АНАЛИЗАТОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММАРНОЙ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

Полезная модель относится к области аналитического приборостроения, в частности к приборам вольтамперометрического анализа и может быть использована при анализе суммарной антиоксидантной активности биологических объектов (сыворотки крови, гомогенатов тканей человека и животных).
Описана установка для определения суммарной антиоксидантной активности биологически активных веществ путем их электрохимического окисления, которая содержит емкость для растворителя, насос, дозатор, выполненный в виде многоходового крана, связанного с выходом насоса, с устройством ввода анализируемого вещества и с термостатированной электрохимической ячейкой амперометрического детектора, усилитель электрического сигнала, аналого-цифровой преобразователь и устройство регистрации выходного сигнала. Установка содержит амперометрический детектор, а электрохимическая ячейка не содержит электрода сравнения (RU 2238555 С1 25.07.2003).
Основным недостатком данного устройства является то, что анализ направлен на определение индивидуальных веществ, а не суммарный показатель их активности. Такая установка используется в большей степени для исследования антиоксидантных свойств биологически активных веществ, и не предназначена для исследования биологических объектов, имеющих сложное композиционное строение. Кроме того, сложное и дорогое оборудование не всегда оправдано для проведения рутинных анализов.
Известна установка для определения антиоксидантной активности препаратов, содержащая термостатируемую емкость с субстратом окисления - полиненасыщенными жирными кислотами кукурузного масла, куда вводят антиоксидантный препарат и воздействуют индикаторами окисления. Емкость соединена со спектрофотометром или с хемилюминесцентным прибором, снабженным специализированной компьютерной программой, при этом антиокислительная активность обратно пропорциональна уровню продуктов перекисного окисления липидов. Установка позволяет стандартизировать оценку результатов, а также использовать доступный субстрат окисления (RU 2182706 20.05.2002)
Данная установка также не может быть использована для измерения суммарной антиоксидантной активности биологических объектов, она пригодна только для анализа индивидуальных веществ. Кроме того, анализ требует дополнительных расходов дорогостоящих реактивов,. Субстрат окисления, используемый в анализе, должен постоянно обновляться, так как легко подвергается окислению при хранении, что также вносит дополнительные трудности для анализа.
Достаточно близким по технической сущности к предлагаемому вольтамперометрическому анализатору является вольамперометрический анализатор «ТА2» (RU 2129713 С1 27.04.1999) вольтамперометрический анализатор содержит блок формирования поляризующего напряжения, подключенный к электрохимической ячейке с электродами, индикаторный электрод, который соединен механически с выходом устройства перемешивания раствора электрохимической ячейки и электрически с входом измерительной схемы, подключенной соответственно к входу и выходу блока управления и вывода данных. Вольтамперометрический анализатор характеризуется тем, что в него введено устройство дезактивации мешающих анализу растворенных веществ, связанное с одной электрохимической ячейкой и образующее с ней единый блок электрохимического датчика, управляемый сигналами с блока управления и вывода данных. Устройство для перемешивания раствора электрохимической ячейки.
Однако данный прибор предназначен для определения концентраций любых элементов, определяемых методом вольтамперометрии. С этой целью в него введены дополнительные схемы, хотя и позволяющие повысить уровень аналитического сигнала при определении некоторых элементов (УФ облучение, барботаж инертным газом, озонироание), но далеко не востребованы (особенно при проведении массовых рутинных анализов). При этом цена анализов существенно возрастает. Кроме того, универсальные анализаторы работают только под управлением персонального компьютера, что существенно облегчает работу оператора, но полностью автоматизации обработки аналитического сигнала при этом достичь не удается из-за трудности создания единого алгоритма обработки множества различных аналитических сигналов, поэтому вмешательство квалифицированного химика-аналитика на этих этапах необходимо.
В качестве прототипа принят анализатор для определения суммарной антиоксидантной активности объектов «Антиоксидант» (RU. 54196 от 10.06.05), содержащий блок управления и вывода данных, который включает в себя персональный компьютер, микроконтроллер, цифро-аналоговый преобразователь (ЦАП), аналого-цифровой преобразователь (АЦП), блок формирования поляризующего напряжения, электрохимическую ячейку с электродами, измерительный преобразователь, регулятор скорости и перемешивающее устройство.
Недостатками прототипа являются: отсутствие термостатируемой электрохимической ячейки, необходимость персонального компьютера, реализующего сравнительно несложный алгоритм обработки вольтамперограмм с целью поиска экстремума, перемешивающее устройство реализовано в виде магнитной мешалки и не обеспечивает необходимой интенсивности и стабильности диффузионного потока к рабочему электроду. Анализатор предназначен для определения антиоксидантной активности индивидуальных биологически активных веществ, а не биологических объектов.
Задача данной полезной модели - создание анализатора для определения суммарной антиоксидантной активности биологических объектов (сыворотки крови, гомогенатов тканей человека и животных), расширение температурного диапазона, в котором анализируется объект, повышение интенсивности и стабильности диффузионного потока анализируемых веществ к рабочему электроду, уменьшение количества оборудования и стоимости анализатора. В качестве модельной реакции предлагается использовать процесс электровосстановления кислорода, идущего по механизму, аналогичному восстановлению кислорода в клетках и тканях организма человека и животных.
Поставленная задача решается тем, что анализатор для определения суммарной антиоксидантной активности биологических объектов содержит микроконтроллер, соединенный с цифро-аналоговым преобразователем (ЦАП) и аналого-цифровым преобразователем (АЦП), потенциостат, первый вход которого соединен с выходом ЦАП, второй вход соединен с электродом сравнения электрохимической ячейки, а выход - с вспомогательным электродом электрохимической ячейки, измерительный преобразователь тока в напряжение, вход которого соединен с рабочим электродом электрохимической ячейки, а выход - с входом АЦП.
Электрохимическая ячейка помещена в активный термостат, вход управления которого соединен с выходом микроконтроллера, жидкокристаллический индикатор (ЖКИ) подключен к выходу микроконтроллера, клавиатура подключена к входу микроконтроллера, перемешивание раствора производится вибрацией рабочего электрода, для чего рабочий электрод электрохимической ячейки расположен на упругом ферромагнитном подвесе, находящимся в электромагнитной связи с электромагнитом, выводы которого соединены с импульсными выходами контроллера.
На фиг.1 представлена структурная схема анализатора для определения суммарной актиоксидантной активности биологических объектов, на фиг.2 - пример подвеса рабочего электрода с электромагнитным приводом вибрации.
Анализатор содержит микроконтроллер 1, соединенный с ЦАП 2 и АЦП 3, потенциостат 4, первый вход которого соединен с выходом ЦАП 2, второй вход соединен с электродом сравнения 5, а выход - с вспомогательным электродом 6, измерительный преобразователь тока в напряжение 7, вход которого соединен с рабочим электродом 8, а выход - с входом АЦП3. Электрод сравнения 5, вспомогательный электрод 6 и рабочий электрод 8 помещены в стаканчик 9 и образуют электрохимическую ячейку. Электрохимическая ячейка помещена в активный термостат 10, который управляется от микроконтроллера 1. Электромагнит 11 подключен к импульсному выходу микроконтроллера 1 и находится в электромагнитной связи с упругим ферромагнитным подвесом, на котором закреплен рабочий электрод 8. ЖКИ 12 подключен к выходу микроконтроллера 1, и предназначен для индикации указаний оператору и вывода результатов анализа. Клавиатура 13 подключена к входу микроконтроллера 1 и предназначена для ввода констант, пуска и останова анализатора.
Рабочий электрод 8 закреплен на упругом ферромагнитном подвесе 14, который консольно закреплен на жестком основании 15. Обмотка 16 и магнитопровод 17 образуют электромагнит, в магнитном поле которого находится упругий ферромагнитный подвес 14. Импульсный ток с микроконтроллера 1 протекает по обмотке 16 и создает переменный магнитный поток, приводящий ферромагнитный подвес 14 и связанный с ним рабочий электрод 8 в движение. Частота следования импульсов тока и их скважность выбираются такими, чтобы обеспечить колебания рабочего электрода 8 на резонансной частоте с желаемой амплитудой. Преимущественно радиальная вибрация рабочего электрода 8 создает турбулентный поток вблизи рабочей поверхности, при этом уменьшается толщина диффузионного слоя и диффузионный поток увеличивается кратно, по сравнению с применением магнитной мешалки.
Таким образом, по сравнению с прототипом, в данном анализаторе внесены следующие принципиальные изменения:
1. Введена термостатируемая ячейка, позволяющая осуществлять контроль температуры и поддерживать ее постоянной в процессе анализа, что улучшает метрологические характеристики методики.
2. Использовано встроенное программное обеспечение, которое позволяет работать анализатору автономно без компьютера, что важно для клинических лабораторий и рутинных анализов.
3. Перемешивание раствора осуществляется при помощи вибрации электродов, а не магнитной мешалкой, которая быстро выходила из строя. Это увеличивает надежность прибора, срок его эксплуатации
4. Увеличение диапазона напряжения, подаваемого на рабочий электрод, позволяет увеличить возможности анализа, проводить анализ в неводных средах.
5. Благодаря внесенным существенным изменениям в принципиальную схему и блок-схему анализатора, он может быть использован для анализа суммарной антиоксидантной активности биологических объектов по току электровосстановления кислорода с высокой степенью надежности и удобством в работе, что очень важно для проведения рутинных анализов в клинических лабораториях.
O2
СТ
Рассмотрим работу анализатора на примере определения суммарной антиоксидантной активности сыворотки крови здорового человека (без видимых патологий, мужского пола, 21 год) и сыворотки крови человека с патологией алкоголизма (мужского пола, 25 лет) в количестве 0.1 мл сыворотки крови в 10 мл. фонового электролита (фосфатный буфер pH=6.86) в ячейке. В стаканчик 9 объемом 25 мл, заливается 10 мл фонового раствора (фосфатный буфер pH=6.86). В стаканчик 9 погружаются электроды: рабочий - ртутно-пленочный 8, электроды сравнения 5 и вспомогательный 6 - хлорид - серебряные. С помощью клавиатуры 13 вводятся: температура анализа Т, количество повторов измерения N, концентрация кислорода в растворе в нормальных условиях С°, значение кинетического критерия для вещества, выбранного в качестве стандарта К. Введенные константы сохраняются в энергонезависимой памяти микроконтроллера 1 и используются при последующих измерениях. Программа выполнения анализа предварительно записана в энергонезависимой памяти микроконтроллера 1 и содержит последовательность директив, определяющих следующие этапы анализа:
1. Нагрев электрохимической ячейки. Оператор нажимает кнопку пуска программы на клавиатуре 13. Микроконтроллер выдает в термостат 10 код температуры раствора и ожидает окончания процесса установления температуры.
0
0
2. Снятия вольтамперограммы тока электровосстановления кислорода в фоновом электролите. Для этого при помощи вибрации рабочего электрода 8 раствор перемешивается в течение 10 секунд, затем он выдерживается 20 секунд в спокойном состоянии. На потенциостат 4 от ЦАП 2 подается линейно изменяющееся напряжение, обеспечивающее потенциал рабочего электрода 8 от 0 до -1В относительно электрода сравнения 5. Ток, протекающий по цепи: выход потенциостата 4, вспомогательный электрод 6, рабочий электрод 8, вход измерительного преобразователя тока в напряжение 7 преобразуется в напряжение, затем преобразуется в последовательность двоичных кодов при помощи АЦП 3, которые поступают в микроконтроллер 1, где хранятся в оперативной памяти в виде зависимости тока от напряжения. Описанный процесс повторяется N раз, все зависимости усредняются. Определяется максимум полученной усредненной зависимости, в оперативной памяти фиксируются ток максимума I и потенциал максимума U. На ЖКИ 12 выводится сообщение оператору о необходимости введения пробы исследуемого вещества в стаканчик 9, программа останавливается и ожидает реакции оператора.
0
j
j
3. Снятия вольтамперограммы тока электровосстановления кислорода в фоновом электролите с добавкой пробы биологического объекта (сыворотки крови человека). Оператор вносит 0,1 мл раствора с исследуемым веществом в стаканчик 9 и нажимает кнопку пуска на клавиатуре 12. На потенциостат 4 от ЦАП 2 подается напряжение, обеспечивающее потенциал рабочего электрода 8 U, определенное в п.1, относительно электрода сравнения 5, включается вибрация рабочего электрода 8 и выдерживается 180 сек. Вибрация выключается и аналогично п.1 регистрируется вольтамперограмма. Определяется максимум полученной зависимости, в оперативной памяти фиксируются ток максимума I, где j - текущий номер вольтамперограммы (j=1..N) и t - текущее время эксперимента. Описанный процесс повторяется N раз.
j
j
O2
O2
0
4. Расчет кинетического критерия. Рассчитывается тангенс угла наклона α прямой, построенной по критерию минимума среднеквадратического отклонения от точек с координатами 1-I/I и t. Рассчитывается значение кинетического критерия по формуле: К=α·С(T), где С(Т) - концентрация кислорода в анализируемом растворе при температуре Т.
Значение кинетического критерия выводится на ЖКИ 12 в размерности мкмоль/л·мин.
СТ
СТ
5. Расчет показателя антиоксидантной активности в единицах ORAC (Oxygen radical absorbance capacity) по отношению к стандартному антиоксиданту. В качестве стандартного антиоксиданта чаще всего в международной практике используется тролокс (Trolox), водорастворимая форма витамина Е. Вычисления проводятся по формуле: К*=К/К, где К - значение кинетического критерия, вычисленное в п.4, К - значение кинетического критерия вещества, принятого в качестве стандарта, например, тролокса. Значение преобразованного кинетического критерия выводится на ЖКИ 12 в безразмерных единицах.
Результаты измерений, проведенных по описанной программе, приведены в таблице 1.
Таблица 1
Значение коэффициентов суммарной актиоксидантной активности сыворотки крови здорового человека (без видимых патологий, мужского пола, 21 год) и сыворотки крови человека с патологией алкоголизма (мужской пол 25 лет)
Название объекта
К, мкмоль/л·мин
К* (ORAC, trolox)
сыворотки крови здорового человека (без видимых патологий, мужского пола, 21 год)
1.01±0.03
1.00±0.07
сыворотки крови человека с патологией алкоголизма (мужской пол 25 лет)
0,09±0.04
0.09±0.07