СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЫСВОБОЖДЕНИЯ АДЕНОЗИНТРИФОСФОРНОЙ КИСЛОТЫ ИЗ ЭРИТРОЦИТОВ IN VITRO
METHOD FOR DETERMINING IN VITRO ADENOSINE TRIPHOSPHORIC ACID RELEASE FROM ERYTHROCYTES

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для оценки высвобождения аденозинтрифосфорной кислоты из эритроцитов в искусственном сдвиговом потоке.
Известно, что аденозинтрифосфорная кислота (АТФ) высвобождается из эритроцитов под влиянием деформации их клеточных мембран (Sprague R.S., Ellsworth М.L., Stephenson А.Н., Kleinhenz М.Е., Lonigro A.J. Deformation-induced ATP release from red blood cells requires CFTR activity. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. - 1998. - Vol. 275, - No. 5. - P. H1726-H1732). Определение количества высвободившейся АТФ очень важно, так как известна ее способность инициировать продукцию оксида азота - потенциального вазодилятора (Лунева О.Г., Сидоренко С.В., Максимов Г.В., Григорчик Р., Орлов С.Н. Эритроциты как регуляторы сосудистого тонуса. Биологические мембраны. 2015. Т. 32. №4. С. 223-234; Kato М., Shiode К, Teragawa Н., Hirao Н., Yamada Т., Yamagata Т., Matsuura Н., Kajiyama G. The role of nitric oxide in bradykinin-induced dilation of coronary resistance vessels in patients with hypercholesterolemia. - Internal Medicine. - 1999. - Vol. 38. - No. 5. - P. 324-329).
В качестве прототипа выбран способ определения высвобождения АТФ из эритроцитов in vitro, включающий деформацию клеток и определение высвободившейся аденозинтрифосфорной кислоты (Sprague R.S., Ellsworth M.L., Stephenson A.H., Kleinhenz M.E., Lonigro A.J. Deformation-induced ATP release from red blood cells requires CFTR activity. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. - 1998. - Vol. 275, - No. 5. - P. H1726-H1732).
Для проведения деформации клеток в способе используется промышленно выпускаемый прибор для фильтрации цельной крови -фильтрометр крови (Carri-Med, Dorking, UK). Под воздействием определенного давления эритроциты деформируются путем прохождения через поликарбонатные фильтры, в результате чего происходит высвобождение из эритроцитов АТФ. После этого во внеклеточной жидкости определяют количество АТФ, высвобождающейся в процессе деформации клеток.
Недостаток известного способа состоит в том, что в данном приборе невозможно создать условия, происходящие с клетками в сдвиговом потоке в живом организме при различных напряжениях сдвига. Кроме того, определение высвобождения АТФ происходит при фиксированном низком гематокрите (10%), что затрудняет процесс определения высвобождения АТФ из эритроцитов со сниженным содержанием АТФ.
Задача предполагаемого изобретения - усовершенствование способа.
Технический результат - определение количества высвобождения аденозинтрифосфорной кислоты из эритроцитов после их деформации в искусственном сдвиговом потоке при различных напряжениях сдвига.
Технический результат достигается за счет того, что в способе, включающем деформацию клеток и определение высвободившейся аденозинтрифосфорной кислоты, эритроциты деформируют в искусственном сдвиговом потоке в течение 20 с при напряжениях сдвига от 10 до 24 Па, суспензию деформированных клеток центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин, в супернатанте определяют количество аденозинтрифосфорной кислоты люциферин-люциферазным методом.
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. Эритроциты, трижды отмытые в физиологическом растворе, помещают в забуференный физиологический раствор (10 мМ трис HCl, 150 мМ NaCl, рН 7,4), подвергают деформации в искусственном сдвиговом потоке при напряжениях сдвига от 10 до 24 Па в течение 20 с в устройстве для деформации эритроцитов в сдвиговом потоке (Левин Г.Я., Яхно В.Г., Царевский Н.Н., Котяева Н.П. Устройство для деформации эритроцитов в сдвиговом потоке. А.с. СССР №1363065, 1987). Данное устройство состоит их двух коаксиальных цилиндров, между которыми помещается суспензия эритроцитов. При вращении наружного цилиндра создается ламинарный поток с напряжением сдвига от 10 до 24 Па. После прекращения вращения суспензию эритроцитов центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. В супернатанте определяют количество аденозинтрифосфорной кислоты люциферин-люциферазным методом с помощью хемилюминометра.
Пример.
Эритроциты здорового донора, трижды отмытые в физиологическом растворе, помещали в забуференный физиологический раствор (10 мМ трис HCl, 150 мМ NaCl, рН 7,4), подвергали деформации в искусственном сдвиговом потоке при напряжении сдвига 21 Па в течение 20 сек в устройстве для деформации эритроцитов в сдвиговом потоке. После прекращения вращения суспензию эритроцитов центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин. В супернатанте определяли количество аденозинтрифосфорной кислоты люциферин-люциферазным методом с помощью хемилюминометра. В этих условиях количество аденозинтрифосфорной кислоты, высвободившейся из эритроцитов здоровых доноров, составило 0,36 мкМ.
Аналогичным образом определяли количество аденозинтрифосфорной кислоты, высвободившейся из эритроцитов больного неспецифическим язвенным колитом. Оно составило 0,15 мкМ., что свидетельствует о резком снижении высвобождения аденозинтрифосфорной кислоты из эритроцитов при неспецифическом язвенном колите. Это может играть роль в нарушении микроциркуляции у данного больного.
Таким образом, предполагаемый способ определения высвобождения аденозинтрифосфорной кислоты из эритроцитов in vitro обеспечивает возможность определять высвобождение АТФ из эритроцитов после их деформации в искусственном сдвиговом потоке при значениях напряжения сдвига от 10 до 24 Па, близким к показателям, характерным для различных сосудов организма. Кроме того, предлагаемый способ позволяет работать с различными значениями гематокрита - от 2,5 до 60%, что, в частности, позволяет определить высвобождение АТФ из эритроцитов с ее пониженным содержанием.