СПОСОБ ЭКСТРАКЦИИ МОЛЕКУЛ, ОБРАЗУЮЩИХСЯ В ХОДЕ АНАЭРОБНОЙ ФЕРМЕНТАЦИИ, ИЗ ФЕРМЕНТАЦИОННОЙ БИОМАССЫ
METHOD OF EXTRACTING MOLECULES FORMED DURING ANAEROBIC FERMENTATION FROM FERMENTATION BIOMASS

Настоящее изобретение относится к способу экстракции молекул, образующихся в ходе анаэробной ферментации, из ферментационной биомассы.
В настоящем документе ферментируемая биомасса означает органический субстрат, являющийся преимущественно непищевым, получаемым из отходов, побочных продуктов и совместно получаемых продуктов, образованных из органических материалов; другими словами, биомасса, образующаяся в результате человеческой деятельности, будь то бытового, промышленного, сельскохозяйственного, лесохозяйственного, аквакультурного, агропромышленного или животноводческого происхождения. В качестве неограничивающего примера можно упомянуть, как органический субстрат, навоз, органическую фракцию бытовых отходов, совместно получаемые продукты переработки животных на скотобойне, целлюлозные или лигноцеллюлозные остатки агропромышленного происхождения, например получаемые в результате переработки сахарного тростника (жмых), семян подсолнечника или соевых бобов.
Анаэробная ферментация означает ферментацию, осуществляемую в анаэробных условиях с помощью микроорганизмов, эукариот или прокариот, таких как бактерии, грибы, водоросли или дрожжи.
В настоящем документе термин «молекула» относится преимущественно, но не исключительно, к так называемым ферментативным метаболитам-прекурсорам. С помощью этих прекурсоров затем можно получить молекулы, обладающие большей энергией и/или представляющие больший интерес с химической точки зрения; следует понимать, что они представляют собой органические молекулы. В качестве молекул, обладающих энергией и/или представляющих интерес с химической точки зрения, можно упомянуть, например, молекулы, имеющие углеродную цепь, включающие кислоты, углеводороды, метан, сложные эфиры, спирты, амиды или полимеры.
Среди так называемых ферментативных метаболитов-прекурсоров, образующихся в ходе ферментации, можно упомянуть летучие жирные кислоты или ЛЖК, которые могут быть преобразованы, например, в кетоны, алканы, спирты, алкены, причем следует понимать, что в ходе такой ферментации также образуются, в том числе, сложные эфиры, газы, молочная кислота, спирты, водород и диоксид углерода.
В патенте США №6043392 описан такой способ получения кетонов путем термической обработки солей летучих жирных кислот, образованных в ходе анаэробной ферментации. Некоторые из летучих жирных кислот также преобразуются в жидкие углеводороды, альдегиды и спирты. Оказывается, этот процесс осуществляется в две отдельные стадии, а именно: ферментация и, затем, обработка ЛЖК путем экстракции в виде осажденных солей с экстрагентом - третичным амином. Известно также, что получение летучих жирных кислот, осуществляемое путем анаэробной ферментации, индуцирует подкисление среды, что является вредным для микроорганизмов. Подкисление среды индуцирует ингибирование микроорганизмов, поэтому оно замедляет или останавливает ферментацию, и работать необходимо в периодическом режиме. Для этой цели ЛЖК экстрагируют после заданного времени ферментации с помощью хорошо известных методик. Способ, поэтому, не допускает быстрое и непрерывное получение молекул, называемых прекурсорами, а их выход не является оптимальным. Анаэробная ферментация, предназначенная для получения бутанола, описана в патенте США №4424275. Экстракцию проводят непрерывно с растворителем, содержащим хлор и фтор. ЕР-А-216221 раскрывает жидкость-жидкостную экстракцию, сопряженную с ферментацией, с помощью растворителя, который не токсичен для микроорганизмов. Такие способы расходуют штаммы микроорганизмов и образуют мало утилизируемых отходов или вообще не образуют их.
Настоящим изобретением делается попытка предложить другой способ экстракции, обеспечивающий возможность получать разнообразные молекулы, называемые прекурсорами и получаемые в ходе анаэробной ферментации, непрерывным, биосовместимым, рутинным и отработанным образом с минимальным количеством отходов очень низкой ценности.
В этой связи, объектом настоящего изобретения является способ экстракции летучих жирных кислот (ЛЖК), органических молекул, называемых прекурсорами, продуцируемых микроорганизмами в реакторе для ферментации путем анаэробной ферментации с использованием ферментируемой биомассы, причем указанные молекулы представляют собой ферментативные метаболиты, характеризующийся тем, что он включает по меньшей мере следующие стадии:
- a) выбор средства экстракции из средств экстракции, которые, по меньшей мере, нерастворимы в ферментационной среде, и условия обработки которыми сохраняют способность микроорганизмов, присутствующих в ферментационной среде, к продуцированию указанных молекул,
- b) приведение выбранного средства экстракции в контакт с ферментационной средой без прерывания ферментации,
- c) выделение из реактора для ферментации экстрагированных молекул с помощью средства экстракции при рН ниже 4,5.
Такой способ позволяет непрерывно извлекать молекулы, в частности так называемые метаболиты-прекурсоры, такие как летучие жирные кислоты, сохраняя при этом продуцирующую способность микроорганизмов, присутствующих в биореакторе. На самом деле, стадия экстракции позволяет не только непрерывно извлекать молекулы, образуемые в реакторе для ферментации, но и сохранять микроорганизмы, ответственные за их продуцирование; причем экстракция проводится в условиях, нелетальных для всех микроорганизмов, иначе говоря, в биосовместимых условиях экстракции. Таким образом, проблемы, связанные с накоплением прекурсоров в реакторе ферментации, устраняются, например связанные с подкислением ферментационной среды из-за накопления образованных летучих жирных кислот, которые являются вредными для микроорганизмов. Активность микроорганизмов поддерживается на высоком уровне, близком к исходному уровню, в течение всего цикла ферментации.
В соответствии с желательными, но не обязательными аспектами изобретения, такой способ может включать одну или несколько из следующих характеристик:
- Средством экстракции является растворитель, имеющий температуру кипения ниже 70°С, тогда как экстракция относится к типу жидкость-жидкость.
- Средством экстракции является растворитель, температура кипения которого ниже температуры ферментации.
- Средством экстракции является растворитель, плотность которого меньше плотности ферментационной среды.
- Средством экстракции является твердое вещество, экстракция типа твердое тело-жидкость.
- Приведение ферментационной среды и средства экстракции в контакт происходит в реакторе, причем средство экстракции отделяют или не отделяют от ферментационной среды.
- Приведение ферментационной среды и средства экстракции в контакт происходит вне реактора, причем изъятие части ферментационной среды проводят непрерывно.
- Приведение ферментационной среды и средства экстракции в контакт происходит вне реактора, причем изъятие части ферментационной среды проводят последовательно.
- После стадии с) по меньшей мере одну часть жидкой фазы, остающейся после экстракции, вновь вводят в реактор для ферментации и включают в ферментационную среду.
Изобретение также относится к установке для осуществления способа в соответствии с одной из предыдущих характеристик, характеризующейся тем, что она содержит, по меньшей мере:
- ферментационный реактор,
- экстракционное устройство, подходящее для обеспечения контакта между ферментационной средой и средством экстракции.
Изобретение будет понятнее, и его другие преимущества будут очевиднее после прочтения описания нескольких вариантов осуществления изобретения, приведенных в качестве неограничивающего примера и со ссылкой на следующие графические материалы, на которых:
- Фигура 1 является упрощенной схемой, представляющей способ, являющийся объектом данного изобретения.
Различные стадии способа описаны ниже со ссылкой на несколько вариантов осуществления, причем следует понимать, что широко известные стадии не детализированы. В частности, ниже будет сделана ссылка на схему, показанную на Фигуре 1, как иллюстрирующую предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения.
Во-первых, субстрат 1 используется преимущественно необработанным, т.е. его не подвергают какой-либо физико-химической или ферментативной предварительной обработке. Этот субстрат 1 состоит в основном из ферментируемой биомассы. В качестве неограничивающих примеров можно упомянуть сельскохозяйственные или растительные отходы (солома, жмых, стебли кукурузы, травы, древесина, овечий настриг), бумажные отходы (картон, бумага), агропродовольственные отходы, отходы со скотобойни, органическая фракция бытовых отходов, навоз (навоз, навозная жижа, помет), водоросли, отходы аквакультуры, лесохозяйственные отходы или ферментируемые совместно получаемые продукты косметической промышленности. Некоторые субстраты содержат органические молекулы, такие как органические кислоты, которые не будут влиять на ферментационный процесс или ограничивать его. С другой стороны, эти молекулы могут быть обнаружены в ферментационной среде и участвовать, например, в производстве определенных конечных органических молекул.
Субстрат 1 вводят в реактор для ферментации 2, который хорошо известен и имеет размер, соответствующий требуемой производительности, будь то в лабораторном масштабе для проведения испытаний или в промышленном масштабе в случае производства. Другими словами, реактор для ферментации 2 или биореактор имеет объем в диапазоне от нескольких литров до нескольких сотен кубических метров в зависимости от необходимости.
Микроорганизмы предпочтительно вводят первоначально в реактор для ферментации в количестве, достаточном для начала ферментации. Микроорганизмы предпочтительно засевают в виде консорциума, что изображено стрелкой М. Термин «консорциум» обозначает состав или смесь микроорганизмов, эукариот и прокариот, которые могут быть бактериями, дрожжами, грибами или водорослями. Эти микроорганизмы происходят по существу из природных экосистем, преимущественно, но не исключительно, из анаэробных экосистем, таких как анаэробная зона водных сред, таких как бескислородная зоны некоторых озер, почв, болот, рубец жвачных животных или кишечник термитов, но не ограничиваясь указанными примерами. Следует иметь в виду, что качественное и количественное распределение различных типов и видов микроорганизмов, входящих в консорциум М, точно не известно, и, прежде всего, может изменяться в значительных пропорциях. Оказывается, что это качественное и количественное разнообразие придает микроорганизмам неожиданную устойчивость и адаптивность, что позволяет обеспечить оптимальное использование субстрата независимо от его состава и при различных условиях ферментации.
К тому же, ввиду использования субстрата 1 как он есть, то есть без его стерилизации или, в более общем смысле, без его очистки от микроорганизмов, которые он содержит перед введением в биореактор 2, представляется, что микроорганизмы, эндемичные для субстрата 1, фактически включаются в консорциум М или, по меньшей мере, действуют совместно с ним в биореакторе 2.
Консорциум микроорганизмов М, объединенный с микроорганизмами, возможно присутствующими в субстрате 1, обеспечивает ферментацию субстрата 1 без добавления таких продуктов, как ферменты. Кроме того, ферментация 3 происходит в анаэробных условиях, точнее, когда окислительно-восстановительный потенциал составляет менее -300 мВ, предпочтительно от -550 мВ до -400 мВ, и при рН ниже 8, предпочтительно от 4 до 7. Ферментация 3 предпочтительно ограничивается получением так называемых ферментативных метаболитов-прекурсоров, а именно летучих жирных кислот или ЛЖК. Таким образом индуцируется реакция, что аналогично явлению ацидоза, встречающегося у жвачных животных, при котором продуцирование метана близко к нулю. Метан является, как правило, одним из конечных ферментационных метаболитов, получаемых в ходе анаэробной ферментации микроорганизмами, полученными из природных экосистем.
Ферментация 3 первоначально приводит к образованию летучих жирных кислот, имеющих от одного до восьми атомов углерода, в основном от двух до четырех атомов углерода, таких как уксусная кислота, пропионовая кислота и масляная кислота. Кроме того, получают и длинноцепочечные летучие жирные кислоты, также имеющие более четырех атомов углерода, такие как валериановая и капроновая, гептановая или октановая кислоты. Продолжая ферментацию и/или увеличивая количество микроорганизмов в биореакторе 2, при необходимости с помощью отдельных микроорганизмов, можно способствовать продуцированию ЛЖК с длинной углеродной цепью, т.е. более чем с четырьмя атомами углерода.
Другими словами, метаболиты, продуцируемые в большом количестве в ходе ферментации 3, по существу представляют собой летучие жирные кислоты, имеющие от двух до шести атомов углерода. Далее, экстракция будет, по существу, касаться экстракции этих метаболитов, однако следует понимать, что этот способ может быть использован для других молекул, полученных в ходе других видов ферментации. Ферментация 3 может быть осуществлена в периодическом режиме, непрерывно, прерывисто или с подпиткой, или, предпочтительно, непрерывно, в одном или нескольких ферментационных реакторах, расположенных последовательно.
Ферментацию 3 во всех случаях проводят с целью обеспечить получение данных молекул, т.е. ЛЖК, в жидкой фазе, причем следует понимать, что изобретение относится к любому типу органических молекул, полученных путем ферментации, или метаболитов постольку, поскольку они продуцируются в жидкой фазе. Таким образом, легко понять, что среда ферментации содержит твердую фазу, содержащую по меньшей мере на начальном этапе твердую фракцию субстрата 1, а также твердую фракцию консорциума микроорганизмов М. Жидкая фаза ферментационной среды содержит молекулы, полученные в процессе ферментации 3, а также жидкую фракцию субстрата 1 по меньшей мере в начале ферментации.
Продолжительность ферментации изменяется, в частности, в зависимости от субстрата 1, присутствующих микроорганизмов М и условий ферментации. Как правило, период ферментации составляет от 1 до 7 суток, предпочтительно от 2 до 4 суток. Концентрация метаболитов, получаемых в ферментационной среде в конце этого периода, является переменной величиной, но, например, для летучих жирных кислот составляет, как правило, порядка от 10 до 20 г/л в зависимости от летучих жирных кислот, причем следует понимать, что при определенных условиях концентрация может составлять более 35 г/л, например около 50 г/л. В конце стадии ферментации 3, рН ферментационной среды является кислым, как правило, от 4 до 6, в связи с наличием летучих жирных кислот в ферментационной среде.
Когда образование метаболитов, или определенных молекул, в данном случае ЛЖК, путем ферментации 3 субстрата 1 достигает определенного количественного уровня, как правило, в стационарной фазе ферментации, начинают стадию экстракции молекул 4. Предпочтительно, но не обязательно, это количество соответствует замедлению роста микроорганизмов, и, таким образом, находится в непосредственной близости от порога ингибирования микроорганизмов.
Средство экстракции выбирают из таких жидких или твердых средств экстракции, которые не растворимы по меньшей мере в ферментационной среде. Когда средство экстракции является жидкостью, и, следовательно, в случае растворителя, температура его кипения предпочтительно составляет менее 70°С. Предпочтительно, чтобы плотность растворителя была ниже, чем плотность ферментационной среды.
Точнее говоря, экстракцию 4 проводят с твердым или жидким средством экстракции 8, условия обработки которым позволяют сохранить активность и/или рост микроорганизмов М в условиях ферментации, преобладающих в биореакторе 2 и определенных для проведения ферментации 3. Молекулы и, таким образом, ферментативные метаболиты, предпочтительно экстрагируют по отдельности, или, по меньшей мере, экстрагируют в пределах молекулярных семейств из жидкой фазы ферментационной среды, что обеспечивает возможность получить лучший выход, кроме всего прочего, и облегчает получение конкретных соединений из этих экстрагированных молекул.
Во всех случаях, метаболиты, продуцируемые в ходе ферментации 3, в данном случае анаэробной, экстрагируют, по меньшей мере частично, в таких условиях, что экстракция 4 не разрушает микроорганизмы М, или по меньшей мере в таких пропорциях, при которых продолжение ферментации 3 микроорганизмами М, присутствующими в ферментационной среде, не модифицируется заметным образом. Другими словами, средство экстракции 8 не является летальным для всех микроорганизмов. Экстракция 4, поэтому, не наносит ущерб, или ухудшает, ни ферментационной среде, ни ферментативным способностям микроорганизмов М, которые она содержит. Экстракция 4, таким образом, осуществляется в таких условиях, что она является биологически совместимой.
Когда молекулы, такие как летучие жирные кислоты, экстрагируют из ферментационной среды, закисление ферментационной среды этими кислотами де факто снижается. Таким образом, ферментация, и, таким образом, продуцирование метаболитов по-прежнему продолжается в условиях, близких к начальным условиям, при кислотности ферментационной среды, остающейся на низком уровне.
Поскольку выбранный метод экстракции не является летальным для всех микроорганизмов, преимущество было обнаружено в том, что остаточная жидкая фаза 5, после экстракции 4, может содержать живые микроорганизмы М, соответственно, потенциально активные. Поскольку в этой жидкой фазе 5 присутствует меньше летучих жирных кислот, чем первоначально, рН жидкой фазы 5 является менее кислым. Поэтому можно повторно впрыскивать ее в реактор для ферментации 2, как показано стрелкой 6. Таким образом, не только снижается уровень закисления и/или снижается рН ферментационной среды в процессе ферментации 3 путем экстракции 4 кислых соединений, но в какой-то степени среда также повторно засевается микроорганизмами, обеспечивая ферментацию 3 без снижения рН ферментационной среды.
Такое решение позволяет оптимизировать выход ферментации 3 и осуществить непрерывную ферментацию за счет снижения времени ферментации, в то же время приближаясь к безотходному производству.
Экстракцию 4 осуществляют непрерывно или последовательно, например проводя экстракцию через каждые 12 часов. Другими словами, можно продолжить ферментацию 3 во время экстракции образованных метаболитов, либо при их образовании, либо на регулярной основе. После экстракции метаболиты очищают и/или преобразуют в другие продукты 7, такие как алканы, алкены, амиды, амины, сложные эфиры, полимеры, с помощью широкоизвестных химических методов, таких как перегонка, синтез, электросинтез, амидирование или полимеризация.
Жидкость-жидкостную экстракцию с полярными или неполярными органическими растворителями в качестве средства экстракции 8, выбирают как предпочтительный, но не исключительный режим экстракции.
В частности, когда экстракции относится к типу жидкость-жидкость, смесь, образованную органическим растворителем 8 и жидкой фазой, происходящей из ферментационной среды, приводят в контакт 9, предпочтительно при перемешивании, с тем чтобы облегчить перенос водной фазы в органическую фазу.
После контакта 9, органическую 10 и водную фазы 11 предпочтительно разделяют декантацией 12. По ее окончании водная фаза 11 обеднена метаболитами, в данном случае летучими жирными кислотами, а органическая фаза 10 обогащена метаболитами, соответственно, летучими жирными кислотами.
В одном из воплощений, экстракцию не осуществляют в устройстве, отдельном от реактора для ферментации, а непосредственно в последнем. Растворитель, например, вводят с помощью устройства типа барботера, расположенного в нижней части реактора. Как вариант, экстракционное устройство помещают в объем реактора, причем обеспечивают сообщение с ферментационной средой.
Затем можно вновь ввести водную фазу 11, и, за счет этого, возможно, микроорганизмы М, в биореактор 2.
Так называемые метаболиты-прекурсоры собирают из органической фазы с помощью широко известных методов, например перегонкой или испарением. Органический растворитель 8 предпочтительно выбирают так, чтобы он имел низкую температуру кипения, и в любом случае в диапазоне температур, несмертельных для микроорганизмов, т.е. менее 70°С. Другими словами, температура кипения растворителя предпочтительно находится ниже температуры ферментации, так что в ферментационной среде не имеется никаких следов растворителя.
Кроме того, испарение растворителя с низкой температурой кипения является недорогим по затратам энергии и лучше всего сохраняет экстрагированные молекулы; температуры, достигаемые для испарения растворителя, не вызывают термическое разложение молекул, которые будет экстрагированы.
Другими словами, температура кипения органического растворителя предпочтительно также находится ниже, чем температура кипения экстрагированных молекул.
Кроме того, более низкая плотность растворителя по сравнению с плотностью ферментационной среды дает возможность получить, предпочтительно, супернатант, в котором присутствуют молекулы. В том случае, когда экстракцию проводят за пределами биореактора 2, любые присутствующие микроорганизмы затем удерживаются гравитацией в водной фазе, и таким образом отделяются из супернатанта и от растворителя 8. Ингибирование, а то и разрушение микроорганизмов растворителем, таким образом, по меньшей мере ограничено.
В соответствии с различными вариантами осуществления заявителем были проведены тесты по извлечению летучих жирных кислот.
Тест 1:
Летучие жирные кислоты, полученные в ходе ферментации субстрата, содержащего ферментируемую фракцию бытовых отходов с концентрацией сухого вещества (СВ) 50 г/л. Отбирали 50 мл ферментационной среды, и, таким образом, жидкой фазы. Этот образец имел рН 4,3. Эти 50 мл затем подвергали, при умеренном перемешивании 9, экстракции пентаном в качестве средства экстракции 8 с использованием равного объема органической фазы (т.е., 50 мл) и водной фазы.
После разделения органической 10 и водной 11 фаз декантацией 12, выделяли 14,3 г/л летучих жирных кислот в органической фазе путем выпаривания растворителя и 41,1 г/л летучих жирных кислот в водной фазе; выход экстракции составляет 26%. Получали 0,7 г летучих жирных кислот биологического происхождения, то есть в ходе ферментации 3 субстрата 1.
Тест 2:
Тест 1 был повторен, но отбираемый образец ферментационной среды подкисляли 10 М соляной кислотой (HCI) до рН 2,25 вместо 4,3. После перемешивания 9, декантации 12 и выпаривания растворителя, таким же образом извлекли 18 г/л ЛЖК в органической фазе и 32,5 г/л ЛЖК в водной фазе. Выход экстракции, полученный в данном случае, составил 36%.
Тест 3:
Тест 2 повторили с использованием той же самой культуральной среды, но с доведением рН до 5,35 вместо 4,3 с использованием ЮМ раствора NaOH. Таким способом извлекли 6 г/л ЛЖК в органической фазе и 44,5 г/л ЛЖК в водной фазе. Выход экстракции, полученный в данном случае, составил 12%.
Тест 4:
Тест 1 был повторен с диэтиловым эфиром вместо пентана в качестве средства экстракции 8, и было изучено влияние рН на выход экстракции. Выход экстракции, полученный при экстракции диэтиловым эфиром при соотношении 1/1 при различных значениях рН, являются следующим:
рН
выход экстракции
1,5
55%
4,3
43%
6
8%
Поэтому представляется, что полученный выход был разным в зависимости от условий рН при экстракции, независимо от взятого жидкого средства экстракции 8, в данном случае органического растворителя. В частности, заявитель неожиданно обнаружил, что при рН выше 4,5 выход падает. Значение рН ниже, чем исходное значение рН ферментационной среды, предпочтительно рН менее 3, будет обеспечивать более высокую эффективность экстракции по сравнению с промежуточным рН, при этом следует понимать, что эффективность экстракции при промежуточном рН является лучшей, чем при рН выше 6. Эти результаты были также неожиданно обнаружены и для других типов растворителей, как проиллюстрировано результатами теста №5.
Тест 5:
Исследовали влияние природы растворителя на выход экстракции с подкисленной средой с рН менее 3. Получены следующие результаты:
Растворители
Выход экстракции
Пентан
36%
Циклопентан
35%
Гексан
33%
Циклогексан
24%
Гептан
30%
Оказывается, что самый высокий выход получают, используя такие растворители, как пентан, циклопентан или диэтиловый эфир, как показано в тесте 4, при этом следует понимать, что выход во всех случаях превышает 20%. Понятно, что средство экстракции может представлять собой смесь по меньшей мере двух растворителей, при условии, что смесь, по меньшей мере, не растворяется в ферментационной среде. С точки зрения температуры кипения, больший интерес представляют растворители с более низкой точкой кипения, т.е. ниже чем 100°С, а более конкретно от 30°С до 70°С. Это позволяет экстрагировать молекулы непосредственно в реакторе 2, не изменяя мезофильный или термофильный режим. Более того, хотя этот тип растворителя квазинерастворим в воде, его низкая температура кипения обеспечивает лучшее разделение органической и водной фаз при температуре, возникающей в реакторах в ходе ферментации.
Водная фаза, которая содержит меньшее количество летучих жирных кислот, чем первоначально, и которая не была изменена при экстракции 4, может быть переработана, т.е. вновь введена в реактор для ферментации, участвуя в непрерывности ферментации 3.
Провели серию тестов путем изменения соотношения растворитель/растворенное вещество при жидкость-жидкостной экстракции. Экстракцию проводили при объемном соотношении растворитель/растворенное вещество, составляющем 2/1 вместо 1/1, в отношении ферментационной среды, аналогичной той, что и в первом примере. Наблюдали выход экстракции, составляющий 43% против 36% в примере 1.
Тест был повторен при объемном соотношении растворитель/растворенное вещество, составляющем 1/2. Выход экстракции составил 27% по сравнению с 36% в примере 1.
Таким образом, отмечается, что выход экстракции улучшается за счет значительного увеличения доли растворителя по отношению к растворенному веществу, не оказывая влияния на микроорганизмы.
Заявитель обнаружил преимущество в том, что можно повысить выход жидкость-жидкостной экстракции с помощью одного или нескольких соединений, часто обозначаемых английским термином "extractant" ("экстрагент"), в комбинации с растворителем или смесью растворителей, т.е. соединения, способного реагировать с растворенным веществом в растворе, такого как, в частности, ТБФ (трибутилфосфат). При 10%-ной концентрации этого экстрагента выход экстракции на ферментационной среде, аналогичной указанной в примере 1, составил 53% с пентаном и 50% с гексаном по сравнению с 36% в тесте 1 без экстрагента, при этом условия рН и соотношения были аналогичны тем, что использованы в тесте 1.
Тесты также проводили с другими средствами экстракции, в частности с твердыми экстракционными элементами в контексте экстракции твердое тело-жидкость. К ним относятся смолы, активированный уголь или цеолиты в качестве таких средств экстракции.
Во всех случаях, твердые средства экстракции предпочтительно являются гидрофобными настолько, насколько это возможно.
Тест с использованием анионной смолы обеспечил выход экстракции летучих жирных кислот из ферментационной среды, аналогичный выходу в первом тесте, - 22% за 15 минут. После того, как стадия экстракции была проведена, эти твердые средства могут быть регенерированы и использованы в других стадиях экстракции.
Использование активированного угля, который уже был использован и который был регенерирован с целью экстракции летучих жирных кислот, протестировали на ферментационной среде, аналогичной первому тесту. После того, как из ферментационной среды была извлечена часть общего количества летучих жирных кислот путем экстракции активированным углем, она была повторно использована для новых анаэробных ферментаций с различными консорциумами микроорганизмов и на различных субстратах.
Результаты, полученные при экстракции летучих жирных кислот, независимо от типа экстракции показывают, что все концентрации летучих жирных кислот для всех ферментаций и, следовательно, с различными субстратами и/или консорциумами микроорганизмов превышают начальную концентрацию летучих жирных кислот в среде до ферментации в течение нескольких поколений культур. Ферментационную активность поддерживали с помощью среды, прошедшей стадии экстракции. Это показывает, что данный способ жидкость-жидкостной или твердотельно-жидкостной экстракции не изменяет характеристики ферментационной среды и позволяет осуществлять непрерывное производство с по меньшей мере частичной переработкой последней.
8
7
8
Тесты на экстракцию in situ позволили продемонстрировать биосовместимость средства экстракции, другими словами, последовательное или непрерывное выделение молекул, таких как летучие жирные кислоты, продуцируемых микроорганизмами в ходе ферментации субстрата в течение более чем 2000 часов. Эта биосовместимость характеризуется числом микроорганизмов на мл, присутствующих в биореакторе, как определено методом проточной цитометрии. Эти результаты составляют, например среди образцов, взятых до и после экстракции in situ, от 2,3⋅10 до 8,0⋅10 микроорганизмов/мл, в одной серии измерений, и от 2,9 до 2,3⋅10 микроорганизмов/мл для другой серии измерений. Это показывает, что происходит уменьшение популяции микроорганизмов, присутствующих в биореакторе, после экстракции образованных молекул, т.е. в данном случае летучих жирных кислот, и, следовательно, де-факто после отбора ферментационной среды, однако это сокращение не приводит к масштабному и полному уничтожению микроорганизмов. Популяции микроорганизмов достаточно, количественно и качественно, так что микроорганизмы активны, и потеря ферментативной активности консорциума микроорганизмов мала или вообще отсутствует. Другими словами, колебания в популяции микроорганизмов, вызванные экстракцией, не влияют на общую активность микроорганизмов в макроскопическом масштабе, тем самым сохраняя оптимальное продуцирование ферментативных метаболитов, называемых прекурсорами.
Экстракция, таким образом, может быть осуществлена без необратимых стрессовых воздействий непосредственно в реакторе ферментации, будь то экстракция жидкость-жидкостного или твердотельно-жидкостного типа.
В одном предпочтительном воплощении, поэтому, возможно осуществлять непрерывную ферментацию с in situ экстракцией ингибирующих ферментацию метаболитов, т.е. путем экстракции летучих жирных кислот, вызывающих закисление среды, по мере их образования или по меньшей мере через равные промежутки времени. В варианте, который не показан, эти операции экстракции могут быть выполнены во втором отсеке. В этом случае осуществляют непрерывный или повторяемый забор ферментационной среды.
Осуществление такого способа включает не только наличие в установке по меньшей мере одного реактора для ферментации, но и по меньшей мере одного экстракционного устройства, подходящего для проведения стадии экстракции. Эти устройства хорошо известны, причем их количество и размеры адаптируются к типу производства, в зависимости от того, проводится ли экстракция внутри или снаружи реактора.
Такая установка предпочтительно содержит по меньшей мере одно устройство для хранения продуктов, образующихся в результате экстракции. Предусмотрены средства управления и контроля, такие как датчики температуры, рН и/или зонды окислительно-восстановительного потенциала. Кроме того, мониторинг активности микроорганизмов осуществляют хорошо известными методами, например с помощью аналитического мониторинга образования газообразных и жидких метаболитов, подсчетов с использованием проточной цитометрии, методов молекулярной биологии, таких как молекулярные маркеры или биочипы.