Биомедицинская композиция для лечения дегенеративных заболеваний суставов на основе региональных стволовых клеток взрослого организма
BIOMEDICAL COMPOSITION FOR TREATING DEGENERATIVE JOINT DISEASES BASED ON REGIONAL ADULT STEM CELLS

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области биомедицины, в частности, к тканевой инженерии и клеточной терапии. Более подробно изобретение относится к созданию композиции на основе региональных стволовых клеток, предназначенной для восстановления поврежденных тканей суставов и, в частности, хрящевой гиалиновой ткани человека. Композиция может быть выполнена в форме, предназначенной для внутрисуставного введения. Композиция может найти широкое применение в ортопедии, а именно: для лечения дегенеративных заболеваний суставов различных локализации и этиологии.
Уровень техники
Тканевая инженерия и клеточная терапия – новые перспективные направления биомедицины, которые в последние годы активно развиваются и с успехом применяются в регенеративной медицине. В организме восстановление поврежденных тканей происходит за счет региональных стволовых/прогениторных клеток. Однако в течение жизни, из-за воздействия неблагоприятных факторов, не только уменьшается количество этих клеток, но и нарушаются механизмы регуляции их активности (Rao M.S., Mattson M.P. Stem cell and aging: expanding the possibilities. // Mech. Ageing Dev. 2001. Vol.122. P. 713-734). В результате в работе организма происходят сбои, которые в итоге приводят к различным нарушениям и заболеваниям.
В последние годы выделены и охарактеризованы практически все типы клеток человеческого организма. Проводятся активные работы по внедрению новых клеточных технологий в медицинскую практику, благодаря чему становится возможным восстановление/замена поврежденных тканей и органов. Разработаны технологии, позволяющие использовать выделенные и размноженные в условиях in vitro клетки для лечения самых разных патологических состояний. Эффективность инновационного подхода для репарации поврежденной ткани, прежде всего, зависит от грамотного выбора клеточного материала.
Наиболее изученными, перспективными и безопасными для применения в регенеративной медицине на сегодняшний день являются мезенхимные мультипотентные стромальные клетки (ММСК), которые обладают выраженными потенциями к восстановлению тканей мезенхимного происхождения.
Впервые ММСК были выделены из костного мозга группой ученых в 1974 году (Fridenshtein A.J., Deriglazova U.F., Kulagina N.N. et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method.// Exp. Hematol. 1974. Vol. 2. P. 83-92).
В процессе изучения было продемонстрировано, что мультипотентные мезенхимные стромальные клетки отличаются относительной простотой выделения и культивирования, способностью пролиферировать в течение длительного времени in vitro и широким спектром дифференцировки не только в клетки тканей мезенхимного происхождения, но и в клетки тканей других зародышевых листков. В настоящее время отработаны методики выделения ММСК из многих тканей организма (жировая ткань, дерма, тимус, плацента, фетальные ткани и др.), наиболее легкодоступным источником из них является жировая ткань. Доказано, что ММСК обладают свойством хоуминга, характерным для стволовых клеток, – при  введении внутривенно они мигрируют в проблемную зону, где принимают активное участие в репарации поврежденной ткани.
На сегодняшний день ММСК человека полностью охарактеризованы, подтверждена их биобезопасность и клиническая эффективность применения для восстановления тканей мезенхимного происхождения. Показано, что клетки, выращенные in vitro, способны при культивировании в соответствующих условиях сохранять свои физиологические потенции и восстанавливать поврежденные ткани при введении в проблемную зону, Например, ММСК  применяются в лечении дегенеративных заболеваний суставов.
Для лечения суставов человека с использованием ММСК, выделенных из различных источников взрослого организма предлагаются различные композиты. Основные стратегии разработки оптимальных биотехнологических способов восстановления дефектных тканей направлены на выбор предпочтительного способа выделения и размножения клеток и выбор адекватного носителя с целью их доставки в область повреждения, адаптации в дефектной области и поддержания потенций.
Для доставки клеток в область дефекта предлагаются различные вещества: биосовместимые гели (US20090269406 A1, RU2352584 С1), гидрогели (US2011182957 A1), биологические материалы, представляющие собой жидкий вязкий раствор, содержащий, по меньшей мере, один природный и/или полусинтетический полисахарид (US2012114609 A1), полисульфированные полисахариды (JP5542686 B2).
За последние годы опубликовано множество исследований по лечению суставов с применением современных биотехнологий (Tosun H.B.,  Uludag A., Üçer Ö., Serbest S.,  The effect of sodium hyaluronate-chondroitin sulfate combined solution on cartilage formation in osteochondral defects of the rabbit knee: an experimental study // Ther Clin Risk Manag. 2017. 13. Р. 523–532; de Windt T.S., Vonk L.A., Slaper-Cortenbach I.C.M., Nizak R., van Rijen M.H.P., Saris D.B.F. Allogeneic MSCs and Recycled Autologous Chondrons Mixed in a One-Stage Cartilage Cell Transplantion: A First-in-Man Trial in 35 Patients // Stem Cells. 2017. 35(8). Р. 1984-1993; Jo C.H., Lee Y.G., Shin W.H., Kim H., Chai J.W., Jeong E.C., Kim J.E., Shim H., Shin J.S., Shin I.S., Ra J.C., Oh S., Yoon K.S. Intra-articular injection of mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis of the knee: a proof-of-concept clinical trial // Stem Cells. 2014. 32(5). Р. 1254-1266; Koh Y.G., Choi Y.J. Infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cell therapy for knee osteoarthritis // Knee. 2012. 19(6). Р. 902-907; Sekiya I., Muneta T., Horie M., Koga H. Arthroscopic Transplantation of Synovial Stem Cells Improves Clinical Outcomes in Knees With Cartilage Defects // Clin Orthop Relat Res. 2015. 473(7). Р. 2316–2326).
Во всех перечисленных работах для восстановления дефекта суставного хряща используются выделенные из разных источников ММСК или их производные и носители различной природы. Представлены также различные способы введения клеточных композитов в область дефекта. Однако ни в одной из известных работ не был достигнут эффект полного замещения дефекта необходимой хрящевой гиалиновой тканью, – восстановления либо не происходило, либо оно было частичным или временным, либо вместо хрящевой гиалиновой ткани зарастание дефекта проходило с образованием волокнистой хрящевой ткани.
Таким образом, поиск новых эффективных решений для лечения дегенеративных заболеваний суставов с использованием клеточных технологий остается актуальным.
В качестве прототипа предлагаемого решения выбрано решение, представленное в документе RU2452527 C1. Данное решение представлено и в источнике C.B. Коржикова, Е.В. Фролов, З.А. Тепляшин, В.Н. Воловенко, A.C. Тепляшин. Перспективы клинического применения мультипотентных мезенхимных стромальных клеток для регенерации хрящевой гиалиновой ткани // Биомедицина. 2017. № 2. С. 23-32.
В документе RU2452527 C1 раскрыта композиция для регенерации хрящевой гиалиновой ткани суставов, включающая ММСК кролика и гель «Линтекс-Мезогель». Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки жировой ткани кролика вводили в 2,2% гель, пипетировали до гомогенного состояния и вводили внутрисуставно.
Однако в данном решении вязкость препарата значительно меньше вязкости синовиальной жидкости здорового человека, что снижает его эффективность.
Вязкость препарата, приближенная к физиологическим параметрам здорового человека, является очень важным фактором для процессов регенерации внутри сустава (A.Y. Hui, W. J. McCarty, K. Masuda, G. S. Firestein, and R. L. Sah. A Systems Biology Approach to Synovial Joint Lubrication in Health, Injury, and Disease// Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2012. 4(1). Р. 15–37).
Необходимо при этом учесть, что при воспалительных состояниях, таких как ревматизм, ревматоидный, подагрический или псориатический артриты, болезнь Рейтера, артрозы и др. вязкость синовиальной жидкости снижается.
Выше отмечено (и подтверждено примерами настоящей заявки), что слишком низкая вязкость прототипа приводит к снижению его эффективности.
Помимо этого, нами было обнаружено и подтверждено экспериментально, что чрезмерное увеличение вязкости также негативно сказывается на потенциях клеток в составе композиции и снижает в итоге его терапевтическую эффективность.
В связи с этим поставлена задача – создать композицию оптимальной вязкости и состава, более эффективную в лечении дегенеративных заболеваний суставов, чем решение-прототип, позволяющую сохранить высокие физиологические потенции клеток в ее составе.
Раскрытие изобретения
Предлагаемое изобретение направлено на создание биомедицинской композиции для лечения дегенеративных заболеваний суставов у человека, активным агентом которой являются мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК), выделенные из жировой ткани (ЖТ) организма взрослого млекопитающего. Настоящая биомедицинская композиция включает также гель «Линтекс мезогель», аутосыворотку и физиологический раствор в следующих соотношениях, % от общего объема композиции:
ММСК ЖТ –  2,5-3,0 млн на 1 мл препарата
«Линтекс-Мезогель»  - 60-70%;
Аутосыворотка  - 10-20%
Физиологический раствор – до 100%.
Техническим результатом заявленного изобретения является создание более эффективной, чем прототип, недорогой, легко воспроизводимой композиции, для лечения дегенеративных заболеваний суставов, обеспечивающей высокую жизнеспособность, пролиферативную активность и способность клеток к дифференцировке в клетки хрящевой ткани в ее составе.
Технический результат достигается благодаря использованию композиции предлагаемого состава, имеющей вязкость, приближенную к вязкости синовиальной жидкости здорового человека, обеспечивающей высокую жизнеспособность, пролиферативную активность и способность клеток к дифференцировке в клетки хрящевой ткани в ее составе.
Выбор ММСК ЖТ базируется, прежде всего, на их способности в определенных условиях превращаться в клетки хрящевой ткани. Кроме того жировая ткань является легкодоступным альтернативным источником для получения клеток, которая может быть получена амбулаторно под местной анестезией от любого человека. Метод выделения ММСК из этого источника легко воспроизводим, а мезенхимные стволовые клетки, выделенные из жировой ткани, по своим потенциям не уступают ММСК из других источников (Тепляшин А.С., Коржикова, С.В. Шарифуллина С.З., Чупикова Н.И., Ростовская М.С., Савченкова И.П. Характеристика мезенхимальных стволовых клеток человека, выделенных из костного мозга и жировой ткани. //Цитология. 2005. Т.47. №2. С. 130-135).
В настоящем изобретении применяются ММСК, выделенные из жировой ткани организма взрослого млекопитающего. Подходящим млекопитающим в контексте настоящего изобретения являются, в частности, человек, кролик, собака, лошадь, кошка.
В настоящем изобретении могут применяться ММСК пациента.
Концентрация ММСК в контексте настоящего изобретения составляет 2,5-3,0 млн на 1 мл препарата.
В составе носителя в предлагаемой композиции используются физиологический раствор и аутосыворотка, присутствующие в виде транссудата в суставе. Носитель для доставки клеток и адаптации их внутри сустава дополнительно к физиологическому раствору и аутосыворотке содержит гель «Линтекс мезогель» (патент RU2352584 С1), используемый в медицине на органах и тканях, имеющих серозное покрытие (в том числе на суставах).
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что добавление аутосыворотки при сокультивировании геля с клетками в физиологическом растворе в предлагаемых соотношениях способствует сохранению жизнеспособности, пролиферативной активности и хондрогенных потенций ММСК. Полученный композит, благодаря своей плотности и вязкости, создает каркас, который обеспечивает эффективную защиту на время, необходимое для адаптации клеток внутри сустава, а также их приживаемость в организме.
Композиция может трансплантироваться непосредственно в поврежденный сустав.
Препараты, включающие композицию, могут быть выполнены в виде геля.
Осуществление изобретения
Представленные ниже примеры описывают способ получения предлагаемой композиции и подтверждают наличие у нее указанных выше свойств и преимуществ.
Выделение и культивирование мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) из жировой ткани (ЖТ) человека.
0
2
6
2
0
6
2
2
Забор жировой ткани объемом 1-3 мл проводят амбулаторно, под местной анестезией. Ткань промывают фосфатно-солевым буфером (ФСБ), измельчают механически и в течение 30 минут при 37 С подвергают ферментативной обработке 0,075 %-ным раствором коллагеназы тип I в среде Игла в модификации Дюльбеко (ДМЕМ). Коллагеназу отмывают питательной средой ДМЕМ, дополненной 10% эмбриональной сыворотки теленка и центрифугируют в течение 5 минут со скоростью 1000 g. Полученный осадок ресуспендируют и пропускают через фильтры с диаметром пор 100 мкм и 10 мкм соответственно для удаления клеточных остатков и получения гомогенной популяции клеток. Полученную клеточную суспензию высевают в культуральные флаконы площадью 75 см из расчета 10 клеток/см (доля прикрепившихся клеток примерно 1-1,5%). Культивируют мезенхимные стромальные клетки в среде ДМЕМ с низким содержанием глюкозы, дополненной 10% эмбриональной сыворотки теленка, однократным раствором заменимых аминокислот и антибиотиками (100 ед/мл пеницилина, 100 мкг/мл стрептомицина) или в  безсывороточной среде AIM-V (Gibco, BRL, Grand Island, NY)  при 37  С и 5 % СО в воздухе. Смену среды производят каждые 4 суток и по достижении конфлуэнтного монослоя осуществляют субкультивирование: клетки снимают с субстрата раствором 0,05% трипсин-ЭДТА, суспендируют в ростовой среде и высевают на культуральные флаконы из расчета 5х10 клеток/см. Клетки наращивают до необходимого терапевтического количества. Для подготовки препарата клетки снимают с субстрата, отмывают средой ДМЕМ, а затем физраствором с альбумином, ресуспендируют в небольшом количестве физиологического раствора и подсчитывают в камере Горяева.
Характеристика клеток.
Выделенные из свежеизолированной жировой ткани клетки обладают свойством адгезивности к субстрату, имеют фибробластоподобную морфологию с четко выраженным ядром, повышенной гранулярностью, вакуолями и выростами цитоплазмы.
Цитофлуореметрический анализ (цитометр Epics Elite Coulter) популяции выделенных клеток выявил на их поверхности наличие АГ, характерных для ММСК человека.  Клетки положительно окрашивались AT (BD Bioscience Pharmingen, США) к АГ CD29, CD44, CD49a, b, d, CD73, CD90, CD105, CD166, HLA АВС и отрицательно к CD34, CD45 (маркеры стволовых клеток крови), CD31 (маркер эндотелиальных клеток), CD 117 (рецептор фактора стволовых клеток c-kit), STRO-1, а также HLA DR, HLA DP, HLA DQ.
Мультипотентность полученной популяции клеток подтверждена in vitro. При добавлении соответствующих индукторов дифференцировки они формируют клетки костной, хрящевой и жировой тканей.
G-анализ хромосом показал, что линия имеет диплоидный кариотип 46, XX.
Митотический индекс и время цитогенерации составляют 34‰ и 54-62 час.    соответственно.
Получение аутосыворотки
0
0
Для получения аутосыворотки параллельно с забором жировой ткани у пациента производят забор венозной крови с помощью вакуумных шприцев-контейнеров S-Monovette с активатором свертывания крови (SARSTEDT, Германия). Кровь центрифугируют при 600g в течение 25 минут, после чего отбирают сыворотку в стерильные пробирки и хранят при -18С. Перед использованием сыворотку размораживают в водяной бане при 37  С.
Выбор носителя композиции
При создании композиции учитывали следующие свойства, которыми она должна обладать: гелеобразная консистенция, максимально приближенная по плотности к синовиальной жидкости здорового человека, носитель не должен подавлять жизнеспособность клеток, их пролиферативную активность и способность к хондродифференцировке, состав композиции должен быть совместимым с тканями сустава.
С этой целью осуществляли in vitro сокультивирование клеток с различными носителями, с последующей оценкой по данным критериям. В качестве носителей были выбраны и протестированы коммерческие препараты, используемые в ортопедии для внутрисуставных инъекций: гель «Линтекс-Мезогель» и препараты гиалуроновой кислоты (основной компонент синовиальной жидкости) – «Синокром Форте» и «Остенил».
«Линтекс-Мезогель» –  гель на основе карбоксиметилцеллюлозы, 2,2% - 4,5% растворы, используются в медицине на органах и тканях, имеющих серозное покрытие (в том числе на суставах). 4,5% раствор «Линтекс-Мезогель» по вязкости аналогичен синовиальной жидкости здорового человека.
«Синокром Форте» – 2% изотонический, апирогенный, стерильный раствор гиалуроновой кислоты в виде натриевой соли гиалуроновой кислоты – гиалуроната натрия (20 мг/мл), применяется для внутрисуставных инъекций при дегенеративных заболеваниях суставов.
«Остенил» – 2% изотонический раствор гиалуроновой кислоты, используется в ортопедии при лечении дегенеративных и травматических изменений крупных  (коленного, тазобедренного, локтевого) синовиальных суставов. Кроме гиалуроната натрия (20 мг/мл) содержит воду для инъекций, хлорид натрия, моногидрогенфосфат натрия, дигидрогенфосфат натрия. Остенил выпускается в шприцах для внутрисуставных локальных инъекций.
Сокультивирование проводили в течение суток путем добавления носителя в культуральную среду. С этой целью с конфлуэнтного монослоя ММСК сливали рабочую среду и заливали средой, в которой часть питательной среды DMEM заменяли гелем, а затем оценивали его воздействие на клетки. Через сутки в чашках с «Синокром Форте» и «Остенил» наблюдались открепившиеся клетки (приблизительно 10 % от общего количества клеток), причем чем больше была концентрация геля, тем больше наблюдалось открепившихся клеток, в то время как при добавлении «Линтекс-Мезогель» клетки не откреплялись (Таблица 1).
Через 24 часа среду с клеток сливали, центрифугировали при 300g 7 минут и оценивали количество открепившихся клеток путем подсчета в камере Горяева.
Таким образом, из тестируемых препаратов наилучшие свойства в качестве носителя для доставки клеток в область дефекта оказался «Линтекс-Мезогель».
Таблица 1. Воздействие носителей на жизнеспособность клеток
количество геля                                                                                                     носитель
20%
30%
40%
«Линтекс-Мезогель»
-
-
-
«Синокром
+
+
++
«Остенил»
+
++
+++
где «+» – 10 % открепившихся клеток от общего количества ММСК в конфлуэнтном монослое.
Оптимизация состава композиции
Поскольку для культивирования ММСК используется исключительно жидкая среда, необходимо было изучить воздействие вязкой среды на потенции клеток. С этой целью определяли оптимальную концентрацию геля в биомедицинской композиции, обеспечивающую вязкость, максимально приближенную к вязкости синовиальной жидкости здорового человека и при этом не влияющую негативно на физиологический потенциал клеток.  Для этого смешивали клетки в различных вариантах и концентрациях с ингредиентами препарата (Таблица 2), выдерживали в течение 5-ти часов при комнатной температуре, отмывали клетки путем суспендирования-центрифугирования и оценивали жизнеспособность, пролиферативную активность и способность клеток к дифференцировке в клетки хрящевой ткани. В качестве контроля были клетки, культивируемые в стандартных условиях.
Таблица 2. Варианты композиций
№композиции
Ингредиенты на 1 мл препарата  (мкл)
«Линтекс-Мезогель»4,5 %
Аутосыворотка
Физиологическийраствор
ММСК
1
1000
-
-
2,5 млн
2
900
-
100
2,5 млн
3
900
100
-
2,5 млн
4
700
200
100
2,5 млн
5
700
100
200
2,5 млн
6
600
200
200
2,5 млн
7
600
100
300
2,5 млн
8
500
200
300
2,5 млн
9
500
100
400
2,5 млн
10
400
-
600
2,5 млн
Отмытые клетки суспендировали в небольшом объеме физиологического раствора и проводили тест на жизнеспособность. Для этого суспензию клеток окрашивали 4% раствором трипанового синего в эквивалентном объеме в течение 5 мин. Затем 10 мкл окрашенной суспензии клеток переносили в камеру Горяева и сразу производили оценку. Путем прямого микроскопического наблюдения производили подсчет окрашенных клеток в пяти больших квадратах камеры. Процент жизнеспособности клеток в суспензии определяли по стандартной формуле, описанной для ММСК человека.
6
2
6
Для оценки пролиферативной активности клетки высевали на чашки в концентрации 10 клеток/см. Митотический индекс для каждой популяции клеток рассчитывали в фазе логарифмического роста как отношение числа митозов (n) к общему количеству подсчитанных клеток (N, не менее 1Ч10 ), умноженное на 1000 (в ‰).
МИ = 1000 ‰
Время удвоения популяции определяли путем подсчета количества клеток в десяти выбранных и отмеченных квадратах культуральной чашки через 18, 24, 36, 48 и 60 часов.
Для подтверждения способности клеток к дифференцировке в клетки хрящевой ткани из отмытых клеток путем центрифугирования формировали плотный агрегат с последующим культивированием его в среде, содержащей индукторы хондродифференцировки. Путем иммуноцитохимического анализа в сформированных в пробирке трехмерных кусочках ткани определяли наличие клеток, положительно окрашенных антителами к маркеру хондроцитов – аггрекану.
В результате было установлено:
- Оптимальными по критериям «жизнеспособность/вязкость/потенциал клеток к делению и дифференцировке» оказались композиции №№ 4, 5, 6, вязкость препаратов в этих композициях наиболее приближена к вязкости синовиальной жидкости здорового человека и составляет 3,15%  для №№ 4, 5 и 2,7% для № 6 (относительно вязкости 4,5% – го «Линтекс-Мезогеля», аналогичного вязкости синовиальной жидкости здорового человека). При достаточно высокой вязкости этих композиций, клетки, благодаря добавлению сыворотки, имеют характерный для ММСК диапазон значений по показателям жизнеспособности (%) и пролиферативной активности (МИ-митотический индекс) – 90-95% и 32-34‰ соответственно.
- Клетки из композиций №№ 4, 5, 6 сохраняют свои потенции к цитодифференцировке: при добавлении индукторов хондродифференцировки они формируют клетки хрящевой ткани.
- Дальнейшее увеличение вязкости, даже при добавлении сыворотки сказывается негативно на жизнеспособности и пролиферативной активности клеток. Так в композиции № 3, по вязкости максимально приближенной к синовиальной жидкости здорового человека (4,05 % относительно Мезогеля), несмотря на добавление сыворотки, жизнеспособность и пролиферативная активность клеток резко снижаются.
-  Смешивание клеток с 4,5 % «Линтекс-Мезогель»  (№ 1) приводит к деградации клеток.
- При низкой вязкости композиции (№№ 8, 9, 10) клетки полностью сохраняют жизнеспособность, пролиферативную активность и потенции к цитодифференцировке in vitro, однако при введении в сустав этого композита эффективность репарации хряща значительно ниже, по сравнению  с более вязкими композитами.
Сравнение предлагаемых композиций с прототипом
Для сравнения процесса регенерации хрящевой ткани в зависимости от состава трансплантата у кроликов через 14 суток и 28 суток после введения трансплантатов изолировали костно-хрящевой композит сустава, на который был нанесен дефект, и проводили визуальный и гистологический анализ (Таблица 3). С этой целью формировали 2 группы животных и осуществляли моделирование дефекта суставного хряща. На внутренней суставной поверхности бедренной кости кроликам в 1-й группе скальпелем срезали часть гиалинового хряща длиной около 1 см и шириной примерно 1 мм, а кроликам из 2-й группы – часть гиалинового хряща длиной около 1 см и шириной примерно 3 мм. Введение препаратов производили через 7 суток после нанесения дефекта путем внутрисуставных инъекций однократно. Через 14 и 28 суток животных выводили из эксперимента. При увеличении размера дефекта прототип значительно уступает по эффективности по сравнению с более вязкими препаратами.
Таким образом, продемонстрировано, что предлагаемые композиции оказались эффективнее прототипа в скорости и качестве регенерации хрящевой гиалиновой ткани, и, соответственно, в терапии суставного дефекта хрящевой гиалиновой тканью, вне зависимости от размера этого дефекта.
Таблица 3. Степень регенерации суставного хряща в зависимости от состава препарата.
№
Состав композита
1-я группа(дефект 1 см х 1 мм)
2-я группа(дефект 1 см х 3 мм)
Степень регенерации дефекта (%)  на 14 сутки после введения препарата
Степень регенерации  дефекта (%) на 28 сутки после введения препарата
Степень регенерации дефекта (%) на 14 сутки после введения препарата
Степень регенерации дефекта (%) на 28 сутки после введения препарата
1
2,2 % гель + ММСК(прототип)
80%
100%
50%
65%
2
2,7 % гель + ММСК + сыворотка
90%
100%
70%
80%
3
3,15 % гель + ММСК + сыворотка
95%
100%
80%
90%
Подготовка биомедицинской композиции для внутрисуставного введения
После финального пассирования клетки снимают с субстрата, отмывают средой ДМЕМ, а затем физраствором с альбумином, подсчитывают в камере Горяева. Затем клетки ресуспендируют в аутосыворотке (10%–20% от общего объема композиции) из расчета 2,5 млн клеток на 1 мл препарата. В 4,5 % Мезогель (60%–70% от общего объема композиции) добавляют физиологический раствор (10%–20% от общего объема композиции) и смешивают до гомогенного состояния, после чего в него вносят сыворотку с клетками и тщательно пипетируют, не допуская образования пузырей.
Общий объем вводимой композиции определяется врачом-ортопедом в зависимости от размера суставной полости и локализации сустава (от 2 мл до 5 мл).
Подготовленная композиция набирается в стерильный шприц и подлежит введению в сустав в течение 2-х часов.
Примеры композиций на 1 мл (1000 мкл) препарата:
1. ММСК ЖТ – 2,5 млн
«Линтекс-Мезогель»  – 600 мкл
Аутосыворотка  – 200 мкл
Физиологический раствор – 200 мкл
2. ММСК ЖТ – 2,5 млн
«Линтекс-Мезогель»  – 700 мкл
Аутосыворотка  –  100 мкл
Физиологический раствор – 200 мкл.
3.  ММСК ЖТ – 3,0 млн
«Линтекс-Мезогель»  – 700 мкл
Аутосыворотка – 200 мкл
Физиологический раствор – 100 мкл
4. ММСК ЖТ – 3,0 млн
«Линтекс-Мезогель»  – 600 мкл
Аутосыворотка – 200 мкл
Физиологический раствор – 200 мкл
Пример терапевтического применения изобретения.
Пациент С. поступил в клинику с жалобами на боль в области правого и левого ВНЧС (височный нижне-челюстной сустав) при открывании рта и ограничение открывания рта.
Пациенту был диагностирован артроз обоих височных нижне-челюстных суставов.
Учитывая клинические данные и данные КЛКТ и МРТ ВНЧС, пациенту была произведена артроскопическая операция с введением в оба сустава по 2 мл препарата на основе ММСК (2,5 млн ММСК в 1 мл препарата, т.е. в каждый сустав было введено по 5 млн клеток)
В первые 7 дней после хирургического вмешательства боль и отек в послеоперационной области соответствовали тяжести перенесенного хирургического вмешательства.
На 14-е сутки после операции пациент чувствовал себя удовлетворительно, ограничения открывания рта и затруднения в приеме пищи пациент не испытывал. Объективно отрывание рта увеличилось до 3,9 см. Отмечалось наличие небольшой девиации и дефлекции влево при открывании рта на 1-2 мм. Сохранялись незначительные болевые ощущения возникающие, со слов пациента, крайне редко.
Через месяц после вмешательства клинические данные при обследовании пациента соответствовали норме. Ограничение открывания рта, дефлекция и боли отсутствовали. На 6 месяце после проведенного лечения отсутствовали какие-либо клинические симптомы нарушения работы ВНЧС, пациенту были произведены КЛКТ и МРТ ВНЧС.
На МРТ и КЛКТ ВНЧС прослеживается восстановление контуров головок мыщелковых отростков нижней челюсти, положения и формы суставных дисков.