КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ В ОБРАЗЦЕ

1. Способ количественного определения специфического продукта в реакции амплификации с внесением одноцепочечных разрывов и достройкой, при этом способ включает:
(a) приведение целевой молекулы нуклеиновой кислоты в контакт в практически изотермических условиях с полимеразой, двумя или более олигонуклеотидными праймерами/матрицами, каждый из которых специфически связывается с комплементарной последовательностью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты, ферментом, вносящим одноцепочечный разрыв, и выявляемым полинуклеотидным зондом, где каждый из олигонуклеотидных праймеров/матриц содержит один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов в последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты;
(b) образование ампликонов, содержащих по меньшей мере часть указанной целевой молекулы нуклеиновой кислоты; и
(c) выявление сигнала, специфичного для гибридизации олигонуклеотидного зонда с целевой молекулой нуклеиновой кислоты или ее ампликоном, где сигнал указывает на количество целевой молекулы нуклеиновой кислоты, присутствующей в образце, или ее ампликона.
2
2
2
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что 2'-модификацию выбирают из группы, состоящей из 2'-О-метила, 2'-метоксиэтокси, 2'-фтора, 2'-гидроксила, 2'-аллила, 2'-О-[2-(метиламино)-2-оксоэтила], 4'-тио, 4'-CH-О-2'-мостика, 4'-(CH)-O-2'-мостика, 2'-LNA и 2'-O-(N-метилкарбамата) или содержащих аналоги оснований.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов расположены на 3'-конце последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов расположены на 5'-конце последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты.
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов, расположенных на 5'-конце последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты, отделены от сайта одноцепочечного разрыва с помощью 1, 2, 3, 4, 5 или более немодифицированных нуклеотидов.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что два или более 2'-модифицированных нуклеотида являются смежными.
7. Способ по п. 3, отличающийся тем, что 5 смежных нуклеотидов с 2'-O-метильной модификацией расположены на 3'-конце последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты.
8. Способ по п. 4, отличающийся тем, что 5 смежных нуклеотидов с 2'-O-метильной модификацией расположены на 5'-конце последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты.
9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что на этапе выявления не выявляют ампликон нецелевой молекулы.
10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что способ выполняют в режиме реального времени.
11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что способ представляет собой полуколичественный и/или количественный способ порогов для определения количества молекулы нуклеиновой кислоты, присутствующей в биологическом образце до амплификации.
12. Способ по п. 1, отличающийся тем, что расположение одного или нескольких 2'-модифицированных нуклеотидов ближе к 5'-концу последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты, увеличивает время выявления в амплификации.
13. Способ по п. 1, дополнительно включающий применение соотношений олигонуклеотидных праймеров/матриц для обеспечения повышенной степени выявления продуктов реакции, получаемых из различных количеств исходного целевого материала.
14. Способ по п. 1, дополнительно включающий применение модификатора скорости амплификации для обеспечения повышенной степени выявления продуктов реакции, получаемых из различных количеств исходного целевого материала.
15. Способ по п. 1, отличающийся тем, что целевая молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты ДНК или РНК.
16. Способ по любому из пп. 1-15, отличающийся тем, что зонд представляет собой SYBR Green или молекулярный маяк.
17. Способ по любому из пп. 1-15, отличающийся тем, что зонд представляет собой неамплифицируемый выявляемый полинуклеотидный зонд, содержащий по меньшей мере приблизительно 10 нуклеотидов, комплементарных целевой последовательности, выявляемый фрагмент и молекулу, подавляющую активность полимеразы, где молекула, подавляющая активность полимеразы, предотвращает амплификацию зонда с помощью полимеразы в условиях, поддерживающих полимеразную активность в остальных случаях.
18. Способ выявления множества различных продуктов реакции, получаемых в ходе одной реакции, при этом способ включает:
(a) приведение целевой молекулы нуклеиновой кислоты в контакт в практически изотермических условиях с полимеразой, двумя или более олигонуклеотидными праймерами/матрицами, каждый из которых специфически связывается с комплементарной последовательностью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты, ферментом, вносящим одноцепочечный разрыв, и выявляемым полинуклеотидным зондом, где каждый из олигонуклеотидных праймеров/матриц содержит один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов в последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты;
(b) образование ампликонов, содержащих по меньшей мере часть указанной целевой молекулы нуклеиновой кислоты; и
(c) выявление сигнала, специфичного для гибридизации олигонуклеотидного зонда с целевой молекулой нуклеиновой кислоты или ее ампликоном, где сигнал указывает на количество целевой молекулы нуклеиновой кислоты, присутствующей в образце, или ее ампликона.
19. Способ количественного определения специфического продукта в реакции амплификации с внесением одноцепочечных разрывов и достройкой, при этом способ включает:
(a) приведение целевой молекулы нуклеиновой кислоты в контакт в практически изотермических условиях с полимеразой, двумя олигонуклеотидными праймерами/матрицами, каждый из которых специфически связывается с комплементарной последовательностью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты, ферментом, вносящим одноцепочечный разрыв, и выявляемым полинуклеотидным зондом, где каждый из олигонуклеотидных праймеров/матриц содержит 5 смежных нуклеотидов с 2'-O-метильной модификацией, расположенных на 3'-конце последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты;
(b) образование ампликонов, содержащих по меньшей мере часть указанной целевой молекулы нуклеиновой кислоты; и
(c) выявление сигнала, специфичного для гибридизации олигонуклеотидного зонда с целевой молекулой нуклеиновой кислоты или ее ампликоном, где сигнал указывает на количество целевой молекулы нуклеиновой кислоты, присутствующей в образце, или ее ампликона.
20. Способ по п. 18, отличающийся тем, что этап (c) выполняют в режиме реального времени для определения количества целевой молекулы, присутствующей в реакционной смеси.
21. Способ контроля в режиме реального времени реакции амплификации с внесением одноцепочечных разрывов и достройкой, при этом способ включает:
(a) приведение тестируемого образца в контакт в практически изотермических условиях с полимеразой, двумя или более олигонуклеотидными праймерами/матрицами, каждый из которых специфически связывается с комплементарной последовательностью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты, ферментом, вносящим одноцепочечный разрыв, и выявляемым полинуклеотидным зондом, где каждый из олигонуклеотидных праймеров/матриц содержит один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов в последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты;
(b) образование ампликонов, содержащих по меньшей мере часть указанной целевой молекулы нуклеиновой кислоты; и
(c) выявление сигнала в режиме реального времени с количественным определением, таким образом, целевой(целевых) молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты.
22. Способ по п. 21, отличающийся тем, что тестируемый образец содержит патоген.
23. Способ по п. 22, отличающийся тем, что патоген представляет собой вирус, бактерию, дрожжи или гриб.
24. Способ по п. 21, отличающийся тем, что тестируемый образец представляет собой биологический образец.
25. Способ по п. 24, отличающийся тем, что биологический образец представляет собой биологическую жидкость, клетку или образец ткани.
26. Способ по п. 25, отличающийся тем, что биологическая жидкость представляет собой мочу, сперму, влагалищный секрет или кал.
27. Способ по п. 21, отличающийся тем, что тестируемый образец представляет собой пробу из окружающей среды.
28. Способ по п. 21, отличающийся тем, что этап (c) выполняют в режиме реального времени.
29. Способ контроля в режиме реального времени целевой молекулы нуклеиновой кислоты в NEAR-реакции, включающий:
(a) приведение целевой молекулы нуклеиновой кислоты в контакт в практически изотермических условиях с полимеразой, двумя или более олигонуклеотидными праймерами/матрицами, каждый из которых специфически связывается с комплементарной последовательностью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты, ферментом, вносящим одноцепочечный разрыв, специфичным для гетеродуплексов ферментом, вносящим одноцепочечный разрыв, и выявляемым полинуклеотидным зондом, где каждый из олигонуклеотидных праймеров/матриц содержит один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов в последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты;
(b) образование ампликонов, содержащих целевую последовательность, связывающуюся с выявляемым олигонуклеотидным зондом; и
(c) выявление сигнала в режиме реального времени с количественным определением, таким образом, целевой молекулы нуклеиновой кислоты.
30. Способ контроля в режиме реального времени целевой молекулы нуклеиновой кислоты в тестируемом образце, при этом способ включает:
(a) приведение целевой молекулы нуклеиновой кислоты в контакт в практически изотермических условиях с полимеразой, двумя или более олигонуклеотидными праймерами/матрицами, каждый из которых специфически связывается с комплементарной последовательностью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты, ферментом, вносящим одноцепочечный разрыв, репаративным ферментом или ферментом для исправления ошибок и выявляемым полинуклеотидным зондом, где каждый из олигонуклеотидных праймеров/матриц содержит один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов в последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты;
(b) образование ампликонов, содержащих целевую последовательность, связывающуюся с выявляемым олигонуклеотидным зондом; и
(c) выявление сигнала в режиме реального времени с количественным определением, таким образом, целевой молекулы нуклеиновой кислоты.
31. Способ по п. 30, отличающийся тем, что тестируемый образец содержит патоген.
32. Способ по п. 31, отличающийся тем, что патоген представляет собой вирус, бактерию, дрожжи или гриб.
33. Способ по п. 30, отличающийся тем, что тестируемый образец представляет собой биологический образец.
34. Способ по п. 33, отличающийся тем, что биологический образец представляет собой биологическую жидкость, клетку или образец ткани.
35. Способ по п. 34, отличающийся тем, что биологическая жидкость представляет собой мочу, сперму, влагалищный секрет или кал.
36. Способ по п. 30, отличающийся тем, что тестируемый образец представляет собой пробу из окружающей среды.
37. Способ по п. 30, отличающийся тем, что этап (c) выполняют в режиме реального времени.
38. Набор для выявления целевой последовательности в NEAR-реакции, при этом набор содержит один или несколько олигонуклеотидных праймеров/матриц, которые специфически связываются с комплементарной последовательностью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты и содержат один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов в последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты, и инструкцию для применения олигонуклеотидного праймера/матрицы в способах по настоящему изобретению.
39. Выделенный олигонуклеотид, содержащий в направлении 5'-3':
i) первый участок и
ii) второй участок,
где первый участок содержит последовательность распознавания для фермента, вносящего одноцепочечный разрыв; где второй участок содержит по меньшей мере 9 нуклеотидов, специфически связывающихся с комплементарной последовательностью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты; и где второй участок содержит один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов.
2
2
2
40. Выделенный олигонуклеотид по п. 39, где 2'-модификация выбрана из группы, состоящей из 2'-О-метила, 2'-метоксиэтокси, 2'-фтора, 2'-гидроксила, 2'-аллила, 2'-О-[2-(метиламино)-2-оксоэтила], 4'-тио, 4'-CH-О-2'-мостика, 4'-(CH)-O-2'-мостика, 2'-LNA и 2'-O-(N-метилкарбамата) или содержащих аналоги оснований.
41. Выделенный олигонуклеотид по п. 39, где один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов расположены на 3'-конце последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты.
42. Выделенный олигонуклеотид по п. 39, где один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов расположены на 5'-конце последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты.
43. Выделенный олигонуклеотид по п. 42, где один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов, расположенных на 5'-конце последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты, отделены от сайта одноцепочечного разрыва с помощью 1, 2, 3, 4, 5 или более немодифицированных нуклеотидов.
44. Выделенный олигонуклеотид по п. 39, где два или более 2'-модифицированных нуклеотида являются смежными.
45. Выделенный олигонуклеотид по п. 44, где количество смежных 2'-модифицированных нуклеотидов составляет 2, 3, 4, 5 или более.
46. Выделенный олигонуклеотид по любому из пп. 39-45, где последовательность распознавания для фермента, вносящего одноцепочечный разрыв, представляет собой 5'-GAGT-3'.
47. Выделенный олигонуклеотид по п. 41, где 5 смежных нуклеотидов с 2'-O-метильной модификацией расположены на 3'-конце последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты.
48. Выделенный олигонуклеотид по п. 42, где 5 смежных нуклеотидов с 2'-O-метильной модификацией расположены на 5'-конце последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты.
49. Выделенный олигонуклеотид, где олигонуклеотид является одним из представленных на фигуре 1.