Способ получения каллусной культуры чайного растения (Camellia sinensis. L.)
METHOD FOR PRODUCTION OF CALLUS CULTURE OF TEA PLANT (CAMELLIA SINENSIS L.)

Область применения.
Изобретение относится к области биотехнологии и физиологии растений, в частности, к способу получения каллусной культуры чайного растения, что может быть использовано в фармацевтической, пищевой, косметологической промышленности, а также для фундаментальных исследований в области физиологии растений и биотехнологии.
Уровень техники.
Чайное растение обладает специализированным обменом, направленным на биосинтез фенольных соединений, в том числе фенилпропаноидов, которые представлены фенольными кислотами (Lorenzo J. М., Munekata P. Е. S. Phenolic compounds of green tea: Health benefits and technological application in food //Asian Pacific journal of tropical biomedicine. 2016. T. 6. №8. C. 709-719).
Показано, что они обладают высокой биологической активностью, включая антиоксидантную, антимикробную, противовирусную, антиканцерогенную и кардиопротекторную, что вызывает интерес для их применения (Borges A., Ferreira С, Saavedra M.J., Simoes М. Antibacterial activity and mode of action of ferulic and gallic acids against pathogenic bacteria //Microbial Drug Resistance. 2013. T. 19. №4. C. 256-265).
Перспективным источником для получения биологически активных веществ являются клеточные культуры, выращиваемые в условиях in vitro. Однако их содержание ниже по сравнению с интактным растением (Загоскина Н.В., Дубравина Г.А., Запрометов М.Н. Особенности формирования хлоропластов и накопление фенольных соединений в фотомиксотрофных каллусных культурах чайного растения // Физиология растений. 2000. Т. 47. С. 537-543).
В связи с этим, перед исследователями встает задача получения более высокопродуктивных культур in vitro, что может быть выполнено с помощью различных подходов, включая, экзогенное воздействие регуляторов роста, элиситоров или предшественников биосинтеза биологически активных соединений.
Известен способ получения гетеротрофных культур чая (Camellia sinensis L.) с повышенным накоплением фенольных соединений. Каллусы выращивают на модифицированной питательной среде Хеллера (глюкоза 25 г/л), содержащей гормоноподобные соединения (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) или 1-нафтилуксусная кислота) в различных концентрациях (Николаева Т.Н., Загоскина Н.В., Запрометов М.Н. Образование фенольных соединений в каллусных культурах чайного растения под действием 2,4-Д и НУК //Физиология растений. 2009. Т. 56. №1. С. 53-58).
Основным недостатком этого способа является низкий рост культуры и незначительное повышение количества фенольных соединений.
Еще одним способом были получены суспензионные культуры из каллуса чая (Camellia sinensis L.) с повышенным содержанием фенольных соединений на основе добавления во время стационарной фазы роста клеток в питательную среду Мурасиге-Скуга регуляторов роста (индолил уксусная кислота - 5 мг/л, 2,4-Д - 5 мг/л, бензиламинопурин - 2 мг/л, кинетин - 2 мг/л) в разных комбинациях и предшественников биосинтеза фенольных соединений - L-тирозина, L-фенилаланина (концентрация 20 мМ) и шикимовой кислоты (концентрация 10-30 мМ) (Muthaiya M.J., Nagella P., Thiruvengadam M., Mandal A.A. Enhancement of the productivity of tea (Camellia sinensis) secondary metabolites in cell suspension cultures using pathway inducers //Journal of Crop Science and Biotechnology. 2013. T. 16. №2. C. 143-149).
Недостатками данного способа являются использование достаточно высоких концентраций экзогенных веществ и небольшой конечный выход полифенолов.
Известен также способ регуляции биосинтеза полифенолов в каллусной культуре Ephedra alata Decne, выращиваемой в течение 60 дней на питательной среде Мурасиге-Скуга (30 г/л сахароза, 2,4-Д - 1 мг/л, кинетин - 1 мг/л) в присутствии разных концентраций L-фенилаланина или элиситора - гидролизата казеина в условиях 16-ти часового фотопериода при 25°С (Hegazi G.A.E., El-Lamey Т.М. In vitro production of some phenolic compounds from Ephedra alata Decne //J Appl Environ Biol Sci. 2011. Т. 1. №8. C. 158-16).
Недостатком этого способа является относительно длительное культивирование каллусов.
Способ получения высокопродуктивных клеточных культур, наиболее близкий к заявленному изобретению, изложен в работе Palacio L., Cantero J.J.,  R., Goleniowski M. Phenolic compound production by Larrea divaricata Cav. plant cell cultures and effect of precursor feeding //Process biochemistry. 2011. T. 46. №1. C. 418-422 - прототип.
Он состоит в получении суспензионных культур через каллус из листьев растения Larrea divaricata Cav. - продуцента лигнана (нордигидрогваяретовая кислота) и фенилпропаноидов (n-кумаровая кислота, феруловая кислота, синаповый спирт). Клеточную культуру выращивают в жидкой питательной среде Мурасиге-Скуга с 9 мкМ 2,4-Д и 5 мкМ бензиладенина на роторном шейкере при 25°С в условиях светового/темнового (16/8) фотопериода с использованием холодного белого флуоресцентного света в течение 15 дней.
В этом способе для увеличения продукции фенольных соединений при субкультивировании суспензии в питательную среду того же состава вносят этанольные растворы как L-фенилаланина, так и других соединений, и далее выращивают в условиях, описанных выше.
Согласно данным прототипа максимальное накопление биомассы клеток у необработанных культур происходит на 9-тый день роста. Воздействие L-фенилаланина в концентрации 3 мМ приводит к ингибированию роста клеток растений. При этом количество n-кумаровой кислоты максимально увеличивается на 4-ый день культивирования и постепенно снижается к концу пассажа. Синаповый спирт имеет ту же тенденцию накопления.
Недостатками способа-прототипа являются кратковременное повышение содержания фенилпропаноидов на определенном этапе роста культуры и невысокий выход биомассы клеток. Кроме этого, использование источников флуоресцентного света при выращивании клеточной культуры удорожает целевой продукт.
Задача изобретения.
Задача настоящего изобретения - получение каллусной культуры чайного растения (Camellia sinensis L.) с высокой способностью накопления фенилпропаноидов при стабильной ростовой активности.
Решение задачи.
Данная задача решается новым способом получения культуры чая (Camellia sinensis L.), включающий выращивание каллусов на питательной среде, содержащей макро- и микросоли, витамины, аденин, дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), агар, при 26°С, перенос их в жидкую питательную среду того же состава и воздействие L-фенилаланина в концентрации 3 мМ, причем, неизмельченный каллус помещают в жидкую питательную среду Хеллера, содержащую макро- и микросоли по Хеллеру, витамины по Уайту, мезо-инозит - 20 мг/л, Са-пантотенат - 0,1 мг/л, аденин - 5 мг/л, 2,4-Д - 5 мг/л, глюкозу - 25 г/л, выращивают при относительной влажности воздуха 70%, на качалке с частотой 90 об./мин. в условиях темноты 14 дней, а в качестве растворителя для L-фенилаланина используют воду.
Положительный эффект предлагаемого изобретения состоит в том, что перенос каллусов чая в жидкую питательную среду способствует поступлению в клетки L-фенилаланина, что приводит к повышению биосинтеза фенилпропаноидов, обладающих широким спектром биологической активности. При выращивании культуры чая в темновых условиях происходит более интенсивный (146,5%) и стабильный рост каллусов в течение пассажа.
Новизна изобретения.
Новизной настоящего изобретения является совокупность признаков прямого переноса неизмельченного каллуса в жидкую питательную среду Хеллера, содержащую макро- и микросоли по Хеллеру, витамины по Уайту, мезо-инозит - 20 мг/л, Са-пантотенат - 0,1 мг/л, аденин - 5 мг/л, 2,4-Д - 5 мг/л, глюкозу - 25 г/л, агар 7%, и выращивание его в темновых условиях.
Изобретение иллюстрируется следующим образом:
Пример 1. Каллусную культуру стебля чайного растения (Camellia sinensis L.), грузинская популяция; штамм ИФР, №54) выращивают 42 дня в условиях факторостата при 26°С, относительной влажности воздуха 70%, в темноте на агаризованной питательной среде Хеллера, содержащей макро- и микросоли по Хеллеру, витамины по Уайту, мезо-инозит - 20 мг/л, Са-пантотенат - 0,1 мг/л, аденин - 5 мг/л, 2,4-Д - 5 мг/л, глюкоза - 25 г/л, агар 7%. Для эксперимента каллусы переносят в колбы с 20 мл жидкой питательной среды того же состава и добавляют через стерильный мембранный фильтр (0.22 мкм, Millex) водный раствор L-фенилаланина в концентрации 3 мМ. Для контрольного варианта используют питательную среду без L-фенилаланина. Культуру выращивают на качалке с частотой 90 об/мин. в указанных условиях. Цикл субкультивирования составляет 14 дней. Отбор проб для определения прироста и содержания фенилпропаноидов осуществляют на 3, 7, 9, 14 дни выращивания.
Пример 2. Эксперимент проводят аналогично примеру 1, с разницей в том, что каллусную культуру стебля чайного растения (Camellia sinensis L.), выращивают на агаризованной питательной среде Хеллера 35 дней, что уменьшает длительность пассажа.
max
0
Для определения веса сырой массы каллусы отделяют от среды культивирования фильтрованием на бумажных фильтрах, промывают дистиллированной водой для удаления остатков среды и взвешивают. Прирост рассчитывают, как отношение Х/Х, где X - масса соответственно в конце и начале цикла субкультивирования, выраженное в процентах.
Содержание воды в каллусах определяют после их высушивания до постоянной массы при 70°С и считают по стандартной методике.
50 мг сырой массы каллусных культур экстрагируют 96% этанолом (соотношение биомасса/экстрагент 1:3) при 45°С в течение 45 минут. После центрифугирования гомогената (16000 об./мин, 20 мин., микроцентрифуга Eppendorf), надосадочную жидкость отделяют и используют для определения содержания фенилпропаноидов. Количество фенилпропаноидов определяют методом прямого спектрофотометрирования (спектрофотометр СФ-26, Россия) при длине волны 330 нм. Калибровочную кривую строят по кофейной кислоте.
Исследования проводят в трех биологических и двух аналитических повторностях. Все результаты статистически обрабатывают в программе Excel. В таблицах представлены средние значения и их стандартные ошибки.
Перечень графических материалов:
Таблица 1. Ростовые параметры культур, выращиваемых в условиях in vitro, при воздействии L-фенилаланина (табл. а, б).
Таблица 2. Содержание воды в каллусах чайного растения при воздействии L-фенилаланина.
Таблица 3. Содержание фенилпропаноидов в культурах, выращиваемых в условиях in vitro, при воздействии L-фенилаланина (табл. а, б, в).
Результаты изобретения.
Как следует из представленных данных (таблица 1, а) прирост каллусной культуры чая в темноте к 14 дню культивирования составляет 135,2%, что является ее характерной особенностью. После действия L-фенилаланина ростовая активность клеток повышается, начиная с 7 дня, и достигает своего максимума к концу пассажа (146,5%).
В отличие от данных способа-прототипа, отображающих выраженное ингибирование роста суспензионных клеток на свету (таблица 1, б), в наших исследованиях выявлена положительная динамика прироста.
Таким образом, действие L-фенилаланина приводит к повышению ростовой активности клеток растений при культивировании в темновых условиях.
Еще одним показателем при оценке роста культур in vitro является определение содержания в них воды. Как следует их представленных в таблице 2 данных, оводненность растительных клеток чая при действии L-фенилаланина практически не изменяется и остается на уровне контроля в течение пассажа. Все это свидетельствует о стабильном росте культуры на среде с этим предшественником.
Как следует из представленных в таблице 3 данных, эндогенный уровень фенилпропаноидов в каллусной культуре чая (Camellia sinensis L.) выше (табл. 3а), чем в суспензионных клетках ларреи (Larrea divaricata Cav.) прототипа (табл. 3б и 3в).
В настоящем изобретении в опытном варианте воздействие L-фенилаланина приводит к увеличению количества фенилпропаноидов в 4-5 раз по сравнению с контролем, что отмечается на протяжении всего цикла выращивания.
В известном способе в присутствии действующего вещества наблюдается лишь кратковременное увеличение количества фенилпропаноидов с максимальным накоплением на 4-ый день культивирования, тогда как в настоящем изобретении отмечается стабильная тенденция к биосинтезу фенилпропаноидов на протяжении всего цикла выращивания (14 дней).
Таким образом, совокупность отличительных признаков работает на достижение положительного эффекта, позволяя достигнуть поставленной задачи настоящего изобретения, а именно, получения каллусной культуры чайного растения (Camellia sinensis L.) с высокой способностью накопления фенилпропаноидов.
В результате изобретения показана возможность достаточно быстрого получения культуры чая со стабильными ростовыми параметрами и устойчивым синтезом фенилпропаноидов, обладающих высокой биологической активностью. Данный способ позволяет получать вещества вторичного метаболизма с антиоксидантными свойствами из биотехнологически чистого растительного сырья и вне зависимости от сезонного периода.