МЕТИЛГЛИОКСАЛЬ В КАЧЕСТВЕ МАРКЕРА ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ОПУХОЛИ
METHYLGLYOXAL AS MALIGNANT TUMOUR MARKER

В настоящем изобретении раскрыт новый, надежный, чувствительный и легкий в обращении диагностический и прогностический тест для злокачественной опухоли у человеческих или животных субъектов. Авторы настоящего изобретения показали здесь впервые, что повышенные уровни метилглиоксаля (МГ) в биологических образцах от несущих злокачественные опухоли субъектов имеют существенную положительную корреляцию с развитием и прогрессированием клеток злокачественной опухоли, которые метаболически активны. Это подчеркивает, что клетки злокачественной опухоли продуцируют и высвобождают значительно более высокие количества МГ, чем нормальные клетки в опухоли, а также во внеклеточных текучих веществах в организме, и поэтому возможно получать надежный и чувствительный диагностический и прогностический тест злокачественной опухоли по одному образцу крови. Настоящее изобретение, следовательно, относится к способу раннего обнаружения и диагностирования злокачественной опухоли in vitro, а также прогностической оценки, мониторинга и принятия терапевтических решений у несущих злокачественные опухоли субъектов посредством измерения присутствия МГ.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
При растущем числе случаев злокачественных опухолей, которые диагностируют по всему миру, и сохраняющемся высоком числе смертей из-за позднего обнаружения заболевания, повсеместно принята ключевая роль идентификации новых биологических маркеров как для раннего обнаружения, так и нацеленного терапевтического вмешательства, как для предупреждения злокачественной опухоли, так и для более хорошего исхода у пациентов, у которых лечили злокачественную опухоль. Злокачественные опухоли являются второй по значимости причиной смерти по всему миру, причем наиболее распространены злокачественные опухоли легких, ободочной кишки, молочной железы (у женщин), поджелудочной железы и предстательной железы (у мужчин).
В настоящее время наиболее используемые диагностические и прогностические индикаторы злокачественных опухолей основаны на морфологических и гистологических характеристиках опухолей, поскольку нет доступных биологических маркеров в крови с достаточной чувствительностью и специфичностью для диагноза; и существует лишь несколько биологических маркеров для мониторинга терапии и прогностической оценки злокачественной опухоли.
US Food and Drug Administration (FDA) определяет биологический маркер как молекулярную характеристику, которую объективно измеряют и оценивают и которая отражает нормальные биологические процессы, патологические процессы или фармакологические ответы на терапевтическое вмешательство. Такие биологические маркеры может продуцировать или сама опухоль или организм в ответ на озлокачествляющее давление в направлении нормальных клеток, которое превращает их в злокачественные. Согласно US National Cancer Institute (NCI), биологические маркеры можно использовать для скрининга злокачественных опухолей, оценки риска, раннего диагностирования заболевания, мониторинга, прогностической оценки, принятия терапевтического решения и предсказания ответа на терапию.
Однако основная проблема при использовании этого потенциала онкологических биологических маркеров состоит в том, что возникновение и внедрение злокачественной опухоли, а также прогрессирование опухоли являются сложными процессами, в которых задействованы различные ненормальные генетические и эпигенетические молекулярные события и клеточные взаимодействия.
Малигнизация ведет к специфичным и неспецифичным изменениям фенотипической клеточной сигнатуры и, таким образом, к клональному отбору и прогрессированию клеток злокачественной опухоли в организме. Вдобавок злокачественная опухоль может быть результатом воздействия множественных и разнообразных канцерогенов из окружающей среды, таких как химические соединения, излучение и/или микроорганизмы; в особенности, у генетически восприимчивых организмов-хозяев (Belpomme et al. Environ Res 2007; Irigaray and Belpomme, Carcinogenesis 2010).
Вследствие такой сложности процессов канцерогенеза, широко варьирует этиология и патогенез опухолей, так что злокачественная опухоль включает больше чем 200 отдельных заболеваний, поражающих более 60 органов человека. Эта сложность также обусловлена тем, что, несмотря на то, что во многих биологических анализах искали корреляции между клиническими онкологическими конечными точками и биологическими маркерами, до сих пор существует очень немного клинически эффективных биологических маркеров, которые помогают онкологам при принятии решений и уходе за пациентом, и вообще нет отдельного биологического маркера который позволяет обнаруживать все или многие типы злокачественных опухолей. Настоящее изобретение устраняет многие из этих ограничений посредством предоставления нового отдельного биологического маркера, который делает возможным обнаружение многих типов злокачественных опухолей через простое измерение в биологических образцах пациента/субъекта. Это измерение является хорошо воспроизводимым, что позволяет обнаруживать злокачественную опухоль, даже на ранней стадии.
В основном, настоящее изобретение состоит в измерении уровня образования метаболического побочного продукта метилглиоксаля (МГ), посредством обнаружения и определения количества этой молекулы в биологическом образце от субъекта.
На фиг. 1 представлено схематическое изображение, иллюстрирующее метаболический процесс гликолиза и образование метилглиоксаля (МГ) в эукариотических клетках.
Полный гликолитический путь для получения энергии является анаэробным (без использования кислорода). Нормальные клетки в аэробных условиях входят в цикл трикарбоновых кислот Кребса (ТСА), чтобы продуцировать аденозинтрифосфат (АТФ); тогда как при сохранении аэробных условий эффект Варбурга ведет многие клетки злокачественной опухоли, вместо входа в цикл Кребса, к усилению гликолиза (т.е. «аэробного гликолиза»). Во время процесса гликолиза, МГ путь обходит классический гликолитический путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса и представляет собой метаболический тупик; следовательно, этот путь ведет к образованию МГ и D-лактата в качестве конечных отходов/побочных продуктов, тогда как гликолитический путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса ведет или к образованию пирувата и затем к циклу Кребса в аэробных условиях или к образованию L-лактата из пирувата в анаэробных условиях. Любой дефицит в цикле Кребса или в дыхательной цепи, как в случае с многими клетками злокачественной опухоли, усиливает гликолиз для компенсации продукции АТФ и, следовательно, образование МГ через усиленное образование дигидроксиацетон-фосфата.
На фиг. 1 bis представлено образование МГ в среде для культивирования клеточной линии карциномы человека (НСТ16) в зависимости от присутствия высокой или низкой концентрации глюкозы в среде для культивирования. Количественное определение МГ в кондиционированной среде (КС) выполняли с использованием анализа жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (LC-MS/MS). В условиях высокой глюкозы клетки злокачественной опухоли продуцируют в 10 раз больше МГ, чем в условиях низкой глюкозы; эта находка подсказывает, что синтез и высвобождение МГ клетками злокачественной опухоли непосредственно зависит от потребления глюкозы и метаболизма.
На фиг. 2 представлена продукция МГ в озлокачествленном клеточном клоне PRO с использованием прямого анализа ткани посредством MALDI-TOF/TOF масс-спектрометрии. Клеточные клоны PRO изначально получали из аденокарциномы ободочной кишки, индуцированной введением 1,2-диметилгидразина. Опухоль представлена без окрашивания и после окрашивания гематоксилин-эозин-сафраном (HES) на изображениях 1 и 2, соответственно. Внутриопухолевое обнаружение МГ посредством MALDI-TOF/TOF масс-спектрометрии представлено на изображениях 3 и 4, полученных, соответственно, из анализа молекулярных фрагментов 2MQX 91 Да и 118 Да. Следует отметить, что в некротической зоне, которая преобладает в средней и нижней части опухоли на 1 и 2, на 3 и 4 МГ, по-видимому, обнаруживают меньше, тогда как его, по-видимому, главным образом, обнаруживают в некоторых зонах, сильно окрашенных с помощью HES.
На фиг. 3 представлена значительная положительная корреляция между уровнями МГ в крови и стадиями опухоли у пациентов со злокачественными опухолями. Независимо от стадии злокачественной опухоли, большинство значений уровня МГ в крови выше нормального (незлокачественного) контрольного значения 0,06 мкМ МГ (р=0,0109), что показывает, что систематическое измерение МГ в крови является эффективным инструментом для диагностирования злокачественной опухоли, что является решающим в обеспечении простого и раннего обнаружения и скрининга.
На фиг. 4 представлены различия (р<0,01) в соотношении МГ крови к глюкозе крови (показатель МГ/Г) между пациентами со злокачественными опухолями и контрольными пациентами (или нормальные субъекты или нормогликемические (проходящие терапию) пациенты с диабетом 2 типа). Следует отметить, что нет значительных различий для уровней МГ в крови между нормальными контрольными субъектами и субъектами с нормогликемическим диабетом 2 типа, проходящими терапию.
На фиг. 5 раскрыта значительная положительная корреляция между уровнями МГ в крови и объемом опухоли у крыс BD-IX, развившейся после трансплантации опухолеродных клеток злокачественной опухоли ободочной кишки PRO (р<0,001). Клеточные клоны PRO и REG изначально получали из одной аденокарциномы ободочной кишки, индуцированной с помощью 1,2-диметилгидразина у крысы BD-IX.
На фиг. 6 показано, что при подкожной инъекции сингенному организму-хозяину, клетки PRO, подобно родительским клеткам, индуцируют прогрессирующие опухоли, тогда как клетки REG индуцируют опухоли, которые регрессируют после 3 недель. Опухолевый трансплантат клеток PRO связан с постоянным прогрессированием объема опухоли, поэтому отмечают положительную корреляцию между уровнями МГ в крови и объемом опухоли; через три недели после трансплантации имеет место постоянное прогрессирование уровней МГ в крови. Опухолевый трансплантат клеток злокачественной опухоли REG отторгается через 3 недели после трансплантации и МГ в крови остается на низком уровне во время всего экспериментального периода. Посредством сравнения результатов, полученных с использованием клона опухолеродных клеток злокачественной опухоли PRO (фиг. 5), предполагают, что активно прогрессирующая злокачественная опухоль и более специфичные пролиферативные опухолеродные клетки злокачественной опухоли синтезируют большие количества МГ; при этом непрогрессирующая злокачественная опухоль, более специфичные непролиферативные неопухолеродные клетки злокачественной опухоли, не могут этого.
На фиг. 7 показано, что у пациентов со злокачественными опухолями (В) уровни МГ в крови имеют значительную обратную корреляцию с индексом массы тела (BMI) (р=0,0064); тогда как корреляция МГ с BMI у нормальных субъектов (А) отсутствует. Это указывает на то, что МГ продуцируют клетки злокачественной опухоли.
На фиг. 8 представлено, что у пациентов со злокачественными опухолями имеет место значительная обратная зависимость между показателем соотношения инсулин/глюкоза (И/Г) и уровнями МГ в крови, тогда как показатель И/Г у нормальных здоровых субъектов остается постоянным. Следовательно пересечение 2 кривых делает возможной индивидуализацию критической точки, в котором уровень МГ крови 0,2 мкМ называют как «ассоциированное с кахексией контрольное значение», выше которого резистентность к инсулину выше, а секреция инсулина ниже, чем у нормальных субъектов; так что пациент со злокачественной опухолью входят в кахексию или тяжелую прекахексию.
В таблице 1 приведены средние значения уровня МГ в крови (+ стандартная ошибка и доверительная область) (в мкМ) у пациентов со злокачественными опухолями, в сравнении с нормальными субъектами и пациентами с нормогликемическим диабетом 2 типа, проходящими терапию, используемыми в качестве контрольных субъектов.
В таблице 2 приведены средние значения уровня МГ в крови (+ стандартная ошибка и доверительная область) (в мкМ) у пациентов со злокачественными опухолями в соответствии с типами опухолей в сравнении с нормальными субъектами и нормогликемическими пациентами с диабетом 2 типа, проходящими терапию, используемыми в качестве контрольных субъектов.
В таблице 3 представлены средние значения (+ стандартная ошибка) уровней МГ в крови (в мкМ) у пациентов со злокачественными опухолями, проходивших лечение, в соответствии с клиническими ответами; т.е. полный ответ, частичный ответ или стабильное/прогрессирующее заболевание, как определяют непосредственно по клинической опухоли и/или измерению опухоли с использованием способов визуализации. У двух пациентов с явным полным клиническим ответом, как определяют с помощью классических способов визуализации, уровни МГ в крови были выше нормальных значений. У этих двух пациентов злокачественная опухоль рецидивировала через 3 и 7 месяцев.
В таблице 4 представлены средние (+ стандартная ошибка) уровни МГ в крови (мкМ) у различных пациентов со злокачественными опухолями в соответствии с их BMI. Различия между тремя категориями по BMI имеют большую статистическую значимость, и прекахектические или кахектические состояния (ВМК18) связаны со значительно более высокими уровнями МГ в крови в сравнении с пациентами со злокачественными опухолями с избыточным весом/ожирением (ВМ1>25).
Биологические образцы. Как используют в настоящем документе, термин «биологические образцы» относится к образцам различных типов, получаемым от пациентов или от нормальных индивидуумов, для того, чтобы использовать их в диагностическом мониторинговом анализе. Указанные биологические образцы включают любые внеклеточные текучие вещества, такие как кровь, сыворотка, плазма, моча или другие образцы жидкостей, таких как слюна, перитонеальная или плевральная жидкость, цереброспинальная жидкость, желудочная или колоректальная жидкость, лимфа, синовиальная жидкость, интерстициальная жидкость, амниотическая жидкость, физиологические секреты, слезы, слизь, пот, молоко, семенная жидкость, вагинальный секрет и текучее вещество из язв и других высыпаний на поверхности тела. Также они могут представлять собой солидные ткани, такие как опухоль, или органы и клеточные мазки, полученные, например, из шейки матки, костного мозга, лимфатических узлов и т.п. Термин «биологические образцы» включает также внеклеточный матрикс и внеклеточные текучие вещества, которые составляют внеклеточный компартмент организма. Он включает не только клинические образцы, но также клеточные культуры, тканевые культуры и клетки, полученные из них, а также их потомство.
Метилглиоксаль. В настоящем изобретении, «метилглиоксаль» относится к выявлению того, что клетки злокачественной опухоли продуцируют и высвобождают значительно более высокие количества метилглиоксаля (МГ), чем нормальные клетки, так чтоб МГ можно измерять и количественно определять в опухоли и внеклеточных текучих веществах организма, в частности в периферической крови после высвобождения МГ из клеток злокачественной опухоли. МГ подтверждают в образцах посредством измерения in vitro фракции свободного МГ, который самопроизвольно существует в организме; или посредством измерения общего количества свободного МГ, которое соответствует свободному МГ, который самопроизвольно существует в образцах в дополнение к МГ, который можно извлекать из обратимо связанного лигандом МГ после обработки образцов с использованием способа, схожего или идентичного таковому в Chaplen (Chaplen et al. Anal Biochem 1996; Chaplen et al., PNAS 1998). Такие способы изначально разработаны для того, чтобы измерять внутриклеточный обратимо связанный лигандом МГ.
Следовательно, МГ, уровень которого измеряют способом по изобретению, соответствует уровню свободных молекул МГ, измеряемых в опухоли или в текучих веществах организмов индивидуумов, более конкретно в периферической крови, поскольку это делает клиническое использование биологического маркера очень простым. Однако, как предварительно указано, способ по изобретению не основан исключительно на измерении свободного МГ, который самопроизвольно присутствует в опухоли или во внеклеточном компартменте организма, но также он основан на измерении свободного МГ, который извлекают после обработки in vitro обратимо связанного лигандом МГ. Однако когда термины «МГ», «продукция МГ» или «уровни образования МГ» используют в настоящем документе без дополнительного определения, МГ уровень соответствует свободным молекулам, которые присутствуют самопроизвольно в рассматриваемом образце, а не общему количеству свободного МГ, который можно извлекать из образца, измерение которого, однако, также включено в изобретение.
Термин «биологические образцы» включает образцы, с которыми выполняли какие-либо манипуляции после их получения.
Указанный биологический образец можно «обрабатывать» перед анализом МГ, например, посредством: получения плазмы из крови, удаления клеток из образца или выполнения обогащения клеточной популяции, разбавления вязких текучих веществ или тому подобное. Способы лечения могут включать фильтрование, дистилляцию, концентрирование, инактивацию мешающих соединению, лизис клеток; например, посредством, обработки ультразвуком, добавления реактивов, фиксации клеток или фиксации солидной ткани перед анализом МГ. В примерах так называемых обработанных образцов перед анализом МГ используют способы извлечения внутриклеточного и/или внеклеточного обратимо связанного лигандомом МГ (Chaplen et al. Anal Biochem 1996; Chaplen et al. PNAS 1998).
Субъекты, индивидуумы, пациенты: Термины «субъекты» или «индивидуумы», используемые в настоящем документе, относится к людям (или животным) любого возраста или пола, здоровым или страдающим заболеваниями; тогда как термин «пациенты» относится к субъектам или индивидуумам, имеющим заболевания, таким как имеющие злокачественную опухоль или диабет.
Термины «здоровый субъект(ы)» и «здоровый индивидуум(ы)» относятся к бессимптомным субъектам или индивидуумам, у которых подтверждено отсутствие каких-либо поддающихся обнаружению заболеваний с использованием обычных медицинских тестов. Более точно, эти термины относятся к людям, у которых подтверждено отсутствие злокачественной опухоли, диабета, хронической уремии, артериальной гипертензйи и болезни Альцгеймера.
Злокачественная опухоль или лейкоз: Эти термины относятся к опухолям, клетки которых проявляют аберрантный озлокачествленный фенотип, который отличается несколькими распознанными и подтвержденными признаками, которые преимущественно включают автономный рост в организме и утрату регуляции клеточной пролиферации. Эти признаки более точно рассмотрены и проанализированы в последнее время (Hanahan and Weinberg, Cell 2011). В отличие от этого, термин «опухоль» относится к клеткам, которые могут проявлять озлокачествленный или неозлокачествленный фенотип. Термин «доброкачественная опухоль» используют для того, чтобы охарактеризовать опухоли, пролиферативные возможности которых остаются ограниченным, поскольку клетки не несут озлокачествленный фенотип.
Нет конкретного ограничения, касающегося того, злокачественные опухоли каких типов идентифицируют с помощью способа по настоящему изобретению: они включают солидные и несолидные злокачественные опухоли, которые охватывают эпителиальные или неэпителиальные типы.
Злокачественные опухоли эпителиального происхождения включают все гистологические типы, такие как аденокарцинома и плоскоклеточная карцинома; и все локализации, например, злокачественные опухоли головы и шеи (т.е. ротовая полость, язык, ротоглотка, глотка, гортань и т.д.), бронхов и легких, молочных желез, желудка, ободочной и прямой кишки, поджелудочной железы, печени (и все другие типы, относящиеся к пищеварительной системе), шейки и эндометрия матки, яичников, мочеполовой системы (предстательная железа, мочевой пузырь, почки); и т.д. Неэпителиальные злокачественные опухоли включают, в частности, лейкоз любого типа, лимфому, меланому или саркому.
Другие злокачественные опухоли также можно идентифицировать с помощью настоящего изобретения, например, среди прочих, злокачественную опухоль яичек, дисгерминому, глиобластому, астроцитому, мезотелиому, саркому Юинга, детские злокачественные опухоли и ВИЧ-ассоциированные опухоли.
Под «ранним обнаружением» злокачественной опухоли в настоящем документе понимают обнаружение или идентификацию развившейся субклинической (не поддающейся очевидному диагностированию) микроскопической уже метаболически активной злокачественной опухоли у бессимптомных субъектов.
Под «скринингом» злокачественной опухоли понимают систематическое обнаружение метаболически активной злокачественной опухоли или предзлокачественных повреждений в популяции бессимптомных индивидуумов.
Под «диагностированием» злокачественной опухоли понимают обнаружение уже макроскопической прогрессирующей злокачественной опухоли у симптоматических пациентов. Способ обнаружения/диагностирования по изобретению, таким образом, не специализирован для того, чтобы обнаруживать так называемые предзлокачественные повреждения, которые могут быть подтверждены в биопсии ткани, а которые не обязательно могут прогрессировать в истинную метаболически активную микроскопическую злокачественную опухоль. Точнее, это изобретение легко и надежно обнаруживает истинно пролиферативную и прогрессирующую злокачественную опухоль. Это может происходить у бессимптомных субъектов в форме субклинических микроскопических повреждений или у симптоматических субъектов в форме повреждений на более поздних стадиях, до того, как они могут быть подтверждены обычными доступными клиническими диагностическими инструментами. Поскольку уровни МГ относятся к метаболической активности прогрессирующих клеток злокачественной опухоли, способ обнаружения/диагностирования по настоящему изобретению можно использовать не только для скрининга метаболически активной злокачественной опухоли у бессимптомных субъектов, но также для прогрессирования пролиферативной злокачественной опухоли у симптоматических субъектов и, следовательно, у таких субъектов для оценки вероятности того, что злокачественная опухоль будет прогрессировать клинически; прежде чем прогрессирование злокачественной опухоли будет подтверждено обычными доступными клиническими инструментами.
Как используют в настоящем документе, термины «нормальные контрольные значения МГ» или «эталонные значения МГ» относятся к конкретному значению и/или интервалам значений, которые определены по нормальным свободным от заболеваний субъектам, в частности, свободным от злокачественных опухолей и диабета (т.е. здоровые доноры). Нормальное контрольное значение 0,6 мкМ + 0,02, используемое в настоящем документе, представляет собой среднее значение уровня образования МГ в образцах цельной крови от здоровых доноров, измеряемое посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в соответствии со способом, описанным ниже. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления указанное нормальное контрольное значение представляет собой уровень образования МГ, который измерен в биологическом образце, предпочтительно образце крови, от субъектов, которые не страдают злокачественной опухолью или диабетом и которые также свободны от иных заболеваний. Эталон может представлять собой одно общее значение, такое как медиана или среднее значение, или он может представлять собой различные значения для конкретных субпопуляций субъектов. Специалист в данной области примет во внимание, что соотношение между уровнем образования МГ в тестовом образце и контрольное значение МГ может зависеть от того, контрольное значение какого типа используют.
Способ по изобретению позволяет профессиональным медикам и биомедикам определять, что субъект без диабета имеет высокий или низкий риск иметь злокачественную опухоль. Эту вероятность злокачественной опухоли оценивают пропорционально уровню образования МГ у тестируемых субъектов при значениях выше нормального контрольного значения.
Говорят, что субъект без диабета имеет «высокий риск иметь злокачественную опухоль», когда уровень образования МГ в указанном биологическом образце выше, чем указанное нормальное контрольное значение: это значит, что субъект имеет высокий риск иметь злокачественную опухоль в момент взятия биологического образца, несмотря на то, что злокачественная опухоль может быть или может еще не быть поддающейся обнаружению посредством обычных доступных диагностических инструментов. Другими словами, считают, что субъект имеет более высокую вероятность иметь злокачественную опухоль по сравнению с нормальной популяцией, когда уровень образования МГ у тестируемого субъекта выше нормального контрольного значения МГ. Более точно в контексте изобретения, говорят, что субъект имеет «высокий риск иметь злокачественную опухоль», когда он/она имеет вероятность выше, чем 50%, предпочтительно 70%, лучше 90%, идеально 95% иметь злокачественную опухоль.
В отличие от этого, риск иметь злокачественную опухоль низок, когда уровень образования МГ в биологическом образце тестируемого субъекта находится в интервале нормальных контрольных значений и тем более когда уровень образования МГ ниже нижнего предела интервала нормальных контрольных значений. Это обозначает, что субъект имеет низкую вероятность иметь злокачественную опухоль или в момент взятия биологического образца злокачественная опухоль у него не развивается.
В контексте изобретения субъект имеет низкий риск иметь злокачественную опухоль, когда он/она имеет вероятность иметь злокачественную опухоль ниже чем 10%, предпочтительно ниже чем 5%, как сравнивают с нормальной популяцией. Другими словами, субъект имеет 90%, предпочтительно 95% вероятность не иметь злокачественную опухоль. В контексте настоящего изобретения уровень образования МГ в образце субъекта, как называют, «значительно выше» или «выше», чем контрольное значение, когда указанный уровень МГ в 1,5 раза превышает, более надежно в 2 раза превышает, наиболее надежно в 3 раза превышает указанное контрольное значение. Говорят, что субъект имеет высокий риск иметь злокачественную опухоль (типично риск между 50% и 80%), когда его уровень образования МГ в 2 раза выше, чем указанное контрольное значение. Риск злокачественной опухоли (типично риск между 80% и 100%) еще выше, когда его уровень образования МГ в 3 раза выше, чем указанное контрольное значение. В отличие от этого, уровень образования МГ у тестируемого субъекта называют «значительно более низким» или «более низким», чем контрольное значение, когда указанный уровень образования МГ в 1,5 раза ниже, предпочтительно в 2 раза ниже и более предпочтительно 3 раза ниже, чем указанное контрольное значение. Наоборот, говорят, что субъект имеет низкий риск иметь злокачественную опухоль (типично риск между 20% и 50%), когда его уровень образования МГ в 2 раза ниже, чем указанное контрольное значение, и еще более низкий риск (типично риск между 0% и 20%), когда его уровень образования МГ в 3 раза ниже, чем указанное контрольное значение. Наконец, уровень образования МГ тестируемого субъекта называют «близким к контрольному значению», если соотношение между указанным уровнем образования МГ и указанным контрольным значением МГ составляет между 0,8 и 1,2, предпочтительно между 0,9 и 1,1, более предпочтительно между 0,95 и 1,05.
6
12
6
5
Глюкоза представляет собой моносахарид формулы CHO или H-(С=O)-(СНОН)-Н, пять гидроксильных групп (ОН) которого специфично расположены на его шестиуглеродном остове, обычно в виде кольца. В ее кратковременной форме с открытой цепью молекула глюкозы имеет открытый (в противоположность циклической) и неразветвленный остов из шести углеродных атомов, с С-1 до С-6; где С-1 является частью альдегидной группы Н(С=O)-, и каждый из других пяти углеродов несет одну гидроксильную группу -ОН (остальные связи углеродов остова насыщены атомами водорода -Н).
В растворах на водной основе форма глюкозы с открытой цепью («D-» или «L-» изомер) существует в равновесии несколькими циклическими изомерами глюкозы, каждый содержит углеродное кольцо, замкнутое с помощью одного атома кислорода. В водном растворе более 99% глюкозы существует в виде пиранозы. Форма с открытой цепью ограничена приблизительно 0,25%, а фураноза присутствует в ничтожных количествах. Термины «глюкоза» и «D-глюкоза» в целом также используют для этих циклических форм. Кольцо возникает из формы с открытой цепью посредством реакции нуклеофильного присоединения между альдегидной группой -(С=O)Н в С-1 и гидроксильной группы -ОН в С-4 или С-5, что дает группу -С(ОН)Н-O-. Открытой изомер D-глюкозы дает начало четырем различным циклическим изомерам: α-D-глюкопираноза, β-D-глюкопираноза, α-D-глюкофураноза и β-D-глюкофураноза; все они являются хиральными.
Другой изомер L-глюкозы с открытой цепью аналогичным образом дает начало четырем различным циклическим формам L-глюкозы.
В контексте настоящего изобретения, термин «глюкоза» обозначает любой из изомеров глюкозы, или циклических или в форме с открытой цепью.
Когда определяют уровни МГ и глюкозы в тестируемом биологическом образце, можно вычислять так называемый показатель МГ/Г, который представляет собой соотношение между уровнем МГ и уровнем глюкозы в тестируемом биологическом образце. Это соотношение, выраженное ммоль/г, после этого сравнивают с нормальным контрольным соотношением для того, чтобы определять, если пациент страдает злокачественной опухолью.
Поскольку клетки злокачественной опухоли потребляют более высокое количество глюкозы и продуцируют и высвобождают более высокое количество МГ, чем нормальные в контексте настоящего изобретения, метаболическая активность клеток злокачественной опухоли во внеклеточном компартменте организма характеризуется показателем МГ/Г, который определяют как соотношение уровня образования МГ в крови, выраженного в нмоль/г, к уровню глюкозы в крови (Г), выраженному в ммоль/л, в соответствии с формулой: показатель МГ/Г=МГ/Г, в котором МГ/Г выражают в мкмоль/г.
У диабетических пациентов без злокачественной опухоли имеет место положительная корреляция между уровнем глюкозы, процентной долей гликированного гемоглобина HbAlc и уровнем образования МГ в крови (Beisswenger et al. Диабет 1999). Другими словами, у таких пациентов чем выше гликемия, тем выше процентная дола гликированного гемоглобина HbAlc и выше уровень циркулирующего МГ в крови. Это объясняет, почему в крови диабетических пациентов без злокачественной опухоли имеет место одновременное увеличение уровней и глюкозы и МГ. В отличие от этого, у несущих злокачественную опухоль диабетических пациентов значительное увеличение показателя МГ/Г относится к тому факту, что, в силу их более высокого потребления глюкозы (так называемый эффект «глюкозной помпы») и их более высокой гликолитической активности (Hsu and Sabatini, Cell 2008; Koppenol et al., Nat Rev Cancer 2011), клетки злокачественной опухоли продуцируют и высвобождают значительно более высокие количества МГ в кровь, как авторы изобретения показали в настоящем документе (см. ниже); при этом, из-за их специфического эффекта глюкозной помпы, они одновременно склонный к снижению внеклеточной глюкозы в организме; это объясняет разницу, которая возникает между диабетическими пациентами и гликемией, которая остается нормальной у пациентов со злокачественными опухолями, даже в запущенном состоянии.
В предпочтительном варианте осуществления контрольное соотношение (далее обозначаемое как «нормальный контрольный показатель МГ/Г») представляет собой показатель соотношения МГ/Г, который определили по биологическим образцам, предпочтительно образцам крови субъектов, которые не имеют ни злокачественной опухоли, ни диабета, предпочтительно здоровых субъектов.
В контексте изобретения, нормальный контрольный показатель соотношения МГ/Г составляет приблизительно 0,01, что соответствует промежуточному значению между медианным значением показателя МГ/Г, полученным из крови здоровых доноров, и медианным значением показателя МГ/Г, полученным из крови нормогликемических диабетических субъектов, проходящих терапию без злокачественных опухолей (см. фиг. 4).
В контексте настоящего изобретения, показатель МГ/Г диабетического пациента «значительно выше» или «выше», чем нормальный контрольный показатель МГ/Г, когда указанный показатель МГ/Г в 1,5 раза выше, предпочтительно в 2 раза выше и более надежно в 3 раза выше, чем указанный нормальный контрольный показатель МГ/Г. Говорят, что диабетический пациент имеет высокий риск иметь злокачественную опухоль (типично риск между 50% и 80%), когда его/ее показатель МГ/Г в 2 раза выше, чем указанный контрольный показатель, и даже более высокий риск (типично риск между 80% и 100%), когда его/ее показатель МГ/Г в 3 раза выше, чем указанный контрольный показатель.
В отличие от этого, показатель МГ/Г диабетического пациента называют «значительно более низким» или «более низким», чем нормальный контрольный показатель МГ/Г, когда указанный показатель МГ/Г в 1,5 раза ниже, предпочтительно в 2 раза ниже и более предпочтительно в 3 раза ниже, чем указанный нормальный контрольный показатель МГ/Г. Говорят, что пациент имеет низкий риск иметь злокачественную опухоль (типично риск между 20% и 50%), когда его показатель МГ/Г в 2 раза ниже, чем указанный нормальный контрольный показатель МГ/Г, и даже более низкий риск (типично риск от 0% до 20%), когда его показатель МГ/Г в 3 раза ниже, чем указанный нормальный контрольный показатель МГ/Г. Наконец, показатель МГ/Г диабетического пациента называют «близким к контрольному показателю», если соотношение между указанным показателем МГ/Г и указанным контрольным показателем содержится между 0,8 и 1,2, предпочтительно между 0,9 и 1,1, более предпочтительно между 0,95 и 1,05.
Как используют в настоящем документе, термины «стадийность злокачественной опухоли» или «стадии злокачественной опухоли» обозначает клиническую классификацию злокачественных опухолей по четырем международно признанным категориям, называемым I, II, III и IV стадии. Эти четыре прогностические стадии определяют в момент диагностирования, т.е. до введения какого-либо лечения злокачественной опухоли. Стадийность, главным образом, основана на классификации злокачественных опухолей «TNM» (где Τ = размер и тканевая инвазия; N = вовлечение регионарных лимфатических узлов, M = отдаленные метастазы). В зависимости от типа опухоли, стадийность можно определять с использованием других систем классификации. Так, хотя, например, классификацию TNM широко используют для злокачественных опухолей молочной железы, злокачественных опухолей бронхов и злокачественных опухолей головы и шеи; классификацию FIGO (International Federation of Gynecologists and Obstetricians) широко используют для карциномы яичника, а модифицированную классификацию Дюкса для злокачественных опухолей ободочной кишки. Таким образом, в контексте настоящего изобретения, авторы изобретения классифицировали злокачественные опухоли по четырем стадиям I, II, III и IV прогностической классификации, принимая во внимание наиболее широко используемую классификацию для каждого типа злокачественных опухолей. Вдобавок, стадия 0 была ограничена неинвазивными злокачественными опухолями in situ.
Термины «лечение», «лечить» и т.п., используемые в настоящем документе, в целом относятся к получению фармакологического и/или физиологического ответа против злокачественной опухоли. Эффект может быть профилактическим с точки зрения предотвращения прогрессирования злокачественной опухоли у бессимптомных субъектов, и/или он может быть, строго говоря, терапевтическим у симптоматических пациентов, чтобы достигать частичной или полной стабилизации или излечения злокачественной опухоли.
Более точно, как используют в настоящем документе, термин «лечение злокачественных опухолей» относится к химиотерапии, лучевой терапии, хирургическому вмешательству или какой-либо признанной биологической или химической терапии, используемой практикующими врачами. Существующее лечение кратко изложено, например, на веб-сайте US National Cancer Institute (NCI) по адресу: http://www.cancer.gov/cancertopics/treatment/types-of-treatment.
Время роста в два раза для опухоли определяют как период времени, который необходим опухоли для удвоения объема (или, более точно, для удвоения числа нестромальных опухолевых клеток).
Как используют в настоящем документе, термин «ответ опухоли» относится к различным международно принятым модальностям развития опухоли после введения лечения злокачественной опухоли пациенту со злокачественной опухолью, у которого заболевание различимо, т.е. где ответ опухоли можно оценивать непосредственно с помощью измерения опухоли клинически и/или опосредованно с помощью измерения опухоли, используя доступные способы визуализации. Тип ответа определяют после определенного временного интервала, в течение которого вводили лечение злокачественной опухоли. Оценка заключается в сравнении измерений, выполненных после лечения, с измерениями, выполненными перед лечением. Существует четыре категории ответов: (1) прогрессирующая опухоль: увеличение объема опухоли составляет больше чем 25%; (2) стабильная опухоль: увеличение объема опухоли составляет меньше чем 25% и уменьшение опухоли составляет меньше чем 25%; (3) частичный ответ: уменьшение опухоли составляет больше чем 25%, но меньше чем 100%; и (4) полный ответ: измеряемый объем опухоли равен нулю, т.е. опухоль не поддается обнаружению с использованием доступных способов.
Временной интервал между первым и вторым биологическими образцами, т.е. время, за которое второй биологический образец должен быть предоставлен для того, чтобы оценивать прогноз или терапевтический ответ, преимущественно зависит от времени роста опухоли в два раза; чем короче время удвоения, тем короче должен быть временной интервал. Само по себе время роста в два раза зависит от типа опухоли и эффективности лечения. Так, в случае быстро растущей опухоли, временной интервал для взятия образца может составлять один, два или три месяца, тогда как для медленно растущей опухоли он может составлять четыре, пять, шесть месяцев или даже больше.
В настоящем документе считают, что указанное лечение злокачественной опухоли не эффективно для указанного пациента, если, когда предоставляют второй биологический образец через один, два или три месяца или даже шесть месяцев после первого биологического образца, в зависимости от времени удвоения опухоли, уровень образования МГ в 2 раза и более предпочтительно в 3 раза выше, чем указанный уровень образования МГ в первом образце. В отличие от этого, говорят, что указанное лечение злокачественной опухоли эффективно для указанного пациента, если, когда второй образец получают, например, через один, два, три месяца или даже шесть месяцев после первого образца, в зависимости от времени роста опухоли в два раза, второй уровень образования МГ в 2 раза и более предпочтительно в 3 раза ниже, чем уровень образования МГ в первом образце.
Выживаемость зависит от типа опухоли, стадии и лечения. Под «долгосрочной выживаемостью» в настоящем документе понимают, что указанные тестируемые субъекты будут иметь выживаемость по меньшей мере 12 месяцев, предпочтительно 3 года и более предпочтительно 5 лет после выполнения взятия образца. С другой стороны, под «краткосрочной выживаемостью» в настоящем документе понимают, что указанные тестируемые субъекты будут жить не больше чем 5 лет, вероятно меньше чем 3 года и более вероятно меньше чем 12 месяцев после выполнения взятия образца.
В контексте настоящего изобретения, полагают, что вероятность излечения пациента или даже выживаемость в течение длительного времени является низкой, когда определение уровня образования МГ во втором образце, полученном через один месяц, два месяца, три месяца или даже шесть месяцев после первого образца, в 2 раза и более определенно в 3 раза выше, чем указанный уровень образования МГ в первом образце. В отличие от этого, полагают, что пациент имеет более высокий шанс долгосрочной выживаемости или даже определенно может быть излечен, когда уровень образования МГ во втором образце, полученном через три месяца, предпочтительно через шесть месяцев и более предпочтительно через один год после первого образца, в 2 раза, более предпочтительно в 3 раза ниже, чем уровень образования МГ в первом образце, и идеально когда уровни образования МГ, измеряемые в нескольких образцах после второго образца, остаются в пределах нормального диапазона.
Кахексия представляет собой комплексный метаболический синдром, который возникает при хроническом заболевании, таком как злокачественная опухоль (Tisdale, Physiol Rev. 2009). У пациентов, теряющих вес, показано, что измерение инсулинового ответа в тесте на толерантность к глюкозе может указывать на резистентность к инсулину в случае высокого соотношения инсулин/глюкоза (показатель И/Г) или сниженную секрецию инсулина β-клетками поджелудочной железы в случае низкого показателя И/Г (Rofe et al. Anticancer Res 1994).
Следовательно, авторы настоящего изобретения измеряли показатель И/Г у пациентов со злокачественными опухолями и у нормальных субъектов. Они сравнивали кривую, характеризующую пациентов со злокачественными опухолями, с кривой нормальных субъектов и находили в точке пересечения двух кривых присутствие соответствующего критического значения МГ, после этого обозначаемое как «связанное с кахексией контрольное значение МГ», выше которого, в сравнении с нормальными субъектами, имеет место снижение показателя И/Г. Это обозначает, что пациенты, имеющие уровни образования МГ выше связанного с кахексией контрольного значения МГ, имеют сниженную секрецию инсулина поджелудочной железой и, следовательно, входят в тяжелую прекахексию или кахексию.
В контексте изобретения связанное с кахексией контрольное значение МГ в крови пациентов со злокачественными опухолями составляет 0,2 мкМ, что приблизительно в 3 раза выше, чем нормальное контрольное значение МГ у здоровых субъектов (см. выше), что обозначает, что при значении МГ 0,2 мкМ пациент со злокачественной опухолью имеет точно то же самое соотношение инсулин/глюкоза, как. измеряли у здоровых субъектов и, следовательно, имеет идентичный уровень резистентности к инсулину и секрецию поджелудочной железы.
В контексте изобретения говорят, что пациент имеет «высокий риск развития кахектического синдрома» (типично, риск между 50% и 80%), когда уровень образования МГ в крови составляет приблизительно в 2 раза выше, чем связанное с кахексией контрольное значение МГ 0,2 мкМ, тогда как при уровне МГ в крови приблизительно в 3 раза выше, чем указанное связанное с кахексией контрольное значение МГ, риск развития кахексии выше (типично, риск между 80% и 100%). В отличие от этого, говорят, что пациент имеет «низкий риск развития кахектического синдрома» (типично, риск между 20% и 50%), когда уровень МГ в крови приблизительно в 2 раза ниже, чем указанное связанное с кахексией контрольное значение МГ 0,2 мкМ, при этом риск развития кахектического синдрома даже еще ниже (типично, риск между 0% и 20%), когда уровень МГ в крови составляет приблизительно в 3 раза ниже, чем указанное связанное с кахексией контрольное значение МГ.
Как используют в настоящем документе, термины «корреляция», «коррелировать» или «коррелировать с» и т.п. относятся к статистической связи между двумя переменными, состоящих из чисел, наборов данных и т.п. Положительная корреляция (или «положительно коррелированный») обозначает, что с увеличением одной переменной, другая также увеличивается. В отличие от этого отрицательная корреляция (или «отрицательно» или «обратно коррелированный») обозначает, что с увеличением одной переменной другая уменьшается. В настоящем изобретении используют руководства US National Cancer Institute-European Organization for Research and Treatment of Cancer (NCI-EORTC) для исследований опухолевых маркеров, адаптированные к биохимическим характеристикам и биологическим свойствам МГ. Руководства NCI-EORTC включают релевантные рекомендации о постановке экспериментов, априорных гипотезах, характеристиках пациентов и образцов, аналитических способах и статистическом анализе. Кроме того, для раннего обнаружения и скрининга использовали рекомендации NCI Early Detection Research Network (EDRN) для разработки биологических маркеров.
Следует принимать во внимание, что это изобретение не ограничено конкретными описанными вариантами осуществления. Также следует принимать во внимание, что терминология, используемая в настоящем документе, служит только цели описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена в качестве ограничения, поскольку объем настоящего изобретения ограничен только приложенной формулой изобретения.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
3
3
4
2
Метилглиоксаль (МГ) - альдегидная форма пировиноградной кислоты, также называемая пирувальдегид или 2-оксопропаналь, формулы (СН-СО-СН=O или CHO) - представляет собой уникальную, но повсеместную молекулу, присутствующую в большинстве биологических систем, включая все клетки млекопитающих (Inoue, Adv Microb Physio 1995). Он обладает высокой реакционной способностью и является дозозависимым цитотоксическим метаболитом, который в первую очередь образуется во время гликолиза, ключевой метаболической стадии для дышащих организмов.
Главное открытие, которое позволяет отличать клетки злокачественной опухоли от нормальных клеток, состоит в том, что многие клетки злокачественной опухоли преимущественно используют гликолиз в своей цитоплазме для того, чтобы генерировать аденозинтрифосфат (АТФ), чтобы обеспечивать клетки энергией. Этот феномен так называемого аэробного гликолиза относится к эффекту Варбурга, который является признаком метаболизма клеток злокачественной опухоли (Hsu and Sabatini, Cell 2008). Сейчас этот эффект вполне понятен, поскольку точно установлено, что клетки злокачественной опухоли связаны с нарушением функции митохондрий и мутациями в митохондриальной ДНК (мтДНК) (Copeland et al. Cancer Invest 2002; Wallace, Cold Spring Harb Symp Quant Biol 2005). Показано, что чрезмерное гликирование митохондриальных белков, липидов и мтДНК из-за ассоциированного с митохондриями карбонилового стресса вносит вклад в нарушение функции митохондрий и мутации мтДНК (Pun and Murphy, Int J Cell Biol 2012). Кроме того, продукция свободных радикалов в избытке вблизи мтДНК митохондриями с нарушенной функцией и отсутствие защитных гистонов в мтДНК (Baynes, Ann Ν Y Acad Sci 2002) могут объяснять, почему митохондриальный геном значительно более восприимчив как к карбониловому стрессу, так и к окислительному стрессу, чем ядерный геном, и, таким образом, подвергается мутациям с более высокой частотой (Yakes and Van Houten, PNAS 1997). Кроме того показано, что эпигенетические и/или мутагенные изменения в клетках злокачественной опухоли могут индуцировать: (1) сверхэкспрессию гексокиназы 2-го типа (Goel et al. J Biol Chem 2003); (2) активацию мембранных рецепторов глюкозы, обычно регулируемых инсулином, в частности, GLUT1, GLUT3 и GLUT5 (Merral et al. Cell Signal 1993), что ведет к легкому проникновению внеклеточной глюкозы в клетки злокачественной опухоли; и наконец (3) сверхэкспрессию всех гликолитических ферментов в аэробных и анаэробных условиях, что вызывает активный метаболизм внутриклеточной глюкозы в клетках злокачественной опухоли независимо от кислородных условий внутри опухоли (Hanahan and Weinberg, Cell 2011).
Настоящее изобретение направлено на тот факт, что клетки злокачественной опухоли будут продуцировать характерно значительно более высокие количества МГ, чем нормальные клетки, что делает МГ потенциальным метаболическим маркером злокачественной опухоли. Кроме того, показано, что из-за его реакционноспособных альдегидных и кетоновых групп, МГ является мощным акцептором электронов и поэтому представляет собой чрезвычайно реакционноспособное соединение, отличающееся посредством уникальными химическими и биологическими свойствами.
Во многих организмах, включая бактерий, МГ образуется в качестве побочного продукта некоторых метаболических путей. Он может образовываться из 3-аминоацетона, который представляет собой промежуточный продукт катаболизма треонина, а также через перикисное окисление липидов. Однако наиболее важным источником является гликолиз, в котором МГ образуется через неферментативное элиминирование фосфата из дигидроксиацетонфосфата (DHAP) и глицеральдегид-3-фосфата (G-3Р).
Поскольку МГ является очень цитотоксическим, организмы развили некоторые механизмы детоксификаци. Одним из них является глиоксалазная система, которая играет ключевую роль в защите клеток от электрофильной токсичности, в частности, от индуцированного МГ повреждающего гликирования. Во время этого процесса МГ активирует глиоксалазу 1 (GLO-1), которую использует восстановленный глутатион (GSH) в качестве кофактора для того, чтобы превращать МГ в S-D-лактоилглутатион, метаболический промежуточный продукт, который в дальнейшем расщепляет глиоксалаза 2 (GLO-2) до D-лактата (Thornalley, Gen Pharmacol 1996). Стоит отметить, что продемонстрирована повышенная активность GLO-1 по сравнению с нормальными тканями во многих злокачественных опухолях человека, включая злокачественные опухоли ободочной кишки, легких, молочных желез, яичника, предстательной железы, мочевого пузыря, почек, поджелудочной железы и желудка и при лейкозе и меланоме и более конкретно при агрессивных злокачественных опухолях (Jones et al. Proteomics 2002; Zhang et al. Mol Cell Proteomics 2005). Кроме того, выявлена корреляция сверхэкспрессии GL0-1 и GLO-2 с множественной лекарственной устойчивостью опухолей (Sakamoto et al. Blood 2000). Однако GLO-2 активность в целом ниже в злокачественных тканях, чем в нормальных тканях, что указывает на то, что, в сравнении с нормальными клетками, клетки злокачественной опухоли могут быть менее способны к самостоятельной детоксификации внутриклеточного МГ и возвращению к нормальному GSH. Это может увеличивать как карбониловый стресс, так и окислительный стресс и, таким образом, или развитию и прогрессированию опухоли или апоптозу/некрозу, в зависимости концентрации от внутриклеточных свободных радикалов (Irigaray and Belpomme, Carcinogenesis 2010).
Описана роль МГ в качестве сигнальной молекулы. Egyiid и Szent-Gyorgyi впервые предположили, что GLO-1 и ее субстрат МГ вовлечены в регулирование клеточного деления (Egyiid and Szent-Gyorgyi, PNAS 1966). Позже было сделано предположение о том, что МГ регулирует активность фактора транскрипции NF-κΒ и экспрессию индуцируемого NF-κΒ репортерного гена (Ranganathan et al. Gene 1999; Laga et al). Кроме того, показано, что образование конечных продуктов усиленного гликирования (AGE) вносит вклад в старение и, возможно, в развитие основных патологических состояний, таких как диабет (Brownlee, Nature 2001; Brownlee, Diabetes 2005), артериальная гипертензия (Wang et al. J Hypertens 2005), пролиферация адипоцитов, связанная с избыточным весом/ожирением (Jia et al. PloS One 2012), болезнь Альцгеймера (Smith et al. PNAS 1994) и злокачественные опухоли (van Heijst et al. Ann Ν Υ Acad Sci 2005).
Образование внутриклеточного МГ возрастает в гипергликемических условиях. Ненормально увеличенные уровни внеклеточного МГ в крови подтверждены у пациентов с диабетом 1-го и 2-го типов (Beisswenger et al. Diabetes 1999) и в последнее время описан механизм, посредством которого МГ может вызывать резистентность к инсулину при диабете 2-го типа (Ribouley-havey et al. Diabetes 2006).
Некоторые данные ясно показывают, что из-за выраженной электроноакцепторной способности МГ представляет собой мощный гликирующий агент и наиболее реакционноспособный предшественник AGE (Shinohara et al. J Clin Invest 1998). Не только белки, но также липиды и нуклеиновые кислоты восприимчивы к гликированию посредством МГ (Thornalley, Drug Metabol Drug Interact 2008).
Следовательно, с одной стороны полагают, что МГ вносит вклад в злокачественные опухоли в качестве мощного мутагена и может отвечать за канцерогенез и развитие злокачественных опухолей. С другой стороны, из-за его проапоптотических и/или пронекротических дозозависимых цитотоксических свойств, его также считают лекарственным средством против злокачественных опухолей и полагают, что он обеспечивает определенные канцеростатические эффекты у животных (Conroy, Ciba Found Symp 1978) и индивидуумов (Talukdar et al. Drug Me tab Drug Interact 2008) со злокачественными опухолями. Кроме того, на основе возможного противоопухолевого эффекта МГ, несколько родственных МГ соединений, таких как соединение метилглиоксаль-бис-циклопентиламидиногидразин и соединение митогуазон, т.е. метилглиоксаль-бис(бутиламиногидразон), коммерчески доступное под названием Methyl-GAG (NSC-32946), синтезировано для того, чтобы лечить злокачественные опухоли. Однако ни для МГ, ни для этих синтетических соединений не продемонстрировано обладание фактическими релевантными противоопухолевыми положительными эффектами в соответствующих клинических исследованиях I и II фазы. Несмотря на прогресс в понимании системных эффектов МГ, многое остается неизвестным. По большей части это обусловлено тем, что МГ существует преимущественно в форме аддукта, учитывая, что из-за его чрезвычайно выраженных гликирующих свойств он связывается с внутриклеточными и внеклеточными лигандами (Chaplen et al. PNAS 1998). Кроме того, вопрос осложнен тем, что МГ взаимодействует с этими лигандами обратимо или необратимо. Однако показано, что свободный циркулирующий МГ можно обнаруживать в образцах крови, получаемых от пациентов, страдающих диабетом 1-го или 2-го типа (Beisswenger et al. Диабет 1999.).
В 1959 году Lewis, Majane и Weinhouse, используя способ Neuberg и Strauss, точно предположили, что обнаружение МГ в клетках злокачественной опухоли ничтожно (Lewis et al. Cancer Res 1959).
Кроме того, в 1978 Brandt и Siegel предположили, что прямое определение МГ в биологических тканях является сложным из-за активной глиоксалазной системы и, таким образом, предположили дозировать D-Лактат вместо МГ в крови (Brandt and Siegel, Ciba Found Symp 1978). Позже, основываясь на ограниченной группе исследованных пациентов с так называемыми установленными злокачественными опухолями, пришли к заключению о том, что уровни МГ в крови значительно снижены у пациентов с злокачественными опухолями молочной железы и предстательной железы (Kumar, Biswas et al. Biomedical Res 2011); при этом говорилось, что уровни МГ в крови увеличены при предзлокачественных повреждениях ротовой полости, т.е. при повреждениях ротовой полости, про которые говорилось, что они не установлены в качестве озлокачествленной злокачественной опухоли. Фактически, в это время не было ясно, обусловлены ли увеличенные уровни МГ в крови у пациентов с предзлокачественными повреждениями ротовой полости курением табака и/или алкогольной зависимостью, при условии, что эти факторы риска обыкновенно связаны с такими субъектами и что подтверждено содержание МГ в дыме сигарет, а также в алкоголе (Nagao et al. Environ Health Perspect 1986); и получали или не получали пациенты с заявленными установленными злокачественными опухолями предварительно лечение злокачественных опухолей и, следовательно, были ли эти пациенты ассоциированы с истинными клинически и/или биологически активными пролиферативными опухолями во время взятия образцов крови или нет.
Авторы изобретения к удивлению обнаружили, что уровни МГ в крови значительно повышены у пациентов, страдающих установленными прогрессирующими злокачественными опухолями, тогда как при метаболически неактивных злокачественных опухолях, т.е. в предзлокачественном состоянии или даже при злокачественной опухоли на стадии 0 in situ уровни МГ в крови повышены незначительно. В действительности, уровни МГ в крови значительно увеличены при эпителиальных злокачественных опухолях, таких как злокачественные опухоли головы и шеи, легких, молочных желез, предстательной железы, прямой и ободочной кишки, поджелудочной железы и других злокачественных опухолях пищеварительной системы; и при неэпителиальных злокачественных опухолях, таких как лейкоз, лимфома, меланома и саркома. Более конкретно, уровни МГ в крови коррелируют с объемом опухоли и терапевтическими ответами у пациентов, страдающих злокачественными опухолями. Чем выше уровень МГ в крови, тем выше опухолевая масса. Уровень МГ, следовательно, и критически выглядит клинически значимым биологическим маркером, чтобы помогать онкологам при принятии решений и лечении пациентов со злокачественными опухолями.
Соответственно, настоящее изобретение относится к применению МГ в качестве клинически эффективного биологического маркера для раннего обнаружения и диагностирования злокачественных опухолей у несущих злокачественные опухоли субъектов и для прогностической оценки, мониторинга и принятия терапевтических решений у пациентов со злокачественными опухолями, людей или животных. Поскольку уровни МГ в крови можно измерять точно и быстро, способ диагностирования по изобретению вносит вклад в мониторинг заболевания и оценку терапевтического ответа очень чувствительным образом. Наконец, поскольку образование МГ клетками злокачественной опухоли относится к фундаментальному и характерному нарушению метаболических функций этих клеток, использование МГ в качестве биологического маркера злокачественной опухоли делает возможным обнаружение многих, если не всех злокачественных опухолей; в отличие от доступных в настоящее время биологических маркеров, связанных с типом опухоли. Другая цель изобретения представляет собой набор для раннего обнаружения и диагностирования злокачественной опухоли, стадийности злокачественной опухоли, для предсказания шансов на выживаемость у пациентов со злокачественными опухолями, для мониторинга ответ на терапию против злокачественной опухоли и для предсказания и раннего обнаружения кахексии.
Другая цель изобретения состоит в применении МГ при раннем обнаружении и диагностировании метаболически активной злокачественной опухоли, измерении и анализе образования МГ в образцах внеклеточных текучих веществ, клеток и/или тканей посредством использования каких-либо химических или иммунологических способов измерения МГ in vitro; при условии, что использование MALDI-TOF/TOF масс-спектрометрии или схожих способов является предпочтительным.
1. МГ в качестве естественного внутриопухолевого биологического маркера, образуемого клетками злокачественной опухоли.
Авторы изобретения обнаружили, что клетки злокачественной опухоли могут продуцировать и высвобождать более высокие количества МГ, чем нормальные клетки, что клетки злокачественной опухоли продуцируют и высвобождают большие количества МГ непосредственно внутри опухоли, чем во внеклеточном компартменте в организме и, более конкретно, в периферической крови; тогда как нормальные клетки (или воспалительные клетки) продуцируют и высвобождают не поддающиеся обнаружению или только низкие поддающиеся обнаружению количества МГ в тканях и во внеклеточном компартменте в организме, более конкретно в периферической крови.
Эти удивительные результаты подтверждены в культурах in vitro и на животных моделях, а также, более конкретно, посредством использования MALDI-TOF/TOF масс-спектрометрии для анализа опухолевого МГ in situ и клинически у пациентов. МГ можно непосредственно обнаруживать в опухолевых тканях и опухолевых областях, где обнаруживаемый МГ главным образом соответствует зонам активной пролиферации в опухоли (см. фиг. 2). Кроме того, количество МГ, образуемого и высвобождаемого клетками злокачественной опухоли в культурах, зависит от концентрации глюкозы в среде для культивирования т.е. чем выше концентрация глюкозы, там выше образование МГ клетками злокачественной опухоли (см. фиг. 1 bis), что подтверждает то, что клетки злокачественной опухоли преимущественно используют гликолиз для образования АТФ, даже в аэробных условиях. Вдобавок, авторы изобретения показали, что количество МГ, синтезированного и высвобождаемого из опухоли, положительно коррелирует с опухолевой массой, т.е. чем больше объем опухоли, тем выше уровне образования МГ в периферической крови (см. фиг. 3 для пациентов со злокачественными опухолями и фиг. 5 для животной модели); тогда как в случае отторжения опухоли воспалительными и/или иммунокомпетентными клетками, уровни МГ остаются очень низкими (см. фиг. 6). Следовательно, один основной вариант осуществления изобретения состоит в том, что уровень образования МГ, обнаруживаемого в опухоли и/или во внеклеточном компартменте в организме несущего злокачественную опухоль субъекта, относится к уровню метаболической активности клеток злокачественной опухоли, который соответствует уровню пролиферативной активности опухоли, которой страдает субъект.
Настоящее изобретение, следовательно, относится к способу раннего обнаружения и диагностирования злокачественной опухоли посредством измерения и анализа продуцирования МГ in situ метаболически активными клетками злокачественной опухоли в образцах клеток и/или тканей, посредством использования какого-либо химического или иммунологического способа измерения МГ in vitro. Эти способы включают использование MALDI-TOF/TOF масс-спектрометрии или схожих способов.
Следовательно настоящее изобретение относится к МГ для его применения в способе обнаружения злокачественной опухоли посредством измерения и анализа продуцирования и высвобождения МГ в образцах тканей и/или клеток с использованием тканевых биоптатов, как это обыкновенно делают для любой солидной опухоли и/или любых клеточных мазков, как широко применяют для диагностирования и мониторинга гематологических злокачественных опухолей (лейкоз, лимфома) и/или для скрининга некоторых солидных злокачественных опухолей (шейки матки), а также злокачественных опухолей других типов. Поскольку основная часть МГ, который продуцируют и высвобождают клетки злокачественной опухоли, происходит от их увеличенной гликолитической активности, настоящее изобретение также включает способ определения пролиферативной агрессивности опухоли и, таким образом, может вносить вклад в различение злокачественных опухолей и доброкачественных опухолей или воспалительных процессов, поскольку метаболическая активность клеток злокачественной опухоли в целом увеличена в сравнении с таковой у клеток доброкачественных опухолей или воспалительных клеток.
2. МГ в качестве естественного биологического маркера, высвобождаемого клетками злокачественной опухоли во внеклеточные текучие вещества, для раннего обнаружения, диагностирования и прогностической оценки у субъектов без диабета.
Во втором основном варианте осуществления изобретения настоящее изобретение относится к способу определения наличия опухоли у указанных субъектов, посредством измерения уровней образования МГ в биологических образцах внеклеточного компартмента организма; более предпочтительно в периферической крови; и сравнения измеренного уровня образования МГ с его нормальным контрольным значением.
Настоящее изобретение также относится к способу раннего обнаружения, скрининга и диагностирования злокачественной опухоли in vitro у субъектов без диабета, включающему стадии:
a) определение уровня образования МГ в биологическом образце указанных субъектов во внеклеточном текучем веществе,
b) сравнение указанного уровня образования МГ с контрольным значением, т.е. с уровнем МГ у субъектов без злокачественной опухоли, где, если уровень образования МГ в указанном биологическом образце выше, чем указанное контрольное значение, указанные субъекты страдают злокачественной опухолью или имеют высокий риск иметь ее.
В отличие от этого, когда уровень образования МГ в указанном биологическом образце находится в диапазоне указанного нормального контрольного значения, указанные субъекты не страдают злокачественной опухолью или имеют низкий риск иметь ее. Настоящее изобретение делает возможным обнаружение и диагностирование злокачественной опухоли у субъектов людей или животных, которые не страдают диабетом, т.е. у субъектов, которые имеют уровень гликированного гемоглобина HbAlc ниже 7%. В предпочтительном варианте осуществления способ диагностирования по изобретению делает возможным обнаружение злокачественных опухолей головы и шеи, бронхов и легких, молочных желез, предстательной железы, прямой и ободочной кишки, поджелудочной железы и других частей пищеварительного тракта, в дополнение к злокачественным опухолям яичников и эндометрия, почек и мочевого пузыря, лейкозу и неходжкинской лимфоме, меланоме и саркоме. В предпочтительном варианте осуществления нормальное контрольное значение МГ представляет собой уровень образования указанного МГ, который измеряли в биологических образцах здоровых индивидуумов. Предпочтительно, это значение для цельной крови составляет 0,0 6 мкМ + 0,02 с доверительной областью от 0,02 мкМ до 0,11 мкМ. Кроме того настоящее изобретение также включает способ определения пролиферативной агрессивности опухоли, который включает стадию измерения МГ в биологическом образце указанных субъектов и сравнение измеренного уровня образования МГ с его контрольным значением.
3. Раннее обнаружение и диагностирование злокачественной опухоли: диабетические пациенты.
Имеет место статистически значимая более высокая заболеваемость злокачественными опухолями у 30 пациентов с сахарным диабетом 1-го и 2-го типа, не получавших лечение. Однако известно, что уровень образования МГ увеличен в гипергликемических условиях, т.е. у диабетических пациентов, которые не получали или получали неправильное лечение, (McLellan, Clin Sci 1994). Следовательно, у этих пациентов данный биологический маркер злокачественных опухолей МГ будет скомпрометирован.
Следовательно, цель изобретения представляет собой то, что показатель МГ/Г позволяет отличать тех пациентов, которые могут иметь злокачественную опухоль, от тех, кто может не иметь, даже среди диабетических пациентов. Следовательно, оценка этого показателя делает возможным раннее обнаружение и диагностирование злокачественной опухоли у диабетических пациентов и, следовательно, будет улучшать прогноз злокачественной опухоли у этих пациентов.
Настоящее изобретение, следовательно, относится к способу раннего обнаружения, скрининга и диагностирования злокачественной опухоли in vitro у диабетических субъектов, включающему стадии:
а) определение уровня образования МГ в первом биологическом образце указанных диабетических субъектов,
b) определение уровня глюкозы во втором биологическом образце указанных субъектов,
c) сравнение соотношения МГ/Г для этих двух уровней (показатель МГ/Г) с соответствующим контрольным соотношением, определяемым у здоровых индивидуумов и нормогликемических диабетических субъектов, проходящих терапию, где, если показатель МГ/Г, полученный на стадии с), выше, чем указанное соответствующее контрольное соотношение, указанных субъектов считают страдающим злокачественной опухолью или имеющими повышенный риск злокачественной опухоли; где, если показатель МГ/Г, полученный на стадии с), похож на указанное соответствующее контрольное соотношение, указанных субъектов не считают ни страдающими злокачественной опухолью, ни имеющими повышенный риск злокачественной опухоли.
Важно, что этот способ можно применять к любому животному или человеческому субъекту без диабета, предпочтительно, к диабетическим пациентам, получающим корректное лечение, но и даже некорректное лечение, т.е. к субъектам с уровнем гликированного гемоглобина HbAlc ниже 7%.
Как отмечено ранее, указанный первый и указанный второй биологические образцы (в которых проводят измерение уровней МГ и глюкозы у одного и того же индивидуума, соответственно) предпочтительно представляют собой образцы биологических жидкостей, например, выбранных из крови, сыворотки, плазмы, мочи, перитонеального или плеврального выпота и цереброспинальной жидкости. В способе по изобретению, указанные первый и второй образцы должны обладать одинаковыми свойствами (т.е. оба должны быть кровью, перитонеальным или плевральным выпотом и т.д.).
Указанный первый и указанный второй образцы можно брать у субъекта последовательно. В предпочтительном варианте осуществления образцы берут одновременно. В улучшенном варианте осуществления один образец разделяют на два с тем, чтобы уровни МГ и глюкозы измерять в одном и том же образце. Обычно используют несколько способов для того, чтобы измерять уровень глюкозы в биологическом образце. Специалист хорошо знает, как измерять уровень глюкозы в зависимости от типа биологического образца. Например, когда используют образец крови, глюкозу можно измерять в цельной крови, плазме или сыворотке стандартными способами. Однако образец нужно хранить при 4°C, если нужно надежное измерение МГ.
2
2
Но в контексте изобретения электрические или ферментативные способы измерения глюкозы являются предпочтительными. Два наиболее распространенно используемых фермента представляют собой глюкозоксидазу и гексокиназу. В предпочтительном варианте осуществления глюкозу измеряют посредством измерения уровня пероксида водорода (НO), образуемого в реакции глюкозы с глюкозоксидазой.
Уровень МГ измеряют в биологическом образце, как раскрыто ранее.
В предпочтительном варианте осуществления показатель МГ/Г, измеряемый в и определяемый по биологическим образцам здоровых индивидуумов или нормогликемических диабетических субъектов, проходящих терапию, предпочтительно представляет собой значение приблизительно 0,01, соответствующе значению показателя МГ/Г, которое представляет собой промежуточное значение между медианным значением показателя МГ/Г, получаемым для крови здоровых доноров, и медианным значением показателя МГ/Г, получаемым для крови нормогликемических диабетических пациентов без злокачественной опухоли, проходящих терапию (фиг. 4).
4. Определение стадии, прогностическая оценка, мониторинг и терапевтическая оценка у пациентов со злокачественными опухолями
Способы визуализации не достаточно точны для того, чтобы обнаруживать начальные злокачественные состояния, а также для того, чтобы корректно определять стадию злокачественной опухоли в соответствии с четырьмя международно признанными (с I до IV) категориями. В действительности, клиническим онкологам критически важно правильно оценивать прогрессирование злокачественной опухоли и распространение по организму при субклинических состояниях.
Настоящее изобретение показывает, что уровни образования МГ у животных коррелируют с объемом опухоли (фиг. 5) и что у пациентов уровни образования МГ в периферической крови коррелируют со стадиями опухолей (фиг. 3) и с ответом опухоли после лечения (таблица 3).
Настоящее изобретение, следовательно, относится к способу определения стадии заболевания и прогностической оценки in vitro у пациентов со злокачественными опухолями, людей или животных, посредством определения уровня образования МГ в биологическом образце, предпочтительно, образце крови, полученном у указанных пациентов, и мониторинга терапевтической эффективности у пациентов со злокачественными опухолями, включающий стадии:
- для определения стадии и прогностической оценки:
a) определение уровня образования МГ в начальном биологическом образце, полученном у указанных пациентов до лечения,
b) сравнение указанного уровня МГ до лечения с нормальным контрольным значением МГ,
c) классификация указанного уровня МГ до лечения согласно одной из четырех стадий в классификации стадий,
- для мониторинга эффективность лечения злокачественной опухоли:
a) определение начального уровня образования МГ до лечения в первом биологическом образце, полученном у указанных пациентов,
b) определение второго уровня образования МГ во втором биологическом образце, полученном после лечения у указанных пациентов,
где указанный второй образец получают в заданное время после получения первого образца,
c) сравнение указанного начального и указанного второго уровня продуцирования МГ, где, если указанный второй уровень образования МГ выше, чем указанный начальный уровень образования МГ, указанное лечение считают не эффективным у указанных пациентов; тогда как если указанный второй уровень образования МГ ниже, чем указанный начальный уровень образования МГ, указанное лечение считают эффективным у указанных пациентов, и предпочтительно его следует продолжать.
Этот способ мониторинга можно применять к любым субъектам людям или животным, имеющим злокачественную опухоль.
Данный способ in vitro также можно использовать для мониторинга терапевтической эффективности какого-либо профилактического лечения злокачественной опухоли, вводимого бессимптомным субъектам, у которых субклиническая злокачественная опухоль обнаружена с использованием данного способа.
Данный способ in vitro также можно использовать для мониторинга терапевтической эффективности какого-либо профилактического лечения злокачественной опухоли, вводимого пациентам со злокачественными опухолями, которых уже лечили от обнаружимого заболевания и которым требуется вспомогательное лечение злокачественной опухоли для того, чтобы вылечить остаточное субклиническое заболевание, предпочтительно с использованием данного способа.
Как отмечено ранее, первый и второй биологические образцы (т.е. соответственно образцы до и после лечения) предпочтительно представляют собой образцы биологической жидкости, например, выбранной из цельной крови, сыворотки, плазмы, мочи, плевральных или перитонеальных экссудатов и цереброспинальной жидкости, и в остальном должны быть настолько идентичными, насколько возможно. В этом способе указанный первый и указанный второй образцы следует брать с интервалами, чтобы указанное лечение злокачественной опухоли, осуществляемое между взятием образцов, имело достаточно времени для проявления своей эффективности и измерять и интерпретировать полученный результат в соответствии с настоящим изобретением. Более точно, как указано выше, указанный второй биологический образец следует получать «в заданное время после первого образца», то есть в зависимости от времени роста злокачественной опухоли в два раза, по меньшей мере один месяц; предпочтительно два или три месяца или даже шесть месяцев после первого образца; и предпочтительно после того, как указанное лечение проведено полностью или инициировано достаточно длительное время назад, чтобы обеспечить результаты, поддающиеся интерпретации.
Настоящее изобретение также относится к способу предсказания вероятности выживаемости in vitro у пациентов, страдающих злокачественными опухолями, с использованием биологических образцов указанных пациентов, включающий стадии:
a) определение начального уровня образования МГ в первом биологическом образце, полученном от указанных пациентов,
b) определение второго уровня образования МГ во втором биологическом образце, полученном от указанных пациентов, где указанный второй образец получают в заданное время после получения первого образца,
c) сравнение указанных начального и второго уровней образования, где, если указанный второй уровень образования МГ выше, чем указанный начальный уровень образования МГ, указанным пациентам предсказывают вероятность краткосрочной выживаемости; где, если указанный второй уровень образования ниже, чем указанный начальный уровень образования, указанным пациентам предсказывают вероятность пролонгированной выживаемости.
Этот способ предсказания эффективности терапии можно применять к любому субъекту человеку или животному, имеющему злокачественную опухоль.
Как указано ранее, первый и второй биологические образцы (т.е. соответственно образцы до и после лечения) предпочтительно представляют собой образцы биологической жидкости; например, выбранные из цельной крови, сыворотки, плазмы, мочи, плевральных или перитонеальных экссудатов и цереброспинальной жидкости; и должны иметь одинаковые свойства. Кроме того, в этом способе указанный первый и указанный второй образцы следует брать последовательно, то есть через один месяц, два месяца, три месяца или даже шесть месяцев после первого образца, в зависимости от времени роста злокачественной опухоли в два раза, чем короче время роста в два раза, тем короче должен быть временной интервал.
Предпочтительно, способ осуществляют на образце крови.
Следует отметить, когда уровень образования МГ в указанном втором образце схож с уровнем образования МГ в указанном первом образце; т.е. если их соотношение содержится между 0,7 и 1,3 и даже более предпочтительно между 0,9 и 1,1, указанные первый и второй образцы взяты, например, с интервалом в один месяц, тогда невозможно точно предсказать, имеет ли пациент растушую, стабильную или уменьшающуюся злокачественную опухоль. Таким образом, необходимо продолжать то же лечение и повторить измерение неделями или месяцами позже для того, чтобы подтверждать результат.
5. Предсказание и раннее обнаружение кахексии
По оценкам, кахексия возникает у большой процентной доли пациентов со злокачественными опухолями (в частности, со злокачественными опухолями поджелудочной железы, желудка, ободочной кишки и легких), и ее связывают с низким качеством жизни и уменьшенным временем выживаемости, независимо от опухолевой массы и присутствия метастазов. Клинически она отличается сниженным потреблением пищи и потерей массы, а биологически - системным воспалением, увеличенной мобилизацией липидов и окислением, усиленным расщеплением белков и белковым обменом во всем организме, и замедленным метаболизмом углеводов. У кахектических пациентов изменения метаболизма углеводов включают непереносимость глюкозы, резистентность к инсулину во всем организме, снижение окисления глюкозы организмом-носителем, усиленный неогенез глюкозы и увеличенный обмен и круговорот глюкозы; все процессы, в которых инсулин играет ключевую роль (Tayek, J Am Coll Nutr 1992).
Авторы настоящего изобретения измеряли МГ по отношению к BMI и обнаружили, что уровни продуцирования МГ в крови имеют значительную обратную корреляцию с BMI пациентов со злокачественными опухолями, но не с BMI нормальных субъектов (см. фиг. 7); и что у пациентов со злокачественными опухолями с BMI ниже чем 18, т.е. у пациентов с прекахектическим или кахектическим синдромом, уровни образования МГ значительно увеличены в сравнении с некахектическими пациентами со злокачественными опухолями (таблица 4). Это обозначает, что измерение МГ у пациентов со злокачественными опухолями может представлять собой полезный инструмент для предсказания или подтверждения диагноза кахексия. Кроме того, у кахектических пациентов со злокачественными опухолями, непереносимость глюкозы и, более конкретно, резистентность к инсулину, представляют собой ранние биохимические события, происходящие задолго до начала потери массы (Tayek et al. J Am Coll Nutr 1992), и у пациентов, теряющих массу, измерение инсулиновой реакции в тесте на толерантность к глюкозе может указывать на резистентность к инсулину в случае высокого показателя инсулин/глюкоза (И/Г) или сниженную секрецию инсулина в случае низкого показателя И/Г (Rofe et al. Anticancer Res 1994). Следовательно, авторы настоящего изобретения измеряли показатель И/Г у пациентов со злокачественными опухолями и у нормальных субъектов в соответствии с уровнем образования МГ и установили, что связанное с кахексией контрольное значение МГ в крови пациентов со злокачественными опухолями составляет 0,2 мкМ, что значит, что при значении МГ 0,2 мкМ пациенты со злокачественными опухолями имеют точно такое же соотношение И/Г, какое измеряли у здоровых субъектов, и что, следовательно, они имеют идентичный уровень резистентности к инсулину и секреции поджелудочной железы (см. фиг. 8).
Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу предсказания, обнаружения и диагностирования кахексии или прекахексии in vitro у субъектов или пациентов со злокачественными опухолями, включающему стадии:
a) определение уровня образования МГ в биологическом образце, получаемом от указанного пациента,
b) сравнение указанного уровня образования МГ с контрольным значением, связанным с МГ при кахексии,
где, если уровень образования МГ в указанном биологическом образце выше, чем указанное контрольное значение, связанное с МГ при кахексии, то указанный пациент входит в кахексию или тяжелую прекахексию и, следовательно, в отсутствие эффективного специфического лечения против кахексии, ему предсказывают краткосрочную выживаемость тогда как если уровень образования МГ в указанном биологическом образце ниже, чем указанное контрольное значение, указанный пациент не входит в кахексию или тяжелую прекахексию и, следовательно, ему предсказывают более пролонгированную выживаемость.
В этом способе указанное контрольное значение МГ определили при сравнении между эволюцией соотношения инсулин/глюкоза (показатель И/Г) у пациентов со злокачественными опухолями и эволюцией показателя И/Г у нормальных субъектов, что делает возможным определение характеристик критической точки для уровня образования МГ, называемой «связанное с кахексией контрольное значение», которую оценили равной приблизительно 0,2 мкМ МГ в крови и выше которой уровень секреции инсулина β-клетками поджелудочной железы является недостаточным, что обозначает, что пациенты со злокачественными опухолями входят в кахексию или тяжелую прекахексию.
То есть приблизительно в 3 раза выше, чем нормальное контрольное значение МГ у здоровых субъектов.
Кроме того, этот способ предсказания можно применять к любым субъектам людям или животным, у которых присутствует злокачественная опухоль.
СПОСОБЫ ИЗМЕРЕНИЯ МЕТИЛГЛИОКСАЛЯ
Прямой анализ/обнаружение МГ in situ в образцах солидных тканей и, более конкретно, опухолей можно выполнять с использованием MALDI-TOF/TOF масс-спектрометрии, которая объединяет ионизацию лазерной десорбцией с использованием матрицы (MALDI) с времяпролетной масс-спектрометрией (TOF).
Процедура, осуществляемая для прямого измерения и анализа МГ in situ в биоптатах солидных тканей и клеточных мазках посредством MALDI-TOF/TOF масс-спектрометрии, описана ниже в «Примерах». В кратком изложении, в случае солидных тканей, перед получением срезов толщиной 12 мкм, солидные ткани сначала замораживают при -80°C и фиксируют с помощью ультрачистой воды во время процедуры в криостате. Затем срезы помещают на специальные пластины для MALDI и обрабатывают этанолом перед обработкой α-фенилендиамином (o-PD). После этого препараты инкубируют во влажной камере в течение ночи при комнатной температуре в темноте, затем сушат (с использованием осушителя) и покрывают матричным раствором α-циано-4-гидроксикоричной кислоты (НССА). Посредством анализа эффекта, который оказывает MALDI-TOF/TOF масс-спектрометрия на 2MQX, авторы изобретения обнаружили, что два молекулярных фрагмента 2MQX, один 91 Да и другой 118 Да, являются наилучшей выбранной сигнатурой МГ, которую можно использовать для того, чтобы обнаруживать и количественно определять МГ в солидных тканях, после использования анализа MS/MS визуализации. Схожую процедуру устанавливали и проводили для обнаружения и измерения внутриклеточного МГ в клеточных мазках. Анализ/обнаружение свободного МГ в образцах жидкости можно осуществлять стандартными средствами, известными в данной области, например, с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (RP-HPLC), тестов ELISA или других способов, которые предложены (см. Ohmori et al. J Chromatogr. 1987; McLellan et al. Anal Biochera 1992; Nemet et al. Clin Biochem 2004; Chaplen et al. Anal Biochem 1996).
В предпочтительном варианте осуществления изобретения, указанные текучие биологические образцы выбирают из цельной крови, сыворотки, плазмы, мочи, плевральных или перитонеальных экссудатов, цереброспинальной жидкости или текучих веществ пищеварительной системы. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, обнаружение встречающегося в природе свободного МГ осуществляют посредством добавления в образец крови производного 1,2-диаминобензола, предпочтительно о-фенилендиамина (o-PD). Реакция между МГ и o-PD в действительности образует хиноксалины, которые представляют собой сильные хромофоры или флуорофоры или и то и другое, легко поддающиеся количественному определению с использованием RP-HPLC. Однако в изобретении также используют 1,2-диамино-4,5-диметоксибензол (DMB, также называемый DDB) в соответствии со способом, описанным McLellan et al. (McLellan et al. Anal Biochem 1992), в котором измеряют получаемый хиноксалин, также посредством RP-HPLC.
Простой способ количественного определения уровня МГ в образце цельной крови приведен далее в экспериментальной части. В этом конкретном варианте осуществления, образец цельной крови берут у субъекта стандартными средствами и незамедлительно помещают на лед перед заморозкой при -80°С до измерения МГ. После размораживания вплоть до температуры процедуры получения производных, образец хранят при 4°C, поскольку МГ очень реакционноспособен и нестабилен. На первой стадии трифторуксусную кислоту (TFA) добавляют в размороженный образец цельной крови для мгновенной преципитации белков. После этого образец центрифугируют при 4°С и извлекают супернатант. На второй стадии получение производных осуществляют посредством добавления o-PD или DMB в супернатант, и указанную смесь хранят в течение 4-6 часов при комнатной температуре (23°С) в темноте. Осуществляют финальное центрифугирование и удаляют супернатант с тем, чтобы проводить анализ с использованием RP-HPLC или газовой хроматографии, соединенной с системой обнаружения, обе они обеспечивают точное количественно определение уровней МГ.
Альтернативно этой процедуре авторы изобретения предлагают усовершенствованный способ упрощения взятия образца и обработки и измерения МГ. В этом альтернативном способе сосуды, уже содержащие TFA, используют для сбора образцов, образцы незамедлительно смешивают посредством переворачивания и хранят при 4°C перед заморозкой при -80°C. Поэтому после размораживания образец можно незамедлительно центрифугировать при 4°C, получать супернатант и получать производные для количественного определения МГ, как указано выше. Измерение МГ также можно осуществлять с использованием количественного твердофазный иммуноферментный сэндвич-анализа («сэндвич» ELISA), основанного на получении специфичных антител к МГ. Получение антител, специфичных к свободному МГ, является ключевым для достоверности этого теста. Коммерчески доступно несколько наборов ELISA для МГ человека.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения антителами, специфичными к МГ, предварительно покрывают микропланшеты. Затем калиброванные образцы вводят в лунки предварительно покрытых микропланшетов, так что свободный МГ, который присутствует в образце, связывается с предварительно нанесенными антителами. После удаления любых несвязанных веществ, непосредственно в лунки добавляют антитела к МГ, конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP). После промывания следует добавление раствора субстрата 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМВ) (конкретный субстрат для используемого конъюгата с ферментом) в каждую лунку. Только лунки, которые содержат МГ, будут менять цвет, что можно измерять посредством спектрофотометрии. Наконец, уровни МГ в образцах определяют посредством сравнения со стандартом. Этот количественный иммуноферментный сэндвич-анализ представляет собой упрощение коммерчески доступных тестов ELISA, с использованием, например, системы конъюгированных с биотином антител, связанных с конъюгированной с авидином HRP. Поскольку достоверность сэндвич-тестов ELISA зависит от специфичности и качества антител против МГ, такие тесты требуют регулярных контрольных проверок с использованием RP-HPLC для каждой новой партии реактивов.
СНИЖЕНИЕ ЛОЖНООТРИЦАТЕЛЬНЫХ И ЛОЖНОПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
По данным, представленным в настоящем документе (см. фиг. 3 и «Примеры»), при измерении МГ в цельной крови пациента со злокачественной опухолью посредством RP-HPLC авторы изобретения оценили возможность ложноотрицательных результатов от 10 до 15% случаев. В таких случаях следует использовать другие способы, такие как способы по изобретению, которые измеряют непосредственно МГ в ткани или клетках. Ложноположительная ошибка может возникать у пациентов с хронической уремией (Nakayama et al. Am J Nephrol 2008) и сахарным диабетом 1-го и 2-го типов, но хроническую уремию и диабет можно легко распознать и диагностировать, и авторы изобретения предложили использование показателя МГ/Г для того, чтобы обнаруживать злокачественную опухоль у диабетических пациентов. Как указано ранее, в дополнение к диабету, AGE связаны со старением и некоторыми незлокачественными возрастными заболеваниями, такими как артериальная гипертензия, избыточный вес/ожирение и болезнь Алыдгеймера. Увеличение уровней МГ обнаружено в стенах артерий и в крови крыс с гипертензией (Wu and Juurlink Hypertension 2002), но не доказано, что пациенты с обыкновенной артериальной гипертензией имеют увеличенные уровни образования МГ в своей крови. Сообщалось о повышенном гликировании белков и уровнях МГ в цереброспинальной жидкости пациентов с болезнью Альцгеймера, но не наблюдали повышения МГ в периферической крови пациентов. Кроме того, обнаружено, что параметры, связанные с конечными продуктами усиленного гликирования, обнаруживаемые в периферической крови пациентов с болезнью Альцгеймера, имеют более низкие значения в сравнении с контролями без слабоумия (Thome J et al. Life Science 1996), и эта находка не указывает на то, что уровни МГ в крови могут быть увеличены у таких пациентов. В действительности, за исключением хронической уремии и сахарного диабета 1-го и 2-го типов, нет данных, подтверждающих присутствие высоких уровней свободного МГ в крови у людей с возрастными заболеваниями, таким как артериальная гипертензия или болезнь Альцгеймера. Кроме того, считается, что у нормальных здоровых субъектов старение не влияет на уровень образования МГ в крови, и возрастные уровни МГ в крови находятся в нормальном диапазоне значений, так что старение само по себе не может служить причиной ложноположительных результатов. Кроме того, не наблюдали какого-либо увеличения уровней образования МГ в крови нескольких пациентов с хроническим воспалительным заболеванием.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к набору для раннего обнаружения и диагностирования злокачественной опухоли, для определения стадии злокачественной опухоли, для предсказания вероятности выживаемости пациентов со злокачественными опухолями, для мониторинга ответа на терапию против злокачественной опухоли и для предсказания и раннего обнаружения кахексии, который содержит:
средство для сбора биологических образцов,
средство для измерения уровней образования МГ,
инструкции для использования указанного набора,
оптимально, контрольный (эталонный) образец.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный набор содержит инструкции и средства для обнаружения и изменения МГ in situ в клеточных мазках или тканях посредством MALDI-TOF/TOF масс-спектрометрии или схожих способов и количественного определения МГ, посредством использования одного из доступных способов:
- химический тест, содержащий o-PD или DMB, 2MQX или DMQ, MQX или DDQ для RP-HPLC анализа во внеклеточных текучих веществах
Для химического теста, указанный набор содержит следующие реактивы:
- трифторуксусная кислота (TFA) для преципитации белков
- о-фенилендиамин (o-PD) или 1,2-диамино-4,5-диметоксибензол (DMB также называемый DDB) для получения производных конкретный хиноксалиновый продукт, соответствующий используемым средствам для получения производных: 2-метилхиноксалин (2-MQX) или 6,7-диметокси-2-метилхиноксалин (DMQ) для калибровочной кривой.
- стандарты, состоящие из хиноксалиновых производных 5-метилхиноксалина (5-MQX) или 6,7-диметокси-2,3-диметил-хиноксалина (DDQ), для внутреннего стандарта.
- Необязательно, химический тест с использованием химических реактивов для MALDI-TOF/TOF масс-спектрометрического анализа для измерения МГ в солидных тканях или клеточных мазках.
- Необязательно, количественный ферментативный иммунологический сэндвич-тест на основе моноклональных или поликлональных антител, специфически распознающих свободный МГ, для измерения МГ во внеклеточных текучих веществах.
В другом предпочтительном варианте осуществления набор по изобретению дополнительно содержит средство для обнаружения уровня образования глюкозы и инструкции для определения показателя МГ/Г на основе ферментативных тестов с глюкозоксидазой или гексокиназой.
Пример 1: Получение образцов солидных тканей и измерение МГ в опухолях
Образцы опухолей получали через 6 недель после пересадки 90 самцам и самкам крыс BD-IX (Charles River, France) опухолеродных клеток злокачественной опухоли ободочной кишки PRO (45 самок и 4 5 самцов, предоставленных Charles River). Перед получением срезов толщиной 12 мкм, опухоли замораживали при -80°С и фиксировали ультрачистой водой во время процедуры в криостате при -20°C. Затем срезы помещали на специальные пластины для MALDI (предоставлены Bruker) и препараты обрабатывали этанолом, затем o-PD (0,01%) (Sigma Aldrich, France), прежде чем инкубировать во влажной камере в течение ночи при комнатной температуре в темноте. После этой инкубации срезы сушили (с использованием осушителя) и покрывали матричным раствором α-циано-4-гидроксикоричной кислоты. (НССА) (предоставлена Sigma Aldrich). Посредством анализа эффекта, оказываемого на 2MQX (2-метилхиноксалин) (предоставлен Sigma Aldrich), с использованием MALDI TOF/TOF масс-спектрометрии (Bruker UltraFlex III), выбрали два молекулярных фрагмента 2MQX, один 91 Да и другой 118 Да, которые делали возможным обнаружение МГ в опухоли после анализа MS/MS визуализации.
Контрольные диапазоны получали следующим образом: использовали внутренний стандарт 5MQX (5-метилхиноксалин) (предоставлен Sigma Aldrich) 0,4 мкМ, который смешивали в этой конечной концентрации с каждой аликвотой 2MQX, полученной в соответствии с диапазоном концентраций, от 0 до 1,6 мкМ. Разведения выполняли с использованием ультрачистой воды. Анализ выполняли с использованием MALDI-TOF/TOF масс-спектрометрии.
Пример 2: Получение образцов внеклеточных текучих веществ и измерение МГ в крови:
Субъекты не должны принимать пищу в течение 8-12 часов перед взятием образцов, поскольку МГ может присутствовать в некоторых продуктах питания и напитках. Образцы крови берут при 4°C, и можно осуществлять анализ цельной крови, поскольку МГ находится в постоянной концентрации в красных клетках крови. Эта возможность происходит из того факта, что в красных клетках крови МГ образуется неферментативно с постоянной скоростью из глицеронфосфата и глицеральдегид-3-фосфата (Thornalley, Biochera 1989).
Способ основан на простой процедуре получения производных, за чем следует газово-хроматографический/масс-спектрометрический (GC/MS) анализ. Подготовку и количественное определение МГ выполняют с использованием способа высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (RP-HPLC), который включает получение производных или с использованием o-PD или DMB, сопряженный с масс-спектрометрическим анализом. В кратком изложении, после центрифугирования цельной крови при 4°C, обработка требует преципитации белков трифторуксусной кислотой (TFA), инкубации супернатанта со средством для получения производных o-PD или DMB в течение 4-6 часов при 23°С в темноте и количественного анализа МГ после его превращения в 2MQX для o-PD или в 6,7-диметокси-2-метилхиноксалин (DMQ) для DMB.
Стандартные растворы получают следующим образом: концентрацию исходного водного раствора МГ определяют ферментативно с помощью анализа конечной концентрации. Количественное определение МГ включает превращение в S-D-лактоилглутатион с помощью глиоксалазы I в присутствии восстановленного глутатиона (GSH). Получают калибровочные стандарты, которые содержат 0,0625-1,6 нмоль МГ в 1 мл воды. Получение производных осуществляют с помощью процедуры, описанной выше. Калибровочные кривые строят посредством нанесения на график отношений площадей пиков для 2MQX и 5MQX (внутренний стандарт) к концентрациям МГ для средства для получения производных o-PD или посредством нанесения на график отношений площадей пиков для DMQ и 6,7-диметокси-2,3-диметил-хиноксалина (DDQ) (внутренний стандарт) к концентрациям МГ для средства для получения производных DMB.
Для того чтобы идентифицировать и определять концентрацию МГ в крови, хиноксалиновые производные 2MQX и 5MQX для o-PD и DMQ и DDQ для DMB разрешают с помощью RP-HPLC и анализируют с помощью ионизации электрораспылением/контроля заданных ионов (ESI/SIM). Наконец, количественное определение МГ осуществляют посредством вычисления отношения площадей пиков для интенсивности протонированного молекулярного ионного пика (m/z 145 для 2MQX и m/z 205 для DMQ) к интенсивности протонированного молекулярного ионного пика внутреннего стандарта (m/z 145 для 5MQX и m/z 218 для DDQ) в режиме контроля заданных ионов (SIM).
Пример 3: Эксперименты in vitro
Измерение образования МГ клетками злокачественной опухоли в сравнении с нормальными клетками выполняли с использованием тканевых культур in vitro. В типичном эксперименте с использованием клеточных культур, образование МГ клетками злокачественной опухоли в кондиционированной среде (КС) клеточной линии карциномы толстой кишки человека НСТ116 выполняли с использованием LC-MS/MS. Клетки культивировали или в условиях низкой глюкозы (5,6 мМ) или в условиях высокой глюкозы (25 мМ) и собирали после 48 часов.
Обнаружено, что образование МГ в КС в 10 раз выше в условиях высокой глюкозы (концентрация МГ 0,05917 мкМ), чем в условиях низкой глюкозы (концентрация МГ 0,00515 мкМ), что показывает, что клетки злокачественной опухоли синтезируют МГ из глюкозы и, таким образом, преимущественно используют гликолиз для продуцирования АТФ.
Дополнительные эксперименты показали, что эта зависимость от дозы касается клеток злокачественных опухолей различных типов; при этом, в силу более низкого потребления глюкозы и гликолиза, нормальные клетки синтезируют и высвобождают меньше МГ.
Пример 4: Эксперименты in vivo
Группу из 101 последовательного пациента со злокачественными опухолями различных типов и локализаций на различных стадиях их заболевания анализировали на присутствие МГ в крови, и уровни, полученные для пациентов со злокачественными опухолями, сравнивали с уровнями, полученными в группе из 36 нормальных контрольных субъектов, которые скорректированы по возрасту и полу, и 12 пациентов с нормогликемическим сахарным диабетом 2-го типа, проходящих терапию, (в дополнение к 6 с сахарным диабетом 2-го типа без терапии, которых использовали в качестве положительного контроля для теста). Критерии включения для пациентов злокачественными опухолями представляли собой патологический диагноз злокачественной опухоли, отсутствие предыдущего лечения, присутствие клинически и/или биологически обнаружимого заболевания, отсутствие сахарного диабета, почечной недостаточности и других хронических заболеваний.
Критерии включения для нормальных контрольных субъектов представляли собой отсутствие злокачественной опухоли, сахарного диабета, артериальной гипертензии, болезни Альцгеймера и почечной недостаточности; для пациентов с инсулинонезависимым диабетом 2 типа, отсутствие осложнений, связанных с диабетом, и для диабетических пациентов, проходящих терапию, гликированный гемоглобин HbAlc ≤7% и нормальная гликемия. Для всех включенных субъектов критерии включения представляли собой отсутствие курения, отсутствие потребления алкоголя и кофе за 24 часа до времени взятия образца, и всех пациентов с сильной табачной и/или алкогольной зависимостью исключали из исследования. BMI, а также измерение глюкозы крови и инсулина последовательно определяли согласно стандартным процедурам у первых 66 включенных пациентов и у всех контрольных субъектов.
Пример 5: Животные модели in vivo
Проводили группу экспериментов с использованием лабораторных животных, в частности, модели индуцированного 1-2 диметилгидразином трансплантабельной злокачественной опухоли ободочной кишки у сингенных крыс BDIX, для которых предварительно отбирали in vitro два клеточных клона карциномы, (DHD-K12/SRb и DH-K12/JSb), чтобы формировать прогрессирующие (PROb) опухоли и регрессирующие (REGb) опухоли, соответственно, при пересадке крысам. В этих экспериментах, образцы крови для измерения МГ и других молекул, таких как глюкоза и инсулин, брали во 2, 3, 4, 6 и 9 недели. Одновременно опухолевые массы измеряли для оценки опухоли. Статистический анализ осуществляли с использованием JMP 7 (SAS Software, NC, USA). Статистическую значимость определяли с использованием точного критерия Фишера и двустороннего критерия Стьюдента.
Опухолью ободочной кишки является аденокарцинома, которую получали от крыс BD-IX через 6 недель после трансплантации опухолеродных клеток злокачественной опухоли ободочной кишки PRO (см. выше). На 1 и 2 на фиг. 2 опухоль четко связана с большой некротической зоной, которая преобладает в ее средней и нижней части. Это, в частности, хорошо подтверждено в 2 на фиг. 2, который соответствует опухоли, окрашенной гематоксилин-эозин-сафраном.
Местоположение МГ в опухоли определяли посредством обнаружения двух молекулярных фрагментов 2MQX, одного 91 Да и другого 118 Да, после анализа MS/MS визуализации посредством MALDI-TOF/TOF. Это позволяло получать изображения опухолей, которые представлены на 3 и 4 на фиг. 2 соответственно.
Изображения на 3 и 4 представляют собой примеры, которые подтверждают, что злокачественные опухоли способны продуцировать МГ в высоких количествах, тогда как анализ нормальных контрольных тканей с использованием этого способа выявлял низкий поддающийся обнаружению МГ или не выявлял его. Как показано на изображениях 3 и 4 на фиг. 2, не было ясно, обнаруживали ли МГ внутри клеток, вне клеток или и там и там. Однако на изображении 3 на фиг. 2 (которое соответствует фрагменту 2MQX 91 Да) количество МГ выглядит менее обильным в некротической зоне опухоли, и при этом оно выглядит наиболее обнаруживаемым в активной пролиферативной части опухоли.
Пример 6: Пациенты со злокачественными опухолями
Результаты в таблице 1 демонстрируют, что средние и крайние значения уровней МГ в крови у пациентов со злокачественными опухолями значительно выше, чем у нормальных контрольных субъектов как мужского, так и женского пола, и у пациентов с нормогликемическим сахарным диабетом 2-го типа, проходящих терапию. Найдены незначительные различия между нормальными субъектами и пациентами с нормогликемическим сахарным диабетом 2-го типа, проходящими терапию, используемыми в качестве контроля.
В дополнение к определению МГ в крови, у пациентов с патологически подтвержденными злокачественными опухолями проспективно и последовательно исследовали глюкозу и инсулин крови перед лечением злокачественной опухоли. Аналогичное исследование выполняли у нормальных субъектов. У пациентов со злокачественными опухолями обнаружили незначительную корреляцию между уровнями МГ в крови и гликемией, тогда как уровни МГ в крови склонны к обратной корреляции с инсулинемией (данные не представлены), что обозначает то, что у пациентов со злокачественными опухолями уровень МГ в крови представляет собой относительно независимый параметр. Незначительный результат найден у нормальных контрольных субъектов. Следовательно, такие данные обозначают то, что обнаружение увеличенного уровня МГ в крови диабетических пациентов, проходящих правильную терапию, т.е. у пациентов с нормальной гликемией и нормализованным HbAlc, может быть обусловлено, как и у здоровых субъектов без диабета, злокачественным исходом.
Следовательно, оправданы систематические измерения МГ у нормогликемических диабетических пациентов, проходящих терапию, поскольку показана значительная связь высокой заболеваемости злокачественными опухолями определенных типов, включая злокачественные опухоли ободочной и прямой кишки, поджелудочной железы, печени, молочной железы и мочевого пузыря, с сахарным диабетом 1-го или 2-го типа.
Результаты в таблице 2 раскрывают сравнение уровней МГ в крови у пациентов со злокачественными опухолями в соответствии с типами опухолей:
В действительности, в сравнении с нормальными контрольными субъектами (и нормогликемические пациенты с диабетом 2 типа, проходящие терапию) уровни МГ в крови значительно увеличены у пациентов, страдающих злокачественными опухолями головы и шеи, легких, молочных желез, предстательной железы, ободочной и прямой кишки, поджелудочной железы и/или других органов пищеварения, и они демонстрируют у этих пациентов различные значения МГ, которые в 1,5-2 раза выше, чем нормальное контрольное значение, в зависимости от типа опухоли. Следует отметить статистически значимое отличие уровня МГ от нормальных контрольных субъектов, полученное для злокачественных опухолей молочных желез и предстательной железы, которые являются наиболее частыми злокачественными опухолями; и выраженные статистически значимые различия в уровне МГ для злокачественных опухолей легких, ободочной и прямой кишки, поджелудочной железы, головы и шеи, для которых в настоящее время не доступны биологические маркеры раннего обнаружения.
Пример 7: Статистически значимая зависимость между уровнями МГ в крови пациентов со злокачественными опухолями и стадиями заболевания
Поскольку хорошо продемонстрировано, что объем опухоли имеет прогностическое значение, уровни МГ в крови при определении стадии можно рассматривать как прогностический индикатор. Кроме того, поскольку авторы изобретения показали, что уровни МГ в крови точно отражают объем опухоли, уровни МГ в крови также представляют собой прогностический индикатор позднее в ходе развития заболевания.
Для злокачественных опухолей in situ (стадия 0) значительные увеличенные уровни МГ в крови отсутствуют в сравнении с нормальным контрольным значением (0,06 мкМ), эта находка подтверждает то, что некоторые злокачественные опухоли на стадии 0 могут не быть метаболически активными, тогда как для злокачественных опухолей на стадиях с I до IV имеет место значительная положительная корреляция (р=0,0109). Это обозначает, что систематическое измерение МГ в крови пациентов со злокачественными опухолями представляет собой эффективный инструмент для диагностирования и определения стадии злокачественной опухоли, а также для прогностической оценки.
Пример 8: уровни МГ в крови и объем опухоли в экспериментах на животных
На фиг. 5 раскрыта динамика уровней МГ в крови крыс BD-IX после трансплантации опухолеродных клеток злокачественной опухоли ободочной кишки PROb, а на фиг. 6 динамика уровней МГ в крови крыс BD-IX после трансплантации неопухолеродных клеток злокачественной опухоли ободочной кишки REGb. Как демонстрируют эти данные, явно имеет место статистически значимая положительная корреляция между уровнями МГ в крови и объемом опухоли у крыс, которым пересаживали опухолевые клетки PROb. В отличие от этого, у крыс, которым трансплантировали опухолевые клетки REGb и у которых трансплантат не может прижиться, уровни МГ в крови, после временного увеличения на 4 неделе после трансплантации, не поддаются дальнейшему обнаружению, что обозначает, что у животных, у которых опухолевый трансплантат не приживается, не подтверждали значительное увеличение количества циркулирующего МГ. Этот эксперимент показывает, что растущие опухоли в значительной мере связаны с более высокими уровнями МГ в крови, чем не растущие опухоли, т.е. что пролиферативные клетки злокачественной опухоли продуцируют и высвобождают более высокие количества циркулирующего МГ, чем непролиферативные злокачественные или нормальные клетки. Это объясняет, почему увеличенные уровни МГ в крови поддаются обнаружению у пациентов со злокачественными опухолями, тогда как у субъектов без злокачественных опухолей, более точно без пролиферативных активных злокачественных опухолей обнаруживают значительно более низкие уровни МГ в крови или даже нулевые уровни МГ в крови.
Пример 9: Средние и крайние значения (в нМ) уровней МГ в крови в соответствии с клиническими ответами, полученными у пациентов со злокачественными опухолями, проходивших лечение
Как указано в таблице 3, лонгитюдные исследования нескольких пациентов, у которых лечили злокачественные опухоли, показали, что пациенты, у которых ответ после лечения злокачественных опухолей клинически оценивали как полный, связаны с нормальными уровнями МГ в крови, тогда как пациенты, которые не отвечали на лечение или имели частичный ответ или стабильное заболевание после лечения, имели сохраняющиеся высокие уровни МГ в крови. Таким образом у пациентов со злокачественными опухолями МГ представляет собой маркер динамики заболевания и терапевтического ответа. Однако несколько пациентов, которых, при использовании в настоящее время доступных биологических маркеров и способов визуализации для оценки ответа, считали отвечающими на лечение полностью, имели все еще поддающиеся обнаружению повышенные уровни МГ в их крови, в дальнейшем эти уровни были связаны с ранним рецидивом опухоли. Эта находка явно подсказывает, что обнаружение МГ у пациентов со злокачественными опухолями, которые проходили лечение, может представлять собой более качественный инструмент для оценки терапевтического ответа опухоли, чем доступные в настоящее время клинические подходы на основе классических биологических маркеров и/или способов визуализации.
Пример 10: показатель МГ/Г в крови пациентов со злокачественными опухолями, нормальных субъектов и пациентов с диабетом 2 типа, проходящих терапию
Как показано на фиг. 4, показатель МГ/Г, который определяли в крови, значительно увеличен почти в два раза у пациентов со злокачественными опухолями в сравнении со здоровыми субъектами и нормогликемическими пациентами с диабетом 2-го типа, проходящими терапию. Этот результат явно указывает на то, что можно отличать диабетических пациентов со злокачественными опухолями (которые имеют высокий показатель МГ/Г) от тех, которые не имеют злокачественных опухолей (которые имеют низкий показатель МГ/Г); несмотря на нарушение регуляции глюкозы у диабетиков, потенциально компрометирующее МГ.
Пример 11: Корреляция между уровнями МГ в крови и BMI у пациентов со злокачественными опухолями и здоровых субъектов
Поскольку показано, что пациенты с избыточным весом/ожирением связаны со значительным увеличением заболеваемости злокачественными опухолями, проводили исследование корреляции между уровнями МГ в крови и BMI у пациентов со злокачественными опухолями в сравнении с нормальными контрольными субъектами.
а. Уровни МГ в крови у пациентов со злокачественными опухолями с избыточным весом или ожирением
Как показано в таблице 4, пациенты со злокачественными опухолями и избыточным весом/ожирением (BMI>25) связаны с более низкими, но все же достаточно высокими уровнями МГ в крови в сравнении с пациентами со злокачественными опухолями, которые имеют нормальный вес (18<BMI<25). Однако в отличие от нормальных субъектов, у пациентов со злокачественными опухолями имеет место статистически значимая обратная корреляция между BMI и уровнями МГ в крови (фиг. 7), что обозначает то, что обнаружение уровня МГ в крови выше, чем 0,1 мкМ у пациентов с избыточным весом или ожирением вероятно обусловлено злокачественной опухолью. Следовательно, оправдано измерение МГ у пациентов с избыточным весом/ожирением.
b. Уровень МГ в крови у прекахектических или кахектических пациентов со злокачественными опухолями
Как показано в таблице 4, пациенты со злокачественными опухолями с BMI ниже 18 (т.е. с недостаточным весом или кахексией) имеют значительно более высокие уровни МГ в крови, чем пациенты с нормальным BMI (18<BMI<25). Также обнаружено, что уровни МГ в крови имеют значительную обратную корреляцию с уровнями альбумина в крови (данные не представлены). Поскольку показано, что гипоальбуминемия связана с кахексией, это, опосредованно, подтверждает, что у пациентов со злокачественными опухолями высокие уровни МГ в крови связаны с кахексией. Этот результат представлен на фиг. 7, на которой, как указано ранее, показано, что уровни МГ в крови у пациентов со злокачественными опухолями имеют значительную обратную корреляцию с BMI (фиг. 7В), тогда как у нормальных субъектов уровни МГ в крови и ВМГ не коррелируют (фиг. 7А).
Поскольку недостаточный вес и кахексия связаны с уменьшенным временем выживаемости, независимо от объема опухоли или присутствия метастазов, эти данные явно подсказывают, что повторное измерение МГ у пациентов со злокачественными опухолями составляет новый инструмент для предсказания и раннего обнаружения кахексии и, следовательно, для объективной оценки прогноза пациента.
Пример 12: Определение связанного с кахексией контрольного значения МГ в крови
При кахексии показатель И/Г увеличен или является нормальным в 25% случаев, соответственно, и снижен в 50% случаев; в зависимости от состояния развития кахексии, чем ниже показатель, тем ниже тяжесть кахексии. В действительности, хорошо известно, что увеличенный показатель И/Г относится к резистентности к инсулину, тогда как сниженный показатель И/Г относится к недостаточной секреции инсулина β-клетками поджелудочной железы. Как показано на фиг. 8, у нормальных субъектов показатель И/Г является постоянным, каким бы не было значение уровней МГ в крови, тогда как у пациентов со злокачественными опухолями он имеет значительную обратную корреляцию с уровнями МГ в крови. На основе предыдущих соображений (см. выше), точка пересечения двух кривых определяет предел, относительно которого показатель И/Г у пациентов со злокачественными опухолями становится ниже, чем у нормальных субъектов. Эта точка пересечения, следовательно, относится к критическому значению МГ, так называемому «связанному с кахексией контрольному значению МГ», выше которого встречается более низкая секреция инсулина у пациентов со злокачественными опухолями, чем у нормальных субъектов, эта находка явно связана с кахексией. Это обозначает, что контрольное значение МГ в крови 0,2 мкМ, которое определено на графике, соответствует предельному значению МГ, выше которого пациенты со злокачественными опухолями входят в кахексию или тяжелую прекахексию (фиг. 8).
Измерение МГ в крови пациентов со злокачественными опухолями выглядит обоснованным для того, чтобы определять уровень резистентности к инсулину в сравнении с секрецией инсулина поджелудочной железой, а также для того, чтобы объективно распознавать вхождение этих пациентов в кахектическое или тяжелое прекахектическое состояние.