СПОСОБ ПРОГНОЗА МЕТАСТАЗИРОВАНИЯ ОПУХОЛЕЙ РАКА ЖЕЛУДКА

1. Способ прогноза метастазирования опухолей рака желудка (РЖ), при котором:
получают образцы ткани опухоли РЖ и нормальной слизистой ткани желудка пациента, проводят выделение РНК из образцов для чего выполняют лизирование ткани, фенольную экстракцию, доочистку на колонке, проверку концентрации суммарной РНК и определяют отношение поглощения на длинах волн 260 нм и 280 нм,
260/280
260/230
отделяют образцы для определения экспрессии микроРНК и генов, выбранные из условия, что отношение поглощения на длинах волн 260 нм и 280 нм составляет (А)>1,9, отношение поглощения на длинах волн 260 нм и 230 нм (А)>1,8, выравнивают концентрацию суммарной РНК до 50 нг/мкл;
затем выполняют обратную транскрипцию мРНК и микроРНК и количественное определение экспрессии мРНК и микроРНК с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ), получают значения уровней экспрессии микроРНК и мРНК в опухолевой ткани относительно нормальной слизистой желудка методом количественной ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) в парных образцах опухоль нормальная ткань,
определяют уровни экспрессии микроРНК miR-34a, miR-146a, miR-335 и miR-590 и генов VEGF, VEGFR1, VEGFR2, NRP1, в опухолевой ткани относительно нормальной слизистой ткани желудка используя полученные обратной транскрипцией ДНК для микроРНК и мРНК,
сравнение уровней экспрессии указанных микроРНК разных стадий РЖ выполняют ROC-анализом и получают пороговые значения 0,4; 0,8; 0,3 и 0,4 для miR-34a, miR-146a, miR-335 и miR-590, соответственно,
пороговые значения, оптимально дифференцирующее уровни экспрессии указанных микроРНК и генов между метастазирующими и не метастазирующими опухолями рака желудка, полученные ROC-анализом используют для дальнейшего анализа полученных уровней экспрессии и дают прогноз риска метастазирования РЖ, исходя из следующего:
неблагоприятный прогноз риска метастазирования опухоли рака желудка в лимфоузлы в случаях, когда экспрессия любых трех из этих четырех микроРНК miR-34a, miR-146a, miR-335 и miR-590 ниже порогового значения;
неблагоприятный прогноз риска отдаленного метастазирования (диссеминации опухоли) рака желудка в том случае, когда значения уровня экспрессии двух маркеров из группы трех маркеров: miR335 и FGFR2 ниже, а VEGFR1 - выше пороговых значений в образцах опухолевой ткани относительно нормальной ткани,
неблагоприятный прогноз риска отдаленного метастазирования (диссеминации опухоли) рака желудка в том случае, когда для гена VEGFR1 экспрессия в образцах опухолевой ткани превышает пороговое значение 0,5 относительно нормальной ткани, значение уровня экспрессии мРНК гена FGFR2 ниже 0,05, а уровень экспрессии miR335 ниже 0,3,
или благоприятный прогноз риска отдаленного метастазирования при отсутствии указанных выше значений уровней экспрессии микроРНК и генов в опухолевой ткани относительно нормальной.
2. Способ прогноза метастазирования опухолей рака желудка по п. 1, отличающийся тем, что исследуют образцы больных РЖ без метастазов в лимфатические узлы (Т3-4, N0), больных РЖ с наличием метастазов в лимфатических узлах (Т3-4, N3) и больных РЖ с отдаленными метастазами (диссеминированный рак желудка).
3. Способ прогноза метастазирования опухолей рака желудка по п. 2, отличающийся тем, что определенный с помощью ROC-анализа пороговый уровень экспрессии гена, оптимально дифференцирующий уровни экспрессии указанных генов между метастазирующими и не метастазирующими опухолями рака желудка, для гена VEGFR1 составляет 0.5, а для генов FGFR2 и NRP1 он составляет 0,05 и 0.97, соответственно.
4. Способ прогноза метастазирования опухолей рака желудка по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что образцы опухолей РЖ и нормальной ткани желудка подучают во время хирургических операций или путем биопсии, а после забора образцы сразу замораживают и хранят при температуре минус 70°С, берут для исследования не менее 10 мкл выделенной ДНК с концентрацией не менее 5 нг/мкл.
5. Способ прогноза метастазирования опухолей рака желудка по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что количественную ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) в парных образцах опухоль - норма производят троекратно с использованием наборов TaqManGene Expression Assays:
HER 2 - TaqMan Gene Expression Assay Hs 01001580_m1
VEGFA - TaqMan Gene Expression Assay Hs 00900055_m1
NRP1 - TaqMan Gene Expression Assay Hs00826128_m1
bFGF / FGF2 - TaqMan Gene Expression Assay Hs00266645_m1
TGF b - TaqMan Gene Expression Assay Hs00998133_m1
FGFR2 - TaqMan Gene Expression Assay Hs01552918_m1
VEGFR1 / FLT1 - TaqMan Gene Expression Assay Hs01052961_m1
VEGFR2 / KDR - TaqMan Gene Expression Assay Hs00911700_m1
GAPDH - TaqMan Gene Expression Assay Hs02786624_g1
6. Способ прогноза метастазирования опухолей рака желудка по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что количественную ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) в парных образцах опухоль - норма производят троекратно с использованием наборов TaqMan miRNA Assays:
7. Способ прогноза метастазирования опухолей рака желудка по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что наличие и качество РНК в образцах проверяют, используя электрофорез в 1,8% агарозном геле, качественными считают образцы РНК, демонстрирующие четкие полосы 18S и 28S РНК, без детектируемой электрофоретически примеси ДНК.
8. Способ прогноза метастазирования опухолей рака желудка по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что порог, оптимально дифференцирующий уровни экспрессии микроРНК miR-34a, miR-146a, miR-335 и miR-590 между метастазирующими и не метастазируюшими опухолями рака желудка, определенные ROC-анализом составляют 0,4; 0,8; 0,3 и 0,4, соответственно).
9. Способ прогноза метастазирования опухолей рака желудка по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что концентрацию водного раствора РНК определяют троекратно на спектрофотометре, а количественное определение экспрессии микроРНК осуществляют троекратно с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ).
10. Способ прогноза метастазирования опухолей рака желудка по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что статистическую обработку результатов проводят с помощью пакета стандартных программ Statistica 10, при этом уровень значимости для выявленных различий принимают равным менее 0,05, указанные пороги использовуют при статистической обработке результатов с помощью точного критерия Фишера, а для анализа полученных результатов используют встроенную программу Applied Biosystems Step One Plus, при этом в качестве контрольного гена использовуют ген GAPDH.