СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КРОВЕЗАМЕНИТЕЛЯ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ВЕТЕРИНАРИИ
METHOD FOR PRODUCTION OF BLOOD SUBSTITUTE FOR USE IN VETERINARY MEDICINE

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности, к гематологии, и относится к способу получения кровезаменителя на основе полимеризованного гемоглобина с функцией переноса кислорода. Способ включает получение дезоксигенированного гемоглобина, его полимеризацию и очистку. Изобретение может быть использовано для производства кровезамещающих растворов, сопоставимых по эффективности газового транспорта (по переносу кислорода) с эритроцитами крови животных.
Известен способ получения кровезаменителя-переносчика кислорода «Геленпол» /RU 2132687, А61К 35/18, опубл. 1999, RU 2162707, A61K 38/42, опубл.2001/. Для его приготовления в качестве сырья предложено использовать эритроцитарную массу человеческой крови со сроком хранения не более 36 суток, а это может негативно сказаться на запасах клинической крови. В технологии получения препарата «Геленпол» отсутствует этап удаления низкомолекулярного гемоглобина (несшитого тетрамера), что может негативно сказаться на качестве лечения больных.
Известен способ получения кровезаменителя - «бесклеточного заменителя эритроцитов» /RU 2203087, 2003, А61К 38/42/, в соответствии с которым удаляют лейкоциты и тромбоциты из крови, отмывают и лизируют эритроциты, переводят гемоглобин эритроцитов в СО-форму, удаляют примеси стромы с помощью фильтрации и тепловой обработки. Затем получают дезоксиформу гемоглобина, которую пиридоксилируют и полимеризуют. Проводят дальнейшую очистку, концентрирование и дезоксигенацию.
Недостатком известного способа является его многостадийность, высокая стоимость и низкая производительность. Указанные недостатки связаны с тем, что для защиты гемоглобина от окисления используют окись углерода, для удаления которой необходима оксигенация раствора гемоглобина с последующей дезоксигенацией, что значительно (на 16 часов) удлиняет технологический процесс. Удаление негемовых белков в прототипе осуществляют путем нагрева раствора гемоглобина до 60°С, что также приводит к увеличению длительности технологического процесса на 10 часов. Кроме того, проведение модификации гемоглобина, а также тепловая обработка и гемолиз в атмосфере окиси углерода могут привести к денатурации гемоглобина, что снижает надежность технологии.
Известен способ получения кровезаменителя /Патент RU2341286, 2007, А61К 38/42/, включающий получение дезоксигенированного гемоглобина, его полимеризацию и очистку.  При этом получение дезоксигенированного гемоглобина включает гемолиз добавлением воды к эритроцитарной массе, отделение стромы, осаждение негемовых белков и их удаление из полученного раствора гемоглобина.
Полимеризация включает обработку полученного дезоксигенированного гемоглобина модифицированным глутаровым альдегидом и восстановление боргидридом натрия, а чистка включает диафильтрацию.  Для получения дезоксигенированного гемоглобина используют свободную от лейкоцитов эритроцитарную массу; осаждение негемовых белков ведут путем добавления к раствору гемоглобина концентрированного раствора хлорида натрия. После удаления негемовых белков осуществляют концентрирование раствора гемоглобина ультрафильтрацией. Очистку диафильтацией ведут на отсекающих мембранах с получением готового продукта в диапазоне по молекулярной массе не более 450 кДа и не менее 100 кДа.
Недостатком известного способа является его сложность, высокая степень затрат ресурсов и времени на проведение технологического процесса. Указанный недостаток связан с тем, что при получении дезоксигенированного гемоглобина используют стадию концентрирования гемоглобина ультрафильтрацией, что удлиняет технологический процесс и приводит к удорожанию продукта. Для процесса полимеризации дезоксигенированного гемоглобина используют модифицированный глутаровый альдегид, что также удлиняет технологический процесс.
Известен способ получения кровезаменителя /Патент RU2361608, А61К 38/42, опубл. 2008/, включающий получение дезоксигенированного гемоглобина, его полимеризацию, очистку и сушку. Для процесса полимеризации не требуется модификации глутарового альдегида, следовательно, процесс сокращается на один этап, при этом исключается использование модификатора глутарового альдегида, глутаминовой кислоты.  Диафильтацию проводят в стеклянных реакторах, вместо полимерных одноразовых контейнеров, как указано в способе по патенту /RU 2203087/, на отсекающих мембранах дважды (двухстадийная диафильтрация): по молекулярной массе 300 кДа, а затем 100 кДа. При этом получают готовый целевой продукт с молекулярной массой в диапазоне 192-320 кДа.  Данный способ получения кровезаменителя выбран за прототип.
Недостатком прототипа является высокая степень затрат ресурсов и времени на проведение технологического процесса. Указанный недостаток связан с тем, что при двухстадийной диафильтрации очистку полимеризованного гемоглобина проводят дважды на отсекающих мембранах 300 кДа и 100 кДа, что удлиняет технологический процесс до 40 часов, а также требует использования значительных объемов воды для инъекций, используемой для приготовления промывного буфера (до 320 л).
Таким образом, техническая проблема, на решение которой направлено заявленное изобретение, заключается в упрощении технологии получения кровезаменителя и получении безопасного конечного продукта.
Технический результат заключается в сокращении времени фильтрации полимеризованного гемоглобина в 4 раза, снижении объема промывочного раствора до 4-х раз, снижении пирогенности готового продукта.
Для решения обозначенной технической проблемы и достижения заявленного технического результата предлагается способ получения кровезаменителя, включающий получение дезоксигенированного гемоглобина, его полимеризацию, очистку и сушку. Причем получение дезоксигенированного гемоглобина включает сепарацию, гемолиз, отделение стромы, осаждение негемовых белков и их удаление из полученного раствора гемоглобина, его фильтрацию. Полимеризация включает обработку полученного дезоксигенированного гемоглобина немодифицированным глутаровым альдегидом, завершение реакции полимеризации проводят путем внесения боргидрида натрия; очистка включает диафильтрацию.
Отличительной особенностью заявленного способа является то, что для получения дезоксигенированного гемоглобина выделяют свободную от лейкоцитов эритроцитарную массу посредством плазмафереза, осаждение негемовых белков проводят путем добавления к раствору гемоглобина сухого хлорида натрия до конечной концентрации 0,6 мас.%, этап диафильтрации для очистки полимеризованного гемоглобина осуществляют  в одну стадию на отсекающих мембранах по молекулярной массе 100 кДа, получают готовый продукт со следующим  молекулярным составом гемоглобина:
- полимеризованный гемоглобин с молекулярной массой более 64 кДа - от 75% до 95%;
- модифицированный гемоглобин с молекулярной массой 64 кДа - от 25% до 5%.
Далее приводятся конкретные примеры реализации заявленного способа получения кровезаменителя.
Пример 1. Способ получения кровезаменителя.
Стабилизированная, охлажденная до +2-4°С кровь крупного рогатого скота (КРС), в пластиковых емкостях объемом 10 л передается из холодильной камеры через шлюз в производственное помещение. С помощью перистальтического насоса кровь подается в реактор, где проходит этап плазмафереза. Плазмаферез и отмывка эритромассы осуществляются с помощью ультрафильтрации на мембранах с диаметром пор 0,45 мкм. Для осуществления гемолиза эритроцитов в реактор, содержащий 2 л отмытой эритромассы, с помощью перистальтического насоса подается 6 л воды для инъекций (ВДИ) с температурой +6-8°С из сборной емкости, размещенной в помещении подготовки растворов. Этап гемолиза проходит при перемешивании в течение 40 мин.
Этап фильтрации. Полученный гемолизат перекачивают насосом на расположенные последовательно патронные фильтры с размером пор 50; 20; 10; 5 и 1 мкм, и далее в биоконтейнер Флексель для осаждения негемовых белков объемом 10 л. После перекачки насосом всего объема, в емкость подается сухой хлорид натрия до конечной концентрации 0,6 масс.%, в количестве 0,028 кг.  Процесс осаждения длится 30 мин. После осаждения негемовых белков раствор гемоглобина перекачивают насосом на патронные фильтры с размером пор 5; 1 и 0,65 мкм, расположенные последовательно, и далее на стерилизующий фильтр с размером пор 0,22 мкм и затем в реактор для проведения синтеза полигемоглобина. В реактор подается поток стерильного азота (контроль по ротаметру) для перемешивания и дезоксигенации гемоглобина.
Дезоксигенацию проводят до достижения концентрации кислорода в равновесной газовой среде 1,0-2,0 об.% (по показанию датчика концентрации кислорода в реакторе).
Получение полимеризованного гемоглобина (Этап полимеризации). В реактор, содержащий дезоксигемоглобин, переносят 2,5% раствор глутарового альдегида в количестве 0,083 кг в течение 40 мин. Реакцию проводят при перемешивании в течение 1 ч при температуре +6-8°С в токе азота. Для остановки реакции в смесь вносят раствор боргидрида натрия в количестве 0,002 кг. Реакцию проводят в течение 30 мин при перемешивании.
Реакционную смесь подвергают очистке методом диафильтрации на отсекающих мембранах для молекул с молекулярной массой 100 кДа и выше.  Использование только одного вида мембраны вместо использования двух видов отсекающих мембран с молекулярной массой 300 кДа, а затем 100 кДа, является отличительной особенностью данного способа, по сравнению с указанным в патенте RU2361608 способе. Раствор промывают 80 л ВДИ для частичного удаления модифицированного гемоглобина (внутримолекулярносшитого тетрамера) и низкомолекулярных соединений, менее 64 кДа. Полученный пермеат концентрируют до 2 л и сливают в биоконтейнер объемом 5 л. Промывной раствор направляют на станцию очистки стоков.
В биоконтейнер с раствором полимеризованного гемоглобина добавляют 0,231 л 40% стерильного раствора глюкозы путем стерильного соединения коннектором 0,01 л 13,6% стерильного раствора аскорбиновой кислоты, 0,750 л 0,9% стерильного раствора NaCl, перемешивают. Затем приготовленный раствор перистальтическим насосом подают на установку стерилизующей фильтрации с размером пор 0,22 мкм. Фильтрат поступает в накопительную емкость для подачи на розлив по флаконам с дальнейшей лиофилизацией препарата, для чего используется лиофилизатор, обеспечивающий получение стерильного порошка.
Таблица 1 – Результаты сравнения с прототипом (технологические параметры)
Наименование
Время проведения процесса диафильтрации,час
Объем промывного раствора, л
Рейтинг отсекающих мембран, кДа
Способ по патенту /RU2361608/
36
320
300; 100
Заявляемый способ
9
80
100
Пример 2. Снижение пирогенности готового препарата.
Испытание на пирогенность инъекционных растворов и субстанций, из которых они изготавливаются, основано на измерении температуры тела у кроликов до и после инъекции (ОФС 42-0061-07).
Испытание лекарственного средства проводили на группе из трех кроликов с исходной температурой 38,5 - 39,5°С.
Перед опытом, с интервалом не менее 30 мин, у каждого кролика дважды измеряют температуру тела. Различия в показаниях температуры у одного и того же животного не должны превышать 0,2°С. В противном случае кролика исключают из испытания. За исходную температуру принимают величину последнего результата измерения.
Раствор испытуемого лекарственного средства вводят внутривенно животным сразу после второго измерения температуры. Измерения температуры после введения испытуемого лекарственного средства проводят с интервалом не более 30 мин на протяжении трех часов.
Лекарственное средство признают апирогенным, если сумма индивидуальных максимальных повышений температур меньше или равна 1,2°С, а индивидуальное повышение температуры ни у одного из кроликов не превышает 0,5 °С.
Таблица 2 - Результаты сравнения с прототипом (биологические параметры)
Наименование
Показатель
Результат испытания
Способ по патенту RU2361608
Пирогенность
Испытуемый раствор в тест-дозе ввели каждому из 3-х кроликов. Максимальные изменения температуры у животных на протяжении 3-х часов:+0,6; +1,2; +0,3.Сумма максимальных повышений температуры у 3 кроликов: +2,1.Субстанция пирогенна.
Заявляемый способ
Пирогенность
Испытуемый раствор в тест-дозе ввели каждому из 3-х кроликов. Максимальные изменения температуры у животных на протяжении 3-х часов:+0,2; +0,2; +0,5.Сумма максимальных повышений температуры у 3 кроликов: +0,9.Субстанция апирогенна.
Пример 3. Определение молекулярного состава гемоглобина в готовом продукте (кровезаменителе).
Предложенный способ позволяет получать кровезаменитель, основу которого составляет полимеризованный гемоглобин из крови КРС со следующим молекулярным распределением:
- полимеризованный гемоглобин с молекулярной массой свыше 64 кДа -  от 75% до 95%;
- фракция модифицированного гемоглобина (64 кДа) - от 25% до 5%.
На хроматограммах (фиг. 1, 2, 3) представлены молекулярные параметры препарата. Профилю хроматограмм в интервале времени удерживания от 12 до 18 минуты соответствует фракция полимеризованного гемоглобина с молекулярным весом более 64 кДа. Интервалу времени удерживания от 18 до 22 минуты соответствует профиль модифицированного гемоглобина с молекулярной массой 64 кДа. Молекулярные параметры определяли методом ВЭЖХ с использованием колонки YMC-Pack Diol-200. Содержание фракций в препарате оценивали методом нормализации площадей пиков.
На фиг. 1-3 представлены хроматограммы трех опытных партий препарата.
Таким образом, указанный метод получения кровезаменителя способствует 4-х кратному снижению времени проведения этапа диафильтрации полимеризованного гемоглобина для удаления низкомолекулярных соединений с молекулярной массой менее 64 кДа и способствует 4-х кратному снижению объема промывного раствора. Кроме того, снижение объема промывного раствора благоприятно сказывается на показателе пирогенности получаемого препарата за счет снижения вероятности загрязнения продукта допускаемым количеством пирогенов в воде (по ФС.2.2.0019.15), а также себестоимости препарата.