СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ТКАНЕЙ КЛЕЩА ДЛЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
METHOD OF PREPARING TICK TISSUES FOR BIOLOGICAL ANALYSIS

Изобретение относится к способам подготовки биологических материалов для проведения исследований, в частности подготовки тканей клеща для дальнейшего определения наличия в них вируса клещевого энцефалита (ВКЭ), и может быть использовано в здравоохранении, биотехнологиях и иммунологии.
Известен способ подготовки биологического материала для ПЦР генамплифакационной диагностики, который заключается в лизисе образцов раствором NaI, содержащим РНК-носитель, осаждении вирусных, бактериальных и клеточных ДНК и РНК изопропанолом, центрифугировании и их очистке (патент RU №2134871, МПК G01N 1/28, G01N 1/30, опубл. 20.08.1999).
Известный способ является весьма специфичным и не может быть применен для подготовки тканей клеща, поскольку в процессе его осуществления разрушается белковая структура вируса, которая в дальнейшем необходима для проведения исследования.
В качестве прототипа был выбран способ выделения ВКЭ из клеща (интернет-ресурс: http://www.bio-ua.com/index.php/prod?i=l66&PHPSESSID=3fl72c88947d863e65bb76f2a0ff3bb2). Данный способ заключается в том, что ткани клеща промывают в 70-80%-ном растворе этилового спирта, высушивают с помощью фильтровальной бумаги, помещают в пробирку типа "Эппендорф" и плотно закрывают, затем помещают в жидкий азот для замораживания, далее замороженные ткани клеща растирают при помощи пестика для гомогенизации и, добавив раствор для разведения образцов, центрифугируют.
Основным недостатком известного способа является его нетехнологичность, заключающаяся в использовании в нем жидкого азота, для получения и хранения которого требуется узкоспециализированное оборудование.
Задачей заявляемого технического решения является создание технологичного способа пробоподготовки тканей клеща.
Технический результат, получаемый от использования изобретения, заключается в обеспечении простого и надежного процесса пробоподготовки тканей клеща без использования дорогостоящей техники и снижении трудозатрат на стадии гомогонезации клеща.
Технический результат достигается за счет того, что в способе пробоподготовки тканей клеща ткани клеща промывают в 70-80%-ном растворе этилового спирта, высушивают при помощи фильтровальной бумаги или любой другой бумажной салфетки плотной текстуры и помещают в пробирку, затем в пробирку с клещом добавляют 100-200 мкл лизирующего буфера и производят растирание тканей клеща в растворе в этой же пробирке, а полученный гомогенат центрифугируют в течение 2-10 мин при 2000-6000 об/мин.
Высушивание можно осуществлять при помощи фильтровальной бумаги или любого бумажного полотенца.
Растирание тканей клеща можно осуществлять при помощи скальпеля или пестика для гомогенизации.
2
4
2
4
Лизирующий буфер включает NaCl 145 мМ, NaHPО 10 мМ, KHPО 1,76 мМ, pH 7,4, NP-40 0,5%, казеин 2,5%, Проклин 300 0,1%.
Для каждого образца клеща следует использовать отдельный пестик во избежание контаминации. Для повторного использования пестик необходимо инактивировать: смочить в 95% этиловом спирте и поджечь на спиртовке, а затем остудить.
Подготовленные для анализа образцы тканей клещей можно хранить в течение 3 ч при температуре 2-8°C или в течение 3-х месяцев при температуре не выше минус 20°C.
Использование в заявляемом способе определенных диапазонов режимов центрифугирования обусловлено достижением требуемых параметров растворения тканей клеща. Результаты опытов приведены в таблице 1.
2
Поскольку одним из применений описанной пробоподготовки клеща является полимеразная цепная реакция, поэтому помимо визуальной оценки состояния надосадочной жидкости и осадка, проводили проверку получаемой надосадочной жидкости методом полимеразной цепной реакции. Анализ образца методом полимеразной цепной реакцией проводили следующим образом: к гомогенизированному образцу клеща добавляли плазмиду pQE30, содержащую ген GFP. Далее, к 5 мкл образца затем добавляли 5 мкл 5×ПЦР-буфера, 0,5 мкл 10 мкМ dNTP, 0,75 мкл 100 мМ MgCl, 1 мкл 5 мкМ прямого праймера, 1 мкл 5 мкМ обратного праймера, 3 мкл 5 мкМ флуоресцентно меченной пробы, 1 ед.акт. ДНК-полимеразы. Смесь тщательно перемешивали на вортексе и проводили полимеразную цепную реакцию с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени по программе: 45 циклов: 95°C 15 сек, 60°C 30 сек. Флуоресцентную детекцию проводили при 60°C. Детектируемые прибором значения порогового цикла (Ct) использовали для оценки состояния надосадочной жидкости.
Из полученных данных видно, что при скорости центрифугирования 1000 об/мин в диапазоне продолжительности центрифугирования от 2 до 10 мин наблюдалось неполное осаждение фрагментов клеща, формирование неплотного (подвижного) осадка (что затрудняло отбор надосадочной жидкости без частиц осадка), что, в конце концов, приводило к сдвигу Ct в сторону больших циклов при анализе образца методом ПЦР.
В диапазоне скоростей центрифугирования от 2000 до 6000 об/мин при временах от 2 до 10 мин наблюдалось формирование прозрачной надосадочной жидкости, плотного осадка, приемлемые значения Ct при анализе образцов методом ПЦР.
При больших (более 6000 об/мин) значениях центрифугирования при продолжительности центрифугирования от 2 до 10 мин не наблюдалось заметных отличий получаемых результатов от тех, что получены при скорости центрифугирования 6000 об/мин при 2-10 мин.
Простота описанного способа обусловлена тем, что для его реализации требуется проведение 3 последовательных этапов: 1. Промывка клеща в 70% спирте, 2. Высушивание клеща фильтровальной бумагой или бумажным полотенцем, 3. Гомогенизация клеща в лизирующем буфере, в то время, как для реализации способов-аналогов требуется либо большее количество стадий (например, патент RU №2134871), либо привлечение специализированного оборудования для работы и хранения жидкого азота, специальных одноразовых гомогенизаторов, предназначенных для работы с жидким азотом, что не всегда реализуемо в условиях лаборатории (http://www.bio-ua.com/index.php/prod?i=166&PHPSESSID=3fl72c88947d863e65bb76f2a0ff3bb2).
Надежность реализации способа оценивали методом ПЦР. Из данных, приведенных в таблице 1, видно, что в указанном диапазоне параметров центрифугирования образцы определялись как положительные.
Примеры конкретного выполнения способа.
Пример 1.
Клеща промывают 70%-ным раствором этанола, выкладывают на чистую бумажную салфетку и высушивают клеща 2 минуты. Помещают в пробирку типа «Эппендорф» объемом 1,5 мл. В пробирку с клещом добавляют 150 мкл лизирующего буфера. Клеща в растворе тщательно гомогенизируют при помощи скальпеля. Полученную суспензию центрифугируют в течение 2 минут при 3000 об/мин.
Пример 2.
Клеща промывают 75%-ным раствором этанола, выкладывают на чистую бумажную салфетку и высушивают клеща 2 минуты. Помещают в пробирку типа «Эппендорф» объемом 0,6 мл. В пробирку с клещом добавляют 120 мкл лизирующего буфера. Клеща в растворе тщательно гомогенизируют при помощи скальпеля или пестика для гомогенизации клещей (каталожный №Е-9259 ЗАО «Вектор-Бест»). Полученную суспензию центрифугируют в течение 5 минут при 2000 об/мин.
Пример 3.
Пинцетом захватывают клеща и помещают в емкость с 80% этанолом, затем клеща перемещают на чистую сухую фильтровальную бумагу для высушивания клеща. Клеща переносят в одноразовую пробирку типа «Эппендорф» объемом 1,5 мл. В пробирку с клещом добавляют 200 мкл лизирующего буфера. Клеща тщательно гомогенизируют при помощи пестика для гомогенизации клещей (каталожный №Е-9259 ЗАО «Вектор-Бест»).
Полученную суспензию перемешивают на Vortex в течение 30 секунд. Далее гомогенизат центрифугируют в течение 3 минут при 4000 об/мин.
Таким образом, заявляемый способ пробоподготовки тканей клеща позволяет обеспечить технологичность процесса без использования дорогостоящего оборудования.