Исследование воздействия растворов некоторых гидролитических ферментов на Saccharomyces cerevisiae

Полученные изотермы сорбции (рис. 5) позволили определить величину ПСЕ образцов грунтов по отношению к свинцу. Она составила для грунта, грунт+АКФКсух., грунт+АКФКгель и грунт+АКФКсух.+СаО 39, 42, 50 и 74 мг/г соответственно.

Таким образом, показано, что внесение в грунт добавки АКФКсух. и АКФКгель несущественно повышает сорбционную ёмкость глины, тогда как в трёхкомпонентной системе грунт+АКФКсух.+СаО сорбционная ёмкость образца возрастает практически в два раза.

Библиографические ссылки 1. Бражник, И.А. Влияние модифицирующих добавок на увеличение сорбционной ёмкости глинистых грунтов : дис. ... канд. геолого-минер. наук: 25.00.08 / И.А. Бражник; Моск. гос. ун-т. - М., 2007. - 203 с.

УДК 579.087.9+543.95

*

А.Г.Буланов, А.А.Белов, Н.С. Марквичев, E.H. Дмитриева, Н.П.Мышенков

Российский химико-технологический университет им. Д.И.Менделеева, г. Москва, Россия ГУП «Тепличный», г. Владимир, Россия

ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ РАСТВОРОВ НЕКОТОРЫХ ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ НА

Saccharomyces cerevisiae

Исследовано воздействие растворов трипсина, химотрипсина, лизоцима, лизоамидазы, протеолитического комплекса из гепатопанкреаса краба и их смесей на Saccharomyces cerevisiae.

Influence of solutions of lizoamidazy, trypsin, chemtrypsin, lysozyme, and proteolytic complex from hepatopancreas of a crab and their mixes on a mushroom of sort Saccharomyces cerevisiae.

В век высокой индустриализации и промышленной интенсификации особую значимость приобретает проблема продовольственной безопасности. Эта значимость усиливается жесткой конкуренцией за рынки сбыта сельскохозяйственной продукции. Основными критериями конкурентности продукции является ее себестоимость и качество. Для получения высоких урожаев и сохранности продукции производители сельхозпродукции зачастую используют самые разные и не безопасные для природы и человека индустриальные и химические средства. В мире создан большой и разнообразный ассортимент микробных препаратов для защиты растений. Однако зачастую эффективность микробиологических препаратов оказывалась недостаточной или нестабильной из-за чего они не смогли сыграть значимую роль в повышении продуктивности сельскохозяйственного производства [1].

В России посадки огурца занимают самые большие площади в пленочных и остекленных теплицах. Ежегодно этой культуре наносят существенный вред многие болезни, в том числе грибной этиологии. В последнее время в овощеводческих хозяйствах защищенного грунта выращивается большое разнообразие сортов интенсивного типа, предназначенных для различных технологий. В то же время поражаемость таких сортов грибными патогенами изучена недостаточно. Введение в хозяйстве дополнительного осенне-зимнего оборота (све-

токультура) привело к созданию замкнутого круглогодичного цикла выращивания растений, что исключает возможность одновременного проведения профилактических мер на всей культивационной площади и создает благоприятные условия для накопления и размножения инфекции. Изменилась также фи-тосанитарная ситуация в тепличном агробиоценозе с внедрением новой технологии выращивания огурца на малообъемном субстрате с капельным поливом растений, в первую очередь, в прикорневой зоне растений. В результате этого усилилось значение аэрогенной и семенной инфекции. Все это свидетельствует о необходимости совершенствования системы защиты огурца от комплекса грибных заболеваний как в условиях традиционной, так и современной технологии выращивания культуры. Для теплиц установлена этиология заболеваний огурца и уточнен видовой состав наиболее распространенных фитопатогенов. Показано, что основным видом, вызывающим мучнистую росу огурца, является Erysiphe cichoracearum (DC), аскохитоза - Ascochyta melonis (Pot), фузариоз-ного увядания - грибы рода Fusarium, пероноспороза - Pseudoperonospora cubensis (Rostowz), серой гнили - Botrytis cinerea (Pers.) [2,3].

Всего известно более 500 видов мучнисто-росяных грибов. Используя такие признаки, как число сумок в клейстотециях, особенности придатков плодовых тел и различия бесполого спороношения, мучнисторосяные грибы делят на роды. Мы рассмотрим наиболее важные из них. У грибов рода Erysiphe придатки клейстотеция простые, похожи на вегетативные гифы. В клейстотеции несколько сумок. Гриб так же быстро оканчивает цикл развития и образует сумчатую стадию. В этом случае, как гриб, так и хозяин имеют короткий период вегетации, большую часть года проводя в покое (клубеньки - у хозяина, клейстотеции - у гриба). Другой вид эризифе - Erisiphe cichoracearum -способен паразитировать на растениях из разных семейств. Внутри этого вида известно более 110 биологических форм, которые приспособились к паразитизму на каком-либо роде или виде растений. Из них наиболее вредоносны следующие: Erisiphe cichoracearum f. cucurbitacearum - поражает растения семейства тыквенные (огурцы, дыни и особенно - тыквы), более вреден в теплицах. Гриб поражает в основном листья, а при сильном развитии - и стебли, вызывая раннее засыхание растений [4,5].

Матрикс клеточной стенки грибов составляют, полисахариды, белки, липиды, пигменты. Эти соединения присутствуют в виде гликопротеидов, пеп-тидополисахаридов, протеин- и липид-пигментных комплексов. В клеточной стенки обнаружены также неорганические элементы (фосфор, железо, марганец и др.) и неорганические полифосфаты. Соединения входящие клеточную стенку грибов, образуют между собой ионные или ковалентные связи. Образование комплексов между компонентами клеточной стенки оказывает влияние на свойства входящих в них компонентов. Содержание белка в стенке грибов подвержено значительным колебаниям, но не превышает 20% (обычно 5-10%) от сухих веществ клеточной стенки. Обычно в клеточной стенке спор определяется больше белка, чем в стенках спороносцев и вегетативно растущего мицелия. Высокое содержание фосфора клеточной стенке мицелия грибов многие авторы объясняют присутствием полифосфатных соединений. В состав клеточной стенки спор входят те же элементы, что и в клеточную стенку гиф [4].

В состав клеточных стенок аскомнцетов (мучнистая роса), как и у хит-ридиомицетов и зигомицетов, входит хитин, но его содержание у грибов этого класса ниже и составляет не более 20-25% полисахаридов клеточной стенки (для сравнения: у некоторых хитридиомицетов - до 60%, у зигомицетов - до 37-40%). У некоторых дрожжей (род Schizosaccharomyces) хитин не обнаружен. Большую часть полисахаридов клеточной стенки аскомицетов (80-90%) составляют глюканы - полимеры D-глюкозы, отличающиеся от целлюлозы характером связи между мономерами. У дрожжей, кроме глюканов, обнаружены маннаны - полимеры маннозы. Целлюлоза у аскомицетов не обнаружена, за исключением двух видов из рода цератоцистис. В цикле развития аскомицетов большую роль играет бесполое размножение. Споры бесполого размножения (конидии) образуются на гаплоидном мицелии экзогенно (реже эндогенно) на конидиеносцах различного строения. Конидиальные спороноше-ния аскомицетов очень разнообразны по морфологии. Конидиеносцы образуются одиночно на мицелии, соединяются в пучки (коремии) или подушечки (спородохии), развиваются плотным слоем на поверхности сплетения гиф (ложа) или внутри шаровидных либо грушевидных споровместилищ с отверстием на вершине (пикниды). Типы конидиальных спороношений и различные способы образования конидий подробно онисапы в главе о дейтеромице-тах, или несовершенных грибах. Конидиальные спороношения развиваются в период вегетации грибов и служат для их массового расселения. У аскомицетов - паразитов растений они обычно образуются на живом растении, а сумчатые спороношения, за немногими исключениями, - после отмирания растения или его частей, в конце периода вегетации или после перезимовки.

Ранее нами было исследовано действие ряда гидролаз на биомассу и споры гриба вида Pythium Pringsh [6-8]. Род Pythium Pringsh - один из крупных родов среди оомицетов. По образу жизни и морфологии представители этого рода имеют сходные черты с грибами порядков Saprolegniales, Lepto-mitales, Lagenidiales и Peronosporales (ложная мучнистая роса) [9]. Оболочка клеток содержит целлюлозу и глюканы, хитин в клеточных стенках у большинства оомицетов отсутствует. Основные запасные вещества - ß-глюкан и миколаминарин [5].

Изучение действия препаратов ферментов на живые и убитые клетки Saccharomyces смотрели двумя методами: по увеличению редуцирующих сахаров и турбидимитрическим методами.

Измерение дрожжелитической активности (А) определяли турбидимет-рическим методом - по уменьшению поглощения суспензии клеток Saccharomyces cerevisiae, раса «я» (коллекция каф. биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева) в результате их лизиса в 1/15 М фосфатном буферном растворе (ФБ), рН 8,0 (или при рН 6,2) [10]. К 5 мл взвеси клеток в 1/15М ФБ требуемого значения рН, поглощение суспензии должно быть 0,5 - 0,6 оптических единиц при 540 нм (толщина оптического слоя кюветы 10 мм), добавляли 0,1 мл раствора фермента (в контрольные пробирки добавляли по 0,1 мл буфера). Смесь инкубировали 2-24 часа при 37°С на вибровстряхивателе (VXR-Vibrax-IKA, Janke & Kunkel, Германия, 400 оборотов/мин). Останавливали реакцию помещением пробирок в лед. Тщательно встряхивали и измеряли поглощение

(Д) суспензии в 1-ой (опытной) и 2-ой (контрольной) пробирках на спектрофотометре при 540 нм в кювете толщиной оптического слоя 10 мм.

Во время измерения в кювету сравнения наливают дистиллированную воду. Для расчета активности разница в поглощении опытной и контрольной пробирок (АД) должна быть около 0,1. Если АД больше 0,1 проводят измерение активности при меньшей концентрации в пробе препарата.

Засев дрожжей Saccharomyces cerevisiae, раса «я», производили петлей с косяка в колбы с 100 мл жидкой питательной среды Сабуро, содержащей глюкозу 40 г/л, пептон 10 г/л и дрожжевой автолизат (экстракт) 2-5 г/л. Культура инкубировалась 4-5 суток при температуре 25°С на качалке (160 об/мин). После культивирования дрожжи отмывались от питательной среды дистиллированной водой и 1/15М ФБ нужного значения рН и хранились в холодильнике при 5°С.

За 1 единицу дрожжелитической активности принимают такое количество фермента, которое приводит к уменьшению поглощения клеточной суспензии Saccharomyces cerevisiae на 0,01 при 370С за 1 час.

Активность рассчитывают по следующей формуле:

(Дк - До)*Р*Ук

А =--------------- Е/мг;

х * Уг* 0,01*^

Дк - поглощение во 2-ой (контрольной) пробирке, Д0 - поглощение в 1 -ой (опытной) пробирке, х - время реакции (час),

Ук - объем колбы в котором растворили навеску препарата (мл),

- навеска препарата (мг), Уг- объем ферментного раствора, взятого для измерения (мл), Р - разведение раствора фермента взятого для измерения (если оно было). В контрольных пробах учитывали также мутность растворов ферментов.

Действие исследованных препаратов на дрожжи распределилось следующим образом: наиболее активным оказался препарат (лизоамидаза) ЛА, затем (протеолитический комплекс из гепатопанкреаса краба) ПК, Лз (лизо-цим), для Тр (трипсина) и ХТр (химотрипсина) действие было приблизительно одинаковым. Наиболее активными препараты были при рН 6,2. В области рН 8,0 активность была ниже это связано на наш взгляд с тем, что хи-тинолитические ферменты входящие в состав ЛА и ПК имеют рН оптимум в кислой области значений рН, для Тр и ХТр в щелочной области рН на термоинактивацию (37°С 24 часа, накладывается и автолиз).

Полученные нами данные хорошо согласуются с данными полученными другими авторами о действии препаратов лизоамидазы, протеиназ [ 10] или лизоцима [11] на живые клетки дрожжей.

Нами не было обнаружено увеличение количества редуцирующих сахаров (с помощью 3,5 динитросалициловой кислоты) в пробах дрожжей после инкубации исследованных ферментов или их смесей (до 0,5 мг фермента/мл пробы) кроме растворов лизоамидазы.

Библиографические ссылки:

1. Биопрепараты в сельском хозяйстве. / Под ред. И.А.Тихоновича и Ю.В.Круглова. М.: 2005, 154с.

2. Кокоулина Е. М. Оптимизация системы защиты огурца от комплекса грибных болезней в теплицах Предуралья // Автореф., дисс. на соиск. уч. ст. к.с/х.н., С-Петербург-Пушкин, 2009, 17 с.

3. Комплексная система защиты растений в закрытом грунте, Технологии Байер КронСайенс, 2007, с. 7-13, brosh-Teplitsa(spt06)-N1.pmd 19.09.2006, 15:25

4. Феофилова Е.П. Клеточная стенка грибов, М.: Наука, 1983, с.315.

5. Чикин Ю.А. Общая фитопатология (часть 1): учебное пособие-Томский госуниверситет - Томск, 2001. 170 с.

6. Белов А.А., Россинец Е.А., Марквичев Н.С. Антигрибковые пролонгированные ферментативные препараты // Московск. межд. научно-практ. конф. "Биотехнология: экология крупн. городов". 15-17 март, 2010., Мат. конф., М.- С.130-131.

7. Белов А.А., Россинец Е.А., Марквичев Н.С. Исследование свойств немодифицированной и иммобилизованной в хитозановый гель лизоамида-зы (ХТ-ЛА) // Всерос. научно-техническая конф. "Наука-произ-во-технол.-экология" Киров, ВятГУ- 2010.-Т.2- С. -60-63.

8. Россинец Е.А., Белов А.А., Марквичев Н.С., Васильева А.В., Мышен-ков Н.П. Исследование воздействия растворов некоторых гидролитических ферментов на споры гриба рода Pythium // Успехи в химии и химической технологии.- М.: РХТУ им.Д.И.Менделеева, 2011, Т.ХХУ, №10, С.24-27.

9. Пыстина К.А. Род Pythium Pringsh.- СПб.: Наука, 1998, С.5.

10. Рязанова Л.П., Ледова Л.А., Цурикова Н.В. и др. Воздействие протео-литических ферментов Bacillus licheniformis и лизоамидазы Lisobacter sp. XL1 на клетки Proteus vulgaris и Proteus mirabilis //Прикл биохим и микроб., 2005, Т.41, №5, с. 558-563.

11. Петровский А.С. Структурная модификация ферментных белков для изменения эффективности катализируемых реакций // Дисс. на соиск. уч. ст. к.б.н. М.: РХТУ, 2012, 160 с.

Данная работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки РФ

УДК 628.3:658.01

В.В. Бутылин

Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия

АНАЛИЗ РЕСУРСОСБЕРЕГАЮЩЕГО ПОТЕНЦИАЛА

БЕССТОЧНОЙ ТЕХНОЛОГИИ ОБОРОТНОГО ВОДОСНАБЖЕНИЯ ОХЛАЖДАЮЩИХ СИСТЕМ ТЕПЛОЭЛЕКТРОСТАНЦИЙ