СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ МОДИФИКАЦИЙ ДНК И СВЯЗЫВАНИЯ С БЕЛКОМ ПУТЕМ МАНИПУЛЯЦИЙ С ОДИНОЧНЫМИ МОЛЕКУЛАМИ

1. Способ определения связывания белка с молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, указанный способ включает этапы, при которых:
a) денатурируют молекулу двуцепочечной нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты, прикладывая к указанной молекуле физическую силу;
b) берут указанный белок;
c) ренатурируют указанную молекулу двуцепочечной нуклеиновой кислоты в присутствии указанного белка;
d) детектируют блокирование ренатурации двуцепочечной нуклеиновой кислоты; и
e) определяют позицию в указанной молекуле двуцепочечной нуклеиновой кислоты, где происходит указанное блокирование.
2. Способ по п. 1, в котором на этапе (б) дополнительно берут молекулу одноцепочечной нуклеиновой кислоты, соответствующую указанной последовательности.
3. Способ по любому из пп. 1 или 2, в котором указанная молекула двуцепочечной нуклеиновой кислоты имеет шпилечную структуру.
4. Способ по п. 1, в котором по меньшей мере одно из оснований первой цепи двуцепочечной нуклеиновой кислоты непосредственно или опосредованно присоединено к поверхности и в котором по меньшей мере одно из оснований второй цепи двуцепочечной нуклеиновой кислоты присоединено к подвижной поверхности.
5. Способ по п. 1, в котором двуцепочечную нуклеиновую кислоту денатурируют на этапе (а), отдаляя носители друг от друга.
6. Способ по п. 5, в котором к двуцепочечной молекуле прикладывают физическую силу, равную или превышающую 15 пН, предпочтительно превышающую или равную 17 пН, более предпочтительно равную или превышающую 18 пН, отдаляя носители друг от друга.
7. Способ по п. 1, в котором денатурированную двуцепочечную нуклеиновую кислоту ренатурируют на этапе (в), приближая носители друг к другу.
8. Способ по п. 7, в котором силу, прикладываемую к двуцепочечной молекуле, снижают до уровня, равного или меньшего 12 пН, предпочтительно меньшего или равного 11 пН, более предпочтительно меньшего или равного 10 пН, приближая носители друг к другу.
9. Способ по п. 1, в котором концы двуцепочечной нуклеиновой кислоты, не присоединенные к носителю, соединяют друг с другом ковалентно или нековалентно.
10. Способ по п. 1, в котором этапы (а)-(г) повторяют несколько раз (так, чтобы набрать достаточное количество измерений и увеличить отношение сигнал/шум).
11. Способ по п. 1, в котором детекция на этапе (г) включает измерение расстояния (z) между двумя концами молекулы двуцепочечной нуклеиновой кислоты, присоединенными к носителю.
high
12. Способ по п. 11, также включающий этап измерения расстояния (z) между двумя концами молекулы двуцепочечной нуклеиновой кислоты, присоединенными к носителю, при этом указанная молекула двуцепочечной нуклеиновой кислоты денатурирована.
high
13. Способ по п. 12, в котором этап (д) также включает предварительный этап сравнения z и z.
14. Способ по п. 1, также включающий этап измерения длительности блокирования.
15. Способ по п. 14, также включающий этап сравнения длительности блокирования с референтным значением.
16. Способ по п. 1, также включающий этап секвенирования последовательности нуклеиновой кислоты, связанной с указанным белком.
17. Способ идентификации молекул нуклеиновых кислот, содержащих последовательность, которая способна связываться с определенным белком, связывающим нуклеиновые кислоты, указанный способ включает этапы, при которых:
a) берут популяцию молекул двуцепочечных нуклеиновых кислот;
b) изучают связывание указанного белка с указанной молекулой нуклеиновой кислоты способом по любому из пп. 1-16; и
c) выбирают молекулы нуклеиновых кислот, способные связывать указанный белок.
18. Способ обнаружения по меньшей мере одного модифицированного основания, содержащегося в молекуле двуцепочечной нуклеиновой кислоты, указанный способ включает этапы, при которых:
а) берут указанную двуцепочечную нуклеиновую кислоту;
b) берут белок, способный связываться с указанным модифицированным основанием; и
c) изучают связывание указанного белка с указанной молекулой нуклеиновой кислоты способом по любому из пп. 1-16.
6
19. Способ по п. 18, в котором модифицированное основание выбрано из группы, включающей 4-метилцитозин (4mC), 5-метилцитозин (5mC), 5-гидроксиметилцитозин (5hmC), 5-формилцитозин (5fC), 5-карбоксилцитозин (5саС), 5-гидроксиметилурацил (5hmU) и N-метиладенозин (m6A).
20. Способ по любому из пп. 18 или 19, в котором модифицированное основание представляет собой 5mC.
21. Способ по п. 18, в котором указанный белок способен связывать указанное модифицированное основание.
22. Способ обнаружения по меньшей мере одного некомплементарного основания в молекуле двуцепочечной нуклеиновой кислоты, указанный способ включает этапы, при которых:
a) берут указанную молекулу двуцепочечной нуклеиновой кислоты;
b) берут белок, способный связываться с указанным некомплементарным основанием; и
c) изучают связывание указанного белка с указанной молекулой нуклеиновой кислоты способом по любому из пп. 1-16.
23. Способ по п. 22, в котором указанный белок выбирают из группы, включающей димер MutS, Msh2/Msh6 (MutSα) и Msh2/Msh3 (MutSβ).
24. Способ обнаружения однонуклеотидного полиморфизма в последовательности, входящей в состав молекулы нуклеиновой кислоты, указанный способ включает этапы, при которых:
a) гибридизуют указанную молекулу с одноцепочечной нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность, встречающуюся у большей части популяции; и
b) обнаруживают некомплементарное основание способом по любому из пп. 22 или 23.
25. Способ идентификации по меньшей мере одного соединения, способного предотвращать взаимодействие белка с его сайтом связывания, указанный способ включает этапы, при которых:
a) берут указанный белок и молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность, соответствующую указанному сайту связывания;
b) берут соединение; и
с) изучают связывание указанного белка с указанной молекулой нуклеиновой кислоты способом по любому из пп. 1-16.