Способ отбора проб воды с поверхности водоёмов для определения присутствия холерных вибрионов, и переносное устройство для его осуществления
METHOD OF SAMPLING SURFACE WATER RESERVOIRS TO DETERMINE PRESENCE OF VIBRIO CHOLERAE AND PORTABLE DEVICE FOR ITS IMPLEMENTATION

Предлагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к области получения и подготовки образцов проб с водных поверхностей водоемов для проведения бактериологических исследований.
В настоящее время в период эпидемических сезонов ежегодно (май - октябрь), в зависимости от погодных условий, актуальна проблема забора вручную проб воды в естественных водоемах (моря, реки, озера, пруды), который проводят один раз в неделю в литровые емкости (батометры). Последние собирают со всех стационарных точек (не менее 200 штук) в тару для перемещения патогенного материала и привозят в лабораторию для последующего биологического исследования жидкостей на присутствие холерных вибрионов. Технология отбора представляет собой рутинный, громоздкий и трудоемкий процесс. Токсигенные вибрионы редко выделяются из водной среды в период между холерными эпидемиями, но в последние годы они были обнаружены в скоплениях биопленок в морской и речной воде стран Азии и Латинской Америки (1, 2, 3, 4). Формирование биопленок холерными вибрионами является важным способом их выживания в окружающей среде, последние могут располагаться на поверхности водорослей, ракообразных, хитине и щитках крабов, креветок (5, 6).
Кроме того, биопленки обеспечивают селективное преимущество патогенным вибрионам, повышая их способность к распространению в различных природных условиях. В связи с этим, важно на этапе забора проб получить биопленку для ее дальнейшего исследования.
Известен батометр - бутылка на штанге типа ГР-16М (см. ТУ 52-05-62-64), содержащий емкость в виде бутылки, вставленной в металлическую обойму и закрепленной на ней с помощью зажимной ленты и винта, при этом обойма с бутылкой установлена и закреплена на штанге, а бутылка снабжена металлической головкой, через которую проходят две трубки (водозаборная и воздухоотводная).
Недостатком батометра является то, что с его помощью берут только одну пробу с одного места, в которой, как правило, присутствует малая концентрация холерных вибрионов и многочисленная сопутствующая микрофлора, подавляющая рост холерных вибрионов.
Таким образом, исследование батометров неэффективно при проведении постоянных мониторингов водоемов на наличие холерных вибрионов.
При этом выделение единичных клеток холерных вибрионов с минимальным загрязнением пробы является трудоемким и длительным процессом.
За прототип выбран способ отбора проб воды (см. пат. RU №2160891, кл. G01N 1/10, 20.12.2000 г.), включающий спуск батометра с использованием троса и балластного груза на глубину пробоотбора, при которой осуществляют замену стерильной жидкости пробой с последующим ее охлаждением до температуры замерзания со скоростью не ниже 0,3°C в секунду.
Кроме того, батометр содержит корпус, на котором закреплен пробоотборник с крышкой, герметично закрывающей полость пробоотборника и емкость с жидким азотом, последняя связана посредством клапана с теплообменником, размещенным в пробоотборнике между его каркасом и полостью.
В корпусе батометра размещены водяной насос, блок управления, связанный с датчиком глубины погружения и управляющий клапанами водяного насоса и положением крышки пробоотборника.
Недостатком прототипа является его неэффективность в отношении взятия проб и проведения исследований на присутствие холерных вибрионов.
Заморозка проб до 20-30°C отрицательно влияет на жизнеспособность холерных вибрионов, в соответствии с МУК 4.2.2870-11 «Лабораторная диагностика холеры», проба, взятая из воды в течение 4-х час должна быть доставлена в лабораторию для исследований. Кроме того, устройство, которым осуществляется известный способ, сложно по конструкции и ненадежно в эксплуатации.
Техническая задача предлагаемого изобретения состояла в разработке способа и устройства в виде переносной конструкции для отбора проб с водной поверхности водоемов, позволяющей повысить эффективность проведения бактериологических исследований на присутствие холерных вибрионов.
Поставленная задача достигается тем, что в способе отбора проб воды с поверхности водоемов для определения присутствия холерных вибрионов, включающем спуск устройства для отбора воды с использованием троса на глубину пробоотбора, одновременно берут в отведенном месте водоема с помощью переносного устройства шесть проб, используя сменные пробоотборники, представляющие собой стеклянные трубки диаметром 5 мм и длиной 7 см для образования биопленок холерных вибрионов, затем в течение 6 дней, в зависимости от температурных изменений окружающей среды, устройство тросом поднимают и трубки извлекают пинцетом, размещают в отдельные пробирки с 1% пептонной водой, закрывают крышкой и устанавливают в контейнер для транспортирования в лабораторию для бактериологических исследований, а на место извлеченных пробоотборников устанавливают новые.
Предложенный способ может быть реализован с помощью переносного устройства для отбора проб воды, состоящего из корпуса для размещения в нем пробоотборника, причем корпус представляет собой основание в виде диска, выполненного с гнездами диаметром 7 мм под пробоотборники в виде стеклянных трубок в количестве шести штук, и круглой пластины, связанной с основанием вертикальным стержнем, имеющим с двух сторон резьбу, на которой внизу с помощью гаек и колпачка зафиксировано основание, а вверху посредством шайбы и гайки пластина, над которой размещен поплавок, посаженный на втулку, и закреплен колпачком-держателем с отверстием под трос, при этом основание и пластина для жесткости дополнительно стянуты тремя винтами.
Сущность предлагаемого изобретения поясняется чертежами, где на
Фиг. 1 изображен общий вид устройства для отбора проб;
Фиг. 2 - вид А;
Фиг. 3 - разрез Б-Б;
Фиг. 4 - разрез В-В;
Фиг. 5 - разрез Г-Г.
Устройство представляет собой основание 1, выполненное в виде диска с бортиком 2 и шестью гнездами 3, диаметром 7 мм и глубиной 10 мм под пробоотборники 4 (см. фиг. 1, 3, 4). Последние представляют собой стеклянные трубки длиной 7 см и диаметром 5 мм.
С помощью стержня 5, установленного вертикально, основание 1 связывают с круглой пластиной 6, имеющей сквозные отверстия в количестве 6 штук и закрепленной на расстоянии Н=5,5 см от основания 1 (см. фиг. 2).
Стержень 5 выполнен с двух сторон с резьбой, на которой внизу с помощью шайбы 7, гаек 8, 9 (см. фиг. 1) колпачка 10 удерживается основание 1. С противоположной стороны стержня 5, вверху посредством гайки 11, шайбы 12 закреплена пластина 6. Над последней размещен поплавок 13, посаженный на втулку 14 (см. фиг. 5) и выполненный из пористого материала (пробки, губки, дерева и любых материалов с удельным весом меньше воды) (см. фиг. 1). Поплавок 13 зафиксирован колпачком-держателем 15 с отверстием под трос 16.
При этом пластина 6 и основание 1 для жесткости конструкции стянуты тремя винтами 17 и закреплены гайками 18 (см. фиг. 4).
Работа устройства осуществляется следующим образом.
Устройство с размещенными в нем пробоотборниками 4 в количестве 6 штук с помощью троса 16 опускают в водоем на глубину, достаточную для забора проб. Благодаря поплавку 13, устройство под своей тяжестью не опускается на дно, а удерживается в верхнем слое водной поверхности, где наблюдается наиболее высокая температура воды. Кроме того, трос позволяет регулировать необходимую глубину от поверхности водоема и фиксировать устройство в стационарном положении. Затем закрепленное посредством троса 16 устройство оставляют на несколько дней не менее 6 дней в постоянно отведенных местах в зависимости от температурных изменений окружающей среды.
Таким образом, забор проб производят как минимум один раз в неделю, для этого поднимают трос 16, и с помощью пинцета собирают пробоотборники 4, укладывая каждый из них в отдельную пробирку с 1% пептонной водой, и закрывают крышкой.
Затем на место взятых для исследования пробоотборников устанавливают пробоотборники новые, так чтобы они одновременно проходили в сквозные отверстия пластины 6 и фиксировались в гнездах 3 основания 1.
После этого пробирки с пробоотборниками транспортируют в лабораторию для бактериологических исследований.
Как правило, на поверхности стеклянных трубочек за период нахождения в воде уже формируется биопленка, которую непосредственно и изучают в лаборатории на предмет присутствия как холерных вибрионов, так и других патогенных микроорганизмов (V.parahaemoliticus, E.coli, Enterococcus spp. и т.д.).
Благодаря адгезии микроорганизмов на стенках пробоотборника и формировании биопленки на его поверхности появляется возможность изучать как качественный, так и количественный состав микробиоты водоема, а также фаговый состав.
Пример 1
В июне 2015 г. в стационарной точке р. Дон был установлен опытный образец пробоотборника, экспозиция пребывания в воде составила сутки. После извлечения из реки образцы были помещены в соответствующую питательную среду для дальнейших микробиологических исследований. Одновременно из этой же точки была отобрана проба воды и исследована по классической схеме, рекомендованной МУК 4.2.2870-11.
Результаты апробации нового способа отбора и устройства для его проведения показали (см. таблицы 1, 2), что при бактериологическом исследовании общее количество микроорганизмов в КОЕ, накопленное в пробоотборниках, значительно превышало КОЕ в пробах воды, отобранных известным способом. Тенденция сохранялась и в отношении холерных вибрионов. Если в пробоотборниках микроорганизмы рода Vibrio накапливались до 50-70% от общего числа оксидазоположительной микрофлоры, то в пробах из воды было 20-35% соответственно.
Пример 2
В июле 2015 г. в стационарной точке р. Темерник был установлен опытный образец пробоотборника, экспозиция пребывания в воде составила сутки. После извлечения из реки образец был помещен в соответствующую питательную среду для дальнейших микробиологических исследований. Одновременно из этой же точки была отобрана проба воды и исследована по классической схеме, рекомендованной МУК 4.2.2870-11.
Результаты проведенных исследований (см. таблицы 3, 4)
Из таблиц 3, 4 видно, что, наряду с выявлением вибрионов, принадлежащих к не O1/ не O139 серогруппам, в пробе воды, отобранной известным способом, был выявлен холерный вибрион, отнесенный к O1 серогруппе, серовару Инаба. Аналогичный микроорганизм был изолирован и из пробоотборника.
Пример 3
В августе 2015 г. в стационарной точке р. Темерник в районе Ботанического сада был установлен опытный образец пробоотборника, экспозиция пребывания в воде составила сутки. После извлечения из реки образец был помещен в соответствующую питательную среду для дальнейших микробиологических исследований. Одновременно из этой же точки была отобрана проба воды и исследована по классической схеме, рекомендованной МУК 4.2.2870-11.
Из результатов проведенных исследований (см. таблицы 5, 6) видно, что благодаря новому способу отбора воды уже через сутки удалось обнаружить в биопленке вирулентный штамм V.cholerae O1 серогруппы, серовара Инаба. В пробе воды, отобранной известным способом, изолировать данный холерный вибрион не удалось. Этот факт свидетельствует о том, что чем больше изучено изолятов (проб), тем наибольшая вероятность отследить вибриопейзаж поверхностного водоема в данной стационарной точке.
Использование предлагаемого изобретения позволяет за счет переносной конструкции устройства для отбора проб воды осуществлять новую технологию отбора с созданием в естественных условиях биопленок холерных вибрионов, так как определять их жизнеспособность в составе биопленок проще и быстрее, что повышает эффективность проведения бактериологических исследований на присутствие холерных вибрионов.
Кроме того, одновременное взятие несколько проб дает возможность проводить исследования на наличие других патогенных организмов в воде, а именно кишечных палочек, энтерококков.
Источники информации
1. Alam М., Sultana М., Nair G.B. et al. // Appl. Environ. Microbiol. - 2006. - Vol. 72, №4. - P. 2849-2855.
2. Binsztein N., Costagligla, Pitchel M. // Appl. Environ. Microbiol. - 2004. - Vol. 70, №12. - P. 7481-7486.
3. Davey M.E., O’Toole G.A. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. - 2000. - Vol. 64, - P. 847-867.
4. Hall-Stoodley Z., Stoodley P. // Trends Microbiol. - 2005. - Vol. 13, - P. №7-10.
5. Harrison-Balestra C., A.L. Cazzaniga, S.C. Davis, et al. // Dermatol. Surg. - 2003 - Vol. 29, - P. 631-635.
6. Karatan E., Duncan T.R., Watnick P.I. // J. Bacteriol. - 2005. - Vol. 187, №21. - P. 7434-7443.