СПОСОБ НЕИНВАЗИВНОЙ ПРЕНАТАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ АНЕУПЛОИДИЙ ПЛОДА

1. Способ неинвазивной пренатальной диагностики анеуплоидий плода, включающий:
a. выделение внеклеточной ДНК (вкДНК) из образца крови, полученной у беременной женщины;
b. внесение к фрагментам вкДНК молекулярных меток, содержащих вырожденную последовательность нуклеотидов, универсальную последовательность и последовательность, комплементарную регионам генома вкДНК, характеризующимся открытостью хроматина между плацентой и клетками крови матери, отличающейся не менее чем на 20%,
c. полученные на этапе b) фрагменты вкДНК с внесенной молекулярной меткой амплифицируют с использованием праймеров, отжигающихся на универсальную последовательность молекулярных меток с одной стороны, и специфических праймеров, отжигающихся на регионы генома вкДНК, характеризующихся открытостью хроматина между плацентой и клетками крови матери, отличающейся не менее чем на 20%,
d. приготовление геномных библиотек из полученных на этапе с) ампликонов;
e. определение последовательности нуклеотидов полученных геномных библиотек;
f. картирование полученных последовательностей на референсный геном или части генома человека с определением их координат;
g. удаление ПЦР дупликатов из картированных последовательностей;
h. определение значения покрытия для каждого региона генома, характеризующегося открытостью хроматина между плацентой и клетками крови матери, отличающейся не менее чем на 20%;
i. корректировка полученного значения покрытия для каждого региона генома, полученного на этапе h, на общее покрытие генома, с последующим сравнением скорректированного значения покрытия со значениями покрытий или их распределений, полученных для обучающей выборки образцов крови беременных женщин при эуплоидии и анеуплоидий плода и определение принадлежности исследуемого образца к одной из данных групп, по которому делают вывод о наличии анеуплоидий плода.
2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что определение последовательности, комплементарной регионам генома вкДНК, характеризующимся открытостью хроматина между плацентой и клетками крови матери, отличающейся не менее чем на 20% (выбор регионов генома для проведения амплификации, перед приготовлением геномных библиотек), осуществляют из базы данных покрытий кандидатных регионов генома для образцов крови беременных женщин с эуплоидией и анеуплоидией, при этом вычисляют значимость отличия покрытия между образцами с эу- и анеуплоидией для каждого кандидатного региона, характеризующуюся значением р-value с учетом корректировки на общее покрытие образца, и выбирают из кандидатных регионов генома те регионы, которые характеризуются значением p-value не более 0,1.
3. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что определение принадлежности образца к группе с эуплоидией или анеуплоидией плода осуществляют следующим образом:
a. для каждого региона, характеризующегося открытостью хроматина между плацентой и клетками крови матери, отличающейся не менее чем на 20%, вычисляют p-value, которое определяет вероятность наблюдать полученное значение покрытия или более экстремальное значение при условии, что данное значение соответствует распределению покрытий для беременности без анеуплоидии, и p-value того, что его покрытие получено из распределения покрытий для беременности с анеуплоидией по данной хромосоме по БД покрытий кандидатных регионов генома для образцов крови беременных женщин с эуплоидией и анеуплоидией;
b. вычисляют произведение по всем регионам полученных значений p-value для вычисления p-value того, что значения покрытия регионов, характеризующихся открытостью хроматина между плацентой и клетками крови матери, отличающейся не менее чем на 20%, получены из распределения покрытий для беременности без анеуплоидии, и p-value того, что значения покрытия регионов получены из распределения покрытий для беременности с анеуплоидией по данной хромосоме;
c. по полученным произведениям p-value и априорным вероятностям наличия анеуплоидии у плода вычисляют по теореме Байеса вероятности наличия анеуплоидии или эуплоидии в исследуемом образце.
4. Способ по п. 3, характеризующийся тем, что вывод о наличии или отсутствии анеуплоидий плода делают, если вероятность для одного из вариантов диагноза не превышает порог значимости из интервала 0.01-0.1, а вероятность для другого варианта превышает порог значимости, при этом диагноз ставится по наибольшему значению вероятности, и в случае, если оба p-value выше или оба ниже порога значимости, диагноз не ставится.
5. Способ получения регионов генома, характеризующихся открытостью хроматина между плацентой и клетками крови матери, отличающейся не менее чем на 20%, для неинвазивной пренатальной диагностики анеуплоидий плода по п. 1 по вкДНК крови матери методом секвенирования, включающий
a. получение данных секвенирования вкДНК крови матери, чтобы все кандидатные регионы генома, характеризующиеся открытостью хроматина между плацентой и клетками крови матери и отличающиеся не менее чем на 20%, были прочитаны для образцов крови нескольких беременных женщин без анеуплоидий плода и нескольких беременных женщин с анеуплоидией плода по конкретной хромосоме;
b. картирование полученных чтений на референсный геном человека для определения их координат;
c. определение покрытия каждого кандидатного региона каждого полученного образца;
d. вычисление для каждого региона значимости отличия, характеризующейся значением p-value покрытия между образцами с плодом без анеуплоидий и образцами с анеуплоидией плода по конкретной хромосоме, с учетом корректировки на общее покрытие образца;
e. выбор из кандидатных регионов генома регионов, характеризующихся значением р-value не более 0,1.
6. Способ по п. 5, характеризующийся тем, что этап d осуществляют в предположении отрицательного биномиального распределения покрытия региона в образце, например, с использованием программного обеспечения для определения дифференциальной экспрессии РНК DESeq.
7. Способ по п. 5, характеризующийся тем, что для регионов, найденных в пункте d, аналогично пунктам b-е вычисляют покрытие прочтениями в образцах крови не менее 5 мужчин и для каждого региона определяют значимость, выражающуюся в виде p-value отличий между покрытием ДНК в образцах мужчин и беременных женщин с плодом без анеуплоидии, отбирают участки с p-value не более 0.1.