Способ лечения местно-распространенного нерезектабельного рака поджелудочной железы
METHOD FOR TREATMENT OF REGIONAL UNRESECTABLE PANCREATIC CANCER

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для лечения местно-распространенного нерезектабельного рака поджелудочной железы.
Частота панкреатогенного рака в мире неуклонно растет. В настоящее время заболеваемость раком поджелудочной железы составляет в среднем 9,0 на 100 тыс. человек в год. Среди других онкопатологий он занимает 10-е место по заболеваемости и 4-е место по смертности. В России за последние 30 лет заболеваемость злокачественными новообразованиями поджелудочной железы возросла на 30%. В США ежегодно примерно 40000 человек умирают от рака поджелудочной железы или его осложнений (см. Сидоров А.Н., Захаров А.Г., Макаров А.Д. и др. Опыт хирургического лечения опухолей поджелудочной железы и периампулярной зоны // Бюллетень ВСНЦ СО РАН. - 2012. - №4 (86), часть 1. - С. 90-92; Daniel Laheru. Pancreatic cancer // Goldman-Cecil Medicine, Twenty-Fifth Edition. - 2016, 194. - P. 1332-1334. e2).
В 90% случаев злокачественные новообразования поджелудочной железы представлены протоковыми аденокарциномами, в остальном это нейроэндокринные опухоли, карциноидные опухоли, лимфомы и редкие саркомы. Протоковая аденокарцинома является наиболее агрессивной опухолью поджелудочной железы. Показатели пятилетней выживаемости у больных с протоковой аденокарциномой колеблются в пределах 3-6%, что является наихудшим результатом среди других солидных опухолей (см. , , Hoskovec D., Ulrych J. Pancreatic Cancer Diagnostics and Treatment--Current State // Prague Med Rep - 2015. - January 1.-116 (4). - P. 253-267). Основными причинами поздней диагностики (запущенности) рака поджелудочной железы являются скрытое течение и отсутствие клинической симптоматики при начальных стадиях заболевания, неверно расцененные ранние жалобы пациента на тошноту, эпигастральную боль, анорексию, изменения стула. На момент постановки диагноза более чем у 50% больных имеет место метастатический характер заболевания, а у 30-40% выявляется неоперабельный местно-распространенный процесс (см. Силаев A.M., Селиванова М.В., Новиков П.В. и др. Опухоли поджелудочной железы: диагностика, лечение, прогноз // Сибирский онкологический журнал. - 2006. - №2 (18). - С. 51-55; Aggarwal S., Topaloglu Н., Kumar S. Systematic Review of Epidemiology and Burden of Pancreatic Cancer // Value in Health. - 2015. - Vol. 18. - Issue 3 - P. A198-A199).
При первично нерезектабельном местно-распространенном раке поджелудочной железы выполнение облигатной хирургической резекции как компонента мультимодальной терапии исключено, что оставляет методом выбора паллиативную химиотерапию (см. Кек Т. Карцинома поджелудочной железы: актуальное место мультимодальной терапии // Медицинский совет. - 2011. - №7-8. - С. 110-115; Norbert Huser, Volker Assfalg, Daniel Hartmann et al. Диагностика и хирургическое лечение рака поджелудочной железы // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. - 2011. - №7. - С. 102-111).
Однако химиотерапия, в силу отсутствия специфичности цитостатиков, имеет ограниченное значение в лечении неоперабельных местно-распространенных опухолей поджелудочной железы. Применение таргетных препаратов также пока не позволило существенно улучшить результаты лечения данной категории больных (см. Семенов Н.Н. Авастин (бевацизумаб) в лечении опухолей желудка и поджелудочной железы // Фарматека. - 2012. - №18. С. 20-24; Chiorean E.G., Coveler A.L. Pancreatic cancer: optimizing treatment options, new, and emerging targeted therapies // Drug Des. Devel. Ther. - 2015. - Vol. 9. - P. 3529-3545). Изучая эффективность применения различных химиопрепаратов в комплексном или самостоятельном лечении рака поджелудочной железы, наибольшую эффективность показал гемцитабин. Монотерапия гемцитабином является стандартом лечения метастатического рака поджелудочной железы. Добавление других препаратов, производных платины (цисплатина или оксалиплатина), капецитабина не улучшило результаты терапии. Изучалось добавление к гемцитабину таргетных препаратов, хотя не доказана их клиническая значимость (Kindler H.L., Niedzwiecki D., Hollis D. et al. A double blind, placebo controlled randomized phase III trial of gemcitabine plus bevacizumab versus gemcitabine plus placebo in patients with advanced pancreatic cancer: a preliminary analysis of Cancer and Leukemia Group В // J. Clin. Oncol. -2007. - Vol. 25(18S). - P. 4508.)
Неблагоприятный прогноз при проведении химиотерапевтического лечения больным раком поджелудочной железы связан с чрезвычайно высоким лекарственно-устойчивым фенотипом этого злокачественного новообразования (см. Krug S., Michl P. New developments in pancreatic cancer treatment // Minerva Gastroenterol Dietol. - 2012. - December 1. - 58 (4). - P. 427-443).
Новым подходом в лечении рака поджелудочной железы может явиться проведение таргетной альфа-радионуклидной терапии (ТАТ). Суть ее заключается в том, что таргетная молекула обеспечивает прицельную доставку и связывание поверхности опухолевой клетки с радионуклидной меткой, генерирующей токсичные альфа-частицы, которые выделяют наибольшую часть своей энергии в раковых клетках, обеспечивая высокую цитотоксичность для них. В настоящее время проведены доклинические исследования по использованию PAI2 в качестве таргетного вектора при раке поджелудочной железы. Имея небольшой молекулярный вес 47 кД, альфа-РАI2 может легко диффундировать через поры опухолевых капилляров к мишенным раковым клеткам, обеспечивая эффект антиваскулярной ТАТ. Но обратной стороной этого подхода является более высокое поглощение радиофармпрепарата почками из-за его низкого молекулярного веса, а следовательно, и увеличение токсичности терапии (Барри Дж. Аллен. Системная таргетная альфа-радионуклидная терапия рака // Радиационная онкология и ядерная медицина. - 2013. - №2. - С. 64-76).
Таким образом, поиск новых вариантов лечения неоперабельного местно-распространенного рака поджелудочной железы является актуальной задачей онкологии.
С этих позиций одним из перспективных направлений является изучение микроокружения аденокарциномы поджелудочной железы. Были проведены исследования, которые показали, что опухолевое микроокружение при раке поджелудочной железы играет ключевую роль в инвазивном росте, а также оказывает действие иммуносупрессивного характера, способствующее повышению устойчивости к химиотерапии (см. Окладникова Е.В., Рукша Т.Г. Роль микроокружения в развитии и прогрессии рака поджелудочной железы // Сибирский онкологический журнал. - 2016. - Т. 15. - №3. - С. 82-90). Доклинические и клинические испытания новых методов иммунотерапии, ориентированных на микроокружение опухоли с целью снижения иммунной толерантности и повышения эффективности проводимой терапии, показали обнадеживающие предварительные результаты (см. Usha L. Katari, Jacqueline М. Keirnan, Anna С. Worth et al. Engineered T cells for pancreatic cancer treatment // HPB. - 2011. - №13. - P. 643-650; Thind K., Padrnos L.J., Ramanathan R.K., Borad M.J. Immunotherapy in pancreatic cancer treatment: a new frontier. // Therap. Adv. Gastroenterol. - 2017. - January 1. - №10 (1). - P. 168-194).
Исходя из вышесказанного, иммунотерапию можно рассматривать в качестве потенциальной стратегии лечения местно-распространенного нерезектабельного рака поджелудочной железы.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка способа лечения больных местно-распространенным нерезектабельным раком поджелудочной железы, позволяющего увеличить продолжительность и улучшить качество жизни.
Технический результат достигается тем, что в условиях процедурного кабинета после обработки кожи передней грудной стенки раствором антисептика вводят внутрикожно по 0,3 мл донорской дендритно-клеточной вакцины, содержащей 1.250.000 дендритных клеток, по две инъекции с каждой стороны грудины примерно между III и IV, IV и V ребрами таким образом, что суммарно достигают 5.000.000 дендритных клеток, введения осуществляют каждые две недели в течение одного года.
Способ осуществляется следующим образом.
После проведения стандартной схемы полихимиотерапии (ПХТ) и оперативных пособий осуществляют введение дендритно-клеточной вакцины (ДКВ).
3
Периферическую венозную кровь донора забирали в стерильные 50-мл пробирки, содержащие антикоагулянт (K - ЭДТА) и разбавляли равным объемом питательной среды RPMI-1640 (Панэко, Россия). Затем 10 мл полученной суспензии наслаивали на 3 мл «Ficoll-Paque Premium» и центрифугировали в 15 мл стерильных пробирках при 1500 об/мин. в течение 40 мин при комнатной температуре (см. Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow // Scand. J. Clin. Lab. Investig. - 1968. - Vol. 21 - Suppl. 97. p. 1-9).
После центрифугирования на дне пробирки оставались эритроциты и гранулоциты, а мононуклеарные клетки (МНК) - на границе раздела фаз. Прозрачный слой среды, расположенный непосредственно над опалесцирующим слоем, содержащим МНК, удаляли, а МНК собирали по всей площади сечения пробирки, добиваясь очистки от других клеток.
Взвесь МНК вносили в стерильные 15 мл центрифужные пробирки, разбавляли 4-кратным избытком неполной питательной среды RPMI-1640 и тщательно ресуспендировали. Отмывали МНК в неполной питательной среде RPMI-1640 двукратным центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин.
6
Затем проводили подсчет и оценку жизнеспособности МНК с помощью камеры Горяева и 0,4% трипанового синего, получали 3,5-7×10 и более клеток с жизнеспособностью не менее 98%.
6
2
2
Для получения дендритных клеток (ДК) из МНК периферической крови последние помещали в неполную питательную среду RPMI-1640 (посевная доза 1,5×10 кл/мл) и 2 плоскодонных культуральных флакона 75 см с вентилируемыми пробками для выращивания адгезионных культур. Инкубировали в условиях контролируемого 5% СO и 98% влажности при 37°С в течение 2-х часов.
Затем среду RPMI-1640, содержащую не прикрепившиеся клетки (преимущественно лимфоциты), удаляли и повторно промывали оставшиеся на подложке клетки 4 мл среды RPMI-1640.
В культуральные флаконы добавляли 15 мл среды CellGroDC, ростовые факторы и факторы дифференцировки: GM-CSF (72 нг/мл) и IL-4 (20 нг/мл).
2
Культуральные флаконы инкубировали в СО - инкубаторе.
На 3-й и 5-й день культивирования добавляли свежую порцию GM-CSF (72 нг/мл) и IL-4 (20 нг/мл).
На 7-й день культивирования в каждый флакон добавляли ростовые факторы и факторы дифференцировки GM-CSF (72 нг/мл), IL-4 (20-45 нг/мл) и TNF-α (20 нг/мл), а также клеточный лизат культуры клеток HeLa из расчета 3 клетки культуры HeLa на 1 дендритную клетку.
2
Для приготовления лизата, содержащего антигены культуры HeLa, клетки культивировали во флаконах в полной питательной среде DMEM/F12 с 10% телячьей эмбриональной сыворотки с добавлением глутамина и гентамицина (50 мкг/мл) в условиях контролируемого 5% СО и 98% влажности при 37°С.
После достижения конфлюэнтного монослоя производили пересев клеток и дальнейшее культивирование в течение недели.
После получения достаточного количества клеточной массы из флаконов отбирали культуральную среду, снимали клетки культуры HeLa с подложки с помощью раствора трипсин-Версена и ресуспендировали до получения однородной клеточной суспензии.
Проводили подсчет клеток в камере Горяева и определение процента жизнеспособных клеток по окрашиванию с 0,4% трипановым синим.
Для получения клеточного лизата выполняли шесть последовательных циклов моментального замораживания суспензии клеток в жидком азоте и оттаивания до комнатной температуры в фосфатно-солевом буфере без криопротектора (качество лизиса клеток контролировали с помощью 0,4% трипанового синего).
В дальнейшем клеточный детрит осаждали центрифугированием (10 мин, 3000 об/мин, 20°С) и фильтровали супернатант через стерильный фильтр (диаметр пор 0,2 мкм).
Опухолевый лизат, полученный из культуры HeLa, хранили при -20°С до использования.
2
Спустя 48 часов после добавления лизата культуры HeLa отбирали культуральную среду, центрифугировали, удаляли надосадочную жидкость. В каждый флакон добавляли 3 мл раствора трипсин-Версена и инкубировали в СО-инкубаторе в течение 5 мин.
Затем снимали клетки скрепером, осаждали центрифугированием (10 мин, 1000 об/мин, 20°С), удаляли супернатант. Объединяли клетки из двух флаконов с полученными клетками из надосадочной жидкости путем их ресуспендирования в неполной среде RPMI 1640 (конечный объем 10 мл).
Отбирали аликвоту клеточной суспензии, равную 0,1 мл, и проводили подсчет клеток в камере Горяева и определение процента жизнеспособных клеток с помощью окрашивания 0,4% трипановым синим.
Затем отбирали 200000 клеток для определения иммунофенотипа зрелых ДК на проточном цитометре, которое проводили путем выделения на графиках популяции МНК-ДК и очистки ее от дебриса и лимфоцитов с помощью меток CD45, CD3, CD4, CD8, CD16+56, CD19.
Оценка стадии созревания мононуклеаров производилась с помощью антител к CD1a, CD11c, CD14, CD33, CD38, CD83, CD86, HLA-DR.
Необходимое количество клеток дендритной вакцины осаждали центрифугированием, отмывали в 10 мл 0,9% раствора хлорида натрия, содержащего 10% альбумина человека, производили подсчет и оценку жизнеспособности с помощью автоматического счетчика клеток «Countess» и 0,4% трипанового синего.
При соблюдении вышеуказанных условий получали клетки, с жизнеспособностью не менее 98% и иммунофенотипом зрелых ДК (CD14-, CD1alow, CD83high, HLA-DRhigh, CD80high, CD86high, CCR7high).
ДК криоконсервировали и хранили в жидком азоте до следующей вакцинации.
Лечение начинают с обработки кожи передней грудной стенки раствором антисептика вводят внутрикожно по 0,3 мл донорской дендритно-клеточной вакцины, содержащей 1.250.000 дендритных клеток, по две инъекции с каждой стороны грудины примерно между III и IV, IV и V ребрами, таким образом, что суммарно достигают 5.000.000 дендритных клеток, введения осуществляют каждые две недели в течение одного года.
Визуально наблюдается реакция в виде образования папул, незначительной гиперемии в месте введения препарата. Отмечается субфебрильная температура тела в течение двух суток после введения вакцины. Аллергических реакций, как и других нежелательных побочных явлений, не зафиксировано.
Через 2 недели после введения первой дендритно-клеточной вакцины вводят вторую дендритно-клеточную вакцину по той же схеме, в той же дозировке - 5.000.000 клеток.
Затем каждые 2 недели в течение одного года вводят дендритно-клеточную вакцину по той же схеме, в той же дозировке - 5.000.000 клеток.
После каждого ведения визуально наблюдается реакция в виде образования папул, незначительной гиперемии в месте введения препарата. Отмечается субфебрильная температура тела в течение двух суток после введения вакцины.
Для лучшего понимания сущности заявленного изобретения, а также для подтверждения его соответствия условию "промышленная применимость", приводим пример конкретной реализации способа.
Приводим пример клинического применения способа.
Больная З., 24.05.1956 года рождения находится под наблюдением ФГБУ РНИОИ МЗ РФ с 16.11.2015 г. с диагнозом рак тела поджелудочной железы pT4N0M0 G2 ст. 3.
При обследовании в ОКДЦ 10.11.2015 г. проведено УЗИ ОБП: поджелудочная железа не увеличена, структура паренхимы неоднородная. На границе головки и тела патологическое образование 50×25×32 мм. Контуры очага неоднородны. Парапанкреатическая клетчатка инфильтрирована. Плотность в области головки и хвоста не изменена, паренхима в области хвоста истончена. Парапанкреатический проток в области хвоста расширен до 6 мм. Регионарные лимфоузлы до 9 мм. В левой доле печени киста 9 мм. В среднем сегменте левой почки подкапсульно киста 8,5 мм.
Заключение - признаки тумора поджелудочной железы. Киста левой доли печени. Киста левой почки.
Больная самостоятельно обратилась в РНИОИ.
16.11.2015 г. в РНИОИ проведено СРКТ ОБП: поджелудочная железа. Объемное образование головки поджелудочной железы 4,6×3,4 см неоднородной структуры. Вирсунгов проток расширен до 0,6 см. Инфильтрация парапанкреатической клетчатки с лимфоузлами в ней до 1,0 см. Печень - в левой доле киста 0,9 см.
03.12.2015 г. в РНИОИ выполнена операция - эксплоративная лапаротомия, биопсия опухоли.
При ревизии - опухоль тела панкреаз 6×4×3, прорастает в чревный ствол и его ветви, воротную вену. Увеличенные до 2 см парапанкреатические л/узлы, плотные на ошупь. Отдаленных метастазов не выявлено. Случай признан нерезектабельным.
Гистологический анализ от 08.12.15 г. - умеренно дифференцированная протоковая аденокарцинома, в лимфатических узлах и клетчатке метастазов нет.
08.12.15 г. проведена последовательная селективная химиоэмболизация опухоли: микросферы гемцитабина 500 мг + эмульсия липиодола + Гемцитабин 1000 мг.
14.01.2016 г. по поводу механической желтухи выполнена операция - чрезкожная чрезпеченочная холангиостомия.
Учитывая нерезектабельное состояние пациентки и размеры очага поражения, рекомендованы курсы ПХТ с оценкой клинического эффекта после проведения 3-х курсов.
С 09.02.2016 по 20.04.2016 проведено 3 курса ПХТ по схеме: Gem-Cap, суммарно введено 3000 мг гемцитабина и 2800 мг капецитабина, цикл повторяют через 3 недели.
Жалобы на боли, слабость, нарастающую иктеричность кожных покровов, субфебрильную температуру, зуд кожи.
27.04.2016 выполнена операция чреспеченочная холангиостомия эндопротезирование желчных протоков (стентирование - Hanarostent Biliary CCC, NC).
2
2
12.05.2016 по 24.06.2016 проведено 3 курса ПХТ по схеме: гемцитабин 1000 мг/м в/в в 1-й и 8-й дни + цисплатин 25 мг/м в 1-й и 8-й дни, цикл повторяют через 2 недели.
11.07.2016 выполнено СРКТ ОБП - поджелудочная железа не увеличена, структура паренхимы неоднородная. Размеры образования на границе головки и тела 50×52 мм. Вирсунгов проток расширен до 6 мм. Регионарные лимфоузлы до 11 мм. Распространение процесса на прилежащие структуры, в том числе на область ворот печени, отсутствие контрастирования воротной вены на уровне очага. Инфильтрация парапанкреатической клетчатки. Вовлечение чревного ствола.
Печень: структура паренхимы однородная. В левой доле киста 9 мм без динамики. Внутрипеченочные и внепеченочные желчные протоки содержат газ. Состояние после дренирования холедоха. По переднему контуру печени скопление выпота.
Заключение по сравнению с данными до лечения (от 16.11.2015) - признаки отрицательной динамики в виде увеличения размеров тумора поджелудочной железы, вовлечения прилежащих структур, прорастания воротной вены и увеличения регионарных лимфоузлов. Скопление выпота в околопеченочном пространстве.
Решением консилиума ФГБУ РНИОИ МЗ РФ в связи с прогрессированием процесса, отсутствием эффекта на лекарственную терапию, курсы специального лечения прекращены. Принято решение о введении ДКВ.
6
26.07.16 проведено первое введение клеточно-дендритной вакцины в дозе 5×10 клеток, полученных от донора.
Затем каждые две недели продолжали ведение клеточно-дендритной вакцины по той же схеме, в той же дозировке - 5.000.000 клеток.
27.09.2016 проведено СРКТ ОБП - тумор головки и тела поджелудочной железы 6×5,1×7,6 см с прорастанием нижней полой вены, неотделим от 12-ти перстной кишки с выраженной инфильтрацией окружающей клетчатки. Забрюшинные лимфоузлы чревного ствола 1,2 см, паракавальные, парааортальные - 1,3 см. Боли прекратились, 04.10.16 г. больная приступила к работе
6
25.07.17 г. проведено последнее введение клеточно-дендритной вакцины в дозе 5×10 клеток, полученных от донора.
27.07.2017 г. СРКТ ОБП - поджелудочная железа не увеличена, структура паренхимы неоднородная. Размеры образования на границе головки и тела без динамики при сравнении с данными от 22.08.16 г. (52 мм в диаметре). Распространение процесса на прилежащие структуры, в том числе на область ворот печени, отсутствие контрастирования воротной вены на уровне очага. Инфильтрация парапанкреатической клетчатки. Вовлечение чревного ствола и его ветвей. Панкреатический проток в области хвоста расширен до 6 мм. Регионарные лимфоузлы до 12 мм. Печень: структура паренхимы однородная. В левой доле киста 9 мм без динамики. Внутрипеченочные и внепеченочные желчные протоки содержат газ. Состояние после дренирования холедоха. По переднему контура печени скопление выпота. Заключение: тумор поджелудочной железы. Стабилизация процесса. В настоящее время самочувствие больной удовлетворительное, продолжается динамическое наблюдение. Данным способ было пролечено 5 больных местно-распространенным нерезектабельным раком поджелудочной железы.
Способ позволяет увеличить продолжительность и улучшить качество жизни пациентов с местно-распространенным нерезектабельным раком поджелудочной железы.