Рентгено-флуоресцентный анализ состава элементов атеросклеротической бляшки

_ВЕСТНИК ПНИПУ_

2014 Химическая технология и биотехнология № 2

УДК 616.132-007.64

О.В. Колесова, В.З. Пойлов, С.Ю. Солодников

Пермский национальный исследовательский политехнический университет, Пермь, Россия

Д.Д. Аширов, Г.Г. Фрейнд

Пермская государственная медицинская академия им. акад. Е.А. Вагнера, Пермь, Россия

РЕНТГЕНО-ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ СОСТАВА ЭЛЕМЕНТОВ АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКОЙ БЛЯШКИ

В большинстве развитых стран сердечно-сосудистые заболевания, особенно ишемическая болезнь сердца, являются основной причиной смерти лиц старше 40 лет. В соответствии с определением комитета экспертов атеросклеротическая бляшка может формироваться весьма длительно и волнообразно.

Нарушение метаболизма липопротеидов различной плотности и дисбаланс химических элементов, нарушения структуры и функции эндотелия и клеток стенок сосудов в организме человека являются причиной формирования атеросклеротических бляшек. Однако большинство исследований в этом направлении касается определения содержания кальция в стенке аорты. Немногочисленные работы по содержанию других химических элементов в тканях крайне противоречивы.

Методом рентгено-флуоресцентного анализа изучен элементный состав пяти различных атеросклеротических бляшек, и проведено сопоставление с их морфологическими особенностями. Установлено более высокое содержание Mg, К на поверхности атеросклеротической бляшки, чем в ее ядре, что может быть связано с инфильтрацией покрышки атеросклеротической бляшки данными элементами из крови. Также определено повышенное содержание в участках кальциноза бляшек не только Са, но и Р, что может быть объяснено присутствием значительной части кальция и фосфора в форме гидроксиапатита Са10(РО4)6(ОИ)3.

Ключевые слова: атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, кальцинаты, элементный состав, сканирующая электронная микроскопия.

O.V. Kolesova, V.Z. Poilov, S.Yu. Solodnikov

Perm National Research Polytechnic University, Perm, Russian Federation

D.D. Ashirov, G.G. Freind

Vagner Perm State Medical Academy, Perm, Russian Federation

X-RAY FLUORESCENCE ELEMENTAL ANALYSIS OF ATHEROSCLEROTIC PLAQUE COMPOSITION

The current epidemic of obesity with the associated increasing incidence of insulin resistance, diabetes mellitus and atherosclerosis affecting a large proportion of the population all over the world has generated a strong interest in the field atherosclerosis development of and its complications. According to the definition of an expert committee of the World Health Organization, atherosclerosis is a "variable combination of changes of the intima and media of arteries consisting of focal accumulation of lipids, complex carbohydrates, fibrous tissue, salt deposits and blood fragments." World Health Organization statistics stresses circulatory diseases kill more than 16 million people each year all over the world. Disbalance of chemical elements in the human body and other metabolic disorders are the cause of atherosclerotic plaque formation.

The aim of this study was to identify the elemental composition of atherosclerotic plaque in its different regions. The elemental composition of cholesterol plaque was studied using a scanning electron microscope with high resolution of X-ray fluorescence attachment. It has been shown that in cholesterol plaque elemental composition is heterogeneous; it consists of the various elements on the surface and in the corn, as well as on calcification areas. Thus, it was shown that the elements composition, mainly metals, varies significantly in different areas of atherosclerotic plaque.

Keywords: atherosclerosis, coronary heart disease, calcification, elemental composition, scanning electron microscopy.

В последнее время атеросклероз с полным основанием называют эпидемией ХХ1 века. По статистическим данным 35 % смертей в мире, в том числе и в России, происходит вследствие атеросклеротических поражений артерий сердца и мозга, обусловливающих развитие инфаркта и инсульта. За последнее десятилетие количество операций

аортокоронарного шунтирования возросло в 5 раз. К 2020 году прогнозируется 60 % летальности населения от заболеваний, обусловленных атеросклерозом [1]. В соответствии с определением комитета экспертов Всемирной организации здравоохранения атеросклероз представляет собой «вариабельную комбинацию изменений интимы (внутренней оболочки стенки кровеносных сосудов) и медии (средней оболочки артериальных сосудов, представленной в основном гладкомышечными клетками) артерий, состоящую из очагового накопления липидов, сложных углеводов, фиброзной ткани, солевых отложений и элементов крови». Диагностика, лечение и профилактика атеросклероза остаются важнейшими задачами современной медицины, от решения которых во многом зависит успех борьбы с этими заболеваниями [1]. Атероскле-ротическую бляшку упрощенно можно представить в виде двухкомпо-нентного образования, состоящего из плотной фиброзной капсулы и ядра, содержащего эфиры холестерина. В последние годы интерес исследователей привлекает изучение взаимосвязи обмена липопротеи-дов с различными химическими элементами. Мишенью атеросклеро-тического процесса является сосудистая стенка, в которой под действием патологических факторов происходит нарушение метаболических процессов. Одной из причин формирования сосудистой патологии является возникновение дисбаланса химических элементов. Однако большинство исследований в этом направлении касается содержания кальция в стенке аорты. Немногочисленные работы по содержанию других химических элементов в тканях крайне противоречивы [2-6]. Среди химических элементов, обнаруженных на поверхности атеросклероти-ческих бляшек, как правило, отмечается присутствие Са, Бе, Мп, Си, 2п, К, 2п, Вг и РЬ. Отмечено, что именно состав атеросклеротической бляшки, а не ее размер или объем, в большей степени определяет нестабильность [3]. Нестабильные бляшки легко подвергаются эрозии, разрывам, приводя к острым тромбозам, окклюзиям и инфарктам еще до развития стенозов сосудов. В связи с этим для разработки эффективных методов разрушения атеросклеротических бляшек в сосудах человека как химическими, так и физическими способами необходимо знать их состав. Целью данных исследований являлось изучение элементного состава атеросклеротических бляшек при помощи сканирующего электронного микроскопа высокого разрешения с рентгено-флуоресцентной приставкой. Особое внимание было уделено изучению локализации химических элементов в ее различных областях.

Материал и методы

В исследование были включены 5 образцов аорты, пораженных атеросклерозом, полученных при аутопсиях. Средний возраст умерших составил 65±5 лет. Анализ элементного состава был проведен при помощи сканирующего электронного микроскопа высокого разрешения с рентгено-флуоресцентной приставкой S3400N HITACHI (Япония). Предварительная пробоподготовка включала высушивание пробы при температуре -60 °С в течение 80 ч в лио-филизаторе VaCo 2-II (Zirbus technology GmbH, Германия). Контрольному гистологическому исследованию подвергались образцы биотканей из тех же участков, что и для анализа химических элементов по общепринятой методике с помощью программно-микроскопного комплекса, который включал в себя световой микроскоп AXIOSKOP 40 фирмы ZEISS, цифровую видеокамеру AxioCam MRc и компьютер Pentium 4. Полученные с каждого гистологического препарата изображения обрабатывались с помощью программного обеспечения AxioVision 3.1 (Саг1 Zeiss). Препараты были окрашены гематоксилином и эозином, а также Суданом 3.

Результаты и их обсуждение

Атеросклеротическая бляшка является гетерогенной структурой с включениями кальцинатов и других структур и имеет неровную поверхность. Кроме того, локализация химических элементов и их концентрация существенно варьируются в разных ее областях.

При исследовании микропрепаратов было установлено, что ате-росклеротические бляшки имели фиброзную покрышку, содержащую большое количество упорядоченных коллагеновых волокон, с поверхности покрышка не имела видимых повреждений и была покрыта эндотелием. В отдельных участках обнаруживалась небольшая инфильтрация лимфоцитами и макрофагами (рис. 1). Видно обилие плотно расположенных коллагеновых волокон, а на поверхности - слой эндотелия.

Ядро бляшки было представлено жировым детритом (рис. 2) с обилием коллагеновых волокон, ксантомных клеток - макрофагов, нагруженных липидами (рис. 3).

В отдельных участках бляшки содержали фокусы кальциноза (рис. 4).

Рис. 1. Стабильная атеросклеротическая бляшка. Окраска гематоксилином и эозином

Рис. 2. Липидное ядро бляшки. Окрашено суданом 3

Рис. 3. Коллагеновые волокна бляшки. Окрашено гематоксилином и эозином

Коллагеновые волокна (см. рис. 3) расположены рыхло, наряду с отложениями холестерина имеется выраженная диффузная инфильтрация лимфоцитами, плазмоцитами, макрофагами.

Рис. 4. Участок кальциноза в атеросклеротической бляшке

Элементный состав поверхностных слоев атеросклеротических бляшек, их липидного ядра и участков с кальцинозом приведен в таблице.

Элементный состав поверхности, липидного ядра и области кальциноза атеросклеротической бляшки

Элемент Процентное содержание, %

Поверхностные слои бляшки Липидное ядро Участки кальциноза

№ 1,10-1,20 0,90-1,01 0,38

0,15-0,50 0,00 0,30

Мй 0,30-0,50 0,00 0,11

Са 1,10-2,03 0,29-0,63 16,00

К 0,85-1,13 0,00 0,00

Б 0,35-0,44 0,35-0,57 0,12

Р 0,30-0,70 0,31-0,62 5,70

С1 0,90-1,12 0,91-1,36 0,36

Результаты сканирующей электронной микроскопии позволяют сделать вывод о существенных различиях в составе поверхностных, глубоких участков атеросклеротических бляшек и фокусов кальциноза. Так, концентрация элементов Б, Р, С1 на поверхности бляшки и внутри липидного ядра практически одинакова. Обращает на себя внимание более высокое содержание кальция, а также присутствие Б1, М§ и К на поверхности атеросклеротической бляшки по сравнению с липидным ядром.

На рис. 5-7 представлены лиофилизированные образцы поверхности, липидного ядра и области кальциноза атеросклеротической бляшки. Видно, что поверхности каждой из областей существенно отличаются друг от друга. Это объясняется различным элементным составом образцов. В случае кальциноза, например, повышенное содержание P и Ca ведет к образованию неровностей на поверхности и агломератов частиц солей.

Рис. 6. Ядро атеросклеротической бляшки

В участке кальциноза (см. рис. 6) и в поверхностных слоях атеросклеротической бляшки наблюдается повышенное содержание Са (16 %) и Р (5,7 %). Корреляция между высоким содержанием кальция и фосфора неудивительна. В ряде недавних исследований была установлена связь между уровнем фосфора в крови и риском появления отложений солей кальция на стенках артерий (кальцинозом коронарных артерий) [7].

Рис. 7. Участок кальциноза

Развитию кальциноза способствует увеличение содержания кальция и фосфора в сыворотке крови. Очевидно, значительная часть кальция и фосфора находится в форме гидроксиапатита Cai0(PÜ4)6(OH)3 [8]. Увеличение содержания кальция может способствовать активизации ме-таллопротеиназ, синтезируемых макрофагами (U. Keil).

Таким образом, в результате исследования был определен элементный состав атеросклеротической бляшки аорты и выявлена разница в локализации и концентрации элементов металлов и фосфора в различных ее областях (на поверхности, внутри липидного ядра и в области кальциноза). Кроме того, в составе атеросклеротической бляшки аорты был обнаружен Si, наличие которого не было выявлено при анализе литературы [9-11]. Полученные данные могут быть использованы для разработки модели развития атеросклероза, а также методов удаления атеросклеротических отложений в организме человека. Предполагается, что нарушения метаболизма при многих заболеваниях, таких как сахарный диабет, патология почек и другие, косвенной характеристикой которых является повышенное содержание фосфора в крови, способствуют развитию кальциноза.

Список литературы

1. Основы геронтологии. Общая гериатрия. Руководство по геронтологии и гериатрии: в 4 т. / под ред. В.Н. Ярыгина, А.С. Мелентьева. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. - 715 с.

2. Распределение химических элементов в сосудистой системе больных ишемической болезнью сердца / Г.Н. Окунева, А.М. Караськов, А.М. Чернявский, А.М. Волков, В.В. Зверева // Ишемическая болезнь сердца. - 2010. -Т. 1, № 5. - С. 22-25.

3. Elemental composition of the human atherosclerotic artery wall / T. Cichocki, D. Heck [et al.] // Histochemistry. - 1985. - Vol. 83, № 1. - P. 87-92.

4. Леллюк С.Э., Леллюк В.Г. Комплексная ультразвуковая оценка степени риска развития ишемических нарушений мозгового кровообращения у больных с атеросклеротической патологией магистральных артерий головы // Ультразвуковая диагностика. - 1997. - № 3. - С. 5-11.

5. Tuttle K.R., Short R. Longitudinal Relationships among Coronary Artery Calcification, Serum Phosphorus, and Kidney Function // American Society of Nephrology. - 2009. - Vol. 4, № 12. - Р. 1968-1973.

6. Chemical Composition of Atherosclerotic Plaques of apoE/LDLR-Double Knockout Mice by Synchrotron Radiation FTIR Microspectroscopy / J. Kowalska, M. Gajda [et al.] // ACTA PHYSICA POLONICA A. - 2012. - Vol. 121. -P.555-560.

7. Histopathology of human ^rona^ atherosclerosis by quantifying its chemical composition with Raman Spectroscopy / J.R. Tjeerd, F.B. James [et al.]; American Heart Association. - 1998. - 885 р.

8. Экспериментальный атерогенез у крыс. Морфологическая реконструкция стенки магистральной артерии полисахаридными биополимерами / И.Н. Большаков, Л.А. Шестакова, А.Р. Котиков, Г.И. Каптюк // Биологические науки. - 2013. - Т. 3, № 10. - С. 557-563.

9. Scanning electron microscopy examination of endothelium morphology in human carotid plaques / Т. Congiu, L. Schembri [et al.] // Micron. - 2010. -Vol. 41. - Р. 532-536.

10. Elemental analisis of soft plaque and calcified plaque deposits from human coronary arteries and aorta / J. Bacsso, Y. Lusztig, A. Pal [et al.] // Journal of Experimental Pathology. - 1986. - Vol. 29, № 2. - P. 119-125.

11. Elemental Analysis of soft plaque and calcified plaque deposits from human coronary arteries and aorta / J.I. Murungi, S. Thiam, R.E. Tracy [et al.] // Environmental science health. - 2004. - Vol. 39, № 6. - P. 1487-1496.

References

1. Osnovy gerontologii. Obschaya geriatriya. Rukovodstvo po gerontologii i geriatrii: v 4 tomakh [Foundations of gerontology. Overal geriatrics. Guidelines for gerontology and geriatrics: in 4 volumes]. Ed. by V.N. Yarygina, A.S. Melenteva Moscow: Geotar-media, 2010. 715 р.

2. Okuneva G.N., Karaskov A.M., Chernyavskiy A.M., Volkov A.M. Ras-predelenie khimicheskikh elementov v sosudistoy sisteme bolnykh ishemicheskoy bo-leznyu serdtsa [Chemical elements distribution in vascular system of patients with ischemic heart disease]. Ishemicheskaya bolezn serdtsa, 2010, vol. 1, no. 5, pp. 22-25.

3. Cichocki T., Heck D. [et al.]. Elemental composition of the human atherosclerotic artery wall. Histochemistry, 1985, vol. 83, no. 1, рp. 87-92.

4. Lelyuk S.E., Lelyuk V.G. Kompleksnaya ultrazvukovaya otsenka stepeni riska razvitiya ishemicheskikh narusheniy mozgovogo krovoobrascheniya u bolnykh s ateroskleroticheskoy patologiey magistralnykh arteriy golovy [Integraled ultrasound assessment of the risk of ischemic cerebrovascular events in patients wirth atherosclerotic pathology cerebral arteries]. Ultrazvukovaya diagnostika, 1997, no. 3, pp. 5-11.

5. Tuttle K.R., Short R. Longitudinal relationships among coronary artery calcification, serum phosphorus, and kidney function. American Society of Ne-phrology, 2009, vol. 4, no. 12, pp. 1968-1973.

6. Kowalska J., Gajda M. [et al.]. Chemical composition of atherosclerotic plaques of apoE/LDLR-Double knockout mice by synchrotron radiation FTIR mi-crospectroscopy. ACTA PHYSICA POLONICA A, 2012, vol. 121, pp. 555-560.

7. Tjeerd J.R., James F.B. [et al.]. Histopathology of human raronary atherosclerosis by quantifying its chemical composition with Raman Spectroscopy. American Heart Association, 1998, pp. 878-885.

8. Bolshakov I.N., Shestakov L.A., Kotikov A.R., Kaptyuk G.I. Eksperi-mentalnyy aterogenez u krys. Morfologicheskaya rekonstruktsiya stenki magistral-noy arterii polisakharidnymi biopolimerami [Experimental rats atherogenesis. Morphological reconstruction of the main artery wall polysaccharide biopolymers]. Biologicheskie nauki, 2013, vol. 3, no. 10, pp. 557-563.

9. Congiu Т., Schembri L. [et al.]. Scanning electron microscopy examination of endothelium morphology in human carotid plaques. Micron, 2010, vol. 41, pp. 532-536.

10. Bacsso J., Lusztig Y., Pal A. [et al.]. Elemental analisis of soft plaque and calcified plaque deposits from human coronary arteries and aorta. Journal of Experimental Pathology, 1986, vol. 29, no. 2, рp. 119-125.

11. Murungi J.I., Thiam S., Tracy R.E. [et al.]. Elemental analysis of soft plaque and calcified plaque deposits from human coronary arteries and aorta. Еnvironmental science health, 2004, vol. 39, no. 6, рp. 1487-1496.

Об авторах

Колесова Ольга Владиславовна (Пермь, Россия) - аспирант кафедры химических технологий Пермского национального исследовательского политехнического университета (614990, г. Пермь, Комсомольский пр., 29; e-mail: goldacox@mail.ru).

Солодников Сергей Юрьевич (Пермь, Россия) - кандидат медицинских наук, доцент кафедры химии и биотехнологии Пермского национального исследовательского политехнического университета (614990, г. Пермь, Комсомольский пр., 29; e-mail: s.u.solodnikov@rambler.ru).

Пойлов Владимир Зотович (Пермь, Россия) - доктор технических наук, профессор, заведующий кафедрой химических технологий Пермского национального исследовательского политехнического университета (614990, г. Пермь, Комсомольский пр., 29; e-mail: Vladimirpoilov@mail.ru).

Аширов Дамир Данилович (Пермь, Россия) - ординатор кафедры патологической анатомии с секционным курсом Пермской государственной медицинской академии им. акад. Е.А. Вагнера (614990, г. Пермь, ул. Петропавловская, 26; e-mail: nightdamir@gmail.com).

Фрейнд Генриетта Герхардовна (Пермь, Россия) - доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой патологической анатомии с секционным курсом Пермской государственной медицинской академии им. акад. Е.А. Вагнера (614990, г. Пермь, ул. Петропавловская, 26; e-mail: gfreynd@mail.ru).

About the authors

Olga V. Kolesova (Perm, Russian Federation) - graduate student, department of chemical technology, Perm National Research Polytechnic University (Komsomol-sky av., 29, Perm, 614990, Russian Federation; e-mail: goldacox@mail.ru).

Sergey Y. Solodnikov (Perm, Russian Federation) - Ph.D. of medicine, associate professor, department of chemistry and biotechnology, Perm National Research Polytechnic University (Komsomolsky av., 29, Perm, 614990, Russian Federation; e-mail: s.u.solodnikov@rambler.ru).

Vladimir Z. Poilov (Perm, Russian Federation) - doctor of technical sciences, professor, head of department of chemical technology, Perm National Research Polytechnic University (Komsomolsky av., 29, Perm, 614990, Russian Federation; e-mail: Vladimirpoilov@mail.ru).

Damir D. Ashirov (Perm, Russian Federation) - ordinator, department of pathologic anatomy, Vagner Perm State Medical Academy (Petropavlovskaya st., 26, Perm, 614990, Russian Federation; e-mail: nightdamir@gmail.com).

Genrietta G. Freind (Perm, Russian Federation) - doctor of medical science, professor, head of department of pathologic anatomy, Vagner Perm State Medical Academy (Petropavlovskaya st., 26, Perm, 614990, Russian Federation; e-mail: gfreind@mail.ru).

Получено 9.07.2014