Влияние интерферона на мутагенное и цитотоксическое действие вируса гриппа у белых мышей и их эмбрионов

Влияние интерферона на мутагенное и цитотоксическое действие вируса гриппа у белых мышей и их эмбрионов

А.Г. Пирцхелани, Н.А. Пирцхелани, Н.В. Мамаладзе, Г.А. Пирцхелани,

Н.Г. Джаджанидзе, Г.Д. Капанадзе

Тбилисский государственный университет, Республика Грузия Тбилисский государственный медицинский университет, Республика Грузия Научный центр биомедицинских технологий РАМН, Москва

На лабораторных мышах и их эмбрионах изучено антииммуногенное и антицитотоксичес-кое действия эндогенного интерферона при индукции мутации вирусом гриппа А0/ PR 8 . Однократное и интраназальное введение животным в разные сроки беременности вируса гриппа А0 вызывает достоверное повышение количества структурных нарушений хромосом, геномных мутаций, патологических митозов, центромерных ассоциаций хромосом и нарушение интерфазных ядер, как у беременных мышей так и их эмбрионов. Хромосомы эмбрионов, как на стадии до имплантации, так и на стадии активного органогенеза, более чувствительны к воздействию вируса гриппа А0, чем хромосомы взрослых животных. Эндогенный интерферон в три раза уменьшает частоту мутагенных и цитотоксических эффектов вируса гриппа А0.

Ключевые слова: вирус гриппа, интерферон, митоз, хромосомы, мыши, эмбрионы.

Среди причин перинотальной заболеваемости и смертности исключительно важное место принадлежит инфекциям беременных, в частности вирусным болезням. Особенно тяжело эти инфекции протекают у эмбрионов и плодов, так как интенсивное клеточное деление создает благоприятную среду для размножения вирусов, которые оказывают выраженное цитопато-генное воздействие на клетки эмбриона, нарушают их генетический аппарат и часто приводят к гибели.

Если проблема перинатальной вирусной инфекции в настоящее время привлекает к себе все большее внимание, то вопрос о влиянии противовирусных препаратов, в том числе и интерферона, на хромосомы эмбрионов при гриппозной инфекции изучен крайне недостаточно. Имеются единичные сведения о влиянии экзогенного интерферона на хромосомы клеток людей, инфицированных вирусом гриппа [15]. Авторы показали, что экзогенный ин-

терферон снижает число структурных нарушений хромосом.

В наших предыдущих работах [12, 13, 14] было показано, что вирус гриппа А0 обладает выраженным эмбриотоксическим и мутагенным действием как в клетках беременных мышей, так и в клетках плодов [14]. Мутагенное действие вируса гриппа установлено также в культурах лимфоцитов человека [11]. Исходя из этого, изыскание препаратов, уменьшающих указанный эффект вирусов, представляется исключительно важным.

Целью настоящего исследования явилось изучение влияния эндогенного интерферона на хромосомы беременных мышей и их эмбрионов при гриппозной инфекции.

Материал и методы

Опыты проводились на нелинейных белых мышах. Первым днем беременности считали день обнаружения влагалищных

пробок у самок после подсаживания к ним самцов. В работе использованы патогенный для мышей вирус Aq/PR8 (далее Aq), который вводили интраназально однократно в дозе 104 ЭИД50/0,2 мл и индуктор интерферона вирус болезни Ньюкасла (далее ВБН) ‘ в дозе 107 ЭИД50/0,2 мл — вводили внутривенно.

Всего исследовано 22 беременные мыши, 40 эмбрионов на стадии органогенеза и 121 4-дневный эмбрион, которые распределены в 4 группы: 1) зараженных вирусом гриппа Aq через 6 часов индукции интерферона у беременных мышей; 2) зараженных только вирусом гриппа Aq; 3) зараженных вирусом болезни Ньюкасла; 4) контрольная группа.

Для приготовления хромосомных препаратов из клеток беременных мышей использовали метод Форда-Уоллама [17].

Хромосомные препараты из зародышей периода органогенеза (9-12-дневные) готовили по методу Врублевской-Дыбана [19]. Зародышей периода дробления и на стадии бластоцисты исследовали под бинокулярной лупой МБС-2. Подсчет числа бластомеров и хромосомный анализ проводился на препаратах, приготовленных по методу Тарковского [20]. Учет структурных нарушений хромосом проводился по классификации Н.Бочкова [5], геномный мутаций -

Н.Дубинина [6], патологических митозов — И.Алова [2]. Изучение нарушения интерфазных ядер проводились по модифицированному методу А. Пирцхелани, Н. Мамаладзе [13]. Все полученные данные были статистически обработаны.

Результаты и обсуждение

Анализ полученных данных показал (см. табл.), что вирус гриппа А0 в клетках взрослых мышей вызывает резкое возрастание частоты хромосомных аномалий (структурные нарушения хромосом, геномные мутации). Со дня инфицирования частота этих нарушений постепенно возрастает и на седьмой день достигает 40, 47% (в

контроле 2,0%). Аналогичные данные получены клиническими наблюдениями некоторых автовов [8, 9]. Следует отметить, что из структурных нарушений в три раза чаще наблюдается лизис хромосом, чем единичные и множественные фрагменты.

Кроме хромосомных аномалий вирус гриппа А0 характеризуется высоким цито-токсическим действием. Он часто вызывает образование патологических митозов и на 7-й день инфицирования достигает 27,9%. Из патологических митозов под воздействием вируса гриппа А0 наиболее часто наблюдается полая метафаза, деспира-лизация и склеивание хромосом, значительно реже — трехгрупповая метафаза и набухание хромосом. Из патологических митозов в контроле наблюдается только полая метафаза и склеивание хромосом.

Анализ полученного нами материала также показал, что вирус гриппа А0 вызывает нарастание нарушения интерфазных ядер: плотноконденсированный хроматин распологается в виде кольца по периферии клетки, а середина остается пустой. Микроскопический анализ таких ядер проводился в тех же препаратах, где проводился учет хромосомных аномалии.

Под влиянием вируса гриппа А0 в клетках взрослых мышей на 7-й день инфицирования частота нарушений интерфазных ядер достигала 3,4% (в контроле 1,1). Цитогенетический анализ показал, что под влиянием вируса гриппа резко возрастает частота центромерных ассоциаций хромосом, и на 7-е сутки после инфицированния в клетках взрослых мышей они достигали 30,0 % (в контроле 0,8 %).

Мутагенная и цитотоксическая активность вируса гриппа А0 еще более выражена в эмбриональных клетках (9-12-дневные). Цитогенетический анализ показал, что под влиянием вируса гриппа А0 на 5 сутки после инфицирования в клетках эмбрионов число структурных изменений хромосом составлял 48%, а число патологических митозов 45% (см. табл.).

Антимутагенное и антицитотоксическое действие эндогенного интерферона в клетках взрослых мышей и эмбрионов в условиях индукции мутации вирусом гриппа Ад

Варианты Группа животных Количество животных Дни исследования Число метафаз Общее число структурных нарушений хромосом (%±ст. от) Число геномных мутации (%±ст. от.) Число патологических митозов(%) Р

А0 Взрослые мыши 5 6 5 53 7 15 500 340 500 11,29±1,3 40,2±2,6 4,0±0,9 4? °" °" ЭТ +| +| ю ю~ ^ 19,15±1,8 27,9±1,9 7,3±1,3

Инт+ А0 6 7 400 13,5±1,4 10,5±0,4 11,3±1,5 <0,001

А0 9-12- дневные эмбрионы 20 10 3 5 350 300 33,3±2,6 48,0±4,0 8,9±2,8 5,5±1,7 29,8±2,3 45,0±4,0

Инт+ А0 10 5 350 13,0±2,1 2,0±0,7 19,0±2,0 <0,001

А0 4-дневные эмбрионы 45 46 2 3 75 100 30,0±4,6 37,0±4,0 9,0±2,9 13,7±2,0 28,3±5,2 35,0±4,7

Инт+ А0 30 3 50 7,8±4,2 2,2±0,8 12,0±3,8 <0,001

Из цитогенетического анализа явствует, что вирус гриппа А0 в клетках 4-дневных эмбрионов вызывает высокую частоту как структурных нарушении хромосом, так и геномных мутации и патологических митозов. Например, число структурных нарушений хромосом на 3-и сутки после инфицирования было 17,0%; геномных мутаций — 4,0%, а число патологических митозов достигает 35,3%.

Таким образом, эмбриональные клетки оказались более чувствителными к действию вируса гриппа, чем клетки взрослых мышей. Этот факт согласуется с данными других авторов, показавших, что при действии разных факторов внешней среды в большей степени повреждаются клетки плода и эмбриона, чем клетки взрослого организма [3, 10], что, по их мнению, связано с несовершенством защитно-приспособительных механизмов эмбриона.

Ранее нами было установлено, что вирус гриппа А0 характеризуется высоким летальным и эмбриотоксическим действием [12]. На возможную связь между цитогенетичес-

ким нарушением и эмбриотоксическим эффектом вируса гриппа, с одной стороны, указывает совпадение пиков их действия, а с другой — известно [11], что клетки с грубыми нарушениями хромосом (лизис, дес-пирализация, полая метафаза, фрагментация) в дальнейшем элиминируются, так как в изученных нами случаях около 50% делящихся эмбриональных клеток были повреждены указанными изменениями. С большой долей вероятности можно допустить, что эмбрионы с подобными повреждениями хромосом оказывались нежизнеспособными и погибали, то есть эмбриотоксическое действие вируса было обусловлено его мутагенным и цитотоксическим эффектом.

Таким образом, гриппозная инфекция характеризуется высоким летальным, эм-бриотоксическим, мутагенным и цитоток-сическим действием. Исходя из этого, большое внимание было уделено выявлению и использованию протекторных веществ, которые снижали бы до минимума как нарушения хромосомного аппарата, так и гибель животных и их эмбрионов.

Раньше нами было установлено, что вирус гриппа А2/АкЫ характеризуется высоким мутагенным действием. Эндрогенный интерферон, индуцированный вирусом болезни Ньюкасла, обладает способностью снижать смертность мышей от гриппозной инфекции, а также существенно угнетает мутагенный эффект вируса гриппа [16].

Было отмечено, что влияние противовирусных препаратов, в том числе интерферона на генетический аппарат эмбрионов (стадия бластоциста и стадия активного органогенеза) при гриппозной инфекции изучено крайне недостаточно.

Беременным мышам до моделирования гриппозной инфекции вводили вирус болезни Ньюкасла (ВБН), который вызывает индукцию эндогенного интерферона. Результаты опытов показали, что число аномальных метафаз на фоне эндогенного интерферона уменьшалось с 40,4% (7-е сутки вируса гриппа А0 ) до 13,5% ^ < 0,001). На фоне интерферона в клетках беременных мышей аналогично уменьшилась число патологических митозов.

Следующая серия опытов проведена на 9-12-дневных и на 4-дневных эмбрионах. Было показано, что эндогенный интерферон как в клетках 9-12-дневных эмбрионов, так и в клетках 4-дневных эмбрионов в среднем в три раза уменьшает частоту хромосомных аномалий и патологических митозов. Под влиянием интерферона в три раза снижалась также гибель животных и их эмбрионов.

Достоверность полученных данных, свидетельствующих об антимутагенном действии как экзогенных, так и эндогенных интерферонов, подтверждена нами и другими авторами [4, 7, 12, 18].

При изучении механизмов действия антимутагенов основную сложность представляет то, что они относятся к соединениям разных классов. Антимутагены обладают свойством включаться в разные биологические процессы. Один из способов реализации протекторных свойств — это

дисмутогенизация, т.е. инактивация вредного агента антимутагеном. Второй путь — это участие антимутагенов в активации репарационных процессов. Указанные механизмы изучены и доказаны экспериментально [1, 7].

Исходя из вышесказанного, представляется перспективным использование антимутагенов с лечебно-профилактической целью людьми, имеющими контакт с вирусными инфекциями и другими вредни-ми веществами.

Выводы

1. Вирус гриппа А0 обладает мутагенной и цитотоксической активностью, которые зависят от стадии онтогенеза и срока заражения. Хромосомы эмбрионов более чувствительны к воздействию вируса, чем хромосомы взрослых животных.

2. Вирус гриппа А0 вызывает в генетическом аппарате 5 типов повреждений:

— хромосомные аберрации (одиночные и множественные фрагменты. лизис хромосом);

— геномные мутации (анеуплоидия, триплоидия, тетраплоидия);

— патологические митозы (полая метафаза, деспирализация, трехгрупповая метафаза, набухание и слипание хромосом);

— нарушение интерфазных ядер (полое ядро);

— вирус гриппа вызывает резкое возрастание частоты центромерных ассоциаций хромосом.

3. Эндогенный интерферон обладает выраженным антимутагенным и антици-тотоксическим действием. Он в три раза уменьшает мутагенный и цитотоксичес-кий эффект вируса гриппа А0.

Литература

1. Алакперов У.К. Антимутагенез. — М.: Наука, 1984.

2. АловИ.А. Цитофизиология и патология митоза. — М. 1972.

3. Барилян И.Р. Особенности эмбриотоксичес-кого действия вируса гриппа // Арх. анат. гист. и эмбриол., № 2, с. 53-58, 1985.

4. Бичикашвили Н. Автореф. канд. дисс. 2003.

5. Бочков И.П., Демин Ю.С., Лучник И.В. Классификация и методы учета хромосомных аберрации в соматических клетках // Генетика, № 8, т. 5, с. 138-142.

6. Дубинин Н.Р. Общая генетика. — М.: Наука, 1976.

7. Засухина Г.Д. Реперативные механизмы клеток и проблемы окружающей среды. — М. : Наука, 1979.

8. Канторович Р.А., Соколова Н.М., Гаврина Е.М. и др. Действие вируса гриппа на хромосомы человека // Биол. экперим. бюл., № 77, т. 2, с. 99-102,1974.

9. Кучерова Н.Г. Влияние гриппозной инфекции на хромосомы клеток человека и животных // Тез. докл. XIV Международный генетический конгресс. М., 343с., 1983.

10. Дибан А.П., Удалова Л.Д. Изучение хромосомных нарушений на начальных стадиях эмбриогенеза млекопитающих // Генетика, № 4, с. 52-65,1967.

11. Михайлова Г.Р, Горшунова Л.П. Цитологическое и кариологическое изучение культур клеток человека. Хрон. инфекц. вируса гриппа // Цитол. и генетика, № 10, т. 6, с. 582-534,1980.

12. Пирцхелани А.Г, Кинтраия П.Я, Кристесаш-вили Д.И, Корсантия Б.М. Влияние эндогенного интерферона на эмбриональное развитие и хромосомы при гриппозной инфек-

ции // Вопросы охраны материнства и детства, № 11, с. 71, 1985.

13. ПирцхеланиА.Г., МамаладзеИ.В. Нарушение интерфазных ядер митозов и хромосом как показатель общетоксического и мутагенного действия факторов среды на организм. Методические рекомендации. — Тбилиси, 1991.

14. Пирцхелани А.Г. Докт. дисс. 1994.

15. ФроловА.Ф.,Дядюн С.Т.,ДзябликИ.В.// Цитол. генет., №1, с. 18-20, 1982.

16. Шелия Г.П., Кинтрая П.Я., Корсантия Б.М., Пирцхелани А.Г. Влияние эндогенного интерферона на эмбриональное и мутагенное действие вируса гриппа у белых мышей // Вопросы вирусологии, № 2, с. 179-183, 1984.

17. Ford E., Wollam D. A study of the mitotic chromosomes of mice of the strong a line // Exp. Cell. Res., v. 32, p. 320,1963.

18. Pirtskhelani A., Pirtskhelani G. Investigation of antimutagenous and antitoxic action of interferon and a-tocopherol on the background of metapyrin // Proc. Georgian Acad. Sci. Biol. Ser vol. 24. v 1-6, p. 299-301,1998.

19. TarkowskiA. An air-drying method for chromosome preparation from mouse ages cytogenetics // Cytogenetics, v.5, p.394,1966.

20. Wroblewska L., Dyban A. Chromosome preparations from mouse embryons during early organogenesis dissociation after fixation followed by air-drying // Stain Technol., v.44, p. 147, 1969.

THE INFLUENCE OF INTERFERON ON MUTAGENIC AND CYTOTOXIC ACTION OF INFLUENZA VIRUS IN WHITE MICE AND THEIR EMBRYOS

A. Pirtskhelani, N. Pirtskhelani, N. Mamaladze, G. Pirtskhelani, N. Jajanidze, G. Kapanadze

Tbilisi Medical State University, Republic of Georgia Tbilisi State University, Republic of Georgia The Research Centre for Biomedical Technologies of RAMS, Moscow

In the laboratory mice and their embryos, the antimutagenic and anticitotoxic effects of the endogenous interpheron during mutation influenza virus A0 (Strain PR8) have been studied . The ten-day administration of influenza virus A0 (0,2 ml dose) induced high incidence of structural aberrations of the chromosomes (deletions, multiple fragments, lyses) genomic mutations (triploid, tetraploidy) the chromosomal centromere associations and pathologic mitosis (hollow metaphase, K mitosis, chromosomal adhesion) and deterioration of the interphase nuclei (hollow nucleus) as mice and their embryon. Endogenous interferon exerted higly effective antimutagenic and anticytotoxic action. It decreased incidence and mutagenic and cytotoxic effects of the influenza virus A0 by about 3 times.

Key words: influenza virus, interpheron, mitosis, chromosomes, mice, embryo.