СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДАПТОГЕНА ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ АГЕНТОВ БИОФУНГИЦИДОВ К ДЕЙСТВИЮ НЕБЛАГОПРИЯТНЫХ УСЛОВИЙ И УВЕЛИЧЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ БОЛЕЗНЕЙ РАСТЕНИЙ И АДАПТОГЕН, ПОЛУЧЕННЫЙ СПОСОБОМ
METHOD OF PRODUCING ADAPTOGEN FOR INCREASING STABILITY OF BIOLOGIC AGENTS OF BIOFUNGICIDES TO UNFAVOURABLE CONDITIONS AND INCREASING EFFICIENCY OF BIOLOGICAL CONTROL OF PLANT DISEASES AND ADAPTOGEN PRODUCED BY SAID METHOD

Изобретение относится к области биотехнологии в сельском хозяйстве и может быть использовано в растениеводстве для повышения эффективности применения биологических препаратов для защиты сельскохозяйственных культур от инфекционных и неинфекционных болезней.
Болезни растений различной этиологии (инфекционные и неинфекционные) наносят значительный ущерб урожаю и качеству сельскохозяйственных культур. Для контроля болезней растений используются химические и биологические препараты - фунгициды. Биологические фунгициды (препараты от болезней растений) играют существенную роль в современных экологически безопасных системах защиты сельскохозяйственных культур [1]. В основе таких биопрепаратов лежат различные биоагенты - микроскопические бактерии или грибы [2]. В большинстве случаев, это живые культуры микроорганизмов или их покоящиеся стадии (споры). Способность к контролю развития болезней у биоагентов биофунгицидов обусловлена различными механизмами, в том числе выделением антибиотиков, образованием сидерофоров и других веществ [3].
Микроорганизмы - биологические агенты биопрепаратов находятся под влиянием различных экологических факторов, оказывающих разностороннее воздействие на их рост и развитие. Например, для большинства биологических агентов бактериальной природы оптимальные условия для роста и развития складываются при достаточном доступе кислорода (аэробы) и умеренных положительных температурах [4]. Именно высокая зависимость эффективности биологической защиты от внешних условий во многом сдерживает внедрение данного метода в практику растениеводства [5]. Так, хозяйственная эффективность использования широко распространенного биофунгицида Фитоспорин-М (Bacillus subtilis 26Д) на яровой пшенице колебалась в пределах от 2,6 до 143% [6].
Значительную роль в повышении устойчивости биологических агентов могут играть адаптогены - «вещества, контролирующие компенсаторно-приспособительные реакции микроорганизмов к стрессовым воздействиям и развитие культур в неоптимальных условиях роста» [7]. Наряду с внутриклеточными адаптогенами, известны и ряд внеклеточных ауторегуляторов, участвующие в развитии адаптивных реакций микроорганизмов, которые относятся к различным химическим соединениям. Разработка и промышленное производство новых адаптогенов для повышения эффективности биологических агентов относится к числу наиболее актуальных направлений повышения эффективности биологической защиты растений от стрессов.
Известен препарат на основе водных вытяжек рапсового жмыха, используемый для повышения устойчивости биоагентов биопестицидов к неблагоприятным условиям [8]. Основой положительного влияния данных препаратов на повышение устойчивости биологических агентов к стрессам выступает наличие необходимых для микроорганизмов аминокислот, в том числе и серосодержащих, а также различных витаминов и других физиологически активных веществ. Недостатком препаратов на основе рапсового жмыха является возможное наличие в них глюкозинолатов, обладающих антимикробным действием [9].
Значительный интерес представляют физиологически активные вещества растительного происхождения, получаемые с помощью экстракции различными методами. В частности, аминокислоты и белки, получаемые при экстракции из растительных материалов, обладают выраженным ростостимулирующим эффектом при использовании на разных сельскохозяйственных культурах [10]. Наиболее интересны экстракты семян злаковых культур, которые имеют ряд преимуществ при таком использовании: а) приготовление экстрактов из семенного материала осуществляется быстро и воспроизводимо [11]; б) эффективное взаимодействие между рядом биологических агентов биопрепаратов и растениями происходит на этапе прорастания семян, поэтому применение экстрактов семян имеет значение для стимулирования развития полезных микроорганизмов [12].
Для экстракции полезных веществ из растительного материала для получения физиологически активных веществ используются различные методы. Наиболее распространены следующие методы экстракции - получение водных [13], спиртовых [14] и ферментных [15] вытяжек. При этом, в зависимости от метода экстракции меняется состав вытяжки. В частности, при экстракции горячей водой из семян выделяются преимущественно водорастворимые белки (альбумины и т.д.), спиртом - спирторастворимые белки (проламины), а при использовании ферментации - различные аминокислоты. Гидролизаты белков обладают способностью стимулировать рост и развития различных микроорганизмов [16]. Так продукты распада проламинов - гетероциклические аминокислоты пролины, являются хорошо известными веществами повышающими устойчивость микроорганизмов к стрессам [17].
Семена проса обыкновенного (Panicum miliaceum L.) отличаются от семян других злаковых культур повышенным содержанием проламинов [18]. Кроме того, в них содержатся различные физиологически активные вещества - витамины, аминокислоты, жирные кислоты [19]. Экстракты семян проса активно используется в косметологии, что свидетельствует об их безопасности для человека [20].
Известно, что при прорастании семян злаковых культур происходит гидролиз запасных белков, в том числе из проламинов образуются пролины, хорошо растворимые в спиртах [18].
Для предотвращения развития плесневых грибов и других микроорганизмов при проращивании семян зерновых культур рекомендуется проводить их предварительное обеззараживание путем замачивания в 96%-ном этаноле или растворе 1%-ного раствора перманганата калия в течение 1-2 минут, как например при фитоэкспертизе семян [21].
Недостатком существующих подходов к повышению устойчивости биологических агентов биопрепаратов к неблагоприятным условиям и повышения эффективности их применения является использование специально непредназначенных для данных целей и не адаптированных под требования конкретных микроорганизмов их смесей с различными удобрениями, например с гуматами [22]. Применение же для данных целей специализированного адаптогена [9] на основе продуктов переработки рапса ограничено как возможным присутствием глюкозинолатов, так и тем, что при производстве данного адаптогена применяется экстракция водой при температуре близкой к 100°С, что может привести к денатурации белков и разрушению аминокислот, что значительно снижает ценность данного препарата для защиты биоагентов от стрессов. Кроме того, как отмечалось выше пролины, лучше экстрагируются спиртами, чем водой [18].
Целью изобретения является повышение устойчивости биологических агентов биофунгицидов к действию неблагоприятных условий, увеличение эффективности биологического контроля болезней растений и повышение урожайности сельскохозяйственных культур.
Указанная цель достигается тем, что в способе получения адаптогена для повышения устойчивости биологических агентов биофунгицидов к действию неблагоприятных условий и увеличения эффективности биологического контроля болезней растений, включающий измельчение на мельнице предварительно стерилизованных в течение 1-2 минут в 96%-ном этаноле или растворе 1%-ного раствора перманганата калия и просушенных в стерильной фильтровальной бумаге кондиционных семян проса обыкновенного, спиртовую экстракцию измельченной массы и фильтрацию через керамический фильтр, полученной после экстракции надосадочной жидкости, кондиционные семена просо после стерилизации и просушивания в стерильной фильтровальной бумаге помещаются во влажные камеры со стерильной фильтровальной бумагой с добавлением стерильной воды и проращиваются при температуре от 21 до 25°С в течение 7 дней, затем высушиваются до влажности 14%, а при экстракции к 1 кг измельченной массы добавляется 70%-ный этанол или 50%-ный изопропиловый спирт в соотношении 1:3, причем экстракция проводится при температуре от 23 до 25°С в течение 12 часов, кроме того, после фильтрации через керамический фильтр, надосадочная жидкость подвергается выпариванию при температуре от 25 до 30°С до получения осадка, затем к полученному осадку добавляется стерильная вода объемом 10 л.
Полученная таким способом адаптоген представляет собой прозрачную бесцветную жидкость, а выход готового к применению адаптогена составляет 10 л из 1 кг семян.
Биохимический анализ на наличие пролина в жидкости проводился с применением метода анализа нингидрином с использованием методики описанной в ГОСТ Р 54947-2012 [23]. Анализ показал наличие пролина в полученной жидкости. Изучение величины рН полученного адаптогена показала величину равную от 5,8 до 6,0, что является оптимальным параметрам для микроскопических грибов и не вызывает отрицательного влияния на бактерии биоагентов биофунгицидов.
Для испытания активности адаптогена в повышении устойчивости биологических агентов биофунгицидов применялись лабораторные и полевые исследования.
Результаты лабораторных исследований
Определение антистрессовой активности экстрактов
2
4
2
2
4
4
2
4
4
2
7
В качестве среды для выращивания тестового биоагента использовали среду ВМ содержащую 7,6 г/л KHPO⋅3HO, 3 г/л KHPO, 1 г/л (NH)SO и 0,2. г/л MgSO⋅7HO без добавления или с добавлением 2% глюкозы. Данная среда является модификацией сукцинатной среды Майера [24]. Для экспериментов по анализу влияния растительных экстрактов использовалась культура штамма Pseudomonas putida PCL1760. Данный штамм был выделен из ризосферы авокадо и является активным колонизатором ризосферы растений [25]. Кроме того, PCL1760 является агентом биологического контроля корневых гнилей томатов и защищает растения посредством механизма конкуренции за экологические ниши [26]. Штамм P. putida PCL1760 является прототрофом, т.е. растет на минеральных средах, и имеет оптимум роста 30°С. Для определения влияния на рост штамма PCL1760 50 мкл каждого из экстрактов добавляли к 150 мкл среды ВМ уже смешанной с суспензией клеток PCL1760 до расчетной концентрации (ОП600=0.01), что примерно соответствует 10 клеток/мл. Каждый вариант испытывался в трех лунках планшета для статистической обработки данных. Планшеты инкубировали при 30°С для определения влияния экстрактов на рост штамма PCL1760, а также влияние экстрактов при солевом, осмотическом и холодовом стрессе. Для определения влияния экстрактов на штамм PCL1760 во время теплового стресса планшеты инкубировали при 37°С. Оптическую плотность культуры измеряли при помощи iMark (Bio-Rad Laboratories, США) при длине волны 600 нм.
На первом этапе изучалось влияние препарата на рост бактерии при недостатке питания (табл. 1).
Результаты показали стимулирующее влияние адаптогена из семян проса на рост штамма PCL1760 при недостатке питания.
На втором этапе изучалось влияние адаптогена на развитие бактерии при оптимальных условиях (температура 30°С), тепловом (температура 37°С) и холодовом стрессах (температура 20°С) (таблица 2).
Независимо от температуры исследований, добавление адаптогена из семян проса приводило к стимулированию размножения бактерии, что говорит о выраженном протекторном действии вытяжки в отношении к температурному стрессу.
Результату оценки влияния адаптогена на устойчивость к действию солевого стресса приведены в таблице 3. В среду для создания стресса добавлялся 3% раствор NaCl.
Добавление изучаемой вытяжки привело к росту оптической плотности раствора почти в 3,1 раза, что говорит о выраженном влиянии вытяжки на повышение устойчивости бактерий к осмотическому стрессу.
Полученные данные показали высокую активность адаптогена из семян проса в стимулировании размножения и развития бактерии Pseudomonas putida PCL1760 в условиях теплового и осмотического стресса.
В лабораторных условиях оценивалось влияние адаптогена на биологическую активность распространенного биофунгицида Ризоплан. Семена обрабатывались на лабораторной установке. Норма расхода Ризоплана составила 0,5 л/т, а норма расхода адаптогена соответственно 0,5, 1,0 и 1,5 л/т семян. Исследования проводили на яровой пшенице сорта «Йолдыз».
Было показано положительное влияние адаптогена на повышение активности биологического агента биопрепарата (табл. 4).
Добавление в рабочий состав с Ризопланом адаптогена с нормой 0,5 л/т способствует росту активности в контроле семенной инфекции возбудителей корневых гнилей и плесневых грибов. Однако дальнейший рост нормы расхода адаптогена снижает его положительное влияние. По всей видимости, избыточное количество аминокислот вносимых при больших нормах расхода вытяжки может несколько стимулировать развитие фитопатогенных грибов.
При длительном контакте ряда бактериальных биологических агентов с солнечным светом происходит их гибель и снижение эффективности контроля патогенов. Для изучения данного вопроса, обработанные семена оставлялись на свету в прозрачных поддонах (продолжительность светового дня) при температуре 21°С. Результаты оценки биологической эффективности в отношении наиболее опасного патогена семян Bipolaris spp. представлены в таблице 5.
Результаты оценки показали, что при применении Ризоплана, уже через недели поле обработки под влиянием солнечного света активность против Bipolaris spp. упала в 1,93 раза, а через 3 недели - в 7,9 раза. При добавлении адаптогена в норме 0,5 л/т через неделю падение было лишь в 1,15 раза, а через 21 день - 1,3 раза. С увеличение нормы расхода адаптогена положительный эффект значительно слабел. Таким образом, адаптоген на основе семян проса в норме 0,5 л/т способствовал более длительному действию биоагента даже при интенсивном попадании солнечного света.
Результаты полевых опытов
Объект исследований - яровая пшеница сорта «Йолдыз».
Схема опыта:
1. Контроль - без обработки.
2. Стандартный биофунгицид (Ризоплан), 0,5 л/т.
3. Ризоплан + адаптоген (0,5 л/т)
4. Ризоплан + адаптоген (1,0 л/т)
5. Ризоплан + адаптоген (1,5 л/т)
2
2
Общая площадь делянки - 2,1 м, учетная - 1,5 м. Повторность в опыте - пятикратная. Под культивацию вносились 2 ц/га азофоски и 1 ц/га аммиачной селитры. Посев яровой пшеницы сорта «Йолдыз» провели 9 мая, с нормой высева 5,5 млн. всхожих семян. Агротехнология возделывания яровой пшениц - общепринятая для зоны Предкамья Республики Татарстан. Расход рабочей жидкости - 10 л/т.
В полевых условиях проводился учет развития корневых гнилей в разные фазы развития растений пшеницы (табл. 6).
Результаты оценки показали, что во все фазы учета, минимальное поражение растений корневыми гнилями было при применении варианта - Ризоплан + адаптоген (0,5 л/т). Увеличение нормы адаптогена до 1,0 л/т на начальных этапах развития растений также усиливало активность в сравнении с вариантом только с биопрепаратом, но затем эффект пропадал. Высокая норма расхода (1,5 л/т) оказала минимальное влияние на снижение развитие корневых гнилей.
Таким образом, можно говорить о положительном влиянии адаптогена в норме 0,5 л/т на повышение активности биофунгицида.
Добавление к Ризоплану адаптогена в норме 0,5 л/т привело к росту урожайности на 0,22 т/га в сравнении с использованием только одного биофунгицида и на 0,41 т/га по сравнению с контролем.
Таким образом, использование адаптогена, полученного из проросших семян проса предлагаемым способом, позволяет значительно повысить устойчивость биологических агентов биофунгицидов к различным стрессам, повышает их активность в контроле фитопатогенных грибов и способствует росту урожайности.
Изобретение создано при финансовой поддержке Минобрнауки России в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» по соглашению №14.610.21.0017 от 03 октября 2017 г., уникальный идентификатор проекта RFMEFI61017X0017.
Список использованной литературы
1. Захаренко, В.А. Биотехнологии и защита растений // Защита и карантин растений. - 2015. - №11. - С. 3-8.
2. Whipps, J.М. Biological control agents in plant disease control / J.M. Whipps, M. McQuilken // Disease Control in Crops: Biological and Environmentally Friendly Approaches. - Blackwell Publishing Ltd, 2009. - P. 27-61.
3. Xu, X.-M. Combined use of biocontrol agents to manage plant diseases in theory and practice / Xu, X.-M., Jeffries, P., Pautasso, M., and Jeger, M.J. // Phytopathology. - 2011. - Vol. 101. - P. 1024-1031.
4. Нетрусов. А.И. Экология микроорганизмов: Учеб. для студ. вузов / А.И. Нетрусов, Е.А. Бонч-Осмоловская, В.М. Горленко и др.; Под ред. А.И. Нетрусова. - М.: Издательский центр «Академия», 2004. - 272 с.
5. Bardin, М. Is the efficacy of biological control against plant diseases likely to be more durable than that of chemical pesticides? / M. Bardin, S. Ajouz, M. Comby, M. Lopez-Ferber, B. Graillot, M. Siegwart and P.C. Nicot // Front. Plant Sci. - 2015. - Vol. 6:566 / doi: 10.3389/fpls.2015.00566.
6. Ласточкина, O.B. Влияние бактерий Bacillus subtilis 26Д на засухоустойчивость растений яровой мягкой пшеницы сортов лесостепного западносибирского и степного волжского экотипов на начальных этапах онтогенеза / О.В. Ласточкина, Р.А. Юлдашева, Л.И. Пусенкова // Известия Уфимского научного Центра РАН. - 2017. - №3(1) - С. 99-102.
7. Николаев, Ю.А. Ауторегуляция стрессового ответа микроорганизмов. - Автореф… на соиск. ученой степени докт. биол. наук по специальности 03.02.03 - микробиология. - М.: Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, 2011. - 48 с.
8. Сафин Р.И., Исмаилова А.И., Ермаков Н.А., Семушкин Н.И. Патент RU №2452181 на изобретение СОСТАВ ДЛЯ АДАПТАЦИИ БИОПЕСТИЦИДОВ. Опубликовано: 10.01.2012, Бюл. №1.
9. Buxdorf, К. The Effects of Glucosinolates and Their Breakdown Products on Necrotrophic Fungi / K. Buxdorf, Yaffe H, Barda O, Levy M. // PLoS ONE. - 2013. - №8(8): e70771. doi:10.1371/journal.pone.0070771.
10. Calvo, P Agricultural uses of plant biostimulants / P. Calvo, L. Nelson, J.W. Kloepper // Plant Soil. - 2014. - Vol. 383. - P. 3-41.
11. Vancura, V. & Hanzlikova, A. Root exudates of plants. IV. Differences in chemical composition of seed and seedlings exudates / Vancura, V. & Hanzlikova, A. // Plant Soil. - 1972. - Vol. 36. - P. 271-282.
12. Jacoud, C. Development of a strain-specific probe to follow inoculated Azospirillum lipoferum CRT1 under field conditions and enhancement of maize root development by inoculation / Jacoud, C., Faure, D., Wadoux, P. & Bally, R. // FEMS Microbiol Ecol. - 1998. - Vol. 27, 43-51.
13. Прокудина, O.C. Действие экстрактов из нетрадиционных растений на прорастание семян, рост и развитие сельскохозяйственных культур / О.С. Прокудина, А.Ф. Степанов, М.П. Чупина // Вестник КрасГАУ. - 2017. - №2. - С. 21-25.
14. Pothier, F. Promoter-trap identification of wheat seed extractinduced genes in the plant-growth-promoting rhizobacterium Azospirillum brasilense Sp245 / J.F. Pothier, F. Wisniewski-Dye et al. // Microbiology. - 2007. - Vol. 153. - P. 3608-3622.
15. Брыкалов А.В., Грядских Д.А., Головкина E.M. Патент RU №2409952 СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕГУЛЯТОРА РОСТА РАСТЕНИЙ. Опубликовано: 27.01.2011, Бюл. №3.
16. du Jardin, P. Plant biostimulants: Definition, concept, main categories and regulation / P. du Jardin // Scientia Horticulturae. - 2015. - Vol. 196. - P. 3-14.
17. Селиванова, Е.А. Механизмы выживания микроорганизмов в гиперосмотических условиях // Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2012, №3.
18. Казаков, Е.Д. Биохимия зерна и продуктов его переработки / Е.Д. Казаков, В.Л. Кретович - М.: «Агропромиздат», 1989. - 368 с.
19. В.И. Хорева, А.Ф. Курцева. Биохимическая характеристика сортов проса в связи с проблемой качества зерна // Аграрная Россия. - 2006. - №6. - С. 32-36.
20. Lamour Irene, Laimay Francois, Gaillard Vannes Emmanuelle. Patent No.: US 9,180,135 B2. MILIACIN AND SPHINGOLIPIDS AND/OR PHOSPHOLIPIDS COMPOSITION FOR HAIR AND SCALP CARE. Oct. 23, 2014.
21. ГОСТ 12044-93. Межгосударственный стандарт семена сельскохозяйственных культур. Методы определения зараженности болезнями.
22. Терещенко, Н.Н. Исследование эффективности комплексного применения оксигумата торфа и бактериальной культуры Pseudomonas sp. для создания биопрепарата системного действия / Н.Н. Терещенко, А.Б. Бубина, Л.Н. Сысоева, Т.И. Бурмистрова, Н.М. Трунова // Вестник Томского государственного университета. Биология. 2009. №1. С. 27-36
23. ГОСТ Р 54947-2012. Мед. Метод определения пролина.
24. Meyer J.M. & М.А. Abdallah The Fluorescent Pigment of Pseudomonas fluorescens: Biosynthesis, Purification and Physicochemical Properties J. Gen. Microbiol. - 1978. - Vol. 107. - P. 319-328.
25. Validov S, Kamilova F, Qi S, Stephan D, Wang JJ, Makarova N, Lugtenberg B. Selection of bacteria able to control Fusarium oxysporum f. sp radicis-lycopersici in stonewool substrate. Journal of Applied Microbiology. 2007. - Vol. 102. - P. 461-471.
26. Validov S. Biocontrol of tomato foot and root rot by pseudomonads in stonewool. Leiden. - 2007. - P. 193.