СПОСОБ ПРИЖИЗНЕННОЙ ОЦЕНКИ ДЕЙСТВИЯ РЕАГЕНТОВ НА ОБРАЗОВАНИЕ СТОМАТОЦИТОВ
METHOD FOR INTRAVITAL EVALUATION OF REAGENT EFFECT ON STOMATOCYTES FORMATION

Изобретение относится к области медицины и фармации и может использоваться для оценки действия различных реагентов на форму эритроцитов.
При физиологических условиях нормальные эритроциты человека имеют форму двояковогнутого диска.
Известно, что многие реагенты могут обратимо модифицировать эту форму. Одна серия реагентов, действующая на внешнюю половину липидного бислоя, индуцирует серию кренированных форм, называемых эхиноцитами и характеризующихся наличием спикул. Другая серия реагентов, проникающих во внутреннюю половину липидного бислоя, индуцирует образование чашеподобных эритроцитов, называемых стоматоцитами (Sheetz М.Р., Singer S.J. Biological membranes as bilayer couples. A molecular mechanism of drug-erythrocyte interactions. Proc. Nat. Acad .Sci. U.S.A. 1974. V. 71. P. 4457-4461.
В качестве прототипа выбран способ оценки действия реагентов на эритроциты (Reinhart W.H., Lubszky S., Thony S., Schulzki T. Interaction of injectable neurotropic drugs with the red cell membrane. Toxicol in Vitro. 2014. V. 28. P. 1274-1279), включающий их выделение, отмывание от плазмы и белых клеток крови центрифугированием. После инкубации эритроцитов с реагентами их фиксируют с помощью глутарового альдегида и проводят специальную подготовку фиксированных клеток. Затем изменение формы эритроцитов изучают с помощью сканирующего электронного микроскопа.
Однако этот способ трудоемок, занимает длительное время, требует применения дорогостоящего оборудования и не позволяет получить микрофотографии прижизненного изменения формы эритроцитов.
Задачей предлагаемого изобретения является создание несложного, быстрого способа прижизненной оценки действия реагентов на образование стоматоцитов.
Известно, что нормальные эритроциты трансформируются в эхиноциты при контакте двух стеклянных поверхностей (Wong P. A basis of echinocytosis and stomatocytosis in disc-sphere transformation of the erythrocyte. J. Theor. Biol. 1999. V. 196. P. 343-361). Это называется «эффектом стекла». Эффект стекла, в частности, происходит, когда в суспензию эритроцитов, помещенных на предметное стекло, опускают объектив 100х.
Поставленная задача решается за счет того, что суспензию эритроцитов помещают на предметное стекло, опускают в нее объектив (100х) светового микроскопа, после того как образуются эхиноциты, добавляют реагент и проводят микрофотосъемку.
х
Способ прижизненной оценки действия реагентов на образование стоматоцитов осуществляют следующим образом. Эритроциты трижды отмывают от плазмы и белых клеток крови центрифугированием в 10-кратном объеме физиологического раствора. Отмытые эритроциты ресуспендируют в забуференном физиологическом растворе (10 мМ трис-HCl, 150 мМ NaCl, pH 7.4), после чего каплю 0.5% суспензии клеток помещают на предметное стекло, опускают объектив светового микроскопа (100), после образования эхиноцитов добавляют различные реагенты и проводят микрофотосъемку.
Известно, что такие реагенты, как хлористый лантан (Шереметьев Ю.А., Суслов Ф.Ю. Способ оценки изменения состояния мембран эритроцитов Пат. 2082968, 1997), акридиновый оранжевый (Шереметьев Ю.А., Шереметьева А.В. Способ оценки агрегационной способности эритроцитов. Пат. 2390778, 2008) и хлористый цинк (Шереметьев Ю.А., Левин Г.Я., Поповичева А.Н. Способ оценки агрегационной способности эритроцитов. Пат. 2452958, 20 (2) индуцируют агрегацию эритроцитов человека. В то же время мало известно о влиянии их на форму эритроцитов человека.
х
Пример 1. Каплю 0.5% суспензии отмытых эритроцитов помещают на предметное стекло, в нее опускают объектив светового микроскопа (100) и после образования эхиноцитов (рис. 1) добавляют хлористый лантан (320 мкМ). На рисунке 2 видно, что эхиноциты переходят в стоматоциты.
х
Пример 2. Каплю 0.5% суспензии отмытых эритроцитов помещают на предметное стекло, опускают объектив светового микроскопа (100) и после образования эхиноцитов (рис. 1) добавляют акридиновый оранжевый (3 мМ). На рисунке 3 видно, что эхиноциты переходят в стоматоциты.
х
Пример 3. Каплю 0.5% суспензии отмытых эритроцитов помещают на предметное стекло, опускают объектив светового микроскопа (100) и после образования эхиноцитов (рис. 1) добавляют хлористый цинк (4 мМ). На рисунке 4 видно, что эхиноциты переходят в стоматоциты.
Преимуществами предлагаемого способа является простота, доступность и быстрота, отсутствие необходимости в дорогостоящем и сложном оборудовании. Способ позволяет определить прижизненное изменение формы эритроцитов при большом увеличении светового микроскопа (1000х). Важным преимуществом способа является то, что он позволяет изучать переход эхиноцитов в стоматоциты. Отсутствие необходимости фиксации эритроцитов глутаровым альдегидом позволяет избежать искажения истинной картины процесса изменения формы эритроцитов, которая может возникать при использовании фиксаторов клеток крови.