Эффективность точечной иммуноферментной реакции (дот-ИФА) в диагностике трихинеллеза и эхинококкоза

центральных эрготропных влиянии свидетельствует о переключении механизмов регуляции сердечного ритма с одного уровня на другоИ и об усилении экс-тракардиального управления СР при ортопереходе.

Список литературы

1. Баевский Р.М., Берсенева А.П. Оценка адаптационных возможностей организма и риск развития заболевании. М. «Медицина»,1997. 236 с.

2. Гиренко Л.А., Головин М.С., Колмогоров А.Б., Айзман Р.И. Влияние занятий лыжным спортом на морфофункциональные и психофизиологические показатели здоровья юношей // Вестник НГПУ, 2012. № 1. С. 33-41.

3. Ильницкий В.И. Объем и работоспособность сердца юных спортсменов в зависимости от направленности тренировочного процесса // Кардиология, 1982. № 6. С. 107-109.

4. Кылосов А.А. Динамика физической работоспособности, вариабельности ритма сердца, биохимических и гематологических показателей в течение годичного цикла подготовки у юных лыжников: авто-реф. дис. ... канд. биол. наук. Ярославль, 2009. 23 с.

5. Приходько В.И., Беляева И.М. Особенности функционального состояния сердечно-сосудистой системы юных пловцов, достигших высоких спортивных результатов // Теория и практика физической культуры, 1996. № 9. С. 2-5.

6. Спицин А.П., Шестопалова О.М. Особенности реакции сердечно-сосудистой системы на ор-тостатическую пробу в зависимости от исходного вегетативного тонуса // Паллиативная медицина и реабилитация, 2006. № 2. С. 34.

7. Шлык Н.И., Сапожникова Е.Н., Кириллова Т.Г., Семенов В.С. Типологические особенности функционального состояния регуляторных систем у школьников и юных спортсменов // Физиология человека. 2008. № 6. С. 1-9.

8. Шлык Н.И. Сердечный ритм и тип регуляции у детей, подростков и спортсменов: монография. Ижевск: Изд-во «Удмуртский университет», 2009. 255 с.

9. Шумихина И.И. Особенности вариабельности сердечного ритма и центральной гемодинамики у юных футболистов под влиянием тренировочного процесса: автореф. дис. .канд. биол. наук. Киров, 2005. 20 с.

10. Шумихина И.И., Шлык Н.И., Красноперова Т.В. Особенности вариабельности сердечного ритма у юных хоккеистов // XX Съезд физиологического общества им. И.П. Павлова: (Москва, 4-8 июня, 2007). Москва, 2007. С. 497.

Сведения об авторах

Ефремова Руфина Ильсуровна - аспирантка кафедры медико-биологических дисциплин Вятского государственного гуманитарного университета. E-mail: rufina_85@inbox.ru.

Спицин Анатолий Павлович - д.м.н., профессор, зав. кафедрой патофизиологии Кировской ГМА. E-mail: kf23@kirovgma.ru.

Воронина Галина Андреевна - к.б.н., доцент кафеДры медико-биологических диСциплин факультета физической культуры Вятского государственного гуманитарного университета.

УДК 619:616.995. Л.А. Написанова1, В.К. Бережко1, Т.Н. Сивкова2

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ТОЧЕЧНОЙ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ РЕАКЦИИ (ДОТ-ИФА) В ДИАГНОСТИКЕ ТРИХИНЕЛЛЕЗА И ЭХИНОКОККОЗА

'Всероссийский научно-исследовательский

институт фундаментальной и прикладной

паразитологии животных и растений им. К.И. Скрябина

L.A. Napisanovai, V.K. Berezhkoi, T.N. Sivkova2

EFFICIENCY OF DOT-ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (DOT-ELISA) FOR DIAGNOSTICS OF TRICHINELLOSIS AND CYSTIC ECHINOCOCCOSIS

'Russian Federation Research Institute of Fundamental and Applied Parasitology of Animals and Plants named after K.I. Skryabin

Трихинеллез и эхинококкоз являются одними из наиболее опасных гельминтозоонозов. Исследовали диагностическую эффективность разработанной нами тест-системы дот-ИФА при трихинеллезе и цистном эхинококкозе с сыворотками людей, а также свиней. При трихинеллезе чувствительность реакции в обоих случаях была 100%, специфичность - 95,7% и 95,1% соответственно. При эхино-коккозе показатели чувствительности составляли 84% и 73,1%, а специфичности - 88,4% и 72,5% соответственно.

Ключевые слова: зооноз, трихинеллез, цист-ный эхинококкоз, человек, животные.

Trichinellosis and echinococcosis are some of the most dangerous zoonoses. The test system dot-ELISA was investigateded for diagnostics of trichinellosis and cystic echinococcosis. Diagnostic efficiency of this method was investigated with human and swine serums. In trichinellosis the sensitivity of reaction in the both cases was 100%, specificity - 95,7% and 95,1 % respectively. In echinococcosis the indicators of sensitivity were 84% and 73,1%, specificity - 88,4% and 72,5% respectively.

Key words: zoonosis, trichinellosis, cystic echinococcosis, humans, animals.

Иммунодиагностика трихинеллеза и эхинокок-коза была и остается приоритетным направлением и необходимым важнейшим звеном совершенствования мер борьбы с этими широко распространенными зоонозами. Эффективной и достаточно широко применяемой в медицинской и ветеринарной практике при этих гельминтозах является диагностическая тест-система на основе иммуноферментной реакции (ИФА, ELISA) [1-8, 17]. Однако для проведения ши-

роких сероэпидемиологических и сероэпизоотоло-гических исследований, на наш взгляд, научный и практический интерес представляет разновидность твердофазной ИФР - точечная иммуноферментная реакция (дот-ИФА, иммунодот, dot-ELISA), которая осуществляется на разных полимерных мембранах. Принцип ее состоит в том, что образцы антигена или антител наносят на полимерный материал и после высушивания обрабатывают раствором балластного белка для блокирования оставшихся свободными сайтов связывания, затем проводят иммунное проявление и визуализацию образующегося комплекса антиген-антитело.

Метод достаточно широко используется в диагностике различных вирусных, бактериальных, грибковых и паразитарных заболеваний [11]. Причем, судя по имеющимся литературным источникам, дот-ИФА при гельминтозах чаще используется в медицинской практике в диагностике нейроцистицеркоза [16]; цистногогидатидоза [13]; трихинеллеза [9].

Преимущество этого метода перед другими иммуноферментными тестами заключается, прежде всего, в возможности проведения значительного количества анализов с меньшими объемами исследуемого образца, реактивов, иммунореагентов и, что немаловажно, времени проведения исследований. Антигены (или антитела) в дот-ИФА наносятся в микроколичествах на ограниченный участок полимерного листового материала, обладающего в 80-120 раз большей сорбционной емкостью, чем полистирол, поливинилхлорид, акрилекс и т.д., используемые в других твердофазных иммунотестах. С другой стороны, для проведения дот-ИФА можно обойтись без электрооборудования, что особенно привлекательно и удобно при проведении массовых серологических исследований в полевых условиях.

Цель исследования: изучить диагностическую эффективность дот-ИФА при трихинеллезе и эхино-коккозе.

Материалы и методы

Исследования при трихинеллезе проводили с 76 пробами сыворотки крови людей с известным гельминтологическим статусом, включающих 6 - с подтвержденной инвазией Trichinella spiralis; 5 - с хирургически подтвержденным диагнозом цистного и 1 - альвеолярного эхинококкоза; 6 - с инвазией Toxocara canis «larvamigrans» и 58 проб здоровых людей (доноры); также исследовано 156 проб сыворотки крови свиней, в том числе 6 - от естественно и

6 - от экспериментально инвазированных Т. spiralis;

7 - от экспериментально и 6 - от естественно зараженных Echinococcus granulosus; 5 - с естественной инвазией Cysticercus tenuicollis; 2 - с естественной инвазией Oesophagostomum dentatum и 124 пробы клинически здоровых животных. В исследованиях по эхинококкозу использовали 111 проб сыворотки крови людей, в том числе 25 проб - с подтвержденным хирургически диагнозом цистного эхинококко-за; 5 - с подтвержденной инвазией трихинеллеза; 5 - с ларвальной стадией токсокароза; 2 - цисти-церкоза (Cysticercus cellulosae) и 74 пробы доноров, а также с 219 пробами сыворотки крови свиней, включая 45 - с естественной и 7 - с экспериментальной инвазией Е. granulosus; 5 - с естественной

инвазией Cysticercus tenuicollis; 6 - Т. spiralis; 2 -Oesophagostomum dentatum и 154 пробы клинически здоровых животных.

Антигеном в реакции при трихинеллезе служили экскреторно-секреторные продукты культивируемых в питательной среде ДМЕМ личинок Т. spiralis [3], а при цистном эхинококкозе - клеточный антиген, представляющий собой метаболиты культивируемых в искусственной питательной среде RPMI-1640 клеток протосколексов Е. granulosus [5].

Постановку дот-ИФА осуществляли в непрямом варианте для выявления антител в сыворотке крови больных трихинеллезом и цистным эхинокок-козом людей, а также свиней с учетом рекомендаций Pappas [9]. В качестве твердофазного носителя использовали нитроцеллюлозные мембраны фирмы «Millipore» (США). Все манипуляции проводили с помощью анатомического пинцета, не касаясь их руками. Определение оптимальной концентрации каждого типа антигена и минимального диагностического титра проводили: с референс-сыворотками человека с подтвержденным диагнозом трихинеллеза или эхинококкоза, с сыворотками клинически здоровых доноров и пациентов с гетерологичной инвазией; с сыворотками свиней, экспериментально инвазиро-ванных Т. spiralis и Е. granulosus, клинически здоровых животных и животных с гетерологичной инвазией, путем последовательных двукратных разведений. Антигены разводили от 800 мкг/мл до 6,25 мкг/мл, сыворотки от 1:5 до 1:320. Результаты учитывали визуально. Сенсибилизацию мембран осуществляли при комнатной температуре, блокирование несвязав-шихся сайтов мембраны с антигеном из трихинелл проводили 2%-ным бычьим сывороточным альбумином (БСА), а с эхиноккоковым - 0,5%-ным раствором сухого обезжиренного молока в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), pH 7,2-7,4 в течение 20 часов при 4°С. Затем мембраны промывали 0,01М раствором ФСБ pH 7,2-7,4 с 0,05% содержанием твина-20 и 0,05% БСА. Сыворотки разводили ФСБ рН 7,2-7,4 с 0,05% твином-20 и 0,5-1,0% БСА в титре 1:10 и наносили в объеме 2 мкл/дот.

Инкубирование проводили при комнатной температуре (18-26°С) во влажной камере. Продолжительность инкубации при трихинеллезе - 40 мин., эхинококкозе - 1 час 20 мин. Отмывку мембран осуществляли трехкратно по 5 мин. ФСБ с 0,05% тви-на-20 и 0,05% БСА. Конъюгатом в реакции служили диагностические антитела против IgG сыворотки крови человека и сыворотки крови свиньи, меченные пероксидазой, которые разводили тем же раствором, что и сыворотки, предварительно установив титр для каждой новой серии. На заключительном этапе мембраны помещали в раствор субстратной смеси (3,3'-диаминобензидина в 0,5М растворе трис-HCI буфера, pH 7,4) на 10-15 минут. После проявления реакцию останавливали промыванием мембраны в водопроводной воде.

Для статистической обработки материала и построения диаграмм использован пакет программ Exсel 2013.

Результаты и обсуждение

Исследования по оценке диагностической эффективности дот-ИФА при трихинеллезе человека, представленные на диаграмме, убедительно свиде-

тельствуют о высокой чувствительности и специфичности теста. Все сыворотки больных трихинеллезом людей реагировали положительно. Ложноположи-тельный ответ регистрировали в 3 случаях, а именно в двух пробах из пяти - с диагнозом цистный эхино-коккоз и в одной из шести - с диагнозом токсокароз «larvamigrans». Таким образом, при 100%-ной чувствительности специфичность дот-ИФА составила 95,7%. Аналогичные испытания этой реакции, проведенные с сыворотками свиней, подтвердили высокую диагностическую эффективность этой реакции (диаграмма). Все 12 сывороток свиней с экспериментальной и естественной инвазией T. spiralis реагировали в дот-ИФА положительно, из 20 проб сыворотки с гетерологичной инвазией только 3 показали ложно-положительный результат. Причем все они были от свиней естественно (2 пробы) и экспериментально (1 проба) инвазированных Е. granulosus. Что касается сывороток от клинически здоровых животных, у которых при убое тканевых гельминтов не обнаружили, ложноположительный результат регистрировали только в 4 пробах из 124. Таким образом, в этом случае чувствительность иммунодота также составила 100%, а специфичность - 95,1%.

Диагностическая эффективность этого теста при цистном эхинококкозе людей была ниже, чем при трихинеллезе, однако вполне сопоставима с результатами исследований ИФА, проведенных при этом гельминтозе на полистироловых планшетах. Анализ полученных данных показал 4 ложноотрицательных ответа с сыворотками больных цистным эхинококко-зом, что повлияло на чувствительность иммунодота и снизило его показатели до 84,0% (диаграмма).

С сыворотками пациентов с гетерологичной инвазией и здоровых людей регистрировали в дот-ИФА 10 ложноположительных результатов, большинство из которых (9 проб) было из группы доноров и одна из 5 проб больных T. canis «larvamigrans». Исходя из этих показателей, специфичность теста составила 88,4% (диаграмма). Аналогичные исследования, проведенные с сыворотками свиней при экспериментальном и естественном цистном эхино-коккозе, показали 14 ложноотрицательных ответов, в основном (13 проб) из группы животных с естественной инвазией (диаграмма). Таким образом, чувствительность иммунодота в этом случае составила 73,1%.

В то же время из 167 проб сыворотки свиней, инвазированных другими гельминтами и клинически здоровых, ложноположительный ответ регистрировали в 46 пробах.

В большинстве случаев (41 проба) такой результат был получен в группе клинически здоровых животных, поскольку и число исследованных свиней в этой группе было значительно больше. Тем не менее, ложноположительная реакция была также зарегистрирована с сыворотками свиней естественно инвазированных трихинеллами и тенуикольными цистицерками.

С учетом этих показателей специфичность дот-ИФА при цистном эхинококкозе свиней составила 72,5%. Ложноположительные результаты, зарегистрированные между диагностическим антигеном из личинок трихинелл и сывороткой больных цист-

ным эхинококкозом людей и свиней, с одной стороны, могут быть следствием наличия общих белковых эпитопов у Т. spiralis и Е. granulosus, а с другой, могут быть спровоцированы различными заболеваниям печени, при которых ложнопозитивные ответы наблюдаются на антигены самых различных возбудителей. В то же время существенных различий в динамике титров специфических антител при экспериментальном трихинеллезе, определенных двумя иммунотестами - EL1SAи dot-ELISA, не отмечено [3, 5]. Эти данные позволили авторам сделать заключение в пользу dot-ELISA, как более простого и экономичного в исполнении при проведении се-роэпизоотологических исследований. Аналогичный вывод в отношении этого теста в диагностике трихинеллеза у свиней и проведении сероэпизоотоло-гических исследований был сделан Aguilar Figueroa B.R. et al. Ранее Tong et al., испытавшие dot-ELISA в диагностике цистицеркоза, трихинеллеза и токсо-плазмоза у людей, рекомендовали тест, как наиболее быстрый, практичный, высокочувствительный и специфичный для использования в лабораториях. Что касается цистного эхинококкоза, то, как правило, показатели иммунодиагностических тестов при этом гельминтозе в большинстве случаев ниже, чем при трихинеллезе. Однако, сравнивая результаты ELISAи dot-ELISA, исследователи отмечали высокую корреляцию результатов обоих тестов [5, 7, 8, 10-13]. В наших исследованиях наибольший процент ложноположительных ответов в дот-ИФА при цистном эхинококкозе регистрировали с сыворотками свиней, инвазированных С. tenuicollis. Специфичность реакции при этой инвазии не превышала 40%, что, безусловно, отразилось на общей специфичности теста при цистном эхинококкозе. Основной причиной в этом случае является близкое антигенное родство между этими паразитами, что доказано иммунохимическим анализом [15]. Достаточно большое количество ложноположительных результатов регистрировали также в группе клинически здоровых животных. Не исключено, что в этой группе могли быть свиньи с миграционной стадией эхинококкоза без наличия видимых паразитарных цист.

Эффективность дот-ИФА

Трихинеллез человека Чувствительность

Трихинеллез свиней

Эхинококкоз человека

Эхинококкоз свиней

Диаграмма. Чувствительность и специфичность дот-ИФА при трихинеллезе и эхинококкозе.

Заключение

Приведенные выше факторы, безусловно, сказываются на эффективности иммунотестов, но, тем не менее, полученные нами результаты при трихинеллезе и цистном эхинококкозе в дот-ИФА позволяют сделать заключение о преимуществе этого теста

при проведении массовых сероэпидемиологических и сероэпизоотологических исследований, поскольку он не уступает по эффективности другим иммуноте-стам, но более простой и экономичный в исполнении.

Список литературы

1. Белозеров С.Н., Жданова О.Б. // Ветеринария. 2000. № 2. С. 34-36.

2. Бережко В.К., Написанова Л.А., Успенский А.В., Шеховцов Н.В. // Материалы докл. 7-й науч. конф. по трихинеллезу человека и животных. М., 1996. С. 7-10.

3. Мартусевич А.К., Жданова О.Б., Хайдарова А.А., Бережко В.К., Написанова Л.А. Анализ физико-химических свойств антигенов некоторых гельминтов как технология паразитологической метаболоми-ки // Фундаментальные исследования. 2014. № 12-7. С. 1437-1441.

4. Мартусевич А.К., Жданова О.Б., Написанова Л.А. Биокристалломика в паразитологии: современное состояние, возможности и перспективы // Российский паразитологический журнал. 2012. № 4. С. 77-88.

5. Написанова Л.А., Бессонов А.С. // Ветеринария. 1999. № 3. С. 27-30.

6. Полетаева О.Г., Красовская Н.Н. //Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 1995. № 2. С. 33-35.

7. Сивкова Т.Н., Бережко В.К. // Ветеринария. 2002. № 10. С. 32-34.

8. Aquilar Figueroa B.R., Bautista-Garfias C.R., Rojas L.etal. //Rev. Latinoamer. de Microbiol. 2000. V. 42. P. 57-62.

9. Dzebenski T.H., Bitkowska E„ Plonka W. // Zentralblatt fur Bakteriologie. 1994. V. 281, № 4. P. 519-525.

10. Moosa R.A., Abdel-Hafez S.K. //Parasitol. Res. 1994. V 80, № 8. P. 664-671.

11. Pappas MG.//Vet. Parasitology. 1988. V 29. P. 105-129.

12. Sato C., Kawase S., Yano S.//Jpn. Infect. Dis. 1999 Aug; 52(4):156-9.

13. Swarna S.R., Parija S.C.//Rev. Inst. Med. Trop. San Paulo. 2008 Jul-Aug; 50(4):233-6.

14. Tong W.D., Guo S.J., Sun L.G. //Int. Conf. Parasitic Zoonosses, sept.20-24. 1994. Changchun. China. Abstracts. 1994. P. 138.

15. Valera-Diaz V.M., Coltorti E.A., RickardM.D., Torres J.M. //Res. Vet. SC. 1977. V2 3. № 2. P. 213-216.

16. Vaz A.J., Nakamura P.M., Camargo M.E., Camargo E.D., FerreiraA.W. //Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paulo. 1996. V. 36, № 6. P. 391-396.

17. Xiao N., Mamuti W., Yamasaki H. et al. Hi. Clin. Microbiol.2003. V 41, № 7. P. 3351-3353.

Сведения об авторах

Написанова Людмила Александровна - к.б.н., с.н.с. лаборатори и иммунодиагностики ФГБНУ «ВНИИП им. К.И. Скрябина». Тел. (495) 124-68-11.

Бережко Вера Кузьминична - д.б.н., профессор, зав. лабораторией иммунодиагностики ФГБНУ «ВНИИП им. К.И. Скрябина». Тел. (495) 124-68-11.

Сивкова Татьяна Николаевна - д.б.н., кафедра паразитологии и микробиологии Пермской ГСХА. E-mail: tatiana-sivkova@yandex.ru.

УДК 612.6:612.66

С.Б. Петров, А.Н. Токарев, Б.А. Петров, И.В. Попова

ВЗАИМОСВЯЗЬ ЖИЗНЕННОЙ

ЁМКОСТИ ЛЁГКИХ С ФИЗИЧЕСКИМ РАЗВИТИЕМ ДЕТЕЙ

Кировская государственная медицинская академия

S.B. Petrov, A.N. Tokarev, B.A. Petrov, I.V. Popova

INTERRELATION OF VITAL CAPACITY OF LUNGS AND PHYSICAL DEVELOPMENT IN CHILDREN

Kirov State Medical Academy

Проанализирована корреляционная зависимость между жизненной ёмкостью лёгких и физическим развитием детей. Анализ взаимосвязей жизненной ёмкости лёгких с антропометрическими и физиометрическими параметрами показал, что динамика изменения их силы отличалась у мальчиков и девочек. У мальчиков наблюдалось постепенное нарастание силы, у девочек уменьшение силы корреляционных связей жизненной ёмкости лёгких с показателями физического развития, что объясняется их разными массо-ростовыми показателями и различным гормональным статусом.

Ключевые слова: дети, корреляционная связь, жизненная ёмкость лёгких, антропометрические показатели, физиометрические показатели.

Correlation dependence between the vital capacity of lungs and physical development in children is analysed. The analysis of interrelations of vital capacity of lungs with anthropometric and physiometric parameters showed that dynamics of their force varied in boys and girls. In boys gradual increase of force was observed, while in girls the reduction of force in correlation with vital capacity of lungs indicated physical development. The results are explained by their different masso-growth indicators and various hormonal status.

Key words: children, correlation, vital lung capacity, anthropometric indicators, physiometric indicators.

Введение

Важным функциональным показателем, зависящим от пола, возраста, размеров тела, является величина жизненной ёмкости лёгких (ЖЕЛ). Нормативные величины ЖЕЛ получают при обработке результатов массовых обследований здоровых детей, при этом рекомендуется разрабатывать их нормативы для конкретных регионов, так как её показатели находятся в зависимости от многих факторов, в том числе и от климато-географической зоны места проживания. Большинство авторов отмечают, что в настоящее время у детей имеет место снижение показателей ЖЕЛ, что свидетельствует о трофологической недостаточности и вероятном увеличении продолжительности периода активации катаболических процессов