Идентификация генов устойчивости к листовой ржавчине Lr39 и Lr50 в интрогрессивных линиях мягкой пшеницы, полученных с участием синтетической формы Triticum miguschovae

УДК 577.21:633.11:632.4

идентификация генов устойчивости к листовой ржавчине LR39 и LR50 в интрогрессивных линиях мягкой пшеницы, полученных с участием синтетической формы тыпсим МЮШСНОУАЕ*

Ю.С. ЗУБАНОВА, младший научный сотрудник

Э.Р. ДАВОЯН, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Р.О. ДАВОЯН, доктор биологических наук, зав. отделом

И.В. БЕБЯКИНА, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник

А.Н. ЗИНЧЕНКО, младший научный сотрудник Д.С. МИКОВ, младший научный сотрудник Краснодарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства имени П.П. Лукьяненко, центральная усадьба КНИИСХ, Краснодар, 350012, Российская Федерация

Резюме. Проведена идентификация генов устойчивости к листовой ржавчине мягкой пшеницы Lr39 и Lr50 у синтетического гексаплоида Triticum miguschovae Zhir. (GGA'A'DD), который включает в себя геномы двух диких видов Triticum militinae Zhuk. (AG) и Aegilops tauschii (Coss.) Schmalh. (D), а также 93 линий, полученных от скрещивания этой синтетической формы с восприимчивыми сортами озимой мягкой пшеницы Безостая 1 и Кавказ. Изучаемые образцы оценивали на устойчивость к листовой ржавчине в полевых условиях. T. miguschovae проявляет полный иммунитет (тип реакции 0) к болезни. Интрогрессивные линии варьировали от высокоустойчивых (тип реакции 01 и 1) до неустойчивых (тип реакции 3 и 4). С использованием молекулярных маркеров проведен скрининг синтетической формы T. miguschovae и созданных на ее основе интрогрессивных линий мягкой пшеницы на присутствие маркеров, сцепленных с генами устойчивости к листовой ржавчине Lr39 и Lr50. Эти маркеры (GDM35 и Xbarc 124b, Xgwm382 и Xgdm87) идентифицированы в синтетической форме T. miguschovae. Высокоэффективный ген Lr39 не выявлен ни в одной из 93 линий. Обнаружено 39 линий, несущих маркеры, сцепленные с частично эффективным геном Lr50, в том числе 5 с низкой устойчивостью к листовой ржавчине. Это свидетельствует о возможной потере эффективности гена Lr50. Одновременно выявлены линии с высокой устойчивостью к листовой ржавчине, в которых не установлено присутствие генов Lr39 и Lr50. Вероятно, они несут другие эффективные гены устойчивости к болезни.

Ключевые слова: мягкая пшеница, синтетическая форма Triticum miguschovae, интрогрессивные линии, листовая ржавчина, гены устойчивости, молекулярные маркeры. Для цитирования: Идентификация генов устойчивости к листовой ржавчине Lr39 и Lr50 в интрогрессивных линиях мягкой пшеницы полученных с участием синтетической формы Triticum miguschovae/Ю.С. Зубанова, Э.Р. Давоян, Р.О. Давоян, И.В. Бебякина, А.Н. Зинченко, Д.С. Миков//Достижениянауки и техники АПК. 2015. Т. 29. № 12. С. 30-32.

По данным каталога генных символов, на сегодня известно около 80 генов устойчивости к листовой ржавчине ^-генов) [1]. Для идентификации многих ¿/-генов используют сцепленные с ними молекулярные маркеры.

Многие эффективные гены устойчивости к грибным болезням пшеницы перенесены из генофонда дикорастущих сородичей. Большой интерес в качестве их источников представляет вид ТгШсит timopheevii 7Иик. и его естественный мутант Т. тШпае, а также Ае. tauschii. От вида Т. timopheevii в геном мягкой пшеницы сегодня

переданы гены устойчивости к листовой ржавчине Lr18 и Lr50, от Ae. tauschii - Lr21, Lr32, Lr39 (Lr41), Lr42.

При передаче генов от этих видов в мягкую пшеницу, в качестве генетического мостика использовали синтетическую форму T. miguschovae (GGA'A'DD), у которой к геномам AG от T. militinae добавлен геном D от Ae. tauschii [2]. Полученный синтетик проявляет устойчивость к листовой и желтой ржавчинам, мучнистой россе, а также отличается высоким содержанием белка. С участием T. miguschovae создан большой набор интрогрессивных линий мягкой пшеницы, характеризующихся комплексом хозяйственно-ценных признаков [3]. Предположительно, такие линии могут нести гены устойчивости к листовой ржавчине, переданные от видов T. timopheevi и Ae. tauschii, в том числе эффективные сегодня Lr39(Lr41) и Lr50.

Цель исследования - анализ синтетической формы T. miguschovae и созданных на её основе интрогрессивных линий на присутствие молекулярных маркеров, сцепленных с генами, детерминирующими устойчивость к листовой ржавчине Lr39 и Lr50.

Условия, материалы и методы. От скрещивания синтетической формы T. miguschovae и восприимчивых сортов озимой мягкой пшеницы Безостая 1 и Кавказ получено большое число интрогрессивных линий, которые характеризуются устойчивостью к болезням, высоким содержанием белка и другими интересными для селекции морфо-биологическими признаками. Предположительно они могут нести эффективные гены устойчивости к листовой ржавчине Lr39 и Lr50 от T. miguschovae.

Мы исследовали 93 интрогрессивные линии мягкой пшеницы. Реакцию растений на поражение листовой ржавчиной устанавливали в полевых условиях. Популяцию линий заражали в фазе выхода в трубку смесью уредоспор, собранных с разных сортов пшеницы. Определение устойчивости проводили по международной шкале Майнса и Джексона [4]. К устойчивым относили растения с типом реакции 0 (иммунные), 1 (высокоустойчивые) и 2 (умеренно устойчивые). Растения с промежуточным типом реакции от 0 до 1 обозначали баллом 01, с типом реакции 3 (умеренно восприимчивые) и 4 (сильно восприимчивые) относили к восприимчивым.

С применением молекулярных маркеров, сцепленных с эффективными генами устойчивости к листовой ржавчине Lr39 (Lr41) и Lr50, был проведен молекулярный анализ T. miguschovae. ДНК пшеницы выделяли из 5-7-дневных этиолированных проростков по методу Плашке с соавторами [5]. Идентификацию генов осуществляли с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами, маркирующими гены Lr39 и Lr50 (табл. 1), которые отбирали на основании литературных данных [6, 7, 8, 9].

Для идентификации высокоэффективного гена устойчивости к листовой ржавчине Lr39 использовали микросател-литные маркеры GDM35 и Xbarc124b. Праймеры GDM35-L/R к SSR-маркеру GDM35 у линий с функциональной аллелью гена Lr39 выявляют продукт амплификации с молекулярным весом 190 п.н. (пар нуклеотидов). По данным S. Singh [7]

*Работа выполнена при финансовой поддержке гранта № 13-04-96-545-р-юр-а РФФИ и администрации Краснодарского края.

Таблица 1. Происхождение генов устойчивости к листовой ржавчине, условия ПЦр и характеристика праймеров, используемых для идентификации соответствующих генов

Ген Источник гена Название праймера Условия амплификации фрагментов Размер фрагмента, п.н. Литературный источник

Lr39 Ae.tauschii GDM35-L GDM35-R 94° 4 мин; 30 циклов (94° 30 с, 55° 30 с, 72° 30 с); 72° 5 мин 190 [6]; [7]

Lr39 Ae.tauschii Xbarc124b-L 94° 4 мин; 30 циклов (94°

Xbarc124b-R 30 с, 55° 30 с, 72° 30 с); [8]

72° 5 мин 260

Lr50 Tr.timopheevi GDM87-L GDM87-R 94° 4 мин; 30 циклов (94° 30 с, 60° 30 с, 72° 30 с);

72° 5 мин 110 [9] [9]

Lr50 Tr.timopheevi WMS382-L WMS382-R 94° 4 мин; 30 циклов (94° 30 с, 60° 30 с, 72° 30 с); 72° 5 мин 139

расстояние между маркером и геном оценивается в 1,9 сМ. При использовании праймеров к маркеру Xbarc124b наличие гена Lr39 показывает продукт амплификации раз-

з г з

260 H.H.

7.

1 3 i 4 \ ; j 4

шт

п

—*

] '.Hl 1Г.1Н. НО Jl PIr

рис. 1. Электрофореграмма продуктов ПЦР, полученных с праймерами к диагностическим маркерам, сцепленными с генами Lr39 и Lr50: а - GDM35-L/R (1 - маркер длины,

2 - T. miguschovae, 3 - Безостая 1); б - Xbarc124b-L/R(1 - маркер длины, 2 - Безостая 1, 3 -KS86WGRC02 (Lr39), 4 - T. miguschovae); в - GDM87-L/R (1 - маркер длины, 2 - Безостая 1,

3 - KS96WGRC36 (Lr50), 4 - T. miguschovae); г - WMS382-L/R (1 - маркер длины, 2 - Безостая 1, 3 - KS96WGRC36 (Lr50), 4 - T. miguschovae).

мером 260 п.н., причем этот маркер расположен к локусу гена Lr39 на более близком расстоянии 1 сМ [8].

Идентификацию частично эффективного гена устойчивости к листовой ржавчине Lr50 проводили по двум микросателлитным маркерам Xgwm382 и Xgdm87, фланкирующим локус Lr50 на расстоянии 6,7 и 9,4 сМ, соответственно. По литературным данным [9], при использовании праймеров GDM87-L/R на наличие гена Lr50 указывает продукт амплификации c молекулярной массой 110 п.н., а при использовании праймеров WMS382-L/R - 139 п.н.

Продукты ПЦР разделяли с помощью электрофореза в агарозном геле с 0,5 х буфером ТВЕ. Концентрация геля варьировала от 1,8 до 2,5% в зависимости от размера амплифицированного фрагмента. Гели окрашивали бромистым этидием и фотографировали в ультрафиолетовом свете c помощью фотобокса «INFINITI 1000». Как маркер молекулярной массы использовали ДНК-маркер М 24 100 bp «СибЭнзим». В качестве положительных контролей для определения известных генов были задействованы линии пшеницы KS86WGRC02 и KS96WGRC36 с генами устойчивости к листовой ржавчине Lr39 и Lr50 соответственно.

результаты и обсуждение. Специфичные фрагменты амплификации для молекулярных маркеров, сцепленных с геном Lr39, были детектированы в положительном контроле линии KS86WGRC02 и синтетической форме T. miguschovae (рис. 1).

После амплификации с парой праймеров WMS382-L/R в положительном контроле линии KS96WGRC36, а также устойчивой к листовой ржавчине форме ^ miguscho-vae выявлен полиморфный фрагмент около 200 п.н., который отсутствовал в отрицательных контролях, восприимчивых к листовой ржавчине сортах Безостая 1 и Кавказ. Его мы учитывали как детектирующий маркер, сцепленный с геном Lr50.

По типу реакции (табл. 2) интрогрессивные линии, полученные в результате скрещивания синтетической формы T. miguschovae и восприимчивых сортов озимой мягкой пшеницы Безостая 1 и Кавказ, варьировали от высокоустойчивых (тип реакции 01) до сильно восприимчивых (тип реакции 4).

Продукты амплификации, характерные маркерам GDM35 и Xbarc124b, сцепленным с высокоэффективным геном Ь39, были идентифицированы только в положительном контроле KS86WGRC02 и не выявлены ни в одной анализируемой интрогрессивной линии с генетическим материалом T. miguschovae.

Изучение на присутствие маркеров, сцепленных с частично эффективным геном устойчивости к листовой ржавчине Lr50, позволило идентифицировать фрагмент амплификации, специфичный маркеру GDM87, в 39 линиях. В частности он отмечен в линиях 295, 431, 1792, 1877, 1843, 1999, 2305, 2519, 2713, 4009 (на рис. 2 № 8, 9, 10, 12, 13, 15, 18, 19, 21, 24, соответственно). При этом некоторые из них (1792, 1843, 2305, 2519, 2713) сильно поражались листовой ржавчиной. На электрофореграмме продуктов ПЦР

Таблица 2. Тип реакции на устойчивость к листовой ржавчине интрогрессивных линий мягкой пшеницы

-40Q им.

/

Линия Тип реакции, балл Линия Тип реакции, балл Линия Тип реакции, балл

T.miguschovae 0 1715 1 1957 1

KS86WGRC02 01 1727 1 1999 2

KS96WGRC36 01 1729 1 2283 01

219 01 1743 1 2305 4

268 01 1747 1 2311 1

277 01 1792 4 2337 1

295 2 1795 1 2497 1

425 1 1799 1 2519 4

431 01 1801 1 2713 3

463 01 1807 1 2833 2

493 01 1843 4 3841 1

595 01 1873 1 3844 2

627 01 1875 2 3865 1

631 01 1877 1 3946 2

685 01 1879 1 3967 1/3

1421 2 1885 1 3970 01

1681 1 1893 1 4009 2

рис. 2. Продукты амплификации с использованием пары праймеров GDM87-L/R к диагностическому маркеру, сцепленному с геном устойчивости к листовой ржавчине Lr50. 1 - маркер длины; 2 - T. miguschovae; 3 - KS96WGRC36 (Lr50). 4 - сорт Безостая 1; 5-26 - линии, полученные на основе Т. miguschovae.

î S j t ft т » v 14 и iî Iji 11 m, IT It n г» л к h У H >

в линиях 219, 268, 277, 463, 493, 595, 685, 1715, 1747, 1893, 2311, 2337 (№ 5, 6, 7, 11, 14, 16, 17, 20, 22, 23, 25, 26, соответственно) искомый фрагмент отсутствует.

Для проверки и подтверждения полученных результатов образцы анализировали на присутствие молекулярного маркера Xgwm382. При использовании пары праймеров WMS382-L/R к этому маркеру картина была аналогичной.

Среди образцов, включенных в молекулярный анализ, выявлено 27 интрогрессивных линий с высокой устойчивостью к листовой ржавчине (тип реакции 01 и 1), не несущих генов Lr39 и Lr50.

выводы. В результате проведенного исследования частично эффективный ген Lr50 выявлен в синте-

тической форме T. miguschovae и 39 интрогрессивных линиях, созданных на ее основе, 5 из них (1792, 1843, 2305, 2519, 2713) обладают низкой устойчивостью к листовой ржавчине. Это свидетельствует о возможной потере эффективности гена Lr50 в указанных линиях.

Высокоэффективный ген Lr39 идентифицирован в синтетической форме T. miguschovae, однако в изучаемых образцах он не обнаружен. Выявлены линии с высокой устойчивостью к листовой ржавчине, в которых не установлено присутствие генов Lr39 и Lr50. Вероятно, они несут другие, отличные от Lr39 и Lr50, эффективные гены устойчивости к этой болезни.

Литература.

1. Catalogue of gene symbols for wheat / R.A. Mcintosh, Y., J Yamazaki Dubcovsky, J. Rogers, C. Morris, D.J. Somers, R. Appels, K.M Devos// Wheat genetic resources database KOMUGI. 2010. URL: http://www.shigen.nig.ac.jp/wheat/komugi/genes/download. jsp/

2. Жиров Е.Г. Синтез новой гексаплоидной пшеницы // Тр. По прикладной ботанике, генетике и селекции. 1980. Т. 68. вып. 1 С. 14-16.

3. Давоян Р.О., Бебякина И.В., Давоян О.Р. и др. Синтетические формы как основа для сохранения и использования генофонда диких сородичей мягкой пшеницы // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2012. Т.16. №1. С. 44.

4. Mains E.B., Jakson H.S. Fhysiologic specialization in leaf rust of wheat, Puccinia triticiana Erikss // Phytopatology. 1926. V. 16. P. 89-120.

5. Plaschke J., Ganal M.W., Roder M.S. Detedion of genetic diversity in closely related bread wheat using microsatellite markers // Theor. Appl. Genet. 1995. V. 91. P. 1001-1007.

6. Pestsova E., Ganal M.W., Roder M. S. Isolation and mapping of microsatellite markers specific for the D genome of bread wheat // Genome. 2000. V. 43(4). P. 689-697.

7. Singh S., Franks C.D., Huang L. et al. Lr41, Lr39, and a leaf rust resistance gene from Aegilops cylindrical may be allelic and are located on wheat chromosome 2DS// Theor. Appl. Genet. 2004. V. 108. P. 586-591.

8. Sun X., Bai G., Carver B.F. Molecular markers for wheat leaf rust resistance gene Lr41//Mol. Breedingm. 2009. V. 23. P. 311-321.

9. Brown-Guedira G., Singh S., Fritz A.K. Performance and mapping of leaf rust transferred to wheat from Triticum timopheevii subsp. armeniacum//Phytopathology. 2003. V. 93. P. 784-789.

10. Zhemchuzina A., Kurkova N. Structure of population of Puccinia triticina in various regions of Russia in 2006-2008// Abstr. of 8th Intren. Wheat Conf. 1-4 June 2010. St. Petersburg, Russia. P. 279.

IDENTIFICATION OF LEAF RuST RESISTANCE GENES LR39 AND LR50 IN INTROGRESSIVE LINES OF COMMON WHEAT OBTAINED BY uSING THE SYNTHETIC FORM TRITIcuM MIGuschovAE

Yu.S. Zubanova, E.R. Davoyan, R.O. Davoyan, I.V. Bebyakina, A.N. Zinchenko, D.S. Mikov

Krasnodar P.P. Lukyanenko Research Institute of Agriculture, Tsentralnaya Usadba KNIISKH, Krasnodar, 350012, Russian Federation Summary. The identification of leaf rust resistance genes of common wheat Lr39 and Lr50 in a synthetic hexaploid Triticum miguschovae Zhir. (GGAtAtDD) was carried out. This hexaploid includes the genomes of two wild species Triticum militinae Zhuk. (AG) and Aegilops tauschii (Coss.) Schmalh. (D). We also studied 93 lines derived from crosses of the synthetic form with susceptible varieties of common winter wheat Bezostaya1 and Kavkaz. The studied samples were evaluated for resistance to leaf rust under the field conditions. T. miguschovae showed full immunity (type of reaction 0) to the disease. Introgression lines varied from highly resistant (type of reaction 01 and 1) to susceptible ones (type of reaction 3 and 4). With the use of molecular markers the synthetic form T. miguschovae and introgressive lines of common wheat obtained on its base were screened for the presence of markers linked to leaf rust resistance genes Lr39 and Lr50. These markers (GDM35 and Xbarc124b, Xgwm382 and Xgdm87) were identified in the synthetic form T. miguschovae. The highly efficient gene Lr39 was not detected in any of the 93 lines. The partially effective Lr50 gene was identified in 39 lines. Among these lines, 5 lines show low leaf rust resistance. This indicates a possible loss of the effectiveness by the gene Lr50 in these lines. Lines with high resistance to leaf rust, which did not carry genes Lr39 and Lr50, were detected. Perhaps these lines carry other leaf rust resistance genes, different to Lr39 and Lr50. Key words: common wheat, synthetic form Triticum miguschovae, introgression lines, leaf rust, resistance genes, molecular markers. Author Details: Yu.S. Zubanova, junior research fellow (e-mail: zubanova-yu@mail.ru); E.R. Davoyan, Cand. Sc. (Biol.), senior research fellow; R.O. Davoyan, D. Sc. (Biol.), head of division; I.V. Bebyakina, Cand. Sc. (Biol.), leading research fellow; A.N. Zinchenko, junior research fellow; D.S. Mikov, junior research fellow.

For citation: Zubanova Yu.S., Davoyan E.R., Davoyan R.O., Bebyakina I.V., Zinchenko A.N., Mikov D.S. Identification of Leaf Rust Resistance Genes Lr39 and Lr50 in Introgressive Lines of Common Wheat Obtained by Using the Synthetic Form Triticum Miguschovae. Dostizheniya naukii tekhnikiAPK. 2015. Vol. 29. No. 11. Pp. 30-32 (In Russ).