ПРОИЗВОДНОЕ БЕНЗИЛФЕНИЛОВОГО ЭФИРА, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ЕГО ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ
BENZYLPHENYL ETHER DERIVATIVE, METHOD FOR PRODUCTION THEREOF, PHARMACEUTICAL COMPOSITION THEREOF AND USE THEREOF

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение раскрывает производное бензилфенилового эфира, способ его получения, и его фармацевтическую композицию и применение. В частности, изобретение относится к производным бензилфенилового эфира, представленным формулой (I), его фармацевтически приемлемой соли, его стереоизомеру, способу его получения, фармацевтической композиции, содержащей одно или несколько соединений, и применению соединений при лечении заболеваний, связанных с сигнальными путями PD-1/PD-L1, таких как рак, инфекционные заболевания и аутоиммунные заболевания.
Уровень техники
С углублением исследований в области иммунологии рака было обнаружено, что микроокружение опухолей может защитить опухолевые клетки от распознавания и уничтожения иммунной системой человека. Ускользание от иммунного ответа опухолевых клеток играет очень важную роль в возникновении и развитии опухоли. В 2013 году журнал Science оценил иммунотерапию опухолей как первую из десяти лучших прорывов, вновь сделав иммунотерапию «фокусом» в области лечения рака. Активация или ингибирование иммунных клеток регулируется положительными и отрицательными сигналами, в которых белок программируемой смерти клеток 1 (PD-1)/лиганд PD-1 (PD-L1) представляет собой отрицательный иммунорегуляторный сигнал, который ингибирует иммунную активность опухолеспецифичных CD8+ Т-клеток и опосредует ускользание от иммунного ответа.
Опухолевые клетки ускользают от иммунной системы путем связывания лиганда программируемой смерти клеток (PD-L1), продуцируемого на их поверхности, с белком PD-1 Т-клеток. Микроокружение опухоли индуцирует высокую экспрессию молекул PD-1 в инфильтрирующих Т-клетках, и опухолевые клетки высоко экспрессируют PD-1-лиганды PD-L1 и PD-L2, что приводит к непрерывной активации пути PD-1 в микроокружении опухоли. Ингибированные Т-клетки не могут найти опухоль, так что они не могут сигнализировать иммунной системе атаковать и убивать опухолевые клетки. PD-1 антитело против PD-1 или PD-L1 блокирует этот путь, предотвращая связывание двух белков и частично восстанавливая функцию Т-клеток, позволяя им убивать опухолевые клетки.
Иммунотерапия на основании PD-1/PD-L1 представляет собой перспективную иммунотерапию нового поколения, направленную на использование собственной иммунной системы организма для борьбы с опухолями. Она имеет потенциал для лечения различных типов опухолей путем блокирования сигнального пути PD-1/PD-L1 для индукции апоптоза. Недавно ряд неожиданных исследований подтвердил, что PD-1/PD-L1 ингибирующие антитела обладают сильной противоопухолевой активностью против множества опухолей, что являются особенно привлекательным. 4 сентября 2014 года Keytruda (пембролизумаб) от Merck, США, стал первым одобренным FDA PD-1 моноклональным антителом для лечения пациентов с прогрессирующей или неоперабельной меланомой, которые не ответили на другое медикаментозное лечение. В настоящее время MSD исследует потенциал Keytruda в лечении более чем 30 различных типов рака, включая различные типы рака крови, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак желудка и рак головы и шеи. 22 декабря 2014 года фармацевтический гигант Bristol-Myers Squibb стал лидером в получении ускоренного одобрения Управления по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA). Принадлежащее им противораковое иммунотерапевтическое средство ниволумаб был указано под торговым названием Opdivo для лечения пациентов с неоперабельной или метастатической меланомой, которые не ответили на другие лекарственные средства, и оно является вторым ингибитором PD-1, зарегистрированным в США, после Keytruda от MSD. 4 марта 2015 года FDA одобрило ниволумаб для лечения метастатического плоскоклеточного немелкоклеточного рака легкого, который прогрессировал во время химиотерапии на основе платины или после химиотерапии. Согласно исследованию фазы I KEYNOTE-028 по лечению солидных опухолей Keytruda (пембролизумаб), опубликованному MSD, лечение Keytruda достигло 28% общей частоты ответа (ORR) у 25 пациентов с мезотелиома плевры (PM). И 48% пациентов имеют стабильное заболевание и частота контроля заболевания достигла 76%. Пациенты с прогрессирующей лимфомой Ходжкина (HL), у которых не было ответа на лечение на любое из одобренных лекарственных средств, смогли достичь полной ремиссии после лечения с Keytruda от MSD и Opdvio от Bristol-Myers. На ежегодном собрании AACR в 2015 году, Лейша А. Эменс (Leisha A. Emens), MD, PhD, доцент онкологии в Johns Hopkins Kimmel Cancer Center, сообщила, что PD-L1 моноклональное антитело MPLL3280A от Roche имеет длительный эффект при распространенном трижды негативном раке молочной железы.
Иммунотерапия опухолей считается революцией в лечении рака после таргетной терапии опухоли. Однако терапевтическое средство моноклонального антитела имеет свои собственные недостатки: оно легко разлагается протеазами, поэтому является нестабильным в организме и не может приниматься перорально; легко продуцирует иммунную перекрестную реакцию; качество препарата нелегко контролировать, и технология производства является высокой; большое количество получения и очистка затруднены, и стоимость высокая; неудобно использовать, и его можно только инъецировать или капать. Поэтому низкомолекулярные ингибиторы PD-1/PD-L1 взаимодействия являются лучшим выбором для иммунотерапии опухоли.
Содержание изобретения
Технической задачей, которая должна быть решена настоящим изобретением, является предоставление производного бензилфенилового эфира со структурной формулой (I), которое ингибирует взаимодействие PD-1/PD-L1, и его стереоизомера и его фармацевтически приемлемой соли и способа его получения и его лекарственных композиций и их применения в профилактике или лечении заболевания, связанного с сигнальным путем PD-1/PD-L1.
Нижеприведенные технические решения представлены настоящим изобретением для решения вышеуказанной технической задачи.
Первый аспект технического решения предусматривает производное бензилфенилового эфира, представленное формулой (I), его стереоизомер и его фармацевтически приемлемую соль:
где:
1
R выбран из  и ;
2
3
2
1
5
1
5
R выбран из водорода, циано, метилсульфонила, ацетиламино, карбамоила, диметиламиноформила (-CON(CH)), фтора, хлора, брома, йода, трифторметила, C-C алкила и C-C алкокси;
3
1
8
2
6
2
6
1
5
1
5
1
6
2
2
2
2
3
2
2
2
3
1
8
R выбран из замещенного C-C насыщенного алкиламино, замещенного C-C ненасыщенного алкиламино, замещенного N-содержащего C-C гетероцикл-1-ила, где каждый моно-, ди-, три- или тетра-замещен заместителем(заместителями), выбранным из водорода, фтора, хлора, брома, йода, гидрокси, C-C алкила, C-C алкокси, амино, C-Cалкиламино, ацетиламино, циано, уреидо (-NH(C=O)NH), гуанидино (-NH(C=NH)NH), уреидо амино (-NH-NH(C=O)NH), гуанидино амино (-NH-NH(C=NH)NH), сульфониламино (-NHSOH), сульфамоила (-SONH), метансульфониламино (-NH-SOCH), гидроксиформила (-COOH), C-C алкоксилкарбонила, сульфидрила, имидазолила, тиазолила, оксазолила, тетразолила, ,  и ;
1
4
X выбран из водорода, фтора, хлора, брома, йода, C-C алкила, этенила, трифторметила, метокси.
Предпочтительными являются производные бензилфенилового эфира, их стереоизомеры и их фармацевтически приемлемые соли, где соединение представлено формулой (IA):
где:
1
R выбран из  и;
2
3
2
1
5
1
5
R выбран из водорода, циано, метилсульфонила, ацетиламино, карбамоила, диметиламиноформила (-CON(CH)), фтора, хлора, брома, йода, трифторметила, C-C алкила и C-C алкокси;
3
1
8
2
6
2
6
1
5
1
5
1
6
2
2
2
2
3
2
2
2
3
1
8
R выбран из замещенного C-C насыщенного алкиламино, замещенного C-C ненасыщенного алкиламино, замещенного N-содержащего C-C гетероцикл-1-ила, где каждый моно-, ди-, три- или тетра-замещен заместителем(заместителями), выбранным из водорода, фтора, хлора, брома, йода, гидрокси, C-C алкила, C-C алкокси, амино, C-Cалкиламино, ацетиламино, циано, уреидо (-NH(C=O)NH), гуанидино (-NH(C=NH)NH), уреидо амино (-NH-NH(C=O)NH), гуанидино амино (-NH-NH(C=NH)NH), сульфониламино (-NHSOH), сульфамоила (-SONH), метансульфониламино (-NH-SOCH), гидроксиформила (-COOH), C-C алкоксилкарбонила, сульфидрила, имидазолила, тиазолила, оксазолила, тетразолила, ,  и ;
1
4
X выбран из водорода, фтора, хлора, брома, йода, C-C алкила, этенила, трифторметила и метокси.
Предпочтительными являются производные бензилфенилового эфира, их стереоизомеры и их фармацевтически приемлемые соли, где соединение представлено формулой (IA-1):
где:
2
3
2
1
5
1
5
R выбран из водорода, циано, метилсульфонила, ацетиламино, карбамоила, диметиламиноформила (-CON(CH)), фтора, хлора, брома, йода, трифторметила, C-C алкила и C-C алкокси;
3
1
8
2
6
2
6
1
5
1
5
1
6
2
2
2
2
3
2
2
2
3
1
8
R выбран из замещенного C-C насыщенного алкиламино, замещенного C-C ненасыщенного алкиламино, замещенного N-содержащего C-C гетероцикл-1-ила, где каждый моно-, ди-, три- или тетра-замещен заместителем(заместителями), выбранным из водорода, фтора, хлора, брома, йода, гидрокси, C-C алкила, C-C алкокси, амино, C-Cалкиламино, ацетиламино, циано, уреидо (-NH(C=O)NH), гуанидино (-NH(C=NH)NH), уреидо амино (-NH-NH(C=O)NH), гуанидино амино (-NH-NH(C=NH)NH), сульфониламино (-NHSOH), сульфамоила (-SONH), метансульфониламино (-NH-SOCH), гидроксиформила (-COOH), C-C алкоксилкарбонила, сульфидрила, имидазолила, тиазолила, оксазолила, тетразолила, ,  и ;
1
4
X выбран из водорода, фтора, хлора, брома, йода, C-C алкила, этенила, трифторметила и метокси.
Предпочтительными являются производные бензилфенилового эфира, их стереоизомеры и их фармацевтически приемлемые соли, где соединение представлено формулой (IA-1a):
где:
3
1
8
2
6
2
6
1
5
1
5
1
6
2
2
2
2
3
2
2
2
3
1
8
R выбран из замещенного C-C насыщенного алкиламино, замещенного C-C ненасыщенного алкиламино, замещенного N-содержащего C-C гетероцикл-1-ила, где каждый моно-, ди-, три- или тетра-замещен заместителем(заместителями), выбранным из водорода, фтора, хлора, брома, йода, гидрокси, C-C алкила, C-C алкокси, амино, C-Cалкиламино, ацетиламино, циано, уреидо (-NH(C=O)NH), гуанидино (-NH(C=NH)NH), уреидо амино (-NH-NH(C=O)NH), гуанидино амино (-NH-NH(C=NH)NH), сульфониламино (-NHSOH), сульфамоила (-SONH), метансульфониламино (-NH-SOCH), гидроксиформила (-COOH), C-C алкоксилкарбонила, сульфидрила, имидазолила, тиазолила, оксазолила, тетразолила, ,  и ;
1
4
X выбран из водорода, фтора, хлора, брома, йода, C-C алкила, этенила, трифторметила и метокси.
Предпочтительными являются производные бензилфенилового эфира, их стереоизомеры и их фармацевтически приемлемые соли, где соединение представлено формулой (IA-1b):
где:
3
1
8
2
6
2
6
1
5
1
5
1
6
2
2
2
2
3
2
2
2
3
1
8
R выбран из замещенного C-C насыщенного алкиламино, замещенного C-C ненасыщенного алкиламино, замещенного N-содержащего C-C гетероцикл-1-ила, где каждый моно-, ди-, три- или тетра-замещен заместителем(заместителями), выбранным из водорода, фтора, хлора, брома, йода, гидрокси, C-C алкила, C-C алкокси, амино, C-Cалкиламино, ацетиламино, циано, уреидо (-NH(C=O)NH), гуанидино (-NH(C=NH)NH), уреидо амино (-NH-NH(C=O)NH), гуанидино амино (-NH-NH(C=NH)NH), сульфониламино (-NHSOH), сульфамоила (-SONH), метансульфониламино (-NH-SOCH), гидроксиформила (-COOH), C-C алкоксилкарбонила, сульфидрила, имидазолила, тиазолила, оксазолила, тетразолила, ,  и ;
1
4
X выбран из водорода, фтора, хлора, брома, йода, C-C алкила, этенила, трифторметила и метокси.
Предпочтительными являются производные бензилфенилового эфира, их стереоизомеры и их фармацевтически приемлемые соли, где соединение представлено формулой (IA-2):
где:
2
3
2
1
5
1
5
R выбран из водорода, циано, метилсульфонила, ацетиламино, карбамоила, диметиламиноформила (-CON(CH)), фтора, хлора, брома, йода, трифторметила, C-C алкила и C-C алкокси;
3
1
8
2
6
2
6
1
5
1
5
1
6
2
2
2
2
3
2
2
2
3
1
8
R выбран из замещенного C-C насыщенного алкиламино, замещенного C-C ненасыщенного алкиламино, замещенного N-содержащего C-C гетероцикл-1-ила, где каждый моно-, ди-, три- или тетра-замещен заместителем(заместителями), выбранным из водорода, фтора, хлора, брома, йода, гидрокси, C-C алкила, C-C алкокси, амино, C-Cалкиламино, ацетиламино, циано, уреидо (-NH(C=O)NH), гуанидино (-NH(C=NH)NH), уреидо амино (-NH-NH(C=O)NH), гуанидино амино (-NH-NH(C=NH)NH), сульфониламино (-NHSOH), сульфамоила (-SONH), метансульфониламино (-NH-SOCH), гидроксиформила (-COOH), C-C алкоксилкарбонила, сульфидрила, имидазолила, тиазолила, оксазолила, тетразолила, ,  и ;
1
4
X выбран из водорода, фтора, хлора, брома, йода, C-C алкила, этенила, трифторметила и метокси.
Предпочтительными являются производные бензилфенилового эфира, их стереоизомеры и их фармацевтически приемлемые соли, где соединение представлено формулой (IA-2a):
где:
3
1
8
2
6
2
6
1
5
1
5
1
6
2
2
2
2
3
2
2
2
3
1
8
R выбран из замещенного C-C насыщенного алкиламино, замещенного C-C ненасыщенного алкиламино, замещенного N-содержащего C-C гетероцикл-1-ила, где каждый моно-, ди-, три- или тетра-замещен заместителем(заместителями), выбранным из водорода, фтора, хлора, брома, йода, гидрокси, C-C алкила, C-C алкокси, амино, C-Cалкиламино, ацетиламино, циано, уреидо (-NH(C=O)NH), гуанидино (-NH(C=NH)NH), уреидо амино (-NH-NH(C=O)NH), гуанидино амино (-NH-NH(C=NH)NH), сульфониламино (-NHSOH), сульфамоила (-SONH), метансульфониламино (-NH-SOCH), гидроксиформила (-COOH), C-C алкоксилкарбонила, сульфидрила, имидазолила, тиазолила, оксазолила, тетразолила, ,  и ;
1
4
X выбран из водорода, фтора, хлора, брома, йода, C-C алкила, этенила, трифторметила и метокси.
Предпочтительными являются производные бензилфенилового эфира, их стереоизомеры и их фармацевтически приемлемые соли, где соединение представлено формулой (IA-2b):
где:
3
1
8
2
6
2
6
1
5
1
5
1
6
2
2
2
2
3
2
2
2
3
1
8
R выбран из замещенного C-C насыщенного алкиламино, замещенного C-C ненасыщенного алкиламино, замещенного N-содержащего C-C гетероцикл-1-ила, где каждый моно-, ди-, три- или тетра-замещен заместителем(заместителями), выбранным из водорода, фтора, хлора, брома, йода, гидрокси, C-C алкила, C-C алкокси, амино, C-Cалкиламино, ацетиламино, циано, уреидо (-NH(C=O)NH), гуанидино (-NH(C=NH)NH), уреидо амино (-NH-NH(C=O)NH), гуанидино амино (-NH-NH(C=NH)NH), сульфониламино (-NHSOH), сульфамоила (-SONH), метансульфониламино (-NH-SOCH), гидроксиформила (-COOH), C-C алкоксилкарбонила, сульфидрила, имидазолила, тиазолила, оксазолила, тетразолила, ,  и ;
1
4
X выбран из водорода, фтора, хлора, брома, йода, C-C алкила, этенила, трифторметила и метокси.
3
Предпочтительными являются производные бензилфенилового эфира, их стереоизомеры и их фармацевтически приемлемые соли, где соединение представлено в приведенных выше формулах, где R выбран из:
,
где R выбран из метила, этила, пропила, изопропила, бутила, пентила, гексила, гептила, октила; и
X выбран из водорода, фтора, хлора, брома, метила, этенила и трифторметила.
Производное бензилфенилового эфира вышеуказанных формул, его стереоизомер и его фармацевтически приемлемая соль характеризуются тем, что фармацевтически приемлемая соль включает соль, образованную с неорганической кислотой, соль, образованную с органической кислотой, соль с ионами щелочного металла, соль с ионами щелочноземельного металла или соль, образованную с органическим основанием, которая обеспечивает физиологически приемлемый катион, и соль аммония.
Кроме того, указанная неорганическая кислота выбрана из хлористоводородной кислоты, бромистоводородной кислоты, фосфорной кислоты или серной кислоты; указанная органическая кислота выбрана из метансульфоновой кислоты, п-толуолсульфоновой кислоты, трифторуксусной кислоты, лимонной кислоты, малеиновой кислоты, винной кислоты, фумаровой кислоты, лимонной кислоты или молочной кислоты; указанный ион щелочного металла выбран из иона лития, иона натрия, иона калия; указанный ион щелочноземельного металла выбран из иона кальция, иона магния; указанное органическое основание, которое обеспечивает физиологически приемлемый катион, выбрано из метиламина, диметиламина, триметиламина, пиперидина, морфолина или трис(2-гидроксиэтил)амина.
Второй аспект настоящего изобретения предусматривает способ получения соединений по первому аспекту.
Для получения соединений формулы (I), согласно ее структуре, способ получения разделяют на пять стадий.
(a) 2-бром-3-йодтолуол 1 и бензолбороновую кислоту или замещенную бензолбороновую кислоту или эфир борной кислоты бензола или замещенного бензола, в качестве исходных веществ, подвергают взаимодействию с помощью реакции сочетания сузуки с получением промежуточного соединения 2;
(b) промежуточное соединение 2, в качестве исходного вещества, подвергают бромированию метильной группы бромирующим реагентом с получением бромсодержащего промежуточного соединения 3;
(c) промежуточное соединение 3 в качестве исходного вещества подвергают взаимодействию с 2,4-дигидрокси-X-замещенным бензальдегидом в основных условиях с получением промежуточного соединения 4, содержащего бензилариловый эфир;
(d) промежуточное соединение 4, в качестве исходного вещества, подвергают взаимодействию с бензилгалогенидом или замещенным бензилгалогенидом в основных условиях с получением промежуточного соединения 5;
3
(e) промежуточное соединение 5, содержащее альдегидную группу, в качестве исходного вещества, конденсировали с HR, содержащей аминогруппу или иминогруппу, и полученный продукт восстанавливали до получения целевого соединения I.
1
2
3
R, R, R и X каждый определяется, как описано в первом аспекте.
Кроме того, исходные вещества и промежуточные соединения в вышеуказанной реакции легко получают, и каждая стадия реакция может быть легко осуществлена в соответствии с опубликованной литературой или квалифицированным специалистом в данной области традиционным способом в органическом синтезе. Соединение формулы I может существовать в сольватированных или несольватированных формах, и кристаллизация из различных растворителей может приводить к разным сольватам. Фармацевтически приемлемые соли формулы (I) включают различные кислотно-аддитивные соли, такие как кислотно-аддитивные соли следующих неорганических или органических кислот: хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, фосфорная кислота, серная кислота, метансульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота, трифторуксусная кислота, лимонная кислота, малеиновая кислота, винная кислота, фумаровая кислота, лимонная кислота, молочная кислота. Фармацевтически приемлемые соли формулы (I) включают различные кислотно-аддитивные соли, такие как кислотно-аддитивные соли следующих неорганических или органических кислот: хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, фосфорная кислота, серная кислота, метансульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота, трифторуксусная кислота, лимонная кислота, малеиновая кислота, винная кислота, фумаровая кислота, лимонная кислота, молочная кислота. Фармацевтически приемлемые соли формулы I также включают различные соли щелочных металлов, такие как соли лития, натрия, калия; различные соли щелочноземельных металлов, такие как соли кальция, магния и соли аммония; и различные соли органических оснований, которые обеспечивают физиологически приемлемые катионы, такие как соли метиламина, диметиламина, триметиламина, пиперидина, морфолина и соли трис(2-гидроксиэтил)амина. Все эти соли в рамках изобретения могут быть получены обычными способами. Во время получения соединений формулы (I) и их сольватов или солей поликристаллическая или эвтектическая может происходить при различных условиях кристаллизации.
Третий аспект настоящего изобретения предусматривает фармацевтическую композицию, включающую производное бензилфенилового эфира по первому аспекту настоящего изобретения и его стереоизомер, и фармацевтически приемлемую соль в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
Изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей соединение по изобретению в качестве активного ингредиента. Фармацевтическая композиция может быть получена способами, хорошо известными в данной области. Любая лекарственная форма, подходящая для использования человеком или животным, может быть получена путем объединения соединения по изобретению с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами и/или адъювантами в твердом или жидком состоянии. Содержание соединения по настоящему изобретению в его фармацевтической композиции обычно составляет от 0,1 до 95% масс.
Соединение по настоящему изобретению или его фармацевтическую композицию, содержащую его, можно вводить в стандартной лекарственной форме с помощью энтерального или парентерального пути, например, перорально, внутривенно, внутримышечно, подкожно, назально, через слизистую оболочку полости рта, глазное введение, введение через легкие и дыхательные пути, через кожу, вагинально, ректально и т.п.
Лекарственная форма может быть жидкой лекарственной формой, твердой лекарственной формой или полутвердой лекарственной формой.
Жидкие лекарственные формы могут представлять собой раствор (включая истинный раствор и коллоидный раствор), эмульсию (включая тип м/в, тип в/м и двойную эмульсю), суспензию, инъекцию (включая водный препарат для инъекции, порошок для инъекции и инфузию), глазные капли, капли назальные, лосьоны, линименты и т.п.; твердые лекарственные формы могут представлять собой таблетки (в том числе обычные таблетки, кишечнорастворимые таблетки, пастилки для рассасывания, диспергируемаые таблетки, жевательные таблетки, шипучие таблетки, таблетки, распадающиеся в полости рта таблетки), капсулы (включая твердые капсулы, мягкие капсулы, кишечнорастворимые капсулы), гранулы, порошки, пеллеты, капельные пилюли, суппозитории, пленки, пластыри, газовые (порошковые) спреи, спреи и т.п.; полутвердые лекарственные формы могут представлять собой мази, гель, пасту и т.п.
Соединения по настоящему изобретению могут быть сформулированы в виде общих препаратов, а также препаратов с замедленным высвобождением, препаратов с контролируемым высвобождением, препаратов направленного действия и различных систем доставки в виде микрочастиц.
Для образования таблеток соединения по настоящему изобретению можно широко использовать различные эксципиенты, известные в данной области, включая разбавители, связующие вещества, смачивающие агенты, дезинтегрирующие агенты, лубриканты и глиданты. Разбавителем может быть крахмал, декстрин, сахароза, глюкоза, лактоза, маннитол, сорбитол, ксилитол, микрокристаллическая целлюлоза, сульфат кальция, гидрофосфат кальция, карбонат кальция и тому подобное; смачивающим агентом может быть вода, этанол или изопропанол и тому подобное; связующим может быть крахмальный сироп, декстрин, сироп, мед, раствор глюкозы, микрокристаллическая целлюлоза, слизь акации, желатин, натрийкарбоксиметилцеллюлоза, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, этилцеллюлоза, акриловая смола, карбомер, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль и тому подобное; дезинтегрирующими агентами могут быть сухой крахмал, микрокристаллическая целлюлоза, низкозамещенная гидроксипропилцеллюлоза, сшитый поливинилпирролидон, кроскармеллоза натрия, натрий карбоксиметилкрахмал, гидрокарбонат натрия и лимонная кислота, сложный эфир полиоксиэтиленсорбитана и жирной кислоты, додецилсульфонат натрия и тому подобное; лубрикант и глидант могут представлять собой тальк, кремнезем, стеарат, винную кислоту, жидкий парафин, полиэтиленгликоль и тому подобное.
Таблетки также могут быть кроме того сформулированы в таблетки, покрытые оболочкой, такие как таблетки, покрытые сахаром, таблетки, покрытые пленочной оболочкой, таблетки, покрытые кишечнорастворимой оболочкой, или двухслойные таблетки и многослойные таблетки.
Для получения дозированной лекарственной формы в виде капсулы, соединение активного ингредиента по настоящему изобретению может быть смешано с разбавителем, глидантом, и смесь может быть непосредственно помещена в твердую капсулу или мягкую капсулу. Активный ингредиент может быть также получен в виде гранулы или пеллеты с разбавителем, связующим, разрыхлителем и затем помещен в твердую или мягкую капсулу. Различные разбавители, связующие, смачивающие агенты, дезинтегрирующие агенты и глиданты для получения таблеток соединения по изобретению также могут быть использованы для получения капсул соединения по изобретению.
Для получения соединения по настоящему изобретению в виде инъекции в качестве растворителя могут быть использованы вода, этанол, изопропанол, пропиленгликоль или их смесь. Кроме того, может быть добавлено соответствующее количество солюбилизирующего агента, сорастворителя, агента, регулирующего рН, и агента для регулирования осмотического давления, которые обычно используются в данной области техники. Солюбилизирующим агентом или сорастворителем могут быть полоксамер, лецитин, гидроксипропил-β-циклодекстрин и тому подобное; агент, регулирующий рН, может представлять собой фосфат, ацетат, хлористоводородную кислоту, гидроксид натрия и тому подобное; агентом, регулирующим осмотическое давление, может быть хлорид натрия, маннит, глюкоза, фосфат, ацетат и тому подобное. Для получения лиофилизированного порошка для инъекций также могут быть добавлены маннитол, глюкоза и так далее в качестве проппанта.
Кроме того, красители, консерванты, отдушки, вкусовые агенты или другие добавки также могут быть добавлены к фармацевтическим препаратам по мере необходимости.
Соединение или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить любым известным способом введения с целью введения и усиления терапевтического эффекта.
Дозировка соединения или фармацевтической композиции по настоящему изобретению может вводиться в широких пределах в зависимости от характера и тяжести заболевания, которое следует предотвратить или лечить, индивидуального состояния пациента или животного, способа введения и лекарственной формы и тому подобное. В общем, подходящая суточная доза соединения по изобретению будет составлять от 0,001 до 150 мг/кг массы тела, предпочтительно от 0,01 до 100 мг/кг массы тела. Указанные дозы могут вводиться в однократных единицах дозирования или в разделенных единицах дозирования в зависимости от клинического опыта врача и режима дозировки, включая использование других терапевтических средств.
Соединения или композиции по изобретению можно вводить отдельно или в комбинации с другими терапевтическими или симптоматическими средствами. Когда соединение по настоящему изобретению взаимодействует с другими терапевтическими средствами, его дозировка должна быть скорректирована в соответствии с фактической ситуацией.
Четвертый аспект настоящего изобретения предусматривает производное бензилфенилового эфира, или его стереоизомер, или его фармацевтически приемлемую соль, которые используют для получения лекарственного средства, полезного для профилактики и/или лечения заболевания, связанного с сигнальным путем PD-1/PD-L1.
Заболевание, связанное с сигнальным путем PD-1/PD-L1, выбрано из рака, инфекционных заболеваний и аутоиммунных заболеваний. Рак выбран из рака кожи, рака легких, опухоли мочеполовой системы, гематологической опухоли, рака молочной железы, глиомы, опухоли пищеварительной системы, опухоли репродуктивной системы, лимфомы, опухоли нервной системы, опухоли головного мозга, рака головы и шеи. Инфекционное заболевание выбрано из бактериальной инфекции и вирусной инфекции. Аутоиммунное заболевание выбрано из органоспецифического аутоиммунного заболевания, системного аутоиммунного заболевания, где органоспецифическое аутоиммунное заболевание включает хронический лимфоцитарный тиреоидит, гипертиреоз, инсулинозависимый сахарный диабет, миастению гравис, язвенный колит, злокачественную анемию с хроническим атрофическим гастритом, легочный геморрагический синдром с нефритом, первичный билиарный цирроз, множественный рассеянный склероз и острый идиопатический полиневрит. И системные аутоиммунные заболевания включают ревматоидный артрит, системную красную волчанку, системный васкулит, склеродермию, пемфигус, дерматомиозит, смешанное заболевание соединительной ткани, аутоиммунную гемолитическую анемию.
ПОЛЕЗНЫЕ ТЕХНИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ:
Соединения по настоящему изобретению обладают высокой ингибирующей активностью в отношении взаимодействия PD-1/PD-L1, намного выше, чем соединения, о которых сообщалось ранее. Они обладают сильной способностью связывать белок PD-L1, даже сильнее, чем антитела PD-L1, о которых сообщалось ранее. Эти соединения также обладают способностью облегчать ингибирование IFN-γ PD-L1. Фармакодинамические исследования in vivo показывают, что соединения могут значительно ингибировать рост подкожных опухолей как по объему опухоли, так и по массе. Количество лимфоцитов в крови и селезенке мышей может быть увеличено, очевидно.
ПРИМЕРЫ
Изобретение далее иллюстрируется следующими примерами; однако изобретение не ограничивается иллюстративными примерами, приведенными ниже в настоящем описании.
Измерительный прибор: Ядерную магнитно-резонансную спектроскопию проводили с помощью аппарата ядерного магнитного резонанса Vaariaan Mercury 300. Масс-спектрометрию проводили с использованием масс-спектрометра ZAD-2F и масс-спектрометра VG300.
Пример 1: N-ацетиламиноэтил-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензиламин
(1) 2-бром-3-метил-1,1'-бифенил:
1
d
6
3
В 50 мл сосуд добавляли 2-бром-3-иодотолуол (350 мг) и диоксан/воду при перемешивании. Раствор барботировали аргоном в течение 10 мин для удаления растворенного кислорода. Затем последовательно добавляли фенилбороновую кислоту (172,65 мг), карбонат цезия (961,2 мг) и трифенилфосфин палладий (40,91 мг). Смесь перемешивали в течение 12 ч при 80-100°C под защитой аргона. Реакцию остановливали. После охлаждения до комнатной температуры, смесь фильтровали с помощью кизельгура. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и три раза экстрагировали водой и этилацетатом в три раза. Органическую фазу объединяли, промывали насыщенным солевым раствором и сушили над безводным сульфатом натрия. Органический слой фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток подвергали колоночной хроматографии на силикагеле (петролейный эфир) с получением бесцветного масла (221 мг). H ЯМР (400 МГц, DMSO-), δ 7,49-7,29 (м, 7H, Ar-H), 7,14 (д, 1H, Ar-H), 2,42 (с, 3H, Ar-CH).
(2) 2-бром-3-(бромметил)-1,1'-бифенил:
4
Брали 2-бром-3-метил-1,1'-бифенил (234 мг) в качестве исходного вещества и растворяли в 20 мл CCl в 100 мл сосуде. К этому раствору добавляли NBS (178 мг) при перемешивании. И смесь нагревали до 80°C и кипятили с обратным холодильником. Затем добавляли бензоил пероксид (4 мг), и через 2 ч, снова добавляли бензоил пероксид (4 мг), и смесь перемешивали в течение еще 2 ч. Реакцию остановливали. После охлаждения до комнатной температуры, смесь гасили водой, экстрагировали дихлорметаном и водой. Органическую фазу промывали насыщенным солевым раствором и сушили над безводным сульфатом натрия. Органический слой фильтровали и концентрировали в вакууме с получением желтого масла (192 мг), которое использовали для следующей стадии без дополнительной очистки.
(3) 4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-2-гидроксибензальдегид:
1
d
6
2
Брали 2, 4-дигидроксибензальдегид (73,94 мг) и растворяли в 6 мл безводного ацетонитрила в 50 мл сосуде, и затем добавляли гидрокарбонат натрия (98,88 мг). После перемешивания при комнатной температуре в течение 40 мин, 2-бром-3-(бромметил)-1,1'-бифенил (192 мг, растворенный в 8 мл DMF) медленно добавляли к реакционной смеси через воронку постоянного перепада давления, и нагревали до кипения с обратным холодильником, пока реакция не будет завершена. После охлаждения до комнатной температуры, смесь экстрагировали водой и этилацетатом. Органическую фазу промывали насыщенным солевым раствором и сушили над безводным сульфатом натрия, затем фильтровали и концентрировали в вакууме. Неочищенный остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле с получением белого твердого вещества (152 мг). H ЯМР (400 МГц, DMSO-) δ 10,99 (с, 1H, -OH), 10,03 (с, 1H, -CHO), 7,64 (д, 1H, Ar-H), 7,57 (д, 1H, Ar-H), 7,45 (м, 4H, Ar-H), 7,37 (д, 3H, Ar-H), 6,67 (д, 1H, Ar-H), 6,59 (с, 1H, Ar-H), 5,25 (с, 2H, -CH-).
(4) 4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензальдегид:
1
d
6
2
2
4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-2-гидроксибензальдегид (100 мг) растворяли в 6 мл DMF в 50 мл сосуде, и затем добавляли карбонат цезия (127,53 мг). После перемешивания при комнатной температуре в течение 15 мин, раствор 3-цианобензил бромида (76,65 мг) в DMF (4 мл) добавляли по каплям. После перемешивания смеси при 80°C в течение 2 ч, реакцию остановливали. После охлаждения до комнатной температуры, смесь экстрагировали водой и этилацетатом. Органическую фазу промывали насыщенным солевым раствором и сушили над безводным сульфатом натрия, затем фильтровали и концентрировали в вакууме. Неочищенный остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле с получением белого твердого вещества (70 мг). H ЯМР (400 МГц, DMSO-) δ 10,26 (с, 1H, -CHO), 8,00 (с, 1H, Ar-H), 7,83 (дд, 2H, Ar-H), 7,72 (д, 1H, Ar-H), 7,61 (т, 2H, Ar-H), 7,55-7,23 (м, 7H, Ar-H), 6,95 (с, 1H, Ar-H), 6,81 (д, 1H, Ar-H), 5,35 (с, 2H, -CH-), 5,30 (с, 2H, -CH-).
(5) N-ацетиламиноэтил-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензиламин:
1
d
6
2
2
2
2
2
3
4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензальдегид (50,8 мг) растворяли в 5 мл DMF, и затем добавляли 2-ацетамидоэтиламин (31,25 мг) и ледяную уксусную кислоту (36,75 мг). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20 мин, добавляли цианоборгидрид натрия (19,23 мг) и смесь перемешивали при 25°C в течение 14 ч. Реакцию остановливали. Смесь экстрагировали водой и этилацетатом. Органическую фазу промывали насыщенным солевым раствором и сушили над безводным сульфатом натрия, затем фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле с получением белого твердого вещества (35 мг). H ЯМР (400 МГц, DMSO-) δ 8,01 (с, 1H, -CONH-), 7,96 (с, 1H, Ar-H), 7,82 (дд, 2H, Ar-H), 7,59 (дд, 2H, Ar-H), 7,43 (дд, 4H, Ar-H), 7,35 (т, 4H, Ar-H), 6,81 (с, 1H, Ar-H), 6,68 (д, 1H, Ar-H), 5,23 (с, 2H, -CH-), 5,18 (с, 2H, -CH-), 3,96 (с, 2H, -CH-), 3,28-3,21 (м, 2H, -CH-), 2,80 (т, 2H, -CH-), 1,89 (с, 1H, -NH-), 1,78 (с, 3H, -CH). MS (FAB): 585 (M+1).
Пример 2: N-(4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензил)серин
1
D
d
6
2
2
2
2
2
20
2
2
Процедура была такой же, как в примере 1, за исключением того, что L-серин использовали вместо 2-ацетамидоэтиламина с получением белого твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, DMSO-) δ 8,00 (с, 1H, Ar-H), 7,89 (д, 1H, Ar-H), 7,79 (д, 1H, Ar-H), 7,58 (дд, 2H, Ar-H), 7,53-7,29 (м, 8H, Ar-H), 6,81 (с, 1H, Ar-H), 6,67 (д, 1H, Ar-H), 5,23 (с, 2H, -CH-), 5,18 (с, 2H, -CH-), 4,14-3,97 (м, 2H, -CH-), 3,74 (дд, 1H, -CH-), 3,62 (дд, 1H, -CH-), 3,17 (т, 1H, -CH-). MS (FAB): 588 (M+1). [α]=-16 (C=0,18, CHCl).
Пример 3: N-Этил-N-гидроксилэтил-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензиламин
1
d
6
2
2
2
2
2
3
Процедура была такой же, как в примере 1, за исключением того, что 2-(этиламино)этанол использовали вместо 2-ацетамидоэтиламина с получением бледно-желтого твердого порошка. H ЯМР (400 МГц, DMSO-) δ 9,33 (с, 1H, -OH), 8,01 (с, 1H, -ArH), 7,84 (дд, 2H, -ArH), 7,61 (дд, 2H, -ArH), 7,55-7,28 (м, 8H, -ArH), 6,88 (с, 1H, -ArH), 6,74 (д, 1H, -ArH), 5,24 (с, 2H, -CH- ), 5,21 (с, 2H, -CH- ), 4,25 (с, 2H, -CH-), 3,69 (с, 2H, -CH-), 3,06 (с, 4H, -CH-), 1,18 (м, 3H, -CH). MS (FAB): 572 (M+1).
Пример 4: N-(4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензил)пролин
1
d
6
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Процедура была такой же, как в примере 1, за исключением того, что пролин использовали вместо 2-ацетамидоэтиламина с получением бледно-желтого твердого порошка. H ЯМР (400 МГц, DMSO-) δ 8,00 (с, 1H, -ArH), 7,89 (д, 1H, -ArH), 7,80 (д, 1H, -ArH), 7,60 (дд, 2H, -ArH), 7,40 (м, 8H, -ArH), 6,82 (с, 1H, -ArH), 6,68 (д, 1H, -ArH), 5,31-5,22 (м, 2H, -CH-), 5,19 (с, 2H, -CH-), 4,19-4,01 (м, 2H, -CH-), 3,53 (м, 1H, -CH-), 3,23 (м, 1H, -CH-), 2,83 (м, 1H, -CH-), 2,09 (т, 1H, -CH-), 1,95 (т, 1H, -CH-), 1,83 (с, 1H, -CH-), 1,66 (м, -CH-). MS (FAB): 598 (M+1).
Пример 5: N-гидроксилэтил-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензиламин
1
d
6
2
2
2
2
2
Процедура была такой же, как в примере 1, за исключением того, что 2-аминоэтанол использовали вместо 2-ацетамидоэтиламина с получением бледно-желтого твердого порошка. H ЯМР (400 МГц, DMSO-) δ 8,91 (с, 1H, -OH), 7,99 (с, 1H, -ArH), 7,84 (дд, 2H, -ArH), 7,60 (дд, 2H, -ArH), 7,54-7,28 (м, 8H, -ArH), 6,84 (д, 1H, -ArH), 6,71 (дд, 1H, -ArH), 5,24 (с, 2H, -CH-), 5,20 (с, 2H, -CH-), 4,09 (с, 2H, -CH-), 3,65 (д, 2H, -CH-), 2,91 (т, 2H, -CH-). MS (FAB): 544 (M+1).
Пример 6: N-(4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензил)аланин
1
d
6
2
2
2
3
Процедура была такой же, как в примере 1, за исключением того, что аланин использовали вместо 2-ацетамидоэтиламина с получением бледно-желтого твердого порошка.H ЯМР (400 МГц, DMSO-) δ 7,99 (с, 1H, -ArH), 7,84 (дд, 2H, -ArH), 7,59 (дд, 2H, -ArH), 7,40 (dq, 8H, -ArH), 6,90-6,56 (м, 2H, -ArH), 5,22 (с, 2H, -CH-), 5,18 (с, 2H, -CH-), 3,99 (д, 2H, -CH-), 1,86 (с, 1H, -CH-), 1,26 (с, 3H, -CH). MS (FAB): 572(M+1).
Пример 7: N-(4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензил)метионин
1
d
6
2
2
2
2
2
3
2
2
Процедура была такой же, как в примере 1, за исключением того, что метионин использовали вместо 2-ацетамидоэтиламина с получением бледно-желтого твердого порошка.H ЯМР (400 МГц, DMSO-) δ 7,99 (с, 1H, -ArH), 7,88 (д, 1H, -ArH), 7,80 (д, 1H, -ArH), 7,60 (дд, 2H, -ArH), 7,47 (д, 3H, -ArH), 7,43 (д, 1H, -ArH), 7,36 (м, 4H, -ArH), 6,80 (с, 1H, -ArH), 6,67 (д, 1H, -ArH), 5,23 (с, 2H, -CH-), 5,19 (с, 2H, -CH-), 3,90 (q, 2H, -CH-), 3,21 (д, 1H, -CH-), 2,56 (д, 1H, -CH-), 2,03 (с, 1H, -CH-), 1,98 (с, 3H, -CH), 1,94-1,87 (м, 1H, -CH-), 1,87-1,80 (м, 1H, -CH-). MS (FAB): 632(M+1).
Пример 8: N-(4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензил)треонин
1
d
6
2
2
3
Процедура была такой же, как в примере 1, за исключением того, что треонин использовали вместо 2-ацетамидоэтиламина с получением белого твердого порошка. H ЯМР (400 МГц, DMSO-) δ 8,01 (с, 1H, -ArH), 7,90-7,86 (т, 1H, -ArH), 7,84-7,81 (т, 1H, -ArH), 7,75-7,73(д, 1H, -ArH), 7,63-7,58 (м, 2H, -ArH), 7,50-7,46(м, 3H, -ArH), 7,43-7,42 (д, 1H, -ArH), 7,39-7,35 (м, 3H, -ArH), 5,36-5,32 (д, 2H, -CH-), 5,24-5,23 (м, 2H, -CH-), 3,98-3,96 (м, 1H, -CH-), 3,88-3,86 (м, 1H, -CH-), 1,13 (д, 3H, -CH). MS (FAB): 602(M+1).
Пример 9: N-(тетрагидро-2H-пиран-4-ил)-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензиламин
1
d
6
2
2
2
2
2
2
Процедура была такой же, как в примере 1, за исключением того, что тетрагидро-2H-пиран-4-амин использовали вместо 2-ацетамидоэтиламина с получением бледно-желтого твердого порошка. H ЯМР (400 МГц, DMSO-) δ 8,12 (д, 1H, -ArH), 7,95 (м, 3H, -ArH), 7,73 (м, 2H, -ArH), 7,65-7,41 (м, 7H, -ArH), 6,96 (д, 1H, -ArH), 6,83 (д, 1H, -ArH), 5,33 (с, 4H, -CH-), 4,13 (д, 2H, -CH-), 3,94 (д, 2H, -CH-), 3,37 (д, 2H, -CH-), 3,23 (с, 1H, -CH-), 2,02 (д, 2H, -CH-), 1,61 (д, 2H, -CH-). MS (FAB): 584(M+1).
Пример 10: N-[4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензил]морфолин гидрохлорид
1
d
6
2
2
2
2
2
2
2
Процедура была такой же, как в примере 1, за исключением того, что морфолин использовали вместо 2-ацетамидоэтиламина с получением бледно-желтого твердого порошка. H ЯМР (400 МГц, DMSO-) δ 11,20 (с, 1H, H-Cl), 8,03 (д, 1H, -ArH), 7,94-7,86 (м, 1H, -ArH), 7,81 (т, 2H, -ArH), 7,61 (м, 3H, -ArH), 7,54-7,44 (м, 2H, -ArH), 7,42 (д, 1H, -ArH), 7,38 (д, 2H, -ArH), 7,23 (с, 1H, -ArH), 6,89 (д, 1H, -ArH), 6,75 (т, 1H, -ArH), 5,27 (д, 2H, -CH-), 5,23(д, 2H, -CH-), 4,25 (т, 2H, -CH-), 3,58 (т, 2H, -CH-), 3,04 (с, 2H, -CH-), 2,98-2,82 (м, 2H, -CH-), 2,59 (м, 2H, -CH-). MS (FAB): 606(M+1).
Пример 11: N-гидроксилэтил-4-(2-бром-3-(3,4-диметоксифенил)бензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензиламин
(1) 2-бром-3-(3,4-диметоксифенил)толуол:
1
d
3
3
Процедура была такой же, как в примере 1, за исключением того, что 2-(3,4-диметоксифенил)-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан использовали вместо фенилбороновой кислоты, [1,1'-Бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладий(II) использовали вместо трифенилфосфин палладия, карбонат калия использовали вместо карбоната цезия с получением 2-бром-3-(3,4-диметоксифенил)толуола. H ЯМР (400 МГц, Хлороформ-) δ 7,22 (д, 2H, -ArH), 7,15 (кв, 1H, -ArH), 6,93 (с, 3H, -ArH), 3,91 (д, 6H, -OCH), 2,49 (с, 3H, -CH).
(2) 4-(2-бром-3-(3,4-диметоксифенил)бензилокси)-2-гидроксибензальдегид:
1
d
6
2
3
Процедура была такой же, как в примере 1, за исключением того, что 2-бром-3-(3,4-диметоксифенил)толуол использовали вместо 2-бром-3-метил-1,1'-бифенила для осуществления бромирования; и бромид, без дальнейшей очистки, подвергали взаимодействию непосредственно с 2, 4-дигидроксибензальдегидом с получением белого твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, DMSO-) δ 10,99 (с, 1H, -OH), 10,03 (с, 1H, -CHO), 7,64 (д, 1H, -ArH), 7,53 (д, 1H, -ArH), 7,46 (т, 1H, -ArH), 7,37 (д, 1H, -ArH), 7,02 (д, 1H, -ArH), 6,94 (с, 1H, -ArH), 6,92-6,85 (м, 1H, -ArH), 6,67 (д, 1H, -ArH), 6,59 (с, 1H, -ArH), 5,24 (с, 2H, -CH-), 3,77 (с, 6H, -OCH).
(3) 4-(2-бром-3-(3,4-диметоксифенил)бензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензальдегид:
1
d
6
2
2
3
3
Процедура была такой же, как в примере 1, за исключением того, что 4-(2-бром-3-(3,4-диметоксифенил)бензилокси)-2-гидроксибензальдегид использовали вместо 4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-2-гидроксибензальдегида с получением белого твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, DMSO-) δ 10,28 (с, 1H, -CHO), 8,02 (с, 1H, -ArH), 7,87 (д, 1H, -ArH), 7,83 (д, 1H, -ArH), 7,74 (д, 1H, -ArH), 7,64 (т, 1H, -ArH), 7,58 (д, 1H, -ArH), 7,48 (т, 1H, -ArH), 7,40 (д, 1H, -ArH), 7,04 (д, 1H, -ArH), 6,96 (с, 2H, -ArH), 6,91 (д, 1H, -ArH), 6,82 (д, 1H, -ArH), 5,37 (с, 2H, -CH-), 5,32 (с, 2H, -CH-), 3,81 (с, 3H, -OCH), 3,78 (с, 3H, -OCH).
(4) N-гидроксилэтил-4-(2-бром-3-(3,4-диметоксифенил)бензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензиламин:
1
d
6
2
2
2
3
3
2
2
Процедура была такой же, как в примере 1, за исключением того, что 4-(2-бром-3-(3,4-диметоксифенил)бензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензальдегид использовали вместо 4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензальдегида, 2-аминоэтанол использовали вместо 2-ацетамидоэтиламина с получением белого твердого порошка. H ЯМР (400 МГц, DMSO-) δ 8,52 (с, 1H, -OH), 7,98 (с, 1H, -ArH), 7,83 (дд, 2H, -ArH), 7,61 (т, 1H, -ArH), 7,54 (д, 1H, -ArH), 7,45 (м, 1H, -ArH), 7,37 (дд, 2H, -ArH), 7,02 (д, 1H, -ArH), 6,93 (д, 1H, -ArH), 6,91-6,81 (м, 2H, -ArH), 6,72 (дд, 1H, -ArH), 5,24 (с, 2H, -CH-), 5,20 (с, 2H, -CH-), 4,10 (с, 2H, -CH-), 3,79 (с, 3H, -OCH), 3,76 (с, 3H, -OCH), 3,63 (кв, 2H, -CH-), 2,92 (т, 2H, -CH-). MS (FAB): 604(M+1).
Пример 12: Метил N-(4-(2-бром-3-(3,4-диметоксифенил)бензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензил)серинат
1
d
6
2
2
3
3
2
2
3
2
Процедура была такой же, как в примере 11, за исключением того, что метил серинат использовали вместо 2-аминоэтанола, с получением бледно-желтого твердого порошка. H ЯМР (400 МГц, DMSO-) δ 7,93 (с, 1H, -ArH), 7,79 (с, 2H, -ArH), 7,60 (т, 1H, -ArH), 7,53 (д, 1H, -ArH), 7,44 (т, 1H, -ArH), 7,34 (д, 1H, -ArH), 7,22 (д, 1H, -ArH), 7,02 (д, 1H, -ArH), 6,94 (с, 1H, -ArH), 6,89 (д, 1H, -ArH), 6,75 (с, 1H, -ArH), 6,61 (д, 1H, -ArH), 5,19 (с, 2H, -CH-), 5,15 (с, 2H, -CH-), 4,88 (с, 1H, -NH-), 3,79 (с, 3H, -OCH), 3,76 (с, 3H, -OCH), 3,65 (д, 1H, -CH-), 3,57 (д, 2H, -CH-), 3,55 (с, 3H, -OCH),, 3,35 (м, 1H, -CH-). MS (FAB): 662(M+1).
Пример 13: N-(4-(2-бром-3-(3,4-диметоксифенил)бензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензил)серин
2
6
2
2
2
3
3
2
2
1
d
Метил N-(4-(2-бром-3-(3,4-диметоксифенил)бензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензил)серинат (50 мг) растворяли в метаноле/HO (10 мл/1 мл), и затем добавляли литий гидроксид моногидрат (90 мг). После нагревания с обратным холодильником в течение 2 ч, реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры. Реакцию остановливали. И несколько капель уксусной кислоты добавляли к смеси на бане со льдом для регулирования рН до 5-6. Смесь экстрагировали водой и этилацетатом. Органическую фазу объединяли, промывали насыщенным солевым раствором и сушили над безводным сульфатом натрия. Органический слой затем фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток промывали диэтиловым эфиром с получением не совсем белого твердого порошка (25 мг). H ЯМР (400 МГц, DMSO-) δ 8,00 (с, 1H, -ArH), 7,90 (д, 1H, -ArH), 7,81 (д, 1H, -ArH), 7,61 (т, 1H, -ArH), 7,55 (д, 1H, -ArH), 7,45 (т, 1H, -ArH), 7,37 (д, 2H, -ArH), 7,04 (д, 1H, -ArH), 6,95 (с, 1H, -ArH), 6,90 (д, 1H, -ArH), 6,82 (с, 1H, -ArH), 6,74-6,61 (м, 1H, -ArH), 5,25 (с, 2H, -CH-), 5,19 (с, 2H, -CH-), 4,09 (с, 2H, -CH-), 3,85 (с, 1H, -CH-), 3,81 (с, 3H, -OCH), 3,73 (с, 3H, -OCH), 3,72-3,62 (м, 1H, -CH-), 3,38 (кв, 1H, -CH-). MS (FAB): 648(M+1).
Пример 14: N-ацетиламиноэтил-4-(2-бром-3-(3,4-диметоксифенил)бензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензиламин
1
d
6
2
2
2
3
3
2
2
3
Процедура была такой же, как в примере 11, за исключением того, что 2-ацетамидоэтиламин использовали вместо 2-аминоэтанола с получением не совсем белого твердого порошка. H ЯМР (400 МГц, DMSO-) δ 8,67 (с, 1H, -NH-), 8,11 (т, 1H, -NHCO-), 7,99 (с, 1H, -ArH), 7,83 (дд, 2H, -ArH), 7,61 (т, 1H, -ArH), 7,53 (д, 1H, -ArH), 7,44 (т, 1H, -ArH), 7,37 (дд, 2H, -ArH), 7,02 (д, 1H, -ArH), 6,93 (с, 1H, -ArH), 6,89 (д, 1H, -ArH), 6,84 (с, 1H, -ArH), 6,72 (д, 1H, -ArH), 5,25 (с, 2H, -CH-), 5,19 (с, 2H, -CH-), 4,10 (с, 2H, -CH-), 3,79 (с, 3H, -OCH), 3,76 (с, 3H, -OCH), 3,30(м, 2H, -CH-), 2,92 (т, 2H, -CH-), 1,80 (с, 3H, -COCH). MS (FAB): 645(M+1).
Пример 15: N-(4-(2-бром-3-(3,4-диметоксифенил)бензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензил)пролин
1
d
6
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
Процедура была такой же, как в примере 11, за исключением того, что пролин использовали вместо 2-аминоэтанола с получением не совсем белого твердого порошка. H ЯМР (400 МГц, DMSO-) δ 8,02 (с, 1H, -ArH), 7,90 (д, 1H, -ArH), 7,82 (д, 1H, -ArH), 7,62 (т, 1H, -ArH), 7,56 (д, 1H, -ArH), 7,46 (т, 1H, -ArH), 7,37 (д, 2H, -ArH), 7,04 (д, 1H, -ArH), 6,96 (с, 1H, -ArH), 6,91 (д, 1H, -ArH), 6,83 (с, 1H, -ArH), 6,69 (д, 1H, -ArH), 5,27 (м, 2H, -CH-), 5,19 (с, 2H, -CH-), 4,20-4,02 (м, 2H, -CH-), 3,81 (с, 3H, -OCH), 3,78 (с, 3H, -OCH), 3,55-3,49 (м, 1H, -CH-), 3,28-3,20(м, 1H, -CH-), 2,85 (кв, 1H, -CH-), 2,18-2,05 (м, 1H, -CH-), 2,02-1,94 (м, 1H, -CH-), 1,91-1,79 (м, 1H, -CH-), 1,77 -1,61 (м, 1H, -CH-). MS (FAB): 658(M+1).
Пример 16: N-ацетиламиноэтил-4-(2-бром-3-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)бензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензиламин
(1) 2-бром-3-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)толуол:
1
d
2
2
3
Процедура была такой же, как в примере 1, за исключением того, что 2-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан использовали вместо фенилбороновой кислоты, [1,1'-Бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладий(II) использовали вместо трифенилфосфин палладия, карбонат калия использовали вместо карбоната цезия с получением 2-бром-3-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)толуола в виде бледно-желтого масла. H ЯМР (400 МГц, Хлороформ-) δ 7,21 (д, 2H, -ArH), 7,11 (м, 1H, -ArH), 6,90 (д, 2H, -ArH), 6,86 (д, 1H, -ArH), 4,30 (м, 4H, -OCHCHO-), 2,48 (с, 3H, -CH).
(2) 4-(2-бром-3-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)бензилокси)-2-гидроксибензальдегид:
1
d
6
2
2
2
Процедура была такой же, как в примере 1, за исключением того, что 2-бром-3-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)толуол использовали вместо 2-бром-3-метил-1,1'-бифенила для осуществления бромирования; бромид без дальнейшей очистки подвергали непосредственному взаимодействию с 2, 4-дигидроксибензальдегидом с получением белого твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, DMSO-) δ 10,91 (с, 1H, -OH), 9,95 (с, 1H, -CHO), 7,57 (д, 1H, -ArH), 7,45 (д, 1H, -ArH), 7,37 (т, 1H, -ArH), 7,25 (д, 1H, -ArH), 6,84 (д, 1H, -ArH), 6,78 (с, 1H, -ArH), 6,74 (д, 1H, -ArH), 6,59 (д, 1H, -ArH), 6,51 (с, 1H, -ArH), 5,16 (с, 2H, -CH-), 4,20 (м, 4H, -OCHCHO-).
(3) 4-(2-бром-3-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)бензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензальдегид:
1
d
6
2
2
2
2
Процедура была такой же, как в примере 1, за исключением того, что 4-(2-бром-3-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)бензилокси)-2-гидроксибензальдегид использовали вместо 4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-2-гидроксибензальдегида с получением белого твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, DMSO-) δ 10,28 (с, 1H, -CHO), 8,01 (с, 1H, -ArH), 7,85 (дд, 2H, -ArH), 7,74 (д, 1H, -ArH), 7,63 (т, 1H, -ArH), 7,58 (д, 1H, -ArH), 7,46 (т, 1H, -ArH), 7,35 (д, 1H, -ArH), 6,94 (д, 2H, -ArH), 6,87 (с, 1H, -ArH), 6,82 (д, 2H, -ArH), 5,36 (с, 2H, -CH-), 5,30 (с, 2H, -CH-), 4,29 (м, 4H, -OCHCHO-).
(4) N-гидроксиэтил-4-(2-бром-3-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)бензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензиламин:
1
d
6
2
2
2
2
2
2
2
3
Процедура была такой же, как в примере 1, за исключением того, что 4-(2-бром-3-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)бензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензальдегид использовали вместо 4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензальдегида с получением не совсем белого твердого порошка. H ЯМР (400 МГц, DMSO-) δ 8,74 (с, 1H, -NH-), 8,14 (м, 1H, -CONH-), 8,00 (с, 1H, -ArH), 7,85 (дд, 2H, -ArH), 7,63 (т, 1H, -ArH), 7,54 (д, 1H, -ArH), 7,50-7,37 (м, 2H, -ArH), 7,33 (д, 1H, -ArH), 6,94 (д, 1H, -ArH), 6,86 (с, 2H, -ArH), 6,82 (д, 1H, -ArH), 6,74 (д, 1H, -ArH), 5,27 (с, 2H, -CH-), 5,20 (с, 2H, -CH-), 4,29 (м, 4H, -OCHCHO-), 4,13 (с, 2H, -CH-), 3,34-3,39 (м, 2H, -CH-), 2,96 (м, 2H, -CH-), 1,82 (с, 3H, -COCH). MS (FAB): 643(M+1).
Пример 17: N-(4-(2-бром-3-(3,4-диметоксифенил)бензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензил)аланин
1
d
6
2
2
2
2
3
3
3
Процедура была такой же, как в примере 11, за исключением того, что аланин использовали вместо 2-аминоэтанола, с получением белого твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, DMSO-) δ 7,99 (с, 1H, -ArH), 7,89 (дд, 1H, -ArH), 7,80 (д, 1H, -ArH), 7,60 (т, 1H, -ArH), 7,53 (д, 1H, -ArH), 7,44 (т, 1H, -ArH), 7,35 (д, 2H, -ArH), 7,02 (д, 1H, -ArH), 6,94 (с, 1H, -ArH), 6,89 (д, 1H, -ArH), 6,81 (д, 1H, -ArH), 6,67 (д, 1H, -ArH), 5,23 (с, 2H, -CH-), 5,17 (с, 2H, -CH-), 3,94 (с, 1H, -CH-), 3,84 (с, 1H, -CH-), 3,79 (с, 3H, -OCH), 3,76 (с, 3H, -OCH), 3,35-3,38 (м, 1H, -CH-), 1,22 (с, 3H, -CH). MS (FAB): 632(M+1).
Пример 18: N-(4-(2-бром-3-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)бензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензил)серин
1
d
6
2
2
2
2
2
2
Процедура была такой же, как в примере 16, за исключением того, что серин использовали вместо 2-ацетамидоэтиламина, с получением не совсем белого твердого порошка.H ЯМР (400 МГц, DMSO-) δ 8,01 (с, 1H, -ArH), 7,90 (д, 1H, -ArH), 7,82 (д, 1H, -ArH), 7,61 (т, 1H, -ArH), 7,54 (д, 1H, -ArH), 7,44 (т, 1H, -ArH), 7,33 (т, 2H, -ArH), 6,93 (д, 1H, -ArH), 6,86 (с, 1H, -ArH), 6,82 (с, 2H, -ArH), 6,68 (д, 1H, -ArH), 5,24 (с, 2H, -CH-), 5,18 (с, 2H, -CH-), 4,29 (с, 4H, -OCHCHO-), 4,04 (с, 2H, -NCH-), 3,73 (с, 1H, -NH-), 3,70-3,58 (м, 1H, -NCH-), 3,17 (с, 2H, -CH-). MS (FAB): 646(M+1).
Пример 19: N-(4-(2-бром-3-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)бензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензил)треонин
1
d
6
2
2
2
2
2
3
Процедура была такой же, как в примере 16, за исключением того, что треонин использовали вместо 2-ацетамидоэтиламина с получением белого твердого вещества.H ЯМР (400 МГц, DMSO-) δ 7,96 (с, 1H, -ArH), 7,91-7,77 (м, 2H, -ArH), 7,62 (т, 1H, -ArH), 7,54 (д, 1H, -ArH), 7,44 (т, 1H, -ArH), 7,32 (д, 1H, -ArH), 7,24 (с, 1H, -ArH), 6,93 (д, 1H, -ArH), 6,82 (м, 3H, -ArH), 6,64 (д, 1H, -ArH), 5,22 (с, 2H, -CH-), 5,16 (с, 2H, -CH-), 4,29 (с, 4H, -OCHCHO-), 3,82 (с, 2H, -CH-), 3,35-3,38 (м, 1H, -CH-), 1,87 (с, 3H, -CH). MS (FAB): 660(M+1).
Пример 20: N-(4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(3-цианобензилокси)бензил)серин
(1) 4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-гидроксибензальдегид:
1
d
6
2
Процедура была такой же, как в примере 1, за исключением того, что 2, 4-дигидрокси-5-хлор-бензальдегид использовали вместо 2, 4-дигидроксибензальдегида с получением белого твердого вещества.H ЯМР (500 МГц, DMSO-) δ 11,18 (с, 1H, -OH), 10,09 (с, 1H, -CHO), 7,74 (с, 1H, -ArH), 7,66 (д, 1H, -ArH), 7,57 (т, 1H, -ArH), 7,51 (м, 2H, -ArH), 7,46 (д, 1H, -ArH), 7,42 (д, 3H, -ArH), 6,85 (с, 1H, -ArH), 5,37 (с, 2H, -CH-).
(2) 4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(3-цианобензилокси)бензальдегид:
1
d
6
2
2
Процедура была такой же, как в примере 1, за исключением того, что 4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-гидроксибензальдегид использовали вместо 4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-2-гидроксибензальдегида с получением белого твердого вещества.H ЯМР (500 МГц, DMSO-) δ 10,27 (с, 1H, -CHO), 8,07 (с, 1H, -ArH), 7,91 (д, 1H, -ArH), 7,87 (д, 1H, -ArH), 7,77 (с, 1H, -ArH), 7,73-7,64 (м, 2H, -ArH), 7,56 (м, 1H, -ArH), 7,51 (м, 2H, -ArH), 7,46 (д, 1H, -ArH), 7,43 (м, 3H, -ArH), 7,25 (с, 1H, -ArH), 5,48 (с, 2H, -CH-), 5,46 (с, 2H, -CH-).
(3) N-(4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(3-цианобензилокси)бензил)серин:
1
d
6
2
2
2
2
Процедура была такой же, как в примере 1, за исключением того, что 4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(3-цианобензилокси)бензальдегид использовали вместо 4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензальдегида, серин использовали вместо 2-ацетамидоэтиламина с получением не совсем белого твердого вещества. H ЯМР (500 МГц, DMSO-) δ 8,02 (с, 1H, -ArH), 7,92 (д, 1H, -ArH), 7,84 (д, 1H, -ArH), 7,65 (м, 2H, -ArH), 7,55 (д, 2H, -ArH), 7,52-7,47 (м, 2H, -ArH), 7,46 (д, 1H, -ArH), 7,41 (м, 3H, -ArH), 7,07 (с, 1H, -ArH), 5,33 (с, 2H, -CH-), 5,31 (с, 2H, -CH-), 4,03 (с, 2H, -CH-), 3,83-3,63 (м, 2H, -CH-), 3,38-3,43 (м, 1H,, -CH-). MS (FAB): 622(M+1).
Пример 21: N-гидроксилэтил-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(3-цианобензилокси)бензиламин
1
d
6
2
2
2
2
2
Процедура была такой же, как в примере 1, за исключением того, что 4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(3-цианобензилокси)бензальдегид использовали вместо 4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензальдегида, 2-аминоэтанол использовали вместо 2-ацетамидоэтиламина с получением бледно-желтого твердого вещества.H ЯМР (500 МГц, DMSO-) δ 8,00 (с, 1H, -ArH), 7,86 (д, 1H, -ArH), 7,82 (д, 1H, -ArH), 7,63 (кв, 2H, -ArH), 7,56 (с, 1H, -ArH), 7,54-7,49 (м, 1H, -ArH), 7,47 (д, 2H, -ArH), 7,43 (д, 1H, -ArH), 7,38 (д, 3H, -ArH), 7,07 (с, 1H, -ArH), 5,32 (с, 2H, -CH-), 5,30 (с, 2H, -CH-), 3,97 (с, 2H, -CH-), 3,59 (т, 2H, -CH-), 2,81 (т, 2H, -CH-). MS (FAB): 679(M+1).
Пример 22: N-ацетиламиноэтил-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(3-цианобензилокси)бензиламин
1
d
6
2
2
2
2
2
3
Процедура была такой же, как в примере 1, за исключением того, что 4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(3-цианобензилокси)бензальдегид использовали вместо 4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензальдегида с получением не совсем белого твердого вещества.H ЯМР (500 МГц, DMSO-) δ 8,00 (с, 1H, -ArH), 7,86 (дд, 2H, -ArH), 7,69-7,62 (м, 2H, -ArH), 7,53 (д, 2H, -ArH), 7,50 (д, 2H, -ArH), 7,46 (д, 1H, -ArH), 7,41 (т, 3H, -ArH), 7,07 (с, 1H, -ArH), 5,33 (с, 2H, -CH-), 5,32 (с, 2H, -CH-), 3,89 (с, 2H, -CH-), 3,25 (м, 2H, -CH-), 2,74 (т, 2H, -CH-), 1,83 (с, 3H, -COCH). MS (FAB): 620(M+1).
Пример 23: N-(2-метансульфониламиноэтил)-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензиламин. гидрохлорид
3
6
2
2
2
2
2
3
1
d
N-(2-аминоэтил)метансульфонамид-FCCOOH (76 мг) растворяли в 5 мл DMF, и добавляли триэтиламин (30 мг). После перемешивания в течение 20 мин, добавляли 4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензальдегид (50 мг) и уксусную кислоту (54 мг). После перемешивания в течение 30 мин, добавляли цианоборгидрид натрия (15,7 мг) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 ч. Реакцию остановливали. Смесь экстрагировали водой и этилацетатом три раза. Органическую фазу промывали насыщенным солевым раствором и сушили над безводным сульфатом натрия, затем концентрировали в вакууме. Неочищенный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с получением вязкого продукта. Добавляли 10 мл насыщенного раствора HCl метанола и перемешивали в течение ночи. Смесь концентрировали в вакууме, и промывали эфиром с получением бледно-желтого твердого порошка. H ЯМР (400 МГц, DMSO-) δ 9,06 (с, 2H, -NH-), 8,01 (с, 1H, -ArH), 7,89 (д, 1H, -ArH), 7,83 (д, 1H, -ArH), 7,68-7,57 (м, 2H, -ArH), 7,50 (д, 1H, -ArH), 7,48 (д, 2H, -ArH), 7,45 (с, 1H, -ArH), 7,42 (с, 1H, -ArH), 7,39 (м, 3H, -ArH), 6,86 (д, 1H, -ArH), 6,75 (д, 1H, -ArH), 5,28 (с, 2H, -CH-), 5,22 (с, 2H, -CH-), 4,14 (т, 2H, -CH-), 3,30 (м, 2H, -CH-), 3,02 (м, 2H, -CH-), 2,94 (с, 3H, -CH). MS (FAB): 658(M+1).
Пример 24: (S)-N-(4-(2-бром-3-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)бензилокси)-5-хлор-2-(3-цианобензилокси)бензил)пипеколиновая кислота
1
d
J
J
J
J
J
6
2
2
2
1
=
2
=
2
2
2
2
2
2
Процедура была такой же, как в примере 16, за исключением того, что 2, 4-дигидрокси-5-хлор-бензальдегид использовали вместо 2, 4-дигидроксибензальдегида, и пипеколиновую кислоту использовали вместо 2-ацетамидоэтиламина с получением не совсем белого твердого порошка.H ЯМР (400 МГц, DMSO-) δ 7,94 (с, 1H, ArH), 7,81 (м, 2H, ArH), 7,61 (т, =8,0 Гц, 2H, ArH), 7,46 (м, 2H, ArH), 7,34 (д, =7,6 Гц, 1H, ArH), 7,01 (с, 1H, ArH), 6,94 (д, =8,4 Гц, 1H, ArH), 6,89- 6,79 (м, 2H, ArH), 5,28 (с, 2H, -CH-), 5,25 (с, 2H, -CH-), 4,29 (с, 4H, -CH-), 3,70 (дд, 13,6 Гц, 52,4 Гц, 2H, -CH-), 3,22-3,12 (м, 1H, -CH-), 2,91 (м, 1H, -CH-), 2,31 (м, 1H, -CH-), 1,76 (м, 2H, -CH-), 1,49 (шир. с, 3H, -CH-), 1,38 (шир.с, 1H, -CH-). MS (FAB): 705(M+1).
Пример 25: N-(4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(3-цианобензилокси)бензил)аланин
Процедура была такой же, как в примере 1, за исключением того, что 4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(3-цианобензилокси)бензальдегид использовали вместо 4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензальдегида, и аланин использовали вместо 2-ацетамидоэтиламина с получением N-(4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(3-цианобензилокси)бензил)аланина в виде белого твердого вещества. MS (FAB): 606(M).
Пример 26: N-(4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(3-цианобензилокси)бензил)треонин
Процедура была такой же, как в примере 1, за исключением того, что 4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(3-цианобензилокси)бензальдегид использовали вместо 4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-2-(3-цианобензилокси)бензальдегида, и треонин использовали вместо 2-ацетамидоэтиламина с получением N-(4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(3-цианобензилокси)бензил)треонина в виде белого твердого вещества. MS (FAB): 636(M).
Пример 27: N-(4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(3-метансульфонилбензилокси)бензил)серин
Процедура была такой же, как в примере 1, за исключением того, что 4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-гидроксибензальдегид использовали вместо 4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-2-гидроксибензальдегида, 3-метансульфонилбензил бромид использовали вместо 3-цианобензил бромида, и серин использовали вместо 2-ацетамидоэтиламина с получением N-(4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(3-метансульфонилбензилокси)бензил)серина в виде твердого порошка. MS (FAB): 675(M).
Пример 28: N-(4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(3-метансульфонилбензилокси)бензил)пипеколиновая кислота
Процедура была такой же, как в примере 1, за исключением того, что 4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-гидроксибензальдегид использовали вместо 4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-2-гидроксибензальдегида, 3-метансульфонилбензил бромид использовали вместо 3-цианобензил бромида, и пипеколиновую кислоту использовали вместо 2-ацетамидоэтиламина с получением N-(4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(3-метансульфонилбензилокси)бензил)пипеколиновой кислоты в виде твердого порошка. MS (FAB): 699(M).
Фармакологические эксперименты
1. Оценка активности in vitro: набор для анализа связывания PD-1/PD-L1 Cisbio применяли для метода обнаружения уровня фермента in vitro.
Принципы и методы скрининга низкомолекулярных ингибиторов PD-1/PD-L1
1) Принцип: Белок PD-1 имеет HIS-метку, и PD-1-лиганд PD-L1 имеет hFc-метку. Eu меченое анти-hFc антитело и XL665 меченое анти-HIS антитело объединяли с вышеуказанными двумя мечеными белками, соответственно. После лазерного возбуждения энергия может переноситься от донора Eu к рецептору XL665, позволяя XL665 светиться. После добавления ингибиторов (соединений или антител) блокирование связывания PD-1 и PD-L1 делает более отдаленным расстояние между Eu и XL665, энергия не может быть передана, и XL665 не светится.
+
4
50
2) Экспериментальный метод: Конкретный метод можно отнести к набору PD-1/PD-L1 Cisbio (номер 64CUS000C-2). Реагенты следует вносить в следующем порядке. В 384-луночном белом планшете ELISA в каждую лунку добавляли 2 мкл разбавителя или целевого соединения, разбавленного разбавителем, и затем добавляли на лунку 4 мкл белка PD-1 и 4 мкл белка PD-L1, инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре; и 10 мкл смеси анти-Tag1-Eu3 и анти-Tag2-XL665 добавляли на лунку и инкубировали в течение от 1 ч до 4 ч при комнатной температуре, а сигналы флуоресценции измеряли при 665 нм и 620 нм с помощью прибора Envison. Скорость HTRF=(665 нм/620 нм)*10. 8-10 концентраций определяли для каждого соединения и IC рассчитывали с помощью программного обеспечения Graphpad.
3) Результаты скрининга показаны в таблице 1.
Таблица 1. Оценка ингибирующей активности соединений примеров на молекулярном уровне на взаимодействие между PD-1 и PD-L1:
Пример
IC<sub>50</sub> (М)
Пример
IC<sub>50</sub> (М)
1
4,39×10<sup>-7</sup>
15
------
2
2,94×10<sup>-8</sup>
16
2,68×10<sup>-7</sup>
3
2,30×10<sup>-7</sup>
17
3,16×10<sup>-6</sup>
4
5,92×10<sup>-8</sup>
18
3,85×10<sup>-8</sup>
5
3,07×10<sup>-7</sup>
19
1,81×10<sup>-8</sup>
6
1,78×10<sup>-7</sup>
20
2,48×10<sup>-9</sup>
7
4,59×10<sup>-6</sup>
21
5,29×10<sup>-9</sup>
8
1,34×10<sup>-7</sup>
22
6,23×10<sup>-8</sup>
9
7,88×10<sup>-7</sup>
23
9,79×10<sup>-7</sup>
10
4,58×10<sup>-7</sup>
24
6,75×10<sup>-8</sup>
11
7,87×10<sup>-6</sup>
25
3,16×10<sup>-9</sup>
12
--------
26
≤10<sup>-8</sup>
13
5,35×10<sup>-6</sup>
27
≤10<sup>-8</sup>
14
6,65×10<sup>-6</sup>
28
≤10<sup>-8</sup>
50
-13
Обнаружение HTRF Cisbio показало, что взаимодействие PD-1 и PD-L1 может быть значительно ингибировано соединениями примеров на молекулярном уровне, с IC<10моль/л.
2. Способность соединений примеров ослабить ингибирование IFNγ лигандом PD-L1:
Уровень экспрессии IFNγ может отражать пролиферативную активность Т-лимфоцитов. Используя экстрагированные человеческие РВМС (мононуклеарная клетка периферической крови), на основании того, что Т-лимфоцит можно активировать анти-CD3/анти-CD28-антителом, лиганд PD-L1 добавляли к ингибирующему Т-лимфоциту, исследовали способность соединений примеров ослабления ингибирования лигандом PD-L1.
5
Конкретная процедура заключается в следующем. Раствор для выделения человеческих лимфоцитов DAKEWE (DKW-KLSH-0100) использовали для экстракции РВМС из цельной крови человека, и РВМС инокулировали в 96-луночный планшет с 3×10 клетками на лунку. Добавляли человеческий белок PD-L1 (конечная концентрация 5 мкг/мл), анти-CD3/анти-CD28 антитело (конечная концентрация 1 мкл/мл) и пропорциональное разбавление соединений примеров, соответственно. Через 72 ч определяли уровень экспрессии IFNγ в супернатанте с помощью набор для тестирования IFNγ Cisbio. Результаты экспериментов показали, что ингибирование PD-L1 до уровня экспрессии IFNγ может быть частично ослаблено соединениями примеров при 10 нМ.
3. Эффективность соединений примеров in vivo
Способы фармакодинамики были следующими:
6
Способ с подкожной ксенотрансплантатной опухолью был следующим. Культивированные специфичные опухолевые клетки расщепляли и собирали центрифугированием, и дважды промывали стерильным физиологическим раствором и затем подсчитывали. Концентрацию клеток доводили до 5×10/мл физиологическим солевым раствором, и 0,2 мл суспензии клеток инокулировали в правую подмышечную ямку мышей C57BL/6 или Bablc. После инокуляции животных случайным образом разделяли на две группы на следующий день. В каждой группе было 6-7 мышей. После взвешивания животным вводили дозу один раз в день для контроля размера опухоли. После взвешивания животным вводили дозу один раз в день до контроля размера опухоли. Когда размер опухоли достиг определенного размера, мышей взвешивали и забирали кровь из глазницы мышей, и затем мышей убивали отрывом шеи. Опухолевую ткань, ткань тимуса и ткань селезенки собирали и взвешивали, соответственно. Наконец, рассчитывали скорость ингибирования роста опухоли, и скорость ингибирования роста опухоли использовали для оценки уровня противоопухолевого эффекта.
6
Способ с моделью метастазирующей в легкие B16F10 был следующим. Культивированные опухолевые клетки B16F10 расщепляли и собирали центрифугированием, и дважды промывали стерильным физиологическим раствором и затем подсчитывали. И концентрацию клеток доводили до 2,5×10/мл физиологическим солевым раствором. 0,2 мл клеток инъецировали мышам C57BL/6 через хвостовую вену, и опухолевые клетки будут собираться в легких мышей. После инокуляции животных случайным образом разделяли на две группы на следующий день. В каждой группе было 6-7 мышей. После взвешивания животным вводили дозу один раз в день. Через 3 недели мышей взвешивали и убивали, собирали и взвешивали легочную ткань и подсчитывали количество опухолей легких после фиксации с помощью жидкости Буэна. Наконец, рассчитывали скорость ингибирования роста опухоли, и скорость ингибирования роста опухоли использовали для оценки уровня противоопухолевого эффекта.
5
Способ с моделью гидроторакса рака легких Льюиса был следующим: Подкожную ксенотрансплантатную опухоль рака легких Льюиса гомогенизировали и дважды промывали стерильным физиологическим раствором, и концентрацию клеток доводили до 2,5×10/мл физиологическим солевым раствором. 0,2 мл клеток вводили в грудную полость мышей C57BL/6. После инокуляции животных случайным образом разделяли на две группы на следующий день. В каждой группе было 6-7 мышей. После взвешивания животным вводили дозу один раз в день. Животных умерщвляли, когда масса животных в контрольной группе внезапно падала. Жидкость в грудной полости извлекали с помощью шприца, и регистрировали объем жидкости.
6
5
4
При исследовании механизма вышеуказанных моделей был применен метод проточной цитометрии при измерении общей доли клеток Т-клеток различных типов. Конкретные стадии были следующие. Образцы были обработаны сначала. Для ткани крови брали орбитальную кровь. Лизат эритроцитов использовали для удаления эритроцитов, и затем для промывки использовали буфер PBS. После промывки клетки собирали. Для опухоли и селезенки ткани измельчали с помощью гомогенизатора, а затем разбавляли буфером PBS, затем фильтровали через сито 300 меш. После подсчета количества клеток для каждого образца в пробирку с EP добавляли 1×10 клеток и окрашивали относительно потока антител. После инкубации в течение 1 часа на льду, каждый образец промывали 2 раза буфером PBS. Популяцию клеток анализировали с помощью проточного измерительного прибора VERSE от BD Company. Общее количество клеток в ткани опухоли составляло 1×10, а общее количество клеток в тканях крови и селезенки составляло 1×10. Отношение Т-клеток к общему количеству клеток анализировали после проточной цитометрии.
(1) Подкожная ксенотрансплантатная модель метастатической меланомы B16F10 с высокой степенью
Для метастатической меланомы B16F10 с высокой степенью соединения примеров могут значительно ингибировать рост подкожной опухоли с учетом объема или массы опухоли.
Из анализа механизма, соединения примеров могут увеличить долю инфильтрирующих опухоль лимфоцитов и долю лимфоцитов в селезенке.
(2) Модель метастазов в легком метастатической меланомы B16F10 с высокой степенью
Для моделей метастатического рака легкого с метастатической меланомой B16F10 с высокой степенью, соединения примеров могут значительно ингибировать количество метастазов в легких.
Исходя из анализа механизма, соединения примеров могут увеличивать процент лимфоцитов в крови мышей.
(3) Подкожная ксенотрансплантатная модель рака молочной железы мыши EMT6
Для подкожной ксенотрансплантатной модели рака молочной железы мыши EMT6 соединения примеров оказывают некоторое ингибирующее действие на рак молочной железы мыши EMT6, и комбинация соединений примеров и CTX может значительно увеличить скорость ингибирования роста опухоли CTX.
(4) Модель гидроторакса рака легких Льюиса у мыши
Соединения примеров оказывают значительное ингибирующее действие на модель гидроторакса рака легких Льюиса у мыши и могут снижать частоту возникновения гидроторакса.
(5) Подкожная ксенотрансплантатная модель рака толстой кишки мыши MC38
Для подкожной ксенотрансплантатной модели рака толстой кишки мыши MC38 соединения примеров оказывают значительное ингибирующее действие на рак толстой кишки мыши MC38 и оказывают синергетическое противоопухолевое действие на этот рак в сочетании с CTX.
4. Взаимодействие соединения примера/PD-L1 антитела с белком PD-L1 определяли с помощью Biacore
(1) Принцип эксперимента
Поверхностный плазмон представляет собой разновидность электромагнитной волны на поверхности металла, возникающей при взаимодействии фотона и электрона при свободных колебаниях. Поверхностный плазмонный резонанс (SPR) представляет собой оптическое явление, возникающее на поверхности двух видов сред, которое может быть индуцировано фотоном или электроном. Явление полного отражения света из светло-плотной среды в светорассеивающую среду сформирует затухающую волну в светорассеивающей среде. Когда полная отраженная затухающая волна встречает плазменную волну на поверхности металла, может возникнуть резонанс, и энергия отраженного света уменьшается, и резонансный пик появляется в энергетическом спектре отраженного света. Этот резонанс называется поверхностным плазмонным резонансом. Угол падения поверхностного плазмонного резонанса называется углом SPR. Биосенсор SPR обеспечивает чувствительный в режиме реального времени без меток метод обнаружения для мониторинга взаимодействия молекул. Сенсор обнаруживает изменение угла SPR, и SPR также связан с показателем преломления поверхности металла. Когда аналит связывается на поверхности чипа, это приводит к изменению показателя преломления поверхности чипа, что приводит к изменению угла SPR. Это основной принцип обнаружения межмолекулярного взаимодействия в реальном времени с помощью биосенсора SPR. В анализе взаимодействия изменение угла SPR записывается на карту сенсора в режиме реального времени.
(2) Экспериментальные методы
Белок PD-L1 захватывали на Fc4 канале чипа NTA методом захвата, и буферная система представляла собой PBS-P+, pH 7,4, 0,01% DMSO. Серию концентраций соединений и PD-L1 антител получали и пропускали через поверхность чипа для определения взаимодействия.
(3) Результаты экспериментов
Предварительно было определено, что связывающим белком соединений примеров является PD-L1. Дальнейшие эксперименты Biacore подтвердили, что соединения примеров имели сильную способность связывания PD-L1.