ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСЛАБЛЕННЫЙ ВИРУС ВЕЗИКУЛЯРНОГО СТОМАТИТА, КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

1. Выделенный, генетически модифицированный вирус везикулярного стоматита (VSV), имеющий по меньшей мере одну аминокислотную мутацию в области, соответствующей по меньшей мере одному из следующих положений:
аминокислоты в положениях 119 или 142 белка М;
аминокислоты в положениях 109, 224, 438, 477 или 481 белка G; и
аминокислоты в положениях 205, 220 или 1450 белка L.
2. Генетически модифицированный VSV по п.1, где нуклеиновая кислота, кодирующая генетически модифицированный VSV, дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один гетерологичный антиген или его фрагмент.
3. Генетически модифицированный VSV по п.1, где один гетерологичный антиген или его фрагмент происходит от патогенного микроорганизма.
4. Генетически модифицированный VSV по п.3, где патогенный микроорганизм, из которого получена нуклеиновая кислота, кодирующая гетерологичный антиген, выбран из группы, состоящей из вируса, бактерии, простейшего или гриба.
5. Генетически модифицированный VSV по п.4, где гетерологичный антиген выбран из группы, состоящей из антигена вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), антигена HTLV (вирус Т-клеточного лейкоза человека), антигена SIV (вирус иммунодефицита обезьяны), антигена RSV (вирус саркомы Рауса), антигена PIV (вирус парагриппа), антигена HSV (вирус простого герпеса), антигена CMV (цитомегаловирус), антигена вируса Эпштейна-Барр, антигена вируса ветряной оспы, антигена вируса эпидемического паротита, антигена вируса кори, антигена вируса гриппа, антигена полиовируса, антигена риновируса, антигена вируса гепатита А, антигена вируса гепатита В, антигена вируса гепатита С, антигена норовируса, антигена тогавируса, антигена альфавируса, антигена вируса краснухи, антигена вируса бешенства, антигена вируса, вызывающего Марбургскую болезнь, антигена вируса Эбола, антигена вируса папилломы, антигена вируса полиомы, антигена метапневмовируса, антигена коронавируса, антигена Vibrio cholerae, антигена Plasmodium falciparum, антигена Plasmodium vivax, антигена Plasmodium ovale, антигена Plasmodium malariae, антигена Plasmodium knowlesi, антигена Streptococcus pneumoniae, антигена Streptococcus pyogenes, антигена Helicobacter pylori, антигена Streptococcus agalactiae, антигена Neisseria meningitidis, антигена Neisseria gonorrhoeae, антигена Corynebacterium diphtheriae, антигена Clostridium tetani, антигена Bordetella pertussis, антигена Haemophilus, антигена Chlamydia и антигена Escherichia coli.
6. Генетически модифицированный VSV по п.5, где гетерологичный антиген содержит белок ВИЧ.
7. Генетически модифицированный VSV по п.6, где белок ВИЧ кодируется геном, выбранным из группы, состоящей из gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev и vpu.
8. Генетически модифицированный VSV по п.6, где белок ВИЧ представляет собой белок gag ВИЧ.
9. Генетически модифицированный VSV по п.8, где белок gag ВИЧ имеет по меньшей мере одну мутацию в положении 165, 270, 329 или 348.
10. Генетически модифицированный VSV по любому из пп.1-9, где мутация включает консервативную или неконсервативную аминокислотную замену.
11. Генетически модифицированный VSV по п.1, где мутация находится в любом из положениий 119 или 142 белка М или в обоих положениях 119 и 142 белка М.
12. Генетически модифицированный VSV по п.1, где мутация аминокислоты в положении 119 белка М представляет собой мутацию Т→N, и мутация аминокислоты в положении 142 белка М представляет собой мутацию Р→Т.
13. Генетически модифицированный VSV по п.1, где мутация аминокислот в положении 109, 224, 438, 477 или 481 белка G представляет собой мутацию K→N, N→T, S→I, A→V/G→L или V→I соответственно.
14. Генетически модифицированный VSV по п.1, где мутация аминокислоты в положении 205, 220 или 1450 белка L представляет собой P→L, K→Е или L→I соответственно.
15. Генетически модифицированный VSV по п.9, где мутация аминокислот в положении 165, 270, 329 или 348 белка gag ВИЧ представляет собой S→G, L→S, D→N или Т→K соответственно.
16. Генетически модифицированный VSV по п.1, где мутация любой одной или более чем одной аминокислоты приводит к повышенной стабильности генотипа и/или фенотипа вируса.
17. Генетически модифицированный VSV по п.16, где мутация любой одной или более чем одной аминокислоты дополнительно приводит к повышенному выходу продукции вируса клеткой, инфицированной указанным вирусом.
18. Генетически модифицированный VSV по п.1, дополнительно содержащий по меньшей мере две другие мутации в своем геноме, выбранные из группы, состоящей из температурочувствительной мутации, точечной мутации, мутации, связанной с перетасовкой генов, мутации G-ствола (G-stem), нецитопатической мутации гена М, амбисенс (ambisense) мутации РНК, мутации, связанной с усечением гена G, вставочной мутации гена G и мутации, связанной с делецией гена.
6
19. Способ получения генетически модифицированного VSV по любому из пп.1-15, включающий серийное пассирование VSV в непрерывной линии клеток млекопитающего при низкой множественности инфекции (MOI), варьирующей от примерно 0,001 до примерно 0,1 бляшкообразующих единиц (PFU)/мл в течение по меньшей мере 5-15 пассажей, где данный вирус имеет титр по меньшей мере 1×10 PFU/мл и по меньшей мере одну или более чем одну мутацию по любому из пп.1-14.
7
20. Способ по п.19, где данный вирус имеет титр по меньшей мере 1×10 PFU/мл.
21. Способ по любому из пп.19 или 20, где линия клеток представляет собой линию клеток Vero, BHK (клетки почки детеныша хомяка) или 293.
22. Способ по п.19, который приводит к выходу вируса в 5-100 раз выше по сравнению с выходом, полученным со штаммом вируса, который не пассировали от примерно 5 до 15 раз при низкой MOI, варьирующей от примерно 0,001 до примерно 0,1 бляшкообразующих единиц (PFU)/клетку.
23. Способ по п.19, где генетически модифицированный VSV демонстрирует увеличение стабильности генотипа и/или фенотипа вируса.
24. Иммуногенная композиция, содержащая любой один или более чем один генетически модифицированный VSV по любому из пп.1-15 и фармацевтически приемлемый носитель.
25. Иммуногенная композиция по п.24, дополнительно содержащая адъювант.
26. Способ защиты млекопитающего против инфекции патогенным микроорганизмом, включающий введение иммунологически эффективного количества генетически модифицированного VSV по любому из пп.1-15.
27. Способ защиты млекопитающего против инфекции патогенным микроорганизмом, включающий введение иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции по любому из п.24 или 25.
28. Способ адаптации вируса для роста в культуре клеток, включающий
а) инфицирование культуры клеток вирусом при низкой множественности инфекции (MOI), варьирующей от примерно 0,001 до примерно 0,1 бляшкообразующих единиц (PFU) на клетку;
б) сбор клеточной культуральной среды, содержащей вирус;
в) осветление клеточной культуральной среды;
г) замораживание клеточной культуральной среды; и
д) повторение стадий (а)-(г) от примерно 5 до примерно 15 раз,
где данный способ приводит к 5-100-кратному увеличению продукции/выхода и к улучшению характеристик стабильности генотипа и фенотипа вируса.
29. Способ по п.28, где вирус представляет собой ослабленный вирус.
30. Способ по п.29, предусматривающий поддержание любой(ых) ранее существующей(их) мутации(ий), связанной(ых) с ослаблением вируса.
31. Способ по п.29, предусматривающий поддержание низкого профиля нейровирулентности, связанного с ослаблением вируса.
32. Способ по п.28, используемый для крупномасштабного производства иммуногенной композиции.
33. Способ по п.32, приводящий к выходу вируса в 5-100 раз выше по сравнению с выходом, полученным со штаммом вируса, который не пассировали от примерно 5 до 15 раз при низкой множественности инфекции, варьирующей от примерно 0,001 до примерно 0,1 бляшкообразующих единиц на клетку.
34. Способ по п.30, где ранее существующая(ие) мутация(ии), связанная(ые) с ослаблением вируса, выбрана(ы) из группы, состоящей из температурочувствительной мутации, точечной мутации, мутации, связанной с перетасовкой генов, мутации G-ствола, нецитопатической мутации гена М, амбисенс мутации РНК, мутации, связанной с усечением гена G, вставочной мутации гена G, и мутации, связанной с делецией гена.
35. Способ по п.29, где ослабленный вирус представляет собой штамм вируса везикулярного стоматита (VSV).
36. Способ по п.30, где VSV имеет по меньшей мере одну аминокислотную мутацию в области, соответствующей по меньшей мере одному из следующих положений:
аминокислоты в положениях 119 или 142 белка М;
аминокислоты в положениях 109, 224, 438, 477 или 481 белка G; и
аминокислоты в положениях 205, 220 или 1450 белка L.
37. Способ по п.36, где данная мутация включает консервативную или неконсервативную аминокислотную замену.
38. Способ по п.36, где данная мутация находится в любом из положений 119 или 142 белка М или в обоих положениях 119 и 142 белка М.
39. Способ по п.38, где мутация аминокислоты в положении 119 белка М представляет собой мутацию T→N, и мутация аминокислоты в положении 142 белка М представляет собой мутацию Р→Т.
40. Способ по п.36, где мутация аминокислот в положении 109, 224, 438, 477 или 481 белка G представляет собой мутацию K→N, N→T, S→I, (A→V/G→L) или V→I, соответственно.
41. Способ по п.36, где мутация аминокислоты в положении 205, 220 или 1450 белка L представляет собой P→L, K→E или L→I, соответственно.
42. Способ по п.35, где штамм VSV выбран из штамма Indiana, или штамма New Jersey, или серотипа Isfahan, или из других везикуловирусов.
43. Способ по любому из п.36 или 42, где штамм VSV содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один гетерологичный антиген.
44. Способ по п.43, где гетерологичный антиген получен из патогенного микроорганизма, выбранного из группы, состоящей из вируса, бактерии, простейшего и гриба.
45. Способ по п.43, где гетерологичный антиген выбран из группы, состоящей из антигена вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), антигена HTLV, антигена SIV, антигена RSV, антигена PIV, антигена HSV, антигена CMV, антигена вируса Эпштейна-Барр, антигена вируса ветряной оспы, антигена вируса эпидемического паротита, антигена вируса кори, антигена вируса гриппа, антигена полиовируса, антигена риновируса, антигена вируса гепатита А, антигена вируса гепатита В, антигена вируса гепатита С, антигена норовируса, антигена тогавируса, антигена альфавируса, антигена вируса краснухи, антигена вируса бешенства, антигена вируса, вызывающего Марбургскую болезнь, антигена вируса Эбола, антигена вируса папилломы, антигена вируса полиомы, антигена метапневмовируса, антигена коронавируса, антигена Vibrio cholerae, антигена Plasmodium falciparum, антигена Plasmodium vivax, антигена Plasmodium ovale, антигена Plasmodium malariae, антигена Plasmodium knowlesi, антигена Streptococcus pneumoniae, антигена Streptococcus pyogenes, антигена Helicobacter pylori, антигена Streptococcus agalactiae, антигена Neisseria meningitidis, антигена Neisseria gonorrhoeae, антигена Corynebacterium diphtheriae, антигена Clostridium tetani, антигена Bordetella pertussis, антигена Haemophilus, антигена Chlamydia и антигена Escherichia coli.
46. Способ по п.43, где гетерологичный антиген содержит белок ВИЧ.
47. Способ по п.46, где белок ВИЧ кодируется геном, выбранным из группы, состоящей из gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev и vpu.
48. Способ по п.46, где данный белок ВИЧ представляет собой белок gag ВИЧ.
49. Способ по п.48, где белок gag ВИЧ имеет по меньшей мере одну мутацию в положении 165, 270, 329 или 348.
50. Способ по п.49, где мутация аминокислоты в положении 165, 270, 329 или 348 белка gag ВИЧ представляет собой S→G, L→S, D→N или Т→K, соответственно.