СПОСОБЫ МОДУЛИРОВАНИЯ РЕЦЕПТОРОВ КЛЕТОЧНЫХ ПОВЕРХНОСТЕЙ ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ИЛИ СНИЖЕНИЯ ВОСПАЛЕНИЯ
METHODS FOR MODULATING CELL-SURFACE RECEPTORS FOR PREVENTION OR REDUCTION OF INFLAMMATION

Перекрестная ссылка на родственные заявки
Данная заявка подтверждает приоритет предварительной патентной заявки США №60/757,751, поданной 10 января 2006 г., содержание которой включено в заявку посредством ссылки.
Уровень техники
Известно, что мягкие ткани полости рта млекопитающего являются наиболее ранними индикаторами воспаления. Это генерализованное незначительное воспаление может привести к гингивиту и/или периодонтиту. Вообще полагается, что подобное воспаление, является результатом, по крайней мере частично, присутствия бактерий в полости рта. Кроме того, воспаление тканей полости рта также может быть вызвано хирургической операцией, локализированным повреждением, травмой, некрозом, неправильной гигиеной полости рта или различными системными происхождениями.
Вообще полагается, что клеточные компоненты, связанные с этими болезнями и состояниями, включают эпителиальную ткань, десневые фибробласты и циркулирующие лейкоциты, которые все вносят вклад в реакцию хозяина на патогенные факторы, проводимые бактериями. Некоторые бактериальные патогенны, вовлеченные в эти инфекции полости рта, известны, хотя многие могут оставаться неизвестными или не характеризованными. Хотя инфекция определенными типами бактерий является чистым этиологическим случаем во многих из этих болезней полости рта, патогенез болезни или состояния опосредует реакцию хозяина. Использование антибактериальных средств сокращает популяцию бактерий в данной полости рта и может привести к ослаблению воспаления. Однако этот подход несовершенен, так как такое уничтожение происходит не избирательно (могут погибнуть как полезные бактерии полости рта, так и вредные бактерии), и он является зависимым от дозы и времени.
Бактериальная инфекция ткани полости рта стимулирует иммунную реакцию хозяина и ослабляет процесс излечения положительно регулирующими воспалительными медиаторами, которые вызывают значительное повреждение ткани. Эти метаболиты были вовлечены как главные медиаторы в случае гингивита, периодонтита, остеомиелита и других воспалительных заболеваний.
Уже сообщалось, что один механизм воспаления опосредуется посредством определенных трансмембранных рецепторов клеток млекопитающего. Например, Толл-подобные рецепторы "TLR" являются гликозилированными трансмембранными белками и, будучи активизированными олигомеризацией, вызванной лигандом, инициируют иммунную реакцию в пределах клетки, в конечном счете заканчивающейся экспрессией цитокинов, интерлeйкинов, и других молекул, которые являются медиаторами при состоянии воспаления.
В уровне техники существует потребность в средствах и методах, полезных в диагностике, лечении, и предотвращении таких воспалительных эффектов.
Краткое описание фигур
Фиг.1 - схематическая диаграмма, показывающая поверхность клетки в контакте с микробом.
Фиг.2 - показывает сигнальные пути Толл-подобных рецепторов (TLR)1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 9, а также различные молекулы, произведенные модуляцией каждого TLR.
Краткая сущность изобретения
Изобретение включает способ различения видов бактерий полости рта с целью определения, является ли вид вредным для полости рта. Такой способ включает контактирование по крайней мере одной бактерии или части бактерии вида бактерий полости рта с клеткой десны и обнаружение присутствия индикаторного соединения. Отсутствие по существу индикаторного материала означает, что данный вид бактерий не является вредным.
К объему изобретения также относятся способы определения противовоспалительного действия агента. Такие способы включают контактирование клетки с агентом в присутствии вредной бактерии или части такой бактерии и обнаружении присутствия индикаторного соединения. Отсутствие по существу индикаторного материала означает, что агент является противовоспалительным.
Подробное описание изобретения
Изобретение обеспечивает способы (1) различения вредных и полезных видов бактерий полости рта и (2) способы определения противовоспалительного действия конкретного агента. Также обеспечиваются способы, предотвращения модуляции Толл-подобного рецептора в клетке с использованием триклозана.
Термин "воспаление", используемый здесь, относится к локализованной защитной реакции, вызываемой повреждением или разрушением тканей, которая служит, чтобы разрушить, ослабить или секвестировать как вредного агента, так и травмированную ткань. В острой форме это может быть характеризовано болью, высокой температурой, краснотой и набуханием. Гистологически, воспаление включает сложный ряд событий, включающих расширение артериол, капилляров и малых вен с увеличением проницаемости и тока крови; эксудиции жидкостей, включая плазменные белки, и миграцию лейкоцитов в очаг воспаления. Воспаление соответствует увеличенным уровням провоспалительных клеточных медиаторов или веществ, которые высвобождаются, например, в результате взаимодействия антигена с антителом или при взаимодействии антигена с сенсибилизированным лимфоцитом. Вообще говоря, противовоспалительным агентом является любой, который снижает качество и/или количество этих гистологических эффектов в клетке, по сравнению с подобной клеткой, не подвергавшейся действию агента.
В частности, изобретение обеспечивает способ оценки бактерий или бактериальных штаммов специфического вида для определения того, является ли такой вид или штамм вредным для полости рта.
Термин "вредный" подразумевает патогенные бактерии, присутствие которых приводит к генерации воспалительных медиаторов клетками, подвергнувшимися воздействию. Сообщалось, что некоторые штаммы/виды бактерий были признаны вредными, включая приведенные в Таблице 1 ниже:
<b>Таблица 1:</b><b>Бактерии полости рта, признанные вредными:</b>
A. gerencseriae
A. naeslundii 1
A. naeslundii 2
V. parvula
S. mitis
S. oralis
C. gingivalis
C. sputigena
F. nucleatum ss nucleatum
F. nucleatum ss polymorphum
F. periodonticum
P. intermedia
T. forsythia
L. buccalis
N. mucosa
P. acnes
P. melaninogenica
S. noxia
Способ включает контактирования по крайней мере одной бактерии вида или штамма бактерий полости рта, которые будут оценены, с по крайней мере одной десневой клеткой. Альтернативно, десневая клетка может войти в контакт с частью бактерии, клеточной мембраной, компонентами цитоплазмы, конечными или побочными продуктами метаболизма бактерий и/или факторами вирулентности.
,
Эта стадия может быть выполнена в условиях in vitroнапример, путем поддержания культуры бактерий или части бактерий и десневых клеток и комбинирования таких культур. Альтернативно, контактирование может производиться в условиях in vivo путем нанесения бактериальной культуры в соответствующем носителе на полость рта.
,
,
После такого контактирования могут быть обнаружены один или более индикаторных материалов. Такие индикаторные материалы включают любые, которые уже являются известными, либо требуют обнаружения, среди тех, которые обычным образом генерируются иммунной реакцией хозяина, включая промежуточные соединения, ферменты, белки, РНК, ДНК и другие молекулы, которые вовлечены в продуцирование клетками цитокинов и других провоспалительных медиаторов. Предпочтительными являются материалы индикатора, которые генерируются модуляцией любого из Толл-подобного рецептора (например, как показано на Фиг.2), включая, например, TLR 2, 3, 4, 5, 7 и 9; молекулы пути NFk-B, цитокины, интерлейкины (например1, 6, 8, 12), фактор некроза опухолей (TNF), пептидазы и мРНК, кодирующая интерлейкин или субъединицы TNF и/или интерлейкины, хемокины (напримерCCL5, CCL4, CCL3 и CC10) и металопротеиназный матрикс.
Обнаружение выбранного индикаторного материала может быть выполнено способом, который является известным, или разработанным в перспективе и путем относительного или абсолютного измерения. Обнаружение может быть осуществлено непосредственным измерением количества выбранного индикаторного материала(ов). Альтернативно, это может быть достигнуто косвенным измерением с использованием дополнительных систем обнаружения, таких как радиоактивные и/или флуоресцентные маркеры, антитела, изменения в уровне генной экспрессии специфических генов, анализа мРНК, анализа на микроматрицах и/или изменений статуса антиоксиданта. Например, если индикаторный материал фермент, можно поместить образец на подходящий субстрат и измерить конечный продукт ферментной каталитической реакции, чтобы определить наличие или отсутствие ферментного индикаторного материала. В практике этого аспекта изобретения отсутствие по существу выбранного индикаторного материала демонстрирует, что вид/штамм бактерий не является вредным, т.е. не воздействует на клетку таким образом, чтобы инициировать продуцирование любых провоспалительных медиаторов.
Изобретение также включает способ оценки противовоспалительной способности или эффекта действия специфического агента, т.е. способности агента снизить или устранить воспаление в ткани, подвергнутой действию патогенной бактерии. Способ включает выбор агента для проведения оценки. Таким агентом может быть белок, пептид, органическая молекула, неорганическая молекула или конъюгат любого из них.
При некоторых обстоятельствах может быть желательным, чтобы выбранный для оценки агент не оказывал значительного бактерицидного эффекта в полости рта. Например, агент может быть выбран из тех, которые показывают минимальную подавляющую концентрацию (MIK) - равную 0, меньше чем приблизительно 5%, меньше чем приблизительно 10%, меньше чем приблизительно 20% и меньше чем приблизительно 30%.
Исследования по оценке MIK обычно включают подготовку раствора активного агента в подходящем растворителе с дальнейшим последовательным серийным разбавлением солюбилизированного раствора активного агента. Стандартная суспензия выбранных бактерий (это могут быть группы бактерий, каждая из которых требует своего собственного специализированного протокола для роста и обработки) добавляется к каждой концентрации разбавленного активного агента. Бактерии и активный агент выращиваются в соответствующих условиях при 37°C и рост бактерий контролируется обычно после 48 часов инкубации.
Контроль при исследовании по оценке MIK включает контроль роста, в котором контролируется рост бактерий в отсутствие любых добавленных растворителей или эксципиентов. Дополнительно контроль включает оценку стерильности среды, используемой для тестов. Действие растворителя(ей), используемого для растворения активных агентов на бактерии, являются заключительной в серии контролей, применяемых в этих исследованиях.
После инкубации чашки анализируются в спектрофотометре для микропланшет при 610 нм. Результаты интерпретируются как самая низкая концентрация активного агента, которая замедляет бактериальный рост. При высоких концентрациях активного агента бактерии не будут расти (характеризуется низкой величиной измеренной оптической плотности), а на низких концентрациях активного агента бактерии быстро размножаются (характеризуется высокой величиной измеренной оптической плотности). Самая низкая концентрация активного агента, приводящая к остановке роста бактерий, определяется как MIK. В качестве контроля служит следующее:
Стерильность среды - отсутствие роста бактерий.
Контроль роста бактерий - культуры демонстрируют интенсивный рост.
Растворители, используемые для растворения активных агентов, не должны замедлять рост бактерий (поскольку они должны быть по существу безвредными).
,
Способ оценки противовоспалительной способности или эффекта специфического агента включает стадию контактирования клетки с патогенной или вредной бактерией. Клетка, с которой производится контакт, может находиться в состоянии in vivo или in vitro быть прокариотической или эукариотической и может быть получена из линии клеточной культуры или клинического образца.
Подходящие патогенные или вредные бактерии для использования в способе по изобретению могут быть любыми из числа уже известных или которые будут обнаружены, которые воздействуют на выбранную клетку таким способом, чтобы вызвать иммунную реакцию. Такими бактериями могут быть, например, бактерии, перечисленные в Таблице 1 выше.
Способ оценки противовоспалительной способности или эффекта специфического агента включает стадию обнаружения наличия или отсутствия одного или более индикаторного соединения. Индикаторные соединения, способы и методы обнаружения и системы обнаружения могут быть любыми из описанных выше.
В изобретение также включены композиции для орального применения, содержащие агенты, которые, как показали упомянутые выше исследования, оказывают противовоспалительный эффект, а также способы предотвращения модуляции Толл-подобных рецепторов в клетках ткани полости рта при их контакте с триклозаном.
Изобретение также обеспечивает способы снижения или предотвращения воспаления ткани полости рта путем нанесения соединения, такого как триклозан, на ткань на уровнях ниже MIK.