БИОКАТАЛИЗАТОР ДЛЯ ПЕРЕЭТЕРИФИКАЦИИ ЖИРОВ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
BIOCATALYST FOR RE-ESTERIFICATION OF FATS AND METHOD FOR PRODUCTION THEREOF

Изобретение относится к области пищевой химии, а именно к способам получения биокатализатора для переэтерификации жиров и биокатализаторам, в частности к катализаторам переэтерификации жиров на основе иммобилизированных липаз. Переэтерификация жиров, проводимая, как правило, в отсутствие растворителя в расплавах масложировых смесей, предназначена для получения жиров с заданными свойствами по плавкости, твердости и жирно-кислотному составу. Примерами таких жиров могут быть заменители какао-масла для кондитерских изделий, саломасы, специальные жиры, включающие полиненасыщенные жирные кислоты.
Известен способ получения биокатализатора для переэтерификации жиров путем иммобилизации липаз, полученных из микроорганизмов рода Humicola, вида Candida antarctica или вида Rhizomucor miehei, на носитель. Носитель при этом содержит не менее 65% диоксида кремния или силикатов, причем не менее 90% частиц носителя имеют размер от 100 до 1000 мкм, и не менее 80% пор частиц имеют размер, превышающий размер используемой липазы не менее чем в 12 и не более чем в 45 раз. Липаза адсорбируется на носителе путем контакта носителя с водным раствором фермента и высушивания до получения продукта с остаточным влагосодержанием от 1 до 20% (US 5342768, 1994).
Описываемый способ достаточно энергоемкий. Недостатками катализатора являются сложность подбора носителя с заявленными характеристиками, а также тот факт, что липаза удерживается на поверхности носителя лишь за счет адсорбционного взаимодействия, что приводит к попаданию используемого фермента в производимую масложировую продукцию вследствие его десорбции.
Из известных катализаторов для переэтерификации жиров и способов их получения наиболее близкими к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату являются биокатализатор на основе иммобилизированной липазы и способ его получения, осуществляемый путем адсорбции липаз на силикагеле размером частиц до 100 мкм и последующей грануляции в присутствии органического связующего, например желатина или поливинилпирролидона (US 5776741, 1998). Липолитическая активность получаемого таким способом катализатора примерно равна 0,71 ед./мг (определено для коммерчески доступного биокатализатора Lipozyme TL IM; здесь и далее единицы активности соответствуют числу мкмоль масляной кислоты, выделяющихся в минуту при гидролизе трибутирина испытуемым биокатализатором).
При этом указанному способу свойственна сложная технология его осуществления вследствие использования специального оборудования для проведения грануляции и необходимости подбора силикагеля определенной дисперсности. Недостатки полученного таким способом биокатализатора заключаются в недостаточно высокой каталитической активности вследствие блокирования по крайней мере части доступной поверхности силикагеля с нанесенной липазой органическим связующим, а также в низкой механической прочности получаемого гранулята за счет использования вышеуказанных связующих.
Поскольку процесс переэтерификации жиров обычно проводится в реакторах с неподвижным слоем катализатора, где развивается значительный перепад давления, данная технология требует использования катализаторов с высокой прочностью.
Задачей описываемой группы изобретений является разработка способа получения биокатализатора переэтерификации жиров, проводимого по упрощенной технологии, а также создание биокатализатора, полученного описываемым способом, обладающего высокими эксплуатационными характеристиками.
Поставленная задача достигается описываемым способом получения биокатализатора для переэтерификации жиров путем аминирования носителя - гранулированного силикагеля или диоксида кремния дисперсностью 0,3-1,0 мм аминопропилтриэтоксисиланом, обработки аминированного носителя органическим агентом, реагирующим с аминогруппами - водным раствором глутарового альдегида или глиоксаля концентрацией 2,0 мас.% или 5,0 мас.% в течение 2 ч, иммобилизации на обработанном носителе путем рециркуляции через него раствора термостабильной липазы бактерий Geobacillus lituanicus в фосфатном буфере при температуре 0°С или 4°С, при рН 6,5 в течение 12 ч с последующей промывкой полученного биокатализатора водным раствором соединения, содержащего аминогруппы - трис(гидроксиметил)аминометана гидрохлорида.
Поставленная задача достигается также созданием биокатализатора для переэтерификации жиров, полученного вышеописанным способом.
Достигаемый технический результат заключается в упрощении технологии способа и в получении биокатализатора, обладающего высокой каталитической активностью и высокой механической прочностью.
Способ проводят следующим образом.
Проводят аминирование носителя, в качестве которого используют силикагель, диоксид кремния, путем выдерживания его в аминирующем агенте - аминопропилтриэтоксисилане. Аминирующий агент возможно использовать как индивидуально, так и в растворителе. Процесс проводят при температуре от 30°С до температуры кипения аминирующего агента.
Аминирующий агент возможно использовать как индивидуально, так и в растворителе. Используют носитель дисперсностью 0,3-1,0 мм.
Аминированный носитель обрабатывают органическим агентом, обладающим способностью реагировать с аминогруппами носителя. В качестве органического агента используют водные растворы глутарового альдегида, глиоксаля. Концентрация органического агента составляет 2,0 мас.% или 5,0 мас.%. Процесс проводят в течение 2 часов. Используемые органические агенты реагируют с аминогруппами носителя с образованием ковалентных связей с атомами азота аминогрупп и сохраняют эту способность для последующего реагирования с аминогруппами используемых липаз. Последнее исключает десорбцию липаз и их попадание в конечный продукт.
Затем на обработанном таким образом носителе проводят иммобилизацию термостабильной липазы. В качестве липаз используют липазы, продуцируемые бактериями Geobacillus lituanicus, обладающие высокой активностью при температурах свыше 60°С. Процесс иммобилизации проводят путем рециркуляции через носитель раствора термостабильной липазы бактерий Geobacillus lituanicus в фосфатном буфере при температуре 0° или 4°С, при рН 6,5 в течение 12 часов.
Затем проводят последующую промывку полученного биокатализатора водным раствором соединения, содержащего аминогруппы, - трис(гидроксиметил)аминометана гидрохлорида.
Описываемый способ позволяет иммобилизировать термостабильные липазы, обладающие высокой активностью при высоких температурах (свыше 60°С), что обуславливает высокие эксплуатационные характеристики получаемого биокатализатора для переэтерификации жиров вследствие понижения вязкости масложировых смесей при повышении их температуры.
Достижение высокой каталитической активности катализатора не является очевидным.
Последнее основывается на том, что иммобилизация липаз на обработанном носителе является сложноконтролируемым процессом. Активность получаемого катализатора зависит одновременно от нескольких факторов, в частности от эффективности иммобилизации (то есть доли фермента, успешно зафиксированного на носителе) и от степени сохранения активности иммобилизованного фермента (отношения активности полученного катализатора к активности исходного фермента). При этом указанная высокая активность достигается при соблюдении совокупности всех вышеописанных параметров. Изменение указанных параметров описываемого способа приводит к снижению вышеоговоренных характеристик получаемого катализатора, в частности активность получаемого катализатора не превышает 0,65 ед./мг.
Полученный вышеописанным образом биокатализатор обладает высокой липолитической активностью при достаточно высоких степенях иммобилизации и сохранении активности иммобилизованной липазы, а также высокой механической прочностью.
Изобретение иллюстрируется нижеприведенными примерами, не ограничивающими его использование.
Пример 1.
5,0 г силикагеля марки АСКГ дисперсностью 0,3-0,5 мм выдерживают в аминопропилтриэтоксисилане при температуре 90°С в течение 12 часов. Полученный силикагель с привитыми аминогруппами выдерживают в водном растворе глутарового альдегида концентрацией 2,0 мас.% в течение 2 часов. На обработанном таким образом носителе проводят иммобилизацию рекомбинантной термостабильной липазы бактерий Geobacillus lituanicus DSM15325 путем рециркуляции через него раствора липазы в фосфатном буфере концентрацией 200 ммоль/л и рН 6,5 в течение 12 часов при температуре 4°С. Полученный биокатализатор обладает липолитической активностью 0,78 ед./мг, что выше на 10% отн. активности известного биокатализатора. Для повышения активности биокатализатор промывают водным раствором трис(гидроксиметил)аминометана гидрохлорида концентрацией 200 ммоль/л и рН 7,5. Промытый биокатализатор обладает липолитической активностью 0,93 ед./мг, что выше на 30% отн. активности известного биокатализатора. Средняя механическая прочность указанного биокатализатора составляет 150 Н/гранулу. Степень иммобилизации катализатора составляет 67,6% отн., степень сохранения активности иммобилизованной липазы - 25,85% отн. Проведение описываемого способа в аналогичных условиях при концентрации глутарового ангидрида ниже 2 мас.% приводит к снижению показателей качественных характеристик получаемого катализатора. Так, при концентрации 1,0 мас.% степень иммобилизации катализатора составляет 41,1% отн., степень сохранения активности иммобилизованной липазы - 14,42% отн., активность катализатора - 0,55 ед./мг.
Пример 2.
Силикагель марки КСКГ размалывают, отбирают навеску 5,0 г фракции дисперсностью 0,5-1,0 мм, прокаливают при температуре 500°С в течение 6 часов, выдерживают полученный диоксид кремния в аминопропилтриэтоксисилане при температуре 120°С в течение 12 часов. Полученный диоксид кремния с привитыми аминогруппами выдерживают в водном растворе глутарового альдегида концентрацией 5,0 мас.% в течение 2 часов. На подготовленном таким образом носителе проводят иммобилизацию рекомбинантных термостабильных липаз бактерий Geobacillus lituanicus DSM15325 путем рециркуляции через него раствора липаз в фосфатном буфере концентрацией 200 ммоль/л и рН 6,5 в течение 12 часов при температуре 4°С. После проведения иммобилизации полученный биокатализатор промывают водным раствором трис(гидроксиметил)аминометана гидрохлорида концентрацией 200 ммоль/л и рН 7,5. Полученный биокатализатор обладает липолитической активностью 0,90 ед./мг, что выше на 27% отн. активности известного биокатализатора. Средняя механическая прочность указанного биокатализатора составляет 127 Н/гранулу. Степень иммобилизации катализатора составляет 87,9% отн., степень сохранения активности иммобилизованной липазы - 19,22% отн. Проведение описываемого способа в аналогичных условиях при концентрации глутарового ангидрида выше 5 мас.%, при температуре иммобилизации выше 4°С приводит к снижению показателей качественных характеристик получаемого катализатора. Так, при концентрации глутарового ангидрида 6,0 мас.%, при температуре иммобилизации 8°С степень иммобилизации катализатора составляет 48,9% отн., степень сохранения активности иммобилизованной липазы - 13,84% отн., активность катализатора - 0,50 ед./мг.
Пример 3.
Гранулированный диоксид кремния дисперсностью 0,3-1,0 мм выдерживают при температуре 80°С в растворе аминопропилтриэтоксисилана в бензоле концентрацией 10 мас.% в течение 2 часов. Полученный диоксид кремния с привитыми аминогруппами выдерживают в водном растворе глиоксаля концентрацией 2,0 мас.% в течение 2 часов. На обработанном таким образом носителе проводят иммобилизацию рекомбинантной термостабильной липазы бактерий Geobacillus lituanicus DSM15325 путем рециркуляции через него раствора липазы в фосфатном буфере концентрацией 200 ммоль/л и рН 6,5 в течение 2 часов при температуре 0°С (при температуре ниже 0°С начинается процесс замерзания раствора). Полученный биокатализатор обладает липолитической активностью 0,81 ед./мг, что выше на 14% отн. активности известного биокатализатора. Для повышения активности биокатализатор промывают водным раствором трис(гидроксиметил)аминометана гидрохлорида концентрацией 200 ммоль/л и рН 7,5. Промытый биокатализатор обладает липолитической активностью 0,89 ед./мг, что выше на 25% отн. активности известного биокатализатора. Средняя механическая прочность указанного биокатализатора составляет 140 Н/гранулу.
Пример 4.
Способ проводят аналогично примеру 1. При этом во время иммобилизации поддерживают температуру, равную 0°С.
Полученный биокатализатор обладает липолитической активностью 0,76 ед./мг, что выше на 7,0% отн. активности известного биокатализатора.
Таким образом, описываемый способ получения катализатора переэтерификации жиров обладает более простой технологией, а полученный при этом катализатор - более высокими эксплуатационными характеристиками в сравнении с известными способом и катализатором.