СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ОДИНОЧНОЙ В-КЛЕТКИ

1. Способ получения B-клетки, включающий следующие этапы:
а) получение B-клеток из крови кролика,
+
+
б) мечение IgG-B-клеток, и/или CD138-B-клеток,
в) инкубация В-клеток при температуре 37°C в течение одного часа в среде для совместного культивирования перед размещением меченых B-клеток в виде одиночных клеток,
г) культивирование размещенных по отдельности клеток вместе с фидерными клетками в среде для совместного культивирования,
д) выбор B-клетки, пролиферирующей на этапе г) и, тем самым, получение B-клетки.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что способ включает этап центрифугирования клеток, размещенных в виде одиночных клеток, перед совместным культивированием.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что способ включает непосредственно перед этапом мечения следующий этап: аб) пэннинг B-клеток с иммобилизованным антигеном.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что совместное культивирование осуществляют в полистироловых многолуночных планшетах, покрытых неволокнистым субстратом, изготовленным из смеси полимерной пластической смолы и амфипатических молекул.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что B-клетки получают центрифугированием в градиенте плотности.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что фидерные клетки являются мышиными клетками EL-4 B5.
7. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что среда для совместного культивирования содержит фидерную смесь.
8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что указанная фидерная смесь представляет собой культуральный супернатант тимоцитов.
+
9. Способ по п. 7, отличающийся тем, что указанная фидерная смесь содержит интерлейкин-1 бета и фактор некроза опухоли альфа, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из интерлейкина-2, интерлейкина-10, клеток золотистого стафилококка штамма Cowan, интерлейкина-21, B-клеточного фактора активации из семейства фактора некроза опухоли (BAFF), интерлейкина-6, интерлейкина-4, 5-(4-феноксибутокси)псоралена и других стимулирующих компонентов, увеличивающих способность B-клеточного клона к продукции IgG, не уменьшая число IgG-клеток.
10. Способ получения антитела, включающий следующие этапы, при которых:
а) берут популяцию зрелых В-клеток, полученную из крови кролика,
+
+
б) осуществляют мечение IgG-B-клеток, и/или CD138-B-клеток по меньшей мере одной флуоресцентной меткой,
в) инкубируют B-клетки при температуре 37°C в течение одного часа в среде для совместного культивирования перед размещением одиночных клеток из популяции меченых B-клеток в отдельные контейнеры,
г) культивируют размещенные по отдельности В-клетки в присутствии фидерных клеток и фидерной смеси,
д) определяют специфичность связывания антител, секретируемых в среду для культивирования отдельных В-клеток,
е) определяют аминокислотную последовательность вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей специфически связывающихся антител путем ПЦР с обратной транскрипцией и путем секвенирования нуклеотидов, тем самым получая нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельные домены легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела,
ж) вводят нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельные домены легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела, в экспрессионную кассету для экспрессии антитела,
з) вводят нуклеиновую кислоту в клетку,
и) культивируют клетку и выделяют антитело из клетки или клеточного культурального супернатанта, тем самым получая антитело.