СИСТЕМА ЦЕНТРИФУГИ ОДНОРАЗОВОГО ПРИМЕНЕНИЯ
SYSTEM OF DISPOSABLE CENTRIFUGE

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В области культуры клеток, применительно к биофармецевтическим процессам, существует потребность в отделении клеток от среды, в которой они выращиваются. Существуют несколько вариантов процесса, используемых в настоящее время, которые включают в себя партию, повторяющуюся партию и перфузию. Продуктом могут являться молекулярные соединения, которые клетки выделяют в среду, молекулярные соединения, которые остаются внутри клетки, или им может являться сама клетка. В любом случае продукт, в конечном счете, должен быть отделен от других компонентов процесса до окончательной очистки и оформления продукта, и настоящее изобретение направлено на такое отделение в больших системах.
Способы, широко используемые в настоящее время для этой цели, включают в себя непрерывное и полунепрерывное центрифугирование, тангенциальную поточную фильтрацию (TFF) и глубинную фильтрацию. Центрифуги для периодических и повторяющихся периодических процессов в производственном масштабе являются сложными системами, которые требуют технологии чистки на месте (CIP) и паром на месте (SIP) для обеспечения асептической среды, чтобы предотвратить загрязнение микроорганизмами. В лабораториях и для процессов перфузии в настоящее время используются небольшие системы. Эти небольшие системы основаны на стерилизованных компонентах одноразового применения канала текучей среды.
В настоящее время в данной отрасли имеется потребность в использовании стерилизованных центрифуг одноразового применения для некоторых крупных операций производственного масштаба, но лишь увеличение геометрических размеров существующих небольших конструкций не имело успеха при производительности свыше 1-2 литра/мин. Технические ограничения, присущие существующим небольшим конструкциям, исключают метод непосредственного увеличения геометрических размеров. Например, простое увеличение геометрических размеров мелкомасштабной конструкции ведет к уровням напряжений, которые не выдерживаются материалами конструкции, обычно используемыми в конструкциях одноразового применения.
Другим ограничением, которое исключает простое увеличение геометрических размеров, является изменение при масштабировании соответствующих динамических факторов текучей среды. Например, наибольшая производительность любой центрифуги зависит от скорости осаждения отделяемых частиц. Скорость осаждения описывается модификацией закона Стокса, определяемой Уравнением 1:
<img file="00000001.tif" he="12" wi="32" img-content="undefined" img-format="tif" />
Уравнение 1
где  - скорость осаждения,  - разность плотности тела и жидкости,  - диаметр частицы,  - радиальное положение частицы,  - угловая скорость и  - вязкость жидкости. В отношении увеличения геометрических размеров радиус ротора влияет на наибольшее радиальное положение , которое частицы могут занять. Следовательно, если остальные параметры в Уравнении 1 остаются неизменными, увеличение диаметра ротора приведет к увеличению средней скорости осаждения и улучшенной эффективности отделения. Однако влияние угловой скорости, , ротора на скорость осаждения является квадратичным. Таким образом, несмотря на то что увеличенный ротор может вращаться с достаточно высокой угловой скоростью, влияние увеличенного радиуса ротора может быть сведено к нулю и может стать невозможным сохранение той же эффективности отделения при увеличении.
Поскольку использование стерилизованных компонентов одноразового применения (i) снижает риск загрязнения, (ii) позволяет упростить технологические операции, (iii) улучшает эффективность эксплуатации и (iv) снижает общие затраты, существует потребность в разработке крупномасштабных стерилизованных систем центрифуг.
В то время как стерилизованные компоненты одноразового применения используются в настоящее время в качестве хранилища среды, смесительных емкостей, емкостей выдержки и биореакторов, например, вместимостью вплоть до 2000 литров, не существует доступных серийных центрифуг, которые используют стерилизованные компоненты, которые могут использоваться для обработки таких больших партий клеточных культур. В настоящее время самая большая полунепрерывная коммерчески доступная центрифуга способна обрабатывать при наибольшей гидравлической скорости только около 2 литров в минуту (литр/мин), что ограничивает ее использование партиями размером максимум только около 250 литров или процессами перфузии. Конструкция полунепрерывных центрифуг предшествующего уровня техники ограничивает их рабочую динамическую перегрузку около 300×g (в 300 раз больше силы тяжести), что сокращает типы клеток, которые могут быть отделены, и также ограничивает их характеристики скорости потока. Существуют полунепрерывные центрифуги стерилизованной конструкции одноразового применения, предназначенные для использования в других областях, например, для отделения составных частей крови, для сбора компонента крови и различных терапевтических процедур. Однако эти устройства имеют еще меньшие характеристики скорости потока.
Одним ключевым компонентом, требуемым во всех этих системах, является средство подачи и сбора потоков жидкости в асептических условиях из вращающихся компонентов. Патенты США №№4778444 и 4459169 раскрывают использование гибкой трубы, один конец которой закреплен и неподвижен и другой конец которой вращается, то есть вращающийся в противоположную сторону держатель трубы постоянно раскручивает трубу. Другие промышленные системы используют механические вращающиеся уплотнения.
Ни один из вышеуказанных методов не был успешно масштабирован для выполнения рабочих условий, присущих процессу размером от 300 до 2000 литров. Одним аспектом такого масштаба работы является потребность в способности подавать жидкость в и из вращающегося компонента со скоростями потока в диапазоне около от 3 до 30 литров/мин. Надежность раскручивающейся конструкции трубы оказалась ограничением для длительных процессов, таких как перфузия, которые проводятся со скоростью потока только около 2 литров/мин или менее. Попытки масштабирования раскручивающейся конструкции трубы до скоростей потока более 2 литров/мин не предпринимались. В то время как надежность таких устройств неизвестна, предполагается, что она снижается с увеличением масштаба.
Другой группой центрифуг предшествующего уровня техники, к которым усовершенствование этого изобретения может относиться, являются конструкции патентов США №№4086924 и 4300717, которые имеют систему подачи, которая включает в себя подающую трубу и ускоритель, а также центростремительный насос или чистящие диски для выгрузки. В то время как воздух часто увлекается потоком жидкости во время этапа подачи, вспенивание отработавших жидкостей контролируется использованием центростремительного насоса. Эти центрифуги, которые используются исключительно для обработки крови, имеют конструкцию одноразового применения и достаточно малы - скорости потока не превышают нескольких сотен миллилитров/минуту.
Были сконструированы некоторые тарелочные центрифуги многоразового применения, которые исключают увлечение воздуха во время этапа подачи. Обычно они называются “герметичными конструкциями”. Однако получаемые центрифуги являются слишком механически сложными для использования в системах центрифуг одноразового применения. Более того, многие из этих конструкций требуют механических уплотнений, которые находятся в соприкосновении с каналом протекания технологической жидкости. Этого контакта следует избегать в биотехнологической промышленности, поскольку механические уплотнения имеют склонность выбрасывать частицы в поток жидкости и эти частицы загрязняют фармацевтические продукты. Настоящее изобретение, с другой стороны, использует механическое уплотнение, которое только не допускает проникновения воздуха в систему и не контактирует с какой-либо технологической жидкостью.
Тарелочные центрифуги многоразового применения обычно выгружают клетки во время вращения, и механизмы, используемые для выгрузки, слишком сложны, чтобы быть включенными в центрифуги одноразового применения. Также клетки часто разрушаются во время выгрузки. Следовательно, тарелочные конструкции многоразового применения используются только в тех биотехнологических задачах, где жизнеспособность, неповрежденность клеток не является необходимым условием. Настоящее изобретения, с другой стороны, может использоваться для сбора неповрежденных, жизнеспособных клеток, а также очищенной жидкости без воздуха и проблем пенообразования.
Патент США №6616590 раскрывает ряд центрифуг многоразового применения со сплошным ротором, используемых для отделения клеточной культуры млекопитающих. В то время как эта конструкция способна к сбору жизнеспособных, неповрежденных клеток, используя ускоритель подачи с малым сдвиговым усилием, который не требует уплотнения в канале текучей среды, она использует подающую трубу и ускоритель, который может увлекать воздух, а также каскадную выгрузку очищенной жидкости. Таким образом, существует значительный риск вспенивания очищенной жидкости.
Наиболее релевантный настоящему изобретению предшествующий уровень техники обнаруживается в области непрерывных или полунепрерывных центрифуг, которые включают в себя сменный, стерилизованный вставной элемент канала текучей среды, позволяющий одноразовое применение.
Соответственно, настоящее изобретение преодолевает ограничения скорости потока предшествующих стерилизованных систем центрифуг одноразового применения и обеспечивает средство подачи и сбора потоков жидкости в асептических условиях из вращающихся компонентов, в то же время исключая какое-либо загрязнение воздуха или проблемы вспенивания.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение содержит устройство и способы отделения центрифугированием клеток в крупной клеточной культуре - то есть партиях объемом более, по меньшей мере, 100 литров, чаще партиях объемом, лежащим в пределах около от 300 до 2000 литров - используя стерилизованные компоненты канала текучей среды одноразового применения. Центрифуги настоящего изобретения имеют стерилизованную конструкцию одноразового применения и способны к обработке клеточной суспензии со скоростью потока в диапазоне от около 3 до около 30 литров в минуту, предпочтительно от около 7 до около 20 литров в минуту. Эта пропускная способность приводит к общей продолжительности работы от около 2 до около 4 часов для сбора партии 2000-литрового биореактора.
Устройства настоящего изобретения избегают использования термина “раскручивающие” трубы для переноса жидкостей к или из вращающихся компонентов. Кроме того, устройства не содержат уплотнений контактного типа, в непосредственном контакте с технологическими жидкостями.
Включая в состав герметизирующую мембрану с затопленной зоной подачи в сочетании с центростремительным насосом для выгрузки, настоящее изобретение устраняет оба источника загрязнения воздуха и образования пены. Более того, изобретение использует подвижную подающую трубу, которая позволяет герметизирующей мембране и затопленной зоне подачи работать простым методом выгрузки с малым сдвиговым усилием для собираемых клеток. Уплотняющий метод предлагает не только улучшенную надежность и снижает риск загрязнения обоими наружными агентами и отказывается от механических уплотнений, но также снижает риск утечек технологических жидкостей.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг.1 - схематичный вид стерилизованной системы центрифуги одноразового применения настоящего изобретения во время цикла подачи, в которой показаны только стерилизованные компоненты одноразового применения системы, то есть как вращающиеся компоненты, так и неподвижные опорные компоненты были опущены. При использовании компоненты, обведенные тонкой черной линией, неподвижны, в то время как компоненты, которые обведены толстой сплошной или пунктирной линией, вращаются.
Фиг.2 - увеличенный вид соединений между нижеприведенными элементами по Фиг.1: внутренней подающей трубой, наружной подающей трубой, трубой выгрузки очищенной жидкости и жестким внутренним фланцем вращающегося ротора.
Фиг.3 - схематичный вид системы центрифуги по Фиг.1 во время цикла выгрузки. Внутренняя подающая труба 1 была опущена вниз до непосредственной близости с дном камеры, которая содержит клеточный концентрат. По мере того как внутренняя подающая труба 1 перемещается вниз, наружная подающая труба 3 остается неподвижной и защитные сильфоны 2 сжаты, поддерживая стерильность системы.
Фиг.4 - схематичный вид альтернативной системы центрифуги согласно настоящему изобретению, в которой компоненты одноразового применения показаны черным, и постоянные компоненты показаны серым.
Фиг.5 - увеличенный вид области верхнего фланца центрифуги по Фиг.4, который показывает предпочтительный способ уплотнения гибкого материала камеры к поверхности фланца.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение содержит устройство и способы отделения центрифугированием клеток в крупных клеточных культурах - то есть партиях, объемом около 2000 литров и более. Центрифуги настоящего изобретения имеют стерилизованную конструкцию одноразового применения и способны к обработке таких клеточных суспензий со скоростями потока, превышающими 20 литров в минуту. Эта пропускная способность позволяет иметь общую продолжительность работы от 2 до 3 часов для сбора партии 2000-литрового биореактора. Более предпочтительно, системы центрифуги одноразового применения способны к обработке около от 300 до 2000 литров текучей среды, в то же время работая со скоростью около от 3 до 30 литров в минуту.
На Фиг.1 показан предпочтительный вариант выполнения настоящего изобретения. Фиг.1 схематичный вид системы центрифуги, изображающий только сменные стерилизованные компоненты одноразового применения. Как вращающиеся, так и неподвижные компоненты были опущены для простоты. Компоненты, показанные тонкой черной линией, неподвижны, в то время как компоненты, показанные толстой сплошной или пунктирной линией, вращаются. Компоненты, показанные сплошными тонкими линиями, предпочтительно выполнены пластическим формованием, в то время как компоненты, показанные пунктирными тонкими линиями, предпочтительно являются гибкой полимерной пленкой.
Фиг.1 показывает внутреннюю подающую трубу 1, стерильно присоединенную к источнику клеточной суспензии, например биореактору и подходящему насосу (не показан). Внутренняя подающая труба 1 проходит через наружную подающую трубу 3, к которой она уплотнена посредством гибких сильфонов 2. Труба 4 выгрузки очищенной жидкости расположена соосно наружной подающей трубе 3, образуя кольцевой канал выгрузки. Выход трубы 4 выгрузки очищенной жидкости стерильно присоединен к сосуду, принимающему очищенную жидкость (не показан). Все компоненты, описанные до сих пор, показаны тонкими линиями, обозначая, что они неподвижны и поддерживаются структурой, которая не показана на этой Фигуре.
Стерилизованный внутренний ротор 5 одноразового применения содержит жесткий верхний фланец 5a (тонкая сплошная линия) и гибкую пластиковую облицовку 6 (тонкая пунктирная линия). Гибкая пластиковая облицовка 6 полностью поддерживается жестким наружным ротором (не показан), который является постоянным компонентом центрифуги. Жесткий верхний фланец 5a прикреплен к верхнему ободу жесткого наружного ротора, что служит для передачи крутящего момента всему вращающемуся узлу. Внутри внутреннего ротора 5 имеется цилиндрическая сердцевина 7, которая прикреплена к верхнему фланцу 5а посредством ребер, которые не показаны. Нижний участок цилиндрической сердцевины 7 предпочтительно содержит одну или более пластин 8 ускорителя.
Фиг.2 показывает детали соединения между внутренней подающей трубой 1, наружной подающей трубой 3, трубой 4 выгрузки очищенной жидкости и жестким верхним фланцем 5а внутреннего ротора 5. Как показано, набор чистящих дисков 9 прикреплен к наружной подающей трубе 3 и трубе 4 выгрузки очищенной жидкости. Малые пластины 10 ускорителя расположены внутри верхнего участка сердцевины 7. Герметичный фланец 11 жидкостного уплотнения расположен на конце наружной подающей трубы 3, и вращающееся уплотнение 12 контактного типа используется для предотвращения проникновения воздуха окружающей среды в стерильную оболочку. Это вращающееся уплотнение 12 является строго газовым уплотнением и не приходит в соприкосновение с какой-либо технологической жидкостью. Вращающееся уплотнение 12 показано в виде сдвоенного манжетного уплотнения, хотя механическое уплотнение или уплотнения другого типа может быть использовано для этой цели.
Пластины 10 ускорителя работают совместно с фланцем 11 жидкостного уплотнения следующим образом. Первый малый объем жидкости, которая проходит над фланцем 11 жидкостного уплотнения, ускоряется до скорости ротора. Это сообщает жидкости, находящейся над фланцем жидкостного уплотнения, увеличение углового момента относительно неускоренной жидкости, поступающей под фланцем жидкостного уплотнения. Эта отличие угловых моментов позволяет установление разности давления между верхней и нижней сторонами фланца жидкостного уплотнения. Пластины 10 ускорителя и фланец 11 жидкостного уплотнения позволяют работу системы с затопленной зоной подачи, в то же время избегая присутствия вращающегося уплотнения контактного типа в контакте с жидкостью и проблем, связанных с ним, тем самым позволяя использование бесконтактного герметичного уплотнения, которое подходит для использования со стерилизованными системами центрифуг одноразового применения.
Во время цикла подачи подаваемая суспензия втекает во вращающийся ротор в сборе через внутреннюю подающую трубу 1. Когда подаваемая суспензия поступает в сердцевину 7, она еще не разогнана до угловой скорости вращающегося ротора (обозначена светлой поперечной штриховкой 13, видимой наилучшим образом на Фиг.1). Когда подаваемая суспензия проходит вниз через сердцевину 7 ко дну ротора, она сталкивается с пластинами 8, которые способствуют ускорению жидкости до скорости ротора (обозначена темной поперечной штриховкой 14, видимой наилучшим образом на Фиг.1).
Это изобретение не ограничивается этой конструкцией ускорителя подачи. Альтернативно, например, ускоритель подачи также может быть выполнен пластинами, выступающими радиально наружу из нижней части сердцевины 7.
Очищенная жидкость собирается в кольцевом пространстве между верхним фланцем 5 и сердцевиной 7, протекая вверх до столкновения с чистящими дисками 9. Чистящие диски 9 являются неподвижными компонентами, которые собирают очищенную жидкость без какого-либо контакта с воздухом и выгружают ее под давлением, таким образом избегая вспенивания. Чистящие диски 9 преобразуют кинетическую энергию вращающейся жидкости в давление, служащее для выгрузки очищенной жидкости через трубу 4 выгрузки. Чистящие диски обеспечивают усовершенствованное средство выгрузки очищенной жидкости, избегая возможного выбрасывания частиц в жидкость, которое имеет место с механическими уплотнениями при контакте с жидкостью, и чрезмерного вспенивания, которое часто происходит при каскадном методе выгрузки очищенной жидкости (тем самым, очищенная жидкость перемещается с большой скоростью через воздушный зазор и затем сталкивается с твердой поверхностью).
В настоящем изобретении выгрузка клеточного концентрата выполняется мгновенной остановкой вращения ротора и затем откачиванием клеточного концентрата, который был образован. Вращающийся ротор 5 выполнен такого размера, что его емкость для клеточного концентрата позволяет обработку некоторых партий за один цикл. Для самых больших и наиболее концентрированных партий может потребоваться несколько рабочих циклов. Например, если биореактор на 1000 литров содержит партию клеточной культуры, которая имеет 5% клеток по объему, тогда общий клеточный концентрат, который необходимо выпустить, составляет 50 литров по объему. Таким образом, ротор емкостью 25 литров необходимо будет остановить один раз во время цикла, чтобы выгрузить клеточный концентрат и затем выгрузить снова в конце цикла. Диапазон емкостей ротора, которые совместимы с настоящим изобретением, составляет от около 1 до 50 литров.
На Фиг.3 система центрифуги изображена в начале цикла выгрузки. Заштрихованная поперечными штрихами область 15 обозначает выгружаемый клеточный концентрат. Серая область 16 обозначает жидкость, очищенную от клеток. Как видно на Фиг.3, когда внутренний ротор 5 заполнен до отказа, клеточный концентрат не достигает самой верхней секции ротора, где расположены чистящие диски 9 и вращающееся уплотнение 12.
Когда емкость внутреннего ротора 5 заполняется концентратом, вращение прекращается. Внутренняя подающая труба 1 перемещается вниз, сжимая сильфоны 2, и, проходя через наружную подающую трубу 3, останавливается, немного не доходя до дна внутреннего ротора 5. Затем клеточный концентрат извлекается выкачиванием его через внутреннюю подающую трубу 1. Внешне по отношению к центрифуге используется соответствующее клапанное устройство (не показано), чтобы направлять концентрат в сосуд для сбора (не показан). Если не вся партия биореактора была полностью обработана, тогда вращение ротора возобновляется, с последующими дополнительными циклами подачи и выгрузки до тех пор, пока партия не будет обработана до требуемой степени.
Фиг.4 раскрывает усовершенствованную альтернативную структуру 20 центрифуги одноразового применения, в которой гибкая пластиковая облицовка, которая продолжает от дна ротора на Фиг.1, заменена гибкой цилиндрической облицовкой 22, нижний фланец 24 был добавлен и гибкая облицовка 22 уплотнена как к верхнему фланцу 26, так и к нижнему фланцу 24. Центростремительный насос 28 и вращающееся механическое уплотнение 30 (также показанные на Фиг.1-3) включены в состав.
Верхний фланец 26, сердцевина 34 и нижний фланец 24 предпочтительно выполнены в виде цельной структуры, чтобы способствовать удерживанию гибкой облицовки 22 на месте, вдоль внутренней поверхности сплошного ротора 36 многоразового применения, тем самым улучшая течение подаваемой текучей среды в наружную камеру, образованную элементами одноразового применения, в которой частицы с плотностью больше плотности жидкости осаждаются. Чтобы способствовать переносу жидкости из подающей трубы 32 в камеру, образованную гибкой облицовкой 22, множество отверстий 38 могут быть обеспечены в сердцевине 34.
На Фиг.4 показано средство 32 соединения подачи концентрата, которое включает в себя подающую трубу 33, которая продолжается в положении, показанном на Фиг.3, вблизи нижней части структуры. В этом положении подающая труба может выполнять как функцию подачи, так и функцию выгрузки, без необходимости перемещения трубы.
Вариант, показанный на Фиг.4, дополнительно включает в себя центростремительный насос 28 для выгрузки очищенной жидкости через патрубок для очищенной жидкости. При тестировании с пенящейся средой, пена не образовывалась.
На Фиг.5 показана структура, которая обеспечивает усовершенствованное уплотнение гибкой облицовки к верхнему и нижнему фланцам. Гибкой облицовкой 22 может являться термопластичный эластомер, такой как полиуретан (PTU) или другой растягиваемый, прочный, нервущийся, биосовместимый полимер, в то время как верхний и нижний фланцы могут быть выполнены из жесткого полимера, такого как полиэфиримид, поликарбанат или полисульфон. Процесс термического прикрепления используется для соединения разнородных материалов в области, показанной на Фиг.5. Термическое соединение образуется нагреванием материала фланца, помещением эластомерного полимера поверх нагретого фланца и прикладыванием тепла и давления к эластомерной пленке при температуре выше ее температуры размягчения.
Компоненты одноразового применения являются стерилизованными. Во время переноса этих компонентов из их защитной упаковки и установки в центрифугу термические соединения сохраняют стерильность внутри камеры одноразового применения.
Дополнительно к термическому соединению выступы уплотнения или "шишки" 42 имеются на металлической крышке ротора, чтобы прижать термопластичную эластомерную пленку к жестким верхним фланцам 26, образуя дополнительное уплотнение. Такое же компрессионное уплотнение также используется в нижней части ротора 36, чтобы прикрепить термопластичную эластомерную пленку к жестким нижним фланцам 24. Эти компрессионные уплотнения изолируют области с термическим соединением от гидростатического давления, которое обнаруживается во время центрифугирования, когда камера наполнена жидкостью. Комбинация термического соединения и компрессионных уплотнений в виде выступов была исследована при 3000×g, что соответствует гидростатическому давлению на стенку ротора в 97 фунтов на квадратный дюйм. При исследовании была использована гибкая полиуретановая облицовка, которая имела толщину всего 0,010 дюйма, тем не менее средство уплотнения было полностью эффективно и протечек обнаружено не было.
Структура по Фиг.4-5 не требует гидрогерметичной уплотняющей мембраны относительно варианта, показанного на Фиг.1-3, и, таким образом, элементы, работающие совместно с гидрогерметичным уплотнением - то есть верхняя и нижняя лопасти и сильфоны - не включены в состав.
Структура по Фиг.4-5 была подготовлена для работы внутри ротора, который имел диаметр 5,5 дюймов. При 2000×g он имел гидравлическую емкость более 7 литров/минуту и успешно отделил клетки млекопитающих с эффективностью 99% при скорости 3 литра/мин.