СРЕДСТВА ДЛЯ ОКРАШИВАНИЯ ОСНОВЫ
MEANS FOR WARP PAINTING

Объектом настоящего изобретения являются средства, продукты и способ окрашивания основ из неорганических или органических материалов и, в частности, живой материи, такой как кожа.
Известен способ печатания на основах, таких как бумага и ткани, при помощи красок. Этот тип техники используется в настоящее время заявителем для окрашивания основ, исходя из трех первичных цветов (желтого, сине-зеленого и пурпурного), предоставленных красками, причем черный цвет получают при использовании черной краски, белый дается самой основой. Основу для окрашивания разворачивают, например, в форме листа, проходящего через принтер, который поточечно распределяет капли краски объемом несколько нанолитров каждая согласно намеченному рисунку, предпочтительно, под контролем компьютера. Распределяющее краску устройство должно, между тем, много раз проходить по одному и тому же месту для достижения желательной интенсивности, на что требуется время.
Кроме того, некоторые химические краски рассматриваются как загрязняющие для окружающей среды.
О методах, основанных на использовании ферментов, уже сообщалось. Так, например, в патенте EP 1342831 описывается способ окрашивания тканей ферментативным путем, включающий погружение ткани в водный раствор, содержащий одно или несколько ароматических или гетероароматических соединений, с последующей пропиткой материала источником перекиси водорода и ферментом, обладающим пероксидазной активностью, или ферментом, обладающим оксидазной активностью, в отношении указанного или указанных ароматических или гетероароматических соединений.
В этом способе не существует никакого контроля элементов, фиксирующихся в течение различных периодов замачивания образцов, и особенно катализатора окисления. Этот последний связан только абсорбцией и, следовательно, может быть удален в процессе промывок. Кроме того, полученные цвета не являются первичными цветами.
Изобретатели констатировали, что эти проблемы могут быть преодолены заменой этих красок и этих ферментов каталитическими фотоактивируемыми системами, способными генерировать три первичных цвета, смешение которых может привести к окрашенным соединениям.
Итак, изобретение имеет целью предоставить такие системы, а также способ генерации цвета, основанный на их использовании, в котором цвета на вышеупомянутой основе проявляются только в желаемый момент и в желаемом месте.
Другая цель настоящего изобретения касается способа окрашивания основы, в котором указанная основа может быть многократно повторно использована для того, чтобы генерировать другие цвета, чем изначально генерированные.
Термин "основа", используемый в описании и в формуле изобретения, означает неорганические или органические материалы, в частности живую материю, такую как кожа.
Каталитические системы, используемые согласно изобретению для генерации цветов на основе, характеризуются тем, что они содержат один или несколько инактивированных катализаторов окисления.
В частности, можно назвать оксидазы, такие как пероксидазы, лакказы, и гидролазы, например щелочные фосфатазы или кислые фосфатазы.
Пероксидаза (EC 1.11.1.7.) представляет собой особенно интересный фермент, учитывая его очень слабую специфичность по отношению к субстратам.
Лакказа (EC 1.10.3.2) также может быть использована. Как и пероксидаза, она катализирует окислительное связывание, используя те же субстраты.
Щелочная фосфатаза (EC 3.1.3.1) и кислая фосфатаза (EC 3.1.3.2) обладают прекрасными характеристиками, но их субстраты более ограничены и являются более дорогими, чем субстраты пероксидазы, гемоглобина или лакказы.
Гемоглобин, в частности бычий гемоглобин, способен окислять субстраты пероксидазы: структурирование гемоглобина, дающее возможность создать явление усиления, позволяет приблизиться к показателям пероксидазы.
192
Предпочтительно, субстраты этих катализаторов многочисленны и доступны по ценам, не слишком высоким. При их окислении получаются многочисленные окрашенные соединения, нерастворимые в воде (Conyers и Kidwell (1991), Anal. Biochem., , 207-211).
Другие катализаторы окисления включают гемоглобины.
Инактивация этих катализаторов удовлетворительно достигается фиксацией фотолабильных групп, преимущественно в их активном положении.
Рассматриваемые группы соответствуют замещающим группам типа "нитрофенил", и включают, например, -о-нитробензил или нитрофенил. Можно назвать, например, 4,5-диметокси-o-нитробензил, o-нитробензилэтил или o-нитробензил.
В соответствии с изобретением, катализаторы окисления ассоциированы с хромогенными субстратами, используемыми в сочетании с ароматическими соединениями.
Под "хромогенными субстратами" понимают соединения, функционирующие обратимым образом с катализаторами и способные приводить к окрашенному соединению в результате окисления катализатором и конденсации с ароматическими соединениями.
Главным образом, каталитические системы согласно изобретению - это системы, способные фотореактивироваться и вновь приобретать достаточную окислительную активность, чтобы генерировать цвета.
Для получения трех первичных цветов (сине-зеленого, пурпурного и желтого), субстраты, описанные, например, у Conyers и Kidwell (1991, см. выше), подходят в наибольшей степени, ибо они быстро дают нерастворимые голубые и красные продукты, осаждающиеся in situ.
В частности, можно назвать гидразон 3-метил-2-бензотиазолинона (MBTH) и производные фенилендиамина, такие как диметилфенилендиамин и диэтилфенилендиамин.
В качестве ароматических соединений, которые могут быть использованы в реакции с хромогенными окисленными субстратами с получением окрашенных осадков, можно назвать хлорнафтолы, нафталиндиолы, аминофенолы, катехины, хлорфенолы, фенол, гвайякол или любую другую молекулу, принадлежащую либо к классу моно-, ди- или полициклических ароматических соединений, либо к классу гетероароматических производных.
Изобретение также относится к способу генерации цветов на основе, характеризующемуся тем, что он включает реактивацию под воздействием светового стимула одного или нескольких инактивированных катализаторов окисления, таких как определенные выше, пропитывающие указанную основу.
Катализаторы окисления являются, таким образом, временно инактивированными, чтобы позволить осуществление изобретения. Их реактивация позволяет генерировать цвета в желаемом месте в желаемый момент.
Преимущественно, этот способ включает:
а) стадию фотообратимого ингибирования одного или нескольких катализаторов окисления, пропитывающих основу,
b) стадию иммобилизации временно инактивированного(ых) катализатора(ов) окисления, полученного(ых) на стадии a) на основе для окрашивания, причем указанную стадию фиксации осуществляют, в частности, путем погружения основы для окрашивания в раствор, включающий один или несколько инактивированных катализаторов окисления,
c) стадию световой стимуляции пропитанной основы, полученной на стадии b), позволяющую реактивировать один или несколько временно инактивированных катализаторов окисления,
d) стадию пропитки основы, на которой были иммобилизированы один или несколько катализаторов окисления на стадии c) раствором, включающим один или несколько хромогенных субстратов и один или несколько окислителей, что позволяет, таким образом, проявить цвета на основе, в месте, активированном световой стимуляцией.
Стадию a) предпочтительно осуществляют путем введения в реакцию используемых катализаторов с соединениями, содержащими фотолабильные группы, такие как определено выше. Соединения, содержащие -O-нитробензильные группы, особенно предпочтительны в этом отношении. Эти соединения могут фиксироваться действительно спонтанно, за счет ковалентного связывания, на аминокислотах, в частности на активных сайтах, например на звеньях лизина, аспарагина, глутамина или цистеина. Для фиксации на лизинах также успешно используют такое соединение, как 3,4-диметокси-о-нитробензилхлорформиат. Реакция может быть осуществлена в водной среде. Для реакции со звеньями, содержащими карбоксильную функциональную группу, например, аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты, готовят производное диазоэтана исходя из производного гидразоноэтана.
Стадия b) включает пропитку основы раствором катализатора в условиях, позволяющих получить желаемую интенсивность цвета. Основа представляет собой, например, ткань, образованную натуральными, в частности хлопчатобумажными, волокнами и/или синтетическими волокнами, или полимерный материал, такой как полиэстер. Основа также может представлять собой бумагу.
Раствор катализатора преимущественно является водным раствором и включает в себя количества катализатора порядка 5-50 мкг/мл для HRP и от 50 до 200 мкг/мл для Hb со значениями параметра pH приблизительно в диапазоне от 4 до 6.
Перед стадией b) иммобилизации предпочтительно осуществляют предварительную стадию пропитки основы для окрашивания раствором, включающим одну или несколько добавок, способных связывать один или несколько катализаторов окисления с основой для окрашивания.
Согласно одному варианту осуществления способа по изобретению, если основа для окрашивания представляет собой, в частности, синтетическую ткань, осуществляют стадию предварительной пропитки альгинатом, в частности альгинатом кальция: присутствие этого кислого полисахарида обеспечивает возможность иммобилизации значительного количества катализатора окисления на ткани за счет ковалентного связывания после активации карбоксильных функциональных групп в сложноэфирные функциональные группы NHS парой водно-растворимый карбодиимид [EDC]: N-этил-N'-(3-диметиламинопропил) карбодиимид, N-циклогексил-N'-(2 морфолиноэтил) карбодиимид мето-п-толуолсульфонат/гидроксисукцинимид (NHS).
2
На стадии предварительной пропитки альгинат, присутствующий на ткани на площади 1 см, активируют в воде в течение от 5 до 30 мин парой EDC/NHS (200 мкг/200) в объеме, варьирующем приблизительно от 2 до 4 мл.
Активированную ткань погружают в раствор катализатора окисления с концентрацией, уточненной выше, с поддержанием pH от 6 до 7. Длительность сочетания варьирует приблизительно от 30 до 90 мин.
Согласно другому предпочтительному положению изобретения по окончании предварительной стадии активации и пропитки основы для окрашивания в растворе, включающем одну или несколько добавок, осуществляют стадию сушки. Сушку предпочтительно осуществляют на холоде, чтобы не повреждать катализаторы. Световая стимуляция, необходимая для реактивации, имеет место при длине волны 366 нм в течение 5-30 мин.
На стадии d) пропитывают основу раствором, включающим один или несколько хромагенных субстратов, которые являются субстратами для катализатора, одно или несколько ароматических соединений и один или несколько окисляющих агентов.
Концентрации в субстратах варьируют от 1 до 4 мМ и концентрации окислителей фиксируют на уровне 1 мМ; концентрации каждого из составляющих пару субстратов варьируют приблизительно от 1 до 4 мМ. Эту смесь реализуют в среде, забуференной приблизительно при 4,5-6, при температуре приблизительно от 20 до 25°C, до проявления окрашивания.
Конденсация оксидных субстратов с ароматическими соединениями ведет к образованию окрашенных соединений, которые осаждаются in situ на том же самом месте превращения предшественников (хромогенные субстраты).
Чтобы окрашиваемая основа оставалась бесцветной в присутствии хромогенных субстратов, необходимо достигнуть тотального ингибирования активности катализатора окисления.
При тотальном ингибировании достигают степени ингибирования, варьирующей приблизительно от 80% приблизительно до 100%, преимущественно приблизительно от 90% приблизительно до 98%.
Реактивация, даже частичная, катализатора окисления фотолизом является достаточной для запуска способа генерации цветов.
Под частичной реактивацией понимают реактивацию, варьирующую приблизительно от 10% приблизительно до 30%, преимущественно приблизительно от 20% приблизительно до 25%. Таким образом, восстановление деятельности катализатора после облучения приблизительно на 25% является достаточным для запуска способа генерации цветов.
Под воздействием светового фактора фотолабильные группы удаляются за счет фотолиза, оставляя первоначальную мишень (катализатор окисления) химически интактной и биологически активной. Полученный катализатор окисления является частично реактивированным.
Затем происходит химическая реакция, в которой участвует ароматический субстрат, полностью или частично реактивированный катализатор окисления, окислитель и ароматическое соединение, что приводит к получению окрашенного продукта.
Способ по изобретению обладает некоторыми преимуществами, в частности, по отношению к способу классического окрашивания с использованием красок. Действительно, согласно способу по изобретению возможно получать более быстрое окрашивание основы, чем при точечной печати, лучшее разрешение, учитывая, что величина элемента изображения соответствует размеру иммобилизированного катализатора окисления, и избавиться от проблем, связанных с забиванием головок распределения красок.
Изобретение также относится к способу, в котором указанная система представляет собой гибкую и прозрачную фотоферментную пленку, позволяющую локализовать "очаги" эмиссий in vivo гаммафотонов в ядерной медицине. Проявление цветового пятна на пленке, приложенной к коже, позволяет, например, локализовать место патологического роста клеток (например, с использованием «сторожевого угла» в случае рака груди) до хирургического вмешательства. Этот способ предпочтительно позволяет избавиться от ограничений, присущих использованию гамма-сцинтиграфических камер, и значительно сократить участие специалистов по ядерной медицине в рутинных процедурах.
Изобретение также относится к способу, как определено выше, в котором основа состоит из макромолекул, например из целлофана, и несет фотоферментную систему, такую как описано выше. Сторона пленки, контактирующая с кожей, является рифленой, чтобы играть роль коллиматора по отношению к гамма-фотонам.
Согласно другому аспекту изобретения, представляющему большой интерес, изобретение относится к применению способа генерации цветов на коже в косметике. Другие аспекты и преимущества настоящего изобретения иллюстрируются примерами, которые характеризуют генерацию цветов на хлопчатобумажной основе или на полиэстере.
ПРИМЕР 1: Использование гемоглобина
1) Фотообратимое ингибирование гемоглобина
Бычий гемоглобин в водном растворе (32 мкМ) обрабатывают различными концентрациями 1-(2-нитрофенил)этил-диазоэтата (NPE-диазо) в растворе в DMSO, при 20°C в течение 1 ч, в темноте. Окончательная концентрация в DMSO не должна превышать 5%. Концентрации NPE-диазо варьируют от 50 до 100 эквивалентов по отношению к гемоглобину. Реакцию сочетания останавливают добавлением 100 мМ раствора ацетатного буфера с pH 4,4 (1 эквивалент по отношению к NPE-диазо). Времена контакта варьируют от 10 до 30 мин. Реакционную среду подвергают диализу против воды при температуре от 4 до 20°C и в течение от 1 до 16 часов в 1000 объемах воды. Конъюгат хранят при 20°C.
Процент ингибирования окисления ABTS [соль диаммония 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолинона-6-сульфоновой кислоты), 1 мМ] определяют перед диализом на планшетах для микротитрования с 96 лунками (Costar, Corning Incorporated) в буферном растворе ацетата натрия, 50 мМ, pH 5 в присутствии 1 мМ перекиси водорода. Число молекул, фиксированных с молекулой гемоглобина, определяется масс-спектрометрией с электрораспылением. Результаты объединены в таблице 1.
<b>ТАБЛИЦА 1</b>
Объединенный NPE-гемоглобин
Числа NPE фиксированные/на молекулу Hb
Остаточная активность (%)
Гемоглобин нативный
0
100
Hb-50*
от 0 до 5
12,6
Hb-75*
от 1 до 6
5,4
Hb-100*
от 1 до 6
2,5
*50, 70, 100 соответствует числу эквивалентов NPE, введенных в реакционную среду.
Обработка гемоглобина с помощью NPE-диазо приводит к сильному ингибированию окислительной активности (более 90%).
2) Фотореактивация катализатора окисления
2
Катализатор окисления реактивируют облучением растворов различных конъюгатов (1 мг/мл) в буферном растворе ацетата натрия (25 мМ, pH 4,4). Фотолиз имеет место при длине волны 366 нм (лампа УФ 100 Вт, 7 мВт/см на расстоянии 30 см), времена облучения варьируют от 5 до 30 мин. Эту стадию предпочтительно осуществляют в присутствии 5 мМ 2-этаноламина для того, чтобы не допустить вероятные перекрестные реакции между продуктами фотолиза и гемоглобином.
После 30 минут облучения гемоглобин полностью освобожден от защитных групп.
2
2
Восстановление ферментативной активности определяют в микротитрационных планшетах, как описано ранее, в присутствии ABTS (1 мМ) и HO (1 мМ).
После 30 мин облучения 57% активности восстановлено для Hb-50, 28% для Hb-75 и 16% для Hb-100. Эти проценты активности достаточны, чтобы осуществлять впоследствии способ генерации окрашивания.
3) Закрепление ферментов на основе для окрашивания
Катализатор окисления, бычий гемоглобин, фиксируется ковалентно на тканях из полиэстера, предварительно пропитанных альгинатом кальция.
2
Карбоксильные функции полисахарида активируют в воде, в присутствии пары EDC/NHS, в течение времени, варьирующегося от 10 до 30 мин. Для 1 см ткани количества активаторов карбодиимид/N-гидроксисукцинимид составляют по 200 мкг каждого в объемах от 2 до 4 мл. Активированную таким образом ткань погружают в раствор катализатора окисления при концентрации от 50 до 200 мкг/мл при рН 6. Время инкубации варьируется от 45 до 90 мин.
В этих условиях ткань таким образом готова к облучению, чтобы реактивировать катализатор окисления, и затем ее пропитывают раствором, содержащим одну или несколько пар гомогенных субстратов.
4) Пропитка парами хроматогенных и окислительных субстратов
а) Использование пары DMPDA/4-хлорнафтол
Реактивированную в предыдущем примере ткань погружают в буферный раствор с pH от 4,5 до 6, включающий диметилфенилендиамин (маточный раствор, приготовленный в воде, 110 мМ), 4-хлорнафтол (маточный раствор, приготовленный в этаноле, 110 мМ). Их конечные концентрации варьируют от 1 до 4 мМ. Добавляют окислитель, перекись водорода; его концентрацию предпочтительно фиксируют на 1 мМ. Реакцию проводят при температуре от 20 до 25°C, до проявления голубого цвета.
b) Использование пары MBTH/4-хлорнафтол
Как описано в a), реактивированную ткань погружают в буферный раствор с pH от 4,5 до 6, включающий 3-метилбензотиазолин (MBTH, маточный раствор, приготовленный в воде, 110 мМ), 4-хлорнафтол и окислитель. Концентрации различных веществ, а также операционные условия являются такими же, что и для a). В этом случае генерируется красный цвет.
c) Использование пары MBTH/1,3-нафталиндиол
Как описано в a), реактивированную ткань погружают в буферный раствор с pH от 4,5 до 6, включающий 3-метилбензотиазолин (MBTH), 1,3-нафталиндиол (маточный раствор, приготовленный в этаноле, 110 мМ) и окислитель. Концентрации различных веществ, а также операционные условия являются такими же, что для a). В этом случае развивается желтый цвет.