Идентификация бактерий рода Lactobacillus на основе анализа фрагмента гена бета-субъединицы РНК-полимеразы rpoB

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ФИЛОГЕНЕТИКА

УДК 606:575:57.082.13

ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ РОДА LACTOBACILLUS НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ФРАГМЕНТА ГЕНА БЕТА-СУБЪЕДИНИЦЫ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ rpoB

А.Б. Шевцов1, А.Р. Кушугулова2, С.С. Кожахметов2, С.С. Оралбаева1,

Л.Г. Стоянова, А.Б. Сейдалина1, К.Т. Момыналиев1

В настоящей работе проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей rpoB гена для оценки возможности его использования в качестве генетического маркера видовой идентификации бактерий рода Lactobacillus spp., выделенных из кисломолочных продуктов разных районов республики Казахстан. Показано, что дискриминационная характеристика нуклеотидной последовательности rpoB гена более достоверна для идентификации близкородственных генов Lactobacillus по сравнению с использованием для этих целей только 16S rRNA гена. Филогения последовательности rpoB гена идентична 16S rRNA гену и может быть использована как дополнительный филогенетический маркер.

Ключевые слова: Lactobacillus, бета-субъединица РНК-полимеразы, идентификация, сек-венирование, филогения, 16S rRNA ген, rpoB ген.

Род Lactobacillus является самым представительным по числу среди молочнокислых бактерий. Многие виды Lactobacillus spp. имеют важное значение для пищевой и медицинской промышленности в качестве заквасочных, стартовых и пробиоти-ческих культур [1, 2]. Поэтому для контроля качества и безопасности продуктов питания важной задачей является их правильная таксономическая идентификация. Влияние различных факторов на фе-нотипические показатели, а также высокий уровень фенотипической изменчивости лактобацилл способствуют широкому применению генетических методов для видовой идентификации [3]. Метод ДНК/ДНК гибридизация является "золотым стандартом" видовой идентификации, но трудоемкость и высокая стоимость не позволяют использовать его как рутинный метод. Альтернативным подходом является анализ последовательности ДНК. На современном этапе секвенирование ДНК — недорогой и быстрый метод, позволяющий создавать общедоступные базы данных нуклеотидных последовательностей. Все эти составляющие способствуют интенсивному развитию данного метода идентификации. Для того чтобы анализ нуклеотидных последовательностей обладал высоким таксономическим разрешением необходимо подобрать генетические маркеры, позволяющие надежно дифференцировать лактоба-циллы до вида. Широко используемый в таксономии ген 16S rRNA не позволяет точно дифференцировать новые выделенные в результате скрининга

штаммы бактерий. Необходимы новые генетические маркеры (гены), которые по своей информативности могут быть идентичны или превосходить ДНК/ДНК гибридизацию. Комитет по переоценке бактериальных видов [4] рекомендует проведение анализа пяти генов, что может предоставить достаточную информацию для видовой идентификации микроорганизмов.

Высокую дискриминационную характеристику видов лактобацилл показали фрагменты нуклеотидных последовательностей tuf [5], pheS, rpoA [6] и hsp60 [7] генов. Кроме того, гены, кодирующие указанные белки, обладают двойным потенциалом: использование нуклеотидной последовательности для дифференциации близкородственных видов, а также использование аминокислотной и нуклеотидной последовательностей для филогении и таксономии отдаленных и близко связанных таксонов. Нуклео-тидная последовательность rpoB гена кодирует бе-та-субъединицу РНК-полимеразы и встречается в единичной копии в геноме лактобацилл [8]. Эволю-ционно древнее происхождение этого гена свидетельствует о его потенциале как бактериального хронометра [9].

Целью данного исследования являлось изучение возможности использования нуклеотидной и аминокислотной последовательности фрагмента rpoB гена в качестве альтернативного генетического маркера видовой дифференциации и филогении видов Lactobacillus spp.

1 РГП Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан КН МОН РК, г. Астана.

2 ДГП Республиканская коллекция микроорганизмов, Республика Казахстан, г. Астана.

Материалы и методы

В исследовании были использованы образцы ДНК, полученные методом Kate Wilson [10] из 66 культур лактобацилл, выделенных из кисломолочных продуктов разных районов республики Казахстан и выращенных на среде MRS 1 (Hi-Media, India).

Амплификация фрагмента rpoB гена была выполнена в объеме 30 мкл ПЦР, смесь содержала 150 нг ДНК, 1 Ед. Maxima Hot Start Taq DNA Polymerase (Fermentas), 0,2 mM каждого дНТФ, 1-х ПЦР буфер (Fermentas), 1,5 mM MgCl2, 15 пмоль каждого праймера. Нами были подобраны праймеры, содержащие вырожденные нуклеотидные позиции на 3' конце For-rpoB 5' — TAACCgTggTgCTTggCTDgA-ATWYgAAAC — 3'; Rev-rpoB 5' — ATCAAACCAAT-gTTAggNCCTTCWggDgTTTC — 3'. Программа ПЦР амплификации включала длительную денатурацию 95° в течение 7 мин; 30 циклов: 95° — 50 с, 59° — 1 мин, 72° — 1 мин 30 с; заключительная элонгация 7 мин при 72°, ПЦР программа была выполнена с применением амплификатора DNA Engine Tetrad 2 Cycler PTC-0240 (Bio-Rad).

Определение нуклеотидной последовательности. При очистке ПЦР продуктов использовали ферментативный метод [11]. Реакцию секвенирования проводили с применением BigDyeTerminator v3.1 Cycle Sequencing Kit и подобранных праймеров согласно инструкции производителя, с последующим разделением фрагментов на автоматическом генетическом анализаторе 3730 х l DNA Analyzer (Applied Biosystems).

Анализ нуклеотидных последовательностей. Нук-леотидные последовательности были проанализированы и объединены в общий контиг, используя программное обеспечение SeqScape 2.6.0 (Appfed Biosystems). Филогенетический анализ проводили с использованием программного обеспечения Mega 3.1. Выравнивание нуклеотидных последовательностей делали, используя алгоритм ClustalW, построение филогенетических деревьев проводили с использованием метода ближайших соседей (Neiighbor-Joi-ning NJ). Идентичность нуклеотидной последовательности рассчитывали с использованием программного обеспечения MegAlign 6.00 DNASTAR Inc. Дополнительно в анализ были включены нуклеотидные последовательности rpoB гена 23 видов лактобацилл, а также Bacillus subtillis и Escherichia coli.

Исследуемые культуры были предварительно идентифицированы методом анализа нуклеотидной последовательности 16S rRNA гена в GenBank по алгоритму

BLAST, с применением программного обеспечения MicroSeq ID (Applied Biosystems).

Результаты и обсуждение

Амплифицикация фрагмента rpoB гена размером 1100 п.н. методом ПЦР 66 культур представлена на рис. 1.

Для анализа использовали фрагмент нуклеотидной последовательности rpoB гена длиной 769 п.н. (исключая последовательность праймеров и неперекрывающихся областях).

Результаты филогенетического анализа нуклео-тидных последовательностей 66 анализируемых микроорганизмов отображены на дендрограмме (рис. 2). Нуклеотидные последовательности rpoB гена 35 идентифицируемых культур (K-0015, K-0023, K-0024, K-0025, K-0041, K-0043, K-0103, K-0104, K-0105, K-0106, K-0108, K-0149, K-0153, K-0154, K-0155, K-0201, K-0208, P-001, P-003, P-006, P-010, P-012, P-019, P-020, P-021, P-025, P-027, P-028, P-159, P-034, P-96, P-039, P-41, P-043, P-51) расположены на одной филогенетической ветви с L. paracasei ssp. paracasei 8700:2, L. paracasei ssp. paracasei ATCC 25302 и референтными штаммами L. casei ATCC334, L. casei BL23. При идентификации данных культур по 16S rRNA максимальная идентичность была получена с L. paracasei. Внутривидовой полиморфизм rpoB гена L. paracasei не превысил 0,8%.

Нуклеотидные последовательности rpoB гена идентифицируемых культур P-86, P-67, P-73, P-85, P-78, P-79, P-98, P-66 при анализе сформировали отдельную филогенетическую ветвь с L. rhamnosus GG и L. rhamnosus Lc 705. Данные культуры по гену 16 S rRNA были идентифицированы как L. rham-nosus. Вариабельность нуклеотидных последовательностей rpoB гена среди L. rhamnosus не превышала 1,7%, однако была значительно выше, чем в L. casei. Важно отметить, что нуклеотидная идентичность между филогенетически близкородственными бактериями группы L. casei, такими как L. rhamnosus GG и L. paracasei, составила от 85,6 до 86,1%, тогда как межвидовая идентичность 16 S rRNA гена составила более 98%, что не позволяет однозначно диф-

Рис. 1. Электрофорерограмма ПЦР продуктов амплификации фрагмента rpoB гена. 1—47 образцы, М — маркер 100—1000 п.н. шаг 100 п.н., Fermentas, "К—" — отрицательный контроль

постановки ПЦР

ft

K-0025 K-0041 K-0024 K-0023 K-0015

L.paracasei subsp. paracasei 8700:2

P-010

K-0043

K-0103

K-0104

K-0106

K-0105

K-0108

P-027

P-003

P-028

L.casei ATCC 334 K-0208 P-159 P-96 \P-41 I P-51

L.paracasei subsp. paracasei ATCC 25302 P-039

L.casei BL23

P-043

K-0201

P-006

P-012

P-019

P-020

P-021

P-034

K-0149

K-0153

K-0154

K-0155

P-86

P-67

L.rhamnosus GG P-73

L.rhamnosus Lc 705

P-85

P-78

P-79

P-98

P-66

L.sakei subsp. sakei 23K L.iiters DSM 13335 L.jensenii JV-VJ6

_I L.johnsonii FI9785

J1 L.johnsonii NCC 533 '— L.gasseri A TCC 33323  L.crispatus MV-3A-US L.ultunensis DSM 16047

L. acidophilus NCFM L.helveticus DPC 4571 L.ruminis A TCC 25644 I L.reuteri DSM 20016 L.reuteri JCM 1112

— L. vaginalis A TCC 49540

— L. an tri DSM 16041

— L.coleohominis 101-4-CHN _I L.fermentum IFO 3956

I P-59 r ¡'-005 "L P-231 P-024 P-025-2 j L.buchneri ATCC 11577 l;..............

1 L. hilgarciii A TCC 8290  L.salivarius VCCI 18 K-0007 K-0010 K-0006 K-0005 K-0004 K-0011

L.brevis ATCC 367 P-014 P-032 P-042 P-040NTL K-0202 NTL K-0021

L.plantarum WCFS1

L.plantarum JDM1

K-0012

K-0026

K-0044

K-0110

K-0048

К-0203

B.subtilis subsp. subtilis sir. 168

I L.clelbrueckii subsp. bulgaricus ATCC ... ~ L. delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC... -- E.coli 536

h

0,1

4

Рис. 2. Филогенетическое дерево, построенное по нуклеотидной последовательности

rpoB гена

ференцировать указанные виды. Нуклеотидная идентичность гроВ гена Ь. рагаса&е1 и Ь. гкатпош& к Ь. заке1 не превысила 77%, тогда как по 16Б гЯИЛ гену процент составил 90,1 и 90,7% соответственно.

Уровень генетического родства гроВ гена исследуемой культуры Р-59 по отношению к Ь./ег-тепШт №03956 составила 99,9%, а к наиболее близкородственному виду Ь. геШеп — 91,0% по 16БгШЛ и 76,8% по гроВ гену.

Нуклеотидная последовательность гроВ гена культур Р-005, Р-231 и Р-024, Р-025-2, идентифицированных как Ь. рагаЬыскпе-п и Ь. Ьыскпеп, сформировала две филогенетические ветви, отдаленно расположенные от референтного штамма Ь. Ьыскпеп АТСС11577. Последний в свою очередь расположен на одной филогенетической ветви с Ь. кИ^агйИ АТСС8290, являющимся неотипом для данного вида. Идентичность нуклеотидной последовательности гроВ гена между ними составила 99,6%, а сродство Ь. Ьыскпеп АТСС 11577 с Р-005, Р-231 и Р-024, Р-025-2 составила 84,3%, 83,9% и 87,3%, 86,6%, соответственно. Важно отметить, что различие в уровнях генетического родства гроВ гена Р-005, Р-231 (Ь. рагаЬыскпеп) и Р-024, Р-025-2 (Ь. Ьыскпеп) превысило 12,0%, а 16Б гШЛ — всего 2,0—2,5%.

Как видно на рис. 2, идентифицируемые культуры К-0007, К-0010, К-0006, К-0005, К-0004, К-0011, Р-014, Р-032 и Р-042 филогенетически связаны с Ь. Ьгеу1& АТСС 367, процент идентичности гроВ гена между ними составил 99,9—100%.

Нуклеотидные последовательности гроВ гена выделенных культур Р-040, К-0202, К-0021, К-0012, К-0026, К-0044, К-0110, К-0048 и К-0203 анализировали по отношению к последовательности гроВ генам референтным штаммам Ь. р1ап-1агыт WCFS1 и Ь. р1аМагыт .ГОМ1. Уровень генетического родства внутри данной группы составил 99,9—100%. В нашей выборке отсутствуют близкородственные виды

P-41

P-51

P-96

P-JS9

K-0208

K-0108

K-010S

P-039

P-034

P-021

P-020

P-0J9

P-012

P-006

K-0201

P-043

P-02S

K-0155

K-01S4

K-0J53

K-0106

K-0104

K-0103

K-0043

K-0041

K-0025

K-0024

K-0023

K-0015

P-010

P-001

P-003

P-02 7

P-02S

L. casei JBL23 L. casei TCC 334

L.paracasei subsp. parcicasei A TCC 25302 L.paracasei subsp. paracasei 8700:2 K-0149 P-86 P-67

L.rhamnosus GG

L.rhamnosus / c 705

P-73

P-85

P-78

P-79

P-98

P-66

L.sakei subsp. sakei 23K

I L.delbrueckii subsp. bulgaricus A TCC... L. delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC... L.iners DSM 13335 L.iensenii JK- VI6 L.jolinsonii FI9785 L.jolinsonii NCC 533 L.gasseri A TCC 33323 L.ufiunensis DSM 16047 L.crispatus MV-3A-US L.acidophilus NCFM L.Itelveticus DPC 4571 P-0401WTI K-0202 NTI K-0203 K-0048 K-Ol 10 K-0044 K-0026 K-0021 K-0012

L.plantaruni WCFS1 L.plantarutn JDM1

L.ruminis A TCC 25644 L.salivarius UCC118 L.antri DSM 16041 L. vaginalis A TCC 49540 L.reuteri DSM 20016 L. reuteri JCM1112

L.coleohominis 101-4-CIIN

_| L.fermentum TFO 3956

I P-59

i P-005 _P ¡'-231

_I L.buchneri A TCC 11577

I L. hilgardii A TCC 8290 L. brevis A TCC 367 K-0011 K-0004 K-0005 K-0006 K-0007

K-ooio

P-014 P-032 P-042

B.subtilis subsp. subtilis sir. 168 E.coli 536

с L. plantarum составила около 92,0%, а идентичность фрагмента rpoB гена не превысила 82,0%.

Отмечено, что топология дерева, построенного на нук-леотидной последовательности rpoB гена, значительно отличается от традиционной филогении, построенной на анализе 16S rRNA гена (рис. 3). Согласно филогенетической структуре рода Lactobacillus, построен -ной на основании нуклеотид-ныгх последовательностей гена 16SrRNA, L. delbrueckii входит в группу L. acidophilus [10], тогда как при анализе нук-леотидной последовательности rpoB гена L. delbrueckii ssp. bulgaricus сформировали отдельную филогенетическую ветвь, а L. sakei, традиционно входящий в группы L. casei по нук-леотидной последовательности rpoB гена, стал ближе к группе L. acidophilus. Кроме того, анализ гена rpoB показал, что L. brevis филогенетически ближе к L. plantarum, тогда как по 16S rRNA он входит в группу L. buchneri. Также L. rumi-nis ATCC 25644 вместе с L. sa-livarius UCC118, традиционно входящие в одну филогенетическую группу L. salivarius, расположены на разных ветвях.

Заключение

Рис. 3. Филогенетическое дерево, построенное по аминокислотной последовательности бета-субъединицы РНК-полимеразы и традиционной филогении по 16S rRNA гену

группы L. plantarum (Ь. paraplantarum и L. pentosus), что не позволило нам оценить дискриминационную характеристику rpoB гена для видов данной группы. Но в целом отмечена общая тенденция уменьшения процента сродства L. plantarum к другим видам. Так, например, идентичность фрагмента нукле-отидной последовательности 16S rRNA гена L. brevis

Ген rpoB уже был использован в качестве генетического маркера при идентификации бактерий, отнесенных к типу Firmicutes. Например, анализ 318 п.н. позволил дифференцировать бациллы B. anth-racis от B. cereus и B. thuringi-ensis [11], а также от молочнокислых бактерий методом PCR-DGGE [12]. Аминокислотная последовательность бе-та-субъединицы РНК-полимеразы была использована при изучении филогении грамположительных, грамотрицательных бактерий и представителей Ar-chaea [13—16]. Однако идентификационная и филогенетическая способность нуклеотидной и аминокислотной последовательностей rpoB гена не была изучена для рода Lactobacillus spp. В нашем иссле-

довании были подобраны праймеры, позволяющие амплифицировать фрагменты rpoB гена лактобацил, входящие в различные филогенетические группы (L. casei, L. reuteri, L. plantarum, L. buchneri). В целом анализ нуклеотидной последовательности rpoB гена показал высокую идентификационную способность генетически и фенотипически близкородственных бактерий рода Lactobacillus по сравнению

с дискриминационным свойством 16S rRNA гена. Топология дерева на основе анализа аминокислотной последовательности только по 16S rRNA гену является недостаточной для идентификации генов близкородственных видов Lactobacillus. Анализ нук-леотидной последовательности rpoB гена может быть использована как филогенетический маркер.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Claesson M.J., van Sinderen D, O'Toole P.W. The genus Lactobacillus — a genomic basis for understanding its diversity // FEMS Microbiol. Let. 2007. Vol. 269. Is. 1. P. 22—28.

2. Mаkarova K.S., Koonin E.V.Evolutionary genomics of lactic acid bacteria //J. Bacteriol. 2007. Vol. 189. P. 1199—1208.

3. Kao Y.T., Liu Y.S., Shyu Y.T. Identification of Lactobacillus spp. in probiotic products by real-time PCR and melting curve analysis // Food Research Int. 2007. Vol. 40. Is. 1. P. 71—79.

4. Stackebrandt E, Frederiksen W, Garrity G.M., Gri-mont P.A.D., Kampfer P., Maiden M.C.J, Nesme X., Rossel-lo-Mora R, Swings J, Truper H.G, Vauterin L, Ward A.C., Whitman W.B. Report of the ad hoc committee for the re-evaluation of the species definition in bacteriology // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. Vol. 52. P. 1043—1047.

5. Chavagnat F, Haueter M, Jimeno J., Casey M.G. Comparison of partial tuf gene sequences for the identification of lactobacilli // FEMS Microbiology Letters. 2002. Vol. 217. P. 177—183.

6. Naser S.M., Dawyndt P., Hoste B., Gevers D, Vande-meulebroecke K., Cleenwerck I., Vancanneyt M., Swings J. Identification of lactobacilli by pheS and rpoA gene sequence analyses // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. Vol. 57. P. 2777—2789.

7. Blaiotta G., Fusco V., Ercolini D., Aponte M, Pepe O., Villani F. Lactobacillus strain diversity based on partial hsp60 gene sequences and design of PCR-restriction fragment length polymorphism assays for species identification and differentiation // Appl. Environ. Microbiol. 2008. Vol. 74. P. 208—215.

8. Morse R, Collins M.D, O'Hanlon K., Wallbanks S., Richardson P.T. Analysis of the beta' subunit of DNA-de-pendent RNA polymerase does not support the hypothesis inferred from 16S rRNA analysis that Oenococcus oeni (for-

merly Leuconostoc oenos) is a tachytelic (fast-evolving) bacterium // Int. J. Syst. Bacteriol. 1996. Vol. 46. Is. 4. P. 1004—1009.

9. Adekambi T., Drancourt M, Raoult D. The rpoB gene as a tool for clinical microbiologists // Trends in Microbiology. 2009. Vol. 17. N 1.

10. Wilson K. Preparation of genomic DNA from bacteria, in Current Protocols in Molecular Biology (Ausu-bel F.M., Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A. et al.). Wiley; New York, 1987. P. 241—245.

11. Werle E, Schneider C., Renner M., Volker M, Fi-ehn W. Convenient single-step, one tube purification of PCR products for direct sequencing // Nucleic Acids Res. 1994. Vol. 22. P. 4354—4355.

12. Ko K.S., Kim J.M, Kim J. W, Jung B. Y, Kim W., Kim IJ, Kook Y.-H. Identification of Bacillus anthracis by rpoB sequence analysis and multiplex PCR // J. Clinic. Microbiol. 2003. Vol. 41. Is. 7. P. 2908—2914.

13. Rantsiou K., Comi G., Cocolin L. The rpoB gene as a target for PCR-DGGE analysis to follow lactic acid bacterial population dynamics during food fermentations // Food Microbiol. 2004. Vol. 21. P. 481—487.

14. Morse R., O'Hanlon K., Collins M.D. Phylogenetic, amino acid content and indel analyses of the beta subunit of DNA-dependent RNA polymerase of Gram-positive and Gram-negative bacteria // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. Vol. 52. P. 1477—1484.

15. Pot B., Tsakalidou E. Taxonomy and metabolism of lactobacillus. Lactobacillus molecular biology from genomics to probiotics. L.: Caister Academic Press, 2009. P. 26—27.

16. Matte-Tailliez O., Brochier C., Forterre P., Philippe H. Archaeal phylogeny based on ribosomal proteins // Mol. Biol. Evol. 2002. Vol. 19. P. 631—639.

Поступила в редакцию 29.05.10

THE IDENTIFICATION OF LACTOBACILLUS spp. ON THE BASE OF ANALYSIS

OF GENE FRAGMENT BETA- SUBUNIT RNA -POLYMERASE

A.B. Shevtsov, A.R. Kushugulova, S.S. Kojakhmetov, S.S. Oralbaeva,

L.G. Stoyanova, A.B. Seidalina, K.T. MoMinaliev

It was carry out a comparative analysis of the nucleotide sequences of the rpoB gene to assess its use as a genetic marker for identification genus Lactobacillus spp., obtained from acid milk product of different regions of Kazakhstan. Discriminatory ability of the nucleotide sequence analyze of rpoB gene is higher than the 16S rRNA gene for closely related species of the Lactobacillus genus. Phylogeny of nucleotide sequence of rpoB gene is identical to 16S rRNA gene and can be used as its additional phylogenetic marker.

Key words: Lactobacillus, beta-subunit of RNA- polymerase, identification, sequencing, phylogeny, 16S rRNA gene, rpoB gene.

Сведения об авторах

Шевцов Александр Борисович — науч. сотр. Национальной научной лаборатории коллективного пользования РГП Национальный центр биотехнологии РК КН МОН РК. Тел. 87172200793; e-mail: nmcrshevtsov@mail.ru

Кушугулова Алмагулъ Рахимберлиевна — канд. мед. наук, зав. лабораторией коллекции микроорганизмов, ДГП Республиканская коллекция микроорганизмов РГП "НЦБ РК" КН МОН РК. Тел. 87172200793; факс: 87172200927, e-mail: Lgene@biocenter.kz

Кожахметов Самат Серикович — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаборатории генетики и биохимии микроорганизмов, ДГП Республиканская коллекция микроорганизмов РГП "НЦБ РК" КН МОН РК. Тел. 87172200793; факс: 87172200927, e-mail: Lgene@biocenter.kz

Оралбаева Сания Саттыбаевна — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. Национальной научной лаборатории коллективного пользования РГП Национальный центр биотехнологии РК КН МОН РК. Тел. 87172200793; e-mail: soralbaeva@mail.ru

Стоянова Лидия Григоръевна — докт. биол. наук кафедры микробиологии биологического факультета МГУ. Тел. 939-27-63; e-mail: stoyanovamsu@mail.ru

Сейдалина Айгерим Бекболатовна — мл. науч. сотр. Национальной научной лаборатории коллективного пользования РГП Национальный центр биотехнологии РК КН МОН РК. Тел. 87172200793.

Момыналиев Куват Темиргалиевич — докт. биол. наук, гл. науч. сотр. Национальной научной лаборатории коллективного пользования РГП Национальный центр биотехнологии РК КН МОН РК. Тел. 87172200793.