Распределенный синтетический генный осциллятор

Математическое моделирование. Оптимальное управление Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского,2014, № 4 (1), с. 464-469

УДК 537.86, 537.87, 530.182

РАСПРЕДЕЛЕННЫЙ СИНТЕТИЧЕСКИЙ ГЕННЫЙ ОСЦИЛЛЯТОР © 2014 г. Т.В. Лаптева, А.И. Калякулина, М.В. Иванченко

Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского ^апсЬепко. mv@gmail.com

Поступили с ррдчкцию 11.07.2014

В настоящее время сложность синтетических контуров генной регуляции, которые могут быть встроены в живую клетку, весьма ограничена. В работе предложена и исследована математическая модель распределенного генного осциллятора, в котором за счет использования двух популяций клеток удается понизить число синтетических генов в клетке, что потенциально освобождает место для дополнительных функциональных генов. Показана возможность возникновения автоколебаний, исследована зависимость порога от параметров системы, продемонстрирована возможность синхронизации различных центров колебаний в модели неоднородных планарных клеточных культур.

Ключрсыр слосч: нелинейная динамика, синтетические генные сети, синхронизация.

Введение

Создание регуляторных генных контуров внутри живой клетки, которые могут выполнять заданную функцию, является одной из основных задач синтетической биологии [1—3]. Эта задача требует изучения возможных сложных динамических режимов и возможностей управления ими [4]. Результаты исследований многогранны; они как раскрывают фундаментальные принципы генной регуляции в естественных генных сетях, так и указывают на способы создания биосенсоров и «клеточных машин» для производства биотоплива, лекарственных компонент, переработки органических отходов [5-7].

В последнее десятилетие был достигнут существенный прогресс в разработке синтетических генных осцилляторов, переключателей (бистабильных элементов), способов межклеточной коммуникации и клеточных вычислений [4, 8-13]. Вместе с тем, до сих пор остается ограниченным число привнесенных в клетку генетических конструктов. Воплощение более сложных систем генной регуляции по-прежнему является практически непреодолимой проблемой, не говоря о реализации полезной функциональной нагрузки, управляемой сложной динамикой.

Недавно возможности организации более сложных систем, открывающиеся за счет взаимодействия между контурами в различных клетках, были подмечены и использованы для реализации различных логических операций в объединенных популяциях клеток [14, 15]. В настоящей работе на основе аналогичного подхода предложена и исследована математическая модель распределенного генного осциллятора.

Для этого колебательный контур разделен между популяциями клеток-«репрессоров» и кле-ток-«активаторов», взаимодействие между которыми осуществляется посредством молекулярного «кворум-сенсинга». Отметим, что режим автоколебаний в этой модели достигается исключительно за счет генной динамики, в отличие от ранее изученной синтетической системы «хищник-жертва», где генная регуляция модулировала плотность клеток через активацию их гибели [16].

Исследование динамики сформулированной модели позволило определить условия возбуждения автоколебаний, в том числе, в зависимости от величин плотности популяций клеток, получить зависимость частоты колебаний от ряда параметров системы и, наконец, показать возможность синхронизации колебаний в пла-нарной геометрии пространственно-неоднородных колоний клеток.

Математическая модель

Предлагаемая схема генного контура представлена на рис. 1 и состоит из клеток типа А (репрессоры) и В (активаторы). Гены 1их11 и 1их12 принадлежат к одному семейству и участвуют в синтезе молекул межклеточной коммуникации АЫЬ1 и АЫЬ2 соответственно. Эти молекулы достаточно малы, и свободно проходят сквозь мембрану клетки, насыщая межклеточное пространство, и проникают в соседние клетки, где образуют комплексы с соответствующими белками семейства ЬихЯ (не показаны на диаграмме). Эти комплексы обладают регу-ляторными свойствами и активируют экспрес-

сию генов, на которые воздействуют. В клетках типа А усиливается экспрессия гена ¡ихН, в то время как в клетках типа В усиливается экспрессия промежуточного гена ¡ас1, который, в свою очередь, репрессирует экспрессию гена ¡их12. В итоге клетки типа А являются репрес-сорами генного контура клеток типа В, а клетки типа В - активаторами генного контура клеток типа А. Для визуализации в эксперименте можно добавить гены флуоресцентных белков разного цвета в тандем к генам ¡их11 и ¡их12 (УГР и СРГ соответственно).

Математическая модель, описывающая динамику данного контура, в безразмерной форме имеет следующий вид:

Я № + Г

о х =-- - х,

1 + ух

0 а = Ьп1 х — уа + БАа,

д,У =

1

1 + (l / L)m

У,

д l

д ,г

l„

1 + а,

--l,

= Ъп2 y — jr + DAr.

тора - ¡РТв. Параметры Ь1 и Ь2 задают скорость синтеза АНЬ в клетке; п1 и п2 - соответствующие плотности клеток. Отметим, что плотность каждой из популяций клеток может быть (а в эксперименте - всегда является) функцией пространственных координат.

Пространственно-однородные решения

Рассмотрим сначала приближение пространственно-однородного распределения плотности популяций клеток. В этом случае уравнения (1) допускают пространственно-однородные решения. Исследуем динамику сосредоточенной системы, получаемой из (1) обнулением диффузионных членов:

д ,x =

Ц + r,

— x,

1 + r, д ta = Ъпх x — ja,

д 1

д ,У = -:

1 + (l / L)4

д; = l„ —l,

У,

Здесь динамические переменные представляют собой безразмерные концентрации: x и y - белков LuxI1 и LuxI2, l - белка LacI в клетках типа B, а и r - концентрации молекул кворум-сенсинга AHL1 и AHL2. Параметрами модели являются: m=4 - степень олигомеризации ре-прессора LacI, (х~„.„1 - т.н. «протечка» промоторов, у - константа деградации AHL (нормированная на константу деградации LuxI), D -коэффициент диффузии AHL, A - лапласиан, индекс , обозначает задержку во времени, которая складывается из характерных времен диффузии молекул AHL через мембрану клетки, образования комплексов AHL-LuxR, синтеза и активации белков. Величина l„ отвечает насыщенной концентрации LacI при полностью активированном промоторе, L - восприимчивости промотора гена luxI2 к LacI. В эксперименте l„ может целенаправленно изменяться, например, путем изменения числа копий гена lacI, а L - изменением концентрации специального индук-

1 + а

0 г = Ьп2 у — уг. Решая задачу на состояния равновесия си стемы (2) путем исключения переменных, можно получить следующее уравнение для ¡ :

§- (2 + ¡„Ц)5 — ^ („ + в2 )4 +

+

— ¡„ ((„ + Ц(в^„ + в2 + Р1Р2))= „,

у

где 2 =-. Принимая во внимание неотри-

пх 2Ь

цательность параметров модели, несложно показать, что полином (3) всегда имеет один и только один положительный вещественный корень. Таким образом, система (2) всегда обладает единственным состоянием равновесия, а подходящим сценарием возникновения автоколебаний могла бы стать бифуркация Андронова-Хопфа.

Поскольку аналитическое исследование устойчивости этого состояния равновесия не

ц + а,

Рис. 2. Зависимость максимальной действительной части характеристических показателей состояния равновесия Я.е X от времени задержки и восприимчивости к репрессору Ьас1. Положительные значения отвечают режиму автоколебаний. Здесь п1 = 1, п2 = 1, Ь = 2, 10 = 2

представляется возможным, был проведен численный анализ собственных чисел матрицы линеаризации, который дал следующие результаты:

• в отсутствие задержки (т = 0) рождение

предельного цикла возможно только при нулевой «протечке» промоторов (ц = 0) и малых

величинах восприимчивости L << 1;

• учет задержки (т Ф 0) позволяет получить автоколебания в широком диапазоне параметров, см. рис. 2.

Исследование устойчивости пространственно-однородных решений исходного уравнения (1) по отношению к пространственно-неоднородным возмущениям вида ж exp(ikR) показывает, что в данном случае развивается длинноволновая неустойчивость с наибольшим инкрементом для k = 0 . (Легко видеть, что подстановка в (1) приводит к увеличению эффективной деградации AHL у=у + k2, минимизируемой k = 0 .) Таким образом, автоколебания, возбуждающиеся в случае пространственно-однородной среды, также пространственно-однородны.

Интересным обстоятельством является величина плотности клеток популяций как бифуркационного параметра. Действительно, для возникновения автоколебаний необходимо одновременное присутствие двух типов клеток. Насколько сильно могут отличаться их относительные доли? Численное моделирование показывает, что автоколебания могут возникать при сильной диспропорции: например, всего 10%

клеток типа В достаточно для реализации автоколебательного режима (рис. 3). Таким образом, данная система может рассматриваться как своего рода биосенсор присутствия, начинающий генерировать периодические колебания флуоресценции при появлении клеток фенотипа А в концентрации, превышающей порог чувствительности.

Пространственно-неоднородная система

В реальности распределение клеток в пространстве может оказаться существенно неоднородным - в результате самостоятельной эволюции или намеренной конфигурации эксперимента. В этом случае среда будет обладать различными локальными свойствами: быть локально не осцилляторной или осцилляторной, частоты колебаний могут быть различны. В этой связи естественным образом встает задача о синхронизации колебаний в разных точках пространства. Этот вопрос напрямую связан с оценкой робастности предложенного распределенного генного осциллятора: способно ли взаимодействие клеток нивелировать влияние пространственной неоднородности на частоту результирующих колебаний?

Рассмотрим сначала случай двух взаимодействующих центров колебаний. (Здесь и далее в численных экспериментах уравнение (1) было дискретизировано на пространственной решетке N х N, N = 25 ; динамика отдельного узла, таким образом, подчинялась системе дифференциальных уравнений (2).) Зададим плотность клеток типа А в узлах в центре решетки,

0.7-

0.6-

0.3 -

0.2 -

0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16

»2

Рис. 3. Зависимость наблюдаемых величин концентрации белка Ьих11 (переменная х) от плотности клеток типа В («активаторов»). Здесь п1 = 1, Ь = 2, 10 = 2, % = 2

0.381-т-т-т-т-

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

D

Рис. 4. Зависимость наблюдаемых средних частот колебаний и переход к синхронизации в пространственно-дискретной версии модели (1) от коэффициента диффузии, % = 2 , Ь = 0.5 , Ь = 2, 10 = 2 . Основной график: случайные величины плотности клеток в узлах пространственной решетки п12 е [0.2; 1.0]. Вставка: плотность клеток типа А в двух узлах в центре решетки п1 = 0.2 и п1 = 1.0, в остальных узлах п1 = 0.01, везде п2 = 1, частоты в этих узлах обозначены <вт1 и <в р1

разделенных одним промежуточным узлом, равной п1 = 0.2 и п1 = 1.0 соответственно, а в остальных узлах п1 = 0.01. При прочих параметрах % = 2, Ь = 0.5, Ь = 2, 10 = 2, п2 = 1 в

двух центрах неоднородности реализуется локально колебательный режим с различными частотами, а основная часть среды находится в неколебательном, пассивном режиме. На рис. 4

(вставка) показана зависимость наблюдаемых средних частот в центрах автоколебаний от коэффициента диффузии D молекул «кворум-сенсинга» AHL, который, фактически, играет роль силы взаимодействия. Наблюдается переход к синхронизации двух центров при увеличении коэффициента диффузии. Интересно, что частоты колебаний возрастают с увеличением D . Обратившись к случайному пространствен-

ному распределению плотностей клеток обоих типов п12 е[„.2; 1.„] при прежних остальных

параметрах, мы также наблюдаем переход к синхронизованным колебаниям при увеличении коэффициента диффузии (рис. 4).

Заключение

В статье предложена математическая модель распределенного синтетического генного осциллятора, отдельные гены которого находятся в клетках двух различных типов - «активаторов» и «репрессоров» - и взаимодействуют посредством «ортогональных» сигналов «кворум-сенсинга», молекул, свободно проникающих через клеточную мембрану. В случае пространственно-однородной системы показано, что единственное нетривиальное состояние равновесия может терять устойчивость в результате бифуркации Андронова-Хопфа, что приводит к рождению устойчивого предельного цикла. Для уверенного наблюдения автоколебательного режима в пространстве параметров системы математическая модель должна учитывать задержку по времени, биологическая природа которой заключается в многоступенчатости процесса синтеза белков, а также в диффузии сигнальных молекул через мембрану, во внутриклеточном и межклеточном пространстве. В случае пространственных неоднородностей при достаточно большом коэффициенте диффузии устанавливается режим взаимной синхронизации колебаний между локальными центрами, частота которых, вообще говоря, различна.

Таким образом, предложенную схему распределенного синтетического генного осциллятора можно рекомендовать для реализации в биологическом эксперименте. Полученные результаты свидетельствуют не только о возможности генерации автоколебаний за счет генной кросс-регуляции в двух различных клеточных популяциях, но и надежности этой системы с точки зрения устойчивости к различного рода возмущениям, которые могут возникать в реальных условиях: локальных вариаций плотности клеток или сильной диспропорции популяций. Поскольку одновременное присутствие клеток обоих типов является необходимым условием возбуждения автоколебаний, данная схема может рассматриваться как своеобразный клеточный биосенсор, реагирующий на появление в гомогенной колонии клеток второго типа периодическими колебаниями флуоресцирующего белка.

Дальнейшие направления математических исследований включают более детальное рас-

смотрение процессов структурообразования, а также выяснение роли популяционной динамики и диффузии клеток.

Результаты получены при поддержке РФФИ, грант № 13-02-00918.

Список литературы

1. Jacob F., Monod J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins //Journal of molecular biology. 1961. V. 3. №. 3. P. 318-356.

2. Nandagopal N., Elowitz M.B. Synthetic biology: integrated gene circuits //Science. 2011. V. 333. V. 6047. P. 1244-1248.

3. Rollie S., Mangold M., Sundmacher K. Designing biological systems: systems engineering meets synthetic biology //Chemical Engineering Science. 2012. V. 69. № 1. P. 1-29.

4. O'Brien E.L., Van Itallie E., Bennett M.R. Modeling synthetic gene oscillators //Mathematical biosciences. 2012. V. 236. № 1. P. 1-15.

5. Lu T.K., Collins J.J. Engineered bacteriophage targeting gene networks as adjuvants for antibiotic therapy // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2009. V. 106. № 12. P. 4629-4634.

6. Lee S.K. et al. Metabolic engineering of microorganisms for biofuels production: from bugs to synthetic biology to fuels //Current opinion in biotechnology. 2008. V. 19. № 6. P. 556-563.

7. Sayler G.S., Simpson M.L., Cox C.D. Emerging foundations: nano-engineering and bio-microelectronics for environmental biotechnology //Current opinion in microbiology. 2004. V. 7. № 3. P. 267-273.

8. Gardner T.S., Cantor C.R., Collins J.J. Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli //Nature. 2000. V. 403. № 6767. P. 339-342.

9. Elowitz M.B., Leibler S. A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators //Nature. 2000. V. 403. № 6767. P. 335-338.

10. Stricker J. et al. A fast, robust and tunable synthetic gene oscillator //Nature. 2008. V. 456. № 7221. P. 516-519.

11. Danino T. et al. A synchronized quorum of genetic clocks // Nature. 2010. V. 463. № 7279. P. 326-330.

12. Anderson J.C., Voigt C.A., Arkin A.P. Environmental signal integration by a modular AND gate //Molecular systems biology. 2007. V. 3. № 1. Article number 133. P. 1-8.

13. Levskaya A. et al. Synthetic biology: engineering Escherichia coli to see light //Nature. 2005. V. 438. № 7067. P. 441-442.

14. Tamsir A., Tabor J.J., Voigt C.A. Robust multi-cellular computing using genetically encoded NOR gates and chemical wires //Nature. 2011. V. 469. № 7329. P. 212-215.

15. Regot S. et al. Distributed biological computation with multicellular engineered networks // Nature. 2011. V. 469. № 7329. P. 207-211.

16. Balagadde F.K. et al. A synthetic Escherichia coli predator-prey ecosystem // Molecular Systems Biology. 2008. V. 4. P. 187.

DISTRIBUTED SYNTHETIC GENE OSCILLATOR T.V. Lapteva, A.I. Kalyakulina, M. V. Ivanchenko

Today the complexity of synthetic gene regulatory circuits that can be embedded into a cell is quite limited. This article develops and studies a mathematical model of a distributed gene oscillator that can reduce the number of synthetic genes in the cell through the use of two cell populations, which potentially frees up space for additional functional genes. A possible onset of self-oscillations is shown, the dependence of the threshold on the system parameters is studied, and the ability to synchronize the various centers of oscillations in the model of inhomogeneous planar cell cultures is demonstrated.

Keywords: nonlinear dynamics, synthetic gene networks, synchronization.

References

1. Jacob F., Monod J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins //Journal of molecular biology. 1961. V. 3. №. 3. P. 318-356.

2. Nandagopal N., Elowitz M.B. Synthetic biology: integrated gene circuits //Science. 2011. V. 333. V. 6047. P. 1244-1248.

3. Rollie S., Mangold M., Sundmacher K. Designing biological systems: systems engineering meets synthetic biology //Chemical Engineering Science. 2012. V. 69. № 1. P. 1-29.

4. O'Brien E.L., Van Itallie E., Bennett M.R. Modeling synthetic gene oscillators //Mathematical biosciences. 2012. V. 236. № 1. P. 1-15.

5. Lu T.K., Collins J.J. Engineered bacteriophage targeting gene networks as adjuvants for antibiotic therapy // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2009. V. 106. № 12. P. 4629-4634.

6. Lee S.K. et al. Metabolic engineering of microorganisms for biofuels production: from bugs to synthetic biology to fuels //Current opinion in biotechnology. 2008. V. 19. № 6. P. 556-563.

7. Sayler G.S., Simpson M.L., Cox C.D. Emerging foundations: nano-engineering and bio-microelectronics for environmental biotechnology //Current opinion in microbiology. 2004. V. 7. № 3. P. 267-273.

8. Gardner T.S., Cantor C.R., Collins J.J. Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli //Nature. 2000. V. 403. № 6767. P. 339-342.

9. Elowitz M.B., Leibler S. A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators //Nature. 2000. V. 403. № 6767. P. 335-338.

10. Stricker J. et al. A fast, robust and tunable synthetic gene oscillator //Nature. 2008. V. 456. № 7221. P. 516-519.

11. Danino T. et al. A synchronized quorum of genetic clocks // Nature. 2010. V. 463. № 7279. P. 326-330.

12. Anderson J.C., Voigt C.A., Arkin A.P. Environmental signal integration by a modular AND gate //Molecular systems biology. 2007. V. 3. № 1. Article number 133. P. 1-8.

13. Levskaya A. et al. Synthetic biology: engineering Escherichia coli to see light //Nature. 2005. V. 438. № 7067. P. 441-442.

14. Tamsir A., Tabor J.J., Voigt C.A. Robust multicellular computing using genetically encoded NOR gates and chemical wires //Nature. 2011. V. 469. № 7329. P. 212-215.

15. Regot S. et al. Distributed biological computation with multicellular engineered networks // Nature. 2011. V. 469. № 7329. P. 207-211.

16. Balagadde F.K. et al. A synthetic Escherichia coli predator-prey ecosystem // Molecular Systems Biology. 2008. V. 4. P. 187.