АНТИТЕЛА, НЕЙТРАЛИЗУЮЩИЕ ЦИТОМЕГАЛОВИРУС ЧЕЛОВЕКА, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
ANTIBODIES NEUTRALISING HUMAN CYTOMEGALOVIRUS AND USE THEREOF

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к антителам, обладающим специфичностью по отношению к человеческому цитомегаловирусу, приемлемым моноклональным антителам, обладающим такой специфичностью, и иммортализованным В-клеткам, которые продуцируют такие моноклональные антитела. Настоящее изобретение также относится к эпитопам, с которыми связываются такие антитела, к применению антител и эпитопов в способах скрининга, а также в диагностике, профилактике и лечении заболевания.
Уровень техники
Человеческий цитомегаловирус (hCMV) является широко распространенным патогеном, который может вызывать тяжелую патологию у взрослых с пониженным иммунитетом и после инфицирования эмбриона, и непосредственно связан с хроническими заболеваниями, такими как атеросклероз. hCMV инфицирует множество типов клеток, включая фибробласты, эндотелиальные, эпителиальные и гемопоэтические клетки [1]. Распространенные аттенуированные in vitro штаммы hCMV, которые были разработаны в качестве кандидатных вакцин, утратили тропизм по отношению к эндотелиальным клеткам, сохраняя при этом способность к инфицированию фибробластов [2]. Недавно было показано, что два вирусных гликопротеиновых комплекса контролируют клеточный тропизм hCMV. Для инфицирования фибробластов необходим комплекс gH, gL и gO, в то время как комплекс gH, gL и протеинов, кодированных UL131-UL128 генами, отвечает за инфицирование эндотелиальных клеток, эпителиальных клеток и дендровидных клеток [2-8].
Гипериммунные глобулины уже введены в коммерческий оборот для применения для профилактики заболевания hCMV, связанного с трансплантацией, а недавно полученные данные указывают на то, что они обладают терапевтическим действием по отношению к беременным [9]. Такой терапевтический подход ограничен малым количеством нейтрализующего антитела, которое может быть перенесено, и по этой причине чрезвычайно желательным было бы наличие человеческих антител (таких как человеческие моноклональные антитела) с высокой нейтрализующей способностью. Однако все еще необходимо определить мишень для нейтрализующих hCMV антител. В предыдущих работах gB и gH были идентифицированы в качестве потенциальных мишеней. Однако гуманизированное антитело к gH (MSL 109) не показало какого-либо значительного эффекта в клинических испытаниях [10, 11]. Все нейтрализующие антитела, описанные до настоящего времени, имели низкую нейтрализующую способность, поскольку они нейтрализуют инфекцию hCMV только при высоких концентрациях. Например, антитело MSL-109 проявляет только 50% нейтрализующей активности при концентрации 10 мкг/мл, что может объяснять отсутствие эффекта in vivo [11]. Нейтрализующую активность анти-hCMV антител, типично, измеряют с использованием фибробластов в качестве клеток-мишеней. Однако известно, что hCMV вызывает патологию путем инфицирования других типов клеток, таких как эндотелиальные, эпителиальные клетки и лейкоциты. Поэтому не очевидно, что не существует каких-либо моноклональных антител, которые могли бы быть способны к высокоэффективной нейтрализации инфицирования нефибробластных клеток-мишеней. Недавно описанные нейтрализующие антитела к UL128 и UL130 также показали очень низкую активность при нейтрализации инфицирования эндотелиальных клеток [7].
Поэтому существует необходимость в получении нейтрализующих антител к hCMV, а также в определении мишени, с которой связываются такие антитела.
Описание изобретения
Настоящее изобретение основано на продуцировании антител и фрагментов антител, которые нейтрализуют hCMV инфекцию и имеют особо высокую активность при нейтрализации инфекции hCMV. Такие антитела являются желательными, поскольку для нейтрализации данного количества вируса необходимы только низкие концентрации. Это способствует образованию более высоких степеней защиты при введении меньших количеств антител. Человеческие моноклональные антитела и клоны иммортализованных В-клеток, которые секретируют такие антитела, также входят в объем настоящего изобретения.
Изобретатели открыли, что антитела, направленные на комбинацию UL130 и UL131A, особо эффективны при нейтрализации hCMV. Такая комбинация может представлять собой комплекс UL130 и UL131A, формирующий эпитоп, распознаваемый антителом, или антитело может быть направлено на один из UL130 и UL131A, наличие других протеинов необходимо для специфичности.
Настоящее изобретение также относится к характеристике эпитопа, с которым связываются антитела, и к применению такого эпитопа при повышении иммунного отклика.
Настоящее изобретение также относится к различным способам и применениям, в которых задействованы антитела в соответствии с настоящим изобретением и эпитопы, с которыми они связываются.
Антитела в соответствии с настоящим изобретением
Настоящее изобретение обеспечивает моноклональные или рекомбинатные антитела, обладающие особо высокой активностью при нейтрализации hCMV. Настоящее изобретение также обеспечивает фрагменты таких рекомбинантных или моноклональных антител, в особенности фрагменты, сохраняющие антигенсвязывающую активность антител, например сохраняющие, по меньшей мере, один гипервариабельный участок (CDR), обладающий специфичностью по отношению к hCMV протеинам UL130 и UL131A.
В данной заявке под термином "высокая активность при нейтрализации hCMV" подразумевают, что молекула антитела в соответствии с настоящим изобретением нейтрализует hCMV в стандартном анализе при концентрации, значительно более низкой, чем концентрация антител, известных из уровня техники, например, по сравнению с MSL-109.
-8
-9
-10
-11
-12
-13
Предпочтительно, молекула антитела в соответствии с настоящим изобретением может нейтрализовать при концентрации 0,16 мкг/мл или ниже (т.е. 0,15, 0,125, 0,1, 0,075, 0,05, 0,025, 0,02, 0,016, 0,015, 0,0125, 0,01, 0,0075, 0,005, 0,004 или ниже), предпочтительно 0,016 мкг/мл или ниже (концентрация антитела 10 или ниже, предпочтительно 10 М или ниже, предпочтительно 10 М или ниже, т.е. 10 М, 10 М, 10 М или ниже). Это означает, что только очень низкие концентрации антитела необходимы для 50% нейтрализации клинического изолята hCMV in vitro по сравнению с концентрацией MSL-109, необходимой для нейтрализации того же самого титра hCMV. Предпочтительно, концентрация антитела в соответствии с настоящим изобретением, необходимая для 50% нейтрализации инфицирования эндотелиальных клеток, эпителиальных клеток и дендровидных клеток клиническим изолятом hCMV в 50 раз или более (т.е. в 75, 100, 150, 200 или более) ниже, чем концентрация, необходимая для MSL-109. Эффективность может быть измерена при помощи стандартного анализа нейтрализации, как описано в уровне техники.
Антитела в соответствии с настоящим изобретением могут нейтрализовать hCMV. Предпочтительно, антитело в соответствии с настоящим изобретением предотвращает инфицирование фибробластов или эндотелиальных клеток. Более предпочтительно, антитело в соответствии с настоящим изобретением предотвращает инфицирование эндотелиальных клеток. Предпочтительно, антитело в соответствии с настоящим изобретением предотвращает инфицирование как фибробластов, так и эндотелиальных клеток. Антитела в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно, также предотвращают инфицирование дендровидных клеток и эндотелиальных клеток, таких как ретинальные клетки.
Антитела могут быть применены в качестве профилактических или терапевтических средств после получения соответствующего лекарственного средства или в качестве диагностического средства.
"Нейтрализующее антитело" представляет собой антитело, которое может нейтрализовать способность патогена инициировать и/или сохранять инфекцию у хозяина (носителя). Изобретение обеспечивает нейтрализующее моноклональное человеческое антитело, где антитело распознает антиген человеческого цитомегаловируса (hCMV).
Предпочтительно, антитело в соответствии с настоящим изобретением обладает специфичностью по отношению к комбинации UL130 и UL131A.
Предпочтительно, антитело в соответствии с настоящим изобретением является моноклональным антителом, которое в данной заявке имеет название 1F11 или 2F4. Такие антитела были первоначально выделены из hCMV инфицированного донора, они продуцируются клонами иммортализованных В-клеток, имеющими название 1F11 или 2F4. Было показано, что такие антитела нейтрализуют инфицирование hCMV эндотелиальных клеток, эпителиальных клеток, ретинальных клеток и дендровидных клеток. Дополнительно, антитела 5А2 и 9А11, выделенные из hCMV инфицированного донора, проявляют аналогичную специфичность по отношению к комбинации UL130 и UL131A и способность к нейтрализации инфицирования hCMV эндотелиальных, эпителиальных, ретинальных и дендровидных клеток. Такие антитела продуцируются клонами иммортализованных В-клеток, имеющими название 5А2 и 9А11 соответственно.
1F11 состоит из тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:7, и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:8. 2F4 состоит из тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:17, и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:18. CDRs тяжелых цепей антитела имеют название CDRH1, CDRH2 и CDRH3 соответственно. Аналогично, CDRs легких цепей антитела имеют название CDRL1, CDRL2 и CDRL3 соответственно. Положение CDR аминокислот определено в соответствии с системой нумерации IMGT [12, 13, 14] следующим образом: CDR1 - IMGT положения 27-38, CDR2 - IMGT положения 56-65 и CDR3 - IMGT положения 105-117.
5А2 состоит из тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:39, и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:40.
Аминокислотные последовательности CDRs данных антител показаны в Таблице 1.
Таблица 1
1F11
2F4
5А2
CDRH1
GFTFSSYA (SEQ ID NO:1)
GFSFNTYG (SEQ ID NO:11)
GGTFSSYV (SEQ ID NO:33)
CDRH2
ISFDGDNK (SEQ ID NO:2)
IWDDGSKM (SEQ ID NO:12)
IIPIFNTA (SEQ ID NO:34)
CDRH3
AREELVGLMPPYYNYGLD V (SEQ ID NO:3)
ARDEGAIMLHAMTDYGL DV (SEQ ID NO:13)
ARDFLSGPMEMPGGYYGLD V (SEQ ID NO:35)
CDRL1
SSNTGNNF (SEQ ID NO:4)
NLGDEF (SEQ ID NO:14)
QSVLYSSNNKNY (SEQ ID NO:36)
CDRL2
DND (SEQ ID NO:5)
QDS (SEQ ID NO:15)
WAS (SEQ ID NO:37)
CDRL3
ETWDGSLNPAVV (SEQ ID NO:6)
QAWDSSTAHYV (SEQ ID NO:16)
QQYYSTPIT (SEQ ID NO:38)
Настоящее изобретение также включает антитело, содержащее тяжелую цепь, содержащую один или более (т.е. один, два или все три) CDRs тяжелой цепи из 1F11 или 2F4 (SEQ ID NO:1-3 или 11-13). Также включено антитело, содержащее тяжелую цепь, содержащую один или более (т.е. один, два или все три) CDRs тяжелой цепи из 5А2 (SEQ ID NO:33-35).
Предпочтительно, антитело в соответствии с настоящим изобретением содержит тяжелую цепь, содержащую (i) SEQ ID NO:1 для CDRH1, SEQ ID NO:2 для CDRH2 и SEQ ID NO:3 для CDRH3, или (ii) SEQ ID NO:11 для CDRH1, SEQ ID NO:12 для CDRH2 и SEQ ID NO:13 для CDRH3. Дополнительное предпочтительное антитело в соответствии с настоящим изобретением содержит тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO:33 для CDRH1, SEQ ID NO:34 для CDRH2 и SEQ ID NO:35 для CDRH3.
Настоящее изобретение также включает антитело, содержащее легкую цепь, содержащую один или более (т.е. один, два или все три) CDRs легкой цепи из 1F11 или 2F4 (SEQ ID NO:4-6 или 14-16). Также включено антитело, содержащее легкую цепь, содержащую один или более (т.е. один, два или все три) CDRs легкой цепи из 5А2 (SEQ ID NO:36-38).
Предпочтительно, антитело в соответствии с настоящим изобретением содержит легкую цепь, содержащую (i) SEQ ID NO:4 для CDRL1, SEQ ID NO:5 для CDRL2 и SEQ ID NO:6 для CDRL3, или (ii) SEQ ID NO:14 для CDRL1, SEQ ID NO:15 для CDRL2 и SEQ ID NO:16 для CDRL3. Дополнительное предпочтительное антитело в соответствии с настоящим изобретением содержит легкую цепь, содержащую SEQ ID NO:36 для CDRL1, SEQ ID NO:37 для CDRL2 и SEQ ID NO:38 для CDRL3.
Предпочтительно, антитело в соответствии с настоящим изобретением содержит тяжелую цепь, имеющую последовательность, указанную в SEQ ID NO:7, 17 или 39. Предпочтительно, антитело в соответствии с настоящим изобретением содержит легкую цепь, имеющую последовательность, указанную в SEQ ID NO:8, 18 или 40.
Также могут существовать молекулы гибридного антитела, которые содержат один или более CDRs из 1F11 и один или более CDRs из 2F4. Предпочтительно, такие гибридные антитела содержат три CDRs из 1F11 и три CDRs из 2F4. Таким образом, предпочтительные гибридные антитела содержат i) три CDRs легких цепей из 1F11 и три CDRs тяжелых цепей из 2F4, или ii) три CDRs тяжелых цепей из 1F11 и три CDRs легких цепей из 2F4. В альтернативном варианте такие гибриды могут содержать один или более CDRs из 5А2.
Настоящее изобретение также включает последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие часть или все легкие и тяжелые цепи и CDRs в соответствии с настоящим изобретением. Предпочтительные последовательности нуклеиновых кислот в соответствии с настоящим изобретением включают SEQ ID NO:9 (кодирующую 1F11 вариабельный регион тяжелой цепи), SEQ ID NO:10 (кодирующую 1F11 вариабельный регион легкой цепи), SEQ ID NO:19 (кодирующую 2F4 вариабельный регион тяжелой цепи) и SEQ ID NO:20 (кодирующую 2F4 вариабельный регион легкой цепи). Предпочтительные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих различные CDRs, включают SEQ ID NO:21 (кодирующую 1F11 CDRH1), SEQ ID NO:22 (кодирующую 1F11 CDRH2), SEQ ID NO:23 (кодирующую 1F11 CDRH3), SEQ ID NO:24 (кодирующую 1F11 CDRL1), SEQ ID NO:25 (кодирующую 1F11 CDRL2), SEQ ID NO:26 (кодирующую 1F11 CDRL3), SEQ ID NO:27 (кодирующую 2F4 CDRH1), SEQ ID NO:28 (кодирующую 2F4 CDRH2), SEQ ID NO:29 (кодирующую 2F4 CDRH3), SEQ ID NO:30 (кодирующую 2F4 CDRL1), SEQ ID NO:31 (кодирующую 2F4 CDRL2) и SEQ ID NO:32 (кодирующую 2F4 CDRL3). Дополнительные предпочтительные последовательности нуклеиновых кислот в соответствии с настоящим изобретением включают SEQ ID NO:41 (кодирующую 5А2 вариабельный регион тяжелой цепи), SEQ ID NO:42 (кодирующую 5А2 вариабельный регион легкой цепи), SEQ ID NO:43 (кодирующую 5А2 CDRH1), SEQ ID NO:44 (кодирующую 5А2 CDRH2), SEQ ID NO:45 (кодирующую 5А2 CDRH3), SEQ ID NO:46 (кодирующую 5А2 CDRL1), SEQ ID NO:47 (кодирующую 5А2 CDRL2), SEQ ID NO:48 (кодирующую 5А2 CDRL3). Вследствие избыточности генетического кода будут существовать варианты таких последовательностей, которые кодируют те же самые аминокислотные последовательности.
Вариантные антитела также входят в объем настоящего изобретения. Таким образом, варианты последовательностей, указанные в данной заявке, также входят в объем настоящего изобретения. Такие варианты могут возникать из-за вырожденности генетического кода, как указано выше. Альтернативно, природные варианты могут продуцироваться вследствие ошибок транскрипции или трансляции. Вариант 2F4 также описан в данной заявке. Данный вариант содержит, дополнительно, два сериновых остатка в С-концевой области 2F4 аминокислотной последовательности тяжелой цепи (SEQ ID NO:17). Таким образом, данный вариант 2F4 состоит из тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:49, и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:18. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариантную тяжелую цепь, указана в SEQ ID NO:50. Таким образом, антитела, содержащие 2F4 вариантную тяжелую цепь (SEQ ID NO:49), входят в объем настоящего изобретения.
Дополнительные варианты последовательностей антител, имеющих повышенную афинность, могут быть получены при помощи способов, известных из уровня техники, и входят в объем настоящего изобретения. Например, аминокислотные замещения могут быть применены для получения антител с дополнительно повышенной афинностью. Альтернативно, оптимизация кодонов нуклеотидной последовательности может быть применена для повышения эффективности трансляции в системах экспрессии для продуцирования антитела.
Предпочтительно, такие последовательности вариантных антител будут иметь 70% или более (т.е. 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99% или более) идентичность последовательностей с последовательностями, указанными в данной заявке. Предпочтительно, такую идентичность последовательностей рассчитывают по отношению к полному размеру контрольной последовательности (т.е. последовательности, указанной в данной заявке). Предпочтительно, процент идентичности, указанный в данной заявке, является таким, как определено при помощи BLAST, версия 2.1.3, с использованием параметров по умолчанию, указанных NCBI (Национальный Центр Биотехнологической Информации (National Center for Biotechnology Information); http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) [Blosum 62 матрица; штраф за открытие пропуска последовательности = 11, штраф за продолжение пропуска последовательности = 1].
Дополнительно в объем настоящего изобретения входят векторы, например векторы экспрессии, содержащие последовательность нуклеиновых кислот в соответствии с настоящим изобретением. Клетки, трансформированные такими векторами, также входят в объем настоящего изобретения.
Настоящее изобретение также относится к моноклональным антителам, которые связываются с эпитопом, способным связывать моноклональное антитело 1F11 или 2F4. Настоящее изобретение также относится к моноклональным антителам, которые связываются с эпитопом, способным связывать моноклональное антитело 5А2.
Моноклональные и рекомбинантные антитела являются особо полезными при идентификации и очистке индивидуальных полипептидов или других антигенов, на которые они направлены. Антитела в соответствии с настоящим изобретением являются дополнительно полезными, поскольку они могут быть применены в качестве реагентов в иммунном анализе, радиоиммунном анализе (RIA) или твердофазном иммуноферментном анализе (ELISA). В таких применениях антитела могут быть помечены аналитически детектируемым реагентом, таким как радиомеченый изотоп, флуоресцентная молекула или фермент. Антитела могут быть также применены для молекулярной идентификации и характеристики (эпитоп картирования) антигенов.
125
131
35
3
Антитела в соответствии с настоящим изобретением могут быть включены в состав лекарственного средства для доставки к месту лечения или связаны с детектируемой меткой для облегчения получения изображения места, содержащего рассматриваемые клетки, такие как клетки, инфицированные hCMV. Способы включения антител в состав лекарственных средств и связывания с детектируемыми метками хорошо известны из уровня техники, так же как и способы получения изображения при помощи детектируемых меток. Меченые антитела могут быть применены для широкого диапазона анализов, в которых используют широкий диапазон меток. Детектирование образования комплекса антитело-антиген между антителом в соответствии с настоящим изобретением и рассматриваемым эпитопом (эпитопом hCMV) может быть облегчено путем присоединения детектируемой субстанции к антителу. Приемлемые средства детектирования включают использование таких меток, как радионуклеотиды, ферменты, коферменты, флуоресцентные вещества, хемилюминесцентные вещества, хромогены, ферментные субстраты или кофакторы, ферментные ингибиторы, комплексы простетических групп, свободные радикалы, частицы, красители и т.п. Примеры приемлемых ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры приемлемых комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры приемлемых флуоресцентных материалов включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеин, дансил хлорид или фикоэритрин; примером люминесцентного материала является люминол; примеры биолюминисцентных материалов включают люциферазу, люциферин и экворин; и примеры приемлемых радиоактивных материалов включают I, I, S или H. Такие меченые реагенты могут быть использованы во множестве хорошо известных анализов, таких как радиоиммунный анализ, ферментные иммуноанализы, например ELISA, флуоресцентные иммуноанализы и т.п. См., например, ссылки 15-18.
Антитело в соответствии с настоящим изобретением может быть конъюгировано с лекарственной группой, такой как цитотоксин, лечебное средство или ион радиоактивного металла или радиоизотоп. Примеры радиоизотопов включают, но не ограничиваются приведенным, I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212, Bi-213, Pd-109, Tc-99, In-111 и т.п. Такие конъюгаты антител могут быть использованы для модифицирования данного биологического отклика; лекарственная группа не должна быть истолкована как группа, ограниченная классическими химическими лечебными средствами. Например, лекарственная группа может быть протеином или полипептидом, обладающим желаемой биологической активностью. Такие протеины могут включать, например, токсин, такой как арбин, рицин А, экотоксин синегнойной палочки или дифтерийный токсин.
Методы конъюгирования такой лечебной группы и антител хорошо известны. См., например, Arnon et al. (1985) "Monoclonal Antibody for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy," в Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, ed. Reisfeld et al. (Alan R. Liss, Inc.), pp.243-256; ed. Hellstrom et al. (1987) "Antibodies for Drug Delivery," в Controlled Drug Delivery, ed. Robinson et al. (2d ed; Marcel Dekker, Inc.), pp.623-653; Thorpe (1985) "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review," в Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, ed. Pinchera et al. pp.475-506 (Editrice Kurtis, Milano, Italy, 1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy," в Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, ed. Baldwin et al. (Academic Press, New York, 1985), pp.303-316; и Thorpe et al. (1982) Immunol. Rev. 62:119-158.
Альтернативно, антитело может быть конъюгировано со вторым антителом с образованием гетероконъюгата антител, как описано в ссылке 19. Дополнительно, могут быть использованы линкеры между метками и антителами в соответствии с настоящим изобретением [20]. Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты могут быть непосредственно помечены радиоактивным йодом, индием, иттрием или другой радиоактивной частицей, известной из уровня техники [21]. Лечение может состоять из комбинации лечения конъюгированными и неконъюгированными антителами, которые вводят одновременно или последовательно [22, 23].
Антитела в соответствии с настоящим изобретением могут быть присоединены к твердой подложке.
2
2
n
Дополнительно, антитела могут быть химически модифицированы путем ковалентной конъюгации с полимером для увеличения их периода полувыведения из кровотока, например. Предпочтительные полимеры и способы их присоединения к пептидам показаны в ссылках 24-27. Предпочтительными полимерами являются полиоксиэтилированные полиолы и полиэтиленгликоль (ПЕГ). ПЕГ растворим в воде при комнатной температуре и имеет общую формулу: R(O-CH-CH)-O-R, где R может быть водородом или защитной группой, такой как алкильная или алканольная группа. Предпочтительно, защитная группа содержит от 1 до 8 атомов углерода, более предпочтительно, она является метилом. Символ n является положительным целым числом, предпочтительно от 1 до 1000, более предпочтительно, от 2 до 500. ПЕГ имеет предпочтительную молекулярную массу от 1000 до 40000, более предпочтительно, от 2000 до 20000, наиболее предпочтительно, от 3000 до 12000. Предпочтительно, ПЕГ имеет, как минимум, одну гидроксигруппу, более предпочтительно, она является концевой гидроксигруппой. Такая гидроксигруппа, предпочтительно, активирована для реакции со свободной аминогруппой в ингибиторе. Однако будет понятно, что вид и количество реакционно-способных групп могут быть различными для получения ковалентно конъюгированного ПЕГ/антитело в соответствии с настоящим изобретением.
Растворимые в воде полиоксиэтилированные полиолы также полезны в данном изобретении. Они включают полиоксиэтилированный сорбитол, полиоксиэтилированную глюкозу, полиоксиэтилированный глицерин (ПОГ) и т.п. ПОГ является предпочтительным. Одной из причин этого является то, что структура глицерина в полиоксиэтилированном глицерине аналогична структуре, которая встречается в природе в, например, моно-, ди- и триглицеридах животных и людей. Поэтому такое разветвление необязательно будет рассматриваться как чужеродный агент в организме. ПОГ имеет предпочтительную молекулярную массу в том же самом диапазоне, что и ПЕГ. Структура ПОГ показана в ссылке 28, а обсуждение ПОГ/IL-2 конъюгатов приведено в ссылке 24.
Другая система доставки лекарств для увеличения периода полувыведения из кровотока представляет собой липосому. Способы получения липосомных систем доставки обсуждены в ссылках 29, 30 и 31. Другие системы доставки лекарств известны из уровня техники и описаны, например, в ссылках 32 и 33.
Антитела в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно, обеспечены в очищенной форме. Типично, антитело будет присутствовать в композиции, которая, по существу, не содержит другие полипептиды, например, менее 90% (по массе), обычно менее 60% и более обычно менее 50% композиции приготовлено из других полипептидов.
Антитела в соответствии с настоящим изобретением могут быть иммуногенными у нечеловеческих (или гетерологических) хозяев, например у мышей. В частности, антитела могут иметь идиотип, который является иммуногенным у нечеловеческих хозяев, но не у человеческого хозяина. Антитела в соответствии с настоящим изобретением для применения у людей включают антитела, которые не могут быть получены от таких хозяев, как мыши, козы, кролики, крысы, неприматные млекопитающие и т.д., и не могут быть получены гуманизацией или от ксено-мышей.
Антитела в соответствии с настоящим изобретением могут быть антителами любого изотипа (например, IgA, IgG, IgM, т.е., α, γ или µ тяжелой цепью), но, в общем, будут антителами типа IgG. В изотипе IgG антитела могут быть подклассами IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Антитела в соответствии с настоящим изобретением могут иметь κ или λ легкую цепь.
Продуцирование антител
Моноклональные антитела в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены одним из способов, известных из уровня техники. Общая методология получения моноклональных антител с использованием гибридомной технологии хорошо известна [34, 35]. Предпочтительно, используют альтернативный способ иммортализации EBV, описанный в ссылке 36.
Применение способа описано в ссылке 36, В-клетки, продуцирующие антитело в соответствии с настоящим изобретением, могут быть трансформированы EBV в присутствии поликлонального активатора В-клеток. Трансформация EBV является стандартной технологией и может быть легко адаптирована для включения активаторов поликлональных В-клеток.
Дополнительные стимуляторы клеточного роста и дифференциации могут быть добавлены во время стадии трансформации для дополнительного повышения эффективности. Такими стимуляторами могут быть цитокины, такие как IL-2 и IL-15. В особенно предпочтительном аспекте IL-2 добавляют во время стадии иммортализации для дополнительного повышения эффективности иммортализации, но его использование не является существенным.
Иммортализованные В-клетки, продуцируемые при помощи данных способов, могут быть затем культивированы при помощи способов, известных из уровня техники, и из них выделяют антитела.
Моноклональные антитела могут быть дополнительно очищены, при желании, при помощи фильтрования, центрифугирования и различных хроматографических способов, таких как ВЕРХ или аффинная хроматография. Методы очистки моноклональных антител, включая методы продуцирования антител фармацевтической степени чистоты, хорошо известны из уровня техники.
2
Фрагменты моноклональных антител в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены из моноклональных антител способами, которые включают дигестию ферментами, такими как пепсин или папаин, и/или путем расщепления дисульфидных связей путем химического восстановления. Альтернативно, фрагменты моноклональных антител могут быть получены путем клонирования и экспрессии части последовательностей тяжелых или легких цепей. "Фрагменты" антител включают Fab, Fab', F(ab') и Fv фрагменты. Настоящее изобретение также охватывает одноцепочные Fv фрагменты (scFv), полученные из тяжелых и легких цепей моноклонального антитела в соответствии с настоящим изобретением. Например, настоящее изобретение включает scFv, содержащий CDRs из антител в соответствии с настоящим изобретением. Также включены мономеры и димеры тяжелой или легкой цепи, а также антитела легкой цепи, например Fv легкой цепи, в котором вариабельные домены тяжелой и легкой цепей соединены пептидным линкером.
Стандартные методы молекулярной биологии могут быть использованы для получения ДНК последовательностей, кодирующих антитела или фрагменты антител в соответствии с настоящим изобретением. Желаемые ДНК последовательности могут быть синтезированы полностью или частично, используя методы олигонуклеотидного синтеза. В случае необходимости могут быть использованы методы сайт-направленного мутагенеза и полимеразной цепной реакции (ПЦР).
2
Для экспрессии ДНК последовательностей, кодирующих молекулы антител в соответствии с настоящим изобретением или их фрагменты, могут быть использованы любые приемлемые системы клетки-хозяина/векторные системы. Могут быть использованы бактериальные, например, Е.coli, и другие микробные системы, частично, для экспрессии фрагментов антител, таких как Fab и F(ab') фрагменты, в особенности Fv фрагментов и фрагментов одноцепочных антител, например одноцепочных Fvs. Эукариотные системы экспрессии клеток-хозяев, например млекопитающих, могут быть использованы для продуцирования больших молекул антител, включая молекулы полных антител. Приемлемые клетки-хозяева млекопитающих включают СНО, HEK293T, PER.C6, миеломные или гибридомные клетки.
Настоящее изобретение также обеспечивает способ продуцирования молекулы антитела в соответствии с настоящим изобретением, включающий культивирование клетки-хозяина, содержащей вектор в соответствии с настоящим изобретением, в условиях, приемлемых для экспрессии протеина из ДНК, кодирующей молекулу антитела в соответствии с настоящим изобретением, и выделение молекулы антитела.
Молекула антитела может содержать только полипептид тяжелой или легкой цепи, в таком случае только последовательность, кодирующая полипептид тяжелой или легкой цепи, должна быть использована для трансфекции клеток-хозяев. Для продуцирования продуктов, содержащих как тяжелые, так и легкие цепи, клеточные линии могут быть трансфицированы двумя векторами, первым вектором, кодирующим полипептид легкой цепи, и вторым вектором, кодирующим полипептид тяжелой цепи. Альтернативно, может быть использован один вектор, где вектор содержит последовательности, кодирующие полипептиды тяжелой и легкой цепи.
Альтернативно, антитела в соответствии с настоящим изобретением могут быть продуцированы путем i) экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением в клетке, и ii) выделения экспрессированного продукта антитела. Дополнительно, способ может включать iii) очистку антитела.
Скрининг и выделение В-клеток
Трансформированные В-клетки подвергают скринингу на предмет выявления В-клеток, продуцирующих антитела, обладающих желаемой специфичностью антигенов, и индивидуальные клоны В-клеток затем могут быть продуцированы из позитивных клеток.
Стадия скрининга может быть осуществлена при помощи метода ELISA, путем окрашивания тканей или клеток (включая трансфицированные клетки), анализа нейтрализации или одного из ряда способов, известных из уровня техники для идентификации желаемой специфичности антигена. В анализе отбор может быть произведен на основании простого распознавания антигенов, или отбор может быть произведен на основании дополнительной желаемой функции, например, для отбора нейтрализующих антител, а не просто антигенсвязывающих антител, для отбора антител, которые могут изменять характеристики клеток-мишеней, таких как их сигнальные каскады, их форма, скорость их роста, способность влиять на другие клетки, отклик на влияние других клеток или других реагентов или изменение условий, статус их дифференциации, и т.д.
Стадия клонирования для разделения индивидуальных клонов и смеси позитивных клеток может быть проведена при помощи серийного разведения, микроманипулирования, одноклеточного осаждения путем клеточного сортинга или другого способа, известного из уровня техники. Предпочтительно, клонирование проводят при помощи серийного разведения.
Клоны иммортализованных В-клеток в соответствии с настоящим изобретением могут быть применены различными способами, например в качестве источника моноклональных антител, в качестве источника нуклеиновой кислоты (ДНК или иРНК), кодирующей рассматриваемое моноклональное антитело, для исследований и т.д.
N
Настоящее изобретение обеспечивает композицию, содержащую иммортализованные В-лимфоциты памяти, где лимфоциты продуцируют антитела, обладающие высокой нейтрализующей активностью, специфичной по отношению к hCMV, и где антитела продуцируют при ≥5 пг на одну клетку в день. Настоящее изобретение также обеспечивает композицию, содержащую клоны иммортализованных В-лимфоцитов памяти, где клоны продуцируют моноклональное антитело, обладающее высокой афинностью, специфичной по отношению к hCMV, где антитело продуцируют при ≥10 нг на один клон в день. Предпочтительно, указанные клоны продуцируют моноклональное антитело, обладающее высокой активностью при нейтрализации hCMV инфекции.
Предпочтительными клонами иммортализованных В-клеток в соответствии с настоящим изобретением являются 1F11 и 2F4. Дополнительными предпочтительными клонами являются 5А2 и 9А11.
Эпитопы
Как указано выше, антитела в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы для картирования эпитопов, с которыми они связываются. Заявители открыли, что антитела IF 11, 2F4, 5А2 и 9А11, нейтрализующие инфицирование hCMV эндотелиальных клеток, эпителиальных клеток, ретинальных клеток и дендровидных клеток, направлены на эпитоп, обнаруженный в комбинации UL130 и UL131A. Хотя заявитель не стремится быть ограниченным данной теорией, считают, что антитела 1F11 и 2F4 связываются с конформационным эпитопом, образованным данными двумя протеинами. Также считают, что 5А2 и 9А11 также связываются с таким конформационным эпитопом, образованным UL130 и UL131A.
Вследствие того факта, что 1F11, 2F4, 5А2 и 9А11 не нейтрализуют инфицирование фибробластов, теоретически допускают, что данные антитела распознают различные эпитопы к человеческим моноклональным антителам 10С6, 5F1, 6В4 и 7Н3. Дополнительно, считают, что моноклональные антитела 10С6, 5F1, 7Н3 и 6В4 связываются с функциональным эпитопом gB.
Эпитопы, распознанные такими антителами, могут иметь ряд применений. Эпитопы и мимеотопы в очищенной или синтезированной форме могут быть применены для повышения иммунного ответа (т.е. в качестве вакцины, или для продуцирования антител для другого применения) или для скрининга сыворотки пациента для выявления антител, которые иммунореагируют с эпитопами или мимеотопами. Предпочтительно, такой эпитоп, или мимеотоп, или антиген, содержащий такой эпитоп или мимеотоп, используют в качестве вакцины для повышения иммунного отклика. Антитела в соответствии с настоящим изобретением также могут использоваться в способе для мониторинга качества вакцин, в частности для проверки того, что антиген в составе вакцины содержит правильный иммуногенный эпитоп в правильной конформации.
Эпитопы также могут быть полезны при скрининге на предмет выявления лигандов, которые связываются с указанными эпитопами. Такие лиганды, предпочтительно, блокируют эпитопы и, таким образом, предотвращают инфицирование. Такие лиганды входят в объем настоящего изобретения.
Рекомбинантная экспрессия
Иммортализованные В-лимфоциты памяти в соответствии с настоящим изобретением также могут быть использованы в качестве источника нуклеиновой кислоты для клонирования генов антител для последующей рекомбинантной экспрессии. Экспрессия из рекомбинантных источников является более традиционной для применения в фармацевтических целях, чем экспрессия из В-клеток или гибридом, например, по причине стабильности, репродуктивной способности, легкости культивирования и т.д.
Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает способ получения рекомбинантной клетки, содержащий стадии: (1) получения одной или более нуклеиновых кислот (например, генов тяжелой и/или легкой цепи) из клона В-клеток, кодирующего рассматриваемое антитело; и (и) вставку нуклеиновой кислоты в носитель экспрессии для того, чтобы позволить экспрессию рассматриваемого антитела в данном носителе.
Аналогично, настоящее изобретение обеспечивает способ получения рекомбинантной клетки, содержащий стадии: (i) секвенирования нуклеиновой кислоты (нуклеиновых кислот) из клона В-клеток, который кодирует рассматриваемое антитело; и (ii) использование информации о последовательностях, полученной на стадии (i) для получения нуклеиновой кислоты (нуклеиновых кислот) для вставки в носитель экспрессии для того, чтобы позволить экспрессию рассматриваемого антитела в данном носителе.
Настоящее изобретение также обеспечивает способ получения рекомбинатной клетки, включающий стадию трансформации клетки-хозяина одной или более нуклеиновыми кислотами, которые кодируют рассматриваемое моноклональное антитело, где нуклеиновые кислоты являются нуклеиновыми кислотами, полученными из клона иммортализованных В-клеток в соответствии с настоящим изобретением. Таким образом, процедуры для первого получения нуклеиновой кислоты (нуклеиновых кислот) и последующего использования для трансформации клетки-хозяина могут быть осуществлены в разное время разными людьми в разных местах (например, в разных странах).
Такие рекомбинантные клетки в соответствии с настоящим изобретением могут быть затем применены для экспрессии и культивирования. Они, в особенности, полезны для экспрессии антител для широкомасштабного фармацевтического производства. Они также могут быть применены в качестве активного ингредиента фармацевтической композиции. Могут быть применены любые приемлемые средства культивирования, включая, но не ограничиваясь приведенным, стационарное культивирование, культивирование при помощи вращающегося флакона, асцитную жидкость, картридж биореактора мембранного типа, модульный мини-ферментер, реактор с механическим перемешиванием, культуру на микроносителях, перфузию с керамическими заполнителями, и т.д.
Способы получения и секвенирования иммуноглобулиновых генов из В-клеток хорошо известны из уровня техники, например, см. ссылку 37.
Носителем экспрессии, предпочтительно, является эукариотная клетка, включая дрожжевые клетки и клетки животных, в особенности клетки млекопитающих (например, СНО клетки, человеческие клетки, такие как PER.C6 [Crucell; ссылка 38] или HKB-11 [Bayer; ссылки 39 и 40] клетки, миеломные клетки [41 и 42], и т.д.), а также растительные клетки. Предпочтительные носители экспрессии могут гликозилировать антитело в соответствии с настоящим изобретением, в особенности, имеющее углеводные структуры, которые сами по себе не являются иммуногенными у людей. Носители экспрессии, которые могут расти в средах, не содержащих сыворотки, являются предпочтительными. Носители экспрессии, которые могут расти в культуре в отсутствие продуктов, полученных из животных, являются предпочтительными.
Носитель экспрессии может быть культивирован с получением клеточной линии.
Настоящее изобретение обеспечивает способ получения одной или более молекул нуклеиновой кислоты (например, генов тяжелой и легкой цепей), кодирующих рассматриваемое антитело, содержащий стадии: (i) получения клона иммортализованных В-клеток в соответствии с настоящим изобретением; (ii) получения из клона В-клеток нуклеиновой кислоты, кодирующей рассматриваемое антитело. Настоящее изобретение также обеспечивает способ получения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей рассматриваемое антитело, содержащий стадии: (i) получения клона иммортализованных В-клеток в соответствии с настоящим изобретением; (ii) секвенирования из клона В-клеток нуклеиновой кислоты, кодирующей рассматриваемое антитело.
Настоящее изобретение также обеспечивает способ получения молекулы (молекул) нуклеиновой кислоты, кодирующей рассматриваемое антитело, содержащий стадию получения нуклеиновой кислоты из клона В-клетки, полученного из трансформированной В-клетки в соответствии с настоящим изобретением. Таким образом, процедуры первого получения клона В-клетки и последующего получения нуклеиновой кислоты (нуклеиновых кислот) из нее могут быть осуществлены в совершенно разное время разными людьми в разных местах (например, в разных странах).
Настоящее изобретение обеспечивает способ получения антитела (например, для фармацевтического применения), включающий стадии: (i) получения и/или секвенирования одной или более нуклеиновых кислот (например, генов тяжелой и легкой цепей) из отобранного клона В-клеток, экспрессирующего рассматриваемое антитело; (ii) вставки нуклеиновой кислоты (нуклеиновых кислот) в или использование нуклеиновой кислоты (нуклеиновых кислот) для получения носителя экспрессии, который может экспрессировать рассматриваемое антитело; (iii) культивирования или субкультивирования носителя экспрессии в условиях экспрессии рассматриваемого антитела; и, необязательно, (iv) очистки рассматриваемого антитела.
Настоящее изобретение также обеспечивает способ получения антитела, содержащий стадии: культивирования или субкультивирования популяции клеток-носителей экспрессии в условиях экспрессии рассматриваемого антитела и, необязательно, очистки рассматриваемого антитела, где указанную популяцию клеток-носителей экспрессии получают (i) обеспечением нуклеиновой кислоты (нуклеиновых кислот), кодирующей (кодирующих) отобранное рассматриваемое антитело В-клетки, продуцированное популяцией В-лимфоцитов памяти, полученными так, как описано выше, (ii) вставкой нуклеиновой кислоты (нуклеиновых кислот) в носитель экспрессии, который может экспрессировать рассматриваемое антитело, и (iii) культивированием или субкультивированием носителей экспрессии, содержащих указанные вставленные нуклеиновые кислоты с получением указанной популяции клеток-носителей экспрессии. Таким образом, процедуры для первого получения рекомбинантного носителя экспрессии и его последующего культивирования для экспрессии антител могут быть осуществлены в совершенно разное время разными людьми в разных местах (например, в разных странах).
Фармацевтические композиции
Применение антител в качестве активного ингредиента фармацевтических композиций в настоящее время широко распространено, включая продукты Herceptin™ (трастузумаб), Rituxan™, Campath™, Remicade™, ReoPro™, Mylotarg™, Zevalin™, Omalizumab, Synagis™ (палавизумаб), Zenapax™ (даклизумаб) и т.д.
Настоящее изобретение, таким образом, обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую антитела в соответствии с настоящим изобретением и/или нуклеиновую кислоту, кодирующую такие антитела и/или иммортализованные В-клетки, экспрессирующие такие антитела и/или эпитопы, которые распознаются антителами в соответствии с настоящим изобретением. Фармацевтическая композиция также может содержать фармацевтически приемлемый носитель для того, чтобы позволить введение. Носитель не должен сам вызывать продуцирование антител, вредных по отношению к пациентам, получающим композицию, и не должен быть токсичным. Приемлемые носители могут быть большими макромолекулами с замедленным метаболизмом, такими как протеины, полипептиды, липосомы, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и частицы неактивных вирусов.
Могут быть использованы фармацевтически приемлемые соли, например соли минеральных кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты и сульфаты, или соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты и бензоаты.
Фармацевтически приемлемые носители в лечебной композиции могут дополнительно содержать жидкости, такие как вода, солевой раствор, глицерин и этиловый спирт. Дополнительно, в таких композициях могут присутствовать вспомогательные вещества, такие как смачивающие и эмульгирующие агенты или рН буферные вещества. Такие носители позволяют получать фармацевтические композиции в виде таблеток, пилюлей, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов и суспензий, для приема внутрь пациентом.
Предпочтительные формы введения включают формы, приемлемые для парентерального введения, например путем инъекции или инфузии, например путем болюсной или непрерывной инфузии. Если продукт предназначен для инъекции или инфузии, он может иметь форму суспензии, раствора или эмульсии в носителе на основе масла или воды и может содержать средства для получения композиции, такие как суспендирующие, консервирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства. Альтернативно, молекула антитела может находиться в сухой форме, для восстановления перед использованием с использованием соответствующей стерильной жидкости.
После получения композиции в соответствии с настоящим изобретением могут быть введены непосредственно субъекту. Предпочтительным является, если композиции адаптированы для введения людям.
Фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть введена при помощи любого количества маршрутов, включая, но не ограничиваясь приведенным, пероральный, внутривенный, внутримышечный, внутриартериальный, внутримозговой, интраперитонеальный, интратекальный, интравентрикулярный, трансдермальный, чрескожный, местный, подкожный, интраназальный, энтеральный, подъязычный, интравагинальный или ректальный маршруты. Также для введения фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы безыгольные шприцы. Типично, лечебная композиция может быть получена как композиция для впрыскивания в виде жидких растворов или суспензий. Также могут быть получены твердые формы, приемлемые для растворов или суспензий в жидких основах перед инъекцией.
Непосредственное введение композиции будет, в общем, сопровождаться инъекцией, подкожно, интраперитонеально, внутривенно или внутримышечно, или она будет доставлена в межклеточное пространство тканей. Композиции также могут быть введены в очаг поражения. Дозированное лечение может быть проведено по схеме одноразового приема или по схеме многоразового приема. Известные фармацевтические средства на основе антител обеспечивают рекомендации относительно частоты введения, например касательно того, должны ли лекарственные средства быть доставлены ежедневно, еженедельно, ежемесячно и т.д. Частота и дозировка могут также зависеть от тяжести симптомов.
Композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть получена в различных формах. Например, композиции могут быть получены как впрыскиваемые композиции, в виде жидких растворов или суспензий. Также могут быть получены твердые формы, приемлемые для получения растворов или суспензий в жидких носителях перед инъекцией (например, лиофилизованная композиция, такая как Synagis™ и Herceptin™, для восстановления стерильной водой, содержащей консервант). Может быть получена композиция для местного введения, например, в виде мази, крема или порошка. Может быть получена композиция для перорального введения, например, в виде таблетки или капсулы, в виде спрея, или в виде сиропа (необязательно ароматизированного). Может быть получена композиция для легочного введения, например, в виде ингалятора, с использованием тонкодисперсного порошка или спрея. Может быть получена композиция в виде суппозитория или пессария. Может быть получена композиция для назального введения, введения в уши или глаза, например, в виде капель. Композиция может быть в виде набора, сконструированного таким образом, чтобы объединенная композиция была восстановлена непосредственно перед введением пациенту. Например, может быть обеспечено лиофилизированное антитело в виде набора, содержащего стерильную воду или стерильный буфер.
Будет оценено, что активным ингредиентом в композиции будет молекула антитела. Как таковая, она будет чувствительна к распаду в желудочно-кишечном тракте. Таким образом, если композиция предназначена для введения по маршруту, включающему желудочно-кишечный тракт, то необходимо, чтобы композиция содержала агенты, защищающие антитело от распада, но высвобождающие антитело после его поглощения из желудочно-кишечного тракта.
Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых носителей приведено в Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, ISBN: 0683306472.
Фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением, в общем, имеет значение рН от 5,5 до 8,5 предпочтительно от 6 до 8 и более предпочтительно приблизительно 7. Значение рН можно поддерживать путем применения буфера. Композиция может быть стерильной и/или не содержащей пирогенов. Композиция может быть изотонической по отношению к людям. Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно поставляют в герметично закрытых контейнерах.
2
Фармацевтическая композиция будет содержать эффективное количество одного или более антител в соответствии с настоящим изобретением, и/или одну или более иммортализованных В-клеток в соответствии с настоящим изобретением, и/или полипептид, содержащий эпитоп, связывающий антитело в соответствии с настоящим изобретением, т.е. количество, достаточное для лечения, улучшения или профилактики желаемого заболевания или состояния или для проявления детектируемого лечебного эффекта. Лечебные эффекты также включают уменьшение физических симптомов. Точное, эффективное количество для любого конкретного субъекта будет зависеть от его габаритов и состояния здоровья, природы и степени состояния и лечебных средств или комбинации лечебных средств, отобранных для введения. Эффективное количество для данной ситуации определяют при помощи стандартных экспериментов и в рамках оценки, произведенной врачом-клиницистом. Для целей настоящего изобретения эффективная доза будет, в общем, составлять от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 50 мг/кг или от приблизительно 0,05 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг композиции в соответствии с настоящим изобретением для пациента, которому ее вводят. Известные фармацевтические средства на основе антител обеспечивают рекомендации относительно такой дозы, например, Herceptin™ вводят путем внутривенной инфузии раствора в концентрации 21 мг/мл, где первоначальная ударная доза составляет 4 мг/кг массы тела, а еженедельная поддерживающая доза составляет 2 мг/кг массы тела; Rituxan™ вводят еженедельно в дозе 375 мг/м и т.д.
Композиция может содержать более одного (например, 2, 3, 4, 5 и т.д.) антител в соответствии с настоящим изобретением, в особенности, когда такие антитела связываются с различными антигенами (или различными эпитопами в том же самом антигене) для обеспечения аддитивного или синергического лечебного эффекта. Например, одно антитело может связываться с комбинацией (или комплексом) UL130-UL131A, в то время как другое антитело может связываться с gH. В дополнительном примере одно антитело может связываться с комбинацией (или комплексом) UL130-UL131A, в то время как другое антитело может связываться с gB. Таким образом, одно антитело может быть направлено на механизм, опосредующий инфицирование фибробластов, в то время как другое антитело может быть направлено на механизм, опосредующий инфицирование эндотелиальных клеток. Для оптимального клинического эффекта полезным может быть применение механизмов инфицирования и сохранения hCMV.
Антитела в соответствии с настоящим изобретением могут быть введены (в комбинации или отдельно) с другими лекарственными средствами, например с химиотерапевтическими соединениями, с лучевой терапией и т.д. Предпочтительные лекарственные соединения включают противовирусные соединения, такие как ганцикловир, фоскамед и цидофовир. Такая комбинированная терапия обеспечивает аддитивное или синергическое повышение терапевтической активности по отношению к индивидуальным лекарственным средствам при введении по отдельности. Термин "синергия" используют для описания комбинированного эффекта двух или более активных средств, превышающего сумму индивидуальных эффектов каждого соответствующего активного средства. Таким образом, если комбинированный эффект двух или более средств приводит к "синергическому ингибированию" активности или процесса, подразумевается, что ингибирование активности или процесса превышает сумму ингибирующих эффектов каждого соответствующего активного средства. Термин "синергический лечебный эффект" относится к лечебному эффекту, наблюдаемому при использовании комбинации двух иди более лекарственных средств, где лечебный эффект (который измеряют при помощи любого количества параметров) превышает сумму отдельных лечебных эффектов, наблюдаемых при использовании соответствующих отдельных лекарственных средств.
Антитела могут быть введены тем пациентам, для которых предварительно было показано отсутствие реакции на лечение hCMV инфекции, т.е. было показано, что они не поддаются анти-hCMV лечению. Такое лечение может включать предварительное лечение противовирусным агентом. Это может быть вызвано, например, инфекцией стойкого к противовирусному лечению штамма hCMV.
В композиции в соответствии с настоящим изобретением, которая включает антитела в соответствии с настоящим изобретением, антитела предпочтительно составляют, как минимум, 50% по массе (например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или более) от общего содержания протеина в композиции. Антитела, таким образом, находятся в очищенной форме.
Настоящее изобретение обеспечивает способ получения фармацевтического средства, включающий стадии: (i) получения антитела в соответствии с настоящим изобретением; и (ii) смешивания очищенного антитела с одним или более фармацевтически приемлемым носителем.
Настоящее изобретение также обеспечивает способ получения фармацевтического средства, включающий стадию смешивания антитела с одним или более фармацевтически приемлемым носителем, где антитело является моноклональным антителом, полученным из трансформированной В-клетки в соответствии с настоящим изобретением. Таким образом, процедуры для первого получения моноклонального антитела и последующего получения фармацевтического средства могут быть осуществлены в совершенно разное время разными людьми в разных местах (например, в разных странах).
В качестве альтернативы доставке антител или В-клеток в лечебных целях возможно доставлять субъекту нуклеиновую кислоту (типично, ДНК), кодирующую рассматриваемое моноклональное антитело (или его активный фрагмент), таким образом, что нуклеиновая кислота может быть экспрессирована в организме субъекта in situ для обеспечения желаемого лечебного эффекта. Приемлемая генная терапия и векторы доставки нуклеиновых кислот известны из уровня техники.
Композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть иммуногенной композицией, более предпочтительно композицией вакцины, содержащей антиген, содержащий эпитоп, обнаруженный в комбинации hCMV протеинов UL130 и UL131A. Альтернативная композиция может содержать (i) антиген, содержащий эпитоп, обнаруженный в комбинации hCMV протеинов UL130 и UL131A, и (ii) антиген, содержащий эпитоп, обнаруженный в hCMV gB. Вакцины в соответствии с настоящим изобретением могут быть профилактическими (т.е. предотвращать инфицирование) или лечебными (т.е. для лечения инфекции), но, типично, будут профилактическими.
Композиции могут включать антимикробные композиции, в особенности, если они упакованы в формат для многократного приема.
Композиция может содержать детергент, например Tween (полисорбат), такой как Tween 80. Детергенты, в общем, присутствуют в малых количествах, например <0,01%.
Композиции могут содержать соли натрия (например, хлорид натрия) для обеспечение тоничности. Концентрация 10±2 мг/мл NaCl является типичной.
Композиции могут содержать сахарный спирт (например, маннитол) или дисахарид (например, сахарозу или трегалозу), например, приблизительно 15-30 мг/мл (например, 25 мг/мл), в особенности, если они предназначены для лиофилизации, или содержать вещество, восстановленное из лиофилизованного вещества. Значение рН композиции для лиофилизации может быть отрегулировано перед лиофилизацией до значения приблизительно 6,1.
Композиции в соответствии с настоящим изобретением могут также содержать одно или более иммунорегуляторных средств. Предпочтительно, одно или более иммунорегуляторных средств включает адъювант.
Композиции в соответствии с настоящим изобретением будут предпочтительно вызывать опосредованный клетками иммунный отклик, а также гуморальный иммунный отклик для эффективной направленности на hCMV инфекцию. Данный иммунный отклик будет предпочтительно индуцировать длительный иммунитет, опосредованный антителами (например, нейтрализующими), и клетками, которые могут быстро реагировать на воздействие hCMV.
Лечение и медицинское применение
Антитела в соответствии с настоящим изобретением или их фрагменты могут быть применены для лечения hCMV инфекции, для профилактики hCMV инфекции или для диагностики hCMV инфекции.
Способы диагностики могут включать контактирование антитела или фрагмента антитела с пробой. Такие пробы могут быть пробами тканей, взятых из, например, слюнных желез, легких, печени, панкреазы, почек, уха, глаза, плаценты, пищеварительного тракта, сердца, яичников, гипофиза, надпочечной железы, щитовидной железы, мозгов или кожи. Способы диагностики могут также включать детектирование комплекса антиген/антитело.
Поэтому изобретение обеспечивает (i) антитело в соответствии с настоящим изобретением, (ii) клон иммортализованных В-клеток в соответствии с настоящим изобретением, (iii) эпитоп, способный к связыванию одного из 1F11 или 2F4, или (iv) эпитоп, способный к связыванию одного из 5А2 или 9А11, для применения в терапии.
Также обеспечен способ лечения пациента, включающий введение данному пациенту (i) антитела в соответствии с настоящим изобретением, (ii) эпитопа, способного к связыванию одного из 1F11 или 2F4, или (iii) эпитопа, способного к связыванию одного из 5А2 или 9А11.
Настоящее изобретение также обеспечивает применение (i) антитела в соответствии с настоящим изобретением, (ii) клона иммортализованных В-клеток в соответствии с настоящим изобретением, (iii) эпитопа, способного к связыванию одного из 1F11 или 2F4, (iv) антитела, связывающего эпитоп, способный к связыванию одного из 1F11 или 2F4, (v) эпитопа, способного к связыванию одного из 5А2 или 9А11, или (vi) антитела, которое связывается с эпитопом, способным к связыванию одного из 5А2 или 9А11, при производстве лекарственного средства для профилактики или лечения hCMV инфекции.
Настоящее изобретение обеспечивает композицию в соответствии с настоящим изобретением для применения в качестве лекарственного средства. Оно также обеспечивает применение антитела в соответствии с настоящим изобретением и/или протеина, содержащего эпитоп, с которым связывается данное антитело, при производстве лекарственного средства для лечения пациента и/или диагностики пациента. Оно также обеспечивает способ лечения субъекта и/или осуществления диагностики субъекта, включающий стадию введения субъекту композиции в соответствии с настоящим изобретением. Субъектом, предпочтительно, является человек. Один из способов проверки эффективности терапевтического лечения включает мониторинг симптомов заболевания после введения композиции в соответствии с настоящим изобретением. Лечение может быть осуществлено в режиме введения однократных доз или в режиме введения многократных доз. Настоящее изобретение является полезным для CMV инфекции.
Предпочтительно, антитело, клон иммортализованных В-клеток, эпитоп или композицию в соответствии с настоящим изобретением, вводят группе субъектов, в особенности, имеющих риск возникновения или чувствительных к hCMV инфекции. Такие группы субъектов включают субъектов со сниженным иммунитетом, таких как страдающие от ВИЧ или проходящие иммуноподавляющую терапию, как, например, пациенты после трансплантации.
Антитела в соответствии с настоящим изобретением могут быть применены для пассивной иммунизации.
Антитела и их фрагменты, как описано в данном изобретении, могут быть также применены в наборе для диагностики hCMV инфекции.
Эпитопы, способные к связыванию моноклонального антитела 1F11 или 2F4, описанные в данном изобретении, могут быть применены в наборе для мониторинга эффективности процедур вакцинации путем детектирования наличия защитных анти-hCMV антител.
Эпитопы, способные к связыванию моноклонального антитела 5А2 или 9А11, описанные в данном изобретении, могут быть применены в наборе для мониторинга эффективности процедур вакцинации путем детектирования наличия защитных анти-hCMV антител.
Антитела и их фрагменты, как описано в данном изобретении, могут быть также применены в наборе для мониторинга производства вакцины с желаемой иммуногенностью.
Настоящее изобретение также обеспечивает способ получения фармацевтических средств, включающий стадию смешивания моноклонального антитела с одним или более фармацевтически приемлемым носителем, где моноклональное антитело является моноклональным антителом, которое было получено от носителя экспрессии в соответствии с настоящим изобретением. Таким образом, процедуры для первого получения моноклонального антитела (например, его экспрессии и/или очистки) и его последующего смешивания с фармацевтическим носителем (носителями) могут быть проведены в разное время разными людьми в разных местах (например, в разных странах).
Начиная с трансформированной В-клетки в соответствии с настоящим изобретением, различные стадии культивирования, субкультивирования, клонирования, субклонирования, секвенирования, получения нуклеиновых кислот и т.д. могут быть осуществлены для сохранения антитела, экспрессирующегося трансформированной В-клеткой, с необязательной оптимизацией на каждой стадии. В предпочтительном осуществлении вышеуказанные способы дополнительно включают методы оптимизации (например, созревание или оптимизацию афинности), которые применяют к нуклеиновым кислотам, кодирующим антитело. Изобретение охватывает все клетки, нуклеиновые кислоты, векторы, последовательности, антитела и т.д., которые используют и получают на этих стадиях.
Во всех таких способах нуклеиновая кислота, которую применяют в носителе экспрессии, может быть обработана между стадиями (ii) и (iii) для вставки, исключения или изменения конкретных последовательностей нуклеиновых кислот. Изменения в результате такой обработки включают, но не ограничиваются приведенным, изменения для введения сайтов рестрикции, изменения применения кодонов, для добавления или оптимизации регуляторных последовательностей транскрипции и/или трансляции и т.д. Также возможным является изменение нуклеиновой кислоты для изменения кодированных аминокислот. Например, может быть полезным введение одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д.) аминокислотных замещений, одной или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д.) аминокислотных делеций и/или одной или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д.) аминокислотных вставок в аминокислотную последовательность антитела. Такие точечные мутации могут модифицировать функции эффектора, антигенсвязывающую афинность, пост-трансляционные модификации, иммуногенность и т.д., могут вводить аминокислоты для присоединения ковалентных групп (например, меток) или могут вводить маркеры (например, с целью очистки). Мутации могут быть введены в специфичные сайты или могут быть введены случайным образом, с последующим отбором (например, молекулярная эволюция).
Общая часть
Термин "содержащий" охватывает "включающий", а также "состоящий", например, композиция "содержащая" X, может состоять исключительно из Х или может содержать нечто дополнительное, например Х+Y.
Словосочетание "по существу" не исключает "полностью", например, композиция, которая "по существу не содержит" Y, может вообще не содержать Y. При необходимости, слово "по существу" может отсутствовать в определении в соответствии с настоящим изобретением.
Термин "приблизительно" по отношению к численному значению x означает, например, x±10%.
Термин "заболевание", как используют в данной заявке, предназначен для того, чтобы быть, в общем, синонимичным, и его используют в качестве взаимозаменяемого с терминами "расстройство" и "состояние" (как в медицинском состоянии), в том, что все эти термины отражают ненормальное состояние человеческого или животного организма или одной из его частей, которое ухудшает нормальное функционирование, которые типично проявляются путем различения признаков и симптомов, и приводят к уменьшению продолжительности жизни и качества жизни человека или животного.
Как используют в данной заявке, ссылка на термин "лечение" пациента предназначена для включения предупреждения и профилактики. Термин "пациент" означает всех млекопитающих, включая людей. Примеры пациентов включают людей, коров, собак, котов, коней, козлов, овец, свиней и кроликов. Предпочтительно, пациентом является человек.
Краткое описание чертежей
На Фигуре 1 показан SDS-PAGE, где продемонстрировано, что человеческие моноклональные антитела (1) 1FI1 и (2) 2F4 осаждают комплексы hCMV протеинов, в то время как нерелевантные IgG не осаждают.
На Фигуре 2 показан FACS-анализ, где продемонстрировано, что человеческие моноклональные антитела (А) 1F11 и 2F4 и (В) 5А2 и 9А11 распознают конформационный эпитоп, полученный из генных продуктов UL130 и UL131A.
На Фигуре 3 показаны нуклеотидные и аминокислотные последовательности тяжелых и легких цепей 1F11 и 2F4. CDR последовательности выделены жирным шрифтом.
На Фигуре 4 показан FACS-анализ, где продемонстрировано, что человеческие моноклональные антитела 7Н3, 10С6, 5F1 и 6В4 распознают эпитоп hCMV протеина gB.
На Фигуре 5 показаны нуклеотидные и аминокислотные последовательности тяжелых и легких цепей 5А2. CDR последовательности выделены жирным шрифтом.
Способы реализации изобретения
Пример 1: Клонирование В-клеток и скрининг нейтрализующей активности по отношению к hCMV
+
+
+
+
Было идентифицировано два донора, имеющих высокие титры нейтрализующих антител к hCMV в сыворотке. В-клетки памяти выделяли и иммортализовали при помощи EBV и CpG, как описано в ссылке 36. Кратко, В-клетки памяти выделяли путем негативного отбора при помощи подложек CD22, с последующим удалением IgM, IgD IgA В-клеток, используя специфичные антитела и клеточный сортинг. Отсортированные клетки (IgG) иммортализовали EBV в присутствии CpG 2006 и облученных аллогенных моноядерных клеток. Репликатные культуры, каждая из которых содержит 50 В-клеток памяти, помещали в двадцать планшет на 96 лунок с U-образным дном. Через две недели культуральные супернатанты собирали и анализировали на предмет их способности к нейтрализации инфицирования hCMV фибробластов или эпителиальных клеток путем проведения отдельных анализов. Клоны В-клеток выделяли из позитивных поликлональных культур, как описано в ссылке 36. Концентрации IgG в супернатанте отобранных клонов определяли при помощи IgG-специфичного анализа ELISA.
Для анализа нейтрализации вирусов оттитрованное количество клинического изолята hCMV смешивали с равным объемом культурального супернатанта или с разведениями человеческих сывороток, содержащих нейтрализующие антитела. Через 1 час инкубации при комнатной температуре смесь добавляли к конфлюэнтным монослоям эндотелиальных клеток (например, HUVEC клеток) или фибробластов в планшетах на 96 лунок с плоским дном и инкубировали при 37°C в течение двух дней. Супернатант удаляли, клетки фиксировали охлажденным метанолом и окрашивали смесью мышиных моноклональных антител к hCMV ранним антигенам, а затем меченным флуоресцеином козлиным антимышиным Ig. Планшеты анализировали при помощи флуоресцентного микроскопа. В отсутствие нейтрализующих антител количество инфицированных клеток составляло ~1000/поле, в то время как в присутствии насыщенных концентраций нейтрализующих антител инфекция была полностью ингибирована. Нейтрализующий титр показан как концентрация антитела (мкг/мл), при которой происходит 50% уменьшение hCMV инфекции.
В Таблице 2 показано, что были идентифицированы три разных типа антител. Антитела, которое могут нейтрализовать инфицирование фибробластов, антитела, которые могут нейтрализовать инфицирование эндотелиальных клеток, и антитела, которые могут нейтрализовать инфицирование и тех, и других. Это согласуется с ранее полученными данными о том, что различные протеины отвечают за тропизм по отношению к конкретному типу клеток [7]. Дополнительно к нейтрализации эндотелиальных клеток, наблюдали 1F11 и 2F4 для нейтрализации инфицирования эпителиальных клеток, таких как ретинальные клетки, и дендровидных клеток (данные не показаны).
Таблица 2
50% нейтрализация (мкг/мл)
Клон
Специфичность
Фибробласты
Эндотелиальные клетки
1F11
UL130/UL131A
*
0,001
2F4
UL130/UL131A
*
0,003
5А2
UL130/UL131A
*
0,002
9А11
UL130/UL131A
*
0,001
7Н3
gB
2
*
10С6
gB
0,3
0,3
5F1
gB
0,3
0,3
6В4
gB
0,5
2
Cytotec^
5000
50
Донорская сыворотка
33
1
* отсутствие нейтрализации при наиболее высоких проанализированных концентрациях (т.е. >2 мкг/мл).
<sup>^</sup> Cytotect (Biotest) является пулом hCMV гипериммунного IgG.
Некоторые антитела нейтрализовали инфицирование как фибробластов, так и эндотелиальных клеток при концентрациях IgG в диапазоне от 0,3 до 0,5 мкг/мл. Другие антитела (1F11, 5А2, 9А11 и 2F4) не были способны нейтрализовать инфицирование hCMV фибробластов, но нейтрализовали инфицирование эндотелиальных клеток при чрезвычайно низких концентрациях в диапазоне от 0,001 до 0,004 мкг/мл (более чем в 1000 раз более эффективно, чем ранее известные антитела).
Следует отметить, что при изначальной характеристике было определено, что 5F1 связывается с эпитопом gB, а не gH. Это согласуется с результатами, которые демонстрируют, что блокирование gB позволяет нейтрализацию инфицирования фибробластов, которую наблюдали для 7Н3, 10С6 и 6В4.
Пример 2: Идентификация антигенов-мишеней, распознанных моноклональными антителами
35
Человеческие MRC-9 фибробласты инфицировали клиническим hCMV изолятом. Через 3 дня клетки метаболически помечали S метионином и цистеином. После предварительного выведения лизата добавляли человеческие моноклональные антитела 1F11 и 2F4, а иммунокомплексы осаждали путем добавления подложек протеина А и разлагали на SDS-PAGE (Фигура 1). Человеческое моноклональное IgG антитело с нерелевантной специфичностью использовали в качестве негативного контроля. Результаты показывают, что человеческие моноклональные антитела 1F11 и 2F4 осаждают комплексы CMV протеинов.
Для картирования специфичности человеческих моноклональных антител конструировали векторы экспрессии, кодирующие маркированные геммаглютинином (НА) UL128Δ1-27, UL130Δ1-25 и UL131AΔ1-18 hCMV протеины, у которых отсутствовали сигнальные пептиды. HEK293T клетки трансфицировали данными векторами отдельно или в комбинации. Через 36 часов клетки фиксировали, перегородку делали проницаемой и окрашивали их анти-НА антителом (для контроля эффективности трансфекции) и моноклональным антителом, а затем козлиным античеловеческим IgG. HuMab IgG, обладающие нерелевантной специфичностью, использовали в качестве негативного контроля. На Фигуре 2А показано, что человеческие моноклональные антитела 1F11 и 2F4 распознают конформационный эпитоп, созданный UL130 и UL131A генными продуктами. На Фигуре 2В показано, что человеческие моноклональные антитела 5А2 и 9А11 распознают конформационный эпитоп, полученный из UL130 и UL131A генных продуктов.
Заключение
Вышеуказанные результаты определяют два человеческих моноклональных антитела, способные к высокоэффективной нейтрализации и селективности по отношению к hCMV инфекции человеческих эндотелиальных клеток. Для идентификации распознанного эпитопа антитела анализировали на их способность к иммуноосаждению протеинов из инфицированных клеток hCMV (Фигура 1). Человеческие Mabs 1F11 и 2F4 осаждали несколько протеинов, имеющих кажущуюся молекулярную массу ~15, 33-35 и ~100 кДа. Данные модели согласуются с осаждением комплекса, содержащего gH, gL и UL128, UL130 и, возможно, UL131 А.
Для более точного определения мишени таких антител мы охарактеризовали их способность к окрашиванию HEK293T клеток, трансфицированных векторами, кодирующими НА-маркированный UL128, UL130 и UL131A. Как показано на Фигуре 2А, 1F11 и 2F4 окрашивали только клетки, которые коэкспрессировали UL130 и UL131A, что предполагает распознавание ими конформационного эпитопа, определенного такими двумя генными продуктами. Данное заключение подтверждено тем фактом, что данные антитела не реагируют в анализе вестерн-блоттинг с лизатами инфицированных или трансфицированных клеток в условиях восстановления и денатурации (данные не показаны).
Аналогичные результаты получали для 5А2 и 9А11. На Фигуре 2b показано, что такие антитела окрашивали только клетки, коэкспрессирующие UL130 и UL131A, что предполагает распознавание ими конформационного эпитопа, определенного такими двумя генными продуктами.
Пример 3: Дополнительная идентификация антигенов-мишеней, распознанных моноклональными антителами
Для картирования специфичности человеческих моноклональных антител, нейтрализующих инфицирование фибробластов, был сконструирован вектор экспрессии, кодирующий полноразмерный gB. НЕК293Т клетки были трансфицированы данным вектором. Через 36 часов клетки фиксировали, нарушали проницаемость стенок и окрашивали человеческим моноклональным антителом (HuMab), а затем козлиным античеловеческим IgG. На Фигуре 4 показано, что моноклональные антитела 7Н3, 10С6, 5F1 и 6В4 (но не IgG антитело, обладающее нерелевантной специфичностью) специфично окрашивали клетки, трансфицированные gB, что указывает на то, что они распознают эпитоп gB. Следует особо отметить, что моноклональные антитела 10С6, 5F1 и 6В4 нейтрализуют инфицирование фибробластов и эндотелиальных клеток, в то время как моноклональное антитело 7Н3 нейтрализует инфицирование фибробластов (но не эндотелиальных клеток). Настоящее изобретение предполагает, что моноклональные антитела 10С6, 5F1 и 6В4 связываются с функциональным эпитопом gB, отличным от эпитопа, связанного моноклональным антителом 7Н3.
Будет понятно, что изобретение было описано только при помощи примеров, а модификации могут быть сделаны, не выходя за рамки и сущность настоящего изобретения.