АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЙ СЕНСОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТРАЦИКЛИНОВЫХ ПРЕПАРАТОВ

Заявленное техническое решение относится к области аналитической химии и фармакологии может быть использовано для определения антрациклиновых препаратов, таких как доксорубицин, в лекарственных препаратах и плазме крови. Определение антрациклиновых препаратов необходимо для медицины, биохимии, фармакологии, в производстве лекарственных препаратов и контроле их качества.
2
3
4
Известен способ, который реализуется с использованием устройства по патенту CN 103464109 A для определения доксорубицина в биологических жидкостях на основе магнитного нано-адсорбента. Устройство представляет собой магнитный нано-адсорбент, состоящий из SiO, покрытого FeO и триметилстериламмоний бромидом методом послойного химического соосаждения. Определение доксорубицина проводится в несколько этапов:
- доведение pH пробы до значения 4-5 с помощью фосфатного буфера;
- взбалтывание 3 мин;
- проведение магнитной сепарации;
- удаление несвязанных частиц, добавление элюента в продукт магнитной сепарации;
- проведение элюирования;
- проведение магнитной сепарации;
- сбор супернатанта;
- проведение анализа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуоресцентным детектором.
Предел обнаружения доксорубицина с помощью данного устройства составил 5 мкг/л (8.6 нМ).
К недостаткам данного устройства можно отнести высокую стоимость компонентов устройства и хроматографического детектирования, продолжительность анализа вследствие большого количества стадий, недостаточно низкий предел обнаружения.
Известно устройство (Evtugyn G., Porfireva A., Stepanova V., Budnikov H. Electrochemical biosensors based on native DNA and nanosized mediator for the detection of anthracycline hreparations // Electroanalysis, 2015. - V. 27. - P. 629 - 637) для обнаружения и измерения концентрации противораковых лекарственных препаратов - интеркаляторов ДНК (таких, как доксорубицин, даунорубицин и идарубицин) - в водном растворе, фармпрепаратах и плазме крови. Устройство представляет собой стеклоуглеродный электрод в тефлоновом корпусе, рабочая область которого покрыта слоем электрополимеризованного Нейтрального красного и поликарбоксилированного тиакаликс[4]арена с ковалентно связанным медиатором и электростатически адсорбированной ДНК. Перед проведением измерения сенсор предварительно инкубируют в растворе антрациклинового препарата в течение 30 минут. Устройство позволяет проводить определение антрациклиновых препаратов (доксорубицин, даунорубицин и идаруцибин) на уровне 0.05 нМ доксорубицина, 0.1 нМ даунорубицина и 0.5 нМ идаруцибина. К недостаткам сенсора можно отнести наличие сложной в изготовлении полимерной мембраны, не достаточно низкий предел обнаружения, сложную конструкцию сенсора, сложность его изготовления, продолжительность инкубирования сенсора. Кроме того, основным недостатком всех твердоконтактных пленочных электродов с полимерными мембранами является сложность достижения однородной толщины мембраны, изготовляемой из большого количества компонентов, и неравномерное распределение в ней компонентов. Процедура изготовления поверхностного слоя многостадийна, что приводит к снижению воспроизводимости характеристик мембраны и сигнала сенсора при замене полимерного слоя.
Наиболее близким аналогом, выбранным в качестве прототипа по наибольшему количеству совпадающих признаков и достигаемому техническому результату, является техническое решение по патенту на полезную модель РФ №157411, сущностью является Электрохимический сенсор для определения антрациклиновых препаратов в водном растворе, фармпрепаратах и плазме крови на основе стеклоуглеродного электрода в тефлоновом корпусе, отличающийся тем, что рабочая область электрода покрыта слоем электрополимеризованного полианилина, включающим нативную ДНК.
Полимерная пленка полианилина выполнена путем электроосаждения из раствора анилина, содержащего ДНК, в течение 15-25 циклов сканирования потенциала. Устройство функционирует следующим образом.
3
Электрохимический сенсор устанавливают рабочей поверхностью вверх, наносят раствор антрациклинового препарата на рабочую поверхность, выдерживают в течение 15 мин. После этого сенсор промывают один раз дистиллированной водой и дважды буферным раствором и погружают в электрохимическую ячейку с буферным раствором. Затем в ячейку добавляют раствор K[Fe(CN)] и снимают циклическую вольтамограмму феррицианид-иона. Аналитическим сигналом является величина тока пика феррицианид-иона.
Устройство позволяет проводить определение антрациклиновых препаратов с пределом обнаружения 0.01 нМ доксорубицина, 0.1 нМ даунорубицина и 0.2 нМ идаруцибина.
3
К недостаткам сенсора можно отнести не достаточно низкий предел обнаружения, продолжительность инкубирования сенсора и сложность проведения измерения с введением дополнительного реагента - K[Fe(CN)], концентрация и чистота которого оказывают значительное влияние на результаты измерений, что приводит к снижению воспроизводимости сигнала сенсора.
Технической задачей создания заявленной полезной модели является:
- упрощение конструкции сенсора;
- снижение стоимости сенсора;
- снижение предела обнаружения;
- снижение продолжительности анализа;
- повышение воспроизводимости измерения сигнала сенсора.
Заявленное техническое решение поясняется чертежом, на котором представлена конструкция электрохимического сенсора, состоящая из следующих элементов:
1 - токосъемник;
2 - изолирующий корпус из политетрафторэтилена;
3 - стеклоуглеродный стержень;
4 - слой электрополимеризованного полианилина, включающий комплекс ДНК с метиленовым синим.
Заявленное техническое решение устраняет недостатки, присущие наиболее близкому аналогу, и обеспечивает реализацию поставленных задач, а именно, обеспечивает:
- упрощение конструкции сенсора;
- снижение стоимости сенсора;
- снижение предела обнаружения;
- снижение продолжительности анализа;
- повышение воспроизводимости измерения сигнала сенсора.
При этом указанные технические результаты обеспечиваются соответственно за счет следующего:
- упрощение конструкции сенсора реализуется за счет упрощения стадии электрополимеризации полианилина, которая включает 6-10 циклов сканирования потенциала вместо 15-30 у прототипа;
- расширение диапазона определяемых концентраций лекарственных препаратов;
- снижение предела обнаружения;
- снижение стоимости сенсора обеспечивается за счет использования амперометрического способа детектирования сигнала сенсора, который не требует дорогостоящего оборудования, за счет того, что снижается количество ДНК в составе пленки, благодаря наличию метиленового синего, образующего супрамолекулярный комплекс с ДНК, который в свою очередь повышает чувствительность ее взаимодействия с антрациклиновыми препаратами, при этом эффект усиливается за счет использования в качестве аналитического сигнала токов окисления и восстановления полианилина в составе полимерной пленки, при этом отсутствует потребность в дополнительных реактивах в процессе измерения сигнала.
При этом чувствительность измерения аналитического сигнала обеспечивается наличием медиатора электронного переноса - метиленового синего.
Повышение воспроизводимости сигнала сенсора обеспечивается за счет однородной толщины мембраны, изготовляемой в одну стадию из небольшого количества компонентов (полианилин и комплекс ДНК с метиленовым синим), и использования в качестве аналитического сигнала токов окисления и восстановления полианилина в составе полимерной пленки, указанному эффекту способствует отсутствие потребности в дополнительных реактивах в процессе измерения сигнала, а это, в свою очередь, реализуется за счет равномерного распределения компонентов в мембране вследствие одностадийности процесса электрополимеризации анилина из раствора, содержащего комплекс ДНК с метиленовым синим.
Использование в качестве аналитического сигнала токов окисления и восстановления полианилина в составе пленки обеспечивается благодаря наличию в составе пленки метиленового синего в комплексе с ДНК, который улучшает и усиливает сигнал полианилина за счет того, что последний (полианилин) обладает медиаторными свойствами к переносу электрона.
Сущностью заявленного технического решения является амперометрический сенсор для определения антрациклиновых препаратов в водном растворе, фармпрепаратах и плазме крови на основе стеклоуглеродного электрода в тефлоновом корпусе, рабочая область которого покрыта слоем электрополимеризованного полианилина, отличающийся тем, что слой электрополимеризованного полианилина включает комплекс ДНК с метиленовым синим.
При этом наличие на поверхности стеклоуглеродного электрода электропроводящего слоя электрополимеризованного полианилина, содержащего комплекс ДНК с метиленовым синим, облегчает электронный обмен на границе раздела фаз, и также за счет нахождения на поверхности сенсора электрополимеризованной пленки при отсутствии необходимости использования дополнительных компонентов, которые могут приводить к утолщению и неоднородности мембраны.
Полученная мембрана, состоящая только из полианилина с включенным в него комплексом ДНК с метиленовым синим, имеет;
- простую конструкцию;
- низкую стоимость;
- малое время изготовления за счет отсутствия в ее составе пленкообразователя, что обеспечивает однородный состав и одинаковую толщину заявленного электрода по всей поверхности за счет малого числа компонентов;
- повышение воспроизводимости измерения сигнала сенсора обеспечивается за счет одностадийности изготовления электрода в процессе электрополимеризации.
Принципиальным отличием заявленного технического решения от прототипа является наличие слоя электрополимеризованного полианилина, включающего комплекс ДНК с метиленовым синим, который обеспечивает электронно-ионную проводимость, увеличивает обратимость электронного обмена, что приводит к увеличению воспроизводимости сигнала и его величины. Кроме того, супрамолекулярный комплекс ДНК с метиленовым синим, образующийся в результате самосборки в растворе, включается в состав поверхностного слоя сенсора на стадии электрополимеризации, поэтому на поверхности сенсора комплекс ДНК с метиленовым синим находится не на поверхности проводящей пленки, а в ее объеме, в составе наноструктурированного полиэлектролитного комплекса, который за счет множественных взаимодействий заряженных групп обладает высокой чувствительностью к взаимодействию ДНК с нейтральными молекулами антрациклиновых препаратов.
Таким образом, наноструктурированная мембрана, состоящая из полиэлектролитного комплекса, включающего электрополимеризованный полианилин и супрамолекулярный комплекс ДНК с метиленовым синим, обладает принципиально новыми свойствами по связыванию и распознаванию аналитов, а воспроизводимость сигнала сенсора, расширение диапазона определяемых концентраций и снижение предела обнаружения антрациклиновых препаратов достигнуты за счет того, что ДНК, взаимодействующая с антрациклиновыми препаратами, и метиленовый синий, являющийся медиатором, находятся в составе наноструктурированного полиэлектролитного комплекса, образованного за счет множественных взаимодействий заряженных групп, что также позволяет использовать в качестве аналитического сигнала токи окисления и восстановления полианилина в составе пленки.
Амперометрический сенсор для определения антрациклиновых препаратов в водном растворе, фармпрепаратах и плазме крови на основе стеклоуглеродного электрода в тефлоновом корпусе, рабочая область которого покрыта слоем электрополимеризованного полианилина, характеризующийся тем, что слой электрополимеризованного полианилина включает комплекс ДНК с метиленовым синим.
Такое выполнение электрохимического сенсора обеспечивает технический результат - простоту конструкции сенсора, широкий диапазон определяемых концентраций и низкий предел обнаружения, низкую стоимость сенсора - за счет использования амперометрического способа детектирования сигнала сенсора (не требует дорогостоящего оборудования), и за счет использования дешевого и доступного реактива в составе мембраны (полианилин), и за счет снижения количества ДНК в составе пленки, высокую воспроизводимость сигнала сенсора за счет однородной толщины мембраны и за счет равномерного распределения компонентов в мембране, изготовляемой в одну стадию из небольшого количества компонентов (полианилин и комплекс ДНК с метиленовым синим, осаждаемые из общего раствора). Наличие электрополимеризованной пленки, содержащей медиатор электронного переноса метиленовый синий, обеспечивает воспроизводимость сигнала, однородность и устойчивость покрытия, характеристики которого определяются параметрами электрополимеризации и легко регулируются на стадии получения полимера.
-3
Конструкция амперометрического сенсора представлена на фиг. 1. Амперометрический сенсор состоит из стеклоуглеродного электрода в тефлоновом корпусе, а также из полимерной наноструктурированной пленки электрополимеризованного полианилина, включающей комплекс ДНК с метиленовым синим (фиг. 1). Полимерная пленка выполнена путем электроосаждения из 0.05-1 М раствора анилина в 0.5 М растворе щавелевой кислоты, содержащего ДНК в концентрации 0.1-1 мг/мл и 5×10 М МС, на стеклоуглеродный электрод в потенциодинамическом режиме в интервале от -0.3 до +1.3 В при скорости сканирования 50-100 мВ/с, 6-10 циклов сканирования потенциала. После проведения электролиза электрод ополаскивали дистиллированной водой с последующим высушиванием на воздухе при комнатной температуре. Характеристики электрохимического сенсора определяли в растворе антрациклиновых препаратов - доксорубицина, даунорубицина и идарубицина (5 пМ - 0.1 мМ доксорубицина, 0.05 нм - 0.1 мМ даунорубицина и 0.15 нМ - 0.1 мМ идаруцибина). Растворы препаратов готовили растворением точной навески в дистиллированной воде с добавлением хлорида натрия (изотонический раствор).
Данное устройство используется для определения антрациклиновых препаратов. Устройство функционирует следующим образом. Амперометрический сенсор погружают в электрохимическую ячейку, содержащую 2 мл универсального буферного раствора, и регистрируют циклическую вольтамперограмму в диапазоне потенциалов от -1 до 1 В при скорости циклирования потенциала 50 мВ/с. Далее в ячейку последовательно добавляют раствор доксорубицина. Вольтамперометрические измерения проводят после каждого добавления доксорубицина в ячейку. Измеряют ток пика окисления или восстановления полианилина. Аналитическим сигналом является величина тока пика. Строят градуировочную зависимость в координатах «ток пика, мкА - концентрация антрациклинового препарата, нМ». Воспроизводимость сигнала составляет 2.0±0.5%. Устройство позволяет проводить определение антрациклиновых препаратов с пределом обнаружения 5 пМ доксорубицина, 0.05 нМ даунорубицина и 0.15 нМ идаруцибина.
Таким образом, по сравнению с прототипом предлагаемое устройство имеет следующие преимущества:
1) широкий диапазон определяемых концентраций и низкий предел обнаружения антрациклиновых препаратов;
2) простое устройство сенсора;
3) низкая стоимость сенсора;
4) высокая воспроизводимости сигнала, высокая чувствительность определения концентрации аналита, более надежное функционирование устройства благодаря наличию в его составе однородного электрополимеризованного покрытия, включающего комплекс ДНК с метиленовым синим.