Способ прогнозирования риска плохого ответа опухоли на неоадъювантную химиотерапию у пациенток с инвазивной карциномой молочной железы
METHOD FOR PREDICTING THE RISK OF POOR TUMOR RESPONSE TO NEOADJUVANT CHEMOTHERAPY IN PATIENTS WITH INVASIVE BREAST CANCER

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и может быть использовано для прогнозирования риска плохого ответа на неоадъювантую химиотерапию (НАХТ) у пациенток с инвазивной карциномой молочной железы.
В структуре онкологической заболеваемости и смертности у женщин на протяжении многих лет первое месте прочно занимает рак молочной железы [1]. При лечении данной патологии существует два вида проводимой химиотерапии: неоадъювантная и адъювантная. Неоадъювантная химиотерапия с последующим оперативным лечением дает возможность оценить чувствительность опухоли к проводимой лекарственной терапии, предоставляя данные, с помощью которых можно осуществить коррекцию последующей адъювантной химиотерапии [2-5].
На сегодняшний день при оценке ответа опухоли на неоадъювантную химиолучевую терапию широко используют клиническую классификацию ответа опухоли RECIST (Response Evaluation Criteria in Solid Tumors от 2000 г.). Критерии оценки ответа солидных опухолей (RECIST) - это набор стандартизированных критериев используемых для оценки уменьшения размеров опухоли в ответ на проводимую терапию. Согласно данной классификации выделяют «хороший» ответ опухоли, который проявляется в наличии признаков, характеризующих полную либо частичную регрессию новообразования, и «плохой» ответ, проявлением которого является стабилизация либо прогрессирование заболевания [6].
Как при «хорошем», так и при «плохом» ответе опухоли на терапию при раке молочной железы важным представляется возможность прогнозирования течения заболевания. Необходимость прогностических маркеров и поиск новых дополнительных морфологических параметров прогноза болезни с развитием разных форм опухолевой прогрессии, и в наибольшей степени - гематогенного метастазирования, представляет актуальную проблему. Известные независимые прогностические маркеры гематогенного метастазирования при раке молочной железы на сегодняшний день включают: размер первичной опухоли, степень злокачественности, наличие инвазии в сосуды, параметры метастатического поражения регионарных лимфатических узлов и др. [7-9].
Наиболее близким к предлагаемому является способ прогнозирования эффективности неоадъювантной химиотерапии больных раком молочной железы, разработанный Франциянц Е.М. и соавт. [10]. Сущность данного способа заключается в том, что во время операции радикального объема производят забор ткани злокачественной опухоли массой 100-150 мг. Готовят 10% гомогенат, определяют в нем содержание метаболитов эстрагенов - 2 гидроксиэстрона 2-ОНЕ1 и 16α-гидроксиэстрона 16α-ОНЕ1. Вычисляют соотношение 2OHE1\16α-ОНЕ1, и при уровне этого показателя больше 1,5 прогнозируют наступление клинического эффекта от проводимого неоадъювантного лечения.
Недостатком указанного способа является то, что он основан на исследовании операционного материала опухолевой ткани и не дает возможности оценить риск плохого эффекта неоадъювантной химиотерапии до начала лечения.
Показано, что циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) представляют собой гетерогенную популяцию: часть клеток являются стволовыми опухолевыми клетками, часть опухолевых клеток находятся в состоянии ЕМТ (epithelial-mesenchymaltransition), и большая часть ЦОК не имеют признаков стволовости и ЕМТ [11, 12]. Также было выявлено, что неоадъювантная химиотерапия (НАХТ) при раке молочной железы не способна удалять ЦОК в состоянии ЕМТ [13].
Новая техническая задача - ускорение и упрощение контроля эффективности лечения.
Для достижения нового технического результата в способе прогнозирования риска плохого ответа опухоли на неоадъювантную химиотерапию у пациенток с инвазивной карциномой молочной железы, включающем исследование биопсийного материала опухоли, до начала лечения с помощью молекулярной панели маркеров, включающей EpCam, CD45, CD44, CD24 и N-Cadherin и меченные флюорохромами моноклональные антитела против данных маркеров, методом многоцветной проточной цитометрии определяют количество циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) с признаком эпитителиально-мезенхимального перехода и без такового, при этом, пороговое значение ЦОК без признаков эпителиально-мезенхимального перехода (ЕМТ) до начала лечения при содержании клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin-менее 0,19 клеток/мкл оценивают в 0 баллов, содержание клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin-более или равно 0,19 клеток/мкл оценитвают в 1 балл, пороговое значение ЦОК с признаком ЕМТ до начала лечения при содержание клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+менее 0,24 клеток/мкл оценивают в 0 баллов, а при содержании клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+более или равно 0,24 клеток/мкл оценивают в 1 балл, по биопсийному материалу учитывают степень злокачественности опухоли, при этом, степень злокачественности низкую оценивают в 1 балл, умеренную в 2 балла, высокую в 3 балла, также учитывают состояние менструальной функции пациентки: сохранение менструальной функции оценивают в 1 балл, а менопаузу в 2 балла, далее рассчитывают значение параметра Y в уравнении регрессии по формуле:
Y=-4,88+10*X1-32,36*X2+6,81*X3+38,28*X4
X1 - степень злокачественности: Х1=1 при низкой степень злокачественности; X1=2 при умеренной степень злокачественности; Х1=3 при высокой степень злокачественности.
Х2 - состояние менструальной функции пациентки: Х2=1 при сохранении менструальной функции; Х2=2 при менопаузе.
Х3 - пороговое значение ЦОК без признаков эпителиально-мезенхимального перехода до начала лечения: Х3=0 при содержании клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin-менее 0,19 клеток/мкл; Х3=1 при содержании клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin-более или равно 0,19 клеток/мкл.
Х4 - пороговое значение ЦОК с признаком эпителиально-мезенхимального перехода до начала лечения: Х4=0 при содержании клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+менее 0,24 клеток/мкл; Х4=1 при содержании клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+более или равно 0,24 клеток/мкл.
далее значение вероятности риска плохого ответа на неоадъювантную химиотерапию Р определяют по формуле:
Y
Y
Р=e /(1+e), где е - математическая константа, равная 2,72, и при вероятности Р ≥ 0,5 определяется высокий, а при вероятности Р<0,5 - низкий риск плохого ответа на неоадъювантную химиотерапию. Способ осуществляют следующим образом.
Материалом для исследования служит венозная стабилизированная гепарином кровь, взятая до начала лечения (до биопсии) и биопсийный материал.
На основе молекулярной панели маркеров, включающей EpCam, CD45, CD44, CD24 и N-Cadherin и меченных разными флюорохромами моноклональньгх антител против данных маркеров, определяют различные популяции циркулирующих опухолевых клеток методом многоцветной проточной цитометрии на аппарате BD FACSCanto II (США) с помощью программного обеспечения BD FACSDiva. Клетки с фенотипом EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin-являются ЦОК без признаков эпителиально-мезенхимального перехода, а клетки с фенотипом EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+ - ЦОК с признаком эпителиально-мезенхимального перехода без признаков стволовости. Уровень различных популяций циркулирующих опухолевых клеток в крови выражают в количестве клеток/мкл.
Макроскопической оценке подвергают ткань первичной опухоли.
Материал фиксируют в 10-12% растворе нейтрального формалина. Проводку материала и изготовление гистологических препаратов осуществляют по стандартной методике. Препараты окрашивают гематоксилином и эозином. Гистологический тип рака устанавливают согласно рекомендациям ВОЗ, Женева, 2012.
Степень злокачественности оценивают по модифицированной схеме P. Scarff, H. Bloom и W. Richardson. Для определения степени злокачественности исследуют 3 параметра, каждый из которых оценивают в баллах от 1 до 3: количество тубулярных и протоковых структур (>75% - 1 балл, >10<75% - 2 балла, <10% - 3 балла), число митозов (<10 в 10 полях зрения - 1 балл, >10<20 - 2 балла, >20 - 3 балла), клеточный полиморфизм (клетки одного размера и формы, мелкие, с дисперсным распределением хроматина, без ядрышек - 1 балл, небольшой полиморфизм ядер, некоторое укрупнение клеток - 2 балла, ядра крупные различной формы с одним или несколькими ядрышками, с грубым хроматином - 3 балла). На основании суммы баллов 3-х параметров определяют степень злокачественности (3-5 баллов - низкая степень, 6-7 баллов - умеренная степень, 8-9 баллов - высокая степень злокачественности).
далее рассчитывают значение параметра Y в уравнении регрессии по формуле:
Y=-4,88+10*X1-32,36*X2+6,81*X3+38,28*X4
X1- степень злокачественности: X1=1 при низкой степень злокачественности; X1=2 при умеренной степень злокачественности; Х1=3 при высокой степень злокачественности.
Х2- состояние менструальной функции пациентки: Х2=1 при сохранении менструальной функции; Х2=2 при менопаузе.
Х3- пороговое значение ЦОК без признаков эпителиально-мезенхимального перехода до начала лечения: Х3=0 при содержании клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin-менее 0,19 клеток/мкл; Х3=1 при содержании клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin-более или равно 0,19 клеток/мкл.
Х4- пороговое значение ЦОК с признаком эпителиально-мезенхимального перехода до начала лечения: Х4=0 при содержании клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+менее 0,24 клеток/мкл; Х4=1 при содержании клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44-СВ24-Ncdherin+более или равно 0,24 клеток/мкл.
далее значение вероятности риска плохого ответа на неоадъювантную химиотерапию Р определяют по формуле:
Y
Y
Р=e/(1+e), где е - математическая константа, равная 2,72,
и при вероятности Р≥0,5 определяется высокий, а при вероятности Р<0,5 - низкий риск плохого ответа на неоадъювантную химиотерапию.
Модель имеет высокую степень достоверности (х2=9,52; р=0,040). Чувствительность 100%, специфичность 100%.
Сущность предлагаемого способа иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Больная П, 47 лет. с инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы, 3 степени злокачественности (3), стадия T2N1M0, менструальная функция сохранена (2). До биопсии в крови были обнаружены ЦОК с фенотипом EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin- в концентрации 0,38 клеток/мкл, что превышало значение 0,19 клеток/мкл (1); уровень ЦОК с фенотипом EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+был равен 1,30 клеток/мкл, что превышало пороговое значение 0,24 клеток/мкл и (1).
Рассчитывали значение параметра Y уравнения регрессии по формуле:
1
2
3
4
Y=-4,88+10*X-32,36*X+6,81*X+38,28*X
Y=-4,88+10*3-32,36*2+6,812*1+38,28*1=5,492
5,492
5,492
Значение вероятности плохого ответа на неоадъювантую химиотерапию определяли по формуле: Р=е/1+е=0,995 Вероятность плохого ответа на НАХТ составила 99,5%.
После 3 курсов НАХТ по схеме FAC по УЗИ было выявлено увеличение опухолевого узла (эффект прогрессирования). Смена схемы химиотерапии на таксотер в монорежиме также не дало положительной динамики, по УЗИ было выявлено увеличение опухолевого узла.
Пример 2. Больная K., 44 лет, с инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы, 3 степени злокачественности (3), T2NxM0, менструальная функция сохранена (2). До биопсии в крови ЦОК с фенотипом EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin- не были обнаружены (0); уровень ЦОК с фенотипом EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+был равен 0,08 клеток/мкл, что не превышало пороговое значение 0,24 клеток/мкл (0).
Рассчитывали значение параметра Y уравнения регрессии по формуле Y=-4,88+10*X1-32,36*Х2+6,81*Х3+38,28*Х4=-39,6
Y
Y
-39,6
-39,6
Значение вероятности плохого ответа на неоадъювантую химиотерапию определяется по формуле: Р=e/(1+e)=е/1+е=0,000. Вероятность плохого ответа на НАХТ составила 0%.
После 4 курсов НАХТ отмечалась полная регрессия опухоли, которая была подтверждена морфологически. Гистологическое исследование операционного материала выявило лечебный патоморфоз по RCB pCR и по Лавниковой Г.А. 4 степени.
Предлагаемый способ основан на анализе результатов клинических наблюдений, оценки злокачественности опухоли данных исследования крови методом проточной цитометрии.
2
2
2
В проспективном исследовании изучалась кровь 28 пациенток с инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы, взятая до начала лечения. Все пациентки проходили лечение в НИИ онкологии Томского НИМЦ. Средний возраст больных составил 50,0±9,8 лет, стадии T1-4N0-3M0.14 пациенток на предоперационном этапе получили 2-6 курсов полихимиотерапии по схеме FAC (5-фторурацил 500 мг/м2 в 1-й день, адриамицин 50 мг/м2в 1-й день, циклофосфамид 500 мг/м2 в 1-й день, внутривенно; проведение курсов через 21 день), по схеме САХ (циклофосфан 100 мг/м внутримышечно в течение 14 дней, адриамицин 30 мг/м внутривенно в 1-й и 8-й дни, кселода 1000 мг/м 2 раза в день, peros, в течение 14 дней; проведение курсов через 21 день), 14 пациенток не получали неоадъювантную терапию. Операция выполнялась в объеме радикальной мастэктомии или радикальной резекции молочной железы.
С помощью меченных различными флюорохромами моноклональных антител к EpCam, CD45, CD44, CD24 и Ncadherin методом многоцветной проточной цитометрии на аппарате BD FACSCanto II (США) и программного обеспечения BD FACSDiva в крови больных измеряли уровень различных популяций циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) до начала лечения: ЦОК-1 - клетки без признаков стволовости и ЕМТ (EpCam+CD45-CD44-CD24-NCadherin-); ЦОК-2 - клетки без признаков стволовости, с признаками ЕМТ (EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+); ЦОК-3 - стволовые опухолевые клетки без признаков ЕМТ (EpCam+CD45-CD44+CD24-Ncadherin-); ЦОК-4 - стволовые опухолевые клетки с признаками ЕМТ (EpCam+CD45-CD44+CD24-Ncadherin+); ЦОК-5 - стволовые опухолевые клетки с потерей мембранной экспрессии EpCam без ЕМТ (EpCam-CD45-CD44+CD24-Ncadherin-); ЦОК-6 - стволовые опухолевые клетки с потерей мембранной экспрессии EpCam с признаками ЕМТ (EpCam-CD45-CD44+CD24-Ncadherin+).
Уровень разных популяций циркулирующих опухолевых клеток в крови выражали в количестве клеток/мкл.
Степень злокачественности оценивалась по модифицированной схеме P. Scarff, H.Bloom и W.Richardson. При этом учитывалось количество тубулярных и протоковых структур, число митозов и клеточный полиморфизм.
Статистическая обработка результатов выполнялась с помощью пакета программ «Statistica 8.0 forWindows» и «IBM SPSS Statistics 22».
Для предсказания риска плохого ответа на неоадъювантую химиотерапию использовался метод логистической регрессии и ROC анализ. Была определена формула:
Y=-4,88+10*X1-32,36*X2+6,81*X3+38,28*X4
X1- степень злокачественности: X1=1 при низкой степень злокачественности; X1=2 при умеренной степень злокачественности; Х1=3 при высокой степень злокачественности.
Х2- состояние менструальной функции пациентки: Х2=1 при сохранении менструальной функции; Х2=2 при менопаузе.
Х3- пороговое значение ЦОК без признаков эпителиально-мезенхимального перехода до начала лечения: Х3=0 при содержание клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin-менее 0,19 клеток/мкл; Х3=1 при содержании клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin-более или равно 0,19 клеток/мкл.
Х4- пороговое значение ЦОК с признаком эпителиально-мезенхимального перехода до начала лечения: Х4=0 при содержании клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+менее 0,24 клеток/мкл; Х4=1 при содержании клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+более или равно 0,24 клеток/мкл.
далее значение вероятности риска плохого ответа на неоадъювантную химиотерапию Р определяют по формуле:
Y
Y
Р=e/(1+e), где е - математическая константа, равная 2,72,
и при вероятности Р≥0,5 определяется высокий, а при вероятности Р<0,5 - низкий риск плохого ответа на неоадъювантную химиотерапию.
Оценка различных популяций ЦОК в крови больных инвазивной карциномой молочной железы до начала лечения показала, что у пациенток, у которых наблюдался плохой ответ на НАХТ количества ЦОК с фенотипами EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+и EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin - были выше, чем у пациенток с хорошим ответом на НАХТ (табл. 1).
Изолированно, вне прогностической модели, связи ответа опухоли на НАХТ с состоянием менструальной функции и степени злокачественности обнаружено не было (табл. 2, 3).
Таким образом, предлагаемый способ позволяет с большей точностью и информативностью прогнозировать риск плохого ответа на НАХТ при инвазивной карциноме неспецифического типа молочных желез, что является крайне необходимым для определения тактики ведения и создания персонализированного подхода при лечении таких пациенток. Получены достоверные числовые показатели, характеризующие степень риска плохого ответа на НАХТ у конкретной больной, отражающие прогноз течения онкологического заболевания.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания:
1 Alexander S. Cancer invasion and resistance: interconnected processes of disease progression and therapy failure / S. Alexander, P. Friedl // Trends Mol Med. - 2012. - Vol. 18. - P. 13-26.
2. Gampenrieder S.P. Neoadjuvant Chemotherapy and Targeted Therapy in Breast Cancer: Past, Present, and Future / S.P. Gampenrieder, G. Rinnerthaler, R. Greil // J. Oncol. - 2013. - 732047. Epub 2013 Aug 20.
3. Redden M.H. Neoadjuvant chemotherapy in the treatment of breast cancer / M.H. Redden, G.M. Fuhrman // Surg. Clin. North Am. - 2013. - Vol.93, N 2. - P. 493-499.
4 Cazzaniga M. Breast cancer chemoprevention: old and new approaches / M. Cazzaniga, B. Bonanni // J. Biomed. Biotechnol. - 2012. - doi: 10.1155/2012/985620.
5 Minckwitz G. Update on neoadjuvant/preoperative therapy of breast cancer: experiences from the German Breast Group / G. von Minckwitz, M. Untch, S. Loibl // Curr. Opin. Obstet. Gynecol. - 2013. - Vol. 25, N 1. - P. 66-73.
6 Padhani AR, Ollivier L. The RECIST (Response Evaluation Criteria in Solid Tumors) criteria: implications for diagnostic radiologists. The British journal of radiology. 74 (887): 983-6. doi:10.1259/bjr.74.887.740983
7 Гидранович А.В. Прогнозирование исхода рака молочной железы на основании биохимических показателей сыворотки крови / А.В. Гидранович // Новости хирургии. - 2012. - Том 20, №4. - С. 64-69.
8 Bloom H.J.G. Prognosis in carcinoma of the breast / H.J.G. Bloom // Br J Cancer. - 1950. - Vol. 4. - P. 259-288.
9 Телегина H.C Связь гематогенной диссеминации с лимфогенным метастазированием при различных молекулярно-генетических вариантов рака молочной железы / Н.С. Телегина, О.Д. Брагина, К.Ю. Христенко, М.В. Завьялова, С.В. Вторушин, В.М. Перельмутер, Е.М. Слонимская, Е.В. Денисов, Н.В. Чердынцева // Бюллетень сибирской медицины. - 2013. - Том 12, №6. - С. 62-66.
10. Франциянц Е.М., Кечеджиева СМ., Лисутин А.Э., Верескунова М.И., Кит О.И Способ прогнозирования эффективности неоадъювантной химиотерапии больных раком молочной железы // Патента RU 2469651 Опубликовано: 20.12.2012 Бюл. №35
11. Кайгородова Е.В. Циркулирующие опухолевые клетки: клиническое значение при раке молочной железы (обзор литературы). Вестник РАМН. 2017; 72 (6): 450-457. doi: 10.15690/vramn833)
12. Kaigorodova, E.V.; Tarabanovskaya, N.A.; Staheeva, M.N.; Savelieva, О. E.; Tashireva, L. A.; Denisov, E. V.; Perelmuter V. M. Effect of minor and major surgical injury on the level of different populations of circulating tumor cells in the blood of breast cancer patients. Neoplasma. 2017; 64(3): 437-443. doi: 10.4149/neo_2017_315.
13. Mego M., Mani S.A. et all. Expression of epithelial-mesenchymal transition-inducing transcription factors in primary breast cancer: the effect of neoadjuvant therapy. Int. J. Cancer. 2012; 130 (4), 808-816 doi: 10.1002/ijc.26037