Способ подавление роста бактериальной микрофлоры у коров с субклиническим маститом
METHOD FOR INHIBITING THE GROWTH OF BACTERIAL MICROFLORA IN COWS WITH SUBCLINICAL MASTITIS

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к ветеринарной медицине, а именно к способу лечения скрытого (субклинического) мастита у коров.
Мастит является наиболее распространенным заболеванием молочных животных, наносит огромный экономический ущерб молочной промышленности. Мастит является серьезной экономической и медицинской проблемой, связанной со стадами молочных коров, и является основной причиной чрезмерной выбраковки.
Наиболее часто применяют следующие способы лечения скрытого мастита у коров: Мастисан А - комплексный препарат, состоящий бензилпенициллина, стрептомицина, норсульфазола или сульфадимезина, растительного или вазелинового масла.
В состав препарата Мастисан Б входят неомицин, сульфадимезин, метилурацил, диастарат полиглицерин, вазелиновое масло.
Суспензия из эритромицина и сульфадимезина входят в состав препарата Мастисан Е.
В состав Мастицида входят пенициллин, стрептомицин, сульфадимизин и норсульфазол в растительном масле.
Дифурол А - препарат, содержащий фурагин, фуразолидон, полиэтиленоксид - 400 и димексид.
Антибиотики, такие как пенициллин, цефалоспорин, стрептомицин и тетрациклин, используются для лечения и профилактики заболеваний, поражающих молочных коров, вызванных различными грамположительными и грамотрицательными бактериями. Антибиотики часто регулярно вводят целым стадам, чтобы предотвратить мастит.Увеличение заболеваемости в стаде, как правило, приводит к увеличению использования противомикробных препаратов, что, в свою очередь, увеличивает потенциал остатков антибиотиков в молоке и потенциал повышения устойчивости бактерий к противомикробным препаратам.
(патент RU 2201756, опубл. 10.04.2003)
Также известен способ профилактики и лечения мастита у коров  по методике которого предлагается введение в сосковый канал антимикробного средства (озонированное рафинированное дезодорированное растительное масло) с кислородом.
Недостатком данного способа является то, что препарат применяется только для коров в период сухостоя.
патент RU 2201758, опубл. 10.04.2003
Предложен способ введения тканевого препарата (), который обладает иммуномодулирующим действием, состоящий из фильтрата экстракта молочной железы здоровых животных, стабилизированных маннитом.
Недостатком способа является то, что препарат готовят самостоятельно (кустарно) в лабораториях и на мясокомбинатах, в результате чего препарат различается по биологической активности и, естественно, эффективности.
патенту RU 2320325, опубл. 27.03.2008
Согласно  предусматривается введение комплексного препарата, состоящего из 2%-раствора новокаина, АСД фракции-2, димексида и 40% раствора глюкозы. К недостаткам данного способа относится низкая эффективность предложенного препарата, длительность лечения мастита.
Патент RU 2463995, опубл. 20.10.2012
является наиболее близким аналогом, который предусматривает лечение субклинического мастита у коров с помощью препарата растительного происхождения - календулы и адаптогена - Лигфола. Недостатком данного способа является трудоемкость приготовления и хранения растительного сырья.
Техническим результатом настоящего изобретения является подавление ростабактериальной микрофлоры у коров с субклиническим маститом.
Thymus serpyllum L
Технический результат достигается тем, что коровам с субклиническим маститом внутрицистернально вводят фитораствор на основе порошкообразного экстракта лекарственного растения Тимьяна ползучего (.) (чабрец) в разведении 1:4 для подавления роста бактериальной микрофлоры у коров с субклиническим маститом.
Streptoccocus faecalis
Escherichia coli
Экстракт чабреца обладает антибактериальной активностью в отношении грамположительных () и грамотрицательных () микроорганизмов.
Способ осуществляется следующим образом.
Streptoccocus faecalis, Escherichia coli
Для инокуляции использовали микробные взвеси ( выделенные из молока коров, больных маститом).
3
6
Для определения чувствительности экстракта чабреца к штаммам микроорганизмов применяли метод серийных разведений в бульоне. Тестировали в объеме 2 смкаждого разведения экстракта чабреца с конечной концентрацией исследуемых микроорганизмов 1×10 КОЕ/мл.
3
Питательный бульон (МПБ) для определения чувствительности разливали по 2,0 см в каждую пробирку. Количество пробирок определяли из необходимого диапазоном разведений чабреца (шесть штук) и увеличили на две пробирки для постановки контролей (контроль на рост культуры - МПБ с культурой без чабреца; контроль на чистоту (стерильность) бульона - МПБ (без чабреца и без культуры).
Для определения необходимой максимальной концентрации фитораствора в ряду серийных разведений использовался исходный образец порошкообразного экстракта чабреца. Разводили 1:1 (10 г экстракта+10 мл стерильной дистиллированной воды).
3
3
3
3
3
Исходный раствор экстракта чабреца, разведенный 1:1 в количестве 2,0 см при помощи микропипетки со стерильным наконечником, вносили в первую пробирку ряда, содержащую 2,0 см МПБ. Тщательно перемешивали и новым стерильным наконечником переносили 2,0 см раствора экстракта чебреца в МПБ из первой пробирки во вторую пробирку, содержавшую первоначально также 2,0 см МПБ. Эту процедуру повторяли, пока не приготовили необходимый ряд разведений, состоящий из восьми пробирок. Из последней пробирки 2,0 см взвеси удаляли.
Таким образом, получили ряд пробирок с растворами чабреца, концентрации которых отличаются в соседних пробирках в 2 раза.
9
9
7
6
6
Для этой цели использовали свежие 16-18-часовые агаровые культуры, которые для приготовления взвеси, вносили в стерильный 0,9%-ный водный раствор натрия хлорида. Делали взвесь по стандарту мутности 10 ЕД (в 1 мл культуры концентрация микробных клеток 10). В первую пробирку, содержащую 10 мл МПБ, вносили 0,1 мл культуры с концентрацией микробных клеток 10 (получив концентрацию микробных клеток в 1 мл 10). Содержимое перемешивали и 1 мл переносили во вторую пробирку с 9 мл питательной среды МПБ для приготовления конечного инокулюма (в 1 мл культуры концентрация микробных клеток составила 10, то есть в 1 мл среды будет 100 тыс.микробных клеток). Таким образом, конечная концентрация микроорганизма в каждой пробирке достигнет 1·10 КОЕ/мл (100 тыс.микробных клеток в 1 мл среды)
Пробирки закрывали стерильными ватно-марлевыми пробками. Все пробирки с тестируемыми штаммами, и пробирки с контролями, инкубировали в термостате при обычной атмосфере при температуре 37°С в течение 16-18 часов.
Для определения наличия роста микроорганизмов пробирки с посевами просматривали в проходящем свете, отмечая пробирку, в которой отсутствует рост.Рост культур в присутствии чабреца сравнивали с контрольной пробиркой МПБ без засеянного в нее микроорганизма и разведения чабреца. При отсутствии роста культур в контрольных пробирках с МПБ (без чабреца и культуры), и при росте культур (в пробирке с культурой, но без чабреца) определяли МПК по наименьшей концентрации чабреца, которая подавляет видимый рост микроорганизма в разведениях.При постановке методов серийных разведений в бульоне проводили контроль роста культур в питательных бульонах без чабреца. Также контролировали чистоту суспензии микроорганизмов, использованных для инокуляции, путем высева на неселективные среды (МПБ, МПА).
Рост культур в МПБ во взвесях с чабрецом контролировался микроскопией - окраска мазков по Грамму и высевом на плотные питательные среды (среда Эндо для кишечной палочки; среда МИС для стрептококка).
Таблица 1- Результаты опыта
Степень разведения
Бактериальныекультуры
контроль МПБ с культурой без чабреца
контроль МПБ чабрецаи без культуры
1:2
1:4
1:8
1:16
1:32
1:64
-
-
+
+
+
+
Escherichia coli
+
-
-
-
-
-
+
+
Enterococcus faecalis
+
-
(+) - реакция положительная (есть рост бактериальной микрофлоры)
(-) - реакция отрицательная (нет роста бактериальной микрофлоры)
Escherichia coli и Enterococcus faecalis
Таким образом, оптимальным для подавления роста бактериальных культур  является разведение 1:4.
Сущность способа поясняется примерами.
Для подтверждения эффективности предлагаемого способа были проведены опыты по изучению влияния фитораствора на основе порошкообразного экстракта чабреца с целью подавления ростабактериальной микрофлоры у коров с субклиническим маститом.
Научно-хозяйственный опыт проводили на коровах черно-пестрой породы. В опыт было отобрано 12 коров по принципу аналогов, больных скрытой формой мастита, у каждого животного было поражено по одной доле вымени.
Диагноз на скрытый мастит у коров устанавливали на основании отсутствия у них клинически выраженных признаков воспаления вымени и положительных реакций молока с 2%-ным раствором мастидина. С целью исключения раздражения вымени исследования молока повторяли через 3 суток.
С целью установления чувствительности к антибиотикам выделенных из проб молока культур использовался метод диффузии в агар с применением дисков содержащих антибиотики.
Таблица 2 - Чувствительность к Escherichia coli Экспертиза №1Н
№
Диск антибиотика
Зона,мм
Срок годности
№
Диск антибиотика
Зона, мм
Срок годности
1
Ампициллин
21
сер. 16 до 05.2022
16
Тетрациклин
27
сер.030321 до 03.2022
2
Амоксициллин
20
сер. 6 до 05.2022
17
Норфлоксацин
30
сер.050520 до 11.2021
3
Оксациллин
-
сер.010121 до 12.2022
18
Левофлоксацин
31
сер. 15 до 04.2022
4
Имипенем
30
сер. 11 до 12.2021
19
Левомицетин
-
сер. 14 до 04.2022
5
Цефалексин
24
сер. 10 до 03.2022
20
Линкомицин
-
сер. 15 до 04.2022
6
Цефуроксим
20
сер. 14 до 04.2022
21
Фурагин
26
сер. 10 до 11.2021
7
Цефотаксим
26
сер. 14 до 05.2022
22
Кларитромицин
-
сер.060621 до 12.2022
8
Цефтазидим
22
сер. 17 до 03.2022
23
Олеандомицин
-
сер.030321 до 03.2022
9
Эритромицин
-
сер. 11 до 04.2022
24
Рокситромицин
-
сер.010121 до 07.2022
10
Стрептомицин
23
сер.010121 до 01.2022
25
Цефтриаксон
30
сер.030321 до 03.2022
11
Гентамицин
20
сер. 19 до 03.2022
26
Меропенем
27
сер. 17 до 03.2022
12
Амикацин
21
сер. 17 до 04.2022
27
Энрофлоксацин
28
сер.070721 до 07.2022
13
Тобрамицин
20
сер. 17 до 04.2022
28
Нитроксолин
21
LOT 0000456548 до 10.2022
14
Доксициклин
20
сер. 11 до 03.2022
29
Фосфомицин
36
сер.010121 до 01.2022
15
Ципрофлоксацин
23
сер. 14 до 05.2022
30
Ломефлоксацин
22
сер.050520 до 05.2022
Таблица 3 - Чувствительность к <i>Enterococcus faecalis</i> Экспертиза №1Н+2Н
№
Диск антибиотика
Зона,мм
Срок годности
№
Диск антибиотика
Зона, мм
Срок годности
1
Ампициллин
26
сер. 16 до 05.2022
16
Тетрациклин
-
сер.030321 до 03.2022
2
Амоксициллин
26
сер. 6 до 05.2022
17
Норфлоксацин
21
сер.050520 до 11.2021
3
Оксациллин
-
сер.010121 до 12.2022
18
Левофлоксацин
25
сер. 15 до 04.2022
4
Имипенем
26
сер. 11 до 12.2021
19
Левомицетин
-
сер. 14 до 04.2022
5
Цефалексин
-
сер. 10 до 03.2022
20
Линкомицин
-
сер. 15 до 04.2022
6
Цефуроксим
-
сер. 14 до 04.2022
21
Фурагин
25
сер. 10 до 11.2021
7
Цефотаксим
-
сер. 14 до 05.2022
22
Кларитромицин
21
сер.060621 до 12.2022
8
Цефтазидим
-
сер. 17 до 03.2022
23
Олеандомицин
20
сер.030321 до 03.2022
9
Эритромицин
21
сер. 11 до 04.2022
24
Рокситромицин
20
сер.010121 до 07.2022
10
Стрептомицин
-
сер.010121 до 01.2022
25
Цефтриаксон
20
сер.030321 до 03.2022
11
Гентамицин
-
сер. 19 до 03.2022
26
Меропенем
20
сер. 17 до 03.2022
12
Амикацин
-
сер. 17 до 04.2022
27
<b>Энрофлоксацин</b>
<b>28</b>
сер.070721 до 07.2022
13
Тобрамицин
-
сер. 17 до 04.2022
28
Нитроксолин
-
LOT 0000456548 до 10.2022
14
Доксициклин
-
сер. 11 до 03.2022
29
Фосфомицин
20
сер.010121 до 01.2022
15
Ципрофлоксацин
26
сер. 14 до 05.2022
30
Ломефлоксацин
21
сер.050520 до 05.2022
Escherichia coli
Enterococcus faecalis.
Был проведен анализ полученных данных, в результате которого, был выбран антибиотик Энрофлоксацин, имеющий наибольшую зону задержки роста (28 мм) для обоих культур и Действующее вещество Энрофлоксацин входит в состав лекарственного препарата Энрофлон-гель.
Были сформированы 2 группы (контрольная и опытная).
В контрольной группе проводили лечение Энрофлон-гелем (шприц 7,5 г), согласно инструкции для интрацистернального применения, в состав лекарственного препарата входит: 300 мг энрофлоксацина и 50 мг кетопрофена.
Таблица 4 - Результаты опыта
Группа
Схема лечения
День диагностики (от начала лечения)
3-ий день
4-ий день
5-ий день
Контрольная
Энрофлон-гель интрацистернально 7,5 г два раза в сутки с интервалом 12 часов
+
+
-
Опытная
Фитораствор на основе порошкообразного экстракта Тимьяна ползучего (разведение 1:4), интрацистернально 10 мл два раза в сутки с интервалом 12 часов
+
-
-
Примечание:+положительная реакция; - отрицательная реакция с 2%-ным раствором мастидина.
Таким образом, интрацистернальное применении фитораствора на основе порошкообразного экстракта чабреца в разведении 1:4 у коровссубклиническим маститом (опытная группа) подавляло рост микроорганизмов на 3-е сутки введения препарата по сравнению с контрольной группой, где положительный результат наблюдали на 5-й день применения препарата Энрофлон-геля.