СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ КУМАРИНА ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ РАЗЛИЧНЫХ СИСТЕМ "КВОРУМ СЕНСИНГА" LUX/LUXR ТИПА У БАКТЕРИЙ
METHOD OF COUMARIN APPLICATION FOR INHIBITION OF DIFFERENT "QUORUM SENSING" LUX/LUXR TYPE SYSTEMS IN BACTERIA

Изобретение относится к микробиологии и фармацевтике и касается молекул растительного происхождения, способных подавлять плотностно-зависимую коммуникацию и регулируемое ей коллективное поведение («кворум сенсинг») у бактерий. Изобретение может найти применение при создании новых лекарственных препаратов, предназначенных для предупреждения и лечения бактериальных инфекций растений, животных и человека, возбудители которых используют систему «кворум сенсинга» для индукции своего патогенного потенциала.
Ввиду развития новых взглядов на использование одних и тех же антибиотических препаратов, как в медицине, так и в животноводстве и последующее негативное воздействие через продукты питания животного происхождения на организм человека, заставляет по-новому относиться к бесконтрольному их применению, в том числе в кормлении животных. Мировое животноводство является основным потребителем антибиотиков, до 50% от ежегодного производства. В настоящее время кормовые антибиотики все еще применяются в некоторых других государствах: в Канаде, странах Южной Америки и Африки. США выступают самым крупным производителем и потребителем антибиотиков в животноводстве. В качестве кормовых добавок США используют их в рационах примерно 80% птицы, 75% свиней и молочного скота, 60% мясного скота [1]. Широкое использование антибиотиков в животноводстве на фоне исчерпания терапевтического потенциала данной группы веществ и распространения феномена антибиотикорезистентности, является угрозой для человека. В связи с этим актуальность проблемы определяется необходимостью замены кормовых антибиотиков в рационах сельскохозяйственных животных на новые препараты и созданию на их основе высокоэффективных систем кормления.
Одним из перспективных направлений подобного поиска является разработка новых решений по управлению чувством кворума у бактерий.
Обнаружение бактериального кворума (QS) представляет собой форму связи между клетками, которая жизненно важна для патогенности многих бактерий и, следовательно, является многообещающей целью для разработки новых методов лечения микробных инфекций. Хотя многие лекарственные растения обладают антибактериальной активностью, было показано, что только несколько растений нацелены на определение кворума. Перед лицом повышенного микробного сопротивления существующим антибиотикам в сочетании со снижением развития новых антибиотиков ингибиторы QS из лекарственных растений являются перспективным направлением для новых антибактериальных методов лечения.
Реакции «чувства кворума» различаются у грамположительных и грамотрицательных бактерий. Так первой из описанных и наиболее распространенной кворум-системой у грамотрицательных бактерий является двухкомпонентная система LuxI/LuxR-типа, состоящая из низкомолекулярного регулятора - продукта гена LuxI, и взаимодействующего с ним рецепторного регуляторного белка - продукта гена LuxR. По мере того как популяция бактерий достигает критического уровня численности, автоиндукторы (АИ) накапливаются в среде до порогового значения, что приводит к активации определенных генов и оперонов, что способствует быстрой адаптации популяций бактерий к меняющимся условиям и их выживанию в среде.
Важно отметить, что, так как факторы вирулентности многих патогенных микроорганизмов находится под контролем «чувства кворума», ингибирование QS-систем является перспективной мишенью для создания антибактериальных средств нового принципа действия. Ингибиторы QS из лекарственных растений являются перспективным направлением для новых антибактериальных методов лечения [2].
Данный факт подтверждается рядом исследований, так цис-цис-п-ментоленод, извлеченный и выделенный из растения Mentha suaveolens ssp. insularis, действует как ингибитор образования альтекинов и образования биопленки [3], лекарственная трава Cassia alata ослабляет чувствительность кворума в Chromobacterium violaceum и Pseudomonas aeruginosa [4], тритерпены и флавоноидные соединения, обнаруженные в трех растительных экстрактах индийских лекарственных растений, могут быть ингибиторами QS [5].
Подобные исследования ведутся во всем мире и в настоящее время представлено несколько подходов к ингибированию «чувства кворума», однако до сих пор не один из них не доведен до состояния фармацевтического препарата [6].
Отдельным направлением является обнаружение и исследование природных (растительных) соединений, в естественных условиях, ингибирующих «кворум сенсинг» фитопатогенных бактерий, а при переносе в организм человека или животного способных оказывать аналогичное воздействие на практически аналогичные системы плотностно-зависимой коммуникации LuxI/LuxR типа у фито - и зоопатогенных микроорганизмов.
Что касается кумарина, о котором идет речь в заявке, то в литературе указывается на его антибактериальное действие именно через QS, в то же время не конкретизируется какой именно кумарин или его производное используется [7].
В то же время производные кумарина могут по-разному проявлять свое действие, например, кумаринпроизводные со вторичным углеродом в положении С-3 уменьшают рост P. aeruginosa, тогда как соединения с одним дополнительным заместителем (2Н-хромен-2-он) оказывают значительное влияние на продукцию пиоцианина [8]. Сравнительное исследование кумаринов показало, что молекулы с гидроксильными группами на ароматическом кольце проявляют более высокую активность при ингибировании образования биопленки Р. aeruginosa над кумаринами с заместителями в позициях 3 и 4 или без двойной 3,4-связи [9].
Прототипом является патент 2616237 [10], где также предложено применение кумарина и его производных в качестве ингибиторов системы «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа у бактерий, (1) отличием является то что производился скрининг растений семейства Астровые в котором обнаружены кумарин и его производные. В нашем же случае проведен скрининг представителей семейства Яснотковые, в которых имеется соединение кумарина (7,8-дигидрокси-4-метил). Предлагаемое применение (2) кумарина (7,8-дигидрокси-4-метил) представленной общей формулой, в качестве ингибиторов систем «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа у бактерий ранее не описано.
Кроме того, выраженное ингибирующее воздействие (3) на все четыре исследованные системы «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа у предлагаемого соединения более выражены, в отличие от прототипа (пример описан ниже).
Пример. В качестве ингибитора «кворум сенсинга» у бактерий, было использовано соединение кумарина (7,8-дигидрокси-4-метил), выделенного из растения семейства Яснотковые.
Определение способности данного соединения к ингибированию «чувства кворума» проводилось с использованием четырех различных бактериальных тест-систем LuxI/LuxR типа, каждая из которых индуцировалась определенным АГЛ и содержала соответствующие ему LuxR-подобный рецепторный белок. При этом три из них были сформированы на основе Escherichia coli JLD271 с мутацией в гене sdiA, ответственном за восприятие экзогенных АГЛ, что исключало интерференцию с клонированными в данном хозяйском штамме генноинженерными биолюминесцентными конструкциями [11]. В свою очередь сами подобные генетические конструкции были представлены плазмидами с последовательностями генов  и  специфически реагирующими развитием свечения при появлении в среде культивирования С4-АГЛ (N-бутаноил-L-гомосеринлактона), С6-оксо-АГЛ (N-(оксогексаноил)-L-гомосеринлактона) и С12-оксо-АГЛ (N-(оксододеканоил)-L-гомосеринлактона), соответственно. Четвертая тест-система была представлена Chromobacterium violaceum NCTC 13274, особенностью которого являлась инсерция транспозона Tn5 в ген eviI, ответственного за синтез С6-АГЛ (N-гексаноил-L-гомосеринлактона), с сохранением функционально активного гена cviR и кодируемого им рецепторного белка, ответственного за восприятие данного автоиндуктора [12]. Вследствие подобной генетической организации данный штамм в присутствии экзогенно вносимого С6-АГЛ образовывал доступный для оптической регистрации (575 нм) сине-фиолетовый пигмент виолацеин.
Возможность применения 7,8-дигидрокси-4-метилкумарина для ингибирования перечисленных систем «кворум сенсинга» проводилась путем внесения серий их двукратных разведений в жидкие питательные среды, содержащие бактериальный биотест и соответствующий ему автоиндуктор (АГЛ). Характеристикой ингибирующего эффекта служили выраженные в мкг/мл величины ЕС50 - концентрации исследованного соединения, вызывающие подавление биолюминесценции или нарушение образования пигмента виолацеина на 50% от максимально возможного выраженного эффекта, рассчитанного относительно соответствующих контролей: 0% - в отсутствие АГЛ; 100% - в присутствии только АГЛ. Результаты анализа подобной активности иллюстрируются на Фиг. 1, а в обобщенном виде приведены в таблице 1.
Из приведенных значений видно, что 7,8-дигидрокси-4-метилкумарин проявляет выраженное ингибирующее воздействие на все четыре исследованные системы «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа, характеризуемое величинами ЕС50 от 1,35 до 5,09 мМ, будучи менее активным в исследуемом диапазоне исследуемых концентраций данного соединения в отношении биотеста Escherichia coli pAL103. В свою очередь Chromobacterium violaceum NCTC 13274 оказывался наиболее восприимчивой тест-системой к воздействию исследованного соединения, значение ЕС50 которого равнялось 1,35 мМ.
Источники информации
1. Ульрих Е.В. История и современное состояние производства фитобиотических кормовых добавок в мире / Е.В. Ульрих, Д.А. Латышева // материалы VII Международной научно-практической конференции «Климат, экология, сельское хозяйство Евразии». - Иркутск, 24-26 мая 2018 г. - Изд-во: Иркутский государственный аграрный университет им. А.А. Ежевского. - С. 125-136.
2. Yarmolinsky L., Bronstein М.& Gorelick J. (2015). Review: Inhibition of bacterial quorum sensing by plant extracts. Israel Journal of Plant Sciences, 62:4, 294-297, DOI: 10.1080/07929978.2015.1067076.
3. Poli J.P., Guinoiseau E., de Rocca Serra D., Sutour S., Paoli M., Tomi F., Quilichini Y., Berti L., Lorenzi V. Anti-Quorum Sensing Activity of 12 Essential Oils on chromobacterium violaceum and Specific Action of cis-cis-p-Menthenolide from Corsican Mentha suaveolens ssp. Insularis. Molecules. 2018 Aug 23;23(9). pii: E2125. doi: 10.3390/molecules23092125.
4. Rekha P.D., Vasavi H.S., Vipin C, Saptami K., Arun A.B. A medicinal herb Cassia alata attenuates quorum sensing in Chromobacterium violaceum and Pseudomonas aeruginosa. Lett Appl Microbiol. 2017 Mar; 64(3):231-238. doi: 10.1111/lam.12710.
5. Tiwary B.K., Ghosh R., Moktan S., Ranjan V.K., Dey P., Choudhury D., Dutta S., Deb D., Das A.P., Chakraborty R. Prospective bacterial quorum sensing inhibitors from Indian medicinal plant extracts. Lett Appl Microbiol. 2017 Jul; 65(1):2-10. doi: 10.1111/lam. 12748.
6. Scutera S., Zucca M. & Savoia D. (2014). Novel approaches for the design and discovery of quorum-sensing inhibitors, Expert Opinion on Drug Discovery, 9:4, 353-366, DOI: 10.1517/17460441.2014.894974.
7. Zhang Y., Sass A., Van Acker H., Wille J., Verhasselt В., Van Nieuwerburgh F., Kaever V., Crabbe A., Coenye T. Coumarin Reduces Virulence and Biofilm Formation in Pseudomonas aeruginosa by Affecting Quorum Sensing, Type III Secretion and C-di-GMP Levels. Front Microbiol. 2018 Aug 21;9:1952. doi: 10.33 89/fmicb.2018.01952.
8. da S M Forezi L., Froes T.Q., Cardoso M.F.C., de Oliveira Maciel C.A., Nicastro G.G., Baldini R.L., Costa D.C.S., Ferreira V.F., Castilho M.S., de С da Silva. Synthesis and Biological Evaluation of Coumarins Derivatives as Potential Inhibitors of the Production of Pseudomonas aeruginosa Virulence Factor Pyocyanin. Curr Top Med Chem. 2018; 18(2): 149-156. doi: 10.2174/1568026618666180329122704.
9. D'Almeida R.E., Molina R.D.I., Viola СМ., Luciardi M.C., Nieto Penalver C, Bardon A., Arena M.E. Comparison of seven structurally related coumarins on the inhibition of Quorum sensing of Pseudomonas aeruginosa and Chromobacterium violaceum. Bioorg Chem. 2017 Aug; 73:37-42. doi: 10.1016/j.bioorg.2017.05.011.
10. Патент на изобретение №2616237 Применение кумарина и его производных в качестве ингибиторов системы "кворум сенсинга" LuxI/LuxR типа у бактерий. Дерябин Д.Г., Толмачева А.А., Инчагова К.С.
11. Lindsay А., & Ahmer В.М., Effect of sdiA on biosensors of N-acylhomoserine lactones. Journal of Bacteriology, Vol. 187, No. 14, 2005, pp. 5054-5058.
12. McClean K.H., Winson M.K., Fish L., Taylor A., Chabra S.R., Camara M., Daykin M., Lamb J.H., Swift S., Bycroft B. W., Stewart G.S.A.B., Williams P. 1997. Quorum sensing and Chromobacterium violaceum: exploitation of violacein production and inhibition for the detection of N-acylhomoserine lactones. Microbiology. 143, 3703-3711.