IN VIVO ЭКСПРЕССИЯ НЕПРИРОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ В МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖАХ Pichia pastoris

1. Клетка метилотрофных дрожжей, содержащая:
неприродную аминокислоту;
ортогональную аминоацил-тРНК синтетазу (О-РС), причем указанная О-РС предпочтительно аминоацилирует ортогональную тРНК (О-тРНК) неприродной аминокислотой в клетке метилотрофных дрожжей; и
ортогональную тРНК (О-тРНК), которая О-тРНК распознает селекторный кодон и которую указанная О-РС предпочтительно аминоацилирует неприродной аминокислотой в клетке метилотрофных дрожжей.
2. Клетка по п.1, отличающаяся тем, что:
i) О-РС экспрессируется с нуклеиновой кислоты, которая содержит полинуклеотид, кодирующий О-РС, интегрированной в геном;
ii) О-РС экспрессируется с индуцибельного промотора;
iii) О-РС экспрессируется с конститутивного промотора;
iv) i) и ii); или
v) i) и iii).
3. Клетка по п.1, отличающаяся тем, что:
i) О-тРНК экспрессируется с нуклеиновой кислоты, которая содержит полинуклеотид, кодирующий или содержащий О-тРНК, интегрированной в геном.
ii) О-тРНК экспрессируется с конститутивного промотора высокого уровня;
iii) i) и ii).
4. Клетка по п.1, содержащая нуклеиновую кислоту, которая содержит полинуклеотид, кодирующий целевой полипептид, причем:
i) указанный полинуклеотид содержит селекторный кодон, распознаваемый О-тРНК;
ii) указанный полинуклеотид интегрирован в геном в одной копии;
iii) указанный полинуклеотид интегрирован в геном в нескольких копиях;
iv) i) и ii); или
v) i) и iii).
5. Клетка по п.4, отличающаяся тем, что целевой полипептид экспрессируется с индуцибельного промотора или конститутивного промотора.
6. Клетка по п.1, отличающаяся тем, что клетка метилотрофных дрожжей представляет собой клетку Candida, клетку Hansenula, клетку Pichia, клетку Torulopsis или клетку Pichia pastoris.
7. Способ получения в клетке метилотрофных дрожжей целевого полипептида, содержащего неприродную аминокислоту в выбранном положении, включающий:
а) предоставление клетки метилотрофных дрожжей, содержащей:
i) неприродную аминокислоту;
ii) ортогональную аминоацил-тРНК синтетазу (О-РС); причем указанная О-РС предпочтительно аминоацилирует ортогональную тРНК (О-тРНК) неприродной аминокислотой в метилотрофных дрожжах; и,
iii) ортогональную тРНК (О-тРНК), которую указанная О-РС предпочтительно аминоацилирует неприродной аминокислотой, и
iv) целевую нуклеиновую кислоту, кодирующую целевой полипептид, причем указанная целевая нуклеиновая кислота содержит по меньшей мере один селекторный кодон, распознаваемый О-тРНК; и
б) встраивание указанной неприродной аминокислоты в выбранном положении целевой нуклеиновой кислоты в ходе трансляции целевого полипептида в ответ на селекторный кодон, с обеспечением продуцирования целевого полипептида, содержащего неприродную аминокислоту в выбранном положении.
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что обеспечение О-РС включает:
i) интегрирование полинуклеотида О-РС, который кодирует последовательность О-РС, ниже промотора в геном клетки и экспрессию кодируемой О-РС;
ii) экспрессию О-РС с индуцибельного промотора;
iii) экспрессию О-РС с конститутивного промотора;
iv) i) и ii); или
v) i) и iii).
9. Способ по п.7, отличающийся тем, что указанная клетка содержит ортогональную тРНК, причем указанная тРНК является супрессором амбер-кодона, тРНК, супрессором охра-кодона, тРНК, являющаяся опал-кодона, или представляет собой тРНК, распознающую кодон из четырех нуклеотидов, редкий кодон или некодирующий кодон, причем указанная тРНК кодируется полинуклеотидом О-тРНК под транскрипционным контролем конститутивного промотора высокого уровня, причем указанный полинуклеотид О-тРНК интегрирован в геном.
10. Способ по п.7, отличающийся тем, что обеспечение целевой нуклеиновой кислоты включает интегрирование нуклеиновой кислоты, которая находится под транскрипционным контролем конститутивного промотора или индуцибельного промотора, в геном клетки.
11. Способ по п.10, отличающийся тем, что интегрирование нуклеиновой кислоты в геном включает интегрирование нуклеиновой кислоты в геном в одной копии или в нескольких копиях.
12. Способ по п.7, отличающийся тем, что обеспечение клетки метилотрофных дрожжей включает обеспечение клетки Candida, клетки Hansenula, клетки Pichia, клетки Torulopsis или клетки Pichia pastoris.
13. Способ по п.7, отличающийся тем, что получаемый полипептид
i) сульфатирован,
ii) гликозилирован,
iii) содержит одну или более дисульфидных связи,
iv) экспрессируется в клетках в концентрации до 10 мг/л, или
v) любая комбинация i), ii), iii) и iv).