ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО ИЛИ ПРОФИЛАКТИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО ПРОТИВ ДЕМЕНЦИИ
THERAPEUTIC AGENT OR PROPHYLACTIC AGENT FOR DEMENTIA

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к терапевтическому средству или профилактическому средству против когнитивных расстройств. Конкретнее, изобретение относится к новому антителу против фосфорилированного белка или пептиду, имеющему превосходное действие по улучшению когнитивной функции, и к терапевтическому средству или профилактическому средству против когнитивных расстройств, содержащему антитело против фосфорилированного тау или антиген, который вызывает образование антитела против фосфорилированного тау.
Уровень техники
Когнитивное расстройство является состоянием, при котором развивается ухудшение умственных способностей из-за какой-то приобретенной причины, что вызывает проблемы в социальной адаптации. Когнитивные расстройства классифицируются как нейродегенеративные заболевания, сосудистые когнитивные расстройства, прионные заболевания, инфекционные заболевания, обменные/эндокринные расстройства, травмы и церебральные расстройства, и токсические расстройства (нпл 1). На 2010 в Японии насчитывалось примерно 2,1 миллиона пациентов с когнитивным расстройством с коэффициентом распространенности заболевания примерно 8-10% или даже более 10% среди пожилых людей в возрасте старше 65, и это признается серьезной проблемой в стареющем обществе во всем мире (нпл 2). Данные по заболеваниям, лежащим в основе когнитивных расстройств, показывают, что большую часть составляют нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера (AD) и лобно-височная лобарная дегенерация (FTLD), причем приблизительно 35% приходится на AD, приблизительно 15% на комбинацию AD и болезни мозгового кровообращения, и 5% на нейродегенеративные заболевания, такие как FTLD (нпл 2). Когнитивное расстройство, вызванное нейродегенеративным заболеванием характеризуется медленно развивающимся ухудшением памяти и/или изменением личности, что прогрессирует в течение периода, по меньшей мере в 6 месяцев или более. Типичным фактором при нейродегенеративных процессах, которые показывают высокую степень корреляции со степенью ухудшения когнитивной функции, является присутствие нейрофибриллярных клубков (NFT) (нпл 3).
Тау (белок) представляет собой белок, кодированный геном МАРТ, который локализован на хромосоме 17 (17q21) у человека. Он является одним из связывающих микротрубочки белков, которые в большом количестве экспрессируются в центральной нервной системе. Обнаружено, что тау является главным составляющим белком в спаренных спиральных филаментах и прямых филаментах, формирующих NFT при AD (одном из наиболее известных нейродегенеративных заболеваний), и показано, что он накапливается в клетках при различных невропатологических состояниях. Заболевания, вызванные внутриклеточным накоплением тау, все вместе называются «таупатиями» (нпл 4). Нейродегенеративными заболеваниями, включенными в число таупатий, являются болезнь Альцгеймера (AD), кортикобазальная дегенерация ганглиев (CBD или CBS), прогрессирующий надъядерный паралич, болезнь Пика, аргирофильная зернистая деменция (аргирофильная зернистая болезнь), множественная системная таупатия с деменцией (MSTD), связанная с хромосомой 17 лобно-височная деменция с паркинсонизмом (FTDP-17), деменция с нейрофибриллярными клубками, диффузные нейрофибриллярные клубки с кальцификацией (DNTC), таупатия белого вещества с глобулярными глиальными включениями (WMT-GGI) и лобно-височная лаборная дегенерация с тау-положительными включениями (FTLD-тау), но не-нейродегенеративные заболевания, в том числе инфекционные заболевания, такие как болезнь фон Экономо (постэнцефалитический паркинсонизм) и подострый склерозирующий панэнцефалит, и состояния, вызванные травмой, такие как эцефалопатия боксеров, также включаются в таутопатии (нпл 4).
Было определено, что ген МАРТ кодирует белок, состоящий из 13 экзонов, с несколькими изоформами вследствие альтернативного сплайсинга (нпл 4). Особенностью структуры тау является то, что он содержит N-концевой кислотный домен, содержащий 0-2 повторяющиеся последовательности (N) из 29 аминокислот, в зависимости от альтернативного сплайсинга экзона 2 и экзона 3 (N0-N2), промежуточный домен, обогащенный пролином, и С-концевой связывающий микротрубочки домен (кодированный экзонами 9-12), содержащий 3 (3R) или 4 (4R) повторяющиеся последовательности (R), которые вносят вклад в связывание микротрубочек (нпл 3 и 4). Следовательно, тау имеет 6 характерных изоформ 3R0N (352 аминокислоты) ⋅ 3R1N (381 аминокислота) ⋅ 3R2N (410 аминокислот) ⋅ 4R0N (383 аминокислоты) ⋅ 4R1N (412 аминокислот) и 4R2N (441 аминокислота), зависящие от числа повторяющихся последовательностей из 29 аминокислот (N) и связывающих микротрубочки повторяющихся последовательностей (R), которые он содержит. Из этих изотипов только 3R0N присутствует в головном мозге эмбриона, в то время как в головном мозге взрослого человека присутствуют все 6 изотипов, причем тип 4R является наиболее распространенным (нпл 3). Различие между изотипами 3R и 4R состоит в том, удален ли экзон 10 альтернативным сплайсингом (3R) или присутствует (4R). Поэтому существует несколько изоформ тау, но для идентификации позиции аминокислоты указывают номера аминокислот (1-441) в соответствующих позициях самой длинной изоформы 4R2N (SEQ ID NO: 1). Например, обозначение «Ser413» относится к серину, который является 413-ым аминокислотным остатком в 4R2N (SEQ ID NO: 1), хотя этот серии является 384-ым аминокислотным остатком в 4R1N (SEQ ID NO: 2), 355-ым в 4R0N (SEQ ID NO: 3), 382-ым в 3R2N (SEQ ID NO: 4), 353-им в 3R1N (SEQ ID NO: 5) и 324-ым в 3R0N (SEQ ID NO: 6).
Что касается роли тау в нейродегенеративных заболеваниях то обнаружилось, что существует соотношение между мутациями гена МАРТ и накоплением тау при связанной с 17 хромосомой лобно-височной деменции с паркинсонизмом (FTDP-17). В частности, сообщалось о более чем 40 различных мутациях гена МАРТ, которые связаны с FTDP-17 (нпл 4). Предполагается, что такие генные мутации могут привести к изменениям в пропорции изоформ тау и изменению взаимодействия мутаната тау с микротрубочками, внося таким образом вклад в установление патологии. Однако, в отличие от семейных нейродегенеративных заболеваний, мутации в МАРТ обычно не обнаруживаются при спорадических нейродегенеративных заболеваниях, таких как AD. Более того, одной из особенностей накопления тау при нейродегенеративных заболеваниях является высокая степень модификации путем фосфорилирования. Так, у пациентов, показывающих умеренное ухудшение когнитивной функции (MCI), видна корреляция между уровнями фосфорилированного тау в цереброспинальной жидкости и атрофией гипофиза, что наводит на мысль о том, что фосфорилированный тау является надежным биомаркером нейродегенерации у пациентов с таупатиями (нпл 5). По этой причине были попытки использовать ингибиторы ферментов киназ, и в частности, GSK-3-бета, поскольку эти ферменты вовлечены в фосфорилирование, для того, чтобы ингибировать избыточное фосфорилирование тау, и существует ряд разработок в этой области (нпл 5). Однако, поскольку киназы, такие как GSK-3-бета, являются ферментами, которые вовлечены не только в заболевание, но также и в регулирование функций при нормальных физиологических процессах, побочное действие вызывает беспокойства. Действительно, так как некоторые сайты, где тау фосфорилирован GSK-3-бета, совпадают с сайтами фосфорилирования тау, встречающемся в головном мозге зародыша и здорового человека (нпл 3), существует вероятность влияния на нормальную функцию тау.
Обычно считается, что внеклеточный тау вытекает из клетки в результате гибели дегенерировавших нейронов, но в недавних исследования предположили, что после избыточного внутриклеточного фосфорилирования тау процессируется и активно выделяется из клетки. Полагают, что фосфорилированный тау, секретированный из клетки, дефосфорилируется в некоторых сайтах фосфорилирования, впоследствии действуя на мускариновые рецепторы M1 и М3 окружающих клеток, таким образом промотируя внутриклеточное фосфорилирование тау, и внося свой вклад в стимулирование гибели клетки (нпл 6, нпл 7). В настоящее время все сходится к мнению, что тау функционирует как фактор с внеклеточной активностью, поэтому все больше внимание фокусируется но воздействии на него терапевтическими средствами, типа с лекарственных компонентов, которые представляют собой макромолекулы, такие как антитела, которые не так легко заставить проявить внутриклеточную активность. Однако, как указано выше, секретированный внеклеточно тау может быть частично процессирован и может стать дефосфорилированным, возможно подвергаясь другим модификациям, помимо тех, которые свойственны избыточно фосфорилированному тау, который являлся мишенью. Также предполагается, что лекарственные средства, которые действуют на части дефосфорилированного тау, могут влиять на функцию нормального тау. Таким образом, когда мишенью для антител или подобного должен стать ассоциированный с патологией тау, более важно выбрать сущность, которая будет действовать на специфический для данной патологии сайт, т.е. эпитоп фосфорилированного тау, и выбор эпитопа становится еще более трудным из-за сложности и недостаточности информации.
Сообщалось об изобретениях, относящиеся к иммунотерапии таупатий, где мишенью является белок тау, которые оказывают направленное действие против тау (нпл 5, птл (PTL) 1, птл 2, птл 3). Иммунотерапию проводят с целью вызвать продуцирование специфических антител путем введения пептидных вакцин и т.п., и ожидается, что у них будет мало побочных действий, вследствие их высокой специфичности к белкам-мишеням или пептидам. Сообщается, что улучшается двигательная функция у животных моделей, экспрессирующих мутантный тау за счет вакцинации с использованием частичных пептидов фосфорилированного тау (имеющего аминокислотные остатки, соответствующие фосфорилированным Ser396 и Ser404, и имеющего аминокислотный остаток, соответствующий фосфорилированному Ser262). Однако указанные сообщения являются исследованиями с использованием трансгенных мышей (Tg мыши) с индуцированными генными мутациями, такими как P301L (мутация замена пролина на лейцин в 301-м аминокислотном остатке тау), и хотя такие Tg мыши служат в качестве моделей мутации гена в случае FTDP-17 (семейного нейродегенеративного заболевания), они не репрезентативны для большинства нейродегенеративных заболеваний из числа таупатий, которые не сопровождаются мутациями гена тау, и в частности, спорадических нейродегенеративных заболеваний. Кроме того, так как мыши P301Ltg являются моделями улучшения двигательной функции и не являются моделями, для исследований нарушения когнитивной функции, что вызывает проблему, если вопрос касается когнитивных нарушений у человека (нпл 8), ведь затруднительно понять, можно ли результаты, полученные на таких животных моделях, применить к лечению когнитивных нарушений у людей. В птл 4 исследовали эффект от лечения таупатий с помощью введения антител, которые участвуют во взаимодействии антиген-антитело с тау-пептидом, имеющим фосфорилированный Ser409. Однако пептидные вакцины являются дорогостоящими, требуют высоких общих дозировок и до того как они проявляют свое действие проходит достаточно много времени. Кроме того, действие пептидных вакцин и реактивность иммунного ответа после введения у людей и животных различаются из-за разного генетического фона, и продуцирование эффективных антител не всегда может проявиться у каждого индивидуума. Поэтому, хотя иммунотерапия путем пассивной иммунизации антителами имеет потенциал, очень большое число сайтов в тау фосфорилированы, и фактически не существует информации, касающейся какие антитела для каких сайтов фосфорилирования можно эффективно применять. Кроме того, нельзя считать, что те антитела, которые доступные в настоящее время, имеют достаточную функцию для использования в терапии, основываясь только на их эффективности у животных моделей.
Кроме того, когда в качестве основного компонента терапевтического средства или профилактического средства используется антитело, необходимо также учитывать количество используемого для лечения антитела для того, чтобы избежать побочных эффектов и минимизировать проблемы стоимости лечения, и это особенно важно в отношении доз в случае хронических заболеваний. Например, доза для лечения актемрой (тоцилизумаб), которая является человеческими антителами против IL-6R, составляет 8 мг на 1 кг массы тела в течение 1-4 недель, и доза для лечения солирисом (экулизумаб), который представляет собой гуманизированные антитела против комплемента С5, составляет 600-900 мг для введения взрослому человеку в течение 2-4 недель. Это превосходные антитела, разработанные путем отбора из большого числа антител, но их дозировки являются относительно высокими по сравнению с используемыми в настоящее время лекарственными средствами на основе антител. Таким образом, для лекарственных средств на основе антител, которые будут разработаны в будущем, действие должно проявляться при дозировках, равных или меньших, чем указанные. Кроме того, поскольку органом на который воздействуют при лечении когнитивных расстройств, таких как AD, является головной мозг, считается, что антитела, используемые для лечения таких расстройств, имеют меньший фармакологический эффект по сравнению с антителами используемыми для лечения заболеваний с участием других органов, поскольку при системном введении внутривенным или подкожным путем скорость миграции антител из крови в головной мозг достаточно низкая из-за наличия гематоэнцефалического барьера, что составляет главную проблему.
Основными симптомами при когнитивных расстройствах у людей являются ухудшение памяти и ухудшение когнитивной функции, и так как когнитивная функция является особенно важной для основанной на памяти способности к умозаключениям, общения и работоспособности, симптомы когнитивных расстройств это вопрос первостепенной важности. С другой стороны, двигательная функция хотя и является симптомом, обнаруженном при связанной с хромосомой 17 лобно-височной деменции с паркинсонизмом (FTDP-17), необязательно является основным симптомом, проявляющимся при когнитивных расстройствах. Следовательно, основным вопросом, рассматриваемым в случае лечения когнитивных расстройств, является улучшение когнитивной функции. Однако в настоящее время нет способов получения терапевтического средства или профилактического средства против когнитивных расстройств, которое показывает превосходное улучшение или когнитивной функции с использованием подходящих животных моделей ухудшения когнитивной функции, связанного с таупатией, которые необходимы для решения проблемы, очерченной выше, ни какого-либо терапевтического средства или профилактического средства против когнитивных расстройств, которое показывает специфическое и превосходное действие против когнитивных расстройств.
Поэтому в свете таких обстоятельств существует потребность в терапевтическом средстве или профилактическом средстве с сильным эффектом в отношении улучшения когнитивной функции.
Список процитированной литературы
Патентная литература
[Птл 1] US 8012936
[Птл 2] WO 2010/142423
[Птл 3] WO 2010/144711
[Непатентная литература]
[Нпл 1] Kishimoto Т., Takahashi S., STEP Series Seishinka, 2th Edition, p. 103-104, Kaibashobo, 2008
[Нпл 2] Asada Т., Igaku no Ayumi, supplementary volume, "Cognitive disorders", p. 5-10, Ishiyaku Publishing, 2011
[Нпл 3] Alistair Burns, John O'Brien and David Ames, Dementia. 3rd Edition, p. 408-464, 2005
[Нпл 4] Arai, Т., Shinkei Naika, Vol. 72, special number, (Suppl. 6), p. 46-51, 2010
[Нпл 5] Wendy Noble et al., Expert Opin. Drug Discov., Vol. 6, No. 8, p. 797-810, 2011
[Нпл 6] Miguel Diaz-Hernandes et al., Journal of Biological Chemistry, Vol. 285, p. 32539-32548, 2010
[Нпл 7] Venessa Plouffe et al., PLoS ONE, Vol. 7, p. 36873, 2012
[Нпл 8] Alistair Burns, John O'Brien and David Ames, Dementia. 3rd Edition, p. 459, 2005
Раскрытие изобретения
Проблемы, решаемые изобретением
Целью настоящего изобретения является получение терапевтического средства или профилактического средства против когнитивных расстройств, сосредоточенное на тау-фосфорилировании при таупатиях.
Другой целью изобретения является получение терапевтического средства или профилактического средства против когнитивных расстройств, содержащее в качестве активного ингредиента антитела, которые участвуют в специфическом взаимодействии антиген-антитело с тау, фосфорилированном в аминокислотном остатке, находящемся в непосредственной близости от Ser413, или пептид, характеризующийся аминокислотной последовательностью аналогичной аминокислотной последовательности в непосредственной близости от Ser413 и фосфорилированным, по меньшей мере, в одном аминокислотном остатке.
Еще одной целью изобретения является получение моноклонального антитела, обладающего сильным эффектом в отношении улучшения когнитивной функции и способ получения антитела, которое является еще более подходящим для лечения когнитивного расстройства, такого как гуманизированное антитело, где способ основан на анализе структуры моноклонального антитела.
Способы решения проблем
Настоящее изобретение подробно описывается ниже. Белок тау по изобретению включает не только 4R2N, но все 6 типов изоформ. Для удобства, позиции аминокислотных остатков в настоящем изобретении идентифицированы относительно SEQ ID NO: 1, и, например, если упоминается аминокислотный остаток, соответствующей Ser413 в SEQ ID NO: 1, это относится к 413-ому серину SEQ ID NO: 1 (4R2N), или серину, который является 384-ым аминокислотным остатком SEQ ID NO: 2 (4R1N), 355-ым SEQ ID NO: 3 (4R0N), 382-ым SEQ ID NO: 4 (3R2N), 353-им SEQ ID NO: 5 (3R1N) или 324-ым SEQ ID NO: 6(3R0N).
(1) Терапевтическое средство или профилактическое средство против когнитивных расстройств, содержащее в качестве активного ингредиента антитело, которое участвуют во взаимодействии антиген-антитело с тау белком, который фосфорилирован в, по меньшей мере, одном аминокислотном остатке, находящимся в положении, соответствующем позициям 410-421 тау-белка, представленного SEQ ID NO: 1.
(2) Терапевтическое средство или профилактическое средство против когнитивных расстройств согласно (1), при этом антитело представляет собой антитело, которое участвуют во взаимодействии антиген-антитело с фосфорилированным тау-белком, характерным для когнитивных расстройств.
(3) Терапевтическое средство или профилактическое средство против когнитивных расстройств согласно (1) или (2), при этом антитело участвуют во взаимодействии антиген-антитело с тау-белком, который фосфорилирован в одном или нескольких сайтах, выбранных из числа Ser412, Ser413, Thr414 и Ser416.
(4) Терапевтическое средство или профилактическое средство против когнитивных расстройств согласно любому из (1)-(3), при этом антитело представляет собой антитело, которое при связывании с тау-белком конкурирует с антителом, содержащим VH, состоящую из аминокислотной последовательности, указанной как SEQ ID NO: 20, и VL, состоящую из аминокислотной последовательности, указанной как SEQ ID NO: 26.
(5) Терапевтическое средство или профилактическое средство против когнитивных расстройств согласно любому из (1)-(3), при этом антитело представляет собой антитело, содержащее VH, состоящую из аминокислотной последовательности, указанной как SEQ ID NO: 20, и VL, состоящую из аминокислотной последовательности, указанной как SEQ ID NO: 26.
(6) Терапевтическое средство или профилактическое средство против когнитивных расстройств согласно любому из (1)-(4), при этом антитело представляет собой антитело, которое участвуют во взаимодействии антиген-антитело с тау-белком, который фосфорилирован в аминокислотном остатке, соответствующем Ser413.
(7) Терапевтическое средство или профилактическое средство против когнитивных расстройств согласно любому из (1)-(6), при этом антитело представляет собой антитело, содержащее последовательности CDR Н-цепи, представленные SEQ ID NO: 7-13, или последовательность CDR Н-цепи, представленную, по меньшей мере, одной из SEQ ID NO: 7-13, или последовательность CDR Н-цепи, имеющую, по меньшей мере, 85% гомологию с, по меньшей мере, одной последовательностью CDR Н-цепи, представленных SEQ ID NO: 7-13, и/или последовательности CDR L-цепи, представленные SEQ ID NO: 14-17, последовательность CDR L-цепи, представленную, по меньшей мере, одной из SEQ ID NO: 14-17, или последовательность CDR L-цепи, имеющую, по меньшей мере, 85% гомологию с, по меньшей мере, одной последовательностью CDR L-цепи, представленных SEQ ID NO: 14-17.
(8) Терапевтическое средство или профилактическое средство против когнитивных расстройств согласно любому из (1)-(7), при этом антитело представляет собой антитело, содержащее вариабельный участок Н-цепи, представленный любой из последовательностей SEQ ID NO: 18-24, или вариабельный участок Н-цепи, содержащий последовательность, имеющую, по меньшей мере, 85% гомологию с любой из последовательностей SEQ ID NO: 18-24, и/или вариабельный участок L-цепи, представленный любой из последовательностей SEQ ID NO: 25-30, или вариабельный участок L-цепи, содержащий последовательность, имеющую, по меньшей мере, 85% гомологию с любой из последовательностей SEQ ID NO: 25-30.
(9) Терапевтическое средство или профилактическое средство против когнитивных расстройств согласно любому из (1)-(8), при этом антитело представляет собой гуманизированное антитело или химерное антитело.
(10) Терапевтическое средство или профилактическое средство против когнитивных расстройств, содержащее в качестве активного ингредиента пептид, который содержит последовательность из, по меньшей мере, 8 последовательных аминокислот из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков, соответствующих аминокислотам 410-421 SEQ ID NO: 1, причем, по меньшей мере, один из аминокислотных остатков в пептиде фосфорилирован.
(11) Терапевтическое средство или профилактическое средство против когнитивных расстройств согласно (10), при этом, по меньшей мере, один из фосфорилированных аминокислотных остатков в пептиде соответствует аминокислотным остаткам Ser412, Ser413, Thr414 или Ser416 SEQ ID NO: 1.
(12) Терапевтическое средство или профилактическое средство против когнитивных расстройств согласно (10) или (11), при этом фосфорилированные аминокислотные остатки в пептиде включают, по меньшей мере, аминокислотный остаток, соответствующий Ser413 SEQ ID NO: 1.
(13) Терапевтическое средство или профилактическое средство против когнитивных расстройств согласно любому из (1)-(12), при этом когнитивное расстройство представляет собой таупатию.
(14) Терапевтическое средство или профилактическое средство против когнитивных расстройств согласно (13), при этом таупатия представляет собой болезнь Альцгеймера, кортикобазальную дегенерацию ганглиев, прогрессирующий надъядерный паралич, болезнь Пика, аргирофильную зернистую деменция (аргирофильную зернистую болезнь), множественную системную таупатию с деменцией (MSTD), связанную с хромосомой 17 лобно-височную деменцию с паркинсонизмом (FTDP-17), деменцию с нейрофибриллярными клубками, диффузные нейрофибриллярные клубки с кальцификацией (DNTC), таупатию белого вещества с глобулярными глиальными включениями (WMT-GGI) или лобно-височную лобарную дегенерацию с тау-положительными включениями (FTLD-тау).
(15) Моноклональное антитело, которое участвует во взаимодействии антиген-антитело с пептидом, содержащим последовательность из, по меньшей мере, 8 последовательных аминокислот из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислот 410-421 SEQ ID NO: 1, причем аминокислотный остаток в пептиде, соответствующий Ser413 SEQ ID NO: 1, фосфорилирован.
(16) Антитело направленное на фосфорилированный тау-белок, причем антитело является тем, которое конкурирует с антителом, содержащим VH, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной как SEQ ID NO: 20, и VL, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной как SEQ ID NO: 26 при связывании с антигеном.
(17) Антитело направленное на фосфорилированный тау-белок, причем антитело является тем, которое содержит VH, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной как SEQ ID NO: 20, и VL, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной как SEQ ID NO: 26.
(18) Моноклональное антитело, имеющее последовательность CDR Н-цепи, представленные SEQ ID NO: 7-13, последовательность CDR Н-цепи, представленную, по меньшей мере, одной из SEQ ID NO: 7-13, или Н-цепь, содержащую последовательность CDR, имеющую, по меньшей мере, 85% гомологию с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR Н-цепи, представленных SEQ ID NO: 7-13, и/или последовательности CDR L-цепи, представленные SEQ ID NO: 14-17, последовательность CDR L-цепи, представленную, по меньшей мере, одной из SEQ ID NO: 14-17, или L-цепь, содержащую последовательность CDR, имеющую, по меньшей мере, 85% гомологию с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR L-цепи, представленных SEQ ID NO: 14-17.
(19) Моноклональное антитело, содержащее вариабельный участок Н-цепи, представленный любой из последовательностей SEQ ID NO: 18-24, или вариабельный участок Н-цепи, имеющий, по меньшей мере, 85% гомологию с любой из последовательностей SEQ ID NO: 18-24, и/или вариабельный участок L-цепи, представленный любой из последовательностей SEQ ID NO: 25-30, или вариабельный участок L-цепи, имеющий, по меньшей мере, 85% гомологию с любой из последовательностей SEQ ID NO: 25-30.
(20) Моноклональное антитело согласно любому из (15)-(19), при этом антитело представляет собой гуманизированное антитело или химерное антитело.
(21) Пептид, состоящий из последовательности из по меньшей мере 8 последовательных аминокислот из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков, соответствующих аминокислотам 410-421 SEQ ID NO: 1, причем, по меньшей мере, один из аминокислотных остатков в пептиде является фосфорилированным.
(22) Пептид согласно (21), при этом, по меньшей мере, один из аминокислотных остатков, соответствующих аминокислотам Ser412, Ser413, Thr414 и Ser416 SEQ ID NO: 1, является фосфорилированным.
(23) Пептид согласно (21) или (22), при этом фосфорилированный аминокислотный остаток представляет собой аминокислотный остаток, соответствующий Ser413 SEQ ID NO: 1.
Эффекты изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает терапевтическое средство или профилактическое средство против когнитивных расстройств, содержащее в качестве активного ингредиента антитела, которые участвуют во взаимодействии антиген-антитело специфически с фосфорилированным тау, где взаимодействие происходит по соседству с аминокислотным остатком, соответствующим Ser413 SEQ ED NO: 1; или пептид, содержащий аминокислотную последовательность соответствующую аминокислотной последовательности вблизи Ser413 SEQ ID NO: 1, причем, по меньшей мере, один из аминокислотных остатков является фосфорилированным. Изобретение также обеспечивает моноклональные антитела, имеющие сильный улучшающий эффект на когнитивную функцию, и способ получения антител, которые являются еще более подходящими для лечения когнитивного расстройства, таких как гуманизированные антитела, где способ основан на анализе структуры моноклональных антител.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 представляет собой перечень начальных частей аминокислотных последовательностей изоформ человеческого тау-белка, выровненных с использованием Clusta1W.
Фиг. 2 представляет собой перечень конечных частей аминокислотных последовательностей изоформ человеческого тау-белка, выровненных с использованием Clusta1W.
Фиг. 3 представляет собой график, показывающий специфичность кроличьих поликлональных антител в отношении пептида pSer413.
Фиг. 4 представляет собой график, показывающий результаты предварительного испытания на мышиной модели поликлональных кроличьих антител, распознающих pSer413..
Фиг. 5 представляет собой график, показывающий результаты основного исследовательского испытания на мышиной модели поликлональных кроличьих антител, распознающих pSer413.
Фиг. 6 представляет собой линейный график, показывающий результаты теста «открытое поле» с мышиной моделью, которой вводили поликлональные кроличьи антитела, распознающие pSer413.
Фиг. 7 представляет собой гистограмму, показывающую результаты теста «открытое поле» с мышиной моделью, которой вводили поликлональные кроличьи антитела, распознающие pSer413.
Фиг. 8 представляет собой график, показывающий результаты предварительного испытания на мышиной модели моноклонального мышиного антитела к pSer413 (Та1505).
Фиг. 9 представляет собой гистограмму, показывающую результаты основного исследовательского испытания на мышиной модели моноклонального мышиного антитела к pSer413 (Ta1505).
Фиг. 10 представляет собой линейный график, показывающий результаты теста «открытое поле» с мышиной моделью, которой вводили моноклональное мышиное антитело к pSer413 (Та1505).
Фиг. 11 представляет собой гистограмму, показывающую результаты теста «открытое поле» с мышиной моделью, которой вводили моноклональное мышиное антитело к pSer413 (Ta1505).
Фиг. 12 представляет собой график, показывающий результаты предварительного испытания на мышиной модели мышиного моноклонального антитела, распознающего pSer413, (Та9).
Фиг. 13 представляет собой гистограмму, показывающую результаты основного исследовательского испытания на мышиной модели мышиного моноклонального антитела, распознающего pSer413, (Та9)
Фиг. 14 представляет собой линейный график, показывающий результаты теста «открытое поле» с мышиной моделью, которой вводили мышиное моноклональное антитело, распознающее pSer413, (Та9).
Фиг. 15 представляет собой гистограмму, показывающую результаты теста «открытое поле» с мышиной моделью, которой вводили мышиное моноклональное антитело, распознающее pSer413, (Та9).
Фиг. 16 представляет собой гистограмму, показывающую уровни синаптофизина в гиппокампе у мышиной модели при введении антител Та1505.
Фиг. 17 представляет собой схема, фрагмента, содержащего ген тау.
Фиг. 18 представляет собой график, показывающий результаты предварительного испытания в водном лабиринте мышей с нарушенным запоминанием при обучении (Tau-Tg), которым вводили антитела Та1505.
Фиг. 19 представляет собой гистограмму, показывающую результаты предварительного испытания в водном лабиринте мышей с нарушенным запоминанием при обучении (Tau-Tg), которым вводили антитела Та1505.
Фиг. 20 представляет собой график, показывающий результаты предварительного испытания в водном лабиринте мышей с нарушенным запоминанием при обучении (Tau-Tg), которым вводили антитела Та9.
Фиг. 21 представляет собой гистограмму, показывающую результаты предварительного испытания в водном лабиринте мышей с нарушенным запоминанием при обучении (Tau-Tg), которым вводили антитела Та9.
Фиг. 22 представляет собой фотографии, показывающие иммуногистоокрашивание антителами Та1505 участка гиппокампа СА3 и участка СА23 мышей с нарушенным запоминанием при обучении (Tau-Tg) при введении контроля IgG (1 мг/мышь) или антител Та1505 (1 мг/мышь).
Фиг. 23 представляет собой фотографии, показывающие иммуногистоокрашивание с Та1505 участка парагиппокампальной извилины у мышей с нарушенным запоминанием при обучении (Tau-Tg) при введении контроля IgG (1 мг/мышь).
Фиг. 24 представляет собой фотографии, показывающие иммуногистоокрашивание с Та1505 участка парагиппокампальной извилины у мышей с нарушенным запоминанием при обучении (Tau-Tg) при введении антител Та1505 (1 мг/мышь).
Фиг. 25 представляет собой фотографии, показывающие иммуногистоокрашивание участка гиппокампа СА3 и участка СА23 АТ8 у мышей с нарушенным запоминанием при обучении (Tau-Tg) при введении контроля IgG (1 мг/мышь) или антител Та1505 (1 мг/мышь).
Фиг. 26 представляет собой фотографии, показывающие иммуногистоокрашивание участка парагиппокампальной извилины АТ8 у мышей с нарушенным запоминанием при обучении (Tau-Tg) при введении контроля IgG (1 мг/мышь).
Фиг. 27 представляет собой фотографии, показывающие иммуногистоокрашивание участка парагиппокампальной извилины АТ8 у мышей с нарушенным запоминанием при обучении (Tau-Tg) при введении антител Та1505 (1 мг/мышь).
Фиг. 28 представляет собой график, показывающий количество тау, реагирующего с G2, АТ8, PHF1 и Та1505, в растворимой в TBS фракции головного мозга мышей с нарушенным запоминанием при обучении (Tau-Tg) при введении Та1505 (1 мг/мышь).
Фиг. 29 представляет собой график, показывающий количество тау, реагирующего с G2, АТ8, PHF1 и Та1505, в растворимой в саркозиле фракции головного мозга мышей с нарушенным запоминанием при обучении (Tau-Tg) при введении Та1505 (1 мг/мышь).
Наилучший способ осуществления изобретения
Авторы настоящего изобретения получили антитела, которые участвуют в специфическом взаимодействии антиген-антитело с тау, который фосфорилирован в аминокислотном остатке, соответствующем Ser413 SEQ ID NO: 1, который является сайтом, специфически фосфорилированным при AD. Эти антитела ввели Tg мышам, проявляющим ассоциированное с возрастом ухудшение когнитивной функции, и обнаружили, что когнитивную функцию можно восстановить приблизительно до такого же уровня, как у контрольной группы. С другой стороны, адекватного улучшения когнитивной функции не наблюдают при использовании сравнимой концентрации антител к тау, который фосфорилирован в аминокислотных остатках, соответствующих Ser396 SEQ ID NO: 1, которые имели даже более высокую аффинность к эквивалентному антигену, чем антитела по изобретению. Часть вблизи аминокислотного остатка, соответствующего Ser413 SEQ ID NO: 1, является участком, для которого нет конкретной информации о связи между этой структурой тау и функцией, поэтому совершенно неожиданным является то, что антитела, которые участвуют во взаимодействии антиген-антитело специфически с этой частью, имеют такое сильное улучшающий эффект на когнитивную функцию. Таким образом, в настоящем изобретении впервые показано, что сайт по соседству с аминокислотным остатком, соответствующим Ser396 SEQ ID NO: 1, который до сих пор не вызывал интерес, является важным сайтом для начала ухудшения когнитивной функции при таупатиях, и тем самым было получено настоящее изобретение.
Антитело против фосфорилированного тау
Тау (белок) для целей изобретения включает не только тау-белок человека, представленный SEQ ID NO: 1-6, но также его генетические мутанты. Как пояснялось выше в разделе «Уровень техники», с FTDP-17 (семейном нейродегенеративном заболевании, ассоциированном с когнитивным расстройством) ассоциировано более 40 мутаций, но места мутаций необязательно ограничиваются ими. Более того, белки с мутациями в аминокислотах в местоположениях 1-50, предпочтительно, местоположениях 1-30, предпочтительнее, местоположениях 1-10, такие как ряд мутаций в SEQ ID NO: 1-6, также рассматриваются как тау для цели изобретения. Кроме того, также включаются белки, показывающие, по меньшей мере, 85% гомологию (идентичность) с тау-белком человека, обозначенным как SEQ ID NO: 1, согласно методу BLAST (условия по умолчанию NCBI PBLAST), и их изоформы. Такие белки также включают тау иных видов, чем люди, таких как шимпанзе, макака резус, лошадь, свинья, собака, мышь, кролик и крыса, и могут использоваться для получения терапевтических средств или профилактического средства, имеющих целью такие тау-белки, с целью улучшения когнитивной функции у таких животных.
Номера аминокислот согласно изобретению, т.е. позиции аминокислотных остатков, для удобства обозначаются их номерами в последовательности SEQ ID NO: 1. Так, например, если упоминается аминокислотный остаток, соответствующий Ser413 SEQ ID NO: 1, это относится к серину, который является 413-ым аминокислотным остатком в SEQ ID NO: 1 (4R2N), 384-ым в SEQ ID NO: 2 (4R1N), 355-ым в SEQ ID NO: 3 (4R0N), 382-ым в SEQ ID NO: 4 (3R2N), 353-им в SEQ ID NO: 5 (3R1N) или 324-ым в SEQ ID NO: 6 (3R0N). В таблице 1 показаны позиции аминокислотных остатков для каждой изоформы, которые находятся в одних и тех же соответственных позициях. В таблице 1 позиции аминокислотных остатков для каждой изоформы показаны относительно 410-421 в SEQ ID NO: 1, и соотношения соответственных позиций аминокислотных остатков для других позиций можно легко определить на основе фиг. 1 и фиг. 2, например.
Термин «антитело против фосфорилированного тау» относится к антителу, которое принимает участие во взаимодействии антиген-антитело с тау, который фосфорилирован в аминокислотном остатке в одном или нескольких местоположениях аминокислотной последовательности тау, описанной выше. Фосфорилированные аминокислотные остатки могут представлять собой серин (Ser), треонин (Thr), тирозин (Tyr) или подобные. Также сайт в фософрилированном тау, с которым антитело против фосфорилированного тау взаимодействует по механизму антиген-антитело, предпочтительно является сайтом, который специфически фосфорилирован при нейродегенеративных заболеваниях, таких как AD. Кроме того, в другом предпочтительном варианте сайт фосфорилированного тау, с которым антитело против фосфорилированного тау по изобретению взаимодействует по механизму антиген-антитело, это тот сайт, с которым связывается антитело, которое участвует во взаимодействии антиген-антитело с тау, который фосфорилирован в одном или нескольких сайтах, выбранных из числа аминокислотных остатков, соответствующих Ser412, Ser413, Thr414 и Ser416 SEQ ID NO: 1, предпочтительнее, антитело, которое участвует во взаимодействии антиген-антитело с тау, который фосфорилирован в аминокислотном остатке, соответствующем Ser412 или Ser413 SEQ ID NO: 1, или обоих сайтах, и даже предпочтительнее, антитело, которое участвует во взаимодействии антиген-антитело с тау, который фосфорилирован в сайте аминокислотного остатка, соответствующем Ser413 SEQ ID NO: 1. В данном случае аминокислотный остаток, соответствующий Ser412, Ser413, Thr414 или Ser416 SEQ ID NO: 1, относится к сайту, соответствующему номеру аминокислоты в тау 4R2N человека (SEQ ID NO: 1), и как это поясняется в разделе «Уровень техники», соответствующий сайт в изоформе или соответствующий сайт в гомологах, не относящихся к человеку, рассматривают таким же образом независимо от номера аминокислоты в такой аминокислотной последовательности. Специалист в данной области техники может определить соответствующие сайты в изоформах или гомологах посредством анализа методом попарного выравнивания последовательностей, таким как метод Нидлмана-Вунша или метод Смита-Ватермана, или множественного выравнивания последовательностей, таким как метод ClustalW или метод PRRP. Пример метода анализа соответствующего сайта показан на фиг. 1 и фиг. 2 с аминокислотными последовательностями (однобуквенное представление) 6 различных изоформ у людей, выровненных с использованием ClustalW. Как видно в данном случае, структура вблизи аминокислотных остатков, соответствующих Ser412, Ser413, Thr414 или Ser416 SEQ ID NO: 1, консервативна в 6 изоформах, и можно легко увидеть, какие аминокислоты являются соответствующими.
Антитело против фосфорилированного тау, которое можно использовать в терапевтическом средстве или профилактическом средстве согласно изобретению, представляет собой антитело, которое участвует во взаимодействии антиген-антитело с тау-белком, который фосфорилирован, по меньшей мере, в одном аминокислотном остатке, присутствующем в позициях от 410 до 421 тау-белка SEQ ID NO: 1, предпочтительно, представляет собой антитело, которое участвует во взаимодействии антиген-антитело с тау-белком, который фосфорилирован в одном или нескольких сайтах, выбранных из числа аминокислотных остатков, соответствующих Ser412, Ser413, Thr414 и Ser416 SEQ ID NO: 1, предпочтительнее, антитело, которое конкурирует за связывание с антигеном с антителом, аминокислотная последовательность VH которого представлена SEQ ID NO: 20, и аминокислотная последовательность VL которого представлена SEQ ID NO: 26 (в данном описании называемое «антитело 1505»), или даже предпочтительнее, представляет собой антитело, которое участвует во взаимодействии антиген-антитело именно с тау-белком, который фосфорилирован в сайте Ser413. Тау-белок, который фосфорилирован, по меньшей мере, в одном аминокислотном остатке, соответствующем позициям 410-421 SEQ ID NO: 1, тау-белок, который фосфорилирован в одном или нескольких сайтах, выбранных из числа аминокислотных остатков, соответствующих Ser412, Ser413, Thr414 и Ser416 SEQ ID NO: 1, или тау-белок, который фосфорилирован в сайте аминокислотного остатка, соответствующего Ser413 SEQ ID NO: 1, считается тау-белком, который фосфорилирован в соответствующем сайте, по изобретению, и включает изотипы человека или других видов, упомянутых выше, но предпочтительнее, является тау-белком человека, и даже предпочтительнее, любой из 6 изоформ у людей.
Что касается тау-белка по изобретению, который фосфорилирован, по меньшей мере, в одном аминокислотном остатке, соответствующем позициям 410-421 SEQ ID NO: 1, то тау-белок, который фосфорилирован в одном или нескольких сайтах, выбранных из числа аминокислотных остатков, соответствующих Ser412, Ser413, Thr414 и Ser416 SEQ ID NO: 1, или тау-белок, который фосфорилирован в сайте аминокислотного остатка, соответствующего Ser413 SEQ ID NO: 1 - такие фосфорилированные тау-белки включают пептиды, которые имеют полную гомологию с частями последовательностей аминокислотных остатков, соответствующих позициям 410-421 тау-белка, или гомологию с, по меньшей мере, 80% последовательностей, и фосфорилированы в таких аминокислотных остатках, и антитело, которое участвует во взаимодействии антиген-антитело специфически с таким пептидом, также является антителом против фосфорилированного тау по изобретению.
-6
-7
-8
Согласно изобретению, «участвует во взаимодействии антиген-антитело» означает связывание с тау-белком, который фосфорилирован, по меньшей мере, в одном аминокислотном остатке, соответствующем позициям 410-421 тау-белка SEQ ID NO: 1, тау-белком, который фосфорилирован в одном или нескольких сайтах, выбранных из числа аминокислотных остатков, соответствующих Ser412, Ser413, Thr414 и Ser416 SEQ ID NO: 1, и/или с тау-белком, который фосфорилирован в сайте аминокислотного остатка, соответствующего Ser413 SEQ ID NO: 1, с аффинностью, представленной константой равновесия диссоциации (KD), по меньшей мере, 1×10 М, предпочтительно, связывание с аффинностью, представленной константой равновесия диссоциации, по меньшей мере, 1×10 М, и даже предпочтительнее, связывание с аффинностью, представленной константой равновесия диссоциации, по меньшей мере, 1×10 М.
Термин «специфичность» означает, что связывание с тау-белком, который фосфорилирован, по меньшей мере, в одном аминокислотном остатке, соответствующим позициям 410-421 SEQ ID NO: 1, тау-белком, который фосфорилирован в одном или нескольких сайтах, выбранных из числа аминокислотных остатков, соответствующих Ser412, Ser413, Thr414 и Ser416 SEQ ID NO: 1, и/или с тау-белком, который фосфорилирован в сайте аминокислотного остатка, соответствующего Ser413 SEQ ID NO: 1, по меньшей мер, в 10 раз сильнее, предпочтительнее, по меньшей мере, в 30 раз сильнее и даже предпочтительнее, по меньшей мере, в 100 раз сильнее, чем связывание с тау-белком, который не фосфорилирован в таком сайте (включая пептиды, имеющие полную гомологию с частью аминокислотной последовательности тау-белка, или имеющие гомологию с, по меньшей мере, 80% последовательности).
50
Кроме того, «связывается конкурентно» с антителом, аминокислотная последовательность VH которого представлена SEQ ID NO: 20, и аминокислотная последовательность VL которого представлена SEQ ID NO: 26 (антитело 1505), обозначает явление, согласно которому, если во время связывания с антигеном помимо моноклонального антитела присутствует другое антитело, связывание моноклонального антитела подавляется и, вообще говоря, это можно измерить, измеряя количество (концентрацию) добавки, при котором количество моноклонального антитела, связывающееся с антигеном, уменьшается, когда другое антитело добавляют в изменяющемся количестве (концентрации) относительно фиксированного количества (концентрации) моноклонального антитела, причем степень ингибирования выражают в виде величины IC или Ki. Антитело, которое связывается конкурентно с антителом, аминокислотная последовательность VH которого представлена SEQ ID NO: 20, и аминокислотная последовательность VL которого представлена SEQ ID NO: 26 (антитело 1505), по изобретению, представляет собой антитело, которое имеет величину IC50 менее 1 мкМ, предпочтительнее, менее 100 нМ, и даже предпочтительнее, менее 10 нМ, когда связывание антиген-антитело анализирует при концентрации 10 нМ моноклонального антитела.
Специалист в данной области техники может определить связывание по типу антиген-антитело подобного антитела с фосфорилированным тау-белком, что может быть сделано посредством соответствующего анализа связывания с использованием твердофазной или жидкофазной системы, таким методом как ELISA, EIA, поверхностный плазмонный резонанс, FRET, LRET или подобным, хотя возможные методики особо не ограничены. Когда измеряют такое связывание антиген-антитело, антитело и/или антиген (фосфорилированный тау-белок или тау-белок) метят ферментом, флуоресцентным веществом, люминесцентным веществом, радиоактивным изотопом или подобным образом, и используют способ измерения, основанный на физических и/или химических свойств меченого вещества, для детекции взаимодействия антиген-антитело.
Антитело против фосфорилированного тау по изобретению также включает антитело, в котором вариабельный участок Н-цепи содержит аминокислотные последовательности CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, состоящие из комбинации SEQ ID NO: 7 или 8 в качестве аминокислотной последовательности CDR-H1, любой последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 9, 10, 11 и 12 в качестве аминокислотной последовательности CDR-H2 и SEQ ID NO: 13 в качестве аминокислотной последовательности CDR-H3, и вариабельный участок L-цепи содержит аминокислотные последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, состоящие из комбинации SEQ ID NO: 14 или 15 в качестве аминокислотной последовательности CDR-L1, SEQ ID NO: 16 в качестве аминокислотной последовательности CDR-L2 и SEQ ID NO: 17 в качестве аминокислотной последовательности CDR-L3. Предпочтительно, антитело представляет собой антитело, в котором CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 в вариабельном участке Н-цепи представляет собой любой набор, выбранный из комбинаций SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 13, и CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 в вариабельном участке L-цепи представляет собой SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17, и предпочтительнее, представляет собой антитело, в котором CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 в вариабельном участке Н-цепи и CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 в вариабельном участке L-цепи выбирают из комбинаций SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14. SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14. SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15. SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17. Антитело по изобретению также включает антитела, в которых, по меньшей мере, одна из соответствующих последовательностей CDR из числа аминокислотных последовательностей CDR-H1, CDR-Н2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 представляет собой последовательность, имеющую, по меньшей мере, 85% гомологию (идентичность), и предпочтительно, по меньшей мере, 90% гомологию с любой из SEQ ID NO: 1-17 согласно методу BLAST (условия по умолчанию для NCBI PBLAST).
Способ идентификации последовательности CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 или CDR-L3 в антителе может представлять собой способ Кабат или способ Чотиа, и специалист в данной области техники может идентифицировать части последовательность, соответствующей каждому CDR, причем методы Кабат (Kabat Е.А. and Wu Т.Т., J. Immunol., 147, 1709-1719, 1991) и Чотиа (Al-Lazikani В., Lesk А.М. and Chothia С, J. Mol. Biol., 273, 927-948, 1997) являются традиционно используемыми методами, известными специалистам в соответствующей области, и их обзоры можно найти, например, на веб-сайте Dr. Andrew C.R. Martin's Group (http://www.bioinf.org.uk/abs/).
Как другая форма антитела по изобретению, это может быть антитело, в котором вариабельный участок Н-цепи (VH) аминокислотной последовательности представляет собой участок, выбранный из SEQ ID NO: 18-24, и вариабельный участок L-цепи (VL) аминокислотной последовательности представляет собой участок, выбранный из SEQ ID NO: 25-30, и предпочтительно, антитело, в котором комбинацию аминокислотных последовательностей VH и VL выбирают из комбинаций SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 29, и SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 30. Антитело по изобретению включает антитела, в которых, по меньшей мере, одна из аминокислотных последовательностей VH и VL представляет собой любую аминокислотную последовательность VH, обозначенную как SEQ ID NO: 18-24, или любую аминокислотную последовательность VL, обозначенную как SEQ ID NO: 25-30, и последовательности, имеющие, по меньшей мере, 85% гомологию (идентичность), и предпочтительно, по меньшей мере, 90% гомологию с SEQ ID NO: 18-30 по методу BLAST (условия по умолчанию для NCBI PBLAST).
Аминокислотные последовательности константных участков в таких антителах выбирают из соответствующих участков антител подтипов IgG, IgA, IgM, IgE и IgD млекопитающих или их вариантов.
Специалист в данной области техники может создавать рекомбинантные антитела, подходящие для введения представляющему интерес виду при его лечении, такие как гуманизированные антитела, основываясь на информации об аминокислотных последовательностях CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 и/или нуклеотидных последовательностях генов, кодирующих их, или аминокислотных последовательностях CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 и/или нуклеотидных последовательностях генов, кодирующих их. Специалист в данной области техники также может создавать химерные антитела в соответствии с целью, основываясь на информации об аминокислотной последовательности вариабельного участка Н-цепи и/или нуклеотидной последовательности гена, кодирующего его, или аминокислотной последовательности вариабельного участка L-цепи и/или нуклеотидной последовательности гена, кодирующего его. Кроме того, специалист в данной области техники может соответствующим образом использовать известную технологию для создания низкомолекулярных антител или антител-скаффолдов, с учетом информации об аминокислотных последовательностях CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 и/или нуклеотидных последовательностях генов, кодирующих их, или аминокислотных последовательностях CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 и/или нуклеотидных последовательностях генов, кодирующих их, или с учетом информации о аминокислотной последовательности вариабельного участка Н-цепи и/или нуклеотидной последовательности гена, кодирующего его, или аминокислотной последовательности вариабельного участка L-цепи и/или нуклеотидной последовательности гена, кодирующего его.
Антитело по изобретению может представлять собой антитело, составленное из двух Н-цепей и двух L-цепей, или оно может представлять собой антитело, составленное только из двух Н-цепей. Также антитело по изобретению может представлять собой фрагмент антитела, причем примеры фрагментов антител включают F(ab')2, Fab и Fv.
Антитело по изобретению можно получить с использованием известных специалистам в данной области техники методов. Антитело по изобретению может представлять собой поликлональное антитело или моноклональное антитело (Milstein et al., Nature (England), October 6, 1983, Vol. 305, No. 55934, p. 537-540). Например, можно получить поликлональное антитело с использованием в качестве антигена для сенсибилизации млекопитающего тау-белка, который фосфорилирован, по меньшей мере, в одном аминокислотном остатке, соответствующем позициям 410-421 SEQ ID NO: 1, или тау-белка, который фосфорилирован в одном или нескольких сайтах, выбранных из числа Ser412, Ser413, Thr414 и Ser416 SEQ ID NO: 1, или тау-белка, который фосфорилирован в сайте Ser413 SEQ ID NO: 1, или пептида, имеющего полную гомологию с, по меньшей мере, частью аминокислотной последовательности в позициях 410-421 тау-белка SEQ ID NO: 1, или гомологию с, по меньшей мере, 80% последовательности, и который фосфорилирован в указанных аминокислотных остатках, и антитела, извлеченного из сыворотки животного. Когда в качестве антигена следует использовать пептид, антиген можно использовать в форме конъюгата, где антиген соединен с белком-носителем, таким как BSA или KLH, или с полилизином. Конкретные примеры пептидов, используемых в качестве антигенов, включают пептиды SEQ ID NO: 31 или 32, которые фосфорилированы в сайте, соответствующем Ser413 SEQ ID NO: 1, как описано в примерах 1 и 2, но не ограничиваются ими. Для получения моноклонального антитела по изобретению можно клонировать гибридому, созданную путем получения иммуноцитов от млекопитающего, сенсибилизированного антигеном, и слияния их с клетками миеломы или подобными, и извлечь антитела из культуры. Способ получения таких моноклональных антител описан в примере 2, и моноклональные антитела, полученные таким образом, могут представлять собой моноклональные антитела, содержащие аминокислотные последовательности VH SEQ ID NO: 18-24 и последовательности VL SEQ ID NO: 25-30 (Та1501, 1502, 1505-1509), но ими не ограничиваются.
Для полученного антитела можно определить молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую последовательность, кодирующую аминокислоты антитела, и возможно получить антитело методами генной инженерии с использованием такой молекулы нуклеиновой кислоты. Введение модификаций для усиления связывающей способности или специфичности антитела основываясь на генетической информации об антителе, такой как информация о Н-цепи, L-цепи или вариабельных участках последовательностях CDR, и получение антител, имеющих структуру, подходящую для применения при лечении путем модификации антитела животного, такого как мышь, для приближения к антителу человеческого типа, представляют собой методы, которые хорошо известны специалистам в данной области техники. Кроме того, используя не относящихся к человеку трансгенных животных, которые трансфицированы геном человеческого антитела, в качестве животных для сенсибилизации антигеном, можно получить моноклональные антитела человеческого типа. Кроме того, можно использовать фаговую библиотеку, экспрессирующую антигенсвязывающий участок человеческого антитела, или ее часть (фаговый дисплей человеческого антитела), для получения антитела, специфически связывающегося с соответствующим антигеном, или фагового клона, содержащего специфическую аминокислотную последовательность. Получение таким образом человеческого антитела может быть осуществлено специалистами в данной области техники если желательно использовать методы, которые не требуют сенсибилизации животных (см., например, Taketo Tanaka et al., Keio J. Med., Vol. 60, p. 37-46).
Более того, как говорилось выше, для получения моноклональных антител можно культивировать гибридомы, продуцирующие желаемые антитела, и очистить антитела из полученного культурального супернатанта с помощью традиционно используемых способов, тем самым получая их. В качестве другого способа получения антител, вначале можно получить ген, кодирующий антитело, и конкретнее, ген, кодирующий тяжелую цепь и/или легкую цепь иммуноглобулина, из гибридомы, которая продуцирует желаемые антитела, или из фагового клона или из подобного, полученного с помощью фагового дисплея человеческого антитела, и вставить в вектор для экспрессии, который затем перенести в клетки-хозяева (клетки млекопитающего, клетки насекомого, бактерии или подобное) для получения антитела. Во время такой процедуры специалист в данной области техники может использовать широко известные методы для модификации гена, кодирующего тяжелую цепь и/или легкую цепь иммуноглобулина, или для введения нужных признаков, или может создать антитело человеческого типа, антитело-химеру, низкомолекулярное антитело или антитело-скаффолд с использованием структурной информации о вариабельном участка или CDR тяжелой цепи и/или легкой цепи иммуноглобулина. Кроме того, для того, чтобы улучшить характеристики антитела или избежать побочных эффектов, соответственно могут быть использованы известные специалистам в данной области техники методы для введения модификаций в структуру константного участка антитела или модификации сахаристых частей его цепи.
Фосфорилированный пептид с аминокислотной последовательностью, происходящей от тау
Изобретение охватывает пептиды, которые содержат части аминокислотной последовательности тау, и которые фосфорилированы в одном или нескольких аминокислотных остатках. «Фосфорилированный» аминокислотный остаток представляет собой остаток, боковая цепь которого связана эфирной связью с фосфатной группой, причем типичными фосфорилированными аминокислотными остатками являются серии, треонин и тирозин. Фосфорилированный пептид представляет собой пептид длиной, по меньшей мере, в 8 аминокислот, содержащий, по меньшей мере, 3 последовательных аминокислоты из последовательности аминокислот, содержащей аминокислоты 410-421 SEQ ID NO: 1, предпочтительно, пептид длиной, по меньшей мере, в 8 аминокислот, содержащий, по меньшей мере, 5 последовательных аминокислот, и предпочтительнее, пептид длиной, по меньшей мере, в 8 аминокислот, содержащий, по меньшей мере, 8 последовательных аминокислот. Также фосфорилированные аминокислотные остатки в фосфорилированных пептидах могут представлять собой любые из аминокислотных остатков, соответствующих аминокислотам под номерами 410-421 SEQ ID NO: 1, предпочтительно, любые из аминокислотных остатков, соответствующих аминокислотам Ser412, Ser413, Thr414 и Ser416 SEQ ID NO: 1, и предпочтительнее, аминокислотный остаток, соответствующий Ser413 SEQ ID NO: 1. Типичным примером такого фосфорилированного пептида является фосфорилированный пептид, используемый для получения антител в примере 1 (SEQ ID NO: 31), но не ограничиваясь этим.
Фосфорилированный пептид по изобретению, имеющий происходящую от тау аминокислотную последовательность, можно использовать в терапевтическом средстве или профилактическом средстве против когнитивных расстройств, которое содержит антиген, для получения антител против фосфорилированного тау по изобретению или сам пептид. Фосфорилированный пептид также можно модифицировать по N-концу и/или С-концу последовательности веществами, обеспечивающими другие функции согласно цели. Например, он может иметь метиониновый остаток, ацетил- или пироглутамовую кислоту, присоединенные к N-концу фосфорилированного пептида, или он может быть модифицирован флуоресцентным веществом или подобным. Вещества, используемые для модификации N-конца и/или С-конца фосфорилированного пептида, также могут представлять собой пептиды или белки, примеры которых включают пептиды содержащие последовательность метки (обычно гистидиновой метки или метки FLAG), последовательность, узнаваемую Т-клеточными рецепторами (TCR) или антигенами главного комплекса гистосовместимости (МНС), и вирусные или бактериальные белки, или пептиды с последовательностями, происходящими от них. Фосфорилированный пептид по изобретению также включает пептиды, модифицированные соединениями или пептидами в одном или нескольких аминокислотных остатках иных, чем остатки N-конца и/или С-конца. Такую модификацию фосфорилированного пептида можно выполнить с использованием методов, известных специалистам в данной области техники, таких как метод, описанный Hermanson et al. (Bioconjugate techniques, USA, 1996, Academic Press).
Специалист в данной области техники может получить фосфорилированный пептид по изобретению с использованием соответствующих методов синтеза или генной инженерии. Примеры методов, которые можно использовать для получения фосфорилированных пептидов, включают методы Boc (Wakamiya Т. et al., Chemistry Letters, Vol. 22, p. 1401, 1993), методы Fmoc (PERICH J.W., International Journal of Peptide and Protein Research, vol. 40, p. 134-140, 1992), и методы, описанные в патенте Японии №3587390, хотя специалист в данной области техники может использовать другие подходящие методы. Также получение методами генной инженерии может включать получение генетического материала (ДНК, РНК), имеющего нуклеотидную последовательность, кодирующую получаемый пептид или его предшественник, и встраивание ее в соответствующий экспрессирующий вектор с добавлением промоторной последовательности и т.п., который можно использовать для введения в подходящего для экспрессии хозяина, или в способах получения с использованием бесклеточной системы синтеза белков. В таком случае фосфорилированный пептид, который фосфорилирован в представляющем интерес сайте, можно получить в хозяине соответствующей реакцией фосфорилирования с помощью киназы, которая находится в хозяине, или появляется благодаря генетически измененной экспрессии, или представляющий интерес пептид, сначала собирают и затем проводят in vitro реакцию фосфорилирования путем взаимодействия его с киназой или подобным. Фермент, используемый для такой реакции фосфорилирования in vitro, может представлять собой фермент, для которого известно, что он участвует в реакции тау-фосфорилирования представляющего интерес пептида, такой как GSK3 или CDK5. Для того, чтобы получить пептид, у которого нужные аминокислотные остатки фосфорилированы из тех пептидов, которые были фосфорилированы таким образом в хозяине или in vitro, можно выделить фосфорилированные пептиды, которые специфически связанны с антителом, посредством взаимодействия антитело-антиген, с использованием антител против фосфорилированного тау, указанных выше.
Терапевтическое средство или профилактическое средство против когнитивных расстройств, содержащее антитело против фосфорилированного тау или фосфорилированного тау-пептид.
Термин «когнитивные расстройства» людей обозначает состояние ухудшения интеллектуальной функции, которое развилось или приобретено, и считается типом интеллектуального нарушения (Kamijima K., Niwa S., Nankodo's Essential Well - Advanced Series, New Seishin Igaku, p. 69-70, 2008), и в более широком смысле, они рассматриваются как заболевания, при которых проявляется интеллектуальные нарушения и/или ухудшение памяти. При нейродегенеративных заболеваниях, таких как AD, «нейродегенерация» может быть установлена путем подтверждения наличия нейрофибриллярных клубков (NFT) путем посмертного гистологического анализа, но врач может установить диагноз нейродегенеративного заболевания с помощью пересмотренной шкалы деменции Хасегавы (HDS-R) или минимальной оценки психического состояния (MMSE), основанных на опросе как части нейропсихологической проверки, клинического рейтинга деменции (CDR) или функциональной оценки стадии заболевания (FAST), основанных на наблюдении, по повышению распространенности тау или фосфорилированного тау или повышению распространенности Аβ в цереброспинальной жидкости при биохимической проверке или на основании информации, полученной при СТ, MRI, SPECT или PET головного мозга при проверке с помощью изображений для диагностики когнитивного расстройства и специфического нейродегенеративного заболевания. Так, терапевтическое средство или профилактическое средство по изобретению против когнитивных расстройств вводят пациенту с установленным врачом диагнозом когнитивного расстройства, и такое введение имеет улучшающий эффект по сравнению с состоянием до введения для, по меньшей мере, одного диагностического симптома нейродегенеративного заболевания, или эффект ингибирования развития симптомов или поддержание или восстановление состояния до введения.
Пациенты, которым вводят терапевтическое средство или профилактическое средство по изобретению против когнитивных расстройств, являются пациентами с когнитивными расстройствами, и в частности, пациентами с таупатиями, к которым относятся пациенты с болезнью Альцгеймера (AD), кортикобазальной дегенерацией ганглиев (CBD или CBS), прогрессирующим надъядерным параличом, болезнью Пика, аргирофильной зернистой деменцией (аргирофильной зернистой болезнью), множественной системной таупатией с деменцией (MSTD), связанной с хромосомой 17 лобно-височной деменцией с паркинсонизмом (FTDP-17), деменцией с нейрофибриллярными клубками, диффузными нейрофибриллярными клубками с кальцификацией (DNTC), таупатией белого вещества с глобулярными глиальными включениями (WMT-GGI), лобно-височной лобарной дегенерацией с тау-положительными включениями (FTLD-тау), болезнью фон Экономо постэнцефалитическим паркинсонизмом, подострым склерозирующим панэнцефалитом или эцефалопатией боксеров. Следовательно, терапевтическое средство по изобретению против когнитивных расстройств является терапевтическим средством или профилактическим средством против таупатий, и с другой точки зрения, его можно рассматривать как терапевтическое средство или профилактическое средство против болезни Альцгеймера (AD), кортикобазальной дегенерации ганглиев (CBD или CBS), прогрессирующего надъядерного паралича, болезни Пика, аргирофильной зернистой деменции (аргирофильной зернистой болезни), множественной системной таупатий с деменцией (MSTD), связанной с хромосомой 17 лобно-височной деменции с паркинсонизмом (FTDP-17), деменции с нейрофибриллярными клубками, диффузных нейрофибриллярных клубков с кальцификацией (DNTC), таупатий белого вещества с глобулярными глиальными включениями (WMT-GGI), лобно-височной лобарной дегенерации с тау-положительными включениями (FTLD-тау), болезни фон Экономо постэнцефалитического паркинсонизма, подострого склерозирующего панэнцефалита или эцефалопатии боксеров.
Терапевтическое средство или профилактическое средство по изобретению против когнитивных расстройств также можно рассматривать как оказывающее эффект улучшения когнитивной функции или ингибирования утраты или поддержания когнитивной функции у животных, не относящихся к человеку. Такие животные, не относящиеся к человеку, включают таких животных как шимпанзе, макаки резус, лошади, свиньи, собаки, мыши, кролики, крысы, кошки и т.п., экспрессирующие тау с высокой гомологией с человеческим тау, и ими не ограничиваются.
Животные модели когнитивного расстройства
Животные для исследования терапевтического средства или профилактического средства по изобретению против когнитивных расстройств включают животные модели когнитивных расстройств, в числе которых можно упомянуть, в частности, животные модели таупатий. Животные модели таупатий представляют собой животных, экспрессирующих в головном мозгу тау нормального типа или мутантного, и в частности, животные модели, показывающие ухудшение когнитивной функции. Таких животных, экспрессирующих в головном мозгу тау нормального типа или мутантного, можно получить методами генной инженерии, причем типичным примером являются трансгенные мыши (Tg мыши). Животные модели, такие как Tg мыши, которые экспрессируют мутантный тау, используют в качестве моделей генетически обусловленных семейных таупатий, но для проверки действия терапевтического средства или профилактического средства против спорадических таупатий, которые составляют большую часть таупатий среди людей, предпочтительно, когда действие проявляется на Tg мышах, экспрессирующих тау нормального типа. Наиболее подходящими в качестве Tg мышей, экспрессирующих тау нормального типа, являются мыши, полученные в примерах настоящей заявки, но также можно использовать Tg мышей, описанных в Kambe et al. (Neurobiology of Disease, Vol. 42, p. 404-414, 2011) и Kimura et al. (The EMBO J., vol. 26, p. 5143-5152, 2007). Хотя ухудшение когнитивной функции у мышей по Kambe et al. и Kimura et al. заметно, оно появляется в возрасте после 14 месяцев и 20 месяцев, соответственно, то есть болезнь возникает при старении, и эффекты старения также могут вносить свой вклад, в то время как эффекты от длительного кормления и трудозатраты вызванные этим также являются проблемами. Напротив, мыши, полученные в примерах получения в настоящем изобретении, экспрессируют тау нормального типа и показывают начало ухудшения когнитивной функции на относительно ранней стадии развития, в возрасте примерно 6 месяцев, и поэтому они являются наиболее подходящими в качестве моделей когнитивных расстройств, для которых такие факторы, как старение, можно исключить, и использование таких моделей допускает более точную оценку терапевтического средства или профилактического средства против когнитивных расстройств, которые оказывают эффект улучшения когнитивной функции.
Предпочтительным методом проверки действия терапевтического средства или профилактического средства по изобретению против когнитивных расстройств на животной модели является метод тестирования когнитивной функции, такой как тест на запоминание при обучении. Такой метод может представлять собой тест Морриса в водном лабиринте, тест постадийного обучения животных или тест на узнавание нового объекта, но предпочтительно, представляет собой комбинацию измерительных поведенческих тестов, такую как тест «открытое поле», для того, чтобы учесть условия тех или иных поведенческих проявлений и страх животного.
В качестве методов оценки действия терапевтического средства или профилактического средства по изобретению против когнитивных расстройств возможно использование методов, оценивающих уровни тау-белка или фосфорилированного тау в ткани головного мозга у животной модели когнитивного расстройства, которым вводили указанное средство. При AD и других нейродегенеративных заболеваниях уровни экспрессии тау-белка или повышенные уровни анормально фосфорилированного тау ассоциируются с патологией (Khalid Iqbal et al., Curr. Alzheimer Res., Vol. 7, p. 654-664, 2010). Также хорошо известно, что уменьшение уровней экспрессии тау и анормально фосфорилированного тау у некоторых животных моделей патологий вызывает улучшение когнитивной функции и двигательной функции (K. Santa Cruz et al., Science, 30, Vol. 9, p. 476-481, 2005; Sylvie Le Corre et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 10, Vol. 3, p. 9673-9678, 2006). Изменение в уровнях тау-белка или фосфорилированного тау можно оценить с помощью такого метода, как вестерн-блоттинг, с использованием гомогената головного мозга, как описано в примерах, но специалист в данной области техники может выбрать другой подходящий метод, например ELISA (Xiyun Chai et al., J. Biol. Chem., Vol. 286, p. 34457-34467, 2011) или иммуногистохимический метод (David J. Irwin et al., BRAIN, Vol. 135, p. 807-818, 2012).
Эффект терапевтического средства или профилактического средства по изобретению против когнитивных расстройств на животной модели можно использовать как данные по фармакологическому действию для разработки терапевтического средства или профилактического средства для людей.
Терапевтическое средство или профилактическое средство против когнитивных расстройств
Одной формой терапевтического средства или профилактического средства по изобретению против когнитивных расстройств является форма, содержащая антитело против фосфорилированного тау, и предпочтительно, антитело, которое участвует во взаимодействии антиген-антитело специфически с тау-белком, который фосфорилирован, по меньшей мере, в одном аминокислотном остатке, соответствующем позициям 410-421 SEQ ID NO: 1, предпочтительнее, антитело, которое участвует во взаимодействии антиген-антитело с тау-белком, который фосфорилирован в одном или нескольких сайтах, выбранных из числа аминокислотных остатков, соответствующих Ser412, Ser413, Thr414 и Ser416 SEQ ID NO: 1, предпочтительнее, антитело, которое связывается конкурентно с антителом, аминокислотная последовательность VH которого представлена SEQ ID NO: 20, и аминокислотная последовательность VL которого представлена SEQ ID NO: 26 (1505), и даже предпочтительнее, антитело, которое участвует во взаимодействии антиген-антитело с тау-белком, который фосфорилирован в сайте аминокислотного остатка, соответствующего Ser413 SEQ ID NO: 1. Такие антитела описаны выше под заголовком «Антитело против фосфорилированного тау».
Другой формой терапевтического средства или профилактического средства по изобретению против когнитивных расстройств является форма, содержащая пептид, который содержит часть последовательности тау и фосфорилирован в одном или нескольких аминокислотных остатках, причем пептид представляет собой фосфорилированный пептид, который является петидом длиной, по меньшей мере, в 8 аминокислот, содержащий, по меньшей мере, 3 последовательных аминокислоты из последовательности аминокислот 410-421 SEQ ID NO: 1, предпочтительно, пептид длиной, по меньшей мере, в 8 аминокислот, содержащий, по меньшей мере, 5 последовательных аминокислот, и предпочтительнее, пептид длиной, по меньшей мере, в 8 аминокислот, содержащий, по меньшей мере, 8 последовательных аминокислот. Также фосфорилированные аминокислотные остатки в фосфорилированных пептидах могут представлять собой любые из аминокислотных остатков, соответствующих аминокислотам под номерами 410-421 SEQ ID NO: 1, предпочтительно, любые из аминокислотных остатков, соответствующих аминокислотам Ser412, Ser413, Thr414 и Ser416 SEQ ID NO: 1, и предпочтительнее, аминокислотный остаток, соответствующий Ser413 SEQ ID NO: 1. Такие пептиды описаны выше под заголовком «Фосфорилированный пептид с аминокислотной последовательностью, происходящей от тау».
Терапевтическое средство или профилактическое средство по изобретению против когнитивных расстройств также может содержать фармацевтически приемлемые добавки. Препараты содержащие фармацевтически приемлемые добавки можно получить способом, описанным в «Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, University of the Sciences in Philadelphia, Williams & Wilkins, December 15, 2000». Одной формой такого терапевтического средства или профилактического средства является жидкое лекарственное средство, полученное растворением, суспендированием или эмульгированием в асептическом водном растворе или масляном растворе. Растворители для этого включают дистиллированную воду для инъекции и физиологический раствор осморегулирующего вещества (например, D-глюкозы, D-сорбита, D-маннита, хлорида натрия и т.п.), часто в комбинации с подходящим вспомогательным растворителем, таким как спирт (например, этанол), полиол (например, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль) или неионогенное поверхностно-активное вещество (например, полисорбат 80 или полиоксиэтилированное гидрогенизованное касторовое масло 50). Масляные растворы также иногда используют в качестве растворителей, причем примеры таких масляных растворов включают сезамовое масло и соевое масло, которые часто используют в комбинации с бензилбензоатом, бензиловым спиртом или подобными веществами как способствующими растворению веществами. В таких жидких лекарственных средствах обычно используют соответствующие добавки, такие как буферирующие вещества (например, фосфатные буферирующие вещества и ацетатные буферирующие вещества), мягчительное средство (например, хлорид бензалкония и гидрохлорид прокаина), стабилизаторы (например, человеческий сывороточный альбумин и полиэтиленгликоль), консерванты (например, аскорбиновую кислоту, эриторбовую кислоту и их соли), красители (например, медь-хлорофилл-β-каротен, красный №2 и синий №1), антисептические средства (например, эфиры параоксибензойной кислоты, фенол, хлорид бензетония и хлорид бензалкония), загустители (например, гидроксипропилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу и их соли), стабилизаторы (например, человеческий сывороточный альбумин, маннит и сорбит) и отдушки (например, ментол и цитрусовые ароматы). Различные формы терапевтических средств или профилактического средства включают твердые препараты, такие как порошки, таблетки, гранулы, капсулы, пилюли, суппозитории, пастилки и т.п.. Для твердого препарата для введения в пероральной форме могут использоваться такие добавки, как эксципиенты (например, кристаллическая целлюлоза, лактоза и крахмал), смазывающие вещества (например, стеарат магния и тальк), связующие вещества (гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, макрогол и т.п.) и вещества, способствующие рассыпанию (например, крахмал и карбоксиметилцеллюлоза кальций). При необходимости могут использоваться добавки, такие как асептические средства (например, бензиновый спирт, хлорбутанол, метилпараоксибензоат и пропилпараоксибензоат), антиоксиданты, красители, подслащивающие вещества и т.п.. Другие альтернативные формы включают терапевтические средства или профилактическое средство для применения к слизистым оболочкам, причем такие препараты часто содержат такие добавки, как чувствительные к давлению адгезивы, чувствительные к давлению энхансеры, регуляторы вязкости, загустители и т.п. (например, муцин, агар, желатин, пектин, каррагенан, альгинат натрия, смола плодов рожкового дерева, ксантановая смола, трагакантовая смола, аравийская камедь, хитозан, пуллулан, восковидный крахмал, сукральфат, целлюлоза и ее производные (такие как гидроксипропилметилцеллюлоза), полиглицериновые эфиры жирных кислот, сополимеры акриловой кислоты и алкил(мет)акрилата), в первую очередь, с целью улучшения свойств адсорбции или удерживания на слизистой оболочке. Однако форма, растворитель и добавки для терапевтического средства или профилактического средства, которое вводят в организм, не ограничиваются перечисленным, и специалист в данной области техники может сделать соответствующий выбор.
Терапевтическое или профилактическое средство по изобретению против когнитивных расстройств также охватывает концепцию терапевтического средства или профилактического средства, содержащего, кроме вышеуказанных антител против фосфорилированного тау или фосфорилированного пептида, существующие вещества с ингибирующим действием на развитие когнитивного расстройства. Также терапевтическое или профилактическое средство по изобретению против когнитивных расстройств охватывает набор для комбинированного использования терапевтического средства или профилактического средства, содержащего антитела против фосфорилированного тау или фосфорилированный пептид, и терапевтического средства или профилактического средства, содержащего существующее вещество с ингибирующим действием на развитие когнитивного расстройства. Примеры включают, но не ограничиваются перечисленным, донепезил, галантамин, мемантин и риваститмин. Дозировка вещества с ингибирующим действием на развитие когнитивного расстройства, которое следует добавить, или терапевтического средства или профилактического средства, содержащего вещество с ингибирующим действием на развитие когнитивного расстройства, может представлять собой дозировку, обычно используемую для лечения, которая может изменяться согласно состояниям.
Также, хотя примеры показывают, что антитела, используемые для осуществления изобретения, проявляют лекарственное действие путем действия на головной мозг через гематоэнцефалический барьер когда вводятся периферически посредством интарперитонеального введения, возможно получение препарата, который эффективно доставляет антитела против фосфорилированного тау, который также можно использовать как терапевтическое или профилактическое средство по изобретению в ткани головного мозга, и такие препараты также охватываются терапевтическим или профилактическим средством по изобретению. Методы эффективного снабжения антителами или пептидами ткани головного мозга через гематоэнцефалический барьер известны, например, методы с добавлением нацеливающих веществ или методы инкапсулирования в липосомах или наночастицах. Вещества, используемые для нацеливания, включают вещества, которые подвергаются полному или частичному изменению в характеристиках заряда путем связывания с антителами или пептидами, белками или другими соединениями, имеющими свойство связываться со специфическим рецептором или переносчиком. Примеры пептидов, белков или других соединений, имеющих свойство связываться со специфическим рецептором или мембранным белком, включают лиганды, которые связываются с рецепторными лигандами или мембранными белками, и их аналоги, и антитела, соединения агонисты /соединения антагонисты/ аллостерические модуляторы, которые связываются с рецепторными лигандами или мембранными белками, и их аналоги. Примеры рецепторных лигандов или мембранных белков как мишеней для пептида, белка или другого соединения, имеющего свойство связываться со специфическим рецептором или переносчиком, включают трансферриновый рецептор (TfR), инсулиновый рецептор (IR), рецептор инсулиноподобного фактора роста (IGFR), LDL-рецептору родственный белок (LRP) и рецептор дифтерийного токсина (HB-EGF), без особого ограничения указанным (Angela R. Jones et al., Pharm. Res., Vol. 24, p. 1759-1771, 2007). Вещество для нацеливания может быть химически добавлено к антителу, используемому как терапевтическое или профилактическое средство против когнитивных расстройств по изобретению, причем способ является способом, который специалист в данной области техники может выполнить известным методом, таким как описанный, например, в Hermanson et al., Bioconjugate techniques, USA 1996, Academic Press. Вещество для нацеливания также можно связать с липосомами или наночастицами, инкапсулирующими антитело или пептид (Sonu Bhaskar et al., Particle and Fibre Toxicology, Vol. 7, No. 3, 2010). Кроме того, когда вещество для нацеливания представляет собой пептид или белок, специалист в данной области техники может его получить в виде соответствующего слитого белка с использованием методов генной инженерии или получая слитый белок химическим пептидным синтезом, или комбинируя нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность пептида или белка, с нуклеотидной последовательностью, кодирующей аминокислотную последовательность используемого антитела или пептида.
Средство по изобретению для лечения или предупреждения с целью улучшения симптомов можно вводить перорально или парентерально. Для перорального введения можно выбрать такую лекарственную форму, как гранулы, порошок, таблетки, капсулы, жидкое лекарство, сироп, эмульсию, суспензию или эликсир. Для парентерального введения можно получить трансназальное средство, и можно выбрать жидкое лекарственное средство, суспензию или твердый препарат. Инъекцию можно получить в виде различных форм для парентерального введения, причем инъекцию выбирают как гиподермическую инъекцию, внутривенную инъекцию, капельную инъекцию, внутримышечную инъекцию, интрацеребровентрикулярную инъекцию или интраперитонеальную инъекцию. Другие препараты, используемые для парентерального введения, включают суппозитории, сублингвальные средства, чрескожные средства и средства для трансмукозного введения. Кроме того, возможно внутрисосудистое введение путем добавления или нанесения на стент или интраваскулярный обтуратор.
Доза средства для лечения или предупреждения согласно изобретению будет различаться в зависимости возраста пациента, пола, массы тела и симптомов, терапевтического действия, способа введения, времени лечения или типов активных ингредиентов в лекарственной композиции, но обычно ее можно вводить в интервале 0,1 мг - 1 г, и предпочтительно, в интервале 0,5 мг - 200 мг активного соединения на введение для взрослых. Однако, так как доза будет изменяться в зависимости от различных условий, могут быть достаточными дозы меньше упомянутых выше, или могут потребоваться дозы, превышающие указанные интервалы.
Средство для лечения или предупреждения согласно изобретению может проявить действие в течение короткого периода введения.
Примеры
Теперь настоящее изобретение для лучшего понимания будет поясняться примерами, причем следует иметь в виду, что примеры не ограничивают изобретение каким-либо образом. Эксперименты проводили с одобрения Animal Experiment Committee at Osaka City University, Abeno Campus.
Пример 1. Получение кроличьих поликлональных антител для пептида pSer413
Антиген, используемый для получения антитела к пептиду pSer413, представляет собой синтетический пептид (SEQ ID NO: 31, синтезирован Medical & Biological Laboratories Co., Ltd. [MBL]), имеющий Cys, присоединенный в С-концевом положении аминокислотной последовательности, соответствующей участку от 410-го Asn до 416-го Ser аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 имитирующий человеческий тау-белок, фосфорилированный в Ser, в 413 положении (такой пептид в данном описании далее будет называться пептид pSer413 (S)).
Пептид pSer413(S): N-AsnValSer(pSer)ThrGlySerCys-C (SEQ ID NO: 31).
После синтеза пептид pSer413(S) очищают ВЭЖХ и ковалентно связывают с KLH (гемоцианин лимфы улитки). Полученный конъюгат используют для иммунизации кроликов 0,1 мг на дозу на кролика. Для первой иммунизации 0,2 мл раствора конъюгата (концентрация конъюгата 0,5 мг/мл) смешивают с равным количеством полного адъюванта Фрейнда и инъецируют интрадермально в обритую область спины белого японского кролика в 8 мест по 50 мкл в каждое. Для второй и последующих иммунизаций используют неполный адъювант Фрейнда. Иммунизации осуществляют каждые 2 недели. Через 2 недели после последней иммунизации берут образец крови, и титр антител анализируют ELISA с использованием иммунизированного пептидного конъюгата, и через 1 неделю животных умерщвляют, и берут цельную кровь. Из полученной крови получают сыворотку, и антитела из сыворотки очищают с использованием аффинной колонки с пептидом pSer413(Af) (SEQ ID NO: 32).
Титр сыворотки подтверждают следующим способом. Пептид pSer413(S) разбавляют PBS до 5 мкг/мл и затем раскапывают в планшет по 100 мкл/лунка и оставляют стоять в течение ночи при 4°С. После удаления раствора в лунки добавляют блокирующий буфер (MBL Со.) по 250 мкл/лунка, и планшет оставляют стоять в течение ночи при 4°С. Серийные разведения кроличьей сыворотки первичной иммунизации и кроличьей сыворотки после иммунизации составляют 100, 500, 2500, 12500 и 62500 крат с разведенным в PBS образцом, добавленным по 100 мкл/лунка, и реакцию проводят при 25°С в течение 60 минут. После промывки добавляют для мечения комплекс антикроличий IgG-пероксидаза (продукт MBL), разведенный в 8000 раз буфером (MBL), по 100 мкл/лунка, и проводят реакцию при 25°С в течение 60 минут. После промывки добавляют для окрашивания окрашивающий раствор (MBL) по 100 мкл/лунка на 3-10 минут, и затем добавляют 2 N серную кислоту по 100 мкл/лунка для прекращения реакции. После завершения реакции измеряют поглощение при длине волны 450 нм и эталонной длине волны 620 нм.
AsnValSer(pSer)ThrGlySer
2
Реакционную способность очищенных антител подтверждают следующим способом. Пептид pSer413(L) [пептид pSer413(S) (подчеркнут), дополнительно удлиненный с N-конца и С-конца (SEQ ID NO: 33, синтезирован Biosynthesis Co.): N-ProArgffisLeuSerIleAspMetValAsp-C] или пептид NonP(L), имеющий такую же аминокислотную последовательность, но нефосфорилированный в сайте, соответствующем Ser413 SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 34, синтезирован Biosynthesis Co.), разбавляют PBS до 1 мкг/мл и затем раскапывают в планшет по 50 мкл/лунка и оставляют стоять в течение ночи при 4°С. После удаления раствора в лунки добавляют блокирующий буфер (3% BSA-PBS) по 250 мкл/лунка, и смесь оставляют стоять еще при 37°С в течение 1 часа или дольше. Добавляют по 50 мкл/лунка очищенных антител, разбавленных PBS и стерилизованных, и проводят реакцию при 25°С в течение 90 минут. После промывки метку комплекс козий антикроличий IgG-щелочная фосфатаза (Bioscience) разводят в 2000 раз буфером для разведения (3% BSA-PBS) и добавляют по 50 мкл/лунку, и проводят реакцию при 25°С в течение 60 минут. После промывки добавляют для окрашивания окрашивающий раствор (раствор 0,1 М диэтаноламинного буфера, содержащего 2,5 мМ MgCl, с 1 мг/мл PNPP [паранитрофенилфосфат], добавленного до pH 9,8) по 100 мкл/лунка на 30 минут, и измеряют поглощение при длине волны 405 нм и эталонной длине волны 550 нм.
<Результаты>
Как видно на фиг. 3, очищенные антитела имеют высокую специфичность в отношении пептида pSer413(L), в то время как фактически не наблюдают взаимодействия с пептидом nonP(L). Следовательно, антитела представляют собой антитела, которые участвуют во взаимодействии антиген-антитело специфически с pSer413(L), (в настоящем описании он также может называться как «pSer413, меченный кроличьими поликлональными антителами» или «pS413AB»).
Пример 2. Получение моноклональных антител для пептида pSer413 (ряд Ta15)
7
7
5
2
Используемый антиген представляет собой синтетический пептид pSer413(Im) (SEQ ID NO: 35), содержащий GlyCysSerGly, присоединенный к N-концу последовательности, соответствующей участку от 403-го Thr до 423-го Pro, фосфорилированный в аминокислотном остатке, соответствующем Ser в позиции 413 аминокислотной последовательности человеческого тау-белка, представленной SEQ ID NO: 1. После синтеза пептид pSer413(Im) очищают ВЭЖХ и ковалентно связывают с KLH (гемоцианин лимфы улитки). Полученный конъюгат используют для иммунизации в количестве 0,04 мг на дозу на мышь. Иммунизацию проводят интроперитонеальной инъекцией 10 мышам по 200 мкл на каждую смесью 0,4 мл раствора конъюгата (1,1 мг/мл в расчете на пептид), 0,7 мл физиологического раствора и 1,1 мл полного адъюванта Фрейнда. Затем проводят еще три похожие иммунизации (в тех же местах иммунизации и дозе антигена с использованием неполного адъюванта Фрейнда) каждые 2 недели. Через месяц после последней иммунизации в каудальную вену одной мыши из десяти, у которых повышенный титр сывороточного антитела для антигена, инъецируют 100 мкл 0,5 мг/мл раствора антигена (растворенного в физиологическом растворе) в расчете на пептид, и на третий день животных умерщвляют и извлекают селезенки. Используют две иглы для инъекции 18G для разрушения селезенок, и затем разрушенные селезенки осторожно разминают резиновой пробкой. Размятые спленоциты суспендируют в приблизительно 10 мл холодной среды RPMI 1640, супернатант фильтруют с помощью 40-мкм клеточного сита, и фильтрат собирают в 50-мл пробирку. Затем дебрис клеток селезенки разминают резиновой пробкой, и также суспендируют в холодной среде RPMI 1640, фильтруют, и собирают фильтрат. Добавляют холодную среду RPMI 1640 (или холодный PBS) до конечного объема суспензии клеток селезенки 40 мл. С помощью гемацитометра измеряют концентрацию лимфоцитов в суспензии, и лимфоциты в конечном количестве, соответствующем 2×10 клеток, переносят в 50-мл пробирку. К ним добавляют эквивалент 4×10 клеток клеточной линии миеломы мышей P3X63Ag8⋅U1 (Р3⋅U1) в логарифмической стадии роста, которые культивированы в культуральном растворе В (RPMI 1640 + 10% сыворотки плода коровы + 2 мМ глутамина + 100 мкг/мл стрептомицина + 100 единица/мг пенициллина), и после центрифугирования при 1500 об/мин в течение 5 минут супернатант отбрасывают. Клеточный осадок тщательно диспергируют, постукивая по пробирке. К суспензии добавляют 0,5 мл раствора полиэтиленгликоля (состоящего из RPMI 1640 (2,3 мл) + полиэтиленгликоль 2000 (1,4 мл) + диметилсульфоксид (0,3 мл), в данном описании далее сокращенно «раствор ПЭГ»), и клетки осторожно суспендируют. Через 1 минуту добавляют постепенно, по каплям, в течение 1 минуты 0,5 мл раствора ПЭГ, постепенно, по каплям, в течение 1 минуты 1,0 мл RPMI 1640, и затем постепенно, по каплям, в течение 2 минут добавляют 2 мл RPMI 1640. Далее, добавляют по каплям в течение 2 минут 4 мл культурального раствора HAT/GIT (среда GIT [Ninon Pharmaceutical Co., Ltd.] + 5% сыворотки плода коровы + 100 мкг/мл стрептомицина + 100 единица/мг пенициллина + 95 мкМ гипоксантина + 0,4 мкМ аминоптерина + 16 мкМ тимидина), и затем добавляют по каплям в течение 2 минут 4 мл культурального раствора HAT/GIT. Наконец, добавляют культуральный раствор HAT/GIT для получения 40-50 мл клеточной суспензии. После инкубации в термостатированной бане при 37°С в течение 30 минут суспензию высевают в 7 культуральных планшетов (96-луночные). Используемые культуральные планшеты являются 96-луночными планшетами (фидер-планшеты), в которых культивируют макрофаги брюшной полости мыши (ICR) (клетки-фидеры) в течение нескольких дней (>1×10/лунка). Затем планшеты культивируют в течение 7-10 дней при 37°С, 5% СО.
Половину культурального раствора заменяют свежим культуральным раствором НТ (культуральный раствор HAT/GIT без аминоптерина) один раз каждую неделю, и получают гибридомы.
2
Скрининг антител выполняют следующим образом. Пептид pSer413(L) разбавляют PBS до 1 мкг/мл и затем раскапывают в 96-луночный планшет по 50 мкл/лунка и оставляют стоять в течение ночи при 4°С. После удаления раствора добавляют блокирующий буфер (3% BSA-PBS) по 250 мкл/лунка, и смесь оставляют стоять при комнатной температуре в течение 1 часа или долее. Блокирующий буфер (3% BSA-PBS) аспирируют, добавляют гибридомный супернатант по 30-50 мкл/лунка, и проводят реакцию при 25°С в течение 60 минут. После промывки забуференным фосфатом физиологическим раствором, содержащим 0,05% твина 20 (PBS-твин), добавляют вторичные антитела (раствор, содержащий меченные щелочной фосфатазой козьи антитела Fc против мышиного IgG [SouthernBiotech], разведенные 2000 крат блокирующим буфером), по 100 мкл/лунка, и проводят реакцию при 25°С в течение 60 минут. После промывки при 25°С добавляют для окрашивания раствор субстрата (0,1 М диэтаноламинный буфер, содержащий 2,5 мМ MgCl, с 0,7-1,2 мг/мл PNPP [паранитрофенилфосфат], добавленного до pH 9,8), по 100 мкл/лунка на 60 минут, после чего измеряют поглощение при длине волны 405 нм.
При таком скрининге клетки извлекают из Положительных лунок и считают с помощью гемацитометра и затем высевают в 96-луночный планшет (предварительный фидер-планшет) по 1-3 клеток на лунку для клонирования методом ограниченного разведения (Та1501, Та1502, Ta1505-1509). Для последующего анализа клоны массово культивируют, и антитела очищают с помощью колонки с белком G. Ta1505 является таким же, как Ta1505-2. Изотипы определяют с использованием набора AbD Serotec.
Очищенные антитела вводят во взаимодействие с неполным пептидом, нанесенном на планшете для ELISA, где различные пептиды соответствуют различным сайтам фосфорилирования тау, для определения специфичности к фосфатной группе. Метод такой, как описанный далее.
Раствор каждого тау-пептида (10% в ДМСО) (pS46 [SEQ ID NO: 36], pS199 [SEQ ID NO: 37], pS202 [SEQ ID NO: 38], pT212 [SEQ ID NO: 39], pS214 [SEQ ID NO: 40], pT212/pS214 [SEQ ID NO: 41], pT217 [SEQ ID NO: 42], pS413 [SEQ ID NO: 33], non pS413 [SEQ ID NO: 34]) или раствор в PBS BSA-конъюгированного пептида (pS400 [SEQ ID NO: 43]-BSA, pS412 [SEQ ID NO: 44]-BSA) разбавляют до 1 мкг/мл PBS (pH 7) и добавляют в 96-луночный планшет (MaxiSorp: Nunc) по 50 мкл/лунка, и затем инкубируют в течение ночи при 4°С для иммобилизации. Затем пептидный раствор удаляют, и лунки промывают 3 раза TBS, содержащим 0,05% твина 20, после чего добавляют 3% BSA/PBS по 280 мкл/лунка, и выполняют блокировку при 37°С в течение 1 часа.
Блокирующий раствор аспирируют, выполняют промывку 3 раза TBS, содержащим 0,05% твина 20, и затем добавляют раствор каждого моноклонального антитела из ряда Ta15 в 3% BSA-PBS по 50 мкл/лунка, и проводят реакцию при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывки 3 раза TBS, содержащим 0,05% твина 20, добавляют 50 мкл меченных щелочной фосфатазой козьих антител против мышиного IgG (ThermoScience), разведенных в 2000 раз PBS, содержащим 3% BSA, и проводят реакцию при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывки 3 раза TBS, содержащим 0,05% твина 20, добавляют 100 мкл 1 мг/мл раствора PNPP (паранитрофенилфосфат), растворенного в 0,1 М диэтаноламине (pH 10), проводят реакцию при комнатной температуре в течение 1 часа, и измеряют поглощение при 405 нм. Результаты оценки реакционной способности каждого антитела для каждого пептида приводятся в таблице 2. Реакционную способность оценивают по 3-уровневой шкале.
+: Реакционная способность; -: Реакционная способность отсутствует; ±: Легкая, но очень слабая реакционная способность.
Указанные антитела (называемые в данном описании «ряд Ta15») из проверенных пептидов взаимодействуют только с pSer413, и специфичность к фосфатной группе исключительно высокая.
Пример 3. Измерение аффинности связывания антител ряда Ta15
Для того, чтобы оценить аффинность связывания между антителами ряда Tal 5 и пептидным антигеном (пептид pSer413(Im), см. пример 2), используют для измерения систему Biacore основанную на эффекте поверхностного плазменного резонанса (SPR, BIACORE3000, код # BR-1100-45, GE Healthcare, Япония) и каждый продукт согласно руководству изготовителя. Один из методов измерения представляет собой метод иммобилизации (код # BR-1006-33) антимышиных антител (код # BR-1008-38) на чипе СМ5 (чип из слоя карбоксиметилдекстрана, код # BR-1100-14) путем ковалентного связывания через реакцию присоединения амина, связывания антител ряда Ta15 с иммобилизованными антимышиными антителами и измерения свойства связывания пептида-антигена со связанными антителами ряда Ta15.
Реакционную смесь для специфического связывания используют с буфером HBS-ЕР (код # BR-T-1001-88), и чип СМ5 активируют смешанным раствором гидрохлорида N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS). Раствор антимышиных антител, разведенный до 0,001 мг/мл 10 мМ раствором натрийацетатаого буфера при pH 5,0, вводят во взаимодействие с 4 проточными кюветами на чипе, и после ковалентного связывания антимышиных антител с чипом его подвергают блокировке этаноламином. Из 4 проточных кювет, иммобилизующих антимышиные антитела, одна захватывает отрицательные антитела (контроль изотип мышиного IgG2, код # МАВ003, R&D Systems), в то время как другие проточные кюветы захватывают антитела ряда Ta15 при плотности примерно 1000 RU каждого. Буфер HBS-ЕР (0,01 М HEPES, pH 7,4, 0,15 М NaCl, 3 мМ ЭДТК, 0,005%, об./об., поверхностно-активного вещества Р20) с добавленной 1 М HCl вводят во взаимодействие на 3 минуты, и удаляют неспецифические адсорбированные антитела, и затем вводят в реакцию буфер HBS-EP на 10 минут при скорости потока 50 мкл/мин, и стабилизируют базовую линию. Пептид серийно разводят буфером HBS-EP в концентрациях от 100 пМ до 5 мМ (вблизи оцененной константы диссоциации связывания [KD]), полученные растворы пептидов (5 концентраций) вводят во взаимодействие от 4 минут до 6 минут (одинаково) с интервалами 6 минут каждый постоянно со стороны низкой концентрации, и измеряют свойства связывания.
Что касается динамической характеристики специфического связывания для пептида-антигена, то для этого определяли динамическую характеристику связывания для нефосфорилированного пептида (пептид non-pSer413) в качестве отрицательного контроля, и вычитали эти результаты из динамической характеристики связывания для пептида-антигена для того, чтобы устранить влияние помехи, производимой процедурой. Связывания нефосфорилированного пептида с антителами при данных концентрациях не наблюдают. Динамическую характеристику специфического связывания приводят в соответствие с кинетикой одного цикла 1:1 связывания с моделью дрейфа, используя аналитическую программу Biacore (оценка BIA : одноциклический кинетический анализ, код # АР-4000-01), и одновременно получают скорость ассоциации (Ка) и скорость диссоциации (Kd) (Karlsson R., Katsamba P.S., Nordin H., Pol E. and Myszka D.G. (2006), "Analyzing a kinetic titration series using affinity biosensors." Anal. Biochem., 349(1): 136-47). Вычисляют величину константы равновесия диссоциации (KD) как меру аффинности для антител ряда Та в виде Kd/Ka.
<Результаты>
Из всех антител ряда Та для проведения поведенческого теста на мышах с нарушенной памятью используют антитела Ta1505 с самой сильной аффинностью в отношении пептида-антигена.
Пример 4. Получение моноклональных антител, узнающих пептид pSer396 и/или pSer404
В качестве антигена используют синтетический пептид (SEQ ID NO: 47, синтезированный Biosynthesis Co.), имеющий GlyCys, присоединенный к N-концу последовательности от 379-го Arg до 408-го Leu, и фосфорилированный в аминокислотных остатках, соответствующих Ser в позициях 396 и 404 аминокислотной последовательности человеческого тау-белка, представленной SEQ ID NO: 1 (в данном описании далее такой пептид будет упоминаться как «пептид pSer396/pSer404»).
Пептид pSer396/pSer404: N-GlyCys-ArgGluAsnAlaLysAlaLysThrAspHisGlyAlaGluIleValTyrLys(pSer)ProValValSerGlyAspThr(pSer)ProArgHisLeu-C (SEQ ID NO: 47).
7
7
5
2
После синтеза пептид pSer396/pSer404 очищают ВЭЖХ и ковалентно связывают с малеимидактивированным KLH (гемоцианин лимфы улитки) (Thermo Scientific). Полученный конъюгат используют для иммунизации мышей Balb/c приблизительно 0,4 мг на дозу на мышь. Иммунизацию проводят путем интраперитонеальной инъекции 4 мышам по 100 мкл смеси, содержащей 0,3 мл раствора конъюгата (0,77 мг/мл в расчете на пептид) и 0,3 мл полного адъюванта Фрейнда. Двух из этих мышей иммунизируют интраперитонеальной иммунизацией (с тем же количеством антигена с использованием неполного адъюванта Фрейнда) и иммунизацией в подошву лапы (антиген + адъювант для наибольшего титра), в то время как двух других иммунизируют только интраперитонеальной иммунизацией, и это повторяют дважды с интервалами в 2 недели. Мышам, иммунизированным интраперитонеальной иммунизацией и иммунизацией в подошву лапы, которые имели повышенные титры антител на антиген, инъецируют раствор антигена (растворенного в физиологическом растворе) в каудальную вену через 15 дней после последней иммунизации, и через 3 дня животных умерщвляют, и извлекают селезенки. Используют две иглы для инъекции 18G для разрушения селезенок, и затем разрушенные селезенки осторожно разминают резиновой пробкой. Размятые спленоциты суспендируют в приблизительно 10 мл холодной среды RPMI 1640, супернатант фильтруют с помощью 40-мкм клеточного сита, и фильтрат собирают в 50-мл пробирку. Затем дебрис клеток селезенки разминают резиновой пробкой, и также суспендируют в холодной среде RPMI 1640, фильтруют, и собирают фильтрат. Добавляют холодную среду RPMI 1640 (или холодный PBS) до конечного объема суспензии клеток селезенки 40 мл. С помощью гемацитометра измеряют концентрацию лимфоцитов в суспензии, и лимфоциты в конечном количестве, соответствующем 2×10 клеток, переносят в 50-мл пробирку. К ним добавляют эквивалент 4×10 клеток клеточной линии миеломы мышей Р3⋅U1 в логарифмической стадии роста, которые культивированы в культуральном растворе В (RPMI 1640 + 10% сыворотки плода коровы + 2 мМ глутамина + 100 мкг/мл стрептомицина + 100 единица/мг пенициллина), и после центрифугирования при 1500 об/мин в течение 5 минут супернатант отбрасывают. Клеточный осадок тщательно диспергируют, постукивая по пробирке. К суспензии добавляют 0,5 мл раствора ПЭГ, и клетки осторожно суспендируют. Через 1 минуту добавляют постепенно, по каплям, в течение 1 минуты 0,5 мл раствора ПЭГ, постепенно, по каплям, в течение 1 минуты 1,0 мл RPMI 1640, и затем постепенна, по каплям, в течение 2 минут добавляют 2 мл RPMI 1640. Далее, добавляют по каплям в течение 2 минут 4 мл культурального раствора HAT/GIT (среда GIT [Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.] + 5% сыворотки плода коровы + 100 мкг/мл стрептомицина + 100 единица/мг пенициллина + 95 мкМ гипоксантина + 0,4 мкМ аминоптерина + 16 мкМ тимидина), и затем добавляют по каплям в течение 2 минут 4 мл культурального раствора HAT/GIT. Наконец, добавляют культуральный раствор HAT/GIT для получения 40-50 мл клеточной суспензии. После инкубации в термостатированной бане при 37°С в течение 30 минут суспензию высевают в 7 культуральных планшетов (96-луночные). Используемые культуральные планшеты являются 96-луночными планшетами (фидер-планшеты), в которых культивируют макрофаги брюшной полости мыши (ICR) (клетки-фидеры) в течение нескольких дней (>1×10/лунка). Затем планшеты культивируют в течение 7-10 дней при 37°С, 5% СО.
Половину культурального раствора заменяют свежим культуральным раствором НТ (культуральный раствор HAT/GIT без аминоптерина) один раз каждую неделю, и получают гибридомы.
2
Скрининг моноклональных антител выполняют следующим образом. Антигенами, используемыми для скрининга, являются пептид pSer396/pSer404 - BSA, где BSA конъюгирован с N-концевым Cys пептида pSer396/pSer404 (N-GlyCys-ArgGluAsnAlaLysAlaLysThrAspHisGlyAlaGluIleValTyrLys(pSer)ProValValSerGlyAspThr(pSer)ProArgHisLeu-C) (SEQ ID NO: 47), и нефосфорилированный пептид-BSA, где BSA конъюгирован с N-концевым Cys нефосфорилированного пептида (N-GlyCys-ArgGluAsnAlaLysAlaLysThrAspHisGlyAlaGluIleValTyrLysSerProValValSerGlyAspThrSerProArgHisLeu-C) (SEQ ID NO: 48). Нефосфорилированный пептид-BSA или пептид pSer396/pSer404-BSA разбавляют PBS до 1 мкг/мл и затем раскапывают в 96-луночном планшете по 50 мкл/лунка и оставляют стоять в течение ночи при 4°С. После удаления раствора добавляют блокирующий буфер (3% BSA-PBS) по 250 мкл/лунка, и смесь оставляют стоять при комнатной температуре в течение 1 часа или долее. Блокирующий буфер (3% BSA-PBS) аспирируют, добавляют гибридомный супернатант по 30-50 мкл/лунка, и проводят реакцию при 25°С в течение 60 минут. После промывки забуференным фосфатом физиологическим раствором, содержащим 0,05% твина 20 (PBS-твин), добавляют реагент для детекции (раствор, содержащий добавленный меченный щелочной фосфатазой белок А, разведенный в 2000 раз блокирующим буфером) по 100 мкл/лунка, и проводят реакцию при 25°С в течение 60 минут. После промывки добавляют раствор субстрата (0,1 М диэтаноламинный буфер, содержащий 2,5 мМ MgCl, с 0,7-1,2 мг/мл PNPP [паранитрофенилфосфат], добавленного до pH 9,8) по 100 мкл/лунка для окрашивания при 25°С на 60 минут, после чего измеряют поглощение при длине волны 405 нм.
Извлекают клетки из лунок с низкой реакционной способностью в отношении нефосфорилированного пептида-BSA и высокой реакционной способностью в отношении пептида pSer396/pSer404-BSA и затем высевают в 96-луночный планшет (предварительный фидер-планшет) по 1-3 клеток на лунку для клонирования методом ограниченного разведения. Из них отбирают клоны, продуцирующие антитела Та9 (IgG3/κ). Для последующего анализа клоны массово культивируют, и антитела очищают с помощью колонки с белком G.
-10
После измерения величины KD антител Та9 в отношении пептида pSer396/pSer404 методом, описанным в примере 3, найдено, что она составляет 1,08×10, с аффинностью в отношении пептида более высокой, чем в ряду антител Ta15.
Пример 5. Поведенческий тест: эффект, оказываемый полученными антителами на мышей с нарушенным запоминанием при обучении
Проверяют эффект от введения указанных далее трех антител у мышей (Tau-Tg) с нарушенным запоминанием при обучении
(1) Кроличьи поликлональные антитела к pSer413: Tau-Tg мыши (линия 609) или non-Tau-Tg мыши (здоровый контроль) в возрасте 9-11 месяцев, n=9-10 на группу.
(2) Ta1505 (моноклональные антитела к pSer413): Tau-Tg мыши (линия 784) или non-Tau-Tg мыши в возрасте 14 месяцев, n=9-10 на группу.
(3) Та9 (моноклональные антитела к pSer396): Tau-Tg мыши (линия 609) или non-Tau-Tg мыши в возрасте 14 месяцев, n=9-10 на группу.
Для эксперимента используют самцов гетеромутантов Tau-Tg мышей (линия 609 или линия 784) и однопометных non-Tg в возрасте 9-14 месяцев. Группы подбирают так, чтобы не было различия в средней массе между группами. Tau-Tg мышам гетеромутантам вводят антитела, разбавленные PBS или цитратным буфером (pH 5), один раз в неделю, всего 5 раз, в брюшную полость, по 1 мг на мышь на введение. В качестве отрицательного контроля используют буфер для получения антител или мышиные моноклональные антитела IgG не реактивные в отношении тау и вводят в брюшную полость в той же дозировке. В качестве положительного контроля однопометным non-Tg в брюшную полость вводят в той же дозировке буфер, используемый для получения антител.
Структуры для групп (1)-(3) приводятся ниже.
(1) <Используемые мыши>: Tau-Tg мутанты (линия 609) в возрасте 9-11 месяцев.
<Структура группы>
Группа для оценки антител: 1,6 мг/мл анти-тау pSer413 кроличьих поликлональных антител в PBS (n=10).
Контрольная группа: PBS (n=9).
Группа non-Tg: PBS (n=9).
(2) <Используемые мыши>: Tau-Tg мутанты (линия 784) в возрасте 14 месяцев.
<Структура группы>
Группа для оценки антител: 3,84 мг/мл анти-тау pSer413 мышиных моноклональных антител Ta1505 в 0,1 М цитратном буфере (pH 5) (n=10).
Контрольная группа: 4,28 мг/мл мышиных моноклональных антител 4C10F4 против Pseudomonas aeruginosa в 0,1 М нитратном буфере (pH 5) (n=9).
Группа non-Tg: 0,1 М цитратный буфер (pH 5) (n=9).
(3) <Используемые мыши>: Tau-Tg мутанты (линия 609) в возрасте 14 месяцев.
<Структура группы>
Группа для оценки антител: 2,66 мг/мл анти-тау pSer396 мышиных моноклональных антител Та9 в 0,02 М цитратном буфере (pH 6) (n=10).
Контрольная группа: 4,50 мг/мл мышиных моноклональных антител 6F11 против Pseudomonas aeruginosa в 0,02 М цитратном буфере (pH 6) (n=9).
Группа non-Tg: 0,02 М цитратный буфер (pH 6) (n=9).
Начиная с понедельника недели, следующей сразу после той недели, на которой последний раз вводили исследуемые вещества, проводят испытания на долговременную память с использованием водного лабиринта Морриса (тест в водном лабиринте). На следующий день после завершения теста в водном лабиринте используют аппарат открытого поля для измерения количества активного движения мышей (тест открытого поля).
<Тест в водном лабиринте для групп (1)-(3)>
Подготовка. Темный бассейн с внутренним диаметром 100 см и высотой 45 см наполняют водой на высоту 16 см. Температуру воды подгоняют до 21-23 градусов, оставляя бесцветной и прозрачной без окрашивания оксидом титана или подобным веществом. Хлор не добавляют, и после каждого дня испытания удаляют фекалии, и заменяют приблизительно 10 л воды.
Предварительный тест (приобретение навыков). Прозрачную платформу высотой 15 см погружают в позиции 20 см от стенки (30 см от центра). С разделением на 4 сектора, включая место, где платформа покрыта водой, мышей произвольно впускают в один их 3 секторов без платформы. Пределом каждого теста являются 60 секунд, причем в день проводят 5 испытаний. Интервал между испытаниями составляет приблизительно 5 минут. «Время спасения», то есть то время которое проходит до того как мышь достигнет платформы регистрируют как результат. Мышей, которые не спасаются за 60 секунд, оператор направляет к платформе рукой, и время спасения рассматривают как 60 секунд. Мышь с платформы удаляют из бассейна через 10 секунд и разрешают вести себя свободно до следующего испытания, чтобы они могли высохнуть. Результаты для каждой мыши в каждый день считают как среднее число секунд времени спасения в 5 испытаниях.
Тест на приобретение навыков завершают, когда стабилизируются результаты контрольной группы (nonTg), и на следующий день проводят основной исследовательский тест.
Основной исследовательский тест. На следующий день после последнего дня предварительного испытания платформу удаляют из бассейна, и с помощью видеокамеры снимают свободное плавание в течение 60 секунд. Затем смотрят отснятое видео, и засекают то время, в течение которого свободно плавающие мыши плавают в том секторе, в котором находилась платформа (сектор-мишень). Полученное время выражают в виде процента от 60 секунд. Также учитывается плавание вплоть до 30 секунд после погружения в бассейн.
Критерий значимости для предварительного (приобретения навыков) испытания определяют с помощью повторного измерения и PLSD Фишера, и критерий значимости для основного исследовательского испытания определяют с помощью PLSD Фишера.
<Тест открытого поля> для групп (1)-(3)
2
Аппарат. Используют прозрачную акриловую панель толщиной 5 мм для изготовления ящика 30×30×30 см, и хранят его в звуконепроницаемой среде. Над средой для хранения помещают 40 Вт лампу накаливания, и пол облучают с освещенностью 110 люкс.
Количественная оценка действий, (i) Снаружи на боковых сторонах акрилового ящика устанавливают системы инфракрасных лучей в местах 1,5 см от поверхности пола на расстоянии 10 см. Когда мышь постоянно блокирует два луча, детектируют передвижение, что затем подсчитывают. (ii) Поверхности инфракрасных лучей подают на две противоположные стороны, 3,5 см от поверхности пола. Когда мышь блокирует часть поверхности лучей, детектируют подъем на задние лапы, что затем подсчитывают.
Испытание. Каждую мышь подвергают испытанию в одном 20-минутном сеансе. Мышь запускают в центральную секцию акрилового ящика, и после того, как быстро закроют дверь для создания звуконепроницаемой среды, начинают сеанс.
Первые 10 минут сеанса предоставляют свободную активность в условиях освещения, в то время как в течение последних 10 минут освещение прерывают для свободной активности в условиях темноты.
Анализ. Количество действий каждой мыши каждую минуту указывают на линейном графике для передвижения и подъема на задние лапы.
Нормальное визуальное восприятие определяются как проявление реакции у мыши на изменение в окружающей среде на условия темноты через 10 минут после начала сеанса, о чем свидетельствует то, что количество действий мыши изменяется.
Каждое количество действий в условиях освещения и темноты и общее количество действий на протяжении 20 минут представляют на гистограмме.
Критерий значимости проводят между группами для общего количества действий передвижения и подъема на задние лапы.
Передвижение является основным критерием спонтанных действий, в то время как подъем на задние лапы является основным познавательным инстинктом, но в действительности оба индикатора являются взаимовлияющими (пример: когда кажется, что передвижение уменьшается, и если в это время увеличивается подъем на задние лапы, тогда нельзя говорить, что количество действий уменьшается).
<Иммуногистохимическое испытание: только группа (2)>
После завершения поведенческого теста из 5 мышей каждой группы умерщвляли, и фиксировали перфузией формалином. После заливки парафином с использованием микротома получали тонкий срез головного мозга, который обрабатывали 4 раза ксилолом и этанолом каждые 10 минут для депарафинизации. Затем его кипятят в течение 30 минут в лимоннокислом буфере (pH 6) (антигенактивирующая обработка) и возвращают к комнатной температуре, после чего его дважды промывают смесью трис-буфер-физиологический раствор (TS) в течение 10 минут. После блокировки в течение 60 минут при комнатной температуре TS, содержащим 20% бычьей сыворотки, образец обрабатывают препаратом мышиных антител против человеческого синаптофизина (SVP-38, разведенный в 200 раз TS, содержащим 10% бычьей сыворотки, Sigma), и оставляют на ночь при 4°С. После промывки TS дважды в течение 10 минут образец обрабатывают препаратом меченных FITC антител против мышиного IgG (антитела, разведенные в 20 раз TS, содержащим 10% бычьей сыворотки, Vector), и проводят обработку при комнатной температуре в течение 60 минут. После промывки TS дважды в течение 10 минут обрабатывают препаратом VECTASHIELD (Vector), и наблюдают с помощью микроскопа. Оценивают количественно интенсивность флуоресценции которую «отцифровывают» с помощью NIH imageJ, и выражают в условных единицах.
<Результаты>
1. Влияние введения каждого антитела на нарушенную память
(1) Кроличьи поликлональные антитела к pSer413
Результаты для (1-1) - (1-3) показаны на фиг. 4 - фиг. 7. В итоге пассивная иммунизация поликлональными антителами против pSer413 заметно улучшает память на мышиной модели с нарушенной памятью (Tau-Tg) до такого же уровня, как у non-Tg. В (1-3) существенного отличия между группами в активном движении и визуальном восприятии не видно.
(2) Мышиные моноклональные антитела к pSer413 (антитела 1505)
Результаты для (2-1) - (2-3) показаны на фиг. 11. В итоге пассивная иммунизация моноклональными антителами против pSer413 заметно улучшает память на мышиной модели с нарушенной памятью до такого же уровня, как у non-Tg. В (2-3) существенного отличия между группами в активном движении и визуальном восприятии не видно.
На основании результатов в (2-1) и (2-2) сделан вывод, что эпитоп pSer413 является эпитопом пригодным в качестве мишени для терапии в виде пассивной иммунизации как поликлональными антителами, так и моноклональными антителами.
(3) Мышиные моноклональные антитела к pSer396 (антитела Та9)
Результаты для (3-1) - (3-3) показаны на фиг. 12 - фиг. 15. В итоге введение Та9 существенно улучшает память на модели с нарушенной памятью до такого же уровня, как у non-Tg. В (3-3) существенного отличия между группами в активном движении и визуальном восприятии не видно.
Однако, когда Та9 сравнивают с Ta1505, обнаружилось, что их лекарственное действие слабее. Хотя аффинность к антигену Та9>Ta1505 (см. примеры 2 и 3), лекарственное действие Та9<Ta1505 (пример 5), из чего можно предположить, что существенное различие в лекарственном действии вызвано различиями в фосфорилировании эпитопа.
Пример 6. Эффект от введения антител Ta1505 на невральную функцию
Эффект от введения антител Ta1505 на уровни синаптофизина, который как известно является «маркером», отражающим невральную функцию, анализируют с помощью иммуноокрашивания антителами против синаптофизина участка гиппокампа СА3, который является центром памяти. Интенсивность флуоресценции измеряют количественно NIH-Image J.
Результаты приводятся на фиг. 16. С введением антител Ta1505 наблюдают восстановление уровней синаптофизина в гиппокампе, хотя не в существенной степени.
Пример 7. Секвенирование нуклеиновой кислоты кДНК моноклональных антител ряда Ta15
(1) Очистка тотальной РНК гибридомы
Культивируют гибридомы, продуцирующие различные моноклональные антитела, и для лизиса клеток добавляют 1 мл ISOGEN на лунку 6-луночного планшета. После добавления к лизату 0,2 мл хлороформа и смешивания с помощью vortex смесь оставляют стоять при комнатной температуре в течение 2-3 минут. Затем центрифугируют при 12000 об/мин, 4°С, в течение 10 минут, и верхний слой переносят в новую пробирку. Затем добавляют 0,5 мл изопропилового спирта и перемешивают, после чего смесь оставляют стоять при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем смесь центрифугируют при 15000 об/мин, 4°С, 15 минут, для осаждения тотальной РНК. Затем, к осадку добавляют 1 мл 75% этанола и тщательно перемешивают, после чего смесь центрифугируют при 10000 об/мин, 4°С, в течение 5 минут. Осадок сушат на воздухе, растворяют в воде, свободной от ДНКазы/РНКазы, и хранят при -80°С.
(2) Получение кДНК Н-цепи и L-цепи путем 5'-RACE и 3'-RACE и секвенирование кДНК
Синтезируют праймеры для 5'-RACE (быстрая амплификация концов кДНК) и 3'-RACE на основе известных последовательностей кДНК константных участков Н-цепей мышиного IgG2a и IgG2b. Схожим образом синтезируют праймеры для 5'-RACE (быстрая амплификация концов кДНК) и 3'-RACE на основе последовательности кДНК константного участка мышиной L-цепи.
Отдельно 1 мкг тотальной РНК, полученной из гибридом, используют для синтеза кДНК для 5'-RACE и 3'-RACE с использованием набора SMART-RACE (продукт Clontech), и выполняют 5'-RACE и 3'-RACE. Проводят реакцию ПЦР (PCR) с использованием Advantage 2 Polymerase Mix (Clontech) согласно протоколу изготовителя. Продукты ПЦР, полученные 5'-RACE и 3'-RACE, разгоняют электрофорезом в агарозном геле, и из агарозного геля вырезают основной амплифицировавшийся фрагмент ДНК, который встраивают в клонирующий вектор ТА (Invitrogen) и используют для трансформации Е. coli, получая несколько клонов. Из трансформантов получают плазмиды установленным способом, и определяют нуклеотидную последовательность встроенного фрагмента ДНК.
(3) Получение полноразмерной кДНК Н-цепи и L-цепи и секвенирование кДНК
Последовательности кДНК, кодирующие N-конец и С-конец Н-цепи и L-цепи, определяют на основе информации о нуклеотидной последовательности, и создают прямой и обратный праймеры для амплификации полноразмерной последовательности. Такие праймеры используют для амплификации полноразмерных Н-цепи и L-цепи с использованием Prime STAR MaxPCR (TaKaRa), и ПЦР фрагменты клонируют в вектор pEF4. Это используют для окончательного определения последовательностей полноразмерных кДНК.
«Трансляцию» в аминокислотные последовательности проводят на основе полученной информации о нуклеотидных последовательностях, и используют IgBLAST (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) для идентификации участков CDR методом Кабат (Kabat Е.А. and Wu Т.Т., J. Immunol., 147, 1709-1719, 1991).
Последовательности полученных участков CDR приводятся далее начиная с SEQ ID NO: 14.
Информацию, касающуюся последовательностей CDR антител, которые специфически узнают pSer413, получают из данных о гомологии этих последовательностей (таблицы 4-6).
Пример 8. Поведенческий тест: Эффект, оказываемый полученными антителами на мышей с нарушенным запоминанием при обучении
Проверяют эффект от введения указанных далее двух антител в дозировке 0,1 мг на мышей с нарушенным запоминанием при обучении.
(4) Та1505 (моноклональное антитело, узнающее pSer413): Tau-Tg мыши (линия 784) или non-Tg мыши в возрасте 10 месяцев, n=9-10 на группу.
(5) Та9 (моноклональное антитело, узнающее pSer396): Tau-Tg мыши (линия 784) или non-Tg мыши в возрасте 11 месяцев, n=8-10 на группу.
Для эксперимента используют самцов гетеромутантов Tau-Tg мышей (линия 784) и их однопометных non-Tg в возрасте 10-11 месяцев. Группы подбирают так, чтобы не было различия в средней массе между группами. Tau-Tg мышам гетеромутантам вводят антитела, разбавленные PBS, один раз в неделю, всего 5 раз, в брюшную полость, по 0,1 мг на мышь на введение. В качестве отрицательного контроля PBS, используемый для разведения антител, или мышиные моноклональные антитела с отсутствием реакционной способности в отношении тау вводят в брюшную полость в той же дозировке. В качестве положительного контроля однопометным non-Tg вводят в брюшную полость PBS, используемый для разведения антител, в той же дозировке.
Структуры для групп (4)-(5) приводятся ниже.
(4) <Используемые мыши>: Tau-Tg мутанты (линия 784) в возрасте 10 месяцев.
<Структура группы>
Группа для оценки антител: 0,25 мг/мл анти-тау pSer413 мышиных моноклональных антител Ta1505 в PBS (n=10).
Контрольная группа: 0,25 мг/мл мышиных моноклональных антител 4C10F4 против Pseudomonas aeruginosa в PBS (n=10).
Группа non-Tg: PBS (n=9).
(5) <Используемые мыши>: Tau-Tg мутанты (линия 784) в возрасте 11 месяцев.
<Структура группы>
Группа для оценки антител: 0,25 мг/мл анти-тау pSer396 мышиных моноклональных антител Та9 в PBS (n=10).
Контрольная группа: 0,25 мг/мл моноклональных антител 6F11 против Pseudomonas aeruginosa в PBS (n=8).
Группа non-Tg: PBS (n=8).
Начиная с понедельника недели, следующей после недели, на которой было осуществлено последнее введение, проводят испытания на пространственную долговременную память с использованием водного лабиринта Морриса (тест в водном лабиринте). Тест в водном лабиринте проводят так же, как в примере 5.
<Результаты>
1. Эффект от введения каждого антитела на нарушенную память
(4) Мышиные моноклональные антитела к pSer413 (антитела 1505)
Результаты для предварительного теста (4-1) и основного исследовательского теста (4-2) показаны на фиг. 18 и фиг. 19. В итоге пассивная иммунизация моноклональными антителами против pSer413 улучшает память у мышиной модели с нарушенной памятью до уровня 50% или выше по сравнению с non-Tg.
Результаты (4-1) и (4-2) подтверждают лекарственный эффект моноклональных антител для эпитопа pSer413 даже при дозе 0,1 мг.
(5) Мышиные моноклональные антитела к pSer396 (антитела Та9)
Результаты для предварительного теста (5-1) и основного исследовательского теста (5-2) показаны на фиг. 20 и фиг. 21. В итоге не наблюдается никакого улучшения нарушенной памяти при введении Та9 в дозировке 0,1 мг.
Такие испытания даже еще яснее указывают на различие в лекарственном эффекте этих антител при дозировке 0,1 мг, вызванных различиями в фосфорилировании эпитопа.
Введение антител в количестве 0,1 мг на мышь соответствует введению в дозе приблизительно 2,5 мг/кг.
Пример 9. Изменение уровня фосфорилированного тау в головном мозге путем введения антител Ta1505
Эффект от введения антител Ta1505 на уровень фосфорилированного тау в головном мозге Tau-Tg мышей анализируют путем иммуногистоокрашивания антителами Ta1505, узнающими pSer413, и антителами АТ8 (PHF, узнающие эпитоп pSer202/pTh205), участков гиппокампа, которые являются центрами памяти.
После завершения поведенческого теста 5 мышей из каждой группы умерщвляют и фиксируют перфузией смеси 4% формальдегида/PBS. Головной мозг извлекают и заливают в парафине, и с помощью микротома получают тонкие 5-мкм срезы. После обработки 4 раза ксилолом и этанолом каждый раз по 10 минут для депарафинизации, срезы подвергают обработке кипячением (антитенактивирующая обработка) в течение 10 минут при pH 2. После возвращения к комнатной температуре срезы дважды промывают смесью трис-НС1-физиологический раствор (TS) в течение 10 минут. Затем блокируют в течение 60 минут при комнатной температуре с использованием TS, содержащего 20% бычьей сыворотки.
Наносят препараты антител против тау (Ta1505, АТ8), разведенных до 1 мкг/мл в TS, содержащем 10% бычьей сыворотки, для обработки в течение ночи при 4°С. После промывки TS дважды в течение 10 минут вносят препараты меченных биотином антимышиных антител (Vector Co.), разведенных в 500 раз TS, содержащим 10% бычьей сыворотки, для обработки при комнатной температуре в течение 60 минут.
После промывки TS дважды в течение 10 минут добавляют препараты раствора ABC, меченного HPR (Vector Co.), для реакции при комнатной температуре в течение 30 минут, и после дополнительной промывки окрашивают диаминобензидином (DAB). Все инкапсулируют с Entellan (Merck) и наблюдают и фотографируют.
Результаты иммуногистоокрашивания Ta1505 показаны на фит. 22 - фиг. 24.
Как видно на фиг. 22, Та1505-положительное окрашивание тау наблюдается в участке гиппокампа СА3 (первая колонка слева) и участке гиппокампа СА23 (вторая колонка слева) у 5 особей контрольной группы, которым вводили IgG, при этом степень окрашивания в участке гиппокампа СА3 (третья колонка слева) и участке гиппокампа СА23 (четвертая колонка слева) у 5 особей группы с введенными Ta1505 явно ниже, чем в контрольной группе с введенным IgG. Это подтверждает, что введение Ta1505 снижает уровень Та1505-положительного тау, т.е. Ser413-фосфорилированного тау, в участке гиппокампа СА3 и участке гиппокампа СА23. Конкретнее, в контрольной группе с IgG наблюдалось скопление мелких темных точек, в широкой полосе слева направо в СА3. Что касается СА23, то окрашивается широкая кривая полоса от верха правой стороны до левой стороны. У группы с введенным Ta1505 в широкой окрашенной полосе слева направо в СА3 наблюдались очень мелкие темные точки. Что касается СА23, то окрашивается широкая кривая полоса от верха правой стороны до левой стороны. Фактически окрашивания не видно в четырех участках СА3 и трех участках СА23.
На фиг. 23 и фиг. 24 видно АТ8-положительное окрашивание тау в участках коры головного мозга (периринальном кортексе (первая колонка слева на фиг. 23), латеральном энторинальном кортексе (вторая колонка слева на фиг. 23) и медиальном энторинальном кортексе (третья колонка слева на фиг. 23)) у пяти особей в контрольной группе с введенным IgG (окрашивание в виде темных пятен на фиг. 23).
Степень окрашивания в участках коры головного мозга у пяти особей в группе с введенным Ta1505 (периринальном кортексе (первая колонка слева на фиг. 24), латеральном энторинальном кортексе (вторая колонка слева на фиг. 24) и медиальном энторинальном кортексе (третья колонка слева на фиг. 24)) явно ниже, чем у контрольной группы с введенным IgG, влоть до того, что окрашивание не наблюдается.
Это подтверждает, что введение Ta1505 снижает уровни Та1505-положительного тау, т.е. Ser413-фосфорилированного тау, в участках коры головного мозга (периринальном кортексе, латеральном энторинальном кортексе, медиальном энторинальном кортексе).
Окрашивание в виде темных пятен присутствует на фиг. 23, но фактически на фиг. 24 не наблюдается окрашивание в виде темных пятен.
Подтверждается, что введение антител Ta1505 снижает уровни Ser413-фосфорилированного тау в головном мозге (= участке гиппокампа СА3, участке гиппокампа СА23, PRh, Ent (латеральном, медиальном)).
PRh = периринальный кортекс,
Ent = энторинальный кортекс.
Результаты иммуногистоокрашивания с АТ8 показаны на фиг. 25 - фиг. 27.
Как видно на фиг. 25, АТ8-положительное окрашивание тау наблюдается в участке гиппокампа СА3 (первая колонка слева) и участке гиппокампа СА23 (вторая колонка слева) у 5 особей контрольной группы с введенным IgG, при этом у 5 особей группы с введенными Ta1505 степень окрашивания в участке гиппокампа СА3 (третья колонка слева) и участке гиппокампа СА23 (четвертая колонка слева) явно ниже, чем в контрольной группе с введенным IgG. Это подтверждает, что введение Ta1505 снижает уровень АТ8-положительного тау, т.е. Ser202/Thr205-фосфорилированного тау, в участке гиппокампа СА3 и участке гиппокампа СА23. Конкретнее, на фиг. 25 у контрольной группы с IgG наблюдалось скопление мелких темных точек, в в широкой окрашенной полосе проходящей от верхней части левой стороны до нижней части правой стороны в СА3. Что касается СА23, то окрашивается широкая кривая полоса от верхней части правой стороны в направлении левой стороны. У группы в введенными Ta1505 в широкой окрашенной полосе от верхней части слева до нижней части справа в СА3 наблюдались очень мелкие темные точки. Что касается СА23, то окрашивается широкая кривая полоса от верхней части правой стороны в направлении левой стороны.
На фиг. 26 АТ8-положительное окрашивание тау видно в участках коры головного мозга (периринальном кортексе (первая колонка слева на фиг. 26), латеральном энторинальном кортексе (вторая колонка слева на фиг. 26) и медиальном энторинальном кортексе (третья колонка слева на фиг. 26)) у пяти особей в контрольной группе с введенным IgG. (См. окрашивание в виде темных пятен на фиг. 26).
На фиг. 27 у пяти особей в группе с введенным Ta1505 степень окрашивания в участках коры головного мозга (периринальном кортексе (первая колонка слева на фиг. 27), латеральном энторинальном кортексе (вторая колонка слева на фиг. 27) и медиальном энторинальном кортексе (третья колонка слева на фиг. 27)) явно ниже контрольной группы с введенным IgG. (См. окрашивание в виде мелких темных пятен на фиг. 27).
Это подтверждает, что введение Ta1505 снижает уровни АТ8-положительного тау, т.е. Ser202/Thr205-фосфорилированного тау, в участках коры головного мозга (периринальном кортексе, латеральном энторинальном кортексе, медиальном энторинальном кортексе).
Подтверждается, что введение антител Ta1505 имеет тенденцию снижать уровень узнающего АТ8 Ser202/Thr205-фосфорилированного тау в головном мозге (= участке гиппокампа СА3, участке гиппокампа СА23, PRh, Ent (латеральном, медиальном)).
Такой результат подтверждает, что введение антител уменьшает степень проявления патологии в головном мозге и вызывает улучшение нарушенной памяти. Результаты показывают, что антитела, введенные интраперитонеально, действуют в головном мозге.
Пример 10. Эффект от введения антител Ta1505 на уровни тау в головном мозге
С использованием антител АТ8, которые предположительно узнают гиперфосфорилированный тау, присутствующий в PHF (мышиные моноклональные антитела, узнающие pSer202/pThr205, Innax Co.), G2 (античеловеческие специфические узнающие N-концевой участок антитела кроличьи поликлональные антитела), PHF1 (мышиные моноклональные антитела, узнающие pSer396/pSer404, которые предположительно узнают гиперфосфорилированный тау, присутствующий в PHF), и Ta1505 проверяют эффект от введения антител Ta1505 на уровни тау и гиперфосфорилированного тау в гомогенатах головного мозга методом вестерн-блоттинга с использованием гомогенатов головного мозга Tau-Tg мышей с введенными антителами.
Выполняют обработку ультразвуком 100-200 мг полушарий большого мозга мыши в 5-кратном количестве TBS (содержащего коктейль ингибиторов протеаз и коктейль ингибиторов фосфатаз). Смесь центрифугируют при 100000g в течение 15 минут при 4°С, и собирают супернатант в виде растворенной в TBS фракции.
Осадок суспендируют в смеси 1% саркозила/TBS (содержащего коктейль ингибиторов протеаз и коктейль ингибиторов фосфатаз) и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре. Смесь центрифугируют при 100000g в течение 15 минут при комнатной температуре, и используют супернатант, представляющий собой растворенную в саркозиле фракцию.
Растворенную в TBS фракцию и растворенную в саркозиле фракцию разгоняют в 7% трис-ацетатном геле электрофорезом, переносят на PVDF мембрану и блокируют в течение ночи при комнатной температуре со смесью 1% BSA/3% обезжиренного молока/0,05% твина 20/TBS. Затем проводят реакцию с раствором антител, где конъюгат антител с HPR использовался в качестве вторичных антител, реакцию проводят методом ECL, и анализируют результат с помощью анализатора изображений LAS3000 для количественной оценки.
Результаты показаны на фиг. 28 и фиг. 29.
Для TBS-растворимой фракции подтверждается, что введение антител Ta1505 существенно снижает уровни человеческого тау (узнаваемого антителами G2), гиперфрсфорилированного тау (узнаваемого АТ8 (эпитоп pS202/pT205) и PHF1 (эпитоп pS396/pS404)) и pS413-Tay (узнаваемого Та1505) в головном мозге Tau-Tg мышей.
Для саркозил-растворимой фракции подтверждается, что введение антител Ta1505 существенно снижает уровни гиперфрсфорилированного тау (узнаваемого АТ8) в головном мозге Tau-Tg мышей.
Такой результат подтверждает, что введение антител степень проявления патологии в головном мозге и имеет улучшающий эффект в отношении нарушенной памяти. Результаты также показывают, что антитела, введенные интраперитонеально, действуют в головном мозге.
Пример получения 1. Tg мыши, экспрессирующие нормальный тип человеческого тау (Tau-Tg мыши) как модель нарушения когнитивной функции
Фармакологический эффект антител по изобретению в отношении улучшения когнитивной функции проверяют с использованием Tg мышей, экспресирующих нормальный тип человеческого тау, и в частности, такой же паттерн экспрессии, как при онтогенезе у людей, где на эмбиональной стадии экспрессируется только типа 3R-Tay, и обо типа 3R- и 4R-тау экспрессируются при продолжающемся росте, и у которых ухудшение когнитивной функции начинается примерно в 6 месяцев после рождения. Tg мышей получают следующим методом.
Генная структура, используемая для получения Tg мышей, представляет собой нуклеиновую кислоту, обеспечивающую ген тау, имеющую структуру, показанную на фиг. 17, включающую 5'-интрон вируса обезьян 40 (SV40) (0,3 кб), ген тау (тау; 7,3 кб), 3'-интрон SV40 (0,8 кб) и сигнал полиА SV40 (0,3 кб) в указанном порядке, в направлении по ходу танскрипции от промотора α-калмодулинкиназы IIα (CaMKII) (8,5 кб). Используемый ген тау получают таким же методом, какой описан в Yamashita Т. et al. (FEBS Letters, Vol. 579, p. 241-244, 2005), в виде гена длиной в 7,3 кб, включающего нуклеотидную последовательность части, соответствующей экзонам 1-9 кДНК, кодирующей человеческий тау, нуклеотидную последовательность, содержащую часть из первых 18 нуклеотидов и последние 3 кб интрона 9, нуклеотидную последовательность экзона 10, часть из первых 3 кб и последних 38 нуклеотидов интрона 10 (с цитозином, заменяющим тимин в 16 положении от 5'-конца интрона 10) и нуклеотидную последовательность кДНК, соответствующую экзонам 11-13. Ген тау клонируют по сайтам рестриктазы EcoRV в pNN265 - векторе, содержащем 5'-интрон SV40 и 3'-интрон и сигнальную последовательность поли(А) (Choi Т. et al., Mol. Cell. Biol., vol. 11, pp. 3070-3074, 1991). Фрагмент ДНК, содержащий 5'-интрон SV40, ген тау, 3'-интрон SV40 и сигнальную последовательность поли(А), вырезают из полученной плазмиды рестрикционными ферментами XhoI и NotI, и фрагмент ДНК клонируют в векторе рММ403, содержащем промотор CaMKII (Mayford М. et al., Cell, vol. 81 pp. 891-904, 1995). Также из полученной плазмиды рестрикционным ферментом SfiI вырезают фрагмент гена, имеющий структуру, показанную на фиг. 17, содержащий ген тау (17,2 кб), выделяют электрофорезом в агарозном геле и очищают из соответствующего участка геля с использованием набора для экстракции из геля QIAGEN (R) QIAquick Gel Extraction Kit (кат. №28704). Полученный фрагмент гена (ДНК) инкубируют с эмбрионами на пронуклеарной стадии, полученными бридингом самцов/самок мышей C57BL/6 согласно известному методу. Их имплантируют инъекцией в маточные трубы мышей C57BL, приведенных в состояние ложной беременности. Части хвостов рожденных мышей ампутируют, проводят ПЦР для подтверждения того, перенесен ли введенный ген, и самцов или самок мышей с перенесенным геном размножают с обычными самцами или самками мышей, чтобы создать Tg мышей гетеро по перенесенному гену тау, которых используют в экспериментах. Tau-Tg мыши, упоминаемые в примерах в линии 609 и линии 784, являются мышами, полученными таким методом и проявляющими соответствующие свойства.