ДИАГНОСТИКА НА ОСНОВЕ ЭФФЕКТОРНОЙ СИСТЕМЫ CRISPR

1. Система обнаружения нуклеиновой кислоты, включающая:
детектирующую систему CRISPR, содержащую эффекторный белок и одну или более направляющих РНК, сконструированных с возможностью связывать целевые молекулы; и
аптамер нуклеиновой кислоты, содержащий квадруплекс, обладающий ферментативной активностью.
2. Система по п. 1, в которой ферментативная активность представляет собой пероксидазную активность.
3. Система по п. 1 или 2, дополнительно содержащая реагенты для амплификации нуклеиновых кислот.
4. Система по п. 1, в которой целевой молекулой является целевая ДНК, и система дополнительно содержит праймер, который связывает целевую ДНК и содержит промотор РНК-полимеразы.
5. Система по любому из пп. 1-4, в которой эффекторный белок системы CRISPR представляет собой РНК-нацеленный эффекторный белок.
6. Система по п. 5, в которой РНК-нацеленный эффекторный белок содержит один или более доменов HEPN.
7. Система по п. 6, в которой один или более доменов HEPN содержат последовательность мотива RxxxxH.
1
2
3
8. Система по п. 7, в которой мотив RxxxH содержит последовательность R[N/H/K]XXXH.
9. Система по п. 8, в которой X1 представляет собой R, S, D, E, Q, N, G или Y, и X2 независимо представляет собой I, S, T, V или L, и X3 независимо представляет собой L, F, N, Y, V, I, S, D, E или A.
10. Система по любому из пп. 1-9, в которой РНК-нацеленный эффекторный белок CRISPR представляет собой C2c2.
11. Система по п. 6, в которой РНК-нацеленный эффекторный белок CRISPR представляет собой C2c2.
12. Система по п. 11, в которой C2c2 находится в пределах 20 т. п. о. гена Cas 1.
13. Система по п. 12, в которой эффекторный белок C2c2 получен из организма рода, выбранного из группы, состоящей из: Leptotrichia, Listeria, Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Flaviivola, Flavobacterium, Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor, Mycoplasma, Campylobacter, и Lachnospira.
14. Система по п. 13, в которой эффекторный белок C2c2 или Cas13b получен из организма, выбранного из группы, состоящей из: Leptotrichia shahii; Leptotrichia wadei (Lw2); Listeria seeligeri; бактерии Lachnospiraceae MA2020; бактерии Lachnospiraceae NK4A179; [Clostridium] aminophilum DSM 10710; Carnobacterium gallinarum DSM 4847; Carnobacterium gallinarum DSM 4847 (второй локус CRISPR); Paludibacter propionicigenes WB4; Listeria weihenstephanensis FSL R9-0317; бактерии Listeriaceae FSL M6-0635; Leptotrichia wadei F0279; Rhodobacter capsulatus SB 1003; Rhodobacter capsulatus R121; Rhodobacter capsulatus DE442; Leptotrichia buccalis C-1013-b; Herbinix hemicellulosilytica; [Eubacterium] rectale; бактерии Eubacteriaceae CHKCI004; вид Blautia Marseille-P2398; вид Leptotrichia пероральный таксон шт. 879. F0557; бактерии Lachnospiraceae NK4A144; Chloroflexus aggregans; Demequina aurantiaca; вид Thalassospira TSL5-1; вид Pseudobutyrivibrio OR37; вид Butyrivibrio YAB3001; вид Blautia Marseille-P2398; вид Leptotrichia Marseille-P3007; Bacteroides ihuae; бактерии Porphyromonadaceae KH3CP3RA; Listeria riparia; и Insolitispirillum peregrinum.
15. Система по п. 14, в которой эффекторный белок C2c2 представляет собой эффекторный белок C2c2 L. wadei F0279 или L. wadei F0279 (Lw2).
16. Система по любому из пп. 1-15, в которой аптамер РНК распознает охратоксин A (OTA).
17. Система по любому из пп. 1-16, в которой одна или более направляющих РНК, сконструированных с возможностью связывания с соответствующими целевыми молекулами, содержат (синтетическое) несовпадение.
18. Система по п. 17, в которой указанное несовпадение расположено выше или ниже по ходу транскрипции относительно ОНП или другой однонуклеотидной вариации в указанной целевой молекуле.
19. Система по любому из пп. 1-18, в которой одна или более направляющих РНК сконструированы для обнаружения однонуклеотидного полиморфизма в целевой РНК или целевой ДНК, или варианта сплайсинга РНК-транскрипта.
20. Система по любому из пп. 1-19, в которой одна или более направляющих РНК сконструированы для связывания с одной или более целевыми молекулами, которые являются диагностическими в отношении болезненного состояния.
21. Система по п. 20, в которой болезненное состояние представляет собой онкологическое заболевание.
22. Система по п. 21, в которой болезненное состояние представляет собой аутоиммунное заболевание.
23. Система по п. 20, в которой болезненное состояние представляет собой инфекцию.
24. Система по п. 23, в которой инфекция вызвана вирусом, бактерией, грибком, простейшим организмом или паразитом.
25. Система по п. 24, в которой инфекция является вирусной инфекцией.
26. Система по п. 25, в которой вирусная инфекция вызвана ДНК-вирусом.
27. Система по п. 26, в которой ДНК-вирус представляет собой Myoviridae, Podoviridae, Siphoviridae, Alloherpesviridae, Herpesviridae (включая вирус герпеса человека и вирус ветряной оспы), Malocoherpesviridae, Lipothrixviridae, Rudiviridae, Adenoviridae, Ampullaviridae, Ascoviridae, Asfarviridae (включая вирус африканской чумы свиней), Baculoviridae, Cicaudaviridae, Clavaviridae, Corticoviridae, Fuselloviridae, Globuloviridae, Guttaviridae, Hytrosaviridae, Iridoviridae, Maseilleviridae, Mimiviridae, Nudiviridae, Nimaviridae, Pandoraviridae, Papillomaviridae, Phycodnaviridae, Plasmaviridae, Polydnaviruses, Polyomaviridae (включая вирус обезьян 40, вирус JC, вирус BK), Poxviridae (включая коровью оспу и черную оспу), Sphaerolipoviridae, Tectiviridae, Turriviridae, Dinodnavirus, Salterprovirus или Rhizidovirus.
28. Система по п. 25, в которой вирусная инфекция вызвана вирусом, содержащим двухцепочечную РНК, вирусом, содержащим положительно-полярную РНК, вирусом, содержащим отрицательно-полярную РНК, ретровирусом или их комбинацией.
29. Система по п. 28, в которой вирусная инфекция вызвана коронавирусом, пикорнавирусом, калицивирусом, флавивирусом, тогавирусом, борнавирусом, филовирусом, парамиксовирусом, пневмовирусом, рабдовирусом, аренавирусом, буньявирусом, ортомиксовирусом или дельтавирусом.
30. Система по п. 29, в которой вирусная инфекция вызвана коронавирусом, SARS, полиовирусом, риновирусом, вирусом гепатита A, вирусом Норуолк, вирусом желтой лихорадки, вирусом Западного Нила, вирусом гепатита C, вирусом лихорадки Денге, вирусом Зика, вирусом краснухи, вирусом Росс-ривер, вирусом Синдбис, вирусом Чикунгунья, вирусом болезни Борна, вирусом Эбола, вирусом Марбург, вирусом кори, вирусом свинки, вирусом Нипах, вирусом Хендра, вирусом ньюкаслской болезни, респираторным синцитиальным вирусом человека, вирусом бешенства, вирусом Ласса, хантавирусом, вирусом конго-крымской геморрагической лихорадки, вирусом гриппа или вирусом гепатита D.
31. Система по п. 24, в которой инфекция является бактериальной инфекцией.
32. Система по п. 31, в которой бактерия, вызывающая бактериальную инфекцию, представляет вид Acinetobacter, вид Actinobacillus, вид Actinomycetes, вид Actinomyces, Aerococcus species вид Aeromonas, вид Anaplasma, вид Alcaligenes, вид Bacillus, вид Bacteriodes, вид Bartonella, вид Bifidobacterium, вид Bordetella, вид Borrelia, вид Brucella, вид Burkholderia, вид Campylobacter, вид Capnocytophaga, вид Chlamydia, вид Citrobacter, вид Coxiella, вид Corynbacterium speces, вид Clostridium, вид Eikenella, вид Enterobacter, вид Escherichia, вид Enterococcus, вид Ehlichia, вид Epidermophyton, вид Erysipelothrix, вид Eubacterium, вид Francisella, вид Fusobacterium, вид Gardnerella, вид Gemella, вид Haemophilus, вид Helicobacter, вид Kingella, вид Klebsiella, вид Lactobacillus, вид Lactococcus, вид Listeria, вид Leptospira, вид Legionella, вид Leptospira, Leuconostoc, вид Mannheimia, вид Microsporum, вид Micrococcus, вид Moraxella, вид Morganell, вид Mobiluncus, вид Micrococcus, Mycobacterium, вид Mycoplasm, вид Nocardia, вид Neisseria, вид Pasteurelaa, вид Pediococcus, вид Peptostreptococcus, вид Pityrosporum, вид Plesiomonas, вид Prevotella, вид Porphyromonas, вид Proteus, вид Providencia, вид Pseudomonas, вид Propionibacteriums, вид Rhodococcus, вид Rickettsia, вид Rhodococcus, вид Serratia, вид Stenotrophomonas, вид Salmonella, вид Serratia, вид Shigella, вид Staphylococcus, вид Streptococcus, вид Spirillum, вид Streptobacillus, вид Treponema, вид Tropheryma, вид Trichophyton, вид Ureaplasma, вид Veillonella, вид Vibrio, вид Yersinia, вид Xanthomonas или их комбинацию.
33. Система по п. 24, в которой инфекция вызвана грибком.
34. Система по п. 33, в которой грибок представляет собой Aspergillus, Blastomyces, Candidiasis, Coccidiodomycosis, Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gatti, вид Histoplasma (такой как Histoplasma capsulatum), вид Pneumocystis (такой как Pneumocystis jirovecii), Stachybotrys (такой как Stachybotrys chartarum), Mucroymcosis, Sporothrix, глазные грибковые инфекции, трихофитию, Exserohilum, Cladosporium, Geotrichum, Saccharomyces, вид Hansenula, вид Candida, вид Kluyveromyces, вид Debaryomyces, вид Pichia, вид Penicillium, вид Cladosporium, вид Byssochlamys или их комбинацию.
35. Система по п. 24, в которой инфекция вызвана простейшим организмом.
36. Система по п. 35, в которой простейший организм представляет собой Euglenozoa, Heterolobosea, Diplomonadida, Amoebozoa, Blastocystic, Apicomplexa или их комбинацию.
37. Система по п. 24, в которой инфекция вызвана паразитом.
38. Система по п. 37, в которой паразит представляет собой Trypanosoma cruzi (болезнь Шагаса), T. brucei gambiense, T. brucei rhodesiense, Leishmania braziliensis, L. infantum, L. mexicana, L. major, L. tropica, L. donovani, Naegleria fowleri, Giardia intestinalis (G. lamblia, G. duodenalis), canthamoeba castellanii, Balamuthia madrillaris, Entamoeba histolytica, Blastocystic hominis, Babesia microti, Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayetanensis, Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae и Toxoplasma gondii или их комбинацию.
39. Система по любому из пп. 1-38, в которой реагенты для амплификации целевых молекул РНК включают амплификацию на основе последовательностей нуклеиновых кислот (NASBA), рекомбиназную полимеразную амплификацию (РПА), петлеопосредованную изотермическую амплификацию (LAMP), амплификацию с замещением цепей (SDA), геликазо-зависимую амплификацию (HDA), реакцию амплификации с ферментом, создающим одноцепочечный разрыв (NEAR), ПЦР, амплификацию с множественным замещением (MDA), амплификацию по типу катящегося кольца (RCA), лигазную цепную реакцию (LCR) или рамификационный метод амплификации (RAM).
40. Система по любому из пп. 1-39, дополнительно содержащая систему обогащения CRISPR, в которой система обогащения CRISPR предназначена для связывания соответствующих целевых молекул перед обнаружением детектирующей системой CRISPR.
41. Система по п. 40, в которой система обогащения CRISPR содержит каталитически неактивный эффекторный белок CRISPR.
42. Система по п. 41, в которой каталитически неактивный эффекторный белок CRISPR представляет собой каталитически неактивный C2c2.
43. Система по любому из пп. 40-42, в которой эффекторный белок системы обогащения CRISPR дополнительно содержит метку, причем метка используется для специфического выделения системы обогащения CRISPR или для связывания системы обогащения CRISPR с твердой подложкой.
44. Система по п. 43, в которой твердая подложка представляет собой проточную ячейку.
45. Диагностическое устройство, содержащее один или более отдельных дискретных объемов, при этом каждый отдельный дискретный объем состоит из системы CRISPR по любому из пп. 1-44.
46. Устройство по п. 45, в котором каждый отдельный дискретный объем дополнительно содержит реагенты для амплификации нуклеиновых кислот.
47. Устройство по п. 45, в котором целевой молекулой является целевая ДНК, и отдельные дискретные объемы дополнительно содержат праймер, который связывает целевую ДНК и содержит промотор РНК-полимеразы.
48. Устройство по любому из пп. 45-47, в котором отдельные дискретные объемы представляют собой капли.
49. Устройство по любому из пп. 45-48, в котором отдельные дискретные объемы определены на твердой подложке.
50. Устройство по п. 49, в котором отдельные дискретные объемы представляют собой микролунки.
51. Диагностическое устройство по любому из пп. 45-47, в котором отдельные дискретные объемы представляют собой пятна, определенные на подложке.
52. Устройство по п. 51, в котором подложка представляет собой подложку из гибкого материала.
53. Устройство по п. 52, в котором подложка из гибкого материала представляет собой бумажную подложку или подложку на основе гибкого полимера.
54. Способ обнаружения целевых нуклеиновых кислот в образцах, включающий:
распределение образца или набора образцов по одному или более дискретным объемам, причем отдельные дискретные объемы содержат систему CRISPR по любому из пп. 1-44;
инкубацию образца или набора образцов в условиях, достаточных для обеспечения связывания одной или более направляющих РНК с одной или более целевыми молекулами;
активацию эффекторного белка CRISPR посредством связывания одной или более направляющих РНК с одной или более целевыми молекулами, причем активация эффекторного белка CRISPR приводит к модификации содержащего квадруплекс РНК-аптамера таким образом, что ферментативная активность квадруплекса инактивируется; и
обнаружение ферментативной активности, при этом обнаружение ниже порогового значения указывает на присутствие одной или более целевых молекул в образце.
55. Способ по п. 54, в котором целевая молекула представляет собой целевую ДНК, и способ дополнительно включает связывание целевой ДНК с праймером, содержащим сайт РНК-полимеразы.
56. Способ по любому из пп. 54-55, дополнительно включающий амплификацию образца РНК или триггерной РНК.
57. Способ по п. 56, в котором амплификация РНК включает амплификацию с помощью NASBA.
58.Способ по п. 56, в котором амплификация РНК включает амплификацию с помощью RPA.
59. Способ по любому из пп. 54-58, в котором образец представляет собой биологический образец или образец окружающей среды.
60. Способ по п. 59, в котором биологический образец представляет собой кровь, плазму, сыворотку, мочу, кал, мокроту, слизь, лимфатическую жидкость, синовиальную жидкость, желчь, асциты, плевральный выпот, серому, слюну, цереброспинальную жидкость, внутриглазную жидкость или стекловидное тело или любые выделения организма, транссудат, экссудат (например, жидкость, полученную из абсцесса или любого другого участка инфекции или воспаления) или жидкость, полученную из сустава (например, нормального сустава или сустава, пораженного заболеванием, таким как ревматоидный артрит, остеоартрит, подагра или септический артрит), или мазок с поверхности кожи или слизистой оболочки.
61. Способ по п. 59, в котором образец окружающей среды получен из пробы пищи, бумажной поверхности, ткани, металлической поверхности, деревянной поверхности, пластиковой поверхности, пробы почвы, пробы свежей воды, пробы сточной воды, пробы соленой воды, или их комбинации.
62. Способ по любому из пп. 54-61, в котором одна или более направляющих РНК сконструированы для обнаружения однонуклеотидного полиморфизма в целевой РНК или целевой ДНК, или варианта сплайсинга РНК-транскрипта.
63. Способ по любому из пп. 54-62, в котором одна или более направляющих РНК сконструированы для связывания с одной или более целевыми молекулами, которые являются диагностическими в отношении болезненного состояния.
64. Способ по любому из пп. 54-63, в котором одна или более направляющих РНК сконструированы для связывания с внеклеточными нуклеиновыми кислотами.
65. Способ по п. 63, в котором болезненное состояние представляет собой инфекцию, заболевание органа, заболевание крови, заболевание иммунной системы, рак, заболевание головного мозга и нервной системы, эндокринное заболевание, беременность или связанное с рождением ребенка заболевание, наследственное заболевание или приобретенное вследствие влияния окружающей среды заболевание.
66. Способ выявления целевой нуклеиновой кислоты в образце, включающий:
приведение в контакт образца с системой обнаружения нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-44; и
подвергание указанного контактирующего образца иммунохроматографическому анализу латерального потока.
67. Способ по п. 54, в котором ферментативная активность квадруплекса приводит к появлению в образце цветового сигнала.
68. Способ по п. 67, в котором деактивация ферментативной активности квадруплекса приводит к потере цветового сигнала, при этом потеря цветового сигнала указывает на присутствие целевой молекулы.