СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЧАСТИЦ, ОБРАЗУЮЩИХ ЭМУЛЬСИЮ ПИКЕРИНГА, ПУТЕМ ДЕРИВАТИЗАЦИИ ОБОГАЩЕННЫХ ЦЕЛЛЮЛОЗОЙ ПИЩЕВЫХ ВОЛОКОН С ПОМОЩЬЮ ПРИГОТОВЛЕННЫХ ФЕРМЕНТОВ И ЭМУЛЬСИЙ
METHOD FOR PRODUCTION OF PARTICLES FORMING PICKERING EMULSION BY DERIVATIZATION OF CELLULOSE-ENRICHED FOOD FIBERS, USING PREPARED ENZYMES AND EMULSIONS

Область применения изобретения
Настоящее изобретение относится к способу получения функционализированного пищевого волокна. Настоящее изобретение дополнительно относится к композициям, содержащим функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент. Настоящее изобретение дополнительно относится к частицам Пикеринга. Настоящее изобретение дополнительно относится к применению функционализированного пищевого волокна и денатурированного фермента или к частице Пикеринга настоящего изобретения для стабилизации эмульсий и к эмульсии или продукту, их содержащему.
Предпосылки создания изобретения
Стенки растительных клеток, которые являются основным источником пищевого волокна, состоят из первичного и вторичного слоев, состоящих из различных макромолекул, формирующих сложную сеть (McDougall et al, 1996 Processing and Function. Journal of the Science of Food and Agriculture, 70(2), pp. 133–150). Первичные стенки из высших растений в основном состоят из полисахаридов (до 90 мас.% сухого вещества), большая часть из которых устойчива к ферментативному расщеплению в кишечнике человека, и поэтому они называются пищевыми волокнами. Оставшиеся компоненты представляют собой относительно небольшие доли структурных гликопротеинов (2–10%), фенольных эфиров (<2%), минералов (1–5%) и ферментов.
Основным полисахаридом клеточной стенки является целлюлоза. В целом целлюлоза представляет собой нерастворимый в воде гомополимер, состоящий из линейной цепи повторяющихся β-1,4-глюкозиловых звеньев. Отдельные целлюлозные цепи тесно связаны друг с другом в микрофибриллы и удерживаются вместе водородными связями. Соотношение аморфных и кристаллических областей в целлюлозе может варьироваться, при этом кристаллические области очень устойчивы к гидролизу.
Пектины представляют собой разнообразную группу полисахаридов и имеют самые сложные структуры (Vincken, Voragen and Beldman, 2003 Enzymes degrading rhamnogalacturonan and xylogalacturonan. J. Whitaker, A. Voragen and D. Wong, ed., Handbook of food enzymology, 1st ed. New York: Marcel Dekker, pp. 930–941). К этой группе относятся следующие структуры: гомогалактуронан, рамногалактуронан 1 и 2, ксилогалактуронан, арабинан, арабиногалактан 1 и 2 (Bonnin, Garnier, & Ralet, 2014 Applied Microbiology and Biotechnology, 98(2), pp. 519–532). В зависимости от растения или фракции растения тип пектина может отличаться.
Изложение сущности изобретения
В соответствии с первым аспектом в настоящем изобретении предложен способ образования функционализированного пищевого волокна, включающий смешивание фермента и водной суспензии пищевого волокна, причем распределение частиц по размерам D90 указанного пищевого волокна составляет менее 800 мкм, соответственно менее 500 мкм, и указанное пищевое волокно содержит менее 25 мас.%. растворимых волокон и по меньшей мере 40 мас.% целлюлозы, при этом указанный фермент способен разрушать пищевое волокно; денатурацию указанного фермента с образованием водной суспензии, содержащей функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент.
50
В соответствии с дополнительным аспектом в настоящем изобретении предложен способ образования функционализированного пищевого волокна, включающий смешивание фермента и водной суспензии пищевого волокна, причем распределение частиц по размерам D указанного пищевого волокна составляет менее 30 мкм после разложения ферментом и указанное пищевое волокно содержит менее 25 мас.% растворимых волокон и по меньшей мере 40 мас.% целлюлозы; денатурацию указанного фермента с образованием функционализированного, амфифильного пищевого волокна с помощью адсорбированного фермента.
В соответствии с дополнительным аспектом настоящего изобретения предложено функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент, получаемые или полученные способом в соответствии с настоящим изобретением.
В дополнительном аспекте в настоящем изобретении предложена частица Пикеринга, содержащая функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент.
В одном аспекте настоящего изобретения предложено применение функционализированного пищевого волокна и денатурированного фермента в соответствии с настоящим изобретением или частицы Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением для стабилизации эмульсии типа «вода в масле» или эмульсии типа «масло в воде».
В настоящем изобретении также дополнительно предложена эмульсия типа «масло в воде» или эмульсия типа «вода в масле», содержащая функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент в соответствии с настоящим изобретением или частицу Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением.
В настоящем изобретении дополнительно предложен пищевой продукт, или косметический продукт, или продукт для ухода за кожей, или фармацевтический продукт, или продукт личной гигиены, или продукт для укладки волос, содержащий (например, стабилизированный) функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент в соответствии с настоящим изобретением или частицу Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением.
Краткое описание графических материалов
Варианты осуществления изобретения далее описаны только в качестве примера со ссылкой на прилагаемые чертежи.
На фиг. 1 показано содержание белка в очищенных ферментах и коммерческих ферментных смесях, измеренное методом Бредфорда и Лоури.
На фиг. 2 представлены хроматограммы, полученные посредством жидкостной хроматографии гидрофильных взаимодействий (HILIC), надосадочных жидкостей из волокна кожуры гороха (PHF), обработанного коммерческими ферментными смесями. Сверху вниз: PHF-пектин+целлюлоза, PHF-целлюлоза, PHF-пектин и контроль (разведение 1 : 100, контроль 1 : 10). IS: внутренний стандарт (ламинаритриоза).
На фиг. 3 представлены хроматограммы, полученные посредством высокоэффективной ионообменной хроматографии (HPAEC) надосадочных жидкостей из дисперсий PHF, обработанных коммерческими ферментными смесями.
На фиг. 4 показан выход восстанавливающего сахара в надосадочных жидкостях комплекса PHF-пектин+целлюлоза в зависимости от времени реакции.
На фиг. 5 показано объемное распределение частиц по размерам в водных дисперсиях PHF, обработанных коммерческими ферментными смесями.
На фиг. 6 показаны микрофотографии в оптическом микроскопе обработанных PHF и контроля после инкубации в течение 16 ч. A: контроль, B: PHF-целлюлоза, C: PHF-пектин, D: PHF-пектин+целлюлоза.
4,3
3,2
На фиг. 7 показан средний диаметр на основании объема (d) и на основании площади поверхности (d) в зависимости от времени реакции для комплекса PHF-пектин+целлюлоза.
На фиг. 8 показана кажущаяся вязкость в зависимости от скорости сдвига обработанных дисперсий PHF (10 мас.%) и контроля через 16 ч инкубации. Измерения проводили при 20°C.
На фиг. 9 показаны изображения измерений угла смачивания с использованием a) капли масла и b) капли воды и поверхности PHF в течение периода времени, равного 5 секундам. В данном примере твердую поверхность получали путем прессования 20 мг ультрадисперсного Exafine-PHF на клейкую ленту.
На фиг. 10 показано смачивание, определяемое как время (с), необходимое для полного погружения 1 г порошкового обработанного ферментами PHF и контрольного образца в 10 мл воды milli-Q.
На фиг. 11 показаны 50% эмульсии «масло в воде», полученные с 0,4% (масса/объем) обработанным ферментами PHF (pH 5). Контрольный образец содержал PHF, которые были обработаны в тех же условиях без добавления фермента a) через один день, b) через 4 недели.
На фиг. 12 показаны эмульсии, стабилизированные растворимой фазой (a) и нерастворимой фазой (b) дисперсий PHF-целлюлоза и PHF-пектин+целлюлоза через 24 часа после приготовления. Эмульсии оставались визуально неизменными в течение четырех недель.
На фиг. 13 представлены микрофотографии в оптическом микроскопе капель масла в эмульсиях 50%, полученных с помощью дисперсий PHF-целлюлоза и PHF-пектин+целлюлоза, pH 5, через 24 часа после приготовления. Масштабная полоска: 100 мкм.
На фиг. 14 показаны изображения, полученные с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ) 50% эмульсии «масло в воде», стабилизированной дисперсиями PHF-пектин+целлюлоза и PHF-целлюлоза (частицы PHF показаны желтым цветом). Красный и зеленый сигналы соответствуют масляной и водной фазам соответственно. Эмульсии были приготовлены перед визуализацией, и их выдерживали в течение по меньшей мере 24 часов.
На фиг. 15 показаны гели додецилсульфата натрия (SDS) надосадочных жидкостей и осадков PHF, обработанных коммерческими ферментными смесями.
На фиг. 16 показана эмульсия 50% «масло в воде», стабилизированная (A) термообработанным PHF-BSA и (B) только термообработанным BSA при pH 5 через 4 недели.
На фиг. 17 показаны образцы эмульсий «масло в воде», полученных с различными соотношениями масла и воды.
На фиг. 18 представлена микрофотография в оптическом микроскопе эмульсии 20% «вода в масле» с высокой скоростью сдвига при 22 000 1/мин. Масштабная полоска: 50 мкм.
На фиг. 19 представлены жидкие забеливатели, приготовленные в соответствии с таблицей 12. Слева направо: забеливатель A, B, C, D, E и F. a) Сразу после приготовления и b) через 30 минут после приготовления.
На фиг. 20 показан кофе, смешанный с жидкими забеливателями в соотношении 1 : 6. Слева направо: забеливатель A, B, C, D, E, F. a) Непосредственно после приготовления и b) через 30 минут после приготовления.
На фиг. 21 показаны эмульсии 50% (об./об.) «масло в воде», стабилизированные 0,4% (масса/объем) PHF, обработанным Alcalase и альфа-амилазой (левая фотография), а также контроли только с инактивированными альфа-амилазой и Alcalase (правая фотография).
На фиг. 22 показаны эмульсии 50% (об./об.) «масло в воде», стабилизированные 0,4% (масса/объем) дисперсией AF-пектин+целлюлоза, и контроли.
На фиг. 23 показаны эмульсии 50% (об./об.) «масло в воде», стабилизированные 0,4% (масса/объем) дисперсией AF, и контроли.
На фиг. 24 показаны эмульсии 50% (об./об.) «масло в воде», стабилизированные 0,4% (масса/объем) дисперсией WF, обработанной D740 L, и контроли.
На фиг. 25 показаны эмульсии 50% об./об., стабилизированные 0,4% (масса/объем) дисперсией PHF, доведенной до различных значений pH перед инактивацией фермента. HT: термообработка
На фиг. 26 показаны изображения шоколадного мусса, полученные в ходе испытаний в масштабе кухни (вид сверху).
На фиг. 27 показаны изображения шоколадного мусса, полученные в ходе масштабных испытаний на кухне (вид спереди).
На фиг. 28 показана полипептидная последовательность SEQ ID No. 1 целлобиогидролазы, которую можно получить из Trichoderma reesei.
На фиг. 29 показана полипептидная последовательность SEQ ID No. 2 целлобиогидролазы, которую можно получить из Trichoderma reesei.
На фиг. 30 показана полипептидная последовательность SEQ ID No. 3 полигалактуроназы, которую можно получить из Aspergillus aculeatus.
Подробное описание
Основной вывод настоящего изобретения заключается в получении композиции, содержащей функционализированные пищевые волокна и денатурированный фермент, которые могут быть использованы для стабилизации эмульсии, за счет обработки пищевых волокон с высоким содержанием целлюлозы и низким содержанием растворимых волокон ферментом, способным разлагать пищевые волокна.
Впервые авторы настоящего изобретения показали, что функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент в соответствии с настоящим изобретением выступают в качестве частицы Пикеринга.
На основании этих данных был предложен способ образования функционализированного пищевого волокна, включающий смешивание фермента и водной суспензии пищевого волокна, причем распределение частиц по размерам D90 указанного пищевого волокна составляет менее 800 мкм, соответственно менее 500 мкм, и указанное пищевое волокно содержит менее 25 мас.% растворимых волокон и по меньшей мере 40 мас.% целлюлозы, при этом указанный фермент способен разрушать пищевое волокно; денатурацию указанного фермента с образованием водной суспензии, содержащей функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент.
В одном варианте осуществления функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент взаимодействуют между собой с образованием частиц Пикеринга. Фермент настоящего изобретения может иметь аффинность к волокну в качестве субстрата (и таким образом связываться с ним). Благодаря ферментативному разложению пищевого волокна возможно соответственное уменьшение размера его частиц. Фермент для применения в настоящем изобретении способен разлагать пищевое волокно. Функционализированные пищевые волокна (например, частицы пищевых волокон) в комбинации с денатурированным(-и) ферментом(-ами) демонстрируют поверхностную активность и выступают в качестве частиц Пикеринга. Функционализированные частицы пищевого волокна и денатурированный(-ые) фермент(-ы) могут образовывать функционализированное пищевое волокно, связанное в комплекс с ферментом. Функционализированные пищевые волокна, связанные в комплекс с ферментом, в соответствии с настоящим изобретением могут выступать в качестве частиц Пикеринга. Фермент(-ы) может (могут) по-прежнему быть прикреплен(-ы) к поверхности функционализированного пищевого волокна и выступать в качестве белкового структурного компонента, закрепляющего частицу на поверхности раздела «масло/вода» или «вода/масло».
Без ограничений, накладываемых какой-либо теорией, можно улучшать стабилизирующие эмульсию свойства пищевого волокна, например PHF, путем уменьшения размера частиц и индуцирования амфифильности любой части волокна/частицы, которая может быть подвергнута воздействию воды (в том числе поверхности частицы и внутренних областей частицы, подвергающихся воздействию воды) с помощью одного или более ферментов, способных к разложению волокна. Вследствие индуцирования амфифильности возможно увеличение средней смачивающей способности частицы. Без ограничений, накладываемых какой-либо теорией, цель ферментативной обработки может заключаться в модификации амфифильности и размера поверхности частицы (например, части частицы, которая может быть подвергнута воздействию воды) путем разрыва волоконной сети с обеспечением возможности воздействия на гидрофобные групп на поверхности частицы. Этого можно достичь путем обнажения структур кристаллической целлюлозы с использованием ферментов, которые расщепляют неупорядоченную аморфную часть целлюлозы, или путем обнажения гидрофобных групп, присутствующих на пектиновом каркасе (сложные метиловые, ацетиловые эфиры и сложные эфиры феруловой кислоты). Кроме того, структурные белки, связанные с пищевым волокном, могут способствовать повышению поверхностной активности функционализированного пищевого волокна.
В некоторых вариантах осуществления пищевое волокно может не разлагаться или не гидролизоваться ферментом. Однако фермент должен быть способен гидролизовать пищевое волокно. Фермент, способный гидролизовать пищевое волокно, представляет собой фермент, который обладает аффинностью к пищевому волокну в качестве субстрата и, таким образом, связывается с пищевым волокном.
В одном варианте осуществления фермент представляет собой фермент, который гидролизует пищевое волокно.
В одном варианте осуществления пищевое волокно может быть гидролизовано указанными одним или более ферментами в течение периода до 24 часов.
В одном варианте осуществления пищевое волокно может быть гидролизовано в течение от приблизительно 10 минут до приблизительно 24 часов. В некоторых вариантах осуществления пищевое волокно может быть гидролизовано в течение от приблизительно 30 минут до 20 часов, соответственно от 4 часов до 20 часов, соответственно от 14 часов до 20 часов.
В некоторых вариантах осуществления пищевое волокно может быть гидролизовано в течение от приблизительно 6 до приблизительно 24 часов. В некоторых вариантах осуществления пищевое волокно может быть гидролизовано в течение 4–10 часов.
В некоторых вариантах осуществления пищевое волокно может быть гидролизовано в течение менее приблизительно 8 часов, например, для уменьшения вторичного гидролиза, который может происходить после этого.
В некоторых вариантах осуществления пищевое волокно может быть гидролизовано в течение по меньшей мере 30 минут, например по меньшей мере 1 часа, или по меньшей мере 4 ч, или по меньшей мере 6 часов, или по меньшей мере 10 ч, или по меньшей мере 15 ч.
В некоторых вариантах осуществления пищевое волокно может быть гидролизовано в течение приблизительно 16 ч.
В одном варианте осуществления посредством ферментативного гидролиза можно гидролизовать полисахаридные компоненты до олигосахаридов, но можно предотвратить полное расщепление олигосахаридов до моносахаридов. В некоторых вариантах осуществления процесс продолжается до расщепления приблизительно 35–50% полисахаридов или 35–50% целлюлозы до моносахаридов, соответственно до расщепления приблизительно 40–48% полисахаридов или 40–48% целлюлозы до моносахаридов.
Условия гидролиза будут оптимальными условиями для конкретного используемого фермента. Как правило, их указывают при покупке фермента или определяют экспериментально. Предпочтительно гидролиз можно проводить при оптимальном значении pH для используемого(-ых) фермента(-ов). Предпочтительно гидролиз можно проводить при рН от 5 до 8. Предпочтительно гидролиз можно проводить при оптимальной температуре для используемого(-ых) фермента(-ов). Предпочтительно гидролиз можно проводить при температуре от 45 до 65°C. Предпочтительно гидролиз можно проводить при непрерывном перемешивании.
Благодаря соответственно обработке ферментами пищевого волокна уменьшается размер частиц. Другими словами, размер частиц функционализированного пищевого волокна меньше, чем у пищевого волокна до обработки. В некоторых вариантах осуществления за счет обработки ферментами можно уменьшать средний объемный диаметр пищевого волокна приблизительно на десять.
Распределение частиц по размерам D90 пищевого волокна (например, перед обработкой) соответственно составляет менее 800 мкм.
Распределение частиц по размерам D90 пищевого волокна (например, перед обработкой или после обработки) соответственно составляет менее 500 мкм.
В одном варианте осуществления распределение частиц по размерам D90 пищевого волокна (например, перед обработкой или после обработки) может составлять менее 30 мкм.
В одном варианте осуществления распределение частиц по размерам D90 пищевого волокна (например, перед обработкой или после обработки) может составлять менее 10 мкм.
В одном варианте осуществления распределение частиц по размерам D90 пищевого волокна (например, перед обработкой или после обработки) может составлять менее 3 мкм.
Пищевое волокно (например, исходное пищевое волокно перед обработкой) можно измельчать до подходящего распределения частиц по размерам D90, например менее 800 мкм, или менее 500 мкм, или менее 30 мкм, или менее 10 мкм, или менее 3 мкм любым подходящим средством. Одним из подходящих средств может быть размалывание в струйной мельнице. В качестве примера пищевое волокно может быть измельчено в мельнице с порционной загрузкой IKA M20 (Milian, Швейцария) при постоянной скорости 2000 g в течение 10 секунд.
В одном варианте осуществления размалывание пищевого волокна может происходить до обработки ферментами.
В одном варианте осуществления размалывание пищевого волокна может происходить после обработки ферментами, например после сушки указанной водной суспензии.
В одном варианте осуществления размалывание пищевого волокна может происходить как до, так и после обработки ферментами.
При размалывании пищевого волокна пищевое волокно предпочтительно находится в относительно сухом состоянии.
В настоящем изобретении дополнительно предложен способ образования функционализированного пищевого волокна, включающий смешивание фермента и водной суспензии пищевого волокна, причем распределение частиц по размерам D50 указанного пищевого волокна составляет менее 30 мкм после разложения ферментом и указанное пищевое волокно содержит менее 25 мас.% растворимых волокон и по меньшей мере 40 мас.% целлюлозы; денатурацию указанного фермента с образованием функционального амфифильного пищевого волокна с помощью адсорбированного фермента.
Функционализированные пищевые волокна (например, частицы пищевых волокон) в комбинации с денатурированным(-и) ферментом(-ами) демонстрируют поверхностную активность и выступают в качестве частиц Пикеринга. Фермент(-ы) может (могут) по-прежнему быть прикреплен(-ы) к поверхности функционализированного пищевого волокна и выступать в качестве белкового структурного компонента, закрепляющего частицу на поверхности раздела «масло/вода» или «вода/масло».
Без ограничений, накладываемых какой-либо теорией, можно улучшать стабилизирующие эмульсию свойства пищевого волокна, например PHF, путем уменьшения размера частиц и индуцирования амфифильности любой части волокна/частицы, которая может быть подвергнута воздействию воды (в том числе поверхности частицы и внутренних областей частицы, подвергающихся воздействию воды) с помощью одного или более ферментов, способных к разложению волокна. Вследствие индуцирования амфифильности возможно увеличение средней смачивающей способности частицы. Без ограничений, накладываемых какой-либо теорией, цель ферментативной обработки может заключаться в модификации амфифильности и размера поверхности частицы (например, части частицы, которая может быть подвергнута воздействию воды) путем разрыва волоконной сети с обеспечением возможности воздействия на гидрофобные групп на поверхности частицы. Этого можно достичь путем обнажения структур кристаллической целлюлозы с использованием ферментов, которые расщепляют неупорядоченную аморфную часть целлюлозы, или путем обнажения гидрофобных групп, присутствующих на пектиновом каркасе (сложные метиловые, ацетиловые эфиры и сложные эфиры феруловой кислоты). Кроме того, структурные белки, связанные с пищевым волокном, могут способствовать повышению поверхностной активности функционализированного пищевого волокна.
Пищевое волокно разлагается или гидролизуется ферментом. Фермент, который гидролизует пищевое волокно, представляет собой фермент, который обладает аффинностью к пищевому волокну в качестве субстрата и, таким образом, связывается с пищевым волокном.
В одном варианте осуществления пищевое волокно может быть гидролизовано указанными одним или более ферментами в течение периода до 24 часов.
В одном варианте осуществления пищевое волокно может быть гидролизовано в течение от приблизительно 10 минут до приблизительно 24 часов. В некоторых вариантах осуществления пищевое волокно может быть гидролизовано в течение от приблизительно 30 минут до 20 часов, соответственно от 4 часов до 20 часов, соответственно от 14 часов до 20 часов.
В некоторых вариантах осуществления пищевое волокно может быть гидролизовано в течение от приблизительно 6 до приблизительно 24 часов. В некоторых вариантах осуществления пищевое волокно может быть гидролизовано в течение 4–10 часов.
В некоторых вариантах осуществления пищевое волокно может быть гидролизовано в течение менее приблизительно 8 часов, например, для уменьшения вторичного гидролиза, который может происходить после этого.
В некоторых вариантах осуществления пищевое волокно может быть гидролизовано в течение по меньшей мере 30 минут, например по меньшей мере 1 часа, или по меньшей мере 4 ч, или по меньшей мере 6 часов, или по меньшей мере 10 ч, или по меньшей мере 15 ч.
В некоторых вариантах осуществления пищевое волокно может быть гидролизовано в течение приблизительно 16 ч.
В одном варианте осуществления посредством ферментативного гидролиза можно гидролизовать полисахаридные компоненты до олигосахаридов, но можно предотвратить полное расщепление олигосахаридов до моносахаридов. В некоторых вариантах осуществления процесс продолжается до расщепления приблизительно 35–50% полисахаридов или 35–50% целлюлозы до моносахаридов, соответственно до расщепления приблизительно 40–48% полисахаридов или 40–48% целлюлозы до моносахаридов.
Условия гидролиза будут оптимальными условиями для конкретного используемого фермента. Как правило, их указывают при покупке фермента или определяют экспериментально. Предпочтительно гидролиз можно проводить при оптимальном значении pH для используемого(-ых) фермента(-ов). Предпочтительно гидролиз можно проводить при рН от 5 до 8. Предпочтительно гидролиз можно проводить при оптимальной температуре для используемого(-ых) фермента(-ов). Предпочтительно гидролиз можно проводить при температуре от 45 до 65°C. Предпочтительно гидролиз можно проводить при непрерывном перемешивании.
Благодаря обработке ферментами пищевого волокна уменьшается размер частиц. Другими словами, размер частиц функционализированного пищевого волокна меньше, чем у пищевого волокна до обработки. В некоторых вариантах осуществления за счет обработки ферментами можно уменьшать средний объемный диаметр пищевого волокна приблизительно на десять.
В одном варианте осуществления распределение частиц по размерам D50 пищевого волокна после обработки может составлять менее 10 мкм.
В одном варианте осуществления распределение частиц по размерам D50 пищевого волокна после обработки может составлять менее 3 мкм.
Пищевое волокно (например, исходное пищевое волокно перед обработкой) можно измельчать до подходящего распределения частиц по размерам D50, например менее 800 мкм, или менее 500 мкм, или менее 30 мкм, или менее 10 мкм, или менее 3 мкм любым подходящим средством. Одним из подходящих средств может быть размалывание в струйной мельнице. В качестве примера пищевое волокно может быть измельчено в мельнице с порционной загрузкой IKA M20 (Milian, Швейцария) при постоянной скорости 2000 g в течение 10 секунд.
В одном варианте осуществления размалывание пищевого волокна может происходить до обработки ферментами.
В одном варианте осуществления размалывание пищевого волокна может происходить после обработки ферментами, например после сушки указанной водной суспензии.
В одном варианте осуществления размалывание пищевого волокна может происходить как до, так и после обработки ферментами.
При размалывании пищевого волокна пищевое волокно предпочтительно находится в относительно сухом состоянии.
Без ограничений, накладываемых какой-либо теорией, считается, что денатурированный фермент настоящего изобретения образует амфифильные комплексы с волокнами уменьшенного размера, таким образом передавая поверхностную активность гидрофильной части частицы.
90
90
В одном варианте осуществления соответственно распределение частиц по размерам D функционализированного пищевого волокна или частицы Пикеринга составляет менее приблизительно 300 мкм. В одном варианте осуществления распределение частиц по размерам D функционализированного пищевого волокна или частицы Пикеринга составляет менее приблизительно 50 мкм.
90
В одном варианте осуществления распределение частиц по размерам D функционализированного пищевого волокна или частицы Пикеринга составляет менее приблизительно 25 мкм.
90
В одном варианте осуществления распределение частиц по размерам D функционализированного пищевого волокна или частицы Пикеринга составляет приблизительно 10 мкм или менее.
90
В одном варианте осуществления распределение частиц по размерам D функционализированного пищевого волокна или частицы Пикеринга составляет приблизительно 3 мкм или менее.
50
В одном варианте осуществления распределение частиц по размерам D функционализированного пищевого волокна или частицы Пикеринга составляет менее приблизительно 25 мкм.
50
В одном варианте осуществления распределение частиц по размерам D функционализированного пищевого волокна или частицы Пикеринга составляет приблизительно 10 мкм или менее.
50
В одном варианте осуществления распределение частиц по размерам D функционализированного пищевого волокна или частицы Пикеринга составляет приблизительно 3 мкм или менее.
P, 3
90,3
D измеряют в единицах длины (например, мкм), и он обозначает такой диаметр частицы, при котором P% от общего объема, занимаемого частицей в образце, имеют диаметр, меньший или равный длине, заданной для этого параметра. Следовательно, например, если D = 1 мкм, это означает, что 90% от общего объема частиц в образце представлены частицами, имеющими диаметр 1 мкм или менее.
Например, объемный средний размер частиц можно измерять способом, в котором средний объемный диаметр частицы получают с помощью лазерной дифракции с применением оптического инструмента Malvern (Mastersizer 2000, г. Малверн, Великобритания).
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения частицы функционализированного пищевого волокна настоящего изобретения и/или используемые в настоящем изобретении также могут иметь распределение частиц по размерам (PSD) на основании объема, которое является би- или мономодальным.
В некоторых вариантах осуществления отношение размера функционализированного пищевого волокна или частицы Пикеринга к размеру масла (в эмульсии может находиться в диапазоне 1 : 10. Другими словами, в некоторых вариантах осуществления функционализированное пищевое волокно (в комбинации с денатурированным ферментом) или частица Пикеринга должны быть по меньшей мере на один порядок меньше, чем стабилизируемые ими капли масла.
В одном варианте осуществления способ в соответствии с настоящим изобретением включает сушку указанной водной суспензии, содержащей функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент.
Сушку можно проводить любыми известными подходящими средствами, включая распылительную сушку, вакуумную сушку, сушку в барабанной сушилке, сублимационную сушку (или лиофилизацию) или сверхкритическую сушку.
В одном предпочтительном варианте осуществления функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент в соответствии с настоящим изобретением или частица Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением высушены посредством сублимационной сушки.
Функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент в соответствии с настоящим изобретением или частица Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы в сухом состоянии.
Функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент в соответствии с настоящим изобретением или частица Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением может быть в любой подходящей форме. В одном варианте осуществления настоящее изобретение или частица Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением может быть в форме гранулы или порошка.
В одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение или частица Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой порошок.
В настоящем документе термин «частица Пикеринга» означает твердую частицу, которая адсорбируется на поверхности раздела масляной и водяной фаз в эмульсии, например, из-за их смачивающих свойств, для стабилизации эмульсии с образованием эмульсии Пикеринга. Используемый в настоящем документе термин «частица Пикеринга» может означать частицу, проявляющую межфазную активность на поверхности раздела масло/вода. В настоящем изобретении частицы Пикеринга настоящего изобретения могут стабилизировать как эмульсии «масло в воде», так и «вода в масле».
Фермент (-ы)
Соответственно фермент для применения в настоящем изобретении может представлять собой один или более ферментов, выбранных из группы, состоящей из эндо-1,4-β-глюканазы, целлобиогидролазы, β-глюкозидазы, эндополигалактуроназы, экзополигалактуроназы, пектинметилэстеразы, эндопектатлиазы, экзопектатлиазы и пектинлиазы.
Основным полисахаридом клеточной стенки является целлюлоза. В целом целлюлоза представляет собой нерастворимый в воде гомополимер, состоящий из линейной цепи повторяющихся β-1,4-глюкозиловых звеньев. Отдельные целлюлозные цепи тесно связаны друг с другом в микрофибриллы и удерживаются вместе водородными связями. Соотношение аморфных и кристаллических областей в целлюлозе может варьироваться, при этом кристаллические области очень устойчивы к гидролизу.
Для деполимеризации этого неразветвленного и гомогенного полимера необходимы три различных класса ферментов: эндо-1,4-β-глюканазы (которые гидролизуют целлюлозу до глюкоолигосахаридов); экзоглюканазы или целлобиогидролазы (которые высвобождают целлобиозу из целлюлозы и глюкоолигосахаридов) и β-глюкозидазы (которые расщепляют целлобиозу до глюкозы). Недоступность целлюлозы для гидролитических ферментов в матриксе клеточной стенки является основным препятствием для ее разрушения. Для повышения доступности целлюлозы может потребоваться совместное действие ферментов, расщепляющих пектин и гемицеллюлозу, и/или подходящая предварительная обработка.
Пектины представляют собой разнообразную группу полисахаридов и имеют самые сложные структуры (Vincken, Voragen and Beldman, 2003 Enzymes degrading rhamnogalacturonan and xylogalacturonan. J. Whitaker, A. Voragen and D. Wong, ed., Handbook of food enzymology, 1st ed. New York: Marcel Dekker, pp. 930–941). К этой группе относятся следующие структуры: гомогалактуронан, рамногалактуронан 1 и 2, ксилогалактуронан, арабинан, арабиногалактан 1 и 2 (Bonnin, Garnier, & Ralet, 2014 Applied Microbiology and Biotechnology, 98(2), pp. 519–532). В зависимости от растения или фракции растения тип пектина может отличаться.
Пектины расщепляются различными типами пектиназ, которые можно различать в зависимости от стороны их действия и типа расщепления. Эндополигалактуроназа, экзополигалактуроназа и пектин/пектатлиазы расщепляют каркас однородных областей. Метилэстеразы и ацетилэстеразы участвуют в удалении метанола и ацетэтиловых эфиров из галактуроновой кислоты соответственно.
В одном варианте осуществления подходящим ферментом для применения в настоящем изобретении может быть ферментная композиция, имеющая более одного фермента или более одной ферментативной активности.
В одном варианте осуществления предпочтительно фермент для применения в настоящем изобретении имеет две или более ферментативных активности, выбранных из группы, состоящей из эндо-1,4-β-глюканазы, целлобиогидролазы, β-глюкозидазы, эндополигалактуроназы, экзополигалактуроназы, пектинметилэстеразы, эндопектатлиазы, экзопектатлиазы и пектинлиазы.
В настоящем изобретении один или более ферментов, которые действуют на целлюлозу, например один или более из эндо-1,4-β-глюканазы, целлобиогидролазы, β-глюкозидазы могут быть использованы в комбинации с одним или более ферментов, расщепляющих пектин, например одним или более из эндополигалактуроназы, экзополигалактуроназы, пектинметилэстеразы, эндопектатлиазы, экзопектатлиазы и пектинлиазы.
В одном варианте осуществления один или более ферментов для применения в настоящем изобретении представляют собой ферментную смесь, которая обладает активностью эндо-1,4-β-глюканазы и β-глюкозидазы.
В одном варианте осуществления один или более ферментов для применения в настоящем изобретении представляют собой ферментную смесь, которая обладает активностью целлобиогидролазы.
В одном варианте осуществления один или более ферментов для применения в настоящем изобретении представляют собой ферментную смесь, которая обладает активностью эндо-1,4-β-глюканазы, целлобиогидролазы и β-глюкозидазы.
В одном варианте осуществления один или более ферментов для применения в настоящем изобретении представляют собой ферментную смесь, обладающую одной или более ферментативными активностями, выбранными из эндополигалактуроназы, экзополигалактуроназы, пектинметилэстеразы, эндопектатлиазы, экзопектатлиазы и пектинлиазы.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения ферментная смесь, содержащая два или более из эндо-1,4-β-глюканазы, целлобиогидролазы и/или β-глюкозидазы могут быть использованы в комбинации с одним или более ферментов, расщепляющих пектин, например одним или более из эндополигалактуроназы, экзополигалактуроназы, пектинметилэстеразы, эндопектатлиазы, экзопектатлиазы и пектинлиазы.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения ферментную смесь, содержащую два или более из эндо-1,4-β-глюканазы, целлобиогидролазы и/или β-глюкозидазы, можно применять в комбинации с полигалактуроназой, например эндополигалактуроназой или экзополигалактуроназой.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения ферментную смесь, содержащую целлобиогидролазу, можно применять в комбинации с полигалактуроназой, например эндополигалактуроназой или экзополигалактуроназой.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный один или более ферментов для применения в настоящем изобретении могут представлять собой один или более ферментов, содержащих (или имеющих или состоящих из) полипептидные последовательности, показанные в настоящем документе как SEQ ID № 1, SEQ ID № 2 или SEQ ID № 3, или полипептидную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную ей.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный один или более ферментов для применения в настоящем изобретении могут представлять собой один или более ферментов, содержащих (или имеющих или состоящих из) полипептидные последовательности, показанные в настоящем документе как SEQ ID № 1, SEQ ID № 2 или SEQ ID № 3, или полипептидную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную ей.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный один или более ферментов для применения в настоящем изобретении могут представлять собой один или более ферментов, содержащих (или имеющих или состоящих из) полипептидные последовательности, показанные в настоящем документе как SEQ ID № 1, SEQ ID № 2 или SEQ ID № 3, или полипептидную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную ей.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный один или более ферментов для применения в настоящем изобретении могут представлять собой один или более ферментов, содержащих (или имеющих или состоящих из) полипептидные последовательности, показанные в настоящем документе как SEQ ID № 1, SEQ ID № 2 или SEQ ID № 3, или полипептидную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную ей.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный один или более ферментов для применения в настоящем изобретении могут представлять собой полипептид, имеющий активность целлобиогидролазы, содержащий (или имеющий или состоящий из) полипептидную последовательность, показанную в настоящем документе как SEQ ID № 1 или SEQ ID № 2, или аминокислотную последовательность, которая содержит консервативную замену по меньшей мере одной из аминокислот; или вариант, гомолог или производное SEQ ID № 1 или SEQ ID № 2, по меньшей мере на 70% идентичное ей.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный один или более ферментов для применения в настоящем изобретении могут представлять собой полипептид, имеющий активность полигалактуроназы, содержащий (или имеющий или состоящий из) полипептидную последовательность, показанную в настоящем документе как SEQ ID № 3, или аминокислотную последовательность, которая содержит консервативную замену по меньшей мере одной из аминокислот; или вариант, гомолог или производное SEQ ID № 3, по меньшей мере на 70% идентичное ей.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения один или более ферментов кодируют нуклеотидной последовательностью, которая кодирует полипептидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 1, SEQ ID № 2 или SEQ ID № 3, или аминокислотную последовательность, которая содержит консервативную замену по меньшей мере одной из аминокислот; или вариант, гомолог или производное SEQ ID № 1, SEQ ID № 2 или SEQ ID № 3, по меньшей мере на 70% идентичное ей.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный один или более ферментов для применения в настоящем изобретении могут представлять собой комбинацию полипептида, показанного в настоящем документе как SEQ ID № 1 или SEQ ID № 2, или аминокислотную последовательность, которая содержит консервативную замену по меньшей мере одной из аминокислот; или вариант, гомолог или производное SEQ ID № 1 или SEQ ID № 2, по меньшей мере на 70% идентичное ей, и полипептид, имеющий активность полигалактуроназы, содержащий (или имеющий или состоящий из) полипептидную последовательность, показанную в настоящем документе как SEQ ID № 3, или аминокислотную последовательность, которая содержит консервативную замену по меньшей мере одной из аминокислот; или вариант, гомолог или производное SEQ ID № 3, по меньшей мере на 70% идентичное ей.
В одном варианте осуществления фермент представляет собой эндо-1,4-β-глюканазу. Ферменты эндо-1,4-β-глюканазы можно охарактеризовать как относящиеся к КФ. 3.2.1.4 в соответствии с рекомендациями по номенклатуре ферментов Международного союза биохимии и молекулярной биологии (IUBMB). Этот фермент эндогидролизует (1→4)-β-D-глюкозидные связи в целлюлозе, лихенине и β-D-глюканах зерновых. Другими названиями этого фермента могут быть целлюлаза, β-1,4-глюканаза; β-1,4-эндоглюкангидролаза; целлюлаза A; целлюлозин АР; эндоглюканаза D; щелочная целлюлаза; целлюлаза A 3; целлюдекстриназа; 9.5 целлюлаза; авицелаза; панцеллаза SS; 1,4-(1,3;1,4)-β-D-глюкан-4-глюканогидрола. Систематическим названием этого фермента является 4-(1,3;1,4)-β-D-глюкан-4-глюканогидролаза.
В одном варианте осуществления фермент представляет собой β-глюкозидазу. β-глюкозидаза может быть отнесена к классификации КФ 3.2.1.21 в соответствии с рекомендациями по номенклатуре ферментов Международного союза биохимии и молекулярной биологии (IUBMB). В некоторых вариантах осуществления данный фермент гидролизует концевые, невосстанавливающие β-D-глюкозиловые остатки с высвобождением β-D-глюкозы. Другими названиями этого фермента могут быть гентиобиаза; целлобиаза; эмульсин; элатераза; арил-β-глюкозидаза; β-D-глюкозидаза; β-глюкозидглюкогидролаза; арбутиназа; амигдалиназа; p-нитрофенил-β-глюкозидаза; примеверозидаза; амигдалаза; линамараза; салицилиназа; β-1,6-глюкозидаза. Систематическим названием этого фермента является β-D-глюкозидглюкогидролаза. В одном варианте осуществления фермент может представлять собой фермент GH3 согласно классификации с использованием базы данных углеводных активных ферментов (www.CAZy.org).
1
В одном варианте осуществления фермент представляет собой целлобиогидролазу. Целлобиогидролаза может представлять собой целлюлозо-1,4-β-целлобиозидазу (невосстанавливающий конец). Целлобиогидролаза может быть отнесена к классификации КФ 3.2.1.91 в соответствии с рекомендациями по номенклатуре ферментов Международного союза биохимии и молекулярной биологии (IUBMB). В некоторых вариантах осуществления данный фермент гидролизует(1→4)-β-D-глюкозидные связи в целлюлозе и целлотетраозе за счет высвобождения целлобиозы из невосстанавливающих концов цепей. Другими названиями этого фермента могут быть экзоцеллобиогидролаза; β-1,4-глюканцеллобиогидролаза; β-1,4-глюканцеллобиосилгидролаза; 1,4-β-глюканцеллобиозидаза; экзоглюканаза; авицелаза; CBH 1; C целлюлаза; целлобиогидролаза I; целлобиогидролаза; экзо-β-1,4-глюканцеллобиогидролаза; 1,4-β-D-глюканцеллобиогидролаза; целлобиозидаза. Систематическим названием этого фермента является 4-β-D-глюканцеллобиогидролаза (невосстанавливающий конец).
В одном варианте осуществления фермент представляет собой эндополигалактуроназу. В одном варианте осуществления фермент представляет собой эндо-1,4-α-полигалактуроназу. Эндо-1,4-α-полигалактуроназа может быть отнесена к классификации КФ 3.2.1.15 в соответствии с рекомендациями по номенклатуре ферментов Международного союза биохимии и молекулярной биологии (IUBMB). В некоторых вариантах осуществления данный фермент гидролизует (1→ 4)-α-D-галактозидуроновые связи в пектате и других галактуронанах. Другими названиями этого фермента могут быть полигалактуроназа, пектиндеполимераза; пектиназа; эндополигалактуроназа; пектолаза; пектингидролаза; пектинполигалактуроназа; эндополигалактуроназа; поли-α-1,4-галактуронидгликаногидролаза; эндогалактуроназа; эндо-D-галактуроназа; поли(1,4-α-D-галактуронид)гликаногидролаза. Систематическим названием этого фермента является (1→4)-α-D-галактуронангликаногидролаза.
n
2
n-1
В одном варианте осуществления фермент представляет собой экзополигалактуроназу. Экзополигалактуроназы могут быть отнесены к классификации КФ 3.2.1.67 в соответствии с рекомендациями по номенклатуре ферментов Международного союза биохимии и молекулярной биологии (IUBMB). В некоторых вариантах осуществления данный фермент осуществляет гидролиз в следующей реакции: [(1→4)-α-D-галактуронид] + HO = [(1→4)-α-D-галактуронид] + D-галактуронат. Другими названиями этого фермента могут быть галактуран-1,4-α-галактуронидаза; поли(галактуронат)гидролаза; экзо-D-галактуроназа; экзо-D-галактуронаназа; экзополи-D-галактуроназа; поли(1,4-α-D-галактуронид)галактуроногидролаза. Систематическим названием этого фермента является поли[(1→4)-α-D-галактуронид]галактуроногидролаза.
2
В одном варианте осуществления фермент представляет собой пектинметилэстеразу. Пектинметилэстеразы могут быть отнесены к классификации КФ 3.1.1.11 в соответствии с рекомендациями по номенклатуре ферментов Международного союза биохимии и молекулярной биологии (IUBMB). В некоторых вариантах осуществления данный фермент осуществляет гидролиз в следующей реакции: пектин + n HO = n метанол + пектат. Другими названиями этого фермента могут быть пектиндеметоксилаза; пектинметоксилаза; пектинметилэстераза. Систематическим названием этого фермента является пектинпектилгидролаза.
В одном варианте осуществления фермент представляет собой эндопектатлиазу. Эндопектатлиазы могут быть отнесены к классификации КФ 4.2.2.2 в соответствии с рекомендациями по номенклатуре ферментов Международного союза биохимии и молекулярной биологии (IUBMB). В некоторых вариантах осуществления данный фермент осуществляет гидролиз в следующей реакции: элиминационное расщепление (1→4)-α-D-галактуронана с получением олигосахаридов с 4-дезокси-α-D-галакт-4-энуронозиловыми группами на невосстанавливающих концах. Другими названиями этого фермента могут быть лиаза альфа-1,4-D-эндополигалактуроновой кислоты; лиаза эндо-альфа-1,4-полигалактуроновой кислоты; эндогалактуронаттрансэлиминаза; эндопектинметилтрансэлиминаза; пектаттрансэлиминаза; лиаза пектиновой кислоты; трансэлиминаза пектиновой кислоты; пектиновая лиаза; пектинтрансэлиминаза; лиаза PGA; полигалактуронатлиаза; лиаза полигалактуроновой кислоты; трансэлиминаза полигалактуроновой кислоты; трансэлиминаза полигалактуроновой кислоты; PPase-N. Систематическим названием этого фермента является (1→4)-α-D-галактуронанлиаза.
В одном варианте осуществления фермент представляет собой экзопектатлиазу. Экзопектатлиазы могут быть отнесены к классификации КФ 4.2.2.9 в соответствии с рекомендациями по номенклатуре ферментов Международного союза биохимии и молекулярной биологии (IUBMB). В некоторых вариантах осуществления данный фермент осуществляет гидролиз в следующей реакции: элиминационное расщепление 4-(4-дезокси-α-D-галакт-4-энуронозил)-D-галактуроната из восстанавливающего конца пектата, т.е. деэтерификация пектина. Другими названиями этого фермента могут быть экзо-PATE; экзо-PGL; экзопектатлиаза; трансэлиминаза экзопектиновой кислоты; экзополигалактуронатлиаза; трансэлиминаза экзополигалактуроновой кислоты; PATE; пектатэкзолиаза. Систематическим названием этого фермента является (1→4)-α-D-галактуронандисахаридлиаза восстанавливающего конца.
В одном варианте осуществления фермент представляет собой пектинлиазу. Пектинлиазы могут быть отнесены к классификации КФ 4.2.2.10 в соответствии с рекомендациями по номенклатуре ферментов Международного союза биохимии и молекулярной биологии (IUBMB). В некоторых вариантах осуществления данный фермент осуществляет гидролиз в следующей реакции: элиминационное расщепление метилового сложного эфира (1→4)-α-D-галактуронана с получением олигосахаридов с 4-дезокси-6-O-метил-α-D-галакт-4-энуронозиловыми группами на невосстанавливающих концах. Другими названиями этого фермента могут быть эндопектинлиаза; пектинметилтрансэлиминаза; пектинтрансэлиминаза; пектолиаза; PL; PMGL; PNL; трансэлиминаза полиметилгалактуроновой кислоты. Систематическим названием этого фермента является (1→4)-6-O-метил-α-D-галактуронанлиаза.
В одном варианте осуществления ферментативную активность можно измерять в соответствии с ферментными анализами, представленными в разделе 1.2.1 раздела примеров.
В одном варианте осуществления фермент может быть выбран из группы, состоящей из:
целлюлаз, включая эндоглюканазу и бета-глюкозидазу
Novozymes (Sigma-Aldrich)
Celluclast, в особенности Celluclast 1.5L
бета-глюканазы
ABVista
Econase BG
β-глюкозидазы
Danisco
Accellerase BGTM
бета-глюканазы
Huvepharma
Hostazym C
бета-глюканазы
Le Saffre
Safizyme G
бета-глюканазы
Lyven
Feedlyve AGL
полигалактуроназы
Novozymes (Sigma-Aldrich)
Pectinex Ultra SP-L
В одном варианте осуществления соответственно фермент может представлять собой Celluclast 1.5L, или Pectinex Ultra SP-L, или их комбинацию.
В одном варианте осуществления фермент может представлять собой ферментный комплекс, имеющий более одной ферментативной активности.
Способ настоящего изобретения предусматривает денатурирование фермента(-ов). Без ограничений, накладываемых какой-либо теорией, фермент(-ы) в активной и растворимой форме не обладают какими-либо эмульгирующими свойствами в комбинации с функционализированным пищевым волокном. Однако после инактивации или денатурирования фермент(-ы) становятся поверхностно-активными агентами и стабилизируют эмульсию в присутствии функционализированных пищевых волокон. Без ограничений, накладываемых какой-либо теорией, денатурированный(-ые) фермент(-ы) может (могут) образовывать амфифильные комплексы с функционализированным пищевым волокном и, таким образом, передавать поверхностную активность гидрофильной части частицы волокна. Данные показывают, что фермент(-ы) связан(-ы) с функционализированным пищевым волокном, поскольку фермент не экстрагируется с растворимой фазой и может быть измерен в нерастворимой фазе посредством электрофореза белков в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE).
Фермент (-ы) можно денатурировать любым подходящим средством, например с помощью тепла, например путем повышения температуры выше 60°C, например до 100°C, в течение 10 минут; или с использованием крайних значений pH, например путем обработки щелочью, например путем увеличения pH до уровня выше 9.
В одном варианте осуществления функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент настоящего изобретения или частица Пикеринга настоящего изобретения содержит денатурированный фермент в соотношении более 0,25 мг денатурированного фермента : 1 г масла.
В одном варианте осуществления фермент можно выбирать таким образом, чтобы он имел оптимальное значение pH в пределах диапазона pH для применения продукта. Таким образом можно обеспечивать устойчивость к образованию хлопьев в конечном продукте.
Пищевое волокно
Настоящее изобретение относится к способу получения функционализированного пищевого волокна.
Настоящее изобретение включает смешивание фермента и пищевого волокна, которое имеет распределение частиц по размеру D90 менее 800 мкм и которое содержит по меньшей мере 40 мас.% целлюлозы.
В одном варианте осуществления пищевое волокно может иметь по меньшей мере 50 мас.% целлюлозы.
В одном варианте осуществления пищевое волокно может иметь по меньшей мере 55 мас.% целлюлозы.
В одном варианте осуществления пищевое волокно может иметь по меньшей мере 60 мас.% целлюлозы.
В одном варианте осуществления пищевое волокно может содержать по меньшей мере 40–98 мас.% целлюлозы.
В одном варианте осуществления пищевое волокно может содержать по меньшей мере 50–80 мас.% целлюлозы.
В одном варианте осуществления пищевое волокно может содержать по меньшей мере 60–75 мас.% целлюлозы.
Настоящее изобретение включает смешивание фермента и пищевого волокна, которое имеет распределение частиц по размеру D50 менее 30 мкм и которое содержит по меньшей мере 40 мас.% целлюлозы.
В одном варианте осуществления пищевое волокно может иметь по меньшей мере 50 мас.% целлюлозы.
В одном варианте осуществления пищевое волокно может иметь по меньшей мере 55 мас.% целлюлозы.
В одном варианте осуществления пищевое волокно может иметь по меньшей мере 60 мас.% целлюлозы.
В одном варианте осуществления пищевое волокно может содержать по меньшей мере 40–98 мас.% целлюлозы.
В одном варианте осуществления пищевое волокно может содержать по меньшей мере 50–80 мас.% целлюлозы.
В одном варианте осуществления пищевое волокно может содержать по меньшей мере 60–75 мас.% целлюлозы.
В одном варианте осуществления пищевое волокно в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой волокно кожуры растения. В другом варианте осуществления пищевое волокно может быть получено из богатой волокнами фракции овоща или фрукта.
Кожура или кожица растения представляет собой внешнюю оболочку или покрытие семени. Кожица или кожура включает в себя защитное внешнее покрытие семян, фруктов или овощей. Кожура бобовых и некоторых схожих фруктов может называться стручком.
В одном варианте осуществления волокно кожуры растения может представлять собой любое волокно кожуры растения, которое содержит менее 25 мас.% растворимых волокон.
В одном варианте осуществления волокно кожуры растения может представлять собой любое волокно кожуры растения, которое содержит менее 20 мас.% растворимых волокон.
В одном варианте осуществления волокно кожуры растения может представлять собой любое волокно кожуры растения, которое содержит менее 15 мас.% растворимых волокон.
В одном варианте осуществления волокно кожуры растения может представлять собой любое волокно кожуры растения, которое содержит менее 10 мас.% растворимых волокон.
В одном варианте осуществления волокно кожуры растения может представлять собой любое волокно кожуры растения, которое содержит менее 25 мас.% растворимых волокон и по меньшей мере 40 мас.% целлюлозы.
В одном варианте осуществления волокно кожуры растения может представлять собой любое волокно кожуры растения, которое содержит менее 20 мас.% растворимых волокон и по меньшей мере 50 мас.% целлюлозы.
В одном варианте осуществления волокно кожуры растения может представлять собой любое волокно кожуры растения, которое содержит менее 15 мас.% растворимых волокон и по меньшей мере 55 мас.% целлюлозы.
В одном варианте осуществления волокно кожуры растения может представлять собой любое волокно кожуры растения, которое содержит менее 10 мас.% растворимых волокон и по меньшей мере 60 мас.% целлюлозы.
В одном варианте осуществления волокно кожуры растения выбрано из группы, состоящей из волокна кожуры гороха, кожуры бобовых (например, чечевицы, бобов), волокна бамбука, волокон какао и волокон кофе. Волокно кожуры растения может представлять собой волокно кожуры гороха.
В одном варианте осуществления пищевые волокна могут быть выбраны по вкусу, а также по другим характеристикам. В качестве примера пищевое волокно может представлять собой волокно с нейтральным вкусом или волокно, которое не имеет вкуса.
В одном варианте осуществления пищевые волокна могут быть выбраны по цвету, а также по другим характеристикам. В качестве примера пищевое волокно может представлять собой волокно, которое имеет светлый цвет, нейтральный цвет или бесцветно.
В одном варианте осуществления пищевые волокна могут быть выбраны по запаху, а также по другим характеристикам. В качестве примера пищевое волокно может представлять собой волокно, которое не имеет запаха.
В одном варианте осуществления пищевые волокна не являются пшеничными отрубями (или пшеничными волокнами).
В одном варианте осуществления пищевые волокна не являются яблочными выжимками или яблочными волокнами.
В одном варианте осуществления пищевые волокна не являются подорожником.
В одном варианте осуществления пищевые волокна не являются высокорастворимым пектиновым волокном, например пищевое волокно может представлять собой волокно, которое содержит менее 50% растворимого пектина.
В одном варианте осуществления пищевое волокно не является волокном с низким содержанием целлюлозы, например не является волокном, которое содержит менее 60 мас.% целлюлозы.
Используемый в настоящем документе термин «функционализированный» означает, что пищевое волокно модифицируют (например, с помощью способа настоящего изобретения) путем смешивания с ферментом для получения стабилизирующих эмульсию свойств при нахождении в комбинации с денатурированным ферментом. Используемый в настоящем документе термин «функционализированный» может означать возможность обеспечения функции, например стабилизатора эмульсии типа «масло в воде». Используемый в настоящем документе термин «функционализированный» может означать, что пищевое волокно модифицируют (например, с помощью способа настоящего изобретения) с образованием частицы Пикеринга. Без ограничений, накладываемых какой-либо теорией, пищевое волокно, например PHF, может быть модифицировано путем уменьшения размера частиц и индуцирования амфифильности на поверхности частицы с применением одного или более ферментов с расщепляющей волокно активностью.
Горох (Pisum sativum L.) представляет собой богатый источник сложных углеводов, и интерес к нему объясняется его использованием в качестве богатого волокнами побочного продукта, имеющего коммерческую ценность (Weightman et al, 1995). Общее содержание пищевых волокон и относительное содержание целлюлозных и нецеллюлозных полисахаридов зависит от их локализации в семядоле или кожуре гороха (Guillon & Champ 2002). В данном исследовании для работы выбран коммерческий состав волокна кожуры гороха, полученный из желтого гороха (Exafine, Cosucra), из-за относительно высокого общего содержания пищевых волокон и из-за меньшего количества крахмальных и белковых примесей (см. таблицу A).
ТАБЛИЦА A. Композиция коммерчески доступных волокон кожуры гороха в мас.% сухого вещества (по данным Guillon & Champ, 2002)
Семядоля гороха
Кожура гороха
Общее содержание пищевых волокон
55
89
Растворимые пищевые волокна
14
7
Белки
17
5
Липид
0,5
1,5
Доступные углеводы<sup>a</sup>
23
2
Минеральные вещества
4
4
a
Перевариваемые поли-, олиго- и моносахариды
Используемый в настоящем документе термин «волокно» означает пищевой материал, содержащий такие вещества, как целлюлоза, лигнин и пектин, которые устойчивы к действию пищеварительных ферментов.
Для выбора оптимального состава ферментов для их расщепления может быть желательно получить подробные сведения о химической структуре волокон. Клеточные стенки кожуры гороха приблизительно на 69 мас.% состоят из целлюлозы, на 16,8 мас.% из пектина и на 7,5 мас.% из гемицеллюлозы в пересчете на сухое вещество (Reichert, 1982), что согласуется с составом нейтрального сахара, описанным в нескольких исследованиях (см. таблицу B). Кожура гороха только в малой степени лигнифицируется (<1,5 мас.% сухого вещества), и, следовательно, считается, что она не содержит большого количества вторичных клеточных стенок (Weightman et al, 1995 Carbohydrate Polymers, 26, pp. 121–128; Reichert 1981 Cereal Chemistry, 58(4), pp. 266–270).
Таблица B. Композиция (мг/г) кожуры гороха (Weightman et al, 1995 Carbohydrate Polymers, 26, pp. 121–128)
Сахар
Рамноза
Фукоза
Арабиноза
Ксилоза
Галактоза
Глюкоза
AUA<sup>b</sup>
мг/г
16
н/о<sup>a</sup>
39
122
28
581
150
a
н/о — не обнаружено
b
AUA — ангидроуроновые кислоты
Помимо высокого содержания целлюлозы, кожура гороха имеет значительное содержание пектина и гемицеллюлозы. Пектиновые фракции из кожуры гороха содержат как гомогалактуронановые, так и рамногалактуронановые области с очень сложными и разнообразными боковыми цепями, главным образом состоящими из остатков арабинозила, галактозила и ксилозила. В кожуре гороха остатки рамнозила обнаруживались в (1→2)-связанной, (1→2,4)-связанной и концевой форме (Renard et al, 1997). Известно, что рамногалактуронаны с 1→5-связанными арабинанами, ассоциированными с (арабино)галактанами типа 1 и 2 представляют собой наиболее распространенный признак. Арабинаны также имеют свободную форму в кожуре гороха (Weightman et al, 1995 Carbohydrate Polymers, 26, pp. 121–128; Renard et al, 1997 (см. ниже); Ralet et al, 1993 (см. ниже)). Уроновые кислоты преимущественно состоят из галактуроновой кислоты с соотношением галактуроновая кислота / глюкуроновая кислота 97 : 3 (Weightman et al, 1994 Carbohydrate Polymers, 24(2), pp. 139–148). Известно, что гомогалактуронановая фракция из кожуры гороха имеет относительно низкую степень метилирования (приблизительно 12–50) и сильно ацетилирована, отличаясь этим от высокометилированных пектинов, обычно встречающихся в первичных клеточных стенках фруктов (Weightman et al, 1995 Carbohydrate Polymers, 26, pp. 121–128; Le Goff et al, 2001 Carbohydrate Polymers, 45(4), pp. 325–334; Weightman et al, 1994 Carbohydrate Polymers, 24(2), pp. 139–148). В нескольких исследованиях также отмечено значительное количество ксилогалактуронана в кожуре гороха (18 мг/г), в котором ксилозиловые звенья присутствуют в виде отдельных звеньев или коротких боковых цепей на каркасе галактуроновой кислоты (Le Goff et al, 2001 Carbohydrate Polymers, 45(4), pp. 325–334; Weightman et al, 1995 Carbohydrate Polymers, 26, pp. 121–128; Ralet et al, 1993 Biochemical Engineering Journal, 16(2), pp. 191–201; Renard et al, 1997 International Journal of Biological Macromolecules, 21(1–2), pp. 155–162). Анализ метилирования выявил наличие (1,4)- и (1,3,4)-связанных остатков галактуроновой кислоты и терминальных остатков ксилозила, что указывает на замещение галактуронанового каркаса ксилозой на O-3. Кроме того, были выявлены некоторые олигомерные боковые цепи (1→2)-связанной ксилозы. Молярное отношение ксилозы к галактуроновой кислоте, согласно принятым данным, составляет 0,76 (Le Goff et al, 2001 Carbohydrate Polymers, 45(4), pp. 325–334). Ксилогалактуронаны можно рассматривать как подфракцию волосяных областей пектинов (Schols et al, 1995 Carbohydrate Research, 279, pp. 265–279).
D
Ксиланы представляют собой наиболее часто встречающуюся в кожуре гороха гемицеллюлозу (Weightman et al, 1994 Carbohydrate Polymers, 24(2), pp. 139–148; Tosh & Yada 2010 Food Research International, 43(2), pp. 450–460). Ксиланы, встречающиеся в кожуре гороха, представляют собой главным образом кислые ксиланы, имеющие (1→4)-β--ксилановый каркас с несколькими точками ветвления в O-2 и арабиноксиланах (Banerji & Rao 1963 Structural Studies On An Arabinoxylan From Pea Skin (Pisum Sativum): Part I. Methylation Studies. Canadian Journal of Chemistry, 41(11), pp. 2844–2848; Renard et al, 1997 International Journal of Biological Macromolecules, 21(1–2), pp. 155–162; Weightman et al, 1994 Carbohydrate Polymers, 24(2), pp. 139–148; Ralet et al, 1993 Biochemical Engineering Journal, 16(2), pp. 191–201). Отношение арабинозы к ксилозе в гемицеллюлозной фракции, экстрагированной из кожуры гороха, составляет 0,36 (Ralet et al, 1993, см. выше). Присутствие небольшого количества ксилоглюкана также показано Weightman et al, (1994 Carbohydrate Polymers, 24(2), pp. 139–148), но эти структуры чаще встречаются в семядоле гороха (Hayashi & MacLachlan 1984 Plant Physiology, 75(3), pp. 596–604).
Эмульсии
Эмульсии представляют собой смесь двух несмешивающихся текучих сред, в большинстве случаев воды (в) и масла (м), в которой масляная фаза диспергирована в водной фазе в виде капель масла (эмульсии м/в) или в которых капли воды диспергированы в масляной фазе (эмульсии в/м). Эмульсия представляет собой термодинамически нестабильную систему (Floury, Desrumaux and Lardières, 2000 Innovative Food Science & Emerging Technologies, 1(2), pp. 127–134). Амфифильные белки или низкомолекулярные эмульгаторы (LMWE), адсорбирующиеся на поверхности раздела м/в, чаще всего используют для замедления термодинамически управляемого разделения фаз эмульсии путем уменьшения поверхностного натяжения.
Волоконные материалы природного происхождения, включая PHF, преимущественно гидрофильны, а значит, как правило, не адсорбируются на поверхности раздела масло-вода. При использовании в качестве гидроколлоидов волокна, как правило, добавляют к эмульсиям м/в высоких концентрациях, при которых они за счет способности к сгущению/превращению в гель вододисперсионной фазы физически захватывают капли масла, за счет чего замедляется отстаивание сливок и коалесценция капель масла.
Частицы Пикеринга должны иметь достаточный размер и смачиваемость в отношении обеих фаз для адсорбирования на поверхности раздела. Наиболее распространенной методикой определения смачиваемости материала является измерение угла смачивания, образуемого между поверхностью раздела жидкости и твердым веществом. Принцип этого измерения основан на уравнении Юнга  , в котором  и  отражают натяжения на поверхности раздела жидкость — пар, твердое вещество — пар и твердое вещество — жидкость соответственно, а представляет собой угол смачивания (Bracco and Holst, 2013 Surface Science Techniques. 51st ed. Heidelberg: Springer). Размер частицы, и в частности ее угол смачивания, обозначают положение частицы на поверхности раздела, которое определяет энергию, необходимую для десорбции таких частиц из поверхности раздела. При правильном угле смачивания (30° << 150°) энергия десорбции может составлять несколько тысяч kTs для всех частиц больше 10 нм, следовательно, можно сказать, что частицы необратимо присоединены (Hunter et al, 2008 Advances in Colloid and Interface Science, 137(2), pp. 57–81), а значит, обеспечена долгосрочная устойчивость эмульсии.
Без ограничений, накладываемых какой-либо теорией, структурные компоненты пищевого волокна (волокно кожуры растения), такие как кристаллическая целлюлоза и гидрофобные метиловые, ацетиловые эфиры и эфиры феруловой кислоты на пектиновом каркасе, могут появляться на поверхности частицы после обработки ферментами в соответствии с настоящим изобретением и, следовательно, сообщать некоторую степень амфифильности очень гидрофильной в иных условиях поверхности.
Функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент в соответствии с настоящим изобретением или частица Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы для стабилизации и эмульсии. Эмульсия может представлять собой эмульсию типа «масло в воде» (м/в) или эмульсию типа «вода в масле» (в/м) или непрерывную масляную дисперсию или двойную эмульсию (например, в/м/в).
В настоящем изобретении предложена эмульсия типа «масло в воде» или эмульсия типа «вода в масле», содержащая функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент в соответствии с настоящим изобретением или частицу Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением.
В одном варианте осуществления функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент в соответствии с настоящим изобретением или частица Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы в комбинации с другим эмульгатором, например казеинатом натрия.
В одном варианте осуществления функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент в соответствии с настоящим изобретением или частица Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением содержат значительное количество белка, например более 0,5 мг на 1 г масла, например от 0,6 до 0,9 мг на 1 г масла.
Применение
Функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент настоящего изобретения или частица Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы для стабилизации эмульсии, например эмульсии типа «вода в масле» или эмульсии типа «масло в воде».
Эмульсия может представлять собой эмульсию, используемую в любом продукте, таком как пищевой продукт или косметический продукт или фармацевтический продукт.
В настоящем изобретении дополнительно предложен пищевой продукт, или косметический продукт, или продукт для ухода за кожей, или фармацевтический продукт, или продукт личной гигиены, или продукт для укладки волос, содержащий функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент в соответствии с настоящим изобретением или частицу Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением.
Функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент в соответствии с настоящим изобретением или частица Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением стабилизируют эмульсию.
Под «стабилизацией» в контексте настоящего документа подразумевается задержка разделения эмульсии на водную и масляную фазы, например путем коалесценции капель, благодаря функционализированному пищевому волокну и денатурированному ферменту в соответствии с настоящим изобретением или частица Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением. В одном варианте осуществления может учитываться устойчивость эмульсий к разрушению.
Пищевой продукт, или косметический продукт, или продукт для ухода за кожей, или фармацевтический продукт, или продукт личной гигиены, или продукт для укладки волос может содержать функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент в соответствии с настоящим изобретением или частицу Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением и быть стабилизированным ими.
Пищевые продукты
Частицы Пикеринга настоящего изобретения или функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы в пищевой эмульсии, например в смеси двух или более жидкостей, которые в обычных условиях не смешиваются.
В настоящем документе термин «продукт» используется в широком смысле и охватывает пищу для людей, а также пищу для животных (т.е. корм). В предпочтительном аспекте продукт предназначен для потребления человеком.
Эмульсия может представлять собой эмульсию типа «масло в воде» или эмульсию типа «вода в масле» или непрерывную масляную дисперсию или двойную эмульсию (например, в/м/в). Примеры пищевых эмульсий, в которых можно использовать настоящее изобретение, включают в себя уксусные заправки, гомогенизированное молоко, соусы, например майонез или голландский соус, супы, крема (пену) в эспрессо, молочные эмульсии и растительные эмульсии, такие как соевые напитки.
Продукты для ухода за кожей
Частицы Пикеринга настоящего изобретения или функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы в продуктах для ухода за кожей.
Продукт для ухода за кожей может представлять собой любой продукт, содержащий эмульсию.
Продукт для ухода за кожей может представлять собой, например, очищающие, защитные, лечебные или гигиенические кремы; солнцезащитные кремы, защищающие от УФ-излучения; лосьоны для ухода за кожей, такие как очищающие или дезинфицирующие лосьоны; или увлажнители.
Продукт для ухода за кожей настоящего изобретения может представлять собой композицию, содержащую другие ингредиенты, включая масло ши, масло какао, кокосовое масло, подсолнечное масло и масла из ядер орехов (такие как масло ядер абрикоса).
Если композиция изобретения представляет собой эмульсию, доля жировой фазы может находиться в диапазоне от 5 мас.% до 80 мас.% и предпочтительно от 10 мас.% до 50 мас.% относительно общей массы композиции.
Фармацевтические продукты, продукты для укладки волос, продукты для личной гигиены и косметические продукты
В фармацевтических препаратах, продуктах для укладки волос, для личной гигиены и косметических продуктах часто используют эмульсии. Эти эмульсии могут называться кремами, мазями, линиментами (бальзамами), пастами, пленками или жидкостями, главным образом в зависимости от соотношения в них масла и воды, наличия других добавок и предусмотренного способа введения.
Эмульсии могут представлять собой лекарственные формы для местного применения, и их можно применять на поверхности кожи, трансдермально, путем внутриглазной инъекции, ректально или вагинально.
Очень жидкую эмульсию также можно использовать перорально или в некоторых случаях ее можно вводить в виде инъекции.
К распространенным лекарственным препаратам, представленным в форме эмульсии, относятся, например, масло печени трески, полиспорин, кортизоловый крем или «Канестен».
Нуклеотидная последовательность
Термин «нуклеотидная последовательность» в настоящем документе означает олигонуклеотидную последовательность или полинуклеотидную последовательность и ее вариант, гомологи, фрагменты и производные (например, ее части). Нуклеотидная последовательность может иметь геномное, или синтетическое, или рекомбинантное происхождение, и может быть двухцепочечной или одноцепочечной, независимо от того, является ли она кодирующей или некодирующей цепью.
Термин «нуклеотидная последовательность» в отношении настоящего изобретения включает геномную ДНК, кДНК, синтетическую ДНК и РНК. Это предпочтительно означает последовательность ДНК, более предпочтительно кДНК, кодирующую настоящее изобретение.
Получение нуклеотидной последовательности
Нуклеотидная последовательность, кодирующая фермент настоящего изобретения, может быть идентифицирована, и/или изолирована, и/или очищена от любой клетки или организма, продуцирующего указанный белок. В данной области хорошо известны различные способы идентификации, и/или выделения, и/или очистки нуклеотидных последовательностей. Например, методики амплификации ПЦР для получения большего количества последовательности могут быть использованы после идентификации, и/или выделения, и/или очистки подходящей последовательности.
В качестве дополнительного примера, библиотека геномной ДНК и/или кДНК может быть сконструирована с использованием хромосомной ДНК или матричной РНК, полученной из организма, вырабатывающего фермент. Если известна аминокислотная последовательность фермента, можно синтезировать меченые олигонуклеотидные зонды и применять их для идентификации кодирующих фермент клонов из геномной библиотеки, полученной из организма. В альтернативном варианте осуществления для идентификации кодирующих фермент клонов можно использовать меченый олигонуклеотидный зонд, содержащий последовательности, гомологичные другому известному гену фермента. В последнем случае используют условия гибридизации и промывки меньшей жесткости.
В альтернативном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая фермент, может быть получена синтетическим путем с помощью установленных стандартных способов, например с помощью амидофосфитного способа, описанного Beucage S.L. et al, (1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859–1869, или с помощью способа, описанного Matthes et al, (1984) EMBO J. 3, p 801–805. В амидофосфитном способе олигонуклеотиды синтезируют, например в автоматическом синтезаторе ДНК, очищают, отжигают, лигируют и клонируют в соответствующие векторы.
Аминокислотные последовательности
При использовании в настоящем документе термин «аминокислотная последовательность» является синонимом термина «полипептид» и/или термина «белок». В некоторых случаях термин «аминокислотная последовательность» является синонимом термина «пептид». В некоторых случаях термин «аминокислотная последовательность» является синонимом термина «фермент».
Аминокислотная последовательность может быть получена/изолирована из подходящего источника, или она может быть получена синтетическим способом, или может быть получена с применением методик рекомбинантной ДНК.
Идентичность последовательности или гомология последовательности
Настоящее изобретение также включает применение последовательностей, имеющих определенную степень идентичности последовательности с аминокислотной(-ыми) последовательностью(-ями) полипептида, имеющего специфические свойства, определенные в настоящем документе, или любой нуклеотидной последовательности, кодирующей такой полипептид.
Аминокислотная последовательность и/или нуклеотидная последовательность должны обеспечивать и/или кодировать полипептид, который сохраняет функциональную активность.
В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность или нуклеотидная последовательность может быть по меньшей мере на 75, 85 или 90% идентичной, предпочтительно по меньшей мере на 95 или 98% идентичной последовательности субъекта. Как правило, последовательности с определенным процентом идентичности содержат, например, те же активные сайты и т.п., что и, например, аминокислотная последовательность субъекта.
В одном варианте осуществления последовательность, которая имеет определенный процент идентичности, может быть выбрана таким образом, чтобы включать в себя аминокислотную последовательность или нуклеотидную последовательность, которая имеет одно или несколько добавлений, делеций и/или замен по сравнению с последовательностью субъекта.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к белку (или к нуклеотидной последовательности (или гену), чья аминокислотная последовательность кодирует белок), аминокислотная последовательность которого представлена в настоящем документе, или белку, полученному из этого (родительского) белка путем замены, делеции или добавления одной или более аминокислот, например 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 аминокислот, или более аминокислот, например 10 или более 10 аминокислот, в аминокислотную последовательность родительского белка, и имеющему активность родительского белка.
Степень идентичности в отношении аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности соответственно определяют на протяжении по меньшей мере 20 смежных аминокислот/нуклеотидов, соответственно на протяжении по меньшей мере 30 смежных аминокислот/нуклеотидов, соответственно на протяжении по меньшей мере 40 смежных аминокислот/нуклеотидов, соответственно на протяжении по меньшей мере 50 смежных аминокислот/нуклеотидов, соответственно на протяжении по меньшей мере 60 смежных аминокислот/нуклеотидов, соответственно на протяжении по меньшей мере 100 смежных аминокислот/нуклеотидов, соответственно на протяжении по меньшей мере 200 смежных аминокислот/нуклеотидов.
Степень идентичности в отношении аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности соответственно определяют на всей протяженности аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности.
Сравнение идентичности можно проводить визуально или чаще всего с помощью легкодоступных программ сравнения последовательностей. Эти доступные на рынке компьютерные программы могут вычислять % гомологии между двумя или более последовательностями.
% идентичности может быть рассчитан по смежным последовательностям, т.е. одну последовательность совмещают с другой последовательностью, и каждую аминокислоту в одной последовательности напрямую сравнивают с соответствующей аминокислотой в другой последовательности, по одному остатку за раз. Это называется выравниванием «без гэпов». Как правило, такие выравнивания без гэпов выполняют только на относительно небольшом количестве остатков.
Хотя это очень простой и надежный способ, в нем не учитывается, например, что в идентичной во всем остальном паре последовательностей из-за одной вставки или делеции будет нарушено выравнивание следующих аминокислотных остатков, а значит, возможно значительное снижение % гомологии при выполнении общего выравнивания. Следовательно, большинство способов сравнения последовательностей разработаны с возможностью получения оптимальных выравниваний, в которых учитываются возможные вставки и делеции без необоснованного уменьшения общего показателя гомологии. Это возможно за счет вставки «гэпов» при выравнивании последовательности, чтобы попытаться максимально увеличить локальную гомологию.
Однако в этих более сложных способах предусмотрены «штрафы за гэп» каждому гэпу, возникающему при выравнивании так, что при одинаковом числе идентичных аминокислот в случае выравнивания последовательности с как можно меньшим количеством гэпов, отражающего более высокую корреляцию между двумя сравниваемыми последовательностями, будет получен больший показатель, чем при наличии множества гэпов. Как правило, используют «аффинные штрафы за гэп», предусматривающие относительно высокий штраф за наличие гэпа и меньший штраф за каждый последующий остаток в гэпе. Это наиболее часто используемая система оценки гэпов. Высокие штрафы за гэп, естественно, обеспечивают оптимальные выравнивания с меньшим числом гэпов. С помощью большинства программ выравнивания можно изменять штрафы за гэп. Однако при использовании такого программного обеспечения для сравнения последовательностей рекомендуется использовать значения по умолчанию.
Таким образом, для расчета максимального % идентичности в первую очередь требуется оптимальное выравнивание с учетом штрафов за гэп. Подходящей компьютерной программой для выполнения такого выравнивания является Vector NTI (Invitrogen Corp.). Примеры программного обеспечения, которое может выполнять сравнение последовательностей, включают в себя, без ограничений, например, пакет BLAST (см. Ausubel et al, 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18), BLAST 2 (см. FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247–50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 и tatiana@ncbi.nlm.nih.gov), FASTA (Altschul et al, 1990 J. Mol. Biol. 403–410) и AlignX. По крайней мере BLAST, BLAST 2 и FASTA доступны для автономного и интерактивного поиска (см. Ausubel et al, 1999, стр. от 7-58 до 7-60), например в инструменте поиска GenomeQuest (www.genomequest.com).
Хотя конечный % идентичности может быть измерен с точки зрения идентичности, сам способ выравнивания, как правило, не основан на сравнении пар по принципу «все или ничего». Вместо этого, как правило, используют пересчитанную матрицу оценки сходства, в которой присваиваются показатели каждому попарному сравнению на основании химического сходства или эволюционного расстояния. Часто используемым примером такой матрицы является матрица BLOSUM62, представляющая собой используемую по умолчанию матрицу для программного пакета BLAST. В программах Vector NTI обычно используют либо общие значения по умолчанию, либо пользовательскую таблицу сравнения символов при наличии (дополнительные сведения приведены в руководстве пользователя). Для некоторых приложений рекомендуется использовать значения по умолчанию для пакета Vector NTI.
В альтернативном варианте осуществления процентную гомологию можно рассчитывать с использованием функции множественного выравнивания в Vector NTI (Invitrogen Corp.) на основании алгоритма, аналогичного CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237–244).
После обеспечения в ПО оптимального выравнивания можно рассчитывать % гомологии, предпочтительно % идентичности последовательности. ПО, как правило, делает это в рамках сравнения последовательностей и генерирует числовой результат.
Если при определении идентичности последовательности необходимо использовать штрафы за гэп, для попарного выравнивания предпочтительно использовать следующие параметры.
ДЛЯ BLAST
ОТКРЫТИЕ ГЭПА
9
ПРОДЛЕНИЕ ГЭПА
2
ДЛЯ CLUSTAL
ДНК
БЕЛКИ
Весовая матрица
IUB
Gonnet 250
ОТКРЫТИЕ ГЭПА
15
10
ПРОДЛЕНИЕ ГЭПА
6,66
0,1
В одном варианте осуществления CLUSTAL можно использовать с указанными выше штрафом за гэп и штрафом за продление гэпа.
В контексте настоящего документа термин «запрашиваемая последовательность» означает гомологичную последовательность или чужеродную последовательность, совмещаемую с последовательностью субъекта, чтобы определить, входит ли она в объем настоящего изобретения. Соответственно, такая запрашиваемая последовательность может представлять собой, например, последовательность предшествующего уровня техники или последовательность третьей стороны.
В одном предпочтительном варианте осуществления последовательности выравнивают при помощи универсальной программы выравнивания, а идентичность последовательности рассчитывают путем определения числа точных совпадений, выявленных программой, и деления на длину последовательности субъекта.
В одном варианте осуществления степень идентичности последовательности между запрашиваемой последовательностью и последовательностью субъекта определяют путем 1) выравнивания двух последовательностей с помощью любой подходящей программы выравнивания с использованием выбранных по умолчанию матрицы оценки и штрафа за гэп, 2) определения числа точных совпадений, причем точное совпадение представляет собой место, в котором программа выравнивания выявила идентичную аминокислоту или нуклеотид в двух выровненных последовательностях в данном положении в выравнивании, и 3) деления числа точных совпадений на длину последовательности субъекта.
В другом дополнительном предпочтительном варианте осуществления универсальная программа выравнивания выбрана из группы, состоящей из CLUSTAL и BLAST (предпочтительно BLAST), а идентичность последовательности рассчитывают путем определения числа точных совпадений, выявленных программой, и деления на длину последовательности субъекта.
Последовательности могут также иметь делеции, вставки или замены аминокислотных остатков, из-за которых происходит неактивное изменение и образование функционально эквивалентного вещества. Преднамеренные аминокислотные замены могут быть выполнены на основе сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатков при условии сохранения вторичной связывающей активности вещества. Например, отрицательно заряженные аминокислоты включают в себя аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту; положительно заряженные аминокислоты включают в себя лизин и аргинин; и аминокислоты с незаряженными полярными головками, имеющими сходные значения гидрофильности, включают в себя лейцин, изолейцин, валин, глицин, аланин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, фенилаланин и тирозин.
Консервативные замены могут быть выполнены, например, в соответствии с таблицей ниже. Аминокислоты в одном блоке во втором столбце и предпочтительно в одной и той же строке в третьем столбце могут быть замещены друг другом.
Алифатические
Неполярные
G A P
I L V
Полярные — незаряженные
C S T M
N Q
Полярные — заряженные
D E
K R
Ароматические
H F W Y
Настоящее изобретение также включает в себя гомологичную замену (термины «замещение» и «замена» в настоящем документе используются для обозначения замены существующего аминокислотного остатка с альтернативным остатком), которая может происходить, т.е. сопоставимую замену, например щелочного на щелочной, кислого на кислый, полярного на полярный и т.п. Негомологичная замена также может происходить, т.е. из одного класса остатка на другой или в альтернативном варианте осуществления включающая вставку неприродных аминокислот, таких как орнитин (далее обозначаемый как Z), орнитин диаминобутировой кислоты (далее обозначаемый как B), орнитин норлейцина (далее обозначаемый как O), пирилаланин, тиенилаланин, нафтилаланин и фенилглицин.
#
#*
#
#
#
Замены также могут быть выполнены с помощью синтетических аминокислот (например, неприродных аминокислот), включая альфа-* и альфа-двузамещенные* аминокислоты, N-алкиламинокислоты*, молочную кислоту*, галидные производные природных аминокислот, такие как трифтортирозин*, p-Cl-фенилаланин*, p-Br-фенилаланин*, p-I-фенилаланин*, L-аллилглицин*, β-аланин*, L-α-аминобутировую кислоту*, L-γ-аминобутировую кислоту*, L-α-аминоизобутировую кислоту*, L-ε-аминокапроновую кислоту, 7-аминогептаноевую кислоту*, L-метионинсульфон, L-норлейцин*, L-норвалин*, p-нитро-L-фенилаланин*, L-гидроксипролин, L-тиопролин*, метиловые производные фенилаланина (Phe), такие как 4-метил-Phe*, пентаметил-Phe*, L-Phe (4-амино), L-Tyr (метил)*, L-Phe (4-изопропил)*, L-Tic (1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновая кислота)*, L-диаминопропионовая кислота и L-Phe (4-бензил)*. Отметка * используется в приведенном выше обсуждении (в отношении гомологичной или негомологичной замены) для обозначения гидрофобного характера производного, в то время как # используется для обозначения гидрофильного характера производного, #* подразумевает амфипатические свойства.
Варианты аминокислотных последовательностей могут включать в себя подходящие спейсерные группы, которые могут быть вставлены между любыми двумя аминокислотными остатками последовательности, включая алкильные группы, такие как метильные, этильные или пропильные группы, в дополнение к аминокислотным спейсерам, таким как остатки глицина или β-аланина. Дополнительная форма вариации, включающая наличие одного или более аминокислотных остатков в форме пептоида, будет хорошо понятной специалистам в данной области. Во избежание сомнений, термин «форма пептоида» используется для обозначения вариантов аминокислотных остатков, в которых α-углеродная замещающая группа находится на атоме азота остатка, а не на α-углероде. Способы получения пептидов в форме пептоидов хорошо известны специалистам в данной области, например, см. Simon RJ et al, PNAS (1992) 89(20), 9367–9371 and Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132–134.
Нуклеотидные последовательности для применения в настоящем изобретении могут включать в себя синтетические или модифицированные нуклеотиды. В данной области известен ряд различных типов модификации олигонуклеотидов. К ним относятся метилфосфонатные и фосфортиоатные каркасы и/или добавление акридиновых или полилизиновых цепей на 3'- и/или 5'-концах молекулы. Для целей настоящего изобретения следует понимать, что нуклеотидные последовательности, описанные в настоящем документе, могут быть модифицированы любым способом, известным в данной области. Такие модификации могут быть выполнены для повышения активности in vivo или продолжительности жизни нуклеотидных последовательностей настоящего изобретения.
Экспрессия ферментов
Нуклеотидная последовательность для применения в настоящем изобретении может быть встроена в рекомбинантный реплицируемый вектор. Вектор может быть использован для репликации и экспрессии нуклеотидной последовательности в форме белка/фермента, в совместимой клетке-хозяине и/или из нее.
Экспрессией можно управлять с помощью управляющих последовательностей, например регуляторных последовательностей.
Белок, продуцируемый рекомбинантной клеткой-хозяином путем экспрессии нуклеотидной последовательности, может быть секретирован или может находиться внутри клетки в зависимости от последовательности и/или используемого вектора. Кодирующие последовательности могут быть сконструированы вместе с сигнальными последовательностями, которые управляют секрецией кодирующих вещество последовательностей с помощью конкретной прокариотической или эукариотической клеточной мембраны.
Экспрессионный вектор
Термин «экспрессионный вектор» означает конструкт, способный к экспрессии in vivo или in vitro.
Экспрессионный вектор предпочтительно встроен в геном подходящего организма-хозяина. Термин «встроен» предпочтительно относится к устойчивому встраиванию в геном.
Нуклеотидная последовательность настоящего изобретения может присутствовать в векторе, в котором нуклеотидная последовательность функционально связана с регуляторными последовательностями, способными обеспечивать экспрессию нуклеотидной последовательности подходящим организмом-хозяином.
Векторы для применения в настоящем изобретении могут быть трансформированы в подходящую клетку-хозяина, как описано ниже, для обеспечения экспрессии полипептида настоящего изобретения.
Выбор вектора, например плазмидного, космидного или фагового вектора, часто будет зависеть от клетки-хозяина, в которую его вводят.
Векторы для применения в настоящем изобретении могут содержать один или более селектируемых маркерных генов, таких как ген, который сообщает устойчивость к антибиотикам, например устойчивость к ампициллину, канамицину, хлорамфениколу или тетрациклину. В альтернативном варианте осуществления селекция может быть осуществлена путем котрансформации (как описано в WO91/17243).
Векторы можно использовать in vitro, например для производства РНК, или использовать для трансфекции, трансформации, трансдукции или инфицирования клетки-хозяина.
Таким образом, в дополнительном варианте осуществления в изобретении предложен способ получения нуклеотидных последовательностей настоящего изобретения посредством введения нуклеотидной последовательности настоящего изобретения в реплицируемый вектор, введения вектора в совместимую клетку-хозяина и выращивания клетки-хозяина в условиях, в которых возможна репликация вектора.
Вектор может дополнительно содержать нуклеотидную последовательность, благодаря которой возможна репликация вектора в рассматриваемой клетке-хозяине. Примерами таких последовательностей являются точки начала репликации плазмид pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 и pIJ702.
Регуляторные последовательности
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность для применения в настоящем изобретении функционально связана с регуляторной последовательностью, которая способна обеспечивать экспрессию нуклеотидной последовательности, такой как выбранная клетка-хозяин. В качестве примера, настоящее изобретение включает в себя вектор, содержащий нуклеотидную последовательность настоящего изобретения, функционально связанную с такой регуляторной последовательностью, т.е. вектор представляет собой экспрессионный вектор.
Термин «функционально связанный» относится к смежному положению, в котором описанные компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать надлежащим образом. Регуляторная последовательность, «функционально связанная» с кодирующей последовательностью, лигирована с возможностью осуществления экспрессии кодирующей последовательности в условии, которое подходит для управляющих последовательностей.
Термин «регуляторные последовательности» включает промоторы и энхансеры, а также другие сигналы регуляции экспрессии.
Термин «промотор» используется в обычном понимании в данной области, например промотором является область связывания РНК-полимеразы.
Усиленная экспрессия нуклеотидной последовательности, кодирующей фермент настоящего изобретения, также может быть достигнута путем выбора гетерологичных регуляторных областей, например промоторных, секреторных лидерных и терминаторных областей.
Нуклеотидная последовательность для применения в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно функционально связана с по меньшей мере промотором.
Для управления экспрессией полипептида настоящего изобретения можно использовать и другие промоторы.
Примеры подходящих промоторов для управления транскрипцией нуклеотидной последовательности в бактериальном, грибковом или дрожжевом хозяине хорошо известны в данной области.
Промотор может дополнительно включать в себя элементы для обеспечения или повышения экспрессии в подходящем хозяине. Например, элементы могут представлять собой консервативные области, такие как бокс Прибнова или ТАТА-бокс.
Конструкции
Термин «конструкт», который является синонимом таких терминов, как «конъюгат», «кассета» и «гибрид», означает нуклеотидную последовательность для применения в соответствии с настоящим изобретением, непосредственно или опосредованно прикрепленную к промотору.
Конструкция может даже содержать или экспрессировать маркер, с помощью которого можно осуществлять селекцию генетического конструкта.
В некоторых областях применения конструкция настоящего изобретения предпочтительно содержит по меньшей мере нуклеотидную последовательность для применения в настоящем изобретении, функционально связанную с промотором.
Клетки-хозяева
Термин «клетка-хозяин» в отношении настоящего изобретения включает любую клетку, которая содержит либо нуклеотидную последовательность, либо экспрессионный вектор, как описано выше, и которую используют при рекомбинантном производстве белка, имеющего специфические свойства, как определено в настоящем документе.
Таким образом, в дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения предложены клетки-хозяева, трансформированные или трансфицированные нуклеотидной последовательностью, которая экспрессирует белок настоящего изобретения. Клетки будут выбраны с возможностью их совместимости с указанным вектором и могут, например, быть прокариотическими (например, бактериальными), грибковыми, дрожжевыми или растительными.
Трансформация клеток-хозяев/организма
Как указано выше, организм-хозяин может представлять собой прокариотический или эукариотический организм. Примеры подходящих прокариотических хозяев включают в себя E. coli и Bacillus subtilis.
Принципы трансформации прокариотических хозяев подробно описаны в данной области, например, в издании Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). При использовании прокариотического хозяина перед трансформацией может потребоваться соответствующая модификация нуклеотидной последовательности, например удаление интронов.
Мицелиальные грибковые клетки могут быть трансформированы с использованием различных способов, известных в данной области, таких как способ, включающий образование протопластов и трансформацию протопластов с последующей регенерацией клеточной стенки известным способом. Применение Aspergillus в качестве микроорганизма-хозяина описано в EP 0 238 023.
Другим организмом-хозяином может быть растение. Обзор общих методик, используемых для трансформации растений, можно найти в публикациях Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205–225) и Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17–27). Дополнительные принципы трансформации растений можно найти в EP-A-0449375.
Культивирование и продуцирование
Клетки-хозяева, трансформированные нуклеотидной последовательностью настоящего изобретения, могут быть культивированы в условиях, способствующих продуцированию кодируемого полипептида и облегчающих восстановление полипептида из клеток и/или культуральной среды.
Среда, используемая для культивирования клеток, может представлять собой любую стандартную среду, подходящую для выращивания интересующих клеток-хозяев и получения экспрессии полипептида.
Белок, продуцируемый рекомбинантной клеткой, может быть представлен на поверхности клетки.
Белок может быть секретирован из клеток-хозяев и может быть легко извлечен из культуральной среды с помощью хорошо известных процедур.
Секреция
Часто желательна секреция белка из экспрессионного организма-хозяина в культуральную среду, из которой белок можно легче извлекать. В соответствии с настоящим изобретением лидерную последовательность секреции можно выбирать на основании желаемого организма-хозяина экспрессии. В контексте настоящего изобретения также можно использовать гибридные сигнальные последовательности.
К типичным примерам гетерологичных лидерных последовательностей секреции относятся последовательности, происходящие из гена амилоглюкозидазы (AG) грибов (glaA, как версия с 18 аминокислотами, так и с 24 аминокислотами, например из Aspergillus), гена А-фактора (дрожжи, например Saccharomyces, Kluyveromyces и Hansenula) или гена α-амилазы (Bacillus).
В качестве примера секреция гетерологичных белков в E. coli рассматривается в Methods Enzymol (1990) 182:132–43.
Преимущества
Преимущества настоящего изобретения станут понятны из принципов, представленных в настоящем документе.
Одним из преимуществ настоящего изобретения является получение функционализированного пищевого волокна и денатурированного фермента и их применение в качестве частиц Пикеринга, например, для стабилизации эмульсий и/или замены применения поверхностно-активных веществ в производстве эмульсии.
Одно из преимуществ настоящего изобретения заключается в способности эмульсий, стабилизированных низкими количествами (0,4% масса/объем) функционализированного пищевого волокна и денатурированного фермента настоящего изобретения, эффективно защищать крупные отстоявшиеся капли масла от коалесценции в течение четырех недель или дольше.
Одно дополнительное преимущество настоящего изобретения заключается в способности эмульсий, стабилизированных низкими количествами (0,4% масса/объем) функционализированного пищевого волокна и денатурированного фермента настоящего изобретения, эффективно защищать крупные отстоявшиеся капли масла от коалесценции в широком диапазоне рН (например, рН 3,0–8,0).
Обнаружена большая устойчивость частиц Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением в эмульсии по сравнению только с белками или поверхностно-активными веществами.
Одно дополнительное преимущество настоящего изобретения состоит в способности функционализированного пищевого волокна и денатурированного фермента или частицы Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением заменять стандартные стабилизаторы эмульсии с получением, таким образом, чистого, безмолочного стабилизатора эмульсии на основе волокон.
С помощью функционализированного пищевого волокна и денатурированного фермента или частицы Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением можно стабилизировать относительно большие капли, например до 500 мкм.
За счет функционализированного пищевого волокна и денатурированного фермента или частицы Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением можно улучшать характеристики текстуры, и/или вкуса, и/или цвета, и/или запаха по сравнению со стандартными стабилизаторами эмульсии.
Все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, если не дано иное их определение, имеют общепринятое значение, понятное любому специалисту в области, к которой принадлежит настоящее изобретение. В изданиях Singleton et al DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994) и Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) для специалистов приведен общий словарь многих терминов, используемых в настоящем описании.
Настоящее описание не ограничено примерами способов и материалов, описанных в настоящем документе, и любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем документе, могут быть использованы при практической реализации или тестировании вариантов осуществления настоящего описания. Числовые диапазоны включают числа, определяющие диапазон.
Заголовки, представленные в настоящем документе, не ограничивают различные аспекты или варианты осуществления этого описания, которые могут существовать в виде ссылок на описание в целом. Соответственно, термины, определения которых даны в настоящем документе, более полно определены путем ссылки на описание в целом.
Используемый в настоящем документе термин «белок» включает белки, полипептиды и пептиды.
При использовании в настоящем документе термин «аминокислотная последовательность» является синонимом термина «полипептид» и/или термина «белок». В некоторых случаях термин «аминокислотная последовательность» является синонимом термина «пептид». В некоторых случаях термин «аминокислотная последовательность» является синонимом термина «фермент».
Термины «белок» и «полипептид» в настоящем документе применяются взаимозаменяемо. В настоящем описании и пунктах формулы изобретения могут использоваться стандартные однобуквенные и трехбуквенные коды для обозначения аминокислотных остатков. 3-буквенный код для аминокислот, определенный в соответствии с Объединенной комиссией IUPACIUB по биохимической номенклатуре (JCBN). Кроме того, следует понимать, что полипептид может быть кодирован более чем одной нуклеотидной последовательностью из-за вырожденности генетического кода.
В настоящем описании могут встречаться другие определения терминов. Перед более подробным описанием примеров осуществления следует понять, что данное описание не ограничено конкретными описанными вариантами осуществления, так как они могут, конечно, изменяться. Кроме того, следует понимать, что терминология, используемая в настоящем документе, служит только для описания конкретных вариантов осуществления и не ограничивает объем настоящего описания, который может быть ограничен только прилагаемой формулой изобретения.
Если приводится диапазон значений, следует понимать, что каждое промежуточное значение до десятой доли единицы нижнего предела (если в контексте явно не указано иное) между верхним и нижним пределами этого диапазона также включено в изобретение. Каждый меньший диапазон между любым указанным значением или промежуточным значением в указанном диапазоне и любым другим указанным или промежуточным значением в указанном диапазоне входит в объем этого описания. Верхнее и нижнее предельные значения этих меньших диапазонов могут быть независимо включены в диапазон или исключены из него, и каждый диапазон, в котором один из, ни один из или оба предельных значения включены в эти меньшие диапазоны, также входит в объем этого описания при условии соблюдения специально исключенного предельного значения в указанном диапазоне. Если указанный диапазон значений включает один или оба предела, диапазоны, из которых исключены любой из двух или оба таких предела сразу, также включены в это описание.
Следует отметить, что в настоящем документе и в приложенной формуле изобретения формы единственного числа также включают объекты во множественном числе, если из контекста явно не следует иное. Так, например, слово «фермент» подразумевает множество таких потенциальных агентов и их эквивалентов, известных специалистам в данной области, и т.д.
Обсуждаемые в настоящем документе публикации приведены исключительно для их описания до даты подачи настоящей заявки. Ничто в настоящем документе не должно толковаться как признание того, что такие публикации представляют собой предшествующий уровень техники в отношении формулы изобретения, прилагаемой к настоящему документу.
Далее изобретение будет описано только в качестве примера со ссылкой на следующие фигуры и примеры.
Примеры
Повышение уровня информированности потребителей о состоянии здоровья приводит к росту спроса на продукты, основанные на природных ингредиентах. В этом исследовании в качестве функциональных пищевых ингредиентов оценены фракции, богатые пищевыми волокнами (например, целлюлоза) из кожицы (или кожуры) растений, например гороха. Такое применение может быть перспективным способом оценки этого сырья и разработки более здоровых продуктов. Например, кожура гороха богата пищевым волокном (приблизительно 90 мас.% сухого вещества) и состоит главным образом из целлюлозы (69 мас.% сухого вещества), гемицеллюлозы (7,5 мас.% сухого вещества) и пектина (16,8 мас.% сухого вещества) (публикация Reichert, 1981 Cereal Chemistry 58(4) pp 266–270, включенная в настоящий документ путем ссылки). Согласно эпидемиологическим данным потребление волокна имеет важные последствия для здоровья (публикация Hu, 2003 American J. of Clinical Nutrition (78) pp 544–551, включенная в настоящий документ путем ссылки). Кроме того, волокна кожуры гороха (PHF), например, имеют нейтральный вкус, светлый цвет и, следовательно, могут быть включены в различные пищевые продукты в качестве «невидимого» источника волокна (публикация Guillon & Champ 2002 The British J. of Nutrition 88 Suppl.3, pp. S293–S306, включенная в настоящий документ путем ссылки). В настоящем документе описано влияние гидролиза пищевого волокна, например PHF, с выбранными ферментами на функциональные возможности и поиск новых областей применения для этих модифицированных волокон. Были изучены две системы, а именно масляные непрерывные дисперсии и эмульсии типа «масло в воде» (м/в).
Пример 1
Методика
1.1. Материалы
Субстрат
В Cosucra (к. Пек, Бельгия) были закуплены порошковые PHF Exafine. Материал один раз пропускали через струйную мельницу при постоянном давлении 10 бар и скорости подачи 0,5 кг/ч для уменьшения размера частиц и улучшения диспергируемости растворов. Приблизительный состав PHF показан в таблице 1.
Таблица 1. Приблизительный состав PHF Exafine. Информация предоставлена компанией Cosucra
Компонент
Процентное содержание(мас.%/мас.%)
Волокно
мин. 85%
Крахмал
макс. 5%
Белки
макс. 6,5%
Зольные вещества
макс. 3%
Сухое вещество
94 ± 3%
Ферменты
Целлюлолитические и пектинолитические ферменты (таблица 2 и таблица 3) отбирали для ферментативной обработки на основании наиболее часто встречающихся классов полимеров в кожуре растений, например кожуре гороха.
Очищенные ферменты
Таблица 2. Описание очищенных ферментов, используемых в данном исследовании. Информация предоставлена компанией Megazyme
Коммерческий фермент
Кодировка<sup>b</sup>
Поставщик
Грибковое происхождение
CAZy<sup>a</sup>
Номер КФ
Основная активность
Оптимальный pH
Оптимальная температура
E-CELAN
PHF-E-CELAN
Megazyme
A. niger
GH 12
КФ 3.2.1.4
Эндо-1,4-β-D-глюканаза
4,5
60°C
E-BCLUC
PHF-E-BCLUC
Megazyme
A. niger
GH 3
КФ 3.2.1.21
β-глюкозидаза
4
70°C
E-XYAN4
PHF-E-XYAN4
Megazyme
A. niger
GH 11
КФ 3.2.1.8
4-β-D-ксиланксилано-гидролаза
4,5
60°C
a
CAZy = база данных активного фермента углеводов (www.CAZy.org)
b
Кодирование для PHF, обработанных соответствующими ферментами.
Коммерческие ферментные смеси
Таблица 3. Описание коммерческих ферментных смесей, использованных в данном исследовании. Информация предоставлена компанией Novozymes
Коммерческий фермент
Кодирование<sup>a</sup>
Поставщик
Грибковое происхождение
Основная активность
Оптимальный pH
Оптимальная температура
Celluclast 1.5 L(Целлюлоза)
PHF-целлюлоза
Novo-zymes
Trichoderma reesei ATCC 26921
Эндоглюканаза
5
65°C
Pectinex Ultra SP-L(Пектин)
PHF-пектин
Novo-zymes
Aspergillus aculeatus
Полигалактуроназа
н/д
н/д
a
Кодирование для PHF, обработанных соответствующими ферментами
1.2. Ферментативная модификация волокон кожуры растений, например волокон кожуры гороха
1.2.1. Определение ферментативной активности
Анализы активности ксиланазы, целлюлазы и пектиназы
Активности ксиланазы (эндо-β-1,4-ксиланазы), целлюлазы (эндо-β-1,4-глюканазы) и пектиназы (эндо-1,4-α-полигалактуронаназы) оценивали с использованием динитросалицилового (DNS) способа для уменьшения содержания сахаров. 1% (масса/объем) растворы субстрата пшеничного арабиноксилана (средняя вязкость, Megazyme, Ирландия), карбоксиметилцеллюлозы (CMC, Megazyme, Ирландия) или полигалактуроновой кислоты (Megazyme, Ирландия) готовили в 100 мМ цитрат-фосфатном буфере при рН 5,0. Добавляли 12,5 мкл фермента в разведении (1 : 10 – 1 : 10 000) к 112,5 мкл соответствующего раствора субстрата в пробирке Эппендорфа объемом 1,5 мл. Реакции выполняли при 50°C в течение 10 мин. Реакции останавливали на ледяной бане и добавляли 125 мкл реагента DNS. В контрольные образцы добавляли реагент DNS перед добавлением ферментов. Холостой образец включал в себя добавление воды вместо фермента. Строили соответствующие стандартные кривые ксилозы и глюкозы (стандарты от 0,1 до 2 мг/мл в воде). Абсорбцию определяли при 540 нм с помощью спектрометра Unicam видимого и УФ-диапазонов (Helios Gamma, г. Хелиос-Дельта, Великобритания).
В этом исследовании одна единица активности (1 Ед) определяется как масса (мг) или объем (мл) ферментного препарата, высвобождающего 1 мкмоль продукта (глюкоза, ксилоза) в минуту в определенных условиях. Все образцы готовили и анализировали в двух повторностях.
Анализ активности β-глюкозидазы
D
2
3
2
3
Активность β-глюкозидазы определяли при pH 5,0 с помощью 1 мМ раствора p-нитрофенил-β-D-глюкопиранозида (pNP-β--glcP, Sigma, Швейцария), который готовили в 100 мМ цитрат-фосфатном буфере. 0,25 мл фермента в соответствующем разведении (1 : 10 – 1 : 10 000) добавляли к 1,25 мл pNP-b-D-glcP. Реакции (50°C, 10 мин) останавливали на ледяной бане путем добавления 0,25 мл NaCO (2% масса/объем, Merck). Абсорбцию определяли при 410 нм с помощью спектрометра Unicam видимого и УФ-диапазонов (Helios Gamma, г. Хелиос-Дельта, Великобритания). В контрольные образцы добавляли NaCO перед добавлением ферментативной активности. Холостой образец включал в себя добавление воды вместо фермента. Строили стандартную кривую p-нитрофенола (от 0,05 мМ до 0,3 мМ). В данном исследовании одну единицу β-глюкозидазы определяли как количество фермента, которое высвобождало 1 мкмоль p-нитрофенола в минуту в условиях анализа.
Анализ активности протеазы
2
Активность протеазы в коммерческих ферментных составах и волокне кожуры растения, например PHF, измеряли с помощью набора эндопротеазы Megazyme, используя таблетки протазима AK. Таблетку протазима AK добавляли к 5 мл 100 мМ ацетатного буфера при pH 5 мл в стеклянной пробирке объемом 20 мл и оставляли таблетку для гидратации в течение 1 часа при температуре 50°C. Фермент и PHF разводили в ацетатном буфере (1 : 1 – 1 : 10 000) и перемешивали в течение 15 минут при комнатной температуре. В пробирку с перемешанным раствором добавляли 1 мл суспензии ферментов, и реакция продолжалась в течение 10 минут и 1, 8, 24 часов. Реакцию прекращали путем добавления 10 мл 2% (масса/объем) тринатрий-фосфатного буфера (pH 12) с энергичным перемешиванием на вихревом смесителе. Пробирки оставляли на 5 минут при комнатной температуре. При образовании осадка надосадочную жидкость центрифугировали при 1000 g в течение 10 минут. Абсорбцию фильтрата измеряли при 590 нм относительно холостого образца. Положительный контроль содержал алкалазу (разведенную в 20 000 раз). Одну протеазную единицу определяли как количество фермента/PHF, которое в определенных заданных условиях продуцирует эквивалент одного микромоля тирозина в минуту из растворимого казеина. Стандартная кривая была предоставлена компанией Megazyme (мЕд / анализ (т.е. 1 мл)) = 2029 x Abs590 - 4,5; R = 0,99).
1.2.2. Ферментативная обработка волокон кожуры растений, например волокон кожуры гороха, очищенными ферментами и коммерческими ферментными смесями
Инкубация
3
Готовили дисперсию PHF с общим содержанием твердых веществ (TS) 10% в 100 мМ цитратном/фосфатном буфере с pH 5,0, которую перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре для достижения полной гидратации. Буфер содержал 0,04% (масса/объем) NaN (Sigma Aldrich, Швейцария) в качестве антимикробного агента. Ферментативные реакции проводили в течение ночи (16 часов) с непрерывным перемешиванием при 430 об./мин и 50°C. Использованные дозы ферментов указаны в таблице 6 в разделе результатов. Образцы кипятили в течение 10 минут для завершения ферментативной реакции. Для стандартного контроля PHF подвергали одной и той же обработке без добавления фермента. Другие контроли содержали инактивированные ферменты или бычий сывороточный альбумин (BSA) вместо активного фермента при эквивалентных концентрациях белка, как с PHF, так и без него. Корректировку pH дисперсий BSA выполняли с помощью 1 M HCl и 1 M NaOH. Дисперсии PHF, полученные после ферментативной обработки, либо непосредственно использовали для дополнительных анализов, либо сублимировали перед дальнейшим использованием.
Сублимационная сушка и размалывание
-1
Для экспериментов, в которых требуется обработанный PHF в сухом состоянии, дисперсии PHF были подвергнуты сублимационной сушке. Дисперсию, полученную после обработки, центрифугировали в угловом роторе Sorvall SLA-3000 (Thermofisher Scientific, Швейцария) при 10 000 g в течение 10 минут при 20°C. Полученный осадок собирали и сублимировали (-40°C, 10 мбар в течение 72 ч). После сублимационной сушки сухую массу переносили в мельницу с порционной загрузкой IKA M20 (Milian, Швейцария) и размалывали при постоянной скорости 2000 g в течение 10 секунд.
1.3. Физико-химические свойства волокон кожуры гороха
1.3.1. Влагосодержание
Содержание влаги в подвергнутых сублимационной сушке PHF и контрольных образцах измеряли с помощью анализатора влажности Mettler Toledo METLAB (Mettler-Toledo, Швейцария). Выбирали способ Puree en flocon с нагреванием 1,7–2,5 г PHF до 115°C.
1.3.2. Плотность
3
Плотность подвергнутых сублимационной сушке PHF и контролей измеряли с помощью газовой пикнометрии с помощью пикнометра AccuPyc 1330 (Instrumat AG, Швейцария). Известное количество газа (при известных давлении и температуре) пропускали через калиброванный эталонный объем в калиброванную кювету, содержащую приблизительно 2 г образца. Плотность определяли путем измерения изменения давления гелия в калиброванном объеме (10 см) на основании уравнения состояния идеального газа.
1.3.3. Распределение частиц по размерам
Распределение по размерам частиц, подвергнутых сублимационной сушке PHF и контролей измеряли с помощью лазерной дифракции с использованием прибора Malvern Mastersizer 2000 (Malvern, Великобритания) с дисперсионным блоком небольшого объема, содержащим масло с триглицеридами средней цепи (MCT). Применяли способ MCT, в котором используется методика дифракции Фраунгофера для определения распределения частиц по размерам (публикация Lee Black, McQuay, and Bonin, 1996 Progress in Energy and Combustion Science, 22(3), pp. 267–306 включена в настоящий документ путем ссылки).
Распределение по размерам частиц обработанных дисперсий PHF и контролей измеряли с использованием того же прибора, но дисперсионного блока для влажного образца Hydro 2000 SM, содержащего воду.
3
2
4,3
Используемые показатель преломления, коэффициент абсорбции и плотность составляли 1,544, 0,1 и 1,5 соответственно, что соответствует значениям чистой целлюлозы (данные предоставлены компанией Malvern). Анализ выполняли в трех повторениях с затуханием излучения лазера в диапазоне от 8 до 12%. Полученное распределение по размерам было представлено в виде объемного процентного содержания в зависимости от диаметра частиц. Средние размеры частиц выражали в виде средних диаметров частиц на основании площади поверхности (d,) и объема (d).
1.3.4. Морфология
Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (КЛСМ)
Изображения микроструктуры эмульсий 50% м/в, стабилизированных обработанными ферментами PHF и контролями, получали с помощью КЛСМ. Для этого анализа эмульсии получали с использованием воды milli-Q вместо цитратно-фосфатного буфера, поскольку флуоресцеин проявлял реакционную способность в отношении буфера. Водную фазу образцов окрашивали посредством 0,01 мас.% флуоресцеина натрия (Merck, Германия). Масляную фазу окрашивали разбавлением в 100 раз маточного раствора нила красного (Sigma, США) из 0,25 мг / 100 мл EtOH. Образцы помещали внутрь пластиковой камеры глубиной 1 мм, закрытой предметным стеклом для предотвращения дефектов, вызванных сжатием и высыханием. Визуализацию выполняли при комнатной температуре с помощью конфокального микроскопа LSM 710, модернизированного путем установки детектора Airyscan (Zeiss, Германия). Сбор данных и обработку изображений выполняли с использованием программного обеспечения Zen 2.1.
Параметры регистрации для флуоресцеина:
Длина волны возбуждения: 488 нм. Эмиссия: BP = 420–480 нм и BP = 495–550 нм.
Параметры регистрации для нила красного:
Длина волны возбуждения: 561 нм. Эмиссия: BP = 570–620 нм и LP = 645 нм.
Растровая электронная микроскопия (SEM)
Обработанные PHF после сушки сублимацией и коммерческие эталонные волокна PHF анализировали с помощью SEM. Порошки приклеивали к металлической ножке для образцов, оснащенной двусторонней проводящей лентой. Ножку встряхивали для обеспечения хорошего распределения порошка. Образцы покрывали слоем золота толщиной 10 нм с использованием устройства для ионного напыления Leica SCD500, а затем визуализировали в режиме низкого вакуума при 6 кВ с использованием растрового электронного микроскопа Quanta F200 (FEI, Нидерланды).
Влажные образцы устанавливали на металлическую ножку для образцов, оснащенную двусторонней проводящей лентой. Ножку помещали на столик Пельтье, температуру которого поддерживали на уровне 4°C. Изображения регистрировали с помощью газового вторичного электронного детектора в растровом электронном микроскопе Quanta F200, работающем при 10 кВ. Давление микроскопа устанавливали равным 4,60 торр, что соответствует относительной влажности 75%, для визуализации образца в гидратированном состоянии.
Световая микроскопия
Изображения микроструктур эмульсий 50% м/в и дисперсий PHF 10 мас.% и контролей получали с использованием световой микроскопии. Каплю образца помещали на стеклянную пластину и получали изображение с помощью светового микроскопа Olympus SZX16 (Olympus, Германия), оснащенного цифровой камерой и программным обеспечением для обработки изображений (cellSens) с использованием освещения темного поля и соответствующего увеличения.
1.3.5. Поверхностный заряд
Для определения электрофоретической подвижности обработанного ферментами PHF и контролей в воде (1% масса/объем) использовали прибор серии Zetasizer Nano (Malvern, Великобритания), который затем переводили в дзета-потенциал. Оптимальный диапазон размеров частиц в растворе для измерения дзета-потенциала составлял от 5 нм до 10 мкм, поэтому PHF (размер >10 мкм) не подходили для данного анализа, так как во время измерения они оседали в кювете. Возможно потенциальное улучшение данного способа путем фильтрации частиц до диапазонов размеров по меньшей мере 1–10 мкм.
1.3.6. Смачивающие способности
Для исследования смачиваемости сухих PHF применяли гониометр KSV CAM200 (Biolin Scientific, Финляндия). Каплю воды или масла (3–5 мкл) наносили на уплощенную поверхность волокна с помощью шприца, закрепленного на установке гониометра. Изменение угла смачивания с течением времени регистрировали при высокой контрастности и рассчитывали угол смачивания с помощью программы анализа изображений, которая выстраивает круг на основании формы капли и получает угол смачивания по наклону этой кривой в точке, в которой этот круг пересекает базовую линию (публикация Mitchell et al, 2017 Chemical Engineering Science, 167, pp. 29–41 включена в настоящий документ путем ссылки).
Для создания уплощенной поверхности волокон кожуры гороха использовали три различных методики.
Таблетирование. 2 г порошка прессовали между двумя штампами при давлении 20 т в форме для таблетирования, изготовленной из нержавеющей стали, с диаметром 24 мм.
Покрытие методом центрифугирования. Готовили раствор волокна с TS 10–20% и перемешивали его в течение одного часа. Небольшую каплю наносили на стеклянную пластину в центре центрифуги для нанесения покрытия и выполняли вращение с разными скоростями, создавая такую центробежную силу, с помощью которой можно получать тонкий слой.
Фиксация порошкового волокна на ленте. 20 мг волокна распределяли с помощью шпателя по ленте, фиксируемой на предметном стекле.
1.4. Способность стабилизации эмульсии «масло в воде»
1.4.1. Приготовление эмульсии
3
Если не указано иное, эмульсии 50 мас.% м/в готовили следующим образом. Первые 10 мл 100 мМ цитратно-фосфатного буфера с pH 5 (содержащего 0,04 мас.% NaN в качестве антимикробного агента) добавляли в пробирку Pyrex и смешивали с 1 мл обработанной или контрольной дисперсии. К водной фазе добавляли 10 мл подсолнечного масла с высоким содержанием олеиновой кислоты (Nestrade, Швейцария) и встряхивали эмульсию вручную в течение 10 секунд. Если не указано иное, образцы выдерживали при комнатной температуре в течение 4 недель.
Для оценки стабилизирующего эмульсию эффекта растворимой фазы 2 мл дисперсии PHF центрифугировали в кювете Эппендорфа объемом 2 мл при 16 000 g в течение десяти минут. В водную фазу эмульсий 50% м/в добавляли 1 мл надосадочной жидкости вместо дисперсии PHF. Для оценки стабилизирующего эмульсию эффекта нерастворимой фазы осадок, полученный после центрифугирования, 3 раза промывали цитратно-фосфатным буфером для удаления любых оставшихся растворимых компонентов, а затем дисперсию PHF восстанавливали промытым PHF до такой же концентрации путем повторного заполнения кюветы Eppendorf цитратно-фосфатным буфером до метки 2 мл, допуская, что количество PHF, потерянное в ходе промывки, ничтожно мало. 1 мл промытого осадка в цитратно-фосфатном буфере добавляли к водной фазе эмульсий 50% м/в, как описано выше.
1.4.2. Устойчивость эмульсий
Устойчивость эмульсий к схлопыванию оценивали визуально в течение по меньшей мере 4 недель, если не указано иное. Для определения механизма стабилизации обработанного ферментами (функционализированного) PHF использовали различные методики микроскопии (1.3.4.).
1.4.3. Кухонные прототипы
Способность функционализированных (обработанных ферментами) PHF стабилизировать эмульсию оценивали в прототипах жидкого забеливателя. Готовили 250 мл дисперсии 10% (масса/объем) PHF в воде PANNA и перемешивали ее в течение 1 часа при комнатной температуре для обеспечения полной гидратации. В дисперсию добавляли 240 мкл целлюлозы на г PHF и 120 мкл пектина на г PHF. Дисперсию инкубировали в течение ночи (16 часов) при 50°C с непрерывным перемешиванием, не регулируя pH (значение pH, измеренное при 21°C перед реакцией: 5,98).
Составы прототипов забеливателя и результаты представлены в примере 2.
Сначала все водорастворимые ингредиенты растворяли в воде PANNA путем перемешивания смеси в пластиковом стакане объемом 200 мл, покрытом парафином, в течение двух часов при комнатной температуре. После этого в водную фазу добавляли в пластиковый стакан объемом 500 мл, содержащий предварительно взвешенное подсолнечное масло с высоким содержанием олеиновой кислоты. Смесь гомогенизировали с помощью прибора IKA Ultra-turax (IKA, Германия) при 16 000 1/мин в течение 2 минут.
Растворимый кофе (2,5 г кофе Nescafé Gold / 150 г воды) растворяли в воде PANNA при 80°C. 5 г жидкого забеливателя добавляли к 30 мл кофе и выдерживали в печи при 70°C до дегустации в течение максимум одного часа. Перед дегустацией образцы слегка перемешивали пластиковым шпателем и подавали под красным освещением для маскировки цвета. Контрольный образец (совпадающий со стандартным образцом) подавали для проверки воспроизводимости органолептической оценки.
1.5. Аналитические способы
1.5.1. Определение содержания белков-ферментов
Содержание белка в очищенных ферментах и коммерческих ферментных смесях определяли с помощью анализа Брэдфорда и Лоури в соответствии с протоколом Sigma (Sigma Aldrich, Швейцария).
Метод Брэдфорда
100 мкл реагента Брэдфорда (Sigma Aldrich, Швейцария) добавляли к 100 мкл образцов в 96-луночном микропланшете Nunc MicroWell (Thermo Scientific, Швейцария). Соответствующие разведения образцов готовили в milli-Q для получения концентрации в пределах линейной части калибровочной кривой. Растворы оставляли для протекания реакции на 5 минут при комнатной температуре, после чего определяли абсорбцию стандартов и образцов при длине волны 595 нм с использованием Varioskan Flash (Thermo Scientific, Швейцария). Калибровочную кривую с бычьим сывороточным альбумином (BSA, Sigma, Швейцария) готовили с концентрациями в диапазоне от 0 до 25 мкг/мл.
Метод Лоури
100 мкл раствора реагента Лоури добавляли к 100 мкл образцов в 96-луночном микропланшете Nunc MicroWell (Thermo Scientific, Швейцария). Растворы оставляли для протекания реакции на 20 минут при комнатной температуре, после чего в каждую лунку добавляли 50 мкл фенолового реагента Фолина — Чокальтеу и оставляли для проявления цвета на 30 минут при комнатной температуре. Абсорбцию образцов определяли при длине волны 600 нм с помощью прибора Thermo Scientific Varioskan Flash (Thermo Scientific, Швейцария). Калибровочную кривую с бычьим сывороточным альбумином (BSA) готовили с концентрациями в диапазоне от 0 до 400 мкг/мл.
1.5.2. SDS-PAGE
Электрофорез белков в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) проводили на растворимой и нерастворимой фазе дисперсий PHF после инкубации. Образцы для анализа SDS готовили следующим образом. Дисперсии PHF центрифугировали в кювете Eppendorf объемом 2 мл при 16 000 g в течение 10 минут, после чего надосадочную жидкость отделяли от осадка (надосадочная жидкость 1). Осадок растворяли в буфере трис-SDS-мочевина с pH 8,5 в той же кювете Eppendorf в течение по меньшей мере 10 минут, после чего смесь центрифугировали, а надосадочную жидкость отделяли от гранулы (надосадочная жидкость 2). Надосадочную жидкость 1 и надосадочную жидкость 2 использовали для анализа белков, присутствующих в растворимой и нерастворимой фазах соответственно. Контрольные образцы готовили с применением дисперсий PHF, которые инкубировали с инактивированными ферментами и без ферментов.
25 мкл буфера для образцов NuPAGE LDS (Invitrogen, Швейцария) и 10 мкл восстанавливающего агента для образцов NuPAGE (Invitrogen, Швейцария) добавляли к 65 мкл образца, а затем нагревали при 70°C в течение 10 минут в приборе Thermomixer (Thermo Scientific, Швейцария, Швейцария).
Гели трижды промывали подвижным буфером NuPAGE MOPS SDS и помещали в миникювету X-CELL II Mini Cell (LifeTechnologies, Швейцария). Затем образцы помещали в лунки на NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel (Invitrogen, Швейцария), а маркер молекулярной массы (Sigma Aldrich, Швейцария) помещали в лунки 1 и 12. Буфер для образцов NuPAGE LDS помещали в пустые лунки. Обе камеры кюветы для электрофореза заполняли подвижным буфером NuPAGE MOPS SDS (Invitrogen, Швейцария), а к буферу в верхнюю камеру добавляли 500 мкл антиоксиданта NuPAGE (Invitrogen, Швейцария). Электрофорез проводили в миникювете X-CELL II Mini Cell при 200 В в течение 50 минут. Затем гель инкубировали в 100 мл фиксирующего раствора (50% метанол, 10% уксусная кислота и 40% вода milli-Q) в Q пластиковом контейнере в течение 10 минут при комнатной температуре при осторожном встряхивании. Через 10 минут контейнер опорожняли и заполняли окрашивающим раствором (55% мл воды milli-Q, 20 мл метанола, 20 мл красителя A из набора для окрашивания коллоидным синим (Invitrogen, Швейцария)). Гель инкубировали в течение еще 10 минут, после чего добавляли 5 мл красителя B из набора для окрашивания коллоидным синим (Invitrogen, Швейцария). Гели окрашивали в течение 3–4 часов. Окрашивающий раствор удаляли и добавляли 200 мл воды milli-Q и осторожно встряхивали в течение по меньшей мере 7 часов для обесцвечивания. Гели сканировали с помощью сканера Image Scanner III (GE Healthcare, Life Sciences, Швейцария) с использованием белой подложки.
1.5.3. Анализ восстанавливающего сахара
Восстанавливающие сахара в реакционных надосадочных жидкостях и контрольных образцах измеряли с помощью способа DNS.
4
4
6
2
Реагент DNS готовили путем смешивания 200 мл 8% (масса/объем) NaOH (Merck, Швейцария) с 500 мл воды milli-Q с последующим добавлением 10 г 3,5-динитросалициловой кислоты (DNS). 402,7 г CHKNaOx4HO медленно добавляли при непрерывном перемешивании.
125 мкл раствора DNS добавляли к 125 мкл образца, а смесь кипятили в течение 5 минут. Добавляли 1 мл воды milli-Q и считывали абсорбцию при 540 нм с помощью спектрометра Unicam видимого и УФ диапазонов (Helios Gamma, г. Хелиос-Дельта, Великобритания). Стандартные кривые готовили с использованием глюкозы, ксилозы и D-галактуроновой кислоты в концентрациях, варьирующихся от 0 до 2 мг/мл.
1.5.4. Качественный анализ олигосахаридов с использованием гидрофильной хроматографии (HILIC)
Реакционные надосадочные жидкости PHF, обработанные коммерческими ферментными смесями, анализировали с помощью HILIC.
Готовили мальтотриозные стандарты (2 мкмоль/мл, 0,5 мкмоль/мл и 0,1 мкмоль/мл) и ламинаритриозный внутренний стандартный рабочий раствор (0,4 мкмоль/мл). Реагент для мечения 2AB готовили путем добавления 524,2 мг антраниламида (Sigma Aldrich, Швейцария) и 691,2 мг цианоборогидрида натрия (Sigma Aldrich, Швейцария) в растворе 3,6 мл безводной уксусной кислоты (Merck, Швейцария) и 8,4 мл сульфоксида диметила (Sigma Aldrich, Швейцария). Затем реагент для мечения 2AB смешивали на встряхивателе и помещали в ультразвуковую баню на 10 минут для полного растворения. Элюент A (раствор вода : ацетонитрил в соотношении 25 : 75) готовили путем смешивания 250 мл воды Milli-Q и 750 мл ацетонитрила (Merck, Швейцария). Элюент B (50 мМ формиат аммония) готовили путем добавления 1,89 мл муравьиной кислоты 100% (Merck, Швейцария) в 800 мл воды Milli-Q и последующей корректировки рН до 4,4 с помощью гидроксида аммония 25% (Merck, Швейцария).
Интересующие образцы разбавляли в 20–100 раз в воде Milli-Q. 50 мкл рабочего раствора внутреннего стандарта ламинаритриозы (0,4 мкмоль/мл) добавляли к 50 мкл разбавленных образцов и стандартов мальтотриозы. 20 мкл каждой смеси переносили в микропробирку емкостью 2 мл и добавляли в нее 200 мкл реагента для мечения 2AB. После перемешивания вихревым смесителем пробирки инкубировали при 65°C в течение 2 ч на водяной бане. После этой реакции мечения пробирки выдерживали при температуре 4°C в течение 10 мин. Каждую из смесей затем разбавляли 0,6 мл элюента A, встряхивали, а затем количественно переносили в хроматографические виалы емкостью 2 мл (Agilent, Швейцария), а на них навинчивали крышки с отверстием (Agilent, Швейцария).
Анализы выполняли на системе УВЭЖХ Thermo Scientific Vanquish (Thermo Scientific, Швейцария). При использовании вводимого объема 2 мкл олигосахариды разделяли на колонке ACQUITY UPLC BEH Amide (130 Å, 1,7 мкм, 2,1 мм X 150 мм, Waters, Швейцария) с предколонкой ACQUITY UPLC BEH Amide VanGuard (130 Å, 1,7 мкм, 2,1 мм X 5 мм, Waters, Швейцария). Элюенты A и B применяли со скоростью потока подвижной фазы 0,5 мл/мин с градиентным профилем, состоящим из элюента A со следующими пропорциями (об./об.) элюента B: 0–2,3 мин, 5% B; 2,3–2,5 мин, 5–10% B; 2,5–4,9 мин, 10% B; 4,9–65 мин, 10–22% B; 65–65,5 мин, 22–70% B; 65,5–68 мин, 70% B; 68–69 мин, 70–10% B; 69–74 мин, 10% B; 74–75,5 мин, 10–5% B. Камеру колонки нагревали и выдерживали при 60°C в течение всего периода анализа. Использовали флуоресцентный детектор Vanquish F (Thermo Scientific, Швейцария) с длиной волны возбуждения 330 нм, длиной волны излучения 420 нм и чувствительностью 3 в режиме высокой мощности лампы. Получали хроматограммы и анализировали площади пика с помощью программного обеспечения Chromeleon 7.2 Chromatography Data System (Dionex, Швейцария).
1.5.5. Количественный анализ моно- и олигосахаридов с использованием высокоэффективной ионообменной хроматографии (HPAEC)
Реакционные надосадочные жидкости PHF, обработанные коммерческими ферментными смесями, анализировали с помощью HPAEC.
Моно- и олигосахариды
Моно- и олигосахариды анализировали с использованием устройства Dionex ICS-3000 DC, оснащенного колонкой CarboPac PA1 (Dionex Corporation, 2010) и настроенного на температуру на 30°C и импульсную амперометрическую детекцию (PAD) с тройным потенциалом на золотом электроде. В качестве подвижной фазы с градиентом ацетата натрия использовали элюент A (100 мМ водный раствор NaOH) и элюент B (600 мМ ацетат натрия в 100 мМ водном растворе NaOH): 0–5 мин, 0 мМ; 5–50 мин, 0–48 мМ; 50–55 мин, 48–600 мМ; 55–65 мин, 600 мМ; 65–68 мин, 600–0 мМ; 68–75 мин, 0 мМ при скорости потока 1,0 мл/мин. Приложенные потенциалы PAD для E1 (400 мс), E2 (200 мс) и E3 (400 мс) составляли соответственно 50, 750 и -150 мВ, а выходной диапазон составил 1 мкКл. Вводимый с помощью автоматического пробоотборника Dionex AS (настройка температуры: 10°C) объем для каждого образца составлял 20 мкл. Образцы разводили в 100 раз и фильтровали (0,2 мкм). Стандарты с целлобиозой, -триозой, -тетраозой и -пентаозой получали в трех различных концентрациях (25 мкг/мл, 75 мкг/мл и 150 мкг/мл, при этом линейность подтверждена). Для получения и обработки хроматографических данных использовали программное обеспечение хроматографии Chromeleon™ версия 7.1.
Анализ на моносахариды
Маточный раствор углеводного стандарта готовили путем растворения 100 мг глюкозы (Sigma Aldrich, Швейцария), маннозы (Merck, Швейцария), арабинозы (Sigma Aldrich, Швейцария), ксилозы (Sigma Aldrich, Швейцария), галактозы (Sigma Aldrich, Швейцария) в 100 мл воды Milli-Q в мерной колбе емкостью 100 мл, с получением раствора с концентрацией 1000 мкг/мл для каждого моносахарида. Из этого маточного раствора готовили серию стандартов 500 мкг/мл, 250 мкг/мл, 100 мкг/мл, 25 мкг/мл, 5 мкг/мл, 2,5 мкг/мл и 0,5 мкг/мл. 1,5 мл стандартов и разведенных в 100 раз образцов помещали в хроматографические виалы емкостью 2 мл (Agilent, Швейцария), на которые навинчивали крышки с отверстием (Agilent, Швейцария).
Анализы проводили на безреагентной системе HPIC Thermo Scientific Dionex ICS-5000+ (Dionex, Швейцария). Используя вводимый объем 25 мкл, моносахариды разделяли на колонке CarboPac PA1 (4 x 250 мм, Dionex, Швейцария). Элюент A представлял собой 300 мМ гидроксид натрия (J.T.Baker Chemicals, Швейцария), а элюент B представлял собой воду Milli-Q со скоростью потока подвижной фазы 1 мл/мин и градиентным профилем, состоящим из элюента A со следующими пропорциями (об./об.) элюента B: 0–60 мин, 100% B; 60–75 мин, 0% B; 75–90 мин, 100% B. Послеколоночный элюент, представляющий собой 300 мМ гидроксид натрия, добавляли со скоростью потока 0,6 мл/мин для повышения силы сигнала и уменьшения отношения сигнала к шуму. Электрохимический детектор Dionex ICS-5000+ ED40 (Dionex, Швейцария), оснащенный золотым рабочим электродом, использовали с импульсным амперометрическим датчиком, используя параметры импульса волны Carbo Quad. Получали хроматограммы и анализировали площади пика с помощью программного обеспечения Chromeleon 7.2 Chromatography Data System (Dionex, Швейцария).
Результаты
2.1. Определение характеристик очищенных ферментов и коммерческих расщепляющих волокна ферментных смесей
Содержание белка в очищенных ферментах и коммерческих ферментных смесях, измеренное с помощью стандартных анализов Лоури и Брэдфорда, показано на фиг. 1. Независимо от выбранного анализа, в коммерческих ферментных составах было существенно более высокое содержание белка (раствор фермента 19,1–182 мг/мл) по сравнению с очищенными ферментами (раствор фермента 0,2–1,0 мг/мл). Содержание белка, измеренное с помощью анализа Лоури, было стабильно выше, чем значение, измеренное с помощью анализа Брэдфорда. Различия можно объяснить различиями в чувствительности анализа по отношению к определенным пептидам или другим соединениям, присутствующим в растворе ферментов (Berges, Fisher and Harrison, 1993). Хотя анализ Лоури в целом считается более точным способом количественного определения белка (Redmile-Gordon et al, 2013 Soil Biology and Biochemistry, 67, pp. 166–173), в его ходе была выявлена высокая реакционная способность в отношении очищенной ß-глюкозидазы (E-BGLUC). Следовательно, для нормализации ферментов по содержанию белка использовали метод Брэдфорда.
Активность эндоглюканазы, эндоксиланазы, β-глюкозидазы и пектиназы
Активность очищенных ферментов и коммерческих ферментных смесей показана в таблице 4. Коммерческие ферментные составы обладали гораздо более высокими активностями (9748–10 467 Ед/мл), чем очищенные ферменты (182–3844 Ед/мл). Однако специфическая активность очищенных ферментов была существенно выше, чем в коммерческих ферментных смесях. Важно отметить, что эти значения применимы только при определенных условиях анализа.
Таблица 4. Ферментативные активности (целлюлаза, ксиланаза, пектиназа и β-глюкозидаза) очищенных ферментов и коммерческих ферментных смесей
Фермент
Измеренная активность
Ферментативная активность(раствор фермента Ед/мл)
Специфическая активность<sup>b</sup>(Ед/мг белка)
E-CELAN
Эндоглюканаза
2192,02
12 177,9
E-XYAN4
Эндоксиланаза
3843,93
20 890,9
E-BGLUC
β-глюкозидаза
182,93
223,1
Celluclast 1.5 L
Эндоглюканаза
10 467,92
104,4
Pectinex SP-L
Эндополигалактуроназа
9748,75
510,4
b
На основе данных Брэдфорда (фиг. 1)
Протеолитическая активность в коммерческих ферментных смесях и в PHF показана в таблице 5. Цель данного измерения заключалась в подтверждении или опровержении наличия протеолитической активности, которая может воздействовать на белки или ферменты гороха, присутствующие в реакционном растворе. Pectinex Ultra SP-L обладал протеолитической активностью, в то время как эта активность отсутствовала в отношении Celluclast 1.5 L. Exafine PHF также обладал значимой протеолитической активностью. Это можно объяснить наличием эндогенных ферментов, которые обычно образуют часть стенок первичных клеточных стенок (публикация O’Neill & York, 2003 The composition and structure of plant primary cell wall. In Annual Plant Reviews 8: The plant cell wall, Rose, JKC Ed. Oxford: Blackwall, которая включена в настоящий документ путем ссылки), и не были инактивированы во время промышленной обработки. Следует отметить, что единицы были рассчитаны по стандартной калибровочной кривой, предоставленной компанией Megazyme (см. публикацию 1.5.1.), и не отражают общее количество единиц, поскольку условия проведения анализа были адаптированы к обычным условиям реакции (pH 5, температура 50°C), которые отличаются от условий, используемых Megazyme для калибровки.
Таблица 5. Эндопротеазная активность в коммерческих ферментных смесях и в PHF
Фермент
Разведение
Время
Активность (Ед/мл или г)
Alcalase
40 000
10 мин
19 199,0
Celluclast 1.5 L
1
10 мин
0,09
Pectinex SP-L
25
10 мин
18,8
Эндогенные ферменты в Exafine PHF
5000
24 часа
1629,1
Влияние обработки очищенными ферментами и коммерческими ферментными смесями на степень гидролиза PHF
Таблица 6. Дозы ферментов, используемые для ферментативной обработки PHF (10% TS, 16 ч, 50°C, pH 5) очищенными ферментами и коммерческими ферментными смесями, включая снижение выхода сахаров для каждой реакции
Код образца
Описание образца
Доза фермента(мкл/г PHF)
Добавленные единицы(Ед/г PHF)
Эквивалент (г/л) восстанавливающего сахара (RS)<sup>a</sup>
Контроль
PHF инкубировали в тех же условиях без добавления ферментов
–
–
1,1
PHF-E-CELAN
PHF, обработанные E-CELAN
16,6
36,4
1,6
PHF-E-XYAN4
PHF, обработанные E-XYAN4
40
153,8
2,9
PHF-E-BGLUC
PHF, обработанные E-B-GLUC
10
1,8
1,6
PHF-пектин
PHF, обработанные Pectinex Ultra SP-L
120
1169,9
29,3
PHF-целлюлоза
PHF, обработанные Celluclast 1.5 L
240
2512,3
46,3
PHF-пектин+целлюлоза
PHF, обработанные Pectinex и Celluclast
120 и 240 соответственно
1169,9 и 2512,3 соответственно
75,4
a
Стандартное отклонение восстанавливающих сахаров для каждого образца составляло менее 6%
Анализ восстанавливающего сахара после обработки очищенными ферментами указал на высвобождение только незначительного количества новых восстанавливающих концов или отсутствие новых высвобожденных восстанавливающих концов (1,6–2,9 г/л, таблица 6). Это было ожидаемо, поскольку не предполагалось, что действие только очищенных ферментов, по существу, гидролизует резистентные волокна. Однако низкие значения также указывают на повышенную сложность и плотность, по существу, гетерогенной полисахаридной сети для разложения очищенными ферментами (Huisman, Schols and Voragen, 1999 Carbohydrate Polymers, 38(4), pp 299–307). Эквивалентные концентрации восстанавливающего сахара в контрольных образцах можно объяснить наличием загрязнителей, таких как растворимые олигосахариды или крахмал, из семядолей, которые поступают в раствор во время инкубации.
Затем проводили ферментативную обработку коммерческими целлюлолитическими и пектинолитическими ферментными препаратами в высоких дозах для обеспечения более эффективного гидролиза. Как и ожидалось, после этой обработки заметно увеличивалась степень гидролиза по сравнению с очищенными ферментами, о чем свидетельствует увеличение числа высвобожденных восстанавливающих концов (46,3–75,4 г/л, таблица 6). Увеличенный гидролиз волокна можно объяснить как более высокой концентрацией ферментов, так и синергетическим эффектом нескольких ферментов, присутствующих в коммерческих ферментных составах.
Анализ надосадочной жидкости с помощью HILIC
Для лучшего понимания воздействия ферментативной обработки на химический состав PHF гидролизаты анализировали дополнительно с помощью HILIC и HPAEC. С помощью этой информации можно было бы отнести изменения функциональных свойств PHF к экстрагированным углеводам и, следовательно, ферментативной активности.
Графики обработанных ферментами PHF и контрольных образцов представлены на фиг. 2. Результаты показали неожиданное присутствие в надосадочной жидкости низкомолекулярного материала, подтвержденное путем раннего (2–15 минут) элюирования всех компонентов. Несмотря на то, что были выполнены длительные, а затем короткие анализы HILIC при различных разведениях, в PHF было выявлено либо отсутствие, либо малое количество олигосахаридов (минута 17). Все спектры, кроме контрольных, состояли из идентичных пиков с различной высотой, за исключением двух различных пиков на 2-й и 5-й минутах в образцах, обработанных пектином. Можно сделать вывод об образовании низкомолекулярных фрагментов в результате действия ферментов, которые в основном приводила в действие активность клетки.
Анализ надосадочной жидкости с помощью HPAEC
Для выявления целло-олиго-, ди- и моносахаридов выполняли композиционный анализ гидролизатов с помощью HPAEC при различных разведениях (от 1 : 10 до 1 : 100). С помощью анализа на целлоолигосахариды не удалось выполнить точное комплексирование из-за совместного элюирования соединений и недостаточного разрешения пиков. Наконец, посредством анализа на моносахариды обработанных ферментами PHF путем аналогичной системы удалось разделить пики при разведениях 1 : 100 и продемонстрировать, что молекулы, которые элюировали раньше, представляли собой глюкозу (26,5–31,4 г / 100 PHF в виде сухого вещества), арабинозу (0,2–3,3 г / 100 PHF в виде сухого вещества) и ксилозу (7,6–8,0 г / 100 PHF в виде сухого вещества). Пик на 45-й минуте не идентифицировали, но он мог соответствовать целлозозе. Эти молекулы соответствуют общей композиции PHF. Принимая во внимание, что источником глюкозы в основном была фракция целлюлозы в PHF (69 мас.% сухого вещества), было рассчитано, что приблизительно 40–48% целлюлозы было расщеплено на моносахариды в комплексе PHF-целлюлоза и PHF-пектин+целлюлоза.
Согласно результатам за счет длительного периода выдерживания в сочетании с присутствием экзоактивности в коммерческих ферментных смесях активировалось расщепление волокон, присутствующих в PHF, до моносахаридов. Наличие экзоактивности в ферментных смесях пектина и целлюлозы ранее сообщалось в публикации Combo et al. (2012) Food and Bioproducts Processing 90(3) p 588–596 (включена в настоящий документ путем ссылки) и Rosales-Calderon, Trajano and Duff (2014) Peer J. 2 pe402 (включена в настоящий документ путем ссылки).
При наблюдении за восстанавливающими сахарами комплекса PHF-пектин+целлюлоза в зависимости от времени реакции (фиг. 4) можно наблюдать первичные и вторичные процессы гидролиза. После первых 4–6 часов высвобождение восстанавливающих сахаров достигало плато. На этой стадии растворимые промежуточные соединения из поверхности частиц волокна, вероятно, высвобождались в растворимую фазу (первичный гидролиз) (публикация Sievers et al., 2009 Industrial & Engineering Chemistry Research 48(3) p 1277-1286 включена в настоящий документ путем ссылки). Через 8 часа эти длинноцепочечные и короткоцепочечные промежуточные соединения затем расщеплялись до моносахаридов ферментами, обладающими экзоактивностью. Эта стадия была гораздо быстрее первичного гидролиза, о чем свидетельствует резкое увеличение наклона восстанавливающих сахаров с 8 до 16 часов.
2.2. Функциональные свойства обработанных ферментами волокон кожуры гороха
2.2.1. Обработанные ферментами волокна кожуры гороха в качестве стабилизаторов эмульсии Пикеринга типа «масло в воде»
Влияние ферментативной обработки коммерческими ферментными смесями на размер частиц и морфологию PHF
Объемное распределение частиц по размерам (PSD) для всех обработанных ферментами образцов и контрольного образца представлено на фиг. 5.
Приведенная ниже таблица соответствует фиг. 5. Контрольный образец соответствует ультрадисперсным волокнам кожуры гороха, в отношении которых не выполняли ферментативную обработку.
D [3, 2] — взвешенное среднее поверхности [мкм]
D [4, 3] — взвешенное среднее объема [мкм]
d (0,1) [мкм]
d (0,5) [мкм]
d (0,9) [мкм]
Контроль(без ферментов)
65
243
30
202
523
PHF-целлюлоза
42
203
20
160
459
PHF-пектин
22
51
15
43
99
PHF-пектин+целлюлоза
10
25
4
17
51
Одним из последствий ферментативной обработки для физической структуры ультрадисперсного PHF было уменьшение размера частиц, вследствие чего были получены частицы в диапазоне размеров от 1 до 300 мкм. Частицы самых малых размеров получали при одновременной обработке PHF с Pectinex SP-L и Celluclast 1.5 L. При такой обработке средний объемный диаметр снижался в десять раз.
Влияние ферментативной обработки на физическую структуру PHF также оценивали с помощью оптической микроскопии. Качественный анализ результатов показал изменения в морфологии и полидисперсности размеров частиц при различных типах ферментативной обработки. По сравнению с обработанными PHF необработанные модифицированные частицы PHF демонстрировали более высокую полидисперсность и повышенную шероховатость поверхности, которые четко не видны на изображениях из-за их низкого разрешения. С помощью обработки PHF только с пектинолитическими ферментами (фиг. 6C) получали стержнеподобные частицы в отличие от обработки целлюлолитическими ферментами (фиг. 6 B, D).
Важно подчеркнуть, что PSD на фиг. 5 выражено в виде объемного распределения по размерам. Поскольку большая часть объема в образцах с полидисперсным распределением по размерам занята более крупными частицами, относительный вклад частиц меньшего размера в распределение объема уменьшается, и, следовательно, эти малые частицы плохо представлены при измерении устройством компании Malvern. Наличие некоторых крупных частиц в комплексе PHF-целлюлоза (фиг. 6, B) может объяснить, почему при измерении PSD с помощью Malvern Mastersizer 2000 не наблюдалось существенных изменений размера частиц для комплекса PHF-целлюлоза (фиг. 5), тогда как на микрофотографиях в оптическом микроскопе показано значительное образование частиц меньшего размера (фиг. 6, B).
На графике на фиг. 7 представлен средний размер частиц комплекса PHF-пектин+целлюлоза в зависимости от времени реакции. Уменьшение размера частиц постепенно сглаживалось через 8 часов. Таким образом, для будущей оптимизации процесса время реакции можно сократить до приблизительно 8 часов без изменения конечного размера частиц. За счет этого будет также ограничен вторичный гидролиз, возникающий приблизительно через 6–8 часов, как описано ранее при обсуждении (фиг. 4), а значит, уменьшится нежелательное образование моносахаридов.
Влияние ферментативной обработки на скорость сдвига в водных суспензиях PHF
Вискозиметрические измерения проводили на обработанных ферментами водных дисперсиях PHF (10 мас.%) после инкубации. В комплексе PHF-пектин+целлюлоза были самые низкие значения вязкости (фиг. 8), которые соответствовали системе с наименьшим размером частиц (фиг. 5). Таким образом, кажущаяся вязкость, по-видимому, в большей степени обусловлена корпускулярной дисперсной фазой по сравнению с содержащей моносахарид водной дисперсионной фазой.
В отношении комплекса PHF-целлюлоза не было измерено никаких изменений значений кажущейся вязкости в соответствии с результатами распределения частиц по размерам, которые не показали существенных отличий. Наконец, измеренного уменьшения размера частиц PHF-пектин оказалось недостаточно для существенного изменения скорости потока по сравнению с контрольным образцом.
Влияние ферментативной обработки на смачивающую способность PHF
Оценка смачивающей способности PHF была центральной частью данного исследования, поскольку изменение поверхностной гидрофобности в иных условиях гидрофильных частиц имело решающее значение для получения функциональных частиц для стабилизации эмульсии. Смачивающая способность относится к трехфазному углу θ смачивания, определяющему разделение частиц между двумя фазами текучей среды.
Результаты показаны на фиг. 9.
Точное определение угла смачивания, образованного между каплей масла или воды и PHF, было затруднено из-за пористости PHF, вследствие которой происходило быстрое поглощение жидкости в течение первых 3–5 секунд, постепенное снижение объема капель, набухание частиц при контакте с водой и захват частиц каплей.
Использовали другой способ, при котором смачиваемость была выражена в виде количества времени (с), необходимого для полного погружения 1 г образца в фиксированный объем (10 мл) воды mili-Q. Для этого PHF подвергали сушке сублимацией и растирали в порошок. Этот способ продемонстрировал значительные различия между образцами и хорошую воспроизводимость (см. фиг. 10).
Комплекс PHF-пектин+целлюлоза показал наилучшую смачиваемость (для полного погружения частиц требовалось всего 3 секунды), а следующие результаты показали PHF-пектин и PHF-целлюлоза. Контрольному PHF потребовалось почти 120 секунд для исчезновения с поверхности, и, следовательно, его считали наименее гидрофильным. Однако улучшенная смачиваемость может также быть результатом снижения размера частиц (фиг. 5), вследствие которой на поверхности частицы появляются более функциональные группы, которые доступны для связывания с молекулами воды (публикация Einhorn-Stoll, Hatakeyama and Hatakeyama, 2012 Food Hydrocolloids 27(2) pp 494–502, включенная в настоящий документ путем ссылки).
Стабилизирующие эмульсию свойства обработанного ферментами PHF
Первоначальные эмульсии готовили с возможностью ускорения дестабилизации, за счет чего получалось более быстрое сравнение образцов. Вкратце 1 мл обработанного PHF сначала диспергировали в водной фазе, после чего добавляли подсолнечное масло с высоким содержанием олеиновой кислоты. Смесь вручную встряхивали в течение 10 секунд и сравнивали устойчивость эмульсий, полученных с обработанными волокнами, с устойчивостью их необработанных аналогов в течение четырех недель, если не указано иное. На фиг. 21 показано изображение полученных эмульсий через 1 день и 4 недели.
Вследствие приложения небольшого количества энергии в результате ручного встряхивания формировались более крупные капли масла и, следовательно, повышалась скорость отстаивания, из-за чего появлялся толстый отстоявшийся слой. Через 30–180 секунд отстоявшийся слой эмульсий, приготовленных с использованием комплекса PHF-пектина, и контрольных образцов разделяли на масляную и водную фазы, а капли (диапазон размеров 10–500 мкм) в отстоявшемся слое эмульсии, приготовленном с использованием комплексов PHF-пектин+целлюлоза и PHF-целлюлоза, сохраняли стабильность в течение по меньшей мере 4 недель. Те же результаты наблюдали при приготовлении эмульсий при рН 3,0, 5,0 и 8,0.
Устойчивость эмульсии, как правило, оценивают на основании ее способности сопротивляться физико-химическим изменениям в течение времени хранения (издание McClements, 2005 Food Emulsions: Principles, Practice, and Techniques. Boca Raton: CRC Press, которое включено в настоящий документ путем ссылки). Эмульсии считаются стабильными при наличии однородного внешнего вида без разделения фаз. Благодаря такому способу приготовления эмульсий возможно быстрое отстаивание сливок, поэтому определение устойчивости было основано на том, будут ли отстоявшиеся капли масла сохранять устойчивость с течением времени, независимо от размера капель или высоты отстоявшегося слоя. С помощью такого сравнительного анализа можно получить только два варианта ответа, причем «стабильный» относится к случаю, при котором отстоявшиеся капли масла устойчивы к коалесценции в течение по меньшей мере 4 недель, а «нестабильный» к случаю отсутствия капель.
Ослабление влияния растворимой и нерастворимой фракций на стабилизирующие эмульсию свойства
Проведены дополнительные эксперименты по ослаблению влияния частиц и других потенциальных поверхностно-активных соединений в растворе. Дисперсии PHF (PHF-целлюлоза и PHF-пектин+целлюлоза) центрифугировали, а надосадочную жидкость и осадок использовали отдельно для приготовления эмульсий. Как показано на фиг. 12, эмульсии, полученные с нерастворимой фазой (b), сохраняли стабильность в течение по меньшей мере 4 недель. Эмульсии, полученные с растворимой фазой (a), быстро разделялись на фазы (приблизительно через 10 минут), но медленнее по сравнению с контрольным образцом. Согласно этим результатам устойчивость эмульсии была обусловлена нерастворимой корпускулярной фазой. Это согласуется с ранее сообщенными результатами химического анализа (фиг. 3), согласно которым с помощи ферментативной обработки получали главным образом моносахариды, которые не обладают поверхностной активностью. После определения фазы, обеспечивающей устойчивость, все же продолжали эксперименты с использованием смеси обеих фаз.
Микроструктура эмульсий, стабилизированных обработанным ферментами PHF
Эмульсии визуализировали с помощью светового микроскопа для наблюдения за микроструктурой устойчивых капель. На микрофотографиях на фиг. 13 показана текстурированная шероховатая поверхность капель, которая представляет собой типичную характеристику жидких поверхностей, стабилизированных частицами. Капли контрольного образца и PHF-пектин не визуализировали, поскольку они быстро теряли стабильность после приготовления эмульсии.
Изображения тех же эмульсий, полученные посредством CLSM, (фиг. 14) показали предпочтительное присутствие мелких частиц (<30 мкм) на поверхности раздела, а не в основной массе эмульсии, и, следовательно, более высокую аффинность к поверхности раздела м/в. Полученные эмульсии соответствуют определению эмульсии Пикеринга, в которой эмульсия стабилизируется адсорбцией твердых частиц на поверхности раздела м/в (публикация Murray et al., 2011 Food Hydrocolloids 25(4) p 627–638, включенная в настоящий документ путем ссылки). Была выявлена разнородность как капель масла, так и частиц PHF в отношении формы и размера частиц, но общее отношение частиц к маслу находилось в диапазоне 1 : 10, что соответствует общепринятому убеждению в том, что частицы Пикеринга должны быть по меньшей мере на один порядок меньше, чем стабилизируемые ими капли масла (публикация Berton-Carabin and Schroën, 2015 Annual review of Food Science and Technology 6(1) pp 263–297 включена в настоящий документ путем ссылки). Частицы большего размера (>30 мкм) не могли адсорбироваться на поверхности раздела м/в и, как правило, выпадали в осадок из эмульсии. Эти неадсорбированные частицы могут играть роль в обеспечении дополнительной устойчивости путем структурирования дисперсионной фазы между каплями (Gould, Vieira and Wolf, 2013 Food & Function 4(9), p 1369; Tamayo Tenorio et al, 2017 Food Hydrocolloids 71 pp 8–16).
3,2
Эффект Пикеринга, по-видимому, был более выраженным для комплекса PHF-пектин+целлюлоза, чем для PHF-целлюлоза. Причина этого заключается в получении с помощью ферментативной обработки комплексом пектин+целлюлоза частиц меньшего размера по сравнению с обработкой только целлюлозой (фиг. 5), вследствие чего возрастало количество частиц, покрывающих масляную поверхность раздела. Результаты, полученные Gould, Vieira и Wolf, (2013) (см. выше), также показали, что только фракция частиц малого размера (<2 мкм) из какао будет адсорбироваться на поверхности капель масла (d приблизительно 10 мкм).
Несмотря на меньшее количество частиц Пикеринга на поверхности раздела м/в в эмульсиях, стабилизированных с помощью комплекса PHF-целлюлоза, были получены аналогичные уровни устойчивости, что указывает на возможность влияния других поверхностно-активных соединений на обеспечение дополнительной устойчивости капель. Сообщается, что для обеспечения эффективной защиты от коалесценции в течение нескольких месяцев требуется покрыть частицами капли масла только на 20% (Binks et al, 2005 Naturally Occurring Spore Particles at Planar Fluid Interfaces and in Emulsions. Langmuir 21(18), pp. 8161–8167). Однако в случае комплекса PHF-целлюлоза (фиг. 14) некоторые капли вообще не содержали частиц.
При первой попытке измерения присутствия белков на поверхности раздела эмульсию окрашивали красителем Fast Green, который флуоресцирует при контакте с белками, но сигнал не был получен. Однако отсутствие сигнала не было достаточным доказательством отсутствия белков на поверхности раздела из-за пределов обнаружения при таких низких концентрациях.
Наличие белков в растворимой и нерастворимой фазах
Таблица 7. Композиция эмульсий м/в, приготовленных с использованием обработанного ферментами PHF, и контрольного образца. Контрольный образец был приготовлен с использованием PHF, которое обрабатывали в тех же условиях без добавления фермента
Образец
PHF-пектин+целлюлоза
PHF-целлюлоза
PHF-пектин
Контроль
Эмульсия
г
г
г
G
Масло
10
10
10
10
Вода
10,9
10,9
10,9
10,9
Белок-фермент<sup>a</sup>
0,003
0,002
0,001
–
Белок гороха<sup>b</sup>
0,005
0,005
0,005
0,005
PHF
0,09
0,09
0,09
0,09
Прочее
0,001
0,001
0,001
0,001
Всего
21
21
21
21
a
На основе данных Брэдфорда
b
На основе данных Кьелдала, взятых из RDLS-RD170010-00
Хотя с помощью CLSM не было выявлено ни одного белка, а устойчивость капель масла не зависела от pH, нельзя исключать участие белков, поскольку они присутствовали в значительных количествах (от 0,8 до 0,7 мг на 1 г масла в случае комплекса PHF-пектин+целлюлоза и PHF-целлюлоза, таблица 7). Более того, стабильными были только эмульсии с наиболее высоким содержанием белка (таблица 7).
Растворимая (надосадочная жидкость) и нерастворимая фазы (осадок) дисперсий PHF (PHF-целлюлоза и PHF-пектин+целлюлоза) дополнительно анализировали с помощью SDS-PAGE, чтобы определить, остаются ли белки в растворимой или нерастворимой фракции (фиг. 15). Гели SDS показали, что в растворимой фазе белки отсутствовали или присутствовали только в следовых количествах (полосы 1–5). Анализ SDS осадков показал, что практически весь доступный белок оставался в нерастворимой фазе (фиг. 15, полоса 8–12). Инактивированные ферменты, которые добавляли к контрольному образцу до инкубации в течение 16 ч, были показаны в виде низкомолекулярного материала в полосах 8 и 11, вероятно, из-за разложения эндогенными ферментами, присутствующими в PHF. Протеолитическую активность эндогенных ферментов в PHF ранее подтверждали путем анализа протеазной активности (таблица 7). Активные ферменты в сворачиваемой форме, по-видимому, были устойчивы к протеолитической активности.
Для того чтобы сделать выводы из этого эксперимента, было показано, что белки остаются в нерастворимой фазе, следовательно, с частицами PHF, но неясно, связаны ли оба компонента или они присутствуют в виде отдельных компонентов.
Таблица 8. Описание полос на фиг. 15
Описание образца
Описание образца
1
Надосадочная жидкость, контроль (без ферментов)
8
Осадок, PHF-целлюлоза (контроль с инактивированными ферментами)
2
Надосадочная жидкость, PHF-целлюлоза
9
Осадок, PHF-пектин+целлюлоза
3
Надосадочная жидкость, PHF-пектин+целлюлоза
10
Осадок, PHF-целлюлоза
4
Надосадочная жидкость, PHF-пектин+целлюлоза (контроль с инактивированными ферментами)
11
Осадок, PHF-пектин+целлюлоза (контроль с инактивированными ферментами)
5
Надосадочная жидкость, PHF-целлюлоза (контроль с инактивированными ферментами)
12
Осадок, контроль (без ферментов)
6
Инактивированный фермент (целлюлоза)
M
Стандарт молекулярной массы
7
Инактивированный фермент (пектин+целлюлоза)
Оценка роли фермента в стабилизации эмульсии «масло в воде»
Четкая корреляция между содержанием фермента в эмульсии и устойчивостью стала причиной исследования стабилизирующих эмульсию свойств ферментов. Ферменты представляют собой белки и могут частично обуславливать эмульгирующий эффект вследствие своей естественной амфифильности. Данную гипотезу тестировали путем приготовления контрольных дисперсий PHF, содержащих активные и инактивированные ферменты с PHF и без него. В следующих экспериментах было продолжено применение только комплекса PHF-пектин+целлюлоза, поскольку с помощью такой обработки получали больше частиц Пикеринга, которые представляют особый интерес для данного исследования.
Таблица 9. Обзор экспериментальных условий для эмульсий, приготовленных с активными и инактивированными ферментами (пектин+целлюлоза)
Контроль
pH
Инкубация
Термообработка
Концентрация белка из фермента мг/мл воды<sup>a</sup>
Стабильность
PHF-пектин+целлюлоза
5
16 ч
Без термообработки
0,51
Нестабильная
Пектин+целлюлоза
5
–
Без термообработки
0,51
Нестабильная
PHF-пектин+целлюлоза
5
–
100°C, 10 минут
0,51
Стабильная
PHF-пектин+целлюлоза
5
16 ч
100°C, 10 минут
0,51
Стабильная
Пектин+целлюлоза
5
–
100°C, 10 минут
0,51
Стабильная
a
В данном случае концентрацию белка в мл водной фазы оценивали по содержанию белка в ферментах, предоставленных поставщиком (14 мас.% и 7,5 мас.% для целлюлозы и пектина соответственно.)
Интересно, что в активной и растворимой форме ферменты не демонстрировали никаких эмульгирующих свойств, но когда их подвергали термообработке (100°C в течение 10 минут) для инактивации, они превращались в поверхностно-активные вещества и стабилизировали эмульсию как в присутствии, так и в отсутствие PHF в течение по меньшей мере 4 недель. С помощью результатов этого эксперимента удалось создать вторую основную гипотезу этого исследования, а именно, о стимуляции денатурированными ферментами свойств, стабилизирующих эмульсию.
В связи с этим было также было выдвинуто предположение о влиянии прямых взаимодействий фермента с частицами PHF на повышенную функциональность частиц PHF на поверхности раздела м/в. Ферменты являются катализаторами биохимических реакций и должны находиться в физическом контакте со своим субстратом для инициирования гидролиза. Крепление фермента к субстрату обычно опосредовано связывающим углевод доменом, который состоит из нескольких ароматических аминокислотных последовательностей (публикация Levy, Shani, and Shoseyov, 2002 Biomolecular Engineering, 19(1), pp. 17–30, включенная в настоящий документ путем ссылки; публикация Shoseyov, Shani and Levy, 2006 Microbiology and Molecular Biology Reviews, 70(2), pp. 283–295, включенная в настоящий документ путем ссылки). Соединение CBM с субстратом осуществляется посредством водородных связей, гидрофобных, а также слабых электростатических взаимодействий с углеводом, и сильно зависит от укладки белка (публикация Boraston et al, 2004 Biochemical Journal, 382(3), pp. 769–781, включенная в настоящий документ путем ссылки). После денатурации фермент разворачивается и теряет свою третичную (и часто вторичную) структуру. Из-за этого явления появляются гидрофобные группы на поверхности белка (публикация Daniel, Dines and Petach, 1996 Biochemical Journal, 317(1), pp. 1–11, включенная в настоящий документ путем ссылки). Хотя природа взаимодействия PHF-фермент остается неясной, из-за термообработки могли потенциально возникнуть конформационные изменения фермента на поверхности частицы с обеспечением амфифильности поверхности частицы. Это может объяснить более высокую аффинность частиц PHF к поверхности раздела м/в.
Эмульгирующие свойства «не содержащих белка» частиц PHF
Для того чтобы проверить, обусловлена ли стабильность капель в основном инактивированным ферментом, необходимо подтвердить, что модифицированные частицы PHF сами по себе не оказывают какого-либо влияния. Основная трудность такого доказательства состояла в получении обработанных ферментами частиц без присутствия остаточных ферментов.
Таблица 10. Обзор экспериментальных условий для эмульсий, приготовленных с использованием термообработанного BSA
Образец
pH
Время инкубации (ч)
Термообработка
Концентрация белка в водной фазе (мг/мл)
Стабильная?
PHF-пектин+целлюлоза, промытые
5
16
Без термообработки
следы
Нестабильная
PHF-пектин+целлюлоза, не промытые
5
16
Без термообработки
0,51
Нестабильная
Удаление активного растворимого фермента после инкубации путем его промывки цитратно-фосфатным буферным раствором при температуре инкубации (50°C) представляет собой хороший способ предотвращения инактивации фермента после обработки и получения частиц со схожими свойствами. Более того, было доказано, что ферменты в активной форме не обладают эмульгирующими свойствами (таблица 9). Эмульсия не была стабильной ни в одном из случаев (таблица 10). Это подтвердило отсутствие зависимости между адсорбцией мелких частиц PHF на поверхности раздела м/в и наличием инактивированных ферментов.
Альтернативные источники белка для функционализации частиц
Таблица 11. Обзор экспериментальных условий для эмульсий, приготовленных с использованием термообработанного BSA, содержащих и не содержащих PHF
Образец, используемый для стабилизации эмульсии
pH
Время инкубации (ч)
Термообработка
Концентрация белка в водной фаземг/мл
Стабильная
PHF-BSA
5
16
100°C, 10 минут
0,51
Нестабильная
PHF-BSA
7
16
100°C, 10 минут
0,51
Нестабильная
BSA
3
–
100°C, 10 минут
5,14
Стабильная
BSA
5
–
100°C, 10 минут
5,14
Стабильная
PHF-BSA
5
–
100°C, 10 минут
5,14
Нестабильная
BSA
7
–
100°C, 10 минут
5,14
Стабильная
Все белки, даже не обладающие каталитической активностью, как правило, адсорбируются на поверхностях, присутствующих в одной и той же системе (Murray et al., 2011 (см. выше)). Контрольные образцы, содержащие бычий сывороточный альбумин (BSA) в концентрациях белка, эквивалентных концентрациям ферментов, готовили при различных значениях pH для оценки преимуществ инактивированных целлюлозы и пектина по сравнению с другими белками в отношении функционализации частиц PHF в поверхностно-активные стабилизаторы эмульсии.
Контрольные образцы, содержащие BSA, не были стабильными при концентрациях белка, эквивалентных обработанным ферментами образцам (таблица 11). Стабилизацию наблюдали только при концентрациях BSA, в 10 раз превышающих (5,14 мг/мл) концентрации в обработанных ферментами образцах. Кроме того, образцы, полученные с использованием BSA, были чувствительны к изменениям температуры и pH, и это отражалось в появлении видимого осадка после термообработки при pH 5 (фиг. 16A). Появление осадка в эмульсиях, стабилизированных BSA при pH 5, относится к уменьшению электростатического отталкивания между белками вблизи изоэлектрической точки (IEP, pH 5 для BSA), а также к увеличению гидрофобных взаимодействий вследствие термической обработки (публикация Evans, Ratcliffe, Williams, 2013 Current Opinion in Colloid & Interface Science, 18(4), pp. 272–282 (включена в настоящий документ путем ссылки); публикация McClements, 2004 Current Opinion in Colloid & Interface Science, 9(5), pp. 305–313 (включена в настоящий документ путем ссылки), публикация Medda, Monduzzi and Salis, 2015 Chemical Commuications., 51(30), pp. 6663–6666 включена в настоящий документ путем ссылки). Только термообработанный BSA был способен стабилизировать капли, несмотря на переход в нерастворимую форму (фиг. 16B), но в отношении эмульсий, стабилизированных смесями PHF и BSA при pH 5, из-за осаждения в конечном итоге происходила дестабилизация эмульсии через одну неделю (фиг. 16A).
Механизм Пикеринга, наблюдаемый для обработанных ферментами PHF, может быть дополнен предварительным уменьшением размера частиц за счет каталитической активности ферментов, с образованием частиц достаточно малого размера (<30 мкм) для адсорбции на поверхности раздела. Поверхностно-активные частицы Пикеринга не образовывались при совместной инкубации PHF и BSA, главным образом из-за отсутствия снижения размера частиц и, возможно, также из-за низкой аффинности BSA к PHF по сравнению с ферментами. Результаты данного исследования указывают на потенциальную возможность применения аффинности фермента к субстрату в качестве новой стратегии создания пищевых функциональных белково-углеводных комплексов.
Выводы
3.1. Заключение
Обработанные ферментами PHF в виде стабилизаторов эмульсий Пикеринга м/в
Воздействие коммерческих пектиназ и целлюлаз в концентрациях 1169–3682,2 Ед/г PHF выразилось в существенном уменьшении размера частиц (с 87,2 до <30 мкм) и образовании поверхностно-активных участков с возможностью адсорбции частиц на поверхности раздела м/в и действия в роли стабилизаторов эмульсии м/в. Эмульсии м/в (50% об./об. масла) готовили с низкими концентрациями обоих обработанных PHF (0,4% масса/объем) и фермента (0,01% масса/объем), но несмотря на это отстоявшиеся капли масла (10–500 мкм) были устойчивы к коалесценции в широком диапазоне pH (3,0–8,0) в течение по меньшей мере четырех недель.
Без ограничений, накладываемых какой-либо теорией, функциональные свойства этих модифицированных PHF усиливались главным образом за счет изменения исходной формы добавленных ферментов и их взаимодействия с малыми частицами PHF, а не за счет появления гидрофобных полимерных групп на поверхности частицы PHF, как это первоначально предполагалось в данном исследовании. Два интересных наблюдения были сделаны в отношении стабилизирующих свойств обработанных ферментами PHF.
1. Активные в отношении волокон ферменты, присутствующие в дисперсии, становились отличными эмульгаторами после денатурации, что можно объяснить появлением гидрофобных групп на поверхности из-за разворачивания белка.
2. Благодаря взаимодействию между этими ферментами и небольшими расщепленными PHF происходит образование пищевых стабилизаторов эмульсии Пикеринга.
В целом показано, что частицы PHF сами по себе не обладают поверхностной активностью, но функционализированные частицы PHF в комплексе с денатурированными ферментами обладают поверхностной активностью и выступают в качестве частиц Пикеринга. Функционализированные частицы PHF могут формировать комплексы фермент-PHF, которые выступают в качестве частиц Пикеринга. Ферменты могут все еще быть прикрепленными к поверхности PHF и выступать в качестве белкового структурного компонента, закрепляющего частицу на поверхности раздела «масло/вода».
Способ изготовления поверхностно-активных частиц посредством взаимодействия частицы-белок не может быть использован для других белков, таких как BSA, при заданных условиях.
Пример 2. Растительные волокна с низким содержанием целлюлозы
Испытывали различные растительные волокна, а именно волокна кожуры гороха (PHF), богатые пектином яблочные волокна, не содержащие целлюлозы пшеничные волокна.
Те же ферменты (Pectinex и Celluclast) и другие ферменты (протеаза [Alcalase от компании Sigma-Aldrich — в настоящее время Merck], α-амилаза [Mats L Classic от компании DSM] и ксиланаза) проверяли на способность функционализировать эти волоконные частицы и на способность обработанных ферментами волоконных частиц стабилизировать масляные капли эмульсии.
Условия инкубации: 10% TS, pH 5, 50°C, 16 ч, доза фермента: 51,4 мг белка / г волокна. Температура и рН соответствуют оптимальным условиям для всех ферментов. Инактивация фермента: кипячение в течение 10 мин.
«Устойчивость эмульсии»: 1 мл обработанных ферментами волокон (10 мас.%, в буфере с pH 5, если не указано иное) добавляют к 10 мл водной фазы, pH 5, эмульсий 50% м/в. Эмульсию встряхивали вручную в течение 10 секунд. Устойчивость оценивали по устойчивости больших отстоявшихся капель масла к коалесценции в течение 9 недель.
Результаты
Стандартный образец. Эмульсии 50% об./об. м/в, содержащие 0,4% (масса/объем) волокон кожуры гороха (PHF), обработанных Pectinex и Celluclast (пектин+целлюлоза)
PHF, обработанные не расщепляющими волокна ферментами
Эмульсии, содержащие 0,4% (масса/объем) PHF, обработанные не расщепляющими волокна ферментами (Alcalase 2.4 L, MATS L CLASSIC (DSM)) или только инактивированные ферменты были нестабильными (фиг. 21). Однако поверхностная активность только ферментов после термообработки является ключевым требованием для выполнения функционализации, независимо от основной активности фермента.
Яблочные волокна, обработанные Pectinex и Celluclast
Эмульсии, содержащие 0,4% (масса/объем) яблочных волокон, обработанных Pectinex и Celluclast (AF-пектин+целлюлоза), были нестабильными (фиг. 22A и фиг. 23A). Однако все контроли [только инактивированный фермент (фиг. 23B), яблочные волокна (AF) с инактивированными ферментами (фиг. 23C) или только AF (фиг. 3D)] были стабильными, что указывает на взаимодействие определенных соединений, присутствующих в AF, с активными ферментами и изменение их функциональности во время инкубации.
Стабилизирующий эффект в образцах, содержащих только AF, был, предположительно, обусловлен растворимой фракцией пектина в AF. Отсутствие стабилизирующего эффекта в обработанных образцах было связано с разрушением пектинов под воздействием пектиназ.
Дополнительный анализ показал, что стабилизирующий агент расположен в нерастворимой фазе (фиг. 22C) гидратированных AF и что он также является нерастворимой фазой, которая содержит влияющие на функциональность соединения (фиг. 22E). Термообработка (кипячение, 15 минут) AF перед ферментативной реакцией для инактивации потенциальных нативных протеаз в AF не изменяла результат.
Растворимая фаза дисперсий AF не стабилизировала эмульсии (фиг. 22B), но при обработке комплексом пектин+целлюлоза наблюдали некоторые стабильные капли (фиг. 22D), что можно объяснить наличием денатурированных, поверхностно-активных комплексов пектин+целлюлоза.
Пшеничные волокна, обработанные Depol 740 L
Эмульсии, содержащие 0,4% (масса/объем) пшеничных волокон (WF), обработанных ферулоилэстеразой, а именно Depol 740 L (D740 L) (бета-глюканаза с ферулоилэстеразной и ксиланазной побочными активностями, продаваемая компанией Biocatalysts, Великобритания), были нестабильными (фиг. 24B), при этом контроли с инактивированным D740 L были стабильными (фиг. 24A). Как было отмечено ранее для AF-пектин+целлюлоза, определенные соединения в WF, по-видимому, ингибируют поверхностную активность D740 L. Однако, когда D740 L заменяли ферментами пектин+целлюлоза, этот ингибирующий эффект отсутствовал (фиг. 24C), что указывает на то, что ингибирование является специфичным в отношении фермента/субстрата.
Волокна кожуры гороха, обработанные комплексом пектин+целлюлоза, регулировка pH перед термообработкой
Дополнительный эксперимент проводили с использованием PHF и комплекса пектин+целлюлоза, в котором pH доводили до 2,0 или 11,0 перед термообработкой (HT), чтобы понять, изменяет ли это взаимодействие фермент-частица и могут ли такие частицы по-прежнему стабилизировать масляные капли.
Независимо от pH перед HT, получали стабильные масляные капли. Для дисперсий PHF, доведенных до pH 11,0, поверхностной активности достигали без термообработки, вероятнее всего из-за индуцированной рН денатурации. Это не относилось к образцам, доведенным до pH 2,0 перед HT.
Выводы
- Способ функционализации комплекса PHF-пектин+целлюлоза не работал с яблочными волокнами (волокна с высоким содержанием пектина) или пшеничными волокнами (волокна с низким содержанием целлюлозы или не содержащие целлюлозу) или с ферментами, которые не были способны расщеплять пищевое волокно.
Пример 3. Кухонные прототипы. Жидкие забеливатели для кофе и органолептические испытания
Предварительные органолептические испытания показали хорошее восприятие жидких забеливателей для кофе, приготовленных с обработанным ферментом PHF в качестве альтернативных эмульгаторов для казеината натрия.
Обработанные ферментами PHF (PHF-пектин+целлюлоза) тестировали в выбранном прототипе продукта. Жидкие забеливатели для кофе выбирали в качестве модельной системы для оценки потенциала обработанных ферментами (функционализированных) волокон кожуры гороха (и денатурированного фермента) в качестве стабилизаторов эмульсии и сравнивали их стабилизирующие характеристики с традиционным эмульгатором казеинатом натрия. Упрощенная рецептура для экспериментального жидкого забеливателя показана в таблице 12.
Предварительные испытания выполняли путем приготовления эмульсий с постоянным количеством обработанного PHF (0,5 мл на 10 мл эмульсии) и различным соотношением масла и воды. Эмульсии смешивали с помощью Ultra-turax при двух разных скоростях сдвига (13 000 и 22 000 1/мин). Эмульсию дестабилизировали в двухслойной системе, причем высота слоя сливок прямо пропорциональна объемной доле масла. В связи с проведением стадии гомогенизации при более высоких скоростях сдвига размер капель существенно уменьшился по сравнению с ранее приготовленными эмульсиями 50% м/в, полученными путем ручного встряхивания, как показано на фиг. 17. Размер капель по-прежнему находился в диапазоне 50 мкм. Считается, что эти относительно большие масляные капли способны усиливать вкус / улучшать покрытие полости рта (фиг. 18).
Затем в экспериментальной кухне получали пять различных составов путем частичного или полного замещения казеината натрия в жидких забеливателях, который представляет собой основной эмульгатор, используемый в настоящее время, с различными концентрациями PHF (таблица 12).
Таблица 12. Составы прототипов жидких забеливателей и стандартного образца
Код
A
B
C
D
E
F
Образец
Стандартный образец
Контроль
100% замена казеината, 0,1 г PHF<sup>a</sup> / г масла
100% замена казеината, 1 г PHF<sup>a</sup> / г масла
100% замена казеината, 7,3 г PHF<sup>a</sup> / г масла
50% замена казеината, 1 г PHF<sup>a</sup> / г масла
Сахар (г)
30
30
30
30
30
30
Масло (г)
8,4
8,4
8,4
8,4
8,4
8,4
Казеинат натрия (г)
0,9
0,9
0
0
0
0,45
Гидрофосфат калия (г)
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
PHF (г)
0
0
0,84
8,4
61,2
4,2
Вода (г)
60,3
60,3
60,36
52,8
0
56,55
Всего (г)
100
100
100
100
100
100
a
В данном случае PHF относится к комплексу PHF-пектин+целлюлоза
8 дегустаторам было предложено провести органолептическую оценку для получения информации о устойчивости, вкусе, ощущении во рту и внешнем виде жидких забеливателей, стабилизированных обработанным ферментами PHF в соответствии с настоящим изобретением по сравнению со стандартным образцом. Дегустаторам было предложено пять различных опытных образцов и один контрольный, который и в этом случае являлся стандартным образцом для оценивания достоверности этого испытания.
Изображения забеливателей представлены на фиг. 19. Благодаря замене казеината натрия волокном кожуры гороха получали слегка бежевый цвет. Во всех образцах наблюдали образование сливок, которое было наиболее выраженным в образцах C и D. Смесь PHF и казеината натрия 50 : 50 скрывала все неблагоприятные влияния на внешний вид.
То же справедливо и для образцов, приготовленных с кофе и забеливателем (фиг. 20).
Согласно комментариям дегустаторов было выявлено общее хорошее органолептическое восприятие жидких забеливателей, приготовленных с использованием PHF, по сравнению со стандартным образцом.
Главными преимуществами жидких забеливателей, стабилизированных PHF, было бы замещение традиционных эмульгаторов волокнами в качестве альтернативы, подходящей под определение «чистой этикетки». Функциональное преимущество заключается в предположительном наличии капель масла большего размера, благодаря которому будет лучшее ощущение во рту. Другим преимуществом является неполное покрытие поверхности, которое способствует увеличению переноса массы между масляной и водной фазой и способно захватывать агрессивные липофильные ароматические соединения (например, в кофе).
Пример 4. Технические испытания «раствора кожуры гороха»
Испытания в масштабе кухни проводили на шоколадном муссе, чтобы увидеть, в какой степени обработанные PHF могут обеспечивать частичную/полную замену искусственных эмульгаторов и/или желатина.
Стандарт-ная рецептура
Свежее молоко, 36,1 г жира /л
63,50
0,635
Сливки, жирность 30–32%
8,75
0,088
Жидкий молочный шоколад (включая подсолнечный лецитин)
7,00
0,070
Кристаллический сахар
11,40
0,114
Сухое обезжиренное молоко среднего нагрева
2,00
0,020
Коровий желатин с прочностью студня по Блюму, равной 150
1,05
0,011
Эфир молочной кислоты (Lactem PQ 22-K)
0,50
0,005
Карамель
1,00
0,010
Какао-порошок (масло какао 10–12%)
3,10
0,031
Какао-порошок (масло какао 20–22%)
1,70
0,017
Обработанная кожура гороха
0,00
0,000
Конечный продукт (%)
100
1,000
Рецептура 1
Свежее молоко, 36,1 г жира /л
64,15
0,642
Сливки, жирность 30–32%
9,25
0,093
Жидкий молочный шоколад (включая подсолнечный лецитин)
7,00
0,070
Кристаллический сахар
11,40
0,114
Сухое обезжиренное молоко среднего нагрева
2,00
0,020
Коровий желатин с прочностью студня по Блюму, равной 150
0,00
0,000
Эфир молочной кислоты (Lactem PQ 22-K)
0,00
0,000
Карамель
1,00
0,010
Какао-порошок (масло какао 10–12%)
3,10
0,031
Какао-порошок (масло какао 20–22%)
1,70
0,017
Обработанная кожура гороха
0,40
0,004
Конечный продукт (%)
100
1,000
Рецептура 2
Свежее молоко, 36,1 г жира /л
64,15
0,642
Сливки, жирность 30–32%
8,75
0,088
Жидкий молочный шоколад (включая подсолнечный лецитин)
7,00
0,070
Кристаллический сахар
11,40
0,114
Сухое обезжиренное молоко среднего нагрева
2,00
0,020
Коровий желатин с прочностью студня по Блюму, равной 150
0,00
0,000
Эфир молочной кислоты (Lactem PQ 22-K)
0,50
0,005
Карамель
1,00
0,010
Какао-порошок (масло какао 10–12%)
3,10
0,031
Какао-порошок (масло какао 20–22%)
1,70
0,017
Обработанная кожура гороха
0,40
0,004
Конечный продукт (%)
100
1,000
Рецептура 3
Свежее молоко, 36,1 г жира /л
63,95
0,640
Сливки, жирность 30–32%
8,95
0,090
Жидкий молочный шоколад (включая подсолнечный лецитин)
7,00
0,070
Кристаллический сахар
11,40
0,114
Сухое обезжиренное молоко среднего нагрева
2,00
0,020
Коровий желатин с прочностью студня по Блюму, равной 150
0,50
0,005
Эфир молочной кислоты (Lactem PQ 22-K)
0,00
0,000
Карамель
1,00
0,010
Какао-порошок (масло какао 10–12%)
3,10
0,031
Какао-порошок (масло какао 20–22%)
1,70
0,017
Обработанная кожура гороха
0,40
0,004
Конечный продукт (%)
100
1,000
Рецептура 4
Свежее молоко, 36,1 г жира /л
63,50
0,635
Сливки, жирность 30–32%
8,75
0,088
Жидкий молочный шоколад (включая подсолнечный лецитин)
7,00
0,070
Кристаллический сахар
11,40
0,114
Сухое обезжиренное молоко среднего нагрева
2,15
0,022
Коровий желатин с прочностью студня по Блюму, равной 150
0,50
0,005
Эфир молочной кислоты (Lactem PQ 22-K)
0,50
0,005
Карамель
1,00
0,010
Какао-порошок (масло какао 10–12%)
3,10
0,031
Какао-порошок (масло какао 20–22%)
1,70
0,017
Обработанная кожура гороха
0,40
0,004
Конечный продукт (%)
100
1,000
Рецептура 5
Свежее молоко, 36,1 г жира /л
63,50
0,635
Сливки, жирность 30–32%
8,85
0,089
Жидкий молочный шоколад (включая подсолнечный лецитин)
7,00
0,070
Кристаллический сахар
11,40
0,114
Сухое обезжиренное молоко среднего нагрева
2,00
0,020
Коровий желатин с прочностью студня по Блюму, равной 150
1,05
0,011
Эфир молочной кислоты (Lactem PQ 22-K)
0,00
0,000
Карамель
1,00
0,010
Какао-порошок (масло какао 10–12%)
3,10
0,031
Какао-порошок (масло какао 20–22%)
1,70
0,017
Обработанная кожура гороха
0,40
0,004
Конечный продукт (%)
100
1,000
Рецептура 6
Свежее молоко, 36,1 г жира /л
63,50
0,635
Сливки, жирность 30–32%
9,25
0,093
Жидкий молочный шоколад (включая подсолнечный лецитин)
7,00
0,070
Кристаллический сахар
11,40
0,114
Сухое обезжиренное молоко среднего нагрева
3,05
0,031
Коровий желатин с прочностью студня по Блюму, равной 150
0,00
0,000
Эфир молочной кислоты (Lactem PQ 22-K)
0,00
0,000
Карамель
1,00
0,010
Какао-порошок (масло какао 10–12%)
3,10
0,031
Какао-порошок (масло какао 20–22%)
1,70
0,017
Обработанная кожура гороха
0,00
0,000
Конечный продукт (%)
100
1,000
OR (%)
pH
Способ
Масса / чашка
Комментарии
Рецептура 1
62
6,61
15 мин /2-я скорость
60 г
Слабое взбивание, небольшое схлопывание мусса. Взбитость видна только на поверхностиТемный цвет. Не очень стабильна
Рецептура 2
202
6,60
15 мин /2-я скорость
40 г
Жидкая текстура перед взбиванием при 4°CБыстрое взбивание. Аэрированная текстура. Не очень стабильнаНезначительное схлопывание во время дозирования. Отсутствуют пузырьки. Быстро принимает форму чашки.Светлый цвет
Рецептура 3
61
6,58
15 мин /2-я скорость
60 г
Жидкая текстураСложно взбивается. Взбивание начинается через 10 минут.Отсутствие устойчивости и отсутствие когезии ингредиентовВсплытие пузырьков воздуха при дозированииТемный цвет
Рецептура 4
232
6,55
15 мин /2-я скорость
40 г
Характер взбивания аналогичен рецептуре № 2Быстрое взбиваниеБолее твердая текстура по сравнению с рецептурой № 2 — небольшой фигурный купол при дозированииНебольшое схлопывание муссаСветлый цвет (цвет мусса из молочного шоколада)
Рецептура 5
68
6,54
15 мин /2-я скорость
60 г
Твердая текстура перед взбиванием (при извлечении из холодильника)Сложно взбивается. Схлопнувшийся мусс. Очень темный цвет.
Рецептура 6
68
6,52
15 мин / 2-я скорость
60 г
Отсутствие взбиванияОчень жидкая текстура перед взбиваниемТекстура мусса только на поверхности. Жидкая текстура на дне чашки.
OR = значения взбитости
Изображения рецептур 1–6 шоколадного мусса в течение срока годности показаны сверху после удаления ложки мусса (фиг. 26) и спереди (фиг. 27).
Все публикации, указанные в описании выше, включены в настоящий документ путем ссылки. Специалистам в данной области будут очевидны различные модификации и вариации описанных способов и системы настоящего изобретения, без выхода за рамки сущности и объема настоящего изобретения. Хотя настоящее изобретение описано в связи с конкретными предпочтительными вариантами осуществления, следует понимать, что заявленное изобретение не должно излишне ограничиваться такими конкретными вариантами осуществления. Фактически подразумевается, что в объем приведенной ниже формулы изобретения входят различные модификации описанных способов реализации изобретения, которые очевидны для специалистов в области биохимии и биотехнологии или родственных областях.