Клиническое применение хемилюминесцентного анализа

51. Morcos F. N.. Funke-Ferber J. Anxiety and depression in the Mother and father and their relationship to physical complications of pregnancy and labour // Emotional and reproduction: 5th Intern. Congr. ofpsy-chosomatic obstetrics a. gynaecology. - London: Acad. Press, 1979. - Vol.20A. - P.757-767.

52. Myers R. E. Maternal psychological stress and fetal asphyxia: a study in the monkey // Amer. J. Obstet. Gynecol. - 1975. - Vol.122, N.I. - P.47-59.

53. Otchet F., MS Carey, and L Adam. General health and psychological symptom status in pregnancy and the puerperium: what is normal? // Obstet Gynecol, December 1. - 1999. - Vol.94, N.6. - P.935-941.

54. Polland 1. Stress effects on pregnancy: foetal development and prolonged effects to subsequent litters of the same generation and into succeeding generations // Proc. 14th Ann. Conf. Ausrtal. Soc. Reprod. Biol. -Sidney, 1982. -P.6.

55. Shabanach E.II., Tricomi V., Suarez J.R. Stress and its influence on gestation // Obstet. and Gynecol. -1971. - Vol.37, N.4. - P.574-579.

56. Vaido Al, NV Shiryaeva, and VV Vshivtseva. Effect of prenatal stress on proliferative activity and chromosome aberrations in embryo brain in rats with different excitability of the nervous system // Bull Exp Biol Med, April 1. - 2000. - Vol.129, N.4. - P.380-2.

57. Vellay P. The action of conscious and unconscious stress on uterine contractions Tl Emotional and reproduction (5th Intern. Congr. of psychosomatic obstetrics a. gynecology). - London: Acad. Press, 1979. -Vol.20A. -P.909-910.

58. Vetsch E., Morcos F. Funke-Furbar J. The relationship between maternal anxiety (depression and maternal medication and the behaviour of the new-born) // Emotional and reproduction: 5th intern Congr. of psychosomatic obstetrics a. gynecology. - London, Acad, press., 1979. - Vol.20A. - P. 1 155-1 162.

© ВИННИК Ю.С., САВЧЕНКО А.А., ПЕРЬЯНОВА О.В., ТЕПЛЯКОВА О.В., ЖИМОВ С.В.,

ТЕПЛЯКОВ Е.Ю., МЕШКОВА О.С. -

КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА

/О.С. винн.ик. А. А. Савченко, О.В. ПерьАнова, О.В. Тетякова, С.В. Якимов,

Е./О. Тепляков, О.С. Мешкова.

Резюме. В обзоре представлены возможности современных методик хемилюминесценции в диагностике предпатологических состояний, прогнозировании тяжести течения заболевания, контроле безопасности и эффективности проведения окислительной терапии. Основными достоинствами хемилюминесцентного анализа являются простота, высокая чувствительность. Ключевые слова: хемилюминесценция, клиническое применение, научный обзор.

Явление хемилюминесценции - свечения, сопровождающего химические реакции, - все более широко используется в практических целях, поскольку позволяет создать ультрачувствительные и специфические методы анализа различных биологических субстратов. Хемилюминесценция (ХЛ) обусловлена, реакциями экзотермического типа и протекает, как правило, в три стадии [1,3,16]:

1. Восстановление одного из участников реакции (присоединение электрона) и окисление второго (отрыв электрона), что приводит к запасанию химической энергии в системе, которая позднее выделится в виде фотона.

2. Перенос электрона (окислительно-восстановительная реакция) на один из более высоких энергетических уровней и образование продукта реакции в электронно-возбужденном состоянии.

3. Высвечивание фотона при переходе молекулы из электронно-возбужденного в основное состояние (люминесценция). Обычно химические реакции, сопровождающиеся свечением, протекают через целый ряд промежуточных стадий, но основные этапы образования и испускания энергии сходны [4,23].

Хемилюминесцентный метод позволяет регистрировать короткоживущие свободные радикалы, которые можно разделить на четыре группы: а)

свободные радикалы (СР) активных форм кислорода, б) СР липидов, в) СР, осуществляющие ферментативное дыхание в митохондриях, г) СР естественных антиоксидантов [5,17,19].

Анализ кинетики, квантовых и энергетических характеристик ХЛ биологических объектов показал ее тесную взаимосвязь со свободнорадикальным окислением, протекающим неферментативно за счет биохимических процессов восстановления молекулярного кислорода с образованием его активных форм - супероксидного анионрадикала, синглетного кислорода и гидроксильного радикала [4,20]. Аутоокисление липидов, главным образом, ненасыщенных жирных кислот, приводит к генерации свободных радикалов, взаимодействующих с кислородом и образующих пероксиды, которые рекомбинируют, излучая кванты света. Эмиссия фотоной наблюдается при распаде промежуточных продуктов реакции с молекулярным кислородом (перекисей). Источниками хемилюминесценции при свободнорадикальном окислении могут быть возбужденные молекулы кетонов и димеров кислорода, циклические гидроперекиси при их разложении, оксалаты и альдегиды, биогенные амины [1,8].

Ингибиторами свободнорадикального окисления в организме являются природные антиокси-

данты, обладающие способностью в незначительных концентрациях вызывать обрыв цепи окисления и снижать уровень хемилюминесценции [23]. По своим физико-химическим свойствам они распределяются на антиоксиданты гидрофобной и гидрофильной фазы. К первой группе относятся токоферолы, флавины, каротиноиды, стероидные гормоны, а ко второй - сульфгидрильные соединения вН- группы белков, аскорбиновая кислота и некоторые другие [1,19].

В клинической практике ХЛ используют для измерения содержания АТФ, креатинкиназы, аде-нилатциклазы, фосфодиэстеразы, АТФ-азы, про-теолитических и других ферментов и их изоформ. Особенно расширились возможности ХЛ после разработки ее модификаций, основанных на им-мунолюминесцентном анализе [4,6,20]. По идеологии хемилюминесцентный иммунный анализ не отличается от радиоиммунного, с той только разницей, что вместо радиоактивно-меченных субстратов или антител используются субстраты и антитела, "меченные" соединением, которое вступает в реакции, сопровождающиеся ХЛ, в присутствии перекиси водорода и катализатора (обычно это фермент пероксидаза) [23].

Хемилюминесцентной меткой (ХЛ-меткой) чаще всего служат низкомолекулярные соединения, по химической структуре близкие люминолу и люцигенину, такие как изолюминол, сукцини-лированный люминол, эфиры акридиния и другие. Присоединение хемилюминесцентной метки производится либо к антигену, либо к антителу на этот антиген. В первом случае метод называется хемилюминесцентный иммунный анализ, во втором - иммуно-хемилюминометрический анализ [6]. Оба метода направлены на определение биологически важных низкомолекулярных соединений, например, гормонов в тех концентрациях (как правило, очень низких), в которых они встречаются в биологических объектах.

Другое важное направление клинического применения ХЛ - ее использование для оценки функциональной активности иммунокомпетент-ных клеток. Впервые ХЛ лейкоцитов при фагоцитозе была обнаружена в 1972 г. С этого времени ХЛ широко используется для исследования состояния лейкоцитов, нейтрофилов, моноцитов, эо-зинофилов и лимфоцитов [9,13]. Показано, что инкубация фагоцитирующих клеток с зимозаном, латексом или бактериями сопровождается усилением ХЛ, интенсивность которой отражает функциональное состояние клеток и динамику процесса фагоцитоза [7,10]. Уровень ХЛ при фагоцитозе характеризует интенсивность "респираторного взрыва" в клетках с продукцией активных форм кислорода, оказывающих бактерицидное действие. Механизм этого действия определяется деполяризацией мембранного потенциала при связывании рецепторов фагоцитов, повышением концентрации внутриклеточного кальция, изменением уровня кальмодулина с активацией фосфоли-паз и НАДФН-оксидаз. При этом метаболизм ара-хидоновой кислоты ускоряется, повышается про-

дукция простагландинов и лейкотриенов - регуляторов иммунного ответа, ингибирующих ХЛ в системе миелопероксидазы [13,23].

Следует отметить повышение ХЛ при фагоцитозе иммунных комплексов, инкубации с конка-навалином А и компонентами системы комплемента, что позволяет проводить быструю и точную количественную оценку бактерицидной способности клеток. При этом можно получить дополнительную информацию о состоянии рецепторного аппарата, ферментных систем и особенностей метаболизма фагоцитов [14].

ХЛ ответ при фагоцитозе характеризуется бимодальным распределением. Первый быстрый пик имеет небольшую амплитуду и длится 4-5 секунд. Второй подъем более медленный, отличается высокой амплитудой и достигает плато через 24 минуты. Бимодальность ХЛ ответа фагоцитирующих нейтрофилов связывают с выделением клетками люминолокисляющих факторов, попадающих в реакционную среду при контактном взаимодействии активирующего агента с мембраной клетки [22]. Второй пик обусловлен реакцией люминола с молекулами перекиси, хлорноватистой кислоты и других кислородсодержащих продуктов, проходящих через систему фагоцита.

Повышение спонтанной и инициированной ХЛ фагоцитов наблюдали у больных опухолями, бактериальной инфекцией, а снижение - при артритах, диабете, врожденном дефиците факторов системы комплемента. При инфекционных процессах повышение индуцированной ионами железа ХЛ фагоцитов коррелировало с увеличением содержания в мембранах конъюгированных диенов и свободных жирных кислот [17,21].

Помимо фагоцитирующих клеток, собственной слабой ХЛ обладают лимфоциты и тимоциты. Для регистрации свечения этих объектов используют различные инициаторы, митогены, антииммуноглобулины. Параметры свечения зависят от функционального состояния лимфоцитов и используются для оценки метаболической активности клеток и устойчивости их мембран к повреждению. В основе ХЛ лимфоцитов лежат механизмы, сходные с таковыми у фагоцитирующих клеток, но интенсивность свечения мононуклеаров значительно меньше, что связано с пониженной активностью ряда оксидаз и оксйгеназ. ХЛ можно использовать для изучения функционального состояния лимфоцитов, в частности ответа на митогены, поскольку уровень свечения изменяется на разных этапах активации клеток. Различие профилей ХЛ лимфоцитов и фагоцитов позволяет проводить исследование как цельной, так и фракционированной крови [7,9]. Показана возможность оценки терапевтического эффекта иммуномодуляторов по данным анализа ХЛ лимфоцитов до и после инкубации с этими препаратами.

Большое количество работ посвящено исследованию ХЛ сыворотки и плазмы крови больных с различными заболеваниями [3,5,8,11,12,15]. Показано повышение ХЛ сыворотки и плазмы крови при воспалительных процессах, ревматизме, яз-

венной болезни, на ранних стадиях атеросклероза, при развитии стрессовых ситуаций, при гиповитаминозе Е [11,12]. Усиление ХЛ при этих заболеваниях связывают с активацией СР окисления, снижением уровня антиоксидантов, накоплением кислородных радикалов и гидроперекисей липидов. При ряде заболеваний интенсивность свечения сыворотки и плазмы крови снижается. Так, при ишемии, гипоксии, злокачественных новообразованиях, хроническом бронхите, гипервитами-нозе Е и других наблюдается угнетение свечения сыворотки крови больного [17,19,20]. Снижение интенсивности ХЛ при этих патологических состояниях большинство исследователей объясняют нарушением проницаемости клеточных мембран и выходом в кровь низкомолекулярных пептидов, являющихся тушителями ХЛ. Снижают ХЛ содержащиеся в крови церулоплазмин, ионы переменной валентности и антиоксиданты.

Наряду с ХЛ крови обнаружено спонтанное и индуцированное сверхслабое свечение мочи человека, отражающее не только состояние почек, но и характер метаболических изменений в организме. По данным М. Асанова, А.И. Журавлевой, моча имеет определенный показатель сверхслабого свечения, соответствующий норме, что свидетельствует о наличии физиологического уровня перекисных радикальных реакций в организме здоровых людей [2]. При хронических заболеваниях, сопровождающихся гипоксией, наблюдаются метаболические изменения со снижением биоэнергетических реакций и повышением в моче количества недоокисленных продуктов, усиливающих ее ХЛ. Повышение уровня ХЛ мочи отмечено у больных пиелонефритом и гломерулонефритом, по-видимому, в результате накопления продуктов недоокисления при активации СР реакций [18]. Напротив, при заболеваниях, сопровождающихся нарушением концентрационной и выделительной функции почек, ХЛ мочи снижалась [2]. Угнетение свечения наступало до развития клинических признаков почечной недостаточности. Это явление может использоваться для ее раннего определения.

удаления среднемолекулярных пептидов, являющихся маркером эндогенной интоксикации, све-тосумма ХЛ плазмы увеличивается. Таким простым способом удается оценить эффективность и подобрать оптимальные режимы проведения де-токсикационной терапии [4,8]. Существующие способы, основанные на измерении концентрации некоторых веществ - мочевины, креатинина, мочевой кислоты - трудоемки, занимают много времени.

Традиционно для ХЛ анализа в клинике используют клеточные элементы (нейтрофилы, эо-зинофилы, лимфоциты, моноциты), плазму и сыворотку крови, а также мочу больного [17,19]. Созданные в последние годы высокочувствительные детекторы позволяют изучать слабое свечение не только в растворах или суспензиях клеток, но и на целых органах в составе организма [23]. Наиболее важные части комплекса регистрации излучения - это совершенно непроницаемый для света ящик, в который помещают лабораторное животное, и высокочувствительный приемник света - фотоумножитель, соединенный через усилитель и другие промежуточные устройства с самопишущим потенциометром или персональным компьютером. Аналогичную конструкцию используют для изучения свечения изолированных органов, например, перфузируемого легкого или сердца. При этом исследователь получает информацию о степени активации СР окисления в организме и состоянии антиоксидантной системы, содержании антигенов, гормонов, антител и метаболитов, функциональной активности клеток. Полученные результаты используются для дифференциальной диагностики острых и хронических воспалительных процессов, ишемических, гипокси-ческих и гипероксических состояний, для распознавания стадии заболевания, и степени активности патологического процесса, для контроля за эффективностью лечения.

Представленные данные свидетельствуют о перспективности широкого клинического применения ХЛ анализа для оценки состояния свободно-радикальных процессов в организме. Активное внедрение этого метода позволит ускорить и упростить иммунологическое обследование больных.

Хемилюминесцентный метод можно применять для оценки степени очищения организма при гемосорбции, гемофильтрации, других эфферентных способах детоксикации организма. По мере

THE CLINICAL ASPECTS OF APPLICATION OF BIOLUMINESCENCE METHODS IN MEDICINE

Y.S. Vinnik, A.A. Savchenko, O.V. Peryanova, O.V. Teplyakova, S.V. Yakimov, E.Yu. Teplyakov,

O.S. Meshkova

The possibilities of up date methods of chemiluminescent analysis in diagnosis of disease, prognosis of different pathologic conditions, control safety and efficacy of oxygen therapy are discussed. The main advantage of bioluminescence methods lies in its high sensitiveness and specificity along with its simplicity.

физическими факчорами // Свсрхслабыс свсчсния в медицине и сельском хозяйстве. - М.: Изд-во

Моск. yn-ia, 1974. - С.41-45.

3. Веселовский В. А. Хсмилюмимссцсмчмый меч од анализа в биологии // Спскчроскопичсскис меч оды исследования в физиологии и биохимии. - Л.: Наука, 1987. -С.34-37.

Литература

1. Архангельская Н.Н. Сверхслабая хсмилюмимсс-ценция модельных и биологических сисчсм // Изв. АН ЭССР. - 1982. - Т.31, №2. - С.65-78.

2. Асанов М.Н., Журавлева А.И. Хсмилюминссцсн-ция мочи здоровых и больных заболеваниями периферических сосудов и се изменения при лечении

4. Власенко II.Б., Гаврилова Е.М. Научные основы и перспективы применения в иммунохимических методах анализа хеми- и биолюминесцентных реакций // Журн. всесоюз. хим. о-ва им. Д.И. Менде-лееева. - 1989. - Т.34, .\»1. - С.24-29.

5.Гительзон И.И., Сандалова Т.П. Перспективы применения биолюминесцентных методов в медицине // Врачебное дело. - 1990. - .\»9. - С.31-34.

6. Гриневич Ю.А., Барабан В.А., Орел В.О. Хемилю-минесцентный метод в иммунологии // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1986. - .\»1. - С.91-97.

7. Дорохина II.А., Савченко А.А., Чесноков А.Б. Использование специфических антигенных препаратов в качестве индукторов дыхательного взрыва лейкоцитов крови при хемилюминесцентном анализе // Клин. лаб. диагностика. - 2001. - Ле 1. -С.39-43.

8. Журавлев А.К., ІІІерстнев М.И. Метод регистрации перекисной хемилюминесценции плазмы крови // Лаб. Дело. - 1985. - Леї0. - С.586-587.

9. Зенков II.К., Меньшикова Е.Б. Практические замечания по регистрации хемилюминесценции фагоцитирующих клеток // Бюлл. СО АМН СССР. -1990. - .\»2. - С.72-77.

10. Зурочка А.В., Долгушин П.П., Власов А.В., Ряби-нин В.Е. Изучение латексиндуцированной люми-нолзависимой хемилюминесценции нейтрофилов // Лаб. дело. - 1989. - ЛеЗ. - С.32-36.

11. Иванигакина Е.В., Подопригорова В.Г., Каневский А.С., Азизова О.А. Значение хемилюминес-центных тестов в оценке эффективности лечения язвенной болезни микроволновой резонансной терапией // Клин, медицина. - 2000. - .\»3. - С.39-41.

12. Маргулис Г.В., Журавлев А.И. Сверхслабое свече-

ние сыворотки крови человека при некоторых хронических заболеваниях // Сверхслабые свечения в медицине и сельском хозяйстве. - М.: Изд-во

Моск. ун-та, 1972. - С.27.

13. Маянский А П.. Певмятуллин А.Л., Чеботарь И.В. Реактивная хемилюминесценция в системе фагоци-

тоза // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1987. - .\»7. - С.109-115.

14. Павленко Р.А., Куденко Ю.А. Хемилюминесцент-ный метод определения окислительной активности нейтрофилов в процессе фагоцитоза // Лаб. дело. -1988. -Д» 1 . - С.35-37.

15. Регаетова II.В., Дидковский II.А., Литвиненко Е В. Хемилюминесцентный способ диагностики непереносимости лекарственных средств // Клин. лаб. диагностика. - 1997. - Х»5. - С.83-84.

16. Тарусов Б.П., Иванов И.И., Петрусевич Ю.М. Сверхслабое свечение биологических систем. - М.: Изд-во Моск. ун-та, 1967. - 70 с.

17. Угарова П.П., Боровко Л.Ю., Лебедева О.В., Березин И.В. Биолюминесцентные методы и реагенты для целей медицинской диагностики // Вестн. АМН СССР. - 1985. - .\»7. - С.1540-1558.

18. Фархутдинов P.P., Кантюков С.А., Ахмадеев Р.И. Хемилюминесценция мочи, индуцированная ионами двухвалентного железа // Лаб. дело. - 1986. -.\»5. - С.263-267.

19. Шестаков В.А., Шерстнев М.П. Применение био-хемилюминесценции в медицине (научный обзор) // Медицина и здравоохранение. Сер. хирургия. -1977. - Д»3 . -С.40-96.

20. Bochev В.G., Margisso M.J., Bochev P.O. et al. De-pedence of whole blood luminol chemiluminescence on PMNL and RBC count // J. Biochem. Biophys. Methods. - 1993. - Vol.27, N.4. - P.301-311.

21. De Sole P., Lippa S., Littaru G.P. Chemiluminescence of phagocytic cells // Acta med. Romane. - 1984. -Vol.22, N.2. - P.178-195.

22. Pauksens K., Sjolin J.,Venge P. Chemiluminescence of polymorphonuclear leukocytes and whole blood during acute bacterial infections // Scand. J. Infec. Dis. - 1989. - Vol.21. -P.277-284.

23. Vladimirov Yu.A., Sherstnev M P. Biophysical chemiluminescent analysis. Physicochemical Aspects of Medicine Rewiews. // Harwood Academic Publishers GMBH. - 1991. - Vol.2. -P.1-44.

© ИГНАТОВА И.А., СМИРНОВА С.В. -

НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ КЛАССИФИКАЦИИ АЛЛЕРГИЧЕСКОГО РИНИТА

И. А. Игнатова, С.В. Смирнова.

Резюме. При изучении патологии, в первую очередь, сталкиваешься с определением и классификацией заболевания. В настоящее время не существует универсального общепринятого определения ринита, которое охватывало бы все его известные формы. Отмечаются разногласия и в терминологии, и в классификации ринитов. В статье рассмотрены существующие на сегодняшний день различные классификации ринитов. Однако, эти классификации, либо очень громоздки, либо предельно упрощены и не всегда удобны в практическом применении. Представлено собственное видение этой проблемы - определение и классификация аллергической риносинусопатии, которые были апробированы на 11 Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2001).

Ключевые слова: аллергический ринит, научный обзор.

На основании стремительного роста распро- ческих заболеваний одно из ведущих мест зани-

страненности аллергопатологии (около 40% попу- мает аллергический ринит (аллергическая рино-

ляции страдает аллергией вообще и около 20% - синусопатия, АР). Распространённость АР колеб-

аллергическим ринитом, в частности), можно го- лется в значительных пределах и, вероятнее всего,

ворить об эпидемии аллергии, охватившей боль- зависит от экологических условий региона. Так, в

шинство стран мира [23,46]. В Структуре аллерги- Великобритании распространенность АР - от 16