Структурные особенности эндометрия у женщин с невынашиванием беременности ранних сроков, ассоциированным с хроническим эндометритом

СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЭНДОМЕТРИЯ У ЖЕНЩИН С НЕВЫНАШИВАНИЕМ БЕРЕМЕННОСТИ РАННИХ СРОКОВ, АССОЦИИРОВАННЫМ С ХРОНИЧЕСКИМ ЭНДОМЕТРИТОМ

Е.Е. Воропаева, Е.Л. Казачков, Б.И. Медведев, В.Л. Коваленко, Э.А. Казачкова

Кафедры акушерства и гинекологии № 1 и патологической анатомии с секционным курсом ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Росздрава» ул. Воровского, 64, Челябинск, Россия, 454092

Цель исследования — изучение морфофункциональных и молекулярно-биологических особенностей эндометрия у пациенток с синдромом первичной и привычной потери беременности ранних сроков инфекционно-воспалительного генеза. Проведено патогистологическое и морфо-метрическое изучение биоптатов слизистой оболочки матки от 102 пациенток репродуктивного возраста, страдающих невынашиванием беременности ранних сроков инфекционно-воспалительного генеза. 1-ю группу составили 66 женщин, имеющих один самопроизвольный выкидыш на сроке беременности до 12 недель инфекционно-воспалительного генеза. Во 2-ю группу вошли 36 пациенток с двумя и более самопроизвольными выкидышами на сроке беременности до 12 недель инфек-ционно-воспалительного генеза. В работе использован комплекс методов диагностики гениталь-ных инфекций, гистологические, гистохимические, морфометрические, статистические методы исследования. У женщин обеих групп в 100% случаев регистрируется хронический эндометрит, преимущественно, уреаплазменно-микоплазменной и вирусной, нередко — смешанной этиологии. При этом у пациенток 2-й группы достоверно более выражены явления фиброза и атрофии стромы эндометрия, повреждение рецепторного аппарата, угнетение тканевых протективных иммунных реакций, падение уровня желатиназ во внеклеточном матриксе слизистой оболочки матки.

Одной из главных составляющих репродуктивных потерь является невынашивание беременности (НБ). Около 80% самопроизвольных выкидышей (СВ) происходит до 12 недель беременности. Частота привычных ранних потерь беременности в популяции достигает 3—5%. Риск потери желанной беременности возрастает с увеличением числа неудач и достигает 25% после 2 предшествующих СВ и 30—45% — после 3-х СВ [1, 5—8].

Ведущими в генезе НБ среди большого количества экзо- и эндогенных причин являются инфекционно-воспалительные заболевания эндометрия, а своевременное квалифицированное морфологическое исследование слизистой оболочки матки имеет решающее значение для выяснения механизмов развития НБ и восстановления возможных нарушений репродуктивного здоровья [2].

Целью настоящего исследования явилось изучение морфофункциональ-ных и молекулярно-биологических особенностей эндометрия у пациенток с синдромом первичной и привычной потери беременности инфекционно-воспалитель-ного генеза.

Материалы и методы. Проведено патогистологическое и морфометриче-ское изучение биоптатов эндометрия от 102 пациенток репродуктивного возрас-

та, страдающих НБ ранних сроков инфекционно-воспалительного генеза. 1-ю группу составили 66 женщин, имеющих один СВ, во 2-ю группу вошли 36 пациенток с двумя и более СВ.

Критериями исключения явились другие причины НБ, прием гормональных препаратов в течение последних двух месяцев перед исследованием.

Все женщины дали информированное согласие на участие в исследовании и открытую публикацию его результатов.

Обследование пациенток проводили по единой схеме, включающей анализ жалоб, анамнеза, общепринятые клинические и лабораторные, а также специальные методы исследования. Последние включали комплекс методов диагностики генитальной инфекции (ИФА, ПЦР, микроскопия, культуральный метод), морфологические методы исследования эндометрия, полученного путем пайпель-био-псии на 20—22-й день менструального цикла через 3—4 месяца после СВ.

Гистологическое изучение парафиновых срезов эндометрия проводили при окраске материала гематоксилином и эозином, пикрофуксином по ван Гизону и метиловым зеленым-пиронином по Браше. При этом обращали внимание на степень выраженности и активности хронического эндометрита (ХЭ) [4].

Тканевые образцы для иммуногистохимического исследования готовили по общепринятой методике. Используемые моноклональные (МКАТ) или поли-клональные антитела (ПКАТ) («Novocastra», UK) были предназначены для работы с парафиновыми срезами. Для визуализации антигенреактивных клеток использовали тест-систему «Novostain Universal Detection Kit» («Novocastra», UK). Использование каждого вида МКАТ и ПКАТ сопровождалось постановкой реакций положительного контроля на тех же самых срезах согласно оригинальным инструкциям по их использованию.

Для оценки пролиферативной активности эпителиоцитов эндометрия учитывали интенсивность экспрессии маркера Ki-67 (clone MM1, 1 : 100). Активность апоптоза изучали с помощью исследования экспрессии СРР32 (clone JHM62, 1 : 50). Клетки воспалительного инфильтрата иммунофенотипировали с использованием МКАТ к CD4- (clone 4B12, r.t.u.), CD8- (clone 4B11, r.t.u.) и ПКАТ к IgA- (polyclonal, 1:200), ^М- (polyclonal, 1:200) и IgG- (polyclonal, 1 : 200) антигенам. Анализ интенсивности и направленности процессов ремоделирования слизистой оболочки матки проводили с помощью МКАТ к MMP-2 (clone 17B11, 1 : 60), MMP-9 (clone 15W2, 1 : 30) и TIMP-1 (clone 6F6a, 1 : 150).

Для маркеров CD4, CD8, IgA, ^М и IgG, Ki-67, CPP32, а также рецепторов стероидных гормонов: эстрогенов (ER; clone 6F11, r.t.u.) и прогестерона (PR; clone 1A6, r.t.u.), в 10 полях зрения (площадь поля зрения при об. 90 и ок. 8 составляет 994,5 мкм2) подсчитывали количество клеток, дающих интенсивное связывание пероксидазы в 1 мм2. Морфометрические исследования проводили с помощью программы анализа изображений Диа-Морф_Cito_W (Россия). Результаты реакций с маркерами к MMP-2, MMP-9 и TIMP-1 оценивали в баллах (полуколичественный метод с учетом процента окрашенных клеток: 2 балла — менее 20% маркированных клеток, 4 балла — 20—50%, 6 баллов — более 50% клеток).

Для гистохимических и иммуноморфологических исследований эндометрия контролем служили биоптаты слизистой оболочки матки от 15 соматически и гинекологически здоровых женщин репродуктивного возраста, обратившихся для обследования перед планированием беременности или контрацепции (группа контроля).

Просмотр и фотографирование микропрепаратов осуществляли при оптимальном увеличении на микроскопе Axioplan 2 («Carl Zeiss Jena», Germany) с использованием цифровой фотокамеры («Carl Zeiss Jena», Germany).

Для выявления взаимосвязей между изучаемыми факторами был использован комплексный статистический анализ полученных количественных и порядковых величин. Применялись методы вариационного, регрессионного анализа. Пороговая величина вероятности ошибки устанавливалась традиционно на уровне равном 0,05. Достоверность различий величин в группах по изучаемым факторам оценивали по критериям Стьюдента (различие средних) и Фишера (различие дисперсий), критерию согласия Пирсона, с использованием точного метода Фишера и линейного дискриминантного анализа [3]. Расчеты выполнены с помощью персонального компьютера с использованием программы «Биостатистика» и статистического пакета «Microsoft Excel-97» для операционной системы «Windows-98».

Группы обследованных женщин были сопоставимы по характеру менструальной функции, сексуальному дебюту, количеству родов и абортов, характеру контрацептивного поведения. Каждая третья пациентка в 1-й группе и каждая вторая — во 2-й группе те или иные гинекологические заболевания в анамнезе, преимущественно, осложненную эктопию цилиндрического эпителия шейки матки и хронический цервицит, ХЭ и сальпингоофорит, инфекции, передающиеся половым путем (ИППП). Следует отметить, что при привычном НБ в 2 раза чаще, чем у пациенток 1 -й группы, встречались ХЭ и ИППП.

При исследовании ткани эндометрия наличие различных микроорганизмов выявлено в 100% случаев в обеих группах. При этом не было зарегистрировано достоверных отличий в группах по характеру микрофлоры. Так, хламидийная инфекция выделена в эндометрии у 19,7% в 1-й группе и у 19,4% — во 2-й, уреа-плазменная и микоплазменная инфекция — у 50% и 52,8%, вирусная инфекция — у 50% и 47,2%, аэробные и неспорообразующие анаэробные бактерии обнаружены у 30,3% и у 22,3% соответственно группам. Следует отметить, что в эндометрии микроорганизмы выявлялись чаще, чем в цервикальном канале, что свидетельствует о необходимости идентификации возбудителей непосредственно в слизистой оболочке матки. Моноинфекция в эндометрии была зарегистрирована у 42,4% женщин 1-й группы и 41,6% — 2-й группы.

Морфологическое исследование биоптатов эндометрия показало, что у всех женщин имеются структурные изменения слизистой оболочки матки, характерные для ХЭ. При этом обнаружена примерно одинаковая степень активности воспалительного процесса в группах, чаще — низкая либо умеренная. Однако в био-птатах женщин 2-й группы отмечены достоверно более выраженные явления фиб-робластической трансформации клеток стромы, фиброза и атрофии, большее уг-

нетение тканевых протективных иммунных реакций, чаще отсутствовали адекватные секреторные преобразования желез слизистой оболочки матки в связи с повреждением рецепторного аппарата гландулоцитов.

У женщин 1-й и 2-й группы отмечено однонаправленное перераспределение желатиназ и их ингибитора во внеклеточном матриксе эндометрия, выраженное, однако, в большей степени при привычном НБ. Уровень экспонирования MMP-9 эпителиоцитами желез и клетками стромы был в 1,5 раза ниже значения данного параметра в группе контроля: в покровных эпителиоцитах и гландулоцитах желез в среднем 1,6 балла (1,2—2,0), в базальной мембране и клетках воспалительного инфильтрата — 1,9 балла (1,4—2,5). Уровень экспрессии MMP-2 был примерно в 2 раза ниже одноименных показателей контрольной группы: в эпителиальных структурах эндометрия в среднем 1,0 балл, в базальной мембране и клетках воспалительного инфильтрата — 1,2 балла. При сравнении экспонирования ММР-2 и ММР-9 в слизистой оболочке матки в обеих группах на фоне общего снижения уровня их экспрессии отмечены более высокие значения исследуемых маркеров в базальном слое эндометрия, чем в функциональном слое. При этом выявлена прямая сильная корреляционная связь анализируемых параметров со степенью активности воспаления в слизистой оболочке матки. Распределение TIMP-1 в цитоплазме поверхностных эпителиоцитов и гландулоцитов желез было неравномерным (в среднем 2,0 балла) и несколько превышало уровни MMP-9 и MMP-2. Экспрессия метки TIMP-1 отмечена и в клетках воспалительного инфильтрата (макрофаги, нейтрофильные гранулоциты) (в среднем 2,2 балла).

Нами обнаружены патоморфологические и молекулярно-биологические особенности воспалительного процесса в эндометрии в зависимости от идентифицированных возбудителей. Так, морфологическими компонентами ХЭ бактериальной этиологии являлись значительные дистрофические изменения покровных эпите-лиоцитов и клеток желез, различно выраженная полиморфноклеточная инфильтрация слизистой оболочки матки со снижением значения иммунорегуляторного индекса (CD4+/CD8+), а также фибробластическая перестройка стромы и сосудов со снижением объемной плотности покровного эпителия эндометрия, относительного объема желез и повышением уровня относительного объема соединительной ткани. Зарегистрировано уменьшение количества плазмоцитов, продуцирующих IgA (Р < 0,05), а также повышение значения представительства IgG-(Р < 0,01) и IgM-синтезирующих клеток (Р > 0,05). Как правило, эти изменения соответствовали высокой степени активности воспалительного процесса. При этом уровень ММР-2, ММР-9 и TIMP-1 был значительно выше, чем при ХЭ иной этиологии, хотя и не достигал контрольных значений. Пролиферативная активность покровных эпителиоцитов и гландулоцитов желез оказалась ниже нормальных показателей (Р < 0,01), однако экспрессия СРР32 была выше контрольного параметра. При этом отмечалось умеренное повышение интенсивности экспрессии ER и падение уровня экспрессии PR (Р < 0,05) как в эпителиальных, так и в стро-мальных клетках эндометрия. Таким образом, структурными особенностями клеточного обновления и рецепции, характерными для ХЭ бактериальной природы,

были интенсивные процессы апоптоза на фоне слабой пролиферативной активности и относительно высоком уровне металлопротеиназ, что обусловливало атрофию желез и стромы эндометрия и, на наш взгляд, могло явиться причиной формирования синдрома потери беременности.

При ХЭ уреаплазменно-микоплазменной этиологии в эндометрии выявлялись мозаичные слабо или умеренно выраженные воспалительные изменения с превалированием лимфогистиоцитарной реакции и формированием в отдельных полях зрения продуктивных васкулитов. Отмечено плазматическое пропитывание стенок сосудов базального слоя эндометрия, их очаговый фибриноидный некроз, разновеликие кровоизлияния в строму, фибротизация последней. При относительной сохранности представительства ^-продуцирующих плазмоцитов классов А, М и G зафиксировано выраженное снижение уровня CD4+-лимфоци-тов и в меньшей степени — СD8+-клеток со значительным уменьшением отношения CD4+/СD8+. Пролиферативная активность клеток покровного эпителия и эпи-телиоцитов желез была низкой (уровень Ю-67 в 1,2 раза ниже показателя нормы; Р < 0,05). Вместе с тем отмечена повышенная экспрессия СРР32, что наряду с измененной пролиферативной активностью эпителиоцитов обусловливало более или менее выраженную атрофию паренхиматозных и стромальных компартментов эндометрия. Особенностью рецепции половых стероидных гормонов явилась выраженная экспрессия ER (Р < 0,01) и тенденция к снижению экспрессии PR. Все это обусловило частую регистрацию у пациенток данной подгруппы мозаичных картин строения слизистой оболочки матки с чередованием очагов фиброза, атрофии и полипоза эндометрия.

При хламидийной этиологии ХЭ отмечали значительные альтеративные и дистрофические изменения покровного эпителия, гландулоцитов маточных желез, а также выраженную фибробластическую перестройку элементов стромы. Отмечены явления мальформации эндометриальных сосудов (прекапилляров, ве-нул, лимфатических коммуникаций) со структурными признаками лимфостаза, плазмо- и лимфоррагии и очагами миксоидизации стромы. Среди элементов необильной воспалительно-клеточной инфильтрации преобладали лимфоциты и макрофаги, иногда с построением периваскулярных лимфоцитарных «муфточек», наличием плазмоцитов (по 4—6 клеток в поле зрения), фибробластов, единичных нейтрофильных гранулоцитов. При этом отмечено падение уровня CD4+-лимфо-цитов при относительно сохранном содержании СD8+-клеток и уменьшении по сравнению с контролем показателя иммунорегуляторного индекса. Установлено увеличение количества IgM-продуцирующих плазматических клеток при незначительном росте уровня IgG- и снижении числа ^А-плазмоцитов (Р > 0,05). При ХЭ хламидийной этиологии отмечены самые низкие показатели ММР-2 и ММР-9. Кроме того, выявлено достоверное повышение в эндометрии экспрессии ER и пролиферативной активности гландулоцитов желез (значения Ю-67 в 3,2 раза выше контрольного параметра; Р < 0,01) при практически неизменной интенсивности экспрессии PR и СРР32.

При ХЭ, ассоциированном с ВПГ ^П серотипов, и ЦМВ, в базальном слое эндометрия обнаруживали очаговый продуктивный васкулит, дистрофические

изменения эндотелия, нередко явления тромбоваскулита с организацией тромбов и облитерацией сосудов. Имели место умеренная атрофия и дистрофические расстройства поверхностного эпителия и клеток желез. Выявляли скудную лимфо-гистиоцитарную инфильтрацию фиброзированной стромы. Среди лимфоцитов отмечено резкое падение уровня Т-клеток популяций CD4+ и СD8+ с практически не отличающимся от нормы показателем иммунорегуляторного индекса. В группе ^-продуцирующих плазмоцитов некоторый отмечен рост популяции IgM-и IgG-лимфоцитов, а также падение уровня IgA-синтезирующих клеток. Экспрессия ER клетками желез и стромы достоверно превышала нормальный показатель, а уровень экспрессируемых PR не достигал контрольного параметра, особенно в клетках стромального компартмента (Р < 0,05). При вирусной этиологии ХЭ пролиферативная активность эпителиоцитов слизистой оболочки матки была высока (уровень Ю-67 в 2,1 раза превысил норматив; Р < 0,05), интенсивность апо-птоза по сравнению с контрольной группой несколько замедлена (Р > 0,05). Вероятно, в связи с этим у каждой 5-й пациентки из этой подгруппы наряду с ХЭ выявлялась простая очаговая гиперплазия эндометрия.

Заключение. При НБ ранних сроков инфекционно-воспалительного генеза имеет место ХЭ, преимущественно, уреаплазменно-микоплазменной либо вирусной этиологии, часто встречаются микробные ассоциации. При этом морфо-функциональными особенностями эндометрия являются мозаичность воспали-тельно-дисрегенераторных изменений, перестройка паренхиматозно-стромальных отношений и отсутствие адекватных секреторных преобразований компонентов слизистой оболочки матки. При синдроме привычной потери беременности достоверно более выражены явления фиброза и атрофии стромы эндометрия, повреждение рецепторного аппарата, угнетение тканевых протективных иммунных реакций, снижение уровня экспрессии ММР-9 и ММР-2, а также повышение значений TIMP-1 как своеобразного «противовеса» системе желатиназ. Это служит причиной ремоделирования слизистой оболочки матки с прогрессированием кол-лагеногенеза и атрофии железистого аппарата на фоне персистенции возбудителя, что может явиться одним из факторов в генезе НБ. Патоморфологические и моле-кулярно-биологические особенности воспалительного процесса в слизистой оболочке матки в зависимости от характера патогена диктуют необходимость не только эффективной элиминации инфекционного агента, но и проведения комплекса реабилитационных мероприятий, направленных на восстановление структурно-функциональных характеристик эндометрия.

ЛИТЕРАТУРА

[1] Доброхотова Ю.Э. Реабилитация репродуктивной функции у женщин с неразвивающейся беременностью в анамнезе / Ю.Э. Доброхотова, Т.А. Чернышенко, А.А. Аушева // Ж. акуш. и жен. болезн. — 2006.— Т. LV.— № 1.— С. 91—94.

[2] Овчинникова В.В. Оптимизация прегравидарной подготовки женщин с невынашиванием беременности на фоне хронического эндометрита: Автореф. дис. ... канд. мед. наук / В.В. Овчинникова.— М., 2006.— 20 с.

[3] Платонов А.Е. Статистический анализ в медицине и биологии: задачи, терминология, логика, компьютерные методы / А.Е. Платонова.— М: Издательство РАМН, 2000. — 52 с.

[4] Полуколичественная морфологическая оценка активности воспалительного процесса при хроническом эндометрите / О.А. Алимова, Е.Е. Воропаева, Э.А. Казачкова, Е.Л. Казачков // Матер. Всерос. науч.-практ. конф. «Актуальные проблемы патологоанатомиче-ской службы муниципальных учреждений здравоохранения». — Челябинск, 2008.— С. 198—201.

[5] Радзинский В.Е. Ранние сроки беременности / В.Е. Радзинский, А.А. Оразмурадов. — М., 2005.— 448 с.

[6] Сидельникова В.М. Проблема ранних потерь беременности / В.М. Сидельникова // VIII Всерос. науч. форум «Мать и дитя». — М., 2006.— С. 239—240.

[7] Тетруашвили Н.К. Клинико-патогенетическое обоснование использования различных методов иммунотерапии при привычном выкидыше / Н.К. Тетруашвили // Акушерство и гинекология. — 2008. — № 5. — С. 7—12.

[8] Sheinera E. Pregnancy outcome following recurrent spontaneous abortions / E. Sheinera, A. Levy // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. — 2005. — Vol. 118. — № 10. — Р. 61—65.

STRUCTURAL FEATURES OF ENDOMETRIUM BY LOSS OF PREGNANCY OF EARLY TERMS ASSOCIATED WITH CHRONIC ENDOMETRITIS

E.E. Voropaeva, E.L. Kazachkov, B.I. Medvedev, V.L. Kovalenko, E.A. Kazachkova

Department of tocology and gynecology Department of pathology anatomy with sectional course Chelyabinsk State Medical Academy of Roszdrav Vorovskogo str., 64, Chelyabinsk, Russia, 454092

The purpose of research is studying morfofunctional and molecular-biological features of endometrium in patients with a syndrome of initial and habitual loss of pregnancy of early terms by infection-ally-inflammatory genesis. Clinico-laboratory inspection of 102 reproductive age patients, which are suffering from the losing of pregnancy of early terms by infectionally-inflammatory genesis is carried out. 1st group have made 66 women having one spontaneous premature baby, 2nd group — 36 patients with two and more spontaneous premature babies in the anamnesis. In the work we used the complex diagnostic methods for genital infections, histological, histochemical, morphometric, statistical methods of research. At women of both groups in 100% of cases was registered chronic endometritis, associated with virus and mycoplasmico-ureaplasmical microflora mainly, often by mixed etiology. Thus at patients of 2nd group were authentically more expressed such pathologies as fibrosis and atrophy of endometrial stroma, damage of receptor apparatus, depression of tissue protective immune reactions, fall of level of gelatinases in extracellular matrix of endometrium.