Эпителиально-мезенхимальный переход при прогрессии гепатокарцином

Н. Л. Лазаревич

ЭПИТЕЛИАЛЬНО-МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЙ ПЕРЕХОД ПРИ ПРОГРЕССИИ

ГЕПАТОКАРЦИНОМ

НИИ канцерогенеза ГУРОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва

Эпителиально-мезенхимальный переход, выражающийся в утрате эпителиальной морфологии, дедифференцировке и повышении двигательной способности клеток, является важным этапом прогрессии эпителиальных опухолей. Исследования последних лет показали, что существенную роль в этом процессе могут играть тканеспецифические механизмы регуляции экспрессии генов. На модели экспериментальной системы одноступенчатой прогрессии гепатокарцином мыши в обзоре рассмотрены морфологические изменения, происходящие при развитии злокачественного фенотипа опухолей печени, и показана ключевая роль ядерного рецептора Hnf4a в этом процессе.

Ключевые слова: эпителиально-мезенхимальный переход, прогрессия опухолей, гепатоцеллю-лярные карциномы, гепатоцитарные ядерные факторы, дифференцировка.

Epithelial-mesenchymal transition associated with the loss of epithelial morphology, dedifferentiation and acquisition of cell motility is the essential step of epithelial tumor progression. Investigations of the last few years revealed the involvement of tissue-specific mechanisms of transcriptional regulation in this process. In this review on the experimental model of one-step hepatocellular carcinoma progression we discuss morphological alterations, taking place during the development of invasive phenotype of liver tumors and the key role of nuclear receptor Hnf4a in this process.

Key words: epithelial-mesenchymal transition, tumor progression, hepatocellular carcinoma, hepatocellular nuclear factors, differentiation.

Список сокращений, используемых в тексте

БГК — быстрорастущая гепатокарцинома

ВКМ — внеклеточный матрикс

ГК — гепатоцеллюлярная карцинома

мгк — медленнорастущая гепатокарцинома

ЭМП — эпителиально-мезенхимальный переход

Сх — коннексин

EGF — эпидермальный фактор роста

FGF — фактор роста фибробластов

HGF/SF — фактор роста гепатоцитов

HNF — гепатоцитарный ядерный фактор

IGF — инсулиноподобный ростовой фактор

TGFß — трансформирующий фактор роста |3

© Лазаревич H. JI., 2003

УДК 616.36-006.6-091.8:616-092.4/.90

ЭМП был впервые описан в конце XIX в. биологами как морфологическая перестройка, происходящая в определенных участках эмбрионального эпителия и приводящая к появлению отдельных мигрирующих клеток. Образующиеся мезенхимные клетки обладают повышенной подвижностью и инвазивностыо, что позволяет им покинуть локальное микроокружение, переместиться в новые условия и дать начало другим типам клеток. ЭМП — один из фундаментальных процессов раннего онтогенеза большинства многоклеточных организмов, определяющий некоторые ключевые стадии обособления и формирования эмбриональных тканей [27; 31]. Значительно позже была показана способность некоторых культур нормальных или трансформированных эпителиальных клеток превращаться в фибробластоподобные при изменении специфических условий культивирования, прежде всего под действием ряда ростовых факторов. В частности, в серии блестящих работ Ю. М. Васильева и его сотрудников были заложены основы представлений о динамике и закономерностях реорганизации цитоскелета, определяющих изменения формы клеток, характерных для ЭМП.

Позже было установлено, что ЭМП играет важную роль в прогрессии эпителиальных опухолей, карцином, в сторону дедифференцированного и более злокачественного фенотипа

in vivo. Межклеточные контакты и взаимодействие клеток с Матриксом являются важным фактором поддержания структуры и гомеостаза эпителиальных структур взрослого организма [1]. Разрушение межклеточных связей и повышение подвижности клеток, происходящие на поздних стадиях канцерогенеза, позволяют опухолевым клеткам метастазиро-вать — выходить за пределы первичной опухоли и заселять новые пространства.

Несмотря на огромное различие (нельзя забывать, что в ходе эмбриогенеза ЭМП индуцируется физиологическими механизмами, а в опухолевых клетках отражает накопление генетических изменений), процессы ЭМП в раннем развитии и при канцерогенезе определяются схожими, если не идентичными, эффекторными механизмами, контролирующими перестройки цитоскелета и адгезионных систем [27; 31].

ЭМП индуцируется сигналами, поступающими извне клетки, это прежде всего растворимые ростовые факторы (EGF, HGF/SF, представители семейств FGF, IGF и TGFp) и компоненты матрикса (фибронектин, ламинин-5, коллаген). Сигналы ростовых факторов интегрируются на мембране клетки за счет взаимодействия со специфическими рецепторами, которые содержат внутриклеточный киназный домен, активирующийся при связывании лиганда. После фосфори-лирования этот домен взаимодействует с S Н2-содержащими белками, что приводит к активации малых ГТФ-связываю-щих белков Ras, Rho и Rae. Ras активирует MAP-киназный и Р13-киназный каскады, которые, вероятно, определяют специфичность ЭМП [27]. Еще одним возможным механизмом передачи сигнала для ЭМП является Src-зависимый сигнальный путь, определяющий фосфорилирование белков, связанных с цитоскелетом [8].

Основными критериями ЭМП in vitro являются утрата эпителиальной полярности, разделение на отдельные клетки и дисперсия при приобретении клеточной подвижности. При этом происходит разрушение плотных контактов, адгезионных контактов и десмосом и реорганизация комплексов, обеспечивающих прикрепление клетки к субстрату. Утрата полярности клеток ведет к изменению цитоскелета, одним из маркеров ЭМП является переход от цитокератиновых промежуточных филаментов к виментиновым. ЭМП сопровождается изменением профилей транскрипции генов, в том числе компонентов цитоскелета и В КМ. В фибробластоидных клетках обычно повышается синтез фибронектина и некоторых типов коллагена, а также протеолитических ферментов, участвующих в деградации ВКМ. В каждом отдельном случае ЭМП не обязательно включает в себя все перечисленные признаки, однако общее направление — обособление и приобретение подвижности — остается неизменным [27].

Одним из наиболее общих механизмов ЭМП, описанным для большинства типов эпителиальных клеток, является подавление экспрессии Е-кадхерина. Этот трансмембранный гликопротеин — один из ключевых кадхеринов, обеспечивающий гомотипическую адгезию в эпителиальных тканях. Его внутриклеточный домен связывается с рядом белков, прежде всего с ß-катенином, который в свою очередь взаимодействует с актиновыми микрофиламентами. Снижение уровня Е-кад-херина описано для многих типов карцином и является неблагоприятным прогностическим фактором. Оно происходит

преимущественно на транскрипционном уровне и может быть связано с гиперметилированием промотора или активацией репрессорных факторов, мутации или хромосомные делеции встречаются несколько реже [31]. Наиболее важными репрес-сорами Е-кадхерина являются родственные факторы Snail и Slug, в регуляцию экспрессии которых при ЭМП вовлечены различные сигнальные каскады (TGFp, FGF и Wnt) [10; 25].

Снижение уровня Е-кадхерина может приводить к освобождению Р-катенина из зоны контакта, его стабилизации и транслокации в ядро, где он активирует транскрипцию целого ряда генов, вовлеченных в контроль клеточной пролиферации и адгезии (с-шус, c-jun, гены, кодирующие циклин D1, матриксные металлопротеазы и фибронектин) [9]. Однако гиперэкспрессия р-катенина сама по себе не приводит к ЭМП, по-видимому, ключевым событием в этом случае является снижение уровня Е-кадхерина [31].

В то время как нарушение межклеточных контактов является ранним событием ЭМП, оно само по себе недостаточно для приобретения клетками подвижности и способности проникать в новое для них микроокружение [10]. Важная роль в этих событиях отводится интегринам, определяющим взаимодействие клеток с ВКМ, и протеазам, осуществляющим перестройку или деградацию компонентов ВКМ. Изменение соотношения разных интегриновых субъединиц в клетке и их аффинности может не только сообщать клетке новую субстратную специфичность, но и модулировать активность протеолитических ферментов, контролировать организацию цитоскелета и влиять на выживаемость клеток [19].

Классической моделью изучения ЭМП в опухолевых клетках являются карциномы молочной железы, почки и кишечника. Существенно меньше известно о механизмах, определяющих ЭМП в других типах эпителиальных клеток, в частности в основных клетках печени — гепатоцитах. Причина этого заключается прежде всего в сложности подбора адекватной экспериментальной системы для таких исследований. Чаще всего модельными системами ЭМП служат культуры гепатомных линий, пережившие значительное количество пассажей in vitro, или первичных гепатоцитов, лишенных нормального микроокружения. Разрушение ВКМ, играющего определяющую роль в поддержании архитектуры печени, вызывает немедленную дедифференциров-ку печени, искажая морфологические и функциональные свойства гепатоцитов [16]. Эта трансформация обратима при восстановлении трехмерной структуры ВКМ [17].

Создание новой экспериментальной модели одноступенчатой прогрессии ГК мышей in vivo позволило нам исследовать некоторые механизмы ЭМП при развитии злокачественного фенотипа опухолей печени.

Модель одноступенчатой прогрессии ГК мыши

В этой работе нами была использована коллекция перевиваемых ГК мышей, полученная О. В. Морозовой (лаборатория канцерогенных веществ НИИ канцерогенеза РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН) по стандартной методике химического гепатоканцерогенеза: инициация (диэтилнитрозамин) — промоция (фенобарбитал). При подкожной перевивке одна из дифференцированных МГК на третьем пассаже в одном из животных резко увеличила скорость роста, дав начало

дедифференцированной БГК [6]. В то время как для МГК интервал между пассажами in vivo составлял 5—7 мес, БГК требовала перевивки каждые 2 нед. Мы рассчитывали, что сравнение биологических свойств и спектров экспрессии генов МГК и одномоментно вьпцепившегося из нее инвазивного высокозлокачественного варианта БГК позволит идентифицировать генетические пути, определяющие основные свойства прогрессии опухолей печени. По гистологической характеристике МГК — дифференцированная, частично трабекулярная, частично солидная опухоль, состоящая из крупных, в основном октаплоидных клеток. БГК — низкодифференцированная мелкоклеточная анапластическая опухоль, потерявшая балочную структуру, состоящая в основном из беспорядочно расположенных преимущественно диплоидных клеток [6].

Из-за слабой связи клеток БГК друг с другом (см. ниже) при легком механическом диспергировании из нее была получена суспензия клеток, способных расти in vitro. Полученная культура БГК состоит в основном из одиночных распластанных клеток веретеновидной формы, а также шаровидных клеток, организованных в многоклеточные сфероиды, которые легко отрываются от подложки и растут в суспензии, и гигантских многоядерных полиплоидных клеток. Культуру клеток МГК, чрезвычайно прочно связанных друг с другом и с матриксом, получить не удалось [3].

Утрата эпителиальной морфологии при прогрессии ГК

МГК имеет типичную для ее дольчатой структуры базальную мембрану, состоящую из коллагенов I и IV типов, ламинита, энтактина и фибронектина [3]. В МГК все клетки взаимодействуют с ВКМ. В БГК синтезируются те же компоненты матрикса, но клеточная адгезия значительно нарушена. В отличие от МГК, большая часть клеток не образует контактов с матриксом. Белок плотных контактов ZO-1 локализуется на мембране клеток МГК, но не БГК. Этот факт наряду с перераспределением домен-специфических маркеров свидетельствует об утрате полярности в БГК [6]. Сходные закономерности отмечены и в распределении Е-кадхерина — в МГК он выявляется сплошной линией на всем базолатеральном домене плазматической мембраны, а в БГК — антитела к Е-кадхе-рину слабо окрашивают цитоплазму, однако на мембране клеток этот белок не выявляется [3]. Таким образом, морфологические изменения, произошедшие при прогрессии от МГК к БГК, — утрата клеточной полярности, ослабление межклеточных контактов и связи с ВКМ — могут быть отнесены к ЭМП. Эти явления сопровождаются изменениями в экспрессии некоторых генов, кодирующих компоненты межклеточных контактов и адгезионные молекулы.

Мы установили, что в ходе прогрессии в БГК произошла активация транскрипции гена аЗ-субъединицы интегрина [2]. В печени эта субъединица экспрессируется в основном в незрелых и трансформированных гепатоцитах, а также в холан-гиоцитах, и в комплексе с (31 связывается преимущественно с ламинином и коллагеном. Вероятно, рецептор oc3(31 необходим на ранних этапах развития и определяет дифференциро-вочный ответ клеток на ВКМ [22].

Примечательно, что в МГК, характеризующейся усилением межклеточных и матриксных контактов, наблюдается

гиперэкспрессия генов Е-кадхерина и |3-катенина по сравнению с нормальной печенью. В БГК произошло значительное подавление экспрессии основного компонента щелевых контактов печени Сх32 и Е-кадхерина. Уровень экспрессии партнера Е-кадхерина по контакту |3-катенина в МГК и БГК не изменился, однако произошел переход от мембранной локализации Р-катенина в МГК к цитоплазматической в БГК. Значительное подавление уровня Е-кадхерина в БГК наблюдалось параллельно со значительным повышением уровня экспрессии гена Snail, кодирующего один из ключевых регуляторов ЭМП в некоторых типах клеток и способного репрессировать промотор Е-кадхерина [10].

Одновременно с утратой эпителиальных признаков при прогрессии в БГК произошло координированное подавление экспрессии целого ряда гепатоспецифических генов, соответствующее типичному для карцином антигенному упрощению опухолей [7]. В то же время дедифференцированный вариант несет отпечаток гепатоцитарного происхождения, сохраняя экспрессию ряда генов, специфичных для печени (трансферрин и некоторые аполипопротеины). Поскольку описываемая прогрессия ГК произошла очень быстро, мы предположили, что она может быть следствием нарушения работы одного или немногих мастер-генов, определяющих дифференцировку гепатоцитов. Наиболее вероятными кандидатами на роль таких ключевых регуляторов представляются транскрипционные факторы.

Гепатоспецифическая экспрессия генов и дифференциро-вочный статус печеночных клеток контролируются в основном комбинаторным действием пяти семейств транскрипционных факторов: Hnfl, HnO, Hnf4, C/ebpa и Hnf6 [4]. Эти факторы образуют регуляторную сеть, обеспечивающую четкую координацию различных печеночных функций на уровне экспрессии генов. Регуляционная иерархия между гепато-цитарными ядерными факторами крайне сложна и пока полностью не выяснена. Основная часть данных о взаимной регуляции гепатоцитарных ядерных факторов получена в исследованиях на нокаутных мышах и не всегда отражает ситуацию во взрослой печени. Мы установили, что при прогрессии от МГК к БГК произошло координированное изменение уровней экспрессии целого блока транскрипционных факторов, влияющих на установление и поддержание гепатоцитарного фенотипа: Hnf4a, Hnfl, vHnfl, Hnf3y, Hnf6, C/ebpa, Ftf. Таким образом, наблюдавшаяся одноступенчатая прогрессия связана с нарушением контроля дифференцировки, который | был вызван утратой гепатоцитарных факторов транскрипции с взаимосвязанной регуляцией [2].

Мы предположили, что причиной по крайней мере некоторых фенотипических изменений, произошедших в ходе прогрессии, могло стать нарушение нормальной функции ядерного рецептора Hnf4a [28], являющегося важным регулятором морфогенеза [12; 26] и дифференцировки [21] эмбриональной печени. Инактивация Hnf4a приводит к смерти гомозиготных мышиных эмбрионов на 11-й день развития за счет аномальной гаструляции, связанной с нарушением развития висцеральной энтодермы [12]. В дедифференциро-ванных гепатомных клеточных линиях утрата гепатоцитарного фенотипа обычно сопровождается падением транскрипции Hnf4a, а его реэкспрессия ведет к частичному

восстановлению эпителиальной морфологии [30]. Hnf4a — единственный из гепатоцитарных ядерных факторов, для которого in vitro показана морфогенная активность. Трансфекция вектора, экспрессирующего Hnf4a в культуру клеток БГК, привела к значительным изменениям клеточной морфологии. Примерно после месяца культивирования клетки стали образовывать эпителиальные островки с плотными контактами, маркируемыми окраской антителами к ZO-1 [2].

Ранее было показано, что морфогенный эффект Hnf4a в дедифференцированной крысиной гепатоме Н5 скорее всего опосредован восстановлением уровня транскрипции Е-кад-херина [30]. В нашем случае прогрессия от МГК к БГК также сопровождалась снижением транскрипции Е-кадхерина, хотя определенное количество этого белка продолжало выявляться в цитоплазме дедифференцированных клеток. Реэкспрессия Hnf4a в культуре БГК не оказывает сколько-нибудь существенного влияния ни на уровень мРНК, ни на цитоплазматическую локализацию Е-кадхерина. Вероятно, восстановление эпителиальной морфологии в культуре БГК происходит при участии других белков семейства кадхери-нов. Ни при культивировании, ни при клонировании исходной культуры или контрольных клонов островки с эпителиальной морфологией не возникали.

Восстановление эпителиального фенотипа при реэкспрессии Hnf4a сопровождалось нормализацией контактов клеток с ВКМ. В эпителиальных островках НпГ4а-трансфицирован-ных клонов восстанавливалась характерная для культур эпителиальных клеток локализация компонентов матрикса. Фибриллы энтактина, фибронектина, ламинина и коллагена IV типа были расположены вдоль межклеточных контактов. Таким образом, клетки, экспрессирующие Hnf4a, образовывали более сформированную базальную мембрану, чем клетки исходной культуры. Кроме того, реэкспрессия Hnf4a в культуре клеток БГК вызвала индукцию ряда гепатоспецифичес-ких генов, в том числе транскрипционных факторов, метаболических ферментов и молекул межклеточной адгезии.

В отличие от исследований других авторов [30], в нашем случае экспрессии Hnf4a было достаточно для установления полярности клеток без каких-либо дополнительных воздействий. Это означает, что анализ индуцированных Hnf4a изменений в экспрессии генов может привести к идентификации прямых регуляторных связей между гепатоспецифическими регуляторами транскрипции и сигнальными каскадами, ответственными за поддержание эпителиальной морфологии. Один из таких механизмов может быть связан с наблюдавшейся нами НпГ4а-зависимой активацией транскрипции важнейшего компонента щелевых контактов печени Сх32. Действительно, в то время как разрушение щелевых контактов и подавление экспрессии коннексинов неоднократно отмечались среди маркеров гепатоканцерогенеза [33], соответствующие гены крайне редко мутированы в человеческих опухолях. Скорее всего, регистрируемое в ГК подавление экспрессии Сх32 может отражать потерю функциональной активности Hnf4a или его мишени Hnfl, опосредующего активацию промотора Сх32, в опухолях печени.

Итак, реэкспрессия Hnf4a в культуре клеток БГК вызывает сдвиг в сторону эпителиальной морфологии, сопровождающийся восстановлением межклеточных контактов и контактов

клеток с матриксом, и восстановление экспрессии некоторых печеночных генов. Эти наблюдения прямо указывают на возможность частичной реверсии опухолевого фенотипа ГК при реэкспрессии Hnf4a.

Общий характер выявленных закономерностей подтвердился при исследовании коллекции независимо индуцированных диэтилнитрозамином и фенобарбиталом перевиваемых ГК мышей, проведенном совместно с В. С. Турусовым и О. В. Морозовой [5]. Нами было отобрано 12 опухолей, 5 из которых были классифицированы как медленнорастущие высокодифференцированные ГК и 7 как быстрорастущие низкодифференцированные ГК. Степень дифференцировки определялась следующими факторами: сохранилась ли в опухоли хотя бы частично балочная структура печени; состоит ли опухоль из клеток эпителиального типа; одинаковы ли клетки по размеру и плоидности; каков пролиферативный статус опухолевых клеток; имеются ли очаги некрозов; врастают ли в опухоль тяжи соединительной ткани. Гистологическая классификация была подтверждена определением уровня экспрессии гена сывороточного альбумина, основного маркера дифференцированных гепатоцитов.

Анализ уровней экспрессии в образцах ГК показал, что Hnf4a экспрессируется только в печени и во всех высокодифференцированных опухолях, т. е. уровень дифференцировки ГК четко коррелирует с уровнем экспрессии гена Hnf4a. Аналогичные закономерности экспрессии выявлены для ряда транскрипционных факторов, являющихся прямыми или опосредованными мишенями Hnf4a.

Важно отметить, что большинство исследованных генов, являющихся возможными эффекторами ЭМП (Сх32, Snail, интегрин аЗ и Е-кадхерин), попали в группу последовательностей, транскрипция которых нестрого связана с диф-ференцировочным статусом ГК (не более 3 несовпадений в 12 образцах). Е-кадхерин экспрессируется в 3 наиболее дифференцированных опухолях, а также в 1 дедифференцированной опухоли, гистологический анализ которой свидетельствует о тесном взаимодействии между клетками. Примечательно, что ген Snail, кодирующий важный эффектор ЭМП и репрессор Е-кадхерина, активен в тех опухолях, где транскрипция Е-кадхерина подавлена. По-видимому, гены этой группы могут быть вовлечены в развитие злокачественного фенотипа ГК, но не являются определяющими для этого процесса, а регуляция их экспрессии напрямую не связана с активностью Hnf4a.

В группу генов, экспрессирующихся независимо от Hnf4a и не связанных с прогрессией ГК, попали с-тус и ген, кодирующий р-катенин. Их гиперэкспрессия является ранним событием гепатоканцерогенеза и не является непосредственной причиной ЭМП. Итак, данные, полученные при анализе ГК мышей независимого происхождения, указывают на существование связи между дифференцировочным статусом опухоли, ее морфологическими характеристиками, скоростью роста и спектром экспрессии тканеспецифических регуляторов транскрипции. В совокупности с полученными ранее результатами эти данные указывают на важную роль ядерного рецептора Hnf4a в прогрессии опухолей печени.

Недавние исследования на мышиных эмбрионах, дефектных по экспрессии Hnf4a в эмбриональной печени, показали,

что этот фактор абсолютно необходим для формирования печеночного эпителия в ходе раннего развития [26]. Более того, было установлено, что экзогенная экспрессия НпГ4а в культуре мышиных фибробластов N111ЗТЗ может индуцировать мезенхимально-эпителиальный переход, характеризующийся приобретением клетками полигональной формы и мембранной локализацией ЪО-1 и Е-кадхерина. Другая группа исследователей показала, что экспрессия Нп£4а в клетках эмбриональной карциномы ¥9 инициирует их диф-ференцировку [11]. Образование поляризованных эпителиальных клеток в этом случае сопровождается активацией экспрессии белков плотных контактов (окклюдин, клаудины 6 и 7) и усилением мембранной локализации 20-1, Е-кадхе-рина и |3-катенина. Все эти данные подтверждают ключевую роль НпГ4сх в установлении эпителиальной морфологии и указывают на то, что снижение экспрессии этого фактора стало критическим событием прогрессии ГК, по крайней мере частично определившим дедифференцировку и ЭМП в быстрорастущей опухоли.

В то же время с помощью трансфекционного анализа мы установили, что регуляторный район Н1#1а в культуре клеток БГК неактивен. Это значит, что репрессия Нп£4а в БГК определяется на транскрипционном уровне, а не связана с мутацией, перестройкой или другим повреждением промотора или кодирующей части гена НгиГ4а. Выявление фрагмента регуляторного района, определяющего негативную регуляцию его активности, позволяет предположить, что подавление транскрипции Нп£4а могло стать следствием активации пока не идентифицированного репрессора этого гена.

Анализ спектров экспрессии генов в ГК мышей методом гибридизации с кДНК-микрочипами

Для поиска генов, задействованных в прогрессии ГК и подавлении экспрессии гена Нп1!4а, в сотрудничестве с исследователями Медицинского колледжа им. А. Эйнштейна (Нью-Йорк, США) мы провели сравнение профилей уровней экспрессии генов в МГКи БГК методом гибридизации с кДНК-микрочипами [20]. При гибридизации образцов МГК и БГК с кДНК-микрочипами на 9000 генов мыши было выявлено 380 генов, экспрессия которых при прогрессии снижается более чем в 2 раза, в том числе 110 генов более чем с 5-кратным уровнем репрессии. Более половины наиболее значительно репрессированных генов кодирует сывороточные белки, синтезируемые в печени, существенную часть из них составляют ингибиторы протеиназ. Возможно, именно активация протеиназ в отсутствие их ингибиторов могла привести к нарушению морфологии и повышению инвазив-ности быстрорастущей опухоли.

Одновременно было установлено, что при прогрессии ГК существенно повышается экспрессия 250 генов, причем 30 из них — более чем в 4 раза. Они кодируют транскрипционные факторы, белки, участвующие в передаче сигнала или контролирующие пролиферацию, метаболические ферменты, транспортные и адгезионные молекулы. Существенная часть генов с максимальным уровнем активации оказались ТОР|3-индуцируемыми, что указывает на вовлеченность сигнального пути, регулируемого факторами этого семейства, в прогрессию опухолей печени. Несколько последовательностей

из этого списка в геноме человека картированы в хромосомных локусах, чаще всего амплифицированных в ГК, в которых предполагается наличие неидентифицированных пока онкогенов. Один из них — упоминавшийся ранее ген аЗ-субъединицы интегрина. Как уже отмечалось, интегри-нам отводится важная роль в интеграции внутри- и внеклеточных сигнальных путей, определяющих пролиферацию, морфогенез и дифференцировку клеток. Экспрессия аЗ-субъединицы интегрина характерна для дедифференциро-ванных гепатоцитов, а ее субстратная специфичность направлена преимущественно на взаимодействие с деградированными компонентами ВКМ, которые могут образовываться благодаря описанной выше инактивации ингибиторов протеиназ. Экспрессия аЗ-субъединицы интегрина в гепатомных клетках может быть индуцирована TGFp и сопровождается развитием инвазивного фенотипа [15].

Цитокины семейства TGFp играют исключительно важную роль регуляции пролиферации, апоптоза и морфогенеза эпителиальных клеток [23]. Благодаря работам последних лет стала очевидна значимость этого пути передачи сигнала в контроле дифференцировочного статуса гепатоцитов.

На первый взгляд роль TGF|3 в развитии и канцерогенезе опухолей печени достаточно противоречива. С одной сторо- j ны, TGFp блокирует пролиферацию, подавляет трансформацию и индуцирует апоптоз гепатоцитов [14]. Вероятно, именно этот фактор определяет своевременную остановку деления гепатоцитов при регенерации печени [24], нарушение этого | сигнального пути нарушает регуляцию клеточной смерти при развитии ГК. С другой стороны, в человеческих ГК синтез и секреция TGFp существенно повышены, трансформированные клетки нередко приобретают устойчивость к этому фактору, а конститутивная экспрессия TGFp в печени ускоряет ге-патоканцерогенез у трансгенных мышей [13]. Недавно было показано, что TGFp индуцирует ЭМП в Ha-Ras-трансформи-рованных гепатоцитах [18]. Этот переход сопровождается утратой полярности, разрушением межклеточных контактов, дедифференцировкой и повышением инвазивности при росте in vivo. Важно отметить, что развитие инвазивного фенотипа сопровождается секрецией в среду значительных количеств TGFp, что обеспечивает аутокринную регуляцию сигнала.

Сходные результаты получены при изучении влияния TGFp на рост и дифференцировку эмбриональных гепатоцитов крысы в культуре [32]. В то время как основная часть эмбриональных гепатоцитов при воздействии TGFp погибает, выжившие клетки претерпевают ЭМП и приобретают устойчивость к TGFp. Эти события сопровождаются подавлением экспрессии ряда дифференцировочных маркеров, снижением уровней Hnf4a и Hnfl, индукцией транскрипции фибро-нектина и транскрипционного регулятора Snail.

Показана также способность TGFp блокировать дифференцировку c-met иммортализованных мышиных гепатоцитов в культуре от фибробластоподобных к эпителиальным клеткам [29]. Этот фактор стабилизирует фибробластоподоб-ный фенотип гепатоцитов в культуре параллельно с репрессией Hnf4 и Hnfl и активацией транскрипции гена Snail.

Нетрудно заметить значительное сходство изменений, выявленных нами при исследовании прогрессии ГК, с описанными выше последствиями активации'TGFp сигнального

пути в других экспериментальных системах. Наши предварительные результаты (Д. И. Овчинников и др., неопубликованные данные) указывают на то, что в ходе прогрессии ГК in vivo действительно произошла активация TGFp-зависимого сигнального пути. Еще предстоит выяснить, за счет чего произошла такая активация, как она связана с подавлением экспрессии Hnf4a и нарушением каких механизмов была опосредована, однако уже сейчас можно предполагать важную роль TGFp-зависимых сигнальных путей в процессе развития злокачественного фенотипа опухолей печени и, в частности, в утрате ими эпителиальной морфологии. Наше наблюдение о том, что снижение уровня экспрессии Hnf4a может происходить и в клинических образцах ГК [5], является существенным указанием на то, что Hnf4a вовлечен в процесс гепатоканцерогенеза у человека. Более того, наблюдавшееся в одном из случаев полное подавление экспрессии Hnf4a коррелировало с полной потерей печеночной архитектуры и приобретением способности к метастазированию. Это указывает на то, что репрессия Hnf4a может быть неблагоприятным прогностическим фактором, отражающим приобретение клетками ГК дедифференцированного высоко инвазивного фенотипа. Таким образом, ЭМП играет важную роль в прогрессии опухолей печени и приобретении ими инвазивных свойств. По-видимому, одним из ключевых эффекторов этого процесса является гепатоспецифический транскрипционный фактор Hnf4a, осуществляющий координацию тканеспецифических механизмов регуляции транскрипции и основных путей передачи сигнала, определяющих морфологические и пролиферативные свойства клеток.

В то же время нами получены данные, свидетельствующие о существовании пока не идентифицированных механизмов регуляции гена Hnf4a, ответственных за его подавление в ходе прогрессии ГК и определяющих дедифференцировку и утрату эпителиальной морфологии при развитии злокачественного фенотипа опухолей печени. Мы ожидаем, что исследование роли TGFP-зависимых сигнальных путей в прогрессии опухолей печени и подробное изучение идентифицированных нами новых генов-мишеней Hnf4a, которые проводятся в настоящее время, позволят приблизиться к пониманию того, как осуществляется интеграция тканеспецифических и общих механизмов регуляции важнейших клеточных свойств при прогрессии опухолей печени.

Экспериментальные данные, использованные в этом обзоре, получены в рамках проектов Американского фонда гражданских исследований и развития для независимых государств бывшего Советского Союза (АФГИР) № RB1-2033, ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» (контракт № 43.073.1.1.2507), Российского фонда фундаментальных исследований № 02-04-49059 и гранта поддержки ведущих научных школ НШ 1494.2003.4.

ЛИТЕРАТУРА

1. Абелев Г. И. Дифференцировочные антигены в опухолях — зависимость от механизмов канцерогенеза и прогрессии опухолей // Мол. биол. — 2003. — Т. 37. - С. 1-8.

2. Варга Е. В., Черемнова О. А., Энгелъгардт Н. В., Лазаревич Н. Л. Экспрессия тканеспецифических генов при прогрессии гепато-карцином мыши // Генетика. — 2001. — Т. 37. — С. 803—810.

3. Кудрявцева Е. И., Морозова О. В., Рудинская Т.Д., Энгелъгардт Н. В. Нарушение межклеточных контактов и взаимодействия клеток с внеклеточным матриксом в быстрорастущей гепатокарциноме мышей // Арх. патол. —2001. — Т. 4. — С. 33—37.

4. Лазаревич Н. Л. Молекулярные механизмы регуляции экспрессии гена альфа-фетопротеина // Биохимия. — 2000. — Т 65. —

С. 139-158.

5. Лазаревич Н. Л. Изменения спектров экспрессии генов при гепа-токанцерогенезе и прогрессии опухолей печени: Дис... д-ра биол. наук. — М., 2003. — 245 с.

6. Энгелъгардт Н. В., Кудрявцева Е. И., Морозова О. В. и др. Скачкообразная прогрессия перевиваемой гепатокарциномы мышей, сопряженная с утратой полярности клеток // Арх. патол. — 2000. — Т. 62. - С. 24-29.

7. Abelev G. I. Antigenic structure of chemically-induced hepatomas // Progr. Exp. Tumor Res. — 1965. — Vol. 7. — P. 104—157.

8. Boyer B., Valles A. М., Edme N. Induction and regulation of epithelial-mesenchymal transitions // Biochem. Pharmac. — 2000. — Vbl. 60. —

P. 1091-1099.

9. Calvisi D. F., Factor V. М., Loi R., Thorgeirsson S. S. Activation of beta-catenin during hepatocarcinogenesis in transgenic mouse models: relationship to phenotype and tumor grade I I Cancer Res. — 2001. —

Vol. 61.-P. 2085-2091.

10. Cano A., Perez-Moreno M. A., Rodrigo I. et al. The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression//Nat. Cell Biol. — 2000. — Vol. 2. — P. 76—83.

11. Chiba H., Gotoh T., Kojima T. et al. Hepatocyte nuclear factor (HNF)-4alpha triggers formation of functional tight junctions and establishment of polarized epithelial morphology in F9 embryonal carcinoma

• cells // Exp. Cell Res. — 2003. - Vol. 286. — P. 288-297.

12. Duncan S. A., Nagy A., Chan W. Murine gastrulation requires HNF-4 regulated gene expression in the visceral endoderm: tetraploid rescue of Hnf-4(-/-) embryos // Development. — 1997. — Vol. 124. — P. 279—287.

13. Factor V. М., Kao C. Y., Santoni-Rugiu E., Thorgeirsson S. S. Constitutive expression of mature transforming growth factor betal in the liver accelerates hepatocarcinogenesis in transgenic mice // Cancer Res. -1997. - Vol. 57. - P. 2089-2095.

14. Fausto N. Liver regeneration //J. Hepatol. — 2000. — Vol. 32. —

P. 19-31.

15. Giannelli G., Fransvea E., Marinosci F. et al. Transforming growth factor-betal triggers hepatocellular carcinoma invasiveness via alpha3betal inte-grin //Am. J. Pathol. — 2002. - Vol. 161. — P. 183-193.

16. GleibermanA. S., Abelev G. I. Cell position and cell interactions in expression of fetal phenotype of hepatocytes // Int. Rev. Cytol. — 1985. — Vol. 95. - P. 229-266.

17. GleibermanA. S., Kudrjavtseva E. I., Sharovskaya Yu. Yu., Abelev G. I. Synthesis of alpha-fetoprotein in hepatocytes is co-ordinately regulated with cell-cell and cell-matrix interactions // Mol. Biol. Med. — 1989. — Vol. 6. - P. 95-107.

18. Gotzmann J., Schulte-Hermann R., BeugH., Mikulits W. Hepatocytes convert to a fibroblastoid phenotype through the cooperation of TGF-betal and Ha-Ras: steps towards invasiveness //J. Cell Sci. — 2002. — Vol. 115.-P. 1189-1202.

19. HoodJ. D., Cheresh D. A. Roleofintegrins in cell invasion and migration // Nature Rev. Cancer. — 2002. — Vol. 2. — P. 91—100.

20. Lazarevich N. L., Cheremnova O. A., Varga E. V. et al. Comparative analyses of main properties and gene expression during mouse hepatocellular carcinoma one-step progression // Rev. Oncol. — 2002. —

Vol. 4 (SI). - P. 91-92.

21. Li J., Ning G., Duncan S. A. Mammalian hepatocyte differentiation requires the transcription factor HNF-4alpha // Genes Dev. — 2000. — Vol. 14. - P. 464-474.

22. Lora J. М., Rowader К. E., Soares L., Zaret K. S. Alpha3betal-integrin as a critical mediator of the hepatic differentiation response to the extracellular matrix // Hepatology. — 1998. — Vol. 28. — P. 1095—1104.

23. Massague J., Chen Y. G. Controlling TGF-p signaling // Genes Dev. —

2000. - Vol. 14. - P. 627-644.

24. Michalopoulos G. K., DeFrances M. C. Liver regeneration // Science. — 1997. - Vol. 276. - P. 60-66.

25. Nieto M. A. The snail superfamily of zinc-flnger transcription factors // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. - 2002. - Vol. 3. - P. 155-166.

26. ParvizF., Matullo C., Garrison W. D. etal. Hepatocyte nuclear factor 4alpha controls the development of a hepatic epithelium and liver morphogenesis I I Nat. Genet. — 2003. — \W. 34. — P. 292—296.

27. Savagner P. Leaving the neighborhood: molecular mechanisms involved during epithelial-mesenchymal transition // Bioassays. —

2001. - Vol. 23. - P. 912-923.

28. Sladek F. M., Zhong W., Lai E., Darnell J. E., Jr. Liver-enriched transcription factor Hnf4 is a novel member of the steroid hormon receptor superfamily // Genes Dev. — 1990. — Vbl. 4. — P. 2353—2364.

29. Spagnoli F. M., Cicchini C., Tripodi M., Weiss M. C. Inhibition of MMH (Met murine hepatocyte) cell differentiation by TGF-beta is

abrogated by pre-treatment with the heritable differentiation effector FGF1 // J. Cell Sci. - 2000. - Vol. 113. - P. 3639-3647.

30. Spath G. F., Weiss M. C. Hepatocyte nuclear factor 4 provokes expression of epithelial marker genes, acting as a morphogen in dediffe-renti-ated hepatoma cells // J. Cell Biol. — 1998. — Vol. 140. —

P. 935-946.

31. Thiery J. P. Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression // Nature Rev. Cancer. — 2002. — Vol. 2. — P. 442—454.

32. Valdes F., Alvarez A. M., Nieto M. A., Fabregat I. The epithelial mesenchymal transition confers resistance to the apoptotic effects of transforming growth factor Beta in fetal rat hepatocytes // Mol. Cancer Res. —

2002.-Vol. 1,-P. 68-78.

33. Yamasaki H., Krutovskikh V., MesnilM. et al. Role of connexin (gap junction) genes in cell growth control and carcinogenesis // C. R. Acad. Sci. III. - 1999- - Vol. 322. - P. 151-159.