Оптимизация протокола агробактериальной трансформации ячменя

Аграрная наука Евро-Северо-Востока, № 2 (39), 2014 г. УДК 575.25: 579.222.4

Оптимизация протокола агробактериальной трансформации ячменя

Анна Владимировна Бакулина, мл. научный сотрудник,

Ирина Геннадьевна Широких, доктор биол. наук, зав. лабораторией

ГНУ НИИСХ Северо-Востока, г. Киров, Россия

E-mail: drugaeann1@rambler.ru С целью повышения эффективности агробактериальной трансформации в работу были вовлечены экспланты ячменя трех различных типов: каллусная ткань, зрелые и незрелые зародыши. В качестве целевого гена вектор содержал ген Fe-супероксиддисмутазы 1 (Fe-SOD1), экспрессия которого может способствовать формированию неспецифической устойчивости растений к стрессовым воздействиям. Для каллусной ткани ячменя подобраны время инокуляции и сокультивирования эксплантов с агробактерией, эффективные приемы элиминации агробактерии после этапа сокультивирования. Получены 2 фертиль-ные трансгенные линии ячменя Купец и 1 линия ячменя Белгородский 100 с геном Fe-SOD1. Наличие чужеродной вставки подтверждено методом ПЦР. Полученные результаты могут быть использованы при проведении агробактериальной трансформации ячменя и других зерновых злаков.

Ключевые слова: ячмень, трансформация, Agrobacterium tumefaciens AGL0, супероксиддисмутаза, регенерация, молекулярно-генетический анализ

Наиболее доступным и распространенным методом генетической трансформации растений является трансформация с использованием почвенных бактерий Agrobacterium tumefaciens. В связи с ограниченностью круга хозяев агробактерий в природе долгое время этот метод использовали только для трансформации двудольных растений. Однако с использованием супервирулентных штаммов бактерии к настоящему времени удалось трансформировать многие однодольные виды, в том числе - зерновые злаки [1]. Ячмень до сих пор остается сложным объектом генетической модификации из-за низкой частоты (эффективности) трансформации и низкого регенерационного потенциала в культуре in vitro, который еще более снижается при совместном культивировании эксплантов с агробактерией и под воздействием антибиотиков, вносимых в питательные среды для удаления бактерии после процедуры сокультивирования. Успехи в генной инженерии ячменя ограничиваются, в основном, работами на модельных сортах, таких как Golden Promise и Igri [2]. В связи с этим особое значение имеет разработка эффективных протоколов трансформации для сортов ячменя отечественной селекции, в особенности - для создания сортов с повышенной устойчивостью к стрессам.

Цель исследований - оценить трансформационный потенциал отечественных сортов ячменя и получить трансгенные по

Fe-SOD1 гену растения для повышения их антиоксидантой защиты.

Материал и методы. Растительный материал. В работе использовали ячмень (Hordeum vulgare L.) генотипов: Купец, Белгородский 100, 465-08, 498-08, 637-98. Для введения ячменя в культуру in vitro незрелые и зрелые зародыши помещали на питательную среду Мурасиге-Скуга (МС) [3]. Индукцию каллусогенеза из незрелых зародышей проводили в присутствии 2 мг/л дихлорфе-ноксиуксусной кислоты (2,4-Д) (среда МС1). Эксплантированные зародыши культивировали при следующем режиме: температура днем 20-22°С, ночью 16-18°С, фотопериод 16 час. В возрасте 3 недель каллус пассировали на среду для пролиферации (МС2) с 1 мг/л 2,4-Д. Для индукции морфогенеза каллус переносили на среду МС3 с добавлением 1 мг/л кинетина, 0,5 мг/л индолилуксусной кислоты (ИУК), 0,1 мг/л гибберелловой кислоты (ГК). Для получения эмбриокультуры из зрелых зародышей ячменя использовали безгормональную среду МС.

Штамм агробактерии и вектор для трансформации. Для трансформации использовали штамм Agrobacterium tumefaciens AGL0, содержащий плазмиду pBI-FeSOD. На рисунке 1 представлена схема Т-ДНК экспрессионного вектора.

В качестве целевого гена вектор содержал ген антиоксидантного фермента Fe-супероксиддисмутазы 1 (Fe-SOD1) из Arabi-dobsis thaliana. Так как продукция активных

форм кислорода (АФК) является одной из наиболее ранних и универсальных реакций растительных клеток на стресс [4], предполагается, что антиоксидантную активность внутри клетки можно значительно повысить

введением в геном растения гена фермента СОД. Для первичного отбора трансформантов экспрессионный вектор содержал ген неомицинфосфотрансферазы (прг II), обеспечивающий устойчивость к канамицину.

Рис. 1. Схема Т-ДНК экпресссионного вектора с генами npt II и Fe-SOD1: LB - левая граница Т-ДНК; RB - правая граница Т-ДНК; npt II - ген неомицинфосфотрансферазы II E. Coli, T-NOS - терминатор гена нопалинсинтетазы (nos) A. tumefaciens, P-NOS - промотор гена nos A. tumefaciens, P-35S - промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (35S CaMV), Signal - сигнальная последовательность гена rbsc гороха (Pisum sativum L.), направляющая супероксиддисмутазу в хлоропласт.

Инокуляция и сокультивирование. Для трансформации ячменя использовали зрелые, незрелые зародыши и морфогенный каллус. Трансформацию проводили путем сокультивирования эксплантов с суспензией агробактерии. Клетки бактерий выращивали в жидкой среде LB [5] с добавлением антибиотика спектиномицина (50 мг/л) на качалке (180 об./мин) при 25°С. Спектиномицин вносили в среду для ограничения роста агро-бактерий, утративших ранее введенный трансформационный вектор. Для трансформации зрелых зародышей использовали суточную суспензию агробактерии (108 КОЕ/мл), для инокуляции незрелых зародышей и каллуса - 12-часовую культуру (105 КОЕ/мл). В суспензию для инокуляции вносили аце-тосирингон (100 мкМ) с целью повышения эффективности трансформации. Зрелые зародыши инокулировали в колбе на качалке в течение 1 суток, инокуляцию незрелых зародышей проводили путем капельного нанесения (5 мкл на 1 зародыш), морфогенный каллус трансформировали в возрасте 3 недель путем обмакивания каллуса или инкубации в суспензии агробактерии в течение 20, 60 или 120 мин. Сокультивирование проводили в темноте в течение 1 -2 суток до появления видимого роста бактерии вокруг эксплантов. Затем экспланты отмывали в жидкой УгМС-среде и пересаживали на свежую МС-среду с различным гормональным составом (в зависимости от типа экспланта) с добавлением тиментина для элиминации агробактерии.

Отбор и регенерация трансгенных растений. Первичный отбор трансформантов проводили после регенерации растений путем культивирования на среде, содержащей 50 мг/л канамицина. Растения, не потерявшие хлорофилл после 10 дней культивирования на канамицин-содержащей среде, высаживали в сосуды с почвой и выращивали при 16-18°С днем/14°С ночью, фотопериоде 16 час, освещенности 7-10 тыс. лк, влажности воздуха 80%. По мере роста реге-нерантов температуру повышали до 22-24°С, освещение - до 20 тыс. люкс. При данном режиме растения выращивали до получения семенного потомства.

ДНК-анализ. Подтверждение наличия целевого гена в геноме канамицин-устойчивых растений ячменя проводили методом полиме-разной цепной реакции (ПЦР). Выделение ДНК из листьев ячменя проводили по методике Sambrook и Russel [6]. Для постановки ПЦР-реакции использовали пару праймеров: FeS1 5'-ACCTCCATTCG CACTGGAГGCTTT-3' и FeS2 5'-TTCGGTGATGCAGAACTCACTGT-3'. Реакционная смесь (25 мкл) содержала 1 нг ДНК, 0,1 мМ аЖР8, 0,2 мкМ каждого прай-мера, 1хРСЯ-буфер и 1 ед. Тад-полимеразы ^уЬ-Еп2уше). ПЦР проводили в следующем режиме: 1 цикл 94°С - 5 мин, далее 40 циклов - 94°С - 1 мин, 65°С - 1 мин, 72°С - 1 мин, конечная элонгация 72°С - 5 мин.

Результаты и их обсуждение. Эксперимент по трансформации зрелых зародышей ячменя проводили на генотипах Белгородский 100, Купец и 637-98 (табл. 1).

Таблица 1

Эффективность агробактериальной трансформации зрелых зародышей

Генотип Количество эксплантов, шт. Количество проростков, шт. Количество трансгенных линий (ПЦР+), шт. Эффективность трансформации, %

Белгородский 100 116 51 - -

Купец 97 20 15 15,5

637-98 81 16 - -

Из трех испытанных генотипов только у сорта Купец были получены трансгенные растения. По данным ПЦР-анализа, все 15 трансгенных линий, прошедших отбор на канамицине, имели в геноме гетерологичный ген Fe-SOD1 (рис. 2). Жизнеспособными из них оказались 2 трансгенных растения (линии 11 и 14). Трансформанты сформировали семенное потомство, но отличались пониженной завязываемостью семян по сравне-

нию с интактными (контрольными) растениями того же сорта. Так, от линии 11 было получено 28 семян, от линии 14 - 35 семян, которые далее будут использованы в оценке на наследование целевого гена.

При трансформации особую трудность вызывало удаление (элиминация) агробакте-рии после проведения процедуры сокульти-вирования. Быстрое размножение бактерии на поверхности эксплантов вело к их гибели.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Рис. 2. ПЦР-анализ геномной ДНК, выделенной из первичных (Т0) растений ячменя сорта Купец, с праймерами FeS1 и FeS2: 1 - маркер DNA Ladder (SybEnzyme); 2 - плазмидная ДНК (положительный контроль, длина ампликона 645 п.н); 3 - нетрансгенное растение ячменя сорта Купец (отрицательный контроль); 4-18 - линии 1-15 ячменя Купец, полученного при трансформации зрелых зародышей

Большая часть эксплантов (от 41 до 97% у разных генотипов) была заражена агробак-терией, что снизило количество растений, подвергнутых первичному отбору на среде с канамицином. Высокий процент зараженных эксплантов мог быть обусловлен недостаточностью 150-300 мг/л тиментина для удаления агробактерии, поэтому возникла необходимость определения минимальной подавляющей концентрации (МПК) данного антибиотика в отношении штамма AGL0 A. tumefaciens. МПК тиментина составила 37,5 мг/л (при культивировании бактерии в жидкой LB-

среде) и оказалась гораздо ниже концентрации, использованной нами и рекомендуемой в работах по агробактериальной трансформации [7, 8]. Прочное связывание бактерии с тканью экспланта, способность агробактерий к формированию крупных клеточных агрегатов [9], а также отсутствие контакта всей поверхности экспланта (и развивающейся на нем бактерии) с плотной питательной средой, содержащей антибиотик, требовало разработки более эффективных приемов удаления агробактерии. Поэтому в протокол трансформации незрелых зародышей после сокультивирования ввели

дополнительный этап отмывания эксплантов в жидкой УгМС-среде с добавлением тиментина.

Трансформации было подвергнуто 174 зародыша двух генотипов: 465-08 и 498-08. Трансформированные экспланты отмывали средой без антибиотика, а затем на несколько минут помещали их в среду, содержащую 40 мг/л тиментина. Подсушенные экспланты переносили на среду МС1 со 150 мг/л ти-ментина. При дальнейшем появлении роста агробактерии экспланты вновь отмывали в среде УгМС с добавлением 150 мг/л тиментина и пересаживали на свежую МС1-среду, содержащую от 350 до 500 мг/л тиментина. Агробактерию удалось полностью элиминировать при отмывке зародышей в среде со 150 мг/л тиментина и пересадке на среду с 500 мг/л тиментина. Незрелые зародыши после трансформации образовывали на среде МС1 каллус диаметром 3-4 мм, пересадка на среду МС2 не способствовала пролиферации каллусной ткани. В результате трансформации незрелых зародышей получить растения-регенеранты ячменя не удалось.

Подобранную и апробированную на незрелых зародышах методику элиминации

1000

1 2 3 4 5

Трансформации было подвергнуто 234 каллуса ячменя Белгородский 100 и 129 каллусов ячменя Купец, частота трансформации для сорта Белгородский 100 составила 0,4% (1 растение), для сорта Купец трансформанты в этом случае не получены. Полученное от трансформанта семенное потомство (332 зерна) будет оценено на наследование целевого гена и физиологическую устойчивость к окислительному стрессу.

Выводы. В результате проведенных исследований удалось осуществить агробак-

агробактерии использовали при трансформации каллусной ткани ячменя. В эксперименте с каллусом подбирали время инокуляции и сокультивирования, которое бы в меньшей степени снижало частоту регенерации каллусной ткани, прошедшей процедуру трансформации. На этапе органогенеза учитывали частоту встречаемости каллусов с меристематическими зонами и некрозами. Некротизации каллуса при сокультивирова-нии в течение 1 суток не отмечали, при со-культивировании в течение 2 суток частота некротизации не превышала 5%. Количество меристематических зон варьировало от 0 до 60%. Более высокая (22,6-60,0%), чем в других временных вариантах опыта (0,0-16,7%), меристематическая активность наблюдалась у каллуса ячменя, претерпевшего инокуляцию продолжительностью 20 мин со временем сокультивирования - 1 сутки. В результате использования установленных временных параметров трансформации было получено 1 растение-регенерант сорта Белгородский 100. ПЦР-анализ показал наличие в геноме трансформанта сорта Белгородский 100 гетерологичного гена Гв-80В1 (рис. 3).

териальную трансформацию ячменя отечественных сортов Купец (15 линий) и Белгородский 100 (1 линия). Молекулярно-генетический анализ подтвердил наличие гетерологичного гена ¥г-8001 в геноме регенерированных растений ячменя. Эффективность трансформации зрелых зародышей сорта Купец была выше (15,5%), чем эффективность трансформации каллусной ткани сорта Белгородский 100 (0,4%). Однако в результате трансформации зрелых зародышей не все регенерантные растения сумели

Рис. 3. ПЦР-анализ геномной ДНК, выделенной из первичных (Т0) растений ячменя сорта Белгородский 100, с праймерами FeS1 и FeS2: 1,5 - маркер DNA Ladder (SybEnzyme), 2 - плазмидная ДНК (положительный контроль); 3 - нетрансгенное растение ячменя сорта Белгородский 100 (отрицательный контроль); 4 - трансформированная линия ячменя Белгородский 100, полученная при трансформации морфогенного каллуса

адаптироваться к почвенным условиям. Поэтому эффективность трансформации, с учетом получения фертильных трансгенных растений, составила всего 2,1%. В целом, частота агробактериальной трансформации исследованных сортов сопоставима с имеющимися данными по агробактериальной трансформации ячменя другими авторами (0,5-9,2%) [10].

В процессе работы были подобраны эффективные приемы для удаления агробак-терии после её совместного культивирования с различными типами эксплантов. Для кал-лусной ткани ячменя определены оптимальные временные параметры инокуляции и сокультивирования. Полученные результаты могут быть использованы при проведении агробактериальной трансформации ячменя и других зерновых злаков.

Список литературы

1. Cheng M., Lowe B., Spencer M., Ye X., Armstrong C. Invited review: factors influencing agrobacterium-mediated transformation of monocotyledonous species // In vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 2007. V. 40. P. 31-45.

2. Dahleen L.S., Manoharan M. Recent advances in barley transformation // In Vitro Cell and Dev. Biol. Plant. 2007. V. 43. P. 493-506.

3. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and b^ssays with tobacco tissue culture // Physiol. Plant. 1962. V. 15. P. 473-497.

4. Креславский В.Д., Лось Д.А., Ал-лахвердиев С.И., Кузнецов Вл.В. Сигнальная роль активных форм кислорода при стрессе у растений // Физиология растений. 2012. Т. 59. №2. С. 163-178.

5. Miller J. H. Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, New York: Cold Spring Harbor. 1972. 466 с.

6. Sambrook J., Russel D.W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Harbour, New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring, 2001. V. 1. 2344 p.

7. Халилуев М.Р., Долгов С.В. Генетическая трансформация томата (Solanum lycopersicum L.) генами защитных хитинсвя-зывающих белков и антимикробных пептидов // Известия ТСХА. 2010. №6. С. 75-83.

8. Савчин Д.В., Панюш А.С., Картель Н.А. Молекулярно-генетический анализ трансгенных растений картофеля с геном GOX Penicillium funiculosum // Труды БГУ. 2011. Т. 6. ч. 2. С. 116-120.

9. Матис Э., Кайн Я. Прикрепление Rizobiaceae к растительным клеткам. /В кн.: Rizobiaceae: молекулярная биология бактерий, взаимодействующих с растениями / Под ред. И.А. Тихоновича, Н.А. Проворова. Спб., 2002. С. 259-274.

10. Shravat A.K., Lorz H. Agrobacterium-mediated transformation of cereals: a promising approach crossing barriers // Plant Biotechnology Journal. 2006. V. 4. P. 575-603.

Optimization of Agrobacterium-mediated transformation protocol of barley Bakulina A., Shirokikh I.

To improve the efficiency of Agrobacterium-mediated transformation barley explants of three different types were involved in the work: callus tissue, mature and immature embryos. The vector contained the Fe-superoxide dismutase 1 (Fe-SOD1) gene as a target gene, which expression may contribute to the formation of non-specific plant resistance to stresses. Time of inoculation and co-cultivation of explants with Agrobacterium and effective methods of elimination of agrobacteria after co-cultivation stage was selected for barley callus tissue. Two fertile transgenic barley lines (cultivar Kupets) and one barley line (cultivar Belgorodsky 100) with Fe-SOD1 gene were obtained. The presence of alien insert was confirmed by PCR method. The obtained results can be used in the course of the Agrobacterium-mediated transformation of barley and other cereals.

Key words: barley, transformation, Agrobacterium tumefaciens AGL0, superoxid dismutase, regeneration, molecular genetic analysis