Некоторые аспекты применения микросателлитных маркёров в сельскохозяйственной практике

Некоторые аспекты применения микросателлитных маркёров в сельскохозяйственной практике*

К.П. Гайнуллина, к.б.н., Башкирский НИИСХ ФГБНУ УФИЦ РАН

В последние годы современные молекулярно-генетические методы получают всё более широкое распространение в сельском хозяйстве [1,2]. Так, благодаря внедрению мультилокусных маркёров появилась возможность проведения отбора желательных генотипов на ранних этапах селекционного процесса, картирования генов хозяйственно ценных признаков, индивидуальной, сортовой и породной идентификации, установления родства, что способствует решению проблем снижения генетического разнообразия, устойчивости организмов к болезням и вредителям, ускорения селекции пород и сортов [3, 4].

Среди высокополиморфных кодоминантных генетических маркёров в растениеводстве с большим успехом применяются микросателлиты. С их помощью может осуществляться эффективный подбор родительских пар при скрещиваниях, генетическая паспортизация сортов для защиты авторских прав селекционеров, контроль генетической чистоты и однородности семенного материала [5].

В области продуктивного молочного и мясного скотоводства остро стоит проблема идентификации, паспортизации животных, а также поиска генетических маркёров для решения широкого круга селекционных задач, включая определение степени го-мозиготности, генетического родства по отцовской и материнской линии, оценку уровня внутрипо-родной генеалогической дифференциации, а также прогнозирование работоспособности и плодовитости [6]. Согласно базе данных INRA (French National Institutefor Agricultural research) у крупного рогатого скота выявлено 2402 микросателлитных маркёра, из которых 2244 картированы [7, 10]. Тем не менее генетическая структура многих отечественных пород крупного рогатого скота в России по-прежнему остаётся недостаточно изученной [8]. Основными плановыми породами крупного рогатого скота молочного направления разведения в Республике Башкортостан являются чёрно-пёстрая (61% от общего поголовья), симментальская (25%) и бестужевская (14%), отличающиеся высокой и стабильной молочной продуктивностью, выносливостью, адаптационной пластичностью, неприхотливостью к кормам, а также хорошей оплатой корма и приростом.

В связи с вышеизложенным применение микросателлитов в исследованиях отечественных пород крупного рогатого скота является актуальным, поскольку позволяет выявлять своеобразные чер-

ты их генофонда, генетической структуры пород и популяций, определять степень инбредности, генетическое расстояние между семействами, линиями, породами [9].

Цель исследования заключается в изучении генетического разнообразия чёрно-пёстрой, симментальской и бестужевской пород крупного рогатого скота с помощью микросателлитных маркёров.

Вышеозначенная цель предопределила необходимость решения следующих задач:

1. Исследовать полиморфизм шести микросателлитных локусов ДНК основных пород крупного рогатого скота молочного направления разведения;

2. Выявить дифференциацию изученных пород на основе ДНК-типирования;

3. Отобрать потенциально информативные микросателлитные маркёры для чёрно-пёстрой, симментальской и бестужевской пород крупного рогатого скота.

Материал и методы исследования. Опыты проводили в лаборатории молекулярно-генетической экспертизы Башкирского НИИСХ УФИЦ РАН.

Объектом изучения послужили животные, принадлежащие трём основным породам крупного рогатого скота молочного направления разведения в Республике Башкортостан: чёрно-пёстрой (ООО «Агрофирма им. Цюрупы», n=50), симментальской (СПК им. Кирова, n=50) и бестужевской (СПК им. Иванова, n=50). В качестве исследуемого биологического материала в работе использовали образцы периферической венозной крови, в качестве антикоагулянта применяли 5-процентный раствор цитрата натрия. ДНК выделяли с помощью набора «Genomic DNA Purification Kit» («Fermentas»).

Для исследования были отобраны шесть микро-сателлитных локусов, рекомендованных Международным обществом генетики животных (International Society for Animal Genetics — ISAG) для контроля достоверности происхождения крупного рогатого скота. Их характеристика приведена в таблице 1.

Полимеразная цепная реакция проводилась в амплификаторе ДТ-322 (ДНК-Технология). Использовали праймеры, синтезированные фирмой «Евроген». Реакционная смесь объёмом 20 мкл содержала следующие компоненты: 7,5 мкл PCR Master Mix (Fermentas), 7,5 мкл H2O, 2 мкл каждого из праймеров, 1 мкл тотальной геномной ДНК. Условия амплификации были следующими: начальная денатурация 5 мин. при 940Q 35 циклов: денатурация при 940С — 30 с., отжиг праймеров при 550С — 30 с. и элонгация при 720С — 90 с.; заключительная элонгация 10 мин. при 720С.

* Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Республики Башкортостан молодым учёным и молодёжным научным коллективам в 2018 г.

1. Характеристика микросателлитов, использованных для генетической оценки крупного рогатого скота

Локус Хромосома Длина аллелей, п.н. Максимальное число аллелей Нуклеотидная последовательность праймеров

BM1824 1-я 179 - 191 7 сattctccaactccttccttc сассааcctctttttccaatc

BM2113 2-я 122 - 142 10 cctcccttctaccaaataccc cttcctcacacaaccaacacc

SPS115 15-я 244 - 257 б aaactcacacaacaccttctccac aaccactctcctactttccctctc

TGLA122 21-я 138 - 182 17 aatcacatcccaaataactacatac ccctcctccacctaaatcacc

ETH10 5-я 211 - 223 7 cttcaccactccccctcctaaca cctccaccccactttctcttctc

ETH225 9-я 139 - 153 8 catcaccttcccactatttcct acatcacacccacctcctact

Примечание: п.н. — пар нуклеотидов

Продукты ПЦР разделяли методом электрофореза в 7-процентном полиакриламидном геле с трис-боратным электродным буфером в вертикальной камере VE-20 (Хеликон).

Результаты исследования. При анализе полиморфизма микросателлитных локусов исследуемых пород крупного рогатого скота суммарно было выявлено 47 различных аллельных вариантов. Амплифицированные аллели микросателлитных локусов чётко визуализировались в полиакриламидном геле (рис.). Количество полученных аллелей для крупного рогатого скота чёрно-пёстрой породы составило 41, или в среднем 6,83 аллеля на локус, бестужевской породы — 37, или 6,17 аллеля на локус, симментальской породы — 34, или 5,67 аллеля на локус.

Для каждой из исследованных пород нами были рассчитаны наблюдаемая гетерозиготность (НО) и индекс полиморфизма (PIC). Наблюдаемая гетерозиготность определялась как отношение числа гетерозигот к размеру выборки, индекс полиморфизма — по формуле:

PICj = 1 -¿р2,

г=1

где i — i-й аллель j-го маркёра;

n — количество аллелей j-го маркёра; P — частота аллелей.

Полученные результаты представлены в таблице 2.

Как видно по данным таблицы, у крупного рогатого скота чёрно-пёстрой породы средняя гетерозиготность была равна 0,97, у бестужевской породы — 0,95, у симментальской породы — 1, что находится в соответствии с данными о численности данных пород в республике: чем больше поголовье, тем меньше вероятность инбридинга и выше гетерогенность.

Индекс полиморфизма в нашем опыте у крупного рогатого скота чёрно-пёстрой породы варьировал от 0,73 (ВМ1824) до 0,79 (TGLA122, ETH225, ETH10), что в среднем составляло 0,77. У бестужевской породы данный показатель колебался

250 п.н.

200 п.н.

__150 п.н.

аллель l^

аллель 4^ аллель ¡TSfl ^аллель2

100 п.н.

M 1 2 3 4 5 6 . l 8 9 10 11 12 13 14 15

Рис. - Электрофоретические спектры продуктов амплификации ДНК крупного рогатого скота чёрно-пёстрой породы по локусу BM2113 в полиакриламидном геле:

M - маркёр молекулярной массы GeneRuler™ 50 bp DNA Ladder, Fermentas; дорожки 1-15 - образцы ДНК исследованных животных

в пределах от 0,66 (ETH225) до 0,82 (TGLA122), в среднем составляя 0,72, у симментальской породы — от 0,75 (ETH10) до 0,84 (BM2113), в среднем — 0,78. В соответствии с классификацией Botstein et al. (1990), к высокоинформативным маркёрам относятся такие маркёры, у которых PIC>0,5, к среднеинформативным — имеющие PIC от 0,25 до 0,5, к малоинформативным — с PIC<0,25 [10]. Следовательно, все использованные нами в исследовании микросателлиты оказались высокоинформативными.

Сравнительная характеристика распределения частот аллелей локуса SPS115 среди исследованных нами пород крупного рогатого скота показала, что у чёрно-пёстрой породы преобладают аллели 1 и 3 (38 и 23% соответственно), у бестужевской — 3 и 1 (36 и 29% соответственно), в то время как у симментальской породы наблюдалось более-менее равномерное распределение всех аллелей, кроме аллеля 6, который отсутствовал в генотипах животных данной породы.

При проведении анализа распределения частот аллелей по локусу ВМ2113 было выявлено,

2. Число аллелей на локус (Na), наблюдаемая гетерозиготность (НО) и индекс полиморфизма (PIC) в популяциях крупного рогатого скота чёрно-пёстрой, симментальской и бестужевской пород в Республике Башкортостан

Локус Na HO PIC

ЧП С Б ЧП С Б ЧП С Б

BM2113 7 7 7 1 1 0,72 0,76 0,84 0,68

TGLA122 5 6 7 0,98 1 1 0,79 0,81 0,82

ETH225 8 6 6 0,96 1 1 0,79 0,76 0,66

BM1824 7 5 5 1 1 1 0,73 0,76 0,70

ETH10 8 5 6 1 1 1 0,79 0,75 0,71

SPS115 6 5 6 0,88 1 1 0,75 0,79 0,75

Среднее 6,83 5,67 6,17 0,97 1 0,95 0,77 0,78 0,72

Примечание: ЧП — чёрно-пёстрая порода; С — симментальская порода; Б — бестужевская порода

что у чёрно-пёстрой породы крупного рогатого скота преобладает аллель 4 (40%), а аллели 8 и 9 отсутствуют. Для симментальской породы было характерно отсутствие аллелей 2, 3. В генотипах животных бестужевской породы наиболее часто встречались аллели 4 и 7 (47 и 26% соответственно), а аллели 6 и 9 не были обнаружены.

По локусу ЕТН225 у чёрно-пёстрой породы крупного рогатого скота чаще встречались аллели

2, 4, 1 и 6—28; 28; 17 и 15% соответственно. Симментальская порода отличалась преобладанием аллелей 4, 1 и 2 (32; 29 и 18% соответственно), и отсутствием аллеля 7. По данному локусу у бестужевской породы отмечались высокие значения частот встречаемости аллелей 4 и 7 (44 и 36% соответственно), а аллель 1 при проведении SSR-анализа у данной породы выявлен не был.

На основе полученных нами данных о распределении аллелей по локусу TGLA122 можно сделать вывод о том, что у исследованных животных чёрно-пёстрой породы аллели 2, 1, 3, 4, 5 характеризовались близкими по значению частотами (22, 21, 21, 19, 17% соответственно), а аллели 6, 7, 8 отсутствовали. У симментальской породы не был обнаружен аллель 3, а остальные аллели встречались в генотипах данной породы с приблизительно одинаковой частотой. Отличительной особенностью бестужевской породы оказалась относительно высокая частота встречаемости аллелей 1, 3, 4, 2, 5 (24, 20, 18, 16, 12% соответственно) и отсутствие аллеля 7.

В нашем опыте для чёрно-пёстрой породы крупного рогатого скота была характерна высокая частота встречаемости аллеля 3 микросателлитного локуса ВМ1824 (41%). У животных симментальской породы достаточно высокие значения процентного соотношения были установлены для аллелей 4 и 5—31 и 30% соответственно. Аллели 6 и 7 у данной породы не были обнаружены. Отличительной особенностью бестужевской породы по данному локусу является высокая частота встречаемости аллелей 1 и 4 (42 и 32% соответственно) и отсутствие аллеля 7.

Наше исследование показало, что у чёрно-пёстрой породы по локусу ЕТН10 была отмечена относительно высокая частота встречаемости аллелей

3, 5, 7, 1 и 6 (34, 21, 21, 16 и 14% соответственно),

а аллель 3 не был обнаружен. Симментальская порода характеризовалась высокими значениями частот аллелей 3 и 5 (36 и 27% соответственно), и отсутствием аллелей 2 и 4. В генотипах животных бестужевской породы преобладал аллель 3 (46%). Выводы.

1. В результате SSR-анализа образцов ДНК крупного рогатого скота чёрно-пёстрой, симментальской и бестужевской пород получены данные по аллельным состояниям исследованных микро-сателлитных локусов, которые являются основой для расчёта уровня внутривидовой изменчивости, а также определения породной и индивидуальной принадлежности животных.

2. Установлено наличие выраженной генетической дифференциации исследованных пород.

3. Наибольшей информативностью обладали микросателлитные маркёры TGLA122 и SPS115.

Литература

1. Глазко В.И. Молекулярная биология для животноводства // Farm Animals. 2012. № 1 (1). С. 24-29.

2. Давлетов Ф.А., Гайнуллина К.П. Изучение полиморфизма микросателлитных локусов гороха посевного (Pisum sativum L.) // Вестник Башкирского государственного аграрного университета. 2013. № 2 (26). С. 10.

3. Гайнуллина К.П. Генетическое разнообразие исходного материала для селекции гороха (Pisum sativum L.) в условиях Предуральской степи Башкортостана: дисс. ... канд. биол. наук. СПб., 2013.

4. Давлетов Ф.А., Гайнуллина К.П. Влияние метеорологических условий на результаты гибридизации // Аграрный вестник Урала. 2011. № 4. С. 5-6.

5. Давлетов Ф.А., Гайнуллина К.П., Ахмадуллина И.И. Комплексная оценка нового сорта гороха Юлдаш и его родительских форм с применением современных молекулярно-генетических методов // Зерновое хозяйство России. 2017. № 4 (52). С. 24-26.

6. Шириев В.М., Уразбахтин Р.Ф., Гайнуллина К.П. Исследование полиморфизма микросателлитной ДНК у лошадей башкирской породы // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. 2014. № 5. С. 13-15.

7. Киселёва Т.Ю. Анализ 30 микросателлитных маркёров у шести локальных популяций крупного рогатого скота / Т.Ю. Киселёва, Б.Е. Подоба, Е.Е. Заблудовский [и др.] // Сельскохозяйственная биология. 2010. № 6. С. 20-25.

8. Зиновьева Н.А. Изучение генетического разнообразия и популяционной структуры российских пород крупного рогатого скота с использованием полногеномного анализа SNP / Н.А. Зиновьева, А.В. Доцев, А.А. Сермягин [и др.] // Сельскохозяйственная биология. 2016. Т. 51. № 6. С. 788-800.

9. Шумкина С.Г. Полиморфизм микросателлитных локусов ДНК крупного рогатого скота красно-пёстрой породы: дисс. ... кан,д. биол. наук. П. Лесные поляны (Моск. обл.), 2004. 105 с.

10. Botstein D. et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms // American Journal of Human Genetics. 1980. Vol. 32. № 3. P. 314-331.