СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НЕЛЕТУЧИХ ПРОДУКТОВ МИКРОБНОГО МЕТАБОЛИЗМА В ТВЕРДОЙ ФОРМЕ
METHOD OF PREPARING NONVOLATILE SOLID MICROBIAL METABOLISM PRODUCTS

Настоящее изобретение касается ферментативного получения нелетучих продуктов микробного метаболизма в твердой форме посредством размола, сжижения и осахаривания источников крахмала, выбираемых из зерен злаковых культур, и использования полученной при этом содержащей сахар жидкой среды для ферментации.
Способы получения нелетучих продуктов микробного метаболизма, например, аминокислот, витаминов и каротиноидов, посредством микробной ферментации, в общем, известны. В зависимости от условий процесса при этом используют различные источники углерода. Разнообразные варианты включают в себя чистую сахарозу, мелассу из свекловичного и тростникового сахара, так называемые „high test molasses" (высокосахаристые мелассы, обращенные тростниково-сахарные мелассы), вплоть до глюкозы из гидролизатов крахмала. Кроме того, для биотехнологического производства L-лизина в качестве дополнительных субстратов, применение которых возможно в технических масштабах, применяют уксусную кислоту и этанол (Pfefferle et al., Biotechnogical Manufacture of Lysine, Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Vol.79 (2003), 59-112).
На использовании указанных источников углерода основаны различные методы и способы ферментативного получения нелетучих продуктов микробного метаболизма на базе сахара. На примере L-лизина, Pfefferle et al. (указ. соч.) описывают эти процессы с точки зрения развития штаммов, процесса и промышленного производства.
Важный источник ферментативного получения нелетучих продуктов микробного метаболизма, опосредованного микроорганизмами, - это крахмал. Прежде чем его можно будет использовать как источник углерода в ферментации, на предшествующих этапах реакции его необходимо подвергнуть сжижению и осахариванию. Крахмал для этих целей получают из натуральных источников крахмала, например картофеля, маниока, злаков, например пшеницы, кукурузы, ячменя, ржи, тритикале или риса, обычно прошедших предварительную очистку, а затем ферментативным способом сжижают и осахаривают, чтобы использовать его затем собственно в ферментации для производства желаемых продуктов метаболизма.
Помимо использования источников крахмала, прошедших такую предварительную очистку, описано также применение источников крахмала, не прошедших предварительную обработку, для создания источников углерода для ферментативного получения нелетучих продуктов микробного метаболизма. Обычно источники крахмала при этом сначала измельчают размолом. Продукт помола затем подвергают сжижению и осахариванию. Поскольку этот продукт помола, естественно, состоит помимо крахмала еще и из ряда не содержащих крахмала компонентов, оказывающих отрицательное влияние на ферментацию, эти компоненты перед ферментацией обычно отделяют. Отделение можно проводить либо непосредственно после размола (международная заявка WO 02/277252; патентные заявки Японии JP 2001-072701; JP 56-169594; патент КНР CN 1218111), после сжижения (международная заявка WO 02/277252; патент КНР CN 1173541) или после осахаривания (патент КНР CN 1266102; Beukema et al.: Production of fermentation syrups by enzymatic hydrolysis of potatoes; potatoe saccharification to give culture medium (Conference Abstract), Symp.Biotechnol. Res. Neth. (1983), 6; NL8302229). Во всех вариантах, однако, в ферментации используют гидролизат крахмала высокой очистки.
В более новых способах используют, в частности, улучшенные методы, которые должны обеспечить возможность очищать, например, сжиженные и осахаренные растворы крахмала перед ферментацией (патент Японии JP 57159500) и ферментационные среды из возобновляемых ресурсов (европейский патент ЕР 1205557).
С другой стороны, широко известно масштабное применение необработанных источников крахмала при ферментативном получении биоэтанола. При этом получил широкое промышленное применение способ, известный как „Dry-milling" («сухой размол»), включающий в себя сухой размол, сжижение и осахаривание источников крахмала. Описание этого процесса приведено, например, в „The Alcohol Textbook - A reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries", Jaques et al. (Hg.), Nottingham Univ. Press 1995, ISBN 1-8977676-735, и в McAloon et al., „Determining the cost of producing ethanol from corn starch and lignocellulosic feedstocks", NREL/TP-580-28893, National Renewable Energy Laboratory, October 2000.
В способе сухого размола на первом этапе цельные зерна злаков, предпочтительно кукурузы, пшеницы, ячменя, проса и ржи, подвергают тонкому помолу. В отличие от способа влажного размола, так называемого „Wet-Milling", при этом не добавляют жидкость. Размол на мелкие частицы предназначен для того, чтобы обеспечить доступ воды и ферментов к содержащемуся  в зернах крахмалу в последующих процессах сжижения и осахаривания.
Поскольку при ферментативном получении этанола биологического происхождения конечный продукт получают дистилляцией, использование источников крахмала в неочищенной форме после процессов сухого размола не представляет особой проблемы. При использовании же способа сухого размола для получения нелетучих продуктов микробного метаболизма возникает проблема, состоящая в потоке твердого вещества, вносимого сахарным раствором в ферментацию, поскольку оно может как отрицательно сказаться на ферментации, так и существенно осложнить последующую переработку.
Так, для многих видов ферментации лимитирующим фактором является снабжение кислородом применяемых микроорганизмов, в особенности, когда их потребность в кислороде высока. О влиянии высокого содержания твердых веществ на переход кислорода из газовой фазы в жидкую и, таким образом, на уровень кислородного обмена известно в общем мало. С другой стороны, известно, что рост вязкости, связанный с повышением концентрации твердых веществ, снижает уровень кислородного обмена. Если, кроме того, в ферментационную среду с твердыми веществами вводят поверхностно-активные вещества, последние влияют на склонность пузырьков газа к коагуляции. Обусловленная этим величина пузырьков, в свою очередь, существенно влияет на кислородный обмен (Mersmann, A. et al.: Selection and Design of Aerobic Bioreactors, Chem. Eng. Technol. 13 (1990), 357-370).
Из-за внесения твердых веществ уже при создании крахмалсодержащей суспензии возможно достижение критических величин вязкости используемой среды, поскольку гомогенное перемешивание, например, суспензии, содержащей более 30% масс. кукурузной муки в воде, невозможно (Industrial Enzymology, 2. Aufl., T.Godfrey, S.West, 1996). Поэтому концентрация глюкозы при использовании обычных технологий ограничена. По экономическим причинам, как правило, не выгодно работать с растворами более низкой концентрации, поскольку это ведет к чрезмерному разбавлению ферментационного бульона. Это обуславливает снижение достижимой конечной концентрации итоговых продуктов, что ведет к дополнительным расходам при получении их из ферментационной среды, а пространственно-временной выход снижается, что ведет к потребности в больших объемах, т.е. к росту инвестиций при неизменной производительности.
Ввиду этих сложностей известные доныне варианты способов сухого размола непригодны для подготовки источников крахмала для ферментативного получения нелетучих продуктов микробного метаболизма, а поэтому не имеют заметного экономического значения. На настоящий момент имеются описания попыток переноса концепции сухого размола и принципиальных преимуществ, связанных с этим способом, на получение нелетучих продуктов микробного метаболизма в промышленных масштабах только при использовании маниока в качестве источника крахмала.
Так, в патентной заявке Японии JP 2001/275693 описан способ ферментативного получения аминокислот, при котором в качестве источника крахмала используют очищенные от кожуры клубни маниока, которые размалывают в сухом виде. Для проведения процесса по этому способу, однако, необходимо задать в продукте помола размер частиц не более 150 мкм. При используемой для этого фильтрации перед сжижением/осахариванием имеющегося крахмала и последующей ферментацией происходит отделение более 10% масс. используемого продукта помола, включая не содержащие крахмала компоненты. Похожий способ описан в патентной заявке Японии JP 2001/309751 для получения кормовой добавки, содержащей аминокислоты.
По сравнению с другими источниками крахмала, в частности злаками или зернами злаков, маниок, однако, относительно прост для сухого размола. В то время как типичное содержание крахмала в корнях маниока составляет в сухом состоянии, по меньшей мере, 80% масс. (Menezes et al., Fungal celluloses as an aid for the saccharification of Cassava, Biotechnology and Bioengineering, Bd. 20 (4), 1978, John Wiley and Sons, Inc., Tabelle 1, Seite 558), в злаках это содержание крахмала в сухом состоянии значительно ниже, как правило, менее 70% масс., например ок. 68% масс. у кукурузы, а у пшеницы - ок. 65% масс. (Jaques et al., The Alcohol Textbook, cm. выше). Соответственно, раствор глюкозы, получаемый после сжижения и осахаривания, содержит при использовании размолотого сухим способом маниока относительно мало посторонних компонентов, а в частности меньше твердых веществ. Эти посторонние компоненты, а особенно не содержащие крахмала твердые вещества, как оказалось, представляют собой проблему при использовании зерен злаков в качестве источников крахмала, поскольку доля этих твердых веществ в таких источниках крахмала значительно выше, чем в маниоке. Ввиду повышенного количества посторонних компонентов, в частности, существенно возрастает вязкость реакционной смеси.
Следует полагать, что крахмал из маниока относительно легко подвергается обработке. Он, правда, обладает более высокой вязкостью при температуре набухания, чем кукурузный крахмал, но зато при росте температуры вязкость в случае маниока снижается быстрее, чем, например, у кукурузного крахмала (Menezes, T.J.B. de, Saccharification of Cassava for ethyl alcohol production, Process Biochemistry, 1978, Seite 24, правый столбец). Кроме того, температуры набухания и желатинизации крахмала из маниока ниже, чем таковые крахмала из злаков, например маиса, а поэтому его доступность для бактериальной α-амилазы выше, чем крахмала из злаков (Menezes, T.J.B. de, a.a.O.).
К прочим преимуществам маниока по сравнению с источниками крахмала из злаков относятся низкое содержание в ней клетчатки и фитатов. Клетчатка и полуклетчатка, особенно при осахаривании в кислой среде, могут быть преобразованы в фурфуролы (Jaques et al., The Alcohol Textbook, cм. выше; Menezes, T.J.B. de, см. выше), которые, в свою очередь, могут оказывать ингибирующее воздействие на используемые в ферментации микроорганизмы. Фитат также ингибирует используемые в ферментации микроорганизмы.
Соответственно, хотя технически и возможно перерабатывать маниок в качестве источника крахмала способом, соответствующим понятию сухого размола, такой способ на основе маниока тем не менее сложен, не оптимизирован и, следовательно, не слишком широко распространен. Об использовании в качестве источников крахмала злаков в способе, соответствующем понятию сухого размола, для получения продуктов тонких химических технологий, например нелетучих продуктов микробного метаболизма, до сих пор не сообщали.
В международной заявке WO 2005/116228 впервые описан способ ферментации на основе сахара, предназначенный для получения продуктов тонких химических технологий, при котором в качестве источника крахмала используют продукт помола зерен злаков или других сухих плодов или семян зерновых, не удаляя не содержащие крахмала компоненты перед ферментацией. Полноценное удаление летучих компонентов из ферментационного бульона с получением твердого вещества, содержащего продукт ферментации, не описано.
Задача настоящего изобретения состояла в том, чтобы предложить эффективный способ для ферментативного получения на основе сахара нелетучих продуктов микробного метаболизма, допускающий использование в качестве источников крахмала злаков, включая кукурузу. Способ должен давать возможность легко обрабатывать ферментационную смесь, в частности, посредством сушки. Кроме того, он должен отличаться простотой обращения с применяемыми средами, а в особенности, позволять обойтись перед ферментацией без сложных этапов предварительной или дополнительной очистки, как, например, отделения твердых компонентов, не содержащих крахмал.
В рамках проведенных фирмой-заявителем работ неожиданно было обнаружено, что такой способ, несмотря на свойственное ему большое количество вносимых твердых веществ, можно эффективно применять, если для получения содержащей сахар жидкой среды проводить в жидкости на основе воды сжижение продукта помола, полученного из зерен злаков, в присутствии, по меньшей мере, одного фермента, сжижающего крахмал, а затем осахаривать, используя, по меньшей мере, один осахаривающий фермент, причем, по меньшей мере, одну долю продукта помола в процессе сжижения добавляют непрерывным или периодическим образом в жидкость на водной основе.
Объектом изобретения, таким образом, является способ получения, по меньшей мере, одного нелетучего продукта микробного метаболизма в твердой форме посредством микробной ферментации на основе сахара, при котором культивируют штамм микроорганизмов, производящий желаемый продукт (желаемые продукты) метаболизма, с использованием содержащей сахар жидкой среды, имеющей содержание моносахаридов более 20% масс. от общей массы жидкой среды, а затем удаляют основную часть летучих компонентов ферментационного бульона, причем содержащую сахар жидкую среду создают посредством:
а1) получения продукта помола размолом источника крахмала, выбранного из зерен злаков; и
а2) сжижения продукта помола в жидкости на основе воды в присутствии, по меньшей мере, одного сжижающего крахмал фермента и последующего осахаривания с применением, по меньшей мере, одного осахаривающего фермента,
отличающийся тем, что, по меньшей мере, одну долю продукта помола в процессе сжижения непрерывным или периодическим образом добавляют в жидкость на водной основе.
Источниками крахмала являются, в первую очередь, сухие плоды или семена зерновых, которые в сухом состоянии характеризуются долей крахмала не менее 40% масс., а предпочтительно не менее 50% масс. Таковые имеются во многих широкомасштабно культивируемых на сегодняшний день злаковых растениях, например кукурузе, пшенице, овсе, ячмене, ржи, тритикале, рисе и в различных сортах проса, например сорго и белом сорго. Предпочтительно выбирать источник крахмала из группы, включающей зерна кукурузы, ржи, тритикале и пшеницы. В принципе, способ согласно изобретению можно также применять и с использованием аналогичных источников крахмала, как, например, смеси различных содержащих крахмал плодов или семян зерновых.
Сахара, содержащиеся в жидкой среде согласно изобретению, содержащей сахар, представляют собой в основном моносахариды, например гексозы и пентозы, например глюкозу, фруктозу, маннозу, галактозу, сорбозу, ксилозу, арабинозу и рибозу, в особенности глюкозу. Доля отличных от глюкозы моносахаридов может варьировать в зависимости от используемого источника крахмала и имеющихся в его составе не содержащих крахмала компонентов, а посредством вариантов применения способа, например посредством включения компонентов клетчатки ввиду добавления целлюлаз, на нее можно влиять. Целесообразно, чтобы моносахариды содержащей сахар жидкой среды включали в себя глюкозу в количестве не менее 60% масс., предпочтительно не менее 70% масс., а особо предпочтительно не менее 80% масс. от общего количества сахара, имеющегося в содержащей сахар жидкой среде. Обычно доля глюкозы находится в пределах от 75 до 99% масс., в частности от 80 до 97% масс., а особенно от 85 до 95% масс. от общего количества сахара, имеющегося в содержащей сахар жидкой среде.
Концентрация моносахаридов, в особенности концентрация глюкозы, в получаемой согласно изобретению жидкой среде часто составляет, по меньшей мере, 25% масс., предпочтительно не менее 30% масс., особо предпочтительно не менее 35% масс., в частности не менее 40% масс., например от 25 до 55% масс., в частности от 30 до 52% масс., особо предпочтительно от 35 до 50% масс., а в особенности от 40 до 48% масс. от общей массы жидкой среды.
Согласно изобретению жидкая среда, содержащая сахар, в которой культивируют штамм микроорганизмов, производящий желательные продукты метаболизма, содержит, по меньшей мере. часть, предпочтительно не менее 20% масс., в частности не менее 50% масс., в особых случаях не менее 90% масс., а в весьма специальных случаях не менее 99% масс. имеющихся в размолотых зернах злаков не содержащих крахмал твердых компонентов, соответственно степени помола. При расчете относительно содержащих крахмал компонентов продукта помола (и, соответственно, относительно количества моносахарида в содержащей сахар жидкой среде) доля не содержащих крахмал твердых компонентов предпочтительно составляет не менее 10% масс., в частности не менее 25% масс., например от 25 до 75% масс., а в особых случаях от 30 до 60% масс.
Для получения содержащей сахар жидкой среды на этапе а1) конкретный источник крахмала с добавлением жидкости, например воды, или без такового размалывают, предпочтительно, без добавления жидкости. Возможно также сочетание сухого размола с последующим мокрым размолом. Для сухого размола, как правило, используют молотковые дробилки, роторные мельницы или вальцовые дробилки, для мокрого размола пригодны смесители, шаровые мельницы с мешалкой, циркуляционные мельницы, дисковые мельницы, мельницы с кольцевой камерой, вибрационные или планетарные мельницы. В принципе, возможно использование и других мельниц. Необходимое для мокрого размола количество жидкости специалист может определить в процессе проведения опытов. Обычно его задают так, чтобы содержание сухого вещества находилось в пределах от 10 до 20% масс.
Размолом задают величину зерна (частиц), пригодную для последующих этапов способа. При этом оказалось целесообразно, чтобы при размоле, особенно в случае сухого размола, продукт помола, получаемый на этапе а1), содержал частицы муки, т.е. компоненты в виде частиц, с размером в пределах от 100 до 630 мкм в количестве от 30 до 100% масс., предпочтительно от 40 до 95% масс., а особо предпочтительно от 50 до 90% масс. Целесообразно, чтобы полученный продукт помола содержал 50% масс. частиц муки размером более 100 мкм. Как правило, по меньшей мере 95% масс. полученных при размоле частиц муки обладают размером менее 2 мм. Измерение размера частиц при этом проводят посредством ситового анализа с использованием вибрационной анализирующей машины.
Малый размер частиц принципиально выгоден для достижения высокого выхода продукции. Слишком малый размер частиц, однако, может вызвать проблемы, в частности, ввиду образования комьев/агломерации при подмешивании продукта помола во время сжижения или последующей обработки, например, при сушке твердых веществ после этапа ферментации.
Для обозначения видов муки обычно используют степень помола или тип муки, причем они соотносятся друг с другом так, что с ростом степени помола возрастает также и характеристическое число типа муки. Степень помола соответствует массе полученной муки относительно 100 частей размалываемого материала. В то время как на начальных этапах размола получают чистую и наиболее тонкую муку, например, из внутренней части зерна при дальнейшем размоле, то есть при возрастании степени помола, возрастает доля грубых волокон и пленчатость (доля оболочек), а доля крахмала при этом уменьшается. Степень размола, следовательно, отображается также в так называемых типах муки, которые указывают в числах и используют для классификации муки, особенно муки злаковых, и которые основаны на содержании в муке золы (так называемая шкала зольности). Типы муки или номер типа при этом означает количество зол (минеральных веществ) в мг, которое остается при сжигании 100 г сухой муки. Для муки злаковых более высокий номер типа означает более высокую степень помола, поскольку внутренняя часть зерна злаковых содержит ок. 0,4% масс., а оболочка, напротив, ок. 5% масс. золя. Следовательно, при более низкой степени помола мука злаковых состоит преимущественно из измельченного эндосперма, т.е., крахмалистой части зерен злаковых; при более высокой степени помола мука злаковых содержит также измельченный алейроновый слой зерен злаковых, богатый белком, а в случае продуктов грубого дробления еще и компоненты зародышей, содержащие белок и жир, а также оболочек семян, содержащих грубые волокна и золи. Для целей согласно изобретению предпочтительны виды муки с высокой степенью помола либо высоким типовым числом. Если в качестве источника крахмала используют злаковые, то предпочтительно размалывать и подвергать дальнейшей обработке целые неочищенные зерна, при необходимости, после предварительного механического отделения зародышей и лузги.
Для сжижения крахмала в продукте помола на этапе а2) в реактор в процессе сжижения и предпочтительно перед осахариванием вводят, по меньшей мере, часть продукта помола, предпочтительно не менее 40% масс., в частности не менее 50% масс., а крайне предпочтительно не менее 55% масс. Добавленное количество продукта помола не должно превышать 90% масс., в частности 85% масс, а особо предпочтительно 80% масс. от общего количества используемого продукта помола. Обычно часть продукта помола, добавляемую в реактор в процессе сжижения, вводят в тех условиях, которые и имеются при сжижении. Добавление можно осуществлять периодическим способом, т.е. частями в виде нескольких порций, которые в каждом случае составляют не более 20% масс., особо предпочтительно не более 10% масс., например от 1 до 20% масс., в особенности от 2 до 10% масс. общего количества подлежащего сжижению продукта помола, или же непрерывно. В рамках изобретения существенно, чтобы к началу сжижения в реакторе находилась только часть продукта помола, предпочтительно не более 60 вес.%, в особенности не более 50 вес.%, а особо предпочтительно не более 45 вес.% продукта помола, а остальное количество продукта помола добавляли во время сжижения.
Продукт помола можно вводить в виде порошка, т.е. без добавления воды, или в виде суспензии в жидкости на основе воды, например в чистой воде, рециркулированной воде из процесса, например из ферментации или из последующей обработки.
Сжижение также можно проводить непрерывно, например, в многоступенчатом каскаде реакций.
Согласно изобретению сжижение на этапе а2) происходит в присутствии, по меньшей мере, одного сжижающего крахмал фермента, который целесообразно выбирать из α-амилаз. Также возможно применение других сжижающих крахмал ферментов, активных и устойчивых в условиях этой реакции.
Нижеследующие варианты исполнения касаются применения α-амилаз; они, однако, действительны вообще для всех ферментов, сжижающих крахмал.
α-Амилаза (либо используемый фермент, сжижающий крахмал) может быть заранее помещена в реакционный сосуд или же добавлена во время проведения этапа а2). Предпочтительно часть α-амилазы, необходимой на этапе а2), добавляют в начале этапа а2) или же помещают эту часть в реактор заранее. Общее количество α-амилазы обычно лежит в пределах от 0,002 до 3,0% масс., предпочтительно от 0,01 до 1,5% масс., а особо предпочтительно от 0,02 до 0,5% масс. от общего количества используемого источника крахмала.
Сжижение можно проводить при температуре выше или ниже температуры желатинизации. Предпочтительно сжижение на этапе а2) проводят, по крайней мере, некоторое время выше температуры желатинизации используемого крахмала (так называемый Cooking Prozess). Как правило, выбирают температуру в пределах от 70 до 165°С, предпочтительно от 80 до 125°С, а особо предпочтительно от 85 до 115°С, причем предпочтительно, чтобы температура превышала температуру желатинизации, по меньшей мере, на 5°С, а особо предпочтительно, не менее чем на 10°С.
2
4
3
4
Для оптимизации эффективности α-амилазы этап а2) целесообразно проводить, по меньшей мере, на протяжении некоторого времени при величине рН, лежащей в слабокислой области, предпочтительно между 4,0 и 7,0, особо предпочтительно от 5,0 до 6,5, причем обычно в начале этапа а2) или перед ним устанавливают величину рН; эту величину целесообразно контролировать и, при необходимости, корректировать во время сжижения. Установку величины рН предпочтительно проводить с помощью разбавленных минеральных кислот, например HSO или HPO, либо же с помощью разведенных щелочей, например водного раствора едкого натра (NaOH) или едкого кали (КОН), или с помощью гидроксидов щелочноземельных металлов, например водного раствора гидроксида кальция.
В предпочтительной форме исполнения этап а2) способа согласно изобретению проводят так, чтобы часть, составляющую не более 60% масс., предпочтительно максимум 50% масс., а особо предпочтительно максимум 45% масс., например от 10 до 60% масс., в особенности от 15 до 50% масс., а особо предпочтительно 20 - 45% масс., от общего количества продукта помола суспендировать в жидкости на основе воды, например в чистой воде, рециркулированной воде из процесса, например из ферментации или из последующей обработки или в смеси этих жидкостей, а затем проводить сжижение. Жидкость, используемая для приготовления суспензии продукта помола, может быть предварительно подогрета до слегка повышенной температуры, например в пределах от 40 до 60°С. Предпочтительно, чтобы температура жидкости, используемой для приготовления суспензии продукта помола, не превышала 30°С, а в особенности равнялась комнатной температуре, т.е. от 15 до 28°С.
Затем в эту суспензию вводят, по меньшей мере, один фермент, сжижающий крахмал, предпочтительно α-амилазу. Если используют α-амилазу, то целесообразно добавлять лишь часть α-амилазы, например от 10 до 70% масс., а в особенности от 20 до 65% масс. от общего количества применяемой на этапе а2) α-амилазы. Добавленное к этому моменту количество α-амилазы задают соответственно активности конкретной α-амилазы относительно используемого источника крахмала с учетом условий реакции, оно располагается обычно в пределах от 0,0004 до 2,0% масс., предпочтительно от 0,001 до 1,0% масс., а особо предпочтительно от 0,02 до 0,3% масс. от общего количества используемого источника крахмала. В качестве альтернативы можно смешать эту часть α-амилазы с используемой жидкостью перед созданием суспензии.
При этом целесообразно добавлять часть α-амилазы в суспензию перед началом нагрева до температуры, имеющей место при сжижении, в частности при комнатной температуре или при лишь слегка повышенной температуре, например в пределах от 20 до 30°С.
-1
Целесообразно выбирать количества α-амилазы и продукта помола так, чтобы вязкость во время процесса осахаривания, в особенности во время процесса желатинизации, оказывалась снижена достаточно, чтобы было возможно эффективное перемешивание суспензии, например, мешалкой. Предпочтительно, чтобы вязкость реакционной смеси во время желатинизации составляла не более 20 Па·с, особо предпочтительно максимум 10 Па·с, а крайне предпочтительно максимум 5 Па·с. Измерение вязкости осуществляют, как правило, вискозиметром Haake типа Roto Visko RV20 с измерительной системой М5 и измерительным устройством MVDIN при температуре 50°С и скорости сдвига, составляющей 200 с.
Приготовленную таким образом суспензию затем целесообразно нагреть до температуры выше температуры желатинизации используемого крахмала. Как правило, выбирают температуру в пределах от 70 до 165°С, предпочтительно от 80 до 125°С, а особо предпочтительно от 85 до 115°С, причем предпочтительно, чтобы температура превышала таковую желатинизации, по меньшей мере, на 5°С, а особо предпочтительно не менее чем на 10°С. Контролируя вязкость, последовательно добавляют в суспензию дальнейшие количества продукта помола, например, порциями, составляющими в каждом случае от 2 до 20% масс., а особенно, от 5 до 10% масс. от общего количества используемого продукта помола. Предпочтительно добавлять в реакционную смесь в процессе сжижения подлежащую введению долю продукта помола не менее чем 2, предпочтительно не менее чем 4 и особо предпочтительно не менее чем 6 порциями. В качестве альтернативы можно осуществлять добавление части продукта помола, не введенной при приготовлении суспензии, непрерывно в процессе сжижения. Температуру при введении целесообразно поддерживать выше температуры желатинизации крахмала. Предпочтительно осуществлять добавление продукта помола таким образом, чтобы вязкость реакционной смеси во время добавления или же во время сжижения составляла не более 20 Па·с, особо предпочтительно максимум 10 Па·с и крайне предпочтительно не более 5 Па·с.
После добавления всего продукта помола реакционную смесь обычно некоторое время, например от 30 до 60 минут или дольше, если это необходимо, выдерживают при температуре, установленной выше температуры желатинизации крахмала, при этом крахмальные компоненты продукта помола вывариваются. Затем реакционную смесь, как правило, охлаждают до несколько более низкой температуры, превышающей температуру желатинизации, например до 75-90°С, после чего добавляют еще одну часть α-амилазы, предпочтительно основную часть. В зависимости от активности используемой α- амилазы при условиях реакции, количество α-амилазы, добавляемой в этот момент, предпочтительно составляет от 0,002 до 2,0% масс., особо предпочтительно от 0,01 до 1,0% масс., а крайне предпочтительно от 0,02 до 0,4% масс. от общего количества используемого источника крахмала.
При таких температурах происходит разрушение гранулированной структуры крахмала (желатинизация), благодаря чему становится возможно его ферментативное расщепление (сжижение). Для полного расщепления крахмала до декстринов реакционную смесь выдерживают при заданной температуре или, при необходимости, дополнительно нагревают до тех пор, пока тест на крахмал с использованием йода или, при необходимости, иной тест на наличие крахмала не даст отрицательный или в основном отрицательный результат. При необходимости, в реакционную смесь при этом можно ввести еще одну или несколько порций α-амилазы, например, в пределах от 0,001 до 0,5% масс., а предпочтительно от 0,002 до 0,2% масс. от общего количества используемого источника крахмала.
По завершении сжижения крахмала проводят осахаривание содержащихся в жидкой среде декстринов, т.е. их разложение до глюкозы, непрерывным или периодическим способом, предпочтительно непрерывным. Сжиженную среду можно полностью осахарить в специальном баке осахаривания, прежде чем подать ее на этап ферментации b). С другой стороны, оказалось выгодно проводить перед ферментацией лишь частичное осахаривание. Например, возможен такой образ действий, при котором осахаривают часть содержащихся в жидкой среде декстринов, например, в пределах от 10 до 90% масс., а особенно в пределах от 20 до 80% масс. от общей массы декстринов (или исходного крахмала), а полученную жидкую среду, содержащую сахар, используют в ферментации. В ферментационной среде в таком случае может происходить дальнейшее осахаривание in situ. Также возможно проведение осахаривания без использования отдельного бака осахаривания непосредственно в ферментаторе (in situ).
Преимущества осахаривания по месту, т.е. осахаривания, происходящего частично или полностью в ферментаторе, состоят, с одной стороны, в снижении капиталовложений, а с другой - благодаря замедленному высвобождению глюкозы можно, при необходимости, заранее создать повышенную концентрацию в порции (Batch) без того, чтобы наступило ингибирование или изменение метаболизма используемых микроорганизмов. В случае E.coli, повышенная концентрация глюкозы ведет, например, к образованию органических кислот (ацетата), в то время как Saccharomyces cerevisae в этом случае, например, переключается на сбраживание, хотя в вентилируемых ферментаторах достаточно кислорода (эффект Крэбтри). Замедленное высвобождение глюкозы можно обеспечить, регулируя концентрацию глюкоамилазы. Благодаря этому можно подавить вышеупомянутые эффекты, и можно заранее разместить больше субстрата, так что разведение, создаваемое поступающим потоком, может быть снижено.
В случае раздельного осахаривания, например осахаривания в баке осахаривания, сжиженный раствор крахмала обычно охлаждают или подогревают до температурного оптимума осахаривающего фермента или чуть ниже его, например до температуры от 50 до 70°С, предпочтительно от 60 до 65°С, а затем добавляют к нему глюкоамилазу.
Если осахаривание проводят в ферментаторе, сжиженный раствор крахмала, как правило, охлаждают до температуры ферментации, т.е. до 32-37°С, прежде чем подавать его в ферментатор. Глюкоамилазу (или же иной, по меньшей мере, один осахаривающий фермент) для осахаривания в этом случае добавляют непосредственно в ферментационный бульон. Осахаривание сжиженного крахмала по этапу а2) при этом происходит параллельно метаболизации сахара микроорганизмами.
2
Перед добавлением глюкоамилазы целесообразно довести величину рН жидкой среды до величины, лежащей в диапазоне оптимальной эффективности используемой глюкоамилазы, предпочтительно в пределах от 3,5 до 6,0; особо предпочтительно от 4,0 до 5,5 и крайне предпочтительно от 4,0 до 5,0. Также, однако, возможно, особенно при проведении осахаривания непосредственно в ферментаторе, установить рН вне упомянутых выше диапазонов, например в пределах от 6,0 до 8,0. Например, при производстве лизина, пантотената и витамина B, несмотря на ограниченную активность стандартных глюкоамилаз в этом диапазоне рН, это может быть в общем целесообразно или необходимо по причине заданных условий ферментации.
В предпочтительной форме исполнения осахаривание проводят в специальном баке осахаривания. Для этого доводят температуру сжиженного раствора крахмала до оптимальной для фермента температуры или таковой несколько ниже, а величину рН доводят описанным выше способом до оптимальной для фермента.
Глюкоамилазу добавляют в содержащую декстрины жидкую среду обычно в количестве от 0,001 до 5,0% масс., предпочтительно от 0,005 до 3,0% масс., а особо предпочтительно от 0,01 до 1,0% масс. от общего количества использованного источника крахмала. После добавления глюкоамилазы содержащую декстрины суспензию целесообразно выдерживать на протяжении некоторого времени, например от 2 до 72 часов или более, в той мере, в которой это необходимо, в особенности от 5 до 48 часов, при заданной температуре, причем происходит осахаривание декстринов до моносахаридов. Прогресс осахаривания можно отслеживать известными специалисту методами, например ВЭЖХ, ферментными тестами или стержнями для теста на глюкозу. Осахаривание завершено, когда концентрация моносахаридов в основном прекращает расти или начинает опять уменьшаться.
В предпочтительной форме исполнения добавление продукта помола осуществляют в присутствии, по меньшей мере, одной α-амилазы, а также, по меньшей мере, одной глюкоамилазы на этапе а2) таким образом, чтобы вязкость жидкой среды составляла не более 20 Па·с, особо предпочтительно максимум 10 Па·с и крайне предпочтительно не более 5 Па·с. Для поддержания контроля вязкости оказалось целесообразно добавлять, по меньшей мере, 25% масс., предпочтительно не менее 35% масс. и особо предпочтительно не менее 50% масс. общего количества добавляемого продукта помола при температуре выше температуры желатинизации содержащегося в продукте помола крахмала. На регулирование вязкости можно также влиять, добавляя, по меньшей мере, один фермент, сжижающий крахмал, предпочтительно α-амилазу, или/и, по меньшей мере, один осахаривающий фермент, предпочтительно глюкоамилазу, также порциями.
Проводя этапы а1) и а2), можно создать содержащую сахар жидкую среду с концентрацией моносахаридов, в частности, содержанием глюкозы предпочтительно более 25% масс., например более 30% масс. или более 35% масс., особо предпочтительно более 40% масс., например от 25 до 55% масс., в частности, от 30 до 52% масс., особо предпочтительно от 35 до 50% масс., а в особенности от 40 до 48% масс. от общей массы жидкой среды. Общее содержание твердых веществ в жидкой среде тогда составляет обычно от 30 до 70% масс., нередко от 35 до 65% масс., в особенности от 40 до 60% масс. Концентрация моносахаридов, в частности глюкозы, и содержание твердых веществ зависят, известным образом, от соотношения продукта помола, используемого при сжижении, и количества жидкости, а также от доли крахмала в продукте помола.
Для сжижения крахмальной доли в продукте помола можно, в принципе, использовать все α-амилазы (класс ферментов ЕС 3.2.1.1), в частности α-амилазы, которые получают из Bacillus lichenformis или Bacillus staerothermophilus, а в особенности таковые, применяемые для сжижения материалов, получаемых способом сухого размола в процессе производства биоэтанола. Пригодные для сжижения α-амилазы также представлены на рынке, например, от фирмы Novozymes под торговым названием Termamyl 120 L, Тур L; или от фирмы Genencor под обозначением Spezyme. Также можно использовать для сжижения сочетание различных α-амилаз.
Для осахаривания декстринов (т.е. олигосахаридов) в сжиженном растворе крахмала, в принципе, можно применять все пригодные для сжижения декстринов ферменты, обычно глюкоамилазы (класс ферментов ЕС 3.2.1.3). В частности, пригодны к использованию глюкоамилазы, полученные из Aspergilus, а в особенности таковые, применяемые для осахаривания материалов, получаемых способом сухого размола в процессе производства биоэтанола. Пригодные для сжижения α-амилазы также представлены на рынке, например, от фирмы Novozymes под торговым названием Dextrozyme GA; или от Genencor под обозначением Optidex. Также можно использовать сочетание различных осахаривающих ферментов, например различных глюкоамилаз.
2+
2+
2
2
Для стабилизации используемых ферментов можно, при необходимости, отрегулировать концентрацию ионов Са, например, доводя ее с помощью CaCl или Са(ОН) до оптимальной для конкретного фермента величины. Подходящие концентрации специалист может определить в процессе проведения опытов. Если в качестве α-амилазы используют, например, термамил, то целесообразно довести концентрацию Са в жидкой среде до величины, например, от 50 до 100 частей на млн, предпочтительно от 60 до 80 частей на млн и особо предпочтительно ок. 70 частей на млн.
Поскольку для получения содержащей сахар жидкой среды согласно а1) подвергают размолу весь источник крахмала, т.е. целое зерно, в ее состав входят также и не содержащие крахмала компоненты источника. Нередко этим обусловлено поступление из плода зерновых доли фитата, которой нельзя пренебречь. Чтобы избежать вызванного этим ингибирующего действия, в жидкую среду на этапе а2) целесообразно добавить, по меньшей мере, одну фитазу, прежде чем подать содержащую сахар жидкую среду на этап ферментации.
Добавление фитазы можно осуществлять до сжижения или осахаривания, во время таковых или после них, если она обладает достаточной температурной стабильностью для данного этапа.
Можно применять любые фитазы, активность которых в условиях реакции не подвергается существенным ограничениям. Предпочтительны фитазы с температурной устойчивостью (Т50) выше 50°С и особо предпочтительно выше 60°С.
Количество фитазы составляет обычно от 1 до 10000 единиц/кг источника крахмала, а в особенности - от 10 до 2000 ед./кг источника крахмала.
Для повышения общего выхода сахара либо же для получения свободных кислот в реакционную смесь во время производства содержащей сахар жидкой среды можно, помимо указанных, добавлять другие ферменты, например пуллуланазы, целлюлазы, гемицеллюлазы, глюканазы, ксиланазы, глюкозидазы или протеазы. Добавление этих ферментов может положительно сказаться на вязкости, т.е. снизить ее (например, ввиду расщепления длинноцепочечных глюканов и/или (арабино-)ксиланов), обеспечить высвобождение пригодных для метаболизации глюкозидов и высвобождение (остаточного) крахмала. Использование протеаз дает аналогичные положительные результаты, причем дополнительно могут выделяться аминокислоты как факторы роста для ферментации.
В способе согласно изобретению содержащую сахар жидкую среду используют для ферментативного производства нелетучего продукта микробного метаболизма. Для этого содержащую сахар жидкую среду, изготовленную на этапах а1) и а2), подают на ферментацию. В процессе ферментации микроорганизмы производят нелетучие продукты микробного метаболизма.
Ферментация может, как правило, проходить известным специалисту обычным образом. При этом объемное отношение подаваемой содержащей сахар жидкой среды к предварительно помещенной (в реактор) и содержащей микроорганизмы жидкой среде обычно лежит в пределах от ок. 1:10 до 10:1, предпочтительно в пределах от ок. 1:2 до 2:1, например 1:2 или ок. 2:1, а особенно ок. 1:1. Контролировать содержание сахара в ферментационном бульоне можно, в частности, через скорость подачи содержащей сахар жидкой среды. Как правило, скорость подачи задают таким образом, чтобы содержание моносахаридов в ферментационном бульоне находилось в пределах от 0% масс. до ок. 5% масс.; ферментацию, однако, можно проводить и при гораздо более высоком содержании моносахаридов в ферментационном бульоне, например при ок. от 5 до 20% масс. и в особенности от 10 до 20% масс.
Поскольку осахаривание и ферментацию проводят отдельно, полученную на этапе а) содержащую сахар жидкую среду можно перед ферментацией при необходимости стерилизовать. При этом уничтожают, возможно, присутствующие вредные микроорганизмы, которые, например, привнесены с продуктом помола (контаминанты), с помощью подходящего способа, обычно термического. При термическом способе бульон обычно нагревают до температур, превышающих 80°С. Уничтожение или лизис клеток можно проводить непосредственно перед ферментацией. Для этого на лизис или уничтожение подают всю содержащую сахар жидкую среду. В рамках способа согласно изобретению, однако, оказалось, что проводить этап стерилизации, описанный здесь, перед ферментацией нет необходимости, но гораздо более целесообразным оказалось такой этап стерилизации не проводить. Соответственно к предпочтительной форме исполнения изобретения относится способ, при котором жидкую среду, полученную на этапе а) (или на этапах а1) и а2)), непосредственно, т.е. без предварительной стерилизации, подают на ферментацию или, по меньшей мере, частично проводят осахаривание по месту.
В результате ферментации получают жидкую среду, которая кроме желательного нелетучего продукта микробного метаболизма и воды в основном содержит нерастворимые твердые вещества, например биомассу, полученную во время ферментации, не подвергающиеся метаболизации компоненты осахаренного раствора крахмала, а в особенности не содержащие крахмала твердые компоненты источника крахмала, как, например, волокна, а также заранее растворенные в ферментационном бульоне компоненты (растворимые компоненты), например не подвергшиеся утилизации буферные и питательные соли, а также не подвергшиеся реакции моносахариды (т.е. не переработанный сахар). Эту жидкую среду в дальнейшем также называют ферментационным бульоном, причем выражение «ферментационный бульон» также включает в себя жидкую среду (содержащую сахар), в которой прошло только частичное или неполное ферментативное преобразование содержащегося в нем сахара, т.е. прошла частичная или неполная микробная метаболизация моносахаридов.
Согласно изобретению удаляют, по меньшей мере, летучие компоненты ферментационной среды. Таким образом, получают твердое вещество, которое содержит нелетучий полезный продукт совместно с нерастворимыми компонентами ферментационного бульона и, возможно, с компонентами, содержавшимися в ферментационном бульоне в растворенном виде.
В рамках настоящего изобретения под нелетучими продуктами микробного метаболизма подразумевают соединения, которые в общем случае невозможно удалить из ферментационного бульона путем дистилляции, не подвергнув их разрушению.
Эти соединения, как правило, характеризуются точкой кипения выше температуры кипения воды, нередко выше 150°С, а в особенности выше 200°С при нормальном давлении. Как правило, это соединения, которые при нормальных условиях (298 K, 101,3 кПа) находятся в твердом агрегатном состоянии. Возможно, однако, также применять способ согласно изобретению для производства нелетучих продуктов микробного метаболизма, которые при нормальном давлении характеризуются точкой плавления ниже температуры кипения воды или/и обладают маслянистой консистенции. В этом случае, как правило, необходимо контролировать максимальные температуры во время обработки, в особенности во время сушки. Также целесообразно получать эти соединения, осуществляя их формирование в псевдотвердой форме на адсорбентах.
2
3
4
4
3
4
Пригодными для этих целей адсорбентами являются, например, активированные угли, оксиды алюминия, силикагели, кремниевые кислоты, глина, сажи, цеолиты, неорганические соли щелочных и щелочноземельных металлов, например гидроксиды, карбонаты, силикаты, сульфаты, фосфаты натрия, калия, магния и кальция, в особенности соли магния и кальция, например Mg(ОН), MgCO, MgSiO, CaSO, СаСО, оксиды щелочноземельных металлов, например MgO и СаО, другие неорганические фосфаты и сульфаты, например ZnSO, соли органических кислот, в частности, их соли со щелочными и щелочноземельными металлами, а особенно их соли с натрием и калием, например ацетат, формиат, гидроформиаты, цитрат натрия и калия, а также более высокомолекулярные органические носители, например углеводы, например сахар, при необходимости, модифицированные виды крахмала, целлюлоза, лигнин, а также упомянутые ниже в связи с составом продукта материалы-носители. Как правило, упомянутые материалы-носители не содержат вообще или содержат лишь незначительные количества, в частности только следы галогенов, например хлорид-ионов, и нитратов.
Примеры соединений, которые таким образом целесообразно получать способом согласно изобретению, это γ-линоленовая кислота, дигомо-γ-линоленовая кислота, арахидоновая кислота, эйкозопентаеновая кислота и докозогексаеновая кислота, а также пропионовая кислота, молочная кислота, пропандиол, бутанол и ацетон. Эти соединения в псевдотвердом виде также рассматривают в рамках настоящего изобретения как нелетучие продукты микробного метаболизма в твердой форме.
6
12
Термин «нелетучие продукты микробного метаболизма» также включает, в частности, органические монокарбоновые, ди- и трикарбоновые кислоты, предпочтительно с 3-10 атомами углерода, имеющие, при необходимости, одну или несколько, например 1, 2, 3 или 4 гидроксильные группы, например винную кислоту, итаконовую кислоту, янтарную кислоту, пропионовую кислоту, молочную кислоту, 3-гидроксипропионовую кислоту, фумаровую кислоту, малеиновую кислоту, 2,5-фурандикарбоновую кислоту, глутаровую кислоту, левулиновую кислоту, глюконовую кислоту, аконитовую и диаминопимелиновую кислоту, лимонную кислоту; протеиногенные и непротеиногенные аминокислоты, например лизин, глутамат, метионин, фенилаланин, аспарагиновую кислоту, триптофан и треонин; пу-риновые и пиримидиновые основания; нуклеозиды и нуклеотиды, например никотинамидадениндинуклеотид (NAD) и аденозин-5′-монофосфат (АМФ); липиды; насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты, предпочтительно с 10-22 атомами углерода, например γ-линоленовую кислоту, дигомо-γ-линоленовую кислоту, арахидоновую кислоту, эйкозопентаеновую кислоту и докозогексаеновую кислоту; диолы, предпочтительно с 3-8 атомами углерода, например пропандиол и бутандиол; многоатомные спирты с 3 или более, например 3, 4, 5 или 6 гидроксильными группами, например глицерин, сорбитол, манитол, ксилитол и арабинитол; более длинноцепочечные спирты, по меньшей мере, с 4 атомами углерода, например, имеющие 4-22 атома углерода, например бутанол; углеводы, например гиалуроновую кислоту и трегалозу; ароматические соединения, например ароматические амины, ванилин и индиго; витамины и провитамины, например аскорбиновую кислоту, витамин B, витамин B и рибофлавин, кофакторы и так называемые нутрицевтики; белки, например, ферменты, например, амилазы, пектиназы, кислые, гибридные или нейтральные целлюлазы, эстеразы, например липазы, панкреазы, протеазы, ксиланазы и оксидоредуктазы, как то лакказу, каталазу и пероксидазу, глюканазы, фитазы; каротиноиды, например ликопин, β-каротин, астаксантин, зеаксантин и кантаксантин; кетоны, предпочтительно с 3-10 атомами углерода и одной или несколькими гидроксильными группами, например, ацетон и ацетоин; лактоны, например γ-бутинолактон, циклодекстрины, биополимеры, например, полигидроксиацетат, полиэфиры, например полилактид, полисахариды, полиизопреноиды, полиамиды; а также предшественники и производные упомянутых соединений. Прочие соединения, представляющие собой нелетучие продукты микробного метаболизма, описаны Gutcho в Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973), ISBN: 0818805086.
В понятие "кофактор" включены небелковые соединения, необходимые для проявления нормальной активности фермента. Эти соединения могут быть органическими или неорганическими; молекулы кофакторов согласно изобретению предпочтительно органические. Примеры таких молекул представляют собой НАД и никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ); предшественник этих кофакторов - ниацин.
Понятие "нутрицевтик" включает в себя пищевые добавки, укрепляющие здоровье растений и животных, в особенности человека. Примерами таких молекул являются витамины, антиоксиданты и определенные липиды, например многократно ненасыщенные жирные кислоты.
Производимые продукты метаболизма в особенности относятся к ферментам, аминокислотам, витаминам, дисахаридам, алифатическим монокарбоновым и дикарбоновым кислотам с 3-10 атомами углерода, алифатическим гидроксикарбоновым кислотам с 3-10 атомами углерода, кетонам с 3-10 атомами углерода, алканолам с 4-10 атомами углерода и алкандиолам с 3-10 атомами углерода, а в особенности с 3-8 атомами углерода.
Специалисту понятно, что соединения, полученные ферментативным путем согласно изобретению, получают в каждом случае в форме оптического изомера, производимого данными микроорганизмами (если существуют различные энантиомеры). Так, например, аминокислоты, как правило, получают в форме L-изомеров.
Использование в ферментации тех или иных микроорганизмов определяют в каждом случае известным образом через конкретный продукт метаболизма, как это в подробностях описано ниже. Они могут быть природного происхождения или продуктами генетической модификации. Примеры подходящих микроорганизмов и способов ферментации приведены в нижеследующей таблице А.
Предпочтительные варианты способа согласно изобретению касаются производства ферментов, например фитаз, ксиланаз, глюканаз; аминокислот, например лизина, метионина, треонина; витаминов, например пантотеновой кислоты и рибофлавина, их предшественников и производных, а также производства вышеупомянутых монокарбоновых, дикарбоновых и трикарбоновых кислот, в особенности алифатических монокарбоновых и дикарбоновых кислот с 3-10 атомами углерода, например пропионовой кислоты, фумаровой и янтарной кислоты, алифатических гидроксикарбоновых кислот с 3-10 атомами углерода, например молочной кислоты; вышеупомянутых длинноцепочечных алканолов, в особенности алканолов с 4-10 атомами углерода, например бутанола; вышеупомянутых диолов, в особенности алкандиолов с 3-10 атомами углерода, а в особенности с 3-8 атомами углерода, как, например, пропандиола; вышеупомянутых кетонов, в особенности кетонов с 3-10 атомами углерода, например ацетона; и вышеупомянутых углеводов, а в особенности дисахаридов, например трегалозы.
В предпочтительной форме исполнения применяемые в ферментации микроорганизмы, соответственно, выбирают среди натуральных или рекомбинантных микроорганизмов, пригодных к производству, по меньшей мере, одного из следующих продуктов метаболизма: ферментов, например фитаз, ксиланаз, глюканаз; аминокислот, например лизина, метионина, треонина; витаминов, например пантотеновой кислоты и рибофлавина, их предшественников и/или производных; дисахаридов, например трегалозы; алифатических монокарбоновых и дикарбоновых кислот с 3-10 атомами углерода, например пропионовой кислоты, фумаровой и янтарной кислоты, алифатических гидроксикарбоновых кислот с 3-10 атомами углерода, например молочной кислоты; кетонов с 3-10 атомами углерода, например ацетона; алканолов с 4-10 атомами углерода, например бутанола; и алкандиолов с 3-8 атомами углерода, как, например, пропандиола.
В особенности, микроорганизмы выбирают из родов Corynebacterium, Bacillus, Ashbya, Escherichia, Aspergillus, Alcaligenes, Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Lactobacillus, Propionibacterium, Rhizopus и Clostridium, в частности, из штаммов Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Ashbya gossypii, Escherichia coli, Aspergillus niger или Alcaligenes latus, Anaerobiospirillum succiniproducens, Actinobacillus succinogenes, Lactobacillus delbrückii, Lactobacillus leichmannii, Propionibacterium arabinosum, Propionibacterium schermanii, Propionibacterium freudenreichii, Clostridium propionicum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium acetobutlicum, Rhizopus arrhizus и Rhizopus oryzae.
В особо предпочтительной форме исполнения продукт метаболизма, производимый микроорганизмами при ферментации, является лизином. Для проведения ферментации в этом случае можно использовать условия и способы работы, аналогичные тем, которые были описаны для других источников углерода, например, в соответствующих местах у Pfefferle et al. и в патенте США US 3,708,395. В принципе, возможна работа как в непрерывном, так и в периодическом (Batch или Fed-Batch, порционном или с подпиткой) режиме, а предпочтителен режим с подпиткой.
Еще в одной особо предпочтительной форме исполнения продукт метаболизма, производимый микроорганизмами при ферментации, является метионином. Для проведения ферментации в этом случае можно использовать условия и способы работы, аналогичные тем, которые были описаны для других источников углерода, например, в международных заявках WO 03/087386 и WO 03/100072.
Еще в одной особо предпочтительной форме исполнения продукт метаболизма, производимый микроорганизмами при ферментации, является пантотеновой кислотой. Для проведения ферментации в этом случае можно использовать условия и способы работы, аналогичные тем, которые были описаны для других источников углерода, например, в международной заявке WO 01/021772.
Еще в одной особо предпочтительной форме исполнения продукт метаболизма, производимый микроорганизмами при ферментации, является рибофлавином. Для проведения ферментации в этом случае можно использовать условия и способы работы, аналогичные тем, которые были описаны для других источников углерода, например, в международной заявке WO 01/011052, немецком патенте DE 19840709, международной заявке WO 98/29539, европейском патенте ЕР 1186664 и в Fujioka, K.: New biotechnology for riboflavin (vitamin B2) and character of this riboflavin. Fragrance Journal (2003), 31(3), 44-48.
Еще в одной особо предпочтительной форме исполнения продукт метаболизма, производимый микроорганизмами при ферментации, - это фумаровая кислота. Для проведения ферментации в этом случае можно использовать условия и способы работы, аналогичные тем, которые были описаны для других источников углерода, например, в Rhodes et al., Production of Fumaric Acid in 20-L Fermentors, Applied Microbiology, 1962, 10 (1),9-15.
Еще в одной особо предпочтительной форме исполнения продукт метаболизма, производимый микроорганизмами при ферментации, является фитазой. Для проведения ферментации в этом случае можно использовать условия и способы работы, аналогичные тем, которые были описаны для других источников углерода, например, в международной заявке WO 98/55599.
Перед дальнейшей обработкой ферментационного бульона целесообразно провести этап стерилизации. Этап стерилизации можно проводить термическим, химическим или механическим способом или же сочетанием этих мероприятий. Термическую стерилизацию можно проводить описанным выше образом. Для химической стерилизации ферментационный бульон, как правило, обрабатывают кислотами или щелочами способом, который ведет к уничтожению микроорганизмов. Механическую стерилизацию проводят, как правило, воздействуя сдвиговым усилием. Такие способы известны специалисту.
Целесообразно, чтобы способ согласно изобретению включал в себя нижеупомянутые три этапа, следующие друг за другом: а), b) и с):
а) получение содержащей сахар жидкой среды с содержанием моносахаридов более 20% масс. согласно этапам а1) и а2), причем в состав содержащей сахар жидкой среды входят также не содержащие крахмала твердые компоненты источника крахмала;
b) применение содержащей сахар жидкой среды в ферментации для производства нелетучего продукта (нелетучих продуктов) метаболизма; и
c) получение из ферментационного бульона нелетучего продукта (нелетучих продуктов) метаболизма в твердой форме совместно с, по меньшей мере, одной частью не содержащих крахмала компонентов источника крахмала посредством, по меньшей мере, частичного удаления летучих компонентов из ферментационного бульона.
Полученная на этапе а) содержащая сахар жидкая среда, в которой на этапе b) культивируют штамм микроорганизмов, производящий желательные продукты метаболизма, содержит, по меньшей мере, часть или все количество, как правило, однако, по меньшей мере, 90% масс., а особенно ок. 100% масс., содержавшихся в размолотых зернах злаковых твердых компонентов, не содержащих крахмала, соответственно степени помола. Относительно содержащих крахмал компонентов продукта помола доля таких твердых компонентов, крахмала не содержащих, составляет в содержащей сахар жидкой среде предпочтительно не менее 10% масс., а в частности не менее 25% масс., например от 25 до 75% масс., а особенно от 30 до 60% масс. Эти не содержащие крахмала твердые компоненты поступают на ферментацию вместе с содержащей сахар жидкой средой согласно этапу b) и соответственно присутствуют также в конечном ферментационном бульоне, содержащем конечный продукт метаболизма.
Если это желательно, то перед удалением летучих компонентов по этапу с) можно удалить из ферментационного бульона часть, например от 5 до 80% масс., а особенно от 30 до 70% масс. не содержащих крахмала твердых, т.е. нерастворимых компонентов. Обычно такое удаление осуществляют обычными способами разделения твердых и жидких компонентов, например посредством центрифугирования или фильтрации. При необходимости, проводят такое предварительное разделение, чтобы удалить крупные твердые частицы, которые не содержат нелетучих продуктов микробного метаболизма или содержат очень малые их количества. Для предварительной фильтрации можно использовать обычные методы, известные специалисту, например, с использованием крупноячеистых сит, сеток, дырчатых пластин или подобных устройств. При необходимости, можно также провести удаление крупных твердых частиц в центробежном сепараторе. Используемые для этого устройства, например декантаторы, центрифуги, седиканторы и сепараторы также известны специалисту. Предпочтительно, однако, отделять от ферментационного бульона до удаления летучих компонентов не более 30% масс., в особенности не более 5% масс. нерастворимых компонентов.
Предпочтительно получать, по меньшей мере, один нелетучий продукт метаболизма в твердой форме в основном без предварительного отделения от ферментационного бульона твердых компонентов.
Согласно изобретению после ферментации, при необходимости, после частичного удаления твердых компонентов, не содержащих крахмал, проводят полноценное удаление летучих компонентов из ферментационного бульона. «Полноценное» означает, что после удаления летучих компонентов остается твердый или хотя бы частично твердый остаток, который, при необходимости, можно перевести в твердую форму добавлением твердых веществ. Как правило, это означает удаление летучих компонентов до остаточного содержания влаги, не превышающего 20% масс., часто не более 15% масс., а особенно не более 10% масс. Обычно же представляется целесообразным удалять из ферментационного бульона его летучие компоненты до остаточной влажности в пределах от 0,2 до 20% масс., предпочтительно от 1 до 15% масс., особо предпочтительно от 2 до 10% масс. и крайне предпочтительно 5 до 10% масс. от определенного после сушки общей массы твердых компонентов. Содержание остаточной влажности можно определить обычными, известными специалисту методами, например с помощью термогравиметрии (Hemminger et al., Methoden der thermischen Analyse, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, 1989).
Согласно первой форме выполнения, для удаления летучих компонентов ферментационного бульона можно действовать так, чтобы в основном удалять только сами летучие компоненты ферментационного бульона, например, выпаривая его.
Согласно же второй форме выполнения, жидкие компоненты ферментационного бульона, которые помимо летучих компонентов, как правило, также содержат растворенные нелетучие компоненты, отделяют от нерастворенных компонентов, т.е. от желаемого продукта метаболизма, а также биомассы и не содержащих крахмал твердых составных частей источника крахмала. Отделение жидких компонентов в этом случае осуществляют обычными способами разделения твердой и жидкой фаз, например фильтрацией, центрифугированием и т.д.
Способы первой и второй формы выполнения можно также применять в сочетании друг с другом. Например, можно вначале отделить часть или основное количество жидких компонентов ферментационного бульона от нерастворенных компонентов, а остаточные количества летучих компонентов удалить из отделенных нерастворимых компонентов ферментационного бульона путем выпаривания. Также можно удалить выпариванием все летучие компоненты или большую их часть из отделенной жидкой части ферментационного бульона и подвергнуть их дальнейшей переработке. Остаток, который получают при выпаривании летучих компонентов из отделенной жидкой части, можно также соединить с получаемыми после отделения жидких компонентов твердыми веществами, что с точки зрения технологии может быть особо благоприятно.
Получение из ферментационного бульона на этапе с) нелетучего продукта (нелетучих продуктов) метаболизма в твердой форме, при необходимости, после вышеупомянутого предварительного отделения проводят в один, два или три шага, в частности в виде одно- или двухшагового процесса. Как правило, по меньшей мере, один, в частности, завершающий шаг получения продукта метаболизма в твердой форме включает в себя этап сушки.
При работе в один шаг летучие компоненты ферментационного бульона, при необходимости, после вышеупомянутого предварительного отделения удаляют, пока не будет достигнуто желаемое остаточное содержание влаги.
При работе в два или несколько шагов ферментационный бульон, при необходимости, после вышеупомянутого предварительного отделения вначале подвергают концентрированию, например, посредством фильтрации (микрофильтрации, ультрафильтрации) или термическим способом, выпаривая часть летучих компонентов. Доля летучих компонентов, которую удаляют на этом этапе, составляет, как правило, от 10 до 80% масс., а в особенности от 20 до 70% масс. от общей массы летучих компонентов ферментационного бульона. На одном или нескольких последующих шагах процесса удаляют остальные летучие компоненты ферментационного бульона, пока не будет достигнуто желаемое остаточное содержание влаги.
Согласно изобретению удаление летучих компонентов жидкой среды проводят в основном без предварительного обогащения или, тем более, выделения основного продукта. Следовательно, при удалении летучих компонентов ферментационного бульона нелетучий продукт метаболизма большей частью не удаляют вместе с летучими компонентами жидкой среды; он остается в получаемом остатке вместе с основным количеством, а в особенности со всем количеством остальных твердых компонентов ферментационного бульона. Согласно изобретению, однако, возможно, что часть, предпочтительно небольшая, желаемого нелетучего продукта микробного метаболизма, как правило, максимум 20% масс., например от 0,1 до 20% масс., предпочтительно не более 10, а в особенности не более 5% масс., особо предпочтительно, максимум 2,5% масс. и крайне предпочтительно максимум 1% масс. от общей сухой массы продукта метаболизма при удалении летучих компонентов ферментационного бульона удаляют вместе с ними. В особо предпочтительной форме выполнения желаемый нелетучий продукт микробного метаболизма, по меньшей мере, на 90% масс., в частности не менее чем на 95% масс., в особенности на 99% масс., а крайне предпочтительно на 100% масс. в каждом случае от общей сухой массы продукта метаболизма, в виде твердого вещества остается в смеси с полученной после удаления летучих компонентов частью или совокупностью твердых компонентов ферментационной среды.
Таким образом получают твердый или, например, пастообразный остаток, который содержит нелетучий продукт метаболизма и нелетучие, как правило, твердые, не содержащие крахмала компоненты источника крахмала или, по меньшей мере, большую их часть, нередко, по меньшей мере, 90% масс. или все количество твердых не содержащих крахмала компонентов.
Посредством добавления вспомогательных средств, например носителей и покрывающих материалов, связывающих средств и прочих добавок можно известным образом целенаправленно регулировать свойства высушенного и находящегося в смеси с твердыми компонентами ферментации продукта метаболизма с точки зрения различных параметров, например содержания действующего вещества, зернистости, формы частиц, склонности к пылеобразованию, гигроскопичности, стабильности, в особенности лежкости, цвета, запаха, текучести, склонности к агломерации, электростатического заряда, чувствительности к свету и температуре, механической прочности и пригодности к редиспергированию.
К применяемым обычно вспомогательным средствам относятся, например, связующие средства, материалы-носители, средства, модифицирующие порошкообразование или текучесть, а также красители, биоциды, диспергаторы, пеногасители, средства, регулирующие вязкость, кислоты, щелочи, антиоксиданты, стабилизаторы ферментов, ингибиторы ферментов, адсорбаты, жиры, жирные кислоты, масла или смеси таковых. Такие вспомогательные средства целесообразно применять, в частности, в качестве средств, способствующих сушке при использовании способов формирования смесей и сушки, например распылительной сушки, сушки в вихревом слое и низкотемпературной сушки.
Примерами связующих средств являются углеводы, в особенности сахара, например моно-, ди-, олиго- и полисахариды, например декстрины, трегалоза, глюкоза, глюкозный сироп, мальтоза, сахароза, фруктоза и лактоза; коллоидные вещества, например животные белки, например желатин, казеин, в особенности казеинат натрия, растительные белки, например соевый белок, гороховый белок, бобовый белок, люпин, зеин, пшеничный белок, кукурузный и рисовый белки, синтетические полимеры, например полиэтиленгликоль, поливиниловый спирт, а в особенности продукты марки Kollidon от фирмы BASF, биополимеры, при необходимости модифицированные, например лигнин, хитин, хитозан, полилактид и модифицированные крахмалы, например октенилсукцинатангидрид (OSA);
камеди, например камедь акации; производные целлюлозы, например метилцеллюлоза, этилцеллюлоза, (гидроксиэтил)метилцеллюлоза (НЕМС), (гидроксипропил)метилцеллюлоза (НРМС), карбоксиметилцеллюлоза (CMC); различные виды муки, например кукурузная мука, пшеничная мука, ржаная мука, ячменная и рисовая мука.
2
4
2
4
2
4
Примерами материалов-носителей являются углеводы, в частности приведенные выше в качестве связующих средств сахара, а также крахмалы, например, из кукурузы, риса, картофеля, пшеницы и маниока; модифицированные крахмалы, например октенилсукцинатангидрид; целлюлоза и микрокристаллическая целлюлоза; неорганические минералы или глины, например чистая глина, уголь, диатомовая земля, кремниевая кислота, тальк и каолин; крупа, например пшеничная, отруби, например пшеничные, виды муки, упомянутые выше в качестве связующих средств; соли, например, соли металлов, в особенности соли органических кислот со щелочными и щелочноземельными металлами, например цитрат, ацетат, формиат и гидроформиаты магния, кальция, цинка, натрия и калия, неорганические соли, например сульфаты, карбонаты, силикаты или фосфаты магния, кальция, цинка, натрия и калия; оксиды щелочноземельных металлов, как то СаО и MgO; неорганические средства буферизации, как, например, гидрофосфаты щелочных металлов, в особенности гидрофосфаты натрия и калия, например KHPO, KHPO и NaHPO; а также адсорбенты, вообще указываемые в связи с производством продуктов метаболизма с низкой температурой плавления или маслянистой консистенцией согласно изобретению.
Примеры средств, модифицирующих порошкообразование или текучесть, это диатомовая земля, кремниевая кислота, например, марок Sipernat от фирмы Degussa; чистая глина, уголь, тальк и каолин; указанные в качестве материалов-носителей крахмалы, модифицированные крахмалы, неорганические соли, соли органических кислот и средства буферизации; целлюлоза и микрокристаллическая целлюлоза.
2

Что касается прочих добавок, в качестве примеров могут быть упомянуты пигменты, например TiO, каротиноиды и их производные, витамин B2, капсантин, лютеин, криптоксантин, кантаксантин, астаксантин, тартразин, Sunsetgelb FCF, индиготин, растительные угли, биксин, оксид железа; биоциды, например бензоат натрия, сорбиновая кислота, сорбаты щелочных и щелочноземельных металлов, например, сорбат натрия сорбат калия и сорбат кальция, этиловый эфир 4-гидроксибензойной кислоты, бисульфиты щелочных металлов, например бисульфит и метабисульфит натрия, муравьиная кислота, формиаты, а в особенности формиаты щелочных металлов, например формиат натрия, формальдегид, нитрат натрия, ацетаты, а в особенности ацетаты щелочных и щелочноземельных металлов, например ацетаты натрия и калия, уксусная кислота, молочная кислота, пропионовая кислота, диспергаторы и средства регулирования вязкости, как то: альгинаты, лецитин, 1,2-пропандиол, агар-агар, карраген, гуммиарабик, гуаровая камедь, ксантановая камедь, геллановая камедь, камедь китайской сенны, сорбит, полиэтиленгликоль, глицерин, пектин, модифицированные крахмалы, модифицированные варианты целлюлозы, (например, метилцеллюлоза, НРМС, этилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза), микрокристаллическая целлюлоза, моно- и диглицериды, эфиры сахарозы: пеногасители, как, например, винилфункциональные силиконовые масла, например SILOFOAMSC 155 от фирмы Wacker Chemie, и алкоксилаты жирных спиртов, например Plurafac от фирмы BASF AG; неорганические кислоты, например фосфорная кислота, азотная, соляная и серная кислоты; органические кислоты, например насыщенные и ненасыщенные монокарбоновые и дикарбоновые кислоты, например муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая, масляная, валериановая кислота, пальмитиновая кислота, стеариновая кислота, щавелевая кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, глутаровая кислота, адипиновая кислота, пимелиновая кислота, малеиновая и фумаровая кислоты; щелочи, например гидроксиды щелочных металлов, например NaOH и KОН; антиоксиданты, например витамин С, 3 трет-бутил-4-гидроксианизол (ВНА), 3,5-дитретичный-4-гидрокситолуол (ВНТ), 6-этокси-1,2-дигидрокси-2,2,4-триметилхинолин (этоксикин); стабилизаторы ферментов, например соли кальция, соли цинка, например, сульфат цинка, соли магния, например сульфат магния, аминокислоты, ингибиторы ферментов, например пепстатин А или гуанидин *HCl; адсорбаты, например кремниевая кислота, оксид кремния, сахар или соли; жиры, например глицериды, например моно-, ди- и триглицериды; жирные кислоты, например стеариновая кислота; масла, например подсолнечное, кукурузное, соевое и пальмовое масло.
В зависимости от конкретных требований данного продукта метаболизма, а также в зависимости от свойств используемых добавок доля вышеупомянутых дополнительных веществ и, при необходимости, прочих добавок, например материалов оболочек, может широко варьировать и находиться в пределах, например, от 0,1 до 80% масс., а особенно в пределах от 1 до 30% масс. в каждом случае от общей массы готового состава продукта или смеси веществ.
Добавлять вспомогательные средства можно до дополнительной обработки ферментационного бульона (называемой также составлением продукта или структурированием твердых веществ), во время ее или по ее окончании, а в особенности во время сушки. Добавление вспомогательных средств до дополнительной обработки ферментационного бульона или продукта метаболизма может быть особенно целесообразно для улучшения пригодности к обработке веществ или продуктов, подлежащих этой обработке. Вспомогательные средства можно добавлять как к продукту метаболизма, получаемому в твердой форме, так и к раствору или суспензии, содержащей продукт метаболизма, например, по окончании ферментации непосредственно в ферментационный бульон или перед сушкой в раствор или суспензию, получаемые в процессе дополнительной обработки, перед завершающим этапом сушки.
Так, например, вспомогательные вещества можно, перемешивая, вводить в суспензию продукта микробного метаболизма; такую суспензию можно также наносить на материал-носитель, например, путем распыления или подмешивания. Добавление вспомогательных средств во время сушки может играть роль, например, если раствор или суспензию, содержащие продукт метаболизма, распыляют. Добавление вспомогательных средств после сушки производят, например, в особенности при покрытии высушенных частиц специальными составами (слоями). Прочие вспомогательные вещества можно добавлять в продукт как после сушки, так и после, возможно, имеющего место этапа покрытия.
Удаление летучих компонентов из ферментационного бульона осуществляют известным способом, используя обычные методы отделения твердой фазы от жидкой, включая фильтрационные методы и способы выпаривания летучих компонентов жидких фаз. Такие способы, которые могут также включать этапы грубой очистки концентрата, а также этапы дополнительной обработки, описаны, например, в Belter, P.A, Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnology, John Wiley & Sons (1988), и Ullmann′s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5. Aufl. auf CD-ROM, Wiley-VCH. Известные специалисту и применимые в рамках составления продукта или дополнительной обработки по окончании ферментации способы, аппаратура, вспомогательные вещества, а также общие и особые формы выполнения также описаны в европейских патентах ЕР 1038527, ЕР 0648076, ЕР 835613, ЕР 0219276, ЕР 0394022, ЕР 0547422, ЕР 1088486, ЕР 0758018 и международных заявках WO 98/55599, WO 92/12645.
В первом предпочтительном варианте отделения летучих компонентов от конечного продукта и не содержащих крахмала твердых компонентов ферментационного бульона нелетучий продукт микробного метаболизма, постольку поскольку он содержится в жидкой фазе в растворенном виде, переводят из жидкой в твердую фазу, например, путем кристаллизации или осаждения. Затем осуществляют отделение нелетучих твердых компонентов, включая продукт метаболизма, от жидких компонентов посредством какого-либо обычного способа разделения твердой и жидкой фаз, например посредством центрифугирования, декантации или осаждения. Подобным же образом можно отделить маслянистые продукты метаболизма, причем конкретные маслянистые продукты ферментации переводят в твердую форму добавлением адсорбентов, например кремниевой кислоты, силикагелей, глин и активированного угля.
Осаждение продуктов микробного метаболизма можно проводить способами, известными из (см. например, J.W.Mullin: Crystallization, 3. Aufl., Butterworth-Heinemann, Oxford 1993). Вызвать осаждение можно, например, добавлением еще одного растворителя, добавлением солей и варьированием температуры. Образующийся осадок, вместе с остальными твердыми компонентами, можно отделить от бульона с помощью описанных здесь обычных способов отделения твердых веществ.
Кристаллизацию продуктов микробного метаболизма также можно проводить обычным образом. Обычные технологии кристаллизации описаны, например, в Janeic, S.J., Grootscholten, PA, Industrial Crystallization, New York, Academic, 1984; A.W.Bamforth: Industrial Crystallization, Leonard Hill, London 1965; G.Matz: Kristallisation, 2. Aufl., Springer Verlag, Berlin 1969; J.Nývlt: Industrial Crystallization - State of the Art. VCH Verlagsges., Weinheim 1982; S. J. Jancic′, P.A.M. Grootscholten: Industrial Crystallization, Reidel, Dordecht 1984; O.Söhnel, J.Garside: Precipitation, Butterworth-Heinemann, Oxford, 1992; A.S.Myerson (Hg.): Handbook of Industrial Crystallization, Butterworth-Heineman, Boston 1993; J.W.Mullin: Crystallization, 3. Aufl., Butterworth-Heinemann, Oxford 1993; A.Mersmann (Hg.): Crystallization Technology Handbook, Marcel Dekker, New York 1995. Инициировать кристаллизацию можно, например, с помощью охлаждения, испарения, кристаллизации в вакууме (адиабатического охлаждения), кристаллизации посредством реакции или высаливания. Проводить кристаллизацию можно, например, в котлах с перемешиванием или без перемешивания, методом прямого контакта, в испарительных кристаллизаторах (R.K.Multer, Chem Eng. (N.Y.) 89 (1982) March, 87-89), в вакуумных кристаллизаторах периодически или непрерывно, например, в кристаллизаторах с принудительной циркуляцией (Swenson forced-circulation crystaller) или в кристаллизаторах с вихревым слоем (тип Осло) (A.D.Randolph, M.A.Larson: Theory of Particulate Processes, 2. Aufl. Academic Press, New York 1988; J. Robinson, J. E. Roberts, Can. J. Chem. Eng. 35 (1957) 105-112; J. Nývlt: Design of Crystallizers, CRC Press, Boca Raton, 1992). Возможна также фракционированная кристаллизация (L.Gordon, M.L.Salutsky, H.H.Willard: Precipitation from Homogeneous Solution, Wiley-lnterscience, New York 1959). Также возможно разделение оптических изомеров и рацематов (J.Jacques, A.Collet, S.H.Willen: Enantiomers, Racemates and Resolutions, Wiley, New York 1981; R.A.Sheldon: Chirotechnology, Marcel Dekker, New York 1993; A.N.Collins, G.N.Sheldrake, J.Crosby (Hg.): Chirality in Industry, Wiley, New York 1985).
Обычными способами фильтрации являются, например, фильтрация с образованием осадка и глубинная фильтрация (описанные, например, в А.Rushton, A.S.Ward, R.G.Holdich: Solid - Liquid Filtration and Separation Technology, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim 1996, pp.177ff., K.J.Ives, in A.Rushton (Hg.): Mathematical Models and Design Methods in Solid-Liquid Separation, NATO ASI series E №88, Martinus Nijhoff, Dordrecht 1985, pp.90ff.) и фильтрование в перекрестном потоке, в особенности микрофильтрация для отделения твердых частиц размером более 0,1 мкм (описанная, например, в J.Altmann, S.Ripperger, J.Membrane Sci. 124 (1997) 119-128).
Для микро- и ультрафильтрации можно использовать, например, микропористые мембраны (A.S.Michaels: "Ultrafiltration," in E.S.Perry (ed.): Progress in Separation and Purification, vol.1, Interscience Publ., New York 1968.), гомогенные мембраны (J. Crank, G.S.Park (eds.): Diffusion in Polymers, Academic Press, New York 1968; S.A.Stern: "The Separation of Gases by Selective Permeation," in P.Meares (ed.): Membrane Separation Processes, Elsevier, Amsterdam 1976.), асимметричные мембраны (R.E.Kesting: Synthetic Polymeric Membranes, A Structural Perspective, Wiley-lnterscience, New York 1985.) и мембраны, несущие электрический заряд (F.Helfferich: Ion-Exchange, McGraw-Hill, London 1962.), изготовляемые различными способами (R.Zsigmondy, патент США US 1421341, 1922; D.B.Pall, патент США US 4340479, 1982; S.Loeb, S.Sourirajan, патент США US 3133132, 1964.). Обычными для этого материалами являются эфиры целлюлозы, нейлон, поливинилхлорид, акрилонитрил, полипропилен, поликарбонат и керамика. Эти мембраны используют в виде плоских модулей (R.F.Madsen, Hyperfiltration and Ultrafiltration in Plate-and-Frame Systems, El-sevier, Amsterdam 1977), спиральных модулей (US 3417870, 1968 (D.T.Bray)), пучков труб или полых волокон (Н.Strathmann: "Synthetic Membranes and their Preparation," in M.C.Porter (ed.): Handbook of Industrial Membrane Technology, Noyes Publication, Park Ridge, NJ 1990, pp.1-60). Помимо этого, возможно использование жидких мембран (N.N.Li: "Permeation Through Liquid Surfactant Membranes," AlChE J. 17 (1971) 459; S.G.Kimura, S.L.Matson, W.J.Ward III: "Industrial Applications of Facilitated Transport," in N.N.Li (ed.): Recent Developments in Separation Science, Bd. V, CRC Press, Boca Raton, Florida, 1979, pp.11-25). Возможно как обогащение желаемых веществ со стороны подачи и удаление их потоком ретентата, так и обеднение их со стороны подачи и удаление в потоке фильтрата или проникающей фракции.
Обычные технологии центрифугирования описаны, например, в G.Hultsch, Н.Wilkesmann, "Filtering Centrifuges," in D.B.Purchas, Solid - Liquid Separation, Upland Press, Croydon 1977, pp.493-559; и Н.Trawinski, Die äquivalente Klärfläche von Zentrifugen, Chem. Ztg. 83 (1959) 606-612. Возможно применение различных вариантов, например трубчатых и корзинчатых центрифуг, а также специальных сепараторов со сдвижным дном, выворачиваемыми манжетами и тарелочных сепараторов.
В способе согласно этой первой форме выполнения, при необходимости, возможно подключить к разделению твердой и жидкой фаз этап сушки, который проводят обычным образом. Обычные способы сушки описаны, например, в О.Krischer, W.Kast: Die wissenschaftlichen Grundlagen der Trocknungstechnik, 3. Aufl., Springer, Berlin-Heidelberg-New York 1978; R.B.Keey: Drying: Principles and Practice, Pergamon Press, Oxford 1972; К.Kröll: Trockner und Trocknungsverfahren, 2. Aufl., Springer, Berlin-Heidelberg-New York 1978; Williams-Gardener, A.: Industrial Drying, Houston, Gulf, 1977; К.Kröll, W.Kast: Trocknen und Trockner in der Produktion, Springer, Berlin-Heidelberg-New York 1989. Например, к способам сушки относятся способы конвекционной сушки, например, в сушильной печи, туннельной сушилке, конвейерной сушилке, дисковой сушилке, сушилках с нагревом, с вихревым слоем, вентилируемых, а также вращающихся барабанных сушилках, в распылительных и поточных сушилках, циклонных сушилках, смесительных сушилках, сушилках с размолом пасты, размалывающих сушилках, кольцевых сушилках, шахтных сушилках, сушилках с вращающейся трубой и карусельных сушилках. В других способах используют контактную сушку, например в лопастных сушилках, вакуумных или замораживающих сушилках, конусных сушилках, нутч-фильтр-сушилках, дисковых сушилках, тонкослойных контактных сушилках, вальцовых сушилках, сушилках густой фазы, тарельчатых сушилках, шнековых, в сушилках с двойным конусом; или же тепловое излучение (инфракрасное, например, в инфракрасной сушилке с вращающейся трубой) или СВЧ-излучение. Сушильные аппараты, применяемые для термической сушки, как правило, отапливают паром, жидким топливом, газом или электрическим током, также, в зависимости от конструкции, возможна работа под вакуумом.
Отделенную жидкую фазу можно возвращать и использовать как технологическую воду. Часть жидкой фазы, не возвращаемую в процесс, можно сконцентрировать до сиропа путем многоступенчатого выпаривания. Если желательный продукт метаболизма не был до декантации переведен из жидкой фазы в твердую, то полученный таким образом сироп содержит также продукт метаболизма. Как правило, содержание сухого вещества в сиропе находится в пределах от 10 до 90% масс., предпочтительно от 20 до 80% масс., а особо предпочтительно от 25 до 65% масс. Этот сироп смешивают с твердыми веществами, отделенными при декантации, а затем сушат. Сушку можно проводить, например, в барабанной сушилке, распылительной или лопастной сушилке, предпочтительно использовать барабанную сушилку. Целесообразно проводить сушку так, чтобы получаемое твердое вещество обладало остаточной влажностью максимум 30% масс., предпочтительно не более 20% масс., особо предпочтительно не более 10% масс., а крайне предпочтительно не более 5% масс. от общей сухой массы полученного твердого вещества.
Во втором предпочтительном варианте отделения летучих компонентов от конечного продукта и не содержащих крахмала твердых компонентов ферментационного бульона летучие компоненты, при необходимости, после описанного выше этапа предварительного отделения твердых компонентов удаляют выпариванием. Выпаривание можно осуществлять известными способами. Примерами подходящих способов для выпаривания летучих компонентов являются распылительная сушка, сушка или агломерация в вихревом слое, сушка с замораживанием, поточная или контактная сушка, а также экструзионная сушка. Также возможно сочетание упомянутых способов с формообразующими технологиями, например экструзией, зернением или производством окатышей. В последних случаях предпочтительно использовать содержащие продукт метаболизма смеси веществ, частично или в основном прошедшие предварительную сушку.
В особо предпочтительной форме выполнения удаление летучих компонентов ферментационного бульона включает в себя распылительную сушку или сушку в вихревом слое, включая гранулирование в вихревом слое. Для этого ферментационный бульон, при необходимости, после предварительного разделительного этапа для отделения грубых частиц, не содержащих нелетучих продуктов микробного метаболизма или же содержащих их в незначительном количестве, подают в одну или несколько установок для распылительной сушки или сушки в вихревом слое. Транспортировку или подачу нагруженного твердыми веществами ферментационного бульона целесообразно осуществлять с помощью обычных транспортных устройств для жидкостей, содержащих твердые вещества, например насосов, в частности эксцентриковых шнековых насосов (например, от фирмы Delasco PCM) или насосов высокого давления (например, от фирмы LEWA Herbert Ott GmbH).
В качестве устройств для распылительной сушки можно использовать все известные в отрасли обычные аппараты распылительной сушки, как это описано, например, в процитированной выше литературе, в частности башни с соплами, особенно с соплами высокого давления, и дисковые башни; распылительные сушилки с интегрированными распылительными грануляторами кипящего и вихревого слоя целесообразно использовать в описанной ниже форме исполнения с использованием сушки в вихревом слое.
Для сушки распылительным способом особо пригодны установки, в которых насыщенный твердыми веществами ферментационный бульон сушат в прямотоке или в противотоке, предпочтительно в противотоке. При этом целесообразно подводить ферментационный бульон к головной части вертикально расположенной распылительной башни, подавать его в нее посредством сопла или вращающегося диска и одновременно распылять его, в то время как поток газа, используемого для сушки, например воздуха или азота, вводят в башню в ее верхней или же в нижней части. Летучие компоненты ферментационного бульона выводят через выпускную часть или через головную часть распылительной башни, а нелетучие (твердые) компоненты, включая желаемый продукт микробного метаболизма в виде в основном сухого порошка, получают или извлекают в нижней части башни, и его можно подавать на дальнейшую переработку.
Достигать желательной остаточной влажности продукта на этом этапе сушки, однако, необязательно, ее можно отрегулировать на дополнительном этапе сушки. Для этого распылительную сушку можно дополнить, например, сушкой с вихревым слоем. Отходящий из распылительной башни и/или из вихревого слоя воздух целесообразно очищать от содержащихся в нем частиц или пыли с помощью циклона и/или фильтра и забирать его на дальнейшую переработку; летучие компоненты в этом случае можно, при необходимости, выделить, например, в конденсирующем устройстве и использовать снова, например, как технологическую воду.
При проектировании и эксплуатации используемых установок специалисту следует соответствующим образом учитывать содержание, иногда очень высокое, твердых веществ в ферментационном бульоне. Так, в частности, внутренний диаметр и/или выпускные отверстия используемых распылительных сопел необходимо выбирать так, чтобы по возможности минимизировать или вообще исключить склонность к закупорке или блокировке. Разумные величины для выходных отверстий или внутреннего диаметра, как правило, составляют, по меньшей мере, 0,4 мм, предпочтительно не менее 1 мм, а обычно, в зависимости от свойств ферментационного бульона и содержащихся в нем веществ, лежат в пределах от 0,6 до 5 мм.
Газовый поток, используемый для сушки, характеризуется обычно температурой, превышающей температуру кипения водного ферментационного бульона при желаемом давлении, например, в пределах от 110 до 300°С, в частности от 120 до 250°С, а особенно от 130 до 220°С. Нагрев водной ферментационной среды до температуры ниже ее точки кипения, например в пределах от 25 до 85°С, а в частности от 30 до 70°С, также возможен для поддержания процесса сушки. Равным образом допустим и перегрев водной ферментационной среды, предпочтительно выше 100°С, причем жидкую среду нагревают до такой степени, чтобы перед соплом при выбранном давлении она еще не кипела, а после сброса давления с помощью сопла наступало спонтанное испарение.
Перед подачей в распылительную башню ферментационный бульон можно смешать с потоком газа, например воздуха или азота, при необходимости, предварительно подогретого, например, до температуры в пределах от 30 до 90°С. Если вместо однокомпонентных сопел использовать двухкомпонентные, такое смешение можно проводить непосредственно перед подачей собственно в сушильную камеру распылительной башни.
При выборе температуры, во всяком случае, необходимо учитывать термостабильность или температуру кипения конкретного желаемого продукта микробного метаболизма. Как правило, целесообразно задавать температуру потока газа, используемого для сушки так, чтобы она находилась, по меньшей мере, на 20°С, а предпочтительно не менее чем на 50°С ниже температуры кипения или разложения соответствующего нелетучего продукта микробного метаболизма. При этом следует также учитывать, что температура сушащегося материала может располагаться ниже, иногда существенно, температуры подаваемого газового потока, пока не испарились все летучие компоненты. Следовательно, на температуру сушащегося материала влияет также заданное время пребывания. Соответственно, процесс сушки можно, как минимум временно, проводить при температурах поступающего воздуха, которые находятся в области точки кипения подлежащих сушке продуктов метаболизма или выше. Подходящие температурные условия специалист может определить с помощью обычных экспериментов.
В особо предпочтительной форме выполнения сушку проводят в вертикально расположенной распылительной башне, работающей с прямотоком или противотоком, предпочтительно с противотоком. Подачу нагруженного твердыми веществами ферментационного бульона, охлажденного до комнатной температуры или еще имеющего температуру ферментации или ниже, например от 18°С до 37°С, осуществляют в головной части распылительной башни через одно или несколько, например 1, 2, 3 или 4, в особенности через 1 или 2 распылительных сопла. В верхнюю или же в нижнюю часть распылительной башни подают предусмотренный для сушки поток горячего газа, предпочтительно воздуха. Полученный порошок извлекают из нижней части или же, соответственно, из головной части распылительной башни. Если желательно, к этому процессу может быть подключена сушка в вихревом слое.
3
3
Определяющее влияние на размер частиц полученного порошка оказывает степень распыления, достигаемая при подаче загруженного твердыми веществами ферментационного бульона в распылительную башню. Степень распыления, в свою очередь, зависит от подаваемого на распылительные сопла давления или от скорости вращения вращающегося диска. Приложенное к распылительным соплам давление располагается обычно в пределах от 5 до 200 бар, например, составляя от 10 до 100 бар, а в особенности в интервале от 20 до 60 бар, выше нормального давления. Скорость вращения диска находится обычно в пределах от 5000 до 30000 об/мин. Скорость течения газового потока, подаваемого для использования при сушке, очень сильно зависит от скорости потока жидкой среды. При низком потоке жидкой среды (например, в пределах от 10 до 1000 л/ч) она обычно находится в пределах от 100 до 10000 м/ч, при более высоком потоке (например, в пределах от 1000 до 50000 л/ч), обычно в пределах от 10000 до 10000000 м/ч.
При необходимости, возможно также дополнительно применять известные в отрасли обычные вспомогательные вещества для распылительной сушки. Они снижают агломерацию образующихся в распылительной башне первичных частиц порошка или препятствуют ей, так что на свойства порошка, поступающего из распылительной башни, можно оказывать целенаправленное влияние, например, в отношении размеров частиц, в отношении улучшения степени сушки, улучшения сыпучести и/или пригодности к редиспергированию в растворителях, например в воде. В качестве примеров обычных вспомогательных средств распыления следует назвать упомянутые выше вспомогательные средства. Их применяют в обычных количествах, например в пределах от 0,1 до 50% масс., в частности от 0,1 до 30% масс., а особенно от 0,1 до 10% масс. от общей сухой массы нелетучих твердых компонентов ферментационного бульона.
Конструкцию аппаратуры, которая будет пригодна в конкретном случае, в особенности размеры используемых распылительных сопел и подходящие параметры процесса специалист может без затруднений определить посредством обычных экспериментов.
Еще в одном варианте второй предпочтительной формы выполнения удаление летучих компонентов ферментационного бульона осуществляют с применением технологии сушки в вихревом слое. При этом информация, приведенная выше относительно способа распылительной сушки, справедлива аналогичным образом, например, в том, что касается транспортировки содержащего твердые вещества ферментационного бульона, конструирования оборудования и выбора технологических параметров, в частности рабочей температуры. В качестве сушильных устройств с вихревым слоем можно использовать все обычные, известные в отрасли сушилки с вихревым слоем, в частности распылительные сушилки с интегрированными распылительными грануляторами в кипящем и вихревом слое, например, фирм Allgaier, DMR, Glatt, Heinen, Hüttlin, Niro und Waldner.
Сушилки с вихревым слоем могут работать в непрерывном или периодическом режимах. При непрерывной работе время пребывания материала в сушилке составляет от нескольких минут до нескольких часов. Таким образом, аппарат пригоден также и для длительной сушки, например, длительностью от 1 часа до 15 часов. Если желательно обеспечить малый разброс времени пребывания, в вихревом слое можно с помощью разделительных пластин организовать каскад или приблизить поток продукта к идеально равномерному с помощью внутренних устройств, имеющих форму меандров. Большие сушилки разделяют на несколько зон сушки, числом, например, от 2 до 10, а в особенности от 2 до 5, в которых работа идет при различных скоростях и температурах газа. Последнюю зону можно в этом случае использовать как зону охлаждения; в этом случае обычно задают температуру подаваемого воздуха в пределах от 10 до 40°С.
В зоне разгрузки влажного продукта необходимо, как правило, стремиться избежать комкообразования. Этого можно добиться различными способами, например местным повышением скорости газа или использованием мешалки. В случае небольших установок или в целях облегчения чистки установки в сушилку с вихревым слоем можно встроить фильтры для очистки отходящего газа.
В случае сушилок с вихревым слоем, работающих в порционном режиме, время пребывания также составляет от нескольких минут до многих часов. Эти аппараты также пригодны для длительной сушки.
Сушилки с вихревым слоем могут работать с вибрацией, причем вибрация способствует транспортировке продукта при низких скоростях газа (т.е. ниже скорости минимальной флюидизации) и малой высоте слоя, а также препятствует комкообразованию. Кроме вибрации, для снижения потребления сушильного газа можно использовать пульсирующую подачу газа. Влажный продукт турбулентно перемешивается в направленном вверх горячем потоке газа и при этом сохнет с высокими коэффициентами тепло- и массообмена. Необходимая скорость зависит в основном от размера частиц и их плотности. В качестве примера, для частиц с диаметром в несколько сот микрометров может потребоваться скорость газа в пустом трубопроводе в пределах от 1 до 10 м/с. Перфорированные полки (дырчатые пластины, пластины с отверстиями Conidur, полки из ткани или металлокерамики) препятствуют проваливанию твердого вещества в пространство с горячим газом. Теплоподача осуществляется либо исключительно сушильным газом, либо в вихревой слой дополнительно вводят теплообменники (пучки труб или пластины) (K. Masters: Spray Drying Handbook, Longman Scientific & Technical 1991; Arun S.Mujumdar, Handbook of Industrial Drying, Marcel Dekker, Inc. 1995).
В остальном для сушки с вихревым слоем аналогичным образом справедливо сказанное относительно распылительной сушки, например относительно добавления вспомогательных средств сушки и возможного в связи с этим влияния на качества продукта.
В случае маслянистых продуктов метаболизма сушку с применением аппаратуры вихревого слоя или смесителя проводят, например, таким образом, чтобы в аппарат вихревого слоя или в смеситель поместить адсорбирующий агент и перемешивать или флюидизировать его. При этом ферментационный бульон с маслянистыми продуктами метаболизма распыляют на адсорбирующий агент. Летучие компоненты ферментационного бульона можно в этом случае испарять благодаря подаче энергии в смеситель, либо же они выпариваются потоком нагретого воздуха в вихревом слое.
Еще в одной предпочтительной форме исполнения удаление летучих компонентов ферментационного бульона осуществляют с применением способа сушки вымораживанием (сублимацией). При этом ферментационный бульон, содержащий твердые вещества, полностью замораживают, а замороженные летучие компоненты испаряют из твердого состояния, т.е. сублимируют (Georg-Wilhelm Oetjen, Gefriertrocknen, VCH 1997). В качестве устройств для сушки вымораживанием можно использовать все обычные сублимационные сушилки, известные в отрасли, например, производства фирм Klein Vakuumtechnik и Christ.
Еще в одной предпочтительной форме выполнения удаление летучих компонентов ферментационного бульона осуществляют с применением прямоточных пневматических сушилок. При этом ферментационный бульон, содержащий твердые вещества, подают в нижнюю часть вертикально расположенной сушильной трубы. Сушильный газ гонит образованные частицы вверх со скоростью газа в пустой трубе от 10 до 20 м/с.Подачу ферментационного бульона, содержащего твердые вещества, осуществляют шнеками, лопастными колесами или пневматически. Частицы отделяют циклоном в головной части сушильной трубы, и их можно, если еще не достигнута желаемая степень сушки, возвращать в сушильную трубу или же подавать в последовательно подключенный вихревой слой (K. Masters: Spray Drying Handbook, Longman Scientific & Technical 1991; Arun S.Mujumdar, Handbook of Industrial Drying, Marcel Dekker, Inc. 1995). В качестве устройств можно использовать все обычные прямоточные пневматические сушилки, известные в отрасли, например производства фирм Nara и Orth.
Еще в одной предпочтительной форме выполнения удаление летучих компонентов ферментационного бульона осуществляют с применением контактных пневматических сушилок. Этот тип сушилок особо удобен для сушки пастообразных средств. Использование контактных сушилок также, однако, целесообразно в случае средств, в которых твердые вещества уже находятся в форме частиц. Ферментационный бульон, содержащий твердые вещества, подают на горячие поверхности сушилки, через которые осуществляется подача энергии. Летучие компоненты ферментационного бульона испаряются (K.Masters: Spray Drying Handbook, Longman Scientific & Technical 1991; Arun S.Mujumdar, Handbook of Industrial Drying, Marcel Dekker, Inc. 1995). Существует и используется множество различных конструкций контактных сушилок, см. вышеупомянутые примеры. Они известны специалисту, в частности, например, тонкослойные контактные сушилки, например, производства фирмы BUSS-SMS, вальцовые сушилки, например, производства фирмы Gouda, лопастные сушилки, например, производства фирмы BTC-Technology и Drais, ленточные (конвейерные) контактные сушилки, например, производства фирм Kunz и Merk, а также вращающиеся сушилки с пучком труб, например, от фирмы Vetter.
Еще в одной форме выполнения способа согласно изобретению, при которой вспомогательные средства используют перед сушкой, в суспензию продукта микробного метаболизма можно добавить, например, стабилизаторы или вяжущие агенты, например поливиниловый спирт или желатин, например, в баке с мешалкой или в статическом смесителе. Такую суспензию также можно нанести на материал-носитель, например, распылением или смешением в смесителе или в вихревом слое.
Еще одна форма выполнения, при которой вспомогательные средства добавляют во время сушки, касается припудривания капель, содержащих продукт метаболизма (см. для сравнения европейские патенты ЕР 0648076 и ЕР 835613), когда суспензию, содержащую продукт метаболизма, распыляют, капли пудрят средством порошкообразования в целях стабилизации, например, кремниевой кислотой, крахмалом или одним из указанных выше средств порошкообразования или агентов текучести, а затем при необходимости, сушат, например, в вихревом слое.
Еще одна форма выполнения, при которой вспомогательные средства добавляют после сушки, касается, например, нанесения на высушенные частицы оболочек или покрытий/покровных слоев. Как после сушки, так и после этапа покрытия в продукт можно добавлять, в частности, агенты текучести, чтобы улучшить характеристики текучести, например кремниевую кислоту, крахмал или иные упомянутые выше агенты текучести.
Для получения маслянистых продуктов метаболизма или этих продуктов с температурой плавления ниже точки кипения воды соответствующий продукт целесообразно адсорбировать на адсорбирующем агенте (см. примеры выше). При этом обычно действуют таким образом, чтобы добавлять необходимый адсорбирующий агент в ферментационный бульон в конце ферментации или после нее. При необходимости, добавление адсорбирующего агента можно проводить после предварительного концентрирования ферментационного бульона. Можно использовать как гидрофобные, так и гидрофильные адсорбирующие агенты. В первом случае адсорбирующий агент с адсорбированным продуктом метаболизма отделяют от летучих компонентов ферментационного бульона таким же образом, как и твердые компоненты, и вместе с ними. Во втором случае необходимо следить, чтобы адсорбирующие агенты с адсорбированными продуктами, присутствующие в растворенном виде или в форме суспензии, не были удалены во время дополнительной обработки. Например, при фильтровании этого можно добиться, выбирая фильтры с достаточно малым размером пор. Предпочтительными гидрофобными или гидрофильными адсорбентами являются адсорбенты, названные в связи с производством нелетучих продуктов микробного метаболизма в псевдотвердой форме, в особенности диатомовая земля, кремниевая кислота, сахар и вышеупомянутые неорганические и органические соли щелочных и щелочноземельных металлов.
Еще одна возможность составления продукта состоит в формообразовании путем механического воздействия, например, посредством экструзии, гранулирования или так называемого зернения. При этом продукт метаболизма или содержащую его смесь веществ, которая предпочтительно прошла полную или предварительную сушку и/или была обогащена вспомогательными средствами, продавливают через матрицу или сито. Подачу продукта к матрице осуществляют обычно с помощью одного или нескольких шнеков, тестоката или других механических элементов, например, вращающихся или движущихся поступательно. Нити, получаемые после прохождения через матрицу или сито, можно отделять механически, например, с помощью ножа, либо же они могут практически самостоятельно распадаться на более мелкие частицы. Формообразующими технологиями составления продукта, работающими без матриц являются, например, компактирование или грануляция в смесителях, например так называемая „high shear granulation".
Указанные формообразующие технологии целесообразно применять, если при испарении суспензии, содержащей продукт метаболизма, и/или посредством добавления к ней вспомогательных средств, как крахмала и клеящих материалов, например лигнина или поливинилового спирта, непосредственно получают материал, который обладает высокой вязкостью, тестообразной консистенцией или пригодностью к грануляции, и, таким образом, пригоден к непосредственному использованию в этих способах. В других случаях необходимую тестообразную консистенцию или высокую вязкость перед экструзией, образованием окатышей, компактированием, грануляцией (например, high shear granulation) или зернением можно также обеспечить с помощью сушки или предварительной сушки содержащей продукт метаболизма суспензии, например ферментационного бульона, посредством описанных выше способов сушки, предпочтительно посредством распылительной сушки. Полученный таким образом продукт, при необходимости, смешивают с обычными вспомогательными средствами, использование которых в этих целях известно специалисту, и подают его на экструзию, образование окатышей, компактирование, грануляцию или зернение. Эти способы можно реализовывать еще и так, чтобы перед этапом формообразования расплавлять одно из веществ, содержащихся в смеси веществ, включающей в себя продукт метаболизма, а после этапа формообразования это вещество вновь застывало. Для такого исполнения требуется, как правило, добавление обычных вспомогательных веществ, использование которых в этих целях известно специалисту. Получаемые при этом продукты характеризуются типичными размерами частиц в пределах от 500 мкм до 0,05 м. Применяя способы измельчения, например размол, при необходимости, в сочетании с технологиями просеивания, можно в дальнейшем, если желательно, получать частицы меньших размеров.
Частицы, полученные с помощью описанных формообразующих способов формулирования, можно сушить описанными выше способами сушки до достижения желательного остаточного содержания влаги.
На все продукты метаболизма, полученные в твердой форме одним из описанных выше способов, либо же на смеси веществ, содержащие их, например частицы, грануляты или экструдаты, можно нанести оболочку или покрытие, т.е. покрыть их, по меньшей мере, еще одним слоем вещества. Покрытие осуществляют, например, в смесителях или вихревых слоях, в которых подлежащие покрытию частицы приводят в вихревое движение или «флюидизируют» их, а затем опрыскивают оболочечным или покровным материалом. Покровный материал может быть представлен в сухом виде, например порошком, или в форме раствора, дисперсии, эмульсии или суспензии в растворителе, например в воде, органических растворителях и их смесях, в особенности в воде. Если присутствует растворитель, то во время разбрызгивания на частицы или после разбрызгивания его удаляют испарением. Такие покровные материалы, как жиры, можно также наносить в виде расплавов.
Покровные материалы, которые можно наносить распылением в виде водной дисперсии или суспензии, описаны, например, в международной заявке WO 03/059087. К ним, в частности, относятся полиолефины, например полиэтилен, полипропилен, полиэтиленовые воски, воски, соли, например сульфаты, хлориды и карбонаты щелочных и щелочноземельных металлов, например сульфат натрия, сульфат магния, сульфат кальция, хлорид натрия, хлорид магния, хлорид кальция, карбонат натрия, карбонат магния и карбонат кальция; акронали, например сополимер бутилакрилата и метилакрилата, марки Styrofan от фирмы BASF, например, на основе стирола и бутадиена, и гидрофобные вещества, как это описано в международной заявке WO 03/059086. При использовании подобных материалов содержание твердых веществ в субстанции покрытия находится обычно в пределах от 0,1 до 30% масс., в частности в пределах от 0,2 до 15% масс., а особенно в пределах от 0,4 до 5% масс. в каждом случае от общей массы готового продукта.
Покровные материалы, которые можно наносить распылением в виде растворов, это, например, полиэтиленгликоли, производные целлюлозы, как то: метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза и этил целлюлоза, поливиниловый спирт, белки, например желатин, соли, например сульфаты, хлориды и карбонаты щелочных и щелочноземельных металлов, например сульфат натрия, сульфат магния, сульфат кальция, хлорид натрия, хлорид магния, хлорид кальция, карбонат натрия, карбонат магния и карбонат кальция; углеводы, например сахар, например глюкоза, лактоза, фруктоза, сахароза и трегалоза; различные виды крахмала и модифицированного крахмала. При использовании подобных материалов содержание твердых веществ в субстанции покрытия находится обычно в пределах от 0,1 до 30% масс., в частности в пределах от 0,2 до 15% масс., а особенно в пределах от 0,4 до 10% масс., в каждом случае от общей массы готового продукта.

Покровные материалы, которые можно наносить распылением в виде расплавов, описаны, например, в немецком патенте DE 199 29 257 и международной заявке WO 92/12645. К ним, в частности, относятся полиэтиленгликоли, синтетические жиры и воски, например Polygen WE от фирмы BASF, натуральные жиры, в частности животные жиры, например пчелиный воск, и растительные жиры, например свечной воск, жирные кислоты, например животные воски, жирные кислоты сала, пальмитиновая кислота, стеариновая кислота, триглицериды, продукты Edenor, продукты Vegeole, воски эфиров монтановой кислоты, например, Luwax E от фирмы BASF. При использовании подобных материалов содержание твердых веществ в субстанции покрытия находится обычно в пределах от 1 до 30% масс., в частности в пределах от 2 до 25% масс., а особенно в пределах от 3 до 20% масс, в каждом случае от общей массы готового продукта.
Покровные материалы, которые можно применять в порошках при сухом покрытии, это, например, полиэтиленгликоли, производные целлюлозы, например метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза и этилцеллюлоза, поливиниловый спирт, белки, например желатин, соли, например сульфаты, хлориды и карбонаты щелочных и щелочноземельных металлов, например сульфат натрия, сульфат магния, сульфат кальция, хлорид натрия, хлорид магния, хлорид кальция, карбонат натрия, карбонат магния и карбонат кальция; углеводы, например сахар, например глюкоза, лактоза, фруктоза, сахароза и трегалоза; различные виды крахмала и модифицированного крахмала, жиры, жирные кислоты, сало, мука, например, из кукурузы, пшеницы, ржи, ячменя или риса, глина, зола и каолин. Приклеивание порошка, наносимого в качестве покрытия, к покрываемым продуктам, может происходить посредством веществ, которые можно наносить напылением в виде растворов или расплавов. Распыление этих растворов или расплавов можно чередовать с нанесением порошка или проводить их параллельно. Предпочтительно подлежащий покрытию продукт флюидизируют в вихревом слое или смесителе. Затем порошок, предпочтительно непрерывно, подают для покрытия в вихревой слой или смеситель. В особо предпочтительной форме выполнения во время добавления порошка в технологическое пространство подают также раствор или расплав. Раствор можно, например, подавать через патрубок или, предпочтительно, впрыскивать в технологическое пространство через сопло (например, однокомпонентное или двухкомпонентное сопло). Особо предпочтителен вариант, при котором место выгрузки порошка и положение сопла разнесены в технологическом пространстве, так что раствор или расплав преимущественно попадают на подлежащий покрытию продукт, а не на подлежащий нанесению порошок.
Также возможно наносить смеси различных покровных материалов, в частности, можно последовательно наносить несколько одинаковых или различных слоев покрытия.
В альтернативной форме выполнения желательный нелетучий продукт микробного метаболизма можно получать из остающегося ферментационного бульона вместе с твердыми компонентами такового, подобно побочному продукту, получаемому при производстве биоэтанола (который в этом случае называется „Distiller′s Dried Grains with Solubles (DDGS)" и распространяется под этим названием). При этом может происходить в основном полное или же лишь частичное отделение жидких компонентов ферментационного бульона от твердых веществ. Получаемый таким образом побочный продукт, содержащий белки, можно как до, так и после прочих этапов переработки использовать в качестве корма или кормовой добавки для питания животных, предпочтительно сельскохозяйственных животных, особо предпочтительно крупного рогатого скота, свиней и птицы, а крайне предпочтительно для кормления крупного рогатого скота.
Обычно для этого подвергают концентрированию в одноступенчатом или, как правило, многоступенчатом процессе выпаривания весь бульон, т.е. включая нелетучий продукт микробного метаболизма, а также прочие нерастворимые или твердые компоненты, а полученные твердые вещества затем отделяют от остающейся жидкости (жидкой фазы), например, в отстойнике. В способе согласно изобретению можно сначала перевести в твердую форму из жидкой фазы желательно так, что его получают вместе с прочими твердыми веществами. Отделяемые при этом твердые вещества, как правило, характеризуются содержанием сухого вещества в пределах от 10 до 80% масс., предпочтительно от 15 до 60% масс., а особо предпочтительно от 20 до 50% масс., и их, при необходимости, можно подвергнуть дальнейшей сушке обычными, например, описанными выше способами. Целесообразно, чтобы готовый состав, получаемый посредством дальнейших этапов обработки или переработки, содержал, по меньшей мере, ок. 90% масс. сухого вещества, так чтобы уменьшить опасность порчи при хранении на складе.
Отделенную жидкую фазу можно возвращать и использовать как технологическую воду. Часть жидкой фазы, не возвращенную в процесс, можно сконцентрировать до сиропа путем многоступенчатого выпаривания. Если желательный продукт метаболизма не был до декантации переведен из жидкой фазы в твердую, то полученный таким образом сироп содержит также продукт метаболизма. Как правило, содержание сухого вещества в сиропе находится в пределах от 10 до 90% масс., предпочтительно от 20 до 80% масс., а особо предпочтительно от 25 до 65% масс. Этот сироп смешивают с твердыми веществами, отделенными при декантации, а затем сушат. Сушку можно проводить, например, в барабанной сушилке, распылительной или лопастной сушилке, предпочтительно использовать барабанную сушилку. Целесообразно проводить сушку так, чтобы получаемое твердое вещество обладало остаточной влажностью максимум 30% масс., предпочтительно, не более 20% масс., особо предпочтительно не более 10% масс., а крайне предпочтительно не более 5% масс. от общей сухой массы полученного твердого вещества.
В качестве технологической воды можно возвращать не только жидкую фазу, отделенную в этой альтернативной форме исполнения, но также и летучие компоненты, возможно, получаемые в других описанных выше формах исполнения, после их конденсации. Целесообразно использовать эти возвращаемые в процесс части жидкой или летучей фазы, например, полностью или частично, при производстве содержащей сахар жидкости после этапа а) или для создания раствора буферных или питательных солей для применения в ферментации. При подмешивании возвращенной технологической воды на этапе а) следует учитывать, что слишком высокая ее доля может отрицательно повлиять на ферментацию ввиду чрезмерного количества определенных минеральных веществ или ионов, например ионов натрия или лактата. Целесообразно, следовательно, чтобы при создании суспензии для сжижения крахмала согласно изобретению доля возвращенной технологической воды была ограничена максимум 75% масс., предпочтительно максимум 60% масс., а особо предпочтительно не более чем 50% масс. Целесообразно, чтобы доля технологической воды при создании суспензии в предпочтительном варианте организации этапа а2) находилась в пределах от 5 до 60% масс., а предпочтительно от 10 до 50% масс.
Посредством описанных здесь способов сушки и дополнительной обработки можно в широком диапазоне варьировать средние размеры частиц получаемых твердых веществ, например, от относительно малых частиц в пределах от ок. 1 до 100 мкм, через средний размер частиц в пределах от 100 до нескольких сот мкм, вплоть до относительно больших частиц размером ок. 500 мкм или ок. 1 мм и более до нескольких мм, например до 10 мм. При производстве порошков средний размер частиц, как правило, располагается в пределах от 50 до 1000 мкм. При изготовлении других твердых форм продукта, например экструдатов, компактатов, а особенно гранулятов, например, получаемых с помощью распылительной сушилки или распылительных грануляторов с вихревым слоем, задают, как правило, большие размеры, при этом средний размер частиц часто располагается в пределах от 200 до 5000 мкм. Понятие «средний размер частиц» здесь относится к средней величине максимальной длины частиц для отдельных частиц в случае иной, чем сферическая, формы или же к средней величине диаметра сферических или приблизительно сферических частиц. Следует учитывать, что ввиду агломерации первичных частиц во время процесса распылительной сушки могут образовываться более крупные вторичные частицы. При реализации способа согласно изобретению получают обычные распределения размеров частиц для распылительной сушки.
Еще одним объектом изобретения является способ, как описано выше, отличающийся тем, что
(i) из полученной на этапе а2) жидкой среды, содержащей сахар, которая включает в себя не содержащие крахмал твердые компоненты источника крахмала, выбранного среди семян зерновых, отбирают часть, составляющую не более 50% масс., а оставшееся количество подвергают ферментации для создания первого нелетучего продукта метаболизма (А) в твердой форме; а
(ii) от этой части полностью или частично отделяют не содержащие крахмал твердые компоненты источника крахмала и подвергают ее ферментации для создания второго нелетучего продукта метаболизма (В) в твердой форме, который идентичен продукту метаболизма (А) или отличен от него.
В предпочтительной форме выполнения отделение не содержащих крахмал твердых компонентов осуществляют согласно (ii) так, чтобы содержание твердого вещества в остающейся доле содержащей сахар жидкой среды составляло не более 50% масс., предпочтительно не более 30% масс., особо предпочтительно максимум 10% масс. и крайне предпочтительно максимум 5% масс.
Такой способ работы позволяет использовать в отдельной ферментации согласно (ii) микроорганизмы, требующие выполнения определенных минимальных условий, например, относительно скорости кислородного обмена. Такими микроорганизмами, используемыми в отдельной ферментации согласно (ii), могут быть, например, Bacillus species, предпочтительно Bacillus subtilis. К соединениям, производимым такими микроорганизмами в отдельной ферментации, относятся, в частности, витамины, кофакторы и нутрицевтики, пуриновые и пиримидиновые основания, нуклеозиды и нуклеотиды, липиды, насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты, ароматические соединения, белки, каротиноиды, в особенности витамины, кофакторы и нутрицевтики, белки и каротиноиды, а особенно рибофлавин и пантотенат кальция.
Предпочтительный вариант этого способа работы означает параллельное производство одинаковых продуктов (А) и (В) в двух отдельных ферментациях. Это целесообразно, в частности, в тех случаях, когда к одному и тому же продукту метаболизма в различных его применениях предъявляют различные требования по чистоте. Соответственно, первый продукт метаболизма (А), например предназначенную для использования в качестве кормовой добавки аминокислоту, например лизин, производят с использованием содержащего твердые вещества ферментационного бульона, а второй такой же продукт метаболизма (В), например такую же аминокислоту, в данном случае, например, лизин, но предназначенную уже для использования в качестве пищевой добавки, производят с использованием ферментационного бульона, содержание твердых веществ в котором понижено согласно (ii). Благодаря полному или частичному отделению не содержащих крахмала твердых компонентов можно снизить затраты на очистку при последующей обработке продукта метаболизма, область применения которого требует более высокой чистоты, например в качестве пищевой добавки.
Еще в одной предпочтительной форме выполнения этого способа работы продуктом метаболизма В, производимым микроорганизмами во время ферментации, является рибофлавин. При проведении ферментации в этом случае можно применять условия и способы работы, аналогичные тем, что были описаны для других источников углерода, например, в международных заявках WO 01/011052 и WO 98/29539, немецком патенте DE 19840709, европейском патенте ЕР 1186664 и Fujioka, К.: New biotechnology for riboflavin (vitamin B2) and character of this riboflavin. Fragrance Journal (2003), 31(3), 44-48.
Для реализации этого варианта способа можно действовать, например, следующим образом. Запускают ферментацию, предпочтительно в большом объеме, для производства продуктов метаболизма А, например аминокислот, в частности лизина, соответственно способу согласно изобретению, например, с применением предпочтительных этапов способа от а) до с). Соответственно (i), часть полученной после этапа а) жидкой среды, содержащей сахар, извлекают, а согласно (ii) полностью или частично очищают ее обычными способами, например центрифугированием или фильтрацией, от твердых веществ. Полученную при этом содержащую сахар жидкую среду, полностью или частично освобожденную от твердых веществ, подают согласно (ii) на ферментацию для производства продукта метаболизма В, например рибофлавина. Поток твердого вещества, отделенный согласно (ii), целесообразно возвращать в поток содержащей сахар жидкой среды для ферментации в большом объеме.
Дальнейшую обработку полученного таким образом согласно (ii) содержащего рибофлавин ферментационного бульона можно проводить, применяя условия и способы работы, аналогичные тем, что были описаны для других источников углерода, например в немецких патентах DE 4037441, DE 3819745, европейских патентах ЕР 464582 и ЕР 438767. После лизирования клеточной массы проводят отделение рибофлавина, присутствующего в кристаллической форме, предпочтительно путем декантирования. Другие способы отделения твердых веществ, например фильтрование, также возможны. Затем рибофлавин сушат, предпочтительно с помощью распылительных сушилок и сушилок с вихревым слоем. В качестве альтернативы содержащую рибофлавин ферментационную смесь, полученную согласно (ii), обрабатывают, применяя условия и способы работы, аналогичные тем, что были описаны в европейских патентах ЕР 1048668 и ЕР 730034. В этом случае после пастеризации ферментационный бульон центрифугируют, а остающуюся фракцию, содержащую твердые вещества, обрабатывают минеральной кислотой. Образовавшийся рибофлавин фильтруют из кислой водной среды, при необходимости, отмывают, а затем сушат.
Еще в одной предпочтительной форме выполнения этого способа работы продуктом метаболизма В, производимым микроорганизмами во время ферментации, является пантотеновая кислота. При проведении ферментации в этом случае можно применять условия и способы работы, аналогичные тем, что были описаны для других источников углерода, например в международной заявке WO 01/021772.
Для реализации этого варианта способа можно действовать, например, как описано выше для рибофлавина. Жидкую среду, содержащую сахар, предварительно очищенную согласно (ii), предпочтительно в основном освобожденную от твердых веществ, подают согласно (ii) на ферментацию для производства пантотеновой кислоты. При этом особые преимущества дает сниженная по сравнению с содержащей твердые вещества жидкой средой вязкость. Отделенный поток твердого вещества целесообразно возвращать в поток содержащей сахар жидкой среды для ферментации в большом объеме.
Дальнейшую обработку полученного таким образом согласно (ii) содержащего пантотеновую кислоту ферментационного бульона можно проводить, применяя условия и способы работы, аналогичные тем, что были описаны для других источников углерода, например, в европейском патенте ЕР 1050219 и международной заявке WO 01/83799. После пастеризации ферментационного бульона остающиеся твердые вещества отделяют, например, центрифугированием или фильтрованием. Фильтрат после отделения твердых веществ частично выпаривают, при необходимости, добавляют к нему хлорид кальция и сушат, в частности, распылением.
Отделенные твердые вещества получают в рамках идущего параллельно процесса ферментации в большом объеме вместе с конкретным желаемым нелетучим продуктом микробного метаболизма (А).
После сушки и/или составления продукта в него могут быть добавлены целые или размолотые семена зерновых, предпочтительно кукуруза, пшеница, ячмень, просо, тритикале и/или рожь.
Еще один объект изобретения представляет собой твердые составы нелетучих продуктов метаболизма, полученные описанным здесь способом. Эти составы обычно помимо, по меньшей мере, одного нелетучего продукта метаболизма (компонент А) ферментации содержат биомассу из процесса ферментации (компонент В) и части или все количество не содержащих крахмала твердых компонентов источника крахмала (компонент С). Кроме того, при необходимости, смеси веществ согласно изобретению содержат вышеупомянутые вспомогательные средства, например связующие средства, материалы-носители, средства, модифицирующие порошкообразование или текучесть, а также красители, биоциды, диспергаторы, пеногасители, средства, регулирующие вязкость, кислоты, щелочи, антиоксиданты, стабилизаторы ферментов, ингибиторы ферментов, адсорбаты, жиры, жирные кислоты, масла и им подобные.
Типичное количество продукта метаболизма составляет более 10% масс., например от 10 до 80% масс., в частности от 20 до 60% масс. от общей массы компонентов А, В и С. От общей массы состава типичное количество продукта метаболизма составляет от 0,5 до 80% масс., в частности от 1 до 60% масс.
Типичное количество биомассы из процесса ферментации, производящего продукт метаболизма, составляет от 1 до 50% масс., в частности от 10 до 40% масс. от общей массы компонентов А, В и С, и, соответственно, от 0,5 до 50% масс., в частности от 2 до 40% масс. от общей массы состава.
Количество не содержащих крахмала твердых компонентов источника крахмала из ферментационного бульона составляет, как правило, по меньшей мере, 1% масс., в частности от 5 до 50% масс. от общей массы компонентов А, В и С, или, соответственно, по меньшей мере, 0,5% масс., в частности не менее 2% масс., например в пределах от 2 до 50% масс., в частности от 5 до 40% масс. от общей массы состава.
Количество вспомогательных средств составляет, как правило, до 40% масс. от общей массы компонентов А, В и С, и часто находится в пределах от 0 до 100% масс. от общей массы компонентов А, В и С, или, соответственно, в пределах от 0 до 80, в частности от 1 до 30% масс. от общей массы состава.
Составы согласно изобретению находятся в твердом агрегатном состоянии, а типичными их формами являются порошки, грануляты, окатыши, экструдаты, компактаты или агломераты.
Составы согласно изобретению, как правило, содержат балластные вещества (dietary fibers), которые частично образуются от твердых компонентов источника крахмала, а кроме того, находят применение в качестве разбавителей/носителей при производстве составов согласно изобретению. С точки зрения определений и компонентов, которые в рамках изобретения можно подразумевать под термином «балластные вещества», дана ссылка на отчет Американской ассоциации химиков зерновых (American Association of Cereal Chemists, AACC) в Cereal Foods World (CFW), 46 (3), „The Definition of Dietary Fiber", 2001, S.112-129, в особенности на S.112, 113 и 118. Содержание балластных веществ, как правило, составляет не менее 1% масс., в частности не менее 5% масс., в особых случаях не менее 10% масс., и часто находится в пределах от 1 до 60% масс., в частности от 5 до 50% масс., а особенно в пределах от 10 до 40% масс. в каждом случае от общей массы состава. Определение содержания балластных веществ вообще проводят по стандартному методу AACC (American Association of Cereal Chemists. 2000. Approved Methods of the American Association of Cereal Chemists, 10. Aufl., Method 32-25, Total dietary fiber determined as neutral sugar residues, uronic acid residues, and Klason lignin (Uppsala method). The Association, St. Paul, MN).
Смеси веществ согласно изобретению обладают высоким содержанием белка, которое в основном соответствует биомассе В. Некоторая доля белка может также образовываться в используемом источнике крахмала. Типичное содержание белка находится в пределах от 20 до 70% масс. от общей массы состава.
Наличие белка (особенно компонента В) и балластных веществ (а именно, компонента С) благоприятно в смысле многих технологий формирования состава, например, в случае работы с маслянистыми продуктами метаболизма, в частности с точки зрения соответствующих этапов сушки.
Целесообразно, чтобы составы согласно изобретению содержали одну или несколько незаменимых аминокислот, в частности, не менее одной аминокислоты, выбранной из группы, включающей лизин, метионин, треонин и триптофан. Незаменимые аминокислоты, в особенности перечисленные, обычно имеются в количестве, повышенном по сравнению с обычным побочным продуктом DDGS, получаемом при ферментативном производстве биоэтанола, в частности, по меньшей мере, в 1,5 раза. Если данная конкретная кислота присутствует в составе, то содержание лизина в составе составляет, по меньшей мере, 1% масс., в частности, находится в пределах от 1 до 10% масс., а особенно в пределах от 1 до 5% масс., содержание метионина составляет как минимум 0,8% масс., в частности находится в пределах от 0,8 до 10% масс., а особенно в пределах от 0,8 до 5% масс., содержание треонина как минимум 1,5% масс., в частности, находится в пределах от 1,5 до 10% масс., а особенно в пределах от 1,5 до 5% масс. и/или содержание триптофана составляет как минимум 0,4% масс., в частности находится в пределах от 0,4 до 10% масс., а особенно в пределах от 0,4 до 5% масс. в каждом случае от общей сухой массы состава.
Обычно составы согласно изобретению также содержат небольшую долю воды, часто в пределах от 0 до 25% масс., в частности в пределах от 0,5 до 15% масс., особенно в пределах от 1 до 10% масс., а в особых случаях в пределах от 1 до 5% масс. воды в каждом случае от общей массы состава.
2
6
12
Составы согласно изобретению пригодны для использования в питании животных или людей, например, как таковые или в качестве добавки, а также в форме предварительно приготовленных смесей. В частности, для этого можно использовать составы, которые содержат аминокислоты, например лизин, глутамат, метионин, фенилаланин, треонин или триптофан; витамины, например витамин B (рибофлавин), витамин B или витамин B; каротиноиды, например астаксантин или кантаксантин; сахара, например трегалозу; или органические кислоты, например фумаровую кислоту.
Составы согласно изобретению также пригодны для использования в текстильной, кожевенной, целлюлозной и бумажной промышленности. При этом в текстильной промышленности, в частности, используют составы, которые в качестве продуктов метаболизма содержат ферменты, например амилазы, пектиназы и/или кислые, гибридные или нейтральные целлюлазы; в кожевенной отрасли, в особенности те, которые содержат такие ферменты, как липазы, панкреазы или протеазы; а в целлюлозной и бумажной промышленности,в частности, составы, содержащие такие ферменты, как амилазы, ксиланазы, целлюлазы, пектиназы, липазы, эстеразы, протеазы, оксидоредуктазы, например лакказы, каталазы и пероксидазы.
Нижеследующие примеры служат для иллюстрации различных вариантов настоящего изобретения, однако не ограничивают объем изобретения.
Примеры
I. Размол источника крахмала
Используемые ниже материалы помола были изготовлены следующим образом. Целые кукурузные зерна полностью размололи с применением роторной мельницы. С использованием различных ударных механизмов, путей помола и встроенных сит при этом получили три различные степени тонкости. Ситовый анализ материала помола с помощью лабораторного вибрационного сита (вибрационный анализатор: Retsch Vibrotronic Тур VE1; время просеивания 5 мин; амплитуда 1,5 мм) дал результаты, приведенные в таблице 1.
Таблица 1
Номер эксперимента
Т 70/03
Т 71/03
Т 72/03
<2 мм/%<sup>1)</sup>
99,4
100
100
<0,8 мм/%
66
100
99
<0,63 мм/%
58,6
98,5
91
<0,315 мм/%
48,8
89
65
<0,1 мм/%
25
9,6
<0,04 мм/%
8
3,2
Общее количество материала помола
20 кг
11,45 кг
13,75 кг
1) % масс. от общего количества материала помола
II. Ферментативное сжижение и осахаривание крахмала
II.1. Без фитазы на этапе осахаривания
II.1а) Ферментативное сжижение крахмала
2
4
Из 320 г кукурузной муки, полученной сухим размолом (Т71/03), создали при постоянном перемешивании суспензию в 480 г воды и добавили 310 мг хлорида кальция. Перемешивание продолжали в течение всего эксперимента. После доведения рН с помощью HSO до величины 6,5 и нагрева до 35°С добавили 2,4 г Termamyl 120L Тур L (Novozymes A/S). На протяжении 40 минут реакционную смесь нагрели до 86,5°С, причем рН, при необходимости, доводили до ранее заданной величины с помощью NaOH. В течение 30 минут добавили еще 400 г кукурузной муки, полученной сухим размолом (Т71/03), при этом температуру повысили до 91°С. Реакционную смесь выдерживали при этой температуре ок. 100 минут. Затем добавили еще 2,4 г Termamyl 120L и удерживали температуру ок. 100 минут. В процессе работы сжижение контролировали с помощью реакции крахмала с йодом. В завершение температуру подняли до 100°С и кипятили реакционную смесь еще 20 минут. К этому моменту крахмал более не обнаруживали. Реактор охладили до 35°С.
II. 1b) Осахаривание
2
4
Полученную в 11.1 а) реакционную смесь, постоянно перемешивая, нагрели до 61°С. Перемешивание продолжали в течение всего эксперимента. После доведения рН с помощью HSO до величины 4,3 добавили 10,8 г (9,15 мл) Dextrozyme GA (Novozymes A/S). Температуру поддерживали ок. 3 часов, причем прохождение реакции отслеживали с помощью стержней для теста на глюкозу (S-Glucotest от Boehringer). Результаты представлены в приведенной ниже таблице 2. Потом реакционную смесь нагрели до 80°С, а затем охладили. Получили ок. 1180 г жидкого продукта с плотностью ок. 1,2 кг/л и содержанием сухой массы, определенным с помощью инфракрасной сушилки, составляющим ок. 53,7% масс. Содержание сухого вещества (без водорастворимых компонентов) составило после отмывания водой ок. 14% масс. Доля глюкозы в реакционной смеси, определенная ВЭЖК, составила 380 г/л (ср. Табл. 2, обр. №7).
Таблица 2
№ пробы
мин (после добавления глюкоамилазы)
концентрация глюкозы в супернатанте [г/л]
1
5
135
2
45
303
3
115
331
4
135
334
5
165
340
6
195
359
7
225
380
II.2. С фитазой на этапе осахаривания
II. 2а) Сжижение крахмала
Сжижение пробы кукурузной муки, полученной сухим размолом, провели согласно II.1а).
II. 2b) Осахаривание
2
4
Полученную в II.2а) реакционную смесь, постоянно перемешивая, нагрели до 61°С. Перемешивание продолжали в течение всего эксперимента. После доведения рН с помощью HSO до величины 4,3 добавили 10,8 г (9,15 мл) Dextrozyme GA (Novozymes A/S) и 70 мкл фитазы (700 Units Phytase, Natuphyt Liquid 10000L производства BASF Aktiengesellschaft). Температуру поддерживали ок. 3 часов, причем прохождение реакции отслеживали с помощью стержней для теста на глюкозу (S-Glucotest от Boehringer). Потом реакционную смесь нагрели до 80°С, а затем охладили. Полученный продукт высушили инфракрасной сушилкой и отмыли водой. Долю глюкозы в реакционной смеси определили с помощью ВЭЖК.
II.3. Прочие указания по ферментативному сжижению и осахариванию крахмала
II. 3а) Кукурузная мука
2
2
2
2+
360 г деионизированной воды помещают в реакционный сосуд. 1,54 мл маточного раствора CaCl (100 г CaCl×2HO/л) добавили до конечной концентрации Са в кашице 70 частей на млн. Постоянно перемешивая, медленно разводят в воде 240 г кукурузной муки. После доведения рН до 6,5 с помощью 50% масс. водного раствора NaOH добавляют 4,0 мл (=2 вес.% фермента/на сухую массу) Termamyl 120 L Тур L (Novozymes A/S). Затем кашицу быстро нагревают до 85°С. При этом необходимо постоянно контролировать и, при необходимости, корректировать величину рН.
2
2
2
2+
По достижении конечной температуры начинают добавлять дальнейшие порции муки, сначала 50 г. Дополнительно в кашицу вводят 0,13 мл маточного раствора CaCl, чтобы поддержать концентрацию Са на уровне 70 частей на млн. В процессе добавления поддерживают постоянную температуру 85°С. Чтобы обеспечить полноту прохождения реакции, ждут не менее 10 минут, прежде чем добавить еще одну порцию (50 г муки и 0,13 мл маточного раствора CaCl). После добавления двух порций вводят 1,67 мл Termamyl; затем добавляют еще две порции (каждый раз 50 г муки и 0,13 мл маточного раствора CaCl). Достигают содержания сухой массы 55% масс. После добавления температуру доводят до 10°С и кипятят кашицу 10 минут.
Отбирают пробу и охлаждают ее до комнатной температуры. После разбавления пробы деионизированной водой (примерно 1:10) добавляют каплю концентрированного раствора Люголя (смесь 5 г I и 10 г KI на литр). Темно-синяя окраска указывает на присутствие остаточного крахмала; если крахмал полностью гидролизовался, происходит коричневое окрашивание. Если тест указывает на наличие остаточного крахмала, температуру снова понижают до 85°С и поддерживают на этом уровне. Добавляют еще 1,67 мл Termamyl, пока реакция йода с крахмалом не даст отрицательный результат.
Смесь, тестирование которой дает отрицательный результат, затем охлаждают до 61°С для последующей реакции осахаривания. Добавляя 50%-ную серную кислоту, доводят рН до 4,3. Во время прохождения реакции поддерживают эту величину рН. Температуру удерживают на уровне 61°С. Чтобы превратить сжиженный крахмал в глюкозу, добавляют 5,74 мл (= 1,5% масс. фермента/на сухую массу) Dextrozym GA (Novozymes A/S). На прохождение реакции выделяют один час. Для инактивации фермента смесь нагревают до 85°С. Горячую смесь разливают в стерильные емкости и хранят их при 4°С. Конечная концентрация глюкозы составила 420 г/л.
II. 3b) Ржаная мука (включая предварительную обработку целлюла-зой/гемицеллюлазой)
360 г деионизированной воды помещают в реакционный сосуд. Постоянно перемешивая, медленно разводят в воде 155 г ржаной муки. Поддерживают постоянную температуру 50°С. После доведения рН до 5,5 с помощью 50% масс. водного раствора NaOH добавляют 3,21 мл (=2,5% масс. фермента/на сухую массу) Viscozyme L (Novozymes A/S). Через 30 минут начинают добавлять дальнейшие порции муки, сначала добавляют 55 г муки. Еще через 30 минут снова добавляют 50 г муки; 30 минут спустя - еще 40 г муки. Через 30 минут после последнего добавления можно начинать сжижение.
2
2
2
Добавляют 1,7 мл маточного раствора CaCl (100 г CaCl×2HO/л). После доведения рН до 6,5 с помощью 50% масс. водного раствора NaOH добавляют 5,0 мл (=2% масс. фермента/на сухую массу) Termamyl 120 L Тур L (Novozymes A/S). Затем кашицу быстро нагревают до 85°С. При этом необходимо постоянно контролировать и, при необходимости, корректировать величину рН.
2
2
2
2+
По достижении конечной температуры начинают добавлять дальнейшие порции муки, сначала 60 г. Дополнительно в кашицу вводят 0,13 мл маточного раствора CaCl, чтобы поддержать концентрацию Са на уровне 70 частей на млн. В процессе добавления поддерживают постоянную температуру 85°С. Чтобы обеспечить полноту прохождения реакции, ждут не менее 10 минут, прежде чем добавить еще одну порцию (40 г муки и 0,13 мл маточного раствора CaCl). Добавляют 1,1 мл Termamyl; затем добавляют еще одну порцию (40 г муки и 0,13 мл маточного раствора CaCl). Достигают содержания сухой массы 55% масс. После добавления температуру доводят до 100°С и кипятят кашицу 10 минут.
Отбирают пробу и охлаждают ее до комнатной температуры. После разбавления пробы деионизированной водой (примерно 1:10) добавляют каплю концентрированного раствора Люголя (смесь 5 г I и 10 г KI на литр). Темно-синяя окраска указывает на присутствие остаточного крахмала; если крахмал полностью гидролизовался, происходит коричневое окрашивание. Если тест указывает на наличие остаточного крахмала, температуру снова понижают до 85°С и поддерживают на этом уровне. Добавляют еще 1,1 мл Termamyl, пока реакция йода с крахмалом не даст отрицательный результат.
Смесь, тестирование которой дает отрицательный результат, затем охлаждают до 61°С для последующей реакции осахаривания. Добавляя 50%-ную серную кислоту, доводят рН до 4,3. Во время прохождения реакции поддерживают эту величину рН. Температуру удерживают на уровне 61°С. Чтобы превратить сжиженный крахмал в глюкозу, добавляют 5,74 мл (= 1,5% масс. фермента/на сухую массу) Dextrozym GA (Novozymes A/S). На прохождение реакции выделяют один час. Для инактивации фермента смесь нагревают до 85°С. Горячую смесь разливают в стерильные емкости и хранят их при 4°С. Конечная концентрация глюкозы составила 370 г/л.
II. 3с) Пшеничная мука (включая предварительную обработку ксиланазой)
360 г деионизированной воды помещают в реакционный сосуд. Воду нагревают до 55°С, а рН с помощью 50% масс. водного раствора NaOH доводят до 6,0. После установления температуры и рН добавляют 3,21 мл (=2,5% масс. Enzym/Trockenmasse) Shearzyme 500L (Novozymes A/S). Непрерывно перемешивая, медленно разводят в воде 155 г ржаной муки. Температуру и рН поддерживают постоянными. Через 30 минут начинают добавлять дальнейшие порции муки, сначала добавляют 55 г муки. Еще через 30 минут снова добавляют 50 г муки; 30 минут спустя - еще 40 г муки. Через 30 минут после последнего добавления можно начинать сжижение.
Сжижение и осахаривание проводят так, как описано в II.3b. Конечная концентрация глюкозы составила 400 г/л.
fbr
III. Штамм АТСС 13032 lysC
fbr
В одном из следующих примеров использовали модифицированный штамм Corynebacterium glutamicum, описанный под названием АТСС13032 lysC в международной заявке WO 05/059144.
Пример 1
а) Ферментативное сжижение и осахаривание крахмала
Из 500 г кукурузной муки, полученной сухим размолом, создали суспензию в 750 мл воды и снова размололи ее в смесителе. Суспензию разделили на 4 пробы, с № от 1 до 4, каждую из которых обработали ок. 3 г термостабильной α-амилазы (пробы №1 и 2: Termamyl L; пробы №3 и 4: Spezyme). Пробы №2 и 4 затем дополнительно обработали глюкоамилазой, ок. 7 г/л (проба №2: Dextrozyme GA; проба №4: Optidex). Получили желтоватые вязкие образцы, твердую фракцию которых в каждом случае отделили центрифугированием, причем поверх прозрачной жидкой фазы оказался слой гидрофобных твердых веществ.
В каждом случае, полученный прозрачный супернатант из полученных таким образом проб проанализировали с помощью ВЭЖК в 10-кратном разведении, пренебрегая, либо же включая отцентрифугированные гранулы. При учете гранул принимали содержание сухой массы в них равным 50% масс. Результаты, из расчета в отношении исходного образца, приведены в нижеследующей таблице 3.
Таблица 3
№ пробы
1
2
3
4
Супернатант, 10-кратное разведение, без гранул
Глюкоза [г/кг]
73,0
287,3
63,7
285,1
Фруктоза [г/кг]
3,4
2,3
5,3
2,7
Олигосахариды [г/кг]
202,1
38,2
150,8
31,5
Общий сахар [г/кг]
278
328
220
319
Супернатант, 10-кратное разведение, с гранулами
Глюкоза [г/кг]
178
168
Общий сахар [г/кг]
172
203
130
188
Супернатант, неразбавленный, с гранулами
Глюкоза [г/кг]
198
189
b) Ферментация
Два гидролизата кукурузной муки, полученные по II.1, задействовали в опытах со встряхиванием колб, с использованием Corynebacterium glutamicum (колбы 4-9). Кроме того, использовали гидролизат пшеничной муки, изготовленный параллельно аналогично примеру II.1 (колбы 1-3).
b.1) Изготовление инокулята
600
После посева на полноценный агар (состав: см. таблицу 4; 20 минут при 121°С) клетки инкубировали в течение 48 часов при 30°С. Затем клетки соскоблили с пластинок и ресуспендировали в солевой среде. 25 мл среды (см. таблицу 5) в 250-мл конических колбах в каждом случае привили таким количеством среды, чтобы оптическая плотность OD при 600 нм достигла величины 1.
Таблица 4
Состав полноценного агара
Концентрация
Компонент
10,0 г/л
D-глюкоза
2,5 г/л
NaCI
2,0 г/л
мочевина
10,0 г/л
Bacto Pepton (Difco)
5,0 г/л
экстракт дрожжей (Difco)
5,0 г/л
экстракт говядины (Difco)
22,0 г/л
агар
b.2) изготовление ферментационного бульона
Составы среды в колбах с номерами от 1 до 9 приведены в таблице 5.
Таблица 5
Среда в колбах
№ колбы
1-3
4-6
7-9
пшеница 399,66 г/кг**
250 г/л***
кукуруза 1 283,21 г/кг**
353 г/л***
кукуруза II 279,15 г/кг**
358 г/л***
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
50 г/л
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
0,4 г/л
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
0,6 г/л
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
2 мг/л
MnSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O
2 мг/л
тиамин*HCl
0,3 мг/л
биотин
1 мг/л
СаСО<sub>3</sub>
50 г/л
рН*
7,8
* устанавливают разбавленным водным раствором NaOH
** концентрация глюкозы в гидролизате
*** навеска гидролизата на литр среды
После прививки колбы инкубировали в увлажняемом шкафу-шейкере в течение 48 часов при 30°С в движении (200 об./мин). После прерывания ферментации содержание сахаров и лизина определили с помощью ВЭЖК. ВЭЖК провели с помощью прибора 1100 Series LC System производства Agilent. Предколоночная дериватизация ортофталевым альдегидом позволяет квантифицировать образовавшиеся аминокислоты, разделение смеси продуктов осуществляют колонкой АА производства Agilent. Результаты представлены в таблице 6.
Таблица 6
№ колбы
фруктоза, г/л
глюкоза, г/л
сахароза, г/л
общий сахар, г/л
1
0,00
0,00
4,71
4,71
2
0,00
7,75
4,82
12,57
3
0,00
13,85
4,57
18,42
4
0,00
17,20
11,38
28,58
5
0,00
21,08
11,31
32,39
6
0,00
25,51
11,29
36,80
7
0,00
32,59
9,83
42,42
8
0,00
24,10
10,01
34,11
9
0,00
39,26
9,94
49,20
Во всех колбах был синтезирован лизин в сравнимых количествах, порядка 30-40 г/л, соответственно выходу, получаемому при стандартной ферментации с питательным раствором глюкозы.
с) Изготовление сухих порошков
с.1) Распылительная сушка
При комнатной температуре в стакан поместили 250 г содержащего лизин бульона с содержанием твердых веществ 20% масс. (полученного из суспензии кукурузной муки аналогично примерам 1а и 1b) и подавали его с помощью перистальтического насоса (Тур: ISM444, Ismatec) в прямоточное двухкомпонентное сопло распылительной башни (Niro, Minor High Tec). Давление распыления составило 4 бар. Во время распыления поэтапно добавили 2-3 г Sipernat S22. Температура на входе составляла от 95°С до 100°С. Производительность насоса подачи была задана так, чтобы температура продукта в основном не оказывалась ниже 50°С.
Во время проведения распылительной сушки стенки распылительной башни были умеренно покрыты лизином. Полученный сухой порошок имеет на вид тонкую структуру и обладает хорошей сыпучестью. Было получено 23 г сухого порошка.
с.2) Экструзия
w
К 400 г содержащего лизин бульона с содержанием твердых веществ 20% масс. (полученного из суспензии кукурузной муки аналогично примерам 1а и 1b), который 60 минут выдерживали при температуре 80°С, добавили водный раствор ПВС, полученный растворением 14 г поливинилового спирта (ПВС; M=10000 до 190000 г/моль) в 75 г воды. Величина рН полученной суспензии составляла ок. 7. Суспензию добавили к примерно 950 г кукурузного крахмала (фирма Roquette), находившимся в смесителе Lodige, и перемешали при 100-350 об./мин.
Мучнистый, влажный тестообразный продукт, извлеченный из смесителя, имевший температуру около 30°С, затем заправили в экструдер DOME (фирма Fuji Paudal Co. Ltd.) и экструдировали при температуре менее 30°С. Полученный при экструзии продукт высушили в сушилке с кипящим слоем от фирмы BÜCHI в течение 120 минут при температуре продукта ниже 60°С. Было получено 600 г гранулята.
с.3) Агломерация в кипящем слое
2
4
3
В конус аппаратуры с кипящим слоем Aeromatic MP-1 (фирма Niro Aeromatic; площадь отверстий дырчатой полки: 12% (12% FF)) поместили 500 г NaS0 и нагрели до температуры 50°С. С помощью перистальтического насоса в двухкомпонентное сопло (d=1,2 мм) подали 998 г содержащего лизин бульона с содержанием твердых веществ 20% масс. (полученного из суспензии кукурузной муки аналогично примерам 1а и 1b) и напылили его через это сопло в положении „Topspray" (т.е. сверху) на помещенное в конус твердое вещество. Давление распыления составило 1,5 бар. Процесс распыления прерывали после добавления 278 г и после добавления еще 320 г содержащего лизин бульона (соответственно долям в 10 и 20% масс. напыленного твердого вещества ферментации, от общего количества твердого вещества в аппаратуре с кипящим слоем), каждый раз для промежуточной сушки и отбора проб (по 50 г). Воздушный поток подачи был задан в пределах от ок. 45 до 60 m/ч, и его снижали во время этапов сушки. Температура подаваемого воздуха находилась в пределах от ок. 46°С до 80°С, во время заключительно сушки - частично ниже. Производительность насоса подачи была задана так, чтобы температура продукта составляла около 50°С и в основном не оказывалась ниже 45°С.
После охлаждения извлекали 513 г продукта. Размер агломератов всех трех отобранных проб составлял порядка нескольких сотен микрометров.
с.4) Контактная сушка
240 г содержащего лизин бульона с содержанием твердых веществ 20% масс. (полученного из суспензии кукурузной муки аналогично примерам 1а и 1b) поместили в круглодонную колбу емкостью 500 мл, а затем сгустили на ротационном испарителе при несколько пониженном давлении (880-920 мбар). Температура бани составляла 140-145°С. По прошествии ок. 40 минут сформировавшийся на стенках колбы налет измельчили и продолжили сушку, а еще через 40 минут предприняли повторное измельчение. Затем сушку продолжали, иногда прерывая ее, чтобы еще раз измельчить остаток. Общая продолжительность сушки составила 2,5 часа. Полученный гранулят имеет коричневый цвет и обладает хорошей сыпучестью. Остаточная влажность гранулята составила 3%. Лишь небольшое количество гранулята осталось на стенке колбы.
Пример 2
fbr
Используя гидролизат кукурузной муки, полученный согласно примеру II.1, проводят ферментацию аналогично примеру 1b), причем использовали описанный в международной заявке WO 05/059144 штамм АТСС 13032 lysC. Клетки инкубировали на стерильном полноценном агаре (состав: см. таблицу 4; 20 минут при 121°С) в течение 48 часов при 30°С. Затем клетки соскоблили с пластинок и ресуспендировали в солевой среде. 25 мл среды (см. таблицу 5) в 250-мл конических колбах в каждом случае привили таким количеством среды, чтобы оптическая плотность OD600 при 600 нм достигла величины 1. Затем образцы инкубировали в увлажняемом (отн. влажность воздуха 85%) шкафу-шейкере в течение 48 часов при 30°С в движении (200 об/мин). Концентрацию лизина в средах определяют с помощью ВЭЖК. Во всех случаях были синтезированы примерно одинаковые количества лизина.
Содержащие лизин ферментационные бульоны, полученные таким образом, переработали в экструдат согласно примеру 1 с.2).
fbr
Гидролизат кукурузной муки, полученный согласно примеру II.3а, использовали в опыте с колбами и шейкером с применением Corynebacterium glutamicum (ATCC13032 lysC) (колбы 1 и 2). Кроме того, параллельно использовали изготовленные аналогично примеру II.3 гидролизаты пшеничной (колбы 3 и 4) и ржаной муки (колбы 5 и 6).
3.1) Изготовление инокулята
610
После посева на стерильный полноценный агар с аминокислотами из казеина (состав: см. таблицу 7:20 минут при 121°С) клетки инкубировали в течение 48 часов при 30°С, затем пересадили их в новую чашку и ночь инкубировали при 30°С. Затем клетки соскоблили с пластинок и ресуспендировали в солевой среде. 23 мл среды (см. таблицу 8) в 250-мл конических колбах с двумя дефлекторами в каждом случае привили таким количеством среды, чтобы оптическая плотность OD при 610 нм достигла величины 0,5.
Таблица 7
Состав полноценного агара с аминокислотами из казеина
Концентрация
Компонент
10,0 г/л
D-глюкоза
2,5 г/л
NaCl
2,0 г/л
мочевина
5,0 г/л
Bacto Pepton (Difco)
5,0.г/л
экстракт дрожжей (Difco)
5,0 г/л
экстракт говядины (Difco)
20,0 г/л
аминокислоты казеина
20,0 г/л
агар
3.2) Изготовление ферментационного бульона
Составы среды в колбах с номерами от 1 до 6 приведены в таблице 8. В контрольной среде вместо гидролизата муки использовали соответствующее количество глюкозы.
Таблица 8
Среда в колбах
№ колбы
1+2
3+4
5+6
кукуруза 344 г/кг **
174 г/л***
пшеница 343 г/кг **
175 г/л***
рожь 310 г/кг**
194 г/л ***
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
20 г/л
мочевина
5 г/л
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
0,113 г/л
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
0,138 г/л
ACES
52 г/л
MOPS
21 г/л
лимонная кислота × Н<sub>2</sub>О
0,49 г/л
3,4-дигидроксибензойная кислота
3,08 мг/л
NaCl
2,5 г/л
KCl
1 г/л
MgSO<sub>4</sub> × 7H<sub>2</sub>O
0,3 г/л
FeSO<sub>4</sub> × 7H<sub>2</sub>O
25
мг/л
MnSO<sub>4</sub> × 4-6H<sub>2</sub>O
5
мг/л
ZnCl<sub>2</sub>
10
мг/л
CaCl<sub>2</sub>
20
мг/л
Н<sub>3</sub>ВО<sub>3</sub>
150
мкг/л
CoCl<sub>2</sub> × 6H<sub>2</sub>O
100
мкг/л
CuCl<sub>2</sub> × 2H<sub>2</sub>O
100
мкг/л
NiSO<sub>4</sub> × 6H<sub>2</sub>O
100
мкг/л
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub> × 2H<sub>2</sub>O
25
мкг/л
биотин (витамин Н)
1050
мкг/л
тиамин × HCl (витамин B<sub>1</sub>)
2100
мкг/л
никотинамид
2,5
мг/л
пантотеновая кислота
125
мг/л
цианокобаламин (витамин B<sub>12</sub>)
1
мкг/л
4-аминобензойная кислота (РАВА; витамин H<sub>1</sub>)
600
мкг/л
фолиевая кислота
1,1
мкг/л
пиридоксин (витамин B<sub>6</sub>)
30
мкг/л
рибофлавин (витамин В<sub>2</sub>)
90
мкг/л
CSL
40
мл/л
pH*
6,85
* устанавливают разбавленным водным раствором NaOH
** концентрация глюкозы в гидролизате
*** навеска гидролизата на литр среды
После прививки колбы инкубировали в увлажняемом шкафу-шейкере в течение 48 часов при 30°С в движении (200 об/мин). После прерывания ферментации содержание cахаров и лизина определили с помощью ВЭЖК. ВЭЖК провели с помощью прибора 1100 Series LC System производства Agilent. Определение аминокислот требует предколоночной дериватизации ортофталевым альдегидом, разделение проводят на колонке Zorbax Extend C18 производства Agilent. Результаты представлены в таблице 9.
Таблица 9
№ колбы
глюкоза [г/л]
лизин [г/л]
1
1,2
12,0
2
1,2
10,8
3
0,2
10,6
4
0,2
10,0
5
0,0
11,1
6
0,0
9,5
Во всех колбах был синтезирован лизин в сравнимых количествах, порядка 10-12 г/л, соответственно выходу, получаемому при стандартной ферментации с питательным раствором глюкозы.
Полученные таким образом содержащие лизин ферментационные бульоны переработали в сыпучий порошок согласно примеру 1 с.1).
Пример 4
Гидролизат кукурузной муки, полученный согласно примеру II.3а, использовали в опыте с колбами и шейкером (колбы 1-3). В качестве производящего пантотенат штамма использовали Bacillus PA824 (подробное описание - в международной заявке WO 02/061108). Кроме того, параллельно использовали изготовленные аналогично примеру II.3 гидролизаты пшеничной (колбы 4-6) и ржаной муки (колбы 7-9).
4.1) Изготовление инокулята
42 мл среды предварительной культуры (см. в таблице 10) в 250-мл конических колбах с двумя дефлекторами в каждом случае привили 0,4 мл замороженной культуры и инкубировали 24 часа при 43°С в движении (250 об/мин) увлажняемом шкафу-шейкере.
Таблица 10
Состав среды предварительной культуры
Компонент
Концентрация
мальтоза
28,6 г/л
соевая мука
19,0 г/л
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
7,6 г/л
моноглутамат натрия
4,8 г/л
цитрат натрия
0,95 г/л
FeSO<sub>4</sub> × 7H<sub>2</sub>O
9,5 мг/л
MnCl<sub>2</sub> × 4Н<sub>2</sub>О
1,9 мг/л
ZnSO<sub>4</sub> × 7H<sub>2</sub>O
1,4 мг/л
CoCl<sub>2</sub> × 6H<sub>2</sub>O
1,9 мг/л
CuSO<sub>4</sub> × 5H<sub>2</sub>O
0,2 мг/л
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub> × 2H<sub>2</sub>O
0,7 мг/л
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> × 3H<sub>2</sub>O
15,2 г/л
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
3,9 г/л
MgCl<sub>2</sub> × 6H<sub>2</sub>O
0,9 г/л
CaCl<sub>2</sub> × 2H<sub>2</sub>O
0,09 г/л
MOPS
59,8 г/л
pH*
7,2
* устанавливают разбавленным водным раствором KОН
42 мл среды главной культуры (см. в таблице 11) в 250-мл конических колбах с двумя дефлекторами в каждом случае привили 1 мл предварительной культуры.
4.2) Изготовление ферментационного бульона
Составы среды в колбах с номерами от 1 до 9 приведены в таблице 11. В контрольной среде вместо гидролизата муки использовали соответствующее количество раствора глюкозы.
Таблица 11
Среда в колбах
№колбы
1-3
4-6
7-9
кукуруза 381,4 г/кг**
75 г/л***
пшеница 342,0 г/кг**
84 г/л***
рожь 303,0 г/кг**
94 г/л***
соевая мука
19,0 г/л
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
7,6 г/л
моноглутамат натрия
4,8 г/л
цитрат натрия
0,95 г/л
FeSO<sub>4</sub> × 7Н<sub>2</sub>О
9,5 мг/л
MnCl<sub>2</sub> × 4H<sub>2</sub>O
1,9 мг/л
ZnSO<sub>4</sub> × 7H<sub>2</sub>O
1,4 мг/л
CoCl<sub>2</sub> × 6H<sub>2</sub>O
1,9 мг/л
CuSO<sub>4</sub> × 5H<sub>2</sub>O
0,2 мг/л
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub> × 2H<sub>2</sub>O
0,7 мг/л
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> × 3H<sub>2</sub>O
15,2 г/л
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
3,9 г/л
MgCl<sub>2</sub> × 6H<sub>2</sub>O
0,9 г/л
CaCl<sub>2</sub> × 2H<sub>2</sub>O
0,09 г/л
MOPS
59,8 г/л
pH*
7,2
* устанавливают разбавленным водным раствором NaOH
** концентрация глюкозы в гидролизате
*** навеска гидролизата на литр среды
После прививки колбы инкубировали в увлажняемом шкафу-шейкере в течение 24 часов при 43°С в движении (250 об/мин). После прерывания ферментации содержание глюкозы и пантотеновой кислоты определили с помощью ВЭЖК. Определение концентрации глюкозы осуществляли с помощью колонки НРХ-87Н производства фирмы Bio-Rad. Определение концентрации пантотеновой кислоты проводили посредством разделения на колонке С18 производства фирмы Phenomenex. Результаты представлены в таблице 12.
Таблица 12
№ колбы
глюкоза [г/л]
пантотеновая кислота [г/л]
1
0,00
1,75
2
0,00
1,70
3
0,00
1,73
4
0,10
1,80
5
0,10
1,90
6
0,19
1,96
7
0,12
2,01
8
0,12
2,12
9
0,13
1,80
Во всех колбах была синтезирована пантотеновая кислота в сравнимых количествах, порядка 1,5-2 г/л, соответственно выходу, получаемому при стандартной ферментации с питательным раствором глюкозы.
Полученные таким образом содержащие пантотеновую кислоту ферментационные бульоны частично переработали в агломерат согласно примеру 1 с.3) или согласно примеру 1 с.4) - далее, в сухой порошок грубой консистенции.
Пример 5
Гидролизат кукурузной муки, полученный согласно примеру II.3а, использовали в опыте с колбами и шейкером с применением Aspergillus niger (колбы 1-3). Кроме того, параллельно использовали изготовленные аналогично примеру II.3 гидролизаты пшеничной (колбы 4-6) и ржаной муки (колбы 7-9).
5.1) Штаммы
Производящий фитазу штамм Aspergillus niger с 6 копиями гена phyA от Aspergillus ficuum под контролем промотора glaA был создан аналогично подробно описанному в международной заявке W098/46772 производству NP505-7. В качестве контроля использовали штамм с 3 модифицированными ампликонами glaA (аналогично ISO 505), но без интегрированного полигенного экспрессирующего кластера phyA.
5.2) Изготовление инокулята
20 мл мл среды предварительной культуры (см. в таблице 13) в 100-мл конических колбах с одним дефлектором в каждом случае привили 100 мкл замороженной культуры и инкубировали 24 часа при 34°С в движении (170 об/мин) увлажняемом шкафу-шейкере.
Таблица 13
Состав среды предварительной культуры
Компонент
Концентрация
глюкоза
30,0 г/л
пептон из казеина
10,0 г/л
экстракт дрожжей
5,0 г/л
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
1,0 г/л
MgSO<sub>4</sub> × 7H<sub>2</sub>O
0,5 г/л
ZnCl<sub>2</sub>
30 мг/л
CaCl<sub>2</sub>
20 мг/л
MnSO<sub>4</sub> × 1H<sub>2</sub>O
9 мг/л
FeSO<sub>4</sub> × 7H<sub>2</sub>O
3 мг/л
Tween 80
3,0 г/л
пенициллин
50000 ЕД/л
стрептомицин
50 мг/л
pH*
5,5
* устанавливают разбавленной серной кислотой
50 мл среды главной культуры (см. в таблице 14) в 250-мл конических колбах с одним дефлектором в каждом случае привили 5 мл предварительной культуры.
5.3) Изготовление ферментационного бульона
Составы среды в колбах с номерами от 1 до 9 приведены в таблице 14. В контрольной среде вместо гидролизата муки использовали соответствующее количество раствора глюкозы.
Таблица 14
Среда в колбах
№ колбы
1-3
4-6
7-9
кукуруза 381,4 г/кг**
184 г/л***
пшеница 342,0 г/кг **
205 г/л***
рожь 303,0 г/кг **
231 г/л***
пептон из казеина
25,0 г/л
экстракт дрожжей
12,5 г/л
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
1,0 г/л
K<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
2,0 г/л
MgSO<sub>4</sub> × 7H<sub>2</sub>O
0,5 г/л
ZnCl<sub>2</sub>
30 мг/л
CaCl<sub>2</sub>
20 мг/л
MnSO<sub>4</sub> × 1H<sub>2</sub>O
9 мг/л
FeSO<sub>4</sub> × 7H<sub>2</sub>O
3мг/л
пенициллин
50000 ЕД/л
стрептомицин
50 мг/л
рН*
5,6
* устанавливают разбавленной серной кислотой
** концентрация глюкозы в гидролизате
*** навеска гидролизата на литр среды
2
4
После прививки колбы инкубировали в увлажняемом шкафу-шейкере в течение 6 суток при 34°С в движении (170 об/мин). После прерывания ферментации активность фитазы определили с помощью теста. После прерывания ферментации активность фитазы определили с использованием фитиновой кислоты в качестве субстрата и на надлежащем уровне активности фитазы (стандарт: 0,6 U/мл) в буфере состава: 250 mM уксусной кислоты / ацетата натрия / Tween 20 (0,1 вес.%), рН 5,5. Тест был стандартизирован для применения на микротитровальных пластинах (МТР). 10 мкл раствора фермента смешали с 140 мкл 6,49 mM раствора фитата в 250 mM ацетатном буфере (ацетат натрия), рН 5,5 (фитат: додеканатриевая соль фитиновой кислоты). После одного часа инкубации при 37°С реакцию остановили добавлением равного объема (150 мкл) трихлоруксусной кислоты. Аликвоту этой смеси (20 мкл) перенесли в 280 мкл раствора, содержащего 0,32 N HSO, 0,27 вес.% молибдата аммония и 1,08% масс. аскорбиновой кислоты. Затем инкубировали 25 минут при 50°С. Поглощение света синим раствором измеряли при длине волны 820 нм. Результаты представлены в таблице 15.
Таблица 15
Активность фитазы [FTU/мл]<sup>*</sup>
кукуруза
433
пшеница
476
рожь
564
контроль
393
<sup>*</sup>) FTU = единица мутности по формазину
Полученные таким образом содержащие фитазу ферментационные бульоны переработали согласно примеру 1 с.1) в порошок, а согласно примеру 1 с.3) в агломерат частиц.
Пример 6
Гидролизат кукурузной муки, полученный согласно примеру II.3а, использовали в опыте с колбами и шейкером с применением Ashbya gossypii (колбы 1-4). Кроме того, параллельно использовали изготовленные аналогично примеру II.3 гидролизаты пшеничной (колбы 5-8) и ржаной муки (колбы 9-12).
6.1) Штамм
Использованный производящий рибофлавин штамм представляет собой
Ashbya gossypii ATCC 10895 (см. также Schmidt G, et al. Inhibition of purified isocitrate lyase identified itaconate and oxalate as potential antimetabolites for the riboflavin overproducer Ashbya gossypii. Microbiology 142: 411-417, 1996).
6.2) Изготовление инокулята
После посева на стерильный агар HMG (состав: см. в таблице 16; 20 минут при 121°С) клетки инкубировали 72 часа при 28°С.
Таблица 16
Состав агарных пластин HMG
Компонент
Концентрация
D-глюкоза
4,0 г/л
экстракт дрожжей
4,0 г/л
экстракт солода
10,0 г/л
агар
30,0 г/л
pH
7,2
Затем 50 мл среды предварительной культуры (см. в таблице 17) в 250-мл конических колбах с двумя дефлекторами в каждом случае привили микробиологической петлей, полной клеток, и инкубировали 24 часа при 28°С в движении (180 об/мин) в увлажняемом шкафу-шейкере.
Таблица 17
Состав среды предварительной культуры
Компонент
Концентрация
Bacto Pepton
10,0 г/л
экстракт дрожжей
1,0 г/л
мио-инозит
0,3 г/л
D-глюкоза
10,0 г/л
рН*
7,0
* устанавливают разбавленным водным раствором NaOH
50 мл мл среды главной культуры (см. в таблице 18) в 250-мл конических колбах с двумя дефлекторами в каждом случае привили 1 мл предварительной культуры.
6.3) Изготовление ферментационного бульона
Составы среды в колбах с номерами от 1 до 12 приведены в таблице 18. В контрольной среде вместо гидролизата муки использовали соответствующее количество раствора глюкозы.
Таблица 18
Среда в колбах
№ колбы
1-4
5-8
9-12
кукуруза 381,4 г/кг**
26,2 г/л ***
пшеница 342,0 г/кг**
29,2 г/л***
рожь 303,0 г/кг**
33,0 г/л***
Bacto Pepton
10.0 г/л
Экстракт дрожжей
1,0 г/л
мио-инозит
0,3 г/л
pH*
7,0
* устанавливают разбавленным водным раствором NaOH
** концентрация глюкозы в гидролизате
*** навеска гидролизата на литр среды
2
После прививки колбы инкубировали в увлажняемом шкафу-шейкере в течение 6 суток при 28°С в движении (180 об/мин). После прерывания ферментации содержание витамина B определили с помощью ВЭЖК. Результаты представлены в таблице 19.
Таблица 19
витамин В<sub>2</sub>
кукуруза
2,73 г/л
пшеница
2,15 г/л
рожь
2,71 г/л
контроль
0,12 г/л
2
Полученные таким образом содержащие витамин В ферментационные бульоны переработали согласно примеру 1 с.1) в порошок, а согласно примеру 1 с.3) в агломерат частиц.
Пример 7
Гидролизат кукурузной муки, полученный согласно примеру II.3а, использовали в опыте с колбами и шейкером с применением Corynebacterium glutamicum (колбы 1-3). Кроме того, параллельно использовали изготовленные аналогично примеру II.3 гидролизаты пшеничной (колбы 4-6) и ржаной муки (колбы 7-9).
7.1) Штаммы
Штаммы Corynebacterium, производящие метионин, известны специалисту. Изготовление таких штаммов описано, например, в Kumar D. Gomes J. Biotechnology Advances, 23(1):41-61, 2005; Kumar D. et al., Process Biochemistry, 38:1165-1171, 2003; международных заявках WO 04/024933 и WO 02/18613.
7.2) Изготовление инокулята
После посева на стерильный полноценный агар с канамицином (состав:
610
см. в таблице 20; 20 минут при 121°С) клетки инкубировали 24 часа при 30°С. Затем клетки соскоблили с пластинок и ресуспендировали в солевой среде. 25 мл среды (см. таблицу 5) в 250-мл конических колбах с двумя дефлекторами в каждом случае привили таким количеством среды, чтобы оптическая плотность OD при 610 нм достигла величины 0,5.
Таблица 20
Состав полноценной агаровой среды с канамицином
Концентрация
Компонент
10,0 г/л
D-глюкоза
2,5 г/л
NaCl
2,0 г/л
мочевина
10,0 г/л
Bacto Pepton (Difco)
5,0 г/л
экстракт дрожжей (Difco)
5,0 г/л
экстракт говядины (Difco)
20 мкг/мл
канамицин
25,0 г/л
агар
7.3) Изготовление ферментационного бульона
Составы среды в колбах с номерами от 1 до 9 приведены в таблице 21. В контрольной среде вместо гидролизата муки использовали соответствующее количество глюкозы.
Таблица 21
Среда в колбах
№ колбы
1-3
4-6
7-9
кукуруза 381,4 г/кг**
157,2 г/л***
пшеница 342,0 г/кг**
175,6 г/л***
рожь 303,0 г/кг**
198,0 г/л***
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
20 г/л
мочевина
5 г/л
КН<sub>2</sub>РО<sub>4</sub>
0,113
г/л
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
0,138
г/л
ACES
52
г/л
MOPS
21
г/л
лимонная кислота × H<sub>2</sub>O
0,49
г/л
3,4-дигидроксибензойная кислота
3,08
мг/л
NaCl
2,5
г/л
KCl
1
г/л
MgSO<sub>4</sub> × 7H<sub>2</sub>O
0,3
г/л
FeSO<sub>4</sub> × 7H<sub>2</sub>O
25
мг/л
MnSO<sub>4</sub> × 4-6H<sub>2</sub>O
5
мг/л
ZnCl<sub>2</sub>
10
мг/л
CaCl<sub>2</sub>
20
мг/л
Н<sub>3</sub>ВО<sub>3</sub>
150
мкг/л
CoCl<sub>2</sub> × 6H<sub>2</sub>O
100
мкг/л
CuCl<sub>2</sub> × 2H<sub>2</sub>O
100
мкг/л
NiSO<sub>4</sub> × 6H<sub>2</sub>O
100
мкг/л
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub> × 2H<sub>2</sub>O
25
мкг/л
биотин (витамин Н)
1050
мкг/л
тиамин × HCl (витамин B<sub>1</sub>)
2100
мкг/л
никотинамид
2,5
мг/л
пантотеновая кислота
125
мг/л
цианокобаламин (витамин B<sub>12</sub>)
1
мкг/л
4-аминобензойная кислота (РАВА; витамин H<sub>1</sub>)
600 мкг/л
фолиевая кислота
1,1 мкг/л
пиридоксин (витамин B<sub>6</sub>)
30 мкг/л
рибофлавин (витамин B<sub>2</sub>)
90 мкг/л
CSL
40 мл/л
канамицин
25 мкг/мл
рН*
6,85
* устанавливают разбавленным водным раствором NaOH
** концентрация глюкозы в гидролизате
*** навеска гидролизата на литр среды
После прививки колбы инкубировали в увлажняемом шкафу-шейкере при 30°С в движении (200 об/мин), пока не была израсходована глюкоза. После прерывания ферментации содержание метионина определили с помощью ВЭЖК (колонка: Agilent ZORBAX Eclipse AAA; метод согласно протоколу Eclipse AAA, Technical Note 5980-1193). Результаты представлены в таблице 22.
Таблица 22
Колбы
Метионин [мкмоль/л]
кукуруза
1
9643,1
2
9509,2
3
9395,3
пшеница
4
6839,9
5
7133,9
6
7028,9
рожь
7
7894,7
8
7526,5
9
6998,9
контроль
10
1920,8
11
1916,3
Полученные таким образом содержащие метионин ферментационные бульоны переработали в грубый порошок согласно примеру 1 с.4).
Пример 8
Гидролизат кукурузной муки, полученный согласно примеру II.3а, использовали в опыте с колбами и шейкером с применением Bacterium 130Z.
8.1) Штамм
В качестве производящего сукцинат штамма использовали Bacterium 130Z (АТСС No. 55618).
8.2) Изготовление ферментационного бульона
2
50 мл среды главной культуры (см. в таблице 23) в 120-мл флаконах в каждом случае привили 1 мл замороженной культуры. Перед закрытием во флаконы нагнетали CO (0,7 бар).
Состав среды приведен в таблице 23 (ср. патент США US 5,504,004). В контрольной среде вместо гидролизата муки использовали соответствующее количество раствора глюкозы (итоговая концентрация глюкозы: 100 г/л).
Таблица 23
Среда*
Компонент
Концентрация
кукуруза 381,4 г/кг**
262 г/л ***
NaCl
0,1 г/л
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
0,3 г/л
MgCl<sub>2</sub> × 6H<sub>2</sub>O
20 мг/л
CaCl<sub>2</sub> × H<sub>2</sub>O
20 мг/л
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
0,1 г/л
биотин
200 мкг/л
CSL
15,0 г/л
10% экстракт дрожжей
15,0 г/л
MgCO<sub>3</sub>
80,0 г/л
* обработана и заполнена в атмосфере CO<sub>2</sub>/N<sub>2</sub>
** концентрация глюкозы в гидролизате
*** навеска гидролизата на литр среды
После прививки флаконы инкубировали в шкафу-шейкере в течение 46 часов при 37°С в движении (160 об/мин). После прерывания ферментации содержание глюкозы и сукцината определили с помощью ВЭЖК. Определение концентрации глюкозы осуществляли с помощью колонки НРХ-87Н производства фирмы Bio-Rad. Результаты представлены в таблице 24.
Таблица 24
№
Глюкоза [г/л]
Сукцинат [г/л]
1
30,93
42,501
2
29,273
44,114
контроль
17,414
47,73
Полученные таким образом содержащие сукцинат ферментационные бульоны переработали согласно примеру 1 с.1) в сухой порошок.
Пример 9
Гидролизат кукурузной муки, полученный согласно примеру II.3а, использовали в опыте с колбами и шейкером с применением Escherichia coli (Kolben 1-3) (колбы 1-3). Кроме того, параллельно использовали изготовленные аналогично примеру II.3 гидролизаты пшеничной (колбы 4-6) и ржаной муки (колбы 7-9).
9.1) Штамм
Штаммы Escherichia coli Stämme, производящие L-треонин, известны специалисту. Изготовление таких штаммов описано, например, в европейских патентах ЕР 1013765 А1, ЕР 1016710 А2 и в патенте США US 5,538,873.
9.2) Изготовление инокулята
610
Клетки высеяли на стерильный агар Luria Bertani. В агар LB добавляют антибиотики, если в соответствующем штамме имеются пригодные в качестве маркеров гены резистентности. Для этого можно использовать, например, канамицин (40 мкг/мл) или ампициллин (100 мг/л). Штаммы инкубировали 24 часа при 30°С. После посева на стерильную минимальную глюкозную среду М9 с метионином (50 мкг/мл), канамицином (40 мкг/мл) и гомосерином (10 мкг/л) клетки инкубировали 24 часа при 30°С. Затем клетки соскоблили с пластинок и ресуспендировали в солевой среде. 25 мл среды (см. в таблице 25) в 250-мл конических колбах с двумя дефлекторами в каждом случае привили таким количеством среды, чтобы оптическая плотность OD при 610 нм достигла величины 0,5.
9.3) Изготовление ферментационного бульона
Составы среды в колбах с номерами от 1 до 9 приведены в таблице 25.
В контрольной среде вместо гидролизата муки использовали соответствующее количество глюкозы.
Таблица 25
Среда в колбах
№ колб
1-3
4-6
7-9
кукуруза 381,4 г/кг**
157,2 г/л***
пшеница 342,0 г/кг**
175,6 г/л***
рожь 303,0 г/кг**
198,0 г/л***
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
22 г/л
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
2 г/л
NaCl
0,8 г/л
MgSO<sub>4</sub> × 7H<sub>2</sub>O
0,8 г/л
FeSO<sub>4</sub> × 7H<sub>2</sub>O
20 мг/л
MnSO<sub>4</sub> × 5H<sub>2</sub>O
20 мг/л
тиамин×HCl (витамин B<sub>1</sub>)
200 мг/л
экстракт дрожжей
1,0 г/л
СаСО<sub>3</sub> (стерилизован отдельно)
30 г/л
канамицин
50 мг/л
ампициллин
100 мг/л
рН*
6,9±0,2
* устанавливают разбавленным водным раствором NaOH
** концентрация глюкозы в гидролизате
*** навеска гидролизата на литр среды
После прививки колбы инкубировали в увлажняемом шкафу-шейкере при 30°С в движении (200 об/мин), пока не была израсходована глюкоза. После прерывания ферментации содержание L-треонина можно определить ВЭЖК в обращенной фазе, как описано Lindroth et al., Analytical Chemistry 51:1167-1174, 1979.
Полученные таким образом содержащие треонин ферментационные бульоны переработали согласно примерам 1 с.1) - 1 с.3) в порошок, экструдат или агломерат.
Пример 10
Подобно тому, как описано в примере 9, с использованием соответствующих штаммов производят другие L-аминокислоты глутамат, гистидин, пролин и аргинин. Соответствующие штаммы описаны, например, в европейском патенте ЕР 1016710.
Полученные таким образом содержащие аминокислоты ферментационные бульоны переработали согласно примерам 1 с.1) - 1 с.3) в сухой продукт.
Пример 11
Частично осахаренный гидролизат кукурузной муки использовали в опыте с колбами и шейкером с применением Aspergillus niger.
11.1) Сжижение и (частичное) осахаривание
Сжижение провели аналогично примеру II.3а. После охлаждения суспензии до 61°С и доведения рН до 4,3 добавили 5,38 мл (=1.5 вес.% фермента/на сухую массу) Dextrozyme GA (Novozymes A/S). Через 10, 15, 20, 30, 45 и 60 минут после добавления фермента отбирали пробы объемом 50 г и суспендировали их в 25 мл стерильной, охлажденной льдом полностью деионизированной воды. Образцы поместили в ледяную баню и немедленно использовали в тесте с колбами. Инактивация фермента не происходила.
11.2) Ферментация
Использовали штамм, примененный в примере 5.1). Изготовление инокулята было проведено так, как описано в примере 5.2).
Для приготовления ферментационного бульона использовали приведенные в таблице 29 составы среды. Каждую пробу использовали в двух колбах.
Таблица 29
Среда в колбах
кукуруза
10г/л***
пептон из казеина
25,0 г/л
экстракт дрожжей
12,5 г/л
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
1,0 г/л
K<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
2,0 г/л
MgSO<sub>4</sub> × 7H<sub>2</sub>O
0,5 г/л
ZnCl<sub>2</sub>
30 мг/л
CaCl<sub>2</sub>
20 мг/л
MnSO<sub>4</sub> × 1Н<sub>2</sub>О
9 мг/л
FeSO<sub>4</sub> × 7H<sub>2</sub>O
3 мг/л
пенициллин
50000 IU/л
стрептомицин
50 мг/л
рН*
5,6
* доводят разбавленной серной кислотой
*** навеска частично осахаренного гидролизата на литр среды
После прививки флаконы инкубировали в увлажняемом шкафу-шейкере в течение 6 суток при 34°С в движении (160 об/мин). После прерывания ферментации активность фитазы определили с помощью теста (как это описано в примере 5.3). Результаты представлены в таблице 30.
Таблица 30
Прерывание стандартного осахаривания по прошествии × минут
колба
активность фитазы [FTU/мл]
10
1
425
2
387
15
3
312
4
369
20
5
366
6
316
30
7
343
8
454
45
9
372
10
358
60
11
298
12
283
Полученные таким образом содержащие фитазу ферментационные бульоны переработали согласно примерам 1 с.2) и 1 с.3) в экструдат и в агломерат.
Пример 12
Частично осахаренный гидролизат кукурузной муки использовали в опыте с колбами и шейкером с применением Corynebacterium glutamicum.
12.1) Сжижение и (частичное) осахаривание
Сжижение провели аналогично примеру II. 3а. После охлаждения суспензии до 61°С и доведения рН до 4,3 добавили 5,38 мл (=1.5 вес.% фермента/на сухую массу) Dextrozyme GA (Novozymes A/S). Через 10, 15, 20, 30, 45 и 60 минут после добавления фермента отбирали пробы объемом 50 г и суспендировали их в 25 мл стерильной, охлажденной льдом полностью деионизированной воды. Образцы поместили в ледяную баню и немедленно использовали в тесте с колбами. Инактивация фермента не происходила.
12.2) Ферментация
Использовали штамм, примененный в примере 3). Изготовление инокулята было проведено так, как описано в примере 3.1).
Для приготовления ферментационного бульона использовали приведенные в таблице 31 составы среды. Каждую пробу использовали в трех колбах.
Таблица 31
Среда в колбах
кукуруза
4,5 г/л***
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
20 г/л
мочевина
5 г/л
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
0,113 г/л
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
0,138 г/л
ACES
52 г/л
MOPS
21 г/л
лимонная кислота × Н<sub>2</sub>О
0,49 г/л
3,4-дигидроксибензойная кислота
3,08 мг/л
NaCl
2,5 г/л
KCl
1 г/л
MgSO<sub>4</sub> × 7H<sub>2</sub>O
0,3
г/л
FeSO<sub>4</sub> × 7H<sub>2</sub>O
25
мг/л
MnSO<sub>4</sub> × 4-6 H<sub>2</sub>O
5
мг/л
ZnCl<sub>2</sub>
10
мг/л
CaCl<sub>2</sub>
20
мг/л
Н<sub>3</sub>ВО<sub>3</sub>
150
мкг/л
CoCl<sub>2</sub> × 6H<sub>2</sub>O
100
мкг/л
CuCl<sub>2</sub> × 2H<sub>2</sub>O
100
мкг/л
NiSO<sub>4</sub> × 6H<sub>2</sub>O
100
мкг/л
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub> × 2H<sub>2</sub>O
25
мкг/л
биотин (витамин Н)
1050
мкг/л
тиамин × HCl (витамин B<sub>1</sub>)
2100
мкг/л
никотинамид
2,5
мг/л
пантотеновая кислота
125
мг/л
цианокобаламин (витамин B<sub>12</sub>)
1
мкг/л
4-аминобензойная кислота (РАВА; витамин H<sub>1</sub>)
600
мкг/л
фолиевая кислота
1,1
мкг/л
пиридоксин (витамин B<sub>6</sub>)
30
мкг/л
рибофлавин (витамин В<sub>2</sub>)
90
мкг/л
CSL
40
мл/л
pH*
6,85
* устанавливают разбавленным водным раствором NaOH
*** навеска гидролизата на литр среды
После прививки колбы инкубировали в увлажняемом шкафу-шейкере в течение 48 часов при 30°С в движении (200 об/мин). После прерывания ферментации содержание глюкозы и лизина определили с помощью ВЭЖК. ВЭЖК провели с помощью прибора 1100 Series LC System производства Agilent. Определение концентрации глюкозы осуществляли с помощью колонки НРХ-87Н производства фирмы Bio-Rad. Определение концентрации аминокислоты проводили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на аппаратуре Agilent 1100 Series LC System. Предколоночная дериватизация ортофталевым альдегидом позволяет квантифицировать образовавшиеся аминокислоты, а разделение смеси аминокислот проходит на колонке Hypersil AA (Agilent). Результаты представлены в таблице 32.
Таблица 32
Прерывание стандартного осахаривания по прошествии × минут
колба
лизин [г/л]
10
1
15,05
2
11,71
3
14,24
15
4
14,91
5
15,27
6
12,20
20
7
13,19
8
13,65
9
11,14
30
10
15,38
11
12,45
12
11,56
45
13
13,13
14
14,64
15
13,48
60
16
14,58
17
13,72
18
14,27
Полученные таким образом содержащие фитазу ферментационные бульоны переработали согласно примерам 1 с.1) или 1 с.4) в порошок или в гранулят, соответственно.