СПОСОБЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ DPP3 И ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ СПОСОБЫ
METHODS FOR DETERMINING DPP3 AND THERAPEUTIC METHODS

Настоящее изобретение относится к способам определения активной DPP3 в образце жидкости организма, анализу или набору для определения активной DPP3 в образце жидкости организма, способу диагностики заболевания или состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, и способам лечения указанного заболевания.
Уровень техники
Дипептидилпептидаза-3 также известна как дипептидиламинопептидаза III, дипептидилариламидаза III, дипептидилпептидаза III, энкефалиназа B или эритроцитарная ангиотензиназа; сокращенное название: DPP3, DPPIII - представляет собой металлопептидазу, которая катализирует отщепление дипептидов из физиологически активных пептидов, таких как энкефалины и ангиотензины.
DPP3 была впервые идентифицирована и ее активность была измерена в экстрактах очищенной передней доли гипофиза крупного рогатого скота Ellis & Nuenke, 1967. Фермент, который указан как EC 3.4.14.4, имеет молекулярную массу примерно 83 кДа и является высококонсервативым в прокариотах и эукариотах (Prajapati & Chauhan, 2011). Аминокислотная последовательность человеческого варианта показана в SEQ ID NO: 1. Дипептидилпептидаза III преимущественно является цитозольной пептидазой, которая экспрессируется повсеместно. Несмотря на отсутствие сигнальной последовательности, в нескольких исследованиях сообщалось о мембранной активности (Lee & Snyder, 1982).
2+
2+
DPP3 представляет цинк-зависимую экзопептидазу, относящуюся к семейству пептидаз M49. Она обладает широкой субстратной специфичностью для олигопептидов, включающих от трех/четырех до десяти аминокислот различных составов, и также способна катализировать расщепление после пролина. Известно, что DPP3 гидролизует дипептиды из N-конца ее субстратов, включая ангиотензин II, III и IV; лей- и мет-энкефалин; эндоморфин 1 и 2. Металлопептидаза DPP3 имеет оптимальную активность при рН 8,0-9,0, и может активироваться добавлением ионов двухвалентных металлов, таких как Co и Mg. Структурный анализ DPP3 показал наличие каталитических мотивов HELLGH (hDPP3 450-455) и EECRAE (hDPP3 507-512), а также следующих аминокислот, которые важны для связывания субстрата и гидролиза: Glu316, Tyr318, Asp366, Asn391, Asn394, His568, Arg572, Arg577, Lys666 и Arg669 (Prajapati & Chauhan 2011, Kumar et al., 2016; нумерация относится к последовательности DPP3 человека, см. SEQ ID NO: 1). С учетом всех известных аминокислот или областей последовательности, которые участвуют в связывании субстрата и гидролизе, активный сайт DPP3 человека можно определить как область между аминокислотами 316 и 669.
Активность DPP3 может ингибироваться неспецифически различными общими ингибиторами протеаз (например, PMSF, TPCK), сульфгидрильными реагентами (например, pHMB, DTNB) и хелаторами металлов (ЭДТА, o-фенантролин, Abramić et al., 2000).
Активность DPP3 может ингибироваться специфически различными типами соединений: эндогенным ингибитором DPP3 является пептид спинорфин. Получено несколько синтетических производных спинорфина, например, тинорфин, и было показано, что они ингибируют активность DPP3 в разной степени (Yamamoto et al., 2000). Другими пептидными ингибиторами DPP3, о которых имеются сообщения, являются пропиоксатин А и В (патент США № 480676) и аналоги пропиоксатина А (Inaoka et al., 1988).
DPP3 также можно ингибировать небольшими молекулами, такими как флуостатины и производные бензимидазола. Флуостатины A и B представляют антибиотики, продуцируемые Streptomyces sp. TA-3391, которые нетоксичны и эффективно ингибируют активность DPP3. К настоящему времени было синтезировано и опубликовано 20 различных производных бензимидазола (Agić et al., 2007; Rastija et al., 2015), из которых два соединения 1' и 4' демонстрируют самый высокий ингибирующий эффект (Agić et al., 2007). Полный список ингибиторов DPP3 приведен в таблице 2.
Точная биологическая функция DPP3 в клеточной физиологии не понятна, но последние данные указывают на ее роль не только в метаболизме белков, но также в регуляции кровяного давления, модуляции боли и воспалительных процессах (Prajapati & Chauhan 2011).
В нескольких публикациях было показано, что DPP3 является перспективным биомаркером, все источники относятся к внутриклеточной DPP3. Было показано, что активность DPP3 повышается в гомогенатах опухолей яичников и эндометрия. Активность DPP3 даже увеличивается с увеличением тяжести/ злокачественности указанных опухолей (Šimaga et al., 1998 и 2003). Анализ иммуногистологией и вестерн-блоттингом клеточных линий глиобластомы также выявил повышенные уровни DPP3 (Singh et al., 2014).
Также было предположено, чтобы внутриклеточная или мембранная DPP3 является потенциальным маркером артериального риска (US 2011008805) и маркером ревматоидного артроза (US 2006177886). В международной заявке на патент WO 2005106486 раскрывается экспрессия и активность DPP3 в качестве диагностического маркера и DPP3 в качестве терапевтической мишени при многих видах заболеваний за счет повсеместной экспрессии DPP3 в клетке или на поверхности клетки. В EP1498480 упоминается потенциальное диагностическое и терапевтическое применение гидролитических ферментов, включая DPP3.
DPP3 была предложена не только качестве потенциального биомаркера, но также и в качестве потенциальной терапевтический мишени за счет ее способности расщеплять несколько биологически активных пептидов. Сверхэкспрессия DPP3 защищает клетки нейробластомы от окислительного стресса (Liu et al., 2007). Вирус гриппа А изменяет уровни DPP3 хозяина для собственной репликации (исследования с клеточными культурами, Meliopoulos et al., 2012). В общем, ферменты, расщепляющие энкефалин и/или ангиотензин, включая DPP3, обладают терапевтическим потенциалом в качестве мишеней для лечения боли, сердечно-сосудистых заболеваний (CVD) и рака, и соответствующие ингибиторы в качестве потенциального лечения боли, психических заболеваний и сердечно-сосудистых заболеваний (Khaket et al. 2012, Patel et al., 1993, Igic et al., 2007).
Несмотря на то, что DPP3 известна как внутриклеточный белок, активность DPP3 была обнаружена в некоторых жидкостях организма: ретроплацентарной сыворотке (Shimamori et al., 1986), семенной плазме (Vanha-Perttula et al., 1988) и СМЖ (Aoyagi et al., 1993). В СМЖ наблюдали повышенные уровни активности DPP3, измеренные у пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера (AD, Aoyagi et al., 1993). Wattiaux et al. (2007) предложили высвобождение внутриклеточной DPP3 в качестве маркера погибших и/или умирающих клеток в клеточной культуральной системе. Также было высказано предположение, что высвобождение DPP3 из некротических клеток влияет на иммунный ответ на мышиной модели (Gamrekelashvili et al., 2013).
Целью настоящего изобретения является обеспечение способа специфического определения активной DPP3 в образце жидкости организма, т. е., определения активной DPP3, но не любой другой аминопептидазы, чем DPP3.
Целью изобретения является обеспечение соответствующих анализов и наборов.
Еще одной целью изобретения является обеспечение способа диагностики заболевания или состояния у индивида, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, и способов лечения указанного заболевания.
Предметом настоящего изобретения является способ определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида, включающий стадии:
контактирования указанного образца с захватывающим-связывающим соединением, которое специфически связывается с полноразмерной DPP3,
отделения DPP3, связанной с указанным с захватывающим-связывающим соединением,
добавления субстрата DPP3 к указанной отделенной DPP3,
количественного определения активности DPP3 измерением превращения субстрата DPP3.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный способ представляет анализ с захватом фермента (ECA, см., например, US 5612186A, US 5601986A).
Все определения и конкретные варианты осуществления, указанные в описании, следует применять ко всем аспектам и объектам изобретения. Следует понимать, что определения и конкретные варианты осуществления, которые подробно изложены в одном аспекте или объекте изобретения, будут представлять определения и конкретные варианты осуществления для других аспектов и объектов изобретения, например, определение захватывающего-связывающего соединения или специфического захвата применимо ко всем вариантам осуществления изобретения: например, способам определения DPP3, анализам и наборам, диагностическим методам, терапевтическим методам. Такие определения могут не повторяться по тексту описания.
Связывание специфически с полноразмерной DPP3 означает, что указанное захватывающее-связывающее соединение не связывается с каким-либо другим белком, отличным от DPP3. Связывание специфически с полноразмерной DPP3 означает, что указанное захватывающее-связывающее соединение не связывается с какой-либо другой аминопептидазой, отличной от DPP.
Связывающее соединение, которое связывается с полноразмерной DPP3, представляет связывающее соединение, которое связывается с белком с последовательностью SEQ ID NO: 1. Связывающее соединение, которое связывается с полноразмерной DPP3, представляет связывающее соединение, которое связывается с SEQ ID NO: 1.
В конкретном варианте осуществления указанное захватывающее-связывающее соединение ингибирует активность DPP3 в жидкофазном анализе менее чем на 50%, предпочтительно менее чем на 40%, предпочтительно менее чем на 30%. Жидкофазный анализ представляет собой анализ, в котором расщепление субстратов DPP3 имеет место в жидкой фазе.
Ингибирование активности DPP3 в жидкофазном анализе связывающим соединением можно определить согласно настоящему изобретению. Возможные захватывающие-связывающие соединения DPP3 инкубируют с рекомбинантной или очищенной нативной DPP3 и специфическими субстратами DPP3 в жидкофазном анализе. Предпочтительно, в качестве захватывающего-связывающего соединения для ECA выбирают такое, которое обладает, по меньшей мере, ингибирующей способностью. Захватывающее-связывающее соединение должно ингибировать активность DPP3 менее чем на 50%, предпочтительно менее чем на 40%, предпочтительно менее чем на 30%. Специфический жидкофазный анализ активности DPP3 для определения ингибирующей способности возможных захватывающих-связывающих соединений подробно описан в примере 1 и включает следующие стадии:
2
Инкубацию 25 нг/мл рекомбинантной GST-hDPP3 с 5 мкг/мл соответствующего захватывающего-связывающего соединения и контрольного буфера в 50 мМ Трис-HCl, pH 7,5 и 100 мкМ ZnCl в течение 1 ч при комнатной температуре.
Добавление флуорогенного субстрата Arg-Arg-βNA (20 мкл, 2 мМ).
Инкубацию при 37°C и мониторинг образования свободного βNA на микропланшетном флуорометре Twinkle LB 970 (Berthold Technologies GmbH) в течение 1 ч. Флуоресценцию βNA детектируют при волне возбуждения 340 нм и волне эмиссии 410 нм.
Вычисляют наклоны (в RFU/мин) увеличения флуоресценции различных образцов. Наклон GST-hDPP3 с контрольным буфером определяется как 100% активность. Ингибирующая способность возможного захватывающего-связывающего соединения определяется как снижение активности GST-hDPP3 инкубацией с указанным захватывающим-связывающим соединением в процентах.
Напротив, твердофазный анализ представляет собой анализ, где соответствующие события связывания имеют место в твердой фазе (см. пример 4 и 5).
Для четкого понимания, способ определения активной DPP3 можно провести в виде жидкофазного анализа и в виде твердофазного анализа. Ингибирование активности DPP3 можно определить в жидкофазном анализе, тем не менее, согласно вышеописанной процедуре.
Таким образом, твердофазный анализ является вариантом осуществления настоящего изобретения. Контактирование указанного образца с захватывающим-связывающим соединением, которое специфически связывается с полноразмерной DPP3, может иметь место в жидкой фазе (жидкофазный анализ захвата), и затем стадия отделения может включать иммобилизацию указанного комплекса захватывающее-связывающее соединение-DPP3. В качестве альтернативы захватывающее-связывающее соединение может быть иммобилизовано на поверхности, и связующее событие - захватывающее-связывающее соединение с DPP3 - имеет место в твердой фазе (твердофазный анализ).
В одном конкретном варианте осуществления для предотвращения полного ингибирования DPP3 и для ингибирования активности DPP3 менее чем на 50%, предпочтительно менее чем на 40%, предпочтительно менее чем на 30% в вышеописанном жидкофазном анализе, захватывающее-связывающее соединение предпочтительно не связывается с DPP3 в области или около области аминокислот 316-669 SEQ ID NO: 1. Область аминокислот 316-669 SEQ ID NO: 1 включает активный центр DPP3 и область связывания субстрата (например, Prajapati & Chauhan 2011, Kumar et al., 2016).
Активность DPP3 можно измерить детектированием продуктов расщепления субстратов DPP3.
Известные субстраты, пептидные гормоны, включают ангиотензин II, III и IV, лей-энкефалин, мет-энкефалин, эндоморфин 1 и 2, валорфин, β-казоморфин, динорфин, проктолин, АКТГ (адренокортикотропный гормон) и MSH (меланоцитстимулирующий гормон, Abramić et al., 2000, Baršun et al., 2007, Dhanda et al., 2008). Расщепление указанных пептидных гормонов, а также других немеченых олигопептидов (например, Ala-Ala-Ala-Ala, Dhanda и др., 2008), можно контролировать детектированием соответствующих продуктов расщепления. Способы детектирования включают, не ограничиваясь этим, анализ ВЭЖХ (например, Lee & Snyder, 1982), масс-спектрометрию (например, Abramić et al., 2000), H1-ЯМР анализ (например, Vandenberg et al., 1985), капиллярный зональный электрофорез (CE; например, Baršun et al., 2007), тонкослойную хроматографию (например, Dhanda et al., 2008) или обращеннофазовую хроматографию (например, Mazocco et al., 2006).
Детектирование флуоресценции за счет гидролиза флуорогенных субстратов DPP3 является стандартной процедурой для контроля активности DPP3. Данные субстраты представляют собой специфические ди- или трипептиды (Arg-Arg, Ala-Ala, Ala-Arg, Ala-Phe, Asp-Arg, Gly-Ala, Gly-Arg, Gly-Phe, Leu-Ala, Leu-Gly, Lys-Ala, Phe-Arg, Suc-Ala-Ala-Phe), связанные с флуорофором. Флуорофоры включают, не ограничиваясь этим, β-нафтиламид (2-нафтиламид, βNA, 2NA), 4-метокси-β-нафтиламид (4-метокси-2-нафтиламид) и 7-амидо-4-метилкумарин (AMC, MCA, Abramić et al., 2000, Ohkubo et al., 1999). Расщепление этих флуорогенных субстратов приводит к высвобождению флуоресцентного β-нафтиламина или 7-амино-4-метилкумарина соответственно. В жидкофазном анализе субстрат ECA и DPP3 инкубируют, например, в 96-луночном планшете, и флуоресценцию измеряют с использованием флуоресцентного детектора (Ellis & Nuenke 1967). Кроме того, образцы, содержащие DPP3, можно иммобилизовать и разделить гель-электрофорезом, окрасить гели флуорогенным субстратом (например, Arg-Arg-βNA) и Fast Garnet GBC и полосы флуоресцентного белка, детектировать на ридере для измерения флуоресценции (Ohkubo et al., 1999).
Те же самые пептиды (Arg-Arg, Ala-Ala, Ala-Arg, Ala-Phe, Asp-Arg, Gly-Ala, Gly-Arg, Gly-Phe, Leu-Ala, Leu-Gly, Lys-Ala, Phe-Arg, Suc-Ala-Ala-Phe) можно связать с хромофорами, такими как п-нитроанилида диацетат. Детектирование изменения окраски за счет гидролиза хромогенных субстратов можно использовать для контроля активности DPP3.
Другим вариантом детектирования активности DPP3 является анализ Protease-Glo™ (коммерчески доступный в Promega). В данном варианте осуществления указанного способа определения DPP3 специфические ди- или трипептиды (Arg-Arg, Ala-Ala, Ala-Arg, Ala-Phe, Asp-Arg, Gly-Ala, Gly-Arg, Gly-Phe, Leu-Ala, Leu -Gly, Lys-Ala, Phe-Arg, Suc-Ala-Ala-Phe) связывают с аминолюциферином. При расщеплении под действием DPP3 аминолюциферин высвобождается и служит в качестве субстрата для связанной люциферазной реакции, которая испускает детектируемую люминесценцию.
В предпочтительном варианте осуществления активность DPP3 измеряется добавлением флуорогенного субстрата Arg-Arg-βNA и контролем флуоресценции в режиме реального времени.
В конкретном варианте осуществления указанного способа определения ингибирующего эффекта связывающих соединений DPP3 и/или активности DPP3 в образце жидкости организма индивида указанное связывающее соединение может быть выбрано из группы, включающей антитело, фрагмент антитела или каркасный белок, отличный от IgG.
2
Антитело по настоящему изобретению представляет белок, включающий один или более полипептидов, по существу кодированных генами иммуноглобулина, которые специфически связываются с антигеном. Известные иммуноглобулиновые гены включают гены константной области каппа, лямбда, альфа (IgA), гамма (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), дельта (IgD), эпсилон (IgE) и мю (IgM), а также многочисленные гены вариабельной области иммуноглобулинов. Полноразмерные легкие цепи иммуноглобулина обычно имеют длину примерно 25 кД или 214 аминокислот. Полноразмерные тяжелые цепи иммуноглобулина обычно имеют длину примерно 50 кД или 446 аминокислот. Легкие цепи кодируются геном вариабельной области на NH-конце (длиной примерно 110 аминокислот) и геном константной области каппа или лямбда на COOH-конце. Тяжелые цепи аналогичным образом кодируются геном вариабельной области (длиной примерно 116 аминокислот) и одним из генов другой константной области.
2
Основная структурная единица антитела обычно представляет собой тетрамер, который состоит из двух идентичных пар цепей иммуноглобулина, где каждая пара имеет одну легкую и одну тяжелую цепь. В каждой паре вариабельные области легкой и тяжелой цепи связываются с антигеном, а константные области опосредуют эффекторные функции. Иммуноглобулины также существуют в различных других формах, включая, например, Fv, Fab и (Fab'), а также бифункциональные гибридные антитела и одиночные цепи (например, Lanzavecchia et al., 1987; Huston et al., 1988; Bird et al., 1988; Hood et al., 1984. Hunkapiller & Hood, 1986). Вариабельная область легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина включает каркасную область, прерываемую тремя гипервариабельными областями, также называемыми областями, определяющими комплементарность (CDR) (см. Kabat et al., 1983). Как отмечено выше, CDR в основном ответственны за связывание с эпитопом антигена. Иммунный комплекс представляет антитело, такое как моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или человеческое антитело или функциональный фрагмент антитела, специфически связанные с антигеном.
Химерные антитела представляют антитела, гены легкой и тяжелой цепи которых были сконструированы, как правило, методами генной инженерии из генов вариабельной и константной областей иммуноглобулинов, относящихся к разным видам. Например, вариабельные сегменты генов из мышиного моноклонального антитела могут быть присоединены к человеческим константным сегментам, таким как каппа и гамма 1 или гамма 3. Таким образом, в одном примере терапевтическое химерное антитело представляет собой гибридный белок, состоящий из вариабельного или антигенсвязывающего домена из мышиного антитела и константного или эффекторного домена из человеческого антитела, хотя можно использовать другие виды млекопитающих, или вариабельную область можно получить молекулярными методами. Способы получения химерных антител хорошо известны в данной области, например, см. патент США № 5807715. «Гуманизированный» иммуноглобулин представляет иммуноглобулин, включающий человеческую каркасную область и один или более CDR из иммуноглобулина, отличного от человеческого (например, мышиного, крысиного или синтетического). Иммуноглобулин, отличный от человеческого, обеспечивающий CDR, называется «донором», и иммуноглобулин человека, обеспечивающий каркасную область, называется «акцептором». В одном варианте осуществления в гуманизированном иммуноглобулине все CDR происходят из донорного иммуноглобулина. Константные области необязательно должны присутствовать, но если они имеются, то они должны быть в основном идентичны константным областям иммуноглобулина человека, т. е. идентичны, по меньшей мере, примерно на 85-90%, например, примерно на 95% или более. Следовательно, все части гуманизированного иммуноглобулина, за исключением, возможно, CDR, по существу идентичны соответствующим частям последовательностей природных человеческих иммуноглобулинов. «Гуманизированное антитело» представляет антитело, содержащее гуманизированную легкую цепь и гуманизированную тяжелую цепь иммуноглобулина. Гуманизированное антитело связывается с тем же антигеном, что и донорное антитело, которое обеспечивает CDR. Акцепторная каркасная область гуманизированного иммуноглобулина или антитела может иметь ограниченное число замен аминокислот, взятых из донорной каркасной области. Гуманизированные или другие моноклональные антитела могут иметь дополнительные консервативные аминокислотные замены, которые по существу не влияют на связывание антигена или другие функции иммуноглобулина. Примерами консервативных замен являются такие, как gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; и phe, tyr. Гуманизированные иммуноглобулины могут быть сконструированы с помощью методов генной инженерии (например, см. патент США № 5585089). Человеческое антитело представляет антитело, в котором гены легкой и тяжелой цепи имеют человеческое происхождение. Человеческие антитела могут быть получены с использованием способов, известных в данной области. Человеческие антитела можно получить иммортализацией человеческой В-клетки, секретирующей представляющее интерес антитело. Иммортализация может быть осуществлена, например, посредством инфицирования EBV или слияния В-клетки человека с миеломной или гибридомной клеткой с получением клетки триомы. Человеческие антитела также можно получить с помощью способов фагового дисплея (см., например, публикацию PCT № WO 91/17271, публикацию PCT № WO 92/001047, публикацию PCT № WO 92/20791, которые включены здесь посредством ссылки) или отобраны из комбинаторной библиотеки человеческих моноклональных антител (см. веб-сайт Morphosys). Человеческие антитела также могут быть получены с использованием трансгенных животных, несущих ген человеческого иммуноглобулина (например, см. публикацию PCT № WO 93/12227, публикацию PCT № WO91/10741, которые включены здесь посредством ссылки).
2

Таким образом, антитело против DPP3 может иметь форматы, известные в данной области. Примерами являются человеческие антитела, моноклональные антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, CDR-привитые антитела. В предпочтительном варианте осуществления антитела по настоящему изобретению представляют рекомбинантно продуцированные антитела, например, IgG, типичный полноразмерный иммуноглобулин, или фрагменты антитела, включающие, по меньшей мере, F-фрагмент вариабельного домена тяжелой и/или легкой цепи, например, химически связанные антитела (антигенсвязывающий фрагмент), включая, не ограничиваясь этим, Fab-фрагменты, включая Fab-минитела, одноцепочечный Fab-фрагмент, антитело в виде моновалентного Fab-фрагмента с эпитопными метками, например, FAB-V5S×2; бивалентный Fab (миниантитело), димеризованный с доменом CH3; бивалентный Fab или поливалентный Fab, т.е. образованный посредством мультимеризации с помощью гетерологичного домена, например, посредством димеризации доменов dHLX, например, FAB-dHLX-FSx2; F(ab')-фрагменты, scFv-фрагменты, мультимеризированные мультивалентные и/или мультиспецифические scFv-фрагменты, бивалентные и/или биспецифические диатела, BITE (биспецифический активатор Т-клеток), трифункциональные антитела, поливалентные антитела, например, из другого класса, отличного от класса G; однодоменные антитела, например, нанотела, полученные из иммуноглобулинов верблюдов или рыб, и многие другие.
В дополнение к анти-DPP3-антителам, другие биополимерные каркасы хорошо известны в области техники для связывания молекулы-мишени, и их использовали для получения высокоспецифичных биополимеров. Примерами являются аптамеры, шпигельмеры, антикалины и конотоксины.
Каркасные белки, отличные от Ig, могут представлять каркасные белки и могут использоваться в качестве миметиков антител, поскольку они способны связываться с лигандами или антигенами. Каркасные белки, отличные от Ig, могут быть выбраны из группы, включающей каркасные белки, отличные от Ig, на основе тетранектина (например, описанные в US 2010/0028995), каркасные белки на основе фибронектина (например, описанные в EP 1266025, каркасные белки на основе липокалина ((например, описанные в WO 2011/154420), каркасные белки на основе убиквитина (например, описанные в WO 2011/073214), каркасные белки для переноса (например, описанные в US 2004/0023334), каркасные белки на основе белка А (например, описанные в ЕР 2231860), каркасные белки на основе анкириновых повторов (например, описанные в WO 2010/060748), каркасные белки на основе микропротеинов (предпочтительно микропротеинов, образующих цистиновый узел) (например, описанные в ЕР 2314308), каркасные белки на основе домена Fyn SH3 (например, описанные в WO 2011/023685), каркасные белки на основе домена EGFR-A (например, описанные в WO 2005/040229) и каркасные белки на основе домена Кунитца (например, описанные в EP 1941867). Каркасные белки, отличные от Ig, могут быть пептидными или олигонуклеотидными аптамерами. Аптамеры обычно получают выбором из большого пула случайных последовательностей, и они представляют собой короткие цепи олигонуклеотидов (ДНК, РНК или XNA; Xu et и др. 2010, Deng et al. 2014) или короткие вариабельные пептидные домены, присоединенные к белковому каркасу (Li et al., 2011).
В одном варианте осуществления изобретения анти-DPP3-антитела по настоящему изобретению могут быть получены следующим образом:
Мышей иммунизировали рекомбинантной DPP3 (например, GST-hDPP3 из USBio, Salem, США), пептидами, содержащими фрагменты аминокислотной последовательности DPP3, например, конъюгированные с BSA, или нативной очищенной DPP3 (например, из эритроцитов человека, Abramić et al., 1988).
Мышам Balb/c вводили внутрибрюшинно (в/б) 100 мкг рекомбинантной GST-hDPP3, нативной очищенной hDPP3 или конъюгаты DPP3-пептид-BSA на сутки 0 (эмульгированные в адъюванте TiterMax Gold), 100 мкг на 14 сутки (эмульгированные в полном адъюванте Фрейнда) и 50 мкг на 21 и 28 сутки (в неполном адъюванте Фрейнда). На сутки 49 животное получало внутривенную (в/в) инъекцию 50 мкг GST-hDPP3, нативной очищенной hDPP3 или конъюгаты DPP3-пептид-BSA, растворенные в физиологическом растворе. Через 3 суток мышей подвергали эвтаназии и проводили слияние иммунных клеток.
Спленоциты от иммунизированных мышей и клетки миеломной клеточной линии SP20 сливали с использованием 1 мл 50% полиэтиленгликоля в течение 30 с при 37°С. После промывания клетки высевали в 96-луночные планшеты для культивирования клеток. Гибридные клоны отбирали культивированием в среде HAT [среда для культивирования RPMI 1640 с добавлением 20% фетальной телячьей сыворотки и добавки HAT]. Через одну неделю среду HAT заменяли средой НТ на три пассажа с последующим возвратом на обычную клеточную культуральную среду.
2
2
Супернатанты клеточной культуры сначала подвергали скринингу на IgG-антитела, связывающиеся с рекомбинантной DPP3, через две недели после слияния. Соответственно, рекомбинантную GST-меченную DPP3 (USBiologicals, Salem, США) иммобилизовали в 96-луночных планшетах (100 нг/лунку) и инкубировали с 50 мкл клеточного культурального супернатанта на лунку в течение 2 ч при комнатной температуре. После промывания планшета добавляли POD-кроличий антимышиный IgG из расчета 50 мкл/лунку и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После следующей стадии промывания в каждую лунку добавляли 50 мкл раствора хромогена (3,7 мМ о-фенилендиамин в цитратно-гидрофосфатном буфере, 0,012% НО), инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре и хромогенную реакцию останавливали добавлением 50 мкл 4 Н серной кислоты. Поглощение детектировали при 490 мм.
Тестированные положительные микрокультуры переносили в 24-луночные планшеты для размножения. После повторного тестирования выбранные культуры клонировали и реклонировали с использованием метода предельных разведений и определяли изотипы.
Антитела, полученные против GST-меченной человеческой DPP3 или пептидов DPP3, получали с помощью стандартных методов получения антител (Marx et al., 1997) и очищали на белке A. Чистота антител составляла ≥ 90% на основе данных анализа электрофорезом в SDS-геле.
Антитела можно получить с использованием фагового дисплея в соответствии со следующей процедурой:
Библиотеки генов человеческого интактного антитела HAL7/8 использовали для выделения рекомбинантной одиночной цепи F-вариабельных доменов (scFv) против пептида DPP3. Библиотеки генов антитела подвергали скринингу, используя стратегию пэннинга, которая включает использование пептидов, содержащих биотиновую метку, связанную через два различных спейсера с пептидной последовательностью DPP3. Смесь из раундов пэннинга, используя неспецифически связанный антиген и стрептавидин-связанный антиген, использовали, чтобы минимизировать фон неспецифических связывающих соединений. Элюированные фаги из третьего раунда пэннинга использовали для получения штаммов E. coli, экспрессирующих моноклональное scFv. Супернатант, полученный в результате культивирования этих клональных штаммов, непосредственно использовали для тестирования антигена ELISA (см. также Hust et al., 2011; Schütte et al., 2009)
Гуманизацию мышиных антител можно проводить в соответствии со следующей процедурой:
Для гуманизации антитела мышиного происхождения анализируют последовательность антитела на структурное взаимодействие каркасных областей (FR) с областями, определяющими комплементарность (CDR), и антигеном. На основе структурного моделирования отбирают подходящую FR человеческого происхождения и мышиные последовательности CDR пересаживают в FR человека. В аминокислотной последовательности CDR или FR могут быть введены изменения для восстановления структурных взаимодействий, которые были отменены в результате видового переключения последовательностей FR. Такое восстановление структурных взаимодействий может быть достигнуто посредством случайного подхода с использованием библиотек фагового дисплея или посредством направленного подхода с использованием молекулярного моделирования (Almagro & Fransson, 2008).
2
В альтернативном варианте осуществления выбирают формат антитела к DPP3 из группы, включающей Fv-фрагмент, scFv-фрагмент, Fab-фрагмент, scFab-фрагмент, F(ab)-фрагмент и слитый белок scFv-Fc. В еще одном предпочтительном варианте осуществления формат антитела выбирают из группы, включающей scFab-фрагмент, Fab-фрагмент, scFv-фрагмент и их оптимизированные по биодоступности конъюгаты, такие как ПЭГилированные фрагменты.
В конкретном варианте осуществления указанного способа для определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида указанное связывающее соединение представляет собой антитело.
В одном варианте осуществления можно провести анализ захвата или связывания для детектирования и/или количественного определения DPP3. Связывающее соединение, реагирующее с белком DPP3, но не оказывающее отрицательного влияния на активность пептидазы более чем на 50%, предпочтительно более чем на 40%, предпочтительно более чем на 30% в жидкофазном анализе, может быть иммобилизовано на твердой фазе. В одном варианте осуществления для предупреждения ингибирования DPP3 захватывающее-связывающее соединение предпочтительно не связывается с DPP3 в области аминокислот 316-669 SEQ ID NO: 1. Область аминокислот 316-669 SEQ ID NO: 1 включает активный центр DPP3 и область связывания субстрата (Prajapati & Chauhan 2011, Kumar et al., 2016).
В конкретном варианте осуществления указанного способа для определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида указанное связывающее соединение может быть выбрано из группы, включающей антитело, фрагменты антитела, каркасные белки, отличные от Ig, или аптамеры.
В конкретном варианте осуществления указанного способа определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида указанное захватывающее-связывающее соединение, реагирующее с DPP3, иммобилизовано на твердой фазе.
Испытуемый образец пропускают над иммобилизованным связывающим соединением, и DPP3, если она присутствует, связывается со связывающим соединением и сама иммобилизуется для детектирования. Затем может быть добавлен субстрат и продукт реакции можно детектировать для определения присутствия или количества DPP3 в испытуемом образце. Для целей настоящего описания термин «твердая фаза» можно использовать для включения любого материала или резервуара, в котором или на котором можно проводить анализ, и она включает, не ограничиваясь этим: пористые материалы, непористые материалы, пробирки, лунки, предметные стекла, агарозовые смолы (например, Сефароза производства GE Healthcare Life Sciences), магнитные частицы (например, магнитные частицы Dynabeads™ или Pierce™ производства Thermo Fisher Scientific) и т. д.
2+
Связывающие соединения белкового или пептидного происхождения (например, антитело, фрагменты антител, каркасные белки, отличные от IgG) иммобилизуют на твердой фазе способами, включающими физическую адсорбцию (например, электростатическое взаимодействие или гидрофобное взаимодействие), биоаффинную иммобилизацию (например, авидин-биотин, белок А/G/L, His-метку и Ni-NTA, GST-метку и глютатион, гибридизацию ДНК, аптамеры), ковалентную связь (например, посредством амина и N-гидроксисукцинимида) или комбинацию указанных методов иммобилизации (Kim & Herr 2013). Связывающие соединения олигонуклеотидного происхождения (например, аптамеры) могут быть иммобилизованы на твердой фазе с использованием системы (стрептококковый) авидин-биотин (Müller et al., 2012, Deng et al., 2014).
В конкретном варианте осуществления указанного способа определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида указанная стадия отделения представляет стадию промывания, на которой удаляются ингредиенты образца, которые не связаны с указанным захватывающим-связывающим соединением, от захваченной DPP3. Данная стадия отделения может быть любой другой стадией, которая отделяет DPP3, связанную с указанным захватывающим-связывающим соединением, от ингредиентов указанного образца жидкости организма.
В конкретном варианте осуществления указанного способа определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида превращение указанного субстрата DPP3 иммобилизованной DPP3 измеряется (детектируется) способом, выбранным из группы, включающей флуоресценцию флуорогенных субстратов (например, Arg-Arg-βNA, Arg-Arg-AMC), изменение окраски хромогенных субстратов, люминесценцию субстратов, связанных с аминолюциферином (анализ Promega Protease-Glo™), масс-спектрометрию, ВЭЖХ/FPLC (обращеннофазовую хроматографию, эксклюзионную хроматографию), тонкослойную хроматографию, капиллярный зональный электрофорез, гель-электрофорез с последующим окрашиванием активности (иммобилизованной, активной DPP3) или вестерн-блоттинг (продукты расщепления).
В конкретном варианте осуществления указанного способа определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида указанный субстрат может быть выбран из группы, включающей ангиотензин II, III и IV, лей-энкефалин, мет-энкефалин, эндоморфин 1 и 2, валорфин, β-казоморфин, динорфин, проктолин, ACTH и MSH, или ди- и трипептиды, связанные с флуорофором, хромофором или аминолюциферином (анализ Promega Protease-Glo™). Ди- или трипептиды, которые расщепляются под действием DPP3, включают, не ограничиваясь этим, Arg-Arg, Ala-Ala, Ala-Arg, Ala-Phe, Asp-Arg, Gly-Ala, Gly-Arg, Gly-Phe, Leu -Ala, Leu-Gly, Lys-Ala, Phe-Arg, Suc-Ala-Ala-Phe. Флуорофоры включают, не ограничиваясь этим, β-нафтиламид (2-нафтиламид, βNA, 2NA), 4-метокси-β-нафтиламид (4-метокси-2-нафтиламид) и 7-амидо-4-метилкумарин (AMC, MCA, Abramic et al., 2000, Ohkubo et al., 1999). Расщепление данных флуорогенных субстратов приводит к высвобождению флуоресцентного β-нафтиламина или 7-амино-4-метилкумарина соответственно. Хромофоры включают, не ограничиваясь этим, п-нитроанилида диацетат (pNA). Гидролиз связи пептид-pNK в хромогенных субстратах приводит к высвобождению pNA, который, в свою очередь, изменяет окраску. Таким образом, изменение оптической плотности (DA/мин) прямо пропорционально ферментативной активности. Используя анализ Protease-Glo™ от Promega, при расщеплении DPP3 высвобождается аминолюциферин и служит в качестве субстрата для связанной люциферазной реакции, которая испускает детектируемую люминесценцию.
В предпочтительном варианте осуществления активность DPP3 измеряют добавлением флуорогенного субстрата Arg-Arg-βNA и определением флуоресценции в режиме реального времени. В одном конкретном варианте осуществления указанного способа определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида указанный образец выбирают из группы, включающей цельную кровь, сыворотку, плазму, спинномозговую жидкость, мочу, слюну, мокроту и плевральный выпот.
В конкретном варианте осуществления указанного способа определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида указанный образец представляет образец крови, выбранный из группы, включающей цельную кровь, сыворотку и плазму.
Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является анализ или набор для определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида, включающий:
связывающее соединение, которое связывается с полноразмерной DPP3
субстрат DPP3.
Набор может дополнительно содержать калибратор:
калибратор может представлять образцы с известной концентрацией DPP3 (нативной, очищенной или рекомбинантной);
калибратор может представлять сами продукты расщепления, такие как свободные флуорофоры (например, 2-нафтиламин), свободные хромофоры (например, п-нитроанилид) или свободный люциферин.
Набор может дополнительно содержать реагенты для промывания:
реагент для промывания (может быть любым водным буферным раствором с или без детергента. В данном случае использовали 8 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 60 мМ NaCl, 0,02% Твин 20).
В конкретном варианте осуществления указанный анализ представляет анализ с захватом фермента (ECA, например, US 5612186A, US 5601986A).
В конкретном варианте осуществления указанное захватывающее-связывающее соединение, которое связывается с полноразмерной DPP3, специфически ингибирует активность DPP3 менее чем на 50% в жидкофазном анализе, предпочтительно менее чем на 40%, более предпочтительно менее чем на 30%. Определение термина «жидкофазный анализ» см. выше. В одном конкретном варианте осуществления для предупреждения ингибирования DPP3 захватывающее-связывающее соединение не должно связываться с DPP3 в области около активного центра и области связывания субстрата (аминокислоты 316-669 SEQ ID NO: 1).
В конкретном варианте осуществления указанного анализа или набора для определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида указанное связывающее соединение может быть выбрано из группы, включающей антитело, фрагмент антитела или каркасный белок, отличный от IgG.
В конкретном варианте осуществления указанного анализа или набора для определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида указанное связывающее соединение представляет собой антитело.
Термин «антитело» обычно включает моноклональные и поликлональные антитела и их связывающие фрагменты, в частности, Fc-фрагменты, а также так называемые «одноцепочечные антитела» (Bird et al., 1988), химерные, гуманизированные, в частности, CDR-привитые антитела, диатела или тетратела (Holliger et al., 1993). Также данный термин включает иммуноглобулиноподобные белки, которые выбирают с помощью методов, включая, например, фаговый дисплей, со специфическим связыванием с интересующей молекулой, содержащейся в образце. В этом контексте термин «специфическое связывание» относится к антителам, продуцированным против представляющей интерес молекулы, или его фрагментам. Антитело считается специфическим, если его аффинность к представляющей интерес молекуле, или вышеуказанного фрагмента, по меньшей мере, предпочтительно в 50 раз выше, более предпочтительно в 100 раз выше, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, в 1000 раз выше, чем в отношении других молекул, входящих в состав образца, содержащего интересующую молекулу. В данной области техники хорошо известно, как получить антитела и выбрать антитела с определенной специфичностью.
В конкретном варианте осуществления указанного анализа или набора для определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида указанное захватывающее-связывающее соединение иммобилизовано на поверхности.
В конкретном варианте осуществления указанного анализа или набора для определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида указанный субстрат может быть выбран из группы, включающей ангиотензин II, III и IV, лей-энкефалин, мет-энкефалин, эндоморфин 1 и 2, валорфин, β-казоморфин, динорфин, проктолин, ACTH и MSH, или ди- и трипептиды, связанные с флуорофором, хромофором или аминолюциферином (анализ Promega Protease-Glo™). Ди- или трипептиды, которые расщепляются DPP3, включают, не ограничиваясь этим, Arg-Arg, Ala-Ala, Ala-Arg, Ala-Phe, Asp-Arg, Gly-Ala, Gly-Arg, Gly-Phe, Leu -Ala, Leu-Gly, Lys-Ala, Phe-Arg, Suc-Ala-Ala-Phe. Флуорофоры включают, не ограничиваясь этим, β-нафтиламид (2-нафтиламид, βNA, 2NA), 4-метокси-β-нафтиламид (4-метокси-2-нафтиламид) и 7-амидо-4-метилкумарин (AMC, MCA, Abramic et al., 2000, Ohkubo et al., 1999). Расщепление данных флуорогенных субстратов приводит к высвобождению флуоресцентного β-нафтиламина или 7-амино-4-метилкумарина соответственно. Хромофоры включают, не ограничиваясь этим, п-нитроанилида диацетат (pNA). Гидролиз связи пептид-pNK в хромогенных субстратах приводит к высвобождению pNA, который, в свою очередь, изменяет окраску. Таким образом, изменение оптической плотности (DA/мин) прямо пропорционально ферментативной активности. Используя анализ Protease-Glo™ от Promega, при расщеплении под действием DPP3 высвобождается аминолюциферин и служит в качестве субстрата для связанной люциферазной реакции, которая испускает детектируемую люминесценцию.
В предпочтительном варианте осуществления активность DPP3 измеряется добавлением флуорогенного субстрата Arg-Arg-βNA и контролем флуоресценции в режиме реального времени.
В конкретном варианте осуществления указанного анализа или набора для определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида указанный калибратор выбирают из группы, включающей: A) рекомбинантную DPP3 (например, GST-hDPP3 от USBio), очищенную нативную DPP3 (например, из эритроцитов человека, Abramić et al., 1988) или фрагменты DPP3 (нативные, синтетические или рекомбинантные); B) сами продукты расщепления: свободные флуорофоры (например, 2-нафтиламин), свободные хромофоры (например, п-нитроанилид) или свободный люциферин, для количественного измерения флуоресценции, изменения окраски и сигналов биолюминесценции.
Один вариант осуществления настоящего изобретения с использованием DPP3 в качестве диагностического биомаркера включает иммуноанализы в различных форматах, такие как, например, радиоиммуноанализ (RIA), хемилюминесцентный и флуоресцентный иммуноанализы, твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), анализ на основе гранул Luminex, анализы на основе белковых микрочипов, и экспрессные аналитические форматы, например, такие как анализы на иммунохроматографических тест-полосках.
Анализы могут представлять гомогенные или гетерогенные анализы, конкурентные и неконкурентные анализы сэндвич-типа. В особенно предпочтительном варианте осуществления, в котором используется два антитела по настоящему изобретению, анализ проводят в формате сэндвич-анализа, который является неконкурентным иммуноанализом, где DPP3 или ее фрагмент, подлежащий детектированию и/или количественному определению, связаны с первым антителом и вторым антителом. Первое антитело может быть связано с твердой фазой, например, гранулой, поверхностью лунки или другого контейнера, чипом или тест-полоской, и второе антитело представляет собой антитело, которое помечено, например, красителем, радиоизотопом или реакционноспособной или каталитически активной группой. Затем измеряют соответствующим методом количество меченого антитела, связанного с аналитом. Общий состав и процедуры, связанные с «сэндвич-анализами», хорошо разработаны и известны специалистам в данной области. (The Immunoassay Handbook, Ed. David Wild, 2005; Hultschig et al., 2006).
В особенно предпочтительном варианте осуществления анализ включает жидкую реакционную смесь, в которой первый метящий компонент присоединен к первому антителу, где указанный первый метящий компонент является частью системы мечения на основе гашения или амплификации флуоресценции или хемилюминесценции, и второй метящий компонент указанной системы мечения присоединен ко второму антителу, так что при связывания обоих антител с аналитом генерируется измеримый сигнал, который позволяет детектировать образовавшиеся сэндвич-комплексы в растворе, содержащем образец.
В контексте настоящего изобретения анализы на основе флуоресценции включают использование красителей, которые могут, например, быть выбраны из группы, включающей FAM (5- или 6-карбоксифлуоресцеин), VIC, NED, флуоресцеин, флуоресцеин изоотиоцианат (FITC), IRD-700/800, цианиновые красители, такие как CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, Cy7, ксантен, 6-карбокси-2',4',7',4,7-гексахлорфлуоресцеин (HEX), TET, 6-карбокси-4',5'-дихлор-2',7'-диметоксифлуоресцеин (JOE), N,N,N',N'-тетраметил-6-карбоксиродамин (TAMRA), 6-карбокси-X-родамин (ROX), 5-карбоксиродамин-6G (R6G5), 6-карбоксиродамин-6G (RG6), родамин, родамин зеленый, родамин красный, родамин 110, BODIPY-красители, такие как BODIPY TMR, орегоновый зеленый, кумарины, такие как умбеллиферон, бензимиды, такие как Hoechst 33258; фенантридины, такие как техасский красный, Yakima Yellow, Alexa Fluor, PET, бромистый этидий, акридиновые красители, карбазоловые красители, феноксазиновые красители, порфириновые красители, полиметиновые красители и тому подобное.
В контексте настоящего изобретения анализы на основе хемилюминесценции включают использование красителей на основе физических принципов, описанных для хемилюминесцентных материалов в монографии Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical technology, 4th ed., executive editor, J. I Kroschwitz; редактор, М. Хоу-Грант, John Wiley & Sons, 1993, vol. 15, p. 518-562, включенной в настоящее описание посредством ссылки, включая цитаты на стр. 551-562. Предпочтительными хемилюминесцентными красителями являются акридиновые эфиры.
Один вариант осуществления настоящего изобретения включает химический анализ DPP3. В анализе используют субстрат фермента, который реагирует с DPP3 с образованием детектируемого продукта реакции. Альтернативно, может контролироваться скорость реакции субстрата для определения присутствия или количества DPP3 в испытуемом образце. Подходящие субстраты фермента включают, не ограничиваясь этим, дипептидные субстраты, такие как Arg-Arg-β-NA или Arg-Arg-AMC.
Анализы, включающие такие реагенты и реакции, могут быть выполнены в любом подходящем реакционном резервуаре, например, в пробирке или лунке микротитрационного планшета. В качестве альтернативы, могут быть разработаны аналитические устройства в одноразовой форме, например, устройства в форматах индикаторной полоски или тест-полоски, которые хорошо известны специалистам в данной области и которые обеспечивают простоту изготовления и применения. Такие одноразовые аналитические устройства могут быть упакованы в виде наборов, содержащих все необходимые материалы, реагенты и инструкции по применению.
Аналитические устройства по настоящему изобретению предпочтительно могут находиться в формате индикаторных полосок или тест-полосок. Например, индикаторная полоска может быть изготовлена из кусочка гигроскопичного материала, содержащего хромогенный субстрат для DPP3. Альтернативно, индикаторная полоска может быть изготовлена из непористого материала, на который нанесен субстрат. При контактировании устройства с желательным испытуемым образцом субстрат и любая DPP3, присутствующие в образце, взаимодействуют, с образованием детектируемой реакции на устройстве.
В альтернативном варианте осуществления устройство может представлять тест-полоску, где находится субстрат в одной или более зонах вдоль длины полоски из гигроскопичного материала. При контактировании одного конца полоски с желаемым испытуемым образцом жидкий образец мигрирует вдоль гигроскопичного материала. Реакция субстрата и генерация детектируемого сигнала указывает на присутствие DPP3 в исследуемом образце. В мультизональном устройстве количество дискретных или изолированных зон вдоль длины полоски, которые генерируют детектируемый сигнал, также может указывать на количество DPP3, присутствующей в испытуемом образце. Альтернативно, большая часть тест-полоски может содержать субстрат. Длина цветной реакции, образованной на тест-полоске, имеющей такую единую вытянутую зону субстрата, может использоваться для указания на присутствие или количество DPP3 в испытуемом образце.
В альтернативном варианте осуществления анализа может детектироваться скорость, с которой протекает реакция, в качестве указания на количество DPP3, присутствующей в испытуемом образце. Например, скорость, с которой реагирует субстрат, можно использовать для указания на количество DPP3, присутствующей в испытуемом образце. Альтернативно, скорость, с которой образуется продукт реакции, можно использовать для указания на количество DPP3, присутствующей в образце.
В еще одном варианте осуществления может быть проведен анализ захвата или связывания для детектирования и/или количественного определения протеазы. Например, антитело, реагирующее с белком DPP3, но не оказывающее отрицательного влияния на активность пептидазы, может быть иммобилизовано на твердой фазе. Испытуемый образец пропускают над иммобилизованным антителом, и DPP3, если она присутствует, связывается с антителом и сама иммобилизуется для детектирования. Затем можно добавить субстрат, и продукт реакции может детектироваться с указанием на наличие или количество DPP3 в испытуемом образце. Для целей настоящего описания термин «твердая фаза» может использоваться для включения любого материала или резервуара, в котором или на котором может быть проведен анализ, и она включает, не ограничиваясь этим, пористые материалы, непористые материалы, пробирки, лунки, предметные стекла и т. д.
В еще одном конкретном варианте осуществления DPP3 ECA можно проводить в виде анализа с тест-полоской. В примерном устройстве с тест-полоской слой нанесения испытуемого образца необязательно присоединяется к одному концу пористой тест-полоски. Тест-полоска содержит иммобилизованное антитело, которое будет связываться с и тем самым иммобилизовать DPP3 на заранее определенном участке с последующим детектированием. Необязательно, устройство может включать конец индикатора анализа, который расположен на дистальном конце тест-полоски от места контакта испытуемого образца. Конец с индикатором анализа генерирует детектируемый сигнал при контакте с испытуемым образцом или аналитическим реагентом, тем самым указывая, что анализ завершен.
Слой нанесения испытуемого образца может быть частью самой пористой тест-полоски или материала в контакте жидкой среды с концом пористой тест-полоски, относящимся к проксимальному концу, так что испытуемый образец может проходить или мигрировать со слоя нанесения на пористую тест-полоску. Контактирование с жидкой средой может включать физический контакт слоя нанесения с пористой тест-полоской, а также отделение слоя нанесения от пористой тест-полоски промежуточным пространством или дополнительным материалом, которые все еще позволяют жидкой среде протекать между слоем нанесения и пористой тест-полоской. По существу, весь слой нанесения может перекрывать пористую тест-полоску так, чтобы испытуемый образец проходил через практически через любую часть слоя нанесения к проксимальному концу пористой тест-полоски. Альтернативно, только часть слоя нанесения может находиться в контакте жидкой среды с пористой тест-полоской. Слой нанесения может представлять собой любой материал, который может переносить испытуемый образец на пористую тест-полоску.
Пористая тест-полоска аналитического устройства может представлять любой подходящий абсорбирующий, пористый, гигроскопичный, хроматографический или капиллярный материал, через который испытуемый образец, содержащий аналит, может транспортироваться посредством капиллярного или продольного капиллярного эффекта. Природные, синтетические или встречающиеся в природе материалы, которые синтетически модифицированы, можно использовать в качестве пористой тест-полоски, включая, не ограничиваясь этим: целлюлозные материалы, такие как бумага, целлюлоза и производные целлюлозы, такие как ацетилцеллюлоза и нитроцеллюлоза; стекловолокно; ткань, как из встречающегося в природе материала (например, хлопка), так и синтетическая (например, нейлон); пористые гели, такие как силикагель, агароза, декстран и желатин; пористые волокнистые матрицы; материалы на основе крахмала, такие как сшитые цепи декстрана; керамические материалы; пленки из поливинилхлорида и комбинации поливинилхлорида-диоксида кремния; и тому подобное. Пористая тест-полоска не должна мешать генерации детектируемого сигнала. Пористая тест-полоска должна иметь приемлемый внутренний запас прочности, или прочность может быть обеспечена с помощью дополнительной подложки.
Конкретные размеры пористой тест-полоски будут предметом удобства в зависимости от размера испытуемого образца, протокола анализа, средств детектирования и измерения сигнала и тому подобное. Например, размеры могут быть выбраны для регуляции скорости миграции жидкой среды, а также количества испытуемого образца, подлежащего поглощению пористой тест-полоской.
В одном возможном устройстве на основе тест-полосок по настоящему изобретению субстрат DPP3 и/или антитело, захватывающее DPP3, могут быть иммобилизованы на пористой тест-полоске с образованием, по меньшей мере, одного участка детектирования аналита, т. е. области пористой тест-полоски, содержащей один или более аналитических реагентов, недиффузно присоединенных к ней. В еще одном варианте осуществления изобретения область измерения или детектирования тест-полоски может включать множество участков, содержащих субстрат DPP3 и/или иммобилизованное антитело против DPP3. Необязательно, различные участки детектирования могут содержать различные количества субстрата и/или иммобилизованного антитела против DPP3, т. е. большее количество на первом участке детектирования и меньшие количества на других участках. Например, если 20 нанограмм антитела захватывают эквивалент 1 нмоль/мин/мл DPP3, то тогда первый участок детектирования аналитического устройства может содержать 50 нанограмм анти-DPP3-антитела, тогда как другие участки содержат 10, 20, 30 и т. д. нанограмм антител. При добавлении испытуемого образца количество участков, отображающих детектируемый сигнал, дает количественное указание на количество DPP3, присутствующее в образце. Участки детектирования могут быть сконфигурированы в любой приемлемо детектируемой форме и обычно имеют форму полосы, охватывающей ширину тест-полоски.
Необязательно, может быть получено устройство с множеством участков захвата так, что если пороговое количество DPP3 не присутствует в испытуемом образце, то по существу вся DPP3 будет связываться с антителом в первом участке захвата и, таким образом, иммобилизоваться в этом участке. Если в испытуемом образце присутствует количество DPP3 больше порогового значения, то оставшаяся DPP3 будет связываться с последующими зонами детектирования иммобилизованного антитела по длине тест-полоски. Чем больше количество DPP3 в испытуемом образце, тем больше количество участков захвата, которые будут отображать детектируемый сигнал за счет наличия DPP3. Как будет понятно специалистам в данной области техники, также можно получить устройства, содержащие много участков с субстратом DPP3, в которых количество субстрата в отдельных участках предназначено для получения результата количественного или полуколичественного анализа.
Другим важным вариантом осуществления изобретения является способ диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, включающий:
определение количества общей DPP3 или определение количества активной DPP3 в образце жидкости организма указанного индивида;
сравнение указанного определенного количества с заранее определенным пороговым значением;
где у указанного индивида диагностируется наличие заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, если указанное определенное количество выше указанного заранее определенного порогового значения.
В конкретном варианте осуществления указанного способа диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, указанное количество общей или активной DPP3 определяется в единицах концентрации.
Способы определения количества общей или активной DPP3 известны в данной области техники. В контексте способа диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по настоящему изобретению, можно использовать как способы и анализы современного уровня техники, так и вышеописанные способы и анализы для определения DPP3.
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
Пороговое значение заранее определяется измерением концентрации DPP3 и/или активности DPP3 у здоровых контрольных субъектов и вычислением, например, соответствующего 75-процентиля, более предпочтительно 90-процентиля, еще более предпочтительно 95-процентиля. Верхняя граница 75-процентиля, более предпочтительно 90-процентиля, еще более предпочтительно 95-процентиля, определяет пороговое значение для здоровых субъектов против больных пациентов. В отношении указанных процентилей, то пороговое значение, которой разделяет здоровых субъектов и больных пациентов, может составлять от 5 до 25 нг/мл, более предпочтительно от 7 до 20 нг/мл, более предпочтительно от 8 до 18 нг/мл, наиболее предпочтительно от 10 до 15 нг/мл в плазме с использованием иммуноанализа сэндвич-типа с анти-DPP3-антителом (см. пример 3). В анализе специфической активности DPP3 в плазме с захватом фермента пороговое значение, которое разделяет здоровых субъектов и больных пациентов, может составлять от 0,5 до 2 нмоль βNA мин мл, более предпочтительно от 0,7 до 1,8 нмоль βNA мин мл, более предпочтительно от 0,8 до 1,5 нмоль βNA мин мл, наиболее предпочтительно от 1,0 до 1,3 нмоль βNA мин мл (см. пример 5).
Специалист в данной области знает, как определить пороговые значения по результатам ранее проведенных исследований. Специалист в данной области знает, что конкретное пороговое значение может зависеть от когорты субъектов, используемой для вычисления заранее определенного порогового значения, которое позднее может быть использовано на практике. Специалист в данной области знает, что конкретное пороговое значение может зависеть от калибровки, используемой в анализе. Специалист в данной области знает, что конкретное пороговое значение может зависеть от чувствительности и/или специфичности, которые для практика считаются приемлемыми.
Чувствительность и специфичность диагностического теста зависят не только от аналитического «качества» теста, но и зависят от определения того, что представляет собой аномальный результат. На практике характеристические кривые (ROC-кривые) обычно вычисляют построением графика зависимости значения переменной от ее относительной частоты в «нормальных» (т. е., явно здоровых) и «больных» популяциях (т. е. пациентов, страдающих инфекцией). В зависимости от конкретного диагностического вопроса, который исследуется, референсная группа не обязательно должна быть «нормальной», а это может быть группа пациентов, страдающих другим заболеванием или патологическим состоянием, от которых дифференцируется интересующая группа больных пациентов. Для любого конкретного маркера распределение уровней маркера для субъектов с или без заболевания, вероятно, будет перекрываться. В таких условиях тест не различает абсолютно норму от болезни со 100% точностью, и область перекрывания указывает на то, где тест не может различить норму от заболевания. Выбирают пороговое значение, выше которого (или ниже которого, в зависимости от того, как изменяется маркер при заболеваниях), результаты теста считаются аномальными и ниже которого результаты теста считаются нормальными. Площадь под ROC-кривой является показателем вероятности того, что различаемое измерение позволяет правильно идентифицировать патологическое состояние. ROC-кривые можно использовать, даже если результаты испытаний не обязательно дают точное число. При условии того, что можно ранжировать результаты, можно построить ROC-кривую. Например, результаты теста образцов на наличие «заболевания» можно ранжировать в соответствии со степенью (например, 1=низкая, 2=нормальная и 3=высокая). Такое ранжирование можно соотнести с результатами для «нормальной» популяции, и построить ROC-кривую. Эти способы хорошо известны в данной области (см., например, Hartley et al, 1982). Предпочтительно, пороговое значение выбирают таким образом, чтобы обеспечить область ROC-кривой выше примерно 0,5, более предпочтительно выше примерно 0,7. Термин «примерно» в этом контексте относится к±5% от данного измерения.
Если пороговое значение определяется с использованием когорты предыдущего исследования и с учетом всех вышеуказанных пунктов, то практикующий врач будет использовать заранее определенное пороговое значение для способов диагностики заболевания по изобретению и определит, имеет ли субъект показатель выше или ниже указанного заранее определенного порогового значения, чтобы поставить соответствующий диагноз.
Концентрации DPP3 в тканевых гомогенатах и жидкостях организма можно измерить, используя несколько коммерчески доступных наборов для постановки ELISA для определения DPP3 (например, производства LifeSpan BioSciences). Все эти анализы основаны на принципе анализа сэндвич-типа и применяются только для исследовательских целей.
Стандартная процедура измерения концентрации DPP3 заключается в определении активности DPP3 с использованием флуорогенного субстрата (например, Arg-Arg-β-нафтиламида) в жидкофазном анализе (Ellis & Nuenke 1967). Коммерчески доступные наборы (например, производства BPS Bioscience) обычно включают черные микротитрационные планшеты с низким связыванием, рекомбинантную DPP3, флуорогенный субстрат и соответствующие буферы. Данные наборы регулярно используются для скринингового анализа для субстратов и ингибиторов DPP3.
В конкретном варианте осуществления указанного способа диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, указанный образец выбирают из группы, включающей цельную кровь, сыворотку и плазму. Жидкость организма в контексте способа по настоящему изобретению также может быть выбрана из группы, включающей кровь, сыворотку, плазму, спинномозговую жидкость, мочу, слюну, мокроту и плевральный выпот.
В данном случае некротические процессы определяются всеми процессами в организме, которые приводят к гибели клеток и высвобождению DPP3 из цитоплазмы клеток во внеклеточное пространство и/или жидкости организма. Такие процессы включают, не ограничиваясь этим, некроз, апоптоз, некроптоз, эриптоз.
В конкретном варианте осуществления указанного способа диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, указанное заболевание выбрано из группы, включающей: сердечную недостаточность, хроническую сердечную недостаточность, острую сердечную недостаточность (AHF), инфаркт миокарда (MI), инсульт, печеночную недостаточность, ожоговые травмы, травматические повреждения, тяжелую инфекцию (микробную, вирусную (например, СПИД), паразитарную (например, малярию)) или ССВО или сепсис, рак, острую почечную недостаточность (AKI), расстройства центральной нервной системы (ЦНС) (например, судороги, нейродегенеративные заболевания), аутоиммунные заболевания, сосудистые заболевания (например, синдром Кавасаки) и гипотензию. В таблице 1 перечислены клинические симптомы/заболевания, которые сопровождаются или связаны с некротическими процессами и соответствующим некротическим событием.
В еще одном варианте указанное заболевание выбрано из группы, включающей острую сердечную недостаточность (AHF), инфаркт миокарда (MI), печеночную недостаточность, ожоговые травмы, тяжелую инфекцию (микробную, вирусную (например, СПИД), паразитарную (например, малярию)) или ССВО или сепсис, рак и острую почечную недостаточность (AKI).
В одном варианте осуществления указанное заболевание представляет собой гипотензию.
Таблица 1Заболевания, сопровождаемые или связанные с некротическими процессами
<b>клинический симптом/ заболевание</b>
<b>некротическое/апоптическое событие</b>
<b>ссылка</b>
острая сердечная недостаточность
внезапная гибель клеток/участков тканей/органов
Fischer et al., 2005, Zong et al., 2006
инфаркт миокарда
инсульт
печеночная недостаточность/повреждение печени
почечная недостаточность/повреждение почек
ожоговые травмы
Lanier et al., 2011
травматические повреждения (например, травматическое повреждение головного мозга); политравма
Raghupathi, 2004
вирусные+микробные+паразитарные инфекции
гибель макрофагов, лизис клеток хозяина
Zong et al., 2006; Fink et al., 2005
СПИД
прогрессирующая гибель иммунных клеток
Fischer et al., 2005
сепсис
некроз в результате иммунного ответа/апоптоз иммунных клеток
Pinheiro da Silva et al., 2009
малярия
лизис эритроцитов хозяина (эриптоз)
Lang et al., 2015
нейродегенеративные заболевания (например, AD, болезнь Гентингтона)
медленно прогрессирующая гибель нейрональных клеток
Fischer et al., 2005
другие расстройства ЦНС (например, судороги)
гибель клеток в результате эксайтотоксичности
Zong et al., 2006
рак
сильное воспаление
Wallach et al., 2014
аутоиммунное заболевание
болезнь Кавасаки
сильное воспаление и некроз кровеносных сосудов
Dimitrades et al., 2014
Апоптоз представляет процесс запрограммированной гибели клеток (PCD), который может возникать в многоклеточных организмах. Биохимические события приводят к характерным изменениям клеток (морфологии) и их гибели. Эти изменения включают пузырение, сморщивание клеток, фрагментацию ядра, конденсацию хроматина и фрагментацию хромосомной ДНК. См. обзор в публикации Elmore 2007, Toxicol. Pathol., 35 (4): 495-516.
Некроз представляет форму повреждения клеток, которая приводит к преждевременной гибели клеток в живой ткани в результате аутолизиса (Vanlangenakker et al., 2008. Current Molecular Medicine, 8 (3): 207-220). Некроз вызван факторами, внешними по отношению к клетке или ткани, такими как инфекция, токсины или травма, которые приводят к неконтролируемому перевариванию клеточных компонентов.
Несмотря на то, что апоптоз часто оказывает положительные эффекты на организм, некроз почти всегда вреден и может привести к фатальному исходу.
Клеточная смерть за счет некроза не следует пути передачи сигнала апоптоза, а в большей степени имеет место активирование различных рецепторов, что приводит к потере целостности клеточной мембраны и неконтролируемому высвобождению продуктов гибели клеток во внеклеточное пространство. Это событие инициирует в окружающих тканях воспалительный ответ, который препятствует притоку находящихся рядом фагоцитов и устранению мертвых клеток фагоцитозом. По этой причине часто бывает необходимым удалять некротическую ткань хирургическим путем, процедурой, известной как санация раны. В отсутствии лечения некроз приводит к нарастанию разложения мертвой ткани и клеточного дебриса в или рядом с местом гибели клеток.
Форма запрограммированного некроза, называемая некроптозом, считается альтернативной формой запрограммированной гибели клеток. Некроптоз может служить в качестве резервной для апоптоза гибели клеток, когда сигнальный путь апоптоза блокируется эндогенными или экзогенными факторами, такими как вирусы или мутации (Linkermann et al., 2014. NEJM, 370 (5): 455-465). Позднее были обнаружены другие типы регулируемого некроза, которые разделяют несколько сигнальных событий с некроптозом и апоптозом (Vanden Berghe et al., 2014).
Сердечная недостаточность (HF) представляет заболевание сердца, которое возникает, когда проблема со структурой или функцией сердца ухудшает его способность обеспечивать достаточный приток крови для удовлетворения потребностей организма. Такое патологическое состояние может вызвать большое разнообразие симптомов, в частности, одышку (SOB) в состоянии покоя или во время физических нагрузок, симптомы задержки жидкости, такие как отек легких или отеки в области лодыжки, и объективное свидетельство нарушения структуры или функции сердца в состоянии покоя.
Сердечная недостаточность представляет клинический синдром, характеризующийся рядом симптомов и признаков, вызванных сердечной дисфункцией. Сердечная недостаточность является одной из основных причин заболеваемости и смертности в развитых странах с частотой распространения на уровне 1-2%. Сердечную недостаточность можно разделить на хроническую HF и острую HF. Пациентов с хронической HF можно разделить на пациентов со стабильной хронической HF, ухудшением признаков и симптомов хронической HF, и с острой декомпенсацией хронической HF. Острая сердечная недостаточность (AHF) определяется как быстрое начало развития признаков и симптомов сердечной недостаточности, которая приводит к необходимости в неотложной терапии или госпитализации. AHF может представлять вновь возникшую острую HF (вновь возникшая AHF у пациента без предшествующей сердечной дисфункции) или острую декомпенсацию хронической HF. AHF является основной причиной госпитализации взрослых людей в возрасте старше 65 лет. Несмотря на заметный прогресс в улучшении прогноза у пациентов с хронической сердечной недостаточностью, что в основном связано с терапевтическими достижениями за последние несколько десятилетий, как краткосрочные, так и долгосрочные исходы остаются очень неблагоприятными, как только пациенты госпитализируются по поводу декомпенсированной сердечной недостаточности. Почти 25% пациентов, госпитализированных по поводу AHF, нуждаются в повторной госпитализации в течение 30 дней после выписки из больницы, а <50% выживают в течение менее 5 лет после госпитализации. В дополнение к значительному снижению выживаемости и качества жизни у больных пациентов, денежная нагрузка за счет AHF на системы здравоохранения огромна. По оценкам, общая стоимость лечения сердечной недостаточности составляла 31 млр. долл. США только в 2012 году, и большая часть этих расходов связана с внутрибольничной помощью. По прогнозам, эти расходы увеличатся до беспрецедентного уровня 70 млрд. долл. США в 2030 году за счет старения населения.
Сердечная недостаточность затрагивает широкий круг пациентов, у которых нормальная фракция выброса левого желудочка (LVEF) обычно составляет ≥50%, также известная как HF с сохраненным EF (HFpEF), по сравнению с пациентами с пониженным LVEF, обычно равным <40%, также известным как HF с пониженным EF (HFrEF). Пациенты с LVEF в диапазоне 40-49% представляют «серую зону», которая определяется как HF со средним EF (HFmrEF) (Ponikowski et al., 2016. European Heart Journal 18 (8): 891-975).
Сердечная недостаточность может проявляться в виде острой или хронической сердечной недостаточности.
Термин «острая» используется для обозначения стремительного начала и для описания осложненной или декомпенсированной сердечной недостаточности, относящейся к эпизодам, когда пациента можно охарактеризовать как имеющего изменение признаков и симптомов сердечной недостаточности, приводящих к необходимости в срочной терапии или госпитализации.
Термин «хроническая» относится к длительной продолжительности течения заболевания. Хроническая сердечная недостаточность является долговременным состоянием, обычно сохраняющимся стабильным при лечении симптомов (стабильная хроническая HF).
Стабильная хроническая HF характеризуется:
(i) наличием структурной или функциональной недостаточности сердца, которая ухудшает его способность обеспечивать достаточный приток крови для удовлетворения потребностей организма;
(ii) отсутствием объемной перегрузки (проявляющейся отеком легких и/или системным отеком) и/или выраженным снижением сердечного выброса (проявляющимся в гипотензии, почечной недостаточности и/или шоковом синдроме);
и когда пациент не нуждается в неотложной терапии или корректировке терапии, и не требуется госпитализация.
Хроническая HF с ухудшающимися признаками и симптомами характеризуется:
(i) наличием структурной или функциональной недостаточности сердца, которая ухудшает его способность обеспечивать достаточный приток крови для удовлетворения потребностей организма;
(ii) объемной перегрузкой (проявляющейся отеком легких и/или системным отеком) и/или выраженным снижением сердечного выброса (проявляющимся в гипотензии, почечной недостаточности и/или шоковом синдроме);
и когда пациент не нуждается в неотложной терапии, или не требуется госпитализация, но нуждается в корректировке терапии.
Хроническая сердечная недостаточность также может декомпенсироваться (относится к острой декомпенсированной сердечной недостаточности или острой декомпенсированной хронической сердечной недостаточности), что чаще всего является результатом интеркуррентного заболевания (например, пневмонии), инфаркта миокарда, аритмий, неконтролируемой гипертензии или неспособности пациента поддерживать ограничения в жидкости, соблюдать диету или лечение. После лечения пациенты с острой декомпенсированной хронической HF могут вернуться к стабильному хроническому компенсированному статусу (стабильной хронической HF).
Вновь возникшая острая HF и острая декомпенсированная хроническая HF характеризуются:
(i) наличием структурной или функциональной сердечной недостаточности, которая ухудшает его способность обеспечивать достаточный приток крови для удовлетворения потребностей организма;
(ii) объемной перегрузкой (проявляющейся отеком легких и/или системным отеком) и/или выраженным снижением сердечного выброса (проявляющимся в гипотензии, почечной недостаточности и/или шоковом синдроме);
и когда пациент нуждается в неотложной терапии или в корректировке терапии, и не требуется госпитализация.
<b>Острая HF</b>
<b>Хроническая HF</b>
Вновь возникшая AHF
Острая декомпенсированная HF=острая декопенсированная хроническая HF
Ухудшение признаков/симптомов хронической HF
Стабильная хроническая HF
Вышеприведенные определения острой сердечной недостаточности, вновь возникшей AHF, острой декомпенсированной HF, острой декомпенсированной хронической HF или ухудшение симптомов хронической сердечной недостаточности, соответствуют приведенным в публикации Voors et al., European Journal of Heart Failure (2016), 18, 716-726.
В конкретном варианте осуществления указанного способа диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, активность DPP3 можно определить с использованием жидкофазного анализа активности или с использованием анализа активности с захватом фермента.
В жидкофазном анализе образцы жидкостей организма непосредственно подвергаются контактированию с флуорогенным субстратами (например, Arg-Arg-β-NA). Поскольку в плазме много других аминопептидаз (Sanderink et al., 1988), то возможно, что использованный субстрат расщепляется пептидазами, отличными от DPP3. Для того, чтобы обойти эту проблему, одним из предпочтительных способов определения специфической активности DPP3 является использование анализа активности с захватом фермента.
В одном конкретном варианте осуществления определение активной DPP3 в анализе с захватом фермента включает стадии:
контактирования указанного образца с захватывающим-связывающим соединением, которое связывается с полноразмерной DPP3, но предпочтительно ингибирует активность DPP3 в жидкофазном анализе менее чем на 50%, предпочтительно менее чем на 40%, более предпочтительно менее чем на 30%. Для предупреждения ингибирования DPP3 захватывающее-связывающее соединение не должно связываться с DPP3 в области около активного центра и области связывания субстрата (аминокислоты 316-669 SEQ ID NO: 1);
отделения DPP3, связанной с указанным захватывающим-связывающим соединением, от образца жидкости организма;
добавления субстрата DPP3 к указанной отделенной DPP3;
количественного определения активности DPP3 измерением превращения субстрата DPP3;
оценки измеренных сигналов в сравнении с контрольными индивидами, не страдающими заболеваниями. Пороговое значение может быть заранее определено, например, измерением концентрации DPP3 и активности DPP3 у здоровых контрольных субъектов и вычислением соответствующего 75-процентиля. Верхняя граница 75-процентиля определяет пороговое значение для здоровых субъектов против больных пациентов.
В одном конкретном варианте осуществления определение активной DPP3 проводят согласно вышеописанному способу по настоящему изобретению.
В конкретном варианте осуществления указанного способа диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, указанное связывающее соединение может быть выбрано из группы, включающей антитело, фрагмент антитела или каркасный белок, отличный от Ig.
В конкретном варианте осуществления указанный способ диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, представляет анализ с захватом фермента (ECA, патент США № 5612186A, патент США № 5601986A). Связывающее DPP3 соединение в этом анализе представляет собой антитело.
В конкретном варианте осуществления указанного способа диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, указанное захватывающее-связывающее соединение иммобилизуют на поверхности. Связывающее соединение, реагирующее с белком DPP3, но не оказывающее отрицательного влияния на активность пептидазы более чем на 50%, предпочтительно более чем на 40%, предпочтительно более чем на 30%, может быть иммобилизовано на твердой фазе. Для предупреждения ингибирования DPP3, захватывающее-связывающее соединение не должно связываться с DPP3 в области около активного центра и области связывания субстрата (аминокислоты 316-669 SEQ ID NO: 1).
В конкретном варианте осуществления указанного способа определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида указанное связывающее соединение может быть выбрано из группы, включающей антитело, фрагмент антитела, каркасный белок, отличный от Ig, или аптамеры.
Испытуемый образец пропускают над иммобилизованным связывающим соединением, и DPP3, если она присутствует, связывается со связывающим соединением и сама иммобилизуется для детектирования. Затем может быть добавлен субстрат и продукт реакции можно детектировать для определения присутствия или количества DPP3 в испытуемом образце. Для целей настоящего описания термин «твердая фаза» можно использовать для включения любого материала или резервуара, в котором или на котором можно проводить анализ, и она включает, не ограничиваясь этим: пористые материалы, непористые материалы, пробирки, лунки, предметные стекла, агарозовые смолы (например, Сефароза производства GE Healthcare Life Sciences), магнитные частицы (например, магнитные частицы Dynabeads™ или Pierce™ производства Thermo Fisher Scientific) и т. д.
2+
Связывающие соединения белкового или пептидного происхождения (например, антитело, фрагменты антител, каркасные белки, отличные от IgG) иммобилизуют на твердой фазе способами, включающими физическую адсорбцию (например, электростатическое взаимодействие или гидрофобное взаимодействие), биоаффинную иммобилизацию (например, авидин-биотин, белок А/G/L, His-метку и Ni-NTA, GST-метку и глютатион, гибридизацию ДНК, аптамеры), ковалентную связь (например, посредством амина и N-гидроксисукцинимида) или комбинацию указанных методов иммобилизации (Kim & Herr 2013). Связывающие соединения олигонуклеотидного происхождения (например, аптамеры) могут быть иммобилизованы на твердой фазе с использованием системы (стрептококковый) авидин-биотин (Müller et al., 2012, Deng et al., 2014).
В конкретном варианте осуществления указанного способа диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, указанная стадия отделения представляет стадию промывания, на которой удаляются ингредиенты образца, которые не связаны с указанным захватывающим-связывающим соединением, от захваченной DPP3.
В конкретном варианте осуществления указанного способа диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, превращение указанного субстрата DPP3 иммобилизованной DPP3 измеряется (детектируется) способом, выбранным из группы, включающей флуоресценцию флуорогенных субстратов (например, Arg-Arg-βNA, Arg-Arg-AMC), изменение окраски хромогенных субстратов, люминесценцию субстратов, связанных с аминолюциферином (анализ Promega Protease-Glo™), масс-спектрометрию, ВЭЖХ/FPLC (обращеннофазовую хроматографию, эксклюзионную хроматографию), тонкослойную хроматографию, капиллярный зональный электрофорез, гель-электрофорез с последующим окрашиванием активности (иммобилизованной, активной DPP3) или вестерн-блоттинг (продукты расщепления).
В конкретном варианте осуществления указанного способа диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, указанный субстрат может быть выбран из группы, включающей ангиотензин II, III и IV, лей-энкефалин, мет-энкефалин, эндоморфин 1 и 2, валорфин, β-казоморфин, динорфин, проктолин, ACTH и MSH, или ди- и трипептиды, связанные с флуорофором, хромофором или аминолюциферином (анализ Promega Protease-Glo™). Ди- или трипептиды, которые расщепляются под действием DPP3, включают, не ограничиваясь этим, Arg-Arg, Ala-Ala, Ala-Arg, Ala-Phe, Asp-Arg, Gly-Ala, Gly-Arg, Gly-Phe, Leu -Ala, Leu-Gly, Lys-Ala, Phe-Arg, Suc-Ala-Ala-Phe. Флуорофоры включают, не ограничиваясь этим, β-нафтиламид (2-нафтиламид, βNA, 2NA), 4-метокси-β-нафтиламид (4-метокси-2-нафтиламид) и 7-амидо-4-метилкумарин (AMC, MCA, Abramic et al., 2000, Ohkubo et al., 1999). Расщепление данных флуорогенных субстратов приводит к высвобождению флуоресцентного β-нафтиламина или 7-амино-4-метилкумарина соответственно. Хромофоры включают, не ограничиваясь этим, п-нитроанилида диацетат (pNA). Гидролиз связи пептид-pNK в хромогенных субстратах приводит к высвобождению pNA, который, в свою очередь, изменяет окраску. Таким образом, изменение оптической плотности (DA/мин) прямо пропорционально ферментативной активности. Используя анализ Protease-Glo™ от Promega, при расщеплении DPP3 высвобождается аминолюциферин и служит в качестве субстрата для связанной люциферазной реакции, которая испускает детектируемую люминесценцию.
В предпочтительном варианте осуществления активность DPP3 измеряется добавлением флуорогенного субстрата Arg-Arg-βNA и определением флуоресценции в режиме реального времени.
Еще одним важным вариантом осуществления настоящего изобретения является ингибитор активности DPP3 для применения в профилактике или лечении заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида.
Ингибиторы представляют собой молекулы, которые предпочтительно достоверно ингибируют активность DPP3. Данные молекулы могут представлять пептиды и небольшие молекулы (см. таблицу 2) или антитела (см. таблицу 3). Достоверное ингибирование означает ингибирование более чем на 80% в жидкофазном анализе, как описано выше, предпочтительно более чем на 90%, более предпочтительно почти или фактически 100% ингибирование.
Пептидные ингибиторы DPP3 включают, не ограничиваясь этим, спинорфин, синтетические производные спинорфина (тинорфин и другие пептиды, см. таблицу 2, Yamamoto et al., 2000), пропиоксатин А и В (патент США № 4808076) и синтетические аналоги пропиоксатина А (Inaoka et 1988).
Низкомолекулярные ингибиторы DPP3 включают, не ограничиваясь этим, флуостатины и производные бензимидазола. Флуостатины A и B являются антибиотиками, продуцируемыми Streptomyces sp. TA-3391, которые нетоксичны и эффективно ингибируют активность DPP3. К настоящему времени синтезировано, и имеются сообщения о 20 различных производных бензимидазола (Agic et al., 2007; Rastija et al., 2015), из которых два производных 1' и 4' демонстрируют самый высокий ингибирующий эффект (Agic et al., 2007).
В предпочтительном варианте осуществления изобретения выбранный ингибитор является фармацевтически приемлемым, селективным и/или специфичным для DPP3 и не проходит через клеточную мембрану и/или гематоэнцефалический барьер. Селективные и специфические ингибиторы DPP3 не связываются с другими белками/ферментами или связаны другими белками/ферментами, и не ингибируют какой-либо другой фермент/протеазу/пептидазу, отличную от DPP3. Низкомолекулярные пептиды могут связываться и расщепляться неспецифическими аминопептидазами, и низкомолекулярные ингибиторы легко проходят через клеточную мембрану и гематоэнцефалический барьер. Антитела против DPP3, фрагменты антител против DPP3 или каркасные белки, отличные от Ig, против DPP3, специфически и селективно связываются с DPP3 и не проходят через клеточную мембрану или гематоэнцефалический барьер. Следовательно, предпочтительными ингибиторами активности DPP3 являются специфические антитела против DPP3, фрагменты антител против DPP3 или каркасные белки, отличные от Ig, против DPP3.
В конкретном варианте осуществления изобретения ингибитор активности DPP3 применяется для профилактики или лечения заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, где указанный ингибитор выбран из группы, включающей антитело против DPP3, фрагмент антитела против DPP3 или каркасный белок, отличный от Ig, против DPP3.
В конкретном варианте осуществления изобретения ингибитор или эффектор активности DPP3 применяют для профилактики или лечения заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, где указанное заболевание выбрано из группы, включающей: сердечную недостаточность, хроническую сердечную недостаточность, острую сердечную недостаточность (AHF), инфаркт миокарда (MI), инсульт, печеночную недостаточность, ожоговые травмы, травматические повреждения, тяжелую инфекцию (микробную, вирусную (например, СПИД), паразитарную (например, малярию)) или ССВО или сепсис, рак, острую почечную недостаточность (AKI), расстройства центральной нервной системы (ЦНС) (например, судороги, нейродегенеративные заболевания), аутоиммунные заболевания, сосудистые заболевания (например, синдром Кавасаки) и гипотензию.
В еще одном варианте осуществления указанное заболевание выбрано из группы, включающей острую сердечную недостаточность (AHF), инфаркт миокарда (MI), печеночную недостаточность, ожоговые травмы, тяжелую инфекцию (микробную, вирусную (например, СПИД), паразитарную (например, малярию)) или ССВО или сепсис, рак и острую почечную недостаточность (AKI).
В одном конкретном варианте осуществления изобретения ингибитор активности DPP3 применяется для профилактики заболевания или патологического состояния у индивида, где заболевание или патологическое состояние представляет острую сердечную недостаточность (AHF), инфаркт миокарда (MI), печеночную недостаточность, рак и острую почечную недостаточность (AKI) и гипотензию.
В одном конкретном варианте осуществления изобретения ингибитор активности DPP3 применяется в лечении заболевания или патологического состояния у индивида, где заболевание или патологическое состояние представляет острую сердечную недостаточность (AHF), инфаркт миокарда (MI), печеночную недостаточность, рак и острую почечную недостаточность (AKI) и гипотензию.
В одном конкретном варианте осуществления для всех вариантов осуществления изобретения указанное заболевание не является болезнью Альцгеймера. В одном конкретном варианте осуществления для всех вариантов осуществления изобретения указанное заболевание не является раком. В одном конкретном варианте осуществления для всех вариантов осуществления изобретения указанное заболевание не является ревматоидным артритом.
В одном конкретном варианте осуществления указанное заболевание или патологическое состояние представляет гипотензию.
В конкретном варианте осуществления изобретения ингибитор активности DPP3 применяется для профилактики или лечения заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, где указанный ингибитор представляет антитело, которое является моносвязывающим или, по меньшей мере, двусвязывающим.
В конкретном варианте осуществления изобретения ингибитор или эффектор активности DPP3 применяется в профилактике или лечении заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, где указанный ингибитор или эффектор представляет антитело против DPP3, фрагмент антитела против DPP3 или каркасный белок, отличный от Ig, против DPP3, которые связываются с SEQ ID NO: 1, в конкретном варианте осуществления антитело против DPP3, фрагмент антитела против DPP3 или каркасный белок, отличный от Ig, против DPP3, которые связываются с SEQ ID NO: 2.
-7
В конкретном варианте осуществления изобретения ингибитор или эффектор активности DPP3 применяется в профилактике или лечении заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, где указанный ингибитор или эффектор представляет антитело или фрагмент, или каркасный белок, которые проявляют минимальную аффинность связывания с DPP3 ниже 10 М.
В конкретном варианте осуществления способа профилактики или лечения заболевания или состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, указанный ингибитор или эффектор представляет антитело или фрагмент, или каркасный белок, которые связываются с полноразмерной DPP3 и ингибируют активность DPP3, по меньшей мере, на 10% или, по меньшей мере, на 50%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 60%, еще более предпочтительно более чем на 70%, еще более предпочтительно более чем на 80%, еще более предпочтительно более чем на 90%, еще более предпочтительно более чем на 95%. Активность может быть определена в жидкофазном анализе, как описано выше.
В конкретном варианте осуществления изобретения ингибитор или эффектор активности DPP3 применяется в профилактике или лечении заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, где указанный ингибитор или эффектор представляет антитело или фрагмент, или каркасный белок, которые являются моноспецифическими.
Моноспецифическое антитело против DPP3 или моноспецифический фрагмент антитела против DPP3, или моноспецифический каркасный белок, отличный от Ig, против DPP3, означает, что указанное антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3, или каркасный белок, отличный от Ig, против DPP3, связываются с одной определенной областью, охватывающей, по меньшей мере, 5 аминокислот в целевой DPP3. Моноспецифическое антитело против DPP3 или моноспецифический фрагмент антитела против DPP3 или моноспецифический каркасный белок, отличный от Ig, против DPP3, представляют антитела против DPP3 или фрагменты антител против DPP3, или каркасные белки, отличные от Ig, против DPP3, которые имеют аффинность к одному и тому же антигену.
В еще одном конкретном и предпочтительном варианте осуществления антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3, или каркасный белок, отличный от Ig, против DPP3, связывающиеся с DPP3, представляют моноспецифические антитело, фрагмент антитела или каркасный белок, отличный от Ig соответственно, где моноспецифические означает, что указанное антитело или фрагмент антитела или каркасный белок, отличный от Ig, связываются с одной определенной областью, охватывающей, по меньшей мере, 4 аминокислоты в целевой DPP3. Моноспецифические антитела или фрагменты или каркасные белки, отличные от Ig, по изобретению представляют антитела или фрагменты, или каркасные белки, отличные от Ig, которые имеют аффинность к одному и тому же антигену. Моноклональные антитела являются моноспецифическими, но моноспецифические антитела также могут быть получены другими способами, чем их получение из общей зародышевой клетки.
В конкретном варианте осуществления изобретения ингибитор или эффектор активности DPP3 применяется в профилактике или лечении заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, где указанный субъект имеет повышенный уровень DPP3. Повышенный уровень представляет уровень выше заранее определенного порогового значения.
Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая ингибитор активности DPP3, как описано выше, для применения в профилактике или лечении заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида.
Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является способ профилактики или лечения заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, которому вводят ингибитор активности DPP3.
В конкретном варианте осуществления способа профилактики или лечения заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, указанный ингибитор выбран из группы, включающей антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3 или каркасный белок, отличный от Ig, против DPP3.
В конкретном варианте осуществления способа профилактики или лечения заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, указанное заболевание выбрано из группы, включающей: сердечную недостаточность, хроническую сердечную недостаточность, острую сердечную недостаточность (AHF), инфаркт миокарда (MI), инсульт, печеночную недостаточность, ожоговые травмы, травматические повреждения, тяжелую инфекцию (микробную, вирусную (например, СПИД), паразитарную (например, малярию)) или ССВО или сепсис, рак, острую почечную недостаточность (AKI), расстройства центральной нервной системы (ЦНС) (например, судороги, нейродегенеративные заболевания), аутоиммунные заболевания, сосудистые заболевания (например, синдром Кавасаки) и гипотензию.
В конкретном варианте осуществления способа профилактики или лечения заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, указанный ингибитор представляет антитело, которое является моносвязывающим или, по меньшей мере, двусвязывающим.
В конкретном варианте осуществления способа профилактики или лечения заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, указанный ингибитор представляет антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3, или каркасный белок, отличный от Ig, против DPP3, которые связываются с SEQ ID NO: 1, в конкретном варианте осуществления антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3, или каркасный белок, отличный от Ig, против DPP3, которые связываются с SEQ ID NO: 2.
-7
В конкретном варианте осуществления способа профилактики или лечения заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, указанный ингибитор представляет антитело или фрагмент, или каркасный белок, которые проявляют минимальную аффинность связывания с DPP3 ниже 10 М.
В конкретном варианте осуществления способа профилактики или лечения заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, указанный ингибитор или эффектор представляет антитело или фрагмент, или каркасный белок, которые являются моноспецифическими.
В конкретном варианте осуществления способа профилактики или лечения заболевания или состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, указанный ингибитор или эффектор представляет антитело или фрагмент, или каркасный белок, которые связываются с полноразмерной DPP3 и ингибируют активность DPP3, по меньшей мере, на 10% или, по меньшей мере, на 50%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 60%, еще более предпочтительно более чем на 70%, еще более предпочтительно более чем на 80%, еще более предпочтительно более чем на 90%, еще более предпочтительно более чем на 95%.
В конкретном варианте осуществления изобретения способа профилактики или лечения заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, указанный субъект имеет повышенный уровень DPP3. Повышенный уровень представляет уровень выше заранее определенного порогового значения. Пороговые значения имеют определение, приведенное выше.
Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является удаление DPP3 из крови пациента. Удаление может быть достигнуто несколькими методами афереза и/или стадиями аффинной хроматографии (Balogun et al., 2010). Данные способы включают, не ограничиваясь этим, фильтрацию плазмы пациента через адсорбент, содержащий специфическое и высокоаффинное антитело к DPP3, связанное с агарозовыми смолами, см. в примере 12 анализ связывания DPP3 с возможным материалом адсорбента.
Фармацевтическая композиция по изобретению формулирована таким образом, чтобы она была совместимой с предполагаемым путем ее введения. Пути введения обычно классифицируются по месту, где применяется соединение. Наиболее распространенные примеры включают пероральное, эпикутанное, подкожное, внутрикожное, сублингвальное, внутримышечное, внутриартериальное, внутривенное и внутрибрюшинное введение.
Фармацевтические композиции также можно вводить через центральную нервную систему (ЦНС), например, эпидуральной (синоним: перидуральной) инъекцией или инфузией в эпидуральное пространство, интрацеребральной (в головной мозг) прямой инъекцией в мозг, интрацеребровентрикулярной (введение в желудочковую систему головного мозга) или интратекальной (в канал спинного мозга) инъекцией.
В следующих конкретных вариантах осуществления изобретения приведены основные положения:
1. Способ диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, включающий:
определение количества общей DPP3 и/или определение количества активной DPP3 в образце жидкости организма указанного индивида;
сравнение указанного определенного количества общей DPP3 или активной DPP3 с заранее определенным пороговым значением;
где у индивида диагностируется наличие заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, если указанное определенное количество выше указанного заранее определенного порогового значения.
2. Способ диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по п.1, где количество общей или активной DPP3 определяется в единицах концентрации.
3. Способ диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, по пп.1 или 2, где указанный образец выбран из группы, включающей цельную кровь, сыворотку и плазму.
4. Способ диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по любому из пп.1-3, где указанное заболевание выбрано из группы, включающей сердечную недостаточность, хроническую сердечную недостаточность, острую сердечную недостаточность (AHF), инфаркт миокарда (MI), инсульт, печеночную недостаточность, ожоговые травмы, травматические повреждения, тяжелую инфекцию (микробную, вирусную (например, СПИД), паразитарную (например, малярию)) или ССВО или сепсис, рак, острую почечную недостаточность (AKI), расстройства центральной нервной системы (ЦНС) (например, судороги, нейродегенеративные заболевания), аутоиммунные заболевания, сосудистые заболевания (например, синдром Кавасаки) и гипотензию.
5. Способ диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по любому из пп.1-4, где количество общей DPP3 и/или количество активной DPP3 определяют в образце жидкости организма указанного индивида, и включает стадии:
контактирования указанного образца с захватывающим-связывающим соединением, которое специфически связывается с полноразмерной DPP3;
отделения DPP3, связанной с указанным захватывающим-связывающим соединением;
добавления субстрата DPP3 к указанной отделенной DPP3;
количественного определения указанной активной DPP3 измерением и количественным определением превращения субстрата DPP3.
6. Способ диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по п.5, где указанное захватывающее-связывающее соединение может быть выбрано из группы, включающей антитело, фрагмент антитела или каркасный белок, отличный от IgG.
7. Способ диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по пп.5 или 6, где указанное захватывающее-связывающее соединение представляет антитело.
8. Способ диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по любому из пп.5-7, где захватывающее-связывающее соединение иммобилизовано на поверхности.
9. Способ диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по любому из пп.5-8, где указанная стадия отделения представляет стадию промывания, на которой удаляются ингредиенты образца, которые не связаны с указанным захватывающим-связывающим соединением, от захваченной DPP3.
10. Способ диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по любому из пп.5-9, где превращение субстрата DPP3 детектируется способом, выбранным из группы, включающей флуоресценцию флуорогенных субстратов (например, Arg-Arg-βNA, Arg-Arg-AMC), изменение окраски хромогенных субстратов, люминесценцию субстратов, связанных с аминолюциферином (анализ Promega Protease-Glo™), масс-спектрометрию, ВЭЖХ/FPLC (обращеннофазовую хроматографию, эксклюзионную хроматографию), тонкослойную хроматографию, капиллярный зональный электрофорез, гель-электрофорез с последующим окрашиванием активности (иммобилизованной, активной DPP3) или вестерн-блоттинг (продукты расщепления).
11. Способ диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по любому из пп.5-10, где указанный субстрат может быть выбран из группы, включающей ангиотензин II, III и IV, лей-энкефалин, мет-энкефалин, эндоморфин 1 и 2, валорфин, β-казоморфин, динорфин, проктолин, ACTH и MSH, или дипептиды, связанные с флуорофором, хромофором или аминолюциферином, где дипептид представляет Arg-Arg.
12. Способ диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по любому из пп.5-11, где указанный субстрат может быть выбран из группы, включающей: дипептид, связанный с флуорофором, хромофором или аминолюциферином, где дипептид представляет Arg-Arg.
13. Способ контроля заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, где способ диагностики по любому из пп.1-12 проводится, по меньшей мере, дважды.
14. Ингибитор активности DPP3 для применения в профилактике или лечении заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида.
15. Ингибитор активности DPP3 для применения в профилактике или лечении заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по п.14, где указанный ингибитор выбран из группы, включающей антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3 или каркасный белок, отличный от Ig, против DPP3.
16. Ингибитор активности DPP3 для применения в профилактике или лечении заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по пп.14 или 15, где указанное заболевание выбрано из группы, включающей сердечную недостаточность, хроническую сердечную недостаточность, острую сердечную недостаточность (AHF), инфаркт миокарда (MI), инсульт, печеночную недостаточность, ожоговые травмы, травматические повреждения, тяжелую инфекцию (микробную, вирусную (например, СПИД), паразитарную (например, малярию)) или ССВО или сепсис, рак, острую почечную недостаточность (AKI), расстройства центральной нервной системы (ЦНС) (например, судороги, нейродегенеративные заболевания), аутоиммунные заболевания, сосудистые заболевания (например, синдром Кавасаки) и гипотензию.
17. Ингибитор активности DPP3 для применения в профилактике или лечении заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по любому из пп.14-16, где указанный ингибитор представляет антитело, которое является моносвязывающим или, по меньшей мере, двусвязывающим.
18. Ингибитор активности DPP3 для применения в профилактике или лечении заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по любому из пп.14-17, где указанный ингибитор представляет антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3 или каркасный белок, отличный от Ig, против DPP3, которые связываются с SEQ ID NO: 1, в частности, которые связываются с SEQ ID NO: 2.
-7
19. Ингибитор активности DPP3 для применения в профилактике или лечении заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по любому из пп.14-18, где указанный ингибитор представляет антитело или фрагмент или каркасный белок, которые проявляют минимальную аффинность связывания с DPP3, равную или ниже 10 М.
20. Ингибитор активности DPP3 для применения в профилактике или лечении заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по любому из пп.14-19, где указанный ингибитор представляет антитело или фрагмент, или каркасный белок, которые являются моноспецифическими.
21. Ингибитор активности DPP3 для применения в профилактике или лечении заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по любому из пп.14-20, где указанный ингибитор представляет антитело или фрагмент, или каркасный белок, которые связываются с DPP3 и ингибируют активность DPP3, по меньшей мере, на 10% или, по меньшей мере, на 50%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 60%, еще более предпочтительно более чем на 70%, еще более предпочтительно более чем на 80%, еще более предпочтительно более чем на 90%, еще более предпочтительно более чем на 95%.
22. Ингибитор активности DPP3 для применения в профилактике или лечении заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по любому из пп.14-21, где указанный ингибитор является селективным и специфичным к DPP3, и не проходит через клеточные мембраны и/или гематоэнцефалический барьер.
23. Ингибитор активности DPP3 для применения в профилактике или лечении заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по любому из пп. 14-22, где указанный субъект имеет количество общей DPP3 и/или количество активной DPP3 в образце жидкости организма указанного индивида, которое выше заранее определенного порогового значения.
24. Фармацевтическая композиция, содержащая ингибитор активности DPP3 по любому из пп.14-23 для применения в профилактике или лечении заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида.
25. Применение ингибитора активности DPP3 по любому из пп.14-23 в способе экстракорпорального удаления DPP3 из плазмы, включающем аферез и аффинную хроматографию.
26. Способ определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида, включающий стадии:
контактирования указанного образца с захватывающим-связывающим соединением, которое специфически связывается с полноразмерной DPP3;
отделения DPP3, связанной с указанным захватывающим-связывающим соединением;
добавления субстрата DPP3 к указанной отделенной DPP3;
количественного определения указанной активной DPP3 измерением и количественным определением превращения субстрата DPP3.
27. Способ определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида по п.26, где указанное захватывающее-связывающее соединение может быть выбрано из группы антитела, фрагмента антитела или каркасного белка, отличного от IgG.
28. Способ определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида по пп.26 или 27, где указанное захватывающее-связывающее соединение является антителом.
29. Способ определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида по любому из пп.26-28, где захватывающее-связывающее соединение иммобилизовано на поверхности.
30. Способ определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида по любому из пп.26-29, где указанная стадия отделения представляет стадию промывания, на которой удаляются ингредиенты образца, которые не связаны с указанным захватывающим-связывающим соединением, от захваченной DPP3.
31. Способ определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида по любому из пп.26-30, где превращение субстрата DPP3 детектируется способом, выбранным из группы, включающей флуоресценцию флуорогенных субстратов (например, Arg-Arg-βNA, Arg-Arg-AMC), изменение окраски хромогенных субстратов, люминесценцию субстратов, связанных с аминолюциферином (анализ Promega Protease-Glo™), масс-спектрометрию, ВЭЖХ/FPLC (обращеннофазовую хроматографию, эксклюзионную хроматографию), тонкослойную хроматографию, капиллярный зональный электрофорез, гель-электрофорез с последующим окрашиванием активности (иммобилизованной, активной DPP3) или вестерн-блоттинг (продукты расщепления).
32. Способ определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида, по любому из пп.26-31, где указанный субстрат может быть выбран из группы, включающей: дипептид, связанный с флуорофором, хромофором или аминолюциферином, где дипептид представляет Arg-Arg.
33. Способ определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида по любому из пп.26-32, где указанный образец представляет образец крови, выбранный из группы, включающей цельную кровь, сыворотку и плазму.
34. Анализ или набор для определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида, включающий:
захватывающее-связывающее соединение, которое специфически связывается с полноразмерной DPP3;
субстрат DPP3.
35. Анализ или набор для определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида по п.34, где указанное захватывающее-связывающее соединение может быть выбрано из группы, включающей антитело, фрагмент антитела или каркасный белок, отличный от IgG.
36. Анализ или набор для определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида по пп.34 или 35, где указанное захватывающее-связывающее соединение ингибирует активность DPP3 менее чем на 50% в жидкофазном анализе, предпочтительно менее чем на 40%, более предпочтительно менее чем на 30%.
37. Анализ или набор для определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида по любому из пп.34-36, где область связывания DPP3 для захватывающего-связывающего соединения не находится в области аминокислот 316-669 SEQ ID NO: 1.
38. Анализ или набор для определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида по любому из пп.34-37, где указанное захватывающее-связывающее соединение представляет антитело.
39. Анализ или набор для определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида по любому из пп.34-38, где указанное захватывающее-связывающее соединение иммобилизовано на поверхности.
40. Анализ или набор для определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида по любому из пп.34-39, где указанный субстрат может быть выбран из группы, включающей ангиотензин II, III и IV, лей-энкефалин, мет-энкефалин, эндоморфин 1 и 2, валорфин, β-казоморфин, динорфин, проктолин, ACTH и MSH, или дипептид, связанный с флуорофором, хромофором или аминолюциферином, где дипептид представляет Arg-Arg.
41. Применение способа определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида по любому из пп.26-33 или применение анализа или набора по любому из пп.34-40 в способе диагностики или контроля заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по любому из пп.1-13.
Примеры
1. Пример 1
Активность DPP3 в плазме пациентов с различными заболеваниями (пациентов с острым инфарктом миокарда (AMI), кардиогенным шоком, септическим шоком и печеночной недостаточностью) определяли с использованием анализа специфической активности DPP3 с захватом и сравнивали с активностью DPP3 в плазме здоровых контрольных субъектов.
1.1. Когорта исследуемых пациентов
:
Образцы плазмы были получены от 388 пациентов, поступивших в отделение неотложной помощи непосредственно при их первом представлении. Согласно окончательному диагнозу эти пациенты можно разделить на 4 подгруппы: пациенты, страдающие острым инфарктом миокарда (AMI), кардиогенным шоком, септическим шоком и печеночной недостаточностью. Контрольная группа представляла собой коллекцию образцов плазмы от 93 здоровых контрольных субъектов.
1.2. Анализ активности hDPP3 с захватом:
-1
-1
DPP3 образцов плазмы (10 мкл) сначала обогащали на стадии аффинной очистки, и затем ее активность измеряли добавлением флуорогенного субстрата Arg-Arg-βNA (подробное описание см. в примере 4). Высчитанные наклоны (в нмоль βNA/мин на мл образца [нмоль βNA мин мл]) увеличения флуоресценции различных образцов относятся к объему образца, равному 10 мкл.
1.3. Результаты:
Сравнение образцов плазмы пациентов и здоровых контрольных субъектов показало достоверно более высокие значения активности DPP3 для всех пациентов с тяжелыми заболеваниями или органной недостаточностью (фиг.10).
2. Пример 2
В данном эксперименте исследовали эффект инъекционного введения рекомбинантной hDPP3 у здоровых крыс по контролю артериального давления.
2.1. Метод:
Для данного исследования использовали крыс самцов Вистар в возрасте 2-3 месяцев (питомник Charles River Laboratories, Германия). Для измерения и регистрации артериального давления (BP) катетер (Introcan-W; 22 G/1''; B.Braun) вводили в артерию carotis communis dextra (правую общую сонную артерию). Человеческую рекомбинантную дипептидилпептидазу-3 с N-концевой GST-меткой (recGST-hDPP3) вводили в хвостовую вену.
Сначала животных анестезировали изофлураном для проведения взвешивания (в целых г) и внутрибрюшинной (в/б) инъекции уретана в дозе 1,2 г/кг массы тела (c=0,4 г/мл) для продолжительной анестезии. Затем с вентральной области шеи выстригали шерстный покров и участок протирали этиловым спиртом. Сосуды препарировали и вводили катетеры. В концы обоих катетеров вводили гепаринизированный изотонический раствор хлорида натрия. Затем датчики давления (medex logical, Medex Medical Ltd.) соединяли с системой мониторинга животного (Datex-Ohmeda, GE). Портативный компьютер через программное обеспечение сбора данных S/5, подключенный к монитору АД, отдельно записывал данные АД.
Крыс обрабатывали recGST-hDPP3 в дозе 0,2 мг/кг в PBS инъекцией в хвостовую вену. Кровяное давление постоянно контролировали до и после инъекции DPP3.
2.2. Результаты:
Инъекция рекомбинантной GST-hDPP3 здоровым крысам приводит к мгновенному снижению артериального давления (фиг.11).
3. Пример 3
Продукция антител и определение способности связываться с DPP3: получали несколько мышиных антител и подвергали скринингу на их способность связываться с DPP3 человека в сэндвич-анализе или анализе активности (см. таблицу 3).
3.1. Методы:
Пептиды/конъюгаты для иммунизации:
Синтезировали пептиды DPP3 для иммунизации, см. таблицу 3 (JPT Technologies, Берлин, Германия) с дополнительным N-концевым цистеином (если цистеин отсутствовал в выбранной последовательности DPP3) для конъюгации пептидов с бычьим сывороточным альбумином (BSA). Пептиды ковалентно связывали с BSA с использованием геля для связывания Sulfolink (Perbio-science, Bonn, Германия). Процедуру связывания проводили в соответствии с инструкцией Perbio. Рекомбинантную GST-hDPP3 получали от USBio.
Иммунизация мышей, слияние и скрининг иммунных клеток
:
Мышам Balb/c внутрибрюшинно (в/б) вводили 84 мкг GST-hDPP3 или 100 мкг конъюгатов DPP3-пептид-BSA на сутки 0 (эмульгированных в адъюванте TiterMax Gold), 84 мкг или 100 мкг на сутки 14 (эмульгированных в полном адъюванте Фрейнда) и 42 мкг или 50 мкг на сутки 21 и 28 (в неполном адъюванте Фрейнда). На сутки 49 животным вводили внутривенно 42 мкг GST-hDPP3 или 50 мкг конъюгатов DPP3-пептид-BSA, растворенных в физиологическом растворе. Через 3 суток мышей подвергали эвтаназии и проводили слияние иммунных клеток.
Спленоциты от иммунизированных мышей и клетки миеломной клеточной линии SP2/0 сливали с использованием 1 мл 50% полиэтиленгликоля в течение 30 с при 37°С. После промывания клетки высевали в 96-луночные планшеты для культивирования клеток. Гибридные клоны отбирали культивированием в среде HAT [среда для культивирования RPMI 1640 с добавлением 20% фетальной телячьей сыворотки и добавкой HAT]. Через одну неделю среду HAT заменяли средой НТ на три пассажа с последующим возвратом на обычную клеточную культуральную среду.
2
2
Супернатанты клеточной культуры первоначально подвергали скринингу на IgG-антитела, связывающиеся с рекомбинантной DPP3, через две недели после слияния. Соответственно, рекомбинантную GST-меченную DPP3 (USBiologicals, Salem, США) иммобилизовали в 96-луночных планшетах (100 нг/лунку) и инкубировали с 50 мкл клеточного культурального супернатанта на лунку в течение 2 ч при комнатной температуре. После промывания планшета добавляли 50 мкл/лунку POD-кроличий антимышиный IgG и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После следующей стадии промывания добавляли 50 мкл раствора хромогена (3,7 мМ o-фенилендиамин в цитратно-гидрофосфатном буфере, 0,012% HO) в каждую лунку, инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре и хромогенную реакцию останавливали добавлением 50 мкл 4 Н серной кислоты. Оптическую плотность определяли при 490 нм.
Тестированные положительные микрокультуры переносили в 24-луночные планшеты для размножения. После повторного тестирования отобранные культуры клонировали и реклонировали с использованием метода предельных разведений и определяли изотипы.
Продукция мышиных моноклональных антител
:
Антитела, продуцированные против GST-меченной человеческой DPP3 или пептидов DPP3, получали с помощью стандартных методов получения антител (Marx et al., 1997) и очищали на белке A. Чистота антител составляла ≥ 90% на основе анализа электрофореза в SDS-геле.
Характеристика антител - анализ ингибирования hDPP3
2
Для анализа способности ингибирования DPP3 различными антителами и клонами антител проводили анализ определения активности DPP3 с использованием известной процедуры (Jones et al., 1982). Рекомбинантную GST-меченную hDPP3 разводили в аналитическом буфере (25 нг/мл GST-DPP3 в 50 мМ Трис-HCl, pH 7,5 и 100 мкМ ZnCl) и 200 мкл этого раствора инкубировали с 10 мкг соответствующего антитела при комнатной температуре. Через 1 ч предварительной инкубации к раствору добавляли флуорогенный субстрат Arg-Arg-βNA (20 мкл, 2 мМ), и образование свободного βNA во времени контролировали с использованием микропланшетного флуорометра Twinkle LB 970 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG) при 37°C. Флуоресценцию βNA определяли при волне возбуждения 340 нм и волне эмиссии 410 нм. Вычисляли наклоны (в ОЕФ/мин) увеличения флуоресценции различных образцов. Наклон GST-hDPP3 с контрольным буфером принимали за 100% активность. Ингибирующую способность возможного захватывающего-связывающего соединения определяли по снижению активности GST-hDPP3 инкубацией с указанным захватывающим-связывающим соединением в процентах. Полученные значения снижения активности DPP3 показаны на фиг. 1a и в таблице 3.
3.2. Результаты:
В следующей таблице представлен отбор полученных антител и их максимальная скорость ингибирования (таблица 3). Моноклональные антитела, продуцированные против указанных ниже областей DPP3, отбирали по их способности связываться с нативной DPP3 (mAb-FL-DPP3_2555 в виде твердой фазы и _2553 в качестве индикатора для иммуноанализа, подробности см. в примере 4).
Для анализа активности иммобилизованной DPP3 (см. примеры 6 и 7) необходимо было выбрать антитело на твердой фазе, которое не слишком сильно ингибирует активность DPP3. В качестве порога отсечения для скрининга антител антитела на твердой фазе не должны ингибировать активность DPP3 более чем на 50%. Антитело mAbDPP3_2555 показало наименьшую степень ингибирования (таблица 3, фиг. 1A).
50
Для получения сильного ингибитора DPP3, который можно было бы использовать в терапевтических целях (см. примеры 6-11), необходимо было выбрать связывающее DPP3 соединение, которое проявляет самую высокую скорость ингибирования. Моноклональное антитело mAbDPP3_1967, обладающее способностью ингибировать активность DPP3 на 70%, было выбрано как возможное терапевтическое антитело (см. фиг. 1A и таблицу 3), и весь дальнейший анализ проводили с использованием этого антитела. На фиг. 1В показана кривая ингибирования mAbDPP3_1967, которое имеет IC 0,2041 мкг/мл.
Таблица 3Последовательность иммуногена, обозначение и характеристики продуцированных анти-DPP3-антител
<b>Номер последовательности</b>
<b>Антиген/иммуноген</b>
<b>Область hDPP3</b>
<b>Обозначение</b>
<b>Клон</b>
<b>Максимальное ингибирование DPP3</b>
<b>SEQ ID: 1</b>
GST-меченная рекомбинантная FL-DPP3
1-737
mAb-FL-DPP3
2552
65%
2553
35%
2554
30%
2555
25%
<b>SEQ ID: 2</b>
CETVINPETGEQIQSWYRSGE
474-493
mAb-pep1-DPP3
1963
60%
1964
60%
1965
70%
1966
65%
1967
70%
1968
65%
1969
70%
4. Пример 4
Определение комбинации антител, которая дает высокие отношения сигнал/шум в иммуноанализе hDPP3.
4.1. Методы:
Получение моноклональных антител
Получали моноклональные антитела к GST-меченной человеческой DPP3, стандартными методами получения антител (Marx et al., 1997) и очищали на белке A. Чистота антител составляла ≥ 90% на основании анализа электрофореза в SDS-геле. Различные клоны анализировали по способности связываться с DPP3. Полученные положительные клоны использовали в виде антител на твердой фазе или индикаторных антител.
Твердая фаза
96-луночные полистироловые микропланшеты (Greiner Bio-One International AG, Австрия) покрывали (1 ч при комнатной температуре) одним клоном анти-DPP3-антитела (захватывающее антитело, 1,5 мкг антитела/0,25 мл 100 ммоль/л, NaCl, 50 ммоль/л Трис/HCl, pH 7,8). После блокирования 5% бычьим сывороточным альбумином микропланшеты высушивали в вакууме.
Процедура мечения (индикатор)
2
6
100 мкг (100 мкл) другого анти-DPP3-антитела (детектирующее антитело, 1 мг/мл в PBS, pH 7,4) смешивали с 10 мкл NHS-эфира акридиния (1 мг/мл в ацетонитриле, InVent GmbH, Германия, EP 0353971) и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Меченное анти-DPP3-антитело очищали гель-фильтрацией ВЭЖХ на Shodex Protein 5 мкм KW-803 (Showa Denko, Япония). Очищенное меченное антитело разбавляли в аналитическом буфере (50 ммоль/л фосфата калия, 100 ммоль/л NaCl, 10 ммоль/л Na-EDTA, 5 г/л бычьего сывороточного альбумина, 1 г/л мышиного IgG, 1 г/л бычьего IgG, 50 мкмоль/л амастатина, 100 мкмоль/л лейпептина, рН 7,4). Конечная концентрация составляла примерно 7×10 относительных световых единиц (RLU) меченого соединения (примерно 20 нг меченого антитела) на 200 мкл. Хемилюминесценцию эфира акридиния измеряли с использованием люминометра Centro LB 960 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG).
Калибраторы
Стоковый раствор (в PBS, pH 7,4) рекомбинантной человеческой GST-DPP3 (USBiological, США) линейно разводили, используя (50 ммоль/л фосфата калия, 100 ммоль/л NaCl, 10 ммоль/л Na-ЭДТА, 5 г/л сывороточного альбумина, 1 г/л мышиного IgG, 1 г/л бычьего IgG, 50 мкмоль/л амастатина, 100 мкмоль/л лейпептина, рН 7,4). Стоковый раствор хранили при -80°С. Калибраторы готовили перед использованием.
Иммуноанализ hDPP3
10 мкл образца (или калибратора) пипетировали в покрытые 96-луночные микропланшеты после добавления меченого и разведенного детектирующего антитела (200 мкл), планшеты инкубировали в течение 18-24 ч при 2-8°С. Несвязанный индикатор удаляли промыванием 4 раза по 350 мкл раствора для промывания (20 мМ PBS, pH 7,4, 0,1% Тритон X-100). Связанную с лунками хемилюминесценцию измеряли с использованием люминометра Centro LB 960 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG).
4.2. Результаты:
Все антитела использовали в иммуноанализе сэндвич-типа, в виде покрытого микропланшета и меченого антитела, объединенных в следующих вариантах (таблицы 4 и 5). Инкубацию проводили, как описано в hDPP3-Immunoassay. Результаты приведены в виде соотношения специфического сигнала/фонового сигнала для рекомбинантной человеческой GST-DPP3 (при 100; 10 и 1 нг/мл) и нативной hDPP3 в образцах плазмы.
Все комбинации имели хорошие отношения сигнал/шум для рекомбинантной GST-hDPP3. Кроме того, все комбинации, за исключением 2552 и 2554, давали хорошие отношения сигнал/шум для нативных образцов. Следовательно, все остальные комбинации можно использовать для дальнейших исследований. В отношении самого высокого абсолютного сигнала RLU, то использовали комбинацию 2555 в качестве антитела на твердой фазе и 2553 в качестве меченого антитела.
5. Пример 5
Концентрацию DPP3 в плазме пациентов с различными заболеваниями (пациентов с острой сердечной недостаточностью (AHF), инфарктом миокарда (MI), сепсисом, раком, острой почечной недостаточностью (AKI) и инфекцией нижних дыхательных путей (LRTI)) определяли с использованием иммуноанализа hDPP3 и сравнивали с концентрациями DPP3 в плазме крови здоровых контрольных субъектов.
5.1. Когорта исследуемых пациентов
:
Образцы плазмы были получены у 214 пациентов, поступивших в отделение неотложной помощи непосредственно при их первом представлении. Согласно окончательному диагнозу этих пациентов можно разделить на 6 подгрупп: пациенты, страдающие острой сердечной недостаточностью (AHF), инфарктом миокарда (MI), сепсисом, раком, острой почечной недостаточностью (AKI) и инфекцией нижних дыхательных путей (LRTI). Контрольная группа представляла собой коллекцию образцов плазмы от 93 здоровых контрольных субъектов.
5.2. Иммуноанализ hDPP3:
mAbDPP3_2555 использовали в качестве антитела на твердой фазе и mAbDPP3_2553 в качестве меченого индикаторного антитела. Иммобилизацию, мечение и инкубацию антител проводили, как описано в примере 2.
5.3. Результаты:
Вместе с соответствующей подробной информацией, касающейся диагноза, полученные данные были обработаны статистически (фиг.2А). Все пациенты показали достоверно повышенную концентрацию DPP3 в плазме по сравнению со здоровыми контрольными индивидами (нормой). В таблице 6 показан процент пациентов с концентрацией DPP3 выше 75-процентиля контрольной группы и их соответствующий диагноз. Результаты анализа концентрации DPP3 в плазме указывают на статус заболевания пациента. Данное изобретение можно использовать в областях диагностики, а также для создания основы для терапевтического лечения, например, посредством ингибирования DPP3.
Таблица 6Сравнение концентраций DPP3 у пациентов с различными заболеваниями и здоровых контрольных субъектов в иммуноанализе сэндвич-типа
<b>Процент пациентов с концентрацией DPP3 выше 75-процентиля контрольной группы</b>
<b>Заболевание</b>
<b>AHF</b>
<b>MI</b>
<b>сепсис</b>
<b>рак</b>
<b>AKI</b>
<b>LRTI</b>
<b>Анализ сэндвич-типа</b>
48,7
64,3
85,5
91,7
51,4
53,3
Ту же когорту исследуемых пациентов анализировали по показателю смертности. Пациенты, которые умерли после поступления в отделение неотложной помощи, имели значительно более высокую концентрацию DPP3 в плазме, чем пациенты с неотложной ситуацией, но которые выжили в больнице. Таким образом, повышенная концентрация DPP3 указывает на плохой прогноз относительно смертности (фиг.2 B).
6. Пример 6
Количество DPP3 в плазме человека можно определить не только концентрациями DPP3, но также анализом активности. Одной стандартной процедурой является анализ растворимой активности с использованием Arg-Arg-βNA в качестве флуорогенного субстрата:
3
-1
-1
Активность нативной человеческой DPP III определяли гидролизом Arg-Arg-β-нафтиламида (Bachem Holdig AG, Швейцария) с образованием флуоресцентного бета-нафтиламина. 200 мкл буфера (50 мМ Трис/HCl, pH 8,8, 0,04% NaN, 50 мкМ амастатина, 100 мкМ лейпептина) и 10 мкл образца (плазмы человека) пипетировали в черные 96-луночные микропланшеты (Greiner Bio-One International GmbH, Австрия)), предварительно нагретые при 37°С в течение 10 мин. После добавления субстрата (20 мкл, 2 мМ) увеличение флуоресценции контролировали в течение 1 ч при 37°С на микропланшетном флуорометре Twinkle LB 970 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG) с использованием длины волны возбуждения 340 нм и длины волны эмиссии 410 нм. Наклоны увеличивающейся флуоресценции различных образцов рассчитывали в нмоль βNA/мин на мл образца [нмоль βNA мин мл], по отношению к калибратору свободному βNA.
С описанным стандартом невозможно провести анализ активности растворимой DPP3, поскольку неясно измеряется активность DPP3 или активность других аминопептидаз в плазме. Для получения сигналов, специфичных для DPP3, проводили анализ с захватом фермента, где на первой стадии DPP3 иммобилизовали на поверхности посредством связывания с моноклональным антителом, и после стадии промывания можно измерить только специфическую активность DPP3:
3
-1
-1
Твердую фазу готовили, как описано в примере 3, с использованием черных 96-луночных микропланшетов (Greiner Bio-One International GmbH, Австрия). 10 мкл образца (плазмы или стандарта) и 200 мкл буфера (50 ммоль/л фосфата калия, 100 ммоль/л NaCl, 5 г/л бычьего сывороточного альбумина, 1 г/л мышиного IgG, 1 г/л бычьего IgG, 50 мкмоль/л амастатина, 100 мкмоль/л лейпептина, рН 7,4) пипетировали в указанные покрытые микропланшеты и инкубировали (18-24 ч, 2, 600 об/мин). Несвязанный аналит удаляли промыванием (3 × 350 мкл) раствором для промывания. После добавления субстрата (200 мкл, 100 мкМ, в 50 мМ Трис/HCl, pH (25°C) 8,8, 0,04% NaN), увеличение флуоресценции контролировали в течение 1 ч при 37°C на микропланшетном флуорометре Twinkle LB 970 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG) с использованием длины волны возбуждения 340 нм и с длины волны эмиссии 410 нм. Наклоны увеличивающейся флуоресценции различных образцов рассчитывали в нмоль βNA/мин на мл образца [нмоль βNA мин мл], по отношению к калибратору свободному βNA.
3
В каждом анализе активности использовали свободный βNA в качестве калибратора. Таким образом, увеличение концентрации βNA (в 200 мкл, в 50 мМ Трис/HCl, pH (25°C) 8,8, 0,04% NaN, 0; 4; 8; 16; 32; 64; 125; 250 мкМ βNA) измеряли на микропланшетном флуорометре Twinkle LB 970 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG) при 37°C с использованием длины волны возбуждения 340 нм и с длины волны эмиссии 410 нм. Все измерения образцов были откалиброваны по этому стандарту βNA.
7. Пример 7
Активность DPP3 в плазме пациентов с различными заболеваниями (пациентов с острой сердечной недостаточностью (AHF), сепсисом, острой почечной недостаточностью (AKI) и инфекциями нижних дыхательных путей (LRTI)) определяли с использованием специфического анализа активности DPP3 с захватом фермента и сравнивали с активностью DPP3 в плазме здоровых контрольных субъектов.
7.1. Методы:
-1
-1
Части когорты, которые анализировали в примере 3, были подвергнуты анализу специфической активности DPP3 с захватом фермента. В данном анализе DPP3 образцы плазмы (10 мкл) сначала обогащали стадией аффинной очистки, и затем измеряли ее активность добавлением флуорогенного субстрата Arg-Arg-βNA (подробное описание см. в примере 4). Высчитанные наклоны (в нмоль βNA/мин на мл образца [нмоль βNA мин мл]) увеличения флуоресценции в различных образцах относятся к объему, равному 10 мкл.
7.2. Результаты:
Сравнение образцов пациентов и здоровых контрольных субъектов показало достоверно более высокие значения активности DPP3 для всех пациентов (AHF, сепсис, AKI и LTRI, фиг.3).
В таблице 7 показан процент пациентов с концентрацией DPP3 выше 75-процентиля контрольной группы и их соответствующие диагнозы. Активность показывает лучшее отличие здоровых контрольных субъектов от пациентов с различными заболеваниями.
Таблица 7Сравнение концентрации DPP3 у пациентов с различными заболеваниями и здоровых контрольных субъектов в иммуноанализе сэндвич-типа и в анализе активности фермента с захватом
<b>Процент пациентов с концентрацией DPP3 выше 75-процентиля контрольной группы</b>
<b>Заболевание</b>
<b>AHF</b>
<b>MI</b>
<b>сепсис</b>
<b>рак</b>
<b>AKI</b>
<b>LRTI</b>
<b>Анализ сэндвич-типа</b>
48,7
64,3
85,5
91,7
51,4
53,3
<b>Анализ активности</b>
77,8
данные отсутствуют
87,0
данные отсутствуют
70,0
85,7
Для еще лучшего сравнения анализа активности DPP3 с анализом определения концентрации, проводили ROC-анализ (характеристическая кривая) для отделения здоровых контрольных субъектов от пациентов с AHF (фиг.4 A) или пациентов с сепсисом (фиг.4 B). Значения площади под кривой (AUC) и доверительного интервала (CI) показаны в таблице 8. Анализ данных показал более высокую специфичность для анализа определения активности по сравнению с иммуноанализом сэндвич-типа.
Таблица 8Данные ROC-анализа (AUC - площадь под кривой, CI - доверительный интервал)
<b>Значение</b>
<b>Анализ сэндвич-типа</b>
<b>Анализ активности</b>
<b>Норма против AHF</b>
<b>AUC</b>
0,6747
0,8506
<b>95% CI</b>
0,5638-0,7853
0,7482-0,9530
<b>p-значение</b>
< 0,005
< 0,0001
<b>Норма против сепсиса</b>
<b>AUC</b>
0,8875
0,9384
<b>96% CI</b>
0,8270-0,9479
0,8865-0,9479
<b>p-значение</b>
< 0,0001
< 0,0001
8. Пример 8
В данном эксперименте оценивали общую безопасность повышающихся доз mAbDPP3 на здоровых мышах.
8.1. Метод:
Мышей самок BALB/c nude (CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl) (питомник Charles River GmbH, Sulzfeld, Германия) в возрасте 4-5 недель при доставке и массой тела примерно 15-18 г содержали в оптимальных гигиенических условиях, с кондиционированием воздуха с 10-15-кратным обменом воздуха в ч и постоянно контролируемой средой с целевыми диапазонами температуры 22±3°C и относительной влажности 30-70%, искусственным флуоресцентным освещением 12 ч свет/12 ч темнота. Максимально 4 животных содержали в индивидуально вентилируемой клетке (IVC) и скармливали рацион, состоящий из M-Zucht (ssniff Spezialdiäten GmbH), и давали автоклавированную водопроводную воду.
После периода адаптации в течение 4 суток начинали применение mAbDPP3: mAbDPP3 в трех разных концентрациях (0,65 мг/кг; 1,9 мг/кг и 5,75 мг/кг) в PBS вводили 4 мышам на группу. MAbDPP3 вводили внутрибрюшинно (в/б) на сутки 1; 3; 5 и 7, и проводили наблюдение за мышами в течение 14 суток.
8.2. Результаты:
Все мыши выживали в течение 14-суточного периода обработки без проявления побочных эффектов, даже в максимальной дозировке. MAbDPP3 безопасно для применения в других экспериментах на животных, которые всегда будут выполняться с дозой 1,9 мг/кг.
9. Пример 9
В данном эксперименте оценивали общую безопасность обработки mAbDPP3 на здоровых крысах по мониторингу среднего кровяного давления.
9.1. Метод:
Для данного исследования использовали крыс самцов Вистар в возрасте 2-3 месяцев (питомник Charles River Laboratories, Германия). Для измерения и регистрации артериального давления (BP) катетер (Introcan-W; 22 G/1''; B.Braun) вводили в артерию carotis communis dextra (правую общую сонную артерию). Катетер для введения и отбора проб вводили в вену jugularis sinista (левую яремную вену).
Сначала животных анестезировали изофлураном для проведения взвешивания (в целых г) и внутрибрюшинной (в/б) инъекции уретана в дозе 1,2 г/кг массы тела (c=0,4 г/мл) для продолжительной анестезии. Затем с вентральной области шеи выстригали шерстный покров и участок протирали этиловым спиртом. Сосуды препарировали и вводили катетеры. В концы обоих катетеров вводили гепаринизированный изотонический раствор хлорида натрия. Затем датчики давления (medex logical, Medex Medical Ltd.) соединяли с системой мониторинга животного (Datex-Ohmeda, GE). Портативный компьютер через программное обеспечение сбора данных S/5, подключенный к монитору АД, отдельно записывал данные АД.
Крыс обрабатывали PBS, mAbDPP3 в дозе 1,9 мг/кг и 5,75 мг/кг в PBS (n=3 на группу). Соединения вводили через венозный катетер. Кровяное давление контролировали в течение 1 ч перед введением соединений и в течение 6 ч после введения соединений.
9.2. Результаты:
Крысы хорошо переносили обработку mAbDPP3. У крыс, получавших высокую дозу mAbDPP3, имело место небольшое повышение среднего кровяного давления (фиг.5). В общем, mAbDPP3 также безопасно для применения на крысиной модели даже в более высоких дозировках.
10. Пример 10
В данном исследовании оценивали, как обработка mAbDPP3 может повлиять на гибель в результате сепсиса на мышиной модели CLP.
10.1. Методы:
Для исследования использовали мышей самцов в возрасте 12-15 недель C57Bl/6 (питомник Charles River Laboratories, Германия). Перитонит воспроизводили хирургически при легкой анестезии изофлураном. Разрезы делали в левом верхнем квадрате брюшной полости (нормальное расположение слепой кишки). Обнажали слепую кишку и накладывали тугую лигатуру вокруг слепой кишки со швами, дистальнее разреза в тонком кишечнике. Одним проколом иглой 24 размера делали рану в слепой кишке, и небольшое количество содержимого слепой кишки вытекало через рану. Слепую кишку возвращали в брюшную полость, и закрывали участок лапаротомии. Наконец, животных возвращали в клетки со свободным доступом к корму и воде. 500 мкл физиологического раствора вводили п/к для замещения жидкости.
MAbDPP3 (1,9 мг/кг в PBS) тестировали в сравнении с растворителем (PBS). В/в инъекцию соединения и растворителя проводили за 5 мин до CLP (профилактическая обработка) и после полного развития сепсиса через 2 ч после CLP (терапевтическая обработка). Каждая группа включала 10 мышей, и наблюдение за животными проводили в течение 7 суток.
10.2. Результаты:
По данным фиг. 6 следует, что антитело mAbDPP3 достоверно снижало гибель по сравнению с введением PBS. Через 4 суток 75% мышей выживали при обработке mAbDPP3. В отличие от этого почти все мыши пали через 4 суток при обработке растворителем.
11. Пример 11
Модель септического шока использовали для индукции сердечной недостаточности у крыс, и затем для определения влияния mAbDPP3 на функцию сердца.
11.1. Методы:
Дизайн исследования
Схема исследования приведена на фиг. 7A ниже. После CLP или ложной операции животных оставляли на 20 ч восстановиться со свободным доступом к воде и корму. Затем их анестезировали, проводили трахеотомию и прокладывали артериальную и венозную линию. Через 24 ч после операции CLP вводили mAbDPP3 в дозе 2 мг/кг или растворитель (физиологический раствор). Показатели гемодинамики контролировали инвазивно и непрерывно от t=0 до 3 ч. Эхокардиографию сердца проводили сразу после операции, и через 15 мин; 1 ч; 2 ч и 3 ч после введения mAbDPP3 или физиологического раствора.
Модель сепсиса CLP
Крыс самцов Вистар (в возрасте 2-3 месяцев, с массой тела от 300 до 400 г, выборка группы приведена в таблице 1) из Centre d'élevage Janvier (Франция) рандомизировали в одну из трех групп. Всех животные подвергали анестезии с использованием кетамина гидрохлорида (90 мг/кг) и ксилазина (9 мг/кг) внутрибрюшинно (в/б). Для индукции полимикробного сепсиса проводили лигирование и пункцию слепой кишки (CLP) с использованием протокола Rittirsch с незначительной модификацией. Делали вентральный срединный разрез (1,5 см) для обеспечения экстериоризации слепой кишки. Затем слепую кишку лигировали чуть ниже илеоцекального клапана и пунктировали один раз иглой 18 размера. Затем брюшную полость закрывали в двух слоях с последующим восстановлением жидкости (вводили 3 мл/100 г массы тела физиологического раствора подкожно) и животное возвращали в клетку. Контрольных животных подвергали хирургическому вмешательству, без проведения пункции слепой кишки.
Инвазивное измерение кровяного давления
Показатели гемодинамики определяли с использованием системы AcqKnowledge (BIOPAC Systems, Inc., США). Она обеспечивает полностью автоматизированную систему анализа артериального давления. Катетер подключается к системе BIOPAC через датчик давления.
Для проведения данной процедуры крыс анестезировали (кетамин и ксилазин). Животных помещали на нагревательную подушку для поддержания необходимой температуры тела при 37-37,5°C. Датчик температуры с обратной связью вводили в прямую кишку. Крыс помещали на операционный стол в положении лежа на спине. Обнажали трахею, и вводили катетер (16G) для внешнего вентилятора без повреждения сонных артерий и блуждающих нервов. Артериальный катетер вводили в правую сонную артерию. Перед лигированием сонную артерию отделяли от блуждающего нерва.
Через левую яремную вену вводили центральный венозный катетер, позволяющий вводить лекарственное средство.
После операции животным давали время восстановиться до стабильного состояния до проведения гемодинамических измерений. Затем регистрировали исходное кровяное давление (BP). Во время сбора данных инфузию физиологического раствора через артериальную линию останавливали.
Эхокардиография
Животных анестезировали с использованием кетамина гидрохлорида. С области грудной клетки выстригали шерстный покров, и крыс помещали в лежачее положение.
Для исследования трансторакальной эхокардиографией (ТТЭ) использовали коммерчески доступную ультразвуковая систему GE Healthcare Vivid 7, оснащенную высокочастотным линейным датчиком (14 МГц) и 10-МГц датчиком сердечного ритма. Все данные записывались в цифровой форме и сохранялись для последующего оффлайн анализа.
Полутоновые изображения были записаны на глубине 2 см. Двумерное исследование начинали в виде парастернальной проекции по длинной оси для измерения диаметра кольца аорты и диаметра легочной артерии. Также использовали M-режим для измерения размеров левого желудочка (LV) и оценки фракции укорочения (FS%). LVFS рассчитывали как конечно-диастолический диаметр левого желудочка/конечно-систолический диаметр левого желудочка/конечно-диастолический диаметр левого желудочка и выражали в%. Соответственно, конечно-диастолический объем определяли при максимальном диаметре левого желудочка. Соответственно, конечно-систолический объем определяли как минимальный диаметр в одном сердечном цикле. Все параметры измеряли вручную. Для каждого измерения по трем сердечным циклам определяли среднее значение.
Из той же парастернальной проекции по длинной оси регистрировали легочной кровоток с использованием импульсно-волнового допплера. Измеряли интеграл скорости легочного оттока.
Из апикального пятикамерного обзора регистрировали митральный поток с использованием импульсного допплера на уровне кончика митральных клапанов.
Временные точки эксперимента и группы животных
Регистрировали исходный уровень АД и проводили эхокардиографию после операции. Затем вводили mAbDPP3 (2 мг/кг) или растворитель (физиологический раствор) (в течение 5 мин после операции) и начинали инфузию физиологического раствора. Показатели гемодинамики (АД и эхокардиография) регистрировали через 15 мин после введения mAbDPP3 или инъекции растворителя и через 1; 2 и 3 ч после. В опыте была 1 контрольная группа и 2 группы с CLP, которые приведены в таблице ниже (таблица 9). В конце эксперимента животное было подвергнуто эвтаназии, отбирали кровь для получения ЭДТА-плазмы, и собирали органы для последующего анализа.
Таблица 9Экспериментальные группы
<b>Группа</b>
<b>Выборка группы</b>
<b>CLP</b>
<b>Обработка</b>
<b>1 - ложный контроль</b>
7
нет
физиологический раствор
<b>2 - CLP-физиологический раствор</b>
7
да
физиологический раствор
<b>3 - CLP-mAbDPP3</b>
10
да
mAbDPP3
11.2. Результаты:
По сравнению с животными в ложном контроле крысы с сепсисом имеют очень низкое кровяное давление и пониженную фракцию укорочения сердца. Применение mAbDPP3 достоверно увеличивало фракцию укорочения (фиг.7B), повышало среднее кровяное давление (фиг.7C) и существенно улучшало состояние крыс с сепсисом.
12. Пример 12
Цель описанного в данном примере исследования заключалась в оценке потенциального антипролиферативного эффекта mAbDPP3 в клеточной культуральной системе in vitro с использованием нескольких линий опухолевых клеток.
12.1. Метод:
Стоковый раствор mAbDPP3 (1 мг/мл в PBS) разбавляли с охватом диапазона конечных концентраций от 0 до 100 мкг/мл. PBS использовали в качестве стандартного соединения. Опухолевые клетки, происходящие из стабильных линий опухолевых клеток (A549, HCT116, MDA-MB231), культивировали в DMEM, содержащей 10% FCS и пенициллин/стрептомицин.
Клетки A549 представляют собой клетки базальной эпителиальной альвеолярной аденокарциномы человека. Эта клеточная линия была впервые была стабильно получена при удалении и культивировании опухолевой легочной ткани эксплантированной опухоли 58-летнего мужчины. В естественных условиях эти клетки плоские и ответственны за диффузию некоторых веществ, таких как вода и электролиты, через альвеолы легких. В случае, если указанные клетки A549 культивируют in vitro, то они растут в виде монослойных клеток, адгезированных к культуральному флакону. Еще одна характеристика заключается в том, что эти клетки способны синтезировать лецитин и содержат высокий уровень ненасыщенных жирных кислот. Линия клеток A549 широко используется в качестве модели in vitro легочных эпителиальных клеток типа II для исследования метаболизма лекарственных средств и в качестве хозяина для трансфекции.
Клеточная линия HCT116 представляет клетки опухоли ободочной кишки человека. Данные эпителиальные клетки обладают адгезивными культуральными свойствами и происходят от взрослого мужчины. Эта клеточная линия является подходящим хозяином для трансфекции. Данная линия имеет мутацию в кодоне 13 протоонкогена ras и может использоваться в качестве положительного контроля для ПЦР-анализов мутации в этом кодоне.
Клеточная линия MDA-MB231 представляет клетки аденокарциномы молочной железы человека, имеющую эпителиальную морфологию. Данные клетки были выделены из плеврального выпота пациентки с раком молочной железы кавказской национальности.
2
Для каждой клеточной линии готовили 96-луночные планшеты с суспензионной культурой клеток. 100 мкл нижнего слоя мягкого агара (конечная концентрация 0,6% в полной среде) выливали и оставляли для отверждения. Затем поверх добавляли 50 мкл верхнего слоя мягкого агара (конечная концентрация 0,4%), содержащего соответствующие клетки и поверх добавляли количество клеток, отверждали и такие 96-луночные планшеты инкубировали в течение ночи при 37°С, в 10% атмосфере СО.
На следующий день во внутренние лунки планшета добавляли испытуемые соединения. Затем планшеты инкубировали в термостате для культивирования клеток. Наконец, реакции развивали с использованием Alamar Blue и через 3-5 ч инкубации при 37°C определяли интенсивность флуоресценции (длина волны возбуждения: 560 нм, длины волны эмиссии: 590 нм). В качестве низкого контроля клетки обрабатывали 10-5 М стауроспорином (6-кратные значения). В качестве высокого контроля клетки обрабатывали 0,1% ДМСО (контроль растворителя, 6-кратные значения).
50
Необработанные данные преобразовывали в показатели роста в процентах на мягком агаре по сравнению с высоким контролем (растворитель 0,1% ДМСО) и низким контролем (10-5 М стауроспорина), которые были установлены на 100% и 0% соответственно. Вычисление IC проводили с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 5 с моделью сигмоидального отклика с переменным наклоном с использованием 0% роста на мягком агаре в качестве нижнего ограничения и без нижнего ограничения и 100% роста на мягком агаре в качестве верхнего ограничения.
12.2. Результаты:
50
50
В клеточной культуральной системе оценивали рост трех линий опухолевых клеток (A549, HCT116, MDA-MB231) в зависимости от различных концентраций mAbDPP3 (фиг. 8). Значения ICопределяли с использованием стандартных параметров на основе сигнала контрольного растворителя в качестве верхнего ограничения (100% рост на мягком агаре) и сигнала контрольного стауроспорина в качестве нижнего ограничения (0% рост на мягком агаре). Соответствующие значения IC приведены в таблице 10.
Обработка MAbDPP3 оказывала антипролиферативный эффект на трех тестированных клеточных линиях.
Таблица 10Значения IC<sub>50</sub> для обработки mAbDPP3
<b>Клеточная линия</b>
<b>Источник ткани</b>
<b>Время инкубации</b>
<b>IC</b><sub><b>50</b></sub>
A549
Легкие
8 суток
6,3 мкг/мл
HCT116
Ободочная кишка
8 суток
2,0 мкг/мл
MDA-MB231
Молочная железа
11 суток
8,7 мкг/мл
13. Пример 13
Цель исследования, описанного в данном примере, заключалась в том, чтобы оценить способность mAbDPP3 предупреждать образование опухоли на моделях ксенотрансплантатов злокачественной опухоли молочной железы и злокачественной опухоли ободочной кишки (исследование ингибирования роста опухоли).
13.1. Методы:
6
2
Монослойные клетки MDA-MB-231 (рак молочной железы) и клетки HCT-116 (рак ободочной кишки) соответственно, культивировали в DMEM+10% FCS. Клетки культивировали во влажной атмосфере с 90% воздуха и 10% диоксида углерода при 37°С. Среду регулярно заменяли каждые 3 суток. Конфлуентные культуры разделяли 1:3 к 1:3 каждые 3-4 суток с использованием трипсина/ЭДТА и высевали при плотности примерно 3-4 × 10 клеток/15 см+25 мл среды.
nu
Мышей самок BALB/c nude (CAnN.Cg-Foxn1/Crl) (питомник Charles River GmbH, Sulzfeld, Германия) в возрасте 4-5 недель при доставке и массой тела примерно 15-18 г содержали в оптимальных гигиенических условиях, с кондиционированием воздуха с 10-15-кратным обменом воздуха в ч и постоянно контролируемой средой с целевыми диапазонами температуры 22±3°C и относительной влажности 30-70%, искусственным флуоресцентным освещением 12 ч свет/12 ч темнота. Максимально 4 животных содержали в индивидуально вентилируемой клетке (IVC) и скармливали рацион, состоящий из M-Zucht (ssniff Spezialdiäten GmbH), и давали автоклавированную водопроводную воду.
6
3
В данном исследовании использовали клетки злокачественной молочной железы человека MDA-MB-231 и клетки злокачественной ободочной кишки HCT-116, предоставленные ATCC. Проводили субкультивирование клеток в течение 5 пассажей перед инокуляцией мышам из расчета 3 × 10 клеток/0,1 мкл подкожно в правый бок мыши. Когда объем опухоли достигал примерно 100-200 мм, 20 мышей, имеющих подходящий размер опухолей, рандомизировали в группы в соответствии с объемом опухоли и массой тела (10 мышей на группу). Испытуемые соединения вводили животным в соответствии с объемом опухоли и массой тела, и начинали введение. Группы указаны в таблице ниже (таблица 11).
Таблица 11Общее представление стратегии обработки
<b>Группа</b>
<b>Концентрация</b>
<b>Путь введения</b>
<b>Схема</b>
<b>Растворитель</b>
<b>Клеточная линия</b>
<b>Время наблюдений</b>
<b>Количество животных</b>
<b>mAbDPP3 - злокачественная опухоль молочной железы</b>
1,9 мг/кг
в/в
сутки 1, 3, 5, 7, 9
PBS
MDA-MB231
24 суток
10
<b>mAbDPP3 - злокачественная опухоль ободочной кишки</b>
HCT116
28 суток
10
<b>PBS - злокачественная опухоль молочной железы</b>
-
в/в
сутки 1, 3, 5, 7, 9
PBS
MDA-MB231
24 суток
10
<b>PBS - злокачественная опухоль ободочной кишки</b>
HCT116
28 суток
10
2
t
0
t
0
Ежедневно наблюдали за поведением и состоянием животных, и каждые 2 суток оценивали рост опухолей измерением штангенциркулем в течение 24 или 28 суток. Размеры первичных опухолей измеряли с помощью штангенциркуля (ручной штангенциркуль, OMC Fontana). Размеры опухолей рассчитывали по формуле V=W × L/2 (L=длина и W=перпендикулярная ширина опухоли, L > W). Индивидуальный относительный объем опухолей (RTV) рассчитывали следующим образом: RTV=V/V, где V представляет объем на каждый день, и V представляет объем в начале обработки.
13.2. Результаты:
На моделях опухолевых ксенотрансплантатов применение mAbDPP3 уменьшало образование всех исследованных опухолей (фиг.9A-D). При обработке mAbDPP3 для увеличения опухоли молочной железы до 20-кратного размера потребовалось на 2 суток дольше (фиг.9 B), и для опухоли ободочной кишки до 10-кратного размера на 2 суток дольше (фиг.9D). На данных моделях опухоли, индуцированные клеточной линией рака ободочной кишки, росли намного медленнее, чем опухоли, индуцированные клеточной линией рака молочной железы.
14. Пример 14
Для оценки возможности применения DPP3-адсорбента для очистки плазмы от избытка DPP3, необходимо было определить, будет ли DPP3 достаточно связываться с колонкой с анти-DPP3-антителом. Колонки для аффинной хроматографии готовили иммобилизацией антител, связывающихся с DPP3, на колонках GlycoLink (Thermo Fisher). Связывание DPP3 с этими колонками анализировали измерением концентрации DPP3 до и после элюирования через эти колонки.
14.1. Методы:
На первой стадии все антитела, связывающиеся с DPP3 (mAbDPP3_2552, 2553, 2554, 2555) окисляли и иммобилизовали на одной колонке GlycoLink каждое в соответствии с инструкцией по применению. Затем на колонку загружали образцы рекомбинантной GST-hDPP3 (USBio) или плазмы пациента, и также определяли связывание DPP3.
Окисление антител
Соответственно, 300 мкл соответствующего раствора анти-DPP3-антитела с концентрацией 3 мг/мл разводили в 700 мкл буфера для связывания GlycoLink до конечного объема 1 мл и рН <6. Для окисления углеводных групп антител 2,1 мг метапериодата натрия добавляли к раствору и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Окисляющий агент удаляли из раствора антитела с использованием обессоливающих колонок.
Подготовка колонок GlycoLink
Для каталитической реакции связывания к окисленному антителу добавляли 0,1 М анилин. Затем раствор наносили на уравновешенную колонку GlycoLink и инкубировали в течение 4 ч при комнатной температуре. Несвязанному материалу давали возможность вытекать с колонки. Затем колонку промывали, уравновешивали и хранили до дальнейшего использования.
Аффинная очистка DPP3
В каждом случае рекомбинантную GST-hDPP3 или плазму пациента разбавляли в буфере для связывания (конечная концентрация recDPP3=100 нг/мл, 1 мл; 1 мл плазмы+1 мл буфера для связывания), наносили mAbDPP3 на уравновешенную колонку и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Весь элюент сохраняли для оценки эффективности и способности связывания. Колонку промывали, связанный белок элюировали с использованием буфера для элюирования GlycoLink и колонку уравновешивали перед хранением.
Анализ содержания DPP3
Концентрацию DPP3 в образцах и рекомбинантной GST-hDPP3 перед аффинной очисткой и прохождением измеряли с использованием люминесцентного иммуноанализа сэндвич-типа (подробности см. в примере 4). 20 мкл образца (или калибратора) пипетировали в покрытые 96-луночные микропланшеты, после добавления меченого и разведенного детектирующего антитела (200 мкл), планшеты инкубировали в течение 18-24 ч при 2-8°С. Несвязанный индикатор удаляли промыванием 4 раза по 350 мкл раствора для промывания (20 мМ PBS, pH 7,4, 0,1% Тритон X-100). Связанную с лунками хемилюминесценцию измеряли с использованием люминометра Centro LB 960 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG).
14.2. Результаты:
Почти вся DPP3 в плазме и растворах рекомбинантной DPP3 удалялась из образцов аффинной хроматографией (см. таблицу 12). Различные антитела mAbDPP3 проявляли различную аффинность к DPP3. Поскольку mAbDPP3_2555 показывало самый высокий уровень связывания recDPP3, то это антитело было выбрано для применения в хроматографии образцов плазмы. В таблице 12 показано, что концентрации DPP3 в плазме могут эффективно снижаться с помощью аффинной хроматографии. Полученные результаты показывают, что DPP3-адсорбент можно использовать в аферезе для очистки плазмы от избыточной DPP3.
Таблица 12Концентрации нативной или рекомбинантной DPP3 в образцах до и после аффинной хроматографии с показанными анти-DPP3-антителами
<b>Образец</b>
<b>Иммобилизованное антитело</b>
<b>c</b><sub><b>DPP3</b></sub><b> [нг/ мл]</b>
<b>до колонки GlycoLink</b>
<b>после колонки GlycoLink</b>
<b>рекомбинантная GST-hDPP3</b>
<b>2552</b>
100
16,3
<b>2553</b>
100
21,6
<b>2554</b>
100
14,1
<b>2555</b>
100
8,5
<b>плазма_1</b>
<b>2555</b>
18
1,2
<b>плазма_2</b>
26,1
4,3
<b>плазма_3</b>
37,5
3,7
Ссылки
Abramić M. et al., 2000. Human and rat dipeptidyl peptidase III: Biochemical and mass spectrometric arguments for similarities and differences. Biological Chemistry, 381(December), pp.1233-1243.
Abramić M., Zubanović M. & Vitale L., 1988. Dipeptidyl peptidase III from human erythrocytes. Biol. Chem. Hoppe Seyler, pp.29-38.
Agić D. et al., 2007. Novel amidino-substituted benzimidazoles: Synthesis of compounds and inhibition of dipeptidyl peptidase III. Bioorganic Chemistry, 35(2), pp.153-169.
Almagro J.C., Fransson J., 2008. Humanization of antibodies. Front Biosci., 2008 Jan. 1;13:1619-33.
Aoyagi T. et al., 1993. Enzymatic Changes in Cerebrospinal Fluid of Patients with Alzheimer-Type Dementia. J. Clin. Biochem. Nutr., 14, pp.133-139.
Balogun R.A. et al., 2010. Clinical applications of therapeutic apheresis. Journal of clinical apheresis, 25(5), pp.250-64.
Baršun M. et al., 2007. Human dipeptidyl peptidase III acts as a post-proline-cleaving enzyme on endomorphins. Biological Chemistry, 388(3), pp.343-348.
Bird et al., 1988. Single-chain antigen-binding proteins. Science, 242:423-426.
Chiba T. et al., 2003. Inhibition of recombinant dipeptidyl peptidase III by synthetic hemorphin-like peptides. Peptides, 24(5), pp.773-778.
Couston R.G. et al., Adsorption behavior of a human monoclonal antibody at hydrophilic and hydrophobic surfaces. mAbs, 5(1), pp.126-39.
Deng B. et al., 2014. Aptamer binding assays for proteins: The thrombin example-A review. Analytica Chimica Acta, 837, pp.1-15.
Dhanda S., Singh J. & Singh H., 2008. Hydrolysis of various bioactive peptides by goat brain dipeptidylpeptidase-III homologue. Cell biochemistry and function, 26(3), pp.339-45.
Ellis S. & Nuenke J.M., 1967. Dipeptidyl Arylamidase III of the Pituitary: Purification and Characterization. Journal of Biological Chemistry, 242(20), pp.4623-4629.
Gamrekelashvili J. et al., 2013. Peptidases released by necrotic cells control CD8+T cell cross-priming. Journal of clinical investigation, 123(11), pp.4755-4768.
Hartley et al, 1982. Radiology 143: 29-36
Holliger P. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:6444-8
Hood et al., Immunology, Benjamin, N.Y., 2nd ed., 1984
Hultschig C. et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2006 February; 10(1):4-10. PMID: 16376134)
Hunkapiller & Hood, 1986. The growing immunoglobulin gene superfamily. Nature, 323:15-16.
Hust M., Meyer T., Voedisch B., Rülker T., Thie H., El-Ghezal A., Kirsch M.I., Schütte M., Helmsing S., Meier D., Schirrmann T., Dübel S., 2011. A human scFv antibody generation pipeline for proteome research. Journal of Biotechnology, 152, 159-170
Huston et al., 1988. Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:5879-5883.
Igic R. & Behnia R., 2007. Pharmacological, immunological, and gene targeting of the renin-angiotensin system for treatment of cardiovascular disease. Current pharmaceutical design, 13(12), pp.1199-214.
Inaoka Y. & Naruto S., 1988. Propioxatins A and B, New Enkephalinase B Inhibitors, IV. Characterization of the Active Site of the Enzyme Using Synthetic Propioxatin Analogues. J. Biochem., 104(5), pp.706-711.
Jones T.H. & Kapralou A, 1982. A rapid assay for dipeptidyl aminopeptidase III in human erythrocytes. Analytical biochemistry, 119(2), pp.418-23.
Kabat et al., 1983. Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services.
Khaket T.P. et al., 2012. Enkephalin degrading enzymes: metalloproteases with high potential for drug development. Current pharmaceutical design, 18(2), pp.220-30.
Kim D. & Herr, A.E., 2013. Protein immobilization techniques for microfluidic assays. Biomicrofluidics, 7(4), p.41501.Kirk-Othmer, Encyclopedia of chemical technology, 4th ed., executive editor, J. I. Kroschwitz; editor, M. Howe-Grant, John Wiley & Sons, 1993, vol. 15, p. 518-562
Kumar P. et al., 2016. Substrate complexes of human dipeptidyl peptidase III reveal the mechanism of enzyme inhibition. Scientific Reports, 6(March), p.23787.
Lanzavecchia A. & Scheidegger D., 1987. The use of hybrid hybridomas to target human cytotoxic T lymphocytes. Eur. J. Immunol., 17:105.
Lee C.M. & Snyder S.H., 1982. Dipeptidyl-aminopeptidase III of rat brain. Selective affinity for enkephalin and angiotensin. The Journal of biological chemistry, 257(20), pp.12043-50.
Li J. et al., 2011. Peptide aptamers with biological and therapeutic applications. Current medicinal chemistry, 18(27), pp.4215-22.
Liu Y. et al., 2007. A genomic screen for activators of the antioxidant response element. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 104(12), pp.5205-10.
Marx et al., 1997. Monoclonal Antibody Production, ATLA 25, 121.
Mazzocco C. et al., 2006. Identification and characterization of two dipeptidyl-peptidase III isoforms in Drosophila melanogaster. FEBS Journal, 273(5), pp.1056-1064.
Meliopoulos V.A. et al., 2012. MicroRNA regulation of human protease genes essential for influenza virus replication. PloS one, 7(5), p.e37169.
Müller J. et al., 2016. Aptamer-Based Enzyme Capture Assay for Measurement of Plasma Thrombin Levels. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 1380, pp.179-89.
Müller J. et al., 2012. Monitoring of plasma levels of activated protein C using a clinically applicable oligonucleotide-based enzyme capture assay. Journal of Thrombosis and Haemostasis, 10(3), pp.390-398.
Ohkubo I. et al., 1999. Dipeptidyl peptidase III from rat liver cytosol: purification, molecular cloning and immunohistochemical localization. Biological chemistry, 380(12), pp.1421-1430.
Patel A., Smith H.J. & Sewell R.D., 1993. Inhibitors of enkephalin-degrading enzymes as potential therapeutic agents. Progress in medicinal chemistry, 30, pp.327-78.
Pinheiro Da Silva F. & Nizet V., 2009. Cell death during sepsis: Integration of disintegration in the inflammatory response to overwhelming infection. Apoptosis, 14(4), pp.509-521.
Prajapati S.C. & Chauhan S.S., 2011. Dipeptidyl peptidase III: a multifaceted oligopeptide N-end cutter. FEBS Journal, 278(18), pp.3256-3276.
Raghupathi R., 2004. Cell death mechanisms following traumatic brain injury. Brain pathology (Zurich, Switzerland), 14(2), pp.215-22.
Rastija V. et al., 2015. Synthesis, QSAR, and Molecular Dynamics Simulation of Amidino-substituted Benzimidazoles as Dipeptidyl Peptidase III Inhibitors. Acta Chimica Slovenica, 62, pp.867-878.
Rittirsch D., Huber-Lang M., Flierl M. Ward P.: Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nature Protocols 4, - 31-36 (2009)
Sanderink G.J., Artur Y. & Siest G., 1988. Human aminopeptidases: a review of the literature. Journal of clinical chemistry and clinical biochemistry. Zeitschrift für klinische Chemie und klinische Biochemie, 26(12), pp.795-807.
Schütte M., Thullier P., Pelat T., Wezler X., Rosenstock P., Hinz D., Kirsch M.I., Hasenberg M., Frank R., Schirrmann T., Gunzer M., Hust M., Dübel S., 2009. Identification of a putative Crf splice variant and generation of recombinant antibodies for the specific detection of Aspergillus fumigatus. PLoS One 4, e6625.
Shimamori Y., Watanabe Y. & Fujimoto Y., 1986. Purification and Characterization of Dipeptidyl Aminopeptidase III from Human Placenta. Chem. Pharm. Bull., 34(8), pp.3333-3340.
Šimaga Š. et al., 1998. Dipeptidyl peptidase III in malignant and non-malignant gynaecological tissue. European Journal of Cancer, 34(3), pp.399-405.
Šimaga Š. et al., 2003. Tumor cytosol dipeptidyl peptidase III activity is increased with histological aggressiveness of ovarian primary carcinomas. Gynecologic Oncology, 91(1), pp.194-200.
Singh R. et al., 2014. Transcription factor C/EBP-beta mediates downregulation of dipeptidyl-peptidase III expression by interleukin-6 in human glioblastoma cells. FEBS Journal, 281, pp.1629-1641.
Vandenberg I., King F. & Kuchel P., 1985. Enkephalin Degradation by Human Erythrocytes and Hemolysates Studied Using 1H NMR Spectroscopy. Archives of Biochemistry and Biophysics, 242(2), pp.515-522.
Vanha-Perttula T., 1988. Dipeptidyl peptidase III and alanyl aminopeptidase in the human seminal plasma: origin and biochemical properties. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry, 177(2), pp.179-95.
Wattiaux R. et al., 2007. Lysosomes and Fas-mediated liver cell death. The Biochemical journal, 403(1), pp.89-95.
Wild David (2005). The Immunoassay Handbook, Elsevier LTD, Oxford; 3rd ed., ISBN-13: 978-0080445267
Xu Y., Yang X. & Wang E., 2010. Review: Aptamers in microfluidic chips. Analytica chimica acta, 683(1), pp.12-20.
Yamamoto Y. et al., 2000. Characterization of tynorphin, a potent endogenous inhibitor of dipeptidyl peptidaseIII. Peptides, 21(4), pp.503-8.
Yamamoto Y. et al., 1998. Inhibitory action of spinorphin, an endogenous regulator of enkephalin-degrading enzymes, on carrageenan-induced polymorphonuclear neutrophil accumulation in mouse air-pouches. Life sciences, 62(19), pp.1767-73.
Zong W.-X. & Thompson C.B., 2006. Necrotic Cell Death as a Cell Fate. Genes & Development, 20, pp.1-5.
Zuk et al., Enzyme Immunochromatography--A Quantitative Immunoassay Requiring No Instrumentation, Clinical Chemistry, 31 (7): 1144-1150 (1985).
Последовательности
SEQ ID NO: 1
hDPP3 AS 1-737
MADTQYILPNDIGVSSLDCREAFRLLSPTERLYAYHLSRAAWYGGLAVLLQTSPEAPYIYALLSRLFRAQDPDQLRQHALAEGLTEEEYQAFLVYAAGVYSNMGNYKSFGDTKFVPNLPKEKLERVILGSEAAQQHPEEVRGLWQTCGELMFSLEPRLRHLGLGKEGITTYFSGNCTMEDAKLAQDFLDSQNLSAYNTRLFKEVDGEGKPYYEVRLASVLGSEPSLDSEVTSKLKSYEFRGSPFQVTRGDYAPILQKVVEQLEKAKAYAANSHQGQMLAQYIESFTQGSIEAHKRGSRFWIQDKGPIVESYIGFIESYRDPFGSRGEFEGFVAVVNKAMSAKFERLVASAEQLLKELPWPPTFEKDKFLTPDFTSLDVLTFAGSGIPAGINIPNYDDLRQTEGFKNVSLGNVLAVAYATQREKLTFLEEDDKDLYILWKGPSFDVQVGLHELLGHGSGKLFVQDEKGAFNFDQETVINPETGEQIQSWYRSGETWDSKFSTIASSYEECRAESVGLYLCLHPQVLEIFGFEGADAEDVIYVNWLNMVRAGLLALEFYTPEAFNWRQAHMQARFVILRVLLEAGEGLVTITPTTGSDGRPDARVRLDRSKIRSVGKPALERFLRRLQVLKSTGDVAGGRALYEGYATVTDAPPECFLTLRDTVLLRKESRKLIVQPNTRLEGSDVQLLEYEASAAGLIRSFSERFPEDGPELEEILTQLATADARFWKGPSEAPSGQA
SEQ ID NO: 2
hDPP3 AS 474-493 (N-Cys)
CETVINPETGEQIQSWYRSGE
Описание фигур
Фиг.1: ингибирование активности DPP3
(A) Активность рекомбинантной GST-hDPP3 измеряли в присутствии нескольких различных анти-DPP3-антител. DPP3-связывающие антитела, которые были получены против пептидов и/или полноразмерной (FL) нативной DPP3, проявляют сильный ингибирующий эффект на уровне до 70%.
50
(B) Кривая ингибирования рекомбинантной GST-hDPP3 ингибирующим mAbDPP3. Ингибирование DPP3 специфическим антителом зависит от концентрации, со значением IC примерно 0,2 мкг/мл.
Фиг 2: концентрация DPP3 в качестве диагностического маркера
A) концентрация DPP3 в ЭДТА-плазме здоровых контрольных субъектов и пациентов с различными заболеваниями (AHF - острая сердечная недостаточность, MI - инфаркт миокарда, сепсис, рак, AKI - острая почечная недостаточность, LRTI - инфекция нижних дыхательных путей). Медианы групп пациентов достоверно отличаются от здоровых контрольных субъектов (тест Манна-Уитни p <0,005).
(B) Сравнение концентраций DPP3 в плазме пациентов, которые умерли вскоре после поступления в отделение неотложной помощи, и выживших пациентов. У выживших пациентов достоверно более низкие уровни DPP3 (тест Манна-Уитни p <0,05).
Фиг. 3: Активность DPP3 в качестве диагностического маркера
Активность DPP3 в ЭДТА-плазме здоровых контрольных субъектов и пациентов с различными заболеваниями (AHF - острая сердечная недостаточность, сепсис, AKI - острая почечная недостаточность, LRTI - инфекция нижних дыхательных путей). Медианы групп пациентов достоверно отличаются от здоровых контрольных субъектов (тест Манна-Уитни p <0,0001).
Фиг. 4: Анализ с ROC-кривой для определения активности и концентрации DPP3.
(A) ROC-анализ здоровых контрольных субъектов и пациентов, страдающих AHF.
(B) ROC-анализ здоровых контрольных субъектов и пациентов, страдающих сепсисом.
Фиг. 5: Безопасность обработки mAbDPP3 (кровяное давление)
Здоровых крыс обрабатывали PBS или mAbDPP3 (5,75 мг/кг). Кровяное давление (BP) измеряли и регистрировали через катетер, введенный в правую общую сонную артерию. Катетер для введения и отбора проб вводили в левую яремную вену. Обработка приводит к незначительному повышению относительного кровяного давления по сравнению с крысами, обработанными PBS (n=3 на группу).
Фиг. 6: Влияние mAbDPP3 на гибель мышей от сепсиса
Мышей с сепсисом (модель CLP) обрабатывали PBS или mAbDPP3 (1,9 мг/кг) за 5 мин до и через 2 ч после CLP. Наблюдение за гибелью животных проводили в течение 7 суток. График по методу Каплана-Майера показывает повышенную выживаемость мышей с сепсисом после обработки mAbDPP3.
Фиг. 7: Влияние mAbDPP3 на сердечную недостаточность у крыс с сепсисом
(A) Схема исследования сердечной недостаточности у крыс при септическом шоке.
(В) CLP вызывает сердечную недостаточность у крыс, о чем свидетельствует уменьшение фракции укорочения по сравнению с контрольными животными. Данная фракция укорочения достоверно повышается при обработке mAbDPP3 (2 мг/кг, n ≥ 7 на группу, тест Манна-Уитни p <0,0001).
(C) Среднее кровяное давление у обработанных растворителем крыс с сепсисом снижается во времени, тогда как обработка mAbDPP3 приводит к достоверному увеличению mBP (2 мг/кг, n ≥ 7 на группу, тест Манна-Уитни p <0,005).
Фиг. 8: Влияние mAbDPP3 на рост опухоли in vitro
Анализ на мягком агаре с линиями опухолевых клеток (злокачественные опухоли легких, ободочной кишки и молочной железы). Добавление анти-DPP3-антитела снижает рост опухолевых клеток.
Фиг. 9: Влияние mAbDPP3 на рост опухоли in vivo
(A) Мышей с ксенотрансплантатом клеток злокачественной опухоли молочной железы (n=10 на группу) обрабатывали PBS или mAbDPP3. Кривая роста относительного объема опухолей в течение 24 суток показывает снижение роста опухоли у мышей, обработанных mAbDPP3.
(B) Сравнение времени, в течение которого объем опухоли молочной железы должен увеличиваться в 20 раз с и без обработки mAbDPP3. Рост занимает значительно больше времени при обработке mAbDPP3 (тест Манна-Уитни, p <0,05).
(C) Мышей с ксенотрансплантатом клеток злокачественной опухоли ободочной кишки (n=10 на группу) обрабатывали PBS или mAbDPP3. Кривая роста относительного объема опухоли в течение 30 суток показывает снижение роста опухоли у мышей, обработанных mAbDPP3.
(D) Сравнение времени, в течение которого объем опухоли ободочной должен увеличиваться в 10 раз с и без лечения mAbDPP3. Рост занимает больше времени при обработке mAbDPP3.
Фиг. 10: Активность DPP3 в качестве диагностического маркера (II)
Активность DPP3 в ЭДТА-плазме здоровых контрольных субъектов и пациентов с различными заболеваниями (острый инфаркт миокарда (MI), кардиогенный шок, септический шок и печеночная недостаточность). Медианы групп пациентов достоверно отличаются от здоровых контрольных субъектов (тест Манна-Уитни p <0,05).
Фиг. 11: Влияние DPP3 на кровяное давление у здоровых крыс
Здоровым самцам крыс Вистар вводили 0,2 мг/кг рекомбинантной GST-hDPP3. Кровяное давление (BP) измеряли и регистрировали через катетер, введенный в правую общую сонную артерию. DPP3 вводили в/в в хвостовую вену. Инъекция DPP3 приводит к снижению АД.
--->
Список последовательностей
<110>  СФИНГОТЕК ТЕРАПЬЮТИКС ГМБХ
<120>  Способы определения DPP3 и терапевтические способы
<130>  S75076WO
<150>  16166476.8
<151>  2016-04-21
<160>  2
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  737
<212>  БЕЛОК
<213>  человек
<400>  1
Met Ala Asp Thr Gln Tyr Ile Leu Pro Asn Asp Ile Gly Val Ser Ser
1               5                   10                  15
Leu Asp Cys Arg Glu Ala Phe Arg Leu Leu Ser Pro Thr Glu Arg Leu
20                  25                  30
Tyr Ala Tyr His Leu Ser Arg Ala Ala Trp Tyr Gly Gly Leu Ala Val
35                  40                  45
Leu Leu Gln Thr Ser Pro Glu Ala Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Ser
50                  55                  60
Arg Leu Phe Arg Ala Gln Asp Pro Asp Gln Leu Arg Gln His Ala Leu
65                  70                  75                  80
Ala Glu Gly Leu Thr Glu Glu Glu Tyr Gln Ala Phe Leu Val Tyr Ala
85                  90                  95
Ala Gly Val Tyr Ser Asn Met Gly Asn Tyr Lys Ser Phe Gly Asp Thr
100                 105                 110
Lys Phe Val Pro Asn Leu Pro Lys Glu Lys Leu Glu Arg Val Ile Leu
115                 120                 125
Gly Ser Glu Ala Ala Gln Gln His Pro Glu Glu Val Arg Gly Leu Trp
130                 135                 140
Gln Thr Cys Gly Glu Leu Met Phe Ser Leu Glu Pro Arg Leu Arg His
145                 150                 155                 160
Leu Gly Leu Gly Lys Glu Gly Ile Thr Thr Tyr Phe Ser Gly Asn Cys
165                 170                 175
Thr Met Glu Asp Ala Lys Leu Ala Gln Asp Phe Leu Asp Ser Gln Asn
180                 185                 190
Leu Ser Ala Tyr Asn Thr Arg Leu Phe Lys Glu Val Asp Gly Glu Gly
195                 200                 205
Lys Pro Tyr Tyr Glu Val Arg Leu Ala Ser Val Leu Gly Ser Glu Pro
210                 215                 220
Ser Leu Asp Ser Glu Val Thr Ser Lys Leu Lys Ser Tyr Glu Phe Arg
225                 230                 235                 240
Gly Ser Pro Phe Gln Val Thr Arg Gly Asp Tyr Ala Pro Ile Leu Gln
245                 250                 255
Lys Val Val Glu Gln Leu Glu Lys Ala Lys Ala Tyr Ala Ala Asn Ser
260                 265                 270
His Gln Gly Gln Met Leu Ala Gln Tyr Ile Glu Ser Phe Thr Gln Gly
275                 280                 285
Ser Ile Glu Ala His Lys Arg Gly Ser Arg Phe Trp Ile Gln Asp Lys
290                 295                 300
Gly Pro Ile Val Glu Ser Tyr Ile Gly Phe Ile Glu Ser Tyr Arg Asp
305                 310                 315                 320
Pro Phe Gly Ser Arg Gly Glu Phe Glu Gly Phe Val Ala Val Val Asn
325                 330                 335
Lys Ala Met Ser Ala Lys Phe Glu Arg Leu Val Ala Ser Ala Glu Gln
340                 345                 350
Leu Leu Lys Glu Leu Pro Trp Pro Pro Thr Phe Glu Lys Asp Lys Phe
355                 360                 365
Leu Thr Pro Asp Phe Thr Ser Leu Asp Val Leu Thr Phe Ala Gly Ser
370                 375                 380
Gly Ile Pro Ala Gly Ile Asn Ile Pro Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Gln
385                 390                 395                 400
Thr Glu Gly Phe Lys Asn Val Ser Leu Gly Asn Val Leu Ala Val Ala
405                 410                 415
Tyr Ala Thr Gln Arg Glu Lys Leu Thr Phe Leu Glu Glu Asp Asp Lys
420                 425                 430
Asp Leu Tyr Ile Leu Trp Lys Gly Pro Ser Phe Asp Val Gln Val Gly
435                 440                 445
Leu His Glu Leu Leu Gly His Gly Ser Gly Lys Leu Phe Val Gln Asp
450                 455                 460
Glu Lys Gly Ala Phe Asn Phe Asp Gln Glu Thr Val Ile Asn Pro Glu
465                 470                 475                 480
Thr Gly Glu Gln Ile Gln Ser Trp Tyr Arg Ser Gly Glu Thr Trp Asp
485                 490                 495
Ser Lys Phe Ser Thr Ile Ala Ser Ser Tyr Glu Glu Cys Arg Ala Glu
500                 505                 510
Ser Val Gly Leu Tyr Leu Cys Leu His Pro Gln Val Leu Glu Ile Phe
515                 520                 525
Gly Phe Glu Gly Ala Asp Ala Glu Asp Val Ile Tyr Val Asn Trp Leu
530                 535                 540
Asn Met Val Arg Ala Gly Leu Leu Ala Leu Glu Phe Tyr Thr Pro Glu
545                 550                 555                 560
Ala Phe Asn Trp Arg Gln Ala His Met Gln Ala Arg Phe Val Ile Leu
565                 570                 575
Arg Val Leu Leu Glu Ala Gly Glu Gly Leu Val Thr Ile Thr Pro Thr
580                 585                 590
Thr Gly Ser Asp Gly Arg Pro Asp Ala Arg Val Arg Leu Asp Arg Ser
595                 600                 605
Lys Ile Arg Ser Val Gly Lys Pro Ala Leu Glu Arg Phe Leu Arg Arg
610                 615                 620
Leu Gln Val Leu Lys Ser Thr Gly Asp Val Ala Gly Gly Arg Ala Leu
625                 630                 635                 640
Tyr Glu Gly Tyr Ala Thr Val Thr Asp Ala Pro Pro Glu Cys Phe Leu
645                 650                 655
Thr Leu Arg Asp Thr Val Leu Leu Arg Lys Glu Ser Arg Lys Leu Ile
660                 665                 670
Val Gln Pro Asn Thr Arg Leu Glu Gly Ser Asp Val Gln Leu Leu Glu
675                 680                 685
Tyr Glu Ala Ser Ala Ala Gly Leu Ile Arg Ser Phe Ser Glu Arg Phe
690                 695                 700
Pro Glu Asp Gly Pro Glu Leu Glu Glu Ile Leu Thr Gln Leu Ala Thr
705                 710                 715                 720
Ala Asp Ala Arg Phe Trp Lys Gly Pro Ser Glu Ala Pro Ser Gly Gln
725                 730                 735
Ala
<210>  2
<211>  21
<212>  БЕЛОК
<213>  человек
<400>  2
Cys Glu Thr Val Ile Asn Pro Glu Thr Gly Glu Gln Ile Gln Ser Trp
1               5                   10                  15
Tyr Arg Ser Gly Glu
20
<---