Рекомбинантная плазмидная ДНК pET-15b_T3_RL, обеспечивающая синтез рекомбинантного слитого белка, состоящего из опухоль-специфического пептида и противоопухолевого пептида RL2, и рекомбинантный слитый белок, обладающий противоопухолевой активностью по отношению к раку молочной железы человека
RECOMBINANT PLASMID pET-15b_T3_RL DNA PROVIDING SYNTHESIS OF RECOMBINANT FUSION PROTEIN CONSISTING OF TUMOR-SPECIFIC PEPTIDES AND ANTITUMOR PEPTIDE RL2, AND RECOMBINANT FUSION PROTEIN POSSESSING ANTI-TUMOR ACTIVITY AGAINST HUMAN BREAST CANCER

Группа изобретений относится к биотехнологии, генетической и белковой инженерии, конкретно - к получению рекомбинантного слитого белка направленного противоопухолевого действия, состоящего из опухоль-специфического (адресного) пептида и противоопухолевого пептида RL2.
На сегодняшний день онкологические заболевания являются одной из главных причин смертности, как в России, так и за рубежом. Рак молочной железы (РМЖ) является ведущей патологией у женского населения (21,2%) [1]. Особое внимание уделяют РМЖ с тройным негативным фенотипом (трижды-негативный РМЖ или базальный тип) в связи с отсутствием привычных для этого заболевания терапевтических мишеней - рецепторов эстрогенов (ER), прогестерона (PgR) и HER2/neu [2]. Клинико-патологическими и прогностическими особенностями трижды-негативного РМЖ являются ранний возраст диагноза, протоковый или метапластический гистологический тип, низкая дифференцировка, высокий пролиферативный индекс, большой размер опухоли, вовлечение лимфатических узлов, ядерный плейоморфизм, некрозы, стромальный лимфатический ответ. Базальные опухоли отличаются высокой агрессивностью, а также большой вероятностью развития метастатических форм. Выживаемость в этой группе ниже, чем для любого другого молекулярном подтипа рака [3].
Ранее из молока человека был выделен и охарактеризован протеолитический фрагмент к-казеина - белок лактаптин (~8.6 кДа), способный индуцировать апоптотическую гибель раковых клеток в культуре [4, 5]. Был получен ряд рекомбинантных аналогов природного пептида [6, 7] и показано, что аналог лактаптина RL2 индуцирует апоптоз раковых клеток человека в культуре и тормозит рост и метастазирование опухолей животных и человека в системе in vivo. Наибольшую чувствительность к действию RL2 проявляют клетки аденокарциномы молочной железы человека линий MDA-MB-231 (трижды негативный тип) и MCF-7 (экстроген-зависимый тип) [8, 9]. В настоящее время проведены доклинические испытания лекарственного средства «Лактаптин», созданного на основе RL2, показана безопасность и противоопухолевая эффективность препарата. Однако «Лактаптин», как и другие белковые терапевтические препараты, имеет ряд существенных недостатков. Он равномерно распределяется по органам и тканям организма, что уменьшает его концентрацию в опухоли несоответственно, снижает эффективность противоопухолевого действия [10].
Одним из путей повышения эффективности противоопухолевого действия является адресная доставка лекарственного средства непосредственно в опухоль, позволяющая снизить цитотоксическое действие лекарства на нормальные клетки и увеличить, за счет повышения локальной концентрации препарата в опухоли, эффективность действия на раковые клетки. Получение генно-инженерных рекомбинантных белков (слитых белков), которые объединяют адресный пептид, обеспечивающий доставку лекарственного средства непосредственно в опухоль, и противоопухолевое лекарственное средство, является перспективным направлением совершенствования терапевтический средств лечения злокачественных новообразований.
Одним из способов получения адресных опухоль-специфических пептидов является скрининг фаговых пептидных библиотек, который проводят in vitro на культурах раковых клеток и in vivo на животных моделях [11]. Ранее в результате скрининга (аффинной селекции) фаговой пептидной библиотеки на культурах раковых клеток человека в системе in vitro был отобран пептид, имеющий аминокислотную последовательность YTYDPWLIFPAN, обладающий специфичностью к раковым клеткам молочной железы человека линии MDA-MB-231. При внутривенном введение бактериофаг, экспонирующий отобранный пептид YTYDPWLIFPAN, специфически накапливался в опухолевой ткани MDA-MB-23 1 по сравнению с контрольными органами (печень, легкое).
D
Известен слитый белок m(KLA)-iRGD ((KLAKLAKKLAKLA)-K-GGCRGDKGPDC), состоящий из антимикробного пептида KLA, обладающего апоптотической активностью по отношению к эукариотическим клеткам, и опухоль-специфического пептида iRGD, являющегося лигандом для интегриновых рецепторов αvβ3, αvβ5 и α5β1. Белок m(KLA)-iRGD обладает противоопухолевой активностью по отношению к раку молочной железы мыши линии 4Т1 in vivo, вызывая торможение роста опухоли на 30% [12].
Наиболее ближайшим к заявляемой группе изобретений -прототипом, является рекомбинантная плазмидная ДНК pFK2, обеспечивающая синтез рекомбинантного пептида RL2, являющегося аналогом фрагмента каппа-казеина человека и рекомбинантный пептид, аналог фрагмента каппа-казеина человека, имеющий молекулярную массу 14,2 кДа, состоящий из остатка метионина, фрагмента каппа-казеина человека с 24 по 134 аминокислотный остаток и С-концевого гистидинового тракта, обладающий апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам, включающий аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 [13].
Известная плазмида pFK2 имеет молекулярную массу 2,1 MDa, размер 3164 п.о., содержит следующие элементы: плазмидный вектор
pGSDI, гидролизованный no SalI и BglII сайтам и содержащий сайт инициации репликации плазмиды pBR322, промотор фага Т7 и уникальные сайты рестрикции EcoRI (1595), BglII (1613), SalI (1985), PstI (1995), HindIII (2000), ClaI (2053); BglII-SalI, фрагмент размером 372 п.о., включающий стартовый кодон, сегмент, кодирующий фрагмент каппа-казеина человека с 24 по 134 аминокислотный остаток, олигопептид с последовательностью GGSHHHHHH и стоп-кодон; генетические маркеры: AMPr - ген ампициллин резистентности (ген бетта-лактамазы), определяющий устойчивость к ампициллину при трансформации Escherichia coli.
Недостатком известной плазмиды pFK2 является то, что она не обеспечивает продукцию в клетках Escherichia coli рекомбинантного слитого белка, состоящего из RL2 и пептида, специфичного к опухолевой ткани трижды негативного типа рака молочной железы человека.
Недостатком известного белка (RL2) является то, что он не обладает таргетными свойствами (тропностью) к опухолевой ткани, равномерно распределяясь по органам и тканям, что снижает эффективность его противоопухолевого действия.
Задачей группы изобретений является создание рекомбинантной плазмиды, обеспечивающей синтез рекомбинантного слитого белка, состоящего из пептида, специфического к опухолевой ткани рака молочной железы человека, и противоопухолевого пептида RL2, и получение рекомбинантного слитого белка, обладающего противоопухолевой активностью по отношению к раку молочной железы человека.
Техническим результатом группы изобретений является получение рекомбинантного слитого белка, обладающего повышенной противоопухолевой активностью по отношению к раку молочной железы человека.
Указанный технический результат достигается путем конструирования плазмиды pET-15b_T3_RL встройкой в плазмидный вектор рЕТ-15b фрагмента ДНК, кодирующего остаток метионина, опухоль-специфический пептид с аминокислотной последовательностью YTYDPWLIFPAN, глициновый спейсер (GGGS) и рекомбинантный аналог лактаптина RL2 в единой рамке трансляции, трансформацией полученной плазмидой клеток Escherichia coli, выращивания биомассы индуцированных клеток с последующим выделением и очисткой рекомбинантного слитого белка с помощью многостадийной хроматографии.
Сущность заявляемой группы изобретений заключается в следующем:
Генно-инженерными методами получают плазмиду pET-15b_T3_RL, несущую ген, кодирующий рекомбинантный слитый белок, состоящий из опухоль-специфического пептида, отобранного из фаговой пептидной библиотеки к раковым клеткам молочной железы человека линии MDA-МВ-231, и рекомбинантного аналога лактаптина RL2. Вектор рЕТ-15b устроен таким образом, что клонированный ген слитого белка находится под контролем промотора бактериофага Т7.
Исходным генетическим материалом для конструирования рекомбинантной плазмиды pET-15b_T3_RL являются:
а) плазмидный вектор рЕТ-15b (5708 п. н.) (Novagen, США), обеспечивающий встройку фрагмента ДНК, кодирующего слитый белок, и его экспрессию под контролем позднего промотора Т7 ДНК-полимеразы;
б) фрагмент ДНК 1, кодирующий остаток метионина, опухоль-специфический пептид, глициновый спейсер и N-конец последовательности RL2, который получают в полимеразной цепной реакции с использованием олигонуклеотидных праймеров t3_RL2_F 5`- и t3_R  и химически синтезированного олигонуклеотида ClonN3_target 5`  G в качестве матрицы. Праймер t3_RL2_F обеспечивает наличие в амплификационном фрагменте сайта рестрикции NcoI.
в) фрагмент ДНК 2, кодирующий фрагмент рекомбинантного аналога лактаптина RL2, который получают в полимеразной цепной реакции с использованием олигонуклеотидных праймеров: RL2F 5' AACCAGAAACAACCAGCATGCCATGAGAATGAT и c1_RL2_R 5' CATCATGGATCCTTAGTGATGGTGATGGTGATGTGATCCGCCGATGG и плазмиды pGSD/RL2 в качестве матрицы [6]. Праймер c1_RL2_R обеспечивает наличие в амплификационном фрагменте сайта рестрикции BamHI;
г) фрагмент ДНК, кодирующий слитый белок, состоящий из остатка метионина, опухоль-специфического пептида, глицинового спейсера и RL2, который получают в полимеразной цепной реакции с использованием олигонуклеотидных праймеров t3_RL2_F и c1_RL2_R и фрагментов ДНК 1 и 2 в качестве матрицы.
Полученная плазмида pET-15b_T3_RL (фиг. 2) характеризуется следующими признаками:
- имеет размер 6057 п.о.;
- кодирует рекомбинантный слитый белок, содержащий остаток метионина, опухоль-специфическй пептид (YTYDPWLIFPAN), глициновый спейсер (GGGS) и RL2;
- состоит из следующих элементов:
1) фрагмента ДНК размером 417 п.о., кодирующего рекомбинантный слитый белок,
2) сайта инициации репликации плазмиды pBR322;
3) промотора бактериофага Т7;
4) генетических маркеров: AMPr - ген ампициллин резистентности (bla), определяющий устойчивость к ампициллину при трансформации Escherichia coli;
5) гена lacI, кодирующего белок-репрессор;
6) lac оператора, перекрывающегося с Т7 промотором;
7) уникальных сайтов узнавания эндонуклеазами рестрикции, имеющими следующие координаты: BglII (849), NcoI (739), BamHI (320), HindIII (30), EcoRI (6057).
Таким образом, впервые получена плазмида, обеспечивающая продукцию в клетках Escherichia coli рекомбинантного слитого белка, состоящего из опухоль-специфического пептида и противоопухолевого пептида RL2, обладающего противоопухолевой активностью по отношению к раку молочной железы человека.
600
Клетки E. coli BL21(DE3), геном которых содержит фрагмент ДНК бактериофага X, DE3, в котором закодирован ген lacI и ген РНК полимеразы Т7 под контролем промотора lacUV5, трансформируют сконструированной плазмидой pET-15b_T3_RL и выращивают в LB-среде с добавлением ампициллина (150 мкг/мл) и глюкозы (1%) в течение 14-16 ч при 37°C, 170 об/мин. Выросшую культуру засевают в LB среду с ампициллином (100 мкг/мл) с плотностью засева 1% от объема среды и наращивают при 37°C, 170 об/мин. По достижению оптической плотности культуры OD=0,7-0,8 о.е. добавляют индуктор изопропилтиогалактозид (ИПТГ) до концентрации 0,5 мМ и продолжают процесс ферментации в тех же условиях в течение 4 часов. После чего биомассу собирают центрифугированием при 10000 g, 10 мин, 4°C. Биомассу индуцированных клеток E. coli BL21(DE3)/pET-15b_T3_RL используют для выделения рекомбинантного слитого белка с помощью многостадийной хроматографии.
В результате получают слитый белок, имеющий молекулярную массу 15,9 кДа, состоящий из остатка метионина, опухоль-специфического пептида, глицинового спейсера и рекомбинантного аналога лактаптина RL2. Слитый белок обладает противоопухолевой активностью по отношению к раку молочной железы человека, имеет аминокислотную
последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 (фиг. 1).
Изобретение иллюстрируется следующими фигурами:
Фиг. 1. Нуклеотидная последовательность фрагмента плазмиды рЕТ-15b_T3_RL и кодируемая ею аминокислотная последовательность слитого белка T3_RL.
Фиг. 2. Карта генетической конструкции pET-15b_T3_RL, где: Fragment - последовательность ДНК, кодирующая слитый белок; Ар - ген устойчивости к ампициллину; lacI - ген белка-репрессора; ori репликации ColE1 (pBR322).
Фиг. 3. Анализ белков лизатов клеток Е. coli BL21(DE3)/pET-15b_T3_RL на содержание целевого белка (13% ПААГ в присутствии 2-меркаптоэтанола). Дорожки: 1 - набор маркерных белков, 2 - белки лизата клеток Е. coli до проведения индукции, 3, 4, 5, 6, 7 - белки лизата клеток E.coli через 1, 2, 3, 4, 5 ч с момента проведения индукции, соответственно.
Фиг. 4. Электрофоретический анализ белков целевых фракций, полученных на разных стадиях хроматографической очистки рекомбинантного слитого белка T3_RL. Дорожки: 1 - набор маркерных белков, 2 - белки фракции 2, полученной ионообменной хроматографией на DEAE Sephadex А-25, 3 - белки фракции 3, полученной катионообменной хроматографией (1) на SP Sepharose Fast Flow, 4 - белки второго пика (λ=280), полученного катионообменной хроматографией (1) на SP Sepharose Fast Flow, 5 - белки диализованной фракции 4, полученной концентрированием фракции 3, 6 - белки фракции 5, полученной анионообменной хроматографией на сорбенте Q Sepharose Fast Flow, 7 - белки диализованной фракции 5.
Фиг. 5. Изменение жизнеспособности клеток аденокарцинрмы молочной железы человека MDA-MB-231 и MCF-7 при инкубации с T3_RL и RL2. Жизнеспособность клеток определяли относительно жизнеспособности контрольных клеток (инкубации без белков) ± стандартное отклонение (М±s) по результатам трех независимых экспериментов.
3
Фиг. 6. Противоопухолевая активность рекомбинантного слитого белка T3_RL на мышиной опухолевой модели ксенографтов MDA-MB-231. Мышам SCID с подкожно трансплантированной опухолью проводили лечение RL2 и рекомбинантным слитым белком T3_RL при внутривенном введении препарата в дозе 40 мг/кг трехрактно через сутки. Контрольной группе мышей вводили физиологический раствор в режиме введения препаратов. Опухоли извлекали и взвешивали при достижении размера опухолевого узла в одной из групп 80 мм. Данные представлены средним весом опухоли в группе±стандартная ошибка среднего (М±m).
Для лучшего понимания сущности предлагаемой группы изобретений ниже следуют примеры их осуществления.
Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды рЕТ-15b_T3_RL.
Нуклеотидную последовательность, кодирующую рекомбинантный аналог лактаптина (RL2), амплифицируют с плазмиды pGSD/RL2, используя праймеры RL2_F  и cl_RL2_R . Реакцию проводят в амплификаторе Eppendorf Mastercycler. В состав реакционной смеси объемом 50 мкл входит: 1xSEBuffer Pfu ДНК-полимераза (СибЭнзим, Россия), смесь дезоксинуклеозид трифосфатов (dATP, dGTP, dCTP, dGTP) (dNTP-смесь) (2,5 мМ), плазмида pGSD/RL2 (10 нг), праймер RL2_F (0,3 нМ), праймер cl_RL2_R (0,3 нМ), Pfu ДНК-полимераза (2,5 ед.) (СибЭнзим, Россия). Условия проведения ПЦР: предварительная денатурация - 5 минут при 96°С; 35 циклов - 30 секунд При 96°С, 30 секунд при 66°С, 40 секунд при 72°С; заключительная стадия -10 минут при 72°С.
Амплифицируют последовательность Т3, кодирующую остаток метионина, опухоль-специфический пептид, глициновый спейсер и N-конец последовательности RL2, используя химически синтезированный олигонуклеотид ClonN3_target 5`  в качестве матрицы. Последовательность Т3 амплифицируют, используя праймеры t3_RL2_F 5` и t3_R 5` В состав реакционной смеси объемом 50 мкл входит: 1×SEBuffer Pfu ДНК-полимераза (СибЭнзим, Россия), dNTP-смесь (2,5 мМ), ДНК-матрица ClonN3_target (10 нг), праймер t3_RL2_F (0,3 нМ), праймер t3_R (0,3 нМ), Pfu-полимераза (2,5 ед.) (СибЭнзим, Россия). Условия проведения ПЦР: предварительная денатурация - 5 минут при 96°С; 35 циклов - 30 секунд при 96°С, 30 секунд при 66°С, 10 секунд при 72°С; заключительная стадия -10 минут при 72°С.
Единую (слитую) нуклеотидную последовательность T3_RL2, кодирующую адресный пептид и RL2 в единой рамке трансляции, получают также с помощью ПЦР. Для получения последовательности T3_RL2 на основе ПЦР-фрагментов Т3 и RL2 используют праймеры t3_RL2_F и cl_RL2_R, обеспечивающие в амплификационном фрагменте наличие сайтов рестрикции NcoI и BamHI. В состав реакционной смеси объемом 50 мкл входит: 1×SEBuffer Pfu ДНК-полимераза (СибЭнзим, Россия), dNTP-смесь (2,5 мМ), ДНК-матрица Т3 (20 нг), ДНК-матрица RL2 (80 нг), t3_RL2_F (0,3 нМ), cl_RL2_R (0,3 нМ), Pfu-полимераза (2,5 ед.) (СибЭнзим, Россия). Условия проведения ПЦР: предварительная денатурация - 5 минут при 96°С; 35 циклов - 30 секунд при 96°С, 30 секунд при 61°С, 60 секунд при 72°С; заключительная стадия - 10 минут при 72°С.
Все продукты ПЦР-реакции очищают от белков фенол-хлороформной экстракцией и осаждают в течение нескольких часов при температуре минус 20°С добавлением 3М NaAc рН 5,2 (1/10 от объема растворенной фракции нуклеиновых кислот), 96% этиловым спиртом (2,5 объема растворенной фракции нуклеиновых кислот). Полученный после центрифугирования (10000 g, 10 мин) осадок промывают 70% этиловым спиртом и высушивают в вакуумном испарителе.
Векторную ДНК pET-15b (1 мкг) и клонируемый ДНК-фрагмент T3_RL2 (1 мкг), кодирующий слитый белок, обрабатывают эндонуклеазами рестрикции BamHI и NcoI (по 2 ед. каждого фермента) (СибЭнзим, Россия) в объеме реакционной смеси 50 мкл. Реакцию проводят в условиях, рекомендованных производителем.
После обработки рестриктазами BamHI и NcoI векторную ДНК рЕТ-15b и клонируемый ПЦР-фрагмент очищают электрофорезом в 1,5% агарозном геле и экстрагируют из геля набором QIAquick Gel Extarction Kit («Qiagen», США) согласно протоколу производителя.
Реакцию лигирования Т4 ДНК-лигазой (СибЭнзим, Россия) линеализированного вектора рЕТ-15b и клонируемого фрагмента, обработанных ранее эндонуклеазами рестрикции BamHI и NcoI, проводят в объеме 5 мкл при комнатной температуре в течение 30 мин. В реакции используют 50 нг линейной формы плазмиды рЕТ-15b и клонируемый фрагмент в трехкратном молярной избытке по отношению к вектору.
Пример 2. Получение штамма Е. coli - продуцента рекомбинантного слитого белка.
600
Бактериальные клетки Е. coli BL21(DE3), несущие ген РНК-полимеразы фага Т7 под индуцибельным lacUV5 промотором, трансформируют сконструированной плазмидой pET-15b_T3_RL. Отдельную колонию трансформированных клеток выращивают в LB-среде с добавлением ампициллина (150 мкг/мл) и глюкозы (1%) в шейкер-инкубаторе при 170 об/мин и температуре 37°С в течение 14-16 ч. Выросшую культуру засевают в LB-среду, содержащую ампициллин (100 мкг/мл) с плотностью засева 1% от объема среды. По достижению оптической плотности культуры OD=0,7-0,8 о.е. добавляют индуктор изопропилтиогалактозид (ИПТГ) (Медиген, Россия) до концентрации 0,5 мМ и продолжают процесс ферментации в тех же условиях (170 об/мин, 37°С) в течение 4 ч. Биомассу индуцированных клеток собирают центрифугированием в течение 5 мин, при 10000 g. Содержание целевого белка анализируют с помощью электрофореза по Лэммли [15] в 13% полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии 2-меркаптоэтанола. Результаты этого анализа, представленные на фиг. 3, демонстрируют, что до момента проведения индукции в белках лизата клеток E.coli видимых следов целевого белка не наблюдается, в то время как уже спустя час с момента проведения индукции ИПТГ происходит наработка целевого рекомбинантного белка с электрофоретической подвижность в диапозоне 10-15 кДа.
Пример 3. Выделение и очистка рекомбинантного слитого белка из клеток-продуцентов Е. coli.
Биомассу индуцированных клеток E.coli разрушают экструзионным гомогенизатором. К разрушенной биомассе добавляют раствор 1, содержащий мочевину 4 М, имидазол 10 мМ, NaCl 0,3 М, Трис 20 мМ, фенилметилсульфонилфлюорид (PMSF) 1 мкМ, меркаптоэтанол 10 мМ, и центрифугируют в течение 25 минут при температуре 10°С и частоте вращения 7300 об/мин. Полученный супернатант, содержащий раствор белков, разделяют хроматографически.
2
На колонку, содержащую аффинный сорбент IMAC Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare, Швеция), модифицированный ионами никеля, и уравновешенную раствором 1, наносят супернатант. После нанесения раствора с белком сорбент промывают 4 CV (colum volume - объем колонки) раствора 2, содержащего имидазол 10 мМ, NaCl 0,3 М, Трис 20 мМ, PMSF 1 мкМ, меркаптоэтанол 10 мМ, далее - 3 CV раствора 3, содержащего имидазол 200 мМ, NaCl 0,3 М, Трис 20 мМ, PMSF 1 мкМ, меркаптоэтанол 10 мМ. Элюцию белка проводят 4,5 CV раствора 4, содержащего ЭДТА-Na 200 мМ, гуанидин гидрохлорид 6М. Целевую фракцию 1 направляют на вторую стадию очистки ионообменной хроматографией на DEAE Sephadex А-25.
Колонку с сорбентом DEAE Sephadex А-25 (GE Healthcare, Швеция) урановешивают раствором 5, содержащим NaCl 50 мМ. На колонку наносят фракцию 1, после чего сорбент промывают 0,8 CV раствора 5 и осуществляют сбор целевой фракции. Полученную фракцию 2 диализуют против воды (18 ч при 4°С) и затем направляют на следующую стадию очистки катионообменной хроматографией на SP Sepharose Fast Flow (GE Healthcare, Швеция).
Колонку, содержащую SP Sepharose Fast Flow, уравновешивают 2 CV раствора 5. На колонку наносят диализованную фракцию 2, предварительно восстановленную дитиотреитолом. После нанесения сорбент промывают 2 CV раствора 5, 4 CV раствора 6, содержащего NaCl 1 М, Трис 0,02 М, рН 8.8 и 3 CV раствора 7, содержащего NaCl 0,45 М, натрия ацетат трехводный 0,02 М, рН 4.5. Элюцию белка проводят 9 CV раствора 8, содержащего мочевину 3 М, NaCl 0,45 М, натрия ацетат трехводный 0,025 М; дитиотреитол 30 мМ. Проводят повторную катиоцообменную хроматографию на SP Sepharose Fast Flow полученной фракции 3 целевого белка с целью ее концентрирования.
Колонку, содержащую SP Sepharose Fast Flow, уравновешивали 2 CV раствора 5. На колонку наносят фракцию 3 и промывают 2 CV раствора 5. Элюцию белка проводят 3 CV раствора 9, содержащего мочевину 6 М, NaCl 0,7 М. Полученную сконцентрированную фракцию 4 диализуют против воды (18 ч при 4°С) и затем проводят финальную стадию очистки рекомбинантного слитого белка анионообменной хроматографией на сорбенте Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare, Швеция).
Колонку с сорбентом Q Sepharose Fast Flow уравновешивают 1,5 CV раствора 5. На колонку наносят диализованную фракцию 4. Элюцию белка проводят 3 CV раствора 5, получая целевую фракцию 5. Фракцию 5 диализуют против воды (18 ч при 4°С).
Фракции анализируют электрофорезом в ПААГ с SDS по Лэммли [13], образцы для нанесения на гель готовят в присутствии 2-меркаптоэтанола. Пример такой очистки приведен на фиг. 4.
Определение концентрации слитого белка проводят по методу Брэдфорд [16]. Для построения калибровочной кривой используют бычий сывороточный альбумин (Serva, США).
Пример 4. Оценка цитотоксической активности рекомбинантного слитого белка по отношению к раковым клеткам молочной железы.
Для анализа цитотоксического действия рекомбинантного слитого белка T3_RL используют клетки аденокарциномы молочной железы человека линии MDA-MB-231 (трижды негативный тип), полученные из коллекции клеточных культур ЗАО «Исследовательский Институт Химического Разнообразия», г. Химки, Московская область, и клетки аденокарциномы молочной железы линии MCF-7 (гормон-зависимый тип), полученные из института цитологии РАН, г. Санкт-Петербург.
2
Клетки MDA-MB-231 культивируют в среде L15 (Gibco, Life Technologies, UK) в присутствии 10% FBS, 2 мМ L-глутамина (Gibco, Life Technologies, UK), 250 мг/мл амфотерицина В и 100 ед/мл пенициллина/стрептомицина (Gibco, Life Technologies, UK). Клетки MCF-7 культивируют в среде IMDM (Gibco, Life Technologies, UK) в присутствии 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 250 мг/мл амфотерицина В и 100 ед/мл пенициллина/стрептомицина. Клетки культивируют при 37°С в атмосфере 5% СО. Подсчет количества клеток проводят в камере Горяева.
3
2
В качестве способа, позволяющего быстро и точно оценить цитотоксический эффект рекомбинантного слитого белка, используют МТТ-тест. Клетки высаживают на 96-луночные планшеты для культур клеток в концентрации 4-5*10 клеток/лунку в 100 мкл питательной среды RPMI-1640 (Gibco, Life Technologies, UK), содержащей 10% по объему FBS с добавлением раствора антибиотиков-антимикотиков состава: 100 ед/мл пенициллина G, 100 мг/мл стрептомицина сульфата, 0,25 мкг/мл амфотерицина, и инкубируют в течение 24 час при температуре (37,0±1,0)°С в атмосфере (5,0±0,5)% CO.
2
Готовят ряд последовательных разбавлений исследуемого белка в питательной среде RPMI-1640, не содержащей FBS. Вносят по 100 мкл полученных разведений белка в лунки пластикового планшета с клетками. Через 48 ч инкубации при температуре (37,0±1,0)°С в атмосфере (5,0±0,5)% СО удаляют среду из лунок и вносят в каждую лунку по 200 мкл питательной среды RPMI-1640 и 10 мкл раствора МТТ (Sigma, США) с концентрацией 5 мг/мл после чего продолжают инкубацию в тех же условиях в течение 4 ч. Затем удаляют среду с МТТ из лунок, и растворяют оставшиеся кристаллы МТТ-формазана добавлением 150 мкл ДМСО. Оптическую плотность растворенного в ДМСО МТТ-формазана измеряют на многоканальном планшетном сканере при λ=570 нм.
Результаты эксперимента представлены на фиг. 5. Результаты эксперимента показывают, что инкубация клеток MDA-MB-231 (тройной негативный фенотип) и MCF-7 (гормон-зависимый тип) в присутствии созданного слитого белка приводит к дозозависимому снижению их жизнеспособности. При этом концентрация T3_RL, при которой происходит гибель 50% клеток, ниже, чем у RL2, что указывает на его более высокую цитотоксическую активность.
Пример 5. Оценка противоопухолевой активности рекомбинантного слитого белка T3_RL
Мышей с подкожно трансплантированной опухолью аденокарциномы молочной железы человека MDA-MB-231 (мыши линии SCID), достигшей 0,2-0,4 см в диаметре, делят на группы так, чтобы средний объем опухоли в группе был одинаковым (количество животных с большими и маленькими опухолями в каждой из групп должно быть одинаковым). Размер группы составляет не менее 6 животных.
Рекомбинантный слитый белок T3_RL и белок сравнения RL2 вводят животным внутривенно в хвостовую вену трех-четырехкратно через день в дозе 40 мг/кг в 500 мкл физиологического раствора. Животным контрольной группы вводят физиологический раствор в режиме введения исследуемых препаратов.
3
2
Измерение размеров опухолей проводят с помощью штангенциркуля. Объем опухоли (мм) рассчитывают по формуле (1): L×W/2=V,
где L - наибольший диаметр опухоли, мм;
W - наименьший диаметр опухоли, мм.
3
При достижении размера опухолевого узла в одной из групп 80 мм животных декапитируют, опухоли извлекают и взвешивают.
Противоопухолевую активность исследуемых препаратов определяют, рассчитывая индекс ТРО (%) (торможение роста опухоли относительно опухолей в контрольной группе 2). Индекс ТРО (%) рассчитывают по формуле (2): ТРО (%)=(Кср-Эср)×100/Кср, где: Кср - средний вес опухоли в контрольной группе, гр.;
Эср - средний вес опухоли в экспериментальной группе, гр.
Результаты эксперимента представлены на фиг. 6. При лечении мышей статистически значимые различия обнаружены между средним весом опухолей в контрольной группе и в группе, получавшей лечение слитым белком T3_RL (р<0,005). Индекс ТРО для RL2 составил 28%, для T3_RL - 81%. Противоопухолевый эффект белка T3_RL выше (ТРО=81%), чем у RL2 (ТРО=28%), проявлялся на ранней стадии развития опухолевого процесса, был выраженным и стабильным.
Таким образом, впервые получена плазмидная ДНК рЕТ-15b_T3_RL, обеспечивающую продукцию в клетках Escherichia coli рекомбинантного слитого белка T3_RL, состоящего из опухоль-специфичекского пептида и противоопухолевого пептида RL2, и получен рекомбинантный слитый белок, обладающий цитотоксической активностью к клеткам рака молочной железы человека (в том числе к РМЖ с тройным негативным фенотипом) in vitro и противоопухолевой активностью, вызывая достоверное торможение роста перевитой опухоли трижды негативного рака молочной железы человека MDA-MB-231.
Источники информации
1. Злокачественные новообразования в России в 2014 году (заболеваемость и смертность). Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. - М.: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России, 2016. 250 с.
2. Тюляндин С.А., Стенина М.Б., Фролова М.А. Тройной негативный рак молочной железы // Практическая онкология. - 2010. - Т. 11. - №4. - С. 247-252.
3. Кулигина Е.Ш. Эпидемиологические и молекулярные аспекты рака молочной железы // Практическая онкология. - 2010. - T.11. - №4. - С. 203-2016.
4. Некипелая В.В., Семенов Д.В., Потапенко М.О., Кулигина Е.В., Кит Ю.Я., Романова И.В., Рихтер В.А. Лактаптин - белок человеческого молока, индуцирующий апоптоз клеток аденокарциномы MCF-7.//Докл. АН. - 2008. - Т. 419. - С. 268-271.
5. Власов В.В., Рихтер В.А., Семенов Д.В., Некипелая В.В., Кулигина Е.В., Потапенко М.О. Пептид, обладающий апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам человека. // Патент RU 2317304 C1, оп. 20.02.2008.
6. Тикунова Н.В. и др. Рекомбинантная плазмидная ДНК pFK2, обеспечивающая синтез рекомбинантного пептида, являющегося аналогом фрагмента каппа-казеина человека, способ получения рекомбинантного пептида и рекомбинантный пептид, аналог фрагмента каппа-казеина человека, обладающий апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам. // Патент RU 2401307 С1, оп. 10.10.2010.
7. Semenov D.V., Fomin A.S., Kuligina E.V., Koval O.A., Matveeva V.A., Babkina I.N., Tikunova N.V., Richter V.A. Recombinant analogues of novel milk pro-apoptotic peptide lactaptin and their effect on cultured human cells. // The Protein Journal. - 2010. - Vol. 29. - N.3. - P. 174-180.
8. Koval O.A., Fomin A.S., Kaledin V., Semenov D.V., Potapenko M.O., Kuligina E.V., Richter V.A. A novel pro-apoptic effector lactaptin inhibits tumor growth in mice models. // Biochimie. - 2012. - Vol. 94. - N. 12. - P. 2467-2474.
9. Koval O.A., Tkachenko A.V., Fomin A.S., Semenov D.V., Nushtaeva A.A., Kuligina E.V., Zavjalov E.L. and Richter V.A. Lactaptin induces p53-independent cell death associated with features of apoptosis and autophagy and delays growth of breast cancer cells in mouse xenografts. // PLoS One. - 2014. - Vol. 9, N 4. - E. 93921.
Ю.Бондаренко Д.А., Рихтер B.A., Кулигина E.B., Коваль О.А., Фомин А.С.и др. Исследование токсичности и фармакокинетики препарата «Лактаптин» // Биофармацевтический журнал, - 2015. - №7. - С. 40-47.
И. Немудрая А.А., Рихтер В.А., Кулигина Е,В. Фаговые пептидные библиотеки как источник адресующих лигандов // Acta Naturae. - 2016. - №1.
12. Qifan W., Fen N., Ying X., Xinwei F., Jun D., Ge Z. iRGD-targeted delivery of a pro-apoptotic peptide activated by cathepsin В inhibits tumor growth and metastasis in mice // Tumour Biol. - 2016.
13. Тикунова H.B. и др. Рекомбинантная плазмидная ДНК pFK2, обеспечивающая синтез рекомбинантного пептида, являющегося аналогом фрагмента каппа-казеина человека, способ получения рекомбинантного пептида и рекомбинантный пептид, аналог фрагмента каппа-казеина человека, обладающий апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам. // Патент RU 2401307 С1, оп. 10.10.2010.
14. Kuligina E.V., Vaskova A.A., Kaledin V., Ilyichev A., Borgoyakova M., Koval O.A., Richter V.A. Targeted delivery of antitumor peptide lactaptin to tumors // FEBS J. - 2013. - V. 280. - P. 316.
15. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. - 1970. - V.227. - P. 680-685.
16. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. // Anal. Biochem. - 1976. - V.72. - P. 248-254.