Способ профилактики ретинальной ишемии-реперфузии миноксидилом в эксперименте
METHOD FOR RETINAL ISCHEMIA-REPERFUSION PREVENTION BY MINOXIDIL IN EXPERIMENT

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии и офтальмологии.
По известным литературным источникам – в последние годы отмечается рост ишемических заболеваний глазного дна, связанных с распространением атеросклероза, гипертонической болезни, ишемической болезни сердца, сахарного диабета, которые приводят к патологии сетчатки. Ретинальная ишемия приводит к развитию слепоты и инвалидности по зрению у людей различных возрастных групп (Камилов Х. М. Состояние общей и регионарной гемодинамики при глазном ишемическом синдроме [Текст] / Х. М. Камилов, М. С. Касимова, Д. К. Махкамова // Вестник Тамбовского университета. Сер. Естественные и технические науки. – 2015. – Т. 20, № 3. – С. 596–599). В связи с этим, профилактика и коррекция ишемических повреждений сетчатки, возникающих при различных системных заболеваниях и состояниях, является актуальной проблемой современной медицины.
Известен способ профилактики ишемии сетчатки эритропоэтином в эксперименте (RU № 2539629, публ. 20.01.2015), включающий воспроизведение модели патологии и введение лабораторному животному рекомбинантного эритропоэтина в дозе 50 МЕ/кг, отличающийся тем, что рекомбинантный эритропоэтин вводят однократно в 1-й день эксперимента внутрибрюшинно в качестве прекондиционирующего агента, а через 30 минут проводят моделирование ишемии сетчатки путем оказания механического давления (110 мм рт.ст.) на переднюю камеру глаза в течение 30 минут в 1-й день эксперимента.
Основным недостатком способа является то, что профилактика ишемии сетчатки рекомбинантным эритропоэтином в эксперименте не приводит к достижению целевых значений уровня ретинальной микроциркуляции после 72 часов реперфузии в отличие от предлагаемой профилактики, где уровень микроциркуляции в сетчатке в группе крыс с коррекцией патологии миноксидилом стремится к значению в группе интактных животных, достоверно не отличаясь от него, и превосходит показатели коррекции рекомбинантным эритропоэтином.
Наиболее близким к заявленному решению является способ профилактики ишемии сетчатки в эксперименте (RU № 2539630, публ. 20.01.2015), включающий фармакологическое прекондиционирование никорандилом путем его введения лабораторному животному в виде раствора внутрижелудочно через зонд, а затем моделирование патологии, а никорандил вводят в дозе 0,86 мг/кг массы тела животного однократно, а через 30 минут проводят моделирование ишемии сетчатки путем оказания механического давления 110 мм рт.ст. на переднюю камеру глаза в течение 30 минут в 1-й день эксперимента.
Основным недостатком способа является то, что оценку профилактического действия никорандила проводят только по изменению показателей уровня микроциркуляции в сетчатке, не учитывая показатели функциональной активности сетчатки, что не позволяет полностью оценить фармакологическое действие препарата при проведении доклинических исследований.
Задачей предлагаемого изобретения является создание эффективного способа профилактики ретинальной ишемии-реперфузии миноксидилом в эксперименте, включающего прекондиционирующий агент миноксидил.
Поставленная задача достигается тем, что предложен способ профилактики ретинальной ишемии-реперфузии миноксидилом в эксперименте, включающий фармакологическое прекондиционирование лекарственным средством путем его введения лабораторному животному в виде раствора внутрижелудочно через зонд, а затем моделирование патологии путем оказания механического давления 110 мм рт.ст. на переднюю камеру глаза в течение 30 минут в 1-й день эксперимента, причем в качестве лекарственного средства применяют миноксидил, который вводят в дозе 0,5 мг/кг массы тела животного однократно, а через 60 минут проводят моделирование ретинальной ишемии-реперфузии. Результат подтверждается электроретинографически через 72 часа реперфузии.
Основным преимуществом предлагаемого способа является то, что внутрижелудочное введение миноксидила в дозе 0,5  мг/кг массы тела животного однократно приводит к более выраженной коррекции ретинальной ишемии-реперфузии в эксперименте, чем в прототипе и аналоге, так как миноксидил открывает митохондриальные АТФ-зависимые К+-каналы, за счет чего реализуется эффект прекондиционирования, что подтверждается достижением лучших показателей уровня ретинальной микроциркуляции и восстановлением электрофизиологической активности сетчатки при коррекции миноксидилом.
Регистрацию уровня микроциркуляции в сетчатке и электроретинографию (ЭРГ) проводили через 72 часа реперфузии после моделирования ретинальной ишемии.
Кроме того, в предлагаемом способе выявлена более эффективная профилактика ретинальной ишемии-реперфузии в эксперименте, подтверждаемая достижением лучших показателей уровня микроциркуляции в сетчатке при коррекции миноксидилом, чем в прототипе, и улучшением электрофизиологической активности сетчатки при проведении ЭРГ.
СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ СЛЕДУЮЩИМ ОБРАЗОМ
Опыты  проведены на 40 белых лабораторных крысах обоих полов массой  180-220 г. Каждая группа включала 10 крыс. Первая группа – группа интактных животных, вторая группа – с ретинальной ишемией (контроль), третья группа – с коррекцией миноксидилом; четвертая группа - с коррекцией никорандилом (препарат сравнения).
Моделирование ретинальной ишемии-реперфузии проводили путем оказания механического давления 110 мм рт.ст. на переднюю камеру глаза в течение 30 минут в 1-й день эксперимента. Подтверждением формирования ишемии служило отсутствие глазного кровотока (побеление глаза лабораторного животного).
В третьей группе животных за 60 мин до моделирования патологии вводили миноксидил в дозе 0,5 мг/кг массы тела крысы (терапевтическая доза получена в результате переноса доз с человека на крысу с использованием формулы межвидового переноса и коэффициента пересчета доз для разных видов животных в зависимости от массы тела по Улановой И.П.) однократно внутрижелудочно через зонд в виде крахмального раствора. За 15 мин до моделирования ишемии осуществляли наркотизацию внутрибрюшинным введением  раствора хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг массы тела крысы.
В четвертой группе животных за 30 мин до моделирования ретинальной ишемии-реперфузии вводили никорандил в дозе 0,86 мг/кг массы тела животного (терапевтическая доза получена в результате переноса доз с человека на крысу с использованием формулы межвидового переноса и коэффициента пересчета доз для разных видов животных в зависимости от массы тела по Улановой И.П.) однократно внутрижелудочно через зонд в виде крахмального раствора. За 15 мин до моделирования ишемии осуществляли наркотизацию внутрибрюшинным введением  раствора хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг массы тела животного.
О выраженности ретинопротективного эффекта судили по электрофизиологическим изменениям в сетчатке крыс через 72 часа реперфузии. Для этого под наркозом (хлоралгидрат, 300 мг/кг массы тела животного, внутрибрюшинно) животное фиксировали. Функциональное состояние сетчатки оценивали по амплитуде а- и b-волн электроретинограммы. Угнетение волны b является наиболее чувствительным показателем ишемического повреждения ткани и отражает функциональное состояние сетчатки даже при отсутствии заметных структурных повреждений (Константинова Т. С. Протекторная и нейротоксическая роль оксида азота в моделях зрительных патологий [Текст] : автореф. дис. … канд. биол. наук : 03.00.02 / Т. С. Константинова. – Москва, 2009. – 26 с.). Вызванные биопотенциалы пропускались на частоте 1-1000 Гц, усиливались, усреднялись и представлялись графически на экране при помощи Biopac-systems MP-150 с компьютерной программой AcqKnowledge 4.2 (США).
Уровень микроциркуляции в сетчатке крыс определяли сразу после проведения ЭРГ при помощи лазер-Доплер флоуметра Biopac-systems MP-150 и датчика игольчатого типа TSD-144 (США). Регистрацию уровня микроциркуляции в сетчатке оценивали в десяти точках, из полученных значений выводили среднее, которое вносили в протокол и принимали за уровень микроциркуляции в сетчатке у данного животного.
Достоверность изменений абсолютных параметров определяли разностным методом вариационной статистики с нахождением средних значений сдвигов, средней арифметической и вероятности возможной ошибки (р) по таблицам Стьюдента. Различия оценивали как достоверные при p<0,05. Для расчётов использовали программу статистического анализа Microsoft Excel 2003.
ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ
Оценку электрофизиологической активности сетчатки проводят по её основным компонентам – по амплитуде а- и b-волн. Для проведения ЭРГ животных выдерживают в темноте 30 мин (Effects of the duration of dark adaptation on the retinal function of normal SD rats [Text] / L. Zahng, Y.-h. Gu, J. An [et al.] // Chinese journal of optometry ophthalmology and visual science. – 2013. – Vol. 15, № 6. – P. 323-326), далее наркотизируют и фиксируют на столике, изолированном от электромагнитного излучения. Роговичный серебряный электрод помещают на роговицу, предварительно смоченную физ. раствором для более полного контакта, референтный игольчатый электрод помещают подкожно в области черепа, заземляющий игольчатый электрод помещают подкожно в области основания хвоста. Стробоскоп со вспышкой белого света, подключенный к стимулятору, размещают за спиной животного, регистрацию ЭРГ проводят в ответ на одиночную стимуляцию. Вызванные биопотенциалы пропускают на частоте 1-1000 Гц, усиливают, усредняют и представляют графически. Запись ЭРГ проводят в течение 0,5 с у каждой крысы. Для оценки степени развития ишемии сетчатки используют соотношение амплитуд b- и а-волн ЭРГ – коэффициент b/a (Константинова Т. С. Протекторная и нейротоксическая роль оксида азота в моделях зрительных патологий [Текст] : автореф. дис. … канд. биол. наук : 03.00.02 / Т. С. Константинова. – Москва, 2009. – 26 с.; Нероев В. В. Ишемия сетчатки и оксид азота [Текст] / В. В. Нероев, М. М. Архипова // Вестник РАМН. – 2003. – № 5. – С. 37-40).
Результаты оценки электрофизиологической активности сетчатки крыс на 72 час реперфузии после моделирования ретинальной ишемии в экспериментальных группах представлены в таблице 1.
Таблица 1
Результаты оценки электрофизиологической активности сетчатки крыс на 72 час реперфузии (М±m), усл.ед.
№ п/п
Экспериментальные группы
Коэффициент b/a после 72 ч реперфузии
1
Интактные (n=10)
2,5±0,10<sup> у</sup>
2
Ретинальная ишемия (n=10)
1,2±0,04*
3
Коррекция миноксидилом, 0,5 мг/кг  (n=10)
2,4±0,09<sup> у</sup>
4
Коррекция никорандилом,0,86 мг/кг (n=10)
2,2±0,06<sup></sup>*<sup>у</sup>
у
Примечание: * - р<0,05 в сравнении с группой интактных животных;   - р<0,05 в сравнении с группой с ретинальной ишемией
В нашем исследовании при развитии ретинальной ишемии через 72 ч после моделирования патологии коэффициент b/a снижался до 1,2±0,04 при его нормальных значениях у белых лабораторных крыс 2,5±0,1 (р<0,05). На фоне коррекции патологии миноксидилом коэффициент b/a достоверно возрастал до 2,4±0,09 (р<0,05) по сравнению с группой контроля (табл. 1). При коррекции ишемии никорандилом коэффициент b/a составил 2,2±0,06, что достоверно отличается как от значений в группе контроля (р<0,05), так и от значений в группе интактных крыс (р<0,05).
Оценку микроциркуляции проводили при помощи лазер-Доплер флоуметра Biopac-systems MP-150 и датчика TSD-144 (США). Для этого производили регистрацию уровня микроциркуляции в сетчатке в десяти точках по окружности склеры с шагом 1 мм. Запись кривой уровня микроциркуляции проводили в течение 20 секунд в каждой точке. Из полученных десяти значений выводили среднее, которое вносили в протокол и принимали за уровень микроциркуляции в сетчатке у данного животного. Из 10 полученных значений выводили среднее, которое принимали за уровень микроциркуляции в сетчатке в данной группе животных.
Результаты оценки уровня микроциркуляции в сетчатке крыс на 72 час реперфузии после моделирования ретинальной ишемии в экспериментальных группах представлены в таблице 2.
Таблица 2
Результаты оценки уровня микроциркуляции в сетчатке крыс на 72 час реперфузии (М±m), п.е. (перфузионные единицы)
№ п/п
Экспериментальные группы
Уровень микроциркуляции после 72 ч реперфузии
1
Интактные (n=10)
743,9±5,0<sup> у</sup>
2
Ретинальная ишемия (n=10)
353,3±11,7*
3
Коррекция миноксидилом, 0,5 мг/кг  (n=10)
739,5±14,1<sup> у</sup>
4
Коррекция никорандилом,0,86 мг/кг (n=10)
705,2±15,5 <sup>у</sup>
Примечание: * - р<0,05 в сравнении с группой интактных животных;  у - р<0,05 в сравнении с группой с ретинальной ишемией
Уровень микроциркуляции в сетчатке интактных крыс составил 743,9±5,0 п.е. Уровень микроциркуляции после моделирования ретинальной ишемии в группе контроля составил на 72 час реперфузии 353,3±11,7 п.е., что достоверно ниже значения в группе интактных животных (р<0,05). На фоне коррекции патологии миноксидилом уровень микроциркуляции в сетчатке достоверно возрастает до 739,5±14,1 п.е. (р<0,05) по сравнению с группой контроля. При коррекции ишемии никорандилом уровень микроциркуляции в группе возрастает до 705,2±15,5 п.е. и достоверно отличается от значений в группе контроля (р<0,05).
В связи с вышеизложенным следует, что коррекция ретинальной ишемии-реперфузии миноксидилом в дозе 0,5 мг/кг массы тела животного приводит к достижению более высоких показателей уровня микроциркуляции в сетчатке лабораторных крыс после 72 ч реперфузии по сравнению с коррекцией никорандилом в дозе 0,86 мг/кг массы тела животного и стремится к значениям в группе интактных крыс.
Таким образом, в предлагаемом способе введение миноксидила в дозе 0,5  мг/кг массы тела животного производится внутрижелудочно через зонд однократно, что приводит к более выраженной коррекции ретинальной ишемии-реперфузии в эксперименте, чем в прототипе и аналоге, так как миноксидил открывает митохондриальные АТФ-зависимые К+-каналы, за счет чего реализуется эффект прекондиционирования, что подтверждается достижением лучших показателей уровня ретинальной микроциркуляции и восстановлением электрофизиологической активности сетчатки.