СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОБИОТИКОВ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
METHOD FOR OBTAINING PROBIOTICS AND METHODS FOR THEIR USE

Перекрестная ссылка на родственные заявки
Настоящая заявка испрашивает приоритет по дате подачи предварительной заявки США №61/821,990, которая была подана 10 мая 2013 года. Применительно к любой заявке США, которая может истребовать приоритет на основании предварительной заявки США №61/821,990, содержание этой ранее поданной заявки включено посредством ссылки в полном объеме.
Область техники
Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим пробиотические организмы и способы введения этих композиций беременным и кормящим субъектам. Эти способы полезны для лечения инфекции у потомства таких субъектов.
Уровень техники
Несмотря на современные клинические достижения, инфекции продолжают вызывать значительную неонатальную заболеваемость и смертность, особенно у небольших недоношенных новорожденных. По данным Всемирной организации здравоохранения, инфекции, в том числе сепсис, пневмония, столбняк и диарея, составляют примерно 36% от 3,3 млн. смертей новорожденных по всему миру в год. Неонатальная иммунная система является функционально незрелой. Диагностика стиха инфекций у новорожденных может быть сложной, потому что симптомы могут быть слабыми и неспецифическими. Хотя многие инфекции отвечают на антибиотики, задержка в антибиотикотерапии может привести к быстрому прогрессированию инфекции и развитию очень серьезных заболеваний, таких как сепсис новорожденных. Нелеченный неонатальный сепсис - неизменно фатальный. Смертность от сепсиса у детей, получавших антибиотики, находится в пределах от 5% до 60% с наиболее высокими показателями в странах с наименьшим уровнем дохода. Существует постоянная потребность в новых стратегий и средствах для лечения и профилактики инфекций у младенцев.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к способам лечения микробной инфекиии у ребенка кормящей матери, причем способ включает введение эффективного количества композиции, содержащей пищевой продукт для матери, в котором пищевой продукт был ферментирован посредством пробиотической бактерии, Lactobacillus paracasei СВА L74, регистрационный номер в международном депозитарии LMG Р-24778. Бактерия может быть нереплицируемой. Композиция может вводиться внутриутробно, постнатально или внутриутробно и постнатально вплоть до того момента, как младенца отнимают от груди. Способ может дополнительно включать в себя стадию идентификации младенца, нуждающегося в лечении. Микроорганизм может быть Salmonella typhimurium, Cronobacter sakazakii, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Streptococcus pneumoniae Neisseria meningitidis или ротавирусом. Ферментированный пищевой продукт может быть молочным или зерновым продуктом. Также обеспечиваются способы предотвращения или снижения тяжести микробной инфекции у ребенка кормящей матери, причем способ включает введение эффективного количества композиции, содержащей пищевой продукт для матери, в котором пищевой продукт был ферментированным посредством пробиотической бактерии, Lactobacillus paracasei СВА L74, регистрационный номер в международном депозитарии LMG Р-24778. Бактерия может быть нереплицируемой.
Краткое описание чертежей
Эти и другие признаки и преимущества настоящего изобретения будут более полно раскрыты, или станут очевидными посредством нижеследующего подробного описания предпочтительного варианта осуществления изобретения, который должен рассматриваться совместно с прилагаемыми чертежами, на которых одинаковые номера относятся к одинаковым частям и дополнительно где:
Фиг. 1 представляет собой график, изображающий результаты анализа эффекта введения матери риса, ферментированного L. paracasei, штамм СВА L74, на выживаемость потомства, инфицированного Cronobacter sakazakii.
Фиг. 2 представляет собой график, изображающий результаты анализа эффекта введения матери риса, ферментированного L. paracasei, штамм СВА L74, на выживаемость потомства, инфицированного Cronobacter sakazakii.
Фиг. 3 представляет собой график, изображающий результаты анализа эффекта введения матери молока, ферментированного L. paracasei СВА L74, на выживаемость потомства, инфицированного Salmonella typhimurium FB62.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение частично основано на открытии изобретателей о том, что введение пищи, ферментированной посредством пробиотического организма Lactobacillus paracasei, штамма СВА L74, беременным и кормящим животным может уменьшить или смягчить серьезность микробных инфекций у их потомства. Более конкретно, авторы изобретения обнаружили, что введение риса, ферментированного L. paracasei, штамм СВА L74 беременным и кормящим матерям приводило к увеличению процента выживаемости их новорожденных после инфицирования Cronobacter sakazakii. Аналогичным образом, изобретатели также обнаружили, что введение молока, ферментированного L. paracasei, штамм СВА L74 беременным и кормящим матерям приводит к увеличенному проценту выживания их новорожденных после инфицирования Salmonella typhimurium FB62. Таким образом, изобретение представляет способы для уменьшения или ослабления тяжести или профилактики микробных инфекций в организмах новорожденных посредством введения композиции, содержащей пищевые продукты, ферментированные L. paracasei, штамм СВА L74, их матерям. Композиции могут быть введены матери во время беременности, то есть внутриутробно. Альтернативно или в дополнение, эти композиции могут быть введены матери после рождения ребенка, то есть постнатально. В некоторых вариантах осуществления L. paracasei, штамм СВА L74 является нереплицируемым.
Lactobacillus paracasei, штамм СВА L74 изобретатели выделяли и депонировали в соответствии с Будапештским Договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры 9 сентября 2008 года в Бельгийской координационной коллекции микроорганизмов (ВССМ) Laboratorium voor Microbiologic (LMG), Ghent, Belgium. Регистрационный номер выданный международным органом по депонированию является LMG Р-24778. Для удобства прочтения, мы не будем повторять фразу "регистрационный номер LMG Р-24778" в каждом случае. Следует понимать, что когда мы имеем в виду L. paracasei, штамм СВА L74, мы ссылаемся на депонированный штамм, имеющий регистрационный номер LMG Р-24778.
В то время как по нашему мнению мы понимаем определенные события, которые происходят при введении композиций, содержащих или произведенных с помощью ферментации с L. paracasei СВА L74, композиции по настоящему изобретению не ограничиваются теми композициями, которые работают посредством воздействия какого-либо конкретного клеточного механизма.
Композиции
L. paracasei СВА L74
Композиции по настоящему изобретению могут включать пробиотическкн организм L. paracasei СВА L74. Всемирная организация здравоохранения определила пробиотики как: "Живые микроорганизмы, которые при введении в адекватных количествах обеспечивают лечебный эффект хозяину". В некоторых вариантах осуществления L. paracasei СВА L74 могут быть подвергаться обработке, которая делает их нереплицируемыми, например, посредством воздействия тепла, γ-облучения, или УФ-облучения. Нереплицируемая L. paracasei СВА L74 может быть мертвой клеткой или живой клеткой, которая оказалась неспособной к клеточному делению. Нереплицируемая L. paracasei СВА L74 может быть интактной клеткой или клеткой, которая подверглась частичному или полному лизису. В некоторых вариантах осуществления нереплицируемые клетки могут включать смесь интактных и лизированных клеток.
Продукты питания
Композиции по изобретению могут включать физиологически приемлемый носитель. Физиологический носитель может быть пищевым продуктом или фармацевтическим носителем. Мы используем термины "физиологически приемлемые" (или "фармакологически приемлемые") для обозначения молекулярных структур и композиций, которые не продуцируют нежелательные, аллергические или другие нежелательные реакции при введении животному или человеку, в зависимости от конкретного случая. Таким образом, композиции по настоящему изобретению включают пищевые продукты, ферментированные посредством пробиотического организма, L. paracasei СВА L74. Пищевой продукт может включать в себя клетки L. paracasei СВА L74, либо живые, либо нереплицируемые. В некоторых вариантах осуществления пищевой продукт может быть обработан, чтобы удалить все или практически все клетки L. paracasei СВА L74. Любой пищевой продукт, который подлежит ферментации L. paracasei СВА L74, может быть использован. Пищевым продуктом может быть молочный продукт, например, молоко или продукт на основе молока. Примеры источников молока включают, без ограничения, крупный рогатый скот, овец, коз, яков, буйволов, лошадей, ослов, оленей и верблюдов. Независимо от источника, молоко или молочные продукты могут быть в любой форме, подходящей для ферментации посредством L. paracasei СВА L74. Например, молоко может быть цельным молоком или молоком, которое было обработано, чтобы удалить некоторую часть или весь молочный жир, например, 2% молоко, 1% молоко или обезжиренное молоко. Альтернативно или в дополнение, молоко может быть предварительно пастеризовано и гомогенизировано или высушено и восстановлено, концентрированно или сгущено. Также могут быть использованы фракции молочных продуктов, включая казеин, белок молочной сыворотки или лактозу. В некоторых вариантах осуществления молочный продукт может состоять от примерно 1% до примерно 30% порошка восстановленного обезжиренного молока, например, примерно 2%, примерно 5%, примерно 7%, примерно 9%, примерно 10%, примерно 12%, примерно 15%, примерно 20%, примерно 25%, примерно 30% восстановленного сухого обезжиренного молока. Перед ферментацией молочный продукт может быть комбинирован с одним или более из следующего: а) углеводом (например, дисахаридом, таким как декстроза или крахмал; b) липидами; в) витаминами г) минералами. Например, сухое обезжиренное молоко может быть комбинировано с декстрозой до примерно 2%, например, примерно 0,25%, примерно 0,50%, примерно 0,75%, примерно 1,0%, примерно 1,5% или примерно 2,0%.
Пищевой продукт может быть зерновым продуктом, например, рисом, кукурузой, овсом, сорго или просом. В некоторых вариантах осуществления зерновой продукт может быть пшеницей, ячменем, рожью или тритикале. Зерновой продукт может быть из цельного зерна или измельченным в муку. Пищевой продукт может быть одним видом зерновых или смесью двух или нескольких видов зерновых, например, овсяной муки плюс рисовой муки. Зерновые продукты могут быть качества и типа, подходящего для потребления человеком или могут быть продуктами, подходящими для потребления домашними животными. Как правило, продукт из злаков гидратируют перед ферментацией. Концентрация хлопьев может варьироваться, но полезные диапазоны включают от примерно 5% до примерно 50% масса/объем, например, примерно 8% масса/объем, примерно 10% масса/объем, примерно 12% масса/объем, примерно 15% масса/объем, примерно 18% масса/объем, примерно 20% масса/объем, примерно 22% масса/объем, примерно 25% масса/объем, примерно 30% масса/объем, примерно 35% масса/объем, примерно 40% веса/объем, примерно 45% масса/объем или примерно 50% масса/объем. Примерные концентрации включают 15% масса/объем риса или смесь 18,5% масса/объем овсяной муки плюс 5% масса/объем соложеной ячменной муки. рН гидратированных зерновых можно регулировать с помощью любой кислоты, подходящей для усвоения. Кислота может быть, например, органической кислотной. Полезные органические кислоты включают уксусную кислоту, лимонную кислоту, молочную кислоту, адипиновую кислоту, яблочную кислоту и винную кислоту. Любая комбинация из двух или нескольких кислот может быть использована. В некоторых вариантах осуществления значение рН может быть отрегулировано до 4,0 с использованием лимонной кислоты.
Пищевой продукт также может быть растительным или фруктовым продуктом, например, соком, пюре, концентратом, пастой, соусом, соленьем или кетчупом. Примерные овощи и фрукты включают без ограничения, кабачки, например, цукини, желтый сквош, тыкву, тыкву крупноплодную; картофель, спаржу, брокколи, брюссельскую капусту, бобы, например, зеленые бобы, восковую фасоль, фасоль, конские бобы, соевые бобы, капусту, морковь, цветную капусту, огурцы, кольраби, лук-порей, зеленый лук, лук, сахарный горох, английский горох, перец, репу, брюкву, помидоры, яблоки, груши, персики, сливы, клубнику, малину, ежевику, чернику, бруснику, бойзенову ягоду, крыжовник, виноград, смородину, апельсины, лимоны, грейпфруты, бананы, манго, киви и карамболу.
Пищевой продукт также может быть "молоком", изготовленным из орехов или бобовых, например, соевое молоко или миндальное молоко.
Рассматриваются также пищевые продукты, содержащие белки животного происхождения, например, мясо, например, колбасы, обезвоженное мясо, рыба и сушеные рыбные продукты.
Независимо от типа пищевого продукта, который используется, продукт комбинируется с L. paracasei СВА L74 и инкубируется при температуре и в течение времени, достаточного для того, чтобы произошла ферментация. Может быть использован любой стандартный способ ферментации, известный в данной области техники. Конкретные условия ферментации будут варьироваться в зависимости от многих факторов, в том числе, например, от типа пищевого продукта, концентрации пищевого продукта, оборудования, которое используется, объема образца, начальной концентрации инокулята L. paracasei СВА L74, наличия, если таковой имеется, дополнительного инокулята, органолептических свойств ферментированной пищи, и предназначения использования ферментированной пищи.
Как оборудование, так и субстрат (т.е. пищевой продукт, который должен быть ферментирован) стерилизуют перед посевом L. paracasei СВА L74, чтобы уменьшить уровень или удалить жизнеспособные бактерии и/или грибки и/или инфекционные вирусы. Оборудование может быть стерилизовано с использованием стандартных методов или в соответствии с инструкциями изготовителя. Выбор конкретного метода для стерилизации субстрата будет зависеть, частично, от стабильности субстрата к способу стерилизации. Например, субстрат может быть стерилизован паром под давлением, например в автоклаве, посредством повторяющихся циклов нагревания и охлаждения (например, тиндализацией) посредством воздействия высоких давлений (например, паскализацией), ультрафильтрацией или посредством излучения (например, воздействием гамма-, рентгеновского излучения, электронного пучка и/или ультра-фиолетового излучения (длина волны от 10 нм до 320 нм, например, от 50 нм до 320 нм, от 100 нм до 320 нм, от 150 нм до 320 нм, от 180 нм до 320 нм или от 200 нм до 300 нм). Аликвоты субстрата могут быть отоюраны после обработки и высеваться на подходящей среде для подтверждения отсутствия бактериальных и/или грибковых контаминантов. Если субстрат стерилизуют при высоких температурах, его следует охладить до по меньшей мере 37°C перед инокуляцией L. paracasei СВА L74.
6
6
6
6
6
6
6
8
9
2
Субстрат может быть инокулирован L. paracasei СВА L74 в соответствии со стандартными методами, например, из свежей жидкой культуры или лиофилизированной культуры, которую ресуспендируют в водной среде в течение короткого времени перед посевом. В целом, L. paracasei СВА L74 добавляют в концентрации от примерно 0,5×10 до примерно 1×10 КОЕ/мл субстрата, например, примерно 1×10 КОЕ/мл, примерно 2×10 КОЕ/мл, примерно 5×10 КОЕ/мл, 7×10 КОЕ/мл 8×10 КОЕ/мл. Культуру необходимо достаточно перемешивать для получения относительно равномерного распределения бактерий и субстрата, но не чрезмерно, так как L. paracasei СВА L74 является анаэробной бактерией. Например, пять литров культуры можно перемешивать при примерно 150 оборотов в минуту. Температура ферментации, как правило, составляет 37°C. Различные параметры, например, рН, парциальное давление О, скорость мешалки, температуру, перемешивание газа, уровень пены и концентрацию субстрата можно контролировать во время ферментации и соответствующим образом корректировать. Рост L. paracasei СВА L74 можно контролировать с помощью стандартных микробиологических методов. Ферментацию проводят до тех пор, пока концентрация L. paracasei СВА L74 не станет примерно между примерно 10/мл и примерно 10/мл. В зависимости от субстрата и других условий, эта концентрация может быть достигнута через от около 10 до около 30 часов после инокуляции, например, через примерно 12 часов, примерно 15 часов, примерно 18 часов, примерно 24 часов, примерно 30 часов.
Образцы субстрата можно анализировать до, во время и после ферментации для обеспечения качества с использованием стандартных микробиологических методов: Примерные способы включают, но не ограничиваются этим, рост на агаре Рогоза для L. paracasei СВА L74, рост посевом на чашках Петри для определение количества микроорганизмов (PCA) на аэробы, рост на агаре Мак-Конки для бактерий группы кишечной палочки, рост на усиленном клостридиальном агаре (RCM) для клостридий. В дополнение к подсчету колоний, можно наблюдать морфологию колонии по сравнению с контрольными образцами.
4
5
8
8
В некоторых вариантах осуществления может быть добавлен дополнительный инокулят вместе с L. paracasei СВА L74, чтобы помочь инициировать ферментацию. Полезные дополнительные посевные материалы для ферментации молочных продуктов включают в себя, например, без ограничения, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus salivarious, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei, Lactobacillus lactis, Lactobacillus delbrueckii, subsp. Bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis или Leuconostoc mesenteroides. В общем, концентрация дополнительного инокулята будет ниже, чем у L. paracasei СВА L74, например, примерно 1×10/мл ×10/мл. Конечная концентрация S. thermophilus может варьироваться от примерно 0,5×10/мл до примерно 2,5×10/мл.
После того, как были достигнуты подходящие концентрации L. paracasei СВА L74, ферментированный пищевой продукт может быть дополнительно обработан для использования. В некоторых вариантах осуществления ферментированный пищевой продукт можно фракционировать, чтобы удалить все или по существу все клетки L. paracasei СВА L74. В некоторых вариантах осуществления значение рН ферментированного пищевого продукта можно регулировать, например, от примерно 3,0 до близкого к нейтральному, например, 6,5, посредством добавления NaOH или КОН. В некоторых вариантах осуществления ферментированный пищевой продукт можно высушить. Полученный ферментированный продукт питания может быть высушен любым способом, известным в данной области техники, который не приведет к потери иммуномодулирующих свойств ферментированной пищи. Примеры способов сушки включают сушку распылением, сублимационную сушку, например лиофилизацию или барабанную сушку. Конечное содержание воды в ферментированном пищевом продукте может изменяться, но может быть от примерно 1% до примерно 10% или более. В некоторых вариантах осуществления, процесс сушки может приводить L. paracasei СВА L74 в нереплицируемое состояние.
2
12
7
12
7
8
8
9
9
10
10
11
11
Высушенные ферментированные продукты питания могут быть гидратированы перед использованием. В зависимости от количества жидкости, используемой для гидратации, ферментированные пищевые продукты могут содержать; эквивалент примерно 10 и 10 КОЕ/мл L. paracasei СВА L74. Высушенный L. paracasei СВА L74 не образует колоний, поэтому понятно, что это количество рассчитано на основании количества живых бактерий, которые присутствовали в ферментированных пищевых продуктов перед стадией сушки. В некоторых вариантах осуществления ферментированные пищевые продукты могут включать эквивалент от около 10 до около 10 КОЕ/г, например, примерно 5×10 КОЕ/г, примерно 1×10 КОЕ/г, примерно 5×10 КОЕ/г, примерно 1×10 КОЕ/г, примерно 5×10 КОЕ/г, примерно 1×10 КОЕ/г, примерно 5×10 КОЕ/г, примерно 1×10 КОЕ/г, примерно 5×10 КОЕ/г сухой массы.
Два или несколько ферментированных продуктов, полученных посредством способов по изобретению могут быть объединены перед введением. Например, ферментированные кисломолочные продукты могут быть объединены с ферментированными зерновыми продуктами. В качестве альтернативы, ферментированный пищевой продукт может быть объединен с другими пищевыми продуктами, например, неферментированными пищевыми продуктами или пищевыми продуктами, ферментированными с использованием других бактериальных штаммов. Любая комбинация может быть использована при условии, что сохраняется воздействие на глиадиновые пептиды ферментированного пищевого продукта. Примерные продукты питания включают в себя, без ограничения, молочные продукты, например молоко, йогурт, творог, сыр и сырные продукты на основе ферментированного молока, кисломолочные продукты, продукты, основанные на кисломолочном брожении, продукты, основанные на порошковом молоке, продукты для детей, протертая пища для детей на основе молока, мороженое, холодный десерт, пудинги, супы, соусы, пюре или заливка, пищевые рецептуры для пожилых людей; крупяные продукты, например, паблум, протертая пища для детей на зерновой основе, овсянка, фарина, манная крупа, полента, макаронные изделия, печенье, крекеры, энергетические батончики; растительные продукты, например, пюре, протертая пища для детей на основе овощей, марин генные овощи, включая огурцы, капусту, морковь, фасоль, сладкий перец или релиши; фруктовые продукты, например, протертая пища для детей на основе фруктов, томатные продукты, пюре, соусы, пасты, кетчупы, фруктовые пюре; или продукты на основе белков, например, бобовые, сосиски, колбасы, хот-доги или протертое мясо. В некоторых вариантах осуществления ферментированный пищевой продукт может быть комбинирован с кормами для питомцев или кормами для животных.
Фармацевтические композиции
Композиции, описанные в настоящем изобретении, могут быть объединены с фармацевтически приемлемым носителем. Термин "фармацевтически приемлемый носитель", как он использован в настоящем изобретении, включает все без исключения растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные агенты, изотонические агенты и агенты, задерживающие всасывание, буферы, вспомогательные вещества, связующие вещества, смазывающие вещества, гели, поверхностно-активные вещества и т.п., которые могут быть использованы в качестве среды для фармацевтически приемлемых веществ.
Таким образом, настоящее изобретение также включает фармацевтические композиции, которые содержат в качестве активного ингредиента L. paracasei СВА L74 или один или несколько метаболитов, продуцируемых L. paracasei СВА L74, описанных в настоящем изобретении, в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями. В некоторых вариантах осуществления L. paracasei СВА L74 может быть стерилизовано с использованием обычных методик стерилизации, до или после того, как осуществиться объединение с фармацевтически приемлемым носителем. При изготовлении композиций по данному изобретению L. paracasei СВА L74 или один или нескольких метаболитов, продуцируемых L. paracasei СВА L74, обычно смешивают с вспомогательным веществом, разбавляют вспомогательным веществом или заключают в таком носителе в форме, например, капсулы, таблетки, саше, бумаги или в другого контейнера. Когда вспомогательное вещество служит в качестве разбавителя, оно может быть твердым, полутвердым или жидким материалом, (например, физиологическим раствором), которое действует как растворитель, носитель или среда для активного ингредиента. Таким образом, композиции могут быть в форме таблеток, пилюль, порошков, лепешек, облаток, эликсиров, суспензий, эмульсий, растворов сиропов, аэрозолей (в виде твердого вещества или в жидкой среде), мазей, мягких и твердых желатиновых капсул, суппозиториев, стерильных растворов для инъекций и стерильных упакованных порошков. Как известно в данной области техники, тип разбавителя может варьироваться в зависимости от предполагаемого пути введения. Полученные композиции могут включать дополнительные вещества, такие как консерванты. Вспомогательное вещество или носитель выбирают на основании режима и способа введения. Подходящие фармацевтические носители, а также фармацевтические принадлежности для использования в фармацевтических композициях, описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences (Е.W. Martin), хорошо известномй основополагающем тексте в этой области техники, и в USP/NF (Фармакопея США и Национальный формуляр). Некоторые примеры подходящих вспомогательных веществ включают лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, крахмалы, аравийскую камедь, фосфат кальция, альгинаты, трагакант, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, воду, сироп и метилцеллюлозу. Композиции могут дополнительно включать: смазывающие агенты, такие как тальк, стеарат магния и минеральное масло; смачивающие агенты; эмульгирующие и суспендирующие агенты; консерванты, такие как метил- и пропилгидроксибензоаты; подсластители и ароматизаторы. Фармацевтические композиции могут быть приготовлены таким образом, чтобы обеспечить быстрое, длительное или замедленное высвобождение активного ингредиента после введения пациенту с использованием процедур, известных в данной области техники.
Фармацевтически приемлемые композиции для использования в способах настоящего изобретения, в том числе такие, в которых L. paracasei СВА L74 или один или несколько метаболитов, продуцируемых L. paracasei СВА L74, захватываются в коллоид для пероральной доставки, могут быть получены в соответствии с стандартными методиками. L. paracasei СВА L74 или один или несколько метаболитов, продуцируемых L. paracasei СВА L74, могут быть высушены и компактизированы посредством дробления или измельчения в порошок и заключением в капсулу для пероральнохо введения. В некоторых вариантах осуществления L. paracasei СВА L74 или один или несколько метаболитов, продуцируемых L. paracasei СВА L74, могут быть скомбинированы с один или несколько вспомогательными веществами, например, разрыхлителем, наполнителем, скользящим веществом или консервантом. Подходящие капсулы включают как твердые капсулы, так мягкие капсулы. Любой коллоид на основе липидов или на основе полимера может быть использован для формирования капсулы. Примерные полимеры, используемые для коллоидных препаратов, включают желатин, полисахариды растений или их производные, такие как каррагинаны и модифицированные формы крахмала и целлюлозы, например, гипромеллозу. При необходимости другие ингредиенты могут быть добавлены в раствор гелеобразующего агента, например пластификаторы, такие как глицерин и/или сорбит для уменьшения жесткости капсулы, красители, консерванты, разрыхлители, лубриканты и обработка поверхности. В некоторых вариантах осуществления капсула не содержит желатин. В других вариантах осуществления капсула не содержит растительных полисахаридов или их производных.
Независимо от их первоначального источника или способа, которым они получены, в L. paracasei СВА L74 или один или несколько метаболитов, продуцируемых L. paracasei СВА L74, могут быть сформулированы в соответствии с их использованием. Эти композиции могут быть получены способом, хорошо известным в фармацевтической области техники, и могут быть введены различными способами в зависимости от того, требуется ли местное или системное лечение, и от области, подлежащей обработке Введение может быть пероральным или местным (включая офтальмологические и на слизистые оболочки, включая интраназальное, вагинальное и ректальное введение). В некоторых вариантах осуществления введение может быть через легкие (например, посредством ингаляции или инсуффляции порошков или аэрозолей, в том числе с помощью небулайзера; интратрахеальное, интраназальное, эпидермальное и трансдермальное) или интраокулярное. Методы для интраокулярной доставки могут включать в себя местное введение (глазные капли), субконъюнктивальную, периокулярную или интравитреальную инъекцию или введение посредством баллонного катетера или офтальмологических вставок, помещаемых хирургическим путем в конъюнктивальный мешок. Парентеральное введение включает внутривенную, внутриартериальную, внутрибрюшинную, подкожную или внутримышечную инъекцию или инфузию; или внутричерепное, например, интратекальное или интравентрикулярное введение. Парентеральное введение может быть в виде единственного болюса, или может быть, например, введено посредством непрерывного перфузионного насоса. Фармацевтические композиции и лекарственные формы для местного применения могут включать трансдермальные пластыри, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, суппозитории, спреи, жидкости, порошки и тому подобное. Обычные фармацевтические носители, водные, порошковые или масляные основы, загустители и т.п. могут быть необходимыми или желательными.
Композиции могут быть приготовлены в виде единичной дозированной формы, причем каждая доза содержит, например, от около 0,005 мг до около 2000 мг L. paracasei СВА L74 или одного или нескольких метаболитов, продуцируемых L. paracasei СВА L74, в суточной дозе.
Термин "единичные дозированные формы" относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве единичных доз для человека и других млекопитающих, причем каждая единица содержит заданное количество активного материала, рассчитанное на получение желаемого терапевтического эффекта, в сочетании с подходящим фармацевтическим вспомогательным веществом. Для получения твердых композиций, таких как таблетки, основной активный ингредиент смешивают с фармацевтическим вспомогательным веществом с образованием твердой композиции до придания ей лекарственной формы, содержащей гомогенную смесь соединения по настоящему изобретению. Когда говорится об этих композициях, как о гомогенных, активный ингредиент обычно равномерно распределяют по всей композиции до придания ей лекарственной формы, так что композицию можно легко разделить на равно эффективные единичные дозированные формы, такие как таблетки, пилюли и капсулы. Эту твердую композицию до придания ей лекарственной формы затем делят единичные дозированные формы описанного выше типа, содержащие от, например, 0,005 мг до около 1000 мг L. paracasei СВА L74 или одного или нескольких метаболитов, продуцируемых L. paracasei СВА L74 по настоящему изобретению.
Композиции могут быть приготовлены в виде единичной дозированной формы, причем каждая доза содержит, например, от примерно 0,1 мг до примерно 50 мг, от примерно 0,1 мг до примерно 40 мг, от примерно 0,1 мг до примерно 20 мг, от примерно 0,1 мг до примерно 10 мг, от примерно 0,2 мг до примерно 20 мг, от примерно 0,3 мг до примерно 15 мг, от примерно 0,4 мг до примерно 10 мг, от примерно 0,5 мг до примерно 1 мг; от примерно 0,5 мг до примерно 100 мг, от примерно 0,5 мг до примерно 50 мг, от примерно 0,5 мг до примерно 30 мг, от примерно 0,5 мг до примерно 20 мг, от примерно 0,5 мг до примерно 10 мг, от примерно 0,5 мг до примерно 5 мг; от примерно 1 мг до примерно из 50 мг, от примерно 1 мг до примерно 30 мг, от примерно 1 мг до примерно 20 мг, от примерно 1 мг до примерно 10 мг, от примерно 1 мг до примерно 5 мг; от примерно 5 мг до примерно 50 мг, от примерно 5 мг до примерно 20 мг, от примерно 5 мг до примерно 10 мг; от примерно 10 мг до примерно 100 мг, от примерно 20 мг до примерно 200 мг, от примерно 30 мг до примерно 150 мг, от примерно 40 мг до примерно 100 мг, от примерно 50 мг до примерно 100 мг активного ингредиента.
В некоторых вариантах осуществления таблетки или пилюли по настоящему изобретению могут быть покрыты или иным образом компаундированы, чтобы обеспечить лекарственную форму, предоставляющую преимущества пролонгированного действия. Например, таблетка или пилюля может содержать внутренний дозированный и внешний дозированный компонент, причем последний в виде оболочки над первым. Два компонента могут быть разделены кишечнорастворимым слоем, который обеспечивает устойчивость к дезинтеграции в желудке и позволяет внутреннему компоненту проходить неповрежденным в двенадцатиперстную кишку или задержать в высвобождение. Множество материалов может быть использовано для таких кишечнорастворимых слоев или покрытий, причем такие материалы включают ряд полимерных кислот и смесей полимерных кислот с такими материалами, как шеллак, цетиловый спирт и ацетат целлюлозы.
Жидкие формы, в которые композиции по настоящему изобретению могут быть включены для перорального введения или путем инъекции, включают водные растворы, соответствующим образом ароматизированные сиропы, водные или масляные суспензии и ароматизированные эмульсии с пищевыми маслами, такими как хлопковое масло, кунжутное масло, кокосовое масло или арахисовое масло, а также эликсиры и подобные фармацевтические носители.
Пропорция или концентрация композиции по изобретению в фармацевтической композиции может варьироваться в зависимости от целого ряда факторов, включая дозировки, химические характеристики (например, гидрофобность) и способ введения. Например, L. paracasei СВА L74 или один или несколько метаболитов, продуцируемых L. paracasei СВА L74, согласно изобретению могут обеспечиваться в виде капсулы, содержащей от примерно 0,005 мг грамм до примерно 1000 мг для перорального введения.
В некоторых вариантах осуществления композиции могут включать в себя ферментаты L. paracasei СВА L74, из которых все или по существу все из клеток L. paracasei СВА L74 были удалены. Способы отделения клеток от питательной среды хорошо известны в данной области техники и могут опираться на физические методы, например, центрифугирование, для получения клеточной массы и культурального супернатанта, фильтрацию, ультрафильтрацию, тангенциальную проточную фильтрацию, простую фильтрацию или обратного осмоса. Альтернативно или в дополнение, способ разделения может быть основан на взаимодействии с лигандом и включает, например, антитело, которое специфически связывается с L. paracasei СВА L74. Антитело может быть соединено с твердой подложкой, такой как магнитный шарик.
Композиции включают один или несколько метаболитов L. paracasei СВА L74, то есть любое вещество, продуцируемое L. paracasei СВА L74. Метаболит может быть кодироваться с помощью одного или несколько генов, или он может образовываться с помощью ферментативной активности одного или нескольких генных продуктов. Метаболиты включают, например, низкомолекулярные вещества, например, аминокислоты, нуклеозиды, нуклеотиды, а также более крупные полимерные структуры, такие как полипептиды, углеводы, нуклеиновые кислоты, липиды и протеогликаны. Метаболит может быть первичным метаболитом, например, метаболитом, принимающим непосредственное участие в нормальной функции клеток, или вторичным метаболитом, например, метаболитом, обычно, не требующимся для основных клеточных функций. Метаболит может также включать любое метаболическое промежуточное соединение, генерируемое в процессе синтеза первичного или вторичного метаболита. Промежуточные вещества могут включать, но не ограничиваются этим промежуточные вещества Эмбден-Мейергофа, пентозофосфатного (пентозо-Ф) путей, пути Энтнер-Дудорова, цикла лимонной кислоты, и биосинтеза аминокислот.
Примеры первичных метаболитов включают, без ограничения, спирты, например, этанол, метанол, бутанол; аминокислоты, например, лизин, аргинин, орнитин, гистидин, цитруллин, изолейцин, аланин, валин, лейцин, глицин, треонин, серии, пролин, фенилаланин, тирозин, триптофан, цистеин, цистин, метионин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, глутамин и аспарагин; нуклеотиды, например, 5'-гуаниловую кислоту; антиоксиданты, например, изоаскорбиновую кислоту; органические кислоты, например, уксусную кислоту, молочную кислоту, лимонную кислоту; витамины, например, витамин В12; сахара, жирные кислоты.
Метаболит также может быть вторичным метаболитом. Вторичные метаболиты, как правило, метаболиты, которые не требуются для основных клеточных функций. Вторичные метаболиты могут варьироваться в широких пределах; примерные вторичные метаболиты включают антибиотики, гормоны, флавоноиды, терпеноиды, алкалоиды, фенилпропаноиды, фенильные производные, производные гексанола, кумарины, стильбены, циангидрины, глюкозинолаты, стерины и сапонины.
Лактобактерии обычно производят следующие метаболиты в процессе ферментации молочных продуктов: молочную кислоту/лактат, ацетат, этанол, формиат, ацетальдегид, α-ацетолактат, ацетоин, диацетил и 2,3-бутиленгликоль (бутан диол) в процессе ферментации молочных продуктов. Ферментацией может быть любой процесс, 6 котором микроорганизм вызывает разложение или способствует разложению сложного органического вещества на более простые вещества.
Метаболит L. paracasei СВА L74 может содержаться в среде, в ферментатах или культуральных супернатантах. В некоторых вариантах осуществления, метаболит может быть частично или по существу полностью изолирован из среды, ферментата или культуральных супернатантов. Методы выделения метаболитов будут варьироваться в зависимости от структуры и химии конкретного метаболита. Частично или по существу полностью изолированный метаболит сохраняет функциональную активность, то есть способность придавать терапевтическое действие у потомства при введении кормящей матери потомства. Стандартные известные в данной области техники способы могут быть использованы для выделения и характеризации метаболитов L. paracasei СВА L74: Примерные способы включают, например, анализ стабильности, например, устойчивость к нагреванию, рН и/или ферментативную активность; хроматографический анализ, например, гель-хроматографию, высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), газовую хроматографию, тонкослойную хроматографию, ионообменную хроматографию, аффинную хроматографию, хроматографию на обращенной фазе; масс-спектрометрию.
Применение
Композиции и способы, раскрытые в настоящем изобретении, как правило, и по-разному полезны для лечения или для уменьшения тяжести микробных инфекций у младенцев при введении кормящим матерям этих младенцев. Композиции могут быть введены матери внутриутробно, то есть до рождения ребенка или постнатально, то есть после рождения ребенка, или как внутриутробно, то есть, до рождения ребенка, так и постнатально, то есть после рождения ребенка. Субъекты, для которых такое лечение полезно, включают нормальные доношенные младенцы, а также преждевременно новорожденные, досрочно или маловесные новорожденные.
Настоящее изобретение этим нисколько не ограничивается однако, и приведенные способы могут быть использованы для лечения и профилактике инфекций у младенцев на грудном вскармливании любого возраста, например, 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 30-дневного возраста; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 или 12 месячного возраста; или 1, 2, 3 или примерно 4 летнего возраста или до тех пор, пока ребенка не отнимут от груди. Эти способы применимы как к врожденным инфекциям, т.е. инфекциям, приобретенным в период внутриутробного развития, так и неонатальным инфекциям, т.е. инфекциям, приобретенным пренатально, или вскоре после рождения. Микробная инфекция может включать в себя инфекцию, вызванную бактерией, вирусом, простейшими или грибком; Врожденные инфекции обычно являются результатом трансплацентарной передачи и проявляются пренатально, интранатально или сразу после родов. Обычные врожденные инфекционные агенты включают Viridans streptococci и S. agalactiae. Инфекции новорожденных обычно приобретаются как восходящие инфекции из родового канала, или через внешнюю среду или через грудное молоко. Такие инфекции, проявляются во время послеродового периода, например, в течение примерно месяца после рождения. Обычные неонатальные инфекционные агенты включают, например, Viridans streptococci, S. agalactiae и другие стрептококки группы В, Cronobacter sakazakii, Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Klebsiella spp., Listeria monocytogenes, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Yersinia, Shigella, Clostridium и Helicobacter pylori. В некоторых вариантах осуществлений инфекционный агент может быть вирусом, например, ротавирусом, вирусом краснухи, цитомегаловирусом или вирусом герпеса. В некоторых вариантах осуществления инфекционным агентом могут быть простейшие, например, Entamoeba histolytica, Cryptosporidium spp, Campylobacter spp. или Toxoplasma spp. В некоторых вариантах осуществления инфекционным агентом может быть грибок, например, Candida spp., например, С. albicans или С. parapsilosis или Malassezia, Zygomycetes или Aspergillus. Субъект, например, потомство кормящей матери, получающей пищевой продукт или фармацевтическую композицию, содержащие L. paracasei СВА L74, описанные в настоящем изобретении, эффективно вылечивается, когда достигается клинически полезный результат. Это может означать, например, полное разрешение симптомов, связанных с инфекцией, уменьшение тяжести симптомов, связанных с инфекцией, или замедление прогрессирования симптомов, связанных с инфекцией. Эти способы могут дополнительно включать в себя следующие этапы: а) идентификацию субъекта (например, пациента и, более конкретно, пациента - человека), который имеет инфекцию; и b) обеспечение кормящей матери пациента композицией, содержащей описанные в настоящем изобретении L. paracasei СВА L74, такой как любой ферментированный пищевой продукт, или композицией, содержащей L. paracasei СВА L74 в физиологически приемлемом носителе. Количество такой композиции, обеспечиваемое кормящей матери, которое приводит к полному разрешению симптомов младенца, связанных с инфекцией, уменьшению тяжести симптомов, связанных с инфекцией, или замедление прогрессирования симптомов, связанных с инфекцией, считается терапевтически эффективным количеством. Настоящие способы также могут включать в себя этап мониторинга для оптимизации дозирования и планирования, а также прогнозирование исхода.
Способы, раскрытые в настоящем изобретении, могут быть применены к широкому кругу видов, например, людям, нечеловекообразным приматам, (например, обезьянам), лошадям, свиньям, коровам или другим животным, собакам, кошкам и другим млекопитающим, содержащимся в качестве домашних животных, крысам, мышам или другим лабораторным животным. Описанные в настоящем изобретении композиции могут быть использованы в терапевтических композициях и схемах или для изготовления лекарственного средства для применения для лечения состояний, как описано в настоящем изобретении (например, у новорожденных или с врожденной инфекцией). Пищевые композиции, описанные в настоящем изобретении, могут вводиться перорально в рамках обычного ежедневного рациона беременной или кормящей матери. При составлении фармацевтических препаратов, композиции могут вводиться в любую часть тела хозяина для последующей доставки в клетку-мишень. Композиция может доставляться, без ограничения, в мозг, в спинномозговую жидкость, в суставы, в слизистую оболочку носа, в кровь, в легкие, в кишечник, в мышечные ткани, в кожу или в брюшную полость млекопитающего. С точки способов введения композиция может вводиться посредством внутривенной, внутричерепной, внутрибрюшинной, внутримышечной, подкожной, внутримышечной, ректальной, интравагинальной, интратекальной, внутритрахиальной, внутрикожной или чрескожной инъекции, посредством перорального или интраназального введения, или посредством постепенной перфузии в на протяжении определенного времени. В дополнительном примере может быть предоставлен аэрозольный препарат композиции, который вводится посредством ингаляции.
Независимо от того, готовят ли композиции в виде пищевых продуктов или в качестве лекарственных средств, требуемые дозы будут зависеть от способа введения, характера лекарственной формы, размера матери, массы, площади поверхности, возраста и пола, других вводимых препаратов и решений лечащего клинициста. Приемлемые дозы лежат в интервале 0,01-1000 мг/кг. Некоторые типичные диапазоны доз находятся в пределах от 1 мкг/кг до 1 г/кг массы тела в день. В некоторых вариантах осуществления диапазон доз составляет от около 0,01 мг/кг до около 100 мг/кг массы тела в день. В некоторых вариантах осуществления, доза может быть, например, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 5 мг/кг, 10 мг/кг, 20 мг/кг, 50 мг/кг или 100 мг/кг. Дозировка может зависеть от таких переменных, как тип и степень прогрессирования заболевания или расстройства, общего состояния здоровья конкретного пациента, относительной биологической эффективности выбранного соединения, состав вспомогательных веществ и способ его введения. Эффективные дозы могут быть экстраполированы из кривых доза-ответ, полученных в тест-системах in vitro или в животной модели. Например, анализ in vitro функционирования иммунной системы, например, продукции цитокинов мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) может быть полезен для количественного анализа про- и противовоспалительных реакций, например, секреции IL-1 (3, IL-12 IL-4, ФНО-α. или IL-10, соответственно. Композиции также могут быть проанализированы на эффекты в животных моделях, например, выживаемость в модели инфекционных систем, например с С. sakazakii или S. typhimurium или других показателей функционирования иммунной системы, например, продукцию IgA, продукцию цитокинов эксплантов Пейеровых бляшек, и ответов дендритных клеток и Т-клеток.
Широкие вариации в необходимой дозировке следует ожидать с учетом различных клеточных мишеней и различных эффективностей различных способов введения. Различия в этих дозах могут быть скорректированы с использованием стандартных эмпирических процедур для оптимизации, как хорошо известно в данной области техники. Введений может быть один раз или несколько (например, 2- или 3-, 4-, 6-, 8-, 10 -, 20-, 50-, 100-, 150-кратное или больше).
Инкапсуляция соединений в подходящем носителе для доставки (например, в полимерных микрочастицах или имплантируемых устройствах) может повысить эффективность доставки.
Продолжительность лечения любой композицией, предложенной в настоящем изобретении, также может варьироваться. Введение композиций может начаться во время беременности и продолжаться после родов до тех пор, пока потомство не отнимут от груди. Кроме того, введение может быть прекращено после рождения или введение может начаться в любое время после рождения потомства и продолжаться, пока потомство не отнимут от груди. Следует также отметить, что частота лечения может быть переменной. Например, композиции по настоящему изобретению можно вводить один раз (Или два раза, три раза, и т.д.), ежедневно, еженедельно, ежемесячно. Когда композиции готовят в виде пищевого продукта, например, композиции могут быть введены ежедневно при каждом приеме пищи.
Любой способ, известный в данной области техники, может быть использован для определения, будет ли индуцироваться конкретный ответ. Для определения, будет ли индуцироваться ответ, могут быть использованы клинические методы, которые могут оценить степень конкретного болезненного состояния. Например, субъект может контролироваться: на облегчение симптомов, например, ослабление лихорадки, колик, диареи, тошноты, рвоты, судорог, желтухи, низкого уровня сахара в крови, в дополнение к мониторингу посредством клинических анализов, например, культивирование микроорганизмов, показатели крови, скрининга спинномозговой жидкости, сывороточных маркеров, методик визуализации, например, ультразвуковые, посредством рентгеновских лучей и эндоскопические методы.
Композиции могут быть также введены в комбинации с другими терапевтическими воздействиями. В некоторых вариантах осуществления потомство можно лечить с помощью стандартных средств, например, антибиотиками, противовоспалительными средствами, антигистаминными препаратами и другими диетологическими терапиями, например, гипоаллергенными молочными смесями. При одновременном применении двух или нескольких терапевтических агентов не требуется, чтобы агенты вводились одновременно или посредством одного и того же способа, до тех пор, когда существует перекрывание во времени, в течение которого агенты оказывают свое терапевтическое действие. Одновременное или последовательное введение рассматривается, как введение в различные дни или недели.
Это описание предпочтительных вариантов предназначено для чтения в связи с прилагаемыми чертежами, которые должны рассматриваться как часть всего описания настоящего изобретения. Чертежи не обязательно выполнены в масштабе и некоторые отличительные признаки изобретения могут быть показаны в увеличенном масштабе или в несколько схематичной форме в интересах ясности и краткости. В настоящем описании относительные термины, такие как «горизонтальный», «вертикальный», «верх», «низ», «сверху» и «снизу», а также их производные (например, "горизонтально", "вниз", «вверх» и т.д.) должны быть истолкованы как относящиеся к ориентации, как описано, или как показано в графической фигуре по обсуждаемому вопросу. Эти относительные термины предназначены для удобства описания и обычно не предназначены, чтобы требовать определенной ориентации. Термины, включающие "внутри" в противоположность "снаружи", "продольный" в противоположность "поперечный" и т.п., должны интерпретироваться относительно друг друга или относительно продольной оси, или оси или центра вращения, в случае необходимости. Термины, касающиеся присоединения, сочленения и т.п., такие, как "соединенные" и "связанные между собой", относятся к взаимосвязи, где структуры прикреплены или присоединены друг к другу непосредственно или косвенно через промежуточные структуры, а также либо подвижным, либо жестким присоединением или взаимосвязью, если специально не указано иное. Термин "функционально связан" представляет собой такое присоединение, связь или взаимосвязь, которые позволяют соответствующие структуры работать, как предполагалось благодаря этой взаимосвязи.
Когда проиллюстрирована только одна машина, термин "машина" также должен включать любую совокупность машин, которые по отдельности или совместно выполняют набор (или несколько наборов инструкций), чтобы выполнить одну или несколько методик, описанных в настоящем изобретении. В формуле изобретения клаузула "средство плюс функция", если она используется, предназначена для охвата конструкций, описанных, предложенных или становящихся очевидным благодаря письменному описанию или чертежам для выполнения указанной функции, включая не только структурные эквиваленты, но также эквивалентные структуры.
Примеры
Пример 1: Материалы и методы
Получение молока, ферментированного L. paracasei СВА L74:
- Субстрат: 9% порошок восстановленного обезжиренного молока, добавлена 0,25% декстроза.
0
- Термообработка субстрата: УВТ - 135°C в течение 3 с или эквивалент F.
6
4
- Дополнительная инокуляция: 5×10 для Lactobacillus paracasei CBA-L74 5×10 для Streptococcus thermophilus (в качестве инициатора ферментации)
- Температура ферментации: 37°C
- Время ферментации: 15 ч часов
- рН в процессе ферментации: не регулируется
- В конце ферментации рН доводится до 6,5 с помощью раствора NaOH
- Распылительная сушка с температурой на входе 190°C и температурой на выходе 90°C.
- Анализ: число клеток на конечном продукте ферментации для определения Streptococcus thermophilus и Lactobacillus paracasei СВА СВА L74.
Посев: Селективный агар для лактобактерий (LBS) использовали для обнаружения Lactobacillus paracasei СВА L74. Агар L-M17 использовали для подсчета Streptococcus thermophilus. Оба инкубировали при 37°C в анаэробных условиях. Агар для определения количества микроорганизмов (РСА) использовали для обнаружения контаминантов и инкубировали при 30°C в аэробных условиях.
8
6
8
4
8
4
8
Ферментация: L. paracasei СВА L74 и дополнительный инокулят С. thermophilus 1773 coinoculum добавляли как свежие культуры. Ферментацию проводили в течение 15 часов, до концентрации 10 КОЕ/мл L. paracasei СВА L74. Начальное значение рН 6,6. В конце ферментации рН составлял 5,1. Значение рН доводили до 6,5 добавлением 2,5 н. NaOH. Начальная концентрация L. paracasei СВА L74 составляла 5×10 КОЕ/мл; конечная концентрация составляла более 10 КОЕ/мл. Начальная концентрация Streptococcus thermophilus составляла 5×10 КОЕ/мл; конечная концентрация составляла 1×10 КОЕ/мл. Начальное общее количество бактерий на РСА составляло 0 в молоке перед инокуляцией и при ТО и слишком малом количестве колоний для расчета (TFTC) после 15-часового периода ферментации, составляло 5×10 КОЕ/мл; конечная концентрация составляла 1×10 КОЕ/мл.
Сушка: ферментат сушили при температуре на входе 190°C и температуре на выходе 90°C. Содержание влаги в порошке после распылительной сушки составляло 4,87%.
6
in
out
Получение риса, ферментированного L. paracasei СВА L74: Мы получали один литр раствора риса (15% масса/объем) посредством объединения 150 г риса и 900 мл воды. Смесь получали при комнатной температуре и смешивали при встряхивании в течение нескольких минут при 1000-1300 оборотах в минуту. Рисовую смесь обрабатывали посредством тиндализации нагреванием смеси внутри прибора при 70°C, голоданием при 70°C в 20-30 минут, охлаждением при 30-37°C, голоданием 30-37°C в 20-30 минут, нагреванием при 70°C, голоданием при 70°C в 20-30 минут, охлаждением при температуре ферментации (37°C), при встряхивании 150-600 оборотов в минуту. L. paracasei СВА L74 добавляли из лиофилизированного образца до конечной концентрации 1×10 КОЕ/мл. Лиофилизированный образец вновь суспендировали в воде и недолго инкубировали при 37°C, чтобы активировать бактерии. После инокуляции смесь гомогенизировали путем кратковременного встряхивания при 300-600 оборотов в минуту; в процессе ферментации раствор встряхивали при 150 оборотов в минуту. Ферментацию проводили при 37°C в течение 24 часов при р02<15%. Аликвоты отбирали в момент инокуляции (ТО), через 16 часов (Т16), 18 часов (Т18), 21 час (Т21) и через 24 часа (Т24). После ферментации крупяной продукт нагревали до 50°C при непрерывном перемешивании. Нагретый крупяной продукт затем сушили распылением при Т air 80°C, Т air 210°C. Конечное содержание влаги составляло 6%.
Образцы анализировали на агаре Рогоза (+ ванкомицин 12 мкг/мл) (48 ч при 37°C) для количественного определения L. paracasei СВА L74), на РСА на общее содержание аэробов (24 ч при 37°C), на агаре Мак-Конки для бактерий группы кишечной палочки и RCM-arape для клостридий.
Результаты этой ферментации были следующими:
6
8
инокулят (L. paracasei СВА-174): 1×10 (+/- log) КОЕ/мл (на приборе) концентрация L. paracasei СВА L74 после 24 часов ферментации: 1×10 (+/- log) КОЕ/мл
4
Контаминанты на РСА перед инокуляцией: <10 КОЕ/мл
4
Контаминанты на Мак-Конки перед инокуляцией: <10 КОЕ/мл
Контаминанты на РКМ перед инокуляцией: <10 КОЕ/мл
4
Контаминанты на РСА после инокуляции: <10 КОЕ/мл
4
Контаминанты на РСА после 24 часов ферментации: <10 КОЕ/мл
рН перед добавлением инокулята: 6 (+/- 0,20)
рН на 16-18 часов: 3,70 (+/- 0,20)
рН на 24 час: 3,60 (+/- 0,20).
Пример 2: Влияние введения матери риса, ферментированного L. paracasei СВА L74, на выживание потомства, зараженного С. sakazakii
Рис, ферментированный L. paracasei СВА L74, получали, как описано в примере 1. Стандартные гранулы для питания мышей ((Mucedola, SLR, 4RF21 GLP Certificate) смешивали либо с рисом, ферментированным L. paracasei СВА L74, либо с неферментированным рисом, так что рис составлял 10% от общего ежедневного рациона мышей. Это количество было рассчитано таким образом, чтобы имитировать ежедневное количество L. paracasei СВА L74, которое новорожденный получал бы, если ферментированный рис вводили непосредственно в новорожденного. Беременные мыши CD1 получали питательные гранулы, содержащие либо рис, ферментированный L. paracasei СВА L74, либо неферментированный рис, начиная с 14-ого дня беременности до 21 -ого дня беременности и в период лактации.
10
Бактериальную инфекцию С. sakazakii новорожденных проводили следующим образом. С. sakazakii штамм N13 выращивали в бульоне M17 до OD600≈0,6 и ресуспендировали в карбонатом буфере (5% в воде) до концентрации 10 КОЕ/100 мкл. Серийные разведения высевали на LB-агар, чтобы проверить концентрацию инокулята.
10
Новорожденным вводили с помощью желудочного зонда 100 мкл бактериального раствора (т.е., 10 КОЕ), на 3 день после родов. Новорожденных оценивали ежедневно на предмет выживания и результаты представлены в виде кривой выживания Каплан-Мейера. Результаты этого эксперимента показаны на Фиг. 1 и Фиг. 2. Как показано на Фиг. 2, более высокий процент новорожденных от матерей, которые получили рис; ферментированный L. paracasei СВА L74, во время беременности и в период Лактации («Е (RF)») (заполненные столбики), выживших после инфекции С. sakazakii, по сравнению с теми, чьи матери новорожденных получали неферментированный рис («D (RNF)») (белые столбики).
Пример 3: Влияние введения матери молока, ферментированного L. paracasei СВА L74, на выживание потомства, инфицированного S. typhimurium FB62
Молоко, ферментированное L. paracasei СВА L74, получали, как описано в примере 1. Стандартные гранулы для питания мышей ((Mucedola, SLR, 4RF21 GLP Certificate) смешивали либо с молоком, ферментированным L. paracasei СВА L74, либо с неферментированным молоком, что составило 5% от общего ежедневного рациона мышей. Это количество было рассчитано таким образом, чтобы имитировать ежедневное количество L. paracasei СВА L74, которое новорожденный получал бы, если ферментированное молоко вводили непосредственно в новорожденного. Беременные мыши CD1 получили продовольственные гранулы, содержащие либо молоко, ферментированное L. paracasei СВА L74, либо неферментированное молоко, начиная с 14-ого дня беременности до 21-ого дня беременности и в период лактации.
8
Бактериальную инфекцию S. typhimurium FB62 новорожденных проводили следующим образом. S. typhimurium FB62 выращивали в бульоне LB до OD600≈0,6 и ресуспендировали в карбонатом буфере (5% в воде) до концентрации 10 КОЕ/100 мкл. Серийные разведения высевали на LB-агар, чтобы проверить концентрацию инокулята. Новорожденным вводили с помощью желудочного зонда 100 мкл бактериального раствора на 15 день_после родов. Новорожденных оценивали ежедневно на предмет выживания, и результаты представлены в виде кривой выживания Каплан-Мейера. Результаты этого эксперимента показаны на Фиг. 3. Как показано на Фиг. 3, наибольший процент новорожденных от матерей, которые получили молоко, ферментированное L. paracasei СВА L74, во время беременности и в период лактации ("С (LF)"), выживали после инфекции S. typhimurium FB62, по сравнению с теми, чьи матери новорожденных получали неферментированное молоко ("B(LNF)").