СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛОКАЛИЗАЦИИ БЕЛКОВ В ВЫСОХШЕЙ КАПЛЕ СЫВОРОТКИ (ПЛАЗМЫ) КРОВИ
METHOD FOR DETECTION OF PROTEINS LOCALISATION IN DRY DROP OF SERUM OF BLOOD (PLASM)

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения наличия и локализации различных групп органических веществ, в частности белков, с диагностическими или исследовательскими целями.
Известен способ определения локализации отдельных групп белков в высохшей капле сыворотки крови (см. Яхно Т.А., Яхно В.Г., Санин А.Г., и др. Белок и соль: пространственно-временные события в высыхающей капле. // Журнал технической физики. - 2004 г. - т.49, вып.8. - С.1055-1063).
Известный способ заключается в том, что высохшую каплю плазмы крови, приготовленную методом клиновидной дегидратации, после фиксации с целью выявления кислых гликопротеинов окрашивают с помощью реактива Шиффа, т.е. йодной кислотой (ШИК-реакция). После окраски на поверхности ШИК-отрицательного мелкоячеистого геля появлялась крупноячеистая сеть (ШИК-положительная).
Однако известный способ имеет ряд недостатков. Прежде всего, такой подход не позволяет отслеживать миграцию различных групп белков при испарении жидкости. Это лишает исследователя возможности делать какие-либо выводы о процессах, происходящих в биологических жидкостях при высыхании. Кроме того, проведение фиксации вносит искажение в конечный результат исследования: при данном способе обработки вымываются все солевые компоненты.
За прототип предлагаемого изобретения выбран известный способ определения локализации белков в высохшей капле сыворотки (плазмы) крови, включающий забор биологического материала, высушивание капли на горизонтально расположенном стекле при комнатной температуре в течение 18-24 часов, последующий анализ дегидратированной капли с помощью светового микроскопа и определение локализации белков в краевой зоне высохшей капли (см. Шабалин В.Н., Шатохина С.Н. Морфология биологических жидкостей человека. - М.: Хризостом, 2001. - С.304). По данным авторов способа белки расположены в краевой зоне высохшей капли.
Однако известный способ не дает возможность аргументировано подтвердить место локализации белков в высохшей капле биологической жидкости и не позволяет идентифицировать типовую принадлежность белков (например, разделить гликопротеины, альбумины, липопротеины).
Задачей предлагаемого изобретения является обеспечение возможности определения локализации в высохшей капли крови различных групп белков.
Поставленная задача решается тем, что в известном способе определения локализации белков в высохшей капле сыворотки (плазмы) крови, включающем исследование биологической жидкости методом клиновидной дегидратации и определение белков в краевой зоне высохшей капли, предварительно к исследуемой жидкости добавляют концентрированный раствор водорастворимого красителя в соотношении 3:1, перемешивают, высушивают каплю материала на горизонтально расположенном стекле при комнатной температуре в течение 18-24 часов, анализируют с помощью светового микроскопа и определяют локализацию различных типов белков в высохшей капле, при этом иммуноглобулины определяют в центре капли, липопротеиды в промежуточной зоне и альбумины по краю высохшей капли. В качестве водорастворимых красителей используют амидочерный 10В или толуидиновый синий.
Предлагаемое изобретение отвечает критерию «новизна», так как в процессе проведенных патентно-информационных исследований по патентной и научно-технической литературе не выявлено источников информации, которые бы порочили новизну изобретения.
Предлагаемое изобретение отвечает критерию «изобретательский уровень», так как не выявлено технических решений с существенными признаками предлагаемого способа.
Известно применение красителей в гистологии для определения местоположения различных веществ (Пирс Э. Гистохимия теоретическая и прикладная. М: «Иностранная литература», 1962. - С.962). При гистохимических реакциях неорганические и органические вещества изучаемых объектов вступают в химическую реакцию с различными красителями и образуют окрашенные продукты реакции. По степени интенсивности этих продуктов можно судить не только о расположении, но и о количественном содержании химического вещества (О.В.Волкова, Ю.К.Елецкий. Основы гистологии с гистологической техникой. М.: «Медицина», 1982. - С.304).
В научной литературе отсутствуют сведения об использовании водорастворимых красителей для исследования наличия и локализации белков различной типовой принадлежности в высохшей капле, полученной методом клиновидной дегидратации.
Предварительно была проведена исследовательская работа по определению типа красителей и их необходимой концентрации. От применения растворимых в спирте и других органических растворителях гистохимических красителей пришлось отказаться, поскольку при добавлении их к содержащим белки жидкостям происходила денатурация последних. В ходе экспериментальной разработки способа были изучены практически все известные водорастворимые красители, традиционно применяемые для окраски белков (метиленовый голубой, кармин, альциановый голубой, амидочерный 10В, кумасси бриллиантовый синий R-250, оранжевый G, бромфеноловый синий, толуидиновый синий, бромкрезоловый пурпурный).
Наиболее информативными были результаты, полученные с окрашиванием следующими водорастворимыми красителями - амидочерный 10В и толуидиновый синий. Только при использовании для окрашивания двух вышеназванных водорастворимых красителей специфично окрашивались только протеины, при отсутствии окраски пептидов, и имело место максимальное количество концентрических зон окраски различных групп белков, то есть наиболее точно осуществлялась их дифференциация.
В ходе разработки предлагаемого способа экспериментальным путем была доказана необходимость и достаточность для определения локализации белков появления характерной окраски в какой-либо зоне высохшей капли крови при добавлении амидочерного 10В или толуидинового синего.
Были исследованы и проанализированы образцы сыворотки крови от 14 трупов, доставленных в Нижегородское Областное Бюро СМЭ для проведения вскрытия. Из них 5 скончались от отравления наркотическими и сильнодействующими веществами, 3 - от различных заболеваний (ни алкоголя, ни наркотических веществ обнаружено не было), 6 - от алкогольной интоксикации. Исследовали кровь от трупов лиц с давностью наступления смерти 24-48 часов до момента вскрытия. Также были исследованы образцы сыворотки крови от 20 больных и 4 практически здоровых людей, проходивших обследование в Нижегородском областном клиническом диагностическом центре.
Описание чертежей
На фиг.1 показано изображение высохшей капли сыворотки крови при добавлении амидочерного 10В (ув.×15).
На фиг.2 показано изображение высохшей капли раствора, содержащего гнексапептид (аргинил-альфа аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин), с добавлением амидочерного 10В (ув.×15).
На фиг.3 показано изображение высохшей капли сыворотки крови практически здорового человека при добавлении толуидинового синего (ув.×15).
1
2
На фиг.4 показано изображение высохшей капли сыворотки крови больного с повышенным содержанием γ-глобулинов и снижением содержания альбуминов, нормальным содержанием глобулинов α, α и β, уровнем общего холестерина и холестерина ЛПНП при добавлении толуидинового синего (ув.×15).
1
2
На фиг.5 показано изображение высохшей капли сыворотки крови больного с содержанием α, α, γ-глобулинов, соответствующим норме, снижением содержания альбуминов, повышенным уровнем β-глобулинов, уровнем общего холестерина и холестерина ЛПНП при добавлении толуидинового синего (ув.×15).
Предложенным способом исследовали сыворотку крови 20 больных с нарушением процентного соотношения белковых фракций (диспротеинемией). Параллельно определяли общее количество белка в сыворотке крови, процентное соотношение белковых фракций, уровень общего холестерина, холестерин ЛПНП, ЛПВП. Высохшие капли фотографировали и рассчитывали соотношение ширины различных зон окраски к их радиусу (для каждой из окрашенных капель проводили 3 измерения). Затем определяли коэффициенты корреляции между этими показателями и величинами белковых фракций сыворотки, общим холестерином, холестерином ЛПНП, ЛПВП.
При применении красителей (амидочерный 10В и толуидиновый синий) наблюдалось четыре концентрических зоны окраски: краевая, промежуточная, состоящая из двух подзон, и центральная.
Обнаружена прямая взаимосвязь между содержанием альбуминов в сыворотке крови и шириной краевой зоны. Обратная взаимосвязь наблюдалась с шириной центральной зоны и промежуточной зоны.
Следовательно, при высыхании капля сыворотки крови альбумины группируются в краевой зоне.
Суммарное содержание глобулинов прямо коррелировало с шириной центральной зоны и промежуточной зоны. Обратная связь наблюдалась с шириной краевой зоны.
Следовательно, глобулины располагаются в центральной и промежуточных зонах высохшей капли сыворотки крови.
1
2
С размерами промежуточной зоны прямо коррелировало содержание глобулинов α, α и β. Известно (Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. М: Медицина, 1982. - С.750), что ά- и β-глобулиновые фракции содержат липопротеиды.
Содержание γ-глобулинов (иммуноглобулинов) прямо связано с размерами центральной зоны и обратно с шириной краевой зоны.
1
2
Таким образом, складывается следующая картина расположения групп белков в высохшей капле сыворотки крови: альбумины - краевая зона; α, α, β-глобулины - промежуточная зона, γ-глобулины (иммуноглобулины) - центральная зона.
Кроме того, обнаружена прямая корреляция уровня холестерина ЛПВП с шириной промежуточной зоны.
Опыты с сывороткой крови больных с гиперлипидемией (5 образцов) показали, что осаждение липидов и липопротеидов (добавлением хлороформа с последующим центрифугированием при 11 тыс. об/мин) приводит к исчезновению промежуточной зоны высохшей капли.
Таким образом, местом локализации липопротеинов является промежуточная зона.
Предлагаемый способ при использовании дает следующий положительный эффект. Способ позволяет определить наличие и локализацию, то есть зоны расположения различных групп белков в высохшей капле сыворотки (плазмы) крови, и предварительно оценить их количество.
Способ прост в исполнении, не требует дорогостоящего оборудования и реактивов, большого количества исследуемого материала, что позволяет в дальнейшем проводить другие виды исследований. Способ может быть использован в клинико-лабораторных исследованиях с диагностическими целями.
Предполагаемый способ осуществляют следующим образом.
К исследуемой жидкости добавляют концентрированный раствор водорастворимого красителя в соотношении 3:1, перемешивают. Затем на предметное стекло, специальным образом обработанное, расположенное строго горизонтально, наносят каплю приготовленной смеси объемом 0,01 мл (10 мкл). При этом диаметр капли составляет около 5 мм. Делают 6 повторов для проверки достоверности и взаимной идентичности высохшей капли. Высушивание проводят при температуре 20-25°С и относительной влажности 65-70% вдали от нагревательных приборов и прямых солнечных лучей при минимальной подвижности окружающего воздуха. В процессе высыхания капля должна быть неподвижной. Продолжительность периода высыхания составляет 18-24 часов. Вид и структуру дегидратированной капли оценивают с помощью микроскопа в отраженном свете при увеличении 10×8. В сыворотке (плазме) крови иммуноглобулины определяют в центре капли, липопротеины - в промежуточной зоне капли и альбумины - по краю высохшей капли. В качестве водорастворимых красителей используют амидочерный 10В или толуидиновый синий.
Примеры использования предлагаемого способа при установлении локализации белков в высохшей капле сыворотки (плазмы) крови.
Пример 1. Способность амидочерного 10В образовывать с белками окрашенный комплекс была использована для выявления локализации белков в высохшей капле сыворотки крови (фиг.1) и для сравнения в капле раствора, содержащего гексапептид (аргинил-альфа аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин) (фиг.2).
Связывание с белками амидочерного 10В весьма специфично: нуклеиновые кислоты, полисахариды, аминокислоты и некоторые другие азотсодержащие вещества не дают с ним окрашенных производных. С помощью взаимодействия с амидочерным черным 10В определяют белок в растворах с довольно низкой концентрацией - до 0,75 мкг/мл (Шишкин С.С. Использование связывания красителей для количественного определения содержания белка в растворах (обзор) // Вопросы медицинской химии. - 1982. - №5, т.28. - С.134-141).
Для высохшей капли сыворотки крови с добавлением раствора амидочерного 10В (фиг.1) характерно наличие ярко окрашенной коричневой широкой краевой зоны и нескольких менее интенсивно окрашенных зон ближе к центру. Раствор пептида с добавлением того же красителя дает неокрашенную высохшую каплю (фиг.2).
Пример 2. Женщина 1982 г.р. проходила обследование в Нижегородском областном клиническом диагностическом центре, в ходе которого было выявлено содержание γ-глобулинов - 19,4% от общего содержания белков (верхняя граница нормы - 18,3%) и снижение содержания альбуминов до 53,3% (при нижней границе нормы - 58,8%). Для выявления локализации различных групп белков к сыворотке крови был добавлен концентрированный раствор толуидинового синего в соотношении 3:1 (фиг.4). Было обнаружено незначительное снижение ширины краевой зоны и увеличение диаметра центральной зоны по сравнению с высохшей каплей сыворотки крови практически здорового человека (фиг.3).
1
2
Пример 3. Мужчина 1966 г.р. проходил обследование в Нижегородском областном клиническом диагностическом центре, в ходе которого было выявлено снижение содержания альбуминов до 53,8% (при нижней границе нормы - 58,8%), нормальное содержание α, α γ-глобулинов, повышенный уровень β-глобулинов - 15,1% при верхней границе нормы - 13,6%), повышенный уровень общего холестерина (6,9 мМ/л, при верхней границе нормы - 6,5 мМ/л) и холестерина ЛПНП (4,8 мМ/л, при верхней границе нормы 4,12 мМ/л). Для выявления локализации различных групп белков к сыворотке крови был добавлен концентрированный растворы толуидинового синего в соотношении 3:1 (фиг.5). Выявлено незначительное снижение ширины краевой зоны и увеличение ширины промежуточной зоны по сравнению с высохшей каплей сыворотки крови практически здорового человека (фиг.3).
Таким образом, с помощью вышеуказанного способа можно объективно установить месторасположение тех или иных веществ в высохшей капле любой биологической жидкости, полученной методом клиновидной дегидратации. Данный способ, как и все методики, основанные на связывании красителей, при достаточно высокой чувствительности не требует каких-либо специальных условий и предназначен для массовых анализов.