Способ скринингового обследования для выявления групп риска развития гиперкоагуляционного состояния в условиях экспедиционной работы в Арктике
METHOD OF SCREENING EXAMINATION FOR DETECTION OF RISK GROUPS OF DEVELOPING HYPERCOAGULATION STATE IN CONDITIONS OF EXPEDITIONARY WORK IN THE ARCTIC

Изобретение относится к медицине, а точнее к диагностике гиперкоагуляционного состояния на основе метода кинетики тромбина, и может быть использовано в клинической практике врачами клинической лабораторной диагностики, судовыми врачами, терапевтами, кардиологами с целью своевременной диагностики претромботического состояния и сосудистых событий в условиях экспедиционной работы в Арктике.
Стоит отметить, что в структуре заболеваний системы кровообращения, представляющих опасность для жизни и здоровья человека, особое место занимают тромбозы и тромбоэмболические осложнения (ТЭО), при этом имеются данные о формировании гиперкоагуляционного состояния при вахтовом и экспедиционном пребывании человека в Арктике. Предполагается, что триггерными механизмами, которые приводят к гиперкоагуляционным сдвигам в системе гемостаза, являются стресс-реакция, атмосферная гипоксия, неустойчивость атмосферного давления, активация перекисного окисления липидов, снижение функциональной активности сосудистой стенки - дисфункция эндотелия. При этом отсутствует адекватная активация противосвертывающих механизмов, и динамическое равновесие системы гемостаза нарушается в сторону гиперкоагуляции.
В настоящее время до сих пор не существует достоверного и доступного скрининга диагностики претромботического состояния у практически здоровых людей, планирующих экспедиционную и вахтовую работу в Арктике. Наиболее распространенными тестами исследования гемостаза являются: активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбиновое время (ПВ) и его производные, такие как протромбиновый индекс, протромбин по Квику, международное нормализованное отношение (MHO), определение плазменной активности антитромбина III (AT III), плазменная концентрация D-димера, содержание фибриногена и тромбоцитов, агрегация тромбоцитов с различными индукторами [Raber M.N.Coagulation Tests / Μ.N. Raber - Butterworths, 1990]. Однако данные тесты не позволяют оценить систему гемостаза в целом. Результатом хронометрических тестов является образование нитей фибрина или сгустка, т.е. клоттинговые тесты завершаются на стадии образования фибринового сгустка и не оценивают его характер и лизис. Кроме того, с помощью данных тестов плазменный гемостаз оценивается отдельно от тромбоцитарного. Скрининговые тесты коагуляции, отражая только 5% генерации тромбина, не решают полностью эту задачу, поскольку могут оставаться неизменными даже при развитии тромбоза, что не приемлемо для скрининга. Данных недостатков лишены интегральные или глобальные тесты оценки гемостаза. В отличие от классических клоттинговых исследований, данные методы отображают кинетику всех стадий формирования тромба, качество фибринового сгустка, функциональную активность тромбоцитов и фибринолиз [ How I treat hyperleukocytosis in acute myeloid leukemia /  G. Ehninger // Blood - 2015. - T. 125 - № 21 - 3246-3252 с.]. Данные тесты основаны на графической регистрации изменений вязкости и упруго-эластических свойств крови в процессе образования сгустка. С помощью интегральных тестов исследуют не активность отдельных факторов свертывающей или противосвертывающей систем, а всю систему гемостаза в целом как результат взаимодействия ЭТИХ факторов [Lang Т. Multi-centre investigation on reference ranges for ROTEM thromboelastometry / T. Lang, A. Bauters, S. L. Braun, B.  K.-W. von Ρ ape, H.-J. Kolde, M. Lakner // Blood Coagul. Fibrinolysis - 2005. - T. 16 - № 4 - 301-10 c.].
Одним из новых и перспективных интегральных тестов является тест генерации (кинетики) тромбина (ТГТ), который отражает количество генерируемого тромбина, кинетику его образования и служит финальной характеристикой соотношения прокоагулянтных и антикоагулянтных факторов [Carlier L. Ex vivo thrombin generation patterns in septic patients with and without disseminated intravascular coagulation / L. Carlier [et al.] // Thrombosis Research. - 2015. - Vol. 135, № 1. - P. 192-197].
Тест генерации тромбина (ТГТ) измеряет кинетику и количество тромбина, образующегося в плазме крови при стандартной величине активации системы свертывания. Регистрируется кинетика возникновения и последующего исчезновения тромбина в плазме крови после активации свертывания.
Наиболее близким к предлагаемому техническому решению проблемы является способ диагностики венозного тромбоза, основанный на методе определения Д-димера [P. S. WELLS. Integrated strategies for the diagnosis of venous thromboembolism. - Jth. Volume5, July 2007. - Pages 41-50 issuesl Special Issue: State of the Art].
Однако данные методы имеют низкую специфичность в виду того, что и фибриноген, и Д-димер являются белками острофазового воспаления и закономерно увеличиваются при любом воспалении, беременности, старости, раке.
Все это в конечном итоге не позволяет в полной мере объективно и достоверно оценить риск развития гиперкоагуляции применительно к скринингу.
Задачей настоящего изобретения является устранение существующих недостатков рутинных клоттинговых методов - объективизация анализируемого признака гиперкоагуляционного синдрома за счет применения интегрального метода теста генерации тромбина, повышение диагностической значимости метода и упрощение интерпретации результатов, на основании которых выносят суждение о возможности наличия гиперкоагуляционного синдрома в условиях экспедиционной работы в Арктике.
Поставленная задача решается за счет того, что у практически здоровых людей, моряков, членов научных экспедиций выполняется лабораторный скрининг гиперкоагуляционного состояния перед планированием экспедиции/вахты с использованием автоматического определения параметров кинетики тромбина. Полученные результаты выражают в виде следующих показателей: время лаг-фазы (tLag), время образования пика тромбина (tPeak), пик тромбина (Peak) и эндогенный потенциал тромбина (AUC).
В доступных нам литературных источниках мы не обнаружили сведений по использованию метода Теста Генерации Тромбина для превентивного скрининга гиперкоагуляционного синдрома в условиях экспедиционной/вахтовой работы в Арктике.
Способ осуществляют следующим образом.
У участников экспедиции, моряков, вахтовых рабочих перед выходом в арктическую зону проводится забор венозной крови объемом 5 мл в вакуумный вакутейнер с 3.2% цитратом натрия. Полученные образцы крови центрифугируют при скорости 3000 оборотов в минуту в течение 15 минут. Определение параметров кинетики тромбина выполняется на автоматическом анализаторе «Ceveronalpha» с TGA-модулем с использованием реагентов Ceveron TGA High (БиоХимМак). Анализируются следующие параметры кинетики тромбина: время лаг-фазы (tLag), время образования пика тромбина (tPeak), пик тромбина (Peak) и эндогенный потенциал тромбина (AUC). Программное обеспечение «Ceveronalpha» рассчитывает автоматически показатели генерации/кинетики тромбина в образце в течении 10-15 минут, результаты представляются в нМ тромбина, генерированного в образце для каждой точки времени в течение всего процесса свертывания.
Используя референтные показатели кинетики тромбина (см. таблицу 1), делается заключение о наличии или отсутствии состояния гиперкоагуляции как фактора риска развития тромботических и сосудистых осложнений (тромбозы, инсульты, инфаркты, гипертонические кризы и транзиторные ишемические атаки). Данный способ скринингового обследования для выявления групп риска развития гиперкоагуляционного состояния, основан на интегральном анализе системы гемостаза с использованием количества генерируемого тромбина, кинетики его образования для финальной характеристики соотношения прокоагулянтных и антикоагулянтных факторов.
При необходимости возможно провести динамический контроль за указанными показателями кинетики тромбина, что отражает эффективность назначенной превентивной терапии или ее отсутствие.
Основанием для использования теста кинетики тромбина у практически здоровых людей, находящихся в условиях арктического региона, при котором возможно суждение о развитии состояния гиперкоагуляции и связанным с ним риском развития тромботических сосудистых событий (инфаркты, инсульты, гипертонические кризы), явились результаты анализа вышеперечисленных параметров у участников морской трансширотной арктической экспедиции длительностью 45 суток в высоких широтах (80°34’ с.ш. 57°41’ в.д.).
В проспективное клинико-лабораторное исследование были включены 52 участника трансширотного рейса «ТрансАрктика-2019» на научно-исследовательском судне «Михаил Сомов» (34 мужчины и 18 женщин), средний возраст обследуемых составил 36 (20-70) лет. Длительность рейса составила 45 суток.
Критериями включения в исследование явились: участие в научно-исследовательской экспедиции «ТрансАрктика-2019»; письменное добровольное информированное согласие на участие в исследовании; возраст старше 18 лет. Критерии не включения: отказ на участие в исследовании; возраст младше 18 лет; прием лекарственных препаратов из группы дезагрегантов и антикоагулянтов.
Дизайн исследования был одобрен локальным этическим комитетом Северного государственного медицинского университета.
Забор образцов плазмы осуществлялся в двух точках: нулевая точка - г. Архангельск (64°33’ с.ш. 40°32’ в.д.), самая высокая точка экспедиции - о. Хейса (80°34’ с.ш. 57°41’ в.д.) на 18-20 сутки рейса. Материалом для исследования явилась венозная кровь, полученная путем венепункции локтевой вены. Полученные образцы крови центрифугировали при скорости 3000 оборотов в минуту в течении 15 минут, плазма переносилась в микропробирки объемом 0,5 мл, замораживалась и хранились в низкотемпературном морозильнике «Thermo Scientific Forma 7000» при температуре - 70°С. Образцы плазмы оттаивали при температуре 37°С непосредственно перед началом выполнения анализа.
Лабораторные исследования выполнены после возвращения НИС «Михаил Сомов» из рейса на базе Регионального центра антитромботической терапии ГБУЗ Архангельской области «Первая городская клиническая больница им. Е.Е. Волосевич» г. Архангельска. Определение параметров кинетики тромбина выполнено на автоматическом анализаторе «Ceveronalpha» с TGA-модулем с использованием реагентов Ceveron TGA High (БиоХимМак). Проанализированы следующие параметры кинетики тромбина: время лаг-фазы (tLag), время образования пика тромбина (tPeak), пик тромбина (Peak), эндогенный потенциал тромбина (AUC).
Каждый из вышеперечисленных параметров имеет диагностическое значение. Lag time представляет собой эквивалент времени свертывания в традиционном тесте на коагуляцию. Peak thrombin представляет наибольшую концентрацию тромбина, которая может быть получена. Time to peak представляет скорость генерации тромбина. Исследуемая плазма может достигать time to peak быстрее или медленнее, что отражает гипер- или гипокоагуляционные состояния. Наконец, эндогенный тромбиновый потенциал AUC представляет собой общее количество тромбина, которое может генерировать образец плазмы под действием двух противоположных (про- и антикоагулянтных) активаторов, действующих в плазме (фиг. 1).
Используемые референтные показатели ТГТ представлены в таблице 1 [Полеводова О.А. Диагностика и мониторинг терапии жизнеугрожающих геморрагических и тромботических осложнений у пациентов с заболеваниями системы крови – канд. дисс. Москва, 2019].
Статистический анализ выполнен с использованием R версия 3.6.1. Показатели, распределение которых не отличалось от нормального гауссова распределения, представлены в виде среднего арифметического (М) и стандартного отклонения (SD). Для описания данных, распределение которых отличается от нормального, использованы медиана (Me), первый (Q1) и третий (Q3) квартили. Соответствие распределения гауссову распределению проверялось с помощью критерия Шапиро-Уилка.
На момент проведения исследования по данным анкетирования участников экспедиции общий стаж работы в арктической зоне больше 5 лет был отмечен в 34,4% случаев, от 1 до 5 лет в 46,9%, меньше одного года в 12,5% и впервые находились в арктической зоне 6,3%. Табакокурение отметили 59,6% участников. Анализ факторов риска развития сосудистых событий показал следующее: артериальная гипертензия в анамнезе отмечена в 23,05% случаев, нормальная масса тела (ИМТ 18-25) имела место в 40,4%, избыточная масса тела (ИМТ 25-30) - 36,5%, а ожирение первой степени (ИМТ 30-35) присутствовало у 15,4% участников (таблица 2).
Анализ не показал наличие усиления гиперкоагуляционного потенциала по мере продвижения в высоких широтах Арктики при использовании стандартных клоттинговых показателей - фибриноген, АЧТВ, протромбиновое время (таблица 2). В связи с чем был использован анализ интегрального показателя оценки состояния системы гемостаза - тест генерации тромбина. Результаты анализа показателей ТГТ представлены в таблице 3.
-5
Важно отметить, что в самой высокой точке трансширотного рейса (о. Хейса) время показателя лаг-фазы - tLag (min) было статистически значимо меньше, чем в исходной нулевой точке (критерий Стьюдента, t=4.358, p-value=6.364е). В высокой точке время достижения пика тромбина - tPeak (min) было статистически значимо меньше по сравнению с нулевой точкой (критерий Стьюдента, t=4.0495, p-value=0.0002). Показатель AUC (nM) - эндогенный потенциал тромбина у членов экспедиции трансширотного рейса «ТрансАрктика-2019» был статистически значимо больше в высокой точке (критерий Стьюдента, t=-3.3305, p-value=0.0016), что свидетельствовало о развитии гиперкоагуляционного состояния (фиг. 2).
Следующим этапом исследования был поиск возможной связи лабораторных показателей ТГТ с отдельными модифицирующими факторами риска развития состояния гиперкоагуляции. Анализ выявил положительную связь средней силы между временем задержки образования сгустка и стажем работы в Арктике в нулевой точке (р=0.009; r=0.368), положительную связь средней силы между временем задержки образования сгустка и ИМТ в нулевой точке (р=0.01263; r=0.3436) и положительную связь средней силы между временем задержки образования сгустка и ИМТ в высокой точке (р=0.008036; r=0.3637).
Также обнаружено, что у людей с субклиническим атеросклерозом (34% из изучаемой выборки) толщина интимы - медии каротидных артерий выраженно коррелирует с повышением AUC (nM) и временем достижения пика tPeak (min) (р=0.0076; r=0.681 и р=0.005; r=0.47).
Анализ показал статистически значимые различия в зависимости от наличия атерогенной дислипидемии по следующим показателям: во времени задержки образования сгустка в нулевой точке и в высокой точке (двухвыборочный t-критерий Уэлча, t=-2.0592, df=39.898, p=0.04604 и t=-2.7356, df=40.446, p=0.009201 соответственно); во времени образования пика в нулевой точке и в высокой точке (двухвыборочный t-критерий Уэлча, t=-2.5721, df=45.033, p=0.01348 и t=-2.6702, df=47.328, p=0.01036 соответственно) и в величине пика в нулевой точке и в высокой точке (Критерий Манна-Уитни, W=434, p=0.04328 и W=451, p=0.01879 соответственно).
Полученные результаты свидетельствуют об увеличении уровня эндогенного тромбинового потенциала и признаков нарастания гиперкоагуляционного синдрома по всем тестам кинетики тромбина в зависимости от степени выраженности атерогенной дислипидемии и атеросклеротических поражений по данным толщины интимы - медии во время нахождения в арктической морской экспедиции.
Таким образом кинетика тромбина может рассматриваться в качестве маркера развития локального воспаления и, как следствие - гиперкоагуляционного состояния, в ответ неблагоприятные условия Арктики - высокие широты, атмосферная гипоксия. Данные результаты нашего исследования согласуются с отдельными данными, что многие провоспалительные эффекты тромбина также играют роль в прогрессировании атеросклероза и развития сосудистых событий [Favaretto е. Thrombin generation and intracranial atherosclerotic disease in patients with a transient ischaemic attack / Е. Favaretto fet al.] // Thrombosis Research. - 2017. - Vol .155. - P. 72-77].
Апробирование скринингового метода мониторинга кинетики тромбина на проспективной выборке участников морской трансширотной экспедиции показало, что в 81,2% случаев выявляет гиперкоагуляционное состояние на фоне субклинического атеросклероза в отличие от клоттинговых методов, которые не показали свою диагностическую ценность.
Представляем несколько клинических примеров, демонстрирующих значимость данного скринингового метода в плане диагностики гиперкоагуляционного синдрома как фактора риска сосудистых событий в условиях нахождения в высоких широтах Арктики. Хронометрические и структурные показатели системы гемостаза во всех случаях не показали гиперкоагуляционного состояния в отличие от теста генерации тромбина.
Клинические примеры
2
1. Участник Л., мужчина, 61 год. Арктический стаж - 27 лет. В анамнезе гипертоническая болезнь II ст, риск 3. ИМТ 32 кг/м, курит, толщина интимы медиа 10.1 мм, общий холестерин 6.2 ммоль/л. Во время рейса на 18 сутки - гипертонический криз с признаками транзиторной ишемической атаки. Показатели теста генерации тромбина в динамике - tLag, min (4,81-3,80); tPeak,min (11,9-9,9); Peak, nM (200,1-265,1); AUC, nM (2048,1-3011,2) - гиперкоагуляционного состояние в начале рейса и его прогрессирование в высокой точке. Назначены дезагреганты, статины.
2
2. Участник Г., мужчина, 43 года. Арктический стаж - 12 лет. В анамнезе ТЭЛА после автодорожной травмы. ИМТ 37 кг/м, курит, толщина интимы медиа 12.2 мм, общий холестерин 5.1 ммоль/л. Во время рейса на 23 сутки - гипертонический криз. Показатели теста генерации тромбина в динамике - tLag, min (2,59-4,80); tPeak,min (13,2 - 9,2); Peak, nM (167,1-302,1); AUC, nM (2471,1-2919,7) -гиперкоагуляционного состояние в начале рейса и его прогрессирование в высокой точке. При ЭХОКС - повышение давления в легочной артерии - назначена антитромботическая терапия варфарином.
2
3. Участник Р., женщина, 32 года. Арктический стаж - 1 год. Атерогенная дислипидемия. ИМТ 29,2 кг/м, не курит, толщина интимы медиа 11 мм, общий холестерин 6.8 ммоль/л. Показатели теста генерации тромбина в динамике - tLag, min (5,11-3,20); tPeak,min (18,9-10,1); Peak, nM (176,2-311,0); AUC, nM (1870,9-2849,9) - гиперкоагуляционного состояние в начале рейса и его прогрессирование в высокой точке. Назначена терапия статинами.
2
4. Участник Ш., мужчина, 41 год. Арктический стаж - 14 лет. Атерогенная дислипидемия. ИМТ 26,6 кг/м, курит, толщина интимы медиа 12 мм, общий холестерин 5.2 ммоль/л. Показатели теста генерации тромбина в динамике - tLag, min (4,12-3,11); tPeak,min (11,2-9,5); Peak, nM (203,9-302,0); AUC, nM (2921,3-3021,2) - гиперкоагуляционного состояние в начале рейса и его прогрессирование в высокой точке. По приходу судна в порт госпитализирован с болями в области сердца. При госпитализации - острый коронарный синдром с подъемом сегмента ST. Выполнено реканализация инфаркт - зависимой коронарной артерии голометаллическим стентом. Назначена терапия базисная терапия ишемической болезни сердца - статины, бета-блокаторы, аспирин, клопидогрел, ингибиторы ангиотензи-превращающего фермента.
2
5. Участник М., женщина, 59 лет. Арктический стаж - 9 лет. Атерогенная дислипидемия. ИМТ 31,0 кг/м, не курит, толщина интимы медиа 10 мм, общий холестерин 5.3 ммоль/л. По данным ЭКГ - признаки рубца по задней стенки левого желудочка. Перенесенный ОИМ женщина отрицает. Показатели теста генерации тромбина в динамике - tLag, min (8,15-3,98); tPeak,min (19,9-11,4); Peak, nM (201,1-329,0); AUC, nM (1972,1-2902,4) - гиперкоагуляционного состояние в начале рейса и его прогрессирование в высокой точке. При контрольном ЭХОКС исследовании зона гипокинезии по задней стенке левого желудочка.
Назначена базисная терапия ишемической болезни сердца.
Вышеизложенный материал клинически подтверждает простоту и полезность предложенного метода способа скрининга состояния гиперкоагуляции. Кроме того, разработанный и апробированный метод значительно оптимизирует диагностику гиперкоагуляции в отличии от базовых хронометрических и структурных тестов (фибриноген, АЧТВ, ПВ), которые в данных условиях не показали свою диагностическую ценность. Немаловажно, что врач-клиницист (судовой врач, терапевт) получает объективный показатель, указывающий на возможность присутствия гиперкоагуляционного состояния. В конечном итоге данный метод позволяет по результатам теста кинетики тромбина осуществлять скрининг гиперкоагуляции, профилактировать развитие сосудистых осложнений - инфарктов, инсультов, тромбозов при проведении превентивных мероприятий, проводить целенаправленный отбор участников экспедиций для работы в Арктическом регионе РФ.
Источники информации
1. А.А. Мельник. Тест генерации тромбина - уникальный метод интегральной оценки системы гемостаза Медична газета «Здоров’я  21 сторiччя» № 2 (375), ciчень 2016 p.; Hemker Н.С., Al Dieri R., De Smedt Ε. et al. // Thromb. Haemost. 2006; 96: 553-561.
2. Armando Tripodi. Thrombin Generation Assay and Its Application in the Clinical Laboratory // Clinical Chemistry. - 2016. - No. 5. - S. 699-707.
3. Eichinger S. Prediction of recurrent venous thromboembolism by endogenous thrombin potential and D-dimer / S.Eichinger [et al.] // Clin Chem. - 2008. - Vol. 54, № 12. - P. 2042-2048.
4. Hemker H.C., Beguin S. Thrombin generation in plasma: its assessment via the endogenous thrombin potential. Throm. Haemost. 1995; 74(5): 134-138.
5. Hemker Η. С, Al Died R., De Smedt E. et al., Thrombin generation, a function test of the haemostatic-thrombotic system // Thromb Haemost.. - 2006. - Вып. 96, № 5. - С. 553-561.
6. Raber M.N.Coagulation Tests / M. N. Raber - Butterworths, 1990.
7. Wells P.S. Integrated strategies for the diagnosis of venous thromboembolism. - Jth. Volume5, July 2007. - Pages 41-50 Issuesl Special Issue: State of the Art.