Геномная инженерия представителей рода Nepeta L . In situ и in vitro

БИОТЕХНОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ

ГЕНОМНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА NEPETA L.

IN SITU И IN VITRO

В.Д. РАБОТЯГОВ, доктор биологических наук;

И В. МИТРОФАНОВА, доктор биологических наук; Ю.В. АКСЁНОВ Никитский ботанический сад - Национальный научный центр

Введение

Из года в год растет интерес к проблеме рационального использования растительных ресурсов. Большие возможности открывает использование эфирномасличных растений как источника биологически активных соединений, необходимых для медицины, парфюмерно-косметической и пищевой промышленности. С каждым годом увеличивается спрос на эфирные масла с цветочным, цитральным, эвгенольным и другими запахами [6, 8, 9].

Решение данной проблемы заключается в изыскании, привлечении и глубоком изучении биологии и биохимии ароматических растений, содержащих ценные эфирные масла. Наиболее интересными в данном вопросе являются представители рода Nepeta L. Котовник известен как пряно-ароматическое, лекарственное и эфирномасличное растение [5, 8]. Эфирное масло котовников имеет высокую антимикробную активность, применяется в качестве фунгицида для борьбы с плесневыми грибами. В последнее время масло котовника используется во многих странах мира в медицине и парфюмерно-косметической промышленности, в связи, с чем этому растению уделяется особое внимание [8, 9].

В Никитском ботаническом саду проводятся селекционные работы по получению новых сортов сельскохозяйственных культур методами отдаленной гибридизации, экспериментальной полиплодии, культуры органов, тканей и клеток [3, 6, 10, 14]. Показаны результаты селекции при правильном подборе родительских пар по созданию новых высокопродуктивных и устойчивых к неблагоприятным факторам среды сортов.

Целью настоящей работы было создание сложных межвидовых гибридов с заданными признаками путем комбинирования геномов исходных видов котовника для получения высокопродуктивных сортов, дальнейшего их введения в условия in vitro и разработки биотехнологических приемов клонального микроразмножения.

Объекты и методы исследования

Материалом для исследования служили образцы трех видов котовника: Nepeta cataria Beck., Nepeta transcaucasica Grosen и Nepeta grandiflora L. Полиплоиды получали действием водного раствора колхицина (0,1%) на проростки семян. Межвидовую гибридизацию проводили по общепринятым методикам, а также по методике, разработанной в отделе новых ароматических и лекарственных культур [1, 9, 11]. Эфирное масло получали из надземной части растений, собранной в период массового цветения. Массовую долю эфирного масла определяли методом гидродистилляции на аппаратах Клевенджера [2]. Компонентный состав эфирного масла исследовали на хроматографе Agilent Technology 6890N c масс-спектрометрическим детектором 5973N. Условия анализа: хроматографическая колонка кварцевая, капиллярная HP5MS. Температура испарителя - 250°С. Газ-носитель - гелий. Скорость газа носителя 1 мл/мин. Ввод пробы с делением потока 1/50. Температура термоса - 50°С с программированием 3 мин до 220°С. Температура детектора - 250°С. Индексы удерживания компонентов рассчитывали по результатам контрольных анализов эфирных масел с набором нормальных алканов [12].

Микропобеги полученных полиплоидных форм вводили в условия in vitro. В процессе работы придерживались как общепринятых методов асептики, так и методов, разработанных в отделе биотехнологии НБС-ННЦ [4, 7]. Вычленение эксплантов и их пассаж проводили в ламинарных боксах марки Fotran Lf и БП-4-004. Экспланты, помещенные в пробирки и колбы, выращивали на модифицированной питательной среде МС [13] в культуральной комнате, где поддерживалась постоянная температура 23±1°С, 16-часовой фотопериод, интенсивность освещенния 0,5-3 клк и 70-80%-ная относительная влажность воздуха.

Результаты и обсуждение

В условиях Южного берега Крыма все интродуцированные виды проходят полный цикл развития, обильно цветут и плодоносят. Цитогенетический анализ показал, что вид N. grandiflora имеет соматическое число хромосом 2n=4x=36 и является аутотетраплоидом. Для вида N. cataria v. citriodora характерно основное число хромосом 2n=4x=36. Вид N. transcaucasica -2n=2x=18 хромосом. Таким образом, первые два вида являются аутотетраплоидами, а котовник закавказский содержит диплоидное число хромосом.

Изучение содержания эфирного масла у исследуемых видов показало, что массовая доля эфирного масла варьирует в пределах от 0,24 до 0,42% на сырую массу сырья или от 0,82 до 1,56% на абсолютно сухую массу. Наибольшая массовая доля эфирного масла отмечена у котовника лимонного, наименьшая - у котовника крупноцветкового. Эфирное масло котовников является ценным сырьем для парфюмерии и содержит следующие компоненты: нерол, нераль, гераниол, гераниаль, цитронеллол и непеталактоны. Лучшим по качеству и содержанию эфирного масла оказался N. cataria, а по урожайности - N. grandiflora.

Известно, что при направленном скрещивании возникает новая генотипическая изменчивость, которая служит источником отбора новых комбинаций признаков и широко используеться в селекции растений. Однако размах генетической изменчивости возрастает еще больше, если взаимодействие генов происходит на разных уровнях плоидности [1]. Поэтому экспериментальная полиплоидия и направленная межвидовая гибридизация дивергентных особей представляет собой один из богатейших источников создания новой генетической изменчивости для нужд селекции котовника. Учитывая вышесказанное, нами путем колхицинирования синтетически созданы автотетраплоиды N. transcaucasica (2n=4x=36). При скрещивании N. transcaucasica х N. grandiflora получен аллотриплоид. Межвидовой гибрид имеет 2n=3x=27 хромосом, т.е. в его образовании участвовали сбалансированные 9-хромосомные гаметы котовника закавказского и 18-хромосомные гаметы котовника крупноцветкового. Гибрид включает один геном первого вида и два генома второго вида (рис. 1).

N. transcaucasica (TT) 2n = 2x = 18

1

N. grandiflora (GGGG) 2n = 4x = 36

Аллотриплоид (TGG, 2n = 27) полиплоидизация

1

N. transcaucasica (TTTT) 2n = 4x = 36

x N. grandiflora (GGGG) 2n = 4x = 36

Амфидиплоид

2n = 4x = 36

1

Аллотетраплоид~

x

Рис. 1. Схема межвидовых скрещиваний исходных форм N. cataría, N. transcaucasica и N. grandiflora с дальнейшей полиплоидизацией и скрещиванием синтетических амфидиплоидов

Скрещивание индуцированного автотетраплоида N. transcaucasica х N. grandiflora позволило создать амфидиплоид с двумя геномами котовника закавказского и двумя геномами котовника крупноцветкового. Гибрид - 2n=4x=36 хромосом, в его образовании участвовали сбалансированные 18-хромосомные гаметы как одного, так и другого вида (рис. 1). Амфидиплоид является фертильным и образует семена от свободного опыления. Гибрид отличается мощным габитусом, крупными листьями и соцветиями.

С целью создания нового ароматического растения, совмещающего высокую урожайность с повышенным содержанием эфирного масла и ценных компонентов, проведены скрещивания трех

видов котовника. Для скрещивания были использованы лучшее хемотипы котовника закавказского, крупноцветкового и лимонного (рис. 1).

Скрещивание сложного индуцированного амфидиплоида между двумя видами котовника (геномная формула TTGG) с видом N. cataria (гаметы СС - 18-хромосомные) позволило синтезировать гибриды F1 с участием трех видов (геномная формула TGCC 2n=45). Цитологический анализ гибрида показал, что он имеет 2n=45, т.е. в его образовании участвовали сбалансированные 18-хромосомные гаметы котовника кошачьего и по одному геному котовника закавказского (Т) и крупноцветкового (геном G). Уникальный трехвидовой гибрид оказался высокопродуктивным, с большим выходом эфирного масла (1,78% на сухую массу сырья) и интересным компонентным составом эфирного масла: нерол - 20%, нераль - 32%, гераниол -15,4%, гераниаль - 7,2% и геранилацетат - 10,5%, но с недоразвитой женской сферой, что не позволяет его размножать семенами. В обратной комбинации скрещивания N. cataria (геномная форма СССС) х аллотетраплоид (TTGG) удалось синтезировать трехвидовой гибрид (геномная формула CCTTGG, 2n=54). Число хромосом у гибрида 2п=6х=54, т.е. в его образовании участвовали сбалансированные 18-хромосомные гаметы котовника лимонного (СС), закавказского (ТТ) и крупноцветкового (GG). Следует отметить, что у сложных трехвидовых гибридов котовника (аллогексаплоида) продуцируются наряду с нормальными и неполноценные семена с низкой энергией прорастания. Среди аллогексаплоидов выделены формы с оригинальным компонентным составом эфирного масла: нерол - 61,2%, гераниол - 23,4%, гераниаль - 9,5%. Однако большинство гибридов имело высокую массовую долю непеталактонов (до 90%) в эфирном масле, что отрицательно сказывается на его качестве.

Нашими исследованиями установлено, что очень часто при отдаленной гибридизации эфирномасличных и лекарственных растений сложные синтетические гибриды формируют неполноценные семена, что препятствует внедрению их в производство. Однако вышеприведенные примеры показывают, что при отдаленной гибридизации получаются уникальные гибриды с ценными признаками, но с недоразвитыми зародышами.

Применение методов культуры органов и тканей позволяет получать полноценные проростки. Для межвидовых гибридов, характеризующихся недоразвитием мужской и женской сферы, особое значение имеет также клональное микроразмножение. Огромным преимуществом является то, что с помощью биотехнологических методов можно получить здоровый растительный материал, свободный от вирусной, бактериальной и грибной инфекции. В культуре in vitro открывается также возможность получения растений F2 из гибридных зародышей для отбора форм с высоким содержанием биологически активных веществ.

Нами разработан способ клонального микроразмножения видов и сложных гибридов котовника. Способ включает пять последовательных этапов:

1) отбор донорных растений на коллекционных участках НБС-ННЦ - май-июнь (частота регенерации - 80%);

2) ступенчатая стершизация растительного материала (1%-ный раствор Thimerosal - 1520 мин —» 70%-ный С2Н5ОН - 1 мин —> 0,08%-ный раствор AgN03 - 2-3 мин с добавлением 1-2 капель детергента Tween-80 и последующей 3-4-кратной промывкой в стерильной дистиллированной воде). При этом режиме стерилизации получено от 70-80% растительного материала, свободного от контаминации;

3) вычленение эксплантов и введение их в условия in vitro (вегетативные почки, междоузлия культивировали на модифицированной питательной среде МС, дополненной 3,19-4,56 мкМ зеатина, 0,89 мкМ ИМК; частота регенерации составила - 85%; начало побегообразования на 12-14 сутки культивирования);

4) собственно микроразмножение - 2 типа: а) культура вегетативных почек с последующим побегообразованием и микрочеренкованием. Микрочеренкование и получение множественных микропобегов проводили на среде МС с половинным содержанием нитрата аммония и нитрата калия, дополненной 2,28 мкМ зеатина и 0,49 мкМ ИМК. На этом этапе интенсивность освещения возрастала до 2,5-3 клк, а температура понижалась до 23°С; б) культура листовых дисков с последующим микрочеренкованием побегов, полученных в результате прямой регенерации. Листовые диски культивировали на среде МС, дополненной TDZ. Оптимальная концентрация TDZ составили 9 мкМ. Через 4 недели после введения эксплантов на питательную среду отмечено

массовое формирование адвентивных почек (12 шт/эксплант). Адаксиальное расположение эксплантов увеличивало частоту регенерации до 70%;

5) укоренение in vitro. Укоренение in vitro осуществляли на питательной среде МС, содержащей половинный набор макро- и микросолей. В среду добавляли ИМК в концентрации 2,46 мкМ. Культуральные сосуды выставляли на стеллажи с интенсивностью освещения 0,5-1 клк. Корни длиной 5-6 см формировались в течение 2-2,5 недель. Количество укорененных микропобегов котовника достигало 72%.

Выводы

Исследование 3 видов рода Nepeta L. показало, что при направленном скрещивании возникает новая, огромная по своим масштабам генотипическая изменчивость, которая служит источником отбора новых комбинаций признаков и широко используется в селекции эфирномасличных растений. Только использование межвидовой гибридизации и полиплоидии позволило создать уникальные сложные гибриды, обладающие комплексом биологически активных веществ, являющихся носителями нужных генов. После проведения генетически обоснованного подбора родительских пар по генам, контролирующим синтез терпеноидов, получены трехвидовые гибриды с соотношением геномов исходных видов (1:1:2; 1:2:1; 2:1:1; 2:2; 2:1) со следующей геномной формой (CCTG, TCCGG, TTGG, TGG, CCGG, CCTTGG) от исходных видов Nepeta. Созданы гибриды с цветочным, цитральным и розовым запахом эфирного масла. Разработаны биотехнологические приемы клонального микроразмножения видов и ценных гибридов котовника.

Список литературы

1. Бороевич С. Принципы и методы селекции растений. - М.: Колос. - 1984. - 344 с.

2. Горяев М., Плива И. Методы исследования эфирных масел. - Алма-Ата: Из-во АН Каз. ССР, 1961. - 752 с.

3. Здруйковская-Рихтер А.И. Культура изолированных зародышей и некоторые другие приемы выращивания растений in vitro: Методические рекомендации. - М., 1974. - 62 с.

4. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. - К.: Наукова думка, 1980. - 488 с.

5. Либусь О.К., Работягов В.Д., Кутько Л.А. Эфирномасличные и пряно-ароматические растения. - Херсон: Айлант, 2004. - 270 с.

6. Машанов В.И. Некоторые итоги и проблемы интродукции и селекции эфирно масличных растений // Труды ГНБС. - 1978. - Т. 75. - С. 5-27.

7. Митрофанова О.В., Логвиненко И.Е., Иванова Н.Н. Регенерация растений из изолированных органов и тканей Artemisia balchanorum Krasch. и Artemisia scoparia W. K. // Биотехнологические исследования садовых и других ценных многолетних культур: Сб. науч.трудов Никит.ботан.сад. - 1997. - Т. 119. - С. 143-153.

8. Новые эфирномасличные культуры / Машанов В.И., Андреева Н.Ф., Машанова Н.С., Логвиненко И.Е. - Симферополь: Таврия, 1988. - 160 с.

9. Работягов В.Д., Машанов В.И., Андреева Н.Ф. Интродукция эфирномасличных и пряно-ароматических растений. - Ялта, 1999. - 31 с.

10. Работягов В.Д. Аллотриплоидные формы в роде Lavandula L. // Цитолого-эмбриологические исследования высших растений: Сб.науч.трудов // Никит.ботан.сад. - 1992. - Т. 113. - С. 102-114.

11. Чувашина Н.П. Цитогенетика и селекция отдаленных гибридов и полиплоидов смородины. - Л.: Наука, 1980. - 121 с.

12. Jennings W., Shibamoto T. Qualitative analysis of flavor and fragrance volatites by glass capillary gas chromatography. - NewYork: Academk Press, 1980. - 380 p.

13. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - V. 15, N 4. - P. 473-497.

14. The effect of dinitroaniline and phosphorothiamidate herbicides on polyploidisation in vitro of Nepeta plants / Mitrofanova I.V., Zilbervarg I.R., Yemets A.I., Mitrofanova O.V., Blume Ya.B. // Cell Biology International. - 2003. - Vol. 27. - P. 229-231.

Рекомендовано к печати д.б.н., проф. Митрофановой О.В.