УМЕНЬШЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ У НАСЕКОМЫХ-ВРЕДИТЕЛЕЙ
REDUCING GENE EXPRESSION IN INSECT PESTS

Область техники
Настоящее изобретение относится в целом к генетическому контролю заражения видами насекомых-вредителей, в частности, к предотвращению и/или контролированию заражения растений вредителями. Конкретнее, настоящее изобретение относится к уменьшению экспрессии генов-мишеней у видов насекомых-вредителей с помощью молекул интерферирующих рибонуклеиновых кислот (РНК). Также обеспечиваются трансгенные растения, которые (i) экспрессируют или способны экспрессировать интерферирующие РНК настоящего изобретения и (ii) являются устойчивыми к заражению видами насекомых-вредителей. Также описываются композиции, содержащие молекулы интерферирующих РНК настоящего изобретения, для локального нанесения на растения или применения в среде, окружающей растения.
Предпосылки создания изобретения
Существует большое количество видов насекомых-вредителей, которые могут инфицировать или заражать широкое множество окружающих сред и организмов хозяев. Насекомые-вредители включают множество видов из отрядов насекомых Hemiptera (клопы), Coleoptera (жуки), Siphonaptera (блохи), Dichyoptera (тараканы и богомолы), Lepidoptera (мотыльки и бабочки), Orthoptera (например, кузнечики, саранча) и Diptera (настоящие мухи). Заражение вредителями может приводить к значительному ущербу. Насекомые-вредители, которые заражают виды растений, являются особенно проблематичными в сельском хозяйстве, поскольку они могут являться причиной серьезной порчи культур и значительно уменьшают размеры урожаев растений. Широкое множество различных типов растений, включая коммерческие культуры, такие как рис, хлопчатник, сою, картофель и кукуруза, являются подверженными заражению вредителями.
Традиционно заражение насекомыми-вредителями предотвращали или контролировали посредством использования химических пестицидов. Однако эти химические вещества не являются всегда подходящими для применения для обработки культур, поскольку они могут быть токсичными по отношению к другим видам и могут являться причиной значительного ущерба, наносимого окружающей среде. За последние десятилетия ученые разработали более учитывающие последствия для окружающей среды способы контролирования заражения вредителями. Например, использовались такие микроорганизмы, как бактерии Bacillus thuringiensis, которые по природе экспрессируют белки, токсичные для насекомых-вредителей. Ученые также выделили гены, кодирующие эти инсектицидные белки, и использовали их для создания трансгенных культур, устойчивых к насекомым-вредителям, например, генетически создаваемых растений кукурузы и хлопчатника, которые продуцируют белки семейства Cry.
Хотя бактериальные токсины были высоко результативными в контролировании некоторых типов вредителей, они не являются эффективными против всех видов вредителей. Поэтому ученые искали другие более направленные подходы к контролированию вредителей и, в частности, к РНК-интерференции или «выключению (сайленсингу) генов» в качестве способа контролирования вредителей на генетическом уровне.
РНК-интерференция является процессом, в результате которого экспрессия генов в рамках клетки или всего организма уменьшается специфическим для последовательностей образом. В настоящее время РНК-интерференция является твердо установившимся в данной области техники методом ингибирования или уменьшения экспрессии генов в широком множестве организмов, включая организмы вредителей, такие как грибы, нематоды и насекомые. Кроме того, предшествующие исследования показали, что уменьшение экспрессии генов-мишеней у видов насекомых-вредителей может использоваться в качестве способа контролирования заражения вредителями.
В WO2007/074405 описываются способы ингибирования экспрессии генов-мишеней у беспозвоночных вредителей, в том числе колорадского жука. В WO2005/110068 описываются способы ингибирования экспрессии генов-мишеней у беспозвоночных вредителей, включающих, в частности, западного кукурузного жука, в качестве способа контролирования заражения насекомыми. Кроме того, в WO2009/091864 описываются композиции и способы для супрессии генов-мишеней видов насекомых-вредителей, включающих вредителей рода Lygus.
Хотя использование РНК-интерференции для уменьшения экспрессии генов у видов насекомых известно в данной области техники, успешность этого метода в случае применения в качестве меры для контролирования вредителей зависит от выбора наиболее подходящих генов-мишеней, а именно тех, утрата функционирования которых приводит к значительному нарушению важнейшего биологического процесса и/или смерти организма. Таким образом, настоящее изобретение направлено на уменьшение экспрессии конкретных генов-мишеней у насекомых-вредителей в качестве способа достижения более эффективного предотвращения и/или контролирования заражения насекомыми-вредителями, особенно растений.
Краткое изложение сущности изобретения
Авторы настоящего изобретения предприняли попытки к установлению улучшенных способов предотвращения и/или контролирования заражения насекомыми-вредителями, используя генетические подходы. В частности, они исследовали применение РНК-интерференции для уменьшения экспрессии генов так, чтобы ослабить способность насекомого-вредителя к выживанию, росту, колонизации специфических окружающих сред и/или заражению организмов хозяев и, таким образом, ограничить ущерб, причиной которого является вредитель.
В настоящее время авторы настоящего изобретения установили, что уменьшение экспрессии с использованием РНК-интерференции конкретных генов-мишеней отдельно или в комбинации в видах насекомых-вредителей может использоваться в качестве эффективного способа контролирования заражения вредителями.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к интерферирующей рибонуклеиновой кислоте (РНК или двухцепочечной РНК), которая ингибирует или уменьшает экспрессию гена-мишени, который кодирует рибосомный белок насекомого, такой как рибосомный белок L19 (например, ортолог у насекомого белка CG2746 Dm (Drosophila melanogaster)), рибосомный белок L40 (например, ортолог у насекомого белка CG2960 Dm) или рибосомный белок S27A (например, ортолог у насекомого белка CG5271 Dm).
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к интерферирующей рибонуклеиновой кислоте (РНК или двухцепочечной РНК), которая ингибирует или уменьшает экспрессию гена-мишени, который кодирует субъединицу протеасомы насекомого, такую как белок Rpn6 (например, ортолог у насекомого белка CG10149 Dm), белок Pros 25 (например, ортолог у насекомого белка CG5266 Dm), белок Rpn2 (например, ортолог у насекомого белка CG11888 Dm), белок в виде β1-субъединицы протеасомы (например, ортолог у насекомого белка CG8392 Dm) или белок Pros бета 2 (например, ортолог у насекомого белка CG3329 Dm).
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к интерферирующей рибонуклеиновой кислоте (РНК или двухцепочечной РНК), которая ингибирует или уменьшает экспрессию гена-мишени, который кодирует β-коатомер пузырька COPI (комплекса Гольджи) насекомого (например, ортолог у насекомого белка CG6223 Dm), γ-коатомер пузырька COPI (например, ортолог у насекомого белка 1528 Dm), белок в виде β’-коатомера (например, ортолог у насекомого белка CG6699 Dm) или ζ-коатомер пузырька COPI (например, ортолог у насекомого белка CG3948 Dm).
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к интерферирующей рибонуклеиновой кислоте (РНК или двухцепочечной РНК), которая ингибирует или уменьшает экспрессию гена-мишени, который кодирует белок Тетраспанин 2 A насекомого, который является предполагаемым белком, содержащим трансмембранные домены, (например, ортолог у насекомого белка CG11415 Dm).
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к интерферирующей рибонуклеиновой кислоте (РНК или двухцепочечной РНК), которая ингибирует или уменьшает экспрессию гена-мишени, который кодирует белок насекомого, относящийся к семейству актинов (например, ортолог у насекомого белка CG5409 Dm), такой как Актин 5C (например, ортолог у насекомого белка CG4027 Dm).
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к интерферирующей рибонуклеиновой кислоте (РНК или двухцепочечной РНК), которая ингибирует или уменьшает экспрессию гена-мишени, который кодирует белок убиквитин-5E насекомого (например, ортолог у насекомого белка CG32744 Dm).
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к интерферирующей рибонуклеиновой кислоте (РНК или двухцепочечной РНК), которая ингибирует или уменьшает экспрессию гена-мишени, который кодирует белок Sec23 насекомого, который является активатором ГТФазы, вовлеченным во внутриклеточный транспорт белков (например, ортолог у насекомого белка CG1250 Dm).
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к интерферирующей рибонуклеиновой кислоте (РНК или двухцепочечной РНК), которая ингибирует или уменьшает экспрессию гена-мишени, который кодирует закрученный белок насекомого, который представляет собой необычный миозин, который вовлечен в двигательную активность (например, ортолог у насекомого белка CG7595 Dm).
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к интерферирующей рибонуклеиновой кислоте (РНК или двухцепочечной РНК), которая ингибирует или уменьшает экспрессию гена-мишени, который кодирует белок с кривым поперечным сужением насекомого, который вовлечен в регуляцию альтернативного сплайсинга мРНК в ядре (например, ортолог у насекомого белка CG3193 Dm).
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к интерферирующей рибонуклеиновой кислоте (РНК или двухцепочечной РНК), которая ингибирует или уменьшает экспрессию гена-мишени, который кодирует белок в виде G-субъединицы вакуолярной H+-АТФазы (например, ортолог у насекомого белка CG6213 Dm).
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к интерферирующей рибонуклеиновой кислоте (РНК или двухцепочечной РНК), которая ингибирует или уменьшает экспрессию гена-мишени, который кодирует Tbp-1 насекомого; Tat-связывающий белок (например, ортолог у насекомого белка CG10370 Dm).
Следовательно, в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения обеспечивается интерферирующая рибонуклеиновая кислота (РНК или двухцепочечная РНК), которая функционирует с момента поглощения видом насекомого-вредителя с уменьшением экспрессии гена-мишени у указанного насекомого-вредителя, причем ген-мишень
(i) выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, включающую любую из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплемент, или имеющих нуклеотидную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения двух последовательностей идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплементу, или
(ii) выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, состоящую из любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплемента, или
(iii) выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, включающую фрагмент из по крайней мере 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или его комплемент, или имеющих нуклеотидную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения указанного гена, включающего указанный фрагмент, с любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40 идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплементу, или
(iv) выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, включающую фрагмент из по крайней мере 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или его комплемент, и причем после оптимального совмещения и сравнения указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40 указанная нуклеотидная последовательность указанного фрагмента идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% указанному соответствующему фрагменту любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплементу, или
(v) является ортологом у насекомого-вредителя гена, имеющего нуклеотидную последовательность, включающую любую из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплемент, причем последовательности двух ортологичных генов схожи настолько, что после оптимального совмещения и сравнения двух генов ортолог имеет последовательность, которая идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% любой из последовательностей, представленной SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или
(vi) выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения двух аминокислотных последовательностей идентична на по крайней мере 70%, предпочтительно по крайней мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеотидной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или
(vii) выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения двух аминокислотных последовательностей идентична на по крайней мере 70%, предпочтительно по крайней мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 285, 242, 271, 226, 227, 281, 228, 282, 229, 230-233, 234, 283, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 284, 241, 243, 244, 286, 269, 270, 287, 288, 206-225.
В конкретном аспекте настоящего изобретения молекулы интерферирующих РНК настоящего изобретения включают по крайней мере один двухцепочечный район, типично элемент сайленсинга интерферирующей РНК, включающий смысловую цепь РНК, подвергнутую отжигу в результате спаривания комплементарных оснований с антисмысловой цепью РНК, причем смысловая цепь молекулы дцРНК включает последовательность нуклеотидов, комплементарную последовательности нуклеотидов, находящейся в РНК-транскрипте с гена-мишени.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к молекуле интерферирующей РНК, которая включает по крайней мере один двухцепочечный район, типично элемент сайленсинга молекулы интерферирующей РНК, включающий смысловую цепь РНК, подвергнутую отжигу в результате спаривания комплементарных оснований с антисмысловой цепью РНК, причем смысловая цепь молекулы дцРНК включает последовательность из по крайней мере 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов, которая комплементарна на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% последовательности нуклеотидов, находящейся в РНК-транскрипте с гена-мишени, который кодирует рибосомный белок насекомого, такой как рибосомный белок L19 (например, ортолог у насекомого белка CG2746 Dm), рибосомный белок L40 (например, ортолог у насекомого белка CG2960 Dm) или рибосомный белок S27A (например, ортолог у насекомого белка CG5271 Dm).
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к молекуле интерферирующей РНК, которая включает по крайней мере один двухцепочечный район, типично элемент сайленсинга молекулы интерферирующей РНК, включающий смысловую цепь РНК, подвергнутую отжигу в результате спаривания комплементарных оснований с антисмысловой цепью РНК, причем смысловая цепь молекулы дцРНК включает последовательность из по крайней мере 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов, которая комплементарна на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% последовательности нуклеотидов, находящейся в РНК-транскрипте с гена-мишени, который кодирует субъединицу протеасомы насекомого, такую как белок Rpn6 (например, ортолог у насекомого белка CG10149 Dm), белок Pros 25 (например, ортолог у насекомого белка CG5266 Dm), белок Rpn2 (например, ортолог у насекомого белка CG11888 Dm), белок в виде β1-субъединицы протеасомы (например, ортолог у насекомого белка CG8392 Dm) или белок Pros бета 2 (например, ортолог у насекомого белка CG3329 Dm).
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к молекуле интерферирующей РНК, которая включает по крайней мере один двухцепочечный район, типично элемент сайленсинга молекулы интерферирующей РНК, включающий смысловую цепь РНК, подвергнутую отжигу в результате спаривания комплементарных оснований с антисмысловой цепью РНК, причем смысловая цепь молекулы дцРНК включает последовательность из по крайней мере 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов, которая комплементарна на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% последовательности нуклеотидов, находящейся в РНК-транскрипте с гена-мишени, который кодирует β-коатомер пузырька COPI (комплекса Гольджи) насекомого (например, ортолог у насекомого белка CG6223 Dm), γ-коатомер пузырька COPI (например, ортолог у насекомого белка 1528 Dm), белок в виде β’-коатомера (например, ортолог у насекомого белка CG6699 Dm) или ζ-коатомер пузырька COPI (например, ортолог у насекомого белка CG3948 Dm).
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к молекуле интерферирующей РНК, которая включает по крайней мере один двухцепочечный район, типично элемент сайленсинга молекулы интерферирующей РНК, включающий смысловую цепь РНК, подвергнутую отжигу в результате спаривания комплементарных оснований с антисмысловой цепью РНК, причем смысловая цепь молекулы дцРНК включает последовательность из по крайней мере 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов, которая комплементарна на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% последовательности нуклеотидов, находящейся в РНК-транскрипте с гена-мишени, который кодирует белок Тетраспанин 2 A насекомого, который является предполагаемым белком, содержащим трансмембранные домены, (например, ортолог у насекомого белка CG11415 Dm).
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к молекуле интерферирующей РНК, которая включает по крайней мере один двухцепочечный район, типично элемент сайленсинга молекулы интерферирующей РНК, включающий смысловую цепь РНК, подвергнутую отжигу в результате спаривания комплементарных оснований с антисмысловой цепью РНК, причем смысловая цепь молекулы дцРНК включает последовательность из по крайней мере 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов, которая комплементарна на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% последовательности нуклеотидов, находящейся в РНК-транскрипте с гена-мишени, который кодирует белок насекомого, относящийся к семейству актинов (например, ортолог у насекомого белка CG5409 Dm), такой как Актин 5C (например, ортолог у насекомого белка CG4027 Dm).
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к молекуле интерферирующей РНК, которая включает по крайней мере один двухцепочечный район, типично элемент сайленсинга молекулы интерферирующей РНК, включающий смысловую цепь РНК, подвергнутую отжигу в результате спаривания комплементарных оснований с антисмысловой цепью РНК, причем смысловая цепь молекулы дцРНК включает последовательность из по крайней мере 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов, которая комплементарна на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% последовательности нуклеотидов, находящейся в РНК-транскрипте с гена-мишени, который кодирует белок убиквитин-5E насекомого (например, ортолог у насекомого белка CG32744 Dm).
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к молекуле интерферирующей РНК, которая включает по крайней мере один двухцепочечный район, типично элемент сайленсинга молекулы интерферирующей РНК, включающий смысловую цепь РНК, подвергнутую отжигу в результате спаривания комплементарных оснований с антисмысловой цепью РНК, причем смысловая цепь молекулы дцРНК включает последовательность из по крайней мере 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов, которая комплементарна на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% последовательности нуклеотидов, находящейся в РНК-транскрипте с гена-мишени, который кодирует белок Sec23 насекомого, который является активатором ГТФазы, вовлеченным во внутриклеточный транспорт белков (например, ортолог у насекомого белка CG1250 Dm).
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к молекуле интерферирующей РНК, которая включает по крайней мере один двухцепочечный район, типично элемент сайленсинга молекулы интерферирующей РНК, включающий смысловую цепь РНК, подвергнутую отжигу в результате спаривания комплементарных оснований с антисмысловой цепью РНК, причем смысловая цепь молекулы дцРНК включает последовательность из по крайней мере 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов, которая комплементарна на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% последовательности нуклеотидов, находящейся в РНК-транскрипте с гена-мишени, который кодирует закрученный белок насекомого, который представляет собой необычный миозин, который вовлечен в двигательную активность (например, ортолог у насекомого белка CG7595 Dm).
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к молекуле интерферирующей РНК, которая включает по крайней мере один двухцепочечный район, типично элемент сайленсинга молекулы интерферирующей РНК, включающий смысловую цепь РНК, подвергнутую отжигу в результате спаривания комплементарных оснований с антисмысловой цепью РНК, причем смысловая цепь молекулы дцРНК включает последовательность из по крайней мере 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов, которая комплементарна на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% последовательности нуклеотидов, находящейся в РНК-транскрипте с гена-мишени, который кодирует белок с кривым поперечным сужением насекомого, который вовлечен в регуляцию альтернативного сплайсинга мРНК в ядре (например, ортолог у насекомого белка CG3193 Dm).
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к молекуле интерферирующей РНК, которая включает по крайней мере один двухцепочечный район, типично элемент сайленсинга молекулы интерферирующей РНК, включающий смысловую цепь РНК, подвергнутую отжигу в результате спаривания комплементарных оснований с антисмысловой цепью РНК, причем смысловая цепь молекулы дцРНК включает последовательность из по крайней мере 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов, которая комплементарна на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% последовательности нуклеотидов, находящейся в РНК-транскрипте с гена-мишени, который кодирует белок в виде G-субъединицы вакуолярной H+-АТФазы (например, ортолог у насекомого белка CG6213 Dm).
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к молекуле интерферирующей РНК, которая включает по крайней мере один двухцепочечный район, типично элемент сайленсинга молекулы интерферирующей РНК, включающий смысловую цепь РНК, подвергнутую отжигу в результате спаривания комплементарных оснований с антисмысловой цепью РНК, причем смысловая цепь молекулы дцРНК включает последовательность из по крайней мере 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов, которая комплементарна на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% последовательности нуклеотидов, находящейся в РНК-транскрипте с гена-мишени, который кодирует Tbp-1 насекомого; Tat-связывающий белок (например, ортолог у насекомого белка CG10370 Dm).
В соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения обеспечивается выделенный полинуклеотид, выбираемый из группы, состоящей из:
(i) полинуклеотида, который включает по крайней мере 21, предпочтительно по крайней мере 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов нуклеотидной последовательности, представленной любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120, или ее комплементом, или
(ii) полинуклеотида, который включает по крайней мере 21, предпочтительно по крайней мере 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов нуклеотидной последовательности, представленной любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120, или ее комплементом, или
(iii) полинуклеотида, который включает по крайней мере 21, предпочтительно по крайней мере 22, 23 или 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов нуклеотидной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120, или ее комплементе, причем после оптимального совмещения и сравнения двух последовательностей указанный полинуклеотид идентичен на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120, или ее комплементу, или
(iv) полинуклеотида, который включает фрагмент из по крайней мере 21, предпочтительно по крайней мере 22, 23 или 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов нуклеотидной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120, или его комплемент, и причем указанный фрагмент или указанный комплемент имеет нуклеотидную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120 идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% указанному соответствующему фрагменту любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120 или его комплементу, или
(v) полинуклеотида, который состоит из фрагмента из по крайней мере 21, предпочтительно по крайней мере 22, 23 или 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов нуклеотидной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120, или его комплемента, и причем указанный фрагмент или указанный комплемент имеет нуклеотидную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120 идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% указанному соответствующему фрагменту любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120 или его комплементу, или
(vi) полинуклеотида, кодирующего аминокислотную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения двух аминокислотных последовательностей идентична на крайней мере 70%, предпочтительно по крайней мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеотидной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120, или
(vii) полинуклеотида, кодирующего аминокислотную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения двух аминокислотных последовательностей идентична на крайней мере 70%, предпочтительно по крайней мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 285, 242, 271, 226, 227, 281, 228, 282, 229, 230-233, 234, 283, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 284, 241, 243, 244, 286, 269, 270, 287, 288, 206-225, и
причем указанный полинуклеотид не длиннее, чем 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000 или 1500 нуклеотидов.
В конкретном аспекте настоящего изобретения выделенный полинуклеотид является частью молекулы интерферирующей РНК, типично частью элемента сайленсинга, включающей по крайней мере один двухцепочечный район, включающий смысловую цепь РНК, подвергнутую отжигу в результате спаривания комплементарных оснований с антисмысловой цепью РНК, причем смысловая цепь молекулы дцРНК включает последовательность нуклеотидов, комплементарную последовательности нуклеотидов, находящейся в РНК-транскрипте с гена-мишени. Конкретнее, выделенный полинуклеотид клонирован в ДНК-конструкцию в смысловой и антисмысловой ориентации так, что после транскрипции смыслового и антисмыслового полинуклеотида образуется молекула дцРНК, которая функционирует с момента поглощения вредителем с ингибированием или уменьшением экспрессии гена-мишени у указанного вредителя.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, который клонирован в ДНК-конструкцию в смысловой и антисмысловой ориентации так, что после транскрипции смыслового и антисмыслового полинуклеотида образуется молекула дцРНК, которая функционирует с момента поглощения насекомым с ингибированием или уменьшением экспрессии гена-мишени, который кодирует рибосомный белок насекомого, такой как рибосомный белок L19 (например, ортолог у насекомого белка CG2746 Dm), рибосомный белок L40 (например, ортолог у насекомого белка CG2960 Dm) или рибосомный белок S27A (например, ортолог у насекомого белка CG5271 Dm).
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, который клонирован в ДНК-конструкцию в смысловой и антисмысловой ориентации так, что после транскрипции смыслового и антисмыслового полинуклеотида образуется молекула дцРНК, которая функционирует с момента поглощения насекомым с ингибированием или уменьшением экспрессии гена-мишени, который кодирует субъединицу протеасомы насекомого, такую как белок Rpn6 (например, ортолог у насекомого белка CG10149 Dm), белок Pros 25 (например, ортолог у насекомого белка CG5266 Dm), белок Rpn2 (например, ортолог у насекомого белка CG11888 Dm), белок в виде β1-субъединицы протеасомы (например, ортолог у насекомого белка CG8392 Dm) или белок Pros бета 2 (например, ортолог у насекомого белка CG3329 Dm).
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, который клонирован в ДНК-конструкцию в смысловой и антисмысловой ориентации так, что после транскрипции смыслового и антисмыслового полинуклеотида образуется молекула дцРНК, которая функционирует с момента поглощения насекомым с ингибированием или уменьшением экспрессии гена-мишени, который кодирует β-коатомер пузырька COPI (комплекса Гольджи) насекомого (например, ортолог у насекомого белка CG6223 Dm), γ-коатомер пузырька COPI (например, ортолог у насекомого белка 1528 Dm), белок в виде β’-коатомера (например, ортолог у насекомого белка CG6699 Dm) или ζ-коатомер пузырька COPI (например, ортолог у насекомого белка CG3948 Dm).
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, который клонирован в ДНК-конструкцию в смысловой и антисмысловой ориентации так, что после транскрипции смыслового и антисмыслового полинуклеотида образуется молекула дцРНК, которая функционирует с момента поглощения насекомым с ингибированием или уменьшением экспрессии гена-мишени, который кодирует белок Тетраспанин 2 A насекомого, который является предполагаемым белком, содержащим трансмембранные домены, (например, ортолог у насекомого белка CG11415 Dm).
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, который клонирован в ДНК-конструкцию в смысловой и антисмысловой ориентации так, что после транскрипции смыслового и антисмыслового полинуклеотида образуется молекула дцРНК, которая функционирует с момента поглощения насекомым с ингибированием или уменьшением экспрессии гена-мишени, который кодирует белок насекомого, относящийся к семейству актинов (например, ортолог у насекомого белка CG5409 Dm), такой как Актин 5C (например, ортолог у насекомого белка CG4027 Dm).
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, который клонирован в ДНК-конструкцию в смысловой и антисмысловой ориентации так, что после транскрипции смыслового и антисмыслового полинуклеотида образуется молекула дцРНК, которая функционирует с момента поглощения насекомым с ингибированием или уменьшением экспрессии гена-мишени, который кодирует белок убиквитин-5E насекомого (например, ортолог у насекомого белка CG32744 Dm).
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, который клонирован в ДНК-конструкцию в смысловой и антисмысловой ориентации так, что после транскрипции смыслового и антисмыслового полинуклеотида образуется молекула дцРНК, которая функционирует с момента поглощения насекомым с ингибированием или уменьшением экспрессии гена-мишени, который кодирует белок Sec23 насекомого, который является активатором ГТФазы, вовлеченным во внутриклеточный транспорт белков (например, ортолог у насекомого белка CG1250 Dm).
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, который клонирован в ДНК-конструкцию в смысловой и антисмысловой ориентации так, что после транскрипции смыслового и антисмыслового полинуклеотида образуется молекула дцРНК, которая функционирует с момента поглощения насекомым с ингибированием или уменьшением экспрессии гена-мишени, который кодирует закрученный белок насекомого, который представляет собой необычный миозин, который вовлечен в двигательную активность (например, ортолог у насекомого белка CG7595 Dm).
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, который клонирован в ДНК-конструкцию в смысловой и антисмысловой ориентации так, что после транскрипции смыслового и антисмыслового полинуклеотида образуется молекула дцРНК, которая функционирует с момента поглощения насекомым с ингибированием или уменьшением экспрессии гена-мишени, который кодирует белок с кривым поперечным сужением насекомого, который вовлечен в регуляцию альтернативного сплайсинга мРНК в ядре (например, ортолог у насекомого белка CG3193 Dm).
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, который клонирован в ДНК-конструкцию в смысловой и антисмысловой ориентации так, что после транскрипции смыслового и антисмыслового полинуклеотида образуется молекула дцРНК, которая функционирует с момента поглощения насекомым с ингибированием или уменьшением экспрессии гена-мишени, который кодирует белок в виде G-субъединицы вакуолярной H+-АТФазы (например, ортолог у насекомого белка CG6213 Dm).
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, который клонирован в ДНК-конструкцию в смысловой и антисмысловой ориентации так, что после транскрипции смыслового и антисмыслового полинуклеотида образуется молекула дцРНК, которая функционирует с момента поглощения насекомым с ингибированием или уменьшением экспрессии гена-мишени, который кодирует Tbp-1 насекомого; Tat-связывающий белок (например, ортолог у насекомого белка CG10370 Dm).
В соответствии с третьим аспектом настоящего изобретения обеспечивается композиция для предотвращения и/или контролирования заражения насекомым-вредителем, включающая по крайней мере одну интерферирующую рибонуклеиновую кислоту (РНК) и по крайней мере один подходящий носитель, наполнитель или разбавитель, причем интерферирующая РНК функционирует с момента поглощения вредителем с уменьшением экспрессии гена-мишени у указанного вредителя, причем ген-мишень
(i) выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, включающую любую из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплемент, или имеющих нуклеотидную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения двух последовательностей идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплементу, или
(ii) выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, состоящую из любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплемента, или
(iii) выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, включающую фрагмент из по крайней мере 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или его комплемент, или имеющих нуклеотидную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения указанного гена, включающего указанный фрагмент, с любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40 идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплементу, или
(iv) выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, включающую фрагмент из по крайней мере 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или его комплемент, и причем после оптимального совмещения и сравнения указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40 указанная нуклеотидная последовательность указанного фрагмента идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% указанному соответствующему фрагменту любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или его комплементу, или
(v) является ортологом у насекомого-вредителя гена, имеющего нуклеотидную последовательность, включающую любую из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплемент, причем последовательности двух ортологичных генов схожи настолько, что после оптимального совмещения и сравнения двух генов ортолог имеет последовательность, которая идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% любой из последовательностей, представленной SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или
(vi) выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения двух аминокислотных последовательностей идентична на по крайней мере 70%, предпочтительно по крайней мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеотидной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или
(vii) выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения двух аминокислотных последовательностей идентична на по крайней мере 70%, предпочтительно по крайней мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 285, 242, 271, 226, 227, 281, 228, 282, 229, 230-233, 234, 283, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 284, 241, 243, 244, 286, 269, 270, 287, 288, 206-225.
В соответствии с четвертым аспектом настоящего изобретения обеспечивается способ уменьшения экспрессии гена-мишени у вида насекомого-вредителя, включающий контактирование указанного вида насекомого-вредителя с эффективным количеством по крайней мере одной интерферирующей рибонуклеиновой кислоты (РНК) или эффективным количеством композиции, включающей по крайней мере одну интерферирующую рибонуклеиновую кислоту (РНК) и по крайней мере один подходящий носитель, наполнитель или разбавитель, причем интерферирующая РНК функционирует с момента поглощения вредителем с уменьшением экспрессии гена-мишени у указанного вредителя, и причем ген-мишень
(i) выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, включающую любую из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплемент, или имеющих нуклеотидную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения двух последовательностей идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплементу, или
(ii) выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, состоящую из любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплемента, или
(iii) выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, включающую фрагмент из по крайней мере 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или его комплемент, или имеющих нуклеотидную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения указанного гена, включающего указанный фрагмент, с любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40 идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплементу, или
(iv) выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, включающую фрагмент из по крайней мере 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или его комплемент, и причем после оптимального совмещения и сравнения указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40 указанная нуклеотидная последовательность указанного фрагмента идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% указанному соответствующему фрагменту любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или его комплементу, или
(v) является ортологом у насекомого-вредителя гена, имеющего нуклеотидную последовательность, включающую любую из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплемент, причем последовательности двух ортологичных генов схожи настолько, что после оптимального совмещения и сравнения двух генов ортолог имеет последовательность, которая идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% любой из последовательностей, представленной SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или
(vi) выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения двух аминокислотных последовательностей идентична на по крайней мере 70%, предпочтительно по крайней мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеотидной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или
(vii) выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения двух аминокислотных последовательностей идентична на по крайней мере 70%, предпочтительно по крайней мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 285, 242, 271, 226, 227, 281, 228, 282, 229, 230-233, 234, 283, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 284, 241, 243, 244, 286, 269, 270, 287, 288, 206-225.
Предпочтительно способ настоящего изобретения находит практическое применение в предотвращении и/или контролировании заражения насекомыми-вредителями, в частности, контролировании заражения вредителями сельскохозяйственных культур, таких как, но без ограничения, рис, хлопчатник, клубника, культуры на семена, такие как люцерна, соя, картофель, помидоры, канола, подсолнечник, сорго, просо американское, кукуруза, баклажаны, перец и табак. Кроме того, интерферирующая РНК настоящего изобретения может быть введена в растения для их защиты с помощью обычных методов генетической инженерии.
Следовательно, в соответствии с пятым аспектом настоящего изобретения обеспечивается способ создания трансгенного растения, устойчивого к заражению видом насекомого-вредителя, включающий:
(a) трансформацию клетки растения ДНК-конструкцией, включающей полинуклеотидную последовательность, кодирующую интерферирующую рибонуклеиновую кислоту (РНК), которая функционирует с момента поглощения видом насекомого-вредителя с уменьшением экспрессии гена-мишени у указанного вида насекомого-вредителя, причем ген-мишень
(i) выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, включающую любую из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплемент, или имеющих нуклеотидную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения двух последовательностей идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплементу, или
(ii) выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, состоящую из любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплемента, или
(iii) выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, включающую фрагмент из по крайней мере 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или его комплемент, или имеющих нуклеотидную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения указанного гена, включающего указанный фрагмент, с любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40 идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплементу, или
(iv) выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, включающую фрагмент из по крайней мере 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или его комплемент, и причем после оптимального совмещения и сравнения указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40 указанная нуклеотидная последовательность указанного фрагмента идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% указанному соответствующему фрагменту любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или его комплементу, или
(v) является ортологом у насекомого-вредителя гена, имеющего нуклеотидную последовательность, включающую любую из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплемент, причем последовательности двух ортологичных генов схожи настолько, что после оптимального совмещения и сравнения двух генов ортолог имеет последовательность, которая идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% любой из последовательностей, представленной SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или
(vi) выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения двух аминокислотных последовательностей идентична на по крайней мере 70%, предпочтительно по крайней мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеотидной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или
(vii) выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения двух аминокислотных последовательностей идентична на по крайней мере 70%, предпочтительно по крайней мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 285, 242, 271, 226, 227, 281, 228, 282, 229, 230-233, 234, 283, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 284, 241, 243, 244, 286, 269, 270, 287, 288, 206-225.
(b) регенерацию растения из трансформированной клетки растения; и
(c) выращивание трансформированного растения в условиях, подходящих для экспрессии интерферирующей РНК с рекомбинантной ДНК-конструкции, при этом указанное растение является устойчивым к указанному вредителю по сравнению с нетрансформированным растением.
В соответствии с шестым аспектом настоящего изобретения обеспечивается трансгенное растение, или материал для репродукции или размножения трансгенного растения или культивируемая трансгенная клетка растения, которое экспрессирует или способно экспрессировать по крайней мере одну интерферирующую рибонуклеиновую кислоту (РНК), которая функционирует с момента поглощения видом насекомого-вредителя с уменьшением экспрессии гена-мишени у указанного вредителя, причем ген-мишень
(i) выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, включающую любую из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплемент, или имеющих нуклеотидную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения двух последовательностей идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплементу, или
(ii) выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, состоящую из любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплемента, или
(iii) выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, включающую фрагмент из по крайней мере 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или его комплемент, или имеющих нуклеотидную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения указанного гена, включающего указанный фрагмент, с любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40 идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплементу, или
(iv) выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, включающую фрагмент из по крайней мере 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или его комплемент, и причем после оптимального совмещения и сравнения указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40 указанная нуклеотидная последовательность указанного фрагмента идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% указанному соответствующему фрагменту любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или его комплементу, или
(v) является ортологом у насекомого-вредителя гена, имеющего нуклеотидную последовательность, включающую любую из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплемент, причем последовательности двух ортологичных генов схожи настолько, что после оптимального совмещения и сравнения двух генов ортолог имеет последовательность, которая идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% любой из последовательностей, представленной SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или
(vi) выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения двух аминокислотных последовательностей идентична на по крайней мере 70%, предпочтительно по крайней мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеотидной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или
(vii) выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения двух аминокислотных последовательностей идентична на по крайней мере 70%, предпочтительно по крайней мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 285, 242, 271, 226, 227, 281, 228, 282, 229, 230-233, 234, 283, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 284, 241, 243, 244, 286, 269, 270, 287, 288, 206-225.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к трансгенному(ой) растению или клетке растения, включающему(ей) интерферирующую нуклеиновую кислоту (РНК или двухцепочечную РНК), которая комплементарна на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% части из по крайней мере 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов или всей мРНК, кодирующей рибосомный белок насекомого, такой как рибосомный белок L19 (например, ортолог у насекомого белка CG2746 Dm), рибосомный белок L40 (например, ортолог у насекомого белка CG2960 Dm) или рибосомный белок S27A (например, ортолог у насекомого белка CG5271 Dm), и причем интерферирующая нуклеиновая кислота ингибирует трансляцию указанной мРНК или мешает ей, и причем растение или клетка растения является устойчивым к насекомому по сравнению с нетрансформированным растением.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к трансгенному(ой) растению или клетке растения, включающему(ей) интерферирующую нуклеиновую кислоту (РНК или двухцепочечную РНК), которая комплементарна на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% части из по крайней мере 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов или всей мРНК, кодирующей субъединицу протеасомы насекомого, такую как белок Rpn6 (например, ортолог у насекомого белка CG10149 Dm), белок Pros 25 (например, ортолог у насекомого белка CG5266 Dm), белок Rpn2 (например, ортолог у насекомого белка CG11888 Dm), белок в виде β1-субъединицы протеасомы (например, ортолог у насекомого белка CG8392 Dm) или белок Pros бета 2 (например, ортолог у насекомого белка CG3329 Dm), и причем интерферирующая нуклеиновая кислота ингибирует трансляцию указанной мРНК или мешает ей, и причем растение или клетка растения является устойчивым к насекомому по сравнению с нетрансформированным растением.
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к трансгенному(ой) растению или клетке растения, включающему(ей) интерферирующую нуклеиновую кислоту (РНК или двухцепочечную РНК), которая комплементарна на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% части из по крайней мере 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов или всей мРНК, кодирующей β-коатомер пузырька COPI (комплекса Гольджи) насекомого (например, ортолог у насекомого белка CG6223 Dm), γ-коатомер пузырька COPI (например, ортолог у насекомого белка 1528 Dm), белок в виде β’-коатомера (например, ортолог у насекомого белка CG6699 Dm) или ζ-коатомер пузырька COPI (например, ортолог у насекомого белка CG3948 Dm), и причем интерферирующая нуклеиновая кислота ингибирует трансляцию указанной мРНК или мешает ей, и причем растение или клетка растения является устойчивым к насекомому по сравнению с нетрансформированным растением.
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к трансгенному(ой) растению или клетке растения, включающему(ей) интерферирующую нуклеиновую кислоту (РНК или двухцепочечную РНК), которая комплементарна на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% части из по крайней мере 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов или всей мРНК, кодирующей белок Тетраспанин 2 A насекомого, который является предполагаемым белком, содержащим трансмембранные домены, (например, ортолог у насекомого белка CG11415 Dm), и причем интерферирующая нуклеиновая кислота ингибирует трансляцию указанной мРНК или мешает ей, и причем растение или клетка растения является устойчивым к насекомому по сравнению с нетрансформированным растением.
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к трансгенному(ой) растению или клетке растения, включающему(ей) интерферирующую нуклеиновую кислоту (РНК или двухцепочечную РНК), которая комплементарна на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% части из по крайней мере 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов или всей мРНК, кодирующей белок насекомого, относящийся к семейству актинов (например, ортолог у насекомого белка CG5409 Dm), такой как Актин 5C (например, ортолог у насекомого белка CG4027 Dm), и причем интерферирующая нуклеиновая кислота ингибирует трансляцию указанной мРНК или мешает ей, и причем растение или клетка растения является устойчивым к насекомому по сравнению с нетрансформированным растением.
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к трансгенному(ой) растению или клетке растения, включающему(ей) интерферирующую нуклеиновую кислоту (РНК или двухцепочечную РНК), которая комплементарна на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% части из по крайней мере 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов или всей мРНК, кодирующей белок убиквитин-5E насекомого (например, ортолог у насекомого белка CG32744 Dm), и причем интерферирующая нуклеиновая кислота ингибирует трансляцию указанной мРНК или мешает ей, и причем растение или клетка растения является устойчивым к насекомому по сравнению с нетрансформированным растением.
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к трансгенному(ой) растению или клетке растения, включающему(ей) интерферирующую нуклеиновую кислоту (РНК или двухцепочечную РНК), которая комплементарна на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% части из по крайней мере 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов или всей мРНК, кодирующей белок Sec23 насекомого, который является активатором ГТФазы, вовлеченным во внутриклеточный транспорт белков (например, ортолог у насекомого белка CG1250 Dm), и причем интерферирующая нуклеиновая кислота ингибирует трансляцию указанной мРНК или мешает ей, и причем растение или клетка растения является устойчивым к насекомому по сравнению с нетрансформированным растением.
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к трансгенному(ой) растению или клетке растения, включающему(ей) интерферирующую нуклеиновую кислоту (РНК или двухцепочечную РНК), которая комплементарна на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% части из по крайней мере 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов или всей мРНК, кодирующей закрученный белок насекомого, который представляет собой необычный миозин, который вовлечен в двигательную активность (например, ортолог у насекомого белка CG7595 Dm), и причем интерферирующая нуклеиновая кислота ингибирует трансляцию указанной мРНК или мешает ей, и причем растение или клетка растения является устойчивым к насекомому по сравнению с нетрансформированным растением.
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к трансгенному(ой) растению или клетке растения, включающему(ей) интерферирующую нуклеиновую кислоту (РНК или двухцепочечную РНК), которая комплементарна на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% части из по крайней мере 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов или всей мРНК, кодирующей белок с кривым поперечным сужением насекомого, который вовлечен в регуляцию альтернативного сплайсинга мРНК в ядре (например, ортолог у насекомого белка CG3193 Dm), и причем интерферирующая нуклеиновая кислота ингибирует трансляцию указанной мРНК или мешает ей, и причем растение или клетка растения является устойчивым к насекомому по сравнению с нетрансформированным растением.
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к трансгенному(ой) растению или клетке растения, включающему(ей) интерферирующую нуклеиновую кислоту (РНК или двухцепочечную РНК), которая комплементарна на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% части из по крайней мере 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов или всей мРНК, кодирующей белок в виде G-субъединицы вакуолярной H+-АТФазы (например, ортолог у насекомого белка CG6213 Dm), и причем интерферирующая нуклеиновая кислота ингибирует трансляцию указанной мРНК или мешает ей, и причем растение или клетка растения является устойчивым к насекомому по сравнению с нетрансформированным растением.
Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к трансгенному(ой) растению или клетке растения, включающему(ей) интерферирующую нуклеиновую кислоту (РНК или двухцепочечную РНК), которая комплементарна на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% части из по крайней мере 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов или всей мРНК, кодирующей Tbp-1 насекомого; Tat-связывающий белок (например, ортолог у насекомого белка CG10370 Dm), и причем интерферирующая нуклеиновая кислота ингибирует трансляцию указанной мРНК или мешает ей, и причем растение или клетка растения является устойчивым к насекомому по сравнению с нетрансформированным растением.
Краткое описание таблиц и чертежей
Таблица 1: Полинуклеотидные последовательности генов-мишеней, идентифицированных у Leptinotarsa decemlineata (колорадского жука, CPB).
Таблица 2: Аминокислотные последовательности генов-мишеней, идентифицированных у Leptinotarsa decemlineata (колорадского жука, CPB).
Таблица 3: Полинуклеотидные последовательности генов-мишеней, идентифицированных у Lygus hesperus.
Таблица 4: Аминокислотные последовательности генов-мишеней, идентифицированных у Lygus hesperus.
Таблица 5: дцРНК (смысловая цепь, представленная эквивалентной последовательностью ДНК), соответствующие генам-мишеням Leptinotarsa decemlineata.
Таблица 6: дцРНК (смысловая цепь, представленная эквивалентной последовательностью ДНК), соответствующие генам-мишеням Lygus hesperus.
50
Таблица 7: Эффекты дцРНК, происходящих из различных генов-мишеней, на период времени, необходимый для уничтожения 50% личинок CPB, (LT), представленные в виде отношений в сравнение с эффектом дцРНК, происходящей из контрольного гена-мишени Ld248 (SEQ ID NO: 40).
50
Таблица 8: Эффекты дцРНК, происходящих из различных генов-мишеней, на период времени, необходимый для уничтожения 50% взрослых особей CPB, (LT), представленные в виде отношений в сравнение с эффектом дцРНК, происходящей из контрольного гена-мишени Ld248 (SEQ ID NO: 40).
Таблица 9: Эффекты дцРНК, происходящих из различных генов-мишеней, на продукцию яиц CPB.
Сокращения: EM, нормальные кладки; SE, отдельные яйца; YS, желтое липкое вещество; none, нет яиц.
Таблица 10: Относящиеся к выживанию анализы дцРНК, происходящих из мишеней, в сравнение с дцРНК, происходящей из GFP, в присутствии тРНК в анализе кормления личинок Lygus hesperus. Логарифмический ранговый критерий использовали для проверки различий между кривыми выживания в случае дцРНК, происходящей из мишени, (или только корма) и дцРНК, происходящей из GFP, созданными с использованием оценок Каплана-Мейера.
Таблица 11: Ранжирование различных генов-мишеней в соответствии с эффективностью.
Таблица 12: Сравнение кривых выживания в случае исследуемых объектов в концентрации, составляющей 0,1, 0,05 или 0,025 мкг/мкл, с таковыми в случае дцРНК, происходящей из GFP, в концентрации, составляющей 0,1 мкг/мкл. Статистические выкладки выполняли на данных, графически представленных на фиг. 5. ***: P-значение ≤ 0,001; **: 0,001 < P-значение ≤ 0,01; *: 0,01 < P-значение ≤ 0,05; ns: не значимое, P-значение > 0,05.
Таблица 13: Мишени Lygus, в случае которых были клонированы полноразмерные кДНК.
Таблица 14: Полноразмерные полинуклеотидные последовательности генов-мишеней, идентифицированных у Lygus hesperus.
Таблица 15: Аминокислотные последовательности, соответствующие полноразмерным кДНК генов-мишеней, идентифицированных у Lygus hesperus.
Фиг. 1: Эффект дцРНК, происходящих из различных генов-мишеней, на выживание и приспособленность взрослых особей CPB. В случае каждого исследуемого гена-мишени 10 молодым взрослым жукам по отдельности давали в качестве пищи обработанные дцРНК, происходящими из мишеней, листовые диски картофеля (всего 10 мкг дцРНК) в течение первых 24 часов, и впоследствии их размещали вместе на не обработанных листьях картофеля. Число умерших или умирающих насекомых оценивали в течение 14-дневного периода. Данные представлены в виде процента смертности или умирания. В качестве контроля использовали дцРНК, происходящую из GFP, (SEQ ID NO: 245). дцРНК, происходящая из Ld105, (SEQ ID NO: 39), дцРНК, происходящая из Ld248, (SEQ ID NO: 40), дцРНК, происходящая из Ld516, (SEQ ID NO: 29), дцРНК, происходящая из Ld511, (SEQ ID NO: 36), дцРНК, происходящая из Ld512, (SEQ ID NO: 37), дцРНК, происходящая из Ld513, (SEQ ID NO: 22), дцРНК, происходящая из Ld520, (SEQ ID NO: 24), дцРНК, происходящая из Ld537, (SEQ ID NO: 25), дцРНК, происходящая из Ld563, (SEQ ID: NO 38), дцРНК, происходящая из Ld579, (SEQ ID NO: 30).
Фиг. 2: Кривые выживания личинок Lygus hesperus, подвергнутых воздействию 0,5 мкг/мкл дцРНК, происходящей из мишени, в присутствии 5 мкг/мкл дрожжевой тРНК в анализе кормления, (a) Мишени: Lh520 (SEQ ID NO: 143), Lh423 (SEQ ID NO: 152), Lh537 (SEQ ID NO: 144), (b) Мишени: Lh504.2 (SEQ ID NO: 142), Lh512 (SEQ ID NO: 153), Lh334 (SEQ ID NO: 145), (c) Мишени: Lh300.1 (SEQ ID NO: 151), Lh327 (SEQ ID NO: 146), Lh332 (SEQ ID NO: 148), (d) Мишени: Lh237 (SEQ ID NO: 149), Lh579 (SEQ ID NO: 147), Lh261 (SEQ ID NO: 150), Lh513 (SEQ ID NO: 141). В качестве контролей использовали обработку дцРНК, происходящей из GFP, плюс дрожжевая тРНК в тех же концентрациях, соответственно, и только кормом. Каждую молодую личику оставляли на 25 мкл корма в виде 15% сахарозы с включенными исследуемыми компонентами или без них на три дня до переноса их на 50 мкл корма Bioserv. Сложный корм обновляли в день 7. В случае всех обработок n=24.
Фиг. 3: Кривые выживания личинок Lygus hesperus, подвергнутых воздействию 0,5 мкг/мкл дцРНК, происходящей из мишени, в присутствии 5 мкг/мкл дрожжевой тРНК в анализе кормления, причем мишени расположены группами в A, B, C, D в соответствии с эффективностью. Постановка как таковая, описанная на фиг. 2.
Фиг. 4: Кривые выживания в динамике времени личинок Lygus hesperus, подвергнутых воздействию уменьшающихся концентраций (от 0,5 до 0,1 мкг/мкл) дцРНК, происходящей из новой мишени, в присутствии дрожжевой транспортной РНК (5 мкг/мкл) в биоанализах кормления. Каждая обработка в биоанализе состояла из того, что 24 личинок однодневного возраста помещали по отдельности в каждую лунку 24-луночного планшета. Каждую личинку оставляли на парафильме-саше, содержащем рибонуклеиновые кислоты в растворе 15% сахарозы, на 3 дня. В дни 3 и 7 корма заменяли свежим кормом для выведения (Bioserv). В анализы были включены следующие контроли: дцРНК, происходящая из GFP, и только корм.
Фиг. 5: Кривые выживания в динамике времени личинок Lygus hesperus, подвергнутых воздействию уменьшающихся концентраций (от 0,1 до 0,025 мкг/мкл) дцРНК, происходящей из новой мишени, в присутствии дрожжевой транспортной РНК (5 мкг/мкл) в биоанализах кормления. Постановка схожа с таковой, описанной на фиг. 4.
Фиг. 6: Кривые выживания в динамике времени личинок Lygus hesperus, подвергнутых воздействию 0,5 мкг/мкл дцРНК, происходящей из мишени, в присутствии дрожжевой транспортной РНК (5 мкг/мкл) в биоанализах кормления. Исследуемые дцРНК, происходящие из мишеней: Lh105.2 (SEQ ID NO: 254), Lh248.2 (SEQ ID NO: 255), Lh248.3 (SEQ ID NO: 256), Lh327 (SEQ ID NO: 146) and Lh300 (SEQ ID NO: 151). Постановка схожа с таковой, описанной на фиг. 4.
Фиг. 7: Схематическое представление вектора для экспрессии в клетках растений, содержащего кассету для шпилечной РНК Lygus hesperus. RB: правый край; LB: левый край; P35S: промотор 35S вируса мозаики цветной капусты; T35S: терминатор 35S вируса мозаики цветной капусты; TNOS: терминатор гена нопалинсинтазы; GFP: ген зеленого флуоресцентного репортера; NPT II: кодирующая последовательность гена неомицин-фосфотрансферазы II; KmR: ген устойчивости к канамицину; pBR322 ori: начало репликации pBR322; pBR322 bom: мобилизация BR322; pVS1 rep: репликон pVS1; pVS1 sta: элемент стабильности pVS1.
Фиг 8: Постановка анализа картофель-Lygus в полевых условиях. Белые стрелки указывает на повреждение насекомыми.
Фиг. 9: Анализы кормления Lygus на трансгенных растениях картофеля, экспрессирующих шпильку Lh423. Уровень выживания личинок Lygus, питающихся трансгенными растениями картофеля, содержащими шпильку Lh423 (P006/XX) или шпильку GUS (P001/XX). В качестве контроля также использовались растения картофеля дикого типа (WT).
Фиг. 10: Анализы кормления Lygus на положительных трансгенных растениях картофеля, экспрессирующих шпильку Lh423. Уровень выживания личинок Lygus, питающихся трансгенными растениями картофеля, содержащими шпильку Lh423 (P006/59, P006/29 и P006/22) или шпильку GUS (P001/19, P001/28). В качестве контроля также использовались растения картофеля дикого типа (WT). Результаты статистического анализа, на основе анализа кривых выживания с использованием GraphPad:
***=P<0,001; *=0,01<P<0,05.
Подробное описание настоящего изобретения
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что уменьшение экспрессии конкретных генов-мишеней у вида насекомого-вредителя с помощью РНК-интерференции может использоваться для эффективного предотвращения и/или контролирования заражения указанным насекомым-вредителем. Используемый здесь термин «контролирование» заражения вредителем относится к любому эффекту на вредителя, который является полезным для ограничения и/или уменьшения или числа организмов вредителей, и/или ущерба, причиной которого является вредитель. Поэтому предпочтительными генами-мишенями являются важнейшие гены, которые контролируют или регулируют одну или более важнейших биологических функций у насекомого-вредителя, например, деление клеток, репродукцию, энергетический метаболизм, пищеварение, неврологическую функцию и т.п. Уменьшение экспрессии этих важнейших генов с помощью РНК-интерференции может привести к смерти насекомого, или в других обстоятельствах к значительному замедлению роста и развития или снижению способности вредителя к колонизации окружающей среды или заражению организмов хозяев.
Таким образом, в первом аспекте настоящим изобретением обеспечивается интерферирующая рибонуклеиновая кислота (РНК), которая функционирует с момента поглощения видом насекомого-вредителя с уменьшением экспрессии гена-мишени у указанного насекомого вредителя.
Как здесь используется, «ген-мишень» включает любой ген у насекомого-вредителя, экспрессию которого планируют уменьшить. В предпочтительном варианте осуществления экспрессию гена-мишени уменьшают, чтобы контролировать заражение вредителем, например, в результате нарушения важнейшего биологического процесса, происходящего у вредителя, или в результате уменьшения патогенности вредителя. Следовательно, предпочтительные гены-мишени включают, но без ограничения, те, которые играют ключевые роли в регуляции питания, выживания, роста, развития, репродукции, инфестации и инфективности. В соответствии с одним вариантом осуществления ген-мишень является таким, что, когда его экспрессия уменьшается или ингибируется, насекомое-вредитель уничтожается. В соответствии с другим вариантом осуществления ген-мишень является таким, что, когда его экспрессия уменьшается или ингибируется, рост вредителя не допускается или замедляется, или останавливается, или приостанавливается, или задерживается, или предотвращается репродукция вредителя. Тем не менее, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения ген-мишень является таким, что, когда его экспрессия уменьшается или ингибируется, уменьшается ущерб, причиной которого является вредитель и/или способность вредителя к инфицированию или заражению окружающих сред, поверхностей и/или вида растения или культуры; или вредитель прекращает питаться из своих природных источников питания, таких как растения и продукты растений Термины «заражать» и «инфицировать» или «инфестация» и «инфицирование», как правило, используются взаимозаменяемо повсюду.
Гены-мишени могут экспрессироваться во всех или некоторых клетках насекомого-вредителя. К тому же гены-мишени могут экспрессироваться насекомым-вредителем только на конкретной стадии его жизненного цикла, например, фазе половозрелой особи, незрелой фазе нимфы или личинки или фазе яйца.
В конкретных вариантах осуществления настоящим изобретением обеспечиваются гены-мишени, которые кодируют белки, вовлеченные в функционирование протеасомы (субъединицы или регуляторной частицы), рибосомного белка, внутриклеточного транспорта белков, пузырька COPI (оболочечного белкового комплекса), процесса модификации белков, цитоскелета, активности активатора АТФазы или ГТФазы (приведенные в таблицах 7 и 8).
В предпочтительных вариантах осуществления настоящим изобретением обеспечиваются гены-мишени, выбираемые из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, включающую любую из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплемент, или имеющих нуклеотидную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения двух последовательностей идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплементу, или имеющих нуклеотидную последовательность, состоящую из любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплемента, или имеющих нуклеотидную последовательность, включающую фрагмент из по крайней мере 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или его комплемент, или имеющих нуклеотидную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения указанного гена, включающего указанный фрагмент, с любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40 идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплементу, или имеющих нуклеотидную последовательность, включающую фрагмент из по крайней мере 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или его комплемент, и причем после оптимального совмещения и сравнения указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40 указанная нуклеотидная последовательность указанного фрагмента идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% указанному соответствующему фрагменту любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или его комплементу, или являющихся ортологом у насекомого-вредителя гена, имеющего нуклеотидную последовательность, включающую любую из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплемент, причем последовательности двух ортологичных генов схожи настолько, что после оптимального совмещения и сравнения двух генов ортолог имеет последовательность, которая идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% любой из последовательностей, представленной SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или имеющих нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения двух аминокислотных последовательностей идентична на по крайней мере 70%, предпочтительно по крайней мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеотидной последовательностью, представленной любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или имеющих нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения двух аминокислотных последовательностей идентична на по крайней мере 70%, предпочтительно по крайней мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 285, 242, 271, 226, 227, 281, 228, 282, 229, 230-233, 234, 283, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 284, 241, 243, 244, 286, 269, 270, 287, 288, 206-225; и причем нуклеотидная последовательность указанного гена не длиннее, чем 5000, 4000, 3000, 2000 или 1500 нуклеотидов.
Используемый здесь термин «идентичность последовательностей» используется для описания родства двух или более нуклеотидных или аминокислотных последовательностей. Процент «идентичности двух последовательностей» определяют посредством сравнения двух подвергнутых оптимальному совмещению последовательностей на протяжении окна сравнения (определенного числа положений), причем часть последовательности в окне сравнения может включать добавления или делеции (т.е. пропуски) по сравнению с контрольной последовательностью для достижения оптимального совмещения. Процент идентичности последовательностей рассчитывают посредством определения числа положений, в которых идентичное(ый) нуклеотидное основание или аминокислотный остаток встречается в обеих последовательностях, для получения числа «совпадающих» положений, деления числа совпавших оснований на общее число положений в окне сравнения и умножения результата на 100. В случае сравнения двух подвергнутых оптимальному совмещению последовательностей окно сравнения будет определяться полной длиной совмещенных областей. Способы и программное обеспечение для определения идентичности последовательностей имеются в данной области техники и включают программное обеспечение Blast и анализ GAP. В случае нуклеиновых кислот процент идентичности предпочтительно рассчитывают с использованием метода совмещения BlastN, в соответствии с которым процент идентичности рассчитывают на протяжении всей длины нуклеотидной последовательности запроса.
Квалифицированному в данной области техники специалисту будет понятно, что можно идентифицировать гомологи или ортологи (гомологи, существующие в различных видах) генов-мишеней, представленных любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40. Эти гомологи и/или ортологи у насекомых-вредителей находятся также в пределах объема настоящего изобретения. Предпочтительными гомологами и/или ортологами являются гены, последовательности которых схожи настолько, что после оптимального совмещения и сравнения двух генов гомолог и/или ортолог имеет последовательность, которая идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80% или 85%, более предпочтительно по крайней мере 90% или 95%, и наиболее предпочтительно по крайней мере приблизительно 99% любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40 или ее комплементу.
Другими гомологами являются гены, которые являются аллелями гена, включающего последовательность, представленную любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40. Кроме того, предпочтительными гомологами являются гены, включающие по крайней мере один однонуклеотидный полиморфизм (SNP) по сравнению с геном, включающим последовательность, представленную любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40.
«Интерферирующая рибонуклеиновая кислота (РНК)» настоящего изобретения включает любой тип молекулы РНК, способный к уменьшению или выключению экспрессии гена-мишени, включая но без ограничения, смысловую РНК, антисмысловую РНК, короткую интерферирующую РНК (киРНК), микроРНК, двухцепочечную РНК (дцРНК), короткую шпилечную РНК (кшРНК) и т.п. Способы анализа функциональных молекул интерферирующих РНК хорошо известны в данной области техники и описываются здесь в другом месте.
Молекулы интерферирующих РНК настоящего изобретения производят специфическое в отношении последовательности уменьшение экспрессии гена-мишени в результате связывания с нуклеотидной последовательностью-мишенью внутри гена-мишени. Связывание происходит в результате спаривания оснований между комплементарными районами интерферирующей РНК и нуклеотидной последовательности-мишени. Используемый здесь термин «элемент сайленсинга» относится к части или району интерферирующей РНК, включающей или состоящей из последовательность(и) нуклеотидов, которая комплементарна, или по крайней мере частично комплементарна, нуклеотидной последовательности-мишени внутри гена-мишени, и которая функционирует в качестве активной части интерферирующей РНК с предписанием уменьшения экспрессии указанного гена-мишени. В одном варианте осуществления настоящего изобретения элемент сайленсинга включает или состоит из последовательности из по крайней мере 17 следующих друг за другом нуклеотидов, предпочтительно по крайней мере 18 или 19 следующих друг за другом нуклеотидов, более предпочтительно по крайней мере 21 следующего друг за другом нуклеотида, даже более предпочтительно по крайней мере 22, 23, 24 или 25 следующих друг за другом нуклеотидов, комплементарной нуклеотидной последовательности-мишени внутри гена-мишени.
Как здесь используется, «экспрессия гена-мишени» относится к транскрипции и аккумуляции РНК-транскрипта, кодируемого геном-мишенью, и/или трансляции мРНК в белок. Термин «уменьшают экспрессию (осуществляют отрицательную регуляцию», как предполагается, относится к любому из известных в данной области техники способов, с помощью которого молекулы интерферирующих РНК уменьшают уровень первичных РНК-транскриптов, мРНК или белка, продуцируемых с гена-мишени. В некоторых вариантах осуществления уменьшение экспрессии относится к ситуации, в соответствии с которой уровень РНК или белка, продуцируемых с гена, уменьшается на по крайней мере 10%, предпочтительно на по крайней мере 33%, более предпочтительно на по крайней мере 50%, еще более предпочтительно на по крайней мере 80%. В особо предпочтительных вариантах осуществления уменьшение экспрессии относится к уменьшению уровня РНК или белка, продуцируемых с гена, на по крайней мере 80%, предпочтительно на по крайней мере 90%, более предпочтительно на по крайней мере 95% и наиболее предпочтительно на по крайней мере 99% в клетках насекомого-вредителя по сравнению с соответствующим контрольным насекомым-вредителем, которое, например, не подвергалось воздействию интерферирующей РНК или было подвернуто воздействию контрольной молекулы интерферирующей РНК. Способы выявления уменьшений уровней РНК или белка хорошо известны в данной области техники и включают гибридизацию РНК в растворе, Нозерн-гибридизацию, обратную транскрипцию (например, количественный анализ с использованием ОТ-ПЦР), анализ с использованием микрочипов, связывание антител, иммуноферментный твердофазный анализ (ELISA) и Вестерн-блоттинг. В другом варианте осуществления настоящего изобретения уменьшение экспрессии относится к уменьшению уровней РНК или белка, достаточному для того, чтобы привести к выявляемому изменению фенотипа вредителя по сравнению с соответствующим контрольным вредителем, например, к гибели клеток, прекращению роста или т.п. Уменьшение экспрессии можно, таким образом, определить с помощью фенотипического исследования насекомого-вредителя, используя обычные в данной области техники методы.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения интерферирующая РНК уменьшает экспрессию генов с помощью РНК-интерференции. РНК-интерференция является процессом специфического для последовательностей регуляции генов, типично опосредуемой молекулами двухцепочечных РНК, такими как короткие интерферирующие РНК (киРНК). киРНК включают смысловую цепь РНК, подвергнутую отжигу в результате спаривания комплементарных оснований с антисмысловой цепью РНК. Смысловая цепь или «направляющая цепь» молекулы киРНК включает последовательность нуклеотидов, комплементарную последовательности нуклеотидов, находящейся в РНК-транскрипте с гена-мишени. Следовательно, смысловая цепь киРНК способна к отжигу с РНК-транскриптом посредством спаривания оснований типа Уотсона-Крика и превращению РНК в мишень для деградации внутри клеточного комплекса, известного как индуцируемый РНК-интерференцией комплекс сайленсинга или RISC. Таким образом, в связи с предпочтительными молекулами интерферирующих РНК настоящего изобретения элемент сайленсинга, упоминаемый здесь, может представлять собой двухцепочечный район, включающий подвергнутые отжигу комплементарные цепи, по крайней мере одна из которых включает или состоит из последовательность(и) нуклеотидов, которая комплементарна или по крайней мере частично комплементарна нуклеотидной последовательности-мишени внутри гена-мишени. В одном варианте осуществления длина двухцепочечного района составляет по крайней мере 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200 пар оснований.
Более длинные молекулы двухцепочечных РНК (дцРНК), включающие один или более функциональных двухцепочечных элементов сайленсинга, описываемых здесь в другом месте, и способные к опосредуемому РНК-интерференцией выключению генов, также предусматриваются в объеме настоящего изобретения. Такие более длинные молекулы дцРНК включают по крайней мере 80, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000 или 1100 пар оснований. Эти молекулы дцРНК могут служить в качестве предшественников активных молекул киРНК, которые направляют РНК-транскрипт в комплекс RISC для последующей деградации. Молекулы дцРНК, присутствующие в среде, окружающей организм или его клетки, могут усваиваться организмом и подвергаться процессингу под действием фермента, называемого Дайсер, с выходом молекул киРНК. Альтернативно, дцРНК может продуцироваться in vivo, т.е. транскрибироваться с кодирующего ее полинуклеотида или полинуклеотидов в клетке, например, бактериальной клетке или клетке растения, и впоследствии подвергаться процессированию под действием Дайсера или в клетке-хозяине, или предпочтительно в клетках насекомого-вредителя после поглощения более длинной дцРНК-предшественника. дцРНК может образовываться из двух отдельных (смысловой и антисмысловой) цепей РНК, которые подвергаются отжигу в силу спаривания комплементарных оснований. Альтернативно, дцРНК может быть одиночной цепью, которая способна к загибанию на себя с образованием короткой шпилечной РНК (кшРНК) или структуры «петля-на-стебле». В случае кшРНК двухцепочечный район или «стебель» образуется из двух районов или сегментов РНК, которые по существу являются инвертированными повторами друг друга и обладают достаточной комплементарностью, чтобы сделать возможным образованием двухцепочечного района. Один или более функциональных двухцепочечных элементов сайленсинга может присутствовать в этом «стеблевом районе» молекулы. Районы инвертированных повторов типично разделяет район или сегмент РНК, известный как «петлевой» район. Этот район может включать любую нуклеотидную последовательность, дающую достаточную гибкость для допуска возникновения самоспаривания между фланкирующими комплементарными районами РНК. Как правило, петлевой район является в основном одноцепочечным и выполняет функцию спейсерного элемента между инвертированными повторами.
Все молекулы интерферирующих РНК настоящего изобретения производят специфическое в отношении последовательности уменьшение экспрессии гена-мишени в результате связывания с нуклеотидной последовательностью-мишенью внутри гена-мишени. Связывание происходит в результате спаривания комплементарных оснований между элементом сайленсинга интерферирующей РНК и нуклеотидной последовательности-мишени. В одном варианте осуществления настоящего изобретения нуклеотидная последовательность-мишень включает последовательность нуклеотидов, представляемую РНК-транскриптом с гена-мишени, или его фрагментом, причем длина фрагмента предпочтительно составляет по крайней мере 17 нуклеотидов, более предпочтительно по крайней мере 18, 19 или 20 нуклеотидов или наиболее предпочтительно по крайней мере 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000 или 1100 нуклеотидов. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения нуклеотидная последовательность-мишень включает последовательность нуклеотидов, эквивалентную РНК-транскрипту, кодируемому любым из полинуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из
(i) полинуклеотида, который включает по крайней мере 21, предпочтительно по крайней мере 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов нуклеотидной последовательности, представленной любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120, или ее комплементом, или
(ii) полинуклеотида, который состоит из по крайней мере 21, предпочтительно по крайней мере 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов нуклеотидной последовательности, представленной любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120, или ее комплементом, или
(iii) полинуклеотида, который включает по крайней мере 21, предпочтительно по крайней мере 22, 23 или 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов нуклеотидной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120, или ее комплементе, причем после оптимального совмещения и сравнения двух последовательностей указанный полинуклеотид идентичен на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120, или ее комплементу, или
(iv) полинуклеотида, который включает фрагмент из по крайней мере 21, предпочтительно по крайней мере 22, 23 или 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов нуклеотидной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120, или его комплемент, и причем указанный фрагмент или указанный комплемент имеет нуклеотидную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120 идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% указанному соответствующему фрагменту любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120 или его комплементу, или
(v) полинуклеотида, который состоит из фрагмента из по крайней мере 21, предпочтительно по крайней мере 22, 23 или 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов нуклеотидной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120, или его комплемента, и причем указанный фрагмент или указанный комплемент имеет нуклеотидную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120 идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% указанному соответствующему фрагменту любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120 или его комплементу, или
(vi) полинуклеотида, кодирующего аминокислотную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения двух аминокислотных последовательностей идентична на крайней мере 70%, предпочтительно по крайней мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеотидной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120, или
(vii) полинуклеотида, кодирующего аминокислотную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения двух аминокислотных последовательностей идентична на по крайней мере 70%, предпочтительно по крайней мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 285, 242, 271, 226, 227, 281, 228, 282, 229, 230-233, 234, 283, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 284, 241, 243, 244, 286, 269, 270, 287, 288, 206-225. В более предпочтительном варианте нуклеотидной последовательности-мишени длина указанного полинуклеотида не превышает 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000 или 1500 нуклеотидов.
Предпочтительно молекулы интерферирующих РНК настоящего изобретения включают по крайней мере один двухцепочечный район, типично элемент сайленсинга интерферирующей РНК, включающий смысловую цепь РНК, подвергнутую отжигу в результате спаривания комплементарных оснований с антисмысловой цепью РНК, причем смысловая цепь молекулы дцРНК включает последовательность нуклеотидов, комплементарную последовательности нуклеотидов, находящейся в РНК-транскрипте с гена-мишени.
Элемент сайленсинга, или по крайней мере одна его цепь, причем элемент сайленсинга является двухцепочечным, может быть полностью комплементарен или частично комплементарен нуклеотидной последовательности-мишени гена-мишени. Используемый здесь термин «полностью комплементарен» означает, что все основания нуклеотидной последовательности элемента сайленсинга комплементарны основаниям или совпадают с основаниями нуклеотидной последовательности-мишени. Термин «по крайней мере частично комплементарен» означает, что существует менее чем 100% совпадение между основаниями элемента сайленсинга и основаниями нуклеотидной последовательности-мишени. Квалифицированному специалисту будет понятно, что необходимо, чтобы элемент сайленсинга был лишь по крайней мере частично комплементарен нуклеотидной последовательности-мишени, чтобы опосредовать уменьшение экспрессии гена-мишени. В данной области техники известно, что последовательности РНК со вставками, делециями или несоответствиями относительно последовательности-мишени могут, тем не менее, быть эффективные в РНК-интерференции. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительно, когда последовательности элемента сайленсинга и нуклеотидной последовательности-мишени гена-мишени идентичны на по крайней мере 80% или 85%, предпочтительно по крайней мере 90% или 95%, или более предпочтительно на по крайней мере 97% или 98% и еще более предпочтительно на по крайней мере 99%. Альтернативно, элемент сайленсинга может включать 1, 2 или 3 несоответствия по сравнению с нуклеотидной последовательностью-мишенью на протяжении каждой длины, составляющей 24 частично комплементарных нуклеотида.
Квалифицированному в данной области техники специалисту будет понятно, что степень комплементарности, которую разделяют элемент сайленсинга и нуклеотидная последовательность-мишень, может варьировать в зависимости от гена-мишени, экспрессия которого должна уменьшиться, и в зависимости от вида насекомого-вредителя, у которого экспрессия гена должна контролироваться.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения элемент сайленсинга включает последовательность нуклеотидов, которая является РНК-эквивалентом любого из полинуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из (i) полинуклеотида, который включает по крайней мере 21, предпочтительно по крайней мере 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов нуклеотидной последовательности, представленной любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120, или ее комплементом, или (ii) полинуклеотида, который включает по крайней мере 21, предпочтительно по крайней мере 22, 23 или 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов нуклеотидной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120, или ее комплементе, причем после оптимального совмещения и сравнения двух последовательностей указанный полинуклеотид идентичен на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120, или ее комплементу, или (iii) полинуклеотида, который включает фрагмент из по крайней мере 21, предпочтительно по крайней мере 22, 23 или 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов нуклеотидной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120, или его комплемент, и причем указанный фрагмент или указанный комплемент имеет нуклеотидную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120 идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% указанному соответствующему фрагменту любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120 или его комплементу, причем указанный полинуклеотид не длиннее, чем 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000 или 1500 нуклеотидов. Будет понятно, что в таких вариантах осуществления элемент сайленсинга может включать или состоять из район(а) двухцепочечной РНК, включающий(его) подвергнутые отжигу комплементарные цепи, одна из которых, смысловая цепь, включает последовательность нуклеотидов, по крайней мере частично комплементарную нуклеотидной последовательности-мишени внутри гена-мишени.
Нуклеотидную последовательность-мишень можно выбрать из любого подходящего района или нуклеотидной последовательности гена-мишени или РНК-транскрипта с него. Например, нуклеотидная последовательность-мишень может находиться внутри 5'UTR или 3'UTR гена-мишени или РНК-транскрипта или внутри экзонных или интронных районов гена.
Квалифицированный специалист будет осведомлен о способах идентификации наиболее подходящих нуклеотидных последовательностей-мишеней в рамках полноразмерного гена-мишени. Например, можно синтезировать и проверить множество элементов сайленсинга, мишенями которых являются различные районы гена-мишени. Альтернативно, расщепление РНК-транскрипта такими ферментами, как РНКаза H, можно использовать для определения сайтов в РНК, которые находятся в конформации, чувствительной к сайленсингу гена. Сайты-мишени можно также идентифицировать, используя методы компьютерного моделирования, например, используя компьютерные алгоритмы, разработанные для предсказания эффективности сайленсинга генов на основе различных сайтов-мишеней внутри полноразмерного гена.
Интерферирующие РНК настоящего изобретения могут включать один элемент сайленсинга или множество элементов сайленсинга, причем каждый элемент сайленсинга включает или состоит из последовательность(и) нуклеотидов, которая по крайней мере частично комплементарна нуклеотидной последовательности-мишени внутри гена-мишени и которая функционирует с момента поглощения видом насекомого-вредителя с уменьшением экспрессии указанного гена-мишени. Конкатемерные РНК-конструкции этого типа описываются в заявке WO2006/046148, которая включена сюда посредством ссылки. В контексте настоящего изобретения термин «множество» означает по крайней мере два, по крайней мере три, по крайней мере четыре и т.д. и вплоть до по крайней мере 10, 15, 20 или по крайней мере 30. В одном варианте осуществления интерферирующая РНК включает множество копий одного элемента сайленсинга, т.е. повторы элемента сайленсинга, который связывается с конкретной нуклеотидной последовательностью-мишенью внутри конкретного гена-мишени. В другом варианте осуществления элементы сайленсинга внутри интерферирующей РНК включают или состоят из различные(х) последовательности(ей) нуклеотидов, комплементарных различных нуклеотидным последовательностям-мишеням. Должно быть понятно, что комбинации множества копий одного и того же элемента сайленсинга с элементами сайленсинга, связывающимися с различными нуклеотидными последовательностями-мишенями, находятся в объеме настоящего изобретения.
Различные нуклеотидные последовательности-мишени могут происходить из одного гена-мишени у насекомого-вредителя для достижения увеличенного уменьшения экспрессии конкретного гена-мишени у вида насекомого-вредителя. В этом случае элементы сайленсинга могут быть объединены в интерферирующей РНК в исходном порядке, в котором нуклеотидные последовательности-мишени встречаются в гене-мишени, или элементы сайленсинга могут быть перемешены и объединены в любом порядке по рангу в рамках интерферирующей РНК по сравнению с порядком нуклеотидных последовательностей-мишеней в гене-мишени.
Альтернативно, различные нуклеотидные последовательности-мишени представляют один ген-мишень, но происходят от различных видов насекомых-вредителей.
Альтернативно, различные нуклеотидные последовательности-мишени могут происходить из различных генов-мишеней. Если интерферирующая РНК предназначена для применения для предотвращения и/или контролирования заражения вредителем, предпочтительно, когда различные гены-мишени выбирают из группы генов, регулирующих важнейшие биологические функции вида насекомого-вредителя, включающие, но без ограничения, выживание, рост, развитие, репродукцию и патогенность. Гены-мишени могут регулировать одинаковые или различные биологические пути или процессы. В одном варианте осуществления по крайней мере один из элементов сайленсинга включает или состоит из последовательность(и) нуклеотидов, которая по крайней мере частично комплементарна нуклеотидной последовательности-мишени внутри гена-мишени, причем ген-мишень (i) выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, включающую SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплемент, или имеющих нуклеотидную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения двух последовательностей идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно на по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплементу, или (ii) выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, включающую фрагмент из по крайней мере 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или его комплемент, или имеющих нуклеотидную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения указанного гена, включающего указанный фрагмент, с любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40 идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплементу, или (iii) выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, включающую фрагмент из по крайней мере 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или его комплемент, и причем после оптимального совмещения и сравнения указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40 указанная нуклеотидная последовательность указанного фрагмента идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% указанному соответствующему фрагменту любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или его комплементу, или (iv) является ортологом у насекомого-вредителя гена, имеющего нуклеотидную последовательность, включающую любую из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплемент, причем последовательности двух ортологичных генов схожи настолько, что после оптимального совмещения и сравнения двух генов ортолог имеет последовательность, которая идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% любой из последовательностей, представленной SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или (v) выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения двух аминокислотных последовательностей идентична на по крайней мере 70%, предпочтительно по крайней мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеотидной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или (vi) выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения двух аминокислотных последовательностей идентична на по крайней мере 70%, предпочтительно по крайней мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 285, 242, 271, 226, 227, 281, 228, 282, 229, 230-233, 234, 283, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 284, 241, 243, 244, 286, 269, 270, 287, 288, 206-225. Предпочтительно, когда нуклеотидная последовательность гена-мишени не длиннее, чем 5000, 4000, 3000, 2000 или 1500 нуклеотидов.
В дальнейшем варианте осуществления настоящего изобретения различные гены, являющиеся мишенями различных элементов сайленсинга, происходят от одного и того же вида насекомого-вредителя. Этот подход предназначен для усиленного нападения на один вид насекомого-вредителя. В частности, различные гены-мишени могут экспрессироваться дифференциально на различных стадиях жизненного цикла насекомого, например, стадии половозрелой особи, незрелых стадиях личинки и яйца. Таким образом, интерферирующая РНК настоящего изобретения может использоваться для предотвращения и/или контролирования заражения насекомым-вредителем на более чем одной стадии жизненного цикла насекомого.
В альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения различные гены, являющиеся мишенями различных элементов сайленсинга, происходят от различных видов насекомых-вредителей. Таким образом, интерферирующая РНК настоящего изобретения может использоваться для предотвращения и/или контролирования заражения более чем одним видом насекомого-вредителя одновременно.
Элементы сайленсинга могут располагаться в виде одного непрерывного района интерферирующей РНК или могут быть разделены в результате присутствия линкерных последовательностей. Линкерная последовательность может включать короткую произвольную нуклеотидную последовательность, которая не является комплементарной каким-либо нуклеотидным последовательностям-мишеням или генам-мишеням. В одном варианте осуществления линкер является саморасщепляемой при определенных условиях последовательностью РНК, предпочтительно чувствительным к pH линкером или чувствительным к гидрофобным условиям линкером. В одном варианте осуществления линкер включает последовательность нуклеотидов, эквивалентную интронной последовательности. Длина линкерных последовательностей настоящего изобретения может находиться в диапазоне от приблизительно 1 пары оснований до приблизительно 10000 пар оснований, при условии, что линкер не ослабляет способность интерферирующей РНК к уменьшению экспрессии гена(ов)-мишени.
Помимо элемента(ов) сайленсинга и любых линкерных последовательностей интерферирующая РНК настоящего изобретения может включать по крайней мере одну дополнительную полинуклеотидную последовательность. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения дополнительную последовательность выбирают из (i) последовательности, способной к защите интерферирующей РНК от процессирования РНК, (ii) последовательности, оказывающей эффект на стабильность интерферирующей РНК, (iii) последовательности, делающей возможным связывание с белком, например, для способствования вводу интерферирующей РНК в клетки вида насекомого-вредителя, (iv) последовательности, облегчающей широкомасштабную продукцию интерферирующей РНК, (v) последовательности, которая является аптамером, который связывается с рецептором или с молекулой на поверхности клеток насекомого-вредителя, для способствования ее вводу, или (v) последовательности, которая катализирует процессирование интерферирующей РНК в клетках насекомого-вредителя и тем самым увеличивает эффективность интерферирующей РНК. Структуры для увеличения стабильности молекул РНК хорошо известны в данной области техники и описываются, кроме того, в WO2006/046148, которая включена сюда посредством ссылки.
Длина интерферирующей РНК настоящего изобретения должна быть достаточной для ввода в клетки вида насекомого-вредителя и уменьшения экспрессии генов-мишеней у вредителя, как описывается здесь в другом месте. Однако верхняя граница длины может зависеть от (i) требования ввода интерферирующей РНК в клетки вредителя, и (ii) требования процессирования интерферирующей РНК в клетках вредителя для опосредования выключения генов через путь с использованием РНК-интерференции. Длину может также определять способ продуцирования и препарат для доставки интерферирующей РНК в клетки. Предпочтительно длина интерферирующей РНК настоящего изобретения будет находиться между 21 и 10000 нуклеотидов, предпочтительно между 50 и 5000 нуклеотидов или между 100 и 2500 нуклеотидов, более предпочтительно между 80 и 2000 нуклеотидов.
Интерферирующая РНК может содержать основания ДНК, неприродные основания или неприродные остовные связи или модификации сахарофосфатного остова, например, для увеличения стабильности во время хранения или увеличения устойчивости к деградации под действием нуклеаз. Кроме того, интерферирующую РНК может получить химически или ферментативно квалифицированный в данной области техники специалист посредством выполняемых вручную или автоматизированных реакций.
Альтернативно, интерферирующая РНК может транскрибироваться с кодирующего ее полинуклеотида. Таким образом, здесь обеспечивается выделенный полинуклеотид, кодирующий любую из интерферирующих РНК настоящего изобретения.
Здесь также обеспечивается выделенный полинуклеотид, выбираемый из группы, состоящей из
(i) полинуклеотида, который включает по крайней мере 21, предпочтительно по крайней мере 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов нуклеотидной последовательности, представленной любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251-254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120, или ее комплементом, или
(ii) полинуклеотида, который состоит из по крайней мере 21, предпочтительно по крайней мере 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов нуклеотидной последовательности, представленной любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120, или ее комплементом, или
(iii) полинуклеотида, который включает по крайней мере 21, предпочтительно по крайней мере 22, 23 или 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов нуклеотидной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120, или ее комплементе, причем после оптимального совмещения и сравнения двух последовательностей указанный полинуклеотид идентичен на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120, или ее комплементу, или
(iv) полинуклеотида, который включает фрагмент из по крайней мере 21, предпочтительно по крайней мере 22, 23 или 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов нуклеотидной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120, или его комплемент, и причем указанный фрагмент или указанный комплемент имеет нуклеотидную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120 идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% указанному соответствующему фрагменту любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120 или его комплементу, или
(v) полинуклеотида, который состоит из фрагмента из по крайней мере 21, предпочтительно по крайней мере 22, 23 или 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов нуклеотидной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120, или его комплемента, и причем указанный фрагмент или указанный комплемент имеет нуклеотидную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120 идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% указанному соответствующему фрагменту любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120 или его комплементу, или
(vi) полинуклеотида, кодирующего аминокислотную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения двух аминокислотных последовательностей идентична на по крайней мере 70%, предпочтительно по крайней мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеотидной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 198-201, 121, 122, 141, 154-157, 273, 123, 142, 158-161, 274, 124, 143, 162-165, 125-129, 144, 166-169, 130, 145, 170-173, 275, 131, 146, 174-177, 132, 133, 147, 178-181, 134, 148, 182-185, 135, 149, 186-189, 136, 150, 190-193, 276, 137, 151, 194-197, 139, 140, 153, 202-205, 278, 251, 254, 257-260, 279, 252, 255, 256, 261-268, 280, 1, 21, 41-44, 2, 22, 45-48, 3, 23, 49-52, 4, 24, 53-56, 5, 25, 57-60, 6, 26, 61-64, 7, 27, 65-68, 8, 28, 69-72, 9, 29, 73-76, 10, 30, 77-80, 11, 31, 81-84, 12, 32, 85-88, 13, 33, 89-92, 14, 34, 93-96, 15, 35, 97-100, 16, 36, 101-104, 17, 37, 105-108, 18, 38, 109-112, 19, 39, 113-116, 20, 40, 117-120, или
(vii) полинуклеотида, кодирующего аминокислотную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения двух аминокислотных последовательностей идентична на по крайней мере 70%, предпочтительно по крайней мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 285, 242, 271, 226, 227, 281, 228, 282, 229, 230-233, 234, 283, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 284, 241, 243, 244, 286, 269, 270, 287, 288, 206-225, и причем указанный полинуклеотид не длиннее, чем 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000 или 1500 нуклеотидов.
В предпочтительных вариантах осуществления выделенный полинуклеотид является частью молекулы интерферирующей РНК, типично частью элемента сайленсинга, включающей по крайней мере один двухцепочечный район, включающий смысловую цепь РНК, подвергнутую отжигу в результате спаривания комплементарных оснований с антисмысловой цепью РНК, причем смысловая цепь молекулы дцРНК включает последовательность нуклеотидов, комплементарную последовательности нуклеотидов, находящейся в РНК-транскрипте с гена-мишени. Следовательно, смысловая цепь дцРНК способна к отжигу к РНК-транскрипту и превращению РНК в мишень для деградации внутри индуцируемого РНК-интерференцией комплекса сайленсинга или RISC.
Полинуклеотиды настоящего изобретения могут быть встроены посредством обычных методов молекулярного клонирования в ДНК-конструкции или векторы, известные в данной области техники. Следовательно, в соответствии с одним вариантом осуществления обеспечивается ДНК-конструкция, включающая любой из полинуклеотидов настоящего изобретения. Предпочтительно здесь обеспечивается ДНК-конструкция, включающая полинуклеотид, кодирующий любую из интерферирующих РНК настоящего изобретения. ДНК-конструкцией может быть рекомбинантный ДНК-вектор, например, бактериальный или дрожжевой вектор или плазмида. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ДНК-конструкцией является экспрессионная конструкция, и полинуклеотид функционально связан с по крайней мере одной регуляторной последовательностью, способной к управлению экспрессией полинуклеотидной последовательности. Термин «регуляторная последовательность» должен пониматься в широком смысле и, как предполагается, относится к любой нуклеотидной последовательности, способной к осуществлению экспрессии полинуклеотидов, с которыми она функционально связана, включая, но без ограничения, промоторы, энхансеры и другие встречающиеся в природе или синтетические элементы-активаторы транскрипции. Регуляторная последовательность может находиться на 5'- или 3'-конце полинуклеотидной последовательности. Термин «функционально связанный» относится к функциональной связи между регуляторной последовательностью и полинуклеотидной последовательностью, так что регуляторная последовательность управляет экспрессией полинуклеотида. Функционально связанные элементы могут быть прилегающими или неприлегающими.
Предпочтительно регуляторной последовательностью является промотор, выбираемый из группы, включающей, но без ограничения, конститутивные промоторы, индуцируемые промоторы, тканеспецифические промоторы и специфические для стадии роста/развития промоторы. В одном варианте осуществления полинуклеотид помещен под контроль сильного конститутивного промотора, такого как любой промотор, выбираемый из группы, включающей промотор CaMV35S, удвоенный промотор CaMV35S, промотор убиквитина, промотор актина, промотор рибулозобисфосфаткарбоксилазы, промотор GOS2, промотор 34S вируса мозаики норичника. В другом варианте осуществления регуляторной последовательностью является промотор растения для применения для регулирования экспрессии полинуклеотида в растениях. Промоторы растений, в частности, тканеспецифические промоторы растений, включенные в объем настоящего изобретения, описываются подробнее здесь в другом месте.
Необязательно одна или более последовательностей терминации транскрипции могут быть включены в экспрессионную конструкцию настоящего изобретения. Термин «последовательность терминации транскрипции» включает контролирующую последовательность на конце транскрипционной единицы, которая сигнализирует о терминации транскрипции, 3' процессировании и полиаденилировании первичного транскрипта. Дополнительные регуляторные последовательности, включающие, но без ограничения, энхансеры транскрипции или трансляции, могут быть включены в экспрессионную конструкцию, например, как в случае с удвоенным, усиленным промотором CaMV35S.
Настоящее изобретение также включает способ создания любой из интерферирующих РНК настоящего изобретения, включающий стадии (i) контактирования полинуклеотида, кодирующего указанную интерферирующую РНК, или включающей его ДНК-конструкции с бесклеточными компонентами; или (ii) введения (например, с помощью трансформации, трансфекции или инъекции) полинуклеотида, кодирующего указанную интерферирующую РНК, или включающей его ДНК-конструкции в клетку. Соответственно, здесь также обеспечивается клетка-хозяин, включающая любую из интерферирующих РНК настоящего изобретения, любой из полинуклеотидов настоящего изобретения или включающую его ДНК-конструкцию. Клеткой-хозяином может быть прокариотическая клетка, включая, но без ограничения, грамположительные и грамотрицательные бактериальные клетки, или эукариотическая клетка, включая, но без ограничения, дрожжевые клетки или клетки растений. Предпочтительно указанной клеткой-хозяином является бактериальная клетка или клетка растения. Бактериальную клетку можно выбрать из группы, включающей, но без ограничения, грамположительные и грамотрицательные клетки, включающие Escherichia spp. (например, E. coli), Bacillus spp. (например, B. thuringiensis), Rhizobium spp., Lactobacilllus spp., Lactococcus spp., Pseudomonas spp. и Agrobacterium spp. Полинуклеотид или ДНК-конструкция настоящего изобретения может существовать или сохраняться в клетке-хозяине в виде экстрахромосомного элемента или может стабильно включаться в геном клетки-хозяина. Характеристики, представляющие особый интерес при выборе клетки-хозяина для целей настоящего изобретения, включают легкость введения в хозяина полинуклеотида или ДНК-конструкции, кодирующего(ей) интерферирующую РНК, наличие совместимых экспрессионных систем, эффективность экспрессии и стабильность интерферирующей РНК в хозяине.
ДНК-конструкция настоящего изобретения может, кроме того, включать начало репликации (ori), которое необходимо для сохранения и/или репликации в конкретном типе клеток или клетке-хозяине. Одним примером является случай, когда необходимо, чтобы экспрессионная конструкция сохранялась в бактериальной клетке в виде экстрахромосомного или эписомного генетического элемента (например, молекулы плазмиды или космиды) в клетке. Предпочтительные начала репликации включают, но без ограничения, f1-ori, pBR322 ori (pMB1) и colE1 ori.
Рекомбинантная конструкция может необязательно включать ген селектируемого маркера. Используемый здесь термин «ген селектируемого маркера» включает любой ген, который сообщает клетке, в которой он экспрессируется, фенотип, который облегчает идентификацию и/или отбор клеток, которые трансфецированы или трансформированы экспрессионной конструкцией настоящего изобретения. Примеры подходящих селектируемых маркеров включают гены устойчивости к ампициллину (Ampr), тетрациклину (Tcr), канамицину (Kanr), фосфинотрицину и хлорамфениколу (CAT). Другие подходящие гены маркеров обеспечивают метаболический признак, например manA. Гены визуальных маркеров могут также использоваться и включают, например, бета-глюкуронидазу (GUS), люциферазу и зеленый флуоресцентный белок (GFP).
В тех случаях, когда интерферирующая РНК экспрессируется в клетке-хозяине и/или используется для предотвращения и/или контролирования заражения вредителем организма хозяина, предпочтительно, чтобы интерферирующая РНК не проявляла значительный «нецелевой» эффект, т.е. чтобы интерферирующая РНК не оказывала эффект на экспрессию генов внутри хозяина. Предпочтительно элемент сайленсинга не демонстрирует значительную комплементарность с нуклеотидными последовательностями, отличными от нуклеотидной последовательности - намеченной мишени гена-мишени. В одном варианте осуществления настоящего изобретения элемент сайленсинга демонстрирует составляющую менее чем 30%, более предпочтительно менее чем 20%, более предпочтительно менее чем 10% и даже более предпочтительно менее чем 5% идентичность последовательности с любым геном клетки-хозяина или организма хозяина. В случае наличия данных, касающихся геномной последовательности организма хозяина, можно перекрестно проверить идентичность с элементом сайленсинга, используя стандартные способы биоинформатики. В одном варианте осуществления нет идентичности последовательностей между элементом сайленсинга и геном клетки-хозяина или организма хозяина на протяжении района из 17, более предпочтительно на протяжении района из 18 или 19 и наиболее предпочтительно на протяжении района из 20 или 21 следующих друг за другом нуклеотидов.
Любая из молекул интерферирующих РНК или ДНК-конструкций, кодирующих молекулу интерферирующей РНК, или клеток-хозяев, включающих молекулу интерферирующей РНК, описанная здесь, может использоваться для предотвращения и/или контролирования заражения насекомым-вредителем. Как таковые, интерферирующие РНК или ДНК-конструкции, или клетки-хозяева, включающие их, можно назвать пестицидами или инсектицидами. Предпочтительно молекулы интерферирующих РНК и/или ДНК-конструкции или клетки-хозяева настоящего изобретения используются для обработки растений в качестве средства для предотвращения и/или контролирования заражения их вредителем. В частности, молекулы интерферирующих РНК и/или ДНК-конструкции или клетки-хозяева могут предоставляться в виде набора с целью предотвращения и/или контролирования заражения вредителем, предпочтительно заражения растений вредителем.
Кроме того, в соответствии с другим аспектом настоящего изобретения здесь обеспечивается композиция для предотвращения и/или контролирования заражения насекомым-вредителем, включающая по крайней мере одну интерферирующую рибонуклеиновую кислоту (РНК) и необязательно по крайней мере один подходящий носитель, наполнитель или разбавитель, причем интерферирующая РНК функционирует с момента поглощения вредителем с уменьшением экспрессии гена-мишени у указанного вредителя. Интерферирующей РНК может быть любая из тех, которые описаны здесь в другом месте. Предпочтительно интерферирующая РНК включает или состоит из по крайней мере один (одного) элемент(а) сайленсинга, и указанным элементом сайленсинга является район двухцепочечной РНК, включающий подвергнутые отжигу комплементарные цепи, одна из которых (смысловая цепь) включает последовательность нуклеотидов, которая по крайней мере частично комплементарна нуклеотидной последовательности-мишени внутри гена-мишени. «Геном-мишенью» может быть любой из генов-мишеней вредителя, описанный здесь в другом месте, включая, но без ограничения, гены, вовлеченные в регуляцию выживания, роста, развития, репродукции и патогенности вредителя. Альтернативно, композиция включает по крайней мере одну клетку-хозяина, включающую по крайней мере одну молекулу интерферирующей РНК или кодирующую ее ДНК-конструкцию и необязательно по крайней мере один подходящий носитель, наполнитель или разбавитель, причем интерферирующая РНК функционирует с момента поглощения клетки-хозяина насекомым-вредителем с уменьшением экспрессии гена-мишени у указанного вредителя.
При практическом применении настоящего изобретения композиция может использоваться для предохранения от и/или контролирования любого насекомого-вредителя, относящегося к отрядам Coleoptera, Lepidoptera, Diptera, Dichyoptera, Orthoptera, Hemiptera и Siphonaptera. Следовательно, композиция может быть в любой форме, подходящей для применения к насекомым-вредителям или для нанесения на субстраты и/или организмы, в частности, растения, подверженные заражению указанным насекомым-вредителем. В одном варианте осуществления композиция предназначена для применения для предотвращения и/или контролирования заражения вредителем растений или материала для размножения или репродукции растений и, таким образом, направлена на вид насекомого-вредителя, который заражает растения. Композиция настоящего изобретения особенно эффективна, когда насекомое-вредитель относится к группе грызущих насекомых, которые являются причиной значительного ущерба, наносимого растениям в результате поедания тканей растений, таких как корни, листья, цветы, почки, веточки и т.п. Примеры этой большой группы насекомых включают жуков и их личинки. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения насекомое-вредителя выбирают из рода Leptinotarsa. Более предпочтительно видом насекомого-вредителя является Leptinotarsa decemlineata.
Композиция настоящего изобретения также эффективна против видов насекомых, которые делают отверстие и/или высасывают жидкости из клеток и тканей растений. Таким образом, в дальнейшем предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения насекомое-вредителя выбирают из рода Lygus. Предпочтительно вид целевого насекомого-вредителя выбирают из группы, включающей Lygus adspersus, Lygus alashanensis, Lygus borealis, Lygus elisus, Lygus gemellatus, Lygus hesperus, Lygus lineolaris или Lygus rugulipennis. Более предпочтительно, видом целевого насекомого-вредителя является Lygus hesperus. Композиция настоящего изобретения может использоваться для контролирования насекомых-вредителей на всех стадиях их жизненного цикла, например, стадии половозрелой особи, стадиях личинки и яйца.
В связи с композицией настоящего изобретения интерферирующую РНК можно получить, исходя из ДНК-конструкции, в частности, экспрессионной конструкции, описанной здесь в другом месте, включающей полинуклеотид, кодирующий ее. Кроме того, интерферирующая РНК может продуцироваться внутри клетки-хозяина или организма, сконструированной(ого) для экспрессии указанной интерферирующую РНК с кодирующего ее полинуклеотида. Подходящие организмы-хозяева для применения в композициях настоящего изобретения включают, но без ограничения, микроорганизмы, которые, как известно, колонизируют среду на представляющих интерес растениях и культурах и/или вокруг них, т.е. растениях и культурах, подверженных заражению видом насекомого-вредителя. Такие микроорганизмы включают, но без ограничения, те, которые оккупируют филлоплану (поверхность листьев растений) и/или ризосферу (почву, окружающую корни растений). Эти микроорганизмы выбирают из условия, чтобы они были способны успешно конкурировать с любыми организмами дикого типа, присутствующими в окружающей растения среде. Микроорганизмы, подходящие для применения в качестве хозяев, включают различные виды бактерий, водорослей и грибов. Понятно, что выбранные микроорганизмы должны быть нетоксичными для растений.
Организмы-хозяева, которые не колонизируют в природе растения и/или окружающую их среду, также находятся в объеме настоящего изобретения. В одном варианте осуществления интерферирующая РНК подвергается ферментации в бактериальном хозяине, и результирующие мертвые бактерии обрабатывают и используют в качестве инсектицидного аэрозоля так же, как использовались штаммы Bacillus thuringiensis в качестве инсектицида для аэрозольного применения.
Если композиция настоящего изобретения предназначена для применения для предотвращения и/или контролирования заражения растения вредителем, композиция может содержать подходящий для сельского хозяйства носитель. Таким носителем может быть любой материал, который переносим растением, подвергаемым обработке, который не является причиной чрезмерного ущерба, наносимого окружающей среде или другим организмам в ней, и который позволяет интерферирующей РНК оставаться эффективной против вида насекомого-вредителя. В частности, могут быть приготовлены композиции настоящего изобретения для подачи на растения в соответствии с обычной сельскохозяйственной практикой, используемой в биоинсектицидной промышленности. Композиция может содержать, кроме того, компоненты, способные выполнять другие функции, включая, но без ограничения, (i) усиление или стимулирование ввода интерферирующей РНК в клетки насекомого и (ii) стабилизацию активных компонентов композиции. Конкретными примерами таких дополнительных компонентов, содержащихся в композиции, включающей интерферирующую РНК, являются дрожжевая тРНК или дрожжевая тотальная РНК.
Композиции могут быть приготовлены для непосредственного применения или в виде концентрирования первичной композиции, в случае которого требуется разбавление перед применением. Альтернативно, композиция может поставляться в виде набора, включающего интерферирующую РНК или клетку-хозяина, включающую или экспрессирующую ее, в одном контейнере и подходящий разбавитель или носитель для РНК или клетки-хозяина в отдельном контейнере. При практическом применении настоящего изобретения композиция может наноситься на растение или любую часть растения на любой стадии развития растения. В одном варианте осуществления композицию наносят на надземные части растения, например, во время выращивания культур растений в поле. В дальнейшем варианте осуществления композиция наносится на семена растения, или во время их хранения, или после их сева в почву. Как правило, важным является достижение хорошего контролирования вредителей на ранних стадиях роста растений, поскольку это является временем, когда вид вредителя может нанести самый серьезный ущерб растению.
Композиция может применяться к среде, окружающей насекомого-вредителя, с помощью различных методов, включающий, но без ограничения, разбрызгивание, распыление, распространение порошкообразного средства, разбрасывание, заливание, покрытие семян, обработка семян, внесение в почву и внесение в воду для орошения. При обработке растений, подверженных заражению вредителем, композицию можно подать на растение или часть растения до появления вредителя (с целью предотвращения), или после того, как начинают появляться признаки заражения вредителем (с целью контролирования вредителя).
В дальнейшем варианте осуществления настоящего изобретения композицию готовят так, чтобы она содержала по крайней мере один дополнительный агрономический агент, например, гербицид или дополнительный пестицид. Как здесь используется, «второй пестицид» или «дополнительный пестицид» относится к пестициду, отличному от первой или первоначальной молекулы интерферирующей РНК композиции. Альтернативно, композиция настоящего изобретения может подаваться в комбинации с по крайней мере одним другим агрономическим агентом, например, гербицидом или вторым пестицидом. В одном варианте осуществления обеспечивается композиция в комбинации с гербицидом, выбираемым из любого известного в данной области техники гербицида, например, глифосата, имидазолинона, сульфонилмочевины и бромоксинила. В дальнейшем варианте осуществления обеспечивается композиция в комбинации с по крайней мере одним дополнительным пестицидом. Дополнительный пестицид можно выбрать из любых пестицидов, известных в данной области техники, и/или может включать интерферирующую рибонуклеиновую кислоту, которая функционируют с момента поглощения вредителем с уменьшением экспрессии гена-мишени у указанного вида вредителя. В одном варианте осуществления целевым вредителем является вид насекомого-вредителя, а интерферирующую РНК выбирают из любой из интерферирующих РНК, описываемых здесь. В дальнейшем варианте осуществления дополнительный пестицид включает интерферирующую РНК, которая функционирует с уменьшением экспрессии известного гена в любом виде целевого вредителя, не ограничиваясь насекомыми-вредителями. Первоначальная молекула интерферирующей РНК композиции и второй или дополнительный пестицид(ы) могут воздействовать на один и тот же вид насекомого-вредителя или могут быть предназначены для воздействия на различные виды насекомых-вредителей. Например, первоначальная интерферирующая РНК и второй пестицид могут воздействовать на различные виды насекомого-вредителя или могут воздействовать на различные семейства или классы организмов вредителей, например, грибы или нематоды, или насекомые. Квалифицированному в данной области техники специалисту будет ясно, как проверить комбинации молекул интерферирующих РНК и других агрономических агентов в отношении синергетических эффектов. В предпочтительном варианте осуществления композиция содержит первую молекулу интерферирующей РНК, описанную здесь в другом месте, и один или более дополнительных пестицидов, каждый из которых является токсичным по отношению к одному и тому же насекомому-вредителю, причем один или более дополнительных пестицидов выбирают из пататина, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous, инсектицидного белка Bacillus spaericus и лигнина, и причем указанный инсектицидный белок Bacillus thuringiensis выбирают из группы, состоящей из Cry1Ab, Cry1C, Cry2Aa, Cry3, TIC851, CryET70, Cry22, VIP, TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417, сдвоенного инсектицидного белка, выбираемого из CryET33 и CryET34, CryET80 и CryET76, TIC100 и TIC101, и PS149B1, и инсектицидных химер любого из предыдущих инсектицидных белков.
Различные компоненты комбинаций, описываемых здесь, могут вводиться, например, в организм хозяина, подверженного заражению вредителем, в любом порядке. Компоненты могут подаваться одновременно или последовательно в область или организм, подвергаемую(ый) обработке.
В соответствии с дальнейшим аспектом настоящего изобретения здесь обеспечивается способ уменьшения экспрессии гена-мишени у вида насекомого-вредителя, включающий контактирование указанного вредителя с эффективным количеством по крайней мере одной интерферирующей рибонуклеиновой кислоты (РНК), причем интерферирующая РНК функционирует с момента поглощения вредителем с уменьшением экспрессии гена-мишени у указанного вредителя.
Геном-мишенью может быть любой из генов вредителя, описываемый здесь в другом месте. В частности, ген-мишень может быть выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, включающую любую из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплемент, или имеющих нуклеотидную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения двух последовательностей идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплементу, или выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, состоящую из любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплемента, или выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, включающую фрагмент из по крайней мере 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или его комплемент, или имеющих нуклеотидную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения указанного гена, включающего указанный фрагмент, с любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40 идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно на по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплементу, или выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, включающую фрагмент из по крайней мере 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или его комплемент, и причем после оптимального совмещения и сравнения указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40 указанная нуклеотидная последовательность указанного фрагмента идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% указанному соответствующему фрагменту любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или его комплементу.
Геном-мишенью может также быть ортолог у насекомого-вредителя гена, имеющего нуклеотидную последовательность, включающую любую из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплемент, причем последовательности двух ортологичных генов схожи настолько, что после оптимального совмещения и сравнения двух генов ортолог имеет последовательность, которая идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% любой из последовательностей, представленной SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40. Предпочтительно нуклеотидная последовательность указанного гена-мишени не длиннее, чем 5000, 4000, 3000, 2000 или 1500 нуклеотидов.
Интерферирующей РНК для применения в способе настоящего изобретения может быть любая из молекул интерферирующих РНК, описанных здесь в другом месте. В одном варианте осуществления интерферирующая РНК опосредует уменьшение экспрессии гена с помощью процесса РНК-интерференции, и интерферирующую РНК выбирают из группы регуляторных молекул РНК, способным к осуществлению РНК-интерференции или «выключения гена», включая, но без ограничения, короткие интерферирующие РНК (киРНК), микроРНК, двухцепочечные РНК (дцРНК) и шпилечные РНК (кшРНК).
В предпочтительных вариантах осуществления молекулы интерферирующих РНК для применения в способе настоящего изобретения включают по крайней мере один элемент сайленсинга, причем элемент сайленсинга представляет собой район двухцепочечной РНК, включающий смысловую цепь РНК, подвергнутую отжигу в результате спаривания комплементарных оснований с антисмысловой цепью РНК, причем смысловая цепь молекулы дцРНК включает последовательность нуклеотидов, комплементарную последовательности нуклеотидов, находящейся в РНК-транскрипте с гена-мишени. Следовательно, смысловая цепь дцРНК способна к отжигу с РНК-транскриптом и превращению РНК в мишень для деградации внутри индуцируемого РНК-интерференцией комплекса сайленсинга или RISC.
В способе настоящего изобретения насекомого-вредителя обрабатывают по крайней мере одной интерферирующей РНК. В одном варианте осуществления способа вид насекомого-вредителя можно контактировать с множеством молекул интерферирующих РНК. Если вредителя контактируют с множеством интерферирующих РНК, различные РНК могут функционировать с уменьшением экспрессии одного и того же гена-мишени или различных генов-мишеней.
Интерферирующую РНК, которую предоставляют виду насекомого-вредителя, можно приготовить в виде композиции, включающей по крайней мере один подходящий носитель, наполнитель или разбавитель. Кроме того, интерферирующая РНК может транскрибироваться с кодирующего ее полинуклеотида или ДНК-конструкции, включающей указанный полинуклеотид. В одном варианте осуществления интерферирующая РНК экспрессируется внутри клетки-хозяина или организма хозяина, включая прокариотического или эукариотического хозяина. Клеткой-хозяином или организмом хозяина может быть хозяин, подверженный заражению насекомым-вредителем, причем интерферирующая РНК функционирует с уменьшением экспрессии гена-мишени у указанного вредителя. В предпочтительном варианте осуществления организмом хозяина является растение, подверженное заражению целевым видом насекомого-вредителя.
Используемый в связи со способом настоящего изобретения термин «контактирование» относится к любому способу, с помощью которого вид насекомого-вредителя или его клетку подвергают воздействию интерферирующей РНК, и который делает возможным вход интерферирующей РНК в клетки вредителя. Таким образом, «контактирование» включает, например, процессы трансформации клеток, микроинъекцию и кормление. Эти методы могут выполняться в отношении выделенных клеток, выращиваемых in vitro, или клеток в интактном теле вида насекомого-вредителя. Если интактное насекомое-вредителя контактируют с интерферирующей РНК способа, РНК можно микроинъецировать во внеклеточное пространство, и впоследствии она поступает в клетки тела с помощью природных процессов, таких как эндоцитоз или трансцитоз. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения интерферирующая РНК предоставляется вредителю в форме корма или включена в корм, который прогладывает вредитель. После проглатывания интерферирующая РНК может поступать из пищеварительного тракта насекомого в клетки тела с помощью природных процессов, таких как эндоцитоз или трансцитоз. В одном варианте осуществления насекомое-вредителя оставляют на растении, которое было обработано интерферирующей РНК или композицией, включающей ее, и интерферирующая РНК поглощается, поскольку вредитель питается тканями растения. Интерферирующая РНК может присутствовать на поверхности растения или его части или может присутствовать внутриклеточно в растении или ткани растения, поедаемом(ой) насекомым-вредителем.
В связи со способом уменьшения экспрессии гена-мишени у вида насекомого-вредителя под выражением «эффективное количество» следует понимать количество или концентрацию интерферирующей РНК, необходимое(ую) для уменьшения экспрессии гена-мишени на по крайней мере 10% или 20%, предпочтительно на по крайней мере 33%, более предпочтительно на по крайней мере 50%, еще более предпочтительно на по крайней мере 80% или 90%. В особенно предпочтительных вариантах осуществления «эффективное количество» представляет собой количество или концентрацию, необходимое(ую) для уменьшения экспрессии гена-мишени на по крайней мере 60%, 70% или 80%, предпочтительно на по крайней мере 90%, более предпочтительно на по крайней мере 95% и наиболее предпочтительно на по крайней мере 99% относительно экспрессии в отсутствие интерферирующей РНК или в присутствии контрольной РНК. Как здесь описано в другом месте, уменьшение экспрессии гена можно определить по уменьшению уровней или РНК-транскрипта, или белка, продуцируемого, в конечном счете, исходя из гена-мишени. Уровни РНК и/или белка можно измерить, используя обычные в данной области техники методы.
Также здесь обеспечивается способ предотвращения и/или контролирования заражения вредителем, включающий контактирование вида насекомого-вредителя с эффективным количеством по крайней мере одной интерферирующей РНК, причем эта РНК функционирует с момента поглощения указанным вредителем с уменьшением экспрессии важнейшего гена-мишени вредителя. Важнейшим геном-мишенью может быть любой ген вредителя, вовлеченный в регуляцию важнейшего биологического процесса, необходимого вредителю для инициации или поддержания заражения, включая, но без ограничения, выживание, рост, развитие, репродукцию и патогенность. В частности, геном-мишенью может быть любой из генов вредителей, описанных здесь в другом месте. Кроме того, здесь обеспечивается способ предотвращения и/или контролирования заражения насекомым-вредителем на поле сельскохозяйственных культур, при этом указанный способ включает экспрессию в указанных растениях эффективного количества интерферирующей РНК, описываемой здесь.
Если способ предназначен для контролирования заражения вредителем, выражение «эффективное количество» распространяется на количество или концентрацию интерферирующей РНК, необходимое(ую) для вызова фенотического эффекта на вредителя, так что число организмов вредителя, заражающих организм хозяина, уменьшается, и/или уменьшения степень ущерба, причиной которого является вредитель. В одном варианте осуществления фенотипическим эффектом является гибель вредителя, и интерферирующая РНК используется для достижения составляющей крайней мере 20%, 30%, 40%, предпочтительно по крайней мере 50%, 60%, 70%, более предпочтительно по крайней мере 80% или 90% смертности вредителей по сравнению с контрольными насекомыми-вредителями. В дальнейшем варианте осуществления фенотипические эффекты включают, но без ограничения, замедление роста вредителя, прекращение кормления и уменьшение откладки яиц. Общее число организмов вредителя, заражающих организм хозяина, может таким образом уменьшаться на по крайней мере 20%, 30%, 40%, предпочтительно по крайней мере 50%, 60%, 70%, более предпочтительно по крайней мере 80% или 90% по сравнению с контрольными вредителями. Альтернативно, ущерб, причиной которого является насекомое-вредитель, может уменьшаться на по крайней мере 20%, 30%, 40%, предпочтительно по крайней мере 50%, 60%, 70%, более предпочтительно по крайней мере 80% или 90% по сравнению с контрольными насекомыми-вредителями. Следовательно, способ настоящего изобретения может использоваться для достижения составляющего по крайней мере 20%, 30%, 40%, предпочтительно по крайней мере 50%, 60%, 70%, более предпочтительно по крайней мере 80% или 90% контролирования вредителей. Как здесь используются, «контрольные вредители» представляют собой вредители, которые не контактировали с каким-либо пестицидом, или вредители, которые контактировали с интерферирующей РНК, мишенью которой является несущественный ген, т.е. ген, который не требуется для инициации или поддержания заражения вредителем, или вредители, которые контактировали с интерферирующей РНК, мишенью которой является ген, не обнаруживаемый и/или не экспрессируемый у указанного вредителя.
Способы уменьшения экспрессии гена-мишени у вида насекомого-вредителя могут использоваться для предотвращения и/или контролирования заражения вредителем конкретного субстрата или материала, подверженного заражению указанным насекомым-вредителем. В одном варианте осуществления способ используется для обработки любого растения, подверженного заражению указанным вредителем. Растения, представляющие интерес для применения в соответствии со способами настоящего изобретения, включают, но без ограничения, рис, картофель, хлопчатник, помидоры, канолу, сою, подсолнечник, сорго, просо американское, кукурузу, культуры на семена, такие как люцерна, клубнику, баклажаны, перец и табак.
Кроме того, здесь обеспечивается способ увеличения размера урожая культуры растений, включающий контактирование указанных растений с эффективным количеством интерферирующей РНК, которая функционирует с момента поглощения видом насекомого-вредителя с уменьшением экспрессии гена-мишени у указанного вредителя, причем уменьшение экспрессии гена-мишени оказывает влияние на важнейшую биологическую функцию вредителя, необходимую для инициации и/или поддержания заражения, так что уменьшается ущерб, наносимый культуре растений, по сравнению с не обработанными культурами.
Растения или культуры растений, подвергаемые обработке в соответствии со способами настоящего изобретения, могут подвергаться внешней обработке интерферирующей РНК или включающей ее композицией. Например, интерферирующую РНК или клетки-хозяева, включающие или экспрессирующие ее, можно наносить на поверхность растения и применять к среде, окружающей растение, с помощью процессов, включающих, но без ограничения, разбрызгивание, распыление, распространение порошкообразного средства, разбрасывание, заливание, покрытие семян, обработку семян, внесение в почву и внесение в воду для орошения. В одном варианте осуществления создают подвергаемое обработке растение, которое экспрессирует интерферирующую РНК внутриклеточно посредством транскрипции с включенного в него полинуклеотида. Поскольку вредитель питается тканями растения, клетки, содержащие интерферирующую РНК, будут разрушаться в пищеварительном тракте насекомого, и интерферирующая РНК будет, таким образом, распространяться по телу насекомого, приводя к уменьшению экспрессии генов-мишеней.
Таким образом, в соответствии с другим аспектом настоящего изобретения обеспечивается способ создания трансгенного растения, устойчивого к заражению видом насекомого-вредителя, включающий стадии (a) трансформации клетки растения ДНК-конструкцией, включающей полинуклеотидную последовательность, кодирующую интерферирующую рибонуклеиновую кислоту (РНК), которая функционирует с момента поглощения видом насекомого-вредителя с уменьшением экспрессии гена-мишени у указанного вида насекомого-вредителя, (b) регенерации растения из трансформированной клетки растения; и (c) выращивания трансформированного растения в условиях, подходящих для экспрессии интерферирующей РНК с рекомбинантной ДНК-конструкции, при этом указанное растение является, таким образом, устойчивым к указанному вредителю по сравнению с нетрансформированным растением.
Интерферирующая РНК, экспрессируемая растением или его частью, может быть любой из тех, которые описаны здесь в другом месте. Предпочтительно интерферирующая РНК включает или состоит из по крайней мере один (одного) элемент(а) сайленсинга, и указанным элементом сайленсинга является район двухцепочечной РНК, включающий подвергнутые отжигу комплементарные цепи, одна из которых (смысловая цепь) включает последовательность нуклеотидов, которая по крайней мере частично комплементарна нуклеотидной последовательности-мишени внутри гена-мишени. Если часть интерферирующей РНК является двухцепочечной, две цепи молекулы могут экспрессироваться с по крайней мере двух отдельных полинуклеотидов или могут кодироваться одним полинуклеотидом, кодирующим интерферирующую РНК, имеющую, например, структуру «петля-на-стебле», описываемую здесь в другом месте.
Мишенью интерферирующей РНК, экспрессируемой растением или его частью, может быть любой из генов вредителей, описываемый здесь в другом месте. В частности, ген-мишень может быть выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, включающую любую из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплемент, или имеющих нуклеотидную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения двух последовательностей идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплементу, или выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, состоящую из любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплемента, или выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, включающую фрагмент из по крайней мере 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или его комплемент, или имеющих нуклеотидную последовательность, которая после оптимального совмещения и сравнения указанного гена, включающего указанный фрагмент, с любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40 идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплементу, или выбирают из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, включающую фрагмент из по крайней мере 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100 или 1115 следующих друг за другом нуклеотидов любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125 to 129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или его комплемент, и причем после оптимального совмещения и сравнения указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40 указанная нуклеотидная последовательность указанного фрагмента идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% указанному соответствующему фрагменту любой из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или его комплементу. Геном-мишенью может также быть ортолог у насекомого-вредителя гена, имеющего нуклеотидную последовательность, включающую любую из SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40, или ее комплемент, причем последовательности двух ортологичных генов схожи настолько, что после оптимального совмещения и сравнения двух генов ортолог имеет последовательность, которая идентична на по крайней мере 75%, предпочтительно по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% любой из последовательностей, представленной SEQ ID NO: 277, 138, 253, 152, 121, 122, 141, 273, 123, 142, 274, 124, 143, 125-129, 144, 130, 145, 275, 131, 146, 132, 133, 147, 134, 148, 135, 149, 136, 150, 276, 137, 151, 139, 140, 153, 278, 251, 254, 279, 252, 255, 256, 280, 1, 21, 2, 22, 3, 23, 4, 24, 5, 25, 6, 26, 7, 27, 8, 28, 9, 29, 10, 30, 11, 31, 12, 32, 13, 33, 14, 34, 15, 35, 16, 36, 17, 37, 18, 38, 19, 39, 20 или 40. Предпочтительно нуклеотидная последовательность указанного гена-мишени не длиннее, чем 5000, 4000, 3000, 2000 или 1500 нуклеотидов. Кроме того, важно, чтобы интерферирующая РНК не нарушала экспрессию каких-либо генов растения-хозяина.
Используемый здесь термин «трансгенное растение» или «клетка трансгенного растения» относится к любому растению или клетке растения, которое(ая) было генетически создано так или происходит от растения, которое было генетически создано так, что оно имеет экзогенную полинуклеотидную последовательность. «Экзогенный» относится к тому факту, что полинуклеотид происходит извне клетки растения. Типично экзогенный полинуклеотид является неприродным по отношению к трансгенному растению, т.е. он не обнаруживается в природе в геноме растения.
Используемый здесь термин «трансформация» относится к введению молекул экзогенных полинуклеотидов в растение или его клетку. Методы введения полинуклеотидов в растения известны в данной области техники. В одном варианте осуществления настоящего изобретения растения являются «стабильно трансформированными» полинуклеотидом или ДНК-конструкцией, включающей его, т.е. полинуклеотид или ДНК-конструкция, введенный в клетку растения, интегрируется в геном растения и способен наследоваться его потомством. Протоколы для трансформации для введения полинуклеотидов или ДНК-конструкций в клетки растений могут меняться в зависимости от типа рассматриваемого растения. Подходящие методы трансформации включают, но без ограничения, микроинъекцию, электропорацию, трансформацию с использованием Agrobacterium и ускорение баллистического движения частиц. В данной области техники также известны способы направленного встраивания полинуклеотида или ДНК-конструкции в конкретное место в геноме растения, используя системы сайт-специфической рекомбинации.
ДНК-конструкцией, включающей полинуклеотид, кодирующий активную молекулу интерферирующей РНК, может быть любой вектор, подходящий для трансформации клеток растений. Подходящие векторы включают, но без ограничения, бактериальные плазмиды, например, плазмиду Ti Agrobacterium tumefaciens, и вирусные векторные системы. ДНК-конструкция, введенная в клетки растения, не должна быть вредной или токсичной для растения и/или не должна вредной или токсичной для любых организмов наверху цепи питания, которые кормятся на указанных растениях.
В одном варианте осуществления ДНК-конструкцией является экспрессионная конструкция, включающая полинуклеотид, кодирующий интерферирующую РНК, функционально связанный с регуляторной последовательностью, способной к управлению экспрессией полинуклеотидной последовательности в растениях, такой как любая последовательность, выбираемая из группы, включающей промотор CaMV35S, удвоенный промотор CaMV35S, промотор убиквитина, промотор актина, промотор рибулозобисфосфаткарбоксилазы, промотор GOS2, промотор 34S вируса мозаики норичника и удвоенный, усиленный промотор CaMV35S. Предпочтительно регуляторной последовательностью является промотор растения, выбираемый из тех, которые известны в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления предпочтительным может быть то, чтобы растение продуцировало молекулы интерферирующих РНК только в тех частях растения, с которыми будет контактировать вид насекомого-вредителя и/или которые будут повреждаться им, например, надземных частях растения, корнях и т.д. Такой эффект можно получить благодаря использованию тканеспецифических промоторов растений, включающих, но без ограничения, специфические для листьев промоторы, специфические для корней промоторы, специфические для стеблей промоторы, специфические для цветов промоторы или специфические для плодов промоторы, известные в данной области техники. Подходящими примерами специфического для корней промотора являются PsMTA и промотор хитиназы класса III. Примеры специфических для листьев и стеблей или фотосинтетических тканеспецифических промоторов, которые также являются фотоактивируемыми, являются промоторы двух хлорофилл-связывающих белков (cabl и cab2) сахарной свеклы, рибулозобисфосфаткарбоксилазы (Rubisco), кодируемой rbcS, субъединиц A (gapA) и B (gapB) глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы хлоропластов, промоторы гена Solarium tuberosum, кодирующего специфический для листьев и стеблей белок (ST-LS1), регулируемых в стеблях, индуцируемых защитой генов, такие как промоторы JAS, специфические для цветов промоторы, такие как промотор халконсинтазы, и специфические для плодов промоторы, такие как промотор RJ39 клубники.
В других вариантах осуществления предпочтительным может быть то, чтобы растение продуцировало молекулы интерферирующих РНК только на конкретной стадии его роста. Этот эффект можно получить благодаря использованию специфических для развития промоторов растений, которые запускают экспрессию только во время определенных периодов развития растений. В частности, важной является защита растений от заражения вредителем во время ранних стадий роста растений или во время цветения (например, в случае риса), или во время плодоношения или созревания плодов, или налива зерна, поскольку это является временем, когда растению может быть нанесен самый серьезный ущерб.
ДНК-конструкция для применения для трансформации растения в соответствии со способом настоящего изобретения может включать более чем один полинуклеотид, кодирующий молекулу интерферирующей РНК настоящего изобретения. В одном варианте осуществления различные полинуклеотиды могут кодировать молекулы интерферирующих РНК, мишенями которых являются различные нуклеотидные последовательности в одном и том же гене-мишени. В дальнейшем варианте осуществления различные полинуклеотиды могут кодировать молекулы интерферирующих РНК, мишенями которых являются различные нуклеотидные последовательности в различных генах-мишенях, причем различные гены-мишени происходят от одного и то же или различных видов насекомых-вредителей. Если ДНК-конструкция кодирует больше одной интерферирующей РНК, эти РНК могут экспрессироваться дифференциально в различных тканях растения в силу нахождения под контролем различных тканеспецифических промоторных последовательностей, описываемых здесь в другом месте. В одном варианте осуществления создают растение, которое экспрессирует интерферирующую РНК в листьях, которая уменьшает экспрессию гена-мишени у насекомого, которое кормится листьями, и которое, кроме того, экспрессирует интерферирующую РНК в корнях, которая уменьшает экспрессию гена-мишени у насекомого, которое колонизирует почву и кормится корнями растения.
ДНК-конструкция может также включать по крайней мере один другой полинуклеотид, представляющий интерес, например, полинуклеотид, кодирующий дополнительную молекулу регуляторной РНК, полинуклеотид, кодирующий белок, токсичный для вида насекомого-вредителя, и/или полинуклеотид, кодирующий белок, придающий устойчивость к гербициду.
В соответствии со способом настоящего изобретения растение регенерируют из трансформированной клетки растения, используя методы, известные в данной области техники. Один такой метод включает ферментативное расщепление стенки клетки растения для получения протопласта растительной клетки, который можно впоследствии подвергнуть множеству циклов деления и дифференциации клеток для получения взрослого растения. Взрослые растения, созданные таким образом, можно впоследствии проверить на устойчивость к заражению вредителем. Термин «устойчивый», как здесь используется, должен интерпретироваться широко и относится к способности растения к защите от нападения вредителя, который типично способен причинять ущерб или убыток растению. Под «устойчивым» может подразумеваться или то, что растение больше не является подверженным заражению вредителем, или то, что любые симптомы заболевания, являющиеся следствием заражения вредителем, уменьшаются на по крайней мере приблизительно 20%, предпочтительно по крайней мере 30%, 40% или 50%, более предпочтительно по крайней мере 60%, 70% или 80% и наиболее предпочтительно на по крайней мере 90%. Методы определения устойчивости растения к виду насекомого-вредителя общеизвестны в данной области техники и включают, но без ограничения, измерение в динамике времени среднего диаметра повреждения, биомассы вредителя и/или определение общего процента разрушенных тканей растения.
В одном варианте осуществления способ создания трансгенного растения настоящего изобретения также включает стадию получения потомка или потомства от трансгенного растения и проверку потомства в отношении устойчивости к насекомому-вредителю. Можно получить два или более поколений для гарантии того, что выражение признака устойчивости стабильно сохраняется и наследуется. От родительского трансгенного растения и/или его потомства можно собрать семена для проверки в отношении устойчивости к насекомому-вредителю.
В настоящее изобретение также включен способ создания трансгенных растений, устойчивых к заражению видом насекомого-вредителя, включающий стадии скрещивания первого трансгенного растения, содержащего ДНК-конструкцию, кодирующую интерферирующую РНК, которая функционирует с уменьшением экспрессии гена-мишени вредителя, со вторым растением, в котором нет указанной ДНК-конструкции, и отбора потомства, устойчивого к указанному вредителю. Скрещивание может осуществляться любыми способами, обычно используемыми в связи с селекцией растений. Потомство, отобранное по признаку устойчивости к вредителю, можно, кроме того, подвергнуть самоопылению для получения последующего поколения устойчивого к вредителю потомства. В одном варианте осуществления может выполняться множество циклов самоопыления для получения 2, 3, 4, 5 или более поколений потомства. Результирующее потомство можно проверить в отношении устойчивости к вредителю для гарантии того, что выражение признака устойчивости стабильно сохраняется и наследуется.
В дальнейшем варианте осуществления любые устойчивые к вредителю растения-потомки, получаемые в результате скрещивания между первым трансгенным родительским растением, содержащим ДНК-конструкцию, представляющую интерес, и вторым родительским растением, в котором отсутствует указанная ДНК-конструкция, можно подвергнуть возвратному скрещиванию со вторым родительским растением, и последующее потомство проверить в отношении устойчивости к заражению вредителем. Растения или их потомство можно проверить в отношении устойчивости к заражению вредителем или с использованием фенотипического исследования, описанного здесь в другом месте, или с помощью стандартных молекулярных методов. Например, устойчивые к вредителю растения можно идентифицировать посредством выявления присутствия ДНК-конструкции, включающей полинуклеотидную последовательность, кодирующую интерферирующую РНК, которая функционирует с момента поглощения видом насекомого-вредителя с уменьшением экспрессии гена-мишени. Методы выявления присутствия конкретных полинуклеотидных последовательностей внутри клеток известны в данной области техники и включают ПЦР, ферментативное расщепление и анализ однонуклеотидного полиморфизма (SNP).
Способы настоящего изобретения могут использоваться для создания «состыкованных трансгенных» растений, которые устойчивы к виду насекомого-вредителя и которые необязательно обладают по крайней мере одним другим желательным признаком. Как здесь используется, «состыкованное» трансгенное растение относится к растению, содержащему более чем одну экзогенную полинуклеотидную последовательность. Выражение «более чем одну» относится к возможности содержания в растении по крайней мере 2, по крайней мере 3, по крайней мере 4 экзогенных полинуклеотида. В одном варианте осуществления клетка растения, трансформируемая ДНК-конструкцией, кодирующей интерферирующую РНК, мишенью которой является ген вредителя, может быть предварительно создана так, что она несет отдельный экзогенный полинуклеотид. Альтернативно, способ создания трансгенного растения из клетки растения, описываемый здесь, может включать протокол котрансформации, в котором ДНК-конструкцию, кодирующую интерферирующую РНК настоящего изобретения, доставляют в клетку растения одновременно или последовательно с отдельным экзогенным полинуклеотидом.
Состыкованные трансгенные растения, демонстрирующие устойчивость к вредителю, можно также создать с помощью стандартных методов селекции растений. В одном варианте осуществления первое, устойчивое к вредителю трансгенное растение скрещивают со вторым растением, созданным для экспрессии экзогенного полинуклеотида или гетерологичного гена, дающего желаемый признак растению. Любое полученное потомство можно проверить в отношении устойчивости к вредителю и приобретению дополнительного желаемого признака. Альтернативно или дополнительно, любое устойчивое к вредителю потомство, полученное в результате скрещивания, можно подвергнуть возвратному скрещиванию со вторым родителем для получения дальнейшего потомства, которое можно отобрать по признаку наследования гетерологичного гена, содержащегося у второго родителя, и, следовательно, дополнительному желаемому признаку у растения. Экзогенный полинуклеотид, содержащийся в состыкованном трансгенном растении настоящего изобретения, может экспрессироваться в тех же частях растения или может экспрессироваться дифференциально в силу того факта, что экспрессия каждого из них контролируется отличным тканеспецифическим промотором.
В одном варианте осуществления экзогенный полинуклеотид или гетерологичный ген, дающий дополнительный желаемый признак, кодирует другую интерферирующую РНК, направленную на тот же самый или отличный вид насекомого-вредителя. В дальнейшем варианте осуществления гетерологичный ген кодирует белок, вредный или токсичный для вида насекомого-вредителя растений, например, инсектицидный белок, выбираемый из группы, включающей, но без ограничения, инсектицидные белки Cry1Ab, Cry1C, Cry2Aa, Cry3, CryET70, Cry22, CryET33, CryET34, CryET80, CryET76, TIC100, TIC101, TIC851, TIC900, TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417, PS149B1 и VIP. Тем не менее, в дальнейшем варианте осуществления гетерологичный ген кодирует белок, придающий устойчивость к гербициду. Примеры генов, придающих устойчивость к гербициду, включают Bar, EPSPS, который придает устойчивость к глифосату, ALS, который придает устойчивость к имидазолинону и сульфонилмочевине, и bxn, который придает устойчивость к бромоксинилу.
Здесь также обеспечивается способ получения гибридного семени от любого из трансгенных растений, созданных способами настоящего изобретения, при этом указанный способ включает стадии (i) сева семени, полученного от первого инбредного растения, и семени, полученного от второго инбредного растения, причем по крайней мере одно из инбредных растений является трансгенным растением, устойчивым к заражению вредителем (ii) выращивания семян в растения, несущие цветы, (iii) предотвращения самоопыления по крайней мере одного из первого или второго взрослых растений, (iv) допуска возникновения перекрестного опыления между первым и вторым растениями; и (v) сбора семян, являющихся следствием перекрестного опыления. Гибридное семя, полученное этим способом, и гибридные растения, полученные в результате выращивания указанного семени, находятся в объеме настоящего изобретения. Гибридные растения, полученные этим способом, будут обычно генетически однородными и, по-видимому, демонстрировать гетерозис или гибридную силу. Таким образом, таким способом можно создать культуры с возможностью увеличенного размера урожая.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения обеспечиваются трансгенные растения, устойчивые к заражению видом насекомого-вредителя. В частности, здесь обеспечиваются трансгенные растения, которые экспрессируют или способны экспрессировать по крайней мере одну интерферирующую рибонуклеиновую кислоту (РНК), которая функционирует с момента поглощения видом насекомого-вредителя с уменьшением экспрессии гена-мишени, описываемого здесь в другом месте, у указанного вредителя. Интерферирующей РНК может быть любая из тех, которые описаны здесь в другом месте. Предпочтительно интерферирующая РНК включает или состоит из по крайней мере один (одного) элемент(а) сайленсинга, и указанным элементом сайленсинга является район двухцепочечной РНК, включающий подвергнутые отжигу комплементарные цепи, одна из которых (смысловая цепь) включает последовательность нуклеотидов, которая по крайней мере частично комплементарна нуклеотидной последовательности-мишени внутри гена-мишени. Уменьшение экспрессии гена-мишени вредителя может использоваться для нарушения важнейшего биологического процесса или функции у вредителя, причем «важнейший» относится к тому факту, что этот процесс или функция необходимы для инициации или поддержания заражения вредителем.
Используемый здесь термин «растение» может включать любой материал для репродукции или размножения растения. Ссылка на растение может также включать клетки растений, протопласты клеток растений, культуры тканей растений, каллусы растений, купы растений и клетки растений, которые являются интактными в растениях или являются частями растений, такими как завязи, пыльца, семяпочки, семена, листья, цветы, ветви, плод, сердцевины плодов, колоса, стержни початков, листовые обертки, цветоножки, корни, корневые кончики и т.п. Потомство, варианты и мутанты любого из трансгенных растений, описываемых здесь, находятся в объеме настоящего изобретения. Также включено семя, полученное из любого из указанных трансгенных растений.
В группу трансгенных растений настоящего изобретения включены трансгенные растения, полученные любым из описываемых здесь способов. Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения трансгенные растения, содержащие первый экзогенный полинуклеотид, придающий устойчивость к вредителю и по крайней мере один другой экзогенный полинуклеотид или гетерологичный ген, дающий дополнительный желаемый признак растению, включают состыкованные трансгенные признаки. Дополнительные гетерологичные гены могут включать гены, кодирующие дополнительные пестициды, гены, кодирующие белки, токсичные или вредные для вида насекомого-вредителя, и/или гены, кодирующие белки, придающие устойчивость к гербициду, описанные здесь в другом месте.
Здесь также обеспечивается применение интерферирующей рибонуклеиновой кислоты (РНК), описываемой здесь, или ДНК-конструкции, описываемой здесь, для предотвращения и/или контролирования заражения насекомым-вредителем, предпочтительно заражения насекомым-вредителем растений.
Настоящее изобретение будет, кроме того, понятно с учетом следующих не ограничивающих примеров.
Примеры
Пример 1 Идентификация генов-мишеней у видов насекомых-вредителей
1.1. Клонирование частичных последовательностей генов Leptinotarsa decemlineata
Нуклеиновые кислоты были выделены из клеток кишки личинок колорадского жука, CPB, (Leptinotarsa decemlineata), и была приготовлена библиотека кДНК. кДНК кишки были клонированы в вектор pGN49A (описанный в WO01/88121) так, чтобы они были фланкированы химически индуцируемыми промоторами T7, с противоположной ориентацией на каждом конце дуплекса кДНК. Конструкции в виде рекомбинантных векторов трансформировали в клетки штамма AB301-105 (DE3) Escherichia coli. Трансформированные клетки впоследствии разбавляли и высевали так, чтобы получить одиночные колонии или клоны. Клоны проверяли для гарантии того, что избыточность клона в библиотеке не превышает 5%. Было создано между 3000 и 4000 клонов
1.2 Проверка эффекта бактериально экспрессированных молекул дцРНК на выживание личинок Leptinotarsa decemlineata
Многолуночные планшеты предварительно наполняли средой LB (питательной средой Лурия), и в каждую лунку инокулировали отдельный клон трансформированных бактериальных клеток, взятый из библиотеки кДНК CPB. Бактерии выращивали при 28°C со встряхиванием при 280 об/мин, с последующей стадией химической индукции при 37°C. После центрифугирования результирующий осадок бактериальных клеток промывали водой и подвергали термообработке для инактивации бактерий.
Проверяли эффекты суспензий бактериальных клеток на выживание личинок CPB, используя анализ кормления на основе искусственного корма. Суспензию бактериальных клеток, полученную из отдельного бактериального клона, локально наносили на твердый искусственный корм в лунках многолуночного планшета, и корм сушили в ламинаре. Эффекты каждого клона проверяли в трех повторах. Впоследствии в каждую лунку добавляли одну личинку CPB на 2-ой стадии. Планшеты хранили в камере для выведения насекомых при 25±2ºC, 60±5% относительной влажности, с фотопериодом освещение: затемнение 16:8 часов. В качестве контролей использовали бактериальные клетки, трансформированные пустым вектором, pGN29 (WO01/88121). Выживание личинок CPB в каждой лунке определяли в день 14.
Ряд бактериальных клонов продемонстрировал высокую эффективность против личинок CPB, что означает, что содержащиеся в них кДНК, кодирующие двухцепочечные РНК, важны для выживания вредителей и, следовательно, представляют собой гены-мишени, представляющие интерес для цели контролирования вредителя. По этой причине были определены последовательности ДНК и соответствующие аминокислотные последовательности этих генов-мишеней, и они представлены в таблицах 1 и 2 соответственно.
1.3 Разработка вырожденных праймеров для клонирования ортологичных последовательностей Lygus hesperus
Поиск белков (blastp) был выполнен для каждого представляющего интерес гена-мишени путем перебора базы не дублированных данных, касающихся белков Arthropods, используя последовательность белка, соответствующую каждой из мишеней Leptinotarsa decemlineata. Отбор вплоть до двадцати последовательностей белков был сделан из наилучших соответствий, которые представляли многообразие видов насекомых.
Эти последовательности сначала составляли в блоки, используя программу "Blockmaker" (http://bioinfo.weizmann.ac.il/blockmkr-bin/makeblocks.pl), которая производила совмещения множества последовательностей и анализы белковых последовательностей в отношении консервативных районов.
Блоки консервативных аминокислотных последовательностей были представлены CodeHop (http://blocks.fhcrc.org/codehop.html). Из вывода вырожденных праймеров был осуществлен отбор вплоть до десяти прямых и десяти обратных праймеров для каждой мишени.
1.4 Клонирование частичных последовательностей генов Lygus hesperus с использованием ряда ПЦР
Интактная РНК высокого качества была выделена из личинок 1-ой личиночной стадии Lygus hesperus. Любую геномную ДНК, присутствующую в препарате РНК, удаляли с помощью обработки ДНКазой. кДНК получали, используя обратную транскриптазу. Для выделения последовательностей кДНК, включающих сегмент генов Lh513, Lh504.2, Lh520, Lh537, Lh334, Lh327, Lh579, Lh332, Lh237, Lh261, Lh300.1, Lh423, Lh512, Lh105 и Lh248, был выполнен ряд реакций ПЦР с использованием вырожденных праймеров.
Полученные в результате ПЦР фрагменты анализировали в агарозном геле, очищали и секвенировали. Последовательности результирующих продуктов ПЦР представлены соответствующими SEQ ID NO:, представленными в таблице 3, и называются частичными последовательностями. Соответствующие частичные аминокислотные последовательности представлены соответствующими SEQ ID NO:, представленными в таблице 4.
1.5 Клонирование полноразмерной кДНК с помощью RACE (быстрой амплификации концов кДНК)
Для клонирования полноразмерной кДНК, начиная с известного клона внутреннего фрагмента наиболее действенных мишеней, использовали набор для 5’3' RACE (Roche, каталожный № 1734792; на основе Sambrook, J. & Russell, D.M). Стандартным протоколом, описанным в руководстве, был следующий. Вкратце, для 5' RACE специфический для последовательности-мишени антисмысловой праймер был разработан на основе известной последовательности, и использован для синтеза первой цепи кДНК, используя РНК Lygus в качестве матрицы. Хвостовая часть была добавлена к первой цепи кДНК и использована в качестве якоря для синтеза второй цепи и амплификации неизвестной концевой части транскрипта. Для 3' RACE якорный праймер в виде олигонуклеотида dT был использован для синтеза первой цепи кДНК. Для 5' и 3' RACE «вложенные» праймеры, специфические для последовательности-мишени, были использованы во второй реакции ПЦР. Полученные в результате ПЦР фрагменты анализировали в агарозном геле, очищали, клонировали и секвенирования ради подтверждения.
Полноразмерные последовательности кДНК, соответствующие мишеням Lygus, перечисленным в таблице 13, собирали в VectorNTi, пакете программ для анализа полностью объединенных последовательностей для анализа последовательностей ДНК (Invitrogen). Нуклеотидные последовательности, являющиеся результатом сборок, представлены в таблице 14, а соответствующие аминокислотные последовательности представлены в таблице 15.
Пример 2 In vitro получение двухцепочечной РНК для выключения гена
2.1 Получение дцРНК, соответствующих частичным последовательностям генов-мишеней Leptinotarsa decemlineata и Lygus hesperus.
Двухцепочечную РНК синтезировали в миллиграммовых количествах. Сначала с помощью ПЦР создавали две отдельные матрицы с 5' промотором T7 для РНК-полимеразы (смысловую и антисмысловую матрицы). ПЦР были разработаны и выполнены так, чтобы получить смысловую и антисмысловую матрицы-полинуклеотиды, каждая из которых имеет промотор T7 в отличной ориентации относительно транскрибируемой последовательности-мишени.
Для каждого из генов-мишеней смысловую матрицу создавали, используя специфический для мишени прямой праймер T7 и специфический для мишени обратный праймер. Антисмысловые матрицы создавали, используя специфические для мишеней прямые праймеры и специфические для мишеней обратные праймеры T7. Последовательности соответствующих праймеров для амплификации смысловой и антисмысловой матриц посредством ПЦР для каждого из генов-мишеней представлены в таблице 5 (для кДНК Leptinotarsa decemlineata) и в таблице 6 (для кДНК Lygus hesperus). Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле и подвергали очистке. Получающиеся в результате смысловые и антисмысловые матрицы с T7 смешивали и транскрибировали посредством добавления T7 РНК-полимеразы. Одноцепочечным РНК, полученным с помощью транскрипции с матриц, позволяли подвергаться отжигу, их обрабатывали ДНКазой и РНКазой и очищали с помощью преципитации. Смысловая цепь результирующей дцРНК, полученная, исходя из каждого из генов-мишеней, представлена в таблице 5 (для Leptinotarsa decemlineata) и в таблице 6 (для Lygus hesperus).
Пример 3 Уменьшение экспрессии генов-мишеней у Leotinotarsa decemlineata в качестве способа достижения контроля вредителя
3.1 Проверка in vitro синтезированных молекул дцРНК на активность против личинок Leptinotarsa decemlineata
2
50
50
Были проверены эффекты in vitro синтезированных дцРНК, транскрибированных с полинуклеотидов-матриц, происходящих из генов-мишеней, идентифицированных в соответствии со способами примера 1, на выживание личинок CPB, используя анализы кормления. Вкратце, анализы на основе искусственного корма были выполнены, как описано ниже. В каждую лунку 48-луночного планшета добавляли 0,5 мл искусственного корма, предварительно обработанного посредством локального нанесения 1000 нг/см синтетической дцРНК в 25 мкл. В каждую лунку добавляли одну личинку на 2-ой личиночной стадии (L2). Используя этот способ, были проверены дцРНК, происходящие из ряда генов-мишеней, и в случае каждой дцРНК исследовали 24 личинок. Общее число выживших личинок подсчитывали с регулярными интервалами вплоть до 14 дней после начала кормления. Время, требуемое для уничтожения с помощью каждой дцРНК 50% подвергаемых обработке личинок, (LT) рассчитывали для каждого исследуемого гена-мишени и сравнивали с LT для контрольного гена-мишени (Ld248), ранее описанного в WO2007/074405. Результаты представлены в таблице 7.
<img file="00000013.jpg" he="162" wi="160" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<sup>1</sup>Drosophila melanogaster
На основе этих результатов можно сделать вывод, что дцРНК, мишенями которых являются гены CPB, идентифицированные в примере 1, являются более эффективными, чем контрольные гены-мишени CPB, о которых ранее сообщалось в WO2007/074405, или по крайней мере настолько же эффективными, как и они, т.е. в большинстве случаев «период времени до уничтожения» личинок CPB был короче, чем в случае контрольных мишеней Ld105 и Ld248 (ранее описанных в WO2007/074405: Ld105=[Идентификационный № мишени: LD010], Ld248=[Идентификационный № мишени: LD027]). Эффективность против личинок CPB после потребления дцРНК различалась в зависимости от природы гена, превращенного в мишень.
3.1 Проверка in vitro синтезированных молекул дцРНК на активность против взрослых особей Leptinotarsa decemlineata
Представленные ниже данные служат примером полученных данных, что исследуемые дцРНК, продуцированные с полинуклеотидов-матриц, происходящих из ряда генов-мишеней CPB, оказывали неблагоприятный эффект на выживание, приспособленность, пищевое поведение, поведение при спаривании, продукцию яиц и создание потомства взрослыми особями CPB.
Различные гены-мишени, отобранные из экспрессионной библиотеки кДНК из кишки личинок и являющиеся, как показано выше в примере 3.1, эффективными в целях уничтожения личинок CPB, были проверены для определения эффектов уменьшения экспрессии генов у взрослых жуков. Гены-мишени, идентифицированные как важные и для личинок CPB, и для взрослых жуков, представляют особый интерес, поскольку они могут использоваться для контролирования и/или предотвращения заражения насекомым-вредителем на различных стадиях жизненного цикла насекомого.
Вкратце, анализ с использованием листовых дисков для проверки эффектов молекул дцРНК, происходящих из различных генов-мишеней, против взрослых жуков был обеспечен, как описано выше. Листовые диска картофеля, диаметром 1,5 см, подвергнутые обработке 5 мкг синтезированной in vitro дцРНК, происходящей из мишени, предоставленной в 20 мкл, помещали в лунку 6-луночного планшета вместе со взрослой особью CPB недельного возраста. Через несколько часов, после того, как насекомое полностью съедало листовой диск, взрослой особи предоставляли другой листовой диск, обработанный 5 мкг синтезированной in vitro дцРНК, происходящей из мишени. В случае каждой исследуемой дцРНК всего десять молодых взрослых жуков (смесь самцов и самок) оставляли на обработанных листовых дисках. На следующий день, после того, как второй обработанный листовой диск был полностью съеден, десять взрослых особей в каждой группе обработке объединяли в одной и той же коробке и кормили имеющимися в избытке, не обработанными листьями картофеля. Взрослых жуков, которых кормили дцРНК, происходящей из гена GFP, использовали в качестве контролей в этом анализе.
Число выживших и/или умирающих взрослых насекомых подсчитывали с регулярными интервалами с дня 4 вплоть до 14 дней после начала анализа кормления. Взрослых особей CPB относили к умирающим, если казались больными и менее подвижными, чем здоровые взрослые особи и не были способны перевернуться после помещения их на спины в течение более чем одной минуты. Эффекты на питание, спаривание, продукцию яиц и вылупление оценивали с регулярными интервалами, начиная с дня 4.
Смертность и умирание
50
50
Процент умирающих и/или умерших взрослых особей CPB, определенный в течение 14-дневного периода для каждого исследуемого гена-мишени, представлен на фиг. 1. Кроме того, рассчитывали период времени, необходимый для достижения 50% смертности взрослых жуков, (LT) в каждой группе обработки, и результаты, представленные в таблице 8, представлены как отношение на основе LT, рассчитанного для контрольного гена-мишени, ранее описанного в WO2007/074405.
На основе этих результатов можно сделать вывод, что дцРНК, мишенями которых являются ряд генов CPB, идентифицированных в примере 1, являются более эффективными, чем контрольные гены-мишени CPB, о которых ранее сообщалось в WO2007/074405, или по крайней мере настолько же эффективными, как и они, т.е. в большинстве случаев «период времени до уничтожения» взрослых особей CPB был короче, чем в случае контрольных мишеней Ld105 и Ld248 (ранее описанных в WO2007/074405: Ld105=[Идентификационный № мишени: LD010], Ld248=[Идентификационный № мишени: LD027]). Эффективность против взрослых особей CPB после потребления дцРНК различалась в зависимости от природы гена, превращенного в мишень.
Угнетение питания
В случае всех представляющих интерес генов-мишеней полное прекращение кормления взрослых особей CPB отмечали с дня 5 анализа и позднее (через 4 дня после замены обработанных листьев картофеля не обработанными листья картофеля). Контрольные взрослые особи CPB питались как обычно на протяжении всего анализа.
Спаривание, продукция яиц и вылупление яиц
Спаривание, продукция яиц и вылупление яиц оценивали на протяжении всего 14-дневного периода анализа. Результаты представлены в таблице 9.
Со дня 5 и затем спаривание взрослых особей СРВ не отмечали в подвергнутых обработкам группах, однако спаривание взрослых особей CPB в группе контроля GFP было как обычно.
В день 4 нормальные кладки (с 20-30 яйцами в каждой кладке) наблюдали в группах, подвергнутых обработкам дцРНК, мишенями которых являются Ld105, Ld248, Ld516, Ld579 и GFP. (Эти кладки были сделаны между днями 1 и 3 анализа.) Однако в случае групп, подвергнутых обработкам дцРНК, мишенями которых являются Ld511, Ld512, Ld513 и Ld537, была обнаружена смесь нормальных кладок и отдельных яиц. Нормальные кладки не наблюдали в случае группы CPB, подвергнутой обработке дцРНК, мишенью которой является Ld520; наблюдали лишь отдельные, одиночные яйца.
Яйца, идентифицированные в день 4, собирали и оценивали как частоту вылупления, так и выживание личинок. Во всех группах обработки, в случае которых были собраны нормальные кладки, вылупление составляло 100% за исключение группы Ld537, в случае которой лишь 50% яиц в одной собранной кладке стали вылупляться. Все личинки из этих кладок развивались нормально.
В случае групп, в которых представляющими интерес генами-мишенями были Ld511 и Ld537, вылуплялось менее 10% отдельных яиц, и эти личинки погибали в пределах 7 дней после вылупления. В случае групп, в которых генами-мишенями были Ld512, Ld520 и Ld513, частота вылупления составляла 30%, 70% и 100% соответственно.
В день 5 кладки не наблюдали ни в одной из групп обработок за исключением контроля GFP. Однако отдельные яйца присутствовали в группах, в случае которых генами-мишенями были Ld105, Ld516, Ld512, Ld537, Ld563 и Ld579. Желтое липкое вещество (указывающее на отсутствие итактных яиц) было видно в камерах для кормления насекомых в группах, обработанных дцРНК, мишенями которых являются Ld248 и Ld511. В случае групп, в которых генами-мишенями были Ld513 и Ld520, яйца не были обнаружены.
Яйца, идентифицированные в день 5, собирали и оценивали как частоту вылупления, так и выживание личинок. В случае групп с генами-мишенями Ld512, Ld516 и Ld563 вылупление составляло от 20 до 50%, но все личинки в группе Ld563 погибли в пределах 7 дней от момента вылупления. В случае групп с Ld579 в качестве гена-мишени все яйца вылуплялись, и личинки развивались как обычно.
В день 6 только отдельные яйца были идентифицированы в группах обработок, в случае которых генами-мишенями были Ld512 и Ld579. Желтое липкое вещество было замечено в группе с Ld248 в качестве мишени. Яйца не присутствовали ни в одной из других групп обработок. С дня 7 и затем яйца не откладывали ни одним из подвергнутых обработке взрослых жуков. Однако подвергнутые обработке дцРНК, мишенью которой является GFP, контрольные самки продолжали делать нормальные кладки на протяжении всего анализа.
Пример 4 Уменьшение экспрессии генов-мишеней у Lygus hesperus в результате проглатывания дцРНК в качестве способа достижения контроля над вредителем
4.1 Модификация анализа кормления Lygus hesperus для обеспечения более эффективного поглощения молекул дцРНК
Хотя корм для выведения от BioServ, используемый для поддержания культур Lygus на протяжении многих поколений, является эффективным, этот корм может не быть подходящим для проверки молекул дцРНК-кандидатов в анализе кормления. Химически неопределенный корм включает ингредиенты, которые не являются химически определенными, и поэтому некоторые компоненты могут, вероятно, взаимодействовать с молекулами, предоставляемыми личинкам. Поэтому анализ кормления Lygus был модифицирован так, чтобы он состоял из двух фаз: первоначальное подвергание личинок на ранней личиночной стадии воздействию молекул дцРНК в простейшем корме (лишь 15% сахарозы) в течение трех дней с последующим переносом личинок на нормальный, химически неопределенный корм для Lygus на остальной период анализа.
4.2 Эффекты различных дцРНК, происходящих из мишеней, плюс дрожжевая тРНК на выживание Lygus hesperus.
Личинки Lygus hesperus подвергали воздействию 0,5 мкг/мкл дцРНК, происходящих из ряда генов-мишеней Lygus hesperus, описанных здесь в другом месте, в присутствии 5 мкг/мкл дрожжевой тРНК (Sigma) в анализе кормления (фиг. 2). Контролями являются обработка дцРНК, мишенью которой является GFP, плюс дрожжевая тРНК в тех же концентрациях, соответственно, и обработка лишь кормом. Каждую из молодых личинок оставляли на 25 мкл корма в виде 15% сахарозы с включенными исследуемыми компонентами или без них на три дня до переноса их на 50 мкл сложного корма (Bioserv). Сложный корм обновляли в день 7.
В этом анализе проглоченные дцРНК, происходящие из всех исследованных мишеней, в комбинации с тРНК приводили к высокой смертности личинок L. hesperus по сравнению с контрольными обработками дцРНК, происходящей из GFP, или только кормом (таблица 10).
Таблица, в которых мишени ранжированы в соответствии с эффективностью, создана на основе результатов этого анализа РНК-интерференции в результате кормления (таблица 11 и фиг. 3).
В другом анализе РНК-интерференции в результате кормления в тех условиях, которые описаны выше, были проверены эффекты дцРНК, мишенями которых являются Lh105 и Lh248, на выживание личинок Lygus hesperus. Двухцепочечные РНК, происходящие из мишеней Lh105 и Lh248, в концентрации, составляющей 0,5 мкг/мкл, в присутствии 5 мкг/мкл тРНК приводили к значимой смертности личинок L. hesperus в день 10 в анализе кормления (83% в случае дцРНК, происходящей из h105.2, и 58% в случае дцРНК, происходящей из Lh248.2, и 71% в случае дцРНК, происходящей из Lh248.3) (фиг. 6). В этот же анализе дцРНК, происходящие из Lh327 и Lh300, продемонстрировали лишь 4% и 13% оставшихся в живых, соответственно, в конце биоанализа (фиг. 6).
4.3 Зависимость в динамике времени реакции от дозы дцРНК, происходящей из мишени, против личинок Lygus hesperus в анализе РНК-интерференции в результате кормления
Зависимость реакции от дозы была исследована для определения чувствительности личинок L. hesperus к понижению концентраций дцРНК, происходящих их исследуемых мишеней, в анализах РНК-интерференции в результате кормления. Данные представлены графически на фиг. 4 и 5. Кривые предполагаемого выживания Каплана-Мейера для исследуемых объектов в низких концентрациях, составляющих 0,1, 0,05 и 0.025 мкг/мкл, были сравнены с таковыми для контрольной дцРНК, происходящей из GFP, в концентрации, составляющей 0,1 мкг/мкл, используя логарифмический ранговый критерий (таблица 12).
Все исследованные объекты были токсичными по отношению к личинкам L. hesperus в концентрации уже 0,1 мкг/мкл. дцРНК, происходящая из мишени Lh423, в этой концентрации давала составляющее ниже 10% выживание личинок к концу биоанализа. В самой низкой проверенной концентрации, т.е. 0,025 мкг/мкл, в случае мишени Lh423 все еще демонстрировалось значимое снижение выживания по сравнению с GFP. Двухцепочечные РНК, происходящие из мишеней Lh300.1 и Lh327, также продемонстрировали высокую эффективность в низких концентрациях со значимыми снижениями выживания в концентрации, составляющей 0,05 мкг/мкл.
Пример 5 Создание растений, устойчивых к видам насекомых-вредителей
5.1 Сборка векторов для экспрессии в клетках растений, включающих шпилечную последовательность Lygus hesperus или шпилечную последовательность Leptinotarsa decemlineata, для трансформации картофеля или хлопчатника.
Поскольку механизм РНК-интерференции работает через фрагменты дцРНК, полинуклеотидные последовательности-мишени были клонированы в антисмысловой и смысловой ориентации, с разделением интроном (SEQ ID NO: 250), для образования конструкции для шпилечной дцРНК. Конструкции для шпилечной дцРНК, кодирующие молекулу дцРНК L. hesperus, происходящие из генов-мишеней, упоминаемых здесь, были субклонированы в вектор для экспрессии в клетках растения. Так же контрольная конструкция для шпилечной дцРНК GUS, в случае которой смысловая полинуклеотидная последовательность, кодирующая GUS, (SEQ ID NO: 272) была клонирована в смысловой и антисмысловой ориентации, с разделением тем же интроном (SEQ ID NO: 250), была субклонирована в вектор для экспрессии в клетках растения.
Вектор для экспрессии в клетках растения включает также элементы, необходимые для сохранения плазмиды в бактериальной клетке. Конструкция для шпилечной дцРНК находится между левым краем (LB) и правым краем (RB), 3' от промотора 35S вируса мозаики цветной капусты (P35S) и 5' от терминатора TNOS. Кассета для экспрессии репортера GFP, включающая последовательность GFP, фланкированную промотором и терминатором P35S, была субклонирована в вектор для трансформации клеток растений, содержащий кассету для шпилечной дцРНК L. hesperus. Кассету для экспрессии NPT II, включающую последовательность NPT II, фланкированную промотором и терминатором P35S, используют для отбора растений, которые были эффективно трансформированы. Правильную сборку генетических фрагментов в векторе для экспрессии в клетках растения подтверждали с помощью секвенирования (фиг. 7).
Векторы для экспрессии в клетках растения, включающие индивидуальные шпильки из мишеней L. hesperus, впоследствии трансформировали в Agrobacterium tumefaciens. В случае всех генов-мишеней L. hesperus, упоминаемых здесь, фрагменты можно выбрать и клонировать в виде шпилек схожим образом.
5.2 Трансформация картофеля вектором для экспрессии в клетках растения, включающим шпилечную последовательность Lygus hesperus или шпилечную последовательность Leptinotarsa decemlineata, и проверка трансформированных растений картофеля на устойчивость к L. hesperus или Leptinotarsa decemlineata.
Представленный ниже пример является приведением примера полученных данных, что трансгенные растения картофеля, экспрессирующие специфические для гена-мишени шпилечные РНК, оказывают неблагоприятный эффект на выживание и/или развитие видов насекомых-вредителей.
РНК-интерференция у Lygus hesperus в результата кормления в полевых условиях
Трансформация картофеля
1
R
Стабильно трансформированные растения картофеля были получены, используя адаптированный протокол, полученный благодаря Julie Gilbert, участвующей в NSF Potato Genome Project (http://www.potatogenome.org/nsf5). Эксплантаты междоузлий в стеблях картофеля «сорта V» (первоначально полученного из Laboratory of Plant Breeding в PRI Wageningen, Нидерланды), который был получен из чувствительного диплоида Solanum tuberosum 6487-9, использовали в качестве исходного материала для трансформации. В полученные in vitro эксплантаты инокулировали Agrobacterium tumefaciens C58CRif, содержащие шпилечные конструкции. Через три дня сокультивирования эксплантаты помещали на селективную среду, содержащую 100 мг/л канамицина и 300 мг/л тиментина. Через 6 недель после трансформации первые предполагаемые ростки удаляли и укореняли в селективной среде. Ростки, происходящие от различных эксплантатов, подвергали обработке как независимые случаи, ростки, происходящие от одного и того же каллуса, называли сибсами» до тех пор, пока их клональный статус мог быть подтвержден с помощью блоттинга по Саузерну, а узловые черенки ростков называли «клонами».
Трансгенное состояние укореняющихся ростков проверяли или по флуоресценции GFP, или с помощью плюс/минус ПЦР для введенной последовательности-мишени. Положительные ростки затем подвергали клональному размножению в культуре тканей для обеспечения наличия достаточного количества копий для анализа Lygus hesperus или Leptinotarsa decemlineatas. Эти ростки сохраняли в среде для культивирования тканей ради большей податливости в случае проверки на устойчивость к личинкам/взрослым особям Lygus hesperus или личинкам/взрослым особям L. decemlineata. Первые растения имелись в распоряжении для проверки через четырнадцать недель после трансформации.
Биоанализ
После получения положительных результатов в экспериментах кормления дцРНК были начаты контрольно-проверочные эксперименты в полевых условиях.
Ростки анализировали с помощью ПЦР для подтверждения интеграции T-ДНК и присутствия шпильки, до размножения. Было получено избыточное количество эксплантатов с целью получения по крайней мере 30 независимых случаев для каждой конструкции.
Анализ в полевых условиях для Lygus hesperus был разработан с использованием полученных in vitro ростков картофеля, которые поддерживали выживание насекомых в течение по крайней мере 8 дней, сохраняя низкой фоновую смертность. Личинки L. hesperus выживали и питались ростками картофеля дикого типа. Это подтверждалось видимым повреждением, вызываемым насекомыми, которое отмечали на листьях и глазках (фиг. 8).
В этом анализе L. hesperus питались трансгенным картофелем, экспрессирующим шпилечную дцРНК, мишень которой являются гены-мишени L. hesperus, идентифицированные здесь. Были созданы плазмиды, содержащие шпилечные конструкции и контроль в виде GUS.
Молодые трансгенные растения картофеля сохраняли в среде для культивирования тканей в комнатной камере для выращивания растений с использованием следующих условий: 25±1ºC, 50±5% относительная влажность, фотопериод освещение: затемнение 16:8 часов. Для каждой конструкции ряд случаях, в этих обстоятельствах 30 (P006/XX), был создан с использованием подходящего числа клонов (более 20) для каждого случая. Некоторое количество молодых личинок/взрослых особей Lygus помещали на находящиеся на отдельных огражденных участках молодые (например, на стадии 4-5 развернутых листьев) растения картофеля и оставляли на по крайней мере семь дней. Устойчивость к Lygus hesperus оценивали регулярно в течение периода анализа по показателю уменьшенного выживания личинок/взрослых особей, замедленного развития и остановленного роста, и/или уменьшенного повреждения растений в результате кормления. На фиг. 9, в частности, продемонстрировано выживание личинок L. hesperus. Трансгенные случаи сравнивали с контрольными случаями трансформации шпилькой GUS (P001/XX) и растениями картофеля дикого типа (фиг. 9 и фиг. 10).
Бионализ для проверки трансгенных растений, трансформированных специфическими для L. decemlineata шпилечными конструкциями, на устойчивость к личинкам или взрослым особям L. Decemlineata проводят так же, как описано для L. hesperus.
5.3 Трансформация хлопчатника вектором для экспрессии в клетках растения, включающим шпилечную последовательность Lygus hesperus, и проверка трансформированного каллусного материала хлопчатники или трансформированных растений на устойчивость к L. hesperus
Представленный ниже пример является приведением примера полученных данных, что трансгенные растения хлопчатника или каллус, экспрессирующие специфические для гена-мишени шпилечные РНК, оказывают неблагоприятный эффект на выживание и/или развитие видов насекомых-вредителей.
Трансформация хлопчатника
Поверхность семени хлопчатника сорта Coker-312 подвергают стерилизации, используя сначала 5-минутную промывку в 70% этанола, а затем встряхивая в 20% растворе отбеливающего вещества (Chlorox Co. США, 1% имеющегося хлора) плюс 10 капель неионного детергента, Tween 20, на литр. Затем семя ополаскивают 3 раза стерильной дистиллированной водой до сушки промоканием на стерильной фильтровальной бумаге. Стерильное семя проращивают в среде для проращивания семян (SG) в течение 4-6 дней, и в этот момент времени гипокотили получают и разрезают на сегменты длиной 0,5 см, готовые для инокуляции Agrobacterium. Разрезанные сегменты помещают на стерильную фильтровальную бумагу, покрывающую основную среду Murashige и Skoog, не содержащую фитогормоны. Эксплантаты инкубируют с использованием цикла день:ночь 16:8 часов при 28ºC ± 2ºC в течение 3 дней до инокуляции.
R
Для инокуляции жидкую культуру LB (10 мл) с Agrobacterium tumefaciens, штаммом GV3101 (pMP90) Gent или штаммом LBA4404, содержащим предпочтительный объект для шпилечной РНК и кодирующую устойчивость к гигромицину кассету для отбора растений, выращивают в течение ночи, и 5 мл используют для инокуляции 100 мл культуры вечером перед инокуляцией. Культуру подвергают центрифугированию, ресуспендируют и разводят до ОП600=0,15 в среде для разведения бактерий.
Сегменты гипокотилей заражают суспензией Agrobacterium в течение 5 минут. После этого эксплантаты промокают стерильной фильтровальной бумагой для удаления избыточного количества суспензии бактериальных клеток. Эксплантаты инкубируют в темноте в среде для сокультивирования хлопчатника (CCM) в течение 48 часов. Затем эксплантаты помещают на селективную среду для индукции образования каллуса (SCIM), содержащую 10 мг/л гигромицина и 500 мг/л цефотаксима и включающую фитогормоны 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (0,1 мкг/мл) и кинетин (0,1 мкг/мл). Через 4-6 недель наблюдают первые устойчивые каллусы, и их можно перенести на свежую SCIM и далее увеличить для молекулярной оценки и биоанализов насекомых. Чашки обновляют каждые 4-6 недель для поддержания питательных веществ и селекции антибиотиками.
Каллусы, которые, как установлено, дают положительные результаты в биоанализе кормления насекомых, отбирают для регенерации, и каллус переносят на неселективную среду для созревания соматических зародышей, способ основан на публикации Trolinder and Goodin, 1986. После достижения зародышами длины, равной 4 мм, и появления дифференцированных семядолей и зародышевых корешков (через 2-3 месяца после переноса на среду для созревания) их можно перенести на среду для продолжения образования корней. Она состоит из стерилизованного вермикулита в больших тест-пробирках, пропитанного основной жидкой средой Stewart & Hsu (1977), дополненной кинетином, гиббереловой кислотой, оба агента добавлены в конечной концентрации, составляющей 0,1 мг/л. Зародыши инкубируют при 28°C с использованием цикла день/ночь 16:8, и после достижения ими стадии 2-3 листьев ростки можно закаливать в горшках с вермикулитом, помещаемых в теплицу для сохранения влажности. После полного укрепления растений (достижения стадии 4-6 настоящих листьев) их можно выращивать в горшках со смесью 50:50 торф:суглинок и с использованием светового цикла 14:10 при 30/20°C днем/ночью.
Биоанализ
Личинки Lygus помещают на чашку Петри, содержащую недифференцированную каллусную ткань хлопчатника, экспрессирующую шпилечную РНК, происходящую из мишени. Для каждой конструкции ряд трансформированных каллусов хлопчатника создают и проверяют в биоанализах кормления в отношении уменьшенного выживания личинок/взрослых особей и/или замедленного развития и остановленного роста. Трансгенные каллусы, не экспрессирующие фрагмент гена для целевой шпилечной РНК Lygus, служат в качестве отрицательного контроля. Кроме того, молодые растения хлопчатника, регенерированные из трансгенных каллусов, выращивают в почве в комнатной камере для выращивания растений с использованием следующих условий: 30/20ºC день/ночь, 50±5% относительная влажность, фотопериод освещение: затемнение 14:10 часов. Для каждой конструкции создают ряд случаев (например, двадцать). Некоторое количество молодых личинок/взрослых особей Lygus помещают на находящиеся на отдельных огражденных участках молодые (например, на стадии 4-5 развернутых листьев) растения и оставляют на по крайней мере семь дней до оценки устойчивости к Lygus hesperus по показателю уменьшенного выживания личинок/взрослых особей, замедленного развития и остановленного роста, и/или уменьшенного повреждения растений в результате кормления. Растения хлопчатника, не трансформированные фрагментом гена для целевой шпилечной РНК Lygus, служат в качестве отрицательного контроля.
Квалифицированным в данной области техники специалистам будет понятно, что многочисленные вариации и/или модификации можно внести в вышеупомянутые анализы, не выходя за пределы сущности или объема этого анализа, описанного в общем. Квалифицированные в данной области техники специалисты различат или смогут установить, используя не более чем обычное экспериментирование, множество эквивалентов конкретных примеров, и такие эквиваленты, как предполагается, охватываются настоящим изобретением. Следовательно, настоящий пример должен рассматриваться во всех отношениях как иллюстративный, а не ограничивающий.