СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТВОРА ПОЛИАКРИЛАМИДА С УВЕЛИЧЕННОЙ ВЯЗКОСТЬЮ
METHOD FOR PRODUCING A SOLUTION OF POLYACRYLAMIDE WITH INCREASED VISCOSITY

Область изобретения
600
600
Настоящее изобретение относится к способам получения раствора полиакриламида, имеющего увеличенную вязкость по сравнению со ссылочным раствором, и растворам полиакриламида, полученным такими способами, где раствор полиакриламида получают посредством полимеризации водных растворов акриламида, имеющих OD равную или менее 0,6, предпочтительно равную или менее 0,4, более предпочтительно равную или менее 0,3, даже более предпочтительно равную или менее 0,2, еще более предпочтительно равную или менее 0,15, еще более предпочтительно равную или менее 0,12, еще более предпочтительно равную или менее 0,1, еще более предпочтительно равную или менее 0,075, наиболее предпочтительно равную или менее 0,05. Более того, настоящее изобретение относится к раствору акриламида, имеющему OD в интервале от 0,6 до 0,001, и применению таких растворов акриламида для получения раствора полиакриламида, имеющего увеличенную вязкость.
Уровень техники
Следующее описание уровня техники настоящего изобретения приводится только для того, чтобы помочь читателю понять настоящее изобретение и не допускается для описания или предназначается для описания или включения предшествующего уровня техники настоящего изобретению.
Полиакриламиды широко используются в качестве флокулянтов и загустителя при обработке воды и в процессах, таких как изготовление бумаги. Полиакриламид может поставляться в виде порошка или жидкости, причем жидкая форма подклассифицируется как полимер, полученный полимеризацией в растворителе и в эмульсии. Другое распространенное применение полиакриламида и его производных относится к подземным применениям, таким как повышенная нефтедобыча. Если после первичной и вторичной добычи нефти дальнейшее повышение обычными методами более является не благоприятным, способы повышения подвижности нефти для повышения эффективности экстракции используются при добыче нефти третичными методами. Одним из таких способов является введение водных растворов, содержащих полимеры, такие как полиакриламид, что позволяет извлекать еще от 5% до 15% нефти месторождения (K.С. Taylor, J.A. Nasr-El-Din, J. Petr. Sci. Ang. 1998, 19, 265-280, K.C. Taylor, Annual Transactions of the Nordic Rheology Society, Vol.11, 2003).
Сырьем для полиакриламида обычно является мономер акриламид. В принципе существуют два разных способа получения акриламида в промышленных масштабах: химический синтез и биологический синтез, причем методы биологического синтеза все более преобладают из-за более мягких условий реакции и присущей биологическим методам технологической безопасности. Из-за более мягких условий реакции, отсутствия медного катализатора и количественной конверсии нитрила в биологическом синтезе можно избежать дорогостоящих последующих стадий обработки, таких как дистилляция или ионный обмен, что приводит к более дешевым установкам с резко уменьшенным размером площади, занимаемой установкой.
Оба метода синтеза используют акрилонитрил в качестве исходного вещества. В то время как в способе химического синтеза используют медные катализаторы (например, US 4048226, US 3597481), в способе биологического синтеза используют биокатализаторы для гидратирования акрилонитрила для получения акриламида. Как правило, такие биокатализаторы представляют собой микроорганизмы, которые способны продуцировать фермент нитрилгидратазу (номенклатура IUBMB по состоянию на 30 сентября 2014 г.: ЕС 4.2.1.84, CAS-№2391-37-5, также называемый, например, NHase). Микроорганизмы, продуцирующие нитрилгидратазу, в основном распределены в окружающей среде и включают, среди прочего, представителей рода Rhodococcus (например, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus ruber), Nocardia (например, Nocardia transvalensis), Pseudonocardia (например, Pseudonocardia thermophila), Bacillus (например, Bacillus subtilis), Pseudomonas (например, Pseudomonas putida, Pseudomonas chlor or aphis), Pyrococcus (например, Pyrococcus abyssi), Comomonas (например, Comomonas testosteroni), и Corynebacterium (например, Corynebacterium propinquum) (смотрите, например, Prasad, Biotechnology Advances (2010), 28(6): 725-741). Фермент нитрилгидратаза бывает либо железо-зависимой, либо от кобальт-зависимой (т.е. он включает либо железо, либо кобальт, координированный в его активном центре), который особенно характеризуется своей способностью катализировать превращение акрилонитрила в акриламид путем гидратации акрилонитрила (Kobayashi, Nature Biotechnology (1998), 16: 733-736). Способность микроорганизмов действовать в качестве биокатализаторов для превращения акрилонитрила в акриламид в основном зависит от двух параметров: Достаточный рост микроорганизмов и их скорость продукции нитрилгидратазы.
Многие способы удаления биокатализатора из раствора акриламида после завершения превращения акрилонитрила в акриламид известны в уровне техники, в основном применяемые для удаления примесей из реакционного раствора. Общепринято, что даже незначительное количество примесей может влиять на полимеризацию мономеров акриламида или вообще предотвращать полимеризацию. В WO 02/088372 описывается, например, способ и устройство для отделения биокатализатора от раствора акриламида с использованием пробирочной центрифуги или центрифуги с кольцевым зазором, необязательно в сочетании с флокуляцией. Биокатализатор промывают водой для удаления остаточного мономера и затем используют в следующей реакции биопревращения.
Альтернативно, иммобилизованный биокатализатор используют для производства акриламида, как описано, например, в US 4248968, WO 2013188844 и TW 411350, с целью предотвращения элюирования примесей от биокатализатора, улучшения отделяемости биокатализатора от продукта реакции и улучшения применимости биокатализатора для повторного использования.
Удаление биокатализатора после завершения превращения акрилонитрила в акриламид также может быть осуществлено посредством различных методик фильтрации, как описано, например, в ЕР 2019146 и CN 203319905, каждая с целью удаления примесей из реакционного раствора.
Однако присутствие биокатализатора в растворе акриламида также оказалось желательным, как сообщается в ЕР 2264003 и US 2011006258, где микробные клетки, имеющие активность нитрилгидратазы, исключительно добавляются для стабилизации водного раствора акриламида. Более того, как описано в WO 2005/054488, также предполагается, что биокатализатор по существу не удаляют из водного раствора акриламида после завершения превращения акрилонитрила в акриламид. Документ скорее описывает процесс получения полимерного раствора, где мономер содержит клеточный материал и/или компоненты ферментационного бульона. Такие полимеры, как оказалось, имеют даже специфически разработанные признаки и свойства, без необходимости удаления либо биокатализатора, либо ферментационного бульона.
Хотя в данной области техники известно множество способов производства полиакриламидов, применение полиакриламидов при добыче нефти третичными методами обеспечивает дополнительные улучшения, Например, приемистость слоя породы в отношении водного раствора полиакриламида имеет особое значение при введении раствора полимера в землю. Точнее, при использовании биологического метода синтеза для получения акриламида следует избегать того, чтобы клетки биокатализатора, имеющие размер такой же величины, как поры породы, попадали внутрь смеси для полимеризации. Однако отделение биокатализатора после полимеризации экономически невозможно.
В общем, в данной области техники существует потребность в новых средствах и способах для получения растворов полиакриламида с улучшенными свойствами и высоким качеством для использования при добыче нефти третичными методами, чтобы далее увеличивать подвижность нефти и повышать коэффициент извлечения из месторождения нефти. Техническая задача, лежащая в основе настоящего изобретения, заключается в том, чтобы удовлетворить данную потребность. Техническая задача решена путем обеспечения вариантов выполнения настоящего изобретения, отраженных в формуле настоящего изобретения, описанных в описании и проиллюстрированных в приведенных ниже примерах и чертежах.
Сущность изобретения
600
600
Настоящее изобретение, по меньшей мере частично, основано на неожиданном открытии, что отделение биокатализатора от биокаталитически полученного водного раствора акриламида, так что OD водного раствора акриламида равно или менее 0,6, предпочтительно равно или менее 0,4, более предпочтительно равно или менее 0,3, даже более предпочтительно равно или менее 0,2, еще более предпочтительно равно или менее 0,15, еще более предпочтительно равно или менее 0,12, еще более предпочтительно равно или менее 0,1, еще более предпочтительно равно или менее 0,075, наиболее предпочтительно равно или менее 0,05, и последующая полимеризация водного раствора акриламида до полиакриламида, обеспечивает раствор полиакриламида, имеющий увеличенную вязкость. В частности, вязкость указанного раствора полиакриламида увеличивается по сравнению со ссылочным раствором, где ссылочный раствор представляет собой раствор полиакриламида, полученный из водного раствора акриламида, имеющего OD более 0,6, и где ссылочный раствор получают посредством того же способа без отделения биокатализатора.
600
600
Значение OD обозначает поглощение ил оптическую плотность жидкого образца, измеренную при длине волны 600 нм. Это предпочтительный способ определения концентрации или количества биокатализатора, как описано в настоящей заявке, в водном растворе, таком как водный раствор акриламида. Соответственно, OD водного раствора измеряют, таким образом определяя количество или концентрацию биокатализатора.
600
Таким образом, вязкость раствора полиакриламида, полученного способом согласно настоящему изобретению, может зависеть от остаточного количества биокатализатора, оставшегося в водном растворе акриламида. Было непредвиденно, так как ранее не сообщалось, что количество оставшегося биокатализатора после биопревращения может непосредственно влиять на значение вязкости раствора полиакриламида. Остаточное количество биокатализатора может быть определено посредством измерения OD водного раствора акриламида.
600
Водный раствор акриламида, имеющий OD, которая равна или менее 0,6, может, например, быть достигнут посредством тарельчатого разделения, осуществляемого с низкой скоростью подаваемого потока.
В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, отделение биокатализатора от водного раствора акриламида осуществляют посредством центрифугирования. Предпочтительно центрифугирование осуществляют посредством тарельчатого сепаратора.
В конкретных вариантах выполнения настоящего изобретения центрифугирование осуществляют со скоростью подаваемого потока менее 600 л/ч, предпочтительно менее 500 л/ч, более предпочтительно менее 400 л/ч, даже более предпочтительно менее 300 л/ч, еще более предпочтительно менее 200 л/ч или 100 л/ч.
Отделение биокатализатора от раствора акриламида может быть осуществлено посредством фильтрации с низкой скоростью подаваемого потока. Это может привести к раствору полиакриламида, имеющему высокую вязкость. Кроме того фильтрационная способность согласно API RP 63 полученного раствора полиакриламида может быть улучшена.
Таким образом, другим объектом настоящего изобретения является способ получения раствора полиакриламида, имеющего увеличенную вязкость по сравнению со ссылочным раствором, включающий следующие стадии:
(a) получение водного раствора акриламида посредством превращения акрилонитрила в акриламид с применением биокатализатора,
(b) отделение биокатализатора от водного раствора акриламида со стадии (a) посредством тарельчатого разделения, осуществляемого со скоростью подаваемого потока менее 600 л/ч,
(c) полимеризация водного раствора акриламида, полученного на стадии (b), в полиакриламид,
где ссылочный раствор получают посредством того же способа без отделения биокатализатора.
Настоящее изобретение также относится к способу увеличения вязкости раствора полиакриламида, полученного посредством биокатализированного превращения акрилонитрила в акриламид, включающему следующие стадии:
(a) получение водного раствора акриламида посредством превращения акрилонитрила в акриламид с применением биокатализатора,
600
(b) отделение биокатализатора от водного раствора акриламида после завершения превращения акрилонитрила в акриламид, так что OD водного раствора акриламида равна или менее 0,6, предпочтительно равна или менее 0,4, более предпочтительно равна или менее 0,3, даже более предпочтительно равна или менее 0,2, еще более предпочтительно равна или менее 0,15, еще более предпочтительно равна или менее 0,12, еще более предпочтительно равна или менее 0,1, еще более предпочтительно равна или менее 0,075, наиболее предпочтительно равна или менее 0,05,
(c) полимеризация водного раствора акриламида, полученного на стадии (b), в полиакриламид.
600
Как раскрывается в настоящей заявке, на вязкость раствора полиакриламида можно влиять, применяя методики разделения, которые селективно отделяют биокатализатор от водного раствора акриламида, и получая OD водного раствора акриламида равную или менее 0,6.
600
Вместе данные согласно настоящему изобретению позволили впервые предположить, что отделение биокатализатора от водного раствора акриламида должно предпочтительно приводить к раствору акриламида, имеющему OD равную или менее 0,6, предпочтительно равную или менее 0,4, более предпочтительно равную или менее 0,4, даже более предпочтительно равную или менее 0,3, еще более предпочтительно равную или менее 0,2, еще более предпочтительно равную или менее 0,1, наиболее предпочтительно равную или менее 0,05, для того чтобы получить раствор полиакриламида с увеличенной вязкостью по сравнению со ссылочным раствором, где значение вязкости составляет ≥60 мПа⋅с при комнатной температуре в искусственной морской воде. Это было неожиданно, так как это никогда не упоминалось в уровне техники, что отделение биокатализатора от водного раствора акриламида перед полимеризацией приводит к увеличенной вязкости полученного раствора полиакриламида.
600
600
Настоящее изобретение вносит вклад в уровень техники, обнаруживая, что отделение биокатализатора от водного раствора акриламида, так что OD водного раствора акриламида находится в интервале от 0,6 до 0,001, как например равная или менее 0,6, предпочтительно равная или менее 0,5, более предпочтительно равная или менее 0,4, даже более предпочтительно равная или менее 0,3, еще более предпочтительно равная или менее 0,2, еще более предпочтительно равная или менее 0,1, наиболее предпочтительно равная или менее 0,05, но более 0,025 или более; 0,01 или более; 0,005 или более; или 0,001 или более, приводит к раствору полиакриламида, имеющему увеличенную вязкость 60 мПа⋅с или более высокую при комнатной температуре в искусственной морской воде по сравнению со ссылочным раствором. В качестве альтернативы или в дополнение к нижнему пределу OD, когда упоминается в настоящей заявке (т.е., но более 0,025 или более; 0,01 или более; 0,005 или более; или 0,001 или более), предусмотрено, что водный раствор акриламида не содержит иммобилизованный биокатализатор.
600
Хотя различные методики разделения известны из уровня техники, о прямой взаимосвязи между остаточным количеством биокатализатора в водном растворе акриламида и значениями вязкости полученного раствора полиакриламида никогда не сообщалось ранее. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что раствор акриламида с низким остаточным количеством биокатализатора приводит к раствору полиакриламида, имеющему увеличенную вязкость. Кроме того, впервые было показано, что раствор акриламида, имеющий OD, которая составляет менее 0,6, приводит к раствору полиакриламида, имеющему увеличенную вязкость. Существует потребность в способе получения раствора полиакриламида, имеющего увеличенную вязкость, так как применение растворов полиакриламида при добыче нефти третичными методами в частности нуждается в растворах полимера, имеющих высокие значения вязкости вместе с уменьшенной растворимостью, что важно для повышения эффективности добычи нефти месторождения из более глубоких слоев горных пород. Таким образом, авторы настоящего изобретения установили способ для существенного улучшения качества раствора полиакриламида.
Первым объектом настоящего изобретения является способ получения раствора полиакриламида, имеющего увеличенную вязкость по сравнению со ссылочным раствором, включающий следующие стадии:
(a) получение водного раствора акриламида посредством превращения акрилонитрила в акриламид с применением биокатализатора,
600
(b) отделение биокатализатора от водного раствора акриламида после завершения превращения акрилонитрила в акриламид, так что OD водного раствора акриламида равна или менее 0,6, предпочтительно равна или менее 0,5, более предпочтительно равна или менее 0,4, даже более предпочтительно равна или менее 0,3, еще более предпочтительно равна или менее 0,2, еще более предпочтительно равна или менее 0,1, наиболее предпочтительно равна или менее 0,05,
(с) полимеризация водного раствора акриламида, полученного на стадии (b), в полиакриламид.
Настоящее изобретение также относится к способу увеличения вязкости раствора полиакриламида, полученного посредством биокатализированного превращения акрилонитрила в акриламид, включающему следующие стадии:
(a) получение водного раствора акриламида посредством превращения акрилонитрила в акриламид с применением биокатализатора,
600
(b) отделение биокатализатора от водного раствора акриламида после завершения превращения акрилонитрила в акриламид, так что OD водного раствора акриламида равна или менее 0,6, предпочтительно равна или менее 0,5, более предпочтительно равна или менее 0,4, даже более предпочтительно равна или менее 0,3, еще более предпочтительно равна или менее 0,2, еще более предпочтительно равна или менее 0,1, наиболее предпочтительно равна или менее 0,05,
(c) полимеризация водного раствора акриламида, полученного на стадии (b), в полиакриламид.
Соответственно, настоящее изобретение относится к способу получения раствора полиакриламида, имеющего увеличенную вязкость по сравнению со ссылочным раствором, включающему следующие стадии:
(а) получение водного раствора акриламида посредством превращения акрилонитрила в акриламид с применением биокатализатора,
(b) отделение биокатализатора от водного раствора акриламида со стадии
600
(a) так что OD водного раствора акриламида равна или менее 0,6, предпочтительно равна или менее 0,5, более предпочтительно равна или менее 0,4, даже более предпочтительно равна или менее 0,3, еще более предпочтительно равна или менее 0,2, еще более предпочтительно равна или менее 0,1, наиболее предпочтительно равна или менее 0,05,
(c) полимеризация водного раствора акриламида, полученного на стадии
(b), в полиакриламид,
600
где ссылочный раствор представляет собой раствор полиакриламида, полученный из водного раствора акриламида, имеющего OD более 0,6, и где ссылочный раствор получают посредством того же способа без отделения биокатализатора.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения раствора полиакриламида, полученного посредством биокатализированного превращения акрилонитрила в акриламид, включающему следующие стадии:
(a) получение водного раствора акриламида посредством превращения акрилонитрила в акриламид с применением биокатализатора,
2
(b) отделение биокатализатора от водного раствора акриламида со стадии (а) посредством тарельчатого разделения, осуществляемого с удельной площадью отстаивания 19,6 мч/л или более,
(c) полимеризация водного раствора акриламида, полученного на стадии (b), в полиакриламид.
В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, OD измеряют непосредственно после отделения биокатализатора.
В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения согласно настоящему изобретению, любой из способов, описанных в настоящей заявке, кроме того включает по меньшей мере одну из следующих стадий:
(d) сушка полиакриламида;
(e) измельчение и/или раздавливание полиакриламида; и/или
(f) растворение полиакриламида в водном растворе.
600
Согласно настоящему изобретению, ссылочный раствор представляет собой раствор полиакриламида, полученный из водного раствора акриламида, имеющего OD более 0,6, полученный согласно любому из способов, описанных в настоящей заявке, без отделения биокатализатора.
Кроме того, вязкость раствора полиакриламида согласно настоящему изобретению составляет предпочтительно более 60 мПа⋅с при комнатной температуре. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения вязкость раствора полиакриламида составляет более 62 мПа⋅с при комнатной температуре. В даже более предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения вязкость раствора полиакриламида составляет более 65 мПа⋅с при комнатной температуре. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения согласно настоящему изобретению, полиакриламид растворяют в искусственной морской воде. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения согласно настоящему изобретению, полиакриламид растворяют в природной морской воде.
Предпочтительно, отделение биокатализатора начинают в течение 5 ч, предпочтительно 2 ч, более предпочтительно 1 ч, наиболее предпочтительно 30 минут после завершения превращения акрилонитрила в акриламид. В более предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения разделение начинают в течение 20 минут после завершения превращения акрилонитрила в акриламид. В даже более предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения разделение начинают в течение 10 минут после завершения превращения акрилонитрила в акриламид.
В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения согласно настоящему изобретению, отделение биокатализатора осуществляют посредством тарельчатого сепаратора. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения отделение биокатализатора осуществляют посредством тарельчатого сепаратора со скоростью подаваемого потока менее 600 л/ч, со скоростью подаваемого потока менее 500 л/ч, со скоростью подаваемого потока менее 400 л/ч, со скоростью подаваемого потока менее 300 л/ч или со скоростью подаваемого потока менее 200 л/ч или 100 л/ч.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
600
600
600
Значения удельной площади отстаивания являются предпочтительными в контексте настоящего изобретения, в частности на стадии разделения средств, таких как продукт или композиция, способов или применений согласно настоящему изобретению. Соответственно, предпочтительно для средств, способов и применений согласно настоящему изобретению, что отделение биокатализатора осуществляют так что удельная площадь отстаивания составляет 19,67 мч/л или более, предпочтительно 23,6 мч/л или более, более предпочтительно 29,5 мч/л или более, даже более предпочтительно 39,3 мч/л или более, еще более предпочтительно 59,0 мч/л или более, наиболее предпочтительно 118,0 мч/л или более. Предпочтительно, если разделение осуществляют так, что удельная площадь отстаивания составляет 19,67 мч/л или более, предпочтительно 23,6 мч/л или более, более предпочтительно 29,5 мч/л или более, даже более предпочтительно 39,3 мч/л или более, еще более предпочтительно 59,0 мч/л или более, или наиболее предпочтительно 118,0 мч/л или более, вязкость раствора полиакриламида будет увеличена по сравнению со ссылочным раствором (не подвергнутым такой стадии разделения). Следовательно, стадию разделения способа или применения согласно настоящему изобретению предпочтительно осуществляют следующим образом: отделение биокатализатора от водного раствора акриламида после завершения превращения акрилонитрила в акриламид посредством фильтрации, так что удельная площадь отстаивания составляет 19,67 мч/л или более, предпочтительно 23,6 мч/л или более, более предпочтительно 29,5 мч/л или более, даже более предпочтительно 39,3 мч/л или более, еще более предпочтительно 59,0 мч/л или более, или наиболее предпочтительно 118,0 мч/л или более. Значения удельной площади отстаивания могут затем быть установлены относительно значений OD (после отделения). Таким образом, как поясняется выше, значения OD, упомянутые в настоящей заявке, могут соответствовать значениям удельной площади отстаивания. Следовательно, предполагается, что значения OD также могут быть заменены значениями удельной площадью отстаивания.
Таким образом, другим объектом настоящего изобретения является способ получения раствора полиакриламида, имеющего увеличенную вязкость по сравнению со ссылочным раствором, включающий следующие стадии:
(a) получение водного раствора акриламида посредством превращения акрилонитрила в акриламид с применением биокатализатора,
(b) отделение биокатализатора от водного раствора акриламида со стадии (a) посредством тарельчатого разделения, осуществляемого со скоростью подаваемого потока менее 600 л/ч, предпочтительно менее 500 л/ч, более предпочтительно менее 400 л/ч, даже более предпочтительно менее 300 л/ч, еще более предпочтительно менее 200 л/ч или 100 л/ч.
(c) полимеризация водного раствора акриламида, полученного на стадии (b), в полиакриламид,
где ссылочный раствор получают посредством того же способа без отделения биокатализатора.
В некоторых вариантах выполнения способа, описанного в настоящей заявке, биокатализатор флокулирован перед разделением.
В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения согласно настоящему изобретению отделение биокатализатора осуществляют посредством фильтрации. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения способом фильтрации является фильтрация под давлением, как например, глубинное фильтрование или образующая фильтрационный осадок фильтрация. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения способом фильтрации является фильтрование с предварительно нанесенным слоем вспомогательного вещества. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения способом фильтрации является фильтрование через фильтры с пористой перегородкой.
В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения отделение биокатализатора осуществляют посредством иммобилизации. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения методикой иммобилизации является ковалентное связывание с поверхностью. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения методикой иммобилизации является сшивание. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения методикой иммобилизации является мембранная сепарация. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения методикой иммобилизации является захватывание.
600
В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения водный раствор акриламида после отделения биокатализатора на стадии (b) имеет OD 0,01 или более, 0,02 или более, 0,03 или более.
В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения согласно настоящему изобретению, биокатализатор представляет собой биокатализатор, имеющий активность нитрилгидратазы. Согласно настоящему изобретению, биокатализатор, имеющий активность нитрилгидратазы, представляет собой выбранный из группы, состоящей из микроорганизмов, принадлежащих к Rhodococcus, Aspergillus, Acidovorax, Agrobacterium, Bacillus, Bradyrhizobium, Burkholderia, Klebsiella, Mesorhizobium, Moraxella, Pantoea, Pseudomonas, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Serratia, Amycolatopsis, Arthrobacter, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Micrococcus, Nocardia, Pseudonocardia, Trichoderma, Myrothecium, Aureobasidium, Candida, Cryptococcus, Debaryomyces, Geotrichum, Hanseniaspora, Kluyveromyces, Pichia, Rhodotorula, Escherichia, Geobacillus, Comomonas, и Pyrococcus, и трансформированные микробные клетки, в которые введен ген нитрилгидратазы. В предпочтительных вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор выбран из бактерий рода Rhodococcus, Pseudomonas, Escherichia и Geobacillus.
В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Rhodococcus erythropolis. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Rhodococcus equi. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Rhodococcus ruber. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Rhodococcus opacus. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Rhodococcus pyridinovorans. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Aspergillus niger. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Acidovorax avenae. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Acidovorax facilis. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Agrobacterium tumefaciens. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Agrobacterium radiobacter. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Bacillus subtilis. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Bacillus pallidus. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Bacillus smithii. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Bacillus sp BR449. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Bradyrhizobium oligotrophicum. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Bradyrhizobium diazoefficiens. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Bradyrhizobium japonicum. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Burkholderia cenocepacia. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Burkholderia gladioli. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Klebsiella oxytoca. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Klebsiella pneumonia. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Klebsiella variicola. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Mesorhizobium cicero. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Mesorhizobium opportunistum. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Mesorhizobium sp F28. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Moraxella. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Pantoea endophytica. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Pantoea agglomerans. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Pseudomonas chlororaphis. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Pseudomonas putida. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Rhizobium. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Rhodopseudomonas palustris. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Serratia liquefaciens. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Serratia marcescens. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Amycolatopsis. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Arthrobacter. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Brevibacterium sp CH1. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Brevibacterium sp СН2. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Brevibacterium sp R312. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Brevibacterium imperial. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Corynebacterium nitrilophilus. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Corynebacterium pseudodiphteriticum. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Corynebacterium glutamicum. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Corynebacterium hoffmanii. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Microbacterium imperial. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Microbacterium smegmatis. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Micrococcus luteus. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Nocardia globerula. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Nocardia rhodochrous. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Pseudonocardia thermophile. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Trichoderma. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Myrothecium verrucaria. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Aureobasidium pullulans. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Candida famata. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Candida guilliermondii. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Candida tropicalis. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Cryptococcus flavus. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Cryptococcus sp UFMG-Y28. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Debaryomyces hanseii. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Geotrichum candidum. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Geotrichum sp JR1. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Hanseniaspora. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Kluyveromyces thermotolerans. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Pichia kluyveri. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Rhodotorula glutinis. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Escherichia coli. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Geobacillus sp. RAPc8. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Comomonas testosterone. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Pyrococcus abyssi. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Pyrococcus furiosus. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой Pyrococcus horikoshii.
В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения согласно настоящему изобретению биокатализатор представляет собой Rhodococcus rhodochrous. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения согласно настоящему изобретению биокатализатор представляет собой штамм Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения согласно настоящему изобретению биокатализатор представляет собой штамм Rhodococcus rhodocrous J-1 (Номер доступа: FERM BP-1478). В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой штамм Rhodococcus rhodocrous М8 (Номер доступа: VKPMB-S926). В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения согласно настоящему изобретению биокатализатор представляет собой штамм Rhododcoccus rhodochrous М33. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор представляет собой штамм Escherichia coli МТ-10822 (Номер доступа: FERM ВР-5785).
В других предпочтительных вариантах выполнения настоящего изобретения, биокатализатор представляет собой Rhodococcus pyridinovorans.
В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор, применяемый согласно настоящему изобретению, был высушен перед получением водного раствора акриламида. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения способом сушки является лиофилизация. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения способом сушки является распылительная сушка. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения способом сушки является термическая сушка. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения способом сушки является сушка воздухом. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения способом сушки является вакуумная сушка. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения способом сушки является сушка в псевдоожиженном слое. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения способом сушки является грануляция распылением.
600
600
600
Другим объектом настоящего изобретения является применение водного раствора акриламида, имеющего OD равную или менее 0,6, предпочтительно равную или менее 0,5, более предпочтительно равную или менее 0,4, даже более предпочтительно равную или менее 0,3, еще более предпочтительно равную или менее 0,2, еще более предпочтительно равную или менее 0,1, наиболее предпочтительно равную или менее 0,05, для получения раствора полиакриламида, имеющего увеличенную вязкость, где биокатализатор отделяют от водного раствора акриламида перед полимеризацией. Водный раствор акриламида является по существу полученным посредством превращения акрилонитрила в акриламид с применением биокатализатора. После отделения раствор предпочтительно имеет OD 0,01 или более, как например 0,02 или более. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения раствор имеет OD 0,01 или более.
600
600
600
Другим объектом настоящего изобретения является водный раствор акриламида, имеющий OD в интервале от 0,6 до 0,001, как например, имеющий ODравную или менее 0,6, предпочтительно равную или менее 0,5, более предпочтительно равную или менее 0,4, даже более предпочтительно равную или менее 0,3, еще более предпочтительно равную или менее 0,2, еще более предпочтительно равную или менее 0,1, наиболее предпочтительно равную или менее 0,05, но имеющий OD 0,025 или более; 0,01 или более; 0,005 или более; или 0,001 или более, где водный раствор акриламида получают посредством превращения акрилонитрила в акриламид с применением биокатализатора и отделения указанного биокатализатора от водного раствора акриламида после завершения превращения акрилонитрила в акриламид.
Другим объектом настоящего изобретения является раствор полиакриламида, полученный согласно любому из способов, описанных в настоящей заявке.
600
600
Другим объектом настоящего изобретения является полиакриламид, имеющий вязкость по меньшей мере 60 мПа⋅с при комнатной температуре в искусственной морской воде, и полученный посредством полимеризации водного раствора акриламида, имеющего OD равную или менее 0,6, предпочтительно равную или менее 0,5, более предпочтительно равную или менее 0,4, даже более предпочтительно равную или менее 0,3, еще более предпочтительно равную или менее 0,2, еще более предпочтительно равную или менее 0,1, наиболее предпочтительно равную или менее 0,05, но имеющего OD 0,025 или более; 0,01 или более; 0,005 или более; или 0,001 или более, где водный раствор акриламида получают посредством превращения акрилонитрила в акриламид с применением биокатализатора и отделения указанного биокатализатора от водного раствора акриламида после завершения превращения акрилонитрила в акриламид.
Другим объектом настоящего изобретения является способ получения раствора полиакриламида, имеющего вязкость более 60 мПа⋅с при комнатной температуре, включающий следующие стадии:
(а) получение водного раствора акриламида посредством превращения акрилонитрила в акриламид с применением биокатализатора,
600
(b) отделение биокатализатора от водного раствора акриламида после завершения превращения акрилонитрила в акриламид, так что OD водного раствора акриламида равна или менее 0,6, предпочтительно равна или менее 0,5, более предпочтительно равна или менее 0,4, даже более предпочтительно равна или менее 0,3, еще более предпочтительно равна или менее 0,2, еще более предпочтительно равна или менее 0,1, наиболее предпочтительно равна или менее 0,05,
(c) полимеризация водного раствора акриламида, полученного на стадии (b), в полиакриламид.
Более того, настоящее изобретение относится к способу получения раствора акриламида включающему следующие стадии:
(a) получение водного раствора акриламида посредством превращения акрилонитрила в акриламид с применением биокатализатора,
600
(b) отделение биокатализатора от водного раствора акриламида со стадии (а), так что OD водного раствора акриламида равна или менее 0,6.
600
Кроме того, настоящее изобретение относится к применению водного раствора акриламида, имеющего OD равную или менее 0,6, для увеличения вязкости раствора полиакриламида, полученного из указанного раствора акриламида.
Подробное описание изобретения
Это описание включает в себя информацию, которая может быть полезной для понимания настоящего изобретения. Это не является признанием того, что какая-либо информация, представленная в настоящем документе, является предшествующим уровнем техники или имеет отношение к заявленным в настоящее время изобретениям, или что любая публикация, специально или неявно упомянутая, является предшествующим уровнем техники.
Следует отметить, что как используется в настоящем документе форма единственного числа включает ссылки на форму множественного числа, если контекст явно не указывает иное. Так, например, ссылка на «реагент» включает один или несколько таких различных реагентов, и ссылка на «способ» включает ссылку на эквивалентные стадии и способы, известные специалистам в данной области техники, которые могут быть изменены или заменены для способов, описанных в настоящем документе.
Специалисты в данной области техники поймут или смогут установить, используя не более чем рутинные эксперименты, многие эквиваленты конкретных вариантов выполнения изобретения, описанных в настоящем документе. Предполагается, что такие эквиваленты охватываются настоящим изобретением.
Если не указано иное, термин «по меньшей мере», предшествующий ряду элементов, следует понимать как относящийся к каждому элементу ряда. Специалисты в данной области техники признают или смогут установить, используя не более чем рутинное экспериментирование, многие эквиваленты конкретных вариантов выполнения способов и применений, описанных в настоящем документе. Предполагается, что такие эквиваленты охватываются настоящим изобретением.
В тексте настоящего описания приводятся несколько документов. Каждый из упомянутых в настоящем описании документов (включая все патенты, заявки на патенты, научные публикации, спецификации изготовителя, инструкции и т.д.), приведенные выше или ниже, включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей их полноте. В той мере, в какой материал, включенный посредством ссылки, противоречит или не соответствует этой спецификации, спецификация заменяет любой такой материал. Ничто в настоящем документе не должно истолковываться как признание того, что изобретение не имеет права передавать такое раскрытие в силу предшествующего изобретения.
В настоящем описании и последующих пунктах формулы изобретения, если контекст не требует иного, слово «содержать» и варианты, такие как «содержит» и «содержащий», будут пониматься как подразумевающие включение указанного целого числа или стадии или группы целых чисел или стадий, но не исключая какого-либо другого целого числа или стадии или группы целого числа или стадии. При использовании в настоящем документе термин «содержащий» может быть заменен термином «состоящий из» или иногда используемым в настоящем документе термином «имеющий».
При использовании в настоящем описании термин «состоящий из» исключает любой элемент, стадию или ингредиент, не указанные в элементе формулы изобретения. При использовании в настоящем документе термин «состоящий в основном из» не исключает материалы или стадии, которые существенно не влияют на основные и новые характеристики формулы изобретения. В каждом случае в настоящем документе любое из терминов «содержащий», «состоящий в основном из» и «состоящий из» может быть заменен любым из двух других терминов.
В используемом в настоящем документе союз «и/или» в сочетании между множественными перечисляемыми элементами понимается, как охватывающий как индивидуальные, так и комбинированные варианты. Например, когда два элемента соединены «и/или», первый вариант относится к применимости первого элемента без второго. Второй вариант относится к применимости второго элемента без первого. Третий вариант относится к применимости первого и второго элементов вместе. Подразумевается, что любой из этих вариантов попадает в значение и, следовательно, удовлетворяет требованию термина «и/или», как используется в настоящем документе. Параллельная применимость более чем одного из вариантов также понимается как подпадающая под значение и, следовательно, удовлетворяющая требованию термина «и/или», как используется в настоящем документе.
Используемое в настоящем документе слово «около» относится к значению, находящемуся в допустимом диапазоне погрешностей для конкретного значения, определенного специалистом обычной квалификации в данной области техники, которое будет частично зависеть от того, как измеряется или определяется значение, т.е. ограничениями измерительной системы. Например, «около» может означать в пределах 1 или более 1 стандартного отклонения в соответствии с практикой в данной области техники. Термин «около» также используется, чтобы указать, что указанные количество или значение могут быть обозначенным значением или некоторым другим значением, которое приблизительно такое же. Эта фраза предназначена для того, чтобы показать, что аналогичные значения приводят к эквивалентным результатам или эффектам в соответствии с изобретением. В этом контексте «около» может относиться к диапазону выше и/или ниже до 10%. Слово «около» относится в некоторых вариантах выполнения к диапазону выше и ниже определенного значения, которое составляет до 5%, например до 2%, до 1% или до 0,5% выше или ниже этого значения. В одном варианте выполнения «около» относится к диапазону до 0,1% выше и ниже заданного значения.
600
600
600
Как указано выше, в настоящем изобретении впервые раскрывается, что отделение биокатализатор от биокаталитически полученного водного раствор акриламида, так что OD водного раствора акриламида равна или менее 0,6, предпочтительно равна или менее 0,5, более предпочтительно равна или менее 0,4, даже более предпочтительно равна или менее 0,3, еще более предпочтительно равна или менее 0,2, еще более предпочтительно равна или менее 0,1, наиболее предпочтительно равна или менее 0,05, но он имеет OD 0,025 или более; 0,01 или более; 0,005 или более; или 0,001 или более, и последующая полимеризация водного раствора акриламида в полиакриламид, приводит к раствору полиакриламида, имеющему увеличенную вязкость по сравнению со ссылочным раствором, где ссылочный раствор представляет собой раствор полиакриламида, полученный из водного раствора акриламида, имеющего OD более 0,6, и где ссылочный раствор получают посредством того же способа без отделения биокатализатора.
Хотя это не было указано в уровне техники, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что существует прямая корреляция между остаточным количеством биокатализатора, оставшемся в растворе акриламида, и вязкостью полученного раствора полиакриламида. Эти обнаружения были непредвиденны, так как хотя широкое многообразие способов разделения описано в уровне техники, о прямом влияние количества биокатализатора в водном растворе акриламида на вязкость полученного раствора полиакриламида ранее не сообщалось. Соответственно, способы, описанные в настоящей заявке, позволяют получение раствора полиакриламида, имеющего увеличенную вязкость и более высокое качество, которые могут, кроме того, применяться при добыче нефти третичными методами.
Настоящее изобретение обеспечивает, среди прочего, способ получения раствора полиакриламида, имеющего увеличенную вязкость по сравнению со ссылочным раствором, включающий следующие стадии:
(a) получение водного раствора акриламида посредством превращения акрилонитрила в акриламид с применением биокатализатора,
600
(b) отделение биокатализатора от водного раствора акриламида после завершения превращения акрилонитрила в акриламид, так что OD водного раствора акриламида равна или менее 0,6, предпочтительно равна или менее 0,5, более предпочтительно равна или менее 0,4, даже более предпочтительно равна или менее 0,3, еще более предпочтительно равна или менее 0,2, еще более предпочтительно равна или менее 0,1, наиболее предпочтительно равна или менее 0,05,
(c) полимеризация водного раствора акриламида, полученного на стадии (b), в полиакриламид.
В частности, настоящее изобретение относится к способу получения раствора полиакриламида, имеющего увеличенную вязкость по сравнению со ссылочным раствором, включающему следующие стадии:
(а) получение водного раствора акриламида посредством превращения акрилонитрила в акриламид с применением биокатализатора,
600
(b) отделение биокатализатора от водного раствора акриламида со стадии (a), так что OD водного раствора акриламида равна или менее 0,6,
(c) полимеризация водного раствора акриламида, полученного на стадии (b), в полиакриламид,
600
где ссылочный раствор представляет собой раствор полиакриламида, полученный из водного раствора акриламида, имеющего OD более 0,6, и где ссылочный раствор получают посредством того же способа без отделения биокатализатора.
600
600
600
Термин "увеличенная вязкость" или "увеличение вязкости", при применении в любом из аспектов настоящего изобретения, в контексте раствора полиакриламида относится к значительно более высокому значению вязкости указанного раствора полиакриламида по сравнению со ссылочным раствором. Вязкость в общем является мерой сопротивления жидкости, и чем более вязкой является жидкость, тем меньше ее легкость движения. Таким образом, термин "увеличенная вязкость", при применении согласно настоящему изобретению, означает, что раствор полиакриламида является более густым и, таким образом, менее легко движется по сравнению со ссылочным раствором. Согласно настоящему изобретению, вязкость раствора полиакриламида, полученного из водного раствора акриламида, имеющего OD равную или менее 0,6, предпочтительно равную или менее 0,5, более предпочтительно равную или менее 0,4, даже более предпочтительно равную или менее 0,3, еще более предпочтительно равную или менее 0,2, еще более предпочтительно равную или менее 0,1, наиболее предпочтительно равную или менее 0,05, на по меньшей мере 10% выше значения вязкости ссылочного раствора. Предпочтительно, вязкость раствора полиакриламида, полученного из водного раствора акриламида, имеющего OD равную или менее 0,6, предпочтительно равную или менее 0,5, более предпочтительно равную или менее 0,4, даже более предпочтительно равную или менее 0,3, еще более предпочтительно равную или менее 0,2, еще более предпочтительно равную или менее 0,1, наиболее предпочтительно равную или менее 0,05, на по меньшей мере 15% выше значения вязкости ссылочного раствора. Наиболее предпочтительно, вязкость раствора полиакриламида, полученного из водного раствора акриламида, имеющего OD равную или менее 0,6, предпочтительно равную или менее 0,5, более предпочтительно равную или менее 0,4, даже более предпочтительно равную или менее 0,3, еще более предпочтительно равную или менее 0,2, еще более предпочтительно равную или менее 0,1, наиболее предпочтительно равную или менее 0,05, на по меньшей мере 20% выше значения вязкости ссылочного раствора.
При измерении вязкости раствора полиакриламида, полученного любым из способов, описанных в настоящей заявке, полученный полиакриламид растворяют в искусственной морской воде. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения раствор полиакриламида, полученный любым из способов, приведенных в настоящей заявке, растворяют в природной морской воде. Согласно настоящему изобретению, предусмотрено, что вязкость раствора полиакриламида определяют любым обычным способом, применяя любой вид вискозиметра, такой как капиллярный вискозиметр, ротационный вискозиметр, крекинг-печь для понижения вязкости нефтепродуктов, вискозиметр с падающим грузом, технологический вискозиметр, кварцевый вискозиметр и тому подобное, предпочтительно при комнатной температуре (19-26°C), более предпочтительно при 25°С +/- 1°C. Вязкость может быть измерена посредством реометр. Предпочтительно вязкость измеряют при скорости сдвига 7 1/с при комнатной температуре на реометре с DIN двухзазорной геометрией.
3
Термин "искусственная морская вода" относится к раствору, полученному согласно стандарту ASTM D1141-98, т.е. NaCl 24,53 г/л, MgCl2 5,20 г/л, Na2SO4 4,09 г/л, CaCl2 1,16 г/л, KCl 0,695 г/л, NaHCO 0,201 г/л, KBr 0,101 г/л, Н3ВО3 0,027 г/л, SrCl2 0,025 г/л, NaF 0,003 г/л.
600
Согласно настоящему изобретению, ссылочный раствор представляет собой раствор полиакриламида, полученный из водного раствора акриламида, имеющего OD более 0,6, и где ссылочный раствор получают посредством того же способа без отделения биокатализатора. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения ссылочный раствор представляет собой водный раствор акриламида, полученный любым из способов согласно настоящему изобретению без отделения биокатализатора от водного раствора акриламида после завершения превращения акрилонитрила в акриламид перед полимеризацией. Таким образом, ссылочный раствор в общем получают способами согласно настоящему изобретению без осуществления стадии разделения (b).
Вязкость раствора полиакриламида согласно настоящему изобретению составляет по существу более 60 мПа⋅с при комнатной температуре. Предпочтительно, вязкость раствора полиакриламида, полученного способами согласно настоящему изобретению, составляет более 62 мПа⋅с при комнатной температуре. Наиболее предпочтительно, вязкость раствора полиакриламида, полученного способами согласно настоящему изобретению, составляет более 65 мПа⋅с при комнатной температуре.
600
600
600
600
600
600
600
При измерении OD водного раствора акриламида, как описано в настоящей заявке, следующее предпочтительное ссылочное значение может применяться: OD насыщенного раствора акриламида в воде или деминерализованной воде. Альтернативно, ссылочным значением может быть значение, которое измеряют после того как водный раствор, такой как водный раствор акриламида, который содержит биокатализатор, подвергают фильтрации, причем размер пор фильтра может составлять 0,1 мкм. Например, фильтрация может быть осуществлена с фильтром, имеющим размер пор 0,4 мкм, затем посредством фильтрации с фильтром, имеющим размер пор 0,2 мкм, и затем последовательно посредством фильтрации с фильтром, имеющим размер пор 0,1 мкм. При размере пор 0,2 мкм или 0,1 мкм предусмотрено, что ни клетки биокатализатора, ни клеточный дебрис не пройдут фильтр, и, таким образом, фильтрат будет по существу свободен от применяемого биокатализатора. Таким образом, всякий раз, когда OD водного раствора измеряют в данном изобретении, упомянутое ссылочное значение предпочтительно используется в отношении значения OD, как описано в контексте средств, способов и применений согласно настоящему изобретению. В контексте измерения OD биокатализатора биокатализатор включает живые клетки, мертвые клетки, и/или клеточный дебрис, как например клеточные стенки, клеточные мембраны и органеллы. Таким образом, когда OD водного раствора, включающего биокатализатор, измеряют в настоящем изобретении, измерение включает живые клетки, мертвые клетки, клеточный дебрис и тому подобное биокатализатора. OD можно, например, измерять с помощью фотометрии, такой как спектроскопия в видимой и инфракрасной области.
Соответственно, настоящее изобретение также обеспечивает способ получения раствора полиакриламида, имеющего вязкость более 60 мПа⋅с при комнатной температуре, включающий следующие стадии:
(a) получение водного раствора акриламида посредством превращения акрилонитрила в акриламид с применением биокатализатора,
600
(b) отделение биокатализатора от водного раствора акриламида со стадии (а), так что OD водного раствора акриламида равна или менее 0,6, предпочтительно равна или менее 0,5, более предпочтительно равна или менее 0,4, даже более предпочтительно равна или менее 0,3, еще более предпочтительно равна или менее 0,2, еще более предпочтительно равна или менее 0,1, наиболее предпочтительно равна или менее 0,05,
(c) полимеризация водного раствора акриламида, полученного на стадии (b), в полиакриламид.
Предпочтительно, биокатализатор отделяют от водного раствора акриламида после завершения превращения акрилонитрила в акриламид.
Термин "превращать" или "превращение", при применении в контексте настоящего изобретения, относится к полной или частичной реакции реагента акрилонитрила в продукт акриламид в водном растворе с применением биокатализатора. Точнее, "превращение" или "превращать" означает, что акрилонитрилу позволяют подвергаться реакции гидратации посредством применения биокатализатора в водном растворе, для того чтобы получить реакционный раствор акриламида, имеющий желаемую концентрацию. Согласно настоящему изобретению, эта реакция гидратации может быть осуществлена любым известным способом. Концентрация акрилонитрила конкретным образом не ограничена, при условии, что получают реакционный раствор акриламида желаемой концентрации. Хотя верхний предел концентрации акрилонитрила специальным образом не ограничен, для подачи избытка акрилонитрила требуется большое каталитическое количество для завершения реакции, реактор с избыточным объемом и избыточный теплообменник для удаления тепла, так что экономическая нагрузка на аспект оборудования становится тяжелой. В случае акрилонитрила предпочтительно подавать акрилонитрил в таком количестве, чтобы теоретическая концентрация полученного раствора акриламида в реакционном растворе стадии (а) в реакторе составляла от 42 до 80 мас./мас. %, когда весь акрилонитрил становится соответствующим акриламидом. Более конкретно, предпочтительно подавать акрилонитрил в количестве от 0,4 до 1,5 мас. частей на основе 1 мас. части водной среды.
В контексте любого из способов согласно настоящему изобретению, акрилонитрил может быть добавлен в реактор до добавления воды, после добавления воды или может быть добавлен вместе с водой. Согласно любому из способов, описанных в настоящей заявке, акрилонитрил может добавляться непрерывно или периодически. Добавление акрилонитрила может осуществляться при постоянной или переменной скорости подачи или порционно. Кроме того, в любом из способов, описанных и приведенных в настоящей заявке, воду добавляют в реактор на стадии (а). Вода может быть добавлена как таковая, может быть частью биокатализатора, как описано в настоящей заявке, может быть частью раствора акрилонитрила, как описано в настоящей заявке, или может быть добавлена иным образом. Микробиологический катализатор может применяться в любом количестве, при условии, что получают реакционный раствор акриламида (I) желаемой концентрации, и его количество должным образом определяется в соответствии с условиями реакции, типом катализатора и его формой. Однако, количество микробиологического катализатора, как правило, находится в пределах от 10 до 50000 мас. части на миллион, предпочтительно от 50 до 30000 мас. частей на миллион, с точки зрения массы сухой бактериальной клетки, на основе водной среды.
Время реакция для реакции гидратации конкретным образом не ограничено, при условии, что получают реакционный раствор акриламида желаемой концентрации. Хотя время реакции зависит от количества применяемого катализатора и условий, таких как температура, оно в частности находится, как правило, в интервале от 1 до 80 часов, предпочтительно от 2 до 40 часов, из расчета на один реактор. Хотя реакцию гидратации, как правило, осуществляют при атмосферном давлении, она может быть осуществлена под давлением, чтобы увеличить растворимость акрилонитрила в водной среде. Температура реакции конкретным образом не ограничена, при условии, что она не ниже, чем точка замерзания водной среды. Однако желательно осуществлять реакцию при температуре, как правило, от 0 до 50°C, предпочтительно от 10 до 40°С. Значение рН водной среды в ходе реакции гидратации конкретным образом не ограничено и может иметь любое значение, при условии, что поддерживается активность нитрилгидратазы. Однако желательно, чтобы значение рН водной среды было в интервале предпочтительно от 6 до 10, более предпочтительно от 7 до 9. Реакция гидратации может быть осуществлена посредством любого периодического способа и непрерывного способа, и реакция может быть осуществлена посредством выбора ее реакционной системы из реакционных систем, таких как суспендированный слой, фиксированный слой, псевдоожиженный слой и тому подобное или посредством объединения различных реакционных систем согласно форме катализатора.
Посредством такой реакции гидратации получают реакционный раствор акриламида стадии (а). В этом реакционном растворе содержатся акриламид, водная среда и растворенный микробиологический катализатор, и, в дополнение, твердые вещества, такие как микробиологический катализатор, фиксированный на носителе, и не живые бактериальные клетки иногда содержатся. Концентрация акриламида, полученного на стадии (а) находится в интервале, как правило, от 42 до 80 мас./мас. %. Концентрация акриламида в реакционном растворе или водном растворе может быть измерена посредством обычного способа, такого как высокоэффективная жидкостная хроматография, газовая хроматография или способ с применением рефрактометра. Специалистам в данной области техники известно множество способов и условий, которые позволят практикующему специалисту подготовить водный раствор акриламида посредством превращения акрилонитрила в акриламид с применением биокатализатора
600
Согласно настоящему изобретению, после завершения превращения акрилонитрила в акриламид, биокатализатор по существу отделяют от водного раствора акриламида. Термин "отделенный" не обязательно означает полное отделение биокатализатора и/или его компонентов от водного раствора акриламида. Таким образом, водные растворы акриламида могут содержать остаточные части биокатализатора после отделения. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор и/или его компоненты частично удалены. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор и/или его компоненты полностью удалены. В контексте настоящего изобретения, термин "отделение" также можно понимать как полное или частичное удаление биокатализатора, применяемого для превращения акрилонитрила в акриламид, из биокаталитически полученного водного раствор акриламида, с получением OD водного раствора акриламида равную или менее 0,6, предпочтительно равную или менее 0,5, более предпочтительно равную или менее 0,4, даже более предпочтительно равную или менее 0,3, еще более предпочтительно равную или менее 0,2, еще более предпочтительно равную или менее 0,1, наиболее предпочтительно равную или менее 0,05. В любом из вариантов выполнения настоящего изобретения, раскрытых в настоящей заявке, слово "разделять" или "разделение" может быть в равной степени заменено словом "отделение" или "отделять". Согласно настоящему изобретению, предпочтительно ровно или более 80 мас./мас. % биокатализатора на основе биокатализатора, присутствующего в водном растворе акриламида при завершении реакции удаляют в ходе такого разделения. Более предпочтительно, ровно или более 90 мас./мас. % биокатализатора на основе биокатализатора, присутствующего в водном растворе акриламида при завершении реакции удаляют в ходе такого разделения. Даже более предпочтительно, ровно или более 95 мас./мас. % биокатализатора на основе биокатализатора, присутствующего в водном растворе акриламида при завершении реакции удаляют в ходе такого разделения. Наиболее предпочтительно, ровно или более 99 мас./мас. % биокатализатора на основе биокатализатора, присутствующего в водном растворе акриламида при завершении реакции удаляют в ходе такого разделения.
Соответственно, остаточное количество биокатализатора в водном растворе акриламида равно или менее 20 мас./мас. % на основе биокатализатора, присутствующего в водном растворе акриламида при завершении реакции удаляют в ходе такого разделения. Предпочтительно, остаточное количество биокатализатора в водном растворе акриламида равно или менее 10 мас./мас. % на основе биокатализатора, присутствующего в водном растворе акриламида при завершении реакции. Более предпочтительно остаточное количество биокатализатора в водном растворе акриламида равно или менее 5 мас./мас. % на основе биокатализатора, присутствующего в водном растворе акриламида при завершении реакции. Наиболее предпочтительно остаточное количество биокатализатора в водном растворе акриламида равно или менее 2 мас./мас. %, предпочтительно менее 1 мас./мас. %, более предпочтительно менее 0,5 мас./мас. % на основе биокатализатора, присутствующего в водном растворе акриламида при завершении реакции. Согласно настоящему изобретению, в некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения количество оставшегося биокатализатора составляет более 0,5 мас./мас. % на основе биокатализатора, присутствующего в водном растворе акриламида при завершении реакции.
Как описано в настоящей заявке выше, согласно настоящему изобретению количество биокатализатора в водном растворе акриламида перед плимеризацией значительно уменьшено после отделения указанного биокатализатора любой из методик разделения, описанных в настоящей заявке, в другом месте. Таким образом, другим объектом настоящего изобретения также является способ уменьшения количества биокатализатора в биокаталитически полученном водном растворе акриламида до оставшегося количества биокатализатора, равного или менее 20 мас./мас. %, предпочтительно менее 10 мас./мас. % на основе общей массы биокатализатора в водном растворе акриламида, причем способ включает отделение биокатализатора от водного раствора акриламида перед полимеризацией, где раствор полиакриламида, полученный из водный раствор акриламида, имеющего остаточное количество биокатализатора, равное или менее 20 мас./мас. %, предпочтительно менее 10 мас./мас. % на основе общей массы биокатализатора в водном растворе акриламида, имеет увеличенную вязкость по сравнению со ссылочным раствором.
В любом из способов, описанных и приведенных в настоящей заявке, отделение биокатализатора начинают после завершения превращения акрилонитрила в акриламид с применением биокатализатора. Термин "после завершения", при применении согласно настоящему изобретению, можно понимать как момент времени, когда достигается желаемая концентрация акриламида в водном растворе согласно настоящему изобретению. Термин "после завершения" может относиться к моменту времени, когда 99,99%, от общего количества акрилонитрила, поданного в реакционную смесь, было превращено. Другими словами, термин "после завершения" может относиться к моменту времени, когда общее количество акрилонитрила, поданного в реакционную смесь, было превращено, так что остаточная концентрация акрилонитрила равна или менее 100 частей на миллион, где части на миллион относятся к мас. частям на основе общей массы водного раствора акриламида. Разделение может быть начато сразу после завершения превращения акрилонитрила в акриламид, или в течение конкретного интервала времени. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, разделение начинают в течение 5 ч, предпочтительно 2 ч, более предпочтительно 1 ч, наиболее предпочтительно 30 минут после завершения превращения акрилонитрила в акриламид. В более предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения разделение начинают в течение 20 минут после завершения превращения акрилонитрила в акриламид. В наиболее предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения разделение начинают в течение 10 минут после завершения превращения акрилонитрила в акриламид.
600
600
600
Эффективность разделения характеризовалась остаточной биомассой в водном растворе акриламида, измеренной как оптическая плотность при 600нм (ODOD). Измерения OD осуществляли с применением двухлучевого спектрофотометра Shimadzu Europe UV-1650PC, и образцы измеряли в полумикрокюветах PS с толщиной светопоглощающего слоя 1 см, относительно контрольного раствора. Деминерализованную воду применяли в качестве контрольного образца. Результаты показаны в Таблицах 1 и 2, показывающие, что более низкие скорости подаваемого потока приводят к меньшим значениям OD, указывая на незначительное количество остаточного биокатализатора в водном растворе акриламида.
600
600
600
600
600
Согласно настоящему изобретению, водный раствор акриламида, имеющий OD равную или менее 0,6, предпочтительно равную или менее 0,5, более предпочтительно равную или менее 0,4, даже более предпочтительно равную или менее 0,3, еще более предпочтительно равную или менее 0,2, еще более предпочтительно равную или менее 0,1, наиболее предпочтительно равную или менее 0,05, может применяться для получения раствора полиакриламида, имеющего увеличенную вязкость, где биокатализатор отделяют от водного раствора акриламида перед полимеризацией. В частности, водный раствор, имеющий OD равную или менее 0,6, предпочтительно равную или менее 0,5, более предпочтительно равную или менее 0,4, даже более предпочтительно равную или менее 0,3, еще более предпочтительно равную или менее 0,2, еще более предпочтительно равную или менее 0,1, наиболее предпочтительно равную или менее 0,05, может применяться для получения раствора полиакриламида, имеющего вязкость более 60 мПа⋅с. Предпочтительно, водный раствор, имеющий OD равную или менее 0,6, предпочтительно равную или менее 0,5, более предпочтительно равную или менее 0,4, даже более предпочтительно равную или менее 0,3, еще более предпочтительно равную или менее 0,2, еще более предпочтительно равную или менее 0,1, наиболее предпочтительно равную или менее 0,05, может применяться для получения раствора полиакриламида, имеющего вязкость более 62 мПа⋅с. Наиболее предпочтительно, водный раствор, имеющий OD равную или менее 0,6, предпочтительно равную или менее 0,5, более предпочтительно равную или менее 0,4, даже более предпочтительно равную или менее 0,3, еще более предпочтительно равную или менее 0,2, еще более предпочтительно равную или менее 0,1, наиболее предпочтительно равную или менее 0,05, может применяться для получения раствора полиакриламида, имеющего вязкость более 65 мПа⋅с. Водный раствор акриламида, имеющий OD равную или менее 0,6, предпочтительно равную или менее 0,5, более предпочтительно равную или менее 0,4, даже более предпочтительно равную или менее 0,3, еще более предпочтительно равную или менее 0,2, еще более предпочтительно равную или менее 0,1, наиболее предпочтительно равную или менее 0,05, применяемый для получения раствора полиакриламида, как описано в настоящей заявке, по существу получают посредством превращения акрилонитрила в акриламид с применением биокатализатора и отделения указанного биокатализатора от водного раствора акриламида после завершения превращения акрилонитрила в акриламид. Как раскрывается в настоящей заявке, оставшееся количество биокатализатора в водном растворе акриламида, содержащем ровно или менее 20 мас./мас. %, предпочтительно менее 10 мас./мас. % биокатализатора, на основе общей массы водного раствора акриламида, составляет после отделения более 0,015 мас./мас. %, предпочтительно 0,01 мас./мас. % на основе общей массы водного раствора акриламида. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения оставшееся количество составляет <0,4 мас./мас. %, предпочтительно <0,1 мас./мас. %, более предпочтительно <0,05 мас./мас. %, наиболее предпочтительно <0,025 мас./мас. % на основе общего количества водного раствора акриламида. Термин "оставшееся количество" или "остаточное количество", при применении согласно настоящему изобретению, относится к количеству биокатализатора, которое не отделяется от водного раствора акриламида посредством любой из методик разделения, описанных в настоящей заявке. Согласно настоящему изобретению, в некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения стадия разделения (b) в любом из способов, приведенных в настоящей заявке, не приводит к полному отделению биокатализатора, но часть остается в водном растворе акриламида.
Отделение биокатализатора от водного раствора акриламида может быть осуществлено согласно любой из методик, раскрытых и описанных в настоящей заявке посредством ссылки. Предпочтительно, отделение биокатализатора может быть осуществлено посредством тарельчатого сепаратора. При применении тарельчатого сепаратора твердые вещества могут быть отделены от жидкостей в непрерывном процессе, применяя чрезмерно большие центрифужные силы. Посредством этой силы твердые вещества прессуются до более высокой плотности по внутренней стенке вращающегося барабана, и жидкая фаза с более низкой плотностью собирается в центре барабана в фазах. Подходящие модели тарельчатого сепаратора, подходящие для применения в любом из способов согласно настоящему изобретению, известны специалистам в данной области техники.
2
2
2
2
2
2
2
В частности, авторы настоящего изобретения обнаружили, что посредством применения тарельчатого сепаратора для отделения биокатализатора от водного раствора акриламида с удельной площадью отстаивания 19,67 мч/л или более, вязкость полученного раствора полиакриламида увеличивается по сравнению со ссылочным раствором, в зависимости от скорости разделения (Таблицы 1 и 2). Ссылочный раствор в контексте настоящего изобретения определен в настоящей заявке. В частности, при применении тарельчатого сепаратора для отделения биокатализатора от водного раствора акриламида с удельной площадью отстаивания равной или более 19,67 мч/л, вязкость полученного раствора полиакриламида всегда была ровна или более 60 мПа⋅с, а когда удельная площадь отстаивания равна или более 29,5 мч/л - равна или более 62 мПа⋅с, и для удельной площади отстаивания равной или более 39,3 мч/л - ровна или более 63 мПа⋅с по сравнению со ссылочным раствором, соответственно (Таблицы 1 и 2). Более того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что удельная площадь отстаивания, равная или более 23,6 мч/л, приводит к более хорошей фильтрационной способности раствора полиакриламида со значениями "Скорости фильтрации ультратонкого фильтра" (MPFR-значения) согласно API RP 63 менее 1,3 при диаметре пор фильтра 3 мкм и 5 мкм. Более того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что удельная площадь отстаивания, равная или более 29,5 мч/л, приводит к более хорошей фильтрационной способности раствора полиакриламида со значениями "Скорости фильтрации ультратонкого фильтра" (MPFR-значения) согласно API RP 63 менее 1,3 при диаметре пор фильтра 2 мкм, 3 мкм и 5 мкм. Более того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что удельная площадь отстаивания, равная или более 39,3 мч/л, приводит к более хорошей фильтрационной способности раствора полиакриламида со значениями "Скорости фильтрации ультратонкого фильтра" (MPFR-значения) согласно API RP 63 менее 1,3 при диаметре пор фильтра 1,2 мкм, 2 мкм, 3 мкм и 5 мкм (Таблицы 1 и 2). MPFR-значения были определены, как описано в настоящей заявке.
2
2
2
2
2
Удельная площадь отстаивания может составлять менее 500 мч/л, менее 400 мч/л, менее 300 мч/л, менее 200 мч/л, или менее 150 мч/л.
При применении тарельчатого сепаратора для отделения биокатализатора от водного раствора акриламида со скоростью подаваемого потока от 200 до 600 л/ч, вязкость полученного раствора полиакриламида может быть равна или более 60 мПа⋅с, для скорости подаваемого потока от 200 до 400 л/ч - ровна или более 62 мПа⋅с, и для скорости подаваемого потока от 200 до 300 л/ч - ровна или более 63 мПа⋅с по сравнению со ссылочным раствором, соответственно (Таблицы 1 и 2). Более того, скорость подаваемого потока от 200 до 500 л/ч может приводить к более хорошей фильтрационной способности раствора полиакриламида со значениями "Скорости фильтрации ультратонкого фильтра" (MPFR-значения) согласно API RP 63 менее 1,3 при диаметре пор фильтра 3 мкм и 5 мкм. Более того, скорость подаваемого потока от 200 до 400 л/ч может приводить к более хорошей фильтрационной способности раствора полиакриламида со значениями "Скорости фильтрации ультратонкого фильтра" (MPFR-значения) согласно API RP 63 менее 1,3 при диаметре пор фильтра 2 мкм, 3 мкм и 5 мкм. Более того, а скорость подаваемого потока от 200 до 300 л/ч может приводить к более хорошей фильтрационной способности раствора полиакриламида со значениями "Скорости фильтрации ультратонкого фильтра" (MPFR-значения) согласно API RP 63 менее 1,3 при диаметре пор фильтра 1,2 мкм, 2 мкм, 3 мкм и 5 мкм (Таблицы 1 и 2). MPFR-значения были определены, как описано в настоящей заявке.
600
Соответственно, одним объектом настоящего изобретения является раствор полиакриламида с увеличенной вязкостью и более хорошей фильтрационной способностью по сравнению со ссылочным раствором, получаемым любым из способов, описанных в настоящей заявке. В частности, отделение биокатализатора от водного раствора акриламида после завершения превращения акрилонитрила в акриламид, так что OD водного раствора акриламида равна или менее 0,6, предпочтительно равна или менее 0,5, более предпочтительно равна или менее 0,4, даже более предпочтительно равна или менее 0,3, еще более предпочтительно равна или менее 0,2, еще более предпочтительно равна или менее 0,1, наиболее предпочтительно равна или менее 0,05, может привести к полученному раствору полиакриламида, имеющему увеличенную вязкость и более хорошую фильтрационную способность согласно API RP 63 по сравнению со ссылочным раствором. Фильтрационная способность представляет собой способность раствора проходить мембрану фильтра, имеющего определенный диаметр пор. Термин "более хорошая фильтрационная способность", при применении согласно настоящему изобретению, относится к раствору, который может более легко проходить мембрану фильтра, имеющую определенный диаметр пор, по сравнению со ссылочным раствором. API RP 63 относится к "Recommended Practices for Evaluation of Polymers Used in Enhanced Oil Recovery Operations". Фильтрационная способность измеряют как MPFR - (Скорости фильтрации ультратонкого фильтра)-значение, как описано в настоящей заявке. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения фильтрационная способность раствора полиакриламида согласно настоящему изобретению составляет менее 1,3 при диаметре пор фильтра 1,2 мкм, 2 мкм, 3 мкм и 5 мкм. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения фильтрационная способность раствора полиакриламида согласно настоящему изобретению составляет менее 1,2 при диаметре пор фильтра 1,2 мкм, 2 мкм, 3 мкм и 5 мкм.
600
Условия разделения поэтому непосредственно влияют на остаточное количество оставшегося биокатализатора, что отражается в более хорошей фильтрационной способности и увеличенной вязкости полученного раствора полиакриламида. Таким образом, более медленные скорости подаваемого потока являются предпочтительными, из-за более высокого отделения биомассы из раствора акриламида. Более того, неожиданно было обнаружено, что оставшееся количество биокатализатора в водном растворе акриламида после отделения непосредственно определяет и влияет на вязкость полученного раствора полиакриламида, где вязкость полученного раствора полиакриламида выше, когда больше биокатализатора отделяют. Поэтому, согласно настоящему изобретению, предпочтительная скорость подаваемого потока, при применении тарельчатого сепаратора, составляет менее 600 л/ч. Более предпочтительной является скорость подаваемого потока менее 500 л/ч. Даже более предпочтительной является скорость потока сепаратора менее 400 л/ч. Даже более предпочтительной является скорость потока сепаратора менее 300 л/ч. Наиболее предпочтительной является скорость потока сепаратора менее 200 л/ч или 100 л/ч или менее. OD после отделения равна или менее 0,6, предпочтительно равна или менее 0,5, более предпочтительно равна или менее 0,4, даже более предпочтительно равна или менее 0,3, еще более предпочтительно равна или менее 0,2, еще более предпочтительно равна или менее 0,1, наиболее предпочтительно равна или менее 0,05.
2
Эквивалентная площадь осаждения или эквивалентная поверхность осветления является параметром, описывающим центрифугу. Эквивалентная площадь отстаивания может составлять, например, 11800 м.
Термин «удельная площадь отстаивания» представляет собой параметр, описывающий процесс разделения. Удельная площадь отстаивания определяется как эквивалентная площадь осаждения тарельчатой центрифуги, поделенная на скорость подаваемого потока. Этот параметр особенно полезен для описания процесса разделения.
600
600
Предпочтительно, OD измеряют непосредственно после отделения биокатализатора от водного раствора акриламида. Это означает, что значение OD достигают посредством отделения биокатализатора, а не другими средствами, такими как разбавление водного раствора акриламида.
Предпочтительные способы фильтрации согласно настоящему изобретению выбирают из группы, состоящей из фильтрования под давлением, фильтрования с предварительно нанесенным слоем вспомогательного вещества, и мембранной фильтрации. Для фильтрования под давлением, предпочтительно слоистые фильтры и модульные фильтра могут быть использованы, где биомасса остается в фильтровальной лепешке, изготовленной из целлюлозы, тогда как жидкая фаза с продуктом акриламида может пройти этот слой. При использовании фильтровании с предварительно нанесенным слоем вспомогательного вещества, патронные фильтры часто применяются, где слой фильтрующих средств (например, целлюлоза) накапливаются до фактической фильтрации реакционной суспензии. В таких условиях, биокатализатор остается частично на предварительно нанесенном слое вспомогательного вещества и частично внутри предварительно нанесенного слоя вспомогательного вещества. Другой метод фильтрации с использованием пленки с поперечным потоком подробно описан в WO 2004089518 и может быть применен также и в любом из способов согласно настоящему изобретению. Результат выполнения фильтрации может быть измерен посредством определения количества остаточного биокатализатор в водном растворе акриламида, например, посредством измерения OD реакционной смеси, как описано в настоящей заявке.
В конкретном варианте выполнения настоящего изобретения, биокатализатор флокулирован перед разделением. В объеме настоящего изобретения, флокуляция означает, что суспендированные или коллоидные примеси водного раствора, такие как биокатализатор, как раскрывается в настоящей заявке, коагулируются, чтобы лучше отделяться от воды посредством осаждения или фильтрации и удаляться. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения флокуляция может быть осуществлена в реакторе, в котором акрилонитрил превращают в акриламид. Предпочтительно флокуляцию осуществляют в отдельной емкости для флокуляции. Согласно настоящему изобретению, флокуляция может быть осуществлена с применением любого из флокулянтов, известных в данной области техники. Предпочтительно флокулянт, применяемый согласно настоящему изобретению, представляет собой сульфат алюминия, хлорид алюминия, полиалюминия хлориды, сульфат железа, хлорид железа, полиэлектролит и/или анионный полимер, такой как Praestol 2510 или Praestol, как описано в WO 02/088372 и DE 19828467. Предпочтительно флокуляцию осуществляют при значении рН от 6,8 до 8,0. Более предпочтительно флокуляцию осуществляют при значении рН от 7,0 до 7,5.
Согласно другому варианту выполнения настоящего изобретения, отделение биокатализатора осуществляют посредством иммобилизации. Иммобилизация означает, что биокатализатор, как применяется согласно настоящему изобретению, пространственно фиксирован в частицах геля, капсулах или в связанных реакционных пространствах, что приводит к сдвигу каталитической активности. Иммобилизованный биокатализатор используют в течение длительного периода времени в процессах получения акриламида, имея преимущество более легкого выделения, очистки и регенерации иммобилизованного биокатализатора после завершения превращения акрилонитрила в акриламид. Обычно используемые методики иммобилизации включают ковалентное связывание с поверхностью, сшивание, мембранное разделение и захват, которые могут быть использованы в любом из аспектов, описанных в настоящем изобретении. В качестве примера, биокатализатор может быть иммобилизован на полиакриламидном геле, альгинате, каррагенане или ионообменной смоле. В конкретном варианте выполнения настоящего изобретения, иммобилизованный биокатализатор согласно настоящему изобретению по существу необратимо удерживается внутри открытого, пористого, высокогидрофильного полимера, где по существу отсутствует дебрис, образованный в результате метаболической активности микроорганизма в ходе метаболического биопревращения, как описано в WO 2013188844. Также колонки, заполненные иммобилизованными биокатализаторами, имеющими активность нитрилгидратазы, как описано в US 4248968, могут применяться согласно настоящему изобретению. В общем, иммобилизация биокатализатора согласно настоящему изобретению может быть осуществлена любым стандартным образом, который известен специалисту в данной области техники.
Альтернативно биокатализатор стадии а) не иммобилизован.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения биокатализатор стадии а) не иммобилизован, а также не иммобилизован на следующей стадии перед стадией разделения b).
Для удаления твердых веществ, таких как биокатализатор, из водного раствора акриламида, следующие методики, такие как центрифугирование и пленочное разделение, описаны в уровне техники, например в WO 02/088372, которые также входят в объем настоящего изобретения. Предпочтительные центрифуги, применяемые в любой из способов или применений согласно настоящему изобретению, представляют собой самодренирующиеся центрифуги и центрифуги с кольцевым зазором.
600
600
600
После отделения биокатализатора от водного раствора акриламида после завершения превращения акрилонитрила в акриламид, водный раствор акриламида, имеющий OD равную или менее 0,6, предпочтительно равную или менее 0,5, более предпочтительно равную или менее 0,4, даже более предпочтительно равную или менее 0,3, еще более предпочтительно равную или менее 0,2, еще более предпочтительно равную или менее 0,1, наиболее предпочтительно равную или менее 0,05, но более 0,025 или более; 0,01 или более; 0,005 или более; или 0,001 или более, полимеризуют до полиакриламида. Полученный полиакриламид имеет вязкость по меньшей мере 60 мПа⋅с при комнатной температуре в искусственной морской воде при получении посредством полимеризации водного раствора акриламида, имеющего OD равную или менее 0,6, предпочтительно равную или менее 0,5, более предпочтительно равную или менее 0,4, даже более предпочтительно равную или менее 0,3, еще более предпочтительно равную или менее 0,2, еще более предпочтительно равную или менее 0,1, наиболее предпочтительно равную или менее 0,05, но более 0,025 или более; 0,01 или более; 0,005 или более; или 0,001 или более. Термин "полимеризация" или "полимеризованный", как применяется согласно настоящему изобретению, относится к процессу реакции мономерных молекул вместе в химической реакции с образованием полимерных цепей или трехмерных сетей. В контексте настоящего изобретения термин "полимеризация" или "полимеризованный" означает, что водный раствор акриламида, полученный любым из способов, описанных в настоящей заявке, превращают в его гомополимер или сополимер. В этом отношении, в случае гомополимера термин "полимеризация" относится к реакции гомополимеризации, тогда как в случае сополимера термин "полимеризация" относится к реакции сополимеризации. Гомополимеризация и сополимеризация может быть осуществлена с применением водного раствора, получаемого или полученного любым из способов, описанных в настоящей заявке. Согласно настоящему изобретению, например, полимеризация водного раствора акриламида, имеющего OD равную или менее 0,6, предпочтительно равную или менее 0,5, более предпочтительно равную или менее 0,4, даже более предпочтительно равную или менее 0,3, еще более предпочтительно равную или менее 0,2, еще более предпочтительно равную или менее 0,1, наиболее предпочтительно равную или менее 0,05, но более 0,025 или более; 0,01 или более; 0,005 или более; или 0,001 или более может быть осуществлена как более подробно описано в настоящей заявке в части Примеры. Полученный полиакриламид далее может быть высушен, измельчен и/или раздавлен в полиакриламид и/или растворен в водном растворе, как описано в Примерах, чтобы получить водный раствор полиакриламида согласно настоящему изобретению. Кроме того способы сушки, измельчения и/или раздавливания полиакриламида, полученного из водного раствора акриламида, известны специалистам в данной области техники. Полученный порошкообразный полиакриламид может быть растворен в любом подходящем водном растворе. Предпочтительно, полиакриламид согласно настоящему изобретению затем растворяют в искусственной или природной морской воде.
Соответственно, в некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, способы, описанные и приведенные в настоящей заявке, могут дополнительно включать по меньшей мере одну из следующих стадий:
(d) сушка полиакриламида;
(e) измельчение и/или раздавливание полиакриламида; и/или
(f) растворение полиакриламида в водном растворе.
Согласно настоящему изобретению, раствор полиакриламида, имеющий увеличенную вязкость по сравнению со ссылочным раствором, может быть получен согласно любому из способов, раскрытых или описанных в настоящей заявке. В частности, раствор полиакриламида согласно настоящему изобретению, имеющий вязкость 60 мПа⋅с или более при комнатной температуре, может быть получен любым из способов, раскрытых или описанных в настоящей заявке,.
Вязкость раствора полиакриламида составляет более 60 мПа⋅с, предпочтительно более 65 мПа⋅с при комнатной температуре, когда полиакриламид растворен при концентрации 4000 частей на миллион в искусственной морской воде, где части на миллион относятся к мас. частям на основе общей массы раствора полиакриламида. Предпочтительно, вязкость раствора полиакриламида менее 200 мПа⋅с, предпочтительно 150 мПа⋅с. В частности, вязкость раствора полиакриламида составляет менее 200 мПа⋅с, предпочтительно 150 мПа⋅с, когда полиакриламид растворен при концентрации 4000 частей на миллион в искусственной морской воде.
Термины "водный раствор" или "водная среда", при применении согласно настоящему изобретению, относятся к водной жидкой среде для применения в контексте настоящего изобретения, в которой буферный агент, такой как фосфат, неорганическая соль, такая как сульфат ли карбонат, гидроксид щелочного металла, соединение амида или тому подобное, растворяют при подходящей концентрации. В водный раствор или водную среду акрилонитрил и биокатализатор добавляют для начала биопревращения. После завершения бопревращения, полученный акриламид также присутствует в указанной водной жидкой среде.
Термин "биопревращение", при применении в контексте настоящего изобретения, относится к реакции, в ходе которой акрилонитрил превращается в акриламид в присутствии воды и биокатализатора. Термин "биокаталитически полученный", при применении согласно настоящему изобретению, относится к любому способу, применяемому для получения водного раствора акриламида, в ходе которого имеет место биопревращение.
Как применяется в отношении любого из вариантов выполнения настоящего изобретения, описанных в настоящей заявке, термин "биокатализатор" содержит в частности микроорганизмы (например, бактерии или простейшие эукариоты) и ферменты, которые способны превращать акрилонитрил в акриламид. Способы определения способности данного биокатализатора (например, микроорганизма или фермента) превращать акрилонитрил в акриламид хорошо известны в данной области техники. Термин "биокатализатор" может, кроме того, содержать клеточный материал в форме целых клеток или фракционированных клеток, или их части, включая полуочищенные или очищенные ферментные препараты, и необязательно содержит ферментационный бульон. Клеточный материал может включать любую из составляющих микробной клетки, например, включая материал клеточной стенки, материал нуклеиновых кислот клетки (например, ДНК или РНК), цитоплазму и белки.
В соответствии с любым из способов настоящего изобретения биокатализатор, способный превращать акрилонитрил в акриламид, может представлять собой микроорганизм, который кодирует фермент нитрилгидратазу. В этом отношении для настоящего изобретения не имеет значения, является ли этот микроорганизм кодирующим нитрилгидратазу естественным образом или он генетически модифицирован для кодирования указанного фермента или микроорганизм, кодирующий нитрилгидратазу естественным образом, модифицирован например, чтобы он был способен производить больше нитрилгидратазы и/или более активную нитрилгидратазу. Как используется в настоящем документе, выражение «биокатализатор (например, микроорганизм), кодирующий (фермент) нитрилгидратаза», или тому подобное обычно означает, что такой микроорганизм обычно также способен продуцировать и стабильно поддерживать нитрилгидратазу. То есть, как используется в данном описании и как легко понятно специалисту в данной области техники, биокатализатор (например, микроорганизм), который должен использоваться в соответствии с настоящим изобретением, который (естественно или неестественно) кодирует нитрилгидратазу, как правило, также способен продуцировать и стабильно поддерживать нитрилгидратазу. Однако в соответствии с настоящим изобретением также возможно, что такие микроорганизмы производят только нитрилгидратазу в ходе культивирования (или ферментации) микроорганизма - таким образом, содержащего нитрилгидратазу - перед добавлением в реактор в соответствии со стадией (а) любого из способов, описанных и представленных в настоящем документе. В таком случае, возможно, что микроорганизмы не продуцируют нитрилгидратазу в описанных и обеспечиваемых в настоящем документе способах, но они действуют только через молекулы нитрилгидратазы, которые они продуцировали ранее и которые они все еще содержат. Как легко понятно специалисту в данной области техники, также возможно, что некоторые молекулы нитрилгидратазы могут покидать микроорганизм (например, вследствие лизиса микроорганизма) и свободно действовать в растворе в качестве биокатализатора. По существу, также возможно, что используемый в настоящем документе термин «биокатализатор» охватывает собственно фермент нитрилгидратазу, если только он способен превращать акрилонитрил в акриламид, как описано и приведено в качестве примеров в настоящем документе. В контексте настоящего изобретения также возможно непосредственно использовать нитрилгидратазу в качестве биокатализатора.
В контексте настоящего изобретения микроорганизмы, кодирующие естественным образом нитрилгидратазу, которые могут быть использованы в качестве биокатализатора в любом из описанных в настоящем документе способов, содержат виды, принадлежащие к роду, выбранному из группы, состоящей из Rhodococcus, Aspergillus, Acidovorax, Agrobacterium, Bacillus, Bradyrhizobium, Burkholderia, Klebsiella, Mesorhizobium, Moraxella, Pantoea, Pseudomonas, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Serratia, Amycolatopsis, Arthrobacter, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Micrococcus, Nocardia, Pseudonocardia, Trichoderma, Myrothecium, Aureobasidium, Candida, Cryptococcus, Debaryomyces, Geotrichum, Hanseniaspora, Kluyveromyces, Pichia, Rhodotorula, Escherichia, Geobacillus, Comomonas, и Pyrococcus. В предпочтительных вариантах выполнения изобретения биокатализатор выбирают из бактерий рода Rhodococcus, Pseudomonas, Escherichia и Geobacillus.
Предпочтительные биокатализаторы, используемые в контексте с любым из способов по настоящему изобретению, включают представителей рода Rhodococcus. Виды, подходящие в качестве биокатализатора для использования в контексте любого из способов по настоящему изобретению, могут содержать, например, Rhodococcus rhodochrous (например, NCIMB 41164 или J1/FERM-BP 1478, М8 (Номер доступа: VKPMB-S926), М33), Rhodococcus pyridinovorans, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus equi, Rhodococcus ruber, Rhodococcus opacus, Aspergillus niger, Acidovorax avenae, Acidovorax facilis, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Bacillus subtilis, Bacillus pallidus, Bacillus smithii, Bacillus sp BR449, Bradyrhizobium oligotrophicum, Bradyrhizobium diazoefficiens, Bradyrhizobium japonicum, Burkholderia cenocepacia, Burkholderia gladioli, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumonia, Klebsiella variicola, Mesorhizobium ciceri, Mesorhizobium opportunistum, Mesorhizobium sp F28, Moraxella, Pantoea endophytica, Pantoea agglomerans, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas putida, Rhizobium, Rhodopseudomonas palustris, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Amycolatopsis, Arthrobacter, Brevibacterium sp CH1, Brevibacterium sp CH2, Brevibacterium sp R312, Brevibacterium imperiale, Brevibacterium casei, Corynebacterium nitrilophilus, Corynebacterium pseudodiphteriticum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium hoffmanii, Microbacterium imperiale, Microbacterium smegmatis, Micrococcus luteus, Nocardia globerula, Nocardia rhodochrous, Nocardia sp 163, Pseudonocardia thermophila, Trichoderma, Myrothecium verrucaria, Aureobasidium pullulans, Candida famata, Candida guilliermondii, Candida tropicalis, Cryptococcus flavus, Cryptococcus sp UFMG-Y28, Debaryomyces hanseii, Geotrichum candidum, Geotrichum sp JR1, Hanseniaspora, Kluyveromyces thermotolerans, Pichia kluyveri, Rhodotorula glutinis, Comomonas testosteroni, Pyrococcus abyssi, Pyrococcus furiosus, Escherichia coli MT-10822 (Номер доступа: FERM BP-5785), Geobacillus sp. RAPc8, или Pyrococcus horikoshii. Вышеуказанные микроорганизмы могут быть культивированы любым способом, который является подходящим для данного микробиологического вида. Согласно предпочтительному варианту выполнения способов согласно настоящему изобретению, биокатализатор, подлежащий применению, принадлежит виду Rhodococcus rhodochrous. Конкретными примерами штаммов, принадлежащих Rhodococcus rhodochrous, которые могут применяться в контексте любого из способов согласно настоящему изобретению, содержат NCIMB 41164, J1 (FERM-BP 1478), М8 (Номер доступа: VKPMB-S926), и М33. В качестве альтернативы или в дополнение к Rhodococcus rhodocrous, биокатализатор, применяемый в любом из способов, описанных в настоящей заявке, может представлять собой Rhodococcus pyridinovorans. Альтернативно или в дополнение к этому, биокатализатором может быть Escherichia coli MT-10822 (Номер доступа: FERM BP-5785).
Согласно настоящему изобретению, также могут применяться комбинации этих микроорганизмов. Кроме того, вышеуказанные микроорганизмы могут быть культивированы любым способом, который может быть подходящим для данного микробиологического вида. Микробиологический биокатализатор согласно настоящему изобретению, который получают из микроорганизмов, относится к культуральному раствору, полученному посредством культивирования микроорганизмов, клеткам, полученным посредством процесса сбора или тому подобного, клетке, разрушенной ультразвуком или тому подобным, или веществам, полученным после разрушения клетки, включая неочищенный фермент, частично очищенный фермент или очищенный фермент. Способ применения микробиологического катализатора может быть выбран подходящим образом в зависимости от стабильности фермента, масштаба производства и тому подобного.
В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор, применяемый для превращения акрилонитрила в акриламид, как описано в настоящей заявке, может быть помыт до применения в указанной реакции. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, биокатализатор может быть промыт один раз водой, буфером или тому подобным, и затем промыт акриловой кислотой перед реакцией. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор, применяемый согласно настоящему изобретению, промывают акриловой кислотой перед реакцией, как подробно описано в ЕР 1380652. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения биокатализатор может быть промыт акриловой кислотой непосредственно перед реакцией. Кроме того, могут применяться любые способы промывки. Примеры такого способа, который может применяться согласно настоящему изобретению, включают способ, который включает повторяющееся промывание и центрифугирование, и способ промывки с применением мембраны с полыми волокнами. Кроме того, иммобилизованные биокатализаторы могут быть промыты посредством повторяющегося встряхивания и осаждения иммобилизованных катализаторов при помывке и удаления супернатанта. Любой способ промывки и любое число промывок может быть установлено с точки зрения эффективности промывки, стабильности фермента и тому подобного. Концентрация акриловой кислоты, подлежащей применению для промывки, предпочтительно составляет от 0,01 мас. % до 10 мас. % в водном растворе акриловой кислоты. Более предпочтительно, концентрация составляет от 0,05 мас. % до 1 мас. %, и наиболее предпочтительно составляет 0,1 мас. %.
В контексте настоящего изобретения, кодирующие нитрилгидратазу микроорганизмы, которые не кодируют естественным образом нитрилгидратазу, могут быть генетически сконструированными микроорганизмами, которые, естественно, не содержат ген, кодирующий нитрилгидратазу, но которые были обработаны таким образом, чтобы содержать полинуклеотид, кодирующий нитрилгидратазу (например, посредством трансформации, транедукции, трансфекции, конъюгации или других способов, подходящих для переноса или вставки полинуклеотида в клетку, как известно в данной области техники; см. Sambrook and Russell 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA), что позволяет микроорганизмам вырабатывать и стабильно поддерживать фермент нитрилгидратазу. Для этой цели может также потребоваться введение дополнительных полинуклеотидов, которые могут быть необходимы для обеспечения транскрипции и трансляции гена нитрилгидратазы или мРНК, соответственно. Такие дополнительные полинуклеотиды могут включать, среди прочего, промоторные последовательности, полиТ- или полиU-хвосты или точку начала репликации или другие последовательности, контролирующие плазмиды. В этом контексте такие генетически модифицированные микроорганизмы, которые, в природе, не содержат ген, кодирующий нитрилгидратазу, но которые были обработаны таким образом, чтобы содержать полинуклеотиды, кодирующие нитрилгидратазу, могут быть прокариотическими или эукариотическими микроорганизмами. Примерами таких прокариотических микроорганизмов являются, например, представители вида Escherichia coli. Примеры таких эукариотических микроорганизмов включают, например, дрожжи (например, Saccharomyces cerevisiae).
В контексте настоящего изобретения термин «нитрилгидратаза» (также обозначаемый в настоящем документе, как NHase) обычно означает фермент, который способен катализировать превращение (то есть гидратацию) акрилонитрила в акриламид. Такими ферментами могут быть, например, фермент, зарегистрированный в номенклатуре IUBMB по состоянию на 30 сентября 2014 г.: ЕС 4.2.1.84; CAS-№. 2391-37-5. Однако используемый в настоящем документе термин «нитрилгидратаза» также включает модифицированные или более активные ферменты, которые, например, способны быстрее превращать акрилонитрил в акриламид или могут быть получены с более высоким соотношением выход/время или которые являются более стабильными, до тех пор, пока они способны катализировать превращение (т.е. гидратацию) акрилонитрила в акриламид. Способы определения способности данного биокатализатора (например, микроорганизма или фермента) для каталитического превращения акрилонитрила в акриламид, известны в данной области техники. В качестве примера, в контексте настоящего изобретения активность данного биокатализатора действовать в качестве нитрилгидратазы в смысле настоящего изобретения может быть определена следующим образом: Сначала проводят реакцию 100 мкл клеточной суспензии, клеточного лизата, растворенного ферментного порошка или любого другого препарата, содержащего предполагаемую нитрилгидратазу, с 875 мкл 50 мМ калий-фосфатного буфера и 25 мкл акрилонитрила при 25°С на шейкере Эппендорфа при 1000 об/мин в течение 10 минут. Через 10 минут времени проведения реакции могут быть отобраны образцы, и реакцию в них немедленно останавливают посредством добавления равного объема 1,4%-ной соляной кислоты. После перемешивания образца, клетки могут быть удалены с помощью центрифугирования в течение 1 минуты при 10000 об/мин, и количество образованного акриламида определяют посредством анализа прозрачного супернатанта с помощью ВЭЖХ. Для подтверждения того, что фермент является нитрилгидратазой в контексте настоящего изобретения, концентрация акриламида должна быть в пределах от 0,25 до 1,25 ммоль/л - если необходимо, образец должен быть разбавлен соответствующим образом, и превращение должно быть повторено. Активность фермента затем может быть вычислена из концентрации акриламида путем деления концентрации акриламида, полученной при анализе ВЭЖХ, на время реакции, которое составляет 10 минут, и посредством умножения этого значения на коэффициент разбавления между образцом ВЭЖХ и исходным образцом. Активности >5 Ед/мг массы сухих клеток, предпочтительно >25 Ед/мг массы сухих клеток, более предпочтительно >50 Ед/мг массы сухих клеток, наиболее предпочтительно >100 Ед/мг массы сухих клеток, указывают на присутствие функционального биокатализатора и рассматриваются в качестве биокатализатора, способного превращать акрилонитрил в акриламид в контексте настоящего изобретения.
В контексте настоящего изобретения нитрилгидратаза может быть полипептидом, кодируемым полинуклеотидом, который содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая составляет по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%, более предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99%, более предпочтительно по меньшей мере 99,5% и наиболее предпочтительно 100% идентичной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 (альфа-субъединица нитрилгидратазы Rhodococcus rhodochrous:
и/или нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3 (бета-субъединица нитрилгидратазы Rhodococcus rhodochrous:
при условии, что полипептид, кодируемый указанным полинуклеотидом, способен катализировать гидратацию акрилонитрила в акриламид (то есть имеет нитрилгидратазную активность), как описано и приведено в качестве примеров в данном описании. Также в контексте настоящего изобретения нитрилгидратаза может быть полипептидом, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая составляет по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%, более предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99%, более предпочтительно по меньшей мере 99,5%, и наиболее предпочтительно на 100% идентичности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 (альфа-субъединицей нитрилгидратазы Rhodococcus rhodochrous: VSEHVNKYTE YEARTKAIET LLYERGLITP AAVDRVVSYY ENEIGPMGGA KVVAKSWVDP EYRKWLEEDA TAAMASLGYA GEQAHQISAV FNDSQTHHVV VCTLCSCYPW PVLGLPPAWY KSMEYRSRVV ADPRGVLKRD FGFDIPDEVE VRVWDSSSEI RYIVIPERPA GTDGWSEEEL TKLVSRDSMI GVSNALTPQE VIV) и/или к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4 (бета-субъединица нитрилгидратазы R. rhodochrous: MDGIHDTGGM TGYGPVPYQK DEPFFHYEWE GRTLSILTWM HLKGISWWDK SRFFRESMGN ENYVNEIRNSY YTHWLSAAE RILVADKIIT EEERKHRVQE ILEGRYTDRK PSRKFDPAQI EKAIERLHEP HSLALPGAEP SFSLGDKIKV KSMNPLGHTR CPKYVRNKIG EIVAYHGCQI YPESSSAGLG DDPRPLYTVA FSAQELWGDD GNGKDVVCVD LWEPYLISA), при условии, что указанный полипептид способен катализировать гидратацию акрилонитрила в акриламид, как описано и подтверждено примерами в данном описании.
Степень идентичности между двумя или более последовательностями (например, последовательностями нуклеиновой кислоты или аминокислотными последовательностями) может быть легко определена с помощью методов, известных в данной области техники, например, с помощью анализа BLAST. В общем случае в контексте настоящего изобретения, если две последовательности (например, полинуклеотидные последовательности или аминокислотные последовательности), которые должны сравниваться, например, при сравнении последовательностей, отличаются по идентичности, тогда термин «идентичность» может относиться к более короткой последовательности, а та часть более длинной последовательности, соответствует указанной более короткой последовательности. Поэтому, когда сравниваемые последовательности различаются по длине, степень идентичности может предпочтительно либо относиться к проценту нуклеотидных остатков в более короткой последовательности, которая идентична остаткам нуклеотидов в более длинной последовательности, либо к процентному содержанию нуклеотидов в более длинной последовательности, которая идентична нуклеотидной последовательности в более короткой последовательности. В этом контексте специалист в данной области техники легко может определить ту часть более длинной последовательности, которая соответствует более короткой последовательности. Кроме того, как используется в настоящем документе, уровни идентичности последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислотных последовательностей могут относиться ко всей длине соответствующей последовательности и, предпочтительно, оцениваться в паре, при этом каждый гэп должен учитываться как одно несоответствие. Эти определения для сравнений последовательностей (например, установления значений «идентичности») должны применяться для всех описанных и раскрытых в настоящем документе последовательностей.
Кроме того, используемый в настоящем документе термин «идентичность» означает, что существует функциональная и/или структурная эквивалентность между соответствующими последовательностями. Последовательности нуклеиновой кислоты/аминокислотные последовательности, имеющие заданные уровни идентичности с описанными в настоящем документе конкретными последовательностями нуклеиновой кислоты/аминокислотными последовательностями, могут представлять производные/варианты этих последовательностей, которые, предпочтительно имеют одну и ту же биологическую функцию. Они могут быть либо природными вариациями, например, последовательностями из других вариететов, видов и т.д., либо мутациями, и указанные мутации могут образоваться естественным путем или могут быть продуцированы преднамеренным мутагенезом. Кроме того, вариации могут быть синтетически полученными последовательностями. Варианты могут быть встречающимися в природе вариантами или синтетически полученными вариантами или вариантами, полученными методами рекомбинантной ДНК. Отклонения от вышеописанных последовательностей нуклеиновой кислоты могут быть получены, например, путем делеции, замены, присоединения, инсерции и/или рекомбинации. Термин «присоединение» относится к присоединению по меньшей мере одного остатка нуклеиновой кислоты/аминокислоты к концу данной последовательности, тогда как «инсерция» относится к вставке по меньшей мере одного остатка нуклеиновой кислоты/аминокислоты в пределах данной последовательности. Термин «делеция» относится к делетированию или удалению по меньшей мере, одного остатка нуклеиновой кислоты или аминокислотного остатка в данной последовательности. Термин «замена» относится к замене, по меньшей мере, одного остатка нуклеиновой кислоты/аминокислотного остатка в данной последовательности. Опять-таки, эти определения, используемые в настоящем документе, применяются, с необходимыми изменениями, для всех последовательностей, предусмотренных и описанных в настоящем документе.
Как правило, в контексте настоящего описания термины «полинуклеотид» и «нуклеиновая кислота» или «молекула нуклеиновой кислоты» должны толковаться как синонимы. Как правило, молекулы нуклеиновых кислот могут содержать, среди прочего, молекулы ДНК, молекулы РНК, олигонуклеотидные тиофосфаты, замещенные рибо-олигонуклеотиды или молекулы ПНК. Кроме того, термин «молекула нуклеиновой кислоты» может относиться к ДНК или РНК или их гибридам или любой их модификации, которая известна в данной области техники (см., например, US 5525711, US 4711955, US 5792608 или ЕР 302175 в качестве примеров модификаций). Эта полинуклеотидная последовательность может быть одно- или двухцепочечной, линейной или кольцевой, природной или синтетической и без каких-либо ограничений по размеру. Например, полинуклеотидная последовательность может представлять собой геномную ДНК, кДНК, митохондриальную ДНК, мРНК, антисмысловую РНК, рибозимную РНК или ДНК, кодирующую такие РНК или химеропласты (Gamper, Nucleic Acids Research, 2000, 28, 4332-4339). Указанная полинуклеотидная последовательность может быть в форме вектора, плазмиды или вирусной ДНК или РНК. Также в настоящем документе описаны молекулы нуклеиновых кислот, которые являются комплементарными молекулам нуклеиновых кислот, описанных выше, и молекулам нуклеиновых кислот, которые способны гибридизоваться с молекулами нуклеиновых кислот, описанными в настоящем документе. Молекула нуклеиновой кислоты, описанная в настоящем документе, также может быть фрагментом молекул нуклеиновой кислоты в контексте настоящего изобретения. В частности, такой фрагмент является функциональным фрагментом. Примерами таких функциональных фрагментов являются молекулы нуклеиновых кислот, которые могут служить в качестве праймеров.
При добавлении биокатализатора в реактор в любом из способов по настоящему изобретению биокатализатор может быть взят непосредственно из ферментационного бульона. Альтернативно, биокатализатор может быть предварительно высушен. В этом контексте, биокатализатор может быть высушен перед добавлением в реактор согласно любому из способов согласно настоящему изобретению. В этом контексте термин «до» не обязательно означает, что биокатализатор был высушен и затем непосредственно добавлен в реактор. Достаточно, чтобы биокатализатор прошел стадию сушки в любое время до его добавления в реактор независимо от того, выполняются ли дополнительные стадии между сушкой и добавлением или нет. В качестве неограничивающих примеров такие дополнительные стадии между стадией сушки и добавлением в реактор могут быть хранение или восстановление влагосодержания. Однако также возможно добавлять биокатализатор в реактор непосредственно после сушки. Авторы неожиданно обнаружили, что при использовании биокатализатора, который прошел стадию сушки, концентрация акриловой кислоты в водном растворе акриламида, полученном любым из способов, описанных в настоящем документе, далее снижается по сравнению со случаем, когда используется биокатализатор, который не подвергался сушке до использования при биопревращении.
Что касается способа сушки, то в любом из способов, описанных в настоящем документе, может быть использован биокатализатор, который был высушен с применением лиофильной сушки, распылительной сушки, термической сушки, вакуумной сушки, сушки в псевдоожиженном слое и/или распылительной грануляции, где распылительная сушка является предпочтительной. С этой точки зрения предпочтительной является сушка распылением, поскольку, как правило, при использовании биокатализатора, который был подвергнут распылительной сушке, в общем достигается более высокое уменьшение концентрации акриловой кислоты в полученных водных растворах акриламида по сравнению с применением биокатализатора, который был высушен другими способами.
В соответствии с любым из способов настоящего изобретения в реактор может быть добавлен высушенный биокатализатор. Это означает, что биокатализатор добавляется в реактор в высушенной форме. Например, катализатор может быть добавлен в высушенной форме на стадии (а) любого из способов, раскрытых в настоящей заявке. В частности, биокатализатор может иметь форму порошка или гранул. В качестве альтернативы высушенный биокатализатор может быть восстановлен перед добавлением на стадии (а) любого из способов, описанных в настоящей заявке. Например, биокатализатор может быть восстановлен суспендированием в водной композиции. В этом отношении водная композиция может быть водой или буфером. В качестве дополнительной альтернативы биокатализатор в форме связанного с матрицей микроорганизма может быть добавлен на стадии (а) любого из способов, раскрытых в настоящей заявке. Используемый в настоящем документе термин «высушенный биокатализатор» относится к биокатализатору, который был подвергнут стадии сушки. Высушенный биокатализатор обычно имеет содержание влаги менее, чем около 20 мас./мас. %, более предпочтительно менее, чем около 15 мас./мас. %, еще более предпочтительно менее, чем около 14 мас./мас. %, наиболее предпочтительно от около 5 до около 10 мас./мас. % в расчете на общую массу образца биокатализатора. Специалисту в данной области техники известны методы определения содержания влаги. Например, в контексте настоящего изобретения содержание влаги в образце высушенного биокатализатора может быть определено с помощью термогравиметрического анализа. В начале термогравиметрического анализа определяется начальная масса образца. Затем образец нагревается, и влага испаряется. Нагревание продолжается до тех пор, пока масса образца не станет постоянной. Разница между постоянной массой в конце анализа и исходной массой представляет собой количество воды, испаренное в ходе анализа, что позволяет рассчитывать содержание влаги в образце. Для определения содержания влаги с помощью термогравиметрического анализа образец биокатализатора можно анализировать, например, на анализаторе влажности «Mettler Toledo HB43-S Halogen», работающем при 130°С до тех пор, пока масса образца не будет оставаться постоянной в течение по меньшей мере 30 секунд.
600
Так как настоящее изобретение обеспечивает получение раствора полиакриламида, имеющего увеличенную вязкость, и, таким образом, проявляющего улучшенные физические свойства, настоящее изобретение также охватывает способ увеличения вязкости раствора полиакриламида по сравнению со ссылочным раствором, причем способ включает применение водного раствора акриламида, имеющего OD равную или менее 0,6, предпочтительно равную или менее 0,5, более предпочтительно равную или менее 0,4, даже более предпочтительно равную или менее 0,3, еще более предпочтительно равную или менее 0,2, еще более предпочтительно равную или менее 0,1, наиболее предпочтительно равную или менее 0,05. Водный раствор акриламида, применяемый в описанном способе, по существу получают посредством превращения акрилонитрила в акриламид с применением биокатализатора, и отделения указанного биокатализатора от водного раствора акриламида после завершения превращения акрилонитрила в акриламид, как описано в настоящей заявке в другом месте.
В общем, настоящее изобретение относится ко всем вариантам выполнения настоящего изобретения, описанным в настоящей заявке, а также ко всем их перестановкам и комбинациям. Любой конкретный объект или варианты выполнения настоящего изобретения, описанные в настоящей заявке, не должны толковаться как ограничивающие объем настоящего изобретения до таких объектов и вариантов выполнения настоящего изобретения.
Более того, настоящее изобретение относится к способу получения раствора акриламида, включающему следующие стадии:
(a) получение водного раствора акриламида посредством превращения акрилонитрила в акриламид с применением биокатализатора,
600
(b) отделение биокатализатора от водного раствора акриламида со стадии (а,) так что OD водного раствора акриламида равна или менее 0,6.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения раствора акриламида, включающему следующие стадии:
(a) получение водного раствора акриламида посредством превращения акрилонитрила в акриламид с применением биокатализатора,
(b) отделение биокатализатора от водного раствора акриламида со стадии (а) посредством тарельчатого разделения, осуществляемого со скоростью подаваемого потока менее 600 л/ч, предпочтительно менее 500 л/ч, более предпочтительно менее 400 л/ч, даже более предпочтительно менее 300 л/ч, еще более предпочтительно менее 200 л/ч или 100 л/ч.
В частности, настоящее изобретение относится к способу получения раствора акриламида, включающему следующие стадии:
(a) получение водного раствора акриламида посредством превращения акрилонитрила в акриламид с применением биокатализатора,
2
2
2
2
2
2
(b) отделение биокатализатора от водного раствора акриламида со стадии (а) посредством тарельчатого разделения, осуществляемого с удельной площадью отстаивания более 19,67 мч/л, предпочтительно удельной площадью отстаивания более 23,6 мч/л, более предпочтительно с удельной площадью отстаивания более 29,5 мч/л, даже более предпочтительно с удельной площадью отстаивания более 39,3 мч/л, еще более предпочтительно с удельной площадью отстаивания более 59,0 мч/л, наиболее предпочтительно с удельной площадью отстаивания более 118,0 мч/л.
Другим объектом настоящего изобретения является способ получения раствора полиакриламида, полученного посредством биокатализированного превращения акрилонитрила в акриламид, включающий следующие стадии:
(a) получение водного раствора акриламида посредством превращения акрилонитрила в акриламид с применением биокатализатора,
2
2
2
2
2
2
(b) отделение биокатализатора от водного раствора акриламида со стадии (а) посредством тарельчатого разделения, осуществляемого с удельной площадью отстаивания более 19,67 мч/л, предпочтительно дельной площадью отстаивания более 23,6 мч/л, более предпочтительно с дельной площадью отстаивания более 29,5 мч/л, даже более предпочтительно с дельной площадью отстаивания более 39,3 мч/л, еще более предпочтительно с дельной площадью отстаивания более 59,0 мч/л, наиболее предпочтительно с дельной площадью отстаивания более 118,0 мч/л.
(c) полимеризация водного раствора акриламида, полученного на стадии (b), в полиакриламид.
600
Кроме того, настоящее изобретение относится к применению водного раствора акриламида, имеющего OD равную или менее 0,6, для увеличения вязкости раствора полиакриламида полученный из указанного раствора акриламида.
600
600
Кроме того, настоящее изобретение относится к применению водного раствора акриламида, имеющего OD равную или менее 0,6, для увеличения вязкости раствора полиакриламида, полученного из указанного раствора акриламида, где OD измеряют непосредственно после отделения биокатализатора от водного раствора акриламида.
600
600
OD измеряют непосредственно после отделения от биокатализатора от водного раствора акриламида, что означает, что значение OD достигается посредством отделения биокатализатора, а не другими средствами, такими как разбавление водного раствора акриламида.
Примеры
Следующие примеры иллюстрируют настоящее изобретение. Эти примеры не следует истолковывать как ограничивающие объем настоящего изобретения. Примеры включены в целях иллюстрации, и настоящее изобретение ограничено только формулой изобретения. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что настоящее изобретение может быть реализовано другими путями, чем конкретно описаны в описании настоящего изобретения и примерах. Многочисленные модификации и варианты выполнения настоящего изобретения возможны в свете приведенного выше раскрытия и, следовательно, входят в объем прилагаемой формулы изобретения.
Гидратация
Биокатализатор Rhodococcus rhodochrous (штамм NCIMB 41164) применяли для гидратации акрилонитрила в акриламид. Экзотермическую реакцию осуществляли в реакторе с мешалкой с входящим потоком акрилонитрила и контуром охлаждения. Реакцию инициировали посредством добавления биокатализатора и акрилонитрила. Добавление акрилонитрила можно надлежащим образом контролировать посредством FTIR анализа. Исходное вещество добавляли до достижения желаемой концентрации акриламида.
Разделение
2
Для стадии разделения применяли тарельчатый сепаратор (ВТРХ 205, Alfa Laval). Эквивалентная поверхность очищения составляла 11800 м. Сепаратор применяли при скорости вращения около 9650 UPM, и волюметрическая скорость подаваемого потока при подаче суспензии находилась в интервале около 100-1000 л/ч. В интервале от 100 л/ч - 500 л/ч MPFR-значения согласно API RP 63 менее 1,3 при диаметре пор фильтра 1,2 мкм, 2 мкм, 3 мкм и 5 мкм могут быть достигнуты (смотрите таблицы 1 и 2).
600
OD измерения
600
600
600
2
Оптическую плотность водного раствора акриламида при 600 нм (OD) измеряли после отделения биокатализатора от реакционной смеси, чтобы определить остаточное количество биомассы. Таблицы 1 и 2 показывают зависимость значений OD водного раствора акриламида от скорости подаваемого потока, при применении тарельчатого сепаратора и применении скоростей подаваемого потока 100-600 л/ч, соответствующих удельным площадям отстаивания 118,0-19,67 мч/л. Деминерализованную воду применяли в качестве ссылочного образца в этих измерениях. OD измерения осуществляли с применением двухлучевого спектрофотометра Shimadzu Europe UV-1650PC, и стандартные слайды кювет заменяли на шестикратные слайды кювет (CPS-Controller CPS-240A). Образцы измеряли в стандартных полумикрокюветах PS с толщиной светопоглощающего слоя 1 см.
Определение фильтрационной способности - MPFR (скорость фильтрации ультратонкого фильтра)
5
Фильтрационную способность сополимеров акриламида оценивали посредством применения MPFR-значений. MPFR-значение (Скорости фильтрации ультратонкого фильтра) означает отклонение раствора полимера от идеального поведения фильтрации, где идеальное поведение фильтрации не уменьшает скорость фильтрации при добавлении фильтра. Для определения значений MPFR около 200 мл раствора полимера, имеющего концентрацию 1,000 частей на миллион при давлении 1,38⋅10 Па, фильтровали через поликарбонатный фильтр с размером пор 5 мкм. Количество фильтрата регистрировалось в зависимости от времени. Расчет значения MPFR осуществлялся по следующей формуле:
180г
160г
80г
60г
MPFR=(t-t) / (Т-t),
180g
где Индекс означает момент времени, в который измеряли конкретное количество фильтрата, т.е. t представляет собой момент времени, когда измерили 180 г фильтрата. Согласно API RP 63 ("Recommended Practices for Evaluation of Polymers Used in Enhanced Oil Recovery Operations", American Petroleum Institute), значения менее 1,3 являются приемлемыми. В случае идеальной фильтрационной способности MPFR-значение составляет 1.
Полимеризация
В пластиковый сосуд с магнитной мешалкой, рН-измерителем и термометром, 112,8 г 35% раствора акрилата натрия присутствовало, и затем последовательно добавляли 108,33 г дистиллированной воды, 154,84 г раствора акриламида (52%), полученного после отделения, 1,2 г раствора Trilon С (5%) и 4 мл раствора ACVA (4,4'-азобис(4-циановалерьяновой кислоты)) (4%). После доведения значения рН раствора до 6,75, применяя 20% или 2% раствор серной кислоты и добавления оставшегося количества воды (общее количество 131,6 г минус уже добавленное количество воды, минус количество необходимое для кислоты), раствор мономера довели до температуры 4°С. Раствор перенесли в термоколбу, установили датчик температуры и промывали азотом в течение 30 мин. Применяя 1 мл AIBN (азобисизобутиронитрильного) раствора в метаноле (4%), 0,1 мл трет-ВНР (трет-бутилгидропероксида) (1%) и 0,2 мл раствора сульфита натрия (1%) начали полимеризацию. Затем блок геля измельчали с использованием мясорубки, и полученные гранулы геля сушили в течение 2 часов при 55°C с использованием сушилки с псевдоожиженным слоем. Получили белый и твердый гранулированный материал, который перевели в порошкообразное состояние с применением шаровой мельницы.
Фильтрационную способность 2000 частей на миллион раствора полимера, полученного, как описано в настоящей заявке, измеряли в искусственной морской воде. MPFR-значения определяли, как описано в настоящей заявке выше. Измерение вязкости 4000 частей на миллион раствора полимера проводили также в искусственной морской воде. Значения в частях на миллион относятся к массовым частям на основе общей массы раствора полимера. Вязкость измеряют при скорости сдвига 7 1/с при 25°С +/- 1°С на реометре (Anton Paar MCR 301/2) с DIN двухзазорной геометрией. Значения фильтрационной способности и вязкости приведены в Таблицах 1 и 2. Значения в частях на миллион основаны на общей массе раствора полимера.
600
Таблица 1 и таблица 2 показывают OD, MPFR MPFR-значения согласно API 63 (фильтрационная способность) для 2000 частей на миллион раствора полиакриламида и значения вязкости для 4000 частей на миллион раствора полиакриламида водных растворов акриламида в зависимости от скорости подаваемого потока и удельной площади отстаивания, при применении тарельчатого сепаратора для отделения биокатализатора от водного раствора акриламида для различных партий. Водный раствор акриламида был биокаталитически получен посредством гидратации акрилонитрила в акриламид, и используемые биокатализатор отделяли перед полимеризацией, применяя различные скорости подаваемого потока. Партия #3 и партия #4 показывают различные удаления из реакции в различные моменты времени разделения. Полиакриламид был растворен в искусственной морской воде, соответственно, и показанные данные представляют собой средние значения для от 3 до 4 отдельных измерений.
--->
Перечень последовательностей
<110>  BASF SE
<120>  СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТВОРА ПОЛИАКРИЛАМИДА С УВЕЛИЧЕННОЙ ВЯЗКОСТЬЮ
<130>  76089WO02 / B14950WO2
<150>  EP16162684
<151>  2016-03-29
<160>  4
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  612
<212>  ДНК
<213>  Rhodococcus rhodochrous
<400>  1
gtgagcgagc acgtcaataa gtacacggag tacgaggcac gtaccaaggc gatcgaaacc       60
ttgctgtacg agcgagggct catcacgccc gccgcggtcg accgagtcgt ttcgtactac      120
gagaacgaga tcggcccgat gggcggtgcc aaggtcgtgg ccaagtcctg ggtggaccct      180
gagtaccgca agtggctcga agaggacgcg acggccgcga tggcgtcatt gggctatgcc      240
ggtgagcagg cacaccaaat ttcggcggtc ttcaacgact cccaaacgca tcacgtggtg      300
gtgtgcactc tgtgttcgtg ctatccgtgg ccggtgcttg gtctcccgcc cgcctggtac      360
aagagcatgg agtaccggtc ccgagtggta gcggaccctc gtggagtgct caagcgcgat      420
ttcggtttcg acatccccga tgaggtggag gtcagggttt gggacagcag ctccgaaatc      480
cgctacatcg tcatcccgga acggccggcc ggcaccgacg gttggtccga ggaggagctg      540
acgaagctgg tgagccggga ctcgatgatc ggtgtcagta atgcgctcac accgcaggaa      600
gtgatcgtat ga                                                          612
<210>  2
<211>  203
<212>  PRT
<213>  Rhodococcus rhodochrous
<400>  2
Val Ser Glu His Val Asn Lys Tyr Thr Glu Tyr Glu Ala Arg Thr Lys
1               5                   10                  15
Ala Ile Glu Thr Leu Leu Tyr Glu Arg Gly Leu Ile Thr Pro Ala Ala
20                  25                  30
Val Asp Arg Val Val Ser Tyr Tyr Glu Asn Glu Ile Gly Pro Met Gly
35                  40                  45
Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ser Trp Val Asp Pro Glu Tyr Arg Lys
50                  55                  60
Trp Leu Glu Glu Asp Ala Thr Ala Ala Met Ala Ser Leu Gly Tyr Ala
65                  70                  75                  80
Gly Glu Gln Ala His Gln Ile Ser Ala Val Phe Asn Asp Ser Gln Thr
85                  90                  95
His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val
100                 105                 110
Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys Ser Met Glu Tyr Arg Ser Arg
115                 120                 125
Val Val Ala Asp Pro Arg Gly Val Leu Lys Arg Asp Phe Gly Phe Asp
130                 135                 140
Ile Pro Asp Glu Val Glu Val Arg Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Ile
145                 150                 155                 160
Arg Tyr Ile Val Ile Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly Trp Ser
165                 170                 175
Glu Glu Glu Leu Thr Lys Leu Val Ser Arg Asp Ser Met Ile Gly Val
180                 185                 190
Ser Asn Ala Leu Thr Pro Gln Glu Val Ile Val
195                 200
<210>  3
<211>  690
<212>  ДНК
<213>  Rhodococcus rhodochrous
<400>  3
atggatggta tccacgacac aggcggcatg accggatacg gaccggtccc ctatcagaag       60
gacgagccct tcttccacta cgagtgggag ggtcggaccc tgtcaattct gacttggatg      120
catctcaagg gcatatcgtg gtgggacaag tcgcggttct tccgggagtc gatggggaac      180
gaaaactacg tcaacgagat tcgcaactcg tactacaccc actggctgag tgcggcagaa      240
cgtatcctcg tcgccgacaa gatcatcacc gaagaagagc gaaagcaccg tgtgcaagag      300
atccttgagg gtcggtacac ggacaggaag ccgtcgcgga agttcgatcc ggcccagatc      360
gagaaggcga tcgaacggct tcacgagccc cactccctag cgcttccagg agcggagccg      420
agtttctctc tcggtgacaa gatcaaagtg aagagtatga acccgctggg acacacacgg      480
tgcccgaaat atgtgcggaa caagatcggg gaaatcgtcg cctaccacgg ctgccagatc      540
tatcccgaga gcagctccgc cggcctcggc gacgatcctc gcccgctcta cacggtcgcg      600
ttttccgccc aggaactgtg gggcgacgac ggaaacggga aagacgtagt gtgcgtcgat      660
ctctgggaac cgtacctgat ctctgcgtga                                       690
<210>  4
<211>  229
<212>  PRT
<213>  Rhodococcus rhodochrous
<400>  4
Met Asp Gly Ile His Asp Thr Gly Gly Met Thr Gly Tyr Gly Pro Val
1               5                   10                  15
Pro Tyr Gln Lys Asp Glu Pro Phe Phe His Tyr Glu Trp Glu Gly Arg
20                  25                  30
Thr Leu Ser Ile Leu Thr Trp Met His Leu Lys Gly Ile Ser Trp Trp
35                  40                  45
Asp Lys Ser Arg Phe Phe Arg Glu Ser Met Gly Asn Glu Asn Tyr Val
50                  55                  60
Asn Glu Ile Arg Asn Ser Tyr Tyr Thr His Trp Leu Ser Ala Ala Glu
65                  70                  75                  80
Arg Ile Leu Val Ala Asp Lys Ile Ile Thr Glu Glu Glu Arg Lys His
85                  90                  95
Arg Val Gln Glu Ile Leu Glu Gly Arg Tyr Thr Asp Arg Lys Pro Ser
100                 105                 110
Arg Lys Phe Asp Pro Ala Gln Ile Glu Lys Ala Ile Glu Arg Leu His
115                 120                 125
Glu Pro His Ser Leu Ala Leu Pro Gly Ala Glu Pro Ser Phe Ser Leu
130                 135                 140
Gly Asp Lys Ile Lys Val Lys Ser Met Asn Pro Leu Gly His Thr Arg
145                 150                 155                 160
Cys Pro Lys Tyr Val Arg Asn Lys Ile Gly Glu Ile Val Ala Tyr His
165                 170                 175
Gly Cys Gln Ile Tyr Pro Glu Ser Ser Ser Ala Gly Leu Gly Asp Asp
180                 185                 190
Pro Arg Pro Leu Tyr Thr Val Ala Phe Ser Ala Gln Glu Leu Trp Gly
195                 200                 205
Asp Asp Gly Asn Gly Lys Asp Val Val Cys Val Asp Leu Trp Glu Pro
210                 215                 220
Tyr Leu Ile Ser Ala
225
<---