ПЕПТИДЫ И СПОСОБЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ДИАБЕТА
PEPTIDES AND DIABETES TREATMENT METHODS

Уровень техники настоящего изобретения
Было описано несколько стратегий по предотвращению возникновения нежелательного иммунного ответа на антиген. В международной заявке WO 2008/017517 описывается новая стратегия, в которой применяются пептиды, содержащие антиген MHC класса II заданного антигенного белка и оксидоредуктазный мотив. Эти пептиды превращают CD4+T-клетки в тип клеток с цитолитическими свойствами, называемый цитолитическими CD4+T-клетками. Эти клетки способны осуществлять цитолиз посредством запуска апоптоза тех антигенпрезентирующих клеток (APC), которые презентируют антиген, из которого получают пептид. В международной заявке WO 2008/017517 демонстрируется этот подход в отношении аллергий и аутоиммунных заболеваний, таких как диабет I типа. В данном документе инсулин может действовать в качестве аутоантигена.
В международной заявке WO 2009101207 и в Carlier et al. (2012) Plos one 7,10 e45366, также более подробно описываются антигенспецифические цитолитические клетки.
В международной заявке WO 2009101206 описывается применение пептидов с оксидоредуктазным мотивом и эпитопа MCH класса II растворимого аллоантигена для предотвращения иммунного ответа на такой антиген при применении в методах заместительной терапии (например, нежелательного иммунного ответа на вводимый инъекцией инсулин у пациентов с диабетом).
В международной заявке WO 2016059236 раскрываются дополнительно модифицированные пептиды, в которых рядом с оксидоредуктазным мотивом присутствует дополнительный гистидин.
При конструировании пептида против диабета I типа можно принимать во внимание много факторов, таких как тип аутоантигена (инсулин, GAD 65, …), специфический домен и эпитоп аутоантигена, оксидоредуктазный мотив, длина и аминокислотная последовательность между оксидоредуктазным мотивом и последовательностью эпитопа.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к новым пептидам, полученным из инсулина, для лечения диабета 1 типа.
Пептиды согласно настоящему изобретению обладают преимуществом, заключающимся в том, что цитолитические CD4+T-клетки, которые были получены с применением этих пептидов, характеризуются повышенной выработкой IFN-гамма и sFasL по сравнению с пептидами из уровня техники. Предполагается, что выработка гранзима B у указанных CD4+T-клеток также является повышенной.
Повышенные уровни экспрессии этих маркеров являются показателями большей способности пептидов согласно настоящему изобретению к образованию цитолитических CD4+T-клеток по сравнению с пептидами из уровня техники.
Один аспект настоящего изобретения относится к пептидам длиной от 12 до 50 аминокислот, содержащим тетрапептидную последовательность Cxx[CST] [SEQ ID NO: 1] или [CST]xxC [SEQ ID NO: 2] (т.е. редокс-мотив) и отделенную от этого тетрапептида 0-5 аминокислотами, предпочтительно, 0-4 аминокислотами (т.е. линкером) последовательность LALEGSLQK [SEQ ID NO: 3] (т.е. эпитоп).
Варианты осуществления этих пептидов содержат последовательность Cxx[CST]SLQPLALEGSLQK [SEQ ID NO: 4] или [CST]xxCSLQPLALEGSLQK [SEQ ID NO:5].
Другие варианты осуществления этих пептидов содержат последовательность CxxCSLQPLALEGSLQK [SEQ ID NO: 6].
Другие варианты осуществления этих пептидов содержат последовательность HCxx[CST]SLQPLALEGSLQK [SEQ ID NO:7] или H[CST]xxCSLQPLALEGSLQK [SEQ ID NO:8].
Другие варианты осуществления этих пептидов содержат последовательность HCxxCSLQPLALEGSLQK [SEQ ID NO: 9].
Другие варианты осуществления этих пептидов содержат последовательность редокс-мотива Cxx[CST] [SEQ ID NO: 1] или [CST]xxC [SEQ ID NO: 2] и последовательность SLQPLALEGSLQKRG [SEQ ID NO: 20].
Конкретные варианты осуществления этих пептидов состоят из последовательности
Cxx[CST]SLQPLALEGSLQK [SEQ ID NO: 4],
[CST]xxCSLQPLALEGSLQK [SEQ ID NO: 5],
CxxCSLQPLALEGSLQK [SEQ ID NO:6],
HCxx[CST]SLQPLALEGSLQK [SEQ ID NO:7],
H[CST]xxCSLQPLALEGSLQK [SEQ ID NO:8] или
HCxxCSLQPLALEGSLQK [SEQ ID NO:9].
Другие конкретные варианты осуществления этих пептидов состоят из последовательности
Cxx[CST]SLQPLALEGSLQKRG [SEQ ID NO: 10],
[CST]xxCSLQPLALEGSLQKRG [SEQ ID NO: 11],
CxxCSLQPLALEGSLQKRG [SEQ ID NO: 12],
HCxx[CST]SLQPLALEGSLQKRG [SEQ ID NO:13],
H[CST]xxCSLQPLALEGSLQKRG [SEQ ID NO:14] или
HCxxCSLQPLALEGSLQKRG [SEQ ID NO: 15].
В соответствии с конкретными вариантами осуществления этих последовательностей Cxx[CST] [SEQ ID NO: 1] представляет собой CPY[CST] [SEQ ID NO: 16], [CST]xxC [SEQ ID NO: 2] представляет собой [CST]PYC [SEQ ID NO: 17], более конкретная CxxC [SEQ ID NO: 18] представляет собой CPYC [SEQ ID NO:19].
Конкретный вариант осуществления представляет собой пептид HCPYCSLQPLALEGSLQKRG [SEQ ID NO: 26]
В соответствии с вышеуказанными вариантами осуществления редокс-мотив находится с N-концевой стороны эпитопа.
В альтернативном наборе вариантов осуществления пептиды имеют редокс-мотив с C-концевой стороны эпитопа.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к любому из пептидов, которые раскрыты выше, для применения в качестве лекарственного средства, в особенности, в лечении или предупреждении диабета 1 типа или для уменьшения симптомов диабета 1 типа.
Еще один аспект относится к фармацевтическим композициям, содержащим любой из пептидов, которые раскрыты выше, и фармацевтически приемлемый носитель.
Еще один аспект относится к in vitro способу получения популяции цитолитических CD4+T-клеток против APC, презентирующих инсулиновые эпитопы, предусматривающему стадии:
- обеспечения клеток периферической крови;
- обеспечения контакта указанных клеток in vitro с любым из иммуногенных пептидов, которые раскрыты выше; и
- выращивания указанных клеток в присутствии IL-2.
Еще один аспект относится к популяции цитолитических CD4+T-клеток против презентирующих инсулин APC, получаемой с помощью вышеуказанного способа, для применения в качестве лекарственного средства.
Еще один аспект относится к популяции клеток, получаемой с помощью вышеуказанного способа, для применения в лечении или предупреждении диабета 1 типа.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Высвобождение sFasL в клеточных линиях, полученных с использованием p17-003 или p17-001.
Клетки, специфические в отношении p17-003 или p17-001 (IL5-положительные клетки; черные столбики на гистограмме), повторно стимулировали в течение 24 часов антигенпрезентирующими клетками, нагруженными пептидами p17-003 или p17-001 в зависимости от пептида, применяемого для их получения, и супернатантом, собранным спустя 24 часа совместного культивирования. IL-5-отрицательные клетки представлены в качестве контрольных популяций PBMC (незакрашенные столбики гистограммы). Результаты представлены в виде среднего значения +/-SD (стандартное отклонение) для концентрации sFasL, скорректрированной на число клеток.
Фиг. 2. На этой фигуре показан ответ клеточных линий на стимуляцию p17-003 или p17-001, выраженный в виде выработки цитокинов.
Подробное раскрытие настоящего изобретения
Настоящее изобретение будет описано применительно к конкретным вариантам осуществления, однако настоящее изобретение ограничивается не ими, а лишь пунктами формулы изобретения. Любые ссылки в пунктах формулы изобретения не будут истолкованы как ограничивающие объем. Следующие термины или определения представлены исключительно для помощи в понимании настоящего изобретения. Если это специально не определено в данном документе, все термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое они будут иметь для специалиста в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Определения, представленные в данном документе, не следует толковать как имеющие объем меньший, чем понимаемый средним специалистом в данной области техники.
Если не определено иное, все способы, стадии, методики и манипуляции, которые не описаны специально подробно, могут быть осуществлены и были осуществлены способом известным по существу, что будет ясно квалифицированному специалисту. Например, со ссылкой на стандартные руководства, на общую информацию из уровня техники, на которую ссылаются выше, и на дополнительные источники, цитируемые там.
В контексте данного документа формы в единственном числе включают в себя соответствующие формы как в единственном, так и во множественном числе, если контекст явно не предписывает иное. Термин «любой» при использовании применительно к аспектам, пунктам формулы изобретения или вариантам осуществления, которые используются в данном документе, относится к любому одному из них (т.е. какому-либо), а также ко всем комбинациям указанных аспектов, пунктов формулы изобретения или вариантов осуществления, на которые ссылаются.
Термины «содержащий», «содержит» и «состоит из», которые используются в данном документе, являются синонимичными терминам «включающий в себя», «включает в себя» или «содержащий», «содержит» и являются включительными или открытыми и не исключают дополнительные члены, элементы или стадии способа, которые не перечислены. Указанные термины также охватывают варианты осуществления «состоящий, по сути, из» и «состоящий из».
Перечисление численных диапазонов с помощью конечных точек включает в себя все числа и дробные части, включенные в соответствующие диапазоны, а также упомянутые конечные точки.
Предполагается, что термин «приблизительно», который используется в данном документе применительно к измеряемому значению, такому как параметр, количество, продолжительность во времени и т.п., охватывает вариации, составляющие +/-10% или менее, предпочтительно +/-5% или менее, более предпочтительно +/-1% или менее и еще более предпочтительно +/-0,1% или менее от определенного значения, в той мере, в которой такие вариации являются подходящими для осуществления в раскрытом изобретении. Следует понимать, что само значение, к которому относится модификатор «приблизительно», также является специально и предпочтительно раскрытым.
В контексте данного документа термин «для применения», который используется в выражении «композиция для применения в лечении заболевания», также будет раскрывать соответствующий способ лечения и соответствующее применение состава для производства лекарственного средства для лечения заболевания.
Термин «пептид» в контексте данного документа относится к молекуле, содержащей аминокислотную последовательность из 12-200 аминокислот, соединенных пептидными связями, но которая при этом может содержать неаминокислотные структуры.
Пептиды согласно настоящему изобретению могут содержать любую из традиционных 20 аминокислот или их модифицированных вариантов или могут содержать не встречающиеся в естественных условиях аминокислоты, включенные с помощью химического синтеза пептидов или с помощью химической или ферментативной модификации.
Термин «антиген» в контексте данного документа относится к структуре макромолекулы, как правило, белка (с полисахаридами или без них), или полученной из белковой композиции, содержащей один или несколько гаптенов и содержащей T-клеточные эпитопы.
Термин «антигенный белок» в контексте данного документа относится к белку, содержащему один или несколько T-клеточных эпитопов. Аутоантиген или аутоантигенный белок в контексте данного документа относится к белку человека или животного, присутствующему в организме, который вызывает иммунный ответ в организме такого же человека или животного.
Термин «эпитоп» относится к одной или нескольким частям (которые могут определять конформационный эпитоп) антигенного белка, которые специфически распознаются и связываются антителом или его частью (Fab', Fab2' и т.д.) или рецептором, присутствующим на поверхности клетки B- или T-лимфоцита, и которые способны посредством указанного связывания индуцировать иммунный ответ.
Термин «T-клеточный эпитоп» в контексте настоящего изобретения относится к доминантному, субдоминатнтному или минорному T-клеточному эпитопу, т.е. части антигенного белка, которая специфически распознается и связывается рецептором на поверхности клетки T-лимфоцита. Является ли эпитоп доминантным, субдоминантным или минорным, зависит от иммунной реакции, вызываемой в отношении эпитопа. Доминантность зависит от частоты, с которой такие эпитопы распознаются T-клетками и способны активировать их среди всех возможных T-клеточных эпитопов белка.
T-клеточный эпитоп представляет собой эпитоп, распознаваемый молекулами MHC класса II, который состоит из последовательности из +/-9 аминокислот, которые помещаются в бороздку в молекуле MHC II. В пептидной последовательности, представляющей собой T-клеточный эпитоп, аминокислоты в эпитопе пронумерованы от P1 до P9, аминокислоты с N-конца относительно эпитопа пронумерованы P-1, P-2 и так далее, аминокислоты с C-конца относительно эпитопа пронумерованы P+1, P+2 и так далее. Пептиды, распознаваемые молекулами MHC класса II, а не молекулами MHC класса I, называются рестриктированными по MHC класса II T-клеточными эпитопами.
Термин «MHC» относится к «антигену главного комплекса гистосовместимости». У людей гены MHC известны как гены HLA («лейкоцитарный антиген человека»). Несмотря на то что нет договоренности, которой систематически придерживаются, в некоторых литературных источниках HLA используется применительно к молекулам белка HLA, а MHC - применительно к генам, кодирующим белки HLA. В связи с этим термины «MHC» и «HLA» являются эквивалентами при использовании в данном документе. Система HLA у человека имеет свой эквивалент у мыши, т.е. систему H2. Наиболее внимательно изучаемыми генами HLA являются девять так называемых классических генов MHC: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA DQB1, HLA-DRA и HLA-DRB1. У людей MHC делится на три участка: класс I, II и III. Гены A, B и C относятся к MHC класса I, в то время как шесть генов D относятся к классу II. Молекулы MHC класса I состоят из одной полиморфной цепи, содержащей 3 домена (альфа 1, 2 и 3), которая связывается с бета-2-микроглобулином на клеточной поверхности. Молекулы класса II состоят из 2 полиморфных цепей, каждая из которых содержит 2 цепи (альфа 1 и 2 и бета 1 и 2).
Молекулы MHC класса I экспрессируются практически на всех ядерных клетках.
Пептидные фрагменты, присутствующие в контексте молекул MHC класса I, распознаются CD8+T-лимфоцитами (цитолитическими T-лимфоцитами или CTL). CD8+T-лимфоциты часто созревают в цитолитические эффекторы, которые могут лизировать клетки, несущие стимулирующий антиген. Молекулы MHC класса II экспрессируются преимущественно на активированных лимфоцитах и антигенпрезентирующих клетках. CD4+T-лимфоциты (хелперные T-лимфоциты или Th) активируются при распознавании уникального пептидного фрагмента, презентируемого молекулой MHC класса II, которая обычно находится на антигенпрезентирующей клетке, подобной макрофагу или дендритной клетке. CD4+T-лимфоциты пролиферируют и секретируют цитокины, такие как IL-2, IFN-гамма и IL-4, которые поддерживают антитело-опосредованные и клеточно-опосредованные ответы.
Функциональные HLA характеризуются глубокой связывающей бороздкой, с которой связываются эндогенные, а также чужеродные потенциально антигенные пептиды. Бороздка дополнительно характеризуется четко определенной формой и физико-химическими свойствами. Сайты связывания HLA класса I являются закрытыми по той причине, что концы пептида связываются в концах бороздки. Они также включены в сеть водородных связей с консервативными остатками HLA. Вследствие этих ограничений длина связанных пептидов ограничивается 8, 9 или 10 остатками. Тем не менее, было продемонстрировано, что пептиды из аминокислотных остатков в количестве вплоть до 12 также способны связываться HLA класса I. Сравнение структур различных комплексов HLA подтвердило общий характер связывания, при котором пептиды принимают относительно линейную вытянутую конформацию или могут задействовать центральные остатки для расширения бороздки.
В отличие от сайтов связывания HLA класса I сайты класса II являются открытыми на обоих концах. Это позволяет пептидам выступать из фактического участка связывания, при этом «свешиваясь» на обоих концах. Вследствие этого HLA класса II может связывать пептидные лиганды переменной длины, варьирующей от 9 до более чем 25 аминокислотных остатков. Подобно HLA класса I аффинность лиганда класса II определяется «постоянной» и «переменной» составляющими. Постоянная часть в этом случае также является результатом сети водородных связей, образующихся между консервативными остатками в эпитопе HLA класса II и основной цепью связанного пептида. Тем не менее, этот паттерн водородных связей не ограничивается N-и C-концевыми остатками в пептиде, а распределен по всей цепи. Последнее является важным, поскольку ограничивает конформацию пептидов в составе комплекса строго линейным характером связывания. Это является общим для всех аллотипов класса II. Вторая составляющая, определяющая аффинность связывания пептида, является переменной вследствие определенных положений полиморфизма в сайтах связывания класса II. Разные аллотипы образуют разные соответствующие карманы в бороздке, таким образом обеспечивая зависимую от подтипа селекцию пептидов или специфичность. Важно, что ограничения в отношении аминокислотных остатков, удерживаемых в карманах класса II, являются, в целом, «более мягкими», чем для класса I. Существует значительно большая перекрестная реактивность у пептидов из различных аллотипов HLA класса II. Последовательность из +/-9 аминокислот (т.е. 8, 9 или 10) в T-клеточном эпитопе MHC класса II, которая помещается в бороздку молекулы MHC II, обычно имеет нумерацию от P1 до P9. Дополнительные аминокислоты с N-конца относительно эпитопа имеют нумерацию P-1, P-2 и так далее, аминокислоты с C-конца относительно эпитопа имеют нумерацию P+1, P+2 и так далее.
Термин «гомолог» в контексте данного документа применительно к эпитопам, применяемым в контексте настоящего изобретения, относится к молекулам, характеризующимся по меньшей мере 50%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью аминокислотной последовательности с встречающимся в естественных условиях эпитопом, таким образом сохраняя способность эпитопа к связыванию с антителом или рецептором на клеточной поверхности B- и/или T-клетки. Конкретные гомологи эпитопа соответствуют природному эпитопу, модифицированному не более чем по трем, более конкретно, не более чем по 2, наиболее конкретно, по одной аминокислоте.
Термин «производное» в контексте данного документа применительно к пептидам согласно настоящему изобретению относится к молекулам, которые содержат по меньшей мере активную часть пептида (т.е. редокс-мотив и эпитоп MHC класса II, способный вызывать активность цитолитических CD4+T-клеток) и дополнительно к ней содержат дополняющую часть, которая может присутствовать с различными целями, такими как стабилизация пептидов или изменение фармакокинетических или фармакодинамических свойств пептида.
Термин «идентичность последовательности» у двух последовательностей в контексте данного документа относится к количеству положений с идентичными нуклеотидами или аминокислотами, поделенному на количество нуклеотидов или аминокислот в более короткой из последовательностей при выравнивании этих двух последовательностей. В частности, идентичность последовательности составляет от 70% до 80%, от 81% до 85%, от 86% до 90%, от 91% до 95%, от 96% до 100% или 100%.
Термины «кодирующий пептид полинуклеотид (или нуклеиновая кислота)» и «полинуклеотид (или нуклеиновая кислота), кодирующий (кодирующая) пептид,» в контексте данного документа относятся к нуклеотидной последовательности, которая при экспрессии в подходящем окружении приводит в результате к образованию последовательности соответствующего пептида или его производного или гомолога. Такие полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты включают в себя нормальные последовательности, кодирующие пептид, а также производные и фрагменты этих нуклеиновых кислот, способные экспрессировать пептид с требуемой активностью. Нуклеиновая кислота, кодирующая пептид согласно настоящему изобретению или его фрагмент, представляет собой последовательность, кодирующую пептид или его фрагмент, происходящий из млекопитающего или соответствующий млекопитающему, наиболее конкретно, фрагмент пептида человека.
Термин «иммунные нарушения» или «иммунные заболевания» относится к заболеваниям, при которых реакция иммунной системы является ответственной за нарушение функции или ненормальную ситуацию в организме или поддерживает их существование. В иммунные нарушения включены, среди прочих, аллергические заболевания и аутоиммунные заболевания.
Термины «аутоиммунное заболевание» или «аутоиммунное нарушение» относятся к заболеваниям, которые являются результатом аберрантного иммунного ответа организма против своих собственных клеток и тканей вследствие неспособности организма распознавать свои собственные составные части (вплоть до субмолекулярного уровня) как «свои». Группу заболеваний можно разделить на две категории: органоспецифические и системные заболевания. «Аллерген» определяется как вещество, обычно макромолекула или белковая композиция, которое вызывает выработку антител lgE у предрасположенных, в особенности, у генетически предрасположенных, индивидов-пациентов (с атопией). Подобные определения представлены в Liebers et al. (1996) Clin. Exp.Allergy 26, 494-516.
Термин «диабет 1 типа» (T1D) или «диабет типа 1» (также известный как «сахарный диабет 1 типа» или «иммуноопосредованный диабет» или ранее известный как «юношеский диабет» или «инсулинозависимый диабет») представляет собой аутоиммунное нарушение, которое, как правило, развивается у чувствительных индивидов в детском возрасте. В основе патогенеза T1D лежит разрушение большинства вырабатывающих инсулин бета-клеток поджелудочной железы посредством аутоиммунного механизма. Вкратце, организм теряет иммунологическую толерантность к бета-клеткам поджелудочной железы, ответственным за выработку инсулина, и индуцирует иммунный ответ, преимущественно опосредованный клетками, ассоциированный с выработкой аутоантител, что ведет к саморазрушению бета-клеток.
Термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству пептида согласно настоящему изобретению или его производного, которое обеспечивает желательный терапевтический или профилактический эффект у пациента. Например, применительно к заболеванию или нарушению оно представляет собой количество, которое уменьшает до некоторой степени один или несколько симптомов заболевания или нарушения и, более конкретно, возвращает к норме, либо частично, либо полностью, физиологические или биохимические параметры, ассоциированные с заболеванием или нарушением или являющиеся их причиной. Как правило, терапевтически эффективное количество представляет собой количество пептида согласно настоящему изобретению или его производного, которое будет приводить к улучшению или восстановлению нормальной физиологической ситуации. Например, при использовании для терапевтического лечения млекопитающего, пораженного иммунным нарушением, оно представляет собой суточное количество пептида/кг массы тела указанного млекопитающего. В качестве альтернативы, в случае, когда введение осуществляют с помощью генной терапии, количество депротеинизированной ДНК или вирусных векторов корректируют для того, чтобы гарантировать локальную выработку соответствующей дозы пептида согласно настоящему изобретению, его производного или гомолога.
Термин «природный» применительно к пептиду относится к факту, что последовательность является идентичной фрагменту встречающегося в естественных условиях белка (дикого типа или мутантного). В отличие от него, термин «искусственный» относится к последовательности, которая сама по себе не встречается в природе. Искусственную последовательность получают из природной последовательности с помощью ограниченных модификаций, таких как изменение/удаление/вставка одной или нескольких аминокислот в пределах последовательности, встречающейся в естественных условиях, или посредством добавления/удаления аминокислот на N- или C-конце последовательности, встречающейся в естественных условиях.
Аминокислоты называются в данном документе своими полными названиями, своими трехбуквенными сокращениями или своими однобуквенными сокращениями.
Мотивы аминокислотных последовательностей записываются в данном документе в соответствии с форматом Prosite. Мотивы используют для описания определенного разнообразия последовательности в конкретных частях последовательности. Символ X используют для положения, в котором приемлемой является любая аминокислота. Альтернативы указываются посредством перечисления приемлемых аминокислот для заданного положения в квадратных скобках («[]»). Например: [CST] обозначает аминокислоту, выбранную из Cys, Ser или Thr. Аминокислоты, которые исключаются как альтернативы, указываются посредством их перечисления в фигурных скобках («{ }»). Например: {AM} обозначает любую аминокислоту за исключением Ala и Met. Различные элементы в мотиве необязательно отделены друг от друга дефисом (-). Повтор идентичного элемента в пределах мотива может быть указан посредством размещения за этим элементом численного значения или диапазона численных значений в круглых скобках. Например, X(2) соответствует X-X или XX; X(2, 5) соответствует 2, 3, 4 или 5 X аминокислот, A(3) соответствует A-A-A или AAA.
Чтобы провести различие между аминокислотами X, аминокислоты между H и C называются внешними аминокислотами X (выделенные одинарным подчеркиванием в вышеуказанной последовательности), аминокислоты в пределах редокс-мотива называются внутренними аминокислотами X (выделенные двойным подчеркиванием в вышеуказанной последовательности).
X представляет собой любую аминокислоту, в частности, L-аминокислоту, более конкретно, одну из 20 встречающихся в естественных условиях L-аминокислот.
Пептид, содержащий T-клеточный эпитоп и модифицированную пептидную последовательность мотива, характеризующуюся пониженной активностью, способен к образованию популяции антигенспецифических цитолитических CD4+T-клеток против антигенпрезентирующих клеток.
Соответственно, в своем наиболее широком смысле настоящее изобретение относится к пептидам, которые содержат по меньшей мере один T-клеточный эпитоп антигена (аутоантигена или антигена, отличного от аутоантигена) с потенциалом для запуска иммунной реакции и модифицированный мотив последовательности тиоредуктазы с восстанавливающей активностью в отношении дисульфидных связей в пептиде. T-клеточный эпитоп и модифицированная последовательность редокс-мотива могут непосредственно примыкать друг к другу в пептиде, или, необязательно, они могут быть разделены одной или несколькими аминокислотами (так называемой линкерной последовательностью). Необязательно, пептид дополнительно содержит последовательность для нацеливания на эндосомы и/или дополнительные «фланкирующие» последовательности.
Пептиды согласно настоящему изобретению содержат T-клеточный эпитоп антигена (аутоантигена или антигена, отличного от аутоантигена) MHC класса II с потенциалом для запуска иммунной реакции и модифицированный редокс-мотив. Восстанавливающую активность последовательности мотива в пептиде можно подвергнуть анализу в отношении ее способности к восстановлению сульфгидрильной группы, как например, в анализе растворимости инсулина, в котором растворимость инулина изменяется при восстановлении, или с использованием меченого флуоресцентной меткой субстрата, такого как инсулин. В примере такого анализа применяется флуоресцентный пептид, и он описан в Tomazzolli et al. (2006) Anal. Biochem. 350, 105–112. Два пептида с FITC-меткой становятся самогасящими, когда они ковалентно прикрепляются друг к другу через дисульфидный мостик. При восстановлении с помощью пептида в соответствии с настоящим изобретением восстановленные отдельные пептиды опять становятся флуоресцентными.
Модифицированный редокс-мотив может располагаться со стороны амино-конца относительно T-клеточного эпитопа или на карбокси-конце T-клеточного эпитопа.
Пептидные фрагменты с восстанавливающей активностью встречаются в тиоредуктазах, которые представляют собой небольшие ферменты, восстанавливающие дисульфидные связи, в том числе глутаредоксины, нуклеоредоксины, тиоредоксины и другие тиол/дисульфид-оксидоредуктазы (Holmgren (2000) Antioxid. Redox Signal. 2, 811-820; Jacquot et al. (2002) Biochem. Pharm. 64, 1065-1069). Они являются многофункциональными, повсеместно распространенными и обнаруживаются у многих прокариот и эукариот.Они проявляют восстанавливающую активность в отношении дисульфидных связей на белках (таких как ферменты) благодаря обладающим окислительно-восстановительной активностью цистеинам в консенсусных последовательностях консервативного активного домена: CXXC [SEQ ID NO: 18], CXXS [SEQ ID NO: 23], CXXT [SEQ ID NO: 24], SXXC [SEQ ID NO: 21], TXXC [SEQ ID NO: 22] (Fomenko et al. (2003) Biochemistry 42, 11214-11225; Fomenko et al. (2002) Prot. Science 11, 2285-2296), в которой X обозначает любую аминокислоту. Такие домены также обнаруживаются в более крупных белках, таких как протеин-дисульфид-изомераза (PDI) и фосфоинозитид-специфическая фосфолипаза C.
4-Аминокислотный редокс-мотив, который известен, например, из Fomenko и международной заявки WO2008/017517, содержит цистеин в положении 1 и/или 4; таким образом, мотив представляет собой либо CXX[CST] [SEQ ID NO: 1], либо [CST]XXC [SEQ ID NO: 2]. Такая тетрапептидная последовательность будет называться «мотивом». Мотив в пептиде может представлять собой любую из альтернатив CXXC [SEQ ID NO: 18], SXXC [SEQ ID NO: 21], TXXC [SEQ ID NO: 22], CXXS [SEQ ID NO: 23] или CXXT [SEQ ID NO: 24]. В частности, пептиды содержат мотив последовательности CXXC [SEQ ID NO: 18].
Как подробно объясняется далее, пептиды согласно настоящему изобретению можно получить с помощью химического синтеза, который обеспечивает возможность включения аминокислот, отличных от природных. Соответственно, «C» в вышеуказанных редокс-модифицированных редокс-мотивах представляет собой либо цистеин, либо другую аминокислоту с тиольной группой, такую как меркаптовалин, гомоцистеин или другие природные аминокислоты или аминокислоты, отличные от природных, с тиольной функциональной группой. Для того чтобы получить сниженную активность, цистеины, присутствующие в модифицированном редокс-мотиве, не должны встречаться в составе цистеинового дисульфидного мостика. Тем не менее, редокс-модифицированный редокс-мотив может содержать модифицированные цистеины, такие как метилированный цистеин, который превращается в цистеин со свободными тиольными группами in vivo. X может представлять собой любую из 20 природных аминокислот, в том числе S, C или T, или может представлять собой аминокислоту, отличную от природной. В соответствии с конкретными вариантами осуществления X представляет собой аминокислоту с небольшой боковой цепью, такой как Gly, Ala, Ser или Thr. В соответствии с дополнительными конкретными вариантами осуществления X не представляет собой аминокислоту с объемной боковой цепью, такую как Trp.В соответствии с дополнительными конкретными вариантами осуществления X не представляет собой цистеин. В соответствии с дополнительными конкретными вариантами осуществления по меньшей мере один X в модифицированном редокс-мотиве представляет собой His. В соответствии с дополнительными конкретными вариантами осуществления по меньшей мере один X в модифицированном редокс-мотиве представляет собой Pro.
2
2
Пептиды могут дополнительно содержать модификации для повышения стабильности или растворимости, как например, модификацию N-концевой NH-группы или C-концевой COOH-группы (например, модификация COOH в CONH-группу).
В пептидах согласно настоящему изобретению, содержащих модифицированный редокс-мотив, мотив располагается таким образом, что в случае, когда эпитоп помещается в бороздку MHC, мотив остается за пределами связывающей бороздки MHC. Модифицированный редокс-мотив располагается вплотную к последовательности эпитопа в пределах пептида [иными словами, линкерная последовательность из нуля аминокислот между мотивом и эпитопом] или отделен от T-клеточного эпитопа линкером, содержащим аминокислотную последовательность из 5 аминокислот или меньшего количества аминокислот. Более конкретно, линкер содержит 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот. Конкретные варианты осуществления представляют собой пептиды с 0, 1 или 2-аминокислотным линкером между последовательностью эпитопа и последовательностью модифицированного редокс-мотива. В тех пептидах, в которых последовательность модифицированного редокс-мотива располагается смежно с последовательностью эпитопа, она указывается как положение от P-4 до P-1 или от P+1 до P+4 при сопоставлении с последовательностью эпитопа. Помимо пептидного линкера другие органические соединения можно применять в качестве линкера для связывания частей пептида друг с другом (например, последовательности модифицированного редокс-мотива с последовательностью T-клеточного эпитопа).
Пептиды согласно настоящему изобретению могут дополнительно содержать дополнительные короткие аминокислотные последовательности с N- или C-конца относительно последовательности, содержащей T-клеточный эпитоп и модифицированный редокс-мотив. Такая аминокислотная последовательность, в целом, называется в данном документе «фланкирующей последовательностью». Фланкирующая последовательность может быть расположена между эпитопом и последовательностью для нацеливания на эндосомы и/или между модифицированным редокс-мотивом и последовательностью для нацеливания на эндосомы. В определенных пептидах, не содержащих последовательность для нацеливания на эндосомы, короткая аминокислотная последовательность может присутствовать с N- и/или C-конца относительно модифицированного редокс-мотива и/или последовательности эпитопа в пептиде. Более конкретно, фланкирующая последовательность представляет собой последовательность из 1-7 аминокислот, наиболее конкретно, последовательность из 2 аминокислот.
Модифицированный редокс-мотив может располагаться с N-конца относительно эпитопа.
В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего изобретения предполагаются пептиды, содержащие одну последовательность эпитопа и последовательность модифицированного редокс-мотива. В соответствии с дополнительными конкретными вариантами осуществления модифицированный редокс-мотив встречается в пептиде несколько раз (1, 2, 3, 4 раза или даже большее число раз), например, в виде повторов модифицированного редокс-мотива, которые могут быть отделены друг от друга одной или несколькими аминокислотами, или в виде повторов, которые расположены вплотную друг к другу. В качестве альтернативы, один или несколько модифицированных редокс-мотивов предполагаются как на N-, так и на C-конце последовательности T-клеточного эпитопа.
Другие варианты, предполагаемые для пептидов согласно настоящему изобретению, включают в себя пептиды, которые содержат повторы последовательности T-клеточного эпитопа, где перед и/или после каждой последовательности эпитопа располагается модифицированный редокс-мотив (например, повторы «модифицированный редокс-мотив-эпитоп» или повторы «модифицированный редокс-мотив-эпитоп-модифицированный редокс-мотив»). В данном случае все модифицированные редокс-мотивы могут иметь одинаковую последовательность, но это не является обязательным. Следует отметить, что повторяющиеся последовательности пептидов, содержащие эпитоп, который сам по себе содержит модифицированный редокс-мотив, будут также давать в результате последовательность, содержащую как «эпитоп», так и «модифицированный редокс-мотив». В таких пептидах модифицированный редокс-мотив в пределах одной последовательности эпитопа функционирует как модифицированный редокс-мотив за пределами второй последовательности эпитопа.
Как правило, пептиды согласно настоящему изобретению содержат только один T-клеточный эпитоп.Как описано ниже, T-клеточный эпитоп в последовательности белка можно идентифицировать с помощью функциональных анализов и/или одного или нескольких прогностических анализов in silica. Аминокислоты в последовательности T-клеточного эпитопа имеют нумерацию в соответствии с их положением в связывающей бороздке белков MHC. T-клеточный эпитоп, присутствующий в пептиде, состоит из 8-25 аминокислот, более конкретно, из 8-16 аминокислот, еще более конкретно, состоит из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 аминокислот.
В соответствии с более конкретным вариантом осуществления T-клеточный эпитоп состоит из последовательности из 9 аминокислот.В соответствии с дополнительным конкретным вариантом осуществления T-клеточный эпитоп представляет собой эпитоп, который презентируется T-клеткам молекулами MHC класса II [рестриктированные по MHC класса II T-клеточные эпитопы]. Как правило, последовательность T-клеточного эпитопа относится к октапептидной или, более конкретно, к нонапептидной последовательности, которая помещается в щель в белке MHC II.
T-клеточный эпитоп в пептидах согласно настоящему изобретению может либо соответствовать последовательности природного эпитопа в белке, либо он может представлять собой его модифицированный вариант при условии, что модифицированный T-клеточный эпитоп сохраняет свою способность к связыванию в пределах щели в MHC подобно последовательности природного T-клеточного эпитопа. Модифицированный T-клеточный эпитоп может характеризоваться такой же аффинностью связывания в отношении белка MHC, что и природный эпитоп, но он также может характеризоваться пониженной аффинностью. В частности, аффинность связывания у модифицированного пептида является не менее чем в 10 раз меньшей, чем у исходного пептида, более конкретно, не менее чем в 5 раз меньшей. Пептиды согласно настоящему изобретению характеризуются стабилизирующим эффектом в отношении белковых комплексов. Соответственно, стабилизирующий эффект комплекса пептид-MHC компенсирует пониженную аффинность модифицированного эпитопа в отношении молекулы MHC.
Последовательность, содержащая T-клеточный эпитоп и восстанавливающее соединение в пределах пептида, может быть дополнительно связана с аминокислотной последовательностью (или другим органическим соединением), которая облегчает поглощение пептида в поздние эндосомы для процессинга и презентирования в детерминантах MHC класса II. Нацеливание на поздние эндосомы опосредуется сигналами, присутствующими в цитоплазматическом хвосте белков и соответствующими хорошо определенным пептидным мотивам. Последовательности для нацеливания на поздние эндосомы обеспечивают возможность процессинга и эффективного презентирования полученного из антигена T-клеточного эпитопа молекулами MHC класса II. Такие последовательности для нацеливания на эндосомы содержатся, например, в белке gp75 (Vijayasaradhi et al. (1995) J. Cell. Biol. 130, 807-820), человеческом белке CD3-гамма, HLA-BM 11 (Copier et al. (1996) J. lmmunol. 157, 1017-1027), цитоплазматическом хвосте рецептора DEC205 (Mahnke et al. (2000) J. Cell Biol. 151, 673-683). Другие примеры пептидов, которые функционируют как сортирующие сигналы для эндосом, раскрыты в обзоре Bonifacio and Traub (2003) Annu. Rev. Biochem. 72, 395-447. В качестве альтернативы, последовательность может представлять собой последовательность субдоминантного или минорного T-клеточного эпитопа из белка, который облегчает поглощение в поздние эндосомы без ослабления T-клеточного ответа в отношении антигена. Последовательность для нацеливания на поздние эндосомы может располагаться либо на амино-конце, либо на карбокси-конце полученного из антигена пептида для эффективного поглощения и процессинга, а также может быть связана через фланкирующую последовательность, такую как пептидная последовательность из аминокислот в количестве вплоть до 10. При применении минорного T-клеточного эпитопа с целью нацеливания, последний, как правило, располагается на амино-конце полученного из антигена пептида.
Соответственно, настоящим изобретением предполагаются пептиды антигенных белков и их применение для того, чтобы вызывать специфические иммунные реакции. Любой из этих пептидов может соответствовать фрагментам белков, которые содержат их в своей последовательности, т.е. восстанавливающее соединение и T-клеточный эпитоп, разделенные не более чем 10, предпочтительно, 7 аминокислотами или меньшим числом аминокислот.В качестве альтернативы и в случае большинства антигенных белков, пептиды согласно настоящему изобретению получают посредством связывания восстанавливающего соединения, более конкретно, восстанавливающего модифицированного редокс-мотива, который описан в данном документе, с N-конца или C-конца относительно T-клеточного эпитопа антигенного белка (либо сразу смежно с ним, либо с использованием линкера из не более чем 10, более конкретно, не более чем 7 аминокислот). Более того, последовательность T-клеточного эпитопа белка и/или модифицированный редокс-мотив могут быть модифицированы и/или могут быть введены (или модифицированы) одна или несколько фланкирующих последовательностей и/или нацеливающая последовательность по сравнению с последовательностью, встречающейся в естественных условиях. Таким образом, в зависимости от того, могут ли элементы согласно настоящему изобретению находиться в последовательности представляющего интерес антигенного белка или нет, пептиды согласно настоящему изобретению могут содержать последовательность, которая является «искусственной» или «встречающейся в естественных условиях».
Пептиды согласно настоящему изобретению могут значительно варьировать по длине. Длина пептидов может варьировать от 13 или 14 аминокислот, т.е. состоять из эпитопа из 8-9 аминокислот, смежного с ним модифицированного редокс-мотива из 5 аминокислот с гистидином, вплоть до 20, 25, 30, 40 или 50 аминокислот.Например, пептид может содержать последовательность для нацеливания на эндосомы из 40 аминокислот, фланкирующую последовательность приблизительно из 2 аминокислот, мотив, который описан в данном документе, из 5 аминокислот, линкер из 4 аминокислот и пептид T-клеточного эпитопа из 9 аминокислот.
Соответственно, в соответствии с конкретными вариантами осуществления полный пептид состоит из аминокислот в количестве от 13 до 20, 25, 30, 40, 50, 75 или 100 аминокислот.Более конкретно, в случае, когда восстанавливающее соединение представляет собой модифицированный редокс-мотив, который описан в данном документе, длина последовательности (искусственной или природной), содержащей эпитоп и модифицированный редокс-мотив, необязательно соединенные линкером (называемые в данном документе последовательностью «эпитоп-модифицированный редокс-мотив»), без последовательности для нацеливания на эндосомы, является критической. Более конкретно, «эпитоп-модифицированный редокс-мотив» имеет длину 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19 аминокислот.Такие пептиды из 13 или 14-19 аминокислот, необязательно, могут быть связаны с сигналом для нацеливания на эндосомы, размер которого является не столь критически значимым.
Как подробно описано выше, в соответствии с конкретными вариантами осуществления пептиды согласно настоящему изобретению содержат восстанавливающий модифицированный редокс-мотив, который описан в данном документе, связанный с последовательностью T-клеточного эпитопа.
В соответствии с дополнительными конкретными вариантами осуществления пептиды согласно настоящему изобретению представляют собой пептиды, содержащие T-клеточные эпитопы, которые не содержат аминокислотную последовательность с окислительно-восстановительными свойствами в своей природной последовательности.
Тем не менее, в соответствии с альтернативными вариантами осуществления T-клеточный эпитоп может содержать любую последовательность из аминокислот, обеспечивающую связывание эпитопа с щелью в MHC. В случае, когда представляющий интерес эпитоп антигенного белка содержит модифицированный редокс-мотив, такой как описанный в данном документе, в своей последовательности эпитопа, иммуногенные пептиды согласно настоящему изобретению содержат последовательность модифицированного редокс-мотива, который описан в данном документе, и/или другую восстанавливающую последовательность, связанную со стороны N- или C-конца с последовательностью эпитопа таким образом (в противоположность модифицированному редокс-мотиву, присутствующему в эпитопе, который погружен в щель), чтобы прикрепленный модифицированный редокс-мотив мог обеспечивать восстанавливающую активность.
Соответственно T-клеточный эпитоп и мотив являются непосредственно примыкающими или отделены друг от друга и не перекрываются. Для оценки понятия «непосредственно примыкающий» или «разделенный» определяют 8 или 9 аминокислотную последовательность, которая помещается в щель в MHC, а также определяют расстояние между этим октапептидом или нонапептидом и тетрапептидом редокс-мотива или пентапептидом модифицированного редокс-мотива, включающим в себя гистидин.
В целом, пептиды согласно настоящему изобретению не являются природными (следовательно, по существу, не являются фрагментами белков), а искусственными пептидами, которые содержат дополнительно к T-клеточному эпитопу модифицированный редокс-мотив, который описанный в данном документе, при этом модифицированный редокс-мотив непосредственно отделен от T-клеточного эпитопа линкером, состоящим из аминокислот в количестве до семи, наиболее конкретно, до четырех или до 2.
Было показано, что при введении (т.е. инъекции) млекопитающему пептида согласно настоящему изобретению (или композиции, содержащей такой пептид) пептид вызывает активацию T-клеток, распознающих полученный из антигена T-клеточный эпитоп, и обеспечивает дополнительный сигнал для T-клетки посредством восстановления поверхностного рецептора. Эта более оптимальная активация приводит в результате к T-клеткам, приобретающим цитолитические свойства в отношении клетки, презентирующей T-клеточный эпитоп, а также подавляющие свойства в отношении посторонних T-клеток. Таким образом, пептиды или композицию, содержащую пептиды, описанные в настоящем изобретении, которые содержат полученный из антигена T-клеточный эпитоп и модифицированный редокс-мотив за пределами эпитопа, можно применять для прямой иммунизации млекопитающих, в том числе людей. Следовательно, настоящим изобретением предполагаются пептиды согласно настоящему изобретению или их производные для применения в качестве лекарственного средства. Соответственно, настоящим изобретением предполагаются терапевтические способы, которые предусматривают введение одного или нескольких пептидов согласно настоящему изобретению пациенту, нуждающемуся в этом.
Настоящим изобретением предлагаются способы, с помощью которых образование антигенспецифических T-клеток, наделенных цитолитическими свойствами, может быть вызвано при иммунизации небольшими пептидами. Было обнаружено, что пептиды, которые содержат (i) последовательность, кодирующую T-клеточный эпитоп из антигена, и (ii) консенсусную последовательность с окислительно-восстановительными свойствами, а также, необязательно, дополнительно содержащие последовательность для облегчения поглощения пептида в поздние эндосомы для эффективного презентирования MHC класса II, вызывают образование супрессорных T-клеток.
Иммуногенные свойства пептидов согласно настоящему изобретению представляют особый интерес в лечении и предупреждении иммунных реакций.
Пептиды, описанные в данном документе, применяют в качестве лекарственного средства, более конкретно, их применяют для производства лекарственного средства для предупреждения или лечения иммунного нарушения у млекопитающего, более конкретно, у человека.
Настоящим изобретением описываются способы лечения или предупреждения иммунного нарушения у млекопитающего, нуждающегося в таком лечении или предупреждении, посредством применения пептидов согласно настоящему изобретению, их гомологов или производных, при этом способы предусматривают стадию введения указанному млекопитающему, страдающему от иммунного нарушения или имеющему риск иммунного нарушения, терапевтически эффективного количества пептидов согласно настоящему изобретению, их гомологов или производных, как например, чтобы уменьшить симптомы иммунного нарушения. Также предполагается лечение как людей, так и животных, таких как домашние питомцы и сельскохозяйственные животные. В соответствии с вариантом осуществления млекопитающее, подлежащее лечению, представляет собой человека. Иммунные нарушения, упоминаемые выше, в соответствии с конкретным вариантом осуществления являются выбранными из аллергических заболеваний и аутоиммунных заболеваний.
Пептиды согласно настоящему изобретению или фармацевтическую композицию, содержащую их, как например, определенную в данном документе, предпочтительно вводят посредством подкожного или внутримышечного введения. Предпочтительно, пептиды или фармацевтические композиции, содержащие их, можно вводить инъекцией подкожно (SC) в область боковой части предплечья, посередине между локтем и плечом. Если есть необходимость двух или более отдельных инъекций, их можно вводить одновременно в обе руки.
Пептид согласно настоящему изобретению или фармацевтическую композицию, содержащую его, вводят в терапевтически эффективной дозе. Иллюстративные, но не ограничивающие дозировки составляют от 50 до 1500 мкг, предпочтительно, от 100 до 1200 мкг. Более конкретные дозировки могут составлять от 50 до 250 мкг, от 250 до 450 мкг или от 850 до 1300 мкг в зависимости от состояния пациента и тяжести заболевания. Схема дозирования может предусматривать введение в одной дозе или в 2, 3, 4, 5 дозах или большем числе доз либо одновременно, либо последовательно. Иллюстративные неограничивающие режимы введения являются следующими:
- режим с низкой дозой, предусматривающий SC (подкожное) введение 50 мкг пептида в двух отдельных инъекциях по 25 мкг в каждой (100 мкл каждая) с последующими тремя последовательными инъекциями 25 мкг пептида в виде двух отдельных инъекций по 12,5 мкг в каждой (50 мкл каждая).
- режим со средней дозой, предусматривающий SC введение 150 мкг пептида в двух отдельных инъекциях по 75 мкг в каждой (300 мкл каждая) с последующими тремя последовательными введениями 75 мкг пептида в виде двух отдельных инъекций по 37,5 мкг в каждой (150 мкл каждая).
- режим с высокой дозой, предусматривающий SC введение 450 мкг пептида в двух отдельных инъекциях по 225 мкг в каждой (900 мкл каждая) с последующими тремя последовательными введениями 225 мкг пептида в виде двух отдельных инъекций по 112,5 мкг в каждой (150 мкл каждая).
Для всех вышеуказанных пептидов предполагается дополнительный вариант, в котором между гистидином и цистеином присутствует одна или две аминокислоты X. Как правило, эта(эти) наружная(наружные) аминокислота(аминокислоты) X не представляет(представляют) собой His, Cys, Ser или Thr.
Пептиды согласно настоящему изобретению также можно применять в in vitro диагностических способах для выявления рестриктированных по классу II CD4+T-клеток в образце. В этом способе обеспечивают контакт образца с комплексом из молекулы MHC класса II и пептида согласно настоящему изобретению. CD4+T-клетки выявляют посредством измерения связывания комплекса с клетками в образце, при этом связывание комплекса с клеткой является показателем для присутствия CD4+T-клеток в образце.
Комплекс может представлять собой гибридный белок пептида и молекулы MHC класса II.
В качестве альтернативы, молекулы MHC в комплексе представляют собой тетрамеры. Комплекс может быть обеспечен в виде растворимой молекулы, или он может быть прикреплен к носителю.
Соответственно, в соответствии с конкретными вариантами осуществления способы лечения и предупреждения согласно настоящему изобретению предусматривают введение иммуногенного пептида, который описан в данном документе, при этом пептид содержит T-клеточный эпитоп антигенного белка, который играет роль в заболевании, подлежащем лечению (например, таком как описанные выше). В соответствии с конкретными дополнительными вариантами осуществления применяемый эпитоп представляет собой доминантный эпитоп.
Пептиды согласно настоящему изобретению будут получать посредством синтеза пептида, в котором T-клеточный эпитоп и модифицированный редокс-мотив будут разделены 0-5 аминокислотами. В соответствии с определенными вариантами осуществления модифицированный редокс-мотив можно получить посредством введения 1, 2 или 3 мутаций за пределами последовательности эпитопа для сохранения контекста последовательности, который встречается в белке. Как правило, аминокислоты в P-2 и P-1, а также P+10 и P+11 относительно нонапептида, которые являются частью природной последовательности, сохраняют в последовательности пептида. Эти фланкирующие остатки, в целом, стабилизируют связывание с MHC класса II. В соответствии с другими вариантами осуществления последовательность с N-конца или C-конца относительно эпитопа будет неродственной относительно последовательности антигенного белка, содержащего последовательность T-клеточного эпитопа.
Таким образом, исходя из вышеуказанных способов конструирования пептида, пептид получают с помощью химического синтеза пептида, способов рекомбинантной экспрессии или, в более редких случаях, с помощью протеолитической или химической фрагментации белков.
Пептиды, которые получают в вышеуказанных способах, можно исследовать в отношении присутствия T-клеточного эпитопа в in vitro и in vivo способах, и их можно исследовать в отношении их восстанавливающей активности в in vitro анализах. В качестве заключительного контроля качества пептиды можно исследовать в in vitro анализах с целью подтверждения того, могут ли пептиды обеспечивать образование CD4+T-клеток, которые являются цитолитическими посредством апоптического пути для антигенпрезентирующих клеток, которые презентируют антиген, содержащий последовательность эпитопа, которая также присутствует в пептиде с модифицированным редокс-мотивом.
Пептиды согласно настоящему изобретению можно получать с помощью методик на основе применения рекомбинантной ДНК в клетках бактерий, дрожжей, клетках насекомых, клетках растений или клетках млекопитающих. Принимая во внимание ограниченную длину пептидов, их можно получать посредством химического синтеза пептидов, при котором пептиды получают посредством связывания различных аминокислот друг с другом. Химический синтез является особенно подходящим для включения, например, D-аминокислот, аминокислот с не встречающимися в естественных условиях боковыми цепями или природных аминокислоты с модифицированными боковыми цепями, таких как метилированный цистеин.
Способы химического синтеза пептидов хорошо описаны, и пептиды можно заказать у компаний, таких как Applied Biosystems и другие компании.
Синтез пептидов можно осуществлять либо в виде твердофазного синтеза пептидов (SPPS), либо, напротив, в виде жидкофазного синтеза пептидов. Наиболее известными способами SPPS является твердофазный химический процесс с использованием t-Boc и Fmoc.
Во время синтеза пептидов применяют несколько защитных групп.Например, гидроксильные и карбоксильные функциональные группы защищают трет-бутильной группой, лизин и триптофан защищают t-Boc группой, и аспарагин, глутамин, цистеин и гистидин защищают тритильной группой, и аргинин защищают pbf-группой. При необходимости такие защитные группы можно оставить на пептиде после синтеза. Пептиды можно связать друг с другом с образованием более длинных пептидов с применением стратегии лигирования (хемоселективное связывание двух незащищенных пептидных фрагментов), которая первоначально описана Kent (Schnelzer & Kent (1992) lnt. J. Pept. Protein Res. 40, 180-193) и рассматривается, например, в Tam et al. (2001) Biopolymers 60, 194-205, обеспечивая огромный потенциал для осуществления синтеза белков, который находится за пределами объема SPPS. Многие белки размером 100-300 были успешно синтезированы с помощью этого способа. Синтетические пептиды продолжают играть все более растущую по важности роль в исследованиях в областях биохимии, фармакологии, нейробиологии, энзимологии и молекулярной биологии вследствие огромного прогресса в SPPS.
В качестве альтернативы, пептиды можно синтезировать с применением молекул нуклеиновой кислоты, которые кодируют пептиды согласно настоящему изобретению, в соответствующем экспрессионном векторе, который включает в себя кодирующие нуклеотидные последовательности. Такие молекулы ДНК можно легко получить с помощью автоматизированного синтезатора ДНК и хорошо известной зависимости кодон-аминокислота из генетического кода. Такую молекулу ДНК также можно получить в виде геномной ДНК или в виде кДНК с применением олигонуклеотидных зондов и общепринятых методов гибридизации. Такие молекулы ДНК могут быть включены в экспрессионные векторы, в том числе в плазмиды, которые адаптированы для экспрессии ДНК и выработки полипептида в подходящем хозяине, таком как бактерия, например, Escherichia coli, клетка дрожжей, клетка животного или клетка растения.
Физические и химические свойства представляющего интерес пептида (например, растворимость, стабильность) оценивают, чтобы определить, является ли/будет ли являться пептид подходящим для применения в терапевтических композициях. Как правило, их оптимизируют посредством коррекции последовательности пептида. Необязательно, пептид может быть модифицирован после синтеза (химические модификации, например, добавление/удаление функциональных групп) с применением методик, известных в уровне техники.
Сами T-клеточные эпитопы, как полагают, запускают ранние события на уровне клетки T-хелпера, связываясь с соответствующей молекулой HLA на поверхности антигенпрезентирующей клетки и стимулируя соответствующую субпопуляцию T-клеток. Эти события приводят к пролиферации T-клеток, секреции лимфокинов, локальным воспалительным реакциям, привлечению дополнительных иммунных клеток в сайт и активации B-клеточного каскада, приводящего в выработке антител. Один изотип этих антител, lgE, имеет фундаментальное значение в развитии аллергических симптомов, и на его выработку оказывает влияние на ранних этапах каскада событий, на уровне клетки T-хелпера, природа секретируемых лимфокинов. T-клеточный эпитоп представляет собой основной элемент или наименьшую единицу распознавания T-клеточным рецептором, при этом эпитоп содержит аминокислотные остатки, необходимые для распознавания рецептором, которые являются смежными в аминокислотной последовательности белка.
Тем не менее, полагают, что при введении пептидов с T-клеточным эпитопом и редокс-мотивом, происходят следующие события:
активация (i) антигенспецифических T-клеток, являющаяся результатом когнатного взаимодействия с полученным из антигена пептидом, презентируемым молекулами MHC класса II;
редуктазная последовательность восстанавливает поверхностные белки T-клетки, такие как молекула CD4, второй домен которой содержит пространственно ограниченный дисульфидный мостик. Это передает сигнал в T-клетки. Среди ряда последствий, связанных с повышенной активностью окислительного пути, важными являются повышенный приток кальция и перемещение транскрипционного фактора NF-kB в ядро. Последнее приводит в результате к повышенной транскрипции IFN-гамма и гранзимов, что позволяет клеткам приобретать цитолитические свойства через механизм индукции апоптоза; цитолитические свойства воздействуют на клетки, презентирующие пептид, посредством механизма, который включает секрецию гранзима B и взаимодействия Fas-FasL. Поскольку эффект цитолиза клеток достигается посредством апоптического пути, термин «цитолитическте клетки» является более подходящим для этих клеток, нежели «цитотоксические клетки». Разрушение антигенпрезентирующих клеток-мишеней предотвращает активацию других T-клеток, специфических в отношении эпитопов, располагающихся на том же антигене, или в отношении несвязанного антигена, который будет подвергаться процессингу той же антигенпрезентирующей клеткой; дополнительным следствием активации T-клеток является подавление активации посторонних T-клеток посредством механизма, зависимого от межклеточных контактов. В таком случае T-клетки, активируемые антигеном, презентируемым отличающейся антигенпрезентирующей клеткой, также подвергаются супрессии при условии, что и цитолитические, и посторонние T-клетки находятся в непосредственной близости, а именно, активируются на поверхности одной и той же антигенпрезентирующей клетки.
Предложенный выше механизм действия подкрепляется экспериментальными данными, раскрытыми в вышеупомянутой PCT заявке WO 2008/017517 и публикациях авторов настоящего изобретения.
Настоящее изобретение относится к способам получения антигенспецифических цитолитических CD4+T-клеток либо in vivo, либо in vitro, и, независимо от них, к способам определения отличий цитолитических CD4+T-клеток от других клеточных популяций, таких как Foxp3+Treg, на основании характерных данных экспрессии.
Настоящим изобретением описываются in vivo способы получения антигенспецифических CD4+T-клеток. Конкретный вариант осуществления относится к способу получения или выделения CD4+T-клеток посредством иммунизации животных (в том числе людей) пептидами согласно настоящему изобретению, которые описаны в данном документе, а затем выделения CD4+T-клеток из иммунизированных животных. Настоящим изобретением описываются in vitro способы получения антигенспецифических цитолитических CD4+T-клеток против APC. Настоящее изобретение относится к способам получения антигенспецифических цитолитических CD4+T-клеток против APC.
В соответствии с одним вариантом осуществления предполагаются способы, которые предусматривают выделение клеток периферической крови, стимуляцию клеточной популяции in vitro иммуногенным пептидом согласно настоящему изобретению и выращивание стимулируемой клеточной популяции, более конкретно, в присутствии IL-2. Способы согласно настоящему изобретению имеют преимущество, заключающееся в том, что вырабатывается большое количество CD4+T-клеток, и что можно получать CD4+T-клетки, которые являются специфическими в отношении антигенного белка (посредством применения пептида, содержащего антигенспецифический эпитоп).
В соответствии с альтернативным вариантом осуществления CD4+T-клетки можно получать in vivo, т.е. посредством инъекции субъекту иммуногенных пептидов, описанных в данном документе, и сбора цитолитических CD4+T-клеток, образованных in vivo.
Антигенспецифические цитолитические CD4+T-клетки против APC, получаемые с помощью способов согласно настоящему изобретению, представляют особый интерес для введения млекопитающим с целью иммунотерапии, при предупреждении аллергических реакций и лечении аутоиммунных заболеваний. Предполагается применение как аллогенных, так и аутогенных клеток.
Популяции цитолитических CD4+T-клеток получают, как описано ниже в данном документе.
Антигенспецифические цитолитические CD4+T-клетки, которые описаны в данном документе, можно применять в качестве лекарственного средства, более конкретно, для применения в адоптивной клеточной терапии, более конкретно, в лечении острых аллергических реакций и рецидивов аутоиммунных заболеваний, таких как рассеянный склероз. Выделенные цитолитические CD4+T-клетки или популяции клеток, более конкретно, популяции антигенспецифических цитолитических CD4+T-клеток, полученных, как описано, применяют для производства лекарственного средства для предупреждения или лечения иммунных нарушений. Раскрыты способы лечения с применением выделенных или полученных цитолитических CD4+T-клеток.
Как объясняется в международной заявке WO 2008/017517, цитолитические CD4+T-клетки против APC можно отличать от природных Treg-клеток на основании характеристик экспрессии у клеток. Более конкретно, популяция цитолитических CD4+T-клеток демонстрирует одну или несколько из следующих характеристик по сравнению с популяцией природных Treg-клеток:
повышенная экспрессия поверхностных маркеров, в том числе CD103, CTLA-4, Fasl и ICOS, при активации,
промежуточный уровень экспрессии CD25,
экспрессия CD4, ICOS, CTLA-4, GITR и низкая или отсутствующая экспрессия CD127 (IL7-R), отсутствующая экспрессия CD27.
экспрессия транскрипционного фактора T-bet и egr-2 (Krox-20), но не репрессора транскрипции Foxp3,
высокая выработка IFN-гамма и отсутствие или только следовые количества IL-10, IL-4, IL-5, IL-13 или TGF-бета.
Кроме того, цитолитические T-клетки экспрессируют CD45RO и/или CD45RA, не экспрессируют CCR7, CD27, и в них присутствуют высокие уровни гранзима B и других гранзимов, а также Fas-лиганда.
Пептиды согласно настоящему изобретению при введении живому животному, как правило, человеку, будут вызывать образование специфических T-клеток, проявляющих подавляющую активность в отношении посторонних T-клеток.
В соответствии с конкретными вариантами осуществления популяции цитолитических клеток согласно настоящему изобретению характеризуются экспрессией FasL и/или интерферона гамма. В соответствии с конкретными вариантами осуществления популяции цитолитических клеток согласно настоящему изобретению дополнительно характеризуются экспрессией гранзима B.
Этот механизм также предполагается, и результаты экспериментов показывают, что пептиды согласно настоящему изобретению, даже содержащие специфический T-клеточный эпитоп определенного антигена, можно применять для предупреждения или лечения нарушений, вызываемых иммунной реакцией в отношении других T-клеточных эпитопов того же антигена, или в определенных обстоятельствах даже для лечения нарушений, вызываемых иммунной реакцией в отношении других T-клеточных эпитопов других отличающихся антигенов, если они будут презентироваться посредством такого же механизма молекулами MHC класса II вблизи T-клеток, активированных пептидами согласно настоящему изобретению.
Раскрыты выделенные клеточные популяции, относящиеся к типу клеток, имеющему характеристики, описанные выше, которые также являются антигенспецифическими, т.е. способны к подавлению антигенспецифического иммунного ответа.
Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим один или несколько пептидов согласно настоящему изобретению, дополнительно содержащим фармацевтически приемлемый носитель. Как подробно описано выше, настоящее изобретение также относится к композициям для применения в качестве медикамента или к способам лечения млекопитающего от иммунного нарушения с помощью применения композиции и к применению композиций для производства лекарственного средства для предупреждения или лечения иммунных нарушений. Фармацевтическая композиция, например, может представлять собой вакцину, подходящую для лечения или предупреждения иммунных нарушений, в особенности, респираторной аллергии и пищевой аллергии, а также заболеваний аллергического происхождения. В качестве примера фармацевтической композиции, дополнительно описанной в данном документе, пептид согласно настоящему изобретению адсорбировано на адъюванте, подходящем для введения млекопитающим, таком как гидроксид алюминия (квасцы). Как правило, 50 мкг пептида, адсорбированного на квасцах, вводят инъекцией посредством подкожного пути за 3 раза с интервалом 2 недели. Специалисту в данной области техники будет очевидно, что возможны другие пути введения, в том числе пероральное, интраназальное или внутримышечное. Число инъекций и вводимое инъекцией количество также может варьировать в зависимости от состояний, подлежащих лечению. Кроме того, можно применять другие адъюванты, отличные от квасцов, при условии, что они облегчают презентирование пептида при презентировании MHC класса II и активации T-клеток. Таким образом, несмотря на то что для активных ингредиентов возможно введение по отдельности, они, как правило, присутствуют в виде фармацевтических составов. Составы согласно настоящему изобретению для применения как в ветеринарии, так и у человека содержат по меньшей мере один активный ингредиент, который описан выше, вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями. Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим в качестве активного ингредиента один или несколько пептидов согласно настоящему изобретению в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению должна содержать терапевтически эффективное количество активного ингредиента, такое как указано ниже в данном документе применительно к способу лечения или предупреждения. Необязательно, композиция дополнительно содержит другие терапевтические ингредиенты. Подходящие другие терапевтические ингредиенты, а также их обычная дозировка в зависимости от класса, к которому они принадлежат, являются хорошо известными специалистам в данной области техники и могут быть выбраны из других известных лекарственных средств, применяемых для лечения иммунных нарушений.
Термин «фармацевтически приемлемый носитель» в контексте данного документа означает любой материал или вещество, с которыми составляют активный ингредиент для того, чтобы облегчить его нанесение или распространение в месте, подлежащем лечению, например, посредством растворения, диспергирования или диффузии композиции, и/или для облегчения его хранения, транспортировки или обращения с ним без ухудшения его эффективности. Они включают в себя любые и все растворители, дисперсионную среду, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства (например, фенол, сорбиновую кислоту, хлорбутанол), изотонические средства (такие как сахара или хлорид натрия) и т.п.Дополнительные ингредиенты могут быть включены с целью контроля продолжительности действия иммуногенного пептида в композиции. Фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой твердое вещество, или жидкость, или газ, который был сжат с образованием жидкости, т.е. композиции согласно настоящему изобретению можно подходящим образом применять в виде концентратов, эмульсий, растворов, гранулятов, пудр, распыляемых растворов, аэрозолей, суспензий, мазей, кремов, таблеток, пеллеты или порошки. Подходящие фармацевтические носители для применения в фармацевтических композициях и их состав являются хорошо известными специалистам в данной области техники, и не существует конкретного ограничения в отношении их выбора в настоящем изобретении. Они также могут включать в себя добавки, такие как смачивающие средства, диспергирующие средства, связующие вещества, адгезивы, эмульгирующие средства, растворители, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства (например, фенол, сорбиновую кислоту, хлорбутанол), изотоничные средства (такие как сахара или хлорид натрия) и т.п., при условии, что они согласуются с фармацевтической практикой, т.е. носители и добавки, которые не причиняют млекопитающим необратимого повреждения. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению можно приготовить любым известным способом, например, посредством однородного смешивания, нанесения покрытия и/или размалывания активных ингредиентов в ходе одностадийной или многостадийной процедуры с выбранным материалом-носителем и, если необходимо, другими добавками, такими как поверхностно-активные средства. Их также можно приготовить с помощью тонкого измельчения, например, с целью их получения в виде микросфер, обычно имеющих диаметр приблизительно от 1 до 10 мкм, а именно, для производства микрокапсул для контролируемого или замедленного высвобождения активных ингредиентов.
Подходящие поверхностно-активные средства, также известные как эмульгирующее вещество или эмульгатор, подлежащие применению в фармацевтических композициях согласно настоящему изобретению, представляют собой неионные, катионные и/или анионные материалы, характеризующиеся хорошими эмульгирующими, диспергирующими и/или смачивающими свойствами. Подходящие анионые поверхностно-активные вещества включают в себя как водорастворимые мыла и водорастворимые синтетические поверхностно-активные средства. Подходящие мыла представляют собой соли щелочных или щелочноземельных металлов, незамещенные или замещенные аммониевые соли высших жирных кислот (C10-C22), например, натриевые или калиевые соли олеиновой или стеариновой кислоты или смесей натуральных жирных кислот, получаемых из кокосового масла или масла из животного жира. Синтетические поверхностно-активные вещества включают в себя натриевые или кальциевые соли полиакриловых кислот; сульфонаты и сульфаты жирных спиртов; сульфонированные производные бензимидазола и алкиларилсульфонаты. Сульфонаты или сульфаты жирных спиртов обычно присутствуют в форме солей щелочных или щелочно-земельных металлов, незамещенных аммониевых солей или аммониевых солей, замещенных алкильным или ацильным радикалом, имеющим от 8 до 22 атомов углерода, например, натриевая или кальциевая соль лигносульфоновой кислоты или додецилсульфоновой кислоты или смесь сульфатов жирных спиртов, полученных из натуральных жирных кислот, соли щелочных или щелочноземельных металлов и сложных эфиров серной или сульфоновой кислоты (таких как лаурилсульфат натрия) и аддукты сульфоновых кислот и жирного спирта/этиленоксида. Подходящие сульфонированные производные бензимидазола, как правило, содержат от 8 до 22 атомов углерода. Примеры алкиларилсульфонатов представляют собой натриевые, кальциевые или алканоламиновые соли додецилбензолсульфоновой кислоты или дибутилнафталинсульфоновой кислоты или продукт конденсации нафталинсульфоновой кислоты/формальдегида. Подходящими также являются соответствующие фосфаты, например, соли эфира фосфорной кислоты и аддукт пара-нонилфенола с этилен- и/или пропиленоксидом или фосфолипиды. Подходящие фосфолипиды для этой цели представляют собой натуральные (происходящие из животных или растительных клеток) или синтетические фосфолипиды типа цефалина или лецитина, такие как, например, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилглицерин, лизолецитин, кардиолипин, диоктанилфосфатидилхолин, дипальмитоилфосфатидилхолин и их смеси.
Подходящие неионные поверхностно-активные вещества включают в себя полиэтоксилированные и полипропоксилированные производные алкилфенолов, жирных спиртов, жирных кислот, алифатических аминов или амидов, содержащих по меньшей мере 12 атомов углерода в молекуле, алкиларенсульфонаты и диалкилсульфосукцинаты, такие как полигликолевые эфирные производные алифатических и циклоалифатических спиртов, насыщенных и ненасыщенных жирных кислот и алкилфенолов, производные, как правило, содержат от 3 до 10 групп гликолевого эфира и от 8 до 20 атомов углерода в фрагменте (алифатического) углеводорода и от 6 до 18 атомов углерода в алкильном фрагменте алкилфенола. Дополнительные подходящие неионные поверхностно-активные вещества представляют собой водорастворимые аддукты полиэтиленоксида с полипропиленгликолем, этилендиаминополипропиленгликолем, содержащие 1-10 атомов углерода в алкильной цепи, при этом аддукты содержат от 20 до 250 этиленгликолевых эфирных групп и/или от 10 до 100 пропиленгликолевых эфирных групп.Такие соединения обычно содержат от 1 до 5 этиленгликолевых звеньев на пропиленгликовое звено. Типичные представители неионных поверхностно-активных веществ представляют собой нонилфенол-полиэтоксиэтанол, полигликолевые эфиры касторового масла, аддукты полипропилен/полиэтиленоксида, трибутилфеноксиполиэтоксиэтанол, полиэтиленгликоль и октилфеноксиполиэтоксиэтанол. Сложные эфиры жирных кислот и полиэтиленсорбитана (такие как полиоксиэтиленсорбитан-триолеат), глицерина, сорбитана, сахарозы и пентаэритрита также являются подходящими неионными поверхностно-активными веществами. Подходящие катионные поверхностно-активные вещества включают в себя соли четвертичного аммония, в особенности, галогениды, у которых 4 углеводородных радикала необязательно замещены галогеном, фенилом, замещенным фенилом или гидрокси; например, соли четвертичного аммония, содержащие в качестве N-заместителя по меньшей мере один C8-C22-алкильный радикал (например, цетил, лаурил, пальмитил, миристил, олеил и т.п.) и, в качестве дополнительных заместителей, незамещенные или галогенированные радикалы низшего алкила, бензила и/или низшего гидроксиалкила.
Более подробное описание поверхностно-активных средств, подходящих для этой цели, можно найти, например, в "McCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual" (MC Publishing Crop., Ridgewood, New Jersey, 1981), "Tensid-Taschenbucw", 2 d ed. (Hanser Verlag, Vienna, 1981) и "Encyclopaedia of Surfactants" (Chemical Publishing Co., New York, 1981). Пептиды, их гомологи или производные согласно настоящему изобретению (и все их физиологически приемлемые соли или фармацевтические композиции включены в термин «активные ингредиенты») можно вводить посредством любого пути, подходящего для состояния, подлежащего лечению, и подходящего для соединений, в данном случае белков и фрагментов, подлежащих введению. Возможные пути включают региональное, системное, пероральное (в твердой форме или ингаляционное), ректальное, назальное, местное (в том числе глазное, буккальное и подъязычное), вагинальное и парентеральное (в том числе подкожное, внутримышечное, внутривенное, интрадермальное, внутриартериальное, интратекальное и эпидуральное). Предпочтительный путь введения может варьировать, например, в зависимости от состояния реципиента или от заболеваний, подлежащих лечению. Как описано в данном документе, носитель(носители) в оптимальном случае является(являются) «приемлемым»(«приемлемыми») в том смысле, что он(они) является(являются) совместимым(совместимыми) с другими ингредиентами в составе и не являются вредными для его реципиента. Составы включают в себя подходящие для перорального, ректального, назального, местного (в том числе, буккального и подъязычного), вагинального или парентерального (в том числе подкожного, внутримышечного, внутривенного, интрадермального, внутриартериального, интратекального и эпидурального) введения.
Составы, подходящие для парентерального введения, включают в себя водные и неводные стерильные инъекционные растворы, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические средства и растворенные вещества, которые делают состав изотоничным с кровью предполагаемого реципиента; а также водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать в себя суспендирующие средства и загустители. Составы могут присутствовать в контейнерах с единичной дозой или несколькими дозами, например, в запечатанных ампулах и пузырьках, и их можно хранить в высушенном сублимацией (лиофилизированном) состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого носителя, например, воды для инъекций, непосредственно перед применением. Инъекционные растворы и суспензии, приготовленные для немедленного введения, можно приготовить из стерильных порошков, гранул и таблеток ранее описанного вида.
Типичные составы в стандартных дозах представляют собой составы, содержащие суточную дозу или стандартные части суточной дозы активного ингредиента, которая упоминается выше в данном документе, или их соответствующую часть. Следует понимать, что дополнительно к ингредиентам, в особенности, упоминаемым выше, составы согласно настоящему изобретению могут включать в себя другие средства, традиционные в области техники, имеющей отношение к рассматриваемому типу состава, например, средства, подходящие для перорального введения, могут включать в себя ароматизаторы. Пептиды, их гомологи или производные согласно настоящему изобретению можно применять для обеспечения контролируемого высвобождения фармацевтических составов, содержащих в качестве активного ингредиента одно или несколько соединений согласно настоящему изобретению («составы с контролируемым высвобождением»), в которых высвобождение активного ингредиента можно контролировать и регулировать, обеспечивая возможность меньшей частоты введения доз или улучшая фармакокинетический профиль или профиль токсичности данного соединения согласно настоящему изобретению. Составы с контролируемым высвобождением, адаптированные для перорального введения, в которых дискретные единицы содержат одно или несколько соединений согласно настоящему изобретению, можно получить в соответствии с общепринятыми способами. Дополнительные ингредиенты могут быть включены с целью контроля продолжительности действия активного ингредиента в композиции. Таким образом, контролируемое высвобождение композиций может быть достигнуто посредством выбора соответствующих полимерных носителей, таких как, например, сложные полиэфиры, полиаминокислоты, поливинилпирролидон, сополимеры этилена и винилацетата, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, протаминсульфат и т.п.Скорость высвобождения лекарственного средства и продолжительность действия также можно контролировать посредством включения активного ингредиента в частицы, например, микрокапсулы, полимерного вещества, такого как гидрогели, полимолочная кислота, гидроксиметилцеллюлоза, полиметилметакрилат и другие вышеописанные полимеры. Такие способы включают в себя коллоидные системы для доставки лекарственного средства, такие как липосомы, микросферы, микроэмульсии, наночастицы, нанокапсулы и так далее. В зависимости от пути введения для фармацевтической композиции могут требоваться защитные покрытия. Фармацевтические формы, подходящие для инъекции, включают в себя стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для их приготовления непосредственно перед введением. Таким образом, типичные носители для этой цели включают в себя биологически совместимые водные буферы, этанол, глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п., а также их смеси. Принимая во внимание тот факт, что в случае, когда несколько активных ингредиентов применяют в комбинации, они не обязательно проявляют свой совместный терапевтический эффект у животного, подлежащего лечению, сразу одновременно, соответствующая композиция также может иметь форму медицинского набора или пакета, содержащего два ингредиента в отдельных, но соседствующих емкостях или отделениях. В последнем случае каждый активный ингредиент, таким образом, можно составлять способом, подходящим для пути введения, отличного от такового для другого ингредиента, например, один из них может присутствовать в форме перорального или парентерального состава, в то время как другой присутствует в форме ампулы для внутривенной инъекции или аэрозоля.
Цитолитические CD4+T-клетки, которые получают согласно настоящему изобретению, индуцируют апоптоз APC после зависимой от MHC класса II когнатной активации, воздействуя как на дендритные клетки, так и на B-клетки, что демонстрируется in vitro и in vivo, и (2) подавляют посторонние T-клетки посредством контакт-зависимого механизма в отсутствие IL-10 и/или TGF-бета. Цитолитические CD4+T-клетки можно отличить как от натуральных, так и от адаптивных Treg, как подробно обсуждается в международной заявке WO 2008/017517.
Настоящее изобретение будет проиллюстрировано с помощью следующих примеров, которые представлены без какой-либо ограничительной цели. Более того, все источники, описанные в данном документе, в явной форме включены в данный документ посредством ссылки.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Конструирование пептида
По сравнению с пептидом, раскрытым в международной заявке WO 2016059236, синтезируют пептид, содержащий T-клеточный эпитоп C-домена инсулина, в котором была удалена дипептидная последовательность VR, которая не встречается в последовательности инсулина, как показано на выравнивании, представленном ниже:
P17001: HCPYC VR SLQPLALEGSLQKRG [SEQ ID NO: 25]
P17 003: HCPYC- SLQPLALEGSLQKRG [SEQ ID NO: 26]
Таким образом, пептид P17 003 содержащий мотив CxxC [SEQ ID NO: 18], перед которым находится His, при этом xx представляют собой Pro и Tyr. T-клеточный эпитоп из 9 аминокислот имеет последовательность LALEGSLQK [SEQ ID NO: 3] и отделен от мотива CxxC [SEQ ID NO: 18] линкером из 4 аминокислот SLQP. Дипептид RG представляет собой фланкирующую последовательность с C-конца относительно эпитопа. В этом пептиде последовательность SLQPLALEGSLQKRG [SEQ ID NO: 20] является на 100% идентичной последовательности, которая встречается в инсулине.
Пример 2. Методика оценки восстанавливающей активности пептидов
Редуктазную активность пептидов определяют с применением флуоресцентного анализа, описанного в Tomazzolli et al. (2006) Anal. Biochem. 350, 105–112. Два пептида с FITC-меткой становятся самогасящими, когда они ковалентно прикрепляются друг к другу через дисульфидный мостик. При восстановлении с помощью пептида в соответствии с настоящим изобретением восстановленные отдельные пептиды опять становятся флуоресцентными.
Контрольные эксперименты проводили с использованием дитиотреитола (100% восстанавливающая активность) и воды (100% восстанавливающая активность).
Пептид P17 001 показывал восстанавливающую активность 68%, тогда как пептид P17 003 показывал 65% восстанавливающую активность.
Пример 3. Высвобождение интерферона гамма линиями цитолитических CD4+T-клеток
Интерферон гамма является важным маркером для характеристики цитолитических CD4+T-клеток.
Линию специфических CD4+T-клеток получали посредством примирования и стимуляции наивных CD4+T-клеток от пациента T1D (T1D07) с использованием пептида p17-001. После 12 стимуляций клетки культивировали совместно с аутологичными LCL B-клетками, нагруженными (2 мкМ) пептида p17-001 или p17-003. Спустя 24 часа супернатанты собирали и количество IFN-гамма измеряли с помощью многоканального анализа (см. таблицу 1 ниже).
Таблица 1
Стимул 1
IFN-гамма (пг/мл)
p17 UL
2,35±1,2
p17 001
11,1±0,8
p17 003
29,7±14,1
Существует разительное отличие в выработке IFN-гамма между двумя пептидами (приблизительно в 3 раза больше IFN-гамма вырабатывалось после стимуляции p17 003 по сравнению с p17 001).
Пример 4. Высвобождение FasL линиями цитолитических CD4+T-клеток
Линию T-клеток, первоначально полученную с использованием p17 001, как описано в примере 3 выше, делили и стимулировали с использованием пептида P17 003 или P17 001 в ходе 4 последовательных in vitro стимуляций с использованием линии аутологичных LCL B-клеток в качестве APC. На 11 сутки каждой стимуляции (в общей сложности 4) клетки исследовали в отношении FasL после повторной стимуляции с использованием их соответствующего пептида, презентируемого аутологичными B-клетками. Супернатанты собирали спустя 24 часа (стимуляция 1 и 2) или 72 часа (стимуляция 3 и 4) совместного культивирования.
Таблица 2. Экспрессия FasL линиями CD4+T-клеток от пациентов T1D
Экспрессия FasL(пг/мл)
Стимуляция 1
Стимуляция 2
Стимуляция 3
Стимуляция 4
Контроль
0
0
0
0
P17-001
1335±23,1
1144±15,4
1227±49,1
1008±102
P17-003
1795±42,4
1812±34,7
2063±166
1526±102
Экспрессия FasL (также называемого sFasL) является значительно более высокой для P17-003 в случае каждой из четырех стимуляций.
Это иллюстрирует большую способность пептида P17-003 к образованию цитолитических T-клеток по сравнению с пептидом P17-001.
Пример 5. Высвобождение sFasL и выработка цитокинов в PBMC T1D-пациентов
PBMC от T1D-пациента T1D018 стимулировали in vitro либо с использованием пептида P17001, либо пептида P17003. Эти две популяции специфически высвобождают Il-5 после антигенной активации. После 6 циклов стимуляции с использованием пептидов обе клеточные линии обогащали вырабатывающими IL-5 клетками с использованием гранул для захвата с цитокином. Две популяции отрицательных по интерлейкину-5 клеток применяли в качестве контролей.
Эти четыре популяции затем исследуют в отношении специфического высвобождения sFasL, гранзима B и цитокинов после стимуляции с использованием их когнатного пептида (P17-001 или P17-003). Супернатанты собирают спустя 24 часа культивирования и количество sFasL и гранзима B измеряют с помощью ELISA (sFasL: Diaclone 851730010; гранзим B: eBioscience BMS2027), а количество цитокинов измеряют с помощью набора MACSplex Cytokine 12 kit (Miltenyi, 130-099-169).
5.1. Выработка sFasL
Уровни sFasL в четырех клеточных линиях показаны на фиг. 1. Это показывает, что IL5-положительные фракции (черные столбики на гистограмме), которые обогащены конкретными клетками, специфическими в отношении пептида p17-003 или p17-001, высвобождают больше sFasL по сравнению с отрицательными фракциями (незакрашенные столбики на гистограмме), что является показателем эффективной очистки специфических клеток.
Более того, результаты указывают на то, что клетки, образованные при in vitro стимуляции с использованием p17-003, специфически высвобождают в 4,5 раза больше sFasL по сравнению с клетками, полученными с помощью пептида p17-001 (p<0,0001).
5.2. Выработка гранзима B
IL5-положительные фракции, которыми обогащены специфические клетки, специфические в отношении пептида p17-003 или p17-001, исследуют в отношении высвобождения большего количества гранзима B по сравнению с IL5-отрицательными фракциями в качестве измеряемого показателя эффективной очистки специфических клеток.
Более того, клетки, образованные при in vitro стимуляции с использованием p17-003, будут исследовать в отношении специфически повышенного высвобождения гранзима B по сравнению с клетками, полученными с помощью пептида p17-001.
5.3. Высвобождение цитокинов
Для определения того, являются ли культивируемые in vitro клетки от доноров T1D специфическими в отношении пептида P17001 или P17003, высвобождение цитокинов, характерный признак активации клеток при стимуляции пептидом, изучали с использованием набора MACSplex Cytokine 12 kit (Miltenyi, 130-099-169). Супернатант собирали спустя 24 часа из культуры PBMC от донора T1D в отсутствие или в присутствии пептида. Концентрации цитокинов определяли для двух биологических образцов в параллели и представляли их в пг/мл. Исследование специфичности осуществляли в конце стимуляции 10 (день отдыха). Результат представлен в виде разницы в концентрациях каждого цитокина в условиях без пептида и с ним.
На фиг. 2 показано, что IL5-положительная фракция клеток линии P17003 специфически отвечает на стимуляцию по сравнению с линиями P17003 IL5-отрицательных, P17001 IL5-отрицательных и P17001 IL5-положительных клеток. Это иллюстрирует, что пептид P17003 является более активным в отношении того, чтобы вызывать образование пептид-специфических клеток по сравнению с P17001.
В заключение, клетки, образованные de novo с P17-003, являются более активными в отношении высвобождения литических молекул (таких как sFasL и, потенциально, гранзим B) и цитокинов, чем клетки, образованные с P17-001. Таким образом, пептид дает в результате популяцию CD4+клеток с превосходными цитолитическими свойствами против APC, презентирующих инсулиновые эпитопы.
Пример 6. Клиническое испытание
Перед введением пептид согласно настоящему изобретению повторно растворяют с использованием разбавителя, содержащего адъювант. Продукт следует повторно растворять непосредственно перед введением, и его предпочтительно используют в течение менее чем 3 часов после повторного растворения.
Исследуемый лекарственный продукт можно составлять таким образом, чтобы после повторного растворения в разбавителе концентрация пептида в пузырьке составляет 250 мкг/мл. Соответствующий объем будут отбирать для соответствия протоколу клинического испытания. Например:
- Низкая доза (когорта 1) может предусматривать SC (подкожное) введение 50 мкг пептида в двух отдельных инъекциях по 25 мкг в каждой (100 мкл каждая) с последующими тремя последовательными инъекциями 25 мкг пептида в виде двух отдельных инъекций по 12,5 мкг в каждой (50 мкл каждая).
- Средняя доза (когорта 2) может предусматривать SC введение 150 мкг пептида в двух отдельных инъекциях по 75 мкг в каждой (300 мкл каждая) с последующими тремя последовательными введениями 75 мкг пептида в виде двух отдельных инъекций по 37,5 мкг в каждой (150 мкл каждая).
- Высокая доза (когорта 3) может предусматривать SC введение 450 мкг пептида в двух отдельных инъекциях по 225 мкг в каждой (900 мкл каждая) с последующими тремя последовательными введениями 225 мкг пептида в виде двух отдельных инъекций по 112,5 мкг в каждой (450 мкл каждая).
Изучаемые продукты согласно настоящему изобретению предпочтительно вводят инъекцией подкожно (SC) в область боковой части предплечья, посередине между локтем и плечом. Если требуются две отдельные инъекции, их предпочтительно вводят одновременно в обе руки: например, инъекцию 1 в правую руку, и инъекцию 2 в левую руку.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>ИмСайс С.А.
Вандер Элст, Люк
Карлье, Винсент
<120>ПЕПТИДЫ И СПОСОБЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ДИАБЕТА
<130>IMCY-006-PCT
<150>17160085.1
<151>2017-03-09
<160>26
<170>PatentIn версия 3.5
<210>1
<211>4
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>редокс-мотив
<220>
<221>ИНОЙ_ПРИЗНАК
<222>(2)..(3)
<223>Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221>ИНОЙ_ПРИЗНАК
<222>(4)..(4)
<223>Xaa представляет собой Cys, Ser или Thr
<400>1
Cys Xaa Xaa Xaa
1
<210>2
<211>4
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>редокс-мотив
<220>
<221>ИНОЙ_ПРИЗНАК
<222>(1)..(1)
<223>Xaa представляет собой Cys, Ser или Thr
<220>
<221>ИНОЙ_ПРИЗНАК
<222>(2)..(3)
<223>Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<400>2
Xaa Xaa Xaa Cys
1
<210>3
<211>9
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>инсулиновый эпитоп
<400>3
Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
1                5
<210>4
<211>17
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>редокс-мотив+инсулиновый эпитоп
<220>
<221>ИНОЙ_ПРИЗНАК
<222>(2)..(3)
<223>Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221>ИНОЙ_ПРИЗНАК
<222>(4)..(4)
<223>Xaa представляет собой Cys, Ser или Thr
<400>4
Cys Xaa Xaa Xaa Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln
1                5                  10                  15
Lys
<210>5
<211>17
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>редокс-мотив+инсулиновый эпитоп
<220>
<221>ИНОЙ_ПРИЗНАК
<222>(1)..(1)
<223>Xaa представляет собой Cys, Ser или Thr
<220>
<221>ИНОЙ_ПРИЗНАК
<222>(2)..(3)
<223>Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<400>5
Xaa Xaa Xaa Cys Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln
1                5                  10                  15
Lys
<210>6
<211>17
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>редокс-мотив+инсулиновый эпитоп
<220>
<221>ИНОЙ_ПРИЗНАК
<222>(2)..(3)
<223>Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<400>6
Cys Xaa Xaa Cys Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln
1                5                  10                  15
Lys
<210>7
<211>18
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>редокс-мотив+T-клеточный эпитоп
<220>
<221>ИНОЙ_ПРИЗНАК
<222>(3)..(4)
<223>Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221>ИНОЙ_ПРИЗНАК
<222>(5)..(5)
<223>Xaa представляет собой Cys, Ser или Thr
<400>7
His Cys Xaa Xaa Xaa Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu
1                5                  10                  15
Gln Lys
<210>8
<211>18
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>редокс-мотив+T-клеточный эпитоп
<220>
<221>ИНОЙ_ПРИЗНАК
<222>(2)..(2)
<223>Xaa представляет собой Cys, Ser или Thr
<220>
<221>ИНОЙ_ПРИЗНАК
<222>(3)..(4)
<223>Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<400>8
His Xaa Xaa Xaa Cys Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu
1                5                  10                  15
Gln Lys
<210>9
<211>18
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>редокс-мотив+инсулиновый T-клеточный эпитоп
<220>
<221>ИНОЙ_ПРИЗНАК
<222>(3)..(4)
<223>Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<400>9
His Cys Xaa Xaa Cys Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu
1                5                  10                  15
Gln Lys
<210>10
<211>18
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>редокс-мотив+инсулиновый эпитоп
<220>
<221>ИНОЙ_ПРИЗНАК
<222>(2)..(3)
<223>Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221>ИНОЙ_ПРИЗНАК
<222>(4)..(4)
<223>Xaa представляет собой Cys, Ser или Thr
<400>10
Cys Xaa Xaa Xaa Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
1                5                   10                  15
Arg Gly
<210>11
<211>19
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>редокс-мотив+инсулиновый T-клеточный эпитоп
<220>
<221>ИНОЙ_ПРИЗНАК
<222>(1)..(1)
<223>Xaa представляет собой Cys, Ser или Thr
<220>
<221>ИНОЙ_ПРИЗНАК
<222>(2)..(2)
<223>Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221>ИНОЙ_ПРИЗНАК
<222>(2)..(3)
<223>Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<400>11
Xaa Xaa Xaa Cys Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln
1                5                  10                  15
Lys Arg Gly
<210>12
<211>19
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>редокс-мотив+инсулиновый T-клеточный эпитоп
<220>
<221>ИНОЙ_ПРИЗНАК
<222>(2)..(3)
<223>Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<400>12
Cys Xaa Xaa Cys Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln
1                5                  10                  15
Lys Arg Gly
<210>13
<211>20
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>редокс-мотив+инсулиновый T-клеточный эпитоп
<220>
<221>ИНОЙ_ПРИЗНАК
<222>(3)..(4)
<223>Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221>ИНОЙ_ПРИЗНАК
<222>(5)..(5)
<223>Xaa представляет собой Cys, Ser или Thr
<400>13
His Cys Xaa Xaa Xaa Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu
1                5                  10                  15
Gln Lys Arg Gly
20
<210>14
<211>20
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>редокс-мотив+инсулиновый T-клеточный эпитоп
<220>
<221>ИНОЙ_ПРИЗНАК
<222>(2)..(2)
<223>Xaa представляет собой Cys, Ser или Thr
<220>
<221>ИНОЙ_ПРИЗНАК
<222>(3)..(4)
<223>Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<400>14
His Xaa Xaa Xaa Cys Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu
1                5                  10                  15
Gln Lys Arg Gly
20
<210>15
<211>20
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>редокс-мотив+инсулиновый T-клеточный эпитоп
<220>
<221>ИНОЙ_ПРИЗНАК
<222>(3)..(4)
<223>Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<400>15
His Cys Xaa Xaa Cys Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu
1                5                  10                  15
Gln Lys Arg Gly
20
<210>16
<211>4
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>редокс-мотив
<220>
<221>ИНОЙ_ПРИЗНАК
<222>(4)..(4)
<223>Xaa представляет собой Cys, Ser или Thr
<400>16
Cys Pro Tyr Xaa
1
<210>17
<211>4
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>редокс-мотив
<220>
<221>ИНОЙ_ПРИЗНАК
<222>(1)..(1)
<223>Xaa представляет собой Cys, Ser или Thr
<400>17
Xaa Pro Tyr Cys
1
<210>18
<211>4
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>редокс-мотив
<220>
<221>ИНОЙ_ПРИЗНАК
<222>(2)..(3)
<223>Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<400>18
Cys Xaa Xaa Cys
1
<210>19
<211>4
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>редокс-мотив
<400>19
Cys Pro Tyr Cys
1
<210>20
<211>15
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>пептид, содержащий инсулиновый T-клеточный эпитоп
<400>20
Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly
1                5                  10              15
<210>21
<211>4
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>редокс-мотив
<220>
<221>ИНОЙ_ПРИЗНАК
<222>(2)..(3)
<223>Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<400>21
Ser Xaa Xaa Cys
1
<210>22
<211>4
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>редокс-мотив
<220>
<221>ИНОЙ_ПРИЗНАК
<222>(2)..(3)
<223>Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<400>22
Thr Xaa Xaa Cys
1
<210>23
<211>4
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>редокс-мотив
<220>
<221>ИНОЙ_ПРИЗНАК
<222>(2)..(3)
<223>CXXS
<400>23
Cys Xaa Xaa Ser
1
<210>24
<211>4
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>редокс-мотив
<220>
<221>Иной
<222>(2)..(3)
<223>Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<400>24
Cys Xaa Xaa Thr
1
<210>25
<211>22
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>пептид с редокс-мотивом и инсулиновым T-клеточным эпитопом
<400>25
His Cys Pro Tyr Cys Val Arg Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Ser Leu Gln Lys Arg Gly
20
<210>26
<211>20
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>пептид с редокс-мотивом и инсулиновым T-клеточным эпитопом
<400>26
His Cys Pro Tyr Cys Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu
1                5                  10                  15
Gln Lys Arg Gly
20
<---