СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ 8-(ТРИФТОРМЕТИЛ)БЕНЗО[F][1,2,3,4,5]ПЕНТАТИЕПИН-6-АМИНА ГИДРОХЛОРИДА В БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ
METHOD OF QUANTITATIVE DETERMINATION OF 8-(TRIFLUOROMETHYL)BENZO[f][1,2,3,4,5]PENTATHIEPIN-6-AMINE HYDROCHLORIDE IN BIOLOGICAL MEDIA

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Изобретение относится к области медицины, а именно к патофизиологии, фармакологии и токсикологии, и может быть использовано для определения 8-(трифторметил)бензо[f][1,2,3,4,5]пентатиепин-6-амина гидрохлорида в биологических средах, в том числе в крови млекопитающих.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Производное бензопентатиепина - 8-(трифторметил)бензо[f][1,2,3,4,5]пентатиепин-6-амина гидрохлорид является действующим веществом разрабатываемого лекарственного средства - антидепрессанта.
Одной из актуальных задач при разработке нового лекарственного средства является изучение его фармакокинетики с целью оценки всасывания, распределения, метаболизма и экскреции у животных и человека. Для проведения исследований фармакокинетики требуется разработать биоаналитическую методику количественного определения действующего вещества в биологических средах, в частности в плазме крови. Для количественного определения действующего вещества в плазме крови как правило используются хроматографические методы, обладающие специфичностью, высокой чувствительностью, точностью и воспроизводимостью.
Одним из самых распространенных для изучения фармакокинетики лекарственного средства является метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием различных детекторов, который обладает рядом преимуществ по сравнению с другими методами, а именно: высокой чувствительностью, которая позволяет определять микроколичества вещества и высокой скоростью анализа.
В настоящее время не существует способов количественного определения 8-(трифторметил)бензо[f][1,2,3,4,5]пентатиепин-6-амина гидрохлорида в биологических средах. Для поиска возможных прототипов проведен анализ сведений о методах определения бензопентатиепина и его производных. Описаны методы определения бензодиазепина.
Известен принятый за прототип способ количественного определения другого биологически активного вещества - гистамина, с использованием метода ВЭЖХ, в котором используют в качестве элюэнта смесь 0,1 М раствора дигидрофосфата натрия и ацетонитрила при градиенте концентрации последнего от 0 до 50% и скорости подачи потока элюента 90 мкл/мин, объеме элюирования 1500 мкл, температуре хроматографической колонки 35°С, детекцию проводят при длине волны 210 нм. (патент RU №2302632, МПК G01N 33/50 (2006.01), опуб. 10.07.2007). Однако для определения 8-(трифторметил)бензо[f][1,2,3,4,5]пентатиепин-6-амина гидрохлорида данный способ не применим вследствие отличий его химической структуры и физико-химических свойств от прототипа.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Предлагаемое изобретение решает задачу разработки нового высокоэффективного способа количественного определения лекарственного средства на основе 8-(трифторметил)бензо[f][1,2,3,4,5]пентатиепин-6-амина гидрохлорида в биологических средах.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Поставленная задача решается способом количественного определения 8-(трифторметил)бензо[f][1,2,3,4,5]пентатиепин-6-амина гидрохлорида в биологических средах, включающем экстракцию определяемого вещества 0,4% раствором муравьиной кислоты в ацетонитриле, с последующим определением его методом высокоэффективной жидкостной хромато-масс-спекторметрии с изократическим режимом элюирования с использованием в качестве подвижной фазы смеси раствора трифторуксусной кислоты и 0,1% раствора муравьиной кислоты в метаноле в соотношении 20:80.
Наиболее оптимальными, но не необходимыми режимами высокоэффективной жидкостной хроматографии при этом являются:
скорость подачи потока элюента
- 0,15 мл/мин;
объем вводимой пробы
- 20 мкл;
детектор
- тандемный масс-спектрометрический;
время анализа
- 10 мин;
температура термостата колонки
- 35°С.
Отсутствие источников информации, содержащих ту же совокупность признаков, что и в разработанном способе, сообщает ему соответствие критерию «новизна».
Та же совокупность признаков позволяет получить новый непредсказуемый эффект - разработка высокоэффективного способа количественного определения в биологических средах нового лекарственного средства 8-(трифторметил)бензо[f][1,2,3,4,5]пентатиепин-6-амина гидрохлорида (далее субстанция ТС) и, таким образом, сообщает ему соответствие критерию «изобретательский уровень».
Проведение количественного определения нового лекарственного средства с использованием известного оборудования с помощью известных препаратов сообщает разработанному способу соответствие критерию «промышленная применимость».
Таким образом, разработанный способ соответствует всем 3 критериям охраноспособности изобретения и может быть квалифицирован как изобретение.
Пример 1. Подбор условий хромато-масс-спектрометрического анализа
Определение действующего вещества ТС в биологических средах проводили методом ВЭЖХ/МС/МС на масс-спектрометре QTRAP 3200 (АВ Sciex, США) в комплексе с жидкостным хроматографом LC-20AD (Shimadzu, Япония).
Приготовление подвижной фазы А (ПФ А)
В мерную колбу вместимостью 2 л помещали 200 мкл трифторуксусной кислоты, доводили объем раствора водой очищенной до метки и перемешивали.
Приготовление подвижной фазы Б (ПФ Б)
В мерную колбу вместимостью 1 л помещали 1 мл муравьиной кислоты, доводили объем раствора водой очищенной до метки и перемешивали.
Приготовление субстанции ТСс концентрацией 0,1 мг/мл
Около 0,01 г (точная навеска) субстанции ТС помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 50 мл метанола и перемешивали до полного растворения. Объем раствора доводили тем же растворителем до метки и перемешивали.
Приготовление исходных градуировочных растворов субстанции ТС
Из раствора субстанции ТС с концентрацией 0,1 мг/мл методом параллельно-последовательного разбавления готовили растворы ТС с концентрациями 1000, 1250, 2500, 5000, 10000 и 25000 нг/мл.
Подбор масс-спектрометрических условий
Раствор субстанции ТС с концентрацией 500 нг/мл анализировали методом масс-спектрометрии при прямом вводе (без использования хроматографа) для получения полного масс-спектра.
При анализе данного раствора в режиме Q1 (простое сканирование масс) в диапазоне 50-400 Да получили полный масс-спектр (представлен отдельным документом) с интенсивным ионом с m/z 255,2, соответствующий молекуле ТС после потери двух атомов серы. При фрагментации этого иона в режиме низкой энергии соударения (СЕ=10 V) наблюдается образование осколков с m/z=235,2 и 191,2.
С целью получения наиболее интенсивных ионов-фрагментов проводили оптимизацию параметра СЕ (Collision Energy), в результате чего установили оптимальное значение данного показателя.
Исходя из проведенных экспериментов, количественное определение ТС в образцах крови проводили по MRM-переходу 255,2→191,3.
Приготовление градуировочных растворов ТС в крови животных
В заранее приготовленные пробирки типа Эппендорф взвешивали по 100±5 мг солей и сорбента из набора QuEChERS VetExQ-tox. В пластиковую центрифужную микропробирку типа Эппендорф помещали 90 мкл холостой крови животного, стабилизированной цитратным буфером, прибавляли 10 мкл исходного градуировочного раствора субстанции ТС соответствующей концентрации и перемешивали на встряхивателе при 2000 об/мин в течение 10 мин. Приготовленный модельный образец крови, содержащий ТС, выдерживали при температуре +4°С в течение 1 ч. Затем к модельному образцу крови прибавляли 500 мкл экстрагента (0,4% раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле) и перемешивали на встряхивателе при 4000 об/мин в течение 0,5 мин. Затем к смеси прибавляли заранее приготовленную соль и перемешивали на встряхивателе при 4000 об/мин в течение 0,5 мин. Полученный раствор центрифугировали при 12350 g в течение 10 мин. Отбирали органический слой и переносили его в другую микропробирку типа Эппендорф, прибавляли заранее приготовленный сорбент и перемешивали на встряхивателе при 4000 об/мин в течение 0,5 мин. Затем раствор центрифугировали при 12350 g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость (супернатант) переносили в другую микропробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл и упаривали в вакуумном концентраторе без нагрева до сухого остатка. К сухому остатку прибавляли 80 мкл метанола, перемешивали на встряхивателе при 2000 об/мин в течение 0,5 мин, затем прибавляли 20 мкл воды очищенной и перемешивали на встряхивателе при 2000 об/мин в течение 20 мин. Пробирку центрифугировали при 12350 g в течение 10 мин, надосадочную жидкость отбирали и анализировали методом ВЭЖХ/МС/МС.
Подготовка образцов крови животных, содержащих ТС
В заранее приготовленные пробирки типа Эппендорф взвешивали по 100±5 мг солей и сорбента из набора QuEChERS VetExQ-tox. В пластиковую центрифужную микропробирку типа Эппендорф помещали 100 мкл крови животного, стабилизированной цитратным буфером, прибавляли 500 мкл экстрагента (0,4% раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле) и перемешивали на встряхивателе при 4000 об/мин в течение 0,5 мин. Затем к смеси прибавляли заранее приготовленную соль и перемешивали на встряхивателе при 4000 об/мин в течение 0,5 мин. Полученный раствор центрифугировали при 12350 g в течение 10 мин. Отбирали органический слой и переносили его в другую микропробирку типа Эппендорф, прибавляли заранее приготовленный сорбент и перемешивали на встряхивателе при 4000 об/мин в течение 0,5 мин. Затем раствор центрифугировали при 12350 g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость (супернатант) переносили в другую микропробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл и упаривали в вакуумном концентраторе без нагрева до сухого остатка. К сухому остатку прибавляли 80 мкл метанола, перемешивали на встряхивателе при 2000 об/мин в течение 0,5 мин, затем прибавляли 20 мкл воды очищенной и перемешивали на встряхивателе при 2000 об/мин в течение 20 мин. Пробирку центрифугировали при 12350 g в течение 10 мин, надосадочную жидкость отбирали и анализировали методом ВЭЖХ/МС/МС.
Хроматографические условия
15.1.2.9 Масс-спектрометрические условия
Полярность:
положительная;
Источник ионов:
турбоэлектроспрей;
Газ завесы:
азот, 40 psi;
Напряжение источника ионов:
5500 В;
Температура источника ионов:
100°С;
Газ источника:
воздух, 20 psi;
Отводимый газ:
воздух, 20 psi;
Режим: MRM
Количественное определение ТС в образцах крови животных проводили по MRM-переходу m/z 255.2 → 191.3.
Пример 2. Оценка нижнего предела количественного определения субстанции ТС в крови
Нижний предел количественного определения представляет собой минимальную концентрацию анализируемого вещества в образце, которая может быть количественно определена с требуемой правильностью и прецизионностью.
Для установления нижнего предела количественного определения использовали соотношение сигнал/шум. Сравнивали величины сигналов, полученные для контрольного опыта (при отсутствии анализируемого вещества) и для образца с низкой концентрацией анализируемого вещества. Для нижнего предела количественного определения величина отношения сигнал/шум должна составлять не менее 10/1.
Результаты оценки соотношения сигнал/шум для нижнего предела количественного определения ТС в крови животных приведены в таблице 1.
Соотношение сигнал/шум для пика ТС в образцах крови крыс с концентрацией 100 нг/мл составляет около 20/1, следовательно, концентрация равная 100 нг/мл является нижним пределом количественного определения субстанции ТС в образцах крови животных.
Пример 3. Оценка линейности количественного определения субстанции ТС в крови
Линейность - это способность методики давать величины, прямо пропорциональные концентрации (количеству) анализируемого вещества в образце. Для построения градуировочной кривой анализировали модельные образцы крови крыс, содержащие ТС в концентрациях 100, 125, 250, 500, 1000 и 2500 нг/мл, в таблице 2 представлены полученные результаты.
Уравнение градуировочной кривой имеет вид: у=22,36 х + 3382.
Критерий приемлемости: квадрат коэффициента корреляции градуировочной кривой должен быть не менее 0,990. Полученные результаты удовлетворяют данному критерию, значение квадрата коэффициента корреляции составляет 0,994.
Таким образом, подтверждена линейность биоаналитической методики в диапазоне концентраций от 100 до 2500 нг/мл. Рассматриваемый диапазон пригоден для количественного определения ТС в крови.
Пример 4. Оценка правильности и повторяемости количественного определения субстанции ТС в крови.
Для оценки правильности и повторяемости анализировали 3 серии модельных образцов крови крыс, содержащих ТС в концентрациях: 300, 1250 и 2000 нг/мл, рассчитывая при этом количественное содержание по градуировочному графику. Для полученных значений концентраций была рассчитана величина относительного стандартного отклонения (RSD, %). Результаты определения правильности и повторяемости приведены в таблице 3.
Полученные значения правильности лежат в диапазоне 94,9-101,4%, что соответствует требованиям (85-115%), величины относительного стандартного отклонения также соответствуют требованиям - не более 15%.
В результате проведенных экспериментов доказано, что разработанная биоаналитическая методика количественного определения ТС в крови животного обладает требуемой правильностью и повторяемостью.
Как видно из приведенных примеров, предлагаемое изобретение позволяет получить необходимую и достоверную информацию о способе количественного определения субстанции 8-(трифторметил)бензо[f][1,2,3,4,5]пентатиепин-6-амина гидрохлорида в биологических средах.