КЛОН КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНОГО MUS MUSCULUS L. Н-24-ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К СТАФИЛОКОККОВОМУ ЭНТЕРОТОКСИНУ Н (SEH)
CLONE OF CULTIVATED HYBRID ANIMAL CELLS MUS MUSCULUS L.H-24-PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN H (SEH)

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к медицинской микробиологии и иммунологии, конкретно к гибридомной технологии, и может быть использовано для иммунохимического выявления стафилококкового энтеротоксина Н (SEH) в животноводстве, пищевой промышленности и медицине. Изобретение представляет собой клон гибридных клеток Н-24 животного Mus Musculus L. - продуцент в клеточных культурах и брюшных полостях сингенных животных моноклонального антитела (МА) к SEH. МА Н-24 может быть использовано в диагностических тест-системах для количественного выявления SEH в пищевых продуктах и клинических образцах. Использование изобретения (Н-24) позволит достоверно выявлять SEH различными иммунохимическими методами: вестерн-блотт-анализом; непрямым ИФА в диапазоне от 0,01 до 10 нанограмм в экспериментальной точке; сэндвич ИФА в комбинации с образующим диагностическую пару антителом Н-18 в диапазоне концентраций от 0,2 (минимальный предел определения) до 3 нг/мл.
Уровень техники
Болезнетворные штаммы Staphylococcus aureus вызывают различные заболевания от легких кожных до смертельно опасных, в том числе и послеоперационных, часто являются причиной внутрибольничных инфекций. Staphylococcus - грам-каталазо-положительные факультативные аэро-анаэробные сферические, не спорообразующие, неподвижные бактерии, собирающиеся в пары, короткие цепочки или виноградные грозди. Стафилококки повсеместно распространены в природе и могут быть найдены в воздухе, пыли, сточных водах, водоемах, на любых поверхностях окружающей среды, в различных живых организмах, в том числе и людях.
Болезнетворные штаммы стафилококков продуцируют энтеротоксины (SEs), способные вызывать рвоту и гастроэнтерит у приматов. SEs - глобулярные белки из одной полипептидной цепи с молекулярной массой от 22 до 30 кДа, устойчивые к действию температуры и протеолитических ферментов, таких как трипсин, папаин, химотрипсин. SEs являются суперантигенами, не специфически активирующими Т-лимфоциты, с последующей шоку, часто с летальным исходом.
Наиболее типично заражение золотистым стафилококком молока и молочных продуктов, так как золотистый стафилококк является частой причиной мастита - болезни коров. Показано, что в изолятах S. aureus от животных, больных маститом, часто выявляется ген seh, такие микроорганизмы способны секретировать SEH в окружающую среду, например молоко. Кроме того, SEH стафилококков способен индуцировать апоптоз эпителиальных клеток молочной железы коров [Liu Y., Chen W., Ali Т., Alkasir R., Yin J., Liu G., Han B. Staphylococcal Enterotoxin H Induced Apoptosis of Bovine Mammary Epithelial Cells in Vitro. Toxins 2014, 6, 3552-3567.]. Применение в научно-исследовательских целях сэндвич иммуноферментного анализа на основе поликлональных антител для выявления SEH описано в работе Сакаи с соавт. [Sakai F., Ihara Н., Aoyama K., Igarashi Н., Yanahira S., Ohkubo Т., Asao Т., Kozaki S. Characteristics of Enterotoxin H-Producing Staphylococcus aureus Isolated from Clinical Cases and Properties of the Enterotoxin Productivity. Journal of Food Protection, Vol. 71, 2008, P. 1855-1860.]. С технологической точки зрения использование поликлональных антител нецелесообразно, так как поликлональные антитела являются не возобновляемым продуктом, их каждый раз необходимо получать и характеризовать вновь, что не обеспечивает стабильной воспроизводимости результатов, также возможны иммуноперекрестные реакции. В настоящее время не существует технологических чувствительных методов экспресс-определения SEH. Необходима разработка аналитических методов детекции SEH на основе МА, направленных против уникальных эпитопов белка, обеспечивающих воспроизводимость и стабильность результатов.
Пищевые стафилококковые отравления диагностируют восстановлением бактериальной культуры из остатков пищи, что осложняется термочувствительностью бактерий S. aureus, в отличие от SEs [Bryan F.L.; Guzewich J.J.; Todd E.C.D. Surveillance of foodborne disease II. Summary and presentation of descriptive data and epidemiologic patterns; their value and limitations. J. Food Prot. 1997, 60, 567-578.]. В термообработанных пищевых продуктах бактерии золотистого стафилококка могут быть устранены без инактивации энтеротоксинов с сохранением их функциональной активности. Применение биологических тестов с использованием лабораторных животных ограничено продолжительностью метода (до трех суток), этическими нормами, недостаточными чувствительностью и специфичностью. Молекулярно биологические методы (полимеразная цепная реакция - ПЦР), как правило, обнаруживают гены, кодирующие энтеротоксины штаммов золотистого стафилококка, выделенных из загрязненных пищевых продуктов. Однако не дают информации о наличии SEs, в том числе и SEH, в продуктах.
Чувствительность и специфичность иммунохимических методов определяются в значительной степени качеством антител. Использование МА вместо поликлональных антител позволяет получать стандартизованные препараты, что увеличивает воспроизводимость анализа.
МА Н-24, продуцируемое клоном Н-24 гибридных клеток животного Mus musculus, может служить основой иммунохимической тест-системы для определения SEH в различных форматах: непрямой иммуноферментный анализ (определение сорбированного на пластик препарата), сэндвич иммуноферментный анализ (ИФА), в том числе и с флуоресцентной меткой, дот-анализ, латекс-агглютинация, биочипы с иммобилизованными антителами, латеральная иммунодиффузия. МА Н-24 в сочетании с МА Н-18 составляет детектирующую или диагностическую пару антител, способную специфически выявлять SEH на фоне присутствия других SEs в различных биологических смесях, таких как пищевые продукты и клинические образцы.
В сэндвич варианте иммуноферментного анализа Н-24 в качестве иммобилизованных антител "захвата" взаимодействуют с токсином в исследуемом препарате. Для детекции используют антитела к токсину, антигенная детерминанта которых находится в другом участке белковой глобулы токсина. Антитела детекции и антитела "захвата" взаимодействуют с антигеном, не препятствуя друг другу. Антитела детекции, меченные меткой (флуоресцентной, ферментной, люминесцентной, биотином, частицами золота и квантовыми точками), выявляют токсин. Сравнение полученных данных о концентрации метки с калибровочной кривой, построенной с использованием SEH известной концентрации, позволяет количественно определить содержание SEH в исследуемом образце.
Предлагаемое изобретение решает задачу получения клона гибридных клеток - продуцента моноклональных антител, способного выявлять SEH в пищевых продуктах и биологических жидкостях в присутствии других SEs. Поставленная задача решается путем создания клона культивируемых гибридных клеток продуцента МА Н-24 животного Mus musculus L.
Раскрытие изобретения
9
-1
Изобретение представляет собой клон гибридных клеток животного Mus musculus L. Н-24 - продуцент в клеточных культурах и брюшных полостях сингенных животных МА, специфичного к SEH и используемого в качестве антитела детекции в диагностической паре иммуноферментной тест-системы формата сэндвич для выявления SEH. МА Н-24, продуцируемое клоном гибридных клеток животного Mus musculus L., относится к подклассу иммуноглобулинов G1, имеет легкую цепь к, взаимодействует с нативной и денатурированной формой SEH. Константа аффинности Н-24 составляет 1,0×10 М. МА Н-24 против SEH не взаимодействует с другими SEs.
МА Н-24 не конкурирует с МА Н-18 за антигенные эпитопы, что позволяет использовать это МА в качестве антитела «захвата» совместно с Н-18 в тест-системе формата сэндвич ИФА для выявления SEH. Тест-система пригодна для контроля пищевых продуктов и анализа биологических препаратов в медицинских целях. Использование изобретения позволит достоверно выявлять SEH, продуцируемый облигатными грамположительными бактериями Staphylococcus aureus, методом сэндвич иммуноферментного анализа в исследуемых образцах.
Также возможно индивидуальное использование МА Н-24 для выявления SEH в инфицированных клетках и тканях методами иммунофлуоресцентного и иммуноферментного анализов.
Авторское название клона культивируемых гибридных клеток животного Mus musculus L. - Н-24.
Родословная клона. Клон гибридных клеток получен путем слияния клеток мышиной миеломной линии SP2/0 с клетками, выделенными из подколенных лимфатических узлов мышей BALB/c, иммунизированных SEH. В качестве сливающего агента использовали 50% (w/v) раствор полиэтиленгликоля (HYBRY MAX, Sigma cat. N Р7181), гибридизацию проводили по методу Келлера и Мильштейна [ G, Milstein С.. Nature. 1975, 256(5517):495-7. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.] Клетки мышиной миеломной линии SP2/0 предварительно культивировали в среде ДМЕМ (Invitrogen, cat. N 52100-039), содержащей 5% (v/v) эмбрионанальной телячьей сыворотки (FCS, Invitrogen, cat. N 16000-044). Гибридизационную смесь переносили в 96-луночные культуральные планшеты (Costar, cat. N 3598) в среде ДМЕМ, содержащей 20% (v/v) FCS, 0.1 мМ гипоксантина, 16 мкМ тимидина и 0.4 мкМ аминоптерина (HAT, Sigma, cat. N Н0262). В планшеты за сутки до гибридизации помещали макрофаги из перитонеальной полости мышей для создания фидерного слоя. Рост гибридных клонов контролировали визуально под микроскопом, из лунок с выросшими клонами на 7-9 день отбирали культуральную жидкость и тестировали методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. В случае регистрации положительного ответа клетки отбирали, наращивали и дважды клонировали методом лимитирующих разведений в среде ДМЕМ, содержащей 20% FCS. Выход позитивных клонов в последнем клонировании составил 100%.
Свойства клона культивируемых гибридных клеток животного Mus musculus L. Н-24
1. Кариологическая характеристика. Кариотип клеток клона Н-24 по видовой принадлежности мышиный, по числу хромосом - 80.
2. Морфологическая характеристика. Клон Н-24 представлен клетками, морфологически близкими к исходной миеломной линии SP-2/0.
3. Маркерные признаки и методы их оценки. Клон секретирует мышиные иммуноглобулины IgG1, имеющие легкую цепь к и специфически взаимодействующие с SEH. Анализ антигенсвязывающей активности мышиных иммуноглобулинов проводят методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа, используя в качестве антигена SEH и антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.
4. Контаминация бактериями и грибами не обнаружена.
2
5. Культуральные свойства. Среда для культивирования - ДМЕМ, содержащая 20% FCS. Клон является монослойно-суспензионной культурой, в которой до 60% клеток находится в суспензии, не прикрепляясь к поверхности посуды для культивирования. Клетки с поверхности культуральной посуды удаляются механически Посевная доза 200 тысяч кл/мл. Частота пассирования - через 2-3 суток. Температура культивирования - 37°С. Содержание СО в атмосфере культивирования - 5%. Индекс пролиферации - не менее 5. Стабильная продукция МА сохраняется на протяжении не менее 10 пассажей in vitro при непрерывном культивировании. Продуктивность клона in vitro составляет в величинах титра супернатанта (относительного содержания антител) при определении методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа 1:10000 1:20000.
6. Культивирование гибридного клона Н-24 в организме животного. Имбредным мышам линии BALB/c предварительно вводят внутрибрюшинно 0,2 мл пристана (2,6,10,14 - тетраметилпентадекан, Sigma). Через 7-10 дней животным вводят внутрибрюшинно 10 млн гибридных клеток. Асцитная опухоль формируется на 7-10 день. Гибридомы прививаются в 100% случаев. От одного животного можно получить 3-10 мл асцитной жидкости, содержащей МА. Гибридный клон сохраняет способность продуцировать антитела на постоянном уровне (контроль по титру - относительному содержанию антител) при перевивании клеток животным на протяжении 6 пассажей (срок наблюдения). Относительное содержание антител (титр МА) в асцитных жидкостях, определенное методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа, составляет для Н-24 не менее 1:1000000. Из одного миллилитра асцитной жидкости можно получить не менее 3,5 мг очищенных МА.
а
9
-1
7. Биотехнологическая характеристика полезного продукта. Типирование гибридомных иммуноглобулинов проводят методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью коммерческого набора «Rapid ELISA mouse mAB isotyping kit»(«Thermo scientific)) cat. N 37503) согласно рекомендациям производителя. MA относится к IgG1, имеет легкую цепь типа к. Константу аффинности МА Н-24 определяют по методу Биатти непрямым твердофазным иммуноферментным анализом [Beatty, J.D., Beatty B.G., Vlahos W.G. Measurement of monoclonal antibody affinity by non-competitive enzyme immunoassay. J. Immunol. Methods. 1987. V. 100. P. 173-179.]. Для этого в лунки ИФА-планшетов сорбируют различные количества SEH, блокируют свободные центры связывания пластика и вносят раствор антител в последовательных двукратных разведениях от 10 до 0.001 мкг/мл. После чего добавляют конъюгат кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши с пероксидазой хрена, иммунохимическую реакцию визуализируют с помощью хромогенного субстрата - орто-фенилендиамина. Константы аффинности вычисляют по формуле К=(n-1)/2(n[Ab']-[Ab]), где [Ab'] - концентрация антител, соответствующая 50% связыванию при сорбции SEH 20 нг на лунку, а [Ab] - концентрация антител, соответствующая 50% связыванию при сорбции SEH 50 нг на лунку. Отношение концентраций антигена выражается буквой n, в данном случае n=2.5. Константа аффинности Н-24 1,0×10 М. МА специфически взаимодействует с SEH в вестерн-блотт-анализе, т.е. узнает денатурированную форму SEH.
8. Криоконсервирование. Среда для замораживания: 90% (v/v) FCS, 10% (v/v) диметилсульфоксид. Клеточную суспензию в среде для замораживания в объеме 0.6-1 мл переносят в пластиковые криопробирки и помещают в пенопластовый контейнер с толщиной стенок не менее 1.5 см. Контейнер вносят в пары жидкого азота и после замерзания (через 4-5 часов) пробирки переносят в жидкий азот. Размораживание проводят, опуская пробирки в воду с температурой 37-41°С. Клетки разводят средой ДМЕМ и центрифугируют при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в среде ДМЕМ, содержащей 20% FCS, и переносят в культуральные флаконы в концентрации 200-300 тысяч/мл. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 80-95% (по результатам окрашивания 0,25% трипановым синим). Каждая ампула содержит не менее 106 клеток.
2
4
2
4
9. Способ получения заявляемого клона. Клон гибридных клеток Mus musculus L. Н-24 получают следующим образом. Мышей BALB/c массой 15-20 г иммунизируют подкожно SEH в количестве 15 мкг на одну мышь. Первую иммунизацию проводят в полном адъюванте Фрейнда, следующие - в неполном, интервал между инъекциями составляет 2 недели. Перед инъекцией раствор SEH в PBS (3 мМ KCl, 1 мМ KHPO, 140 мМ NaCl, 9 мМ NaHPO) эмульгируют с равным объемом адъюванта.
2
4
2
2
Для слияния используют соотношение клеток подколенных лимфатических узлов мышей BALB/c и клеток мышиной миеломы SP2/0 - 2:1. Смесь клеток центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 минут, надосадочную жидкость удаляют и к клеточному осадку добавляют 0,6 мл 50%) раствора полиэтиленгликоля. После инкубации в течение 1 минуты гибридизационную смесь медленно разбавляют 35 мл среды ДМЕМ в течение 14 минут, после инкубации в течение 7 минут клетки центрифугируют 10 мин, 1000 об/мин и ресуспендируют в среде ДМЕМ, содержащей 20% FCS и HAT. Клетки помещают в 96-луночные культуральные планшеты (Costar, cat. N 3598) с заранее приготовленным фидерным слоем из перитонеальных макрофагов по 100 мкл в лунку. Рост гибридных клонов контролируют визуально под микроскопом, из лунок с выросшими клонами на 7-9 день отбирают культуральную жидкость и тестируют методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. SEH вносят в лунки ИФА-планшетов (Costar cat. N 9017) по 50 нг на лунку в 0.05М карбонатном буфере (рН 9.6) и сорбируют в течение ночи при +4°С. Свободные центры связывания пластика блокируют 1% (w/v) раствором желатина в PBS в течение 30 мин. Затем в лунки планшета вносят культуральную жидкость и инкубируют 1 час при комнатной температуре. После инкубации планшеты отмывают раствором PBST (PBS, 0,1% v/v Tween 20), добавляют конъюгат кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши с пероксидазой хрена (DAKO, cat. N Р0260) и инкубируют 40 мин. В качестве субстрата используют 4 мМ раствор орто-фенилендиамина в цитрат-фосфатном буфере (26 мМ лимонная кислота, 50 мМ NaHPO, рН 5.0), содержащем 0,03% (v/v) НО. После развития окраски реакцию останавливают добавлением равного объема 10% (v/v) серной кислоты и определяют оптическое поглощение при длине волны 490 нм с помощью мультипланшетного ридера Anthos 2020. Клетки из лунок, содержащих антитела против SEH, наращивают и дважды клонируют методом лимитирующих разведений, культивируют и замораживают в жидком азоте.
Изобретение иллюстрируют графические материалы.
Фиг. 1. Калибровочный график для определения SEH МА Н-24 методом непрямого иммуноферментного анализа. Представлены три графика выявления SEH МА Н-24 с концентрациями 0,25, 0,5 и 1 мкг/мл. При концентрации МА Н-24 1 мкг/мл минимальное выявляемое количество иммобилизованного токсина составило 20 пикограмм в экспериментальной точке.
Фиг. 2. Калибровочный график для определения концентрации SEH в сэндвич-ИФА с иммобилизованными антителами «захвата» Н-24 и биотинилированными МА Н-18 в качестве детектирующих антител.
При анализе полученных данных оптическое поглощение рассчитывают как среднее значение от четырех одинаковых экспериментальных лунок иммунопланшета.
Предел обнаружения SEHопределяют как концентрацию, соответствующую значению оптического поглощения, превышающего, не менее чем на два стандартных отклонения, оптическое поглощение многократно измеренной нулевой точки.
Величину чувствительности определяют экспериментально, по полученным калибровочным кривым и рассчитывают следующим образом:
o
o
где IF - значение оптического поглощения для каждого измерения нулевой пробы; SD - среднее квадратичное отклонение от среднего арифметического значения IF.
SD вычисляют по следующей формуле
где  - среднее арифметическое значение оптического поглощения при измерении нулевой пробы; n - число измерений. Для представленной кривой чувствительность составляет 0,2 нг/мл.
Фиг. 3. Выявление SEH МА Н-24 в вестерн блотт-анализе. На дорожке 1 - 1 нанограмм SEH, выявленный МА Н-24 и антителами против иммуноглобулинов мыши, меченных пероксидазой хрена. Для визуализации иммунного комплекса использован люминесцентный субстрат пероксидазы. На дорожке 2 - маркеры молекулярных весов.
Таблица 1. Иммуноперекрестная реактивность МА Н-24 против SEH с SEs. За 100% принято максимальное взаимодействие антитела с SEH. Н-24 не взаимодействует с исследованными SEs.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Приведенные ниже примеры подробно раскрывают полезные свойства объекта изобретения.
Пример 1. Культивирование гибридных клеток клона Mus musculus L. Н-24, секретирующих МА к SEH в организме животных, мышей BALB/c
Мышам BALB/c весом 20-22 г не менее чем за 7 дней до введения гибридом вводят внутрибрюшинно по 0,2 мл пристана. Культивируемые клетки, находящиеся в логарифмической фазе роста, центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин на центрифуге Heraeus sepatech Omnifuge 2.0RS. Супернатант удаляют, а осадок клеток суспендируют в PBS. Мышам внутрибрюшинно вводят по 1 мл клеточной суспензии, содержащей не менее 10 млн гибридомных клеток. Через 7-10 дней животных усыпляют и в асептических условиях из брюшной полости извлекают 3-5 мл асцитной жидкости. Клетки из асцитной жидкости отделяют центрифугированием, а в надосадочной (асцитной) жидкости определяют титр МА с помощью непрямого твердофазного ИФА.
Пример 2. Выделение МА, секретируемых гибридными клетками клона Mus musculis L. Н-24, из асцитной жидкости
К одному объему асцитной жидкости приливают 2 объема PBS, а затем медленно, при постоянном перемешивании добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония. Осадок, сформированный в течение 18-24 часов, отделяют центрифугированием 15000 g в течение 30 минут при +4°С, растворяют в 20 мМ Трис-HCl буфере, рН 8.0 и диализуют против того же буфера. Далее проводят хроматографию умеренного давления на колонке Mono Q. Элюцию проводят в градиенте NaCl от 0 до 0.5 М.
Пример 3. Определение методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа специфического взаимодействия МА, продуцируемых гибридными клетками клона Mus musculus L. Н-24, с SEH
2
4
2
2
Специфическое взаимодействие МА с SEH оценивают методом непрямого твердофазного ИФА. SEH сорбируют по 50 нг на лунку в 0.05М карбонатном буфере (рН 9.6) в течение ночи, при +4°С на ИФА-планшеты (Costar cat. N 9017). Свободные центры связывания пластика блокируют 1% (w/v) раствором желатина в PBS в течение 30 мин. Затем в лунки планшета вносят образцы, содержащие антитела, и инкубируют 1 час при комнатной температуре. После инкубации планшеты отмывают раствором PBST (PBS, 0,1% v/v Tween 20), добавляют конъюгат кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши с пероксидазой хрена (DAKO, cat. N Р0260) и инкубируют 40 мин. В качестве субстрата используют 4 мМ раствор орто-фенилендиамина в цитрат-фосфатном буфере (26 мМ лимонная кислота, 50 мМ NaHPO, рН 5.0), содержащем 0.003% (v/v) НО. После развития окраски реакцию останавливают добавлением равного объема 10% (v/v) серной кислоты и определяют оптическое поглощение при длине волны 490 нм с помощью мультипланшетного ридера Anthos 2020. МА Н-24 специфически взаимодействуют с иммобилизованным SEH вплоть до концентрации 0,3 нг/мл.
Пример 4. Выявление в вестерн-блотт анализе взаимодействия МА Н-24, продуцируемого гибридными клетками клона Mus musculus L. Н-24, с SEH
Электрофоретический анализ препарата SEH проводят в градиентном 9-20% полиакриламидном геле в присутствии 2-меркаптоэтанола и додецилсульфата натрия в электрофоретической камере типа Bio-Rad Mini Protean Tetra System (Bio-Rad, США). Для облучения иммуноэлектрофореграммы содержимое геля переносят на нитроцеллюлозную мембрану protran ВА85 (Whatman cat. N 10402680) и разрезают ее на фрагменты, соответствующие белковым трекам. Фрагменты мембраны блокируют 1% (w/v) раствором обезжиренного сухого молока в PBST в течение 30 минут и инкубируют с Н-24, а затем с конъюгированными с пероксидазой хрена кроличьими антителами к иммуноглобулинам мыши. Нитроцеллюлозную мембрану на каждой стадии тщательно отмывают PBST. Сигналы визуализируют на фотопленке с помощью люминесцентного субстрата ECL (Pierce, cat. N 32106).
Пример 5. Сэндвич ИФА для выявления стафилококкового SEH
-3
В лунки ИФА-планшетов вносят МА Н-24 (антитело «захвата») в концентрации 10 мкг/мл в 0.05М карбонатном буфере (рН 9.6) по 100 мкл на лунку и иммобилизуют в течение ночи при +4°С. Свободные центры связывания пластика блокируют 1% раствором желатина в PBS в течение 30 мин., затем вносят SEH (начальная концентрация 100 нг/мл, далее проводят двукратные разведения SEH до 1×10 нг/мл) и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре. В качестве отрицательного контроля вносят SEs типов А, В, C1, D, Е, G и I. Затем в каждую лунку добавляют по 100 мкл антител Н-18, меченных биотином (антитело детекции), в концентрации 10 мкг/мл, инкубируют 1 ч при комнатной температуре, далее вносят конъюгат стрептавидина с пероксидазой хрена в разведении согласно инструкции производителя (Sigma cat. N S5512) и инкубируют 40 мин при комнатной температуре. После каждой стадии планшеты отмывают PBST. Реакцию визуализируют так же, как и в непрямом твердофазном ИФА. Нижним пределом детекции, определяемым тест-системой, считают концентрацию SEH, соответствующую значению оптической плотности при длине волны 490 нм, достоверно превышающую показатель фоновой оптической плотности тест-системы плюс два стандартных отклонения. Тест-система на основе МА Н-24 и Н-18 достоверно выявляет SEH вплоть до концентрации 0,2 нг/мл, не взаимодействуя при этом с SEs типов. А, В, C1, D, Е, G и I.
Пример 6. Определение SEH в молоке
В пастеризованное молоко вносят SEH до концентрации 12,5 нг/мл и тщательно перемешивают в течение 15 минут. Объем вносимого токсина не превышает 0,001% от объема образца. К молоку добавляют Tween 20 до концентрации 0,1% и используют в сэндвич ИФА для определения содержания токсина, как описано в примере 5. В качестве положительного контроля используют раствор токсина в PBST, а в качестве отрицательного контроля - молоко, в которое не вносят SEH. Далее проводят определение, как описано в предыдущем примере. Значения оптического поглощения при добавлении SEH в экспериментальные лунки с молоком и PBST не отличались. Были проверены образцы молока различной жирности: 3,2%, 2,5%, 1,5%. Тест-система, состоящая из МА Н-24 и биотинилированных Н-18, одинаково эффективно выявляет SEH во всех образцах, как в молоке, так и в PBST.
Пример 7. Определение SEH в сыворотке крови крупного рогатого скота
В сыворотку крови крупного рогатого скота вносят SEH до концентрации 12,5 нг/мл и тщательно перемешивают в течение 15 минут. Объем вносимого раствора SEH не превышает 0,001% от объема образца. К сыворотке добавляют Tween 20 до концентрации 0,1% и используют в сэндвич ИФА для определения содержания SEH, как описано в примере 5. В качестве положительного контроля используют раствор SEH в PBST, а в качестве отрицательного контроля - сыворотку крови, в которую не вносят SEH. Далее проводят определение, как описано в примере 5. Значения оптического поглощения при добавлении SEH в экспериментальные лунки с сывороткой крови и PBST не отличались. Тест-система, состоящая из МА Н-24 и биотинилированных Н-18, также эффективно выявляет SEH в сыворотке крови, как и в PBST.
Вышеприведенные свойства клона гибридных клеток Mus musculus L. Н-24 позволяют заключить, что на основе мышиной миеломы получены гибридомы - продуценты МА, специфически взаимодействующие с SEH, не взаимодействующие перекрестно с другими SEs, а также не конкурирующие за антигенные эпитопы SEH с детектирующим МА Н-18. Клон гибридных клеток Н-24 обеспечивает получение мышиных моноклональных иммуноглобулинов класса IgG1 (Н-24) в количестве не менее 3,5 мг очищенных антител из 1 миллилитра асцитной жидкости. Очищенные МА специфично взаимодействуют в ИФА с SEH; выявляют SEH в вестерн-блотт-анализе. Совместное использование МА Н-24 с Н-18 в формате сэндвич ИФА позволяет выявлять SEH с минимальным пределом определения 0,2 нг/мл.