СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО БЕЛКОВОГО ПРЕПАРАТА И ПРЕПАРАТ НА ОСНОВЕ АНТИТЕЛ, ПОЛУЧЕННЫЙ ПО ТАКОМУ СПОСОБУ

1. Способ получения белкового препарата, который содержит эксципиенты и, по меньшей мере, один терапевтический белок, причем способ включает последовательные стадии:
(a) обеспечение раствора, включающего указанный белок;
(b) концентрирование белка в растворе с использованием первой стадии ультрафильтрации;
(c) диафильтрование раствора, полученного таким образом с буфером для диафильтрации, который включает, по меньшей мере, один первый эксципиент, посредством которого получают ретентат, включающих белок и первый эксципиент;
(d) добавление второго эксципиента к ретентату, полученному на стадии диафильтрации;
(e) следуещее концентрирование белка в ретентате на второй стадии ультрафильтрации в ультрафильтрационном оборудовании; и
(f) добавление, по меньшей мере, одного конечного эксципиента, посредством которого получают белковый препарат с требуемой концентрацией белка и который включает указанный первый и конечный эксципиенты.
2. Способ по п. 1, который дополнительно включает, после стадии (е) и перед стадией (f), промывание ультрафильтрационного оборудования буфером для промывки, в результате чего улучшается выделение белка.
3. Способ по п. 2, в котором буфер для промывки содержит первый и второй эксципиенты в по существу равных концентрациях, соответственно, концентрациях первого и второго эксципиентов в белковом препарате.
4. Способ по какому-либо одному из пп. 1-3, в котором первый эксципиент представляет собой аминокислоту, предпочтительно гистидин.
5. Способ по какому-либо одному из пп. 1-4, в котором первый эксципиент в белковом препарате имеет концентрацию от 16 до 24 мМ, предпочтительно от 17 до 23 мМ, наиболее предпочтительно приблизительно 20 мМ.
6. Способ по какому-либо одному из пп. 1-5, в котором второй эксципиент представляет собой сахар, предпочтительно дисахарид.
7. Способ по какому-либо одному из пп. 1-6, в котором конечные эксципиенты включают поверхностно-активное вещество, предпочтительно полисорбат 80.
8. Способ по какому-либо одному из пп. 1-7, в котором конечные эксципиенты включают хелатирующий агент, предпочтительно ЭДТА.
9. Способ по какому-либо одному из пп. 1-8, в котором белковый препарат имеет концентрацию белка от 110 и 165 г/л.
10. Способ по какому-либо одному из пп. 1-9, в котором белок представляет собой антитело.
11. Способ по п. 10, в котором антитело представляет собой анти-PCSK9 (пропротеинконвертаза 9-го субтилизин-кексинового типа) антитело.
12. Способ по п. 11, в котором анти-PCSK9 антитело выбирают из группы, состоящей из бокоцизумаба, эволокумаба (REPATHA™), алирокумаба (PRALUENT™), REGN728, 31Н4, 11F1, 12Н11, 8А1, 8А3, 3С4, 300N, 1D05, LGT209, RG7652 и LY3015014.
13. Способ по п. 11 или 12, в котором анти-PCSK9 антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи (VH), включающий область определения комплементарности одного CDR1, CDR2, и CDR3 аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1; и вариабельный участок легкой цепи (VL), включающий CDR1, CDR2, и CDR3 аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2.
14. Способ по п. 11 или 12, в котором анти-PCSK9 антитело содержит VH CDR1, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 3, 4 или 5, VH CDR2, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 6 или 7, VH CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 8, VL CDR1, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 9, VL CDR2, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 10, и VL CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 11.
15. Способ по какому-либо одному из пп. 11-14, в котором белковый препарат имеет концентрацию белка от 135 до 165 г/л, предпочтительно от 142 до 158 г/л, наиболее предпочтительно приблизительно 150 г/л.
16. Способ по какому-либо одному из пп. 11-15, в котором второй эксципиент в белковом препарате представляет собой трегалозу в концентрации от 67,2 до 100,8 г/л, предпочтительно от 71,4 до 96,6 г/л, наиболее предпочтительно приблизительно 84 г/л.
17. Способ по какому-либо одному из пп. 11-16, в котором конечные эксципиенты включают полисорбат 80, который, в белковом препарате, имеет концентрацию от 0,16 до 0,24 г/л, предпочтительно от 0,17 до 0,23 г/л, наиболее предпочтительно приблизительно 0,2 г/л.
18. Способ по какому-либо одному из пп. 11-17, в котором конечные эксципиенты включают ЭДТА, который, в белковом препарате, имеет концентрацию от 0,04 до 0,06 г/л, предпочтительно от 0,0425 до 0,0575 г/л, наиболее предпочтительно приблизительно 0,05 г/л.
19. Способ по какому-либо одному из пп. 11-18, в котором белковый препарат имеет рН от 5,2 до 5,8, предпочтительно приблизительно 5,5.
20. Способ по какому-либо одному из пп. 11-19, в котором раствор, предусмотренный на стадии (а) имеет концентрацию белка от 5 до 20 г/л.
21. Способ по какому-либо одному из пп. 11-20, в котором белок концентрируют до от 80 до 120 г/л, предпочтительно до от 90 до 110 г/л, и наиболее предпочтительно до приблизительно 100 г/л, на первой стадии ультрафильтрации.
22. Способ по какому-либо одному из пп. 11-21, в котором белок концентрируют до от 143 до 173 г/л, предпочтительно до от 150 до 166 г/л, и наиболее предпочтительно до приблизительно 158 г/л, на второй стадии ультрафильтрации.
23. Способ по какому-либо одному из пп. 11-22, в котором первый эксципиент в буфере для диафильтрации имеет концентрацию более высокую, чем концентрация первого эксципиента в белковом препарате, причем указанная концентрация первого эксципиента в буфере для диафильтрации составляет предпочтительно от 29,75 до 40,25 мМ, наиболее предпочтительно приблизительно 35 мМ.
24. Способ по какому-либо одному из пп. 11-23, в котором буфер для диафильтрации имеет рН от 5,1 до 5,5, предпочтительно приблизительно 5,3.
25. Способ по какому-либо одному из пп. 11-24, в котором добавление второго эксципиента к ретентату, полученному на стадии диафильтрации, достигается за счет добавления первого аддитивного раствора к ретентату, причем указанный первый аддитивный раствор включает второй эксципиент в концентрации от 340 до 460 г/л, предпочтительно от 380 до 420 г/л, наиболее предпочтительно приблизительно 400 г/л.
26. Способ по п. 25, в котором первый аддитивный раствор содержит первый эксципиент в концентрации более низкой, чем концентрация первого эксципиента в буфере для диафильтрации и более высокой, чем концентрация первого эксципиента в белковом препарате, причем указанная концентрация первого эксципиента в первом аддитивном растворе составляет предпочтительно от 25,5 до 34,5 мМ, наиболее предпочтительно приблизительно 30 мМ.
27. Способ по п. 25 или 26, в котором первый аддитивный раствор дополнительно содержит конечный эксципиент.
28. Способ по п. 27, в котором первый аддитивный раствор содержит приблизительно 30 мМ гистидина и приблизительно 400 г/л трегалозы.
29. Способ по какому-либо одному из пп. 25-28, в котором добавление первого аддитивного раствора к ретентату осуществляется при коэффициенте разбавления приблизительно 4,15, в результате чего один объем первого аддитивного раствора добавляют к приблизительно 3,15 кратному такому же объему ретентата.
30. Способ по какому-либо одному из пп. 25-29, в котором добавление конечных эксципиентов включает стадию добавления второго аддитивного раствора к раствору, полученному со второй стадии ультрафильтрации, где указанный второй аддитивный раствор включает второй эксципиент в концентрации более низкой, чем концентрация второго эксципиента в первом аддитивном растворе и более высокой, чем концентрация второго эксципиента в белковом препарате.
31. Способ по п. 30, в котором второй аддитивный раствор содержит первый эксципиент в концентрации по существу равной концентрации первого эксципиента в белковом препарате.
32. Способ по п. 31, в котором второй аддитивный раствор содержит приблизительно 20 мМ гистидина, приблизительно 84 г/л трегалозы, приблизительно 1 г/л ЭДТА и приблизительно 4 г/л полисорбата 80.
33. Способ по какому-либо одному из пп. 30-32, в котором добавление второго аддитивного раствора осуществляется при коэффициенте разбавления приблизительно 20, в результате чего один объем второго аддитивного раствора добавляют к приблизительно 19 кратному такому же объему раствора, полученного на второй стадии ультрафильтрации.
34. Способ по п. 10, в котором антитело представляет собой анти-IL-7R антитело.
35. Способ по п. 10, в котором антитело имеет VH участок, включающий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 13, и VL участок, включающий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 14.
36. Способ по п. 34 или 35, в котором белковый препарат имеет концентрацию белка от 110 до 130 г/л, предпочтительно приблизительно 120 г/л.
37. Способ по какому-либо одному из пп. 34-36, в котором второй эксципиент в белковом препарате представляет собой сахарозу в концентрации от 42 до 58 г/л, предпочтительно приблизительно 50 г/л.
38. Способ по какому-либо одному из пп. 34-37, в котором конечные эксципиенты включают полисорбат 80 который, в белковом препарате, имеет концентрацию от 0,017 до 0,023 г/л, предпочтительно приблизительно 0,02 г/л.
39. Способ по какому-либо одному из пп. 34-38, в котором конечные эксципиенты включают ЭДТА, который, в белковом препарате, имеет концентрацию от 0,42 до 0,58 г/л, предпочтительно приблизительно 0,5 г/л.
40. Способ по какому-либо одному из пп. 34-39, в котором конечные эксципиенты включают аргинин который, в белковом препарате, имеет концентрацию от 85 до 115 мМ, предпочтительно приблизительно 100 мМ.
41. Способ по какому-либо одному из пп. 34-40, в котором белковом препарате имеет рН от 6,5 до 7,5, предпочтительно приблизительно 7,0.
42. Способ по какому-либо одному из пп. 34-41, в котором раствор, предусмотренный на стадии (а) имеет концентрацию белка от 2,6 до 3,4 г/л, предпочтительно приблизительно 3 г/л.
43. Способ по какому-либо одному из пп. 34-42, в котором белок концентрируют до от 36 до 54 г/л, предпочтительно до от 40 до 50 г/л, и наиболее предпочтительно до приблизительно 45 г/л, на первой стадии ультрафильтрации.
44. Способ по какому-либо одному из пп. 34-43, в котором белок концентрируют до от 170 до 210 г/л, предпочтительно до приблизительно 190 г/л, на второй стадии ультрафильтрации.
45. Способ по какому-либо одному из пп. 34-44, в котором первый эксципиент в буфере для диафильтрации имеет концентрацию более высокую, чем концентрация первого эксципиента в белковом препарате, причем указанная концентрация первого эксципиента в буфере для диафильтрации составляет предпочтительно от 19 дл 25 мМ, наиболее предпочтительно приблизительно 22 мМ.
46. Способ по какому-либо одному из пп. 34-45, в котором буфер для диафильтрации включает аргинин в концентрации от 95 до 125 мМ, предпочтительно приблизительно 110 мМ.
47. Способ по какому-либо одному из пп. 34-46, в котором буфер для диафильтрации имеет рН от 6,5 до 7,5, предпочтительно приблизительно 7,0.
48. Способ по какому-либо одному из пп. 34-47, в котором добавление второго эксципиента к ретентату, полученному на стадии диафильтрации достигается добавлением первого аддитивного раствора к ретентату, причем указанный первый аддитивный раствор включает второй эксципиент в концентрации от 230 до 320 г/л, предпочтительно приблизительно 275 г/л.
49. Способ по п. 48, в котором первый аддитивный раствор содержит первый эксципиент в концентрации по существу равной концентрации первого эксципиента в буфере для диафильтрации и более высокой, чем концентрация первого эксципиента в белковом препарате, причем указанная концентрация первого эксципиента в первом аддитивном растворе составляет предпочтительно от 19 до 25 мМ, наиболее предпочтительно приблизительно 22 мМ.
50. Способ по п. 48 или 49, в котором первый аддитивный раствор дополнительно содержит конечный эксципиент.
51. Способ по п. 50, в котором первый аддитивный раствор содержит приблизительно 22 мМ гистидина, 110 мМ аргинина и приблизительно 275 г/л сахарозы, при рН приблизительно 7,0.
52. Способ по какому-либо одному из пп. 34-51, в котором добавление первого аддитивного раствора к ретентату осуществляется при коэффициенте разбавления приблизительно 5, в результате чего один объем первого аддитивного раствора добавляют к приблизительно 4 кратному такому же объему ретентата.
53. Способ по какому-либо одному из пп. 34-52, в котором добавление конечных эксципиентов включает стадию добавления второго аддитивного раствора к раствору, полученному со второй стадии ультрафильтрации, причем указанный второй аддитивный раствор включает ЭДТА и полисорбат 80.
54. Способ по п. 53, в котором добавление второго аддитивного раствора осуществляется при коэффициенте разбавления приблизительно 20, в результате чего один объем второго аддитивного раствора добавляют к приблизительно 19 кратному такому же объему раствора, полученного на второй стадии ультрафильтрации.
55. Препарат антитела, имеющий высокую вязкость, полученный по способу по какому-либо одному из пп. 1-54.
56. Препарат антитела, имеющий высокую вязкость, полученный по способу по какому-либо одному из пп. 11-33, где белковый препарат содержит:
от 135 мг/мл до 165 мг/мл, предпочтительно приблизительно 150 мг/мл, анти-PCSK9 антитела;
от 16 мМ до 24 мМ, предпочтительно приблизительно 20 мМ, гистидина;
от 67,2 мг/мл до 100,8 мг/мл, предпочтительно приблизительно 84 мг/мл, трегалозы; и
от 0,16 мг/мл до 0,24 мг/мл, предпочтительно приблизительно 0,2 мг/мл, полисорбата
и имеет рН от 5,2 до 5,8, предпочтительно приблизительно 5,5.
57. Препарат антитела, имеющий высокую вязкость, полученный по способу по какому-либо одному из пп. 34-54, где белковый препарат содержит:
от 110 г/л до 130 г/л, предпочтительно приблизительно 120 г/л, анти-IL-7R антитела;
от 17 мМ до 23 мМ, предпочтительно приблизительно 20 мМ, гистидина;
от 42 г/л до 58 г/л, предпочтительно приблизительно 50 г/л, сахарозы; и
от 0,017 г/л до 0,023 г/л, предпочтительно приблизительно 0,02 г/л, полисорбата
и имеет рН от 6,5 до 7,5, предпочтительно приблизительно 7,0.