СПОСОБ ОЦЕНКИ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ПРИБРЕЖНЫХ ЭКОСИСТЕМ
METHOD OF ASSESSMENT ENVIRONMENTAL CONDITION OF COASTAL ECOSYSTEMS

Настоящее предполагаемое изобретение относится к области оценки загрязненности прибрежных морских экосистем и может быть использовано при осуществлении мероприятий по предотвращению загрязнения и очистке морских акваторий.
Известен способ экологического мониторинга водной среды на основе регистрации положения створок раковин двустворчатых моллюсков (1). Известный способ предполагает аппаратурное решение поставленной задачи, что технологически сложно выполнимо и создает значительные погрешности контроля.
Известны способы оценки загрязненности акваторий по энергетическому балансу клеток (2), уровню гистопатологий мидий (3) и стабильности мембран лизосом (4). Существенным недостатком этих методов является использование одного методического подхода к оценке загрязнения, поскольку ни один метод, используемый по отдельности, не позволяет получить полной информации о состоянии животного (5): в этом случае от метода зависит не только чувствительность, универсальность ответа, но и скорость задержки в проявлении реакции на загрязнение.
Наиболее близким к предлагаемому является способ оценки загрязненности акваторий по набору морфофизиологических характеристик мидий (Mytilus galloprovincialis) (6). Он заключается в том, что у мидий оценивают стабильность лизосомальных мембран гемоцитов при добавлении к клеткам прижизненного красителя нейтрального красного, частоту сердечных сокращений, уровень гистопатологий и выживаемость личинок. Признаком загрязнения в данном случае оказывается комплекс показателей: снижение способности лизосомальных мембран удерживать нейтральный красный; повышение частоты сердечных сокращений; вакуолизация эпителиальных клеток пищеварительной железы, повышение содержания гранулоцитов в гонадах и соединительной ткани, дегенерация эпителия пищеварительной железы по данным гистологического исследования; а также повышение частоты деформированных Д-стадий развития личинок мидий. Такой комплексный анализ позволяет не только выявлять разовые загрязнения, но и предсказать последствия загрязнения среды обитания родительских особей на дальнейшую динамику популяции. Однако существенным минусом этого способа является невозможность консервации материала, на каком либо этапе выполнения работ, а также трудоемкость исследований, связанных с анализом личиночных стадий. Другим существенным недостатком этого способа является невозможность использования методики оценки стабильности лизосомальных мембран с нейтральным красным для моллюсков, использующих в качестве переносчика кислорода гемоглобин в эритроцитах, поскольку краситель полностью маскируется гемоглобином. Именно такие моллюски вида Anadara cf. inaequivalvis (далее, анадары) в настоящее время широко встречаются в прибрежной зоне южных морей Евразии (7) и чрезвычайно удобны для исследования загрязнений, поскольку обитают, в том числе и в эстуарных зонах рек на рыхлых грунтах, где наиболее вероятно возникновение загрязнений. На песчаных грунтах массовым видом является Chamelea gallina (7). Для исследования скальных и искусственных твердых грунтов удобно использование двустворчатых моллюсков вида Mytilus galloprovincialis (7).
Целью настоящего изобретения является расширение арсенала технических средств для оценки экологического благополучия прибрежных донных экосистем с использованием морфофункциональных характеристик хамелей, анадар и мидий.
16
16
16
Поставленная цель достигается тем, что, в известном способе оценки экологического благополучия прибрежных донных экосистем, включающего изучение морфофункциональных характеристик хамелей, мидий и анадар (далее, двустворчатых моллюсков), в качестве показателя благополучия используют содержание АТФ в гемоцитах, концентрацию гемоцитов в гемолимфе, уровень гистопатологий (присутствие/отсутствие), и об уровне загрязнения судят по отклонению этих показателей от аналогичных показателей у двустворчатых моллюсков, обитающих в оптимальных условиях. При этом, чем меньше концентрация АТФ и гемоцитов и больше уровень гистопатологий, тем менее благополучная ситуация наблюдается в донной экосистеме. Известно, что в норме в незагрязненных акваториях (с не превышающими ПДК значениями концентраций тяжелых металлов и нефтяных углеводородов) концентрация АТФ в гемоцитах анадар в среднем составляет 0,4±0,3 моль/10кл. (8), у мидий 6,2±6/1 моль/10кл., у хамелей 2,4±2,0 моль/10кл. (10); содержание гемоцитов в гемолимфе анадар составляет 25000±10000 кл./мкл, мидий 2500±1500 кл./мкл, 1400±790 кл./мкл; а гистопатологические изменения отсутствуют (8; 9). Изменения вышеуказанных параметров, происходящие вследствие обычных сезонных колебаний абиотических параметров (изменения температуры, например) укладываются в вышеуказанные диапазоны (9). А в загрязненных акваториях концентрация АТФ на порядок меньше нормы, содержание гемоцитов в гемолимфе меньше нормальных на 50%, чем в норме, а также у 80-100% моллюсков отмечаются гистопатологии (основные гистопатологии - вакуолизация эпителиальных клеток пищеварительной железы, коричневые клетки в пищеварительной железе и желтый пигмент в эпителиальных клетках пищеварительной железы) (8; 9).
Возможность практической реализации
Для осуществления изобретения необходимо произвести отбор двустворчатых моллюсков: вручную с использованием легководолазного снаряжения или с использованием драг, черпаков и прочего оборудования. Для анализа концентрации гемоцитов в гемолимфе и АТФ в гемоцитах необходимо отбирать по 10 моллюсков со станции, для гистологического анализа - по 30 моллюсков, для анализа на содержание ТМ - по 3-10 моллюсков. Хранить моллюсков следует при температуре соответствующей температуре отбора не более 2-х часов после момента сбора.
Исследование клеточного состава гемолимфы и концентрации в ней гемоцитов. Гемолимфу необходимо отобрать при помощи стерильных шприцов из синуса мускула-замыкателя, осторожно приоткрыв створки раковины. Подсчет концентрации гемоцитов производится при помощи микроскопа с увеличением 400х в камере Горяева.
-9
Для анализа содержания АТФ в гемоцитах необходимо отобрать по 50 мкл гемолимфы у каждого моллюска и смешать каждую пробу с диметилсульфоксидом в соотношении 1:1. Если дальнейший анализ невозможно произвести непосредственно после отбора гемолимфы, образцы следует хранить при температуре -18°C не более месяца. Биолюминесцентный анализ концентрации АТФ с использованием светлячковой люциферазы следует проводить на люминометре (например, RFT20046 (Германия)) с пороговой чувствительностью не менее 10 моль АТФ/л.
Для гистологического исследования отделенные от раковины мягкие ткани моллюсков следует фиксировать 4% формальдегидом или фиксатором Дэвидсона (глицерин дистиллированный : 40% формальдегид : спирт 96° : морская вода в соотношении 1:2:3:3). В дальнейшем образцы следует обезвоживать по стандартной гистологической методике и заливать в среду Гитомикс. Срезы (5-7 мкм толщиной) следует окрасить гематоксилином Караччи и эозином и изучать под световым микроскопом при увеличении 400х-900х. При анализе препаратов необходимо выявлять присутствие или отсутствие патологии у каждого моллюска (в частности, вакуолизации эпителиальных клеток пищеварительной железы, присутствия коричневых клеток в пищеварительной железе и желтого пигмента в эпителиальных клетках пищеварительной железы), и в результате, определить процентное содержание особей на данной станции с такой патологией.
На микрофотографиях показаны гистологические препараты моллюсков, содержащихся в оптимальных условиях обитания, - Фиг.1 и моллюсков, собранных в загрязненном районе, - Фиг.2. Преимущества предложенного способа оценки уровня загрязнения акватории состоят в том, что он чрезвычайно прост в методическом исполнении, не трудоемок, не требует высокой квалификации работников, определяющих уровень загрязнения акватории. При простоте выполнения исследований он дает репрезентативные результаты и весьма эффективен для получения оценки комплексного загрязнения акватории.
Источники информации
1. Патент России №2361207.
2. Thebault, M.T., Rafflin, J.P., Picado, A.M. et al. 2000. Coordinated changes of adenylate energy charge and ATP/ADP: use in ecotoxicology studies. Ecotoxicol. Environ. Saf. 46, 23-28.
3. Sunila I. Histopathologycal effects of environmental pollutants on the common mussel, Mytilus edulis L. (Baltic Sea), and their application in marine monitoring. Helsinki, 1987. Thesis of PhD.
4. Lowe D. Lisosomal membrane impairment in blood cells of Perna viridis: An invitro marker of contaminant induced damage. // Res. Bull. Phuket Mar. Biol. Cent. 1995. V.60. P.79-82.
5. Phelps D.K., Katz C.H., Scott B.J., Reynolds B.H. Coastal monitoring: evaluation of monitoring methods in Narragansett Bay, Long Islang Sound, and New York Bight, and a general monitoring strategy // New Approaches to Monitoring Aquatic Ecosystems. ASTM 940. Boyle, T.P. (ed.). American Society for testing and Materials. Philadelphia. 1986.
6. Wedderburn J., McFadzen I., Sanger R.C. et al. The field application of cellular and physiological biomarkers, in the mussel Mytilus edulis, in conjunction with early life stage bioassays and adult histopathology // Mar. Pol. Bull. 2000. V.40. №.3. P.257-267.
7. Zaitsev, Yu. P., Ozturk B. (Eds.) Exotic species in the Aegean, Marmara, Black, Azov and Caspian seas. No. 8. Turkish Marine Research Foundation, 2001. 267 pp.
8. Колючкина Г.А., Исмаилов А.Д. Морфофункциональные особенности двустворчатых моллюсков при экспериментальном загрязнении среды тяжелыми металлами // Океанология. 2011. Т.51. №5. С.857-866.
9. Колючкина Г.А., Милютин Д.М. Использование морфофункционального анализа Anadara sp. cf. Anadara inaequivalvis (Bivalvia) в экологическом мониторинге // Океанология. Т.53. №2, Март-Апрель 2013, С.192-199.
10. Колючкина Г.А. Биомаркеры воздействия загрязнений на двустворчатых моллюсков северо-кавказского побережья Черного моря Дисс. канд. биол. наук. 03.00.18. Москва. 2009.