Изучение процессов осаждения гидроксилапатита допированного желатином на поверхности биоинертных сплавов титана

ХИМИЯ

Вестн. Ом. ун-та. 2016. № 2. С. 37-44.

УДК 54.056, 544.6.018.47

О.А. Голованова, А.В. Зайц, Т.В. Панова

ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССОВ ОСАЖДЕНИЯ ГИДРОКСИЛАПАТИТА ДОПИРОВАННОГО ЖЕЛАТИНОМ НА ПОВЕРХНОСТИ БИОИНЕРТНЫХ СПЛАВОВ ТИТАНА

В работе синтезированы порошки композита гидроксилапатит-желатин из модельного раствора внеклеточной жидкости (СБФ) с содержанием желатина от 1 до 3 масс. %. Установлено, что все образцы, не зависимо от концентрации желатина, однофазны и представляют собой гидроксилапатит. Изучены поверхностные и морфологические характеристики полученных кальций-фосфатных покрытий модифицированных желатином. Установлено, что лучшее осаждение композита на поверхности титановых подложек происходит на протравленных образцах. Показано, что после облучения на установке МИП титановых подложек с покрытием на основе гидроксилапатит-желатин возможен дальнейший рост кристаллов и регенерация поверхности. Ключевые слова: кристаллизация, внеклеточная жидкость, гидроксилапатит, желатин, титан, рост кристаллов, обработка поверхности.

Введение

В настоящее время при замене костных дефектов применяют титан и титановые сплавы, но данные материалы в ряде случаев организм человека отторгает, что приводит к необходимости повторных операций и как следствие увеличению срока реабилитации больных, стоимости операции. Решение данной проблемы возможно в формировании слоя биоактивного фосфата кальция на титане и его сплавах. На данный момент существует ряд методов формирования таких покрытий, в том числе кальций-фосфатных, на гладких и структурированных поверхностях металлов и сплавов (бестоковое нанесение покрытий, метод изостатического сжатия, электрофорез, осаждения из химического пара, плазменное напыление и др.) [1-8].

Недостатком всех вышеперечисленных методов является отсутствие достаточной адгезии получаемых покрытий к подложке. Для образования химической связи между покрытием и подложкой возможным является использование спекания при температурах 1073-1273 К, что может привести к образованию прочного диффузионного слоя. Но из-за несоответствий поверхности синтезируемого материала и имплантата возникают значительные напряжения, приводящие к повреждению покрытия в процессе охлаждения.

Альтернативным способом является биомиметическое формирование покрытий [9-11]. При этом способе связь имплантируемого материала с костной тканью развивается через стадию биомиметического формирования биологически активного слоя карбонат-содержащего гидроксилапа-тита (ГА) на поверхности материала. Образование такого слоя инициируется переходом ионов кальция из имплантируемого материала в жидкость, моделирующую по своему составу, например, внеклеточную жидкость (СБФ) организма. Биомиметические апатитовые покрытия могут быть сформированы и на инертном, устойчивом к растворению материале, например полимерном. Данный способ успешно был использован для нанесения покрытий на различные полимерные материалы, в том числе на поверхность волокон или тканей. В дальнейшем именно из них могут быть созданы имплантируемые конструкции, например матриксы для клеточных технологий регенерации костных тканей. Таким конструкциям могут

* Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 15-29-04839 офи_м).

© Голованова О.А., Зайц А.В., Панова Т.В., 2016

быть приданы свойства, близкие к свойствам естественной костной ткани, в том числе высокое сопротивление разрушению и низкий модуль упругости.

Первоначально, биомиметический метод был применен для формирования апатитовых слоев на биостеклах и биоситаллах, которые сами являются источниками ионов кальция. Затем метод был распространен на полимерные и металлические материалы. Покрытия на основе гидроксилапатита весьма эффективны для обеспечения остеоинтегра-ции металлических имплантатов с костными тканями. Титановые имплантаты с такими покрытиями используются в стоматологии и ортопедии. К недостаткам титановых сплавов можно отнести относительно низкую износостойкость и сдвиговую прочность.

Таким образом, при существующем разнообразии методов по формированию биоактивных покрытий фосфатов кальция на титане и титановых сплавов, проблема их получения до сих пор остается открытой и требующей дальнейшего изучения. Цель данной работы - получение биомиметического кальций-фосфатного модифицированного желатином покрытия на титановом сплаве ВТ1-0 и установление состава и физико-химических свойств получаемого покрытия.

Экспериментальная часть

Синтез гидроксилапатита осуществлялся из раствора, модельная среда которого приближенна по электролитному составу к внеклеточной жидкости человека [12]. При проведении синтеза к 500 мл раствора, содержащему CaCl2 и MgCl2, добавляли 500 мл раствора K2HPO4, NaHCO3, Na2SO4 и NaCl с добавкой желатина. Суммарный объем смеси составлял 1 л, рН полученного раствора составляла 7,40 (корректировку кислотности проводили раствором HCl или №ОН (20 %)). Время кристаллизации составило 48 часов. После отстаивания раствор фильтровали с помощью складчатого фильтра (синяя лента). Отбирали часть надосадочной жидкости для проведения химических анализов, измеряли рН конечного раствора. По окончании фильтрования осадок на фильтре промывали водой (V = 50 мл), высушивали в сушильном шкафу.

В работе для исследования использовали сплав титана ВТ1-0. Этот материал имеет высокий предел прочности, обладает высокой биосовместимостью, не токсичен, имеет хорошую коррозийную стойкость, имеет характеристики, близкие к механическим характеристикам костной ткани. Поверхность образцов была подготовлена с различной шероховатостью: шлифованная и травленая, состав травителя: HNO3, NaF (1:1).

Для осаждения гидроксилапатита на поверхность титана марки ВТ1-0, готовились пластинки титана размером 15 х 15 х 1,2 мм. Часть титановых пластинок была дополнительно обработана мощным ионизационным пучком, лазерной абляцией.

Синтез покрытий на пластинках проводился для системы фосфата кальция в присутствии 1, 2 и 3%-ного раствора желатина.

При осаждении композита ГА-желатин на титановые образцы использовали два варианта приготовления суспензии. В первом варианте фазу ГА синтезировали отдельно из модельного раствора, после чего данный порошок добавляли к 3%-ному раствору желатина, с постоянным перемешиванием 550 об/мин, в течение 15 минут. Затем готовили холодную баню, погружали в нее стакан с полученной суспензией и продолжали перемешивать. Смешивание вели до приобретения раствором однородного состава и достижением им температуры 20 °С. После чего в данную суспензию погружали образцы титанового сплава ВТ1-0 и оставляли в холодильную камеру 0-3 °С на различный период времен (3+6+6 дней и 6+6+6 дней) для дальнейших наблюдений. Осаждение проводилось при значении рН = 7,4.

Вторым способом приготовления суспензии является синтез гидроксиапатита с добавкой желатина, после чего в данную суспензию опускали образцы титановых подложек. Показатель рН составлял 7,4, что соответствует физиологическому значению кислотности в норме. Исследования зависимости роста кристаллов ГА и области покрытия поверхности для титанового сплава ВТ1-0 с протравленной и необработанной поверхностью производились методами оптической микроскопии. Первое наблюдение было проведено спустя 3 дня после погружения в раствор, остальные с интервалом 6 дней.

После нанесения слоя ГА-желатин на титановые пластинки они подвергались воздействию мощного ионного пучка (МИП) на установке «Темп» с плотностью ионного тока j = 100 А/см2 и числом импульсов п = 1.

Для измерения краевого угла смачивания был использован метод, базирующийся на измерении геометрических параметров капли жидкости (высоты и диаметра), которая смачивает поверхность. Предварительно поверхность титанового образца обезжиривали раствором этилового спирта, затем при помощи стеклянного капилляра диаметром порядка 0,2 мм наносили каплю, исследуемой суспензии. Измерение геометрических параметров капли производилось на оптическом микроскопе NEOPHOT 2 с использованием микрометрического винта, имеющегося на данном микроскопе. Расчет проводили по формуле: (ё / 2)2 - к2

cos и =

(d / 2)2 + h2

Фазовый состав полученных осадков исследован с помощью РФА (ДРОН-3) и ИК-спектроскопии (спектрофотометр «ФТ-02»). Идентификация пиков на дифрактограммах проводилась с помощью картотеки JCPDS и программных пакетов DifWin4.0 и Crystallographica Search-Match. Для изуче-

ния морфологии поверхности использовались оптические микроскопы Neophot 2 и МБС-9, сканирующие электронный микроскоп JEOL ^М-6610ЬУ.

Результаты экспериментов и их обсуждение

Осуществлен синтез ГА в присутствии от 1 до 3 масс.% желатина. Установлено, что при содержании желатина 1 масс.% кристаллизация ГА происходила недостаточно, тогда как при 3 масс.% добавки образовывалась кристаллическая модификация ГА, о чем свидетельствуют данные оптической микроскопии (рис. 1) и рентгенофазового анализа.

Видно, что в результате кристаллизации в присутствии желатина формируются кристаллы ГА крупных размеров. Результаты

РФА показали, что образцы, синтезируемые в среде модельного раствора внеклеточной жидкости при варьировании концентрации желатина, однофазны и представляют собой гидроксилапатит.

Далее полученные порошки использовали для получения покрытий на титановых пластинках. На рис. 2 представлена морфология поверхности образцов с образовавшимся на них покрытием спустя 15 и 18 дней нахождения в модельном растворе суспензии ГА-желатин. Видно, что покрытие неравномерное и рост кристаллов ГА на поверхности титановой подложки наблюдается локально.

Следует отметить, что при таком способе кристаллизации на начальном этапе желатин образует на поверхности титанового имплан-

Рис. 1. Порошок закристаллизованного ГА в присутствии 3%-ного раствора желатина

Рис. 2. Морфология поверхности титанового сплава ВТ1-0 с кристаллами гидроксилапатита, выращенными за 15 дней нахождения в растворе ГА+3% желатин: а, б - шлифованная поверхность; с, д - травленая поверхность

тата равномерную пленку, тем самым заполняет все неровности поверхности и уменьшает площадь взаимодействия ГА-металл. По этой причине уменьшается возможность

процессов кристаллизации на всей поверхности подложки из-за невозможности образования центров кристаллизации. Это может являться причиной образования локальных

мест центров кристаллизации, в ходе чего рост кристаллов происходит не на титановой подложке, а на желатиновой пленке покрывающей титан, и идет вверх по дендритному механизму, образуя игольчатые кристаллы. При этом рост кристаллов также ограничивается тем, что имеющийся в растворе желатин, обволакивая верхнюю часть кристалла, покрывает слой образовавшегося биополимера, тем самым образуя композитную систему. Таким образом, данный способ получения равномерного покрытия на титановом имплантате оказался неприемлемым, поскольку рост кристаллов осуществляется не по всей поверхности имплантата, а в отдельных центрах кристаллизации. Важно отметить, что через 18 суток рост кристаллов прекратился.

При использовании второго способа получения покрытий (рис. 3) видно, что кристаллизация на образцах начинается с края пластинки по дендритному механизму.

При этом отмечается разница в скорости кристаллизации в зависимости от способа обработки поверхности имплантата, для шлифованных образцов наблюдается более интенсивный рост кристаллов в углублениях шлифа, тогда как на травленых образцах рост дендритов происходит в объемных дефектах, полученных за счет травления.

Следующее наблюдение поверхности титановых образцов было проведено спустя 9 дней после погружения в модельный раствор. На рис. 4 представлена морфология поверхности образцов с покрытием гидрокси-лапатитом при кристаллизации в растворе с содержанием 3 масс.% желатина.

а б

Рис. 3. Морфология поверхности кристаллов гидроксилапатита, выращенных на поверхности сплава титана ВТ1 в присутствии желатина, спустя 3 дня нахождения в растворе: а - травленая поверхность, б - шлифованная поверхность

а б

Рис. 4. Морфология поверхности кристаллов гидроксилапатита, выращенных на поверхности сплава титана ВТ1-0 в присутствии желатина, спустя 9 дней нахождения в растворе: а - шлифованная поверхность, б - травленая поверхность

Как видно на травленой поверхности титанового сплава и на шлифованной поверхности продолжился рост дендритов, при этом для шлифованных образцов дендриты толще и короче, а для травленных длиннее и тоньше. По нашему мнению, это связано с разной подготовкой поверхности образцов. Отмечено начало процесса кристаллизации к центру образцов, а степень покрытия составляет ~ 20 %.

На рис. 5 представлены фотографии морфологии поверхности титанового сплава с закристаллизованным ГА-желатином спустя 15 дней нахождения в исходном модельном растворе, видно, что в обоих случаях наблюдается полное покрытие поверхности образцов. При этом образовалась многослойная рыхлая структура. С помощью толщиномера была определена толщина нанесенного слоя, погрешность в измерениях составила

±3 мкм. Получено, что толщина слоя покрытия на образцах с травленой микроструктурой составила ~ 50 мкм, тогда как толщина слоя на шлифованной поверхности ~ 30 мкм. Характер покрытия для образцов с травленой микроструктурой более плотный и равномерный по сравнению с шлифованной поверхностью. Данный факт объясняется тем, что в процессе травления происходит частичное разрушение кристаллической решетки, в результате чего дефектность металлической пластины выше, чем у образцов со шлифованной поверхностью.

С увеличением времени кристаллизации до 18 дней (рис. 6) установлено, что толщина

слоя покрытия увеличилась, для травленого образца она составила ~ 70 мкм, а для шлифованного ~ 50 мкм. Важно отметить, что после смены суспензии ГА-желатин через три дня прирост покрытия по толщине составил 20 мкм для каждого образца, что характерно при механизме роста кристаллов на поверхности уже сформировавшегося биополимера. На шлифованном образце покрытие рыхлое и легко удаляется с поверхности. На травленой поверхности вследствие большой толщины образовавшегося слоя наблюдается растрескивание.

По данным сканирующей электронной микроскопии (рис. 7) во всех случаях образо-

а б

Рис. 5. Морфология поверхности кристаллов гидроксилапатита, выращенных на поверхности сплава титана ВТ1, спустя 15 дней нахождения в растворе: а - не травленая, б - травленая

а б

Рис. 6. Морфология поверхности кристаллов гидроксилапатита, выращенных на поверхности сплава титана ВТ1, спустя 18 дней нахождения в растворе: а - нетравленая, б - травленая

валось покрытие ГА-желатин с характерной гексагональной структурой кристаллов. При большой толщине слоя наблюдается возникновение трещин.

Далее, после нанесения слоя ГА-желатин на титановые пластинки, они подвергались воздействию мощного ионного пучка (МИП) на установке «Темп». На рис. 8 представлена морфология слоя ГА-желатин на поверхности образцов после облучения МИП. Видно, что под действием МИП, за счет возникающих высоких градиентов температур на поверхности, происходило расплавление поверхностного слоя титанового имплантата и частичное перемешивание слоя ГА-желатин и подложки. В некоторых местах происходил разлет слоя ГА, это связано, по нашему мнению, с неоднородной толщиной покрытия. Установлено, что

при облучении МИП покрытий, полученных из модельного раствора в присутствии желатина, происходит заплавление слоя покрытия и его надежное закрепление. Это способствует повышению биосовместимости титанового имплантата и при этом возможная дальнейшая кристаллизации композита ГА-желатин на поверхности образца.

По данным сканирующей электронной микроскопии (рис. 9), видно, что часть частиц ГА-желатин покрытия приобрела форму палочек, и образец имеет пористую структуру и микротрещины, что также обусловливает дальнейшую возможность роста кристаллов и биодеградацию в живом организме.

Рис. 7. Морфология поверхности кристаллов гидроксилапатита, выращенных на шлифованной поверхности сплава титана ВТ1-0

c д

Рис. 8. Морфология поверхности кристаллов гидроксилапатита, выращенных на поверхности сплава титана ВТ1, полученная с помощью оптической микроскопии, после облучения МИП: a, б - шлифованная поверхность; с, д - травленая поверхность

Рис. 9. Морфология поверхности кристаллов гидроксилапатита, выращенных на шлифованной поверхности сплава титана

ВТ1-0, после облучения МИП

РФА полученного покрытия (рис.10) показал, что присутствуют рефлексы: исходного образца - сплав титана ВТ1-0, композита ГА-желатин и образца после облучения. В образцах после облучения наблюдаются пики ГА и сохраняется структура поверхности титановой подложки. Таким образом,

можно отметить, что облучение МИП получаемого покрытия приводит к прочному закреплению на титановой подложке ГА-желатин закристаллизованного из модельного раствора. Полученное данным способ покрытие может быть использовано в дальнейшем для изготовления имплантата.

Рис. 10. Дифрактограмма: 1 - образец кристаллов ГА-желатин; 2 - образец с выращенными на поверхности ВТ1-0 кристаллов ГА после облучения; 3 - образец сплава титана ВТ1-0

Выводы

1. Синтезированы порошки ГА-желатин из раствора СБФ с содержанием желатина 1 и 3 масс. %. Установлено, что все образцы, синтезируемые в среде модельного раствора внеклеточной жидкости при варьировании концентрации желатина, однофазны и представляют собой гидроксилапатит.

2. Осаждение ГА-желатин на поверхности титановых подложек происходит лучше на протравленных образцах.

3. Установлено, что после облучения титановых подложек МИП с j =100 А/см2 возможен дальнейший рост кристаллов и регенерация поверхности.

ЛИТЕРАТУРА

[1] Сурменева М. А., Сурменев Р. А., Чайкина М. В., Качаев А.А., Пичугин В.Ф., Эппле М. Исследование фазового и элементного состава покрытий на основе кремнийсодержащего гидрокси-апатита для медицинских имплантатов, полученных методом ВЧ-магнетронного распыления // Физика и химия обработки материалов. 2012. № 3. C. 51-60.

[2] Хлусов И. А., Пичугин В. Ф., Гостищев Э. А., Шар-кеев Ю. П., Сурменев Р. А., Сурменева М. A., Ле-гостаева Е. В., Чайкина М. В., Дворниченко М. В., Морозова Н. С. Влияние физических, химических и биологических манипуляций на поверхностный потенциал кальций-фосфатных покрытий на металлических подложках // Бюллетень сибирской медицины. 2011. № 3. C. 72-81.

[3] Хенч Л., Джонс Д. Биоматериалы, искусственные органы и инжиниринг тканей. М. : Техносфера, 2007. 301 с.

[4] Turov V. V, Gun 'ko V. M, Bogatyrev V. M., Zarko V. I., Gorbik S. P., Pakhlov E. M, Leboda R., Shulga O. V., Chuiko A. A. Structured water in

partially dehydrated yeast cells and at partially hydrophobized fumed silica surface // J. Coll. Interf. Sci. 2005. Vol. 283. № 2. P. 329-343.

[5] Murugan R., Ramakrishna S. Crystallografic study of hydroxyapatite bioceramics derived from varios sources // Cryst Growth Des. 2005. Vol. 5. P. 111112.

[6] Sundaram J., Durance T. D., Wang R. Porous scaffold of gelatine - starch with nanohydroxyapatite composite processed via novel microwave vacuum drying // Acta Biomater. 2008. Vol. 4. P. 932-942. 263.

[7] Li J., Chen Y., Yin Y., Yao F.,Yao K. Modulation of nano-hydroxyapatite size via formation on chitozan- gelatin network film in situ // Biomaterials. 2007. Vol. 28. P. 781-790.

[8] Chen M., Tan J., Lian Y., Liu D. Preparation of Gelatin coated hydroxyapatite nanorods and the stability of its aqueous colloidal // Appl. Surf. Sci. 2008. Vol. 254. P. 2730-2735.

[9] Shu C., Xianzhu Y., Zhangyin X., Guohua X., Hong Lv., Kangde Yao. Synthesis and sintering of nanocrystalline hydroxyapatite powders by gelatin - based precipitation method // Ceram. international. 2007. Vol. 33. P. 193-196.

[10] Лясникова А. В., Сакалла А. М. Формирование наноструктурированных биокомпозиционных покрытий электроплазменным напылением в мощном ультразвуковом // Вестник Саратовского государственного технического университета. 2007. № 2 (24). Вып. 1. С. 54-60.

[11] Петровская Т. С., Шахов В. П., Верещагин В. И., Игнатов В. П. Биоматериалы и им-плантаты для травматологии и ортопедии. Томск : Изд-во ТПУ, 2011. 307 с.

[12] Berdinskaya M. V, Golovanova O. A., Zaits A. V, Leont'eva N. N., Anthonicheva N. V. A physicochemical study of the structure, composition, and properties of hydroxylapatite modified by silicate ions 2014 // Journal of Structural Chemistry. 2014. Т. 55. № 5. Р. 954-961.