СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОСОВМЕСТИМЫХ ГАЛЛИЙ(III)-СОДЕРЖАЩИХ ВЫСОКОДИСПЕРСНЫХ ЧАСТИЦ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ПОЗИТРОННО-ЭМИССИОННОЙ ТОМОГРАФИИ
METHOD OF OBTAINING BIOCOMPATIBLE GALLIUM(III)-CONTAINING HIGHLY DISPERSE PARTICLES FOR MANUFACTURING DIAGNOSTIC PREPARATIONS FOR POSITRON-EMISSION TOMOGRAPHY

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к области ядерной медицины, а точнее к способам изготовления радиофармацевтических диагностических средств для позитронно-эмиссионной томографии.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
На сегодняшний день успех лечения многих болезней зависит от того, насколько рано и успешно была проведена диагностика заболевания. Современная медицина располагает большим количеством диагностических методов. Это и методы визуализации (рентгенография, магнитно-резонансная томография (МРТ), позитрон-эмиссионная томография, компьютерная томография и др.), и биохимические анализы, и биопсия (для диагностики новообразований).
Современные методы позитронно-эмиссионной томографии (двухфотонной эмиссионной томографии) основаны на детектировании пары гамма-квантов, образующихся в результате аннигиляции позитронов после распада нестабильных радиоизотопов в тканях и клетках, при этом локацию источников излучения производят с учетом того обстоятельства, что в результате аннигилляции образуется два кванта, а направления, в которых они распространяются, строго противоположны друг другу.
Одно из главных преимуществ позитронно-эмиссионной томографии состоит в том, что в отличие от иных способов диагностики, включение радионуклидов в состав биологически-активных соединений позволяет исследовать их распределение и метаболизм в организме человека в динамике. Во многих случаях это обстоятельство делает ПЭТ незаменимым способом исследования, несмотря на сравнительно низкую пространственную разрешающую способность современных ПЭТ-сканеров.
1
1
1
2
2
1
2
2
В качестве радиоизотопов в позитронно-эмиссионной томографии применяются радионуклиды, подверженные позитронному бета-распаду. Наиболее распространенными являются углерод-11 (T/ 20,4 минут), азот-13 (T/ 9,96 минут), кислород-15 (T/ 2,03 минут) фтор-18 (T/ 109,8 минут) иод.
1
1
2
2
С точки зрения дозовой нагрузки (чем меньше T/, тем большую дозу радиофармацевтического препарата можно ввести в организм пациента единовременно при сохранении той же общей дозы), удобства транспортировки и получения радиофармацевтических препаратов (T/ не должен быть слишком коротким, чтобы за период между моментом изготовления и моментом введения в организм перед исследованием в препарате сохранялось необходимое количество радиоизотопа), и разрешающей способности ПЭТ-сканеров (увеличивается с уменьшением энергии излучения) наиболее оптимальными являются радионуклиды с периодом полураспада больше 60 минут и низкой энергией излучения.
По совокупности ядерно-физических и химических свойств галлий-68 является одним из наиболее удобных радионуклидов для изготовления радиофармацевтических препаратов для позитронно-эмиссионной томографии.
1
1
2
2
Это обусловлено доступностью и удобством применения германий-68/галлий-68 генераторов галлия-68, большим периодом полураспада материнского германия-68 (T/ примерно 250 дней), обеспечивающего длительный срок эксплуатации генератора в лабораторных условиях (см. статьи Astia, M. et al. Validation of 68Ge/68Ga generator processing by chemical purification for routine clinical application of 68Ga-DOTATOC. // Nuclear Medicine and Biology. - 2008. - Vol.35. - P.721-724; Zhemosekov K.P. et al. Processing of generator-produced 68Ga for medical application. J. Nucl. Med. - 2007. - Vol.10. - P.1741-1748; McAlister D.R., Horwitz E.P. Automated two column generator systems for medical radionuclides. Applied Radiation and Isotopes 67 (2009) 1985-1991). При этом галлий-68, напротив, имеет весьма малый период полураспада (T/=68,1 мин), что позволяет использовать радиофармацевтические препараты необходимой активности, не создавая при этом значительной дозовой нагрузки на пациента. Кроме того, катион галлия-68 (III) формирует широкий спектр устойчивых комплексных соединений со многими лигандами, содержащими кислород, азот и серу как атомы-доноры, что делает его пригодным для синтеза большого количества хелатных комплексов и макромолекул различного функционального назначения.
Известные радиофармацевтические препараты, преимущественно, содержат галлий-68 в виде комплексов с бидентатными лигандами, связанными с различными биоспецифическми молекулами. Наиболее значимыми полидентатными представителями используемых бифункциональных хелатирующих агентов являются ациклические лиганды N,N'-бис(2,2-диметил-2-меркаптоэтил)этилендиамин-N,N'-диуксусная кислота (6SS), трис-аминометилэтан (TAME), диэтилентриаминпентауксусная кислота (DTPA), этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) и дифероксамин (DFO), а также макроциклические 1,4,7-триазациклононан-N,N',N''-триуксусная кислота (NOTA), 1,4,8,11-тетраазациклотетрадекан-1,4,8,11-тетрауксусная кислота (TETA) и 1,4,7,10-тетраазациклодекан-N,N',N'',N'''-тетрауксусная кислота (DOTA) и их производные (статьи Maecke H.R. et al. 68Ga-Labeled Peptides in Tumor Imaging, J. Nucl. Med. 46:172S-178S (2005); Breeman W.A.P. et al Radiolabelling DOTA-peptides with 68Ga. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. - 2005. - V.33. - P.478-85 и патентные документы WO 2005/057589, US 20080277350, RU 2343965 C2, US 7586102 B2, WO 2004/089425 A1 и US 7728310 B2).
Несмотря на известность общих подходов к созданию биоконъюгатов галлия-68 и подходов к изготовлению биосовместимых наночастиц, до настоящего времени какие-либо попытки создания радиофармацевтических препаратов в форме наночастиц, содержащих галлий-68, не предпринимались, либо не увенчались успехом. Между тем, создание подобных препаратов могло бы способствовать повышению точности диагностики онкологических заболеваний тех органов, для которых характерно наиболее существенное накопление наночастиц, а именно печени, почек и мозга (см. Semete B. et al. In vivo evaluation of the biodistribution and safety of PLGA nanoparticles as drug delivery systems. Nanomedicine: Nonotechnology, Biology, and Medicine, - 6 (2010) - P.662-671). Кроме того, создание частиц этого типа могло бы стать важным шагом на пути к созданию нацеленных радиофармацевтических препаратов, на основе наночастиц, содержащих наряду с изотопной меткой, различные биоспецифические молекулы, такие как антитела и лиганды рецепторов, характерных для нормальных и малигнизированных клеток.
-6
Одна из проблем, которая препятствует созданию подобных наночастиц, состоит в том, что элюаты коммерчески доступных генераторов германий-68/галлий-68, наряду с галлием-68 содержат большое количество (на 7÷10 порядков больше) конкурирующих катионов, препятствующих образованию комплексов галлия-68 (III). Наличие в рабочем растворе примесей Cd (II); Co (II); Cu (II); In (III); Fe (II); Fe (III); Lu (III); Ni (II); Zn (II) уже в количестве 1 µM может быть серьезной проблемой (Breeman W.A.P. et al Radiolabelling DOTA-peptides with 68Ga. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. - 2005. - V.33. - P.478-85). К тому же элюаты, получаемые с генератора, имеют низкий pH (обычно получают 5,0 мл раствора с pH 1,0), а после разбавления буфером до pH 5,0 получают значительный объем раствора с весьма низкой концентрацией галлия-68. Таким образом, применение наночастиц для изготовления радиофармацевтических препаратов галлия-68 без дополнительной очистки и концентрирования элюата возможно только в том случае, если их сорбционная емкость будет достаточной для связывания не только галлия-68, но и всех мешающих катионов, а их специфичность к галлию-68 будет достаточной для практически полного связывания галлия-68 из растворов с концентрацией менее 1·10 M.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Терминам и выражениям, используемым в настоящем тексте, придают следующее значение, если из контекста не следует иное значение.
DIPEA - диизопропилэтиламин
EDC - N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбонат
1
lgβ - константа устойчивости комплексного соединения в растворе
PDI - индекс полидисперсности
PLGA - сополимер молочной и гликолевой кислоты
PSD - гранулометрическая характеристика
Resomer 202S - биоразлагаемый сополимер D- и L-молочной кислоты с молекулярной массой 10-18 кДа, характеристической вязкостью 0,16-0,24 дл/г, температурой стеклования 38-42°C, свободные карбоксильные группы этерифицированы.
Resomer 502H - биоразлагаемый сополимер молочной и гликолевой кислоты (50:50) с молекулярной массой 7-17 кДа, характеристической вязкостью 0,16-0,24 дл/г, температурой стеклования 42-46°C, имеются свободные карбоксильные группы
Resomer 752H - биоразлагаемый сополимер молочной и гликолевой кислоты (75:25) с молекулярной массой 7-17 кДа, характеристической вязкостью 0,14-0,22 дл/г, температурой стеклования 42-46°C, имеются свободные карбоксильные группы
ZAVeD - средний размер частиц
ZP - дзета-потенциал
Биоразлагаемый полимер - полимер, способный при его введении в организм человека под действием ферментов полностью расщепляется до безвредных некумулирующихся метаболитов, которые могут быть выведены выделительными системами организма.
Биосовместимость - свойство материала, проявляющееся в том, что при введении в организм материал не вызывает реакций непереносимости или аллергических реакций.
ДМСО - диметилсульфоксид
Кислотный индекс - количество миллиэквивалентов KOH, необходимых на грамм полимера для нейтрализации свободной кислотности
Полилактид - биосовместимый биоразлагаемый полимер, выбранный из группы, состоящей из сополимера молочной и гликолевой кислоты и сополимера D и L-молочной кислоты.
Наночастицы (сокращенно - НЧ) - мелкодисперсные частицы, образующие коллоидные системы, в частности суспензии, эмульсии, аэрозоли, гели и золи.
Остальные термины и выражения используют в обычном смысле, известном специалистам в данной области техники.
Задача настоящего изобретения состоит в создании способа получения высокодисперсных биосовместимых частиц для изготовления диагностических радиофармацевтических средств на основе радионуклида галлия-68 для позитронно-эмиссионной томографии.
Технический результат состоит в создании нетоксичного (при эффективных концентрациях) радиофармацевтического средства, обеспечивающего эффективное связывание катионов галлия-68 (III) из сильно разбавленных загрязненных катионами металлов элюатов и высокую концентрацию галлия-68 (III) в связанной форме.
Свободный и связанный с частицами галлий-68 по-разному распределяется в организме, что позволяет легко отличать высококонтрастные скопления связанного галлия-68 с четкими контурами от размытых зон, обогащенных свободным галлием-68. За счет повышения содержания галлия-68 (III) в готовой к введению лекарственной форме по сравнению с растворами галлия-68 (III) стало возможным вводить его в кровоток в болюсном режиме - короткими инъекциями в небольшом объеме жидкости.
Кроме того, можно ожидать, что вследствие незначительного проникновения наночастиц в интерстициальную жидкость, лимфу и лимфоузлы, лимфотоксичность галлия-68 в связанной с частицами форме будет ниже, чем у несвязанных аналогов.
В основе настоящего изобретения положен тот факт, что, как неожиданно было обнаружено, емкость полилактидных частиц с нековалентно связанными комплексами галлия (III) намного превышает емкость частиц с лигандами, ковалентно связанными с поверхностью полилактидных частиц.
Вышеуказанная задача решена благодаря тому, что в способе получения биосовместимых высокодисперсных частиц для in situ изготовления диагностических средств для позитронно-эмиссионной томографии посредством объединения указанных частиц с раствором, содержащим катионы галлия-68 (III)
(а) используют, по меньшей мере, бидентатные ароматические лиганды, имеющие атомы-доноры неподеленной пары электорнов для образования по меньшей мере двух координационных связей с катионом галлия (III), а именно атом(ы) кислорода, непосредственно связанный(-ые) с ароматическим кольцом, и/или атом(ы) азота в ароматическом кольце, при этом константа устойчивости lgβ1 комплексов упомянутых лигандов с катионом галлия (III) в воде при нормальных условиях составляет по меньшей мере 5,0;
(б) используют раствор, содержащий сополимеры молочной кислоты, выбранные из группы, состоящей из сополимеров D- и L-молочной кислоты и сополимеров молочной и гликолевой кислоты, в малополярном растворителе;
(в) используют водный раствор стабилизатора;
(г) (i) объединяют раствор лиганда (а) в малополярном растворителе с раствором (б) и по меньшей мере тремя объемами раствора (в) и интенсивно перемешивают, либо
(ii) объединяют раствор лиганда (а) в полярном растворителе с раствором (б), интенсивно перемешивают смесь с получением высокогомогенной смеси, добавляют по меньшей мере три объема раствора (в) и интенсивно перемешивают с получением высокогомогенной смеси;
(д) упаривают высокогомогенную смесь, полученную на стадии (г) с получением суспензии;
(е) фильтруют суспензию, полученную на стадии (д) посредством фильтра с размером пор менее 30 мкм, с получением фильтрата, содержащего вышеупомянутые частицы.
В предпочтительной форме осуществления способа к фильтрату, полученному на стадии (е), добавляют лиопротектор, замораживают и лиофилизуют. В качестве лиопротектора могут добавлять (но не обязательно) глюкозу, трегалозу, лактозу, сахарозу и/или маннит, предпочтительно - 1%-ный маннит.
Термин «лиопротектор» относится к соединению, которое, будучи включено в лиофилизуемую композицию, будет защищать химические соединения от отрицательных воздействий замораживания и вакуумирования, таких как воздействия, обычно сопровождающие лиофилизацию, например повреждение, адсорбция и потери от вакуума, применяемого в лиофилизации.
Настоящее изобретение не ограничено применением конкретного лиопротектора; примеры подходящих лиопротекторов включают, без ограничений, углеводороды, такие как сахариды, моно-, ди- или полисахариды, например глюкозу, галактозу, фруктозу, сахарозу, трегалозу, мальтозу, лактозу, амилозу, амилопектин, циклодекстрины, декстран, инулин, растворимый крахмал, гидроксиэтилкрахмал (HES), сахарные спирты, например маннитол, сорбит и полигликоли, такие как полиэтиленгликоли. Список веществ с лиопротективным действием приведен в публикации Acta Pharm, Technol. 34 (3), pp.129-139 (1988), содержание которой введено здесь ссылкой. Указанные лиопротективные агенты могут применяться по отдельности или как смеси одного или более соединений.
Также настоящее изобретение не ограничено каким-либо конкретным количеством используемого лиопротектора. Однако оптимальная весовая концентрация лиопротективных агентов в эмульсии до лиофилизации составляет от примерно 1 до примерно 25%, предпочтительно от примерно 2 до примерно 20% и еще более предпочтительно от примерно 5 до примерно 10%.
Заморозку на стадии (ж) могут (но не обязательно) осуществлять до температуры от -196 до -60°C, предпочтительно - до температуры -75°C.
Не менее 90% частиц в лиофилизате, полученном на этапе (ж), могут иметь (но не обязательно) размер 100÷800 нанометров, причем при диспергировании в фармацевтически приемлемом носителе или растворителе частицы образуют пригодную для внутривенного введения устойчивую суспензию, в которой не менее 90% наночастиц имеют размер 200÷800 нанометров.
Лиганды могут быть (но не обязательно) выбраны из группы, состоящей из антрахинонов, флавонов, оксихинолинов, трифенилметанов, имеющих заместители, содержащие атом кислорода, или содержащие атом азота в ароматическом кольце.
Предпочтительно лиганды выбраны группы, состоящей из ализарина, хинализарина, ализаринового красного, кверцетина, 8-оксихинолина и алюминона.
Упомянутый сополимер может иметь (но не обязательно) характеристическую вязкость 0,10÷0,30 дл/г.
Упомянутый сополимер может являться (но не обязательно) сополимером D, L-молочной и гликолевой кислоты с соотношением молочная кислота : гликолевая кислота от 5:1 до 1:5.
Предпочтительно, когда упомянутый сополимер является гидрофильным и имеет кислотный индекс выше 1 мэкв KOH, более предпочтительно выше 1,2, еще более предпочтительно 1,5 мэкв КОН на грамм сополимера.
Малополярный растворитель, в котором растворены сополимеры молочной кислоты, может быть (но не обязательно) выбран из группы, состоящей из этилацетата, хлороформа, дихлорметана или их смеси.
Используемый здесь термин «малополярный растворитель» относится к не смешивающимся с водой растворителям, то есть к таким растворителям, что при его смешивании с водой образуются две отдельные фазы. Не смешиваемые с водой растворители обычно известны в уровне техники как аполярные или неполярные растворители, в отличие от полярных растворителей (таких, как вода). Не смешиваемые с водой растворители, как правило, почти нерастворимы в воде. Для целей настоящего изобретения органическими растворителями, подходящими для эмульгирования с водным растворителем, являются растворители с растворимостью в воде менее примерно 10 г/л. Предпочтительно растворимость указанного растворителя в воде составляет примерно 1,0 г/л или меньше, более предпочтительно примерно 0,2 г/л или меньше и, намного более предпочтительно, примерно 0,01 г/л или меньше. Особенно предпочтительными растворителями являются растворители с растворимостью в воде 0,001 г/л или меньше. В частности, нерастворимые органические растворители (например, перфторуглероды) могут иметь растворимость вплоть до примерно 1,0·10-6 г/л (например, перфтороктан 1,66·10-6 г/л).
Органический растворитель предпочтительно является лиофилизуемым, т.е. указанный растворитель имеет достаточно высокое давление пара при температурах лиофилизации, например, между -30°C и 0°C, чтобы позволить эффективное и полное испарение/сублимацию в пределах приемлемых времен, например 24-48 часов. Предпочтительно давление пара органического растворителя выше примерно 0,2 кПа при 25°C.
Органический растворитель может быть выбран из широкого круга растворителей любой химической природы, то есть не смешиваемых с водой и лиофилизуемых, как указано выше, и которые предпочтительно являются жидкими при комнатной температуре (25°C). Если используется растворитель с точкой кипения ниже, чем комнатная температура, емкость, содержащая эмульгирующую смесь, может преимущественно быть охлаждена ниже точки кипения указанного растворителя, например, до 5°C или 0°C.
Подходящие органические растворители включают, без ограничений, алканы, такие как разветвленные или предпочтительно прямые (C5-C10)-алканы, например пентан, гексан, гептан, октан, нонан, декан; алкены, такие как (C5-C10)-алкены, например 1-пентен, 2-пентен, 1-октен; циклоалканы, такие как (C5-C8)-циклоалканы, возможно замещенные одной или двумя метальными группами, например циклопентан, циклогексан, циклооктан, 1-метилциклогексан; ароматические углеводороды, такие как бензол и производные бензола, замещенные одной или двумя метальными или этильными группами, например бензол, толуол, этилбензол, 1,2-диметилбензол, 1,3-диметилбензол; простые алкиловые эфиры и кетоны, такие как дибутиловый эфир и диизопропилкетон; галогенированные углеводороды или простые эфиры, такие как хлороформ, четыреххлористый углерод, 2-хлор-1-(дифторметокси)-1,1,2-трифторэтан (энфлюран), 2-хлор-2-(дифторметокси)-1,1,1-трифторэтан (изофлюран), тетрахлор-1,1-дифторэтан и, в частности, перфторированные углеводороды или простые эфиры, такие как перфторпентан, перфторгексан, перфторгептан, перфторметилциклогексан, перфтороктан, перфторнонан, перфторбензол и перфтордекалин, метилперфторбутиловый эфир, металперфторизобутиловый эфир, этилперфторбутиловый эфир, этилперфторизобутиловый эфир и их смеси.
Смешивание на стадии (г)(i) могут осуществлять (но не обязательно) 3÷10 минут на емкостном гомогенизаторе при 19000÷30000 оборотах ротора в минуту, а затем 3÷10 минут на гомогенизаторе высокого давления при давлении 20000÷30000 psi.
Смешивание на стадии (г)(ii) предпочтительно осуществляют 1,5÷10 минут на емкостном гомогенизаторе при 19000÷30000 оборотах ротора в минуту.
Высокогомогенную смесь на стадии (д) могут упаривать (но не обязательно) на роторном испарителе.
Фильтрование на стадии (е) могут осуществлять (но не обязательно) на стеклянном фильтре с размером пор, по существу, 10 микрометров.
В качестве стабилизатора на стадии (в) могут использовать (но не обязательно) водный раствор поливинилового спирта, предпочтительно, 1,0% в/о водный раствор поливинилового спирта с молекулярной массой 9,0÷80 кДа.
В одном из вариантов осуществления способа частицы, полученные на этапе (е), промывают и после этого помещают в раствор, содержащий катионы галлия-68 (III).
В еще одном из вариантов осуществления способа pH раствора, содержащего катионы галлия-68 (III), доводят до pH 3,0÷8,0, предпочтительно до pH приблизительно 5,0.
Частицы могут содержать (но не обязательно) стехиометрический избыток лиганда и катионов металлов в растворе, содержащем катионы галлия-68 (III).
Упомянутые частицы могут дополнительно конъюгировать (но не обязательно) с авидином и/или стрептавидином для придания способности избирательно связываться с биоспецифическими биотинилированными лигандами, предпочтительно - с моноклональными антителами.
Упомянутые частицы могкт дополнительно конъюгировать (но не обязательно) с биоспецифическими лигандами.
Упомянутые биоспецифические лиганды могут быть (но не обязательно) выбраны из группы, состоящей из моноклональных антител, активных фрагментов пептидных гормонов, активных фрагментов интегринсвязывающих белков и RGD-пептида.
Упомянутые биоспецифические лиганды могут быть выбраны (но не обязательно) из группы, состоящей из моноклональных антител, специфичных к факторам свертывания крови, предпочтительно к тканевому тромбопластину.
Упомянутые биоспецифические лиганды могут быть выбраны (но не обязательно) из группы, состоящей из моноклональных антител, специфичных к сосудистому эндотелиальному фактору роста (VEGF).
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу изготовления радиофармацевтического препарата для позитронно-эмиссионной томографии, в котором частицы, полученные вышеописанным способом, помещают в раствор, содержащий галлий-68 (III) с pH 3,0÷8,0.
Упомянутые частицы перед помещением в упомянутый раствор могут (но не обязательно) промывать.
В другом своем аспекте изобретение относится к применению частиц, полученных вышеописанным способом, в котором упомянутые частицы объединяют с раствором, содержащим катионы галлия-68 (III), и вводят в организм человека перед проведением позитронно-эмиссионной томографии.
В предпочтительном варианте осуществления упомянутые частицы перед помещением в упомянутый раствор могут (но не обязательно) промывать.
В еще одном аспекте изобретение относится к биосовместимым высокодисперсным частицам для изготовления радиофармацевтического препарата для позитронно-эмиссионной томографии, характеризующимся тем, что они получены в соответствии с вышеописанным способом.
В еще одном аспекте изобретение относится к применению частиц, полученных в соответствии с вышеописанным способом, для изготовления радиофармацевтического препарата для позитронно-эмиссионной томографии.
Позитронно-эмиссионную томографию могут (но не обязательно) совмещать с компьютерной томографией.
Позитронно-эмиссионную томографию также могут (но не обязательно) совмещать с магнитно-резонансной (ядерно-магнитной) томографией.
В качестве контраста в упомянутой магнитно-резонансной томографии могут (но не обязательно) использовать упомянутые частицы с предварительно сорбированными катионами гадолиния (III).
В еще одном своем аспекте изобретение относится к диагностической радиофармацевтической композиции для позитронно-эмиссионной томографии, характеризующейся тем, что она содержит эффективное количество галлия-68 (III), связанного с частицами, изготовленными вышеописанным способом.
Эффективное количество в расчете на массу тела 50÷90 кг соответствует активности 2÷5 мКи.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления после объединения раствор инкубируют, центрифугируют, удаляют супернатант и ресуспендируют в фармацевтически приемлемом растворе для парентерального введения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг.1 показан ЯМР-спектр модифицированного ализарина по примеру 1.
На фиг.2 показан спектр Resomer 752H, ковалентно-модифицированного ализарином, по примеру 1.
2
4
На фиг.3 показаны спектры поглощения ксиленолового оранжевого и его комплекса с галлием (III) в водно-органической среде (вода-ДМСО, pH<1,0 (0,1 н HSO)).
2
4
На фиг.4 показан градуировочный график для определения свободного галлия (вода-ДМСО, pH<1,0 (0,1 н HSO)); длина волны 550 нм.
2
4
На фиг.5 показаны градуировочный график для определения общего содержания галлия (вода-ДМСО, pH<1,0 (0,1 н HSO)); длина волны 550 нм.
На фиг.6 показаны микрофотографии образцов по примеру 2.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Содержание галлия, входящего в виде комплексов в состав полилактидных частиц, а также степень включения галлия (III) в полилактидные частицы, определяют посредством спектрофотометрии растворов с использованием индикатора - ксиленолового оранжевого, образующего окрашенные комплексы с галлием (III) при pH 1,0 и менее. Данный способ основан на том, что в кислой среде комплексы галлия (III) с анализируемыми лигандами разрушаются и не мешают определению содержания галлия в виде его комплекса с индикатором. Поглощение измеряют при длине волны 550 нм (см. фиг.3).
Концентрацию свободного (не связанного с полилактидными частицами) галлия (III) определяют по предварительно построенному градуировочному графику (измеряют поглощение при длине волны 550 нм) (фиг.1 и фиг.2).
Для выявления возможного мешающего влияния собственного поглощения органических реагентов определяют концентрацию в отсутствии и в присутствии органических реагентов. Концентрация органических реагентов в анализируемом растворе соответствовала максимальному теоретически возможному содержанию органических реагентов в препарате.
Результаты валидации способа определения галлия (III) на примере полилактидных частиц с кверцетином, хинализарином и ализарином представлены в таблице 1+.
Таблица 1
Без добавления органических реагентов
Введено, мкг/мл
Найдено, мкг/мл
S<sub>r</sub>, %
3,46
3,49
1,3
1,66
1,61
2
С добавлением органических реагентов (0,1 мл раствора<sup>*</sup>)
1,66 + кверцитин
1,63
3
1,66 + хинализарин
1,81
2,2
1,66 + ализарин
1,58
3
Примечание: концентрация кверцитина, хинализарина и ализарина составляла 1,86·10<sup>-5</sup> моль/мл, 1,25·10<sup>-5</sup> моль/мл и 0,94·10<sup>-5</sup> моль/мл, соответственно.
Как следует из таблицы 1, присутствие хинализарина в растворе приводит к завышению результатов определения концентрации галлия. Поэтому для определения галлия в растворах, содержащих данный реагент, используют метод добавок.
2
4
Для определения концентрации свободного галлия (III) в суспензии полилактидных частиц лиофилизат ресуспендируют в объеме воды, составляющем 0,5 от исходного, количественно переносят в центрифужную пробирку, отделяют полилактидные частицы центрифугированием (Avanti J-301, 180C, 20000 об/мин, 30 мин) и отбирают супернатант. Далее к смеси 0,1% водного раствора индикатора (0,2 мл), 1 н. HSO (0,1 мл) и 0,5 мл диметилсульфоксида добавляют 0,2 мл супернатанта, перемешивают, инкубируют 30 мин при комнатной температуре и определяют концентрацию свободного галлия (III) по предварительно построенному градуировочному графику (фиг.4).
Для определения общего содержания галлия (III) в полилактидныхчастицах их растворяют в диметилсульфоксиде и по предварительно построенному градуировочному графику для растворов галлия (III) в смеси вода:ДМСО = 1:1 (об.:об.) (фиг.5). При этом учитывают, что концентрация раствора полилактида в 50% диметилсульфоксиде, не должна превышать 1 мг/мл.
2
4
Для определения общего содержания галлия (III) в лиофилизате полилактидных частиц лиофилизат, полученный из 1 или 2 мл, суспензии полилактидных частиц растворяют в 5,0 или 10,00 мл диметилсульфоксида, соответственно. В мерные колбы вместимостью 10,00 мл вносят 2 мл 0,1% водного раствора индикатора, 1 мл HSO (1 N), аликвотную часть суспензии образца частиц PLGA (от 1 до 5 мл, по необходимости) и доводят содержание диметилсульфоксида в колбе до 5,00 мл. Далее объем раствора в колбе доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают и через 30 минут измеряют оптическую плотность растворов.
2
4
Для определения общего содержания галлия (III) в осадках полилактидных частиц после центрифугирования осадок, оставшийся в центрифужной пробирке после отбора супернатанта, ресуспендируют и вновь лиофилизируют. Содержимое флакона после лиофилизации растворяют в диметилсульфоксиде (из расчета 5 мл диметилсульфоксида на осадок во флаконе, полученный из 1 мл исходного лиофилизата). В колбу объемом 10 мл вносят 2 мл 0,1% водного раствора индикатора, 1 мл 1 н HSO и 5 мл раствора частиц PLGA в диметилсульфоксиде (в случае, если во флаконе было всего 5 мл, то его переносят количественно). Раствор доводят до метки водой, перемешивают и через 30 минут измеряют поглощение при 550 нм.
Вышеописанный способ определения галлия (III) в лиофилизате валидировали с использованием лиофилизата полилактидных частиц, содержащих хинализарин. Установлено незначительное мешающее влияние собственной окраски хинализарина на результаты определения концентрации галлия. Поэтому для определения галлия в лиофилизатах полилактидных частиц, содержащих хинализатрин, используют метод добавок. Результаты валидации способа представлены в таблице 2.
Таблица 2
Введено, мкг/мл
Найдено, мкг/мл
Образец 1181
0,443
Образец 1181 + добавка (0,700)
1,184
Таким образом, погрешность составляет 3,4%, а способ позволяет с достаточной точностью определять содержание галлия в образцах полилактидных частиц.
Степень связывания вычисляют как выраженное в процентах отношение содержания галлия (III) в осадке полилактидных частиц к содержанию галлия (III) в супернатанте, полученном после центрифугирования суспензии полилактидных частиц после их инкубации в растворе галлия (III).
ПРИМЕР 1 (СРАВНИТЕЛЬНЫЙ)
Получение и исследование полилактидных частиц, содержащих ковалентно связанный лиганд, образующий устойчивые комплексы с галлием (III)
Этап 1
Получение модифицированного ализарина для ковалентного связывания с полилактидными частицами
Растворяют 0,6 г ализарина 1 (2,5 ммоль), 1,0 г (6,3 ммоль) карбоэтоксипиперазина, 0,14 г KOH и 0,07 г параформа в 2,5 мл воды и 2,5 мл этанола и перемешивают при 75°C в течение 24 часов. Затем добавляют еще 0,1 г параформа и перемешивают еще 24 часа при той же температуре. После этого растворитель отгоняют, к остатку добавляют 30 мл воды и подкисляют уксусной кислотой до тех пор, пока цвет реакционной смеси изменится с фиолетового на желто-коричневый. Осадок соединения 2 отфильтровывают, промывают водой и смешивают с 15 мл воды и 15 мл HCl. Полученный раствор кипятят при перемешивании 4 часа. После охлаждения раствор фильтруют, фильтрат упаривают досуха. К остатку добавляют 20 мл этанола и снова упаривают. После этого остаток нагревают с 10 мл этанола до кипения. К кипящему раствору добавляют 30 мл ацетонитрила. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают ацетонитрилом и сушат. Получают 227 мг продукта.
Модифицированный ализарин (220 мг, 0,54 ммоль) смешивают с резомером 360 мг Resomer 752H 3 (приблизительно 0,097 ммоль свободных карбоксильных групп), 192 мг EDC (0,65 ммоль), и 258 мг DIPEA (2 ммоль) перемешивают в 8,0 мл дихлорметана в течение 3-х суток. Смесь выливают в 100 мл воды и 50 мл этилацетата. Органическую фазу отделяют и промывают 8 раз в 100 мл дистиллированной воды. При каждой промывке добавляют 10 мл этилацетата. Промывают до тех пор, пока промывной раствор перестанет окрашиваться. После этого органическую фазу промывают 3-4 раза 100 мл 1% HCl и затем 1 раз 100 мл воды. Органическую фазу сушат сульфатом натрия и упаривают до объема 10 мл. К остатку при перемешивании добавляют 30 мл гексана. Выпавший осадок фильтруют и сушат. Получают 205 мг полимера.
Из сравнения ЯМР-спектров (растворитель - ДМСО, частота 400,46 МГц) модифицированного ализарина 2 и резомера 752H с привитым ализарином следует, что массовое содержание ализарина в продукте составляет приблизительно 5,8%. Кроме того, продукт содержит незначительные примеси гексана и этилацетата.
Этап 2
Получение полилактидных частиц, содержащих ковалентно связанный ализарин
Раствор полилактида (200 мг) и 50 мг модифицированного ализарином полилактида, полученного на этапе 1, в 5 мл дихлорметана смешивали с 25 мл 0,5%-ного раствора поливинилового спирта (9-10 тысяч Дальтон), 2 мин гомогенизировали на гомогенизаторе Turax при 23600 об/мин, затем - 5 мин на гомогенизаторе Avestin при 15000-20000 psi. Дихлорметан отгоняли на роторе до давления 15 миллибар, фильтровали на стеклянном фильтре с порами 10 мкм, добавляли 2,5% маннита, замораживали при -70°C и лиофилизовали на аппарате ALPHA 2-4LSC (Martin Christ GmbH).
Этап 3
Сорбция галлия (III) полилактидными частицами, полученными на этапе 2
Полилактидные частицы, полученные на этапе 2, ресуспендировали и трижды промывали дистиллированной водой от свободного ализарина методом осаждения-ресуспендирования в дистиллированной воде (центрифугирование - 30 минут при 13,2 тысяч об/мин и температуре 18°C на центрифуге 5415R (Eppendorf, Германия)).
Далее осадок частиц ресуспендировали в 1 мл ацетатного буфера с pH 5,0, прибавляли раствор сульфата галлия (III) с концентрацией 12,84 мг/мл и перемешивали на магнитной мешалке 2 часа при 250 об/мин. Супернатант и осадок разделяли центрифугированием 30 минут на центрифуге Beckman при 20000 об/мин и температуре 18°C.
Этап 4
Определение содержания галлия (III) в осадке полилактидных частиц, полученных на этапе 3 и в супернатанте
Модифицированные ализарином полилактидные частицы (образцы №№1324 и 1325) получают вышеописанным способом с использованием полимеров Resomer 752H / Resomer752H-ализарин (5:1) и Resomer 502H / Resomer502H-ализарин (5:1), соответственно. Сорбцию галлия (III) осуществляют в растворе сульфата галлия (III), содержащего заведомый избыток галлия (III) по отношению к ализариновым группам (около 3:1 и 2:1 для образцов 1324 и 1325, соответственно). Содержание свободного галлия (III) в супернатанте и галлия (III), связанного с ковалентно-модифицированными ализарином полилактидными частицами, определяли спектрофотометрически, вышеописанным способом. Полученные результаты представлены в таблице 3.
Таблица 3
№
ZP, мВ
ZAVeD*, нм
PDI
Об. PSD, нм  (%)
Содержание галлия (III), мкг/мг PLGA
1324
-0,456±0,186
160,1±0,1708
0,097±0,009
169 (100%)
0,23
187,2
0,21
1325
-2,82±0,349
173,6±0,6557
0,097±0,007
(100%)
* - размеры измерены при разбавлении образца в 50 раз.
ПРИМЕР 2
Получение полилактидных частиц с нековалентно связанными лигандами, способными образовывать устойчивые комплексы с галлием (III)
Используют бидентатные лиганды, удовлетворяющие следующим требованиям:
(1) лиганды относятся к классу аренов, в которых донорами неподеленной пары электронов для образования двух координационных связей с катионом галлия (III) служат атомы кислорода, непосредственно связанные с ароматическим кольцом, и/или атомы азота ароматического кольца;
(2) константа устойчивости lgβ1 не менее 5,0.
Желательно использовать лиганды, образующие с галлием (III) комплексы с коэффициентом экстракции неполярными растворителями, несмешивающимися с водой, из растворов в воде, полярных растворителях, или их смесей, больше 10, причем особенно желательно, когда дополнительно свободный лиганд растворим в полярном растворителе лучше, чем его комплекс с галлием (III).
Предпочтительными классами лигандов являются антрахиноны, флавоны, оксихинолины и трифенилметаны.
Конкретными примерами подходящих лигандов являются ализарин, хинализарин, ализариновый красный, кверцетин, 8-оксихинолин и алюминон (таблица 4).
Таблица 4
Название
Формула
Стехиометрия комплекса галлий(III):лиганд
<img file="00000002.tif" he="30" wi="44" img-content="undefined" img-format="tif" />
Ализарин
1:3
<img file="00000003.tif" he="30" wi="44" img-content="undefined" img-format="tif" />
Хинализарин
1:3
<img file="00000004.tif" he="35" wi="52" img-content="undefined" img-format="tif" />
Кверцетин
1:3
<img file="00000005.tif" he="22" wi="24" img-content="undefined" img-format="tif" />
8-Оксихинолин
1:3
Этап 1
Получение полилактидных частиц, содержащих нековалентно связанные комплексы галлия с лигандами
Для получения полилактидных частиц использовали 2 способа.
Первый способ. Объединяют 5 мл органического растворителя (этилацетата, хлороформа или дихлорметана), содержащего 50 мг/мл Resomer 752H или Resomer 202S, и лиганд (из расчета полимер : лиганд 50:1÷1000:1 м/м) и 25 мл водного раствора поливинилового спирта с молекулярной массой 9-10 кДа (1%, в/о). Полученную смесь гомогенизируют 5 мин на гомогенизаторе Ultra-Turrax при 23600 об/мин, затем - 5 мин на гомогенизаторе высокого давления Авестин при давлении 20000-25000 psi. Далее удаляют растворитель на роторном испарителе. Полученную суспензию фильтруют через стеклянный фильтр с размером пор 10 мкм, добавляют лиопротектор, - 1% маннит, - разливают по 2 мл во флаконы, замораживают при -70°C и лиофилизируют. Этим способом получены образцы 1163-1191.
Второй способ. Растворяют 250 мг Resomer 502H в 3 мл дихлорметана. К полученному раствору прибавляют 2,0 мл водного раствора, содержащего 5÷25 мг ализаринового красного C, гомогенизируют смесь 2 мин на гомогенизаторе Turrax при 23600 об/мин и переносят в стакан с 25 мл водного раствора поливинилового спирта с молекулярной массой 9-10 кДа (1%, в/о). Повторно гомогенизируют смесь 5 мин на гомогенизаторе Turrax при 23600 об/мин, затем удаляют растворитель на роторе. Суспензию фильтруют через стеклянный фильтр с размером пор 10 мкм, измеряют объем и добавляют 1% маннита. Образцы разливают по флаконам (по 2 мл), замораживают при -70°C и лиофилизуют. Этим способом получены образцы 1324-1331.
Этап 2
Получение раствора комплекса галлия (III) и связанного с полилактидными частицами лиганда
Полилактидные частицы, полученные на этапе 1 примера 2, ресуспендировали и обрабатывали в соответствии с этапом 3 по примеру 1 с получением супернатанта и осадка. Далее характеристики частиц определяют в соответствии с этапом 4 по примеру 1.
Характеристики некоторых частиц PLGA, содержащих комплексы галлия (III) с лигандами, представлены в таблицах 6 и 9.
В таблице 7 представлены результаты определения содержания галлия (III) в полилактидных частицах после сорбции.
В таблице 8 представлены результаты определения степени связывания галлия (III) полилактидными частицами с ализарином красным S и алюминоном до и после отмывки в течение 2 часов.
Фотографии полилактидных частиц после отмывки представлены на фигуре 6. Хорошо видно, что частицы круглые и вокруг явный контрастный ободок - поверхность покрыта контрастным веществом, по-видимому, комплексом галлия с лигандами.
Таблица 6
№
Полимер
Лиганд**
ZP, МВ
ZAVeD*, нм
PDI
Об. PSD, %
1324
Resomer 502Н
ализарин красный S
-1,51±0,160
151,1±1,679
0,087±0,014
156(100%)
1325
Resomer 502Н
алюминон
-21,4±2,41
157,5±1,721
0,122±0,014
166(100%)
* - размеры измерены при разбавлении образца в 50 раз;
** -  соотношение лиганд:полимер 10:1 в/в.
Таблица 7
№
Содержание галлия (III), мкг/флакон*
Степень включения, %**
В супернатанте
В осадке
Осадок и супернатант
1324
80,3
87,6
167,8
56,0
1325
86,5
91,8
178,3
52,6
1326
32,8
141,2
174,0
82,0
1327
48,9
95,0
143,9
73,2
1328
61,5
99,4
160,9
66,3
1329
29,92
121,7
151,6
83,6
1330
55,96
80,1
136,1
69,3
1331
80,7
68,8
149,5
55,8
1324 (отмыт)
88,9
61,6
150,5
51,2
1325 (отмыт)
83,2
63,1
146,3
54,4
* - расчетное значение 209,4 мкг/флакон.
** - отношение количества галлия (III) в осадке к суммарному количеству галлия в осадке и в супернатанте с учетом потерь на сорбцию во флаконе.
Таблица 8
№
Отмывка
Лиганд
Включение галлия (III), %
1322
до отмывки
ализарин красный S
84,9
1322
после отмывки
ализарин красный S
64,2
1323
до отмывки
алюминон
87,9
1323
после отмывки
алюминон
66,4
Сравнение эффективности полилактидных частиц по примеру 1 и 2
Ожидалось, что степень связывания галлия частицами с нековалентной связью лиганда и полимерного ядра будет существенно ниже, чем в случае лиганда, ковалентно связанного с образующим ядро частицы полилактидом. Однако неожиданно обнаружено, что такие частицы связывают галлий (III) лучше частиц по примеру 1, о чем свидетельствуют данные таблиц 3 и 9. Относительно малое включение галлия (III) в образцах по примеру 1, по-видимому, связано с невысокой сорбционной емкостью поверхности частиц.
Удельная сорбционная емкость полилактидных частиц по изобретению по отношению к катионам галлия (III), примерно в 2 раза выше, чем у сравнительных частиц по примеру 1, и может доходить до 80÷100 мкг галлия (III) на 10 мг полилактида. При этом остаточное содержание галлия (III) в навеске частиц по изобретению с начальным содержанием 100 мкг галлия (III)/мг полимера при инкубации в плазме крови в первые 15 минут и далее будет всегда выше, чем таковое у сравнительных частиц с начальным содержанием 40 мг галлия (III)/мг полимера.
Таблица 9
№
Параметры процесса
Состав полилактидных частиц
Включение галлия (III),%
ZAVeD, нм (разб. в 100 раз)
PDI
Полимер
Растворитель
Лиганд
Кол-во комплекса лиганд-галлий (III), мкг/мг PLGA
Комплекс галлия (III) PLGA, мкг/мг
Содержание галлия (III) общее, мкг/мл лиофилизата
Содержание галлия (III), мкг/мг PLGA
1163
Resomer 752H
Этилацетат
Кверцетин
27,1
19,5
14,3
1,4
94
154,1±2,562
0,206±0,009
1164
Resomer 752H
Этилацетат
Хинализарин
18,3
11,4
9,2
0,9
88
162,4±2,173
0,219±0,016
1165
Resomer 752H
Этилацетат
Ализарин
14,7
6,8
5,6
0,6
96
183,9±2,608
0,342±0,047
1190
Resomer 202S
Хлороформ
8-гидрокси-хинолин
167,2
134,1
185
18,5
85
167,3±2,083
0,123±0,011
1191
Resomer 202S
Метилен-хлорид
8-гидрокси-хинолин
167,2
134,1
110
11,0
84
151,3±1,511
0,087±0,005
Примечание: стабилизатор - поливиниловый спирт 1% в/о, молекулярная масса 9-10 тысяч Дальтон.