КОМПОЗИЦИЯ С ПРОТИВОИНФЕКЦИОННОЙ АКТИВНОСТЬЮ
COMPOSITION WITH ANTI-INFECTIOUS ACTIVITY

Изобретение относится к области медицины и фармацевтической промышленности, а именно к средствам профилактики и лечения опасной инфекционной патологии бактериальной и вирусной природы.
Инфекционные заболевания различной природы продолжают оставаться одной из актуальных проблем современной медицины [1-3]. При этом все большее значение приобретают так называемые опасные инфекционные заболевания (ОИЗ), вспышки которых регистрируют, прежде всего, в развивающихся странах с нестабильными социально-экономическими условиями [4-7]. На сегодняшний день ОИЗ не потеряли своей актуальности и для развитых стран, включая Россию, о чем свидетельствуют периодическая активизация на территории страны природных очагов инфекций (сибирская язва, геморрагическая лихорадка с почечным синдромом, Конго-крымская геморрагическая лихорадка, клещевой энцефалит), а также периодические вспышки лихорадки Западного Нила, птичьего гриппа, свиного гриппа. Калифорнийского энцефалита. Японского энцефалита, лихорадки Сахалин, лихорадки Иссык-Куль и других инфекций [8].
По мнению экспертов Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) [8] в ближайшем будущем следует ожидать эпидемий желтой лихорадки на азиатском континенте, новой пандемии оспы, вызываемой трансмиссивным вариантом Monkeypox, распространения вируса Эбола, передающегося аэрогенным путем. Не следует исключать и потенциальной опасности биотерроризма с применением в качестве биологических агентов возбудителей инфекций. По мнению отечественных и зарубежных специалистов приоритет среди этих агентов будет отдаваться нетрадиционным в генетическом отношении возбудителям инфекций, против которых известные средства профилактики и лечения могут оказаться недостаточно эффективными [9, 10].
Инфекционные болезни имеют большую актуальность для здравоохранения, так как занимают ведущие позиции по уровню общей заболеваемости и средней пораженности населения [11], нанося значительный ущерб его трудоспособности, а также качеству жизни в целом. Анализ санитарно-эпидемиологической обстановки в различных регионах России показал, что несмотря на общее ее ухудшение после распада СССР в последнее время отмечается стабилизация ситуации [12, 13]. Организационные и практические мероприятия, проводимые санитарно-эпидемиологической службой страны, привели к созданию мощной системы санитарно-эпидемиологического надзора, способствующей улучшению санитарно-эпидемиологической обстановки в регионах [12-14].
Вышеизложенное свидетельствует о том, что проблема создания и совершенствования эффективных средств и методов профилактики и лечения инфекций, в том числе и ОИЗ, по-прежнему остается крайне актуальной, и в настоящее время ей должно уделяться самое пристальное внимание.
Интенсификация исследований, касающихся патогенеза ОИЗ, позволила установить, что в процессе развития данной патологии имеет место формирование функциональной клеточной анергии и вторичной иммунной недостаточности, основными причинами которой являются дисбаланс между различными компонентами иммунной системы, прежде всего дисбаланс между циклическими нуклеотидами, медиаторами воспаления, цитокинами и клеточными супрессорными факторами [14].
Индуцирование клеточной иммунодепрессии происходит, как правило, при системной гиперпродукции названных молекул или при возрастании их локальной концентрации выше показателей физиологической нормы. Клеточной иммунодепрессии могут также способствовать растворимые молекулы, выделяемые инфицированными клетками. Последнее наиболее характерно для инфекций вирусной природы. В частности, к настоящему времени описаны протеины, выделяемые клетками, инфицированные вирусами натуральной оспы, оспы коров, геморрагических лихорадок Эбола, Ласа, Марбург и других, обладающие мощным супрессирующим эффектом на продукцию интерферона в организме. Применительно к возбудителям бактериальных инфекций подобным супрессирующим действием обладают продукты, выделяемые клетками, которые инфицированы возбудителями чумы, сибирской язвы, туляремии и др.
При этом основными формами проявления дисбаланса в иммунной системе являются:
- изменение соотношения клеток с фенотипами CD4+ и CD8+ (изменение иммунорегуляторного индекса) в сторону уменьшения вследствие снижения под влиянием возбудителя количества клеток с фенотипом CD4+и увеличения количества клеток с фенотипом CD8+;
- нарушение соотношения эффекторных и супрессорных клеток, возникающее в результате сбоев процесса их дифференцировки;
- изменение субпопуляционного состава Т-лимфоцитов-хелперов, приводящее к модификации набора продуцируемых этими клетками цитокинов и, как следствие, к нарушению баланса между клеточной и гуморальной составляющей иммунной системы;
- дисбаланс между пролиферативной и апоптотической регуляторными клеточными программами, проявляющийся в нарушении соотношения между количеством клеток с фенотипами CD25+, CD30+ и CD95+;
- дисбаланс, обусловленный нарушением взаимосвязи между иммунной, нервной и эндокринной системами;
- нарушение принципа клональной активации, проявляющееся формированием поликлонального типа иммунореактивности и приводящее к аутосенсибилизации - агрессии иммунной системы против собственных клеток и тканей [15-17].
Итак, в ходе инфекционного процесса, прежде всего, имеют место дисфункции иммунной системы. При этом ответная реакция иммунной системы на инфицирование организма характеризуется развитием системного острофазного ответа. Патогены, запуская особые механизмы противодействия формированию противоинфекционного иммунитета, оказывают достаточно мощное супрессивное действие на клеточные и гуморальные компоненты иммунной системы, создавая тем самым условие для собственного размножения.
Помимо клеточных нарушаются и гуморальные механизмы иммунной системы, проявляющиеся:
- нарушением синтеза иммуноглобулинов (Ig) вследствие повреждения и деформации антигеном иммунокомпетентных клеток и супрессии продукции специфических антител В-л при участии Т-л-хелперов, а также в результате непосредственного контакта возбудителя с Ig и повреждения их молекулярной структуры, приводящие к утрате ими способности инактивировать антиген;
- повреждением синтеза и секреции иммунокомпетентными клетками медиаторов, энерго- и метаболит-протективных субстанций, участвующих в иммунных процессах (простагландины, аденилатциклаза, гуанилатциклаза, фосфодиэстераза, циклический аденозинмонофосфат, аденозинтрифосфат и др.);
- нарушением поглотительной и переваривающей функций циркулирующих в крови фагоцитов.
Совокупность перечисленных негативных сдвигов отрицательно сказывается на формировании адекватного иммунного ответа. Первоначально нарушаются процессы распознавания патогена иммунокомпетентными клетками, а в дальнейшем - межклеточные взаимосвязи внутри иммунной системы. Эти изменения приводят к супрессии специфического антителогенеза, продукции лимфокинов сенсибилизированными лимфоцитами и формированию иммунной недостаточности в компенсированной или субкомпенсированной формах [18].
Истощение адаптационных возможностей иммунной системы сопровождается выраженными метаболическими расстройствами и свидетельствует о переходе функционально-структурной иммунной недостаточности в декомпенсированную форму. Дальнейшее истощение резервных возможностей организма приводит к тотальной иммунной недостаточности, для которой характерна полная дезорганизация всей системы иммунореактивности и одновременная утрата функциональных возможностей органов кроветворения. Это свидетельствует об исчерпанности последних «стратегических» резервов.
Защитные реакции против ряда вирусных и бактериальных патогенов могут быть усилены путем активации иммунной системы [19], когда стимулирующий сигнал носит неспецифический характер, направленный не избирательно против вызвавшего инфекцию патогена, а повышающий общую иммунологическую резистентность.
В настоящее время описаны различные пути и средства коррекции иммунной недостаточности. С определенной долей условности средства иммуноориентированной терапии можно разделить на этиотропные (экстраиммунные) и патогенетические или собственно иммунотропные, реализующие свое действие через иммунную систему. Действие экстраиммунных препаратов направлено на улучшение общего состояния организма и его обмена веществ, устранение причин, вызвавших дисфункцию иммунной системы. Эти лекарственные средства называют также средствами опосредованной иммунотерапии. Они позволяют повысить неспецифическую иммунологическую резистентность к различного рода воздействиям внешней среды, включая возбудители инфекций. Патогенетические препараты нормализуют функционирование иммунной системы и предназначены для стимуляции или супрессии иммунореактивности, коррекции дисбаланса различных звеньев иммунной системы, компенсации уже имеющихся нарушений иммунореактивности и профилактики развития иммунной недостаточности.
Использование иммунотропных препаратов в комплексной терапии ОИЗ или с профилактической целью представляется весьма актуальным и важным. При инфекционном процессе возникают и усиливаются иммунные дисфункции, тогда как возможности этиотропной терапии ограничены появлением новых и трансформацией известных этиопатогенов, формированием патогенных вирусно-бактериальных ассоциаций и устойчивых штаммов, изменением соотношения между симбиотической и патогенной флорой, возрастанием количества и выраженности возникающих при этом осложнений, увеличением продолжительности лечения, а следовательно, и его стоимости [20]. Возрастает также частота встречаемости иммунологически компрометированных индивидуумов.
Спектр иммунотропных препаратов на сегодняшний день достаточно обширен и включает как средства природного, так и синтетического происхождения [15, 20, 21]. К числу подобных препаратов относятся пробиотики - средства, оказывающие положительное влияние на гомеостаз системы «микроорганизм и его нормальная микрофлора», а также обладающие достаточно выраженным иммуномодулирующим действием, проявляющимся в стимуляции лимфоидного аппарата, синтеза иммуноглобулинов, интерферонов, цитокинов (прежде всего ИЛ-1 и ИЛ-2), процессов синтеза и секреции гуморальных факторов неспецифической резистентности. Помимо этого пробиотические препараты препятствуют колонизации кишечника патогенными бактериями и защищают макроорганизм от потенциально вредных факторов, попадающих в ЖКТ извне или синтезирующихся в кишечнике в ходе ряда процессов [22]. Антагонистический эффект пробиотиков по отношению к патогенам основан на связывании с рецепторами слизистой оболочки и плотном заселении муцинового слоя кишечника, активации синтеза и высвобождения веществ, обладающих бактерицидным или бактериостатическим эффектом, таких как короткоцепочечные жирные цепочки, сероводород, перекись водорода и антибиотики. Бактериостатическое действие оказывают низкомолекулярные метаболиты сахаролитической микрофлоры, в первую очередь короткоцепочечные жирные кислоты (пропионовая, масляная, уксусная, муравьиная, молочная), а также лактат.
Учитывая механизмы иммунотропного действия пробиотических средств, а также иммунопатогенез ОИЗ, представляются целесообразными следующие стратегические направления их применения:
- с целью иммунопротекции - для предотвращения развития иммунной недостаточности. Показанием для назначения иммунотерапии является сам факт воздействия экстраординарного фактора или ситуации;
- с целью иммунокоррекции - для компенсации проявлений иммунной недостаточности, связанной с клеточным компонентом иммунореактивности и ликвидации регуляторного дисбаланса системы иммунитета с последующим восстановлением нормальных алгоритмов иммунореактивности, а также дисбаланса микрофлоры;
- с целью иммунореставрации - для воссоздания элементов иммунореактивности и восстановления морфологической и функциональной целостности иммунной системы.
Что касается лекарственных средств, обладающих противовирусной активностью и находящих применение при профилактике и лечении опасной инфекционной патологии вирусной этиологии, то, как известно, в настоящее время их можно условно разделить на 3 группы:
1. Химиопрепараты, широко применяемые в медицинской практике для профилактики и лечения опасных вирусных инфекций: ацикловир (зовиракс), фоскарнет, ганцикловир, видарабин при герпетической и цитомегаловирусной инфекциях; ремантадин и его аналоги при гриппе; рибамидил, виразол, рибавирин при респираторно-синтициальной инфекции; азидотимидин против ретровирусов и др. [22-24].
2. Индукторы интерферона (ридостин, камедон, циклоферон, неовир и др.), которые уже нашли свое место в профилактике и терапии герпеса, гепатита, рассеянного склероза [25-27].
3. Препараты, ранее использовавшиеся в других областях медицины и у которых выявлена биологическая активность в отношении возбудителей вирусных инфекций: дибазол, никотинамид [28-30] и др.
До настоящего времени сохраняется интерес к нуклеотидным и нуклеозидным аналогам, которые являются ингибиторами различных этапов биосинтеза нуклеиновых кислот. Противовирусное действие этих веществ связано, по-видимому, с наличием в их структуре гидроксильных групп, способных подвергаться фосфорилированию в организме. Важно, что фосфорилирование в большей степени протекает в вирусинфицированной клетке, чем в незараженной. Образующиеся при этом трифосфаты селективно ингибируют вирускодирующие ДНК-полимеразы, чем и обусловлен антивирусный эффект этих препаратов. Типичными представителями этого класса соединений являются ацикловир, широко используемый для лечения герпетических заболеваний, и рибавирин, получающий все более широкое распространение при РС-инфекциях.
Одним из путей повышения резистентности организма к вирусным инфекциям является стимуляция всех звеньев цепи иммунитета с помощью интерферона или его индукторов. Исследования последних лет, проведенные на экспериментальных животных и больных, подтвердили тот факт, что индукторы интерферона являются эффективными средствами профилактики и раннего лечения вирусных инфекций. С этой целью разрешены к применению в медицинской практике отечественные препараты ридостин, циклоферон, неовир, анадин и др.
В то же время известные базовые схемы экстренной профилактики и лечения опасных инфекционных заболеваний бактериальной природы базируются на использовании антибиотиков широкого спектра действия [31-34], применение которых для обеспечения антибактериальной защиты связано с рядом сложностей. Так, имеет место выраженная динамика снижения числа антибиотиков и химиотерапевтических средств, зарегистрированных в России в течение восьми последних лет. Если в 2002 г. общее число разрешенных к применению основных практически значимых антибактериальных соединений составляло 65 наименований, то в 2009 г. - только 43 (66%). Особенно наглядно этот негативный процесс проявляется в отношении номенклатуры беталактамов (28 - в 2002 г., 19 - в 2008 г.), аминогликозидов (соответственно 11 и 7), тетрациклинов (соответственно 5 и 1) и сульфаниламидов (соответственно 8 и 4). Наиболее стабильным в этом отношении является класс фторхинолонов, поскольку выбывание из его состава одного препарата (эноксацина) компенсировано появлением на рынке России в 2008 г. двух новых представителей этого класса - гемифлоксацина и гатифлоксацина [35-38].
Постоянное снижение номенклатуры зарегистрированных в России антибиотиков и химиотерапевтических средств полностью коррелирует с общим состоянием производства этих препаратов в стране. В России мощная индустрия производства антибиотиков была создана в 50-е годы. Объемы производства составляли свыше 3000 т в год, и этого было достаточно для обеспечения антибиотиками всех республик бывшего СССР и стран социалистического содружества. Производство при этом базировалось на штаммах отечественной селекции. В связи с кризисом экономики России уже к середине 1990-х гг.производство отечественных субстанций антибиотиков на основе микробного синтеза стало нерентабельным. В настоящее время значительная часть ферментационных мощностей для производства субстанций антибиотиков простаивает. Так, в 2005 г. мощности по производству субстанций антибиотиков использовались всего на 17%, по производству готовых лекарственных форм для инъекций - на 29%. Выпуск субстанций антибиотиков за последнее время сократился почти в 4 раза (2363 т в 1985 г., 891 т - в 1995 г., 624 т - в 2004 г.) [10]. Основными причинами падения производства субстанций антибиотиков в России являются несовременные технологии биосинтеза и химической трансформации антибиотиков, высокая себестоимость субстанций, отсутствие государственной поддержки производителей субстанций (кредиты, налоговые льготы и т.д.) и демпинговая политика мировых производителей субстанций. В связи с резким сокращением объема производства субстанций отечественных антибиотиков российские производители вынуждены закупать значительную часть субстанций за рубежом, к тому же цена их в 2-3 раза ниже стоимости отечественных продуктов.
Таким образом, исчезновение значительного числа антимикробных соединений с рынка антибактериальных химиотерапевтических средств России не могло не отразиться на общем состоянии проблемы профилактики и лечения инфекций, поскольку многие из препаратов, утративших регистрацию в нашей стране, по-прежнему включены в действующие нормативные документы, регламентирующие порядок профилактики и лечения такого рода опасной патологии.
В настоящее время для защиты от инфекционных заболеваний бактериальной природы рекомендовано использование достаточно большого перечня антибактериальных средств. К числу базовых средств антимикробной терапии относятся доксициклин, рифампицин, рифаметоприм, ампициллин, сульфатон, сизомицин, гентамицин и др.
В результате проведенных в последнее время исследований определены перспективные препараты, к числу которых относится и ряд современных разработок, а именно:
- из группы пенициллинов - азлоциллин, амоксициллин, пиперациллин и др.;
- из группы цефалоспоринов - цефотаксим, цефтазидим, цефтриаксон, цефпиром, цефепим и др.;
- из группы карбапенемов - имипенем, меропенем;
- из группы аминогликозидов - изенамицин;
- из группы макролидов - азитромицин, кларитромицин, спирамицин, рокситромицин и др.;
- из группы фторхинолонов - пефлоксацин, ципрофлоксацин, офлоксацин, норфлоксацин и др.
Вместе с тем нельзя не отметить, что для достижения требуемого уровня антибактериального эффекта указанные противоинфекционные препараты, как правило, необходимо принимать часто, длительно и в больших дозировках. Подобные антибактериальные препараты, с одной стороны, позволяют эффективно бороться с инфекционной патологией, но с другой, при обычно применяемых схемах их дозирования нередко становятся причиной развития целого ряда побочных явлений со стороны различных органов и систем организма, таких как негативное влияние на состояние микробиоценоза кишечника человека ввиду отсутствия селективности действия антибиотиков на микроорганизмы, аллергические реакции и др. Кроме того, базовые антибактериальные препараты токсичны, обладают неспецифичным бактерицидным действием и вызывают появление патогенных микроорганизмов, устойчивых к действию антибактериальных средств, вследствие чего антибиотикотерапия требует как минимум последующего восстановления микробиоценоза кишечника (дисбаланса в системе «макроорганизм и нормальная микрофлора»). Не следует забывать также о существенной зависимости фармацевтического рынка России от лекарственных препаратов импортного производства, что может негативно сказаться на уровне противоэпидемической помощи.
Одним из перспективных направлений преодоления указанных недостатков, проявляющихся в случае использования антибактериальных препаратов, является не самостоятельное их использование, а в комбинации со средствами коррекции микробиоценоза кишечника - пробиотиками. При этом установлено, что в случае сочетанного назначения с антибиотиками приоритет следует отдавать таким пробиотическим средствам, которые в своем составе содержат не целостные живые микроорганизмы (например, бифидобактерин, лактобактерин, споробактерин, ламинолакт), чужеродные для ЖКТ человека, которые будут разрушаться антибактериальными средствами, создавая дополнительную антигенную нагрузку на организм, а метаболиты пробиотических штаммов микроорганизмов [39-41].
К числу подобных средств относится пробиотический комплекс Бактистатин [42]. Его основу составляют (мас.%): стерилизованная культуральная жидкость (СКЖ), полученная при культивировании бактерий вида Bacillus subtilis и содержащая их метаболиты - 1,0, гидролизат соевой муки (ГСМ) - 20,0, природный минерал цеолит с сорбционными и ионообменными свойствами - 78,0 и стеарат кальция (СК) или аэросил - 1,0. Указанный пробиотический комплекс по составу, механизму воздействия на организм и достигаемому эффекту наиболее близок к заявляемой композиции и принят в качестве средства-прототипа.
Основу средства-прототипа составляют иммобилизованные на цеолите экзогенные и эндогенные биологически активные вещества (БАВ), синтезируемые бактериями Bacillus subtilis при глубинном выращивании, которые во многом и обусловливают лечебно-профилактический эффект данного пробиотического комплекса. Перечень их достаточно обширен и включает разнородные по химическому составу и биологическим свойствам вещества: протеолитические и амилолитические ферменты, аминокислоты, полисахариды (гексозамин, глюкозамин), витамины группы В (пиридоксина гидрохлорид, рибофлавин), азотистые основания и их производные (аденин, гуанин, тимин, урацил, цитозин) [43-45]. Среди них широко представлены и различные природные антибактериальные субстанции (бактериоцины, лизоцим, каталазы), которые селективно подавляют рост и размножение патогенных и условно-патогенных микроорганизмов в кишечнике, не влияя при этом на симбионтную микрофлору. Все перечисленные БАВ оказывают положительное влияние на организм человека и животных в целом.
Цеолит, входящий в состав средства-прототипа, обладает выраженным сорбционным действием (преимущественно по отношению к соединениям с низкой молекулярной массой, таким как метан, сероводород аммиак и другие токсические вещества), не вступая в прямое взаимодействие с витаминами, аминокислотами, белками, благодаря чему данные вещества остаются в желудочно-кишечном тракте. Ионы, содержащиеся в организме, могут включаться в кристаллическую структуру минерала, и наоборот, из минерала организм получает те неорганические элементы, в которых испытывает потребность. Благодаря увеличению высоты кишечных ворсинок, улучшению переваривания и повышению площади всасывания питательных веществ в тонком кишечнике происходит, так называемый, селективный ионообмен [46].
Важной составной частью средства-прототипа служит гидролизат соевой муки, который является, с одной стороны, частью защитной среды метаболитов, во многом отвечающей за прочность их сорбции на поверхности цеолита, а с другой стороны, - источником аминокислот, обеспечивающим питательные потребности нормальной микрофлоры кишечника и клеток макроорганизма. Основной компонент гидролизата соевой муки - соевый олигосахарид (SOE) - обладает бифидогенными свойствами [47].
Стеарат кальция (СК) или аэросил включены в состав средства-прототипа в качестве технологической добавки.
Основным предназначением средства-прототипа является восстановление и поддержание оптимальных микроэкологических параметров в кишечнике, лечение заболеваний ЖКТ путем введения в организм веществ, тормозящих развитие патогенной микрофлоры и стимулирующих развитие полезных микроорганизмов. Действие препарата базируется на том, что при его транзитном прохождении по ЖКТ в заданной зоне происходит разрушение защитной капсулы и выделение в полость кишечника иммобилизованных на частицах цеолита компонентов пробиотика. При этом вокруг частиц цеолита формируются образования мицеллярной структуры, которые в процессе движения по ЖКТ постепенно высвобождаются с пористой поверхности цеолита. С одной стороны, это позволяет поддерживать в ЖКТ активность биологических компонентов пробиотика в течение суток, что достаточно для восстановления и стимуляции функциональной активности нормальной микрофлоры кишечника. С другой стороны, эффект постепенного высвобождения с поверхности цеолита иммобилизованных на нем биологически активных веществ (БАВ) приводит к появлению открытых поверхностей его пористой структуры, что обеспечивает включение механизмов ионного обмена и избирательной сорбции токсичных соединений, способствующих очищению ЖКТ от токсинов и продуктов разложения. Это особенно важно для общей детоксикации организма.
Таким образом, благодаря комплексному составу средство-прототип способствует общей нормализации микроэкологических условий в кишечнике через различные механизмы, такие как подавление условно-патогенной флоры, сорбция и выведение токсинов, улучшение процессов пищеварения, улучшение трофической базы для нормальной микрофлоры и эпителия ЖКТ.
Клинические испытания средства-прототипа показали его высокую эффективность при купировании явлений желудочной и кишечной диспепсии у больных с кислотозависимыми заболеваниями верхних отделов ЖКТ. Применение данного препарата у больных с эрозивным антральным гастритом приводило к четкому положительному клиническому эффекту у большинства больных, проявляющемуся в виде уменьшения симптомов кишечной диспепсии, развивающемуся на фоне эрадикационной терапии. Прием данного препарата способствовал улучшению обмена липидов, увеличению липопротеидов высокой плотности и снижению общего холестерина крови. Кроме улучшения соматических симптомов у больных на фоне проведения терапии снижался уровень депрессии и невротизации [48].
Клиническая эффективность средства-прототипа доказана и при назначении его больным хроническим панкреотитом с внешнесекреторной недостаточностью поджелудочной железы сочетанно с ферментозаменительной терапией (мезим-форте, пензитал), проявляющаяся в устранении нарушений микробиоценоза кишечника, коррекции вторичной внешнесекреторной недостаточности поджелудочной железы, обусловленной чрезмерной активизацией кишечной микрофлоры, развивающейся на фоне первичной внешнесекреторной недостаточности и значительно усугубляющей ее течение [49].
Установлена также целесообразность назначения средства-прототипа при реализации принципиально новых схем терапии ишемической болезни сердца (ИБС) - заболевания, имеющего в настоящее время крайне высокую клиническую и социальную значимость вследствие высокой частоты заболеваемости среди людей трудоспособного возраста, а также тяжести возникающих осложнений [50]. Наряду с основными причинами развития данной патологии, выделяют также ряд дополнительных факторов, опосредованно способствующих ее возникновению и развитию. В первую очередь к ним относят дисбактериоз кишечника, так как к настоящему моменту сформировалось мнение о связи ИБС с количественными и качественными нарушениями состава микробиоты, а также ключевой роли микробиоты кишечника с участием механизмов энтерогепатической циркуляции в регуляции липидного обмена. Развитие дисбиоза кишечника опосредует формирование и прогрессирование негативных изменений липидного метаболизма в качестве одного из пусковых факторов холестериновой агрессии. Гиполипидемическая терапия рассматривается в настоящее время в качестве одной из основных задач при лечении ИБС и предусматривает использование статинов в качестве основных и наиболее эффективных холестерин понижающих препаратов. Однако статины последнего поколения, радикально изменившие подход к профилактике ИБС и ее осложнений, имеют побочные действия, существенно ограничивающие широкое их использование: гепатотоксичность, а также снижение эффективности лечения при длительном применении. Дополнительное использование средства-прототипа на фоне стандартной базисной терапии, предусматривающей назначение нитратов, антиагрегантов, β-адреноблокаторов или блокаторов кальциевых каналов, ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента, мочегонных, сопровождается гиполипидемическим действием, превышающим действие в аналогичных условиях симвастатина. Данное обусловлено положительным воздействием средства-прототипа за счет коррекции микробиоценоза кишечника.
Отсутствие в составе средства-прототипа живых микроорганизмов позволяет применять его совместно с антибиотиками. Сочетанное их введение в ЖКТ позволяет улучшить микроэкологические условия, что способствует восстановлению качественных и количественных характеристик симбиотических микроорганизмов. Однако при оценке перспективности сочетанного назначения антибактериального средства (доксициклина) и бактистатина в случаях экстренной профилактики и лечения ОИЗ бактериальной природы (сибиреязвенной инфекции) установлен недостаточно высокий уровень эффекта от воздействия средства-прототипа [51]. Эффект от действия средства-прототипа в отношении других ОИЗ бактериальной природы при этом не оценивался.
Вместе с тем наряду с наблюдаемыми эффектами для средства-прототипа характерен такой существенный недостаток, как невозможность концентрирования культуральной жидкости, полученной на соевой среде с использованием ГСМ, ввиду ее высокой вязкости. Кроме того, использование в технологическом процессе получения средства-прототипа в качестве питательной среды нативной соевой муки не позволяет в полной мере использовать питательные свойства исходного сырья. В данном случае требуется дополнительное проведение химического или ферментативного гидролиза соевой муки, что существенно усложняет технологию получения средства-прототипа.
Следует также отметить, что теоретически обоснована целесообразность и практически доказана возможность применения средства-прототипа в основном только при коррекции нарушений состояния микробиоты и лечения соответствующих заболеваний ЖКТ путем общей нормализации микроэкологических условий в кишечнике. О перспективности использования пробиотиков с целью профилактики и лечения инфекционной патологии сообщалось в работах Садового Н.В. и соавт. (1998 г.) [52], Рыжко И.В. и соавт. (2000 г.) [53], Воробейчикова Е.В. и соавт. (2005 г.) [39]. Однако данные систематических исследований по оценке иммунотропных эффектов препарата Бактистатина (средства-прототипа), свидетельствующие о принципиальной возможности и перспективности использования его при профилактике и лечении широкого спектра инфекционных заболеваний различной этиологии, в том числе опасных инфекционных заболеваний, как в плане монотерапии, так и при сочетанием курсовом назначении с базовыми противоинфекционными средствами отсутствуют. В то же время имеющиеся сведения теоретического характера позволяют рассчитывать на перспективность применения средств на основе пробиотиков для высокоэффективной профилактики и лечения подобной патологии.
Целью изобретения явилось повышение эффективности профилактики и лечения опасных инфекционных заболеваний путем создания композиции для патогенетической терапии на основе комплекса биологически активных веществ с пробиотической и иммуномодулирующей активностью, отличающейся высокой эффективностью и универсальностью в отношении инфекций бактериальной и вирусной природы при пероральном введении как в качестве средства монотерапии, так и при сочетанном назначении с этиотропными средствами базовой терапии, безопасностью и стабильностью при хранении.
Достижение поставленной цели возможно за счет создания композиции для патогенетической терапии, представляющей собой сбалансированный комплекс биологически активных веществ с пробиотической и иммуномодулирующей активностью, качественный и количественный состав которой позволит обеспечить нормализацию функционирования иммунной системы организма путем устранения возникших дисфункциональных изменений в иммунной системе и, прежде всего, преодоление мощного супрессивного действия патогенов на ее клеточные и гуморальные компоненты, препятствующего формированию противоинфекционного иммунитета, компенсацию уже имеющихся нарушений иммунореактивности и профилактику развития иммунной недостаточности.
При формировании качественного состава заявляемой композиции, предназначенной для профилактики и лечения ОИЗ различной этиологии, исходили из того, что основные ее компоненты должны:
- оказывать иммуномодулирующее действие и способствовать устранению дисфункциональных изменений в иммунной системе, развивающихся при воздействии возбудителей ОИЗ;
- сочетаться с базовыми средствами этиотропной терапии ОИЗ бактериальной и вирусной этиологии;
- снижать негативное воздействие антибактериальных средств на качественные и количественные характеристики нормальной микрофлоры ЖКТ;
- повышать резистентность организма к вирусным инфекциям путем стимуляции всех звеньев цепи иммунитета за счет индукции синтеза эндогенного интерферона;
- активировать механизмы элиминации патогенов из организма;
- оказывать антитоксическое действие путем связывания и выведения токсичных компонентов, накапливающихся в организме как вследствие развития инфекционного процесса, так и негативного воздействия антибактериальных препаратов при их курсовом применении.
Важной отличительной особенностью заявляемой композиции является способность эффективно повышать неспецифическую и специфическую иммунную резистентность организма, которая реализуется посредством комплексного воздействия на иммунную систему всех компонентов заявляемой композиции, проявляющих иммуномодулирующую активность.
Для этого в состав заявляемой композиции, представляющей собой сбалансированный комплекс, помимо пробиотического агента, адсорбента и вспомогательной добавки дополнительно включен иммуномодулирующий агент.
Пробиотический агент представляет собой стерилизованную культуральную жидкость (СКЖ), содержащую метаболиты, полученные в результате культивирования и стерилизации бактерий вида Bacillus subtilis. При этом использовали штамм ВКПМ №В-2335, метаболиты которого характеризуются высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных (Salmonella, Staphylococcus, Shigella, Pseudomonas и др.) и условно-патогенных (Proteus, Klebsiella, Candida и др.) микроорганизмов и способны тормозить рост патогенной микрофлоры, не оказывая ингибирующего действия на лактобациллы и бифидобактерии. Кроме того, метаболиты бацилл Bacillus subtilis, повышая фагоцитарную активность макрофагов, сами способны проявлять иммуномодулирующую активность.
Вырабатываемые микроорганизмами биологически активные вещества концентрируются в процессе их культивирования именно в культуральной жидкости. Перечень БАВ, синтезируемых Bacillus subtilis при глубинном выращивании, достаточно представительный, а проявление их биологической активности является неотъемлемой составляющей лечебно-профилактических свойств заявляемой композиции. Среди них широко представлены различные природные антибактериальные субстанции (бактериоцины, лизоцим, каталазы), которые селективно подавляют рост и размножение патогенных и условно-патогенных микроорганизмов в кишечнике, не влияя при этом на симбионтную микрофлору. Особенно ценно то, что при росте и спорообразовании микробы-продуценты Bacillus subtilis синтезируют азотистые основания (пуриновые и пиримидиновые производные). Указанные азотистые основания и их производные, представляющие собой отдельную группу иммуномодулирующих веществ, содержатся в СКЖ в значительных количествах (таблица 1). Данное обстоятельство для заявляемой композиции имеет определяющее значение, так как азотистые основания и их производные восстанавливают функциональную активность единой макрофагальной системы организма, угнетенной вследствие воздействия патогенов, и существенно повышают эффективность неспецифической и специфической защиты на различных стадиях инфекционного процесса.
При этом фармакологическая активность пробиотического агента проявляется путем опосредованного взаимодействия продуцируемых биологически активных веществ с иммунокомпетентными органами после преодоления физиологических защитных барьеров.
Адсорбент в составе заявляемой композиции предназначен, прежде всего, для иммобилизации метаболитов, продуцируемых бациллами в процессе их культивирования и сконцентрированных в СКЖ, транспортировки и адресной доставки их по всему протяжению кишечника. Постепенное высвобождение иммобилизованных на нем БАВ позволяет поддерживать высокий уровень активности заявляемой композиции.
Возможность и целесообразность использования цеолита в качестве компонента заявляемой композиции (адсорбента) определены достоверными представлениями о характере и механизме влияния его на организм. Так, благодаря уникальному химическому строению молекул цеолит обеспечивает селективное связывание и выведение из организма низкомолекулярных токсинов: метана, сероводорода, аммиака, тяжелых металлов, радионуклидов и др. При этом не происходит прямого взаимодействия с полезными нутриентами: витаминами, аминокислотами, белками и др. Цеолит содержит минеральные вещества и обладает ионообменными свойствами, так как основной скелет его кристаллической решетки состоит, прежде всего, из тетраэдр и имеет полости, в которых находятся ионы (натрия, калия, кальция), легко обменивающиеся между собой и с окружающим субстратом. Цеолит, не всасываясь в ЖКТ и проходя транзитом, участвует в селективном ионообмене и избирательной сорбции, являясь дополнительным источником широкого спектра необходимых микроэлементов. Немаловажно и то, что указанный природный минерал улучшает процессы пищеварения в целом за счет активации биохимических реакций в кишечнике, сорбции низкомолекулярных метаболитов и нормализации состояния кишечной микрофлоры. Частицы используемого цеолита имеют размеры не более 500 мкм и овальную форму кристалла, что, в свою очередь, исключает образование микротравм в кишечнике и полностью безопасно [54-56].
Существенное отличие заявляемой композиции от средства-прототипа состоит в том, что в ее состав дополнительно введен высокоактивный иммуномодулирующий агент, представляющий собой комплекс полисахаридов - продуктов ферментативного гидролиза полимеров внутреннего и внешнего слоев клеточной оболочки пивных дрожжей, а именно β-глюкана и маннана. Действие данных легко усваиваемых в организме БАВ отличается комплексностью и заключается, прежде всего, в том, что β-глюкан и маннан посредством иммуномодулирующего воздействия на иммунокомпетентные клетки эффективно ингибируют рост и размножение микробов и вирусов, попавших в организм.
Иммуномодулирующее воздействие применяемого β-глюкана пивных дрожжей обусловлено тем, что, он транспортируется через стенки клеток кишечного тракта в лимфу, в которой взаимодействует с ключевыми клетками иммунной системы - макрофагами - путем прикрепления к специфическим рецепторам, находящимся на их клеточных мембранах, и активизирует макрофаги. Воздействуя на макрофаги, β-глюкан усиливает их фагоцитарную активность - подвижность, а также способность находить и устранять чужеродные, в том числе патогенные микроорганизмы. Кроме того, β-глюкан пивных дрожжей стимулирует и такие клетки как нейтрофилы NK (натуральные клетки-киллеры) и LAK (лимфокиноактивированные клетки-киллеры), существенно повышая антибактериальную активность заявляемой композиции. Он также позволяет активизировать продукцию в клетках макрофагальной системы такого цитокина, как интерферон, повышая тем самым противовирусную активность заявляемой композиции.
В то же время полисахарид маннан, обладая способностью антигенной стимуляции, повышает выработку в лимфоцитах различных классов иммуноглобулинов, которые и обусловливают специфическую защиту организма от воздействия патогенов.
Для улучшения технологичности процесса получения заявляемой композиции в твердой лекарственной форме для перорального введения в виде порошка в ее состав введена вспомогательная добавка. В качестве вспомогательной добавки для исключения прилипания заявляемой композиции к используемому в технологическом процессе оборудованию используют стеарат кальция или аэросил.
Как видно, качественный состав подобран таким образом, что заявляемая композиция представляет собой сбалансированный комплекс с выраженной иммуномодулирующей активностью при следующем соотношении ингредиентов, мас.%:
Стерилизованная культуральная жидкость,
содержащая метаболиты штамма ВКПМ№В-2335
бактерий Bacillus subtilis
1,6-2,3
Цеолит
43,0-46,0
Комплекс полисахаридов (β-глюкан и маннан)
51,0-54,0
Стеарат кальция или аэросил
0,5-1,5
Возможность достижения цели изобретения подтверждается результатами проведенных исследований, представленными в следующих примерах.
Пример 1. Получение заявляемой композиции в виде твердой лекарственной формы для перорального введения (порошок).
Для получения заявляемой композиции в виде порошка выполняют следующий алгоритм действий. Выращивают микроорганизмы Bacillus subtilis методом глубинного культивирования в биологическом реакторе (ферментере). После окончания процесса культивирования культуральную жидкость (КЖ) с микроорганизмами вначале подвергают центрифугированию для отделения и последующего удаления живых клеток микроорганизмов, а затем - стерилизации. Перед стерилизацией КЖ смешивают с адсорбентом - цеолитом, предварительно измельченным до частиц размером не более 500 мкм. Затем в полученную стерилизованную культуральную жидкость (СКЖ), содержащую метаболиты продуцента, вводят комплекс полисахаридов, а также стеарат кальция или аэросил. Полученную смесь подвергают лиофилизации, при которой происходит иммобилизация биологически активных метаболитов продуцента на частицах цеолита. Подготовленную таким образом массу помещают в резервуар установки для гранулирования с целью смешивания и досушивания.
Используемый комплекс полисахаридов (ООО «БИТРА», Москва) включает биологически активные продукты ферментолиза полимеров внутреннего и внешнего слоев клеточной оболочки пивных дрожжей: β-глюкан (30,7%) и маннан (10,3%).
В качестве адсорбента используют цеолит природный - натуральный микропористый силикатный минерал Холинского месторождения (Бурятия) (ЗАО НПФ «НОВЬ», Новосибирск) [57, 58].
В качестве вспомогательной добавки используют стеарат кальция [59] или аэросил [60].
Заявляемая композиция также может быть выполнена в твердой дозированной лекарственной форме для перорального введения в виде капсул или таблеток, что не только существенно упростит пользование ею, но и обеспечит надежную защиту входящих в ее состав компонентов от воздействия факторов, вызывающих их деградацию.
Как видно, процесс получения заявляемой композиции в виде твердой лекарственной формы для перорального введения (порошка) отличается простотой, а используемые при этом ингредиенты недороги, выпускаются отечественной промышленностью и доступны.
Пример 2. Оценка безопасности заявляемой композиции.
Безопасность заявляемой композиции оценивали путем проведения санитарно-химического анализа, санитарно-микробиологических исследований, а также определения важной токсикологической характеристики - острой токсичности.
Санитарно-химический анализ.
Подготовку проб проводили по ГОСТ 26929-94 «Сырье и продукты пищевые. Подготовка проб. Минерализация для определения токсичных элементов. Межгосударственный стандарт». Свинец и кадмий определяли по ГОСТ 30178-96 «Сырье и продукты пищевые. Атомно-абсорбционный метод определения токсичных элементов. Межгосударственный стандарт». Мышьяк определяли согласно ГОСТ 26930-86 «Сырье и продукты пищевые. Метод определения мышьяка». Ртуть определяли согласно «Методическим указаниям по обнаружению и определению содержания общей ртути в пищевых продуктах методом беспламенной атомной абсорбции» (№5178-90).
Содержание хлорорганических пестицидов (токсикантов) определяли согласно «Методическим указаниям по определению остаточных количеств хлорорганических пестицидов» (№1766-77) и официальным методам анализа АОАС («Official methods of analysis of the АОАС», 1984, 14th ed., Chapter 29, pp.537-538).
Исследования проводили с использованием весов лабораторных ВЛ-210, комплекса вольтамперометрического СТА, хроматографа «Кристаллюкс 4000» с детекторами ПИД, ЭЗД, атомно-абсорбционного спектрометра «Квант-2А», фотоэлектроколориметра КФК-2, спектрофотометра СФ-26, радиомера-спектрометра гамма- и бета-излучений МКГБ-01 «РАДЕК».
90
137
Результаты проведенных измерений представлены в таблицах 2 и 3 и показали, что в заявляемой композиции содержание токсикантов (хлорорганические пестициды ГХЦТ и ДДТ), опасных для здоровья веществ (свинец, кадмий, ртуть, мышьяк), радионуклидов (Sr, Cs) не превышает допустимые уровни, установленные «Едиными санитарно-эпидемиологическими и гигиеническими требованиями к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю)» Таможенного союза ЕврАзЭС (глава II, раздел I, индекс 10.6) (норматив ЕТ (глава II, раздел I, индекс 10.6)). Такие же пестициды как алдрин и гептахлор в заявляемой композиции не обнаружены.
Санитарно-микробиологические исследования.
Микробиологические исследования проводили в соответствии с требованиями МУК 4.2.577-96 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов», ГОСТ Р 52814-2007 «Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella», ГОСТ Р 52815-2007 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества коагулазоположительных стафилококков и Staphylococcus aurous», ГОСТ Р 52816-2007 «Продукты пищевые. Метод выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)», ГОСТ 10444.8-88 «Продукты пищевые. Метод определения Bacillus cereus», ГОСТ 10444.12-88 «Продукты пищевые. Метод определения дрожжей и плесневых грибов», ГОСТ 30726-2001 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli».
Результаты исследований по оценке санитарно-микробиологических показателей безопасности представлены в таблице 4. Как видно, по санитарно-микробиологическим показателям безопасности заявляемая композиция соответствует «Единым санитарно-эпидемиологическим и гигиеническим требованиям к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю)» Таможенного союза ЕврАзЭС (глава II, раздел I, индекс 10.6,10.10) (норматив ЕТ (глава II, раздел I, индекс 10.6,10.10)).
Исследование острой токсичности.
Для определения показателей острой токсичности заявляемую композицию вводили здоровым беспородным белым мышам-самцам массой 22-24 г и здоровым беспородным крысам-самкам массой 130-150 г перорально в виде водной суспензии, стабилизированной твин-80, в объеме не более 0,5 мл на животное мышам и не более 5,0 мл - крысам. Исследования проводили с использованием пробит-анализа по Литчфилду-Уилкоксону в модификации З.Рота [61]. Из выборок каждого из видов животных по 50 особей были сформированы по 2 группы по 25 животных в каждой: контрольная (вводили аналогичные объемы дистиллированной воды) и опытная (вводили заявляемую композицию два раза в день в дозе 0,33 мг для мышей и 2,0 мг для крыс).
Наблюдение за подопытными животными в течение 8 сут позволило установить, что ни одно животное не погибло, видимых изменений в их поведении не было. Продолжительность наблюдения составила 1 месяц с момента введения заявляемой композиции. Результаты изучения динамики массы тела подопытных животных в течение 21 сут наблюдения за ними показали, что ни в одной из подопытных групп не было отмечено статистически достоверных по t-критерию Стьюдента отличий от соответствующей контрольной группы (таблица 5).
Так как при максимальной используемой дозе заявляемой композиции токсический эффект не был обнаружен, то в соответствии с требованиями Фармкомитета Минздрав-соцразвития России [62] вводимая доза была увеличена в 10 раз. Действие заявляемой композиции при этом оценивали на молодых половозрелых белых мышах-самцах массой 24-27 г с применением теста на острую токсичность. Подопытные животные содержались в группах по 10 особей в клетке при стандартных условиях: температура в помещении 20±2°С, корм ПК-121-2 (000 «ИНФОРМКОРМ»), питье at libitum. За час до начала эксперимента животных переставали кормить при свободном доступе к воде.
В эксперименте заявляемую композицию вводили перорально в виде водной взвеси посредством металлического зонда. Непосредственно перед каждым введением проба перемешивалась до однородной мутности. Контрольной группе животных вводили физиологический раствор - 0,9% NaCl (плацебо).
Объем вводимой пробы рассчитывали для каждого животного с учетом его массы по формуле:
где V - объем пробы, мкл; m - масса животного, г.
В ходе эксперимента заявляемую композицию вводили по 6,6 мг на одно животное, что соответствует максимальной величине, допустимой для испытания [63]. Опытная и контрольная группа содержали по 20 животных. Критерием служила выживаемость животных опытной и контрольной групп, которую оценивали через 1 сут, 2 сут, 4 сут, 8 сут, 16 сут от момента введения заявляемой композиции. Количество животных в указанные сроки наблюдения приведено в таблице 6. В ходе эксперимента в контрольной и опытной группах случаев гибели животных не наблюдали. Таким образом, экспериментально установлено, что заявляемая композиция не отличается острой токсичностью, так как не вызывает каких-либо видимых изменений в общем состоянии подопытных животных и не вызывает их гибель.
Пример 3. Оценка стабильности заявляемой композиции в процессе хранения.
Исследовали возможность сохранения активности и безопасности разработанной твердой лекарственной формы заявляемой композиции в виде порошка и устанавливали гарантированный срок годности в случае хранения при различных температурах и без использования специального оборудования.
В частном конкретном случае состав заявляемой композиции: СКЖ, содержащая метаболиты штамма ВКПМ№В-2335 бактерий Bacillus subtilis (1,6 мас.%), цеолит (43,4 мас.%), комплекс полисахаридов (53,6 мас.%), стеарат кальция (1,4 мас.%).
В ходе эксперимента порошок закладывали в 80 потребительских упаковок в виде двойных полиэтиленовых пакетов и хранили их в течение 2 лет при температурах 5±2°С, 10±3°С, 25±5°С, 35±6°С, по 20 упаковок на каждый температурный режим хранения.
Через каждые 6 месяцев хранения отбирали по 5 упаковок от соответствующего температурного режима и определяли характеристики порошка: влажность, амилолитическую и протеолитическую активности, антагонистическую активность и микробиологическую чистоту. Для возможности оценки изменений указанных характеристик в ходе хранения определяли их значения в начале исследований.
Данные, представленные в таблице 7, свидетельствуют о том, что при выбранных для испытаний температурных режимах хранения (от 5 до 40°С) оцениваемые показатели заявляемой композиции практически не изменяются в течение 2 лет. При этом средние значения показателей составили: влажность - 6,8±2,5%, амилолитическая активность - 4,8±3,5 ед. АА/г, протеолитическая активность - 0,66±3,0 ед. ПА/г. Микробиологическая чистота заявляемой композиции, оцениваемая отсутствием в ней патогенных микроорганизмов (Pseudomonas aeruginosa, Enterobacteriaceae, Staphylococcus aureus и Bacillus cereus), сохранялась в течение 2 лет, то есть весь период исследований. Антагонистическая активность заявляемой композиции в отношении Staphylococcus aureus, Candida albicans, Shigella sonnei и Salmonella typhimurium также сохранялась в течение всего периода хранения.
Таким образом, гарантированный срок хранения заявляемой композиции, выполненной в твердой лекарственной форме (порошок), составляет не менее 2 лет при температуре не выше 40°С при условии соблюдения сохранности упаковки. Особые температурные условия хранения или использование специального оборудования при этом не требуются.
Пример 4. Исследование иммунотропных эффектов средства-прототипа и заявляемой композиции.
Цель исследований состояла в оценке способности средства-прототипа и заявляемой композиции активировать механизмы противоинфекционного иммунитета и прежде всего оказывать влияние на факторы неспецифической резистентности организма. А также в определении роли в этом активных компонентов (β-глюкана и маннана), дополнительно введенных в состав заявляемой композиции, так как известно, что продукты жизнедеятельности бацилл Bacillus subtilis сами по себе являются достаточно мощными раздражителями для иммунокомпетентных клеток, приводя к их активации. Исследования проводились в сравнении с антибиотиком доксициклином - антибактериальным препаратом, достаточно широко применяемым в клинической практике.
Исследования выполнены на белых беспородных лабораторных мышах (питомник «Рапполово» РАМН) массой 18-23 г. Всего было использовано 200 животных, распределенных на четыре группы по 50 особей в каждой: контрольную (получали изотонический раствор хлорида натрия) и три подопытные, в которых животным вводили антибиотик доксициклин, средство-прототип или заявляемую композицию.
Доксициклин вводили внутрижелудочно 1 раз в сутки в дозе 0,05 мг/мышь.
Средство-прототип вводили перорально 1 раз в сутки в дозе 150 мкг/мышь.
Заявляемую композицию вводили перорально 1 раз в сутки в дозе 150 мкг/мышь.
В частном конкретном случае состав заявляемой композиции: СКЖ, содержащая метаболиты штамма ВКПМ №В-2335 бактерий Bacillus subtilis (2,3 мас.%), цеолит (45,3 мас.%), комплекс полисахаридов (51,7 мас.%), стеарат кальция (0,7 мас.%).
Продолжительность введения антибиотика, средства-прототипа и заявляемой композиции составляла 7 суток. Оценку воздействия применяемых средств осуществляли через 1, 5 и 7 суток. Для этого до введения препаратов (контроль), а также спустя 1, 3 и 7 сут после введения у животных каждой из групп проводили забор крови для исследования. На каждом сроке забор материала проводили от 10 животных из группы, индивидуально от каждой мыши методом декапитации.
Оценку динамики развития изменений факторов неспецифической резистентности осуществляли путем определения функционального состояния клеток фагоцитарной системы (переваривающей активности гранулярных лейкоцитов), а также концентрации в сыворотке крови лизоцима и миелопероксидазы, обладающих не только прямым бактерицидным действием, но и являющихся медиаторами межклеточного взаимодействия при развитии иммунного ответа на любое антигенное воздействие.
Переваривающую активность гранулярных лейкоцитов периферической крови подопытных животных оценивали по методу Зеленовой Е.Г. и Никифорова В.А. (1972). Сыворотку получали по стандартной методике, отделяя сгусток крови от жидкой фазы. Для оценки функционального состояния фагоцитирующих клеток кровь забирали в пробирки, предварительно обработанные силиконом (Serva, Германия) и содержащие раствор гепарина из расчета 20 ЕД на 1 мл крови.
Фагоцитарный индекс (Фи), представляющий собой отношение выраженности поглотительной и переваривающей функций фагоцитирующих клеток, определяли через 15 мин и 30 мин инкубации с тест-объектом фагоцитоза - тест-микробом (М. lysodeicticus), который выращивали на мясопептонном агаре в термостате при температуре 37°С в течение 24 ч. В качестве оцениваемого показателя служил индекс переваривающей активности гранулярных лейкоцитов (ИП), представляющий собой отношение количества фагоцитирующих клеток в мазке через 30 мин инкубации крови с тест-объектом фагоцитоза к количеству фагоцитирующих клеток в мазке через 15 мин инкубации крови с тест-объектом фагоцитоза.
Значения ИП определяли по формуле:
где А - количество фагоцитирующих клеток на 100, просчитанных в мазке гранулярных лейкоцитов, поглотивших тест-микроб в течение 15 мин инкубации;
В - количество фагоцитирующих клеток на 100, просчитанных в мазке гранулярных лейкоцитов, поглотивших тест-микроб в течение 30 мин инкубации.
При удовлетворительном функционировании гранулярных лейкоцитов периферической крови значения ИП всегда больше 1. Величину ИП выражали в условных единицах (фиг.1).
Концентрацию лизоцима в сыворотке крови определяли по методу Бухарина О.В. с соавт. (1974). Кровь подопытного животного собирали в центрифужную пробирку и получали сыворотку. Затем 0,1 мл сыворотки крови переносили в бактериологическую пробирку и добавляли 0,9 мл физиологического раствора. Полученную смесь перемешивали и добавляли к ней 1,5 мл суспензии тест-микроба, которую предварительно стандартизовали на фотоэлектроколориметре ФЭК-56М до экстинкции 0,66.
Готовую суспензию, содержащую тест-микроб и исследуемую сыворотку, перемешивали и помещали в термостат на 30 мин при температуре 37°С. По истечении времени инкубации пробирки вынимали из термостата и определяли экстинкцию материала на ФЭК-56М. Полученные величины экстинкции с помощью специальных таблиц переводили в значения, характеризующие концентрацию лизоцима в сыворотке крови, и выражали в мкг/мл.
Уровень миелопероксидазы (МПО) в сыворотке крови определяли по методу, разработанному на основании общепринятых подходов к выявлению этого субстрата в сыворотке крови и иммунокомпетентных клетках (Gell P.G.H. и др. (1968); Page R.C. и др. (1978)). Для определения концентрации МПО в сыворотке крови в 96-луночные планшеты для иммунологических реакций с плоским дном, начиная со второй лунки ряда А, разливали по 0,1 мл сывороток, взятых от подопытных животных. Затем в них добавляли по 0,1 мл реактива, представляющего собой смесь бензидина и 3% перекиси водорода. В первую лунку ряда А панели (контроль) вместо сыворотки наливали 0,1 мл физиологического раствора. После добавления реактива панели встряхивали, помещали в термостат и выдерживали при температуре 37°С в течение 60 мин. По прошествии времени инкубации панели вынимали из термостата и просматривали на вертикальном спектрофотометре «Dynatech» (Германия) при длине волны 495 нм. Концентрацию фермента в сыворотке крови получали в единицах экстинкции и выражали в условных единицах.
Как свидетельствуют представленные на фиг.2-3 данные, иммунотропные эффекты средства-прототипа и заявляемой композиции проявляются на уровне клеток фагоцитарной системы крови и процессов, связанных с синтезом и секрецией в кровь ферментов лизоцима и миелопероксидазы. Динамика изменений значений факторов неспецифической резистентности подопытных животных экспериментальных групп, которым вводили средство-прототип или заявляемую композицию, практически одинакова, о чем свидетельствует отсутствие статистически значимых различий (р>0,05). Выявленные эффекты, заключающиеся в достоверном повышении функциональной активности факторов неспецифического иммунитета, регистрировали уже через 1 сут после введения указанных средств, и длились они как минимум 7 сут от момента введения. То есть стимулирующее действие как средства-прототипа, так и заявляемой композиции на исследованные механизмы иммунологической резистентности имело место уже после однократного их введения.
Значения факторов неспецифической резистентности животных, получавших доксициклин в течение 1, 3 и 7 сут, остаются практически без изменений по отношению к контролю, что свидетельствует об отсутствии у данного базового антимикробного средства способности стимулировать функциональную активность иммунокомпетентных клеток.
Введение средства-прототипа в течение 1, 3 и 7 сут приводит к достоверному повышению активности факторов неспецифической резистентности по сравнению с контролем. Проявляется это в увеличении индекса переваривающей активности гранулярных лейкоцитов, а также концентрации лизоцима и миелопероксидазы. Достаточно существенное повышение функциональной активности указанных факторов наблюдается после однократного введения средства-прототипа уже в течение первых суток. С одной стороны, это свидетельствует об активации факторов неспецифического иммунитета и возможности обеспечения быстрой неспецифической защиты организма от патогенов. С другой стороны, это означает, что первичные механизмы действия средства-прототипа связаны не только с его прямым влиянием на микрофлору ЖКТ, но и с непосредственным воздействием на компоненты местного иммунитета, которые, в том числе, связаны с регуляцией баланса эндогенных цитокинов, усиливающих защитные реакции.
В случае использования заявляемой композиции, в состав которой дополнительно включен комплекс полисахаридов в виде биологически активных продуктов гидролиза полимеров клеточной оболочки пивных дрожжей (β-глюкан и маннан), прослеживалась большая ее эффективность в установленных эффектах в сравнении со средством-прототипом. Так, заявляемая композиция оказывала достоверно более выраженное влияние на клетки фагоцитарной системы крови и их кислородзависимый бактерицидный механизм (повышалась концентрация миелопероксидазы в сыворотке крови). Вместе с тем известно, что увеличение концентрации сывороточной миелопероксидазы свидетельствует не только об активации неспецифической иммунологической резистентности, но и повышении вероятности ее активирующего влияния на иммунокомпетентные клетки, поскольку на их мембране имеется соответствующий специфический рецептор.
Заявляемая композиция по активности превосходила средство-прототип и в отношении собственно бактерицидных механизмов действия сыворотки крови, к которым относится активность сывороточного лизоцима. Наблюдаемые более выраженные эффекты заявляемой композиции по указанному компоненту иммунной защиты в отношении исследуемой инфекционной патологии бактериальной природы позволяют отдать ей предпочтение в качестве средства противоинфекционной защиты.
Таким образом, проведенные исследования показали, что заявляемая композиция существенно активирует механизмы бактериальной защиты. В ходе дальнейших исследований проведена оценка целесообразности и перспективности применения заявляемой композиции в качестве средства профилактики и лечения опасных инфекций бактериальной этиологии, в том числе генерализованной сальмонеллезной и сибиреязвенной инфекций.
Пример 5. Исследование интерфероногенных свойств средства-прототипа и заявляемой композиции.
Поскольку неспецифическая иммунологическая резистентность призвана оказывать защиту не только при бактериальных, но и вирусных инфекциях, то исследовали в какой степени средство-прототип и заявляемая композиция способны оказывать влияние на интерфероногенез.
Исследования выполнены на белых беспородных лабораторных мышах (питомник «Рапполово» РАМН) массой 18-23 г. Экспериментальные группы животных формировали, как описано в примере 4.
В частном конкретном случае состав заявляемой композиции: СКК, содержащая метаболиты штамма ВКПМ№В-2335 бактерий Bacillus subtilis (2,1 мас.%), цеолит (44,6 мас.%), комплекс полисахаридов (52,4 мас.%), стеарат кальция (0,9 мас.%).
5
2
50
Для определения интерфероногенных свойств средства-прототипа и заявляемой композиции в динамике проводили забор крови у подопытных животных из ретроорбитального синуса, объединяя в одной пробе материал от трех животных. Полученную после центрифугирования при 1000 об./мин в течение 10 мин сыворотку отсасывали и хранили при температуре минус 20°С. Внутренние органы мышей растирали с добавлением физиологического раствора, гомогенат центрифугировали (4000 об./мин) в течение 20 мин и из супернатанта готовили 10% суспензию в физиологическом растворе. Полученные таким образом пробы хранили при температуре минус 20°С. Титрование интерферона (ИФН) в полученных пробах проводили микрометодом в культуре клеток. Культуру клеток L-929, разведенную ростовой средой до необходимой концентрации (3-4·10 клеток/мл), вносили в лунки 96-луночных пластиковых панелей и инкубировали в термостате в течение 24 ч. На протяжении всего процесса титрования инкубация клеточных культур проходила при идентичных условиях: температура 37°С в атмосфере с 5% СO и 98% влажности. После образования на дне лунок клеточного монослоя ростовую среду из панели удаляли и вносили поддерживающую среду, в которой производили последовательные двукратные разведения тестируемых проб (в парных лунках). По окончании суточной инкубации тестируемые пробы удаляли и вносили тест-вирус энцефаломиокардита (ЕМС) в рабочем разведении, составляющем 100ЦПД (цитопатогенная доза, при которой наблюдается гибель 50% клеток). Через сутки производили учет результатов с помощью инвертированного микроскопа. Титр ИФН - величина, обратная последнему разведению сыворотки или пробы гомогената органа, при котором наблюдается 50% защита от тест-вируса.
Установлено, что средство-прототип практически не обладает интерфероногенными свойствами (фиг.4). У подопытных животных, которым вводили средство-прототип, уровень сывороточного интерферона практически не менялся по отношению к контрольным значениям, хотя и несколько возрастал (до 20 ЕД/мл), однако эти различия с контрольным уровнем (5 ЕД/мл) были статистически недостоверными. В то же время, однократное введение заявляемой композиции в такой же дозе, что и средство-прототип (150 мкг/мышь) оказывало достаточно выраженное интерфероногенное действие. Уже спустя 1 сут после введения заявляемой композиции уровень сывороточного интерферона увеличивался до 160 ЕД/мл (различия достоверны (р<0,05) по сравнению с контролем и уровнем сывороточного интерферона у животных, получавших средство-прототип). В дальнейшем наблюдали снижение уровня сывороточного интерферона, однако и на последующих сроках исследования оцениваемый показатель достоверно превышал данные контрольной группы и группы животных, получавших средство-прототип (р<0,05).
Таким образом, проведенные исследования показали, что заявляемая композиция помимо активации механизмов бактериальной защиты существенно активировала и интерфероногенез - ключевой механизм противовирусной защиты. Достаточно быстрая продукция эндогенного интерферона позволяет уже на ранней стадии обеспечить надежную защиту организма от инфекционных заболеваний вирусной этиологии.
В ходе дальнейших исследований проведена оценка целесообразности и перспективности применения заявляемой композиции в качестве средства профилактики и лечения опасных вирусных инфекций, в том числе клещевого энцефалита и лихорадки Западного Нила, имеющих общеэпидемиологическое значение, возбудители которых входят в число потенциальных биологических поражающих агентов и агентов биотерроризма.
Пример 6. Исследование специфической противоинфекционной активности средства-прототипа и заявляемой композиции на модели экспериментальной генерализованной сальмонеллезной инфекции.
Эксперименты выполнены на белых беспородных лабораторных мышах (питомник «Рапполово» РАМН) в возрасте 2-3 мес.и массой 18-23 г. Перед экспериментом подопытные животные в обязательном порядке выдерживали карантин в течение 1 нед.
50
50
50
7
Наиболее адекватной экспериментальной моделью для изучения эффективности средства-прототипа и.заявляемой композиции является модель сальмонеллеза белых беспородных мышей, вьзванного пероральным введением возбудителя. Для моделирования экспериментальной генерализованной сальмонеллезной инфекции использовали коллекционный штамм микроорганизма семейства Enterobacteriaceae (Salmonella typhimurium breslau, штамм №20). В результате определения дозы возбудителя, вызывающей гибель 50% зараженных животных (ЛД/мл), установлено, что ЛД/мл S.typhimurium для беспородных мышей составляет 10 м.к./мл. В ходе дальнейших исследований для заражения животных использовали дозу возбудителя, равную 5 ЛД/мл.
В эксперименте формировали 3 группы животных (контрольная и 2 опытные) по 10 особей в каждой.
Животным первой группы никакие средства не назначали, вводили изотонический раствор хлорида натрия (плацебо) и использовали их в качестве контроля.
Животным второй группы вводили средство-прототип в виде взвеси порошка (перорально в дозе 150 мкг/мышь).
Животным третьей группы вводили заявляемую композицию в виде взвеси порошка (перорально в дозе 150 мкг/мышь).
Для перорального введения взвесей средства-прототипа и заявляемой композиции использовали шприцы со специальным зондом.
В частном конкретном случае состав заявляемой композиции: СКЖ, содержащая метаболиты штамма ВКПМ№В-2335 бактерий Bacillus subtilis (1,8 мас.%), цеолит (46,0 мас.%), комплекс полисахаридов (51,4 мас.%), стеарат кальция (0,8 мас.%).
Схемы введения средства-прототипа и заявляемой композиции относительно заражения возбудителем инфекции: однократно за 24 ч до заражения (профилактическая); однократно через 24 ч после заражения (лечебная); трехкратно: за 24 ч до, одновременно и через 24 ч после заражения (комбинированная).
Критерием противоинфекционной активности применяемых средств служила выживаемость животных в экспериментальных группах. Процент выживших животных определяли по таблицам Генеса В.С. Наблюдали за инфицированными животными в течение 21 сут от момента заражения, ежедневно регистрируя число живых и павших животных в экспериментальных группах.
50
Как следует из представленных на фиг.5а данных, однократное профилактическое введение средства-прототипа до заражения подопытных животных возбудителем сальмонеллезной инфекции в дозе 5ЛД оказывало определенное защитное действие в отношении данного вида инфекции, выражающееся в обеспечении выживаемости 20% инфицированных животных по сравнению со 100% летальностью в контроле. В то же время профилактическая эффективность в аналогичных условиях заявляемой композиции была выше - на фоне 100% летальности в контроле выживаемость животных составила 40%, то есть в 2,0 раза превышала профилактическую эффективность средства-прототипа.
При лечебном применении средства-прототипа и заявляемой композиции (фиг.5б) установлено, что эффективность от применения обоих препаратов оказалась на 10% менее выраженной, чем при их однократном профилактическом использовании. Однако и в данном случае эффективность заявляемой композиции по сравнению со средством-прототипом была в 3,0 раза выше.
Наиболее выраженный протективный эффект как средства-прототипа, так и заявляемой композиции был зарегистрирован при их применении по комбинированной схеме (фиг.5в). При этом в случае применения средства-прототипа выживало 60%, а заявляемой композиции - 100% инфицированных животных на фоне 100% летальности в контроле. Защитные свойства заявляемой композиции не только достоверно превышали контрольные значения (р<0,05), но и в 1,7 раз превышали указанный показатель средства-прототипа.
Таким образом, протективные свойства заявляемой композиции в отношении экспериментальной генерализованной сальмонеллезной инфекции выражены в большей степени, чем у средства-прототипа. При условии однократного профилактического применения превышение составляло 2,0 раза, однократного лечебного - 3,0 раза, а при комбинированном применении- 1,7 раз.
Пример 7. Исследование специфической противоинфекционной активности средства-прототипа и заявляемой композиции на модели экспериментальной сибиреязвенной инфекции.
Исследования выполнены на белых беспородных лабораторных мышах (питомник «Рапполово» РАМН) в возрасте 2-3 мес и массой 18-23 г.Перед экспериментом подопытные животные в обязательном порядке выдерживали карантин в течение 1 нед.
Для моделирования экспериментальной сибиреязвенной инфекции использовали коллекционный штамм Bacillus anthracis 71/12 (второй вакцины Ценковского). Споровую форму возбудителя готовили следующим образом: на мясопептонном бульоне (рH=7,2-7,4) при температуре 37°С в течение 24 ч выращивали маточный материал. Суточную бульонную культуру равномерно распределяли по поверхности пшеничного агара, разлитого в матрацы, и культивировали в термостате при температуре 32±0,5°С в течение 72 ч. По окончании культивирования в термостате матрацы заворачивали в темную бумагу и выдерживали в темном месте при температуре 10°С в течение 5-7 сут. Выросшую культуру смывали с поверхности агара стерильной дистиллированной водой. Полученную суспензию спор переносили в стерильную колбу с притертой пробкой, которую встряхивали в шутель-аппарате в течение 60 мин. По истечении времени встряхивания содержимое колбы фильтровали через стерильный ватно-марлевый фильтр, помещали в стерильный флакон с бусами и хранили при температуре 4±0,5°С.
50
50
50
В результате определения дозы возбудителя, вызывающей гибель 50% зараженных животных (ЛД/мл) установили, что величина ЛД/мл Bacillus anthracis для беспородных мышей составила 20 спор/мл. В ходе дальнейших исследований для заражения животных использовали дозу возбудителя, равную 10 ЛД/мл.
Экспериментальные группы животных формировали аналогично описанному в примере 6. Средство-прототип и заявляемую композицию вводили в дозе 150 мкг/мышь каждого.
Исследования проведены с целью оценки протективных свойств средства-прототипа и заявляемой композиции при однократном введении их в различные сроки относительно заражения возбудителем сибиреязвенной инфекции. Критерием противоинфекционной эффективности применяемых средств служила выживаемость животных в экспериментальных группах.
В частном конкретном случае состав заявляемой композиции: СКЖ, содержащая метаболиты штамма ВКПМ№В-2335 бактерий Bacillus subtilis (1,7 мас.%), цеолит (45,7 мас.%), комплекс полисахаридов (51,1 мас.%), стеарат кальция (1,5 мас.%).
Как следует из представленных данных (фиг.6а), однократное профилактическое введение средства-прототипа или заявляемой композиции наиболее эффективно, если затем заражение происходило через 1 сут после введения средств. В этом случае на фоне 100% летальности в контроле в группах подопытных животных выживало 40% (р<0,05). Эффективность средства-прототипа и заявляемой композиции в этих условиях была одинаковой. С увеличением интервала времени между однократным введением каждого средства и последующим заражением животных возбудителем сибиреязвенной инфекции их защитная эффективность падала. Причем динамика снижения протективных свойств у обоих средств была одинаковой: при введении как средства-прототипа, так и заявляемой композиции за 2 сут до заражения выживало 10% подопытных животных и в дальнейшем с увеличением времени указанные средства противоинфекционную эффективность не проявляли.
Несколько иные результаты получены при однократном лечебном применении средства-прототипа или заявляемой композиции (фиг.6б). Так, средство-прототип практически не проявляло эффективность, обеспечивая только 20% защиту инфицированных животных на фоне 100% летальности в контроле при введении его через 1 сут после инфицирования. В аналогичных условиях заявляемая композиция обеспечивала более выраженный уровень защиты. При ее введении через 1 сут после заражения выживаемость инфицированных животных составила 50%, через 2 сут - 30%, через 3 сут - 10%. Заявляемая композиция была практически не эффективной при ее введении через 4 сут после заражения.
Наиболее эффективным было использование обоих средств в условиях однократного введения одновременно с заражением (фиг.6в), что проявлялось в повышении выживаемости инфицированных мышей на 40% (средство-прототип) и на 60% (заявляемая композиция) на фоне 100% летальности в контроле. Как видно, эффективность заявляемой композиции при этом в 1,5 раз выше по сравнению со средством-прототипом.
Совокупность представленных результатов свидетельствует о том, что однократное использование заявляемой композиции для защиты от экспериментальной сибиреязвенной инфекции более эффективно, чем однократное применение средства-прототипа.
Пример 8. Исследование протективных свойств заявляемой композиции на модели экспериментального клещевого энцефалита.
Эксперименты выполнены на белых неинбредных мышах-самцах массой 16-18 г. Перед экспериментом подопытные животные в обязательном порядке выдерживали карантин в течение 1 нед.
2
3
50
Экспериментальный клещевой энцефалит моделировали с использованием вируса клещевого энцефалита (КЭ) (патогенный штамм Абсеттаров). Накопление вируссодержащего материала для заражения лабораторных животных проводили на мышах-сосунках. Первоначально готовили пять последовательных десятикратных разведений вируссодержащего материала, которым служил центрифугат 10% суспензии мозга зараженных ранее мышей или регидратированный из лиофильного состояния вируссодержащий материал. По 0,02 мл каждого разведения вводили в мозг мышам-сосункам, за которыми устанавливали наблюдение в течение 24-48 ч, по окончании которого животных забивали эфиром, извлекали головной мозг и депонировали его по три образца в пенициллиновые флаконы, которые хранили в морозильной камере при температуре минус 20±0,5°С. В дальнейшем 10% суспензию головного мозга использовали в качестве вируссодержащего материала. Исходный титр вируса составил 10-10 ЛД/мл.
50
В эксперименте формировали 3 группы животных (контрольную и 2 опытные) по 14 особей в каждой. Подопытных животных всех групп инфицировали вирусом в дозе 8ЛД.
Животным контрольной группы никакие средства не назначали и использовали их в качестве контроля.
Животным первой и второй опытных групп вводили заявляемую композицию перорально в объеме 0,5 мл и в дозе 150 мкг/мышь. При этом животным первой опытной группы заявляемую композицию вводили за 5 сут, 4 сут, 3 сут, 2 сут, 1 сут до заражения (профилактическая схема), а животным второй опытной группы - одновременно с заражением и далее 1 раз в сут в течение 5 сут подряд (лечебная схема).
В частном конкретном случае состав заявляемой композиции: СКЖ, содержащая метаболиты штамма ВКПМ№В-2335 бактерий Bacillus subtilis (2,2 мас.%), цеолит (43,8 мас.%), комплекс полисахаридов (53,6 мас.%), стеарат кальция (1,4 мас.%).
Критерием противоинфекционной эффективности заявляемой композиции служила выживаемость животных в экспериментальных группах. В ходе эксперимента установлено (таблица 8), что при введении заявляемой композиции в профилактических или лечебных целях устойчивость подопытных животных к заражению вирусом клещевого энцефалита составляла соответственно 64,28±10,52% или 57,14±12,34% при 100% летальности в контроле (р<0,05). Данное обстоятельство свидетельствует о том, что заявляемая композиция проявляет противовирусную активность, обусловленную ее интерфероногенными свойствами.
Пример 9. Исследование специфической противоинфекционной активности заявляемой композиции на модели экспериментальной лихорадки Западного Нила.
Исследования выполнены на белых беспородных мышах-самцах массой 18-23 г, полученных из питомника «Рапполово» РАМН. Перед экспериментом подопытные животные в обязательном порядке выдерживали карантин в течение 1 нед.
3
4
50
Экспериментальную лихорадку Западного Нила моделировали с использованием вируса лихорадки Западного Нила (ЛЗН) (патогенный штамм НР91). Накопление вируссодержащего материала для заражения подопытных животных проводили на мышах-сосунках. Первоначально готовили пять последовательных десятикратных разведений вируссодержащего материала, которым служил центрифугат 10% суспензии мозга зараженных ранее мышей или регидратированный из лиофильного состояния вируссодержащий материал. По 0,02 мл каждого разведения вводили в мозг мышам-сосункам и устанавливали за ними наблюдение в течение 24-48 ч, по окончании которого животных забивали эфиром, извлекали головной мозг и депонировали его по три образца в пенициллиновые флаконы, которые хранили в морозильной камере при температуре минус 20±0,5°С. В дальнейшем 10% суспензию головного мозга использовали в качестве вируссодержащего материала. Исходный титр вируса составил 10-10 ЛД/мл.
50
В эксперименте формировали 3 группы животных (контрольную и 2 опытные) по 10 особей в каждой. Вирулентный штамм возбудителя применяли в заражающей дозе 10 ЛД и вводили подкожно в объеме 0,3 мл.
Животным контрольной группы никакие средства не назначали.
Животным первой и второй опытных групп вводили заявляемую композицию перорально в объеме 0,5 мл и в дозе 150 мкг/мышь. При этом животным первой опытной группы заявляемую композицию вводили за 5 сут, 4 сут, 3 сут, 2 сут, 1 сут до заражения (профилактическая схема), а животным второй опытной группы - одновременно с заражением и далее 1 раз в сут в течение 5 сут подряд (лечебная схема).
В частном конкретном случае состав заявляемой композиции: СКЖ, содержащая метаболиты штамма ВКПМ№В-2335 бактерий Bacillus subtilis (1,9 мас.%), цеолит (43,2 мас.%), комплекс полисахаридов (53,4 мас.%), стеарат кальция (1,5 мас.%).
Критерием противоинфекционной эффективности заявляемой композиции служила выживаемость животных в экспериментальных группах. Наблюдение за инфицированными животными осуществляли в течение 21 сут, ежедневно учитывая количество живых и павших животных.
50
Установлено, что все подопытные животные, получавшие заявляемую композицию перорально многократно, в условиях заражения их вирусом лихорадки Западного Нила в дозе 10ЛД выжили при 100% летальности в группе контроля (таблица 9). Причем в контрольной группе гибель двух животных (20%) наблюдали уже через 5 сут после заражения, через 7 сут - 8 животных (80%), а через 10 сут - всех 10 животных (100%) (таблица 10).
Таким образом, еще раз доказана целесообразность использования заявляемой композиции в качестве средства для профилактики и терапии вирусных инфекций, в том числе опасной вирусной инфекции - лихорадки Западного Нила.
Пример 10. Исследование эффективности сочетанного назначения заявляемой композиции и антибиотика доксициклина на модели экспериментальной сибиреязвенной инфекции.
Исследования выполнены на белых беспородных лабораторных мышах (питомник «Рапполово» РАМН) массой 18-23 г. Перед экспериментом подопытные животные в обязательном порядке выдерживали карантин в течение 1 нед.
50
Для моделирования экспериментальной сибиреязвенной инфекции использовали коллекционный штамм Bacillus anthracis 71/12 (второй вакцины Ценковского). Споровую форму возбудителя готовили, как описано в примере 7. Для заражения животных возбудитель вводили дозах 10, 100 и 1000 ЛД/мл.
В эксперименте формировали 4 группы животных по 10 особей в каждой.
Животным первой группы никакие средства не назначали, вводили изотонический раствор хлорида натрия (плацебо) и использовали их в качестве контроля.
Животным второй группы назначали антибиотик доксициклин в виде капсул по 0,1 г производства «Ферейн», содержимое которых растворяли в 0,9% растворе хлорида натрия и вводили перорально 1 раз в день. Доза антибактериального средства при этом была эквивалентной одной человеческой дозе и составляла 1 мг/мышь.
Животным третьей и четвертой групп сочетание назначали антибиотик доксициклин и заявляемую композицию и вводили их перорально. Доксициклин назначали по общепринятой схеме, то есть исключительно после заражения. Вводили доксициклин перорально 1 раз в день и в дозе 1 мг/мышь. Заявляемую композицию вводили в разовой дозе 150 мкг/мышь и в объеме 0,5 мл. Животным третьей группы заявляемую композицию вводили по профилактической схеме (до заражения), а животным четвертой группы - по лечебной схеме (после заражения).
В частном конкретном случае состав заявляемой композиции: СКЖ, содержащая метаболиты штамма ВКПМ№В-2335 бактерий Bacillus subtilis (2,3 мас.%), цеолит (45,4 мас.%), комплекс полисахаридов (51,2 мас.%), стеарат кальция (1,1 мас.%).
50
Как представлено на фиг.7, средняя продолжительность жизни животных контрольной группы, инфицированных возбудителем сибиреязвенной инфекции в дозах 10, 100 и 1000 ЛД, составляет соответственно 4,1 сут, 3,5 сут и 2,5 сут.
50
50
50
50
Установлено, что в отличие от монотерапии антибиотиком сочетанное лечебное назначение антибиотика и заявляемой композиции способствует достоверному (р<0,05) увеличению средней продолжительности жизни подопытных животных при заражающих дозах возбудителя 10 и 100 ЛД. Так, пероральное сочетанное назначение антибиотика и заявляемой композиции через 1 сут или 2 сут после заражения способствует увеличению средней продолжительности жизни подопытных животных соответственно на 56,6% или 35,6% при дозе возбудителя 10 ЛД и на 26,6% или 25,0% - при дозе возбудителя 100 ЛД. При высокой дозе возбудителя, составляющей 1000 ЛД, увеличение средней продолжительности жизни животных составило лишь 14,3% или 13,6% и не имело статистической достоверности (р>0,05).
50
Таким образом, экспериментально установлено, что лечебное назначение комбинации доксициклина и заявляемой композиции целесообразно через 1 сут или 2 сут после заражения возбудителем инфекции в низких дозах. Для достоверного увеличения средней продолжительности жизни подопытных животных, инфицированных высокими дозами возбудителя (1000 ЛД), сочетанное введение антибиотика и заявляемой композиции необходимо начинать не позднее 0,5 сут после заражения (фиг.8). Это позволит увеличить среднюю продолжительность жизни подопытных животных на 25,0%.
50
50
Кроме того, установлено, что сочетанное назначение доксициклина и заявляемой композиции вне зависимости от схемы введения заявляемой композиции было более эффективным в плане формирования защиты от заражения возбудителем сибиреязвенной инфекции, чем использование только заявляемой композиции или только доксициклина. Так, при назначении заявляемой композиции сочетанно с доксициклином до заражения высокий уровень устойчивости подопытных животных к заражению обеспечивался не только при заражающей дозе возбудителя 10 ЛД, но и 100 ЛД, то есть в случае, когда моновоздействие заявляемой композиции было малоэффективным, а доксициклин обеспечивал защиту на уровне 70% (фиг.9а).
50
50
Аналогичную картину наблюдали и при введении заявляемой композиции сочетанно с доксициклином после заражения (фиг.9б). Однако в этом случае высокий защитный эффект от сочетанного назначения указанных средств отмечен не только при низких заражающих дозах возбудителя сибиреязвенной инфекции (10 ЛД и 100 ЛД), но и 1000 ЛД5о. В последнем случае монотерапия с использованием доксициклина обеспечивала защиту на уровне 40%, а заявляемая композиция была не эффективной. Эффект же от сочетанного назначения препаратов в аналогичных условиях достигал 90% на фоне 100% летальности в контроле (р<0,001).
Таким образом, совокупность полученных экспериментальных данных свидетельствует о перспективности сочетанного назначения антибактериальных и пробиотических средств в случаях экстренной профилактики и этиотропного лечения опасных инфекционных заболеваний бактериальной природы, в частности сибиреязвенной инфекции. Использование в подобной ситуации заявляемой композиции отличается высокой эффективностью, что связано с развитием между заявляемой композицией и применяемым антимикробным средством определенного взаимопотенцирующего эффекта. Указанный эффект обусловлен присутствием в составе заявляемой композиции полисахаридов в виде комплекса биологически активных продуктов ферментативного гидролиза полимеров клеточной оболочки пивных дрожжей (β-глюкана и маннана), которые оказывают дополнительное существенное активирующее влияние на иммунокомпетентные клетки, чем и обусловливают наблюдаемый потенцирующий эффект.
Пример 11. Исследование эффективности сочетанного назначения заявляемой композиции и антибиотика доксициклина на модели генерализованной сальмонеллезной инфекции.
Исследования выполнены на белых беспородных лабораторных мышах (питомник «Рапполово» РАМН) массой 18-23 г.Перед экспериментом подопытные животные в обязательном порядке выдерживали карантин в течение 1 нед.
50
Использовали коллекционный штамм микроорганизмов семейства Enterobac-teriaceae (S.typhimurium breslau, штамм №20). Заражающая доза возбудителя составляла 5 ЛД/мл. Формировали 4 группы животных, как описано в примере 10.
В частном конкретном случае состав заявляемой композиции: СКЖ, содержащая метаболиты штамма ВКПМ№В-2335 бактерий Bacillus subtilis (1,6 мас.%), цеолит (43,7 мас.%), комплекс полисахаридов (53,2 мас.%), стеарат кальция (1,5 мас.%).
50
В ходе эксперимента установлено, что для повышения эффективности защиты при заражении сальмонеллезной инфекцией целесообразно назначать заявляемую композицию сочетанно с доксициклином, причем вводить ее до заражения (фиг.10а). В этом случае защитный эффект обеспечивается даже в условиях заражения возбудителем в дозе 1000 ЛД, то есть когда монотерапия с применением заявляемой композиции не эффективна, а эффект от антибактериального препарата снижается на 60%. При профилактическом назначении заявляемой композиции обеспечивается как непосредственное воздействие на патогенные микроорганизмы ее пробиотической составляющей, так и существенное активирование иммунокомпетентных клеток. В результате такого воздействия патогенные организмы теряют свою устойчивость, и антибактериальное средство проявляет более выраженное противоинфекционное действие.
Назначение обоих средств после заражения по лечебной схеме также более эффективно, чем монотерапия атибиотиком (фиг.10б).
Подтверждены результаты, полученные в условиях заражения сибиреязвенной инфекцией, которые показали целесообразность сочетанного назначения заявляемой композиции и антибиотика также и при заражении генерализованной сальмонеллезной инфекцией.
90
137
Таким образом, совокупность полученных экспериментальных данных свидетельствует о достижении цели изобретения - создании композиции для эффективной патогенетической профилактики и лечения опасных инфекционных заболеваний, существенно активирующей механизмы противобактериальной защиты и интерфероногенез (ключевой механизм противовирусной защиты) и универсальной в отношении инфекций бактериальной и вирусной этиологии при пероральном введении как при монотерапии, так и при сочетанием назначении с базовыми этиотропными средствами. Заявляемая композиция безопасна, так как содержание в ней токсикантов (хлорорганические пестициды ГХЦТ и ДЦТ), а также опасных для здоровья веществ (свинец, кадмий, ртуть, мышьяк) и радионуклидов (Sr и Cs) не превышает допустимые уровни, и она не обладает острой токсичностью. Гарантированный срок хранения заявляемой композиции составляет не менее 2 лет при температуре не выше 40°С и при хранении не требуется использование специального оборудования.
Заявляемое изобретение удовлетворяет критерию «новизна», так как впервые для профилактики и лечения опасных инфекционных заболеваний предложено использовать композицию, предусматривающую комплексное воздействие метаболитов пробиотических микроорганизмов и продуктов ферментативного гидролиза полимеров внутреннего и внешнего слоев клеточной оболочки пивных дрожжей с иммуномодулирующей активностью, отличающуюся высокой специфической эффективностью и универсальностью в отношении инфекций бактериальной и вирусной природы.
Заявляемое изобретение удовлетворяет критерию «изобретательский уровень», так как из доступных источников информации не является очевидным целесообразность комплексного использования метаболитов пробиотических микроорганизмов и продуктов ферментолиза клеточной оболочки пивных дрожжей (β-глюкана и маннана) в составе заявляемой композиции, а также оптимальное их содержание для обеспечения высокоэффективной противоинфекционной защиты.
Соответствие заявляемого изобретения критерию «пригодность для применения» подтверждается приведенными примерами, показавшими достаточно простую технологию получения твердой лекарственной формы заявляемой композиции в виде порошка, ингредиенты которой недороги, выпускаются отечественной промышленностью и доступны, и результатами многочисленных исследований, подтвердивших ее безопасность и стабильность при хранении в течение 2 лет без использования специального оборудования, а также наличие иммунотропных эффектов, интерфероногенных свойств и высокой противоинфекционной эффективности, свидетельствующих о том, что заявляемая композиция найдет широкое применение в клинической практике при профилактике и лечении опасных инфекций как бактериальной, так и вирусной этиологии в случае введения по схеме монотерапии или при сочетанием назначении с традиционно применяемыми базовыми препаратами.
Список литературы
1. Руководство по военной микробиологии / Под общ. ред. П.И.Мельниченко [и др.]. - М.: Военное издательство, 2005. - 511 с.
2. Руководство по организации и проведению санитарно-противоэпидемических (профилактических) и лечебно-эвакуационных мероприятий в войсках (силах) в условиях применения противником биологического оружия. - М.: Военное издательство, 2003. -176 с.
3. Den biologiske trussel og det biologiske beredskab i Danmark / E.D.Heegaard [et al.] // Ugeskr. Laeger. - 2005. - Vol.167, №36. - P.3381-3384.
4. Спирин А.С. Современная биология и биологическая безопасность / А.С.Спирин // Человек. - 1998. - №5. - С.5-11.
5. CBR Threats: A case study / K.Cuneo [et al.] // Crisis Res. J. - 2005. - Vol.1, №3. - P.50-52.
6. Public Health Assessment of Potential Biological Terrorism Agents / L.D.Ron [et al.] // Emerging Infectious Diseases. - 2002. - Vol.8, №2. - P.18-24.
7. VienPoint: Terrorism and dispelling the myth of a panic prone public / B.Sheppard [et al.] // J.Public Health Policy. - 2006. - Vol.27, №3. - P.219-245.
8. Novel flavivirus or new lineage of West Nile virus, central Europe / T.Bakonyi [et al.] // Emerg. Infec. Disease. - 2005. - Vol.11, №2. - P.225-231.
9. Биотерроризм: национальная и глобальная угроза / Г.Г.Онищенко и др. // Вестн. Рос. Акад. Наук. - 2003. - Т.73, №3. - С.194-204.
10. Онищенко Г.Г. Инфекционные болезни - важнейший фактор биоопасности. // Эпид. и инфекц. бол. - 2003. - №3. - С.4-16.
11. Лобзин Ю.В., Волжанин В.М., Захаренко С.М. Проблема инфекции в современной клинической медицине // Врач. - 2004. - №2. - С.5-9.
12. Покровский В.И., Онищенко Г.Г., Черкасский Б.Л. Актуальные направления совершенствования профилактики инфекционных болезней // Эпидемиол. и инфекц. болезни. - 2000. - №1. - С.4-8.
13. Малеев В.В. Проблемы и перспективы патогенетической терапии инфекционных болезней // Эпидемиол. и инфекц. болезни. - 2002. - №1. - С. 4-8.
14. Иммунология инфекционного процесса / Под ред. В.И.Покровского, С.П. Гордиенко, В.И. Литвинова. - М.: Медицина, 1993. - 306 с.
15. Ярилин А.А Основы иммунологии / А.А. Ярилин - М.: Медицина, 1999. - 608 с.
16. Козлов В.К. Современная иммунотерапия при инфекционной патологии. Опыт клинического применения препарата «Ронколейкин»: Пособие для врачей / В.К.Козлов. - СПб.: СПбГУ, 2001. - 24 с.
17. Езепчук Ю.В. Патогенность как функция биомолекул / Ю.В.Езепчук. - М.: Медицина, 1985. - 236 с.
18. Исин Ж.М. Изменение активности метаболизма полиморфноядерных лейкоцитов и макрофагов первичного очага при экспериментальном заражении мышей возбудителем чумы / Ж.М.Исин // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1989. - №2. - С.235-238.
19. Иммунокоррекгоры: Руководство для врачей и провизоров / В.В.Юшков
[и др.]. - Екатеринбург: ООО «ИРА УТК», 2002. - 255 с.
20. Клиническая иммунология / Под ред. А.В.Караулова. - М.: Медицинское информационное агентство, 1999. - 606 с.
21. Сибиряк С.В., Садыков Р.Ф., Магазов Р.Ш., Сергеева С.А. Иммуномодуляторы: справочник для практических врачей. - Уфа: ГУП «Иммунопрепарат», 1999. - 145 с.
22. Марченко Л.А. Генитальный герпес у женщин (клиника, диагностика, лечение) / Л.А.Марченко// Эпид. и инфекц. бол. - 1996. - №2. - С.53-71.
23. Shigeta S. Antiviral activities of ribavirin 5-ethynyl-1-B-D-ribofuranosilimidazole-4-carboxamide, and 3-(R)-6-C-methylneplanocin a ageinst several ortho- and paromyxoviruses/ S.Shigeta [et al.] // Antimicrob. Agents and Chemother. - 1992. - Vol.36, №2. - P.435-439.
24. Shafer R.W. Combination therapy with zidovudine and didanosine selects for AZT resistant HIV-1 strains laching a ddl resistance mutation / R.W.Shafer [et al.] // Clin. Infec. Dis. - 1993. - V.17, №3 - P.560-563.
25. Голубев С.Ю. Циклоферон в лечении герпетических поражений глаз / С.Ю.Голубев, М.Г.Романцов // III Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство», М. 16-20 апреля 1996 г.: Тез. докл. - М., 1996. - С.86.
26. Малашкин А.Б. Клиническая эффективность циклоферона у детей с повторными респираторными заболеваниями/ А.Б.Малашкин [и др.] // Клин. медицина и региональное здравоохр. - Калининград, 1995. - С.40-41.
27. Тазулахова Э.Б. Иммунологически перспективные индукторы интерферона / Э.Б.Тазулахова // Materia Medica. - 1996. - №2. - С.45-52.
28. Наровлянский А.К. Новые перспективные противовирусные препараты растительного происхождения (кагоцел, рагосин, саврац)/ А.К.Наровлянский [и др.] // II Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство», М., 10-15 апреля 1995 г.: Тез. докл. - М., 1995. - С.193.
29. Красильников И.И. Противовирусная активность некоторых ингибиторов АДФ-рибозилирования при экспериментальных альфа- и буньявирусных инфекциях / И.И.Красильников [и др.] // Вопр. вирусол. - 1994. - №2. - С.85-87.
30. Волгин А.Р. Научно-исторические аспекты развития химиопрофилактики и химиотерапии вирусных инфекций / А.Р.Волгин [и др.]. - М.: «Издательский дом «М-Вести», 2009. - 60 с.
31. Кузьмин М.Н., Шунько А.Н., Макаров М.В. Экстренная и специфическая профилактика в системе мер по защите войск и населения от биологического оружия, перспективы развития. Диагностика, лечение и профилактика инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария: Мат.научной конф. ЦВТП БЗ НИИ Микробиологии МО РФ, Екатеринбург, 30 апреля-1 июня 1999. ЦВТПБЗ НИИМ МО РФ. - 1999. - С.117-118.
32. Противодействие биологическому терроризму. Практическое руководство по противоэпидемическому обеспечению / Под ред. Академика РАМН проф. Г.Г.Огищенко. - М.. 2003. - С.301.
33. Рациональная антимикробная фармакотерапия: руководство для практических врачей / Под ред. В.П.Яковлева, С.В.Яковлева. М.: 2003. II: 1008.
34. Rushak J.M., Kortepeter M.G., Aldis J., Boudreau E. Experience in the medical management of potential laboratory exposures to agents of bioterrorism on the basis of risk assessment at the United States Army Medical Research Institute of Tnfletions Dislases (USAMRIID). J. Occup Environ Med. 2004:46:801-811.
35. Регистр лекарственных средств России. Энциклопедия лекарств. Ежегодный сборник. - М., РЛС. - Выпуск 9, 2002.
36. Регистр лекарственных средств России. Энциклопедия лекарств. Ежегодный сборник. - М., РЛС. - Выпуск 16, 2008.
37. Регистр лекарственных средств России. Энциклопедия лекарств. Ежегодный сборник. - М., РЛС. - Выпуск 17, 2009.
38. Ада Г., Рамсзай А. Вакцины, вакцинация и иммунный ответ. - М., 2002.
39. Воробейчиков Е.В., Василенко А.Ж., Синица А.В и др. Методологические аспекты применения пробиотиков и антибиотиков для экстренной профилактики инфекционных заболеваний // Сб. научи, тр. III съезда общества биотехнологов России им. Ю.А.Овчинникова. - М: МаксПресс, 2005. - С.35-36.
40. Малик Н.И., Панин А.Н. Ветеринарные пробиотические препараты. Ветеринария 2001; 1:46-51.
41. Ткаченко Е.И., Авалуева Е.Б., Успенский Ю.П. и др. Эрадикационная терапия, включающая пробиотики: консенсус эффективности и безопасности // Клиническое питание, 2005. - №1. - С.14-20.
42. RU 2287335 C1, 20.11.2006.
43. Волков М.Ю. Новый пробиотик Бактистатин - продукт современных биотехнологий // Сб. науч. тр. II Междунар. научно-практ. конф. МЕДБИОТЕК «Перспективы развития биотехнологии в России». - Пущино: МаксПресс, 2005. - С.21-22.
44. Лазарева Д.Н., Алехин Е.К. Стимуляторы иммунитета. М: Медицина, 1985.
45. Волков М.Ю., Тухбатов И.А. Влияние нового пробиотика на обменные процессы и показатели иммунитета // Нива Урала, 2006. - №7. - С.14-15.
46. Маннапов А.Н., Панин А.Г., Ахмадиев P.P. Естественный микробиоценоз кишечника хомячков в онтогенезе и при коррекции пробиотиком, препаратами «Микровитам», «Ферран» и цеолитом // Матер, междунар. конф. «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания». - М., 2004. - С.146.
47. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Микрофлора человека и животных и ее функция. - М.: Грантъ, 1998. - 288 с.
48. Ткаченко Е.И., Успенский Ю.П. Питание, микробиоценоз и интеллект человека. - М., 2006. - 590 с.
49. Минушкин О.Н., Ардацкая М.Д., Сергеев А.В., Волков М.Ю., Синица А.В. Опыт применения пробиотика «Бактистатин» в терапии хронического панкреатита // Фармация. - 2006. - №3. - С.39-43.
50. Ткаченко Е.И., Успенский Ю.П., Баскович Г.А., Белоусова Л.Н., Льнявина В.М., Барышникова Н.В., Петренко В.В. Клинические возможности пробиотической терапии в коррекции нарушений липидного обмена у больных ишемической болезнью сердца // Клиническое питание. - 2006. - №1-2. - С.25-30.
51. Волков М.Ю., Воробейчиков Е.В., Добрынин В.М. и др. Перспективы применения пробиотиков при особо опасных инфекциях // Клиническое питание. - 2006. - №1-2. - С.38-39.
52. Садовой Н.В., Литусов Н.В., Поберий И.А. Перспективы использования эубиотиков в системе региональной защиты населения от чрезвычайных ситуаций природного и техногенного характера // Сб. матер. регион. науч. - практ. конф. «Совершенствование защиты населения и территорий от чрезвычайных ситуаций природного и техногенного характера в условиях Уральского региона. Особенности, проблемы, пути решения». - Екатеринбург, 1998. - С.83-84.
53. Рыжко И.В., Кругликов В.Д., Цураева Р.И. и др. Перспективы применения пробиотиков в профилактике и лечении холеры // Эпидемиолог. и инфек. болезни. - 2000. - №4. - С.55-56.
54. Авраменко В.А., Василевский В.А. Новые сорбенты на основе модифицированных цеолитов и их применение в экологии, сельском хозяйстве и медицине // Цеолиты Приморья. Тезисы докладов научно-практической конференции. Владивосток, 1994. - С.16-19.
55. Паничев A.M., Гульков А.Н. Природные минералы и причинная медицина будущего. Владивосток: Издательство ДВГТУ, 2001, - 216 с.
56. Пылев Л.Н., Васильева Л.А., Валамина И.Е. Анализ биологической агрессивности цеолитов различных месторождений РФ // Природные минералы на службе человека. Материалы научно-практической конференции. Новосибирск, 1999. - С.68-70.
57. ТУ 9197-033-16925875-03 «Цеолит природный - сырье для производства биологически активных добавок к пище».
58. Пылев Л.Н. Заключение Комиссии по канцерогенным факторам при МЗ РФ, 1998.
59. ТУ 6-09-4233-76 «Кальций стеариновокислый, 1-водный (кальций стеарат)».
60. ГОСТ 14922-77 «Аэросил. Технические условия».
61. Гланц Э. Медико-биологическая статистика. М., 1999.
62. ГОСТ 12.1.007. Вредные вещества. Классификация и общие требования к безопасности. М., 2000.
63. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М., 2000.