ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭЛЕКТРОПРОВОДЯЩИХ ПОЛИМЕРОВ
ENZYMATIC METHOD OF PRODUCING ELECTROCONDUCTIVE POLYMERS

Изобретение относится к биотехнологии и имеет широкую область применения. Электропроводящие полимеры, к которым относятся полианилин, полипиррол, политиофен и их замещенные производные имеют широкий спектр потенциального использования в электронных и оптоэлектронных наноустройствах, сенсорах, «легких» батареях, системах преобразования энергии, защиты от коррозии, статического электричества и электромагнитного излучения, для создания искусственных мышц и интерфейсов между электронными и биологическими системами (В.Wessling, Synthetic Metals 93 (1998) 143-154; L.Groenendaal, F.Jonas, D.Freitag, H.Pielartzik, J.R.Reynolds, Advanced materials, 12 (2000) 481-493; B.Ch. Liu, L.-P. Ma, H.-M. Cheng, Advanced materials, 22 (2010) E28-E62). В зависимости от требуемых свойств, например электропроводности, растворимости, способности к пленкообразованию, используют соответствующие мономеры, имеющие в своей структуре различные функциональные группы в различных положениях.
2
4
Как правило, электропроводящие полимеры синтезируют химическим или электрохимическим способами. Электрохимическая полимеризация мономеров протекает без добавления химических окислителей, но лимитируется наличием электропроводящей подложки и ее ограниченными размерами. Химическое окисление является достаточно простым методом получения электропроводящих полимеров с использованием сильных окислителей, таких как персульфат аммония, солей ионов трехвалентного железа, бихроматов, перманганатов в количествах, соизмеримых или многократно превышающих концентрации используемых мономеров. Продукты восстановления этих соединений необходимо перерабатывать, что создает дополнительные затраты при осуществлении синтеза электропроводящих полимеров. Кроме того, синтез некоторых проводящих полимеров (например, полианилина) необходимо проводить в сильно кислой среде (1М HCl или 1М HSO) для обеспечения линейной, электропроводящей структуры полианилина, сформированной по типу «голова к хвосту» (J.-C. Chiang, A.G. Mac Diarmid, Synthetic Metals 13 (1986) 193-205; Y. Cao, P. Smith, A.J. Heeger, Synthetic Metals 32 (1989) 263-281). Это требует наличия коррозионно-устойчивой аппаратуры.
Полученные таким образом электропроводящие полимеры имеют крайне низкую растворимость в большинстве известных органических и неорганических растворителей и плохие эксплуатационные характеристики. Для преодоления этого недостатка используют различные подходы, такие как проведение синтеза в мицеллярных растворах, межфазную полимеризацию, нейтральные растворимые полимерные стабилизаторы и полисульфокислоты. Несмотря на большую привлекательность практического использования электропроводящих полимеров, используемые способы химического синтеза, как уже отмечалось выше, являются неудовлетворительными. Кроме того, синтезированные приведенными выше способами электропроводящие полимеры имеют непостоянный состав, который может меняться при небольших изменениях условий синтеза (J.S.Stejskal, I.Sapurina, M.Troehova, E.N.Konyushenko, Macromolecules 41 (2008) 3500-3536).
Электропроводимость полимеров достигается, как правило, кислотным допированием. При этом анионы кислот являются заряд компенсирующими анионами в основной цепи электропроводящих полимеров.
В качестве кислых допирующих агентов используют как низкомолекулярные сильные кислоты (серная, соляная, сульфокамфорная, толуолсульфоновая и др.), так и полисульфокислоты (поли(2-акриламидо-2-метил-1-пропансульфокислота), сульфонированный полистирол и др.) (US Patent, 7462298; Eur. Patent 686662; US Patent 5792558) и мицеллообразующие гидрофобные сульфокислоты или их соли (додецилсульфонат натрия, додецилбензолсульфоновая кислота) (M.G.Han, S.H.Foulger, Small, 2 (2006) 1164-1169; V.Rumbau, J.A.Pomposo, J.A.Alduncin, H.Grande, D.Mecerreyes, E.Ochoteco, Enzyme and microbial technology, 40 (2007) 1412-1421; US Patent 7230071). Полисульфокислоты, а также мицеллообразующие гидрофобные сульфокислоты или их соли используются при проведении матричного синтеза электропроводящих полимеров для получения водных дисперсий наночастиц полимеров. Иногда в качестве допантов используют также кислоты Льюиса (W.Baik, W.Luan, R.H.Zhao, S.Koo, K.-S.Kim, Synthetic Metals, 159 (2009) 1244-1246).
Использование биокатализаторов для синтеза электропроводящих полимеров является альтернативой химическому синтезу и представляет большой интерес, т.к. позволяет проводить процесс окислительной полимеризации в экологически чистых и относительно мягких условиях (в водных растворах, при комнатной температуре, атмосферном давлении и слабокислых значениях pH реакционной среды), без образования большого количества токсичных побочных продуктов и получать полимер, не загрязненный продуктами разложения окислителя. Таким образом, этот подход во многом отвечает требованиям «зеленой» химии.
Однако, несмотря на привлекательность использования ферментов для синтеза электропроводящих полимеров, в научной и патентной литературе описано лишь ограниченное число примеров биокаталитического получения полианилина, полипиррола, политиофена с их помощью (US Patent 5420237; US Patent 6569651; R.Cruz-Silva, E.Amaro, A.Escamilla, M.E.Nicho, S.Sepulveda-Guzman, L.Arizmendi, J.Romero-Garcia, F.F.Castillon-Barraza, M.H.Farias, J.Colloid and Interface Science, 328 (2008) 263-269; Karamyshev A.V., Shieev S.V., Koroleva O.V., Yaropolov A.I., Sakharov I.Yu., Enzyme and microbial technology. 33 (2000) 556-564).
Наиболее часто биокатализаторы используют для синтеза электропроводящего полианилина.
При ферментативном синтезе полианилина к смеси свежеперегнанного под вакуумом анилина и кислотного допанта добавляли водный раствор биокатализатора. В качестве последнего использовали оксидоредуктазы (пероксидазы и лакказы), выделенные из различных объектов. Для пероксидазных реакций инициирование процесса полимеризации анилина проводили, добавляя по порциям в реакционный раствор пероксид водорода, при постоянном перемешивании. При использовании лакказы в качестве катализатора реакции окислительной полимеризации анилина окислителем являлся молекулярный кислород, образующий в качестве продукта восстановления воду.
Биокаталитический синтез электропроводящего полианилина, несмотря на экологическую привлекательность, также имеет ряд недостатков. Во-первых, большинство пероксидаз из различных источников являются кислотолабильными и могут быть использованы в синтезе только в узком интервале значений pH реакционного раствора - вблизи pH 4. При более высоких значениях pH реакционной смеси образуется неэлектропроводящий полимер разветвленного строения. При более кислых значениях pH пероксидазы диссоциируют на гем и апофермент, теряя свою каталитическую активность. Кислые значения pH реакционной среды необходимы для обеспечения электропроводимости полианилина. Во-вторых, в реакционную смесь необходимо добавлять по порциям второй, предварительно разбавленный субстрат пероксидазы - пероксид водорода, так, чтобы его концентрация в условиях синтеза не превышала 1 мМ. При более высокой концентрации пероксида водорода пероксидазы инактивируются, образуя с пероксидом водорода неактивное соединение. В третьих, пероксидазы из корней хрена и другие пероксидазы имеют слишком высокую стоимость для промышленного использования в синтезе электропроводящих полимеров. Лакказы по сравнению с пероксидазами имеют преимущества. Рекомбинантный фермент коммерчески производится фирмой «NOVOZYMES» (http://www.novozymes.com/). а в Российской Федерации разработана опытно-промышленная технология производства лакказы из базидиального гриба Trametes hirsuta. Грибные лакказы являются кислотостабильными ферментами и в качестве окислителя используют кислород воздуха. Однако по сравнению с пероксидазным окислением мономера, лакказа-катализируемая полимеризация анилина протекает медленнее и с меньшим выходом конечного продукта. Ферментативное окисление пиррола, тиофена, его производного 3,4-этилендиокситиофена (ЭДОТ) с участием пероксидаз и лакказ не происходит либо происходит крайне медленно. Таким образом, время проведения синтеза и расходы биокатализаторов возрастают, что приводит к увеличению стоимости конечного продукта.
В качестве прототипа выбран способ ферментативного синтеза электропроводящего полипиррола с использованием лакказы и органического усилителя скорости реакции полимеризации пиррола (Н.-К.Song, G.Т.R.Palmore, J.Phys.Chem.B, 2005, 109. 19278-19287.), включающий следующую последовательность операций:
- приготовление смеси пиррола и 2,2'-азино-бис(3-этил-бензотиазолин-6-сульфонат) диаммониевой соли (АБТС) в ацетатном буфере с pH 4,0;
- инициирование реакции добавлением раствора лакказы из гриба Trametes versicolor.
Реакцию проводили в чашках Петри при комнатной температуре. Соотношение концентраций мономера (пиррола) и ускорителя ферментативной реакции (АБТС) составляло 8:1. В отсутствие АБТС реакция окисления пиррола протекала с низкой скоростью. Недостатками известного способа проведения окислительной полимеризации пиррола являются высокая стоимость ускорителя ферментативной реакции - АБТС и необходимость его использования для полимеризации в больших концентрациях. Кроме того, образующиеся в результате ферментативой реакции катион-радикалы АБТС могут сочетаться с радикалами пиррола, приводя к модификации синтезированного полипиррола, ухудшая его свойства.
Задачей изобретения является разработка простого, экологически чистого способа получения электропроводящих полимеров в водонерастворимых и коллоидных формах с уменьшенным временем проведения синтеза, уменьшенной концентрацией редокс-медиатора в реакционной среде и отсутствием модификации редокс-медиатором получаемых полимеров. Поставленная задача решается предлагаемым способом, предусматривающим проведение окислительной полимеризации мономеров в присутствии медьсодержащих оксидаз (лакказ и билирубиноксидаз) и редокс-медиаторов этих ферментов, относящихся к солям комплексов переходных металлов, ускоряющих ферментативную реакцию окисления мономеров.
Лакказа (п-дифенол:кислород оксидоредуктаза, КФ 1.10.3.2) и билирубиноксидаза (билирубин:кислород оксидоредуктаза, КФ 1.3.3.5) катализируют окисление широкого круга органических и неорганических соединений, молекулярным кислородом с одновременным его восстановлением до воды. Названные оксидазы являются коммерчески доступными или могут быть получены стандартными способами. В принципе продуцентами этих ферментов могут быть как естественные организмы, так и организмы, измененные методами генной инженерии. Для получения особенно предпочтительных лакказ применяются грибы, такие как Pleurotus, Phlebia, Trametes, Cerrena, Panus {Trametes hirsuta, Trametes pubescens, Trametes ochracea, Cerrena maxima, Coriolopsis fulvocinerea, Trametes versicolor, Panus tigrinus), продуцентами билирубиноксидаз являлись грибы Myrothecium verrucaria, Trachyderma tsunodae.
Лакказы и билирубиноксидазы могут непосредственно окислять соединения, потенциалы которых ниже, либо незначительно превышают редокс-потенциал Т1 центра медьсодержащих оксидаз. При превышении потенциала окисления субстратов оксидаз более чем 200 мВ по сравнению с Т1 центром фермента (первичным акцептором электронов в активном центре оксидаз), эффективность ферментативного катализа с участием этих ферментов уменьшается, либо реакция не протекает вообще. Потенциалы окисления анилина, пиррола, тиофена и 3,4 этилендиокситиофена имеют высокие значения. Поэтому скорость окисления анилина с участием лакказ относительно невысока, а реакция окисления ЭДОТ не протекала вообще.
Редокс-медиаторами называют низкомолекулярные соединения, являющиеся субстратами лакказ или билирубиноксидаз, которые в результате ферментативного окисления образуют устойчивые высоко реакционные продукты. Последние в диффузионно-контролируемом режиме могут вступать в химические (неферментативные) реакции с другими соединениями, которые не подвергаются окислению с участием только медьсодержащих оксидаз. При этом окисленный медиатор восстанавливается окисляемым соединением до первоначальной формы и таким образом формируется замкнутый цикл. Образующаяся в процессе ферментативной реакции окисленная форма медиатора может далее окислять соединения с потенциалами ионизации, превышающими редокс-потенциал Т1 центра лакказ и ускорять реакцию окисления этих соединений (СХЕМА 1). Лакказа-медиаторые системы используют для деструкции ксенобиотиков, для делигнификации бумажной пульпы, отбеливания тканей (US Patent 5,965,510; WO 200,302,3133; WO 2003023043; WO 03016615; JP 2001037465).
Предлагаемый способ включает одну стадию: синтез электропроводящих полимеров (полианилина, полипиррола, политиофена) и их замещенных производных, в процессе окислительной полимеризации соответствующих мономеров и в присутствие растворенных в реакционной смеси ускорителя реакции, кислого допанта и окислителя - молекулярного кислорода - при pH 2,5-5,5, температуре 0-55°С, катализируемых оксидазой. В качестве растворителей используют водные или водно-органические растворы.
В качестве ускорителя ферментативной реакции используют соли цианидных комплексов переходных металлов, таких как гексацианоферрат(2+), октоциановольфрамат(4+), гексацианоосмиат(2+), гексацианорутениат(2+), октоцианомолибдат(4+), редокс-потенциалы (Е°) которых находятся в области 0,35-0,95 В отн. нормального водородного электрода (НВЭ). В качестве окислителя используют молекулярный кислород. В качестве биокатализаторов используют грибные лакказы и билирубиноксидазы. В качестве кислотного допанта используют сильные неорганические кислоты, органические сульфокислоты, полисульфокислоты или их соли и кислоты Льюиса.
Ферментативный способ получения электропроводящих полимеров с использованием низких концентраций усилителей реакции неорганической природы и кислотного допанта является экологически чистым, одностадийным, позволяет проводить процесс окислительной полимеризации мономеров с высокой скоростью и высоким выходом в кинетически контролируемом режиме, что удешевляет конечные продукты - полианилин, политиофен, полипиррол или их замещенные производные.
Изобретение поясняется следующими примерами.
Пример №1. Матричный синтез полианилина (ПАНИ) с использованием в качестве допанта поли(2-акриламидо-2-метил-1-пропансульфокислоты) (ПАМПС) в присутствии ускорителя ферментативной реакции октоцианомолибдата(4+).
-7
10 мл 0,05М Na-фосфатно-цитратного буферного раствора, pH 3,5, содержащего свежеперегнанный анилин в концентрации 25 мМ и поли(2-акриламидо-2-метил-1-пропансульфокислоту) с молекулярной массой 2000 кДа, в концентрации 25 мМ рассчитанной на звено полимера, (соотношение анилина и мономерного звена ПАМПС равно 1:1) перемешивали в течение 1,5 часов для связывания и установления электростатического равновесия между положительно заряженными молекулами анилина (рКа 4,63) и отрицательно заряженными сульфогруппами полимера при температуре 20°С. Затем в полученный раствор для ускорения ферментативной реакции полимеризации при постоянном перемешивании добавляли раствор октоцианомолибдата(4+) калия (Е°=0,78 В) с конечной концентрацией в реакционной среде 0,05 мМ (соотношение концентраций мономера и ускорителя 500:1) и продолжали перемешивать раствор в течение 10 минут. Реакцию полимеризации инициировали внесением в реакционный раствор гомогенного по данным градиентного электрофореза препарата лакказы из гриба Trametes hirsuta с концентрацией в реакционной смеси 2,0×10 М (активность ферментного препарата составляла 80 мкмоль пирокатехина/ мин-мг белка). Синтез полимера проводили на воздухе в течение 24 часов при 20°С при постоянном перемешивании. Об образовании интерполимерного электропроводящего комплекса ПАНИ и ПАМПС судили визуально по изменению окраски раствора и по изменению спектра в области длин волн 350-900 нм. После внесения в реакционную смесь лакказы раствор быстро становился синего цвета, а затем превращался в темно-зеленый, что свидетельствовало об образовании эмеральдиновой соли полианилина. Электропроводимость высушенного образца ПАНИ/ПАМПС, измеренная стандартным двухточечным методом была равна 10,2 мСм/см. На УФ-видимых спектрах водной дисперсии наночастиц интерполимерного комплекса ПАНИ/ПАМПС имеются полосы поглощения в области 420 нм и 760 нм, что соответствует эмеральдиновой соли полианилина (Рисунок 1).
Пример №2. Синтез полианилина на матрице ПАМПС проводили аналогично описанному в примере №1, но в реакционную смесь добавляли октоцианомолибдат(4+) калия с конечной концентрацией в реакционной среде 0,01 мМ (соотношение концентраций мономера и ускорителя 2500:1) Скорость реакции полимеризации, измеренная по возрастанию оптической плотности раствора при длине волны 750 нм была в 1,2 раза меньше, чем в примере №1.
Пример №3. Синтез полианилина на матрице ПАМПС проводили аналогично описанному в примере №1, но при температуре 30°С. Электропроводимость высушенного образца ПАНИ/ПАМПС составляла 3,5 мСм/см.
Пример №4. Синтез полианилина на матрице ПАМПС проводили аналогично описанному в примере №1, но при температуре 0°С. Для этого реакционную смесь помещали в сосуд со льдом. Электропроводимость высушенного образца комплекса ПАНИ/ПАМПС составляла 14,3 мС/см.
Пример №5. Синтез полианилина на матрице ПАМПС проводили аналогично описанному в примере №1, но вместо гомогенного препарата лакказы использовали фильтрат культуральной жидкости базидиального гриба Trametes hirsuta. Оксидазная активность препарата составляла 3 мкмоль пирокатехина/мин на мл культуральной жидкости.
Пример №6. Для сравнения синтез полианилина на матрице ПАМПС проводили аналогично описанному в примере №1, но без добавления в реакционную смесь ускорителя ферментативной реакции. В процессе синтеза раствор медленно изменяет цвет от голубого до зеленого и через 24 часа превращается в темно-зеленый. На УФ-видимых спектрах комплекса ПАНИ/ПАМПС так же, как в примере №1, имеются полосы поглощения в области 420 нм и 760 нм, оптическая плотность при 760 нм в 1,5 раза меньше, чем в примере №1. В отсутствие ускорителя скорость реакции полимеризации, измеренная по возрастанию оптической плотности при длине волны 760 нм, была в 4-5 раз меньше, чем в примере №1. Электропроводимость высушенного образца была равна 2,4 мСм/см.
Пример №7. Безматричный ферментативный синтез электропроводящего полианилина с использованием в качестве кислотного допанта сульфокамфорной кислоты и октоцианомолибдата(4+) калия в качестве ускорителя ферментативной реакции полимеризации.
-7
10 мл реакционной смеси, содержащей свежеперегнанный анилин в концентрации 0,15 М и (1S)-(+)-10-сульфокамфорную кислоту (СКК) в концентрации 0,155 М в бидистиллированной воде (pH 2,8) перемешивали на магнитной мешалке в течение 30 минут. Затем в полученный раствор для ускорения ферментативной реакции полимеризации при постоянном перемешивании добавляли раствор октоцианомолибдата(4+) калия с конечной концентрацией в реакционной среде 0,1 мМ и продолжали перемешивать раствор в течение 10 минут. Инициирование полимеризации осуществляли, добавляя в раствор лакказу из гриба Trametes hirsuta (концентрация в реакционной смеси - 3,0·10 М). Синтез проводили при температуре 4°С на воздухе при постоянном перемешивании в течение 24 часов. После проведения реакции осадок синтезированного полимера отделяли центрифугированием (12000 об/мин, 10 мин) и несколько раз промывали 0,05 мМ раствором СКК для удаления избытка реагентов и образовавшихся олигомеров. Осадок высушивали в вакууме. Об образовании синтезированного оптически активного полианилина судили визуально по изменению окраски раствора. Выход составлял 59%.
Пример №8. Синтез ПАНИ на матрице ПАМПС проводили аналогично описанному в примере №1, но в качестве биокатализатора использовали лакказу, выделенную из базидиального гриба Cerrena maxima.
Пример №9. Синтез электропроводящего полианилана в водном растворе мицелл додецилбензолсульфоната натрия (ДБСNа) и ускорителя ферментативной реакции полимеризации.
-7
Раствор мицелл получали путем растворения додецилбензолсульфаната натрия (10 мМ) в 0,05 М Na-цитрат-фосфатном буфере (pH 3,8) при осторожном перемешивании на магнитной мешалке. В исходный раствор добавляли по каплям свежеперегнанный анилин с конечной концентрацией 10 мМ. Перемешивание продолжали в течение 1 часа при комнатной температуре (приблизительно 22°С). Затем в раствор реагентов вносили раствор октоцианомолибдата(4+) калия с конечной концентрацией в реакционной среде 0,05 мМ. Реакцию инициировали внесением в реакционную смесь лакказы (концентрация в реакционной смеси - 2·10 М). Реакцию проводили в течение 24 часов при комнатной температуре и постоянном перемешивании на магнитной мешалке в аэробных условиях. Образование комплекса ПАНИ/ДБСNa регистрировали спектрофотометрически в интервале длин волн 190-1000 нм. В ходе реакции раствор из бело-мутного через сине-зеленый становился темно-зеленого цвета, что свидетельствует об образовании эмеральдиновой соли ПАНИ. Выход ПАНИ, рассчитанный по анилину составлял 67%. В отсутствие ускорителя ферментативной реакции выход ПАНИ составлял 31%.
Пример №10. Матричный ферментативный синтез ПАНИ с использованием в качестве допанта ПАМПС и гексацианоферрата(2+) калия (Е°=0,43 В) в качестве ускорителя ферментативной реакции полимеризации анилина.
Синтез полианилина на матрице ПАМПС проводили аналогично описанному в примере №1, но в реакционную смесь вместо октоцианомолибдата(4+) калия добавляли гексацианоферрат(3+) калия (концентрация в реакционной смеси - 0,3 мМ). Время синтеза составляло 24 часа. На УФ-видимом спектре интерполимерного комплекса ПАНИ/ПАМПС видна четко выраженная полоса поглощения в области 770 нм. Электропроводность образца составляла 14 мСм/см.
Пример №11. Ферментативный синтез полиэтилендиокситиофена (ПЭДОТ) на матрице ПАМПС с использованием лакказы из гриба Trametes hirsuta и ускорителя ферментативной реакции полимеризации октоцианомолибдата(4+) калия.
-7
10 мл 0,05 М Na-цитрат-фосфатного буферного раствора pH 3,5, содержащего ЭДОТ в концентрации 7 мМ и ПАМПС в концентрации 10 мМ перемешивали в течение 10 мин в ультразвуковой ванне, а затем 30 мин на магнитной мешалке при комнатной температуре (22°С). Затем в полученный раствор для ускорения ферментативной реакции добавляли октоцианомолибдат(4+) калия с конечной концентрацией в реакционной среде 0,05 мМ (соотношение концентраций мономера и ускорителя 140:1). Реакцию полимеризации ЭДОТ инициировали внесением в реакционную среду препарата грибной лакказы с концентрацией фермента в реакционной смеси 3·10 М. Синтез проводили при перемешивании в аэробных условиях в течение 24 часов. Образование полиэтилендиокситиофена наблюдали визуально и по изменению спектра в области длин волн 190-1000 нм. После проведения ферментативной полимеризации раствор приобретал темно-синюю окраску. Рисунок 2 иллюстрирует спектр синтезированного полимера. Электропроводимость синтезированного комплекса ПЭДОТ/ПАМПС составляла 25 мСм/см.
Пример №12. Ферментативный синтез полипиррола (ПП) на матрице ПАМПС с использованием лакказы из гриба Trametes hirsuta и ускорителя ферментативной реакции полимеризации октоцианомолибдата(4+) калия.
-7
10 мл 0,05 М Na-цитрат-фосфатного буферного раствора pH 3,5, содержащего пиррол в концентрации 10 мМ и ПАМПС в концентрации 10 мМ перемешивали в течение 30 мин на магнитной мешалке при комнатной температуре (25°С). Затем в полученный раствор для ускорения ферментативной реакции добавляли октоцианомолибдат(4+) калия с конечной концентрацией в реакционной среде 0,05 мМ (соотношение концентраций мономера и ускорителя 200:1). Реакцию полимеризации пиррола инициировали внесением в реакционную среду препарата грибной лакказы с концентрацией фермента в реакционной смеси 3·10 М. Синтез проводили при перемешивании в аэробных условиях в течение 24 часов. Электропроводимость синтезированного комплекса ПП/ПАМПС составляла 8,2 мСм/см.