УСТРОЙСТВО И СПОСОБ ОТБОРА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ С ПОМОЩЬЮ МИКРОМАТРИЦ
DEVICE AND METHOD OF SELECTING NUCLEIC ACIDS BY MEANS OF MICRO-ARRAYS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к устройству для специфичного отбора молекул-мишеней, включающему: (а) по меньшей мере одну зону реакции, содержащую микроматрицу, причем микроматрица включает субстрат, на котором иммобилизованы один или несколько видов захватывающих молекул, которая содержит одну или несколько единиц контроля и/или регуляции температуры для контроля и/или регуляции температуры внутри зоны; (b) по меньшей мере одну нереакционную зону, содержащую одну или несколько единиц контроля и/или регуляции температуры для контроля и/или регуляции температуры внутри зоны, которая соединена с возможностью переноса жидкости с зоной реакции; и (с) по меньшей мере одно средство переноса, способное генерировать и/или регулировать поток жидкости между указанной реакционной зоной (а) и указанной зоной, содержащей одну или несколько единиц контроля и/или регуляции температуры (b). Настоящее изобретение дополнительно относится к устройству для специфичного отбора молекул-мишеней, в котором иммобилизованные захватывающие молекулы организованы в микроматрицу в форме точек, удлиненных точек и/или линий. В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу специфичного отбора молекул-мишеней, включающему в себя введение среды в такое устройство, проведение реакций взаимодействия в реакционной зоне, переноса непровзаимодействовавших или несвязанных молекул-мишеней в зону, позволяющую реактивацию молекул-мишеней, и проведение дополнительных реакций взаимодействия с реактивированными молекулами-мишенями в реакционной зоне, а также к применению такого устройства для специфичного отбора молекул-мишеней, например, для направленного обогащения, также именуемого в литературе микроматричной геномной селекцией (MGS).
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Технологии секвенирования начали очень быстро развиваться, после того как NIH (Национальный институт здравоохранения США) начал проект секвенирования полного генома человека в конце 1990-х гг. В частности, после введения 2-го поколения секвенаторов в 2005-м году стоимость секвенирования упала в 10 раз примерно до 1 миллиона долларов США за геном человека на начало 2008 г. В настоящий момент, индустрия секвенирования направлена на дальнейшее снижение стоимости секвенирования ДНК, целью которого в ближайшем будущем является достижение стоимости секвенирования примерно 1000 долларов США за геном человека. Исходя из этих перспектив и ожиданий, ДНК-секвенирование, в частности, секвенирование геномной ДНК, станет важным клиническим и диагностическим инструментом, который можно использовать для анализа генетической изменчивости, и детекции заболеваний или выявления предрасположенности к заболеваниям, в частности, для диагностики раковых заболеваний или детекции предрасположенности к развитию раковых заболеваний. Однако ключевой областью применения ДНК-секвенирования в клинике является не секвенирование полноразмерных геномов, а повторное секвенирование значимых участков генома или генов, про которые известно, что они вовлечены в этиологию заболеваний.
Необходимым условием такого подхода является эффективное выделение ДНК-мишени, последовательности которой планируется определить (секвенировать). Обычно, сложные эукариотические геномы, например, геном человека, являются слишком крупными для исследования без снижения степени сложности, основанного, например, на прямой амплификации специфичных последовательностей методами ПЦР, включая короткую ПЦР и протяженную ПЦР, на создании фазмидных библиотек, создании ВАС-библиотек (бактериальных искусственных хромосом), на TAR-клонировании (трансформационно-ассоциированной рекомбинации) или на использовании «селекторной технологии» (SELECTOR TECHNOLOGY™).
Альтернативой указанным процедурам для снижения сложности геномной ДНК является микроматричная геномная селекция (MGS), которая была разработана для выделения заданных уникальных геномных последовательностей из сложных эукариотических геномов (WO 2008/097887). Этот способ включает в себя физическое измельчение геномной ДНК для создания случайных фрагментов средней длины примерно 300 п.о., восстановление концов фрагментов, лигирование с уникальными адаптерами с комплементарными выступающими Т-нуклеотидами и гибридизацию фрагментов с олигонуклеотидной микроматрицей высокой плотности комплементарных последовательностей, идентифицированных в референсной геномной последовательности, последующую элюцию фрагментов и их амплификацию с помощью ПЦР с использованием адаптерных последовательностей (WO 2008/097887).
Однако с использованием существующих протоколов для MGS можно выделить только примерно 80-90% целевых областей. Таким образом, от 10% до 20% последовательностей-мишеней оказываются утерянными, а несколько других областей могут быть покрыты на очень низком уровне, что может препятствовать надежному обнаружению мутаций в подходах повторного секвенирования. Проблемой, которой ранее не уделяли внимания, и которая может объяснить встречающиеся сложности с количественным выделением целевых областей, является тот факт, что в обычных MGS-гибридизационных смесях присутствует большое число копий обеих комплементарных цепей геномной ДНК, что способствует обратной гибридизации с комплементарной цепью вместо связывания с захватывающими зондами.
Таким образом, необходим улучшенный способ обогащения молекул-мишеней, в частности, ДНК-молекул-мишеней таких, как геномные нуклеиновые кислоты, который обеспечивает эффективное воспроизводимое и количественное выделение молекул-мишеней.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение направлено на эту потребность и относится к средству и способам специфичного отбора молекул-мишеней. Вышеуказанная задача, в частности, выполняется с помощью устройства для специфичного отбора молекул-мишеней, включающего:
(а) по меньшей мере одну реакционную зону, содержащую микроматрицу, причем микроматрица включает субстрат, на котором иммобилизованы один или более видов захватывающих молекул, причем реакционная зона дополнительно содержит одну или более единиц контроля и/или регуляции температуры для контроля и/или регуляции температуры внутри реакционной зоны;
(b) по меньшей мере одну нереакционную зону, содержащую одну или более единиц контроля и/или регуляции температуры для контроля и/или регуляции температуры внутри нереакционной зоны, которая соединена с возможностью переноса жидкости с реакционной зоной; и
(с) по меньшей мере одно средство переноса, способное генерировать и/или регулировать поток жидкости между указанной реакционной зоной (а) и указанной нереакционной зоной, содержащей одну или более единиц контроля и/или регуляции температуры (b).
Поскольку устройство позволяет предпочтительную повторную реактивацию молекул-мишеней, которые не связались с захватывающими молекулами, в то время как температура области, в которой молекулы-мишени уже связаны с захватывающими молекулами, поддерживают на уровне, оптимально подходящем для связывания. Например, ДНК-молекулы-мишени, которые не гибридизовались с захватывающим зондом в микроматрице, можно предпочтительно денатурировать в повторяющихся циклах, в то время как температуру области, в которой ДНК-молекулы-мишени связаны с захватывающими молекулами, поддерживают на уровне, оптимальном для гибридизации. Таким образом, молекула-мишень, которая не связана с захватывающими зондами, но которая связывается с комплементарной молекулой-мишенью, будет реактивироваться и получит дополнительный шанс обнаружения комплементарной захватывающей молекулы, в то время как молекулы-мишени, уже связанные с захватывающими молекулами, будут оставаться связанными, что приводит к обогащению специфично связанных молекул и значительному снижению количества молекул-мишеней, связанных с комплементарным молекулами-мишенями.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения единица контроля и/или регуляции температуры в внутри зоны может быть встроена в зону или может располагаться снаружи.
В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения указанная выше реакционная зона (а), указанная выше нереакционная зона, содержащая одну или более единиц для контроля и/или регуляции температуры (b) и указанное выше средство переноса (с) расположены в замкнутом контуре или прямоточной линии потока, или встроены в камеру. В особенно предпочтительном варианте настоящего изобретения камера может представлять собой удлиненную камеру, образующую жидкостной канал. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения камера может содержать от 2 до 5 повторов указанной выше реакционной зоны (а), а нереакционная зона может содержать одну или более указанных выше единиц контроля и/или регуляции температуры (b).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанные выше замкнутый контур или прямоточная линия потока, обеспечивают постоянный обмен жидкости между реакционной зоной (а) и нереакционной зоной, содержащей одну или более единиц контроля и/или регуляции температуры (b), указанных выше.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения устройство дополнительно включает в себя перемешивающее средство. Особенно предпочтительно присутствие перемешивающего средства в областях жидкостного соединения между зонами.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления изобретения нереакционная зона, содержащая одну или более единиц контроля и/или регуляции температуры (b), указанных выше, или удлиненная камера, образующая жидкостной канал, указанный выше, включают извилистую линию потока.
В дополнительном, особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанная выше реакционная зона (а) представляет собой зону гибридизации, обеспечивающую возможность гибридизации нуклеиновых кислот с указанными захватывающими молекулами. Устройство способно поддерживать температуру в реакционной зоне от примерно 20°C до 70°C. Еще более предпочтительна температура от примерно 40°C до 70°C.
В дополнительном особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанной выше зоной, содержащей единицу контроля и/или регуляции температуры (b), является зона денатурации, способная осуществлять денатурацию нуклеиновых кислот. Устройство способно поддерживать температуру нереакционной зоны в диапазоне от примерно 80°C до 98°C. В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретения температура поддерживается около 95°C.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, иммобилизованные захватывающие молекулы организованы в микроматрицу в форме точек, удлиненных точек и/или линий.
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанные выше линии расположены под углом примерно от 20° до 90°. В дополнительном, более предпочтительном варианте осуществления изобретения, линии расположены под углом примерно от 45° до 90°. В еще одном, даже более предпочтительном варианте осуществления изобретения, линии расположены под углом примерно 90° относительно линии потока, то есть линии примерно перпендикулярны линии потока.
В другом, особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ширина линий составляет примерно от 300 нм до 30 мкм, и/или линии расположены с дистанцией между ними примерно от 500 нм до 100 мкм, причем предпочтительно, чтобы дистанция между линиями была как можно меньше. Исходя из экспериментальных данных, площадь между линиями предпочтительно должна быть меньше площади линий. Кроме того, площадь, не покрытая зондами или линиями зондов, может вызывать специфичное связывание и тем самым снизить процент фрагментов, отобранных на мишени.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения захватывающими молекулами являются молекулы, выбранные из группы, содержащей нуклеиновые кислоты, пептиды, белки, антигены, антитела, углеводы и/или их аналоги, предпочтительно, нуклеиновые кислоты. Особенно предпочтительно расположение захватывающих молекул на субстрате, имеющем плоскую поверхность или состоящем из шарикоподобных элементов, таких как магнитные частицы.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу специфичного отбора молекул-мишеней, включающему в себя стадии: (а) введения среды, содержащей одну или более молекул-мишеней в зону устройства, указанную в настоящем документе выше; (b) проведения реакции взаимодействия между указанными молекулами-мишенями и иммобилизованными захватывающими молекулами в реакционной зоне; (с) переноса непровзаимодействовавших или несвязанных молекул-мишеней в нереакционную зону, содержащую одну или более единиц контроля и/или регуляции температуры; (d) реактивации, предпочтительно денатурации, указанных молекул-мишеней в указанной зоне, содержащей одну или более единиц контроля и/или регуляции температуры; и (е) переноса реактивированных, предпочтительно денатурированых молекул-мишеней в реакционную зону, тем самым позволяющего дополнительное взаимодействие между указанными молекулами-мишенями и иммобилизованными захватывающими молекулами по стадии (b). Преимуществом этого способа, особенно при отборе нуклеиновых кислот, является исключение длительной гибридизации, поскольку организованное движение среды и реактивация молекул-мишеней значительно увеличивают эффективность реакций взаимодействия в реакционной зоне.
В предпочтительном варианте настоящего изобретения можно повторять стадии (b)-(e) способа специфичного отбора молекул-мишеней, указанного в настоящем документе выше. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления изобретения число повторов может составлять от 2 до 100 раз, и/или их можно проводить постоянно и/или параллельно в течение определенного времени. В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения повторы можно проводить от 1 мин до 72 ч или от 5 мин до 20 ч. Наиболее предпочтительно проводить повторы в течение интервала времени от 10 мин до 2 ч.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению устройства, указанного в настоящем документе выше, для специфичного отбора молекул-мишеней. В предпочтительном варианте осуществления изобретения устройство, указанное в настоящем документе выше, можно использовать для проведения направленного обогащения.
В некоторых вариантах осуществление настоящее изобретение относится к следующим объектам.
Пункт 1. Устройство для специфичного отбора молекул-мишеней, содержащее:
(а) по меньшей мере одну реакционную зону, содержащую микроматрицу, причем микроматрица содержит субстрат, на котором иммобилизованы один или более видов захватывающих молекул, причем реакционная зона также содержит одну или более единиц контроля и/или регуляции температуры для контроля и/или регуляции температуры внутри реакционной зоны;
(b) по меньшей мере одну нереакционную зону, содержащую одну или более единиц контроля и/или регуляции температуры для контроля и/или регуляции температуры внутри нереакционной зоны, которая соединена с возможностью переноса жидкости с реакционной зоной; и
(с) по меньшей мере одно средство переноса, способное генерировать и/или регулировать поток жидкости между указанной реакционной зоной (а) и указанной нереакционной зоной, содержащей одну или несколько единиц контроля и/или регуляции температуры (b).
Пункт 2. Устройство по п.1, в котором указанная единица для контроля и/или регуляции температуры внутри нереакционной зоны встроена в указанную нереакционную зону.
Пункт 3. Устройство по п.1 или п.2, в котором указанная реакционная зона (а), указанная нереакционная зона (b) и указанное средство переноса (с) расположены в замкнутом контуре.
Пункт 4. Устройство по п.3, в котором указанный замкнутый контур позволяет непрерывный обмен жидкости между указанной реакционной зоной (a) и указанной нереакционной зоной.
Пункт 5. Устройство по любому из пп.1-4, в котором указанное устройство дополнительно включает средство перемешивания, предпочтительно, в областях жидкостного соединения между зонами.
Пункт 6. Устройство по любому из пп.1-5, в котором указанное устройство содержит извилистую линию потока.
Пункт 7. Устройство по любому из пп.1-6, в котором указанная реакционная зона (а) представляет собой гибридизационную зону, позволяющую проведение гибридизации нуклеиновых кислот с указанными захватывающими молекулами.
Пункт 8. Устройство по любому из пп.1-7, в котором указанная нереакционная зона, содержащая единицу контроля и/или регуляции температуры (b), представляет собой денатурирующую зону, способную обеспечивать проведение денатурации нуклеиновых кислот.
Пункт 9. Устройство по любому из пп.1-8, в котором указанные иммобилизованные захватывающие молекулы организованы в микроматрицу в форме точек, удлиненных точек и/или линий.
Пункт 10. Устройство по п.9, в котором указанные линии расположены под углом от примерно 20° до 90° относительно линии потока.
Пункт 11. Устройство по п.9 или п.10, в котором линии имеют ширину между примерно 300 нм и 30 мкм и/или расположены на расстоянии от примерно 500 нм до 100 мкм.
Пункт 12. Устройство по любому из пп.1-11, в котором указанными захватывающими молекулами являются молекулы, выбранные из группы, содержащей нуклеиновые кислоты, пептиды, белки, антигены, антитела, углеводы и/или их аналоги.
Пункт 13. Способ специфичного отбора молекул-мишеней, включающий стадии:
(а) введения среды, содержащей одну или более молекул-мишеней в зону устройства, указанную в любом из пп.1-12;
(b) проведения реакции взаимодействия между указанными молекулами-мишенями и иммобилизованными захватывающими молекулами в реакционной зоне;
(с) переноса непровзаимодействовавших или несвязанных молекул-мишеней в нереакционную зону, содержащую одну или более единиц контроля и/или регуляции температуры;
(d) реактивации указанных молекул-мишеней в указанной зоне, содержащей одну или более единиц контроля и/или регуляции температуры; и
(е) переноса реактивированных молекул-мишеней в реакционную зону, таким образом, обеспечивая дополнительное взаимодействие между указанными молекулами-мишенями и иммобилизованными захватывающими молекулами по стадии (b).
Пункт 14. Способ по п.13, в котором стадии (b)-(e) повторяют по меньшей мере 2 раза.
Пункт 15. Применение устройства по любому из пп.1-12 для специфичного отбора молекул-мишеней.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1: схематическая иллюстрация подхода микроматричной геномной селекции.
Фиг. 2: обзор степени выделения геномной ДНК в классической микроматричной геномной селекции, проводимой на микроматрице Agilent, содержащей 244000 различных зондов для отбора 0,1% генома человека; степень выделения очень низкая.
Фиг. 3: схематическое представление устройства, содержащего две камеры, одну для гибридизации и одну для денатурации, между которыми происходит постоянный обмен жидкостью путем перекачивания по замкнутому контуру.
Фиг. 4: схематическое представление гибридизационной камеры и извилистого канала, который проходит поверх нагреваемой поверхности и в котором происходит денатурация. Объем, в частности, длина, определяют время удерживания жидкости в денатурирующем канале.
Фиг. 5: схематическое представление устройства, в котором жидкость перекачивается туда и обратно между денатурирующим и гибридизационным каналами. Соединяющие каналы содержат пассивные перемешивающие структуры, приводящие к оптимальной гомогенизации жидкости и ее компонентов.
Фиг. 6: схематическое представление устройства, включающего извилистый канал с различными зонами нагревания (фиг. 6А) и соответствующая схема ожидаемой и измеренной интенсивности флуоресценции при гибридизации (фиг. 6В). На фиг. 6С показана соответствующая схема изменения температуры по длине канала.
Фиг. 7: изображение, показывающее высокую эффективность связывания в конечной части извилистого канала, включающего различные зоны нагревания, установленные на 95°C. Направление потока справа налево, выходное отверстие находится с левой стороны.
Фиг. 8: изображение, показывающее низкую эффективность связывания в извилистом канале, температура которого установлена на 50°C. Направление потока справа налево, выходное отверстие находится с левой стороны.
Фиг. 9: схематическое изображение планировки микроматрицы, в которой линии зондов по существу ортогональны или перпендикуляры потоку образца. В этой планировке общая поверхность матрицы использована наилучшим образом.
Фиг. 10: схематическое изображение альтернативной планировки микроматрицы, в которой линии зондов находятся под углом α к потоку образца.
Фиг. 11: схематическое изображение альтернативной планировки микроматрицы, в которой линии зондов находятся под углом α к потоку образца. При этом расположении линии также присутствуют в углах, несмотря на то, что они не перекрывают всю матрицу.
Фиг. 12: схематическое изображение альтернативной планировки микроматрицы, в которой линии зондов по существу ортогональны или перпендикуляры потоку образца с широкой стороны матрицы.
Фиг. 13: устройство по настоящему изобретению повышает эффективность гибридизации.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к устройству для специфичного отбора молекул-мишеней, а также к соответствующим способам и применениям.
Хотя настоящее изобретение будет описано относительно конкретных вариантов осуществления, это описание не следует истолковывать в ограничительном смысле.
Перед подробным описанием примеров вариантов осуществления настоящего изобретения приведены определения, важные для понимания настоящего изобретения.
Используемое в данном описании и приложенной формуле изобретения единственное число также включает все соответствующие множественные формы, если иное прямо не продиктовано контекстом.
В контексте настоящего изобретения термины «примерно» и «приблизительно» обозначают интервал погрешности, который для опытного специалиста будет все еще гарантировать технический эффект рассматриваемого признака. Термин обычно указывает отклонение от указанного числового значения ±20%, предпочтительно, ±15%, более предпочтительно, ±10% и, еще более предпочтительно, ±5%.
Следует понимать, что термин «содержащий» не является ограничивающим. В настоящем изобретении термин «состоящий из» считается предпочтительным вариантом осуществления термина «содержащий». Если в настоящем описании группа определена как содержащая, по меньшей мере некоторое число вариантов осуществления, это означает, что она также охватывает группу, которая предпочтительно состоит только из этих вариантов осуществления.
Кроме того, термины «первый», «второй», «третий» или «(а)», «(b)», «(c)», «(d)» и т.д и т.п. в описании и формуле изобретения используются для разделения аналогичных элементов и не обязательно для описания последовательного или хронологического порядка. Следует понимать, что используемые таким образом термины являются взаимозаменяемыми при соответствующих условиях, и что описанные в настоящем документе варианты осуществления изобретения можно выполнять в другой последовательности, относительно описанной или проиллюстрированной в настоящем документе.
В случае, когда термины «первый», «второй», «третий» или «(а)», «(b)», «(c)», «(d)» и т.д относятся к стадиям способа или применения не существует временной связи или временных интервалов между стадиями, то есть стадии можно проводить одновременно, или такие стадии могут быть разделены временными интервалами, составляющими секунды, минуты, часы, дни, недели, месяцы или даже годы, если иное не указано в применении, изложенном в настоящем документе выше или ниже.
Следует понимать, что это изобретение не ограничено конкретными методикой, протоколами, реагентами и т.п., описанными в настоящем документе, поскольку они могут варьировать. Также следует понимать, что используемая в настоящем документе терминология предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления, и не предполагается, что она ограничивает объем настоящего изобретения, ограниченный только приложенной формулой изобретения. Если не указано иное, то все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют такое же значение, какое под ними обычно понимает специалист в данной области техники.
Как было указано выше, в одном аспекте настоящее изобретение касается устройства для специфичного отбора молекул-мишеней, включающего в себя: (а) по меньшей мере одну реакционную зону, содержащую микроматрицу, причем микроматрица включает в себя субстрат, на котором иммобилизованы один или более видов захватывающих молекул, содержащую одну или более единиц контроля и/или регуляции температуры для контроля и/или регуляции температуры внутри зоны; (b) по меньшей мере одну нереакционную зону, содержащую одну или более единиц контроля и/или регуляции температуры для контроля и/или регуляции температуры внутри нереакционной зоны, которая соединена с возможностью переноса жидкости с реакционной зоной; и (с) по меньшей мере одно средство переноса, способное генерировать и/или регулировать поток жидкости между указанной реакционной зоной (а) и указанной зоной, содержащей одну или более единиц контроля и/или регуляции температуры (b).
Используемый в настоящем документе термин «отбор молекул-мишеней» относится к взаимодействию между элементами или частями устройства по изобретению и молекулами-мишенями, например, молекулами, присутствующими в окружающей среде. Таким взаимодействием может быть любое подходящее молекулярное, субмолекулярное или макромолекулярное взаимодействие, известное специалисту в данной области техники, например, аффинное взаимодействие, взаимодействие на основе Ван-ден-Ваальсовых сил и взаимодействие, основанное на водородных связях и/или взаимодействие, основанное на электрических зарядах, например, между противоположно заряженными молекулами. Типичными примерами такого взаимодействия будут белок-белковое взаимодействие, реакция гибридизации с участием нуклеиновых кислот, связывание лиганда с его рецептором, связывание антитела с соответствующим антигеном или эпитопом, связывание низкомолекулярного соединения с активным центром белка или фермента, взаимодействие белка или нуклеиновой кислоты с углеводной структурой. В результате взаимодействия взаимодействующий партнер может связаться с одним или несколькими элементами или частями устройства по настоящему изобретению и, таким образом, его можно отобрать из окружающей среды. Предпочтительно, чтобы отбор молекул-мишеней был специфичным. Термин «специфичный» при использовании в контексте отбора молекул-мишеней имеет различные значения, которые в основном зависят от идентичности молекулы-мишени и/или типа взаимодействия и которые, в общем, попадают в общие соответствующие правила и определения, известные в данной области. Например, взаимодействие между нуклеиновыми кислотами можно считать специфичным, если могут взаимодействовать молекулы-мишени нуклеиновой кислоты, которые полностью или частично комплементарны друг другу, или комплементарны друг другу по меньшей мере примерно на 60%-90% по всей длине или на протяжении части молекулы. Взаимодействие между антителом и его антигеном можно считать специфичным по известным стандартам в данной области, например, если могут распознаваться только молекулярные и/или пространственные параметры эпитопа. Взаимодействие между лигандом и его рецептором можно считать специфичным по известным стандартам в данной области, если лиганд способен связываться с областью связывания рецептора, и/или если лиганд способен запускать молекулярную реакцию в рецепторе или совместно с рецептором, например, возбуждение нижележащего сигнала.
«Молекулой-мишенью» в настоящем изобретении может быть любая подходящая молекула, которая позволяет специфичное взаимодействие, вышеописанное в настоящем документе. Примерами молекул-мишеней для отбора с помощью устройства по настоящему изобретению являются нуклеиновые кислоты, белки, пептиды, лиганды любой формы и формата, антитела, антигены, низкомолекулярные соединения, такие как органические, неорганические или смешанные органические и неорганические структуры, например, углеводы или сахара, полимеры, элементы, такие как клетки или фрагменты клеток, или субкомпартменты клеток, например, бактериальные клетки или их фрагменты, эукариотические клетки или их фрагменты, вирусные частицы или вирусы, или любое производное или комбинация вышеуказанного.
Используемый в настоящем документе термин «окружающая среда» относится к веществу или среде, в которой происходит указанное выше взаимодействие. Среда может быть, например, жидкой средой, газообразной средой. Предпочтительна жидкая среда, особенно предпочтительна водная среда, например, среда, содержащая воду в различных соотношениях. Кроме того, среда может содержать дополнительные ингредиенты, например, соли, ионы, органические или неорганические молекулы, она может быть забуферена любым подходящим буфером, известным специалисту в данной области техники, и может содержать красители или флуоресцентные метки, стабилизирующие агенты для нуклеиновых кислот или белков, например, ингибиторы РНКазы, ингибиторы ДНКазы, ингибиторы протеиназ, среда может содержать дополнительные взаимодействующие элементы, например, вторичные антитела, и т.п.
Используемый в настоящем описании термин «реакционная зона» относится к части устройства, которая подходит для проведения взаимодействия, указанного в настоящем описании выше. В реакционной зоне можно устанавливать или регулировать один или несколько параметров, для того, чтобы они позволяли взаимодействие. Например, температуру в реакционной зоне можно регулировать до соответствующего значения, известного специалисту в данной области техники. Температура по большей части может зависеть от отбираемой молекулы-мишени и проводимого типа взаимодействия, и может отличаться при отборе нуклеиновой кислоты или белка, или отборе органического или неорганического низкомолекулярного соединения и т.д. Оптимальные значения температуры для таких взаимодействий можно подобрать из соответствующих пособий, например, из Lottspeich, F., and Zorbas H. (1998) Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg/Berlin, Germany, или их можно определить экспериментальным путем, повторяя реакции при различных температурах, например, в диапазоне температур от 4°C до 120°C, предпочтительно, в диапазоне примерно от 20°C до 100°C. Дополнительным параметром, который можно устанавливать или регулировать в реакционной зоне по настоящему изобретению, в особенности, в жидких средах, является рН, значения которого могут составлять от 0 до 14, например, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14. Предпочтительный диапазон рН составляет примерно от 6,5 до 8,5, более предпочтительным является рН 7,5. Другим параметром, который можно устанавливать или регулировать в реакционной камере, является скорость потока, в частности, массовая скорость потока окружающего вещества. Массовая скорость потока может, например, составлять примерно от 0 до 1000 мкг/с, например, 0, 5, 10, 50, 100, 150, 500, 700, 750, 800 или 1000 мкг/с. Дополнительным параметром, который можно регулировать или устанавливать в реакционной камере является общая концентрация солей или ионов. По настоящему изобретению можно использовать любую подходящую концентрацию ионов или соли, известную специалисту в данной области техники. Например, общая концентрация соли или ионов может составлять примерно от 0,1 мМ до 1 М. Значения любого параметра могут быть едиными для всей реакционной зоны, они могут представлять собой один или несколько градиентов. Например, в реакционной зоне могут присутствовать градиент температуры, рН, концентрации соли и скорости потока или массовой скорости потока. При количестве более одного, градиенты могут иметь одно направление, или быть противоположными друг к другу, или в альтернативном варианте, иметь различные направления, например, они могут быть перпендикулярны друг к другу, или могут быть расположены под некоторым углом друг к другу, например, под углом 30°, 45°, 60°. Параметры можно дополнительно менять или модифицировать в активном режиме, например, при использовании устройства, например, температуру можно повышать или понижать в течение определенного отрезка времени, рН можно повышать или понижать в течение определенного отрезка времени и/или скорость потока или массовую скорость потока можно повышать или понижать в течение определенного отрезка времени. Реакционная зона может быть либо закрытой, то есть она включает в себя колпак, чехол или крышку, либо открытой. Реакционная зона может состоять из любого подходящего материала, известного специалисту в данной области техники, например, металла, стекла, пластика, например, PMMA или любой их производной или комбинации. Особенно предпочтительно использовать стекло или пластик, например, полимерные материалы. Для нагревательных/охлаждающих элементов можно использовать металлические материалы.
Реакционная зона может дополнительно включать микроматрицу. Термин «микроматрица», используемый в настоящем описании, относится к упорядоченной матрице, представленной для взаимодействия между захватывающими молекулами в матрице и потенциально взаимодействующими соединениями в окружающей среде, например, среде, описанной в настоящем документе выше. Матрица может включать любое двух- или трехмерное расположение адресуемых областей, предпочтительно, двухмерное расположение.
Используемой в настоящем изобретении «захватывающей молекулой» может быть любая подходящая молекула, которая позволяет специфичное взаимодействие с молекулой-мишенью из окружения или среды в устройстве по настоящему изобретению, указанному в настоящем документе выше. Примерами захватывающих молекул, способных отбирать молекулы-мишени из окружения или среды в устройстве, являются нуклеиновые кислоты, белки, пептиды, лиганды любой формы и формата, рецепторы, антитела, антигены, органические и неорганические структуры, например, углеводы или сахара, полимеры, элементы, такие как клетки или фрагменты клеток, или субкомпартменты клеток, например, бактериальные клетки или их фрагменты, эукариотические клетки или их фрагменты, вирусные частицы или вирусы, или любое производное или комбинация вышеуказанного. Особенно предпочтительны захватывающие молекулы, выбранные из нуклеиновых кислот, пептидов, белков, антигенов, антител и углеводов. Еще более предпочтительными в качестве захватывающих молекул являются нуклеиновые кислоты.
Используемый в настоящем документе термин «нуклеиновая кислота» относится к любой нуклеиновой кислоте, известной специалисту в данной области, предпочтительно, к ДНК, РНК, PNA, CNA, HNA, LNA или ANA. ДНК может находиться в форме, например, A-ДНК, B-ДНК или Z-ДНК. РНК может находиться в форме, например, п-РНК, то есть пиранозил-РНК, или может находиться в структурно модифицированных формах, подобно шпилечной РНК или РНК в форме «стебель-петля». Термин «PNA» относится к пептидной нуклеиновой кислоте, то есть искусственно синтезированному полимеру, аналогичному ДНК или РНК, который используется в биологических исследованиях и медицине, но который не известен в природе. Каркас PNA обычно состоит из повторяющихся N-(2-аминоэтил)-глициновых звеньев, соединенных пептидными связями. Различные пуриновые и пиримидиновые основания присоединены к каркасу метилен-карбонильными связями. PNA обычно указывают как пептиды с N-концом в первой (левой) позиции и С-концом справа. Термин «CNA» относится к аминогексилуксусной кислоте-нуклеиновой кислоте. Кроме того, термин относится к циклопентановой нуклеиновой кислоте, то есть молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей, например, 2'-дезоксикарбагуанозин.
Термин «HNA» относится к гекситольным нуклеиновым кислотам, то есть аналогам ДНК, которые состоят из стандартных нуклеиновых оснований и фосфорилированного 1,5-ангидрогекситольного каркаса. Термин «LNA» относится к закрытым нуклеиновым кислотам. Обычно закрытой нуклеиновой кислотой является модифицированный и, поэтому, недоступный РНК-нуклеотид. Рибозная часть LNA-нуклеотида может быть модифицирована дополнительным мостиком, соединяющим 2'- и 4'-углероды. Такой мостик «закрывает» рибозу в 3'-эндо структурной конформации. Закрытая конформация усиливает стэкинг-взаимодействие оснований и преорганизацию каркаса. Это может значительно увеличить термическую стабильность, то есть температуру плавления олигонуклеотида. Термин «ANA» относится к арабиновым нуклеиновым кислотам и их производным. Предпочтительным ANA-производным в контексте настоящего изобретения является 2'-дезокси-2'-фтор-бета-D-арабинонуклеозид (2'F-ANA). В дополнительном предпочтительном варианте осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот могут содержать комбинацию любой одной из ДНК, РНК, PNA, CNA, HNA, LNA и ANA. Особенно предпочтительны смеси LNA-нуклеотидов с ДНК или РНК-основаниями. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот, указанные в настоящем документе выше, могут представлять собой короткие олигонуклеотиды, длинные олигонуклеотиды или полинуклеотиды.
Элементы матрицы могут содержаться на субстрате. Обычно, элементы матрицы или захватывающие молекулы иммобилизованы на субстрате. Используемый в настоящем документе термин «иммобилизованный» относится к ассоциации одной или нескольких захватывающих молекул с поддерживающим субстратом посредством молекулярных взаимодействий, которая позиционирует молекулу в определенной области субстрата и одновременно препятствует откреплению захватывающей молекулы, например, на стадиях отмывки, промывки или взаимодействия и т.п. Обычно такие молекулярные взаимодействия основаны на ковалентных химических связях между структурными элементами или функциональными группами подложки и иммобилизуемой захватывающей молекулой, например, соответствующими функциональными группами нуклеиновых кислот, известными специалисту в данной области техники. Например, иммобилизацию можно провести сшиванием захватывающих молекул при нагревании или на свету, то есть в результате образования молекулярных взаимодействий или связей, которые связывают вместе оба структурных элемента под влиянием или при воздействии энергии, обеспечиваемой источником энергии, таким как тепло или свет, или посредством химической иммобилизации.
Обычно, иммобилизацию посредством сшивки при нагревании проводят путем высушивания и последующего запекания захватывающих молекул на субстрате при определенных температурах. Полагают, что высушивание и запекание приводят к присоединению молекул к субстрату в результате гидрофобных взаимодействий. Эту процедуру можно отнести к одному из типов физической адсорбции. Термин «физическая адсорбция» относится к процессу, включающему стадии предварительного разделения и притяжения, которые базируются на физических адсорбционных процессах, в результате чего захватывающая молекула приближается к реакционно-способным группам. Адсорбция биомолекулы, например, нуклеиновой кислоты, на твердой подложке может происходить практически на любой подложке, поскольку известно, что любая такая подложка будет взаимодействовать практически с любой поверхностью. Обычно уровень взаимодействия между подложкой и иммобилизуемыми захватывающими молекулами варьирует в зависимости от природы и формы подложки и размера и химических свойств захватывающих молекул. Взаимодействие обычно представляет собой пятистадийную процедуру, включающую стадии: (i) переноса захватывающей молекулы к поверхности, (ii) адсорбции на поверхности, (iii) перегруппировки адсорбированной захватывающей молекулы, (iv) потенциальной десорбции адсорбированной захватывающей молекулы и (v) переноса десорбированной захватывающей молекулы от поверхности. Хотя эта процедура подразумевает, до некоторой степени, что существует возможность десорбции, связывание обычно является необратимым, зависящим от размера захватывающей молекулы. Термин «размер захватывающей молекулы» в контексте адсорбционных взаимодействий относится к числу присутствующих сайтов связывания. Хотя любой один сайт связывания может в принципе диссоциировать с поверхности субстрата в любое время, эффект большого числа сайтов связывания выражается в том, что захватывающая молекула в целом будет оставаться связанной. В результате применения энергии в форме тепла, например, температуры примерно от 40 до 150°C, предпочтительно, от 50 до 120°C, более предпочтительно, от 60 до 110°C, еще более предпочтительно, от 70 до 100°C и, наиболее предпочтительно, от 80 до 90°C, можно усилить физическую адсорбцию захватывающей молекулы на подложке и сократить время, необходимое для эффективной иммобилизации. Температурную сшивку можно проводить в течение любого подходящего периода времени, известного специалисту в данной области техники, например, в течение интервала от 2 мин до 12 часов, предпочтительно, от 10 мин до 8 часов, более предпочтительно, от 30 мин до 6 часов, еще более предпочтительно, от 45 мин до 4 часов, еще более предпочтительно, от 1 часа до 3 часов и, наиболее предпочтительно, в течение 2 часов. Сшивку нагреванием или запеканием можно проводить с использованием любого подходящего средства, известного специалисту в данной области техники, например, в сушильной камере или сухожарочном шкафу. Кроме температуры, также другие параметры, такие как влажность, аэрация или вентиляция, можно регулировать до соответствующих значений, известных специалисту в данной области техники. Сшивку нагреванием или запеканием также можно объединить с другими формами иммобилизации, например, сшивкой под воздействием света или химической иммобилизацией.
Сшивку под воздействием света обычно проводят, обрабатывая захватывающие молекулы светом обычной длины волны, например, в диапазоне от 150 до 550 нм, предпочтительно, в диапазоне от 200 до 500 нм для инициации взаимодействия между захватывающими молекулами и подложкой. Обычно индуцируемое взаимодействие между захватывающими молекулами и подложкой является ковалентной связью нуклеиновых кислот с подложкой. Сшивку светом можно проводить, например, используя УФ-свет. УФ-сшивка является одним из самых простых путей для обеспечения ковалентного связывания подложки с зондом. В случае нуклеиновых кислот, связь осуществляется через основания молекулы нуклеиновой кислоты, например, остатки тимина, гуанина, аденина, цитозина или урацила, которые вступают в реакцию с соответствующими и подходящими функциональными химическими группами на подложке, известными специалисту в данной области техники. Присутствие ряда функциональных химических групп на подложке или внутри нее можно контролировать и регулировать посредством соответствующих процессов химической активации. Например, такие процессы активации могут обеспечить определенную локализацию функциональных групп на подложке или внутри подложки и способствовать специфичному взаимодействию между захватывающими молекулами и материалом в контексте этих локализованных функциональных групп. Наличие и число функциональных групп на поверхности или внутри подложки могут также влиять на ориентацию и степень свободы иммобилизованных захватывающих молекул. Например, присутствие большего количества функциональных групп может привести к иммобилизации по различным точкам в захватывающей молекуле. Кроме того, присутствие соответствующих реакционно-способных элементов в захватывающей молекуле можно использовать для контроля ориентации захватывающей молекулы на подложке.
Указанная в настоящем документе «химическая иммобилизация» может представлять собой взаимодействие между подложкой и захватывающей молекулой, основанное на химических реакциях. Обычно такая химическая реакция не обусловлена введением энергии тепла или света, но может быть ускорена либо нагреванием, например, до некоторой оптимальной температуры для химической реакции, или воздействием света определенной длины волны. Например, химическая иммобилизация может происходить между функциональными группами на подложке и соответствующими функциональными элементами на захватывающих молекулах. Такие соответствующие функциональные элементы в захватывающих молекулах могут быть либо частью химического состава молекулы, или их можно ввести дополнительно. Примером такой функциональной группы является аминогруппа. Обычно, иммобилизуемая захватывающая молекула, например нуклеиновая кислота, содержит функциональную аминогруппу или химически модифицирована, чтобы содержать функциональную аминогруппу. Средства и способы для такой химической модификации известны специалисту в данной области техники, и их, например, можно узнать из пособий по органической химии, как Organische Chemie by Hart et al., 2007, Wiley-Vch или Organische Chemie by Vollhardt et al., 2005, Wiley-Vch. Местоположение указанной функциональной группы в иммобилизуемой захватывающей молекуле можно использовать для контроля и направления связывания и/или ориентации захватывающей молекулы, например, функциональную группу можно поместить в конце хвостовой области захватывающей молекулы или в центре захватывающей молекулы. Типичный реакционный партнер для иммобилизуемой захватывающей молекулы содержит элементы, способные связывать такие захватывающие молекулы, например, нуклеиновые кислоты, такие как модифицированные аминогруппами нуклеиновые кислоты. Примерами таких подложек являются альдегидные, эпокси- или NHS-субстраты. Такие материалы известны специалисту в данной области техники. Функциональные группы, которые обеспечивают соединение между захватывающими молекулами, реакционно-способными в результате введения аминогруппы, и подложкой, известны специалисту в данной области техники. Альтернативный реакционный партнер для иммобилизуемых захватывающих молекул возможно должен быть химически активирован, например, путем активации функциональных групп, доступных на подложке. Термин «активированная подложка» относится к подложке, в которой взаимодействующие или реакционно-способные функциональные группы образуются или активируются путем химических модификаций, известных специалисту в данной области техники. Например, субстрат, содержащий карбоксильные группы, необходимо активировать перед использованием. Кроме того, доступны субстраты, которые содержат функциональные группы, которые могут вступать в реакции с определенными группами, уже присутствующими в нуклеиновых кислотах. Некоторые из этих реакций ускоряются под действием тепла или УФ. Примером являются аминогруппы на поверхности субстрата, которые могут связываться с определенными основаниями в ДНК.
in situ
В альтернативном варианте, захватывающие зонды можно синтезировать прямо на субстрате. Способы, подходящие для такого подхода, известны специалисту в данной области техники. Примерами являются методики изготовления, разработанные компаниями Agilent Inc., Affymetrix Inc., Nimblegen Inc. или Flexgen BV. Обычно используют лазеры и наборы зеркал, специфично активирующих точки, в которых происходит добавление нуклеотидов. Такой подход может обеспечить, например, размер точек примерно 30 мкм или больше. Захватывающие зонды могут, соответственно, иметь длину примерно до 80 нуклеотидов. В другой, также предусмотренной методике, захватывающие зонды можно иммобилизовать, используя бесконтактный способ струйной печати, в котором олигомономеры иммобилизуют равномерно на специально подготовленные стеклянные слайды. Этим способом синтеза  можно обычно получить 60-членные олигонуклеотидные зонды, основание за основанием, например, из цифровых файлов последовательности.
«Субстратом» может быть любой подходящий субстрат, известный специалисту в данной области техники. Субстрат может иметь любую подходящую форму или формат, например, он может быть плоским, изогнутым, например, выпуклым или вогнутым относительно зоны, где проводится взаимодействие, он может быть гофрированным, или он может быть волнообразным. Также он может иметь шарообразную форму. Особенно предпочтителен субстрат в форме шарикоподобных элементов, которые могут, например, быть организованы в матрицу. Шарики могут располагаться на поверхности поддержки субстрата или могут быть закреплены в реакционной области с помощью соединительных элементов, например, полосок и т.п. Примером шарикоподобных элементов, предусмотренных настоящим изобретением, являются магнитные частицы, содержащие захватывающие молекулы. В качестве альтернативы можно использовать покрытые оболочкой шарики, известные специалисту в данной области техники.
Обычно, субстратом является твердая подложка, то есть содержащая материал подложки в основном не жидкого состава, и, поэтому, позволяющая точное и пригодное для контроля позиционирование захватывающей молекулы на подложке. Примером субстрата является твердый материал или субстрат, содержащий функциональные химические группы, например, аминогруппы или амино-функционализированные группы. Дополнительными примерами субстрата, предусмотренного настоящим изобретением, является пористый материал или пористый субстрат, такой как нейлон, например, Nytran N или Nytran SPC, или Biodyne C. Дополнительным типичным типом подложки или субстрата является непористый субстрат. Предпочтительными из непористых субстратов являются стекло, покрытый поли-L-лизином материал, нитроцеллюлоза, полистирол, сополимеры циклических олефинов (COC), полимеры циклических олефинов (СОР), полипропилен, полиэтилен и поликарбонат. Нитроцеллюлозные мембраны являются традиционными мембранами, обычно используемыми в методиках переноса в сфере применения нуклеиновых кислот. Способы связывания нуклеиновых кислот с нитроцеллюлозой, обычно, посредством физической адсорбции, широко известны в данной области. Основным преимуществом нитроцеллюлозы является ее доступность и известность. Применение нитроцеллюлозных мембран в радиоактивных способах детекции сигнала является традиционным. В качестве альтернативы нитроцеллюлозным мембранам можно использовать нейлон в качестве субстрата, в частности, для связывания нуклеиновых кислот, благодаря его более высокой физической прочности и связывающей емкости, а также более широкому диапазону предлагаемых доступных химических групп на поверхности, которые оптимизируют присоединение нуклеиновых кислот. Иммобилизацию на нейлоновых мембранах можно проводить, например, сшиванием при воздействии света, в частности, УФ, или химической активацией. Было показано, что иммобилизация на нейлоне является очень стойкой при повторных циклах удаления зонды. В качестве объемного материала можно использовать любой подходящий материал, известный специалисту в данной области техники. Обычно используют стекло или полистирол. Полистирол представляет собой гидрофобное вещество, подходящее для связывания отрицательно заряженных макромолекул, поскольку он обычно содержит немного гидрофильных групп. Для нуклеиновых кислот, иммобилизованных на стеклянных слайдах, дополнительно известно, что с увеличением гидрофобности поверхности стекла можно повысить иммобилизацию ДНК. Такое усиление может дать возможность относительно более плотно упакованной структуры. В дополнение к покрытию или обработке поверхности поли-L-лизином, объемный материал, в частности, стекло можно силанировать, например, эпоксисиланом или аминосиланом, или силилировать, или обработать полиакриламидом. Объемный материал можно также покрыть мембранным материалом или нанести на него оболочку из мембранного материала, указанного выше.
2
2
2
2
2
2
Типичная микроматрица может содержать множественные точки, элементы, области индивидуальной иммобилизации или области индивидуальной молекулярной идентичности. Например, матрица может содержать более 2, 5, 10, 50, 100, 500, 750, 1000, 1500, 3000, 5000, 10000, 20000, 40000, 50000, 70000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 750000, 800000, 1000000, 1200000, 1500000, 1750000, 2000000 или 2100000 точек, элементов, либо областей индивидуальной иммобилизации или областей индивидуальной молекулярной идентичности. Эти области могут содержаться в области площадью меньше примерно 20 см, меньше примерно 10 см, меньше примерно 5 см, меньше примерно 1 см, меньше примерно 1 мм, меньше примерно 100 мкм.
Микроматрица может содержать один или несколько видов захватывающих молекул, то есть один или несколько различных типов молекул могут присутствовать в микроматрице, как, например, нуклеиновые кислоты и белки, белки и углеводы и т.п. В альтернативном варианте, термин «один или несколько видов» также относится к захватывающим молекулам одной категории или имеющим одну форму или формат, например, нуклеиновым кислотам, но которые не являются идентичными или аналогичными по своей молекулярной идентичности, например, последовательности в случае нуклеиновых кислот или белков. Таким образом, микроматрица может включать различные нуклеиновые кислоты или различные белки, или различные углеводы, или различные антитела, или различные лиганды и т.п., или любую комбинацию различных нуклеиновых кислот и различных белков и т.п. Если в микроматрице присутствуют захватывающие молекулы различной молекулярной идентичности, эти захватывающие молекулы могут быть частично идентичными или частично аналогичными, то есть они могут иметь, в частности, в случае нуклеиновых кислот, перекрывающиеся последовательности, или они могут не иметь перекрывающихся последовательностей. Эти захватывающие молекулы могут содержать любую подходящую область или процент генома, например, примерно от 0,00001% до примерно 30% генома, например, по меньшей мере примерно 0,00001, 0,00005, 0,0001, 0,0005, 0,001, 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,75, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 или 30% генома организма, предпочтительно генома млекопитающего, более предпочтительно, генома человека, и/или они могут быть комплементарны таким областям. Такая область или процент идентичности могут включать в себя, например, группу примерно из 2 до 5000 генов, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100, 150, 200, 350, 500, 750, 1000, 1200, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000 или более 5000 генов. Такие гены могут быть либо расположены в прилегающих геномных участках или областях, либо в альтернативном варианте они могут быть распределены по геному. Также предусмотрены подгруппы, комбинации, определенное расположение, например, определенное расположение, исходя из данных об экспрессии и т.п., генов.
Реакционная зона может дополнительно содержать одну или несколько единиц контроля и/или регуляции температуры. Используемый в настоящем описании термин «единица контроля и/или регуляции температуры» относится к механическому, электрическому (резистивному), излучающему, микроволновому или любому другому нагревательному устройству или элементу, которое способно обеспечивать и/или поддерживать температуру в диапазоне между примерно 0,5°C и 120°C, предпочтительно, в диапазоне между примерно 20°C и 100°C, более предпочтительно, в диапазоне между примерно 35°C и 95°C. Таким образом, единица контроля и/или регуляции температуры может функционировать либо в качестве нагревательного элемента, если температура окружения в реакционной зоне находится ниже некоторого заданного значения, либо в качестве охлаждающего элемента, если температура окружения в реакционной зоне находится выше некоторого заданного значения. Единица контроля и/или регуляции температуры может соответственно включать в себя датчик для измерения температуры окружающей среды и элемент, запускающий охлаждение или нагревание, если измеренная температура не соответствует заданному значению. Заданным значением может быть любое подходящее значение, предпочтительно, значение температуры между примерно 0,5°C и 120°C, предпочтительно, в диапазоне между примерно 20°C и 100°C, более предпочтительно, в диапазоне между примерно 35°C и 95°C. Единица контроля и/или регуляции температуры может либо иметь независимое управление, например, через свой собственный интерфейс, либо она может быть встроена в сеть аналогичных единиц или может быть соединена с регулирующим электронным устройством и т.п. Реакционная зона может, предпочтительно, содержать от 1 до 15 единиц контроля и/или регуляции температуры. Если присутствует более одной такой единицы, то их температура может отличаться относительно других единиц, либо она может быть идентичной или аналогичной. Например, устанавливая такие единицы в реакционной зоне на различные температуры можно создать в реакционной зоне температурный градиент. Предпочтительно, чтобы в реакционной зоне была установлена температура, которая способствует взаимодействию между отбираемыми молекулами-мишенями и захватывающими молекулами в реакционной зоне.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения реакционная зона может представлять собой объемную реакционную зону, то есть реакционную зону, содержащую большинство элементов устройства, например, микроматрицу и т.д. Такая реакционная зона может, например, располагаться внутри и/или внизу устройства.
Устройство по настоящему изобретению дополнительно содержит по меньшей мере одну нереакционную зону, содержащую одну или несколько регулирующих единиц для контроля и/или регуляции температуры в нереакционной зоне, как было описано в настоящем документе выше. Таким образом, устройство содержит вторую или дополнительную зону с нагревательными и/или охлаждающими элементами. Реакционная зона и вторая нереакционная зона могут соответственно иметь разную температуру, либо аналогичную или идентичную температуру. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере одна вторая нереакционная зона имела другую температуру по сравнению по меньшей мере с одной реакционной зоной. Например, если температура по меньшей мере в одной реакционной зоне установлена на значении х, то температура во второй нереакционной зоне может быть установлена на значении х + 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 или 85 °C. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере одна нереакционная зона, содержащая одну или несколько регулирующих единиц для контроля и/или регуляции температуры в зоне, была установлена на температуру, которая способствует активации и/или реактивации молекул-мишеней, отбираемых на захватывающих молекулах в реакционной зоне.
Дополнительно или в качестве альтернативного варианта, такие нереакционные зоны могут содержать единицы, элементы или оборудование, позволяющие изменять дополнительные параметры, такие как присутствие заряженных элементов, присутствие ионов, или способные передавать механическое или сдвигающее усилие и т.д. Например, нереакционная зона (зоны) может проводить электрический или электрофоретический ток, зона (зоны) может обеспечивать определенный рН или определенное присутствие химических или физических элементов, например, присутствие некоторых кислот, солей, растворителей и т.д., и/или зона (зоны) может обеспечивать интенсивное движение среды. Любое из вышеуказанных дополнительных свойств могут также быть доступны в любой из других частей устройства по настоящему изобретению, например, в реакционной зоне.
В определенном варианте осуществления настоящего изобретения по меньшей мере одна нереакционная зона, содержащая одну или несколько единиц контроля и/или регуляции температуры, может быть поверхностной реакционной зоной. Используемый в настоящем описании термин «поверхностная реакционная зона» относится к реакционной зоне, указанной в настоящем документе выше, которая расположена снаружи или на поверхности устройства по настоящему изобретению. Предпочтительно, чтобы поверхностная реакционная зоне не включала микроматрицу, а предпочтительно использовалась для процессов нагревания и/или реактивации.
По меньшей мере одна реакционная зона и по меньшей мере одна нереакционная зона, содержащие одну или несколько единиц контроля и/или регуляции температуры, могут быть дополнительно соединены. Соединение может быть жидкостным соединением, если в устройстве содержится жидкая среда. В альтернативном варианте, соединение может быть другим, например, может представлять собой газовое соединение или пространственное соединение и т.д. Используемый в настоящем документе термин «соединение» относится к обеспечению возможности переноса вещества, например, среды, описанной в настоящем документе выше, из одной зоны в другую. Такой перенос может быть либо пассивным, или может быть усиленным или осуществляемым средством переноса. Соединение между зонами устройства может быть в виде трубок, каналов, трубопроводов или в виде перехода одной зоны в другую, например, при соприкосновении зон. Такое соприкосновение зон может иметь любой подходящий формат, например, зоны могут быть соединены боковыми сторонами, или могут быть расположены друг над другом или в стопке, или они могут формировать извилистые структуры и т.д.
«Средством переноса», присутствующим в устройстве по настоящему изобретению, может быть любой подходящий элемент, аппарат или единица, которые дают возможность движения и/или переноса среды из одной зоны в другую и наоборот, то есть, по меньшей мере из одной реакционной зоны по меньшей мере в одну нереакционную зону, содержащую одну или несколько единиц контроля и/или регуляции температуры. Примером такого средства переноса является насос, например, 3-клапанный насос или цилиарный насос. Однако также предусмотрены любые другие типы или формы насосов, которые можно соответственно встроить в устройство по настоящему изобретению. Такое средство переноса может быть расположено между реакционной зоной и нереакционной зоной, содержащей одну или несколько единиц контроля и/или регуляции температуры, и/или может быть расположено на концах устройства. Кроме того, средство переноса можно встроить в одну или несколько зон устройства. Предпочтительно, чтобы средство переноса могло регулировать поток жидкости в устройстве. Регуляцию можно осуществлять, устанавливая и/или меняя скорость потока до некоторого значения. Такое значение можно установить относительно и в зависимости от переносимого материала, используемой температуры, молекул-мишеней или захватывающих молекул, типа взаимодействия, которое происходит между молекулой-мишенью и захватывающей молекулой, и т.д. Средство переноса можно, кроме того, использовать с различными интервалами функционирования. Например, средство переноса можно использовать в течение определенного периода времени, например, в течение примерно 10 с, 20 с, 30 с, 1 мин, 2 мин, 3 мин, 5 мин, 7 мин, 10 мин, 15 мин, 30 мин, 40 мин, 60 мин и т.п., после чего отключать на определенный период времени, например, на примерно 10 с, 20 с, 30 с, 1 мин, 2 мин, 3 мин, 5 мин, 7 мин, 10 мин, 15 мин, 30 мин, 40 мин, 60 мин и т.п., затем снова включать, например, на примерно 10 с, 20 с, 30 с, 1 мин, 2 мин, 3 мин, 5 мин, 7 мин, 10 мин, 15 мин, 30 мин, 40 мин, 60 мин и т.п. и т.д. Интервалы можно менять или модифицировать в соответствии с предшествующими интервалами или стадией реакций взаимодействия, то есть они могут быть длиннее или короче на последующих стадиях. Если в устройстве присутствует более одного средства переноса, то либо все средства переноса могут работать, либо только часть них. Число и расположение активных средств переноса можно определить и установить в соответствии с присутствием и местоположением реакционной зоны и/или второй зоны.
В определенном варианте осуществления настоящего изобретения устройство может включать одну реакционную зону, одну нереакционную зону, содержащую одну или несколько единиц контроля и/или регуляции температуры, и одно средство переноса, описанные в настоящем документе выше. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения устройство может включать более одной реакционной зоны и/или более одной нереакционной зоны, содержащей одну или несколько единиц контроля и/или регуляции температуры, и/или более одного средства переноса, описанных в настоящем документе выше. В устройстве могут присутствовать, например, серии из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 или больше 50 реакционных зон. В альтернативном варианте или дополнительно в устройстве могут присутствовать серии из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 или более 50 нереакционных зон, содержащих одну или несколько единиц контроля и/или регуляции температуры. В альтернативном варианте или дополнительно в устройстве могут присутствовать серии из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 или более 50 средств переноса. Также в настоящем изобретении предусмотрена комбинация нескольких реакционных зон и одной нереакционной зоны, содержащей одну или несколько единиц контроля и/или регуляции температуры, и одного или нескольких средств переноса.
В дополнительном определенном варианте осуществления настоящего изобретения устройство может содержать по меньшей мере одну объемную реакционную зону и по меньшей мере одну поверхностную реакционную зону. Устройство может также включать более одной, например серии из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 или более 50 объемных и поверхностных реакционных зон. В альтернативном варианте или дополнительно в устройстве могут присутствовать серии из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 или более 50 средств переноса. Все эти зоны могут быть встроены в камеру или могут быть помещены в индивидуальные корпуса, например, соединенные соединительными элементами, описанными в настоящем документе выше.
Если в устройстве присутствует более одной зоны определенного типа, то различные типы зон могут присутствовать в матричной форме, то есть по существу все сгруппированные вместе. В альтернативном варианте за различными типами зон, например, реакционными зонами, могут следовать нереакционные зоны, содержащие одну или несколько единиц контроля и/или регуляции температуры, и/или одно или несколько средств переноса.
Если присутствует более одной реакционной зоны, то реакционные зоны могут включать другие микроматрицы, то есть микроматрицы, содержащие другие захватывающие зонды. «Другой микроматрицей» может быть микроматрица, которая способна, например, взаимодействовать с другими частями геномной ДНК, или другими наборами белков, антител, лигандов и т.п. Специфичность взаимодействия также может перекрываться между микроматрицами или зонами с захватывающими молекулами. Различия между захватывающими зондами могут также присутствовать в одной реакционной зоне или в пределах одной микроматрицы. Например, специфичное взаимодействие возможно только на одной стороне матрицы. Можно объединить от одной до нескольких таких различных микроматриц или зон с различными захватывающими молекулами, например, в виде серий. Например, некоторые области геномной ДНК можно покрыть последовательными полосками, областями или сериями различных микроматриц или захватывающих молекул.
В дополнительном конкретном варианте осуществления настоящего изобретения первая реакционная зона может включать захватывающие молекулы для распространенных молекул-мишеней, предпочтительно, высоко распространенных молекул-мишеней, например, распространенных молекул нуклеиновых кислот. Последующие реакционные зоны могут содержать захватывающие молекулы для менее распространенных молекул-мишеней, таким образом, формируя в предпочтительном варианте осуществления последовательность реакционных зон начиная от часто встречающихся мишеней и до, редко встречающихся. Одна или несколько дополнительных нереакционных зон, содержащих одну или несколько единиц контроля и/или регуляции температуры, и одно или несколько средств переноса могут быть разбросаны между одной или несколькими реакционными зонами, например, после каждой, после каждой 2-й, 3-й и т.п. реакционной зоны или находиться в крайних положениях. Такое расположение можно, предпочтительно, использовать для дифференциального отбора сложных молекул-мишеней, поскольку предполагается, что молекулы-мишени взаимодействуют лучше с захватывающими молекулами при снижении фона по мере прохождения каждой новой реакционной зоны.
Зоны могут быть расположены любым подходящим образом. Например, все зоны можно расположить в непрерывной линии, например, в извилистой линии, описанной в настоящем документе, или их можно расположить радиально, например, с соединением или без соединения через центр круга, или их можно расположить в 3-мерных зонах, находящихся выше или ниже центрального уровня.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения единица контроля и/или регуляции температуры внутри зоны может быть встроена в зону. Например, единица может присутствовать в качестве нагревающего устройства в основании или крышке, или стенке зоны. Встраивание может быть осуществлено таким образом, что нагревающее устройство покрыто структурой, например, стеклянной или пластиковой пластиной, которая, предпочтительно, позволяет быстрый отвод тепла или холода. В альтернативном варианте единица может быть расположена в виде выступающего элемента в зоне и, соответственно, способна рассеивать тепло или холод прямо в зоне. Также можно объединить обе формы. Кроме того, одно или несколько средств переноса могут быть встроены в зону по изобретению, например, в реакционную зону. Встраивание может быть осуществлено таким образом, что средство переноса покрыто структурой, или расположено как выступающий элемент в зоне.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения единица контроля и/или регуляции температуры в зоне может располагаться вне зоны. Например, единица может быть расположена выше или ниже зоны и может рассеивать тепло с помощью кондукции, конвекции, излучения (инфракрасного или микроволнового) или в форме горячего или холодного воздуха или горячих или холодных жидкостей, или в форме микроволн, с помощью элементов Пельтье и т.п. Кроме того, можно использовать встроенные охлаждающие и/или нагревающие каналы, через которые прокачивается холодная или горячая жидкость, или можно использовать массивные охлаждающие элементы, например, металлические, к которым может быть присоединено устройство. Также предусмотрено соединение с источником ультразвуковых волн, которые можно использовать для нагревания. Тепло также можно генерировать рассеянием электрической энергии в резисторе и/или с помощью элементов Пельтье. Зоны могут дополнительно располагаться в камерах или пространстве с заданной температурой. Кроме того, любые из вышеуказанных встроенных или внешних нагревающих или охлаждающих единиц можно объединить любым подходящим способом, известным специалисту в данной области техники.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения реакционная зона, указанная в настоящем документе выше, нереакционная зона, содержащая одну или несколько единиц контроля и/или регуляции температуры, указанная в настоящем документе выше, и/или средство переноса, указанное в настоящем документе выше, могут быть расположены в замкнутом контуре. Используемый в настоящем документе термин «замкнутый контур» относится к расположению указанных зон и средств, которое позволяет однонаправленный поток вещества, например, жидкостей, из одной зоны в следующую, и соответствующий возврат вещества в исходную зону. Такое расположение позволяет непрерывное, циркулирующее движение вещества через идентичные зоны, например, через одну или несколько реакционных зон. Циркуляция в частности позволяет повысить число событий взаимодействия между молекулами-мишенями и захватывающими молекулами в результате повторения вероятности соседства этих молекул. Соединение может представлять собой указанное выше в настоящем документе, например, через трубки, каналы, трубопроводы и т.п. При таком расположении скорость потока в различных частях устройства можно регулировать до необходимой. Например, можно использовать скорость потока, сниженную в области взаимодействия, которая позволяет более длительное время взаимодействия для молекул-мишеней. Замкнутый контур может дополнительно иметь одну или несколько входных и выходных точек или портов, например, 1, 2, 3, 4 или 5 входных или выходных отверстий. В этих портах можно вводить или удалять жидкость, содержащую молекулы-мишени, связывающиеся с захватывающими молекулами.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения реакционная зона, указанная в настоящем документе выше, нереакционная зона, содержащая одну или несколько единиц контроля и/или регуляции температуры, указанная в настоящем документе выше, и/или средство переноса, указанное в настоящем документе выше, могут быть расположены в прямоточной линии. Используемый в настоящем документе термин «прямоточная линия потока» «Single flow path» относится к линейному расположению зон без контурного элемента. При таком расположении реакционная зона может быть объединена на одной стороне со средством переноса, например, насосной зоной или камерой, а на другой стороне может быть соединена с нереакционной зоной, содержащей одну или несколько единиц контроля и/или регуляции температуры, указанных в настоящем документе, за которой, в свою очередь, следует средство переноса, например, насосная зона или камера. Соединение может представлять собой указанное выше в настоящем документе, например, через трубки, каналы, трубопроводы и т.п. Средство переноса, соответственно, обеспечивает возможность возвратно-поступательного переноса вещества или среды через реакционную зону и нереакционную зону, содержащую одну или несколько единиц контроля и/или регуляции температуры, указанную в настоящем документе. В альтернативном варианте зоны могут быть расположены в любой другой комбинации, при условии сохранения их линейного расположения. В дополнительном альтернативном варианте можно использовать раздвоенные конечные траектории потока, содержащие средство переноса или зону, указанные выше.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения реакционная зона, указанная в настоящем документе выше, нереакционная зона, содержащая одну или несколько единиц контроля и/или регуляции температуры, указанная в настоящем документе выше, и/или средство переноса могут быть встроены в единую полость или камеру. Такое встраивание может быть выполнено таким образом, что реакционная зона, указанная в настоящем документе выше, нереакционная зона, содержащая одну или несколько единиц контроля и/или регуляции температуры, указанных в настоящем документе выше, и/или средство переноса будут находиться на близком расстоянии друг от друга, или они будут представлять собой продолжение одной зоны в другую или слитые зоны. В особенно предпочтительном варианте осуществления устройство по настоящему изобретению включает реакционную зону, содержащую микроматрицу, указанную в настоящем документе выше, и более одной единицы контроля и/или регуляции температуры для контроля и/или регуляции температуры, причем температура в указанных единицах установлена на двух или нескольких значениях, например, значениях, которые способствуют взаимодействию между молекулой-мишенью и захватывающей молекулой, и значениях, которые способствуют активации или реактивации молекул-мишеней. Средства переноса могут, соответственно, быть расположены в точках входа и выхода камеры. Камера также может быть организована в виде замкнутой системы без точек входа и выхода или может иметь герметизируемые точки входа и/или выхода, которые можно закрыть после введения среды.
Особенно предпочтительной является удлиненная полость или камера. Используемый в настоящем документе термин «удлиненная» относится к форме камеры, у которой одна сторона камеры длиннее другой. Используемый в настоящем документе термин «длиннее» относится к соотношению примерно 2, 4, 5, 6, 10, 15, 20, 30, 40 или 50 и т.д. Обычно камера может быть шире или ниже, например, примерно в 2, 4, 5, 6, 10, 15, 20, 30, 40 или 50 раз. В альтернативном варианте любая другая форма, фигура или расположение, известные специалисту в данной области техники, также предусмотрены настоящим изобретением.
Такая камера может содержать в дополнительном особенно предпочтительном варианте осуществления любое соответствующее число повторов реакционной зоны, указанной в настоящем документе выше, и/или нереакционной зоны, содержащей одну или несколько единиц контроля и/или регуляции температуры, указанных в настоящем документе выше, и/или средство переноса, указанное в настоящем документе выше. Например, количество этих зон может составлять 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15.
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанные в настоящем документе выше замкнутый контур или прямоточная линия потока могут быть расположены с возможностью непрерывного обмена вещества, например, жидкости, между по меньшей мере одной реакционной зоной и по меньшей мере одной нереакционной зоной, содержащей одну или несколько единиц контроля и/или регуляции температуры. Используемый в настоящем документе термин «непрерывный обмен вещества» относится к постоянной скорости потока в вышеуказанных зонах. Термин также относится к количественному обмену вещества между зонами, то есть все или по существу все вещество, среда или жидкость, присутствующие в одной зоне, могут быть перенесены в следующую или другую зону. Используемое в настоящем документе выражение «по существу все» относится по меньшей мере примерно к 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99, 99,5 или 100% вещества. Соответствующий обмен вещества можно осуществлять путем использования гидрофобных или сверхгидрофобных веществ в зонах или соединяющих областях или соединительных трубках или каналах и т.п., путем исключения локальных воронок или турбулентности в зонах, например, путем исключения карманов или углов на пути потока и/или путем регуляции скорости потока и т.п. до уровня, обеспечивающего количественный обмен и т.д. Обмен вещества или жидкости может происходить однократно или несколько раз, например, примерно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000 или более 1000 раз.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения устройство, описанное в настоящем документе выше, может дополнительно содержать средство перемешивания. Используемый в настоящем документе термин «средство перемешивания» относится к перемешивающей структуре, которая обычно находится на траектории потока вещества или среды, например, на траектории потока флюида или жидкости, и способно вызывать образование локальных воронок и/или турбулентность. Такими перемешивающими структурами могут быть, например, одна или несколько распределяющих или разделительных пластинок в линии потока, бугорков или выступов на линии потока, наличие изгибов в линии потока или любым другим подходящим механическим элементом или элементом окружения, известным специалисту в данной области техники. В альтернативном варианте перемешивание можно также обеспечить с помощью перекачивающих или активных перемешивающих единиц, например, турбиноподобных единиц, мешалок, барботеров или барботирующей среды, в частности мешалок для жидкостей. Применение этих элементов может привести к повышению гомогенности в зоне в отношении температуры среды, в частности, жидкости, и/или повышению гомогенности относительно содержания отбираемых молекул-мишеней.
Предпочтительно, чтобы средство перемешивания было расположено в областях соединения зон устройства, например, в зонах жидкостного соединения между зонами. Например, все жидкостные соединения, или 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80% или 90% соединений могут содержать такое средство перемешивания. Средство перемешивания может присутствовать на входе, в середине, на выходе или в любом другом месте соединения, или по всему соединению. Например, средство перемешивания может заполнять примерно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% диаметра соединения, например, трубы, канала или трубопровода.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения любая из вышеописанных зон и/или все устройство могут содержать извилистую линию потока. Используемый в настоящем документе термин «извилистая линия потока» относится к сильно изогнутой и искривленной линии потока, предпочтительно, включающей значительную часть площади зоны. Например, линия потока может быть искривлена или изогнута таким образом, что до 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% площади зоны или всего устройства покрыты или заняты линией потока. Линия потока может, в определенном варианте осуществления изобретения, включать одну или несколько микроматриц или иммобилизованных захватывающих молекул. В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения извилистая линия потока может присутствовать только в реакционной зоне или присутствовать только в нереакционной зоне, содержащей одну или несколько единиц контроля и/или регуляции температуры. По длине извилистой линии потока могут быть расположены средства переноса, например, в стенке устройства или в любом другом подходящем местоположении. Извилистая линия потока может дополнительно иметь раздвоение, приводя к образованию внутреннего контура, который дополнительно может быть оборудован дополнительными средствами переноса, позволяющими циркуляцию среды через извилистую линию потока.
Точки раздвоения или любые другие места в устройстве могут быть обеспечены любым подходящим типом ворот, порталов или клапанов. Такие элементы могут обладать способностью контролировать направление и скорость потока среды. Кроме того, зоны и/или соединения могут дополнительно включать решетки и/или фильтры для удаления или детекции элементов в среде. Решетки или фильтры могут иметь определенный размер пор, позволяющий проходить только объектам, размер которых меньше отсекающего размера. Например, с помощью таких элементов можно отделить другие типы клеток, макромолекулы, такие как белки и т.п.
В дополнительном особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения устройством является устройство, разработанное для отбора молекул-мишеней нуклеиновых кислот. Соответственно, устройство может включать микроматрицу из захватывающих молекул нуклеиновых кислот, которые, предпочтительно, комплементарны отбираемым молекулам-мишеням, указанным в настоящем документе выше. Кроме того, устройство может включать одну или несколько реакционных зон, которые функционируют в качестве зон для гибридизации указанной микроматрицы и указанных отбираемых молекул-мишеней. Температуру в указанной гибридизационной зоне можно поддерживать на любом подходящем уровне, например, между примерно 20°C и 70°C, между примерно 40°C и 70°C, или температура может составлять примерно 20, 30, 40, 42, 45, 50, 55, 58, 59, 60, 62, 65, 67 или 70°C. Температуру можно регулировать или устанавливать в зависимости от одного или нескольких параметров реакции гибридизации, например, длины захватывающей молекулы, состава среды, концентрации солей или ионов, рН, скорости потока и т.п. Длина молекул захватывающего зонда может находиться между примерно 20 и 150 нуклеотидами. Особенно предпочтительны захватывающие молекулы с длиной примерно от 40 до 70 нуклеотидов, более предпочтительно, с длиной примерно от 50 до 60 нуклеотидов. В общем, более короткие захватывающие молекулы могут требовать более низкой температуры гибридизации, а более длинные захватывающие молекулы могут требовать более высокой температуры гибридизации. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, гибридизация в реакционной зоне является специфичной гибридизацией. Кроме того, более низкие значения температуры можно использовать в случае реакционных буферов, содержащих значительный процент формамида, в то время как для реакционных буферов без формамида можно использовать более высокую температуру.
Используемый в настоящем документе термин «специфичная гибридизация» относится к связыванию, образованию дуплексов или гибридизации нуклеиновой кислоты с конкретной дополняющей нуклеиновой кислотой, например, захватывающим зондом, при жестких условиях. Термин «жесткие условия» в контексте гибридизации нуклеиновых кислот зависит от последовательности и ее длины, и может отличаться при различных параметрах эксперимента, что известно специалисту в данной области техники. Примерами жестких условий гибридизации, которые можно использовать в контексте настоящего изобретения являются гибридизация в буфере, содержащем 50%-й формамид, 5×SSC и 1%-й SDS при 42°C, или гибридизация в буфере, содержащем 5×SSC и 1%-й SDS при 65°C. Примеры жестких условий гибридизации могут также включать гибридизацию в буфере, содержащем 40%-й формамид, 1М NaCl и 1%-й SDS при 37°C. В альтернативном варианте гибридизацию можно проводить в 0,5 M NaHPO, 4,7% SDS, 1 mM EDTA при 65°C. Дополнительные жесткие гибридизационные условия включают гибридизацию при 60°C или более высокой температуре и в 3×SSC (450 mM хлорид натрия/45 mM цитрат натрия) или инкубацию при 42°C в растворе, содержащем 30% формамида, 1 M NaCl, 0,5% саркозината натрия, 50 mM MES, pH 6,5. Условия проведения отмывки, используемые в контексте настоящего изобретения, могут включать, например, концентрацию соли примерно 0,02 молярную при рН 7 и температуру по меньшей мере примерно 50°C или примерно от 55°C примерно до 60°C; или концентрацию соли примерно 0,15 M NaCl при 72°C в течение примерно 15 мин; или концентрацию соли примерно 0,2×SSC при температуре по меньшей мере примерно 50°C или от примерно 55°C до примерно 60°C в интервале от примерно 15 до примерно 20 мин; или гибридизационный комплекс промывают дважды раствором с концентрацией соли примерно 2× SSC, содержащим 0,1% SDS, при комнатной температуре в течение 15 мин и затем промывают дважды 0,1×SSC, содержащим 0,1%-й SDS при 68°C в течение 15 мин; или при аналогичных условиях. В качестве альтернативы, отмывку можно проводить в 0,1%-ом SSC/0,1% SDS при 68°C. Жесткими условиями для отмывки также могут быть, например, 0,1×SSC/0,1%-й SDS при 42°C. Кроме того, можно использовать любой подходящий доступный в продаже гибридизационный и/или отмывочный, и/или инкубационный буфер или среду, и т.п.
Среда, используемая для реакций гибридизации по настоящему изобретению, может дополнительно содержать определенные соли, например, соли карбоксильных групп, или соли присоединения кислот к аминогруппам молекул. Соли карбоксильных групп можно получить способами, известными в данной области, и они включают, например, натриевую, кальциевую, аммонийную, железистую или цинковую соли и т.п., и соли с органическими основаниями, которые, образуются, например, с аминами, такими как триэтаноламин, аргинин или лизин, пиперидин, прокаин и т.п. Соли присоединения кислот включают, например, соли с минеральными кислотами, такими как, например, хлористоводородная кислота или серная кислота, или соли с органическими кислотами, такими как, например, уксусная кислота или щавелевая кислота. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения нереакционная зона, содержащая единицу контроля и/или регуляции температуры, является денатурирующей зоной. Используемый в настоящем изобретении термин «денатурирующая зона» относится к реактивации или денатурации молекул-мишеней, отбираемых или связываемых захватывающими молекулами по настоящему изобретению. Предпочтительно, термин относится к зоне, в которой возможно осуществлять денатурацию нуклеиновых кислот, и которую используют для этого. Используемый в настоящем документе термин «денатурация» относится к разделению двухцепочечных нуклеиновых кислот на две отдельные цепи, которые могут возникать при разрушении водородных связей между цепями. Для осуществления денатурации нуклеиновых кислот температуру в денатурирующей зоне можно поддерживать на уровне примерно от 75°C до 100°C, предпочтительно, на уровне примерно от 80° до 95°C, например, на уровне примерно 80, 82, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 или 98°C. Особенно предпочтительной является температура денатурации 95°C.
Если в устройстве по настоящему изобретению присутствуют более одной реакционной зоны и/или денатурирующей зоны, то реакционные зоны могут иметь разную температуру, и/или денатурирующие зоны могут иметь разную температуру. В альтернативном варианте все денатурирующие зоны и все реакционные зоны могут иметь одинаковую или аналогичную температуру. При использовании захватывающих молекул разной длины, например, более чем в одной микроматрице в устройстве, температуру гибридизации можно соответственно регулировать, в частности, следуя общему подходу, приведенному выше. С другой стороны, форма, например, длина и сложность отбираемых молекул-мишеней, то есть нуклеиновых кислот, может оказывать влияние на температуру гибридизации и/или температуру денатурации. Обе температуры могут снижаться при уменьшении длины этих молекул.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к новой улучшенной планировке матрицы. Такую планировку можно использовать для любого типа матрицы, например, для микроматриц, содержащих нуклеиновые кислоты, белковых матриц или любого другого подходящего типа матриц, например, описанного в настоящем документе выше или известного специалисту в данной области техники. Особенно предпочтительны использование или возможность использования системы улучшенной планировки в контексте устройств, описанных в настоящем документе выше. Обычно, новая планировка для матриц больше не содержит зондов, которые должны быть иммобилизованы в форме индивидуальных ячеек, а вместо этого предлагает организацию этих зондов в линиях. Эта новая организация вещества или элементов в матрице обеспечивает преимущество в том, что повышает шанс того, что взаимодействующие соединения, например, комплементарные молекулы нуклеиновых кислот, антитела, лиганды и т.п. найдут соответствующий захватывающий зонд, по сравнению с использованием точек или других форм планировки, используемых до сегодняшнего момента. Присутствие линий, пересекающих канал потока образца, будет дополнительно обеспечивать преимущество в том, что образец вынужден пересекать линию каждого зонда по меньшей мере в какой-либо точке. Соответственно, линии можно использовать как захватывающее устройство для обеспечения более эффективного взаимодействия между захватывающими молекулами и взаимодействующими молекулами, например, молекулами-мишенями. Присутствие новой планировки, включающей в себя линии, предлагает дополнительное преимущество в том, что она чрезвычайно удобна для способов селекции, основанных на технологии микроматриц, поскольку нет необходимости в последующей оптической детекции, то есть оптимизацию реакций связывания с помощью линий можно проводить независимо от любых факторов, связанных с оптической детекцией взаимодействующих элементов, то есть преимущество заключается в том, что организация матрицы диктуется только факторами эффективности связывания, а не факторами, касающимися последующей детекции, и, более важно, распознавания взаимодействий между молекулами-мишенями и захватывающими молекулами.
В конкретном варианте осуществления этого нового аспекта планировка матрицы может содержать линии, которые расположены под углом примерно от 5° до примерно 90° относительно канала на протяжении матрицы.
В дополнительном особенно предпочтительном варианте осуществления этого нового аспекта планировка матрицы может включать в себя линии, которые расположены под углом от примерно 45° до примерно 90° относительно линии потока на протяжении матрицы.
В дополнительном еще более предпочтительном варианте осуществления этого нового аспекта планировка матрицы может включать в себя линии, которые по существу являются перпендикулярными или ортогональными относительно линии потока на протяжении матрицы. Используемый в настоящем документе термин «по существу перпендикулярные» относится к углу примерно от 85° до 95, предпочтительно примерно 90°, относительно канала на протяжении матрицы.
Термин «линия потока» («flow path»), используемый в контексте планировки матрицы, относится к потоку вещества, например, жидкости или зондам в жидкости, относительно матрицы. Линию потока можно задать относительно устройства, содержащего матрицу в фиксированном положении, или матрицу можно расположить относительно линии потока в результате изменения ее положения и/или угла наклона в 3-мерном пространстве. Направление линии потока через матрицу может быть любым, например, линия потока может начинаться с любой стороны матрицы, из любой точки на каждой стороне матрицы или под любым подходящим углом, то есть от 0° до 360°. Линия потока может быть параллельной или может находиться в той же плоскости, что и плоскость матрицы (имеющей угол наклона 0°), или она может иметь наклон, относительно плоскости матрицы. Например, линия потока может иметь наклон от примерно 1° до примерно 45°. При наклоне линия потока может быть направлена сверху матрицы в направлении плоскости матрицы. Линию потока можно также регулировать или поворачивать в обратном направлении в процессе использования матрицы, например, в обратную сторону, с шагом примерно от 1 до 270°, например, с шагом примерно 5°, 10°, 20°, 30°, 45°, 60°, 70°, 80°, 90°, 120°, 145°, 180°, 270° и т.д.
В случае, когда матрица имеет стороны различной длины, например, имеет продолговатую или прямоугольную форму, линия потока, предпочтительно, может быть направлена параллельно более длинным сторонам. В этой конфигурации в матрицу можно поместить большее число линий меньшей длины. В альтернативном варианте, линия потока может быть направлена параллельно более коротким сторонам. В этой конфигурации в матрицу можно поместить меньшее число более длинных линий.
В другом конкретном варианте осуществления этого нового аспекта планировка матрицы может включать в себя линии идентичной или аналогичной длины и/или идентичной или аналогичной ширины. В альтернативном варианте планировка матрицы может включать в себя линии разной длины и/или разной ширины. Термин «разный», используемый в данном контексте, относится к отличию примерно на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 750, 1000 или более 1000% между наиболее короткой и наиболее длинной линией или между наиболее узкой и наиболее широкой линией.
Предпочтительно, чтобы все линии в матрице простирались от одной стороны матрицы до противоположной стороны матрицы, не оставляя непокрытых областей в направлении линии потока. В альтернативном варианте осуществления этого аспекта изобретения линии также могут оканчиваться, не доходя до сторон матрицы, например, не доходя до обеих сторон или не доходя только до одной стороны матрицы.
В дополнительном варианте осуществления этого нового аспекта линии могут продолжаться в направлении углов матрицы, например, если они представлены под углом меньше примерно 90° и больше примерно 5° относительно линии потока. Если предполагается такое продолжение, то линии в углу могут отличаться по качеству по сравнению с другими линиями в матрице. Они могут, например, быть толще других линий. В альтернативном варианте они могут содержать захватывающие молекулы, которые эффективнее вступают во взаимодействия по сравнению с другими захватывающими молекулами, что обеспечивает равную степень взаимодействия в угловых зонах относительно остальной поверхности матрицы. В дополнительном альтернативном варианте их можно использовать для захвата легко захватывающихся фрагментов. Такой подход обеспечивает преимущество в том, что в конечном эксперименте по определению нуклеотидной последовательности можно достигнуть равного покрытия последовательностей.
В дополнительном варианте осуществления этого нового аспекта изобретения каждая линия может содержать другую захватывающую молекулу. В альтернативном варианте каждая линия может включать две или несколько зон, содержащих различные захватывающие молекулы или состоящих из них, например, каждая линия может содержать от 2 до 100 различных захватывающих молекул, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 или 50, или больше 59 различных захватывающих молекул. Индивидуальные зоны в пределах одной линии можно расположить линейно. В альтернативном варианте линии могут включать в себя две или несколько зон, содержащих идентичные захватывающие зоны, между которых находятся зоны, содержащие другие захватывающие молекулы.
В дополнительном варианте осуществления этого нового аспекта изобретения идентичные захватывающие молекулы могут присутствовать в двух или нескольких различных линиях, например, каждая вторая или третья линия и т.п. могут содержать в одной зоне идентичные захватывающие молекулы. Кроме того, некоторые захватывающие молекулы могут содержаться более чем в одной линии, например, некоторые захватывающие молекулы могут присутствовать в 2-50 линиях, например, в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 или более 50 линий матрицы. Эти линии могут быть расположены либо рядом друг с другом, либо могут быть распределены по любой другой подходящей схеме в матрице. Например, каждая 2-я, 3-я, 4-я, 5-я, 6-я, 7-я, 8-я, 9-я, 10-я, 15-я, 20-я, 30-я, 40-я, 50-я, 100-я и т.п. линия может содержать некоторые или определенные захватывающие молекулы или состоять из них.
В дополнительном варианте осуществления этого нового аспекта настоящего изобретения линии, указанные в настоящем документе выше, имеют ширину между примерно 100 нм и примерно 100 мкм, предпочтительно, от примерно 300 нм до 30 мкм, например, ширину примерно 150 нм, 200 нм, 300нм, 400нм, 500 нм, 600 нм, 700 нм, 750 нм, 800 нм, 900 нм, 1 мкм, 2 мкм, 5 мкм, 7 мкм, 10 мкм, 12 мкм, 15 мкм, 20 мкм, 25 мкм, 30 мкм, 35 мкм, 50 мкм, 75 мкм или 100 мкм.
В дополнительном варианте осуществления этого нового аспекта настоящего изобретения линии, указанные в настоящем документе выше, могут быть расположены на любом подходящем и технически достижимом расстоянии. Расстояние между линиями предпочтительно может быть минимально возможным. Исходя из экспериментальных данных, площадь между линиями предпочтительно должна быть меньше площади линий. Кроме того, площадь, не покрытая зондами или линиями зондов, может вызывать специфичное связывание и тем самым снизить процент фрагментов, отобранных на мишени. Расстояние между линиями может составлять от примерно 25 нм до 200 мкм, предпочтительно, от примерно 500 нм до примерно 100 мкм, например, расстояние между лунками может составлять примерно 600 нм, 700 нм, 750 нм, 800 нм, 900 нм, 1 мкм, 2 мкм, 5 мкм, 7 мкм, 10 мкм, 12 мкм, 15 мкм, 20 мкм, 25мкм, 30 мкм, 35 мкм, 50 мкм, 75 мкм, 100 мкм, 150 мкм или 200 мкм.
2
В дополнительном варианте осуществления этого нового аспекта настоящего изобретения на матрице можно создать любое соответствующее количество линий. Число линий в основном зависит от числа и/или длины, и/или сложности захватывающих молекул, помещаемых на матрицу, типа матричного субстрата, предлагаемого общего размера матрицы и т.п. На заданной площади типовой матрицы примерно 1000 мкм можно поместить от примерно 2 до 30000 линий, предпочтительно, от 5000 до 25000 линий, более предпочтительно, от 10000 до 23000 линий.
В дополнительном варианте осуществления этого нового аспекта настоящего изобретения линии, указанные в настоящем документе выше, могут быть расположены в сочетании с различными формами нанесения захватывающих молекул, например, с точками, удлиненными точками, кругами линий, прямоугольниками линий, спиралями и т.п. Круги линий, прямоугольники линий, спирали или любую другую изогнутую или соединенную форму линии можно использовать как единственный тип планировки. Используемые в настоящем документе термины «точки» и «удлиненные точки» относятся, соответственно, либо к дископодобным элементам или коротким широким линиям.
В том случае, когда в планировке используют комбинацию различных форм нанесения, элементы различных форм могут либо перемежаться, либо аналогичные элементы помещают в зоны, за которыми следует следующий тип элемента и т.п. В альтернативном варианте, элементы могут быть распределены на матрице случайным образом. Кроме того, элементы можно наносить в зависимости от траектории потока через матрицу, например, с линиями, пересекающими траекторию потока, точками между линиями или на границах потока и т.п.
Линии по этому новому аспекту настоящего изобретения можно нанести с помощью любой подходящей методики, известной специалисту в данной области техники, например, с помощью методики нанесения точек, включая технологию струйной печати, с помощью дип-пен литографии, с помощью методик наращивания зондов с использованием лазера или микроконтактной печати, или с помощью технологии негативной или фотолитографии. Такие методики и их реализация будут известны специалисту в данной области техники. Например, можно использовать литографические способы, предлагаемые Affymetrix Inc.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения устройство, указанное в настоящем документе выше, может включать иммобилизованные захватывающие зонды, которые организованы в форме точек, удлиненных точек или линий. Особенно предпочтительна организация захватывающих зондов в виде линий, указанных в настоящем документе выше. Кроме того, иммобилизованные захватывающие зонды могут быть организованы в виде набора различных планировок, предпочтительно набора, указанного в настоящем документе выше.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления изобретения устройство по настоящему изобретению может включать иммобилизованные захватывающие зонды, которые расположены в линиях под углом примерно от 20° до 90° относительно линии потока. Особенно предпочтителен угол примерно 90° относительно линии потока, то есть перпендикулярная ориентация линий относительно линии потока. Линии могут дополнительно иметь разные углы относительно линии потока, в частности, углы, указанные в настоящем документе выше в контексте аспекта планировки матрицы.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления изобретения устройство по настоящему изобретению может включать линии, имеющие ширину примерно от 300 нм до 30 мкм. Предпочтительна ширина 300 нм. Также предпочтительна ширина 0,5 мкм, 1 мкм и 10 мкм. Кроме того, линии могут быть расположены на расстоянии от примерно 50 нм до 100 мкм. Особенно предпочтительно расстояние между линиями 2 мкм. Дополнительно линии могут иметь любую ширину, указанную в настоящем документе выше в контексте аспекта планировки матрицы.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу специфичного отбора молекул-мишеней, включающему стадии: (а) введения среды, содержащей одну или более молекул-мишеней в зону любого из устройств, указанных в настоящем документе выше; (b) проведения реакции взаимодействия между указанными молекулами-мишенями и иммобилизованными захватывающими молекулами в реакционной зоне; (с) переноса непровзаимодействовавших или несвязанных молекул-мишеней в нереакционную зону, содержащую одну или более единиц контроля и/или регуляции температуры; (d) реактивации указанных молекул-мишеней в нереакционной зоне, содержащей одну или более единиц контроля и/или регуляции температуры; и (е) переноса реактивированных молекул-мишеней в реакционную зону, таким образом позволяя дополнительное взаимодействие между молекулами-мишенями и иммобилизованными захватывающими молекулами по стадии (b). Используемый в настоящем документе термин «среда, содержащая одну или несколько молекул-мишеней» относится к среде, содержащей молекулы-мишени, указанные в настоящем документе выше, например, нуклеиновые кислоты, белки, пептиды, лиганды любой формы и формата, антитела, антигены, низкомолекулярные соединения, такие как органические, неорганические или смеси органических и неорганических структур, например, углеводы или сахара, полимеры, элементы, такие как клетки или фрагменты клеток, или субкомпартменты клеток, например, бактериальные клетки или их фрагменты, эукариотические клетки или их фрагменты, вирусные частицы или вирусы, или любое производное или комбинация вышеуказанного, которые содержатся в среде. Предпочтительно, чтобы молекулой-мишенью была нуклеиновая кислота, более предпочтительно, ДНК, еще более предпочтительно, геномная ДНК, наиболее предпочтительно, геномная ДНК человека.
Нуклеиновую кислоту, содержащуюся в среде, можно предварительно обработать для того чтобы обеспечить возможность взаимодействия с захватывающими молекулами. Такая обработка может включать в качестве первой стадии фрагментацию молекул нуклеиновой кислоты, например, геномной ДНК. Например, можно провести физическую фрагментацию, следуя соответствующим методикам, известным специалисту в данной области техники, например, которые можно получить из WO 2008/097887. Типичные способы фрагментации включают использование ультразвуковой обработки, распыление или комбинацию двух способов. Впоследствии молекулы нуклеиновой кислоты можно достроить. Например, подходящим подходом для этого является достройка концов, основанная на реакциях получения «тупых» концов ДНК и фосфорилирования, известных специалисту в данной области техники. Дополнительно или в альтернативном варианте молекулы нуклеиновой кислоты можно соединить с адаптерными молекулами, дающими возможность последующей реакции амплификации. Такие адаптерные молекулы можно лигировать с молекулами нуклеиновой кислоты в соответствии с любым подходящим способом, известным специалисту в данной области техники. Такие адаптеры могут дополнительно предупредить или снизить лигирование молекул самих на себя благодаря наличию выступающих концов на адаптерных молекулах, могут быть уникальными относительно целевых нуклеиновых кислот и/или могут быть комплементарными друг другу (смотри также WO 2008/097887). После любой из вышеуказанных стадий нуклеиновые кислоты можно очистить и смешать с подходящей средой. Примером подобной среды является гибридизационный буфер или раствор, указанные в настоящем документе выше.
Среду можно ввести в устройство любым подходящим способом, известным специалисту в данной области техники. Обычно, среду можно ввести в устройство через одно или несколько входных отверстий, описанных в настоящем документе выше. В альтернативном варианте можно поднять крышку, и среду можно ввести на всю площадь устройства; далее крышку можно снова закрыть. Устройство также может быть соединено с сетью других устройств например, прибором для автоматизированной детекции или узлом аппаратов. Соответственно, среду можно автоматически ввести в устройство через трубки или каналы для введения, предпочтительно, оборудованные клапанами и/или средством переноса. Среду можно вводить в любую зону устройства по настоящему изобретению. Предпочтительно вводить среду в нереакционную зону, содержащую одну или несколько единиц контроля и/или регуляции температуры для контроля и/или регуляции температуры внутри зоны. Если среду вводят в указанную зону, среду можно перед проведением последующей стадии активировать, например, нагреванием, например, до температуры от примерно 80 до 99°C, предпочтительно, до 95°C. Среду впоследствии можно перенести в реакционную камеру, предпочтительно, используя средство переноса, указанное в настоящем документе выше.
Впоследствии можно провести реакцию взаимодействия между молекулами-мишенями и иммобилизованными захватывающими молекулами. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения взаимодействием является взаимодействие между молекулами нуклеиновых кислот. Соответственно, проведение реакции гибридизации особенно предусмотрены настоящим изобретением. Такую реакцию гибридизации можно проводить в соответствии с любым подходящим протоколом, известным специалисту в данной области техники, предпочтительно в соответствии с подробностями, приведенными в настоящем документе выше. Особенно предпочтительной является реакция гибридизации, проводимая при температуре примерно от 40°C до 70°C. Гибридизацию, например, можно проводить при температуре примерно 40°C, 42°C, 44°C, 45°C, 50°C, 55°C, 60°C, 65°C и т.п. В качестве захватывающих молекул можно использовать любые из вышеуказанных захватывающих молекул, в случае нуклеиновых кислот можно использовать захватывающие молекулы, содержащие нуклеиновые кислоты, указанные в настоящем документе выше. Описанная реакция взаимодействия может привести к взаимодействию одной или нескольких захватывающих молекул и одной или нескольких молекул-мишеней, например, молекулы нуклеиновых кислот могут связываться с комплементарными захватывающими молекулами. Степень взаимодействия или способность к связыванию между молекулами нуклеиновых кислот, например, между молекулами-мишенями и захватывающими молекулами, можно регулировать с помощью нескольких параметров, например, температуры гибридизации, количества солей и/или формамида в буфере, скорости потока в реакционной зоне и т.п. Предпочтительно, чтобы можно было достигнуть комплементарности примерно от 80% до 100%, более предпочтительно, комплементарности 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99%. Дополнительно, можно контролировать результат процесса взаимодействия, например, используя подходящие контрольные устройства, известные специалисту в данной области техники, например, детекцию флуоресцентных сигналов и т.п.
Молекулы-мишени, которые не взаимодействуют с захватывающими молекулами или которые не связываются с захватывающими молекулами, например, в случае нуклеиновых кислот, которые становятся двухцепочечными в результате взаимодействия с дополнительными комплементарными одноцепочечными нуклеиновыми кислотами, но не образуют дуплексов с захватывающими молекулами, можно впоследствии удалить из реакционной зоны. Это можно осуществить с помощью средства переноса, описанного в настоящем документе выше. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения в устройстве генерируют постоянный или непрерывный поток среды или вещества, который может обеспечивать обмен или замену среды или вещества в реакционной зоне. Среда или вещество, например, гибридизационный буфер, содержащий несвязанные молекулы-мишени или нуклеиновые кислоты, может попадать в нереакционную зону, содержащую одну или несколько единиц контроля и/или регуляции температуры. Такая зона может быть пространственно отделена от реакционной зоны, или может быть встроена в нее, как описано в настоящем документе выше в контексте устройств по настоящему изобретению. В зоне можно (в конкретном варианте осуществления изобретения) установить температуру выше температуры, используемой в реакционной зоне.
status quo antes
После попадания в нереакционную зону, содержащую одну или несколько единиц контроля и/или регуляции температуры, молекулы-мишени можно реактивировать. Реактивация может представлять собой любой подходящий процесс, известный специалисту в данной области техники, который дает возможность создания , в частности, статуса, позволяющего взаимодействие молекул-мишеней с захватывающими молекулами. Реакция может зависеть от используемого типа молекулы-мишени и/или типа захватывающей молекулы. В случае нуклеиновых кислот, реактивация может включать в себя повышение температуры, приводящее к плавлению дуплексных структур, то есть денатурации нуклеиновых кислот. В случае взаимодействий с антителами или лигандами можно изменять параметры, такие как температура, присутствие заряженных единиц, присутствие ионов, механических или сдвигающих сил и т.п. Например, можно подключить электрический ток, можно изменить рН, можно создать более интенсивное движение среды и т.п. Особенно предпочтительной является денатурация молекул нуклеиновых кислот при температуре от примерно 80°C до 98°C, более предпочтительно, примерно 95°C. Стадию реактивации можно проводить в течение любого подходящего промежутка времени, и ее можно контролировать, например, с помощью скорости потока в устройстве. Обычно скорость потока внутри или вблизи нереакционной зоны можно снизить, или средство переноса можно использовать периодически, например, с определенными интервалами от примерно 0,1 с до 10 мин, что позволяет осуществить процесс реактивации. В случае нуклеиновых кислот процесс реактивации или денатурации предпочтительно может привести к денатурации примерно от 50% до 100%, более предпочтительно, по меньшей мере примерно 70%, более предпочтительно, по меньшей мере примерно 85% и, наиболее предпочтительно, по существу всех двухцепочечных молекул-мишеней. Эффекты процесса реактивации можно дополнительно контролировать с помощью соответствующих контролирующих механизмов, известных специалисту в данной области техники, например, с помощью использования интеркалирующих молекул, использования флуоресцентной детекции и т.п.
Впоследствии, реактивированные, например, денатурированные, молекулы-мишени можно перенести в реакционную зону, где может произойти взаимодействие между молекулой-мишенью и захватывающей молекулой. Реакционная зона может быть той же зоной, уже использованной в схеме первого взаимодействия, или может быть другой зоной. Например, при использовании серий реакционных зон, например, с денатурирующими зонами между ними, то реактивированные молекулы-мишени можно переносить в другие реакционные зоны. С помощью контрольных устройств, указанных выше, возможно дополнительно проверять количество молекул-мишеней, присутствующих в среде. В зависимости от количества молекул-мишеней, присутствующих в среде в конкретном варианте осуществления настоящего изобретения, перенос среды можно контролировать. Обычно, перенос можно осуществлять только до тех пор, пока по меньшей мере более 0,01, 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 или 50% от исходного количества молекул-мишеней все еще присутствует в среде. Если такое пороговое значение не достигается, то перенос можно остановить, и/или можно прекратить способ. В альтернативном варианте, если не достигается пороговый уровень, может быть предусмотрено продолжение процесса, например, путем замыкания потока на первой реакционной зоне или других реакционных зонах. Такое замыкание потока можно осуществить, используя клапаны, обводные трубки или каналы и т.п. в устройстве, описанном в настоящем документе выше.
in situ
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения любую из вышеописанных стадий способа можно проводить индивидуально или отдельно от других стадий. Кроме того, одну или несколько стадий можно отменить или исключить, и/или последовательность стадий можно поменять на обратную или изменить любым подходящим образом. Например, после введения среды, содержащей одну или несколько молекул-мишеней, в зону устройства; после проведения реакции взаимодействия между указанными молекулами-мишенями и иммобилизованными захватывающими молекулами в реакционной зоне; и после переноса непрореагировавших или несвязанных молекул-мишеней в зону, содержащую одну или несколько единиц контроля и/или регуляции температуры способ можно остановить. В альтернативном варианте можно не включать стадию переноса, и среду можно реактивировать, например, денатурировать , например, в градиенте температуры. Такой способ можно объединить с элюцией при нагревании, указанном в настоящем документе ниже.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения стадию проведения реакции взаимодействия, стадию переноса непрореагировавших или несвязанных молекул-мишеней в зону, содержащую одну или несколько единиц контроля и/или регуляции температуры, и стадию реактивации молекул-мишеней в нереакционной зоне, содержащей одну или несколько единиц контроля и/или регуляции температуры, и/или стадию переноса реактивированных молекул-мишеней в реакционную зону, можно повторять от одного до нескольких раз. Число повторов может составлять, например, до 1000 раз, предпочтительно, до 100 раз. Стадии можно дополнительно проводить последовательно, то есть одну после другой, или параллельно, в частности, с использованием серий зон. Стадии можно также проводить непрерывно, например, в режиме рециркуляции. Оба варианта также можно объединить при необходимости.
В дополнительном конкретном варианте осуществления изобретения способ можно проводить в течение любого подходящего интервала времени. Например, способ можно проводить в течение интервала времени примерно от 0,5 мин до 150 ч, предпочтительно, в течение интервала времени примерно от 1 мин до 72 ч, более предпочтительно, в течение интервала времени примерно от 5 мин до 20 ч. Еще более предпочтительно, способ можно проводить в течение интервала времени от 10 мин до 2 ч. Время проведения может зависеть, например, от типа, структуры, количества, сложности захватывающих молекул и/или молекул-мишеней.
После завершения стадий переноса, взаимодействия и/или реактивации провзаимодействовавшие или связанные молекулы-мишени можно выделить из микроматрицы с помощью любой подходящей методики, известной специалисту в данной области техники. Например, в случае нуклеиновых кислот связанные ДНК-фрагменты можно элюировать из микроматрицы, например, по протоколам, указанным в WO 2008/097887, в частности, в примерах 3-13 указанного документа. Предпочтительной является элюция нуклеиновых кислот, основанная на высоких температурах, например, температурах 90-99°C, например, при 95°C. В случае белкового или лигандного взаимодействия можно использовать соответствующие подходящие методики выделения или элюции. Такая методика, например, использование высоких концентраций соли, высоких температур, например 95°C, или использование NaOH, известны специалисту в данной области техники и их можно узнать из пособий, например, Lottspeich, F., and Zorbas H. (1998) Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg/Berlin, Germany. Соответственно полученные молекулы можно впоследствии дополнительно подвергнуть обработке или анализу. В случае нуклеиновых кислот молекулы можно дополнительно амплифицировать с помощью ПЦР и/или можно напрямую использовать в секвенировании.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения элюцию при высокой температуре можно проводить с помощью единиц контроля и/или регуляции температуры в зоне, указанных в настоящем документе выше. Например, единицы контроля и/или регуляции температуры в зоне, указанные в настоящем документе выше, которые присутствуют в реакционной зоне, можно нагревать до температуры примерно 95°C, приводящей к элюции провзаимодействовавших элементов, например, нуклеиновых кислот. Такую стадию обычно проводят после смывания исходных немолекул-мишеней, например, части геномной ДНК. Эти элементы можно впоследствии выделить с помощью любого подходящего средства, например, с помощью средства переноса, используя резервуары, приемные единицы, емкости и т.п. Такую элюцию можно осуществлять в процессе проведения дополнительных стадий взаимодействия в других зонах или в процессе работы всего устройства, или после окончания параллельных реакций взаимодействия. Элюированные молекулы можно в дополнительном варианте осуществления изобретения также использовать для дополнительного взаимодействия в том же устройстве, например, с теми же захватывающими молекулами или с другим типом захватывающих молекул или микроматрицами. Такой подход можно использовать для отбора двух или нескольких признаков, присутствующих в одном типе молекулы-мишени.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к применению устройства по настоящему изобретению для специфичного отбора молекул-мишеней, в частности, молекул-мишеней, описанных в настоящем документе выше. Примерами таких молекул являются нуклеиновые кислоты, белки, пептиды, лиганды любой формы и формата, рецепторы, антитела, антигены, низкомолекулярные соединения, такие как, органические, неорганические или смеси органических и неорганических структур, например, углеводы или сахара, полимеры, элементы, такие как клетки или фрагменты клеток, или субкомпартменты клеток, например, бактериальные клетки или их фрагменты, эукариотические клетки или их фрагменты, вирусные частицы или вирусы, или любое производное или комбинация вышеуказанного. Особенно предпочтительным является использование устройства по настоящему изобретению для отбора нуклеиновых кислот, более предпочтительно, молекул ДНК, еще более предпочтительно, молекул геномной ДНК, например, молекул геномной ДНК человека или млекопитающего. Эти молекулы геномной ДНК можно отобрать по присутствию комплементарных областей в захватывающих молекулах. Обычно с помощью этого подхода можно отобрать часть генома, например, от примерно 0,00001% до примерно 30% генома, как, например, по меньшей мере примерно 0,00001, 0,00005, 0,0001, 0,0005, 0,001, 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,75, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 или 30% генома организма, предпочтительно генома млекопитающего, более предпочтительно, генома человека. Такой процент может включать, например, группу от примерно 2 до 5000 генов, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100, 150, 200, 350, 500, 750, 1000, 1200, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000 или более 5000 генов. Такие гены могут либо быть расположены в прилегающих друг к другу участках или областях генома, либо в альтернативном варианте могут быть разбросаны по геному. Также предусмотрены подгруппы, комбинации, сочетание, например сочетание, полученное из данных по экспрессии и т.п. генов. Предварительную подготовку, получение молекул-мишеней, получение захватывающих молекул, элюцию молекул, последующую обработку и т.п. можно проводить по соответствующим методикам, известным в данной области, например, по методикам микроматричной геномной селекции (MGS), методикам захвата мишени, методикам обогащения перед определением нуклеотидной последовательности, описанным в WO 2008/097887. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения устройства или способы по настоящему изобретению можно использовать для обогащения мишени, например, для проведения микроматричной геномной селекции, захвата мишени или обогащения перед определением нуклеотидной последовательности.
Следующие примеры и фигуры приведены для иллюстративных целей. Поэтому, следует понимать, что примеры и фигуры не следует истолковывать как ограничивающие объем изобретения. Очевидно, что специалист в данной области техники будет способен предусмотреть дополнительные модификации принципов, изложенных в настоящем документе.
ПРИМЕРЫ
Пример 1 - гибридизация олигонуклеотидов (ON) на матрице из точек с захватывающими ON на стеклянном субстрате, функционализированном аминосилановым покрытием.
2
Точки с диаметром приблизительно 100 мкм создавали печатью раствора ON (19 п.о.) в PBS в виде матрицы с шагом 300 мкм. После сушки субстраты облучали УФ-светом для сшивки полиА-части ON с аминогруппами, присутствующими на поверхности, с последующей промывкой. На субстраты помещали покровное стекло с помощью вырезанного лазером чувствительного к давлению адгезивного (PSA) слоя. Форму PSA выбирали таким образом, чтобы создавался извилистый канал, соединяющий друг с другом два жидкостных порта на крышке. Эти устройства помещали в структурированное нагревательное устройство с 6 индивидуально контролируемыми зонами площадью 3×6 мм и встроенными температурными датчиками.
Растворы одноцепочечных и двухцепочечных олигонуклеотидов с последовательностью, комплементарной последовательности захватывающих зондов, и несущих флуоресцентную метку (Atto 700) с различными концентрациями прокачивали через извилистый канал при скорости 6 мкл/мин, при этом температуру в 6 нагревающихся зонах устройства поддерживали на следующем уровне 50/50/95/95/50/50°C в направлении потока в течение 30 мин. В конце этой проточной инкубации через каналы прокачивали промывающий раствор (PBS) в течение 5 мин при комнатной температуре. После высушивания устройства помещали в конфокальный флуоресцентный сканер и определяли интенсивность флуоресценции. На фигуре 7 показан типичный результат полученных данных по интенсивности флуоресценции в извилистом канале с указанным направлением потока для случая раствора двухцепочечных олигонуклеотидов с концентрацией 10 нМ. Интенсивность флуоресценции была очень низкой во входной секции извилистого канала, но была очень высокой в выходной секции, то есть после прохождения 95°C-й зоны, в которой двухцепочечные олигонуклеотиды денатурируют таким образом, что свободные одноцепочечные олигонуклеотиды могут гибридизоваться с комплементарным олигонуклеотидным захватывающим зондом на поверхности.
На фигуре 8 показана полученная картина флуоресценции после инкубации при таких же условиях, как на фигуре 7, за исключением температурных настроек, когда использовали 50°C вместо 95°C в средней секции. При таких условиях денатурации не происходит, так что интенсивность связывания не повышается и интенсивность флуоресценции остается низкой.
Пример 2
Гибридизационные тесты проводили на аминосилановых микроматричных слайдах (Genorama) с ПЦР-продуктами (114 п.о.), меченными Atto 700, при скорости потока 6 мкл/мин в микроканалах и при контролируемой температуре в течение 30 мин в 3×SSC-буфере с 0,1%-м SDS.
После гибридизации микроканалы промывали в течение 5 минут в SSC-буфере с 0,2%-м SDS для снижения неспецифичного связывания.
Интенсивность флуоресценции на захватывающих точках и референсных точках измеряли с помощью конфокального сканера; из сигнала от захватывающих точек вычитали фоновую флуоресценцию, и его нормализовали на интенсивность референсных точек.
На фигуре 13 представлен выигрыш в эффективности гибридизации, полученный в результате встроенной денатурации в потоке в гибридизационных каналах:
(А) В этих экспериментальных параметрах образец пропускают через 100 микрометровый канал от входного отверстия до первой стадии гибридизации, проводимой при 50°C; после этого образец проходит через денатурирующую зону с температурой 90°C; образец вводят во вторую гибридизационную зону, в которой гибридизация проходит при 50°C с более высокой эффективностью; и в конце образец выходит через выходное отверстие.
(В) На диаграмме представлен верхний ряд захватывающих точек в (А); флуоресцентный сигнал увеличивается 100 раз при проведении гибридизации после встроенной денатурации.
(С) Выигрыш в эффективности денатурации, полученный в результате встроенной денатурации в гибридизационно-матричном канальном устройстве: встроенная денатурация увеличивает интенсивность флуоресцентного сигнала на 150% по сравнению с гибридизационным сигналом, получаемым от образцов, вводимых в устройство после внешней стадии денатурации в течение 10 минут при 95°C.