МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧНЫЕ К РАЗЛИЧНЫМ ШТАММАМ РЕСПИРАТОРНО-СИНЦИТИАЛЬНОГО ВИРУСА
MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO VARIOUS STRAINS OF RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS

Изобретение относится к моноклональным антителам, специфичным к различным штаммам респираторно-синцитиального вируса, в частности, полученным с помощью гибридомы, и могут быть использованы в диагностике, в частности, в диагностических тест-системах.
По оценкам ВОЗ ежегодные эпидемии сезонных заболеваний приводят к 3–5 миллионам случаев тяжёлой болезни и 250 000–500 000 случаев смерти во всём мире. Вирусы, вызывающие простудные заболевания, легко передаются от человека человеку воздушно-капельным путём при выделении инфицированными людьми мельчайших частиц во время кашля или чихания. При этом вирус имеет тенденцию быстро распространяться, вызывая сезонные эпидемии. Большинство инфицированных людей выздоравливает за одну-две недели без какого-либо лечения. Однако для детей, пожилых людей и людей, страдающих серьёзными заболеваниями, такие вирусы представляют опасность — они могут привести к осложнениям основных заболеваний, развитию пневмонии и смерти (WHO, 2017).
Основными причинами ОРВИ у детей и взрослых являются вирусы гриппа (ВГ) типов A, B и C; вирус парагриппа (ВПГ) типов 1, 2 и 3; респираторно-синцитиальный вирус (РСВ); аденовирус (АВ) и риновирус. Все упомянутые вирусы могут вызвать как инфекцию верхних, так и нижних дыхательных путей, кроме того имеют сходные клинические проявления и зачастую не могут быть различены без специальной лабораторной диагностики (Mahony et al., 2011).
Острые респираторные заболевания занимают ведущее место в структуре инфекционных болезней человека и обуславливают 20–50% временных потерь трудоспособности. Экономический ущерб от ОРЗ можно сравнить лишь с затратами на профилактику и лечение длительно текущих сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний.
Наиболее важное место в развитии патологии дыхательных путей занимают вирусы гриппа и парагриппа, респираторно-синцитиальный вирус, аденовирусы.
В большинстве случаев заболевания, вызванные этими патогенами, имеют благоприятное течение в виде заболеваний верхних дыхательных путей. Однако у части пациентов, особенно при наличии иммуносупрессии, а также у детей младшего возраста, эти вирусы вызывают осложнённое течение заболевания.
Респираторные вирусы способны выступать в качестве пусковых механизмов возникновения гиперреактивности бронхов, обструкции дыхательных путей и атопий, что способствует формированию хронических обструктивных заболеваний лёгких, включая бронхиальную астму (БА) (Matsumoto & Inoue, 2014). Так, при обострении БА наличие РСВ, ПГ 1 и 3 типов, АВ или вирусов гриппа А или В детектировали в 10–85% случаев у детей и до 44–74% у взрослых (Message et al., 2004; Чучалин и др., 2007; Westerly & Peebles, 2010; Kurai et al., 2013).
Респираторные вирусы являются частой причиной внутрибольничных пневмоний: в 17%, 6% и 4% случаев детектировали РСВ, вирусы парагриппа и гриппа, соответственно (Ning et al., 2017; Walter & Wunderink, 2017).
Дифференциальная диагностика респираторных инфекций необходима для осуществления надзора за заболеваемостью и назначения своевременной терапии, поскольку многие препараты эффективны только на ранних стадиях инфекции. Понимание истинной причины заболевания помогает избежать ненужного использования антибиотиков, которые часто назначают пациентам, инфицированным респираторными вирусами. Быстрое и достоверное обнаружение респираторных патогенов позволяет врачам избежать возникновения внутрибольничных заболеваний, а также прогнозировать возможные осложнения и иммунопатологические явления, которые могут возникнуть при этих инфекциях. Использование точных диагностических тестов даёт возможность клиницистам своевременно поставить диагноз и выявить группы риска. В диагностическом алгоритме должны быть использованы маркеры-индикаторы присоединения бактериальной инфекции. Своевременная дифференциальная диагностика вирусной и бактериальной инфекций особенно актуальна для детей при схожести симптоматики заболеваний, которые могут приводить к неблагоприятному исходу, особенно в группах риска.
Использование при конструировании диагностических тест-систем моноклональных антител (МКА), специфичных к вирусам ОРЗ, обеспечивает высокую чувствительность и специфичность анализа, а также выбор правильной схемы лечения.
Выбор мишеней, к которым должны быть направлены МКА, определяется представительством антигенных детерминант в составе самого вируса и в исследуемых клинических материалах, а также степенью консервативности/вариабельности сайтов-мишеней.
В соответствии с данными литературы о приоритетной роли РСВ в структуре как острых, так и хронических респираторных заболеваний, именно к этому вирусу была получена панель МКА с целью создания диагностической тест-системы на основе ИФА.
Респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) и РСВ-инфекция (РСВИ)
РСВИ играет чрезвычайно важную роль в структуре инфекционной патологии дыхательного тракта, особенно у детей первых лет жизни. Заболеваемость РСВИ может превышать таковую, наблюдаемую для гриппа (Lee et al., 2013; Matias et al., 2014). 70% детей переносят РСВИ в возрасте до 1 года, и практически каждый инфицируется в течение первых трёх лет. В развитых индустриальных странах у детей в возрасте до 3 лет, госпитализированных с острыми респираторными заболеваниями с поражением нижних отделов дыхательного тракта, частота диагностирования РСВИ достигает 42–63%. При этом РСВ является причиной 50–90% бронхиолитов, 5–40% пневмоний, 10–30% трахеобронхитов. Согласно метаанализу мировой литературы в развитых странах среди детей, госпитализированных с РСВИ, смертность составляет в среднем 1% (Simoes & Carbonell-Estrany, 2003; Nair et al., 2010; Karron, 2012; Borchers et al., 2013; Bont et al., 2016). Среди госпитализированных пациентов в возрасте до 18 лет с осложнённым анамнезом летальность может достигать 37% (Welliver et al., 2010). Преклонный возраст также является фактором риска тяжёлого течения РСВИ (Lee et al., 2013; Branche & Falsey, 2015).
РСВ является мощным иммуномодулятором и оказывает выраженное иммуносупрессорное действие (Mukherjee et al., 2013; Varga et al., 2013; Gomez et al., 2014). В этой связи индуцируемый им иммунный ответ зачастую оказывает слабое и кратковременное протективное действие, что обуславливает осложнённое течение РСВИ и реинфекции, которые наблюдаются у людей на протяжении всей жизни.
РСВ в значительно большей степени, чем другие часто встречающиеся респираторные вирусы, способствует развитию иммунопатологических проявлений, в том числе обструкции нижних дыхательных путей (Falsey et al., 1995; Byeon et al., 2009), что является специфическим фактором риска, особенно для новорождённых. До 70% детей в возрасте до 1 года, госпитализированных с бронхиолитами, обусловленными РСВ, подвержены рецидивирующим эпизодам бронхообструкции в течение последующих 6–12 лет (Hyvärinen et al., 2007), что связано с риском развития в дальнейшем бронхиальной астмы (Feldman et al., 2015). РСВ у взрослых с неблагоприятным преморбидным фоном способствует развитию хронических лёгочных заболеваний — хронической обструктивной болезни лёгких и бронхиальной астмы (Чучалин и др., 2007). При обследовании пациентов с хронической бронхолёгочной патологией, в частности с бронхиальной астмой, ухудшение общего состояния в 50% случаев вызвано РСВИ (Кривицкая и др., 2015). РСВИ представляет большую опасность для реципиентов костного мозга (Lehners et al., 2016). Частота летальных исходов от РСВИ, регистрируемая среди госпитализированных пациентов в возрасте до 18 лет, составляет около 37% при осложнённом анамнезе (Welliver et al., 2010).
РСВ человека относятся к роду Pneumovirus семейства Paramyxoviridae. Вирионы содержат несегментированную однонитевую антисмысловую минус-РНК. Оболочку вириона составляют 2 основных трансмембранных гликопротеина: белок присоединения G (attachment protein) и белок слияния F (fusion protein), которые являются основными индукторами синтеза РСВ-нейтрализующих антител. РСВ человека существует в виде одного серотипа, но состоит из двух антигенных групп (А и В), что было установлено на основании различий в реагировании МКА (Anderson et al., 1985). Изоляты РСВ из различных групп отличаются генетически. Степень межгрупповых (А/В) отличий в аминокислотных последовательностях (АП) очень сильно варьирует для белков РСВ. Для наиболее консервативных F- и N-белков (внутренний белок, элемент кора вириона) показано до 91% и 96% гомологии АП, соответственно. Наиболее вариабельным из всех является G-белок — только 53–58% гомологии АП между эталонными штаммами РСВ-А и РСВ-В (Collins et al., 2001; Collins & Karron, 2013).
С учётом представленных данных наиболее рациональным для выявления РСВ представляется использование МКА к консервативному F-белку.
Ранее в документе RU 2371726 были описаны антитела к РСВ в составе диагностической тест-системы на основе ИФА для определения уровня антител к вирусным респираторным заболеваниям крупного рогатого скота, однако данные антитела не характеризовались высокой специфичностью именно к РСВ и не были предназначены для диагностики человеческой инфекции.
Таким образом, проблема получения антител, которые бы имели высокую специфичность именно к РСВ, в частности, к группам А и В, и не имели бы специфичности к другим вирусам, является крайне актуальной.
На Фиг. 1 показана схема получения гибридом — продуцентов МКА.
На Фиг. 2 приведена сенсограмма взаимодействия моноклональных антител клона 10G6 с анализируемым штаммом респираторно-синцитиального вируса.
На Фиг. 3 представлена диаграмма аффинности моноклональных антител клона 10G6 к респираторно-синцитиальному вирусу.
Описание изобретения
Данное изобретение описывает моноклональные антитела, специфичные к штаммам респираторно-синцитиального вируса, относящимся к группам А и В, и имеющие высокую специфичность к F-белку. При этом данные антитела представляют собой антитела IgG типа, в частности, мышиные моноклональные антитела.
Описанные антитела могут быть получены способом, включающим:
- получение антитело-продуцирующих спленоцитов;
- накопление клеток мышиной миеломы;
- слияние антитело-продуцирующих спленоцитов с миеломными клетками;
- отбор гибридом;
- введение гибридомы в брюшную полость праймированных пристаном мышей;
- накопление моноклональных антител в асцитах;
- очистка полученных моноклональных антител.
Для получения и накопления антител могут быть использованы специально полученные гибридомы-продуценты моноклональных антител, направленных к F-белку респираторно-синцитиального вируса групп А и В. Такие гибридомы как представители гибридом-продуцентов моноклональных антител, направленных к F-белку респираторно-синцитиального вируса групп А и В, были депонированы как 11G4/RS под номером РККК(П) 786Д, и как 10G6/RS под номером РККК(П) 784Д в Специализированную коллекцию культур клеток ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных» ФГБУН Института цитологии РАН, соответственно.
Моноклональные антитела согласно изобретению могут быть использованы для идентификации респираторно-синцитиального вируса групп А и В, в частности, в диагностических тест-системах.
Более подробно получение и анализ указанных моноклональных антител иллюстрируют примеры, приведённые ниже.
Примеры
Пример 1
Получение МКА к белкам респираторно-синцитиального вируса
Процесс получения гибридом-продуцентов МКА к консервативным эпитопам в составе респираторно-синцитиального вируса состоял из нескольких стадий.
Стадия 1. Очистка вирусов, предназначенных для использования в качестве иммуногена.
Эталонный штамм РСВ, принадлежащий к антигенной группе Long (группа А), полученный из National Institute for Medical Research (Лондон), культивировали в перевиваемой клеточной культуре МА-104 (эпителиальные клетки почки обезьяны) в течение 5–7 суток. В качестве поддерживающей бессывороточной среды использовали среду alpha-МЕМ («Биолот», Россия). Вируссодержащую культуральную жидкость использовали для очистки и концентрации вируса путём ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы по методу Orvell (Orvell et al., 1978). Для этого вирусы из культуральной среды осаждали ультрацентрифугированием при 50 000 g в течение 2 ч, суспендировали в малом количестве 10 мМ трис-ЭДТА буфера, рН 7,2 (STE) и производили очистку через градиент 20–60% сахарозы ультрацентрифугированием при 100 000 g в течение 2,5 ч с последующим осаждением вируса из зоны 36–40% сахарозы на дно при 120 000 g в течение 1 ч. Осадок ресуспендировали в STE. Содержание белка в очищенном вирусном материале определяли с использованием набора “Pierce BCA Protein assay kit” (“Thermo Fisher Scientific”, США). Наличие вирусной контаминации и целостность полученных вирионов контролировали с помощью электронной микроскопии. Полученные цельновирионные вирусные суспензии хранили при –80°С.
Стадия 2. Получение антитело-продуцирующих спленоцитов в результате иммунизации мышей соответствующим антигеном под контролем образования специфических сывороточных антител в ИФА.
Мышей линии BALB/c иммунизировали очищенным антигеном, полученным на стадии 1, смешанным с неполным адъювантом Фрейнда путём внутрибрюшинного введения (иммунизации) очищенного ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы антигена РСВ в концентрации 50–100 мкг/мл (по 1 мл на мышь). Затем проводили мониторинг иммунизированных животных на образование специфических антител. Животных с достаточно высоким титром антител отбирали в качестве источника антитело-продуцирующих клеток.
Инъекции антигенов проводили двукратно с интервалом в 5 недель. Спустя 7 дней после каждой иммунизации из ретробульбарного синуса мышей брали пробы крови для определения титра сывороточных антител против гомологичного РСВ или рекомбинантного белка в ИФА. Через две недели после последней иммунизации мышей, имевших по данным ИФА антитела в титре 1:10000, бустировали антигеном, полученным на стадии 1, или рекомбинантным белком.
Стадия 3. Определение титра сывороточных антител в ИФА.
2
2
Очищенный концентрат РСВ сорбировали на твёрдой поверхности (96-луночный планшет для ИФА) в концентрации 1–5 мкг/мл. После промывания планшета в лунки с сорбированным антигеном вносили серийные двукратные разведения сыворотки от иммунизированной мыши (от 1:10 до 1:20480) и инкубировали в течение часа при температуре 37°C. Для выявления сформированного комплекса антигена с антителом добавляли антитела против IgG мыши, меченные пероксидазой хрена (HRP). После промывания в планшет добавляли субстратную смесь для фермента. В качестве субстрата на стадии детекции использовали раствор ТМБ (3,3’,5,5’-тетраметилбензидин) в концентрации 100 мкг/мл с 0,03% НО. Титр антител оценивали по изменению оптической плотности раствора, регистрируемой спектрофотометрически на фотометре Multiscan FC при длине волны 450 нм.
Стадия 4. Накопление клеток мышиной миеломы.
Через 3 дня после бустер-иммунизации мышь использовали в качестве донора лимфоцитов селезёнки для слияния с клетками мышиной миеломы в целях получения гибридом (Новохатский и др., 1985; Новиков и др., 1988). Для этого проводили гибридизацию спленоцитов иммунизированных мышей с клетками мышиной миеломы в присутствии 50% ПЭГ-2000. В качестве партнёра для слияния при получении гибридом использовали культуру клеток мышиной миеломы линии Х63Аg8.653, адаптированную к росту в среде с добавлением сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС), полученную из коллекции ФГБУ «РНЦРХТ». Данный штамм является устойчивым к 8-азагуанину, то есть дефектным по гену гипоксантин-гуанин-фосфорибозил трансферазы.
7
2
Выбранную клеточную линию культивировали на среде RPMI-1640 c добавлением глутамина, 2-меркаптоэтанола (МЭ), гентамицина и сыворотки КРС для обеспечения в день слияния со спленоцитами плотности популяции не менее 2×10 клеток/мл. Культивирование миеломы осуществляли в пластиковых культуральных планшетах или во флаконах производства “Sarstedt” или “Nunc” (Германия, США). Клетки размножали при температуре 36–37°С и 100% влажности в атмосфере воздуха с 5–7% СО. Базовая культуральная среда содержала 90% RPMI-1640 и 10% сыворотки КРС («Биолот», Санкт-Петербург).
Стадия 5. Слияние антитело-продуцирующих спленоцитов с миеломными клетками.
Для получения антитело-продуцирующих клеток у мышей с высокими титрами специфических антител через 3–4 дня после последней бустер-иммунизации удаляли селезёнку и вымывали из неё спленоциты бессывороточной средой (такой как RPMI-1640) или забуференным физиологическим раствором, после чего их смешивали с миеломными клетками в соотношении от 5:1 до 10:1. Затем клетки центрифугировали (10 мин, 1000 об/мин), осадок разрыхляли, после чего, перемешивая, по каплям добавляли 1 мл бессывороточной среды, содержащей 50% (масс/об) ПЭГ (молекулярный вес 1000–4000 Да). Затем медленно добавляли 10 мл бессывороточной среды, после чего смесь центрифугировали.
–4
–7
–5
2
Осаждённые клетки суспендировали в соответствующем количестве селективной НАТ-среды. Затем клетки переносили в селективную НАТ-среду, приготовленную на основе RPMI-1640 и 20% сыворотки крупного рогатого скота (СКРС) с добавлением гипоксантина (10 М), аминоптерина (4×10 М) и тимидина (1,6×10 М) производства “Sigma-Aldrich” (США), а также 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия (“Sigma-Aldrich”, США), 1 мг/л амфотерицина В и 50 мг/л гентамицина. Суспензию распределяли по ячейкам 96-луночных планшетов для культивирования, содержащих трёхсуточную культуру мышиных макрофагов, и инкубировали в атмосфере 5–7% СО при температуре 37°С в течение 3 недель. После 10 суток культивирования НАТ-среду заменяли на более щадящую НТ-среду, а после 20 суток культуры поддерживали на среде RPMI-1640 с СКРС. Для удаления иммуноглобулинов, секретированных неслившимися спленоцитами мышей, культуральную жидкость из ячеек с растущими гибридами отбирали на 5–6, затем 10–12 и на 16–17 дни после слияния.
Стадия 6. Отбор гибридом.
Поскольку используемый штамм миеломы резистентен к 8-азагуанину, он является дефектным по ферменту гипоксантин-гуанин-фосфорибозил трансферазе, и любые не слитые с лимфоцитами миеломные клетки и любые гибриды миелома-миелома не способны выживать в среде НАТ. С другой стороны, гибриды антителообразующих клеток друг с другом, а также гибридомы, образованные антителопродуцирующими и миеломными клетками, могут выживать в этой среде, причём гибриды спленоцитов друг с другом имеют ограниченное время жизни (на протяжении 3–4 пассажей) и отмирают в ходе культивирования, тогда как гибридомы спленоцитов с миеломными клетками (СМ) способны к неограниченному размножению.
Стадия 7. Реклонирование и криоконсервирование гибридом.
2
2
2
4
Скрининг гибридом проводили методом твердофазного ИФА. Из большого числа активно размножающихся гибридом отбирали гибридомы, активно продуцирующие противовирусные антитела. Для этого в супернатантах гибридом определяли титры специфических антител к вирусу-иммуногену в ИФА. Вирусным материалом (очищенные концентраты), разведённым карбонатно-бикарбонатным буфером (КББ) до концентрации 2–5 мкг/мл, сенсибилизировали планшеты в течение 18 часов при температуре 4°С. После отмывания несвязавшегося антигенного материала 0,01 М фосфатно-солевым буфером (PBS) с добавлением 0,05% Tween 20 (PBS-T), рН 7,2 вносили культуральную жидкость в PBS-T в разведении 1:10 (при тестировании субклонов в 2-х повторах) и инкубировали 1 час при 37°С. Связавшиеся с антигеном антитела детектировали с помощью пероксидазных конъюгатов антител к IgG мыши (“Sigma-Aldrich”, США) в PBS-T в течение 1 часа при температуре 37°С. Пероксидазную реакцию проявляли добавлением субстратной смеси, содержащей 0,1 мг/мл 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина (ТМБ) и 0,02% НО в ацетат-цитратном буфере, рН 5,0. После остановки реакции 2N HSO оптическую плотность измеряли на фотометре Multiscan FC при длине волны 450 нм.
2
Для последующего клонирования отобранных гибридом СМ использовали метод предельных разведений. Клетки гибридомы разводили из расчёта, чтобы на одну лунку планшета приходилось 1–2 клетки, и затем культивировали их, как выше описано, в ростовой среде в инкубаторе с подачей 5–7% СОпри температуре 36–37°С. Процедуру клонирования повторяли 3–4 раза для каждого избранного клона, продуцирующего специфические антитела. Клоны — стабильные продуценты антител — отбирали для последующего накопления культивированием в ростовой среде с целью накопления клеток в количестве, достаточном для последующего пассажа на сингенных мышах и криоконсервирования.
Стадия 8. Криоконсервирование гибридом.
Криоконсервированию подвергали культуры гибридомных клеток, находящиеся в логарифмической фазе роста, или клетки, выращенные в перитонеальной полости мышей сингенной линии (при получении асцитных жидкостей). Перед замораживанием клетки подвергали микроскопическому анализу на жизнеспособность и бактериологическому исследованию на отсутствие контаминации микрофлорой. Количество живых клеток оценивали по эксклюзии трипанового синего. После центрифугирования при 1000 об/мин концентрацию клеток доводили до 1–2 млн в мл. Для криоконсервирования клеток использовали среду, состоящую из 90% СКРС и 10% ДМСО (“Sigma-Aldrich”, США). Предварительно охлаждённые до температуры –80°С в парах азота криопробирки с клетками помещали в жидкий азот (для многолетнего хранения при температуре –196°С) и хранили в Криобанке гибридом ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России.
Полученные гибридомы были депонированы в специализированную коллекцию культур клеток ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных» 08.11.18 под номером РККК(П) 784Д (гибридома 10G6/RS) и 786Д (гибридома 11G4/RS), соответственно.
Стадия 9. Накопление МКА в асцитах.
Асцитные жидкости мышей линии BALB/c, содержащие МКА, секретируемые гибридомой, получали следующим образом. Для этого мышам-реципиентам за 12–14 дней до инокуляции гибридомы вводили внутрибрюшинно 0,5 мл пристана (“Sigma-Aldrich”, США) (Hoogenraad et al., 1983). Восстановленные гибридомы в количестве 5–10 млн инокулировали в брюшную полость праймированных пристаном мышей. Спустя 2–3 недели после образования асцита, контролируемого визуально, делали прокол брюшной стенки и собирали оттекающую жидкость. После центрифугирования асцитов надосадочная жидкость служила источником МКА, а клетки гибридом, прошедшие пассирование на мышах, криоконсервировали. Исследования выполнялись согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 266 МЗ РФ от 19.06.2003). Концентрации МКА после очистки составили:
Клон 10G6 — 4,15 мг/мл,
Клон 11G4 — 5,73 мг/мл.
В общем виде схема получения гибридом — продуцентов МКА представлена на Фиг. 1.
Пример 2
Очистка накопленных моноклональных антител к респираторно-синцитиальному вирусу
Препараты мышиных МКА перед очисткой представляли собой асцитные жидкости мышей, содержащие МКА, секретируемые клетками отобранной гибридомы. Очистку фракции МКА проводили методами аффинной хроматографии и гель-фильтрации. Первый этап очистки МКА методом гидрофобной хроматографии предусматривает удаление большей части белковых примесей из исходных препаратов и получение промежуточных препаратов, содержащих как нативную форму IgG, так и продукты их олигомеризации и деградации. Второй этап очистки предусматривает удаление остаточных белковых примесей, а также агрегатов, димеров и фрагментов IgG из промежуточных препаратов методом гель-фильтрации на колонке с сорбентом высокого разрешения.
Концентрацию IgG определяли при помощи спектрофотометра NanoDrop ND-1000 (“Thermo Fisher Scientific”, США) в режиме IgG (коэффициент молярной экстинции E 1% = 13,70). Результат анализа очищенных препаратов МКА подтверждали методом денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле по методу Лэммли. Гель окрашивали коллоидным кумасси и документировали при помощи системы ChemiDoc MP Imaging System (“Bio-Rad”, США) с последующим денситометрическим анализом. При качественной очистке препарат должен представлять собой две мажорных дорожки — тяжёлая цепь антител представлена на уровне ~ 50 кДа, а лёгкая цепь на уровне ~ 25–30 кДа.
Пример 3
Получение МКА к респираторно-синцитиальному вирусу
Было получено 5 МКА к РСВ (клоны 4F2, 5F3, 5H8, 1H3, 5F8) и были проанализированы их аналитические и диагностические характеристики. Все МКА специфически взаимодействовали в непрямом варианте ИФА с очищенным концентратом вируса-иммуногена (РСВ, эталонный штамм Long), сенсибилизированным на твёрдой фазе, при отсутствии перекрёстного реагирования с гетерологичными респираторными вирусами и клеточными антигенами. Свойства МКА были оценены в различных иммунологических реакциях. Для характеристики направленности полученных МКА был проведен вестерн-блоттинг с использованием в качестве антигена очищенного концентрата РСВ, штамм Long. В случае проведения электрофореза (ЭФ) с РСВ, обработанным в условиях мягкого нагревания при нередуцирующих условиях (нагревание при температуре 37°С без β-меркаптоэтанола (МЭ) в течение 1,5 ч), после иммуноблоттинга все МКА взаимодействовали на мембране с тремя белковыми продуктами с молекулярной массой 130, 110 и 70 кДа. Белку с молекулярной массой 70 кДа соответствует мономер поверхностного F-белка РСВ. Согласно данным литературы, две высокомолекулярные полосы представляют собой олигомерные формы F-гликопротеина РСВ — гомодимерную и гомотримерную. По данным других авторов, высокомолекулярные полосы с близкими молекулярными массами на электрофореграмме соответствуют гетероолигомерам двух поверхностных гликопротеинов РСВ: (мономер F-белка 70 кДа + полностью гликозилированная форма G-белка 90 кДа) и (мономер F-белка 70 кДа + форма G-белка с неполным гликозилированием 55 кДа).
После ЭФ вируса, подвергшегося более жёсткой обработке в нередуцирующих условиях (кипячение 2 мин при температуре 100°С без МЭ), все МКА реагировали на мембране после иммуноблоттинга только с мономерной формой F-белка РСВ (70 кДа), что объясняется распадом олигомеров. С РСВ, обработанным в наиболее жёстких редуцирующих условиях при кипячении в течение 2 мин в присутствии МЭ, МКА не взаимодействовали, что свидетельствует о полном разрушении эпитопа-мишени. Таким образом, результаты иммуноблоттинга свидетельствуют о том, что все полученные МКА взаимодействовали с конформационно лабильными эпитопами, присутствующими как в мономерной, так и в олигомерных формах F-белка РСВ.
Все МКА относились к различным изотипам IgG. МКА 5F8 и 5F3 обладали выраженной вируснейтрализующей активностью (до концентрации 9–26 мкг/мл) по отношению к эталонным штаммам РСВ группы А. Для РСВ группы В этот показатель был значительно ниже. Слабая нейтрализующая активность выявлена также для МКА 5Н8. Остальные МКА не оказывали вируснейтрализующего действия (таблица 1).
50
Примечания: * — конечная концентрация МКА (мкг/мл), при которой наблюдается нейтрализация анализируемого вируса в инфекционной дозе 100 ТЦД, н/а — не анализировали.
Примечание — степень ингибирования (%):
Для характеристики антигенной направленности МКА был проведён конкурентный ИФА с использованием МКА, меченных и не меченных пероксидазой хрена. Результаты анализа представлены в таблице 2.
Результаты конкурентного ингибирования МКА, меченных и не меченных пероксидазой хрена, показали, что у них наблюдаются следующие особенности взаимодействия с антигеном:
1. МКА 5F3, 5H8 и 1H8 не конкурируют друг с другом за связь с F-белком. Однако эти МКА направлены к детерминантам, частично (на 37−51%) общим с сайтом связывания для МКА 4F2.
2. Сайт взаимодействия МКА 5F8 не имеет общих детерминант с сайтами связывания всех остальных МКА.
Для оценки способности полученных новых МКА взаимодействовать со штаммами РСВ, относящимися к различным антигенным группам, был проведён микрокультуральный ИФА (мк-ИФА, in-cell ELISA) с использованием монослойных культур инфицированных вирусом клеток МА-104. При постановке метода для инфицирования использовали 3 эталонных штамма РСВ: Long и А2 (РСВ-А), а также штамм 9320 (РСВ-В).
450
Все МКА специфически реагировали в мк-ИФА с инфицированными данными штаммами РСВ клетками МА-104. Фоновые значения OD при взаимодействии МКА с монослойными культурами неинфицированных клеток не превышали 0,15. Все полученные МКА практически с одинаковой эффективностью взаимодействовали в мк-ИФА с вирусом-иммуногеном (РСВ, штамм Long). На высокую аффинность МКА при взаимодействии с данным вирусом указывает наличие плато на кривых титрования, наблюдаемое в широком диапазоне концентраций МКА (от 0,5 до 50 мкг/мл). С клетками, инфицированными другим штаммом РСВ-А (А2), все МКА взаимодействовали слабее, чем с РСВ Long. Наименее активными при этом оказались МКА 5H8, 1H3 и 5F8. Эти же 3 МКА значительно слабее, чем другие антитела, реагировали также со штаммом 9320, относящимся к гетерологичной группе В.
Следует отметить, что МКА 5F3 оказались единственными из полученных МКА, которые реагировали с эталонными штаммами группы РСВ-А со значительно большей активностью, чем с РСВ-В. Полученные результаты указывают на то, что МКА 4F2 направлены к консервативным эпитопам F-белка, общим для обеих антигенных групп РСВ. Соответственно, МКА 5H8, 1H3, 5F8 и 5F3 взаимодействуют с более вариабельными эпитопами.
50
2
2
2
2
4
450
Было показано, что МКА 10G6 и 11G4 специфически взаимодействуют с F-белком РСВ по данным иммуноблоттинга. Спектр взаимодействия данных МКА был проанализирован методом мк-ИФА. Для этого в лунки планшетов с монослойными культурами клеток МА-104 вносили вируссодержащий материал (культуральную среду, содержащую 50–100 ТЦД РСВ). После инкубации в СО-инкубаторе в течение 3–5 суток при 37°С среду удаляли, клетки в лунках фиксировали 80% холодным ацетоном. На фиксированный клеточный монослой наносили по 100 мкл вирусспецифических МКА в рабочем разведении (5–10 мкг/мл) и инкубировали 2 ч при 37°С. На следующем этапе в лунки добавляли по 100 мкл козьих антител против IgG мыши (1/5000), меченных пероксидазой (“Sigma-Aldrich”, США), и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Пероксидазную реакцию проявляли добавлением субстратной смеси, содержащей 0,1 мг/мл 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина (ТМБ) и 0,02% НО в ацетат-цитратном буфере, рН 5,0. После остановки реакции с помощью 2N HSO измеряли оптическую плотность на фотометре при длине волны 450 нм (ОD).
450
По результатам мк-ИФА МКА 10G6 и 11G4 показали широкий спектр специфического взаимодействия с референс-штаммами РСВ обеих подгрупп: Long и А2 (РСВ-А), а также со штаммом 9320 (РСВ-В). Помимо этого данные МКА эффективно взаимодействовали со штаммами РСВ, выделенными из клинических образцов (назальных соскобов), полученных от госпитализированных детей Санкт-Петербурга в 2017–2018 гг. При рабочем разведении МКА показатели ОD в мк-ИФА превышали для штаммов РСВ 1,0. МКА не показали кросс-реактивности при взаимодействии с клетками, инфицированными гетерологичными вирусами (парагриппом 2 и 3 типа, аденовирусом).
Изоляты РСВ, выделенные в Санкт-Петербурге из клинических материалов в 2018 г. и идентифицированные МКА 10G6 и 11G4 методом мк-ИФА:
RSV/St.Petersburg/457/2018, RSV/St.Petersburg/460/2018, RSV/St.Petersburg/462/2018, RSV/St.Petersburg/466/2018, RSV/St.Petersburg/478/2018, RSV/St.Petersburg/479/2018, RSV/St.Petersburg/494/2018, RSV/St.Petersburg/498/2018, RSV/St.Petersburg/562/2018, RSV/St.Petersburg/570/2018, RSV/St.Petersburg/571/2018, RSV/St.Petersburg/572/2018, RSV/St.Petersburg/654/2018, RSV/St.Petersburg/679/2018, RSV/St.Petersburg/751/2018, RSV/St.Petersburg/949/2018, RSV/St.Petersburg/1335/2018
Идентификация выделенных штаммов РСВ, провёденная с применением МКА методом мк-ИФА, была подтверждена ПЦР.
Описанные МКА могут быть использованы для диагностики, в частности, в диагностических тест-системах, например, в тест-системах по типу «сэндвич»-ИФА.
Пример 4
3
2
Активацию сенсорного чипа СМ5 и иммобилизацию на его поверхность антител 10G6 к F-белку РСВ проводили в соответствии с инструкцией производителя (“GE Healthcare”, США). Раствор лиганда (МКА 10G6) готовили в 10 мМ CHCOONa pH 5,0. Поверхность чипа предварительно активировали обработкой 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлоридом (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соотношении 1:1. Далее, в первую ячейку прибора вносили раствор лиганда (50 мкг/мл при скорости потока 10 мкл/мин, время контакта 420 с), иммобилизация которого проходила путём образования ковалентных связей между аминогруппами в полипептидной цепи лиганда и NHS-активированной поверхностью чипа. Затем в первую ячейку вносили 1М раствор этаноламин гидрохлорида-NaOH pH 8,5 для инактивации участков поверхности чипа, не занятых лигандом. Во вторую ячейку прибора вносили только 1М раствор этаноламин гидрохлорида-NaOH pH 8,5 для инактивации поверхности чипа. Таким образом, первая (рабочая) ячейка служила для снятия сигнала взаимодействия лиганд-аналит, вторая (референсная) ячейка служила для снятия фонового сигнала. Увеличение сигнала на 1 RU (Response Unit, единица ответа) соответствовало иммобилизации ≈ 1 пг/мм лиганда на поверхность чипа CM5.
Инжектирование аналита (РСВ) проводили в серии двукратных разведений (87,5; 43,8; 21,9; 10,9 нМ). Для регенерации поверхности чипа использовали 10 мМ глицин гидрохлорид pH 2,5.
Связывание антител с аналитом было изучено путём мониторинга изменения значений RU в ходе построения сенсограммы взаимодействия во времени. Полученные кривые взаимодействия были обработаны с использованием программного обеспечения Biacore X100 Evaluation Software (Фиг. 2).
–10
Данное взаимодействие было описано кинетикой Лэнгмюра. Так, рассчитанная по данному приближению (Фиг. 3) равновесная константа диссоциации составила KD = 2,88×10 М, что свидетельствует о высокоаффинном взаимодействии МКА 10G6 c РСВ.
Пример 5
3
2
Активацию сенсорного чипа СМ5 и иммобилизацию на его поверхность антител 11G4 к F-белку РСВ проводили в соответствии с инструкцией производителя (“GE Healthcare”, США). Раствор лиганда (МКА 11G4) готовили в 10 мМ CHCOONa pH 5,0. Поверхность чипа предварительно активировали обработкой 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлоридом (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соотношении 1:1. Далее, в первую ячейку прибора вносили раствор лиганда (50 мкг/мл при скорости потока 10 мкл/мин, время контакта 420 с), иммобилизация которого проходила путём образования ковалентных связей между аминогруппами в полипептидной цепи лиганда и NHS-активированной поверхностью чипа. Затем в первую ячейку вносили 1М раствор этаноламин гидрохлорида-NaOH pH 8,5 для инактивации участков поверхности чипа, не занятых лигандом. Во вторую ячейку прибора вносили только 1М раствор этаноламин гидрохлорида-NaOH pH 8,5 для инактивации поверхности чипа. Таким образом, первая (рабочая) ячейка служила для снятия сигнала взаимодействия лиганд-аналит, вторая (референсная) ячейка служила для снятия фонового сигнала. Увеличение сигнала на 1 RU соответствовало иммобилизации ≈ 1 пг/мм лиганда на поверхность чипа CM5.
Инжектирование аналита (РСВ) проводили в серии двукратных разведений (87,5; 43,8; 21,9; 10,9 нМ). Для регенерации поверхности чипа использовали 10 мМ глицин гидрохлорид pH 2,5.
–11
Связывание антител с аналитом было изучено путём мониторинга изменения значений RU в ходе построения сенсограммы взаимодействия во времени. Полученные кривые взаимодействия были обработаны с использованием программного обеспечения Biacore X100 Evaluation Software. Данное взаимодействие было описано кинетикой Лэнгмюра. Так, рассчитанная по данному приближению равновесная константа диссоциации составила KD = 7,16×10 М, что свидетельствует о высокоаффинном взаимодействии МКА 11G4 c РСВ.
Описанные МКА могут быть использованы для диагностики, в частности, в диагностических тест-системах, например, в тест-системах по типу «сэндвич»-ИФА или иных тест-системах.