СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЕФИРАНА
KEFIRAN PRODUCTION METHOD

Изобретение относится к косметической и химико-фармацевтической промышленности, а именно к способу получения биологически активного вещества из биомассы симбиотической микробиологической культуры. Способ может использоваться в косметической, фармацевтической и пищевой промышленности для получения полисахарида из кефирных грибков - кефирана.
Аналогом изобретения является способ получения кефирана, при котором к кефирным грибкам добавляют дистиллированную воду и гомогенизируют в течение 5-10 минут. После центрифугирования полисахарид осаждают из центрифугата добавлением 3-4 объемов 95% этанола или ацетона и растворяют в горячей воде. После 3 процедур переосаждения 2% раствор кефирана в воде замораживают при -20°C с последующим таянием при комнатной температуре. Вода из кефиранового геля удаляется фильтрацией через марлю. Процедура замораживания-таяния повторяется, затем кефиран осаждают спиртом, центрифугируют и сушат. (Riviere J.W.M., Kooiman P.Kefiran, a novel polysaccharide produced in the kefir grain by Lactobacillus brevis // Arch. Microbiol., 1967, 59. - P.269-278.)
Недостатками данного способа являются длительность и трудоемкость совершения процесса, высокий расход этанола/ацетона на переосаждение кефирана, применение гомогенизации, что негативно сказывается на качестве получаемого продукта: значительно снижается вязкость.
Наиболее близким аналогом (прототип) является способ получения кефирана, включающий экстракцию кипящей водой в течение 1 часа (соотношение сырья к воде 1:100). Раствор охлаждают и центрифугируют при 16000 g в течение 15 минут. Полисахарид осаждают добавлением эквивалентного количества холодного этанола и оставляют при 4°C на ночь. Выпавший осадок растворяют в горячей воде (1:100) при 70°C при перемешивании. Процедуру переосаждения повторяют еще 2 раза. Осадок растворяют в 100 мл воды и лиофилизируют. (L.Micheli, D.Uccelletti, С.Palleschi, V.Crescenzi Isolation and characterization of a ropy Lactobacillus strain producing the exopolysaccharide kefiran // Appl. Microbiol. Biotechnol., 1999, Vol.53. - P.69-74.)
Недостатками данного способа являются длительность и трудоемкость совершения процесса, высокий расход этанола на переосаждение кефирана и необходимость использования высокооборотистой центрифуги.
Техническим результатом способа является сокращение времени экстракции, исключение операции центрифугирования и существенное снижение затрат этанола при сохранении высокой чистоты получаемого продукта.
Технический результат достигаются тем, что согласно изобретению экстракцию проводят в кипящей воде при соотношении кефирных грибков к воде примерно 1:10 при перемешивании до получения гомогенной массы в течение 5-10 мин, при охлаждении добавляют протеолитический фермент и выдерживают при температуре и pH оптимума используемого протеолитического фермента в течение не менее 1 часа, остывший до 20°C экстракт фильтруют через мелкопористый фильтр, после осаждения этанолом осадок фильтруют, промывают дистиллированной водой и снова фильтруют несколько раз.
Экстракцию проводят дистиллированной водой при кипячении кефирных грибков в течение приблизительно 5-10 мин при перемешивании, при соотношении кефирных грибков к воде примерно 1:10. Раствор охлаждают до температуры около 60°C, добавляют протеолитический фермент (протеазу №Р5380, Sigma Chemical Co активностью 7-15 ЕД/мг добавляют не более 3-5 мг/1 г кефирных грибков) и выдерживают приблизительно 1 час. Допускается использование других идентичных по действию ферментов, таких как проназа, папаин, пепсин, алкиназа и др. В этом случае экстракт охлаждают до температуры оптимума используемого фермента и доводят pH добавлением раствора NaOH или НСl с контролем по pH-метру до оптимума действия используемого фермента. Затем раствор охлаждают до 20°C и фильтруют через фильтр с диаметром пор 2-5 мкм под вакуумом. Фильтрат осаждают эквивалентным объемом этилового спирта или ацетона и выдерживают не менее часа при температуре не выше 5°C. После раствор подвергают микрофильтрации через мембрану или фильтр с диаметром пор 50-100 мкм. Хлопьевидный осадок смывают с фильтра, промывают дистиллированной водой, объем примерно как для экстракции, температурой 15-20°C и снова фильтруют. Процедуру разбавления водой - микрофильтрацию повторяют еще 3-4 раз. Осадок высушивают при температуре не выше 55°C или растворяют в дистиллированной воде и подвергают сублимационной сушке.
Пример выполнения способа.
К 50 г кефирных грибков приливают 500 мл дистиллированной воды доводят до кипения и кипятят при перемешивании 10 минут. Затем остужают до 60°C и добавляют 20 мл раствора протеазы концентрации 10 мг/мл. Раствор выдерживают на термостате при 60°C в течение 1 часа при помешивании каждые 10 минут. После остывания раствор отфильтровывают через мелкопористый бумажный фильтр (синяя полоса) под вакуумом. Фильтрат осаждают 500 мл этанола и ставят морозильную камеру на 1 час. Раствор фильтруют через стеклянный фильтр №2, стараясь не взбалтывать осадок. Осадок смывают с фильтра, взбалтывают с 500 мл дистиллированной воды и фильтруют. Процедуру повторяют 4 раза. Полученный полисахарид высушивают и взвешивают. Выход из сырья приблизительно составляет 2,5-3,5% или 25-35% на сухое вещество.
Таким образом, упрощение технологического процесса экстракции осуществляется за счет использования протеолитического фермента. Протеаза расщепляет длинные белковые молекулы на короткие пептидные цепи и свободные аминокислоты, которые не осаждаются 50% этанолом и удаляются при микрофильтрации. Это позволяет исключить центрифугирование при 15000-17000 g для удаления тонкодисперсной белковой фракции, требующее дорогостоящего и низкопроизводительного оборудования.
Снижение материальных затрат и сокращение времени процесса осуществляется за счет сокращения числа операций переосаждения этиловым спиртом. Чистота продукта достигается многократной промывкой дистиллированной водой.