СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫМ И БОЛЕУТОЛЯЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
ANTI-INFLAMMATORY AND ANALGESIC AGENT AND METHOD FOR PREPARING THEREOF

Изобретение относится к области медицины, фармации, фармакогнозии, к средствам, обладающим противовоспалительным, и болеутоляющим действием, и способам их получения.
Рациональная терапия раневых поражений включает в себя обязательную антимикробную составляющую. На сегодняшний день клиническая медицина располагает большим ассортиментом антибактериальных и противогрибковых средств (метилурациловая мазь, нистатин, сангвиритрин и др.), однако многие из них обладают побочными эффектами в виде дисперсий, гепато-, нефротоксического и тератогенного действия, аллергических реакций, дисбактерозов, иммунопатий. Одним из путей решения данной проблемы является использование антимикробных препаратов растительного происхождения, имеющих значительные преимущества перед разными синтетическими и полусинтетическими антимикробными средствами: низкая токсичность, отсутствие побочных эффектов, действие на полирезистентные штаммы грамположительных и грамотрицательных бактерий, благоприятное влияние на неспецифическую резистентность организма, наличие противовоспалительного и регенерирующего действия.
Известны препараты, обладающие аналогичным действием, которые представлены следующими группами: ранозаживляющие; противовоспалительные; болеутоляющие.
Экстракт из Sphagnum fuscum отличается сочетанием этих свойств. Известно использование сфагнового мха в народной медицине. Его широкое распространение и дешевизна, в сочетании с наличием бактерицидных, ранозаживляющих и кровоостанавливающих свойств обеспечили ему всеобщее признание особенно во время второй мировой войны. Немаловажным является то, что за все время его применения не было зафиксировано ни одного случая противопоказаний [1].
Наиболее близким к предлагаемому является средство, обладающее противовоспалительным действием, полученное в Биохимической лаборатории Отдела растительных ресурсов БИН АН СССР, представляющее концентрированные водные экстракты из Sphagnum magellanicum. Для его получения измельченный мох заливали горячей очищенной водой и ставили на сутки в термос. Сфагновый настой отсасывали на воронке Бюхнера и уваривали под вакуумом на водяной бане при температуре не выше 70°С. Полученный после отгонки воды экстракт обрабатывали подогретым спиртом, выпадающий осадок отфильтровывали, а фильтрат отгоняли до концентрации густого сиропа [2]. Способ характеризуется достаточной сложностью и является довольно затратным. Кроме того, используемый ранее Sphagnum magellanicum обладает меньшей биологической активностью и ресурсной базой [3].
Новая техническая задача - разработка лекарственного средства сфагнового мха, обладающего комплексным противовоспалительным и болеутоляющим действием, и более рационального способа его получения.
Для решения поставленной задачи лекарственное средство, обладающее противовоспалительным и болеутоляющим действием на основе сфагнового мха, содержит полисахариды, фенольные соединения: фенолкислоты, флавоноиды, кумарины при следующем отношении компонентов, мас.%:
Полисахариды
40±14,65
Фенольные соединения
1,6±0,24
Фенолкислоты
1,04±0,24
Флавониды
0,454±0,25
Кумарины
0,055±0,03
В способе получения средства, обладающего противовоспалительным и болеутоляющим действием, путем экстракции сырья сфагнового мха, экстракцию проводят методом реперколяции по Н.А.Чулкову, подвергают экстракции сырье S. fuscum, экстракцию проводят 20% водно-этанольной смесью в батарее из 4 реперколяторов.
Для отработки параметров режима способа вначале были получены экстракты из сырья S. fuscum различными способами: водно-этанольный 20% экстракт (мацерация, 70°С и перколяция, 23°С), водный экстракт (УЗ-экстракция с ИК-сушкой и мацерация, 95%). Они проявляли различную степень активности в отношении возбудителей дерматофитий: Trychophyton rubrum, Т. mentagrophytes и М. Canis. Наилучшие результаты были получены у 20% водно-этанольного экстракта S. fuscum (табл.5).
Способ приготовления экстракта заключается в следующем.
Средство получают методом реперколяции по Н.А.Чулкову. Согласно этой методике в батарею из 4 перколяторов загружают измельченное до 3-5 мм сырье S. fuscum, которое экстрагируют 20% этанолом. Суть указанной методики заключается в том, что в процессе экстракции различают два периода: пусковой и рабочий. В пусковой период ежедневно загружают по одному перколятору. Сырье делят на равные части. Первую порцию намачивают равным объемом 20% этанола, набухшее сырье загружают в головной перколятор, заливают двойным объемом экстрагента и оставляют на сутки. На следующий день собирают два отпуска: один для намачивания второй порции сырья в объеме, равном его массе, другой в двойном количестве (для настаивания сырья во втором перколяторе). В это время в первый перколятор заливают чистый экстрагент в количестве, равном объемам взятых отпусков. На третий день из второго перколятора собирают два отпуска для работы с третьей порцией сырья, предназначенной для загрузки в третий перколятор.
Во второй перколятор подают отпуски из первого перколятора, а в него снова подают чистый экстрагент и т.д. Через сутки после загрузки последнего перколятора начинают рабочий период с получения первой порции готового продукта в объеме, равном массе загруженного сырья. Одновременно из первого перколятора собирают весь отпуск и подают его во второй перколятор, в который затем начинает поступать чистый экстрагент. Первый перколятор загружают новой порцией сырья, которую обрабатывают отпусками из последнего перколятора. Полученные водно-спиртовые извлечения объединяют и фильтруют через бумажный фильтр, после чего высушивают при температуре не выше 30°С. Выход сухого экстракта составляет 6.92%. Оценку качества проводят по органолептическим признакам, растворимости, содержанию полисахаридов, фенольных соединений (фенолкислоты, флавониды, кумарины) и тяжелых металлов [4, 5, 6].
Были проведены испытания полученного экстракта на токсичность, противомикробную (противобактериальную и противогрибковую) активность и болеутоляющее действие [7].
По результатам испытаний можно было сделать вывод о том, что исследуемый экстракт из S. fuscum является малотоксичным. При введении в желудок белым беспородным мышам-самцам в дозе 10000 мг/кг симптомы острого отравления отсутствовали, не наблюдалось гибели животных и изменения их двигательной активности и поведенческих реакций в течение двух недель наблюдения. Таким образом, согласно существующей классификации (ГОСТ 12.1.007-76) он соответствует IV классу опасности «Вещества малоопасные».
Было обнаружено, что в перспективных концентрациях (31,7-62,5 мкг/мл) экстракт действует на возбудителей дерматофитий. При этом более высокую чувствительность к исследуемым препаратам проявляют тест-грибы Trichophyton rubrum и Microsporum canis (табл.1).
По данным эксперимента экстракт проявляет выраженные бактериостатический и бактерицидный эффекты. Действие экстракта сравнимо, а иногда и превышает воздействие на бактерий водных извлечений зверобоя продырявленного и шалфея лекарственного, которые являются фармакопейными противомикробными средствами. В разведении 1/80 он ингибирует размножение микроорганизмов штаммов Escherichia coli H-304, Staphylococcus aureus P-209 и Klebsiella pneumoniae, слабо влияя на штамм Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (б/ст - 1/20). Бактерицидное действие проявляется в более высоких концентрациях: 1/40-1/20, за исключением влияния на Staphylococcus aureus P-209 (б/ц - 1/80). В табл.2 приведены данные по антимикробной активности 20% водно-этанольного экстракта S. fuscum.
Болеутоляющее действие исследовали, выявляя антиэкссудативный эффект и болевую чувствительность мышей. При субплантарном введении раствора агара наблюдалось интенсивное формирование воспалительного отека задней конечности у мышей. В данных условиях эксперимента предварительное 5-кратное внутрижелудочное (один раз в сутки) введение экстракта в диапазоне доз 100-500 мг/кг приводило к достоверному ослаблению формирования воспалительного отека лапы мышей (табл.3).
При этом наиболее выраженный антиэкссудативный эффект экстракта отмечался для доз 250 и 500 мг/кг - угнетение отека составило 30,1% и 31,1% соответственно. Предварительное введение мышам препарата сравнения - индометацина (10 мг/кг) вызывало более эффективное торможение развития отека - 47,2% (табл.1, в которой представлены данные по влиянию предварительного введения экстракта из (50-500 мг/кг) и индометацина (10 мг/кг) на формирование агарового отека конечностей у белых беспородных мышей-самцов, * различия с контролем достоверны (р≤0,05).
Известно, что анальгетическое действие флоголитиков состоит из периферического и центрального эффектов. К периферическим компонентам, участвующим в обезболивании, относится противоотечное действие. Ослабление экссудации под влиянием исследуемого экстракта позволило предположить болеутоляющие свойства исследуемого экстракта на модели "уксусных корчей" у мышей.
Судя по полученным экспериментальным данным (табл.4) экстракт обладает и выраженным болеутоляющим действием. Предварительное 5-кратное внутрижелудочное введение (один раз в сутки) данного экстракта в диапазоне доз 250-500 мг/кг приводит к достоверному, практически не уступающему аналогичному действию индометацина по снижению среднего количества корчей - на 36,9% и 42,9% соответственно (табл.2, в которой приведены данные о влиянии предварительного введения 20% водно-этанольного экстракта из S. fuscum (50-500 мг/кг) и индометацина (10 мг/кг) на болевую чувствительность белых беспородных мышей-самцов на модели «уксусных корчей», * различия с контролем достоверны (р≤0,05).
Таким образом, экспериментальные исследования биологической активности экстракта S. fuscum показали, что он малотоксичен и при этом обладает выраженным болеутоляющим и противомикробным действием, сравнимым с аналогичными эффектами фармакопейных препаратов, выбранных в качестве эталонов. Экстракт S. fuscum отличается от аналогов мягким и комплексным действием. Сочетание свойств предлагаемого средства позволит использовать его в комплексной терапии раневых и воспалительных процессов, ожоговых поражений кожи, инфицированных ран.
Источники информации
1. Савич-Любицкая С.И. Применение сфагнового (торфяного) мха в медицине / С.И.Савич-Любицкая // Природа. - 1943. - N4. - С.41-50.
2. Савич-Любицкая Л.И. Флора споровых растений СССР. - М.: АН СССР, 1952. - С.97-109 (прототип).
3. Бабешина Л.Г. Сфагновые мхи Томской области и перспективы их применения в медицине. - Автореф. канд. биол. наук. - Томск, 2002, 19 с.
4. Беликов В.В. Унифицированная методика определения флавоноидов для стандартизации фитохимических препаратов / В.В.Беликов // Новые лекарственные препараты из растений Сибири и Дальнего Востока. Тезисы Всесоюзной конференции. - Томск, 1989. - С.21-22.
5. Государственная фармакопея СССР. Вып.2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. 11-е изд., доп. М., 1989. - 400 с.
6. Государственная фармакопея СССР. Вып.1. 11-е изд., доп. М., 1987. - 335 с.
7. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общей ред. Член-корр. РАМН проф. Р.У. Хабриева. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: ОАО «Изд-во «Медицина», 2005. - 832 с.: ил.
Таблица 1
Группа БАВ
Содержание в экстракте
Полисахариды
40±14,65
Фенольные соединения:
1,6±0,24
Фенолокислоты
1,04±0,24
Флавоноиды
0,454±0,25
Кумарины
0,055±0,03
Таблица 2
Тест-грибы
Источник выделения
Исследуемый препарат
Trichoplyton rubrum
Tricholyton mentagrophytes
Microsporum canis
S.fuscum
Водно-этанольный 20% экстракт (мацерация, 70°С)
15,7
15,7
15,7
Водно-этанольный 20% экстракт (перколяция, 23°С)
7,9
15,7
15,7
Водный экстракт (мацерация, 95%)
31,7
62,5
62,5
Водный экстракт (УЗ-экстракция с ИК-сушкой)
125
125
62,5
Индивидуальные вещества
Кофейная кислота
62,5
250
31,7
Кумарин
125
62,5
62,5
Препараты сравнения
Нитрофунгин
7,9
31,7
15,7
Сангвиритрин
15,7
15,7
15,7
Таблица 3
Исследуемые препараты
Действие
Штамм микроорганизмов (посевная доза ≈100000 микробных тел)
Escherichia coli H-304
Staphylococcus aureus P-209
Pseudomonas Aeruginosa ATCC 9027
Klebsiella pneumoniae
20% водно-этанольный экстракт из S.fuscum
б/ст*
1/80
1/80
1/80
1/20
б/ц**
1/40
1/80
1/40
1/20
Водное извлечение из шалфея лекарственного
б/ст
1/40
1/80
1/40
1/80
б/ц
1/40
1/80
1/40
1/80
Водное извлечение из зверобоя продырявленного
б/ст
1/80
1/80
1/40
1/40
б/ц
1/40
1/40
1/20
1/20
Таблица 4
Группа наблюдения, доза (мг/кг)
Средний прирост массы конечности в группе (М±m), мг
Угнетение отека на пике воспаления (%)
Контроль (n=20)
118,20±11,62
-
Индометацин, 10 (n=20)
62,40±5,46*
47,2
20% водно-этанольный экстракт, 50 (n=20)
109,2±9,8
9,2
20% водно-этанольный экстракт, 100 (n=20)
95,6±9,24*
19,1
20% водно-этанольный экстракт, 250 (n=20)
82,6±8,82*
30,1
20% водно-этанольный экстракт, 500 (n=20)
81,4±7,64*
31,1
Таблица 5
Группа наблюдения, доза (мг/кг)
Количество корчей за 20 мин (М±m)
Угнетение болевой чувствительности (%)
Контроль (n=20)
50,4±4,84
-
Индометацин, 10 (n=20)
22,6±2,44*
55,2
20% водно-этанольный экстракт, 50 (n=20)
52,8±4,50
-
20% водно-этанольный экстракт, 100 (n=20)
44,2±3,46
12,4
20% водно-этанольный экстракт, 250 (n=20)
31,8±2,64*
36,9
20% водно-этанольный экстракт, 500 (n=20)
28,8±2,58*
42,9
Приложение
Таблица 1. Количественное содержание биологически активных веществ в экстракте S. fuscum, мас.%.
Таблица 2. Противогрибковая активность 20% водно-этанольного экстракта из S. fuscum (мкг/мл).
Таблица 3. Антимикробная активность 20% водно-этанольного экстракта S. fuscum* - бактериостатическое действие;
** - бактерицидное действие.
Таблица 4. Влияние предварительного введения экстракта из (50-500 мг/кг) и индометацина (10 мг/кг) на формирование агарового отека конечностей у белых беспородных мышей-самцов, различия с контролем достоверны (р≤0,05).
Таблица 5. Влияние предварительного введения 20% водно-этанольного экстракта из S. fuscum (50-500 мг/кг) и индометацина (10 мг/кг) на болевую чувствительность белых беспородных мышей-самцов на модели «уксусных корчей», * различия с контролем достоверны (р≤0,05).