Влияние микробной протеиназы из Bacillus megaterium на комплексные белковые субстраты из низкосортного мясного сырья

УДК 664

В. Я. Пономарев, Э. Ш. Юнусов

ВЛИЯНИЕ МИКРОБНОЙ ПРОТЕИНАЗЫ ИЗ BACILLUS MEGATERIUM НА КОМПЛЕКСНЫЕ БЕЛКОВЫЕ СУБСТРАТЫ ИЗ НИЗКОСОРТНОГО МЯСНОГО СЫРЬЯ

Ключевые слова: мясное сырье, протеолиз, хромофоры, спектрофотометрия.

Изучены спектральные характеристики белковых комплексов мясного сырья с повышенным содержанием соединительной ткани. Установлены хромофоры, характеризующие наличие в системе соединений, имеющих в составе порфириновое кольцо, соединения гемовой группы, оскимиоглобин, метмиоглобин. Изучена динамика изменения спектрофотометрических характеристик отдельных групп хромофоров под действием ферментативной обработки мясного сырья.

Key words: raw meat, proteolysis, chromophores, spectrophotometry.

The spectral characteristics of the protein complexes of raw meat with a high content of connective tissue were studied. Chromophores are installed in a system characterized by the presence of compounds having in the porphyrin ring, connecting the heme group and others. The dynamics of changes in the spectrophotometric characteristics of individual groups of the chromophores by the action of the enzymatic treatment of raw meat was studied.

Основным критерием сортировки мяса, предназначенного для колбасного производства, в нашей стране является содержание в нем мышечной ткани как наиболее ценной в пищевом отношении. Соединительная ткань, особенно сухожилия, содержащие большое количество эластиновых труднопереваримых волокон, характеризуются низкой питательной ценностью. При жиловке выделяют в основном хрящи, крупные сухожилия и становую жилу.

Сухожилия выделяются в большем количестве из туш менее жирных животных, так как в таком мясе они расположены более открыто и их легче найти и удалить. Действующими в нашей стране нормативами допускается выделение при жиловке сухожилий, хрящей и обрези от 3 до 5% к массе мяса на костях в зависимости от упитанности говядины; от 3,5 до 5% при жиловке телятины; от 1,2 до 3,0% при жиловке свинины; от 1,5 до 2,5% при жиловке баранины [1].

Жилованное говяжье мясо от туш любой упитанности разделяют на три сорта. Жилованное говяжье мясо высшего сорта состоит из мышечной ткани без жира, соединительной ткани и других включений, видимых невооруженным глазом. В мясе первого сорта допускается содержание соединительной ткани не более 6% от массы всего мяса. К мясу второго сорта относятся менее ценные части туши, межреберное мясо, мясо с голяшек и другое, в нем допускается до 20 % соединительной ткани и жира [2].

В данной работе на первоначальном этапе исследования нами были изучены основные функционально-технологические характеристики мясного сырья 1 и 2 сортов. Оценивались показатели влагосодержания, влагосвязывающая и влагоудерживающая способности, выход после термической обработки и содержание водо- и солерастворимых белков.

Полученные данные свидетельствуют, что мясо второго сорта имеет низкие уровни связывания и удержания влаги, а также имеет наименьший выход после термической обработки. Тем не менее имеющиеся в литературе данные [3] указывают, что продукты гидролиза коллагена, входящего в состав соединительной ткани - глютин и желатозы обладают высокой влагосвязывающей и экструдирующей способностью. Трансформация коллагена при тепловой обработке позволяет ему образовывать желейные структуры - тонкий трехмерный каркас, включающий в ячейки воду с растворенными в ней низкомолекулярными

веществами. Таким образом, рассматриваемое сырье, несмотря на свои невысокие потребительские свойства и наличие в своем составе балластных веществ, не усваиваемых организмом человека, имеет потенциально высокие технологические свойства. К сожалению, современный уровень научных исследований не позволяет полноценно использовать данный вид сырья при выработке пищевой продукции. Данные обстоятельства предопределяют необходимость поиска путей решения задач более полного и рационального использования коллагенсодержащего сырья при производстве мясопродуктов.

Применение протеолитических ферментных препаратов при обработке мяса с низкими функционально-технологическими свойствами позволит скорректировать его качественные характеристики и увеличить выход готовой продукции за счет целенаправленного воздействия на белковые комплексы.

Ферментные технологии обработки мясного сырья в России используются еще весьма ограниченно и требуют создания специальных препаратов и форсированного внедрения их в производство. Перспективными источниками ферментов, производимых в промышленном масштабе, являются микроорганизмы-продуценты. Известно, что бактерии Bacillus megaterium наряду с другими гидролазами секретируют металлпротеиназу. Ранее нами была показана перспективность и целесообразность применения ферментативной обработки при выпуске эмульгированных мясопродуктов из сырья с отклонениями в характере автолиза [4, 5]. Поэтому представлялось интересным в данной работе изучить возможность его применения для обработки мясного сырья с повышенным содержанием соединительной ткани.

Целью данного исследования являлось изучение влияния микробной протеиназы из Bacillus megaterium на комплексные белковые субстраты, полученные на основе мясного сырья с повышенным содержанием соединительной ткани.

В процессе проведения эксперимента изучали влияние ферментативной обработки на степень гидролиза белков, процессы убыли субстрата и накопления высоко и низкомолекулярных продуктов (поли-, олигопептиды, аминокислоты). Анализ вели, используя белковые фракции водорастворимых (представители: миоглобин, оксимиоглобин,

миоальбумин, кельмодулин и др.) и солерастворимых белков мяса (представители: миозин, актин, актомиозин, тропонин, тропомиозин и др.), которые представляют особенный интерес для технологов мясной отрасли, так как отвечают за создание стабильной эмульсии и проявление основных функционально-технологических свойств фарша (влагосвязывание и влагоудержание), что в свою очередь влияет на такой важнейший технологический и экономический показатель процесса приготовления эмульгированных мясопродуктов как выход.

На рис. 1-2 представлены данные спектрофотометрии водных и солевых фракций мясного сырья второго сорта.

Спектры поглощения света веществом определяются разностью энергий между энергетическими уровнями при переходе электрона с нижнего уровня на верхний. В случае молекулярного состава вещества эти уровни зависят от свойств входящих в него молекул, а также вероятности перехода между уровнями. Разность энергий определяет длину волны, на которой происходит поглощение света, вероятность перехода - коэффициент поглощения вещества.

Для биологически важных молекул характерны широкие полосы поглощения, обусловленные электронными, колебательными и вращательными уровнями. Молекулярные группы, поглощающие свет, в биологии называют хромофорами [6]. Для биологических веществ необходимо рассмотреть следующие основные хромофоры. Спектральные свойства оксигемоглобина характеризуются наличием двух полос поглощения в желто-зеленой части видимого спектра, одна из которых, лежащая ближе к красной области спектра, обозначается как a-полоса; другая, с более короткой длиной волны, более широкая и с менее резкими краями,- как полоса р. В фиолетовой части спектра лежит весьма интенсивная полоса поглощения, обозначаемая как у- полоса (или полоса Соре). Максимум a-полосы поглощения

НЬ02 находится в области длин волн 575-579 нм, максимум Р-полосы приходится на 540-544 нм. у-полоса имеет максимум в интервале 410-416 нм. Между а- и Р-полосой находится минимум при 560 нм. а-, Р- и у-полосы характерны для группы гема. Считается, что у- полоса обусловлена порфирином простетической группы.

200 300 400 500 600 700 800

X, нм

Рис. 1 - Спектры водорастворимых фракций полипептидов мышечной ткани с различной молекулярной массой

200 300 400 500 600 700 800

X, нм

Рис. 2 - Спектры солерастворимых фракций полипептидов мышечной ткани с различной молекулярной массой

Поглощение света белками в области 240-300 нм обусловлено, главным образом, ароматическими аминокислотами - триптофаном, тирозином и фенилаланином. Спектральные свойства триптофана определяются его индольным кольцом. Триптофан имеет две полосы поглощения - в области 218 и 280 нм. Молярный коэффициент поглощении этой аминокислоты в четыре раза больше, чем тирозина, и почти в тридцать раз больше, чем фенилаланина. Спектр поглощения тирозина обусловлен его фенольным кольцом. Максимумы находятся при 222 и 275 нм. Спектральные свойства фенилаланина определяются бензольным ядром. Спектр характеризуется максимумом при 257 нм. Меньший вклад в поглощение белков вносит гистидин.

Свет в области 210 нм, поглощают гистидин и серосодержащие аминокислоты -цистин, цистеин и метионин. Для большинства порфиринов характерно наличие четырех полос поглощения в видимой области спектра и более интенсивной полосы Соре с максимумом около 400 нм. Раствор протопорфирина IX в эфире обнаруживает полосы поглощения с максимумами при 403 (полоса Соре), 504 (I), 535 (II), 575 (III) и 633 нм (IV). Копропорфирин III ( растворитель - эфир) - при 392 (полоса Соре), 495 (I) 528 (II), 568 (III) и 623 нм (IV). Считается, что полоса Соре и полосы I и III обусловлены электронными переходами. Полосы II и IV имеют колебательное происхождение.

В ходе работы в исследуемых образцах отмечены следующие хромофоры:

- а-группа гема

- Р-группа гема

- у-группа гема

- оксигемоглобин

- ф-полоса, белковой части гемоглобина,

- деоксигемоглобин

- деоксигемоглобин

- метгемоглобин

- метгемоглобин

- триптофан

- триптофан

- тирозин

- тирозин

- фенилаланин

- цистин, цистеин и метионин

- порфирины

В образцах отмечены пики при длине волны 420 нм, характеризующей наличие в системе соединений имеющих в составе порфириновое кольцо, наблюдающееся у белков, имеющих в своем составе железопорфирин, или гем. Интенсивность данного пика напрямую связана с количеством пигментов в мясе, ответственных за формирование цветности мышечных волокон. Наличие высокоинтенсивного пика в области Соре (420 нм) свидетельствует о более темной окраске мяса первого сорта. Спектрофотометрия образцов мяса показала наличие хромофор при длине волн 540-580 нм, на которых регистрируются соединения окси- и миоглобина. Темная окраска мяса обуславливается большим количеством в нем пигментирующих белков миоплазмы, таких как миоген. Также регистрировались соединения гемовой группы, оскимиоглобин, метмиоглобин, а также спектры свободных аминокислот - триптофан, тирозин, фенилаланин и ряда серосодержащих аминокислот -цистин, цистеин и метионин.

Ферментативная обработка рассматриваемых фракций привела к значительным количественным и качественным изменениям белковых компонентов. Внесение ферментного препарата привело к снижению интенсивности спектров поглощения всех рассматриваемых

белковых фракций. Независимо от вида исследуемой фракции наблюдалось уменьшение полосы Соре, характеризующей наличие в системе соединений мио- и гемоглобина, снижался общий белковый фон, наблюдаемый при длинах волн 200-300 нм, характерных для соединений, имеющих в своем составе пептидную группу, отмечался гидролиз оксимиоглобина.

Необходимо отметить, что характер изменения хромофоров носил экстремальный характер с выраженными максимумами при 60-180 минутах обработки для гемовых групп, окси- деокси- и метмиоглобина. Вероятно, наблюдаемую картину можно объяснить протеолитическим действием ферментного препарата, под действием которого происходила частичная денатурация белковых комплексов мяса, образование высокомолекулярных пептидов, влияющих на спектрофотометрическую картину. Тем не менее, в дальнейшем все рассматриваемые хромофоры показали устойчивую тенденцию к снижению от первоначальных значений, что является следствием протеолитического действия вносимой протеиназы. Косвенным подтверждением этого является накопление в системе свободных аминокислот, регистрируемых в диапазоне длин волн 210-280 нм во всех исследуемых белковых фракциях. Следует отметить, что наиболее интенсивно процесс накопления аминокислот протекал в водорастворимых белковых фракциях.

Экспериментальная часть

Объектами исследования служили: мясное сырье - говядина жилованная второго сорта (с массовой долей соединительной и жировой ткани не более 20 %), полученная от охлажденной говядины I категории по ГОСТ 779-87; ферментный препарат протеолитического действия микробного происхождения - продуцент Bacillus megaterium. Промышленный выпуск препарата освоен на Вышневолоцком заводе ферментных препаратов (ТУоп 00479942-002-94).

Спектрофотометрические исследования проводили методом Варбурга и Христиана [7]. Определение хромофоров вели согласно методике [6].

Литература

1. Антипова Л.В. Основы рационального использования вторичного коллагенсодержащего сырья мясной промышленности / Л.В. Антипова, И.А. Глотова; Воронеж. гос. технол. акад. - Воронеж, 1997.

- 248 с.

2. Пономарев В.Я. Биотехнологические основы применения препаратов микробиологического синтеза для обработки мясного сырья с пониженными функционально-технологическими свойствами / В.Я. Пономарев, Э.Ш. Юнусов, Г.О. Ежкова, О.А. Решетник - Казань: КГТУ, 2009. - 192 с.;

3. Adler Nisseg J. Enzimic hydrolysis of food protein 4211 Dan Kemi / Adler Nisseg J. - 1989 (1). - P. 19-25.

- N67(2), P. 37-43.

4. Пономарев В. Я. Влияние ферментных препаратов на функционально-технологические свойства мясного сырья с пороками / В.Я.Пономарев и др. // Вестник Казан. технол. ун-та. - 2006. - №1. -С.103-111

5. Пономарев В. Я. Оценка качества колбасных изделий, выработанных с применением белковых гидролизатов / В.Я. Пономарев и др. // Вестник Казан. технол. ун-та. - 2010. - № 9. С. 590-594.

6. Кочубей В.И. Определение концентрации веществ при помощи спектрофотометрии / В.И. Кочубей

- Руководство к лабораторной работе, Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского, Саратов. 2008. - 14 с.

7. Антипова Л. В. Методы исследования мяса и мясных продуктов /, Глотова И. А., Рогов И. А. - М.: Колос, 2001.

© В. Я. Пономарев - канд. техн. наук, доц. каф. технологии пищевых производств КНИТУ, v.y.ponomarev@gmail.com; Э. Ш. Юнусов - канд. биол. наук, доцент той же кафедры, ed.yunusov@gmail.com.