Прямая модификация клеток с использованием поликатион-стабилизированных серебряных наночастиц

94

оригинальные исследования

прямая модификация клеток с использованием

поликатион-стабилизированных серебряных наночастиц

ЕЮ. Тарасова, Е.А. Науменко, Э.В. Рожина, Р.Ф. Фахруллин Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия

Direct modification of cells using polycation-stabilized silver nanoparticles

E.Y. Tarasova, EA. Naumenko, E.V. Rozhina, R.F. Fakhrullin Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia

В работе проведена функционализация поверхности клеток карциномы легкого человека А549 наночастицами серебра, стабилизированными полиаллиламин гидрохлоридом . Изучены временные и дозозависимые эффекты, а также влияние функционализации клеток на их жизнеспособность, формирование монослоя и пролиферативную активность . Установлена безопасная концентрация наноча-стиц серебра, стабилизированных полиаллиламин гидрохлоридом, для клеток А549 . Выявлено дифференциальное воздействие наночастиц серебра, стабилизированных полиаллиламин гидрохлоридом, на клеточные функции и органеллы

Ключевые слова: наночастицы серебра, стабилизация, полиаллиламин гидрохлорид, функционализация поверхности, цитотоксичность, клетки карциномы легкого человека

Here we report the surface functionalization of human lung carcinoma cells A549 with polyallylamine hydrochloride-stabilized silver nanoparticles . We investigated the time and dose-dependent effects of AgPAH on cells, the influence of functionalization on the viability of cells, monolayer formation and proliferative activity . Safe concentration of silver nanoparticles stabilized with polyallylamine hydrochloride for A549 cells were determined . The differential effects of silver nanoparticles stabilized with polyallylamine hydrochloride on cell function and organelles were revealed

Keywords: silver nanoparticles, stabilization, polyallylamine hydrochloride, surface functionalization, cytotoxicity, human lung carcinoma cells

Введение

Наночастицы, разнообразные по строению и функциональным возможностям, широко используют в области биомедицинских исследований и в клинической практике [1], в качестве терапевтических средств [2], антимикробных агентов [3], векторов трансфекции [4], флюоресцентных меток [5]. Из-за большой площади поверхности, высокой каталитической активности, физико-химических, оптоэлектрон-ных и биологических свойств, наноматериалы также находят применение в качестве биосенсоров [6].

Техника послойного покрытия полиэлектролитами, первоначально использованная для изготовления коллоидных микрокапсул [7, 8], в дальнейшем была успешно применена для модификации и функционализации поверхности живых клеток [9, 10]. Стандартным методом модификации поверхности клеток с помощью полиэлектролитов является последовательное осаждение противоположно заряженных полимеров на клетки; между слоями полиэлектролитов могут быть нанесены различные наноматериалы, такие как наночастицы, нанотрубки и т . д . [11]. Тем не менее, до сих пор применение наночастиц с полиэлектролитным покрытием было ограничено, в основном, супермагнитными наноча-стицами оксида железа [12]. Вместе с тем, другие типы наночастиц, в частности, наночастицы серебра, также могут использоваться в технике послойного нанесения на клетки [13]. Наночастицы серебра в последнее время приковывают особое внимание в связи с широким спектром антимикробной активности [14—16], в том числе в отношении нескольких устойчивых к антибиотикам штаммов [17].

Однако в большинстве случаев зависимость от времени экспозиции и функционализации поверхности остались неизученными . Механизм токсичности, вероятно, зависит от свойств наночастиц, таких как площадь поверхности, форма, поверхностный заряд, чистота частиц, структурная деформация и биодо-

e-mail: evgenechka1885@gmail . com

ступность отдельных частиц [18]. В данном исследовании нами изучено воздействие наночастиц серебра (АдНЧ), стабилизированных полиаллиламин гидрохлоридом (PAH), на жизнеспособность, пролиферативную и эндоцитозную активность культуры клеток карциномы лёгкого человека .

Материал и методы

Получение и характеристика АдНЧ. В исследовании использованы наночастицы серебра, стабилизированные РАН . Методика синтеза и стабилизации наночастиц серебра полиаллиламин гидрохлоридом описана ранее [19]. Данный полимер придает нано-частицам положительный заряд и препятствует их агрегации . Гидродинамический диаметр частиц исследуемого вещества и дзета-потенциал определяли методами динамического светорассеяния и лазерной велосиметрии Допплера с использованием прибора Zetasizer Nano ZS (Malvern, Великобритания).

Культура клеток. Клетки культивировали в среде ДМЕМ с добавлением 10% инактивированной телячьей сыворотки, 45 ЕД/мл пенициллина и 45 мкг/мл стрептомицина в условиях повышенной влажности при 37°C, 5% C02 в С02-инкубаторе . В качестве клеток-мишеней были выбраны клетки карциномы легкого человека А549 .

Функционализация клеток А549 AgНЧ. При проведении функционализации клетки А549 (5х105 мл-1) смешивали со стерильной суспензией AgPAH (210 и 105 мкг мл-1) в 0,15 М NaCl . После инкубации в течение 3 мин . клетки центрифугировали для удаления избытка наночастиц серебра. Функционали-зированные клетки микроскопировали с помощью темнопольного микроскопа Olympus .

Изучение цитотоксичности AgPAH. Клетки А549 рассеивали в 96-луночные планшеты из расчета 7000 клеток на лунку . Для подсчета клеток использовали цитометр (Tali Image-Based Cytometer, США) . Изучение цитотоксичности AgPAH проводили в трех

вариантах . Клетки А549, выращенные в течение суток, инкубировали в течение 1ч . и 24 ч . с АдРАН . В третьем варианте клетки А549 и АдРАН вносили в лунки одновременно в концентрации от 105 до 0,8 мкг/мл питательной среды .

Цитотоксичность АдРАН определяли с использованием МТТ теста . Принцип метода основан на способности фермента сукцинатдегидрогеназы ми-тохондриальной мембраны клеток млекопитающих восстанавливать желтую соль 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид (МТТ) до кристаллов формазана фиолетового цвета, накапливающихся в результате этой реакции в цитоплазме живых клеток [20].

Культуру клеток с наночастицами серебра инкубировали в трех вариантах (см . выше), после чего среду удаляли, в лунки вносили 200 мкл ростовой среды, добавляли 20 мкл готового раствора МТТ (исходная концентрация 5 мг/мл в фосфатном буфере) . Время инкубации с нитросиним тетразолием — 4 ч . в термостате . Затем среду удаляли, образовавшийся нерастворимый формазан экстрагировали добавлением 200 мкл ДМСО . Осадок ресуспендировали и 10—15 мин . инкубировали в темноте при комнатной температуре Опыты проведены с 8-кратным повторением Оптическую плотность регистрировали при длине волны 540 нм на планшетном спектрофотометре «МШ^сап» .

Жизнеспособность клеток оценивали также с помощью теста на восстановление резазурина мито-хондриальными дегидрогеназами живых клеток до флуоресцирующего соединения резаруфина [21]. Для этого клетки А549 высевали в 96-луночный планшет, АдРАН вносили аналогично МТТ-тесту . После этого среду удаляли и заменяли на 200 мкл раствора резазурина (0,01 мг/мл) в соответствующей культурной среде, планшеты инкубировали в течение ночи Оптическую плотность измеряли при 595 нм

Изменения метаболического состояния клеток оценивали по уменьшению эндоцитоза витального красителя нейтрального красного, коррелирующим

с лизосомальной функцией [22]. Рабочий раствор нейтрального красного 0,033% концентрации готовили в соответствующей среде непосредственно перед экспериментом . Для устранения кристаллов красителей рабочий раствор нейтрального красного фильтровали через фильтр Millipore (0,22 мкм) . Клетки А549 засевали одновременно с AgPAH в различных концентрациях в 96-луночные планшеты и инкубировали в увлажненной атмосфере с 5% СО2 при 37°С в течение 24 ч . Затем среду заменяли на 200 мкл рабочего раствора нейтрального красного, и планшеты инкубировали в СО2-инкубаторе в течение 3 ч . После этого раствор нейтрального красного заменяли на 200 мкл растворителя (1% ледяной уксусной кислоты в 50% этаноле, приготовленный непосредственно перед использованием) для извлечения красителя из клеток . Оптическую плотность раствора измеряли при длине волны 540 и 690 нм .

Скорость роста и характер формирования монослоя наблюдали в процессе культивирования обработанных наночастицами серебра и интактных клеток, при помощи инвертированного микроскопа (Axio Observer A1).

Апоптогенное действие AgPAH на клетки А549 оценивали с помощью набора TaliTM Apoptosis Kit — Annexin V Alexa Fluor R 488 and Propidium Iodide на приборе «Tali» (США) .

Результаты

Гидродинамический диаметр наночастиц серебра составил 87,2±12,6 нм, стабилизация при помощи РАН придала им положительный дзета-потенциал, который составил +34,1±0,82 мВ . Клетки А549 обладают слабоотрицательным поверхностным зарядом и имеют дзета-потенциал — 26,7±1,42 мВ . Благодаря этому положительно заряженные AgPAH эффективно присоединяются к клеточной мембране, при этом дзета-потенциал повышается до — 21,7±0,44 мВ (рис . 1), что является физиологичным для функционализированных клеток

А

Zeta Potential Distribution

Б

700000 600000 m 500000

с з о О

я +—«

.О

400000 300000 200000 100000 - • О

-50 О

Zeta Potential

50

с з о о

"!5 о

400000

300000

200000

100000

О 50

Zeta Potential

Рис. 1. Дзета-потенциал клеток А549: А — до покрытия AgPAH; Б — после покрытия AgPAH

Темнопольная микроскопия показала, что клетки покрыты однородным слоем АдРАН . Наблюдалась прямо пропорциональная зависимость между интенсивностью покрытия и концентрацией вводимых на-ночастиц . При максимальной концентрации АдРАН (210 мкг/мл) клетки А549 покрывались полностью (рис . 2В) . По мере снижения количества вводимых наночастиц, уменьшалась и площадь покрытия клетки (рис . 2А, Б) .

Анализ апоптозиндуцирующей активности АдРАН в отношении клеток А549 показал, что доля клеток, находящихся в состоянии апоптоза, через 48 ч . культивирования с АдРАН была наиболее выражена при концентрациях 52,5 и 26,3 мкг/мл и составляла 26,0 (р<0,01) и 10,0 (р<0,05) % соответственно . При более низких концентрациях АдРАН количество клеток в состоянии апоптоза было в пределах физиологической нормы и не имело достоверных отличий от контрольного варианта

Внесение АдРАН в концентрации 105 мкг/мл приводило к полной гибели клеток Наночастицы серебра в количестве 52,5 мкг/мл через 24 ч . инкубации вызывали наиболее сильное подавление

клеточного роста и размножения . При более низких концентрациях АдРАН наблюдались отдельные делящиеся клетки В лунках с наночастицами серебра в количестве от 0,8 до 3,3 мкг/мл морфология клеток не изменялась, однако наблюдалось отставание в росте по сравнению с контрольным вариантом

Инкубация с наночастицами серебра в течение 48 ч показала, что в лунках с концентрацией 52,5 мкг/мл пролиферация клеток наблюдалась в меньшей степени, по мере снижения количества вносимых наночастиц способность клеток к росту и пролиферации наоборот повышалась

Через 72 ч . культивирования площадь заполнения лунок при концентрации наночастиц серебра 0,8 мкг/мл не отличалась от таковой у интактных клеток . Однако площадь заполнения лунок при концентрации АдРАН 1,6; 3,3 и 6,6 мкг/мл была ниже примерно на 10, 25 и 28% соответственно, относительно контрольного варианта, у клеток А549 в лунках с концентрацией наночастиц серебра от 13,1 до 52,5 мкг/мл, наблюдалась слабо выраженная про-лиферативная активность

В

Рис. 2. Темнопольная микрофотография клеток А 549, функционализированных АдРАН в концентрации: А, Б — 105 мкг мл-1; В — 210 мкг мл-1

- Ё 1 V В

г ' 1 Ш- . . -'л .у., * •о-*, Д - шш Д Ж '  • '.  * V п - У •• % , :, **

* * ~ V; Ч ;• ,- V' *' * ^ < - Я £* ^» „ - - • ; , - '5 "Л г.'. ' >г«: И - * ^ i 'Г в " * «я

Рис. 3.

Культуры интактных и функционализированных АдРАН клеток А549 через 72 ч культивирования: А - концентрация исследуемого вещества 0 мкг/мл (контроль); Б — 0,8 мкг/мл; В — 1,6 мг/мл; Г — 3,3 мкг/мл; Д — 6,6 мкг/мл; Е — 13,1 мкг/мл; Ж — 26,3 мкг/мл; З — 52,5 мкг/мл; И — 105,0 мкг/мл. Ув. х10

При инкубации клеток А549 с наночастицами серебра в трех вариантах в диапазоне концентраций от 0,8 до 105 мкг/мл показано, что концентрация АдРАН 1С50, ингибирующая на 50% суммарную активность митохондриальных дегидрогеназ, составляет 52,5 мкг/мл, подавление активности наблюдается уже при короткой одночасовой инкубации . Наиболее сильное влияние на способность клеток переводить соль тетразолия в формазан было оказано при одновременном засеве клеток А549 и наночастиц серебра, при таком варианте только в лунках с концентрацией 0,8 мкг/мл не отмечалось достоверного отклонения по сравнению с контролем, и выживаемость клеток составила 95,3%, тогда как при внесении АдРАН в суточную культуру клеток достоверного отклонения не наблюдалось при концентрации наночастиц 0,8 и 1,6 мкг/мл, выживаемость составила 97,8 и 90,9% соответственно . При короткой одночасовой инкубации активность дегидрогеназ не имела достоверного отклонения при концентрации наноча-стиц 3,3; 1,6; 0,8 мкг/мл и составила 91,7; 94,5; 98,8% соответственно (рис . 4А).

Интегральная активность клеточных дегидрогеназ в резазуриновом тесте практически полностью коррелировала с данными, полученными в тесте МТТ (рис . 4Б) .

Следует обратить внимание, что разные клеточные функции и органеллы проявили неодинаковую чувствительность к АдРАН . Показано, что эндоци-тозная активность (рис. 4 В) была ингибирована наполовину под действием дозы АдРАН в 2 раза ниже, чем 1С50 в отношении клеточного дыхания при короткой одночасовой экспозиции, а также при одновременном засеве и совместном инкубировании клеток А549 в течение 24 ч

Таким образом, полученные данные позволяют заключить следующее: наночастицы АдРАН способны оказывать цитотоксическое действие на перевиваемые линии клеток карциномы легкого человека А549 Модификация клеток при помощи АдРАН, в концентрациях 13,1—105 мкг/мл, сказывается на способности к росту и делению функционализированных клеток Безопасной по всем параметрам для клеток А549 является концентрация АдРАН 0,8 мкг/мл .

1,6 В,В 6,6 13,1

концентрация, мкг/мл

Рис. 4.

Цитотоксическое действие наночастиц серебра, стабилизированных полиаллиламин гидрохлоридом, в отношении клеток А549: А — МТТ-тест; Б — тест с резазурином; В — тест с нейтральным красным;

1 — суточная культура клеток А549 (экспозиция с АдРАН 1 ч.);

2 — суточная культура клеток А549 (экспозиция с АдРАН 24 ч.);

3 — культура клеток А549+одновременно АдРАН

Благодарности

Исследования по формированию нанооболочек и определению токсичности были выполнены за счет гранта Российского научного фонда (проект № 1414-00924). Работа выполнена в рамках государ-

ственной программы повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского) федерального университета среди ведущих мировых научно-образовательных центров.

ЛИТЕРАТУРА:

I. Zhang L ., Gu F .X ., Chan J . M . et al . Nanoparticles in medicine: therapeutic applications and developments . Clin . Pharmacol . Ther. 2008; 83: 761-9 .

2 . Kreuter J ., Gelperina S . Use of Nanoparticles for Cerebral Cancer . Tumori . 2008; 94: 271-7 .

3 . Yoon K .Y . , Hoon B . J ., Park J . H . et al . Susceptibility Constants of Escherichia coli and Bacillus subtilis to Silver and Copper Nanoparticles . Sci . Total Environ . 2007; 373: 572-5 .

4 . Tan W . B . , Jiang S ., Zhang, Y . Quantum-Dot Based Nanoparticles for Targeted Silencing of HER2/neu Gene via RNA Interference . Biomaterials 2007; 28: 1565-71.

5 . Su J ., Zhang J ., Liu L . et al . Exploring Feasibility of Multicolored CdTe Quantum Dots for In Vitro and In Vivo Fluorescent Imaging . Na-nosci . Nanotechnol . 2008; 8: 1174-7 .

6 . Tolaymat T . M ., Badawy A . M ., Genaidy A . et al . An evidence-based environmental perspective of manufactured silver nanoparticle in syntheses and applications: A systematic review and critical appraisal of peerreviewed scientific papers Sci Total Environ 2010; 408: 999-1006 .

7 Shutava T G , Pattekari P P , Arapov K A et al Architectural layer-by-layer assembly of drug nanocapsules with PEGylated polyelec-trolytes . Soft Matter . 2012; 8: 9418-27 .

8 . Lvov Y ., Pattekari P ., Shutava T . Making aqueous nanocolloids from low soluble materials: LbL shells on nanocores In Multilayer Thin Films: Sequential Assembly of Nanocomposite Materials 2012: 151-170 .

9 Diaspro A , Silvano D , Krol S et al Single living cell encapsulation in nanoorganized polyelectrolyte shells . Langmuir . 2002; 18: 5047-50

10 Ai H Layer-by-layer capsules for magnetic resonance imaging and drug delivery . Drug Deliv . Rev . 2011; 63: 772-88 .

II. Fakhrullin R . F ., Lvov Y . M . ''Face-lifting'' and ''make-up'' for microorganisms: layer-by-layer polyelectrolyte nanocoating ACS Nano 2012; 6: 4557-64 .

12 . Park S . J ., Kim S ., Lee S . et al . Synthesis and magnetic studies of uniform iron nanorods and nanospheres . Am . Chem . Soc . 2000; 122: 8581-2 .

13 . Milczarek G ., Motylenko M ., Modrzejewska-Sikorska A . et al . Deposition of silver nanoparticles on organically-modified silica in the presence of lignosulfonate . RSC Adv . 2014; 4: 52476-84.

14 . Lok C . N . , Ho C . M ., Chen R . et al . Proteomic Analysis of the Mode of Antibacterial Action of Silver Nanoparticles . Proteome Res . 2006; 5: 916-24 .

15 Gogoi S K , Gopinath P , Paul A et al Green fluorescent protein-expressing Escherichia coli as a model system for investigating the antimicrobial activities of silver nanoparticles Langmuir 2006; 22: 9322-8

16 . Wright J . B, Lam K ., Hansen D . et al . Efficacy of topical silver against fungal burn wound pathogens . Am J Infect Control . 1999; 27: 344-50

17 Wright J B , Lam K , Burrell R E Wound management in an era of increasing bacterial antibiotic resistance: a role for topical silver treatment . Am . J . Infect . Control . 1998; 26: 572-7 .

18 Suresh A K , Pelletier D A , Wang, W et al Silver nanocrystal-lites: biofabrication using shewanella oneidensis, and an evaluation of their comparative toxicity on gram-negative and gram-positive bacteria . Environ . Sci . Technol . 2010; 44: 5210-5 .

19 . Konnova S . A ., Danilushkina A . A ., Fakhrullina G . I . et al . Silver nan-oparticles-coated "cyborg" microorganisms: rapid assembly of polymer-stabilised nanoparticles on microbial cells . RSC Adv. 2015; 5: 13530-7 .

20 Mosmann T Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and citotoxicity assays Immunol Methods . 1983; 65: 55-63 .

21 Clothier R , Starzec G , Pradel L et al The prediction of human skin responses by using the combined in vitro fluorescein leakage Alamar Blue (Resazurin) assay . ATLA 2002; 30: 493-504 .

22 Borenfreund E , Puerner J A Toxicity determined in vitro by morfological alterations and neutral red adsorption . Toxicol . Lett . 1985; 24: 119-24.

nocTynuna: 29.09.2015