Комплексные эффекты «Сальмозана» и пробиотических бактерий рода Lactobacillus на естественную резистентность и адаптивный иммунный ответ экспериментальных животных

Создание новых препаратов целенаправленной регуляции иммунологической реактивности и коррекции ее нарушений является актуальной медицинской проблемой. Большую группу иммуномодуляторов представляют препараты созданные на основе живых бактерий, их лиза-тов, компонентов бактериальной клетки-ЛПС, пептидигликаны, рибосомы, нуклеиновые кислоты, минимальные биологически активные фрагменты (Бронхомунал, Имудон, Проди-гиозан, Рибомунил, Иммуномакс и др.). В последние годы выявлен широкий спектр имму-нотерапевтических эффектов пробиотических препаратов, созданных на основе бактерий рода Lactobacillus (Лактобактерин, Ацилакт, Линекс, Трилакт и др.). Представители рода Lactobacillus являются одним из основных компонентов нормального микробиоценоза кишечника макроорганизма, важнейшей функцией которых является участие в формировании местной и системной иммуннорезистентности [2, 7, 8].

В ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН создан препарат «Сальмозан» представляющий собой полисахаридный компонент О-соматического антигена бактерий S. typhi (не менее 70% углеводов), не содержащий липидов и белков.

Вопросы взаимных эффектов воздействия им-муномодуляторов бактериального происхождения и представителей комменсальной микрофлоры кишечника в системе иммунологического контроля гомеостаза представляют определенный научный и практический интерес.

Целью настоящего исследования являлось изучение влияния препарата «Сальмозан» на показатели естественной резистентности и адаптивного иммунитета экспериментальных животных.

Материалы и методы

Эксперименты выполнены на линейных Balb/с, CBA и беспородных мышах (самцах весом 16-18 г), полученных из питомника «Столбовая» РАМН.

Препарат «Сальмозан» вводили мышам вну-трибрюшинно в дозе 20 мкг/мл. Бактерии рода Lactobacillus штамм L. plantarum, L. acidophilus per os в дозе 5 х 109 КОЕ/0,5 мл. Протективные свойства исследовали при заражении животных живыми бактериями Kl. pneumoniae в дозе 1 х 104 КОЕ/0,5 мл (внутривенно) и Ps. аeruginosa 1 х 105 КОЕ/0,2 мл (внутрибрюшинно).

Влияние препарата «Сальмозан» на продукцию цитокинов IL-1a, IL-12, IL-10 и TNFa пе-ритонеальными макрофагами мышей Balb/с оценивали иммуноферментным анализом; МИФ определялся в супернатантах клеток селезенки и пейеровых бляшек (ПБ) мышей на 7-е сутки после сенсибилизации в реакции торможения

миграции макрофагов; функциональную активность Т-, В-лимфоцитов и естественных киллеров оценивали по включению в спленоциты сенсибилизированных мышей CBA 3Н-тимидина и 3Н-уридина соответственно.

Статистическую обработку полученных данных проводили путем определения средних арифметических и средних геометрических значений с вычислением средних ошибок и доверительных интервалов. Достоверность полученных результатов оценивали с помощью критерия Стьюдента при р < 0,05.

Результаты

Показана протективная активность препарата «Сальмозан» в диапазоне доз от 20 мкг/мл до 0,02 мкг/мл при заражении Balb/c и беспородных мышей грам-бактериями (Kl. pneumoniae и Ps. aeruginosa). Эффект защиты составил 57-83% (рис. 1).

Сенсибилизация мышей препаратом «Саль-мозан» стимулирует продукцию цитокинов IL-1a, TNFa, IL-12 в перитонеальных макрофагах. Максимальные показатели отмечены спустя 3 часа после введения препарата in vivo и инкубации макрофагов in vitro в течение 24 часов (р < 0,05) (рис. 2). Клетки пейеровых бляшек (ПБ), стимулированные «Сальмозаном», вырабатывали TNFa. Продукция IL-10 в этот период не выявлена. Полученные данные свидетельствуют о способности «Сальмозана» активировать синтез медиаторов регулирующих и координирующих развитие клеточных иммунных реакций врожденного и адаптивного иммунных ответов, направленно опосредующих дифференцировку Т-хелперов в направлении Th1 субпопуляции. В реализации эффекта ведущая роль принадлежит IL-12, продуцируемого антигенпрезентиру-ющими клетками, который направляет диффе-ренцировку Т-лимфоцитов в CD4+Т-клетки.

Дальнейшие эксперименты подтвердили модулирующий эффект «Сальмозана» на функциональную активность клеточных факторов иммунного ответа. Анализ показателей цитоток-сической активности ЕК-клеток селезенки показал увеличение ее в 7 раз по сравнению с аналогичным показателем в интактном контроле при добавлении в среду культивирования препарата в дозе 20,0 мкг/мл при соотношении клеток-мишеней и эффекторов 1/10 (р < 0,05). Снижение дозы препарата (0,2 мкг/мл) не вызывало существенного снижения показателей (рис. 3).

О вовлечении в процесс CD4+ лимфоцитов свидетельствуют данные об увеличении продукции фактора, ингибирующего миграцию макрофагов (migration inhibitory factor-MIF) на 7 сутки в присутствии супернатантов клеток ПБ

А

20 10 0

110 100 90 80 70 60

1- 2- 3-

О 20 мкг

2 мкг

Контроль

Сутки

-Q-

2- 3-

О 20 мкг

42 мкг

7-

Сутки

Рисунок 1. Протективная активность препарата «Сальмозан» при и внутривенном введении бактерий Klebsiella pneumoniae в дозе 1 х 104 КОЕ/0,5 мл

и в меньшей степени селезенки мышей, сенсибилизированных «Сальмозаном» (рис. 4).

Показано увеличение пролиферативного потенциала интактных спленоцитов (in vitro) в присутствии препарата в дозе 2 и 0,2 мкг (р < 0,05).

Исследования функциональной активности иммунокомпетентных клеток мышей на 4-е сутки после введения препарата «Сальмозан» свидетельствуют о стимуляции Т-лимфоцитов в присутствии митогена КонА (р < 0,05) (рис. 5).

Важнейшим компонентом естественной резистентности макроорганизма является облигатная

флора, участвующая в поддержании иммунного гомеостаза, ведущими представителями которой являются бактерии рода Lactobacillus. В связи с этим определенный интерес представляло изучение сочетанного воздействия препарата «Саль-мозан» с пробиотическими лактобактериями на развитие клеточных иммунных реакций.

Показано, что культивирование спленоци-тов in vitro одновременно с препаратом «Сальмозан» и живыми бактериями L. acidophilus усиливает цитотоксическую активность клеток по сравнению с наличием в среде одних бактерий

Б

2000 1800 ~ 1600 "§ 1400 g 1200 S. 1000

I—

800

x

hi 600 400 200 0

IL 1a G 3 часа

IL 12 24 часа

TNFa G Контроль

Рисунок 2. Продукция цитокинов в перитонеальных макрофагах мышей, сенсибилизированных препаратом «Сальмозан»

8

-В- 6

S I—

^ С

о 5

X § 4

о

I—

° о

!i 3 ^

- 2 <D е-

=л

S 1

0

20 мкг 0,2 мкг  Сальмозан  L. acidophilus

Сальмозан + L. acidophilus  Контроль

Рисунок 3. Цитотоксическая активность спленоцитов в присутствии препарата «Сальмозан» и живых бактерий Lactobacillus acidophilus

35 г

30

25

20

15

10

Супер КС Супер ПБ

U Сальмозан О L. acidophilus

О Сальмозан + L. acidophilus  Контроль

Рисунок 4. Подавление миграции макрофагов в присутствии супернатантов клеток селезенки (КС) и пейеровых бляшек (ПБ) мышей СВА, сенсибилизированных препаратом «Сальмозан» и живыми бактериями Lactobacillus acidophilus

(р < 0,05). При сенсибилизации мышей СВА препаратом «Сальмозан» и L. acidophilus (per os) отмечено усиление продукции MIF спленоцитами и в меньшей степени клетками ПБ (р < 0,05). Аналогичная тенденция отмечена при исследовании пролиферативного потенциала интактных спле-ноцитов инкубируемых в присутствии препарата «Сальмозан» и бактерий L. plantarum. Совместная сенсибилизация животных препаратом «Сальмозан» и L. plantarum (per os) вызывает более выраженную стимуляцию Т-клеток селезенки, усиливает включение 3Н-тимидина в присутствии В-митогена (ЛПС) и «Сальмозана», добавленного в среду инкубации спленоцитов (р < 0,05).

Обсуждение

Таким образом, результаты проведенных экспериментов свидетельствуют об иммунопротек-тивных свойствах препарата «Сальмозан». Поли-сахаридные структурные компоненты клеточной стенки грам-бактерий широко представлены у представителей комменсальной и транзиторной микрофлоры макроорганизма. Доминирующий вид микробиоты желудочно-кишечного тракта представлен бактериями рода Lactobacillus, важнейшей функцией которых является поддержание естественной резистентности макроорганизма, участие в системе иммунологического контроля гомеостаза [7, 8]. Исследования комплексных модулирующих эффектов воздействия данных бактериальных компонентов экосистемы кишечника выявили их сочетанное иммуностимулирующее и регулирующее воздействие на показатели врожденного и адаптивного иммунитета.

Мишенью действия препарата «Сальмозан» в первую очередь являются антигенпрезенти-рующие клетки, что сопровождается продукцией провоспалительных цитокинов (IL-1a, IL-12, и TNFa), направленно инициирующих, регулирующих и координирующих развитие клеточных иммунных реакций.

IL-1a запускает начальные этапы иммунного ответа. IL-12, в свою очередь, являясь полипо-тентным активатором клеточного иммунного ответа, усиливает активность NK, LAK Т-киллерных клеток и цитотоксических макрофагов. Действуя в кооперативном взаимодействии с TNFy, IL-12, являясь синергистом IL-18, также способствует продукции TNFy Thl-лимфоцитами. Кроме того, IL-12 усиливает экспрессию FasL, участвуя тем самым в индукции апоптоза. TNFa способствует реализации функций NK, LAK-клеток, совместно с Fas-лигандом запускает каскад биохимических реакций, финальным результатом которых является запрограммированная гибель клеток (апоптоз).

7

5

0

А

18 ООО 16 000 14 000 12 000 10 000 8000 6000 4000 2000 0

Сальмозан 2 Сальмозан 0,2 Сальмозан 2 Сальмозан 0,2 L. plantarum Контроль

L. plantarum L. plantarum

Сальм.

L. plan. 30

Сал. + L. plan. 30

Контроль

КонА ЛПС  Сальм.  УЗ ЛАБ  Без АГ

Рисунок 5. Пролиферативная активность клеток селезенки мышей СВА

Результаты проведенных экспериментов свидетельствуют об усилении цитотоксических свойств естественных киллеров (NK), цитотоксических лимфоцитов, CD4+ клеток, продуцирующих MIF, и пролиферативного потенциала иммунокомпетентных лимфоцитов.

Таким образом, «Сальмозан» оказывает комплексное воздействие на иммунную систему, стимулирует механизмы противовирусной, антибактериальной и противоопухолевой естественной защиты макроорганизма.

В настоящее время накоплены фактические данные о механизмах модулирующего воздействия бактерий рода Lactobacillus на показатели естественной резистентности. Показано, что на первом этапе активации иммунокомпе-тентных клеток, ассоциированных с кишечником, в индукцию иммунной системы вовлекаются компоненты клеточной стенки лактобактерий поверхностные пептидогликаны, тейхоевые кислоты (особенно липотейхоевая кислота), взаимодействующие с Toll-like (TLR4, TLR2) рецепторами на поверхности клеток [6, 9]. Это, в свою очередь, приводит к активации транскрипционного фактора NF-kB (nucrear factor «kappa-B»), который является главным регулятором воспаления, контролирующим экспрессию генов врожденного и адаптивного иммунитета. Выявлены модулирующие свойства бактерий рода Lactobacillus видов L. plantarum, L. fermentum, L. acidophilus на показатели иммунного гомео-стаза. Результаты ПЦР-анализа спектра экспрес-сированных генов цитокинов свидетельствуют об индукции синтеза мРНК провоспалительных цитокинов IL-12, IL-18, TNFa. Получены данные о стимуляции продукции MIF, TNFa, TNFy в клетках пейеровых бляшек (ПБ), тимуса и селезенки и увеличение их в сыворотке сенсибилизированных мышей. Активация продукции цитокинов является одним из важнейших механизмов взаимодействия лактобактерий с клеточными факторами естественного иммунитета, приводит к усилению цитотоксической активности NK-клеток и пролиферации иммунокомпетентных Т- и В-лимфоцитов [1, 2, 3, 4, 5].

В результате проведенных экспериментов выявлена комплексная стимуляция функциональной активности иммунокомпетентных клеток, увеличение показателей цитотоксической активности и продукции MIF клетками селезенки при совместной сенсибилизации мышей препаратом «Сальмозан» и введении лактобактерий.

Таким образом, результаты проведенных исследований выявили модулирующее влияние препарата «Сальмозан» на показатели естественной резистентности экспериментальных животных, определяющие иммунный гомеостаза

и участвующие в противоинфекционной, противоопухолевой защите макроорганизма. Введение лактобактерий усиливает модулирующие эффекты препарата «Сальмозан» на клеточные иммунные реакции, что дает основание для его использования с целью иммунопрофилактики и коррекции клеточных иммунных реакций на фоне пробиотикотерапии.

Список литературы

1. Зорина В.В., Николаева Т.Н., Наровлян-ский А.Н. Влияние бактерий рода Lactobacillus на продукцию цитокинов клетками пейеровых бляшек экспериментальных животных // Иммунология. - 2004. - № 5. - С. 288-290.

2. Николаева Т.Н., Зорина В.В., Бондарен-ко В.М. Иммуностимулирующая и антиканцерогенная активность нормальной микрофлоры кишечника // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. - 2004. - № 4. - С. 39-43.

3. Николаева Т.Н., Зорина В.В., Григорьева Е.А. Влияние бактерий рода Lactobacillus на цитотоксическую активность спленоцитов экспериментальных животных // Микробиология. - 2007. - №3. - С. 53-54.

4. Christensen H.R., Frokioer H., Pestka J.J. Lactobacilli Differentially modulate expression of cytokines and maturation surface markers in murine dendritic cells // J. Immunol. - 2002. - Vol. 168. -P. 171-178.

5. Cross. M. Microbes versus microbes: immune signals generated by probiotic lactobacilli and their role in protection agenst microbial phathogens // FEMS. - 2002. - Vol. 34, N 4. - P. 245-253.

6. Grangette C., Nutten S., Palumbo E., Morath S., Hermann C., Dewulf J., Pot B., Hartung T., Hols P., Mercenier A. Enhancer antiflammatory capacity of a Lactobacillus plantarum mutant synthesizing modified teichoic acids // PNAS. - 2005. - Vol. 102, N 29. - P. 10321-10326.

7. Isolauri E., Sutas Y., Arvilommi H., Salminen S. Probiotics: effect on immunity // Amer. J. Clinical Nutrition. - 2001. - Vol. 73. - N. 2. - P. 444S-450S.

8. Perdigon G., Fuller R., Raya R. Lactic acid bacteria and their effect on immune system // Curr. Issues Intest. Microbiol. - 2001. - Vol. 2, N 1. -P. 27-42.

9. Vinderola G., Matar C., Perdigon G. Role of intestinal epithelial cells in immune effects mediated by gram-positive probiotic bacteria: involvement of toll-like receptors // Clinical and diagnostic laboratory immunology. - 2005. - Vol. 12, N 9. - P. 1075-1084.

поступила в редакцию 16.06.2009 отправлена на доработку 19.06.2009 принята к печати 21.06.2009