СПОСОБ ОПТИМАЛЬНОГО ДОСТУПА К АБДОМИНАЛЬНОМУ ОТДЕЛУ ПИЩЕВОДА ИММУНОДЕФИЦИТНЫХ МЫШЕЙ ПРИ ОРТОТОПИЧЕСКОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ФРАГМЕНТА ОПУХОЛИ ПИЩЕВОДА ЧЕЛОВЕКА
METHOD FOR OPTIMAL ACCESS TO THE ABDOMINAL PORTION OF THE ESOPHAGUS OF IMMUNODEFICIENT MICE IN ORTHOTOPIC TRANSPLANTATION OF A HUMAN OESOPHAGEAL TUMOR FRAGMENT

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной онкологии, и касается способа ортотопической трансплантации фрагмента опухоли пищевода человека иммунодефицитным мышам для получения опухолевых моделей, более точно отражающих молекулярные, генетические и морфологические особенности развития рака пищевода человека.
Рак пищевода является опасным заболеванием в связи с высокой смертностью. При этом пятилетняя выживаемость в Европе составляет 9,8%. По распространению во всем мире рак пищевода занимает восьмое место в списке онкозаболеваний (см. Melsens Е., De Vlieghere Е., Descamps В. et al. Improved xenograft efficiency of esophageal adenocarcinoma cell lines through in vivo selection // Oncol Rep. 2017 Jul; 38(1): 71-81). В большинстве случаев рак пищевода диагностируется в поздних стадиях (см. Давыдов М.И., Аксель Е.М. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2013 г. М., 2015) и имеет плохой прогноз. В настоящее время для лечения рака пищевода применяют мультимодальный подход, включающий хирургический, лучевой, химиотерапевтический и сочетанные методы лечения. Тем не менее, у больных раком пищевода имеют место стабильно низкие цифры отдаленной выживаемости как в развитых, так и в развивающихся странах - 17%, при этом летальный исход обусловлен локальными рецидивами и метастазированием, возникающими в течение первого года с момента установления диагноза (см. Скворцов М.Б. Рак пищевода: хирургическое лечение // Сибирский онкологический журнал. - 2011. - №4. - С. 21-30; см. Siegel R., Ward Е., Brawley О., Jenal A. Cancer statistics, 2011: the impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths // CA Cancer J.Clin. - 2011. - Vol.61. - №4. - P. 212-236). Таким образом, агрессивное течение опухолей пищевода, неудовлетворительные результаты лечения диктуют необходимость поиска новых терапевтических подходов к лечению данной тяжелой онкопатологии, разработке новых эффективных таргетных препаратов. Для проведения доклинических исследований in vivo действия субстанций с вероятным противоопухолевым эффектом, а также изучения патогенетических механизмов используют модели злокачественного роста, воспроизводимые на лабораторных животных. В том числе, ими могут служить ксенографты опухолей пищевода на иммунодефицитных мышах.
Известен способ имплантации различных культур клеток рака пищевода под кожу иммунодефицитным мышам (Yaoping Shi, Feng Zhang, Zhibin Bai et al. Orthotopic Esophageal Cancers: Intraesophageal Hyperthermiaenhanced Direct Chemotherapy in Rats // Radiology, 2017, 1, P. 103-113; Hu T, Qi H, Li P et al. Comparison of GFP-Expressing Imageable Mouse Models of Human Esophageal Squamous Cell Carcinoma Established in Various Anatomical Sites // Anticancer research, 2015, 35 (9), P. 4655-4664), однако, согласно литературным данным, гетеротопические модели, предполагающие помещение опухолевого материала в чужеродное микроокружение, не являются адекватным отражением реального поведения данной опухоли (Xianda Zhao, Lihua Li et al. Tumor location impacts immune response in mouse models of colon cancer // Oncotarget, 2017, Vol. 8, (No. 33), P. 54775-54787).
Известен способ ортотопической имплантации путем инъекций различных культур клеток рака пищевода иммунодефицитным мышам (Xianda Zhao, Lihua Li et al. Tumor location impacts immune response in mouse models of colon cancer // Oncotarget, 2017, Vol. 8, (No. 33), P. 54775-54787). Недостатком данного способа является гомогенность вводимого опухолевого материала, в результате чего вышеописанная модель не является аналогичной картине клинического развития рака (Трещалина Е.М. Иммунодефицитные мыши Balb/c Nude и моделирование различных вариантов опухолевого роста для доклинических исследований // Российский биотерапевтический журнал, 2017, Т. 16, №3, С. 6-13). Также при введении культуры клеток высока степень их элиминации.
Из литературных источников известен способ ортотопической ксенотрансплантации фрагмента опухоли пищевода человека (Nikki P. Lee, Chung Man Chan et al. Tumor xenograft animal models for esophageal squamous cell carcinoma // Journal of Biomedical Science, 2018, 29; 25(1):66). Преимуществом данной модели является ее соответствие генетическим, гистологическим и фенотипическим свойствам опухоли донора. Однако представленный способ доступа к пищеводу мыши является неудобным, так как пищевод в этом случае расположен глубоко от входа в брюшную полость, над желудком, который приходится отводить с приложением силы, что может сильно повредить данный орган.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка способа ортотопической трансплантации фрагмента опухоли пищевода человека иммунодефицитным мышам, обеспечивающего оптимальный доступ к абдоминальному отделу пищевода животного.
Технический результат изобретения достигается тем, что осуществляют ортотопическую трансплантацию фрагмента опухоли пищевода человека иммунодефицитным мышам, включающий пересадку ткани опухоли пищевода человека на предварительно поврежденную стенку пищевода в брюшной полости иммунодефицитной мыши Nu/J, отличающийся тем, что доступ к абдоминальному отделу пищевода осуществляют производя послойный разрез кожи и ткани брюшной стенки мыши на протяжении 25 мм, начало разреза находится на реберной дуге в точке пересечения с ней линии, проведенной от левого плеча до левого бедра животного, конец разреза расположен в области средней линии животного и, заходя за нее, линия разреза перпендикулярна оси тела животного, отодвигают левую долю печени вверх, располагая край печени под углом 45° к оси тела животного, надсекают пищевод, отступая на 3 мм вверх от уровня перехода пищевода в желудок, разрез пищевода производят под углом 35° к оси пищевода с длинной разреза не менее половины диаметра пищевода, всего производят 3-4 таких рассечения адвентициального и мышечного слоев пищевода на расстоянии 1-1,5 мм один от другого, продольно прошивают стенку пищевода лигатурой, которой ранее прошили фрагмент человеческой опухоли пищевода, проводя иглу перпендикулярно ранее наложенным разрезам пищевода, лигатуру затягивают, фиксируя опухоль к стенке пищевода, прошивают желудок животного, накладывая первый шов на 2 мм выше перехода пищевода в желудок, той же лигатурой прошивают стенку желудка ниже перехода пищевода в желудок, швы накладывают параллельно оси желудка, оказывая тракцию за шов, направляют вектор силы под углом 35° к оси тела животного, выводя абдоминальный отдел пищевода в рану, завязывают лигатуру на желудке, ушивают брюшную полость.
Способ осуществляют следующим образом.
3
Фрагмент опухоли, выделенный во время операции у больного раком пищевода - донора, помещается в культуральную среду 199. Время от момента взятия опухоли до имплантации иммунодефицитным мышам составляет 10-15 минут. Имплантируют опухолевый материал объемом 5 мм.
Реципиентом опухолевого материала служат иммунодефицитные мыши Nu/J.
В качестве премедикации используют ксилазин концентрацией 20 мг/мл. Животных наркотизируют при помощи золетила концентрацией 22,57 мг/мл.
Для обеспечения доступа к пищеводу производят послойный разрез кожи и ткани брюшной стенки мыши на протяжении 25 мм. Начало разреза находится на реберной дуге в точке пересечения с ней линии, проведенной от левого плеча до левого бедра животного, конец разреза расположен в области средней линии животного и заходя за нее, линия разреза перпендикулярна оси тела животного.
Для получения доступа к абдоминальному отделу пищевода отодвигают левую долю печени вверх, располагая край печени под углом 45° к оси тела животного. Пищевод надсекают, отступая на 3 мм вверх от уровня его перехода в желудок, разрез осуществляют под углом 35° к оси пищевода. Длина разреза составляет не менее половины диаметра пищевода. Всего производят 3-4 таких рассечения адвентициального и мышечного слоев пищевода на расстоянии 1-1,5 мм один от другого.
Лигатурой прошивают сперва фрагмент человеческой опухоли, затем - продольно стенку пищевода, проводя иглу перпендикулярно ранее наложенным разрезам пищевода. Лигатуру затягивают, фиксируя опухоль к стенке пищевода.
Желудок мыши прошивают, накладывая первый шов на 2 мм выше перехода пищевода в желудок, той же лигатурой прошивают стенку желудка ниже перехода пищевода в желудок. Швы накладывают параллельно оси желудка, оказывая тракцию за шов, направляя вектор силы под углом 35° к оси тела животного и выводя абдоминальный отдел пищевода в рану. Лигатуру завязывают на желудке. Послойно ушивают брюшную полость.
Изобретение иллюстрируется фигурами (1-5).
На Фиг 1. изображено прошитие лигатурой фрагмента опухоли пищевода человека.
На Фиг 2. изображена имплантация фрагмента опухоли пищевода человека на стенку абдоминального отдела пищевода иммунодефицитной мыши Nu/J.
На Фиг 3. изображено прошитие лигатурой стенки желудка иммунодефицитной мыши Nu/J ниже перехода пищевода в желудок.
На Фиг 4. изображен желудок иммунодефицитной мыши Nu/J после наложения швов.
На Фиг 5. изображена иммунодефицитная мышь Nu/J после ортотопической трансплантации опухоли пищевода человека.
Данным способом произведена ортотопическая трансплантация опухоли пищевода человека 20 иммунодефицитным мышам Nu/J.
Технико-экономическая эффективность данного способа заключается в том, что способ позволяет обеспечить оптимальный доступ к абдоминальному отделу пищевода иммунодефицитных мышей при ортотопической трансплантации фрагмента опухоли пищевода человека для получения опухолевых моделей, более точно отражающих молекулярные, генетические и морфологические особенности развития рака пищевода человека.