ЭКСТРАКЦИЯ АЛКАНОВЫХ КИСЛОТ
ALKANE ACID EXTRACTION

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу экстрагирования алкановой кислоты и/или ее сложного эфира из водной среды. В частности, в способе применяют смесь по меньшей мере одного алкилфосфиноксида, предпочтительно триоктилфосфиноксида (TOPO), и по меньшей мере одного алкана.
Уровень техники изобретения
Алкановые кислоты представляют собой карбоновые кислоты, в которых атом кислорода (=O) замещен двумя атомами водорода в соответствующем алкане, и функциональная группа OH замещена другим атомом H при том же атоме углерода. Алкановые кислоты характеризуются в данной области техники несколькими функциями. Например, их можно применять при получении полимеров, фармацевтических веществ, растворителей и пищевых добавок.
Хорошо известный способ получения и экстрагирования алкановых кислот предусматривает гидролиз и декарбоксилирование малоновых сложных эфиров. Малоновый сложный эфир подвергают омылению с помощью водного раствора гидроксида натрия, что приводит к образованию водного раствора динатриевой соли и этанола. Солевой раствор затем обрабатывают сильной минеральной кислотой с получением натриевой соли минеральной кислоты и с осаждением дикарбоновой кислоты в виде твердого вещества. Для последующего выделения дикарбоновой кислоты применяют простые процедуры разделения, такие как фильтрация или экстракция. Натриевую соль отбрасывают в виде отходов. Выделенную кислоту дополнительно высушивают и нагревают до температуры, достаточной для обеспечения прохождения реакции декарбоксилирования. Данная процедура является длительной, требует многочисленных стадий, в результате ее осуществления образуются отходы, и она является трудоемкой в отношении оборудования.
Другой способ экстрагирования алкановых кислот, таких как муравьиная, уксусная, пропионовая, молочная, янтарная и лимонная кислоты, представляет собой экстракцию с высаливанием. В данном способе применяют систему, состоящую из этанола и сульфата аммония. Параметры системы, влияющие на эффективность экстракции, включают длину линии, соотношение фазовых объемов, концентрацию кислоты, температуру, pH системы и т. п. Хотя показано, что эффективность экстракции алкановых кислот повышалась с применением данного способа, различные вовлеченные параметры делают способ слишком сложным для промышленного применения.
В CA1167051 раскрыт способ экстрагирования или извлечения некоторых карбоновых кислот, таких как уксусная кислота и муравьиная кислота. Однако, способ требует применения высоких значений температуры и специального оборудования для стадий противоточного теплообмена.
Соответственно, в данной области техники существует необходимость в более дешевом и более эффективном способе экстракции для экстрагирования алкановых кислот, в частности алкановых кислот, полученных в промышленном масштабе. Кроме того, существует необходимость в способе экстракции алкановых кислот, который можно применять вместе с биотехнологическим способом получения алкановых кислот.
Описание изобретения
В настоящем изобретении предпринята попытка решить указанные выше проблемы путем обеспечения способов экстрагирования алкановых кислот и/или их сложного эфира, которые являются более эффективными и более дешевыми, нежели современные способы, доступные из уровня техники. Настоящее изобретение также предусматривает способы экстрагирования алкановых кислот и/или их сложного эфира, которые можно применять в сочетании с биотехнологическим способом получения алкановых кислот и/или их сложного эфира.
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения предусмотрен способ экстрагирования алкановой кислоты и/или ее сложного эфира из водной среды, при этом способ включает
(a) приведение алкановой кислоты и/или ее сложного эфира в водной среде в контакт с по меньшей мере одним экстрагентом на протяжении времени, достаточного для экстрагирования алкановой кислоты и/или ее сложного эфира из водной среды в экстрагент,
(b) отделение экстрагента с экстрагированной алкановой кислотой и/или ее сложным эфиром от водной среды,
где экстрагент предусматривает
- смесь по меньшей мере одного алкилфосфиноксида, предпочтительно триоктилфосфиноксида (TOPO), и по меньшей мере одного алкана, где алкан содержит по меньшей мере 12 атомов углерода.
В частности, способ экстракции согласно любому аспекту настоящего изобретения предусматривает увеличение выхода относительно количества используемых экстрагирующих веществ. Например, менее 50% по весу экстрагента можно применять для экстрагирования того же количества алкановых кислот и/или их сложного эфира, как если бы применяли только чистые алканы. Следовательно, с малым объемом экстрагента можно экстрагировать больший выход алкановых кислот и/или их сложных эфиров. Экстрагент также не является пагубным для микроорганизмов. Соответственно, экстрагент согласно любому аспекту настоящего изобретения может присутствовать при получении алкановой кислоты и/или ее сложного эфира биотехнологическим путем. Кроме того, по меньшей мере в тех случаях, когда алкановая кислота представляет собой гексановую кислоту, она легко может быть отделена от экстрагента согласно любому аспекту настоящего изобретения путем перегонки. Причина состоит в том, что гексановая кислота минимально подвергается перегонке при значительно более низкой точке кипения, нежели экстрагент, и после отделения посредством перегонки экстрагент легко можно рециклировать.
Способ согласно любому аспекту настоящего изобретения может представлять собой способ экстрагирования по меньшей мере одной выделенной алкановой кислоты и/или ее сложного эфира из водной среды. Выделенная алкановая кислота и/или ее сложный эфир могут относиться к по меньшей мере одной алкановой кислоте и/или ее сложному эфиру, которые можно отделять от среды, в которой алкановая кислота и/или ее сложный эфир были получены. В одном примере алкановую кислоту и/или ее сложный эфир можно получать в водной среде (например, среде для ферментации, где алкановая кислота и/или ее сложный эфир продуцируются специфическими клетками из источника углерода). Выделенная алкановая кислота и/или ее сложный эфир могут относиться к алкановой кислоте и/или ее сложному эфиру, экстрагированным из водной среды. В частности, стадия экстрагирования предусматривает отделение избыточной воды от водной среды, что приводит, таким образом, к образованию смеси, содержащей экстрагированную алкановую кислоту и/или ее сложный эфир.
Экстрагент также можно называть «средой для экстракции». Среду для экстракции можно применять для экстрагирования/выделения алкановой кислоты и/или ее сложного эфира, полученных в соответствии с любым способом по настоящему изобретению из водной среды, в которой алкановая кислота и/или ее сложный эфир первоначально были получены. В конце стадии экстрагирования избыточную воду из водной среды можно удалять, с получением таким образом экстрагента, содержащего экстрагированную алкановую кислоту и/или ее сложный эфир. Экстрагент может предусматривать комбинацию соединений, которая может приводить к эффективным способам экстрагирования алкановой кислоты и/или ее сложного эфира из водной среды. В частности, экстрагент может содержать (i) по меньшей мере алкан, содержащий по меньшей мере 12 атомов углерода, и (ii) по меньшей мере одну молекулу алкилфосфиноксида. С помощью среды для экстракции согласно любому аспекту настоящего изобретения можно эффективно экстрагировать алкановую кислоту и/или ее сложный эфир в экстрагент, представляющий собой смесь алкана и алкилфосфиноксида. Данный экстрагент, предусматривающий смесь алкилфосфиноксида и по меньшей мере одного алкана, может считаться подходящим для способа согласно любому аспекту настоящего изобретения, поскольку смесь эффективно работает при экстрагировании необходимой алкановой кислоты и/или ее сложного эфира в присутствии среды для ферментации. В частности, смесь алкилфосфиноксида и по меньшей мере одного алкана может рассматриваться как действующая лучше, нежели любой в настоящее время известный из уровня техники способ экстракции алкановой кислоты и/или ее сложного эфира, поскольку она не требует любого специального оборудования для осуществления, и с ней относительно просто получать высокий выход продукта.
Алкан может содержать по меньшей мере 12 атомов углерода. В частности, алкан может содержать порядка 12-18 атомов углерода. В одном примере алкан может быть выбран из группы, состоящей из додекана, тридекана, тетрадекана, пентадекана, гексадекана, гептадекана и октадекана. В дополнительном примере экстрагент может предусматривать смесь алканов.
3
Алкилфосфиноксиды имеют общую формулу OPX, где X представляет собой алкил. Подходящие алкилфосфиноксиды согласно любому аспекту настоящего изобретения включают алкильную группу, состоящую из линейного, разветвленного или циклического углеводорода, при этом углеводород состоит из от 1 до приблизительно 100 атомов углерода и от 1 до приблизительно 200 атомов водорода. В частности, «алкил», используемый по отношению к алкилфосфиноксиду согласно любому аспекту настоящего изобретения, может относиться к углеводородной группе, имеющей от 1 до 20 атомов углерода, часто от 4 до 15 атомов углерода или от 6 до 12 атомов углерода, и которая может состоять из прямых цепей, циклических звеньев, разветвленных цепей или их смесей. Алкилфосфиноксид может иметь от одной до трех алкильных групп при каждом атоме фосфора. В одном примере алкилфосфиноксид имеет три алкильные группы при атоме P. В некоторых примерах алкильная группа может содержать атом кислорода вместо одного атома углерода алкильной группы C4-C15 или C6-C12, при условии, что атом кислорода не присоединен к атому P алкилфосфиноксида. Как правило, алкилфосфиноксид выбран из группы, состоящей из триоктилфосфиноксида, трибутилфосфиноксида, гексилфосфиноксида, октилфосфиноксида и их смесей.
8
17
3
Еще более конкретно алкилфосфиноксид может представлять собой триоктилфосфиноксид (TOPO). Триоктилфосфиноксид (TOPO) представляет собой фосфорорганическое соединение формулы OP(CH). По меньшей мере один алкилфосфиноксид, предпочтительно триоктилфосфиноксид (TOPO), может присутствовать в среде для экстракции вместе с по меньшей мере одним алканом. В частности, смесь по меньшей мере одного алкилфосфиноксида, предпочтительно триоктилфосфиноксида (TOPO), и алкана, содержащего по меньшей мере 12 атомов углерода, может предусматривать весовое соотношение, составляющее от приблизительно 1:100 до 1:10, по меньшей мере одного алкилфосфиноксида, предпочтительно триоктилфосфиноксида (TOPO), относительно алкана. Более конкретно весовое соотношение по меньшей мере одного алкилфосфиноксида, предпочтительно триоктилфосфиноксида (TOPO), и алкана в среде для экстракции согласно любому аспекту настоящего изобретения может составлять приблизительно 1:100, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1:50, 1:40, 1:30, 1:25, 1:20, 1:15 или 1:10. Еще более конкретно весовое соотношение по меньшей мере одного алкилфосфиноксида, предпочтительно триоктилфосфиноксида (TOPO), и алкана может быть выбрано в диапазоне от 1:90 до 1:10, от 1:80 до 1:10, от 1:70 до 1:10, от 1:60 до 1:10, от 1:50 до 1:10, от 1:40 до 1:10, от 1:30 до 1:10 или от 1:20 до 1:10. Весовое соотношение по меньшей мере одного алкилфосфиноксида, предпочтительно триоктилфосфиноксида (TOPO), и алкана может составлять от 1:40 до 1:15 или от 1:25 до 1:15. В одном примере весовое соотношение по меньшей мере одного алкилфосфиноксида, предпочтительно триоктилфосфиноксида (TOPO), и алкана может составлять приблизительно 1:15. В примере алкан может представлять собой гексадекан, и, следовательно, весовое соотношение по меньшей мере одного алкилфосфиноксида, предпочтительно триоктилфосфиноксида (TOPO), и гексадекана может составлять приблизительно 1:15.
Термин «приблизительно», используемый в данном документе, относится к изменениям в пределах 20 процентов. В частности, термин «приблизительно», используемый в данном документе, относится к +/- 20%, более конкретно +/-10%, еще более конкретно +/- 5% от данного измерения или значения.
На стадии (a) согласно любому аспекту настоящего изобретения алкановую кислоту и/или ее сложный эфир в водной среде можно приводить в контакт с экстрагентом на протяжении времени, достаточного для экстрагирования алкановой кислоты и/или ее сложного эфира из водной среды в экстрагент. Специалист в данной области техники может быть способен определить количество времени, необходимого для достижения равновесия распределения, и надлежащее скопление пузырьков, которое может понадобиться для оптимизации способа экстракции. В некоторых примерах необходимое время может зависеть от количества алкановой кислоты и/или ее сложного эфира, которое можно экстрагировать. В частности, время, необходимое для экстрагирования алкановой кислоты и/или ее сложного эфира из водной среды в экстрагент, может занимать только несколько минут. В примерах, в которых экстракцию проводят по мере прохождения ферментации, время для экстракции эквивалентно времени ферментации.
Соотношение применяемого экстрагента и количества алкановой кислоты и/или ее сложного эфира, подлежащих экстрагированию, может изменяться в зависимости от того, насколько быстро следует проводить экстракцию. В одном примере количество экстрагента равняется количеству водной среды, содержащей алкановую кислоту и/или ее сложный эфир. После стадии приведения экстрагента в контакт с водной средой две фазы (водную и органическую) разделяют с применением любых средств, известных из уровня техники. В одном примере две фазы можно разделять с применением разделительной воронки. Две фазы также можно разделять с применением смесителей-отстойников, пульсационных колонок и т. п. В одном примере, в котором алкановая кислота представляет собой гексановую кислоту, отделение экстрагента от гексановой кислоты можно проводить с применением перегонки с учетом того, что гексановая кислота подвергается перегонке при значительно более низкой точке кипения, нежели экстрагент. Специалист в данной области техники сможет выбрать наилучший способ отделения среды для экстракции от необходимой алкановой кислоты и/или ее сложного эфира на стадии (b) в зависимости от характеристик алкановой кислоты и/или ее сложного эфира, которые необходимо экстрагировать. В частности, стадия (b) согласно любому аспекту настоящего изобретения предусматривает извлечение алкановой кислоты из стадии (a). Приведение алкановой кислоты в контакт с органическим экстрагентом приводит к образованию двух фаз, две фазы (водную и органическую) разделяют с применением любых средств, известных из уровня техники. В одном примере две фазы можно разделять с применением разделительной воронки. Две фазы также можно разделять с применением смесителей-отстойников, пульсационных колонок, разделения по температуре и т. п. В одном примере, в котором алкановая кислота представляет собой гексановую кислоту, отделение экстрагента от гексановой кислоты можно проводить с применением перегонки с учетом того, что гексановая кислота подвергается перегонке при значительно более низкой точке кипения, нежели экстрагент. Специалист в данной области техники сможет выбрать наилучший способ отделения экстрагента от необходимой алкановой кислоты в зависимости от характеристик алкановой кислоты, которую необходимо извлечь.
Стадия (b) предпочтительно оканчивается органическим абсорбентом, доступным снова для рециклизации или повторного применения, предпочтительно на стадии (0) (см. ниже).
Алкановая кислота и/или ее сложный эфир могут быть выбраны из группы, состоящей из алкановых кислот с 2–16 атомами углерода. В частности, алкановая кислота может быть выбрана из группы, состоящей из этановой кислоты, пропионовой кислоты, бутановой кислоты, пентановой кислоты, гексановой кислоты, гептановой кислоты, октановой кислоты, нонановой кислоты, декановой кислоты, ундекановой кислоты, додекановой кислоты, тридекановой кислоты, миристиновой кислоты, пентадекановой кислоты и пальмитиновой кислоты. Более конкретно, алкановая кислота может быть выбрана из группы, состоящей из алкановых кислот с 4–16, 4–14, 4–12, 4–10, 5–16, 5–14, 5–12, 5–10, 6–16, 6–14, 6–12 или 6–10 атомами углерода. Еще более конкретно, алкановая кислота представляет собой гексановую кислоту.
Сложноэфирная часть сложного эфира алкановой кислоты предпочтительно выбрана из группы, состоящей из метила, этила, изопропила, пропила, и изобутила, и бутила.
В некоторых примерах микроорганизмы, способные продуцировать алкановую кислоту и/или ее сложный эфир, можно культивировать с любыми культуральной средой, субстратами, условиями и способами, в общем известными из уровня техники для культивирования бактерий. Это обеспечивает получение алкановой кислоты и/или ее сложного эфира с применением биотехнологического способа. В зависимости от микроорганизма, который применяют для получения алкановой кислоты и/или ее сложного эфира, изменяются подходящие среда для роста, значение pH, температура, скорость перемешивания, уровень инокулята и/или аэробные, микроаэробные или анаэробные условия. Специалист в данной области техники узнает другие условия, необходимые для осуществления способа согласно любому аспекту настоящего изобретения. В частности, условия в контейнере (например, ферментере) можно изменять в зависимости от применяемых микроорганизмов. Изменение условий таким образом, чтобы они подходили для оптимального функционирования микроорганизмов, находится в пределах знаний специалиста в данной области техники.
В одном примере способ согласно любому аспекту настоящего изобретения можно осуществлять в водной среде со значением pH от 5 до 8 или от 5,5 до 7. Давление может составлять от 1 до 10 бар. Микроорганизмы можно культивировать при температуре, находящейся в диапазоне от приблизительно 20°C до приблизительно 80°C. В одном примере микроорганизм можно культивировать при 37°C.
В некоторых примерах для роста микроорганизма и для продуцирования им алкановой кислоты и/или ее сложного эфира, водная среда может содержать любые питательные вещества, ингредиенты и/или добавки, подходящие для выращивания микроорганизма или для стимулирования продуцирования алкановой кислоты и/или ее сложного эфира. В частности, водная среда может содержать по меньшей мере одно из следующего: источников углерода, источников азота, таких как аммонийная соль, дрожжевой экстракт или пептон; минералов; солей; кофакторов; буферных средств; витаминов и любых других компонентов и/или экстрактов, которые могут стимулировать рост бактерий. Подлежащая применению культуральная среда должна соответствовать требованиям конкретных штаммов. Описания культуральных сред для различных микроорганизмов приведено в «Manual of Methods for General Bacteriology».
Соответственно, способ экстракции алкановой кислоты и/или ее сложного эфира согласно любому аспекту настоящего изобретения можно применять вместе с любым биотехнологическим способом получения алкановой кислоты и/или ее сложного эфира. Это особенно преимущественно поскольку, как правило, во время процесса ферментации с получением алкановой кислоты и/или ее сложного эфира с применением биологических способов, алкановую кислоту и/или ее сложный эфир будут оставлять для сбора в водной среде, и после достижения определенных значений концентрации в среде для ферментации как раз целевой продукт (алкановые кислоты и/или их сложный эфир) может подавлять активность и продуктивность микроорганизма. Таким образом, это ограничивает общий выход процесса ферментации. При применении данного способа экстракции алкановые кислоты и/или их сложный эфир экстрагируют по мере их продуцирования, таким образом снижая существенно ингибирование конечным продуктом.
Способ согласно любому аспекту настоящего изобретения также является более эффективным и сокращающим затраты, чем традиционные способы удаления алкановых кислот и/или их сложного эфира, в частности, из способа ферментации по мере их продуцирования, поскольку не существует первичного упора на перегонку и/или осаждение с извлечением алкановых кислот и/или их сложного эфира. Способ перегонки или осаждения может приводить к более высоким производственным затратам, более низкому выходу и более высокой степени образования отходов производства, следовательно снижая общую эффективность способа. С помощью способа согласно любому аспекту настоящего изобретения предпринимают попытки преодолеть эти недостатки.
В одном примере алкановая кислота представляет собой гексановую кислоту. В данном примере гексановую кислоту можно получать из синтез-газа.
Синтез-газ можно превращать в гексановую кислоту в присутствии по меньшей мере одного вида ацетогенной бактерии и/или окисляющей водород бактерии. В частности, можно применять любой способ, известный из уровня техники. Гексановую кислоту можно получать из синтез-газа с помощью по меньшей мере одного рода прокариот. В частности, род прокариот может быть выбран из группы, состоящей из рода Escherichia, такого как Escherichia coli; из рода Clostridia, такого как Clostridium ljungdahlii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium carboxidivorans или Clostridium kluyveri; из рода Corynebacteria, такого как Corynebacterium glutamicum; из рода Cupriavidus, такого как Cupriavidus necator или Cupriavidus metallidurans; из рода Pseudomonas, такого как Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida или Pseudomonas oleavorans; из рода Delftia, такого как Delftia acidovorans; из рода Bacillus, такого как Bacillus subtillis; из рода Lactobacillus, такого как Lactobacillus delbrueckii; или из рода Lactococcus, такого как Lactococcus lactis.
В другом примере гексановую кислоту можно получать из синтез-газа с помощью по меньшей мере одного рода эукариот. Род эукариот, применяемый в способе по настоящему изобретению, может быть выбран из рода Aspergillus, такого как Aspergillus niger; из рода Saccharomyces, такого как Saccharomyces cerevisiae; из рода Pichia, такого как Pichia pastoris; из рода Yarrowia, такого как Yarrowia lipolytica; из рода Issatchenkia, такого как Issatchenkia orientalis; из рода Debaryomyces, такого как Debaryomyces hansenii; из рода Arxula, такого как Arxula adenoinivorans; или из рода Kluyveromyces, такого как Kluyveromyces lactis.
Более конкретно, гексановую кислоту можно получать из синтез-газа с помощью любого способа, раскрытого в Steinbusch, 2011, Zhang, 2013, Van Eerten-Jansen, M. C. A. A, 2013, Ding H. et al, 2010, Barker H.A., 1949, Stadtman E.R., 1950, Bornstein B. T., et al., 1948 и т. п. Еще более конкретно, гексановую кислоту можно получать из синтез-газа в присутствии по меньшей мере Clostridium kluyveri.
2
Термин «ацетогенные бактерии», используемый в данном документе, относится к микроорганизму, который способен осуществлять путь Вуда-Льюнгдаля и, таким образом, способен превращать CO, CO и/или водород в ацетат. Эти микроорганизмы включают микроорганизмы, которые в их форме дикого типа не осуществляют путь Вуда-Льюнгдаля, но приобрели этот признак в результате генетической модификации. Такие микроорганизмы включают без ограничения клетки E. coli. Эти микроорганизмы также могут быть известны как карбоксидотрофные бактерии. В настоящее время, из уровня техники известен 21 род различных ацетогенных бактерий (Drake et al., 2006), и они также могут включать некоторые Clostridia (Drake & Kusel, 2005). Эти бактерии способны использовать диоксид углерода или монооксид углерода в качестве источника углерода с водородом в качестве источника энергии (Wood, 1991). Кроме того, спирты, альдегиды, карбоновые кислоты, а также многочисленные гексозы также могут быть применены в качестве источника углерода (Drake et al., 2004). Восстановительный путь, который ведет к образованию ацетата, называется путем ацетил-CoA или Вуда-Льюнгдаля. В частности, ацетогенные бактерии могут быть выбраны из группы, состоящей из Acetoanaerobium notera (ATCC 35199), Acetonema longum (DSM 6540), Acetobacterium carbinolicum (DSM 2925), Acetobacterium malicum (DSM 4132), вида Acetobacterium № 446 (Morinaga et al., 1990, J. Biotechnol., Vol. 14, p. 187-194), Acetobacterium wieringae (DSM 1911), Acetobacterium woodii (DSM 1030), Alkalibaculum bacchi (DSM 22112), Archaeoglobus fulgidus (DSM 4304), Blautia producta (DSM 2950, ранее Ruminococcus productus, ранее Peptostreptococcus productus), Butyribacterium methylotrophicum (DSM 3468), Clostridium aceticum (DSM 1496), Clostridium autoethanogenum (DSM 10061, DSM 19630 и DSM 23693), Clostridium carboxidivorans (DSM 15243), Clostridium coskatii (ATCC № PTA-10522), Clostridium drakei (ATCC BA-623), Clostridium formicoaceticum (DSM 92), Clostridium glycolicum (DSM 1288), Clostridium ljungdahlii (DSM 13528), Clostridium ljungdahlii C-01 (ATCC 55988), Clostridium ljungdahlii ERI-2 (ATCC 55380), Clostridium ljungdahlii O-52 (ATCC 55989), Clostridium mayombei (DSM 6539), Clostridium methoxybenzovorans (DSM 12182), Clostridium ragsdalei (DSM 15248), Clostridium scatologenes (DSM 757), Clostridium species ATCC 29797 (Schmidt et al., 1986, Chem. Eng. Commun., Vol. 45, p. 61-73), Desulfotomaculum kuznetsovii (DSM 6115), Desulfotomaculum thermobezoicum подвида thermosyntrophicum (DSM 14055), Eubacterium limosum (DSM 20543), Methanosarcina acetivorans C2A (DSM 2834), Moorella sp. HUC22-1 (Sakai et al., 2004, Biotechnol. Let., Vol. 29, p. 1607-1612), Moorella thermoacetica (DSM 521, ранее Clostridium thermoaceticum), Moorella thermoautotrophica (DSM 1974), Oxobacter pfennigii (DSM 322), Sporomusa aerivorans (DSM 13326), Sporomusa ovata (DSM 2662), Sporomusa silvacetica (DSM 10669), Sporomusa sphaeroides (DSM 2875), Sporomusa termitida (DSM 4440) и Thermoanaerobacter kivui (DSM 2030, ранее Acetogenium kivui).
Более конкретно, можно применять штамм ATCC BAA-624 Clostridium carboxidivorans. Еще более конкретно, можно применять бактериальный штамм Clostridium carboxidivorans, помеченный «P7» и «P11», который описан, например, в U.S. 2007/0275447 и U.S. 2008/0057554.
Другим особенно подходящим видом бактерий может являться Clostridium ljungdahlii. В частности, штаммы, выбранные из группы, состоящей из Clostridium ljungdahlii PETC, Clostridium ljungdahlii ERI2, Clostridium ljungdahlii COL и Clostridium ljungdahlii O-52, могут быть использованы при превращении синтез-газа в гексановую кислоту. Эти штаммы, например, описаны в WO 98/00558, WO 00/68407, ATCC 49587, ATCC 55988 и ATCC 55989.
Ацетогенные бактерии можно применять совместно с окисляющими водород бактериями. В одном примере для получения гексановой кислоты из синтез-газа можно применять как ацетогенные бактерии, так и окисляющие водород бактерии. В другом примере для метаболизирования синтез-газа с получением гексановой кислоты из синтез-газа можно применять только ацетогенные бактерии. В еще другом примере в данной реакции можно применять исключительно окисляющие водород бактерии.
Окисляющие водород бактерии могут быть выбраны из группы, состоящей из Achromobacter, Acidithiobacillus, Acidovorax, Alcaligenes, Anabena, Aquifex, Arthrobacter, Azospirillum, Bacillus, Bradyrhizobium, Cupriavidus, Derxia, Helicobacter, Herbaspirillum, Hydrogenobacter, Hydrogenobaculum, Hydrogenophaga, Hydrogenophilus, Hydrogenothermus, Hydrogenovibrio, Ideonella sp. O1, Kyrpidia, Metallosphaera, Methanobrevibacter, Myobacterium, Nocardia, Oligotropha, Paracoccus, Pelomonas, Polaromonas, Pseudomonas, Pseudonocardia, Rhizobium, Rhodococcus, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Streptomyces, Thiocapsa, Treponema, Variovorax, Xanthobacter и Wautersia.
5
11
При получении гексановой кислоты из синтез-газа можно применять комбинацию бактерий. Может присутствовать более одного вида ацетогенных бактерий в комбинации с одним или несколькими видами окисляющих водород бактерий. В другом примере может присутствовать, тем не менее, более одного типа ацетогенных бактерий. В еще одном примере может присутствовать, тем не менее, более одного вида окисляющих водород бактерий. Гексановая кислота, также известная как капроновая кислота, характеризуется общей формулой CHCOOH.
В частности, способ получения гексановой кислоты может включать стадию:
- приведения синтез-газа в контакт с по меньшей мере одним видом бактерий, способных к осуществлению пути Вуда-Льюнгдаля и этанол-карбоксилатного ферментационного пути с получением гексановой кислоты.
Термин «приведение в контакт», используемый в данном документе, означает осуществление прямого контакта между алкановой кислотой и/или ее сложным эфиром в среде со средой для экстракции на стадии (a) и/или прямого контакта между микроорганизмом и синтез-газом. Например, клетка и среда, содержащая источник углерода, могут быть в различных отделениях. В частности, источник углерода может быть в газообразном состоянии и добавляться к среде, содержащей клетки согласно любому аспекту настоящего изобретения.
В одном примере получение гексановой кислоты из синтез-газа может предусматривать применение ацетогенных бактерий совместно с бактерией, способной к продуцированию гексановой кислоты с использованием этанол-карбоксилатного ферментационного пути окисляющих водород бактерий. В одном примере для получения гексановой кислоты из синтез-газа можно применять как ацетогенные бактерии, так и окисляющие водород бактерии. Например, Clostridium ljungdahlii можно применять одновременно с Clostridium kluyveri. В другом примере для метаболизирования синтез-газа с получением гексановой кислоты из синтез-газа можно применять только ацетогенные бактерии. В данном примере ацетогенные бактерии могут быть способны к осуществлению как этанол-карбоксилатного ферментационного пути, так и пути Вуда-Льюнгдаля. В одном примере ацетогенные бактерии могут представлять собой C. carboxidivorans, которые могут быть способны к осуществлению как пути Вуда-Льюнгдаля, так и этанол-карбоксилатного ферментационного пути.
Этанол-карбоксилатный ферментационный путь подробно описан в по меньшей мере Seedorf, H., et al., 2008. Организм может быть выбран из группы, состоящей из Clostridium kluyveri, C. carboxidivorans и т. п. Такие микроорганизмы включают микроорганизмы, которые в их форме дикого типа не осуществляют этанол-карбоксилатный ферментационный путь, но приобрели этот признак в результате генетической модификации. В частности, микроорганизм может представлять собой Clostridium kluyveri.
В одном примере бактерии, применяемые согласно любому аспекту настоящего изобретения, выбраны из группы, состоящей из Clostridium kluyveri и C. carboxidivorans.
2
В частности, клетки приводят в контакт с источником углерода, который включает моносахариды (такие как глюкоза, галактоза, фруктоза, ксилоза, арабиноза или ксилулоза), дисахариды (такие как лактоза или сахароза), олигосахариды и полисахариды (такие как крахмал или целлюлоза), субстраты с одним атомом углерода и/или их смеси. Более конкретно, клетки приводят в контакт с источником углерода, содержащим CO и/или CO, с получением алкановой кислоты и/или ее сложного эфира.
2
2
Применительно к источнику субстратов, содержащих диоксид углерода и/или монооксид углерода, специалист в данной области техники поймет, что существует множество возможных источников для обеспечения CO и/или CO в качестве источника углерода. Можно увидеть, что на практике в качестве источника углерода по настоящему изобретению можно применять любой газ или любую смесь газов, которые способны предоставить микроорганизмам достаточные количества углерода, так чтобы мог быть образован ацетат и/или этанол из источника CO и/или CO.
2
Как правило, для клетки по настоящему изобретению источник углерода предусматривает по меньшей мере 50% по весу, по меньшей мере 70% по весу, в частности по меньшей мере 90% по весу CO и/или CO, где доли в процентах по весу - % относятся ко всем источникам углерода, которые доступны для клетки согласно любому аспекту настоящего изобретения. Может быть предусмотрен источник, представляющий собой углеродный материал.
Примеры источников углерода в газообразных формах включают отработанные газы, такие как синтез-газ, топочный газ и газы от переработки нефтепродуктов, полученные при дрожжевой ферментации или ферментации с помощью клостридий. Эти отработанные газы образуются при газификации содержащих целлюлозу материалов или газификации угля. В одном примере эти отработанные газы не обязательно получают в виде побочных продуктов других процессов, но могут специально получать для применения со смешанной культурой по настоящему изобретению.
Согласно любому аспекту настоящего изобретения источником углерода может быть синтез-газ, в том числе для получения ацетата и/или этанола, применяемых на стадии (0) (см. ниже) согласно любому аспекту настоящего изобретения. Синтез-газ можно, например, получать в виде побочного продукта газификации угля. Соответственно, микроорганизм согласно любому аспекту настоящего изобретения может быть способен к превращению вещества, которое представляет собой отходы производства, в ценный ресурс.
В другом примере синтез-газ может быть побочным продуктом газификации широкодоступных, недорогих сельскохозяйственных сырьевых материалов для применения со смешанной культурой по настоящему изобретению с получением замещенных и незамещенных органических соединений.
Существуют многочисленные примеры сырьевых материалов, которые можно превращать в синтез-газ, поскольку почти все формы растительности могут быть использованы для этой цели. В частности, сырьевые материалы выбраны из группы, состоящей из многолетних трав, таких как мискантус, остатков кукурузы, отходов переработки, таких как опилки, и т. п.
2
2
2
2
В целом, синтез-газ можно получать в устройстве для газификации сухой биомассы в основном за счет пиролиза, частичного окисления и парового риформинга, где первичными продуктами синтез-газа являются CO, H и CO. Синтез-газ также может быть продуктом электролиза CO. Специалист в данной области техники узнает подходящие условия для проведения электролиза CO для получения синтез-газа, содержащего СО в требуемом количестве.
Как правило, часть синтез-газа, полученного в процессе газификации, сначала обрабатывают, чтобы оптимизировать значения выхода продукта и предотвратить образование смолы. Крекинг нежелательных смолы и CO в синтез-газе можно выполнять с использованием извести и/или доломита. Эти процессы подробно описаны, например, в Reed, 1981.
2
2
2
2
2
2
2
2
Общая эффективность, производительность по алкановой кислоте и/или ее сложному эфиру и/или общий захват углерода в способе по настоящему изобретению могут зависеть от стехиометрии CO, CO и H в непрерывном газовом потоке. Подводимые непрерывные газовые потоки могут состоять из CO и H. В частности, в непрерывном газовом потоке диапазон концентраций CO может составлять приблизительно 10–50%, в частности 3% по весу, и H будет в пределах от 44% до 84%, в частности от 64 до 66,04%, по весу. В другом примере непрерывный газовый поток также может предусматривать инертные газы, подобные N, вплоть до концентрации N, составляющей 50% по весу.
Смеси источников можно использовать в качестве источника углерода.
2
Согласно любому аспекту настоящего изобретения восстановитель, например водород, можно подавать вместе с источником углерода. В частности, этот водород можно подавать, когда подают и/или используют С и/или CO. В одном примере газообразный водород является частью синтез-газа, присутствующего согласно любому аспекту настоящего изобретения. В другом примере, где газообразного водорода в синтез-газе недостаточно для способа по настоящему изобретению, можно подавать дополнительный газообразный водород.
2
В одном примере алкановая кислота представляет собой гексановую кислоту. Более конкретно, источник углерода, содержащий CO и/или CO, контактирует с клетками в непрерывном газовом потоке. Еще более конкретно, непрерывный газовый поток содержит синтез-газ. Эти газы можно подавать, например, с применением отдельных сопел, которые открываются в водную среду, фритт, мембран внутри трубы подачи газа в водную среду и т. п.
Специалист в данной области техники поймет, что может быть необходимо контролировать состав и скорости потока струй через определенные промежутки времени. Контроль состава потока может быть достигнут путем изменения пропорций составляющих его струй для достижения целевого или требуемого состава. Состав и скорость потока смешанного потока можно контролировать любыми средствами, известными из уровня техники. В одном примере систему адаптируют для непрерывного контроля скоростей потока и составов по меньшей мере двух струй и объединения их для получения единой смешанной струи субстрата в непрерывном газовом потоке оптимального состава и средств для прохождения оптимизированного потока субстрата в ферментер.
Термин «водный раствор» или «среда» включает любой раствор, содержащий воду, в основном воду, в качестве растворителя, который можно применять для сохранения клетки согласно любому аспекту настоящего изобретения по меньшей мере временно в метаболически активном и/или жизнеспособном состоянии, и содержит, если такое необходимо, любые дополнительные субстраты. Специалисту в данной области техники известны способы получения многочисленных водных растворов, обычно называемых средами, которые можно применять для сохранения культуры и/или клеток, например LB-среда в случае E. coli, можно применять ATCC1754-среду в случае C. ljungdahlii. Преимущественным является применение в качестве водного раствора минимальной среды, т. е. среды с достаточно простым составом, которая содержит только минимальный набор солей и питательных веществ, необходимых для сохранения клетки в метаболически активном и/или жизнеспособном состоянии, в отличие от сложных сред, во избежание необязательных загрязнений продуктов нежелательными побочными продуктами. Например, в качестве минимальной среды можно применять среду M9. Клетки инкубируют с источником углерода достаточно долго для получения необходимого продукта. Например, в течение по меньшей мере 1, 2, 4, 5, 10 или 20 часов. Выбранная температура должна быть такой, чтобы клетки согласно любому аспекту настоящего изобретения оставались каталитически компетентными и/или метаболически активными, например от 10 до 42°C, предпочтительно от 30 до 40°C, в частности от 32 до 38°C в случае, если клетка представляет собой клетку C. ljungdahlii. Водная среда согласно любому аспекту настоящего изобретения также предусматривает среду, в которой получают алкановую кислоту и/или ее сложный эфир. В основном это относится к среде, в которой раствор содержит в основном воду. В одном примере водная среда, в которой клетки используют для получения алкановой кислоты и/или ее сложного эфира, представляет собой именно ту среду, которая контактирует со средой для экстракции с целью экстракции алкановой кислоты и/или ее сложного эфира.
В частности, смесь микроорганизма и источника углерода согласно любому аспекту настоящего изобретения можно применять в любом известном биореакторе или ферментере для осуществления любого аспекта настоящего изобретения. В одном примере полный способ согласно любому аспекту настоящего изобретения, который начинается с получения алкановой кислоты и/или ее сложного эфира и оканчивается экстракцией алкановой кислоты и/или ее сложного эфира, происходит в одном контейнере. Следовательно может не быть стадии разделения между стадией получения алкановой кислоты и/или ее сложного эфира и стадией экстрагирования алкановой кислоты и/или ее сложного эфира. Это сохраняет время и затраты. В частности, во время процесса ферментации микроорганизм можно выращивать в водной среде и в присутствии среды для экстракции. Таким образом, способ согласно любому аспекту настоящего изобретения предусматривает однореакторное устройство для получения алкановых кислот и/или их сложного эфира. Кроме того, поскольку алкановую кислоту и/или ее сложный эфир экстрагируют по мере продуцирования, никакого ингибирования конечным продуктом не происходит, что обеспечивает поддержание выхода алкановой кислоты и/или ее сложного эфира. Дополнительную стадию разделения можно проводить с удалением алкановой кислоты и/или ее сложного эфира. Можно применять любой способ разделения, известный из уровня техники, такой как с использованием воронки, колонки, перегонки и т. п. Оставшиеся экстрагент и/или клетки затем можно рециклировать.
В другом примере способ экстракции может происходить в качестве отдельной стадии и/или в другом реакторе. После осуществления ферментации, при которой уже получили необходимую алкановую кислоту и/или ее сложный эфир, подлежащие экстрагированию, экстрагент согласно любому аспекту настоящего изобретения можно добавлять к среде для ферментации или среду для ферментации можно добавлять в реактор, содержащий экстрагент. Затем можно экстрагировать необходимую алкановую кислоту и/или ее сложный эфир с помощью любого способа разделения, известного из уровня техники, такого как с использованием воронки, колонки, перегонки и т. п. Оставшийся экстрагент затем можно рециклировать.
Другое преимущество способа заключается в том, что экстрагент можно рециклировать. Следовательно, как только алкановую кислоту и/или ее сложный эфир отделяют от среды для экстракции, среду для экстракции можно рециклировать и повторно применять, снижая количество отходов.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предусмотрено применение смеси по меньшей мере одного алкилфосфиноксида, предпочтительно триоктилфосфиноксида (TOPO), и алкана для экстрагирования алкановой кислоты из водной среды, при этом алкан содержит по меньшей мере 12 атомов углерода. В частности, алкан может содержать от 12 до 18 атомов углерода. Более конкретно, алкан может представлять собой гексадекан. Еще более конкретно, алкановая кислота и/или ее сложный эфир выбраны из группы, состоящей из алкановых кислот с 4–16 атомами углерода. В одном примере алкановая кислота может представлять собой гексановую кислоту.
В предпочтительном способе в соответствии с настоящим изобретением этанол и/или ацетат применяют в качестве исходного материала.
С помощью такого предпочтительного способа в соответствии с настоящим изобретением экстрагируют алкановую кислоту и/или ее сложный эфир, полученные из этанола и/или ацетата, и он включает стадию (0) перед стадией (a):
(1) приведение этанола и/или ацетата в контакт с по меньшей мере одним видом микроорганизмов, способных к осуществлению удлинения углеродной цепи в водной среде с получением алкановой кислоты и/или ее сложного эфира из этанола и/или ацетата.
В соответствии с предпочтительным способом в соответствии с настоящим изобретением водную среду после стадии (b) разделения алкановой кислоты и/или ее сложного эфира, можно рециклировать обратно на стадию (0). Данная стадия рециклизации предусматривает рециклизацию и повторное применение микроорганизмов, поскольку экстрагент в соответствии с настоящим изобретением является нетоксичным для микроорганизмов. Данная стадия рециклизации водной среды в способе в соответствии с настоящим изобретением обладает дополнительным преимуществом обеспечения возможности подвергать остаток алкановой кислоты и/или ее сложного эфира, который не был экстрагирован в первую очередь со стадий (a) и (b) в первом цикле, экстрагированию в течение дополнительного времени или столько раз, сколько рециклируют водную среду.
Микроорганизм на (0), способный к осуществлению удлинения углеродной цепи с получением алкановой кислоты, может представлять собой любой организм, который может быть способен к удлинению углеродной цепи (см. Jeon et al. Biotechnol Biofuels (2016) 9:129). Путь удлинения углеродной цепи также раскрыт в Seedorf, H., et al., 2008. Микроорганизмы согласно любому аспекту настоящего изобретения также могут предусматривать микроорганизмы, которые в их форме дикого типа не способны к удлинению углеродной цепи, но приобрели этот признак в результате генетической модификации. В частности, вид микроорганизмов на (0) может быть выбран из группы, состоящей из Clostridium carboxidivorans, Clostridium kluyveri и C. pharus. В частности, микроорганизм согласно любому аспекту настоящего изобретения может представлять собой Clostridium kluyveri.
На стадии (0) согласно любому аспекту настоящего изобретения этанол и/или ацетат приводят в контакт с по меньшей мере одним видом микроорганизмов, способных к осуществлению удлинения углеродной цепи с получением алкановой кислоты и/или ее сложного эфира из этанола и/или ацетата. В одном примере источником углерода может быть этанол в комбинации с по меньшей мере одним другим источником углерода, выбранным из группы, состоящей из ацетата, пропионата, бутирата, изобутирата, валерата и гексаноата. В частности, источником углерода может быть этанол и ацетат. В другом примере источником углерода может быть комбинация пропионовой кислоты и этанола, ацетата и этанола, изомасляной кислоты и этанола или масляной кислоты и этанола. В одном примере углеродным субстратом может быть этанол сам по себе. В другом примере углеродным субстратом может быть ацетат сам по себе.
Источник ацетата и/или этанола может изменяться в зависимости от доступности. В одном примере этанол и/или ацетат может быть продуктом ферментации синтез-газа или любого углевода, известного из уровня техники. В частности, источник углерода для получения ацетата и/или этанола может быть выбран из группы, состоящей из спиртов, альдегидов, глюкозы, сахарозы, фруктозы, декстрозы, лактозы, ксилозы, пентозы, полиола, гексозы, этанола и синтез-газа. Смеси источников можно использовать в качестве источника углерода.
Еще более конкретно, источником углерода может быть синтез-газ. Синтез-газ можно превращать в этанол и/или ацетат в присутствии по меньшей мере одного вида ацетогенных бактерий.
В одном примере получение алкановой кислоты и/или ее сложного эфира из ацетата и/или этанола, который получен из синтез-газа, может предусматривать применение ацетогенных бактерий совместно с микроорганизмом, способным к удлинению углеродной цепи. Например, Clostridium ljungdahlii можно применять одновременно с Clostridium kluyveri. В другом примере одиночная клетка ацетогенных бактерий может быть способна к активности обоих организмов. Например, ацетогенные бактерии могут представлять собой C. carboxidivorans, которые могут быть способны к осуществлению как пути Вуда-Льюнгдаля, так и пути удлинения углеродной цепи.
Этанол и/или ацетат, применяемые на стадии (0) согласно любому аспекту настоящего изобретения, могут быть продуктом ферментации синтез-газа или могут быть получены с помощью других способов. Этанол и/или ацетат затем можно приводить в контакт с микроорганизмом на стадии (0).
Термин «приведение в контакт», используемый в данном документе, означает осуществление прямого контакта между микроорганизмом и этанолом и/или ацетатом. В одном примере этанол представляет собой источник углерода и приведение в контакт на стадии (0) предусматривает приведение этанола в контакт с микроорганизмом из стадии (0). Контакт может являться прямым контактом или непрямым, что может предусматривать отделение мембраной или т. п. клеток от этанола, или случаи, когда клетки и этанол могут содержаться в двух различных отделениях и т. д. Например, на стадии (a) алкановая кислота и/или ее сложный эфир и экстрагент могут быть в различных отделениях.
Согласно любому аспекту настоящего изобретения, где экстракцию проводят на стадии (a) по мере прохождения ферментации на стадии (0), время экстракции может быть эквивалентным времени ферментации.
Примеры
Вышеизложенное описывает предпочтительные варианты осуществления, которые, как будет понятно специалистам в данной области техники, могут подвергаться изменениям или модификациям при разработке, конструировании или эксплуатации без отклонения от объема формулы изобретения. Подразумевается, что эти изменения, например, охвачены объемом формулы изобретения.
Пример 1
Получение с помощью Clostridium kluyveri масляной кислоты из ацетата и этанола
Для биологического превращения этанола и ацетата в масляную кислоту применяли бактерию Clostridium kluyveri. Все стадии культивирования проводили в анаэробных условиях в устойчивых к давлению стеклянных колбах, которые можно герметично закрывать пробкой из бутилкаучука.
2
4
2
4
4
4
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
4
2
2
3
2
2
4
2
2
3
2
2
2
600 нм
Для получения предварительной культуры 100 мл среды DMSZ52 (pH = 7,0; 10 г/л K-ацетата, 0,31 г/л KHPO, 0,23 г/л KHPO, 0,25 г/л NHCl, 0,20 г/л MgSO x 7HO, 1 г/л дрожжевого экстракта, 0,50 мг/л резазурина, 10 мкл/л HCl (25%, 7,7 M), 1,5 мг/л FeCl x 4HO, 70 мкг/л ZnCl x 7HO, 100 мкг/л MnCl x 4HO, 6 мкг/л HBO, 190 мкг/л CoCl x 6HO, 2 мкг/л CuCl x 6HO, 24 мкг/л NiCl x 6HO, 36 мкг/л NaMO x 2HO, 0,5 мг/л NaOH, 3 мкг/л NaSeO x 5HO, 4 мкг/л NaWO x 2HO, 100 мкг/л витамина B12, 80 мкг/л п-аминобензойной кислоты, 20 мкг/л D(+)-биотина, 200 мкг/л никотиновой кислоты, 100 мкг/л D-Ca-пантотената, 300 мкг/л гидрохлорида пиридоксина, 200 мкг/л тиамин-HCl x 2HO, 20 мл/л этанола, 2,5 г/л NaHCO, 0,25 г/л цистеин-HCl x HO, 0,25 г/л NaS x 9HO) в колбе объемом 250 мл инокулировали 5 мл замороженной криокультуры Clostridium kluyveri и инкубировали при 37°C в течение 144 ч. до OD > 0,2.
600 нм
600 нм
Для получения основной культуры 200 мл свежей среды DMSZ52 в колбе объемом 500 мл инокулировали подвергнутыми центрифугированию клетками из предварительной культуры до OD, составляющей 0,1. Данную растущую культуру инкубировали при 37°C в течение 27 ч. до OD > 0,6. Затем суспензию клеток центрифугировали, промывали с помощью буфера для получения (pH 6,0; 8,32 г/л K-ацетата, 0,5 г/л этанола) и снова центрифугировали.
600 нм
Для получения культуры для продуцирования 200 мл буфера для получения в колбе объемом 500 мл инокулировали промытыми клетками из основной культуры до OD, составляющей 0,2. Культуру закрывали пробкой из бутилкаучука и инкубировали в течение 71 ч. при 37°C и 100 об./мин. на открытой водяной бане со встряхиванием. Образцы отбирали в начале и в конце периода культивирования. Их тестировали в отношении оптической плотности, значения pH и различных аналитов (тестировали с помощью ЯМР).
Из результатов видно, что в фазе получения количество ацетата снижалось от 5,5 г/л до 5,0 г/л, и количество этанола снижалось от 0,5 г/л до 0,0 г/л. Кроме того, концентрация масляной кислоты повышалась от 0,05 г/л до 0,8 г/л, и концентрация гексановой кислоты повышалась от 0,005 г/л до 0,1 г/л.
Пример 2
Получение с помощью Clostridium kluyveri гексановой кислоты из ацетата и этанола
Для биологического превращения этанола и ацетата в гексановую кислоту применяли бактерию Clostridium kluyveri. Все стадии культивирования проводили в анаэробных условиях в устойчивых к давлению стеклянных колбах, которые можно герметично закрывать пробкой из бутилкаучука.
2
4
2
4
4
4
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
4
2
2
3
2
2
4
2
2
3
2
2
2
600 нм
Для получения предварительной культуры 100 мл среды DMSZ52 (pH = 7,0; 10 г/л K-ацетата, 0,31 г/л KHPO, 0,23 г/л KHPO, 0,25 г/л NHCl, 0,20 г/л MgSO x 7HO, 1 г/л дрожжевого экстракта, 0,50 мг/л резазурина, 10 мкл/л HCl (25%, 7,7 M), 1,5 мг/л FeCl x 4HO, 70 мкг/л ZnCl x 7HO, 100 мкг/л MnCl x 4HO, 6 мкг/л HBO, 190 мкг/л CoCl x 6HO, 2 мкг/л CuCl x 6HO, 24 мкг/л NiCl x 6HO, 36 мкг/л NaMO x 2HO, 0,5 мг/л NaOH, 3 мкг/л NaSeO x 5HO, 4 мкг/л NaWO x 2HO, 100 мкг/л витамина B12, 80 мкг/л п-аминобензойной кислоты, 20 мкг/л D(+)-биотина, 200 мкг/л никотиновой кислоты, 100 мкг/л D-Ca-пантотената, 300 мкг/л гидрохлорида пиридоксина, 200 мкг/л тиамин-HCl x 2HO, 20 мл/л этанола, 2,5 г/л NaHCO, 0,25 г/л цистеин-HCl x HO, 0,25 г/л NaS x 9HO) в колбе объемом 250 мл инокулировали 5 мл замороженной криокультуры Clostridium kluyveri и инкубировали при 37°C в течение 144 ч. до OD > 0,2.
600 нм
600 нм
Для получения основной культуры 200 мл свежей среды DMSZ52 в колбе объемом 500 мл инокулировали подвергнутыми центрифугированию клетками из предварительной культуры до OD, составляющей 0,1. Данную растущую культуру инкубировали при 37°C в течение 27 ч. до OD > 0,6. Затем суспензию клеток центрифугировали, промывали с помощью буфера для получения (pH 6,0; 0,832 г/л K-ацетата, 5,0 г/л этанола) и снова центрифугировали.
600 нм
Для получения культуры для продуцирования 200 мл буфера для получения в колбе объемом 500 мл инокулировали промытыми клетками из основной культуры до OD, составляющей 0,2. Культуру закрывали пробкой из бутилкаучука и инкубировали в течение 71 ч. при 37°C и 100 об./мин. на открытой водяной бане со встряхиванием. Образцы отбирали в начале и в конце периода культивирования. Их тестировали в отношении оптической плотности, значения pH и различных аналитов (тестировали с помощью ЯМР).
Из результатов видно, что в фазе получения количество ацетата снижалось от 0,54 г/л до 0,03 г/л, и количество этанола снижалось от 5,6 г/л до 4,9 г/л. Кроме того, концентрация масляной кислоты повышалась от 0,05 г/л до 0,28 г/л, и концентрация гексановой кислоты повышалась от 0,03 г/л до 0,79 г/л.
Пример 3
Получение с помощью Clostridium kluyveri гексановой кислоты из масляной кислоты и этанола
Для биологического превращения этанола и масляной кислоты в гексановую кислоту применяли бактерию Clostridium kluyveri. Все стадии культивирования проводили в анаэробных условиях в устойчивых к давлению стеклянных колбах, которые можно герметично закрывать пробкой из бутилкаучука.
2
4
2
4
4
4
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
4
2
2
3
2
2
4
2
2
3
2
2
2
600 нм
Для получения предварительной культуры 100 мл среды DMSZ52 (pH = 7,0; 10 г/л K-ацетата, 0,31 г/л KHPO, 0,23 г/л KHPO, 0,25 г/л NHCl, 0,20 г/л MgSO x 7HO, 1 г/л дрожжевого экстракта, 0,50 мг/л резазурина, 10 мкл/л HCl (25%, 7,7 M), 1,5 мг/л FeCl x 4HO, 70 мкг/л ZnCl x 7HO, 100 мкг/л MnCl x 4HO, 6 мкг/л HBO, 190 мкг/л CoCl x 6HO, 2 мкг/л CuCl x 6HO, 24 мкг/л NiCl x 6HO, 36 мкг/л NaMO x 2HO, 0,5 мг/л NaOH, 3 мкг/л NaSeO x 5HO, 4 мкг/л NaWO x 2HO, 100 мкг/л витамина B12, 80 мкг/л п-аминобензойной кислоты, 20 мкг/л D(+)-биотина, 200 мкг/л никотиновой кислоты, 100 мкг/л D-Ca-пантотената, 300 мкг/л гидрохлорида пиридоксина, 200 мкг/л тиамин-HCl x 2HO, 20 мл/л этанола, 2,5 г/л NaHCO, 0,25 г/л цистеин-HCl x HO, 0,25 г/л NaS x 9HO) в колбе объемом 250 мл инокулировали 5 мл замороженной криокультуры Clostridium kluyveri и инкубировали при 37°C в течение 144 ч. до OD > 0,3.
600 нм
600 нм
Для получения основной культуры 200 мл свежей среды DMSZ52 в колбе объемом 500 мл инокулировали подвергнутыми центрифугированию клетками из предварительной культуры до OD, составляющей 0,1. Данную растущую культуру инкубировали при 37°C в течение 25 ч. до OD > 0,4. Затем суспензию клеток центрифугировали, промывали с помощью буфера для получения (pH 6,16; 4,16 г/л K-ацетата, 10,0 г/л этанола) и снова центрифугировали.
600 нм
Для получения культур для продуцирования 200 мл буфера для получения в колбе объемом 500 мл инокулировали промытыми клетками из основной культуры до OD, составляющей 0,2. В первой культуре в начале добавляли 1,0 г/л масляной кислоты в буфер для получения, во второй культуре не добавляли масляную кислоту в буфер для получения. Культуры закрывали пробкой из бутилкаучука и инкубировали в течение 71 ч. при 37°C и 100 об./мин. на открытой водяной бане со встряхиванием. Образцы отбирали в начале и в конце периода культивирования. Их тестировали в отношении оптической плотности, значения pH и различных аналитов (тестировали с помощью ЯМР).
Из результатов видно, что в фазе получения дополненной масляной кислотой культуры количество ацетата снижалось от 3,1 г/л до 1,1 г/л, и количество этанола снижалось от 10,6 г/л до 7,5 г/л. Кроме того, концентрация масляной кислоты повышалась от 1,2 г/л до 2,2 г/л, и концентрация гексановой кислоты повышалась от 0,04 г/л до 2,30 г/л.
В фазе получения недополненной культуры количество ацетата снижалось от 3,0 г/л до 1,3 г/л, и количество этанола снижалось от 10,2 г/л до 8,2 г/л. Кроме того, концентрация масляной кислоты повышалась от 0,1 г/л до 1,7 г/л, и концентрация гексановой кислоты повышалась от 0,01 г/л до 1,40 г/л.
Пример 4
Культивирование Clostridium kluyveri в присутствии декана и TOPO
Бактерию DSM555 Clostridium kluyveri (German DSMZ) культивировали с целью биологического превращения этанола и ацетата в гексановую кислоту. Для экстракции in situ полученной гексановой кислоты для культивирования добавляли смесь декана с триоктилфосфиноксидом (TOPO). Все стадии культивирования проводили в анаэробных условиях в устойчивых к давлению стеклянных колбах, которые можно герметично закрывать пробкой из бутилкаучука.
2
4
2
4
4
4
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
4
2
2
3
2
2
4
2
2
3
600 нм
Для получения предварительной культуры 250 мл среды Veri01 (pH 7,0; 10 г/л ацетата калия, 0,31 г/л KHPO, 0,23 г/л KHPO, 0,25 г/л NHCl, 0,20 г/л MgSO X 7HO, 10 мкл/л HCl (7,7 M), 1,5 мг/л FeCl X 4HO, 36 мкг/л ZnCl, 64 мкг/л MnCl X 4HO, 6 мкг/л HBO, 190 мкг/л CoCl X 6HO, 1,2 мкг/л CuCl X 6HO, 24 мкг/л NiCl X 6HO, 36 мкг/л NaMO X 2HO, 0,5 мг/л NaOH, 3 мкг/л NaSeO X 5HO, 4 мкг/л NaWO X 2HO, 100 мкг/л витамина B12, 80 мкг/л п-аминобензойной кислоты, 20 мкг/л D(+)-биотина, 200 мкг/л никотиновой кислоты, 100 мкг/л D-Ca-пантотената, 300 мкг/л гидрохлорида пиридоксина, 200 мкг/л тиамин-HCl x 2HO, 20 мл/л этанола, 2,5 г/л NaHCO, 65 мг/л глицина, 24 мг/л гистидина, 64,6 мг/л изолейцина, 93,8 мг/л лейцина, 103 мг/л лизина, 60,4 мг/л аргинина, 21,64 мг/л L-цистеин-HCl, 21 мг/л метионина, 52 мг/л пролина, 56,8 мг/л серина, 59 мг/л треонина, 75,8 мг/л валина) инокулировали 10 мл живой культуры Clostridium kluyveri до стартовой OD, составляющей 0,1.
2
-1

Культивирование проводили в устойчивой к давлению стеклянной колбе объемом 1000 мл при 37°C, 150 об./мин. и интенсивности вентиляции, составляющей 1 л/ч. со 100% CO во встряхивателе на открытой водяной бане в течение 671 ч. Газ высвобождали в свободное пространство над продуктом в реакторе. Значение pH поддерживали при 6,2 с помощью автоматического добавления 100 г/л раствора NaOH. Свежую среду непрерывно подавали в реактор со степенью разбавления, составляющей 2,0 д, и ферментационный бульон непрерывно удаляли из реактора с помощью половолоконной полиэфирсульфоновой мембраны KrosFlo с размером пор, составляющим 0,2 мкм (Spectrumlabs, Ранчо Домингез, США), с удержанием клеток в реакторе.
600 нм
2
Для получения основной культуры 100 мл свежей среды Veri01 в колбе объемом 250 мл инокулировали подвергнутыми центрифугированию клетками из предварительной культуры до OD, составляющей 0,1. Добавляли дополнительный 1 мл смеси 6% (вес/вес) TOPO в декане. Культуру закрывали пробкой из бутилкаучука и инкубировали при 37°C и 150 об./мин. во встряхивателе на открытой водяной бане в течение 43 ч. в атмосфере 100% CO.
600 нм
Во время культивирования отбирали несколько образцов по 5 мл для определения OD, значения pH и степени образования продукта. Определение концентраций продукта выполняли с помощью полуколичественного анализа с применением 1H-ЯМР-спектроскопии. В качестве внутреннего количественного стандарта использовали триметилсилилпропионат натрия (T(M)SP).
Во время основного культивирования концентрация бутирата повышалась от 0,14 г/л до 2,12 г/л, и концентрация гексанoата повышалась от 0,22 г/л до 0,91 г/л, при этом концентрация этанола снижалась от 15,04 до 11,98 г/л, и концентрация ацетата снижалась от 6,01 до 4,23 г/л.
600 нм
OD снижалась за это время от 0,111 до 0,076.
Пример 5
Культивирование Clostridium kluyveri в присутствии тетрадекана и TOPO
Бактерию Clostridium kluyveri культивировали с целью биологического превращения этанола и ацетата в гексановую кислоту. Для экстракции in situ полученной гексановой кислоты для культивирования добавляли смесь тетрадекана с триоктилфосфиноксидом (TOPO). Все стадии культивирования проводили в анаэробных условиях в устойчивых к давлению стеклянных колбах, которые можно герметично закрывать пробкой из бутилкаучука.
3
4
4
2
4
2
2
2
2
3
600 нм
-1

Предварительное культивирование Clostridium kluyveri проводили в устойчивой к давлению стеклянной колбе объемом 1000 мл в 250 мл среды EvoDM24 (pH 5,5; 0,429 г/л Mg-ацетата, 0,164 г/л Na-ацетата, 0,016 г/л Ca-ацетата, 2,454 г/л K-ацетата, 0,107 мл/л HPO (8,5%), 0,7 г/л ацетата NH, 0,35 мг/л Co-ацетата, 1,245 мг/л Ni-ацетата, 20 мкг/л d-биотина, 20 мкг/л фолиевой кислоты, 10 мкг/л пиридоксин-HCl, 50 мкг/л тиамин-HCl, 50 мкг/л рибофлавина, 50 мкг/л никотиновой кислоты, 50 мкг/л Ca-пантотената, 50 мкг/л витамина B12, 50 мкг/л п-аминобензоата, 50 мкг/л липоевой кислоты, 0,702 мг/л (NH4)Fe(SO) x 4HO, 1 мл/л KS-ацетата (93,5 мМ), 20 мл/л этанола, 0,37 г/л уксусной кислоты) при 37°C, 150 об./мин. и интенсивности вентиляции, составляющей 1 л/ч., со смесью, содержащей 25% CO и 75% N, во встряхивателе на открытой водяной бане. Газ высвобождали в свободное пространство над продуктом в реакторе. Значение pH поддерживали при 5,5 с помощью автоматического добавления 2,5 M раствора NH. Свежую среду непрерывно подавали в реактор со степенью разбавления, составляющей 2,0 д, и ферментационный бульон непрерывно удаляли из реактора с помощью половолоконной полиэфирсульфоновой мембраны KrosFlo с размером пор, составляющим 0,2 мкм (Spectrumlabs, Ранчо Домингез, США), с удержанием клеток в реакторе и поддержанием OD, составляющей ~1,5.
2
4
2
4
4
4
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
4
2
2
3
2
2
4
2
2
3
600 нм
2
Для получения основной культуры 100 мл среды Veri01 (pH 6,5; 10 г/л ацетата калия, 0,31 г/л KHPO, 0,23 г/л KHPO, 0,25 г/л NHCl, 0,20 г/л MgSO X 7HO, 10 мкл/л HCl (7,7 M), 1,5 мг/л FeCl X 4HO, 36 мкг/л ZnCl, 64 мкг/л MnCl X 4HO, 6 мкг/л HBO, 190 мкг/л CoCl X 6HO, 1,2 мкг/л CuCl X 6HO, 24 мкг/л NiCl X 6HO, 36 мкг/л NaMO X 2HO, 0,5 мг/л NaOH, 3 мкг/л NaSeO X 5HO, 4 мкг/л NaWO X 2HO, 100 мкг/л витамина B12, 80 мкг/л п-аминобензойной кислоты, 20 мкг/л D(+)-биотина, 200 мкг/л никотиновой кислоты, 100 мкг/л D-Ca-пантотената, 300 мкг/л гидрохлорида пиридоксина, 200 мкг/л тиамин-HCl x 2HO, 20 мл/л этанола, 2,5 г/л NaHCO, 65 мг/л глицина, 24 мг/л гистидина, 64,6 мг/л изолейцина, 93,8 мг/л лейцина, 103 мг/л лизина, 60,4 мг/л аргинина, 21,64 мг/л L-цистеин-HCl, 21 мг/л метионина, 52 мг/л пролина, 56,8 мг/л серина, 59 мг/л треонина, 75,8 мг/л валина, 2,5 мл/л HCl 25%) в колбе объемом 250 мл инокулировали подвергнутыми центрифугированию клетками из предварительной культуры до OD, составляющей 0,1. Добавляли дополнительный 1 мл смеси 6% (вес/вес) TOPO в тетрадекане. Культуру закрывали пробкой из бутилкаучука и инкубировали при 37°C и 150 об./мин. во встряхивателе на открытой водяной бане в течение 47 ч. в атмосфере 100% CO.
600 нм
Во время культивирования отбирали несколько образцов по 5 мл для определения OD, значения pH и степени образования продукта. Определение концентраций продукта выполняли с помощью полуколичественного анализа с применением 1H-ЯМР-спектроскопии. В качестве внутреннего количественного стандарта использовали триметилсилилпропионат натрия (T(M)SP).
Во время основного культивирования концентрация бутирата повышалась от 0,05 г/л до 3,78 г/л, и концентрация гексанoата повышалась от 0,09 г/л до 4,93 г/л, при этом концентрация этанола снижалась от 15,52 до 9,36 г/л, и концентрация ацетата снижалась от 6,36 до 2,49 г/л.
600 нм
OD повышалась за это время от 0,095 до 0,685.
Пример 6
Культивирование Clostridium kluyveri в присутствии гексадекана и TOPO
Бактерию Clostridium kluyveri культивировали с целью биологического превращения этанола и ацетата в гексановую кислоту. Для экстракции in situ полученной гексановой кислоты для культивирования добавляли смесь гексадекана с триоктилфосфиноксидом (TOPO). Все стадии культивирования проводили в анаэробных условиях в устойчивых к давлению стеклянных колбах, которые можно герметично закрывать пробкой из бутилкаучука.
2
4
2
4
4
4
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
4
2
2
3
2
2
4
2
2
3
600 нм
Для получения предварительной культуры 250 мл среды Veri01 (pH 7,0; 10 г/л ацетата калия, 0,31 г/л KHPO, 0,23 г/л KHPO, 0,25 г/л NHCl, 0,20 г/л MgSO X 7HO, 10 мкл/л HCl (7,7 M), 1,5 мг/л FeCl X 4HO, 36 мкг/л ZnCl, 64 мкг/л MnCl X 4HO, 6 мкг/л HBO, 190 мкг/л CoCl X 6HO, 1,2 мкг/л CuCl X 6HO, 24 мкг/л NiCl X 6HO, 36 мкг/л NaMO X 2HO, 0,5 мг/л NaOH, 3 мкг/л NaSeO X 5HO, 4 мкг/л NaWO X 2HO, 100 мкг/л витамина B12, 80 мкг/л п-аминобензойной кислоты, 20 мкг/л D(+)-биотина, 200 мкг/л никотиновой кислоты, 100 мкг/л D-Ca-пантотената, 300 мкг/л гидрохлорида пиридоксина, 200 мкг/л тиамин-HCl x 2HO, 20 мл/л этанола, 2,5 г/л NaHCO, 65 мг/л глицина, 24 мг/л гистидина, 64,6 мг/л изолейцина, 93,8 мг/л лейцина, 103 мг/л лизина, 60,4 мг/л аргинина, 21,64 мг/л L-цистеин-HCl, 21 мг/л метионина, 52 мг/л пролина, 56,8 мг/л серина, 59 мг/л треонина, 75,8 мг/л валина) инокулировали 10 мл живой культуры Clostridium kluyveri до стартовой OD, составляющей 0,1.
2
-1

Культивирование проводили в устойчивой к давлению стеклянной колбе объемом 1000 мл при 37°C, 150 об./мин. и интенсивности вентиляции, составляющей 1 л/ч. со 100% CO во встряхивателе на открытой водяной бане в течение 671 ч. Газ высвобождали в свободное пространство над продуктом в реакторе. Значение pH поддерживали при 6,2 с помощью автоматического добавления 100 г/л раствора NaOH. Свежую среду непрерывно подавали в реактор со степенью разбавления, составляющей 2,0 д, и ферментационный бульон непрерывно удаляли из реактора с помощью половолоконной полиэфирсульфоновой мембраны KrosFlo с размером пор, составляющим 0,2 мкм (Spectrumlabs, Ранчо Домингез, США), с удержанием клеток в реакторе.
600 нм
2
Для получения основной культуры 100 мл свежей среды Veri01 в колбе объемом 250 мл инокулировали подвергнутыми центрифугированию клетками из предварительной культуры до OD, составляющей 0,1. Добавляли дополнительный 1 мл смеси 6% (вес/вес) TOPO в гексадекане. Культуру закрывали пробкой из бутилкаучука и инкубировали при 37°C и 150 об./мин. во встряхивателе на открытой водяной бане в течение 43 ч. в атмосфере 100% CO.
600 нм
Во время культивирования отбирали несколько образцов по 5 мл для определения OD, значения pH и степени образования продукта. Определение концентраций продукта выполняли с помощью полуколичественного анализа с применением 1H-ЯМР-спектроскопии. В качестве внутреннего количественного стандарта использовали триметилсилилпропионат натрия (T(M)SP).
Во время основного культивирования концентрация бутирата повышалась от 0,14 г/л до 2,86 г/л, и концентрация гексанoата повышалась от 0,20 г/л до 2,37 г/л, при этом концентрация этанола снижалась от 14,59 до 10,24 г/л, и концентрация ацетата снижалась от 5,87 до 3,32 г/л.
600 нм
OD повышалась за это время от 0,091 до 0,256.
Пример 7
Культивирование Clostridium kluyveri в присутствии гептадекана и TOPO
Бактерию Clostridium kluyveri культивировали с целью биологического превращения этанола и ацетата в гексановую кислоту. Для экстракции in situ полученной гексановой кислоты для культивирования добавляли смесь гептадекана с триоктилфосфиноксидом (TOPO). Все стадии культивирования проводили в анаэробных условиях в устойчивых к давлению стеклянных колбах, которые можно герметично закрывать пробкой из бутилкаучука.
2
4
2
4
4
4
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
4
2
2
3
2
2
4
2
2
3
600 нм
Для получения предварительной культуры 250 мл среды Veri01 (pH 7,0; 10 г/л ацетата калия, 0,31 г/л KHPO, 0,23 г/л KHPO, 0,25 г/л NHCl, 0,20 г/л MgSO X 7HO, 10 мкл/л HCl (7,7 M), 1,5 мг/л FeCl X 4HO, 36 мкг/л ZnCl, 64 мкг/л MnCl X 4HO, 6 мкг/л HBO, 190 мкг/л CoCl X 6HO, 1,2 мкг/л CuCl X 6HO, 24 мкг/л NiCl X 6HO, 36 мкг/л NaMO X 2HO, 0,5 мг/л NaOH, 3 мкг/л NaSeO X 5HO, 4 мкг/л NaWO X 2HO, 100 мкг/л витамина B12, 80 мкг/л п-аминобензойной кислоты, 20 мкг/л D(+)-биотина, 200 мкг/л никотиновой кислоты, 100 мкг/л D-Ca-пантотената, 300 мкг/л гидрохлорида пиридоксина, 200 мкг/л тиамин-HCl x 2HO, 20 мл/л этанола, 2,5 г/л NaHCO, 65 мг/л глицина, 24 мг/л гистидина, 64,6 мг/л изолейцина, 93,8 мг/л лейцина, 103 мг/л лизина, 60,4 мг/л аргинина, 21,64 мг/л L-цистеин-HCl, 21 мг/л метионина, 52 мг/л пролина, 56,8 мг/л серина, 59 мг/л треонина, 75,8 мг/л валина) инокулировали 10 мл живой культуры Clostridium kluyveri до стартовой OD, составляющей 0,1.
2
-1

Культивирование проводили в устойчивой к давлению стеклянной колбе объемом 1000 мл при 37°C, 150 об./мин. и интенсивности вентиляции, составляющей 1 л/ч. со 100% CO во встряхивателе на открытой водяной бане в течение 671 ч. Газ высвобождали в свободное пространство над продуктом в реакторе. Значение pH поддерживали при 6,2 с помощью автоматического добавления 100 г/л раствора NaOH. Свежую среду непрерывно подавали в реактор со степенью разбавления, составляющей 2,0 д, и ферментационный бульон непрерывно удаляли из реактора с помощью половолоконной полиэфирсульфоновой мембраны KrosFlo с размером пор, составляющим 0,2 мкм (Spectrumlabs, Ранчо Домингез, США), с удержанием клеток в реакторе.
600 нм
2
Для получения основной культуры 100 мл свежей среды Veri01 в колбе объемом 250 мл инокулировали подвергнутыми центрифугированию клетками из предварительной культуры до OD, составляющей 0,1. Добавляли дополнительный 1 мл смеси 6% (вес/вес) TOPO в гептадекане. Культуру закрывали пробкой из бутилкаучука и инкубировали при 37°C и 150 об./мин. во встряхивателе на открытой водяной бане в течение 43 ч. в атмосфере 100% CO.
600 нм
Во время культивирования отбирали несколько образцов по 5 мл для определения OD, значения pH и степени образования продукта. Определение концентраций продукта выполняли с помощью полуколичественного анализа с применением 1H-ЯМР-спектроскопии. В качестве внутреннего количественного стандарта использовали триметилсилилпропионат натрия (T(M)SP).
Во время основного культивирования концентрация бутирата повышалась от 0,15 г/л до 2,82 г/л, и концентрация гексанoата повышалась от 0,19 г/л до 2,85 г/л, при этом концентрация этанола снижалась от 14,34 до 9,58 г/л, и концентрация ацетата снижалась от 5,88 до 3,20 г/л.
600 нм
OD повышалась за это время от 0,083 до 0,363.
Пример 8
Культивирование Clostridium kluyveri в присутствии додекана и TOPO
Бактерию Clostridium kluyveri культивировали с целью биологического превращения этанола и ацетата в гексановую кислоту. Для экстракции in situ полученной гексановой кислоты для культивирования добавляли смесь додекана с триоктилфосфиноксидом (TOPO). Все стадии культивирования проводили в анаэробных условиях в устойчивых к давлению стеклянных колбах, которые можно герметично закрывать пробкой из бутилкаучука.
2
4
2
4
4
4
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
4
2
2
3
2
2
4
2
2
3
600 нм
Для получения предварительной культуры 250 мл среды Veri01 (pH 7,0; 10 г/л ацетата калия, 0,31 г/л KHPO, 0,23 г/л KHPO, 0,25 г/л NHCl, 0,20 г/л MgSO X 7HO, 10 мкл/л HCl (7,7 M), 1,5 мг/л FeCl X 4HO, 36 мкг/л ZnCl, 64 мкг/л MnCl X 4HO, 6 мкг/л HBO, 190 мкг/л CoCl X 6HO, 1,2 мкг/л CuCl X 6HO, 24 мкг/л NiCl X 6HO, 36 мкг/л NaMO X 2HO, 0,5 мг/л NaOH, 3 мкг/л NaSeO X 5HO, 4 мкг/л NaWO X 2HO, 100 мкг/л витамина B12, 80 мкг/л п-аминобензойной кислоты, 20 мкг/л D(+)-биотина, 200 мкг/л никотиновой кислоты, 100 мкг/л D-Ca-пантотената, 300 мкг/л гидрохлорида пиридоксина, 200 мкг/л тиамин-HCl x 2HO, 20 мл/л этанола, 2,5 г/л NaHCO, 65 мг/л глицина, 24 мг/л гистидина, 64,6 мг/л изолейцина, 93,8 мг/л лейцина, 103 мг/л лизина, 60,4 мг/л аргинина, 21,64 мг/л L-цистеин-HCl, 21 мг/л метионина, 52 мг/л пролина, 56,8 мг/л серина, 59 мг/л треонина, 75,8 мг/л валина) инокулировали 10 мл живой культуры Clostridium kluyveri до стартовой OD, составляющей 0,1.
2
-1

Культивирование проводили в устойчивой к давлению стеклянной колбе объемом 1000 мл при 37°C, 150 об./мин. и интенсивности вентиляции, составляющей 1 л/ч. со 100% CO во встряхивателе на открытой водяной бане в течение 671 ч. Газ высвобождали в свободное пространство над продуктом в реакторе. Значение pH поддерживали при 6,2 с помощью автоматического добавления 100 г/л раствора NaOH. Свежую среду непрерывно подавали в реактор со степенью разбавления, составляющей 2,0 д, и ферментационный бульон непрерывно удаляли из реактора с помощью половолоконной полиэфирсульфоновой мембраны KrosFlo с размером пор, составляющим 0,2 мкм (Spectrumlabs, Ранчо Домингез, США), с удержанием клеток в реакторе.
600 нм
2
Для получения основной культуры 100 мл свежей среды Veri01 в колбе объемом 250 мл инокулировали подвергнутыми центрифугированию клетками из предварительной культуры до OD, составляющей 0,1. Добавляли дополнительный 1 мл смеси 6% (вес/вес) TOPO в додекане. Культуру закрывали пробкой из бутилкаучука и инкубировали при 37°C и 150 об./мин. во встряхивателе на открытой водяной бане в течение 43 ч. в атмосфере 100% CO.
600 нм
Во время культивирования отбирали несколько образцов по 5 мл для определения OD, значения pH и степени образования продукта. Определение концентраций продукта выполняли с помощью полуколичественного анализа с применением 1H-ЯМР-спектроскопии. В качестве внутреннего количественного стандарта использовали триметилсилилпропионат натрия (T(M)SP).
Во время основного культивирования концентрация бутирата повышалась от 0,14 г/л до 2,62 г/л, и концентрация гексанoата повышалась от 0,22 г/л до 2,05 г/л, при этом концентрация этанола снижалась от 14,62 до 10,64 г/л, и концентрация ацетата снижалась от 5,92 до 3,54 г/л.
600 нм
OD повышалась за это время от 0,091 до 0,259.
Пример 9
Определение коэффициента распределения гексановой кислоты между водой и смесью гексадекана и TOPO
D
Во время всех стадий эксперимента отбирали образцы из обеих фаз для определения значения pH и концентрации гексановой кислоты с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC). С помощью 100 г водного раствора 5 г/кг гексановой кислоты и 33 г смеси 6% триоктилфосфиноксида (TOPO) в гексадекане заполняли разделительную воронку и смешивали в течение 1 минуты при 37°C. Затем воронку помещали в кольцо на штативе и эмульсию оставляли отстаиваться с самопроизвольным отделением. Измеряли значение pH водной фазы. Затем добавляли 1 M раствор NaOH в воронку и смешивали. Стадию разделения и отбора образцов повторяли до тех пор, пока не достигали значения pH, составляющего 6,2, в водной фазе. Отбирали образцы из обеих фаз для последующего анализа на данный момент времени. Водную фазу можно анализировать непосредственно с помощью HPLC. Для анализа органической фазы разбавленную гексановую кислоту сперва повторно экстрагировали в воду (pH 12,0 путем добавления 1 M NaOH), а затем анализировали с помощью HPLC. Коэффициент распределения K гексановой кислоты в системе воды и 6% TOPO в гексадекане рассчитывали из концентраций гексановой кислоты в обеих фазах.
D
K для гексановой кислоты в системе воды и 6% TOPO в гексадекане при значении pH 6,2 составлял 4,7.
Пример 10
Определение коэффициента распределения гексановой кислоты между водой и смесью гептадекана и TOPO
D
Во время всех стадий эксперимента отбирали образцы из обеих фаз для определения значения pH и концентрации гексановой кислоты с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC). С помощью 100 г водного раствора 5 г/кг гексановой кислоты и 33 г смеси 6% триоктилфосфиноксида (TOPO) в гептадекане заполняли разделительную воронку и смешивали в течение 1 минуты при 37°C. Затем воронку помещали в кольцо на штативе и эмульсию оставляли отстаиваться с самопроизвольным отделением. Измеряли значение pH водной фазы. Добавляли 1 M раствор NaOH в воронку и смешивали. Стадию разделения и отбора образцов повторяли до тех пор, пока не достигали значения pH, составляющего 6,2, в водной фазе. Отбирали образцы из обеих фаз для последующего анализа на данный момент времени. Водную фазу можно анализировать непосредственно с помощью HPLC. Для анализа органической фазы разбавленную гексановую кислоту сперва повторно экстрагировали в воду (pH 12,0 путем добавления 1 M NaOH), а затем анализировали с помощью HPLC. Коэффициент распределения K гексановой кислоты в системе воды и 6% TOPO в гептадекане рассчитывали из концентраций гексановой кислоты в обеих фазах.
D
K для гексановой кислоты в системе воды и 6% TOPO в гептадекане при значении pH 6,2 составлял 5,0.
Пример 11
Определение коэффициента распределения гексановой кислоты между водой и смесью тетрадекана и TOPO
D
Во время всех стадий эксперимента отбирали образцы из обеих фаз для определения значения pH и концентрации гексановой кислоты с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC). С помощью 130 г водного раствора 5 г/кг гексановой кислоты плюс 0,5 г/кг уксусной кислоты и 15 г смеси 6% триоктилфосфиноксида (TOPO) в тетрадекане заполняли разделительную воронку и смешивали в течение 1 минуты при 37°C. Затем воронку помещали в кольцо на штативе и эмульсию оставляли отстаиваться с самопроизвольным отделением. Измеряли значение pH водной фазы. Добавляли 1 M раствор NaOH в воронку и смешивали. Стадию разделения и отбора образцов повторяли до тех пор, пока не достигали значения pH, составляющего 6,2, в водной фазе. Отбирали образцы из обеих фаз для последующего анализа на данный момент времени. Водную фазу можно анализировать непосредственно с помощью HPLC. Для анализа органической фазы разбавленную гексановую кислоту сперва повторно экстрагировали в воду (pH 12,0 путем добавления 1 M NaOH), а затем анализировали с помощью HPLC. Коэффициент распределения K гексановой кислоты в системе воды и 6% TOPO в тетрадекане рассчитывали из концентраций гексановой кислоты в обеих фазах.
D
K для гексановой кислоты в системе воды и 6% TOPO в тетрадекане при значении pH 6,9 составлял 1,3.
Пример 12
Культивирование Clostridium kluyveri с экстракцией in situ гексановой кислоты
Бактерию Clostridium kluyveri культивировали с целью биологического превращения этанола и ацетата в гексановую кислоту. Для экстракции in situ полученной гексановой кислоты смесь тетрадекана с триоктилфосфиноксидом (TOPO) непрерывно пропускали в процессе культивирования. Все стадии культивирования проводили в анаэробных условиях в устойчивых к давлению стеклянных колбах, которые можно герметично закрывать пробкой из бутилкаучука.
3
4
4
2
4
2
2
2
2
3
600 нм
-1

Предварительное культивирование Clostridium kluyveri проводили в устойчивой к давлению стеклянной колбе объемом 1000 мл в 250 мл среды EvoDM45 (pH 5,5; 0,004 г/л Mg-ацетата, 0,164 г/л Na-ацетата, 0,016 г/л Ca-ацетата, 0,25 г/л K-ацетата, 0,107 мл/л HPO (8,5%), 2,92 г/л ацетата NH, 0,35 мг/л Co-ацетата, 1,245 мг/л Ni-ацетата, 20 мкг/л d-биотина, 20 мкг/л фолиевой кислоты, 10 мкг/л пиридоксин-HCl, 50 мкг/л тиамин-HCl, 50 мкг/л рибофлавина, 50 мкг/л никотиновой кислоты, 50 мкг/л Ca-пантотената, 50 мкг/л витамина B12, 50 мкг/л п-аминобензоата, 50 мкг/л липоевой кислоты, 0,702 мг/л (NH4)Fe(SO) x 4 HO, 1 мл/л KS-ацетата (93,5 мМ), 20 мл/л этанола, 0,37 г/л уксусной кислоты) при 37°C, 150 об./мин. и интенсивности вентиляции, составляющей 1 л/ч., со смесью, содержащей 25% CO и 75% N, во встряхивателе на открытой водяной бане. Газ высвобождали в свободное пространство над продуктом в реакторе. Значение pH поддерживали при 5,5 с помощью автоматического добавления 2,5 M раствора NH. Свежую среду непрерывно подавали в реактор со степенью разбавления, составляющей 2,0 д, и ферментационный бульон непрерывно удаляли из реактора с помощью половолоконной полиэфирсульфоновой мембраны KrosFlo с размером пор, составляющим 0,2 мкм (Spectrumlabs, Ранчо Домингез, США), с удержанием клеток в реакторе и поддержанием OD, составляющей ~1,5.
3
4
2
4
2
2
3
Для получения основной культуры 150 мл среды EvoDM39 (pH 5,8; 0,429 г/л Mg-ацетата, 0,164 г/л Na-ацетата, 0,016 г/л Ca-ацетата, 2,454 г/л K-ацетата, 0,107 мл/л HPO (8,5%), 1,01 мл/л уксусной кислоты, 0,35 мг/л Co-ацетата, 1,245 мг/л Ni-ацетата, 20 мкг/л d-биотина, 20 мкг/л фолиевой кислоты, 10 мкг/л пиридоксин-HCl, 50 мкг/л тиамин-HCl, 50 мкг/л рибофлавина, 50 мкг/л никотиновой кислоты, 50 мкг/л Ca-пантотената, 50 мкг/л витамина B12, 50 мкг/л п-аминобензоата, 50 мкг/л липоевой кислоты, 0,702 мг/л (NH4)Fe(SO) x 4HO, 1 мл/л KS-ацетата (93,5 мМ), 20 мл/л этанола, 8,8 мл раствора NH (2,5 моль/л), 27,75 мл/л уксусной кислоты (144 г/л))
600 нм
в колбе объемом 1000 мл инокулировали 100 мл клеточного бульона из предварительной культуры до OD, составляющей 0,71.
2
2
3
600 нм
-1
-1
Культивирование проводили при 37°C, 150 об./мин. и интенсивности вентиляции, составляющей 1 л/ч., со смесью 25% CO и 75% N во встряхивателе на открытой водяной бане в течение 65 ч. Газ высвобождали в свободное пространство над продуктом в реакторе. Значение pH поддерживали при 5,8 с помощью автоматического добавления 2,5 M раствора NH. Свежую среду непрерывно подавали в реактор со степенью разбавления, составляющей 0,5 д, и ферментационный бульон непрерывно удаляли из реактора путем поддержания OD, составляющей ~0,5. К ферментационному бульону добавляли дополнительные 120 г смеси 6% (вес/вес) TOPO в тетрадекане. Затем данную органическую смесь непрерывно подавали в реактор и органическую фазу также непрерывно удаляли из реактора со степенью разбавления, составляющей 1 д.
600 нм
Во время культивирования отбирали несколько образцов по 5 мл из обеих, водной и органической, фаз для определения OD, значения pH и степени образования продукта. Определение концентраций продукта выполняли с помощью полуколичественного анализа с применением 1H-ЯМР-спектроскопии. В качестве внутреннего количественного стандарта использовали триметилсилилпропионат натрия (T(M)SP).
600 нм
Во время основного культивирования в водной фазе достигали концентрации в равновесном состоянии, составляющей 8,18 г/л этанола, 3,20 г/л ацетата, 1,81 г/л бутирата и 0,81 г/л гексаноата. Значение OD оставалось постоянным на уровне 0,5. В органической фазе достигали концентрации в равновесном состоянии, составляющей 0,43 г/кг этанола, 0,08 г/кг ацетата, 1,13 г/кг бутирата и 8,09 г/кг гексаноата. После эксперимента клетки оставались жизнеспособными, несмотря на перенос для дополнительных этапов культивирования.
D
Коэффициент распределения K субстратов и продуктов в системе водной среды и 6% TOPO в тетрадекане рассчитывали из концентраций в обеих фазах.
D
K в равновесном состоянии составлял 0,05 для этанола, 0,03 для уксусной кислоты, 0,62 для масляной кислоты и 9,99 для гексановой кислоты.