Аналоги фрагмента HLDF как модификаторы устойчивости организма к действию холода

АНАЛОГИ ФРАГМЕНТА HLDF КАК МОДИФИКАТОРЫ УСТОЙЧИВОСТИ ОРГАНИЗМА К ДЕЙСТВИЮ ХОЛОДА

Е.Н.Гончаренко1, Л.И.Деев1, И.А.Костанян2, М.Я.Ахалая1, Н.Ю.Кудряшова1, А.Г.Платонов3

биологический факультет, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Воробьевы горы, 119899, Москва, Россия

2Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, ул. Миклухо-Маклая, 16/10, 117871, Москва, Россия 3Экологический факультет, Российский университет дружбы народов, Подольское шоссе, 8/5, 113093, Москва, Россия

Обнаружено, что профилактическое введение синтезированного Tyr-аналога пептида HLDF-6 ограничивало реакцию системы гипоталамус—гипофиз—надпочечники и симпатико-адреналовой системы самцов крыс на холодовое воздействие. HLDF-6 и его Tyr-аналог повышали также устойчивость (продолжительность жизни) самцов мышей к этому воздействию. В аналогичных опытах с самками животных исследованные пептиды подобной биологической активности не проявляли. '

В полипептидной цепи эндогенного фактора дифференцировки HLDF (Human Leukemia Differentiation Factor) был вдентифицирован биологически активный 6-членный фрагмент TGENHR, синтезированный аналог которого (HLDF-6) проявил способность взаимодействовать с липидным компонентом мембран клеток HL-60, влиять на связывание цитокинов с клеточной поверхностью, а также оказывать противоопухолевый эффект на модели перевиваемой NSO миеломы [1]. Неспецифический характер взаимодействия HLDF-6 с биолипидами дает основания предположить, что этот пептид может изменять физико-химические свойства мембран и других клеток, отличных от HL-60, модифицировать чувствительность их липидного компонента к пероксидации, а также влиять на взаимодействие различных биологически активных соединений с биомембранами.

Не исключено, что подобным образом HLDF-6 может модулировать течение важных физиологических и адаптационных процессов как на клеточном, так и на организменном уровне. Об этом, в частности, свидетельствуют результаты исследований влияния пептида HLDF-6 на раннее доимплантаци-онное развитие эмбрионов мышей in vitro. Обнаружено, что пептид благотворно влияет на зародыши, находящиеся в процессе дробления, но не оказывает никакого воздействия на их дифференцировку. На основании этих данных было высказано предположение, что HLDF-6 выполняет роль своеобразного фактора выживания [2].

Для проверки этого предположения было исследовано влияние HLDF-6 и его Tyr-аналога (HLDF-Y) на стресс-реакцию, оцениваемую по ряду биохимических параметров, и жизнеспособность животных в условиях переохлаждения.

Материалы и методика, Объектом исследований служили половозрелые самцы и самки мышей линий CBA/C57Black6, CBWA и SHK (с массой тела 18-20 г) и крыс линии Вистар (180-210 г).

Синтез пептидов проводили твердофазным, методом с использованием Boc/Bzl-методологии. Чистоту полученных препаратов оценивали с помощью аминокислотного и масс-спектрометрического (MALDI-спектрометрия) анали-

зов. Масс-спектрометрический анализ осуществляли на приборе Vision 2000 (Thermo Bioanalysis, Англия) [3]. Свежеприготовленные водные растворы пептидов вводили животным внутрибрюшйнно.

Холодовое воздействие осуществляли, выдерживая животных в ванне с ледяной водой (0-2°С) в течение необходимого времени.

При определейии уровня серотонина (5-ОТ) в селезенке крыс применяли флуорометрический метод [4]. Измерение содержания в надпочечниках катехоламинов (КА) адреналина и норадреналина проводили по [5], а 11-окси-кортикостероидов (КС) — по [6].

При статистической обработке результатов достоверность различий между опытом и контролем оценивали по критерию Стьюдента.

Результаты исследований. Исследование способности HLDF-6 и HLDF-Y повышать устойчивость организма к стрессорным воздействиям проводили в опытах по кратковременному переохлаждению животных, вызывавшему гибель 15-20% животных в контрольной группе. В этих экспериментах влияние HLDF-6 и HLDF-Y на стресс-реакцию организма оценивали по показателям (содержанию в надпочечниках адреналина, норадреналина и 11-кортикостероидов), характеризующим состояние системы гипоталамус—гипофиз—надпочечники и симпатико-адреналовой систем после холодового воздействия. Определение этих биохимических параметров проводили в период максимальной интенсификации процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в организме — через 40 мин. после холодового воздействия [7]. В связи с этим для оценки влияния пептидов на состояние эндогенных защитных систем, способных предотвращать интенсификацию процессов ПОЛ в организме, в селезенке животных определяли уровень серотонина, являющегося эффективным ингибитором пероксидащга биолипидов [8].

Эксперименты проводили по следующей схеме: в различные сро.ки после введения пептида крыс помещали на 5 мин, в ледяную,воду. Одновременно кратковременному переохлаждению подвергали и крыс, которым вместо пептида вводили физиологический pacTBQp. Спустя 40 мин. после окончания воздействия крыс контрольной и двух опытных групп декапитировали и в их тканях определяли содержание указанных выше биологически активных веществ. У животных контрольных групп содержание адреналина, норадреналина, КС в надпочечниках и 5-ОТ в селезенке составляло соответственно 508 ± 40, 235 ± 14, 24,0 ± 1,2 и 3,05 ± 0,45 мкг/г ткани.

Через 40 мин. после действия холода в селезенке и надпочечниках самцов животных наблюдали повышение уровня всех исследуемых биологически активных веществ, тогда как у самок крыс было отмечено лишь снижение содержания серотонина в селезенке (табл. 1). Эти определяемые полом различия в характере изменений содержания КА, КС и серотонина в один и тот же период времени после холодового воздействия, вероятнее всего, обусловлены различной скоростью развития стресс-реакции у самцов и самок животных.

В отсутствие холодового воздействия после введения HLDF-6 и его Туг-аналога крысам обоего пола не было отмечено каких-либо изменений количества биогенных аминов и КС в исследованных тканях. Более того, при всех использованных вариантах применения (введение в дозах 0,5 мг/кг и 1 мг/кг за 4, 24 и 48 ч ) HLDF-6 достоверно не влиял и на сдвиги в содержании этих биогенных веществ, вызываемые переохлаждением у самцов, а также серотонина — у самок крыс (данные не приводятся). В отличие от HLDF-6 его Tyr-аналог HLDF-Y при инъекции самцам крыс в дозе 1 мг/кг за 4 ч до холодового воздействия проявил способность нормализовать содержание биоген1

ных аминов и КС в тканях подопытных животных (табл. 1). В то же время НЫ)Р-У не оказывал какого-либо заметного влияния на эти биохимические показатели у самок крыс, подвергнутых холодовому воздействию.

Таблица 1

Влияние НЬБК-У

Биогенные вещества Ткань Пол Контроль Холод НЫ5Р-У + холод

Адреналин I Надпочечники с? 100 ±6

9 100 ±6 (и = 3) 78 ±9 (я = 8) 66 ±8 (л = 15) р < 0,01

Норадреналин 3 100 ±6

$ 100 ±6 (п= 3) 85+18 (я = 8) 75 ±9 (л = 5) р < 0,01

Кортикостероиды с? 100 ± 5

9 100 ± 17

Серотонин и Я о 5 о в 100 ± 12

$ 100 ± 12 (я = 12) 52 ±2 (п = 7) р < 0,01 58 ±9 (л = 5) р < 0,02

Примечание. За 100% принято содержание биогенных веществ в тканях крыс, не подвергавшихся холодовому воздействию (абсолютные значения этих показателей приведены в тексте); п — число животных в группе; р — показатель достоверности различий относительно контроля по критерию Стьюдента.

Зависящие от пола отличия в действии НЫЗР-У проявились и при оценке влияния на жизнеспособность самцов и самок мышей в условиях интенсивного охлаждения. В этих опытах, результаты которых по самцам приведены в табл. 2, определяли время с момента помещения животных в ледяную воду до их гибели. Величина этого интегрального показателя устойчивости организма к холодовому шоку, в зависимости от линии, пола мышей и от опыта к опыту, варьировала в контроле в пределах от 130 до 175 секунд.

Н1Л)Р-6 и НЬБР-У при всех использованных вариантах предварительного введения не изменяли устойчивости самок мышей к действию холода. В экспериментах же с самцами после введения Н1ЛЭР-6 прослеживалась тенденция к повышению средней продолжительности жизни, а в случае ШЛЭР-У — достоверное повышение жизнеспособности животных в условиях интенсивного охлаждения (см. табл. 2).

Обнаруженная способность НЫ)Р-У сглаживать ответную реакцию системы гипоталамус—гипофиз—надпочечники и симпатико-адреналовой системы организма на холодовое воздействие, а также повышать устойчивость животных к холодовому шоку свидетельствует о наличии адаптогенной активности у этого пептида.

НЫ)Р-6 и Н1Л5Р-У содержат в своем составе остаток гистидина. Известно, что некоторые короткоцепочечные гистидин-содержащие пептиды (ГСП) оказывают положительное влияние на устойчивость организма к различным

экстремальным воздействиям. Ранее было обнаружено, что один из наиболее активных ГСП — карнозин не только предотвращает, интенсификацию ПОЛ и нарушения обмена биогенных аминов в тканях животных, но и снижает процент гибели животных после переохлаждения [7, 9, 10]. Эти эффекты карнозина связывают с его способностью вызывать опосредованные антиок-сидантные эффекты в организме [11, 12]. Низкое значение активной дозы Н1,ОР-У и значительные сроки (4 часа после введения) проявления его про-тивострессоркогс эффекта также позволяют предположить доминирование опосредованных механизмов влияния этого пептида на устойчивость организма к действию холода. Не исключено, что этот эффект Н1Л)Р-У может быть связан с опосредованным влиянием пептида на интенсивность процессов ПОЛ в организме. Однако четкая зависимость адаптогенной активности этого пептида от пола животных, не отмеченная у карнозина и других ГСП [12], указывает на возможность существенных различий в механизмах действия Н1Л)Р-У и карнозина.

Таблица 2

Продолжительность жизни (в % от контроля) самцов мышей в воде (0-2°С) при профилактическом (за 4 часа) введении Н1Л)Р-6 и НЬОР-У

Линия животных Пептид (доза) Холод (контроль) Пептид + холод

CBA/C57Black6 100 ±7 119+13

HLDF-6

SHK (1 мг/кг) 100 ±8 116 + 9

CBWA 100 ± 3 116 ±4

HLDF-Y (л = 25) (,п =25)р< 0,01

SHK (1 мг/кг) 100 ± 5 139 + 8

(п = 24) (« = 25) р < 0,001

Примечание. В контроле (при холодовом воздействии в отсутствие введения препаратов) продолжительность жизни мышей варьировала в разных экспериментах от 130 до 175 секунд; п — число животных в группе; р — показатель достоверности различий относительно контроля по критерию Стьюдента.

Дальнейшее изучение биологической активности синтезированных аналогов TGENHR имеет не только самостоятельное значение, но и представляет особый интерес в связи с возможной перспективностью использования этих пептидов в терапии рака [1].

ЛИТЕРАТУРА

1. Костанян И.А., Астапова М.В., Наволоцкая Е.В. и др. Биологически активный фрагмент фактора клеток дифференцировки клеток линии HL-60. Идентификация и свойства // Биологическая химия. — 2000. — №7. — С. 505-511.

2. Сахарова Н.Ю., Костанян И.А., Лепихова Т.Н. и др. Эффект синтетических пептидов TQVEHR и TGENHR на ранее эмбриональное развитие мышей in vitro // Докл. АН. - 2000. - Т. 372. - С. 84-86.

3. Rodionov I., Ваги М., Ivanov VA. A swellographic approach to monitoring continuous-flow solid-phase peptide synthesis // Pept. Res. — 1992. — Vol. 5. — P. 119-125.

4. Miller E.P., Maicle R.P. Fluorometric determination of indole derivatives // Life Science. - 1970. - Vol. 9. - №3. - P. 747-751.

5. Metcolf G. A rapid method for the simultaneous determination of NA, DA and 5-HT in small amounts of brain tissues // Anal. Biochem. — 1974. — Vol. 57. — №1. — P. 316-320.

6. Панкова Ю.А., Усваитова И.Я. Методы исследования некоторых гормонов и медиаторов / Тр. по новой аппаратуре и методикам. I-й МОЛМИ. Вып. III. — М., 1965. - С. 137-145.

7. Гончаренко Е.Н., Деев Л.И., Ахалая М.Я. и др. Исследование влияния карнозина и мидийного гидролизата на некоторые изменения обмена липидов и аминов у крыс, подвергнутых кратковременному переохлаждению // Вестник МГУ. Сер. 16, Биология. - 1995. - №2. - С. 37-41.

8. Гончаренко Е.Н., Кудряшов Ю.Б. Гипотеза эндогенного фона радиорезистентности. — М.: Изд-во Моск. ун-та, 1980.

9. Гончаренко Е.Н., Антонова С.В., Ахалая М.Я. и др. Влияние карнозина на некоторые компоненты' защитных ресурсов организма в условиях переохлаждения // Вестник МГУ. Сер. 16, Биология. — 1997. — №2. — С. 33-35.

10. Деев Л.И., Байжуманов А.А., Наумова О.В. Сравнительная эффективность влияния препаратов карнозиНа и женьшеня на интенсивность процессов перекисного окисления липидов при переохлаждении животных / Доклады МОИП. Общая биология. — М., 1997. — С. 93-96.

11. Деев Л.И., Граевская Е.Э., Байжуманов А.А. и др. Антиоксидантные и радиоза-щитные эффекты карнозина // Вестник РУДН. Сер. Экология и безопасность жизнедеятельности. — 1997. — №2. — С. 119-124.

12. Болдырев А.А. Карнозин. Биологическое значение и возможности применения в медицине. — М.: Изд-во Моск. ун-та, 1998. — 320 с.

FRAGMENT HLDF ANALOGS AS MODIFIERS OF ORGANISM RESISTANCE TO SUPERCOOLING

E.N.Goncharenko1, L.I.Deyev1, I.A.Kostanyan2, M.Ya.Akhalaya1, N.Yu.Kudryashova1, A.G.Platonov3

biological Faculty, Moscow State University, Vorobjevy Gory, 119899, Moscow, Russia

2Shemyakin & Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Science, Miklukho-Maklaya street, 16/10, 117871, Moscow, Russia 3Ecological Faculty, Peoples’ Friendship Russian University,

Podolskoye shosse, 8/5, 113093, Moscow, Russia

It was shown that the prophylactic administration of synthesized Tyr-analog of a peptide HLDF-6 decreased the response of hypothalamus—hypophysis—adrenal glands system and sympathicoadrenal system of rat males on supercooling. HLDF-6 and its Tyr-analog also increased the resistance (the duration of life) of mouse males to supercooling: In the experiences with females these peptides did not show the similar biological activity.