Перфторан как мембранотропный агент

Раздел VI

РЕДАКЦИОННЫЙ ПОРТФЕЛЬ

УДК 616.477.2

ПЕРФТОРАН КАК МЕМБРАНОТРОПНЫЙ АГЕНТ А.М. ЗАКАРОВ*, Н.Б.КАРМЕН*, Е.И.МАЕВСКИЙ*, Н.П.МИЛЮТИНА**

Препарат «Перфторан», представляющий собой эмульсию перфторорганических соединений (ПФОС), исходно создавался как кровезаменитель с газотранспортной функцией для возмещения частичной утраты эритроцитов, ответственных за перенос газов кровью [1, 12]. Уникальная способность ПФОС растворять в 20 раз больше кислорода и в сотни раз больше монооксида азота, чем водная среда плазмы крови [7, 28, 29], послужила основанием для ожидания инициации при внутривенном введении перфторана свободорадикального окисления - образования активных форм кислорода и пероксинитрида, перекисного окисления липидов (ПОЛ) мембран и изменения активности про- и антиоксидантных систем крови. При тяжелой кровопотере, когда имеется выраженный кислородный дефицит, использование достаточно высоких доз перфторана (порядка 900 мл) способствовало существенному увеличению активности антиоксидантной системы плазмы и эритроцитов, пониженных исходно в результате произошедшей кровопетери [20]. Но может ли перфторан служить инициатором прооксидантных процессов при нормок-сии, при отсутствии гемодилюции и без снижения гематокрита, т.е. без нарушений кислородного режима, надо выяснить.

Цель работы - оценка влияния внутривенного введения перфторана на продукты ПОЛ, структурно-функциональные характеристики мембран эритроцитов и активность основных ферментов антиоксидантной защиты - супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы (КАТ) у интактных животных, а также на интегральные показатели про- и антиоксидантной активности плазмы крови у пациентов, страдающих пародонтозом.

Материал и методы исследования. Экспериментальные исследования выполнены на 28 крысах-самцах линии «Wistar», весом 200-250 г, содержавшихся в клетках по 3-4 животных при температуре 20°С±2°С, корм ПК-121-2 (ООО «ИНФОРМ-КОРМ»), питье at libitum. Животные были распределены на 4 равные группы: I группа контрольная - животным вводили внутривенно изотонический раствор NaCl; II группа - перфторан вводили за 1 сутки до забора крови на исследование; III группа -перфторан вводили за 3 суток до забора крови; IV группа - пер-фторан вводили за 7 суток до забора крови. Перед анализом пробы крови выдерживали 24 часа при +4^10°С на вибрационной стенде при частоте качаний 2 Гц в закрытых пробирках для того, чтобы оценить механическую резистентность мембран эритроцитов по выходу гемоглобина в плазму. Уровень внеэритроцитар-ного гемоглобина (ВЭГ) определяли цианметгемоглобиновым методом с помощью наборов «Реанал» (Венгрия).

Свободно-радикальное окисление липидов оценивали по уровню продуктов ПОЛ в мембране эритроцитов и плазме крови: малонового диальдегида [18], диеновых конъюгатов [17] и шиф-фовых оснований (ШО) [8]. Структурные параметры и микровязкость мембран эритроцитов оценивали с помощью флуоресцентного зонда - пирена (конечная концентрация пирена составляла 8 мкМ), добавляемого к суспензии эритроцитов (разведенной до оптической плотности 0,720 ед. при 650 нм в изотоническом растворе хлорида натрия, забуференном 10 мМ Трис-HCl, рН

7,4). Выделяли мембраны эритроцитов [9], липиды мембран экстрагировали по методу [23]. Микровязкость липидного слоя мембран оценивали по спектру флуоресценции пирена при длине волны возбуждения 334 нм, а микровязкость зон белок-липидных контактов - при максимуме возбуждения 282 нм по величине максимума флуоресценции мономеров пирена при 393 нм и

^Государственный университет

эксимеров при 470 нм [11]. О степени погружения белков в липидный бислой судили по тушению флуоресценции белков пире-ном - параметр AF. Тушение флуоресценции происходит вследствие безизлучательного переноса энергии с триптофановых остатков мембранных белков на пирен при максимуме возбуждения 282 нм [4]. Степень полярности окружения зонда в мембране оценивали по отношению интенсивности флуоресценции пирена в суспензии эритроцитов на длинах волн 372 и 393 нм (F372/F393) при максимуме возбуждения 334 нм. Спектры флуоресценции регистрировали на спектрофлуориметре «Hitachi 650-60» (Япония). Активность СОД эритроцитов определяли по методу [24]. Примеси гемоглобина, мешающего определению активности СОД, удаляли из гемолизата и плазмы по методу [26]. За единицу активности СОД принимали активность такого количества фермента (в пересчете на мг белка), которого достаточно для 50% ингибирования начальной скорости аутоокисления гидроксила-мина. Активность КАТ в мембранах эритроцитов определяли по образованию в присутствии Н2О2 окрашенного комплекса с солями молибдена (спектрофотометр «Beckman DU-7», США) [10]. Активность КАТ в плазме крови определяли по методу [25]. Суммарную пероксидазную активность (СПА) в плазме крови измеряли колориметричесим методов в модификации В.В. Внукова [6] по скорости окисления бензидина в присутствии Н2О2.

В клинических условиях о состоянии про- и антиоксидант-ных систем плазмы крови судили по хемилюминесценции индуцированной добавлением 2,5 мМ раствора FeSÜ4 к разведенной плазме (0,5 мл плазмы в 19,5 мл 105мМ KCl, 20 мМ KH2PO4, рН

7,4) [5]. При этом регистрировали следующие характеристики кривой вспышки люминесценции: Smax - площадь под кривой, Imax - амплитуду максимума вспышки STmax - площадь пика вспышки, отражающие стационарный уровень хемилюминесценции свободно-радикальных соединений в плазме крови. Рассчитывали тангенс угла наклона прямой, апроксимирующей быструю (tg1) начальную компоненту нисходящего колена кривой, характеризующего активность антиоксидантных свойств исследуемого объекта. В целом кривая регистрации хемилюминесценция плазмы, отражает баланс про- и антиоксидантных компонентов и гасителей люминесценции. Кровь для исследования брали у практически здоровых доноров (10 мужчин в возрасте 28-59 лет) на станции переливания крови (норма) и у стоматологических больных (8 пациентов в возрасте 36-60 лет с явлениями парадонтоза) в предоперационный период через 1 час и 24 часа после внутривенного введения малых доз перфторана (1,5-2 мл на кг массы тела), рекомендуемых для уменьшения вторичной альтерации при воспалительных процессах [14].

Таблица 1

Динамика содержания продуктов ПОЛ, концентрации ВЭГ и СПА в плазме крови

Измеряемые Контрольная группа После введения перфторана

показатели Животных через 1 сутки через 3 суток через 7 суток

ДК, нмоль/мл 28,73±2,66 29,47±1,44 28,52±2,57 23,82±3,85

МДА, нмоль/мл 42,13±3,09 47,30±4,30 41,47±3,94 49,79±3,79

ШО. ед./мл 0,592±0,054 0,481±0,050 0,583±0,041 0,477±0,098

ВЭГ, мг/л 1339±195 754±143 773±110 689±156

рк <0,05 рк <0,05 рк <0,05

СПА ед./мл 5,10±0,65 3,07±0,35 рк <0,05 2,74±0,20 рк <0,02 2,65±0,29 рк <0,02

рк - при сравнении с показателями в контрольной группе

Результаты. Динамика ПОЛ, ВЭГ и СПА в плазме крови. Вопреки теоретическим предсказаниям после однократного внутривенного введения перфторана в дозе 5 мл на кг массы тела во все сроки исследования не происходило явных отклонений в

уровне продуктов ПОЛ в плазме крови по сравнению с показателями, характерными для животных контрольной группы (табл. 1).

Хрупкость эритроцитов уменьшалась в группах животных, которым вводили перфторан: количество гемоглобина, выходящего из эритроцитов в результате механического вибрационного воздействия, значимо ниже, чем уровень ВЭГ в контроле. После введения перфторана уменьшалась и величина СПА, характеризующая суммарную прооксидантную активность плазмы.

В проведенных экспериментах обнаружена прямая корреляция между снижением СПА и уменьшением выхода гемоглобина из эритроцитов - коэффициент корреляции между СПА и концентрацией ВЭГ г=0,78 (ри<0,05). Это хорошо согласуется с данными других исследователей о том, что именно уровень ВЭГ является определяющим фактором в инициации свободнорадикального окисления в плазме крови [21. 22]. ВЭГ и метге-моглобин фактически выполняют роль «биологического реактива Фентона» и катализатора «реакции Хабера-Вайса», так как способствует образованию супероксидного (*0 ) и гидроксильного (*ОН ) радикалов, Н2О2 и феррил-радикала (*ИЬ-Ре4+), являющихся активаторами ПОЛ [3, 19]. Полученные нами данные говорят о том, что ожидаемый прооксидантный эффект перфто-рана при нормоксии на уровне плазмы крови не обнаружен.

Динамика продуктов ПОЛ в эритроцитах крови крыс. Однократное внутривенное введение перфторана сопровождается умеренным повышением активности ПОЛ в липидах мембране эритроцитов лишь на 7 сутки (табл. 2.). Это неожиданный результат - «последействие» перфторана. Дело в том, что период полу-выведения перфторана из кровотока у крыс составляет не более 9 часов [15]. Как видно из представленных данных, через сутки после введения перфторана, когда он еще присутствует в кровотоке в виде эмульсии в значимых количествах, вместо ожидаемой активации ПОЛ в эритроцитах наблюдалось уменьшение уровня ШО - конечного продукта ПОЛ. И, напротив, на 3 сутки, когда концентрация перфторана в крови оценивается как следовая, а на 7 сутки, когда перфторан в крови практически не определялся, происходило некоторое увеличение продуктов ПОЛ: ДК, МДА и ШО. При этом активность КАТ возрастала в первые сутки, несколько снижалась на 3 сутки и вновь возрастала на 7 сутки, тогда как активность СОД оставалась неизменной во все сроки наблюдения. По крайней мере, в присутствии перфторана в кровотоке (1 сутки) не происходило накопления продуктов ПОЛ. Поскольку уровень продуктов ПОЛ является результирующей величиной соотношения прооксидантных и антиоксидантным процессов, постольку можно полагать, что в целом эти системы не остаются интактными после введения перфторана, о чем свидетельствует в частности и прирост активности КАТ.

Таблица 2

Динамика содержания ПОЛ, активности СОД и каталазы в эритроцитах крыс после введения перфторана

После введения перфторана

Контроль через 1 сутки через 3 суток через 7 суток

ДК, нмоль/мг Hb 2,23±0,53 2,30±0,23 3,56±0,41 рі <0,01 3,86±0,35 рк <0,01 р1 <0,01

МДА, нмоль/мг Hb 3,53±0,25 4,01±0,27 4,57±0,28 рк <0,02 4,26±0,39

ШО, ед./мг Hb 0,563±0,057 0,413±0,045 рк <0,05 0,605±0,081 0,684±0,040 р1<0,001

СОД, мкмоль/мг Hb 2,92±0,16 2,49±0,13 2,61±0,19 3,31±0,55

КАТ, нмоль Н2О2/мг Hb 19,68±1,17 32,95±4,18 рк <0,01 25,14±2,35 32,49±5,48 рк <0,02

р - указано при сравнении с соответствующими показателями в контрольной группе (рк) и через сутки после введения перфторана (р^.

Судить, является ли физическое взаимодействие перфтора-на и его компонентов с эритроцитами, про- и антиоксидантными системами позитивным или негативным фактором только по показателям ПОЛ, не представляется возможным. Но уменьшение уровня ВЭГ и величины СПА позволяет оценивать эти сдвиги как благоприятствующие сохранению мембран эритроцитов.

Динамика структурно-функциональных свойств мембран эритроцитов крыс свидетельствует о весьма выраженном эффекте введенного перфторана на липид-белковые взаимодействия в мембране (табл. 3). В первую очередь последствия взаимодейст-

вия эритроцитов с перфтораном сказываются на параметрах Бэ/Рм (282) и F372/F393 (334), которые уменьшаются в 1 и 3 сутки после введения препарата животным. Уменьшение значения параметра Бэ/Бм (282) свидетельствует об изменении микровязкости зон белково-липидных контактов, а снижение величины отношения F372/F393 (334) - о возрастании гидрофобности. Именно этого и следовало ожидать в случае взаимодействия липофильного пер-фтордекалина (основного компонента перфторана) с липидами и гидрофобными сайтами структурных белков. В результате на 7 сутки происходит увеличение погружения липидов в бислой -прирост параметра Fэ/Fм (334), что говорит об уменьшении полярности липидов до уровня, характерного для интактных мембран: возрастает однородность липидного бислоя, что должно сопровождаться повышением эластичности и уменьшением хрупкости мембран. Такая «гомогенизация» липидного компонента мембран обусловлена уменьшением погруженности в липидный бислой белковых молекул, что проявляется в снижении величины F0-F/F0 на 7 сутки. Подобное повышение однородности и эластичности теней мембран эритроцитов после контакта с чистым перфтордекалином наблюдали in vitro [13]. Наблюдаемые нами явления свидетельствуют о том, что подобный феномен имеет место и в условиях организма после введения относительно небольших доз перфторана.

Таблица 3

Структурно-функциональные свойства мембран эритроцитов крысы при внутривенном введении перфторана

Показатели Контроль После введения перфторана

через 1 сутки через 3 суток через 7 суток

F3/FM (334) 0,53±0,03 0,47±0,06 0,47±0,05 0,64±0,04 Pl 2<0,05

F3/FM (282) 0,91±0,09 0,71±0,03 PK<0,05 0,53±0,04 PK<0,02 0,56±0,06 PK<0,02

F0-F/F0 0,111±0,011 0,122±0,036 0,121±0,008 0,065±0,003 PKl<0,001

F372/F393 (334) 1,21±0,05 0,99±0,04 PK<0,01 0,96±0,08 PK<0,05 1,17±0,05 Pl<0,05

F372/F393 (282) 1,79±0,06 1,77±0,07 1,77±0,08 1,76±0,06

р - указано при сравнении с соответствующими показателями в контрольной группе (рк) и через сутки после введения перфторана (р1).

Ннам не удалось обнаружить прооксидантного повреждающего эффекта перфторана в отношении плазмы и эритроцитов крови животных. Имеет место позитивное последействие перфторана. Фармакокинетика перфторана такова, что период полувыведения эмульсии перфторорганических соединений из кровотока крыс составляет всего 9 часов, а через 3 суток в крови обнаруживаются лишь следы перфторана, которые через 7 суток вообще не обнаруживаются ни газохроматографически, ни методом F19-ЯMР-спектроскопии [15]. Поэтому едва ли можно говорить об изменении активности ПОЛ как результате прямого влияния газопереносящей среды на кислородный режим крови. Нет оснований считать, что изменение кислородного режима после введения перфторана является фактором, определяющим интенсивность ПОЛ и механическую резистентность эритроцитов. Введенный в/в перфторан модифицирует как окружение, так и мембраны эритроцитов, из-за воздействия поверхностноактивного вещества проксанола - стабилизатора эмульсии - и в результате растворения в липидах мембран молекул перфторор-ганических соединений, в первую очередь более липофильного перфтордекалина [27]. Стабилизация эритроцитов описана при контакте крови с перфторорганическими соединениями [ 2, 16].

Клинические наблюдения позволили проверить, могут ли найденные в эксперименте на животных эффекты перфторана проявляться после его введения в организм человека.

Влияние малых доз перфторана на активность индуцируемой хемолюминесценции плазмы крови и уровень ВЭГ.

Исходно у обследованной группы пациентов, страдающих парадонтозом, наблюдалась несколько сниженная хемолюминесценция плазмы (табл. 4), что может быть свидетельством появления в крови таких гасителей спонтанной люминесценции, как высоко-и среднемолекулярные олигопептидные эндотоксины [19]. Явное увеличение величины tg1 может отражать активацию систем быстрой элиминации свободных радикалов - активацию одного из начальных звеньев антиоксидатной системы.

Таблица 4

Влияние однократного внутривенного введения перфторана на интенсивность хемолюминесценции и концентрацию ВЭГ в плазме периферической крови лиц, страдающих пародонтозом

Норма

До введения через 1 час через 24 часа

Smax 30,6 ± 2,7 21,9 ± 2,1 рк <0,01 23,9 ± 2,8 рк <0,01 25,1 ± 3,1 рк <0,01

Imax 2,8 ± 0,3 2,8 ± 0,4 3,9 ± 0,5 3,8 ± 0,6

STmax 1,6 ± 0,2 1,7 ± 0,3 1,9 ± 0,4 1,7 ± 0,2

tgl 2,5 ± 0,2 5,1 ± 0,7 рк <0,01 4,7 ± 0,6 рк <0,01 6,7 ± 0,7 рк <0,01 р1 <G,G5

*Норма - параметры плазмы крови, взятой у практически здоровых доноров. р - указано при сравнении с соответствующими показателями в контрольной группе

Как видно из табл. 4, введение малых доз перфторана незначительно повышало уровень хемолюминесценции (Smax Imax STmax), почти не влияло на исходно повышенную активность антиоксидантных систем (tg1) плазмы через час, но способствовало активации антиоксидантных процессов через сутки. Малые дозы перфторана, рекомендуемые для уменьшения вторичной воспалительной альтерации, не обладают выраженным про- или антиоксидантным действием у лиц, страдающих пародонтозом.

Представленный материал дает основание считать, что в условиях нормоксии малые дозы перфторан и в эксперименте, и в клинических условиях не обладают прооксидантным повреждающим воздействием, но способствуют повышению стабильности мембран эритроцитов, очевидно, повышая их эластичность вследствие физического воздействия компонентов перфторана.

Литература

1. Белоярцев Ф.Ф. и др. //Анестезиол. и реаниматол.- 1985.-№ 3.- С. 73-77.

2. АС № 990228 / Способ консервирования клеток крови / Брустовецкий Н.Н., Маевский Е.И., Белоярцев Ф.Ф. и др. // Бюлл. изобр. откр. 21.G9.1982.

3. ВладимировЮ.А. //Вестник РАМН, 1998.- № 7.- С.43.

4. Владимиров Ю., Добрецова Г. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран.- М.:Наука, 1980.- 32G с.

5. Владимиров Ю.А. и др. // Вопр. мед. химии.- 1976.- Т. 22, № 2.- С. 216-223

6. Внуков В.В. и др. // Бюл. Эксперим. Биол. и медицины.-1979.- № 6.- С.528-530.

7. Иваницкий Г.Р. / / Биофизика.- 2001.- Т. 46, №1.- С.5-33.

8. Каган В.Е. и др. Проблема анализа эндогенных продуктов перекисного окисления липидов.- М., 1986.

9. Колчинская Л.И. и др. // Биохимия.- 1976.- №3.- С. 933.

1G. Королюк М.А. и др. //Лаб. дело.- 1988.- № 1.- С. 16-19.

11. Милютина Н.П. и др. Перекисное окисление липидов и активность антиоксидантных ферментов крови, структурнофункциональные свойства эритроцитов при атеросклерозе, ишемической болезни сердца, инфаркте миокарда.- Ростов-на-Дону, 1995.- 23 с.

12. Мороз В.В. и др. // Вест. интенсивной тер.- 1996.- № 23.- С. 15-21.

13. Образцов В.В., Тараховский Ю.С. / В кн. Фторуглерод-ные газопереносящие среды.- Пущино, 1984.- С. 156-162.

14. Орлов А.А. Клинико-экспериментальное обоснование применения перфторана в челюстно-лицевой хирургии: Автреф. дис... д.м.н.- М., 2GG4.

15. Склифас А.Н. Исследование механизмов аккумуляции и выведения перфторорганических соединений в организме животных: Афтореф дис... к.м.н.- Пущино, 2GGG.

16. Скорик В.И. и др. // Бюл. экспер. биол. и мед.-1996, Т.121, №5.- С.512-515.

17. Стальная И.Д. / В кн.Современные методы в биохимии.- М.: Медицина, 1977.- С. 63-64.

18. Стальная И.Д., Горишвили Т.Д. Современные методы в биохимии.- М.: Медицина, 1977.- С. 66-68.

19. Теселкин Ю.О. и др. // Вопр. мед. химии.- 1996.- № 5.-С. 87-93.

20. Ханевич М.Д. и др. / В сб.: Физиологически активные вещества на основе префторуглеродов в военной медицине: Всармейская науч. Конф. / Под ред. Г.А.Софронова.- СПБ, 1997.-С. 114-116

21. D'Agnillo F. Pro-oxidant activity of hemoglobin and endothelial cytotoxicity.- ibid.- P.206-216

22. Alayash A.I. Redox and radical reactions of hemoglobin solutions: toxicities and protective strategies.// in: Blood Substitutes. Ed. R.M. Winslow, Amsterdam, Boston, Heidelberg, London, New York, Oxford, Paris, San Diego, San Francisco, Singapore, Sydney, Tokyo, 2006, P. 197-205.

23. Bligh E., Dyel WJ. //Can. Biochem. Physiol.- 1959.- Vol. 37.- № 8.- P. 911- 912.

24. Fried R. Enzymatic and non-enzymatic assay of superoxide dismutase. //Biochemistry.- 1975.- Vol. 87.- P. 657-666.

25. LuckM. Catalase / Ed. By Bergmeyer H. Perg. Press. N-Y.-1966.- Р. 885-894.

26. Minami M., Yoshikama H. A simplitied method of superoxide dismutase activity for clinical use//Clin. Chim. Acta.- 1979.- Vol. 92, № 3.- Р. 337-342.

27. Obraztsov V.V. et al. // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.- 2000.- Vol.278.- Р. L1018-L1024

28. Rafikova O. et al. // Circulation.- 2004.- Vol. 110.-P.3573-3580

29. Riess I. G. et al.// Blood Compatible Materials and Devices', Lancaster-Basel..- 1991.- Vol. 3.- Р. 87-93.

УДК: 616.12-008.331.4:615.225.1:612.13+616-071.3)005

СИСТЕМНЫЙ АНАЛИЗ ГЕМОДИНАМИЧЕСКИХ И АНТРОПОМЕТРИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ У БОЛЬНЫХ ПЕРВИЧНОЙ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПОТЕНЗИЕЙ ДО И ПОСЛЕ ЛЕЧЕНИЯ ГУТРОНОМ

А.В. ПОЗНЯКОВА, Д.А. ШВЕЦ, В.С. БАРСУКОВ, В.И. ВИШНЕВСКИЙ*

Первичная артериальная гипотензия (ПАГ), выделенная в качестве самостоятельного заболевания Н.С. Молчановым (1962), в настоящее время привлекает к себе повышенный интерес. Данное заболевание особенно характерно для молодых людей и проявляет себя выраженными симптомами астеновегетативной дистонии с упорными головными болями, синкопальными состояниями и снижением работоспособности. Изучению состояния кровообращения при ПАГ посвящен ряд исследований [5, 7-9], в которых авторы приводят данные о ведущей патогенетической роли сниженного тонуса артериальных и венозных сосудов, причиной чего, по их мнению, является дисбаланс вегетативной нервной системы (ВНС). Работы, основанные на системном подходе к анализу функциональных показателей сердечнососудистой системы и их взаимоотношений с антропометрическими показателями, отсутствуют. Именно такой подход, основанный на учении П.К. Анохина о функциональных системах [1, 2], дает возможность рассмотреть работу сердечно-сосудистой системы как единого целого и адекватно оценить идущие в ней патологические изменения с позиций адаптации, дизадаптации и декомпенсации, проследить эффекты проводимой терапии.

Цель исследования - изучение системного взаимодействия гемодинамических и антропометрических параметров у больных ПАГ и его изменений под влиянием терапии гутроном, известным и эффективным антигипотензивным препаратом [5, 8].

Материал и методы исследования. Исследование проведено на группе учащихся и преподавателей ряда высших учебных заведений г. Курска и г. Орла. У лиц в возрасте до 25 лет ПАГ диагностировали при систолическом артериальном давлении (САД) не выше 100 мм рт ст и диастолическом давлении (ДАД) не выше 60 мм рт ст; в более старшем возрасте диагностические уровни САД и ДАД составляли, соответственно, 105 мм рт ст и 65 мм рт ст [11, 6]. Помимо уровня АД анализировали наличие характерных симптомов в виде постоянных головных болей, ортостатических синкоп, психической истощаемости со снижением умственной работоспособности, раздражимости, нарушений сна, дискинетических расстройств желудочно-кишечного тракта,

* Каф. Внутр. болезней и каф. общей патол. Мединститута Орловского ГУ