Способ прогнозирования риска лимфогенного метастазирования при раке молочной железы на основе экспрессии гена белка YKL-39
METHOD FOR PREDICTING RISK OF LYMPHATIC CANCER SPREAD IN BREAST CANCER BASED ON YKL-39 PROTEIN GENE EXPRESSION

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и касается способов прогнозирования риска вероятности развития лимфогенного метастазирования при раке молочной железы.
На протяжении многих лет актуальным направлением для исследований в онкологии является поиск маркеров, позволяющих прогнозировать вероятность развития разных форм прогрессирования заболевания [1, 2].
При раке молочной железы одним из факторов, определяющих вероятность лимфогенного и гематогенного метастазирования, является взаимодействие опухоли с компонентами микроокружения [3, 4, 5, 6, 8]. При этом одним из ключевых компонентов микроокружения выступают макрофаги, которые могут способствовать или препятствовать формированию очагов метастатического поражения. Такая возможность определяется свойствами, которыми обладают данные клетки окружающего внеклеточного матрикса. В зависимости от наличия различных поверхностных и секретируемых белков макрофаги подразделяются на несколько субпопуляций. Наличие и особенности разных поверхностных и/или секретируемых белков во многом определяют свойства и возможности макрофагальных клеток к созданию условий для формирования метастазов [7, 9, 10].
Одним из таких белков является YKL-39 - хитиназоподобный протеин макрофагов, относящийся к новому классу внеклеточных медиаторов, которые сочетают в себе свойства цитокинов и факторов роста. Уже известно, что большая часть YKL-39 локализуется не в цитоплазматических везикулах, а в ядерных гранулах, это обстоятельство позволяет предположить не только внеклеточную роль YKL-39 как белка, секретируемого макрофагами, но и его регуляторную функцию для «программирования» самих макрофагов. Изменение уровня хитиназоподобных белков в тканях и в кровотоке отмечается при различной патологии и является ценным диагностическим критерием, в особенности, при злокачественном онкологическом процессе [11, 14].
Наиболее близким к предлагаемому является способ прогнозирования лимфогенного метастазирования при двухсторонней синхронной инвазивной карциноме неспецифического типа молочных желез [патент РФ №2578462, опубл. 27.03.2016], включающий гистологическое исследование препаратов ткани новообразований, определение количества клеточных тубулярных структур в опухолевой ткани молочной железы на светооптическом уровне, причем проводят гистологическое исследование обеих молочных желез, при котором проводят гистологическую оценку инфильтративного компонента ткани новообразования, где подсчитывают количество разных типов структур (от 1 до 5), среди которых дополнительно учитывают альвеолярные, трабекулярные, солидные структуры и дискретные группы опухолевых клеток и при наличии структур одного любого типа в инфильтративном компоненте опухоли данный показатель оценивают в 1 балл, при наличии двух разных типов структур - в 2 балла и так дальше, затем, учитывают наличие либо отсутствие в инфильтративном компоненте дискретных групп опухолевых клеток, при их отсутствии показатель оценивают в 1, а при наличии в 2 балла, также оценивают выраженность воспалительной инфильтрации стромы опухоли, при отсутствии таковой или наличии слабо выраженной воспалительной инфильтрации стромы показатель оценивают в 1 балл, при умеренной в 2 балла, при наличии резко выраженной инфильтрации стромы показатель оценивают в 3 балла, также оценивают выраженность гиалиноза стромы опухоли, при отсутствии такового или наличии слабо выраженного гиалиноза стромы показатель оценивают в 1 балл, при умеренно выраженном гиалинозе в 2 балла, при наличии резко выраженного гиалиноза стромы в 3 балла, после этого рассчитывают значение уравнения регрессии Y по формуле
1
2
3
4
Y=(18-47,8X+7,5Х-4,7Х+44,4Х),
где (18) - значение коэффициента регрессии свободного члена;
1
X - наличие дискретных групп опухолевых клеток в инфильтративном компоненте (1 - нет, 2 - есть),
(-47,8) - значение коэффициента регрессии этого признака;
2
Х - количество разных типов структур в инфильтративном компоненте опухоли (1 - один, 2 - два, 3 - три, 4 - четыре, 5 - пять),
(7,5) - значение коэффициента регрессии этого признака;
3
Х - выраженность воспалительной инфильтрации в строме опухолевого узла (1 - отсутствие либо слабо выраженная воспалительная инфильтрация, 2 - умеренная воспалительная инфильтрация, 3 - резко выраженная воспалительная инфильтрация в строме опухолевого узла),
(-4,7) - значение коэффициента регрессии этого признака;
4
Х - выраженность гиалиноза в строме опухолевого узла (1 - слабо выражен, 2 - умеренно выражен, 3 - резко выражен),
(44,4) - значение коэффициента регрессии этого признака,
далее значение вероятности развития лимфогенных метастазов Р определяют по формуле:
Y
Y
Р=e/(1+e), где е - математическая константа, равная 2,72,
и при Р≥50% определяют высокий, а при Р<50% - низкий риск развития лимфогенных метастазов.
Область применения известного способа ограничена
Новый технический результат - расширение области применения  способа за счет выявления новых маркеров и определения их числовых значений, позволяющих прогнозировать течение заболевания и оценить риск возникновения лимфогенного метастазирования у больных раком молочной железы.
Для решения поставленной задачи в способе прогнозирования риска лимфогенного метастазирования при раке молочной железы на основе экспрессии гена белка YKL-39, включающем исследование препаратов ткани новообразований и последующий рассчет диагностических показателей, проводят молекулярно-генетическое исследование биопсийных образцов опухолевой ткани, которые берут у пациенток под контролем ультразвукового метода исследования до проведения неоадъювантной химиотерапии, с последующим выделением РНК и определением уровня гена, экспрессируемого макрофагами с помощью количественной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени RT-qPCR, определяют уровень экспрессии YKL-39 по технологии TaqMan с помощью специфичных праймеров и пробы Sense 5'-aacaacaaggttatcatcaaggac-3', AntiSense 5'-tttgggattcttggttttgag-3', Probe FAM-5'-agtgaagtgatgctctaccagaccat-3'-BHQ1, далее проводят ПЦР-анализ экспрессии гена белка YKL-39, оценивают относительную экспрессию гена белка YKL-39 с помощью метода Pfaffl в условных единицах (УЕ) относительно гена рефери GAPDH, причем в качестве калибратора используют нормальную ткань молочной железы, в которой при проведении исследования аналогичным выше описанному способом уровень экспрессии гена белка YKL-39 составляет 1, и при уровне экспрессии YKL-39 более 1 УЕ прогнозируют низкий, риск развития лимфогенных метастазов, а при уровне экспрессии гена белка YKL-39 менее 1 УЕ - высокий риск лимфогенного метастазирования
Способ осуществляют следующим образом.
3
Для молекулярно-генетических исследований используют биопсийные образцы опухолевой ткани (~10 мм), которые берут у пациенток под контролем ультразвукового метода исследования до проведения неоадъювантной химиотерапии. Образцы ткани опухоли помещают в раствор RNALater (Ambion, USA) и сохраняют при температуре 80°С (после 24-часовой инкубации при температуре +4°С) для дальнейшего выделения РНК и ДНК.
РНК из взятых биопсийных образцов опухолевой ткани выделяют с помощью набора RNeasy Plus mini Kit, содержащего ДНК-азу I (Qiagen, Germany, # 74134). Ha спектрофотометре NanoDrop-2000 (Thermo Scientific, USA) оценивают концентрацию и чистоту выделения РНК. Целостность РНК оценивают при помощи капиллярного электрофореза на приборе TapeStation (Agilent Technologies, USA) и набора R6K ScreenTape (Agilent Technologies, USA # 5067-5367). С полученной РНК осуществляют синтез ДНК. Уровень экспрессии гена белка YKL-39 оценивают при помощи количественной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени (RT-qPCR) по технологии TaqMan с помощью специфичных праймеров и пробы Sense 5'-aacaacaaggttatcatcaaggac-3', AntiSense 5'-tttgggattcttggttttgag-3', Probe FAM-5'-agtgaagtgatgctctaccagaccat-3'-BHQ1, на амплификаторе RotorGene-6000 (Corbett Research, Australia). С полученной ДНК проводят ПЦР-анализ экспрессии гена белка YKL-39. Относительную экспрессию гена белка YKL-39 оценивают с помощью метода Pfaffl в условных единицах (УЕ) относительно гена рефери GAPDH. В качестве калибратора используют нормальную ткань молочной железы, в которой уровень экспрессии гена белка YKL-39 составляет 1.
И при уровне экспрессии YKL-39 более 1 УЕ прогнозируют низкий риск развития лимфогенных метастазов, а при уровне экспрессии гена белка YKL-39 менее 1 УЕ - высокий риск лимфогенного метастазирования
Сущность предлагаемого способа иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Больная Ж., 45 лет, с инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы. Уницентрическая форма роста опухоли, HER2-позитивный молекулярно-генетический тип. Размер первичного опухолевого узла составляет 7,3 см. При проведении молекулярно-генетического исследования образцов ткани опухоли молочной железы, взятых до проведения неоадъювантной химиотерапии, согласно предлагаемому способу значение уровня экспрессии гена белка YKL-39 составило 1,51. Несмотря на большой размер первичной опухоли, при морфологическом исследовании операционного материала в 8 исследованных аксиллярных лимфоузлах клетчатки метастазов обнаружено не было.
Пример 2. Больная Е., 54 лет, с инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы. Уницентрическая форма рост опухоли, люминальный В молекулярно-генетический тип. Размер первичного опухолевого узла составляет 1,3 см. При проведении молекулярно-генетического исследования образцов ткани опухоли молочной железы, взятых до проведения неоадъювантной химиотерапии, согласно предлагаемому способу значение уровня экспрессии гена белка YKL-39 составило 0,41. Несмотря на малый размер первичной опухоли, при морфологическом исследовании операционного материала лимфогенные метастазы были обнаружены в 4 из 11 исследованных лимфоузлов аксиллярной клетчатки.
Предлагаемый способ основан на анализе данных морфологического и молекулярно-генетического методов исследования биопсийного и операционного материала.
Изучался биопсийный материал от 73 пациенток больных раком молочной железы стадии IIA-IIIC (T1-4N0-3M0) в возрасте от 28 до 68 лет (средний возраст больных составил 47,4±0,8 лет). Все пациентки проходили лечение в отделении общей онкологии Томского НИИ онкологии в период с 2006 по 2010 г. Исследование проходило в соответствии с Хельсинской Декларацией 1964 г. (исправленной в 1975 и 1983 годах), а также с разрешения локального этического комитета института, все пациенты подписали информированное согласие на исследование. Гистологический тип опухоли молочной железы устанавливался согласно рекомендациям ВОЗ (Женева, 2012 г.).
2
2
2
2
2
2
2
В плане комбинированного лечения все пациентки на предоперационном этапе получили 2-4 курса полихимиотерапии по схеме FAC (5-фторурацил 500 мг/м в 1-й день, адриамицин 50 мг/м в 1-й день, циклофосфамид 500 мг/м в 1-й день, внутривенно; проведение курсов через 21 день), по схеме САХ (циклофосфан 100 мг/м внутримышечно в течение 14 дней, адриамицин 30 мг/м внутривенно в 1-й и 8-й дни, кселода 1000 мг/м 2 раза в день, per os, в течение 14 дней; проведение курсов через 21 день), или монотерапия таксотером (100 мг/м внутривенно, часовая инфузия в день). Оценка эффективности неоадъювантной химиотерапии осуществлялась по шкале RECIST (Response Evaluation Criteriain Solid Tumors от 2000 г.) спустя 14 дней после второго и четвертого курсов химиотерапии на основании результатов клинического осмотра, УЗИ молочных желез и маммографии. Оперативный этап осуществлялся через 14-21 день после завершения курсов неоадъювантной химиотерапии. Операция выполнялась в объеме радикальной мастэктомии, радикальной или секторальной резекции молочной железы с аксиллярной лимфаденэктомией.
Для морфологического исследования в течение первого часа после выполнения оперативного вмешательства в операционном материале осуществляли взятие образцов опухолевой ткани. Производили вырезку фрагментов ткани новообразования размером 1×0,5×0,5 см. Кроме того, проводили вырезку всех лимфатических узлов аксиллярной клетчатки на предмет выявления метастатического поражения. Материал фиксировали в 10-12% растворе рН-нейтрального формалина. Проводку материала и изготовление гистологических препаратов осуществляли по стандартной методике. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином. Проводили верификацию диагноза, гистологический тип опухоли молочной железы устанавливали согласно рекомендациям ВОЗ (Женева, 2012 г.). Среди гистологических типов рака молочной железы в исследование были включены инвазивная карцинома неспецифического типа, инвазивный дольковый рак, медуллярный рак, а также другие редкие типы опухоли. В каждом случае в лимфатических узлах определяли наличие метастатического поражения, а также подсчитывали количество лимфоузлов, пораженных метастазами.
3
Для молекулярно-генетических исследований были использованы биопсийные образцы опухолевой ткани (~10 мм), которые были взяты у пациенток под контролем ультразвукового метода исследования до проведения неоадъювантной химиотерапии. Образцы ткани опухоли помещали в раствор RNALater (Ambion, USA) и сохраняли при температуре 80°С (после 24-часовой инкубации при температуре +4°С) для дальнейшего выделения РНК и ДНК.
260
280
260
230
РНК из взятых биопсийных образцов опухолевой ткани выделяли с помощью набора RNeasy Plus mini Kit, содержащего ДНК-азу I (Qiagen, Germany, # 74134). Ha спектрофотометре NanoDrop-2000 (Thermo Scientific, USA) оценивали концентрацию и чистоту выделения РНК. Концентрация РНК составляла от 80 до 250 нг/мкл, А/А=1,95-2,05; А/А=1,90-2,31. Целостность РНК оценивали при помощи капиллярного электрофореза на приборе TapeStation (Agilent Technologies, USA) и набора R6K ScreenTape (Agilent Technologies, USA # 5067-5367). RIN составил 5,6-7,8. С полученной РНК осуществляли синтез ДНК. Уровень экспрессии гена белка YKL-39 оценивали при помощи количественной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени (RT-qPCR) по технологии TaqMan с помощью специфичных праймеров и пробы Sense 5'-aacaacaaggttatcatcaaggac-3', AntiSense 5'-tttgggattcttggttttgag-3', Probe FAM-5'-agtgaagtgatgctctaccagaccat-3'-BHQ1 на амплификаторе RotorGene-6000 (Corbett Research, Australia). С полученной ДНК проводили ПЦР-анализ экспрессии гена белка YKL-39. Относительная экспрессия гена белка YKL-39 оценивалась с помощью метода Pfaffl в условных единицах (УЕ) относительно гена рефери GAPDH. В качестве калибратора использовалась нормальная ткань молочной железы, взятая от 10 пациенток, у которых при морфологическом исследовании материала каких-либо патологических изменений обнаружено не было. Исследование уровня экспрессии гена белка YKL-39 в данных образцах нормальной ткани молочной железы было проведено аналогичным выше описанному способом. При этом уровень экспрессии гена белка YKL-39 в образцах нормальной ткани молочной железы составил 1.
Уровень экспрессии YKL-39 в биопсийных образцах ткани опухоли у больных раком молочной железы более 1 УЕ (YKL-39>1) рассматривается как гиперэкспрессия и оценивается как благоприятный критерий, указывающий на низкий риск развития лимфогенных метастазов. Наоборот, уровень экспрессии гена белка YKL-39 ниже 1 УЕ (YKL-39<1) рассматривается как гипоэкспрессия и оценивается как неблагоприятный показатель, указывающий на высокий риск развития лимфогенного метастазирования.
Статистическая обработка полученных результатов выполнялась с помощью пакета программ «STATISTICA 8.0» (StatSoft Inc., США). Для проверки гипотезы о значимости различий между исследуемыми группами использовали критерий Вилкоксона-Манна-Уитни, непараметрический критерий Вилкоксона для связанных групп. Сравнение частот по качественным данным анализировали при помощи двухстороннего критерия Фишера.
Таким образом, при исследовании частоты встречаемости лимфогенных метастазов у пациенток больных раком молочной железы в зависимости от уровня экспрессии гена белка YKL-39 в опухолевой ткани были получены следующие результаты. Исследование показало, что наибольшая частота развития, а соответственно, более высокий риск возникновения лимфогенных метастазов у пациенток с раком молочной железы сопряжены с низким уровнем экспрессии в ткани новообразования гена белка YKL-39 (уровень экспрессии YKL-39<1) (р=0,036) (табл. 1). Для оценки значимости показателя экспрессии гена белка YKL-39 как прогностического маркера высокого риска лимфогенного метастазирования определяли значение отношения шансов (OR), доверительный интервал [15].
Источники информации
1. Page D.L. Prognosis and breast cancer. Recognition of lethal and favourable prognostic types / D.L. Page // Am. J. Surg. Pathol. - 1991. - Vol. 15. - P. 334-349.
2. Телегина Н.С. Связь гематогенной диссеминации с лимфогенным метастазированием при различных молекулярно-генетических вариантах рака молочной железы / Н.С. Телегина, О.Д. Брагина, К.Ю. Христенко, М.В. Завьялова, С.В. Вторушин, В.М. Перельмутер, Е.М. Слонимская, Е.В. Денисов, Н.В. Чердынцева // Бюллетень сибирской медицины. - 2013. - Том 12, №6. - С. 62-66.
3. Осинский С.П. Микроокружение опухолевых клеток и опухолевая прогрессия. Факторы стромального микроокружения / С.П. Осинский // Онкология. Здоровье Украины. - Червень. - 2013. - Тематический номер. - С. 36-39.
4. Sleeman J.P. Concept of metastasis in flux: the stromal progression model / J.P. Sleeman, G. Christofori, R. Fodde [et al.] // Seminar in Cancer Biology. - 2012. - Vol. 22. - P. 174-186.
5. Smith H.A. The metastasis-promoting roles of tumor-associated immune cells / H.A. Smith, Y. Kang // J. Mol. Med. (Berl). - 2013. - Vol. 91(4). - P. 411-429.
6. Quail D.F. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis / D.F. Quail, J.A. Joyce // Nat. Med. - 2013. - Vol. 19(11). - P. 1423-1437.
7. Mao Y. Stromal cells in tumor microenvironment and breast cancer / Y. Mao, E.T. Keller, D.H. Garfield et al. // Cancer Metastasis Rev. - 2013. - Vol. 32(1-2). - P. 303-315.
8. Kerkar S. P. Cellular Constituents of Immune Escape within the Tumor Microenvironment / S.P. Kerkar, N.P. Restifo // Cancer Research Reviews. - 2012. -Vol. 72(13). - P. 3125-3130.
9. Finger E.C Hypoxia, inflammation, and the tumor microenvironment in metastatic disease / E.C. Finger, A.J. Giaccia // Cancer metastasis reviews. - 2010. - Vol. 29. - P. 285-293.
10. Galli S.J. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity: macrophages, mast cells and neutrophils / S.J. Galli, N. Borregaard, T.A. Wynn // Nature immunology. - 2011. - Vol. 12. - P. 1035-1044.
11. Areshkov P.A., Kavsan V.M. Chitinase 3-like protein 2 (CHI3L2, YKL-39) activates phosphorylation of extracellular signal-regulated kinases ERK1/ERK2 in human embryonic kidney (hek 293) and human glioblastoma (U87 MG) cells // Цитология и генетика. - 2010. - Vol. 44, N. 1. - С. 3-9.
12. Cobleigh M.A. Gene expression markers for breast cancer prognosis / Cobleigh M.A., S. Shak, J.B. Baker, M.T. Cronin // Patent Application Publication. Pub. No: US 2011/0312532 A1. Pub. Date: Dec. 22, 2011.
13. Litviakov N.V. Changing the expression vector of multidrug resistance genes is related to neoadjuvant chemotherapy response / Litviakov N.V. et al. // Cancer Chemotherapy and Pharmacology. - 2013. - Vol. 71, N. l. - P. 153-163.
14. Holness C.L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins / Holness C.L., Simmons D.L. // Blood. - 1993. - Vol. 81, N. 6. - P. 1607-1613.
15. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ Statistica / О.Ю. Реброва // Медиа Сфера. - Москва. - 2006. - 312 с.