Изучение противоинсультного действия Фенотропила на модели геморрагического инсульта (интрацеребральная посттравматическая гематома) у крыс

Изучение противоинсультного действия Фенотропила на модели геморрагического инсульта (интрацеребральная посттравматическая гематома) у крыс

В.И. Ахапкина, Т.А. Воронина

Целью настоящего исследования явилось экспериментальное изучение терапевтических эффектов Фенотропила - нового ноотропного препарата с потенциальным нейропротективным и психоактивирующим действием - на модели геморрагического инсульта (интрацеребральная посттравматиче-ская гематома) у крыс.

В настоящее время экспериментальное изучение сосудистых заболеваний мозга проводится на различных моделях ишемического и геморрагического инсультов [1-4], которые создаются у лабораторных животных (кролики, крысы) чаще всего путем пережатия (разрушения) сосудов оболочек головного мозга или глубоких структур мозга.

В выполненном исследовании моделирование локального кровоизлияния в головном мозге - создание геморрагического инсульта (интраце-ребральной посттравматической гематомы) - проводилось согласно ме-

Валентина Ивановна Ахапкина -

директор департамента экспериментальной и клинической фармакологии, зам. генерального директора ЗАО “Отечественные лекарства”.

Татьяна Александровна Воронина - докт. мед. наук, профессор, зав. лаборатории психофармакологии ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН.

тодике А.Н. Макаренко и соавт. (1990) [2]. Опыты проводили на белых беспородных крысах-самцах массой 200-250 г. Крысы содержались в условиях вивария при свободном доступе к пище и воде.

С целью создания инсульта у крыс, наркотизированных хлоралгидратом (400 мг/кг, в/м), проводилась трепанация черепа и затем при помощи специального устройства (манд-рен-нож) и стереотаксиса осуществлялась деструкция мозговой ткани в области внутренней капсулы с последующим (через 2-3 мин) введением в место повреждения крови, взятой из-под языка животного (0,02-0,03 мл). Таким способом достигается локальный аутогеморрагический билатеральный инсульт в области внутренней капсулы (диаметр - 2 мм, глубина -3 мм) без существенных повреждений вышерасположенных образований мозга и неокортекса.

Во время операции и сразу после нее погибло 40% крыс с инсультом.

У выживших животных с геморрагическим инсультом в последующем регистрировали различные неврологические, когнитивные и другие нарушения поведения.

Животные были поделены на несколько групп:

1 - интактные крысы (I группа);

2 - ложно оперированные крысы, которых наркотизировали и которым

затем проводили трепанацию черепа, но не осуществляли разрушения мозговой ткани (II группа);

- животные с геморрагическим инсультом (III группа);

- животные с геморрагическим инсультом, которым вводили Фенотро-пил (IV группа).

Фенотропил вводили в дозе 100 мг/кг внутрь (интрагастрально, с использованием специального зонда) через 5 ч после операции, затем -ежедневно однократно в течение 7 дней.

Контрольным животным (I, II и III групп) вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме ин-трагастрально.

Для оценки нарушения поведения и состояния животных после геморрагического инсульта использовали комплекс методов, традиционно применяемых для этих целей в эксперименте.

1. Для оценки неврологического статуса:

- метод оценки неврологического дефицита по шкале оценки инсульта (stroke-index) McGrow в модификации И.В. Ганнушкиной (1996) [5];

- метод регистрации мышечного тонуса;

- метод регистрации координации движений.

2. Для оценки когнитивных функций - условный рефлекс пассив-

Таблица 1. Неврологические нарушения функций по шкале MoGrow

Неврологический симптом Stroke index

Вялость, замедленность движений G,5

Тремор 1,G

Односторонний полуптоз 1,G

Двусторонний полуптоз 1,5

Слабость конечностей 1,5

Односторонний птоз 1,5

Двусторонний птоз 1,5

Манежные движения 2,G

Парез 1-4 конечностей 2^-5^

Паралич 1-4 конечностей 3^-6^

Коматозное состояние 7,G

Смерть

ного избегания в темной, светлой камере (установка Lafayette Instrument Co., США).

3. Для оценки ориентировочноисследовательского поведения -методика открытого поля.

4. Оценка влияния препарата на выживаемость крыс. Регистрировали гибель животных в течение 14 дней после операции.

Динамику развития нарушений, вызванных интрацеребральной пост-травматической гематомой, и влияние Фенотропила на поведение крыс наблюдали в течение 14 сут после операции с регистрацией поведения и состояния животных на 1-е, 3-и, 7-е и 14-е сутки после операции.

Статистическую обработку данных проводили с помощью компьютерной программы “Biostat”. Вычисляли средние арифметические и их доверительные интервалы при р < 0,05. Для оценки достоверности результатов использовали параметрический критерий Стьюдента (t-test) и критерий Пирсона (х2) .

Неврологический дефицит у животных определяли по шкале Stroke-index McGrow в модификации И.В. Ганнушкиной (1977) [6]. Тяжесть состояния оценивалась по сумме соответствующих баллов. Отмечалось количество крыс:

• с легкой симптоматикой (до 2,5 баллов по шкале Stroke-index) - вялость движений, слабость конечностей,

односторонний полуптоз, тремор, манежные движения;

• с тяжелыми проявлениями неврологических нарушений (от 3 до 10 баллов) - парезы и параличи конечностей, а также боковое положение (табл. 1).

Для регистрации мышечного тонуса использовали тест подтягивания на горизонтальной перекладине [7]. В этом тесте крысы подвешиваются передними лапами на проволоку, натянутую на высоте 20-30 см от поверхности стола. Интактные крысы с ненарушенным мышечным тонусом быстро подтягиваются и удерживаются на перекладине четырьмя лапами. Невыполнение этого рефлекса животными опытной группы свидетельствует о нарушении мышечного тонуса и неврологическом дефиците.

Для регистрации неврологического дефицита, выражающегося в нарушении координации движений, крыс помещали на горизонтальный стержень диаметром 4 см, вращающийся со скоростью 3 оборота в минуту [7]. Неспособность животных под влиянием препарата удерживать равновесие на стержне в течение 2 мин рассматривалась как проявление нарушения координации движений.

Оценку когнитивных функций проводили на стандартной установке условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) (Passive Avoidance) фирмы Lafayette Instrument Co. (США). Конструктивно установка состоит из маленькой платформы, расположенной на расстоянии 1 м от пола, освещенной специальной лампой и соединенной с ней темной камеры с электродным полом. Крысу помещали на освещенную платформу перед входом в темную камеру установки, хвостом к входному отверстию.

Для оценки норкового рефлекса регистрировали латентное время первого захода в темную камеру. Крыса, предпочитая темную камеру, быстро переходит в нее.

С целью обучения крыса в темной камере получала однократное болевое раздражение электротоком (0,45 мА). Продолжительность раздражения оп-

ределялась выбеганием животного из темного отсека [8]. Животное запоминало, что в темную камеру заходить опасно.

Тест на воспроизведение УРПИ (на сохранение памятного следа) осуществляли через 24 ч после обучения, а также 3, 7 и 14 сут после операции. Животное вновь помещали на освещенную платформу и регистрировали в течение 3 мин латентный период первого захода в темную камеру и время пребывания крысы в темной камере.

Оценка ориентировочно-исследовательского поведения осуществлялась в тесте открытого поля [7]. Установка “открытое поле” для крыс представляет собой камеру размером 120 х 120 см с прозрачной крышкой. Пол камеры разделен равномерно линиями на 9 квадратов с 16 отверстиями диаметром 4 см. В процессе 3-минутного пребывания крысы в открытом поле регистрировали следующие показатели: число вставаний на задние лапки (вертикальная двигательная активность), число переходов из квадрата в квадрат (горизонтальная двигательная активность) и число заглядываний в отверстия.

Результаты исследования Влияние Фенотропила на показатели

неврологического дефицита по шкале МсGrow после инсульта

В первые сутки после операции при оценке неврологических отклонений у контрольных крыс с геморрагическим инсультом (ГИ) показано, что почти у всех (90-100%) животных наблюдались умеренные неврологические нарушения в виде вялости и замедленности движений, тогда как у ложно оперированных крыс эти нарушения были отмечены у 40% особей. Выраженных неврологических нарушений, проявляющихся в виде манежных движений по кругу и параличей конечностей, в группе ложно оперированных животных не наблюдалось, а у животных с ГИ они были отмечены в 30-40% случаев.

Фенотропил после 2-кратного введения в дозе 100 мг/кг достоверно

снижал выраженность неврологических нарушений у крыс через сутки после геморрагического инсульта (табл. 2).

Влияние Фенотропила на мышечный тонус после инсульта в тесте подтягивания на перекладине

Регистрация мышечного тонуса у крыс с ГИ показала, что на 3-и сутки после инсульта ослабление мышечного тонуса отмечалось в среднем у 40-50%, а на 7-14-е сутки - у 36-38% животных.

У крыс, получавших Фенотропил, на 1-е-3-и сутки ослабление мышечного тонуса наблюдалось у 33-42% особей. На 7-е сутки после введения Фенотропила ослабление мышечного тонуса наблюдалось у 25% крыс, а к 14-м суткам этот показатель снижался до 16%, так что различия были статистически значимыми по сравнению с аналогичными показателями у инсультных животных (табл. 3).

Влияние Фенотропила на координацию движений после инсульта в тесте вращающегося стержня

Исследование динамики нарушений координации движений у крыс с ГИ показало, что на 1-е-3-и сутки после инсульта нарушение координации движений отмечалось у 48-50% животных, а на 7-14-е сутки - у 38-45% выживших животных (табл. 4).

Фенотропил в дозе 100 мг/кг ослаблял нарушения координации движений у крыс. Выраженные и статистически значимые результаты лечения были получены на 7-14-е сутки после инсульта (см. табл. 4).

Влияние Фенотропила на когнитивные функции животных с геморрагическим инсультом

Выполнение норкового рефлекса. Норковый рефлекс грызунов основан на стремлении к ограниченному затемненному пространству.

Контрольные крысы (интактные и ложно оперированные) при поме-

Таблица 2. Влияние Фенотропила (1GG мг/кг, внутрь) на неврологический дефицит (по шкале McGrow) у крыс после геморрагического инсульта. Приведено количество животных с различной неврологической симптоматикой (%) в 1-е сутки после операции

Группы животных

Неврологический симптом ложно оперированные инсульт инсульт + + Фенотропил

Вялость, замедленность движений 4G 1GG 5G

Слабость конечностей (начальная) 3G 9G 4 О

Манежные движения G 4G G*

Парез 1-4 конечностей G 3G 3G

Паралич 1-4 конечностей G 3G G*

* Достоверность отличий от инсультных крыс при p < G,G5 (х2).

Таблица 3. Влияние Фенотропила на мышечный тонус животных в тесте горизонтальной перекладины после геморрагического инсульта

Количество животных, не подтянувшихся на горизонтальной перекладине

1 руппа животных 1-е сутки 3-и сутки 7-е сутки 14-е сутки

n/N % n/N % n/N % n/N %

Интактные (без операции) G/Ю G G/Ю G G/Ю G G/Ю G

Ложно оперированные 1/1G 1G 2/Ю 2G 1/1G 1G G/9 G

Инсульт Ю/23 43* 9/18 5G* 5/13 38* 4/11 36*

Инсульт + Фенотропил 5/12 42 4/12 33 3/12 25 2/12 16**

Обозначения: п/Ы - количество не подтянувшихся животных (п) из общего количества (Ы). * Достоверность отличий по сравнению с группой ложно оперированных крыс при р < < 0,05 (х2).

** Достоверность отличий по сравнению с группой инсультных крыс при р < 0,05 (х2).

Таблица 4. Влияние Фенотропила на координацию движений животных в тесте вращающегося стержня после геморрагического инсульта

Количество животных, не удержавшихся на вращающемся стержне

1-е сутки 3-и сутки 7-е сутки 14-е сутки

n/N % n/N % n/N % n/N %

Интактные (без операции) G/Ю G G/Ю G G/Ю G G/Ю G

Ложно оперированные 2/1G 2G 3/Ю 3G 1/1G 1G 1/9 1G

Инсульт 11/23 48* 9/18 5G 5/13 38* 5/11 45*

Инсульт + Фенотропил 5/12 42 4/12 33 G/12 G** G/12 G**

Обозначения: п/Ы - количество не удержавшихся животных (п) из общего количества (Ы). * Достоверность отличий по сравнению с группой ложно оперированных крыс при р < < 0,05 (х2).

** Достоверность отличий от крыс с ГИ при р < 0,05 (х2).

щении их на освещенную платформу быстро, с коротким латентным периодом переходят в темную камеру.

У крыс с ГИ норковый рефлекс не нарушается, но увеличивается латентное время его выполнения (табл. 5).

Фенотропил не нарушает выполнение норкового рефлекса, и при использовании препарата латентное время выполнения рефлекса сопоставимо с норковым рефлексом у крыс с ГИ (см. табл. 5).

Таблица 5. Влияние Фенотропила на выполнение норкового рефлекса. Приведено латентное время захода в темную камеру при обучении норковому рефлексу в 1-е сутки после операции

Группа животных Латентное время, с

Интактные животные (без операции) Ложно оперированные Инсульт Инсульт + Фенотропил 12,8 ± 1,2 13,G3 ± G,9 35,2 ± Ю,1 3G,6 ± 8,8

Таблица 6. Влияние Фенотропила на воспроизведение УРПИ у крыс с интрацеребральной посттравматической гематомой

Воспроизведение УРПИ

24 ч после обучения 3 сут после обучения 7 сут после обучения 14 сут после обучения

Группа латентное количество латентное количество латентное количество латентное количество

животных время крыс, не время крыс, не время крыс, не время крыс, не

захода вошедших захода вошедших захода вошедших захода вошедших

в темную в темную в темную в темную в темную в темную в темную в темную

камеру, с камеру, % камеру, с камеру, % камеру, с камеру, % камеру, с камеру, %

Интактные (без операции) 156,0 ± 24,0 80 152,5 ± 14,3 80 143,1 ± 16,5 75 133,6 ± 25,1 60

Ложно оперированные 143,7 ± 16,3 70 137,6 ± 17,4 65 1243,3 ± 22,0 60 114,2 ± 20,6 55

Инсульт 68,3 ± 26,4* 25* 71,4 ± 39,3* 28 28,0 ± 2,9* 16* 23,7 ± 11,2* 9*

Инсульт + + Фенотропил 101,1 ± 24,2 40 98,3 ±18,7 40 75,2 ± 24,1** 30** 83,2 ± 26,7** 40**

* Достоверность отличий по сравнению с группой ложно оперированных крыс при р < 0,05 (1-тест Стьюдента; х2) ** Достоверность отличий по сравнению с инсультными животными при р < 0,05 (1-тест Стьюдента; х2).

Нарушения памяти животных.

Установлено, что в контрольной группе крыс, получавших в течение всего эксперимента физиологический раствор (интактные), при воспроизведении УРПИ через 24 ч после обучения (получение болевого раздражения в темном отсеке камеры) 80% животных помнили об ударе током и

не заходили в темную “опасную” камеру в течение всего времени наблюдения.

Через сутки после обучения контрольные интактные и ложно оперированные крысы хорошо помнили об ударе током в темной камере, и 70-80% животных не заходили в этот опасный отсек. Остальные крысы за-

Таблица 7. Влияние Фенотропила на ориентировочно-исследовательское поведение и двигательную активность животных в условиях методики открытого поля после геморрагического инсульта

Группа животных Горизонтальная двигательная активность Вертикальная двигательная активность Обследо- вание отверстий Суммарный показатель

1-е сутки после операции

Интактные 15,6 ± 2,3 5,6 ± 1,4 3,3 ± 0,9 24,5 ± 5,4

Ложно оперированные 14,7 ± 1,9 2,9 ± 0,6 3,2 ± 0,7 20,8 ± 2,6

Инсульт 7,3 ± 1,1* 2,7 ± 0,8 1,8 ± 0,3 11,8 ± 2,0*

Инсульт + Фенотропил 8,8 ± 3,5 4,4 ± 2,1 1,3 ± 0,5 14,5 ± 5,5

3-и сутки после операции

Интактные 14,0 ± 1,2 5,1 ± 1,1 3,2 ± 0,8 22,3 ± 2,5

Ложно оперированные 13,7 ± 2,3 3,2 ± 0,8 3,1 ± 0,5 20,0 ± 2,3

Инсульт 6,2 ± 1,2* 2,7 ± 0,4 1,7 ± 0,5 10,6 ± 1,5*

Инсульт + Фенотропил 15,2 ± 5,4 4,5 ± 1,5 1,9 ± 0,7 21,6 ± 6,1**

7-е сутки после операции

Интактные 13,6 ± 2,3 5,3 ± 1,4 4,1 ± 1,2 23,0 ± 5,7

Ложно оперированные 13,4 ± 2,1 4,1 ± 2,8 2,9 ± 0,6 20,4 ± 3,5

Инсульт 7,8 ± 1,9 3,2 ± 1,3 2,4 ± 0,5 13,4 ± 2,9

Инсульт + Фенотропил 20,9 ± 4,1** 10,9 ± 3,2** 4,6 ± 1,3** 36,4 ± 5,6**

14-е сутки после операции

Интактные 12,4 ± 2,5 5,6 ± 1,3 3,5 ± 1,2 21,5 ± 5,9

Ложно оперированные 13,4 ± 2,2 6,2 ± 1,4 3,3 ± 0,6 22,9 ± 3,5

Инсульт 8,1 ± 2,4* 3,7 ± 1,4 3,2 ± 1,3 15,0 ± 3,7*

Инсульт + Фенотропил 12,2 ± 2,8** 6,9 ± 1,9** 3,0 ± 0,7 22,1 ± 3,5**

* Достоверность отличий по сравнению с группой ложно оперированных крыс при р < < 0,05 (1-тест Стьюдента).

** Достоверность отличий по сравнению с инсультными крысами при р < 0,05 (1-тест Стьюдента).

ходили в темный отсек с большим латентным периодом (табл. 6).

У крыс с геморрагическим инсультом (ГИ) через сутки после обучения достоверно уменьшилось латентное время захода в темную камеру. Только 25% животных совсем не зашли в темную камеру, т.е. помнили об ударе током, у 75% крыс память была нарушена (см. табл. 6).

Фенотропил в дозе 100 мг/кг при однократном введении через 5 ч после операции (воспроизведение УРПИ через сутки после обучения) увеличивал до 40% число животных с сохраненной памятью (животные с ГИ - 25%) и увеличивал латентное время захода в темную камеру (на 48%). Эффект при этом был статистически незначим.

Через 3 сут после операции нарушения памяти у животных с ГИ сохранялись на том же уровне (см. табл. 6).

После 3-кратного введения Фено-тропила отмечалось дальнейшее увеличение латентного времени захода в темную камеру и увеличение числа животных, не зашедших в камеру; эти эффекты Фенотропила, однако, оставались статистически незначимыми.

Через 7 и 14 сут после обучения ин-тактные и ложно оперированные животные хорошо помнили о негативной ситуации и выполняли УРПИ (см. табл. 6).

В сравнении с ними у инсультных животных на 7-14-й день после ГИ и обучения память на получение болевого раздражения в темной камере была достоверно нарушена. Причем

Таблица 8. Влияние Фенотропила на выживаемость животных после ГИ

Количество погибших животных в течение 14 сут после геморрагического инсульта

Группа животных

Ложно оперированные Инсульт

Инсульт + Фенотропил

1-е сутки 3-и сутки 7-е сутки 14-е сутки

n/N % n/N % n/N % n/N %

0/10 7/30 0/12 * ** О СО О 2 0/10 5/23 0/12 0 22* 0** 0/10 5/18 0/12 0 28* 0** 1/10 2/13 0/12 * ** 050

Обозначения: п/Ы - количество погибших животных (п) из общего количества (Ы).

* Достоверность отличий по сравнению с группой ложно оперированных крыс при р < < 0,05 (х2).

** Достоверность отличий по сравнению с инсультными крысами при р < 0,05 (х2).

это нарушение памяти было выражено в большей степени в сравнении с показателями через 1 и 3 сут после операции. Так, через 7 сут только 16% животных помнили о негативном раздражении, а остальные крысы заходили в темный опасный отсек уже через 28 с. А через 14 сут только 9% животных сохранили УРПИ (см. табл. 6).

Фенотропил, введенный крысам в дозе 100 мг/кг в течение 7 дней, восстанавливал нарушения памяти в пост-инсультный период на 7-й и 14-й дни после операции. Под влиянием препарата наблюдалось статистически значимое увеличение (до 40%) числа помнивших негативную ситуацию животных (у крыс с ГИ - 9%). Примерно в

3 раза увеличивалось по сравнению с инсультными крысами латентное время захода в темную опасную камеру (см. табл. 6).

Таким образом, Фенотропил при повторном введении обладает выраженной способностью восстанавливать нарушенную при геморрагическом инсульте память на модели условного рефлекса пассивного избегания.

Ориентировочно-исследовательское поведение. Изучение ориентировочно-исследовательского поведения в условиях методики открытого поля показало, что в 1-е сутки после операции у крыс с ГИ отмечалось значительное, практически в 2 раза, снижение суммарных показателей двигательной активности и исследовательского поведения. Сходные показатели поведения крыс наблюдались и на 14-й день после ГИ, хотя животные были в эти сроки несколько активнее (табл. 7).

Фенотропил при регистрации эффекта через 3 сут после ГИ увеличивал суммарные показатели поведения до уровня показателей поведения интактных и ложно оперированных животных (см. табл. 7).

При регистрации эффекта после 7 дней введения Фенотропила суммарный показатель двигательного поведения по сравнению с группой крыс с ГИ увеличивался в 2,7 раза (см. табл. 7).

Через 14 сут после операции активирующий эффект Фенотропила на поведение сохранялся.

Влияние Фенотропила

на выживаемость крыс

с геморрагическим инсультом

Во время операции и непосредственно после операции погибло 40% крыс.

Выживших в первые часы после ГИ животных наблюдали в течение 14 сут.

Как видно из табл. 8, в течение 7 сут после операции в группе ложно оперированных крыс гибели животных не наблюдалось, а на 14-е сутки 1 крыса из 10 погибала.

В группе крыс с ГИ в течение 1-х суток погибло 23% животных, а к 14-му дню этот показатель достиг 57% (см. табл. 8).

Фенотропил в дозе 100 мг/кг внутрь ежедневно в течение 7 дней полностью предупреждал гибель крыс с ГИ (см. табл. 8).

Выводы

В результате проведенных исследований показано, что по сравнению с ложно оперированными животными у крыс с геморрагическим ин-

сультом (интрацеребральной пост-травматической гематомой) наблюдаются: выраженный неврологический дефицит, нарушение координации движений, ослабление процессов обучения и памяти и повышение показателей гибели животных. При этом отмечалось углубление патологической симптоматики к 14-му дню наблюдения.

Фенотропил при введении животным в дозе 100 мг/кг через 5 ч после операции, а затем ежедневно в течение 7 дней вызывает значительное уменьшение выраженности постинсультных нарушений. Препарат улучшает показатели неврологического дефицита по шкале МсО|^ уже через сутки после инсульта, а при курсовом применении повышает мышечный тонус и улучшает координацию движений на 7-е и 14-е сутки после инсульта. Фенотропил при повторном применении восстанавливает нарушенную в результате инсульта память, улучшая воспроизведение условного рефлекса пассивного избегания на 7-е и 14-е сутки после инсульта. Наиболее ярким эффектом Фенотропила является его способность полностью предупреждать гибель животных с геморрагическим инсультом.

Список литературы

1. Воронина Т.А. // Вестник Российской академии медицинских наук. 2000. Т. 9. С. 27.

2. Макаренко А.Н. и др. А. с. № 1767518 от 03.11.1990.

3. Jackowski A. et al. // J. Cerebral Blood Flow and Metabolism. 1990. V. 10. P. 835.

4. Smith S. et al. // Neuroscience. 1997. V. 77. № 4. P 1123.

5. Ганнушкина И.В. // Журн. невропатол. и психиатр. 1996. № 1. С. 14.

6. Ганнушкина И.В. Функциональная ангиоархитектоника головного мозга. М., 1977. С. 224.

7. Воронина Т.А., Середенин С.Б. Методические указания по изучению транквилизирующего (анксиолитического)действия фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М., 2000. С.126-130.

8. Воронина Т. А., Островская Р.У. Методические указания по изучению ноотроп-ной активности фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М., 2000. С. 153-158. >