Концентрация IL8 матрикс-металлопротеиназ в сыворотке крови в динамике терапии Г-КСФ*

.....

Оригинальные исследования

тп

Концентрация IL8 матрикс-металлопротеиназ в сыворотке крови в динамике терапии Г-КСФ*

Е.В. Райкина, С.А. Румянцев

IL8 matrix-metalloproteinasa concentration in blood serum in therapy with G-CSF

E.V. Raikina, S.A. Rumyantsev

В последние несколько лет стало очевидным, что мобилизация ГСК - процесс до конца не изученный и достаточно противоречивый. Он обеспечивается комплексом взаимодействий между ростовыми факторами, хемокинами, про-теазами и молекулами адгезии. Хотя каждый из этих участников может независимо друг от друга запускать каскад мобилизации ГСК, их пути, так или иначе, перекрещиваются и становятся взаимосвязанными. Появились факты, свидетельствующие о том, что мобилизация является результатом действия «периферических» хемокинов, таких как интерлей-кин 8 [^-8 или СХ^8), и ремоделирования матрикса и базальной мембраны энзимами матрикса, такими как же-латиназа-В (ММР-9) [1-4]. Проведенные исследования убеждают, что нейтрофилы, ^-8 и ММР-9 играют ключевую роль в Г-КСФ-индуцированной мобилизации стволовых клеток. Стимуляция препаратами Г-КСФ может приводить к снижению экспрессии CD114 на нейтрофилах с последующей их активацией и повышенной продукцией ^-8, который вызывает дегрануляцию нейтрофилов и высвобождение из них различных энзимов, в том числе матрикс металлопроте-иназ [ММР-9, ММР-2), эластазы, катепсина G [5-7]. Более того, нейтрофилы не продуцируют Т1МР-1 и могут химически активировать латентную про-желатиназу-В. Все вместе это приводит к деградации и/или инактивации молекул адгезии, таких как УСАМ-1/У1А-4, хемокинов [SDF-1/CXCR-4), растворимой фракции К1Т-лиганда и др., тем самым, нарушая контакт между ГСК и костно-мозговым микроокружением. Стволовые клетки, таким образом, получают возможность беспрепятственной миграции из костного мозга через эн-дотелиальный барьер в периферическую кровь [8, 9].

Таким образом, поиск посредников, определяющих эффективность Г-КСФ-индуцированной мобилизации ГСК в периферическую кровь представляется актуальным для получения наиболее эффективного трансплантационного материала.

Материал и методы исследования

Материалом исследования служила периферическая кровь (ПК) 45 детей с онкогематологическими заболеваниями, находившихся на лечении в ФГУ «ФНКЦ ДГО1/1» Росз-драва с 2000 по 2006 годы. /з них 26 пациентов получали препараты Г-КСФ с целью восстановления количества гра-нулоцитов при медикаментозной цитопении, остальные 19 -с целью мобилизации CD34+ клеток в периферическую кровь для сбора и последующей аутологичной трансплантации. Кроме того, исследовали периферическую кровь и сыворотку 15 здоровых доноров ГСК, которые получали

препараты Г-КСФ с целью мобилизации CD34+ клеток в периферическую кровь для дальнейшего отбора и последующей аллогенной трансплантации.

Протоколы клинического применения

препаратов Г-КСФ

В настоящем исследовании использовались препараты Г-КСФ - граноцит [леногастрим], нейпоген [филгастрим] и лейкостим [филгастрим] - в рамках трех протоколов клинического применения Г-КСФ:

1. Мобилизация CD34+ клеток в периферическую кровь с целью их сбора для аллогенной трансплантации.

2. Мобилизация гемопоэтических стволовых клеток в периферическую кровь с целью их сбора для аутологичной трансплантации.

3. Лечение медикаментозной цитопении после курсов высокодозной цитотоксической полихимиотерапии у детей с онкологическими и онкогематологическими заболеваниями.

Получение CD34+ клеток периферической крови

Периферические CD34+ клетки получали с помощью процедуры цитафереза на гемосепараторе «Baxter CS-3000 Plus». Мононуклеарную фракцию клеток крови выделяли на градиенте гравитации. Процедуры цитафереза после периода мобилизации проводили ежедневно до тех пор, пока суммарное количество CD34+ клеток не достигало уровня, обеспечивающего наиболее быстрое приживление трансплантата.

Минимально допустимым количеством CD34+ клеток для трансплантации считали их число более 2х10в/кг массы тела реципиента. Оптимальным считали количество CD34+ клеток более 5х106/кг массы тела реципиента. Для достижения такого уровня требовалось различное число процедур цитафереза [от 1 до 4]. Ежедневное введение препаратов Г-КСФ продолжали и в дни проведения сеансов цитафе-реза.

Определение колониеобразующей

активности ГСК

Колониеобразующую активность лейкоцитарной фракции крови определяли двумя методами:

1. Культивирование в течение 14 суток в метилцеллю-лозе [готовая среда, содержащая факторы роста «MethoCult 4338, StemCellTehnologies, Canada] с подсчетом количества КОЕ-ГЕММ, КОЕ-ГМ, КОЕ-Г, КОЕ-М, КОЕ-Э.

• Эффективность клонирования определяли как общее число КОЕ на 1х105 эксплантированных клеток.

* Материал представлен на международный симпозиум «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантации», Москва, Ц/ТО, 25-26 апреля 2007 г.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 2, 2007

.....

zrn

Оригинальные исследования

• Для определения абсолютного количества гемопоэти-ческих предшественников в 1 мл ПК полученные величины эффективности клонирования умножали на число мононук-леарных клеток в 1 мл крови.

2. Культивирование в полутвердой среде в системе «агаровая капля - жидкая среда» в течение 7 сут. с расчетом следующих показателей:

• Колониеобразующая [КОС] и кластерообразующая [КлОС] способность - число колоний [малые - 20-40 клеток, средние - 41 -100 клеток и большие - более 100 клеток] и кластеров [малые - 5-9 клеток, большие - 10-19 клеток] на 1х105 эксплантированных клеток.

• Эффективность клонирования - общее число колоний и кластеров на 1х105 эксплантированных клеток.

• Для определения абсолютного количества гемопоэти-ческих предшественников в 1 мл крови или костного мозга полученные величины эффективности клонирования умножали на число мононуклеарных клеток в 1 мл крови и на число миелокариоцитов в 1 мл костного мозга.

Определение количества субпопуляций

лейкоцитов и стволовых клеток,

несущих рецептор к IL8 и Г-КСФ

Количество субпопуляций лейкоцитов и гемопоэтичес-ких стволовых клеток, несущих рецепторы к Г-КСФ [CD114] и IL8 [CDw128], определяли по экспрессии мембранных маркеров [CD - clusters of differentiation] в реакции прямой иммунофлюоресценции с моноклональными антителами CD3, CD14, CD15, CD34, CD38, CD45, CD114, CDw128 «Becton Dickinson» [США] при помощи проточной цитомет-рии на приборе FACSCalibur «Becton Dickinson» [США].

Определение концентрации цитокинов

и ферментов в сыворотке крови

Для количественного определения концентрации G-CSF, IL-8, MMP-9, MMP-2, TIMP-1, TIMP-2 в сыворотке крови проводилась реакция 1/1ФА «сэндвич» типа. В качестве ферментных меток использовалась пероксидаза. В настоящем исследовании использовались следующие наборы реагентов: «Human MMP-9 [total]», «Human/mouse MMP-2[total]»,

«Human TIMP-2» [«Quantikine» R&D Systems Inc., USA), «Human TIMP-1» (Biosource International Inc., USA), «Human IL-8 ELISA Kit II» [BD OptEIA™ BD Biosciences Pharmingen, USA).

Статистическая обработка

Статистическую обработку данных производили для вариационных рядов с параметрическим распределением с помощью однофакторного дисперсионного анализа и оценкой по критерию Стьюдента с поправкой Бонферрони и тесту Ньюмена-Кейлса; для вариационных рядов с непараметрическим распределением с помощью критерия Крускалла-Уоллеса и критерия Манна-Уитни. Для оценки равенства долей использовали Z-тест. Корреляционный анализ проводили с использованием уравнений линейной регрессии и по методу Спирмена для рядов с непараметрическим распределением. При расчетах использовали программы Excel 2002 Pro, STATISTIKA for Windows 8.0, Biostat for Windows.

Результаты и обсуждение

Исследования последних лет, в основном на моделях с животными, показали, что Г-КСФ не оказывает прямого воздействия на гемопоэтические клетки-предшественники [10], а мобилизация ГСК является результатом действия «периферических» хемокинов, таких, как интерлейкин 8 [IL-8 или CXCL8), и ремоделирования матрикса и базальной мембраны энзимами матрикса, такими, как желатиназа-В (ММР-9) [11]. В настоящем исследовании показано, что до назначения Г-КСФ наименьший уровень IL-8 наблюдался в группе здоровых доноров (6,07±0,39 пг/мл), а наибольший -у доноров аутологичных стволовых клеток (485±158 пг/мл) [табл. 1).

В результате применения Г-КСФ концентрация IL-8 в сыворотке периферической крови статистически значимо нарастает во всех трех исследованных группах (см. табл. 1).

Учитывая полученные результаты, мы изучили связь между концентрацией IL-8 перед началом курса Г-КСФ и кратностью его роста к моменту отмены, и оказалось, что статистически значимой связи этих признаков не наблюдается (табл. 2).

Таблица 1. Концентрация ^-8 в сыворотке периферической крови до и после применения Г-КСФ

Исследуемая группа N Концентрация IL-8 в сыворотке, пг/мл Р Кратность роста IL-8

после Г-КСФ до Г-КСФ

Медикаментозная цитопения 21 485±158 1113±250 4,9±1,36 0,001

Доноры аутологичных CD34+ клеток 9 108±15 569±159 6,2±2,4 0,040

Здоровые доноры 6 6,07±0,39 47,0±6,18 7,7±3,2 0,022

Таблица 2. Зависимость кратности роста концентрации ^-8 в сыворотке крови от его инициальной концентрации в сыворотке крови

Исследуемая группа Коэффициент корреляции (r) p

Медикаментозная цитопения -0,28 0,2

Доноры аутологичных CD34+ клеток -0,32 0,37

Здоровые доноры -0,64 0,55

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 2, 2007

.....

Оригинальные исследования

тп

Одними из основных участников процесса реализации мобилизирующего эффекта Г-КСФ на клетки-мишени, вероятно, являются матрикс-металлопротеиназы [ММР-9, ММР-2) и их естественные ингибиторы [Т1МР-1 и Т1МР-11). Нами показано, что в результате применения Г-КСФ в сыворотке периферической крови как у больных, подвергшихся химиотерапевтическому лечению, так и у доноров гемопоэ-тических стволовых клеток происходит изменение концентрации ММР-9. Так, в группе медикаментозной цитопении начальная концентрация ММР-9 была наименьшей -24,2±7,7нг/мл. В ответ на действие Г-КСФ она выросла до 826,5±180,37нг/мл, изменившись, таким образом, в 55,75±17,6 раза (р < 0,0001). Самое высокое содержание ММР-9 и до начала курса Г-ГСФ, и в момент его отмены наблюдалось в группе здоровых доноров (182,0±42,1 и 1358,2±261,3 нг/мл соответственно). Кратность роста при этом составила 8,3±2,1 раза [р < 0,0001). Меньше всего изменилась концентрация ММР-9 в группе доноров ауто-ГСК - в 3,94±1,24 раза [р = 0,043) [табл. 3).

Учитывая выявленные статистически значимые изменения уровня ММР-9 в динамике Г-КСФ-мобилизации, мы изучили зависимость количества клеток периферической крови от роста ММР-9. Как показано в таблице 4, во всех исследованных группах отмечается выраженная зависимость роста количества гранулоцитов от увеличения концентрации ММР-9 в сыворотке крови. Зависимость роста количества моноцитов от нарастания концентрации ММР-9 в сыворотке крови наблюдается у доноров аутологичных CD34+ клеток [коэффициент корреляции г = 0,954, р = 0,045) и у здоровых доноров [коэффициент корреляции г = 0,724, р = 0,048). В группе медикаментозной цитопении статистически значимой связи этих процессов не обнаружено. Проведенный корреляционный анализ по законам линейной регрессии показал, что рост лимфоцитов происходит вне зависимости от роста ММР-9.

Учитывая связь роста количества клеток крови со степенью нарастания концентрации в сыворотке крови ^8 и ММР-9, можно предположить, что динамика сывороточной концентрации указанных цитокинов в результате использования препаратов Г-КСФ связана друг с другом. При

исследовании взаимосвязи степени роста концентрации ММР-9 с повышением концентрации ^-8 показано, что прямая корреляционная связь имеется в группе доноров ауто-ГСК [коэффициент корреляции 0,963, р = 0,037) и здоровых доноров [коэффициент корреляции 0,621, р = 0,046). В группе медикаментозной цитопении такая зависимость имеется, хоть и статистически не значима.

Учитывая тот факт, что фермент ММР-9 имеет естественный ингибитор, мы определили концентрацию естественного ингибитора желатиназы-В - Т1МР-1 в сыворотке периферической крови в динамике мобилизации Г-КСФ. Из полученных данных хорошо видно, что в результате действия Г-КСФ концентрация Т1МР-1 в сыворотке не изменяется ни в одной из исследованных групп. Соотношение ММР-9 и ее тканевого ингибитора изменяется во всех группах за счет статистически значимого увеличения содержания ММР-9. В группе медикаментозной цитопении, когда Г-КСФ назначался больным при количестве нейтрофилов менее 500 в 1 мкл, это соотношение изменилось в наибольшей степени [кратность роста ММР-9/Т1МР-1 составила 58,39±28,54 раза, р=0,02).

Другим представителем семейства матрикс-металлопро-теиназ, возможно, участвующим в Г-КСФ-опосредованной мобилизации ГСК, является ММР-2. Нами показано, что до назначения Г-КСФ концентрации ММР-2 в сыворотке крови здоровых доноров и в момент его отмены были самыми высокими: 174,5±111,5 нг/мл и 156±70 нг/мл соответственно, у доноров аутологичных CD34+ клеток концентрация ММР-2 в сыворотке крови составила 9,53±4,74 нг/мл. В результате мобилизации концентрация ММР-2 не изменилась. Содержание тканевого ингибитора ММР-2 [Т1МР-11) в результате мобилизации также не изменялось.

В многочисленных исследованиях показано, что применение гранулоцитарного колониестимулирующего фактора приводит к значительному повышению количества CD34+ клеток в периферической крови. Наши данные не стали исключением, но, учитывая вероятное участие ^8 и ММР-9 в процессе мобилизации ГСК под действием Г-КСФ было важно изучить влияние этих факторов на эффективность мобилизации.

Таблица 3. Концентрация ММР-9 в сыворотке периферической крови до и после применения Г-КСФ

Исследуемая группа N Концентрация ММР-9 в сыворотке (нг/мл) Р Кратность роста ММР-9

после Г-КСФ до Г-КСФ

Медикаментозная цитопения 10 24,2±7,7 826,5±180,3 55,75±17,6 <0,0001

Доноры аутологичных CD34+ клеток 5 175,0±79,7 819,4±254,7 3,94±1,24 0,043

Здоровые доноры 6 182,0±42,1 1358,2±261,3 8,3±2,1 <0,0001

Таблица 4. Зависимость роста количества гранулоцитов от роста концентрации ММР-9 в сыворотке крови

Исследуемая группа N Коэффициент корреляции (г) Р

Медикаментозная цитопения 8 0,839 0,009

Доноры аутологичных CD34+клеток 4 0,957 0,042

Здоровые доноры 4 0,726 0,045

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 2, 2007

......

Оригинальные исследования

ш

Так как в ходе проведенных исследований выяснилось, что во всех исследованных группах происходит статистически значимое увеличение концентрации ^-8 и ММР-9 на фоне стимуляции Г-КСФ, то становится очевидным желание связать эффект мобилизации CD34+ клеток с изменением уровня выше названных факторов.

казалось, что во всех исследованных группах отмечается прямая корреляционная зависимость эффективности мобилизации CD34+ клеток от степени роста концентрации ^-8 в сыворотке крови [табл. 5).

т степени повышения концентрации ММР-9 в сыворотке крови зависит Г-КСФ индуцированная мобилизация CD34+клеток в группе мобилизации ауто-ГСК и у здоровых доноров, в то время как при использовании Г-КСФ для лечения медикаментозной цитопении эффективность мобилизации не зависит от степени изменения концентрации ММР-9 [табл. 6).

При изучении влияния повышения концентрации в сыворотке крови ^8 и ММР-9 под действием Г-КСФ на динамику количества клеток-предшественников гранулоцитар-но-макрофагального ряда кроветворения (К^Е-ГМ) показано, что степень прироста ШЕ-ГМ в периферической крови после применения Г-КСФ зависит от степени роста сывороточной концентрации ^8 и не зависит от ММР-9 [табл. 7, 8).

Таким образом, Г-КСФ, вероятно, не оказывает прямого воздействия на гемопоэтические стволовые клетки, реализуя свой эффект мобилизации CD34+ клеток через клетки-мишени, имеющие рецепторы к Г-КСФ, которыми являются нейтрофильные гранулоциты и, возможно, моноциты [1, 7, 12, 13]. Эти клетки, в свою очередь, получив сигнал от Г-КСФ, инициируют выработку вторичных посредников, которыми могут быть другие цитокины [^-8, ^-3, GM-CSF, SDF-1) или ферменты (коллагеназы), которые разрушают связь CD34+ клеток со стромальными элементами костного мозга и усиливают миграцию CD34+ клеток в периферическую кровь.

В настоящем исследовании мы показали, что сывороточные концентрации ^-8 и ММР-9 значительно повышаются в результате использования Г-КСФ, причем степень этого повышения обратно пропорциональна их первоначальной концентрации. Концентрация другой матрикс-металлопро-теиназы - ММР-2, также предполагающейся на роль посредника в реализации мобилизующего действия Г-КСф, в результате его использования не меняется. Не меняется и концентрация в сыворотке естественных ингибиторов ММР-9 и ММР-2 - Т1МР-1 и Т1МР-11. Таким образом, из наших данных следует, что эффективность мобилизации как гранулоцитов, так и ГСК зависит от степени повышения сывороточной концентрации ^-8 и ММР-9.

Таблица 5. Зависимость эффективности мобилизации С034+ клеток от роста концентрации ^-8 в сыворотке крови

Таблица 6. Зависимость эффективности мобилизации С034+ клеток от роста концентрации ММР-9 в сыворотке крови

Исследуемая группа N Коэффициент корреляции (г) Р

Медикаментозная цитопения 16 0,56 0,048

Доноры аутологичных CD34+ клеток 10 0,72 0,045

Здоровые доноры 6 0,69 0,040

Исследуемая группа N Коэффициент корреляции (г) Р

Медикаментозная цитопения 8 -0,432 0,284

Доноры аутологичных CD34+клеток 4 0,968 0,032

Здоровые доноры 4 0,544 0,024

Таблица 7. Зависимость эффективности мобилизации КОЕ-ГМ от роста концентрации ^8 в сыворотке крови

Таблица 8. Зависимость эффективности мобилизации КОЕ-ГМ от роста концентрации ММР-9 в сыворотке крови

Исследуемая группа N Коэффициент корреляции (г) Р

Медикаментозная

цитопения 16 0,59 0,032

Доноры

аутологичных

CD34+ клеток 10 0,81 0,050

Исследуемая группа N Коэффициент корреляции (г) Р

Медикаментозная

цитопения 8 -0,152 0,487

Доноры

аутологичных

CD34+клеток 4 0,201 0,386

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 2, 2007

.....

Оригинальные исследования

тп

fMTEPATyPA:

1. Imamura R., Miyamoto T., Yoshimoto G. et al. Mobilization of human lymphoid progenitors after treatment with granulocyte colony-stimulating factor. J. Immunol. 2005; 175: 2647-54.

2. Pruijt J.F.M., Fibbe W.E., Laterveer L. et al. Prevention of interleukin-8-induced mobilization of hematopoietic progenitor cells in rhesus monkeys by inhibitory antibodies against the metalloproteinase gelatinase B (MMP-9). Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1999; 96(19): 10863-8.

3. Robinson S.N., Seina S.M., Gohr J.C. et al. Hematopoietic progenitor cell mobilization by granulocyte colony-stimulating factor and erythropoietin in the absence of matrix metalloproteinase-9. Stem Cells and Dev. 2005; 14: 317-28.

4. Takeyama K., Ohto H. PBSC mobilization. Transf. Apheresis Sci. 2004; 31: 233-43.

5. Chakrabarti S., Patel K.D. Regulation of matrix metalloproteinase-9 release from IL-8-stimulated human neutrophils. J. Leukocyte Biol. 2005; 78: 279-88.

6. Domanovic D., Wozniak G., Cernelc P. et al. Matrix metalloproteinase-9 and cell kinetics during the collection of peripheral blood stem cells by leukapheresis. Transf. Apheresis Sci. 2005; 33: 37-45.

7. Jilma B., Hergovich N., Homoncik M. et al. Granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) downregulates its receptor (CD 114) on neutrophils and induces

gelatinase B release in humans. Br. J. Haematol. 2000; 111: 314-20.

8. Robinson S.N., Pisarev V.M., Chavez J.M. et al. Use of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) knockout mice demonstrates that MMP-9 activity is not absolutely required for G-CSF or FLT-3 ligand-induced hematopoietic progenitor cell mobilization or engraftment. Stem Cells 2003; 21: 417-27.

9. Thomas J., Liu F., Link D.C. Mechanisms of mobilization of hematopoietic progenitors with granulocyte colony-stimulating factor. Current Opinion in Hematol. 2002; 9:183-9.

10. Liu F., Poursine-Laurent J., Link D.C. Expression of the G-CSF receptor on hematopoietic progenitor cells is not required for their mobilization by G-CSF. Blood 2000; 95: 3025-31.

11. Starckx S., Van den Steen P.E., Wuyts A. et al. Neutrophil gelatinase B and chemokines in leukocytosis and stem cell mobilization. Leuk. Lymph. 2002; 43(2): 233-41.

12. Imamura R., Miyamoto T., Yoshimoto G. et al. Mobilization of human lymphoid progenitors after treatment with granulocyte colony-stimulating factor. J. Immunol. 2005; 175: 2647-54.

13. Roberts A.W., Metcalf D. Noncycling state of peripheral blood progenitor cells mobilized by granulocyte colony-stimulating factor and other cytokines. Blood 1995; 86: 1600.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 2, 2007