СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИШЕНЕЙ ДЛЯ АНТИБИОТИКОВ

1. Способ идентификации жизненно важного гена, который служит мишенью для антибиотика в бактерии, указанный способ, включает этапы:
A
A
(а) создания совокупности мутантных бактерий путем транспозонного мутагенеза с применением активирующего транспозона (Tn), причем указанный Tn содержит промотор, такой, что при встраивании транспозона в ДНК бактерии увеличивается транскрипция гена в сайте встраивания или поблизости от него;
(б) выращивания бактерий из указанной мутантной совокупности в присутствии различных количеств указанного антибиотика с получением двух или более культур для тестирования; и
А
(в) сравнения распределения вставок Тn между культурами для тестирования с целью идентификации предполагаемого жизненно важного гена, служащего мишенью для указанного антибиотика у указанной бактерии.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что на стадии (а) для создания совокупности мутантных бактерий используют комбинацию двух или более разных транспозонов.
5
5
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная совокупность мутантных бактерий содержит по меньшей мере 0,5×10 мутантов, например по меньшей мере 1×10 мутантов.
6
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная совокупность мутантных бактерий содержит по меньшей мере 5×10 мутантов.
6
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная совокупность мутантных бактерий содержит по меньшей мере 1×10 мутантов.
5
6
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная совокупность мутантных бактерий содержит от 0,5×10 до 2×10 мутантов.
6
7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что указанная совокупность мутантных бактерий содержит приблизительно 1×10 мутантов.
8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный транспозонный мутагенез на этапе (а) приводит к уровню встраивания, равному по меньшей мере одному транспозону на 50 пар оснований бактериальной ДНК.
9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный транспозонный мутагенез на этапе (а) приводит к уровню встраивания, равному по меньшей мере одному транспозону на 30 пар оснований бактериальной ДНК.
10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный этап транспозонного мутагенеза (а) приводит к уровню встраивания, равному по меньшей мере одному транспозону на 25 пар оснований бактериальной ДНК.
11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный этап транспозонного мутагенеза (а) приводит к уровню встраивания, равному по меньшей мере одному транспозону на 15 пар оснований бактериальной ДНК.
12. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный этап транспозонного мутагенеза (а) приводит к уровню встраивания, равному по меньшей мере одному транспозону на 10 пар оснований бактериальной ДНК.
13. Способ по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что бактериальная ДНК на этапе (а) является хромосомной (геномной) ДНК.
14. Способ по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что бактериальная ДНК на этапе (а) является плазмидной ДНК или смесью хромосомной (геномной) и плазмидной ДНК.
15. Способ по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что транспозонный мутагенез в соответствии с этапом (а) происходит in vivo.
16. Способ по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что транспозонный мутагенез на этапе (а) происходит in vitro.
17. Способ по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что указанная бактерия является грамположительной бактерией.
18. Способ по п. 17, отличающийся тем, что указанная бактерия выбрана из Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium и Neisseria gonorrhoeae.
19. Способ по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что указанная бактерия является грамотрицательной бактерией.
20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что указанная бактерия выбрана из: Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Escherichia coli, штаммов E. coli ST131, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes и Neisseria gonorrhoeae;
7
9
8
21. Способ по любому из пп. 1-12, 18 или 20, отличающийся тем, что бактерии выращивают из совокупности мутантов на этапе (б) путем посева на питательную среду от 10 до 10, например, приблизительно 10 КОЕ из указанной совокупности мутантов.
22. Способ по любому из пп. 1-12, 18 или 20, отличающийся тем, что бактерии выращивают из совокупности мутантов на этапе (б) в присутствии антибиотика в концентрации приблизительно 0,5, приблизительно 1 и приблизительно 2 × MIC (минимальную ингибирующую концентрацию) и получают по меньшей мере три культуры для тестирования.
A
A
23. Способ по любому из пп. 1-12, 18 или 20, отличающийся тем, что указанное распределение встраивания активирующих транспозонов (Tn) между анализируемыми культурами сравнивают путем секвенирования ДНК, примыкающей или расположенной поблизости от указанного сайта встраивания Tn.
A
24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что секвенирования ДНК, примыкающей или расположенной поблизости от указанного сайта встраивания Tn включает селективную амплификацию участков соединения транспозон-бактериальная ДНК.
25. Способ по п. 23, отличающийся тем, что указанное секвенирование включает биохимический способ секвенирования путем синтеза (SBS).
A
26. Способ по п 23, отличающийся тем, что секвенируют приблизительно 25, 50, 75, 100 или более 100 пар оснований, примыкающих или расположенных поблизости от указанного сайта встраивания Tn.
A
27. Способ по п. 23, отличающийся тем, что секвенированная ДНК расположена с 5′ и/или 3′-стороны от указанного сайта встраивания Tn.
28. Способ по любому из пп. 1-12, 18, 20 или 24-27, дополнительно включающий этап приписывания определенной жизненно важной функции указанному предполагаемому жизненно важному гену путем сравнения последовательностей с одним или более жизненно важными генами указанной бактерии.
29. Способ по п. 28, отличающийся тем, что указанные жизненно важные гены идентифицируют путем транспозон-направленного секвенирования сайтов встраивания с применением транспозона, который при встраивании оказывает инактивирующее действие.
30. Способ по любому из пп. 1-12, 18, 20, 24-27 или 29, дополнительно включающий этап приписывания определенной жизненно важной функции указанному предполагаемому жизненно важному гену путем определения того, что он не является геном устойчивости к антибиотику.
31. Способ по п. 30, отличающийся тем, что указанный этап определения включает идентификацию гена устойчивости к антибиотику путем транспозон-направленного секвенирования сайтов встраивания с применением транспозона, который при встраивании оказывает инактивирующее действие.
R
R
32. Способ по любому из пп. 1-12, 18, 20, 24-27, 29 или 31, дополнительно включающий этапы: (а) создания устойчивого к антибиотику мутанта указанной бактерии посредством способа, включающего этап отбора в ходе роста в присутствии указанного антибиотика с получением клона мутантов, устойчивых к антибиотику (мутант Ab); трансформации указанного мутанта Ab: (i) одним или более жизненно важными генами указанной бактерии; и (ii) траснпозоном, который при встраивании инактивирует бактериальную ДНК, с получением совокупности транспозонных мутантов, которые являются меродиплоидными по указанному одному или более жизненно важным генам; выращивания бактерий из указанной меродиплоидной совокупности в присутствии разных количеств указанного антибиотика с получением двух или более культур для тестирования; и сравнения распределения вставок траснпозонов между культурами для тестирования с целью идентификации предполагаемого жизненно важного гена, служащего мишенью для указанного антибиотика у указанной бактерии.
33. Способ идентификации антибиотика, включающий идентификацию жизненно важного гена, который служит мишенью воздействия указанного антибиотика согласно способу, описанному в любом из пп. 1-32.
34. Способ получения антибиотика, включающий способ, описанный в п. 33.
35. Способ по п. 34, дополнительно включающий синтез указанного антибиотика.
36 Способ по п. 35, дополнительно включающий смешивание синтезированного антибиотика с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом с получением фармацевтической композиции.