Длительное культивирование in vitro криоконсервированных и нативных нейроклеток эмбрионов человека

Украгнсъкий нейрох1рург1чний журнал, №2, 2003

11

Орипнальы статт

УДК 611-013.7/.8-018.82:591.8.085.25

Длительное культивирование in vitro криоконсервированных и нативных нейроклеток эмбрионов человека

Зозуля Ю.А., Лисяный Н.И., Любич Л.Д., Грищенко В.И., Петренко А.Ю., Бабийчук Г.А.

Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова АМН Украины, г.Киев Институт криобиологии и криомедицины АН Украины, г.Харьков

При длительном культивировании in vitro нейроклеток-предшественников в бессывороточную среду ДМЕМ происходит сокращение их количества в 3-4 раза до 9-х суток культивирования, после чего содержание клеток стабилизируется, что свидетельствует о наличии в культуре популяции самоподдерживающихся стволовых клеток. Добавление в среду дополнительных факторов (ретинола ацетата) способствует пролиферации нейроклеток-предшественников. Разработанная методика длительного культивирования нейроклеток человека позволяет получить обогащенную популяцию нейроклеток-предшественников, способных к пролиферации in vitro. Ключевые слова: нервные стволовые клетки, предшественники нейроклеток, суспензионные кулъ-туры, ретинола ацетат.

Введение. Нервные стволовые клетки (НСК) рассматриваются как многообещающие источники для клеточной и генной терапии заболеваний нервной системы, благодаря своей способности дифференцироваться во все клеточные типы структур нервной системы. В настоящее время внимание исследователей сосредоточено на проблемах идентификации, выделения, размножения и сохранения НСК и изучения их дифференцировки в культуре и при трансплантации в мозг.

На долю стволовых клеток приходится не более 0,1-0,01% клеток всей клеточной массы органа (в головном мозге и печени насчитывается примерно по 10 млрд. клеток, в иммунной системе — 300 млрд.) [4]. В отличие от мозга взрослых особей мозг эмбрионов человека I триместра беременности на 90% состоит из эмбриональных стволовых и прогениторных клеток [6]. Даже в постнатальном мозге человека и млекопитающих присутствуют два пула проге-ниторных нейробластов, способных повторно интегрироваться в нейронные сети эмбриона после экспериментальной трансплантации. Стволовые и мультипотентные клетки присутствуют в герминативных областях (паравентрику-лярной и субэпендимарной зонах) мозга не только в эмбриональном и раннем постнатальном периоде онтогенеза, но и в течение всей жизни млекопитающих и человека.

Разработаны несколько способов получения региональных стволовых клеток нервной ткани в культуре клеток [8, 9, 10]. Общий принцип заключается в том, что при добавлении ростовых факторов в специально подобранную культуру происходит деление стволовых клеток, тогда как убирая ростовые факторы, длительно культивируя и добавляя индукторы клеточной дифференцировки, можно получить обогащенную культуру нейробластов. Цитодиф-ференцировка нейробластов сопровождается образованием агрегатов клеток с формированием нейритов, аксонов и специфических межклеточных контактов [1, 2, 7]. Значительная часть стволовых прогениторных клеток в условиях такого культивирования погибает, остальные приспосабливаются к условиям среды и длительное время переживают в культуре клеток.

Целью данного исследования явилось изучение влияния условий культивирования на динамику переживания нейроклеток-предше-ственников, полученных из различных источников, при длительном культивировании in vitro в бессывороточной среде ДМЕМ.

Материалы и методы. Материалом исследований служили: 1) криоконсервированные нейроклетки человека 7, 8, 9, 10, 11-12 нед гестации, полученные из банка клеток Института криобиологии и криомедицины АН Укра-

12

Зозуля Ю.А., Лисяный Н.И., Любич Л.Д., Грищенко В.И., Петренко А.Ю., Баббийчук Г.А.

ины (г.Харьков); 2) нейроклетки человека из нативного абортивного материала (табл.1).

Получение суспензионных культур клеток-предшественников. Запечатанные контейнеры с криоконсервированными клетками извлекали из жидкого азота, помещали в водяную баню

Таблица 1 Сфнн экспериментальных наблюдений

Манфют Сфня Ц> о дал^мтальнос ть кулынгаро*ання, сут

Криоюнсервиро ванные нейроклетки человека. (7-12 нед гестации), п=14 1 21^18

Нейро кпв тки человека из нативного абортивного материала (3-12 нед гестации), п. =4 2 21

для оттаивания при температуре 38-40°С. Затем клетки переносили в стеклянные флаконы со средой ДМЕМ. Каждых 3 дня половина куль-туральной среды обновлялась.

Нативную эмбриональную мозговую ткань переносили в раствор ОМЕ или изотонический раствор натрия хлорида, освобождали от оболочек, помещали в среду ДМЕМ и суспендировали с помощью шприца с толстой иглой. Отстаивали 3 мин и надосадок переносили в стеклянные флаконы и чашки Петри. Каждых 3 дня половина культуральной среды обновлялась.

Изучение кинетики популяции клеток проводили путем тщательного суспендирования и отбора образцов клеточной взвеси из культу-рального объема. Определяли количество и жизнеспособность клеток согласно рекомендациям [5] по исключению трипанового синего.

Изучение влияния состава культуральной среды на переживаемость предшественников нервных клеток осуществляли в бессывороточной среде ДМЕМ и при добавлении в культу-ральную среду ретинола ацетата (0,2 мг/мл, АО «Киевский витаминный завод»).

Результаты и их обсуждение. Кинетика суспензионных культур предшественников нейроклеток при культивировании в среде ДМЕМ представлена в табл.2 (данные приведены в процентном выражении от первона-

чального количества клеток, внесенных в питательную среду).

Как видно из табл.2, при культивировании нейроклеток человека 8-12 нед гестации в бессывороточной среде ДМЕМ происходило снижение количества клеток. На 5-7-е сутки культивирования количество клеток снизилось в 1,52 раза; на 9-е сутки — в 3-4 раза, в дальнейшем в культуре сохранялась тенденция к снижению количества клеток.

Кинетика суспензионных культур криокон-сервированных нейроклеток человека 8-12 нед гестации представлена на рис.1 и в табл.3., из которых видно, что количество клеток, помещенных в среду ДМЕМ, на 9-е сутки культивирования снижалось в 5 раз по сравнению с первоначальным их количеством и продолжало снижаться до конца наблюдения (19-е сутки). При культивировании клеток в среде ДМЕМ+рети-нола ацетат, который вводили в питательную среду на 5-е сутки, значительного снижения количества клеток в культуре не происходило, их количество начинало возрастать с 7-х суток культивирования и увеличивалось на 9-12-е сутки культивирования в 2 раза и больше, достигая исходного количества клеток. По мере увеличения срока культивирования количество жизнеспособных клеток возрастало. При этом количество клеток, культивируемых в среде ДМЕМ+ретинола ацетат, превышало содержание клеток, помещенных в среду ДМЕМ, в 3-4 раза на 5-7-е сутки (от начала добавления ретинола ацетата) и в 9 раз — на 14-е сутки. Таким образом, добавление в культуральную среду ретинола ацетата значительно увеличивало выживание и размножение нейрогенных клеток.

Кинетика суспензионных культур нативных нейроклеток человека 8-12 нед гестации (абортивный материал) представлена на рис.2 и в табл.4, из которых видно, что количество клеток, помещенных в среду ДМЕМ, снижалось в 3 раза на 9-е сутки культивирования по сравнению с первоначальным количеством, а на 19-е сутки — в 5 раз. При добавлении в среду ДМЕМ ретинола ацетата исходное содержание клеток сохранялось и несколько возрастало с

Таблица 2. Динамика количества клеток-предшественников в суспензионной культуре в бессывороточной среде ДМЕМ, %

Источник клеток Продолжительность культивирования, сутки

0 1-е 3-и 5-е 7-е 9-е 12-е 19-е

Криоконсерви-рованные нейроклетки человека, п=14 100,00±0,00 89,23±6,11 80,53±13,93 63,76±10,86* 50,20±12,40* 24,07±8,44* 35,29±7,34* 11,50±6,40*

Нативные нейроклетки человека, п=4 100,00±0,00 — — 58,10±14,83* — 30,94±11,76* 43,98±19,37* 22,43±10,19*

Примечание. *

— различия достоверны по сравнению с показателем 0 сут культивирования (Р<0,05).

Длительное культивирование in vitro криоконсервированных и нативных нейроклеток эмбрионов челове к<3

сутки

♦ — ДМЕМ

Рис.1. Динамика суспензионной культуры криоконсервированных нейроклеток человека 8-12 нед гестации в бессывороточной среде ДМЕМ и при влиянии ретинола ацетата

12-х по 21-е сутки культивирования. При этом количество клеток в культурах, помещенных в среду ДМЕМ+ретинола ацетат, превышало количество клеток в культурах, помещенных в среду ДМЕМ, в 1,7-1,8 раза на 3-и-7-е сутки (от начала добавления ретинола ацетата). Однако к 21-м суткам содержание нейроклеток уменьшалось.

Таким образом, суммируя результаты длительного культивирования in vitro нейрокле-ток-предшественников, полученных из различ-

ных источников, можно заключить, что к 9-м суткам в бессывороточной среде ДМЕМ происходит снижение их количества в 3-4 раза. Мы считаем, что к этому сроку все дифференцированные клетки погибают, а остаются преимущественно только жизнеспособные переживающие малодифференцированные или недифференцированные клетки, предположительно,

нск.

При добавлении в культуральную среду дополнительных факторов (ретинола ацетата), очевидно, происходит стимуляция пролиферации клеток-предшественников или дифферен-цировка стволовых клеток и увеличение их количества в 2-5 раз, причем прирост количества клеток был выше в культурах криокон-сервированных нейроклеток по сравнению с таковым с культурами нативных нейроклеток эмбриона человека. Такое стимулирующее пролиферацию клеток-предшественников действие ретинола ацетата объясняется, по-видимому, известными биологическими свойствами препаратов витамина А, включающих ретинол, ре-тиналь, ретиноевую кислоту, ретинола ацетат и ретинола пальмитат. Известно, что ретинол необходим для роста, дифференцировки и сохранения функций эпителиальных и костных тканей, а также для их размножения, тогда как ретиноевая кислота — для клеточной диффе-ренцировки и она в 10 раз активнее ретинола, но менее активна в процессах размножения.

Полученные результаты согласуются с известными данными коллектива авторов [3] о том, что при культивировании клеток мозга, полученных от 8-12-недельных плодов человека, в

Таблица 3. Динамика количества и жизнеспособности криоконсервированных нейроклеток человека в суспензионной культуре в бессывороточной среде ДМЕМ и при добавлении ретинола ацетата, %

Состав среды Показатели Продолжительность культивирования, сут

1-е (+ретинола ацетат) 3-и 5-е 7-е 14-е 21-е 42-е

ДМЕМ+ ретинола ацетат, n=14 Количество 68,71±10,66 46,40±14,42 94,61±18,44# 106,19±9,94# 104,73±30,36# 108,48±29,56 46,15± 11,47

Жизнеспособность 19,83±6,68 16,69±7,29 27,00±10,06 36,31±11,88 89,65±0,85 92,40±0,57 96,75±3,25

ДМЕМ, n=14 Количество 63,76±10,86 50,20±12,40 24,07±8,44*# 35,29±7,34# 11,50±6,40*# — —

Жизнеспособность 19,08±7,58 20,95±0,05 16,88±4,54 22,68±9,87 50,00±50,00 — —

Примечание:* — различия достоверны по сравнению с показателями 1-х суток культивирования (Р<0,05).

# — различия достоверны по отношению к соответствующей группе сравнения (Р<0,05).

Таблица 4. Динамика количества нативных нейроклеток человека в суспензионной культуре в бессывороточной среде ДМЕМ при добавлении ретинола ацетата, %

Состав среды Продолжительность культивирования, сут

1-е (+ ретинола ацетат) 3-и 7-е 21-е

ДМЕМ + ретинола ацетат, n=4 35,95±13,55 40,08±14,93 46,95±20,85 20,55±5,14

ДМЕМ, n=4 43,98±19,37 22,43±10,19 27,60±9,05 44,78±31,34

14

Зозуля Ю.А., Лисяный Н.И., Любич Л.Д., Грищенко В.И., Петренко А.Ю., Бабийчук Г.А.

сутки

♦ — ДМЕМ

Рис.2. Динамика суспензионной культуры нативных ней-роклеток человека 8-12 нед гестации в бессывороточной среде ДМЕМ и при влиянии ретинола ацетата

селективной бессывороточной среде количество клеток уменьшается в течение 1-й недели культивирования, а после добавления стандартного парепарата ростовых факторов (включающего hFGF, hEGF, NSF-1) восстанавливается до исходного уровня, сохраняя жизнеспособность и способность дифференцироваться в нейральные клетки.

Выводы. 1. При длительном культивировании in vitro нейроклеток-предшественников в обедненной бессывороточной среде ДМЕМ происходит резкое (в 3-4 раза) снижение их количества к 9-м суткам культивирования, после чего отмечается стабилизация содержания клеток в течение 10-12 сут, что свидетельствует о наличии в культуре длительноживущей популяции стволовых клеток.

2. Добавление в среду дополнительных факторов (ретинола ацетата) способствует пролиферации клеток-предшественников: в течение 7 сут содержание клеток увеличивается в 1,31,5 раза, причем количество клеток в культурах, помещенных в среду ДМЕМ+ретинола ацетат, превышало количество клеток в культурах, помещенных в среду ДМЕМ, в 3-4 раза н а

5-7-е сутки (от начала добавления ретинола ацетата) в культурах криоконсервированных нейроклеток и в 1,7-1,8 раза в культурах нативных нейроклеток эмбриона человека.

Разработанная методика длительного культивирования нейроклеток человека позволяет получать обогащенную популяцию нейроклеток-предшественников, способных к пролиферации in vitro.

Список литературы

1. Анализ развития стволовых нейральных клеток человека in vitro / Полтавцева P.A., Марей М.В., Дубровина И.В. и др. // Цитология. — 2001. — Т.43, №9. — С.884-885.

2. Морфологические аспекты дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в культуре / Гор-деева О.Ф., Мануилова Е.С., Гуляева Д.В. и др. / / Цитология. — 2001. — Т.43, №9. — С.851.

3. Развитие и дифференцировка мультипотентных нейральных клеток человека in vitro / Полтав-цева P.A., Марей М.В., Дубровина И.В. и др. // Докл. PAH. — 2001.-Т.379, №6. — С.845-849.

4. Репин B.C., Сухих Г.Т. Медицинская клеточная био-

логия. — М.: БЭБиМ, 1998. — 199 с.

5. Руководство по культивированию нервной ткани: Методы. Техника. Проблемы // В.П. Божкова, Л.А. Брежетовский, В.М. Буравлев и др. — М.: Наука, 1988. — 318 с.

6. Сухих Г.Т. Трансплантация фетальных клеток в медицине: настоящее и будущее // Бюл. экспе-рим биол. — 1998. — Т.126. Прил.1. — С.3-13.

7. Эмбриональные стволовые клетки: плюрипотент-ность, коммитирование, регуляция дифферен-цировки / Мануилова Е.С., Гордеева О.Ф., Зиновьева Р.Д. и др. // Цитология. — 2001. — Т.43, №9. — С.876.

8. Barami K., Zhao J.,Diaz F.G., Lyman WK. Gamparison

of neural precursor cell fate in second trimester human brain and spinal cord // Neurol. Res. — 2000. — 23(2-3). — P.260-266.

9. Caldwell M.A, He X., Wilhe N. et al. Growth factors regulate the survival and fate of cells derived from human neurospheres // Nat. Biotech. — 2001. — 19(5). — P.475-479.

10. Ciccolini F. Identification of two distinct types of multi potent neural precursors that appear sequentially during CNS development // Mol. Cell Neurosci. — 2001. — 17(5). — P.895-907.

Тривале культивування in vitro крюконсервованих i нативних нейрокл1тин ембрюшв людини

Зозуля Ю.П, Лгсяний М.1., Любич Л.Д., Грищенко B.I., Петренко А.Ю., Бабтчук Г.А. При тривалому культивуванш in vitro нейроклгшн-попереднишв у збгдненому безсироватковому середовищi ДМЕМ зменшуэться 1х кшьшсть у 3-4 рази до 9-1 доби культивування, шсля чого вмют клгтин стабшзуеться, що свгдчить про наявшсть у культурi популяцп стовбу-рових клггин, якг самотдтримуються. Додавання до се-редовища ретинола ацетату сприяе пролГферацп нейро-клиин-попереднишв. Розроблена методика тривалого культивування нейроклгтин людини дозволяе отримати збагачену популяцш нейроклгшн-попереднитв, здатних до пролГферацп in vitro.

The long-term cultivation in vitro of the cryopreserved and native nerve cells of human embryo

Zozulya Yu.P., Lisyany N.I., Lyubych L.D., Grischenho V.I, Petrenho A.Yu., Babiychuh G.A. The long-term cultivation in vitro of neuroprecursors in KMEM without serum lead to the 3-4-fold decrease of the number of cells on the 9-th day of cultivation. Then the number of cells become consistent evidencing about the presence in culture of self-renewing population of stem cells. Retinolacetate stimulate the proliferation of precursors. The method of long-term cultivation of human nerve cells allow to get the enriched population of neuroprecursors with capacity to proliferation in vitro.