Групповые вариации мембранной организации при экстремальных состояниях

ФИЗИОЛОГИЯ

УДК 612.613.1

ГРУППОВЫЕ ВАРИАЦИИ МЕМБРАННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ПРИ ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ СОСТОЯНИЯХ

А.А. Вишневский, Ч.О. Жапаралиева, К. Кенешева

Институт горной физиологии НАН КР, г. Бишкек, Кыргызстан

Представленные в работе данные свидетельствуют о том, что индивидуальная устойчивость к гипоксической гипоксии связана с особенностями фосфолипидной реорганизации мембран. Впервые получены данные о вариативных типах рецепторных ганглиози-дов, цереброзидов и сульфатидов в ткани мозга крыс, различающихся по устойчивости к гипоксии.

Ключевые слова: мембраны, гипоксия, пониженные температуры, адаптация, фосфоли-пиды, гликолипиды.

Введение. Поиски путей повышения выносливости человека в условиях воздействия комплекса экологических и антропогенных экстремальных факторов горной среды представляют важную научно-практическую задачу. Традиционный подход к этой проблеме состоит в том, чтобы путем тренирующих действий повысить лабильность физиологических и биохимических механизмов адаптации. Однако возможности приспособительных перестроек имеют предел. Второй путь, который эмпирически давно используется в природе и практической деятельности человека, заключается в целенаправленном отборе организмов, обладающих в силу генетических и фенотипических особенностей индивидуальными свойствами и признаками, полезными для определенной задачи и в определенных внешних условиях среды [3, 12].

К настоящему времени накоплен большой фактический материал, касающийся многогранных и взаимно обусловленных реакций, которые создают определенную степень устойчивости индивида к влиянию факторов внешней среды. В то же время роль такого важнейшего компонента клетки, как плазматические мембраны, в рассматриваемом аспекте изучена недостаточно, и сведе-

ния здесь ограничены. Хотя исследования последних лет подтвердили верность сложившихся представлений о важной, если не решающей роли мембранных липидов и клеточных сигнальных систем в формировании длительного эффекторного ответа [1, 19]. Это положение основывается на том, что мембраны и элементы их деградации определяют протекание физиологических и биохимических процессов и являются исходным звеном в сложной цепи приспособительных модификаций на всех уровнях: субклеточном, клеточном, тканевом, системном.

Выяснение закономерностей и типов ответа мембранных структур на действие адап-тогенных факторов высокогорья в группах с различной устойчивостью к гипоксии способно внести ясность в механизмы, обусловливающие те или иные индивидуальные особенности резистентности к экстремальным факторам.

Цель исследования. Оценка роли клеточных мембран в детерминации индивидуальной резистентности к воздействию адап-тогенных факторов высокогорной среды.

Материалы и методы. В качестве экспериментальных животных использованы белые лабораторные крысы массой 140-160 г.

Экстремальные состояния моделировали в условиях высокогорья (Центральный Тянь-Шань, 3200 м над ур. м., июль-август) и в камере, где поддерживалась температура +4 °С. Пробу на физическую работоспособность крыс - поднятие груза - проводили по методике С.В. Сперанского [6]. Устойчивость организма животных к гипоксии оценивали по способности животных находиться на «высоте» 11 000 м (в барокамере) [16]. Учитывалось время, в течение которого крыса способна находиться на «высоте» 11 000 м над ур. м. до перехода в боковое положение. После этого давление в камере выравнивалось до атмосферного. Крыс, выдерживающих экспозицию в камере более 8 мин, относили к высокоустойчивым к гипоксии, выдерживающих менее 3 мин - к низкоустойчивым, а выдерживающих интервал 3-8 мин (промежуточная группа) - к среднеустойчивым. Методика позволяет разделить животных на группы с наименьшим разбросом данных.

Гомогенизированную ткань (мозг, кровь), содержащую неочищенные фракции клеточных мембран, наслаивали на ступенчатый градиент сахарозы и центрифугировали в течение 2 ч при 53 000 g (ультрацентрифуга «M0M3170», Венгрия). Плазматические слои отбирали для извлечения и разделения фос-фолипидов в тонком слое силикагеля на пластинах SilufolUV254 (Чехия) в системе растворителей «хлороформ/метанол/уксусная кислота/вода» (60:50:1:4 по объему). Эта система разделяет фосфатидилэтаноламин (PEA), фосфатидилсерин (PS), фосфатидили-нозитол (PI), фосфатидилхолин (PC) и сфин-гомиелин (SM). Лизоформы фосфолипидов (Lyso-PL) при этом остаются вблизи старта. Фракции элюировали и определяли количественно по содержанию фосфолипидного фосфора [14].

Экстракцию гликолипидов проводили по методу Фолча [14]. После промывки верхний водно-метаноловый слой экстракта использовали для определения ганглиозидов, а нижний слой, содержащий хлороформ, шел на определение цереброзидов и сульфатидов. Смесь цереброзидов и сульфатидов выделяли из общего липидного экстракта, освобождали от фосфолипидов и хроматографировали в

тонком слое силикагеля (пластины фирмы «Мерк», Германия) в системе растворителей «хлороформ/метанол/аммиак» (80:20:0,4 по объему). Количество цереброзидов и сульфа-тидов определяли по углеводному компоненту реакцией с резорцином [10]. Раствор ганг-лиозидов после диализа, лиофилизации и освобождения от фосфолипидов пропускали через колонку с ДЕАЕ-сефадексом А-25, после чего содержимое хроматографировали в системе растворителей «хлороформ/метанол/аммиак» (60:35:5 по объему). О содержании ганглиозидов судили по количеству ^ацетилнейраминовой кислоты [10, 11].

Статистическая обработка материала проводилась методом вариационной статистики. Вычисляли среднее значение (М), ошибку средней величины (т). Разницу средних величин оценивали по ^критерию Стьюдента и вероятности р. Различия признавали статистически значимыми при р<0,05. Данные для конкретных экспериментальных точек в каждом независимом определении получали в 6-12-кратной повторности.

Результаты и обсуждение. Предварительные эксперименты с функциональными пробами выявили, что у высокоустойчивых и среднеустойчивых к гипоксии групп животных, в отличие от низкоустойчивых, к концу адаптации к высокогорью (3200 м, 90 сут, июль-август) достоверно повысилась физическая работоспособность (рис. 1). В основе этих функциональных различий лежат структурные, метаболические и биоэнергетические особенности, которые в свою очередь могут определяться особенностями клеточных мембран. Действительно, видно (рис. 2, 3), что адаптационная модификация фосфолипидно-го состава эритроцитарных мембран у крыс с различной устойчивостью к гипоксии в горах имеет групповые отличия. Наиболее существенны изменения у высокоустойчивой группы: появляются лизоформы фосфатидилхо-лина (^о-РС) и фосфатидилэтаноламина (^о-РЕА), свидетельствующие о глубокой молекулярной модуляции эритроцитарных мембран [10]. Кроме того, для высокоустойчивой и среднеустойчивой групп характерно повышение содержания фосфатидилинозито-ла - источника вторичных внутриклеточных

мессенджеров, являющихся активаторами и инициаторами многих внутриклеточных процессов: фосфорилирования клеточных белков, биосинтеза новых структур, ферментов, активации генома и многих других [15, 18]. Экспериментальный материал, представленный выше, свидетельствует о различной стратегии приспособительных модификаций фосфолипидной композиции бислоя клетки у крыс с неодинаковой устойчивостью к гипоксии, что подтверждает известное положение о возможности формирования индии-видуальных адаптационных моделей в ответ на идентичное возмущающее действие [8, 9, 12].

Роль рецепторной части мембран, в частности гликолипидов и сульфатидов, в формировании процесса приспособления к экстремальным факторам горной среды практически не изучена [10, 17]. В первую очередь нас интересовало рецепторное звено мембраны, ответственное за передачу влияний внешнего агониста в толщу мембраны и дальше в клетку.

В связи с этим мы задались целью установить количественные и временные изменения гликолипидов при адаптации, а также их возможные различия в группах животных с различной устойчивостью к гипоксии. В табл. 1 показано, что концентрация всех классов гликолипидов в ткани мозга меняется при адаптации к +4 °С довольно быстро -в течение 6 ч экспозиции животных. Эти изменения, как и следовало ожидать, транзи-торные, поскольку в последующие сроки экспозиции отмечается тенденция к возвращению к исходным величинам. Групповые различия в адаптивных сдвигах этих параметров заключались в снижении уровня ганг-лиозидов у низкоустойчивых к гипоксии животных по мере увеличения сроков экспозиции: в этой группе при 6-часовой экспозиции значительно падает содержание церебрози-дов. Увеличение количества сульфатидов в этой группе становится заметным только через 3 сут экспозиции, тогда как у среднеус-тойчивых и высокоустойчивых к гипоксии крыс это происходит уже через 6 ч.

1200

¿ОБО

Контроль^ 14-й деу> ЗО-йдриь 90-^ день

т Высокоустоичивые  С оед неустойчивые II Низкоустоичивые

Рис. 1. Изменение физической работоспособности крыс с различной устойчивостью к гипоксии при адаптации к высокогорью (3200 м).

По оси ординат - средняя масса поднятого крысой груза, г; по оси абсцисс - продолжительность адаптации, сут; * - р<0,05

Рис. 2. Изменение состава фосфолипидов в эритроцитарных мембранах крыс с низкой устойчивостью к гипоксии при адаптации к высокогорью (3200 м, 90 дней).

По оси ординат - доля от общих мембранных фосфолипидов; по оси абсцисс - классы фосфолипидов: PC - фосфатидилхолин, Lyso-PC - его лизоформа, PEA - фосфатидилэтаноламин, Lyso-PEA - его лизоформа, SM - сфингомиелин, PI - фосфатидилинозитол, PS - фосфатидилсерин, PA - фосфатидная кислота; * - p<0,05; ** - p<0,02; *** - p<0,01

55

PC Lyso-PC PEA Lyso-PEA SM __ PI PS PA

ЙКонтооль  90-и день

Рис. 3. Изменение состава фосфолипидов в эритроцитарных мембранах крыс с высокой устойчивостью к гипоксии при адаптации к условиям высокогорья (3200 м, 90 дней).

* - р<0,05; ** - р<0,02; *** - р<0,01

Таблица 1

Гликолипиды в мозге крыс с различной устойчивостью к гипоксии при адаптации к температуре +4 °С

Время экспозиции при +4 °С Ганглиозиды, мкг/г Цереброзиды, мг/г Сульфатиды, усл. ед./г

Контроль Н 320,0±20,7 1,56±0,14 53,5±18,5

С 356,0±50,2 1,74±0,12 68,3±14,9

В 353,0±32,5 1,28±0,19 112,3±23,2

6 ч Н С В 286,0±7,3 0,64±0,08* 39,2±2,4

238,0±40,8* 1,56±0,14 98,4±13,0

3 сут Н 268,0±21,3 1,45±0,12 105,8±11,4*

С 311,0±11,6 3,52±0,23* 156,6±38,0*

В 347,0±19,4 3,15±0,45 121,9± 25,6

30 сут Н 250,0±30,3* 2,81±0,21* 79,8±14,4

С 290,0±7,9 2,54±0,10* 71,3±17,8

В 394,0±15,1 3,02±0,23* 116,6±18,0

Примечание. Н, С и В - соответственно низко-, средне- и высокоустойчивые к гипоксии крысы. * - различие с контролем при р<0,05.

Быстрое падение содержания ганглиози-дов (через 6 ч) при экспозиции крыс при пониженной температуре, возможно, связано с их приспособительной деструкцией и последующим синтезом рецепторных компонентов de novo, адекватных новым условиям. Это подтверждается возвращением их уровня к норме в последующие сроки адаптации.

Представляют интерес данные о различной динамике количества гликолипидов в зависимости от устойчивости животных к гипоксии и, в частности, более медленное восстановление содержания ганглиозидов в группе низкоустойчивых крыс. Получены доказательства того, что гипоксическая устойчивость формируется не только в функциональных системах организма и фосфолипид-ной структуре эритроцитарных мембран, но и в рецепторных компонентах плазматической мембраны мозга. В пользу этого положения свидетельствует то, что восстановление исходного содержания ганглиозидов у низкоустойчивых к гипоксии крыс происходит медленнее, чем в двух других группах. Эти первые положительные результаты говорят о том, что изучение адаптационной модуляции рецепторной части мембран нуждается в дополнительных исследованиях, касающихся

как влияния различных высот на рецептор-ные гликолипиды, так и воздействия последних на эффекторный ответ клетки [10, 17].

Наши исследования в высокогорье и на модели в холодовой камере продемонстрировали, насколько интенсивно и по-разному меняется фосфолипидный и гликолипидный состав мембран в разные сроки адаптации. Данные о групповых особенностях мембранной организации согласуются с представлениями о высокой генетической детерминированности популяционного разнообразия реакций на гипоксию [7].

Широкий спектр вариативных типов состава и структуры мембран, темпов и уровней их модификаций у низко-, средне- и высокоустойчивых к гипоксии групп животных позволяет допустить, что эти особенности обусловлены внутривидовыми групповыми различиями в структуре адаптационных моделей [2]. Основываясь на этих различиях, можно считать, что одним из факторов, создающих преимущество для высокоустойчивых к гипоксии особей при недостатке кислорода, является более высокая активность мембранных ферментов, обеспечивающих разные скорости фосфолипидной и жирно-кислотной реорганизации мембран [4, 5].

Для понимания групповых особенностей приспособления очень важны данные о трансформации краткосрочных событий в мембранах в долговременные параметры. Возникающая при этом длительная потен-циация, закрепление трансмембранных ферментов в активном состоянии являются элементами адаптационного ответа, специфического для отдельных особей внутри вида. Косвенным свидетельством этих событий является модификация спектра рецепторных гликолипидов, а также мембранные (фосфо-липидные) регуляторные реакции мозга и эритроцитов, причем в группах с различной устойчивостью к гипоксии они протекают по-разному.

Особенности реактивности мембран закреплены в генетическом аппарате, поскольку активность ферментных систем, обеспечивающих эти процессы, в свою очередь детерминируется экспрессией генома [13, 20]. Это значит, что основная роль в создании спонтанной повышенной устойчивости к недостатку кислорода принадлежит генотипиче-ским механизмам реактивности, которые модифицируются в процессе индивидуального приспособления организма к условиям существования. Таким образом, особенности мембранной организации в комплексе с другими системами и механизмами, взаимно обусловливаемые и дополняемые, детерминируют определенную степень устойчивости индивида к экстремальным влияниям внешней среды.

Выводы:

1. Реорганизация фосфолипидного состава эритроцитарных мембран у крыс с различной устойчивостью к гипоксии в горах (3200 м; 90 сут) имеет групповые отличия. В высокоустойчивой группе появляются лизо-формы фосфатидилхолина (^о-РС) и фос-фатидилэтаноламина (^о-РЕА). Перечисленные признаки не выявляются в группе низкоустойчивых к гипоксии животных.

2. Для динамики изменения уровней гликолипидов мозга крыс в условиях холода (+4 °С; 30 сут) характерно резкое падение содержания ганглиозидов, сульфатидов и це-реброзидов в первые сутки экспозиции (все три группы крыс). У низкоустойчивых к ги-

поксии крыс восстановление исходного содержания гликолипидов замедленное в отличие от ускоренного возврата у средне- и высокоустойчивых к гипоксии крыс.

1. Атыканов А. О. Клинико-патогенетичес-кое значение структурно-функционального состояния клеточных мембран при гипоксических состояниях у детей : автореф. дис. ... д-ра мед. наук / А. О. Атыканов. - Новосибирск, 2001. - 25 с.

2. Бахтиярова Ш. К. Состояние клеточных мембран у крыс с различными индивидуально-гипоксическими особенностями ВНД при действии пестицида «Ураган форте» / Ш. К. Бахтиярова // Вестн. Каз. НУ. - 2007. - № 4. - С. 157-162.

3. Билло Е. Е. Сравнительные особенности адаптивных реакций организма человека к гипоксии в норме и при артериальной гипертензии : дис. ... канд. мед. наук / Е. Е. Билло. - М., 2010. -163 с.

4. Взаимосвязь окислительного фосфорили-рования и процесса перекисного окисления липи-дов в митохондриальной фракции головного мозга при гипоксии / Л. М. Овсепян [и др.] // Биохимия. - 2006. - Т. 34. - С. 76-79.

5. Качаева Е. В. Митохондриальной АТФ-чувствительный калиевый канал и его роль в адаптации организма к гипоксии : дис. . канд. биол. наук / Е. В. Качаева. - Пущино, 2007. - 128 с.

6. Короткевич И. Г. Влияние антигипоксан-тов на течение острой церебральной ишемии в условиях низко- и высокогорья : автореф. дис. ... канд. мед. наук / И. Г. Короткевич. - Бишкек : КРСУ, 2008.

7. Лукьянова Л. Д. Влияние гипоксического прекондиционирования на свободно-радикальные процессы в тканях крыс с различной толерантностью к гипоксии / Л. Д. Лукьянова, Ю. И. Кирова // Бюл. экспериментальной биологии и медицины. - 2011. - № 3. - С. 263-268.

8. Малкин В. Б. Индивидуальные проявления дыхательной ритмики / В. Б. Малкин, Е. П. Гора // Успехи физиологических наук. - 1996. - Т. 27, № 1. - С. 87-100.

9. Медведев В. И. Закономерности взаимодействия гормональных влияний и собственной активности клеток в процессе адаптации / В. И. Медведев, Н. И. Косенков // Физиология человека. - 1989. -Т. 13, № 1. - С. 103-110.

10. О способности ганглиозидов улучшать функциональное состояние организма и нормализовать биохимическую организацию клеточных мембран при гипоксии / Н. Ф. Аврова [и др.] // Физиология человека. - 1993. - Т. 19, № 6. -С. 109-120.

11. Орел Н. М. Биохимия липидов : практикум для студентов биол. фак-та / Н. М. Орел. -Минск : БГУ, 2007. - 35 с.

12. Павленко Л. А. Повышение индивидуальной устойчивости к гипоксии головного мозга животных интервальной гипобарической тренировкой и производными бензимидазола : дис. ... канд. мед. наук / Л. А. Павленко. - СПб., 2005. -131 с.

13. Турпаев К. Т. Активные формы кислорода и регуляция экспрессии генов / К. Т. Турпаев // Биохимия. - 2002. - № 3. - С. 339-352.

14. Финдлей Дж. Биологические мембраны. Методы : пер. с англ. / Дж. Финдлей, У. Званз. -М. : Мир, 1990. - 347 с.

15. Chun J. Intracellular lipid messenger / J. Chun // US States Provisional Applications. - 2006. -Vol. 60, № 823. - P. 472-479.

16. Effects of drug-induced reduction in oxihe-moglobin affinity on survival time of muse in severe.

Hypoxic conditions / T. Kugimiya [et al.] // Tohoku J. Exp. Med. - 1984. - Vol. 144. - P. 315-320.

17. Katzir H. Role of plasma membrane leaflets in drugs uptake multidrug resistance / H. Katzir, D. Yehe-skely, G. Eytou // FEBS J. - 2010. - Vol. 277, № 5.

18. Negative regulation of DAG-kinase mediators adenosine-dependent hepatocyte preconditioning / G. Baldanzi [et al.] // Cell death and Differentiation. -2010. - Vol. 17. - P. 1059-1068.

19. Rauch C. On the relationship between drugs size, cell membrane mechanical properties and high level of multidrug resistance / C. Rauch // European Biophysics J. - 2008. - Vol. 38, № 4. - P. 537-546.

20. Regulation of the Caenorhabditis elegans Oxidative Stress Defense Protein SKN-1 by Glycogen Synthase Kinase-3 / J. H. An [et al.] // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 2005. - Vol. 102, № 45. - P. 16275-16280.

VARIANT TYPES OF MEMBRANE ORGANIZATION UNDER EXTREME CONDITIONS

A.A. Vishnevskij C.O. Japaralieva, K. Kenesheva

Institute of High Altitude Physiology National Academy of Science, Bishkek

Represented in the article data show, that individual resistance to hypoxic hypoxia is connected with features of phospholipides reorganization of membranes. For the first time evidence of variant types of receptor of gangliosides, cerebrasides and sulfatides in the brain tissue of rats with different resistance to hypoxia.

Keywords: membrane, hypoxia, low temperature, adaptation, phospholipids, glycolipids.