СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК В ЦЕЛЬНОЙ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ
METHOD FOR DETECTION OF EXTRACELLULAR DNA IN WHOLE PERIPHERAL BLOOD

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и клинической лабораторной диагностике, и предназначено для обнаружения внеклеточных сетей ДНК экспресс-методом с количественной оценкой данного явления.
В настоящее время известно несколько способов обнаружения внеклеточной ДНК. Например, с использованием метода сканирующей электронной микроскопии [1]. Авторы использовали его для визуализации образовавшихся структур. Однако данный способ обнаружения нейтрофильных ловушек требует наличия специального оборудования (электронного микроскопа), набор реактивов для приготовления препарата и очень аккуратного выполнения исследования, так как образующиеся структуры очень хрупкие и быстро разрушаются при механическом воздействии [1].
Известен метод выявления нуклеиновых кислот по способу Фельгена [2]. Данная реакция требует фиксации клеток на стекле по методу Лилли в 10% забуференном формалине, для приготовления реактивов используются агрессивные среды (соляная кислота, фуксинсернистая кислота, сернистая вода), готовые реагенты нуждаются в специальных условиях хранения. Кроме того, реакция проходит в 2 этапа, которые занимают около 2-2,5 часов. При соблюдении всех условий ядерное вещество окрашивается в красно-фиолетовый цвет. Учет реакции проводят с помощью иммерсионной микроскопии при увеличении ×1000. Данный способ имеет ограниченное применение так как занимает длительное время и требует предварительного приготовления реактивов.
Существует способ обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек с помощью люминесцентной микроскопии [3]. Авторы определяют ловушки в мукозальных секретах используя сложный краситель. Данный способ уступает заявленному, так как требует специального оборудования (люминесцентный микроскоп) и приготовления двухкомпонентного красителя ex temporo.
Предлагаемый способ не требует специальной подготовки препарата, основан на базовом методе - приготовление мазка крови, не требует приобретения новых навыков сотрудников и специального оборудования, быстр в исполнении, позволяет четко визуализировать хроматин.
Целью заявляемого способа является разработка экспресс-метода обнаружения внеклеточной ДНК и их количественная оценка в периферической крови.
Сущность предлагаемого способа заключается в использовании раствора азур-эозина по Романовскому для окраски лейкоцитов и внеклеточных волокон ДНК.
Предлагаемый способ диагностики соответствует критерию «новизна», так как в отличие от имеющихся способов обнаружения внеклеточных сетей ДНК ловушек обладает следующими существенными отличительными признаками:
- материалом для исследования является цельная периферическая кровь;
- не требует специального оборудования;
- для окрашивания используется один готовый реактив (Азур-эозин по Романовскому);
- позволяет дать количественную характеристику данному явлению.
Благодаря наличию указанных отличительных признаков в данном способе, а также использованию их в совокупности и в определенной последовательности действий, можно сделать вывод о соответствии заявляемого способа изобретательскому уровню.
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом:
1) Из цельной периферической крови готовят мазок на стекле (аналогично мазку для лейкоцитарной формулы в OAK).
2) Для фиксации мазка используют 96%-ый этиловый спирт, в который помещают препарат на 2-3 сек.
3) Фиксированный препарат окрашивают раствором азур-эозина по Романовскому в разведении 1:9, выдерживают 10-20 минут и промывают фосфатным буфером. Окрашенный препарат высушивают на воздухе.
4) Учет проводят с помощью светового микроскопа, используя иммерсионный объектив, масло иммерсионное для микроскопии, увеличение 40. Внеклеточная ДНК представлена тонкими фиолетово-красными нитями, занимающие пространство, в 2-3 раза превосходящее диаметр неизмененного лейкоцита.
При этом можно провести количественную оценку образования внеклеточных ловушек, так как при таком способе окраски хорошо различима морфология всех форменных элементов крови. Проводили подсчет нейтрофилов, которые являются основным видом лейкоцитов, циркулирующих в крови человека и основными продуцентами внеклеточных ловушек и внеклеточных сетей ДНК. Проводили подсчет следующих морфологических групп: 1 группа объединяет клетки с сегментированным ядром (фрагмент 1), 2 группа включает клетки с U- или S-образным ядром (фрагмент 2), 3 группа - это клетки с недифференцированным ядром (фрагмент 3), и к 4 группе относят свободнолежащие красно-фиолетовые волокна, представляющие собой нити ДНК (фрагмент 4). Проводят подсчет 100 структур разных групп и определяют процентное содержание каждой морфологической единицы.
Предлагаемым способом окрашено и изучено 200 фиксированных препаратов, приготовленных из цельной периферической крови.
Пример 1
Окраске подвергался мазок приготовленный из цельной периферической крови женщины, 57 лет, находящейся в реанимации с панкреонекрозом, септическим шоком. В мазках хорошо визуализировались все морфологические единицы нейтрофилов, в том числе красно-фиолетовые отдельно лежащие нити ДНК (фрагмент 5), что позволило провести количественную оценку образования ловушек (содержание внеклеточных ловушек составило - 34%, сегментоядерных нейтрофилов - 48%, палочкоядерных - 13% и юных (метамиелоцитов) - 5%).
Пример 2
Окраске подвергался мазок приготовленный из цельной периферической крови мужчины, 55 лет, находящейся в реанимации с острым деструктивным панкреатитом, тяжелым сепсисом. В мазках хорошо визуализировались все морфологические единицы нейтрофилов, в том числе красно-фиолетовые отдельно лежащие нити ДНК, что позволило провести количественную оценку образования ловушек (содержание внеклеточных ловушек составило - 23%, сегментоядерных нейтрофилов - 52%, палочкоядерных - 10% и юных (метамиелоцитов) - 15%).
Таким образом, применение предлагаемого способа позволяет быстро обнаружить внеклеточные сети ДНК лейкоцитов и дать количественную характеристику данному явлению.
Литература:
1. Brinkmann V. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. / V. Brinkmann, U. Rechard, C. Goosmann et al. // Science. - 2004. - Vol. 303. - P. 1532-1535.
2. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. / Г.А. Меркулов. - МЕДГИЗ. Ленинградское отделение, 1956. - 263 с.
3. Заявка №2009102579/10 RU. МПК C12N 15/10, C12Q 1/06. Способ обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в мукозальных секретах. Опубликовано 10.10.2012.