СПОСОБ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ТЕРАПИИ ГЕПАТИТА
METHOD FOR EXPERIMENTAL THERAPY OF HEPATITIS

Изобретение относится к области медицины, конкретно к фармакологии и гепато-логии, и касается способа терапии гепатитов.
Для лечения заболеваний печени используется большое количество медикаментозных и немедикаментозных способов [1, 2].
Известен способ экспериментальной терапии хронического гепатита, вызванного введением тетрахлоруглерода с помощью двукратного или курсового введения иммобилизированной гиалуронидазы [3]. Данный способ является наиболее близким к заявляемому и выбран в качестве прототипа.
Недостатком способа прототипа является его недостаточная эффективность, относительно высокая ксенобиотическая нагрузка на организм и ограниченная хроническим течением патологического процесса и его токсической этиологией область применения.
Задачей, решаемой данным изобретением, является повышение эффективности и безопасности способа, а также расширение показаний к его применению.
Поставленная задача достигается техническим решением, заключающимся в однократном пероральном введении лабораторным животным (крысы) иммобилизированной гиалуронидазы в дозе 25 ЕД/кг при моделировании вирусного гепатита с помощью D-галактозамина.
Новым в предлагаемом изобретении является однократное использование иммобилизированной гиалуронидазы в дозе 25 ЕД/кг при моделировании гепатита.
Заболевания печени и желчевыводящих путей являются весьма распространенными во всем мире и занимают одно из ведущих мест в структуре заболеваемости и смертности населения нашей страны. Опасность для здоровья и социальная значимость данной патологии печени определяют необходимость постоянной разработки новых эффективных патогенетически обоснованных методов фармакологической терапии и профилактики данных заболеваний [1, 2]. При этом в последнее время активно ведутся исследования, направленные на разработку средств для лечения различных заболеваний, в том числе заболеваний печени, путем фармакологической стимуляции эндогенных стволовых клеток (СК) организма [4, 5]. На модели хронического гепатита, вызванного курсовым введением тетрахлоруглерода, показано наличие гепатопротекторных свойств у иммобилизированной гиалуронидазы [3], определяемых ее стимулирующим действием на стволовые клетки печени и ткани-депо. При этом оптимальный технический результат достигается лишь при курсовом введении данного средства в дозах 25-50 ЕД/кг, безусловно, сопровождающемся значительной ксенобиотической нагрузкой на организм [6], и исключительно после моделирования патологии печени. Кроме того, до настоящего времени не существует данных о наличии гепатопротекторных эффектов у иммобилизированной гиалуронидазы на других моделях патологии печени, в том числе заболеваниях вирусной этиологии.
Факт однократного применения иммобилизированной гиалуронидазы перед моделированием или одновременно с началом моделирования вирусного гепатита с помощью D-галактозамина для достижения выраженных терапевтических эффектов для специалиста является неочевидным. Эксперимент показал непредсказуемые результаты.
Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Новые признаки позволяют осуществлять эффективную терапию острого экспериментального поражения печени, моделирующего заболевание вирусной этиологии, и предлагаемое изобретение может быть использовано в медицине. Идентичной совокупности признаков не обнаружено при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе.
Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».
Способ осуществляют следующим образом:
Лабораторному животному (крысе) перед моделированием либо одновременно с началом моделирования вирусного гепатита с помощью D-галактозамина однократно перорально вводят иммобилизированную гиалуронидазу в дозе 25 ЕД/кг.
Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на беспородных крысах в количестве 46 штук, массой 250-300 г. Животные получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН (сертификат имеется). Для моделирования острого гепатита использовали D-галактозамин в водном растворе (Галактозамин гидрохлорид, Applichem, кат.№А6859). который вызывает острый гепатит, идентичный по морфологическим и биохимическим изменениям в печени вирусному гепатиту человека. Для этого крысам вводили D-галактозамин в дозе 300 мг/кг внутрибрюшинно в течение 3 дней [7].
У крыс: рассчитывали весовой коэффициент печени (отношение массы органа к массе животного), показатель, определяемый для интегральной оценки наличия гепатотропного влияния ксенобиотиков; проводили биохимические исследования содержания в сыворотки крови аспартат-, аланин-аминотрасфераз (АсАТ, АлАТ), биллирубина, активность щелочной фосфатазы (ЩФ); и морфологическое исследование печени [7]. Активность ферментов сыворотки крови определяли по общепринятым методам, используя полуавтоматический биохимический анализатор фирмы Cormay и стандартные наборы фирм Cormay и «Витал Диагностик» (г.Санкт-Петербург). Кровь для исследования получали через катетер, имплантированный в бедренную артерию с последующей перевязкой сосудов. На гистологических препаратах печени, окрашенных гематоксилином и эозином, подсчитывали количество гепатоцитов в состоянии некроза и фигур митозов на 1000 печеночных клеток. С помощью окулярной сетки Г.Г. Автандилова определяли относительную площадь инфильтрации печеночной паренхимы макрофагами и лейкоцитами и относительную площадь коллагеновых волокон. Для выявления РНК препараты печени окрашивали галлоцианином по Эйнарсону. Гликоген выявляли с помощью Шифф-йодной реакции по J. Mc.Manus. Количественное определение содержания в клетке указанных веществ проводили на сканирующем цитофотометре UNIVAR ("REICHERT-JUNG", Австрия) при длине волны 500 нм, фильтре №42, зондах диаметром 2 (РНК) и 3 (гликоген) мкм. У каждого животного измеряли содержание РНК и гликогена в 50 гепатоцитах. Для выявления липидов готовили криостатные срезы печени толщиной 10 мкм. Срезы фиксировали 4% кальций-формолом и окрашивали Суданом черным В. Степень жировой дистрофии оценивали в баллах [7]. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Использовалась программа Statistica 6.0.
Пример 1.
В первый день эксперимента, обозначенный как «день 1», начинали вводить D-галактозамин, общий период наблюдения составлял 4 сут. Иммобилизированную гиалуронидазу (имГД) (ООО «Саентифик фьючер менеджмент», г.Новосибирск), представляющую собой высокоочищенную тестикулярную бычью гиалуронат-эндо-P-N-ацетилгексозаминидазу, вводили перорально по трем схемам. Первая схема предполагала введение лекарственного средства по способу прототипу: в виде курсового двукратного введения на 1 и 2 дни после введения D-галактозамина в дозе 35 ЕД/кг (доза и режим введения были определены в предварительных экспериментах как максимально эффективные). Вторая схема предполагала однократное введение иммобилизированной гиалуронидазы после первого введения D-галактозамина в дозе 25 ЕД/кг. Третья схема предполагала введение имГД на нулевой день перед началом моделирования острого гепатита. Контрольным животным по той же схеме в эквивалентном объеме вводили дистиллированную воду.
Группы животных:
1) Интактные животные. Группа 1.
2) Контрольные животные, введение D-галактозамина. Группа 2.
3) Группа с курсовым двукратным введением лекарственного средства на 1 и 2 дни после введения D-галактозамина. Группа 3.
4) Группа с однократным введением лекарственного средства в 1 день введения D-галактозамина. Группа 4.
5) Группа с предварительным введением лекарственного средства на 0 день перед введеним D-галактозамина. Группа 5.
При морфологическом исследовании печени крыс с острым поражением печени D-галактозамином, получавших дистиллированную воду, было обнаружено нарушение балочного строения. Преобладала гидропическая (белковая) дистрофия гепатоцитов. Встречалось большое количество гепатоцитов в состоянии апоптоза различной степени выраженности от деградации ДНК до образования «классических» телец Каунсильмена, которые у человека считаются непрямыми маркерами вирусного гепатита [Серов В.В., Лапиш К., 1989]. Портальная и внутридольковая строма была диффузно инфильтрирована лимфоцитами и макрофагами с примесью нейтрофильных лейкоцитов.
Со стороны морфометрических параметров в группе 3 не выявлялось значимых отличий с группой острого гепатита, вызванного введением D-галактозамина (табл.1). В то же время в группах 4 и 5 отмечалось снижение количества апоптозных гепатоцитов, что сопровождалось снижением степени жировой инфильтрации печени в виде статистически не значимой тенденции.
Вместе с тем у крыс через 3 дня после начала введения D-галактозамином отмечалось повышение коэффициента массы печени. В сыворотке крови статистически значимо возрастала активность АлТ и АсТ, содержание билирубина, а также имелась тенденция к увеличению активности щелочной фосфатазы (табл.2). Необходимо отметить также у крыс этой группы увеличение времени тиопенталового сна, вероятно, в связи с ингибированием ферментных систем гепатоцитов, ответственных за антитоксическую функцию печени (табл.3).
При введении иммобилизированной гиалуронидазы на фоне острого D-галактозаминового гепатита весовой коэффициент печени в третьей группе животных превосходил соответствующий показатель первой группы (52,1±2,4 против 44,9±1,9), что было близко к соответствующему значению группы животных с гепатитом без фармакологической коррекции (57,9±1,8). В группах 4 и 5 изученный параметр не отличался от соответствующего значения группы «интактные животные» (группа 1). Наблюдалась также нормализация активности АлТ в группах 3, 4 и 5, АсТ - в группах 4 и 5. Время тиопенталового сна уменьшалось по сравнению с контролем (гепатит) в группе 4 и 5. В группах 3 данный показатель хоть и снижался по сравнению с контролем, но не достигал статистической значимости (табл.3).
Таким образом, иммобилизированная гиалуронидаза в условиях интоксикации D-галактозамином обладала максимально выраженным гепатопротекторным действием при ее однократном введении в самой низкой используемой дозе (25 ЕД/кг) после моделирования патологического процесса либо одновременно с началом моделирования гепатита.
Предлагаемый способ позволяет эффективно снижать тяжесть метаболических и морфологических нарушений печени при ее остром поражении, моделирующем вирусный гепатит, на фоне снижения ксенобиотической нагрузки на организм.
Цитируемая литература
1. Венгеровский А.И. Эффективность и механизм действия гепатопротекторов при экспериментальном токсическом повреждении печени: Дисс... доктора мед. наук. - Томск, 1991. - С.4-57.
2. Машковский М.Д. Лекарственные средства: в 2-х томах. Т. 1. - М.: Медицина, 1996. - 624 с.
3. Патент (RU) на изобретение №2444569 «Гепатопротекторное средство» (опубл. 10.03.2012, Бюл. №7). Авторы: Артамонов А.В., Бекарев А.А., Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н., Удут В.В.
4. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. Гипоксия и система крови. - Томск: Изд-во Том. ун-та, 2006. - 142 с.
5. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. Клеточная терапия: новые подходы // Наука в России - Москва: Изд-во «Наука», 2009. - Том. 169. - №1. С.4-8.
6. Зборовский А.Б., Тюренков И.Н. Осложнения фармакотерапии. - М.: Медицина, 2003.-543 с.
7. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общей редакцией член-корр. РАМН, проф. Р.У. Хабриева - 2-изд., перераб. и доп.- М., ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - 832 с.
Таблица 1
Влияние иммобилизированной гиалуронидазы на морфометрические показатели печени крыс с острым поражением печени D-галактозамином, (X±m)
Группа животных
Степень жировой инфильтрации, баллы
Количество апоптозных гепа-тоцитов, %
Относительная площадь инфильтрации, %
Митотический индекс, %
РНК усл. ед. опт.плотн.
Гликоген усл. ед. опт плотн
2
3,00±0,45
10,14±0,8*
9,00±0,71
0,20±0,04
0,16±0,01
0,21±0,01
3
2,44±0,17
10,06±0,75*
8,60±1,08
0,24±0,07
0,16±0,01
0,22±0,01
4
2,16±0,12
2,04±0,10#
8,60±0,51
0,38±0,08
0,16±0,01
0,22±0,01
5
2,08±0,10
3,76±0,10#
8,40±0,75
0,28±0,04
0,16±0,01
0,22±0,01
* - достоверность различий при сравнении с группой «интактные животные» (группа 1) при р<0,05.
# - достоверность различий при сравнении с группой 2 при р<0,05.
Таблица 2
Влияние иммобилизированной гиалуронидазы на биохимические показатели сыворотки крови крыс с острым поражением печени D-галактозамином, (X±m)
Груп
Весовой
АсТ
АлТ
Коэффициент
Щелочная
Общий
па
коэффициент
(мккат/л)
(мккат/л)
Де Ритиса
фосфа-
билирубин
живот
печени
таза
(мкмоль/л)
ных
(Е/Л)
1
44,9±1,9
0,51±0,02
0,52±0,02
0,99±0,04
136,8±16,0
4,50±1,06
2
57,9±1,8*
0,61±0,03*
0,72±0,04*
0,88±0,09
170,5±23,7
9,86±1,34*
3
52,1±2,4*
0,54±0,03
0,60±0,03 *
0,90±0,04
146,5±20,2
7,62±1,32
4
48,3±2,7
0,48±0,02#
0,51±0,04#
0,95±0,08
162,4±11,4
4,50±0,70
5
49,5±3,1
0,53±0,03#
0,57±0,03#
0,99±0,06
165,6±12,5
5,97±0,84
* - достоверность различий при сравнении с группой «интактные животные» (группа 1) при р<0,05.
# - достоверность различий при сравнении с группой 2 при р≤0,05.
Таблица 3
Влияние иммобилизированной гиалуронидазы на время тиопенталового сна крыс с острым поражением печени D-галактозамином(мин, Х±ш)
Группа 1
Группа 2
Группа 3
Группа 4
Группа 5
44,50±1,34
57,90±3,68*
51,70±2,50*
49,00±1,46*#
51,60±1,93*#
* - достоверность различий при сравнении с группой «интактные животные» (группа 1) при р≤0,05.
# - достоверность различий при сравнении с группой 2 при р≤0,05.