СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА НА ОСНОВЕ ОЛИГОПЕПТИДА АЛЛОФЕРОНА-1, ИМЕЮЩЕГО ПРОТИВОВИРУСНУЮ И ИММУНОМОДУЛИРУЮЩУЮ НАПРАВЛЕННОСТЬ, И ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО УВЕЛИЧЕННОГО СРОКА ХРАНЕНИЯ, ПОЛУЧЕННОЕ С ЕГО ПОМОЩЬЮ
METHOD OF PRODUCING A DRUG BASED ON OLIGOPEPTIDE ALLOFERON-1, HAVING AN ANTIVIRAL AND IMMUNOMODULATING EFFECT, AND PROLONGED STORAGE MEDICINAL PRODUCT OBTAINED WITH ITS HELP

Предлагаемое изобретение относится к белкам или биологически активным пептидам, специфически стимулирующим антивирусную, антимикробную и противоопухолевую активность иммунной системы человека, также к лекарственным средствам на их основе.
Известны соединения пептидной, полипептидной и белковой природы, используемые в медицине в качестве антивирусных, антимикробных и противоопухолевых средств.
Альфа-интерферон в свое время был признан одним из наиболее эффективных средств иммунотерапии при лечении различных вирусных и онкологических заболеваний. В частности, клинические испытания подтвердили его эффективность при гепатите С (Bekkering et al., J. Hepathology, 1998, 28, 6, p. 960-964), герпесе (Cardamakis et al., Gynecol. Obstet. Invest., 1998, 46, I, p. 54-57), рассеянном склерозе (Durelli et al., Mult. Sclerosis, 1995, 1, Suppl. I, p. S32-S37), множественной миеломе (Zee et al., J. Clin. Oncol., 1998, 16, 8, p. 2834-2839), болезни Ходжкина (Aviles et al. Leuk. Lymphoma, 1998, 30, 5-6, p. 651-656), миелоидной лейкемии (Gilbert, Cancer, 1998, 83, 6, p. 1205-13). Интерфероны представляют также интерес для иммунотерапии глубоких микозов (Kullberg, Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 1997, 16, p. 51-55).
Однако высокая стоимость рекомбинантного альфа-интерферона делает его малодоступным для широкого клинического применения. Другим ограничением служат побочные эффекты, связанные с возможной пирогенностью, иммуногенностью и другими нежелательными свойствами рекомбинантного интерферона. Применение лейкоцитарного (донорского) интерферона сопряжено также с риском передачи ВИЧ, гепатита С и других инфекций. Химический синтез интерферонов, ввиду сложности их структуры, в настоящее время нереален.
Проблему решило создание нового соединения, обладающего иммуномодулирующей активностью, которое использовано для создания лекарственных препаратов и разработка способов лечения и профилактики вирусных и микробных инфекций, а также опухолей. С этой целью было разработано новое семейство биологически активных пептидов, отличающихся от интерферонов и других иммуномодулирующих аналогов характерной для них структурой и механизмом действия, и более доступных.
1
2
3
1
2
3
Этим решением стали линейные пептиды-аллофероны (патент RU 2172322, опубл.: 20.08.2001, строение которых описывается следующей структурной формулой: X-His-Gly-X-His-Gly-Val-Х или их фармацевтически приемлемые соли, или эфиры, или амиды, где X отсутствует, либо содержит не менее 1 аминокислоты, Х содержит не менее 1 аминокислоты, либо представляет собой пептидную связь, Х отсутствует, либо содержит не менее 1 аминокислоты, причем указанные аминокислоты выбраны из групп: алифатической, ароматической или гетероциклической.
Предлагаемые соединения синтезированы с использованием твердофазного метода синтеза и охарактеризованы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и могут быть выделены в виде их различных производных, например таких, как эфиры, фармацевтически приемлемые соли или амиды.
На основе данного изобретения был создан и в 2003 году в России зарегистрирован препарат нового типа Аллокин-альфа (Рег. №002829/01 от 22.09.03 г.), выбранный за прототип.
Данный препарат разработан международным коллективом ученых на основе последних достижений мировых исследований в молекулярной иммунологии. Это первое лекарственное средство в современной медицинской практике, действующее вещество которого - Аллоферон - выделено из насекомого.
Аллоферон был получен из иммунизированной гемолимфы личинок насекомых семейства Calliphoridae. В медицине они известны с древних времен как «хирургические личинки», которых до настоящего времени используют для заживления и стерилизации гнойных ран.
Аллоферон представляет собой линейный цитокиноподобный олигопептид, состоящий из 13 аминокислотных остатков и обладающий выраженной прямой и опосредованной антивирусной активностью. Его терапевтические свойства обусловлены прежде всего полным сходством с фрагментом иммунной системы насекомых, ответственным за их антивирусную защиту.
Аллоферон в качестве лекарственной субстанции препарата Аллокин-альфа производится методом химического пептидного синтеза.
Последние десятилетия, ведущие международные фармацевтические компании, активно работают над созданием лекарственных средств, использующих принципы эффективной антивирусной защиты насекомых, которые сформировала эволюция за сотни миллионов лет их совместного существования. В мировой фармацевтике Аллокин-альфа является первым и, возможно, единственным завершенным практическим проектом в этом направлении.
Аллокин-альфа с успехом используется при лечении персистирующих вирусных инфекций человека, таких как вирусы папилломы человека (ВПЧ), герпеса и гепатита В.
По эффективности и безопасности терапии патологических состояний, ассоциированных с ВПЧ, и своему влиянию на снижение вирусной нагрузки, этот препарат не имеет аналогов в мировой медицинской практике. Это обусловлено специфическим механизмом действия Аллокина-альфа.
Аллокин-альфа по первичному биологическому действию близок к интерферону-альфа. Отличие заключается в том, что его действие не заканчивается индукцией синтеза эндогенных интерферонов, но и «включает» активность системы натуральных киллеров. Аллокин-альфа усиливает цитотоксическую активность NK-лимфоцитов.
Свой основной эффект Аллокин-альфа осуществляет посредством индукции интерлейкина18 (IL-18). Пролиферация и активация натуральных киллеров в естественных условиях контролируется цитокинами IL-2, IL-15, IL-18. Как известно, при этом процессе отмечается значительная синергия между действием IL-12 и IL-18. Индуцированное Аллокином-альфа высвобождение IL-18 ведет к усилению цикла IFNγ/IL-18. В след за первой волной образования IFNγ лимфоцитов индуцированного IL-18, вновь синтезированный IFNγ, в свою очередь, стимулирует моноциты/макрофаги, что ведет к увеличению их ICE-активности (индукция каспазы-1, активация апоптоза). Увеличение ICE-активности, в частности, также приводит к образованию IL-18. IL-18 не только стимулирует синтез IFNγ, но и модулирует его функциональную активность. Таким образом, IL-18 самостоятельно и посредством IFNγ стимулирует инициализацию процессов апоптоза клеток зараженных ВПЧ, что обеспечивает либо полную элиминацию ВПЧ из клеток или гибель клеток инфицированных ВПЧ, либо значимое снижение вирусной нагрузки, что приводит к инволюции патологического процесса.
Это обстоятельство определило основные показания для применения Аллокина-альфа: лечение ВПЧ - ассоциированных патологий. ВПЧ - одна из наиболее распространенных вирусных инфекций. Рак шейки матки, связанный с персистирующей инфекцией ВПЧ - один из самых распространенных и опасных видов злокачественных новообразований у женщин во всем мире. Наиболее часто для лечения ВПЧ-инфекции используются интерфероны. Но даже длительная системная терапия интерфероном, сопровождающаяся нежелательными побочными эффектами различной степени тяжести, в 60% случаев не приводит к клиническому улучшению.
Благодаря особому механизму действия, Аллокин-альфа проявляет исключительно высокую эффективность в терапии ВПЧ. Так, при использовании Аллокина-альфа, клиническая ремиссия в патологическом очаге, отмечалась у женщин, инфицированных ВПЧ более чем в 90% случаев. При этом применение препарата легко переносится больными и какие-либо осложнения и побочные реакций полностью отсутствуют. Аллокин-альфа успешно применяется в медицинской практике уже шести стран мира и признан в них самым эффективным средством борьбы с ВПЧ и связанными с ним заболеваниями.
Усиление распознавания вирусных антигенов и инфицированных клеток натуральными киллерами, микрофагами (нейтрофилами) в очаге репликации вирионов на фоне действия Аллокина-альфа с успехом используется также при лечении заболеваний, вызванных вирусами герпеса. Снижение вирусной нагрузки, уникальный механизм и избирательность действия Аллокина-альфа позволяет также хорошо сочетать препарат как с индукторами интерферонов, так и другими антивирусными лекарственными средствами, а так же с антибиотиками.
В последнее время была доказана эффективность применения компонентов аллоферонов для лечения опухолей.
Аллоферон назначается при:
- герпетической инфекции в острой форме;
- герпетической инфекции хронического характера с периодами рецидивов;
- инфекционном процессе хронического характера, спровоцированном ПВЧ онкогенных штаммов;
- вирусных патологиях;
- бактериальных инфекциях;
- гепатите В в острой форме (при средней тяжести патологии);
- инфекционных процессах, вызванных и бактериями, и вирусными агентами (лечение должно стартовать до 7 дня с момента наступления желтухи).
Технической проблемой прототипа является недостаточно длительный срок хранения препарата, полученного на основе физраствора, в связи с чем в настоящее время препарат выпускается в виде лиофилизированного порошка белого цвета для приготовления раствора. В одной ампуле Аллокина-Альфа содержится 1 мг аллоферона. Ампулы упакованы в картонные пачки по 1, 2, 3, 5 или 10 штук в специальных ячейковых формах из полимерных материалов.
Для приготовления раствора для инъекций в качестве растворителя используют 1 мл 0,9%-ного раствора хлорида натрия. Для этого содержимое 1 мг ампулы следует растворить в 1 мл изотонического раствора натрия хлорида.
Таким образом, использовать раствор Аллокин-Альфа следует сразу после приготовления.
Поскольку препарат дорогой, при приготовлении раствора возможны ошибки, особенно у неподготовленного персонала. В результате, часть препарата бракуется.
Более эффективным явилось бы использование препарата в виде готового раствора.
Однако, для этого он не обладал необходимым сроком хранения.
Задачей изобретения явилось устранение указанных недостатков прототипа и решения связанных с ними проблем.
Техническим результатом изобретения является повышение срока хранения готового к использованию раствора на основе Аллокин-Альфа, что позволяет выпускать препарат на основе готового к применению раствора.
3
Указанный технический результат достигается за счет того, что заявлен способ получения лекарственного средства на основе олигопептида аллоферона, имеющего противовирусную и иммуномодулирующую направленность, характеризующийся приготовлением композиции лекарственного средства, содержащей аллоферон в концентрации 1 мг/мл растворенный в среде состава: 0,9%-ного раствора натрия хлорида в фосфатном или ацетатном буфере с рН от 6,0 до 7,5, отличающийся тем, что композицию предварительно путем барботирования насыщают газом, нейтральным к олигопептидам, до получения раствора, композиция которого при комнатной температуре имеет динамическую вязкость не выше 1,007 мПа⋅с и общую плотность 1,0063 г/см, после чего готовый раствор при постоянной продувке газом разливают по флаконам или ампулам. Допустимо, что в качестве газовой среды нейтральной к олигопептидам используют аргон или азот.
Допустимо, что 0,9% раствор натрия хлорида в фосфатном или ацетатном буфере готовят предварительно на основе легкой воды.
Допустимо, что готовят на основе легкой воды «Лангвей».
3
Лекарственное средство на основе олигопептида аллоферона-1 увеличенного срока хранения, имеющее противовирусную и иммуномодулирующую направленность, полученное в форме композиции, состоящей из 0,1%-ного раствора аллоферона-1 в 0,9%-ном растворе натрия хлорида, отличающееся тем, что композиция лекарственного средства выполнена с динамической вязкостью при комнатной температуре не выше 1,007 мПа⋅с, а физраствор при комнатной температуре имеет общую плотность пептидной композиции 1,0063 г/см.
Допустимо, что 0,9%-ный раствор натрия хлорида в фосфатном или ацетатном буфере сформирован на основе легкой воды. Предпочтительно, на основе легкой воды «Лангвей».
Осуществление изобретения
Как известно пептиды, как правило, обладают низкой стабильностью в растворенном состоянии. Одним из главных негативных факторов, влияющих на устойчивость пептидов - кислород воздуха. Для нивелирования его приходится прибегать к использованию стабилизаторов различной природы, что не всегда полезно для лекарственного препарата. С целью устранения этого недостатка препараты на основе пептидов чаще всего имеют форму лиофилизатов. Однако препарат в форме раствора всегда имеет преимущество сточки зрения удобства применения.
3
В заявленном изобретении проблему стабильности удалось решить за счет того, что при приготовлении композиции исключили контакт компонентов смеси с воздухом. Наиболее эффективным способом, позволяющим в максимальной степени вытеснить растворенный воздух - насыщения раствора газом методом барботирования. При барботировании насыщают газом, нейтральным к олигопептидам, до получения раствора, композиция которого при комнатной температуре имеет динамическую вязкость не выше 1,007 мПа⋅с и общую плотность 1,0063 г/см, после чего готовый раствор при постоянной продувке газом разливают по флаконам или ампулам. В качестве газовой среды нейтральной к олигопептидам можно использовать, например, аргон или азот.
3
3
6
Дополнительную гарантию отсутствия воздуха дает продувка флаконов или ампул при их наполнении. Для получаемой композиции при комнатной температуре порядка 20-22°С и естественном атмосферном давлении с помощью ротационного вискозиметра определили, что обеспечивается динамическая вязкость не выше 1,007 мПа⋅с и общая плотность пептидной композиции 1,0063 г/см, которую определяли с помощью электронного плотномера для определения плотности жидкостей в малом объеме (1-2 мл) с точностью до ± 0,0001 г/см. Для этой цели использовался электронный плотномер DA-645, работающий по принципу измерения частоты осцилляции U-образной трубки. Динамическую вязкость определяли вискозиметром BROOKFIELD DV3TLV, имеющего рабочий диапазон измерений от 1 до 6⋅10 мПа⋅с и точность 1% в рамках диапазона измерений.
В процессе барботирования при насыщении газом, нейтральным к олигопептидам, в процессе непрерывных измерений получали разные значения динамической вязкости и плотности композиции в определенном диапазоне, незначительно меняя температуру в пределах от 20 до 22 градусов.
При получении определенного значения вязкости и плотности делали отбор нескольких проб и ставили на хранение.
3
Опытным путем было установлено, что именно при выполнении процесса барботирования при насыщении газом, нейтральным к олигопептидам, в тот момент, когда общая плотность пептидной композиции составляет 1,0063 г/см при вязкости не выше 1,007 мПа⋅с, лучше всего фиксировать получение готового раствора, остановить процесс насыщения газом, а затем разливать готовый раствор по флаконам или ампулам.
Срок хранения препарата считали наступившим, когда фиксировали в отобранных пробах минимальное накопление примесей с течением времени при хранении (см. таблицы ниже).
3
Из таблиц видно, что только при значениях динамической вязкости не выше 1,007 мПа⋅с срок хранения существенно превышал основной срок хранения препарата, а затем резко падал. При этом оптимальным показателем плотности пептидной композиции при разных подборах значений динамической вязкости являлся показатель 1,0063 г/см, который обеспечивал максимальные сроки хранения при всех значениях динамической вязкости.
3
Таким образом, значения динамической вязкости не выше 1,007 мПа⋅с и плотности пептидной композиции плотности 1,0063 г/см являются оптимальными для обеспечения максимального срока хранения препарата.
В ходе дальнейших исследований было выяснено, что можно также 0,9%-ный раствор натрия хлорида в фосфатном или ацетатном буфере предварительно готовить самостоятельно на основе легкой воды, например, легкой воды «Лангвей». В этом случае не требуется строго обеспечивать ограничение воздуха при контакте с конечным продуктом композиции.
3
Таким образом, препарат, приготовленный при смешении с физраствором, приготовленным на легкой воде, позволяет более длительное время хранить препарат. Полученный таким образом препарат на основе олигопептида аллоферона-1 увеличенного срока хранения, имел противовирусную и иммуномодулирующую направленность, был получен в форме композиции, состоящей из 0,1%-ного раствора аллоферона-1 в 0,9%-ном растворе натрия хлорида, где композиция лекарственного средства выполнена с динамической вязкостью при комнатной температуре не выше 1,007 мПа⋅с, а физраствор при комнатной температуре имеет общую плотность пептидной композиции 1,0063 г/см.
Допустимо, что 0,9%-ный раствор натрия хлорида в фосфатном или ацетатном буфере сформирован на основе легкой воды, например, на основе легкой воды «Лангвей».
Полученные 0,1%-ные растворы аллоферона-1 с использованием: воды для инъекций (контроль), 0,9%-ного раствора натрия хлорида, фосфатного и ацетатного буферов, были подвергнуты испытаниям на стабильность при температуре +40°С в течении 182 суток. Контроль производился методом ВЭЖХ.
Результат эксперимента показал, что заявленный препарат аллоферона в 0,9%-ном растворе натрия хлорида и фосфатном буфере успешно выдержали испытания за указанный период времени. Ацетатный буфер обеспечивает несколько меньшую устойчивость раствора аллоферона. Водный раствор пептида подтвердил свою нестабильность и распадался сразу же.
Раствор аллоферона в 0,9%-ном растворе натрия хлорида, как наиболее приемлемый для медицинских целей, также был подвергнут более тщательным и длительным испытаниям при комнатной температуре и температурах от +4 до +40°С. Вышеуказанный срок хранения в 182 суток подтвердился.
Таким образом, заявленное изобретение позволило получить стабильное повышенного срока хранения лекарственное средство, представляющее 0,1% раствор аллоферона-1 в 0,9% раствора натрия хлорида.