Определение специфических антител к бактериям Moraxella bovoculi в 8 сыворотке крови крупного рогатого скота методом ИФА

1. Aleksakhin, R.M. Prospects for the use of radiation technologies in the agricultural sector of the Russian Federation / R.M. Aleksakhin, N.I. Sanzharova, G.V. Kozmin, S.A. Geraskin, A.N. Pavlova // Bulletin of the Russian Academy of Natural Sciences. - 2014, No. 1. - P. 65.

2. Aleksakhin, R.M. Problems of Radioecology: The Evolution of Ideas. Results / R.M. Aleksakhin. -Moscow: Russian Agricultural Academy, 2006. - 880 p.

3. Aleksakhin, R.M. Nuclear Energy and the Biosphere / R.M. Aleksakhin. - M.: Energoizdat, 1982. -

215 p.

4. Bondarenko, A.P. Fundamentals of radiation ecology: textbook / A.P. Bondarenko - Pavlodar, 2006. - 124 p.

5. Vasin, M.V. Means of prevention and treatment of radiation injuries / M.V. Vasin. - M., 2004 . -

329 p.

6. Gaynutdinov, T.R. The effect of gamma radiation on the resistance of the causative agent of necrobacteriosis / T.R. Gaynutdinov, NB Tarasova, V.P. Shashkarov, A.M. Idrisov // Questions of modern science: problems, trends and prospects: X Intern. scientific - prakt. conf., Moscow, March 13, 2017. -M., 2017.- 5 p.

7. Patent RF No. 2675598 C1, IPC A61K 35/74, A61P 43/A method for the treatment of radiation injuries of the body / T.R. Gaynutdinov, R.N. Nizamov, V.P. Shashkarov, A.I. Nikitin, A.M. Idrisov, G.V. Konyukhov, N.B. Tarasova; Applicant and patent holder of the Federal State Budgetary Institution "«FCTRBS-ARRVI". - No. 2018123061; declared 06/25/2018; publ. 12/20/2018, Bull. Number 35.

8. Gaynutdinov, T.R. A method for the treatment of radiation injuries of the body / T.R. Gaynutdinov, R.N. Nizamov, V.P. Shashkarov, A.I. Nikitin, A.M. Idrisov, G.V. Konyukhov, N.M. Vasilevsky // Patent No. 2682712 C1 Ros. Federation, IPC A61K 35/74, A61K 39/085, A61P 43/00; Applicant and patent holder of the Federal State Budgetary Institution "FTsTRB-VNIVI". - No. 2018123042; declared 06/25/2018; publ. 03/21/2019, Bull. Number 9.

9. Ivanov, A.V. Radio vaccines: problems and prospects / A.V. Ivanov, R.N. Nizamov, G.V. Grooms. - Kazan .: Kazan publishing house. state Univ., 2008. - 499 p.

10. The use of ionizing radiation for the inactivation of pathogens of infectious diseases of farm animals: Guidelines / V.P. Shashkarov, T.R. Gaynutdinov A.M. Idrisov, V.A. Guryanova, K.N. Vagin, N.M. Vasilevsky, K.T. Ishmukhametov, M.I. Gulyukin - Moscow: RAS, 2019 .- 17 p.

11. Klemparskaya, N.N. Antibacterial immunity and radioresistance / N.N. Klemparskaya, N.V. Raeva, V.F.Sysoeva. - M .: Medgiz, 1963 .- 120 p.

12. Kozmin, G.V. Radiation technologies in agriculture and food industry / G.V. Kozmin, S.A. Geraskin, N.I. Sanzharova. - Obninsk: VNII RAE, 2015. - 400 p.

УДК:619:617.711/.713-002-022.6:636.2 DOI 10.33632/1998-698Х.2020-4-8-14

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ К БАКТЕРИЯМ MORAXELLA BOVOCULI В СЫВОРОТКЕ КРОВИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА МЕТОДОМ ИФА

Дуплева Л.Ш. - кандидат биологических наук, Спиридонов Г.Н. - доктор биологических наук, Хусаинов И.Т. - мл. н. с.

ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (420075, Казань, Научный городок-2, e-mail: vnivi@mail.ru).

Приведены результаты исследования по созданию иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета. В качестве основных компонентов в иммуноферментной тест-системе использованы антиген, изготовленный из штамма «СХ-Ч6№»-ДЕП» бактерий Moraxella bovoculi путем разрушения бактериальных клеток на ультразвуковом дезинтеграторе, а также положительная и отрицательная к бактериям Moraxella bovoculi сыворотки крупного рогатого скота. По результатам шахматного титрования антигена, контрольных сывороток и пероксидазного конъюгата установлены их оптимальные рабочие дозы. Проведено лабораторное испытание специфичности и чувствительности иммуноферментной тест-системы. В результате исследований установлено, что все компоненты набора чувствительны, специфичны и активны. С использованием «Набора

препаратов для выявления специфических антител к бактериям Moraxella bovoculi методом иммуноферментного анализа (ИФА)» проведено исследование проб сывороток крови крупного рогатого скота из различных в эпизоотическом отношении по инфекционному кератоконъюнктивиту скотоводческих хозяйств Республики Татарстан. Установлено, что иммуноферментная тест-система позволяет обнаруживать специфические антитела к бактериям Moraxella bovoculi у 97,3% здоровых вакцинированных и 95,8% больных инфекционным кератоконъюнктивитом животных. В то же время установлено, что компоненты набора не реагируют с сыворотками крови, полученными от интактных животных из благополучных по инфекционному кератоконъюнктивиту хозяйств. Таким образом, предлагаемая тест-система позволяет по титрам специфических антител в сыворотке крови выявлять больных животных среди невакцинированного поголовья и определить нпряженность иммунитета у вакцинированных животных. По результатам исследований на иммуноферментную тест-систему разработаны нормативные документы на ее изготовление, контроль и применение, получен патент РФ.

Ключевые слова: инфекционный кератоконъюнктивит, бактерии Moraxella bovoculi, крупный рогатый скот, антиген, иммуноферментный анализ.

Инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота бактериальной этиологии в настоящее время приобрел широкое распространение во всем мире, в том числе и в Российской Федерации. Заболевание наносит значительный экономический ущерб сельскохозяйственному производству за счет снижения продуктивности, потерь живой массы, иногда падежа животных, а также расходов на дорогостоящее лечение. Установлено, что ведущая роль в возникновении инфекционного кратоконъюнктивита крупного рогатого скота принадлежит гемолитическим бактериям Moraxella bovis и Moraxella bovoculi на фоне солнечного ультрафиолетового облучения или других возможных предрасполагающих факторов [2, 3, 6, 7, 8, 9, 11, 14].

Особое место в мероприятиях по борьбе с инфекционным кератоконъюнк-тивитом занимает диагностика и специфическая профилактика [10, 12, 13]. Диагноз на инфекционный керато-конъюнктивит устанавливают на основании клинико-эпизоотологического обследования поголовья крупного рогатого скота и лабораторного исследования патологического материала от больных животных. Недостатками лабораторного метода являются: трудоемкость и длительность исследований, требующих для постановки диагноза до 7 рабочих дней, высокая себестоимость исследования (дороговизна питательных сред, реактивов, затраты на приобретение и содержание лабораторных животных).

На сегодняшний день в Российской Федерации не разработан метод серологической диагностики инфекционного

кратоконъюнктивита крупного рогатого скота, вызываемого бактериями Moraxella bovoculi. В настоящее время для диагностики многих инфекционных заболеваний применяют серологические методы (РА, РСК, РДП, РНГА, ИФА и др.), позволяющие по титрам специфических антител в сыворотке крови выявлять больных животных, а также определять напряженность иммунитета у вакцинированных животных. Основным преимуществом метода ИФА являются высокая чувствительность, стабильность результатов при серийном выпуске реагентов набора, простота учета реакции, экспрессность [1, 2, 5].

Целю настоящих исследований явилась разработка иммуноферментной тест-системы для определение специфических антител к бактериям Moraxella bovoculi в сыворотке крови крупного рогатого скота.

Материалы и методы. При разработке иммуноферментной тест-системы использо-вали штамм бактерий Moraxella bovoculi, выделенный нами от больного инфекцион-ным кератоконъюнктивитом теленка и депонированный во Всероссийской госу-дарственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (Россия, 123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5, ФГБУ «ВГНКИ») под регистрационным номером «Штамм Moraxella bovoculi «СХ-Ч6 № -ДЕП» инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота». Штамм признан производственным и предназначен для изготовления вакцины против инфекции-онного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота и диагностикумов [4]. Уровень определяемых антител в ИФА

напрямую зависит от антигена, т.е. от метода его приготовления и используемого количества. Растворимый антиген для реакции ИФА изготовили по методу B. Bishop и др. (1982) из 24-часовой культуры штамма бактерий Moraxella bovoculi, смытой 0, 01М фосфатно-буферным физии-ологическим раствором (рН 7,2). Полученную бактериальную массу трижды отмывали в режиме центрифугирования при 2000 об/мин в течение 20 минут. Осадок ресуспендировали фосфатно-буферным физиологическим раствором и провели дезинтеграцию бактериальной массы на дезинтеграторе «Bandelin GM3100» при частоте 20 kHz ± 500Гц в течение 10 минут. После дезинтеграции суспензию бактерий Moraxella bovoculi осветлили центрифугированием при 2000 об/мин в течение 45 минут. В надосадочную жидкость добавили трихлоруксусную кислоту (ТХУ), доводя ее до 5% концентрации. Осадок дважды промывали в режиме центрифугирования 5% раствором ТХУ, затем осадок ресуспенди-ровали в дистиллированной воде и проводили диализ против водопроводной воды в течение 18-20 часов. Полученный антиген ресуспендировали в карбонатно-бикарбонатном буфере (pH 9,6), содержащем мертиолят в конечной концентрации 0,010,02%.

Для стандартизации в антигене определяли количество белка на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 280 нм и 235 нм. По результатам шахматного титрования антигена и контрольных сывороток установили в ИФА оптимальную рабочую концентрацию бактериального антигена.

Изготовление контрольной

положительной сыворотки к антигену бактерий Moraxella bovoculi осуществляли путем гипериммунизации клинически здорового молодняка крупного рогатого скота 7-месячного возраста. Для этой цели применяли корпускулярный антиген производственного штамма бактерий Moraxella bovoculi, содержащий 10 млрд. м.к. инактивированных формалином бактерий в 1 см3. Гипериммунизацию животных проводили 4-х кратно подкожно с интервалом 14 дней в нарастающих дозах. Производственное взятие крови производили при наличии специфических антител в сыворотке крови животных-продуцентов к бактериям Moraxella bovoculi в титрах 1:6400 - 1:12800 в ИФА.

Контрольную отрицательную сыворотку получали от молодняка крупного рогатого скота 7-месячного возраста из хозяйства, свободного от инфекционного кератоконъюнктивита, после выдерживания их в карантине в течение 2 месяцев.

С использованием полученных компонентов составлен «Набор препаратов для выявления специфических антител к бактериям Moraxella bovoculi методом иммуноферментного анализа (ИФА)». В состав иммуноферментной тест-системы входят:

- планшеты для иммуноферментного анализа с адсорбированным антигеном бактерий Moraxella bovoculi - 2 шт.

- контрольная положительная сыворотка (К+), 1 см3 - 1 ампула.

- контрольная отрицательная сыворотка (К-), 1 см3 - 1 ампула.

- 25-кратный концентрат фосфатно-буферного раствора с Твином-20 для промывки планшетов (ФБР-Т), 20 см3 - 2 флакона.

- буфер для разведения конъюгата (БРК), 10 см3 - 1 флакон.

- антитела к иммуноглобулину G (IgG) крупного рогатого скота, меченые пероксидазой хрена (конъюгат), 0,2 см3 - 1 ампула.

- фостфатно-цитратный буфер (ФЦБ), 10 см3 - 2 флакона.

- хромоген, ортофенилендиамин (ОФД), 4мг - 2 флакона.

- перекись водорода (Н2О2) 3% р-р, 10 см3 - 1 флакон.

- 0,1М серная кислота (стоп-реагент), 10 см3 - 2 флакона.

По внешнему виду контрольные положительная и отрицательная сыворотки -гомогенная аморфная масса светло-желтого цвета, антивидовой пероксидазный конъюгат против IgG быка - гомогенная аморфная масса серого цвета, а растворы: ФБР-Т, БРК, ФЦБ, стоп-реагент - прозрачные, бесцветные жидкости, ортофенилендиамин (ОФД) -светло-желтый кристаллический порошок.

Иммуноферментная тест-система рассчитана для проведения одновременного анализа на одном планшете 46 исследуемых проб сывороток крови в одном разведении (в двух повторах) и 2 контрольных сывороток (в двух повторах) или 22 исследуемых проб сывороток крови (в четырех разведениях) и 2 контрольных сывороток (в четырех разведениях) или 10 проб сывороток крови в

восьми разведениях и 2 контрольных сывороток (в восьми разведениях).

Результаты исследований. Проводили лабораторное испытание специфичности и чувствительности иммуноферментной тест-системы, предназначенной для выявления специфических антител к бактериям Moraxella bovoculi методом иммуно-ферментного анализа. При этом в опыте использовали:

- 10 проб сывороток крови крупного рогатого скота, полученные из благо -получного по инфекционному керато-конъюнктивиту хозяйства;

- 45 проб сывороток крови молодняка крупного рогатого скота после первой и 45 проб после второй иммунизации вакциной против инфекционного кератоконъюнкти-вита крупного рогатого скота на основе антигена бактерий Moraxella bovoculi;

- 3 пробы гипериммунной сыворотки против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозной диареи телят;

- 3 пробы сыворотки положительной к ротавирусу КРС (из набора для диагностики ротавирусного энтерита КРС методом иммуноферментного анализа «РОТА-ИФА ВИЭВ»);

- 3 пробы специфической сыворотки к инфекционному ринотрахеиту (ИРТ) крупного рогатого скота.

- 3 пробы контрольной положительной сыворотки крупного рогатого скота к бактериям Moraxella bovoculi;

- 3 пробы контрольной отрицательной сыворотки крупного рогатого скота.

Учет и интерпретацию результатов реакции проводили после остановки реакции по показаниям оптической плотности субстратно-индикаторной смеси на спектрофотометре при длине волны 490 нм (ОП490). При этом производили расчет коэффициента специфичности, который равен отношению оптической плотности продукта реакции в лунках с контрольной положительной (ОП490К+) или исследуемой сывороткой (ОП490 ИП) к оптической плотности контрольной отрицательной сыворотки (ОП490 К-). Реакцию считали положительной, если коэффициент специфичности был выше 2,0, а отрицательной - если ниже 2,0.

Результаты испытаний специфичности и чувствительности иммуно-ферментной тест-системы представлены в таблице 1 .

Таблица 1 - Результаты испытаний специфичности и чувствительности набора препаратов для выявления специфических антител к бактериям Moraxella bovoculi методом иммуноферментного анализа

Сыворотка крови Уровень антител в ИФА к Moraxella bovoculi, 1/n

200 400 800 1600 3200 6400 12800

от клинически здоровых невакцинированных животных (n' =10) 1 - - - - - -

от иммунизированных однократно вакциной против ИКК животных (n=45) - 2 3 10 30 - -

от иммунизированных двукратно вакциной против ИКК животных (n=45) - - - 1 16 28 -

положительная к антигенам E. coli и Cl. perfringens (n=3) - - - - - - -

положительная к ротавирусу КРС (n=3) - - - - - - -

положительная к герпесвирусу типа 1 (возбудитель ИРТ) (n=3) - - - - - - -

контрольная отрицательная (n=3) - - - - - - -

контрольная положительная к Moraxella bovoculi (n=3) - - - - - 1 2

Из данных таблицы 1 следует, что все компоненты набора чувствительны,

специфичны и активны. Антиген бактерий Moraxella bovoculi не реагирует в ИФА с гетерологичными сыворотками крови (против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозной диареи телят, положительными сыворотками к ротавирусу и вирусу ИРТ КРС), тогда как с

гомологичными сыворотками, полученными от вакцинированных против инфекционного кератоконъюнктивита дает положительную реакцию в титрах 1:400 - 1:6400, с положительной сывороткой к Moraxella bovoculi - 1:6400 - 1:12800.

Провели производственное испытание эффективности набора с использованием

образцов крови крупного рогатого скота, доставленных из различных в эпизоотическом отношении по инфекционному керато-конъюнктивиту скотоводческих хозяйств Республики Татарстан. При этом исследовали сыворотки крови от больных, не

Из данных таблицы 2 видно, что компоненты набора обладают высокой специфичностью в ИФА. Они позволяют определить специфические антитела к бактериям Moraxella bovoculi у 97,3% здоровых вакцинированных животных и 95,8% больных инфекционным кератоконъюнктивитом животных.

В то же время установлено, что компоненты набора не реагируют с сыворотками крови, полученными от интактных животных из благополучных по инфекционному кератоконъюнктивиту хозяйств.

Таким образом, предлагаемая тест-система позволяет по титрам специфических антител в сыворотке крови выявлять больных животных среди невакцинированного поголовья и определить напряженность

вакцинированных и здоровых, вакцинированных животных из неблагополучных по инфекционному кератоконъюнктивиту хозяйств, а также от интактных животных из благополучных хозяйств. Результаты исследования представлены в таблице 2.

иммунитета у вакцинированных животных. По результатам исследований на иммуно-ферментную тест-систему разработаны нормативные документы на ее изготовление, контроль и применение, получен патент РФ.

Заключение. Разработанная иммуно-ферментная тест-система универсальна, обладает высокой специфичностью и чувствительностью, не требует сложного оборудования и приемлема для проведения анализов в массовых количествах. Тест-систему можно использовать как для диагностики инфекционного кератоконъюнк-тивита крупного рогатого скота среди невакцинированного поголовья в стационарно неблагополучных хозяйствах, так и для определения напряженности поствакцинального иммунитета и изучения иммунного статуса у вакцинированных животных.

Таблица 2 - Результаты исследования сывороток крови крупного рогатого скота на наличие специфических антител к бактериям Moraxella bovoculi_

На' именование хозяйства Кол-во проб Состояние животных Реагируют положительно в ИФА

Кол-во %

ООО «Хаерби» 56 здоровые, вакцинированые против инфекционного кератоконъюнктивита 54 96,4

СХ' ПК «Енали» 80 79 98,8

КФХ «Кутлушкино» 50 48 96,0

ООО «Среднее Девятово» 38 37 97,4

Всего 224 218 97,3

ООО «Агрофирма «Татарстан» 48 Больные инфекционным кератоконъюнктивитом, не вакцинированные 46 95,8

КФХ «Сарапкина О.Н.» 39 37 94,9

КФХ «Луч» 57 55 96,5

Всего 144 138 95,8

КФХ «Сулейманов А.И.» 79 здоровые, интактные - 0,0

ООО «Дусым» 40 - 0,0

ООО «Серп и Молот» 35 - 0,0

Всего 154 - 0,0

Литература

1. Васильев, Д.А. Современные методы иммунодиагностики инфекционных болезней / Д.А. Васильев, П.И. Барышников, Б.В. Новиков - Ульяновск. - 1998. - С. 15.

2. Гаффаров, Х.З. Иммуноферментный анализ в диагностике реовирусной инфекции крупного рогатого скота / Х.З. Гаффаров, М.А. Ефимова, О.В. Москвичев // Ветеринарный врач. -2011. - №5. - С. 14.

3. Карайченцев, Д.В. Совершенствование лабораторной диагностики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота: автореф. дис. ... к. вет. наук. / Карайченцев Данила Викторович. - М. - 2016. - 23 с.

4. Патент РФ, № 2 521651 МПК d2N 1/20, А61К 39/00 Штамм бактерий Moraxella bovoculi «СХ-Ч6 №-ДЕП», используемый для изготовления диагностикумов и вакцин против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота / А.В. Иванов, Г.Н. Спиридонов, А.А. Иванов [и др.]; заявитель ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». - 2013117096/10; опубл. 10.07.2014, Бюл. № 19.

5. Спиридонов, А.Г. Иммуноферментный метод диагностики анаэробной энтеротоксемии животных / А.Г. Спиридонов // Ветеринарный врач. - Казань. - 2018. - №6. - С. 26.

6. Спиридонов, Г.Н. Биологические свойства бактерий Moraxella bovoculi - возбудителя инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота / Г.Н. Спиридонов, Л. В. Валебная, Л.Ш. Дуплева [и др.] // Ветеринарный врач. - 2017. - №3. - С. 8.

7. Angelos, J.A. Cloning and characterization of a Moraxella bovis cytotoxin gene / J.A. Angelos, J.F. Hess, L.W. George // Am. J. Vet. Res. - 2001. - V. 62. - P. 1222.

8. Angelos, J.A. Differentiation of Moraxella bovoculi sp. nov. from other coccoid moraxellae by the use of polymerase chain reaction and restriction endonuclease analysis of amplified DNA / J.A. Angelos, L.M. Ball // J. Vet. Diagn. Invest. - 2007. - V. 19 - P. 532.

9. Angelos, J.A Recombinant Moraxella bovoculi cytotoxin-ISCOM matrix adjuvanted vaccine to prevent naturally occurring infectious bovine keratoconjunctivitis / J.A. Angelos, V.M. Lane, L.M. Ball, J. F. Hess // Vet. Res. Commun. - 2010. - V. 34(3). - P. 229.

10. Bishop, B. Enzyme - linked immunosorbent assay for measurement of anti - Moraxella bovis antibodies / B. Bishop, G.G. Schurig, H.F. Troutt // Am. J. Vet. Res. - 1982. - V. 43. - P. 1443.

11. Galväo, K.N. Ulcerative blepharitis and conjunctivitis in adult dairy cows and association with Moraxella bovoculi / N. K. Galväo, J. A. Angelos // Can Vet J. - 2010. - V. 51(4). - P. 400.

12. Lapper, A.W.D. Vaccination against infectious bovine keratoconjunctivitis: protective efficacy and antibody response induced by by pili of homologous und heterologous Strains of Moraxella bovis / A.W.D. Lapper. // Austr. Vet. J. - 1988. - 65-10- P. 129.

13. McConnel, C.S. Serologic cross-reactivity of Australian Moraxella bovis to vaccinal bacterin trains as determined by competitive ELISA / C.S McConnel, L. Shum, B.L. Gleeson, J.K. House // J. Aust. Vet. 2008. -V.86 - P. 124.

14. Postma, G.C. Moraxella bovis pathogenicity: an update / G.C. Postma, J.C. Carfagnini, L. Minatel // Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 2008. - V. 31 (6). - P. 449.

DETERMINATION OF SPECIFIC ANTIBODIES TO MORAXELLA BOVOCULI BACTERIA IN BLOOD

SERUM OF CATTLE BY ELISA

Dupleva L.Sh. - Candidate of Biological Sciences, Spiridonov G.N. - Doctor of Biological Sciences,

Khusainov I.T. - junior research.

FSBSI "Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety",

The results of a study on the creation of an enzyme immunoassay system for the serological diagnosis of infectious keratoconjunctivitis in cattle and the control of post-vaccination immunity are presented. The antigen made from the «SH-CH6 DEP» strain of Mraxella bovoculi bacteria by destroying bacterial cells on an ultrasonic disintegrator, as well as cattle serum positive and negative for Moraxella bovoculi bacteria, were used as the main components in the enzyme immunoassay system. According to the results of chess titration of antigen, control sera and peroxidase conjugate, their optimal working doses were established. A laboratory test of the specificity and sensitivity of the enzyme-linked immunosorbent assay system was carried out. As a result of studies, it was found th' at all components of the kit are sensitive, specific and active. Using the «Drug Kit for the Detection of Specific Antibodies to Moraxella bovoculi Bacteria by Enzyme Immunoassay (ELISA)», a study was carried out of blood serum samples from cattle from various epizootic infectious keratoconjunctivitis cattle farms in the Republic of Tatarstan. An enzyme-linked immunosorbent assay system was found to detect specific antibodies to Moraxella bovoculi bacteria in 97,3% of healthy vaccinated and 95,8% ofpatients with infectious keratoconjunctivitis animals. At the same time, it was found that the components of the kit do not react with blood sera obtained from intact animals from farms that are successful in infectious keratoconjunctivitis. Thus, the proposed test system allows the titer of specific

antibodies in the blood serum to identify sick animals among unvaccinated livestock and determine the intensity of immunity in vaccinated animals. Based on the results of studies on the enzyme immunoassay test system, regulatory documents for its manufacture, control and use were developed, and a RF patent was obtained.

Keywords: infectious keratoconjunctivitis, bacteria Moraxella bovoculi, cattle, antigen, enzyme-linked immunosorbent assay.

References

1.Vasilev, D.A. Sovremennyie metodyi immunodiagnostiki infektsionnyih bolezney [Modern methods of immunodiagnostics of infectious diseases] / D.A. Vasilev, P.I. Baryishnikov, B.V. Novikov / Ulyanovsk. -1998. - P. 15.

2.Gaffarov, H.Z. Immunofermentnyiy analiz v diagnostike reovirusnoy infektsii krupnogo rogatogo skota [Enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of rheovirus infection in cattle] / H.Z. Gaffarov, M.A. Efimova, O.V. Moskvichev // Veterinarnyiy vrach. - 2011. - №5. - P. 14.

3.Karaychentsev, D.V. Sovershenstvovanie laboratornoy diagnostiki infektsionnogo keratokon'yunktivita krupnogo rogatogo skota: avtoref. dis. ... k. vet. nauk. [Improving the laboratory diagnosis of infectious keratoconjunctivitis in cattle] / D.V. Karaychentsev / M. - 2016. - 23 p.

4. Patent № 2521651 Ros. Federatsiya, MPK S12N 1/20, A61K 39/00. Shtamm bakteriy Moraxella bovoculi «SH-CH6 DEP», ispolzuemyiy dlya izgotovleniya diagnostikumov i vaktsin protiv infektsionnogo keratokonyunktivita krupnogo rogatogo skota [The bacterial strain Moraxella bovoculi «SH-CH6 DEP» used for the manufacture of diagnosticums and vaccines against infectious keratoconjunctivitis in cattle] / A.V. Ivanov, G.N. Spiridonov, A.A. Ivanov [i dr.]; zayavitel FGBU «FTsTRB-VNIVI». -2013117096/10; opubl. 10.07.2014, Byul. №19.

5. Spiridonov, A.G. Immunofermentnyiy metod diagnostiki anaerobnoy enterotoksemii zhivotnyih [Enzyme im' munoassay for the diagnosis of animal anaerobic enterotoxemia] / A.G. Spiridonov // Veterinarnyiy vrach. - Kazan. - 2018. - №6. - P. 26.

6. Spiridonov, G.N. Biologicheskie svoystva bakteriy Moraxella bovoculi - vozbuditelya infektsionnogo keratokonyunktivita krupnogo rogatogo skota [Biological properties of bacteria Moraxella bovoculi - the causative agent of infectious keratoconjunctivitis in cattle] / G.N. Spiridonov, L.V. Valebnaya, L.Sh. Dupleva [i dr.] // Veterinarnyiy vrach. - 2017. - № 3. - P. 8.

7. Angelos, J.A. Cloning and characterization of a Moraxella bovis cytotoxin gene / J.A. Angelos, J.F. Hess, L.W. George // Am. J. Vet. Res. - 2001. - V. 62. - P. 1222.

8. Angelos, J.A. Differentiation of Moraxella bovoculi sp. nov. from other coccoid moraxellae by the use of polymerase chain reaction and restriction endonuclease analysis of amplified DNA / J.A. Angelos, L.M. Ball // J. Vet. Diagn. Invest. - 2007. - V. 19 - P. 532.

9. Angelos, J.A Recombinant Moraxella bovoculi cytotoxin-ISCOM matrix adjuvanted vaccine to prevent naturally occurring infectious bovine keratoconjunctivitis / J.A. Angelos, V.M. Lane, L.M. Ball, J. F. Hess // Vet. Res. Commun. - 2010. - V. 34(3). - P. 229.

10. Bishop, B. Enzyme - linked immunosorbent assay for measurement of anti - Moraxella bovis antibodies / B. Bishop, G.G. Schurig, H.F. Troutt // Am. J. Vet. Res. - 1982. - V. 43. - P. 1443.

11. Galvao, K.N. Ulcerative blepharitis and conjunctivitis in adult dairy cows and association with Moraxella bovoculi / N. K. Galvao, J. A. Angelos // Can Vet J. - 2010. - V. 51(4). - P. 400.

12. Lapper, A.W.D. Vaccination against infectious bovine keratoconjunctivitis: protective efficacy and antibody response induced by by pili of homologous und heterologous Strains of Moraxella bovis / A.W.D. Lapper. // Austr. Vet. J. - 1988. - 65-10- P. 129.

13. McConnel, C.S. Serologic cross-reactivity of Australian Moraxella bovis to vaccinal bacterin trains as determined by competitive ELISA / C.S McConnel, L. Shum, B.L. Gleeson, J.K. House // J. Aust. Vet. 2008. -V.86.- P. 124 -129.

14. Postma, G.C. Moraxella bovis pathogenicity: an update / G.C. Postma, J.C. Carfagnini, L. Minatel // Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 2008. - V. 31 (6). - P. 449.