АНТИОКОАГУЛЯНТНОЕ СРЕДСТВО НЕПРЯМОГО ДЕЙСТВИЯ НА ОСНОВЕ ДИУМАНКАЛА
ANTICOAGULANT AGENT OF INDIRECT ACTION ON BASIS OF DIUMANCAL

Изобретение относится к медицине и химико-фармацевтической промышленности, и касается нового непрямого антикоагулянта на основе известного соединения из производных кумарина, а именно, 7,7'-этилендиокси-2Н-1-дибензопиран-2,2'-диона (диуманкала), формулы 1,
которое обладает выраженным влиянием на систему свертывания крови и может найти применение в медицинской практике при лечении сердечнососудистых заболеваний.
Тромботические окклюзии артерий и вен являются основной причиной смерти и инвалидизации большинства больных сердечно-сосудистыми заболеваниями. Инфаркт миокарда, различные виды ишемического инсульта, тромбоз левого желудочка, искусственные клапаны сердца, венозные тромбо-эмболические осложнения (ВТЭО) - тромбоэмболия легочной артерии (ТЭЛА) и тромбоз глубоких вен (ТГВ) - вот далеко не полный перечень заболеваний требующих, с позиции медицины доказательств, длительной антитромботической терапии  Е.С. Исследование фармако-генетики варфарина и клопидогрела для оптимизации антитромботической терапии: пособие для врачей. - ООО М., "Издательская группа "Дуэт", 2015. 76 с.].
Антикоагулянты непрямого действия являются краеугольным камнем современной антитромботической терапии. Известно, что варфарин является одним из важных препаратов из производных кумарина (2Н-хромен-2-она, 2Н-1-бензопиран-2-она) и наиболее часто применяемым антикоагулянтом данной группы лекарственных препаратов. Варфарин, назначаемый для профилактики тромбоэмболических осложнений у больных с фибрилляцией предсердий (ФП), искусственными клапанами и пороками сердца, а также для длительного лечения пациентов, перенесших тромбоз глубоких вен или тромбоэмболию легочной артерии [Eikelboom J.W., Hirsh J, Spence F.A. r, et. al. Antiplatelet Drugs. Antithrombotic Therapy and Prevention of Thrombosis, 9th ed: American College of Chest Physicians Evidence-Based Clinical Practice Guidelines. CHEST 2012. 141 (2) (Suppl). e89S-e119S; Диагностика и лечение больных острым инфарктом миокарда с подъемом сегмента ST ЭКГ. Рекомендации ВНОК. Ред. Руда М.Я. // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2007. 6 (8). Приложение 1. С. 415-500].
Однако использование варфарина в медицинской практике ограничено ввиду его тяжелых побочных эффектов. Среди них нужно выделить возможность возникновения серьезных кровотечений [Ageno W., et.al. Oral anticoagulant therapy. Antithrombotic therapy and prevention of thrombosis, 9th ed: American college of chest physicians evidence-based clinical practice guidelines. CHEST 2008. 141 (2). e44s-e88s; Ansell J., Hirsh J., Hylek E., et. al. The pharmacology and management of the vitamin K antagonists, 8th ed: American college of chest physicians evidence-based clinical practice guidelines. CHEST 2008. 133 (6) (Suppl). 160s-198s].
Также известно, что многие синтетические производные кумарина обладают высокой биологической активностью, улучшенными фармако-кинетическими показателями и действуют как многофункциональные (мультитаргетные) агенты на различных уровнях регуляции организма [Karthik S. et al. Photoresponsive coumarin-tethered multifunctional magnetic nanoparticles for release of anticancer drug // ACS applied materials & interfaces. - 2013. Vol. 5. №. 11. P. 5232-5238; Xie S.S. et al. Design, synthesis and evaluation of novel tacrine-coumarin hybrids as multifunctional cholinesterase inhibitors against Alzheimer's disease // European journal of medicinal chemistry. 2013. Vol. 64. P. 540-553]. Диуманкал является одним из важных препаратов из производных кумарина и обладает широкой фармакологической активностью. Диуманкал также известен как антиаритмическое [Абышев А.З., Дьячук Г.И. Средство для лечения ишемической болезни сердца // Патент РФ №2155036, 27.08.2000; Абышев А.З., Агаев Э.М., Марищенко О.В. Способ получения таблеток диуманкала-forte по 0,01 г // Патент РФ №2187303, 20.08.2002; Абышев А.З., Агаев Э.М. Анкардин-retard - средство пролонгированного антикальциевого действия // Патент РФ №2219927, 27.12.2003] и транквилизирующее средсво [Абышев А.З., Агаев Э.М. Вещество, обладающее транквилизирующей активностью // Патент СССР №1836086, 23.08.1993]. Диуманкал еще в 1996 году одобрен Фармакологическим Государственным комитетом МЗСР РФ (протокол №10 от 27.06.96) и приказом Министра здавроохренения разрешен к применению в медицинской практике в виде таблиток по 0,01 г (думанкал-forte) для лечения ишемической болезни сердца у взрослых (приказ №202 от 14.07.97).
Ближайшими структурными аналогами заявляемого соединения являются 4-метил-7,7'-этилендиокси-2Н-1-дибензопиран-2,2'-дион (4-метил-анкардин) [Абышев А.З., Крауз В.А., Ивкин Д. Ю. Антиаритмическое средство на основе 4-метил-7,7'-этилендиокси-2Н-1-дибензопиран-2,2'-диона // Патент РФ №2427368, Бюл. №23, 28.08.2011] и 4,4'-диметил-7,7'-этилендиокси-2Н-1-дибензопиран-2,2'-дион (иммунокор) [Абышев А.З., Агаев Э.М. Производные 2Н-1-бензопиран-2-она, проявляющие антикальциевую активность // Патент РФ №2242471, Бюл. №, 20.12.2004], формулы 2 и 3, соответственно,
которые взяты за прототипы и, как нами показано, не обладают антикоагулянтной активностью.
В связи с изложенным, разработка новых непрямых антикоагулянтов, лишенных вышеперечисленных побочных действий варфарина, либо препаратов с минимизированными нежелательными лекарственными реакциями, обладающих выраженной антикоагулятной активностью, является весьма актуальной для практической медицины.
Задача изобретения - расширение арсенала фармакологического действия препарата диуманкала, в том числе как антикоагулянта непрямого действия, имеющего низкую токсичность и обладающего более выраженным влиянием на систему свертывания крови, чем препарат, применяющиеся в медицинской практике, а именно варфарин.
Указанная задача достигается созданием антикоагулянтного средства на основе 7,7'-этилендиокси-2Н-1-дибензопиран-2,2'-диона (диуманкала).
Изобретение иллюстрируется примерами синтеза, исследования острой токсичности и антикоагулянтной активности.
Пример 1. Методика синтеза 7,7'-этилендиокси-2Н-1-дибензопиран-2,2'-диона (1)
2
3
2
4
2
5,0 г (30,8 ммоль) умбеллиферон растворяют в 50 мл диметилформамида (ДМФА) в круглодонной колбе вместимостью 100 мл, снабженной магнитной мешалкой, добавляют 10,0 г (72,5 ммоль) KСО. Затем реакционную смесь нагревают при температуре 90-110°С в течение 2 часов. После растворения умбеллиферона добавляют по каплям 5,3 мл (61,6 ммоль) 1,2-дибромэтан (СНВr) и смесь продолжают нагревать при перемешивании еще 10 часов. Затем реакционную смесь охлаждают и вливают к 150 мл дисстилированной воды с льдом в стакане объемом 250 мл с работающей магнитной мешалкой. Осадок отфильтровывают и промывают 5 раза по 15 мл водой перекристаллизуют из диметилформамида. При этом получают 3,69 г (68,4%) белого кристаллического порошка заявляемого соединения с т.пл. 239-241°С.
Структура заявляемого соединения установлена современными методами: ТСХ, ИК-, ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии (см. фиг. 1-3).
f
ТСХ-система: бензол - этилацетат (3:1). ТСХ-пластинка: Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ (силикагель СТХ-1А, УФ-254 нм). Детекция пятен осуществлялась с помощью УФ лампы при длине волны 254 нм или 365 нм. Заявляемое соединение имеет R 0,36.
1
13
6
4
ИК-спектры регистрированы на спектрометре «ФС-М-1201» в дисках с КВг.Спектры ЯМР Н и С зарегистрированы на спектрометре «Bruker» Avance III 400 MHz (при рабочей частоте 400 МГц и 100 МГц, соответственно). В качестве растворителя использован: ДМСО-d; внутренний стандарт- тетраметилсилан (SiMe), 5-шкала порядка 0-15 м.д. и 0-250 м.д. Масс-спектры высокого разрешения записаны на масс-спектрометре ESI-TOF MX 5311, ионизация электрораспылением с прямым вводом образца (скорость потока 4 ил/мин).
-1
2
ИК спектр (KBr, ν, см): 3072-3084 (ср., СН), 2924,44 (сл., СН), 1734,22 (оч.с, С=0 α-пирона), 1614,62 (оч.с, СН=СН α-пирона), 1230,73-1126,57 (С(=0)-0), 1059,05-1001,18 (С-О) (см. фиг. 1).
1
6
2
Спектр ЯМР Н (ДМСО-d), δ, м. д. (J, Гц): 4.47 (с, 4Н, -СН-) 6.30 (д, J=9.54 Hz, 2Н, Н-3, Н-3') 7.00 (дд, J=8.53 Hz, J=2.26 Hz, 2H, H-6, Н-6') 7.06 (д, J=2.01 Hz, 2Н, Н-8, Н-8') 7.63 (д, J=8.53 Hz, 2Н, Н-5, Н-5') 7.99 (д, J=9.54 Hz, 2Н, Н-4, Н-4') (см. фиг. 2).
13
6
2
Спектр ЯМР С (ДМСО-d), δ, м. д.: 67,34 (-СН-), 101,83 (С-8, С-8'), 113,05 (С-6, С-6'), 113,15 (С-10, С-10'), 113,23 (С-3, С-3'), 130,02 (С-5, С-5'), 144,75 (С-4, С-4'), 155,82 (С-9, С-9'), 160,72 (С-7, С-7'), 161,83 (С-2, С-2') (см. фиг. 3).
+
20
15
6
ЭСИ-масс-спектр: Найдено, m/z: 351,075 [М+Н]. СНО. Вычислено, m/z: 351,078.
Приведенные выше результаты спектрального анализа согласуются с литературными данными [Абышев А.З., Агаев Э.М. Вещество, обладающее транквилирующей активностью // Патент СССР №1836086, 23.08.1993].
Таким образом, приведенные хроматографические и спектральные данные полностью согласуются со структурой заявляемого соединения.
Пример 2. Определение острой токсичности заявляемого соединения.
50
Определение острой токсичности (ЛД) проводят на белых беспородных мышах массой 18-20 г, разделенных на 4 группы по 3 животных в каждой, по экспресс-методу Прозоровского [Прозоровский В.Б. Экспресс-метод определения средней эффективной дозы и ее ошибки // Фармакол. и токсикол. 1978. №4. С. 497]. Исследуемые вещества вводят внутрибрюшинно в различных дозах от 300 до 2500 мг/кг и по таблице определяют острую токсичность.
Результаты эксперимента, приведенные в таблице 1, свидетельствуют о том, что заявляемое средство по классификации Hodge и Sterner [Hodge, Н.С. Sterner J.Н. Tabulation of toxicity classes // American Industrial Hygiene Association Journal. 1949. Vol. 10. P. 93-96] относится к 5-му классу токсичности и является практически нетоксичным соединением.
Пример 3. Испытание антикоагулянтной активности заявляемого соединения в тесте определения протромбинового времени у крыс.
Антикоагулянтную активность заявляемого соединения изучает на белых беспородных крыс массой 180-200 г. Животные получены из питомника РАН «Рапполово» (Ленинградская область), прошли необходимый карантин и содержались в стандартных условиях сертифицированного вивария на обычном пищевом рационе, со свободным доступом к воде.
Исследование выполнили в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986 г.и подтвержденной в Страсбурге 15.06.2006 г.) а также с Национальным стандартом РФ ГОСТ Р 53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики», приказом Минздрава России от 01.04.2016 г.. №199н «Об утверждении Правил лабораторной практики», согласно утвержденному письменному протоколу.
Животных разделяют на группы по 10 особей в каждой: 1 - контрольная - интактные животные, получавшие очищенную воду с добавлением твина-80, 2 - крысы, получавшие препарат сравнения варфарина в дозе 0,43 мг/кг, 3, 4, 5 - крысы, получавшие исследуемые вещества (диуманкал, соединение 2 и соединение 3), соответственно. Расчет доз исследуемых соединений осуществляют путем пересчета по молярной эквивалентности дозе субстанции варфарина. Исследуемые соединения и препарат сравнения (варфарин) вводят перорально, предварительно эмульгировав твином-80 в воде очищенной. Животные получают соответствующие вещества в течение 7 дней, после чего проводят запись ЭКГ во втором стандартном отведении и забор крови из десны с определением тромбоцитов и дальнейшим двукратным центрифугированием (1000 и 3000 об/мин) с целью получения плазмы и отделения форменных элементов. Состояние животных оценивают визуально, отслеживают летальность в ходе эксперимента. Для оценки антикоагулянтной активности исследуемых соединений используют готовые тест-системы к гемокоагулометру марки "Humaclot Duo Plus" (Human GmbH, Германия), оценивают общее состояние, ЭКГ и гистологические срезы внутренних органов животных. Статистическую обработку проводят с использованием t-критерия Сьюдента, результаты считают достоверными при р<0,05.
На основании данных, приведенных в таблице 2 видно, что протромбиновое время заявляемого соединения оказывается выше протромбинового времени препарата сравнения - варфарина и прототипов. Такая же тенденция сохраняется и при проверке активированного парциального тромбопластинового времени. Концентрацию фибриногена в плазме крови заявляемое соединение снижает эффективнее варфарина. Это позволяет предположить взаимосвязь антикоагуляционного эффекта с основным типовым механизмом действия исследуемых веществ. Таким образом, определение тромбинового времени позволяет расположить их по влиянию на конечный этап свертывания крови в следующем порядке: варфарин<заявляемое соеденение. Полученные данные полностью согласуются с результатами вычисления MHO (международное нормализованное отношение) или INR (см. табл. 2).
Экспериментальные данные достоверно свидетельствуют о том, что заявляемое соединение (диуманкал) обладает антикоагулянтной активностью.
Необходимо отметить тот факт, что применение заявляемого соединения было более безопасным, нежели варфарин. Сравнивая электрокардиограммы животных в начале и конце эксперимента, было замечено, что у крыс, получавших варфарин, существенно снижалось значение зубца R, тогда как у крыс других групп такого не наблюдалось. Кроме того, в группе животных, получавших варфарин в течении недели погибло 40% крыс, у остальных отмечалась повышенная кровоточивость десен, кровь шла из носа, прямой кишки, гистологическое исследование выявило массовые кровоизлияния в легких, печени, почках, сердце и желудке "варфариновых" крыс. В опытной группе кровоизлияний и кровотечений не выявлено (см. фиг. .4).
В фигуре 4 представлены гистологические срезы органов крыс. При этом изучаемые органы фиксируются в 10% нейтральном забуференном формалине в течение недели. После фиксации объекты заливают парафином. Полученные парафиновые блоки нарезают на ротационном микротоме толщиной 10 мкм. Срезы органов окрашивают гематоксилин-эозином. Исследование проводят с помощью объектива при увеличении 100-400 раз на 5 областях. В процессе анализа установлено, что в контрольных органах не наблюдается отека тканей, а при использовании варфарина наблюдаются многочисленные кровоизлияния на всех пяти областях. При использовании заявленного вещества количество выраженных отеков паренхимы тканей и кровоизлияний также не наблюдается.
Таким образом, заявляемое вещество 7,7'-этилендиокси-2Н-1-дибензо-пиран-2,2'-дион (субстанция диуманкала) (1) является практически нетоксичным соединением и обладает более высокой антикоагулянтной активностью, чем препарат сравнения варфарин. Безопасность применения заявляемого соединения подтверждена гистологическими исследованиями. Поэтому, выявленные свойства позволяют рекомендовать его для проведения клинических испытаний как нового относительно безопасного антикоагулянта непрямого действия для замены известного лекарственного препарата варфарина в клинической практике.