Способ иммобилизации клеточной подложки на основе биомембран в условиях жидкой культуральной системы
METHOD OF IMMOBILIZATION OF BIOMEMBRANE-BASED CELL CARRIER UNDER CONDITIONS OF LIQUID CULTURAL SYSTEM

Изобретение может применяться в медицине, в частности в офтальмологии, с целью создания биоинженерных трансплантатов, необходимых для реконструкции поврежденных эпителиальных тканей передней поверхности глаза, и позволяет оптимизировать культивирование эпителиальных стволовых клеток в жидких культуральных системах путем создания надежной фиксации подложки-носителя клеток (на основе биомембран), что предотвращает ее деформацию в результате движения жидкостей культуральной системы в течение всего периода культивирования.
В настоящее время для реконструкции поврежденных эпителиальных тканей передней поверхности глаза применяется трансплантация культивированных эпителиальных стволовых клеток различного происхождения на различных подложках на основе биомембран.
Например, для культивирования клеток эпителия эктодермального происхождения (роговичного, буккального и т.д.) с целью их последующего использования в реконструктивной хирургии передней поверхности глаза в настоящее время применяется амниотическая мембрана [Tsai, R.J., Li, L.M., Chen, J.K., 2000. Reconstruction of damaged corneas by transplantation of autologous limbal epithelial cells. N. Engl. J. Med. 343, 86-93; Nakamura, Т., Endo, K., Cooper, L.J., Fullwood, N.J., Tanifuji, N., Tsuzuki, M., Koizumi, N., Inatomi, Т., Sano, Y., Kinoshita, S., 2003. The successful culture and autologous transplantation of rabbit oral mucosal epithelial cells on amniotic membrane. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 106-116], известная своим благоприятным лечебным эффектом при данных патологиях, а также хорошими адгезивными свойствами для культивируемых эпителиальных клеток. При этом подготовка биотрансплантата на основе амниотической мембраны с культивированными на ней эпителиальными клетками, в случае выращивания их с использованием жидких питательных сред, зачастую является достаточно трудной задачей, так как в результате движения жидкостей культуральной системы не иммобилизированная амниотическая мембрана легко деформируется и ее сложно поддерживать в расправленном состоянии, что приводит не только к неправильному распределению клеток, но и к невозможности получения их качественного монослоя.
Известен способ культивирования эпителиальных стволовых клеток, в качестве подложки-носителя при котором используется капсула хрусталика [Galal, A., Perez-Santonja, J.J., Rodriguez-Prats, J.L., Abad, М., Alio, J., 2007. Humananterior lens capsule as a biologic substrate for the ex vivo expansion of limbalstem cells in ocular surface reconstruction. Cornea 26, 473-478]. Этот способ также не предусматривает фиксацию подложки-носителя, что при использовании жидких культуральных сред приводит к ее деформированию и существенно затрудняет процедуру культивирования.
Поэтому для решения этой проблемы предлагается использовать разработанный нами «Способ иммобилизации клеточной подложки на основе биомембран в условиях жидкой культуральной системы», что позволит оптимизировать культивирование эпителиальных стволовых клеток в жидких культуральных системах путем создания надежной фиксации подложки-носителя клеток (на основе биомембран) и предотвратит ее деформацию в результате движения жидкостей культуральной системы в течение всего периода культивирования.
Технический результат предлагаемого изобретения - обеспечение надежной фиксации подложки-носителя клеток на основе биологической мембраны.
Технический результат достигается благодаря тому, что подготовленная в стерильных условиях подложка-носитель клеток на основе биологической мембраны по краям механически надежно фиксируется в расправленном состоянии к предварительно залитому в чашку Петри стерильному агар-агару при помощи одноразовых стерильных игл от инсулиновых шприцев под острым углом вкола от 10 до 60 градусов, вершина которого направлена к подложке-носителю клеток на основе биологической мембраны, что позволяет выполнить надежную ее фиксацию и культивировать эпителиальные стволовые клетки в любой жидкой культуральной среде без риска деформации подложки и контаминации клеточной культуры.
Изобретение поясняется фиг. 1-4, на которых показаны этапы иммобилизации мембраны.
Способ иммобилизации клеточной подложки на основе биомембран в условиях жидкой культуральной системы подразумевает несколько этапов.
1. Заполнение стерильной чашки Петри 1 таким объемом стерильного агар-агара 2 (Фиг. 1), которое будет достаточно не только для надежной фиксации подложки-носителя клеток на основе биологической мембраны 3, но и для размещения ее и жидкой культуральной системы (Фиг. 2). Необходимо отметить, что тут действует следующий принцип: чем больше стерильного агар-агара 2, тем надежнее фиксация подложки-носителя клеток на основе биологической мембраны 3, однако тем меньше места остается для размещения ее и жидкой культуральной системы, поэтому решение о количестве используемого стерильного агар-агара 2 принимается индивидуально в соответствии с размером используемой чашки Петри 1 и задачами культивирования.
2. После застывания стерильного агар-агара 2 в чашке Петри 1 на его поверхность укладывается и расправляется подложка-носитель клеток на основе биологической мембраны 3 (Фиг. 2).
3. Расправленная по поверхности стерильного агар-агара 2 подложка-носитель клеток на основе биологической мембраны 3 по краям фиксируется при помощи одноразовых стерильных игл от инсулиновых шприцев 4 (Фиг. 3), под острым углом вкола от 10 до 60 градусов 5, вершина 6 которого направлена к подложке-носителю клеток на основе биологической мембраны 3 (Фиг. 4).
К особенностям предлагаемого «Способа иммобилизации клеточной подложки на основе биомембран в условиях жидкой культуральной системы», позволившим достичь технический результат, относится.
1. Стерильный агар-агар 2 является мягким, ареагенным материалом приготавливающийся в стерильных условиях, который, во-первых, не влияет на условия культивирования клеток, во-вторых, дает возможность «приколоть» к нему любую клеточную подложку на основе биомембран 3, и, в-третьих, ввиду стерильности, исключает контаминацию клеточной культуры.
2. Одноразовые стерильные инсулиновые иглы от инсулиновых шприцев 4 позволяют иммобилизировать клеточную подложку на основе биомембран 3 без риска нарушения стерильности, при этом маленький их внешний диаметр не приводит к разрывам клеточной подложки на основе биомембран 2 в местах вколов.
3. Острый угол вкола от 10 до 60 градусов 5 в стерильный агар-агар 2 одноразовых стерильных инсулиновых игл от инсулиновых шприцев 4, направленный вершиной 6 к подложке-носителю клеток на основе биологической мембраны 3, исключает возможность соскальзывания клеточной подложки на основе биомембран 3 с одноразовой стерильной инсулиновой иглы от инсулиновых шприцев 4.
Таким образом, «Способ иммобилизации клеточной подложки на основе биомембран в условиях жидкой культуральной системы» позволяет выполнить надежную фиксацию клеточной подложки на основе биомембран и культивировать эпителиальные стволовые клетки в любой жидкой культуральной среде без риска деформации подложки и контаминации клеточной культуры.