Способ полуколичественной оценки белка PDCD4 иммуногистохимическим методом
METHOD FOR SEMIQUANTITATIVE EVALUATION OF PDCD4 PROTEIN BY IMMUNOHISTOCHEMICAL METHOD

PDCD4 представляет собой клеточный белок, связанный с регуляцией активности eIF4F-зависимого белкового комплекса инициации трансляции, был впервые выделен как протеин, ассоциированный с клеточным циклом [S. Matsuhashi. Isolation of a novel gene from a human cell line with Pr-28 MAb which recognizes a nuclear antigen involved in the cell cycle. / Matsuhashi S., Yoshinaga H., Yatsuki H.et. al. // Res Commun Biochem Cell Mol Biol. -1997. - №1 - P. 109-120, H. Yoshinaga. Novel human PDCD4 (H731) gene expressed in proliferative cells is expressed in the small duct epithelial cells of the breast as revealed by an anti-H731 antibody. / Yoshinaga H., Matsuhashi S., Fujiyama C. et. al. // Pathol Int. - 1999. - №49 - P. 1067-1077.]. Увеличение количества белка ассоциировано с апоптозом [K. Shibahara. Isolation of a novel mouse gene MA-3 that is induced upon programmed cell death. / Shibahara K., Asano M., Ishida Y. et. al. // Gene. - 1995. - №166 - P. 297-301.] [M. Nakashima. Regulation of tumor suppressor PDCD4 by novel protein kinase С isoforms. / Nakashima M., Hamajima H., Xia J. et. al. // Biochim Biophys Acta. - 2010. - №1803 - P. 1020-1027.]. Белок PDCD4 в норме преимущественно расположен в ядре пролиферирующих клеток [L. Azzoni. Differential transcriptional regulation of CD161 and a novel gene, 197/15a, by IL-2, IL-15, and IL-12 in NK and T cells. / Azzoni L., Zatsepina O., Abebe B. et. al. // Journal of immunology. - 1998. - №161 - P. 3493-3500.]. Снижение продукции PDCD4 ассоциировано с опухолевой прогрессией и неблагоприятным прогнозом при раке легкого, колоректальном раке, раке молочной железы и раке желудка [S. Lee. Differential expression in normal-adenoma-carcinoma sequence suggests complex molecular carcinogenesis in colon. / Lee S., Bang S., Song K. et. al. // O ncol Rep. - 2006. - №16 - P. 747-754.] [Y.H. Wen. Alterations in the expression of PDCD4 in ductal carcinoma of the breast.. / Wen Y.H., Shi X., Chiriboga L. et. al. // Oncol Rep. - 2007. - №18 - P. 1387-1393.]. В клетках рака желудка кишечного типа как и в большинстве других опухолей, отмечается выраженное снижение уровня PDCD4, за счет, в большей степени, утраты ядерной фракции, при этом цитоплазменная метка может сохраняться, пропадая только при раздифференцировке опухоли [Н. Zhang. Involvement of programmed cell death 4 in transforming growth factor-β1-induced apoptosis in human hepatocellular carcinoma. / Zhang H., Ozaki I., Mizuta T. et. al. // Oncogene. - 2006. - №25 - P. 6101-6112.]. [G. Ma. Expression of programmed cell death 4 and its clinico-pathological significance in human pancreatic cancer.. / Ma G., Guo K.J., Zhang H. et. al. // Oncol Rep.- 2005. - №25 - P. 597-600.]. PDCD4 за счет своей основной функции - ингибирования активности белкового комплекса инициации трансляции eIF4F ведет к снижению трансляции белков (в том числе за счет специфического связывание с их мРНК в ядре клетки), играющих роль в молекулярных механизмах пролиферации и клеточного цикла, апоптоза, эпителиально-мезенхимального перехода и деградации межклеточного матрикса [Р.N. Vikhreva. Programmed cell death 4 mechanism of action: The model to be updated?. / Vikhreva P.N., Kalinichenko S.V., Korobko I. V. // Cell Cycle. - 2017. - №16 (19) - P. 1761-1764.]. Участие PDCD4 в молекулярных механизмах имеющих ключевое значение в канцерогенезе, делает оценку уровня синтеза в клетках этого белка важной для оценки риска развития и ранней диагностики рака желудка кишечного типа.
Особенно актуальна оценка уровня синтеза данного белка в гистологических срезах ткани биоптатов in situ с помощью иммуногистохимического метода, что позволяет избирательно оценить его уровень именно в эпителиальных клетках, увеличивая тем самым точность за счет возможности исключения из оценки стромальных клеток и клеток воспалительного ряда. Для иммуногистохимической оценки белка применяют различные подходы, основывающиеся на его детекции в ядре и цитоплазме. Прототипом предлагаемого способа оценки является методика предложенная Yu Н. и соавт. [Н. Yu. Helicobacter pylori promotes epithelial-mesenchymal transition in gastric cancer by downregulating programmed cell death protein 4 (PDCD4). / Yu H., Zeng J., Liang X. et. al. //. PLoS One. - 2014. - №9(8). - P. 105-116], при которой уровень PDCD4 вычисляется как произведение оценки процента позитивно окрашенных клеток и индекса интенсивности окраски клеток, при этом оценка позитивно окрашенных клеток подсчитывается в процентах и переводится в баллы соответственно шкале: <20% - 0 баллов; 20-40% - 1 балл; 40-60% - 2 балла; 60-80% - 3 балла; >80% - 4 балла, а индекс интенсивности окраски клеток распределяется слудующим оразом: 0 - отсутствие окраски; 1 - слабая; 2 - умеренная; 3 - выраженная окраска клеток. Однако такой подход обладает рядом недостатков:
1. Равный вклад ядерной и цитоплазматической метки в общий индекс, тогда как на основании молекулярно-биологических особенностей в аспекте риска опухолевой трансформации значительно большее значение имеет изменение ядерной экспресии PDCD4 [Y. Li. PDCD4 suppresses proliferation, migration and invasion of endometrial cells by inhibiting autophagy and NF-κB/MMP2/MMP9 signal pathway. / Li Y., Wang X., Wang X. et. al. //. Biol Reprod. - 2018. - №99(2). - P. 235-247, Y. Liu. Expression of tumor suppressor programmed cell death 4 in endometrioid endometrial carcinomas and clinicopathological significance. / Liu Y., Sun H., Mao H. et. al. //. Oncol Lett. - 2018. - №15(6). - P. 9369-9376]
2. Отсутствие раздельной оценки ядерной и цитоплазматической метки ввиду их частого несовпадения, а также различного уровня прогностической ценности (см. выше).
3. Отсутствие оценки интенсивности окраски ядер клеток.
Для преодоления недостатков существующих методов в серии наблюдений и экспериментов была разработан собственный способ полуколичественной оценки результатов иммуногистохимической окраски белка PDCD4 в тканях. Предлагаемый способ основывается на подсчете Индекса экспрессии PDCD4 в тканях, который рассчитывается путем суммации экспрессии в ядре (ЭЯ) и экспрессии в цитоплазме (ЭЦ), при этом экспрессия в ядре представляет собой произведение частоты окрашивания ядер (балла полуколичественной оценки распространенности положительно окрашенных ядер согласно таблице 1) и полуколичественной визуальной оценки интенсивности окрашивания ядер (отсутствие метки, отражающее отсутствие белка - 0 баллов, слабое/метка светло-коричневого цвета, отражающая низкое количество белка - 1 балл, умеренное/метка коричневого цвета, отражающая умеренное количество белка - 2 балла, выраженное/метка темно-коричневая, отражающая большое количество белка - 3 балла), а экспрессия в цитоплазме, представляет собой полуколичественную визуальную оценку интенсивности окрашивания цитоплазмы (отсутствие метки, отражающее отсутствие белка - 0 баллов, слабое/метка светло-коричневого цвета, отражающая низкое количество белка - 1 балл, умеренное/метка коричневого цвета, отражающая умеренное количество белка - 2 балла, выраженное/ метка темно-коричневая, отражающая большое количество белка - 3 балла).
Экспрессия PDCD4 рассчитывается по следующей формуле:
Индекс экспрессии PDCD4 = ЭЯ + ЭЦ, где
ЭЯ - экспрессия в ядре; ЭЯ = ЧОЯ × ИЯ
ЧОЯ - частота окрашивания ядер (отсутствие окрашенных ядер - 0 баллов, 1-30% положительно окрашенных ядер эпителиальных клеток - 1 балл, 31-70%) положительно окрашенных ядер - 2 балла, >70% положительно окрашенных ядер эпителиальных клеток - 3 балла;
ИЯ - полуколичественная визуальная оценка интенсивности окраски ядер (отсутствие метки, отражающее отсутствие белка - 0 баллов, слабое/метка светло-коричневого цвета, отражающая низкое количество белка - 1 балл, умеренное/метка коричневого цвета, отражающая умеренное количество белка - 2 балла, выраженное/ метка темно-коричневая, отражающая большое количество белка - 3 балла);
ЭЦ - экспрессия в цитоплазме, полуколичественная визуальная оценка интенсивности окраски цитоплазмы (отсутствие метки, отражающее отсутствие белка - 0 баллов, слабое/метка светло-коричневого цвета, отражающая низкое количество белка - 1 балл, умеренное/метка коричневого цвета, отражающая умеренное количество белка - 2 балла, выраженное/метка темно-коричневая, отражающая большое количество белка - 3 балла).
Полуколичественная оценка распространенности положительно окрашенных ядер эпителиальных клеток
Максимальное значение общего индекса составляет 12, минимальное - 0. При этом выделяется 4 группы:
0 - отрицательный результат;
1-4 - слабая окраска;
5-8 - умеренная окраска;
9-12 - выраженная окраска.
Оценка Индекса экспрессии PDCD4 на примере фрагмента слизистой оболочки антрального отдела желудка с гистологической картиной хронического гастрита (фигура 1). При оценке иммуногистохимической реакции мы выявили 80% положительно окрашенных ядер эпителиальных клеток, что, согласно таблице, соответствует 3 баллам частоты окрашивания ядер, при этом ядерная метка была темно-коричневого цвета -полуколичественная визуальная оценка интенсивности окраски ядер - 3 балла. Таким образом, экспрессия в ядре в данном случае составила 3×3=9. При этом цитоплазматическая метка была светло-коричневого цвета - экспрессия в цитоплазме составила й балла. В итоге, при сложении экспрессии в ядре и экспрессии в цитоплазме мы получили значение Индекса экспрессии PDCD4 равное 10 баллам.
Оценка Индекса экспрессии PDCD4 на примере фрагмента аденокарциномы желудка кишечного типа (фигура 2). При оценке иммуногистохимической реакции мы выявили 5% положительно окрашенных ядер опухолевых клеток, что, согласно таблице, соответствует 1 баллу частоты окрашивания ядер, при этом ядерная метка была светло-коричневого цвета - полуколичественная визуальная оценка интенсивности окраски ядер - 1 балл. Таким образом, экспрессия в ядрах в данном случае составила 1×1=1. При этом цитоплазматическая метка была светло-коричневого цвета - экспрессия в цитоплазме составила 1 балл. В итоге, при сложении экспрессии в ядрах и экспрессии в цитоплазме мы получили значение Индекса экспрессии PDCD4 равное 2 баллам.
Такой способ оценки уровня синтеза регуляторного белка PDCD4 в тканях позволяет придать большее значение изменению ядерной экспрессии PDCD4 в общем индексе и с большей точностью фиксировать изменение его количества в эпителиальных клетках, что позволит обнаруживать нарушение экспрессии PDCD4 на ранних этапах опухолевой трансформации клетки с большей чувствительностью и специфичностью.
При проведения пробной оценки общего индекса иммуногистохимической метки регуляторного белка PDCD4 в гистологических срезах ткани с использованием предлагаемого способа в 129 исследуемых образцах тканей слизистой оболочки желудка -при хроническом атрофическом гастрите (80 образцов) и ткани аденокарциномы желудка кишечного типа (49 образцов) были получены статистически значимые (р=0,00001) отличия значений общего индекса полуколичественной оценки белка PDCD4 в тканях исследуемых групп. При этом для группы аденокарцинома желудка кишечного типа была достигнута чувствительность 95% и специфичность 92%.