Состояние процессов свободно-радикального окисления при термической травме разной степени тяжести

УДК 617-001 .+577.121.7

СОСТОЯНИЕ ПРОЦЕССОВ СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ ПРИ ТЕРМИЧЕСКОЙ ТРАВМЕ РАЗНОЙ СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ

С. А. Кантюков, Л. В. Кривохижина, P.P. Фархутдинов*

Челябинская государственная медицинская академия, г. Челябинск; * Башкирский государственный медицинский университет, г. Уфа

В настоящем исследовании определена интенсивность свободно-радикального окисления при экспериментальной ожоговой травме средней и тяжелой степени тяжести. Свободно-радикальное окисление в крови исследовали методом железо индуцированной хемилюминесценции. Показано, что термическая травма независимо от степени тяжести сопровождается активацией свободно-радикального окисления. Интенсивность свободно-радикального окисления зависит от тяжести ожоговой травмы. Для стадии ожоговой токсемии при ожогах 3—4 степени тяжести характерно снижение в крови гидроперекисей липидов и интенсивности окисления липидов.

Ключевые слова: термическая травма, свободно-радикальное окисление, хемилюми-несценция.

При термических травмах возникают благоприятные патофизиологические и биохимические условия для ускорения процессов свободно-радикального окисления. К ним относятся - гипоксия, активация клеток воспаления и гемостаза, возрастание функции органов детоксикации, усиление липолиза и повышение содержания в крови жирных кислот, истощение систем антиоксидантной защиты [2,4, 8, 11, 13, 14].

В то же время в ряде публикаций указывается на снижение интенсивности данного процесса из-за повышенного расхода жирных кислот, в первую очередь полиненасыщенных, понижения «окис-ляемости» липидов, угнетающего влияния ряда биохимических компонентов ожоговой токсемии, таких как фракции средних молекул (молекулярной массой от 1000 до 5000 дальтон), холестерина, мочевины, билирубина и других [1, 12, 15, 16].

Изменения характера и интенсивности свободно-радикального окисления могут зависеть от стадии и тяжести ожоговой болезни.

Целью исследования было определение интенсивности свободно-радикального окисления при термической травме (стадии ожогового шока и ожоговой токсемии) разной степени тяжести.

Методы исследования

Термическую травму вызывали под эфирным наркозом у взрослых белых крыс массой 150—200 г погружением эпилированной спинки на 1-3 секунды в кипящую воду. Животные были разделены на 3 группы: первая - контрольная и две -опытные. Вторая группа - площадь ожога до 20 % от поверхности тела, 1-2 степень; третья группа -до 40 %, 3—4 степень тяжести. Сроки наблюдения: 1-е сутки - стадия ожогового шока, 3-и, 5-е сутки -стадия ожоговой токсемии.

Интенсивность свободно-радикального окисления в крови исследовали методом железо индуцированной хемилюминесценции (XJI) плазмы на приборе ХЛ-003. Проверку стабильности работы прибора проводили по излучению эталона СФХМ-1 (ГОСТ 9411-81). Интенсивность свечения эталона составляла 5,1 -105 квантов в секунду. Данная величина была принята за одну условную единицу. Плазму крови готовили, используя в качестве антикоагулянта цитрат натрия. Перед измерением свечения 0,5 мл плазмы разводили в 18,5 мл солевого раствора следующего содержания: 20 мМ КН2Р04, 105 мМ КС1, величину pH которого доводили до 7,45 ед. Свечение индуцировали добавлением 1 мл FeS04'7H20, оптимальная концентрация которого составила 2,5 мМ в среде инкубации. Метод железо индуцированной XJ1 позволяет оценить интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ). Учитывали следующие показатели XJI: спонтанное свечение плазмы (СП), амплитуду быстрой вспышки (А), светосумму свечения (S).

Диеновые конъюгаты (ДК) определяли экстракцией в среде хлороформ-метанол [20]. ТБК-активные продукты определяли по образованию окрашенного продукта в реакции с тиобарбитуро-вой кислотой [21].

Концентрацию фракции с молекулярной массой от 500 до 5000 дальтон определяли измерением оптической плотности плазмы крови при длине волны 254 нм [18]. Полученные данные обрабатывали методами вариационной статистики с использованием пакета прикладных программ «Statistica v. 6.0 for Windows» [10, 17]. Для описания результатов использовали М-среднее значение признака, т-стандартную ошибку среднего, s-среднее квадратичное отклонение, характеристику выборки пред-

ставляли в формате М + т. Для анализа нормальности распределения данных применяли критерий Шапиро-Уилка. Проверку статистических гипотез в группах проводили с использованием параметрических (Стьюдента) и непараметрических (Манна-Уитни) критериев. Отличия считали статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты исследования

Исследование природы ХЛ плазмы и сыворотки крови, развивающейся при добавлении солей двухвалентного железа, показало, что при наличии гидроперекисей липидов ионы железа реагируют с ними с образованием перекисных радикалов. Доказательством связи железо индуцированной ХЛ со свободно-радикальным окислением липидов служит параллелизм между интенсивностью свечения, потреблением кислорода и накоплением продуктов перекисного окисления липидов, в частности, малонового диальдегида и диеновых конъюгатов [3, 7, 14]. Переход свечения из одной фазы в другую зависит от стадий окисления. Амплитуда быстрой вспышки определяется содержанием в крови гидроперекисей липидов и скоростью окисления ионов двухвалентного железа. Начало медленной вспышки вызвано свободнорадикальным окислением липидов, главным образом, суммарной фракции липопротеинов низкой и очень низкой плотности [5, 6, 22]. Их увеличение в крови или структурные изменения молекул ведут к возрастанию свечения [9]. Выравнивание скорости образования и распада гидроперекисей становится причиной перехода медленной вспышки в стационарное свечение.

Таким образом, спонтанное свечение

плазмы крови характеризует интенсивность перекисного окисления без вмешательства извне; амплитуда быстрой вспышки (А) - наличие в крови гидроперекисей липидов; светосумма свечения (Б) — количество и способность липидов крови подвергаться окислению.

Запись стандартной хемилюминограммы представлена на рис. 1.

При анализе ХЛ плазмы крови учитывали следующие показатели - спонтанное свечение (СП), амплитуду быстрой вспышки (А) и светосумму свечения медленной вспышки (Б).

Показатели ХЛ плазмы и содержание в крови продуктов перекисного окисления липидов при термической травме представлены в таблице.

Независимо от тяжести ожоговой травмы регистрируется активация свободно-радикального окисления, что подтверждается достоверным возрастанием относительно контроля СП и ДК во все сроки исследования. Но СП на всех сроках исследования была достоверно ниже при ожогах 3-4 степени тяжести относительно ожогов 1-2 степени.

Количество ДК и ТБК-активных продуктов на 1-е и 5-е сутки ожоговой травмы выше при ожогах 3-4 степени тяжести относительно ожогов 1-2 степени. Более того, количество ТБК — активных продуктов при ожогах 1-2 степени на 1,5 сутки не отличается от контрольных значений, а при ожогах 3-4 степени тяжести превосходит контрольные величины в 2 раза.

Таким образом, интенсивность и скорость свободно-радикального окисления выше при ожогах 3-4 степени тяжести, что подтверждается более низкими показателями СП на всех сроках на-

Рис. 1. Запись хемилюминесценции плазмы крови здорового человека: 1 - темновой ток; 2 - спонтанное свечение; 3 - быстрая вспышка; 4 - латентный период; 5 - медленная вспышка; 6 - стационарное свечение; 7 - светосумма хемилюминесценции

ХЛ плазмы и содержание в крови продуктов перекисного окисления липидов при термической травме

Условия эксперимента СП А 8 ДК, ед.Е/мл ТБК-АП, ед.Е/мл

Контроль 1 группа (п = 20) 3,13 ±0,2 75,1 ±2,5 21,4 ±0,3 0,09 ± 0,007 0,04 ±0,001

1 сутки 2 группа (п = 10) 6,4 ± 0,4 *** 74,9 ± 3,2 25,2 ± 0,5 *** 0,127 ±0,005 *** 0,04 ± 0,004

3 сутки 2 группа (п = 10) 8,2 ± 0,4 98,6 ± 3,3 *** 29,6 ± 0,9 *** 0,14 ±0,007 *** 0,08 ± 0,005 ***

5 сутки 2 группа (п = 10) 5,6 ±0,5 *** 84,31 ±3,1 * 25,0 ± 0,4 0,118 ±0,005 *** 0,05 ± 0,004

1 сутки 3 группа (п = 10) 4,3 ±0,2 *** ттт 71,9 ±3,8 27,2 ± 0,6 *** 0,15 ± 0,005 *** ТУТ 0,066 ± 0,006 ***

3 сутки 3 группа (п = 10) 4,4 ± 0,3 ** *   65,7 ±2,1 ***   17,1 ±0,4 *** ТУТ 0,13 ±0,004 *** 0,08 ± 0,003 ***

5 сутки 3 группа (п = 10) 3,8 ± 0,2 *   55 ± 1,9 ***   15,6 ±0,4 ***   0,14 ±0,004 ***  тт 0,09 ± 0,005 ***

Примечания: * - достоверность относительно контроля,  - достоверность между 2 и 3 группой; количество знаков обозначает —р < 0,05; < 0,01; < 0,001.

блюдения (рис. 2), но достоверно более высокими величинами ДК и ТБК-активных продуктов на 1-е и 5-е сутки после травмы (рис. 3, 4).

Более низкие показатели спонтанной (СП) хемилюминесценции при ожогах 3—4 степени могут быть обусловлены - повышением скорости окисления на фоне истощения антиоксидантной защиты и (или) количественным снижением субстратов для окисления. В литературе указывается, что в период ожогового шока происходит активация процессов липолиза с увеличением количества

триацилглицеринов и их переносчиков - липопро-теинов очень низкой плотности; отмечается резкое торможение липогенеза, что проявляется в снижении уровня холестерина, липопротеинов высокой плотности и липопротиенов низкой плотности; разобщение всех звеньев липидного обмена - синтеза, транспорта, снижение периода полужизни липидов [1].

При ожогах 3-4 степени тяжести содержание в крови гидроперекисей липидов было ниже, чем в группе контроля и ожогах 1-2 степени. Доказа-

13 контроль В ожог 1-2 ст.  ожог 3-4 ст

Рис. 2. Показатели спонтанной хемилюминесценции после термической травмы на 1-5-е сутки эксперимента. По оси У - интенсивность свечения, уел. ед.; по оси X - время, сут

Рис. 3. Содержание диеновых конъюгатов после термической травмы на 1-5-е сутки эксперимента

Рис. 4. Содержание ТБК-активных продуктов после термической травмы на 1-5-е сутки эксперимента

тельством являются различия по показателям амплитуды быстрой вспышки. Амплитуда быстрой вспышки (А) при ожогах 1-2 степени тяжести была выше контрольных значений на З-и-5-е сутки, при тяжелых ожогах амплитуда быстрой вспышки в эти же сроки снижалась относительно контроля и ожога 1-2 степени (рис. 5).

Светосумма свечения (8) возрастала на 1 сутки после ожоговой травмы независимо от степени поражения и оставалась выше контрольных значений при ожогах 1-2 степени на З-и-5-е сутки. При ожогах 3^4 степени тяжести светосумма свечения на 3-и, 5-е сутки была снижена не только относительно контроля, но и относительно ожогов 1-2 степени (рис. 6).

Тяжесть ожоговой травмы определяет динамику изменений показателей А и Б. Амплитуда быстрой вспышки (А) и светосумма (Б) свечения при ожогах 3-^4 степени тяжести постепенно снижались и на 5-е сутки были ниже (р<0,001) относительно первых суток ожоговой травмы. Подобная закономерность отсутствует при ожогах 1-2 степени тяжести.

Более низкие значения амплитуды быстрой вспышки и светосуммы свечения могут быть связаны с уменьшением количества легко окисляемых полиненасыщенных жирных кислот и накоплением в крови веществ подавляющих окисление. Указывается, что в крови пациентов при ожогах пре-

Рис. 5. Показатели амплитуды быстрой вспышки после термической травмы на 1-5-е сутки эксперимента

Рис. 6. Показатели светосуммы хемилюминесценции после термической травмы на 1-5-е сутки эксперимента

Б254 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 -

1 3 5 7 С утки

-лёгкая и средняя степень тяжести

тяжёлая степень тяжести

Рис. 7. Изменение содержания молекул средней молекулярной массы при термической травме разной степени тяжести. По оси У - содержание МСММ в плазме крови, ед. оптической плотности; по оси X -время, прошедшее после нанесения термической травмы, сут

обладают насыщенные или моноеновые жирные кислоты, необходимые для устранения дефицита энергии, а полиеновые жирные кислоты используются в качестве пластического материала для синтеза гормонов [12]. При выраженной токсемии отмечается увеличение молекул средней молекулярной массы от 500 до 5000 тысяч дальтон -(МСММ), которые способны подавлять перекис-ное окисление липидов [19].

Установлены различия в динамике и количественном представительстве средних молекул при ожоговой травме различной степени тяжести (рис. 7).

При 1-2 степени термической травмы количество средних молекул возрастало не более чем в 1,5 раза к 3-5-м суткам. В случаях 3-4 степени происходило более быстрое (на 2-е-З-и сутки) и более интенсивное (в 3-4) раза нарастание средних молекул.

При ожогах 1-2 степени тяжести нет соответствия динамики изменения светосуммы и МСММ (рис. 8) и отсутствует корреляция между этими показателями.

При термической травме 3-4 степени тяжести изменения этих показателей противоположны (рис. 9) и существует достоверная отрицательная связь (г - 0,78).

—в— Светосумма

Рис. 8. Динамика изменений светосуммы свечения и молекул средней молекулярной массы при термической травме 1-2 степени тяжести

Рис. 9. Динамика изменений светосуммы свечения и молекул средней молекулярной массы при термической травме 3-4 степени тяжести

Рис. 10. Динамика изменений амплитуды быстрой вспышки (А) и молекул средней молекулярной массы

при термической травме 1-2 степени тяжести

Рис. 11. Динамика изменений амплитуды быстрой вспышки (А) и молекул средней молекулярной массы

при термической травме 3-4 степени тяжести

Точно такая же закономерность установлена и для амплитуды быстрой вспышки (рис. 10, 11).

Таким образом, при термической травме 3-4 степени снижение амплитуды быстрой вспышки и светосуммы свечения может быть связано с нарастанием в крови молекул средней молекулярной массы.

Выводы

1. Установлено, что в крови при термической травме активируется свободно-радикальное окисление.

2. Интенсивность свободно-радикального окисления зависит от тяжести термической травмы.

3. Для стадии ожоговой токсемии при термической травме 3-4 степени тяжести характерно снижение в крови гидроперекисей липидов и интенсивности окисления липидов.

Литература

1. Артемьев, С.А. Содержание липидов сыворотки крови при обширных ожогах у детей разно-

го возраста / С.А Артемьев, Н.И. Камзалакова, Г, В. Булыгин // Бюллетень сибирской медицины. — 2008.-№4. -С. 93-99.

2. Биленко, М. В. Ишемические и реперфузион-ные повреждения органов (молекулярные механизмы, пути предупреждения и лечения) / М. В. Биленко. — М.: Медицина, 1989. — 368 с.

3. Владимиров, Ю.А. Информация анализа кривых хемилюминесценции при перекисном окислении липидов / Ю.А. Владимиров, В.И. Оленев, Т.Б. Суслова // Труды 2-го МОЛГМИ — М., 1974. — Т. 9, №8.-С. 6-34.

4. Владимиров, Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. - М.: Наука, 1972. - 252 с.

5. Владимиров, Ю.А. Свечение, сопровождающее биохимические реакции / Ю.А. Владимиров // Соросовский образовательный журнал. — 1999. — № 6. - С. 25-32.

6. Владимиров, Ю.А. Физико-химические ос-

новы фото-биологических процессов / Ю.А. Владимиров, А.Я. Потапенко. — М.: Высш. шк., 1989. — 199 с.

7. Владимиров, Ю.А. Хемилюминесценция плазмы крови в присутствии ионов двухвалентного железа / Ю.А. Владимиров, А.П. Шаров, Э.Ф. Милютин // Биофизика. -1973. - Т. 18, №1. - С. 148-152.

8. Влияние антиоксидантов на изменение состава липидов лизосом печени крыс после термического ожога / Е.Б. Бурлакова, Т.П. Заец, Н.И. Ду-бинская и др. // Патол. физиол. и эксперим. терапия. - 1984. -№>5.- С. 13-17.

9. Воскресенский, О.Н. Свободно-радикальное окисление бета-липопротеинов плазмы крови и его роль в атерогенезе / О.Н. Воскресенский, Т.Н. Ус-тянская // Структура, биосинтез и превращение липидов в организме животных и человека. — Л., 1978. - С. 105-106.

10. Гланц, С. Медико-биологическая статистика/ С. Гланц. — М.: Практика, 1999. —438 с.

11. Зенков, НК. Окислительный стресс. Диагностика, терапия, профилактика / Н.К. Зенков, Е.Б. Меньшикова, С.М. Шергин. — Новосибирск, 1993. -181 с.

12. Курашвили, Л.В. Липидный обмен при неотложных состояниях / Л. В. Курашвили, В.Г. Васильков. — Пенза, 2003. - 202 с.

13. Медведев, Ю.В. Гипоксия и свободные радикалы в развитии патологических состояний организма / Ю.В. Медведев, АД. Толстой. - Москва, 2000. - 227 с.

14. Меньшикова, Е.Б. Биохимия окислительного стресса. Оксиданты и антиоксиданты / Е.Б. Меньшикова, Н.К. Зенков, С.М. Шергин. -Новосибирск, 1994. -203 с.

15. Мхитарян, В.Г. Влияние а -токоферола на активность некоторых ферментов биосинтеза

и распада фосфолипидов при ожоговой травме /

B.Г. Мхитарян, М.И. Агадтанов, П.А. Казарян // Вопросы мед. химии. — 1979. — № 6. - С. 698—704.

16. Особенности метаболизма токсемиче-ского периода ожоговой болезни / Ф.Х. Каминов, Г.П. Ефименко, B.C. Якушев и др. //Метаболические основы острой ожоговой токсемии: сб. науч. работ. - Омск, 1977. —№ 129. — С. 25—123.

17. Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных Применение прикладных программ STATISTICA / О.Ю. Реброва. - М.: Медиа Сфера, 2006. - 312 с.

18. Скрининговый метод определения средних молекул в биологических жидкостях (методические рекомендации) / Н.И. Габриэлян, Э.Р. Левицкий, А.А. Дмитриев и др. — М., 1985 - 32 с.

19. «Средние молекулы» и продукты перекис-ного окисления липидов как система неспецифических регуляторов гемодинамики у спортсменов-лыжников /И.А. Волчегорский, ДА. Дятлов, Л.М. Куликов и др. // Физиология человека. — 1996. - Т. 22, № 6. - С. 106-110.

20. Стальная, ИД. Метод определения диеновой конъюгации ненасыщенных высших жирных кислот / ИД. Стальная // Современные методы в биохимии. - М., 1977. — С. 63-64.

21. Стальная, ИД. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты / ИД. Стальная, Т.Г. Гаришвили // Современные методы в биохимии. — М., 1977. —

C. 66-68.

22. Фархутдинов P.P. Хемтюминесценция

плазмы крови и её фракций, индуцированная ионами двухвалентного железа / P.P. Фархутдинов, Ю.А. Владимиров // Сверхслабое свечение плазмы крови в клинической диагностике: тр. 2-го

МОЛГМИ. - М., 1974. -Т. 9.- Вып. 8. - С. 34-38.

Поступила в редакцию 25 мая 2010 г.