СПОСОБ ОЦЕНКИ ИММУНОГЕННОСТИ ПРОТИВОБРУЦЕЛЛЕЗНЫХ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ
METHOD OF EVALUATING IMMUNOGENECITY OF ANTI-BRICELLOSIS VACCINE STRAINS

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к способам экспресс-оценки иммуногенности вакцинных штаммов бруцелл.
Известен способ оценки иммуногенности противобруцеллезных штаммов путем иммунизации животных испытуемыми вакцинными препаратами с последующим заражением их вирулентным штаммом возбудителя бруцеллеза (Иванов М.М., Складчикова Р.В. - Сравнительная оценка применения бруцеллезных вакцин. /Ж. - Ветеринария. - 1970. №4. - с.53).
Известно также несколько способов оценки напряженности иммунитета путем определения содержания поствакцинальных противобруцеллезных антител в сыворотке крови с использованием серологических тест-систем (РА, РСК, РДСК, РНГА, РБП, ИФА) Салмаков К.М. - Живая вакцина против бруцеллеза из штамма 82. /Ж. - Ветеринария, 1975, №7, с.43-45; Новицкий А.А., Попова Т.Г., Масанов Ц.Н. Серологические показатели у коров после иммунизации противобруцеллезными вакцинами по различным схемам и после заражения. //Сб. науч. тр. ВАСХНИЛ ВНИИБТЖ. - Бруцеллез сельскохозяйственных животных. Омск. - 1989. - (С.33-40); Вершилова П.А., Чернышева М.И., Князева Э.Н. - Патогенез и иммунология бруцеллеза /Кн.: - М.: Медицина, 1974. - (С.79-148).
Недостатком указанных способов является то, что для подтверждения достоверности результатов серологических реакций и для оценки иммуногенности испытуемых вакцин путем иммунизации и последующего заражения требуется использование лабораторных и сельскохозяйственных животных и длительный срок получения ответа (до 6 мес.).
Из RU 2149184 С1, 20.05.2000 г. известен способ оценки иммуногенности противобруцеллезных вакцинных штаммов путем определения скорости элиминации из организма иммунизированных животных бруцелл контрольного штамма В.abortus KB 13/100-ДЕП, который может быть принят за прототип.
Недостатком способа является иммунизации животных испытуемым штаммом, введение им через 91 день контрольного штамма, убой животных через 30-35 дней, посев органов на питательные среды и проведение бактериологических исследований через 4-5 дней инкубирования посевов, т.е. для получения полного ответа об иммуногенности вакцины затрачивается 130 дней. Способ трудоемкий, длительный и дорогостоящий с обязательным использованием лабораторных животных.
Кроме того, недостатком способов иммуногенности вакцинных препаратов с использованием серологических реакций (PA, PCK, РНГА), включая иммуноферментный анализ (ИФА), является возможность получения недостоверной информации (т.е. ложноположительные результаты) из-за наличия блокирующих антител, феномена «прозоны», а также наличия в организме гетерологичных микроорганизмов (иерсиний, тулярензий), которые обусловливают ложноположительные серологические реакции на бруцеллез.
Известно, что при формировании противобруцеллезного иммунитета антителам принадлежит не ведущая, а вспомогательная роль, которые в создании противобруцеллезного иммунитета никакого участия не принимают (Ройт А., Бростофф Дж. Мейл Д. - Иммунология. Кн.: - М.: Мир. - 2000. - C. 20-160).
+
+
Установлено, что ключевая роль в создании противобруцеллезного иммунитета принадлежит клеточным факторам иммунитета, в частности Т-клеточной системе, включающей Т-лимфоциты (Т-хелперы, СД3, Т-супрессоры, СД4), а главное - Т-киллеры (цитотоксические Т-лимфоциты) (Курманова Г.М. и др. - Оценка иммунного статуса и дифференциальная коррекция при бруцеллезе. - Методические рекомендации. - Алматы, 2002. - 30 с.). Поэтому для оценки иммунного статуса при бруцеллезе используют иммунологические показатели, включающие количественное определение общего числа Т-лимфоцитов, Т-киллеров, Т-супрессоров, Т-хелперов и фагоцитарную активность в НСТ-тесте.
Однако способ является сложным, трудоемким, требующим большого набора различных реактивов и условий для его осуществления, количественное определение числа лимфоцитов и их субпопуляций не всегда отражают их функциональную активность и эффективность противобруцеллезной защиты.
Между тем известно, что центральную, патогенетическую роль в развитии или блокировании бруцеллезного процесса играют медиаторы иммуногенеза-цитокины, в частности интерлейкины - 1β (ИЛ-1β), интерлейкин-6 (ИЛ-6), гамма-интерферон (γ-ИНФ), а также фактор некроза опухолей (ФНФ-α) (Симбирцев А.Е. /Журнал. - Цитокины и воспаление. 2002. - №1. - C.9-16). Поэтому при борьбе с бруцеллезом в последние годы активно используют цитокины, в частности циклоферон, ронколейкин, реаферон, интерферон (Журина Е.В. - Препараты интерферона в комплексном лечении больных бруцеллезом. - Авт. дисс… канд. мед. наук. Алматы, 1993, 23 с.; Ершов Ф.И. и др. - Циклоферон: Итоги и перспективы клинического применения./ - СПб, 2000).
Следовательно, для оценки иммунного статуса и проверки эффективности противобруцеллезных (лечебно-профилактических) препаратов важное значения приобретает определение уровня цитокинов, стимулированных специфическими агентами (антигенами, вакцинами, химическими или другими биологически активными веществами). Цитокины начинают синтезироваться клетками иммунной системы (лимфоцитами, моноцитами, макрофагами, микрофагами) только при наличии чужеродного агента в организме, каковыми являются антигены микроорганизмов.
В связи с этим известен способ оценки иммуногенности противочумных и противохолерных вакцин и сывороток по цитокинову профилю методом иммуноферментного анализа (ИФА) (Шанина Л.Н. - Аутоиммунные реакции при чумном и холерном вакцинальном и инфекционном процессах, методы их коррекции. - Автореф. дисс…. докт. мед. наук. - Саратов, 1983. - 40 с.) Для обнаружения уровня интерферона (ИФН), интерлейкинов (ИЛ) 1β и 4, фактора некроза опухоли - α (ФНО-α) в сыворотке крови использовали иммуноферментные тест-системы ООО «Цитокин» (Санкт-Петербург). Принцип анализа - «Сэндвич» - вариант твердофазного трехстадийного или двухстадийного иммуноферментного анализа на планшетах. При этом установлено, что спонтанная или индуцированная продукция цитокинов осуществляется не только в условиях организма (in vivo), но и в условиях in vitro, т.е. культурами клеток иммунной системы и периферической крови при инкубировании их на питательных средах в присутствии индукторов цитокинов (антигенов, химических и биологических агентов) (Симбирцев А.С. - Цитокины и воспаление, 2002. - №1. - C.9-16). Спонтанная или индуцированная испытуемыми агентами продукция цитокинов культурой мононуклеаров (фагоциты, моноциты, лимфоциты) периферической крови позволяет оценить состояние активизации иммунокомпетентных клеток под антигенным стимулом в условиях как in vitro, так и in vivo (Демьянов А.В., Котов А.Ю., Симбирцев А.С. /Журнал - Цитокины и воспаление, 2003. - №3. - С 20-35). Однако информация по оценке иммуногенности противобруцеллезных вакцинных штаммов по цитокинову профилю методом иммуноферментного анализа отсутствует.
Задачей изобретения является разработка способа, позволяющего проводить экспресс-оценку иммуногенности различных вакцинных штаммов бруцелл in vitro без использования лабораторных и сельскохозяйственных животных и сокращение времени исследования.
Поставленная задача решается тем, что в способе оценки иммуногенности противобруцеллезных вакцинных штаммов, предусматривающем исследование биологической жидкости на наличие иммунорегуляторных цитокинов в иммунохимической тест-системе, согласно изобретению наличие иммунорегуляторных цитокинов определяют иммуноферментным анализом культуральных супернатантов клеток периферической крови на содержание: фактора некроза опухолей (ФНО-α), интерлейкина - 1β (ИЛ-1β) и колониестимулирующего фактора (КСФ), синтезированных мононуклеарами, периферической крови in vitro под воздействием антигенов бруцелл и по соотношению указанных цитокинов 1-1,25 (ФНО-α): 2-2,50 (ИЛ-1β): 3-3,70 (КСФ) определяют иммуногенность изучаемых штаммов бруцелл.
Отличительными признаками предложенного способа являются определение иммуноферментным анализом в культуральных супернатантах клеток периферической крови содержания иммунорегуляторных цитокинов-фактора некроза опухолей (ФНО-α), интерлейкина - 1β (ИЛ-1β) и колониестимулирующего фактора (КСФ), синтезированных мононуклеарами периферической крови in vitro под воздействием антигенов бруцелл, определение иммуногенности изучаемых штаммов бруцелл по соотношению указанных цитокинов 1-1,25 (ФНО-α): 2-2,50 (ИЛ-1β): 3-3,70 (КСФ).
Это позволяет получить предварительную экспресс-информацию об иммуногенности вакцинных штаммов бруцелл, сократить время исследований с 90 дней до 130 дней, а также значительно сохранить поголовье ценных лабораторных и сельскохозяйственных животных.
Способ экспресс-оценки иммуногенности противобруцеллезных вакцинных штаммов осуществляют следующим образом.
Начальным этапом исследований является приготовление специфических антигенных фракций бруцелл путем радиоинактивации и лизиса микробных клеток. В качестве источника испытуемых антигенов-индукторов цитокинов в in vitro тест-системе используют инактивированные гамма-лучами антигены из штаммов В.abortus 19, R-1096,82,82-Пч,82Ц, RB-51,19-США, единый бруцеллезный антиген.
6
Инактивацию бакмассы бруцелл проводят путем облучения культур на гамма - установке «Исследователь» при мощности экспозиционной дозы (0,4-1,4)·10 Р/ч и неравномерности дозного поля в рабочем объеме не более 10% к температуре от 18 до 40°С. Радиоинактивированные бруцеллы (радиоантигены) лизируют в растворе, приготовленном на 0,052-0,125 М трис HCl-буфере, рН 6,8, содержащем 2-5% додецилсульфата натрия и 5% меркаптоэтанола. Бактериальные клетки в лизирующем растворе прогревают на кипящей бане в течение 1 мин, центрифугируют и супернатанты используют в качестве испытуемых антигенов-индукторов цитокинов в in vitro тест-системе.
2
Для определения спонтанной и индуцированной продукции цитокинов мононуклеарами периферической крови 0,6 мл гепаринизированной крови кроликов (20 МЕ/мл) смешивают с 2,4 мл среды Игла с добавлением 2 мМ глутамина и 80 мкг/мл гентамицина. Таким образом, кровь разводят в 5 раз. В 96-луночный планшет для культивирования клеток в лунки каждого ряда вносят по 100 мкл среды Игла. Приготовленные образцы периферической крови тщательно перемешивают и вносят по 100 мкл во все лунки ряда. Культивирование проводят в СО-инкубаторе в течение 24 часов, после чего осторожно отбирают супернатанты и исследуют на наличие изучаемых цитокинов. Культивирование проводят без и в присутствии потенциальных индукторов цитокинов - испытуемых антигенов, которые вносят в инкубационные среды в количестве 5-10 мг/мл по сухому веществу. Уровень цитокинов в супернатантах клеток, культивируемых в отсутствие индукторов, оценивают, как и «спонтанную продукцию цитокинов мононуклеарами периферической крови», а уровень цитокинов в супернатантах клеток, культивируемых в присутствии индукторов - испытуемых антигенов бруцелл - как «индуцированную продукцию цитокинов».
Уровни спонтанной и индуцированной продукции цитокинов (ИЛ-1β, ФНО-α и КСФ) в супернатантах определяют с помощью стандартных тест-систем, разработанных в Государственном НИИ особо чистых препаратов (Санкт-Петербург) и производимых фирмой «Протеиновый контур» (Санкт-Петербург), на основе «сэндвич» - метода твердофазного иммуноферменткого анализа (ИФА) с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента (ст. Лобковой Ю.С. и др. - Цитокиновый профиль как критерий оценки специфической иммунотерапии атопических аллергических заболеваний. - Ж. Иммунология, 1999. - №2, с.35-38).
Подготовку реагентов, проведение анализа и оценку результатов проводят согласно «Инструкциям по применению наборов для иммуноферментного анализа ФНО-α, КСФ и ИЛ-1β», приложенным к наборам.
По результатам иммуноферментного анализа супернатантов с испытуемыми антигенами определяют наиболее активный индуктор цитокинов всех 3 семейств (ИЛ-1β, КСФ, ФНО-α), совместно обеспечивающих регуляцию иммунного ответа на всех этапах его развития, в которой они играют ключевую роль. В целом эта группа эндогенных регуляторов обеспечивает самые разнообразные процессы, такие как: хемотаксис, изменение экспрессии антигенов и различных маркеров, переключение синтеза иммуноглобулинов, индукцию цитотоксичности макрофагов, формирование очага воспаления. В частности, интерлейкин 1β (ИЛ-1β) - многофункциональный цитокин с широким спектром действия, играет ключевую роль в развитии и регуляции неспецифической защиты и специфического иммунитета, один из первых включается в ответную защитную реакцию организма при действии патогенных факторов.
Основными продуцентами ИЛ-1β являются мононуклеары (макрофаги, моноциты, лимфоциты, фибробласты). ИЛ-1β инициирует и регулирует воспалительные, иммунные процессы, активирует нейтрофилы, Т- и В-лимфоциты, повышает хемотаксис, фагоцитоз, гемопоэз, цитотоксическую и бактерицидную активность, повышает литическую активность NK (киллеров) и инициирует лимфокинактивированные киллеры.
Колониестимулирующий фактор (КСФ) - цитокин, стимулирующий гемопоэз, продуцируется мононуклеарными фагоцитами, индуцирует рост и дифференциацию незрелых костномозговых клеток в разные типы клеток миелоидного ряда; при этом ускоряет процесс созревания предшественников гранулоцитов и мононуклеарных фагоцитов.
Фактор некроза опухолей (ФНО-α) является продуктом метаболизма моноцитов (макрофагов, эндотелиальных, тучных и миелоидных клеток, лимфокинактивированных киллеров, активированных Т-лимфоцитов). ФНО-α образуется при действии на Т-клетки антигенов и патогенов значительно раньше, чем другие цитокины. Существует три основных направления действия ФИО-α: цитотоксическое, направленное на клетки, пораженные патогенными агентами; иммуномодулирующее, вызываемое активацией макрофагов, нейтрофилов, эозинофилов и эндотелиальных клеток; влияние на метаболизм.
Опыты по определению уровня цитокинов в супернатантах клеток периферической крови, инкубированных в присутствии испытуемых антигенов различных штаммов бруцелл, показали, что цитокин-индуцирующая активность испытанных штаммов бруцелл была вариабельной (таблица 1).
Таблица 1
Уровень спонтанной и антигениндуцированной продукции цитокинов (в пг/мл) (М±м)
Индуктор
ТНФ-α
ИЛ-1β
КСФ
спонтанная
индуцированная
спонтанная
индуцированная
спонтанная
индуцированная
АГ из шт.19
9,8±1,9
26,9±1,7
15,3±2,5
59,3±2,9
19,1±3,3
138,8±7,3***
АГ из шт.19 США
9,3±2,1
31,8±3,3
14,5±2,9
51,9±2,5**
17,3±3,9
71,8±2,1**
АГ из шт.54
7,9±1,3
15,0±1,9*
15,9±3,3
151,8±9,8***
21,1±4,7
101,42±11,3***
АГ из шт.82
8,5±1,7
31,5±3,7
13,8±2,6
81,9±5,9**
18,9±5,1
119,2±15,3***
АГ из шт.82-Пч
8,8±2,3
34,2±4,1
14,1±2,2
76,8±4,5**
17,5±4,3
119,7±9,9***
АГ из шт.82-ц
7,8±2,1
31,5±3,5
13,9±2,3
76,8±3,9**
18,3±5,5
114,1±7,7***
АГ из шт.R.-1096
8,1±3,3
31,8±4,4
13,7±2,9
125,33±10,3***
19,3±3,9
62,5±2,7**
Как видно из таблицы 1, наиболее активным индуктором всех исследованных классов цитокинов является антиген из шт.82, который вызывал усиление спонтанной продукции ТНФ-α в 3,70 раза (Р<0,05), ИЛ-1β-3,93 раза (Р<0,01) и КСФ - в 6,31 раза (Р<0,001). Антиген из шт.82 Пч по цитокининдуцирующей активности обладал почти идентичной активностью, незначительно (в 1,07 раза, Р>0,05) уступая по интерлейкин (ИЛ-1β)-индуцирующей активности антигену из шт.82, имея равную степень активности по способности синтезировать цитокины ТНФ-α и КСФ. Антиген из шт.82Ц имел аналогичную активность по способности усиливать продукцию цитокинов всех 3 классов, отличаясь от предыдущих двух штаммов весьма незначительно, уступая по КСФ-стимулирующей активности предыдущим антигенам только в 1,04 раза (Р>0,05), уступая по интерлейкин-1β - индуцирующей активности антигену из шт.82Пч, имея равную степень активности по способности синтезировать цитокины ТНФ-α и КСФ. В отличие от вышеуказанных антигенов бруцелл, антигены из штамма 19, 19 США и шт. R-1096, оказались наименее активными усилителями цитокинов. Как видно из данных таблицы 1, ни один из них не является активатором всех 3 классов цитокинов, поскольку они являются усилителями только одного класса цитокинов. Так, антиген из шт.19 является усилителем цитокина КСФ - (138,8±7,3 пг/мл), шт. 19 США-ТНФ-α-(31,8±3,3 пг/мл) и шт.R-1096 цитокина ИЛ-1β - (125,3±10,3 пг/мл). Указанные антигены бруцелл по способности синтезировать остальные классы цитокинов значительно (в 2,5 раза, чем АГ из шт.КВ-51; 1,39 раза, чем АГ из шт-82 и в 1,30 раза, чем АГ из шт.82. Пч и 82 Ц) уступали антигенам из других штаммов бруцелл. Что касается антигена из шт.RB-51, то он, в отличие от первых 3 названных антигенов, отличается низкой активностью по способности синтезировать ТНФ-α.
По способности усиливать синтез иммунорегулирующих цитокинов (ТНФ-α, ИЛ-1β, КСФ) в модельной in vitro тест - системе (инкубирование цитокининдуцирующих клеток периферической крови) испытанные антигены из штаммов бруцелл образуют следующей убывающий ряд: АГ из шт. 82<АГ из шт. 82Пч<АГ из шт. 82ц<АГ из шт. RB-51<АГ из шт. 19<АГ из шт. R1096<АГ из шт. 19 США.
Предлагаемый способ отличается от прототипа тем, что для оценки поствакцинального иммунитета используется супернатант клеток периферической крови интактных животных, полученный путем инкубирования их в присутствии испытуемых антигенов из штаммов бруцелл и определения концентрации ключевых цитокинов иммуногенеза (ИЛ-1β; ТФН-α и КСФ) в ИФА. Установлено, что наиболее активные усилители иммунорегуляторных цитокинов (антиген из шт.82, 82 Пч, 82 Ц) обеспечивают синтез всех трех классов цитокинов, составляя соотношения их активности - 1-1,25 (ТНФ-α): - 2-2,50 (ИЛ-1β): - 3-3,70 (КСФ). Использование других антигенов (шт.RB-51, 19, 19 - США, R-1096) не обеспечивало полноценный синтез иммунорегуляторных цитокинов, что приводило к нарушению соотношения активности цитокинов (например, для шт.19 это соотношение составляло 0,8 (ТНФ-α): 2,26 (ИЛ-1β):5,30 (КСФ): для шт. 19 США - 1:1,64:2,29; для шт. RB-51-0,5 (ТНФ-α): 10 (ИЛ-1β): 6,73 (КСФ); для шт. R-1096-1 (ТНФ-α):4,03 (ИЛ-1β):1,93 (КСФ).
Способ оценки иммуногенности вакцинных штаммов бруцелл иллюстрируется следующим примером.
9
3
Пример. Проверку эффективности предлагаемого способа оценки иммуногенности различных вакцинных штаммов бруцелл и установки корреляции между цитокининдуцирующей активностью штаммов и их иммуногенностью проводили на морских свинках живой массой 400-450 г. Животные были разделены на 7 групп по 10 особей в каждой и были подвергнуты иммунизации испытуемыми штаммами бруцелл. Животным 1-й группы однократно подкожно вводили вакцину из шт.19 в дозе 0,46×10КОЕ в объеме 1 см в область паха; 2-й группы - в аналогичных условиях и дозе - вакцину из шт.19 США; 3-й группы - вакцину из штамма 82; 4-й - вакцину из шт.82 Пч; 5-й - вакцину из шт.82 Ц; 6-й - вакцину из шт.R-1096; 7-й - вакцину из шт.рВ-51.
3
Через 3 мес после иммунизации животных заражали культурой вирулентного штамма В.abortus 54 М ВГНКИ, подкожно, в области паха, со стороны, противоположной месту введения вакцины, в объеме 1 см в дозе 83 КОЕ (16 минимальных инфицирующих доз).
Спустя 1 мес после заражения провели эвтаназию морских свинок с проведением бактериологических исследований. Высевы из органов и лимфатических узлов осуществляли на печеночный бульон и два косячка эритрит агара. Посевы инкубировали в течение 15 сут и с 3-кратным просмотром роста бруцелл с интервалом в 3 сут. Определяли индекс инфицированности (ИИ) по общепринятой в микробиологии методике (кн.: Студенцов К.П. Бруцеллез животных. Научные и практические основы борьбы. Алма-Ата, «Кайнар». - 1975. - 68 с.). По результатам исследований устанавливали процент иммунных животных в той или иной группе.
Результаты сравнительного изучения эффективности применения различных штаммов В.abortus на морских свинках показали (таблица 2), что при использовании вакцины из шт.19 (1-й вариант), шт.19 США (2-й вариант), шт.82 (3-й вариант), шт.R-1096 (6-й вариант) заразилось по 6, 7, 8 и 6 животных, что составляет 40, 30, 20 и 40% защиты соответственно. В отличие от них, в группах 3,4,5, иммунизированных вакцинными шт.82, 82 Пч и 82 Ц, процент защиты составил соответственно 80, 60 и 70%.
Из результатов сопоставительного анализа данных по определению уровня иммунорегуляторных цитокинов в супернатантах культуральных жидкостей клеток периферической крови in vitro и результатов иммунизации животных с последующим заражением вирулентной культурой возбудителя бруцеллеза in vivo просматривается четкая корреляция между цитокининдуцирующей активностью антигенов бруцелл и формированием устойчивости иммунизированных животных к последующему заражению их вирулентным штаммом возбудителя. При этом основным условием является оптимальное соотношение, синтезируемых под воздействием испытуемых антигенов бруцелл иммунорегуляторных цитокинов: ТНФ-α, ИЛ-1β и КСФ, которое составляет 1-1,25; 2-2,50; 3-3,70 соответственно. Любые нарушения этих соотношений как в сторону увеличения или уменьшения, ведут к снижению иммуногенности противобруцеллезных вакцинных штаммов.
Таким образом, техническим результатом изобретения является обеспечение возможности проведения экспресс-оценки, т.е. сокращение времени исследования, иммуногенности вакцинных штаммов бруцелл in vitro без использования лабораторных и сельскохозяйственных животных.