СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕГЕНЕРАНТОВ РИСА В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВ IN VITRO
METHOD OF OBTAINING RICE REGENERATES IN ANTHER CULTURE IN VITRO

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к селекции растений и сельскохозяйственной биотехнологии и может быть использовано для ускорения селекционного процесса риса.
6
Известен способ получения регенерантов риса, в котором растения-доноры выращивают в тепличных условиях, включающий стерилизацию метелок, посадку пыльников на среду N, трансплантацию каллусов на среду MS, укоренение регенерантов на безгормональной среде MS и высадкой в теплицу (см., например, Gueye, Т. Ndir, K.N. In vitro production of double haploid plants from two rice species (Oryza sativa L. and Oryza glaberrima Steudt.) for the rapid development of new breeding material. Scientific Research and Essaya. 2010. Vol. 5 (7). P. 709-713).
Недостатком данного способа получения регенератное риса является:
- не определен период выращивания растений-доноров в течение года и интенсивность освещения на всех этапах;
- большие материальные затраты на реактивы для стерилизации метелок риса;
- низкая интенсивность каллусообразования.
6
Известен также способ получения регенерантов риса, включающий выращивание растений-доноров в идеальных полевых условиях, стерилизацию метелок, инокуляция пыльников на среду N, посадка каллуса на среду MS, укоренение на питательной среде MS с последующей высадкой в теплицу (см., например, Mishra, R., Rao, G.J.N., Rao, R.N. [et al.]. Development and characterization of elite doubled haploid lines from two Indica rice hybrids. Rice Science. 2015. Vol. 22, №6. P. 290-299).
Недостатком данного способа считаем:
- использован только один период выращивания растений-доноров в течение года, а именно летний полевой сезон;
- большие затрат на стерилизацию метелок, использование хлорсодержащего вещества, вредящего здоровью исследователей.
Известен способ получения регенерантов риса в культуре пыльников in vitro (прототип), включающий выращивание растений-доноров, стерилизацию метелок, посадку пыльников на питательную среду, получение каллуса, перенос его на регенерационную питательную среду, получение регенерантов и их укоренение на питательной среде с последующей высадкой растений в открытый грунт или в теплицы (см., например, Гончарова, Ю.К. Использование метода культуры пыльников в селекции риса. Краснодар: ВНИИ риса, 2012. 91 с.).
Недостатки способа получения регенерантов риса в культуре пыльников в прототипе:
- не определена продолжительность выращивания растений доноров, предполагается, что в летний полевой сезон;
- высокие материальные затраты на приобретение препаратов для стерилизации;
- большая трудоемкость стерилизации метелок риса.
Цель изобретения - повысить выход регенерантов риса в культуре пыльников in vitro за счет подбора результативных периодов выращивания растений-доноров в искусственных условиях, исключения процедуры стерилизации метелок и увеличения выхода пробирочных растений.
Указанная цель достигается тем, что способ получения регенерантов риса в культуре пыльников in vitro, включающий выращивание растений-доноров, стерилизацию метелок, посадку пыльников на питательную среду, получение каллуса, перенос его на регенерационную питательную среду, получение регенерантов и их укоренение на питательной среде, отличающийся тем, что семена растений-доноров высевают в климакамере в марте с получением пыльников в мае, которые без стерилизации переносят на среду для индукции каллуса и субкультивируют его на питательной среде с дальнейшим получением зеленых растений-регенерантов.
По сравнению с прототипом признаками изобретательского уровня предлагаемого способа получения регенерантов риса в культуре пыльников является следующее:
1. «… семена растений-доноров высевают в климакамере в марте с получением пыльников в мае …», это позволяет:
- сократить время и затраты на получение максимального количества каллуса и увеличить объем инокулируемого материала;
- увеличить интенсивность каллусообразования с весенних растений-доноров из климакамеры по сравнению с летними растениями в открытом грунте в 2,4 раза;
2. «… без стерилизации переносят на среду для индукции каллуса и субкультивируют его на питательной среде с дальнейшим получением зеленых растений-регенервнтов.», что позволяет:
- экономить время, так как на обработку стерилизующими агентами и промывку автоклавированной дистиллированной водой затрачивается ежедневно час рабочего времени и перенаправить его на инокуляцию пыльников;
- избежать воздействия на цветки риса стерилизующих агентов, которые являются дополнительными стрессорами для пыльников;
- сократить трудозатраты и снизить воздействие вредных веществ на исследователя (гипохлорид натрия - летучее хлорсодержащее вещество).
Признаки, указанные в отличительной части описания достижения цели доказывают, что заявляемый способ получения регенерантов риса в культуре пыльников in vitro обладает новизной. Совокупность признаков, приведенных в сравнении свойств заявляемого и известного решения, дает основание сделать вывод, что заявляемый способ имеет изобретательский уровень.
6
Предлагаемый способ получения регенерантов риса в культуре пыльников in vitro осуществляется следующим образом. Семена растений-доноров высевают 15 марта в сосуды с почвой и выращивают в климатической камере при температуре 24°С, влажности 60%, освещенности 15000 люкс, режиме дня 14 часов. Сбор метелок с растений-доноров осуществляют в мае в утренние часы, когда расстояние между флаговым и предпоследним листами составляет 5-10 см, метелка находится внутри флагового листа. Раскрытия влагалища флагового листа не допускается. Низкотемпературную обработку свежесрезанных метелок внутри растений-доноров проводят путем помещения стеблей с метелкой и листьями в цилиндр с водой при 5°С в течение семи дней. Извлечение метелки из влагалища флагового листа осуществляют в асептических условиях стерильным пинцетом в чашку Петри. Пыльники выделяют стерильным инструментом на предметных стеклах, выдержанных в сухожаровом шкафу при температуре 250°С в течение 2 часов в чашках Петри. Пыльники инокулируют по 2 шт. в пробирку диаметром 14 мм, содержащую питательную среду N, застывшую под углом 45°.
Проведенные в течение года ежемесячные эксперименты подтвердили результативность закладки опыта в марте (табл. 1). В качестве контроля служили растения-доноры, выращенные в сосудах в открытом грунте с конца мая до начала августа в естественных условиях открытого грунта.
Каллусогенез проходит в темноте при температуре 25-27°С до высыхания среды (два месяца). В отдельные месяцы каллусообразование отсутствует (февраль-апрель, октябрь-ноябрь), что свидетельствует о сезонной зависимости каллусообразования при равных условиях выращивания растений-доноров в климатической камере. Результаты свидетельствуют о существенном повышении интенсивности каллусообразования в мае - 120 шт. (43,48%), достоверное превышение над контролем составило 26,46% (табл. 1). Таким образом, установлено, что наиболее интенсивное каллусообразование отмечено в мае, при выращивании в контролируемых условиях.
В таблице 2 представлены результаты инокуляции пыльников на питательную среду без стерилизации.
Результаты свидетельствуют о большей асептической чистоте пыльников, полученных с растений-доноров в климатической камере (0,2%) по сравнению с пыльниками, выделенными из растений, выращенных в поле (7,2%). Это объясняется закрытостью метелки во влагалище листа риса, где сохраняется асептическая чистота в цветках риса, что позволяет исключить этап стерилизации метелок риса перед введением пыльников в культуру in vitro.
6
Регенерацию растений из каллуса проводят в пробирках диаметром 18 мм с ватно-марлевыми пробками на среде N в контролируемых условиях культуральной комнаты (температура 25°С, фотопериод 16/8 часов, интенсивности освещения 4000 люкс). Укоренение регенерантов осуществляют в пробирках диаметром 21 мм на питательной среде MS с половинным минеральным составом в аналогичных контролируемых условиях. Для дальнейшего получения семян регенеранты пересаживают в пластиковые стаканы с автоклавированным грунтом при 1 атм в течение часа.
Применение предлагаемого изобретения позволит эффективно вводить пыльники риса в культуру in vitro два раза в год, экономить время, реактивы и трудозатраты за счет отсутствия этапа стерилизации пыльников и существенно увеличить выход пробирочных растений-регенерантов риса в культуре пыльников.