СПОСОБ ИММУНОТЕРАПИИ ОПУХОЛЕЙ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
METHOD OF EXPERIMENTAL IMMUNE THERAPY OF TUMOURS

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальным исследованиям в онкологии, и может быть использовано при исследовании роли сывороточных факторов в обеспечении контроля опухолевого роста.
Разработка и использование препаратов антител для иммунотерапии опухолевых заболеваний является одним из развивающихся в настоящее время направлений онкологии иммунологии. Несмотря на наличие в клинической практике ряда противоопухолевых препаратов моноклональных антител (мабтера, герцептин), возможности обычных сывороток не исчерпаны, особенно неприменительно к достижению непосредственного противоопухолевого эффекта, а в регуляторном плане.
Известно, что на основе донорских пуловых сывороток разработан препарат IVIG, обладающий свойством препятствовать активизации метастатических клеток (см. А.Г.Исрафилов, М.М.Алсынбаев, Т.Б.Кудашева, В.П.Трофимов. «Вестник инфектологии и паразитологии», 2006 г., стр.1-12). Известно, что введение модифицированных аутологичных веществ, прежде всего белков, в организм опухоносителя может вызывать стимуляцию неспецифического (врожденного) и специфического (адаптивного) ответа его иммунной системы (см. С.В.Баракин. «Аутогемохимиотерапия при опухолевых заболеваниях». 2008 г., стр.5-10). Однако в этом обзоре основное внимание уделено применению аутологичной крови, а не плазмы и сыворотки.
Сыворотка и плазма крови онкологических больных может существенно и разнонаправлено влиять на функциональную активность иммунокомпетентных клеток: естественных киллеров и макрофагов, играющих большую роль в противоопухолевой защите.
Известен «Способ использования аутологичной крови и плазмы онкологических больных при проведении химиотерапии» (см. Автореф. докт. дисс. Л.Ю.Владимировой «О возможности использования аутоплазмохимиотерапии в лекарственной терапии больных раком молочной железы», 2006, г.Ростов н/Дону), выбранный нами в качестве прототипа. В работе описана аутоплазмохимиотерапия (АПХТ), способствующая повышению эффекта химиопрепаратов и снижению токсических реакций у больных раком молочной железы, и показано связывание цитостатиков альбумином плазмы, являющимся основным транспортным белком. Однако в работе не изучалось влияние аутологичной плазмы, не связанной с химиопрепаратами, на опухолевый рост. Тем не менее ее введение может играть определенную самостоятельную роль в противоопухолевой защите за счет антител и других содержащихся в ней факторов.
Исследование влияния введения плазмы опухоленосителей на опухолевый рост может уточнить механизм действия АПХТ и послужить для дальнейшего развития этого метода лечения злокачественных опухолей.
Целью изобретения является индукция торможения или регрессии перевивной опухоли при введении животным аутологичных и аллогенных сывороток.
Поставленная цель достигается тем, что белым беспородным крысам массой 150-200 г перевивают под кожу спины опухоль С-45, через 7-10 дней животным начинают введение сывороток; крысам-опухоносителям С-45 внутримышечно вводят сыворотки в возрастающих дозах: в 1-й день по 0,1 мл, во 2-й день - по 0,2 мл, в 3-й и 4-й дни - по 0,5 мл; 1-я группа крыс получает введение аутологичной сыворотки, 2-я - аллогенной сыворотки от крысы-опухоленосителя, 3-я - аллогенной сыворотки от интактной крысы, 4-я - аллогенной сыворотки от интактной крысы, прогретой при 56°С в течение 30 минут, 5-я - аллогенной сыворотки от интактной крысы после пятикратного замораживания и оттаивания, 6-я группа - контрольная получает введение физиологического раствора; по окончании введения сывороток в течение 2-х месяцев оценивают динамику роста опухолей и устанавливают, что курсовое введение сывороток вызывает полную или частичную регрессию опухоли.
Изобретение «Способ иммунотерапии опухолей в эксперименте» является новым, так как оно неизвестно из уровня медицины при исследовании роли сывороточных факторов в обеспечении контроля опухолевого роста.
Новизна изобретения заключается в исследовании роли сывороточных факторов в обеспечении контроля опухолевого роста. Повышение эффективности лечения аутогемо- и аутоплазмохимиотерапии онкологических заболеваний связано не только с химиопрепаратом, как действующим началом, но и с модификацией сывороточных белков при инкубации с ними. В известной работе (прототипе) показано связывание цитостатиков альбумином, являющимся основным транспортным белком. Однако в работе не изучалось влияние аутологичной сыворотки, не связанной с химиопрепаратами, на опухолевый рост.Тем не менее, ее введение может играть определенную самостоятельную роль в противоопухолевой защите за счет антител и других содержащихся в ней факторов.
Исследование влияния введения сыворотки опухоленосителям на опухолевый рост уточняет механизмы действия АПХТ и служит для дальнейшего развития этого способа лечения злокачественных опухолей. В связи с этим изучение роли сывороточных факторов в обеспечении контроля опухолевого роста является важным для научных и практических разработок в области аутогемо- и аутоплазмохимиотерапии опухолевых заболеваний.
Изобретение является промышленно применимым, так как может быть использовано в медицине, при экспериментальных исследованиях в онкологии, научно-исследовательских онкологических институтах и других медицинских учреждениях здравоохранения.
Пример конкретного выполнения «Способа иммунотерапии опухолевых заболеваний в эксперименте»
Материалы и методы
Опыты были поставлены на 33 белых беспородных крысах массой 150-200 г, которым под кожу спины перевивали опухоль С45. Через 7-10 дней животным начинали введение сывороток. Схема эксперимента представлена в табл.1.
Таблица 1
Схема эксперимента по оценке влияния введения сывороток на опухолевый рост
Группы крыс
Сыворотки
n
Сроки введения, объем сывороток
1-й день
2-й день
3-й день
4-й день
1
Аутологичная
5
По 0,1 мл в/м
По 0,2 мл в/м
По 0,5 мл в/м
По 0,5 мл в/м
2
Аллогенная от опухоленосителя
5
3
Аллогенная от интактной крысы
5
4
Аллогенная от интактной крысы, 56°С, 30 мин*
5
5
Аллогенная от интактной крысы, 5-кратно размороженная*
5
6
Физраствор (контроль)
8
* Прогревание сыворотки при указанной температуре приводит к денатурации термолабильных белков, а пятикратное размораживание - к разрушению иммуноглобулинов.
По окончании введения сывороток в течение 2-х месяцев еженедельно измеряли объем опухоли; проводили оценку динамики по критериям полной и частичной регрессии, торможения и прогрессирования С45. Кроме того, определяли продолжительность жизни животных исследуемых групп. Статистическую обработку проводили с вычислением t-критерия Стьюдента и по Уилкоксону.
Результаты представлены в табл.2-4.
Таблице 2
Динамика изменения объема С45 у животных исследуемых групп
Группы животных
Объем опухоли (см<sup>3</sup>)
До воздействий
Через 1 мес
Через 2 мес
1
0,42±0,16
0,26±0,17*↓
0,0974±0,088*↓**↓
2
1,32±0,2
0,52±0,2**↓
-
3
1,31±0,14
0,44±0,16**↓
-
4
0,68±0,17
3,2±1,2**↑
10,4±4,62**↑
5
0,69±0,13
2,52±0,83**↑
13,5±4,6*↑**↑
6
0,59±0,15
1,09±0,3↑
3,19±1,1**↑
* Статистически достоверные отличия от 6-й (контрольной) группы (t >2 или критерий Уилкоксона); ** - статистически достоверные отличия первоначального объема; ↑ - увеличение объема С45; ↓ - снижение объема С45.
Как видно из данных, представленных в табл.2, у крыс контрольной группы отмечено постепенное увеличение объема опухоли. У животных 1-й, 2-й и 3-й групп, получавших введение термически необработанных сывороток, напротив, наблюдалось его уменьшение. В 1-й группе оно становилось статистически достоверным через 2 мес, а во 2-й и 3-й группах - через 1 месяц; при этом через 2 мес наблюдения во 2-й и 3-й группах у 3 животных из 5 произошла полная регрессия, из-за чего подсчитать средние объемы опухоли не представляется возможным. Обращает на себя внимание выраженный рост С45 у крыс 4-й и 5-й групп, получавших сыворотку интактного животного, предварительно прогретую при 56°С или пятикратно размороженную. У крыс описываемых групп объем опухолей при измерении их через 2 мес в 2-3 раза превышал показатели контрольных животных; различия статистически значимы для 5-й группы.
Как следует из данных, представленных в табл.3, через 1 мес после воздействий у животных, получавших физраствор, наблюдалось прогрессирование С45 в 6 случаях из 8, у одной крысы отмечено торможение и у одной - частичная регрессия опухоли. Введение аутосыворотки привело к развитию частичной регрессии у 3 животных из 5, у одного наблюдалось торможение, у одного - прогрессирование С45. После введения сыворотки опухоленосителя у всех 5 животных развилась частичная регрессия, а при введении сыворотки интактной крысы - у 1 полная, а у 4 - частичная регрессия опухоли. Этот эффект отменялся при применении той же сыворотки (от интактной крысы) как после прогревания, так и после пятикратного размораживания: прогрессирование отмечалось у 4 и 5 животных из 5 соответственно (табл.3).
Таблица 3
Количество животных с регрессией, торможением и прогрессированием С45 через 1 и 2 мес после введения сывороток
Группы животных
Время наблюдения
1 мес
2 мес
ПР
ЧР
Торм.
Прогр.
ПР
ЧР
Торм.
Прогр.
1
0/5
3/5
1/5
1/5
3/5
1/5
1/5
0/5
2
0/5
5/5
0/5
0/5
3/5
1/5
0/5
1/5
3
1/5
4/5
0/5
0/5
3/5
1/5
0/5
1/5
4
0/5
1/5
0/5
4/5
0/5
1/5
0/5
4/5
5
0/5
0/5
0/5
5/5
0/5
0/5
0/5
5/5
6
0/8
1/8
1/8
6/8
1/8
2/8
0/8
5/8
Примечание. Числитель - количество животных с полной регрессией (ПР), частичной регрессией (ЧР), торможением и прогрессированием; знаменатель - общее количество животных в группе.
Подобные различия обнаружены и через 2 месяца после перевивки опухоли (табл.3). Хорошо известно и неоднократно наблюдалось, что С45 в некоторых случаях способна спонтанно регрессировать, и, по-видимому, регрессию у трех животных из 8 (у 1 - полная и у 2 - частичная) в группе, получавшей физраствор, можно отнести к таким случаям. При этом у 5 крыс из контрольной группы наблюдалось прогрессирование опухоли, тогда как у животных, получавших введение аутологичной сыворотки, оно не отмечалось ни в одном случае. После введения аллогенных сывороток, несмотря на достижение регрессии у всех животных через 1 мес, у некоторых из них через 2 мес снова обнаруживался рост, вследствие чего отмечено по 1 случаю позднего прогрессирования у крыс 2-й и 3-й групп (табл.3). Тем не менее, у животных этих групп введение сывороток приводило к полной регрессии в 3 случаях и частичной в 1 случае из 5. Прогревание и особенно пятикратное размораживание сыворотки нивелировало ее противоопухолевое действие.
В табл.4 представлены данные, характеризующие количество выживших животных в исследуемых группах и продолжительность их жизни.
Таблица 4
Количество выживших крыс-опухоленосителей с С45 и продолжительность их жизни после введения сывороток
Группы животных
Время наблюдения (мес)
Продолжительность жизни (нед)
1
1,5
2
2,5
3
3,5
1
5/5
5/5
4/5
3/5
3/5
3/5
11,2±2,64
2
5/5
5/5
5/5
5/5
4/5
4/5
13,4±1,32* **
3
5/5
4/5
3/5
3/5
3/5
3/5
9,8±2,64
4
5/5
4/5
2/5
1/5
1/5
1/5
5,2±1,98
5
5/5
5/5
3/5
1/5
1/5
0/5
5,6±1,54
6
8/8
7/8
6/8
6/8
1/8
1/8
8,125±1,72
* Статистически достоверные отличия от 6-й (контрольной) группы (t >2); ** - статистически достоверные отличия от показателей животных 4-й и 5-й групп; числитель - количество живых животных; знаменатель - общее количество животных в группе.
Приведенные в табл.4 результаты свидетельствуют о том, что гибель животных-опухоленосителей начинается через 1,5 мес после окончания воздействий, а через 3,5 мес из животных контрольной группы в живых осталась только 1 крыса, у которой развилась спонтанная регрессия С45. Аналогичные данные отмечены в группах животных, получавших прогретую сыворотку, а введение пятикратно размороженной сыворотки вызывает гибель всех крыс в течение 3,5 мес. Введение аутологичной сыворотки и нативной сыворотки интактной крысы способствует выживанию 3-х крыс из 5 через 3,5 мес после перевивки. Максимальная выживаемость (4 крысы из 5 через 3,5 мес) была отмечена у животных, которым вводили сыворотку опухоленосителя, а их продолжительность жизни была статистически достоверно выше, чем у контрольных крыс, а также у получавших прогретую и пятикратно размороженную сыворотку (табл.4). У животных остальных групп продолжительность жизни не имела статистически достоверных различий, хотя тенденция к увеличению этого показателя наблюдалась в группах, получавших аутологичную сыворотку и нативную сыворотку интактной крысы.
Технико-экономическая эффективность «Способа иммунотерапии опухолей» заключается в том, что курсовое введение сывороток животным с перевивной опухолью С-45 способно вызвать полную или частичную регрессию опухоли, увеличение количества выживших крыс в группе и продолжительности жизни животных. Действие аутологичной и аллогенной сыворотки, а также взятой от опухоленосителей и от интактной крысы является однонаправленным, хотя и имеет некоторые различия. Однако эффект сыворотки интактной крысы полностью снимается и даже меняется на противоположный после ее прогревания или пятикратного размораживания, что свидетельствует о том, что противоопухолевое действие оказывают именно нативные белки, причем не только антительной, но и неиммуноглобулиновой природы.