СПОСОБ ОЦЕНКИ ИМПЛАНТАЦИОННОЙ СОСТОЯТЕЛЬНОСТИ ЭНДОМЕТРИЯ НА ОСНОВАНИИ ЭНДОМЕТРИАЛЬНОЙ ЭКСПРЕССИИ VDR, HOXA 11 В ПРОГРАММАХ ВРТ У ЖЕНЩИН СТАРШЕГО РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА С ТРУБНО-ПЕРИТОНЕАЛЬНЫМ ФАКТОРОМ БЕСПЛОДИЯ
METHOD FOR ESTIMATION OF IMPLANTATION STATUS OF ENDOMETRY BASED ON ENDOMETRIAL EXPRESSION VDR, HOXA 11 IN ART PROGRAMS IN ELDER REPRODUCTIVE WOMEN WITH TUBE-BODYBODYES

Изобретение относится к области медицины, в частности к патологической анатомии и гинекологии и может быть использовано в сфере вспомогательных репродуктивных технологий у женщин старшего репродуктивного возраста при бесплодии трубного происхождения для оценки прогноза имплантационных возможностей эндометрия. Изобретение обеспечивает возможность персонализации подготовки пациенток к вспомогательным репродуктивным технологиям (ВРТ) с целью повышения их результативности.
Вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ) известны как наиболее эффективный метод лечения бесплодия трубного происхождения, однако частота беременностей в результате ЭКО остается недостаточно высокой. (Liang et al.,2017; Вартанян Е.А.,2018). Наиболее низкая результативность лечения регистрируется у пациенток позднего репродуктивного возраста, поскольку после 36 лет происходит снижение естественной фертильности женского организма. По данным последнего отчета отечественного регистра ВРТ в группе 35 - 39 лет частота наступления беременности(ЧНБ) и частота родов в программах ЭКО составила 27,9% и 19,1% соответственно и ИКСИ -26,6%> и 18,0%) соответственно, что сравнительно ниже с этими показателями в группе женщин 34 года и моложе (ЭКО - 32,9% и 25,1%; ИКСИ - 30,0% и 22,1%). ЧНБ в группе женщин 40 лет и старше была ниже более чем в 2 раза (ЭКО - 14,6%, ИКСИ - 12,6%>), а частота завершения беременностей родами ниже в 3 раза (ЭКО - 7,6%>, ИКСИ - 6,9%>). При этом отмечается стойкая тенденция увеличения частоты обращений в клиники ВРТ женщин позднего репродуктивного возраста.
Повторяющиеся неудачи программ ВРТ у пациенток с бесплодием при переносе эмбрионов высокого качества указывают на то, что причиной могут быть нарушения процессов имплантации эмбриона, связанные с нарушением рецептивности эндометрия (Боярский К.Ю.,2013; Herington J.L et al.,2016; Краснопольская К.В.,2016).
Рецепторы витамина D (VDR), помимо классических органов-мишеней (кости, кишечник), широко распространены и в других тканях, в том числе репродуктивной системы: яичниках, миометрии, эндометрии, что не исключает их важную роль в рецептивности последнего ( Wagner C.L., Taylor S.N., Dawodu Α., et al.,2012; Franasiak JM, Molinaro TA, Dubell EK, ., et а1.,2015;Громова O.A. и др.,2016; Zhao J et al.,2018; Князева E.A.,2020; Guo J. et al., 2020; Deryabin, Ρ et al.,2021).
К числу ключевых регуляторов процессов рецептивности эндометрия, предопределяющих фертильность, принадлежат гены НОХА и кодируемые ими белки (Taylor HS et al., 1997, 2000; Jaslow C.R,2014; Xu В et al., 2014; Du H et al., 2015; Ashary N et al., 2020). В последние годы гинекологические заболевания, в том числе и ассоциированные с бесплодием, нарушения имплантации все чаще начинают рассматриваться как результат нарушения работы генов (Szczepanska M. et al., 2011; Kulp J. et al., 2012; Alizadeh Ζ et al., 2013; Jana S.K et al.,2013; Ônder Çelik et al.,2015; Unlu С et al., 2016; Piltonen T. et al., 2016; Margioula-Siarkou С et al., 2016; Makker Α., et al., 2017 Ôzcan С. et al, 2019; Kara M. et al., 2019; Choux, С et al.,2020; Ben Rafael Ζ., 2021; Deryabin et al.,2021).
Полученные данные свидетельствуют о потенциальной роли VDR, НОХА-И в процессах имплантации и указывают на необходимость их дальнейшего изучения, как вероятных маркеров рецептивности эндометрия.
На момент подачи заявки из свободных источников было известно о следующих наиболее близких аналогах.
Из патента RU 2734840, 23.10.2020 г. (Оразов М. Р., Краснопольская К.В., Михалева Л. М., Хамошина М. Б., Волкова С. В., Хованская Т. Н.,
Шустова В. Б., Абитова М. 3.) известен способ оценки имплантационного потенциала эндометрия при эндометриоз-ассоциированном бесплодии. В период «окна имплантации» в эндометрии определяют уровень экспрессии НОХА 10, ERa, ERp, PR-Α в стромальном компартменте эндометрия и PR-B в железистом. Если экспрессия НОХА 10 < 21%, присваивают «1 балл», если > 21% - «0 баллов». Если экспрессия ERa > 25%>, присваивают «1 балл», если <25%> - «0 баллов». Если экспрессия ERP > 20%, присваивают «1 балл», если <20%, - «0 баллов». Если экспрессия PR-Α < 23%>, присваивают «1 балл», если > 23%, - «0 баллов». Если экспрессия PR-B > 47%>, присваивают «1 балл», если <47%, - «0 баллов». Полученные баллы суммируют. При сумме баллов «4-5 баллов» определяют наличие экстремально низкого имплантационного потенциала эндометрия, указывающего на отрицательный прогноз имплантации. При сумме баллов «2-3 балла» определяют наличие низкого имплантационного потенциала эндометрия, указывающего на отрицательный прогноз имплантации. При сумме баллов «0-1 балл» определяют наличие высокого имплантационного потенциала эндометрия, указывающего на положительный прогноз имплантации. Недостатком метода является трудоемкость способа. Кроме того, установленная модель с целью прогнозирования имплантационных нарушений базируется только на анализе эндометриального паттерна у женщин с эндометриоз-ассоциированным бесплодием.
Из патента RU 2732430,16.09.2020г. (Чистякова Г.Н., Гришкина Α.Α., Ремизова И.И., Данькова И.В., Щедрина И. Н.,Михельсон А. Н. ФГБУ «НИИ ОММ» Минздрава России) известен способ оценки рецептивности эндометрия у женщин с первичным бесплодием и миомой матки. На этапе прегравидарной подготовки к программам высокотехнологичных репродуктивных технологий (ВРТ) в период «окна имплантации» проводят оценку экспрессии маркеров
VEGFr3 и PTEN с последующим вычислением прогностического индекса (PI) по формуле PI = (-0,045) χ Х1+(-0,06) χ Х2+0,27 χ ХЗ+3,38. При ΡΙ более 0 делают заключение о готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона и возможности направления женщины с первичным бесплодием и миомой матки в программу ВРТ. При ΡΙ менее 0 прогнозируют низкую рецептивность эндометрия и высокий риск репродуктивных неудач.Недостатком метода является его применение только у женщин с первичным бесплодием и миомой матки 3-6 классов по FIGO.
Из патента RU 2732432,16.09.2020 г. (Гришкина А.А., Чистякова Г.Н Башмакова Надежда Васильевна Ремизова И.И., Данькова И. В., Филатова Алена Сергеевна ФГБУ «НИИ ОММ» Минздрава России) известен способ оценки эндометриальной дисфункции у женщин с первичным эндометриоз-ассоциированным бесплодием. На 20-22 день менструального цикла производят пайпель-биопсию эндометрия и определяют экспрессию PTEN и р53 с последующим вычислением прогностического индекса (PI) по формуле PI = Х1х-0,54+0,233хХ2-0,165χΧ3+29,2. При ΡΙ более 0 делают заключение о готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона и возможности направления женщины в программу ВРТ. При ΡΙ менее 0 прогнозируют высокий риск репродуктивных неудач в программах ВРТ. Изобретение позволяет с высокой долей вероятности определять восприимчивость эндометрия к имплантации бластоцисты в период «имплантационного окна» у женщин с первичным бесплодием, обусловленным эндометриозом. Недостатком метода является то, что способ прогнозирования основан только на исследовании пациенток с первичным эндометриоз-ассоциированным бесплодием.
Из патента RU 2731203, 31.08.2020 г. (Чистякова Г.Н., Гришкина А.А., Ремизова И.И., Мелкозерова О. А. ФГБУ «НИИ ОММ» Минздрава России) известен способ оценки рецептивности эндометрия
в секреторную фазу у женщин с первичным бесплодием, обусловленным гипоплазией эндометрия на основании иммуногистохимического исследования уровня экспрессии в эндометрии (Т-лимфоцитов - CD3+, р53 - маркера индукции апоптоза и PTEN - фосфотазы с двойной субстратной специфичностью), с последующим вычислением прогностического индекса (PI). по формуле Р1=Х1х-0,69+0,59хХ2+0,99хХЗ+0,37хХ4-69,3. При PI более 0 делают заключение о готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона и возможности направления женщины в программу высокотехнологичных репродуктивных технологий (ВРТ). При PI менее О прогнозируют низкую рецептивность эндометрия и высокий риск репродуктивных неудач в программах ВРТ у женщин с первичным бесплодием, обусловленным гипоплазией эндометрия.
Недостатком метода является его применение только у женщин с первичным бесплодием, обусловленным гипоплазией эндометрия, без учета других форм и причин бесплодия.
Наиболее близким к предлагаемому является способ из патента RU 2636527, 28.10.2016г (Бурменская О.В., Трофимова Д.Ю., Смольникова В.Ю., Корнеева И.Е., Межевитинова Е.А.Ю., Донников А.Е., Сухих Г.Т. ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздрава РФ) известен способ определения персонального "окна имплантации" у женщин на основе анализа транскрипционного профиля генов.
Способ определения персонального «окна имплантации» у женщин включает измерение уровней экспрессии мРНК функциональных генов человека РАЕР, DPP4, HLA-DOB, MSX1 в образцах тканей эндометрия, полученных путем пайпель-биопсии на 7-8 день после пика лютеинизирующего гормона. Далее полученные значения уровней экспрессии мРНК используют для вычисления индекса рецептивности эндометрия. Если значение индекса рецептивности эндометрия менее
или равно пороговому значению, делают заключение о несоответствии эндометрия стадии «окна имплантации»; если значение индекса рецептивности эндометрия больше порогового значения, делают заключение о соответствии эндометрия стадии «окна имплантации», при этом пороговое значение определяют исходя из экспериментальных данных с помощью ROC-анализа.
Недостатком данного метода является исключение из исследования женщин старше 39 лет, измерение уровней экспрессии нескольких мРНК генов, измерение уровней экспрессии мРНК методом количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, требующих особых условий для подготовки и сохранения гистологического материала.
Задачей изобретения является разработка способа оценки имплантационной состоятельности эндометрия методом
иммуногистохимического исследования эутопического эндометрия с определением экспрессии VDR, НОХА 11 в стромальных клетках эндометриального паттерна в программах ВРТ у женщин старшего репродуктивного возраста с трубно-перитонеальным бесплодием (ТПБ).
Техническим результатом предлагаемого способа является прогнозирование успешной имплантации бластоцисты и наступления клинической беременности в программах ВРТ у женщин позднего репродуктивного возраста с трубно-перитонеальным фактором бесплодия.
Технический результат достигается тем, что способ диагностики возможной имплантации включает иммуногистохимическое исследование эндометрия с определением экспрессии VDR, НОХА 11 в клетках стромы с последующим  расчетом  вероятности  (Р)  имплантации  по формуле:
1
2
где х -значение экспрессии НОХА11, х - значение экспрессии VDR.
Отличие способа заключается в том, что проведено принудительное
включение в формулу модели логистической регрессии значений экспрессий VDR, НОХА 11 в стромальных клетках эндометрия, которые согласно проведенному собственному исследованию продемонстрировали высокую статистическую значимость для исходов программ ВРТ, р=0,016 и р=0,001, соответственно.
При Ρ более 0,27, делают заключение о благоприятном прогнозе для имплантации; при Ρ менее 0,27, делают заключение о несоответствии эндометрия благоприятному прогнозу имплантации.   Вероятность (Р) определена на основе формулы модели логистической регрессии. Осуществление изобретения.
С целью разработки формулы модели логистиской регрессии на основе проспективного когортного исследования женщин (п=68) позднего репродуктивного возраста (с 36 до 44 лет) с трубно-перитонеальным бесплодием при подготовке к ВРТ, определены экспрессии VDR, НОХА 11 в клетках стромы эндометрия у женщин с успешной имплантацией и наступлением клинической беременности и у женщин с отсутствием имплантации.
В период предполагаемого окна имплантации (на 18-22 день менструального цикла) проводят пайпель -биопсию эндометрия в цикле, предшествующем проведению ЭКО. Полученные образцы эндометрия обрабатывают по стандартной методике с получением парафиновых блоков. ИГХ проводят на депарафинизированных и дегидратированных срезах толщиной 5 мкм с использованием авидин-биотинового иммунопероксидазного метода.
Иммуногистохимическое исследование биоптатов эндометрия, проведено с применением стандартных наборов поликлональных антител фирмы GeneTex, США (кроличьи поликлональные антитела\ТЖ, НОХА 11). Для визуализации первичных антител использована система детекции N-Histofine DAB (nichirei biosciences ins. Japan). Морфологическое исследование проведено с использованием микроскопа
Primo Star производство Karl Zeiss. Диапазон рабочих увеличений 200-400. Фотографирование произведено с помощью цветной камеры Pixera Pro 150ES (переходник 0,5х). Для оценки морфофункционального состояния использовано лицензированное программное обеспечение «Морфология 5.2.».
Результаты реакции VDR, НОХА 11 идентифицированы по окрашиванию клеток стромы с оценкой процента окрашенных клеток.
Для создания математической модели, позволяющей прогнозировать имплантацию, применялся множественный регрессионный анализ с принудительным включением двух переменных: VDR, НОХА11 стромы, у которых ранее выявили высокую прогностическую значимость для исходов программ ВРТ, р=0,016 и р=0,001, соответственно.
показатель
В
значимость
ОШ(Ехр(в)
ДИ для ОШ
НОХА 11
-0,487
0,003
0,615
[0,444;0,850]
VDR
-0,302
0,012
0,740
[0,585;0,935]
константа
4,121
0,005
61,649
Уравнение модели
1
2
где x - экспрессия НОХА11, х - экспрессия VDR.
Полученная модель является статистически значимой (р <0,001). Чувствительность модели 83,3%, специфичность 74%, процент правильно классифицированных 76,5%.
Обладает высокой прогностической способностью. Площадь под ROC-кривой модели 0,846(0,756;0,935), ρ 0,001.
Если вероятность, рассчитанная по модели (уравнению) >0,27, то
прогнозируется наступление имплантации.
Предлагаемый способ расширяет возможности оценки имплантационных возможностей эндометрия у данной когорты пациенток и позволяет прогнозировать восприимчивость эндометрия к имплантации бластоцисты.
Клинические примеры (таблица 1):
Пример 1. Пациентка И. 39 лет, вторичное бесплодие 10 лет. В анамнезе лапароскопия, 2стороняя тубэктомия (2сторонний сактосальпинкс), секторальная резекция левой молочной железы (фиброаденома). Менархе с 11 лет, цикл 28 дней, регулярный, продолжительность менструаций 5 дней, характер менструаций умеренный. АМГ- 0,8 нг/мл, ФСГ 10,1 мМЕ/мл. Раннее 3 безуспешные попытки ЭКО. Ответ бедный. Рекомендована программа с ДО. По данным иммуногистохимии экспрессия VDR 4,894%, НОХА11 4,569%» в строме эндометрия. Р=0,60. После медикаментозной подготовки эндометрия перенос 2 эмбрионов хорошего качества. Толщина эндометрия 7,9 мм. ХГЧ 1682 мМЕ/мл. По данным УЗИ в полости матки дихориальная, диамниотическая двойня. Своевременные роды.
Пример 2. Пациентка К. 41 год, вторичное бесплодие 8 лет. Соматически - здорова. Менархе с 12 лет, цикл 30 дней, регулярный, продолжительность менструаций 4 дня, характер менструаций умеренный. АМГ- 1,1 нг/мл, ФСГ 12,1 мМЕ/мл. По данным иммуногистохимии экспрессия VDR 7,839%), НОХА11 4,17% в строме эндометрия. Р=0,43. Протокол стимуляции длинный с агонистами, длительность стимуляции 11 дней, курсовая доза гонала 1650 ME и мериоферт (75 ME ФСГ + 75 ME ЛГ) 750 ME. Получено 7 ооцитов, ЭКО,5 эмбрионов, перенос 2 эмбриона отличного качества на 5 сутки. Толщина эндометрия 10 мм. ХГЧ 1000 мМЕ/мл. По данным УЗИ в полости матки плодное яйцо, своевременные роды.
Пример 3. Пациентка Р. 42 г, вторичное бесплодие 10 лет. В анамнезе 1 медаборт по желанию женщины, Лапароскопия. Кистэктомия слева
(разрыв кисты). Соматически здорова. Менархе с 13 лет, цикл 25 дней, регулярный, продолжительность менструаций 3 дня, характер менструаций умеренный. АМГ- 0,25 нг/мл, ФСГ 18,5 мМЕ/мл. Раннее 1 безуспешная попытка ЭКО. Ответ бедный. Рекомендована программа с ДО. По данным иммуногистохимии экспрессия VDR 0,735%, НОХА11 3,583%)в строме эндометрия. Р=0,89. После медикаментозной подготовки эндометрия перенос 2 эмбрионов хорошего и отличного качества. Толщина эндометрия 10,3 мм. ХГЧ 2425,5 мМЕ/мл. По данным УЗИ в полости матки дихориальная, диамниотическая двойня.
Пример 4. Пациентка Т. 40 лет, вторичное бесплодие 6 лет. 2 рубца на матке. Соматическая патология: АИТ. Гипотиреоз (медикаментозная компенсация). Менархе с 14 лет, цикл 27 дней, регулярный, продолжительность менструаций 5 дней, характер менструаций умеренный. АМГ- 1,66 нг/мл, ФСГ- 7,95 мМЕ/мл. Попытка ЭКО первая. По данным иммуногистохимии экспрессия VDR 2,363%), НОХА11 14,83% в строме эндометрия. Р=0,02. Протокол с антагонистами, длительность стимуляции 11 дней, курсовая доза гонала 2475 ME и цетротид №4. Получено 5 ооцитов, ЭКО, 4 эмбрионов. Перенесен на 5 сутки 1 эмбрион хорошего качества. Толщина эндометрия 9 мм. ХГЧ через 14 дней менее 1,0 мМЕ/мл. При УЗИ плодное яйцо в полости матки не обнаружено.
Пример 5. Пациентка М. 40 лет, первичное бесплодие 12 лет. Соматически - здорова. Менархе с 16 лет, цикл 28 дней, регулярный, продолжительность менструаций 5-6 дней, характер менструаций умеренный. АМГ- 2,1 нг/мл, ФСГ 5,4 мМЕ/мл. По данным иммуногистохимии экспрессия VDR 7,137%, НОХА11 10,22% в строме эндометрия. Р=0,04. Протокол стимуляции короткий с агонистами, длительность стимуляции 13 дней, курсовая доза гонала 1800 ME и мериоферт (75 ME ФСГ + 75 ME ЛГ) 975 ME. Получено 8 ооцитов, ЭКО,5 эмбрионов, перенос 2 эмбриона отличного качества на 5 сутки.
Толщина эндометрия 10 мм. ХГЧ менее 1,0 мМЕ/мл. По данным УЗИ в полости матки плодное яйцо не обнаружено.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Челябинской области в рамках научного проекта № 20-415-740014.