УСТРОЙСТВО ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ АНТИГЕНОВ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ
APPARATUS FOR DETECTING ANTIGENS AND USE THEREOF

Перекрестная ссылка на связанную заявку
По настоящей заявке испрашивается приоритет заявки США № 12/533721, поданной 31 июля 2009 года, которая в полном объеме включена в настоящий документ в качестве ссылки.
Область изобретения
Настоящее изобретение частично относится к устройству и анализу для детекции одного или более антигенов и к способам их применения.
Уровень техники, предшествующий изобретению
Детекция антигенов важна для многих областей научных исследований, диагностического применения и терапевтического применения. Существует несколько способов, которыми можно детектировать антигены. Различные способы описаны в патенте США № 5160701, патенте США № 5141850, публикации PCT № WO 91/12336, патенте США № 5451504, патенте США № 5559041, патентной заявке Европы № 0505636A1, публикации PCT № WO 88/08534, патентной заявке Европы № 0284 232A1, публикации патентной заявки США № 20070020768 и в патенте США № RE39664, каждый из которых, таким образом, включен в качестве ссылки в полном объеме. Способы и устройства, доступные до настоящего изобретения, все еще могут требовать улучшений чувствительности и скорости, с которой можно получать результаты. Эти факторы могут являться важными, когда при попытке определить наличие или отсутствие антигена существенное значение имеет время.
Salmonella, E. coli
Campylobacter
Одной такой областью является область детекции пищевых патогенных загрязнителей. Пищевыми расстройствами в Соединенных Штатах Америки страдают приблизительно семьдесят шесть миллионов человек. Из этих семидесяти шести миллионов приблизительно, 325000 становятся тяжелобольными, требуя госпитализации, а приблизительно 5000 погибают. Большинство пищевых расстройств вызывают  и , что оценивают приблизительно в 35 миллиардов долларов.
Современные меры обеспечения безопасных продовольственных ресурсов включают комбинацию местных, принадлежащих штату и федеральных учреждений, а также сложную систему инспекторов и надзорных сетей. Производители продовольственных продуктов подчиняются определенным инструкциям министерства сельского хозяйства Соединенных Штатов, управления по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами Соединенных Штатов и национальной службы морского рыболовства, которые имеют силу закона. USDA создал систему санитарных инспекторов, которые обязаны проводить ежедневные проверки мясных, овощных и других потребляемых продуктов, получаемых или обрабатываемых на промышленных и перерабатывающих предприятиях. Эти проверки созданы, чтобы включать подробный статистический анализ для лучшего обеспечения безопасности и стерильности пищевых продуктов перед достижением ими потребителя. Кроме того, в большинстве мясной промышленности внедрены способы облучения для дополнительной демонстрации стерильности продуктов. На более низком уровне для обеспечения того, что местные дистрибьюторы, рестораны и розничные продавцы следуют строгим рекомендациям для обеспечения безопасных продовольственных ресурсов, действуют местные и муниципальные отделы здравоохранения. Однако, несмотря на эту сложную систему, пищевые инфекции все еще являются частыми.
Как только появляются сильные подозрения на наличие вспышки инфекции, начинаются исследования. В большинстве случаев исследования проводятся в группе индивидуумов, которые могли быть подвергнуты воздействию. Определяют симптомы и время начала и местонахождение возможных случаев, и разработано "определение случая", описывающее эти типичные случаи. Вспышку инфекции методически описывают посредством времени, места и индивидуума. Для графического отображения момента, когда она произошла, строят диаграмму количества заболевших людей в каждые последующие сутки. Рассчитывая распределение случаев по возрасту и полу демонстрируют тех, кто был поражен.
Часто микроорганизм-возбудитель неизвестен, таким образом, у заболевших людей необходимо собирать образцы стула или крови и посылать в санитарно-гигиеническую лабораторию для постановки диагноза. Каждый сбор и получение образцов может стоить более 500$ на тест и анализ часто занимает 2-4 суток (CDC "Пищевые инфекции").
До настоящего изобретения, для определения пищевого или иного источника вспышки инфекции исследователи сначала опрашивали нескольких индивидуумов с наиболее типичными симптомами о воздействиях, которым они подвергались в течение нескольких суток до заболевания. Таким образом, определенные потенциальные воздействия можно исключать, тогда как другие, которые неоднократно упоминались, выступают в качестве возможных источников. Затем в сочетании с другой информацией, такой как вероятные источники конкретного вовлеченного микроорганизма, тестируют гипотезы в формальном эпидемиологическом исследовании. Исследователи проводят систематические опросы о списке возможных воздействий всех больных индивидуумов и сравнительной группы индивидуумов, которые не являются больными. Сравнивая, как часто о воздействии сообщали больные индивидуумы и здоровые индивидуумы, исследователи могут определять ассоциацию воздействия с заболеванием. С использованием вероятностной статистики непосредственно рассчитывают вероятность отсутствия ассоциации.
Так как возникают новые пищевые расстройства, существует необходимость в новых устройствах и способах детекции пищевых патогенных микроорганизмов. Настоящее изобретение относится к устройству для детекции антигенов, таких как антигены пищевых бактерий, и удовлетворяет необходимости наличия устройства и анализа с увеличенной чувствительностью и/или скоростью детекции. Настоящее изобретение удовлетворяет другим необходимостям, а также описано в настоящем документе.
Сущность изобретения
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к устройствам детекции антигена. В некоторых вариантах осуществления устройство содержит корпус, содержащий первую часть корпуса и вторую часть корпуса, где указанный корпус содержит: входное отверстие во второй части корпуса; зажим, прикрепленный к первой части корпуса; подвижный фиксатор, контактирующий с первой частью корпуса и контактирующий с зажимом; систему мембран для детекции антигенов, содержащую в приведенном ниже порядке: подкладку для конъюгации; проницаемую мембрану; тестовую мембрану и абсорбирующий элемент; и гибкий соединитель, прикрепленный к фиксатору и подкладке для конъюгации; где по меньшей мере части подкладки для конъюгации, проницаемой мембраны, тестовой мембраны и абсорбирующего элемента по существу параллельны друг другу; где подкладку для конъюгации можно прижимать по периметру входного отверстия во второй части корпуса и где зажим контактирует с абсорбирующим элементом и способен прикладывать давление по существу перпендикулярно системе мембран для детекции антигенов.
В некоторых вариантах осуществления устройств, устройства дополнительно содержат гидрофобную мембрану, расположенную между тестовой мембраной и абсорбирующим элементом. В некоторых вариантах осуществления первая часть корпуса дополнительно содержит скользящую кнопку, которая выступает из внешней поверхности первой части корпуса, где скользящая кнопка прикреплена к фиксатору, где движение скользящей кнопки перемещает фиксатор.
В некоторых вариантах осуществления подкладка для конъюгации содержит первое специфичное к антигену антитело.
В некоторых вариантах осуществления антиген, распознаваемый первым специфичным к антигену антителом, представляет собой антиген пищевого патогенного микроорганизма.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к системам, содержащим устройство, как описано в настоящем документе, и контейнер для буфера или коллектор для образцов.
Настоящее изобретение также относится к способам детекции антигенов.
Краткое описание чертежей
Фиг.1: Изображен вид представленного устройства по определенным вариантам осуществления настоящего изобретения в перспективе.
Фиг.2: Изображены некоторые компоненты представленного устройства по определенным вариантам осуществления настоящего изобретения.
Фиг.3: Изображены некоторые компоненты представленного устройства по определенным вариантам осуществления настоящего изобретения.
Фиг.4: Изображены некоторые компоненты представленного устройства по определенным вариантам осуществления настоящего изобретения.
Фиг.5: Изображены некоторые компоненты представленного устройства в различных позициях по определенным вариантам осуществления настоящего изобретения.
Фиг.6: Изображена боковая проекция некоторых компонентов представленного устройства по определенным вариантам осуществления настоящего изобретения.
Фиг.7: Изображена боковая проекция некоторых компонентов представленного устройства по определенным вариантам осуществления настоящего изобретения.
Фиг.8: Изображена боковая проекция некоторых компонентов представленного устройства по определенным вариантам осуществления настоящего изобретения.
Фиг.9: Изображен гибкий соединитель, прикрепленный к подкладке для конъюгации.
Фиг.10: Изображены мембраны в представленной части корпуса.
Описание вариантов осуществления
Как применяют в настоящем документе и если не указано иначе, термин "приблизительно" предназначен для обозначения ±5% от значения, которое он модифицирует. Таким образом, приблизительно 100 означает от 95 до 105.
Настоящее изобретение относится к устройствам и способам детекции антигенов или других молекул. В некоторых вариантах осуществления в устройствах применяют хроматографические анализы. В некоторых вариантах осуществления в анализах для проверки присутствия или отсутствия антигена используют анализы специфического связывания.
Термин "захватывающий реагент" относится к реагенту, например, антителу или антигенсвязывающему белку, способному к связыванию молекулы-мишени или анализируемого вещества для детекции в биологическом образце. Захватывающий реагент также может представлять собой, например, олигонуклеотид или пептоид.
Термин "детектирование" или "детекция" применяют в самом широком смысле с включением качественных и/или количественных измерений анализируемого вещества-мишени.
Термины "прикрепленный" или "прикрепление" могут включать непосредственное прикрепление или опосредованное прикрепление. Два компонента, которые непосредственно прикреплены друг к другу, также находятся в физическом контакте друг с другом. Два компонента, которые прикреплены друг другу опосредованно, прикреплены через промежуточный компонент. Например, компонент A может опосредованно прикрепляться к компоненту B, если компонент A непосредственно прикреплен к компоненту C, а компонент C непосредственно прикреплен к компоненту B. Таким образом, в таком примере, можно сказать, что компонент A опосредованно прикреплен к компоненту B.
Термин "выделенный" относится к молекуле, которая по существу отделена от ее природного окружения. Например, выделенный белок представляет собой белок, по существу отделенный от клеточного или тканевого источника, из которых его получают.
Термин "очищенная" относится к молекуле, которая по существу не содержит других веществ, которые ассоциированы с молекулой в ее природном окружении. Например, очищенный белок по существу не содержит клеточного материала или других белков из клетки или ткани, из которых его получают. Термин относится к препаратам, где выделенный белок является в значительной степени чистым для анализа, или по меньшей мере на 70%-80% (масс./масс.) чистым, по меньшей мере на 80%-90% (масс./масс.) чистым, 90-95% чистым; и по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% (масс./масс.) чистым.
-7
-8
-9
-10
-11
-12
-9
-10
-11
-9
-1
Термины "специфическое связывание", "специфически связывается" и т.п. означают, что две или более молекул формируют комплекс, который поддается измерению в физиологических условиях или в условиях анализа и является селективным. Говорят, что антитело или антигенсвязывающий белок или другая молекула "специфически связывается" с белком, антигеном или эпитопом, если такое связывание в соответствующим образом выбранных условиях по существу не ингибировано, тогда как в это же время неспецифическое связывание ингибировано. Специфическое связывание характеризуется высокой аффинностью и селективно для соединения, белка, эпитопа или антигена. Неспецифическое связывание, как правило, является низкоаффинным. Например, связывание антител IgG, как правило, характеризуется аффинностью по меньшей мере приблизительно 10 M или более, такой как по меньшей мере приблизительно 10 M или более, или по меньшей мере приблизительно 10 M или более, или по меньшей мере приблизительно 10 или более, или по меньшей мере приблизительно 10 M или более, или по меньшей мере приблизительно 10 M или более. Термин также применим, когда, например, антигенсвязывающий домен специфичен для конкретного эпитопа, который не находится на многочисленных антигенах, в каком случае антитело или антигенсвязывающий белок, несущие антигенсвязывающий домен, как правило, не связывают другие антигены. В некоторых вариантах осуществления Kd захватывающего реагента для его партнера по связыванию (например, антигена) равна или меньше 10 M, 10 M или 10 M. В некоторых вариантах осуществления Ka захватывающего реагента для его партнера по связыванию больше или равна 10 М.
Захватывающий реагент также может относиться, например, к антителам. Интактные антитела, также известные как иммуноглобулины, как правило, представляют собой тетрамерные гликозилированные белки, состоящие из двух легких (L) цепей приблизительно 25 кДа каждая, и двух тяжелых (H) цепей приблизительно 50 кДа каждая. В антителах существуют два типа легких цепей, называемых лямбда и каппа. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена тяжелых цепей, иммуноглобулины разделяют на пять основных классов: A, D, E, G и M, а некоторые из них дополнительно подразделяют на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Каждая легкая цепь состоит из N-концевого вариабельного (V) домена (VL) и константного (C) домена (CL). Каждая тяжелая цепь состоит из N-концевого V-домена (VH), трех или четыре C-доменов (CH) и шарнирной области. Домен CH, наиболее близкий к VH обозначают CH1. Домены VH и VL состоят из четырех областей с относительно консервативными последовательностями, называемых каркасными областями (FR1, FR2, FR3 и FR4), которые формируют каркас для трех областей гипервариабельных последовательностей (определяющих комплементарность областей, CDR). CDR содержат большинство остатков, отвечающих за специфические взаимодействия антитела или антигенсвязывающего белка с антигеном. CDR обозначают как CDR1, CDR2 и CDR3. Таким образом, CDR, находящиеся на тяжелой цепи, обозначают как H1, H2 и H3, тогда как CDR, находящиеся на легкой цепи, обозначают как L1, L2 и L3. CDR3 является наибольшим источником молекулярного разнообразия участка связывания антител или антигенсвязывающих белков. Например, длина H3 может быть настолько короткой, как два аминокислотных остатка, или составлять более 26 аминокислот. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны в данной области. Для обзора структуры антител, см. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Eds. Harlow et al., 1988. Специалисту в данной области понятно, что каждая структура субъединицы, например, структура CH, VH, CL, VL, CDR и/или FR, содержит активные фрагменты. Например, активные фрагменты могут состоять из части субъединицы VH, VL или CDR, которая связывает антиген, т.е., антигенсвязывающего фрагмента, или части субъединицы CH, которая связывается с рецептором Fc и/или комплементом и/или активирует их.
2
4
3
Неограничивающие примеры связывающих фрагментов включаемых в термин "специфичное к антигену антитело", используемый в настоящем документе, включают: (i) фрагмент Fab, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) фрагмент F(ab'), двухвалентный фрагмент, состоящий из двух фрагментов Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела, (v) фрагмент dAb, состоящий домена VH; и (vi) выделенная CDR. Кроме того, хотя два домена фрагмента Fv, VL и VH, кодируют отдельные гены, их можно рекомбинантно связывать синтетическим линкером, получая единую белковую цепь, в которой домены VL и VH спарены с образованием моновалентной молекулы (известной как одноцепочечный Fv (scFv)). Наиболее широко используемый линкер представляет собой пептид из 15 остатков (GlySer), но в данной области также известны другие линкеры. Одноцепочечные антитела также предназначены для включения в термины "антитело или антигенсвязывающий белок" или "антигенсвязывающий фрагмент" антитела. Антитело также может представлять собой поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело, антигенсвязывающий фрагмент, фрагмент Fc, одноцепочечные антитела или любые их производные.
7
10
Эти антитела получают общепринятыми способами, известными специалистам в данной области, и фрагменты подвергают скринингу на полезность таким же образом, как интактные антитела. Разнообразие антител создается посредством нескольких генов зародышевой линии, кодирующих вариабельные домены, и ряда соматических событий. Соматические события включают рекомбинацию вариабельных генных сегментов с генными сегментами разнообразия (D) и связывания (J) с получением конечного домена VH, и рекомбинацию вариабельных и связывающих генных сегментов с получением конечного домена VL. Сам процесс рекомбинации является неточным, приводящим к потере или добавлению аминокислот в участках соединения V(D)J. Эти механизмы внесения разнообразия действуют в развивающейся B-клетке до воздействия антигена. После антигенной стимуляции экспрессированные гены антител в B-клетках претерпевают соматическую мутацию. На основе расчетного количества генных сегментов зародышевой линии, случайной рекомбинации этих сегментов и случайного спаривания VH-VL можно получить до 1,6×10 различных антител (Fundamental Immunology, 3rd ed. (1993), ed. Paul, Raven Press, New York, N.Y.). С учетом других процессов, вносящих вклад в разнообразие антител (таких как соматические мутации) полагают, что можно получить до 1×10 различных антител (Immunoglobulin Genes, 2nd ed. (1995), eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, Calif.). Вследствие того, что в образование разнообразия антител вовлечено множество процессов, маловероятно, что независимо полученные моноклональные антитела с одинаковой антигенной специфичностью будут иметь идентичные аминокислотные последовательности.
Молекулы антител или антигенсвязывающих белков специфически взаимодействующие с антигенами, эпитопами или другими молекулами, описываемыми в настоящем документе, можно получать способами, хорошо известными специалистам в данной области. Например, моноклональные антитела можно получать, известными способами получая гибридомы. Затем получаемые таким образом гибридомы можно стандартными способами, такими как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и анализ Biacore, подвергать скринингу с идентификацией одной или нескольких гибридом, продуцирующих антитела, специфически взаимодействующие с представляющими интерес молекулой или соединением.
В качестве альтернативы получению секретирующих моноклональные антитела гибридом, моноклональное антитело к полипептиду по настоящему изобретению можно идентифицировать и выделять посредством скрининга библиотеки рекомбинантных комбинаторных иммуноглобулинов (например, библиотека фагового дисплея антител) с полипептидом по настоящему изобретению, таким образом, выделяя члены библиотеки иммуноглобулинов, которые связываются с полипептидом. Способы и коммерчески доступные наборы для получения и скрининга библиотек фагового дисплея хорошо известны специалистам в данной области. Кроме того, примеры способов и реагентов, особенно пригодных для применения для получения и скрининга библиотек дисплея антител или антигенсвязывающих белков, можно найти в литературе.
E. coli
E. coli
E. coli
Термин "захватывающий реагент" также включает химерные антитела, такие как гуманизированные антитела, а также полностью гуманизированные антитела. В некоторых вариантах осуществления захватывающий реагент представляет собой антитело козы к  0157:H7 с каталожным №: 70-XG13 (Fitzgerald Industries); моноклональное антитело козы к  0157:H7 с каталожным №: 10-E13A (Fitzgerald Industries); к  0157:H7 с каталожным №: 10C-CR1295M3(Fitzgerald Industries); моноклональное антитело козы к E. coli 0157:H7 с каталожным №: 10-E12A (Fitzgerald Industries) или антитело козы к IgG мыши с каталожным №: ABSE-020 (DCN).
В некоторых вариантах осуществления устройства по настоящему изобретению содержат корпус, содержащий первую часть корпуса и вторую часть корпуса. В некоторых вариантах осуществления первую и вторую части корпуса можно конструировать в виде единого целого. Корпус может содержать входное отверстие. Входное отверстие обеспечивает введение образца для хроматографического анализа. В некоторых вариантах осуществления входное отверстие содержит первая часть корпуса. Входное отверстие может быть достаточного размера, чтобы обрабатывать достаточный объем раствора, который добавляют в устройство. В некоторых вариантах осуществления размер отверстия является достаточно большим, чтобы обрабатывать приблизительно от 0,1 до 3 мл, приблизительно от 0,1 до 2,5 мл, приблизительно от 0,5 до 2,0 мл, приблизительно от 0,1 до 1,0 мл, приблизительно от 0,5 до 1,5 мл, 0,5 до 1,0 мл и от 1,0 до 2,0 мл.
В некоторых вариантах осуществления корпус содержит подкладку для конъюгации, проницаемую мембрану, тестовую мембрану и/или абсорбирующий элемент. В некоторых вариантах осуществления корпус содержит систему мембран для детекции антигенов. В некоторых вариантах осуществления система мембран для детекции антигенов содержит подкладку для конъюгации, проницаемую мембрану, тестовую мембрану и абсорбирующий элемент. В некоторых вариантах осуществления система мембран для детекции антигенов не содержит проницаемой мембраны. В некоторых вариантах осуществления система мембран для детекции антигенов содержит в следующем порядке: подкладку для конъюгации, проницаемую мембрану, тестовую мембрану и абсорбирующий элемент.
Как применяют в настоящем документе, термин "подкладка для конъюгации" относится к мембране или другому типу материала, который может содержать захватывающий реагент. Подкладка для конъюгации может представлять собой ацетат целлюлозы, нитрат целлюлозы, полиамид, поликарбонат, стекловолокно, мембрану, полиэфирсульфоны, регенерированную целлюлозу (RC), политетрафторэтилен, (PTFE), сложный полиэфир (например, полиэтилентерефталат), поликарбонат (например, 4,4-гидроксидифенил-2,2'-пропан), оксид алюминия, смешанный сложный эфир целлюлозы (например, смесь ацетата целлюлозы и нитрата целлюлозы), нейлон (например, полиамид, гексаметилендиамин и нейлон 66), полипропилен, PVDF, полиэтилен высокой плотности (HDPE)+нуклеирующее средство "дибензоат алюминия" (DBS) (например, 80u 0,024 HDPE DBS (Porex)) и HDPE. Примеры прокладок для конъюгации также включают циклопор (Cyclopore) (полиэтилентерефталат), нуклеопор (Nucleopore) (полиэтилентерефталат), мембрафил (Membra-Fil) (ацетат и нитрат целлюлозы), ватман (Whatman) (ацетат и нитрат целлюлозы), ватман #12-S (вискоза)), анопор (Anopore) (оксид алюминия), анодиск (Anodisc) (оксид алюминия), Sartorius (ацетат целлюлозы, например, 5 мкм) и Whatman Standard 17 (связанное стекло).
В некоторых вариантах осуществления подкладка для конъюгации или тестовая мембрана содержит захватывающий реагент. В некоторых вариантах осуществления подкладку для конъюгации или тестовую мембрану приводят в контакт с захватывающим реагентом, а затем оставляют сохнуть. Подкладка для конъюгации или тестовая мембрана также могут содержать другие композиции для консервации захватывающего реагента так, чтобы его можно было стабильно хранить при комнатной температуре или при температурах охлаждения или замораживания. В некоторых вариантах осуществления подкладку для конъюгации или тестовую мембрану до нанесения захватывающего реагента вымачивают в буфере. В некоторых вариантах осуществления буфер представляет собой блокирующий буфер, который применяют для предотвращения неспецифического связывания. В некоторых вариантах осуществления буфер содержит борат, BSA, PVP40 и/или Tween-100. В некоторых вариантах осуществления буфер представляет собой 10 мМ борат, 3% BSA, 1% PVP40 и 0,25% Tween-100. В некоторых вариантах осуществления захватывающий реагент наносят на подкладку или мембрану в растворе, содержащем трегалозу и сахарозу. В некоторых вариантах осуществления захватывающий реагент наносят на подкладку для конъюгации или тестовую мембрану в растворе, содержащем трегалозу, сахарозу и фосфат и/или BSA. В некоторых вариантах осуществления захватывающий реагент наносят в растворе, представляющем собой 5% трегалозу, 20% сахарозу, 10 мМ фосфат и 1% BSA.
В некоторых вариантах осуществления подкладка или мембрана (например, подкладка для конъюгации или тестовая мембрана) содержит приблизительно от 0,5 до приблизительно 5,0 мкг захватывающего реагента, приблизительно от 1 до приблизительно 3 мкг захватывающего реагента, приблизительно от 1 до приблизительно 2 мкг захватывающего реагента, приблизительно от 2 до приблизительно 3 мкг захватывающего реагента, приблизительно 1,5 мкг захватывающего реагента, 2,5 мкг захватывающего реагента или приблизительно 2,7 мкг захватывающего реагента.
В некоторых вариантах осуществления к тестовой мембране прикреплена или приклеена проницаемая мембрана. В некоторых вариантах осуществления проницаемая мембрана наслоена на тестовую мембрану. Проницаемая мембрана может представлять собой мембрану из любого материала, позволяющего образцу, такому как жидкий образец, проходить через тестовую мембрану. Примеры тестовой мембраны в качестве неограничивающих примеров включают нитроцеллюлозу, целлюлозу, стекловолокно, сложный полиэфир, полипропилен, нейлон и т.п. В некоторых вариантах осуществления проницаемая мембрана содержит отверстие. Отверстие может присутствовать для обеспечения визуального наблюдения или детекции тестовой мембраны. В некоторых вариантах осуществления размер отверстия в проницаемой мембране по существу является таким же, как у входного отверстия в корпусе. Примеры проницаемых мембран в качестве неограничивающих примеров включают Protran BA83, Whatman и т.п.
Как применяют в настоящем документе, "тестовая мембрана" относится к мембране, где происходит детекция партнера захватывающего реагента по связыванию. Тестовые мембраны в качестве неограничивающих примеров включают нитроцеллюлозную мембрану, нейлоновую мембрану, поливинилиденфторидную мембрану, полиэфирсульфоновую мембрану и т.п. Тестовая мембрана может быть из любого материала, который специалист в данной области может использовать для детекции наличия партнера захватывающего реагента по связыванию (например, антигена или эпитопа). Тестовая мембрана также может содержать захватывающий реагент. В некоторых вариантах осуществления тестовую мембрану приводят в контакт с захватывающим реагентом и захватывающему реагенту позволяют высыхать и приклеиваться к тестовой мембране. Примеры тестовых мембран в качестве неограничивающих примеров включают Protran BA83, Whatman, Opitran BA-SA83 и белую гладкую мембрану 0,22 мкм (Millipore Product No. SA3J036107). Тестовая мембрана может содержать несколько захватывающих реагентов. В некоторых вариантах осуществления тестовая мембрана содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 захватывающих реагентов. В некоторых вариантах осуществления тестовая мембрана содержит несколько областей, каждая с особым захватывающим реагентом. В некоторых вариантах осуществления некоторые из областей неполностью перекрываются или совпадают друг с другом. Используя несколько захватывающих реагентов, можно детектировать несколько партнеров по связыванию (например, эпитопов или антигенов).
В некоторых вариантах осуществления корпус также содержит абсорбирующий элемент. Абсорбирующий элемент также можно обозначать как "подкладка для впитывания" или "впитывающая подкладка". Абсорбирующий элемент впитывает жидкость, проходящую через устройство, когда образец наносят на устройство, и обеспечивает капиллярное действие, помогающее протеканию образца при его нанесении на устройство.
Абсорбирующий элемент может быть из любого материала, который может способствовать прохождению образца через подкладку для конъюгации и через тестовую мембрану. Примеры абсорбирующих элементов в качестве неограничивающих примеров включают целлюлозу, суперабсорбирующие полимеры, стекловолоконные подкладки (например, C083 (Millipore)) и т.п. В некоторых вариантах осуществления корпус содержит несколько (например, 2 или более) абсорбирующих элементов. В некоторых вариантах осуществления корпус содержит 2, 3, 4 или 5 абсорбирующих элементов. В некоторых вариантах осуществления абсорбирующий элемент содержит от одной или нескольких мембран до 10 индивидуальных мембран, и каждая мембрана может быть из одинакового материала или из особого материала.
В некоторых вариантах осуществления устройство содержит зажим. Зажим можно использовать для приложения давления или для прижимания других компонентов системы мембран для детекции антигенов друг относительно друга. В некоторых вариантах осуществления зажим может содержать стержень и головку. Зажим может иметь форму гриба, где головка является более широкой, чем стержень. В некоторых вариантах осуществления головка является более узкой, чем стержень. Зажим, содержащий головку и стержень, может представлять собой единое целое или его можно изготавливать из нескольких частей, которые контактируют друг с другом с формированием зажима. Например, головка может представлять собой элемент, который можно отделять от стержня. При сборке головку и стержень приводят в контакт друг с другом с получением зажима. В другом примере головка и стержень представляют собой один связанный элемент и их производят вместе, а не в виде отдельных частей, которые собирают позже с получением зажима. Зажим позволяет устройству работать с вертикальным потоком в отличие от растекания в радиальном направлении.
Устройства, описываемые в настоящем документе, можно использовать в анализах для детекции присутствия партнера захватывающего реагента по связыванию. Например, с использованием устройства по настоящему изобретению посредством антитела можно детектировать антиген. В устройствах по настоящему изобретению используют вертикальный поток. "Вертикальный поток" относится к направлению, в котором образец проходит через различные мембраны и элементы, присутствующие в устройстве. Вертикальный поток относится к образцу, проходящему через мембрану (например, сверху вниз) в противоположность растеканию в радиальном направлении, который обозначает образец, проходящий через (например, поперек) мембрану, подкладку или абсорбирующий элемент. В устройстве с растеканием в радиальном направлении мембраны и подкладки расположены горизонтально, прилегая друг к другу, по существу в одной плоскости. В устройстве с вертикальным потоком каждая мембрана или подкладка по существу расположены параллельно или полностью параллельно друг другу и по существу занимают в устройстве различные плоскости в пространстве. Мембраны и подкладки могут занимать одинаковые плоскости, когда они прижаты или помещены под давлением. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере часть каждой мембраны или подкладки помещают сверху друг друга. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере часть каждого слоя мембраны или подкладка по существу расположены параллельно друг другу. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере часть каждого слоя находится в другой плоскости, чем каждый другой слой.
Для обеспечения эффективного прохождения вертикального потока в некоторых вариантах осуществления подкладка для конъюгации, проницаемая мембрана, тестовая мембрана и абсорбирующий элемент по существу расположены параллельно друг другу. В некоторых вариантах осуществления подкладка для конъюгации, проницаемая мембрана, тестовая мембрана и абсорбирующий элемент находятся в различных плоскостях пространства. В некоторых вариантах осуществления корпус также содержит гидрофобную мембрану, которая может замедлять или останавливать вертикальный поток образца. Гидрофобная мембрана может находиться в контакте с тестовой мембраной, что может позволять образцу задерживаться или оставаться на тестовой мембране. Задержка может обеспечивать увеличенную чувствительность и улучшенную детекцию. Вертикальный поток модулируют давлением, которое прикладывают к мембранам. В некоторых вариантах осуществления давление прикладывают перпендикулярно тестовой мембране и/или подкладке для конъюгации. Давление можно прикладывать так, что подкладка для конъюгации прижимается к корпусу. Прижимание к корпусу может происходить таким, что конъюгат находится в контакте с корпусом, O-образным кольцом или горловиной непосредственно или через промежуточное звено так, что подкладка для конъюгации и тестовая мембрана прижаты друг к другу.
Посредством зажима можно прикладывать давление, которое по существу перпендикулярно тестовой мембране. Давление способствует вертикальному потоку. Давление обеспечивает нахождение каждого слоя блока мембран в контакте с другим слоем. Также давление можно уменьшать с остановкой потока так, что тестируемый образец может задерживаться или останавливаться на тестовой мембране, что может обеспечивать большую чувствительность. Затем давление можно приложить повторно, обеспечивая продолжение вертикального потока, позволяя образцу проходить через абсорбирующий элемент(ы). Посредством зажима можно прикладывать давление так, что подкладка для конъюгации контактирует с частью корпуса. В некоторых вариантах осуществления подкладка для конъюгации контактирует с корпусом, когда она не находится под давлением, прикладываемым посредством зажима, но при прикладывании давления посредством зажима подкладка для конъюгации прижимается к части корпуса.
В некоторых вариантах осуществления подкладка для конъюгации контактирует с периметром входного отверстия. Входное отверстие также может содержать горловину или другой сходный элемент, такой как O-образное кольцо. В некоторых вариантах осуществления подкладка для конъюгации контактирует с периметром горловины и/или O-образного кольца. В некоторых вариантах осуществления подкладка для конъюгации может прижиматься к периметру входного отверстия, которое в некоторых вариантах осуществления может включать горловину и/или O-образное кольцо.
"Может прижиматься к периметру входного отверстия" относится к мембране или подкладке (например, подкладке для конъюгации), непосредственно прижимаемой до контакта с периметром входного отверстия, или прижимаемой к другому слою или материалу (например, мембране), находящемуся в контакте с периметром входного отверстия.
В некоторых вариантах осуществления подкладка для конъюгации не находится в непосредственном физическом контакте с корпусом, а находится в жидкостном контакте с корпусом. "Жидкостной контакт" означает, что если образец наносят на устройство через входное отверстие или другое отверстие, жидкость контактирует с подкладкой для конъюгации. В некоторых вариантах осуществления подкладка для конъюгации может быть отделена от корпуса другой мембраной, такой как проницаемая мембрана, где другая мембрана находится в непосредственном физическом контакте с корпусом или в непосредственном физическом контакте с горловиной или O-образным кольцом. Когда образец наносят на устройство, жидкость может контактировать сначала с другой мембраной, а затем приходить в контакт с подкладкой для конъюгации. Это представляет собой только один пример подкладки для конъюгации, находящейся в жидкостном контакте с корпусом. Существует множество других вариантов осуществления, где подкладка для конъюгации не находится в непосредственном физическом контакте с корпусом, горловиной или O-образным кольцом, а находится в жидкостном контакте с корпусом.
Посредством зажима можно прикладывать любое давление, которого достаточно для обеспечения вертикального потока через различные мембранные слои. В некоторых вариантах осуществления слои устройства (например, подкладка для конъюгации, проницаемая мембрана, тестовая мембрана и абсорбирующий элемент) прижимают с силой, выбранной приблизительно от 22,24 Н до 444,82 Н, приблизительно от 22,24 Н до 222,41 Н, приблизительно от 44,48 Н до 177,93 Н, приблизительно от 66,72 Н до 177,93 Н, приблизительно от 66,72 Н до 111,21 Н, или приблизительно от 133,45 Н до 177,93 Н. Посредством приложения силы также можно прижимать гидрофобную или непроницаемую мембрану, если она присутствует в устройстве.
В некоторых вариантах осуществления зажим контактирует с первой поверхностью абсорбирующего элемента. В некоторых вариантах осуществления подкладка для конъюгации контактирует с тестовой мембраной. В некоторых вариантах осуществления первая поверхность тестовой мембраны контактирует с проницаемой мембраной. В некоторых вариантах осуществления вторая поверхность тестовой мембраны контактирует со второй поверхностью абсорбирующей подкладки. В некоторых вариантах осуществления устройство содержит гидрофобную мембрану, и, например, гидрофобная мембрана контактирует со второй поверхностью тестовой мембраны. В некоторых вариантах осуществления гидрофобная мембрана контактирует с первой поверхностью абсорбирующей подкладки.
В некоторых вариантах осуществления первая поверхность подкладки для конъюгации контактирует с корпусом, а вторая поверхность подкладки для конъюгации контактирует с первой поверхностью проницаемой мембраны, где вторая поверхность проницаемой мембраны контактирует с первой поверхностью тестовой мембраны, где вторая поверхность тестовой мембраны контактирует с первой поверхностью абсорбирующей подкладки, где вторая поверхность абсорбирующей подкладки контактирует с зажимом. В некоторых вариантах осуществления первая поверхность подкладки для конъюгации контактирует с периметром входного отверстия указанного корпуса. В некоторых вариантах осуществления первая поверхность подкладки для конъюгации контактирует с периметром горловины или O-образного кольца.
Устройство также может содержать соединитель. В некоторых вариантах осуществления соединитель является гибким или полученным из гибкого материала. Гибкий материал может представлять собой, например, эластический или эластомерный материал. Соединитель можно прикреплять, например, к подкладке для конъюгации и/или гидрофобной мембране. Соединитель также можно прикреплять к любой мембране или элементу устройства. Примеры соединителей в качестве неограничивающих примеров включают эластомерную ленту, резиновую ленту, пружину и т.п. В некоторых вариантах осуществления соединитель можно получать из материала с эффектом запоминания формы. Соединитель делает возможным осуществлять задержку между движением фиксатора и движением подкладки для конъюгации или мембраны или подкладки любого типа, к которым прикреплен соединитель. Движение подкладки или мембрана не происходит в то же время, как движется скользящая кнопка или фиксатор. Не связываясь с какой-либо конкретной теорией, когда скользящая кнопка или фиксатор перемещаются, энергия накапливается в соединителе, и эту энергию используют для притягивания подкладки или мембраны, прикрепленных к соединителю, после снятия давления. В некоторых вариантах осуществления перед перемещением или удалением подкладки для конъюгации фиксатор отодвигают от зажима (т.е., зажим больше не контактирует с фиксатором). В некоторых вариантах осуществления подкладка для конъюгации перемещается после полного снятия прижатия или давления, прилагаемых посредством зажима.
Соединитель также можно прикреплять к скользящей кнопке или фиксатору. Соединитель к другим компонентам можно прикреплять такими средствами, как адгезивы, скобы, привязывание и т.п. В некоторых вариантах осуществления в мембране или подкладке присутствуют прорези, которые позволяют прикреплять соединитель к мембране или подкладке. Неограничивающий пример можно видеть на фиг.9.
В некоторых вариантах осуществления корпус содержит фиксатор. Фиксатор может представлять собой подвижный фиксатор, который может перемещаться в устройстве. Фиксатор можно использовать для фиксации зажима в таком положении, что прикладываемая посредством зажима на различные слои сила сохраняется. Например, фиксатор фиксирует зажим на месте так, что давление нельзя снять, пока не переместят фиксатор, позволяя зажиму менять положения (т.е. опускаться). Например, фиксатор можно подвести под головку зажима, что может сохранять зажим в поднятом положении. Также фиксатор можно располагать так, чтобы он удерживал зажим в конкретном положении (например, поднятом или опущенном). Фиксатор можно получать из любого материала, включая в качестве неограничивающих примеров пластик и т.п. Фиксатор может контактировать с зажимом, например, непосредственно или опосредовано через другой компонент, который предотвращает снятие давления, прилагаемого посредством зажима. В некоторых вариантах осуществления фиксатор контактирует с зажимом для прижимания подкладки для конъюгации.
Фиксатор также может контактировать с соединителем так, что движение фиксатора перемещает соединитель, любую другую мембрану (например, подкладку для конъюгации, гидрофобную мембрану, тестовую мембрану или абсорбирующий элемент) или другой компонент, который прикреплен к соединителю. Например, если фиксатор перемещают для снятия давления, прилагаемого посредством зажима, таким образом позволяя зажиму изменять положения (например, с поднятого положения на опущенное), движение фиксатора также деформирует соединитель/накапливает в соединителе энергию так, что он может перемещать мембрану или подкладку после достаточного снижения давления. Когда к соединителю прикреплена подкладка для конъюгации и фиксатор перемещают, это после достаточного снижения давления также перемещает подкладку для конъюгации. В некоторых вариантах осуществления давление снимают полностью. Подкладку для конъюгации можно перемещать, например, так, что ее удаляют из устройства. В некоторых вариантах осуществления подкладку для конъюгации перемещают, так, что через входное отверстие становится видна тестовая мембрана. Доля тестовой мембраны, которая становится видна, зависит от типа детекции, который применяют. Для визуальной детекции сделать видимой во входном отверстии может являться необходимым большую часть тестовой мембраны. Для невизуальной, например, флуоресцентной, инфракрасной, радиоактивной или хемилюминесцентной детекции, необходимым сделать видимой может являться меньшую часть тестовой мембраны. В некоторых вариантах осуществления подкладку для конъюгации перемещают так, что ее больше нельзя увидеть или детектировать через входное отверстие. В некоторых вариантах осуществления при перемещении подкладки для конъюгации можно получать другое отверстие, отличное от входного отверстия для визуализации или детекции тестовой мембраны.
В некоторых вариантах осуществления соединитель также прикрепляют к непроницаемой или гидрофобной мембране. Когда соединитель перемещают, перемещение также перемещает или удаляет непроницаемую или гидрофобную мембрану. Как описано в настоящем документе, наличие непроницаемой или гидрофобной мембраны может обеспечивать задержку или остановку на тестовой мембране посредством замедления или остановки вертикального потока. Когда непроницаемую или гидрофобную мембрану перемещают или удаляют, посредством ее прикрепления к соединителю или другими способами, у вертикального потока больше не существуют препятствий или задержек.
В некоторых вариантах осуществления корпус содержит скользящую кнопку. Скользящую кнопку также можно обозначить как ползунок. Скользящая кнопка может пересекать внутреннюю и внешнюю поверхности корпуса. В некоторых вариантах осуществления скользящая кнопка или ползунок выступает из внешней поверхности корпуса. В некоторых вариантах осуществления скользящая кнопка непосредственно или опосредованно прикреплена к фиксатору. Когда скользящая кнопка прикреплена (непосредственно или опосредованно) к фиксатору, перемещение скользящей кнопки также перемещает фиксатор. В некоторых вариантах осуществления к скользящей кнопке можно прикреплять соединитель. В некоторых вариантах осуществления соединитель прикреплен и к скользящей кнопке, и к фиксатору. Скользящую кнопку и фиксатор также можно конструировать в виде одного целого.
2
В некоторых вариантах осуществления входное отверстие включает отверстие, выбранное из диапазона приблизительно 0,2-20 см. В некоторых вариантах осуществления диаметр входного отверстия составляет приблизительно от 1 до приблизительно 2 см. В некоторых вариантах осуществления диаметр входного отверстия составляет приблизительно 1 или приблизительно 1,5 см. В некоторых вариантах осуществления диаметр входного отверстия составляет приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4 или приблизительно 5 см.
Как описано в настоящем документе, подкладка для конъюгации может содержать захватывающий реагент, специфичный к антигену. В некоторых вариантах осуществления подкладка для конъюгации содержит несколько захватывающих реагентов, специфичных к антигенам. В некоторых вариантах осуществления подкладка для конъюгации содержит 1, 2, 3, 4 или 5 захватывающих реагентов, специфичных к антигенам. Антиген может представлять собой любую молекулу, которую может специфически распознавать захватывающий реагент. Примеры антигенов включают полинуклеотидную молекулу (например, ДНК, РНК, миРНК, антисмысловой олигонуклеотид), пептид, белок, сахарид, полисахарид, углевод и т.п. Антиген также может относиться к различным эпитопам, присутствующим на одном белке или полипептиде.
Захватывающий реагент также может представлять собой, например, белок A, белок G и т.п.
В некоторых вариантах осуществления белок представляет собой патогенный белок. Патогенный белок относится к белку, происходящему из патогенного микроорганизма. Примеры патогенных микроорганизмов в качестве неограничивающих примеров включают вирусы, прокариоты и патогенные эукариотические организмы, такие как одноклеточные патогенные организмы и многоклеточные паразиты. Патогенные микроорганизмы также могут включать протозойные патогенные микроорганизмы, которые в жизненном цикле содержат стадию, когда они являются внутриклеточными патогенными микроорганизмами. Как применяют в настоящем документе, термин "внутриклеточный патогенный микроорганизм" предназначен для обозначения вируса или патогенного организма, который по меньшей мере в части его репродуктивного или жизненного цикла существует в клетке-хозяине и таким образом продуцирует патогенные белки или вызывает их продукцию.
Enterobacteriaceae
Pseudomonas
Acinetobacteria
Eikenella
Salmonella
Hemophilus
Yersinia
pasteurella
Streptobacillus moniliformis
Spirilum
Listeria monocytogenes
Erysipelothrix rhusiopathiae
Clostridia
Mycobacteria
Mycoplasma pneumoniae
Lymphogranuloma venereum
Pneumocystis carinii
E. coli
Campylobacter
Salmonella.
Бактериальные патогенные микроорганизмы в качестве неограничивающих примеров включают такие, как бактериальные патогенные грамположительные кокки, которые в качестве неограничивающих примеров включают: пневмококки; стафилококки и стрептококки. Патогенные грамотрицательные кокки включают: менингококки и гонококки. Патогенные кишечные грамотрицательные палочки включают: ; ,  и ; возбудитель мелиоидоза; ; возбудитель шигеллеза; ; возбудитель мягкого шанкра; возбудитель бруцеллеза; возбудитель туляремии;  ();  и ; ; ; возбудитель дифтерии; холеры; сибирской язвы; донованоза (паховой гранулемы) и бартонеллеза. Патогенные анаэробные бактерии включают: возбудитель столбняка; возбудитель ботулизма; другие ; возбудитель туберкулеза; возбудитель лепры и другие . Патогенные спирохетозные заболевания включают: сифилис; трепонематозы: невенерический сифилис, пинта и эндемичный сифилис и лептоспироз. Другие инфекции, вызываемые высшими патогенными бактериями и патогенными грибами включают: актиномикоз; нокардиоз; криптококкоз, бластомикоз, гистоплазмоз и кокцидиоидомикоз; кандидоз, аспергиллез и мукоромикоз; споротрихоз; паракокцидиомикоз, петриеллидиоз, торулопсоз, мицетому и хромомикоз и дерматофитоз. Риккетсиозные инфекции включают риккетсиальные инфекции и риккетсиозы. Примеры микоплазматических и хламидийных инфекций включают: ; ; орнитоз и перинатальные хламидийные инфекции. Таким образом, патогенные простейшее и гельминты и инфекционные эукариоты включают: амебиаз; малярию; лейшманиоз; трипанозомоз; токсоплазмоз; ; бабезиоз; гиардиоз; трихинеллез; филяриоз; шистосомиаз; инфекции нематодами; трематодами или сосальщиками; и цестодами (ленточными червями). Бактерии также включают ,  и
E. coli
E. coli
В некоторых вариантах осуществления  представляет собой  0157.
Примеры вирусов в качестве неограничивающих примеров включают ВИЧ, вирусы гепатитов A, Bи C, FIV, лентивирусы, пестивирусы, вирус Западного Нила, вирус кори, вирус натуральной оспы, вирус коровьей оспы, вирус Эбола, коронавирус и т.п. В публикации патентной заявки США № 20080139494, включенной в качестве ссылки, также описаны другие патогенные микроорганизмы.
E. coli
Campylobacter
Salmonella
E. coli
Campylobacter
Salmonella
E. coli
Salmonella
E. coli
Salmonella
Campylobacter
В некоторых вариантах осуществления патогенный микроорганизм представляет собой пищевой патогенный микроорганизм. Антиген может находиться на пищевом патогенном микроорганизме. Пищевые патогенные микроорганизмы представляют собой патогенные микроорганизмы (например, вирусные или бактериальные), которые вызывают заболевание после потребления зараженной пищи. Непосредственно сама пища может не вызывать заболевание, но точнее это вызывает потребление пищевого патогенного микроорганизма, вызывающего заболевание, который присутствует на пище. В некоторых вариантах осуществления пищевой патогенный микроорганизм представляет собой ,  или . В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой антиген, выбранный из антигена пищевого патогена. Например, антиген пищевого патогена в качестве неограничивающих примеров можно выбирать из антигена , антигена  или антигена . В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой видоспецифичный O-антиген. В некоторых вариантах осуществления O-антиген представляет собой O-антиген  и/или  и его можно использовать для детекции  и . В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой антиген флагеллина. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой антиген флагеллина .
В некоторых вариантах осуществления захватывающий реагент содержит реагент для детекции. Реагент для детекции может представлять собой любой реагент, который можно использовать для детекции наличия связывания захватывающего реагента с его специфическим партнером по связыванию. Захватывающий реагент может содержать реагент для детекции непосредственно или захватывающий реагент может содержать частицу, которая содержит реагент для детекции. В некоторых вариантах осуществления захватывающий реагент и/или частица содержит краситель, коллоидное золото, радиоактивную метку, флуоресцентную метку, или хемилюминесцентный субстрат. Частица может представлять собой, например, вирусную частицу, латексную частицу, липидную частицу или флуоресцентную частицу. В некоторых вариантах осуществления диаметр коллоидного золота составляет: приблизительно 20 нм, приблизительно 30 нм, или приблизительно 40 нм, или он находится в диапазоне приблизительно 20-30 нм, приблизительно 20-40 нм, приблизительно 30-40 нм или приблизительно 35-40 нм.
В некоторых вариантах осуществления тестовая мембрана также содержит один или несколько захватывающих реагентов.
Захватывающие реагенты по настоящему изобретению также могут включать антитело к антителу, например, антитело, которое распознает другое антитело, но не специфично к антигену, в качестве неограничивающих примеров, такое как, антитело к IgG, антитело к IgM или антитело к IgE. Когда тестовая мембрана содержит антитело к антителу, такое как антитело к IgG, антитело к IgM или антитело к IgE, это неспецифическое антитело можно использовать в качестве положительного контроля для детекции того, выходит ли конъюгат из подкладки для конъюгации. Когда образец наносят на устройство, это позволяет первому захватывающему реагенту выходить из подкладки для конъюгации. Когда захватывающий реагент выходит и проходит через устройство, с присоединенным антигеном или без, он может контактировать с антителом к антителу, таким как антитело к IgG или антитело к IgM, которое затем можно детектировать. Эту детекцию можно использовать для демонстрации исправного функционирования устройства.
В некоторых вариантах осуществления тестовая мембрана содержит второй захватывающий реагент, специфичный к антигену. В некоторых вариантах осуществления тестовая мембрана содержит первую область, содержащую первый захватывающий реагент, содержащий захватывающий реагент в виде антитела к IgG; и вторую область, содержащую второй захватывающий реагент, специфичный к антигену, где первая и вторая области неполностью перекрываются или совпадают друг с другом. Этот неограничивающий вариант осуществления можно использовать для демонстрации исправного функционирования устройства и использовать для детекции представляющего интерес антигена.
В некоторых вариантах осуществления подкладка для конъюгации содержит первый захватывающий реагент, специфичный к антигену, а тестовая мембрана содержит второй захватывающий реагент, специфичный к антигену, где первый и второй захватывающие реагенты, специфичные к антигенам, связываются с неконкурирующими эпитопами, присутствующими на антигене. Например, устройство можно использовать для анализа типа сэндвич-анализа, который проводят в два этапа. Первый этап представляет собой связывание антигена с захватывающим реагентом, находящимся в подкладке для конъюгации. После связывания с первым захватывающим реагентом, специфичным к антигену, антиген может проходить через тестовую мембрану или вступать в контакт с тестовой мембраной, где находится второй захватывающий реагент, специфичный к антигену. После взаимодействия с тестовой мембраной, если тестируемый антиген может связываться со вторым захватывающим реагентом, специфичным к антигену, его можно будет детектировать посредством визуализации или с использованием другого детектирующего устройства, в качестве неограничивающих примеров, такого как, сканер флуоресценции. Тестовая мембрана и подкладка для конъюгации могут содержать дополнительные антигенспецифические захватывающие реагенты, распознающие различные антигены или различные эпитопы. В некоторых вариантах осуществления тестовая мембрана или подкладка для конъюгации содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 антигенспецифических захватывающих реагентов. В некоторых вариантах осуществления тестовая мембрана или подкладка для конъюгации содержит несколько антигенспецифических захватывающих реагентов. В некоторых вариантах осуществления каждый антигенспецифический захватывающий реагент распознает отдельный антиген или отдельный эпитоп на том же самом антигене.
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
Campylobacter
Salmonella
"Различные антигены" также могут относиться к одному и тому же белку, но белку, который происходит из различных штаммов одного организма. Различные антигены также могут относиться к антигенам из различных организмов. Например, существует множество штаммов . Не все штаммы  вызывают пищевые расстройства. Настоящее изобретение можно использовать, например, для детекции антигена патогенного штамма  в отличие от антигена непатогенного штамма . В некоторых вариантах осуществления подкладка для конъюгации и/или тестовая мембрана содержит первый и второй антигенспецифические захватывающие реагенты, где первый и второй указанный захватывающий реагенты распознают различные антигены. В некоторых вариантах осуществления тестовая мембрана и/или подкладка для конъюгации содержат несколько областей, содержащих несколько антигенспецифических захватывающих реагентов, где несколько антигенспецифических захватывающих реагентов распознают различные антигены. В некоторых вариантах осуществления несколько областей неполностью перекрываются или совпадают друг с другом. В некоторых вариантах осуществления каждый из множества антигенов независимо выбран из антигена , антигена  и антигена . В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения множество антигенов представляют собой 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более 10 антигенов.
Устройства можно монтировать в одной, в парных или в множественных конфигурациях. Корпус может являться водонепроницаемым для предотвращения утечки, и его можно изготавливать из ряда инертных материалов, таких как полимерные материалы. В некоторых вариантах осуществления входное отверстие может быть достаточного объема, чтобы содержать любое требуемое количество образца или реагентов для применения по изобретению.
Так как мембраны или подкладки устройства предпочтительно являются химически инертными, их желательно активировать в любом участке реакции, где желательно иммобилизовать специфический связывающий реагент по отношению к перемещению растворителя. Для иммобилизации реагента в соответствии с химическими свойствами реагента могут понадобиться различные способы. Как правило, когда носителем является нитроцеллюлоза или смешанный сложный эфир нитроцеллюлозы, для иммобилизации реагентов особых химических связей не требуется. Для других материалов и реагентов можно использовать различные способы, включающие функционализацию такими веществами, как карбонилдиимидазол, глутаральдегид или янтарная кислота, или обработку такими веществами, как бромциан. Другие подходящие реакции включают обработку основаниями Шиффа и борогидридом для восстановления альдегидной, карбонильной и аминогруппы. ДНК, РНК и определенные антигены можно иммобилизовать относительно перемещения растворителя посредством отжига на хроматографическом материале. Отжиг можно проводить при температурах в диапазоне приблизительно от 60°C до приблизительно 120°C в течение периода времени, варьирующего приблизительно от пяти минут до приблизительно 12 часов, а в некоторых вариантах осуществления приблизительно при 80°C в течение приблизительно двух часов.
Настоящее изобретение также относится к системам, содержащим устройства, описываемые в настоящем документе, и контейнер для буфера. Контейнер для буфера может представлять собой любой буфер, с которым можно смешивать подвергаемый тестированию образец, а затем наносить на устройство. Например, образец можно получать из источника и образец можно смешивать с буфером. Буфер может представлять собой лизирующий буфер, который лизирует клетки, или буфер, поддерживающий pH образца так, чтобы можно было должным образом проводить анализ. Контейнер для буфера может быть любой формы и его можно держать снаружи или внутри корпуса устройства.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к системе, которая содержит коллектор образцов. Коллектор образцов можно изготавливать из любого материала, который может собирать образец из источника и обеспечивать тестирование образца. Например, коллектор образцов может представлять собой тампон, такой как ватный тампон. В некоторых вариантах осуществления коллектор образцов представляет собой инокулятор. В некоторых вариантах осуществления корпус содержит коллектор образцов, и часть коллектора образцов находится внутри корпуса. В некоторых вариантах осуществления коллектор образцов находится частично снаружи, а частично внутри корпуса. В некоторых вариантах осуществления коллектор образцов находится полностью снаружи корпуса.
Настоящее изобретение также относится к наборам, содержащим устройства, описываемые в настоящем документе. Набор может содержать устройство, как описано в настоящем документе, коллектор образцов, контейнер для буфера, инструкцию по эксплуатации, положительный контроль, отрицательный контроль, или любое их сочетание. В отношении набора положительный контроль представляет собой образец, для которого известно, что он содержит антиген, который можно детектировать устройством, находящимся в наборе. В отличие от этого отрицательный контроль не содержит антиген, который можно детектировать набором. При использовании в сочетании с антителом к антителу отрицательный контроль может демонстрировать исправную работу устройства.
Также по настоящему изобретению можно включать буферы. Примеры буферов в качестве неограничивающих примеров включают, 1X PBS (10 мМ фосфат, 137 мМ хлорид натрия, 2,7 мМ хлорид калия), буфер для отмывки (например, 10 мМ фосфат натрия, 150 мМ NaCl, 0,5% Tween-20, 0,05% азид натрия), буфер для мембран (например, 10 мМ фосфат натрия, 0,1% сахароза, 0,1% BSA, 0,2%, PVP-40 pH 7,21, фильтруемый через 0,2 мкм фильтр), блокирующий буфер для поликлонального конъюгата (например, 50 мМ борат, 10% BSA, pH 8,93); разбавитель поликлонального конъюгата (например, 50 мМ борат, 1% BSA, pH 9,09) или блокирующие буферы (например, 10 мМ фосфат натрия, 0,1% сахароза, 0,025% Silwet pH 7,42; 10 мМ фосфат натрия, 1% сахароза, 1% трегалоза, 0,01% BSA, 0,025% Tween-20; 0,05% азид натрия, 0,025% Silwet pH 7,4; 10 мМ фосфат натрия, 0,1% сахароза, 0,1% BSA, 0,2% PVP-40 pH 7,21). Также буфер в качестве неограничивающих примеров может представлять собой блокирующий буфер (например, 10% BSA в деионизированной воде, pH 7,4 или 1% BSA в деионизированной воде, pH 7,4); 10 мМ борат, 3% BSA, 1% PVP40 и 0,25% Tween-100; и т.п.
Подкладку для конъюгации и тестовую мембрану можно приводить в контакт с любым из буферов, описываемых в настоящем документе, в присутствии или в отсутствие захватывающего реагента, а в некоторых вариантах осуществления, позволяя высыхать.
Примеры буферов, представляющих собой лизирующие буферы, в качестве неограничивающих примеров включают 2% Tween (об./об.) и 0,1% Triton (об./об.); 2% Tween (об./об.) и 0,1% SDS (масс./об.); 2% Tween (об./об.) и 0,1% BSA (масс./об.); 2% Tween (об./об.) и 1% BSA (масс./об.), 0,1% SDS (масс./об.), 1% BSA (масс./об.) или любое их сочетание. Также лизирующие буферы могут представлять собой, например, 5% Tween/PBS; 2% Tween/PBS+0,1% SDS; 2% Tween/PBS+1% BSA. Другие примеры лизирующих буферов в качестве неограничивающих примеров включают 5% Tween-80 (об./об.); 5% Triton X-100 (об./об.); 5% NP40 (об./об.); 2% Tween-80 (об./об.); 2% Triton X-100 (об./об.); 2% NP40 (об./об.); 1% Tween-80 (об./об.); 1% Triton X-100 (об./об.) и 1% NP40 (об./об.). Детергенты и другие компоненты буферов можно разводить любым подходящим буфером, подходящим для белков и в качестве неограничивающих примеров, включающего воду и фосфатно-солевой буфер. Лизирующие буферы можно использовать для получения образцов до приведения образцов в контакт с устройствами, описываемыми в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления лизирующий буфер не используют. Лизирующий буфер не используют для образца, когда желательно детектировать поверхностный белок или поверхностный антиген. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления образец не подвергают лизису или не помещают в условия, в которых происходит лизис клеток.
Настоящее изобретение также относится к способам детекции антигена, включающим приведения образца в контакт с устройством, как описано в настоящем документе, где образец контактирует с подкладкой для конъюгации и тестовой мембраной, где положительная реакция с тестовой мембраной означает наличие антигена, где подкладка для конъюгации содержит первый антигенспецифический захватывающий реагент, а тестовая мембрана содержит второй антигенспецифический захватывающий реагент. Положительная реакция означает связывание захватывающего реагента, находящегося в тестовой мембране, с антигеном в тестируемом образце. Захватывающий реагент в тестовой мембране наносят на тестовую мембрану так, чтобы он означал положительную реакцию при связывании с его специфичным антигеном. Специфичный захватывающий реагент можно наносить любым способом так, чтобы когда его детектировали, он мог формировать линию, окружность, знак плюс, ломанную линию, "X" или любой другой контур. В некоторых вариантах осуществления контрольная линия, означающая исправную работу устройства, пересекает специфичную для антигена линию, и когда захватывающий реагент, специфичный к антигену, связывается с антигеном, детектируемая метка формирует знак плюс.
В некоторых вариантах осуществления образец контактирует с устройством с последующим после контакта образца с устройством приложением к устройству буфера. Например, образец, содержащий антиген, можно приводить в контакт с подкладкой для конъюгации так, что образец переносят на подкладку для конъюгации. После контакта с подкладкой для конъюгации на устройство можно наносить отдельный раствор для обеспечения или инициации вертикального потока через устройства, описываемые в настоящем документе.
Как описано в настоящем документе, в некоторых вариантах осуществления захватывающий реагент представляет собой антитело. В некоторых вариантах осуществления тестируемый образец представляет собой раствор, но также он может представлять собой смесь раствора или буфера и твердого вещества, которую можно наносить на устройство. Затем раствор растворяет антиген и обеспечивает вступление захватывающего реагента в подкладке для конъюгации в контакт с антигенами, присутствующими в образце. В некоторых вариантах осуществления образец содержит клеточный лизат. В некоторых вариантах осуществления клеточный лизат очищают посредством центрифугирования или другими способами с удалением нерастворимых веществ.
В некоторых вариантах осуществления способы включают приведение тестируемого образца в контакт с коллектором образцов и приведение коллектора образцов в контакт с устройством. В некоторых вариантах осуществления способы включают приведение коллектора образцов в контакт с раствором или буфером, где раствор или буфер наносят на устройство. В некоторых вариантах осуществления образцы до приведения образца в контакт с тестовой мембраной приводят в контакт с подкладкой для конъюгации. В некоторых вариантах осуществления образец приводят в контакт с подкладкой для конъюгации и тестовой мембраной одновременно.
В некоторых вариантах осуществления способ включает удаление подкладки для конъюгации из устройств, описываемых в настоящем документе, где удаление из устройств открывает тестовую мембрану для детекции. В некоторых вариантах осуществления подкладку для конъюгации удаляет фиксатор. В некоторых вариантах осуществления подкладка для конъюгации прикреплена к фиксатору и/или скользящей кнопке. Антиген, который можно использовать в способе для детекции, может представлять собой любой антиген. Антигены могут представлять собой антигены, которые описаны в настоящем документе, или любые другие антигены, которые можно детектировать с применением способов и устройств, описываемых в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления способ включает нанесение образца на устройство и обеспечение прохождение образца через устройство посредством вертикального потока.
В некоторых вариантах осуществления детекция или индикация наличия или отсутствия антигена происходит менее чем за 60 секунд. В некоторых вариантах осуществления детекция или индикация наличия или отсутствия антигена происходит за период приблизительно от 30 до приблизительно 60 секунд. В некоторых вариантах осуществления детекция или индикация наличия или отсутствия антигена происходит менее чем за 2 минуты. В некоторых вариантах осуществления детекция или индикация наличия или отсутствия антигена происходит приблизительно за 30 секунд.
10
15
20
25
30
35
40
45
45
10
20
35
45
25
В отношении чертежей, в некоторых вариантах осуществления на Фиг.1-10 изображены типичные устройства, компоненты устройства и различные проекции устройства. На фиг.1 изображено устройство, содержащее первую часть корпуса (), контейнер для буфера (), вторую часть корпуса (), вырез для скользящей кнопки (), скользящую кнопку (), входное отверстие (), горловину () и тестовую мембрану (). На фиг.1 изображена тестовая мембрана (), содержащая два захватывающих реагента. Первую () и вторую () части корпуса также можно обозначать как нижнюю и верхнюю части корпуса, соответственно. На фиг.1 образец можно наносить через входное отверстие () и можно обеспечивать его вертикальное прохождение через тестовую мембрану (). На фиг.1 вырез () позволяет скользящей кнопке перемещаться, что при прикреплении к фиксатору перемещает фиксатор и в некоторых вариантах осуществления может перемещать подкладку для конъюгации и изменять положение зажима.
10
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
На фиг.2 изображено устройство, содержащее первую часть корпуса (), вторую часть корпуса (), вырез для скользящей кнопки (), скользящую кнопку (), входное отверстие (), горловину (), тестовую мембрану (), подкладку для конъюгации (), несколько абсорбирующих элементов (например, подкладок) (), соединитель (), фиксатор () и зажим (). На фиг.2 изображена подкладка для конъюгации (50), тестовая мембрана (45) и абсорбирующая подкладка (55), расположенные по существу параллельно друг другу. Посредством контакта зажима (70) с абсорбирующим элементом можно прикладывать давление, по существу перпендикулярно подкладке для конъюгации. Как можно видеть на фиг. 2, образец, контактирующий с устройством через входное отверстие (35) может вертикально проходить через подкладку для конъюгации (50) до тестовой мембраны (45). На фиг. 2 явно не показано, но в некоторых вариантах осуществления проницаемая мембрана по существу расположена параллельно подкладке для конъюгации (50) и тестовой мембране (45), при контакте первой поверхности проницаемой мембраны с поверхностью подкладки для конъюгации (50), и контакте второй поверхности проницаемой мембраны с поверхностью тестовой мембраны (45).
На фиг.3 изображена подкладка для конъюгации (50), проницаемая мембрана (75), тестовая мембрана (45) и несколько абсорбирующих элементов (55). На фигуре 3 изображены компоненты, по существу расположенные параллельно друг другу. На фиг. 3 изображена проницаемая мембрана (75), содержащая отверстие. Это отверстие можно использовать для обеспечения визуализации и детекции результатов на тестовой мембране.
На фиг.4 изображено устройство, содержащее первую часть корпуса (10), контейнер для буфера (15), вторую часть корпуса (20), скользящую кнопку (30), тестовую мембрану (45), подкладку для конъюгации (50), проницаемую мембрану (75), несколько абсорбирующих элементов (например, подкладок) (55), соединитель (60), фиксатор (65) и зажим (70). На фиг.4 также изображен зажим
70
72
71
71
72
(), содержащий стержень () и головку (), где головка () является более широкой, чем стержень ().
10
65
30
70
65
70
70
65
30
70
На фиг.5 изображен частичный вид устройства, содержащий первую часть корпуса (), фиксатор (), скользящую кнопку () и зажим (). На фиг.5 изображен фиксатор () в контакте с зажимом () так, что зажим () находится в поднятом положении. На фиг.5 также изображено перемещение фиксатора () и скользящей кнопки () от зажима (), позволяющее зажиму изменять положения. В некоторых вариантах осуществления изменение положения состоит в том, что зажим опускается.
10
20
30
65
40
41
70
73
10
30
65
30
65
65
70
70
72
71
71
65
70
На фиг.6 изображен боковой срез устройства, содержащий первую часть корпуса (), вторую часть корпуса (), скользящую кнопку (), фиксатор (), горловину (), O-образное кольцо (), зажим () и упор для зажима (). Упор для стержня может представлять собой, например, часть первой части корпуса () и она с этой целью по-другому окрашена. На фигуре 6 изображена кнопка () в контакте с фиксатором () таким образом, что перемещение кнопки () перемещает фиксатор (). Перемещение фиксатора () удаляет упор от зажима (), что позволяет зажиму () изменять положения. На фиг.6 также изображен стержень () и головка () зажима. Головка () создает выступ, под который может заходить фиксатор () и подпирать зажим ().
10
20
35
45
50
55
60
65
70
60
На фиг.7 изображен частичный вид устройства, содержащий первую часть корпуса (), вторую часть корпуса (), входное отверстие (), тестовую мембрану (), подкладку для конъюгации (), несколько абсорбирующих элементов (), соединитель (), фиксатор () и зажим (). На фиг.8 изображен соединитель (), прикрепленный к подкладке для конъюгации (50) и фиксатору (65). На фиг.8 также изображена подкладка для конъюгации, прижатая ко второй части корпуса (20) и периметру входного отверстия (35). На фиг.7 изображена головка зажима (71), прикладывающая давление посредством контакта с несколькими абсорбирующими элементами (55). На фиг.7 на устройство через входное отверстие (35) можно наносить образец так, что образец контактирует с подкладкой для конъюгации (50), и вследствие давления образец посредством вертикального потока контактирует с тестовой мембраной (45).
На фиг.8 изображен частичный вид устройства, содержащий первую часть корпуса (10), вторую часть корпуса (20), входное отверстие (35), тестовую мембрану (45), подкладку для конъюгации (50), несколько абсорбирующих элементов (55), соединитель (60), фиксатор (65) и зажим (70). На фиг.8 изображено перемещение фиксатора (65), который прикреплен к соединителю (60). Перемещение соединителя (60), прикрепленного к подкладке для конъюгации (50), перемещает подкладку для конъюгации. На фиг.8 изображен тестовый зажим (70), изменяющий положения и снижающий или устраняющий давление и/или прижимание тестовой мембраны (45). На фиг.9 также изображено удаление подкладки для конъюгации (50) с входного отверстие (35), открывающее тестовую мембрану (45) для визуализации и/или детекции.
На фиг.9 изображен соединитель (60), прикрепленный к подкладке для конъюгации (50). На фиг.9 изображены прорези (51) в подкладке для конъюгации (50) в качестве мест для прикрепления соединителя (60). Соединитель также можно прикреплять посредством других способов, таких как адгезивы, скобы и другие
формы прикрепления.
20
80
85
80
на фиг.10 изображен частичный вид устройства, содержащий вторую часть корпуса (), множество прокладок или мембран (), где множество прокладок содержит тестовую мембрану, проницаемую мембрану и один или несколько абсорбирующих элементов и удерживающих элементов (), которые могут удерживать множество прокладок или мембран (). На фиг.10 изображены структуры, которые при перемещении подкладки для конъюгации оставляют множество прокладок на месте. Для оставления множества прокладок на месте можно использовать любые средства или другую структуру.
Далее изобретение будет описано со ссылкой на приведенные ниже примеры. Эти примеры предоставлены только с целью иллюстрации, и изобретение ни в коем случае не следует считать ограниченным этими примерами, а предпочтительно следует рассматривать, как включающее любую или все вариации, которые очевидны, как результат указаний, предоставленных в настоящем документе. Специалисты в данной области легко определят множество незначительных параметров, которые можно изменять или модифицировать с получением по существу сходных результатов.
Примеры
E. coli
. coli
Антитело, специфичное к  0157:H7, конъюгированное с коллоидным золотом, отжигали и сушили на подкладке для конъюгации. Второе антитело, специфичное к E 0157:H7, и антитело к антителу полосами наносили на тестовую мембрану и собирали в устройство для детекции антигена.
E. coli
E. coli
Образец, содержащий LPS  0157 серийно разбавляли в PBS до концентрации 100 мкг/мл, 50 мкг/мл, 25 мкг/мл, 12,5 мкг/мл, 6,25 мкг/мл, 3,125 мкг/мл, 1,56 мкг/мл и 0,78 мкг/мл. Образцы наносили на устройство для детекции наличия LPS  0157. Эксперименты ранжировали в зависимости от интенсивности сигнала, а результаты приведены ниже. В качестве отрицательного контроля использовали PBS. TL относится к тестовой линии (антигенспецифической), а CL относится к контрольной линии (антигеннеспецифической). Детекцию проводили в течение срока от 30 до 60 секунд нанесения образца на подкладку для конъюгации. Устройство позволяло детектировать наличие пищевого антигена.
<b>Ранг</b>
<b>Концентрация образца</b>
<b>TL</b>
<b>CL</b>
100 мкг/мл
6
8
50 мкг/мл
6
8
25 мкг/мл
4
8
12,5 мкг/мл
4
8
6,25 мкг/мл
3
8
3,125 мкг/мл
3
8
1,56 мкг/мл
1
8
0,78 мкг/мл
1
8
1×PBS (отрицательный контроль)
1
8
Описания каждого и всех из патента, патентной заявки, публикации и номера доступа, цитируемые в настоящем документе, таким образом, в полном объеме включены в настоящий документ в качестве ссылки.
Хотя настоящее изобретение описано на основе конкретных вариантов осуществления, очевидно, что специалисты в данной области могут разрабатывать другие варианты осуществления и вариации настоящего изобретения без отклонения от сущности и объема изобретения. Подразумевается, что приложенная формула изобретения предназначена для включения всех таких вариантов осуществления и эквивалентных вариаций.