СЕДАТИВНОЕ СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ 3-(2-(4-ФТОРОФЕНИЛ)-2-ОКСОЭТИЛИДЕН)-3,4-ДИГИДРО-2Н-БЕНЗО[B][1,4]ОКСАЗИН-2-ОНА
3-(2-(4-FLUOROPHENYL)-2-OXOETHYLIDENE)-3,4-DIHYDRO-2H-BENZO[b][1,4]OXAZIN-2-ON BASED SEDATIVE

1
Изобретение относится к области медицины, ветеринарии, фармации и фармакологии, а именно к седативному средству, действующим веществом в котором является (Z)-3-(2-(4-фторофенил)-2-оксоэтилиден)-3,4-дигидро-2Н-бензо[b][1,4]оксазин-2-он формулы или композиции на его основе и которое может найти применение для лечения людей и животных в качестве седативного средства, не обладающего побочным миорелаксирующим действием.
Технический результат: получено соединение, обладающее седативным действием на основании результатов теста "открытое поле", а также характеризующееся отсутствием миелорелаксирующего действия на основании результатов оценки силы хватки животрных, что в совокупности предполагает возможность его использования в медицине и в ветеринарии в качестве седативного средства, не проявляющего побочный миореласкантный эффект. Такая комбинация свойств - наличие седативного эффекта при отсутствии миорелаксантного - позволяет расширять арсенал седативных средств, применение которых не влияет на текущую деятельность.
1
Zh. Org. Khim
В литературе имеются сведения о синтезе соединения , его физико-химических и спектральных характеристиках. [Andreichikov, Yu.S., Voronova, L.A., and Kozlov, A.P., ., 1979, vol. 15, p. 520-526; E.E. Stepanova, S.Yu. Balandina,  V.A. Drobkova, M.V. Dmitriev, I.V. Mashevskaya, A.N. Maslivets.Synthesis, in vitro antibacterial activity against Mycobacterium tuberculosis, and reverse docking-based targetfishing of 1,4-benzoxazin-2-one derivatives. Archiv der Pharmazie, 2021, vol. 354, № 2, art. no. 2000199].
1
Соединение  и его ближайшие аналоги являются ценными промежуточными продуктами для получения широкого разнообразия гетероциклических соединений [Семенова Т.Д., Красных О.П. Химия ацил(имидоил)кетенов. IX. Синтез и термолиз 3-ароил-8-хлор-1,2-дигидро-4Н-пирроло[2,1-c][1,4]бензоксазин-1,2,4-трионов. ЖОрХ. 2005. №8. 1245-1250].
1
1
Также известно, что соединение  и его аналоги обладают биологической активностью: антибактериальным [Oleshchuk A. L., Shulgau Z. T., Seilkhanov T.M., Vasilchenko А.S., Talipov S.A., Kulakov I.V. Synthesis and Biological Activity of 4-(Pyridin-3-yl)-2-hydroxy-4-oxobut-2-enoic AcidDerivatives // SYNLETT,  2019 31(02);  R. Sharma, L. Yadav, J. Lal, P. Jaiswal, M. Mathur, A. Swami, S.Chaudhary. Synthesis, antimicrobial activity, structure-activity relationship and cytotoxic studies of a new series of functionalized (Z)-3-(2-oxo-2-substituted ethylidene)-3,4-dihydro-2H-benzo[b][1,4]oxazin-2-ones. Bioorg. Med.Chem.Let. 2017, №18, 4393-4398], в том числе антитуберкулезным [X. Li, N. Liu, H. Zhang, S. Knudson, R. Slayden, P. Tonge.  Synthesis and SAR studies of 1,4-benzoxazine MenB inhibitors: Novel antibacterial agents against Mycobacterium tuberculosis. Bioorg. Med.Chem.Let. 2010, №21, Р. 6306-6309] действием, анальгетической активностью [I.V. Kulakov, A.A. Karbainova, Z. T. Shulgau, T.M. Seilkhanov, Yu.V. Gatilov, A.S. Fisyuk. Synthesis and analgesic activity of bis(3,4-dihydroquinoxalin-2(1H)-one) and bis(3,4-dihydro-2H-1,4-benzoxazin-2-onederivative. Chemistry of Heterocyclic Compounds 2017, 53(10), 1094-1097)], анитиагрегантнымдействием [P. Jaiswal, V. Sharma, S. Kumar, M. Мathur, A.K. Swami, D.K. Yadav, S. Сhaudhary. Non-peptide-based new class of platelet aggregation inhibitors: Design, synthesis, bioevaluation, SAR, and in silico studies. Archiv der Pharmazie, 2018, 351 (3-4), 1700349] антиоксидантной активностью [Sharma V., Jaiswal P.K, Saran M., Yadav D.K, Mathur M, Swami A.K., Misra S., Kim M., Chaudhary S.. Discovery of C-3 Tethered 2-oxo-benzo[1,4]oxazines as Potent Antioxidants: Bio-Inspired Based Design, Synthesis, Biological Evaluation, Cytotoxic, and in Silico Molecular Docking Studies. Front. Chem. 2018. 6:56. doi: 10.3389/fchem.2018.00056]. Сообщается также о других видах активности. Однако информация о седативном действии соединения и об оценке егомиорелаксантного эффекта в литературе отсутствует.
1
1
Н
Н
Соединение содержит бензо[b][1,4]оксазиноновый фрагмент. Имеются сообщения о том, что аналоги соединения , принадлежащие к классу 2-бензо[b][1,4]оксазин-2-онов и 3-бензо[b][1,4]оксазин-3-онов, обладают видами активности, связанными  с влиянием на центральную нервную систему.
Н
2
3
Найдено, что 2-бензо[b][1,4]оксазин-2-оны формулы уменьшают двигательную активность мышей при внутрибрюшинном введении:  на 74% (доза 200 мг/кг, R=  CH, X = 6-C(CH3)H=CHCOO-7,8-CH3), на 68% (доза 200 мг/кг, R= СН2СООС2Н5, Х=7-NO2); на 48%, (доза 60 мг/кг, R = СН2СООС2Н5; X= 7,8-(OH)2; на 74% (доза 200 мг/кг, R= СН2СООС2Н5, X = 6-C(CH3)H=CHCOO-7,8-CH3) [R.B. Moffett, 2H-Benzoxazin-2-ones.J.Med.Chem. 1966, V.9, 475-478].
2
1
1
Соединения  отличаются от соединения  тем, что содержат заместители Х в аннелированном бензо-цикле, содержат заместители другой природы в положении 3 цикла (R), а также у них отсутствует экзо-двойная связь в положении 3 и енаминовый фрагмент, характерный для соединения .
3
in vitro
Сообщалось, что 4Н-имидазо[5,1-c][1,4]бензоксазиноны формулы , включая представители, у которых R5+R6 представлен группой C=O, связываются с бензодиазепиновым рецептором, что было подтверждено опытами  [S. N. Bisaha, R.B. Gammill. 4-Oxo- and 4-imidazo[5,1-c][1,4]benzoxazines useful as benzodiazepine receptor-binding agents. 1994. US 005610158A]. Данное свойство позволило авторам предположить, что вещества могут быть полезны для лечения заболеваний центральной нервной системы в качестве анксиолитиков, снотворных, седативных препаратов, мышечных релаксантов, антидепрессантов и др.
3
1
Соединения  отличаются от соединений  тем, что имеют [c]- аннелированный имидазольный фрагмент, а также заместители в бензо-цикле.
4
in vitro
В ряду замещенных 2-арилиден-4-аминоалкил-2Н-1,4-бензоксазин-3-онов (соединения ) обнаружены вещества, проявляющие в опытах на самках крыс депрессантный эффект и уменьшающие силу хватки животных, а также являющиеся антагонистами дофаминовых рецепторов в опытах   [C. F. Turk, J. Krapcho, I. M. Michel, I. Weinryb.  Synthesis and Central Nervous System Activity of 2-Arylidene-4-aminoalkyl-2Н-l,4-benzoxazin-3(4Н)-ones and Related Compounds. Journal of Medicinal Chemistry, 1977, Vol. 20, No. 5, 729].
4
1
1,4-Бензоксазиноны  отличаются от вещества  тем, что карбонильная группа цикла соседствует в них с атомом азота, а не кислорода (находится в положении 3, а не 2), карбонильная группа в боковой цепи отсутствует (заместитель CHAr), а также тем, что у атома азота оксазинового цикла присутствует алкильный заместитель.
2
Наиболее близким к заявляемому техническому решению по сущности и по достигаемым результатам являются соединения , которые приняты за прототип.
2
К основным недостаткам прототипа можно отнести 1) высокие дозы соединений , необходимые для проявления седативного эффекта (60 мг/кг или 200 мг/кг) и 2) отсутствие данных по нежелательному побочному эффекту.
Технической задачей предлагаемого изобретения является расширение арсенала средств, обладающих седативной активностью, но не проявляющих побочного миорелаксирующего действия.
1
Поставленная задача решается использованием химического соединения формулы , проявляющего выраженную седативную активность и показавшего отсутствие миорелаксирующего эффекта.
1
Zh. Org. Khim
Получение соединения реализуется известной реакцией 4-фторфенил-4-оксо-2-бутеновой кислоты или ее метилового эфира с 2-аминофенолом. [Andreichikov, Yu.S., Voronova, L.A., and Kozlov, A.P., ., 1979, vol. 15, p. 520-526; E.E. Stepanova, S.Yu. Balandina,  V.A. Drobkova, M.V. Dmitriev, I.V. Mashevskaya, A.N. Maslivets.Synthesis, in vitro antibacterial activity againstMycobacterium tuberculosis, and reverse docking-based targetfishing of 1,4-benzoxazin-2-one derivatives. Archiv der Pharmazie, 021, vol. 354, № 2, art. no. 2000199. https://doi.org/10.1002/ardp.202000199].
Достоинствами изобретения являются:
1. Подтвержденное на животных влияние на ЦНС в невысокой дозе 0,088 ммоль/кг (24,9 мг/кг) (пример 1, таблица 1). Этим устраняется первый пункт из списка недостатков прототипа.
2. Подтвержденное на животных отсутствие побочного миорелаксантного эффекта в дозе 0,088 ммоль/кг (24,9 мг/кг) (пример 2, таблица 2). Этим устраняется второй пункт из списка недостатков прототипа.
1
50
3. Невысокая токсичность вещества : LD выше 500 мг/кг (пример 3, таблица 3).
1
4. Легкая синтетическая доступность вещества .
1
Биологическую активность соединения формулы  изучали в тесте «открытое поле» и тесте на силу хватки [А. Н. Миронов, Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.; F. Morellini, M. Schachner. Enhanced novelty-induced activity, reduced anxiety, delayed resynchronization to daylight reversal and weaker muscle strength in tenascin-C-deficient mice. Eur J. Neurosci. 2006, №5, 1255-1268].
Тест «открытое поле» регистрирует поведение животных в ответ на новые, потенциально опасные стимулы. Данный тест позволяет изучить изменения в ориентировочной, двигательной и исследовательской активности животных. Исследовали влияние вещества в дозе 0,088 ммоль/кг при внутрибрюшинном введении в 1% крахмальной слизи (КС) или в 1% крахмальной слизи с добавлением солюбилизатора Твин-85 (КС+Твин-85). Каждый эксперимент проводили на двух группах мышей линии CD-1, содержащих по 10 особей (5 самок и 5 самцов). Первой группе вводили вещество в соответствующей формулировке (с добавлением Твин-85 или без него). Вторая группа животных являлась контрольной, ей вводили внутрибрюшинно 1% крахмальную слизь с добавлением Твин-85 или без него соответственно. Животных помещали в установку «открытое поле» через 60 минут после введения исследуемого образца. В течение 5 минут вели съемку поведения животного. В ходе обработки  эксперимента регистрировали следующие показатели: пересечение линий (в двух периферийных секторах), пересечение центрального сектора, стойки (с опорой и без), груминг (короткий - один или два коротких круговых движения лап животного вокруг носа и рта, длительный - более интенсивные умывания), дефекации, мочеиспускания, количество замираний и обследование отверстий - обнюхивание края отверстия и  заглядывание в отверстия «по глаза» (Kalueff, Tuohimaa, 2004).
1
Было установлено, что при введении в 1% крахмальной слизи вещество  уменьшает локомоторную активность животных по показателю пересеченных секторов на периферии на 80% по сравнению с контрольной группой. Значения по другим показателям в контрольной группе и группе, которой вводили вещество, статистически достоверной разницы не обнаруживают (для всех р>0,05).
1.
Введение вещества в крахмальной слизи с добавлением солюбилизатора Твин-85 приводит к эффекту снижения локомоторной активности, распространяющемуся на все сектора, при этом наблюдается снижение общего количества пересеченных секторов по сравнению с контролем на  69,6%. В таблице 1 приведены значения, иллюстрирующие изменения показателей, для которых значения в контрольной и опытной группе статистически достоверно различаются (р<0,05). Исследовательская активность снизилась по показателю заглядывания в отверстия и в то же время осталась на уровне контрольной группы по показателю количества стоек. Существенно увеличилось количество замираний, при этом показатели стресса животных - количество дефекаций (болюсов) и мочеиспусканий - не изменяются под действием соединения  Количество актов груминга, как короткого, так и длинного, остается на уровне контроля, что говорить об отсутствии существенного уровня тревожности.
1
1.
Наличие потенциального миелорелаксантного действия соединения  оценивали по силе захвата передними лапами, которую определяли с помощью измерителя силы захвата (Grip strength meter, TSE-system, Germany) Аппарат состоит из металлической решетки, соединенной с датчиком силы. Чтобы измерить силу захвата, экспериментатор осторожно держал мышь за основание хвоста, позволяя животному ухватиться за конец решетки. Как только мышь ухватилась за решетку передними лапами, экспериментатор осторожно потягивал животных назад за хвост до тех пор, пока захват не был потерян. Пиковая сила каждого измерения автоматически записывалась устройством. Регистрировали 3-5 значений и для оценки выбирали максимальное. Использовали две группы животных по 10 мышей стока CD-1: одной группе внутрибрюшинно вводили вещество 1  в 1%КС с добавлением Твина-85 (доза 0,088 ммоль/кг), второй группе - только 1%КС+Твин-85. Замеры проводили в 4 временных точках: 0, 60, 120 и 180 минут. Во всех случаях достоверного различия показателей для контрольной группы и группы с веществом не наблюдали, что свидетельствует об отсутствии миорелаксантного действия у соединения
50
1
1
Исследование острой токсичности проводили на аутбредных белых мышах линии CD-1. Вещество вводили внутрибрюшинно в 1 % крахмальной слизи и далее оценивали выживаемость животных в группе при постоянном мониторинге в течение 24 часов и последующем общем наблюдении в течение 14 дней. Установлено, что LD вещества более 500 мг/кг. Токсичность препарата сравнения (по действию) диазепама в разных источниках составляет 240-770 мг/кг при внутрибрюшинном способе введения [В.Э. Колла, Б.Я. Сыропятов, М., "Медицина", 1998 - 263с.] и 37 мг/кг [W. Frik, O. Strubelt, K. Wittmann. Strahlentherapie 127 (2) (1965) 245-252]. Таким образом, заявляемое вещество  по токсичности находится на уровне диазепама
Изобретение иллюстрируется следующими примерами:
ПРИМЕР 1
Таблица 1
1
Число поведенческих реакций животных при введении соединения  (внутрибрюшинно, 0,088 ммоль/кг, 1%КС+Твин-85), выраженное в процентах относительно количества аналогичных реакций у контрольной группы животных
Показатель
Уменьшение числа реакций по сравнению с контрольной группой, %
Общее количество пересеченных секторов
69,6
ГДА 1(периферия)
68,7  (80*)
ГДА 2 (2/3)
75,0
ГДА 3 (центр)
60,3
Количество исследованных отверстий
50,0
Количество замираний
-1500,0
1
* - при введении вещества в 1% крахмальной слизи, без Твин-85
Уменьшение каждого параметра по отношению к контролю (в %) рассчитывали для показателей, которые статистически значимо (р<0,05) отличались от значений в контрольной группе,  по формуле:
Уменьшение параметра = 100*(среднее значение в группе с веществом - среднее значение в контрольной группе)/значение в контрольной группе.
ПРИМЕР 2.
Таблица 2
Оценка силы хватки передних конечностей мышей
Время замера,мин
Значения в контрольной группе, г
Значения в группе с веществом 1, г
Р при сравнении значений группе с веществом и в контрольной группы
0
38,4±7,6
42,5±7,6
0,24
60
39,0±8,5
42,9±9,0
0,33
120
34,1±8,9
37,8±8,8
0,36
180
33,6±7,6
35,7±10,1
0,61
ПРИМЕР 3:
Таблица 3
1
Токсичность 3-(2-(4-фторофенил)-2-оксоэтилиден)-3,4-дигидро-2Н-бензо[b][1,4]оксазин-2-она ()
вещество
LD50, мг/кг
<b>1</b>
> 500
диазепам
240-770<sup>*</sup>37<sup>**</sup>
* - [В.Э. Колла, Б.Я. Сыропятов, М., "Медицина", 1998 - 263с.]
** - [W. Frik, O. Strubelt, K. Wittmann. Strahlentherapie 127 (2) (1965) 245-252]
ПРИМЕР 4:
1
3-(2-(4-фторофенил)-2-оксоэтилиден)-3,4-дигидро-2Н-бензо[b][1,4] оксазин-2-он ()
К раствору 16,65 ммоль 4-фтор-4-оксо-2-бутеновой кислоты в 150 мл к смеси вода-этиловый спирт (1:1) при температуре 50°С и при перемешивании добавили подогретый раствор 16,65 ммоль 2-аминофенола в смеси вода-этиловый спирт (1:1). Смесь перемешивали в течение 5 минут, охладили до комнатной температуры, выпавший осадок отфильтровали. Маточный раствор охладили при 4°С, выпавший осадок отфильтровали. Выход соединения 1 в расчете на перекристаллизованный продукт: 80%. Т пл. = 187,5-188,5°С (из смеси изопропанол-диоксан (1:1)). ИК спектр (вазелиновое масло): 1755 (С2=О), 1625 (С3(С2=О)), 1600(С=С) см-1.ЯМР 1H (300 МГц, DMSO-d6, δ, м.д.): 6.82 (c, 1H, СН=); 7.10 - 8.13(м, 8Н, ArН); 12.70 (с, 1Н, NH). Анализ: вычислено для C16H10FNO3: C, 67.84; H, 3.56; N, 4.94. Найдено: C, 67.92; H, 3.59; N, 4.90.