Comparative Analysis of Some Hsps Synthesis in Leaves of Transgenic Potato Plants with Gene gox at High Temperature

Journal of Stress Physiology & Biochemistry, Vol. 11 No. 4 2015, pp. 5-10 ISSN 1997-0838 Original Text Copyright © 2015 by Borovskii, Lyubushkina, Borovik, Grabelnych, Sauchyn and Urbanovich

ORIGINAL ARTICLE

Comparative Analysis of Some Hsps Synthesis in Leaves of Transgenic Potato Plants with Gene gox at High

Temperature

G.B. Borovskii1, I.V. Lyubushkina1,2, O.A. Borovik1,

O.I. Grabelnych1,2*, D.V. Sauchyn3, O.Yu. Urbanovich3

1 Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry, SB RAS, Irkutsk, Russia

2 Irkutsk State University, Irkutsk, Russia

3 Institute of Genetics and Cytology of NAS of Belarus, Minsk, Belarus *E-Mail: srolsa@sifibr.irk.ru

Received September 8, 2015

Analysis of control and transgenic plants of potato, grade Skarb, transformed by vector constructions pBI-L-GOX (LP line) и pBI-F-GOX (F line) with native gene of glucose oxidase gox and pBI-GOX-mod (MOD line) with modified gene gox-mod has been carried out. It has been shown that transgenic potato plants with genes gox and gox-mod did not have fenotypic differences with control plants. It has been confirmed that there was an increase of level of hydrogen peroxide produced by reaction, which catalized by glucose oxidase in leaves of transgenic plants. Using antibodies against some heat shock proteins (Hsp101, Hsp70/Hsc70, Hsp60, Hsp17.6C-1, Hsp17.6C-2) we revealed an increased content of Hsp17.6C-2 in leaves of LP line and Hsp60 in leaves of LP and F in the morning. It has been shown that rise in temperature in the daytime (from 18-23°С to 35-43°С) led to intensification of all studied Hsps synthesis both in control and in transformed lines.

Key words: glucose oxidase, hydrogen peroxide, high temperature, heat stress proteins, potato

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015

6

Comparative Analysis of Some Hsps Synthesis...

Неблагоприятные факторы среды, в частности значительные изменения температуры, негативно влияют на рост и продуктивность растений, в связи с чем получение трансгенных растений с повышенной устойчивостью к действию данных стрессоров является весьма актуальным. Активные формы кислорода (АФК) являются важными сигнальными молекулами. Показано, что увеличение их содержания в клетках может приводить к повышению устойчивости растений к разным биотическим и абиотическим факторам (Wu et al., 1995). АФК могут запускать синтез ряда стрессовых белков, в том числе белков теплового шока (БТШ или Hsp, англ. ”Heat Shock Protein”), участвующих в защите клеток (Piterkova et al., 2013). Разные семейства БТШ выполняют различные функции, при этом большинство БТШ работают в клетке в качестве “молекулярных шаперонов” (Ellis, van der Vies, 1991; Vierling, 1991). Так, шаперонин Hsp60 локализован в митохондриях и участвует в импорте синтезированных в цитоплазме белков в митохондрии (Bukau, Horwich, 1998; Frydman, 2001). Конститутивно синтезируемые белки семейства БТШ70 - Hsc70 (“Heat shock cognate 70-kD”) способствуют фолдингу синтезируемых de novo белков, транспорту белков в клеточные органеллы и деградации поврежденных белков, а стресс-индуцируемые формы Hsp70 препятствуют агрегации денатурированных белков,

способствуют рефолдингу и восстановлению их биологических функций (Vierling, 1991). Другое семейство БТШ - нмБТШ (sHsps) представляют

собой группу молекулярных шаперонов с размером субъединиц 15-30 кД, они предотвращают денатурацию и агрегацию белков, поврежденных каким-либо воздействием (Vierling, 1991).

Увеличение содержания АФК в клетках можно вызвать не только действием внешних факторов, но и путем введения гена глюкозооксидазы gox в геном растения (Wu et al., 1995; Sauchyn et al., 2012). Результатом активности данного фермента является превращение P-D-глюкозы в P-D-глюконо-б-лактон и сопряженное с ним восстановление молекулярного кислорода до пероксида водорода. Влияет ли повышение содержания пероксида водорода, вызванное действием глюкозооксидазы, на синтез БТШ, неизвестно.

В связи с этим целью данной работы было изучение синтеза БТШ в листьях картофеля с измененной экспрессией гена глюкозооксидазы gox.

MATERIALS AND METHODS

В работе использовали контрольные и трансгенные растения картофеля (Solanum tuberosum L., сорт Скарб). Трансгенные растения картофеля были получены в ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси». Для трансформации был использован ген глюкозооксидазы высокоактивного грибного штамма Penicillium funiculosum 46.1. Агробактериальная трансформация растений проводилась векторными конструкциями pBI-L-GOX (линия LP) и pBI-F-GOX (линия F) с нативным геном глюкозооксидазы gox и pBI-GOX-mod (линия

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015

Borovskii et al.

7

MOD) с модифицированным геном gox-mod, фугированием при 15000 g в течение 15 мин на

созданными на основе векторной плазмиды pB1121 центрифуге Allegra 64R («Beckman Coulter», США).

(Sauchyn et al., 2012; Sauchyn et al., 2015). Белок из супернатанта осаждали трехкратным

Растения картофеля выращивали в объемом охлажденного ацетона. Осадок белка

вегетационных сосудах в условиях теплицы на базе растворяли в буфере для образца (0,125 M Трис-

Сибирского института физиологии и биохимии HCl, 0,008 M ДДС-Na, 0,1 M В-меркаптоэтанол,

растений СО РАН. Для экспериментов отбирали 10% глицерин, 0,001% бромфеноловый синий, pH

листья среднего яруса у растений, находящихся в 6,8), инкубировали 5 мин при 100°С,

фазе бутонизации. Отбор проб проводили в центрифугировали 15 мин при 5000 g.

утреннее (9.00 ч) и дневное (15.00 ч) время. Концентрацию белка определяли по методу Лоури

Температура воздуха в период отбора проб (Lowry et al., 1951).

составляла 18-23°С утром и 35-43°С днем. Белковый электрофорез проводили в

Определение содержания пероксида водорода полиакриламидном геле с додецилсульфатом

в листьях проводили с помощью 3,3'- натрия в модифицированной системе Лэммли

диаминобензидина (ДАБ) (Tarasenko et al., 2012). (Laemmli, 1970) с использованием Mini-PROTEIN 3

Листья инфильтровали и инкубировали с ДАБ (0,2 Cell (BIO-RAD, США). Перенос белков на

мг/мл) в трис-ацетатном буфере (pH 5,0) в темноте нитроцеллюлозную мембрану осуществляли в

при 26°С в течение 5 ч. Затем образцы помещали в Таубин буфере в соответствии с рекомендациями

70% этанол и инкубировали при 80°С до тех пор, фирмы-производителя (Mini Trans-Blot

пока весь хлорофилл не переходил в раствор. По Electrophoretic Transfer Cell, BIO-RAD, США). Для

интенсивности коричневого окрашивания судили о изучения синтеза стрессовых белков в

содержании пероксида водорода в листьях растительных клетках использовали антитела

(Thordal-Christensen et al., 1997). против различных групп БТШ: Hsp101 (AS07253,

Для выделения суммарного клеточного белка “Agrisera“, Швеция), Hsp70/Hsc70 (SPA-820,

образцы ткани замораживали в жидком азоте и “StressGen”, США), Hsp60 (H1830-77B, “US

хранили при -70°С. Затем образцы Biological”, США), Hsp17.6C-1 (AS07254, “Agrisera”,

размораживали в буфере для выделения белка Швеция), Hsp17.6C-2 (AS07255, “Agrisera“,

(0,1 M Трис-HCl, 0,003 M ДДС-Na, 0,001 M В- Швеция).

меркаптоэтанол, pH 7,4-7,6), в соотношении 1:4, RESULTS AND DISCUSSION

добавляли 0,5-1 мМ фенилметилсульфонил- В работе было проанализировано 3

флюорид для ингибирования протеаз и растирали независимых линии LP и по 5 независимых линий F

в фарфоровых ступках в жидком азоте. Грубые и MOD. Выявлено, что трансгенные растения не

клеточные компоненты удаляли центри- имели морфологических отличий, как между собой,

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015

8

Comparative Analysis of Some Hsps Synthesis...

так и с контрольными растениями исходного сорта Скарб.

С использованием ДАБ было показано, что содержание пероксида водорода в листьях трансгенных растений картофеля выше по сравнению с контрольными (Рис. 1). На основании проведенного анализа были отобраны растения

линий LP, F и MOD, которые продемонстрировали наибольшее повышение содержания пероксида водорода в утренние часы. Из этих растений были взяты образцы листьев для выделения белков, и с помощью электрофореза и последующего иммуноблоттинга в них был изучен синтез БТШ в ответ на повышение температуры окружающей среды в дневное время.

Figure 1. Детекция пероксида водорода в тканях листьев растений картофеля исходного сорта (К) и растений трансгенных по gox (линии LP, F, MOD).

к

(ч) 9 15

LP F MOD

9 15 9 15 9 15

HsplOI

Hsp70/Hsc70

Hsp60 Hsp17.6C-1 Hsp17.6C-2

Figure 2. Влияние повышенной температуры в дневное время суток (15 ч) на синтез некоторых

БТШ в листьях растений картофеля исходного сорта (К) и растений трансгенных по gox (линии LP, F, MOD).

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015

Borovskii et al.

9

Было показано, что содержание Hsp101, Hsp70/Hsc70 и низкомолекулярных БТШ I и II класса (Hsp17.6C-1 и Hsp17.6C-2) в листьях контрольных и трансгенных растений в утренние часы одинаково (Рис. 2). Исключение составляет образец, растений линии LP, у которого

содержание Hsp17.6C-2 в утренние часы больше, чем в других образцах (Рис. 2). Содержание Hsp60 в утреннее время также было выше в листьях линии LP и линии F (Рис. 2). Содержание всех изученных БТШ значительно увеличивалось в дневные часы при повышении температуры в теплице, однако это повышение было сходным как у контрольных, так и у трансгенных линий.

Таким образом, можно сделать вывод о том, что трансформация растений картофеля векторными конструкциями с нативным и модифицированным геном глюкозооксидазы gox повышает содержание эндогенного пероксида водорода, что приводит к изменению синтеза Hsp60 и Hsp17.6C-2. Однако требуется дальнейшая проверка возможного влияния увеличения эндогенного пероксида водорода на устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды.

REFERENCES

Bukau B., Horwich A.L. (1998) The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines. Cell, 92, 351-366.

Ellis R.J. van der Vies S. (1991) Molecular chaperones. Annu. Rev. Biochem., 60, 321-347. Frydman J. (2001) Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones. Annu. Rev. Biochem., 70, 603-647.

Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of head bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685.

Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. (1951) Protein measurement with folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 193, 265-275.

Piterkova J., Luhova L., Mieslerova B., Lebeda A., Petrivalsky M. (2013) Nitric oxide and reactive oxygen species regulate the accumulation of heat shock proteins in tomato leaves in response to heat shock and pathogen infection. Plant Sci., 207, 57-65.

Sauchyn D.V., Paniush A.S., Kartel N.A. (2012) Sozdanie i analiz trasgennyh rastenii kartofelia i tabaka s genom gox Penicillium funiculosum. Izvestiia NAN Belarusi, 4, 16-20. (in Russian).

Sauchyn D.V., Veresova T.N., Mezhnina O.A., Paniush A.S., Viacheslavova A.O., Goldenkova-Pavlova I.V. (2015) Optimizaciia kodonovogo sostava gribnogo gena gox Penicillium funiculosum dlia effektivnoi ekspressii v rasteniiah Solanum tuberosum. Izvestiia NAN Belarusi, 1, 50-56. (in Russian).

Thordal-Christensen H., Zhang Z., Wei Y., Collinge D.B. (1997) Subcellular localization of H2O2 in plants. H2O2 accumulation in papillae and hypersensitive response during the barley-powdery mildew interaction. Plant J., 11, 11871194.

Vierling E. (1991) The roles of heat shock proteins in plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 42, 579-620.

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015

10

Comparative Analysis of Some Hsps Synthesis...

Wu

G., Shortt B.J., Lawrence E.B., Levine E.B., Fitzsimmons K.C., Shah D.M. (1995) Disease resistance conferred by expression of a gene

encoding H2O2-generating glucose oxidase in transgenic potato plants. The Plant Cell, 7, 13571368.

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015