IgG-антитела против бтш-65 Mycobacterium bovis и БТШ-70 человека в сыворотках крови кроликов, иммунизированных Escherichia coli

Резюме

В статье показана перспективность использования милиацина как средства поддержания иммунологической и эпидемиологической эффективности вакцинопрофилактики в условиях воздействия на организм дестабилизирующих факторов.

Summary

The article researches the promising future use of Miliacin for support of immunological and epidemiological effectiveness of vaccines in the conditions of influence on an organism of destabilising factors are present.

Литература

1. Железнова А.Д., Калинина О.В. Экспериментальная оценка милиацина как средства реабилитации при вторичном иммунодефиците, индуцированном метотрексатом // Вестник уральской медицинской академической науки. № 3 - 1 (14). 2006. С. 63 - 66.

2. Железнова А.Д., Железнов Л.М., Штиль А.А. и др. Морфологические проявления защитного влияния милиацина в органах иммуногенеза при действии метотрексата // Бюл. эксперт, биол. и медицины. 2007. Т. 144. № 10. С. 458 - 463.

3. Железнова А.Д., Панфилова Т.В., Смолягин А.И. и др. Влияние милиацина на продукцию цитокинов спленоцитами мышей (СВА х C57BI6)F1, подвергнутых воздействию метотрексата // Российский иммунологический журнал. 2008. Т. 2 (11). № 2 - 3. С. 313.

4. Ильичова Т.Н., Проняева T.R, Шульц Э.Э. и др. Иммуномодулирующая активность тритерпеноидов растительного происхождения и их производных //Журн. микробиол. 2001. № 2. С. 5 - 56.

5. Каральник Б.В., Маркова С.Г. Экологические аспекты АКДС-вакцинации // ЖМЭИ. 1991. № 12. С. 34 - 38.

6. Кириллова А.В., Скачков М.В., Панфилова Т.В. и др. Стимуляция иммунитета к столбнячному анатоксину милиацином // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2003. № 6 (13). С. 36 - 38.

7. Олифсон Л.Е., Осадчая Н.Д., Нузов Б.Г. и др. Химическая природа и биологическая активность милиацина // Вопр. питания. 1991. № 2. С. 57 - 59.

8. Панфилова Т.В., Штиль А.А., Полосухина E.R и др. Влияние тритерпено-ида милиацина на чувствительность лимфоцитов тимуса и селезенки капоптозу, индуцированномудексаметазоном // Бюл. эксперт, биол. и медицины. 2003. Т. 136. № 10. С. 382 - 385.

9. Першин Б.Б., Емельянов Б.А., Соколов Я.А. и др. Изучение механизма феномена исчезающих иммуноглобулинов при стрессе в эксперименте // Патол. физиол. и эксперим. терапия. 1987. № 5. С. 41 - 44.

10. Першин Б.Б., Гелиев А.Б., Толстов Д.В. и др. Реакции иммунной системы на физические нагрузки // Русский журнал иммунологии. 2002. Т. 7. № 1. С. 1 - 24.

11. Савилов Е.Д. Теоретические аспекты управления инфекционной заболеваемостью в условиях техногенного загрязнения окружающей среды // Бюл. СО РАМН. 2008. № 1. С. 43 - 46.

12. Скачкова М.А., Скачков М.В., Смолягин А.И. и др. Иммунный статус и состояние интерфероновой системы у школьников, проживающих в городах с различной антропогенной нагрузкой // Бюл. эксперт, биол. и медицины. 2001. Т. 131. № 4. С. 442 - 444.

13. Хаитов P.M., Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая иммунология. - М.: Изд-во ВНИРО, 1995. - 219 с.

14. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Основные представления об иммунотроп-ных лекарственных средствах // Иммунология. 1996. № 6. С. 4 - 9.

15. Хаитов P.M., Пинегин Б. В. Современные и ммуно модуляторы. Основные принципы их применения // Иммунология. 2000. № 5. С. 4 - 7.

16. Черешнев В.А., Кеворков Н.Н., Бахметьев Б.А. и др. Экология и иммунитет - патофизиологические аспекты // Второй Российский симпозиум по патофизиологии с международным участием. 9-12.10. - М., 2000. С. 158.

17. Ярилин А.А. Основы иммунологии. - М.: Медицина, 1999. - 608 с.

18. Cetiner М., Sener G., Sehirli А.О. et al. Taurine protects against methotrexate - induced toxicity and inhibits leukocyte death //Toxicol. Appl. Pharmacol. 2005. V. 209. № 1. P. 39 - 50.

19. Cetinkaya A., Bulbuloglu E., Kuratas E. et al. N-acetyl cyste in ameliorates methotrexate - induced oxidative liver damage in rats // Med. Sei. Monit.

2006. V. 12. № 8. P. 274 - 278.

20. Ruiz M.R., Quinones A.G., Diaz N.L. etal. Acute immobilization stress induces clinical and neuroimmunological alterations in experimental murine cu-taneosus leishmaniasis // Br. Dermatol. 2003. V. 149. № 4. P 731 - 738.

21. Sarid 0., Anson 0., Yaari A., Margalith M. Epstein-Barr virus specific salivary antibodies as related to stress caused by examinations // J. Med. Virul. 2001. № 64 (2). P. 149 - 156.

lgG-антитела против БТШ-65 Mycobacterium bovis и БТШ-70 человека в сыворотках крови кроликов, иммунизированных Escherichia со//

И.А. Баснакьян, А.О. Арзуманян, А.Э. Аваков, Н.П. Ванеева, Н.Е. Ястребова ГУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН, Москва

Введение

Гомология стрессовых белков, в том числе белков теплового шока (БТШ), - один из факторов, определяющих перекрестные иммунологические реакции как между отдельными видами бактерий, так и между БТШ бактерий и антигенами человека [8, 9, 12, 14 - 17]. Ввиду гомологии БТШ различных видов бактерий эти белки перспективны в разработках будущих вакцин [4],

Однако лишь единичные исследования посвящены изучению связи перекрестных иммунологических реакций с фазами роста культуры, различающихся, как известно, по степени влияния стрессорных факторов на популяцию и являющихся основой биотехнологии иммунобиологических препаратов [2].

Нами ранее изучены перекрестные иммунологические реакции вакцинных штаммов В. pertussis

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 1 (44)/2009

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 1 (44)/2009

и N. meningitidis в разных фазах роста и показано наличие в культурах этих бактерий в поздних фазах роста антигенов, которые перекрестно реагируют с антигенами других видов бактерий и человека, и отсутствие таких антигенов в культурах фазы экспоненциального роста [3, 5]. Эти данные следует принимать во внимание при разработке новых вакцин. Однако они подчеркивают необходимость иметь в виду другой важный аспект проблемы стресса у бактерий - гомологию стрессовых белков бактерий и человека, по-видимому, имеющую значение в аутоиммунной патологии [1]. Эта гомология изучается главным образом методами молекулярной биологии, и лишь отдельные авторы сообщают об изучении антител к стрессовым белкам и корреляции между антителами против БТШ бактерий и человека в сыворотках крови больных [18,19].

Изучение данной корреляции на людях при аутоиммунных заболеваниях по понятным причинам сопряжено со значительными трудностями и поэтому требует разработки экспериментальных моделей, необходимых для проведения предварительных исследований.

Нам представляется целесообразным использовать для этой цели культуру £ coli в фазе экспоненциального роста и в стационарной фазе, иммунизацию кроликов полученными препаратами, изуче-

ние lgG-антител и корреляции между содержанием этих антител к БТШ-65 М. bovis и БТШ-70 человека в кроличьих иммунных сыворотках.

Выбор £ coli обусловлен тем, что она изучена как прокариотический организм, синтезирующий стрессовые белки, имеющие гомологию (50%-ная идентичность аминокислотной последовательности) со стрессовыми белками других видов бактерий и с антигенами эукариотических организмов [10,11,13].

Однако нам не встречались исследования связи синтеза этих стрессовых белков с фазами роста культуры. Получение таких данных могло бы не только подтвердить гомологию БТШ бактерий и человека, но и быть весомым аргументом, обосновывающим гипотезу о ее роли в этиопатогенезе аутоиммунных заболеваний.

Поэтому целью настоящей работы стало изучение корреляции между уровнями lgG-антител против БТШ-65 М. bovis и уровнями lgG-антител против БТШ-70 человека в сыворотках крови кроликов, иммунизированных препаратами из £. coli в разных фазах роста.

Материалы и методы

В исследовании использовались штамм Escherichia coli М-17, применяемый в производстве пре-

Таблица 1.

Результаты изучения уровней lgG-антител против БТШ-65 М. bovis в сыворотках крови кроликов, иммунизированных цельнокультуральными препаратами из культур штамма Е. coli М-17 в разных фазах роста

Фаза роста культуры (время процесса культивирования) ДОП уровней lgG-антител Медианы ДОП Средние арифметические ДОП

№ сыворотки ДОП № сыворотки ДОП

1 0,381 5 0,348

Экспоненциального роста 2 0,595 6 0,387 0,219 0,256 ±0,172

(3 часа) 3 0,089 7 0,083

4 0,079 8 0,084

1 0,283 5 0,542

Замедления 2 0,655 6 0,640 0,213 0,316 ±0,222

(5 часов) 3 0,050 7 0,117

4 0,101 8 0,142

1 0,629 5 0,476

Стационарная 2 0,791 6 0,711 0,646 0,634 ±0,079

(8 часов) 3 0,689 7 0,512

4 0,606 8 0,662

1 0,081 5 0,086

Отмирания 2 0,086 6 0,080 0,305 0,372 ± 0,289

(17 часов) 3 0,523 7 0,602

4 0,656 8 0,865

АО/7 - разность значений оптических плотностей анализируемой сыворотки и пула из девяти сывороток крови неиммунизированных кроликов - среднее арифметическое из четырех определений оптической плотности в ИФА

Таблица 2.

Результаты изучения уровней ІдЄ-антител против БТШ-70 человека в сыворотках крови кроликов, иммунизированных цельнокультуральными препаратами из культур штамма Е. соїі М-17 в разных фазах роста

Фаза роста культуры (время процесса культивирования) АОП уровней lgG-антител Медианы ДОП Средние арифметические ДОП

№ сыворотки доп № сыворотки ДОП

Экспоненциального роста (3 часа) 1 0,258 5 0,299 0,158 0,178 + 0,128

2 0,326 6 0,339

3 0,041 7 0,061

4 0,053 8 0,045

Замедления скорости роста (5 часов) 1 0,675 5 0,779 0,4-52 0,435 ± 0,292

2 0,676 6 0,781

3 0,049 7 0,219

4 0,075 8 0,229

Стационарная (8 часов) 1 0,436 5 0,397 0,574 0,560 ±0,113

2 0,54-3 6 0,412

3 0,604 7 0,726

4 0,627 8 0,734

Отмирания (17 часов) 1 0,534 5 0,560 0,517 0,465 ± 0,096

2 0,546 6 0,573

3 0,310 7 0,434

4 0,266 8 0,499

АОП - разность значений оптических плотностей анализируемой сыворотки и пула из девяти сывороток крови неиммунизированных кроликов - среднее арифметическое из четырех определений оптической плотности в ИФА

парата Колибактерин. и цельнокультуральные препараты из £ coli в разных фазах роста, а также сыворотки крови кроликов, которым вводились препараты из £ со// в разных фазах роста.

Процесс культивирования £. coli проходил в синтетической питательной среде Ледерберга в биореакторе «Марубиши» (Япония).

Б сыворотках изучали уровни lgG-антител против БТШ-70 человека и против БТШ-65 М. bovis (препараты фирмы Sigma, США). Последний препарат представлял собой синтетический пептид с определенной аминокислотной последовательностью.

В работе использовали иммуноферментные тест-системы, разработанные в ГУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН [7]. Результаты анализа выражали в величинах разности значений оптической плотности (АОП) между анализируемой сывороткой и контрольным пулом сывороток девяти неиммунизированных кроликов - среднее арифметическое из четырех определений оптической плотности в ИФА (отрицательный контроль). Изучаемые сыворотки были разделены на четыре группы в соответствии с фазами роста культур (фаза экспоненциального роста, фаза замедления скорости роста, стационарная фаза и фаза отмирания), из которых

готовили препараты для иммунизации кроликов. Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью автоматической компьютерной программы Microsoft Excel и пособия А.Е. Платонова [6].

Результаты и обсуждение

Изучена зависимость роста биомассы от времени процесса культивирования штамма £ со// М-17 в синтетической питательной среде Ледерберга в биореакторе «Марубиши», определены границы между фазами экспоненциального роста, замедления скорости роста, стационарной и отмирания, а также время взятия проб для дальнейшего изучения.

В таблице 1 представлены результаты изучения уровней lgG-антител против БТШ-65 М. bovis в сыворотках крови кроликов, иммунизированных препаратами из культур штамма £ coli М-17 в разных фазах роста. Видно, что средние арифметические АОП уровней lgG-антител зависят от фазы роста культуры, которой были иммунизированы кролики. Наименьшее значение средних арифметических АОП отмечается при использовании для иммунизации культуры в фазе экспоненциального роста (0,256), наибольшее (0,634) - в стационарной фазе.

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 1 (44)/2009

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 1 (44)/2009

Аналогичные данные в отношении антител против БТШ-70 человека представлены в таблице 2. Наименьшее значение из средних арифметических ДОП уровней lgG-антител против БТШ-70 человека выявляется при использовании культуры в фазе экспоненциального роста (0,178), а наибольшее (0,560) - в стационарной.

Далее мы изучили степень корреляционной связи между средними арифметическими АОП уровней lgG-антител против БТШ-65 М. bovis (0,256: 0,316; 0,634; 0,372) и против БТШ-70 человека (0,178; 0,435; 0,560; 0,465). Полученный коэффициент корреляции 0,795 свидетельствует о высокой степени корреляционной связи между этими показателями.

В таблицах 1 и 2 приведены также значения медиан ДОП уровней lgG-антител против БТШ-65 М. bovis и БТШ-70 человека в сыворотках крови кроликов, иммунизированных препаратами из культур £ coli в разных фазах роста. Видно, что эти показатели, соответствующие фазе экспоненциального роста (0,219; 0,158), значимо меньше аналогичных показателей, зафиксированных в стационарной фазе (0,646; 0,574).

Эти данные свидетельствуют о существенных различиях в содержании антигенов, имеющих гомологию с антигенами М. bovis и человека, в фазе экспоненциального роста и стационарной фазе культур £. coli и о преобла-

дании содержания этих антигенов в культурах в стационарной фазе.

Анализ корреляционной связи, проведенный нами в отношении медиан ДОП уровней lgG-антител против БТШ-65 М. bovis (0,219; 0,213; 0,646; 0,305) и БТШ-70 человека (0,158; 0,452; 0,574; 0,517), также показал достаточно высокую степень корреляционной связи между изученными величинами - 0,628.

Приведенные результаты согласуются с нашими предыдущими исследованиями В. pertussis и N. meningitidis, в которых показано, что эти бактерии в стационарной фазе перекрестно реагируют с антигенами других бактерий и человека [3, 5].

Выводы

Полученные результаты подтверждают на уровне антител гомологию между БТШ-70 человека и БТШ-65 М. bovis, то есть на модели сывороток крови кроликов, иммунизированных £ coli. Эти данные свидетельствуют в пользу гипотезы о роли взаимодействия БТШ бактерий и человека в этио-патогенезе аутоиммунных заболеваний. Однако для более обоснованного представления об этом процессе необходимы дальнейшие исследования корреляции между содержанием антител против БТШ бактерий и человека в сыворотках крови больных различными аутоиммунными заболеваниями. М

Резюме

Для изучения взаимосвязи между уровнями антител к БТШ бактерий и человека в сыворотках крови животных разработана экспериментальная модель - кролики, иммунизированные Е. coli, находящейся в разных фазах роста. Показано, что уровни lgG-антител против БТШ-65 М. bovis и БТШ-70 человека в сыворотках крови кроликов, иммунизированных культурами £ coli в стационарной фазе, значительно выше по сравнению с уровнями указанных антител в сыворотках крови кроликов, иммунизированных культурами £ coli в фазе экспоненциального роста. Установлена высокая степень корреляции между уровнями lgG-антител против БТШ-65 М. bovis и БТШ-70 человека в изученных сыворотках. Коэффициент корреляции между средними арифметическими АОП уровней lgG-антител против указанных антигенов разных фаз роста £ coli составил 0,795, а между соответствующими медианами - 0,628.

Таким образом, на экспериментальной модели на уровне антител получено подтверждение гомологии БТШ бактерий и человека, что имеет значение в исследованиях ее роли в аутоиммунной патологии.

Summary

To study of the relationship between the levels of antibodies to bacterial and human heat shock proteins (HSP) in animal sera we used rabbits, immunized by culture of Escherichia coli of different growth phases as experimental model. We demonstrated, that levels of IgG-antibodies against HSP 65 Mycobacterium bovis and human HSP 70 in sera of rabbits immunized by stationary phase cultures of E. coli, significantly higher compare to the levels of such antibodies in sera of rabbits immunized by exponential phase cultures of E. coli.

Дни памяти

High correlation between IgG-antibody levels against HSP 65 M, bovis and human HSP 70 in studied sera was established. Correlation coefficient between arithmetical means of levels of IgG-antibodies (A OD) against the E. coli antigens from different growth phases was 0.795, and between corresponded medians - 0.628.

Thus, on the experimental model included antibodies, the confirmation of homology between bacterial and human HSP was received. This fact may be important in the research of the homology role in autoimmune pathology.

Литература

1. Арзуманян A.O., Баснакьян И.А., Машилов С.К. Белки теплового шока бактерий и «ошибки» иммунной системы // Эпид. и вакцинопроф.

2007. № 3. С. 28 - 31.

2. Баснакьян И.А. Стрессу бактерий. - М.: Медицина, 2003. - 135 с.

3. Баснакьян И.А., Алексахина Н.Н., Ястребова Н.Е., Ванеева Н.П. Менингококк в состоянии стресса перекрестно реагирует с антигенами других бактерий и человека // Эпидемиол. и инф. бол. 2005. № 3. С. 9 -14.

4. Баснакьян И.А., Машилов С.К., Арзуманян А.О. Белки теплового шока бактерий: будущие вакцины или триггеры аутоиммунных заболеваний // Эпидемиол. и инф. бол. 2007. № 4. С. 39 - 42.

5. Баснакьян И.А., Алексахина Н.Н., Сюндюкова RA. и др. Коклюшный токсин и перекрестно реагирующие антигены в динамике культивирования Bordetella pertussis //Журн. микробиол. 2007. № 5. С. 54 - 57.

6. Платонов А.Е. Статистический анализ в медицине и биологии: задачи, терминология, логика, компьютерные методы. - М.: Изд-во РАМН, 2000. - 52 с.

7. Ястребова Н.Е. Результаты мониторинга антибактериальных и проти-вотканевых антител у людей в норме и при различных заболеваниях // Журн. микробиол. 2007. № 3. С. 42 - 47.

8. Andrie R., Braun R, Welsch U. et al. Chlamidial and humanheat shock protein 60 homologues in acute coronary syndromes. Autoimmune reactions as a link between infection and atherosclerosis // J. Kardiol. 2003 Jun. V. 92. № 6. P. 455 - 465.

9. Bason C., Corrocher R., Lunardi C. Interaction of antibodies against cytomegalovirus with heat-shock protein in pathogenesis of atherosclerosis // Lancet. 2003 Dec. 13. V. 362. № 9400. P. 1949,1950.

10. Bardwell L.C.A., Craig E.A. Major heat shock gene of Drosophila and the Escherichia coli heat inducible dnaK gene are homologue // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. V. 81. R 848 - 852.

11. Bardwell L.C.A., Craig E.A. Eukaryotic Mr 83,000 heat shock protein has a homologgue in Escherichia coli // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. P. 5177 - 5181.

12. Lamb J., El-Sankary W., Ferns G.A. Molecular mimicry in atherosclerosis: a role of heat shock protein in immunization // Atherosclerosis. 2003. V. 167. №. 2. P. 177 - 185.

13. Lindquists., Craig E.A. The Heat-shock proteins //Ann. Rev. Genet. 1988. № 22. P. 631 - 677.

14. Multhoff G. Heat shock proteins in immunity // Handb. Exp. Pharmacol. 2006. № 172. R 279 - 304.

15. Pershinka H., Mayr M., Millonig G. et al. Cross-reactive B-cell epitopes of microbioal and human heat shock protein 60/65 in atherosclerosis //Ar-terioscler. Thromb. Vase. Boil. 2003. V. 23. № 6. P. 1060 - 1065.

16. Wick G. Atherosclerosis - an autoimmune disease due to an immune reaction against heat-shock protein 60 // Herz. 2000 Mar. V. 25. № 2. P. 87 - 90.

17. Xu Q. Role of heat shock proteins in atherosclerosis // Arterioscler. Tromb. Vase. Biol. 2002 Oct. 1. V. 22. № 10. P. 1547 - 1559.

18.Yokota S., Minota S., Fujii N. Anti-HSP auto-antibodies enhance HSP-induced pro-inflammatory cytokine production in human monocytic cells via Toll-like receptors // International Immunology. 2006 Apr. V. 18. № 4. P. 573 - 580.

19.Zlacka D., Vavrincova P., Hien Nguyen T.T., Hromadnikova I. Frequency of anti-hsp60, -65 and -70 antibodies in sera of patients with juvenile idiopathic arthritis // Journal of Autoimmunity. 2006 Sep. V. 27. № 2. P. 81 - 88.

К 75-летию со дня рождения Заслуженного деятеля науки РФ, академика РАМН Бениямина Лазаревича ЧЕРКАССКОГО

Теоретическое наследие академика Б.Л. Черкасского в деятельности кафедры эпидемиологии медико-профилактического факультета последипломного профессионального образования ММД им. И.М. Сеченова

Е.Г. Симонова

ГОУ «ВПО «ММА им. И.М. Сеченова

Жизненный и творческий путь академика Б.Л. Черкасского является ярким примером беззаветного служения одной из самых благородных и непреходящих профессий на Земле - профессии эпидемиолога.

», Москва

Последнее десятилетие жизни и деятельности ученого было теснейшим образом связано с кафедрой эпидемиологии медико-профилактического факультета последипломного профессионального образования (МПФ ППО) Московской медицинской

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 1 (44)/2009