ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АНТИОКСИДАНТОВ
VOLTAMMETRIC METHOD OF DETERMINING ACTIVITY OF ANTIOXIDANTS

Изобретение относится к области определения активности антиоксидантов и может быть использовано в пищевой, косметической, фармацевтической промышленностях, а также в медицине и криминалистике.
7
Известен способ определения суммарной антиоксидантной активности (АОА) биологически активных веществ (патент РФ №2238554, МПКG01N 33/15, G01N 27/26, опубл. 20.10.2004), включающий подготовку проб анализируемого и стандартного веществ, их электрохимическое окисление в ячейке амперометрического детектора, усиление электрических сигналов, их регистрацию и расчет АОА по предложенной математической зависимости. В этом способе подготовку анализируемых проб осуществляют путем смешения соответствующих веществ с растворителем, не обладающим антиоксидантной способностью. Кроме того, в качестве стандартных веществ используют вещества, обладающие высоким редокс-потенциалом, выбранные из ряда: рутин, кверцетин, дигидрокверцетин.
Основными недостатками данного способа являются "относительно низкая чувствительность, а также сложность аппаратурного оформления, т.к. для реализации способа требуется насос, термостатируемая электрохимическая ячейка, кран дозатор. Кроме того, в этом способе окисление антиоксидантов идет электрохимическим путем на поверхности рабочего электрода, на котором происходит глубокое окисление, не характерное для процессов, происходящих в организме.
7
2
4
4
Известен также выбранный нами за прототип вольтамперометрический способ определения суммарной активности антиоксидантов (патент РФ №2224997, МПК G01N 33/00, опубл. 27.02.2004), включающий процесс восстановления вещества на электроде в растворе электролита. В этом способе в качестве модельной реакции используют процесс электровосстановления кислорода, который проводят на ртутно-пленочном электроде на фоне 0,1М NaSO в водной среде, 0,1 М NaClO в апротонной среде или 0,9% NaCl в биологических объектах, регистрацию катодных волн одноэлектронного восстановления кислорода ведут в режиме дифференцирования при скорости развертки потенциала 50-100 мВ/с, суммарную антиоксидантную активность определяют по относительному изменению тока электровосстановления кислорода в интервале потенциалов от 0 до -0,6 В относительно насыщенного хлорид-серебряного электрода сравнения.
.
.
.
.
Основным недостатком этого способа является низкая чувствительность. Кроме того, способ не достаточно объективно оценивает активность антиоксидантов по отношению к процессам, происходящим в организме, т.к. с помощью модельной реакции, указанной в прототипе, невозможно определять активность антиоксидантов по отношению к ОН радикалам. Как показано в работе (Ю.А.Владимиров. Свободные радикалы в биологических системах // Соросовский образовательный журнал. - 2000. - №12, т.6. - С.16), наибольший вред здоровью приносят свободные ОН радикалы, т.к. «в нуклеиновых кислотах ОН разрушает углеводные мостики между нуклеотидами и, таким образом, разрывает цепи ДНК и РНК, в результате чего происходят мутации и гибель клеток. Таким образом, радикал ОН - это радикал-разрушитель, радикал-убийца».
.
Основным техническим результатом предложенного изобретения является повышение чувствительности способа определения активности антиоксидантов в 277 раз. Кроме того, предлагаемый способ позволяет измерять активность антиоксидантов по отношению к наиболее опасным для организма ОН радикалам.
.
Указанный технический результат достигается тем, что в предлагаемом вольтамперометрическом способе определения активности антиоксидантов, включающем использование модельной реакции в процессе восстановления вещества на электроде в растворе фонового электролита, регистрацию катодных волн восстановления вещества в заданном интервале потенциалов относительно насыщенного хлорид-серебряного электрода сравнения, добавление антиоксиданта и определение антиоксидантной активности по относительному изменению тока электровосстановления, согласно предложенному решению, в качестве модельной реакции используют реакцию, генерирующую ОН радикалы, а регистрацию катодных волн ведут в интервале потенциалов -1,2÷-1,9 В.
2
4
4
2
3
2
2
2
.
2+
2+
2+
2-
2+
.
.
.
В предлагаемом способе определения активности антиоксидантов используют метод вольтамперометрии. Измерение вольтамперных зависимостей восстановления вещества проводят с помощью вольтамперометрического анализатора или полярографа любого типа, который подключают к электрохимической ячейке. Электрохимическая ячейка состоит из емкости, в которую наливают фоновый раствор электролита и опускают два электрода - рабочий и электрод сравнения. В качестве фоновых растворов используют хорошо проводящие водные растворы сильных электролитов: KCl, NaSO, ацетатный или цитратный буферы, а также неводные растворы спиртов, в частности этиленгликоль с добавкой тетраалкиламмония бромида (ТААБ) для электропроводности. В качестве электродов используют хлорид-серебряный электрод сравнения, в качестве рабочего - электрод, инертный в рабочей области потенциалов -1,2÷-1,9 В, например, ртутный пленочный, ртутный сферический, пленочный висмутовый и пленочный свинцовый на графитовых подложках. Как правило, используют ртутный пленочный электрод на серебряной подложке. Подготовленные электроды подключают к анализатору, опускают в электрохимическую ячейку с 10-20 мл фонового раствора и записывают вольтамперограмму фона. Затем проводят модельную реакцию, генерирующую ОН радикалы, с помощью одной из модельных систем: Fe-ЭДТА, Cu-ЭДТА, Fe-HPO , NaSO-O и Fe-HO (реакция Фентона). Методика эксперимента заключается в измерении вольтамперометрических зависимостей катодного тока электровосстановления в области потенциалов -1,2÷-1,9 В. При проведении в фоновом растворе электролита модельной реакции, генерирующей ОН радикалы, на вольтамперограммах появляется новая катодная волна, предположительно ОН радикала. При используемых скоростях развертки катодная волна имеет форму пика с максимумом -1,4÷-1,6 В в зависимости от фона. Затем в фоновый раствор электролита добавляют навеску растворимого антиоксиданта или измеренный объем его раствора известной концентрации и повторно измеряют вольтамперометрическую зависимость. При этом величина новой катодной волны, предположительно ОН радикала, уменьшается пропорционально количеству добавленного антиоксиданта.
.
0
Оценку антиоксидантной способности (К) проводят, сравнивая высоту катодной волны, предположительно ОН радикала, до (I, мкА) и после (It, мкА) внесения антиоксиданта по формуле:
-1
0
0
К=X/C·V, г, где Х=(I-It)/I, С - концентрация вносимого раствора антиоксиданта, г/мл, V - объем вносимого раствора антиоксиданта, мл.
Пример конкретного выполнения 1.
Подготавливают прибор - вольтамперометрический анализатор типа СТА-1 (производства ООО «ИТМ», г.Томск), совмещенный с компьютером, к работе. Для этого устанавливают вид полярографии: постояннотоковая, скорость развертки потенциала 50 мВ/с, начальный потенциал - 0 В, конец развертки потенциала -1,9 В. Развертка в катодную область от 0 до -1,9 В. В качестве рабочего электрода применяют ртутно-пленочный, а в качестве электрода сравнения - хлорид-серебряный.
2
4
4
4
4
2
2
2
.
2+
.
.
При осуществлении способа в стеклянный стаканчик (электрохимическую ячейку) наливают 10 мл раствора фонового электролита, а именно 0,1 М NaSO, в него опускают электроды и подключают к прибору. После этого записывают вольтамперограмму (фиг.1) в фоновом растворе в указанной области потенциалов, регистрируя катодные волны кислорода и пероксида водорода (Скуг Д., Уэст Д. Основы аналитической химии / Пер. с англ. под ред. Ю.А.Золотова. - М.: Мир, 1979. - С.69). Затем проводят модельную реакцию, генерирующую ОН радикалы, с помощью модельной системы Fe-ЭДТА. Для этого дозатором вносят в ячейку 0,03 мл 0,01М раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и 0,025 мл 0,01 М раствора соли Мора - FeSO·(NH)2SO·6HO. Перемешивают раствор путем вибрации электродов в течение 5 с. При этом, согласно (X.F.Yang, X.Q.Guo. Fe(II)-EDTA Chelate-Induced Aromatic Hydroxylation of Terephtalate as a New Method for the Evalution of Hydroxil Radical-Scavenging Ability // The Analist. - 2001. - #126. - P.926-932), генерация ОН радикалов протекает из кислорода при участии комплексов железа (II) с ЭДТА. После успокоения раствора в течение 5 с записывают вольтамперограмму и регистрируют исчезновение катодной волны НО, и появление новой катодной волны, возможно ОН радикала, в интервале потенциалов -1,3÷-1,8 В, с максимумом при -1,52 В (фиг.2). Затем добавляют в электрохимическую ячейку 0,045 мл раствора, содержащего 45 мкг антиоксиданта - аскорбиновой кислоты и перемешивают. Далее записывают вольтамперограмму и регистрируют при этом уменьшение катодной волны при -1,52 В и сдвиг ее на 20 мВ в положительную область, т.е. при -1,50 В (фиг.3). Оценивают высоту катодных волн при -1,52÷-1,50 В до (Iо, мкА) и после (It, мкА) внесения антиоксиданта и рассчитывают активность антиоксиданта по формуле:
-1
K=X/C·V, г,
0
0
где Х=(I-It)/I, С - концентрация вносимого раствора антиоксиданта, г/мл, V - объем вносимого раствора антиоксиданта, мл.
-3
Х=(4,41-2,46)/4,4=0,44, С=1·10 г/мл, V=0,045 мл,
-3
3
-1
K=0,44/1·10·0,045=9,8·10 г.
2+
2
4
С помощью модельной системы Fe-ЭДТА на фоне 0,1 М NaSO определяют также антиоксидантную активность других антиоксидантов: сульфита натрия и глюкозы, а на фоне 0,1 М KCl определяют активность аскорбиновой кислоты, сульфита натрия, пирогаллола, пирокатехина и резорцина (см. табл.1). Полученные значения АОА для аскорбиновой кислоты, пирогаллола, пирокатехина и резорцина удовлетворительно коррелируют со способом-прототипом.
2
4
Аналогичные результаты были получены при различных концентрациях раствора фонового электролита NaSO: 0,2 M, 0,5 М и 1 М.
Пример конкретного выполнения 2.
Подготавливают прибор к работе так, как описано в примере 1.
2
2
4
2
2
2
0
.
2+
.
.
В электрохимическую ячейку наливают 10 мл раствора фонового электролита, а именно 0,1 М KCl, в него опускают электроды и подключают к прибору. После этого записывают вольтамперограмму в фоновом растворе, регистрируя катодные волны кислорода и НО (фиг.4, кривая 1). Затем проводят модельную реакцию, генерирующую ОН радикалы, с помощью модельной системы Cu-ЭДТА. Для этого дозатором вносят в ячейку 0,03 мл 0,01М раствора ЭДТА и 0,025 мл 0,01М раствора соли меди - CuSO·5HO. Перемешивают раствор в течение 5 с. При этом генерация ОН радикалов протекает из кислорода при участии комплексов меди с ЭДТА (Christelle Hureau, Peter Faller. Aβ-mediated ROS production by Cu ions: Structural insights, mechanisms and relevance to Alzheimer's disease // Biochimie. - 2009. - V.91, Issue 10. - P.1212-1217). После успокоения раствора в течение 5 с записывают вольтамперограмму и регистрируют исчезновение катодной волны НO, и появление новой катодной волны, возможно ОН радикала, в интервале потенциалов -1,2÷-1,7 В с максимумом при -1,48 В (фиг.4, кривая 2). Затем добавляют в электрохимическую ячейку 0,06 мл раствора, содержащего 60 мкг антиоксиданта - аскорбиновой кислоты, и перемешивают. Записывают вольтамперограмму и регистрируют при этом уменьшение и сдвиг катодной волны при -1,45 В (фиг.4, кривая 3). Оценивают высоту катодных волн при -1,48÷-1,45 В до (I) и после (It) внесения антиоксиданта и рассчитывают активность антиоксиданта К по формуле, приведенной в примере 1:
-3
3
-1
K=X/C·V=(4,49-2,62)/4,49/1·10·0,06=6,9·10 г.
+2
2
4
С помощью модельной системы Cu-ЭДТА определяют также активность аскорбиновой кислоты на другом фоне - 0,1 М NaSO (см. табл.1).
Таблица 1
№ образца
Фоновый раствор
Модельная система
Антиоксидант
Антиоксид. активность, К·10<sup>3</sup>, г<sup>-1</sup>
Интервал потенциалов регистрации катодных волн, В
1
2
3
4
5
6
1
Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
Fe<sup>2+</sup>-ЭДТА
Аскорбиновая кислота
9,80
-1,3÷-1,8
2
Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
Fe<sup>2+</sup>-ЭДТА
Глюкоза
0,51
-1,3÷-1,8
3
Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
Fe<sup>2+</sup>-ЭДТА
Сульфит натрия
2,05
-1,3÷-1,8
4
Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
Cu<sup>2+</sup>-ЭДТА
Аскорбиновая кислота
7,15
-1,3÷-1,75
5
KCl
Cu<sup>2+</sup>-ЭДТА
Аскорбиновая кислота
6,90
-1,2÷-1,7
6
KCl
Fe<sup>2+</sup>-ЭДТА
Пирокатехин
0,21
-1,2÷-1,7
7
KCl
Fe<sup>2+</sup>-ЭДТА
Аскорбиновая кислота
8,20
-1,2÷-1,7
8
KCl
Fe<sup>2+</sup>-ЭДТА
Сульфит натрия
1,73
-1,2÷-1,7
9
KCl
Fe<sup>2+</sup>-ЭДТА
Резорцин
0,13
-1,3÷-1,7
10
KCl
Fe<sup>2+</sup>-НРО<sub>4</sub> <sup>2-</sup>
Аскорбиновая кислота
4,09
-1,3÷-1,65
11
KCl
Fe<sup>2+</sup>-H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
Аскорбиновая кислота
5,48
-1,3÷-1,7
12
KCl
Na<sub>2</sub>SO<sub>3</sub>-O<sub>2</sub>
Аскорбиновая кислота
8,56
-1,2÷-1,65
13
Ацетатный буфер
Fe<sup>2+</sup>-ЭДТА
Аскорбиновая кислота
9,70
-1,4÷-1,85
14
Этиленгликоль с ТААБ
Fe<sup>2+</sup>-ЭДТА
Аскорбиновая кислота
4,30
-1,2÷-1,9
15
Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
Fe<sup>2+</sup>-ЭДТА
Этиловый спирт
0,007
-1,2÷-1,7
16
Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
Fe<sup>2+</sup>-ЭДТА
Пирогаллол
1,13
-1,3÷-1,7
Аналогичные результаты по измерению активности аскорбиновой кислоты получают при использовании других рабочих электродов: ртутного сферического электрода, пленочного висмутового и пленочного свинцового на графитовых подложках, а также в апротонной среде при использовании неводного электролита - этиленгликоля с добавкой 0,1 М тетраалкиламмония бромида (см. табл.1).
.
2+
2+
2-
2
2
4
2
3
2
В табл.1 представлены также результаты по определению антиоксидантной активности аскорбиновой кислоты на фоне КСl с использованием модельных реакций, генерирующих ОН радикалы, с помощью других модельных систем: Fe-НО, Fe-HPO  и NaSO-O.
Из табл.1 следует, что заявляемый интервал потенциалов регистрации катодных волн -1,2÷-1,9 В.
2+
2
4
С помощью модельной системы Fe-ЭДТА на фоне 0,1 М NaSO предлагаемым способом определяют также антиоксидантную активность водных экстрактов продуктов природного происхождения - чеснока, мандарина и яблока (см. табл.2).
Таблица 2
№ образца
Фоновый раствор
Модельная система
Антиоксидант
Антиоксидантная активность, К, г<sup>-1</sup>
Интервал потенциалов регистрации катодных волн, В
1
2
3
4
5
6
1
Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
Fe<sup>2+</sup>-ЭДТА
Чеснок
16,62
-1,3÷-1,8
2
Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
Fe<sup>2+</sup>-ЭДТА
Мандарин
9,59
-1,3÷-1,8
3
Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
Fe<sup>2+</sup>-ЭДТА
Яблоко
6,20
-1,3÷-1,8
Пример конкретного выполнения 3.
Определение чувствительности способа.
.
0
min
cp
Чувствительность предлагаемого способа определения активности антиоксидантов рассчитывают с помощью критерия Зайделя (А.Н.Зайдель. Основы спектрального анализа. - М.: Наука. - 1965). При этом аналитическим сигналом является разность ΔI, мкА между значениями тока пика ОН радикала до (I) внесения антиоксиданта и после (It) внесения определенной концентрации С, мг/л антиоксиданта. Сначала находят среднеквадратичное отклонение σi при определении ΔI в 3-х параллельных опытах (в 3-х ячейках) при одинаковой добавке антиоксиданта. Затем строят график в координатах ΔI-С (фиг.5 и 6). Определяют тангенс угла наклона прямой и подставляют в формулу: C=2σi·C/ΔI.Таким образом рассчитывают минимальную концентрацию антиоксиданта (предел обнаружения), при которой можно заметить уменьшение пика.
Нами был рассчитан предел обнаружения способа-прототипа. Для этого была измерена величина ΔI - снижение пика кислорода от добавок аскорбиновой кислоты, построен график в координатах ΔI-С (фиг.5) и рассчитан предел обнаружения по критерию Зайделя. Для способа прототипа он равен:
min
C=2·0,078·400/0,623=100,2 (мг/л).
Для предлагаемого способа предел обнаружения, рассчитанный с помощью графика (фиг.6), равен:
min
C=2·0,069·3.15/1.194=0,36 (мг/л).
.
Таким образом, из фиг.5 и 6, а также из расчетов на примере аскорбиновой кислоты следует, что чувствительность предлагаемого вольтамперометрического способа определения активности антиоксиданта в 277 раз выше чувствительности способа-прототипа. Кроме того, как видно из примеров 1 и 2, предлагаемый способ позволяет определить активность антиоксидантов по отношению к ОН радикалам.