СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ СЕНСОРОВ НА ОСНОВЕ ЗАМЕЩЕННОГО ПОЛИ(3,4-ЭТИЛЕНДИОКСИТИОФЕНА)
METHOD FOR MANUFACTURING SENSORS BASED ON SUBSTITUTED POLY(3,4-ETHYLENEDIOXYTHIOPHENE)

Область техники
Настоящее изобретение относится к области электроаналитической химии, а именно электрохимическим сенсорам для определения редокс-активных веществ (гексацианоферрата калия, хлорид гексааммин рутения, наночастиц берлинской лазури) в жидких средах, а также биосенсорам на их основе.
Уровень техники
В электрохимических биосенсорах, содержащих биомолекулы для специфического распознавания, могут использоваться редокс-активные вещества (также называются медиаторами электронного переноса [WO2006057722A1]). Сигнал, генерируемый медиаторами, связан с концентрацией определяемого вещества. Для повышения производительности биосенсора необходимо повысить чувствительность определения медиатора.
6
3−/4−
При разработке электрохимических (био)сенсоров одним из ключевых этапов является модификация поверхности электродов, которая обеспечивает надежную иммобилизацию биомолекул. Известен способ снижения неспецифической адсорбции биомолекул в результате модификации электродов этиленгликолем [Doneux et al., Controlled Tuning of the Ferri/Ferrocyanide Electron Transfer at Oligo(Ethylene Glycol)-Modified Electrodes, Electrochimica Acta, 219, 412-417, 2016]. Однако в результате наблюдается значительное снижение скорости переноса заряда для редокс-активной пары [Fe(CN)]и снижение чувствительности её определения.
6
3−
Известен способ функционализации поверхности электрода, заключающийся в модификации поверхности электрода самособирающимися слоями цистеамина [US10520462B1]. Для этого золотые электроды после полировки выдерживали в водном растворе хлорида цистеамина не менее 2 часов. Разность потенциалов пиков окисления и восстановления гексацианоферрата калия (pH 7,4), рассчитанная из циклической вольтамперограммы, зарегистрированной на модифицированном электроде, составляла не менее 90 мВ. К недостаткам такого способа относятся ограниченный выбор материалов для электродной поверхности, длительность процесса, снижение электроактивности в присутствии [Fe(CN)] по сравнению с немодифицированным электродом, о чём свидетельствует увеличение разности потенциалов между пиками на циклической вольтамперограмме. Это также ограничивает разработку и масштабное производство электрохимических биосенсоров на основе самособирающихся монослоёв.
Для модификации поверхности электродов широко используются проводящие полимеры (например, полианилин, пилипиррол, политиофен). Поли(3,4-этилендиокситиофен) (ПЭДОТ) является одним из самых распространенных проводящих полимеров. Его основными преимуществами являются коммерческая доступность, устойчивость к внешним воздействиям, высокая электроактивность в водных и в органических средах. Производные поли(3,4-этилендиокситиофена) (азидометил-ПЭДОТ, хлорометил-ПЭДОТ, гидроксиметил-ПЭДОТ) – проводящие полимеры, обладают преимуществами поли(3,4-этилендиокситиофена) и позволяют провести ковалентную иммобилизацию биомолекул благодаря наличию функциональных групп. Здесь под биомолекулами подразумеваются ДНК, РНК, олигонуклеотиды, белки, ферменты, антитела, антигены и т.д.
Известны способы синтеза поли(3,4-этилендиокситиофена) в результате химической [WO2013034688A1] или электрохимической полимеризации [US9562293B2] для создания сенсоров. Электрохимическая полимеризация обеспечивает воспроизводимое получение полимера непосредственно на ограниченной поверхности рабочего электрода, позволяет контролировать толщину и морфологию полимерной плёнки и потому предпочтительнее для сенсорных приложений. Из-за ограниченной растворимости мономеров в воде синтез поли(3,4-этилендиокситиофена) и его производных преимущественно проводят в органических растворителях.
4
4
Известны сенсоры на основе поли(3,4-этилендиокситиофена) [Motshakeri et al., Rapid electroanalysis of uric acid and ascorbic acid using a poly(3,4-ethylenedioxythiophene)-modified sensor with application to milk, Electrochimica Acta, 265, 184-193, 2018], синтезированного в присутствии органических растворителей. С целью создания сенсоров для определения мочевой и аскорбиновой кислот в молоке проводилась электрополимеризация 3,4-этилендиокситиофена в растворе пропиленкарбоната, содержащем LiClO. Для подготовки сенсора к использованию в водной среде было необходимо зарегистрировать в водном растворе NaClO циклические вольтамперограммы модифицированных электродов. Поскольку анализ биообразцов проводится в водной среде, модификацию поверхности электродов предпочтительно проводить в похожих условиях, так как органические молекулы, включенные в полимерную пленку, могут ингибировать активные центры или центры распознавания биомолекул в процессе функционирования (био)сенсора. Кроме того, синтез в водной среде более экологичен и коммерчески выгоден.
Известны способы электрохимического синтеза поли(3,4-этилендиокситиофена) и его производных в водной среде в присутствии поверхностно-активных веществ [WO2008/130327; WO2008/130326]. Для этого поли(3,4-этилендиокситиофен) или его производные синтезируют на поверхности электродов в результате электрополимеризации в мицеллярном растворе, образованном поверхностно-активными веществами (например, додецилсульфатом натрия) с мономером. Модифицированные электроды представляют собой платформы, на которые могут быть ковалентно иммобилизованы биомолекулы, для создания (био)сенсоров. Однако поверхностно-активные вещества также являются органическими веществами и могут снижать как активность и распознающие свойства рецепторов, так и ухудшать электронтранспортные свойства электродов в составе биосенсоров.
Известен подход для повышения растворимости поли(3,4-этилендиокситиофена) в водном растворе без использования поверхностно-активных веществ, заключающийся во введении полистиролсульфоната в качестве противоиона [Wen et al., Scientific Importance of Water‐Processable PEDOT–PSS and Preparation, Challenge and New Application in Sensors of Its Film Electrode: A Review, Polymer Chemistry, 85, 1121-1150, 2017]. Водную суспензию поли(3,4-этилендиокситиофена) и полистиролсульфоната получают в результате химической полимеризации. Для модификации поверхности электрода полученным полимером можно использовать метод капельного нанесения, метод центрифугирования, метод струйной печати. Однако из-за высокой гидрофильности полистиролсульфоната получаемые полимерные плёнки обладают низкой водостойкостью, разбухают и постепенно отслаиваются от электрода в водном растворе. Значительное количество внедренного полистиролсульфоната приводит к снижению электроактивности и проводимости, особенно снижается чувствительность определения отрицательно заряженных аналитов, поскольку полистиролсульфонат заряжен отрицательно.
Известен способ создания электрохимических ДНК-сенсоров на основе электродов, модифицированных азидометил-замещенным поли(3,4-этилендиокситиофеном) [Galan et al. Label-free electrochemical DNA sensor using “click”-functionalized PEDOT electrodes, Biosensors and Bioelectronics, 74, 751-756, 2015]. Для создания сенсоров на поверхности золотых электродов синтезировали азидометил-ПЭДОТ в результате электрополимеризации в дихлорметане азидометил-замещенного 3,4-этилендиокситиофена. Алкинированные ДНК-зонды иммобилизовали на поверхности модифицированных электродов в результате 1,3-диполярного азид-алкинового циклоприсоединения. Однако синтез полимера проводился в органической среде, а рассматриваемый аналитический сигнал (уменьшение тока окисления) не является специфическим, поскольку может возникать в результате блокировки поверхности электрода непроводящими биомолекулами, деградации полимера.
В результате необходимо разработать способ изготовления электрохимических (био)сенсоров на основе производных поли(3,4-этилендиокситиофена), включающий электрополимеризацию производных 3,4-этилендиокситиофена в водной среде, которые способствуют повышению электроактивности медиаторов на модифицированных электродах при pH 1,1–7,0.
Раскрытие изобретения
-1
-2
Техническим результатом заявляемого изобретения является получение электрохимических сенсоров на основе производных поли(3,4-этилендиокситиофена) (а именно азидометил-, гидроксиметил-хлорометил-ПЭДОТ), которые обеспечивают разность потенциалов пиков окисления и восстановления гексацианоферрата калия в водной среде при pH 1,1–7,0 не более 70 мВ (скорость развертки 40 мВ/c), которая рассчитана из циклической вольтамперограммы, зарегистрированной на сенсоре, а также достижение чувствительности определения редокс-активных веществ в режиме квадратно-волновой вольтамперометрии не более 0,2 А·М·см.
Технический результат достигается способом изготовления сенсоров для определения редокс-активных веществ в водной среде, включающий в себя синтез на поверхности электрода производных поли(3,4-этилендиокситиофена) из мономеров в результате электрополимеризации в водном растворе кислоты, характеризующейся постоянным увеличением скорости окисления мономеров при фиксированном потенциале. При этом в качестве мономера используют 2-хлорометил-3,4-этилендиокситиофен или 2-азидометил-3,4-этилендиокситиофен или 2-гидроксиметил-3,4-этилендиокситиофен, при этом синтез проводят в водном растворе кислоты с нормальностью не менее 0.05. Предпочтительно проводить синтез производных поли(3,4-этилендиокситиофена) в 0,05–0,2 М кислоте, в качестве которой предпочтительно использовать хлорную кислоту, серную кислоту. Предпочтительно, когда концентрация мономера составляет 0.01 моль/л. Получаемый в результате электрополимеризации материал является сополимером 3,4-этилендиокситиофена с 2-хлорометил-3,4-этилендиокситиофеном, 2-азидометил-3,4-этилендиокситиофеном, 2-гидроксиметил-3,4-этилендиокситиофеном. Разность потенциалов пиков окисления и восстановления гексацианоферрата калия в нейтральной водной среде, рассчитанная из циклической вольтамперограммы, зарегистрированной на сенсоре, полученном заявляемым способом, после погружения в раствор, составляет не более 67 мВ при скорости развертки 40 мВ/с.
Технический результат также достигается способ определения редокс-активных веществ в водной среде с помощью сенсоров, полученных заявляемым способом, путем погружения в исследуемую среду, регистрации линейной, циклической, дифференциально-импульсной или квадратно-волновой вольтамперограммы и определением из нее плотности тока пика окисления или восстановления вещества, с последующим определением концентрации искомого соединения методом градуировочного графика, предварительно полученного для определяемого вещества. В качестве редокс-активных веществ, определяемых сенсором, используются гексацианоферрат калия, хлорид гексааммин рутения, наночастицы берлинской лазури. Для построения градуировочного графика сенсор погружают в водный буферный раствор определяемого редокс-активного вещества с известной концентрацией, регистрируют линейную, циклическую, дифференциально-импульсную или квадратно-волновую вольтамперограмму, определяют плотность тока пика окисления или восстановления редокс-активного вещества, затем строят градуировочный график, представляющий собой линейную зависимость плотности тока от концентрации вещества.
Таким образом, технический результат достигается за счет электрохимического синтеза производных ПЭДОТ (азидометил-ПЭДОТ или хлорометил-ПЭДОТ или гидроксиметил-ПЭДОТ) в водной среде в отсутствие поверхностно-активных веществ и органических растворителей, которые негативно влияют на электроактивность редокс-активных веществ на поверхности электродов.
После модификации поверхности производными поли(3,4-этилендиокситиофена) редокс-активные вещества (а именно гексацианоферрат калия и хлорид гексаамин рутения) должны иметь повышенную электроактивность, по сравнению с немодифицированными печатными графитовыми электродами, при значениях pH от 1,1 до 7,0. Для подтверждения повышения электроактивности медиаторов предпочтительно рассчитывать электрохимическую константу скорости, используя расширенный метод Николсона [Lavagnini I. et al. An Extended Method for the Practical Evaluation of the Standard Rate Constant from Cyclic Voltammetric Data // Electroanalysis, 2004. V. 16, № 6. P. 505–506; Shavokshina V.A. et al. Improved Electroactivity of Redox Probes onto Electropolymerized Azidomethyl-PEDOT: Enabling Click Chemistry for Advanced (Bio)Sensors // Appl. Polym. Mater. American Chemical Society, 2021. V. 3, № 3. P. 1518–1524].
3
6
После модификации поверхности азидометил-ПЭДОТ в водной среде разность потенциалов между пиками на циклической вольтамперограмме K[Fe(CN)] на 27 % меньше, по сравнению с циклическими вольтамперограммами азидометил-ПЭДОТ, синтезированного в ацетонитриле и 0,1 М перхлорате тетрабутиламмония [US10591435B2].
Наличие функциональных групп у производных поли(3,4-этилендиокситиофена), подтвержденное методом ИК-спектроскопии, позволяет ковалентно иммобилизовать биомолекулы на поверхности электродов. Биомолекула может быть иммобилизована на поверхности электрода за счёт образования амидной связи, 1,2,3-триазольного цикла, сложноэфирной связи. В отличие от существующих решений, в предложенном способе исключено использование органических растворителей, которые могут ингибировать активные центры биомолекул и ухудшать характеристики биосенсоров.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется чертежами.
3
6
―
На фиг.1 показаны циклические вольтамперограммы 5 мМ K[Fe(CN)] на немодифицированном электроде (- -) и электроде, модифицированном азидометил-ПЭДОТ ().
3
6
3
―
На фиг.2 показаны циклические вольтамперограммы 5 мМ [Ru(NH)]Cl на немодифицированном электроде (- -) и электроде, модифицированном азидометил-ПЭДОТ ().
3
6
На фиг.3 представлена градуировочная зависимость вольтамперометрического определения K[Fe(CN)].
На фиг.4 представлена градуировочная зависимость вольтамперометрического определения наночастиц берлинской лазури.
Осуществление изобретения
4
.
Сенсоры изготавливают в результате электрополимеризации производных 3,4-этилендиокситиофена в водной среде на поверхности печатных графитовых электродов. Синтез проводят в электрохимической ячейке, функционирующей по трехэлектродной схеме, с разделенными пространствами рабочего, вспомогательного электродов и электрода сравнения. Синтез проводят в потенциодинамическом режиме из раствора, содержащего 0,05–0,2 М HClO и 0,01 М мономера, например, азидометил-ЭДОТ, хлорометил-ЭДОТ, гидроксиметил-ЭДОТВыбранное значение максимального анодного потенциала не должно приводить к переокислению полимера. О формировании проводящего полимера свидетельствует самопересечение токов на первом цикле циклической вольтамперограммы электрополимеризации, также увеличение токов с каждым циклом при анодных потенциалах 0,9–1,0 В.
3
6
3
6
3
Электроактивность медиаторов (гексацианоферрата калия K[Fe(CN)], хлорида гексааммин рутения [Ru(NH)]Cl) на поверхности сенсоров исследуют в режиме циклической вольтамперометрии при разных скоростях развертки потенциала (10 мВ/c – 1000 мВ/с) в буферных растворах с различным pH.
6
3
6
6
3
6
3-/4-
3+/2+
3-/4-
3+/2+
Представленные циклические вольтамперограммы демонстрирует увеличение электроактивности [Fe(CN)] и [Ru(NH)] на поверхности модифицированных электродов (фиг.1, фиг.2). Циклическая вольтамперограмма [Fe(CN)]нанемодифицированных электродах соответствует необратимой системе, поскольку не наблюдается выраженных пиков редокс активности. Для [Ru(NH)] система квазиобратима: разность потенциалов между пиками не менее 150 мВ при скорости развертки потенциала 40 мВ/с.
п
п
Модифицированные производными азидометил-ПЭДОТ электроды демонстрируют поведение, близкое к обратимому. Разность потенциалов между пиками (∆E) не более 67 мВ, при увеличении скорости развертки потенциала до 1 В/c ∆Eсоставляет не более, чем 110 мВ. Электроактивность гексацианоферрата калия на поверхности электродов, модифицированных азидометил-ПЭДОТ, синтезированного в органическом растворителе (ацетонитрил) в присутствии перхлората тетрабутиламмония, ниже по сравнению с азидометил-ПЭДОТ, полученным в водной среде. Об этом свидетельствует разность потенциалов между пиками на циклических вольтамперограммах азидометил-ПЭДОТ, полученного в органической среде - не менее 92 мВ, что на 27 % больше, чем на азидометил-ПЭДОТ, синтезированном в водной среде без использования поверхностно-активных веществ.
Данное повышение электроактивности подтверждается и расчетом электрохимической константы скорости (k). Расчёт k проводили согласно уравнению:
,
о
в
υ
где D и D коэффициенты диффузии окисленной и восстановленной формы окислительно-восстановительной пары, скорость развертки потенциала,коэффициент переноса α =0.5.
Модификация поверхности электродов производными поли(3,4-этилендиокситиофена) способствует увеличению k в широком диапазоне pH (от 1,1 до 7,0).
6
3-/4-
-5
-2
Для функционирования (био)сенсоров особенно важно значительное повышение электроактивности при pH, близкому к физиологическим значениям. В присутствии [Fe(CN)] в результате модификации поверхности электрода k возрастает не менее, чем в 2000 раз (от 1 × 10 до 2,3 × 10 см/c) при pH 7,0.
3
6
3+/2+
Для [Ru(NH)], который гораздо менее чувствителен к свойствам поверхности, k возрастает не менее, чем в 2 раза.
Для количественной оценки редокс-активных веществ выполняли построение градуировочной зависимости.
Пример 1
: Сенсор для определения гексацианоферрата калия на основе азидометил-ПЭДОТ, синтезированного в потенциодинамическом режиме
4
Электрополимеризацию проводили на печатных графитовых электродах в стеклянной ячейке, функционирующей по трехэлектродной схеме, с тремя разделенными пространствами. Ростовая смесь содержала 0,1 М HClO и 0,01 М азидометил-ЭДОТ. Электрополимеризацию выполняли в потенциодинамическом режиме, потенциал изменяли в диапазоне от -0,2 до 1,0 В со скоростью 40 мВ/с в течение 10 циклов.
3
6
3
6
-1
-2
Электрод, модифицированный азидометил-ПЭДОТ, погружали в фосфатный буферный раствор (pH 7,0), содержащий гексацианоферрат калия. Измерения проводили в режиме квадратно-волновой вольтамперометрии. Регистрировали последовательно не менее трёх вольтамперограмм до их наложения. Заменяли анализируемый раствор на раствор с большей концентрацией K[Fe(CN)]. Строили градуировочный график зависимости тока от концентрации K[Fe(CN)] (фиг. 3). Коэффициент чувствительности полученного сенсора равен 170±12 мА·М·см, что в 200 раз выше, чем коэффициент чувствительности немодифицированных печатных графитовых электродов.
Пример 2:
Сенсор для определения наночастиц берлинской лазури на основе азидометил-ПЭДОТ
Электрополимеризацию азидометил-ЭДОТ проводили по методике, описанной в примере 1.
-1
-2
Полученный сенсор погружали в фосфатный буферный раствор (pH 6.0), содержащий наночастицы берлинской лазури, проводили измерения в режиме квадратно-волновой вольтамперометрии. Строили градуировочный график зависимости тока от концентрации наночастиц берлинской лазури (фиг. 4). Диапазон линейности полученного графика 0,2–4,8 нМ. Коэффициент чувствительности сенсора равен 2,1±0,2 мА·М·см, что в 175 раз выше коэффициента чувствительности немодифицированных электродов.