СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАЗЫ ВЕГЕТАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ ГОРЦА ПТИЧЬЕГО, ГОРЦА ПЕРЕЧНОГО И ГОРЦА ПОЧЕЧУЙНОГО ПО МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЕ С ПОМОЩЬЮ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ
METHOD FOR DETERMINING VEGETATION PHASE OF MEDICINAL PLANT RAW MATERIAL OF KNOTWEED, WATER PEPPER AND LADY'S THUMB BY MALATE DEHYDROGENASE BY MEANS OF ELECTROPHORESIS IN POLYACRYLAMIDE GEL

Изобретение относится к области фармации и может быть использовано для определения фазы цветения лекарственного сырья, в частности горца птичьего, горца перечного и горца почечуйного.
В настоящее время, в соответствии с действующей нормативной документацией, лекарственное растительное сырье горца птичьего (ГФ XI, ст.56), горца перечного (ГФ XI, ст.57) и горца почечуйного (ГФ XI, ст.58) должно собираться в фазу цветения.
Однако способы определения фазы цветения нормативно-технической документацией не предусмотрены. Имеющийся раздел «Внешние признаки» в фармакопейных статьях на горцы предусматривает определение и доказательство самого вида растения, нежели нужной фазы вегетации (цветения).
Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ изучения динамики фракционного состава белков и активности МФ малатдегидрогеназы в сырье душицы обыкновенной, чабреца, монарды дудчатой методом электрофореза в 7,5% полиакриламидном геле. Гелевые пластинки окрашивали раствором амидочерного В. Выявление МФ ферментов проводили феназинметасульфаттетразолиевой реакцией. Количественный анализ электрофореграмм проводили на денситометре «ДенСкан» (Мащенко З.Е. автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук, Пермь, 2004 г., стр. 17-20).
Недостатком известного метода является то, что он не предназначен для определения фазы цветения горца птичьего, горца перечного и горца почечуйного.
Оптимальной фазой для заготовки сырья является именно стадия цветения, так как именно в этот период сырье горца птичьего, горца перечного и горца почечуйного содержит наибольше количество действующих фармакологически активных соединений (флавоноидов).
Если лекарственное растительное сырье будет собрано на более ранней стадии вегетации (бутонизация и ранее) или более поздней (плодоношение и позже), то сырье не будет содержать необходимого количества биологически активных соединений, определяющих фармакологическую активность самого сырья и препаратов на его основе.
Таким образом, объективный способ определения фазы цветения горца птичьего, горца перечного и горца почечуйного позволит повысить качество собираемого лекарственного растительного сырья и препаратов на его основе.
Задачей изобретения является создание объективного способа определения фазы цветения горца птичьего, горца перечного и горца почечуйного.
В качестве маркера для определения фазы вегетации использована малатдегидрогеназа (МДГ). Малатдегидрогеназа (L-малат: NAD-оксидоредуктаза, 1.1.1.37, МДГ, malate dehydrogenase) - ключевой фермент цикла трикарбоновых кислот, катализирующий обратимую реакцию окисления малата (яблочной кислоты) в оксалоацетат (щавелево-уксусную кислоту). МДГ представляет собой мультифункциональный фермент. Он имеет практически универсальное распространение среди живых организмов, встречается в клетках дрожжей, подавляющего большинства представителей бактерий, а также в тканях всех животных и растений. У многих организмов он является димером.
МДГ представлена в клетках различных организмов в виде множественных молекулярных форм, число которых варьирует в зависимости от групповой принадлежности живых существ, от их образа жизни и от сложности метаболизма.
Для растений обнаруживаются следующие характеристики изоферментного спектра МДГ: генетический полиморфизм, изменчивость, видовая и тканевая специфичность. Соотношения между изоферментами МДГ в тканях и клетках организма изменяются в зависимости от этапа его онтогенетического развития и от физиологического состояния. При изучении изоферментного спектра МДГ из свеклы было установлено существовании раннего полиморфизма фермента и о появлении на первых стадиях онтогенеза растений молекулярных форм, не характерных для других этапов их развития.
Число изоферментов МДГ в щитке также падает на более поздних этапах развития кукурузы до четырех молекулярных форм. Возрастные изменения изоферментного состава малатдегидрогеназной системы были обнаружены при исследовании животного и растительного фермента, а также энзима микроорганизмов.
Данные электрофоретического анализа показывают, что изоферментные спектры МДГ из органов разных растений (кукурузы, клещевины, клевера и сои) непостоянны и могут изменяться в зависимости от возраста, от этапов онтогенеза и от физиологического состояния организма. Изменения в изоферментном спектре МДГ этих растений связаны либо с появлением и синтезом дополнительных молекулярных форм фермента, либо с их репрессией (ингибированием) в ходе развития организма.
Рядом исследователей подтверждено наличие видовой специфичности изоферментного спектра МДГ высших растений. Эти свойства изоферментного спектра МДГ позволяют использовать ее как маркерный белок для ведения селекционных работ или как биохимический признак для классификации видов и создания новых естественных таксономических групп.
Исходя из этого, информация о структурной организации и динамике относительной активности МФ МДГ - одного из ключевых ферментов цикла Кребса - может быть использована для идентификации ЛРС по фазам вегетации.
Сущность изобретения заключается в том, что в качестве объектов исследования на молекулярном уровне выбрана малатдегидрогеназа лекарственных растений горца птичьего, горца перечного и горца почечуйного, которая определяется в приготовленном сырье с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.
Предлагаемый способ реализуется следующим образом.
Образцы свежего растительного сырья были собраны в разные периоды вегетации: бутонизация, цветение, плодоношение.
Для получения извлечения из 1,0 г (точная навеска) свежего лекарственного растительного сырья использовали 10,0 мл 1/15 М фосфатного буфера рН 7,2.
Свежее растительное сырье дезинтегрировали в фарфоровой ступке с 5,0 мл охлажденного до 4°С 1/15 М фосфатного буфера рН 7,2 в течение 5 мин.
Далее дезинтеграт количественно переносили в колбу, добавляли 5,0 мл 1/15 М фосфатного буфера рН 7,2 и 10 капель тритона Х-100 в конечной концентрации 20 мг/мл. Колбу помещали на магнитную мешалку для солюбилизации фермента на 1 час.
Гомогенат из колбы количественно переносили в центрифужную пробирку, центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 мин.
Полученный супернатант помещали в пробирку с пробкой и хранили в замороженном виде не более 6 суток.
В супернатанте определяли молекулярные формы малатдегидрогеназы.
Для выполнения исследований использован электрофоретический метод анализа. Все использованные в эксперименте реактивы были марки «ХЧ» и «ЧДА». Навески веществ отвешивали с помощь весов ВЛТ-150-П.
Исходные растворы для электрофореза готовили по прописям, предложенным для электрофореза в щелочной системе. Для приготовления геля использовали акриламид и метиленбисакриламид фирмы "Sigma". Перед употреблением проводили перекристаллизацию указанных компонентов с целью удаления акриловой кислоты. Заранее приготовленные и хранимые в холодильнике реактивы перед работой выдерживали некоторое время при комнатной температуре. Для электрофореза готовили 7,5% полиакриламидный гель. Полученный раствор разделяющего геля заливали в кюветы прибора, далее шприцом на поверхность наслаивали холодную воду. Окончание полимеризации фиксировали по образованию хорошо видимой границе раздела между гелем и наслоенной водой. После удаления воды на поверхность мелкопористого геля наслаивали раствор крупнопористого геля, на который осторожно наносили охлажденный верхний электродный буфер. Фотополимеризацию крупнопористого геля проводили с помощью ультрафиолетовой лампы. Окончание полимеризации крупнопористого концентрирующего геля устанавливали по образованию четко видимой границы между гелем и наслоенным буферным раствором.
После окончания полимеризации гелей камеры заливали верхним и нижним буферными растворами. В качестве электродного буфера использовали 1 М трис-ЭДТА-боратный буфер рН 9,2.
Анализируемые образцы супернатанта непосредственно перед началом электрофореза смешивали с 40% раствором сахарозы в соотношении 2:1 и 0,5 мл полученной смеси наносили на линию старта.
Режим электрофореза подбирали опытным путем в предварительных экспериментах. Первые 30 мин электрофорез проводили при силе тока 5,0 мА/см, затем 10,0 мА/см до окончания электрофореза. О времени окончания процедуры электрофореза судили по положению диска красителя бромфенолового синего.
По окончании электрофореза буферные растворы сливали, гели из кювет извлекали путем введения шприцем дистиллированной воды между поверхностью геля и стенкой кюветы.
Выявление на пластинках геля молекулярных форм малатдегидрогеназы проводили феназинметасульфат-тетразолиевой реакцией в чашках Петри.
В заявленном изобретении использовалась оптимизированная инкубационная среда: водные растворы NAD (1 мг/мл) - 40 мл, нитросиний тетразолиевый (1 мг/мл) - 30 мл, 1 М раствор малата натрия (рН=7,0) - 10 мл, феназинметасульфат (1 мг/мл) - 4 мл, 0,2 М трис-HCl буферный раствор (рН=7,1)-до 100 мл.
Гелевые пластины инкубировали 12 ч при 37°С. Молекулярные формы МДГ выявлялись в виде темно-синих полос.
Рассчитывали величину относительной электрофоретической подвижности молекулярных форм малатдегидрогеназы как отношение пройденного при электрофорезе веществом пути к длине гелевой пластины с использованием компьютерной программы TLC Manager. В работе использован прибор: камера для вертикального электрофореза VE-10 (производитель «Хеликон»).
Полученные экспериментальные данные были статистически обработаны с использованием методов проверки статистических гипотез.
Были определены молекулярные формы малатдегидрогеназы (МДГ), рассчитаны относительная электрофоретическая подвижность (ОЭП) обнаруженных форм МДГ для лекарственного растительного сырья горца птичьего, горца перечного и горца почечуйного на следующих фазах вегетации: бутонизация, цветение, плодоношение.
Результаты были представлены в виде таблицы:
ОЭП (относительная электрофоретическая подвижность) фермента малатдегидрогеназы - это качественная характеристика, специфичная и характерная для конкретного вида сырья при проведении электрофореза в определенных, описанных выше условиях.
В предлагаемом способе определение фазы вегетации горцев проводится по физиологическим маркерам - молекулярным формам фермента малатдегидрогеназы. Количество молекулярных форм и их значения ОЭП являются качественными характеристиками, присущими конкретным видам сырья при определенных условиях электрофореза.
Результаты исследований позволили выделить именно фазу цветения, как оптимальную и регламентируемую для сборки сырья. Выделяют 3 основные молекулярные формы (МФ) малатдегидрогеназы:
- Малатдегидрогеназа - 1 (МДГ-1);
- Малатдегидрогеназа - 2 (МДГ-2);
- Малатдегидрогеназа - 3 (МДГ-3).
Отличаются три МФ МДГ по молекулярной массе и по тому, в каких процессах участвуют в жизнедеятельности растения. Как видно из приведенной таблицы, в сырье горцев может обнаруживаться как одна (любая) МФ МДГ, так и сразу все три МФ МДГ. Количество МФ МДГ зависит от фазы вегетации растений и его физиологического состояния.
МДГ-1 обнаружение возможно, начиная с ранних стадий развития растений, до цветения на стадии бутонизации. И свидетельствует о том, что происходит активный рост растения, накопление массы самого растения и биосинтез биологически активных веществ.
МДГ-2 обнаружение возможно на разных стадиях вегетации, в большей степени свидетельствует о стабилизации обменных процессов в растении.
МДГ-3 обнаружение возможно преимущественно после периода цветения растений до его отмирания, так как в этот период преобладают окислительные процессы в растительном организме и происходит увядание растения.
Молекулярные формы МДГ в результате проведения электрофореза обнаруживаются в виде темно-синих полос на гелевых пластинках (электрофореграммах).
ОЭП (относительная электрофоретическая подвижность) - величина относительная. Показывает, где именно находится обнаруженная фракция МДГ. Рассчитывается ОЭП как отношение расстояния пройденного МФ МДГ от начала гелевой пластинки до точки окончания электрофореза. Значение ОЭП всегда будет меньше 1,0.
Отличительными особенностями, по которым можно диагностировать фазу вегетации растения, является совокупность признаков, а именно:
- Значение ОЭП для конкретной МФ МДГ;
- Количество определяемых МФ МДГ в растении в определенную фазу вегетации.
Для горца птичьего
- На стадии бутонизации обнаруживается одна МФ МДГ-1 со значением ОЭП 0,83±0,02;
- На стадии цветения одна МФ МДГ-1 со значением ОЭП 0,50±0,02;
- На стадии плодоношения обнаруживаются две МФ МДГ: МДГ 1 с ОЭП 0,65±0,02 и МДГ-2 с ОЭП 0,45±0,01;
Для горца перечного
- На стадии бутонизации обнаруживается две МФ МДГ: МДГ 1 с ОЭП 0,63±0,02 и МДГ 2 с ОЭП 0,42±0,02;
- На стадии цветения обнаруживается только МДГ 1 с ОЭП 0,60±0,02;
- На стадии плодоношения обнаруживаются все три МФ МДГ: МДГ 1 с ОЭП 0,64±0,02, МДГ 2 с ОЭП 0,44±0,02 и МДГ 3 с ОЭП 0,12±0,01.
Для горца почечуйного
- На стадии бутонизации обнаруживается одна МФ МДГ: МДГ 1 с ОЭП 0,63±0,02;
- На стадии цветения обнаруживается только МДГ 1 с ОЭП 0,76±0,02;
- На стадии плодоношения обнаруживаются все три МФ МДГ: МДГ 1 с ОЭП 0,64±0,02, МДГ 2 с ОЭП 0,42±0,02 и МДГ 3 с ОЭП 0,10±0,01.
Таким образом, сделать вывод о том, в какой фазе находится растение, например, горца перечного, мы можем после проведения электрофореза в 7,5% полиакриламидном геле и выявления МДГ, если на электрофореграмме обнаруживается одна форма МДГ 1 с ОЭП 0,60±0,02, то это означает, что растение находится в фазе цветения.
Изобретение создает объективный способ определения фазы цветения горца птичьего, горца перечного и горца почечуйного, что позволит повысить качество препаратов, изготовленных из сырья лекарственных растений.