Полиморфизм гена лептина у коров молочного направления продуктивности

УДК 636.22/.28.082.12 ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА ЛЕПТИНА У КОРОВ МОЛОЧНОГО НАПРАВЛЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ Л.Н. Чижова, д. с.-х. н., проф. Л.В. Кононова, к. с.-х н., доцент Г.Н. Шарко, с. н. с. Г.П. Ковалёва, к. с.-х н., доцент

ВНИИОК-филиал ФГБНУ «Северо-Кавказский ФНАЦ»

Проведено генотипирование по локусу лептина (ЬЕР) (БЫР; Р250, У7Р, А80У) у коров молочного направления продуктивности

(красной степной и швицкой пород). Определен полиморфизм гена лептина, рассчитаны частоты встречаемости аллелей и генотипов. Полученный материал может быть использован в селекционно-племенной работе с данными популяциями. Ключевые слова: крупный рогатый скот, породы коров молочного направления: красная степная, швицкая, ген лептина (ЬЕР), полиморфизм, SNP: R25C, Y7F, A80V, частота встречаемости

UDC 636.22/.28.082.12 POLYMORPHISM OF THE LEPTIN GENE IN COWS OF THE DAIRY DIRECTION OF PRODUCTIVITY

Chizhova L.N., Dr. Agr. Sci., Prof. Kononova L.V., Cand. Agr. Sci., Assistant Professor Sharko G.N., senior researcher Kovaleva G.P., Cand. Agr. Sci., Assistant Professor All-Russian Research Institute of Sheep and Goat Breeding - branch of the FSBSI «North Caucasian FSAC»

Genotyping on the leptin locus (LEP) (SNP: R25C, Y7F, A80V) in the cows of the dairy direction of productivity (Red Steppe and Schwyz breeds) was conducted. The polymorphism of the leptin gene has been determined; the occurrence frequencies of alleles and genotypes have been calculated. The obtained material can be used in selection and breeding work with these populations. Key words: horned cattle, cow breeds of dairy direction: Red Steppe, Schwyz, leptin gene (LEP), polymorphism, SNP: R25C, Y7F, A80V, occurrence frequency

Введение. Скотоводство - одна из ведущих отраслей современного мирового сельского хозяйства. Для крупного рогатого скота характерен довольно большой биологически обусловленный период продуктивного использования (коровы 8-10 лактаций). В последние годы наблюдается определенная тенденция снижения воспроизводительных качеств скота молочного направления продуктивности, остро стоит проблема увеличения продуктивного и племенного использования животных, так как при жестких условиях промышленной технологии срок продуктивного долголетия животных сократился до трёх-четырёх лактаций. Данная проблема кроме

фенотипических факторов имеет и генетическую составляющую, которая непосредственно связана с интенсивной селекцией на увеличение молочной продуктивности [1, 6].

Достижения в сфере современной молекулярной генетики позволяют исследовать гены, коррелирующие с полезными признаками крупного рогатого скота. В настоящее время в качестве гена-маркера, ассоциированного с функциональным долголетием коров и репродуктивными качествами, активно используется аллельный полиморфизм гена лептина (LEP) [2].

Лептин - гормон, вырабатываемый адипоцитами, клетками жировой ткани, - играет важную роль в метаболизме, в частности, в накоплении жира в организме. Структурно лептин представляет собой протеин, состоящий из 167 аминокислот и включающий 21 аминокислотную сигнальную последовательность [7].

Ген лептина расположен в 4 хромосоме крупного рогатого скота. Структура гена лептина представлена промоторной областью, 3 экзонами, 2 интронами и 3"UTR-областью. Полиморфизмы R25C и Y7F встречаются во втором, а A80V - в третьем экзоне LEP-гена [9].

Считается, что лептин обладает плейотропным воздействием на организм. Лептин вовлечён в регуляцию пищевого поведения, влияет на функционирование иммунной системы и репродуктивную функцию, а также на рост и конституцию животных [3].

В литературе описано около 60 полиморфизмов гена лептина. Лептин интересен для селекции тем, что во многом определяет молочную продуктивность скота, содержание компонентов в молоке (белка и жира), и, что не менее важно, он связан с продуктивным долголетием сельскохозяйственных животных.

Установлено, что от LEP - генотипа зависит продолжительность функционального использования коров. Так, коровы с генотипом СС ^ЫР R25C гена лептина) имеют в 3,14 раз больший риск выбраковки, чем животные с гетерозиготными генотипами RC, а коровы с генотипом FF ^ЫР Y7F гена лептина) - в 3,64 раза более высокий риск выбраковки, чем коровы с генотипом YY. Многие авторы отмечают, что полиморфизм локуса R25C ассоциирован с содержанием жира и белка в молоке, лёгкостью отёлов и продолжительностью стельности, а локуса A80V - с продолжительностью хозяйственного использования и уровнем рентабельности [4, 5, 8].

Целью наших исследований было изучение полиморфизма гена лептина ^ЫР: R25C, Y7F, A80V) в выборке коров молочного направления продуктивности красной степной и швицкой пород.

Материал и методы исследований. Методом ПЦР-ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) был исследован полиморфизм по гену LEP у коров красной степной (п=20) и швицкой (п=16) пород.

Выделение ДНК коров проводили из цельной крови с использованием наборов реагентов Diatom™ DNA Prep 100 согласно прописи, предоставленной фирмой-производителем (ООО Лаборатория «Изоген», г. Москва). Принцип действия набора основан на использовании лизирующего реагента с гуанидинтиоционатом, который предназначен для лизиса клеток, солюбилизации клеточного дебриса, а также для денатурации клеточных нуклеаз. Выход ДНК составил 3-5 мкг/100 мкл с OD 260/280 от 1,6 до 2,0.

Выявление SNP полиморфизма в гене LEP проводили в трёх локусах: R25C, Y7F, A80V. При проведении ПЦР-ПДРФ использовали три пары праймеров, каждая из которых давала возможность амплифицировать фрагмент, содержащий SNP. Размер ПЦР-продуктов составил 305; 310 и 424 п.н. соответственно. Анализ полиморфизма проводился с использованием эндонуклеаз рестрикции: Bsp13I (R25C), Bpu14I (Y7F), PspEI (A80V). Последовательности праймеров, размеры ПЦР-продуктов, необходимые для анализа эндонуклеазы рестрикции, и величина фрагментов рестрикции приведены в таблице 1. Таблица 1 - Компоненты и параметры ПЦР/ПДРФ для LEP-

генотип ирования

SNP Последовательность праймеров Размеры ПЦР-продуктов, п.н. Рестрик-таза Величина фрагментов рестрикции, п.н.

R25C F:CCAGGGAGTGCCTTTCATTA R:GGTGTCATCCTGGACCTTCC 305 Bsp13I RR -305 CC - 283 и 22 RC - 305, 283 и 22

Y7F F:CTGCGTGGTCTACAGCACACCTC R:AGGGCCAAAGCCACAGGATTCG 310 Bpu14I YY - 310 FF - 288 и 22 YF - 310, 288 и 22

A80V F:CAAGCAGGAAATAGGGAGTCATGG R:CTGGTGAGGATCTGTTGGTAGGTC 424 PspEI АА - 424, VV - 398 и 26 AV - 424, 398 и 26

Для подсчета частот каждого из аллелей использовали следующую формулу: Р = (2^+Ы2)/2п, где Р - частота аллеля, N-1 - число гомозигот по исследуемому аллелю, N - число гетерозигот, п - объем выборки.

Результаты и их обсуждение. По результатам анализа определена частота встречаемости генотипов гена LEP по полиморфизму R25C: RR, RC и СС; по полиморфизму Y7F: YY, YF и FF и по полиморфизму A80V: АА, AV и VV (табл. 2).

Таблица 2 - Результаты генотипирования коров молочного направления продуктивности

SNP Порода крупного рогатого скота

LEP I группа II группа

красная степная

частота аллелей частота генотипов частота аллелей частота генотипов

R25C R C RR CC RC R C RR CC RC

0,2 0,8 0,05 0,65 0,30 0,16 0,84 0,06 0,75 0,19

Y7F Y F YY FF YF Y F YY FF YF

0,9 0,1 0,90 0,10 - 0,72 0,28 0,60 0,10 0,30

A80V A V AA VV AV A V AA VV AV

0,4 0,6 0,35 0,60 0,05 0,81 0,19 0,60 - 0,40

Анализом результатов генотипирования исследуемых популяций выявлена определенная схожесть частоты встречаемости аллелей в локусе R25C. Установлено, что частота встречаемости аллеля R в красной степной породе составила 0,2, швицкой - 0,16, а концентрация аллеля C - 0,8 и 0,84 соответственно. Гомозиготный «желательный» генотип RR встречался с практически одинаковой частотой (0,05 - в красной степной породе и 0,06 - в швицкой). Частота встречаемости генотипа СС в обеих популяциях довольно высокая и варьировала в пределах 0,65-0,75. Гетерозиготный генотип RC преобладал у коров красной степной породы (0,30 против 0,19 - у швицких).

Полиморфизм локуса Y7F представлен аллелями Y и F с неодинаковой частотой встречаемости, зависящей, по всей видимости, от породных особенностей коров. При анализе частот встречаемости генотипов полиморфизма Y7F в обеих выборках отмечается низкая встречаемость гомозигот FF (0,10), несмотря на высокую частоту встречаемости YY - 0,90 у коров красной степной породы и 0,60 - у швицкой. Гетерозиготные животные YF среди коров красной степной породы не выявлены, а в швицкой породе встречались с частотой 0,30.

По частотам встречаемости аллелей и генотипов локуса A80V данные по исследуемым популяциям разнятся. Так, в выборке коров красной степной породы частота встречаемости аллеля А составила 0,4, а в швицкой породе в два раза больше - 0,81. У коров красной степной породы частота встречаемости аллеля V достигает 0,6 и «нежелательный» генотип VV встречается с частотой 0,60. В группе швицких коров частота встречаемости аллеля V составила 0,19, что практически в три раза меньше, чем в популяции коров красной степной породы и «нежелательный» генотип VV при этом отсутствовал. Доля гетерозигот AV по данному локусу составила 0,05 в красной степной породе и 0,40 - в швицкой (превосходство в восемь раз).

Таким образом, ДНК-диагностика по определению полиморфизма гена лептина (SNP: R25C, Y7F, A80V) и полученные данные могут быть использованы для выявления перспективных животных. Появляется возможность корректировать изменение частот встречаемости тех или

иных аллелей и генотипов в популяции путём определенного отбора и подбора пар для селекционного процесса.

Литература:

1. Ковалюк, Н.В. Использование полиморфизма локуса LEP в селекции черно-пестрого скота /Н.В. Ковалюк, В.Ф. Сацук, Е.В. Мачульская, Н.А. Морковкина, Ю.Ю. Шахназарова //Молочное и мясное скотоводство. - 2017. - № 3. - С. 1416.

2. Ковалюк, Н.В. Выявление полиморфизма в гене лептина крупного рогатого скота / Н.В. Ковалюк, Ф. Дениз //Сборник научных трудов Северо-Кавказского научно-исследовательского института животноводства. - 2014. - Т. 2. - № 3. -С. 30-35.

3. Giblin, L. All Association of bovine leptin polymorphisms with energy output and energy storage traits in progeny tested Holstein-Friesian dairy cattle sires / L. Giblin, S. Butler, B. Kearney, S. Waters et al. // BMC Genetics. - 2010. - № 11:73.

4. Komisarek, J. Impact of leptin gene polymorphisms on breeding value for milk production traits in cattle /J. Komisarek, J. Szyda, A. Michalak, Z. Dorynek //J. Anim. Feed Sci. - 2005. - № 14. - P. 491-500.

5. Komisarek, J. Impact of LEP and LEPR gene polymorphisms on functional traits in Polish Holstein-Friesian cattle /J. Komisarek // Animal Science Papers and Reports. - 2010. - V.10. - P.133-141.

6. Kovaljuk, N.V. LEP gene allelic polymorphism in a subpopulation of ayrshire cattle /N.V. Kovaljuk, A.E. Volchenko, E.V. Machulskaja, V.F. Satsuk //Russian Journal of Genetics. - 2015. - Т. 51. - № 2. - С. 214-217.

7. Szyda, J. Statistical Modeling of Candidate Gene Effects on Milk Production Traits in Dairy Cattle / J. Szyda, J. Komisarek //J. Dairy Sci. - 2007. - № 90. - Р. 2971-2979.

8. Szyda, J. Evaluation markers in selected genes for association with functional longevity of dairy cattle / J. Szyda, М. Morek-Kopec, J. Komisarek, A. Zarnecki // BMC Genetics. - 2011. - 12:30.

9. Yoon, D.H. Highly polymorphic bovine leptin gene / D.H. Yoon, B.H. Cho, Park et al. //J. Anim. Sci. - 2005. - V.18. - № 11. - P.1548-1551.