АНТИТЕЛА К ВИРУСУ ДЕНГЕ, ПОЛИПЕПТИДЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ВАРИАНТЫ FC-ОБЛАСТЕЙ, И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
ANTIBODIES TO DENGUE VIRUS, POLYPEPTIDES CONTAINING FC-REGION OPTIONS AND THEIR APPLICATION METHODS

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к антителам к вирусу денге и способам их применения. Настоящее изобретение относится также к полипептидам, содержащим варианты Fc-областей, и способам их применения.
Предпосылки создания изобретения
Лихорадка денге представляет собой наиболее широко распространенное во всем мире переносимое членистоногими вирусное заболевание. Вирус, вызывающий лихорадку денге (который в настоящем описании обозначен как DENV) можно подразделять на четыре различных инфекционных серотипа (серовара), а именно DENV-1, DENV-2, DENV-3 и DENV-4. Симптомы вызываемой вирусом денге инфекции включают лихорадку, мышечную боль, головную боль, низкие количества тромбоцитов и низкие количества лейкоцитов, коагулопатию, кровотечения и транссудацию, которые могут приводить к шоковому синдрому денге. Если индивидуум контактирует с вирусом денге после предшествующей денге-инфекции, то антивирусные антитела могут усиливать поглощение вируса клетками и пациент подвергается более высокому риску развития серьезной формы лихорадки денге. Однако серьезные формы лихорадки денге могут возникать также и при первой инфекции.
Хотя лихорадка денге является наиболее распространенным переносимым членистоногими вирусным заболеванием, до настоящего времени нет лекарственных средств, пригодных для ее лечения. Подходы, направленные на борьбу с заболеванием, представляющим собой лихорадку денге, в основном были направлены на предупреждение инфекции и/или на лечение с целью облегчения симптомов.
Таким образом, существует необходимость в создании агентов средств, которые могут нейтрализовать и/или связываться по меньшей мере с одним серотипом денге. В последние годы несколько групп исследователей опубликовали данные о нейтрализующих антителах к DENV (см., например, WO 2012/082073, WO 2013/089647, WO 2013/151764, WO 2013/173348, WO 2014/025546, WO 2015/123362, WO 2015/122995 и WO 2016/012800). Однако все еще существует необходимость в антителах с более высокими терапевтическими свойствами.
В настоящее время разрабатываются вакцины и терапевтические средства на основе антител для предупреждения и лечения вирусной инфекции. Однако основанные на применении антител методы лечения не свободны от рисков. Одним из таких рисков является антителозависимое усиление инфекции (ADE), которое происходит, когда не обладающие нейтрализующей способностью противовирусные антитела облегчают проникновение вируса в клетки-хозяева, что приводит к повышению инфективности в клетках (Expert Rev Anti Infect Ther, 11, 2013, сс. 1147-1157). Наиболее распространенный механизм ADE заключается во взаимодействии комплекса вирус-антитело посредством Fc-области антитела с Fc-рецепторами (FcR) на клеточной поверхности. Слабая в обычных условиях вирусная инфекция может усиливаться в результате ADE, переходя в угрожающее жизни заболевание. Опубликованы данные о том, что антитело к DENV с мутациями в Fc-области, которые препятствуют связыванию с FcγR, не обладают способностью усиливать инфекцию DENV (WO 2010/043977). Однако, все еще существует необходимость в терапевтических средствах на основе антител, которые не повышают риск антителозависимого усиления инфекции.
Краткое изложение сущности изобретения
В изобретении предложены антитела к DENV, полипептиды, содержащие варианты Ес-областей и способы их применения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное антитело к DENV, предлагаемое в настоящем изобретении, связывается с белком Е DENV. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к DENV, предлагаемое в изобретении, содержит:
1
2
3
1
2
3
1
2
1
2
1
2
1
2
(a) (I) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность GGXALFYDSYTTPXDXGSWWFDP, в которой X обозначает R или Е, X обозначает R или F, Х обозначает G, D или L (SEQ ID NO: 42), (II) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность QQFXXLPIT, в которой X обозначает D, S или Е, Х обозначает D или A (SEQ ID NO: 45), и (III) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность VINPRGGSXXSAQKFQG, в которой X обозначает Т или R, Х обозначает А или R (SEQ ID NO: 41);
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
3
1
2
3
(б) (I) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SXYXH, в которой X обозначает N или Y, Х обозначает I или М (SEQ ID NO: 40), (II) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность VINPRGGSXXSAQKFQG, в которой X обозначает Т или R, Х обозначает А или R (SEQ ID NO: 41), и (III) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность GGXALFYDSYTTPXDXGSWWFDP, в которой X обозначает R или Е, Х обозначает R или F, Х обозначает G, D или L (SEQ ID NO: 42);
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
3
1
2
3
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
(в) (I) HVR-H1 содержащий аминокислотную последовательность SXYXH, в которой X обозначает N или Y, Х обозначает I или М (SEQ ID NO: 40), (II) HVR-H2 содержащий аминокислотную последовательность VINPRGGSXXSAQKFQG, в которой X обозначает Т или R, X обозначает А или R (SEQ ID NO: 41), (III) HVR-H3 содержащий аминокислотную последовательность GGXALFYDSYTTPXDXGSWWFDP, в которой X обозначает R или Е, Х обозначает R или F, Х обозначает G, D или L (SEQ ID NO: 42), (IV) HVR-L1 содержащий аминокислотную последовательность QASQXIRXYLN, в которой X обозначает D или Е, Х обозначает K или Q (SEQ ID NO: 43); (V) HVR-L2 содержащий аминокислотную последовательность DASXLKX, в которой X обозначает N или Е, Х обозначает Т или F (SEQ ID NO: 44); и (V) HVR-L3 содержащий аминокислотную последовательность QQFXXLPIT, в которой X обозначает D, S или Е, Х обозначает D или А (SEQ ID NO: 45); или
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
(г) (I) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность QASQXIRXYLN, в которой X обозначает D или Е, Х обозначает K или Q (SEQ ID NO: 43); (II) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность DASXLKX, в которой X обозначает N или Е, Х обозначает Т или F (SEQ ID NO: 44); и (III) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность QQFXXLPIT, в которой X обозначает D, S или E, Х обозначает D или A (SEQ ID NO: 45). В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, не представляет собой антитело, содержащее (I) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, (II) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (III) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (IV) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, (V) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, и (VI) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное антитело к DENV, предлагаемое в изобретении, содержит:
(а) (I) HVR-H3 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6, (II) HVR-L3 из последовательности VL, представленной в одной из SEQ ID NO: 8-10, и (III) HVR-H2 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6;
(б) (I) HVR-H1 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6, (II) HVR-H2 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6, и (III) HVR-H3 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6;
(в) (I) HVR-H1 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6, (II) HVR-H2 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6, (III) HVR-H3 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6, (IV) HVR-L1 из последовательности VL, представленной в одной из SEQ ID NO: 8-10; (V) HVR-L2 из последовательности VL, представленной в одной из SEQ ID NOs: 8-10; и (VI) HVR-L3 из последовательности VL, представленной в одной из SEQ ID NO: 8-10;
(г) (I) HVR-L1 из последовательности VL, представленной в одной из SEQ ID NO: 8-10; (II) HVR-L2 из последовательности VL, представленной в одной из SEQ ID NO: 8-10; и (III) HVR-L3 из последовательности VL, представленной в одной из SEQ ID NO: 8-10; или
(д) (I) HVR-H1 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6, (II) HVR-H2 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6, (III) HVR-H3 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6, (IV) HVR-L1 из последовательности VL, представленной в одной из SEQ ID NO: 7; (V) HVR-L2 из последовательности VL, представленной в одной из SEQ ID NO: 7; и (VI) HVR-L3 из последовательности VL, представленной в одной из SEQ ID NO: 7.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, не представляет собой антитело, содержащее (I) HVR-H1 из последовательности VH SEQ ID NO: 1, (II) HVR-H2 HVR-H1 из последовательности VH SEQ ID NO: 1, (III) HVR-H3 HVR-H1 из последовательности VH SEQ ID NO: 1, (IV) HVR-L1 HVR-H1 из последовательности VL SEQ ID NO: 7, (V) HVR-L2 из последовательности VL SEQ ID NO: 7, и (VI) HVR-L3 из последовательности VL SEQ ID NO: 7.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, дополнительно содержит каркасный участок вариабельного домена тяжелой цепи FR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31, FR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, FR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33 или 34, FR4, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35. В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, дополнительно содержит каркасный участок вариабельного домена легкой цепи FR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, FR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, FR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, FR4, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, содержит (а) последовательность VH, идентичную по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6; (б) последовательность VL, идентичную по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности, представленной в одной из SEQ ID NO: 8-10; (в) последовательность VH, представленную в одной из SEQ ID NO: 2-6, и последовательность VL, представленную в одной из SEQ ID NO: 8-10; или (г) последовательность VH, представленную в одной из SEQ ID NO: 2-6, и последовательность VL, представленную в SEQ ID NO: 7.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное антитело к DENV, предлагаемое в настоящем изобретении, представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное антитело к DENV, предлагаемое в настоящем изобретении, представляет собой человеческое, гуманизированное или химерное антитело. В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное антитело, предлагаемое в изобретении, представляет собой фрагмент антитела, который связывается с DENV или белком Е DENV. В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное антитело к DENV, предлагаемое в настоящем изобретении, представляет собой полноразмерное антитело IgG-класса.
В некоторых вариантах осуществления изобретения Fc-область антитела к DENV, предлагаемого в настоящем изобретении, содержит Ala в положении 234 и Ala в положении 235 согласно EU-нумерации. В некоторых вариантах осуществления изобретения Fc-область антитела к DENV, предлагаемого в настоящем изобретении, можно выбирать из вариантов Fc-областей, представленных в настоящем описании.
В изобретении предложены также выделенные нуклеиновые кислоты, которые кодируют антитело к DENV, предлагаемое в настоящем изобретении. В изобретении предложены также клетки-хозяева, которые содержат нуклеиновую кислоту, предлагаемую в настоящем изобретении. В изобретении предложен также способ получения антитела, который включает культивирование клетки-хозяина, предлагаемой в настоящем изобретении, с получением антитела.
В изобретении предложена также фармацевтическая композиция, которая содержит антитело к DENV, предлагаемое в настоящем изобретении, и фармацевтически приемлемый носитель.
Антитела к DENV, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять в качестве лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к DENV, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять для лечения инфекции DENV.
Антитела к DENV, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять для приготовления лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления изобретения лекарственное средство предназначено для лечения инфекции DENV.
В изобретении предложен также способ лечения индивидуума, инфицированного DENV. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ включает введение индивидууму в эффективном количестве антитела к DENV, предлагаемого в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ дополнительно включает введение индивидууму дополнительного терапевтического средства, например, описанного ниже.
В некоторых вариантах осуществления изобретения вариант Fc-области, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит по меньшей мере одно аминокислотное изменение в родительской Fc-области. В других вариантах осуществления изобретения вариант Fc-области обладает существенно сниженной FcγR-связывающей активностью по сравнению с родительской Fc-областью. В других вариантах осуществления изобретения вариант Fc-области не обладает существенно сниженной C1q-связывающей активностью по сравнению с родительской Fc-областью.
В некоторых вариантах осуществления изобретения вариант Fc-области, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит Ala в положении 234, Ala в положении 235 согласно EU-нумерации. В других вариантах осуществления изобретения вариант Fc-области содержит аминокислотные изменения в одном из следующих положений (а)-(в): (а) положения 267, 268 и 324, (б) положения 236, 267, 268, 324 и 332, и (в) положения 326 и 333 согласно EU-нумерации.
В некоторых вариантах осуществления изобретения вариант Fc-области, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит аминокислоты, выбранные из группы, состоящей из: (a) Glu в положении 267, (б) Phe в положении 268, (в) Thr в положении 324, (г) Ala в положении 236, (д) Glu в положении 332, (е) Ala, Asp, Glu, Met или Trp в положении 326 и (ж) Ser в положении 333 согласно EU-нумерации.
В некоторых вариантах осуществления изобретения вариант Fc-области, предлагаемый в настоящем изобретении, дополнительно содержит аминокислоты, выбранные из группы, состоящей из: (а) Ala в положении 434, (б) Ala в положении 434, Thr в положении 436, Arg в положении 438 и Glu в положении, (в) Leu в положении 428, Ala в положении 434, Thr в положении 436, Arg в положении 438 и Glu в положении 440, и (г) Leu в положении 428, Ala в положении 434, Arg в положении 438 и Glu в положении 440; согласно EU-нумерации.
В некоторых вариантах осуществления изобретения вариант Fc-области, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит любые из аминокислотных изменений, индивидуально или в комбинации, которые описаны в таблице 4. В некоторых вариантах осуществления изобретения родительская Fc-область, представленная в настоящем изобретении, происходит из человеческого IgG1. В изобретении предложен полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 51-59.
В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептид, содержащий вариант Fc-области, предлагаемый в настоящем изобретении, представляет собой антитело. В других вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой противовирусное антитело. В других вариантах осуществления изобретения антитело содержит вариабельную область, происходящую из антитела к DENV, представленного в настоящем описании.
В других вариантах осуществления изобретения антитело содержит:
(а) (I) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (II) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и (III) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13;
(б) (I) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, (II) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и (III) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16;
(в) (I) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, (II) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (III) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (IV) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; (V) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; и (VI) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27; или
(г) (I) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; (II) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; и (III) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27.
В других вариантах осуществления изобретения антитело содержит:
(a) (I) HVR-H3 из последовательности VH SEQ ID NO: 6, (II) HVR-L3 из последовательности VL SEQ ID NO: 10, и (III) HVR-H2 из последовательности VH SEQ ID NO: 6;
(б) (I) HVR-H1 из последовательности VH SEQ ID NO: 6, (II) HVR-H2 из последовательности VH SEQ ID NO: 6, и (III) HVR-H3 из последовательности VH SEQ ID NO: 6;
(в) (I) HVR-H1 из последовательности VH SEQ ID NO: 6, (II) HVR-H2 из последовательности VH SEQ ID NO: 6, (III) HVR-H3 из последовательности VH SEQ ID NO: 6, (IV) HVR-L1 из последовательности VL SEQ ID NO: 10; (V) HVR-L2 из последовательности VL SEQ ID NO: 10; и (VI) HVR-L3 из последовательности VL SEQ ID NO: 10;
(г) (I) HVR-L1 из последовательности VL SEQ ID NO: 10; (II) HVR-L2 из последовательности VL SEQ ID NO: 10; и (III) HVR-L3 из последовательности VL SEQ ID NO: 10; или
(д) (I) HVR-H1 из последовательности VH SEQ ID NO: 6, (II) HVR-H2 из последовательности VH SEQ ID NO: 6, (III) HVR-H3 из последовательности VH SEQ ID NO: 6, (IV) HVR-L1 из последовательности VL SEQ ID NO: 7; (V) HVR-L2 из последовательности VL SEQ ID NO: 7; и (VI) HVR-L3 из последовательности VL SEQ ID NO: 7;
В изобретении предложены также выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептид, который содержит вариант Fc-области, предлагаемый в настоящем изобретении. В изобретении предложены также клетки-хозяева, которые содержат нуклеиновую кислоту, предлагаемую в настоящем изобретении. В изобретении предложен также способ получения полипептида, содержащего вариант Fc-области, который включает культивирование хозяина, предлагаемого в настоящем изобретении, с получением полипептида.
В изобретении предложена также фармацевтическая композиция, содержащая полипептид, который содержит вариант Fc-области, предлагаемый в настоящем изобретении, и фармацевтически приемлемый носитель.
Полипептиды, содержащие варианты Fc-областей, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять в качестве лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептиды, которые содержат варианты Fc-областей, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять для лечения вирусной инфекции.
Полипептиды, которые содержат варианты Fc-областей предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять для приготовления лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления изобретения лекарственное средство предназначено для лечения вирусной инфекции.
В изобретении предложен также способ лечения индивидуума, инфицированного вирусом. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ включает введение индивидууму в эффективном количестве полипептида, который содержит вариант Fc-области, предлагаемый в настоящем изобретении.
В изобретении предложено также антитело к DENV, представленное в настоящем описании, которое дополнительно содержит полипептид, который содержит вариант Fc-области, предлагаемый в настоящем изобретении.
Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к способу получения антитела, которое содержит: (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, (б) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, (в) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, (г) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, (д) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, и (е) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, где способ включает стадии, на которых:
(а) объединяют вариант последовательности VH, выбранный из группы, которая состоит из: 3СН1047 (SEQ ID NO: 6) и 3СН1049 (SEQ ID NO: 95), с последовательностью СН человеческого IgG1, выбранной из группы, которая состоит из: SG182 (SEQ ID NO: 46), SG1095 (SEQ ID NO: 54) и SG1106 (SEQ ID NO: 59);
(б) объединяют вариант последовательности VL, выбранный из группы, которая состоит из 3CL (SEQ ID NO: 7) и 3CL633 (SEQ ID NO: 98), с последовательностью человеческой CL SK1 (SEQ ID NO: 60);
(в) клонируют каждую из комбинаций в экспрессионном векторе;
(г) осуществляют экспрессию полученных экспрессионных векторов в котрансфектированных клетках (клетках-хозяевах); и
(д) очищают антитело, полученное на стадии (г).
Краткое описание чертежей
На чертежах показано:

на фиг. 1 (А)-(Г) - сенсограммы, характеризующие связывание антител к DENV 3С и 3Cam с белком Е DENV-1 (А), белком Е DENV-2 (Б), белком Е DENV-3 (В) и белком Е DENV-4 (Г), полученные с помощью системы BIACORE согласно методу, описанному в примере 2;
на фиг. 2 - аффинности связывания антител с различными вариантами Fc-области с человеческим C1q, полученные согласно методу, описанному в примере 4. Связывающие активности измеряли с помощью ELISA. Тестировали следующие варианты Fc: WT, LALA + KWES, LALA + EFT + АЕ, LALA + EFT и LALA;
на фиг. 3 - аффинности связывания антител с различными вариантами Fc-области с человеческим C1q, полученные согласно методу, описанному в примере 4. Связывающие активности измеряли с помощью ELISA. Тестировали следующие варианты Fc: WT, LALA, LALA + KWES, LALA + KAES, LALA + KDES, LALA + KEES и LALA + KMES;
на фиг. 4 - аффинности связывания антител с различными вариантами Fc-области с человеческим C1q, полученные согласно методу, описанному в примере 4. Связывающие активности измеряли с помощью ELISA. Тестировали следующие варианты Fc: WT, LALA, LALA + АСТ3, LALA + АСТ5, LALA + KAES, LALA + АСТ3 + KAES и LALA + АСТ5 + KAES;
на фиг. 5 - аффинности связывания антител с различными вариантами Fc-области с человеческим C1q, полученные согласно методу, описанному в примере 4. Связывающие активности измеряли с помощью ELISA. Тестировали следующие варианты Fc: WT, LALA, LALA + АСТ3, LALA + ACT5, LALA + KAES, LALA + АСТ3 + KAES и LALA + ACT5 + KAES;
на фиг. 6 (а)-(з) - результаты анализа методом Biacore связывания вариантов Fc с человеческими FcγR, полученные согласно методу, описанному в примере 5. Тестировали следующие варианты Fc: WT (на чертеже обозначен как WT IgG), KWES, EFT + АЕ, EFT, KAES, LALA + KWES, LALA + EFT + АЕ, LALA + EFT, LALA, LALA + АСТ3, LALA + ACT5, LALA + KAES, LALA + KAES + АСТ3 и LALA + KAES + ACT5. Указанные варианты Fc тестировали в отношении связывания с FcγR, включающими: (а) человеческий FcγR1a, (б) аллельный вариант человеческого FcγR2a 167H, (в) аллельный вариант человеческого FcγR2a 167R, (г) человеческий FcγR2b, (д) аллельный вариант человеческого FcγR3a 158F, (е) аллельный вариант человеческого FcγR3a 158V, (ж) аллельный вариант человеческого FcγR3b NA1 и (з) аллельный вариант человеческого FcγR3b NA2. Каждый вариант Fc оценивали как в составе индивидуального антитела, имеющего вариант Fc (обозначено как «только Ат»), так и в составе иммунного комплекса, образованного антителом и тримерным антигеном CD154 (обозначен как CD154 IC);
на фиг. 7 (а)-(г) - результаты анализа методом Biacore связывания вариантов Fc с мышиными FcγR, полученные согласно методу, описанному в примере 5. Тестировали следующие варианты Fc: WT (на чертеже обозначен как WT IgG), KWES, EFT + АЕ, EFT, KAES, LALA + KWES, LALA + EFT + AE, LALA + EFT, LALA, LALA + АСТ3, LALA + ACT5, LALA + KAES, LALA + KAES + АСТ3 и LALA + KAES + ACT5. Указанные варианты Fc тестировали в отношении связывания с FcγR, включая: (а) мышиный FcγR1, (б) мышиный FcγR2b, (в) мышиный FcγR3 и (г) мышиный FcγR4. Каждый вариант Fc оценивали как в составе индивидуального антитела, имеющего вариант Fc (обозначено как «только Ат»), так и в составе иммунного комплекса, образованного антителом и тримерным антигеном CD154 (обозначен как CD154 IC);
на фиг. 8 - результаты анализа методом Biacore связывания вариантов Fc с человеческим FcRn, полученные согласно методу, описанному в примере 5. Тестировали следующие варианты Fc: WT (на чертеже обозначен как hIgG1), LALA, LALA + АСТ3, LALA + ACT5, LALA + KAES, LALA + KAES + АСТ3 и LALA + KAES + ACT5. Каждый вариант Fc оценивали как в составе индивидуального антитела, имеющего вариант Fc (обозначено как «только Ат»), так и в составе иммунного комплекса, образованного антителом и тримерным антигеном CD154 (обозначен как CD154 IC);
на фиг. 9 - результаты оценки виремии в день 3 после заражения вирусом DENV-2 мышей линии AG129, полученные согласно методу, описанному в примере 6. Антитела к DENV 3С и 3Cam в комбинации с вариантами Fc WT (обозначен как hIgG1), LALA и LALA + KAES, или ЗФР, применяемый в качестве отрицательного контроля, вводили в день 2 после заражения вирусом;

на фиг. 10 (А)-(Г) - сенсограммы, характеризующие связывание антител к DENV 3С и 3Cam2 с белком Е DENV-1 (А), белком Е DENV-2 (Б), белком Е DENV-3 (С) и белком Е DENV-4 (D), полученные с помощью системы BIACORE, согласно методу, описанному в примере 2.
Подробное описание вариантов осуществления изобретения
Технологии и процедуры, которые описаны или на которые сделаны ссылки в настоящем описании, в целом хорошо известны специалистам в данной области, и их широко применяют с использованием общепринятых методологий, таких, например, как методы, описанные у Sambrook и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3-е изд., изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001; Current Protocols in Molecular Biology (под ред. F.М. Ausubel и др., 2003); серии Methods in Enzymology (изд-во Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (под ред. M.J. MacPherson, B.D. Hames и G.R. Taylor, 1995), Antibodies, A Laboratory Manual, под ред. Harlow и Lane, 1988 и Animal Cell Culture (под ред. R.I. Freshney 1987); Oligonucleotide Synthesis (под ред. M.J. Gait, 1984); Methods in Molecular Biology, изд-во Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (под ред. J.E. Cellis, 1998) из-во Academic Press; Animal Cell Culture (под ред. R.I. Freshney, 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather и Р.Е. Roberts, 1998), изд-во Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (под ред. A. Doyle, J.B. Griffiths и D.G. Newell, 1993-8), изд-во J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (под ред. D.M. Weir и С.С. Blackwell); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (под ред. J.M. Miller и М.Р. Calos, 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (под ред. Mullis и др., 1994); Current Protocols in Immunology (под ред. J.E. Coligan и др., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (изд-во Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway и Р. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (под ред. D. Catty., изд-во IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (под ред. P. Shepherd и С. Dean, изд-во Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow и D. Lane, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (под ред. M. Zanetti и J.D. Capra, изд-во Harwood Academic Publishers, 1995); и Cancer: Principles and Practice of Oncology (под ред. V.T. DeVita и др., изд-во J.B. Lippincott Company, 1993).
I. Определения
Если не указано иное, то технические и научные понятия, применяемые в настоящем описании, имеют значения, хорошо известные обычному специалисту в области, в которой относится настоящее изобретение. У Singleton и др., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2-ое изд., изд-во J. Wiley & Sons, New York, N.Y. 1994 и March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4-ое изд., изд-во John Wiley & Sons, New York, N.Y. 1992, для специалистов в данной области представлено в целом толкование многих понятий, применяемых в настоящей заявке. Все процитированные в настоящем описании ссылки, включая заявки на патент и публикации, полностью включены в него в качестве ссылки.
Для интерпретации настоящего описания изобретения следует применять приведенные ниже понятия, и, если это возможно, понятия, применяемые в единственном числе, включают также их применение во множественном числе и наоборот. Должно быть очевидно, что применяемая в настоящем описании терминология представлена только для цели описания конкретных вариантов осуществления изобретения и не направлена на ограничение его объема. В том случае, если любое указанное ниже определение вступает в противоречие с указанным в любом документе, включенном в описание в качестве ссылки, то следует использовать указанное ниже определение.
Для целей настоящего описания «акцепторный человеческий каркасный участок» означает каркасный участок, который содержит аминокислотную последовательность каркасного участка вариабельного домена легкой цепи (VL) или каркасный участок вариабельного домена тяжелой цепи (VH), происходящую из каркасного участка человеческого иммуноглобулина или человеческого консенсусного каркасного участка, указанного ниже. Акцепторный человеческий каркасный участок, «происходящий из» каркасного участка человеческого иммуноглобулина или человеческого консенсусного каркасного участка, может иметь такую же аминокислотную последовательность или может содержать изменения в аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах осуществления изобретения количество аминокислотных изменений составляет 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее или 2 или менее. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность человеческого акцепторного каркасного участка VL идентична последовательности каркасного участка VL человеческого иммуноглобулина или последовательности человеческого консенсусного каркасного участка.
Понятие «аффинность» относится к суммарной силе всех нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (например, антитела) и ее партнером по связыванию (например, антигеном). В контексте настоящего описания, если не указано иное, «аффинность связывания» относится к присущей молекуле аффинности связывания, отражающей взаимодействие по типу 1:1 между компонентами связывающейся пары (например, антителом и антигеном). Аффинность молекулы Х к ее партнеру Y, как правило, можно характеризовать с помощью константы диссоциации (Kd). Аффинность можно оценивать с помощью общепринятых методов, известных в данной области, включая те, которые представлены в настоящем описании. Ниже в качестве иллюстрации и примеров представлены конкретные варианты измерения аффинности связывания.
Антитело «с созревшей аффинностью» означает антитело с одним или несколькими изменениями в одном или нескольких гипервариабельных участках (HVR) по сравнению с родительским антителом, которое не содержит указанных изменений, указанные изменения приводят к повышению аффинности антитела к антигену.
-8
-8
-13
-9
-13
Понятия «антитело к DENV» и «антитело, которое связывается с DENV» относятся к антителу, которое обладает способностью связываться с DENV с аффинностью, достаточной для того, чтобы антитело можно было применять в качестве диагностического и/или терапевтического агента при таргетировании DENV. Антитело может связываться с белком Е DENV. Понятия «антитело к белку Е DENV» и «антитело, которое связывается с белком Е DENV» относятся к антителу, которое обладает способностью связываться с белком Е DENV с аффинностью, достаточной для того, чтобы антитело можно было применять в качестве диагностического и/или терапевтического агента при таргетировании DENV. В одном из вариантов осуществления изобретения уровень связывания антитела белку Е DENV с неродственным белком, не представляющим собой белок Е DENV, составляет менее чем примерно 10% от связывания антитела с белком Е DENV по данным измерений, полученным, например, с помощью радиоиммуноанализа (РИА). В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, которое связывается с DENV и/или с белком Е DENV, имеет константу диссоциации (Kd) 1 мкМ или менее, 100 нМ или менее, 10 нМ или менее, 1 нМ или менее, 0,1 нМ или менее, 0,01 нМ или менее или 0,001 нМ или менее (например, 10 М или менее, например, от 10 М до 10 М, например, от 10 М до 10 М). В конкретных вариантах осуществления изобретения антитело к DENV связывается с эпитопом DENV, который является консервативным среди DENV из различных серотипов. В конкретных вариантах осуществления изобретения антитело к белку Е DENV связывается с эпитопом белка Е DENV, который является консервативным среди белков Е DENV из различных серотипов.
В контексте настоящего описания понятие «антитело» используется в его наиболее широком смысле и относится к различным структурам антител, включая (но, не ограничиваясь только ими) моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, при условии, что они обладают требуемой антигенсвязывающей активностью.
Понятие «антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность» или «ADCC» относится к форме цитотоксичности, при которой секретированный Ig, связанный с Fc-рецепторами (FcR), присутствующими на определенных цитотоксических клетках (например, NK-клетках, нейтрофилах и макрофагах), дает возможность указанным цитотоксическим эффекторным клеткам специфически связываться с несущей антиген клеткой-мишенью и затем уничтожать клетку-мишень цитотоксинами. Первичные клетки, опосредующие ADCC, NK-клетки, экспрессируют только Fc-гамма RIII, в то время как моноциты экспрессируют Fc-гамма RI, Fc-гамма RII и Fc-гамма RIII. Данные об экспрессии FcR на гематопоэтических клетках обобщены в таблице 3 на стр. 464 публикации Ravetch и Kinet, Annu. Rev. Immunol 9, 1991, cc. 457-492. Для оценки ADCC-активности представляющей интерес молекулы можно осуществлять in vitro ADCC-анализ, такой, как описанный в US №5500362 или US №5821337, или US №6737056 (на имя Presta). Эффекторные клетки, которые можно применять для таких анализов, включают РВМС и NK-клетки. Альтернативно этому или дополнительно можно оценивать ADCC-активность представляющей интерес молекулы in vivo, например, на животных моделях, таких как описанные у Clynes и др., PNAS (USA) 95, 1998, cc. 652-656.
2
Понятие «фрагмент антитела» относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, связывающуюся с антигеном, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антитела включают (но, не ограничиваясь только ими) Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab'); димерные антитела (диабоди); линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител (например, scFv) и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.
Понятие «антитело, которое связывается с тем же эпитопом», что референс-антитело, относится к антителу, которое блокирует связывание референс-антитела с его антигеном при оценке с помощью анализа в условиях конкуренции (конкурентный анализ) и/или, наоборот, референс-антитело блокирует связывание антитела с его антигеном при оценке с помощью конкурентного анализа. Пример конкурентного анализа представлен в настоящем описании.
«C1q» представляет собой полипептид, который включает сайт связывания для Fc-области иммуноглобулина. C1q вместе с двумя сериновыми протеазами, C1r и C1s, образует комплекс С1, первый компонент в пути комплементзависимой цитотоксичности (CDC). Человеческий C1q можно покупать, например, у фирмы Quidel, Сан-Диего, шт. Калифорния.
Понятие «химерное» антитело относится к антителу, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи происходит из конкретного источника или вида, а остальная часть тяжелой и/или легкой цепи происходит из другого источника или вида.
Понятие «класс» антитела относится к типу константного домена или константной области, который/которая входит в его тяжелую цепь. Известно пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM и некоторые из них можно подразделять дополнительно на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулина, обозначают как альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю (α, δ, ε, γ и μ) соответственно.
Понятие «комплементзависимая цитотоксичность» или «CDC» относится к лизису клетки-мишени в присутствии комплемента. Активация классического пути комплемента инициируется путем связывания первого компонента системы комплемента (C1q) с антителами (соответствующего подкласса), которые связываются со своим когнатным антигеном. Для оценки активации комплемента можно осуществлять CDC-анализ, например, как описано у Gazzano-Santoro и др., J. Immunol. Methods 202, 1996, с. 163. Варианты полипептидов с измененными аминокислотными последовательностями Fc-области (полипептиды с вариантом Fc-области) и повышенной или сниженной способностью к связыванию с C1q описаны, например, в US №6194551 В1 и WO 1999/51642. См., например, также Idusogie и др., J. Immunol. 164, 2000, cc. 4178-4184.
211
131
125
90
186
188
153
212
32
212
Понятие «цитотоксический агент» в контексте настоящего описания относится к субстанции, которая ингибирует клеточную функцию или препятствует ей и/или вызывает гибель или деструкцию клеток. Цитотоксические агенты включают (но, не ограничиваясь только ими) радиоактивные изотопы (например, At, I, I, Y, Re, Re, Sm, Bi, P, Pb и радиоактивные изотопы Lu); химиотерапевтические агенты или лекарственные средства (например, метотрексат, адриамицин, алкалоиды барвинка (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мелфалан, митомицин С, хлорамбуцил, даунорубицин или другие интеркалирующие агенты); ингибирующие рост агенты; ферменты и их фрагменты, такие как нуклеолитические ферменты; антибиотики; токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины бактериального, грибного, растительного или животного происхождения, включая их фрагменты и/или варианты; и различные противоопухолевые или противораковые агенты, указанные ниже.
Понятие «эффекторные функции» относится к тем видам биологической активности, связанным с Fc-областью антитела, которые варьируются в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают: связывание C1q и комплементзависимую цитотоксичность (CDC); связывание Fc-рецептора; антитело-обусловленную клеточнозависимую цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; понижающую регуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора) и активацию В-клеток.
Понятие «эффективное количество» агента, например, фармацевтической композиции, означает количество, эффективное в дозах и в течение периода времени, необходимых для достижения требуемого терапевтического или профилактического результата.
Понятие «эпитоп» включает любую детерминанту, обладающую способностью связываться антителом. Эпитоп представляет собой область антигена, которая связывается с антителом, мишенью которого является антиген, и включает специфические аминокислоты, которые непосредственно контактируют с антителом. Эпитопные детерминанты могут включать химически активные поверхностные группы молекул, таких как аминокислоты, боковые сахарные цепи, фосфорильные или сульфонильные группы, и могут иметь специфически характеристики трехмерной структуры и/или специфические характеристики зарядов. Как правило, антитела, специфические в отношении конкретного антигена-мишени, должны предпочтительно распознавать эпитоп на антигене-мишени в сложной смеси белков и/или макромолекул.
«Fc-рецептор» или «FcR» означает рецептор, который связывается с Fc-областью антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретения FcR представляет собой нативный человеческий FcR. В некоторых вариантах осуществления изобретения FcR представляет собой рецептор, который связывается с антителом IgG-класса (гамма-рецептор) и включает рецепторы подкласса Fc-гамма RI, Fc-гамма RII и Fc-гамма RIII, в том числе аллельные варианты и полученные в результате альтернативного сплайсинга формы этих рецепторов. Рецепторы Fc-гамма RII включают Fc-гамма RIIA («активирующий рецептор») и Fc-гамма RIIB («ингибирующий рецептор»), которые имеют сходные аминокислотные последовательности, отличающиеся прежде всего их цитоплазматическими доменами. Активирующий рецептор Fc-гамма RIIA содержит активирующий мотив иммунорецептора на основе тирозина (ITAM) в своем цитоплазматическом домене. Ингибирующий рецептор Fc-гамма RIIB содержит ингибирующий мотив иммунорецептора на основе рецептора тирозина (ITIM) в своем цитоплазматическом домене (см., например, Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15, 1997, cc. 203-234). Обзор сведений о FcR представлен, например, у Ravetch и Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9, 1991, cc. 457-492; Capel и др., Immunomethods 4, 1994, cc. 25-34 и de Haas и др., J. Lab. Clin. Med. 126, 1995, cc. 330-341. Под понятие «FcR», указанное в настоящем описании, подпадают и другие FcR, включая те, которые будут идентифицированы в будущем.
Понятие «Fc-рецептор» или «FcR» включает также неонатальный рецептор, FcRn, который ответствен за перенос материнских IgG эмбриону (Guyer и др., J. Immunol. 117, 1976, cc. 587-593 и Kim и др., J. Immunol. 24, 1994, cc. 2429-2434) и регулирует гомеостаз иммуноглобулинов. Известны методы измерения связывания с FcRn (см., например, Ghetie и Ward., Immunol. Today 18(12), 1997, cc. 592-598; Ghetie и др., Nature Biotechnology 15(7), 1997, cc. 637-640; Hinton и др., J. Biol. Chem. 279(8), 2004, cc. 6213-6216; WO 2004/92219 (Hinton и др.). Связывание с человеческим FcRn in vivo и время полужизни в сыворотке человеческого FcRn, отличающегося высокой аффинностью связывания с полипептидами, можно оценивать, например, в трансгенных мышах или в трансфектированных человеческих клеточных линиях, экспрессирующих человеческий FcRn, или в приматах, которым вводят полипептиды с вариантом Fc-области. В WO 2000/42072 (на имя Presta) описаны варианты антител с повышенной или пониженной способностью связываться с FcR (см., например, также Shields и др., J. Biol. Chem. 9(2), 2001, cc. 6591-6604).
Понятие «Fc-область», применяемое в настоящем описании, относится к С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере часть константной области. Понятие включает нативные последовательности Fc-областей и варианты Fc-областей. В одном из вариантов осуществления изобретения Fc-область тяжелой цепи человеческого IgG простирается с Cys226 или с Pro230 до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако С-концевой лизин (Lys447) или глицин-лизин (остатки 446-447) Fc-области может присутствовать или отсутствовать. Если специально не указано иное, то нумерация аминокислотных остатков в Fc-области или константной области соответствует системе нумерации EU, которую обозначают также как EU-индекс, описанной у Kabat E.A. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
Понятие «содержащее Fc-область антитело» относится к антителу, которое содержит Fc-область. С-концевой остаток лизин (остаток 447) или С-концевые остатки глицин-лизин (остатки 446-447) Fc-области могут быть удалены, например, в процессе очистки антитела или путем рекомбинантного конструирования нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело. Таким образом, композиция, которая содержит антитело, имеющее Fc-область, предлагаемую в настоящем изобретении, может содержать антитело с G446-K447, с G446 и без K447, со всеми удаленными G446-K447 или смесь трех описанных выше типов антител.
«Каркасный участок» или «FR», означает остатки вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельного участка (HVR). FR вариабельного домена, как правило, состоит из четырех FR-доменов: FR1, FR2, FR3 и FR4. Таким образом, последовательности HVR и FR, как правило, имеют следующее расположение в VH (или VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Понятия «полноразмерное антитело», «интактное антитело» и «цельное антитело» в контексте настоящего описания используют взаимозаменяемо для обозначения антитела, имеющего структуру, практически сходную с нативной структурой антитела, или имеющего тяжелые цепи, которые содержат представленную в настоящем описании Fc-область.
«Функциональная Fc-область» обладает «эффекторной функцией», присущей нативной последовательности Fc-области. Примеры «эффекторных функций» включают связывание C1q; (CDC); связывание Fc-рецептора; ADCC; фагоцитоз; понижающую регуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора; BCR) и т.д. Для проявления указанных эффекторных функций, как правило, требуется, чтобы Fc-область была объединена со связывающим доменом (например, вариабельным доменом антитела), и их можно оценивать с помощью различных анализов, например, указанных в настоящем описании.
Понятия «клетка-хозяин», «линия клеток-хозяев» и «культура клеток-хозяев» используют взаимозаменяемо, и они относятся к клеткам, в которые интродуцирована экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство указанных клеток. К клеткам-хозяевам относятся «трансформанты» и «трансформированные клетки», которые включают первично трансформированную клетку и полученное из нее потомство безотносительно к количеству пересевов. Потомство может не быть полностью идентичным по составу нуклеиновых кислот родительской клетке, а может содержать мутации. Под объем изобретения подпадает мутантное потомство, которое обладает такой же функцией или биологической активностью, которая обнаружена в результате скрининга или отобрана у исходной трансформированной клетки. В конкретных вариантах осуществления изобретения клетка-хозяин или котрансфектированная клетка представляет собой CHO-DXB11, СНО-K1 или CHO-DG44. Такая клетка-хозяин или котрансфектированная клетка может представлять собой клетку, экспрессирующую транспортер таурина, полученную путем интродукции ДНК, кодирующей транспортер таурина (WO 2007/119774).
«Человеческое антитело» представляет собой антитело, имеющее аминокислотную последовательность, которая соответствует последовательности антитела, продуцируемого в организме человека или человеческими клетками, или происходящее из нечеловеческого источника, в котором использован спектр человеческих антител или другие кодирующие человеческое антитело последовательности. Из указанного определения человеческого антитела специально исключено гуманизированное антитело, содержащее нечеловеческие антигенсвязывающие остатки.
«Человеческий консенсусный каркасный участок» представляет собой каркасный участок, в который входят наиболее часто встречающиеся аминокислотные остатки в выбранных последовательностях каркасных участков VL или VH человеческого иммуноглобулина. Как правило, выбор последовательностей VL или VH человеческого иммуноглобулина осуществляют из подгруппы последовательностей вариабельных доменов. Как правило, подгруппа последовательностей представляет собой подгруппу, описанную у Kabat и др.. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., публикация NIH 91-3242, Bethesda MD, т.т. 1-3, 1991. В одном из вариантов осуществления изобретения касательно VL подгруппа представляет собой подгруппу каппа I согласно Kabat и др., выше. В одном из вариантов осуществления изобретения касательно VH подгруппа представляет собой подгруппу III согласно Kabat и др., выше.
Понятие «гуманизированное» антитело относится к химерному антителу, которое содержит аминокислотные остатки из нечеловеческих HVR и аминокислотные остатки из человеческих FR. В некоторых вариантах осуществления изобретения гуманизированное антитело может содержать практически все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или практически все HVR (например, CDR) соответствуют участкам нечеловеческого антитела, а все или практически все FR соответствуют участкам человеческого антитела. Гуманизированное антитело необязательно может содержать по меньшей мере часть константной области антитела, происходящей из человеческого антитела. Понятие «гуманизированная форма» антитела, например, нечеловеческого антитела, относится к антителу, которое подвергали гуманизации.
Понятие «гипервариабельный участок» или «HVR» в контексте настоящего описания относится к каждому из участков вариабельного домена антитела, последовательности которых являются гипервариабельными («определяющие комплементарность участки» или «CDR») и/или формируют петли определенной структуры («гипервариабельные петли»), и/или содержат контактирующие с антигеном остатки («контакты с антигеном»). Как правило, антитела содержат шесть HVR: три в VH (H1, Н2, Н3) и три в VL (L1, L2, L3). Согласно настоящему описанию примеры HVR включают
(а) гипервариабельные петли, включающие аминокислотные остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) (Chothia и Lesk, J. Mol. Biol. 196, 1987, cc. 901-917);
(б) CDR, включающие аминокислотные остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) (Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service; National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991, публикация NIH 91-3242);
(в) области контакта с антигеном, включающие аминокислотные остатки 27с-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) и 93-101 (Н3) (MacCallum и др., J. Mol. Biol. 262, 1996, cc. 732-745); и
(г) комбинации остатков, указанных в подпунктах (а), (б) и/или (в), включающие аминокислотные остатки HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (Н3) и 94-102 (Н3).
Если специально не указано иное, то остатки в HVR и другие остатки в вариабельном домене (например, остатки в FR) нумеруют согласно Kabat и др., выше.
«Иммуноконъюгат» представляет собой антитело, конъюгированное с одной или несколькими гетерологичной(ыми) молекулой(ами), включая (но, не ограничиваясь только им) цитотоксический агент.
«Индивидуум» или «субъект» представляет собой млекопитающее. К млекопитающим относятся (но, не ограничиваясь только ими) одомашненные животные (например, коровы, овцы, кошки, собаки и лошади), приматы (например, человек и приматы кроме человека, например, обезьяны), кролики и грызуны (например, мыши и крысы). В конкретных вариантах осуществления изобретения индивидуум или субъект представляет собой человека.
«Выделенное» антитело представляет собой антитело, которое отделено от компонента его естественного окружения. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело очищают до чистоты, превышающей 95% или 99% по данным, например, электрофоретических анализов (таких, например, как ДСН-ПААГ, изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ), капиллярный электрофорез) или хроматографических анализов (таких, например, как ионообменная хроматография или ЖХВР с обращенной фазой). Обзор методов оценки чистоты антител см., например, у Flatman и др., J. Chrom. В 848, 2007, cc. 79-87.
«Выделенная» нуклеиновая кислота представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая отделена от компонента ее естественного окружения. Выделенная нуклеиновая кислота включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетке, которая в норме включает молекулу нуклеиновой кислоты, но в которой молекула нуклеиновой кислоты присутствует вне хромосомы или в которой ее локализация на хромосоме отличается от ее встречающейся в естественных условиях локализации на хромосоме.
Понятие «выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело» относится к одной или нескольким молекулам нуклеиновых кислот, кодирующих тяжелые и легкие цепи антитела (или их фрагменты), включая указанную(ые) молекулу(ы) в одном векторе или в различных векторах, и указанную(ые) молекулу(ы) нуклеиновой(ых) кислоты(т), присутствующую(ие) в одном или нескольких положениях в клетке-хозяине.
Понятие «моноклональное антитело», применяемое в настоящем описании, относится к антителу, полученному из популяции практически гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, входящие в популяцию, идентичны и/или связываются с одним и тем же эпитопом, за исключением возможных вариантов антител, например, содержащих мутации, встречающиеся в естественных условиях или возникающие в процессе производства препарата моноклонального антитела, указанные варианты, как правило, присутствуют в минорных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые, как правило, включают различные антитела к различным детерминантам (эпитопам), каждое моноклональное антитело из препарата моноклонального антитела направлено против одной детерминаты антигена. Таким образом, прилагательное «моноклональный» определяет особенность антитела, характеризуя его как полученное из практически гомогенной популяции антител, а не сконструированное в соответствии с требованиями к получению антитела с помощью какого-либо конкретного метода. Например, моноклональные антитела, которые можно применять согласно настоящему изобретению, можно создавать с помощью различных технологий, включая (но, не ограничиваясь только ими) метод гибридом, методы рекомбинантной ДНК, методы фагового дисплея и методы, основанные на использовании трансгенных животных, которые содержат все или часть локусов человеческого иммуноглобулина, указанные методы и другие, приведенные в качестве примера методы получения моноклональных антител, представлены в настоящем описании.
Понятие «голое антитело» относится к антителу, неконъюгированному с гетерологичным фрагментом (например, цитотоксическим фрагментом) или радиоактивной меткой. Голое антитело может присутствовать в фармацевтической композиции.
Понятие «нативные антитела» относится к встречающимся в естественных условиях молекулам иммуноглобулинов с различными структурами. Например, нативные антитела IgG-класса представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с молекулярной массой примерно 150000 Да, состоящие из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, связанных дисульфидными мостиками. В направлении от N-конца к С-концу, каждая тяжелая цепь имеет вариабельную область (VH), которую называют также вариабельным тяжелым доменом или вариабельным доменом тяжелой цепи, за которой следует три константных домена (СН1, СН2 и СН3). Аналогично этому, в направлении от N-конца к С-концу, каждая легкая цепь имеет вариабельную область (VL), которую называют также вариабельным легким доменом или вариабельным доменом легкой цепи, за которой следует константный домен легкой цепи (CL). Легкая цепь антитела в зависимости от аминокислотной последовательности ее константного домена может принадлежать к одному из двух типов, которые обозначают каппа (κ) и лямбда (λ).
«Имеющая нативную последовательность Fc-область» содержит аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности Fc-области, которая встречается в природе. Нативная последовательность человеческих Fc-областей включает нативную последовательность Fc-области человеческого IgG1 (не-А- и А-аллотипов); нативную последовательность Fc-области человеческого IgG2; нативную последовательность Fc-области человеческого IgG3 и нативную последовательность Fc-области человеческого IgG4, а также их встречающиеся в естественных условиях варианты.
Понятие «листовка-вкладыш в упаковку» применяют для обозначения инструкций, обычно входящих в поступающие в продажу упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозе, пути введения, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или мерах предосторожности при применении указанных терапевтических продуктов.
«Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» относительно полипептидной референс-последовательности определяют как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам в полипептидной референс-последовательности, после выравнивая последовательностей и при необходимости интродукции брешей для достижения максимального процента идентичности последовательностей, и не рассматривая какие-либо консервативные замены в качестве компонента при оценке идентичности последовательностей. Сравнительный анализ для целей определения процента идентичности аминокислотных последовательностей можно осуществлять различными путями, известными в данной области, используя, например, публично доступные компьютерные программы, такие как программа BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR) или GENETYX (фирма Genetyx Co., Ltd.) Специалисты в данной области могут определять соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей.
Авторство компьютерной программы для сравнения последовательностей ALIGN-2 принадлежит фирме Genentech, Inc., и исходный код был представлен в комплекте с документацией для пользователей в U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, где он зарегистрирован как U.S. Copyright Registration № TXU510087. Программа ALIGN-2 публично доступна от фирмы Genentech, Inc., Южный Сан-Франциско, шт. Калифорния, или ее можно компилировать на основе исходного кода. Программу ALIGN-2 можно компилировать для применения в операционной системе UNIX, включая цифровую систему UNIX V4.0D. Все параметры, требуемые для сравнения последовательностей, устанавливаются программой ALIGN-2 и не должны изменяться.
В ситуациях, в которых ALIGN-2 применяют для сравнения аминокислотных последовательностей, % идентичности аминокислотных последовательностей данной аминокислотной последовательности А по сравнению, с или относительно данной аминокислотной последовательности Б (что в альтернативном варианте можно обозначать как данная аминокислотная последовательность А, которая имеет или содержит определенный % идентичности аминокислотной последовательности по сравнению, с или относительно данной аминокислотной последовательности Б), рассчитывают следующим образом:
100 × дробь X/Y,
где Х обозначает количество аминокислотных остатков, определенных как идентичные совпадения при оценке с помощью программы для сравнительного анализа последовательностей ALIGN-2, где с помощью программы осуществляли сравнение А и Б, и где Y обозначает общее количество аминокислотных остатков в Б. Должно быть очевидно, что, если длина аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной последовательности Б, то % идентичности аминокислотных последовательностей А относительно Б не может быть равен % идентичности аминокислотной последовательности Б относительно А. Если специально не указано иное, то все величины % идентичности аминокислотных последовательностей, указанные в настоящем описании, получали с использованием описанной в предыдущем параграфе компьютерной программы ALIGN-2.
Понятие «фармацевтическая композиция» относится к препарату, который находится в такой форме, что он обеспечивает биологическую активность входящего в его состав действующего вещества, которое должно обладать эффективностью, и который не содержит дополнительных компонентов, обладающих неприемлемой токсичностью для субъекта, которому следует вводить композицию.
«Фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту в фармацевтической композиции, отличному от действующего вещества, который является нетоксичным для субъекта. Фармацевтически приемлемые носители включают (но, не ограничиваясь только ими) буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант.
Понятие «белок Е DENV», применяемое в настоящем описании, относится к любому нативному белку Е DENV из любого серотипа DENV, включая DENV-1, DENV-2, DENV-3 и DENV-4, если не указано иное. Геном DENV кодирует три структурных (капсидный (С), предмембранный/мембранный (prM/М) и оболочечный (Е)) и семь неструктурных (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B и NS5) белков. Белок Е, гликопротеин с молекулярной массой примерно 55 кДа, присутствует в виде гетеродимера с белком PrM до созревания вириона. Рентгеновские кристаллографические исследования эктодомена белка Е выявили три отдельных имеющих бета-складчатую конформацию домена, соединенных с мембраной вируса посредством спирального стеблевого «якоря», и два антипараллельных трансмембранных домена. Домен III (EDIII) принимает иммуноглобулин-подобную укладку и, как предполагается, играет решающую роль во взаимодействиях с рецепторами. Домен II (EDII) представляет собой вытянутый домен, состоящий из двух длинных пальцеобразных структур, и содержит высококонсервативную состоящую из 13 аминокислот петлю слияния (EDII-FL) на верхушке, и участвует в слиянии с мембраной и димеризации белка Е. Центральный домен (домен I; EDI) представляет собой девятицепочечную β-складку, которая соединена с EDIII и EDII одним и четырьмя линкерами соответственно. Белки Е имеют важное значение для сборки вируса, присоединения к рецептору, проникновения, слияния вируса и возможно ускользания от иммунного ответа в процессе жизненного цикла вируса, и, таким образом, представляют собой динамические белки, которые требуются для того, чтобы принимать несколько различных конформаций и вариантов расположения на вирусной частице. Понятие включает «полноразмерный» непроцессированный белок Е DENV, а также любую форму белка Е DENV, образующуюся в результате процессинга в клетке. Понятие включает также встречающиеся в естественных условиях варианты белка Е DENV, например, варианты серотипа или квазивиды.
Выражение «существенно сниженный», «существенно повышенный» или «существенно различный», применяемое в настоящем описании, относятся к достаточно большой степени различия между двумя численными величинами (как правило, одно ассоциировано с молекулой, а другое ассоциировано с референс/используемой для сравнения молекулой), так что специалист в данной области может рассматривать различие между двумя величинами как статистически значимое в контексте биологической характеристики, мерой которой являются указанные величины (например, величины Kd).
В контексте настоящего описания понятие «лечение» (и его грамматические вариации, такие как «лечить» или «процесс лечения») относится к клиническому вмешательству с целью изменения естественного течения болезни у индивидуума, подлежащего лечению, и его можно осуществлять либо для профилактики, либо в процессе развития клинической патологии. Требуемыми действиями лечения являются (но, не ограничиваясь только ими) предупреждение возникновения или рецидива болезни, облегчение симптомов, уменьшение любых прямых или косвенных патологических последствий болезни, предупреждение метастазов, снижение скорости развития болезни, облегчение или временное ослабление болезненного состояния и ремиссия или улучшение прогноза. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, применяют для задержки развития болезни или замедления прогрессирования болезни.
Понятие «вариабельная область» или «вариабельный домен» относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL соответственно) нативного антитела, как правило, имеют сходные структуры, при этом каждый домен содержит четыре консервативных каркасных участка (FR) и три гипервариабельных участка (HVR) (см., например, Kindt и др., Kuby Immunology, 6-ое изд., изд-во W.H. Freeman and Co., 2007, с. 91). Одного VH- или VL-домена может быть достаточно для обеспечения специфичности связывания антигена. Кроме того, антитела, которые связываются с конкретным антигеном, можно выделять, используя VH- или VL-домен из антитела, которое связывается с антигеном, для скрининга библиотеки комплементарных VL- или VH-доменов соответственно (см., например, Portolano и др., J. Immunol. 150, 1993, cc. 880-887; Clarkson и др., Nature 352, 1991, cc. 624-628).
«Вариант Fc-области» содержит аминокислотную последовательность, которая отличается от нативной последовательности Fc-области благодаря наличию по меньшей мере одной аминокислотной модификации (изменения), предпочтительно одной или нескольких аминокислотной(ых) замены(замен). Предпочтительно вариант Fc-области имеет по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с нативной последовательностью Fc-области родительского полипептида, например, от примерно одной до примерно десяти аминокислотных замен, и предпочтительно от примерно одной до примерно пяти аминокислотных замен в нативной последовательности Fc-области или в Fc-области родительского полипептида. В контексте настоящего описания вариант Fc-области должен обладать предпочтительно по меньшей мере примерно 80%-ной гомологией с нативной последовательностью Fc-области и/или Fc-области родительского полипептида и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 90%-ной гомологией с ней, более предпочтительно по меньшей мере примерно 95%-ной гомологией с ней.
Понятие «вектор», применяемое в настоящем описании, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая обладает способностью к размножению другой нуклеиновой кислоты, с которой она связана. Понятие включает вектор в виде самореплицирующейся структуры нуклеиновой кислоты, а также вектор, включенный в геном клетки-хозяина, в которую он интродуцирован. Некоторые векторы обладают способностью контролировать экспрессию нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Указанные векторы в контексте настоящего описания обозначают как «экспрессионные векторы».
II. Композиции и способы
Одним из объектов изобретения являются, в частности, антитела к DENV и их применения. Некоторыми вариантами осуществления изобретения являются антитела, которые связываются с DENV и/или белком Е DENV. Антитела, предлагаемые в изобретении, можно применять, например, для диагностирования или лечения вызываемой DENV инфекции.
Одним из объектов изобретения являются, в частности, полипептиды, содержащие варианты Fc-областей, и их применения. В некоторых вариантах осуществления изобретения предложены полипептиды, содержащие варианты Fc-областей с повышенной Fc-гамма RIIb-связывающей активностью. В некоторых вариантах осуществления изобретения предложены полипептиды, содержащие варианты Fc-областей, у которых не снижена существенно C1q-связывающая активность. В конкретных вариантах осуществления изобретения полипептиды, предлагаемые в изобретении, представляют собой антитела. Полипептиды, содержащие варианты Fc-областей, предлагаемые в изобретении, можно применять, например, для диагностирования или лечения вирусной инфекции.
А. Примеры антител к DENV и полипептидов, содержащих варианты Fc-областей
Одним из объектов изобретения являются выделенные антитела, которые связываются с DENV и/или белком Е DENV. В конкретных вариантах осуществления изобретения антитело к DENV блокирует связывание DENV и/или белка Е DENV с клеткой-хозяином. В конкретных вариантах осуществления изобретения антитело к DENV ингибирует проникновение DENV в клетку-хозяина. В конкретных вариантах осуществления изобретения антитело к DENV связывается с цельной частицей DENV. В других вариантах осуществления изобретения антитело к DENV связывается с цельной частицей DENV лучше, чем с мономерным белком Е DENV. В конкретных вариантах осуществления изобретения антитело к DENV, предлагаемое в настоящем изобретении, связывается с и/или нейтрализует по меньшей мере один, по меньшей мере два, по меньшей мере три или все четыре серотипа DENV, выбранные из группы, которая состоит из серотипа 1 DENV (DENV-1), серотипа 2 DENV (DENV-2), серотипа 3 DENV (DENV-3) и серотипа 4 DENV 4 (DENV-4). В конкретных вариантах осуществления изобретения антитело к DENV связывается с и/или нейтрализует белок Е DENV, полученный по меньшей мере из одного, по меньшей мере из двух, по меньшей мере из трех или из всех четырех серотипов DENV, выбранные из группы, которая состоит из DENV-1, DENV-2, DENV-3 и DENV-4. Понятие «серотип» относится к различным вариантам вида вируса.
Одним из объектов изобретения является антитело к DENV, которое содержит по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 11-12; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 13-15; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 16-20; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 21-23; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 24-26; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 27-30.
Другим объектом изобретения является антитело к DENV, которое содержит по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45.
Другим объектом изобретения является антитело к DENV, которое содержит по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (а) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30.
Другим объектом изобретения является антитело к DENV, которое содержит по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (а) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27.
Одним из объектов изобретения является антитело, которое содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, выбранные из (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 11-12; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 13-15; и (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 16-20. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 16-20. В другом варианте осуществления изобретения антитело содержит HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 16-20, и HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 27-30. В другом варианте осуществления изобретения антитело содержит HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 16-20, HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 27-30, и HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 13-15. В другом варианте осуществления изобретения антитело содержит (а) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 11-12; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 13-15; и (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 16-20.
Другим объектом изобретения является антитело, которое содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, выбранные из (а) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41; и (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42. В другом варианте осуществления изобретения антитело содержит HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, и HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45. В другом варианте осуществления изобретения антитело содержит HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41. В другом варианте осуществления изобретения антитело содержит (a) HVR-Н1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41; и (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42.
Другим объектом изобретения является антитело, которое содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, выбранные из (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; и (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20. В другом варианте осуществления изобретения антитело содержит HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, и HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30. В другом варианте осуществления изобретения антитело содержит HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, и HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27. В другом варианте осуществления изобретения антитело содержит HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15. В другом варианте осуществления изобретения антитело содержит HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15. В другом варианте осуществления изобретения антитело содержит (a) HVR-Н1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; и (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.
Другим объектом изобретения является антитело, которое содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, выбранные из (a) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 21-23; (б) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 24-26; и (в) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 27-30. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит (a) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 21-23; (б) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 24-26; и (в) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 27-30.
Другим объектом изобретения является антитело, которое содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, выбранные из (а) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43; (б) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44; и (в) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит (а) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43; (б) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44; и (в) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45.
Другим объектом изобретения является антитело, которое содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, выбранные из (а) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; (б) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; и (в) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит (a) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; (б) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; и (в) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30.
Другим объектом изобретения является антитело, которое содержит (a) VH-домен, содержащий меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, выбранные из (I) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 11-12, (II) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 13-15, и (III) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 16-20; и (б) VL-домен, содержащий меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, выбранные из (I) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 21-23, (II) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 24-26, и (III) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 27-30.
Другим объектом изобретения является антитело, которое содержит (a) VH-домен, содержащий меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, выбранные из (I) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40, (II) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, и (III) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42; и (б) VL-домен, содержащий меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, выбранные из (I) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43, (II) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44, и (III) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45.
Другим объектом изобретения является антитело, которое содержит (a) VH-домен, содержащий меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, выбранные из (I) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, (II) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и (III) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; и (б) VL-домен, содержащий меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, выбранные из (I) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, (II) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и (III) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30.
Другим объектом изобретения является антитело, которое содержит (a) VH-домен, содержащий меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, выбранные из (I) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, (II) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и (III) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; и (б) VL-домен, содержащий меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, выбранные из (I) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, (II) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, и (III) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27.
Другим объектом изобретения является антитело, содержащее (а) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 11-12; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 13-15; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 16-20; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 21-23; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 24-26; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 27-30.
Другим объектом изобретения является антитело, содержащее (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45.
Другим объектом изобретения является антитело, содержащее (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30.
Другим объектом изобретения является антитело, содержащее (а) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27.
В конкретных вариантах осуществления изобретения одну или большее количество аминокислот в антителе к DENV, указанном выше, замещают в следующих положениях в HVR: (а) в HVR-H1 (SEQ ID NO: 11) в положениях 2 и 4; (б) в HVR-H2 (SEQ ID NO: 13) в положениях 9 и 10; (в) в HVR-H3 (SEQ ID NO: 16), в положениях 3, 14 и 16; (г) в HVR-L1 (SEQ ID NO: 21) в положениях 5 и 8; (д) в HVR-L2 (SEQ ID NO: 24) в положениях 4 и 7; и (е) в HVR-L3 (SEQ ID NO: 27) в положениях 4 и 5.
В конкретных вариантах осуществления изобретения одна или несколько аминокислотных замен в антителе к DENV представляют собой консервативные замены, указанные в настоящем описании. В конкретных вариантах осуществления изобретения можно осуществлять одну или несколько из указанных ниже замен в любой комбинации: (а) в HVR-H1 (SEQ ID NO: 11) N2Y; I4M; (б) в HVR-H2 (SEQ ID NO: 13) T9R; A10R; (в) в HVR-H3 (SEQ ID NO: 16) R3E; R14F; G16D и L; (г) в HVR-L1 (SEQ ID NO: 21) D5E; K8Q; (д) в HVR-L2 (SEQ ID NO: 24), N4E; T7F; и (е) в HVR-L3 (SEQ ID NO: 27) D4S или Е; D5A.
Все возможные комбинации указанных выше замен включены в консенсусные последовательности SEQ ID NO: 40, 41, 42, 43, 44 и 45 для HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3 соответственно.
В другом варианте осуществления изобретения антитело к DENV, предлагаемое в изобретении, не представляет собой антитело, содержащее (I) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, (II) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (III) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (IV) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, (V) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, и (VI) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27.
Другим объектом изобретения является антитело к DENV, содержащее по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (а) HVR-H1 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6; (б) HVR-H2 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6; (в) HVR-H3 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6; (г) HVR-L1 из последовательности VL, представленной в одной из SEQ ID NO: 8-10; (д) HVR-L2 из последовательности VL, представленной в одной из SEQ ID NOs: 8-10; и (е) HVR-L3 из последовательности VL, представленной в одной из SEQ ID NO: 8-10.
Другим объектом изобретения является антитело к DENV, содержащее по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (а) HVR-H1 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6;
(б) HVR-H2 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6; (в) HVR-H3 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6; (г) HVR-L1 из последовательности VL, представленной в одной из SEQ ID NO: 7; (д) HVR-L2 из последовательности VL, представленной в одной из SEQ ID NO: 7; и (е) HVR-L3 из последовательности VL, представленной в одной из SEQ ID NO: 7.
Другим объектом изобретения является антитело к DENV, содержащее по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (а) HVR-H1 из последовательности VH SEQ ID NO: 6; (б) HVR-H2 из последовательности VH SEQ ID NO: 6; (в) HVR-H3 из последовательности VH SEQ ID NO: 6; (г) HVR-L1 из последовательности VL SEQ ID NO: 10; (д) HVR-L2 из последовательности VL SEQ ID NO: 10; и (е) HVR-L3 из последовательности VL SEQ ID NO: 10.
Другим объектом изобретения является антитело к DENV, содержащее по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (а) HVR-H1 из последовательности VH SEQ ID NO: 6; (б) HVR-H2 из последовательности VH SEQ ID NO: 6; (в) HVR-H3 из последовательности VH SEQ ID NO: 6; (г) HVR-L1 из последовательности VL SEQ ID NO: 7; (д) HVR-L2 из последовательности VL SEQ ID NO: 7; и (е) HVR-L3 из последовательности VL SEQ ID NO: 7.
Другим объектом изобретения является антитело, содержащее меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, выбранные из (а) HVR-H1 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6; (б) HVR-H2 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6; и (в) HVR-H3 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит HVR-H3 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6. В другом варианте осуществления изобретения антитело содержит HVR-H3 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6, и HVR-L3 из последовательности VL, представленной в одной из SEQ ID NO: 8-10. В другом варианте осуществления изобретения антитело содержит HVR-H3 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6, и HVR-L3 из последовательности VL, представленной в SEQ ID NO: 7. В другом варианте осуществления изобретения антитело содержит HVR-H3 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6, HVR-L3 из последовательности VL, представленной в одной из SEQ ID NO: 8-10, и HVR-H2 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6. В другом варианте осуществления изобретения антитело содержит HVR-H3 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6, HVR-L3 из последовательности VL, представленной в SEQ ID NO: 7, и HVR-H2 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6. В другом варианте осуществления изобретения антитело содержит HVR-H3 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6; (б) HVR-H2 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6; и (в) HVR-H3 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6.
Одним из объектов изобретения является антитело, содержащее меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, выбранные из (a) HVR-H1 из последовательности VH SEQ ID NO: 6; (б) HVR-H2 из последовательности VH SEQ ID NO: 6; и (в) HVR-H3 из последовательности VH SEQ ID NO: 6. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит HVR-H3 из последовательности VH SEQ ID NO: 6. В другом варианте осуществления изобретения антитело содержит HVR-H3 из последовательности VH SEQ ID NO: 6 и HVR-L3 из последовательности VH SEQ ID NO: 10. В другом варианте осуществления изобретения антитело содержит HVR-H3 из последовательности VH SEQ ID NO: 6 и HVR-L3 из последовательности VL SEQ ID NO: 7. В другом варианте осуществления изобретения антитело содержит HVR-H3 из последовательности VH SEQ ID NO: 6, HVR-L3 из последовательности VL SEQ ID NO: 10, и HVR-H2 из последовательности VH SEQ ID NO: 6. В другом варианте осуществления изобретения антитело содержит HVR-H3 из последовательности VH SEQ ID NO: 6, HVR-L3 из последовательности VL SEQ ID NO: 7, и HVR-H2 из последовательности VH SEQ ID NO: 6. В другом варианте осуществления изобретения антитело содержит (а) HVR-H1 из последовательности VH SEQ ID NO: 6; (б) HVR-H2 из последовательности VH SEQ ID NO: 6; и (в) HVR-H3 из последовательности VH SEQ ID NO: 6.
Другим объектом изобретения является антитело, содержащее меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, выбранные из (a) HVR-L1 из последовательности VL, представленной в одной из SEQ ID NO: 8-10; (б) HVR-L2 из последовательности VL, представленной в одной из SEQ ID NO: 8-10; и (в) HVR-L3 из последовательности VL, представленной в одной из SEQ ID NO: 8-10. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит (a) HVR-L1 из последовательности VL, представленной в одной из SEQ ID NO: 8-10; (б) HVR-L2 из последовательности VL, представленной в одной из SEQ ID NO: 8-10; и (в) HVR-L3 из последовательности VL, представленной в одной из SEQ ID NO: 8-10.
Другим объектом изобретения является антитело, содержащее меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, выбранные из (а) HVR-L1 из последовательности VL SEQ ID NO: 10; (б) HVR-L2 из последовательности VL SEQ ID NO: 10; и (в) HVR-L3 из последовательности VL SEQ ID NO: 10. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит (а) HVR-L1 из последовательности VL SEQ ID NO: 10; (б) HVR-L2 из последовательности VL SEQ ID NO: 10; и (в) HVR-L3 из последовательности VL SEQ ID NO: 10.
Другим объектом изобретения является антитело, содержащее (a) VH-домен, который содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, выбранные из (I) HVR-H1 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6, (II) HVR-H2 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6, и (III) HVR-H3 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6; и (б) VL-домен, который содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, выбранные из (I) HVR-L1 из последовательности VL, представленной в одной из SEQ ID NO: 8-10, (II) HVR-L2 из последовательности VL, представленной в одной из SEQ ID NO: 8-10, и (III) HVR-L3 из последовательности VL, представленной в одной из SEQ ID NO: 8-10.
Другим объектом изобретения является антитело, содержащее (a) VH-домен, который содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, выбранные из (I) HVR-H1 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6, (II) HVR-H2 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6, и (III) HVR-H3 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6; и (б) VL-домен, который содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности VL HVR, выбранные из (I) HVR-L1 из последовательности VL, представленной в SEQ ID NO: 7, (II) HVR-L2 из последовательности VL, представленной в SEQ ID NO: 7, и (III) HVR-L3 из последовательности VL, представленной в SEQ ID NO: 7.
Другим объектом изобретения является антитело, содержащее (a) VH-домен, который содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, выбранные из (I) HVR-H1 из последовательности VH SEQ ID NO: 6, (II) HVR-H2 из последовательности VH SEQ ID NO: 6, и (III) HVR-H3 из последовательности VH SEQ ID NO: 6; и (б) VL-домен, который содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, выбранные из (I) HVR-L1 из последовательности VL SEQ ID NO: 10, (II) HVR-L2 из последовательности VL SEQ ID NO: 10, и (III) HVR-L3 из последовательности VL SEQ ID NO: 10.
Другим объектом изобретения является антитело, содержащее (a) VH-домен, который содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, выбранные из (I) HVR-H1 из последовательности VH SEQ ID NO: 6, (II) HVR-H2 из последовательности VH SEQ ID NO: 6, и (III) HVR-H3 из последовательности VH SEQ ID NO: 6; и (б) VL-домен, который содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, выбранные из (I) HVR-L1 из последовательности VL SEQ ID NO: 7, (II) HVR-L2 из последовательности VL SEQ ID NO: 7, и (III) HVR-L3 из последовательности VL SEQ ID NO: 7.
Другим объектом изобретения является антитело, содержащее (а) HVR-H1 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6; (б) HVR-H2 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6; (в) HVR-H3 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6; (г) HVR-L1 из последовательности VL, представленной в одной из SEQ ID NO: 8-10; (д) HVR-L2 из последовательности VL, представленной в одной из SEQ ID NO: 8-10; и (е) HVR-L3 из последовательности VL, представленной в одной из SEQ ID NO: 8-10.
Другим объектом изобретения является антитело, содержащее (a) HVR-H1 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6; (б) HVR-H2 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6; (в) HVR-H3 из последовательности VH, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6; (г) HVR-L1 из последовательности VL, представленной в SEQ ID NO: 7; (д) HVR-L2 из последовательности VL, представленной в SEQ ID NO: 7; и (е) HVR-L3 из последовательности VL, представленной в SEQ ID NO: 7.
Другим объектом изобретения является антитело, содержащее (а) HVR-H1 из последовательности VH SEQ ID NO: 6; (б) HVR-H2 из последовательности VH SEQ ID NO: 6; (в) HVR-H3 из последовательности VH SEQ ID NO: 6; (г) HVR-L1 из последовательности VL SEQ ID NO: 10; (д) HVR-L2 из последовательности VL SEQ ID NO: 10; и (е) HVR-L3 из последовательности VL SEQ ID NO: 10.
Другим объектом изобретения является антитело, содержащее (а) HVR-H1 из последовательности VH SEQ ID NO: 6; (б) HVR-H2 из последовательности VH SEQ ID NO: 6; (в) HVR-H3 из последовательности VH SEQ ID NO: 6; (г) HVR-L1 из последовательности VL SEQ ID NO: 7; (д) HVR-L2 из последовательности VL SEQ ID NO: 7; и (е) HVR-L3 из последовательности VL SEQ ID NO: 7.
Согласно другому объекту изобретения антитело к DENV, предлагаемое в изобретении, не представляет собой антитело, содержащее (I) HVR-H1 из последовательности VH SEQ ID NO: 1, (II) HVR-H2 из последовательности VH SEQ ID NO: 1, (III) HVR-H3 из последовательности VH SEQ ID NO: 1, (IV) HVR-L1 из последовательности VL SEQ ID NO: 7, (V) HVR-L2 из последовательности VL SEQ ID NO: 7, и (VI) HVR-L3 из последовательности VL SEQ ID NO: 7.
В любом из указанных выше вариантов осуществления изобретения антитело к DENV может быть гуманизированным. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к DENV содержит HVR, представленные в любом из указанных выше вариантов осуществления изобретения, и дополнительно содержит человеческий акцепторный каркасный участок, например, каркасный участок человеческого иммуноглобулина или человеческий консенсусный каркасный участок. В другом варианте осуществления изобретения антитело к DENV содержит HVR, представленные в любом из указанных выше вариантов осуществления изобретения, и дополнительно содержит VH или VL, содержащую последовательность FR. В другом варианте осуществления изобретения антитело к DENV содержит указанные ниже последовательности FR вариабельного домена тяжелой цепи и/или легкой цепи: В вариабельном домене тяжелой цепи FR1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31, FR2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, FR3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33 или 34, FR4 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35. В вариабельном домене легкой цепи FR1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, FR2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, FR3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, FR4 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39.
Согласно другому объекту изобретения антитело к DENV содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), идентичную по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности, представленной в одной из SEQ ID NO: 2-6. В конкретных вариантах осуществления изобретения последовательность VH, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции по сравнению с референс-последовательностью, но антитело к DENV, содержащее эту последовательность, сохраняет способность к связыванию с DENV. В конкретных вариантах осуществления изобретения в любой из SEQ ID NO: 2-6 в общей сложности от 1 до 10 аминокислот заменены, встроены путем инсерции и/или удалены путем делеции. В конкретных вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции имеют место в областях, находящихся вне HVR (а именно, в FR). Необязательно антитело к DENV содержит последовательность VH, представленную в одной из SEQ ID NO: 2-6, включая посттрансляционные модификации указанной последовательности. В конкретном варианте осуществления изобретения VH содержит один, два или три HVR, выбранных из: (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 11-12, (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 13-15, и (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 16-20. Посттрансляционные модификации включают (но, не ограничиваясь только ими) модификацию путем пироглутамилирования глутамина или глутамата в N-концевой области тяжелой цепи или легкой цепи в пироглутамовую кислоту.
Согласно другому объекту изобретения антитело к DENV содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), идентичную по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6. В конкретных вариантах осуществления изобретения последовательность VH, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции по сравнению с референс-последовательностью, но антитело к DENV, содержащее такую последовательность, сохраняет способность к связыванию с DENV. В конкретных вариантах осуществления изобретения в SEQ ID NO: 6 заменены, встроены путем инсерции и/или уделены путем делеции в общей сложности от 1 до 10 аминокислот. В конкретном варианте осуществления изобретения замены, инсерции или делеции имеют место в областях, находящихся вне HVR (т.е. в FR). Необязательно антитело к DENV содержит последовательность VH SEQ ID NO: 6, включая посттрансляционные модификации указанной последовательности. В конкретном варианте осуществления изобретения VH содержит один, два или три HVR, выбранные из: (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15 и (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20. Посттрансляционные модификации включают (но, не ограничиваясь только ими) модификацию путем пироглутамилирования глутамина или глутамата в N-концевой области тяжелой цепи или легкой цепи в пироглутамовую кислоту.
Другим объектом изобретения является антитело к DENV, где антитело содержит вариабельный домен легкой цепи (VL), последовательность которого идентична по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности, представленной в одной из SEQ ID NO: 8-10. В конкретных вариантах осуществления изобретения последовательность VL, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции по сравнению с референс-последовательностью, но антитело к DENV, содержащее такую последовательность, сохраняет способность к связыванию с DENV. В конкретных вариантах осуществления изобретения в любой из SEQ ID NO: 8-10 замещены, встроены путем инсерции и/или уделены путем делеции в общей сложности от 1 до 10 аминокислот. В конкретном варианте осуществления изобретения замены, инсерции или делеции имеют место в областях, находящихся вне HVR (т.е. в FR). Необязательно антитело к DENV содержит последовательность VL в любой из SEQ ID NO: 8-10, включая посттрансляционные модификации указанной последовательности. В конкретном варианте осуществления изобретения VL содержит один, два или три HVR, выбранные из (a) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 21-23; (б) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 24-26; и (в) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 27-30. Посттрансляционные модификации включают (но, не ограничиваясь только ими) модификацию путем пироглутамилирования глутамина или глутамата в N-концевой области тяжелой цепи или легкой цепи в пироглутамовую кислоту.
Другим объектом изобретения является антитело к DENV, где антитело содержит вариабельный домен легкой цепи (VL), последовательность которого идентична по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10. В конкретных вариантах осуществления изобретения последовательность VL, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции по сравнению с референс-последовательностью, но антитело к DENV, содержащее такую последовательность, сохраняет способность к связыванию с DENV. В конкретных вариантах осуществления изобретения в SEQ ID NO: 10 заменены, встроены путем инсерции и/или уделены путем делеции в общей сложности от 1 до 10 аминокислот. В конкретном варианте осуществления изобретения замены, инсерции или делеции имеют место в областях, находящихся вне HVR (т.е. в FR). Необязательно антитело к DENV содержит последовательность VL SEQ ID NO: 10, включая посттрансляционные модификации указанной последовательности. В конкретном варианте осуществления изобретения VL содержит один, два или три HVR, выбранные из (a) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; (б) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; и (в) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30. Посттрансляционные модификации включают (но, не ограничиваясь только ими) модификацию путем пироглутамилирования глутамина или глутамата в N-концевой области тяжелой цепи или легкой цепи в пироглутамовую кислоту.
Другим объектом изобретения является антитело к DENV, где антитело содержит VH, представленную в одном из указанных выше вариантов осуществления изобретения, и VL, представленную в одном из указанных выше вариантов осуществления изобретения. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит последовательности VH и VL, представленные в одной из SEQ ID NO: 2-6 и в одной из SEQ ID NO: 8-10 соответственно, включая посттрансляционные модификации указанных последовательностей. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит последовательности VH и VL, представленные в одной из SEQ ID NO: 2-6 и SEQ ID NO: 7 соответственно, включая посттрансляционные модификации указанных последовательностей. Посттрансляционные модификации включают (но, не ограничиваясь только ими) модификацию путем пироглутамилирования глутамина или глутамата в N-концевой области тяжелой цепи или легкой цепи в пироглутамовую кислоту.
Другим объектом изобретения является антитело к DENV, где антитело содержит VH, представленную в одном из указанных выше вариантов осуществления изобретения, и VL, представленную в одном из указанных выше вариантов осуществления изобретения. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит последовательности VH и VL, представленные в SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10 соответственно, включая посттрансляционные модификации указанных последовательностей. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит последовательности VH и VL, представленные в SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7 соответственно, включая посттрансляционные модификации указанных последовательностей. Посттрансляционные модификации включают (но, не ограничиваясь только ими) модификацию путем пироглутамилирования глутамина или глутамата в N-концевой области тяжелой цепи или легкой цепи в пироглутамовую кислоту.
Другим объектом изобретения является антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело к DENV, представленное в настоящем описании. В конкретных вариантах осуществления изобретения предложено антитело, которое связывается с эпитопом, содержащим по меньшей мере одну, по меньшей мере две, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь аминокислот или все аминокислоты, выбранные из группы, которая состоит из G100, W101, K122, I162, S274, K310, W391, F392, на белке Е DENV-2. В конкретных вариантах осуществления изобретения предложено антитело, которое связывается с эпитопом, содержащим по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все аминокислоты, выбранные из группы, которая состоит из K122, I162 и S274, на белке Е DENV-2. В конкретных вариантах осуществления изобретения предложено антитело, которое связывается с эпитопом, дополнительно содержащим по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из группы, которая состоит из G100, W101, K310, W391 и F392, когда эпитоп содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все аминокислоты, выбранные из группы, которая состоит из K122, I162 и S274.
2
Согласно другому объекту изобретения антитело к DENV, предлагаемое в одном из указанных выше вариантов осуществления изобретения, представляет собой моноклональное антитело, включая химерное, гуманизированное или человеческое антитело. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к DENV представляет собой фрагмент антитела, например, Fv-, Fab-, Fab'-, scFv-фрагмент, димерное антитело или F(аb')-фрагмент. В другом варианте осуществления изобретения антитело представляет собой полноразмерное антитело, например, интактное антитело IgG1-класса или антитело другого класса или изотипа, указаное в настоящем описании.
Согласно другому объекту изобретения антитело к DENV, предлагаемое в изобретении, имеет модификацию, которая аннулирует связывание антител с Fc-гамма-рецепторами (FcγR). Не вдаваясь в конкретную теорию, можно считать, что модификация, которая аннулирует связывание антител с Fc-гамма-рецепторами, может оказаться предпочтительной, поскольку снижение связывания с FcR позволяет избегать феномена ADE (антителозависимого усиления инфекции), который, по-видимому, опосредуется в основном взаимодействием с FcR. В одном из вариантов осуществления изобретения Fc-область антитела к DENV, предлагаемого в изобретении, содержит Ala в положении 234 и Ala в положении 235 согласно EU-нумерации.
Согласно следующему объекту изобретения антитело к DENV, представленное в одном из указанных выше вариантов осуществления изобретения, может обладать любыми признаками, представленными ниже в разделах 1-7, индивидуально или в комбинации:
1. Аффинность антител
-8
-8
-13
-9
-13
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, представленное в настоящем описании, имеет величину константы диссоциации (Kd), составляющую 1 мкМ или менее, 100 нМ или менее, 10 нМ или менее, 1 нМ или менее, 0,1 нМ или менее, 0,01 нМ или менее, или 0,001 нМ или менее (например 10 М или менее, например, от 10 М до 10 М, например, от 10 М до 10 М).
125

125

В одном из вариантов осуществления величину Kd измеряют с помощью анализа связывания несущего радиоактивную метку антигена (РИА). В одном из вариантов осуществления изобретения РИА осуществляют с использованием Fab-версии представляющего интерес антитела и его антигена. Например, измеряют в растворе аффинность связывания Fab с антигеном путем уравновешивания Fab минимальной концентрацией меченного I антигена в присутствии полученных титрованием разведений немеченого антигена, осуществляя затем «захват» связанного антигена на сенсибилизированном антителом к Fab планшете (см., например, Chen и др., J. Mol Biol 293, 1999, сс. 865-881). Для обеспечения условий, необходимых для проведения анализа, многолуночные планшеты MICROTITER (фирма Thermo Scientific) сенсибилизируют в течение ночи захватывающим антителом к Fab (фирма Cappel Labs) в концентрации 5 мкг/мл в 50 мМ карбонате натрия (рН 9,6) и затем блокируют с помощью 2% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина в ЗФР в течение 2-5 ч при комнатной температуре (примерно 23°С). В неадсорбирующем планшете (фирма Nunc, №269620) смешивают взятый в концентрации 100 или 26 пМ меченный с помощью I антиген с серийными разведениями представляющего интерес Fab (например, пригодного для оценки антитела к VEGF, Fab-12, см. Presta и др., Cancer Res. 57, 1997, сс. 4593-4599). Затем представляющий интерес Fab инкубируют в течение ночи; однако инкубацию можно осуществлять в течение более продолжительного периода времени (например, в течение примерно 65 ч) для того, чтобы гарантировать достижение равновесия. После этого смеси переносят в планшет для захвата и инкубируют при комнатной температуре (например, в течение 1 ч). Затем раствор удаляют и планшет промывают восемь раз, используя 0,1% полисорбат 20 (TWEEN-20) в ЗФР. После просушки планшетов в них добавляют по 150 мкл/лунку сцинтилляционной жидкости ((MICROSCINT-20™; фирма Packard) и осуществляют считывание планшетов с помощью гамма-счетчика TOPCOUNT™ (фирма Packard) в течение 10 мин. Для осуществления анализа связывания в условиях конкуренции выбирают концентрации каждого Fab, обеспечивающие уровень связывания, составляющий менее или равный 20% от максимального.

6
-1
-1
on
off
off
on
В другом варианте осуществления изобретения Kd измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса с помощью устройства BIACORE. Например, анализ осуществляют с помощью устройства BIACORE-2000 или BIACORE-3000 (фирма GE Healthcare Inc., Пискатавей, шт. Нью-Джерси) при 25°С с использованием антигена, иммобилизованного на СМ5-чипах с уровнем иммобилизации, соответствующим ~10 единицам ответа (RU). В одном из вариантов осуществления изобретения биосенсорные чипы из карбоксиметилированного декстрана (СМ5, фирма GE Healthcare Inc.) активируют с помощью гидрохлорида N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS) согласно инструкциям поставщика. Антиген разводят 10 мМ ацетатом натрия, рН 4,8, до концентрации 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) перед инъекцией со скоростью потока 5 мкл/мин для достижения уровня иммобилизации, соответствующего примерно 10 единицам ответа (RU) сшитого белка. После инъекции антигена инъецируют 1М этаноламин для блокады непрореагировавших групп. Для кинетических измерений инъецируют двукратные серийные разведения Fab (от 0,78 до 500 нМ) в ЗФР, дополненном 0,05% полисорбата 20 (TWEEN-20™) в качестве сурфактанта (ЗФРТ), при 25°С со скоростью потока примерно 25 мкл/мин. Скорость реакции ассоциации (k) и реакции диссоциации (k) рассчитывают с использованием простой модели связывания Ленгмюра 1:1 (программное обеспечение Evaluation версия 3.2, BIACORE) путем одновременной аппроксимации сенсограмм ассоциации и диссоциации. Константу равновесия реакции диссоциации (Kd) рассчитывают как соотношение k/k (см., например, Chen и др., J Mol Biol 293, 1999, сс. 865-881). Если скорость реакции ассоциации превышает 10 М с при оценке с помощью описанного выше метода поверхностного плазмонного резонанса, то скорость реакции ассоциации можно определять с помощью метода гашения флуоресценции, который позволяет измерять повышение или снижение интенсивности излучения флуоресценции (длина волны возбуждения 295 нм; длина волны испускания 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25°С, применяя в концентрации 20 нМ антитело к антигену (Fab-формат) в ЗФР, рН 7,2, в присутствии возрастающих концентраций антигена, осуществляя измерения с помощью спектрометра, такого как спектрофотометр, снабженный блоком для остановки потока (фирма Aviv Instruments), или спектрофотометр SLM-AMINCO™ серия 8000 (фирма ThermoSpectronic), при перемешивании содержимого кюветы.
2. Фрагменты антител
2
2
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, представляет собой фрагмент антитела. Фрагменты антител включают (но, не ограничиваясь только ими) такие фрагменты как Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab'), Fv и scFv и другие описанные ниже фрагменты. Обзор некоторых фрагментов антител см., у Hudson и др., Nat. Med. 9, 2003, сс. 129-134. Обзор scFv-фрагментов см., например, у Plueckthun в: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, под ред. Rosenburg и Moore, изд-во Springer, New York, т. 113, 1994, сс. 269-315; см. также WO 93/16185; и US №№5571894 и 5587458. Обсуждение, касающееся Fab- и Е(аb')-фрагментов, которые содержат остатки эпитопа, связывающегося с рецептором спасения, и обладают удлиненным временем полужизни in vivo, см. в US №5869046.
Димерные антитела представляют собой фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими центрами, которые могут быть двухвалентными или биспецифическими (см., например, ЕР 0404097; WO 1993/01161; Hudson и др., Nat. Med. 9, 2003, сс. 129-134; и Holliger и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, сс. 6444-6448). Тримерные и тетрамерные антитела описаны также у Hudson и др., Nat. Med. 9, 2003, сс. 129-134).
Однодоменные антитела представляют собой фрагменты антител, содержащие весь вариабельный домен тяжелой цепи антитела или его часть, или весь вариабельный домен легкой цепи антитела или его часть. В некоторых вариантах осуществления изобретения однодоменное антитело представляет собой человеческое однодоменное антитело (фирма Domantis, Inc., Уолтхэм, шт. Массачусетс; см., например, US №6248516 В1).
Фрагменты антител можно создавать различными методиками, включая (но, не ограничиваясь только ими) протеолитическое расщепление интактного антитела, а также получать с помощью рекомбинантных клеток-хозяев (например, Е. coli или фаг), указанных в настоящем описании.
3. Химерные и гуманизированные антитела
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, указанное в настоящем описании, представляет собой химерное антитело. Некоторые химерные антитела описаны, например, в US №4816567; и у Morrison и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, сс. 6851-6855. В одном из примеров химерное антитело содержит нечеловеческую вариабельную область (например, вариабельную область из антител мышей, крыс, хомяков, кроликов или приматов кроме человека, таких как обезьяны) и человеческую константную область. В другом примере химерное антитело представляет собой антитело «переключенного класса», класс или подкласс которого был изменен относительно родительского антитела. Химерные антитела включают их антигенсвязывающие фрагменты.
В некоторых вариантах осуществления изобретения химерное антитело представляет собой гуманизированное антитело. Как правило, нечеловеческое антитело гуманизируют для снижения иммуногенности для людей, сохраняя при этом специфичность и аффинность родительского нечеловеческого антитела. Как правило, гуманизированное антитело содержит один или несколько вариабельных доменов, в которых HVR, например, CDR (или их участки), получают из нечеловеческого антитела, a FR (или их участки) получают из последовательностей человеческого антитела. Гуманизированное антитело необязательно может содержать по меньшей мере часть человеческой константной области. В некоторых вариантах осуществления изобретения некоторые остатки FR в гуманизированном антителе заменены на соответствующие остатки из нечеловеческого антитела (например, антитела, из которого происходят остатки HVR), например, для сохранения или улучшения специфичности или аффинности антитела.
Сведения о гуманизированных антителах и методах их создания обобщены, например, у Almagro, Front. Biosci. 13, 2008, сс. 1619-1633, и описаны также у Riechmann и др., Nature 332, 1988, сс. 323-329; Queen и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, сс. 10029-10033; US №№5821337, 7527791, 6982321 и 7087409; Kashmiri и др., Methods 36, 2005, сс. 25-34 (описание трансплантации SDR (а-CDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28, 1991, cc. 489-498 (описание «нанесения нового покрытия»); Dall'Acqua и др., Methods 36, 2005, сс. 43-60 (описание «перестановки FR»); и Osbourn и др., Methods 36, 2005, сс. 61-68 и Klimka и др., Br. J. Cancer 83, 2000, сс. 252-260 (описание подхода «направленной селекции» для перестановки FR).
Человеческие каркасные участки, которые можно применять для гуманизации, включают (но, не ограничиваясь только ими): каркасные участки, выбранные с использованием методов «наилучшего подбора» (см., например, Sims и др., J. Immunol. 151, 1993, сс. 2296-2308; каркасные участки, происходящие из консенсусной последовательности конкретной подгруппы вариабельных областей легких и тяжелых цепей человеческих антител (см., например, Carter и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1992, cc. 4285-4289 и Presta и др., J. Immunol. 151, 1993, cc. 2623-2632); человеческие зрелые (с соматическими мутациями) каркасные области или каркасные области человеческой зародышевой линии (см., например, Almagro и Fransson, Front. Biosci. 13, 2008, с. 1619-1633); и каркасные участки, полученные в результате скрининга FR-библиотек (см., например, Васа и др., J. Biol. Chem. 272, 1997, сс. 10678-10684 и Rosok и др., J. Biol. Chem. 271, 1996, сс. 22611-22618).
4. Человеческие антитела
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, представляет собой человеческое антитело. Человеческие антитела можно получать, используя различные методики, известные в данной области. Человеческие антитела описаны в целом у van Dijk и van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5, 2001, cc. 368-374 и Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20, 2008, cc. 450-459.
Человеческие антитела можно получать путем введения иммуногена трансгенному животному, модифицированному таким образом, чтобы оно продуцировало интактные человеческие антитела или интактные антитела с человеческими вариабельными областями в ответ на контрольное заражение антигеном. Указанные животные, как правило, содержат все или часть локусов человеческого иммуноглобулина вместо эндогенных иммуноглобулиновых локусов, которые либо присутствуют вне хромосом, либо интегрированы произвольно в хромосомы животного. У таких трангенных мышей эндогенные иммуноглобулиновые локусы, как правило, инактивированы. Обзор методов получения человеческих антител в трансгенных животных см. у Lonberg, Nat. Biotech. 23, 2005, сс. 1117-1125 (см., например, также в US №6075181 и US №6150584 описание технологии XENOMOUSE™; в US №5770429 описание технологии HUMAB; в US №7041870 описание технологии K-М MOUSE и в публикации заявки на патент США 2007/0061900 описание технологии VELOCIMOUSE). Человеческие вариабельные области из интактных антител, полученных с помощью указанных животных, можно дополнительно модифицировать, например, путем объединения с другой человеческой константной областью.
Человеческие антитела можно создавать с помощью методов на основе гибридом. Описаны клеточные линии человеческой миеломы и мышиной-человеческой гетеромиеломы, предназначенные для получения человеческих моноклональных антител (см., например, Kozbor, J. Immunol. 133, 1984, сс. 3001-3005; Brodeur и др., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, изд-во Marcel Dekker, Inc., New York, 1987, cc. 51-63 и Boerner и др., J. Immunol. 147, 1991, сс. 86-95). Человеческие антитела, созданные с использованием технологии на основе человеческих В-клеточных гибридом, описаны также у Li и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 2006, cc. 3557-3562. Дополнительные методы включают методы, описанные, например, в US №7189826 (описание получения моноклональных человеческих антител типа IgM из клеточных линий гибридом), и у Ni, Xiandai Mianyixue 26, 2006, сс. 265-268 (описание человеческих-человеческих гибридом). Технология человеческих гибридом (технология Trioma) описана также у Vollmers и Brandlein, Histology and Histopathology 20, 2005, cc. 927-937 и Vollmers и Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27, 2005, cc. 185-191.
Человеческие антитела можно создавать также путем выделения последовательностей вариабельных доменов Fv-клонов, выбранных из фаговых дисплейных библиотек, для создания которых использовали человеческие антитела. Указанные последовательности вариабельных доменов затем можно объединять с требуемым человеческим константным доменом. Методики отбора человеческих антител из библиотек антител описаны ниже.
5. Антитела, полученные из библиотек
Антитела, предлагаемые в изобретении, можно выделять путем скрининга комбинаторных библиотек антител с требуемой активностью или видами активности. Например, в данной области известны разнообразные методы для создания фаговых дисплейных библиотек и скрининга указанных библиотек в отношении антител, обладающих требуемыми характеристиками связывания. Указанные методы обобщены, например, у Hoogenboom и др., Methods in Molecular Biology 178, 2001, cc. 1-37, и описаны также, например, у McCafferty и др., Nature 348, 1990, сс. 552-554; Clackson и др., Nature 352, 1991, сс. 624-628; Marks и др., J. Mol. Biol. 222, 1992, сс. 581-597; Marks и Bradbury, Methods in Molecular Biology 248, 2003, cc. 161-175; Sidhu и др., J. Mol. Biol. 338, 2004, cc. 299-310; Lee и др., J. Mol. Biol. 340, 2004, cc. 1073-1093; Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 2004, cc. 12467-12472 и Lee и др., J. Immunol. Methods 284, 2004, cc. 119-132.
При осуществлении некоторых методов фагового дисплея популяции VH- и VL-генов клонируют по отдельности с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и рекомбинируют произвольно в фаговых библиотеках, которые затем подвергают скринингу в отношении антигенсвязывающего фага согласно методу, описанному у Winter и др., Ann. Rev. Immunol. 12, 1994, сс. 433-455. Фаг, как правило, экспонирует фрагменты антител либо в виде одноцепочечных Fv-фрагментов (scFv), либо в виде Fab-фрагментов. Библиотеки, полученные из иммунизированных источников, включают антитела, обладающие высокой аффинностью к иммуногену, при этом отсутствует необходимость в создании гибридом. Альтернативно этому, можно клонировать необработанную («наивную») популяцию (например, из организма человека), получая один источник антител к широкому спектру чужих, а также своих антигенов без какой-либо иммунизации, что описано у Griffiths и др., EMBO J, 12, 1993, сс. 725-734. И, наконец, «наивные» библиотеки можно получать также методами синтеза путем клонирования неперегруппированных сегментов V-гена из стволовых клеток и с помощью ПЦР-праймеров, содержащих случайную последовательность, для кодирования гипервариабельных CDR3-участков и для осуществления перегруппировки in vitro согласно методу, описанному у Hoogenboom и Winter, J. Mol. Biol. 227, 1992, cc. 381-388. Фаговые библиотеки человеческих антител описаны, например, в следующих патентных публикациях US №5750373 и публикациях заявок на патент США 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 и 2009/0002360.
Антитела или фрагменты антител, выделенные из библиотек человеческих антител, рассматриваются как человеческие антитела или фрагменты человеческих антител.
6. Мультиспецифические антитела
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, указанное в настоящем описании, представляет собой мультиспецифическое антитело, например, биспецифическое антитело. Мультиспецифические антитела представляют собой моноклональные антитела, которые имеют специфичности, связывающиеся по меньшей мере с двумя различными сайтами. В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из связывающих специфичностей обеспечивает связывание с белком Е DENV, а другая с любым другим антигеном. В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифические антитела могут связываться с двумя различными эпитопами белка Е DENV. Биспецифические антитела можно применять также для локализации цитотоксических агентов в клетках, которые экспрессируют белок Е DENV. Биспецифические антитела можно получать в виде полноразмерных антител или фрагментов антител.
Методики создания мультиспецифических антител включают (но, не ограничиваясь только ими) рекомбинантную совместную экспрессию двух пар тяжелых цепей-легких цепей иммуноглобулинов, обладающих различными специфичностями (см. Milstein и Cuello, Nature 305, 1983, сс. 537-540, WO 93/08829 и Traunecker и др., EMBO J. 10, 1991, сс. 3655-3659), и технологию «knob-in-hole» (обеспечение взаимодействия по типу «выступ-во впадину», см., например, US №5731168). Мультиспецифические антитела можно получать также путем создания регулируемых электростатических воздействий для получения молекул антитела с гетеродимерными Fc (WO 2009/089004); перекрестного связывания двух или большего количества антител или фрагментов (см., например, US №4676980 и Brennan и др., Science 229, 1985, сс. 81-83); применения лейциновых молний для получения биспецифических антител (см., например, Kostelny и др., J. Immunol. 148, 1992, сс. 1547-1553); применения технологии «димерных антител (диабоди)» для создания фрагментов биспецифических антител (см., например, Holliger и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, cc. 6444-6448); и применения димеров одноцепочечных Fv (sFv) (см., например, Gruber и др., J. Immunol. 152, 1994, сс. 5368-5374); и получения триспецифических антител согласно методу, описанному, например, у Tutt и др., J. Immunol. 147, 1991, сс. 60-69).
Под объем настоящего изобретения подпадают также сконструированные антитела с тремя или большим количеством функциональных антигенсвязывающих сайтов, включая «антитела-осьминоги» (см., например, US 2006/0025576 А1).
Антитело или его фрагмент может включать также «Fab двойного действия» или «DAF», содержащий антигенсвязывающий сайт, который связывается с DENV, а также с другим, отличным от него антигеном (см., например, US 2008/0069820).
7. Варианты антител
Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к вариантам аминокислотных последовательностей антител, представленных в настоящем описании. Например, может требоваться повышать аффинность связывания и/или другие биологические свойства антитела. Варианты аминокислотной последовательности антитела можно получать путем интродукции соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, или путем синтеза пептидов. Указанные модификации включают, например, делеции и/или инсерции, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Для получения конечной конструкции можно использовать любую комбинацию делеций, инсерций и замен, при условии, что конечная конструкция обладает требуемыми характеристиками, например, способностью связываться с антигеном.
а) Варианты, полученные путем замены, инсерции и делеции
Некоторыми вариантами осуществления изобретения являются варианты антител, которые имеют одну или несколько аминокислотных замен. Сайты, представляющие интерес для замещающего мутагенеза, включают HVR и FR. Консервативные замены представлены ниже в таблице 1 под заголовком «предпочтительные замены». Более важные замены представлены в таблице 1 под заголовком «приведенные в качестве примера замены», и они даны ниже со ссылкой на классы боковых цепей аминокислот. Аминокислотные замены можно интродуцировать в представляющее интерес антитело и продукты подвергать скринингу в отношении требуемой активности, например, сохранения/повышения способности к связыванию антигена, пониженной иммуногенности или повышенной ADCC или CDC.
Аминокислоты можно группировать на основе общих свойств боковых цепей следующим образом:
(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) кислотные: Asp, Glu;
(4)  His, Lys, Arg;
(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro;
(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.
Под неконсервативными заменами подразумевают замену представителя одного из указанных классов на представителя из другого класса.
Один из типов полученного в результате замены варианта включает замен одного или нескольких остатков гипервариабельного участка родительского антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела). Как правило, полученный(ые) в результате вариант(ы), отобранный(ые) для дополнительного исследования, должен(ы) иметь модификации (например, улучшения) некоторых биологических свойств (например, повышенную аффинность, пониженную иммуногенность) относительно родительского антитела, и/или должен(ы) иметь практически сохраненные определенные биологические свойства родительского антитела. Примером полученного в результате замены варианта является антитело с созревшей аффинностью, которое можно создавать, например, с использованием технологий созревания аффинности на основе фагового дисплея, например, указанных в настоящем описании. В целом, метод состоит в следующем: один или несколько остатков HVR подвергают мутации и варианты антител экспонируют на фаге и подвергают скринингу в отношении конкретной биологической активности (например, аффинности связывания).
Изменения (например, замены) можно осуществлять в HVR, например, для повышения аффинности антитела. Указанные изменения можно делать в «горячих (активных) точках» в HVR, т.е. остатках, кодируемых кодонами, которые с высокой частотой подвергаются мутации в процессе соматического созревания (см., например, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207, 2008, cc. 179-196), и/или в остатках, которые контактируют с антигеном, с последующим тестированием варианта VH или VL в отношении аффинности связывания. Созревание аффинности путем создания и повторной селекции из вторичных библиотек описано, например, у Hoogenboom и др., Methods in Molecular Biology 178, 2002, cc. 1-37. В некоторых вариантах осуществления процесса созревания аффинности интродуцируют разнообразие в гены вариабельной области, выбранные для созревания, с помощью любого из широкого разнообразия методов (например, ПЦР пониженной точности, перестановка цепи или сайтнаправленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов). Затем создают вторичную библиотеку. Затем библиотеку подвергают скринингу для идентификации любых вариантов антител с требуемой аффинностью. Другой метод, применяемый для интродукции разнообразия, включает подходы, мишенью которых является HVR, при которых рандомизируют несколько остатков HVR (например, одновременно 4-6 остатков). Остатки HVR, участвующие в связывании антигена, можно специфически идентифицировать, например, используя аланин-сканирующий мутагенез или моделирование. Часто мишенями являются, прежде всего, CDR-H3 и CDR-L3.
В некоторых вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции могут затрагивать один или несколько HVR, если указанные изменения не снижают существенно способность антитела связываться с антигеном. Например, в HVR могут быть сделаны консервативные изменения (например, консервативные замены, указанные в настоящем описании), которые не снижают существенно аффинность связывания. Указанные изменения, например, могут находиться вне принимающих участие в контактировании с антигеном остатков HVR. В некоторых вариантах осуществления изобретения в последовательностях вариантов VH и VL, указанных выше, каждый HVR либо является неизмененным, либо содержит не более одной, двух или трех аминокислотных замен.
Ценным методом идентификации остатков или областей антитела, которые можно подвергать мутагенезу, является так называемый «аланин-сканирующий мутагенез», описанный у Cunningham и Wells, Science 244, 1989, сс. 1081-1085. При осуществлении этого метода остаток или группу остатков-мишеней (например, заряженные остатки, такие как arg, asp, his, lys и glu) идентифицируют и заменяют на нейтральную или отрицательно заряженную аминокислоту (например, аланин или полиаланин) для решения вопроса о том, будет ли это влиять на взаимодействие антитела с антигеном. Дополнительные замены можно интродуцировать в те положения аминокислот, для которых продемонстрирована функциональная чувствительность к начальным заменам. В альтернативном или дополнительном варианте можно анализировать кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело для идентификации точек контакта между антителом и антигеном. Указанные контактирующие остатки и соседние остатки можно рассматривать в качестве мишеней или исключать из рассмотрения в качестве кандидатов для замены. Варианты можно подвергать скринингу для решения вопроса о том, обладают ли они требуемыми свойствами.
Инсерции в аминокислотные последовательности включают амино- и/или карбоксиконцевые слияния, варьирующие по длине от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или большее количество остатков, а также инсерции одного или нескольких аминокислотных остатков внутрь последовательности. Примером результата осуществления концевых инсерции является антитело с N-концевым метионильным остатком. Другие инсерционные варианты молекул антител включают слияние N- или С-концов антитела с ферментом (например, для ADEPT (антитело-направляемый фермент пролекарственной терапии) или полипептидом, который удлиняет время полужизни антитела в сыворотке.
б) Варианты гликозилирования
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, изменяют с целью повышения или понижения степени гликозилирования антитела. Добавление или делецию сайтов гликозилирования в антителе можно легко осуществлять путем такого изменения аминокислотной последовательности, которое позволяет создавать или удалять один или несколько сайтов гликозилирования.
Если антитело содержит Fc-область, то можно изменять присоединенный к ней углевод. Нативные антитела, которые продуцируются клетками млекопитающих, как правило, содержат разветвленный биантенный олигосахарид, который, как правило, присоединен с помощью N-связи к Asn297 СН2-домена Fc-области (см., например, Wright и др., TIBTECH 15, 1997, сс. 26-32). Олигосахарид может включать различные углеводы, например, маннозу, N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), галактозу и сиаловую кислоту, а также фукозу, присоединенную к GlcNAc в «стебле» биантенной олигосахаридной структуры. В некоторых вариантах осуществления изобретения модификации олигосахарида в антителе, предлагаемом в изобретении, можно осуществлять для создания вариантов антитела с определенными улучшенными свойствами.
Одним из вариантов осуществления изобретения являются варианты антитела, имеющие углеводную структуру, в которой снижено содержание фукозы, присоединенной (прямо или косвенно) к Fc-области. Например, содержание фукозы в указанной Fc-области может составлять от 1% до 80%, от 1% до 65%, от 5% до 65% или от 20% до 40%. Содержание фукозы определяют путем расчета среднего содержания фукозы в сахарной цепи на Asn297 относительно суммы всех гликоструктур, присоединенных к Asn297 (например, комплексных, гибридных структур и структур с высоким содержанием маннозы), которое измеряют с помощью MALDI-TOF-масс-спектрометрии согласно методу, описанному, например, в WO 2008/077546. Asn297 обозначает остаток аспарагина, присутствующий примерно в положении 297 в Fc-области (EU-нумерация остатков Fc-области); однако вследствие минорных вариаций последовательности антитела Asn297 может располагаться также в положении, находящемся на расстоянии примерно ±3 аминокислоты в прямом или обратном направлении от положения 297, т.е. между положениями 294 и 300. Указанные фукозилированные варианты могут обладать улучшенной ADCC-функцией (см., например, US 2003/0157108 (Presta L.); US 2004/0093621 (фирма Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Примерами публикаций, касающихся «дефукозилированных» вариантов антител или вариантов антител «с дефицитом фукозы» являются: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki и др., J. Mol. Biol. 336, 2004, cc. 1239-1249; Yamane-Ohnuki и др., Biotech. Bioeng. 87, 2004, cc. 614-622). Примерами клеточных линий, которые обладают способностью продуцировать дефукозилированные антитела, являются Lec13 СНО-клетки с дефицитом белкового фукозилирования (Ripka и др., Arch. Biochem. Biophys. 249, 1986, cc. 533-545; US 2003/0157108 (Presta L.) и WO 2004/056312 (Adams и др., см., прежде всего, пример 11), и клеточные линии с «выключенным» геном, например, СНО клетки с «выключенным» геном альфа-1,6-фукозилтрансферазы, FUT8 (см., например, Yamane-Ohnuki и др., Biotech. Bioeng. 87, 2004, cc. 614-622); Kanda и др., Biotechnol. Bioeng., 94(4), 2006, cc. 680-688; и WO 2003/085107).
Кроме того, описаны варианты антител с бисекционными олигосахаридами, например, в которых биантенный олигосахарид, присоединенный к Fc-области антитела, бисекционнируется с помощью GlcNAc. Указанные варианты антител могут отличаться пониженным фукозилированием и/или повышенной ADCC-функцией. Примеры указанных вариантов антител описаны, например, в WO 2003/011878 (Jean-Mairet и др.); US №6602684 (Umana и др.) и US 2005/0123546 (Umana и др.). Предложены также варианты антител по меньшей мере с одним остатком галактозы в олигосахариде, присоединенном к Fc-области. Указанные варианты антител могут обладать повышенной CDC-функцией. Указанные варианты антител описаны, например, в WO 1997/30087 (Patel и др.); WO 1998/58964 (Raju S.); и WO 1999/22764 (Raju S.).
в) Варианты Fc-области
Согласно конкретным вариантам осуществления изобретения можно интродуцировать в Fc-область антитела, представленного в настоящем описании, одну или несколько аминокислотных модификаций, создавая тем самым вариант Fc-области. Вариант Fc-области может содержать последовательность человеческой Fc-области (например, Fc-области человеческого IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), включающую аминокислотную модификацию (например, замену) в одном или нескольких аминокислотных положениях.

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к варианту антитела, который обладает некоторыми, но не всеми эффекторными функциями, что делает его перспективным кандидатом для путей применения, для которых является важным время полужизни антитела in vivo, однако некоторые эффекторные функции (такие как CDC и ADCC) не являются необходимыми или являются вредными. Можно осуществлять анализы цитотоксичности in vitro и/или in vivo для подтверждения снижения/истощения CDC- и/или ADCC-активности. Например, можно осуществлять анализы связывания Fc-рецептора (FcR) для гарантии того, что у антитела отсутствует способность к связыванию с Fc-гамма R (и поэтому, вероятно, отсутствует ADCC-активность), но сохраняется способность связываться с FcRn. Первичные клетки, опосредующие ADCC, т.е. NK-клетки, экспрессируют только Fc-гамма RIII, в то время как моноциты экспрессируют Fc-гамма RI, Fc-гамма RII и Fc-гамма RIII. Данные об экспрессии FcR на гематопоэтических клетках обобщены в таблице 3 на с. 464 у Ravetch и Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9, 1991, cc. 457-492. Примерами анализов in vitro ADCC-активности представляющей интерес молекулы являются (но, не ограничиваясь только ими) анализы, описанные в US №5500362 (см., например, Hellstrom и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1986, cc. 7059-7063 и Hellstrom и др., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82, 1985, cc. 1499-1502); US №5821337 (см. Bruggemann и др., J. Exp. Med. 166, 1987, cc. 1351-1361). В альтернативном варианте можно применять нерадиоактивные методы анализа (см., например, нерадиоактивный анализ цитотоксичности АСТ1™ на основе проточной цитометрии (фирма CellTechnology, Inc. Маунтин-Вью, шт. Калифорния); и нерадиоактивный анализ цитотоксичности CytoTox 96 (фирма Promega, Мэдисон, шт. Висконсин). Пригодными для таких анализов эффекторными клетками являются мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и естественные клетки-киллеры (NK). В альтернативном или дополнительном варианте ADCC-активность представляющей интерес молекулы можно оценивать in vivo, например, на животной модели, например, как описано у Clynes и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 1998, cc. 652-656. Можно осуществлять также анализы связывания C1q для подтверждения того, что антитело не может связывать C1q и поэтому у него отсутствует CDC-активность (см., например, описание ELISA для оценки связывания C1q и С3с в WO 2006/029879 и WO 2005/100402). Для оценки активации комплемента можно осуществлять анализ CDC (см., например, Gazzano-Santoro и др., J. Immunol. Methods 202, 1996, сс. 163-171; Cragg и др., Blood 101, 2003, сс. 1045-1052; и Cragg, Blood 103, 2004, сс. 2738-2743). Определение FcRn-связывания и клиренса/времени полужизни in vivo можно осуществлять также с использованием методов, известных в данной области (см., например, Petkova и др., Int'l. Immunol. 18(12), 2006, сс. 1759-1769).
Антитела с пониженной эффекторной функцией включают антитела с заменой одного или нескольких следующих остатков Fc-области, таких как 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 (см., например, US №6737056). К указанным мутантам Fc относятся мутанты Fc с заменами в двух или большем количестве из следующих аминокислотных положений: 265, 269, 270, 297 и 327, включая так называемый мутант «DANA» Fc-области, несущий замену остатков 265 и 297 на аланин (US №7332581).
Описаны некоторые варианты антител с повышенной или пониженной способностью связываться с FcR (см., например, US №6737056; WO 2004/056312 и Shields и др., J. Biol. Chem. 276, 2001, сс. 6591-6604).
Согласно конкретным вариантам осуществления изобретения вариант антитела содержит Fc-область с одной или несколькими аминокислотными заменами, которые повышают ADCC, например, замены в положениях 298, 333, и/или 334 Fc-области (EU-нумерация остатков).
В некоторых вариантах осуществления изобретения в Fc-области осуществляют изменения, которые приводят к измененной (т.е. либо повышенной, либо пониженной) способности связывать C1q и/или комплементзависимой цитотоксичности (CDC), что описано, например, в US №6194551, WO 1999/51642 и у Idusogie и др., J. Immunol. 164, 2000, сс. 4178-4184.
Антитела с удлиненным временем полужизни и повышенной способностью к связыванию с неонатальным Fc-рецептором (FcRn), который ответствен за перенос материнских IgG эмбриону (Guyer и др., J. Immunol. 117, 1976, сс. 587-593 и Kim и др., J. Immunol. 24, 1994, сс. 2429-2434), описаны в US 2005/0014934 А1 (Hinton и др.). Эти антитела содержат Fc-область с одной или несколькими заменами, которые повышают связывание Fc-области с FcRn. Указанные варианты Fc-области включают варианты с заменами одного или нескольких следующих остатков Fc-области: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 или 434, например, замену остатка 434 в Fc-области (US №7371826). Дополнительные примеры, касающиеся других вариантов Fc-области, описаны также у Duncan, Nature 322, 1988, сс. 738-740; в US №№5648260 и 5624821 и в WO 1994/29351.
г) Варианты антител, сконструированные с помощью цистеина
В некоторых вариантах осуществления изобретения может оказаться желательным создавать антитела, сконструированные с помощью цистеина, например, «тиоМАт», в которых один или несколько остатков в антителе заменены на остатки цистеина. В конкретных вариантах осуществления изобретения замененные остатки находятся в доступных сайтах антитела. Путем замены этих остатков на цистеин реакционноспособные тиольные группы помещаются в доступные сайты антитела и могут использоваться для конъюгации антитела с другими фрагментами, такими как фрагменты, представляющие собой лекарственное средство, или фрагменты, представляющие собой линкер, связанный с лекарственным средством, с созданием иммуноконъюгата, указанного ниже в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления изобретения любой(ые) один или несколько следующих остатков может(гут) быть заменен(ы) на цистеин: V205 (нумерация по Кэботу) легкой цепи; А118 (EU-нумерация) тяжелой цепи и S400 (EU-нумерация) Fc-области тяжелой цепи. Антитела, сконструированные с помощью цистеина, можно создавать согласно методу, например, описанному в US №7521541.
д) Производные антител
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, представленное в настоящем описании, можно дополнительно модифицировать таким образом, чтобы оно содержало дополнительные небелковые фрагменты, известные в данной области и легко доступные. Фрагменты, пригодные для дериватизации антитела, включают (но, не ограничиваясь только ими) водорастворимые полимеры. Примерами водорастворимых полимеров являются (но, не ограничиваясь только ими) полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (либо гомополимеры, либо статистические сополимеры) и декстран- или поли(н-винилпиролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры пропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси. Полиэтиленгликольпропиональдегид может иметь преимущество при производстве благодаря его стабильности в воде. Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Количество полимеров, присоединенных к антителу, может варьироваться и, если присоединено более одного полимера, то они могут представлять собой одинаковые или различные молекулы. В целом, количество и/или тип полимеров, применяемых для дериватизации, можно определять с учетом таких особенностей (но, не ограничиваясь только ими), как конкретные свойства или функции антитела, подлежащие усовершенствованию, предполагается ли применение производного антитела в терапии в определенных условиях, и т.д.
Другим вариантом осуществления изобретения являются конъюгаты антитела и небелкового фрагмента, которые можно избирательно нагревать, воздействуя на него излучением. В одном из вариантов осуществления изобретения небелковый фрагмент представляет собой углеродную нанотрубку (Kam и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 2005, cc. 11600-11605). Излучение может иметь любую длину волны и включает (но, не ограничиваясь только ими) длины волн, которые не повреждают обычные клетки, но которые нагревают небелковый фрагмент до температуры, при которой уничтожаются клетки, ближайшие к конъюгату: антитело-небелковый фрагмент.
Одним из объектов изобретения является выделенный полипептид, содержащий вариант Fc-области с существенно сниженной FcγR-связывающей активностью. Одним из объектов изобретения является выделенный полипептид, содержащий вариант Fc-области с существенно сниженной C1q-связывающей активностью. Одним из объектов изобретения является выделенный полипептид, содержащий вариант Fc-области с существенно сниженной FcγR-связывающей активностью, но при этом его C1q-связывающая активность не является существенно сниженной. В некоторых объектах изобретения полипептид представляет собой антитело. В некоторых объектах изобретения полипептид представляет собой содержащий Fc слитый белок. В некоторых вариантах осуществления изобретения вариант Fc-области содержит по меньшей мере одно изменение аминокислотного остатка (например, замену) по сравнению с соответствующей нативной последовательностью Fc-области или последовательностью референс-варианта (в некоторых случаях обозначена в целом как «родительская» Fc-область). В некоторых вариантах осуществления изобретения вариант Fc-области, предлагаемый в изобретении, обладает существенно сниженной FcγR-связывающей активностью по сравнению с родительской Fc-областью. В некоторых вариантах осуществления изобретения вариант Fc-области, предлагаемый в изобретении, не обладает существенно сниженной C1q-связывающей активностью по сравнению с родительской Fc-областью. В конкретных вариантах осуществления изобретения FcγR представляет собой человеческий FcγR, обезьяний FcγR (например, FcγR обезьян циномолгус, макак резус, мармозеток, шимпанзе или бабуинов) или мышиный FcγR.
В одном из объектов изобретения вариант Fc-области, предлагаемый в изобретении, обладает существенно сниженной связывающей активностью в отношении одного или нескольких человеческих FcγR, включая, но, не ограничиваясь только ими) FcγRIa, FcγRIIa (включая аллельные варианты 167Н и 167R), FcγRIIb, FcγRIIIa (включая аллельные варианты 158F и 158V) и FcγRIIIb (включая аллельные варианты NA1 и NA2) по сравнению с родительской Fc-областью. В другом объектов изобретения вариант Fc-области, предлагаемый в изобретении, обладает существенно сниженной связывающей активностью в отношении человеческого FcγRIa, FcγRIIa (включая аллельные варианты 167Н и 167R), FcγRIIb, FcγRIIIa (включая аллельные варианты 158F и 158V) и FcγRIIIb (включая аллельные варианты NA1 и NA2) по сравнению с родительской Fc-областью.
В одном из объектов изобретения вариант Fc-области, предлагаемый в изобретении, обладает существенно сниженной связывающей активностью в отношении одного или нескольких мышиных FcγR, включая, но, не ограничиваясь только ими) FcγRI, FcγRIIb, FcγRIII и FcγRIV по сравнению с родительской Fc-областью. В другом объектов изобретения вариант Fc-области, предлагаемый в изобретении, обладает существенно сниженной связывающей активностью в отношении мышиного FcγRI, FcγRIIb, FcγRIII и FcγRIV по сравнению с родительской Fc-областью.
«Fc-гамма-рецепторы» (в контексте настоящего описания обозначают как Fc-гамма рецепторы, Fc-гамма R или FcgR) представляют собой рецепторы, которые могут связываться с Fc-областью моноклональных антител изотипа IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и прежде всего представляет собой любого представителя семейства белков, кодируемых генами Fc-гамма рецептора. У человека это семейство включает (но, не ограничиваясь только ими) Fc-гамма RI (CD64), в том числе изоформы Fc-гамма RIa, Fc-гамма Rib и Fc-гамма RIc; Fc-гамма RII (CD32), в том числе изоформы Fc-гамма RIIa (включая аллотипы Н131 (тип Н) и R131 (тип R)), Fc-гамма RIIb (в том числе Fc-гамма RIIb-1 и Fc-гамма RIIb-2), и Fc-гамма RIIc; и Fc-гамма RIII (CD16), в том числе изоформы Fc-гамма RIIIa (включая аллотипы V158 и F158), и Fc-гамма RIIIb (включая аллотипы Fc-гамма RIIIb-NA1 и Fc-гамма RIIIb-NA2), и любые человеческие Fc-гамма R, изоформы или аллотипы Fc-гамма R, которые пока еще не открыты. Fc-гамма RIIb1 и Fc-гамма RIIb2 описаны в виде сплайсинговых вариантов человеческого Fc-гамма RIIb. Кроме того, описан сплайсинговый вариант, обозначенный как Fc-гамма RIIb3 (J Exp Med, 170, 1989, cc. 1369-1385). Помимо указанных сплайсинговых вариантов человеческий Fc-гамма RIIb включает все сплайсинговые варианты, зарегистрированные в NCBI, которые представляют собой NP_001002273.1, NP_001002274.1, NP_001002275.1, NP_001177757.1 и NP 003992.3. Кроме того, человеческий Fc-гамма RIIb включает каждый из описанных ранее генных полиморфизмов, а также Fc-гамма RIIb (Arthritis Rheum. 48, 2003, cc. 3242-3252; Kono и др., Hum. Mol. Genet. 14, 2005, cc. 2881-2892 и Kyogoju и др., Arthritis Rheum. 46, 2002, cc. 1242-1254), и каждый генный полиморфизм, который будет описан в будущем.
У Fc-гамма RIIa существуют два аллотипа, один, у которого аминокислота в положении 131 Fc-гамма RIIa представляет собой гистидин (тип Н), а другой, у которого аминокислота в положении 131 заменена на аргинин (тип R) (Warrmerdam, J. Exp. Med. 172, 1990, cc. 19-25).
Fc-гамма R включает Fc-гамма R, полученные из человека, мышей, крыс, кроликов и обезьян (но не ограничен только указанными), и он может иметь происхождение из любого организма. Мышиные Fc-гамма R включают (но, не ограничиваясь только ими) Fc-гамма RI (CD64), Fc-гамма RII (CD32), Fc-гамма RIII (CD16) и Fc-гамма RIII-2 (CD16-2) и любые мышиные Fc-гамма R или изоформы Fc-гамма R.
Аминокислотная последовательность человеческого FcγRI представлена в SEQ ID NO: 69; аминокислотная последовательность человеческого FcγRIIa (167Н) представлена в SEQ ID NO: 70; аминокислотная последовательность человеческого FcγRIIa (167R) представлена в SEQ ID NO: 71; аминокислотная последовательность человеческого FcγRIIb представлена в SEQ ID NO: 72; аминокислотная последовательность человеческого FcγRIIIa (158F) представлена в SEQ ID NO: 73; аминокислотная последовательность человеческого FcγRIIIa (158V) представлена в SEQ ID NO: 74; аминокислотная последовательность человеческого FcγRIIIb (NA1) представлена в SEQ ID NO: 75; и аминокислотная последовательность человеческого FcγRIIIb (NA2) представлена в SEQ ID NO: 76.
Аминокислотная последовательность мышиного FcγRI представлена в SEQ ID NO: 77; аминокислотная последовательность мышиного FcγRIIb представлена в SEQ ID NO: 78; аминокислотная последовательность мышиного FcγRIII представлена в SEQ ID NO: 79; и аминокислотная последовательность мышиного FcγRIV представлена в SEQ ID NO: 80.
В одном из объектов изобретения вариант Fc-области обладает существенно сниженной FcγR-связывающей активностью, которая составляет менее чем 50%, менее чем 45%, менее чем 40%, менее чем 35%, менее чем 30%, менее чем 25%, менее чем 20%, менее чем 15%, менее чем 10%, менее чем 5%, менее чем 2%, менее чем 1%, менее чем 0,5%, менее чем 0,2%, или менее чем 0,1% от FcγR-связывающей активности родительской Fc-области. В одном из объектов изобретения вариант Fc-области обладает существенно сниженной FcγR-связывающей активностью, это означает, что отношение [разница величин RU на сенсограммах, характеризующая изменение до и после взаимодействия FcγR с вариантом Fc-области] / [разница величин RU на сенсограммах, характеризующая изменение до и после захвата FcγR на сенсорных чипах] составляет менее чем 1, менее чем 0,8, менее чем 0,5, менее чем 0,3, менее чем 0,2, менее чем 0,1, менее чем 0,08, менее чем 0,05, менее чем 0,03, менее чем 0,02, менее чем 0,01, менее чем 0,008, менее чем 0,005, менее чем 0,003, менее чем 0,002 или менее чем 0,001.
В одном из объектов изобретения вариант Fc-области, предлагаемый в изобретении, не обладает существенно сниженной C1q-связывающей активностью, это означает, что разница между C1q-связывающими активностями варианта Fc-области родительской Fc-областью, предлагаемой в изобретении, составляет менее чем 50%, менее чем 45%, менее чем 40%, менее чем 35%, менее чем 30%, менее чем 25%, менее чем 20%, менее чем 15%, менее чем 10% или менее чем 5% от C1q-связывающей активности родительской Fc-области.
Одним из объектов изобретения является выделенный полипептид, содержащий вариант Fc-области, обладающий существенно сниженной ADCC-активностью. Одним из объектов изобретения является выделенный полипептид, содержащий вариант Fc-области, не обладающий существенно сниженной CDC-активностью. Одним из объектов изобретения является выделенный полипептид, содержащий вариант Fc-области, обладающий существенно сниженной ADCC-активностью, но не обладающий существенно сниженной CDC-активностью.
В одном из объектов изобретения вариант Fc-области, предлагаемый в изобретении, обладает существенно сниженной ADCC-активностью, которая составляет менее чем 50%, менее чем 45%, менее чем 40%, менее чем 35%, менее чем 30%, менее чем 25%, менее чем 20%, менее чем 15%, менее чем 10%, менее чем 5%, менее чем 2%, менее чем 1%, менее чем 0,5%, менее чем 0,2% или менее чем 0,1% от ADCC-активности родительской Fc-области.
В одном из объектов изобретения вариант Fc-области, предлагаемый в изобретении, не обладает существенно сниженной CDC-активностью, это означает, что разница между CDC-активностями варианта Fc-области и родительской Fc-областью, предлагаемой в изобретении, составляет менее чем 50%, менее чем 45%, менее чем 40%, менее чем 35%, менее чем 30%, менее чем 25%, менее чем 20%, менее чем 15%, менее чем 10%, или менее чем 5% от CDC-активности родительской Fc-области.
Одним из объектов изобретения является выделенный полипептид, содержащий вариант Fc-области, обладающий существенно сниженной FcγR-связывающей активностью, но не обладающий существенно сниженной C1q-связывающей активностью по сравнению с полипептидом, содержащим родительскую Fc-область. В других объектах изобретения полипептид, предлагаемый в изобретении, содержит по меньшей мере одно аминокислотное изменение по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, которая состоит из: 234, 235, 236, 267, 268, 324, 326, 332 и 333 согласно EU-нумерации.
В одном из объектов изобретения вариант Fc-области, обладающий существенно сниженной FcγR-связывающей активностью, но не обладающий существенно сниженной C1q-связывающей активностью, содержит Ala в положении 234, Ala в положении 235 и по меньшей мере одно аминокислотное изменение по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, которая состоит из: 236, 267, 268, 324, 326, 332 и 333 согласно EU-нумерации.
В одном из объектов изобретения вариант Fc-области, обладающий существенно сниженной FcγR-связывающей активностью, но не обладающий существенно сниженной C1q-связывающей активностью, содержит Ala в положении 234, Ala в положении 235 и дополнительно аминокислотные изменения в одном из следующих положений (а)-(в): (а) в положениях 267, 268 и 324; (б) в положениях 236, 267, 268, 324 и 332; и (в) в положениях 326 и 333 согласно EU-нумерации.
В одном из объектов изобретения вариант Fc-области, обладающий существенно сниженной FcγR-связывающей активностью, но не обладающий существенно сниженной C1q-связывающей активностью, содержит аминокислоты, выбранные из группы, которая состоит из: (a) Glu в положении 267; (б) Phe в положении 268; (в) Thr в положении 324; (г) Ala в положении 236; (д) Glu в положении 332; (е) Ala, Asp, Glu, Met или Trp в положении 326; и (ж) Ser в положении 333 согласно EU-нумерации.
В одном из объектов изобретения вариант Fc-области, обладающий существенно сниженной FcγR-связывающей активностью, но не обладающий существенно сниженной C1q-связывающей активностью, содержит аминокислоты: Ala в положении 234, Ala в положении 235, Ala в положении 326 и Ser в положении 333 согласно EU-нумерации. В одном из объектов изобретения вариант Fc-области, обладающий существенно сниженной FcγR-связывающей активностью, но не обладающий существенно сниженной C1q-связывающей активностью, содержит аминокислоты: Ala в положении 234, Ala в положении 235, Asp в положении 326 и Ser в положении 333 согласно EU-нумерации. В одном из объектов изобретения вариант Fc-области, обладающий существенно сниженной FcγR-связывающей активностью, но не обладающий существенно сниженной C1q-связывающей активностью, содержит аминокислоты: Ala в положении 234, Ala в положении 235, Glu в положении 326 и Ser в положении 333 согласно EU-нумерации. В одном из объектов изобретения вариант Fc-области, обладающий существенно сниженной FcγR-связывающей активностью, но не обладающий существенно сниженной C1q-связывающей активностью, содержит аминокислоты: Ala в положении 234, Ala в положении 235, Met в положении 326 и Ser в положении 333 согласно EU-нумерации. В одном из объектов изобретения вариант Fc-области, обладающий существенно сниженной FcγR-связывающей активностью, но не обладающий существенно сниженной C1q-связывающей активностью, содержит аминокислоты: Ala в положении 234, Ala в положении 235, Trp в положении 326 и Ser в положении 333 согласно EU-нумерации.
В другом объекте изобретения вариант Fc-области, предлагаемый в изобретении, может дополнительно содержать по меньшей мере одно аминокислотное изменение по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, которая состоит из: 428, 434, 436, 438 и 440 согласно EU-нумерации.
В другом объекте изобретения вариант Fc-области может дополнительно содержать аминокислоты, выбранные из группы, которая состоит из: (a) Ala в положении 434; (б) Ala в положении 434, Thr в положении 436, Arg в положении 438 и Glu в положении 440; (в) Leu в положении 428, Ala в положении 434, Thr в положении 436, Arg в положении 438 и Glu в положении 440; и (г) Leu в положении 428, Ala в положении 434, Arg в положении 438 и Glu в положении 440 согласно EU-нумерации (см. также WO 2016/125495, в котором описана связь между аминокислотными изменениями и FcRn-связывающей активностью варианта Fc-области).
В другом объекте изобретения вариант Fc-области, предлагаемый в изобретении, содержит аминокислоты: Ala в положении 234, Ala в положении 235, Ala в положении 326, Ser в положении 333, Leu в положении 428, Ala в положении 434, Thr в положении 436, Arg в положении 438 и Glu в положении 440 согласно EU-нумерации. В другом объекте изобретения вариант Fc-области, предлагаемый в изобретении, содержит аминокислоты: Ala в положении 234, Ala в положении 235, Ala в положении 326, Ser в положении 333, Leu в положении 428, Ala в положении 434, Arg в положении 438 и Glu в положении 440 согласно EU-нумерации.
Согласно одному из объектов изобретения предпочтительно, чтобы вариант Fc-области, предлагаемый в изобретении, не обладал существенно повышенной FcRn-связывающей активностью, прежде всего при рН 7,4, по сравнению с родительской Fc-областью.
«FcRn» структурно сходен с полипептидами главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) класса I и характеризуется индентичностью последовательности на уровне 22-29% с молекулами ГКГС класса I. FcRn экспрессируется в виде гетеродимера, состоящего из растворимой β-цепи или легкой цепи (β2-микроглобулин), входящей в комплекс с трансмембранной α-цепью или тяжелой цепью. Подобно ГКГС, α-цепь FcRn содержит три внеклеточных домена (α1, α2 и α3) и ее короткий цитоплазматический домен связывает их с клеточной поверхностью, α1- и α2-домены взаимодействуют с FcRn-связывающим доменом Fc-области антитела. Полинуклеотидные и аминокислотные последовательности человеческого FcRn можно получать, например, из предшественников, представленных в NM_004107.4 и NP_004098.1 (содержит сигнальную последовательность) соответственно.
Аминокислотная последовательность человеческого FcRn (α-цепь) представлена в SEQ ID NO: 81; а аминокислотная последовательность человеческого β2-микроглобулина представлена в SEQ ID NO: 82.
Согласно одному из объектов изобретения предпочтительно, чтобы вариант Fc-области, предлагаемый в изобретении, не обладал существенно повышенной FcRn-связывающей активностью, прежде всего при рН 7,4, т.е. чтобы она превышала менее чем в 1000 раз, менее чем в 500 раз, менее чем в 200 раз, менее чем в 100 раз, менее чем в 90 раз, менее чем в 80 раз, менее чем в 70 раз, менее чем в 60 раз, менее чем в 50 раз, менее чем в 40 раз, менее чем в 30 раз, менее чем в 20 раз, менее чем в 10 раз, менее чем в 5 раз, менее чем в 3 раза или менее чем в 2 раза FcRn-связывающую активность родительской Fc-области. В одном из объектов изобретения вариант Fc-области, предлагаемый в изобретении, не обладает существенно повышенной FcRn-связывающей активностью, прежде всего при рН 7,4, это означает, что отношение [разница величин RU на сенсограммах, характеризующая изменение до и после взаимодействия FcγR с вариантом Fc-области] / [разница величин RU на сенсограммах, характеризующая изменение до и после захвата FcγR на сенсорных чипах] составляет менее чем 0,5, менее чем 0,3, менее чем 0,2, менее чем 0,1, менее чем 0,08, менее чем 0,05, менее чем 0,03, менее чем 0,02, менее чем 0,01, менее чем 0,008, менее чем 0,005, менее чем 0,003, менее чем 0,002 или менее чем 0,001.
В другом объекте изобретения вариант Fc-области, предлагаемый в изобретении, содержит любые аминокислотные изменения, индивидуально или в комбинации, описанные в таблице 4. В другом объекте изобретения вариант Fc-области, предлагаемый в изобретении, содержит по меньшей мере одно из аминокислотных изменений, описанных в таблице 4. Другим объектом изобретения является полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 51-59.
В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептид, содержащий вариант Fc-области, предлагаемый в настоящем изобретении, представляет собой константную область тяжелой цепи антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептид, содержащий вариант Fc-области, предлагаемый в настоящем изобретении дополнительно содержит антигенсвязывающий домен. В другом варианте осуществления изобретения полипептид представляет собой тяжелую цепь. В следующем варианте осуществления изобретения полипептид представляет собой антитело. В конкретных вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой химерное антитело или гуманизированное антитело. На происхождение антитела не накладываются конкретные ограничения, примеры включают человеческое антитело, мышиное антитело, крысиное антитело и кроличье антитело. В следующем варианте осуществления изобретения полипептид представляет собой содержащий Fc слитый белок.
Два или большее количество полипептидов, содержащих вариант Fc-области, представленный в настоящем описании, могут быть включены в одну молекулу, в которой два полипептида, содержащие варианты Fc-области, находятся в ассоциации подобно тому, как это имеет место в антителе. На тип антитела не накладываются ограничения, можно применять IgA (IgA1, IgA2), IgD, IgE, IgG (IgG1, LgG2, IgG3, LgG4) и IgM или т.п.
В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептид, содержащий вариант Fc-области, предлагаемый в настоящем изобретении, представляет собой антитело. В других вариантах осуществления изобретения полипептид, содержащий вариант Fc-области, предлагаемый в настоящем изобретении, представляет собой противовирусное антитело.
В других вариантах осуществления изобретения полипептид, содержащий вариант Fc-области, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит вариабельную область антитела, содержащую:
(а) (I) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (II) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и (III) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13;
(б) (I) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, (II) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и (III) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16;
(в) (I) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, (II) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (III) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (IV) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; (V) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; и (VI) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, или
(г) (I) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; (II) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; и (III) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27.
В других вариантах осуществления изобретения полипептид, содержащий вариант Fc-области, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит вариабельную область антитела, содержащую:
(a) (I) HVR-H3 из последовательности VH SEQ ID NO: 6, (II) HVR-L3 из последовательности VL SEQ ID NO: 10 и (III) HVR-H2 из последовательности VH SEQ ID NO: 6;
(б) (I) HVR-H1 из последовательности VH SEQ ID NO: 6, (II) HVR-H2 из последовательности VH SEQ ID NO: 6 и (III) HVR-H3 из последовательности VH SEQ ID NO: 6;
(в) (I) HVR-H1 из последовательности VH SEQ ID NO: 6, (II) HVR-H2 из последовательности VH SEQ ID NO: 6, (III) HVR-H3 из последовательности VH SEQ ID NO: 6, (IV) HVR-L1 из последовательности VL SEQ ID NO: 10; (V) HVR-L2 из последовательности VL SEQ ID NO: 10 и (VI) HVR-L3 из последовательности VL SEQ ID NO: 10;
(г) (I) HVR-L1 из последовательности VL SEQ ID NO: 10; (II) HVR-L2 из последовательности VL SEQ ID NO: 10 и (III) HVR-L3 из последовательности VL SEQ ID NO: 10, или
(д) (I) HVR-H1 из последовательности VH SEQ ID NO: 6, (II) HVR-H2 из последовательности VH SEQ ID NO: 6, (III) HVR- из последовательности VH SEQ ID NO: 6, (IV) HVR-L1 из последовательности VL SEQ ID NO: 7; (V) HVR-L2 из последовательности VL SEQ ID NO: 7 и (VI) HVR-L3 из последовательности VL SEQ ID NO: 7.
В других вариантах осуществления изобретения полипептид, содержащий вариант Fc-области, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит VH-область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и VL-область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7. В других вариантах осуществления изобретения предложено антитело, которое содержит VH-область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариант Fc-области, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54 в тяжелой цепи, и VL-область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 в легкой цепи. В других вариантах осуществления изобретения предложено антитело, которое содержит VH-область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариант Fc-области, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58 в тяжелой цепи, и VL-область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 в легкой цепи. В других вариантах осуществления изобретения предложено антитело, которое содержит VH-область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариант Fc-области, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59 в тяжелой цепи, и VL-область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 в легкой цепи.
В изобретении предложено также антитело к DENV, представленное в настоящем описании, дополнительно содержащее полипептид, который содержит вариант Fc-области, предлагаемый в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к DENV, предлагаемое в изобретении, содержит VH-область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и вариант Fc-области, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54 в тяжелой цепи, и VL-область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 в легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к DENV, предлагаемое в изобретении, содержит VH-область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 и вариант Fc-области, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58 в тяжелой цепи, и VL-область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 в легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к DENV, предлагаемое в изобретении, содержит VH-область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 и вариант Fc-области, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59 в тяжелой цепи, и VL-область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 в легкой цепи.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к DENV, предлагаемое в изобретении, содержит VH-область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 и вариант Fc-области, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59 в тяжелой цепи, и VL-область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 в легкой цепи.
Применяемое в настоящем описании понятие «родительская Fc-область» относится к Fc-области до интродукции в нее аминокислотного(ых) изменения(й), указанного(ых) в настоящем описании. Предпочтительными примерами родительской Fc-области являются Fc-области из нативных антител. Антитела включают, например, IgA (IgA1, IgA2), IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) и IgM или т.п. Антитела могут иметь происхождение из организма человека или обезьян (например, циномолгус, макаки резус, мармозетки, шимпанзе или бабуины). Нативные антитела могут включать также встречающиеся в естественных условиях мутации. Множество аллотипических последовательностей IgG, связанных с генетическим полиморфизмом, описаны в «Sequences proteins of immunological interest)), публикация NIH №91-3242, и любую из них можно применять в настоящем изобретении. В частности, в случае человеческого IgG1, аминокислотная последовательность в положениях 356-358 (EU-нумерация) может представлять собой либо DEL, либо ЕЕМ. Предпочтительные примеры родительской Fc-области включают Fc-области из константной области тяжелой цепи человеческого IgG1 (SEQ ID NO: 83), человеческого IgG2 (SEQ ID NO: 84), человеческого IgG3 (SEQ ID NO: 85) и человеческого IgG4 (SEQ ID NO: 86). Другим предпочтительным примером родительской Fc-области является Fc-область из константной области тяжелой цепи SGI (SEQ ID NO: 87). Другим предпочтительным примером родительской Fc-области является Fc-область из константной области тяжелой цепи SG182 (SEQ ID NO: 46). Кроме того, родительская Fc-область может представлять собой Fc-область, полученную путем добавления аминокислотного(ых) изменения(й), отличного(ых) от аминокислотного(ых) изменения(й), указанного(ых) в настоящем описании для Fc-области из нативного антитела.
Кроме того, аминокислотные изменения, которые осуществляют для другой(их) цели(ей), можно объединять в варианте Fc-области, указанном в настоящем описании. Например, можно добавлять аминокислотные замены, которые повышают FcRn-связывающую активность (Hinton и др., J. Immunol. 176(1), 2006, cc. 346-356; Dall'Acqua и др, J. Biol. Chem. 281(33), 2006, cc. 23514-23524; Petkova и др., Intl. Immunol. 18(12), 2006, cc. 1759-1769; Zalevsky и др., Nat. Biotechnol. 28(2), 2010, cc. 157-159; WO 2006/019447; WO 2006/053301; и WO 2009/086320), и аминокислотные замены, которые повышают гетерогенность или стабильность антитела (WO 2009/041613). Альтернативно этому, полипептиды, обладающие способностью усиливать клиренс антигена, которые описаны в WO 2011/122011, WO 2012/132067, WO 2013/046704 или WO 2013/180201, полипептиды, обладающие способностью специфически связываться с тканью-мишенью, которые описаны в WO 2013/180200, полипептиды, обладающие способностью повторно связываться с множеством молекул антигенов, которые описаны в WO 2009/125825, WO 2012/073992 или WO 2013/047752, можно объединять с вариантом Fc-области, указанном в настоящем описании. Альтернативно этому, с целью придания способности связываться с другими антигенами аминокислотные изменения, описанные в ЕР 1752471 и ЕР 1772465, можно объединять в СН3 варианта Fc-области, указанного в настоящем описании. Альтернативно этому, с целью повышения удерживания в плазме можно объединять аминокислотные изменения, которые снижают pI константной области (WO 2012/016227), в варианте Fc-области, указанном в настоящем описании. Альтернативно этому, с целью повышения поглощения клеткой можно объединять аминокислотные изменения, которые повышают pI константной области (WO 2014/145159), в варианте Fc-области, указанном в настоящем описании. Альтернативно этому, с целью усиления элиминации молекулы-мишени из плазмы можно объединять аминокислотные изменения, которые повышают pI константной области (WO 2016/125495 и WO 2016/098357), в варианте Fc-области, указанном в настоящем описании.
Аминокислотные изменения, приводящие к повышению способности связываться с человеческим FcRn при кислом рН, можно объединять также в варианте Fc-области, указанным в настоящем описании. В частности, такие изменения могут включать, например, замену Met в положении 428 на Leu и замену Asn в положении 434 на Ser согласно EU-нумерации (Zalevsky и др., Nat. Biotechnol. 28, 2010, сс. 157-159); замену Asn в положении 434 на Ala (Deng и др., Metab. Dispos. 38(4), 2010, сс. 600-605); замену Met в положении 252 на Tyr, замену Ser в положении 254 на Thr и замену Thr в положении 256 на Glu (Dall'Acqua и др., J. Biol. Chem. 281, 2006, сс. 23514-23524); замену Thr в положении 250 на Gln и замену Met в положении 428 на Leu (Hinton и др., J. Immunol. 176(1), 2006, сс. 346-356); замену Asn в положении 434 на His (Zheng и др., Clin. Pharmacol. Ther. 89(2), 2011, сс. 283-290), и изменения, описанные в WO 2010/106180, WO 2010/045193, WO 2009/058492, WO 2008/022152, WO 2006/050166, WO 2006/053301, WO 2006/031370, WO 2005/123780, WO 2005/047327, WO 2005/037867, WO 2004/035752, WO 2002/060919, или т.п. В другом варианте осуществления изобретения такие изменения могут включать, например, по меньшей мере одно изменение, выбранное из группы, состоящей из замены Met в положении 428 на Leu, замены Asn в положении 434 на Ala и замены Tyr в положении 436 на Thr. Указанные изменения могут включать также замену Gln в положении 438 на Arg и/или замену Ser в положении 440 на Glu (WO 2016/125495).
В контексте настоящего изобретения понятие «аминокислотное изменение» может обозначать любое из следующих изменений: замену, делецию, добавление, инсерцию и модификацию, или их комбинацию. В контексте настоящего изобретения выражение «аминокислотное изменение» можно перефразировать как «аминокислотная мутация».
Аминокислотные изменения создают с помощью различных методов, известных специалистам в данной области. Такие методы включают метод сайт-направленного мутагенеза (Hashimoto-Gotoh и др., Gene 152, 1995, сс. 271-275; Zoller, Meth. Enzymol. 100, 1983, сс. 468-500; Kramer и др., Nucleic Acids Res. 12, 1984, cc. 9441-9456; Kramer и Fritz, Methods Enzymol. 154, 1987, cc. 350-367; и Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1985, cc. 488-492), метод мутаций с помощью ПЦР и метод кассетного мутагенеза.
Количество аминокислотных изменений, интродуцированных в Fc-область, не ограничено. В конкретных вариантах осуществления изобретения оно может составлять 1, 2 или менее, 3 или менее, 4 или менее, 5 или менее, 6 или менее, 8 или менее, 10 или менее, 12 или менее, 14 или менее, 16 или менее, 18 или менее, или 20 или менее.
Кроме того, полипептид, который содержит вариант Fc-области, предлагаемый в настоящем изобретении, можно химически модифицировать с использованием различных молекул, таких как полиэтиленгликоль (ПЭГ) и цитотоксические субстанции. Методы осуществления такой химической модификации полипептида хорошо известны в данной области.
В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептид, который содержит вариант Fc-области, предлагаемый в настоящем изобретении, представляет собой антитело или содержащий Fc-область слитый белок, содержащий домен(ы), который(е) могут связываться с каким-либо антигеном. Примеры антигенов, которые могут связываться такими антителами, и содержащими Fc-область слитыми белками, включают (но, не ограничиваясь только ими) лиганды (цитокины, хемокины и т.п.), рецепторы, раковые антигены, вирусные антигены, антигены ГКГС, дифференцировочные антигены, иммуноглобулины и иммунные комплексы, в частности, содержащие иммуноглобулины.
Б. Методы рекомбинации и композиции
Один из примеров относится к способу получения антитела, представленного в настоящем описании, где процесс включает стадии, на которых:
(а) объединяют последовательность варианта VH, представленную в настоящем описании, с последовательностью СН человеческого IgG1, представленной в настоящем описании;
(б) объединяют последовательность варианта VL, представленную в настоящем описании, с последовательностью CL человеческого SK1;
(в) клонируют каждую из комбинаций в экспрессионном векторе;
(г) осуществляют экспрессию полученных экспрессионных векторов в котрансфектированных клетках (клетках-хозяевах); и
(д) очищают антитело, полученное на стадии (г).
В конкретных примерах клетка-хозяин представляет собой CHO-DXB11, СНО-K1 или CHO-DG44. Такая клетка-хозяин может представлять собой клетку, экспрессирующую транспортер таурина, которую получают путем интродукции ДНК, кодирующей транспортер таурина (WO 2007/119774). Векторы, которые можно применять для получения таких антител, известны в данной области. Как правило, антитела можно получать, используя методы рекомбинации и композиции, например, описанные в US №4816567. Одним из вариантов осуществления изобретения является выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело к DENV, представленное в настоящем описании. Другим вариантом осуществления изобретения является выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует полипептид, содержащий вариант Fc-области или родительскую Fc-область, указанную в настоящем описании. Указанная нуклеиновая кислота может кодировать аминокислотную последовательность, содержащую VL, и/или аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела (например, легкие и/или тяжелые цепи антитела). Следующим вариантом осуществления изобретения является(ются) один или несколько векторов (например, экспрессионных векторов), который(е) содержит(ат) указанную нуклеиновую кислоту. Еще одним вариантом осуществления изобретения является клетка-хозяин, которая содержит указанную нуклеиновую кислоту. В одном из указанных вариантов осуществления изобретения клетка-хозяин содержит (например, в результате трансформации указанными векторами): (1) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела, и аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела, или (2) первый вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела, и второй вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела. В одном из вариантов осуществления изобретения клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, например, клетку яичника китайского хомячка (СНО) или лимфоидную клетку (например, Y0-, NS0-, Sр20-клетку). Одним из вариантов осуществления изобретения является способ получения антитела к DENV, где способ включает культивирование клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, которая кодирует антитело, описанное выше, в условиях, пригодных для экспрессии антитела, и необязательно выделение антитела из клетки-хозяина (или среды для культивирования клетки-хозяина). Другим вариантом осуществления изобретения является способ получения полипептида, который содержит вариант Fc-области или родительскую Fc-область, где способ включает культивирование клетки-хозяина, которая содержит нуклеиновую(ые) кислоту(ы), кодирующую(ие) полипептид, такой как антитело, Fc-область или вариант Fc-области, указанный выше, в условиях, пригодных для экспрессии полипептида, и необязательно выделение полипептида из клетки-хозяина (или среды для культивирования клетки-хозяина).
Для рекомбинантного получения антитела к DENV нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, например, описанную выше, выделяют и встраивают в один или несколько векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Для рекомбинантного получения Fc-области нуклеиновую кислоту, кодирующую Fc-область, выделяют и встраивают в один или несколько векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Указанную нуклеиновую кислоту легко можно выделять и секвенировать с использованием общепринятых процедур (например, путем использования олигонуклеотидных зондов, которые обладают способностью специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антитела).
Приемлемые клетки-хозяева для клонирования или экспрессии кодирующих антитело векторов включают прокариотические или эукариотические клетки, представленные в настоящем описании. Например, антитела можно получать в бактериях, в частности, когда не требуется гликозилирование и связанная с Fc эффекторная функция. Сведения об экспрессии фрагментов антитела и полипептидов в бактериях см. например, в US №№5648237, 5789199 и 5840523 (см. также у Charlton в: Methods in Molecular Biology, под ред. Lo В.К.С, изд-во Humana Press, Totowa, NJ, т. 248, 2003, cc. 245-254 описание экспрессии фрагментов антител в Е. coli.) После экспрессии антитело можно выделять из пасты бактериальных клеток в виде растворимой фракции и можно дополнительно очищать.
Помимо прокариотических организмов в качестве хозяев, пригодных для клонирования или экспрессии плазмид, которые кодируют антитела, можно использовать эукариотические микроорганизмы, такие как нитчатые грибы или дрожжи, включая штаммы грибов и дрожжей, пути гликозилирования которых были «гуманизированы», что позволяет получать антитело с частично или полностью человеческой схемой гликозилирования (см. Gerngross, Nat. Biotech. 22, 2004, cc. 1409-1414 и Li и др., Nat. Biotech. 24, 2006, cc. 210-215).
Клетки-хозяева, которые можно использовать для экспрессии гликозилированного антитела, получают также из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных животных). Примерами клеток беспозвоночных являются клетки насекомых, а также можно применять клетки растений. Были выявлены многочисленные штаммы бакуловирусов и соответствующие пригодные для них в качестве хозяев клетки насекомых, прежде всего для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.
В качестве хозяев можно применять также культуры растительных клеток (см., например, US №№5959177, 6040498, 6420548, 7125978 и 6417429 (описание технологии PLANTIBODIES™ для получения антител в трансгенных растениях).
-
В качестве хозяев можно применять также клетки позвоночных. Например, можно использовать клеточные линии млекопитающих, которые адаптированы к росту в суспензии. Другими примерами приемлемых линий клеток-хозяев млекопитающих являются линия клеток почки обезьяны CV1, трансформированная с помощью ОВ40 (COS-7); линия клеток почки эмбриона человека (HEK 293-клетки или клетки линии 293, описанные, например, у Graham и др., J. Gen. Virol., 36, 1977, сс. 59-74); клетки почки детеныша хомяка (ВНК); клетки Сертоли мыши (ТМ4-клетки, описанные, например, у Mather, Biol. Reprod., 23, 1980, сс. 243-251); клетки почки обезьяны (CV1); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76,); клетки карциномы шейки матки человека (HELA); клетки почки собаки (MDCK); клетки печени бычьей крысы (BRL 3А); клетки легкого человека (W138); клетки печени человека (Hep G2); клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562); клетки TRI, описанные, например, у Mather и др., Annals N.Y. Acad. Sci., 383, 1982, сс. 44-68); клетки MRC 5 и клетки FS4. Другими ценными линиями клеток-хозяев млекопитающих являются клетки яичника китайского хомячка (СНО), включая DHFR -СНО-клетки (Urlaub и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 1980, сс. 4216-4220); и клеточные линии миеломы, такие как Y0, NS0 и Sp2/0. Обзор конкретных линий клеток-хозяев млекопитающих, которые можно применять для производства антител, см., например, у Yazaki и Wu, в: Methods in Molecular Biology под ред. В.К.С. Lo, изд-во Humana Press, Totowa, NJ, т. 248, 2003, сс. 255-268.
2
1
1
Поликлональные антитела предпочтительно вырабатываются у животных после нескольких подкожных (sc) или внутрибрюшинных (ip) инъекций релевантного антитела и адъюванта. Можно конъюгировать релевантный антиген с белком, иммуногенным для подлежащего иммунизации вида, например, гемоцианином лимфы улитки, сывороточным альбумином, бычьим тироглобулином или соевым ингибитором трипсина, с использованием бифункционального или дериватизирующего агента, например, сложного сульфосукцинимидного эфира малеимидобензоила (конъюгация через остатки цистеина), N-гидроксисукцинимида (конъюгация через остатки лизина), глутарового альдегида, янтарного ангидрида, SOCl или RN=C=NR, где R и R обозначают различные алкильные группы.
Животных (как правило, млекопитающих кроме человека) иммунизируют с использованием антигена, иммуногенных конъюгатов или производных путем объединения, например, 100 или 5 мкг белка или конъюгата (для кроликов и мышей соответственно) с 3 объемами полного адъюванта Фрейнда, и осуществляют введение раствора внутрикожно в несколько мест. Через 1 месяц животных подвергают бустерной вакцинации (ревакцинации) с использованием от 1/5 до 1/10 исходного количества пептида или конъюгата в полном адъюванте Фрейнда путем подкожной инъекции в несколько мест. Через 7-14 дней получают образцы крови животных и оценивают в сыворотке титр антитела. Животных подвергают ревакцинации вплоть до выхода титра на плато. Предпочтительно животных ревакцинируют с использованием конъюгата, в который входит тот же антиген, но конъюгированный с другим белком и/или через другой перекрестносшивающий реагент. Конъюгаты можно получать также в рекомбинантной клеточной культуре в виде белковых слияний. Кроме того, агрегирующие агенты, такие как квасцы, можно применять для усиления иммунного ответа.
Моноклональные антитела получают из популяции практически гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, входящие в популяцию, идентичны за исключением возможных встречающихся в естественных условиях мутаций и/или пост-трансляционных модификаций (например, изомеризации, амидирования), которые могут присутствовать в минорных количествах. Прилагательное «моноклональный» свидетельствует о том, что антитело не присутствует в смеси различных антител.
Например, моноклональные антитела можно получать, используя метод гибридом, впервые описанный Kohler и др., Nature 256(5517), 1975, сс. 495-497. При осуществлении метода гибрид мышь или другое пригодное в качестве хозяина животное, такое как хомяк, иммунизируют согласно описанному выше методу для выработки лимфоцитов, которые продуцируют или обладают способностью продуцировать антитела, специфически связывающиеся с белком, применяемым для иммунизации. Альтернативно этому, лимфоциты можно иммунизировать in vitro.
Иммунизирующий агент должен, как правило, включать антигенный белок или его слитый вариант. Как правило, применяют либо лимфоциты периферической крови (PBL), если требуются клетки человеческого происхождения, либо применяют селезеночные клетки или клетки лимфатических узлов, если источниками являются млекопитающие кроме человека. Затем лимфоциты сливают с иммортализованной клеточной линией с помощью приемлемого агента для слияния, такого как полиэтиленгликоль, с получением клетки гибридомы (Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, изд-во Academic Press, 1986, cc. 59-103).
Иммортализованные клеточные линии, как правило, представляют собой трансформированные клетки млекопитающих, прежде всего клетки миеломы грызунов, быков и человека. Как правило, применяют крысиные или мышиные клеточные линии миеломы. Полученные таким образом клетки гибридомы высевают и выращивают в приемлемой культуральной среде, которая предпочтительно содержит одну или несколько субстанций, которые ингибируют рост или выживание неслитых родительских клеток миеломы. Например, если в родительских клетках миеломы отсутствует фермент гипоксантингуанинфосфорибозилтрансфераза (HGPRT или HPRT), то культуральная среда для гибридом, как правило, включает гипоксантин, аминоптерин и тимидин (НАТ-среда), т.е. субстанции, которые препятствуют росту клеток с дефицитом HGPRT.
Предпочтительными иммортализованными клетками миеломы являются клетки, которые можно эффективно сливать, которые поддерживают стабильный высокий уровень производства антитела отобранными антителопродуцирующими клетками и обладают чувствительностью к среде, такой как НАТ-среда. Среди них предпочтительными являются мышиные линии миеломы, например, полученные из мышиных опухолей МОРС-21 и МРС-11, которые можно получать от фирмы Salk Institute Cell Distribution Center, Сан-Диего, шт. Калифорния, США, и SP-2-клетки (и их производные, например, Х63-Ag8-653), которые можно получать из Американской коллекции типовых культур, Манассас, шт. Вирджиния, США. Также описаны клеточные линии человеческой миеломы и мышиной-человеческой гетеромиеломы, которые можно применять для производства человеческих моноклональных антител (Kozbor и др., J. Immunol. 133(6), 1984, сс. 3001-3005; Brodeur и др., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, изд-во Marcel Dekker, Inc., New York, 1987, cc. 51-63).
Культуральную среду, в которой выращивают клетки гибридомы, оценивают в отношении производства моноклональных антител против антигена. Предпочтительно специфичность связывания моноклональных антител, продуцируемых клетками гибридомы, определяют с помощью иммнопреципитации или анализа связывания in vitro, такого как радиоиммуноанализ (РИА) или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Указанные методики и анализы известны в данной области. Например, аффинность связывания можно определять с помощью анализа Скэтчарда, описанного у Munson, Anal. Biochem. 107(1), 1980, сс. 220-239.
После того, как установлено, что клетки гибридом продуцируют антитела требуемой специфичности, аффинности и/или активности, клоны можно субклонировать, используя процедуры серийного разведения, и выращивать с помощью стандартных методов (Coding, выше). Приемлемые для этой цели культуральные среды включают, например, среду D-MEM или RPMI-1640. Кроме того, клетки гибридомы можно выращивать in vivo в виде опухолей в млекопитающих.
Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, можно отделять от культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки с помощью общепринятых процедур очистки иммуноглобулинов, таких, например, как хроматография на белок А-сефарозе, гидроксиапатите, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография.
2
Fc-область можно получать путем повторной элюции фракции, адсорбированной на белке А, после частичного расщепления моноклональных антител в виде IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или т.п. с помощью протеазы, такой как пепсин. Протеаза не ограничена конкретной протеазой, если она может расщеплять полноразмерное антитело с образованием Fab и F(ab') ограниченным образом при создании соответствующих условий для ферментативной реакции, таких как рН, и ее примеры включают пепсин и папаин.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ получения полипептида, содержащего вариант Fc-области с существенно сниженной FcγR-связывающей активностью, но не обладающего существенно сниженной C1q-связывающей активностью по сравнению с полипептидом, содержащим родительскую Fc-область, который включает интродукцию по меньшей мере одного аминокислотного изменения в родительскую Fc-область. В некоторых объектах изобретения полученный полипептид представляет собой антитело. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой химерное антитело или гуманизированное антитело. В некоторых объектах изобретения полученный полипептид представляет собой содержащий Fc слитый белок.
В одном из объектов изобретения для получения полипептида, содержащего вариант Fc-области с существенно сниженной FcγR-связывающей активностью, но не обладающего существенно сниженной C1q-связывающей активностью, с помощью указанного выше способа изменяют по меньшей мере одну аминокислоту по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, которая включает положения 234, 235, 236, 267, 268, 324, 326, 332 и 333 согласно EU-нумерации.
В другом объекте изобретения для получения полипептида, содержащего вариант Fc-области с существенно сниженной FcγR-связывающей активностью, но не обладающего существенно сниженной C1q-связывающей активностью, с помощью указанного выше способа изменяют две аминокислоты в положениях 234 и 235.
В другом объекте изобретения для получения полипептида, содержащего вариант Fc-области с существенно сниженной FcγR-связывающей активностью, но не обладающего существенно сниженной C1q-связывающей активностью, с помощью указанного выше способа изменяют аминокислоты, при этом изменения включают: (а) изменения двух аминокислот в положениях 234 и 235, и (б) изменение по меньшей мере одной аминокислоты по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, которая состоит из положений 236, 267, 268, 324, 326, 332 и 333 согласно EU-нумерации.
В другом объекте изобретения для получения полипептида, содержащего вариант Fc-области с существенно сниженной FcγR-связывающей активностью, но не обладающего существенно сниженной C1q-связывающей активностью, с помощью указанного выше способа изменяют аминокислоты, при этом изменения включают: (а) изменения двух аминокислот в положениях 234 и 235, и (б) изменение по меньшей мере одной аминокислоты по меньшей мере в одном из следующих положений (I)-(III): (I) положения 267, 268 и 324; (II) положения 236, 267, 268, 324 и 332 и (III) положения 326 и 333 согласно EU-нумерации.
В другом объекте изобретения аминокислотное изменение при осуществлении указанного выше способа получения полипептида, содержащего вариант Fc-области с существенно сниженной FcγR-связывающей активностью, но не обладающего существенно сниженной C1q-связывающей активностью, выбирают для каждого положения из группы, состоящей из: (a) Ala в положении 234; (б) Ala в положении 235; (в) Glu в положении 267; (г) Phe в положении 268; (д) Thr в положении 324; (е) Ala в положении 236; (ж) Glu в положении 332; (з) Ala, Asp, Glu, Met, Trp в положении 326; и (I) Ser в положении 333 согласно EU-нумерации.
В другом объекте изобретения аминокислотное изменение при осуществлении указанного выше способа получения полипептида, содержащего вариант Fc-области с существенно сниженной FcγR-связывающей активностью, но не обладающего существенно сниженной C1q-связывающей активностью, представляют собой: Ala в положении 234, Ala в положении 235, Ala в положении 326 и Ser в положении 333 согласно EU-нумерации. В другом объекте изобретения аминокислотное изменение при осуществлении указанного выше способа получения полипептида, содержащего вариант Fc-области с существенно сниженной FcγR-связывающей активностью, но не обладающего существенно сниженной C1q-связывающей активностью, представляют собой: Ala в положении 234, Ala в положении 235, Asp в положении 326 и Ser в положении 333 согласно EU-нумерации. В другом объекте изобретения аминокислотное изменение при осуществлении указанного выше способа получения полипептида, содержащего вариант Fc-области с существенно сниженной FcγR-связывающей активностью, но не обладающего существенно сниженной C1q-связывающей активностью, представляют собой: Ala в положении 234, Ala в положении 235, Glu в положении 326 и Ser в положении 333 согласно EU-нумерации. В другом объекте изобретения аминокислотное изменение при осуществлении указанного выше способа получения полипептида, содержащего вариант Fc-области с существенно сниженной FcγR-связывающей активностью, но не обладающего существенно сниженной C1q-связывающей активностью, представляют собой: Ala в положении 234, Ala в положении 235, Met в положении 326 и Ser в положении 333 согласно EU-нумерации. В другом объекте изобретения аминокислотное изменение при осуществлении указанного выше способа получения полипептида, содержащего вариант Fc-области с существенно сниженной FcγR-связывающей активностью, но не обладающего существенно сниженной C1q-связывающей активностью, представляют собой: Ala в положении 234, Ala в положении 235, Trp в положении 326 и Ser в положении 333 согласно EU-нумерации.
В другом объекте изобретения с помощью описанного выше способа дополнительно изменяют по меньшей мере одну аминокислоту по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, состоящей из положений 428, 434, 436, 438 и 440 согласно EU-нумерации.
В другом объекте изобретения аминокислотное изменение при осуществлении указанного выше способа дополнительно выбирают из следующих (а)-(г): (a) Ala в положении 434; (б) Ala в положении 434, Thr в положении 436, Arg в положении 438 и Glu в положении 440; (в) Leu в положении 428, Ala в положении 434, Thr в положении 436, Arg в положении 438 и Glu в положении 440; и (г) Leu в положении 428, Ala в положении 434, Arg в положении 438 и Glu в положении 440 согласно EU-нумерации (см. также WO 2016/125495, в котором описана взаимосвязь между аминокислотными изменениями и FcRn-связывающей активностью варианта Fc-области).
В другом объекте изобретения аминокислотные изменения при осуществлении указанного выше способа представляют собой: Ala в положении 234, Ala в положении 235, Ala в положении 326, Ser в положении 333, Leu в положении 428, Ala в положении 434, Thr в положении 436, Arg в положении 438 и Glu в положении 440 согласно EU-нумерации. В другом объекте изобретения аминокислотные изменения при осуществлении указанного выше способа представляют собой: Ala в положении 234, Ala в положении 235, Ala в положении 326, Ser в положении 333, Leu в положении 428, Ala в положении 434, Arg в положении 438 и Glu в положении 440 согласно EU-нумерации.
Согласно одному из объектов изобретения предпочтительно вариант Fc-области, предлагаемый в изобретении, не обладает существенно повышенной FcRn-связывающей активностью, прежде всего при рН 7,4, по сравнению с родительской Fc-областью.
В другом объекте изобретения аминокислотные изменения при осуществлении указанных выше способов получения выбирают из любых индивидуальных изменений, комбинации индивидуальных изменений и комбинации изменений, представленных в таблице 4.
Полипептиды, содержащие вариант Fc-области, полученные с помощью любого из указанных выше способов или других методов, известных в данной области, подпадают под объем настоящего изобретения.
В. Анализы
Представленные в настоящем описании антитела к DENV можно идентифицировать, осуществлять их скрининг или характеризовать их физические/химические свойства и/или виды биологической активности с помощью различных анализов, известных в данной области.
Варианты Fc-областей, представленные в настоящем описании, можно идентифицировать, осуществлять их скрининг или характеризовать их физические/химические свойства и/или виды биологической активности с помощью различных анализов, известных в данной области.
1. Анализы связывания и другие анализы
Согласно одному из объектов изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, тестируют в отношении его антигенсвязывающей активности, например, с помощью известных методов, таких как ELISA, Вестерн-блоттинг, BIACORE и т.д. В одном из объектов изобретения полипептид, содержащий вариант Fc-области, предлагаемый в изобретении, тестируют в отношении его антигенсвязывающей активности, например, с помощью известных методов, таких как ELISA, Вестерн-блоттинг, BIACORE и т.д.
Согласно другому объекту изобретения можно использовать анализы в условиях конкуренции для идентификации антитела, которое конкурирует за связывание с DENV и/или белком Е DENV с любым антителом к DENV, представленным в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления изобретения, когда указанное конкурирующее антитело присутствует в избытке, оно блокирует (например, снижает) связывание референс-антитела с DENV и/или белком Е DENV по меньшей мере на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% или более. В некоторых случаях связывание ингибируется по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95% или более. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное конкурирующее антитело связывается с таким же эпитопом (например, линейным или конформационным эпитопом), с которым связывается антитело к DENV, представленное в настоящем описании. Подробное описание приведенных в качестве примера методов картирования эпитопа, с которым связывается антитело, представлено у Morris, Epitope Mapping Protocols, в: Methods in Molecular Biology, т. 66, изд-во Humana Press, Totowa, NJ, 1996.
В качестве примера анализа в условиях конкуренции иммобилизованный DENV или белок Е DENV инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, которое связывается с DENV и/или белком Е DENV, и второе немеченое антитело, подлежащее тестированию в отношении способности конкурировать с первым антителом за связывание с DENV и/или белком Е DENV. Второе антитело может присутствовать в супернатанте гибридомы. В качестве контроля иммобилизованный DENV или белок Е DENV инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, но не второе немеченое антитело. После инкубации в условиях, приемлемых для связывания первого антитела с DENV или белком Е DENV, избыток несвязанного антитела удаляют и измеряют количество метки, ассоциированной с иммобилизованным DENV или белком Е DENV. Если количество метки, ассоциированной с иммобилизованным DENV или белком Е DENV, существенно снижается в тестируемом образце по сравнению с контрольным образцом, то это свидетельствует о том, что второе антитело конкурирует с первым антителом за связывание с DENV или белком Е DENV (см., например, Harlow и Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, глава 14, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988).
A
L
P
H
A
Анализы по определению активности связывания полипептида, содержащего вариант Fc-области, с одним или несколькими представителями семейства FcR представлены в настоящем описании или известны в данной области. Такие анализы связывания включают (но, не ограничиваясь только ими) BIACORE-анализ, в котором используется явление поверхностного плазмонного резонанса (SPR), скрининг на основе гомогенного анализа усиленной за счет эффекта близости люминесценции (mplified uminescent roximity omogeneous ssay (ALPHA), ELISA, и сортинг клеток по интенсивности флуоресценции (FACS) (Lazar и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103(11), 2006, сс. 4005-4010).
В одном из вариантов осуществления изобретения BIACORE-анализ можно применять для решения вопроса о том, является ли активность связывания полипептида, содержащего вариант Fc-области, в отношении конкретного представителя семейства FcR повышенной, или сохраняется на том же уровне, или снижается. Например, для этой цели определяют, снижается ли или повышается величина константны диссоциации (KD), для определения которой применяют анализ сенсограмм, когда различные FcR подвергают взаимодействию в качестве аналита с полипептидами, содержащими вариант Fc-области, иммобилизованными или «захваченными» на сенсорном чипе, с использованием известных методов и реагентов, таких как белок А, белок L, белок A/G, белок G, антитела к лямбда-цепи, антитела к каппа-цепи, антигенные пептиды, антигенные белки. Изменения в активности связывания можно определять также путем сравнения изменений в количестве резонансных единиц (RU) на сенсограмме до и после того, как один или несколько типов FcR подвергают взаимодействию в качестве аналитов с «захваченными» полипептидами, содержащими вариант Fc-области. Альтернативно этому, FcR можно иммобилизовать или «захватывать» на сенсорных чипах, и полипептиды, содержащие вариант Fc-области, применять в качестве аналита.
При осуществлении BIACORE-анализов одну из субстанций (лиганд), предназначенных для исследования взаимодействия, иммобилизуют на тонкой золотой пленке на сенсорном чипе, и в этом случае при освещении светом с задней поверхности сенсорного чипа таким образом, чтобы имело место полное отражение на границе раздела между тонкой золотой пленкой и стеклом, в части отраженного света формируется область с пониженной интенсивностью (SPR-сигнал). Подготавливают другую субстанцию (аналит), предназначенную для исследования взаимодействия, для инъекции на поверхность сенсорного чипа, и когда лиганд связывается с аналитом, масса иммобилизованной молекулы-лиганда возрастает и показатель преломления растворителя на поверхности сенсорного чипа изменяется. В результате указанного изменения показателя преломления положение SPR-сигнала сдвигается (и наоборот, положение сигнала возвращается в исходное, если происходит диссоциация указанного связывания). С помощью BIACORE-системы определяют уровень описанного выше сдвига, или более конкретно изменение массы в зависимости от времени, откладывая изменение массы на поверхности сенсорного чипа по вертикальной оси, и таким образом получают количественные данные (сенсограмма). Количество аналита, связанного с лигандом, иммобилизованном на поверхности сенсорного чипа, определяют из сенсограммы. Кинетические параметры, такие как константы скорости ассоциации (ka) и константы скорости диссоциации (kd), определяют из представленных в виде кривых сенсограмм, и рассчитывают константу диссоциации (KD) как отношение указанных констант. В качестве метода для анализа ингибирования предпочтительно применяют BIACORE-метод. Примеры такого метода для анализа ингибирования описаны у Lazar и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103(11), 2006, cc. 4005-4010.
ALPHA-скрининг осуществляют на основе технологии ALPHA, которая основана на описанном ниже принципе, с использованием двух типов гранул, доноров и акцепторов. Люминесцентные сигналы поддаются обнаружению только тогда, когда молекулы, связанные с гранулами-донорами, физически взаимодействуют с молекулами, связанными с гранулами-акцепторами, и когда обе гранулы находятся в непосредственной близости друг от друга. Возбужденный лазерным пучком фотосенсибилизатор в гранулах-донорах превращает кислород окружающей среды в возбужденный синглетный кислород. Когда синглетный кислород диффундирует из гранул-доноров и достигает гранул-акцепторов, локализованных в непосредственной близости, то индуцируется хемилюминесцентная реакция в гранулах, что в итоге приводит к испусканию света. Если молекулы, связанные с гранулами-донорами, не взаимодействуют с молекулами, связанными с гранулами-акцепторами, то хемилюминесцентная реакция не происходит, поскольку синглетный кислород, который продуцируется гранулами-донорами, не достигает гранул-акцепторов.
Например, биотинилированный полипептидный комплекс связывают с гранулами-донорами, а Fc-рецептор, меченный глутатион-S-трансферазой (GST), связывают с гранулами-акцепторами. В отсутствии конкурирующего полипептидного комплекса, содержащего вариант Fc-области, полипептидный комплекс, содержащий родительскую Fc-область, взаимодействует с Fc-рецептором и образует сигналы с длиной волны от 520 до 620 нм.
Полипептидный комплекс, содержащий немеченый вариант Fc-области, конкурирует с полипептидным комплексом, содержащим родительскую Fc-область, за связывание с Fc-рецептором. Относительную аффинность связывания можно оценивать, определяя количественно снижение флуоресценции в результате конкуренции. Методы биотинилирования полипептидных комплексов, таких как антитела, с помощью сульфо-NHS-биотина или подобных агентов являются хорошо известными. Метод экспрессии Fc-рецептора и GST в клетке, несущей слитый ген, полученный путем слияния полинуклеотида, который кодирует Fc-рецептор, в рамке считывания с полинуклеотидом, который кодирует GST, в экспрессионном векторе и осуществления очистки с помощью содержащей глутатион колонки, соответствующим образом адаптируют, получая метод мечения Fc-рецептора с помощью GST. Индуцированные сигналы можно анализировать, например, посредством подгонки к односайтовой модели конкуренции на основе нелинейного регрессионного анализа с использованием такого программного обеспечения, как GRAPHPAD PRISM (фирма GraphPad; Сан-Диего).
Понятие «вариант Fc-области с пониженной FcR-связывающей активностью» относится к Fc-области, которая связывается с FcR с существенно более слабой связывающей активностью, чем родительская Fc-область, при осуществлении анализов с использованием практически одинаковых количеств соответствующей родительской Fc-области и варианта Fc-области. Кроме того, понятие «вариант Fc-области с повышенной FcR-связывающей активностью» относится к Fc-области, которая связывается с FcR с существенно более сильной связывающей активностью, чем родительская Fc-область, при осуществлении анализов с использованием практически одинаковых количеств соответствующей родительской Fc-области и варианта Fc-области. Понятие «вариант Fc-области с сохраненной FcR-связывающей активностью» относится к Fc-области, которая связывается с FcR с активностью, эквивалентной или практически такой же, что и активность родительской Fc-области, при осуществлении анализов с использованием практически одинаковых количеств соответствующей родительской Fc-области и полипептида, содержащего вариант Fc-области.
Повышается ли или понижается активность связывания Fc-области с различными FcR, можно определять по увеличению или снижению уровня связывания различных FcR с Fc-областью при определении с использованием вышеописанного метода измерения. В контексте настоящего описания уровень связывания различных FcR с Fc-областью можно оценивать в виде величины, полученной делением разницы в уровнях RU на сенсограммах до и после взаимодействия различных FcR, которые применяют в качестве аналита, с Fc-областью, на разницу в уровнях RU на сенсограммах, которая изменилась до и после «захвата» Fc-областей на сенсорных чипах. Связывающую активность Fc-области в отношении FcγR или FcRn можно определять с помощью метода, описанного в примере 5 настоящего описания.
Согласно настоящему изобретению существенно сниженная FcγR-связывающая активность предпочтительно означает, например, что связывающая активность варианта Fc-области в отношении FcγR составляет менее чем 50%, менее чем 45%, менее чем 40%, менее чем 35%, менее чем 30%, менее чем 25%, менее чем 20%, менее чем 15%, менее чем 10%, менее чем 5%, менее чем 2%, менее чем 1%, менее чем 0,5%, менее чем 0,2% или менее чем 0,1% от FcγR-связывающей активности родительской Fc-области. Это предпочтительно означает также, что, например, отношение [разница величин RU на сенсограммах, характеризующая изменение до и после взаимодействия FcγR с вариантом Рс-области]/[разница величин RU на сенсограммах, характеризующая изменение до и после захвата FcγR на сенсорных чипах] составляет менее чем 1, менее чем 0,8, менее чем 0,5, менее чем 0,3, менее чем 0,2, менее чем 0,1, менее чем 0,08, менее чем 0,05, менее чем 0,03, менее чем 0,02, менее чем 0,01, менее чем 0,008, менее чем 0,005, менее чем 0,003, менее чем 0,002 или менее чем 0,001.
Согласно настоящему изобретению выражение «FcRn-связывающая активность не является существенно повышенной», прежде всего при рН 7,4, предпочтительно означает, например, что связывающая активность варианта Fc-области в отношении FcRn превышает FcRn-связывающую активность родительской Fc-области менее чем в 1000 раз, менее чем в 500 раз, менее чем в 200 раз, менее чем в 100 раз, менее чем в 90 раз, менее чем в 80 раз, менее чем в 70 раз, менее чем в 60 раз, менее чем в 50 раз, менее чем в 40 раз, менее чем в 30 раз, менее чем в 20 раз, менее чем в 10 раз, менее чем в 5 раз, менее чем в 3 раза или менее чем в 2 раза. Это предпочтительно означает также, что, например, отношение [разница величин RU на сенсограммах, характеризующая изменение до и после взаимодействия FcRn с вариантом Рс-области]/[разница величин RU на сенсограммах, характеризующая изменение до и после захвата FcRn на сенсорных чипах] составляет менее чем 0,5, менее чем 0,3, менее чем 0,2, менее чем 0,1, менее чем 0,08, менее чем 0,05, менее чем 0,03, менее чем 0,02, менее чем 0,01, менее чем 0,008, менее чем 0,005, менее чем 0,003, менее чем 0,002 или менее чем 0,001.
2
4
Для оценки связывающей активности полипептида, содержащего вариант Fc-области, в отношении C1q, можно осуществлять анализ связывания C1q с помощью ELISA. В целом метод состоит в следующем. Планшеты для анализа можно сенсибилизировать в течение ночи при 4°С полипептидом, содержащим вариант Fc-области, или полипептидом, содержащим родительскую Fc-область (контроль), в буфере для нанесения покрытия. Затем планшеты можно промывать и блокировать. После промывки в каждую лунку можно добавлять аликвоту человеческого C1q и инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре. После осуществления еще одной промывки в каждую лунку можно добавлять по 100 мкл конъюгированного с пероксидазой овечьего антитела к компоненту C1q системы комплемента и инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем планшет можно еще один раз промывать буфером для промывки и добавлять в каждую лунку по 100 мкл буфера для субстрата, содержащего OPD (о-фенилдиаминдигидрохлорида (фирма Sigma)). Реакции окисления, которую можно наблюдать по появлению желтой окраски, можно давать пройти в течение 30 мин и затем ее можно прекращать путем добавления 100 мкл 4,5н. HSO. Затем можно измерять абсорбцию при 492-405 нм. C1q-связывающую активность Fc-области можно определять с помощью метода, описанного в примере 4 настоящего описания.
В одном из объектов изобретения разница между C1q-связывающей активностью варианта Fc-области и родительской Fc-области составляет менее чем 50%, менее чем 45%, менее чем 40%, менее чем 35%, менее чем 30%, менее чем 25%, менее чем 20%, менее чем 15%, менее чем 10% или менее чем 5% от C1q-связывающей активности родительской Fc-области.
2. Анализы активности
Одним из объектов изобретения являются анализы, предназначенные для идентификации антител к DENV, которые обладают биологической активностью. Биологическая активность может включать, например, блокирование связывания белка Е DENV с клеткой-хозяином, ингибирование проникновения DENV в клетку-хозяина, ингибирование и/или предупреждение заражения DENV клетки-хозяина и т.д. Предложены также антитела, обладающие указанной биологической активностью in vivo и/или in vitro.
В конкретных вариантах осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, тестируют в отношении указанной биологической активности. В конкретных вариантах осуществления изобретения для оценки активности или нейтрализующей способности тестируемого антитела можно применять тест на нейтрализацию с уменьшением бляшек (PRNT). В некоторых вариантах осуществления изобретения можно использовать животных-хозяев для измерения анти-DENV-активности in vivo.
В конкретных вариантах осуществления изобретения можно проводить непосредственно на клетках анализ связывания DENV и тестируемого антитела. Специалистам в данной области хорошо известны иммуногистохимические методы, конфокальные методы и/или другие методы, пригодные для анализа связывания. Для таких скрининговых анализов можно использовать различные линии клеток, включая клетки, специально сконструированные для этой цели. Примеры клеток, которые применяют в скрининговых анализах, включают клетки млекопитающих, грибные клетки, бактериальные клетки или вирусные клетки. Клетка может представлять собой стимулированную клетку, такую как клетка, стимулированная фактором роста. Специалисту в данной области должно быть очевидно, что в контексте представленного в настоящем описании изобретения можно рассматривать широкое разнообразие анализов для измерения способности тестируемого антитела к связыванию с DENV.
В зависимости от анализа можно применять клетку или культуру ткани. Клетку можно исследовать с помощью целого ряда различных физиологических анализов. В альтернативном или дополнительном варианте можно проводить молекулярный анализ, включая (но, не ограничиваясь только ими) вестерн-блоттинг для мониторинга экспрессии белка и/или анализ белок-белковых взаимодействий; масс-спектрометрию для мониторинга других химических модификаций и т.д.
В некоторых вариантах осуществления изобретения в таких методах используют животное-хозяина. Например, животные-хозяева, которые можно использовать согласно изобретению, могут представлять собой любых млекопитающих-хозяев, включая приматов, хорьков, кошек, собак, коров, лошадей и грызунов, таких как мыши, хомяки, кролики и крысы. В некоторых вариантах осуществления изобретения животное-хозяина инокулируют, инфицируют или иным образом подвергают воздействию вируса до или одновременно с введением тестируемого антитела. Наивных и/или инокулированных животных можно использовать для любых из целого ряда исследований. Например, такие животные модели можно применять, как известно в данной области, для исследований трансмиссии вируса. Тестируемое антитело можно вводить пригодному животному-хозяину до, в процессе или после исследований трансмиссии вируса для определения эффективности тестируемого антитела в отношении блокирования связывания вируса и/или инфекционности в организме животного-хозяина.
Одним из объектов изобретения являются анализы для идентификации полипептидов, которые содержат варианты Fc-области, обладающие биологической активностью. Биологическая активность может включать, например, ADCC-активность и CDC-активность. Предложены также полипептиды, содержащие варианты Fc-области, обладающие такой биологической активностью in vivo и/или in vitro.
В конкретных вариантах осуществления изобретения полипептид, содержащий вариант Fc-области, предлагаемый в изобретении, тестируют в отношении указанной биологической активности. В конкретных объектах изобретения полипептид, содержащий вариант Fc-области, предлагаемый в изобретении, модулирует эффекторную функцию по сравнению с полипептидом, содержащим родительскую Fc-область. В конкретном объекте изобретения указанная модуляция представляет собой модуляцию ADCC и/или CDC.

Для подтверждения CDC- и/или ADCC-активности можно проводить анализы цитотоксичности in vitro и/или in vivo. Например, можно проводить анализы связывания Fc-рецептора (FcR) для того, чтобы удостовериться, что антитело обладает способностью к связыванию с FcγR (и, следовательно, по-видимому, обладает ADCC-активностью) и сохраняет способность к связыванию с FcRn. Первичные клетки, опосредующие ADCC, NK-клетки, экспрессируют только FcγRIII, в то время как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Данные об экспрессии FcR на гематопоэтических клетках обобщены в таблице 3 на стр. 464 публикации Ravetch и Kinet, Annu Rev Immunol 9, 1991, cc. 457-492. Примеры анализов, не ограничивающих объем изобретения, для оценки in vitro ADCC-активности молекулы, представляющей интерес, описаны в US №5500362 (см. также, например, Hellstrom и др., Proc Natl Acad Sci USA 83, 1986, cc. 7059-7063) и у Hellstrom и др., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1985, cc. 1499-1502; US 5821337 (см. Bruggemann и др., J Exp Med 166, 1987, cc. 1351-1361). В альтернативном варианте можно применять методы нерадиоактивного анализа (см., например, нерадиоактивный анализ цитотоксичности для проточной цитометрии ACTI™ (фирма CellTechnology Inc. Маунтин-Вью, шт. Калифорния); и нерадиоактивный анализ цитотоксичности CytoTox 96 (фирма Promega, Мэдисон, шт. Висконсин)). Пригодными эффекторными клетками для таких анализов могут служить мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и естественные клетки-киллеры (NK). В альтернативном или дополнительном варианте ADCC - активность представляющей интерес молекулы можно оценивать in vivo, например, на животных моделях, таких как описанные у Clynes и др., Proc Natl Acad Sci USA 95, 1998, cc. 652-656. Можно также осуществлять анализ связывания C1q для подтверждения того, что антитело связывается с C1q и, следовательно, обладает CDC-активностью. См., например, анализ связывания C1q и С3с методом ELISA в WO 2006/029879 и WO 2005/100402. Для оценки активации комплемента можно осуществлять анализ CDC (см., например, Gazzano-Santoro и др., J Immunol Methods 202, 1997, cc. 163-171; Cragg и др., Blood 101, 2003, cc. 1045-1052; и Cragg и Glennie, Blood 103, 2004, cc. 2738-2743). Оценку FcRn-связывания и определение in vivo клиренса/времени полужизни можно осуществлять также с помощью методов, известных в данной области (см., например, Petkova и др., Int Immunol 18, 2006, cc. 1759-1769).
Г. Иммуноконъюгаты
В некоторых вариантах осуществления изобретения предложены также иммуноконъюгаты, содержащие антитело к DENV, представленное в настоящем описании, конъюгированное с одним или несколькими цитотоксическими агентами, такими как химиотерапевтические агенты или лекарственные средства, ингибирующие рост агенты, токсины (например, белковые токсины, обладающие ферментативной активностью токсины бактериального, грибного, растительного или животного происхождения или их фрагменты) или радиоактивные изотопы. В некоторых вариантах осуществления изобретения предложены также иммуноконъюгаты, содержащие полипептид, который содержит вариант Fc-области, представленный в настоящем описании, конъюгированный с одним или несколькими цитотоксическими агентами, такими как химиотерапевтические агенты или лекарственные средства, ингибирующие рост агенты, токсины (например, белковые токсины, обладающие ферментативной активностью токсины бактериального, грибного, растительного или животного происхождения или их фрагменты) или радиоактивные изотопы.
В одном из вариантов осуществления изобретения иммуноконъюгат представляет собой конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC), в котором антитело конъюгировано с одним или несколькими лекарственными средствами, включая (но, не ограничиваясь только ими) майтансиноид (см. US №№5208020, 5416064 и ЕР 0425235 В1); ауристатин, например, фрагменты DE и DF монометилауристатина (ММАЕ и MMAF) (см. US №№5635483, 5780588 и 7498298); доластатин; калихеамицин или его производные (см. US №№5712374, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001 и 5877296; Hinman и др., Cancer Res. 53, 1993, сс. 3336-3342; и Lode и др., Cancer Res. 58, 1998, сс. 2925-2928); антрациклин, такой как дауномицин или доксорубицин (см. Kratz и др., Curr. Med. Chem. 13, 2006, сс. 477-523; Jeffrey и др., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16, 2006, сс. 358-362; Torgov и др., Bioconjug. Chem. 16, 2005, сс. 717-721; Nagy и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 2000, cc. 829-834; Dubowchik и др., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12, 2002, cc. 1529-1532; King и др., J. Med. Chem. 45, 2002, cc. 4336-4343; и US №6630579); метотрексат; виндесин; таксан, такой как доцетаксел, паклитаксел, ларотаксел, тесетаксел и ортатаксел; трихотецен и СС1065.
В другом варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит антитело, представленное в настоящем описании, конъюгированное с обладающим ферментативной активностью токсином или его фрагментом, включая (но, не ограничиваясь только ими) А-цепь дифтерийного токсина, несвязывающиеся активные фрагменты дифтерийного токсина, А-цепь экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), А-цепь рицина, А-цепь абрина, А-цепь модецина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, диантиновые белки, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP -5), ингибитор из Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор из Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трихотецены.
211
131
125
90
186
188
153
212
32
212
99m
123
В другом варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит антитело, представленное в настоящем описании, конъюгированное с радиоактивным атомом с образованием радиоконъюгата. Широкое разнообразие радиоактивных изотопов можно применять для получения радиоконъюгатов. Примеры включают At, I, I, Y, Re, Re, Sm, Bi, P, Pb и радиоактивные изотопы Lu. Когда радиоконъюгат применяют для детекции, то он может содержать радиоактивный атом для сцинтиграфических исследований, например, TC или I, или спиновую метку для визуализации методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (известный также как магнитно-резонансная визуализация, МРВ), такую как йод-123, иод-131, индий-111, фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец или железо.
14
Конъюгаты антитела и цитотоксического агента можно получать с использованием широкого разнообразия бифункциональных связывающих белки агентов, таких как М-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные сложных имидоэфиров (такие как диметиладипимидат × HCL), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаровый альдегид), бисазидопроизводные (такие как бис(пара-азидобензоил)гександиамин), производные бисдиазония (такие как бис(пара-диазониумбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат), и обладающие двойной активностью фторсодержащие соединения (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин рицин можно получать согласно методу, описанному у Vitetta и др., Science 238, 1987, сс. 1098-1104. Меченная с помощью С 1-изотиоцианатбензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA) является примером хелатирующего агента, применяемого для конъюгации радионуклеотида с антителом (см. WO 94/11026). Линкер может представлять собой «расщепляемый линкер», облегчающий высвобождение цитотоксического лекарственного средства. Например, можно использовать неустойчивый в кислой среде линкер, чувствительный к действию пептидаз линкер, фотолабильный линкер, диметильный линкер или содержащий дисульфид линкер (Chari и др., Cancer Res. 52, 1992, сс. 127-131; US №5208020).
В контексте настоящего описания под иммуноконъюгатами или ADC подразумеваются (но, не ограничиваясь только ими) указанные конъюгаты, полученные с использованием перекрестносшивающих реагентов, которые включают (но, не ограничиваясь только ими) BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, МРВН, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC и сульфо-SMPB, а также SVSB (сукцинимидил(4-винилсульфон)бензоат), которые поступают в продажу (например, от фирмы Pierce Biotechnology, Inc., Рокфорд, шт. Иллинойс, США).
Д. Способы и композиции для диагностирования и обнаружения
В некоторых вариантах осуществления изобретения любое из антител к DENV, представленных в настоящем описании, можно применять для обнаружения присутствия DENV и/или белка Е DENV в биологическом образце. Понятие «обнаружение (детекция)» в контексте настоящего описания предусматривает количественное или качественное обнаружение. В некоторых вариантах осуществления изобретения биологический образец содержит клетку или ткань, например, сыворотку, цельную кровь, плазму, полученный с помощью биопсии образец, образец ткани, клеточную суспензию, слюну, мокроту, оральную жидкость, спинномозговую жидкость, амниотическую жидкость, асцитную жидкость, молоко, молозиво, секрет молочных желез, лимфу, мочу, пот, слезную жидкость, желудочный сок, синовиальную жидкость, перитонеальную жидкость, жидкость хрусталика глаза или слизь.
Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело к DENV для применения в способе диагностирования или обнаружения. Другой объект изобретения относится к способу обнаружения присутствия DENV в биологическом образце. В конкретных вариантах осуществления изобретения способ включает приведение в контакт биологического образца с антителом к DENV, представленным в настоящем описании, в условиях, обеспечивающих связывание антитела к DENV с DENV, и выявление образования комплекса между антителом к DENV и DENV. Указанный способ может представлять собой способ in vitro или in vivo. Другим объектом изобретения является способ обнаружения присутствия белка Е DENV в биологическом образце. В конкретных вариантах осуществления изобретения способ включает в том, что приводят в контакт биологический образец с антителом к DENV, представленным в настоящем описании, в условиях, обеспечивающих связывание антитела к DENV с белком Е DENV, и выявляют образование комплекса между антителом к DENV и белком Е DENV. Указанный способ может представлять собой способ in vitro или in vivo. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к DENV применяют для отбора индивидуумов, которых можно лечить с помощью антитела к DENV, например, когда DENV или белок Е DENV является биомаркером для отбора пациентов.
Примеры нарушений, которые можно диагностировать с использованием антитела, предлагаемого в изобретении, включают инфекцию DENV и заболевания и/или симптомы, вызываемые или ассоциированные с инфекцией DENV, такие как лихорадка денге, геморрагическая лихорадка денге (DHF) и шоковый синдром денге (DSS).
32
14
125
3
131
В конкретных вариантах осуществления изобретения предложены меченые антитела к DENV. Метки включают (но, не ограничиваясь только ими) метки или фрагменты, которые можно обнаруживать непосредственно (такие как флуоресцентные, хромофорные, электронноплотные, хемилюминисцентые и радиоактивные метки), а также фрагменты, такие как ферменты или лиганды, которые подлежат косвенному обнаружению, например, посредством ферментативной реакции или молекулярного взаимодействия. Примеры меток включают (но, не ограничиваясь только ими) радиоизотопы Р, С, I, Н и I, флуорофоры, такие как хелаты редкоземельных металлов или флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, умбеллиферон, люциферазы, например, люцифераза светляка и бактериальная люцифераза (US №4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, пероксидаза из хрена (HRP), щелочная фосфатаза, β-галактозидаза, глюкоамилаза, лизоцим, оксидазы сахаридов, например, глюкозооксидаза, галактозооксидаза и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, гетероциклические оксидазы, такие как уриказа и ксантиноксидаза, сшитые с ферментом, который использует пероксид водорода для окисления предшественника красителя, такого как HRP, лактопероксидаза или микропероксидаза, биотин/авидин, спиновые метки, метки в виде бактериофагов, стабильные свободные радикалы и т.п.
В одном из вариантов осуществления изобретения антитело, содержащее вариант Fc-области, предлагаемое в изобретении, можно применять в качестве агента для аффинной очистки. При осуществлении этого процесса вариант антитела иммобилизуют на твердой фазе, такой как смола Sephadex или фильтровальная бумага с помощью методов, хорошо известных в данной области. Иммобилизованный вариант антитела приводят в контакт с образцом, содержащим предназначенный для очистки антиген, и затем промывают подложку пригодным растворителем для практически полного удаления материала образца, за исключением предназначенного для очистки антигена, который связан с иммобилизованным вариантом антитела. В завершение подложку промывают другим пригодным растворителем, таким как глициновый буфер, рН 5,0, который позволяет отщеплять антиген от варианта антитела.
Вариант антитела можно применять также в диагностических анализах, например, для обнаружения экспрессии представляющего интерес антигена в конкретных клетках, тканях или сыворотке.
Вариант антитела можно применять в любом известном методе анализа, таких как анализы связывания в условиях конкуренции, прямые и косвенные сэндвич-анализы и анализы методом иммунопреципитации (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, изд-во CRC Press, Inc., 1987, cc. 147-158).
E. Фармацевтические композиции
Фармацевтические композиции антитела к DENV, представленного в настоящем описании, получают путем смешения указанного антитела, имеющего необходимую степень чистоты, с одним или несколькими необязательными фармацевтически приемлемыми носителями (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16-е изд. под ред. Osol А., 1980) в форме лиофилизированных композиций или водных растворов.
Фармацевтические композиции полипептида, содержащего вариант Fc-области, представленного в настоящем описании, получают путем смешения указанного полипептида, имеющего необходимую степень чистоты, с одним или несколькими необязательными фармацевтически приемлемыми носителями в форме лиофилизированных композиций или водных растворов.

Фармацевтически приемлемые носители, как правило, являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях, они включают (но, не ограничиваясь только ими): буферы, такие как фосфатный, цитратный буферы, а также буферы на основе других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензетония; фенол; бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол и мета-крезол); полипептиды с низкой молекулярной массой (содержащие менее приблизительно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поли(винилпирролидон); аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТК; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; содержащие металл комплексы (например, комплексы Zn-белок); и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ). В контексте настоящего описания примеры фармацевтически приемлемых носителей включают также диспергирующие агенты интерстициальных лекарственных средств, такие как растворимые активные в нейтральной среде гликопротеины гиалуронидаз (sHASEGP), например, человеческие растворимые гликопротеины гиалуронидазы РН-20, такие как rHuPH20 (HYLENEX, фирма Baxter International, Inc.). Некоторые примеры sHASEGP и методы их применения, в том числе rHuPH20, описаны в публикациях патентов США №№2005/0260186 и 2006/0104968. Согласно одному из объектов изобретения sHASEGP объединяют с одним или несколькими дополнительными гликозаминогликаназами, такими как хондроитиназы.
Примеры лиофилизированных композиций антител описаны в US №6267958. Водные композиции антител включают композиции, описанные в US №6171586 и WO 2006/044908, последние композиции включают гистидин-ацетатный буфер.
Композиция, предлагаемая в изобретении, может содержать также более одного действующего вещества, если это необходимо для конкретного подлежащего лечению показания, предпочтительно вещества с дополнительными видами активности, которые не оказывают отрицательного воздействия друг на друга. Например, может оказаться целесообразным дополнительно включать противовирусный агент, такой как (но, не ограничиваясь только ими) интерфероны (например, интерферон-α-2b, интерферон-γ и т.д.), моноклональные антитела к DENV, поликлональные антитела к DENV, ингибиторы РНК-полимеразы, ингибиторы протеазы, ингибиторы геликазы, иммуномодуляторы, антисмысловые соединения, короткие интерферирующие РНК, короткие РНК-шпильки, микро-РНК, РНК-аптамеры, рибозимы и их комбинации. Такие действующие вещества должны присутствовать в комбинации в количествах, эффективных для достижения поставленной цели.
Действующие вещества можно включать также в микрокапсулы, например, полученные с помощью методов коацервации или межфазной полимеризации, например в гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли(метилметакрилатные) микрокапсулы соответственно, в коллоидные системы введения лекарственного средства (например в липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методы описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, 16-е изд., под ред. Osol А., 1980.
Можно приготавливать препараты с замедленным высвобождением. Приемлемыми примерами препаратов с замедленным высвобождением являются полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, включающие антитело или конъюгат, такие матрицы представляют собой изделия определенной формы, например, пленки или микрокапсулы.
Композиции, предназначенные для применения in vivo, как правило, должны быть стерильными. Стерильность можно легко обеспечивать, например, путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны.
Ж. Терапевтические способы и композиции
Любое из антител к DENV, представленных в настоящем описании, можно применять в терапевтических способах.
Одним из объектов изобретения является антитело к DENV, предназначенное для применения в качестве лекарственного средства. Другие объекты изобретения относятся к антителу к DENV, которое предназначено для применения для лечения инфекции DENV. В конкретных вариантах осуществления изобретения предложено антитело к DENV для применения в способе лечения. В конкретных вариантах осуществления изобретения предложено антитело к DENV для применения в способе лечения индивидуума, инфицированного DENV, включающем введение индивидууму в эффективном количестве антитела к DENV. В одном из указанных вариантов осуществления изобретения способ включает также введение индивидууму в эффективном количестве по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства, например, описанного ниже. В других вариантах осуществления изобретения предложено антитело к DENV для применения для блокирования связывания белка Е DENV с клеткой-хозяином и/или проникновения DENV в клетку-хозяина. В конкретных вариантах осуществления изобретения предложено антитело к DENV для применения в способе блокирования связывания белка Е DENV с клеткой-хозяином и/или проникновения DENV в клетку-хозяина в организме индивидуума, включающем введение индивидууму в эффективном количестве антитела к DENV для блокирования связывания белка Е DENV с клеткой-хозяином и/или проникновения DENV в клетку-хозяина. «Индивидуум» в контексте любого из указанных выше вариантов осуществления изобретения предпочтительно представляет собой человека.
Следующим объектом изобретения является применение антитела к DENV для приготовления или получения лекарственного средства. В одном из вариантов осуществления изобретения лекарственное средство предназначено для лечения инфекции DENV. В другом варианте осуществления изобретения лекарственное средство применяют в способе лечения инфекции DENV, включающем введение индивидууму, инфицированному DENV, в эффективном количестве лекарственного средства. В одном из указанных вариантов осуществления изобретения способ включает также введение индивидууму в эффективном количестве по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства, например, описанного ниже. В следующем варианте осуществления изобретения лекарственное средство предназначено для блокирования связывания белка Е DENV с клеткой-хозяином и/или проникновения DENV в клетку-хозяина. В следующем варианте осуществления изобретения лекарственное средство предназначено для применения в способе блокирования связывания белка Е DENV с клеткой-хозяином и/или проникновения DENV в клетку-хозяина в организме индивидуума, включающем введение индивидууму в эффективном количестве антитела к DENV для блокирования связывания белка Е DENV с клеткой-хозяином и/или проникновения DENV в клетку-хозяина. «Индивидуум» в контексте любого из указанных выше вариантов осуществления изобретения может представлять собой человека.
Другим объектом изобретения является способ лечения инфекции DENV. В одном из вариантов осуществления изобретения способ включает введение индивидууму, инфицированному DENV, в эффективном количестве антитела к DENV. В одном из таких вариантов осуществления изобретения способ включает также введение индивидууму в эффективном количестве по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства, описанного ниже. «Индивидуум» в контексте любого из указанных выше вариантов осуществления изобретения может представлять собой человека.
Другим объектом изобретения является способ блокирования связывания белка Е DENV с клеткой-хозяином и/или проникновения DENV в клетку-хозяина в организме индивидуума. В одном из вариантов осуществления изобретения способ включает введение индивидууму в эффективном количестве антитела к DENV для блокирования связывания белка Е DENV с клеткой-хозяином и/или проникновения DENV в клетку-хозяина. В одном из вариантов осуществления изобретения «индивидуум» представляет собой человека.
Другим объектом изобретения являются фармацевтические композиции, содержащие любое из антител к DENV, представленных в настоящем описании, которые предназначены, например, для применения в любом из указанных выше терапевтических способов. В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит любое из антител к DENV, представленных в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит любое из антител к DENV, представленных в настоящем описании, и по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство, например, представленное ниже.
В другом варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция предназначена для лечения инфекции DENV. В другом варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция предназначена для блокирования связывания белка Е DENV с клеткой-хозяином и/или проникновения DENV в клетку-хозяина. В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтическую композицию вводят индивидууму, инфицированному DENV. «Индивидуум» в контексте любого из указанных выше вариантов осуществления изобретения предпочтительно представляет собой человека.
В конкретных вариантах осуществления изобретения инфекция DENV может включать заболевания и/или симптомы, которые вызываются или ассоциированы с инфекцией DENV, такие как лихорадка денге, геморрагическая лихорадка денге (DHF) и шоковый синдром денге (DSS).
Любой из полипептидов, содержащих вариант Fc-области, представленный в настоящем описании, можно применять в терапевтических способах.
Одним из объектов изобретения является полипептид, содержащий вариант Fc-области, который предназначен для применения в качестве лекарственного средства. В конкретных вариантах осуществления изобретения предложен полипептид, содержащий вариант Fc-области, для применения в способе лечения. В конкретных вариантах осуществления изобретения предложен полипептид, содержащий вариант Fc-области, для применения в способе лечения имеющего нарушение индивидуума, включающем введение индивидууму в эффективном количестве полипептида, содержащего вариант Fc-области. В одном из таких вариантов осуществления изобретения способ дополнительно включает введение индивидууму в эффективном количестве по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства. В одном из вариантов осуществления изобретения нарушение представляет собой вирусную инфекцию. В одном из вариантов осуществления изобретения «индивидуум» представляет собой человека.
Другим объектом изобретения является применение полипептида, содержащего вариант Fc-области, для приготовления или получения лекарственного средства. В одном из вариантов осуществления изобретения лекарственное средство предназначено для лечения нарушения. В некоторых объектах изобретения полипептид представляет собой антитело. В некоторых объектах изобретения полипептид представляет содержащий Fc слитый белок. В другом варианте осуществления изобретения лекарственное средство предназначено для применения в способе лечения нарушения, включающем введение индивидууму, который имеет нарушение, подлежащее лечению, лекарственного средства в эффективном количестве. В одном из таких вариантов осуществления изобретения способ дополнительно включает введение индивидууму в эффективном количестве по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства. В одном из вариантов осуществления изобретения нарушение представляет собой вирусную инфекцию. В одном из вариантов осуществления изобретения «индивидуум» представляет собой человека.
Другим объектом изобретения является способ лечения нарушения. В одном из таких вариантов осуществления изобретения способ включает введение индивидууму, имеющему указанное нарушение, в эффективном количестве полипептида, содержащего вариант Fc-области. В одном из таких вариантов осуществления изобретения способ дополнительно включает введение индивидууму в эффективном количестве по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства. В одном из вариантов осуществления изобретения нарушение представляет собой вирусную инфекцию. В одном из вариантов осуществления изобретения «индивидуум» представляет собой человека.
Другим объектом изобретения являются фармацевтические композиции, содержащие полипептид, который содержит вариант Fc-области, представленный в настоящем описании, предназначенные для применения в терапевтическом способе, таком как один из представленных в настоящем описании терапевтических способов. В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит полипептид, содержащий вариант Fc-области, представленный в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит полипептид, содержащий вариант Fc-области, представленный в настоящем описании, и по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство.
В другом объекте изобретения фармацевтическая композиция предназначена для лечения нарушения. В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтическую композицию вводят индивидууму, имеющему нарушение. В одном из вариантов осуществления изобретения нарушение представляет собой вирусную инфекцию. В одном из вариантов осуществления изобретения «индивидуум» представляет собой человека.
Противовирусные антитела, которые содержат вариант Fc-области, предлагаемые в настоящем изобретении, могут подавлять антителозависимое усиление (ADE), которое имеет место в случае обычных противовирусных антител. ADE представляет собой явление, когда вирус, связанный с антителом, подвергается фагоцитозу, опосредуемому активирующими FcγR, в результате чего происходит усиление инфекции вируса в клетках. Модификации Fc, которые снижают взаимодействие с активирующими FcγR, могут снижать риск ADE. Было продемонстрировано, что мутации в положениях 234 и 235, приводящие к замене лейцина на аланин, с образованием несущих LALA мутантов, снижают риск ADE инфекции денге in vivo (Cell Host Microbe, 8, 2010, cc. 271-283). Однако указанные модификации снижают другие эффекторные иммунные функции, опосредуемые антителами, такие как ADCC и CDC. Можно ожидать, что прежде всего CDC играет важную роль в ингибировании ADE, поэтому из соображений терапевтической эффективности не следует снижать связывание Fc-областей с компонентом системы комплемента C1q. Кроме того, можно удлинять время полужизни антитела путем конструирования Fc-областей, которые изменяют аффинность связывания с его «рецептором спасения», FcRn, что может позволять применять антитела в профилактических целях для защиты от вирусной инфекции.
Вирус предпочтительно выбирают из аденовируса, астровируса, гепадновируса, вируса герпеса, паповавируса, поксивируса, аренавируса, буньявируса, кальцивируса, коронавируса, филовируса, флавивируса, ортомиксовируса, парамиксовируса, пикорнавируса, реовируса, ретровируса, рабдовируса и тогавируса.
В предпочтительных вариантах осуществления изобретения аденовирус включает (но, не ограничиваясь только им) человеческий аденовирус. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения астровирус включает (но, не ограничиваясь только им) мам астровирус. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения гепадновирус включает (но, не ограничиваясь только им) вирус гепатита В. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения вирус герпеса включает (но, не ограничиваясь только ими) вирус герпеса простого типа I, вирус герпеса простого типа 2, человеческий цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барра, вирус ветряной оспы, розеоловирус и ассоциированный с саркомой Капоши вирус герпеса. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения паповирус включает (но, не ограничиваясь только им) вирус папилломы человека и вирус полиомы человека. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения поксивирус включает (но, не ограничиваясь только ими) вирус натуральной оспы, вирус осповакцины, вирус коровьей оспы, вирус оспы обезьян, вирус оспы, вирус псевдооспы коров, вирус везикулярного стоматита, танапоксивирус, вирус опухолей обезьян Яба и вирус контагиозного моллюска. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения аренавирус включает (но, не ограничиваясь только ими) вирус лимфоцитарного хориоменингита, вирус Ласса, вирус Мачупо и вирус Юнин. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения буньявирус включает (но, не ограничиваясь только ими) хантавирус, найровирус, ортобуньявирус и флебовирус. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения кальцивирус включает (но, не ограничиваясь только ими) везивирус, норовирус, такой как вирус Норвалк и саповирус. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения коронавирус включает (но, не ограничиваясь только ими), человеческий коронавирус (этиологический агент серьезного острого респираторного синдрома (SARS)). В предпочтительных вариантах осуществления изобретения филовирус включает (но, не ограничиваясь только ими) вирус Эбола и вирус Марбург. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения флавивирус включает (но, не ограничиваясь только ими) вирус желтой лихорадки, вирус Западного Нила, вирус денге (DENV-1, DENV-2, DENV-3 и DENV-4), вирус гепатита С, вирус клещевого энцефалита, вирус японского энцефалита, вирус энцефалита долины Муррея, вирус энцефалита Сент-Луис, вирус русского весеннее-летнего клещевого энцефалита, вирус омской геморрагической лихорадки, вирус вирусной диареи крупного рогатого скота, вирус киасанурской лесной болезни и вирус энцефалита Повассан. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения ортомиксовирус включает (но, не ограничиваясь только ими) вирус гриппа типа А, вирус гриппа типа В, и вирус гриппа типа С. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения парамиксовирус включает (но, не ограничиваясь только ими) вирус парагриппа, вирус эпидемического паротита (эпидемический паротит), вирус кори (корь), пневмовирус, такой как человеческий респираторно-синцитиальный вирус и вирус подострого склеротизирующего панэнцефалита. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения пикорнаксовирус включает (но, не ограничиваясь только ими) полиовирус, риновирус, коксакивирус А, коксакивирус В, вирус гепатита А, эховирус и энтеровирус. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения реовирус включает (но, не ограничиваясь только ими) вирус колорадской клещевой лихорадки и ротавирус. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения ретровирус включает (но, не ограничиваясь только ими) лентивирус, такой как вирус иммунодефицита человека и человеческий Т-лимфотрофный вирус (HTLV). В предпочтительных вариантах осуществления изобретения рабдовирус включает (но, не ограничиваясь только ими) лиссавирус, такой как вирус бешенства, вирус везикулярного стоматита и вирус инфекционного гематопоэтического некроза. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения тогавирус включает (но, не ограничиваясь только ими) альфавирус, такой как вирус лихорадки реки Росс, вирус О'Ньонг-Ньонг, вирус Синдбис, вирус венесуэльского лошадиного энцефалита, вирус восточного лошадиного энцефалита, вирус западного лошадиного энцефалита и вирус краснухи.
Другим объектом изобретения являются способы получения лекарственного средства или фармацевтической композиции, включающие смешение любого из антител к DENV, предлагаемых в настоящем изобретении, с фармацевтически приемлемым носителем, например, для применения в любом из описанных выше терапевтических способов. В одном из вариантов осуществления изобретения способы получения лекарственного средства или фармацевтической композиции включают также добавление по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента к лекарственному средству или фармацевтической композиции.
Антитела, предлагаемые в изобретении, можно применять в терапии индивидуально или в комбинации с другими агентами. Например, антитело, предлагаемое в изобретении, можно вводить совместно по меньшей мере с одним дополнительным терапевтическим агентом. В конкретных вариантах осуществления изобретения дополнительный терапевтический агент представляет собой противовирусное средство, такое как (но, не ограничиваясь только ими) интерфероны (например, интерферон α-2b, интерферон-γ и т.д.), моноклональные антитела к DENV, поликлональные антитела к DENV, ингибиторы РНК-полимеразы, ингибиторы протеазы, ингибиторы геликазы, иммуномодуляторы, антисмысловые соединения, короткие интерферирующие РНК, короткие РНК-шпильки, микро-РНК, РНК-аптамеры, рибозимы и их комбинации.
Другим объектом изобретения являются способы получения лекарственного средства или фармацевтической композиции, включающие смешение любого из полипептидов, содержащих вариант Fc-области, представленных в настоящем описании, с фармацевтически приемлемым носителем, например, для применения в любом из описанных выше терапевтических методов. В одном из вариантов осуществления изобретения способы получения лекарственного средства или фармацевтической композиции включают также добавление по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента к лекарственному средству или фармацевтической композиции.
Полипептиды, содержащие вариант Fc-области, предлагаемый в изобретении, можно применять в терапии индивидуально или в комбинации с другими средствами. Например, полипептид, содержащий вариант Fc-области, предлагаемый в изобретении, можно вводить совместно по меньшей мере с одним дополнительным терапевтическим агентом. В конкретных вариантах осуществления изобретения дополнительный терапевтический агент представляет собой противовирусное средство, такое как (но, не ограничиваясь только ими) интерфероны (например, интерферон α-2b, интерферон-γ и т.д.), моноклональные антитела к DENV, поликлональные антитела к DENV, ингибиторы РНК-полимеразы, ингибиторы протеазы, ингибиторы геликазы, иммуномодуляторы, антисмысловые соединения, короткие интерферирующие РНК, короткие РНК-шпильки, микро-РНК, РНК-аптамеры, рибозимы и их комбинации.
Такие комбинированные терапии, указанные выше, предусматривают совместное введение (когда два или большее количество терапевтических средств включены в одну и ту же или различные композиции) и раздельное введение, в этом случае введение антитела или полипептида, содержащего вариант Fc-области, предлагаемого в изобретении, можно осуществлять до, одновременно и/или после введения дополнительного терапевтического средства или средств. В одном из вариантов осуществления изобретения введение антитела к DENV и введение дополнительного терапевтического средства можно осуществлять в пределах примерно одного месяца или в пределах примерно 1, 2 или 3 недель, или в пределах примерно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 дней друг относительно друга. В другом варианте осуществления изобретения введение полипептида, содержащего вариант Fc-области, и введение дополнительного терапевтического средства можно осуществлять в пределах примерно одного месяца или в пределах примерно 1, 2 или 3 недель, или в пределах примерно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 дней друг относительно друга.
Антитело или полипептид, содержащий вариант Fc-области, предлагаемое/предлагаемый в изобретении (и необязательно любое дополнительное терапевтическое средство), можно вводить любыми приемлемыми путями, включая парентеральный, внутрилегочный и интраназальный и при необходимости применять для местной обработки, введения в повреждение. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Дозирование можно осуществлять любым приемлемым путем, например, путем инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции, в зависимости, в том числе, от того, является ли лечение кратковременным или хроническим. Можно применять различные схемы дозирования, включая (но, не ограничиваясь только ими) однократное введение или несколько введений в различные моменты времени, болюсное введение и пульсирующую инфузию.
Антитела или полипептиды, содержащие вариант Fc-области, предлагаемые в изобретении, можно включать в состав композиций, дозировать и вводить в соответствии с надлежащей клинической практикой. Рассматриваемые в этом контексте факторы включают конкретное нарушение, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, подлежащее лечению, клиническое состояние индивидуального пациента, причину нарушения, область введения агента, метод введения, схему введения и другие факторы, известные практикующим медикам. Антитело можно, но это не является обязательным, включать в композицию в сочетании с одним или несколькими другими агентами, которые в настоящее время применяют для профилактики и лечения рассматриваемого нарушения. Эффективное количество указанных других агентов зависит от количества антитела, присутствующего в композиции, типа нарушения или лечения и других указанных выше факторов. Их, как правило, применяют в таких же дозах и с использованием таких же путей введения, которые указаны в настоящем описании, или в количестве, составляющем от 1 до 99% от дозы, указанной в настоящем описании, или в любой дозе и с помощью любого пути, которые по данным эмпирической/клинической оценки являются пригодными.
Для предупреждения или лечения заболевания приемлемая доза антитела или полипептида, который содержит вариант Fc-области, предлагаемого в изобретении (при его применении индивидуально или в сочетании с одним или несколькими другими дополнительными терапевтическими средствами), должна зависеть от типа заболевания, подлежащего лечению, типа антитела, типа полипептида, содержащего вариант Fc-области, серьезности и течения болезни, от того, применяют ли антитело или полипептид, содержащий вариант Fc-области, для превентивных или терапевтических целей, предшествующей терапии, истории болезни пациента и ответа на антитело или полипептид, содержащий вариант Fc-области, а также предписания лечащего врача. Антитело или полипептид, содержащий вариант Fc-области, можно вводить пациенту однократно или в виде серии обработок. В зависимости от типа и серьезности заболевания примерно от 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,5-10 мг/кг) антитела может представлять собой начальную возможную дозу для введения пациенту, например, с помощью одной или нескольких отдельных обработок или с помощью непрерывной инфузии. Одним из примеров типичных суточных доз может являться доза, составляющая от примерно 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более в зависимости от указанных выше факторов. При использовании повторных введений в течение нескольких дней или более длительного периода времени, в зависимости от состояния, лечение, как правило, следует продолжать до достижения подавления симптомов заболевания. Одним из примеров доз антитела или полипептида, содержащего вариант Fc-области, является доза, составляющая от примерно 0,05 до примерно 10 мг/кг. Так, пациенту можно вводить одну или несколько следующих доз: примерно 0,5, 2,0, 4,0 или 10 мг/кг (или любую их комбинацию). Указанные дозы можно вводить дробно, например, каждую неделю или каждые три недели (например, так, чтобы пациент получал от примерно двух до примерно двадцати, например, примерно шесть доз антитела или полипептида, содержащего вариант Fc-области). Можно применять начальную повышенную ударную дозу с последующим введением одной или нескольких более низких доз. С помощью общепринятых методов и анализов можно легко осуществлять мониторинг действия указанной терапии.
Очевидно, что любые из вышеуказанных композиций или терапевтических способов можно применять с использованием иммуноконъюгата, предлагаемого в изобретении, вместо или в дополнение к антителу к DENV. Очевидно, что любые из вышеуказанных композиций или терапевтических способов можно применять с использованием иммуноконъюгата, предлагаемого в изобретении, вместо или в дополнение к полипептиду, содержащему вариант Fc-области, представленному в настоящем описании.
З. Изделия
Другим объектом изобретения является изделие, которое содержит продукты, применяемые для лечения, предупреждения и/или диагностирования указанных выше нарушений. Изделие представляет собой контейнер и этикетку или листовку-вкладыш в упаковку, которые размещены на контейнере или вложены в него. Приемлемыми контейнерами являются, например банки, пузырьки, шприцы, пакеты для внутривенного раствора и т.д. Контейнеры можно изготавливать из различных материалов, таких как стекло или пластмасса. Контейнер содержит композицию, которая сама или в сочетании с другой композицией является эффективной для лечения, предупреждения и/или диагностирования состояния, и может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может представлять собой пакет для внутривенного раствора или пузырек, снабженный пробкой, которую можно прокалывать с помощью иглы для подкожных инъекций). По меньшей мере одно действующее вещество в композиции представляет собой антитело или полипептид, который содержит вариант Fc-области, предлагаемое/предлагаемый в изобретении. На этикетке или листовке-вкладыше в упаковку указано, что композицию применяют для лечения выбранного состояния. Кроме того, изделие может включать (а) первый контейнер с находящейся в нем композицией, где композиция содержит антитело или полипептид, который содержит вариант Fc-области, предлагаемое/предлагаемый в настоящем изобретении; и (б) второй контейнер с находящейся в нем композицией, где композиция содержит дополнительное цитотоксическое или иное терапевтическое средство. Согласно этому варианту осуществления изобретения изделие может содержать листовку-вкладыш в упаковку, которая содержит информацию о том, что композиции можно использовать для лечения конкретного состояния. В альтернативном или дополнительном варианте изделие может дополнительно включать второй (или третий) контейнер с фармацевтически приемлемым буфером, таким как бактериостатическая вода для инъекций (БСВИ), забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Кроме того, оно может включать другие продукты, необходимые с коммерческой точки зрения и с точки зрения потребителя, в частности, другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.
Как должно быть очевидно, любое из указанных выше изделий может включать иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, вместо или в дополнение к антителу к DENV. Аналогично этому должно быть очевидно, любое из указанных выше изделий может включать иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, вместо или в дополнение к полипептиду, содержащему вариант Fc-области.
Примеры
Ниже приведены примеры способов и композиций, предлагаемых в изобретении. Как должно быть очевидно, различные другие варианты осуществления изобретения можно применять на практике с учетом общего описания изобретения, представленного выше
Пример 1: Получение антигенов и антител
Экспрессия и очистка рекомбинантного растворимого белка Е из DENV-1, DENV-2, DENV-3 и DENV-4
Кратковременную экспрессию рекомбинантных растворимых белков Е (0.8E-His) DENV-1, DENV-2, DENV-3 и DENV-4 с карбоксиконцевой 8×гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 65-68 соответственно) осуществляли с использованием линии клеток FreeStyle293-F или линии клеток Expi293 (фирма Thermo Fisher, Карлсбад, шт. Калифорния, США). При экспрессии prM0.8E-His из DENV-1, DENV-2, DENV-3 и DENV-4 (SEQ ID NO: 61-64 соответственно), prMO.SE-His экспрессировался в клетках в виде одного полипептида, который затем в результате внутриклеточного процессинга расщеплялся между prM и 0.8E-His. В результате этого 0.8E-His секретировался в среды для клеточной культуры. Кондиционированные среды, содержащие 0.8E-His, вносили на колонку, упакованную смолой для аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом (IMAC), загруженной никелем или кобальтом, после чего осуществляли элюцию с использованием имидазола. Фракции, содержащие 0.8E-His, объединяли и вносили на колонку для гель-фильтрации с Супердекс 200 (фирма GE healthcare, Уппсала, Швеция). Фракции, содержащие 0.8E-His, объединяли и хранили при -80°С.
Экспрессия и очистка рекомбинантных человеческих FcγR
Внеклеточные домены человеческих FcγR получали с помощью следующего метода. Сначала с помощью методов, хорошо известных специалистам в данной области, синтезировали ген внеклеточного домена FcγR. В этом случае последовательность каждого FcγR получали на основе информации, имеющейся в NCBI. Более конкретно, FcγRIa получали на основе последовательности с регистрационным номером NCBI NM_000566 (версия № NM_000566.3), FcγRIIa получали на основе последовательности с регистрационным номером NCBI NM_001136219 (версия № NM_001136219.1), FcγRIIb получали на основе последовательности с регистрационным номером NCBI NM_004001 (версия № NM_004001.3), FcγRIIIa получали на основе последовательности с регистрационным номером NCBI NM_001127593 (версия 10 NM_001127593.1) и FcγRIIIb получали на основе последовательности с регистрационным номером NCBI NM_000570 (версия № NM_000570.3), и His-метку присоединяли к С-концу каждой конструкции FcγR. Кроме того, известно, что для FcγRIIa, FcγRIIIa и FcγRIIIb имеет место полиморфизм, и сайты полиморфизма получали согласно методу, описанному у Warmerdam и др., J Exp Med 172, 1990, сс. 19-25, для FcγRIIa; у Wu и др., J Clin Invest 100, 1997, сс. 1059-1070, для FcγRIIIa, и у Ory и др., J Clin Invest 84, 1989, сс. 1688-1691, для FcγRIIIb.
Экспрессионные векторы конструировали путем встраивания полученных генных фрагментов в экспрессионные векторы для клеток животных. Сконструированные экспрессионные векторы кратковременно интродуцировали в клетки линии FreeStyle293, происходящие из клеток рака почки эмбриона человека FreeStyle293 (фирма Invitrogen), для экспрессии представляющих интерес белков. Жидкость, полученную путем фильтрации через 0,22 мкм-фильтр супернатантов культуры, которые получали из культуральных сред 25 описанных выше клеток, подвергнутых кратковременной интродукции, очищали, осуществляя в целом четыре следующие стадии: (I) катионообменная хроматография на колонке (SP Сефароза FF); (II) аффинная хроматография на колонке для His-метки (HisTrap HP); (III) гель-фильтрация на колонке (Супердекс 200) и (IV) стерилизация фильтрацией. Для очистки FcγRI на стадии (I) применяли анионообменную хроматографию на колонке с Q сефарозой FF. Абсорбцию очищенного белка измеряли при 280 нм с помощью спектрофотометра. На основе измеренных величин рассчитывали концентрации очищенных белков с использованием коэффициента экстинкции, который определяли с помощью такого метода, как РАСЕ (Protein Science, 4, 1995, сс. 2411-2423).
Экспрессия и очистка рекомбинантных мышиных FcγR
Внеклеточный домен мышиных FcγR (mFcγR) получали с помощью следующего метода: сначала синтезировали ген внеклеточного домена FcγR с помощью метода, хорошо известного специалистам в данной области. Для осуществления этого синтеза получали последовательность каждого FcγR на основе информации, имеющейся в NCBI. Более конкретно, mFcγRI получали на основе последовательности референс-последовательности NCBI: NP_034316.1; mFcγRIIb получали на основе последовательности референс-последовательности NCBI: NP_034317.1; mFcγRIII получали на основе последовательности референс-последовательности NCBI: NP_034318.2; and mFcγRIV получали на основе последовательности референс-последовательности NCBI: NP_653142.2. Каждую из этих последовательностей метили на С-конце с помощью His-метки.
Для получения экспрессионных векторов каждый из полученных фрагментов гена встраивали в векторы для экспрессии в клетках животных. Полученные экспрессионные векторы кратковременно переносили в клетки FreeStyle 293, происходящие из раковых клеток почки эмбриона человека (фирма Invitrogen), для осуществления экспрессии представляющего интерес белка. Отделяли полученный супернатант культуры и затем пропускали через 0,22 мкм-фильтр для получения супернатанта культуры. Полученный супернатант культуры очищали, как правило, осуществляя четыре следующие стадии: (I) ионообменная хроматография на колонке, (II) аффинная хроматография на колонке для His-метки (HisTrap HP), (III) гель-фильтрация на колонке (Супердекс 200) и (IV) стерилизация фильтрацией. На стадии (I) применяли ионообменную хроматографию на колонке с использованием Q Сефарозы HP для mFcγRI, SP Сефарозы FF для mFcγRIIb и mFcγRIV, и SP Сефарозы HP для mFcγRIII. D-ЗФР(-) применяли в качестве растворителя на стадии (III) или более поздней стадии, при этом для mFcγRIII использовали D-PBS(-), содержащий 0,1М аргинин. Абсорбцию очищенного белка измеряли при 280 нм с помощью спектрофотометра и на основе полученного значения рассчитывали концентрацию очищенного белка с использованием коэффициента экстинкции, который определяли с помощью такого метода, как РАСЕ (Protein Science, 4, 1995, сс. 2411-2423).
Экспрессия и очистка рекомбинантного человеческого FcRn FcRn представляет собой гетеродимер альфа-цепи FcRn и бета2-микроглобулина. Олиго-ДНК-праймеры получали на основе опубликованной последовательности человеческого гена FcRn (J Exp Med 180, 1994, cc. 2377-2381). ДНК-фрагмент, кодирующий полноразмерный ген, получали с помощью ПЦР с использованием человеческой кДНК (кДНК Human Placenta Marathon-Ready, фирма Clontech) в качестве матрицы и с использованием полученных праймеров. С использованием полученного ДНК-фрагмента в качестве матрицы амплифицировали с помощью ПЦР ДНК-фрагмент, кодирующий внеклеточный домен, содержащий сигнальную область (Metl-Leu290), и встраивали в экспрессионный вектор для клеток млекопитающих. Аналогичным образом, олиго-ДНК-праймеры получали исходя из описанной последовательности гена человеческого бета2-микроглобулина (Proc Natl Acad Sci USA 99, 2002, cc. 16899-16903). ДНК-фрагмент, кодирующий полноразмерный ген, получали с помощью ПЦР с использованием человеческой кДНК (кДНК Human Placenta Marathon-Ready, фирма Clontech) в качестве матрицы и с использованием полученных праймеров. С использованием полученного ДНК-фрагмента в качестве матрицы амплифицировали с помощью ПЦР ДНК-фрагмент, кодирующий полноразмерный белок, содержащий сигнальную область (Metl-Met119), и встраивали в экспрессионный вектор для клеток млекопитающих.
Растворимый человеческий FcRn экспрессировали в соответствии с нижеследующей процедурой. Плазмиды, сконструированные для экспрессии альфа-цепи человеческого FcRn (SEQ ID NO: 81) и бета2-микроглобулина (SEQ ID NO: 82), интродуцировали путем липофекции в клетки клеточной линии НЕК293Н, происходящей из раковых клеток почек человеческого эмбриона (фирма Invitrogen), с использованием PEI (фирма Polyscience). Полученный супернатант культуры собирали и FcRn очищали с использованием IgG-сефарозы 6 Fast Flow (фирма Amersham Biosciences), после чего дополнительно очищали на колонке HiTrap Q HP (фирма GE Healthcare) (J Immunol 169, 2002, cc. 5171-5180).
Экспрессия и очистка рекомбинантных антител
Осуществляли кратковременную экспрессию рекомбинантных антител с использованием либо клеточной линии FreeStyle293-F, либо клеточной линии Expi293 (фирма Thermo Fisher, Карлсбад, шт. Калифорния, США). Очистку из кондиционированных сред, в которых имела место экспрессия антител, осуществляли с помощью общепринятого метода с использованием белка А. Затем при необходимости осуществляли гель-фильтрацию.
Экспрессия и очистка рекомбинантного растворимого человеческого CD154
Человеческий ген CD154 синтезировали на основе опубликованной белковой последовательности (NP_000065.1). ДНК-фрагмент, кодирующий растворимую форму человеческого CD154 (shCD154) с FLAG-меткой получали с помощью ПЦР с использованием синтезированной ДНК в качестве матрицы, и полученные ДНК-фрагменты встраивали в экспрессионный вектор для клеток млекопитающих, получая в результате экспрессионный вектор FLAG-shCD154 (SEQ ID NO: 106). Нуклеотидные последовательности полученных экспрессионных векторов определяли с помощью общепринятых методов, известных специалистам в данной области. Экспрессию FLAG-shCD154 осуществляли с использованием клеточной линии FreeStyle 293 (фирма Invitrogen) согласно протоколу, разработанному производителем. После трансфекции клетки выращивали в течение соответствующего периода времени перед сбором кондиционированной среды. Кондиционированную среду подвергали катионообменной хроматографии с использованием 25 мМ MES (рН 6,0), и элюировали FLAG-shCD154 с использованием непрерывного градиента 25 мМ MES, 1М NaCl (рН 6,0). Пиковые фракции объединяли, концентрировали с использованием устройства AmiconUltra Ultracel и подвергали гель-фильтрации с использованием забуференного фосфатом соляного раствора (фирма Wako). Пиковые фракции снова объединяли и концентрировали с использованием устройства AmiconUltra Ultracel, затем стерилизовали фильтрацией с использованием мембранного (0,22 мкм, PVDF) фильтра. Для определения концентрации очищенного FLAG-shCD154 измеряли абсорбцию при 280 нм с помощью спектрофотометра. На основе полученных величин рассчитывали концентрации белка с использованием коэффициента абсорбции, рассчитанного с помощью метода, описанного в Protein Science 4, 1995, cc. 2411-2423.
Пример 2: Создание вариантов антител с повышенной аффинностью к белку Е DENV
Синтезировали гены, кодирующие VH (3СН, SEQ ID NO: 1) и VL (3CL, SEQ ID NO: 7) антитела к белку Е DENV и объединяли с СН человеческого IgG1 (SG182, SEQ ID NO: 46) и человеческой CL (SK1, SEQ ID NO: 60) соответственно, и обе конструкции клонировали в одном экспрессионном векторе. Антитело обозначали в настоящем описании как DG_3CH-SG182/3CL-SK1 или как 3С.
Для идентификации мутаций и комбинаций, которые улучшают характеристики связывания 3С, было изучено большое количество мутаций и их комбинаций. Затем в вариабельные области интродуцировали многочисленные мутации для повышения аффинности связывания с белком Е. Таким путем были созданы оптимизированные варианты VH, 3СН912 (SEQ ID NIO: 2), 3СН953 (SEQ ID NO: 3), 3CH954 (SEQ ID NO: 4), 3CH955 (SEQ ID NO: 5), 3CH1047 (SEQ ID NO: 6), 3CH987 (SEQ ID NO: 90), 3CH989 (SEQ ID NO: 91), 3CH992 (SEQ ID NO: 92), 3CH1000 (SEQ ID NO: 93), 3CH1046 (SEQ ID NO: 94), 3CH1049 (SEQ ID NO: 95) и оптимизированные варианты VL, 3CL499 (SEQ ID NO: 8), 3CL563 (SEQ ID NO: 9), 3CL658 (SEQ ID NO: 10), 3CL012 (SEQ ID NO: 96), 3CL119 (SEQ ID NO: 97), 3CL633 (SEQ ID NO: 98), 3CL666 (SEQ ID NO: 99), 3CL668 (SEQ ID NO: 100). Гены, кодирующие VH, объединяли с СН человеческого IgGl (одной из SG182, SEQ ID NO: 46; SG1095, SEQ ID NO: 54 или SG1106, SEQ ID NO: 59), а гены, кодирующие VL, объединяли с человеческой CL (SK1, SEQ ID NO: 60). Каждую их полученных конструкций клонировали в экспрессионном векторе. Аминокислотные последовательности вариантов антител обобщены в таблице 2. Один из вариантов, DG_3CH1047-SG182/3CL658-SK1, обозначили в настоящем описании также как 3Cam, а другой вариант, DG_3СН1047-SG182/3CL-SK1, обозначили в настоящем описании также как 3Cam2.
Антитела экспрессировали в клетках HEK293, котрансфектированных смесью экспрессионных векторов для тяжелой и легкой цепи и очищали с использованием белка А.
3
Аффинность антител к белку Е DENV к связыванию с белком Е DENV-1, DENV-2, DENV-3 и DENV-4 определяли при 25°С с использованием устройства Biacore Т200 (фирма GE Healthcare). Антитело к гистидину (фирма GE Healthcare) иммобилизовали на всех проточных ячейках сенсорного чипа СМ4 с использованием набора для аминного сочетания (фирма GE Healthcare). Все антитела и аналиты приготавливали в ЗФР, рН 7,4, содержащем 20 мМ фосфат натрия, 150 мМ NaCl, 0,05% Твин 20 и 0,005% NaN. Белок Е DENV-1, DENV-2, DENV-3 и DENV-4 с С-концевой His-меткой захватывали на проточной ячейке 2 или 3, при этом проточная ячейка 1 служила в качестве проточной референс-ячейки. Требуемый уровень захвата белка Е соответствовал 200 резонансным единицам (RU). Антитела к белку Е DENV инъецировали в концентрации 250нМ на всю поверхность сенсорного чипа в течение 180 с, после чего в течение 300 с происходила диссоциация. Поверхность сенсора регенерировали после каждого цикла с использованием 10 мМ Gly-HCl, рН 1,5. Аффинность связывания определяли путем обработки и подгонки данных к модели связывания 1:1 с помощью программного обеспечения Biacore Т200, версия2.0 (фирма GE Healthcare).
d
В таблицах 3а и 3б представлены данные об аффинности (K) антител к белку Е DENV, характеризующие связывание с белком Е DENV-1 (в таблице обозначен как DV1), DENV-2 (в таблице обозначен как DV2), DENV-3 (в таблице обозначен как DV3) и DENV-4 (в таблице обозначен как DV4). Установлено, что каждый из вариантов 3С характеризовался повышенной аффинностью связывания со всеми четырьмя серотипами DENV по сравнению с родительским 3С. В качестве примера на фиг. 1 представлены сенсограммы для родительского антитела 3С (DG_3CH-SG182/3CL-SK1) и одного из вариантов антитела 3Cam (DG_3CH1047-SG182/3CL658-SK1). Сенсограммы для родительского антитела 3С (DG_3CH-SG182/3CL-SK1) и одного из вариантов антитела 3Cam2 (DG_3CH1047-SG182/3CL-SK1) представлены также на фиг. 10.
Пример 3: Создание вариантов СН антитела для улучшения характеристик
В константную область СН тяжелой цепи человеческого IgG1 (SG182, SEQ ID NO: 46) интродуцировали многочисленные мутации и в результате создавали варианты СН человеческого IgG1, SG192 (SEQ ID NO: 47), SG1085 (SEQ ID NO: 48), SG1086 (SEQ ID NO: 49), SG1087 (SEQ ID NO: 50), SG1088 (SEQ ID NO: 51), SG1089 (SEQ ID NO: 52), SG1090 (SEQ ID NO: 53), SG1095 (SEQ ID NO: 54), SG1096 (SEQ ID NO: 55), SG1097 (SEQ ID NO: 56), SG1098 (SEQ ID NO: 57), SG1105 (SEQ ID NO: 58), SG1106 (SEQ ID NO: 59), SG1109 (SEQ ID NO: 107), SG1044 (SEQ ID NO: 108) и SG1045 (SEQ ID NO: 109). Гены, кодирующие варианты СН, объединяли с VH 3С (3СН, SEQ ID NO: 1), одного из вариантов 3С (3СН1047, SEQ ID NO: 6) или антитела к CD154 (SLAPH0336a, SEQ ID NO: 88). Ген VL антитела к CD154 (SLAPL0336a, SEQ ID NO: 89) объединяли с человеческой CL (SK1, SEQ ID NO: 60). Каждую из конструкций клонировали в экспрессионном векторе. Более подробные данные о вариантах СН обобщены в таблице 4. Вариабельную область антитела к CD154 SLAPH0336a/SLAPL0366a, которое может образовывать крупный иммунный комплекс в присутствии тримерного антигена CD154, использовали для оценки авидности связывания вариантов СН с каждым из Fc-рецепторов.
Антитела экспрессировали в клетках HEK293, котрансфектированных смесью экспрессионных векторов для тяжелой и легкой цепи, и очищали с использованием белка А.
Пример 4: Аффинности связывания антитела, содержащего варианты Fc-области, с компонентом системы комплемента C1q
Анализ связывания человеческого C1q
Антитела к CD154 с вариантами Fc (антитела, созданные в лаборатории заявителя, которые создавали с помощью метода, описанного в примере 3), наносили на планшет Nunc-ImmunoPlate MaxiSorp (фирма Nalge Nunc International) и давали выстояться в течение ночи при 4°С. После промывки ЗФРТ планшет блокировали с помощью TBST, содержащего 0,5% БСА и 1 × Block Асе (блокирующий реагент, фирма DS Pharma) в течение 2 ч при комнатной температуре. После промывки планшета на планшет вносили человеческий C1q (фирма Calbiochem) и давали выстояться в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшет промывали, добавляли меченное HRP антитело к человеческому C1q (фирма Bio Rad), давали прореагировать в течение 1 ч при комнатной температуре и осуществляли промывку. Затем добавляли субстрат ТМВ (фирма Invitrogen). Сигнал измеряли с помощью ридера для планшета при длине волны 450 нм (длина волны для измерений) и 570 нм (длина референс-волны). Аффинность связывания антитела, имеющего Fc-область дикого типа (WT) с человеческим C1q снижалась при интродукции мутаций LALA в Fc-область, и сниженная аффинность связывания с человеческим C1q восстанавливалась после дополнительной интродукции KWES, EFT или EFT + AE в добавление к мутациям LALA (фиг. 2). Мутации LALA + KMES приводили к небольшому увеличению аффинности связывания, в то время как мутанты с LALA + KWES, LALA + KAES и LALA + KEES связывались с C1q с аффинностью, сопоставимой с аффинностью WT (фиг. 3). Характеристики связывания указанных выше мутантов с LALA или LALA + KAES не ухудшались при дополнительной интродукции мутаций АСТ3 или АСТ5 (фиг. 4).
Анализ связывания мышиного C1q
Антитела к CD154 с вариантами Fc (антитела, созданные в лаборатории заявителя, которые создавали с помощью метода, описанного в примере 3), наносили на планшет Nunc-ImmunoPlate MaxiSorp (фирма Nalge Nunc International) и давали выстояться в течение ночи при 4°С. После промывки ЗФРТ планшет блокировали с помощью TBST, содержащего 0,5% БСА и 1 × Block Асе (блокирующий реагент, фирма DS Pharma) в течение 7 ч при 4°С. После промывки планшета на планшет вносили 10% мышиную плазму (фирма Innovative Research) и давали выстояться в течение ночи при 4°С. Планшет промывали и добавляли биотинилированное антитело к мышиному C1q (фирма Hycult Biotech), давали прореагировать в течение 1 ч при комнатной температуре и осуществляли промывку. Добавляли стрептавидин-HRP (фирма Pierce), давали прореагировать в течение 1 ч при комнатной температуре и осуществляли промывку. Затем добавляли субстрат ABTS ELISA HRP (фирма KPL). Сигнал измеряли с помощью ридера для планшета при длине волны 405 нм. Аффинность связывания антитела, имеющего Fc-область дикого типа (WT) с мышиным C1q снижалась при интродукции мутаций LALA в Fc-область, и сниженная аффинность связывания с мышиным C1q восстанавливалась после дополнительной интродукции KAES в дополнение к мутациям LALA. Характеристики связывания указанных выше мутантов с LALA или LALA + KAES не ухудшались при дополнительной интродукции мутаций АСТ3 или АСТ5 (фиг. 5).
Пример 5: Biacore-анализ связывания вариантов Fc с FcγR и FcRn
3
Связывание вариантов Fc с человеческими и мышиными FcγR и человеческим FcRn при рН 7,4 оценивали при 25°С с использованием устройства Biacore Т200 (фирма GE Healthcare). Все антитела и FcγR или FcRn приготавливали в ЗФР-Р, рН 7,4, содержащем 50 мМ Na-фосфат, 150 мМ NaCl, 0,05% Твин 20, 0,005% NaN. Для анализа связывания FcγR иммобилизовали антитело к гистидину (фирма GE Healthcare) на всех проточных ячейках сенсорного чипа СМ4 с использованием набора для аминного сочетания (фирма GE Healthcare). Каждый из FcγR захватывали с помощью антитела к гистидину на проточной ячейке 2, 3 или 4, при этом проточная ячейка 1 служила в качестве референс-ячейки. Требуемые уровни захвата FcγR соответствовали 400 резонансным единицам (RU). Все антитела инъецировали в концентрации 100 нМ на все проточные ячейки. Иммунный комплекс получали путем смешения в молярном соотношении 1:1 антитела и тримерного CD154, и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Поверхность сенсора регенерировали после каждого цикла с использованием 10 мМ глицин-HCl, рН 1,5.
Для анализа связывания FcRn иммобилизовали реагент Biotin CAPture (фирма GE Healthcare) на обеих проточных ячейках 1 и 2 сенсорного чипа САР с использованием набора Biotin CAPture (фирма GE Healthcare). Биотинилированный FcRn захватывали на проточной ячейке 2, при этом проточная ячейка 1 служила в качестве проточной референс-ячейки. Целевые уровни захвата FcRn соответствовали 400 RU. Все антитела инъецировали в концентрации 100 нМ на проточные ячейки 1 и 2. Иммунный комплекс получали путем смешения в молярном соотношении 1:1 антитела и тримерного CD154, и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Поверхность сенсора регенерировали после каждого цикла с использованием 8М гуанидин-HCl, 1М NaOH (3:1 об./об.).
Уровни связывания стандартизовали относительно уровня захвата соответствующих FcγR или FcRn. Осуществляли мониторинг связывания антитела индивидуально или иммунного комплекса (антитело и тримерный антиген CD154) с человеческими или мышиными FcγR и человеческим FcRn по характеризующему связывание ответу. Иммунный комплекс использовали для оценки усиления связывания с FcγR или FcRn, обусловленного эффектами авидности. Результаты для человеческих FcγR1a, FcγR2a 167Н и 167R, FcγR2b, FcγR3a 158F и 158V, FcγR3b NA1 и NA2 представлены на фиг 6 (а)-(з). Результаты для мышиных FcγR1, FcγR2b, FcγR3, FcγR4 представлены на фиг. 7 (а)-(г). Связывание Fc-области дикого типа (обозначено как «WT IgG») существенно снижалось при интродукции мутаций LALA, LALA + KAES или LALA + KWES в Fc-область для каждого из протестированных FcγR. Тенденция была примерно одинаковой в анализах с использованием антитела индивидуально (обозначено как «только Ат») и иммунного комплекса (обозначено как «CD154 IC»). Связывание мутантов, имеющих KAES или KWES, снижалось не очень сильно по сравнению со связыванием WT IgG для большинства протестированных FcγR. Результаты для человеческого FcRn представлены на фиг.8. Связывание Fc-области дикого типа (обозначено как «hIgG1») с человеческим FcRn, по-видимому, не ухудшалось даже после интродукции мутаций LALA или LALA + KAES в Fc-область. Связывание немного повышалось при дополнительной интродукции мутаций АСТ3 или АСТ5, но все еще оставалось сравнительно небольшим (фиг. 8).
Пример 6: Эффективность in vivo антител к DENV в отношении инфекции DENV
6
Мышей линии AG129 6-8-недельного возраста инфицировали внутрибрюшинно 10 бляшкообразующих единиц (pfu) штамма DENV-2 D2Y98P. Через 48 ч мышей обрабатывали 25 мкг антитела в ЗФР. Антитело вводили путем внутривенной инъекции через ретро-орбитальное сплетение. Спустя 24 ч, т.е. через 72 ч после начального заражения, собирали кровь. В предшествующих исследованиях (Zust и др., J Virol 88, 2014, сс.7276-7285; Tan и др., PLOS Negl Trop Dis 4, 2010, с. е672) было установлено, что пик виремии после заражения D2Y98P достигался в период с 3 по 4 день после заражения. Вирусную РНК экстрагировали из плазмы каждой мыши, осуществляли количественную ПЦР и сравнивали данные со стандартом DENV-2 с известной инфективностью с помощью анализа бляшкообразования. Оба антитела 3С и 3Cam сильно снижали виремию по сравнению с ЗФР, который служил в качестве контроля при использовании указанной мышиной модели, при этом эффективность обоих антител была сопоставимой. Антитело, имевшее мутацию LALA + KAES в Fc-области, характеризовалось большей эффективностью по сравнению с антителом, которое имело только мутацию LALA. Это имело место для обоих антител 3С и 3Cam (фиг. 9). Этот результат свидетельствует о том, что восстановление активности в отношении связывания C1q в результате добавления мутации KAES к мутации LALA вносит вклад в противовирусную активность антител.
Хотя выше изобретение описано для лучшего понимания с указанием некоторых деталей с целью иллюстрации и примеров, описание и примеры не должны рассматриваться в качестве ограничивающих объем изобретения. Описание всей патентной и научной литературы, процитированной в настоящем описании, специально полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>
ЧУГАИ СЕЙЯКУ КАБУСИКИ КАЙСЯ
5
<120>
АНТИТЕЛА К ВИРУСУ ДЕНГЕ, ПОЛИПЕПТИДЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ВАРИАНТ
FC-ОБЛАСТИ, И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130>
34246SG1/MBR(JKN)/ndh
10
<160>
109
<170>
PatentIn version 3.5
<210>
1
15
<211>
132
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
<400>
1
20
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Asp Val Glu Lys Pro Gly Ala
1
5
10
15
25
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn
20
25
30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
30
35
40
45
Gly Val Ile Asn Pro Arg Gly Gly Ser Thr Ala Ser Ala Gln Lys Phe
50
55
60
35
Gln Gly Arg Ile Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65
70
75
80
40
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85
90
95
45
Ala Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Arg
100
105
110
Asp Gly Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val
115
120
125
5
Thr Val Ser Ser
130
10
<210>
2
<211>
132
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
15
<220>
<223>
VH
<400>
2
20
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Asp Val Glu Lys Pro Gly Ala
1
5
10
15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn
25
20
25
30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35
40
45
30
Gly Val Ile Asn Pro Arg Gly Gly Ser Arg Ala Ser Ala Gln Lys Phe
50
55
60
35
Gln Gly Arg Ile Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65
70
75
80
40
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85
90
95
Ala Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Phe
45
100
105
110
Asp Gly Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val
115
120
125
5
Thr Val Ser Ser
130
<210>
3
10
<211>
132
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
15
<223>
VH
<400>
3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Asp Val Glu Lys Pro Gly Ala
20
1
5
10
15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn
20
25
30
25
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35
40
45
30
Gly Val Ile Asn Pro Arg Gly Gly Ser Arg Arg Ser Ala Gln Lys Phe
50
55
60
35
Gln Gly Arg Ile Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65
70
75
80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
40
85
90
95
Ala Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Phe
100
105
110
45
Asp Gly Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val
115
120
125
Thr Val Ser Ser
5
130
<210>
4
<211>
132
10
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
VH
15
<400>
4
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Asp Val Glu Lys Pro Gly Ala
1
5
10
15
20
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn
20
25
30
25
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35
40
45
30
Gly Val Ile Asn Pro Arg Gly Gly Ser Arg Arg Ser Ala Gln Lys Phe
50
55
60
Gln Gly Arg Ile Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
35
65
70
75
80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85
90
95
40
Ala Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Arg
100
105
110
45
Asp Asp Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val
115
120
125
Thr Val Ser Ser
130
5
<210>
5
<211>
132
<212>
PRT
10
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
VH
15
<400>
5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Asp Val Glu Lys Pro Gly Ala
1
5
10
15
20
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn
20
25
30
25
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35
40
45
Gly Val Ile Asn Pro Arg Gly Gly Ser Arg Arg Ser Ala Gln Lys Phe
30
50
55
60
Gln Gly Arg Ile Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65
70
75
80
35
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85
90
95
40
Ala Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Arg
100
105
110
45
Asp Leu Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val
115
120
125
Thr Val Ser Ser
130
5
<210>
6
<211>
132
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
10
<220>
<223>
VH
<400>
6
15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Asp Val Glu Lys Pro Gly Ala
1
5
10
15
20
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20
25
30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
25
35
40
45
Gly Val Ile Asn Pro Arg Gly Gly Ser Arg Arg Ser Ala Gln Lys Phe
50
55
60
30
Gln Gly Arg Ile Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65
70
75
80
35
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85
90
95
40
Ala Arg Gly Gly Glu Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Phe
100
105
110
Asp Gly Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val
45
115
120
125
Thr Val Ser Ser
130
5
<210>
7
<211>
107
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
10
<400>
7
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1
5
10
15
15
Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Arg Lys Tyr
20
25
30
20
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35
40
45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Lys Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
25
50
55
60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65
70
75
80
30
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Asp Leu Pro Ile
85
90
95
35
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Gln Ile Lys
100
105
40
<210>
8
<211>
107
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
45
<220>
<223>
VL
<400>
8
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1
5
10
15
5
Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Arg Lys Tyr
20
25
30
10
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35
40
45
15
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Lys Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50
55
60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
20
65
70
75
80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Ala Leu Pro Ile
85
90
95
25
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Gln Ile Lys
100
105
30
<210>
9
<211>
107
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
35
<220>
<223>
VL
<400>
9
40
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1
5
10
15
45
Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Arg Gln Tyr
20
25
30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35
40
45
5
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Lys Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50
55
60
10
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65
70
75
80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Ser Ala Leu Pro Ile
15
85
90
95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Gln Ile Lys
100
105
20
<210>
10
<211>
107
<212>
PRT
25
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
VL
30
<400>
10
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1
5
10
15
35
Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Gln Ala Ser Gln Glu Ile Arg Lys Tyr
20
25
30
40
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35
40
45
Tyr Asp Ala Ser Glu Leu Lys Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
45
50
55
60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65
70
75
80
5
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Glu Asp Leu Pro Ile
85
90
95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Gln Ile Lys
10
100
105
<210>
11
<211>
5
15
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
<400>
11
20
Ser Asn Tyr Ile His
1
5
<210>
12
25
<211>
5
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
30
<223>
HVR-H1
<400>
12
Ser Tyr Tyr Met His
35
1
5
<210>
13
<211>
17
40
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
<400>
13
45
Val Ile Asn Pro Arg Gly Gly Ser Thr Ala Ser Ala Gln Lys Phe Gln
1
5
10
15
Gly
5
<210>
14
<211>
17
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
10
<220>
<223>
HVR-H2
<400>
14
15
Val Ile Asn Pro Arg Gly Gly Ser Arg Ala Ser Ala Gln Lys Phe Gln
1
5
10
15
20
Gly
<210>
15
25
<211>
17
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
30
<223>
HVR-H2
<400>
15
Val Ile Asn Pro Arg Gly Gly Ser Arg Arg Ser Ala Gln Lys Phe Gln
35
1
5
10
15
Gly
40
<210>
16
<211>
23
<212>
PRT
45
<213>
Homo sapiens
<400>
16
Gly Gly Arg Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Arg Asp Gly
1
5
10
15
5
Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro
20
10
<210>
17
<211>
23
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
15
<220>
<223>
HVR-H3
<400>
17
20
Gly Gly Arg Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Phe Asp Gly
1
5
10
15
Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro
25
20
<210>
18
<211>
23
30
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
HVR-H3
35
<400>
18
Gly Gly Arg Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Arg Asp Asp
1
5
10
15
40
Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro
20
45
<210>
19
<211>
23
<220>
5
<223>
HVR-H3
<400>
19
Gly Gly Arg Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Arg Asp Leu
10
1
5
10
15
Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro
20
15
<210>
20
<211>
23
<212>
PRT
20
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
HVR-H3
25
<400>
20
Gly Gly Glu Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Phe Asp Gly
1
5
10
15
30
Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro
20
35
<210>
21
<211>
11
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
40
<400>
21
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Arg Lys Tyr Leu Asn
1
5
10
45
<210>
22
<211>
11
<220>
5
<223>
HVR-L1
<400>
22
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Arg Gln Tyr Leu Asn
10
1
5
10
<210>
23
<211>
11
15
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
HVR-L1
20
<400>
23
Gln Ala Ser Gln Glu Ile Arg Lys Tyr Leu Asn
1
5
10
25
<210>
24
<211>
7
<212>
PRT
30
<213>
Homo sapiens
<400>
24
Asp Ala Ser Asn Leu Lys Thr
35
1
5
<210>
25
<211>
7
40
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
HVR-L2
45
<400>
25
Asp Ala Ser Asn Leu Lys Phe
1
5
5
<210>
26
<211>
7
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
10
<220>
<223>
HVR-L2
<400>
26
15
Asp Ala Ser Glu Leu Lys Thr
1
5
<210>
27
20
<211>
9
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
<400>
27
25
Gln Gln Phe Asp Asp Leu Pro Ile Thr
1
5
30
<210>
28
<211>
9
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
35
<220>
<223>
HVR-L3
<400>
28
40
Gln Gln Phe Asp Ala Leu Pro Ile Thr
1
5
<210>
29
45
<211>
9
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
HVR-L3
5
<400>
29
Gln Gln Phe Ser Ala Leu Pro Ile Thr
1
5
10
<210>
30
<211>
9
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
15
<220>
<223>
HVR-L3
<400>
30
20
Gln Gln Phe Glu Asp Leu Pro Ile Thr
1
5
25
<210>
31
<211>
30
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
30
<400>
31
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Asp Val Glu Lys Pro Gly Ala
1
5
10
15
35
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20
25
30
40
<210>
32
<211>
14
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
45
<400>
32
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1
5
10
<210>
33
5
<211>
32
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
<400>
33
10
Arg Ile Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu
1
5
10
15
15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20
25
30
<210>
34
20
<211>
32
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
25
<223>
FR-H3
<400>
34
Arg Ile Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu
30
1
5
10
15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20
25
30
35
<210>
35
<211>
11
<212>
PRT
40
<213>
Homo sapiens
<400>
35
Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser
45
1
5
10
<210>
36
<211>
23
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
5
<400>
36
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1
5
10
15
10
Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys
20
15
<210>
37
<211>
15
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
20
<400>
37
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1
5
10
15
25
<210>
38
<211>
32
<212>
PRT
30
<213>
Homo sapiens
<400>
38
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
35
1
5
10
15
Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys
20
25
30
40
<210>
39
<211>
10
<212>
PRT
45
<213>
Homo sapiens
<400>
39
Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Gln Ile Lys
1
5
10
5
<210>
40
<211>
5
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
10
<220>
<223>
HVR-H1
15
<220>
<221>
MISC_FEATURE
<222>
(2)..(2)
<223>
Xaa is Asn or Tyr
20
<220>
<221>
MISC_FEATURE
<222>
(4)..(4)
<223>
Xaa is Ile or Met
25
<400>
40
Ser Xaa Tyr Xaa His
1
5
30
<210>
41
<211>
17
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
35
<220>
<223>
HVR-H2
40
<220>
<221>
MISC_FEATURE
<222>
(9)..(9)
<223>
Xaa is Thr or Arg
45
<220>
<221>
MISC_FEATURE
<222>
(10)..(10)
<223>
Xaa is Ala or Arg
<400>
41
5
Val Ile Asn Pro Arg Gly Gly Ser Xaa Xaa Ser Ala Gln Lys Phe Gln
1
5
10
15
Gly
10
<210>
42
<211>
23
15
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
HVR-H3
20
<220>
<221>
MISC_FEATURE
<222>
(3)..(3)
25
<223>
Xaa is Arg or Glu
<220>
<221>
MISC_FEATURE
<222>
(14)..(14)
30
<223>
Xaa is Arg or Phe
<220>
<221>
MISC_FEATURE
<222>
(16)..(16)
35
<223>
Xaa is Gly, Asp or Leu
<400>
42
Gly Gly Xaa Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Xaa Asp Xaa
40
1
5
10
15
Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro
20
45
<210>
43
<211>
11
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
5
<220>
<223>
HVR-L1
<220>
10
<221>
MISC_FEATURE
<222>
(5)..(5)
<223>
Xaa is Asp or Glu
<220>
15
<221>
MISC_FEATURE
<222>
(8)..(8)
<223>
Xaa is Lys or Gln
<400>
43
20
Gln Ala Ser Gln Xaa Ile Arg Xaa Tyr Leu Asn
1
5
10
25
<210>
44
<211>
7
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
30
<220>
<223>
HVR-L2
<220>
35
<221>
MISC_FEATURE
<222>
(4)..(4)
<223>
Xaa is Asn or Glu
<220>
40
<221>
MISC_FEATURE
<222>
(7)..(7)
<223>
Xaa is Thr or Phe
<400>
44
45
Asp Ala Ser Xaa Leu Lys Xaa
1
5
<210>
45
<211>
9
5
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
HVR-L3
10
<220>
<221>
MISC_FEATURE
<222>
(4)..(4)
15
<223>
Xaa is Asp, Ser or Glu
<220>
<221>
MISC_FEATURE
<222>
(5)..(5)
20
<223>
Xaa is Asp or Ala
<400>
45
Gln Gln Phe Xaa Xaa Leu Pro Ile Thr
25
1
5
<210>
46
<211>
328
30
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
CH
35
<400>
46
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1
5
10
15
40
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20
25
30
45
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35
40
45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50
55
60
5
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65
70
75
80
10
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85
90
95
15
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100
105
110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
20
115
120
125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130
135
140
25
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145
150
155
160
30
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165
170
175
35
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180
185
190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
40
195
200
205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210
215
220
45
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225
230
235
240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
5
245
250
255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260
265
270
10
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275
280
285
15
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290
295
300
20
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305
310
315
320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
25
325
<210>
47
<211>
328
30
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
CH
35
<400>
47
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1
5
10
15
40
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20
25
30
45
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35
40
45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50
55
60
5
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65
70
75
80
10
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85
90
95
15
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100
105
110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
20
115
120
125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130
135
140
25
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145
150
155
160
30
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165
170
175
35
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180
185
190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
40
195
200
205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210
215
220
45
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225
230
235
240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
5
245
250
255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260
265
270
10
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275
280
285
15
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290
295
300
20
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305
310
315
320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
25
325
<210>
48
<211>
328
30
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
CH
35
<400>
48
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1
5
10
15
40
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20
25
30
45
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35
40
45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50
55
60
5
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65
70
75
80
10
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85
90
95
15
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100
105
110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
20
115
120
125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130
135
140
25
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145
150
155
160
30
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165
170
175
35
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180
185
190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
40
195
200
205
Trp Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ser Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210
215
220
45
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225
230
235
240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
5
245
250
255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260
265
270
10
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275
280
285
15
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290
295
300
20
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305
310
315
320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
25
325
<210>
49
<211>
328
30
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
CH
35
<400>
49
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1
5
10
15
40
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20
25
30
45
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35
40
45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50
55
60
5
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65
70
75
80
10
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85
90
95
15
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100
105
110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
20
115
120
125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130
135
140
25
Val Val Val Asp Val Glu Phe Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145
150
155
160
30
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165
170
175
35
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180
185
190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Thr Asn
40
195
200
205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210
215
220
45
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225
230
235
240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
5
245
250
255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260
265
270
10
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275
280
285
15
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290
295
300
20
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305
310
315
320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
25
325
<210>
50
<211>
328
30
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
CH
35
<400>
50
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1
5
10
15
40
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20
25
30
45
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35
40
45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50
55
60
5
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65
70
75
80
10
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85
90
95
15
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100
105
110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
20
115
120
125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130
135
140
25
Val Val Val Asp Val Glu Phe Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145
150
155
160
30
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165
170
175
35
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180
185
190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Thr Asn
40
195
200
205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210
215
220
45
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225
230
235
240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
5
245
250
255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260
265
270
10
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275
280
285
15
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290
295
300
20
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305
310
315
320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
25
325
<210>
51
<211>
328
30
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
CH
35
<400>
51
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1
5
10
15
40
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20
25
30
45
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35
40
45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50
55
60
5
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65
70
75
80
10
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85
90
95
15
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100
105
110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
20
115
120
125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130
135
140
25
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145
150
155
160
30
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165
170
175
35
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180
185
190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
40
195
200
205
Trp Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ser Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210
215
220
45
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225
230
235
240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
5
245
250
255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260
265
270
10
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275
280
285
15
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290
295
300
20
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305
310
315
320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
25
325
<210>
52
<211>
328
30
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
CH
35
<400>
52
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1
5
10
15
40
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20
25
30
45
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35
40
45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50
55
60
5
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65
70
75
80
10
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85
90
95
15
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100
105
110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
20
115
120
125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130
135
140
25
Val Val Val Asp Val Glu Phe Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145
150
155
160
30
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165
170
175
35
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180
185
190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Thr Asn
40
195
200
205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210
215
220
45
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225
230
235
240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
5
245
250
255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260
265
270
10
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275
280
285
15
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290
295
300
20
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305
310
315
320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
25
325
<210>
53
<211>
328
30
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
CH
35
<400>
53
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1
5
10
15
40
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20
25
30
45
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35
40
45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50
55
60
5
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65
70
75
80
10
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85
90
95
15
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100
105
110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
20
115
120
125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130
135
140
25
Val Val Val Asp Val Glu Phe Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145
150
155
160
30
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165
170
175
35
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180
185
190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Thr Asn
40
195
200
205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210
215
220
45
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225
230
235
240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
5
245
250
255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260
265
270
10
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275
280
285
15
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290
295
300
20
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305
310
315
320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
25
325
<210>
54
<211>
328
30
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
CH
35
<400>
54
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1
5
10
15
40
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20
25
30
45
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35
40
45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50
55
60
5
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65
70
75
80
10
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85
90
95
15
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100
105
110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
20
115
120
125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130
135
140
25
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145
150
155
160
30
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165
170
175
35
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180
185
190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
40
195
200
205
Ala Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ser Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210
215
220
45
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225
230
235
240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
5
245
250
255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260
265
270
10
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275
280
285
15
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290
295
300
20
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305
310
315
320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
25
325
<210>
55
<211>
328
30
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
CH
35
<400>
55
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1
5
10
15
40
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20
25
30
45
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35
40
45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50
55
60
5
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65
70
75
80
10
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85
90
95
15
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100
105
110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
20
115
120
125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130
135
140
25
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145
150
155
160
30
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165
170
175
35
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180
185
190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
40
195
200
205
Asp Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ser Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210
215
220
45
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225
230
235
240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
5
245
250
255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260
265
270
10
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275
280
285
15
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290
295
300
20
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305
310
315
320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
25
325
<210>
56
<211>
328
30
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
CH
35
<400>
56
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1
5
10
15
40
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20
25
30
45
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35
40
45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50
55
60
5
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65
70
75
80
10
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85
90
95
15
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100
105
110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
20
115
120
125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130
135
140
25
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145
150
155
160
30
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165
170
175
35
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180
185
190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
40
195
200
205
Glu Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ser Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210
215
220
45
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225
230
235
240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
5
245
250
255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260
265
270
10
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275
280
285
15
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290
295
300
20
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305
310
315
320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
25
325
<210>
57
<211>
328
30
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
CH
35
<400>
57
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1
5
10
15
40
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20
25
30
45
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35
40
45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50
55
60
5
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65
70
75
80
10
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85
90
95
15
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100
105
110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
20
115
120
125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130
135
140
25
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145
150
155
160
30
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165
170
175
35
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180
185
190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
40
195
200
205
Met Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ser Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210
215
220
45
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225
230
235
240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
5
245
250
255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260
265
270
10
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275
280
285
15
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290
295
300
20
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305
310
315
320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
25
325
<210>
58
<211>
328
30
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
CH
35
<400>
58
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1
5
10
15
40
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20
25
30
45
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35
40
45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50
55
60
5
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65
70
75
80
10
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85
90
95
15
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100
105
110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
20
115
120
125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130
135
140
25
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145
150
155
160
30
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165
170
175
35
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180
185
190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
40
195
200
205
Ala Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ser Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210
215
220
45
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225
230
235
240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
5
245
250
255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260
265
270
10
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275
280
285
15
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290
295
300
20
Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ala His Thr Thr
305
310
315
320
Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
25
325
<210>
59
<211>
328
30
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
CH
35
<400>
59
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1
5
10
15
40
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20
25
30
45
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35
40
45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50
55
60
5
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65
70
75
80
10
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85
90
95
15
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100
105
110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
20
115
120
125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130
135
140
25
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145
150
155
160
30
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165
170
175
35
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180
185
190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
40
195
200
205
Ala Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ser Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210
215
220
45
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225
230
235
240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
5
245
250
255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260
265
270
10
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275
280
285
15
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290
295
300
20
Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr
305
310
315
320
Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
25
325
<210>
60
<211>
107
30
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
CL
35
<400>
60
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1
5
10
15
40
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20
25
30
45
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35
40
45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50
55
60
5
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65
70
75
80
10
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85
90
95
15
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100
105
<210>
61
20
<211>
585
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
25
<223>
DENV
<400>
61
Met Lys Cys Leu Leu Tyr Leu Ala Phe Leu Phe Ile Gly Val Asn Cys
30
1
5
10
15
Phe His Leu Thr Thr Arg Gly Gly Glu Pro His Met Ile Val Ser Lys
20
25
30
35
Gln Glu Arg Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Ser Ala Gly Val Asn
35
40
45
40
Met Cys Thr Leu Ile Ala Met Asp Leu Gly Glu Leu Cys Glu Asp Thr
50
55
60
45
Met Thr Tyr Lys Cys Pro Arg Ile Thr Glu Ala Glu Pro Asp Asp Val
65
70
75
80
Asp Cys Trp Cys Asn Ala Thr Asp Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys
85
90
95
5
Ser Gln Thr Gly Glu His Arg Arg Asp Lys Arg Ser Val Ala Leu Ala
100
105
110
10
Pro His Val Gly Leu Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser
115
120
125
Ser Glu Gly Ala Trp Lys Gln Ile Gln Lys Val Glu Thr Trp Ala Leu
15
130
135
140
Arg His Pro Gly Phe Thr Val Ile Ala Leu Phe Leu Ala His Ala Ile
145
150
155
160
20
Gly Thr Ser Ile Thr Gln Lys Gly Ile Ile Phe Ile Leu Leu Met Leu
165
170
175
25
Val Thr Pro Ser Met Ala Met Arg Cys Val Gly Ile Gly Asn Arg Asp
180
185
190
30
Phe Val Glu Gly Leu Ser Gly Ala Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu
195
200
205
His Gly Ser Cys Val Thr Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp
35
210
215
220
Ile Glu Leu Leu Lys Thr Glu Val Thr Asn Pro Ala Val Leu Arg Lys
225
230
235
240
40
Leu Cys Ile Glu Ala Lys Ile Ser Asn Thr Thr Thr Asp Ser Arg Cys
245
250
255
45
Pro Thr Gln Gly Glu Ala Thr Leu Val Glu Glu Gln Asp Ala Asn Phe
260
265
270
Val Cys Arg Arg Thr Val Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly
275
280
285
5
Leu Phe Gly Lys Gly Ser Leu Leu Thr Cys Ala Lys Phe Lys Cys Val
290
295
300
10
Thr Lys Leu Glu Gly Lys Ile Val Gln Tyr Glu Asn Leu Lys Tyr Ser
305
310
315
320
15
Val Ile Val Thr Val His Thr Gly Asp Gln His Gln Val Gly Asn Glu
325
330
335
Thr Thr Glu His Gly Thr Ile Ala Thr Ile Thr Pro Gln Ala Pro Thr
20
340
345
350
Ser Glu Ile Gln Leu Thr Asp Tyr Gly Thr Leu Thr Leu Asp Cys Ser
355
360
365
25
Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Thr Met Lys
370
375
380
30
Glu Lys Ser Trp Leu Val His Lys Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu
385
390
395
400
35
Pro Trp Thr Ser Gly Ala Ser Thr Ser Gln Glu Thr Trp Asn Arg Gln
405
410
415
Asp Leu Leu Val Thr Phe Lys Thr Ala His Ala Lys Lys Gln Glu Val
40
420
425
430
Val Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly
435
440
445
45
Ala Thr Glu Ile Gln Thr Ser Gly Thr Thr Thr Ile Phe Ala Gly His
450
455
460
Leu Lys Cys Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Thr Leu Lys Gly Met Ser
5
465
470
475
480
Tyr Val Met Cys Thr Gly Ser Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu
485
490
495
10
Thr Gln His Gly Thr Val Leu Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp
500
505
510
15
Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr
515
520
525
20
Gln Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu
530
535
540
Lys Pro Val Asn Ile Glu Thr Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile
25
545
550
555
560
Ile Val Gly Ala Gly Glu Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys Lys
565
570
575
30
Gly His His His His His His His His
580
585
35
<210>
62
<211>
585
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
40
<220>
<223>
DENV
<400>
62
45
Met Lys Cys Leu Leu Tyr Leu Ala Phe Leu Phe Ile Gly Val Asn Cys
1
5
10
15
Phe His Leu Thr Thr Arg Asn Gly Glu Pro His Met Ile Val Ser Arg
20
25
30
5
Gln Glu Lys Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Glu Asp Gly Val Asn
35
40
45
10
Met Cys Thr Leu Met Ala Met Asp Leu Gly Glu Leu Cys Glu Asp Thr
50
55
60
15
Ile Thr Tyr Lys Cys Pro Phe Leu Arg Gln Asn Glu Pro Glu Asp Ile
65
70
75
80
Asp Cys Trp Cys Asn Ser Thr Ser Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys
20
85
90
95
Thr Thr Thr Gly Glu His Arg Arg Glu Lys Arg Ser Val Ala Leu Val
100
105
110
25
Pro His Val Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser
115
120
125
30
Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Ala Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile Leu
130
135
140
35
Arg His Pro Gly Phe Thr Ile Met Ala Ala Ile Leu Ala Tyr Thr Ile
145
150
155
160
Gly Thr Thr His Phe Gln Arg Ala Leu Ile Phe Ile Leu Leu Thr Ala
40
165
170
175
Val Ala Pro Ser Met Thr Met Arg Cys Ile Gly Ile Ser Asn Arg Asp
180
185
190
45
Phe Val Glu Gly Val Ser Gly Gly Ser Trp Val Asp Ile Val Leu Glu
195
200
205
His Gly Ser Cys Val Thr Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp
5
210
215
220
Phe Glu Leu Ile Lys Thr Glu Ala Lys Gln Pro Ala Thr Leu Arg Lys
225
230
235
240
10
Tyr Cys Ile Glu Ala Lys Leu Thr Asn Thr Thr Thr Asp Ser Arg Cys
245
250
255
15
Pro Thr Gln Gly Glu Pro Ser Leu Asn Glu Glu Gln Asp Lys Arg Phe
260
265
270
20
Val Cys Lys His Ser Met Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly
275
280
285
Leu Phe Gly Lys Gly Gly Ile Val Thr Cys Ala Met Phe Thr Cys Lys
25
290
295
300
Lys Asn Met Lys Gly Lys Val Val Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Thr
305
310
315
320
30
Ile Val Ile Thr Pro His Ser Gly Glu Glu His Ala Val Gly Asn Asp
325
330
335
35
Thr Gly Lys His Gly Lys Glu Ile Lys Ile Thr Pro Gln Ser Ser Ile
340
345
350
40
Thr Glu Ala Glu Leu Thr Gly Tyr Gly Thr Val Thr Met Glu Cys Ser
355
360
365
Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Gln Met Glu
45
370
375
380
Asn Lys Ala Trp Leu Val His Arg Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu
385
390
395
400
5
Pro Trp Leu Pro Gly Ala Asp Thr Gln Gly Ser Asn Trp Ile Gln Lys
405
410
415
Glu Thr Leu Val Thr Phe Lys Asn Pro His Ala Lys Lys Gln Asp Val
10
420
425
430
Val Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly
435
440
445
15
Ala Thr Glu Ile Gln Met Ser Ser Gly Asn Leu Leu Phe Thr Gly His
450
455
460
20
Leu Lys Cys Arg Leu Arg Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser
465
470
475
480
25
Tyr Ser Met Cys Thr Gly Lys Phe Lys Val Val Lys Glu Ile Ala Glu
485
490
495
Thr Gln His Gly Thr Ile Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly
30
500
505
510
Ser Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His
515
520
525
35
Val Leu Gly Arg Leu Ile Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp
530
535
540
40
Ser Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile
545
550
555
560
45
Ile Ile Gly Val Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe Lys Lys
565
570
575
Gly His His His His His His His His
580
585
5
<210>
63
<211>
583
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
10
<220>
<223>
DENV
<400>
63
15
Met Lys Cys Leu Leu Tyr Leu Ala Phe Leu Phe Ile Gly Val Asn Cys
1
5
10
15
20
Phe His Leu Thr Ser Arg Asp Gly Glu Pro Arg Met Ile Val Gly Lys
20
25
30
Asn Glu Arg Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Ala Ser Gly Ile Asn
25
35
40
45
Met Cys Thr Leu Ile Ala Met Asp Leu Gly Glu Met Cys Asp Asp Thr
50
55
60
30
Val Thr Tyr Lys Cys Pro His Ile Thr Glu Val Glu Pro Glu Asp Ile
65
70
75
80
35
Asp Cys Trp Cys Asn Leu Thr Ser Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys
85
90
95
40
Asn Gln Ala Gly Glu His Arg Arg Asp Lys Arg Ser Val Ala Leu Ala
100
105
110
Pro His Val Gly Met Gly Leu Asp Thr Arg Thr Gln Thr Trp Met Ser
45
115
120
125
Ala Glu Gly Ala Trp Arg Gln Val Glu Lys Val Glu Thr Trp Ala Leu
130
135
140
5
Arg His Pro Gly Phe Thr Ile Leu Ala Leu Phe Leu Ala His Tyr Ile
145
150
155
160
Gly Thr Ser Leu Thr Gln Lys Val Val Ile Phe Ile Leu Leu Met Leu
10
165
170
175
Val Thr Pro Ser Met Thr Met Arg Cys Val Gly Val Gly Asn Arg Asp
180
185
190
15
Phe Val Glu Gly Leu Ser Gly Ala Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu
195
200
205
20
His Gly Gly Cys Val Thr Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp
210
215
220
25
Ile Glu Leu Gln Lys Thr Glu Ala Thr Gln Leu Ala Thr Leu Arg Lys
225
230
235
240
Leu Cys Ile Glu Gly Lys Ile Thr Asn Ile Thr Thr Asp Ser Arg Cys
30
245
250
255
Pro Thr Gln Gly Glu Ala Ile Leu Pro Glu Glu Gln Asp Gln Asn Tyr
260
265
270
35
Val Cys Lys His Thr Tyr Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly
275
280
285
40
Leu Phe Gly Lys Gly Ser Leu Val Thr Cys Ala Lys Phe Gln Cys Leu
290
295
300
45
Glu Ser Ile Glu Gly Lys Val Val Gln His Glu Asn Leu Lys Tyr Thr
305
310
315
320
Val Ile Ile Thr Val His Thr Gly Asp Gln His Gln Val Gly Asn Glu
325
330
335
5
Thr Gln Gly Val Thr Ala Glu Ile Thr Ser Gln Ala Ser Thr Ala Glu
340
345
350
10
Ala Ile Leu Pro Glu Tyr Gly Thr Leu Gly Leu Glu Cys Ser Pro Arg
355
360
365
Thr Gly Leu Asp Phe Asn Glu Met Ile Leu Leu Thr Met Lys Asn Lys
15
370
375
380
Ala Trp Met Val His Arg Gln Trp Phe Phe Asp Leu Pro Leu Pro Trp
385
390
395
400
20
Thr Ser Gly Ala Thr Thr Lys Thr Pro Thr Trp Asn Arg Lys Glu Leu
405
410
415
25
Leu Val Thr Phe Lys Asn Ala His Ala Lys Lys Gln Glu Val Val Val
420
425
430
30
Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr
435
440
445
Glu Ile Gln Thr Ser Gly Gly Thr Ser Ile Phe Ala Gly His Leu Lys
35
450
455
460
Cys Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Lys Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ala
465
470
475
480
40
Met Cys Leu Asn Thr Phe Val Leu Lys Lys Glu Val Ser Glu Thr Gln
485
490
495
45
His Gly Thr Ile Leu Ile Lys Val Glu Tyr Lys Gly Glu Asp Ala Pro
500
505
510
Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Glu Asp Gly Gln Gly Lys Ala His Asn
515
520
525
5
Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Val Thr Lys Lys Glu Glu Pro
530
535
540
10
Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Asn Ile Val Ile
545
550
555
560
15
Gly Ile Gly Asp Lys Ala Leu Lys Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Gly His
565
570
575
His His His His His His His
20
580
<210>
64
<211>
585
25
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
DENV
30
<400>
64
Met Lys Cys Leu Leu Tyr Leu Ala Phe Leu Phe Ile Gly Val Asn Cys
1
5
10
15
35
Phe Ser Leu Ser Thr Arg Asp Gly Glu Pro Leu Met Ile Val Ala Lys
20
25
30
40
His Glu Arg Gly Arg Pro Leu Leu Phe Lys Thr Thr Glu Gly Ile Asn
35
40
45
45
Lys Cys Thr Leu Ile Ala Met Asp Leu Gly Glu Met Cys Glu Asp Thr
50
55
60
Val Thr Tyr Lys Cys Pro Leu Leu Val Asn Thr Glu Pro Glu Asp Ile
65
70
75
80
5
Asp Cys Trp Cys Asn Leu Thr Ser Thr Trp Val Met Tyr Gly Thr Cys
85
90
95
10
Thr Gln Ser Gly Glu Arg Arg Arg Glu Lys Arg Ser Val Ala Leu Thr
100
105
110
Pro His Ser Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Ala Glu Thr Trp Met Ser
15
115
120
125
Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Ala Gln Arg Val Glu Ser Trp Ile Leu
130
135
140
20
Arg Asn Pro Gly Phe Ala Leu Leu Ala Gly Phe Met Ala Tyr Met Ile
145
150
155
160
25
Gly Gln Thr Gly Ile Gln Arg Thr Val Phe Phe Val Leu Met Met Leu
165
170
175
30
Val Ala Pro Ser Tyr Gly Met Arg Cys Val Gly Val Gly Asn Arg Asp
180
185
190
Phe Val Glu Gly Val Ser Gly Gly Ala Trp Val Asp Leu Val Leu Glu
35
195
200
205
His Gly Gly Cys Val Thr Thr Met Ala Gln Gly Lys Pro Thr Leu Asp
210
215
220
40
Phe Glu Leu Thr Lys Thr Thr Ala Lys Glu Val Ala Leu Leu Arg Thr
225
230
235
240
45
Tyr Cys Ile Glu Ala Ser Ile Ser Asn Ile Thr Thr Ala Thr Arg Cys
245
250
255
Pro Thr Gln Gly Glu Pro Tyr Leu Lys Glu Glu Gln Asp Gln Gln Tyr
260
265
270
5
Ile Cys Arg Arg Asp Val Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly
275
280
285
10
Leu Phe Gly Lys Gly Gly Val Val Thr Cys Ala Lys Phe Ser Cys Ser
290
295
300
15
Gly Lys Ile Thr Gly Asn Leu Val Gln Ile Glu Asn Leu Glu Tyr Thr
305
310
315
320
Val Val Val Thr Val His Asn Gly Asp Thr His Ala Val Gly Asn Asp
20
325
330
335
Thr Ser Asn His Gly Val Thr Ala Met Ile Thr Pro Arg Ser Pro Ser
340
345
350
25
Val Glu Val Lys Leu Pro Asp Tyr Gly Glu Leu Thr Leu Asp Cys Glu
355
360
365
30
Pro Arg Ser Gly Ile Asp Phe Asn Glu Met Ile Leu Met Lys Met Lys
370
375
380
35
Lys Lys Thr Trp Leu Val His Lys Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu
385
390
395
400
Pro Trp Thr Ala Gly Ala Asp Thr Ser Glu Val His Trp Asn Tyr Lys
40
405
410
415
Glu Arg Met Val Thr Phe Lys Val Pro His Ala Lys Arg Gln Asp Val
420
425
430
45
Thr Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Met His Ser Ala Leu Ala Gly
435
440
445
Ala Thr Glu Val Asp Ser Gly Asp Gly Asn His Met Phe Ala Gly His
5
450
455
460
Leu Lys Cys Lys Val Arg Met Glu Lys Leu Arg Ile Lys Gly Met Ser
465
470
475
480
10
Tyr Thr Met Cys Ser Gly Lys Phe Ser Ile Asp Lys Glu Met Ala Glu
485
490
495
15
Thr Gln His Gly Thr Thr Val Val Lys Val Lys Tyr Glu Gly Ala Gly
500
505
510
20
Ala Pro Cys Lys Val Pro Ile Glu Ile Arg Asp Val Asn Lys Glu Lys
515
520
525
Val Val Gly Arg Ile Ile Ser Ser Thr Pro Leu Ala Glu Asn Thr Asn
25
530
535
540
Ser Val Thr Asn Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile
545
550
555
560
30
Val Ile Gly Val Gly Asn Ser Ala Leu Thr Leu His Trp Phe Arg Lys
565
570
575
35
Gly His His His His His His His His
580
585
40
<210>
65
<211>
403
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
45
<220>
<223>
DENV
<400>
65
Met Arg Cys Val Gly Ile Gly Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Leu Ser
1
5
10
15
5
Gly Ala Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Ser Cys Val Thr
20
25
30
10
Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp Ile Glu Leu Leu Lys Thr
35
40
45
15
Glu Val Thr Asn Pro Ala Val Leu Arg Lys Leu Cys Ile Glu Ala Lys
50
55
60
Ile Ser Asn Thr Thr Thr Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala
20
65
70
75
80
Thr Leu Val Glu Glu Gln Asp Ala Asn Phe Val Cys Arg Arg Thr Val
85
90
95
25
Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser
100
105
110
30
Leu Leu Thr Cys Ala Lys Phe Lys Cys Val Thr Lys Leu Glu Gly Lys
115
120
125
35
Ile Val Gln Tyr Glu Asn Leu Lys Tyr Ser Val Ile Val Thr Val His
130
135
140
Thr Gly Asp Gln His Gln Val Gly Asn Glu Thr Thr Glu His Gly Thr
40
145
150
155
160
Ile Ala Thr Ile Thr Pro Gln Ala Pro Thr Ser Glu Ile Gln Leu Thr
165
170
175
45
Asp Tyr Gly Thr Leu Thr Leu Asp Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp
180
185
190
Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Thr Met Lys Glu Lys Ser Trp Leu Val
5
195
200
205
His Lys Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Thr Ser Gly Ala
210
215
220
10
Ser Thr Ser Gln Glu Thr Trp Asn Arg Gln Asp Leu Leu Val Thr Phe
225
230
235
240
15
Lys Thr Ala His Ala Lys Lys Gln Glu Val Val Val Leu Gly Ser Gln
245
250
255
20
Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Thr
260
265
270
Ser Gly Thr Thr Thr Ile Phe Ala Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Lys
25
275
280
285
Met Asp Lys Leu Thr Leu Lys Gly Met Ser Tyr Val Met Cys Thr Gly
290
295
300
30
Ser Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val
305
310
315
320
35
Leu Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro
325
330
335
40
Phe Ser Thr Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn Gly Arg Leu Ile
340
345
350
Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val Asn Ile Glu
45
355
360
365
Thr Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Ile Val Gly Ala Gly Glu
370
375
380
5
Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys Lys Gly His His His His His
385
390
395
400
His His His
10
<210>
66
<211>
403
15
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
DENV
20
<400>
66
Met Arg Cys Ile Gly Ile Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Val Ser
1
5
10
15
25
Gly Gly Ser Trp Val Asp Ile Val Leu Glu His Gly Ser Cys Val Thr
20
25
30
30
Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp Phe Glu Leu Ile Lys Thr
35
40
45
35
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Thr Leu Arg Lys Tyr Cys Ile Glu Ala Lys
50
55
60
Leu Thr Asn Thr Thr Thr Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Pro
40
65
70
75
80
Ser Leu Asn Glu Glu Gln Asp Lys Arg Phe Val Cys Lys His Ser Met
85
90
95
45
Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Gly
100
105
110
Ile Val Thr Cys Ala Met Phe Thr Cys Lys Lys Asn Met Lys Gly Lys
5
115
120
125
Val Val Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Thr Ile Val Ile Thr Pro His
130
135
140
10
Ser Gly Glu Glu His Ala Val Gly Asn Asp Thr Gly Lys His Gly Lys
145
150
155
160
15
Glu Ile Lys Ile Thr Pro Gln Ser Ser Ile Thr Glu Ala Glu Leu Thr
165
170
175
20
Gly Tyr Gly Thr Val Thr Met Glu Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp
180
185
190
Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Gln Met Glu Asn Lys Ala Trp Leu Val
25
195
200
205
His Arg Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Leu Pro Gly Ala
210
215
220
30
Asp Thr Gln Gly Ser Asn Trp Ile Gln Lys Glu Thr Leu Val Thr Phe
225
230
235
240
35
Lys Asn Pro His Ala Lys Lys Gln Asp Val Val Val Leu Gly Ser Gln
245
250
255
40
Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Met
260
265
270
Ser Ser Gly Asn Leu Leu Phe Thr Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Arg
45
275
280
285
Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly
290
295
300
5
Lys Phe Lys Val Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile
305
310
315
320
Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro
10
325
330
335
Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile
340
345
350
15
Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu
355
360
365
20
Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro
370
375
380
25
Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe Lys Lys Gly His His His His His
385
390
395
400
His His His
30
<210>
67
<211>
401
35
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
DENV
40
<400>
67
Met Arg Cys Val Gly Val Gly Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Leu Ser
1
5
10
15
45
Gly Ala Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Gly Cys Val Thr
20
25
30
Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp Ile Glu Leu Gln Lys Thr
5
35
40
45
Glu Ala Thr Gln Leu Ala Thr Leu Arg Lys Leu Cys Ile Glu Gly Lys
50
55
60
10
Ile Thr Asn Ile Thr Thr Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala
65
70
75
80
15
Ile Leu Pro Glu Glu Gln Asp Gln Asn Tyr Val Cys Lys His Thr Tyr
85
90
95
20
Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser
100
105
110
Leu Val Thr Cys Ala Lys Phe Gln Cys Leu Glu Ser Ile Glu Gly Lys
25
115
120
125
Val Val Gln His Glu Asn Leu Lys Tyr Thr Val Ile Ile Thr Val His
130
135
140
30
Thr Gly Asp Gln His Gln Val Gly Asn Glu Thr Gln Gly Val Thr Ala
145
150
155
160
35
Glu Ile Thr Ser Gln Ala Ser Thr Ala Glu Ala Ile Leu Pro Glu Tyr
165
170
175
40
Gly Thr Leu Gly Leu Glu Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe Asn
180
185
190
Glu Met Ile Leu Leu Thr Met Lys Asn Lys Ala Trp Met Val His Arg
45
195
200
205
Gln Trp Phe Phe Asp Leu Pro Leu Pro Trp Thr Ser Gly Ala Thr Thr
210
215
220
5
Lys Thr Pro Thr Trp Asn Arg Lys Glu Leu Leu Val Thr Phe Lys Asn
225
230
235
240
Ala His Ala Lys Lys Gln Glu Val Val Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly
10
245
250
255
Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Thr Ser Gly
260
265
270
15
Gly Thr Ser Ile Phe Ala Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Lys Met Asp
275
280
285
20
Lys Leu Lys Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ala Met Cys Leu Asn Thr Phe
290
295
300
25
Val Leu Lys Lys Glu Val Ser Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Leu Ile
305
310
315
320
Lys Val Glu Tyr Lys Gly Glu Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser
30
325
330
335
Thr Glu Asp Gly Gln Gly Lys Ala His Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala
340
345
350
35
Asn Pro Val Val Thr Lys Lys Glu Glu Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu
355
360
365
40
Pro Pro Phe Gly Glu Ser Asn Ile Val Ile Gly Ile Gly Asp Lys Ala
370
375
380
45
Leu Lys Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Gly His His His His His His His
385
390
395
400
His
5
<210>
68
<211>
403
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
10
<220>
<223>
DENV
<400>
68
15
Met Arg Cys Val Gly Val Gly Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Val Ser
1
5
10
15
20
Gly Gly Ala Trp Val Asp Leu Val Leu Glu His Gly Gly Cys Val Thr
20
25
30
Thr Met Ala Gln Gly Lys Pro Thr Leu Asp Phe Glu Leu Thr Lys Thr
25
35
40
45
Thr Ala Lys Glu Val Ala Leu Leu Arg Thr Tyr Cys Ile Glu Ala Ser
50
55
60
30
Ile Ser Asn Ile Thr Thr Ala Thr Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Pro
65
70
75
80
35
Tyr Leu Lys Glu Glu Gln Asp Gln Gln Tyr Ile Cys Arg Arg Asp Val
85
90
95
40
Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Gly
100
105
110
Val Val Thr Cys Ala Lys Phe Ser Cys Ser Gly Lys Ile Thr Gly Asn
45
115
120
125
Leu Val Gln Ile Glu Asn Leu Glu Tyr Thr Val Val Val Thr Val His
130
135
140
5
Asn Gly Asp Thr His Ala Val Gly Asn Asp Thr Ser Asn His Gly Val
145
150
155
160
Thr Ala Met Ile Thr Pro Arg Ser Pro Ser Val Glu Val Lys Leu Pro
10
165
170
175
Asp Tyr Gly Glu Leu Thr Leu Asp Cys Glu Pro Arg Ser Gly Ile Asp
180
185
190
15
Phe Asn Glu Met Ile Leu Met Lys Met Lys Lys Lys Thr Trp Leu Val
195
200
205
20
His Lys Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Thr Ala Gly Ala
210
215
220
25
Asp Thr Ser Glu Val His Trp Asn Tyr Lys Glu Arg Met Val Thr Phe
225
230
235
240
Lys Val Pro His Ala Lys Arg Gln Asp Val Thr Val Leu Gly Ser Gln
30
245
250
255
Glu Gly Ala Met His Ser Ala Leu Ala Gly Ala Thr Glu Val Asp Ser
260
265
270
35
Gly Asp Gly Asn His Met Phe Ala Gly His Leu Lys Cys Lys Val Arg
275
280
285
40
Met Glu Lys Leu Arg Ile Lys Gly Met Ser Tyr Thr Met Cys Ser Gly
290
295
300
45
Lys Phe Ser Ile Asp Lys Glu Met Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Thr
305
310
315
320
Val Val Lys Val Lys Tyr Glu Gly Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val Pro
325
330
335
5
Ile Glu Ile Arg Asp Val Asn Lys Glu Lys Val Val Gly Arg Ile Ile
340
345
350
10
Ser Ser Thr Pro Leu Ala Glu Asn Thr Asn Ser Val Thr Asn Ile Glu
355
360
365
Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Asn
15
370
375
380
Ser Ala Leu Thr Leu His Trp Phe Arg Lys Gly His His His His His
385
390
395
400
20
His His His
25
<210>
69
<211>
374
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
30
<400>
69
Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln
1
5
10
15
35
Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser
20
25
30
40
Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu
35
40
45
45
Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln
50
55
60
Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser
65
70
75
80
5
Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro Ile
85
90
95
10
Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser Arg
100
105
110
Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys
15
115
120
125
Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala Phe
130
135
140
20
Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn Ile
145
150
155
160
25
Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg Tyr
165
170
175
30
Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro
180
185
190
Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu Val
35
195
200
205
Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln
210
215
220
40
Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg Asn
225
230
235
240
45
Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly
245
250
255
Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys Arg
260
265
270
5
Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Leu Gln Leu Pro Thr Pro
275
280
285
10
Val Trp Phe His Val Leu Phe Tyr Leu Ala Val Gly Ile Met Phe Leu
290
295
300
15
Val Asn Thr Val Leu Trp Val Thr Ile Arg Lys Glu Leu Lys Arg Lys
305
310
315
320
Lys Lys Trp Asp Leu Glu Ile Ser Leu Asp Ser Gly His Glu Lys Lys
20
325
330
335
Val Ile Ser Ser Leu Gln Glu Asp Arg His Leu Glu Glu Glu Leu Lys
340
345
350
25
Cys Gln Glu Gln Lys Glu Glu Gln Leu Gln Glu Gly Val His Arg Lys
355
360
365
30
Glu Pro Gln Gly Ala Thr
370
35
<210>
70
<211>
316
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
40
<400>
70
Met Thr Met Glu Thr Gln Met Ser Gln Asn Val Cys Pro Arg Asn Leu
1
5
10
15
45
Trp Leu Leu Gln Pro Leu Thr Val Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala Asp
20
25
30
Ser Gln Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro Trp
35
40
45
5
Ile Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly Ala
50
55
60
10
Arg Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu
65
70
75
80
15
Ile Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn
85
90
95
Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp
20
100
105
110
Pro Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro
115
120
125
25
His Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His Ser
130
135
140
30
Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys
145
150
155
160
35
Ser Gln Lys Phe Ser His Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gln Ala
165
170
175
Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr
40
180
185
190
Thr Leu Phe Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Val Pro Ser
195
200
205
45
Met Gly Ser Ser Ser Pro Met Gly Val Ile Val Ala Val Val Ile Ala
Thr Ala Val Ala Ala Ile Val Ala Ala Val Val Ala Leu Ile Tyr Cys
5
225
230
235
240
Arg Lys Lys Arg Ile Ser Ala Asn Ser Thr Asp Pro Val Lys Ala Ala
245
250
255
10
Gln Phe Glu Pro Pro Gly Arg Gln Met Ile Ala Ile Arg Lys Arg Gln
260
265
270
15
Leu Glu Glu Thr Asn Asn Asp Tyr Glu Thr Ala Asp Gly Gly Tyr Met
275
280
285
20
Thr Leu Asn Pro Arg Ala Pro Thr Asp Asp Asp Lys Asn Ile Tyr Leu
290
295
300
Thr Leu Pro Pro Asn Asp His Val Asn Ser Asn Asn
25
305
310
315
<210>
71
<211>
316
30
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
<400>
71
35
Met Thr Met Glu Thr Gln Met Ser Gln Asn Val Cys Pro Arg Asn Leu
1
5
10
15
Trp Leu Leu Gln Pro Leu Thr Val Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala Asp
40
20
25
30
Ser Gln Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro Trp
35
40
45
45
Ile Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly Ala
Arg Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu
5
65
70
75
80
Ile Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn
85
90
95
10
Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp
100
105
110
15
Pro Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro
115
120
125
20
His Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His Ser
130
135
140
Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys
25
145
150
155
160
Ser Gln Lys Phe Ser Arg Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gln Ala
165
170
175
30
Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr
180
185
190
35
Thr Leu Phe Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Val Pro Ser
195
200
205
40
Met Gly Ser Ser Ser Pro Met Gly Val Ile Val Ala Val Val Ile Ala
210
215
220
Thr Ala Val Ala Ala Ile Val Ala Ala Val Val Ala Leu Ile Tyr Cys
45
225
230
235
240
Arg Lys Lys Arg Ile Ser Ala Asn Ser Thr Asp Pro Val Lys Ala Ala
245
250
255
5
Gln Phe Glu Pro Pro Gly Arg Gln Met Ile Ala Ile Arg Lys Arg Gln
260
265
270
Leu Glu Glu Thr Asn Asn Asp Tyr Glu Thr Ala Asp Gly Gly Tyr Met
10
275
280
285
Thr Leu Asn Pro Arg Ala Pro Thr Asp Asp Asp Lys Asn Ile Tyr Leu
290
295
300
15
Thr Leu Pro Pro Asn Asp His Val Asn Ser Asn Asn
305
310
315
20
<210>
72
<211>
291
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
25
<400>
72
Met Gly Ile Leu Ser Phe Leu Pro Val Leu Ala Thr Glu Ser Asp Trp
1
5
10
15
30
Ala Asp Cys Lys Ser Pro Gln Pro Trp Gly His Met Leu Leu Trp Thr
20
25
30
35
Ala Val Leu Phe Leu Ala Pro Val Ala Gly Thr Pro Ala Ala Pro Pro
35
40
45
40
Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Gln Trp Ile Asn Val Leu Gln Glu
50
55
60
Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Arg Gly Thr His Ser Pro Glu Ser Asp
45
65
70
75
80
Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro Thr His Thr Gln
85
90
95
5
Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Thr
100
105
110
Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His Leu Thr Val
10
115
120
125
Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu Glu Phe Gln Glu
130
135
140
15
Gly Glu Thr Ile Val Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp Lys Pro Leu
145
150
155
160
20
Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Lys Lys Phe Ser Arg
165
170
175
25
Ser Asp Pro Asn Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His Ser His Ser Gly
180
185
190
Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Leu Tyr Ser Ser Lys
30
195
200
205
Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Ala Pro Ser Ser Ser Pro Met Gly Ile
210
215
220
35
Ile Val Ala Val Val Thr Gly Ile Ala Val Ala Ala Ile Val Ala Ala
225
230
235
240
40
Val Val Ala Leu Ile Tyr Cys Arg Lys Lys Arg Ile Ser Ala Asn Pro
245
250
255
45
Thr Asn Pro Asp Glu Ala Asp Lys Val Gly Ala Glu Asn Thr Ile Thr
260
265
270
Tyr Ser Leu Leu Met His Pro Asp Ala Leu Glu Glu Pro Asp Asp Gln
275
280
285
5
Asn Arg Ile
290
10
<210>
73
<211>
254
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
15
<400>
73
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1
5
10
15
20
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20
25
30
25
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
35
40
45
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
30
50
55
60
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
65
70
75
80
35
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
85
90
95
40
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
100
105
110
45
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
115
120
125
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
130
135
140
5
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
145
150
155
160
10
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Phe
165
170
175
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
15
180
185
190
Gly Leu Ser Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
195
200
205
20
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
210
215
220
25
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp
225
230
235
240
30
Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
245
250
<210>
74
35
<211>
254
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
<400>
74
40
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1
5
10
15
45
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20
25
30
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
35
40
45
5
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
50
55
60
10
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
65
70
75
80
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
15
85
90
95
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
100
105
110
20
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
115
120
125
25
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
130
135
140
30
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
145
150
155
160
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
35
165
170
175
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
180
185
190
40
Gly Leu Ser Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
195
200
205
45
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
210
215
220
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp
225
230
235
240
5
Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
245
250
10
<210>
75
<211>
233
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
15
<400>
75
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1
5
10
15
20
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20
25
30
25
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
35
40
45
30
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
50
55
60
Asn Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
35
65
70
75
80
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
85
90
95
40
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Val Gly Trp Leu Leu Leu Gln
100
105
110
45
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
115
120
125
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
130
135
140
5
Gly Lys Asp Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe His Ile Pro
145
150
155
160
10
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
165
170
175
15
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
180
185
190
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Ser Pro Pro Gly Tyr Gln
20
195
200
205
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
210
215
220
25
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile
225
230
30
<210>
76
<211>
233
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
35
<400>
76
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1
5
10
15
40
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20
25
30
45
Gln Trp Tyr Ser Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
35
40
45
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
50
55
60
5
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
65
70
75
80
10
Val Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
85
90
95
15
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
100
105
110
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
20
115
120
125
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
130
135
140
25
Gly Lys Asp Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe His Ile Pro
145
150
155
160
30
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
165
170
175
35
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
180
185
190
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Ser Pro Pro Gly Tyr Gln
40
195
200
205
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
210
215
220
45
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile
<210>
77
5
<211>
404
<212>
PRT
<213>
Mus musculus
<400>
77
10
Met Ile Leu Thr Ser Phe Gly Asp Asp Met Trp Leu Leu Thr Thr Leu
1
5
10
15
15
Leu Leu Trp Val Pro Val Gly Gly Glu Val Val Asn Ala Thr Lys Ala
20
25
30
Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser Ile Phe Gln Lys Glu Asn
20
35
40
45
Val Thr Leu Trp Cys Glu Gly Pro His Leu Pro Gly Asp Ser Ser Thr
50
55
60
25
Gln Trp Phe Ile Asn Gly Thr Ala Val Gln Ile Ser Thr Pro Ser Tyr
65
70
75
80
30
Ser Ile Pro Glu Ala Ser Phe Gln Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln
85
90
95
35
Ile Gly Ser Ser Met Pro Ser Asp Pro Val Gln Leu Gln Ile His Asn
100
105
110
Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Arg Arg Val Leu Thr Glu Gly Glu
40
115
120
125
Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Gly Trp Lys Asn Lys Leu Val Tyr Asn
130
135
140
45
Val Val Phe Tyr Arg Asn Gly Lys Ser Phe Gln Phe Ser Ser Asp Ser
Glu Val Ala Ile Leu Lys Thr Asn Leu Ser His Ser Gly Ile Tyr His
5
165
170
175
Cys Ser Gly Thr Gly Arg His Arg Tyr Thr Ser Ala Gly Val Ser Ile
180
185
190
10
Thr Val Lys Glu Leu Phe Thr Thr Pro Val Leu Arg Ala Ser Val Ser
195
200
205
15
Ser Pro Phe Pro Glu Gly Ser Leu Val Thr Leu Asn Cys Glu Thr Asn
210
215
220
20
Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln Leu His Phe Ser Phe Tyr Val
225
230
235
240
Gly Ser Lys Ile Leu Glu Tyr Arg Asn Thr Ser Ser Glu Tyr His Ile
25
245
250
255
Ala Arg Ala Glu Arg Glu Asp Ala Gly Phe Tyr Trp Cys Glu Val Ala
260
265
270
30
Thr Glu Asp Ser Ser Val Leu Lys Arg Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln
275
280
285
35
Val Leu Gly Pro Gln Ser Ser Ala Pro Val Trp Phe His Ile Leu Phe
290
295
300
40
Tyr Leu Ser Val Gly Ile Met Phe Ser Leu Asn Thr Val Leu Tyr Val
305
310
315
320
Lys Ile His Arg Leu Gln Arg Glu Lys Lys Tyr Asn Leu Glu Val Pro
45
325
330
335
Leu Val Ser Glu Gln Gly Lys Lys Ala Asn Ser Phe Gln Gln Val Arg
340
345
350
5
Ser Asp Gly Val Tyr Glu Glu Val Thr Ala Thr Ala Ser Gln Thr Thr
355
360
365
Pro Lys Glu Ala Pro Asp Gly Pro Arg Ser Ser Val Gly Asp Cys Gly
10
370
375
380
Pro Glu Gln Pro Glu Pro Leu Pro Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ala Gln
385
390
395
400
15
Thr Ser Gln Ser
20
<210>
78
<211>
293
<212>
PRT
<213>
Mus musculus
25
<400>
78
Met Gly Ile Leu Pro Phe Leu Leu Ile Pro Met Glu Ser Asn Trp Thr
1
5
10
15
30
Val His Val Phe Ser Arg Thr Leu Cys His Met Leu Leu Trp Thr Ala
20
25
30
35
Val Leu Asn Leu Ala Ala Gly Thr His Asp Leu Pro Lys Ala Val Val
35
40
45
40
Lys Leu Glu Pro Pro Trp Ile Gln Val Leu Lys Glu Asp Thr Val Thr
50
55
60
Leu Thr Cys Glu Gly Thr His Asn Pro Gly Asn Ser Ser Thr Gln Trp
45
65
70
75
80
Phe His Asn Gly Arg Ser Ile Arg Ser Gln Val Gln Ala Ser Tyr Thr
85
90
95
5
Phe Lys Ala Thr Val Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Met Glu
100
105
110
Gln Thr Arg Leu Ser Asp Pro Val Asp Leu Gly Val Ile Ser Asp Trp
10
115
120
125
Leu Leu Leu Gln Thr Pro Gln Leu Val Phe Leu Glu Gly Glu Thr Ile
130
135
140
15
Thr Leu Arg Cys His Ser Trp Arg Asn Lys Leu Leu Asn Arg Ile Ser
145
150
155
160
20
Phe Phe His Asn Glu Lys Ser Val Arg Tyr His His Tyr Ser Ser Asn
165
170
175
25
Phe Ser Ile Pro Lys Ala Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr Tyr Cys
180
185
190
Lys Gly Ser Leu Gly Arg Thr Leu His Gln Ser Lys Pro Val Thr Ile
30
195
200
205
Thr Val Gln Gly Pro Lys Ser Ser Arg Ser Leu Pro Val Leu Thr Ile
210
215
220
35
Val Ala Ala Val Thr Gly Ile Ala Val Ala Ala Ile Val Ile Ile Leu
225
230
235
240
40
Val Ser Leu Val Tyr Leu Lys Lys Lys Gln Val Pro Asp Asn Pro Pro
245
250
255
45
Asp Leu Glu Glu Ala Ala Lys Thr Glu Ala Glu Asn Thr Ile Thr Tyr
260
265
270
Ser Leu Leu Lys His Pro Glu Ala Leu Asp Glu Glu Thr Glu His Asp
275
280
285
5
Tyr Gln Asn His Ile
290
10
<210>
79
<211>
267
<212>
PRT
<213>
Mus musculus
15
<400>
79
Met Thr Leu Asp Thr Gln Met Phe Gln Asn Ala His Ser Gly Ser Gln
1
5
10
15
20
Trp Leu Leu Pro Pro Leu Thr Ile Leu Leu Leu Phe Ala Phe Ala Asp
20
25
30
25
Arg Gln Ser Ala Ala Leu Pro Lys Ala Val Val Lys Leu Asp Pro Pro
35
40
45
Trp Ile Gln Val Leu Lys Glu Asp Met Val Thr Leu Met Cys Glu Gly
30
50
55
60
Thr His Asn Pro Gly Asn Ser Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Trp Ser
65
70
75
80
35
Ser Ile Arg Ser Gln Val Gln Ser Ser Tyr Thr Phe Lys Ala Thr Val
85
90
95
40
Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Met Glu Gln Thr Arg Leu Ser
100
105
110
45
Asp Pro Val Asp Leu Gly Val Ile Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gln Thr
115
120
125
Pro Gln Arg Val Phe Leu Glu Gly Glu Thr Ile Thr Leu Arg Cys His
130
135
140
5
Ser Trp Arg Asn Lys Leu Leu Asn Arg Ile Ser Phe Phe His Asn Glu
145
150
155
160
10
Lys Ser Val Arg Tyr His His Tyr Lys Ser Asn Phe Ser Ile Pro Lys
165
170
175
Ala Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr Tyr Cys Lys Gly Ser Leu Gly
15
180
185
190
Ser Thr Gln His Gln Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Asp Pro
195
200
205
20
Ala Thr Thr Ser Ser Ile Ser Leu Val Trp Tyr His Thr Ala Phe Ser
210
215
220
25
Leu Val Met Cys Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Phe Tyr
225
230
235
240
30
Val Arg Arg Asn Leu Gln Thr Pro Arg Asp Tyr Trp Arg Lys Ser Leu
245
250
255
Ser Ile Arg Lys His Gln Ala Pro Gln Asp Lys
35
260
265
<210>
80
<211>
249
40
<212>
PRT
<213>
Mus musculus
<400>
80
45
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Val Leu Thr Ala Phe Ser
1
5
10
15
Gly Ile Gln Ala Gly Leu Gln Lys Ala Val Val Asn Leu Asp Pro Lys
20
25
30
5
Trp Val Arg Val Leu Glu Glu Asp Ser Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly
35
40
45
10
Thr Phe Ser Pro Glu Asp Asn Ser Ile Lys Trp Phe His Asn Glu Ser
50
55
60
Leu Ile Pro His Gln Asp Ala Asn Tyr Val Ile Gln Ser Ala Arg Val
15
65
70
75
80
Lys Asp Ser Gly Met Tyr Arg Cys Gln Thr Ala Leu Ser Thr Ile Ser
85
90
95
20
Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Met Gly Trp Leu Leu Leu Gln Thr
100
105
110
25
Thr Lys Trp Leu Phe Gln Glu Gly Asp Pro Ile His Leu Arg Cys His
115
120
125
30
Ser Trp Gln Asn Arg Pro Val Arg Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn Gly
130
135
140
Lys Gly Lys Lys Tyr Phe His Glu Asn Ser Glu Leu Leu Ile Pro Lys
35
145
150
155
160
Ala Thr His Asn Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Ile Gly
165
170
175
40
His Asn Asn Lys Ser Ser Ala Ser Phe Arg Ile Ser Leu Gly Asp Pro
180
185
190
45
Gly Ser Pro Ser Met Phe Pro Pro Trp His Gln Ile Thr Phe Cys Leu
195
200
205
Leu Ile Gly Leu Leu Phe Ala Ile Asp Thr Val Leu Tyr Phe Ser Val
210
215
220
5
Arg Arg Gly Leu Gln Ser Pro Val Ala Asp Tyr Glu Glu Pro Lys Ile
225
230
235
240
10
Gln Trp Ser Lys Glu Pro Gln Asp Lys
245
15
<210>
81
<211>
365
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
20
<400>
81
Met Gly Val Pro Arg Pro Gln Pro Trp Ala Leu Gly Leu Leu Leu Phe
1
5
10
15
25
Leu Leu Pro Gly Ser Leu Gly Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr
20
25
30
30
His Leu Thr Ala Val Ser Ser Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp
35
40
45
Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu
35
50
55
60
Arg Gly Glu Ala Glu Pro Cys Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val
65
70
75
80
40
Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys
85
90
95
45
Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr
100
105
110
Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Val
115
120
125
5
Pro Thr Ala Lys Phe Ala Leu Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp
130
135
140
10
Leu Lys Gln Gly Thr Trp Gly Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile
145
150
155
160
15
Ser Gln Arg Trp Gln Gln Gln Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr
165
170
175
Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg
20
180
185
190
Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys
195
200
205
25
Ala Arg Pro Ser Ser Pro Gly Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe
210
215
220
30
Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu
225
230
235
240
35
Ala Ala Gly Thr Gly Gln Gly Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser
245
250
255
Phe His Ala Ser Ser Ser Leu Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His
40
260
265
270
Tyr Cys Cys Ile Val Gln His Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val
275
280
285
45
Glu Leu Glu Ser Pro Ala Lys Ser Ser Val Leu Val Val Gly Ile Val
290
295
300
Ile Gly Val Leu Leu Leu Thr Ala Ala Ala Val Gly Gly Ala Leu Leu
5
305
310
315
320
Trp Arg Arg Met Arg Ser Gly Leu Pro Ala Pro Trp Ile Ser Leu Arg
325
330
335
10
Gly Asp Asp Thr Gly Val Leu Leu Pro Thr Pro Gly Glu Ala Gln Asp
340
345
350
15
Ala Asp Leu Lys Asp Val Asn Val Ile Pro Ala Thr Ala
355
360
365
20
<210>
82
<211>
119
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
25
<400>
82
Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser
1
5
10
15
30
Gly Leu Glu Ala Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg
20
25
30
35
His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser
35
40
45
Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu
40
50
55
60
Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp
65
70
75
80
45
Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp
85
90
95
Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile
5
100
105
110
Val Lys Trp Asp Arg Asp Met
115
10
<210>
83
<211>
330
<212>
PRT
15
<213>
Homo sapiens
<400>
83
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
20
1
5
10
15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20
25
30
25
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35
40
45
30
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50
55
60
35
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65
70
75
80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
40
85
90
95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100
105
110
45
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115
120
125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
5
130
135
140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145
150
155
160
10
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165
170
175
15
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180
185
190
20
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195
200
205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
25
210
215
220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225
230
235
240
30
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245
250
255
35
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260
265
270
40
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275
280
285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
45
290
295
300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305
310
315
320
5
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
330
<210>
84
10
<211>
326
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
<400>
84
15
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1
5
10
15
20
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20
25
30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
25
35
40
45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50
55
60
30
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65
70
75
80
35
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85
90
95
40
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100
105
110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
45
115
120
125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130
135
140
5
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145
150
155
160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
10
165
170
175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180
185
190
15
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195
200
205
20
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210
215
220
25
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225
230
235
240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
30
245
250
255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260
265
270
35
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275
280
285
40
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290
295
300
45
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305
310
315
320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
5
<210>
85
<211>
377
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
10
<400>
85
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1
5
10
15
15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20
25
30
20
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35
40
45
25
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50
55
60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
30
65
70
75
80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85
90
95
35
Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro
100
105
110
40
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
115
120
125
45
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys
130
135
140
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
145
150
155
160
5
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
165
170
175
10
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
180
185
190
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
15
195
200
205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
210
215
220
20
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
225
230
235
240
25
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
245
250
255
30
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
260
265
270
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
35
275
280
285
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
290
295
300
40
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
305
310
315
320
45
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
325
330
335
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
340
345
350
5
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
355
360
365
10
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370
375
15
<210>
86
<211>
327
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
20
<400>
86
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1
5
10
15
25
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20
25
30
30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35
40
45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
35
50
55
60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65
70
75
80
40
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85
90
95
45
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100
105
110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115
120
125
5
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130
135
140
10
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145
150
155
160
15
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165
170
175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
20
180
185
190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195
200
205
25
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210
215
220
30
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225
230
235
240
35
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245
250
255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
40
260
265
270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275
280
285
45
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290
295
300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
5
305
310
315
320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
10
<210>
87
<211>
328
<212>
PRT
15
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
CH
20
<400>
87
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1
5
10
15
25
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20
25
30
30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35
40
45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
35
50
55
60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65
70
75
80
40
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85
90
95
45
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100
105
110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115
120
125
5
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130
135
140
10
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145
150
155
160
15
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165
170
175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
20
180
185
190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195
200
205
25
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210
215
220
30
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225
230
235
240
35
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245
250
255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
40
260
265
270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275
280
285
45
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290
295
300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
5
305
310
315
320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
10
<210>
88
<211>
119
<212>
PRT
15
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
VH
20
<400>
88
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Lys Pro Gly Gly
1
5
10
15
25
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His
20
25
30
30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35
40
45
Ala Ile Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Met
35
50
55
60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ile Leu His
65
70
75
80
40
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85
90
95
45
Thr Arg Glu Ser Asn Gly Lys Pro Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100
105
110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
5
<210>
89
<211>
111
<212>
PRT
10
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
VL
15
<400>
89
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1
5
10
15
20
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Ala
20
25
30
25
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35
40
45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
30
50
55
60
Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65
70
75
80
35
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr
85
90
95
40
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100
105
110
45
<210>
90
<211>
132
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
VH
5
<400>
90
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Asp Val Glu Lys Pro Gly Ala
1
5
10
15
10
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20
25
30
15
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35
40
45
20
Gly Val Ile Asn Pro Arg Gly Gly Ser Arg Arg Ser Ala Gln Lys Phe
50
55
60
Gln Gly Arg Ile Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
25
65
70
75
80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85
90
95
30
Ala Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Phe
100
105
110
35
Asp Gly Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val
115
120
125
40
Thr Val Ser Ser
130
<210>
91
45
<211>
132
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
VH
5
<400>
91
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1
5
10
15
10
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn
20
25
30
15
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35
40
45
Gly Val Ile Asn Pro Arg Gly Gly Ser Arg Arg Ser Ala Gln Lys Phe
20
50
55
60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65
70
75
80
25
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85
90
95
30
Ala Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Phe
100
105
110
35
Asp Gly Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val
115
120
125
Thr Val Ser Ser
40
130
<210>
92
<211>
132
45
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
VH
<400>
92
5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1
5
10
15
10
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20
25
30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
15
35
40
45
Gly Val Ile Asn Pro Arg Gly Gly Ser Arg Arg Ser Ala Gln Lys Phe
50
55
60
20
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65
70
75
80
25
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85
90
95
30
Ala Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Phe
100
105
110
Asp Gly Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val
35
115
120
125
Thr Val Ser Ser
130
40
<210>
93
<211>
132
<212>
PRT
45
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
VH
<400>
93
5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Asp Val Glu Lys Pro Gly Ala
1
5
10
15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
10
20
25
30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35
40
45
15
Gly Val Ile Asn Pro Arg Gly Gly Ser Arg Arg Ser Ala Gln Lys Phe
50
55
60
20
Gln Gly Arg Ile Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65
70
75
80
25
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85
90
95
Ala Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Phe
30
100
105
110
Asp Gly Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val
115
120
125
35
Thr Val Ser Ser
130
40
<210>
94
<211>
132
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
45
<220>
<223>
VH
<400>
94
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
5
1
5
10
15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20
25
30
10
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35
40
45
15
Gly Val Ile Asn Pro Arg Gly Gly Ser Arg Arg Ser Ala Gln Lys Phe
50
55
60
20
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65
70
75
80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
25
85
90
95
Ala Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Phe
100
105
110
30
Asp Gly Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val
115
120
125
35
Thr Val Ser Ser
130
40
<210>
95
<211>
132
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
45
<220>
<223>
VH
<400>
95
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1
5
10
15
5
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20
25
30
10
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35
40
45
15
Gly Val Ile Asn Pro Arg Gly Gly Ser Arg Arg Ser Ala Gln Lys Phe
50
55
60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
20
65
70
75
80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85
90
95
25
Ala Arg Gly Gly Glu Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Phe
100
105
110
30
Asp Gly Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val
115
120
125
35
Thr Val Ser Ser
130
<210>
96
40
<211>
107
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
45
<223>
VL
<400>
96
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1
5
10
15
5
Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Arg Lys Tyr
20
25
30
10
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35
40
45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Lys Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
15
50
55
60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65
70
75
80
20
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Glu Asp Leu Pro Ile
85
90
95
25
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Gln Ile Lys
100
105
30
<210>
97
<211>
107
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
35
<220>
<223>
VL
<400>
97
40
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1
5
10
15
Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Gln Ala Ser Gln Glu Ile Arg Lys Tyr
45
20
25
30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35
40
45
5
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Lys Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50
55
60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
10
65
70
75
80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Asp Leu Pro Ile
85
90
95
15
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Gln Ile Lys
100
105
20
<210>
98
<211>
107
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
25
<220>
<223>
VL
<400>
98
30
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1
5
10
15
35
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Arg Lys Tyr
20
25
30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
40
35
40
45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Lys Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50
55
60
45
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65
70
75
80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Asp Leu Pro Ile
5
85
90
95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Gln Ile Lys
100
105
10
<210>
99
<211>
107
<212>
PRT
15
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
VL
20
<400>
99
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1
5
10
15
25
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Glu Ile Arg Lys Tyr
20
25
30
30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35
40
45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Lys Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
35
50
55
60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65
70
75
80
40
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Asp Leu Pro Ile
85
90
95
45
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Gln Ile Lys
100
105
<210>
100
<211>
107
5
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
VL
10
<400>
100
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1
5
10
15
15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Arg Lys Tyr
20
25
30
20
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35
40
45
25
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Lys Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50
55
60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
30
65
70
75
80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Glu Asp Leu Pro Ile
85
90
95
35
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Gln Ile Lys
100
105
40
<210>
101
<211>
5
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
45
<220>
<223>
HVR-H1
<400>
101
Ser Tyr Tyr Ile His
5
1
5
<210>
102
<211>
30
10
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
FR-H1
15
<400>
102
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1
5
10
15
20
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20
25
30
25
<210>
103
<211>
32
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
30
<220>
<223>
FR-H3
<400>
103
35
Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu
1
5
10
15
40
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20
25
30
<210>
104
45
<211>
23
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
FR-L1
5
<400>
104
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1
5
10
15
10
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
15
<210>
105
<211>
32
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
20
<220>
<223>
FR-L3
<400>
105
25
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1
5
10
15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys
30
20
25
30
<210>
106
<211>
157
35
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
CD154
40
<400>
106
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro
1
5
10
15
45
Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser
20
25
30
Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu
5
35
40
45
Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu
50
55
60
10
Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser
65
70
75
80
15
Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg
85
90
95
20
Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys
100
105
110
Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln
25
115
120
125
Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser
130
135
140
30
His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu
145
150
155
35
<210>
107
<211>
328
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
40
<220>
<223>
CH
<400>
107
45
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1
5
10
15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20
25
30
5
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35
40
45
10
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50
55
60
15
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65
70
75
80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
20
85
90
95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100
105
110
25
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115
120
125
30
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130
135
140
35
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145
150
155
160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
40
165
170
175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180
185
190
45
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195
200
205
Ala Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ser Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
5
210
215
220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225
230
235
240
10
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245
250
255
15
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260
265
270
20
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275
280
285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
25
290
295
300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305
310
315
320
30
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
35
<210>
108
<211>
328
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
40
<220>
<223>
CH
<400>
108
45
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1
5
10
15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20
25
30
5
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35
40
45
10
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50
55
60
15
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65
70
75
80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
20
85
90
95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100
105
110
25
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115
120
125
30
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130
135
140
35
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145
150
155
160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
40
165
170
175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180
185
190
45
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195
200
205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
5
210
215
220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225
230
235
240
10
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245
250
255
15
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260
265
270
20
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275
280
285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
25
290
295
300
Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ala His Thr Thr
305
310
315
320
30
Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
35
<210>
109
<211>
328
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
40
<220>
<223>
CH
<400>
109
45
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1
5
10
15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20
25
30
5
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35
40
45
10
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50
55
60
15
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65
70
75
80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
20
85
90
95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100
105
110
25
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115
120
125
30
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130
135
140
35
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145
150
155
160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
40
165
170
175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180
185
190
45
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195
200
205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
5
210
215
220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225
230
235
240
10
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245
250
255
15
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260
265
270
20
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275
280
285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
25
290
295
300
Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr
305
310
315
320
30
Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
<---