СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОРМ КАРТОФЕЛЯ СОРТА СКОРОПЛОДНЫЙ IN VITRO, УСТОЙЧИВЫХ К ТЕМПЕРАТУРНЫМ СТРЕССАМ И К ВОЗБУДИТЕЛЮ ФИТОФТОРОЗА

Способ получения форм картофеля сорта Скороплодный in vitro, устойчивых к температурным стрессам и к возбудителю фитофтороза, заключающийся в том, что стеблевые и листовые экспланты, вычлененные из тридцатидневных асептических растений исходного сорта помещают в чашки Петри с жидкой средой следующего состава:
Макросоли по Мурасиге-Скугу (МС)
50,0 мл/л
Микросоли по МС
1,0 мл/л
CaCl<sub>2</sub>
348,5 мг/л
Fe-хеллат по МС
5,0 мл/л
Тиамин
1,0 мг/л
Пиридоксин
1,0 мг/л
Глюкоза
16,0 г/л
Гидролизат козеина
1,0 г/л
Мезоинозит
100,0 мг/л
Нафтилуксусная кислота (НУК)
5,0 мг/л
Бензиламинопурин
0,2 мг/л
Дистиллированная вода
до 1 л среды
рН
5,8
и прединкубируют в течение 18-24 ч и температуре 22-24° С, затем вносят пипеткой 300 мкл на одну чашку ночной суспензионной культуры агробактерии, несущей плазмиду с геном ацил-липидной Δ9 десатуразы из цианобактерии Synechococcus vulcanus, кокультивируют с агробактериальной суспензией в течение 15-30 мин при периодическом встряхивании, обсушивают между листами стерильной фильтровальной бумаги и помещают на другие чашки Петри с аналогичной средой и посткокультивируют в течение 18-24 ч при температуре 22-24°С на рассеянном свету, затем экспланты таким же образом обсушивают и переносят в чашки Петри с аналогичной средой с добавлением 7 г/л агара и 800 мг/л цефотаксим сульфата и инкубируют в течение 5-7 суток на рассеянном свету при 22-24°С, затем переносят на регенерационные среды состава:
Макросоли по МС
50,0 мл/л,
Микросоли по МС
1,0 мл/л,
CaCl<sub>2</sub>
348,5 мг/л
Fe-хеллат по МС
5,0 мл/л
Тиамин
1,0 мг/л
Пиридоксин
1,0 мг/л
Глюкоза
16,0 г/л
Гидролизат козеина
1,0 г/л
Мезоинозит
100,0 мг/л
Биотин
1,0 мг/л
Кальций пантетонат
5,0 мг/л
Аденинсульфат
40,0 мг/л
НУК
0,1 мг/л
Зеатин
2,0 мг/л*
Цефотаксим
800,0 мг/л*
Агар
7,0 г/л
Дистиллированная вода
до 1000 мл среды
рН
5,8
* Добавлять после автоклавирования
и культивируют в течение 10-14 суток при 22-25°С и освещенности 6000-10000 лк, затем культивируют на аналогичной среде с цефотаксимом 500 мг/л и канамицин сульфатом 15 мг/л 3 пассажа по 21 дню, затем 1 пассаж без канамицина сульфата и снова 3 пассажа с канамицином, при появлении регенерантов размером не менее 10 мм их срезают и переносят на селективную среду состава:
Макросоли по МС
50,0 мл/л,
Микросоли по МС
1,0 мл/л,
CaCl<sub>2</sub>
348,5 мг/л
Fe-хеллат по МС
5,0 мл/л
Тиамин
1,0 мг/л
Пиридоксин
1,0 мг/л
Сахаоза
20,0 г/л
Канамицин сульфат
50,0 мг/л*
Цефотаксим
200,0 мг/л*
Агар
7,0 г/л
Дистиллированная вода
до 1 л среды
рН
5,8
*Добавлять после автоклавирования,
затем проводят первый этап отбора: срезанные регенеранты культивируют на среде МС с 50 мг/л канамицин сульфатом в течение 30-45 дней при при 22-25°С и освещенности 6000-10000 лк при 16-часовом фотопериоде, далее отбирают укрепившиеся регенеранты картофеля с зелеными листьями и стеблями, потом проводят второй этап отбора: укоренившиеся растения проверяют методом ПЦР на наличие вставки целевой ДНК и регенеранты с подтвержденной ПЦР вставкой целевой ДНК размножают микрочеренкованием для проведения дальнейших исследований.