СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АГРИМОНИИНА
METHOD PRODUCING AGRIMONIIN

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности.
С каждым годом растет интерес к препаратам, полученным из растительного сырья. Это обусловлено комплексным действием биологически активных веществ, содержащихся в них, высокой безопасностью, низкой токсичностью и аллергенностью. При этом особое внимание заслуживают лекарственные растения, традиционно применяемые в народной медицине. К таким растениям относится манжетка обыкновенная - Alchemilla vulgaris L.
Трава манжетки с успехом используется как официальное сырье в западно-европейских странах и входит в фармакопеи Великобритании, Франции, Германии, Югославии (используется в виде порошка из сухой травы для внутреннего применения). Для нее установлен широкий спектр фармакологического действия: противовоспалительное, кровоостанавливающее, лимфотропное, гипотензивное, гипогликемическое и др. [Hager H. Pharmacopoe ia Anglica, Gall ica, Germanae, Hevetica, Russae inter se collatae. Vratistaiae. Impesis Ernesti Gunteri. - MDCCCLXIX. - S.10].
Это обусловлено богатством химического состава, обнаружены: флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты и их эфиры, танины, аминокислоты, а также эссенциальные макро- и микроэлементы, такие как кальций, калий, магний, фосфор, хром, медь, кобальт и др.
Фиг.1 показывает хроматограмму, на которой отражена многокомпонентность полифенольного комплекса травы манжетки, состоящего из галловой кислоты (1), хлорогеновой кислоты (2), кофейной кислоты (3), рутина (4), коричной кислоты (5), кемпферола (6), кверцетина (7) и агримониина (8).
Известно, что полифенольные соединения обладают иммуномодулирующей, антимутагенной (геном-стабилизирующей), анаболической, регенераторной, гепатопротекторной, антистрессовой, противовоспалительной, гиполипидемической и антиоксидантной активностью. Противоопухолевую активность растительных полифенолов объясняют присутствием в спектре их действия иммунотропной и антиоксидантной активности. Кроме того, известно, что накопление свободнорадикальных продуктов окисления ингибирует митотическую активность клеток. Введение экзогенных антиоксидантов способно вызвать угнетение синтеза и активности эндогенных стабилизаторов липидов и общее снижение антиокислительной активности. В этом случае имеет место противоопухолевый эффект. Данный механизм имеет опосредованный характер. Также антимитотическое и противоопухолевое действие некоторых полифенолов может быть итогом деятельности других механизмов, связанных, в частности, с непосредственным воздействием их на генетический аппарат клетки и механизмы митоза.
Специфической активностью обладают олигомерные танины, один из них - агримониин - димерный танин, содержащийся в некоторых представителях растений семейства Rosaceae. В зарубежной литературе встречаются отрывочные данные об агримониине, выделенном из Agrimonia pilosa Ledeb. и Agrimonia eupatoria L. японскими исследователями.
Описан способ получения агримониина из некоторых растений семейства розоцветные: двух видов гравилата, репешка волосистого и эндемичной лапчатки (Yoshida Т., Okuda Т. Tannins of Rosaceous medicinal plants // J. Chem. Soc. Perkin Trans., №1, 1985. - S.315-321). Способ характеризуется использованием в качестве экстрагента бутан-1-ола с последующим высушиванием экстракта без дальнейшей отгонки растворителя и выходом целевого продукта 0,57%.
Недостатками способа являются низкий выход агримониина и токсичность используемых экстрагентов.
Задачей изобретения является способ получения агримониина, позволяющий повысить выход целевого продукта и снизить токсичность процесса извлечения.
Поставленная задача решается способом, заключающимся в том, что сухие листья и верхушки цветоносов с цветками и бутонами манжетки обыкновенной измельчают до 1 мм, экстрагируют 70% водным ацетоном в соотношении 1:8-12 при нагревании до 30-40°С в течение 90-150 мин, ацетон отгоняют, водный остаток промывают этилацетатом, полученное извлечение наносят на колонку с сефадексом, колонку промывают 40% ацетоном, ацетон отгоняют, водный экстракт замораживают и лиофильно высушивают.
Экстракцию проводят водным ацетоном, т.к. этот растворитель позволяет получить максимальным выход целевого продукта.
Выход целевого продукта 1,5-2,5%.
Пример 1. Получение агримониина из травы манжетки.
100 г измельченных до 1 мм сухих листьев и верхушек цветоносов с цветками и бутонами манжетки обыкновенной экстрагируют в соотношении 1:8 при нагревании до 30°С водным ацетоном (70%) в течение 90 мин, ацетон отгоняют, водный остаток промывают этилацетатом, полученное извлечение наносят на колонку с сефадексом, колонку промывают 40% ацетоном, ацетон отгоняют, водный экстракт замораживают и лиофильно высушивают.
Выход агримониина - 1,5%.
1
2
2
3
2
Танин был идентифицирован прямым сравнением спектра со спектрами известных образцов как агримониин, анализ его Н ЯМР спектра показал наличие в его структуре галлоильных групп (δ 7.21) и гексагидроксидилфенильных групп (δ 6.73 и 6.48). Для изучения строения полученный танин рехроматографировали в тех же условиях. Спектры ЯМР снимали на спектрометре «Bruker» WH-360 при рабочей частоте 360 МГц (1н). Отнесение сигналов углеводной части выполнено с помощью метода двойного резонанса. Образцы полученных соединений дейтерировали для снятия спектров многократным упариванием с метанолом - d 4 или высушивали лиофильно из раствора DO. Для спектра ПМР образец танина (100 мг) обрабатывали 2×2 мл DO и высушивали лиофильно. Спектр ЯМР Н [(360 МГц; (СО)СО] проявляет 9 синглетных сигналов ароматических протонов при 6.34, 6.36, 6.43, 6.55, 6.60, 6.62, 6.64, 6.66 и 7.28 мд и два дублетных сигнала (J 3.5 Гц) при 6.90 и 7.38 мд. Имеется два дублета аномерных протонов при 6.52 и 6.54 мд (13.5 Гц). Сигналы остальных протонов углеводной части: 3.67 (J 13.5 Гц) 6'α; 3.79 (J 13.5 Гц) 6'β; 4.42 m 5α; 4.62 m 5β; 5.10-5.25 (m 3Н) 4α; 4β; 6α; 5.47; (~t) 3α; 3β; 5.29-5.40 (3Н) 2α; 2β; 6β. На основании данных спектра ПМР, угла оптического вращения и результатов кислотного гидролиза танин манжетки идентифицирован как димерный танин агримониин (фиг.2).
82
54
52
2
D
3
2
2
Агримониин (фиг.2) СНO·13HO, [α] + 162° (с 1.0 этанол), λmax (МеОН) 232 (log ε 5.20) и 270 нм (5.05) - белый со слегка сероватым оттенком аморфный порошок, хроматографически гомогенный (по данным ВЭЖХ в нормальной фазе и гель-фильтрации) и ТСХ (целлюлоза). Протонный ЯМР спектр (200 МГц; CDOD) включает 9 синглетов δ 6.36, 6.37, 6.38, 6.41, 6.44, 6.54, 6.60, 6.71 и 7.27; 2 дублета (J 2 Гц δ 6.85 и 7.39) в ароматической области и два дублета (J 3,5 Гц) за счет аномерных протонов сахара в δ 6.50 и 6.61, последний частично смещен в область 6.60 м.д. При метилировании агримониина CHN образуется соединение, являющееся нонакозаметильным производным, образующим в результате метанолизо-диметил (S)-гексаметоксидифенолят, [α]D - 34° (с 0.1 этанол) диметил-пента-O-метилдегидродигаллат и глюкозу. В ходе хроматографического анализа (ГЖХ 1% OV-1, температура колонки 240°С) установили, что (S)-гексаметоксидифенолят и пента-O-метилдегидродигаллат находятся в молярном соотношении 3,9:1.
13
Это означает, что агримониин состоит из дегидродигаллоильных групп, четырех гексагидроксидифеноильных групп и двух остатков глюкозы. Это было доказано в результате анализа С спектра ЯМР и определения молекулярной массы с использованием ВЭЖХ (гель-фильтрация).
4
2
3
При обработке агримониина растворами MeSO и KCO в ацетоне образуются α-аномер и β-аномер тридека-O-педункулагина и диметил-пента-O-метилдегидродигаллат.
3
13
Другой продукт частичного гидролиза (1Н ЯМР, CDOD) δ 6.43, 6.50, 7.18 (1Н каждый синглет); 6.68 (2Н синглет); 6.80, 7.31 (1Н каждый дублет, J 2 Гц); и 6.43 (1Н частично совпадающий с δ 6.43 аномерных протонов) был также получен в результате обработки агримониина (1) танназой. В результате анализа констант сопряжения (J 3.5 Гц) в спектре ЯМР и химических сдвигов (δ 91.9 и 91.5) аномерных углеродных сигналов в спектре С ЯМР было доказано наличие α-конфигурации С-1 атомов углерода в двух остатках глюкозы агримониина (фиг.2). Полученные данные подтверждают правомерность химической структуры агримониина - как одного из димерных эллаготанинов, имеющих природное происхождение.
Пример 2. Получение агримониина из травы манжетки.
100 г измельченных до 1 мм сухих листьев и верхушек цветоносов с цветками и бутонами манжетки обыкновенной экстрагируют в соотношении 1:12 при нагревании до 40°С водным ацетоном (70%) в течение 150 мин, ацетон отгоняют, водный остаток промывают этилацетатом, полученное извлечение наносят на колонку с сефадексом, колонку промывают 40% ацетоном, ацетон отгоняют, водный экстракт замораживают и лиофильно высушивают.
Выход агримониина - 2,5%.
1. Характеристика препарата. Агримониин представляет собой высокоактивный димерный полифенол, белый со слегка кремовым оттенком аморфный порошок, хорошо растворимый в воде, выделенный из травы манжетки, производящими являются виды: манжетка голостебельная - Alchemilla glabricaulis Lindb.fil., манжетка остролопастная - Alchemilla acutiloba Opiz., манжетка балтийская - Alchemilla baltica G. Sam. ex Juz., манжетка шерстистая - Alchemilla hirsuticaulis Lindb.fil., манжетка близкая - Alchemilla propinqua Lindb.fil., манжетка горная - Alchemilla monticola Opiz., манжетка семиугольная -Alchemilla heptagona Juz., манжетка изящная - Alchemila gracilis Opiz., манжетка городчатая - Alchemilla subcrenata Buser., манжетка сарматская - Alchemilla sarmatica Juz., манжетка полулунная - Alchemilla semilunaris Alech., манжетка волнистолистная - Alchemilla cymatophylla Juz., манжетка шаровидно-скрученная - Alchemilla conglobata Lindb.fil. (A.Juzepzukii Alech.) семейства розоцветные.
2. Предлагаемый способ позволяет получить выход агримониина 1,5-2,5%, в то время как известный способ - 0,57%. Заявленный способ позволяет исключить использование таких токсичных растворителей, как бутан-1-ол.