СПОСОБ ДЛИТЕЛЬНОГО ХРАНЕНИЯ ПРИХОТЛИВЫХ БАКТЕРИЙ В КОНСЕРВИРОВАННОЙ ЦЕЛЬНОЙ ДОНОРСКОЙ КРОВИ ПУТЕМ ЗАМОРАЖИВАНИЯ
LONG-TERM STORAGE METHOD OF FASTIDIOUS BACTERIA IN PRESERVED WHOLE DONOR BLOOD BY FREEZING

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для длительного хранения прихотливых бактерий, например, таких как Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis.
S. pneumoniae не растет на простых питательных средах. К средам необходимо добавлять кровь или нормальную сыворотку животных. А хранение культур пневмококка затруднено из-за склонности последнего к аутолизу. Для этого рекомендуют засевать культуру в пробирку со скошенным кровяным агаром, но не инкубировать в термостате, а хранить при температуре 4-7°C в холодильнике. В таком состоянии возможна и транспортировка культур. Для работы засеянную среду инкубируют при 37°C в течение суток [Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований: учебное пособие. Под ред. Лабинской А.С., Блинковой Л.П., Ещиной А.С. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005 г., - 600 с., стр.56].
N. meningitidis относится к труднокультивируемым бактериям, он требует питательных сред, содержащих продукты триптического расщепления белка (казеина, мяса, рыбы, сои) - аминокислоты, а также многочисленные ростовые факторы и витамины, поэтому к высокопитательным основам (жидким, агаровым) добавляют 20% нормальной лошадиной или бычьей сыворотки или 5% крови [Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований: учебное пособие. Под ред. Лабинской А.С., Блинковой Л.П., Ещиной А.С. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005 г., - 600 с., стр.64].
Бактерии рода Haemophilus почти все виды нуждаются в готовых факторах роста, присутствующих в крови (поэтому их называют гемоглобинофильными бактериями, или гемофилами), особенно в факторе X и/или V [Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований: учебное пособие. Под ред. Лабинской А.С., Блинковой Л.П., Ещиной А.С. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005 г., - 600 с., стр.173].
Поэтому необходим универсальный, доступный и качественный способ длительного хранения прихотливых бактерий, который можно использовать в лабораториях клинической микробиологии любого уровня и научно-исследовательских институтах для длительного хранения музейных штаммов и/или бактерий из клинического материала.
Ближайшим аналогом является способ хранения бактерий путем замораживания в стерильной дефибринированной крови кролика, описанный в «Определителе нетривиальных патогенных грамоотрицательных бактерий (аэробных и факультативно анаэробных). Пер. с англ. Р. Вейант, У. Мосс, Р. Уивер, Д. Холлис, Дж. Джордан, Э. Кук, М. Дейншвар. - М.: Мир, 1999. - 791 с., стр.56].
В известном способе:
1. Культуры для замораживания выращивают на скошенном агаре с экстрактом сердечной мышцы 18-24 часа или до появления роста.
2. После того как культура вырастет, бактерии суспендируют в 7-8 каплях стерильной дефибринированной крови кролика, которую вносят капиллярной пипеткой в пробирку со скошенным агаром с экстрактом сердечной мышцы.
3. Суспензию отсасывают капиллярной пипеткой и переносят в пробирку из полипропилена диаметром 10 мм (объемом 5 мл) с плотными крышками для замораживания, заполняя ее на 2/3 объема.
4. Пробирки с культурами маркируют, наклеивая на них полоску водостойкой липкой ленты, на которой отпечатано название или номер культуры, и помещают в коробку из водостойкой фанеры толщиной 9 мм, с внутренними размерами 37,5×15×7,5 см. На дно коробки помещают блоки 2,5×1,5×37,5 см из полимерного материала с лунками диаметром 9 мм. Диаметр лунок должен быть немного меньше диаметра пробирок.
5. Пробирки с культурами замораживают, помещая в камеру глубокой заморозки, при температуре ниже -40°C.
6. Для высева замороженной культуры пробирки вращают, держа большим и указательным пальцами на уровне мениска крови, пока небольшая часть культуры не оттает. Затем отбирают одну каплю культуры пастеровской пипеткой и засевают на соответствующую среду.
7. Пробирку с замороженной культурой вновь помещают в морозильную камеру, чтобы она не оттаивала дальше.
Признаки, общие с ближайшим аналогом: 1) использование пробирок из полипропилена; 2) для замораживания используется 18-24-часовая культура.
2
2
Отличительные: 1) используется стерильная консервированная донорская человеческая цельная кровь, содержащая гемоконсервант ЦФДА-1; 2) культуры замораживаются в морозильной камере холодильника при -20°C; 3) культуры для замораживания выращивают на соответствующих питательных средах. Так, например, для S. pneumoniae, N. meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Moraxella catarrhalis использовали питательную среду для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств бактерий из клинического материала - кровяно-сывороточный агар - с инкубацией в обычной атмосфере для пневмококка и в СО-инкубаторе для N. meningitidis и N. gonorrhoeae; Н. influenzae - шоколадный агар с инкубацией в СО-инкубаторе; Bordetella pertussis на казеиново-угольный агар. На эти же среды делается высев при необходимости разморозить культуры.
Технический результат заключается в обеспечении выживаемости и возобновления культивирования при использовании доступных компонентов без дефицитных препаратов для лабораторий клинической микробиологии любого уровня.
2
2
Заявляется способ длительного хранения прихотливых бактерий, в частности, таких как Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, в консервированной крови путем замораживания, с использованием 18-24-часовой культуры, в стерильных пробирках из полипропилена с плотными крышками, отличающийся тем, что используют стерильную консервированную донорскую человеческую цельную кровь, содержащую гемоконсервант ЦФДА-1, культуры замораживают в морозильной камере холодильника при -20°C, культуры для замораживания выращивают на соответствующих питательных средах: для S. pneumoniae, N. meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Moraxella catarrhalis используют питательную среду для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств бактерий из клинического материала - кровяно-сывороточный агар - с инкубацией в обычной атмосфере для пневмококка и в CO-инкубаторе для N. meningitidis и N. gonorrhoeae; для Н. influenzae используют шоколадный агар с инкубацией в СО-инкубаторе; Bordetella pertussis на казеиново-угольный агар, на эти же среды делают высев при необходимости разморозить культуры.
Для предлагаемого способа используются:
1) Стерильная консервированная донорская человеческая цельная кровь, которая содержит 63 мл раствора гемоконсерванта ЦФДА-1 для взятия 450 мл крови человека. Каждые 100 мл раствора ЦФДА-1 содержат: натрия цитрат (дигидрат) - 2,630 г.; лимонная кислота (моногидрат) - 0,327 г.; натрия дигидрофосфат (дигидрат) - 0,231 г.; декстроза (безводная) - 2,900 г.; аденин - 0,0275 г.; вода для инъекций quantum satis (с латыни означает сколько нужно). Стерильная консервированная донорская человеческая цельная кровь хранится в холодильнике при температуре 4±2°C до 6 месяцев. А стерильная дефибринированная кровь кролика или другого животного является дорогим дефицитным препаратом и почти не доступна для практических лабораторий клинической микробиологии.
2
2) Пробирки типа Eppendorf 1,5 мл из полипропилена с открытыми крышками, завернутые в крафт-бумагу по 4 штуки в упаковке, стерилизуют автоклавированием при 120°C (1,1 кг/см [ОСТ 42-21-2-85. «Стерилизация и дезинфекция изделий медицинского назначения. Методы, средства и режимы», стр.9) 45 минут. Срок хранения стерильных пробирок типа Eppendorf трое суток.
Способ осуществляется следующим образом.
1. Культуры для длительного хранения путем замораживания в стерильной консервированной донорской человеческой цельной крови, содержащей гемоконсервант ЦФДА-1, выращивают на соответствующей питательной среде в необходимых условиях 18-24 часа.
2. В стерильные пробирки типа Eppendorf 1,5 мл из полипропилена с плотными крышками (такие пробирки устойчивы к резким перепадам температуры, которым они подвергаются, и выдерживают автоклавирование) наливают с помощью пипетки в условиях бокса или в ламинарном шкафу 2 класса биологической защиты по 1 мл стерильной консервированной донорской человеческой цельной крови.
3. Затем полную бактериологическую петлю диаметром 1 мм бактерии суспендируют в стерильной консервированной донорской человеческой цельной крови, содержащей гемоконсервант ЦФДА-1, разлитой в пробирки типа Eppendorf.
4. Пробирки типа Eppendorf с культурами маркируют, наклеивая на них полоску лейкопластыря, на которой нанесено простым карандашом название или номер культуры (данная маркировка не стирается от влаги).
5. Пробирки типа Eppendorf с культурой замораживают, помещая их предварительно в штатив для эппендорфов и затем в морозильную камеру холодильника при -20°C (такие бытовые холодильники имеются в лабораториях клинической микробиологии любого уровня).
6. Для высева замороженной культуры пробирки типа Eppendorf размораживают при комнатной температуре до полного оттаивания.
7. Затем в условиях бокса или в ламинарном шкафу 2 класса биологической защиты по 0,1 мл культуры высевают дозатором на соответствующую среду. Культуру распределяют равномерно по среде с помощью шпателя и инкубируют при необходимых условиях 18-24 часа.
Было протестировано хранение предлагаемым способом музейных тест-штаммов. Результаты представлены в Таблице 1.
Таблица 1
Результаты хранения музейных тест-штаммов в стерильной консервированной донорской человеческой цельной крови путем замораживания
Музейный тест-штамм<sup>1</sup>
Время, через которое проводился высев от момента замораживания
1 месяц
3 месяца
6 месяцев
1 год
S. pneumoniae АТСС 49619
есть рост
есть рост
есть рост
есть рост
Н. influenzae АТСС 49247
есть рост
есть рост
есть рост
есть рост
Н. influenzae АТСС 49766
есть рост
есть рост
есть рост
есть рост
N. meningitidis АТСС 6250
есть рост
есть рост
есть рост
есть рост
Neisseria gonorrhoeae АТСС 49226
есть рост
есть рост
есть рост
есть рост
Streptococcus pyogenes АТСС 4543
есть рост
есть рост
есть рост
есть рост
Streptococcus agalactiae АТСС 27591
есть рост
есть рост
есть рост
есть рост
Moraxella catarrhalis АТСС 8176
есть рост
есть рост
есть рост
есть рост
Bordetella pertussis ATCC 8467
есть рост
есть рост
есть рост
есть рост
Staphylococcus aureus 25923, NCDC, США<sup>2</sup>
есть рост
есть рост
есть рост
есть рост
Enterococcus faecalis ATCC 292122
есть рост
есть рост
есть рост
есть рост
E. coli 5172 (ATCC 11775)<sup>2</sup>
есть рост
есть рост
есть рост
есть рост
Shigella sonnei ATCC 9290<sup>2</sup>
есть рост
есть рост
есть рост
есть рост
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853<sup>2</sup>
есть рост
есть рост
есть рост
есть рост
1 - культуры для замораживания выращивали, и высев после размораживания производили на соответствующие питательные среды: S. pneumoniae, N. meningitidis, N. gonorrhoeae, S. aureus, S. pyogenes, S. agalactiae, M. catarrhalis на питательную среду для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств бактерий из клинического материала (кровяно-сывороточный агар); Н. influenzae на шоколадный агар; Е. coli, S. sonnei, P. aeruginosa, Е. faecalis на кровяной агар; В. pertussis на казеиново-угольный агар.2 - культуры легко культивируемых (не прихотливых) микроорганизмов использовались для контроля применения способа.
Также авторы провели сравнительное исследование заявляемого способа длительного хранения прихотливых бактерий в консервированной цельной донорской крови путем замораживания и способа хранения бактерий путем замораживания в стерильной дефибринированной крови кролика для чего использовались музейные тест-штаммы, приведенные в таблице 1. Результаты исследований показали, что все примененные музейные тест-штаммы одинаково выживали и давали рост при высеве на соответствующие питательные среды через 1, 3, 6 месяцев и год от момента замораживания обоими способами. Но предлагаемый способ в условиях практической лаборатории клинической микробиологии является простым и доступным для лабораторий любого уровня, так как культуры замораживаются в морозильной камере холодильника при -20°C (бытовые холодильники), не используются дорогие дефицитные препараты: стерильная дефибринированная кровь кролика и скошенный агар с экстрактом сердечной мышцы для выращивания культуры перед замораживанием.