Крем с секретомом мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток для коррекции псориазиформного воспаления в эксперименте
CREAM WITH SECRETORY OF MULTIPOTENT MESENCHYMAL STROMAL CELLS FOR CORRECTION OF PSORIASIFORM INFLAMMATION IN EXPERIMENT

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии.
Известно техническое решение, в котором применяют состав для распыления, содержащий клобетазол, для лечения псориаза (RU № 2397769, публ. 10.06.2009). В известном решении на пораженную псориазом кожу ежедневно в течение 4 недель распыляют композицию, содержащую эффективное количество пропионата клобетазола. Кроме того, композиция включает этиловый спирт, изопропилмиристат и анионный сурфактант.
Недостатком указанного способа является то, что, как известно, топические кортикостероиды имеют множество побочных эффектов в виде диспигментации, гипертрихоза, а также стероид-зависимого дерматита, тахифилаксии, развития кушингоида (Sharma R., Abrol S., Wani M. Misuse of topical corticosteroids on facial skin. A study of 200 patients.  J Dermatol Case Rep. 2017 Mar 31;11(1):5-8. doi: 10.3315/jdcr.2017.1240);
Meena S, Gupta L.K., Khare A.K., Balai M., Mittal A., Mehta S., Bhatri G. «Topical Corticosteroids Abuse: A Clinical Study of Cutaneous Adverse Effects», Indian J Dermatol. 2017 Nov-Dec;62(6):675. doi: 10.4103/ijd.IJD_110_17;
Singh S.K., Nasir F. «The reservoir effect of topical steroids in vitiliginous skin: A cross-sectional study», Indian J Dermatol Venereol Leprol. 2015 Jul-Aug;81(4):370-5. doi: 10.4103/0378-6323.159933;
Н.С. Потекаев, А.Н. Львов, В.В. Фадеев, В.В. Самойленко «Тяжелые системные побочные эффекты топической стероидной терапии псориаза», Клиническая дерматология и венерология 1, 2013.
Известно техническое решение крем лечебно-профилактический "Чистопсор" (RU № 2307646, публ. 10.10.2007), включающий чистотел большой, череду трехраздельную и вазелин медицинский, дополнительно содержит корень щавеля конского, яичный белок, цветочный пчелиный мед и лецитин.
Недостатком данного средства является большое количество растительных компонентов, которые могут вызвать аллергические реакции в виде кожной сыпи, зуда. (Kim J.D. , Kim S.Y., Kwak E.J., Sol I.S., Kim M.J., Kim Y.H., Kim K.W., Sohn M.H. «Reduction Rate of Specific IgE Level as a Predictor of Persistent Egg Allergy in Children», Allergy Asthma Immunol Res. 2019 Jul;11(4):498-507. doi: 10.4168/aair.2019.11.4.498;
Bellón T. «Mechanisms of Severe Cutaneous Adverse Reactions: Recent Advances», Drug Saf. 2019 Apr 24. doi: 10.1007/s40264-019-00825-2;
Pokladnikova J, Meyboom R.H., Meincke R., Niedrig D., Russmann S. «Allergy-Like Immediate Reactions with Herbal Medicines: A Retrospective Study Using Data from VigiBase», Drug Saf. 2016 May;39(5):455-64. doi: 10.1007/s40264-016-0401-5).
Таким образом, проблема поиска новых лекарственных препаратов для лечения псориаза остается актуальной задачей. Одними из перспективных направлений в этой области является использование секретом мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК). Известно противовоспалительное и иммуносупрессивное действие ММСК за счет ингибирования активности цитотоксических Т-лимфоцитов, дендритных клеток, макрофагов, стимуляции регуляторных Т-лимфоцитов, с соответствующими сдвигами в продукции цитокинов, в том числе – снижение дифференцировки Th17 и повышение дифференцировки и активности регуляторных Т-лимфоцитов (Bassi, E.J., Aita, C.A. and Camara, N.O. Immune regulatory properties of multipotent mesenchymal stromal cells: Where do we stand? World J Stem Cells. 2011, Vol. 3, 1;    Mengyuan, W., Quan, Y., Liang X. Mesenchymal Stem Cell-Based Immunomodulation: Properties and Clinical Application. 2018. Article ID 3057624;     Ghannam, S., Pène, J., Torcy-Moquet, G., et al. Mesenchymal stem cells inhibit human Th17 cell differentiation and function and induce a T regulatory cell phenotype. J Immunol. 2010, Vol. 185, pp. 302–312).
Особенность использования ММСК в медицине связана с возможностью их аллогенного введения, обусловленного такими свойствами этих клеток, как иммунопривелигерованность и способность к иммуносупрессии, которые к настоящему времени достаточно подробно изучены (Uccelli et al., 2006; Nauta & Fibbe, 2007; Jones &McTaggart 2008; Ankrum et al., 2014; Castro-Manrreza & Montesinos, 2015).
Известно, что мультипотентные мезенхимальные стромальные/стволовые клетки (ММСК) (Caplan,1991; Horwitz et al., 2005) способны мигрировать в поврежденные ткани-мишени, обеспечивая репарацию, поддерживать гемопоэз, а также подавлять иммунный ответ при аутологичном и аллогенном введении (Caplan, 2007; Da Silva Meirelles et al., 2008; Murphy et al., 2013).
Кроме того, ММСК костного мозга обладают высокой миграционной способностью, секретируют большое число биологически активных молекул и обладают иммуномодулирующим действием. Этими ключевыми свойствами ММСК костного мозга и обусловлена возможность их эффективного применения в качестве источников стволовых клеток для лечения гематологических, аутоиммунных, сердечно-сосудистых заболеваний, травм и заболеваний костно-суставной системы (Wang et al., 2011; Bernardo et al.,2012). Известно применение ММСК с противовоспалительной (Патент на изобретение № 2604672 Способ лечения септического шока в состоянии агранулоцитоза») и иммуносупрессивной (Патент на изобретение № 2298410 C1, 10.05.2007 - биотрансплантат для лечения аутоиммунных и ревматических заболеваний, содержащий мезенхимальные стволовые клетки) целью, а их секретома в регенеративной медицине - патент №217.015.CA5C 25.08.2017 «Способ получения средства для стимуляции регенерации на основе продуктов секреции мультипотентных мезенхимных стромальных клеток человека» и  патент № 2280459 C1 – «средство для изменения скорости роста или репродукции клеток и для лечения, в том числе ран и ожогов, содержащее кондиционированную клеточную культуральную среду».
Задачей предполагаемого изобретения является создание более эффективного средства – крема, включающего использование секретома мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, обладающего противовоспалительной и иммуносупрессивной активностью за счет комплекса гуморальных факторов для коррекции псориазиформного воспаления.
Поставленная задача решается с помощью предлагаемого крема с секретомом мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток для коррекции псориазиформного воспаления в эксперименте, содержащего секретом мультипотентных мезенимальных стромальных клеток и индифферентный  детский крем, в следующем соотношении, в мл.:
-  8 - 10 секретома мультипотентных мезенимальных стромальных клеток, содержащего 10-1000 мкг белка на 1 мл питательной среды
-     индифферентную кремовую основу – до 100.
Такое соотношение компонентов приводит к коррекции воспаления при моделируемой патологии. Данный эффект связан с выраженным противовоспалительным и иммуносупрессивным действием комплекса гуморальных факторов, составляющих секретом ММСК.
СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ СЛЕДУЮЩИМ ОБРАЗОМ.
Приготовление крема с секретомом ММСК
В стерильных условиях в объем посуды вносили 10 мл секретома ММСК, содержащего 10-1000 мкг белка на 1 мл питательной среды. Секретом ММСК получают путем сбора питательной бессывороточной среды (МЕМ, DMEM, DMEM/F12, α-МЕМ, IMEM, изотонического солевого раствора, с рН 6,7-7,4, в любых их сочетаниях), в которой культивировали 1×105 – 1×108 ММСК на 1 мл, в течение 1-4 суток.  Затем добавили объемом до 100 мл индифферентный крем  (детский крем). После чего тщательно смешивали в течение 5-10 минут до получения однородной консистенции, затем полученный крем перекладывали в стерильную упаковку. Хранение крема перед использованием и в процессе эксперимента осуществляли при температуре +4°С.
Изобретение поясняется иллюстрациями, на которых:
Фиг. 1 и Фиг. 2 - развитие воспаление, после которого начиналось лечение;
Фиг. 3 –  результат лечения в группе с отрицательным контролем (животные получали детский крем);
Фиг. 4  -    результат лечения кремом, содержащим секретом ММСК.
Морфометрические показатели представлены на Фиг. 5-7:
Фиг. 5  -  показатели общей клеточности препаратов. * - p<0,05;
Фиг. 6  -  показатели толщины дермы. * - p<0,05;
Фиг. 7  -  выраженность акантоза. * - p<0,05.
Опыты проводят на белых крысах самцах линии Wistar 214 до 256 г, на которых было смоделировано псориазиформное воспаление. Псориазиформное воспаление вызывали путем ежедневного нанесения на кожу спины по 50 мкл 1% суспензии Imiquimod (Xi'an Leader Biochemical Engineering Co.,Ltd, China) в оливковом масле с ДМСО и с 1 мл ацетона в соотношении 1:8:1, в течение 4 дней.
После развития выраженного воспаления с появлением крупнопластинчатого шелушения, экскориаций, с обеих сторон начинали лечение: с одной стороны каждое животное получало детский крем (отрицательный контроль), с другой стороны –крем с добавлением секретома ММСК в соответствующей группе, нанесение осуществляли 1 раз в день в течение 3 дней. На 8-й день эксперимента животных подвергали эвтаназии и забирали фрагменты кожи на гистологическое исследование.
Фрагменты кожи фиксировали 4% формальдегидом, окрашивали гематоксилином и эозином. Морфометрические исследования проводили на микроскопе AxioScope A1 в программном пакете Fiji (ImageJ 2.0). Статистическую обработку проводили в MS Excel 2013 с использованием критерия Даннета.
При статистической обработке данных рассчитывается среднее значение, величину стандартного отклонения. Различия считаются достоверными при p<0,05.
ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ.
Выявлена эффективность местного применения секретома ММСК в купировании псориазиформного воспаления у крыс линии Wistar как по клиническим признакам, так и по морфометрическим показателям. Так общая клеточность препаратов в отрицательном контроле (животные получали детский крем) составила 876,9±77,5 (M±sd), а в опытной группе – 589,4±105,4. Толщина дермы в мкм в контроле – 893,0±71,1, а в случае применения секретома ММСК – 629,1±48,0. Также под влиянием факторов, продуцируемых ММСК, статистически значимо уменьшался такой характерный для псориатического поражения кожи признак, как акантоз: 253,6±35,9 мкм в опытной группе, получавшей крем с ММСК и 677,1±80,6 мкм в отрицательном контроле (применялся детский крем). Данные полученных исследований приведены в таблице 1.
Таблица 1
Таким образом, противовоспалительная и иммуносупрессивная активность комплекса гуморальных факторов, составляющих секретом ММСК, обеспечила купирование острого псориазиформного кожного воспаления.