СПОСОБ РАННЕГО ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗМОЖНОСТИ ИНФЕКЦИИ МОЧЕВЫДЕЛЯЮЩИХ ПУТЕЙ У ДЕТЕЙ 3-7 ЛЕТ ФОТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
METHOD FOR EARLY DETECTION OF POTENTIAL URINARY INFECTION IN CHILDREN OF 3-7 YEARS OLD BY PHOTOMETRIC METHOD

Изобретение относится к медицине, а именно педиатрии, и может быть использовано для скрининга детей дошкольного возраста и раннего выявления у них инфекции мочевыводящих путей.
В качестве прототипа авторы выбрали способ определения уреазной активности, предложенный в 1997 году сотрудниками клинико-биохимической лаборатории Научного Центра Урологии им. Б.У. Джарбусынова («Урология и нефрология», 1997, №4, с.13-14).
Способ основан на том, что микробы в процессе жизнедеятельности выделяют в мочу фермент - уреазу, которая имеет различную степень активности в зависимости от вида микроорганизма. При инфицировании мочи образуются микроколонии на уроэпителиальной поверхности, создающие благоприятные условия для кристаллообразования и способствующие росту камней.
Суть способа в том, что в две пробирки помещают по 2 мл исследуемой мочи. В пробирку №1 добавляют 0,4 мл 10% хлористого кальция, перемешивают, замеряют экстинкцию (оптическую плотность) против воды при 691 нм на КФК-3. В пробирку №2 добавляют 0,4 мл дистиллированной воды. Обе пробирки термостатируют при 37 градусах Цельсия в течение часа. Проводят измерение пробирок №1 и №2 сразу после термостатирования при тех же условиях.
Расчеты ведут по формуле УА=((Е2-Е1)*K*10)/100, где
Е1 - экстинкция пробы до термостатирования,
Е2 - экстинкция пробы после термостатирования в течение часа,
3
K - коэффициент соотношения концентрации углекислого кальция (СаСО) в мг % к его экстинкции (находится опытным путем по калибровочной кривой для серии разведении),
10 - коэффициент перевода мг % в ммоль/л,
3
100 - ММ СаСО.
Полученный показатель уреазной активности сравнивают с показателем нормы (0-50 ммоль/л) и при его превышении говорят о присутствии уреазообразующей микрофлоры.
Недостатком данного способа является то, что:
данная методика выполняется в пробирках и пропускная способность лаборатории достаточно низкая и не может быть использована для скрининга - профилактических и диспансерных обследований больших групп населения.
В предлагаемом авторами способе данный недостаток устранен.
Задачей настоящего изобретения явилось создание нового неинвазивного и пригодного для скрининга способа раннего выявления возможности инфекции мочевыводящих путей у детей 3-7 лет фотометрическим методом.
Технический результат изобретения заключается в том, что:
с целью увеличения пропускной способности лаборатории авторами предложено выполнять исследование в 96-луночном микропланшете, что позволяет исследовать 92 пробы мочи (контроль и опыт) у 46 пациентов одновременно и восьмикратно сократить расход реактивов, таким образом снизить себестоимость анализа (фото №1).
Уреазную активность определяли у 46 детей одновременно в 96-луночном микропланшете фотометрически на микропланшетном ридере.
Для количественного определения уреазной активности мочи использовали международные единицы активности ферментов - Е/л.
Заявленный технический результат достигается путем измерения значений оптических плотностей каждой лунки после взаимодействия мочи с 10% водным раствором хлорида кальция после термостатирования в течение 1 час при температуре 37°, в 96-луночном микропланшете фотометрически на микропланшетном ридере при длине волны 620 нм. Уреазную активность определяли у 46 детей одновременно.
Для исследования берется утренняя моча в сухую стерильную банку. Анализ мочи проводится не позднее 1 часа с момента взятия.
1
2
17
18
33
34
49
50
65
66
81
82
3
4
19
20
35
36
51
52
67
68
83
84
5
6
21
22
37
38
53
54
69
70
85
86
7
8
23
24
39
40
55
56
71
72
87
88
9
10
25
26
41
42
57
58
73
74
89
90
11
12
27
28
43
44
59
60
75
76
91
92
13
14
29
30
45
46
61
62
77
78
93
94
15
16
31
32
47
48
63
64
79
80
95
96
В лунку 1 вносят 0,275 мл дистиллированной воды (контроль планшета).
В лунку 2 вносят 0,25 мл дистиллированной воды+0,025 мл 10% водного раствора хлористого кальция (контроль реактивов).
Лунки 1 и 2 - это отрицательный контроль.
В лунку 3 вносят 0,25 мл оксалата натрия+0,025 мл дистиллированной воды; в лунку 4 вносят 0,25 мл оксалата натрия +0,025 мл 10% водного раствора хлористого кальция.
Лунки 3 и 4 - это положительный контроль (стандарт). На основании значений оптических плотностей строится калибровочная кривая.
Во все последующие лунки вносят пробы мочи пациентов: 5 и 6 - пробы пациента №1, 7 и 8 - №2 и т.д. (всего 46 обследованных за 1 раз).
Мочу вносят по 0,25 мл во все лунки, затем в нечетные вносят по 0,025 мл дистиллированной воды, а во все четные - по 0,025 мл 10% водного раствора хлористого кальция. Содержимое лунок микропланшета осторожно перемешивают. Затем измеряют значение оптических плотностей фотометрически на микропланшетном ридере (микропланшетном мультидетекторе Zenyth 1100 (Австрия)) при длине волны 620 нм (фото №2).
Микропланшет заклеивают пленкой и содержимое лунок термостатируют в течение 1 часа при температуре 37°. После чего снова перемешивают содержимое лунок и измеряют значения оптических плотностей на микропланшетном ридере при длине волны 620 нм. Затем рассчитывают уреазную активность мочи в Е/л по формуле
УА(Е/л)=ΔD*11655, где
УА (Е/л) - уреазная активность в (Е/л);
ΔD - разница оптической плотности опыта и контроля пробы мочи пациента после термостатирования;
11655 - коэффициент перевода на уреазную активность (получен опытным путем).
Для определения коэффициента перевода на уреазную активность мочи использовался раствор уреазы (с активностью 10000 Е/л) из коммерческого набора реагентов для определения мочевины в биологических жидкостях уреазным фенол/гипохлоритным методом (Мочевина-02-ВИТАЛ, LOT серия 0349, REF B08.02). Для расчета коэффициента перевода на уреазную активность провели опыты с пробами мочи (моча одного пациента в трехкратном повторе) в микропланшете:
2
Проба №1 - 0,25 мл мочи пациента №1+0,050 мл дистиллированной НО;
2
2
Проба №2 - 0,25 мл мочи пациента №1+0,025 мл дистиллированной. НО+0,025 мл CaCl;
2
Проба №3 - 0,25 мл мочи пациента №1+0,025 мл уреаза+0,025 мл 10% CaCl.
Результаты проведенного опыта приведены в таблице №1.
Таблица №1
Проведение опыта по расчету коэффициента перевода на уреазную активность мочи
Среднее D
до термостатирования
D1
D2
D3
ΔD
Проба №1
0,042
0,058
0,047
0,049
Проба №2
0,06
0,056
0,051
0,056
Проба №3
0,489
0,539
0,424
0,484
после термостатирования
Проба №1
0,046
0,06
0,053
0,053
0,004
Проба №2
0,242
0,164
0,180
0,195
0,139
Проба №3
1,458
1,464
1,522
1,481
0,997
Формула расчета коэффициента: K=10000/(0,997-0,139)=11655 Е/л.
Формула расчета уреазной активности в Е/л
УА(Е/л)=ΔD*11655, где
УА - уреазная активность в (Е/л);
ΔD - разница оптических плотностей проб мочи пациента после термостатирования;
11655 - коэффициент перевода на уреазную активность (получен опытным путем).
Определение биологических нормальных (референтных) величин осуществлялось в группе пациентов с медицинского осмотра в детском дошкольном учреждении (случайный выбор). Всего было обследовано 112 клинически здоровых детей 3-7 лет.
Норма 0-1621,73 Е/л (рассчитанные авторами референтные величины).
Полученный показатель уреазной активности сравнивают с показателем нормы и при его превышении говорят о присутствии уреазообразующей микрофлоры, что свидетельствует о возможности инфекции мочевыводящих путей.
Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами.
Пример 1
Амбулаторная карта №19
Зелинская Ксения, 5 лет, обратилась по поводу рецидивирующего вульвита. После термостатирования проб мочи оптическая плотность контроля 0,283, оптическая плотность опыта 0,875.
УА мочи - (0,875-0,283)*11655=6889,75 Е/л
6889,75 Е/л>1621,73 Е/л
Заключаем, что инфекция мочевыводящих путей возможна.
Ребенок обследован в условиях нефрологического отделения детской областной больницы г.Твери. При бактериологическом посеве мочи высеяны микроорганизмы: кишечная палочка и энтеробактерии в диагностически значимых количествах. Ребенку был выставлен диагноз:
Вторичный дисметаболический пиелонефрит.
Пример 2
Амбулаторная карта №7
Васильева Наташа, 6 лет, обратилась по поводу резей при мочеиспускании.
После термостатирования проб мочи оптическая плотность контроля - 0,063, оптическая плотность опыта - 0,104.
УА мочи=(0,104-0,063)*11655=0,041*11655=477,855 Е/л
477,855 Е/л<1621,73 Е/л
Заключаем, что инфекция мочевыводящих путей маловероятна. Ребенок обследован у нефролога. При бактериологическом посеве мочи микрофлора высеяна не была. Клинический анализ мочи, моча по Нечипоренко в пределах нормы. УЗИ почек: без патологии. У ребенка выявили пищевую сенсибилизацию на белок яиц. Проходит лечение у аллерголога.
Список литературы
1. Меркушева, Н.В. Уреазная активность мочи у больных мочекаменной болезнью / Меркушева, Н.В., Юшина Л.В., Махонина И.А. // Урология и нефрология, 1997. С.13-14.