СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ БИОПЛЕНКООБРАЗОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
METHOD OF QUANTITATIVE EVALUATION OF BIOFILM FORMATION OF MICROORGANISMS

Изобретение относится к области медицинской и промышленной микробиологии и может быть использовано для количественной оценки способности микроорганизмов к биопленкообразованию на различных биотических и абиотических поверхностях и может быть использовано в исследовательских целях и лабораторной диагностике для характеристики штаммов по их биологической активности.
Образование биопленок является одной из основных стратегий выживания бактерий в окружающей среде. Такой способ существования бактерий создает большие проблемы в промышленной деятельности человека и, что особенно важно, в медицинской практике. В настоящее время стало известно, что многие хронические инфекции, возникновение которых связано с использованием медицинского имплантируемого оборудования - линз, катетеров, протезов, искусственных клапанов сердца, - обусловлены способностью бактерий расти в виде биопленок на поверхности этих устройств [Ильина Т.С., Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития // Генетика. - 2004. - Т.40, №11. - С.1445-1456].
Большое значение для диагностики и профилактики биопленкообразования микроорганизмов имеет количественная оценка способности микроорганизма к образованию биопленки. Для количественной оценки биопленкообразования можно использовать различные методы.
Известен способ оценки биопленкообразования, согласно которому биопленку сначала выращивают на определенной поверхности в течение требуемого времени, соскабливают с подложки, суспендируют в физиологическом растворе и определяют количество микроорганизмов в биопленке [Тец В.Г. Роль внеклеточной ДНК и липидов матрикса во взаимодействии бактерий биопленок с антибиотиками // Автореферат диссертации канд. мед. наук. СПб.: С.-Петерб. государственный мед. акад. им. И.И. Мечникова 2007. - 22 с]. Основными недостатками известного способа являются: длительность процесса до 3-4 суток, высокий расход материалов, техническая сложность в получении однородного соскоба с поверхности и в целом высокая трудоемкость.
Известен способ оценки биопленкообразования, предложенный O′Toole G.A. с соавт. [O′Toole G.A., Kaplan H.B., Kolter R. Biofilm formation as microbial development // Ann. Rev. Microbiol. - 2000. - 54. - P.49-79]. Согласно этому способу микроорганизмы выращивают в лунках пластиковых планшетов, окрашивают и по изменению интенсивности окраски красителя судят о способности штамма к биопленкообразованию.
Существенным недостатком данного способа является ограничение по материалу подложки, на которой исследуют биопленкообразование - полистирол. Адсорбция красителя подложкой полистиролового планшета может приводить к получению завышенных результатов.
Наиболее близким к заявляемому способу по назначению и совокупности существенных признаков является способ, предложенный Леоновым В.В. (прототип) [Леонов В.В. Количественная оценка способности условно-патогенных микроорганизмов к образованию биопленки в эксперименте. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2012. - №10. - С.57-59]. Согласно прототипу микроорганизмы выращивают в бульоне на стеклянной подложке в течение 24-48 ч и по изменению краевого угла смачивания поверхности биопленки вазелиновым маслом проводят определение удельной скорости биопленкообразования штамма исследуемого микроорганизма графическим способом.
Основной признак заявляемого изобретения, общий с прототипом: использование в качестве критерия оценки процесса образования биопленки удельной скорости, определяемой по изменению краевого угла смачивания ее поверхности вазелиновым маслом.
Недостатками способа прототипа являются: высокая трудоемкость, длительность свыше 24 ч и низкая чувствительность, связанная с использованием в качестве подложки, на которой исследуется биопленкообразование микроорганизмов, стекла.
Основными отличиями от прототипа, обеспечивающими получение заявляемого технического результата, являются использование в качестве материала подложки агаровой пластинки, измерение краевого угла смачивания поверхности биопленки через 3 и 9 ч инкубации и расчет удельной скорости биопленкообразования проводят по формуле (2).
Заявляемый способ решает задачи по ускорению и упрощению количественной оценки процесса биопленкообразования, а использование в качестве материала подложки агаровой пластинки позволяет увеличить чувствительность и проводить дифференциальную оценку биопленкообразования между штаммами микроорганизмов, хорошо образующими биопленку, например Pseudomonas aeruginosa.
Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что на агаровую пластинку с выросшей биопленкой наносят каплю вазелинового масла и с помощью горизонтального отсчетного микроскопа определяют краевой угол смачивания ее поверхности. Способность микроорганизма к образованию биопленки оценивают по изменению краевого угла смачивания поверхности биопленки в процессе культивирования, рассчитывая удельную скорость биопленкообразования.
Краевой угол смачивания в зависимости от размера капли рассчитывают по следующей формуле:
где θ - краевой угол смачивания (°);
h, l - высота и длина капли (мм) соответственно.
Удельную скорость биопленкообразования рассчитывают по следующей формуле:
b
-1
где µ - удельная скорость биопленкообразования, ч;
1
2
t и t - продолжительность инкубации, ч (3 и 9 ч);
1,2
θ - краевые углы смачивания (°), измеренные после инкубации в течение 3 и 9 ч.
Примеры 1-5. В стерильные чашки Петри (D=90 мм) с 10 мл питательного бульона МПБ (НПО «Питательные среды», Махачкала) и двумя из агаровыми пластинками (Difco) размером 2,5×2,5 см вносят 0,1 мл микробной взвеси Pseudomonas aeruginosa, стандартизованной до оптической плотности 0,100-0,110 опт. ед. (Specord). Чашки Петри с посевами инкубируют при 37°C. После инкубации пластинки с выросшей биопленкой вынимают из культуральной жидкости и отмывают 10 мл стерильной дистиллированной воды от планктонных клеток и 15 мин высушивают в термостате при 37°C. Образование биопленки оценивают по изменению краевого угла смачивания поверхности биопленки вазелиновым маслом. Замеры проводят через 3 и 9 ч инкубации с помощью горизонтального отсчетного микроскопа марки МПБ-2 в герметичной кювете, которая позволяет рассматривать анализируемый объект в условиях равновесия.
Для одного из исследованных штаммов были получены следующие значения: h(3,0 ч)=2,0 мм; l(3 ч)=7,0 мм; h(9 ч)=1,4 мм; l(9 ч)=7,0 мм.
По изменению краевого угла смачивания судили об удельной скорости образования биопленки.
1. Расчет угла смачивания по формуле (1):
2. Расчет удельной скорости биопленкообразования по формуле (2):
Результаты эксперимента приведены в табл.1.
Как видно из данных таблицы 1, с помощью заявляемого способа получены достоверные отличия по биопленкообразованию между разными штаммами и группами микроорганизмов, а величину удельной скорости биопленкообразования, определенную данным способом, можно использовать для количественной оценки способности штамма к биопленкообразованию.
2
-1
Примеры 6-8. Для сравнения чувствительности определения биопленкообразования известным способом и заявляемым были отобраны 3 штамма Pseudomonas aeruginosa с одинаковой способностью к биопленкообразованию, определенной способом-прототипом. Величина признака удельной скорости биопленкообразования составляла (5,6±0,4)·10, ч. Таким образом, при определении удельной скорости биопленкообразования у данных штаммов, заявляемым способом были получены достоверные отличия по биопленкообразованию (табл.2).
Полученные результаты показывают более высокую чувствительность заявляемого способа по сравнению со способом-прототипом.
Примеры 9-13 проведены в условиях, аналогичных примеру 6, но с использованием в качестве исследуемого микроорганизма Staphylococcus aureus (табл.3).
Как видно при сравнении данных таблиц 1 и 3, заявляемый способ позволяет получить статистически достоверные отличия в значениях удельной скорости биопленкообразования микроорганизмов уже через 9 ч инкубации. Использование в качестве материала подложки агара позволяет выявить различия в биопленкообразовании не только между разными группами, но и штаммами микроорганизмов.
Технический результат: изобретение позволяет ускорить и упростить процесс количественной оценки биопленкообразования микроорганизмов, повышает чувствительность метода, позволяет проводить дифференциальную оценку биопленкообразования между штаммами микроорганизмов, хорошо образующими биопленку.
Таблицы
Таблица 1
Биопленкообразование Pseudomonas aeruginosa
Пример
Штамм
µ<sub>b</sub>·10<sup>2</sup>, ч<sup>-1</sup>
1
27853 АТСС
(5,6±0,4)
2
5070
(5,2±0,2)
3
2364
(5,6±0,3)
4
4922
(4,9±0,2)
5
2898
(5,0±0,2)
Таблица 2
Сравнительный анализ чувствительности количественной оценки биопленкообразования Pseudomonas aeruginosa с использованием заявляемого способа и способа-прототипа
Пример
Штамм
Биопленкообразование
Способ-прототип
Заявляемый способ (µ<sub>b</sub>·10<sup>2</sup>, ч<sup>-1</sup>)
6
27853 АТСС
(5,6±0,4)
(5,6±0,4)
7
5070
(5,6±0,2)
(5,0±0,2)
8
2898
(5,6±0,2)
(4,8±0,1)
Таблица 3
Биопленкообразование Staphylococcus aureus
Пример
Вид и штамм
µ<sub>b</sub>·10<sup>2</sup>, ч<sup>-1</sup>
9
25923 АТСС
(3,9±0,1)
10
2891
(2,7±0,1)
11
391
(5,0±0,2)
12
2888
(3,5±0,3)
13
352
(5,9±0,6)