Новая тест-система для выявления полиморфизма аллелей гена ube3b крупного рогатого скота айрширской породы

УДК 636.22/.28.082.2

НОВАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ПОЛИМОРФИЗМА АЛЛЕЛЕЙ ГЕНА UBE3B КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА АЙРШИРСКОЙ

ПОРОДЫ NEW TEST SYSTEM FOR DETECTING POLYMORPHISM OF ALLELE OF UBE3B GENE FOR AIRSHIRE CATTLE

Ковалюк Наталья Викторовна, д.б.н., Мачульская Елена Витальевна, к.б.н., Сацук Владимир Федорович, к.б.н., Шахназарова Юлия Юрьевна,

Северо-Кавказский научно-исследовательский институт

животноводства, Российская Федерация, г. Краснодар, Kovalyuk Natalia Viktorovna, Dr. Biol. Sc, Machulskaya ElenaVitalievna, Cand. Biol. Sc., Satsuk V.F., Cand. Biol. Sc., Shakhnazarova Yulia Yurievna, research worker North-Caucasus Research Institute of Animal Husbandry, Krasnodar, Russian Federation

Аннотация: на основе АС - ПЦР (аллелеспецифиче-ской ПЦР) разработана тест - система для выявления полиморфизма в гене UBE3B, ассоциированного с гаплотипом фертильности AH1, а также проведено генотипирование групп коров и быков - производителей (n=70) с целью определения актуальности подобных исследований в региональной субпопуляции айрширского скота. Установлено, что частота встречаемости гетерозиготного генотипа GA у айрширских коров Краснодарского края в среднем составила 0,07, а у быков - производителей, соответственно, - 0,20.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что проблема наличия аномалии в гене UBE3B актуальна для субпопуляции Краснодарского края.

Ключевые слова: ген UBE3B; мутация; полимеразная цепная реакция; частота встречаемости.

Abstract: based on the AS - PCR (allele-specific PCR), a test system was developed to detect polymorphism in the UBE3B gene associated with the AH1 fertility haplotype, and genotyping groups of cows and breeding bulls (n = 70) was made to determine the relevance of such studies in a regional subpopulation Ayrshire cattle. It has been found that the frequency of occurrence of the GA heterozygous genotype in the Ayrshire cows of the Krasnodar Territory averaged 0.07, while in the breeding bulls - 0.20, respectively. The obtained results indicate that the problem of the presence of an anomaly in the UBE3B gene is relevant for the subpopulation of the Krasnodar Territory.

Key words: gene UBE3B; mutation; polymerase chain reaction; frequency of occurrence.

В последнее время в литературе появились сообщения о выявлении телят с определенными дефектами развития (птоз, задержка роста, умственная отсталость, мышечная гипотония) и увеличении смертности молодняка в финских айрширских стадах. Наблюдаемый спектр нарушений получил название PIRM - синдрома.

Установлено, что причина PIRM - синдрома нуклео-тидная замена G > A в гене UBE3B в позиции 65,921,497 (Chromosomalposition (bp), rs475678587 (NCBI assay ID)), расположенном на 17 хромосоме крупного рогатого скота. Продукт гена UBE3B - убиквитин протеин лигаза E3B - белок, способный специфически связываться с подлежащими деградации белковыми субстратами и запускать сам про-

цесс деградации. Полиморфизм rs475678587 находится на стыке 23 экзона и 23 интрона гена UBE3B и, вероятно, приводит к нарушению процесса сплайсинга у носителей му-тантного аллеля и синтезу дефектной убиквитин протеин лигазы E3B, что приводит к нарушению клеточного гомео-стаза [1].

В гомозиготном состоянии мутация приводит к возникновению PIRM - синдрома, в гетерозиготном - является причиной дефектного гаплотипа фертильности AH1.

Сообщается о высокой частоте встречаемости гаплотипа среди генотипированных айрширов (до 26.1 %) и о значительном снижении фертильности, связанной с широким распространением данного гаплотипа [2].

Целью исследований явилось создание тест системы для идентификации полиморфизма в гене UBE3B, ассоциированного с гаплотипом фертильности айрширского скота АН1, и выявление частоты встречаемости полиморфных вариантов в российской субпопуляции айрширского скота.

Методика. В ходе исследований с использованием молекулярно-биологических методов проанализировано 15 образцов спермы быков - производителей айрширской породы, 22 образца крови коров айрширской породы ЗАО АФП «Нива» Каневского района и 33 образца крови коров, принадлежащих ОАО «ПЗ «Дружба» Калининского района Краснодарского края. Для выделения ДНК из спермы и крови использовали наборы реагентов Diatom™ DNA Prep 100 ООО Лаборатория «Изоген» г. Москва. Выход ДНК составлял 3-5 мкг/100 мкл с OD 260/280 от 1,6 до 2,0.

АС-ПЦР проводили со следующими праймерами: AH 1.3 (5' TCAGCGACAAGCTCCTCACC3') AH 1.4 (5' TCAGCGACAAGCTCCTCACT3') AH 1.5 (5' GGCCTCTCCCACGCTTAACT 3') Использовали следующие условия амплификации:

94°С - 4 минуты;

(94°С 30 секунд, 67°С 30 секунд, 72°С 30 секунд) - 28 циклов;

72°С - 3 минуты

Результативность амплификации оценивали в 2 % ага-розном геле.

Результаты исследований и их обсуждение. H. Ven-horanta, H. Pausch, K. Flisikowski, etal. (2014) с использованием подхода, связанного с идентификацией регионов, характеризующихся отсутствием одного из гомозиготных вариантов, был определен регион 17 хромосомы (65,921,20065,921,600), а затем и выявлен SNP, связанный с появлением PIRM - синдрома.

Анализ последовательности UBE3B в области мутации показал, что хотя мутация и приводит к образованию сайта рестрикции для рестриктазы SetI

(http://www.sibenzyme.com/), свойства этой эндонуклеазы, а именно то, что SetI узнает определенный канонический сайт, но при этом также расщепляет (с меньшей эффективностью) вырожденные варианты этого сайта и в результате происходит гидролиз ДНК как по основным сайтам, так и по вырожденным вариантам, не позволило использовать традиционную в этом случае технологию ПЦР/ПДРФ В этой связи, в качестве метода для моделирования тест-системы нами был выбран метод аллелеспецифической ПЦР (АС-ПЦР).

Праймер AH1.5 в паре со специфическим для аллеля G праймером АН1.3 позволил амплифицировать фрагмент аллеля G длиной 238 п.о.. Праймер AH1.5 в паре с аллеле-специфическим для аллеля A праймером AH1.4 позволил амплифицировать фрагмент аллеля А, также длиной 238 п.о. Последовательность праймеров была подобрана с использованием программы Primer Premier.

Генотипирование одного животного, таким образом, проводили в двух пробирках. Гомозиготных GG животных выявляли по результативной амплификации в пробирке с праймерами AH1.3 и AH1.5; гетерозиготных GA - по результативной амплификации в обеих пробирках (с праймерами AH1.3 и AH1.5; AH1.4 и AH1.5); гомозиготных по мутации (генотип AA) возможно выявлять по результативной амплификации в пробирке с праймерами AH1.4 и AH1.5.

Апробация тест-системы была проведена с использованием ДНК двух айрширских быков - производителей, один из которых, являлся гетерозиготным носителем мутации, а второй - нормальной гомозиготой (рис.1) (сравнительное генотипирование проведено в ООО «Мой Ген» методом секвенирования ПЦР - продукта).

Нами также было проведено генотипирование быков -производителей (п=15), интенсивно используемых в настоящее время в системе искусственного осеменения Краснодарского края (сравнительное генотипирование проведено в ООО «Мой Ген») и коров, принадлежащих двум племенным заводам по разведению айрширского скота (п=55).

Частота встречаемости гетерозиготного генотипа GA в субпопуляции айрширских коров Краснодарского края в среднем составила 0,07, а у быков - производителей, соответственно, - 0,20. Полученные результаты свидетельствуют о том, что проблема наличия аномалии, а, следовательно, и связанных с ней экономических потерь существует и в субпопуляции Краснодарского края. Поскольку частота встречаемости этой аномалии практически в три раза выше у быков - производителей, определяющих завтрашний день субпопуляции, следует ожидать увеличение ее частоты встречаемости у коров в ближайшее время.

Выводы. Таким образом, разработанная тест-система позволяет с минимальными затратами эффективно выявлять носите-

лей мутации в локусе UBE3B и может успешно использоваться для мониторинга данной аномалии у айрширского скота.

Список литературы

1. Venhoranta H., Pausch H., Flisikowski K., et al. In frame exon skipping in UBE3B is associated with developmental disorders and increased mortality in cattle // BMC Ge-nomics.-2014, 15:890, DOI: 10.1186/1471-2164-15-890 (,http://www.biomedcentral.com /1471-2164/15/890).

2. Cooper T.A, Wiggans G.R, Null D.J, Hutchison J.L, Cole J.B. Genomic evaluation, breed identification, and discovery of a haplotype affecting fertility for Ayrshire dairy cattle // J Dairy Sci.- 2014, - 97(6):3878-82. DOI:10.3168 / jds.2013-7427