пружинные контакты по токопроводящим дорожкам платы на контактные площадки микроэлектродной матрицы и по токопроводящим дорожкам микроэлектродной матрицы через микроэлектроды; коннектор содержит основание и крышку, выполненные с возможностью герметичного соединения друг с другом, основание выполнено с отверстием для выступа платы, крышка выполнена с отверстием, покрытым фильтрующей мембраной, при этом микроэлектродную матрицу устанавливают на дно основания, выступ платы выполняют выходящим за периметр основания через отверстие для выступа платы и соединяют с внешним разъемом; используют микроэлектродную матрицу, изготовленную в виде массива из 60 золотых микроэлектродов с 60 контактными площадками по периметру, при этом 56 электродов микроэлектродной матрицы выполняют диаметром 50 мкм и используют для регистрации электрофизиологической активности культуры клеток, а 4 электрода выполняют диаметром 500 мкм и используют для хронической стимуляции клеток; используют измерительные электроды, импеданс которых не превышает 500 кОм; токопроводящие дорожки и всю поверхность микроэлектродной матрицы, которая контактирует с культурами клеток, кроме микроэлектродов, покрывают полимером SU - 8 (MicroChem, США) толщиной 2-3 мкм; используют культуры дифференцированных нейронов гиппокампа эмбрионов мышей; поддержание жизнеспособности культуры клеток осуществляют в условиях стандартного инкубатора при постоянной температуре 35°С, 5% концентрации СО и 100% влажности; осуществляют генерацию электрических сигналов в виде единичных биполярных электрофизиологических импульсов с регулируемой амплитудой 600-800 мкВ и фиксированной длительностью 500 мкс при входном триггер-сигнале амплитудой 5 В.
На фиг. 1 представлена установка, с помощью которой осуществляют хроническую стимуляцию электровозбудимых клеток.
На фиг. 2 представлен коннектор установки для хронической стимуляции электровозбудимых клеток, где: 2а - коннектор в собранном виде; 2б - коннектор в разобранном виде; 2в - плата коннектора.
На фиг. 3 представлены фотографии нейронов около микроэлектродов матрицы.
На фиг. 4 представлен растр активности электродов матрицы на 4 день in vitro до хронической стимуляции. Каждая точка - время возникновения спайка на каждом микроэлектроде.
На фиг. 5 представлен растр активности электродов матрицы на 15 день in vitro, хроническая стимуляция проводилась на протяжении 11 дней.
Предлагаемый способ хронической стимуляции электровозбудимых клеток осуществляют на установке, которая конструктивно на фиг.1 содержит:
1 - стимулятор;
2 - коннектор;
3 - инкубатор.
Конструктивно коннектор 2 на фиг. 2 содержит:
4 - основание;
5 - отверстие для выступа платы;
6 - прозрачное окно;
7 - крышку;
8 - отверстие с фильтрующей мембраной;
9 - микроэлектродную матрицу;
10 - чашу;
11 - контактные площадки;
12 - токопроводящие дорожки микроэлектродной матрицы;
13 - плату;
14 - отверстие платы;
15 - выступ;
16 - прижимные пружинные контакты для соединения с микроэлектродной матрицей;
17 - токопроводящие дорожки платы;
18 - внешний разъем.
Сборку предлагаемой установки осуществляют следующим образом.
Изготавливают стимулятор 1 с разъемом на выходе для нескольких проводных соединений, например четырех. Количество проводных соединений должно соответствовать количеству стимулируемых электродов на микроэлектродной матрице 9.
Шлейф выполняют, например, длиной от 100 см. Длина шлейфа должна быть достаточна для изоляции стимулятора 1 и коннектора 2 друг от друга через инкубатор 3.
2
Изготавливают коннектор 2 в виде контейнера, например, из пластика с основанием 4, с крышкой 7. Основание 4 выполняют с отверстием 5 для выступа платы, а также, например, с углублением, с внутренними выступами и с прозрачным окном 6 на дне основания 4. Крышку 7 выполняют с отверстием 8. Отверстие 8 покрывают фильтрующей мембраной, пропускающей газ СО, необходимый для жизнеобеспечения клеток.
Используют микроэлектродную матрицу 9, изготовленную в виде массива из металлических микроэлектродов, сформированных на стеклянной или кремниевой подложке, с цилиндрической чашей 10 по центру и контактными площадками 11 по периметру, соединенными с микроэлектродами посредством токопроводящих дорожек.12.
Например, используют микроэлектродную матрицу 9, изготовленную в виде массива из 60 золотых микроэлектродов с 60 контактными площадками по периметру. При этом часть, например 56 микроэлектродов, выполняют диаметром 50 мкм и используют для регистрации электрофизиологической активности нейрональной культуры, а остальные, например 4 микроэлектрода, выполняют диаметром 500 мкм и используют для хронической стимуляции клеток.
Токопроводящие дорожки 12 и всю поверхность микроэлектродной матрицы 9, которая контактирует с клетками, кроме микроэлектродов, покрывают, например, полимером SU - 8 (MicroChem, США) толщиной 2-3 мкм, обеспечивая их изоляцию от контакта с клеточной средой.
Культуры нейронональных клеток на питательной среде помещают на цилиндрическую чашу 10 микроэлектродной матрицы 9 непосредственно перед установкой микроэлектродной матрицы 9 в коннектор 2.
Изготавливают плату 13 с отверстием 14, с выступом 15, с прижимными пружинными контактами 16 для соединения с микроэлектродной матрицей 9 и с внешним разъемом 18, соединенными токопроводящими дорожками 17.
Внешний разъем 18 выполняют, например, из стандартной штыревой вилки с расстоянием 2.54 мм между штырьками.
На дно основания 4 устанавливают микроэлектродную матрицу 9 с культурами нейрональных клеток на питательной среде на чаше 10. Плату 13 устанавливают, например, на внутренние выступы основания 4 таким образом, чтобы сквозь отверстие 14 выступала чаша 10 микроэлектродной матрицы 9, выступ 15 выходил за периметр основания 4 через отверстие 5, прижимные пружинные контакты 16 были расположены над контактными площадками 11 микроэлектродной матрицы 9 и взаимодействовали с ними. Затем герметично соединяют основание 4 с крышкой 7 коннектора 2. Для этого место соединения основания 4 с крышкой 7 коннектора 2, а также отверстие 5, которое контактирует с выступом 15 платы 13, покрывают силиконом для обеспечения герметичности и предотвращения попадания на клетки матрицы 9 бактерий и спор грибов. Выступ 15 платы 13 соединяют с внешним разъемом 18, например, с помощью пайки. При этом внешний разъем 18 оставляют снаружи коннектора 2 для соединения со шлейфом проводных соединений.
Для осуществления хронической стимуляции электровозбудимых клеток коннектор 2 помещают в стандартный инкубатор 3, в котором поддерживают постоянную температуру в 35°С и 100% влажность. Используют инкубатор 3 с отверстием для проведения шлейфа, которое герметично закрывают. Отверстие в инкубаторе 3, через которое прокладывают шлейф, герметично закрывают, например, с помощью мягкой пробки из полимера так, чтобы не повредить шлейф и предотвратить утечку газа из инкубатора 3.
Соединяют стимулятор 1 с коннектором 2 путем подключения шлейфа из проводных соединений к разъему стимулятора 1 и к внешнему разъему 18 коннектора.
Стимуляцию электровозбудимых клеток с помощью предлагаемой установки осуществляют следующим образом.
С помощью стимулятора 1 генерируют последовательность, состоящую из серии 5 импульсов с межимпульсным интервалом 20 мс и интервалом между сериями 200 мс в течение всего периода жизнедеятельности культуры клеток. Генерируют последовательность, например, биполярных электрофизиологических импульсов с регулируемой амплитудой 600-800 мкВ и фиксированной длительностью 500 мкс по заданному протоколу.
Передачу генерируемых биполярных импульсов от стимулятора 1 на микроэлектродную матрицу 9 осуществляют посредством шлейфа, например, из четырех проводников, подключенного к разъему на выходе стимулятора 1 с одной стороны и к внешнему разъему 18 коннектора 2 с другой стороны. При этом генерируемые биполярные стимулы передаются через прижимные пружинные контакты 16 по токопроводящим дорожкам 17 платы 13 на контактные площадки 11 микроэлектродной матрицы 9, по токопроводящим дорожкам 12 микроэлектродной матрицы 9 на микроэлектроды и к культурам клеток.
Таким образом, осуществление предлагаемого способа на указанной установке обеспечивает:
- стерильность условий, в которых выращивается культура электровозбудимых нейрональных клеток, что в целом улучшает физиологические условия, необходимые для ее развития, и повышает надежность эксперимента;
- непрерывную длительную стимуляцию культуры электровозбудимых клеток (в течение всего периода жизнедеятельности культуры клеток), имитирующую постоянную электрическую активность нейрональных клеток в развивающемся мозге, что позволяет сформировать культуру электровозбудимых нейрональных клеток с характеристиками, близкими к характеристикам клеток живого развивающегося мозга, которую можно использовать для дальнейших медицинских и научных исследований.
Ниже приведен пример конкретного использования предлагаемого изобретения.
На чашу 10 стерильной микроэлектродной матрицы 9 с питательной средой была произведена посадка культуры дифференцированных нейронов гиппокампа эмбрионов мышей на 18-й день развития (Pimashkin et al., 2013). Микроэлектродная матрица 9 устанавливалась в коннектор 2, сверху помещалась плата 13 так, что контактные площадки 11 матрицы 9 располагались под прижимными пружинными контактами 16 платы 12 и взаимодействовали с ними. Затем основание 4 соединялось с крышкой 7 коннектора 2.
2
Коннектор 2 находился в стандартном инкубаторе 3, в котором поддерживалась постоянная температура в 35°С, 5% концентрация СО и 100% влажность.
На четвертый день in vitro коннектор 2 через внешний разъем 18 платы 13 и шлейфа из четырех проводников соединялся со стимулятором 1. На 4 микроэлектрода диаметром 500 мкм микроэлектродной матрицы 9 подавалась постоянная стимуляция, состоящая из серии 5 импульсов с межимпульсным интервалом 20 мс и интервалом между сериями 200 мс.
Каждый день с четвертого дня in vitro в течение 10 минут биоэлектрическая активность нейрональной культуры регистрировалась с помощью установки MEA-USB-128-BC-Inv (Multichannel Systems) и снимались фотографии культуры на микроскопе Leica DFC420 С. Анализ биоэлектрической активности производился с помощью программы Meaman (Пимашкин А.С. Свидетельство №2012611190 от 27.01.2012).
В результате наблюдалось сохранение жизнеспособности нейронов хронической стимуляции (фиг. 3, 4, 5). Также наблюдалось изменение характера динамики биоэлектрической активности.