Микробные биопленкии проблемы антибиотикотерапии

у

Микробные биопленки и проблемы антибиотикотерапии

В.В. Тец, Г.В. Тец

В работе суммированы современные представления о действии антибиотиков на бактерии в микробных биопленках. Представленные данные позволяют по-новому определить механизмы освобождения организма от инфекции при лечении антимикробными препаратами. Клинический эффект антибиотиков связан с тем, что они мешают биопленкам поддерживать свою жизнедеятельность и распространяться в тканях организма. В таких условиях биопленки патогенных бактерий, очевидно, не могут длительно сохраняться в организме и становятся объектом успешной атаки со стороны представителей нормальной микрофлоры и факторов иммунной защиты организма хозяина.

Ключевые слова: микробные биопленки, антибиотики, антимикробная терапия.

Введение

В современной медицине стремительно возрастает необходимость в повышении эффективности антимикробной терапии. С одной стороны, постоянно увеличивается число заболеваний, основным этиологическим фактором которых являются различные микроорганизмы, с другой стороны, диагностика и терапия заболеваний, вызванных бактериями и грибами, остаются недостаточно результативными и часто не позволяют помочь пациенту. Для достижения желаемого результата прежде всего необходимо знать природу возбудителя, а также условия, в которых реализуется жизнь возбудителя болезни в организме человека. Изучение организации жизни бактерий и грибов в организме человека стало одним из динамично развивающихся современных направлений медицинской и клинической микробиологии.

Микробные сообщества

С момента открытия мира микробов основным объектом изучения являлись и в значительной степени пока остаются изолированные клетки, их морфологические, генетические, биохимические свойства, а также чувствительность к различным антимикробным препаратам. Накопленные на этом пути сведения составляют основную базу современной клинической микробиологии и фармакологии. Все прогнозы по течению патологического процесса и подходы к этиотропной терапии основаны именно на тех знаниях, что главной причиной инфекции является множество одинаковых и самостоятельных микроорганизмов. Вместе с тем одним из наиболее важных достижений микробиологии последних 30 лет является открытие и изучение микробных сообществ, получивших название “биопленки”. Жизнь микробов в составе биопленок принципиально отличается

от той картины, которая соответствует давно сформировавшимся представлениям. Установлено, что в естественных условиях все микробы существуют не как некоторое количество самостоятельных и изолированных клеток, а находятся в составе биопленок [1]. В организме человека микробные сообщества образуют все представители нормальной микрофлоры и возбудители болезней. С их появления начинается развитие любой инфекции [2, 3]. Формирование и распространение биопленок в организме играют важнейшую роль в развитии патологического процесса. Уже сегодня по данным Центров по контролю и профилактике заболеваний США доказано, что более 70% инфекций человека обязательно сопровождается образованием биопленок. В их число входит и большая часть заболеваний дыхательной системы. Накопившиеся данные о свойствах биопленок открыли новые аспекты действия антимикробных препаратов на бактерии или грибы, образующие эти биопленки.

Структура микробных биопленок

Микробные биопленки - это сообщества, образованные родственными и неродственными микроорганизмами, клетки которых имеют специализацию, контактируют между собой, вырабатывают межклеточное вещество и отграничены от окружающей среды дополнительными оболочками. В составе биопленок можно выделить три основных компонента: клетки микроорганизмов, внеклеточный матрикс и поверхностную оболочку (рис. 1а).

Клеточный состав биопленок

Клетки в биопленках могут принадлежать к одному виду или включать несколько неродственных микроорганизмов. В организме человека обнаружены биопленки, сформированные одним видом и разными неродственными микроорганизмами. Бактерии внутри биопленок различаются по многим признакам. Прежде всего, это могут быть живые или погибшие клетки. Живые микроорганизмы биопленок имеют дифференциацию по ряду признаков, которая зависит от места их расположения. Существуют клетки, способные к росту на питательных средах и не дающие такого

Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова.

Виктор Вениаминович Тец - профессор, зав. кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии.

Георгий Викторович Тец - канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаборатории иммунологии НИЦ.

роста. Бактерии внутри биопленок различаются также по наличию капсул, размеру, подвижности и скорости роста. Для расселения в биопленках образуются специальные плавающие клетки, временно неспособные к размножению. Различаются клетки и по их отношению к действию антимикробных препаратов. В биопленках выявлены группы клеток, получившие название “персистеры”, находящиеся в состоянии, при котором они невосприимчивы (толерант-ны) ко всем известным антибиотикам [4-6].

Бактерии в составе биопленок формируют межклеточные контакты, которые позволяют передавать между клетками некоторые молекулы без их освобождения во внешнюю среду. Такие контакты в числе других факторов способствуют формированию единой кооперативной клеточной системы.

Матрикс биопленок

Вторым компонентом биопленок является внеклеточный матрикс (или, как его еще называют, внеклеточная полимерная субстанция (extracellular polymeric substances)), компоненты которого продуцируют образующие сообщество микроорганизмы [7, 8]. Внеклеточный матрикс состоит из комплекса органических веществ и заполняет всё пространство между микробами. В его составе идентифицированы полисахариды, белки, липиды, внеклеточные ДНК и РНК. Внеклеточный матрикс содержит от 50 до 90% органического углерода биопленки. Больше всего в матриксе биопленок бактерий содержится нейтральных или полианионных (в случае грамотрицательных бактерий) полисахаридов. В биопленках грамположительных стафилококков обнаружены катионные полисахариды и тейхоевые кислоты. Матрикс выполняет ряд важных функций. Так, полисахариды матрикса могут связывать двухвалентные катионы кальция и магния, способствуя формированию связей между полимерными нитями, что повышает прочность биопленки. Матрикс удерживает большое количество воды, что в определенных условиях защищает биопленки от высыхания и играет важную роль в формировании внутренней среды биопленки. Именно в матрикс прежде всего попадают многие ферменты и токсины, вырабатываемые бактериями и выделяемые ими во внешнюю среду. Компоненты матрикса служат одним из барьеров между клетками и внешней средой и участвуют в защите микробов от факторов иммунной системы, а также могут связывать поступающие молекулы антибиотиков. Важной функцией матрикса является перераспределение в биопленке потоков органических и неорганических молекул. Их движение происходит разными способами, в том числе за счет образования в матриксе специальных водных каналов. Матрикс содержит молекулы, участвующие в саморегуляции свойств биопленок. Для определения процесса восприятия клетками биопленок изменений окружающей среды и, в первую очередь плотности популяции, было предложено понятие “quorum sensing” (“ощущение кворума”). Реакции

Рис. 1. Бактериальная биопленка: а - схема (1 - бактериальная биопленка; 2 - матрикс; 3 - бактерии; 4 - поверхностная оболочка с мембраноподобной структурой); б - электронограмма биопленки Е. соН. Стрелкой указана мембраноподобная структура поверхностной оболочки.

кворум-сенсинга тесно связаны с такими важными для медицины процессами, как повышенная устойчивость бактерий биопленок к антибиотикам, выработка токсинов, передача генов, образование спор и др. [9]. Механизмы реакций кворум-сенсинга различаются у грамположительных и грамотрицательных бактерий. Для грамположительных бактерий характерны олигопептидные сигнальные молекулы, а у некоторых дополнительно обнаружены вещества низкомолекулярной природы, большинство из которых содержит лактонную группировку. В биопленках грамотри-цательных бактерий роль сигнальных молекул выполняют гомосеринлактоны.

Внеклеточная ДНК матрикса

Показано также, что в саморегуляции свойств биопленок принимает участие внеклеточная ДНК матрикса. Среди компонентов матрикса внеклеточная ДНК заслуживает особого внимания. Свойства внеклеточных нуклеиновых кислот в последние годы привлекают всё больший интерес исследователей. В крови животных и человека содержание внеклеточной ДНК колеблется в диапазоне от 20 до 50 мкг/л. Накопленные данные указывают на функциональ-

Причины повышенной выживаемости бактерий биопленок в

ную активность внеклеточной ДНК. Ее появление в микробных сообществах связано с регуляторными процессами, и ее присутствие необходимо для нормального образования биопленок. Биопленка служит идеальной нишей для обмена генетической информацией между бактериями. Передача генов в биопленках наблюдается в 10-500 раз чаще, чем в планктонно растущих клетках. Всё это позволяет предполагать, что в биопленке происходит ускоренный горизонтальный перенос генетической информации, в том числе генов, определяющих антибиотикоустойчивость. Матрикс биопленок является совершенной средой для появления микроорганизмов с новыми патогенными свойствами, устойчивостью к антибиотикам и способностью к выживанию в различных условиях.

Поверхностная оболочка биопленок

Еще одним важным компонентом биопленки является поверхностная оболочка [10]. Служа границей с внешней средой, поверхностная оболочка представляет собой часть матрикса, имеющего ряд выраженных морфологических признаков. В структуре оболочки биопленок особое внимание привлекает слой липидов, организация которого на электронограммах напоминает элементарную плазматическую мембрану (рис. 1б).

По качественному составу липиды поверхностной оболочки, матрикса и мембран бактерий, которые образуют биопленку, практически идентичны, но различаются по количеству отдельных компонентов. В оболочке и матриксе биопленки по сравнению с клеточной мембраной преобладают стабильные липиды, и в частности кардиолипин, определяющие стабильность структуры и, как установлено, влияющие на многие свойства сообщества.

Поверхностная оболочка биопленок, имеющая липидный, мембраноподобный компонент, окружает всё сообщество и препятствует свободному проникновению в него различных факторов внешней среды (см. рис. 1а). Для медицины наиболее актуально проникновение в биопленки клеточных и растворимых компонентов иммунной системы и, конечно, антибиотиков и антисептиков.

Механизм распространения биопленок

Важным процессом в поддержании инфекции является размножение и распространение микроорганизмов. Установлено, что распространение инфекции в организме связано с процессами размножения бактерий и грибов, а также расселения биопленок, которое может быть связано с отделением части сообщества или отдельных клеток. Очень важным представляется образование новых биопленок за счет их расселения отдельными клетками. Формирование бактерий, обеспечивающих расселение биопленок, сопровождается последовательным изменением многих свойств этих клеток. На этапе отделения от биопленок такие клетки временно теряют способность к размножению, приобретают повышенную подвижность и могут концентрировать вокруг себя воду за счет отъема от содержащих ее комплексов окружающей среды. Эти бактерии двигаются от биопленки, пока не получат сигнал для нового изменения реализации генетической информации. При этом бактерии теряют способность двигаться, прилипают (адгезия) на новом месте и приобретают способность к делению. В результате на месте расселения начинается процесс колонизации, приводящий к образованию новой биопленки.

Биопленки микроорганизмов

и антибиотикоустойчивость

Хотя очевидно, что особенности взаимодействия между организмом хозяина и микробами в биопленках играют важную роль в патогенезе и лечении заболеваний, во многом они остаются недостаточно изученными. Для всех микробов установлено, что бактерии в биопленке:

а) устойчивы к факторам иммунной системы хозяина;

б) вырабатывают и освобождают в матрикс биопленок, а только потом во внешнюю среду эндотоксины;

в) выживают в присутствии антибиотиков;

г) интенсивно обмениваются генетической информацией, в том числе генами антибиотикоустойчивости.

Наиболее, хотя пока недостаточно изученным является взаимодействие антимикробных препаратов с микроорганизмами, находящимися в составе биопленок. Для многих бактерий и грибов в составе биопленок показана выживаемость в присутствии антибиотиков в количествах в 5000 раз больших, чем их минимальная подавляющая концентрация. Возможно, антибиотики вообще не могут полностью уничтожить бактерии биопленок, поскольку в них присутствуют “персистеры”, находящиеся в силу дифференцировки в состоянии полной невосприимчивости практически ко всем препаратам. В настоящее время уже известны многие факторы, обеспечивающие микроорганизмам повышенную выживаемость в составе биопленки, получившую название “толерантность” (таблица).

Имеющиеся данные об эффективности антибиотиков свидетельствуют о том, что их активность складывается из действия на отдельные, изолированные микроорганизмы

присутствии антибиотиков

Эффект Компоненты биопленки, влияющие на процесс

Уменьшение доступа препарата Поверхностная оболочка и компоненты матрикса, снижение свободной поверхности клеток за счет их контакта между собой

Связывание и/или инактивация антибиотика Компоненты матрикса

Индивидуальная чувствительность бактерий Клетки, невосприимчивые к антибиотикам

Перераспределение генов антибиотикоустойчивости Внеклеточная ДНК и/или прямая передача генов из клетки в клетку

110 100 S 90

70

о 60 \о

й 40

ш 20

ш 7 2 6

г 4

1 мпк

5МПК

100 МПК

1 МПК

5 МПК

100 МПК

Интактный контроль Левофлоксацин

Рис. 2. Усредненные данные по действию левофлоксацина: а - на биомассу сформированных биопленок различных изученных бактерий. МПК - минимальная подавляющая концентрация антибиотика; б - на число колониеобразующих единиц (КОЕ) сформированных биопленок.

(общепринятый показатель, известный как спектр активности антибиотиков) и способности действовать на бактерии, находящиеся в составе биопленок, что может происходить только в случае проникновения препарата сквозь поверхностную оболочку и внеклеточный матрикс сообщества.

Изолированные бактерии являются важной мишенью для различных антибиотиков. Такие бактерии появляются при первичном инфицировании, до формирования биопленок, и в процессе расселения биопленок. Для воздействия на такие микроорганизмы антибиотикам не надо проникать сквозь дополнительные оболочки биопленок. Именно в таких условиях проводится лабораторное изучение чувствительности бактерий к антибиотикам. На такие бактерии (исходя из спектра активности) действуют все антибиотики вне зависимости от способности проникать в биопленки.

Когда было установлено, что в биопленках бактерии могут выживать в присутствии высоких концентраций антибиотиков, стало очевидным, что для выбора схем эффективной терапии требуются новые исследования всех антимикробных препаратов и переоценка процесса и результатов их действия на известные патогенные микроорганизмы.

К настоящему времени проведены многочисленные исследования действия антибиотиков и антисептиков на бактерии и грибы, находящиеся в составе биопленок [11-16]. Изучение взаимодействия антибиотиков и возбудителей заболеваний дыхательной системы, лорорганов и мочевыделительной системы, находящихся в биопленках, осуществлялось и нашей исследовательской группой [17-25].

В наших исследованиях действие антибиотиков на бактерии, вызывающие заболевания дыхательной системы, было изучено на примере таких препаратов, как фторхинолоны, доксициклин, цефалоспорины, ампицил-

лин, азитромицин, рифампицин, гентамицин и хлорам-феникол. Бактерии включали Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Escherichia coli, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae и некоторые другие. Установлено, что препараты, проникающие в биопленки, изменяют свойства биопленок, у которых уменьшаются биомасса и число живых клеток, способных давать рост на питательных средах (рис. 2).

Из приведенных данных видно, что полной гибели бактерий биопленок не происходит, хотя их число уменьшается, и достигаемый эффект является дозозависимым.

Результаты, полученные в ходе исследований, выполненных разными авторами, позволили разделить все антимикробные препараты на две основные группы - хорошо и плохо проникающие в биопленки.

В группу антибиотиков, хорошо проникающих в биопленки различных бактерий, вошли: тетрациклины, ма-кролиды, фторхинолоны, рифампины, хлорамфеникол, сульфаниламиды. Плохо проникающими в биопленки оказались р-лактамные препараты (пенициллины, цефалоспорины, монобактамы, карбапенемы и др.), аминогликозиды, фосфомицин и некоторые другие.

Накопленные данные позволяют по-новому определить механизмы освобождения организма от инфекции при лечении антимикробными препаратами. Клинический эффект антибиотиков связан с тем, что они мешают биопленкам поддерживать свою жизнедеятельность и расселяться. В таких условиях биопленки патогенных бактерий, очевидно, не могут длительно сохраняться в организме. Можно предположить, что при этом биопленки становятся объектом успешной атаки со стороны представителей нор-

мальной микрофлоры и факторов иммунной защиты организма хозяина.

Важным результатом сравнения последствий действия антибиотиков, проникающих и не проникающих в биопленки, стали данные о стимуляции последними изменчивости бактерий, что приводит к ускоренному формированию устойчивости. В результате установлено, что не проникающие в биопленки антибиотики могут способствовать хро-низации процесса и формированию персистентных инфекций с рецидивирующим течением.

Еще одним важным выводом из открытия толерантности бактерий в биопленках и особенностей действия на них различных антибиотиков является переоценка существующих методов лабораторного определения чувствительности к антибиотикам. Исследования, выполненные на свободно живущих бактериях, дают результаты, малоприменимые к тем условиям, в которых антибиотик взаимодействует с микробами в организме человека. В связи с этим всё большее число врачей основную информацию о выборе антибиотиков получают из работ, в которых исследования выполнены на биопленках.

Заключение

Современные представления о действии антибиотиков свидетельствуют о том, что никакие антибиотики не могут полностью уничтожить сформированные биопленки.

Антибиотики, не проникающие в биопленки, оказывают действие только на бактерии, не вошедшие еще в состав биопленок или покинувшие их для расселения.

Препараты, проникающие в биопленки, дополнительно действуют и на часть бактерий, находящихся в составе сообщества.

Клинический эффект действия антибиотиков в большей мере связан с прекращением расселения биопленок и снижением биологической активности образующих ее клеток.

Стандартные лабораторные исследования не дают информации о действии антибиотиков на бактерии биопленок.

Список литературы

1. OTool0 G.A. et al. // Annu. Rev. Microbiol. 2000. V. 54. P. 49.

2. Тец В.В. // Клеточные сообщества / Под ред. В. Теца. СПб., 1998. С. 15-73.

3. Anderl J.N. et al. // Antimicrob. Agents Chemother. 2000. V. 44. № 7. P. 1818.

4. Harrison J.J. et al. // Microbiology. 2005. V. 151. Pt. 10. P. 3181.

5. Keren I. et al. // J. Bacteriol. 2004. V. 186. № 24. P. 8172.

6. Lewis K. // Nat. Rev. Microbiol. 2007. V. 5. № 1. P. 48.

7. Sponza D.T. // Enzym. Microb. Tech. 2003. V. 32. № 3. P. 375.

8. Sutherland I.W. // Microbiology. 2001. V. 147. Pt 1. P. 3.

9. H0iby N. et al. // Int. J. Antimicrob. Agents. 2010. V. 35. № 4. P. 322.

10. Tetz V.V. et al. // Biofilms. 2004. V. 1. № 3. P. 149.

11. Davies D. // Nat. Rev. Drug. Discov. 2003. V. 2. № 2. P. 114.

12. Campanac C. et al. // Antimicrob. Agents Chemother. 2002. V. 46. № 5. P. 1469.

13. Chambless J.D. et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2006. V. 72. № 3. P. 2005.

14. Donlan R.M., Costerton J.W. // Clin. Microbiol. Rev. 2002. V. 15. № 2. P. 167.

15. Stewart P.S. // Int. J. Med. Microbiol. 2002. V. 292. № 2. P. 107.

16. Gillis R.J. et al. // Antimicrob. Agents Chemother. 2005. V. 49. № 9. P. 3858.

17. Тец Г.В., Артеменко К.Л. // Антибиот. и химиотер. 2006. № 51(6). С. 3.

18. Тец В.В. и др. // Антибиот. и химиотер. 2009. № 9(10). С. 3.

19. Тец В.В., Тец Г.В. // Consilium Medicum. 2009. № 11. С. 44.

20. Tetz G.V. et al. // Antimicrob. Agents Chemother. 2009. V. 53. № 3. P. 1204.

21. Tetz V.V. // Med. Microbiol. Lett. 1996. V. 5. P. 426.

22. Тец В.В. и др. // Урология. 2010. № 1. С. 13.

23. Tetz G.V., Tetz V.V. // DNA Cell Biol. 2010. V. 29. № 8. P. 399.

24. Тец В.В., Заславская Н.В. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 2005. № 5. С. 24.

25. Тец В.В. Микроорганизмы и антибиотики. Заболевания дыхательной системы. СПб., 2002. ^

Лечебное дело

Мишине иявд пинга ишм

Продолжается подписка на научно-практический журнал

“ЛЕЧЕБНОЕ ДЕЛО” —

ПЕРИОДИЧЕСКОЕ УЧЕБНОЕ ИЗДАНИЕ РНИМУ ИМ. ОД. ПИРОГОВА

Журнал входит в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученых степеней доктора и кандидата наук. Журнал выходит 4 раза в год. Стоимость подписки на полгода по каталогу агентства "Роспечать” - 220 руб., на один номер - 110 руб. Подписной индекс 20832. Подписку можно оформить в любом отделении связи России и СНГ. Редакционную подписку на этот и любой другой журнал издательства '"Атмосфера” можно оформить на сайте http://atm-press.ru или по телефону: (495) 730-63-51