СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОЛЕЙ ФИТИНОВОЙ КИСЛОТЫ В СЕМЕНАХ РАСТЕНИЙ
METHOD FOR DETERMINING SALTS OF PHYTIC ACID IN PLANT SEEDS

Изобретение относится к аналитической химии, предназначено для определения органического соединения фитина в семенах растений.
Фитин является основным фосфорсодержащим компонентом клеток многих растений и играет значительную роль в процессах прорастания семян, ускоренного роста и накопления биомассы. Основными проблемами при определении содержания солей фитиновой кислоты является его труднодоступность в связи с плохой растворимостью как в спирте, так и водных растворах, а также большим содержанием жиров и белков в семенах.
Известен способ выделения концентрата фитина из рисовых отрубей (JPS 6058993, МПК C07C 27/00; C07C 29/12; C07C 35/16; C07C 67/00; C07F 9/117, опубл. 1985-04-05), согласно которому рисовые отруби перемешивают с растворителем, например, н-гексаном и оставляют до образования сверху белой суспензии, содержащей фитин. Известен способ экстракции и очистки фитина из рисовых отходов с помощью обработки 1% раствором азотной кислоты, с последующим осаждением 10% известковым молоком и фильтрацией на прессе (Патент №2171808 C07F 9/117, опубл. 10.08.2001). Полученный технический фитин перекристаллизовывают 10% азотной кислотой, затем осаждают, сушат. Недостатком метода является его многостадийность, не приводящая, однако, к получению высокоочищенного от органических и неорганических примесей препарата, что затрудняет точное определение его концентрации. При этом работы по очистке фитина проводятся на холоду для предотвращения действия фермента фитазы, расщепляющей фитин на низкомолекулярные компоненты.
2
Известен способ количественного определения фитина с применением реактива Вэйда, включающего сульфосалициловую кислоту в присутствии соли трехвалентного хлористого железа FeCl3⋅6НО (Latta М., Eskin М.А simple and rapid colorimetric method for phytate determination // J. Agric. Food Chem. 1980. №28. P. 1313-1315). Недостатком метода является зависимость окраски результирующей смеси от pH среды: в зависимости от кислотности применяется измерение концентрации фитина при трех разных длинах волн. Кроме того, метод не дает точных значений, приходится делать много повторностей, что не всегда возможно, а результирующая смесь имеет нестабильную окраску (не более 1-2 минут).
Известен метод определения фитина с помощью железо-тиоцианатного комплекса (Демьянов Н.Я. Общие приемы анализа растительных веществ. М.: Государственное издательство, 1923. 252 с.), измерение проводят при длине волны 470 нм. Недостатком данного метода является крайняя нестабильность окраски (не более 1 минуты), а также значительный разброс данных, что связано с отсутствием применения оптимальной длины поглощения продукта реакции.
Известен способ количественного анализа фитина в растительных кормах, взятый за прототип, по АС 1432399 (опубл. 23.10.1988), включающий экстракцию фитина соляной кислотой, отделение экстракта от нерастворившегося осадка центрифугированием, пропускание экстракта через хроматографическую колонку с сильнокислотным катеонитом, содержащим 0,1-1 мг-экв железа в 1 г катионита, элюирование фитинового комплекса с железом из колонки 0,4-0,8 MHCl и определение фитина спектрофотометрически в УФ-спектре по светопоглощению фитинового комплекса с железом, при этом используется раствор сравнения, при экстрагировании используется 0,33-0,35 M HCl, а спектрофотомерию проводят при 240 нм. К недостаткам метода можно отнести сложность и большую затратность за счет использования оборудования ЖХ (ВЭЖХ). Кроме того метод дает избыточную точность для сравнительного анализа объектов исследования.
Заявленное изобретение решает задачу выделения из семян, очищенных от жиров и белков, соединений фитиновой кислоты (фитинатов), определения содержания фитина в семенах получением стойкой окраски при использовании железо-тиоцианатного комплекса, снижения погрешности измерения до ±10% абсолютной массы фитина в навеске, работать при комнатной температуре.
Технический результат заключается в повышении точности и упрощении измерения количественного содержания фитина за счет получения абсолютно прозрачных образцов, стабилизации окраски до 10 минут, а также в разработке способа, пригодного для определения фитина при низкой концентрации от 0,08 до 4 мг на 1 г сырья.
4
3
n
Технический результат достигается тем, что в способе определения солей фитиновой кислоты в семенах растений, включающем экстракцию фитина из сырья соляной кислотой, центрифугирование полученной смеси, колориметрирование при длине волны 337 нм, согласно изобретению, проводится дополнительная очистка солянокислой вытяжки добавлением к ней в соотношение объемов 4:1 смеси изоамилового спирта с хлороформом (1:24 об. долей) и перемешиванием, к полученной после центрифугирования надосадочной жидкости добавляют раствор 0.03% роданида аммония NHSCN в 6% HCl и раствор 0.86% FeCl и 0.2% HCl в дистилированой воде в объемном соотношении 1:1,5:1, колориметрирование проводят, принимая в качестве контроля смесь этих же растворов в тех же пропорциях, заменяя объем надосадочной жидкости равным объемом воды, определение абсолютной массы f (мг) фитина в навеске пробы проводят по градировочному графику, а концентрацию F (%) определяют по формуле F=100f/Mn, где M - масса навески пробы (мг).
Авторами настоящего изобретения на Международной научной конференции по биологической химии «XII чтения памяти академика Ю.А. Овчинникова» (Москва, ИБХ РАН, 18-22 сентября) был сделан доклад с примером осуществления заявляемого способа на плодах ореха (Измерение содержания фитина в плодах четырех видов ореха на основе модифицированного колориметрического метода. Ф, Р. Аль Хачами, О.А. Землянухина, В.Н. Епринцев, В.Н. Калаев, Н.Н. Черкасова, В.А. Славский
// под ред. В.Т. Иванова, А.Г. Габибова. - М.: Издательство «Перо», 2017. - с. 179).
В заявляемом изобретении использован метод очистки семян от содержания жиров и белков, применяемый обычно при выделении растительной ДНК.
Определение содержания фитина в полученной надосадочной жидкости проводят с использованием железо-тиоцианатного комплекса. На нанофотометре IMPLEN Р330 (Германия) был определен максимум поглощения тиоцианата. Он составляет 337 нм, что позволяет продлить стабильность окраски реакции до 10 мин и повысить точность измерения с использованием меньшего числа повторностей.
Метод основан на способности анионов солей фитиновой кислоты конкурировать с анионом роданида, дающим в растворе окрашенное труднорастворимое соединение с трехвалентным железом (тиоцианат). Таким образом, концентрация фитина обратно пропорциональна концентрации образованного тиоцианата железа (оптической плотности окрашенного раствора). Зная соотношение взаимодействующих компонентов реакции (4 Fe:l фитинат), можно определить концентрацию фитина по концентрации остаточного железа согласно стехиометрическому закону.
Пример осуществления способа.
Для очистки растительного материала (20-300 мг) к 2 мл гомогената, растертого для лучшего разрушения семян с битым стеклом в 0.5 М HCl (раствор №1), добавляется 0.5 мл раствора изоамилового спирта с хлороформом (1:24) (раствор №2). После чего смесь переносили в эппендорфы и энергично встряхивали в течение 1 мин, после чего центрифугировали в течение 3 мин при 20000 g на центрифуге СМ50 ELMI (Латвия). При этом получали абсолютно прозрачную, очищенную от примесей надосадочную жидкость, содержащую соли фитиновой кислоты.
Ход измерения.
4
3
3
К 1 мл надосадочной жидкости добавляют сначала 1.5 мл индикативного 0.03% кислого раствора роданида аммония NHSCN в 6% HCl (раствор №3), затем прибавляли 50 мкл кислого конкурентного раствора хлорида железа(III) (раствор №4). Раствор хлорида железа готовят из соли FeCl, высушенной в эксикаторе с концентрированной серной кислотой. Содержание раствора представляет собой 0.86% по FeCl в 0.2% по HCl. После добавления раствора №4 образцы колориметрируют в предварительно калиброваных кварцевых кюветах. Можно производить определение фитина в одной кювете для избегания разброса данных. В качестве контроля используют смесь растворов №3 и №4 в тех же пропорциях, что и для образцов, заменяя объем пробы равным объемом воды. Содержание фитина рассчитывают по заранее составленному градуировочному графику, используя в качестве стандарта водный раствор натриевой соли фитиновой кислоты (Sigma). По кривой зависимости величины оптической плотности при 337 нм от количества фитината натрия в образце видно, что линейная зависимость наблюдается при концентрации фитина 0.08-4 мг/г с.м. При больших концентрациях фитина необходимо производить разведение образцов, а при концентрациях меньше 0.08 мг/г с.м. результаты недостоверны. Снижение погрешности определения и сопоставимость данных нескольких определений достигается использованием свежих реактивов одной партии с чистотой не менее ЧДА.
Расчет абсолютной массы (мг) фитина в образце с учетом разбавления в ходе анализа проводили по формуле:
f
n
n
f=C*(M+2000)*1,275/M,
f
n
где f - содержание фитина в пробе (мг); C - измеренная концентрация фитината (мг/мл); M - масса навески пробы (мг).
Расчет концентрации (в % масс.) фитина в образце с учетом разбавления в ходе анализа проводят по следующей формуле:
n
F=100f/M,
где F - содержание фитина в образце (%).
Необходимым замечанием является то, что примеси двух- и трехвалентных катионов металлов могут вносить погрешность в точность определения в связи с большим их сродством к фитиновой кислоте, нежели у катиона железа(III). В связи с этим необходимо следить за чистотой используемых реактивов (ч.д.а.), посуды и воды (дистиллят или бидистиллят).