Redox enzymes of Red Beetroot vacuoles ( Beta vulgaris L. )

Journal of Stress Physiology & Biochemistry, Vol. 10 No. 4 2014, pp. 98-117 ISSN 1997-0838 Original Text Copyright © 2014 by Pradedova, Nimaeva and Salyaev

ORIGINAL ARTICLE

Redox Enzymes of Red Beetroot Vacuoles

E.V. Pradedova, O.D. Nimaeva, R.K. Salyaev

Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences, PO 317, Irkutsk, 664033, Russia

*E-Mail: praded@sifibr.irk.ru

Received November 7, 2014

Years of research have shown that some of the redox elements (enzymes, coenzymes, and co-substrate) are isolated from each other kinetic and spatial manner (compartmentalization) in the eukaryotic cells. The redox elements forming the "highly" and "widely" specialized redox system are found in all cell structures: mitochondria, plastids, peroxisomes, apoplast, nucleus etc. In recent years the active involvement of the central vacuole in the maintenance of the plant cell redox homeostasis is discussed, actually the information about the vacuolar redox system is very small. The high-priority redox processes and "redox-specialization" of the vacuolar compartment are not known. We have begun a study of red beet-root vacuole redox systems (Beta vulgaris L.) and have identified redox enzymes such as: phenol peroxidase (EC 1.11.1.7), superoxide dismutase (EC 1.15.1.1) and glutathione reductase (EC 1.8.1.7). This paper presents some of the characteristics of these enzymes and considers the probable ways of their functioning in vacuolar redox chains.

Key words: Beta vulgaris L., vacuole, glutathione transferase, peroxidase, redox chain,

superoxide dismutase

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

99

Redox Enzymes of Red Beetroot Vacuoles...

ORIGINAL ARTICLE

Редокс-ферменты вакуолей клеток корнеплодов столовой свеклы

Е.В. Прадедова*, О.Д. Нимаева, Р.К. Саляев

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, 664033, Иркутск, ул. Лермонтова, 132, Россия

*E-Mail: praded@sifibr.irk.ru

Поступила в редакцию 7 Ноября 2014 г.

Многолетние исследования показали, что в эукариотических клетках некоторые редокс-элементы (ферменты, коферменты и косубстраты) не только кинетически, но и пространственно изолированы (компартментированы). Редокс-элементы, образующие редокс-системы «узкой» и «широкой» специализации, обнаружены во всех клеточных структурах: митохондриях, пластидах, пероксисомах, апопласте, ядре и т.д. Несмотря на то, что в последние годы обсуждают активное участие центральной вакуоли в поддержании редокс-гомеостаза растительной клетки, в действительности о вакуолярных редокс-системах сведений очень мало. Практически ничего не известно о приоритетных редокс-процессах или «редокс-специализации» этого компартмента. Мы приступили к исследованию редокс-систем вакуолей клеток корнеплодов столовой свеклы (Beta vulgaris L.) и выявили такие редокс-ферменты, как: фенольная пероксидаза (EC 1.11.1.7), супероксиддисмутаза (EC 1.15.1.1) и глутатионредуктаза (EC 1.8.1.7). В настоящей работе представлены некоторые характеристики этих ферментов и рассмотрены вероятные способы их кофункционирования во внутривакуолярных редокс-цепях.

Key words: Beta vulgaris L., вакуоли, глутатионтрансфераза, пероксидаза, редокс-цепь, супероксиддисмутаза

В основе окислительно-восстановительных процессов лежат окислительно-восстановительные реакции (Oxidation-Reduction reaction или Redox reaction). Для редокс-реакций характерно

изменение степени окисления соединений вследствие переноса электронов между ними. При этом один из участников реакции выполняет функцию донора (восстановитель), а другой -

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

Pradedova et al.

100

акцептора электронов (окислитель). Окислитель и 2 e- + H+); 4) перенос e- при прямом

восстановитель образуют сопряженную пару - взаимодействии донора с кислородом. Таким

редокс-пару (Zholnin, 2012). Реакции этого типа образом, редокс-процессы могут протекать без

наиболее распространены в биологических участия и с участием кислорода, акцептирующего

системах. Следует отметить, что редокс-реакции электроны (Murray et al. 1993; Zholnin, 2012).

биологических систем заметно отличаются от Редокс-коферменты, как правило, -

редокс-реакций, протекающих в неорганических и полифункциональны. Они взаимодействуют с

органических системах. Для редокс-реакции разными ферментами (Kritskii, Telegina, 2004).

биологических систем характерны высокая Хотя некоторые из них могут специализироваться

скорость и обратимость, что обусловлено на переносе определенного окислительного

непосредственным участием специализированных эквивалента. Например, редокс-кофакторы Fe2+,

ферментов (оксидоредуктаз) (Ksenzhek, Petrova, Cu2+, Mn2+, Mo4+ и Co2+, а также кофермент гем,

1986; Kritskii, Telegina, 2004). Участие ферментов, обеспечивают перенос e-, тогда как

т.е. каталитических белков, свидетельствует в пиридиннуклеотиды (NAD+, NADP+) переносят

пользу генетического контроля за редокс- главным образом Н~. Флавины (FAD; FMN) могут

процессами в биологических системах (Rogozhin et переносить два эквивалента: Н~ и e-. Хиноновые

al., 2004). А изменение экспрессии генов этих коферменты, глутатион, аскорбиновая и липоевая

белков, которое довольно часто отмечают при кислоты осуществляют перенос e- и H+ (H) (Saab-

действии определенных факторов, указывает на Rincon, Valderrama, 2009). Некоторой

эпигенетический контроль (Martinovich, полифункциональностью могут обладать и редокс-

Cherenkevich, 2008). ферменты, взаимодействующие с определенными

Функционирование редокс-ферментов тесно коферментами. Однако для большинства из них

сопряжено со специализированными характерны узкая специализация и субстратная

коферментами, которые представлены редокс- специфичность (Kritskii, Telegina, 2004).

парами (NAD/NADH; GSH/GSSG; Fe3+/Fe2+ и т.п.). В клетках всех организмов, включая растения,

Редокс-коферменты выполняют функцию редокс-ферменты катализируют многие ключевые

акцепторов и переносчиков восстановительных реакции энергетического обмена и биологического

эквивалентов, им свойственно обратимое окисления. Некоторые из них окисляют

окисление-восстановление. Существует четыре соединения, отнимая один электрон в

способа передачи электронов с помощью свободнорадикальном катализе. Другие отнимают

коферментов:1) прямой перенос электронов (е-) два электрона, при этом интермедиаты, как

между элементами; 2) перенос в составе атома правило, стабилизируются активными сайтами

водорода (H, e- + H+); 3) в форме гидрид-иона (H~, ферментов, что позволяет избежать

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

101

Redox Enzymes of Red Beetroot Vacuoles...

неконтролируемую генерацию реактивных стресс может происходить вследствие нарушения

продуктов (Saab-Rincon, Valderrama, 2009). функционирования этих редокс-цепей при

Редокс-ферменты подразделяют на несколько изменении путей переноса электронов

групп. Основанием для такого разделения служит (Cherenkevich et al., 2013). В то же время

совместное функционирование с определенными эффективность работы редокс-цепей, согласно

коферментами и косубстратами: 1) мнению некоторых авторов, обеспечивается

металлопротеины (содержащие медь, марганец, изоляцией в клеточных структурах

никель, молибден, железо-кластеры, а также гем); (компартментацией) редокс-элементов, а также

2) флавин-содержащие белки; 3) солокализованными с ними механизмами,

пиридиннуклеотид-зависимые белки; 4) хинон- координирующими их функции (Jones, 2008;

зависимые белки (Saab-Rincon, Valderrama, 2009). Cherenkevich et al., 2013).

Наряду с этими группами выделяют группы Идея специализированной компартментации

ферментов, функционально связанные с редокс-цепей и в целом редокс-процессов в

определенными косубстратами. Например, клетках основана на многочисленных фактах

выделяют группы глутатионзависимых ферментов, (Jones, 2008; Martinovich, Cherenkevich, 2008). На

тесно взаимодействующих с глутатионом, или сегодня редокс-цепи выявлены практически во

аскорбатзависимых ферментов, функционально всех клеточных компартментах. Например, широко

связанных с аскорбиновой кислотой. известны электрон-транспортные цепи

Что касается пространственного сопряженного окисления (ЭТЦ) митохондрий и

функционального сопряжения редокс-ферментов, хлоропластов. Электрон-транспортные цепи

кофакторов и косубстратов, то наиболее (несопряженного окисления) с монооксигеназной

распространенным способом их взаимодействия активностью исследованы у микросом клеток

можно назвать объединение в животных и на мембранах эндоплазматического

специализированные редокс-цепи, в которых ретикулума растительных клеток (Berezov,

осуществляется поэтапный или многоступенчатый Korovkin, 2008). Аскорбат-глутатионовый цикл,

перенос электронов от первичного субстрата к представляющий редокс-цепь последовательного

конечному акцептору (Jones, 2008). Поток переноса восстановительных эквивалентов от

электронов (редокс-путь) между элементами таких NADPH к глутатиону и аскорбиновой кислоте,

редокс-цепей зависит от констант скоростей выявлен у хлоропластов (Ksenzhek, Petrova, 1986).

реакций, от суммарного количества и Электрон-транспортные цепи с участием тиоловых

распределения структурных элементов цепи, а редокс-пар функционируют в цитозоле клеток

также от их стандартных редокс-потенциалов животных и растений (Cherenkevich et al., 2013).

(Melissa et a/., 2008). Полагают, что окислительный Все перечисленные и многие другие редокс-

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

Pradedova et al.

102

процессы протекают с обязательным участием редокс-элементов, которые представлены кофакторами, коферментами, косубстратами, ферментами и редокс-группами (остатки цистеина и т.п. в составе белков и пептидов).

Придерживаясь идеи компартментации редокс-процессов, главными структурными единицами которых являются редокс-цепи, мы приступили к изучению редокс-элементов, способных совместно функционировать в редокс-цепях внутри такого клеточного компартмента, как центральная вакуоль. Редокс-системы и редокс-процессы этой клеточной структуры практически не исследуются, в связи с этим ничего не известно о «редокс-специализации» вакуоли. В вакуолярном содержимом клеток корнеплодов столовой свеклы (Beta vulgaris L.) мы выявили активность таких редокс-ферментов, как: фенольная пероксидаза (EC 1.11.1.7), супероксиддисмутаза (EC 1.15.1.1) и глутатионредуктаза (EC 1.8.1.7). В настоящей работе представлены характеристики этих ферментов и рассмотрены вероятные способы их совместного функционирования во

внутривакуолярных редокс-цепях.

MATERIALS AND METHODS

Объектом исследования служили корнеплоды столовой свеклы (Beta vulgaris L.), на стадии их физиологического покоя (осенний-зимний период).

Вакуоли выделяли из паренхимы корнеплодов с помощью макрообъемного метода, предложенного Leigh и Branton, и в дальнейшем модифицированного Саляевым и соавт. (Leigh,

Branton, 1976; Salyaev et al., 1981).

Водны/е экстрактыы получали из тканей корнеплодов, для этого ткань гомогенизировали в среде: 100 мМ K-Na-фосфатный буфер (рН 7.0); 1 мМ дитиотрейтол; 1 мМ EDTA; 1% поливинилпирролидон.

Содержимое вакуолей извлекали, разрушая органеллы в гипотонической среде: 100 мМ K-Na-фосфатный буфер, рН 7.2. Фильтраты экстрактов тканей, а также экстракты вакуолей центрифугировали 20 мин при 15500 g.

Активность GR определяли в вакуолярных и тканевых экстрактах спектрофотометрическим методом (Anderson et al., 1990). В том случае, когда исследовали рН-зависимость фермента,

использовали реакционные среды с разным pH: 5.0-6.0-7.0-8.0. Ингибиторный анализ проводили с 1-хлор-2.4-динитробензолом (CDNB), его конечная концентрация в среде составляла 2 мМ (Bilzer et al., 1984). Относительную активность GR

выражали в мкмолях косубстрата на мг белка в мин.

Количество белка определяли по методу Bradford (Bradford, 1976).

Активность супероксиддисмутазы (SOD) определяли модифицированным способом

(Nishikimi et al., 1972).

Метод изоэлектрофокусирования белков (IEF) применяли для разделения изоформ пероксидазы и SOD. IEF проводили в полиакриламидном геле (PAAG) (T 5%; C 3%), который содержал 10% глицерина и 3% амфолитов (рН 3.5-10) (Fluka) (Gaal et al., 1980). Маркером служил

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

103

Redox Enzymes of Red Beetroot Vacuoles...

калибровочный КИТ для IEF (Pharmacia). Экстракты, полученные из ткани корнеплода и вакуолярных фракций, подвергали частичной очистке, для этого проводили двух часовой диализ при 4°С. Анализируемые пробы содержали в среднем 100 мкг белка.

С помощью электрофоретического метода выявляли изоферментный состав GR. Электрофорез белков осуществляли стандартным способом в 7.5% PAAG при неденатурирующих условиях (Gaal et a/., 1980).

Активность полифенолоксидазы (тирозиназы) в геле выявляли в реакционной среде, содержащей 60 мМ K-Na-фосфатного буфера (рН 5.0 или 8.0), 50 мМ пирокатехина (о-

дигидроксибензола) (PC), 0.93 мМ

парафенилендиамина (PDA) (Voskresenskaya et a/., 2006). В качестве ингибитора пероксидазных реакций использовали 30 мМ 1,3-диэтил-2-тиомочевину.

Визуализацию изоформ пероксидазы в PAAG осуществляли в той же среде, что и изоформы тирозиназы, или в среде, содержащей 100 мМ цитратно-фосфатный буфер (рН 5.0 или рН 8.0). Для развития реакции в среды вносили 0.01% Н2О2, 0.1 мМ 3,3'-диаминобензидин (DAB) или 50 мМ PC и 0.93 мМ PDA.

Активность SOD в PAAG визуализировали согласно методу Beauchamp-Fridovich (Beauchamp, Fridovich, 1971).

Для выявления активности GR в PAAG использовали два метода. Первый предусматривал развитие окраски в агаровом слое, который

наносили на PAAG. Агаровый слой содержал: 200 мМ трис-HCl (pH 8.0); 1 мМ EDTA; 2 мМ 5.5'-дитиобис-2-нитробензойная кислота (DTNB); 1мМ GSSG; 0.5 мМ NADPH; 15 мг/мл агар. В этом слое в зонах локализации GR появлялось желтое окрашивание, вызванное образованием в ходе реакции 5-тио-2-нитробензойной кислоты (Levites, 1986). Другой способ предусматривал инкубацию гелей в темноте в реакционном растворе: 250 мМ трис-HCl (рН 7.5); 3.4 мМ GSSG; 0.5 мМ NADPH; 10 мг 3-(4.5-диметилтриазол-2-4)2.5-дифенилтетразо-лиум бромид (MTT); 10 мг 2.6-дихлорофенолиндофенол (DCPIP) (Anderson et a/., 1990). Маркером ферментативных реакций служила GR из пекарских дрожжей (Sigma).

Для оценки интактности органелл и их контаминации также использовали

электрофоретический метод. Применяли стандартный метод электрофореза в неденатурирующих условиях. В качестве маркера цитозоля и клеточных структур (пластид и митохондрий) служила активность NAD- и NADP-зависимых малатдегидрогеназ (MDH). Активность MDH выявляли зимографическим методом в PAAG после электрофореза с помощью общепринятого метода (Levites, 1986).

Полученные в ходе экспериментов электрофореграммы фотографировали с помощью системы Digi Doc-it Imaging System («Bio-Rad», USA), а также сканировали на сканере (hp scanjet 5400c).

Все эксперименты были выполнены в 4-5 биологических повторностях. На графиках

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

Pradedova et al.

104

приведены средние арифметические значения и средние квадратичные отклонения величин активности фермента.

RESULTS AND DISCUSSION

Согласно сложившимся на сегодня представлениям, центральная вакуоль активно участвует в поддержании редокс-гомеостаза растительной клетки (Ferreres et al., 2011). Однако вакуолярные редокс-системы, вовлекаемые в этот процесс, мало исследованы. Одним из наиболее известных редокс-ферментов вакуолярной локализации можно считать фенольную пероксидазу.

Гемсодержащий редокс-фермент пероксидаза

Несмотря на то, что пероксидаза выявлена в вакуолях у всех исследованных на сегодня растений, о ней не так много сведений, как можно было бы ожидать (Almagro et al., 2009).

Пероксидаза вакуолей, как и все фенольные пероксидазы (POX), является металлопротеином, гемсодержащим белком. Редокс-статус железа (Fe2+ или Fe3+) в белковопорфириновом комплексе POX изменятся в зависимости от каталитического цикла ферментативной реакции (Ferreres et al., 2011).

POX окисляет соединения, восстанавливая H2O2, а также окисляет соединения кислородом. Для фермента характерен переход с пероксидазного каталитического цикла (окисление субстрата и восстановление H2O2), на оксидазный каталитический цикл (окисление субстрата O2). Особенность каталитического механизма POX в

оксидазном цикле заключается в генерации свободных радикалов (О2", HO2', радикал органического субстрата) и Н2О2 (Chen, Schopfer, 1999; Rogozhin et al., 2004). В связи с этим полагают, что окислительные циклы POX могут регулироваться O2" и Н2О2, генерируемыми самим ферментом (Chen, Schopfer, 1999).

Способность окислять соединения кислородом, т.е. оксидазная активность, обнаружена у некоторых изоформ POX корней хрена, а также у POX клеточных стенок.

POX, выявленная нами в вакуолях корнеплодов столовой свеклы, также катализировала реакции оксидазного типа, которые были схожи с реакциями полифенолоксидаз (тирозиназ). Основные результаты этого исследования представлены в статье (Pradedova et al., 2014).

Проведенные ранее спектрофотометрические исследования показали, что реакции оксидазного и пероксидазного окисления POX вакуолей клеток корнеплодов столовой свеклы зависели от условий pH. Для оксидазной активности, определяемой с пирокатехиом (PC), оптимальными были условия с pH 8.0-9.0. Эта активность POX в целом походила на активность полифенолоксидазы (тирозиназы). Однако для большинства полифенолоксидаз клеток растений, согласно данным литературы, оптимальными являются pH 5.0-5.5 (Li et al., 2010).

Что же касается пероксидазных реакций POX вакуолей, то в наших исследованиях, определяемые с PC, PDA, DBA и H2O2 они имели оптимумы при pH 5.0-6.0 (Pradedova et al., 2014).

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

105

Redox Enzymes of Red Beetroot Vacuoles...

С помощью зимографического метода, отличается многообразием. Общим для его

позволяющего выявлять ферментативную представителей является сопряженное

активность в PAAG, установили, что все изоформы функционирование с изоаллоксазиновыми

POX вакуолей клеток корнеплодов столовой коферментами (FMN, FAD и др.), которые

свеклы, в отсутствие Н2О2, могли окислять PC, подвергаются окислению-восстановлению в ходе

подобно тирозиназам (Рис. 1). Оксидазные реакций. Восстанавливающими агентами для них

реакции быстро развивались при pH 8.0

практически отсутствовали при pH 5.0 (Рис. 1б). (Saab-Rincon, Valderrama, 2009).

Они также протекали в присутствие 1,3-диэтил-2- Флавопротеины широко распространены в

тиомочевины, акцептора H2O2, что подтверждало биологических системах. Во многих организмах

их оксидазную природу (Рис. 1г). Если в обнаружен высоко гомологичный флавопротеин -

реакционные среды, содержавшие PC и PDA, глутатионредуктаза (GR). Этот фермент из

вносили H2O2, то результат был прямо семейства флавинзависимых оксидоредуктаз

противоположным, пероксидазные реакции быстро восстанавливает дисульфид глутатиона (GSSG) до

протекали при pH 5.0 (Рис. 1в) и довольно его сульфгидрильной формы (GSH). У растений

медленно - при pH 8.0 (данные не приводятся). глутатион (GSH) обнаружен во всех клетках и

Для пероксидазных реакций POX вакуолей с DAB практически во всех клеточных компартментах

оптимальными также были pH 5.0-6.0 (Рис. 1д). (цитозоле, хлоропластах, митохондриях, вакуолях и

Следует отметить, что ни с DAB, ни с PDA т.д.) (Shao et al., 2008). GSH является главными

оксидазные реакции не развивались, ни при каких повсеместным небелковым тиолом, высокая

условиях pH. Что свидетельствует в пользу химическая активность тиольной группы делает его

субстратной избирательности вакуолярных эффективным восстановителем во многих

изоформ POX в оксидазном цикле, в котором они, окислительно-восстановительных процессах.

по всей видимости, не взаимодействуют с Поскольку GR играет ключевую роль в поддержании

бензидинами. Зависимость пероксидазных и высокого соотношения GSH/GSSG, от ее активности

оксидазных реакций от pH-условий, говорит о том, в определенной мере зависит редокс-гомеостаз

что наиболее вероятным механизмом, клетки (Cherenkevich et al., 2013).

регулирующим переход POX вакуолей из GR растений, по сравнению с GR животных,

пероксидазного цикла в оксидазный, является изучена недостаточно. Не исследованы некоторые

протонирование/депротонирование функциональ- детали строения ферментативного комплекса,

ных групп активного центра фермента. также неясны механизмы регуляции активности

Флавопротеин - глутатионредуктаза фермента, в полной мере не определена его

Большое семейство флавопротеинов компартментация (Noctor et al., 2011). В клетках

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

Pradedova et al.

106

растений GR обнаружена в цитозоле, восстановления GSSG с участием GR

митохондриях и пероксисомах, хотя основным косубстратом-восстановителем может служить и

местом локализации считают хлоропласты (Noctor NADPH, и NADH. При этом ферментативная

et al., 2011). Следует отметить, что о GR вакуолей активность с NADPH в несколько раз выше, чем с

на сегодня практически нет информации NADH. Сродство фермента к пиридиннуклеотидам

(Rautenkranz et al., 1994) определяют условия pH. Для NADPH требуются

Мы выявили активность GR в вакуолях клеток нейтральные и слабощелочные условия, а для

корнеплодов столовой свеклы. Она несколько NADH - кислые (Shigeoka et al., 1987; Rautenkranz

превышала активность GR тканевого экстракта, et al., 1994). Действительно активность GR

которую использовали для сравнения (Рис. 2). вакуолей и экстрактов тканей корнеплодов

Результаты нашего исследования не совпадали с столовой свеклы с NADPH была выше при pH 7.0-

ранее представленными результатам, согласно 8.0, а с NADH - при pH 5.0 (Рис. ЗА и Б). Обращало

которым активность GR вакуолей проростков на себя внимание то, что в целом уровень

ячменя (Hordeum vulgare L.) была в несколько раз активности с NADPH был почти в 10 раз выше, чем

ниже активности GR экстрактов ткани с NADH.

(Rautenkranz et al., 1994). Результаты нашего исследования совпадали с

Специфичные внутриклеточные ингибиторы результатами других авторов, которые также

или активаторы для GR до сих пор не обнаружены. показали, что оптимумы pH для GR с NADPH у

Однако установлено, что некоторые синтетические самых разных растительных организмов варьируют

соединения могут подавлять ее активность. в пределах от 7.0 до 8.0. Например, для GR сосны

Например, нитрофураны и ароматические (Pinus strobus L.) оптимальными были pH 7.3 и 7.8,

нитросоединения. Довольно сильный эффект на а эвглены (Euglena viridis) - pH 8.2 (Shigeoka et al.,

GR оказывают ароматические нитросоединения, к 1987; Anderson et al., 1990). При этом изоформы

которым относится CDNB. При наличии CDNB в GR многих организмов взаимодействуют с NADH

реакционных средах в конечной концентрации 2 как с альтернативным донором электронов.

мМ ферментативная активность GR вакуолей и Например, для GR шпината (Spinacia oleracea L.),

тканевого экстракта заметно снижалась (Рис. 2). дрожжей (Saccharomyces cerevisiae) и Escherichia

Следует отметить, что для GR животных был coli при восстановлении GSSG наряду с NADPH

установлен неконкурентный тип ингибирования субстратом может служить и NADH (Vanoni et al.,

CDNB (Bilzer et al., 1984). 1990).

Уровень ферментативной активности GR в Электрофоретическое исследование

нашем исследовании зависел от природы активности GR в PAAG мы проводили двумя

динуклеотида. Известно, что в реакциях разными методами. С их помощью в экстрактах

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

107

Redox Enzymes of Red Beetroot Vacuoles...

ткани и содержимом вакуолей выявили две специфична для пластид (Edwards et a/., 1985),

изоформы GR с относительными Rf 0.36 и Rf 0.43- тогда как NAD-MDH (EC 1.1.1.37) обнаружена во

0.047 (Рис. 4в). Маркером ферментативной многих клеточных компартментах (пероксисомах,

активности служила активность GR пекарских глиоксисомах, митохондриях, пластидах,

дрожжей (Sigma), величины Rf для ее изоформы в микросомах и цитозоле) (Yudina, 2012). Для

условиях нашего эксперимента составляли 0.33- выявления активности этих ферментов в

0.36 (Рис. 4б). Значения Rf GR пекарских дрожжей экспериментальном материале использовали

оказались близки к значениям Rf одной из чувствительный и наглядный зимографический

изоформ GR вакуолей и экстрактов ткани. Следует метод. С его помощью активность NAD-MDH и

отметить, что две изоформы GR были показаны и у NADP-MDH была выявлена в тканевом экстракте

других растений, например, в листьях Hordeum корнеплодов свеклы (Рис. 5б). Однако в

vulgare и Arabidopsis thaliana (Anderson et a/., 1990; вакуолярных фракциях она не обнаружена (Рис.

Marty et a/., 2009). 5а), что исключало контаминацию изолированных

В целом, проведенное нами исследование вакуолей.

биохимических свойств GR вакуолей в сравнении с Основная функция GR, как уже упоминалось,

GR водных экстрактов ткани, указывало на заключается в поддержании пула

специфичность ферментативных реакций. восстановленного глутатиона. GSH обнаружен

Высокий уровень активности GR вакуолей, практически во всех клеточных структурах, в том

сравнимый с уровнем активности фермента числе и в вакуолях (Noctor et a/., 2011). Ранее при

экстрактов ткани, говорил о том, что эта активность исследовании транспорта глутатиона в вакуоли

не могла быть следствием контаминации фракций отмечали, что скорость переноса дисульфидной

изолированных вакуолей содержимым цитозоля. формы (GSSG) заметно выше скорости переноса

Однако чтобы убедиться в чистоте вакуолярных сульфгидрильной формы глутатиона (GSH).

фракций и исключить вероятность взаимодействия Транспорт GSSG усиливался при окислительном

органелл с вакуолями, а также везикуляцию стрессе (Queval et a/., 2011). В связи с этим было

тонопласта с одновременным захватом высказано предположение о важной роли вакуоли

цитоплазматического содержимого, в ходе в поддержании редокс-статуса глутатиона в

изолирования органелл, мы определили в растительной клетке (Tommasini et a/., 1993). В

исследуемых образцах активность других качестве основного метаболического пути

внутриклеточных ферментов. Наиболее транспортируемого в вакуоли GSSG

подходящими маркерами для того исследования рассматривали его гидролиз Y-

являются NAD- и NADP-малатдегидрогеназы глутамилтранспептидазами и дипептидазами

(MDH). Известно, что NADP-MDH (EC 1.1.1.82) - (Zechmann et a/., 2006; Noctor et a/., 2011). Однако

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

Pradedova et al.

108

результаты наших экспериментов указывают на другой возможный путь метаболизма GSSG в вакуолях, а именно на его активное восстановление до GSH вакуолярными GR.

Металлофермент супероксиддисмутаза

Во фракциях вакуолей, изолированных из корнеплодов столовой свеклы, мы определили активность супероксиддисмутазы (SOD). Основные результаты этого исследования были опубликованы (Pradedova et al., 2009).

Сопоставив уровни активности SOD вакуолей и экстракта ткани корнеплодов, установили, что активность вакуолярного фермента превосходила активность SOD тканевого экстракта, что продемонстрировано на рисунке 6. Высокий уровень ферментативной активности мог указывать на значительное количество фермента в вакуолях.

При помощи электрофоретических методов с применением ингибиторного анализа, в вакуолярном соке была выявлена активность Cu,Zn-SOD. Хотя в клетках корнеплода столовой свеклы обнаружены все формы SOD: Mn-SOD; Fe-SOD и Cu,Zn-SOD (Pradedova et al., 2009). Вакуолярная Cu,Zn-SOD, как показали результаты исследования с помощью метода IEF, была представлена тремя изоформами с низкими значениями pI (от 4.5 до 3.0), заметно отличавшимися от pI вакуолярных анионных пероксидаз, значения которых варьировали в пределах от 7.0 до 4.5 (Рис. 7). Выявляемая на зимограммах активность SOD не являлась неспецифической реакцией пероксидаз,

способных замедлять накопление формазана, проявляя SOD-подобную активность (Giannopolitis, Ries, 1977; Pradedova et al., 2014). Следует отметить, что многочисленные изоформы Cu,Zn-SOD у других растительных объектов тоже были анионными (Wingsle et al., 1991).

Ранее Cu,Zn-SOD в вакуолях была показана в

A. thaliana с помощью метода протеомного анализа

(Carter et al., 2004). Используя методы

спектрофотометрии и электрофореза мы

подтвердили присутствие этого фермента в

вакуолях, на примере вакуолей Beta vulgaris.

Присутствие в вакуолярном содержимом редокс-ферментов предполагает формирование редокс-цепей

Все биологические системы содержат редокс-элементы, которые участвуют в физиологической регуляции и клеточной сигнализации, а также в преобразовании и обмене макромолекул. Многие из них - полифункциональны (Coleman, Rehm, 2000). Например, FAD, NAD(P)H, GSH и др. взаимодействуют со многими ферментами. Некоторой полифункциональностью обладают и оксидоредуктазы, взаимодействующие с различными коферментами и зачастую с различными субстратами. «Узкую специализацию» редокс-элементы (кофакторы, косубстраты и ферменты) приобретают в результате объединения в редокс-цепь, предназначенную для выполнения определенной функции. Таким образом, координация активности редокс-элементов осуществляется через редокс-цепи (Jones, 2008; Melissa et al., 2008).

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

109

Redox Enzymes of Red Beetroot Vacuoles...

Такими редокс-цепями переноса электронов на поверхности плазмалеммы, а SOD и POX в

могут быть ферментативные белковые комплексы клеточной стенке клеток растений, предполагает

(например, NADPH-оксидаза), ассоциированные с активную генерацию H2O2 в апопласте. При этом

мембранами ЭТЦ, ферментативные цепи и циклы очевиден редокс-путь (поток электронов): сначала

(например, тиольные цепи и аскорбат- от NADPH к O2, что приводит к формированию О^-;

глутатионовый цикл), и т.п. В одних случаях затем при дисмутации 2О2^- с участием SOD - к

редокс-элементы объединяются в цепь H2O2; и далее при участии пероксидазы - к H2O

транслокации электронов посредством (Gasaryan et al., 2000; Baranenko, 2006).

растворимых и мобильных переносчиков- Нарушение последовательности переноса

косубстратов (например, аскорбата и глутатиона) электронов между элементами такой редокс-цепи

(Jones, 2008). В других, основным фактором, вызывает спонтанное неконтролируемое

определяющим формирование функционально взаимодействие АФК со структурными молекулами

специализированных редокс-цепей, является как самого компартмента, так и с

компартментация (изоляция в клеточных внутриклеточными компонентами (в случае

структурах). Некоторые узко специализированные миграции H2O2 в цитоплазму), что в итоге может

цепи переноса электронов образуются только в привести к развитию окислительного стресса

определенных клеточных структурах, например, (Cherenkevich et al., 2013).

ЭТЦ хлоропластов, митохондрий, микросом. В вакуолярном компартменте с участием

Другие, напротив, могут функционировать в любой выявленных редокс-ферментов также можно

части клетки. Например, электронный поток, ожидать формирование редокс-цепей. Например,

происходящий между АФК и антиоксидантами, таких:

обнаружен практически во всех клеточных 1) POX (Fe3+/2+) ^ 2О/ + SOD (Cu2+/0) ^ H2O2 +

компартментах. POX (Fe3+/2+) ^ 2H2O.

Наличие тех или иных редокс-элементов в При переходе POX на оксидазный реакционный

определенном компартменте позволяет цикл вероятным продуктом первичного и вторичного

предположить вероятную организацию цепей окисления может быть O2^. Две молекулы

переноса электронов и вероятные «общие узлы» супероксидного анион-радикала с помощью SOD

такого переноса (как правило, ими являются образуют H2O2. Взаимодействуя с каталитическим

мобильные доноры электронов), что может служить центром POX, пероксид водорода, как уже

основанием для формирования представления о упоминалось выше, переводит ферментативный цикл

функциональной активности и специализации на пероксидазное окисление, в ходе которого он

компартмента (Jones, 2008; Melissa et al., 2008). восстанавливается до H2O (Chen, Schopfer,1999).

Так, присутствие NADPH-оксидазного комплекса Главными редокс-элементами в такой цепи

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

Pradedova et al.

110

переноса являются гем пероксидазы и ионы меди глутатионредуктазы и NADH, а восстановительными

SOD, а восстановительными эквивалентами - е- и эквивалентами - е- , H~ и H+ среды.

H (e- + H+). 4) GSSG + GR (FAD-NADH) ^ GSH + H2Q>^

2) POX (Fe3+/2+) ^ 2O2 " + SOD (Cu2+/0) ^ H2O2 + GSSG ^ GR (FAD-NADH).

GSH ^ GSSG + GR (FAD-NADH) ^ GSH. В вакуоли из цитозоля, как было установлено,

Образованный при совместном активно транспортируется GSSG,

функционировании POX и SOD пероксид водорода предположительно для утилизации (Zechmann et

может диффундировать на значительное al., 2006; Noctor et al., 2011). Однако в вакуолях

расстояние от POX. В этом случае восстановителем присутствует GR, поэтому возможен иной путь его

для H2O2 может быть GSH, который, как было метаболизма. Дисульфид глутатиона может

показано ранее, содержится в вакуолях (Shao et al., восстанавливаться в вакуолярном пространстве и

2008; Noctor et al., 2011). Пул восстановленного включаться в локальные редокс-процессы. В связи

глутатиона могут поддерживать вакуолярные GR. с этим будет формироваться специализированная

Главными редокс-элементами в такой редокс-цепи редокс-цепь, основные элементы которой - GSH,

будут: гем пероксидазы, ионы меди SOD, GSH, FAD глутатионредуктазы и NADH, а

FAD глутатионредуктазы и NADH. восстановительные эквиваленты - H~ и H+ среды.

Восстановительные эквиваленты этой цепи: e-, H и Убеждение в том, что редокс-элементы

H~. организуют редокс-пути, которые зависят от

3) POX (Fe3+/2+) + GSH ^ GSSG + GR (FAD- центральных или ключевых редокс-пар (например,

NADH) ^ GSH NAD(P)H, GSH, тиоредоксин и др.) и значительно

Известно, что донором электронов в отличаются функционально и кинетически,

пероксидазных реакциях POX может быть GSH усиливается изобилием информации о редокс-

(Rogozhin et al., 2004). Если такая реакция протекает зависимом контроле над физиологическими и

в вакуолярном пространстве, то один из путей сигнальными процессами (Jones, 2008). В связи с

метаболизма образующегося дисульфида GSSG, по этим в последние годы все чаще говорят о

всей видимости, будет его восстановление необходимости моделирования редокс-путей

вакуолярными GR. Главными редокс-элементами в (Jones, 2008; Melissa et al., 2008; Cherenkevich et

этом случае будут гем пероксидазы, GSH, FAD al., 2013).

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

111

Redox Enzymes of Red Beetroot Vacuoles...

Рисунок 1. Сравнение изоферментного состава пероксидаз вакуолей, катализирующих реакции пероксидазного и оксидазного типа. PAAG после IEF: а - тирозиназная активность с PC и PDA, pH 8.0; б - тирозиназная активность с PC и PDA, pH 5.0; в - пероксидазная активность с PC и PDA, рН5.0; г - тирозиназная активность с PC и PDA в присутствии 1,3-диэтил-2-тиомочевины, акцептора H2O2, pH 8.0; д - пероксидазная активность с DAB, pH 5.0; м - белковые маркеры для IEF (Pharmacia).

Рисунок 2. Активность глутатионредуктазы в вакуолях и тканевом экстракте, и ее ингибирование CDNB (2 мМ).

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

Pradedova et al.

112

Рисунок 3. Изменение активности глутатионредуктазы в зависимости от pH-условий: А - с NADPH (100 мкМ). Б - с NADH (100 мкМ).

Рисунок 4. Определение активности глутатионредуктазы (GR) в PAAG двумя методами: метод I -с применением MTT и DCPIP; метод II - с DTNB (ферментативная реакция с DTNB проявляется в виде желтого окрашивания, на рисунке для улучшения качества изображения цвет изменен на синий). а - GR пекарских дрожжей, окрашенная Кумасси R-250, служила маркером электроподвижности; б - GR пекарских дрожжей в качестве маркера ферментативной активности; в - активность изоформ GR вакуолей; г - активность изоформ GR экстрактов ткани.

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

113

Redox Enzymes of Red Beetroot Vacuoles...

Рисунок 5. Определение интактности вакуолей и чистоты вакуолярных фракций.

Ферментативными маркерами служили NAD-MDH и NADP-MDH, активность которых определяли в PAAG после электрофореза. а - содержимое изолированных вакуолей; б - экстракт ткани клеток корнеплодов столовой свеклы.

f

1

1

экстракт

ткани

Рисунок 6. Уровень активности супероксиддисмутазы (SOD) во фракциях изолированных вакуолей и тканевом экстракте клеток корнеплодов столовой свеклы. Активность рассчитана на количество образующегося в реакции биформазана (BF).

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

Pradedova et al.

114

Рисунок 7. Определение супероксиддисмутазной активности во фракциях изолированных вакуолей и тканевом экстракте в PAAG после IEF с помощью зимогафического метода. м - белковые маркеры (Pharmacia); а - активность пероксидазы в тканевом экстракте; б - активность SOD в тканевом экстракте; в - активность SOD в вакуолях. (Изображение зимограмм SOD негативное).

На основании результатов проведенного исследования можно сделать следующие выводы. Во-первых, в центральной вакуоли, как в любом клеточном компартменте, протекают редокс-реакции с участием редокс-ферментов. Во-вторых, исследованные редокс-ферменты вакуолей могут формировать специализированные редокс-цепи, в рамках которых проходят редокс-пути переноса электронов. Моделирование вакуолярных редокс-цепей позволит выявить приоритетные редокс-процессы, происходящие в вакуоли, что расширит представление о ее роли в редокс-метаболизме и, возможно, редокс-сигналинге растительной клетки. ACKNOWLEDGMENT

Исследование выполнено при поддержке

Российского фонда фундаментальных

исследований (грант № 14-44-04059 р_сибирь_а).

REFERENCES

Almagro L., Gomez Ros L.V., Belchi-Navarro S., Bru R., Ros Barcello A. and Pedreno M.A. (2009) Class III peroxidases in plant defense reactions. J. Exp. Bot., 60, 377-390.

Anderson J.V., Hess J.L. and Chevone B. (1990) Purification, characterization and immunological properties for two isoforms of glutathione reductase from eastern white pine needles. Plant Physiol., 94, 1402-1409.

Baranenko V.V. (2006) Superoxide dismutase in plant cells. Tsitologiya (Rus.), 48, 465-474.

Beauchamp C. and Fridovich I. (1971) Superoxide

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

115

Redox Enzymes of Red Beetroot Vacuoles...

dismutase: improved assays and an assay biochemistry: Transl. German. M .: Mir, 469 p.

applicable to acrylamide gels. Anal. Biochem., Edwards G.E., Nakamoto H., Bunell J.N. end Hatch

44, 276-287. M.D. (1985) Pyruvate, Pi dikinase and NADP-

Berezov T.T. and Korovkin B.F. (1998) Biological malate dehydrogenase in C4 photosynthesis:

chemistry: Uchebnik. 3rd (ed.), Revised. and properties and mechanism of light/dark

suppl. M.: Medicine, 704 p. regulation. Annu. Rev. Plant Physiol., 36, 255-

Bilzer M., Krauth-Siegel R.L., Schirmer R.H., 286.

Akerboom T.P.M., Sies H. and Schulz G.E. Ferreres F., Figueiredo R., Bettencourt S.,

(1984) Interaction of a glutathione S-conjugate Carqueijeiro I., Oliveira J., Gil-Izquierdo A.,

with glutathione reductase kinetic and X-ray Pereira D.M., Valentao P., Andrade P.B., Duarte

crystallographic studies. Eur. J. Biochem., 138, P., Barcelo A.R. and Sottomayor M.

373-378. Identification of phenolic compounds in isolated

Bradford M. (1976) A rapid and sensitive method for vacuoles of the medicinal plant Catharanthus

the quantitation of protein utilising the principal of roseus and their interaction with vacuolar class III

protein-dye binding. Anal. Biochem., 72, 248- peroxidase: an H2O2 affair? J. Exp. Botany., 62,

254. 2841-2854.

Carter C., Pan S., Zouhar J., Avila E.L., Girke T., Gaal O., Medgyesi G.A. and Vereczkey L.

Raikhel N.V. (2004) The vegetative vacuole Electrophoresis in the separation of biological

proteome of Arabidopsis thaliana reveals macromolecules. New York: John Wiley & Sons

predicted and unexpected proteins. Plant cell., Ltd, 422 p.

16, 3285-3303. Giannopolitis C.N. and Ries S.K. (1977) Superoxide

Chen S. and Schopfer P. (1999) Hydroxyl-radical dismutases: I. Occurrence in higher plants. Plant

production in physiological reactions a novel Physiol., 59, 309-314.

function of peroxidase. Eur. J. Biochem., 260, Jones D.P. (2008) Radical-free biology of oxidative

726-735. stress. Am. J. Physiol. Cell Physiol., 295, 849-

Cherenkevich S.N., Martinovich G.G., Martinovich I.V., 868.

Gorudko I.V. and Shamova E.V. (2013) Redox Kritskii M.S. and Telegina T.A. (2004) Coenzymes

regulation of cellular activity: concepts and and evolution of the RNA world. Uspekhi

mechanisms. Bulletin of the National Academy of Biologicheskoi Khimii, 44, 341-361.

Sciences of Belarus. Series of Biological Scien., Ksenzhek O.S. and Petrova S.A. (1986) The

1, 92-108. electrochemical properties of the redox-

Coleman J. and Rehm K.H. (2000) Visual reversible biological systems. M.: Nauka, 152 p.

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

Pradedova et al.

116

Leigh R.A., Branton D. (1976) Isolation of vacuoles from root storage tissue of Beta vulgaris L. Plant Physiol., 58, 656-662.

Levites E.V. (1986) Genetics of plant isozymes. Nauka: Sibir. Dep., 144 p.

Li J.L.Y., Sulaiman M., Beckett R.P. and Minibayeva F.V. (2010) Cell wall peroxidases in the liverwort Dumortiera hirsuta are responsible for extracellular superoxide production, and can display tyrosinase activity. Physiol. Plantarum., 138, 474-484.

Martinovich G.G. and Cherenkevich S.N. (2008) Redox processes in cells: Monograph. Mn .: BSU, 159 p.

Marty L., Siala W., Schwarzlander M., Fricker M.D., Wirtz M., Sweetlove L.J., Meyer Y., Meyer A.J., Reichheld J.P. and Hell R. (2009) The NADPH-dependent thioredoxin system constitutes a functional backup for cytosolic glutathione reductase in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 106, 9109-9114.

Melissa K., Go Y.M. and Jones D.P. (2008) Nonequilibrium thermodynamics of thiol/disulfide redox systems: a perspective on redox systems biology. Free Radic Biol Med., 44, 921-937

Murray R., Grenner D., Meyes P. and Rodwell V. (1993) Biochemiya cheloveka (Harper's biochemistry. 2 volumes. V. 1. Translat. Eng .M.: Mir, 384 p.

Nishikimi M., Rao N.A. and Yagi K. (1972) The occurrence of superoxide anion in the reaction of reduced phenasine methosulfate and molecular

oxygen. Biochem. Biophys. Res. Comm., 46, 849-856.

Noctor G., Queval G., Mhamdi A. Chaouch S. and Foyer C.H. (2011) Glutathione. The Arabidopsis Book. Published By: The American Society of Plant Biologists URL:

http://www.bioone.org/doi/full/10.1199/tab.0142, 9, 2-32.

Pradedova E.V., Isheeva O.D. and Salyaev R.K. (2009) Superoxide dismutase of palnt cell vacuoles. Biochemistry (Moscow) Supplement Series A: Membrane and Cell Biology, 3, 24-32.

Pradedova E.V., Nimaeva O.D., Trukhan I.S. and Salyaev R. K. (2014) Tyrosinase and superoxide dismutase activities of peroxidase in the vacuoles of beet roots. Russian J. of Plant Physiol., 61 , 7079.

Queval G., Jaillard D., Zechmann B. and Noctor G. (2011) Increased intracellular H2O2 availability preferentially drives glutathione accumulation in vacuoles and chloroplasts. Plant Cell and Environ., 34, 21-32.

Rautenkranz A.F., Li L., Machler F., Martinoia E. and Oertli J.J. (1994) Transport of ascorbic and dehydroascorbic acids across protoplast and vacuole membranes isolated from barley (Hordeum vulgare l. cv Gerbel) leaves. Plant Physiol., 106, 187-193.

Rogozhin V.V., Verkhoturov V.V. and Rogozhina T.V. (2004) Peroksidaza: stroenie i mekhanizm deistviya (Peroxidase: structure and mechanism of action). Irkutsk: Irkutsk. Gos. Tech. Univ., 200

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

117

Redox Enzymes of Red Beetroot Vacuoles...

p.

Saab-Rincon G. and Valderrama B. (2009) Protein engineering of redox-active enzymes. Antioxidants & redox signaling, 11, 167-189.

Salyaev R.K., Kuzevanov V.Y., Khaptogaev S.B. and Kopytchuk V.N. (1981) Isolation and purification of vacuoles and vacuolar membranes from plant cells. Russ. J. Plant Physiol., 25, 1295-1305.

Shao H. B., Chu L. Y., Lu Z. H. and Kang C. M. (2008) Primary antioxidant free radical scavenging and redox signaling pathways in higher plant cells. Int. J. Biol. Sci., 4, 8-14.

Shigeoka S., Onishi T., Nakano Y. and Kitaoka S. (1987) Characterization and physiological function of glutathione reductase in Euglena gracilisz. Biochem. J., 242, 511-515.

Tommasini R., Martinoia E., Grill E., Dietz K.J. and Amrhein N. (1993) Transport of oxidized glutathione into barley vacuoles: evidence for the involvement of the glutathione-S-conjugate ATPase. Zeitschrift Naturforsch., 48, 867-871.

Vanoni M.A., Wong K.K., Ballou D.P. and Blanchard J.S. (1990) Glutathione reductase: comparison of steady-state and rapid reaction primary kinetic isotope effects exhibited by the yeast, spinach, and Escherichia coli enzymes. Biochemistri, 29, 5790-5796.

Voskresenskaya, O.L., Alyabysheva, E.A. and Polovnikova, M.G. (2006) Bol'shoi praktikum po bioekologii, Ch. 1 (Large Manual on BioEcology), Ioshkar-Ola: Mariisk. Gos. Univ., 107 p.

Wingsle G., Gardestrom P., Haligren J.E. and Karpinski S. (1991) Isolation, purification, and subcellular localization of isozymes of superoxide dismutase from scots pine (Pinus sylvestris L.) Needles1. Plant Physiol., 95, 21-28.

Yudina R.S. (2012) Malate dehydrogenase in plants: Its genetics, structure, localization and use as a marker. Advances in Bioscience and Biotechnology, 3, 370-377.

Zholnin A.V. (2012) General chemistry: a textbook. V.A., Popkov, A.V., Zholnina (ed). M.: GEOTAR Media, 400 p.

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014