ПРИМЕНЕНИЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ АМИЛОИДА БЕТА ПРИ ГЛАЗНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ
USING ANTI-AMYLOID BETA ANTIBODY IN OPHTHALMIC DISEASES

Перекрестные сведения на родственные заявки
По настоящей заявке испрашивается приоритет на основе предварительной заявки на патент США US 60/960614, поданной 5 октября 2007 г., и предварительной заявки на патент США US 60/960615, поданной 5 октября 2007 г.
Предпосылки создания изобретения
Настоящее изобретение относится к способам и композициям для диагностики и лечения заболеваний и расстройств, вызванных или связанных с амилоидными или амилоидоподобными белками, включая амилоидоз - группу расстройств и нарушений, ассоциированных с амилоидным белком, например болезни Альцгеймера.
Амилоидоз означает не единственное заболевание, а разнородную группу прогрессирующих заболеваний, отличающихся внеклеточными тканевыми отложениями восковидного крахмалоподобного белка, называемого амилоидом, который накапливается в одном или нескольких органах или системах организма. По мере накопления отложений амилоида, они начинают мешать нормальному функционированию органа или системы организма. Имеется по меньшей мере 15 разных типов амилоидоза. Основными формами являются первичный амилоидоз без известных предшествующих проявлений заболевания, вторичный амилоидоз, проявляющийся после некоторого другого болезненного состояния, и наследственный амилоидоз.
Вторичный амилоидоз отмечают у людей с хронической инфекцией или воспалительным заболеванием, например, туберкулезом, бактериальной инфекцией, называемой семейной средиземноморской лихорадкой, костными инфекциями (остеомиелитами), ревматоидным артритом, воспалением тонкой кишки (грануломатозным илеитом), болезнью Ходжкина и лепрой.
Амилоидные белковые фибриллы, которые составляют примерно 90% амилоидного материала, включают один или несколько разных типов белков. Некоторые из этих белков способны складываться в так называемые «бета-складчатые» плоские фибриллы - уникальную белковую конфигурацию, которая имеет сайты связывания для красителя Конго красного, и в результате возникает уникальное для амилоидного белка свойство - окрашивание. Кроме того, амилоидные отложения тесно связаны с компонентом амилоида Р (пентагональный амилоид, amyloid pentagonal - АР) - гликопротеином, близким к нормальному сывороточному амилоиду Р (serum amyloid Р - SAP), и сульфатированными гликозаминогликанами (glycosaminoglycans - GAG) - сложными углеводами соединительной ткани.
Многие возрастные заболевания основаны или связаны с белками амилоидного типа и в частности характеризуются накоплением внеклеточных отложений амилоида или амилоидоподобного материала, который участвует в патогенезе, а также в прогрессировании заболевания. К таким заболеваниям относятся, но ими не ограничиваются, неврологические заболевания, например, болезнь Альцгеймера (БА), в том числе заболевания или состояния, отличающиеся утратой когнитивного объема памяти, например, умеренное когнитивное поражение, болезнь диффузных поражений телец Леви (Lewy body dementia - LBD), синдром Дауна, наследственное цереброспинальное кровоизлияние с амилоидозом (типа Dutch) и комплекс паркинсонизма-деменции о. Гуам. К другим заболеваниям, которые связаны с белками амилоидного типа, относятся прогрессирующий супрануклеарный паралич, рассеянный склероз, болезнь Крейсфельда-Якоба, болезнь Паркинсона, слабоумие, связанное со СПИД, амиотропный латеральный склероз (amyotropic lateral sclerosis - ALS), миозит с включенными тельцами (МВТ), диабет взрослых, старческий кардиальный амилоидоз, эндокринные опухоли и другие заболевания, включая глазные заболевания, ассоциированные с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированные со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов. Указанные патологические нарушения могут наблюдаться, например, в разных тканях глаза, например, в зрительной зоне коры мозга, что приводит к кортикальной зрительной недостаточности; в передней камере глаза и зрительном нерве, приводящие к глаукоме; в хрусталике, приводящие к катаракте из-за отложения бета-амилоида; в стекловидном теле, приводящие к зрительному амилоидозу; в сетчатке, приводящие к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна, например, возрастной дегенерации желтого пятна; в зрительном нерве, приводящие к формированию старческих бляшек в зрительном нерве, зрительной невропатии и ретробульбарному невриту; в роговице, приводящие к решетчатой дистрофии роговицы.
Хотя патогенез этих заболеваний может быть различным, свойственные для них отложения часто содержат много общих молекулярных составляющих. В значительной степени они могут быть следствием местного активирования провоспалительных метаболических путей, связанных с одновременным отложением активированных компонентов комплемента, с веществами острой фазы, иммунными модуляторами и другими медиаторами воспаления (McGeer и др., 1994).
Болезнь Альцгеймера (БА) является нейрологическим расстройством, предположительно вызываемым амилоидными бляшками, накоплением нарушенного отложения белков в мозге. Наиболее часто тип амилоида, обнаруженного в мозге больных, преимущественно состоит из фибрилл Аβ. Научное подтверждение заключается в том, что повышение выработки и накопления бета-амилоидного белка в бляшках приводит к отмиранию нервных клеток, которое влияет на развитие и прогрессирование БА. Утрата нервных клеток в стратегически важных участках мозга в свою очередь вызывает снижение содержания нейротрансмитеров и ухудшает память. К белкам, играющим основную роль в формировании бляшек, относятся амилоидный белок-предшественник (amyloid precursor protein - АРР) и два презенилина (презенилин I и презенилин II). Последующее расщепление амилоидного белка-предшественника (АРР), который экспрессируется конститутивно и подвергается катаболизму в большинстве клеток, ферментами β и γ секретазами приводит к высвобождению пептида Аβ, включающего от 39 до 43 аминокислот. Разрушение АРР вероятно повышает его предрасположенность агрегировать в бляшки. Особенно это относится к фрагменту Ар(1-42), который имеет высокую предрасположенность к связыванию агрегатов из-за двух в высокой степени гидрофобных аминокислотных остатков по С-концу. Поэтому предполагают, что фрагмент Аβ(1-42) преимущественно вовлечен и ответственен за инициацию формирования старческих бляшек у больных БА, и соответственно обладает высоким патологическим потенциалом. Таким образом, существует потребность в агентах для предупреждения формирования амилоидных бляшек и растворения имеющихся бляшек у больных БА.
Симптомы болезни Альцгеймера проявляются медленно, и первым симптомом может быть небольшая забывчатость. На этой стадии индивидуумы могут забывать недавние события, поступки, имена знакомых людей или названия предметов и могут быть не в состоянии решить простые математические задачи. По мере прогрессирования заболевания симптомы становятся более заметными и достаточно серьезными, чтобы больные БА или их родственники стали обращаться за медицинской помощью. На средней стадии БА к симптомам относятся утрата способности выполнять простые задачи, например, поддержание личной гигиены, и проблемы, связанные с речью, пониманием, чтением или письмом. Пациенты на последующей стадии БА могут пребывать в состоянии обеспокоенности или агрессии, могут уйти из дома, а также могут полностью нуждаться в уходе.
В настоящее время единственным точным способом диагностики БА является идентификация бляшек и сплетений в ткани мозга при аутопсии после смерти индивидуума. Следовательно, врачи могут диагностировать БА только «приблизительно» или «примерно» при жизни пациента. С помощью современных методов врачи могут с точностью диагностировать БА до 90% случаев, используя некоторые средства для диагностики «возможной» БА. Врачи проводят опрос об общем состоянии здоровья пациента, перенесенных заболеваниях, а также о появлении каких-либо осложнений в быту. Поведенческое тестирование памяти, решения задач, внимания, счета и речи дают информацию о когнитивном вырождении, а медицинские анализы, например, крови, мочи, спинномозговой жидкости и сканирование мозга, могут предоставить некоторую дополнительную информацию.
Поддержание состояния пациентов с БА заключается в медицинском и немедицинском уходе. Способы лечения, направленные на изменение течения болезни (откладывая или ревертируя ее прогрессирование), до настоящего времени остаются почти совсем неэффективными. Было показано, что лекарственные средства, которые восстанавливают недостаточность (дефицит) или нарушенное действие химических посредников нервных клеток (нейротрансмиттеров), в частности ингибиторов холинэстеразы (cholinesterase inhibitor - ChEI), например, такрин и ривастигмин, проявляют улучшение симптомов. Ингибиторы ChEI препятствуют ферментативному разрушению нейротрансмитеров, тем самым, повышая содержание химических посредников, способных передавать нервный сигнал в мозг.
У некоторых людей на ранних и средних стадиях заболевания лекарственные средства такрин (продукт COGNEX, Morris Plains, Нью-Джерси), донепезил (продукт ARICEPT, Токио, Япония), ривастигмин (продукт EXELON, Восточный Гоновер, Нью-Джерси) или галантамин (продукт REMINYL, Нью-Брунсвик, Нью-Джерси) могут помочь предупредить наихудшее проявление некоторых симптомов в течение ограниченного периода времени. Другое лекарственное средство, мемантин (продукт NAMENDA, Нью-Йорк, Нью-Йорк), было одобрено для лечения БА, проявляющейся в формах от умеренных до тяжелых. Медикаментозные средства также применимы для лечения психиатрических проявлений БА. Кроме того, некоторые медикаментозные средства могут способствовать контролю поведенческих симптомов при БА, например, бессонницы, беспокойства, блуждания, состояния тревоги и депрессии. Лечение этих симптомов часто облегчает существование больных, делая его более комфортабельным, и облегчает уход за ними для персонала. К сожалению, несмотря на существенные преимущества лечения, показавшего, что агенты этого класса стабильно лучше плацебо, болезнь продолжает прогрессировать и обычное воздействие на ментальное функционирование проявляется умеренно. Многие лекарственные средства, используемые для лечения БА, например, ChEI, также обладают побочными эффектами, к которым относятся желудочно-кишечные расстройства, печеночная токсичность и потеря массы тела.
Кортикальная зрительная недостаточность часто ассоциирована с БА, несмотря на отрицательные данные исследования по ухудшению резкости зрения или глазному заболеванию. Посмертное доказательство на материале от пациентов с БА показало патологические изменения в предкорковых зрительных структурах и уменьшение волокон в зрительном нерве.
Развитие дисфункции зрения у БА также ассоциировано с неврологическими изменениями и патологией в вентральном проводящем пути нервной системы, который тянется от сетчатки с Р-ганглиозными клетками через парвоцеллюлярные слои латерального коленчатого узла (lateral geniculate nucleus - LGN), достигая нижней височной коры (inferior temporal cortex - IT), и в дорсальном проводящем пути нервной системы, который тянется от сетчатки с М-ганглиозными клетками через магноцеллюлярные слои LGN, достигая средней височной области коры. Старческие бляшки у пациентов с БА создают нарушения и дисфункции в указанных областях коры мозга. Старческие бляшки также вызывают утрату зрительного восприятия, например, дисфункцию при распознавании лиц знакомых людей, состояния, известного под названием «прозопагнозия (агнозия на лица)».
Другие заболевания, которые основаны или связаны с накоплением и отложением амилоидоподобного белка, представляют умеренное когнитивное поражение, болезнь диффузных поражений телец Леви (Lewy body dementia -LBD), синдром Дауна (трисомия по 21 хромосоме), амиотропный латеральный склероз (amyotropic lateral sclerosis - ALS), миозит с включенными тельцами (МВТ) и глазные заболевания, ассоциированные с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированные со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов. Указанные патологические нарушения могут наблюдаться, например, в разных тканях глаза, например, в зрительной зоне коры мозга, что приводит к кортикальной зрительной недостаточности; в передней камере глаза и зрительном нерве, приводящие к глаукоме; в хрусталике, приводящие к катаракте из-за отложения бета-амилоида; в стекловидном теле, приводящие к зрительному амилоидозу; в сетчатке, приводящие к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна, например, возрастной дегенерации желтого пятна; в зрительном нерве, приводящие к формированию старческих бляшек в зрительном нерве, зрительной невропатии и ретробульбарному невриту; в роговице, приводящие к решетчатой дистрофии роговицы.
Умеренное когнитивное расстройство (mild cognitive impairment - MCI) -общее название, которое обычно означает мягкое, но фиксируемое расстройство памяти. У индивидуума с MCI проявляются проблемы с памятью в большей степени, чем они возникают с возрастом, но нет других признаков слабоумия, например, нарушенного мышления или нарушенных умозаключений. MCI - состояние, которое часто отражает предклиническую стадию БА.
Предполагают, что отложение β-амилоида в энторинальной области коры головного мозга играет ключевую роль в развитии умеренного расстройства с когнитивным нарушением (mild cognitive impairment - MCI) у престарелых. Это согласуется с наблюдением, заключающемся в том, что уровни СМЖ-А Аβ(1-42) существенно снижаются, когда клиническое проявление симптомов БА становится очевидным. В отличие от СМЖ-А Аβ(1-42), уровни СМЖ-тау существенно повышены на стадии MCI, и позднее эти величины продолжают повышаться, свидетельствую о том, что повышенные уровни СМЖ-тау могут помочь выявить субъектов с MCI, у которых прогнозируют развитие БА.
Болезнь диффузных поражений телец Леви (Lewy body dementia - LBD) является нейродегенеративным расстройством, которое может быть у людей старше 65 лет, при котором обычно проявляются симптомы когнитивного (умственного) ухудшения и нарушенного поведения. К симптомам могут относиться когнитивное ухудшение, нейрологические признаки, расстройство сна и недостаточность вегетативной нервной системы. Когнитивное ухудшение представляет симптом LBD в большинстве случаев. У пациентов повторяются приступы помрачения сознания, которые постепенно ухудшаются. Флуктуация когнитивной способности часто связана с изменением степеней проявления внимания и живости поведения. Когнитивное ухудшение и флюктуации мыслительной способности могут меняться на протяжении минут, часов или суток.
Тельца Леви формируются из фосфорилированных и нефосфорилированных нейрофиламентных белков; они содержат синаптический белок альфа-синуклеин, а также убиквитин, часть избыточной хромосомы 21 и часто ассоциированы с ухудшением когнитивной способности и физического роста. Для синдрома Дауна свойственно преждевременное старение: у большинства индивидуумов в возрасте 40-50 лет развивается болезнь Альцгеймера, при этом происходит отложение белка амилоида-бета, формирующего бляшки, причем часто в более тяжелой форме, чем у большинства других пациентов с болезнью Альцгеймера. Кроме того, у многих больных с синдромом Дауна развивается катаракта, начинаясь в детском возрасте, причем у многих наблюдают врожденную глаукому. У людей ген предшественника амилоидного белка, расщепляющегося с формированием амилоида-бета, расположен на 21 хромосоме. У индивидуумов с синдромом Дауна накапливается и растворимый, и внутриклеточный бета-амилоид до внеклеточного бета-амилоида, ответственного за формирование старческих бляшек. Повышение уровней бета-амилоида при синдроме Дауна может быть следствием повышенной экспрессии и повышенных уровней фермента 2, расщепляющего предшественник белка бета-амилоида, локализованного на хромосоме 21.
Амиотропный латеральный склероз (amyotropic lateral sclerosis - ALS) характеризуется дегенерацией нижних и верхних моторных нейронов. У некоторых пациентов с ALS может быть слабоумие или потеря речи (афазия) (ALS-D). Слабоумие в большинстве случаев является лобно-височным слабоумием (frontotemporal dementia - FTD), при этом у многих пациентов имеются убиквитин-положительные тау-отрицательные включения в нейронах зубчатой извилины медиальной и нижней поверхности полушария большого мозга и поверхностные слои лобных и височных долей.
Миозит с включенными тельцами (МВТ) (Inclusion-body myositis - IBM) является травматическим заболеванием, обычно выявляемым у людей старше 50 лет, у которых в мышечных волокнах формируется воспаление и начинается атрофия, но у которых сохранен мозг и полностью сохранен интеллект. Установлено, что в большинстве случаев содержание двух ферментов, участвующих в выработке белка амилоида-6, повышено в мышечных клетках пациентов этого наиболее распространенного прогрессирующего мышечного заболевания пожилых людей, у которых содержание амилоида-В также повышено.
Синдром Дауна (СД) или трисомия по 21 хромосоме представляет генетическое расстройство, вызванное наличием лишней хромосомы 21-й пары, целой или ее части, и часто связанное с некоторым нарушением когнитивных способностей и физического роста. Для синдрома Дауна свойственно преждевременное старение: у большинства индивидуумов в возрасте 40-50 лет развивается болезнь Альцгеймера, при этом происходит отложение белка амилоида-бета, формирующего бляшки, причем часто в более тяжелой форме, чем у большинства других пациентов с болезнью Альцгеймера. Кроме того, у многих больных с синдромом Дауна развивается катаракта, начинаясь в детском возрасте, причем у многих наблюдают врожденную глаукому. У людей ген предшественника амилоидного белка, расщепляющегося с формированием амилоида-бета, расположен на 21 хромосоме. У индивидуумов с синдромом Дауна накапливается и растворимый, и внутриклеточный бета-амилоид до внеклеточного бета-амилоида, ответственного за формирование старческих бляшек. Повышение уровней бета-амилоида при синдроме Дауна может быть следствием повышенной экспрессии и повышенных уровней фермента 2, расщепляющего предшественник белка бета-амилоида, локализованного на хромосоме 21.
Другим заболеванием, основанным или связанным с накоплением и отложением белка типа амилоида, является дегенерация желтого пятна.
Дегенерация желтого пятна представляет распространенное заболевание, при котором происходит повреждение желтого пятна, являющегося центральной областью сетчатки (ткани, толщиной с лист бумаги в задней части глаза, из которой светочувствительные клетки посылают зрительные сигналы в мозг). Острое, четкое, «прямое» зрение перерабатывается желтым пятном. Повреждение желтого пятна приводит к развитию слепых пятен и расплывчатому или искаженному изображению. Возрастная дегенерация желтого пятна (ВДЖП) представляет основную причину ухудшения зрения в США, а для людей старше 65 лет она представляет основную причину развития практической (гражданской) слепоты среди представителей европеоидной расы. Примерно 1,8 миллионов американцев в возрасте 40 лет и старше, имеющие продвинутую форму ВДЖП, и другие 7,3 миллионов американцев, имеющие промежуточную форму ВДЖП, подвержены значительному риску потери зрения. По оценке правительства к 2020 году у 2,9 миллионов людей будет продвинутая форма ВДЖП. Жертвы ВДЖП часто удивляются и расстраиваются, узнав, что о причинах слепоты и ее лечении известно слишком мало.
Имеется две формы дегенерации желтого пятна: сухая дегенерация желтого пятна и влажная дегенерация желтого пятна. Сухая форма, при которой клетки желтого пятна начинают медленно разрушаться, диагностируется в 85% случаев дегенерации желтого пятна. Оба глаза обычно поражены сухой формой ВДЖП, хотя один глаз может потерять зрение при сохранности второго глаза. Старческие бляшки, которые представляют желтые отложения под сетчаткой, обычно представляют ранние симптомы сухой формы ВДЖП. Риск развития продвинутой сухой формы ВДЖП или влажной формы ВДЖП повышается по мере увеличения числа или размера старческих бляшек. Сухая форма ВДЖП может прогрессировать и вызвать потерю зрения без перехода к влажной форме заболевания, однако также возможен для ранней стадии сухой формы ВДЖП внезапный переход во влажную форму.
Влажная форма, хотя она встречается только в 15% случаев, в 90% приводит к слепоте, и рассматривается в виде продвинутой формы ВДЖП (нет ранней или промежуточной стадии у влажной формы ВДЖП). Влажной форме ВДЖП всегда предшествует сухая форма заболевания. По мере ухудшения сухой формы у некоторых людей начинается патологический рост кровеносных сосудов за желтым пятном. Эти сосуды очень хрупкие, и могут быть кровотечения (отсюда «влажная» дегенерация желтого пятна), вызывающие быстрое разрушение желтого пятна.
Сухая форма ВДЖП может в начальной стадии часто вызывать слегка расплывчатое зрение. Центр изображения в частности затем может стать расплывчатым, и эта область разрастается по мере прогрессирования заболевания. Симптомы могут остаться незамеченными, если поражен только один глаз. При влажной форме ВДЖП прямые линии могут казаться волнистыми, а утрата центрального зрения может происходить быстро.
Диагностика дегенерации желтого пятна обычно включает расширенный анализ глаз, используя метод, называемый фундоскопией, который способствует диагностике ВДЖП, и, если предполагается влажная форма ВДЖП, также могут проводить флуоресцентную ангиографию. Если сухая форма ВДЖП достигает продвинутых стадий, в настоящее время нет лечения для предупреждения потери зрения. Однако специфические высокие дозы формулы антиоксидантов и цинка могут отсрочить или предупредить промежуточную стадию ВДЖП от прогрессирования до продвинутой стадии. Продукт Macugen (инъекция пегаптаниба натрия), коагуляция лазером и фотодинамическая терапия могут контролировать патологический рост кровеносных сосудов и кровотечение в желтом пятне, что полезно для некоторых людей с влажной формой ВДЖП, однако, такими способами утраченное зрение восстановить нельзя. Если зрение уже утрачено, существует мало средств, которые могут помочь улучшить качество жизни.
Одним из ранних признаков возрастной дегенерации желтого пятна (ВДЖП) является накопление внеклеточных отложений, известных под названием «старческих бляшек», между базальным слоем пигментированного эпителия сетчатки (retinal pigmented epithelium - RPE) и базальной пластинки, также называемой оболочкой Бруха (Bruch's membrane - ВМ). Предшествующие исследования, выполненные Anderson и др., подтвердили, что старческие бляшки содержат амилоид-бета (Experimental Eye Research 78, 2004, сс.243-256).
Современные исследования продолжают исследовать факторы внешней среды, генетические факторы и факторы питания, которые могут содействовать ВДЖП. Также исследуются новые стратегии лечения, включая трансплантаты клеток сетчатки, лекарственные средства, которые могут предупредить или понизить прогрессирование заболевания, радиационную терапию, генную терапию, имплантацию компьютерного чипа в сетчатку, которые могут помочь стимулировать зрение, и агенты, которые могут предупредить рост новых кровеносных сосудов под желтым пятном.
Важным фактором, который рассматривают при разработке новых лекарственных средств, является легкость применения пациентами, для которых они предназначены. Средства доставки пероральных лекарственных средств, особенно таблетки, капсулы и мази, составляют до 70% от всех потребляемых лекарственных форм, поскольку они удобнее для пациентов. Разработчики лекарственных средств полагают, что пациенты предпочитают пероральное введение в большей степени, чем инъекции или другие более инвазивные формы медикаментозного введения. Также предпочтительны составы, с увеличенными интервалами дозирования (т.е. раз в сутки или составы устойчивого высвобождения). Простота введения антибиотиков в пероральной лекарственной форме приводит к повышению соблюдения пациентом режима и схемы лечения.
Необходимы эффективные способы и композиции для получения высокоспецифичных и высокоэффективных антител, которые необходимы, если антитела предусматривают в пероральной дозированной форме. Предпочтительно такие антитела могут распознать специфические эпитопы на разных антигенах, например, на амилоидном белке.
Необходимы эффективные способы и композиции, направленные на осложнения, ассоциированные с заболеваниями и расстройствами у субъектов, нуждающихся в этом, которые вызваны или ассоциированы с амилоидом или амилоидоподобными белками, включая амилоидоз - группу заболеваний и расстройств, связанных с формированием амилоидных бляшек, включая вторичный амилоидоз и возрастной амилоидоз, включая, но ими не ограничиваясь, неврологические расстройства, например, болезнь Альцгеймера (БА), включая заболевания или состояния, отличающиеся утратой когнитивного объема памяти, например, умеренное когнитивное расстройство (MCI), болезнь диффузных поражений телец Леви, синдром Дауна, наследственное цереброспинальное кровоизлияние с амилоидозом (типа Dutch), комплекс паркинсонизм-деменция о. Гуам, а также другие заболевания, которые основаны или связаны с белками амилоидного типа, например, прогрессирующий супрануклеарный паралич, рассеянный склероз, болезнь Крейсфельда-Якоба, болезнь Паркинсона, слабоумие, связанное со СПИД, амиотропный латеральный склероз (amyotropic lateral sclerosis - ALS), диабет взрослых, старческий кардиальный амилоидоз, эндокринные опухоли и другие, включая глазные заболевания, ассоциированные с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированное со связанными с амилоид-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов. Указанные патологические нарушения могут наблюдаться, например, в разных тканях глаза, например, в зрительной зоне коры мозга, что приводит к кортикальной зрительной недостаточности; в передней камере глаза и зрительном нерве, приводящие к глаукоме; в хрусталике, приводящие к катаракте из-за отложения бета-амилоида; в стекловидном теле, приводящие к зрительному амилоидозу; в сетчатке, приводящие к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна, например, возрастной дегенерации желтого пятна; в зрительном нерве, приводящие к формированию старческих бляшек в зрительном нерве, зрительной невропатии и ретробульбарному невриту; в роговице, приводящие к решетчатой дистрофии роговицы. В частности необходимы агенты, способные противодействовать физиологическим проявлениям заболевания, например, формированию бляшек, ассоциированных с агрегированием волокон амилоида или амилоидоподобного пептида.
1.42
Сообщалось, что антитела против амилоида, возникшие в результате инокуляции амилоидом Аβ, смешанным с полным или неполным адъювантом Фройнда, снижают амилоидную нагрузку у трансгенных мышей, связанную с болезнью Альцгеймера человека (Schenk и др., 1999).
1-16
Внутрибрюшинное введение тетрапальмитоилированного Aβ, помещенного в липосомы, трансгенным мышам NORBA, высвобождает существенные титры анти-амилоидных антител, о которых сообщалось, что они растворяют амилоидные волокна и бляшки in vitro и in vivo (Nicolau и др., 2002).
Возможный механизм, с помощью которого происходит растворение амилоидных бляшек и волокон, впервые был предложен Bard и др. (2000), которые заключили, что опсонизированные антителами бляшки были последовательно разрушены макрофагами микроглии. De Mattos и др. (2001) установили, что моноклональное антитело (MAb), направленное против центрального домена β-амилоида, способно связывать и полностью изолировать амилоид плазмы. Они пришли к заключению, что наличие моноклональных антител в кровеносном русле смещает баланс Аβ между мозгом и плазмой, способствую периферическому очищению и катаболизму вместо отложения в мозге.
Настоящее изобретение предусматривает новые способы и композиции, включающие высоко специфичные и высоко эффективные антитела, способные специфически распознавать и связывать специфические эпитопы разных β-амилоидных белков. Антитела по настоящему изобретению особенно применимы для лечения заболеваний и расстройств у субъектов, нуждающихся в этом, которые вызваны или ассоциированы с амилоидными или амилоидоподобными белками, в том числе амилоидоза - группы заболеваний и расстройств, связанных с формированием амилоидных бляшек, включая вторичный амилоидоз и возрастной амилоидоз, включая, но ими не ограничиваясь, неврологические расстройства, например, болезнь Альцгеймера (БА), в том числе заболевания или состояния, отличающиеся утратой когнитивного объема памяти, например, умеренное когнитивное поражение, болезнь диффузных поражений телец Леви (Lewy body dementia - LBD), синдром Дауна, наследственное цереброспинальное кровоизлияние с амилоидозом (типа Dutch), комплекс паркинсонизм-деменция о. Гуам, а также другие заболевания, которые основаны или связаны с белками амилоидного типа, например, прогрессирующий супрануклеарный паралич, рассеянный склероз, болезнь Крейсфельда-Якоба, наследственное цереброспинальное кровоизлияние с амилоидозом типа Dutch, болезнь Паркинсона, слабоумие, связанное со СПИД, амиотропный латеральный склероз (amyotropic lateral sclerosis - ALS), диабет взрослых, старческий кардиальный амилоидоз, эндокринные опухоли и другие заболевания, включая глазные заболевания, ассоциированные с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированные со связанными с амилоид-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов. Указанные патологические нарушения могут наблюдаться, например, в разных тканях глаза, например, в зрительной зоне коры мозга, приводящие к кортикальной зрительной недостаточности; в передней камере глаза и зрительном нерве, приводящие к глаукоме; в хрусталике, приводящие к катаракте из-за отложения бета-амилоида; в стекловидном теле, приводящие к зрительному амилоидозу; в сетчатке, приводящие к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна, например, возрастной дегенерации желтого пятна; в зрительном нерве, приводящие к формированию старческих бляшек в зрительном нерве, зрительной невропатии и ретробульбарному невриту; и в роговице, приводящие к решетчатой дистрофии роговицы.
Кроме того, настоящее изобретение предусматривает новые способы и композиции для сохранения или повышения когнитивного объема памяти у млекопитающего со связанным с амилоидом заболеванием или состоянием, включающие введение субъекту, особенно млекопитающему, более предпочтительно человеку, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества моноклонального антитела по настоящему изобретению.
Краткое описание изобретения
В настоящем изобретении используют презентации антигенов, что приводит к повышенной экспозиции и стабилизации предпочтительной антигенной конформации, которая в результате приводит к антителам с уникальными свойствами.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, в том числе какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, или более предпочтительно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, которое возникло против надмолекулярной антигенной конструкции, включающей антигенный пептид, соответствующий аминокислотной последовательности β-амилоидного пептида, особенно выбранного фрагмента р-амилоидного пептида, модифицированного гидрофильной частью молекулы, например, полиэтиленгликолем (ПЭГ), или в другом варианте гидрофобной частью молекулы, например пальмитиновой кислотой, причем указанные гидрофильные и гидрофобные части молекулы, соответственно, ковалентно связаны с каждым из концов антигенного пептида через по меньшей мере одну, особенно одну или две аминокислоты, например, лизин, глутаминовую кислоту и цистеин, или какую-либо другую соответствующую аминокислоту или аминокислотный аналог, которые способны выступить в качестве связующего механизма для соединения гидрофобной и гидрофильной частей с пептидным фрагментом.
22-35
20-40
Если ПЭГ используют в качестве гидрофильной части молекулы, выбранный фрагмент β-амилоидного пептида может быть фрагментом, соответствующим аминокислотной последовательности Аβ и Аβ, соответственно, и свободный от ПЭГ конец может быть ковалентно связан с фосфатидилэтаноламином или каким-либо другим соединением, способным функционировать в качестве элемента заякоривания, например, для погружения антигенной конструкции в двойной слой липосомы.
1-15
Если используют пальмитиновую кислоту в качестве гидрофобной части молекулы, выбранный фрагмент β-амилоидного пептида может быть фрагментом, соответствующим аминокислотной последовательности Аβ и эта гидрофобная часть молекулы может непосредственно выступать в качестве элемента заякоривания, например, для погружения антигенной конструкции в двойной слой липосомы.
По одному из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, особенно моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, которое распознает и связывает конформационный эпитоп и связывается с полимерным растворимым амилоидом и с амилоидными фибриллами или волокнами, соответственно, особенно с полимерными растворимыми амилоидными Аβ пептидами и амилоидными Аβ фибриллами или волокнами, соответственно.
1-42
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, которое распознает и связывает конформационный эпитоп, предпочтительно проявленный на полимерных растворимых амилоидных и олигомерных амилоидных пептидах, соответственно, особенно на полимерных растворимых амилоидных Аβ пептидах и олигомерных амилоидных Аβ пептидах, включая множество мономерных Аβ пептидов, соответственно.
1-42
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, которое распознает и связывает конформационный эпитоп, предпочтительно проявленный на полимерных растворимых амилоидных и олигомерных амилоидных пептидах, соответственно, а также на амилоидных фибриллах или волокнах, особенно на полимерных растворимых амилоидных Аβ пептидах и олигомерных амилоидных Аβ пептидах, включая множество мономерных Аβ пептидов, и на амилоидных фибриллах или волокнах, включая множество указанных олигомерных пептидов, соответственно.
Наследование аллеля ε4 белка аполипопротеина Е (ароЕ4) представляет сильный генетический фактор риска в отношении БА. Этот белок способен связывать амилоид, причем известно, что он участвует и в клиренсе Аβ через гематоэнцефалитный барьер, и в стимулировании отложения Аβ. Напротив, связывание амилода преображает область АроЕ, связывающую гидрофобный липопротеин, и такая ассоциация резко снижает общую способность АроЕ связывать липид.
-42
Таким образом, другой вариант осуществления настоящего изобретения предусматривает антитело, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, описанные в настоящем изобретении, причем указанное антитело способно ингибировать или в другом варианте уменьшать взаимодействие амилоида с АроЕ4 в мозге субъекта, особенно млекопитающего, более предпочтительно человека, особенно в мозге человека с заболеванием или состоянием, ассоциированным с повышенной концентрацией Аβ в мозге. Антитело по настоящему изобретению, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, таким образом, предпочтительно связывается с полимерным растворимыми амилоидными и олигомерными амилоидными пептидами, соответственно, особенно с растворимыми полимерными Аβ пептидами и олигомерными Аβ пептидами, включая множество Аβ1 мономерных пептидов, соответственно. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, согласно описанному в настоящем изобретении, особенно моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанное антитело связывается с Аβ мономерными пептидами, имеющими по меньшей мере 30, особенно по меньшей мере 35, более предпочтительно по меньшей мере 38, еще более предпочтительно по меньшей мере 40 аминокислотных остатков, но практически не проявляет связывания с Аβ мономерными пептидами, состоящими менее чем из 30 остатков, особенно с пептидами, состоящими менее чем из 20 остатков, более предпочтительно с пептидами, состоящими менее чем из 10 остатков, но особенно пептидами, состоящими из 8 остатков или менее.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, описанному в настоящем изобретении, особенно моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанное антитело связывается с Аβ мономерными пептидами, имеющими по меньшей мере 30, особенно по меньшей мере 35, более предпочтительно по меньшей мере 38, еще более предпочтительно по меньшей мере 40 аминокислотных остатков, особенно с Аβ мономерным пептидом 1-40 и с растворимым полимерным, и/или олигомерным амилоидным пептидом, включая множество Аβ 1.42 мономерных пептидов, но практически не проявляет связывания с Аβ мономерными пептидами 17-40.
1-42
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу, описанному в настоящем изобретении, особенно моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанное антитело связывается с Аβ мономерным пептидом 1-40, особенно с Аβ мономерным пептидом 1-40 и с растворимым полимерным и/или олигомерным амилоидным пептидом, включая множество Aβ мономерных пептидов, но практически не проявляет связывания с Аβ мономерными пептидами 17-40.
1-42
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу, описанному в настоящем изобретении, особенно моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанное антитело связывается с Аβ мономерным пептидом 1-40, особенно с Аβ мономерным пептидом 1-40 и с растворимым полимерным и/или олигомерным амилоидным пептидом, включая множество Аβ мономерных пептидов, но проявляет существенно более слабое связывание с Аβ мономерным пептидом 1-28.
1-42
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу, описанному в настоящем изобретении, особенно моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанное антитело связывается с Аβ мономерным пептидом 1-40, особенно с Аβ мономерным пептидом 1-40 и с растворимым полимерным и/или олигомерным амилоидным пептидом, включая множество Аβ мономерных пептидов, но проявляет промежуточное связывание с Аβ мономерным пептидом 1-42.
1-42
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу, описанному в настоящем изобретении, особенно моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанное антитело связывается с Аβ мономерным пептидом 1-40, особенно с Аβ мономерным пептидом 1-40 и с растворимым полимерным и/или олигомерным амилоидным пептидом, включая множество Аβ мономерных пептидов, но проявляет существенно более слабое связывание с Аβ мономерным пептидом 1-28 и промежуточное связывание с мономерным пептидом 1-42.
1-42
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу, описанному в настоящем изобретении, особенно моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанное антитело связывается с Аβ мономерным пептидом 1-40, особенно с Аβ мономерным пептидом 1-40 и с растворимым полимерным и/или олигомерным амилоидным пептидом, включая множество Аβ мономерных пептидов, но проявляет существенно более слабое связывание с Аβ мономерным пептидом 1-28 и практически не связывается с Аβ мономерным пептидом 17-40.
1-42
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу, описанному в настоящем изобретении, особенно моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанное антитело связывается с Аβ мономерным пептидом 1-40, особенно с Аβ мономерным пептидом 1-40 и с растворимым полимерным и/или олигомерным амилоидным пептидом, включая множество Аβ мономерных пептидов, но проявляет промежуточное связывание с Аβ мономерным пептидом 1-42 и практически не связывается с Аβ мономерным пептидом 17-40.
1-42
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу, описанному в настоящем изобретении, особенно моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанное антитело связывается с Аβ мономерным пептидом 1-40, особенно с Аβ мономерным пептидом 1-40 и с растворимым полимерным и/или олигомерным амилоидным пептидом, включая множество Аβ мономерных пептидов, но проявляет существенно более слабое связывание с Аβ мономерным пептидом 1-28, промежуточное связывание с мономерным пептидом 1-42 и практически не связывается с Аβ мономерным пептидом 17-40.
1-42
1-42
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело согласно описанию, приведенному в настоящем изобретении, при совместном инкубировании с Аβ мономерным пептидом в мономерной и/или олигомерной форме, имеющем по меньшей мере 30, особенно по меньшей мере 35, более предпочтительно по меньшей мере 38, еще более предпочтительно по меньшей мере 40 аминокислотных остатков в мономерной и/или олигомерной форме, но особенно с Аβ мономерным и/или олигомерным пептидом, включая множество указанных Аβ мономерных пептидов, особенно в соотношении мольной концентрации антитела к Арм2 до 1:1000, но особенно в соотношении мольных концентраций от 1:10 до 1:100, ингибирует агрегирование Аβ мономеров и/или олигомеров в высокомолекулярные полимерные фибриллы.
В частности, совместное инкубирование антитела по настоящему изобретению с амилоидными мономерными и/или олигомерными пептидами проводят в течение 24-60 ч, особенно в течение 30-50 ч, более предпочтительно в течение 48 ч при температуре от 28°С до 40°С, особенно от 32°С до 38°С, но особенно предпочтительно при 37°С.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения совместное инкубирование с амилоидными мономерными и/или олигомерными пептидами проводят в течение 48 ч при температуре 37°С.
1-42
1-40
В частности, антитело, особенно моноклональное антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, связывается преимущественно с Аβ мономерным пептидом и при совместном инкубировании с Аβ мономерным и/или олигомерным пептидом ингибирует агрегирование Аβ мономеров в высокомолекулярные полимерные фибриллы.
1-40
1-42
1-42
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, особенно моноклональное антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, которое связывается предпочтительно с Аβ мономерным пептидом, особенно с Аβ мономерным пептидом 1-40 и с растворимым полимерным и/или олигомерным амилоидным пептидом, включая множество Аβ мономерных пептидов, но проявляет существенно более слабое связывание с Аβ мономерным пептидом 1-28, промежуточное связывание с мономерным пептидом 1-42 и практически не связывается с Аβ мономерным пептидом 17-40, а при совместном инкубировании с Аβ мономерным и/или олигомерным пептидом ингибирует агрегирование мономеров Аβ в высокомолекулярные полимерные фибриллы.
1-40
1-42
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, особенно моноклональное антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, которое связывается предпочтительно с Аβ мономерным пептидом, а также с АрМ2 олигомерными и/или полимерными пептидами, но проявляет существенно более слабое связывание с Аβ мономерным пептидом 1-28 и/или промежуточное связывание с мономерным пептидом 1-42 и практически не связывается с Аβ мономерным пептидом 17-40, и при совместном инкубировании с Аβ мономерным и/или олигомерным пептидом ингибирует агрегирование мономеров Аβ в высокомолекулярные полимерные фибриллы.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело, особенно моноклональное антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, ингибирует агрегирование Аβ мономеров в высокомолекулярные полимерные фибриллы по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, особенно по меньшей мере на 60%, особенно по меньшей мере на 65%, более предпочтительно по меньшей мере на 75%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 80%, но особенно предпочтительно по меньшей мере на 85-90% или более по сравнению с соответствующими мономерами амилоидных пептидов, инкубированными в буфере (контроль).
1-40
1-42
1-42
1-42
1-42
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, особенно моноклональное антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, которое предпочтительно связывается с Аβ мономерным пептидом, а также с Аβ, олигомерными и/или полимерными пептидами, но проявляет существенно более слабое связывание с Аβ мономерным пептидом 1-28, и/или промежуточное связывание с мономерным пептидом 1-42, и/или практически не связывается с Аβ мономерным пептидом 17-40, и при совместном инкубировании с Аβ, мономерным и/или олигомерным пептидом в течение 48 ч при температуре 37°С ингибирует агрегирование Аβ мономеров и/или олигомеров в высокомолекулярные полимерные фибриллы по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, особенно по меньшей мере на 60%, особенно по меньшей мере на 65%, более предпочтительно по меньшей мере на 75%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 80%, но особенно предпочтительно по меньшей мере на 85-90% в соотношении мольных концентраций антитела к Аβ 1:100, и по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, особенно по меньшей мере на 60%, особенно по меньшей мере на 65%, более предпочтительно по меньшей мере на 75%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 80%, но особенно предпочтительно по меньшей мере на 85-90% в соотношении мольных концентраций антитела к Aβ 1:10 по определению с помощью тиофлавин-Т (Th-T) флуоресцентного анализа, особенно тиофлавин-Т (Th-T) флуоресцентного анализа, описанного ниже в примерах 1.4 и 2.4.
Связывание антител по настоящему изобретению по описанию, приведенному в настоящем изобретении, с амилоидогенными мономерными и/или олигомерными пептидами, но особенно с амилоидной формой (1.42), приводит к ингибированию агрегирования мономерных и/или олигомерных амилоидогенных пептидов в высокомолекулярные фибриллы или филаменты. Через ингибирование агрегирования амилоидогенных мономерных и/или олигомерных пептидов антитела по настоящему изобретению способны предупредить или понизить формирование амилоидных бляшек, особенно амилоидной формы (1.42), о которой известно, что она становится нерастворимой за счет изменения вторичной конформации и является главной частью амилоидных бляшек в мозге больных животных или людей.
Способность антитела по настоящему изобретению ингибировать агрегирование может быть определена каким-либо соответствующим методом, известным в данной области, например, путем ультрацентрифугирования в градиенте плотности с последующим анализом SDS-PAGE осаждения в полученном градиенте и/или тиофлавин-Т (Th-T) флуоресцентным анализом.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, особенно моноклональное антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, которое при совместном инкубировании, особенно при соотношении мольных концентраций от 1:10 до 1:1000, более предпочтительно в соотношении 1:100, с ранее сформированным высокомолекулярными полимерными амилоидными фибриллами или филаментами, сформированными путем агрегирования Аβ мономерных и/или олигомерных пептидов, имеющих по меньшей мере 30, особенно по меньшей мере 35, более предпочтительно по меньшей мере 38, еще более предпочтительно по меньшей мере 40 аминокислотных остатков в мономерной и/или олигомерной форме, включая множество указанных мономерных пептидов, но особенно Аβ мономерных и/или олигомерных пептидов, способно дезагрегировать ранее сформированные полимерные фибриллы или филаменты по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, особенно по меньшей мере на 40%, более предпочтительно по меньшей мере на 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 60%, но особенно предпочтительно по меньшей мере на 70% или более.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения ингибирование агрегирования и способность антитела к дезагрегированию, соответственно, определяют путем ультрацентрифугирования в градиенте плотности с последующим анализом SDS-PAGE осаждения в полученном градиенте.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения ингибирование агрегирования и способность антитела к дезагрегированию, соответственно, определяют тиофлавин-Т (Th-T) флуоресцентным анализом.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению совместно инкубируют с ранее сформированными высокомолекулярными полимерными амилоидными фибриллами или филаментами в течение 12-36 ч, особенно в течение 18-30 ч, более предпочтительно в течение 24 ч при температуре от 28°С до 40°С, особенно от 32°С до 38°С, но особенно предпочтительно при 37°С.
В частности совместное инкубирование с ранее сформированным высокомолекулярными полимерными амилоидными фибриллами или филаментами проводят в течение 24 ч при температуре 37°С.
1-40
1-42
1-42
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, особенно моноклональное антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, которое предпочтительно связывается с Aβ мономерным пептидом, особенно с Аβ мономерным пептидом 1-40 и растворимым полимерным и/или олигомерным амилоидным пептидом, включая множество Aβ мономерных пептидов, но проявляет существенно более слабое связывание с Аβ мономерным пептидом 1-28, промежуточное связывание с мономерным пептидом 1-42, и практически не связывается с Аβ мономерным пептидом 17-40, и при совместном инкубировании с ранее сформированными высокомолекулярными полимерными амилоидными фибриллами или филаментами, сформированными путем агрегирования Аβ мономерных и/или олигомерных пептидов, способно дезагрегировать ранее сформированные полимерные фибриллы или филаменты, особенно по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, особенно по меньшей мере на 30%, более предпочтительно по меньшей мере на 40%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 50%, но особенно по меньшей мере на 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 70% или более.
1-40
1-42
1-42
В частности настоящее изобретение относится к антителу, особенно моноклональному антителу по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанное антитело связывается преимущественно с Аβ мономерным пептидом 1-40, а также с Аβ, олигомерными и/или полимерными пептидами, но проявляет существенно более слабое связывание с Аβ мономерным пептидом 1-28, промежуточное связывание с мономерным пептидом 1-42, и/или практически не связывается с Аβ мономерным пептидом 17-40, и при совместном инкубировании с ранее сформированными высокомолекулярными полимерными амилоидными фибриллами или филаментами, сформированными путем агрегирования Аβ мономерных и/или олигомерных пептидов, способно дезагрегировать ранее сформированные полимерные фибриллы или филаменты, особенно по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, особенно по меньшей мере на 30%, более предпочтительно по меньшей мере на 40%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 50%, но особенно по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или более.
1-40
1-42
1-42
1-42
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, особенно моноклональное антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанное антитело связывается преимущественно с Aβ мономерным пептидом, а также с Аβ, олигомерными и/или полимерными пептидами, но проявляет существенно более слабое связывание с Аβ мономерным пептидом 1-28, промежуточное связывание с мономерным пептидом 1-42 и/или практически не связывается с Аβ мономерным пептидом 17-40, и при совместном инкубировании с ранее сформированными высокомолекулярными полимерными амилоидными фибриллами или филаментами, сформированными путем агрегирования Aβ мономерного и/или олигомерного пептида в течение 24 ч при температуре 37°С,приводит к дезагрегированию ранее сформированных полимерных фибрилл или филаментов, по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, особенно по меньшей мере на 55%, особенно по меньшей мере на 60%, более предпочтительно по меньшей мере на 70% и более при соотношении мольной концентрации антитела к Аβ 1:100, и по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, особенно по меньшей мере на 60%, особенно по меньшей мере на 65%, более предпочтительно по меньшей мере на 75%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 80%, но особенно по меньшей мере на 85-90% при соотношении мольной концентрации антитела к Аβ 1.42 1:10 по определению тиофлавин-Т (Th-T) флуоресцентного анализа, особенно тиофлавин-Т (Th-T) флуоресцентного анализа, описанного ниже в примерах 1.4 и 2.4.
За счет ингибирования агрегирования амилоидного белка, а также за счет дезагрегирования амилоидогенных полимерных фибрилл или филаментов, антитела по настоящему изобретению могут предупреждать или медленно понижать формирование амилоидных бляшек, что приводят к облегчению симптомов, ассоциированных с заболеванием, к отсрочке или инверсии его прогрессирования.
Таким образом, в еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, описанные в настоящем изобретении, причем указанное антитело способно снижать общее количество Аβ в мозге субъекта, особенно млекопитающего, но особенно человека с заболеванием или состоянием, ассоциированным с повышенной концентрацией Аβ в мозге.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, описанные в настоящем изобретении, причем указанное антитело способно разрушать бляшки, таким образом понижая нагрузку бляшек в мозге субъекта, особенно млекопитающего, но особенно человека с заболеванием или состоянием, ассоциированным с повышенной концентрацией Аβ в мозге. Антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, снижает нагрузку бляшек по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, особенно по меньшей мере на 25%, более предпочтительно по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, особенно по меньшей мере на 60%, особенно по меньшей мере на 65%, более предпочтительно по меньшей мере на 75%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 80%, но особенно по меньшей мере на 85%-90%.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, описанные в настоящем изобретении, причем указанное антитело способно растворять бляшки, ассоциированные со снижением количества бляшек в мозге субъекта, особенно млекопитающего, но особенно человека с заболеванием или состоянием, ассоциированным с повышенной нагрузкой бляшек в мозге. Антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, снижает количество бляшек в мозге по меньшей мере на 10%, особенно по меньшей мере на 15%, более предпочтительно по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, особенно по меньшей мере на 60%, предпочтительно по меньшей мере на 65%, более предпочтительно по меньшей мере на 75%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 80%, но особенно по меньшей мере на 85%-90%.
Следует учитывать, что антитело по настоящему изобретению может проявлять одно, два или несколько специфических свойств, описанных в настоящем изобретении в разных комбинациях.
Например, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитела, особенно моноклональные антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанные антитела являются биспецифическими или биэффективными и способны ингибировать агрегирование, а также способны дезагрегировать, согласно описанному в настоящем изобретении, особенно вместе с высокой степенью конформационной чувствительности.
1-42
1-42
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению согласно его описанию в настоящем изобретении является биспецифичным или биэффективным и при совместном инкубированиии с Аβ мономерным и/или олигомерным пептидом, имеющим по меньшей мере 30, особенно по меньшей мере 35, более предпочтительно по меньшей мере 38, еще более предпочтительно по меньшей мере 40 аминокислотных остатков в мономерной и/или олигомерной форме, включая множество указанных мономерных пептидов, но особенно с Aβ мономерным и/или олигомерным пептидом, ингибирует агрегирование Аβ мономеров в высокомолекулярные полимерные фибриллы и, кроме того, при совместном инкубировании с ранее сформированными высокомолекулярными полимерными амилоидными фибриллами или филаментами, сформированными путем агрегирования Аβ мономерных и/или олигомерных пептидов, имеющих по меньшей мере 30, предпочтительно по меньшей мере 35, более предпочтительно по меньшей мере 38, еще более предпочтительно по меньшей мере 40 аминокислотных остатков в мономерной и/или олигомерной форме, включая множество указанных мономерных пептидов, но особенно Aβ мономерных и/или олигомерных пептидов, способно дезагрегировать ранее сформированные полимерные фибриллы или филаменты.
В частности совместное инкубирование с амилоидными мономерными и/или олигомерными пептидами и ранее сформированными высокомолекулярными полимерными амилоидными фибриллами или филаментами, соответственно, происходит при соотношении мольных концентраций до 1:1000, но особенно при соотношении мольных концентраций от 1:10 до 1:100, особенно при соотношении мольных концентраций 1:100.
Совместное инкубирование антитела по настоящему изобретению с амилоидными мономерными и/или олигомерными пептидами проводят в течение 24-60 ч, особенно в течение 30-50 ч, более предпочтительно в течение 48 ч при температуре от 28°С до 40°С, особенно от 32°С до 38°С, но особенно предпочтительно при 37°С, причем совместное инкубирование с ранее сформированным высокомолекулярными полимерными амилоидными фибриллами или филаментами проводят в течение 12-36 ч, особенно в течение 18-30 ч, более предпочтительно в течение 24 ч при температуре от 28°С до 40°С, особенно от 32°С до 38°С, более предпочтительно при 37°С.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическое или биэффективное антитело по настоящему изобретению, описанное в нем, способно дезагрегировать ранее сформированные полимерные фибриллы или филаменты по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, особенно по меньшей мере на 55%, предпочтительно по меньшей мере на 65%, более предпочтительно по меньшей мере на 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 70%, но особенно предпочтительно по меньшей мере на 75%-80%.
1-42
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено биспецифическое или биэффективное антитело, описанное в нем, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело ингибирует агрегирование Аβ мономерных и/или олигомерных пептидов, содержащих по меньшей мере 30, особенно по меньшей мере 35, более предпочтительно по меньшей мере 38, еще более предпочтительно по меньшей мере 40 аминокислотных остатков в мономерной и/или олигомерной форме, включая множество указанных мономерных пептидов, но особенно Аβ мономерных и/или олигомерных пептидов, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, особенно по меньшей мере на 65%, более предпочтительно по меньшей мере на 75%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 80%, но особенно предпочтительно по меньшей мере на 85%-90%, или более по сравнению с соответствующими амилоидными пептидными мономерами, инкубированными в буфере (контроль).
1-40
1-42
1-28
17-40
1-38
1-39
1-41
1-42
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено биспецифическое или биэффективное антитело, описанное в нем, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело проявляет высокую специфичность к Аβ мономерным пептидам, особенно к Аβ мономерному пептиду 1-40 и к растворимому полимерному и/или олигомерному амилоидному пептиду, включая множество Аβ мономерных пептидов, но практически не показывает или показывает только от слабой до умеренной перекрестную реактивность к амилоидному пептидному мономеру, выбранному из группы, состоящей из Аβ, Аβ, Аβ, Аβ, Aβ и/или Aβ мономерных пептидов.
1-40
1-28
17-40
1-38
1-39
1-41
1-42
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, описанное в настоящем изобретении, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело до 1000 раз, особенно от 50 до 100 раз, более предпочтительно от 80 до 100 раз, но особенно в 100 раз более чувствительно к амилоидному пептиду Аβ по сравнению с Aβ, Аβ, Аβ, Аβ, Аβ, Аβ и способно ингибировать, in vitro и in vivo, агрегирование амилоидогенных мономерных и/или олигомерных пептидов.
1-40
1-42
1-42
1-42
1-42
1-42
1-42
1-42
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено биспецифическое или биэффективное антитело, описанное в нем, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело предпочтительно связывается с Aβ мономерным пептидом, а также с Аβ, олигомерными и/или полимерными пептидами, но проявляет существенно более слабое связывание с Аβ мономерным пептидом 1-28 и/или промежуточное связывание с мономерным пептидом 1-42 и/или практически не связывается с Аβ мономерным пептидом 17-40 и, при совместном инкубировании с Аβ мономерным и/или олигомерным пептидом в течение 24 ч при температуре 37°С, ингибирует агрегирование Аβ мономеров и/или олигомеров в высокомолекулярные полимерные фибриллы по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, особенно по меньшей мере на 55%, особенно по меньшей мере на 65%, более предпочтительно по меньшей мере на 70%, при соотношении мольных концентраций антитела к Aβ 1:100, и по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, особенно по меньшей мере на 60%, особенно по меньшей мере на 65%, более предпочтительно по меньшей мере на 75%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 80%, но особенно по меньшей мере на 85%-90% при соотношении мольных концентраций антитела к Аβ 1:10, и при совместном инкубировании с ранее сформированными высокомолекулярными полимерными амилоидными фибриллами или филаментами, сформированными путем агрегирования Аβ мономерного и/или олигомерного пептида в течение 24 ч при температуре 37°С, приводит к дезагрегированию ранее сформированных полимерных фибрилл или филаментов по меньшей мере на 10% при соотношении мольных концентраций антитела к Аβ 1:100 и по меньшей мере на 20% при соотношении мольных концентраций антитела к Аβ 1:10 по результатам анализа методом тиофлавин Т (Th-T) флуоресценции, особенно методом тиофлавин Т (Th-T) флуоресценции, описанным ниже в примерах 1.4 и 2.4.
1-40
1-42
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу, описанному в нем, особенно моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело обладает высокой связывающей чувствительностью к амилоидному пептиду Аβ и способно обнаружить Аβ растворимые олигомерные и/или полимерные пептиды в концентрации до 0,01 мкг, но особенно в диапазоне концентраций 0,5-0,01 мкг, более предпочтительно 0,1-0,01 мкг, но особенно в концентрации 0,01 мкг.
1-15
В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, описанное в настоящем изобретении, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело повышается против надмолекулярной антигенной конструкции, включающей антигенный пептид, соответствующий аминокислотной последовательности β-амилоидного пептида, Aβ, модифицированного гидрофобными частями молекулы в виде пальмитиновой кислоты, причем указанные гидрофобные части молекул ковалентно присоединены к каждому концу через аминокислоту, например, лизин или какую-либо другую соответствующую аминокислоту или аминокислотный аналог, который может выступить в качестве линкерной молекулы.
Антитело по настоящему изобретению, описанное в настоящем изобретении, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, распознает и связывается с конформационным эпитопом.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к вариабельной области легкой цепи с аминокислотной последовательностью, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%) или 99% идентична последовательности, обозначенной SEQ ID NO: 7, или ее функциональной части, включающей по меньшей мере одну, по меньшей мере две, более предпочтительно по меньшей мере три области CDR легкой цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs: 9-11, но особенно все области CDR, погруженные в их природные каркасные участки.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к вариабельной области тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности, обозначенной SEQ ID NO: 8, или ее функциональной части, включающей по меньшей мере одну, по меньшей мере две, более предпочтительно по меньшей мере три области CDR легкой цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs: 12-14, но особенно все области CDR, погруженные в их природные каркасные участки.
Кроме того, настоящее изобретение относится к антителу, особенно моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части по настоящему изобретению, описанные в настоящем изобретении, причем указанное антитело включает вариабельный домен легкой цепи с аминокислотной последовательностью, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности, обозначенной SEQ ID NO: 7, или ее функциональной части, включающей по меньшей мере одну, по меньшей мере две, более предпочтительно по меньшей мере три области CDR легкой цепи с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 9-11, но особенно все области CDR, погруженные в их природные каркасные участки.
Кроме того, настоящее изобретение относится к антителу, особенно моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части по настоящему изобретению, описанные в настоящем изобретении, причем указанное антитело включает вариабельный домен тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%о или 99% идентична последовательности, обозначенной SEQ ID NO: 8, или ее функциональной части, включающей по меньшей мере одну, по меньшей мере две, более предпочтительно по меньшей мере три области CDR тяжелой цепи с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 12-14, но особенно все области CDR, погруженные в их природные каркасные участки.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, особенно моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части по настоящему изобретению, описанные в настоящем изобретении, причем указанное антитело включает вариабельный домен легкой цепи и тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательностям, обозначенным SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, или их функциональной части, включающей по меньшей мере одну, по меньшей мере две, более предпочтительно по меньшей мере три области CDR легкой цепи с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 9-14.
Настоящее изобретение также относится к моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело включает полипептидную последовательность SEQ ID NO: 7 и/или - SEQ ID NO: 8. Настоящее изобретение также относится к моноклональному антителу ACI-24-Ab-3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 7-8.
Настоящее изобретение также относится к антителу, последовательность которого была изменена внедрением по меньшей мере одной, особенно по меньшей мере двух, более предпочтительно по меньшей мере трех или более консервативных замещений в последовательностях SEQ ID NO: 7-8 таким образом, что антитело в существенной степени поддерживает свою полную функциональность.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к фрагменту пептида, включающему область CDR1 легкой цепи, приведенной в виде SEQ ID NO: 9, и/или CDR2 легкой цепи, приведенной в виде SEQ ID NO:10, и/или CDR3 легкой цепи, приведенной в виде SEQ ID NO:11.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к фрагменту пептида, включающему область CDR1 тяжелой цепи, приведенной в виде SEQ ID NO: 12, и/или CDR2 тяжелой цепи, приведенной в виде SEQ ID N0:13, и/или CDR3 тяжелой цепи, приведенной в виде SEQ ID NO:14.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к области CDR1 легкой цепи, представленной в виде SEQ ID NO: 9.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к области CDR2 легкой цепи, представленной в виде SEQ ID NO: 10.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к области CDR3 легкой цепи, представленной в виде SEQ ID NO: 11.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к области CDR1 тяжелой цепи, представленной в виде SEQ ID NO: 12.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к области CDR2 тяжелой цепи, представленной в виде SEQ ID NO: 13.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к области CDR3 тяжелой цепи, представленной в виде SEQ ID NO: 14.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 7 или ее функциональной части, включающей по меньшей мере одну, особенно по меньшей мере две, более предпочтительно по меньшей мере три
области CDR легкой цепи с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 9-11, но особенно все области CDR, погруженные в их природные каркасные участки.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 8 или ее функциональной части, включающей по меньшей мере одну, особенно по меньшей мере две, более предпочтительно по меньшей мере три области CDR тяжелой цепи с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 12-14, но особенно все области CDR, погруженные в их природные каркасные участки.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части по настоящему изобретению, описанные в нем, причем указанное антитело включает вариабельный домен легкой цепи с аминокислотной последовательностью, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 7 или ее функциональной части, включающей по меньшей мере одну, особенно по меньшей мере две, более предпочтительно по меньшей мере три области CDR легкой цепи с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 9-11, но особенно все области CDR, погруженные в их природные каркасные участки.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части по настоящему изобретению, описанные в нем, причем указанное антитело включает вариабельный домен тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 8 или ее функциональной части, включающей по меньшей мере одну, особенно по меньшей мере две, более предпочтительно по меньшей мере три области CDR тяжелой цепи с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 12-14, но особенно все области CDR, погруженные в их природные каркасные участки.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части по настоящему изобретению, описанные в нем, причем указанное антитело включает вариабельный домен легкой цепи и тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательностям SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8 или их функциональным частям, включающим области CDR легкой цепи и тяжелой цепи с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 9-14.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело по настоящему изобретению, согласно описанию настоящего изобретения, но особенно нуклеотидную последователь ость, кодирующую моноклональное антитело с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 7-8. В частности такими полинуклеотидными последовательностями являются SEQ ID NO: 15-16.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен полинуклеотид, который гибридизируется в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, кодирующей моноклональное с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 7-8. В частности предусмотрен полинуклеотид, который гибридизируется в жестких условиях с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 15-16.
В частности по положению 52 последовательности SEQ ID NO: 8 может быть какая-либо аминокислота. В другом варианте осуществления настоящего изобретения по положению 52 может быть остаток тирозина, серина или цистеина. Более предпочтительно по положению 52 может быть остаток цистеина.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело обладает отличительными свойствами антитела, вырабатываемого линией гибридомных клеток EJ1A9, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2844.
В частности настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, вырабатываемые линией гибридомных клеток EJ1A9, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2844.
1-15
В частности настоящее изобретение также относится к эпитопу Аβ, который связывается с моноклональным антителом, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело повышается против надмолекулярной антигенной конструкции, включающей антигенный пептид, соответствующий аминокислотной последовательности β-амилоидного пептида, Аβ, модифицированного гидрофобными частями молекулы в виде пальмитиновой кислоты, причем указанные гидрофобные части молекулы ковалентно соединены с каждым концом через аминокислоту, например, лизин или какую-либо другую соответствующую аминокислоту или аналог аминокислоты, способный выступить в качестве молекулы-линкера. Настоящее изобретение также относится к эпитопу Аβ, который связывается с моноклональным антителом ACI-24-Аl-3.
1-42
1-42
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, описанному в настоящем изобретении, особенно моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело связывается с Аβ мономерными пептидами, состоящими по меньшей мере из 10, особенно по меньшей мере из 20, более предпочтительно по меньшей мере из 30, еще более предпочтительно по меньшей мере из 40 аминокислотных остатков, и/или с растворимыми полимерными амилоидными пептидами, включая множество указанных амилоидных мономерных пептидов, и/или с амилоидными волокнами и фибриллами, включая множество указанных полимерных пептидов, но особенно с Аβ мономерным пептидом и полимерными растворимыми Аβ пептидами, включая множество Aβ мономерных пептидов и Аβ фибрилл или волокон, включая множество указанных полимерных пептидов, и практически не связывается с Аβ мономерными пептидами, состоящими из 8 или менее аминокислотных остатков.
1-42
1-42
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, описанному в настоящем изобретении, особенно моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело связывается с Аβ мономерными пептидами, состоящими по меньшей мере из 30, еще более предпочтительно по меньшей мере из 40 аминокислотных остатков, и/или с растворимыми полимерными амилоидными пептидами, включая множество указанных амилоидных мономерных пептидов, и/или амилоидными волокнами или фибриллами, включая множество указанных полимерных пептидов, но особенно с Aβ мономерным пептидом и полимерными растворимыми Аβ пептидами, включая множество Аβ мономерных пептидов и Аβ фибрилл или волокон, включая множество указанных полимерных пептидов, но практически не связывается с Аβ мономерным пептидом 17-40.
1-42
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, описанное в настоящем изобретении, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело связывается с Аβ мономерным пептидом 1.42, и полимерными растворимыми Аβ пептидами, включая множество Aβ мономерных пептидов и Аβ фибрилл или волокон, включая множество указанных полимерных пептидов, но существенно слабее связывается с Аβ мономерным пептидом 1-28.
1.42
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, описанное в настоящем изобретении, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело связывается с Аβ мономерным пептидом 1-42, и полимерными растворимыми Аβ пептидами, включая множество Аβ мономерных пептидов и Аβ фибрилл или волокон, включая множество указанных полимерных пептидов, но существенно слабее связывается с Аβ мономерным пептидом 1-28 и практически не связывается с Аβ мономерным пептидом 17-40.
1-42
1-42
1-42
В частности антитело, особенно моноклональное антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, связывается с Аβ мономерным пептидом и полимерными растворимыми амилоидными Аβ пептидами, включая множество Аβ мономерных пептидов и полимерных растворимых Аβ пептидов, включая множество Аβ мономерных пептидов и Аβ фибрилл или волокон, включая множество указанных полимерных пептидов, но практически не связывается с Аβ мономерным пептидом 1-28 и/или практически не связывается с Аβ мономерным пептидом 17-40, и при совместном инкубировании с Aβ мономерным и/или олигомерным пептидом, ингибирует агрегирование Аβ мономеров в высокомолекулярные полимерные фибриллы.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, особенно моноклональному антителу, описанному в настоящем изобретении, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, которое ингибирует агрегирование Аβ мономеров и олигомеров в высокомолекулярные полимерные фибриллы по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, особенно по меньшей мере на 40%, особенно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 70%, но особенно предпочтительно по меньшей мере на 80%-90% или более по сравнению с соответствующими амилоидными пептидными мономерами, инкубированными в буфере (контроль).
1-42
1-42
1-42
1-42
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, особенно моноклональное антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело связывается с АрМ2 мономерным пептидом и полимерными растворимыми Аβ пептидами, включая множество Аβ мономерных пептидов и Аβ фибрилл или волокон, включая множество указанных полимерных пептидов, но существенно слабее связывается с Аβ мономерным пептидом 1-28 и/или практически не связывается с Аβ мономерным пептидом 17-40, и при совместном инкубировании с Aβ мономерным и/или олигомерным пептидом в течение 24 ч при температуре 37°С ингибирует агрегирование Аβ мономеров в высокомолекулярные полимерные фибриллы по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, особенно по меньшей мере на 40%, особенно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 70% при соотношении мольных концентраций антитела к Аβ 1:100, и по меньшей мере на 50%, особенно по меньшей мере на 60%, более предпочтительно по меньшей мере на 65%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 70% при соотношении мольных концентраций антитела к Аβ 1:10 по результатам анализа методом тиофлавин Т (Th-T) флуоресценции, особенно методом тиофлавин Т (Th-T) флуоресценции, описанным ниже в примерах 1.4 и 2.4.
1-42
1-42
1-42
В частности по настоящее изобретение относится к антителу, особенно моноклональному антителу по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело связывается с Аβ мономерным пептидом и полимерными растворимыми Аβ пептидами, включая множество Аβ мономерных пептидов и Аβ фибрилл или волокон, включая множество указанных полимерных пептидов, но существенно слабее связывается с Аβ мономерным пептидом 1-28 и/или практически не связывается с Аβ мономерным пептидом 17-40, и при совместном инкубировании с ранее сформированными высокомолекулярными полимерными амилоидными фибриллами или филаментами, сформированными путем агрегирования Аβ мономерных и/или олигомерных пептидов, способно дезагрегировать ранее сформированные полимерные фибриллы или филаменты, особенно по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, предпочтительно по меньшей мере на 30%, более предпочтительно по меньшей мере на 40%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 50%, но особенно по меньшей мере на 60% или более.
1-42
1-42
1-42
1-42
1-42
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, особенно моноклональное антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело связывается с Аβ мономерным пептидом и полимерными растворимыми Аβ пептидами, включая множество Аβ мономерных пептидов и Аβ фибрилл или волокон, включая множество указанных полимерных пептидов, но существенно слабее связывается с Аβ мономерным пептидом 1-28 и/или практически не связывается с Аβ мономерным пептидом 17-40, и при совместном инкубировании с ранее сформированными высокомолекулярными полимерными амилоидными фибриллами или филаментами, сформированными путем агрегирования Aβ мономерного и/или олигомерного пептида в течение 24 ч при температуре 37°С, приводит к дезагрегированию ранее сформированных полимерных фибрилл или филаментов по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, особенно по меньшей мере на 40%, особенно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 70%, при соотношении мольных концентраций антитела к Аβ 1:100, и по меньшей мере на 40%, особенно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 70% при соотношении мольных концентраций антитела к Aβ 1:10 по результатам анализа методом тиофлавин Т (Th-T) флуоресценции, особенно методом тиофлавин Т (Th-T) флуоресценции, описанным ниже в примерах 1.4 и 2.4.
За счет ингибирования агрегирования амилоидного белка и/или за счет дезагрегирования амилоидогенных полимерных фибрилл или филаментов антитела по настоящему изобретению способны предупреждать или медленно снижать формирование амилоидных бляшек, которые приводят к облегчению симптомов, ассоциированных с заболеванием, и к отсрочке или отмене его прогрессирования.
Таким образом, это еще один вариант осуществления настоящего изобретения для получения антитела, особенно моноклонального антитела, в том числе какого-либо функционально эквивалентного антитела или его функциональных частей, описанных в настоящем изобретении, причем антитело способно понизить общее количество Аβ в мозге субъекта, особенно млекопитающего, особенно человека с заболеванием или состоянием, ассоциированным с повышенной концентрации Аβ в мозге.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, особенно моноклональное антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, описанные в настоящем изобретении, причем антитело способно разрушать бляшки, тем самым, понижая нагрузку бляшек в мозге субъекта, особенно млекопитающего, но особенно человека с заболеванием или состоянием, ассоциированным с повышенной нагрузкой бляшек в мозге. Антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, снижает нагрузку бляшек в мозге по меньшей мере на 20%, особенно по меньшей мере на 25%, более предпочтительно по меньшей мере на 30%, еще более предпочтительно более чем на 30%.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения описано антитело, особенно моноклональное антитело, включая функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, описанные в настоящем изобретении, которое способно растворять бляшки, ассоциированы с уменьшением количества бляшек в мозге субъекта, особенно млекопитающего, но особенно человека с заболеванием или состоянием, ассоциированным с повышенной нагрузкой бляшек в мозге. Антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, снижает количество бляшек в мозге по меньшей мере на 10%, особенно по меньшей мере на 15%), более предпочтительно по меньшей мере на 20%.
Следует учитывать, что антитело по настоящему изобретению может проявлять одно, два или несколько специфических свойств, описанных в настоящем изобретении в различных комбинациях.
Например, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитела, но особенно моноклональные антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитела являются биспецифичными или биэффективными, поскольку они проявляют и способность к ингибированию агрегирования, и способность к дезагрегированию, описанные в настоящем изобретении, особенно соединенные с высокой степенью конформационной чувствительности.
1-42
1-42
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению согласно его описанию в настоящем изобретении является биспецифичным или биэффективным и при совместном инкубировании с Аβ мономерным и/или олигомерным пептидом, имеющим по меньшей мере 30, особенно по меньшей мере 35, более предпочтительно по меньшей мере 38, еще более предпочтительно по меньшей мере 40 аминокислотных остатков, но особенно с Aβ мономерным и/или олигомерным пептидом, ингибирует агрегирование Аβ мономеров в высокомолекулярные полимерные фибриллы и, кроме того, при совместном инкубировании с ранее сформированными высокомолекулярными полимерными амилоидными фибриллами или филаментами, сформированными путем агрегирования Аβ мономерных и/или олигомерных пептидов, имеющих по меньшей мере 30, предпочтительно по меньшей мере 35, более предпочтительно по меньшей мере 38, еще более предпочтительно по меньшей мере 40 аминокислотных остатков и особенно Aβ мономерных и/или олигомерных пептидов, способно дезагрегировать ранее сформированные полимерные фибриллы или филаменты.
В частности совместное инкубирование с амилоидными мономерными и/или олигомерными пептидами и ранее сформированными высокополимерными амилоидными фибриллами или филаментами, соответственно, при соотношении мольных концентраций до 1:1000, но особенно при соотношении мольных концентраций от 1:10 до 1:1000, особенно при соотношении мольных концентраций 1:100.
Совместное инкубирование антитела по настоящему изобретению с амилоидными мономерными и/или олигомерными пептидами проводят в течение 24-60 ч, особенно в течение 30-50 ч, более предпочтительно в течение 48 ч при температуре от 28°С до 40°С, особенно от 32°С до 38°С, но особенно предпочтительно при 37°С, причем совместное инкубирование с ранее сформированным высокомолекулярными полимерными амилоидными фибриллами или филаментами проводят в течение 12-36 ч, особенно в течение 18-30 ч, более предпочтительно в течение 24 ч при температуре от 28°С до 40°С, особенно от 32°С до 38°С, более предпочтительно при 37°С.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическое или биэффективное антитело по настоящему изобретению, описанное в настоящем изобретении, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, способно дезагрегировать ранее сформированные полимерные фибриллы или филаменты по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, особенно по меньшей мере на 40%, особенно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 70%.
1-42
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическое или биэффективное антитело по настоящему изобретению, описанное в настоящем изобретении, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, способно ингибировать агрегирование Аβ мономерных и/или олигомерных пептидов, состоящих по меньшей мере из 30, особенно по меньшей мере из 35, более предпочтительно по меньшей мере из 38, еще более предпочтительно по меньшей мере из 40 аминокислотных остатков, но особенно Aβ мономерных и/или олигомерных пептидов по меньшей мере на 30%, особенно по меньшей мере на 40%, особенно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 70%, но особенно по меньшей мере на 80-90%) или более по сравнению с соответствующими амилоидными пептидными мономерами, инкубированными в буфере (контроль).
1-42
1-28
17-40
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено биспецифическое или биэффективное антитело, описанное в настоящем изобретении, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, которое проявляет высокую специфичность в отношении Aβ мономерных пептидов, но практически не проявляет или проявляет минимальную перекрестную реактивность в отношении мономера амилоидного пептида, выбранного из группы, состоящей из Aβ, и Aβ мономерных пептидов.
1-42
1-28
17-40
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, описанному в настоящем изобретении, особенно к моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело до 1000 раз, особенно в 50-1000 раз, более предпочтительно в 80-100 раз, но особенно в 100 раз более чувствительно к амилоидному пептиду Аβ по сравнению с Аβ, и/или Аβ, и способно ингибировать in vitro и in vivo агрегирование амилоидогенных мономерных и/или олигомерных пептидов и/или дезагрегировать ранее сформированные полимерные фибриллы или филаменты.
1-42
1-42
1-42
1-42
1-42
1-42
1-42
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено биспецифическое или биэффективное антитело, описанное в настоящем изобретении,, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, которое связывается с Аβ мономерным пептидом и полимерными растворимыми Аβ пептидами, включая множество указанных полимерных пептидов, но существенно слабее связывается с Аβ мономерным пептидом 1-28 и/или практически не связывается с Аβ мономерным пептидом 17-40, и при совместном инкубировании с Аβ мономерным и/или олигомерным пептидом в течение 24 ч при температуре 37°С ингибирует агрегирование Аβ мономеров в высокомолекулярные полимерные фибриллы по меньшей мере на 30% при соотношении мольных концентраций антитела к Аβ 1:100, и по меньшей мере на 65% при соотношении мольных концентраций антитела к Аβ 1:10 и при совместном инкубировании с ранее сформированными высокомолекулярными полимерными амилоидными фибриллами или филаментами, сформированными агрегированием Аβ мономерного и/или олигомерного пептида в течение 24 ч при температуре 37°С, приводит к дезагрегированию ранее сформированных полимерных фибрилл или филаментов по меньшей мере на 20% при соотношении мольных концентраций антитела к Аβ 1:100 и по меньшей мере на 50% при соотношении мольных концентраций антитела к Аβ 1:10 по результатам анализа методом тиофлавин Т (Th-T) флуоресценции, особенно методом тиофлавин Т (Th-T) флуоресценции, описанным ниже в примерах 1.4 и 2.4.
1-42
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу, описанному в нем, особенно моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело обладает высокой связывающей чувствительностью к амилоидному пептиду АрМ2 и способно обнаружить Аβ волокна в концентрации до 0,01 мкг, но особенно в диапазоне концентраций 0,5-0,01 мкг, более предпочтительно 0,1-0,01 мкг, но особенно в концентрации 0,01 мкг.
22-35
29-40
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, описанное в нем, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанное антитело повысилось против надмолекулярной антигенной конструкции, включающей антигенный пептид, соответствующий аминокислотной последовательности β-амилоидного пептида Аβ и Аβ, соответственно, модифицированный гидрофильной частью молекулы, например, полиэтиленгликолем (ПЭГ), причем указанная гидрофильная часть молекулы ковалентно связана с каждым концом через аминокислоту, например, лизин или какую-либо другую соответствующую аминокислоту или аминокислотный аналог, который может выступать в качестве линкерной молекулы.
Антитело по настоящему изобретению, описанное в настоящем изобретении, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, распознает и связывается с конформационным эпитопом.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к вариабельной области легкой цепи с аминокислотной последовательностью, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентична последовательностям, обозначенным SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 19, соответственно, или их функциональной части, включающей по меньшей мере одну, по меньшей мере две, более предпочтительно по меньшей мере три области CDR легкой цепи, но особенно все области CDR, погруженные в их природные каркасные участки.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к вариабельной области тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%о идентична последовательностям, обозначенным SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 20, соответственно, или их функциональной части, включающей по меньшей мере одну, по меньшей мере две, более предпочтительно по меньшей мере три области CDR, но особенно все области CDR, погруженные в их природные каркасные участки.
Кроме того, настоящее изобретение относится к антителу, особенно моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части по настоящему изобретению, описанные в настоящем изобретении, причем указанное антитело включает вариабельный домен легкой цепи с аминокислотной последовательностью, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательностям, обозначенным SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 19, соответственно, или их функциональной части, включающей по меньшей мере одну, по меньшей мере две, более предпочтительно по меньшей мере три области CDR легкой цепи, но особенно все области CDR, погруженные в их природные каркасные участки.
Кроме того, настоящее изобретение относится к антителу, особенно моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части по настоящему изобретению, описанные в настоящем изобретении, причем указанное антитело включает вариабельный домен тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%) или 99% идентична последовательностям, обозначенным SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 20, соответственно, или их функциональной части, включающей по меньшей мере одну, особенно по меньшей мере две, более предпочтительно по меньшей мере три области CDR, погруженные в их природные каркасные участки.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, особенно моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части по настоящему изобретению, описанные в настоящем изобретении, причем указанное антитело включает вариабельный домен легкой цепи и тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательностям, обозначенным SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 20, или их функциональной части, включающей часть или все CDR тяжелой цепи и легкой цепи.
Настоящее изобретение также относится к моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело включает полипептидную последовательность SEQ ID NO: 17, и SEQ ID NO: 19, и/или SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 20. Настоящее изобретение также относится к моноклональному антителу АС1-11-Ab-9 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 17-18 и ACI-12-Ab-ll с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 19-20.
Настоящее изобретение также относится к антителу, последовательность которого была изменена внедрением по меньшей мере одной, особенно по меньшей мере двух, более предпочтительно по меньшей мере трех или более консервативных замещений в последовательностях SEQ ID NO: 17-18 и SEQ ID NO: 19-20, соответственно, таким образом, что антитело в существенной степени поддерживает свою полную функциональность.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к фрагменту пептида, включающему область CDR1 легкой цепи, приведенной в виде SEQ ID NO: 21, и/или CDR2 легкой цепи, приведенной в виде SEQ ID NO: 22, и/или CDR3 легкой цепи, приведенной в виде SEQ ID NO: 23.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к фрагменту пептида, включающему область CDR1 тяжелой цепи, приведенной в виде SEQ ID NO: 24, и/или CDR2 тяжелой цепи, приведенной в виде SEQ ID NO: 25, и/или CDR3 тяжелой цепи, приведенной в виде SEQ ID NO: 26.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к области CDR1 легкой цепи, представленной в виде SEQ ID NO: 21.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к области CDR2 легкой цепи, представленной в виде SEQ ID NO: 22.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к области CDR3 легкой цепи, представленной в виде SEQ ID NO: 23.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к области CDR1 тяжелой цепи, представленной в виде SEQ ID NO: 24.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к области CDR2 тяжелой цепи, представленной в виде SEQ ID NO: 25.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к области CDR3 тяжелой цепи, представленной в виде SEQ ID NO: 26.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательностям SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 19, соответственно, или ее функциональной части, включающей по меньшей мере одну, особенно по меньшей мере две, более предпочтительно по меньшей мере три области CDR легкой цепи с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 21-23, но особенно все области CDR, погруженные в их природные каркасные участки.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательностям SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 20, соответственно, или их функциональной части, включающей по меньшей мере одну, особенно по меньшей мере две, более предпочтительно по меньшей мере три области CDR тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 24-26, но особенно все области CDR, погруженные в их природные каркасные участки.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части по настоящему изобретению, описанные в нем, причем указанное антитело включает вариабельный домен легкой цепи с аминокислотной последовательностью, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 19, соответственно, или их функциональной части, включающей по меньшей мере одну, особенно по меньшей мере две, более предпочтительно по меньшей мере три области CDR легкой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 21-23, но особенно все области CDR, погруженные в их природные каркасные участки.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части по настоящему изобретению, описанные в нем, причем указанное антитело включает вариабельный домен тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательностям SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 20, соответственно, или ее функциональной части, включающей по меньшей мере одну, особенно по меньшей мере две, более предпочтительно по меньшей мере три области CDR тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 24-26, но особенно все области CDR, погруженные в их природные каркасные участки.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части по настоящему изобретению, описанные в нем, причем указанное антитело включает вариабельный домен легкой цепи и тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательностям SEQ ID NO: 17, и SEQ ID NO: 19, и SEQ ID NO: 18, и SEQ ID NO: 20, соответственно, или их функциональным частям, включающим области CDR легкой цепи и тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 21-26.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело по настоящему изобретению, согласно описанию настоящего изобретения, но особенно нуклеотидную последователь ость, кодирующую моноклональное антитело с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 17-18 или моноклональное антитело с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 19-20. В частности полинуклеотидами, кодирующими SEQ ID NO: 17-18 и SEQ ID NO: 19-20, являются SEQ ID NO: 27-28 и SEQ ID NO: 29-30, соответственно.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен полинуклеотид, который гибридизируется в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, кодирующей моноклональное антитело с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 17-18 или моноклональное антитело с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 19-20. В частности предусмотрен полинуклеотид, который гибридизируется в жестких условиях с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 27-28 или SEQ ID NO: 29-30. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело обладает специфическими свойствами антитела, вырабатываемого линией клеток гибридомы FG1F9E4, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2845.
В частности настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, вырабатываемые линией гибридомных клеток FG1F9E4, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2845.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело обладает специфическими свойствами антитела, вырабатываемого линией гибридомных клеток FK2A6A6, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2846.
В частности настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, вырабатываемые линией гибридомных клеток FK2A6A6, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2846.
22-35
29-40
В частности настоящее изобретение также относится к эпитопу Аβ, который связывается с моноклональным антителом, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело повышается против надмолекулярной антигенной конструкции, включающей антигенный пептид, соответствующий аминокислотной последовательности β-амилоидного пептида, Аβ и Аβ соответственно, модифицированного гидрофильными частями молекулы, например, полиэтиленгликолем (ПЭГ), причем указанная гидрофильная часть молекулы ковалентно соединена с каждым концом через аминокислоту, например, лизин или какую-либо другую соответствующую аминокислоту или аналог аминокислоты, способный выступить в качестве молекулы-линкера. Настоящее изобретение также относится к эпитопу Аβ, который связывается с моноклональным антителом ACI-11-Ab-9. Настоящее изобретение также относится к эпитопу Ар, который связывается с моноклональным антителом ACI-12-Ab-11. В одном из объектов антитело по настоящему изобретению, описанное в нем, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, способно снижать общее количество растворимого Аβ в мозге субъекта, особенно млекопитающего, особенно человека с заболеванием или состоянием, ассоциированным с повышенными концентрациями растворимого Аβ в мозге.
Другим объектом настоящего изобретения является антитело, описанное в настоящем изобретении, которое способно разрушать бляшки, тем самым, снижая нагрузку бляшек в мозге субъекта, особенно млекопитающего, особенно человека с заболеванием или состоянием, ассоциированным с повышенной нагрузкой бляшек в мозге.
Другим объектом настоящего изобретения является антитело, которое согласно описанию в настоящем изобретении способно растворять бляшки, ассоциированное с уменьшением числа бляшек в мозге субъекта, особенно млекопитающего, особенно человека с заболеванием или состоянием, ассоциированным с повышенной нагрузкой бляшек в мозге.
Другими объектами настоящего изобретения являются способы и композиции, включая антитело по настоящему изобретению, описанное в нем, для предупреждения, и/или терапевтического лечения, и/или облегчения проявлений заболеваний или расстройств у субъекта, нуждающегося в этом, вызванных или ассоциированных с амилоидными или амилоидоподобными белками, путем пассивной иммунизации субъекта, включая млекопитающее, в том числе человека, антителом по настоящему изобретению, описанным в настоящем изобретении выше. К таким заболеваниям и расстройствам относятся, но ими не ограничиваются, амилоидозы - группа заболеваний и расстройств, ассоциированных с формированием амилоидных бляшек, включая вторичный амилоидоз и возрастной амилоидоз, включая, но ими не ограничиваясь, нейрологические расстройства, например, болезнь Альцгеймера (БА), заболевания или состояния, отличающиеся утратой когнитивного объема памяти, например, умеренное когнитивное нарушение (УКН), болезнь диффузных поражений телец Леви, синдром Дауна, наследственное цереброспинальное кровоизлияние с амилоидозом (типа Dutch), комплекс паркинсонизм-деменция о. Гуам, а также другие заболевания, которые основаны или связаны с белками амилоидного типа, например, прогрессирующий супрануклеарный паралич, рассеянный склероз, болезнь Крейсфельда-Якоба, болезнь Паркинсона, слабоумие, связанное со СПИД, амиотропный латеральный склероз (amyotropic lateral sclerosis - ALS), миозит с включенными тельцами (МВТ), диабет взрослых, старческий кардиальный амилоидоз, эндокринные опухоли и другие заболевания, включая глазные заболевания, ассоциированные с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, ассоциированных со связанными с амилоидом бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов. Указанные патологические нарушения могут наблюдаться, например, в разных тканях глаза, например, в зрительной зоне коры мозга, что приводит к кортикальной зрительной недостаточности; в передней камере глаза и зрительном нерве, приводящем к глаукоме; в хрусталике, приводящие к катаракте из-за отложения бета-амилоида; в стекловидном теле, приводящие к зрительному амилоидозу; в сетчатке, приводящие к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна.
В одном из объектов настоящего изобретения моноклональным антителом в указанных способах является антитело ACI-24-Ab-3 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 7-8 или его функциональные части, описанные в настоящем изобретении.
В другом объекте настоящего изобретения моноклональным антителом в указанных способах является антитело АСI-12-Ab-9 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 17-18 или антитело ACI-12-Ab-1l с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 9-10, соответственно, или их функциональные части, описанные в настоящем изобретении.
Настоящее изобретение также относится к терапевтической композиции, включающей антитело, согласно описанию настоящего изобретения, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, в терапевтически эффективном количестве.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция также включает фармацевтически приемлемый носитель, особенно в терапевтически эффективном количестве.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрена композиция, описанная в настоящем изобретении для применения в лечении заболеваний или расстройств, которые вызваны или ассоциированы с амилоидными или амилоидоподобными белками, включая, но ими не ограничиваясь, амилоидозы, опухоли и другие заболевания, включая глазные заболевания, ассоциированные с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированные со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов. Указанные патологические нарушения могут быть в разных тканях глаза, например, в зрительной зоне коры мозга, приводящие к кортикальной зрительной недостаточности; в передней камере глаза и зрительном нерве, приводящие к глаукоме; в хрусталике, приводящие к катаракте из-за отложения бета-амилоида; в стекловидном теле, приводящие к зрительному амилоидозу; в сетчатке, приводящие к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна.
В одном из объектов настоящего изобретения используемым антителом является антитело ACI-24-Ab-3 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 7-8 или его функциональные части, описанные в настоящем изобретении.
В другом объекте настоящего изобретения используемым моноклональным антителом является моноклональное антитело ACI-11Ab-9 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 17-18 и моноклональное антитело АСI-12-Ab-11 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 19-20, соответственно, или их функциональные части, описанные в настоящем изобретении.
Антитело по настоящему изобретению, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, может вводиться в комбинации с другими биологически действующими веществами или другими терапевтическими процедурами для лечения заболеваний. Другие биологически действующие вещества могут быть частью той же композиции, которая уже включает антитело по настоящему изобретению, в форме смеси, в которой антитело и другое биологически действующее вещество перемешаны или с тем же фармацевтически приемлемым растворителем и/или носителем или антителом и другим биологически действующим веществом, может быть предусмотрено раздельно в качестве части раздельной композиции, которая может быть предоставлена отдельно или вместе в форме набора частей.
Антитело, особенно моноклональное антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, может вводиться субъекту, нуждающемуся в этом, одновременно с другим биологически действующим веществом или веществами, периодически или последовательно. Например, моноклональное антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, может вводиться одновременно с первым дополнительным биологически действующим веществом или последовательно после или перед введением антитела.
в комбинации с другими биологически действующими веществами или другими терапевтическими процедурами для лечения заболеваний. Другие биологически действующие вещества могут быть частью той же композиции, которая уже включает антитело по настоящему изобретению, в форме смеси, в которой антитело и другое биологически действующее вещество перемешаны или с тем же фармацевтически приемлемым растворителем и/или носителем или антителом и другим биологически действующим веществом, может быть предусмотрено раздельно в качестве части раздельной композиции, которая может быть предоставлена отдельно или вместе в форме набора частей. Если выбрана схема применения, в которой вводят более одного дополнительного биологически действующего вещества вместе по меньшей мере одним антителом по настоящему изобретению, соединения или вещества могут частично вводиться одновременно, частично последовательно в разных комбинациях.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к композиции, включающей антитело, описанное в настоящем изобретении, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, в терапевтически эффективном количестве и дополнительно биологически действующее вещество или соединение, особенно соединение, применяемое в лечении заболеваний и расстройств, которые вызваны или ассоциированы с амилоидными или амилоидоподобными белками, включая, но ими не ограничиваясь, амилоидоз, эндокринные опухоли и другие заболевания, включая глазные заболевания, ассоциированные с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированные со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов. Указанные патологические нарушения могут наблюдаться, например, в разных тканях глаза, например, в зрительной зоне коры мозга, что приводит к кортикальной зрительной недостаточности; в передней камере глаза и зрительном нерве, приводящие к глаукоме; в хрусталике, приводящие к катаракте из-за отложения бета-амилоида; в стекловидном теле, приводящие к зрительному амилоидозу; в сетчатке, приводящие к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна, и/или фармацевтически приемлемый носитель, и/или разбавитель, и/или эксципиент.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрена композиция, описанная в настоящем изобретении, включающая антитело, описанное в настоящем изобретении, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, а также включающая по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из соединений, эффективных против оксидативного стресса, анти-апоптических соединений, хелаторов металлов, ингибиторов репарации ДНК, например, пирензепина и метаболитов, 3-амино-1-пропансульфоновой кислота, 1,3-пропандисульфоната, активаторов секретазы, ингибиторов β- и γ-секретазы, тау белков, нейротрансмиттеров, нарушителей β-слоев, противовоспалительных молекул или ингибиторов холинэстеразы (cholinesterase inhibitor - ChEI), например, такрина, ривастигмина, донепезила и/или галантамина и других лекарственных средств и пищевых добавок и необязательно фрамацевтически приемлемый носитель, и/или растворитель, и/или эксципиент.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрена композиция, включающая антитело, описанное в настоящем изобретении, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его части, также включающая по меньшей мере одно соединение, которым является ингибитор холинэстеразы (ChEI).
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрена композиция, включающая антитело, описанное в настоящем изобретении, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, также включающая по меньшей мере одно дополнительное соединение, выбранное из группы, состоящей из такрина, ривастигмина, донепезила, галантамина, ниацина и мемантина.
В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрены композиции, включающие антитело по настоящему изобретению, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, которые дополнительно включают по меньшей мере одно «атипичные антипсихотическое средство», например, клозапин, ципразидон, рисперидон, арипипразол или оланзапин, для лечения положительных и отрицательных психотических симптомов, включающих галлюцинации, бред, нарушения мышления (проявляемые в форме выраженной бессвязности, неадекватности, расстройстве ассоциативного мышления), аномального или дезорганизованного поведения, например, ангедонии, аффекта в форме уныния, апатии и социальной замкнутости, и необязательно дополнительно включают фармацевтически приемлемый носитель, и/или растворитель, и/или эксципиент.
Другие соединения, которые могут быть использованы в смесях в комбинации с антителом по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, описаны, например, в WO 2004/058258 (особенно см. сс.16 и 17), включая мишени для терапевтических лекарственных средств (сс.36-39), алкансульфоновые кислоты и алканосульфуровые кислоты (сс.39-51), ингибиторы холинэстеразы (сс.51-56), антагонисты рецептора NMDA (сс.56-58), эстрогены (сс.58-59), нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (сс.60-61), антиоксиданты (сс.61-62), агонисты рецептора, активированного ролифераторами пероксисом (peroxisome proliferators-activated receptor - PPAR) (сс.63-67), холестерин-понижающие агенты (сс.68-75), ингибиторы амилоида (сс.75-77), ингибиторы формирования амилоида (сс.77-78), хелаторы металла (сс.78-79), антипсихотики и антидепрессанты (сс.80-82), пищевые добавки (сс.83-89) и соединения, повышающие доступность биологически действующих веществ в мозг (см. сс.89-93), и пролекарства (сс.93 и 94), причем указанный документ включен в настоящее изобретение в виде ссылки.
В частности композиция по настоящему изобретению включает моноклональное антитело и/или биологически действующее вещество, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, в терапевтически эффективном количестве.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу получения антитела, описанного в настоящем изобретении, особенно моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанный способ включает формирование в соответствующем организме хозяина антитела против надмолекулярной антигенной конструкции, включающей антигенный пептид, соответствующий аминокислотной последовательности β-амилоидного пептида или его фрагмента, особенно β-амилоидного пептида АрМ5, модифицированного гидрофобными частями молекулы, особенно пальмитиновой кислотой в качестве части молекулы, или в другом варианте особенно β-амилоидного пептида Аβ 22. 35 и Аβ 29-40, соответственно, модифицированного гидрофильными частями молекулы, особенно полиэтиленгликолем (ПЭГ) в качестве части молекулы, причем указанная гидрофобная или гидрофильная части молекулы ковалентно связаны с каждым концом через по меньшей мере одну, особенно одну или две аминокислоты, например, лизин, глутаминовую кислоту и цистеин или какую-либо другую соответствующую аминокислоту или аналог аминокислоты, способные выступать в качестве линкерной молекулы, и выделение антитела.
При использовании гидрофильной части молекулы, например, ПЭГ, выбранный фрагмент β-амилоидного пептида может быть фрагментом, соответствующим аминокислотной последовательности АВ 22-35 и АВ 29-40 соответственно, а свободный от ПЭГ конец может быть ковалентно связан с фосфатидилэтаноламином или каким-либо другим соединением, пригодным для функционирования в качестве элемента заякоривания, например, для погружения антигенной конструкции в двойной слой липосомы.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к применению антитела по настоящему изобретению, описанному в настоящем изобретении, особенно моноклональному антителу, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению, описанной в нем, или смеси по настоящему изобретению, описанной в нем, для приготовления лекарственного средства для лечения или облегчения проявлений заболеваний и расстройств у субъекта, нуждающегося в этом, которые вызваны или ассоциированы с амилоидом или амилоидоподобными белками, включая, но ими не ограничиваясь, амилоидоз, эндокринные опухоли и другие заболевания, включая глазные заболевания, ассоциированные с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированные со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов. Указанные патологические нарушения могут быть, например, в разных тканях глаза, например, в зрительной зоне коры мозга, приводящие к кортикальной зрительной недостаточности; в передней камере глаза и зрительном нерве, приводящие к глаукоме; в хрусталике, приводящие к катаракте из-за отложения бета-амилоида; в стекловидном теле, приводящие к зрительному амилоидозу; в сетчатке, приводящие к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции или смеси по настоящему изобретению, описанных в нем, используя антитело по настоящему изобретению, описанное в нем, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, для применения в лечении или облегчении проявлений заболеваний и расстройств у субъекта, нуждающегося в этом, которые вызваны или ассоциированы с амилоидом или амилоидоподобными белками, включая, но ими не ограничиваясь, амилоидоз, эндокринные опухоли и другие заболевания, включая глазные заболевания, ассоциированные с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированные со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов. Указанные патологические нарушения могут быть, например, в разных тканях глаза, например, в зрительной зоне коры мозга, приводящие к кортикальной зрительной недостаточности; в передней камере глаза и зрительном нерве, приводящие к глаукоме; в хрусталике, приводящие к катаракте из-за отложения бета-амилоида; в стекловидном теле, приводящие к зрительному амилоидозу; в сетчатке, приводящие к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение предусматривает способ получения лекарственного средства, используя антитело, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, фармацевтическую композицию или смесь по настоящему изобретению, описанные в нем, для предупреждения, лечения или облегчения проявлений заболеваний и расстройств у субъекта, нуждающегося в этом, которые вызваны или ассоциированы с амилоидом или амилоидоподобными белками, включая, но ими не ограничиваясь, амилоидоз, эндокринные опухоли и другие заболевания, включая глазные заболевания, ассоциированные с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированные со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов. Указанные патологические нарушения могут быть, например, в разных тканях глаза, например, в зрительной зоне коры мозга, приводящие к кортикальной зрительной недостаточности; в передней камере глаза и зрительном нерве, приводящие к глаукоме; в хрусталике, приводящие к катаракте из-за отложения бета-амилоида; в стекловидном теле, приводящие к зрительному амилоидозу; в сетчатке, приводящие к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу получения фармацевтической композиции, используя в частности антитело по настоящему изобретению, описанное в нем, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, включающему переработку указанного антитела в фармацевтически приемлемой форме, особенно таким образом, что антитело включено в композицию в терапевтически эффективном количестве.
В еще одном объекте настоящего изобретения предусмотрен способ снижения нагрузки бляшек в мозге субъекта, особенно млекопитающего, но особенно человека с заболеванием или состоянием, ассоциированным с повышенной нагрузкой бляшек в мозге, включающий введение субъекту, особенно млекопитающему, более предпочтительно человеку, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества антитела, особенно моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, или композиции или смеси по настоящему изобретению, описанные выше.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения моноклональным антителом, используемым в указанных способах, является антитело ACI-24-Ab-3 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 7-8 или его функциональные части, описанные в настоящем изобретении. В частности моноклональное антитело вырабатывается гибридомой EJ1A9, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2844.
В других специфических объектах настоящего изобретения моноклональным антителом, используемым в указанных способах, является моноклональное антитело, выбранное из группы антител, включающей ACI-11-Ab-9 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 17-18 и ACI-12-Ab-11 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 19-20 или их функциональные части, описанные в настоящем изобретении. В частности моноклональное антитело вырабатывается гибридомой FG1F9E4, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2845, или гибридомой FK2A6A6, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2846.
В частности нагрузку бляшек снимают по меньшей мере на 20%, особенно по меньшей мере на 25%, более предпочтительно по меньшей мере на 30%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 30%.
В другом объекте настоящего изобретения предусмотрен способ снижения количества бляшек в мозге субъекта, особенно млекопитающего, но особенно человека с заболеванием или состоянием, ассоциированным с повышенной нагрузкой бляшек в мозге, включающий введение субъекту, особенно млекопитающему, более предпочтительно человеку, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества антитела, особенно моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, или композиции или смеси по настоящему изобретению, описанные выше.
В другом объекте настоящего изобретения моноклональным антителом, используемым в таких способах, является антитело ACI-24-Ab-3 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 7-8 или их функциональными частями, описанными в настоящем изобретении. В частности моноклональное антитело вырабатывается гибридомой EJ1A9, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2844.
В другом объекте настоящего изобретения моноклональным антителом, используемым в таких способах, является моноклональное антитело, выбранное из группы антител, включающей ACI-11-Ab-9 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 17-18 и ACI-12-Ab-11 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 19-20 или их функциональные части, описанные в настоящем изобретении. В частности моноклональное антитело вырабатывается гибридомой FG1F9E4, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2845, или гибридомой FK2A6A6, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2846.
В частности количество бляшек в мозге снижается по меньшей мере на 10%, особенно по меньшей мере на 15%, более предпочтительно более чем на 15%.
В еще одном объекте настоящего изобретения предусмотрен способ снижения общего количества растворимого АВ в мозге субъекта, особенно млекопитающего, но особенно человека с глазным заболеванием или состоянием, ассоциированным с повышенными концентрациями растворимого Аβ в мозге, включающий введение субъекту, особенно млекопитающему, более предпочтительно человеку, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества антитела, особенно моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, или композицию или смесь по настоящему изобретению, описанную выше.
В другом объекте настоящего изобретения моноклональным антителом в указанных способах является антитело ACI-24-Ab-3 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 7-8 или его функциональная часть, описанные выше. В частности моноклональное антитело вырабатывается гибридомой EJ1A9, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2844.
В другом объекте настоящего изобретения моноклональным антителом, используемым в таких способах, является моноклональное антитело, выбранное из группы антител, включающей ACI-11-Ab-9 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 17-18 и ACI-12-Ab-11 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 19-20, или их функциональные части, описанные в настоящем изобретении. В частности моноклональное антитело вырабатывается гибридомой FG1F9E4, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2845, или гибридомой FK2A6A6, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2846.
В еще одном объекте настоящего изобретения предусмотрен способ предупреждения, лечения или облегчения проявлений заболеваний и расстройств, вызванных или ассоциированных с амилоидом или амилоидоподобными белками у субъекта, нуждающегося в нем, особенно млекопитающего, более предпочтительно человека с таким расстройством, заключающийся во введении терапевтически эффективного количества антитела, особенно моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, или композиции, или смеси по настоящему изобретению, описанные в настоящем изобретении, субъекту, особенно млекопитающему, более предпочтительно человеку, нуждающемуся в таком лечении. К таким заболеваниям и расстройствам относятся, но ими не ограничиваются, амилоидоз, эндокринные опухоли и другие заболевания, включая глазные заболевания, ассоциированные с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированные со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов. Указанные патологические нарушения могут наблюдаться, например, в разных тканях глаза, например, в зрительной зоне коры мозга, что приводит к кортикальной зрительной недостаточности; в передней камере глаза и зрительном нерве, приводящие к глаукоме; в хрусталике, приводящие к катаракте из-за отложения бета-амилоида; в стекловидном теле, приводящие к зрительному амилоидозу; в сетчатке, приводящие к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна.
В еще одном объекте настоящего изобретения предусмотрен способ сохранения или повышения когнитивного объема памяти у субъекта с ассоциированным с амилоидом заболеванием или состоянием, включающим введение субъекту, особенно млекопитающему, более предпочтительно человеку, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества антитела, особенно моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, или композицию, или смесь по настоящему изобретению, согласно описанию настоящего изобретения, приведенному выше.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к линии гибридомных клеток, отличающихся тем, что они вырабатывают моноклональное антитело по настоящему изобретению или антитело, описанное ранее.
В частности настоящее изобретение относится к линии гибридомных клеток, отличающихся тем, что они вырабатывают моноклональное антитело, которое обладает характерными свойствами антитела, вырабатываемого гибридомой EJ1A9, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2844.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрена линия гибридомных клеток EJ1A9, депонированных 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2844.
В частности настоящее изобретение относится к линии гибридомных клеток, отличающихся тем, что они вырабатывают моноклональное антитело, которое обладает свойствами антитела, вырабатываемого гибридомой FG1F9E4, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2845, или гибридомой FK2A6A6, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2846.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрена линия гибридомных клеток FG1F9E4, депонированных 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2845.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрена линия клеток гибридомы FK2A6A6, депонированная 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2846.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу диагностики заболевания или состояния, связанного с амилоидом, у субъекта, особенно у млекопитающего, более предпочтительно у человека с таким заболеванием, включающий включающему обнаружение иммуноспецифического связывания антитела, описанного в настоящем изобретении, особенно моноклональным антителом, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, с эпитопом амилоидного белка в образце или in situ, который включает следующие стадии:
(а) приведения образца, или специфической части тела, или области тела субъекта, в которых предположительно содержится амилоидный белок, в соприкосновение с антителом по настоящему изобретению, причем антитело связывает конформационный эпитоп амилоидного белка, (б) предоставления возможности для антитела связать амилоидный белок с формированием иммунологического комплекса,
(в) выявления формирования иммунологического комплекса, особенно таким образом, что наличие или отсутствие иммунологического комплекса коррелирует с наличием или отсутствием амилоидного белка, и
(г) корреляции наличия или отсутствия иммунологического комплекса с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце, или специфической части тела, или области тела субъекта.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения композиция на стадии (а) включает комбинацию антител для лечения указанного субъекта. К ассоциированным с амилоидом заболеваниям или состояниям относятся глазные заболевания, ассоциированные с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированными со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов, причем указанным патологические нарушения могут быть, например, в разных тканях глаза, например, в зрительной зоне коры мозга, что приводит к кортикальной зрительной недостаточности, в передней камере глаза и зрительном нерве, приводящие к глаукоме, в хрусталике, приводящие к катаракте из-за отложения бета-амилоида, в стекловидном теле, приводящие к зрительному амилоидозу, в сетчатке, приводящие к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна, например, возрастной дегенерации желтого пятна; в зрительном нерве, приводящие к формированию старческих бляшек в зрительном нерве, зрительной невропатии и ретробульбарному невриту; в роговице, приводящие к решетчатой дистрофии роговицы.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ определения степени нагрузки амилоидогенных бляшек в ткани субъекта, нуждающегося в этом, включающий:
(а) получение образца, представляющего ткань и/или жидкости тела исследуемого субъекта,
(б) тестирование указанного образца на наличие амилоидных бляшек с помощью антитела по настоящему изобретению, описанному в нем, особенно моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части,
(в) определения количества антитела, связанного с образцом, причем наличие или отсутствие иммунологического комплекса коррелирует с наличием или отсутствием амилоидных бляшек, и
(г) подсчета нагрузки бляшек в ткани и/или жидкостях тела субъекта. У субъекта может быть ассоциированное с амилоидом заболевание или состояние, к которому относятся глазные заболевания, ассоциированные с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированные со связанными с амилоид-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов, причем указанные патологические нарушения могут быть, например, в разных тканях глаза, например, в зрительной зоне коры мозга, что приводит к кортикальной зрительной недостаточности, в передней камере глаза и зрительном нерве, приводящие к глаукоме, в хрусталике, приводящие к катаракте из-за отложения бета-амилоида, в стекловидном теле, приводящие к зрительному амилоидозу, в сетчатке, приводящие к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна, например, возрастной дегенерации желтого пятна, в зрительном нерве, приводящие к формированию старческих бляшек в зрительном нерве, зрительной невропатии и ретробульбарному невриту, в роговице, приводящие к решетчатой дистрофии роговицы.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ диагностики предрасположенности к ассоциированному с амилоидом заболеванию или состоянию у субъекта, включающий определение специфического связывания антитела, описанного в настоящем изобретении, особенно моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, с эпитопом амилоидного белка в образце или in situ, который включает стадии:
(а) получение образца, представляющего ткань исследуемого субъекта,
(б) тестирование указанного образца на наличие амилоидных бляшек с помощью антитела по настоящему изобретению, описанному в нем, особенно моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части,
(в) определения количества антитела, связанного с образцом, причем наличие или отсутствие иммунологического комплекса коррелирует с наличием или отсутствием амилоидных бляшек, и
(г) подсчета нагрузки бляшек в ткани субъекта. У субъекта может быть ассоциированное с амилоидом заболевание или состояние, к которому относятся глазные заболевания, ассоциированные с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированные со связанными с амилоид-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов, причем указанные патологические нарушения могут быть, например, в разных тканях глаза, например, в зрительной зоне коры мозга, что приводит к кортикальной зрительной недостаточности, в передней камере глаза и зрительном нерве, приводящие к глаукоме, в хрусталике, приводящие к катаракте из-за отложения бета-амилоида, в стекловидном теле, приводящие к зрительному амилоидозу, в сетчатке, приводящие к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна, например, возрастной дегенерации желтого пятна, в зрительном нерве, приводящие к формированию старческих бляшек в зрительном нерве, зрительной невропатии и ретробульбарному невриту, в роговице, приводящие к решетчатой дистрофии роговицы.
Настоящее изобретение также относится к способу диагностики предрасположенности к ассоциированному с амилоидом заболеванию или состоянию у субъекта, включающему обнаружение специфического связывания антитела согласно описанию настоящего изобретения, особенно моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, с эпитопом амилоидного белка в образце или in situ, который включает следующие стадии:
(а) приведения образца, или специфической части тела, или области тела субъекта, у которого предположительно содержится амилоидный белок, в соприкосновение с антителом, причем указанное антитело связывает конформационный эпитоп амилоидного белка,
(б) предоставления возможности для антитела связать амилоидный белок в образце с формированием иммунологического комплекса,
(в) выявления формирования иммунологического комплекса, и
(г) корреляции наличия или отсутствия иммунологического комплекса с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце, или специфической части тела, или области тела субъекта, и
(д) сравнения количества указанного иммунологического комплекса с нормальной контрольной величиной, причем повышение количества комплекса по сравнению с нормальной контрольной величиной показывает, что субъект подвержен риску развития заболевания или состояния, ассоциированного с амилоидом. К ассоциированному с амилоидом заболеванию или состоянию относятся глазные заболевания, ассоциированные с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированные со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов. Патологические нарушения могут быть, например, в разных тканях глаза, например, в зрительной зоне коры мозга, что приводит к кортикальной зрительной недостаточности, в передней камере глаза и зрительном нерве, приводящие к глаукоме, в хрусталике, приводящие к катаракте из-за отложения бета-амилоида, в стекловидном теле, приводящие к зрительному амилоидозу, в сетчатке, приводящие к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна, например, возрастной дегенерации желтого пятна, в зрительном нерве, приводящие к формированию старческих бляшек в зрительном нерве, зрительной невропатии и ретробульбарному невриту, в роговице, приводящие к решетчатой дистрофии роговицы.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ мониторинга минимального проявления остаточного заболевания у субъекта с последующим лечением антителом или композицией по настоящему изобретению, который включает следующие стадии:
(а) приведения образца, или специфической части тела, или области тела субъекта, у которого предположительно содержится амилоидный белок, в соприкосновение с антителом по настоящему изобретению, особенно моноклональным антителом, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело связывает конформационный эпитоп амилоидного белка,
(б) предоставления возможности для антитела связать амилоидный белок в образце с формированием иммунологического комплекса,
(в) выявления формирования иммунологического комплекса, и
(г) корреляции наличия или отсутствия иммунологического комплекса с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце, или специфической части тела, или области тела субъекта, и
(д) сравнения количества указанного иммунологического комплекса с нормальной контрольной величиной, причем увеличение количества указанного комплекса по сравнению с нормальной контрольной величиной показывает, что указанный субъект все еще имеет минимальные остаточные проявления заболевания. Минимальные остаточные проявления могут относиться к глазным заболеваниям, ассоциированным с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированные со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов. Патологические нарушения могут быть, например, в разных тканях глаза, например, в зрительной зоне коры мозга, что приводит к кортикальной зрительной недостаточности, в передней камере глаза и зрительном нерве, приводящие к глаукоме, в хрусталике, приводящие к катаракте из-за отложения бета-амилоида, в стекловидном теле, приводящие к зрительному амилоидозу, в сетчатке, приводящие к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна, например, возрастной дегенерации желтого пятна, в зрительном нерве, приводящие к формированию старческих бляшек в зрительном нерве, зрительной невропатии и ретробульбарному невриту, в роговице, приводящие к решетчатой дистрофии роговицы.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения композиция на стадии (а) включает комбинацию антител для лечения указанного субъекта.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ прогнозирования способности к реагированию субъекта, подвергаемого лечению антителом или композицией по настоящему изобретению, включающий стадии:
(а) приведения образца, или специфической части тела, или области тела, предположительно содержащих амилоидный белок, в контакт с антителом, особенно антителом по настоящему изобретению, описанному в нем, особенно с моноклональным антителом, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем указанное антитело связывает конформационный эпитоп амилоидного белка,
(б) предоставления возможности для антитела связать какой-либо амилоидный белок с формированием иммунологического комплекса,
(в) выявления формирования иммунологического комплекса,
(г) корреляции наличия или отсутствия иммунологического комплекса с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце, или определенной части, или области организма, и
(д) сравнения количества указанного иммунологического комплекса до и после начала лечения,
причем снижение количества иммунологического комплекса показывает, что субъект обладает большим потенциалом ответа на лечение. В другом варианте осуществления настоящего изобретения представлено лечение ассоциированного с амилоидом заболевания или состояния, к которым относятся глазные заболевания, ассоциированные с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов. Патологические нарушения могут быть, например, в разных тканях глаза, например, в зрительной зоне коры мозга, что приводит к кортикальной зрительной недостаточности, в передней камере глаза и зрительном нерве, приводящие к глаукоме, в хрусталике, приводящие к катаракте из-за отложения бета-амилоида, в стекловидном теле, приводящие к зрительному амилоидозу, в сетчатке, приводящие к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна, например, возрастной дегенерации желтого пятна, в зрительном нерве, приводящие к формированию старческих бляшек в зрительном нерве, зрительной невропатии и ретробульбарному невриту, в роговице, приводящие к решетчатой дистрофии роговицы.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения композиция на стадии (а) включает комбинацию антител для лечения указанного субъекта.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к набору для выявления и диагностики связанных с амилоидом заболеваний и состояний у субъекта, нуждающегося в этом, включающему антитело по настоящему изобретению, описанное в нем, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, и инструкции по применению антитела с целью связывания амилоидного белка для формирования иммунологического комплекса и обнаружения формирования иммунологического комплекса, причем наличие или отсутствие иммунологического комплекса коррелирует с наличием или отсутствием амилоидного белка. Ассоциированные с амилоидом заболевания и состояния включают глазные заболевания, ассоциированные с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированные со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированных со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов. Патологические нарушения могут быть, например, в разных тканях глаза, например, в зрительной зоне коры мозга, что приводит к кортикальной зрительной недостаточности, в передней камере глаза и зрительном нерве, приводящие к глаукоме, в хрусталике, приводящие к катаракте из-за отложения бета-амилоида, в стекловидном теле, приводящие к зрительному амилоидозу, в сетчатке, приводящие к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна, например, возрастной дегенерации желтого пятна, в зрительном нерве, приводящие к формированию старческих бляшек в зрительном нерве, зрительной невропатии и ретробульбарному невриту, в роговице, приводящие к решетчатой дистрофии роговицы.
Эти и другие объекты, свойства и преимущества настоящего изобретения станут яснее после рассмотрения подробного описания вариантов его осуществления и приводимой формулы изобретения.
Краткое описание фигур
1-42
1-42
1-42
Фиг.1. Результаты исследования картирования эпитопа моноклонального тела грызунов ACI-24-Ab-3, проведенного методом ELISA, используя библиотеку пептидов для перекрывающихся пептидов, покрывающих всю аминокислотную последовательность Аβ. Связывание всего пептида Аβ используют в качестве положительного контроля. Длина всех других пептидов составляет 8-10 аминокислот. Номер пептида соответствует аминокислоте в последовательности Аβ, с которой пептид начинается. Результаты выражены в виде оптической плотности (ОП).
1-28
Фиг.2. Результаты исследования картирования эпитопа моноклонального тела грызунов ACI-24-Ab-3, проведенного методом ELISA, используя более длинные пептиды, покрывающие Аβ, 17-40, 1-40, М2А (Anaspec) или М2 В (Bachem). Результаты выражены в виде оптической плотности (ОП) после вычитания фона. Результаты показывают среднюю величину ±1 среднюю квадратическую ошибку по двум независимым экспериментам.
1-42
Фиг.3. Опосредованное антителом ACI-24-Ab-3 ингибирование агрегирования Аβ при мольном соотношении антитела к Арi.42 1:100 и 1:10. Результаты показывают среднюю величину ±1 среднюю квадратическую ошибку по двум независимым экспериментам.
1-42
1-42
Фиг.4. Опосредованное антителом ACI-24-Ab-3 дезагрегирование ранее агрегированного Аβ при мольном соотношении антитела к Аβ 1:100 и 1:10. Результаты показывают среднюю величину°1 среднюю квадратическую ошибку по двум независимым экспериментам.
1-42
Фиг.5. Связывание антитела ACI-24-Ab-3 с обогащенным высокомолекулярным протофибриллярным олигомером и низкомолекулярным мономером препаратами пептида Аβ.
1-42
Фиг.6. Связывание контрольного антитела 6Е10 с обогащенным высокомолекулярным протофибриллярным олигомером и низкомолекулярным мономером препаратами пептида Аβ.
1-42
Фиг.7. Связывание антитела ACI-24-Ab-3 (А) и контрольного антитела 6Е10 (Б) с мономерами и олигомерами пептида Аβ. Результаты показывают среднюю величину оптической плотности ±1 среднюю квадратическую ошибку по данным трех независимых экспериментов.
1-42
1-42
Фиг.8. Результаты картирования эпитопа моноклонального тела грызунов ACI-11-Ab-9, проведенного методом ELISA, используя библиотеку пептидов для перекрывающихся пептидов, покрывающих всю аминокислотную последовательность Аβ. Связывание всего пептида Аβ используют в качестве положительного контроля. Длина всех других пептидов составляет 8-10 аминокислот. Номер пептида соответствует аминокислоте в последовательности Арi.42, с которой пептид начинается. Результаты выражены в виде оптической плотности (ОП).
Фиг.9. Результаты картирования эпитопа моноклонального антитела грызунов ACI-11-Ab-9, проведенного методом ELISA, используя более длинные пептиды, покрывающие Аβ 1-28, 17-40, 1-40, М2А (Anaspec) или 1-42B (Bachem). Результаты выражены в виде оптической плотности (ОП) после вычитания фона. Результаты показывают среднюю величину ±1 среднюю квадратическую ошибку по двум независимым экспериментам.
1-42
1-42
1-42
Фиг.10. Результаты картирования эпитопа моноклонального антитела грызунов ACI-12-Ab-11, проведенного методом ELISA с применением библиотеки пептидов, покрывающих полную аминокислотную последовательность Аβ. Связывание с пептидом Аβ полной длины используют в качестве положительного контроля. Все другие пептиды состоят из 8-10 аминокислот. Номер пептида соответствует аминокислоте в последовательности Аβ, с которой пептид начинается. Результаты представлены в виде оптической плотности (ОП).
Фиг.11. Результаты картирования эпитопа моноклонального антитела грызунов ACI-11-Ab-9, проведенного методом ELISA, используя более длинные пептиды, покрывающие Аβ 1-28, 17-40, 1-40, 1.42A (Anaspec) или 1.42 В (Bachem). Результаты выражены в виде оптической плотности (ОП) после вычитания фона. Результаты показывают среднюю величину ±1 среднюю квадратическую ошибку по двум независимым экспериментам.
1-42
1-42
Фиг.12. Опосредованное антителом АСI-11-Ab-9 ингибирование агрегирования пептида Аβ в мольном соотношении 1:100 и 1:10 антитела к Аβ. Результаты показывают среднюю величину ±1 среднюю квадратическую ошибку по двум независимым экспериментам.
1-42
1-42
Фиг.13. Опосредованное антителом АСI-11-Ab-9 дезагрегирование ранее агрегированного пептида Аβ в мольном соотношении 1:100 и 1:10 антитела к Аβ. Результаты показывают среднюю величину ±1 среднюю квадратическую ошибку по трем независимым экспериментам.
1-42
1-42
Фиг.14. Опосредованное антителом ACI-12-Ab-11 ингибирование агрегирования Аβ при мольном соотношении 1:100 и 1:10 антитела к Аβ. Результаты показывают среднюю величину ±1 среднюю квадратическую ошибку по двум независимым экспериментам.
1-42
1-42
Фиг.15. Опосредованное антителом ACI-12-Ab-11 дезагрегирование ранее агрегированного пептида Аβ в мольном соотношении 1:100 и 1:10 антитела к Аβ. Результаты показывают среднюю величину ±1 среднюю квадратическую ошибку по двум независимым экспериментам.
1-42
Фиг.16. Связывание антитела ACI-12-Ab-11 (А) и контрольного антитела 6Е10 (Б) с мономерами и олигомерами пептида Аβ. Результаты представляют в виде величины оптической плотности (ОП) ± средняя квадратичная ошибка по данным трех экспериментов.
Фиг.17. Схематическое отображение стадий метода ELISA, который может быть применен для анализа связывания rhApoE4 с Ар42-биотином.
Фиг.18. Результаты исследования методом ELISA связывания rhApoE4 с Ар42-биотином. Для оптимизации концентраций rhApoE4 и Ар42-биотина исследуют разведения rhApoE4 при постоянной концентрации Ар42-биотина.
Фиг.19. Влияние избытка Ар42-биотина на связывание Ар42-биотина, объединенного с rhApoE4, по данным анализа описанным методом ELISA.
Фиг.20. Пример определения образца с оптимальной концентрацией Ар42-биотина для описанного метода ELISA.
Краткое описание таблиц
Таблица 1.1. Наборы антител и антигенных конструкций, применяемых для повышения определенных антител, описанных в настоящем изобретении.
Таблица 1.2. Связывание пептидов Аβ с антителом ACI-24-Ab-3. Результаты выражены в виде оптической плотности (ОП) после вычитания фона.
1-42
1-42
1-42
Таблица 1.3. Связывание антитела ACI-24-Ab-3 с 33 перекрывающимися пептидами Аβ по данным анализа методом ELISA. Связывание с полным пептидом Аβ используют в качестве положительного контроля. Все другие пептиды имеют длину 8-10 аминокислот. Номер пептида соответствует аминокислоте в последовательности Аβ, с которой пептид начинается. Результаты выражены в виде оптической плотности (ОП).
Таблица 1.4. Связывание антитела ACI-24-Ab-3 (мышь EJ1A9) с обогащенным высокомолекулярным протофибриллярным олигомером и низкомолекулярным мономером препаратами пептида Аβ 1.42.
1-42
Таблица 1.5. Связывание контрольного антитела 6Е10 с обогащенным протофибрилллярными и низкомолекулярными высокомолекулярными протофибриллярными олигомерными и низкомолекулярными мономерными препаратами пептида Аβ.
1-42
Таблица 1.6. Связывание антитела ACI-24-Ab-3 (мышь EJ1A9) с мономерами и олигомерами пептида Аβ. Результаты выражены в виде оптической плотности (ОП).
1-42
Таблица 1.7. Связывание контрольного антитела 6Е10 с мономерами и олигомерами пептида Аβ. Результаты выражены в виде оптической плотности (ОП).
Таблица 2.1. Определение антител и антигенных конструкций, используемых для повышения определенных антител, описанных в настоящем изобретении.
Таблица 2.2. Связывание пептидов Аβ с антителами ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11. Результаты выражены в виде оптической плотности (ОП) после вычитания фона.
1-42
1-42
1-42
Таблица 2.3. Связывание антител ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 с 33 перекрывающимися пептидами Аβ по данным анализа методом ELISA. Связывание с полным пептидом Аβ используют в качестве положительного контроля. Все другие пептиды имеют длину 8-10 аминокислот. Номер пептида соответствует аминокислоте в последовательности Аβ, с которой пептид начинается. Результаты выражены в виде оптической плотности (ОП).
Таблица 2.4. Связывание антитела ACI-12-Ab-11 (клон FK2A6A6) с мономерами и олигомерами пептида Ар,.42. Результаты выражены в виде оптической плотности (ОП).
Таблица 2.5. Связывание контрольного антитела 6Е10 с мономерами и олигомерами пептида АрМ2. Результаты выражены в виде оптической плотности (ОП).
17-40
1-40
1-42
Краткое описание последовательностей SEQ ID NO: 1. Антигенный пептид A(322-35. SEQ ID NO: 2. Антигенный пептид Ap29.40. SEQ ID NO: 3. AB пептидный фрагмент Api.2g. SEQ ID NO: 4. Аβ пептидный фрагмент Aβ. SEQ ID NO: 5. Аβ пептидный фрагмент Aβ. SEQ ID NO: 6. Аβ пептидный фрагмент Аβ.
SEQ ID NO: 7. Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела ACI-24-Ab-3.
SEQ ID NO: 8. Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела ACI-24-Ab-3.
SEQ ID NO: 9. Аминокислотная последовательность CDR1 легкой цепи.
SEQ ID NO: 10. Аминокислотная последовательность CDR2 легкой цепи.
SEQ ID NO: 11. Аминокислотная последовательность CDR3 легкой цепи.
SEQ ID NO: 12. Аминокислотная последовательность CDR1 тяжелой цепи.
SEY ID NO: 13. Аминокислотная последовательность CDR2 тяжелой цепи.
SEQ ID NO: 14. Аминокислотная последовательность CDR3 тяжелой цепи.
SEQ ID NO: 15. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела ACI-24-Ab-3.
SEQ ID NO: 16. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела ACI-24-Ab-3.
SEQ ID NO: 17. Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела ACI-11-Ab-9.
SEQ ID NO: 18. Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела ACI-11-Ab-9.
SEQ ID NO: 19. Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела ACI-12-Ab-11.
SEQ ID NO: 20. Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела ACI-12-Ab-11.
SEQ ID NO: 21. Аминокислотная последовательность CDR1 легкой цепи.
SEQ ID NO: 22. Аминокислотная последовательность CDR2 легкой цепи.
SEQ ID NO: 23. Аминокислотная последовательность CDR3 легкой цепи.
SEQ ID NO: 24. Аминокислотная последовательность CDR1 тяжелой цепи.
SEQ ID NO: 25. Аминокислотная последовательность CDR2 тяжелой цепи.
SEQ ID NO: 26. Аминокислотная последовательность CDR3 тяжелой цепи.
SEQ ID NO: 27. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность вариабельного домена легкой цепи ACI-11-Ab-9.
SEQ ID NO: 28. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность вариабельного домена тяжелой цепи АСI-11-Ab-9.
SEQ ID NO: 29. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность вариабельного домена легкой цепи ACI-12-Ab-11.
SEQ ID NO: 30. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность вариабельного домена легкой цепи ACI-12-Ab-11.
Подробное описание изобретения
Антитела по настоящему изобретению, включая какие-либо функционально эквивалентные антитела или их функциональные части, или, что более предпочтительно, моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, описанные в настоящем изобретении, могут применяться для лечения глазных заболеваний, связанных с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированных со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, деградации нейронов. Указанные патологические нарушения могут быть, например, в разных тканях глаза, например, в зрительной зоне коры мозга, приводящие к кортикальной зрительной недостаточности; в передней камере глаза и глазном нерве, приводящие к глаукоме; в хрусталике, приводящие к катаракте из-за отложения бета-амилоида; в стекловидном теле, приводящие к глазному амилоидозу; в сетчатке, приводящие к первичной дегенерации сетчатки, включая дегенерацию желтого пятна, например, возрастную дегенерацию желтого пятна; в зрительном нерве, приводящие к старческим бляшкам зрительного нерва, зрительной невропатии и ретробульбарному невриту; и в роговице, приводящие к решетчатой дистрофии роговицы.
В частности композиция, особенно терапевтическая композиция, включающая антитело, особенно моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, описанные в настоящем изобретении, в терапевтически эффективном количестве, могут применяться для лечения глазных заболеваний, ассоциированных с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированных со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов. Указанные патологические изменения могут быть, например, в разных тканях глаза, например, в зрительной зоне коры мозга, приводящие к кортикальной зрительной недостаточности; в передней камере глаза и глазном нерве, приводящие к глаукоме; в хрусталике, приводящие к катаракте из-за отложения бета-амилоида; в стекловидном теле, приводящие к глазному амилоидозу; в сетчатке, приводящие к первичной дегенерации сетчатки, включая дегенерацию желтого пятна, например, возрастную дегенерацию желтого пятна; в зрительном нерве, приводящие к старческим бляшкам зрительного нерва, зрительной невропатии и ретробульбарному невриту; и в роговице, приводящие к решетчатой дистрофии роговицы.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения композиция по настоящему изобретению предусмотрена в форме смеси, в которой антитело перемешано с другим биологическим действующим веществом вместе с одним и тем же фармацевтически приемлемым растворителем и/или носителем, или антитело или другое биологически действующее вещество может быть предусмотрено отдельно в виде части отдельной композиции, которая может быть предложена отдельно или вместе в форме набора частей. Композиция может применяться для лечения глазных заболеваний, ассоциированных с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированных со связанными с амилоид-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов. Патологические нарушения могут наблюдаться, например, в разных тканях глаза, например, в зрительной зоне коры мозга, что приводит к кортикальной зрительной недостаточности; в передней камере глаза и зрительном нерве, приводящие к глаукоме; в хрусталике, приводящие к катаракте из-за отложения бета-амилоида; в стекловидном теле, приводящие к зрительному амилоидозу; в сетчатке, приводящие к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна, например, возрастной дегенерации желтого пятна; в зрительном нерве, приводящие к формированию старческих бляшек в зрительном нерве, зрительной невропатии и ретробульбарному невриту; в роговице, приводящие к решетчатой дистрофии роговицы.
Глаукома - группа заболеваний зрительного нерва, включающая утрату ганглиозных клеток сетчатки (ГКС), в виде определенным образом выраженной зрительной невропатии. Глаукома часто, но не всегда, сопровождается повышенным внутриглазным давлением, которое может быть результатом блокады циркуляции жидкости или ее дренажа.
Хотя повышенное внутриглазное давление представляет существенный фактор риска для развития глаукомы, нельзя выделить внутриглазное пороговое давление, которое может быть определяющим для развития глаукомы.
Поражение также может быть выражено плохим кровоснабжением волокон зрительного нерва, слабостью структуры нерва и/или изменениями в здоровом состоянии самих нервных волокон.
При отсутствии лечения глаукома приводит к постоянному разрушению зрительного нерва и в результате к утрате поля зрения, которая может прогрессировать и перейти в слепоту.
Ретинальные ганглиозные клетки (ГКС) являются нервными клетками, которые передают зрительные сигналы в мозг. Каспаза-3 и каспаза-8 - два главных фермента в процессе апоптоза, активируются в процессе, приводящем к апоптозу ГКС. Каспаза-3 расщепляет белок-предшественник амилоида (amyloid precursor protein - АРР) с формированием нейротоксических фрагментов, включая амилоид р. Без защитного эффекта АРР накопление амилоида β в слое ретинальных ганглиозных клеток приводит к гибели ГКС и необратимой утрате зрения.
Разные типы глаукомы классифицируют на открытоугольные глаукомы, если условия хронические, или закрытоугольные глаукомы, если глаукома возникает внезапно. Глаукома обычно поражает оба глаза, но болезнь может прогрессировать быстрее в одном глазу по сравнению с другим.
Хроническая открытоугольная глаукома, также называемая первичной открытоугольной глаукомой, представляет наиболее распространенный тип глаукомы. Хроническая открытоугольная глаукома возникает в результате микроскопической блокады в трабекулярной сети, которая снижает дренаж оттока жидкости в шлемов канал и повышает внутриглазное давление (ВГД). Первичная открытоугольная глаукома поражает оба глаза и жестко связана с возрастом и с положительным семейным анамнезом. Частота ее возникновения повышается у пожилых людей, поскольку механизм дренажа может постепенно осложняться с возрастом. Повышение внутриглазного давления у субъектов с хронической открытоугольной глаукомой не сопровождается какими-либо симптомами до тех пор, пока утрата зрения не ощущается в центральном участке поля зрения.
Острая закрытоугольная глаукома или глаукома закрытого угла представляет относительно редкий тип глаукомы, отличающийся внезапным повышением внутриглазного давления с 35 до 80 мм Hg, приводящим к сильной боли и необратимой утрате зрения. Внезапное повышение давления вызывается закрытием фильтрующего угла и блокадой дренажных каналов. У индивидуумов с узкими углами повышен риск внезапного закрытия угла. Острая закрытоугольная глаукома обычно возникает в одном глазу, но существует риск поражения обоих глаз. Возраст, катаракта и псевдоэксфолиация также представляют факторы риска, поскольку они связаны с укрупнением хрусталика и уплотнением или сужением угла. Внезапное поражение глаукомой может быть связано с сильной болью в глазу и головной болью, воспалением глаза, тошнотой, рвотой и нечетким зрением.
Смешанная глаукома или глаукома комбинированного механизма представляет смесь или комбинацию открытоугольной и закрытоугольной глауком. Она поражает пациентов с острой открытоугольной глаукомой, у которых угол открывается после лазерной иридотомии, но которые продолжают нуждаться в лекарственных средствах для контроля ВГД, подобно пациентам с первичной открытоугольной глаукомой, у которых постепенно наступает сужение угла.
Глаукома с нормальным давлением, также называемая глаукомой, не сопровождающейся повышением внутриглазного давления, глаукомой низкого давления, характеризуется прогрессирующим поражением зрительного нерва и утратой периферийного зрения, схожей с наблюдаемой при других типах глаукомы; однако при этом внутриглазное давление в диапазоне нормы или даже ниже нормы.
Врожденная глаукома (детская глаукома) - относительно редкое заболевание, наследуемый тип открытоугольной глаукомы. Недостаточное развитие дренажной области приводит к повышенному давлению в глазу, которое может привести к потере зрения из-за повреждения зрительного нерва и к увеличению глаза. Ранняя диагностика и лечение принципиально важны для сохранения зрения у младенцев и детей с этим заболеванием.
Вторичная глаукома может возникнуть в результате травмы глаза, воспаления радужной оболочки глаза (ирита), диабета, катаракты или применения стероидов индивидами, чувствительными к стероидам. Вторичная глаукома может также быть связана с отслоением сетчатки или с закупоркой или блокадой вен сетчатки.
Пигментная глаукома отличается отслоением гранул пигмента от сетчатки. Гранулы вызывают блокаду дренажной системы глаза, что приводит к повышению внутриглазного давления и повреждению зрительного нерва.
Эксфолиативная глаукома (псевдоэксфолиация) характеризуется отложением хлопьевидного материала в передней капсуле и в углу глаза. Накопление хлопьевидного материала блокирует дренажную систему и повышает внутриглазное давление.
Диагноз глаукомы может быть поставлен при использовании различных тестов. С помощью тонометров определяют давление в глазу по измерению тона или устойчивости поверхности глаза. Для такого теста можно использовать несколько типов тонометра, обычно используют аппланационный тонометр. Батиметрия определяет толщину роговицы, которая в свою очередь соизмерима с глазным давлением. Гониоскопия позволяет исследовать фильтрующий угол и дренажную область глаза. Гониоскопия позволяет также определить, если нарушенное кровяное давление может блокировать отток жидкости из глаза. Офтальмоскопия позволяет исследовать зрительный нерв и может выявить понижение слоя нервных волокон, или изменение в слепом пятне или вдавленность (чашеобразное углубление) этой структуры, которые могут быть вызваны повышенным внутриглазным давлением или выпадением аксонов. Гониоскопию также используют при оценке повреждения нерва при пониженном кровоснабжении или повышенном внутриглазном давлении. Тестирование поля зрения позволяет индивидуально картировать поле зрения, что может выявить признаки повреждения зрительного нерва из-за глаукомы. Это специфические варианты утраты поля зрения. Оптическую когерентную томографию, позволяющую объективно замерить утрату слоя нервных волокон, проводят путем осмотра толщины слоя волокон зрительного нерва (измененного при глаукоме) по изменению в передаче света через поврежденную ткань аксона.
Старческие бляшки в зрительном нерве и глобулярные конкреции белка и солей кальция, которые предположительно поставляют секреции через вырожденно измененные сосудистые структуры, влияющие на слой нервных волокон аксонов. Такие накопления происходят в околососочковом слое нервных волокон и предположительно повреждают слой нервных волокон аксонов, либо прямо путем компрессии, либо косвенно через разрушения снабжения через сосуды к слою нервных волокон. Они обычно становятся видимыми после первой декады жизни пораженных индивидуумов. Они присутствуют в большинстве случаев в обоих глазах, но может также поразить один глаз, и могут вызвать умеренную утрату периферического зрения на протяжении многих лет.
Зрительная невропатия - заболевание, отличающееся повреждением зрительного нерва, вызванным демиелинизацией, блокадой кровоснабжения, недостаточным поступлением питательных веществ или токсинами. Зрительные невропатии с демиелинизацией (см. ниже зрительные невриты) обычно связаны с лежащим в основе процессом демиелинизации, например, рассеянный склероз. Блокада кровоснабжения, называемая ишемической зрительной невропатией, может привести к гибели или дисфункции клеток зрительного нерва. Неартериитная ишемическая зрительная невропатия обычно наблюдается у людей среднего возраста. К факторам риска относятся высокое кровяное давление, диабет и атеросклероз. Артериитная ишемическая зрительная невропатия обычно наблюдается у пожилых людей после воспаления артерий (артериита), особенно височной артерии (височный артериит). Потеря зрения может быть быстрой или развиваться постепенно на протяжении 2-7 суток, при этом может быть поврежден один или оба глаза. У людей со зрительной невропатией, вызванной экспозицией токсином или пищевым голоданием, обычно поражены оба глаза.
Примерно у 40% людей с неартериитной ишемической зрительной невропатией со временем проявляется спонтанное улучшение. Неартериитную ишемическую зрительную невропатию лечат путем контроля кровяного давления, диабета и уровней холестерина. Артериитную ишемическую зрительную невропатию лечат высокими дозами кортикостероидов для предупреждения потери зрения во втором глазу.
Зрительный неврит ассоциирован с умеренной или тяжелой потерей зрения в одном или обоих глазах и может быть вызван системным процессом демиелинизации (см. выше), вирусной инфекцией, вакцинацией, менингитом, сифилисом, рассеянным склерозом и внутриглазным воспалением (увеитом). Движения глаза могут быть болезненны, и зрение может быть повреждено при повторных эпизодах. Диагностика включает оценку реакций зрачков и определение возможной припухлости диска зрительного нерва. Получение изображений методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) может подтвердить рассеянный склероз или, что бывает реже, давление опухоли на зрительный нерв, причем зрение улучшается при ослаблении давления опухоли. В большинстве случаев зрительный неврит проходит через несколько месяцев при отсутствии лечения. В некоторых случаях может потребоваться лечение внутривенным введением кортикостероидов.
Катаракта представляет помутнение хрусталика или его оболочки. Катаракта обычно вызывает прогрессирующую потерю зрения и при отсутствии лечения может привести к слепоте. При морганиевой катаракте оболочка постепенно разжижается с формированием молочно-белой жидкости и может вызвать тяжелую форму воспаления, если капсула хрусталика разрывается и содержимое подтекает. Без лечения катаракта может также вызвать факоморфическую глаукому. Катаракта может быть наследственной по природе или вызванной генетическими факторами, старением, длительным воздействием ультрафиолета, действием радиации, диабетом, повреждением глаза или физической травмой.
Внекапсулярная хирургия - наиболее эффективное средство лечения катаракты. При хирургическом вмешательстве хрусталик удаляют, но капсула хрусталика в основном сохраняется. Процесс факоэмульсификации - небольшого надрезания роговицы сбоку, обычно используют для разрушения хрусталика перед удалением.
Зрительный амилоидоз - наследственное заболевание, ассоциированное с семейной амилоидозной полиневропатией (Familial Amyloidotic Polyneuropathy - FAP) первого типа и отличающееся нарушенными сосудами конъюнктивы, кератоконъюнктивитной сухостью, пупиллярными нарушениями и в некоторых случаях помутнением стекловидного тела и вторичной глаукомой. FAP первого типа ассоциирована с мутациями в транстиретине, тетрамерном белке плазмы (преальбумине), синтезируемом в печени, пигментном эпителии сетчатки 2 и сосудистом сплетении мозга (thechoroid plexus). Разные мутации индуцируют полимеризацию транстиретина в складчатую структуру амилоидных фибрилл, приводящую к наследственному амилоидозу. Наиболее частой мутацией является мутация TTR-met303, при которой метионин замещен валином в положении 30 транстиретина.
FAP четвертого типа ассоциирована с решетчатой дистрофией роговицы (lattice corneal dystrophy - LCD). Решетчатая дистрофия роговицы представляет наследственный первичный обычно двухсторонний амилоидоз роговицы, для которого характерно наличие преломляющих решетчатых линий с двойным контуром в строме роговицы. LCD первого типа (Biber-Haab-Dimmer) представляет аутосомный доминант, двусторонне симметричное расстройство роговицы, для которого характерно наличие многочисленных полупрозрачных тонких решетчатых линий с белыми точками и слабым помутнением в поверхностных и средних слоях центральной стромы. Симптомы начинают проявляться в течение первой или второй декады жизни, вызывая постепенную потерю зрения. Большинство пациентов нуждается в трансплантации роговицы к сорокалетнему возрасту. LCD второго типа ассоциирована с системным амилоидозом (синдром Меетойя) и отличается наличием тонких решетчатых линий на краю роговицы, в центральной части роговицы и в строме. Зрение не нарушается до наступления старости. LCD третьего типа поражает людей среднего возраста и отличается наличием тонких решетчатых линий, которые тянутся от края до края роговицы. LCD третьего типа отличается накоплением амилоидных отложений в строме и наличием полос амилоида между стромой и слоем Боумана, LCD третьего типа А отличается от LCD третьего типа наличием эрозии роговицы, возникновением белей и аутосомной доминантной наследственной структурой.
Синдром Дауна (СД) или трисомия по 21 хромосоме представляет наиболее распространенное генетическое расстройство, встречающееся примерно с частотой 1 случай на 700 новорожденных, и часто оно связано с различными нарушениями когнитивных способностей. Это расстройство, вызванное наличием избыточной 21 хромосомы, ассоциировано с ранним отложением формирующего старческие бляшки белка амилоида-бета и развитием болезни Альцгеймера в среднем возрасте. Кроме того, у многих больных с синдромом Дауна развивается катаракта, начинаясь в детском возрасте, причем у многих наблюдают врожденную глаукому. Поскольку ген белка - предшественника амилоида, который расщепляется с формированием амилоида бета, локализован на длинном плече 21-й хромосомы у людей, сверхэкспрессия этого гена может привести к повышенным уровням белка-предшественника амилоида и отложениям амилоида при синдроме Дауна.
Полностью вылечить глаукому нельзя. К лекарственным средствам для лечения глаукомы относятся агенты, которые снижают выработку водного содержимого глаза, например, бета-блокаторы (Timoptic, Betoptic), ингибиторы карбоангидразы (Trusopt, Azopt) и альфа-агонисты (Alphagan, Iopidine), а также агенты, которые направляют отток водного содержимого из глаза разными путями, например, простагландин (Xalatan). К лазерной хирургии относится трабекулопластика, процедура, способствующая более эффективному оттоку жидкого содержимого из глаз. По данным Фонда глаукомы примерно 80% пациентов отвечает достаточно хорошо на такую процедуру, которая помогает отсрочить или избежать другого хирургического вмешательства. Однако по данным Национального института зрения (National Eye Institute) давление повышается снова в глазах у половины пациентов в течение двух лет после лазерной хирургии. Инцизионную хирургию проводят, если лечение и первоначальное применение лазера неудачны в плане снижения внутриглазного давления. Один из типов хирургического вмешательства, трабэкулоктомия, вскрывает стенку глаза таким образом, что влага может просачиваться. Однако примерно у трети пациентов после трабэкулоктомии катаракта развивается примерно в течение 5 лет (по данным Фонда глаукомы). Если трабэкулоктомия оказалась неудачной, к дополнительным инцизионным процедурам относятся помещение дренажной трубки в глаз между роговицей и радужкой и применение лазера или заморозки для разрушения ткани глаза, вырабатывающей внутриглазную жидкость. Путем хирургии можно спасти остаточное зрение пациента, но не улучшить зрение. Реально зрение после хирургического вмешательства может стать хуже.
Возрастная дегенерация желтого пятна (Age-related macular degeneration - AMD) является основной причиной слепоты у представителей белой расы старше 65 лет. Хотя ранее был получен значительный прогресс в исследовании дегенерации желтого пятна, нет способов лечения, которые предотвращают гибель нейронов при этом заболевании. Также нет эффективных способов лечения других глазных заболеваний, ассоциированных со связанной с амилоидом-бета деградацией нейронов, например, с кортикальной зрительной недостаточностью, старческими бляшками зрительного нерва, зрительной невропатией, зрительным невритом, зрительным амилоидозом и решетчатой дистрофией роговицы.
Следовательно, существует безотлагательная потребность улучшения способов лечения субъектов с глазными заболеваниями, ассоциированными с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированными со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, деградацией нейронов. Указанные патологические изменения могут быть, например, в разных тканях глаза, например, в зрительной зоне коры мозга, что приводит к кортикальной зрительной недостаточности; в передней камере глаза и зрительном нерве, приводящие к глаукоме; в хрусталике, приводящие к катаракте из-за отложения бета-амилоида; в стекловидном теле, приводящие к зрительному амилоидозу; в сетчатке, приводящие к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна, например, возрастной дегенерации желтого пятна; в зрительном нерве, приводящие к формированию старческих бляшек в зрительном нерве, зрительной невропатии и ретробульбарному невриту; в роговице, приводящие к решетчатой дистрофии роговицы. Настоящее изобретение соответствует указанной потребности за счет предоставления растворов, которые направлены на процесс, вызывающий глазное заболевание, ассоциированное со связанной с амилоидом-бета деградацией нейронов у субъекта с этим заболеванием.
Помимо этого объекта настоящее изобретение относится к применению антитела по настоящему изобретению и, согласно описанию настоящего изобретения, особенно моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, и/или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению, или смеси по настоящему изобретению и, согласно описанию настоящего изобретения, для приготовления лекарственного средства для лечения или облегчения проявлений глазных заболеваний, ассоциированных с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированных со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов. Указанные патологические изменения могут быть, например, в разных тканях глаза, например, в зрительной зоне коры мозга, что приводит к кортикальной зрительной недостаточности; в передней камере глаза и зрительном нерве, приводящие к глаукоме; в хрусталике, приводящие к катаракте из-за отложения бета-амилоида; в стекловидном теле, приводящие к зрительному амилоидозу; в сетчатке, приводящие к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна, например, возрастной дегенерации желтого пятна; в зрительном нерве, приводящие к формированию старческих бляшек в зрительном нерве, зрительной невропатии и ретробульбарному невриту; в роговице, приводящие к решетчатой дистрофии роговицы.
В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрена фармацевтическая композиция или смесь по настоящему изобретению и согласно приведенному в нем описанию, включающая антитело по настоящему изобретению, описанное в настоящем изобретении, особенно гуманизированное моноклональное антитело, включая какой-либо функциональный эквивалент антитела или его функциональные части, для использования в лечении или облегчении проявления болезней глаз, ассоциированных с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированных со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, деградации нейронов. Указанные патологические изменения могут быть, например, в разных тканях глаза, например, в зрительной зоне коры мозга, что приводит к кортикальной зрительной недостаточности; в передней камере глаза и зрительном нерве, приводящие к глаукоме; в хрусталике, приводящие к катаракте из-за отложения бета-амилоида; в стекловидном теле, приводящие к зрительному амилоидозу; в сетчатке, приводящие к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна, например, возрастной дегенерации желтого пятна; в зрительном нерве, приводящие к формированию старческих бляшек в зрительном нерве, зрительной невропатии и ретробульбарному невриту; в роговице, приводящие к решетчатой дистрофии роговицы.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают лекарственное средство, включающее моноклональное антитело, в том числе какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, фармацевтическую композицию или смесь, включающую антитело по настоящему изобретению, и, согласно описанию настоящего изобретения, в терапевтически эффективном количестве для предупреждения, лечения или облегчения проявления болезней глаз, ассоциированных с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированных со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, деградации нейронов. Указанные патологические изменения могут быть, например, в разных тканях глаза, например, в зрительной зоне коры мозга, что приводит к кортикальной зрительной недостаточности; в передней камере глаза и зрительном нерве, приводящие к глаукоме; в хрусталике, приводящие к катаракте из-за отложения бета-амилоида; в стекловидном теле, приводящие к зрительному амилоидозу; в сетчатке, приводящие к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна, например, возрастной дегенерации желтого пятна; в зрительном нерве, приводящие к формированию старческих бляшек в зрительном нерве, зрительной невропатии и ретробульбарному невриту; в роговице, приводящие к решетчатой дистрофии роговицы.
Одним из объектов настоящего изобретения является способ уменьшения нагрузки старческих бляшек в слое ганглиозных клеток сетчатки субъекта, особенно млекопитающего, но особенно человека с болезнью глаз, ассоциированной с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированной со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов, включающий введение субъекту, особенно млекопитающему, более предпочтительно человеку, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества антитела, особенно гуманизированного моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, или композиции или смеси по настоящему изобретению согласно приведенному описанию. Патологические изменения могут быть, например, в разных тканях глаза, например, в зрительной зоне коры мозга, что приводит к кортикальной зрительной недостаточности; в передней камере глаза и зрительном нерве, приводящие к глаукоме; в хрусталике, приводящие к катаракте из-за отложения бета-амилоида; в стекловидном теле, приводящие к зрительному амилоидозу; в сетчатке, приводящие к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна, например, возрастной дегенерации желтого пятна; в зрительном нерве, приводящие к формированию старческих бляшек в зрительном нерве, зрительной невропатии и ретробульбарному невриту; в роговице, приводящие к решетчатой дистрофии роговицы. В другом объекте настоящего изобретения моноклональное, антитело используемое в таких способах, является антителом ACI-24-Ab-3 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 7-8 или их функциональными частями, описанными в настоящем изобретении. В частности моноклональное антитело вырабатывается гибридомой EJ1A9, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2844. В другом объекте настоящего изобретения моноклональными антителами, используемыми в таких методах, являются антитело АСI-11-Ab-9 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 17-18 или антитело ACI-12-Ab-11 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 19-20, или их функциональные части по описанию настоящего изобретения. В частности моноклональное антитело вырабатывается гибридомой FG1F9E4, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2845, или гибридомой FK2A6A6, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2846. В частности, нагрузка бляшек снижается по меньшей мере на 20%, предпочтительно по меньшей мере на 25%, более предпочтительно по меньшей мере 30%, еще более предпочтительно более чем на 30%.
В качестве другого объекта настоящего изобретения предусмотрен способ понижения количества бляшек в слое ганглиозных клеток сетчатки субъекта, особенно млекопитающего, но особенно человека с глазным заболеванием, ассоциированным с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированным со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов, включающий введение субъекту, предпочтительно млекопитающему, более предпочтительно человеку, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества антитела, особенно моноклонального антитела, особенно моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, или композиции или смеси по настоящему изобретению, согласно описанию настоящего изобретения. Патологические изменения могут быть, например, в разных тканях глаза, например, в зрительной зоне коры мозга, что приводит к кортикальной зрительной недостаточности; в передней камере глаза и зрительном нерве, приводящие к глаукоме; в хрусталике, приводящие к катаракте из-за отложения бета-амилоида; в стекловидном теле, приводящие к зрительному амилоидозу; в сетчатке, приводящие к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна, например, возрастной дегенерации желтого пятна; в зрительном нерве, приводящие к формированию старческих бляшек в зрительном нерве, зрительной невропатии и ретробульбарному невриту; в роговице, приводящие к решетчатой дистрофии роговицы. В одном объекте настоящего изобретения моноклональное антитело, применяемое в таких способах, является антителом ACI-24-Ab-3 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 7-8 или их функциональной частью согласно описанию настоящего изобретения. В частности моноклональное антитело вырабатывает гибридома EJ1A9, депонированная 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2844. В другом объекте настоящего изобретения моноклональными антителами, используемыми в таких способах, являются антитело ACI-11-Ab-9 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 17-18 или антитело АСI-12-Ab-11 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 19-20, или их функциональные части, описанные в настоящем изобретении. В частности моноклональное антитело вырабатывается гибридомой FG1F9E4, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2845, или гибридомой FK2A6A6, депонированная 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2846. В частности количество бляшек в мозге снижается по меньшей мере на 10%, особенно по меньшей мере на 15%, более предпочтительно более чем на 15%.
В еще одном объекте настоящего изобретения предусмотрен способ снижения общего количества растворимого Аβ в слое ганглиозных клеток сетчатки у субъекта, особенно млекопитающего, но особенно человека с глазным заболеванием, ассоциированным с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированным со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов, включающий введение субъекту, предпочтительно млекопитающему, более предпочтительно человеку, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества антитела, особенно моноклонального антитела, особенно моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, или композиции или смеси по настоящему изобретению, согласно описанию настоящего изобретения. Патологические изменения могут быть, например, в разных тканях глаза, например, в зрительной зоне коры мозга, что приводит к кортикальной зрительной недостаточности; в передней камере глаза и зрительном нерве, приводящие к глаукоме; в хрусталике, приводящие к катаракте из-за отложения бета-амилоида; в стекловидном теле, приводящие к зрительному амилоидозу; в сетчатке, приводящие к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна, например, возрастной дегенерации желтого пятна; в зрительном нерве, приводящие к формированию старческих бляшек в зрительном нерве, зрительной невропатии и ретробульбарному невриту; в роговице, приводящие к решетчатой дистрофии роговицы. В одном объекте настоящего изобретения моноклональное антитело, применяемое в таких способах, является антителом ACI-24-Ab-3 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 7-8 или их функциональной частью согласно описанию настоящего изобретения. В частности моноклональное антитело вырабатывает гибридома EJ1A9, депонированная 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2844. В другом объекте настоящего изобретения моноклональными антителами, используемыми в таких способах, являются антитело ACI-11-Ab-9 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 17-18 или антитело АСI-12-Ab-11 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 19-20, или их функциональные части, описанные в настоящем изобретении. В частности моноклональное антитело вырабатывается гибридомой FG1F9E4, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2845, или гибридомой FK2A6A6, депонированная 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2846.
В еще одном объекте настоящего изобретения предусмотрен способ предупреждения, лечения или облегчения признаков глазного заболевания, ассоциированного с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированным со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов, у субъекта, предпочтительно млекопитающему, более предпочтительно человеку с глазным заболеванием, ассоциированным со связанной с амилоидом бета деградацией нейронов, введением терапевтически эффективного количества антитела, особенно моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, или композиции или смеси по настоящему изобретению, согласно описанию настоящего изобретения, субъекту, предпочтительно млекопитающему, более предпочтительно человеку, нуждающемуся в таком лечении. Патологические изменения могут быть, например, в разных тканях глаза, например, в зрительной зоне коры мозга, что приводит к кортикальной зрительной недостаточности; в передней камере глаза и зрительном нерве, приводящие к глаукоме; в хрусталике, приводящие к катаракте из-за отложения бета-амилоида; в стекловидном теле, приводящие к зрительному амилоидозу; в сетчатке, приводящие к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна, например, возрастной дегенерации желтого пятна; в зрительном нерве, приводящие к формированию старческих бляшек в зрительном нерве, зрительной невропатии и ретробульбарному невриту; в роговице, приводящие к решетчатой дистрофии роговицы. В одном объекте настоящего изобретения моноклональным антителом, применяемым в таких способах, является антитело ACI-24-Ab-3 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 7-8 или их функциональной частью согласно описанию настоящего изобретения. В частности моноклональное антитело вырабатывает гибридома EJ1A9, депонированная 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2844. В другом объекте настоящего изобретения моноклинальными антителами, используемыми в таких способах, являются антитело ACI-11-Ab-9 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 17-18 или антитело ACI-12-Ab-11 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 19-20, или их функциональные части, описанные в настоящем изобретении. В частности моноклональное антитело вырабатывается гибридомой FG1F9E4, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2845, или гибридомой FK2A6A6, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2846.
В другом объекте настоящего изобретения предусмотрен способ диагностики глазного заболевания, ассоциированного с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированного со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, деградацией нейронов, у субъекта, нуждающегося в этом, включающий обнаружение иммуноспецифического связывания антитела, особенно моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, или композицию или смесь по настоящему изобретению, и, согласно описанному в настоящем изобретении, с эпитопом амилоидного белка в образце или in situ, который включает стадии: а) приведения образца, или специфической части тела, или области тела, предположительно содержащих амилоидный белок, в контакт с антителом по настоящему изобретению, причем антитело связывает конформационный эпитоп амилоидного белка; (б) предоставления возможности для антитела связать какой-либо амилоидный белок с формированием иммунологического комплекса, (в) выявления формирования иммунологического комплекса, особенно таким образом, что наличие или отсутствие иммунологического комплекса коррелирует с наличием или отсутствием амилоидного белка; и (г) корреляции наличия или отсутствия иммунологического комплекса с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце, или определенной части, или области организма. Согласно другому объекту настоящего организма моноклональное антитело, используемое в таких способах, представляет антитело ACI-24-Ab-3 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 7-8 или его функциональные части, описанные в настоящем изобретении. В частности моноклональное антитело вырабатывается гибридомой EJ1A9, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2844. В другом объекте настоящего изобретения моноклональными антителами, используемыми в таких способах, являются антитело ACI-11-Ab-9 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 17-18 или антитело ACI-12-Ab-11 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 19-20, или их функциональные части, описанные в настоящем изобретении. В частности моноклональное антитело вырабатывается гибридомой FG1F9E4, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2845, или гибридомой FK2A6A6, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2846.
В другом объекте настоящего изобретения предусмотрен способ диагностики предрасположенности к глазному заболеванию, ассоциированному с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированного со связанными с амилоидом бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов, у субъекта, нуждающегося в этом, включающий обнаружение специфического связывания антитела, особенно моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, или композицию или смесь по настоящему изобретению, и согласно описанию настоящего изобретения, с эпитопом амилоидного белка в образце или in situ, который включает стадии: (а) приведения образца, или специфической части тела, или области тела, предположительно содержащих амилоидный белок, в контакт с антителом, причем антитело связывает конформационный эпитоп амилоидного белка; (б) предоставления возможности для антитела связать какой-либо амилоидный белок в образце с формированием иммунологического комплекса, (в) выявления формирования иммунологического комплекса, (г) корреляции наличия или отсутствия иммунологического комплекса с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце, или определенной части, или области организма, (д) сравнения количества указанного иммунологического комплекса с нормальной контрольной величиной, причем повышение количества комплекса по сравнению с нормальной контрольной величиной показывает, что субъект подвержен риску развития заболевания, ассоциированного с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированного со связанными с амилоидом бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы. В другом объекте настоящего изобретения моноклональное антитело, используемое в таких методах, является антителом ACI-24-Ab-3 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 7-8 или его функциональными частями, описанными в настоящем изобретении. В частности моноклональное антитело вырабатывается гибридомой EJ1A9, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2844. В другом объекте настоящего изобретения моноклональными антителами, используемыми в таких способах, являются антитело АС1-11-Ab-9 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 17-18 или антитело ACI-12-Ab-11 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 19-20, или их функциональные части, описанные в настоящем изобретении. В частности моноклональное антитело вырабатывается гибридомой FG1F9E4, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2845, или гибридомой FK2A6A6, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2846.
В другом объекте настоящего изобретения предусмотрен способ мониторинга минимального остаточного глазного заболевания, ассоциированного с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированного со связанными с амилоидом бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов, у субъекта после лечения фармацевтической композицией по настоящему изобретению, причем способ включает: (а) приведения образца, или специфической части тела, или области тела, предположительно содержащих амилоидный белок, в контакт с антителом, особенно моноклональным антителом, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, или композицией или смесью по настоящему изобретению, и которое описано в настоящем изобретении, причем указанное антитело связывает эпитоп амилоидного белка, (б) предоставления возможности для антитела связать какой-либо амилоидный белок с формированием иммунологического комплекса, (в) выявления формирования иммунологического комплекса, (г) корреляции наличия или отсутствия иммунологического комплекса с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце, или определенной части, или области организма, и (д) сравнения количества указанного иммунологического комплекса с нормальной контрольной величиной, причем повышение количества комплекса по сравнению с нормальной контрольной величиной показывает, что у субъекта все еще имеется минимальное остаточное глазное заболевание, ассоциированное с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированное со связанными с амилоидом бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы. В другом объекте настоящего изобретения моноклональное антитело, используемое в таких методах, является антителом ACI-24-Ab-3 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 7-8 или его функциональными частями, описанными в настоящем изобретении. В частности моноклональное антитело вырабатывается гибридомой EJ1A9, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2844. В другом объекте настоящего изобретения моноклональными антителами, используемыми в таких способах, являются антитело ACI-11-Ab-9 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 17-18 или антитело ACI-12-Ab-11 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 19-20, или их функциональные части, описанные в настоящем изобретении. В частности моноклональное антитело вырабатывается гибридомой FG1F9E4, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2845, или гибридомой FK2A6A6, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2846.
Еще одним объектом настоящего изобретения является способ прогнозирования способности к реагированию субъекта, подвергаемого лечению фармацевтической композицией по настоящему изобретению, включающий стадии: (а) приведения образца, или специфической части тела, или области тела, предположительно содержащих амилоидный белок, в контакт с антителом, особенно моноклональным антителом, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, или композицией или смесью по настоящему изобретению, и которое описано в настоящем изобретении, причем указанное антитело связывает эпитоп амилоидного белка, (б) предоставления возможности для антитела связать какой-либо амилоидный белок с формированием иммунологического комплекса, (в) выявления формирования иммунологического комплекса, (г) корреляции наличия или отсутствия иммунологического комплекса с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце, или определенной части, или области организма, и (д) сравнения количества указанного иммунологического комплекса до и после начала лечения, причем снижение количества иммунологического комплекса показывает, что субъект обладает большим потенциалом ответа на лечение. В другом объекте настоящего изобретения моноклональное антитело, используемое в таких методах, является антителом ACI-24-Ab-3 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 7-8 или его функциональными частями, описанными в настоящем изобретении. В частности моноклональное антитело вырабатывается гибридомой EJ1A9, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2844. В другом объекте настоящего изобретения моноклональными антителами, используемыми в таких способах, являются антитело ACI-11-Ab-9 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 17-18 или антитело ACI-12-Ab-11 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 19-20, или их функциональные части, описанные в настоящем изобретении. В частности моноклональное антитело вырабатывается гибридомой FG1F9E4, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2845, или гибридомой FK2A6A6, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2846.
Другим объектом настоящего изобретения является способ сохранения или понижения глазного давления в глазах субъекта, особенно млекопитающего, более конкретно человека с глазным заболеванием, ассоциированным с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированным со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, деградацией нейронов, включающий введение субъекту, особенно млекопитающему, точнее человеку, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества антитела, особенно моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, или композицию или смесь по настоящему изобретению, согласно описанию настоящего изобретения. Патологические нарушения могут быть, например, в разных тканях глаза, например, в зрительной зоне коры мозга, что приводит к кортикальной зрительной недостаточности; в передней камере глаза и зрительном нерве, приводящие к глаукоме; в хрусталике, приводящие к катаракте из-за отложения бета-амилоида; в стекловидном теле, приводящие к зрительному амилоидозу; в сетчатке, приводящие к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна, например, возрастной дегенерации желтого пятна; в зрительном нерве, приводящие к формированию старческих бляшек в зрительном нерве, зрительной невропатии и ретробульбарному невриту; в роговице, приводящие к решетчатой дистрофии роговицы. В другом объекте настоящего изобретения моноклональное антитело, используемое в таких методах, является антителом ACI-24-Ab-3 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 7-8 или его функциональными частями, описанными в настоящем изобретении. В частности моноклональное антитело вырабатывается гибридомой EJ1A9, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2844. В другом объекте настоящего изобретения моноклональными антителами, используемыми в таких способах, являются антитело ACI-11-Ab-9 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 17-18 или антитело ACI-12-Ab-11 с полипептидными последовательностями SEQ ID NO: 19-20, или их функциональные части, описанные в настоящем изобретении. В частности моноклональное антитело вырабатывается гибридомой FG1F9E4, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2845, или гибридомой FK2A6A6, депонированной 25 мая 2007 года под номером DSM АСС2846.
Определения
Понятия «полипептид», «пептид» и «белок» в контексте настоящего изобретения взаимозаменяемы и означают биомолекулу, состоящую из аминокислот, связанных пептидными связями.
В контексте настоящего изобретения существительные в единственном числе могут означать «один или несколько» или подразумевать множественное число, если это не противоречит контексту.
Понятия «обнаружение» и «обнаруженный», применяемые в контексте настоящего изобретения, означают применение известных методик для выявления биологических молекул, например, иммунохимических или гистологических методик, и относятся к качественному или количественному определению наличия или концентрации исследуемой биомолекулы.
1-38
1-41
1-43
Понятия «амилоид β, Аβ или β-амилоид» представляют известный в данной области термин и относятся к белкам и пептидам амилоида β, белку-предшественнику амилоида β (АРР), а также к модификациям, фрагментам и каким-либо их функциональным эквивалентам. В частности амилоид Р в контексте настоящего изобретения означает какой-либо фрагмент, получаемый в результате протеолитического расщепления АРР, но особенно те фрагменты, которые вовлечены или связаны с амилоидными патологиями, включая, но ими не ограничиваясь, Aβ, АР1.39, Apt.40, Aβ Apt.42 и Аβ.
Структуры и последовательности амилоидных Р пептидов, указанных выше, известны специалистам в данной области, а способы получения указанных пептидов или их экстракции из мозга и других тканей описаны, например, в работе Glenner, Wong, Biochem Biophys Res Comm 129, 1984, cc. 885-890. Кроме того, амилоидные p пептиды в различных формах также коммерчески доступны.
Понятия «Аβ фибриллы», или «Аβ филаменты», или «амилоидные фибриллы» относятся к полимерным формам мономерного белка, формируя отдельные или собранные в пучки волокна с постоянным диаметром волокон, которые нерастворимы в водной среде и содержат большие количества кросс-β структуры в сердцевине; по большей части с бета-тяжами, перпендикулярными оси фибрилл.
Понятия «мономерный Аβ» или «мономер Аβ» относится к полностью растворимому белку амилоиду β без агрегированных комплексов в водной среде.
Понятия «протофибриллы» или «препарат протофибрилл» в контексте настоящего изобретения относятся к высокомолекулярным фракциям полимерных Аβ амилоидных пептидов, которые обогащены растворимыми олигомерами амилоидов Аβ.
Понятия «полимерный растворимый амилоид», «олигомерные амилоидные пептиды Аβ» и «олигомер Аβ» используют в настоящем изобретении взаимозаменяемо, они относятся к множественным агрегированным мономерам амилоидных пептидов, или амилоидо-подобных пептидов, или модифицированных или усеченных амилоидных пептидов или других производных амилоидных пептидов, формируя олигомерные или полимерные структуры, которые растворимы и в водной среде in vitro, и in vivo в организме млекопитающего или человека, более предпочтительно в мозге, но особенно относится к множественным агрегированным мономерам амилоидных пептидов или модифицированным или усеченным амилоидным пептидам или их производным, которые растворимы в организме млекопитающего или человека, более предпочтительно в мозге.
Понятия «полимерные растворимые амилоидные Аβ пептиды», «олигомерные амилоидные Аβ пептиды» и «олигомер Аβ» используют в настоящем изобретении взаимозаменяемо, они относятся к множественным агрегированным мономерам амилоидных АВ пептидов, или к модифицированным или усеченным амилоидным Аβ пептидам или к другим производным амилоидных Аβ пептидов, формируя олигомерные или полимерные структуры, которые растворимы и в водной среде in vitro, и in vivo в организме млекопитающего или человека, более предпочтительно в мозге, но особенно относится к множественным агрегированным мономерам амилоида Р (Аβ) или к модифицированным или усеченным пептидам амилоида Р (Аβ) или их производным, которые растворимы в организме млекопитающего или человека, более предпочтительно в мозге.
1-42
Моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, которое связывается с Аβ мономерным пептидом 1-40, особенно с Аβ мономерным пептидом 1-40 и с растворимым полимерным и/или олигомерным амилоидным пептидом, включая множество Аβ 1.42 мономерных пептидов, но существенно слабее связывается с Аβ мономерным пептидом 1-28, проявляет промежуточное связывание с мономерным пептидом  и практически не связывается с Аβ мономерным пептидом 17-40; понятие «существенно более слабое связывание» означает связывание, которое по меньшей мере примерно на 80%, особенно по меньшей мере примерно на 85%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90%, но особенно по меньшей мере примерно на 95% меньше, чем связывание с Аβ мономерным пептидом 1-40.
1-42
Моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, которое связывается с Аβ мономерным пептидом 1-42 и полимерными растворимыми пептидами Аβ, включая множество Аβ мономерных пептидов и фибрилл или волокон Аβ, включая множество указанных полимерных пептидов, но существенно слабее связывается с мономерным пептидом 1-28, практически не связывается с мономерным пептидом 17-40; понятие «существенно более слабое связывание» означает связывание, которое по меньшей мере примерно на 60%, особенно по меньшей мере примерно на 65%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, но особенно по меньшей мере примерно на 90% и до 100% меньше, чем связывание с Аβ мономерным пептидом 1-42.
1-42
Моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, которое связывается с Аβ мономерным пептидом 1-40, особенно с Аβ мономерным пептидом 1-40 и с растворимым полимерным и/или олигомерным амилоидным пептидом, включая множество Aβ мономерных пептидов, но существенно слабее связывается с Аβ мономерным пептидом 1-28, проявляет промежуточное связывание с мономерным пептидом 1.42 и практически не связывается с Аβ мономерным пептидом 17-40; понятие «промежуточное связывание» означает связывание, которое по меньшей мере примерно на 60%, особенно по меньшей мере примерно на 65%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80% меньше, чем связывание с Аβ мономерным пептидом 1-40.
1-42
1-42
Моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, которое связывается с Аβ мономерным пептидом 1-40, особенно с Аβ мономерным пептидом 1-40 и с растворимым полимерным и/или олигомерным амилоидным пептидом, включая множество Aβ мономерных пептидов, но существенно слабее связывается с Аβ мономерным пептидом 1-28, проявляет промежуточное связывание с мономерным пептидом  и практически не связывается с Аβ мономерным пептидом 17-40; понятие «практически не связывается» означает связывание, которое по меньшей мере примерно на 95%, особенно по меньшей мере примерно на 98%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 99% и до 100% меньше, чем связывание с Аβ мономерным пептидом 1-40.
1-42
1-42
Моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, которое связывается с Аβ мономерным пептидом 1-42 и полимерными растворимыми пептидами Ар, включая множество Aβ мономерных пептидов и Aβ мономерных пептидов и Аβ фибрилл или волокон, включая множество указанных полимерных пептидов, но существенно слабее связывается с Аβ мономерным пептидом 1-28, но практически не связывается с Аβ мономерным пептидом 17-40; понятие «практически не связывается» означает связывание, которое по меньшей мере примерно на 85%, особенно по меньшей мере примерно на 90%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 98%, но особенно предпочтительно по меньшей мере примерно на 99% и до 100% меньше, чем связывание с Аβ мономерным пептидом 1-42.
Связывание антитела по настоящему изобретению, описанного в настоящем изобретении, особенно моноклонального антитела, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, с Аβ мономерными пептидами определяют методом типа ELISA, особенно методом ELISA, используя биотинилированные Аβ мономерные пептиды, особенно методом ELISA, описанным ниже в примерах 1.16 и 2.16.
Понятие «выделенная» относится к биологической молекуле, освобожденной по меньшей мере от некоторых компонентов, с которыми эта молекула естественным образом вместе содержится.
К «заболеваниям и расстройствам, которые вызваны или ассоциированы с амилоидом или амилоидоподобными белками» относятся, но ими не ограничиваются, заболевания и расстройства, вызванные наличием или действием амилоидоподобных белков в мономерной, фибрильной или полимерной форме, или какой-либо комбинацией этих трех форм. К таким заболеваниям и расстройствам относятся, но ими не ограничиваются, амилоидоз, эндокринные опухоли и глазные заболевания, ассоциированные с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированные со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, например, с деградацией нейронов. Указанные патологические нарушения могут наблюдаться, например, в разных тканях глаза, например, в зрительной зоне коры мозга, приводящие к кортикальной зрительной недостаточности; в передней камере глаза и зрительном нерве, приводящие к глаукоме; в хрусталике, приводящие к катаракте из-за отложения бета-амилоида; в стекловидном теле, приводящие к зрительному амилоидозу; в сетчатке, приводящие к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна, например, возрастной дегенерации желтого пятна; в зрительном нерве, приводящие к формированию старческих бляшек в зрительном нерве, зрительной невропатии и зрительному невриту; в роговице, приводящие к решетчатой дистрофии роговицы.
Фраза «глазные заболевания, ассоциированные с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированные со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов» относится к патологическим нарушениям, ассоциированным с аберрантной функцией β-амилоида или отложением, приводящим к деградации нейронов, которые могут быть, например, в разных тканях глаза, например, в зрительной зоне коры мозга, приводящие к кортикальной зрительной недостаточности; в передней камере глаза и зрительном нерве, приводящие к глаукоме; в хрусталике, приводящие к катаракте из-за отложения бета-амилоида; в стекловидном теле, приводящие к зрительному амилоидозу; в сетчатке, приводящие к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна, например, возрастной дегенерации желтого пятна; в зрительном нерве, приводящие к формированию старческих бляшек в зрительном нерве, зрительной невропатии и зрительному невриту; в роговице, приводящие к решетчатой дистрофии роговицы.
Понятие «амилоидоз» относится к группе заболеваний и расстройств, связанных с формированием амилоидных бляшек, включая, но ими не ограничиваясь, вторичный амилоидоз и возрастной амилоидоз, включая, но ими не ограничиваясь, неврологические расстройства, например, болезнь Альцгеймера (БА), включая заболевания или состояния, характеризующиеся утратой когнитивного объема памяти, например, умеренное когнитивное нарушение (УКН), болезнь диффузных поражений телец Леви, синдром Дауна, наследственное цереброспинальное кровоизлияние с амилоидозом (типа Dutch), комплекс паркинсонизм-деменция о. Гуам, а также другие заболевания, которые основаны или связаны с белками амилоидного типа, например, прогрессирующий супрануклеарный паралич, рассеянный склероз, болезнь Крейсфельда-Якоба, болезнь Паркинсона, слабоумие, связанное со СПИД, амиотропный латеральный склероз (amyotropic lateral sclerosis - ALS), миозит с включенными тельцами (МВТ), диабет взрослых, старческий кардиальный амилоидоз, и другие заболевания, включая глазные заболевания, связанные с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно связанные с амилоид-бета-связанными патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, например, с деградацией нейронов. Указанные патологические нарушения могут наблюдаться, например, в разных тканях глаза, например, в зрительной зоне коры мозга, что приводит к кортикальной зрительной недостаточности; в передней камере глаза и зрительном нерве, приводящие к глаукоме; в хрусталике, приводящие к катаракте из-за отложения бета-амилоида; в стекловидном теле, приводящие к зрительному амилоидозу; в сетчатке, приводящие к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна, например, возрастной дегенерации желтого пятна; в зрительном нерве, приводящие к формированию старческих бляшек в зрительном нерве, зрительной невропатии и зрительному невриту; в роговице, приводящие к решетчатой дистрофии роговицы.
Понятия «антитело» или «антитела» в контексте настоящего изобретения являются известными в данной области терминами и означают молекулы или действующие фрагменты молекул, которые связываются с известными антигенами, особенно молекулы иммуноглобулина, и иммунологически действующие части молекул иммуноглобулина, т.е. молекул, которые содержат сайт связывания, который специфически связывает антиген. Иммуноглобулин по настоящему изобретению может принадлежать к какому-либо типу (IgG, IgM, IgD, IgE, IgA и IgY), или классу (IgG1 IgG2, IgG3, IgG4, IgAl и IgA2) или подклассу молекул иммуноглобулинов.
2
«Антитела», подпадающие в рамки охвата настоящего изобретения, включают моноклональные антитела, поликлональные антитела, химерные антитела, одноцепочечные, двухвалентные или биспецифические, симинизированные, антитела человека и гуманизированные антитела, а также их действующие фрагменты. К примерам действующих фрагментов молекул, которые связываются с известными антигенами, относятся фрагменты Fab, F(ab'), scFv и Fv, включая продукты библиотеки экспрессии Fab иммуноглобулинов и эпитоп-связывающие фрагменты какого-либо антитела и фрагментов, указанных выше.
Такие действующие фрагменты могут быть получены из антитела по настоящему изобретению с помощью ряда методик. Например, моноклональные антитела могут быть расщеплены ферментом, например, пепсином, и подвергнуты HPLC гель фильтрации. Соответствующая фракция, содержащая фрагменты Fab, затем может быть собрана и сконцентрирована мембранной фильтрацией и прочее. Дальнейшее описание основных методик по выделению действующих фрагментов антител см. в публикациях Khaw В. А. и др., J. Nucl. Med. 23, 1982, сс.1011-1019; Rousseaux и др. Methods Enzymology, 121, 1986, изд. Academic Press, сс.663-669.
В контексте настоящего изобретения понятие «гуманизированное антитело» относится к типу сконструированного антитела, у которого области CDR, полученные от иммуноглобулина донора, которым не является человек, а оставшиеся части молекулы иммуноглобулина получены от одного (или нескольких) иммуноглобулина (иммуноглобулинов) человека. Кроме того, остатки поддержки каркасного участка могут быть изменены для сохранности связывающего сродства. Способы получения «гуманизированных антител» известны специалистам в данной области. (См., например, Queen и др., Proc. Natl Acad Sci USA, 86, 1989, сс.10029-10032, Hodgson и др., Bio/Technology, 9, 1991, с.421).
«Гуманизированное антитело» может также быть получено с помощью нового генно-инженерного подхода, который позволяет получать поликлональные антитела типа антител человека со сформировавшимся сродством у крупных животных, например, кроликов (см., например, US 7129084).
Понятие «моноклональное антитело» также известно в данной области и относится к антителу, которое в большом количестве получают в лаборатории из одного клона и которое распознает только один антиген. Моноклональное антитела обычно получают путем гибридизации нормально короткоживущих антитело-продуцирующих В-клеток с быстрорастущими клетками, например раковыми клетками (иногда называемыми «бессмертными» клетками). Образуемые гибридные клетки, или гибридомы, быстро размножаются, создавая клон, который вырабатывает большие количества антитела. Для цели настоящего изобретения понятие «моноклональное антитело» также подразумевает антитела, которые вырабатываются материнским клоном, который еще не достиг полной моноклональности.
Понятие «CDR» относится к гипервариабельной области антитела. Понятие «гипервариабельная область», «HVR» или «HV» в контексте настоящего изобретения относится к областям вариабельного домена антитела, которые гипервариабельны по последовательности и/или по форме структурно выраженных петель. Обычно антитела содержат шесть гипервариабельных областей - трех в VH (H1, Н2, Н3 и трех в VL (L1, L2, L3). Используют ряд ограничений гипервариабельных областей, которые применены в настоящем изобретении. Комплементарно детерминируемые области по Kabat основаны на вариабельности последовательности и используются наиболее часто (Kabat и др. в кн.: «Sequences of Proteins of Immunological Intcrcst», 1991, 5-е изд., Министерство здравоохранения, Национальный институт здравоохранения, Bethesda, Мэриленд).
Обозначения «НС» и «IX», предшествующие обозначению «CDR», относятся к CDR тяжелой цепи (heavy chain) и легкой цепи (light chain) соответственно. По Chothia, напротив, ссылаются на расположение структурных петель (Chothia, Lesk J. Mol. Biol. 196, 1987, cc.901-917). Гипервариабельные области AbM подставляют компромисс между CDR по Kabat и структурными петлями по Chothia, они используются в программном моделировании антител Oxford Molecular's AbM. «Контактные» гипервариабельные области основаны на анализе имеющихся сложных кристаллических структур. Остатки от каждой из этих гипервариабельных областей указаны ниже.
Петля
Kabat
AbM
Chothia
Контакт
-
-
-
-
-
LI
L24--L34
L24--L34
L26--L32
L30--L36
L2
L50--L56
L50--L56
L50--L52
L46--L55
L3
L89--L97
L89--L97
L91--L96
L89--L96
HI (нумерация no Kabat)
Н31--Н35В
Н26--Н35В
H26--H32
H30--H35B
HI(нумерация по Chothia)
Н31--Н35
Н26--Н35
H26--H32
H30--H35
H2
Н50--Н65
Н50--Н58
H53--H55
H47--H58
НЗ
Н95--H102
Н95--H102
H96--H101
H93--H101
Гипервариабельные области могут включать следующие «протяженные гипервариабельные области»: 24-36 или 24-34 (L1), 46-56 или 50-56 (L2) и 89-97 или 89-96 (L3) в VL и 26-35 (H1), 50-65 или 49-65 (Н2) и 93-102, 94-102, или 95-102 (НЗ) в VH. Остатки вариабельного домена нумерованы по Kabat и др., см. выше, для каждого из этих определений.
е
Понятие «нумерация остатков вариабельного домена по Kabat» или «нумерация положения аминокислоты по Kabat» и различные вариации этого понятия относятся к системе нумерации доменов тяжелой цепи или доменов легкой цепи при компиляции антител, описанной Kabat и др. в кн.: «Sequence of Proteins of Immunological Interest)), 1991, 5 изд., Министерство здравоохранения и социального развития, Национальный институт здоровья, Bethesda, Мэриленд.
При использовании этой системы нумерации реальная линейная аминокислотная последовательность может содержать меньше аминокислот или дополнительные аминокислоты, соответствующие укорочению или инсерции, FR или HVR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может включать инсерцию одиночной аминокислоты (остаток 52а по Kabat) после остатка 52 в Н2 и инсертированные остатки (например, остатки 82а, 82b и 82с, и др. по Kabat) после остатка 82 FR тяжелой цепи. Нумерация остатков по Kabat может быть определена для данного антитела путем выравнивания по областям гомологии последовательности антитела со «стандартной» нумерованной по Kabat последовательностью.
1-42
1-42
1-42
1-42
Понятие «функционально эквивалентное антитело» в рамках охвата настоящего изобретения относится к антителу, которое существенным образом разделяет по меньшей мере одно важное функциональное свойство с антителом, например, функциональные свойства, к которым в контексте настоящего изобретения относят, но ими не ограничиваются: связывающую специфичность в отношении β-амилоидного белка, особенно Аβ белка, и более конкретно в отношении области эпитопа 4-16 белка Аβ, иммунореактивность in vitro, подавление агрегирования мономеров Аβ в высокомолекулярные полимерные фибриллы и/или дезагрегирования ранее сформированных полимерных фибрилл Аβ, и/или свойство разрушения β-слоя и облегчения проявлений заболеваний и расстройств, которые вызваны или связаны с амилоидом или амилоидоподобным белком, но ими перечень не ограничивается, амилоидоза, эндокринных опухолей и глазных заболеваний, ассоциированных с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированных со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов, при профилактическом или терапевтическом введении. Антитела могут относиться к какому-либо классу, например, IgG, IgM или IgA и др., или какому-либо подклассу, например, IgG1, IgG2a и др., и другим подклассам, описанным в настоящем изобретении или известным в данной области, но особенно к классу IgG4. Кроме того, антитела могут быть получены каким-либо способом, например, фаговым дисплеем, или могут быть получены в каком-либо организме или линии клеток, включая бактерий, насекомых, млекопитающих, или клетки или линии клеток другого типа, которые вырабатывают антитела с определенными свойствами, например, гуманизированные антитела. Антитела могут также быть получены комбинированием части Fab и области Fc от разных видов.
Понятия «биспецифичное», «бифункциональное» или «биэффективное» применительно к антителам используется в настоящем изобретении взаимозаменяемо для описания антитела, которое проявляет и ингибирующее действие в отношении формирования амилоида или амилоидоподобного волокна, и дезагрегирующее действие в отношении амилоидных и амилоидоподобных волокон.
Понятие «антиген» относится к целому соединению или к его фрагменту, которые могут вызвать в организме иммунный ответ, особенно у животного, более предпочтительно у млекопитающего, включая человека. Понятие «антиген» включает иммуногены и их области, ответственные за антигенность, или антигенные детерминанты.
В контексте настоящего изобретения понятие «растворимый» означает частичную или полную растворимость в водном растворе.
Также в контексте настоящего изобретения понятие «иммуногенный» относится к веществам, которые вызывают или повышают выработку антител, Т-клеток и реактивных иммунных клеток, направленных против иммуногенного агента, и участвуют в иммунном ответе человека или животных.
Иммунный ответ происходит, когда индивидуум производит достаточное количество антител, Т-клеток и других реактивных иммунных клеток против введенных иммуногенных композиций настоящего изобретения для ослабления или облегчения расстройства, подвергаемого лечению.
Фраза «полимерный растворимый амилоид» относится к множеству агрегированных мономеров амилоидных пептидов, или амилоидоподобных пептидов, или модифицированных или усеченных амилоидных пептидов или других производных амилоидных пептидов, формируя олигомерные или полимерные структуры, которые растворимы в организме млекопитающего или человека, особенно в мозге, особенно к множеству агрегированных мономеров амилоида β (Аβ) или к модифицированным или усеченным пептидам амилоида β (Аβ) или их производным, которые растворимы в организме млекопитающего или человека, особенно в мозге.
Понятие «гибридома» принято в данной области и известно специалистам; оно относится к клеткам, полученным путем гибридизации клетки, вырабатывающей антитело, и бессмертной клетки, например, клетки множественной миеломы. Такая гибридная клетка способна непрерывно вырабатывать антитело. См. выше определение «моноклонального антитела» и примеры ниже для более подробного описания метода гибридизации.
Понятие «носитель» в контексте настоящего изобретения означает структуру, в которую антигенный пептид или надмолекулярная конструкция может быть включена или может быть ассоциирована, тем самым презентируя или выставляя антигенные пептиды или часть пептида в иммунную систему человека или животного. Какая-либо частица может быть соответствующим образом пригодна для терапии животного или человека таким образом, например, что растворитель, частица или корпускулярное тело могут применяться в качестве носителя в контексте настоящего изобретения. Понятие также включает способы доставки, в которых композиции надмолекулярной антигенной конструкции, включающие антигенный пептид, могут быть транспортированы в соответствующие места за счет механизмов доставки. В одном из примеров такой системы доставки используют коллоидные металлы, например, коллоидное золото. Понятие «носитель» также относится к механизмам доставки, известным специалистам в данной области, включая, но ими не ограничиваясь, гемоцианин моллюска блюдечка (keyhole limpet hemocyanin - KLH), бычий сывороточный альбумин (БСА) и другие адъюванты.
В антигенной надмолекулярной конструкции по настоящему изобретению липосома может иметь двойную функцию, заключающуюся в том, что она может применяться в качестве носителя, включающего надмолекулярную конструкцию, например, описанную в настоящем изобретении, и в то же время функцию адъюванта для повышения или стимуляции иммунного ответа у целевого животного или человека, подвергаемого лечению терапевтической вакциной по настоящему изобретению. Также следует учитывать, что композиции надмолекулярной антигенной конструкции по настоящему изобретению могут также включать дополнительные адъюванты, например, липид А, квасцы, кальций фосфат, интерлейкин 1 и/или микрокапсулы палисахаридов и белков, но особенно детоксифицированный липид А, например, монофосфорильный или дифосфорильный липид А, или квасцы, дополнительные консерванты, разбавители, эмульгаторы, стабилизаторы и другие компоненты, известные и используемые в данной области для вакцин. Кроме того, система адъюванта, известного в данной области, может применяться в композиции по настоящему изобретению. К таким адъювантам относится, но ими не ограничиваются, неполный адъювант Фройнда, полный адъювант Фройнда, полидиспергированный β-(1,4) связанный ацетилированный маннан («Асетаппап»), продукт Titermax (адъюванты сополимера полиоксиэтилена-полиоксипропилена от фирмы CytRx Corporation), модифицированный липидный адъювант от фирмы Chiron Corporation, адъюванты производного сапонина от фирмы Cambridge Biotech, убитые клетки Bordetella pertussis, дипополисахарид грамотрицательных бактерий, крупные полимерные анионы, например, сульфат декстрана, и неорганические гели, например, квасцы, алюминий гидрохлорид или алюминий фосфат.
К белкам-носителям, которые могут применяться в композициях надмолекулярной антигенной конструкции настоящего изобретения, относятся, но ими перечень не ограничивается, белок, связывающий мальтозу, (maltose binding protein - МВР); бычий сывороточный альбумин (БСА); гемоцианин моллюска блюдечка (keyhole lympet hemocyanin - KLH); овулярный альбумин; флагеллин; тироглобулин; сывороточный альбумин каких-либо видов; гамма глобулин каких-либо видов; сингенные клетки; сингенные клетки, несущие антигены 1а; и полимеры D- и/или L-аминокислоты.
Кроме того, понятие «терапевтически эффективное количество» относится к количеству антитела, которое при введении человеку или животному вызывает иммунный ответ, достаточный для терапевтического эффекта в организме указанного человека или животного. Эффективное количество легко может быть определено специалистом в данной области рутинными методами.
«Гомологию» между двумя последовательностями определяют по идентичности последовательностей. Если две последовательности, которые сравнивают друг с другом, отличаются по длине, идентичность последовательностей предпочтительно относится к проценту нуклеотидных остатков более короткой последовательности, которые идентичны иуклеотидиым остаткам более длинной последовательности. Идентичность последовательности обычно может быть определена с применением компьютерных программ, например, программы Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, версия 8 для Unix, фирма Genetics Computer Group по адресу: University Research Park, 575 Science Drive Madison, WI 53711). Программа Bestfit использует алгоритм гомологии Smith и Waterman, Advances in Applied Mathematics 2, 1981, cc.482-489, чтобы установить сегмент, имеющий самую высокую идентичность двух последовательностей. При использовании программы Bestfit или другой программы выравнивания последовательностей для определения, может ли определенная последовательность иметь, например, 95% идентичности с референсной последовательностью по настоящему изобретению, параметры предпочтительно так подобраны, что процент идентичности рассчитывают по всей длине референсной последовательности, и что допустимы гомологичные гэпы до 5% от общего числа нуклеотидов в референсной последовательности. При использовании программы Bestfit так называемые необязательные параметры предпочтительно оставляют в их заранее установленных («по умолчанию») величинах. Отклонения, проявляемые при сравнении определенной последовательности с описанными выше последовательностями по настоящему изобретению, могут быть вызваны, например, путем добавления, делеции, замещения, инсерции или рекомбинации. Такое сравнение последовательностей предпочтительно также может выполняться по программе «fasta20u66» (версия 2.0и66, сентябрь 1998, предложена William R. Pearson и Университетом Вирджинии, см. также W.R.Pearson, Methods in Enzymology 183, 1990, cc.63-98, приводимые в настоящем изобретении примеры и сайт http://workbench.sdsc.edu/). Для этой цели могут быть применены установки «параметров по умолчанию».
В контексте настоящего изобретения понятие «консервативное изменение» относится к изменениям, которые в существенной степени конформационно и антигенно нейтральны, производя минимальные изменения в третичной структуре мутантных полипептидов, или производя минимальные изменения в антигенных детерминантах мутантных полипептидов, соответственно, по сравнению с нативным белком. Применительно к антителам и фрагментам антител по настоящему изобретению консервативное изменение означает аминокислотное замещение, которое не изменяет способности антитела связываться с рецептором субъекта. Специалист в данной области может прогнозировать, какие аминокислотные замещения могут быть получены при поддержании высокой вероятности поддержания конформационной и антигенной нейтральности. Такой подход предусмотрен, например, в публикациях Berzofsky, Science 229, 1985, cc.932-940, и Bowie и др., Science 247, 1990, cc.1306-1310. К факторам, которые рассматривают в качестве влияющих на возможность поддерживать конформационный и антигенный нейтралитет, относятся, но ими не ограничиваются: (а) замещение гидрофобных аминокислот менее вероятно влияет на антигенность, поскольку гидрофобные остатки более вероятно локализованы во внутренней части белка, (б) замещение физически и химически сходно, аминокислоты менее вероятно влияют на конформацию, поскольку замещенные аминокислоты структурно подражают нативным аминокислотам, и (в) изменение эволюционно консервативных последовательностей предположительно отрицательно влияет на конформацию, поскольку такая консервативность означает, что аминокислотные последовательности могут иметь важное значение для проявления функциональности. Специалист в данной области может оценить изменения конформации белка, используя известные методы, например, но ими не ограничиваются, методы фиксации микродобавлений (Wasserman и др., J. Immunol. 87, 1961, сс.290-295, Levine и др., Meth. Enzymol. 11, 1967, сс.928-936) и методы анализа связывания, используя конформационнозависимые моноклональное антитела (Lewis и др., Biochem. 22, 1983, сс.948-954).
Понятие «гибридизировать» в контексте настоящего изобретения относится к обычным условиям гибридизации, предпочтительно к условиям гибридизации, к которым относятся 5 х SSPE, 1% SDS, 1 х раствор Денхардта, который используют в качестве раствора, и/или температуры гибридизации, находящиеся в интервале от 35°С до 70°С, предпочтительно 65°С. После гибридизации промывание предпочтительно проводят сначала с помощью 2×SSC, 1% SDS и затем с помощью 0,2 х SSC при температуре от 35°С до 70°С, предпочтительно при 65°С (расшифровку SSPE, SSC и раствора Денхардта см. в кн.: Sambrook и др. «Molecular Biology: A Laboratory Manual», 1989, изд. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк). Условия жесткой гибридизации, например, описанные Sambrook и др., см. выше, являются особенно предпочтительными. Особенно предпочтительные условия жесткой гибридизации, например, применяют, если гибридизацию и промывку проводят при 65°С согласно указанному выше. Условия гибридизации, не являющиеся жесткими, например, с гибридизацией и промывкой, проводящимися при 45°С или меньше, предпочтительно при 35°С или меньше.
Настоящее изобретение может быть легче понято с помощью ссылки на нижеследующее подробное описание специфических вариантов осуществления настоящего изобретения. Хотя настоящее изобретение было описано со ссылкой на конкретные подробности определенных вариантов его осуществления, их не следует рассматривать в качестве ограничений области охвата настоящего изобретения.
Настоящее изобретение предусматривает антитела и их функциональные части, которые представляют конформационно чувствительные антитела. Такие антитела распознают специфические эпитопы при широком разнообразии амилоидных белковых антигенов. Такие антитела применимы для диагностики и терапевтического вмешательства в заболевания и расстройства, вызываемые или ассоциированные с амилоидом или амилоидоподобными белками, особенно при болезни Альцгеймера.
Антитела могут вводиться индивидуумам для пассивной иммунизации против различных заболеваний и расстройств, вызванных амилоидом или амилоидоподобными белками или ассоциированных с ними, например, против болезни Альцгеймера.
Антитела, предусмотренные в настоящем изобретении, являются моноклинальными или поликлональными антителами, обладающими связывающей специфичностью в отношении антигенных пептидов, участвующих в инициации, прогрессировании и/или ухудшении различных заболеваний и расстройств, вызванных или ассоциированных с амилоидом или амилоидоподобными белками ними, например, болезни Альцгеймера.
Антитела, предусмотренные в настоящем изобретении, получают иммунизацией животных, например, мышей, крыс или животных каких-либо других видов, которые могут вырабатывать нативные антитела или антитела человека, композицией надмолекулярной антигенной конструкции.
Надмолекулярные антигенные конструкции, описанные в настоящем изобретении, обычно включают пептиды, модифицированные для повышения антигенного эффекта, причем такие пептиды модифицированы путем пэгелирования (используя полиэтиленгликоль или модифицированный полиэтиленгликоль), или модифицированы другими методами, например, путем применения пальмитиновой кислоты, полиаминокислот (например, полиглицина, полигистидина), полисахаридов (например, полигалактуроновой кислоты, полимолочной кислоты, полигликолида, хитина, хитозана), синтетических полимеров (полиамидов, полиуретанов, полиэфиров) и сополимеров (например, сополимера полиметакрилатной кислоты и N-(2-гидрокси)пропилметакриламида) и др.
16:0
Модификация с применением пальмитиновой кислоты (пальмитилирование), наряду с тем, что обеспечивает якорь для пептида в двойном слое липосомы, из-за относительно уменьшенной длины части молекулы жирной кислоты С приводит к пептиду, особенно лежащему на поверхности липосомы. Следовательно, клетки, процессирующие антиген, могут поглощать целую липосому с пептидом, который в большинстве случаев приводит к замедленному иммунному ответу в относительных единицах.
22-35
29-40
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения модифицированный амилоидный пептид Аβ и пептид Аβ» соответственно, используют для приготовления антитела, особенно моноклонального антитела по настоящему изобретению.
1-15
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения модифицированный амилоидный пептид Аβ используют для приготовления антитела, особенно моноклонального антитела по настоящему изобретению.
1
15
1-42
Модифицированный амилоидный Аβ- пептид может быть синтезирован способом, описанным Nicolau и др. в 2002 году. Подход, описанный Nicolau и др., включает модификацию антигенного пептида путем переноса на смолу липофильной или гидрофильной части молекулы, по концевым аминокислотным остаткам ранее сформированного пептида, что приводит к продукту довольно высокой степени чистоты. В частности защищенную аминокислоту, особенно Fmoc-защищенную аминокислоту, присоединяют к смоле, используя известную химию сцепления. Защитную группу удаляют и присоединяют второй защищенный аминокислотный остаток. Затем применяют стандартный автоматизированный синтез, используя известную в химии методику защиты, особенно методику Fmoc/tBu, после чего используют стандартные защитные группы боковой цепи для синтеза Аβ антигенного пептида путем соединения аминокислот 22 с 25, 29 с 40 и 1 с 15, соответственно, амилоидного белка Аβ для получения пептидного фрагмента. На заключительной стадии присоединяют две другие защищенные аминокислоты к растущему пептидному фрагменту. Группы Mtt затем могут быть селективно отщеплены и соединены с пальмитиновой кислотой. После промывки смолы защитную группу удаляют и смолу одновременно расщепляют, с последующим удалением защиты боковой цепи, используя стандартную методологию. Затем может быть получен конечный продукт высокой степени чистоты, идентичность которого подтверждают методами, известными в данной области, например, масс-спектрометрией электроспреем.
Липофильные или гидрофильные части молекул по настоящему изобретению могут быть жирной кислотой, триглицеридом или фосфолипидом, причем углеродный каркас жирной кислоты содержит по меньшей мере 10 атомов углерода. В частности липофильной или гидрофильной частью молекулы является жирная кислота с каркасом молекулы примерно из 14 атомов углерода и примерно до 24 атомов углерода, причем каждое отдельное число атомов углерода, попадающее в этот диапазон, также является частью настоящего изобретения. Более предпочтительно липофильные или гидрофильные части молекулы имеют углеродный каркас по меньшей мере из 14 атомов углерода. К примерам гидрофобных частей молекул относятся, но ими не ограничиваются, пальмитиновая кислота, стеариновая кислота, миристимовая кислота, лауриновая кислота, олеиновая кислота, линолевая кислота, линоленовая кислота и холестерин или DSPE. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения липофильной или гидрофильной частью молекулы является пальмитиновая кислота.
Для повышения иммунного ответа соответствующим образом может быть применен другой якорь/спейсер для восстановления пептида в липосоме, например, полиэтиленгликоль (ПЭГ).
ПЭГ ковалентно присоединен к аминокислотному остатку связями по обоим концам пептида, в частности, к аминокислотному остатку Glu, Cys или Lys, или какому-либо другому аминокислотному остатку, который может соответствующим образом использоваться для ковалентно связанного ПЭГ с пептидом. С другой стороны цепи гидрофобная часть молекулы может быть ковалентно присоединена для функционирования в качестве заякоривающего элемента в двойном слое липосомы, например, фосфатидилэтаноламин (phosphatidyl ethanol amine - PEA). Таким образом, липосома по прежнему функционирует в качестве адъюванта, и пептид, находящийся достаточно далеко от двойного слоя, может быть процессирован отдельно и таким образом повышается его иммуногенность по сравнению с пальмитилированным антигеном.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения надмолекулярные антигенные конструкции, используемые в рамках охвата настоящего изобретения, включают пептидную последовательность, ковалентно присоединенную к пэгелированному лизину - по одной с каждого конца. Длина цепи ПЭГ (полиэтиленгликоля) может варьировать от n=8 до n=150000 или более, особенно от n=10 до n=80000, более предпочтительно от n=20 до n=10000. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения длина цепи ПЭГ составляет не более чем n=45, особенно от n=5 до n=40, более предпочтительно от n=10 до n=30, и более предпочтительно от n=10.
Надмолекулярные конструкции, описанные в настоящем изобретении, могут быть синтезированы, используя автоматизированный синтез пептидов и известные в химии методы применения защитных групп, особенно Fmoc/tBu и стандартных групп защиты боковых цепей. Обычно пэгелирование пептидов приводит к смесям региоизомеров.
Для достижения сайт-специфического присоединения конъюгата ПЭГ-липид и к С-, и N-концу Ар, могут применяться частично замещенные пептиды. Для таких пептидных последовательностей, содержащих внутренние остатки Lys или His, к каждому концу добавляют остатки присоединенного под прямым углом защищенного Lys(ivDde). Дополнительный остаток Gly может быть добавлен к С-концу для облегчения синтеза. Защитную группу удаляют и N-ацетилируют, используя уксусный ангидрид, с последующим селективным отщеплением групп ivDde.
Смола, особенно 2-хлортритильная смола, предпочтительна, поскольку она чувствительна к кислотам и таким образом способна выделять защищенные пептиды.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения реакцию соединения выполняют в растворе. Затем избирательное отщепление от смолы в мягких условиях высвобождает внутренне защищенные пептиды.
22-35
29-40
1-15
Соединения в растворе могут быть успешно выполнены с пептидами, производными от последовательности β-амилоидного белка, например, Аβ и Аβ, соответственно, или Аβ с молекулой ПЭГ, модифицированной жирной кислотой - фосфатидилхолином, например, DSPE. Разделения моно- и ди-соединенных продуктов перед конечной стадией удаления защиты с боковых цепей можно достичь, используя катионообменную хроматографию. Последующее удаление защиты с боковых цепей пептида приводит к выделению требуемых конъюгатов с приемлемой степенью чистоты. Очистка может быть произведена известными в данной области методами, например, ВЭЖХ и др.
Такой подход к синтезу N- и С-концевых липид-ПЭГ β-амилоидных антигенов с применением защитных групп применим к широкому кругу разных пептидных последовательностей.
22-35
29-40
1-15
Липосомальные антигены по настоящему изобретению также могут быть получены по описанию Nicolau и др., 2002. Модифицированный амилоидный Аβ антигенный пептид, особенно модифицированный пэгилированный Аβ и Аβ антигенный пептид, или пальмитилированный Аβ антигенный пептид, может быть перестроен в конструкцию, состоящую из липосом, особенно из липосом, сделанных из димиристоилфосфатидилхолина (dimyristoyl phosphatidyl choline - DMPC), димиристоилфосфатидилэтаноламина (dimyristoyl phosphatidyl ethanolamine - DMPEA), димиристоилфосфатидилглицерина (dimyristoyl phosphatidyl glycerol - DMPG) и холестерина, необязательно содержащих монофосфорильный липид А.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения липосомы с липидом А используют в качестве адъюванта для приготовления антиамилоидной вакцины. Смешивают димиристоилфосфатидил-холин, глицерин и холестерин, особенно в мольном соотношении 0,9:1,0:0,7. Затем добавляют сильный иммуномодулятор, например, монофосфорильный липид А в соответствующей концентрации 30-50 мг/ммоль, более предпочтительно 40 мг/ммоль фосфолипидов. Модифицированный антигенный Аβ пептид затем добавляют в мольном соотношении пептида к фосфолипидам от 1:30 до 1:200, особенно в мольном соотношении 1:1000, 1:50 и 1:120, более предпочтительно 1:100. Растворители удаляют, например, выпариванием, и получаемую пленку гидратируют стерильным буферным раствором, например, ФСБ.
Липосомы могут также быть приготовлены методом перекрестной инъекции, описанным, например, Wagner и др., Journal of Liposome Research Vol 12(3), 2002, сс.259- 270. Во время инъекции липидного раствора в водную буферную систему липиды проявляют тенденцию к формированию «осадков», которые впоследствии самоорганизуются в везикулы. Размер получаемых везикул зависит от ряда факторов, например, от концентрации липидов, скорости взбалтывания, скорости впрыскивания, емкостей для полярой фазы (например, в буферном растворе ФСБ), сосуда с этанол/липидным раствором и устройства для нагнетания давления, но особенно устройства для подачи под давлением азота. Хотя водный и полярный растворы нагнетают через модуль перекрещивающегося впрыскивания, этанол/липидный раствор впрыскивают в полярную фазу при варьирующем давлении.
Липосома продолжает функционировать в качестве адъюванта, и пептид, находящийся достаточно далеко от двойного слоя, может быть процессирован отдельно и таким образом повышает свой иммуногенность по сравнению с пальмитилированным антигеном.
Конец без ПЭГ ковалентно присоединяют к молекуле фосфатидилэтаноламина (где может быть жирная кислота: миристиновая, пальмитиновая, стеариновая, олеиновая и др. или их комбинация) для функционирования в качестве заякоривающего элемента. Такая надмолекулярная структура может быть заякорена путем восстановления в липосомах, состоящих из фосфолипидов и холестерина (фосфатидилэтаноламина, фосфатидилглицерина, холестерина в разных мольных соотношениях). Могут применяться другие фосфолипиды. Используют липид А в концентрации примерно 40 мкг/мкМ фосфолипидов.
22-35
29-40
1-15
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения пальмитилированные или пэгелированные надмолекулярные антигенные конструкции включают пептид с аминокислотной последовательностью β-амилоида. Пептиды также могут включать или соответствовать целому амилоид-бета пептиду и его действующим фрагментам. Кроме того, пептиды, применимые в настоящем изобретении, в частности включают Aβ и Aβ, соответственно, или Aβ и его действующие фрагменты.
Для извлечения и приготовления антител и для определения иммуногенности модифицированной Аβ антигенной конструкции соответствующее животное, выбранное из группы, включающей мышей, крыс, кроликов, свиней, птиц и др., но особенно мышей, особенно мышей линии C57BL/6, иммунизированных антигенным пептидом. Иммуногенность антигенной конструкции определяют по образцам сыворотки, отобранных с определенными интервалами после иммунизации, используя иммуноанализ, например, ELISA.
Моноклональные антитела по настоящему изобретению могут быть приготовлены, используя классическое клонирование и методы слияния клеток, известные в данной области. Исследуемый иммуноген (антиген) обычно вводят (например, внутрибрюшинной инъекцией) мышам дикого типа или инбредным мышам (например, мышам линий BALB/c или C57BL/6), крысам, кроликам или животным других видов, или трансгенным мышам, которые могут вырабатывать нативные антитела или антитела человека. Иммуноген может быть введен отдельно, или в смеси с адъювантом, или экспрессирован с вектора (вектор репликона VEE - вируса лошадиного энцефалита, вакцина), или в виде ДНК, или в виде гибридного белка для индукции иммунного ответа. Гибридные белки включают пептид, против которого желателен иммунный ответ, соединенный с белками-носителями, например, бета-галактозидазой, глютатион-S-трансферазой, гемоцианином моллюска блюдечка (keyhole limpet hemocyanin -KLH), бычьим сывороточным альбумином (БСА). В этих случаях пептиды служат гаптенами с белками-носителями. После ревакцинации животных, например, два или три раза, у иммунизированных животных забирают клетки селезенки и получают гибридомы путем слияния сенсибилизированных клеток селезенки с линией клеток миеломы, например, линией клеток миеломы мыши SP2/0 (коллекция АТСС, Manassas, Вирджиния), используя хорошо известные методы Kohler и Milstein (Nature 256, 1975, cc.495-497) и Harlow и Lane (в кн.: «Antibodies: A Laboratory Manual», 1988, Cold Spring Harbor Laboratory, Нью-Йорк).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антигенная конструкция по настоящему изобретению, особенно вакцинная композиция, включающая указанную антигенную конструкцию в фармацевтически приемлемой форме, вводится в повторяющихся дозах, в частности от 1 до 15 доз, более предпочтительно 2-10 доз, еще более предпочтительно 3-7 доз, но особенно предпочтительно 4-6 доз, с интервалами 1-10 недель, особенно с интервалами 1-6 недель, более предпочтительно с интервалами 1-4 недели, и еще более предпочтительно с интервалами 2-3 недели. Иммунный ответ подвергают мониторингу путем получения образцов сыворотки в соответствующее время после ревакцинаций, особенно через 3-10 суток после ревакцинаций, более предпочтительно через 4-8 суток после ревакцинаций и более предпочтительно через 5-6 суток после ревакцинаций, и определения иммуногенности антигенной конструкции, используя известную методологию, особенно один из наиболее применяемых иммуноанализов, например, анализ ELISA.
Иммунизация антигенной конструкцией по настоящему изобретению, но особенно вакцинной композицией, включающей антигенную конструкцию по настоящему изобретению в фармацевтически приемлемой форме, приводит к существенному иммунному ответу у обрабатываемых животных. Животных, особенно мышей с терапевтическими титрами, выбирают для слияния вырабатывающих антитело клеток, особенно В-лимфоцитов, с непрерывно растущими (бессмертными) клетками, например, клетками линии миеломы. Клетки индуцируют к гибридизации путем добавления полиэтиленгликоля. Терапевтическими титрами являются те, которые показывают положительный результат в анализе ELISA, при разведении от 1:4000 до 1:6000, особенно от 1:4500 до 1:5500, более предпочтительно 1:5000.
Получаемые клетки гибридомы затем клонируют соответствующим образом, например, используя серийные разведения, и получаемые клоны, которые вырабатывают требуемые моноклональные антитела, культивируют.
Полученные таким образом гибридомы отбирают химически путем выращивания клеток в селективной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (hypoxanthine, aminopterin, thymidine - HAT).
Гибридомы подвергают последовательному скринингу для выявления способности вырабатывать моноклональные антитела против определенных ассоциированных с амилоидом заболеваний и расстройств. Гибридомы, вырабатывающие целевые антитела, клонируют, размножают и хранят замороженными для дальнейшего получения антител. Предпочтительные гибридомы вырабатывают моноклональное антитело с изотипом IgG.
Поликлональное антитело получают путем иммунизации животных, например, мышей и кроликов или каких-либо соответствующих животных, композициями надмолекулярной антигенной конструкции по настоящему изобретению, описанной в нем. Последовательно отбирают кровь у животных для получения сыворотки и анализа антител в сыворотке на связывающую активность в отношении амилоидного белка.
Антитела по настоящему изобретению могут быть получены в физиологически приемлемом составе и могут включать фармацевтически приемлемый носитель, растворитель и/или эксципиент, используя известные методики. Например, антитело по настоящему изобретению, описанное в нем, включая какое-либо функционально эквивалентное ему антитело или его функциональные части, в частности моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное ему антитело или его функциональные части, комбинируют с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем и/или эксципиентом для формирования терапевтической композиции. Соответствующие фармацевтические носители, разбавители и/или эксципиенты известны в данной области и включают, например, растворы фосфатно-солевого буфера, воду, эмульсии, например, эмульсии масло/вода, различных типов увлажняющие агенты, стерильные растворы и др.
Состав фармацевтической композиции по настоящему изобретению может быть выполнен по стандартной методике, известной специалистам в данной области.
Композиции по настоящему изобретению могут вводиться субъекту в твердой, жидкой форме или в виде аэрозоля в соответствующей фармацевтически эффективной дозе. Примерами твердых композиций являются пилюли, мази и дозированные единицы, пригодные для трансплантации. Пилюли могут вводиться перорально. Терапевтические мази могут применяться местно. Дозированные единицы, пригодные для трансплантации, могут вводиться местно, например, по месту опухоли, или могут имплантироваться для системного высвобождения терапевтической композиции, например, подкожно. К примерам жидких композиций относятся составы, адаптированные для внутримышечной, подкожной, внутривенной, внутриартериальной инъекции, а также составы для местного и внутриглазного введения. К примерам аэрозольных составов относятся составы для ингаляции для введения в легкие.
Композиции могут вводиться стандартными способами. В основном композиция может вводиться местно, перорально, ректально, назально, чрезкожно, внутрибрюшинно или парентерально (например, внутривенно, подкожно или внутримышечно). Кроме того, композиция может быть включена в матрицы устойчивого высвобождения, например, в поддающиеся биологическому разложению полимеры, полимеры, имплантированные по соседству с местом целевого высвобождения, например, в месте опухоли. Способ включает введение одной дозы, введение повторных доз с заранее установленными интервалами, и устойчивое высвобождение в течение заранее установленного периода времени.
Матрица устойчивого высвобождения, используемая в настоящем изобретении, сделана из материалов, обычно полимеров, которые разрушаются ферментативно, или кислотным/щелочным гидролизом, или растворением. При внедрении в организм на матрицу воздействуют ферменты и тканевые жидкости. После внедрения в организм матрица подвергается воздействию ферментов и тканевых жидкостей. Матрицу устойчивого высвобождения желательно выбирать из биосовместимых материалов, например, используемых для липосом: полилактидов (полимолочной кислоты), полигликолида (полимера гликолевой кислоты), сополимера гликолида и полилактида (сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты), полиангидридов, полиортоэфиров, полипептидов, гиалуроновой кислоты, коллагена, хондроитина сульфата, карбоновых кислот, жирных кислот, фосфолипидов, полисахаридов, нуклеиновых кислот, полиаминокислот, аминокислот, например, фенилаланина, тирозина, изолейцина, полинуклеотидов, поливинилпропилена, поливинилпирролидона и силикона. Предпочтительной биоразрушаемой матрицей является полилактид, полигликолид, или сополимер гликолида и полилактида (сополимер молочной кислоты и гликолевой кислоты).
Специалистам в данной области известно, что доза композиции зависит от разных факторов, например, условий обработки, определенной используемой композиции и других клинических факторов, например, массы, размера, пола и общего состояния здоровья пациента, площади поверхности тела, определенного вводимого соединения или композиции, других лекарственных средств, вводимых одновременно, а также от способа введения.
Композиция может вводиться в комбинации с другими композициями, включающими биологически активное вещество или соединение, по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, включающей: соединения против окислительного стресса, противоапоптические соединения, хелаторы металлов, ингибиторы репарации ДНК, например, пирензепин и метаболиты, 3-амино-1-пропансульфоновую кислоту, 1,3-пропандисульфонат, активаторы секретазы, ингибиторы β- и γ-секретазы, тау белки, нейротрансмиттер, разрушители β-слоев, противовоспалительные молекулы, «атипичное антипсихотическое средство», например, клозапин, ципразидон, рисперидон, арипипразол или оланзапин, или ингибиторы холинэстеразы (ChEIs), например, такрин, ривастигмин, донепезил и/или галантамин, и другие лекарственные средство и пищевые добавки, например, витамин В12, цистеин, предшественник ацетилхолина, лецитин, холин, гингко билоба, ацетил-Ь-карнитин, идебенон, пропентофиллин или производное ксантина, вместе с антителом по настоящему изобретению и необязательно фармацевтически приемлемый носитель, и/или растворитель, и/или эксципиент и инструкции для лечения заболеваний.
Белковый материал фармацевтического действия может быть в количестве от 1 нг до 10 мг на дозу. Обычно режим введения должен быть в диапазоне от 0,1 мкг до 10 мг антитела по настоящему изобретению, особенно в диапазоне от 1,0 мкг до 1,0 мг, и более предпочтительно в диапазоне от 1,0 мкг до 100 мкг, причем число отдельных попаданий в такие диапазоны также является частью настоящего изобретения. Если вводят непрерывной инфузией, более точно дозировка может составлять от 0,01 мкг до 10 мг единиц на кг массы тела в час, причем число отдельных попаданий в такие диапазоны также является частью настоящего изобретения.
Введение обычно может быть парентеральным, например, внутривенным. Препараты для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. К неводным растворителям относятся, но ими не ограничиваются, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло и инъекционные органические эфиры, например, этилолеат. Водные растворители могут быть выбраны из группы, состоящей из воды, спиртовых/водных растворов, эмульсий или суспензий, включая солевые и буферные среды. К парентеральным растворителям относятся раствор хлорида натрия, раствор декстрозы Рингера, декстрозы и натрия хлорида, раствор лактата Рингера и нелетучие масла. Внутривенные растворители включают жидкие и пищевые наполнители, электролитные наполнители (например, основанные на растворе декстрозы Рингера) и другие. Консерванты также могут быть, например, антимикробными, антиоксидантными, хелатирующими агентами, инертными газами и др.
Фармацевтическая композиция может дополнительно включать белковые носители, например, сывороточный альбумин или иммуноглобулин, особенно от человека. Другие биологически действующие агенты могут содержаться в фармацевтической композиции настоящего изобретения в зависимости от их назначения.
Если связывающая мишень расположена в мозге, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения предусматривают перенос антитела или его действующего фрагмента через гематоэнцефалитный барьер. Некоторые нейродегенеративные заболевания связаны с повышением проницаемости гематоэнцефалитного барьера таким образом, что антитело или его действующий фрагмент могут быть легко внедрены в мозг. Если гематоэнцефалитный барьер остается интактным, имеется несколько известных в данной области подходов по транспортировке молекул через него, включая, но ими не ограничиваясь, физические методы, методы, основанные на липидах, и методы, основанные на рецепторе и канале.
К физическим методам транспортировки антитела или его действующего фрагмента через гематоэнцефалитный барьер относятся, но ими не ограничиваются, обход гематоэнцефалитного барьера, или создание проходов в гематоэнцефалитном барьере. К методам обхода относятся, но ими не ограничиваются, прямая инъекция в мозг (см., например, Papanastassiou и др., Gene Therapy 9, 2002, сс.398-406) и имплантация устройства по доставке в мозг (см., например, Gill и др., Nature Med. 9, 2003, сс.589-595, и Gliadel Wafers™, фирма Guildford Pharmaceutical). Методы по созданию проходов в барьере включают, но ими не ограничиваются, ультразвук (см., например, US 2002/0038086), осмотическое давление (например, введение гипертонического маннита (Neuwelt Е. А. в кн.: ((Implication of the Blood-Brain Barrier и its Manipulation)), 1989, тт. 1 и 2, изд. Plenum Press, Нью-Йорк)), обеспечение проницаемости, например, брадикинином или агентом обеспечения проницаемости А-7 (см., например, US 51 12596, 5268164, 5506206 и 5686416), и трансфекцией нейронов, которые проходят гематоэнцефалитный барьер векторами, содержащими гены, которые кодируют антитело или антигенсвязывающий фрагмент (см., например, US 2003/0083299).
Основанные на липидах способы транспортировки антитела или его действующего фрагмента через гематоэнцефалитный барьер включают, но ими не ограничиваются, инкапсулирование антитела или его действующего фрагмента в липосомы, которые соединены с его действующими фрагментами, которые связываются с рецепторами на эндотелии сосудов гематоэнцефалитного барьера (см., например, US 20020025313), и покрытие антителом или его действующим фрагментом частиц липопротеина низкой плотности (см., например, US 20040204354) или аполипопротеина Е (см., например, US 20040131692).
Методы транспортировки антитела или его действующего фрагмента через гематоэнцефалитный барьер, основанные на рецепторе и канале, включают, но ими не ограничиваются, применение глюкокортикоидных блокаторов для повышения проницаемости через гематоэнцефалитный барьер (см., например, US 2002/0065259, 2003/0162695 и 2005/0124533), активирование калиевых каналов (см., например, US 2005/0089473), ингибирование переносчиков ABC лекарственных средств (см., например, US 2003/0073713), нанесение антител с трансферином и модулирующим действием одного или нескольких рецепторов трансферина (см., например, US 2003/0129186), и катионизации антител (см., например, US 5004697).
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены способы и наборы для выявления и диагностики ассоциированных с амилоидом заболеваний и состояний, включая глазные заболевания, ассоциированные с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированные со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов. Патологические нарушения могут быть, например, в разных тканях глаза, например, в зрительной зоне коры мозга, что приводит к кортикальной зрительной недостаточности; в передней камере глаза и зрительном нерве, приводящие к глаукоме; в хрусталике, приводящие к катаракте из-за отложения бета-амилоида; в стекловидном теле, приводящие к зрительному амилоидозу; в сетчатке, приводящие к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна, например, возрастной дегенерации желтого пятна; в зрительном нерве, приводящие к формированию старческих бляшек в зрительном нерве, зрительной невропатии и ретробульбарному невриту; в роговице, приводящие к решетчатой дистрофии роговицы. Кроме того, настоящее изобретение предусматривает способы и наборы для диагностики предрасположенности к ассоциированному с амилоидом заболеванию или состоянию, включая глазные заболевания, ассоциированные с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированные со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов, которые могут быть, например, в разных тканях глаза, например, в зрительной зоне коры мозга, что приводит к кортикальной зрительной недостаточности; в передней камере глаза и зрительном нерве, приводящие к глаукоме; в хрусталике, приводящие к катаракте из-за отложения бета-амилоида; в стекловидном теле, приводящие к зрительному амилоидозу; в сетчатке, приводящие к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна, например, возрастной дегенерации желтого пятна; в зрительном нерве, приводящие к формированию старческих бляшек в зрительном нерве, зрительной невропатии и ретробульбарному невриту; в роговице, приводящие к решетчатой дистрофии роговицы, для мониторинга минимального остаточного заболевания у пациента или для прогнозирования способности пациента к реагированию на лечение антителом или вакцинной композицией по настоящему изобретению, описанной в нем. Указанные способы включают известные иммунологические методы, обычно используемые для выявления или количественной оценки веществ в биологических образцах или в условиях in situ.
Диагностика связанного с амилоидом заболевания или состояния или предрасположенности к связанному с амилоидом заболеванию или состоянию у субъекта, нуждающегося в этом, особенно млекопитающего, более предпочтительно человека, включая глазные заболевания, ассоциированные с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированные со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов, у пациента может быть осуществлена путем выявления иммуноспецифического связывания антитела по настоящему изобретению, особенно моноклонального антитела или его действующего фрагмента, с эпитопом амилоидного белка в образце или in situ, которое включает приведение образца, или специфической части тела, или области тела субъекта, которые предположительно содержат амилоидный белок, в контакт с антителом, которое связывает эпитоп амилоидного белка, позволяя антителу связать амилоидный белок для формирования иммунологического комплекса, выявление формирования иммунологического комплекса и корреляции наличия или отсутствия иммунологического комплекса с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце, или специфической части тела, или области тела, необязательно сравнивая количество указанного иммунологического комплекса с нормальной контрольной величиной, причем повышение количества указанного иммунологического комплекса по сравнению с контрольной величиной означает, что указанный субъект подвержен риску развития заболевания или состояния, связанного с амилоидом. Амилоидный белок может быть в мономерной, фибриллярной и/или полимерной форме. Антитело или его действующая часть может быть специфичной для мономерной, фибриллярной и/или полимерной формы амилоидного белка.
Мониторинг минимального остаточного заболевания у субъекта, особенно млекопитающего, более предпочтительно человека, после лечения антителом или вакцинной композицией по настоящему изобретению, может быть достигнут выявлением иммуноспецифического связывания антитела по настоящему изобретению, особенно моноклонального антитела или его действующего фрагмента, с эпитопом амилоидного белка в образце или in situ, и включает приведение образца, или специфической части тела, или области тела субъекта, которые предположительно содержат амилоидный белок, в контакт с антителом, которое связывает эпитоп амилоидного белка, предоставление возможности для антитела связать амилоидный белок для формирования иммунологического комплекса, выявление формирования иммунологического комплекса и корреляции наличия или отсутствия иммунологического комплекса с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце, или специфической части тела, или области тела, и необязательно сравнение количества указанного иммунологического комплекса с нормальной контрольной величиной, причем повышение количества указанного иммунологического комплекса по сравнению с нормальной контрольной величиной показывает, что у указанного пациента все еще сохранилось минимальное остаточное заболевание. Амилоидный белок может быть в мономерной, фибриллярной и/или полимерной форме. Антитело или его действующая часть могут быть специфичными для мономерной, фибриллярной и/или полимерной формы амилоидного белка.
Прогнозирование восприимчивости субъекта, особенно млекопитающего, более предпочтительно человека, к лечению вакцинной композицией по настоящему изобретению может быть достигнуто путем определения иммуноспецифического связывания моноклонального антитела или его действующего фрагмента с эпитопом амилоидного белка в образце или in situ, которое включает приведение образца, или специфической части тела, или области тела, которые предположительно содержат амилоидный белок, в контакт с антителом, которое связывает эпитоп амилоидного белка, предоставление возможность для антитела связать амилоидный белок для формирования иммунологического комплекса, выявление формирования иммунологического комплекса и выявление корреляции наличия или отсутствия иммунологического комплекса с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце, или специфической части тела, или области тела, и необязательно сравнение количества указанного иммунологического комплекса до и после начала лечения, причем снижение количества указанного агрегата показывает, что у указанного пациента велика вероятность проявления восприимчивости к лечению. Амилоидный белок может быть в мономерной, фибриллярной и/или полимерной форме. Антитело или его действующая часть могут быть специфичными для мономерной, фибриллярной и/или полимерной формы амилоидного белка.
Биологическими образцами, которые могут быть применены для диагностики связанного с амилоидом заболевания или состояния, диагностики предрасположенности к связанному с амилоидом заболеванию или состоянию, включая глазные заболевания, ассоциированные с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированные со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов, которые могут быть, например, в разных тканях глаза, или для мониторинга минимального остаточного заболевания у пациента, или для прогнозирования восприимчивости пациента к лечению антителом или вакцинной композицией по настоящему изобретению, описанной в нем, являются, например, жидкости, например, сыворотка, плазма, слюна, секреты желудка, слизь, спинномозговая жидкость, лимфа и др., или образцы тканей или клеток, полученные из организма, например, нервной ткани, мозга, сердца или сосудов. Для определения наличия или отсутствия амилоидного белка в образце может быть применен какой-либо иммуноанализ, известный специалистам в данной области, например, анализы, в которых используют непрямые способы выявления, используя вторичные реагенты для выявления, ELISA и методы иммунопреципитации и агглютинации. Подробное описание таких исследований приводится, например, в кн. Harlow и Lane «Antibodies: A Laboratory Manual», изд. Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, Нью-Йорк, cc. 555-612, WO96/13590, WO96/29605.
Для диагностики in situ антитело или какая-либо его действующая часть могут вводиться в диагностируемый организм способами, известными в данной области, например, внутривенно, интраназально, внутрибрюшинно, подоболочечно, внутриартериально таким образом, что может произойти специфическое связывание антитела по настоящему изобретению с областью эпитопа амилоидного белка. Комплекс антитело/антиген может быть определен обычными методами с помощью метки, присоединенной к антителу или его функциональному фрагменту, или каким-либо другим известным способом обнаружения.
Иммуноисследования, применяемые для диагностики или для прогноза предрасположенности к связанному с амилоидом заболеванию или состоянию, включая глазные заболевания, ассоциированные с патологическими нарушениями/изменениями
в тканях зрительной системы, особенно ассоциированные со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов, которые могут быть, например, в разных тканях глаза, или для мониторинга минимального остаточного заболевания у пациента, для прогнозирования восприимчивости пациента к лечению антителом или вакцинной композицией по настоящему изобретению, обычно основаны на антигенах и антителах с нанесенной меткой или на вторичных реагентах для выявления. На такие белки или реагенты может быть нанесена метка в виде соединений, обычно известных специалистам в данной области, включая ферменты, радиоизотопы и флуоресцентные, люминесцентные и хромогенные вещества, включая, но ими не ограничиваясь, окрашенные частицы, например, коллоидное золото и гранулы латекса. Из таких соединений радиоактивная метка может применяться почти для всех типов анализов с большинством вариаций. Метки в виде конъюгированного фермента особенно применимы, если радиоактивности следует избежать или если нужно быстро получить результаты. Флюорохромы, хотя для их использования требуется дорогое оборудование, представляют очень чувствительный метод выявления. Антитела, применимые в таких анализах, включают моноклональные антитела, поликлональные антитела и поликлональные антитела аффинной очистки.
В другом варианте, антитело может быть мечено косвенно путем реакции с мечеными веществами, проявляющими сродство с иммуноглобулином, например, белком А или G, или вторыми антителами. Антитело может быть объединено со вторым веществом и выявлено с меченым третьим веществом, имеющим сродство со вторым веществом, объединенным с антителом. Например, антитело может быть объединено с биотином и конъюгат антитело-биотин выявляют, используя меченый авидин или стрептавидин. Сходным образом антитело может быть конъюгировано с гаптеном, и конъюгат антитело-гаптен выявляют, используя меченое анти-гаптеновое антитело.
Специалистам в данной области известны указанные и другие соответствующие метки, которые могут применяться в соответствии с настоящим изобретением. Связывание таких меток с антителами или их фрагментами может быть выполнено, используя стандартные методики, обычно известные специалистам в данной области. Типичные методики описаны Kennedy J.Н. и др., Clin. Chim. Acta 70, 1976, cc.1-31, и Schurs A.H. W.M. и др., Clin. Chim Acta 81, 1977, cc.1-40). Методики соединения, указанные в приведенных ссылках, представляют метод с применением глутаральдегида, метод с применением периодата, метод с применением дималеимида и другие, каждый из которых включен в настоящее изобретение в виде ссылки.
В современных иммуноисследованиях используют метод двойных антител для обнаружения наличия определенного соединения, причем антитело метят косвенным образом путем взаимодействия со вторым антителом, на которое была нанесена выявляемая метка. Второе антитело предпочтительно является таким антителом, которое связывается с антителами животного, из которого моноклональное антитело получено. Иначе говоря, если моноклональное антитело является антителом мыши, тогда второе антитело с нанесенной меткой является антителом против антитела мыши. Для антитела, используемого в описанном ниже анализе, такая метка предпочтительно представляет гранулы, покрытые антителом, особенно магнитные гранулы. Для антитела, применяемого в описанном в настоящем изобретении иммуноанализе, предпочтительно меткой является выявляемая молекула, например, радиоактивное, флуоресцентное или электрохемилюминесцентное вещество.
Другая система двойного антитела, которую часто относят к формату систем быстрого действия, поскольку они адаптированы для быстрого определения наличия определяемого вещества, также может быть применена в рамках охвата настоящего изобретения. Система требует высокого сродства между антителом и определяемым веществом. По одному из вариантов осуществления настоящего изобретения определяют наличие амилоидного белка, используя пару антител, каждое специфичное для амилоидного белка. Одно из указанных пар антител в настоящем изобретении обозначают «идентифицирующим (детекторным) антителом», а второе из пары антител в настоящем изобретении обозначают «иммобилизованным антителом (антителом-ловушкой)». Моноклональное антитело по настоящему изобретению может применяться или в качестве иммобилизованного антитела, или в качестве идентифицирующего антитела. Моноклональное антитело по настоящему изобретению также может применяться одновременно и в качестве идентифицирующего, и в качестве иммобилизованного антитела в одном исследовании. В одном из варианте осуществления настоящего изобретения, таким образом, используют метод сэндвича двойного антитела для выявления амилоидного белка в образце биологической жидкости. В этом методе исследуемое вещество (амилоидный белок) оказывается «в сэндвиче» - между иммобилизованным и идентифицирующим антителами, иммобилизованное антитело становится обратимо иммобилизованным на твердой основе. Идентифицирующее антитело может содержать выявляемую метку для идентификации наличия выявляемого сэндвича антитела-выявляемого вещества, и, таким образом, наличия выявляемого вещества.
Примерами твердых веществ являются, но ими не ограничиваются, планшеты для микротитрований, пробирки из полистирола, магнитные, пластиковые или стеклянные гранулы и пластины, известные специалистам в области радиоиммуноанализа и ферментного иммуноанализа. Способы соединения антител с твердой фазой хорошо известны специалистам в данной области. Ранее ряд пористых материалов, например, нейлона, нитроцеллюлозы, ацетата целлюлозы, стеклянных волокон и других пористых полимеров использовали в качестве твердых основ.
Настоящее изобретение также относится к диагностическому набору для выявления амилоидного белка в биологическом образце, который включает описанную выше композицию. Кроме того, настоящее изобретение относится к указанному диагностическому набору, который помимо указанной выше композиции также включает описанный выше реагент для выявления. Понятие «диагностический набор» относится в целом к какому-либо диагностическому набору, известному в данной области. Более конкретно это понятие относится к диагностическому набору, описанному Zrein и др. (1998).
В качестве еще одного объекта настоящего изобретения предусмотрены иммунозонды и наборы для тестирования с целью выявления и диагностики ассоциированных с амилоидом заболеваний и состояний, включая глазные заболевания, ассоциированные с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированные со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов, которые могут быть, например, в разных тканях глаза, включающие антитела по настоящему изобретению. Для иммунозондов антитела прямо или опосредованно присоединены к соответствующей репортерной молекуле, например, ферменту или радионуклиду. Тест-набор включает контейнер, несущий одно или несколько антител по настоящему изобретению и инструкции по применению антител для связывания с амилоидным антигеном для формирования иммунологического комплекса и детекции формирования иммунологического комплекса таким образом, что наличие или отсутствие иммунологического комплекса коррелирует с наличием или отсутствием амилоидного белка.
Примеры
1-15
Пример 1. Антитело, выработанное путем иммунизации пальмитилированными Aβ надмолекулярными антигенными конструкциями
15
Пример 1.1. Способ получения пальмитилированных Аβ1- надмолекулярных антигенных конструкций
1-15
1.1.1. Синтез тетра(пальмитоиллизин)-Аβ пептидного антигена
Пальмитилированный амилоидный 1-15 пептид синтезируют по ранее опубликованному усовершенствованному методу (Nicolau и др. 2002). Такой новый подход включает пересадку на смолу пальмитиновой кислоты к концевым остаткам Lys ранее сформированного пептида предпочтительнее поэтапного твердофазного синтеза, включающего модифицированную аминокислоту 9-флуоренилметоксикарбонил (Fmoc)-Lys(Pal)-OH. Такой новый подход улучшает эффективность соединения и дает продукт существенно более высокой степени чистоты. Таким образом, ортогонально защищенную аминокислоту Fmoc-Lys(Mtt)-OH присоединяют к смоле Wang, используя [2-(1 Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тертаметилуроний гексафлюорофосфат] (НБТУ) химию сцепления. Группу Fmoc удаляют, используя 20% пиперидин в диметилформамиде (ДМФ), и присоединяют второй остаток Fmoc-Lys(Mtt)-OH. Стандартный автоматизированный синтез пептидов с применением Fmoc/tBu и стандартных защитных групп боковых цепей затем применяют для присоединения следующих 15 аминокислот для получения пептидной последовательности. В итоге двумя последними присоединенными аминокислотами являются Fmoc-Lys(Mtt)-OH.
Группы Mtt затем селективно отщепляют, используя 1% трифторуксусную кислоту в дихлорметане для высвобождения пептидного фрагмента, и затем объединяют с пальмитиновой кислотой, используя ТФУК. После промывки смолы группу Fmoc удаляют 20% пиперидином в диметилформамиде (ДМФ) и в заключении одновременно расщепляют смолу и снимают защиту с боковых цепей, используя ТФУК в стандартных условиях. В результате измельчения в порошок из холодного диэтилового эфира получают продукт в виде белого порошка. Масс-спектрометрия методом электроспрея подтверждает идентичность продукта (ожидаемая величина m/z: 1097,9 ([М]3+); установленная величина: 1096,8 ([М-3Н]3+), при отсутствии других три-, ди- или моно-пальмитилированных пептидов.
Пример 1.2. Антитела, индуцированные надмолекулярными антигенными конструкциями
1-15
Получение антител mAb, возникающих против пальмитилированной Аβ надмолекулярной антигенной конструкции
1-15
Пальмитилированный антиген (ACI-24, Аβ) используют для иммунизации мышей C57BL/6 с двухнедельными интервалами. Иммунизируют 10-12 животных каждым антигеном (объем инъекции: 200 мкл, содержащих 8 нмолей пептида). Последнюю инъекцию проводят за 4 суток до умерщвления животных. После 5 ревакцинаций мышей с терапевтическими титрами (которые при разведении сыворотки 1:5000 дают положительную реакцию в методе ELISA) отбирают для гибридизации. Клетки селезенки собирают от иммунизированных животных и гибридомы получают путем гибридизации сенсибилизированных клеток селезенки с линией клеток миеломы. Гибридизацию В-лимфоцитов мыши из селезенок осуществляют с клетками линии миеломы SP2-0. (коллекция АТСС, Manassas, Вирджиния), используя известные методы Kohler и Milstein (Nature 256, 1975, сс.495-497) и Harlow и Lane (в кн.: ((Antibodies: A Laboratory Manual», 1988, Cold Spring Harbor Laboratory, Нью-Йорк).
1-42
Клетки индуцируют для гибридизации путем добавления полиэтиленгликоля. Получаемые гибридные клетки затем культивируют в течение 10±14 суток обычным образом для осуществления роста клонов. Инициальный отбор клонов проводят, используя серийные разведения. Клоны гибридом, вырабатывающие IgG, отбирают и тестируют на специфическое связывание с пептидом Аβ методом ELISA, а получаемые клоны, которые вырабатывают требуемое моноклональное антитело, культивируют.
Полученные указанным образом гибридомы отбирают химически, путем высева клеток в селективную среду, содержащую гипоксантин, миноптерин и тимидин (hypoxanthine, aminopterin, thymidine - HAT).
Затем гибридомы подвергают скринингу для обнаружения способности вырабатывать моноклональные антитела против определенных ассоциированных с амилоидом заболеваний или расстройств. После идентификации материнского клона его подвергают субклонированию четыре раза чтобы убедиться в моноклональности и стабилизировать гибрид. Гибридомы, вырабатывающие требуемые антитела, клонируют, размножают и хранят замороженными для последующей наработки антител.
Антитело изотипируют с помощью коммерчески доступного набора для изотипирования моноклональных антител мыши, стабильный клон адаптируют к среде без сыворотки и помещают в биореактор для выработки антитела.
Предпочтительной является гибридома, продуцирующая моноклональное антитело изотипа IgGl.
Пример 1.3. Определение специфичности антитела mACI-24-Аb3
Для анализа специфичности антитела mACI-24-Аb3 ранее сформированные фибриллы амилоида 1.42, 1-40 и 17-40, 1-28 в разных концентрациях наносят на мембрану из нитроцеллюлозы Hybond ECL Nitrocellulose Membrane (фирма Amersham Biosciences). После блокирования с помощью 10% сухого молока и 0,7% Tween 20 мембраны инкубируют с первичным антителом в концентрации 20 мкг/мл в течение 2 ч при комнатной температуре. После промывки мембраны инкубируют с антителом овцы против IgG мыши, конъюгированным с пероксидазой хрена (фирма Amersham Biosciences), в течение 1 ч при комнатной температуре, промывают и инкубируют с хемилюминесцентным раствором с последующим экспонированием мембраны на рентгеновской пленке.
Для измерения связывания mAb mACI-24-Аb3 с амилоидомными р М2, 1-40 и 17-40, 1-28 волокна заранее формируют в течение 7 суток при температуре 37°С и наносят на мембрану. 20 мкг/мл антитела используют для измерения связывающей способности и связанное антитело выявляют с помощью антитела овцы против IgG мыши, конъюгированного с пероксидазой хрена, в течение 20 мин экспозиции.
Пример 1.4. Тиофлавин-Т (Th-T) флуоресцентный анализ
1-42
Для измерения и ингибирования агрегирования, и способности к дезагрегированию mAb, используют тиофлавин-Т (Th-T) флуоресцентный анализ, which специфически связывается с фибриллярными молекулами АР1.42 и впоследствии интенсивность флуоресцентной эмиссии коррелирует с количеством Аβ филаментов, содержащихся в растворе.
1-42
Лиофилизированный порошок Аβ восстанавливают в гексафторизопропаноле до концентрации 1 мМ. Раствор пептида обрабатывают ультразвуком в течение 15 мин при комнатной температуре, перемешивают в течение ночи и аликвоты помещают в несиликонизированные пробирки для микроцентрифугирования. Затем выпаривают гексафторизопропанол в потоке аргона. Получаемую пептидную пленку сушат в вакууме в течение 10 мин и хранят при -80°С до применения.
1-42
1.4.1. Исследование агрегирования Аβ
1-42
1-42
1-42
Для изучения опосредованного антителом ингибирования агрегирования пептида Аβ, антитело предварительно разводят в ФСБ и исследуемый раствор, содержащий приведенные далее компоненты, помещают в несиликонизированные пробирки для инкубирования: 3,3 или 0,33 мкМ предварительно разведенного антитела, 10 мкМ тиофлавина Т, 33 мкМ Аβ и 8,2% ДМСО. Таким образом, в итоге мольное соотношение антитела к пептиду Аβ составляет 1:10 и 1:100. Так же получают соответствующие контрольные растворы. Растворы затем инкубируют дополнительно в течение 24 ч при 37°С, и спектральную флуоресценцию (в относительных единицах флуоресценции - ОЕФ) считывают в шести повторностях в черных 348-луночных планшетах (фирма Perkin-Elmer) на спектрофлуориметре Perkin-Elmer. Ингибирование агрегирования или дезагрегирования выражают в виде процента подавления или дезагрегирования, соответственно, по следующему уравнению относительно контроля:
<mrow><mi>П</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>ц</mi><mi>е</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mo>=</mo><mfrac><mtable columnalign="left"><mtr><mtd><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>О</mi><mi>Е</mi><mi>Ф</mi><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mi>п</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>о</mi><mi>ж</mi><mi>и</mi><mi>т</mi><mi>е</mi><mi>л</mi><mi>ь</mi><mi>н</mi><mi>о</mi><mi>г</mi><mi>о</mi><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mi>к</mi><mi>о</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>я</mi><mtext> </mtext><mo>−</mo><mtext> </mtext><mi>О</mi><mi>Е</mi><mi>Ф</mi><mtext> </mtext><mi>о</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>и</mi><mi>ц</mi><mi>а</mi><mi>т</mi><mi>е</mi><mi>л</mi><mi>ь</mi><mi>н</mi><mi>о</mi><mi>г</mi><mi>о</mi><mtext> </mtext><mi>к</mi><mi>о</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>я</mi></mrow><mo>)</mo></mrow><mo>−</mo></mtd></mtr><mtr><mtd><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>О</mi><mi>Е</mi><mi>Ф</mi><mtext> </mtext><mi>о</mi><mi>б</mi><mi>р</mi><mi>а</mi><mi>з</mi><mi>ц</mi><mi>а</mi><mtext> </mtext><mi>п</mi><mi>о</mi><mi>д</mi><mi>а</mi><mi>в</mi><mi>л</mi><mi>е</mi><mi>н</mi><mi>и</mi><mi>я</mi><mtext> </mtext><mi>А</mi><msub><mi>β</mi><mrow><mn>1</mn><mo>−</mo><mn>42</mn></mrow></msub><mtext> </mtext><mo>−</mo><mtext> </mtext><mi>О</mi><mi>Е</mi><mi>Ф</mi><mtext> </mtext><mi>о</mi><mi>б</mi><mi>р</mi><mi>а</mi><mi>з</mi><mi>ц</mi><mi>а</mi><mtext> </mtext><mi>б</mi><mi>е</mi><mi>з</mi><mtext> </mtext><mi>А</mi><msub><mi>β</mi><mrow><mn>1</mn><mo>−</mo><mn>42</mn></mrow></msub></mrow><mo>)</mo></mrow></mtd></mtr></mtable><mrow><mi>п</mi><mi>о</mi><mi>д</mi><mi>а</mi><mi>в</mi><mi>л</mi><mi>е</mi><mi>н</mi><mi>и</mi><mi>я</mi><mtext> </mtext><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>О</mi><mi>Е</mi><mi>Ф</mi><mtext> </mtext><mi>п</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>о</mi><mi>ж</mi><mi>и</mi><mi>т</mi><mi>е</mi><mi>л</mi><mi>ь</mi><mi>н</mi><mi>о</mi><mi>г</mi><mi>о</mi><mtext> </mtext><mi>к</mi><mi>о</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>я</mi><mtext> </mtext><mo>−</mo><mtext> </mtext><mi>О</mi><mi>Е</mi><mi>Ф</mi><mtext> </mtext><mi>о</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>и</mi><mi>ц</mi><mi>а</mi><mi>т</mi><mi>е</mi><mi>л</mi><mi>ь</mi><mi>н</mi><mi>о</mi><mi>г</mi><mi>о</mi><mtext> </mtext><mi>к</mi><mi>о</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>я</mi></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow></mfrac><mo>×</mo><mn>100</mn><mi>%</mi></mrow>
1-42
При мольном соотношении антитела к Аβ 1:100 ингибирование в среднем составляет 26% (2 независимых эксперимента), а при мольном соотношении 1:10 ингибирование составляет 51% (2 независимых эксперимента).
1-42
1.4.2. Исследование дезагрегирования Аβ
1-42
1-42
Для измерения способности mAb к дезагрегированию используют тиофлавин-Т (Th-T) флуоресцентный анализ, который специфически связывает фибриллярные Аβ молекулы и впоследствии интенсивность флуоресцентной эмиссии коррелирует с количеством Аβ филаментов, имеющихся в растворе.
1-42
1-42
1-42
Для анализа опосредованного антителом дезагрегирования ранее агрегированного пептида Аβ, низкомолекулярный Аβ, приготовленный согласно описанному выше, получают в виде 110 мкМ раствора в 27% ДМСО и 1х ФСБ. Затем допускают агрегирование раствора при 37°С в течение 24 ч, после чего добавляют: 3,3 или 0,33 мкМ предварительно разведенного антитела и 10 мкМ тиофлавина Т.В результате получают мольное соотношение 1:10 и 1:100 антитела к Аβ, причем раствор содержит 8,2% ДМСО. Этот раствор затем инкубируют в течение дополнительных 24 ч при 37°С. Затем измеряют спектральную флуоресценцию, и процент дезагрегирования подсчитывают согласно описанному выше.
1-42
1-42
Антитело ACI-24-Ab-3 показывает существенное дезагрегирование ранее агрегированного пептида Аβ при исследовании дезагрегирования. При мольном соотношении антитела к Аβ 1:100 дезагрегирование в среднем составляет 12% (2 независимых эксперимента), а при мольном соотношении 1:10 дезагрегирование составляет 20% (2 независимых эксперимента).
1-42
1-42
1-42
Из представленных выше результатов следует, что антитело ACI-24-Ab-3 проявляет бифункциональность при взаимодействии с Аβ филаментами, которая проявляется в способности ингибировать агрегирование Аβ и дезагрегирование ранее сформированных волокон Аβ.
1-42
Пример 1.5. Взаимодействия mACI-01Ab7 С2 - Аβ
1-42
Взаимодействия между антителом ACI-24-Ab-3 и амилоидным пептидом Аβ исследуют, используя поверхностный плазмонный резонанс (ППР). Определяют связывание антитела мыши с мономерами или волокнами Аβ 1.42.
1-42
1-42
1-42
1-42
1-42
Все эксперименты с ППР проводят на инструменте Biacore X (фирма Biacore АВ). Реагенты для иммобилизации (EDC, NHS и этаноламин), сенсорные чипы СМ5 и SA, а также текущий буфер и буфер для образцов HBS-EP получают от фирмы Biacore АВ. Натрий ацетат (10 мМ, pH 5,0) используют в качестве соединяющего буфера для повышения связывания. Фибриллярный пептид Аβ (фирма BAchem) получают добавлением буфера ФСБ к Аβ до конечной концентрации 3 мг/мл и емкости оставляют при 37°С на 7 суток. Фибриллярный пептид Аβ соединяют с сенсорным чипом СМ5, содержащим связанную с поверхностью матрицу из карбоксиметилдекстрана. Биотинилированный мономерный пептид Аβ (фирма Bachem) соединяют с сенсорным чипом SA, состоящим из матрицы из карбоксиметилдекстрана с ковалентно присоединенным страптавидином. Обычно четыре или пять концентраций моноклонального антитела исследуют серийными разведениями, используя текущий буфер. Впрыскивания проводят, начиная с самой низкой концентрации, и пропускают через проточные кюветы 1 и 2 при скорости тока 30 мкл/мин в течение 3 мин. Проточную кювету 2 не изменяют и полученные величины вычитают из проточной кюветы 1 для коррекции аппаратурного шума и массы рефракторных изменений. После завершения впрыскиваний поверхности немедленно промывают текущим буфером в течение 5 мин. Для удаления связанного антитела с Аβ фибрилл регенерируют поверхность путем впрыскиваний 10 мМ NaOH. Проводят кинетический анализ, используя алгоритмы для численного интегрирования и глобального анализа с применением программного обеспечения BIAevaluation 3.0. Кривые, полученные при впрыскивании определяемого в анализе вещества в разных концентрациях, накладывают, и исходные данные доводят до нуля. Для подгонки кривой все данные согласовывают одновременно с гомогенным комплексом 1:1.
Определяют связывание антитела мыши АС1-24-Ab-3 с амилоидом.
Пример 1.6. Связывание моноклонального антитела ACI-24-Ab-3 с амилоидными волокнами
Для анализа молекулярного связывания стороны антитела ACI-24-Ab-3 с ранее сформированными волокнами проводят отрицательно контрастированную трансмиссионную электронную микроскопию.
Антитело ACI-24-Ab-3 соединяют с 8 нм коллоидным золотом по методике Slot JW, Geuze HJ (1985). Для совместного инкубирования амилоидных 1.42 (ABt. 42) волокон, 6,65 мкмолей волокон инкубируют в течение 24 ч при комнатной температуре с антителом, меченым золотом, в мольном соотношении 1:100. Впоследствии 5 мкл образца инкубируют на свежей испускающей свет медной сетке (ячейка 200), покрытой парлодий/С пленкой в течение 45 сек, промывают трижды водой и 1 раз 2% свежеприготовленным и фильтрованным уранил ацетатом. Образцы окрашивают 2% уранил ацетатом в течение 15-20 сек. Избыток красителя на сетке отсасывают и затем высушивают на воздухе. Приготовляют по три сетки каждого образца. Сетки анализируют с помощью электронного трансмиссивного микроскопа Hitachi 7000.
Пример 1.7. Фракционирование путем ультрацентрифугирования в градиенте плотности
1-42
Способности моноклонального антитела ACI-24-Ab-3 к ингибированию полимеризации ApV42 волокон и дезагрегированию Аβ-волокон исследуют ультрацентрифугированием в градиенте плотности (Rzepecki и др., 2004), основанным на распределении полученных пептидных волокон разного размера после инкубирования с антителами и без антител с последующим анализом SDS-PAGE осаждения на ранее полученном градиенте (OptiPrep™). Одновременный анализ популяций ранее сформированных Аβ-волокон, способностей к дезагрегированию и ингибированию агрегирования совместно инкубируемых антител и связывание антител с волокнами являются очевидными преимуществами этих способов.
1-42
1-42
1-42
1-42
Для ингибирования агрегирования Аβ мономеры Аβ инкубируют с моноклональным антителом ACI-24-Ab-3 при двух разных мольных соотношениях (мольное содержание мономера Аβ в тридцать или сто раз выше мольного содержания моноклонального антитела) с конечной концентрацией Аβ 50 мкМ. После 24 ч инкубирования при 37°С образцы наслаивают поверх ступенчатого градиента Optiprep™ и пробирки центрифугируют при 259000 g в течение 3 ч при 4°С. Собирают 15 фракций (по 140 мкл каждая), фракция 1 наименее плотная фракция градиента от дна, а фракция 15 самая плотная фракция от дна градиента. Осадок также отбирают. Собранные фракции анализируют SDS-PAGE с окрашиванием серебром. Концентрация Аβ для исследования ингибирования в пять раз ниже, чем для исследования дезагрегирования, которое снижает кинетику агрегирования амилоида и обеспечивают измерение в линейной фазе.
1-42
1-42
Для дезагрегирования ранее сформированных фибрилл Аβ путем совместного инкубирования с моноклональным антителом ACI-24-Ab-3 (при двух разных мольных соотношениях 1:30 и 1:100, mAb + мономер Аβ с итоговой концентрацией Аβ 246 мкМ), образцы инкубируют в течение 24 ч при 37°С. Через 24 ч образцы фракционируют ультрацентрифугированием и разделяют методом SDS-PAGE, описанным выше и ранее (Rzepecki и др., 2004).
1-42
1-42
Пример 1.8. Флуоресцентное исследование для оценки подавления агрегирования Аβ филаментов и дезагрегирования ранее сформированных Аβ филаментов путем совместного инкубирования с моноклональным антителом АС1-24-Ab-3
BIS-ANS флуоресцентный анализ
1-42
1-42
Для оценки способности моноклонального антитела к ингибированию проводят флуоресцентное исследование BIS-ANS (LeVine, 2002), которое выявляет мономерную или нефибриллезную популяцию Аβ филаментов. До флуоресцентного измерения мономеры Аβ предварительно инкубируют либо с буфером (контроль), либо с моноклональным антителом ACI-24-Ab-3 (мольное соотношение моноклонального антитела к пептиду Аβ 1.42 составляет 1:100) в течение 14 ч при 37°С. Единицы относительной флуоресценции автоматически записывают и результаты выражают в процентах в виде изменений относительно контроля.
13
1-42
Пример 1.9. Описание методами ЯМР и анализом флуоресценции взаимодействия моноклонального антитела ACI-24-Ab-3 с С-меченым β-амилоид  пептидом
13
Для оценки возможного механизма, с помощью которого mAb растворяет ранее сформированные волокна или ингибирует формирование волокон, проводят сопоставление метода флуоресцентного исследования с применением Th-T и метода ЯМР в твердом теле U-C TyrlO и Vа112-меченого β-амилоидного 1-42 пептида. Следовательно, цель настоящего исследования заключается в анализе спектроскопией ЯМР в твердом теле перехода β-слоя в β-амилоидном пептиде и в присутствии моноклонального антитела, и для прямого сравнения со способностью к дезагрегированию, измеренной методом флуоресцентного исследования с применением Th-T.
1-42
α
β
13
13
Спектроскопия ЯМР в твердом теле не только определяет переход во вторичной структуре, но также позволяет локализовать домены АР1.42-пептида, которые определяют структурный переход. Метод ЯМР в твердом теле подтвердил свою применимость для решения указанной задачи, поскольку способствует определению структуры Аβ-волокон (Petkova и др., 2004, Petkova и др., 2002). В частности корреляция С и С химического сдвига с вторичной структурой (Cornilescu и др., 1999, Luca и др., 2001, Iwadate и др, 1999) является полезным инструментом для анализа изменения вторичной структуры пептида.
13
12
13
10
1-42
Синтез меченого пептида, включающего С предварительно меченый аланин в положении 12 (Val) и С предварительно меченый тирозин в положении 10 (Tyr), осуществляют по протоколу синтеза Fmoc. Идентичность и чистоту пептида подтверждают масс-спектроскопией MALDI. Меченый β-амилоидный пептид () используют для получения волокон путем инкубирования пептидного раствора в буфере ФСБ в течение 1 недели при 37°С. Главная проблема - плохая растворимость амилоидного β-пептида в буфере ФСБ, может быть решена следующим образом: величина pH буфера ФСБ временно повышается малыми количествами аммония для растворения амилоидного β-пептида. Исходную величину pH буфера ФСБ восстанавливают инкубированием образца в присутствии большего объема ФСБ, используя способность аммония улетучиваться.
Для измерения воздействия антител на изменение β-слоя, раствор волокон инкубируют с антителом в течение 24 ч при 37°С и для ЯМР, и для Th-T анализа. Для сравнения в реальном масштабе времени аликвоту одного и того же раствора используют для анализа Th-T флуоресценции, а оставшийся раствор лиофилизируют для измерений методом ЯМР.
13
Способность антитела ACI-24-Ab-3 к дезагрегированию исследуют путем совместного культивирования с ранее сформированным С-меченными амилоидными β-волокнами, используя флуоресцентный анализ Th-T.
Для исследования различий между ФСБ (контроль) и mAb инкубированием, каждый спектр распутывают, используя PeakFit (www.systat.com/-products/PeakFit). Линии подобраны с помощью смешанной процедуры подгонки (Lorentzian/Gaussian).
Пример 1.10. Воздействие антитела ACI-24-Ab-3 на амилоидные волокна
12.1. Модификация конформации Аβ1-42 волокон и инициация дезагрегирования после связывания антитела ACI-24-Ab-3
1-42
13
Для оценки возможного механизма, с помощью которого антитело дезагрегирует ранее сформированные бета-амилоидные волокна (Аβ), проводят сопоставление «голова-к-голове» тиофлавин Т (Th-T) флуоресцентного анализа, который проводят для измерения дезагрегирования, и метода ЯМР в твердом теле, который проводят для измерения вторичной конформации U-С Tyr 10 и Vа112-меченого β-амилоидного 1-42 пептида.
Пример 1.11. Картирование эпитопа моноклонального антитела ACI-24-Ab-3
1-42
1-42
1-28
17-40
1-40
1-42
Картирование эпитопа моноклонального антитела ACI-24-Ab-3 проводят методом ELISA, используя пептидную библиотеку, включающую в общей сложности 33 биотинилированных пептида, покрывающих полную аминокислотную (аа) последовательность Аβ (фирма Mimotopes, Clayton Victoria, Австралия, продажа от фирмы ANAWA Trading SA, Wangen, Швейцария). Пептиды в пептидной библиотеке состоят из 8, 9 или 10 аминокислот. Биотинилированный полный пептид Аβ (последовательность человека) используют в качестве положительного контроля (фирма Bachem, Bubendorf, Швейцария). Кроме того, более длинные пептиды, охватывающие Аβ, Аβ, Аβ и Аβ, используют для определения более широкой области, с которой эти антитела могут связаться. Эти 4 пептида также биотинилированы (фирма Anaspec, продажа от фирмы ANAWA Trading SA, Швейцария). Картирование эпитопа проводят по инструкциям производителя (фирма Mimotopes). Вкратце, планшеты, покрытые страптавидином (фирма NUNC, Roskilde, Дания), блокируют 0,1% БСА в ФСБ в течение ночи при 4°С. После промывки ФСБ-0,05% Твин 20 на планшеты в течение 1 ч при комнатной температуре наносят покрытие разными пептидами из библиотеки, разведенными в 0,1% БСА, 0,1% азиде натрия в ФСБ до конечной концентрации 10 мкМ. После промывки планшеты инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре с разными антителами, разведенными до 10 мкг/мл для ACI-24-Ab-3 в 2% БСА, 0,1% азиде натрия в ФСБ. Планшеты опять промывают и инкубируют со щелочной фосфатазой, объединенной с козьим антителом против IgG мыши (фирма Jackson Immunresearch West Grove, Пенсильвания, США) в течение 1 ч при комнатной температуре. После заключительного промывания планшеты инкубируют с фосфатазным субстратом (pNPP, Sigma-Aldrich, Сэнт-Луис, Миссури, США) и считывают через 3 ч инкубирования при 405 нм, используя ридер для планшетов ELISA.
1-42
1-42
Неожиданно было установлено, что антитело ACI-24-Ab-3 существенным образом не связывается с Аβ, а также не проявляет какого-либо связывания с какими-либо другими пептидами из библиотеки, несмотря на его способность ингибировать агрегирование Аβ.
1-42
Чтобы определить, может ли антитело ACI-24-Ab-3 распознавать другие Аβ пептиды, оценивали связывание с Аβ1 -28, АР17-40, Aβ1-40 и Аβ. Антитело ACI-24-Ab-3 не проявляет связывания с Аβ 17-40, не связывается или слабо связывается с Аβ 1-28 и Аβ 1.42, но существенно связывается с Аβ 1-40. Этот результат означает, что ACI-24-Ab-3 может быть специфичным в отношении Аβ1-40.
Пример 1.12, Влияние пассивной вакцинации антителом ACI-24-Ab-3 на нагрузку амилоида в мозге однократно трансгенных hAPP мышей
1-42
Для оценки in vivo способности моноклонального антитела ACI-24-Ab-3 связать растворимый амилоид и очистить от него мозг, 6-месячных однократно трансгенных hAPP мышей, подобранных по полу и возрасту, используют для исследования пассивной иммунизации разными дозами. Нагрузку растворимого амилоида анализируют в конце исследования по мозгу животных, исследуя Аβ 1-40 и Аβ методом ELISA (фирма TGC, Германия).
1-42
1-40
1-42
Животным, по 8-13 животных на группу, вводят с интервалом в одну неделю две инъекции моноклонального антитела в количестве 100, 300 и 1000 мкг в 200 мкл ФСБ, причем инъекция только одного ФСБ является контролем. Через сутки после второй инъекции животных умерщвляют для биохимического анализа растворимой амилоидной фракции. Для подсчета количества Аβ 1-40 человека и Аβ человека в растворимой фракции гомогенатов мозга и/или в спинномозговой жидкости (СМЖ) используют коммерчески доступные наборы для фермент-связанного иммуносорбентного анализа (Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay - ELISA) (h амилоид β 40 или β 42 ELISA высокой чувствительности, фирма TGC, Швейцария). Анализ ELISA проводят по протоколу производителя. Вкратце, стандарты (разведения синтетических Аβ или Аβ) и образцы получают в 96-луночном полипропиленовом планшете, не связывающем белки (фирма Greiner, Германия). Разведения стандарта с конечной концентрацией 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,3 и 15,6 пг/мл и образцы получают в образце растворителя, поставляемого в наборе ELISA, до конечного объема 60 мкл. Поскольку уровни амилоида у мышей повышаются с возрастом, и поскольку реальная оценка может быть получена при считывании образцов в рамках линейной части стандартной кривой, образцы для анализа Аβ 40 разводят 2:3, образцы для анализа Аβ 42 не разводят.
1-42
Образцы, стандарты и пустые пробы (50 мкл) добавляют в планшет из полистирола с покрытием анти-Аβ (иммобилизованное антитело избирательно распознает С-конец антигена) дополнительно с селективным конъюгатом анти-Ар-антитело (биотинилированное выявляемое антитело) и инкубируют в течение ночи при 4°С для того, чтобы допустить формирование комплекса антитело-амилоид-антитело. На следующий день добавляют конъюгат стрептавидина-пероксидазы, через 30 мин добавляют смесь ТМВ/пероксид, что приводит к конверсии субстрата в окрашенный продукт и интенсивность окраски измеряют с помощью фотометрии на ELISA-ридере с фильтром 450 нм. Количественную оценку содержания Аβ в образцах получают путем сравнения поглощения со стандартной кривой, полученной с синтетическим Аβ 1-40 или Аβ. Данные выражают в виде индивидуальных изменений относительно средней контрольной величины (в проценте к контролю).
Пример 1.13. Влияние хронического пассивного введения антитела ACI-24-Ab-3 на нагрузку бляшек у двукратно трансгенных мышей hAPP×PSl
Для оценки in vivo способности моноклонального антитела ACI-24-Ab-3 связывать и уменьшать амилоидные бляшки в мозге, дважды трансгенных мышей hAPPxPSl в возрасте 3,5 месяцев, подобранных по полу и возрасту, используют в течение 4 месяцев в исследовании постоянной пассивной иммунизации. Амилоидные бляшки анализируют в конце исследования методами гистохимии мозга животных путем связывания тиофлавина S.
15 трансгенных мышей получают 16 еженедельных инъекций 500 мкг моноклонального антитела в ФСБ. 15 животным вводят инъекцией только ФСБ в качестве контроля. Все инъекции вводят внутрибрюшинно. При умерщвления мышей анестезируют и промывают через сердце физиологической сывороткой при 4°С для удаления крови из сосудов мозга. Затем мозг удаляют из черепной коробки, а задний мозг и передний мозг разделяют ножом в корональном/фронтальном разрезе. Передний мозг ровно разделяют на левую и правую полусферу, используя сагиттальный скальпель. Одну полусферу фиксируют в течение ночи в 4% параформальдегиде для гистологического исследования. Сагиттальные вибратомные срезы (40 мкм) нарезают для свободного плавающего инкубирования и хранят при 4°С до окрашивания в ФСБ с 0,1% азидом натрия. Пять срезов на разных уровнях окрашивают для выявления плотных бляшек тиофлавином S. Срезы всех используемых животных рандомизируют для окрашивания и подсчитывают «вслепую». Для визуализации используют микроскоп Leica DMR, оборудованный камерой Sony DXC-9100P, и анализируют, используя программное обеспечение Leica Q-Win. Интенсивность света и установку конденсора для микроскопа сохраняют постоянными на протяжении всего анализа изображений. Все полученные изображения обрабатывают на одной и той же компьютерной подпрограмме для сведения к минимуму предвзятости исследователя. Для всех анализов выбирают одинаковую пороговую плотность срезов. Область основания выбирают для автоматического подсчета амилоидной нагрузки при окрашивании тиофлавином S.
Пример 1.14. Влияние пассивной вакцинации антителом ACI-24-Ab-3 на емкость памяти у однократно трансгенных мышей hAPP
Для оценки in vivo способности антитела ACI-24-Ab-3 модифицировать или повышать когнитивную функциональность, однократно трансгенных мышей hAPP в возрасте 9 месяцев, подобранных по полу и возрасту, используют в исследовании пассивной иммунизации. Непространственное распознавание измеряют в конце периода иммунизации с помощью задачи распознавания нового объекта (new Object Recognition Task - ORT).
12,13
Животным, по 12 животных на группу, вводят дважды внутрибрюшинной инъекцией по 400 мкг моноклонального антитела в 200 мкл ФСБ, причем инъекция только одного ФСБ является контролем. Через сутки после второй инъекции когнитивную емкость исследуют с помощью задачи распознавания нового объекта (new Object Recognition Task - ORT). Для регистрации ORT мышей помещают на 10 мин в зону оценки поведения и оставляют с новым неизвестным объектом. Время исследования записывают. Через 3 ч тех же животных переносят в ту же зону на второй сеанс, но им предъявляют старый, ранее ими исследованный, объект, а также дополнительно новый объект. Опять записывают время исследования животными обоих объектов, а получаемый когнитивный индекс рассчитывают в виде соотношения времени исследования нового объекта относительно общего времени исследования, и выражают в виде пропорциональных изменений к контролю.
1-42
Пример 1.15. Предпочтительное связывание моноклонального антитела мыши с препаратом, обогащенным высокомолекулярным протофибриллярным олигомером пептида Аβ сверх низкомолекулярных мономеров
1-42
1-42
Связывание моноклональных антител мыши против амилоида бета с низкомолекулярным мономер Аβ и высокомолекулярными протофибриллярными олигомер-обогащенными препаратами пептида Аβ может быть выполнено, используя метод ELISA.
1-42
1-42
1-42
Высокоразрешающей хроматографию по размеру молекул (size exclusion chromatography - SEC) с использованием двух SEC колонок, Superdex 75 HR 10/30 (диапазон 3-70 кДа) и Superose 6 HR 10/30 (диапазон 5-5,000 кДа), используют для получения Аβ пептидных фракций, состоящих из высокомолекулярных протофибриллярных обогащенных олигомерами и низкомолекулярными мономерными препаратами пептида Аβ. Затем получаемые элюаты окрашивают уранилацетатом и исследуют трансмиссивной электронной микроскопией высокого разрешения при 100 кВ для контроля структурной морфологии элюированных фракций Аβ.
Затем проводят анализ ELISA путем нанесения фракций Аβ 1-42 на планшет для анализа высокого связывания в концентрации 2 мкМ на ночь. Планшеты с нанесением затем блокируют 1,0% БСА и антитело ACI-24-Ab-3 (мышь EJ1A9) добавляют в серийное разведение, начиная с 20 мкг/мл. Также используют серийное разведение стандартного антитела (6Е10, фирма Chemicon). Антитело против IgG мыши, конъюгированное со щелочной фосфатазой, и 4-нитрофенилфосфат используют для выявления связывания. Планшеты считывают при 405 нм. Все условия исследуют с повтором с коэффициентом вариации <0,2.
1-42
1-42
Связывание антитела мыши ACI-24-Ab-3 против Аβ (мышь EJ1A9) и контрольного антитела 6Е10 измеряют методом ELISA. Таблица 1.4 и фиг.5 показывают величины оптической плотности (ОП) для антитела ACI-24-Ab-3 (мышь EJ1A9) при связывании с протофибриллярными обогащенными олигомерами и низкомолекулярными мономерными препаратами пептида Аβ 1.42. Таблица 1.5 и фиг.6 показывают величины оптической плотности (ОП) для 6Е10 анти- Аβ контрольного антитела при связывании с обогащенными протофибриллярными олигомерами и низкомолекулярными мономерами препаратами пептида Аβ человека.
1-42
1-42
Эти результаты показывают, что моноклональное антитело ACI-24-Ab-3 проявляет повышенное связывание с Аβ пептидами, имеющими PF/олиго морфологию более высокого порядка по сравнению с низкомолекулярным мономерным пептидом. Кроме того, эти результаты подтверждают, что ACI-24-Ab-3 связывается с эпитопом, который преимущественно проявлен на протофибриллярных обогащенных олигомером фракциях Аβ.
1-42
Пример 1.16. Связывание моноклонального антитела ACI-24-Ab-3 с мономерами и олигомерами амилоидного  пептида
1-42
1-42
Оценивают связывание антитела ACI-24-Ab-3 против амилоида Р (клон: EJ1A9) с мономерами и олигомерами пептида Аβ. До связывания в этом исследовании антитело хранят при -80°С. Пептид Аβ (W.M. Keck Facility, Йельский Университет) хранят в виде лиофильно высушенного порошка до использования. Все другие используемые реактивы приобретают на фирме Sigma-Aldrich (фирма Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Швейцария), если не указано иначе.
1-42
1-42
1-42
1-42
1-42
1-42
1-42
1-42
Для получения мономерных и высокомолекулярных фракций с улучшенным обогащенным олигомером пептидом Аβ, используют улучшенную методологию с применением высокоразрешающей хроматографии по размеру молекул (size exclusion chromatography - SEC). Две колонки SEC, Supelco TSK G4000PW-XL (диапазон: 10-1500 кДа, фирма Sigma) и Superose 6 HR 10/30 (диапазон 5-5000 кДа, фирма GE Healthcare Bio-Sciences АВ Уппсала, Швеция) используют для получения пептидных фракций Аβ, обогащенных низкомолекулярными мономерными и высокомолекулярными олигомерными фракциями. Получаемые SEC элюаты затем окрашивают уранилацетатом и исследуют трансмиссивной электронной микроскопией высокого разрешения при 100 кВ для контроля структурной морфологии фракций Аβ (данные не представлены). Для исследования связывания антитела с фракциями Аβ используют метод ELISA. Фракции Аβ наносят в планшеты для анализа высокого связывания в количестве 2,2 мкМ в ФСБ в течение 2 ч. Планшеты с покрытием затем промывают пять раз 0,05% твин-20 в ФСБ и блокируют 1,0% БСА. Анти-Аβ антитела, включая контрольное антитело (6Е10), добавляют к серийному разведению, начиная с указанных концентраций. Антитело против IgG мыши, соединенное со щелочной фосфатазой (фирма Jackson ImmunoResearch, Suffolk, Великобритания), и 4-нитрофенилфосфат используют для выявления связывания. Планшеты считывают при 405 нм после 14 ч инкубирования при комнатной температуре. Анализ повторяют трижды. Фиг.7 показывает величины средней оптической плотности (±SEM), полученные в трех независимых анализах ELISA. Антитело ACI-24-Ab-3 показывает повышенное связывание с препаратом Аβ, обогащенным олигомерами, по сравнению с фракцией, не обогащенной олигомерами и состоящей преимущественно из мономеров Аβ (фиг.7А). Напротив, контрольное антитело 6Е10 связывается одинаково хорошо с обеими фракциями Аβ.
Таблицы 1.6 и 1.7 показывают величины ОП, полученные в анализах ELISA 1, 2 и 3, для антител ACI-24-Ab-3 и 6Е10, соответственно.
Эти результаты показывают, что антитело ACI-24-Ab-3 (клон: EJ1A9) проявляет повышенное сродство с обогащенными олигомерами препаратами Аβ 1.42, по сравнению со сродством с мономерными препаратами АР1.42.
Пример 1.17. Влияние моноклонального антитела ACI-24-Ab-3 на апоптоз ганглиозных клеток сетчатки
Для оценки in vitro способности моноклонального антитела ACI-24-Ab-3 снижать гибель ганглиозных клеток сетчатки (ГКС), связанную с глазными заболеваниями, ассоциированными с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированными со связанными с амилоидом бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов, используют культивируемые ганглиозные клетки сетчатки, выделенные из крыс и мышей.
2
Для получения клеток животных анестезируют, удаляют глаза, сетчатку нарезают и инкубируют в растворе папаина 2 мг/мл в течение 25 мин при 37°С для разрушения внеклеточного матрикса. К концу обработки клетки промывают трижды средой для культивируемых ганглиозных клеток сетчатки в присутствии ингибитора протеазы для остановки действия папаина. Затем ткань растирают путем быстрого пропускания через пастеровскую пипетку до получения диспергированных клеток. Коммерческий счетчик Coulter используют для определения плотности клеток в суспензии перед культивированием клеток в смеси 95% воздуха/5%о СO при 37°С.
Для имитации повреждения, вызванного глазным заболеванием, ассоциированным с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированным со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов, и оценки превентивного действия мноклонального антитела ACI-24-Ab-3 клетки инкубируют с L-глутаматом в течение трех суток в присутствии или отсутствии моноклонального антитела ACI-24-Ab-3. Клетки, отдельно инкубировавшиеся в буфере, служат контролем.
Для определения выживания ГКС в конце периода инкубирования клетки фиксируют 3,7% формальдегидом в фосфатно солевом буфере (ФСБ) при комнатной температуре в течение 30 мин, промывают трижды в ФСБ и инкубируют в течение 1 ч в ФСБ, содержащем специфические маркеры ГКС Thyl.l или NF-L антитело. Антитело затем удаляют путем промывки и инкубируют клетки в течение 30 мин с флуоресцентно мечеными вторичными козьими антителами против мышиного IgG, козьими антителами против кроличьего IgG или кроличьим антителом против козьего IgG. К концу инкубирования клетки промывают, окрашивают в течение 5 мин раствором DAPI и промывают. Выжившие клетки ГКС подсчитывают с помощью флуоресцентной микроскопии и число клеток, имеющихся после инкубирования с моноклональным антителом ACI-24-Ab-3, сравнивают с контролем.
Пример 1.18. Влияние моноклонального антитела ACI-24-Ab-3 на апоптоз ганглиозных клеток сетчатки (ГКС) in vivo
Для оценки in vivo способности моноклонального антитела ACI-24-Ab-3 снижать гибель ганглиозных клеток сетчатки (ГКС) у индивидуумов с глазными заболеваниями, ассоциированными с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированными со связанными с амилоидом бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов, крыс и мышей используют в течение 2-16 недель исследования индуцированного внутриглазного давления (ВГД). Гибель ганглиозных клеток сетчатки (ГКС) измеряют в конце исследования по визуальному анализу in vivo и гистологическим анализом в конце исследования.
Для имитации повышения внутриглазного давления, ассоциированного с определенными глазными заболеваниями, ассоциированными с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированными со связанными с амилоидом бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов, в частности с глаукомой, животных сначала анестезируют внутрибрюшинно кетамином (75 мг/кг) и ксилазином (5 мг/кг), а также местно глазными каплями 1% пропаракаина. Затем используют два других метода для искусственного повышения ВГД в одном глазу (односторонне) у крыс и мышей. По одному методу анестезированные животные получают инъекцию туши в переднюю камеру глаза с последующей индуцированной лазером фотокоагуляцией красителя в трабекулярной сети диодным лазером с помощью лампы с узким пучком с длиной волны 532 нм перпендикулярно трабекулам и параллельно радужной оболочке. В виде начальной обработки животные получают по 40-50 пятнышек размером 50 мкм, 0,4 Вт длительностью 0,6 сек. По второму методу для искусственного повышения ВГД анестезированные животные получают инъекцию 50 мкл гипертонического солевого раствора в эписклеральные вены одного глаза, используя микроиглу с усилием, достаточным для обесцвечивания вены.
Для измерения ВГД используют коммерческий ручной тонометр (фирма TonoLab). Проводят измерения у животных, находящихся под действием анестезии, и получают среднюю величину по 12 считываниям непосредственно перед обработкой лазером и через 1, 4 и 7 суток после обработки, и затем еженедельно на протяжении эксперимента. Если с интервалом 1 неделя разница ВГД между двумя глазами животного составляет менее 6 мм Hg, животных в дальнейшее исследование не включают.
Для оценки превентивного воздействия моноклонального антитела ACI-24-Ab-3 на апоптоз ГКС половина животных, получающих ВГД-индуцирующую обработку, получает инъекцией в стекловидное тело или внутривенно моноклональное антитело ACI-24-Ab-3 ко времени повышения ВГД. Другая половина животных служит контролем. Функциональные ГКС по всей сетчатки глаз с оценкой ВГД отображают и подсчитывают, а затем сравнивают с количеством, имеющимся в другом глазу того же животного. Разница в количестве ГКС по двум глазам представляет клетки, которые были утрачены в результате повышения ВГД в прооперированном глазу. Анализ изменений дифференцирующей величины помогает в идентификации защитных действий, вызванных моноклональным антителом ACI-24-Ab-3.
Количество ГКС измеряют путем гистологического анализа по конечным точкам через 2, 4, 8 и 16 недель после индуцированного повышения ВГД. Сетчатку, полученную от животных, фиксируют в 4% параформальдегиде, и окрашивают срезы или весь препарат, используя специфический для ГКС маркер Вrn3b. Многочисленные исследования показывают, что утрата окрашивания ВгпЗЬ коррелирует с утратой функции у ГКС. Для подтверждения точности нанесения гистологической ГКС метки, может быть применен указанный метод в соединении с обратным нанесением метки глазного нерва из ЦНС с DiASP или Fluorogold в подгруппе животных для идентификации ГКС, которые поддерживают интактный функциональный аксон, не утративший соединения с мишенями в мозге.
В качестве второго заключительного исследования также измеряют апоптоз ГКС в подгруппе глаз. Флуоресцентно меченый аннексии V используют для нанесения метки на апоптозные клетки путем инъекции в глазное тело белка за один час до умерщвления животного. Сетчатки обрабатывают согласно указанному выше, и визуализацию аннексина V осуществляют в сочетании с визуализацией при заключительном гистологическом исследовании.
Пример 2. Антитело, выработанное путем иммунизации пэгелированной надмолекулярной антигенной конструкцией
Пример 2.1. Способы получения надмолекулярных антигенных конструкций
2.1.1. Синтез пэгелированного β-амилоидного пептидного антигена
Для повышения иммунного ответа используют якорь/спейсер для восстановления пептида в липосоме, например полиэтиленгликоль (ПЭГ). ПЭГ ковалентно присоединен к остатку лизина по двум концам пептида. С другим концом цепи (ПЭГ n=70) ковалентно связан фосфатидилэтаноламин (ФЭА) для функционирования в качестве элемента заякоривания в двойном слое липосомы. Таким образом, липосома продолжает функционировать в качестве адъюванта и пептид, достаточно далеко расположенный от двойного слоя, может быть процессирован отдельно, и таким образом повышается его иммуногенность по сравнению с пальмитилированным антигеном.
Надмолекулярные конструкции, описанные в настоящем изобретении, синтезируют, используя только стандартную Fmoc/tBu аминокислотную защиту боковой цепи. Обычно пэгелирование пептидов приводит к смесям региоизомеров. В настоящем изобретении применяют обычный способ сайт-специфического присоединения конъюгата ПЭГ-липид к обоим концам, С- и N-, пептида Аβ, используя частично защищенные пептиды.
Для таких пептидных последовательностей, содержащих внутренние остатки Lys или His (22-35), к каждому концу добавляют ортоганально защищенный Lys(ivDde). Дополнительный остаток Gly добавляют к С-концу для облегчения синтеза. Группу Fmoc удаляют 20% пиперидином в DMF и N-ацетилируют, используя уксусный ангидрид. Селективного расщепления групп ivDde достигают 3% гидразингидратом в DMF в течение 1 ч. 2-хлортритиловая смола предпочтительнее по сравнению с более широко используемой смолой Ванга, поскольку установлено, что она более устойчива к гидразинолизису. Кроме того, 2-хлортритиловая смола чрезвычайно чувствительна к кислотам и поэтому, в отличие от смолы Ванга, позволяет выделять защищенные пептиды. В самом деле, необходимо провести реакцию объединения в растворе в виде объединения смолы-связанного пептида с ранее активированным липидным реагентом DSPE-n3T-SPA не приводит к какому-либо объединенному продукту. Такое избирательное отщепление от смолы в мягких условиях (уксусная кислота/трифторэтанол/ дихлорметан, 1:1:8, 1 ч, комнатная температура) дает внутренне защищенные пептиды.
22-35
29-40
Соединение в фазе раствора успешно достигают с пептидами, производными от последовательностей Аβ и Aβ соответственно, с DSPE-n3r-SPA в ДМСО при избытке основания. Реакции затем заглушают добавлением избытка этаноламина в течение 2 и раствор лиофилизируют.
Для последовательности 29-40 не требуется специальной стратегии защиты.
Оценка методом ВЭЖХ (полупрепаративная обратной фазы С4 колонка) позволяет получить чистоту 50-70% N- и С- концевых конъюгатов ПЭГ-липид, идентичность которых подтверждают методом MALDI (matrix assisted laser desorption ionization - масс-спектрометрия с лазерной десорбцией/ионизацией при содействии матрицы). Каждую последовательность, проявившую существенную вариацию, касающуюся легкости вступления реакции соединения, и условия соответствующим образом выверяют (температура, число мольных эквивалентов DSPE-nST-SPA, время). Для отделения избытка DSPE-rOT-SPA от желаемого продукта применяют очистку ВЭЖХ. Разделение моно- и ди-соединенных продуктов до итогового снятия защиты с боковых цепей может быть достигнуто с помощью использования катион-обменной хроматографии. Последующее удаление защиты боковой цепи пептида и удаление избытка закаленного DSPE-n3T-SPA приводит к выделению целевых конъюгатов с приемлемой степенью чистоты.
Такой подход к синтезу N- и С-концевых липид-ПЭГ β-амилоидных антигенов, используя защищенные пептиды, может быть применен к широкому кругу различных пептидных последовательностей.
Пример 2.2. Антитела, индуцированные надмолекулярными антигенными конструкциями
22-35
29-40
Получение моноклональных антител, содержание которых повышается против пэгелированных Аβ и Аβ надмолекулярных антигенных конструкций
22-35
29-40
Липосомальные антигены получают согласно описанию Nicolau и др. (PNAS, 99, 2002, сс.2332-2337). Последовательности ПЭГ-Аβ и -Аβ восстановлены в конструкцию, состоящую из липосом, полученных из димиристоилфосфатидилхолина (dimyristoyl phosphatidyl choline - DMPC), димиристоилфосфатидилэтаноламина (dimyristoyl phosphatidyl ethanolamine -DMPEA), димиристоилфосфатидилглицерина (dimyristoyl phosphatidyl glycerol -DMPG) и холестерина (мольные соотношения 0,9: 0,1: 0,1: 0,7), содержащих монофосфорильный липид А (40 мг/мМ фосфолипидов). Эти антигены используют для иммунизации мышей C57BL/6 с двухнедельными интервалами. По 10-12 животных иммунизируют каждым из антигенов. После 3-6 иммунизации мышей с терапевтическими титрами (при которых разведение сыворотки 1:5000 положительны по методу ELISA) отбирают для слияния. Клетки селезенки собирают от иммунизированных животных и получают гибридомы путем гибридизации сенсибилизированных клеток селезенки с линией клеток миеломы. Гибридизацию В-лимфоцитов мыши из селезенки проводят с клетками линии миеломы SP2-0 (фирма АТСС, Manassas, Вирджиния), используя хорошо известные способы Kohler и Milstein (Nature 256, 1957, сс.495-497) и Harlow и Lane (кн.: «Antibodies: A Laboratory Manuab, 1988, изд. Cold Spring Harbor Laboratory, Нью-Йорк).
1-42
Клетки индуцируют к слиянию добавлением полиэтиленгликоля. Получаемые гибридные клетки затем клонируют обычным образом, например, используя серийные разведения. Клоны гибридомы, вырабатывающие IgG, отбирают и исследуют на специфичность связывания с пептидом Аβ методом ELISA, и получаемые клоны, которые вырабатывают требуемые моноклональные антитела, культивируют.
Полученные таки образом гибридомы отбирают химически, помещая клетки в селективную среду, содержащую гипоксантин, аминоптерин и тимидин (hypoxanthine, aminopterin, thymidine - HAT).
Гибридомы последовательно подвергают скринингу для определения способности вырабатывать моноклональные антитела против специфических связанных с амилоидом заболеваний и расстройств. Гибридомы, вырабатывающие исследуемые антитела, клонируют, размножают и хранят замороженными для будущего использования. Предпочтительная гибридома вырабатывает моноклональное антитело с изотипом IgG.
Пример 2.3. Специфическое определение антител АС1-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-3
Для анализа специфичности антител ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 различные концентрации ранее сформированного амилоида 1.42, 1-40 и 17-40, 1-28 фибрилл наносят на мембрану из нитроцеллюлозы Hybond ECL (фирма Amersham Biosciences). После блокирования 10% сухим молоком и 0,7% твин 20 мембраны инкубируют с основным антителом в концентрации 20 мкг/мл в течение 2 ч при комнатной температуре. После промывки мембраны инкубируют с пероксидазой хрена, объединенной с овечьим антителом против мышиного IgG (фирма Amersham Biosciences), в течение 1 ч при комнатной температуре, промывают и инкубируют с хемилюминесцентным раствором с последующим экспонированием мембраны на рентгеновской пленке.
Для измерения связывания моноклональных антитела ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 с амилоидом Р1-42, 1-40 и 17-40, волокна 1-28 заранее формируют в течение семи суток при 37°С и наносят на мембрану. 20 мкг/мл антитела используют для измерения связывающей способности, и связанное антитело выявляют объединенным с пероксидазой хрена овечьим антителом против IgG мыши в течение 20 мин обработки.
Пример 2.4. Исследование флуоресценции с применением тиофлавина Т (Th-T)
1-42
1-42
Для измерения подавления ингибирования и дезагрегирования, свойственных моноклональному антителу, используют анализ флуоресценции с применением тиофлавина Т (Th-T), который специфически связывается с фибриллярными молекулами Аβ, и впоследствии интенсивность флуоресцентной эмиссии коррелирует с количеством Аβ филаментов в растворе.
Порошок лиофилизированного Аβ 1-42 восстанавливают в гексафлюороизопропаноле до концентрации 1 мМ. Раствор пептида обрабатывают ультразвуком в течение 15 мин при комнатной температуре, перемешивают в течение ночи, и аликвоты помещают в микроцентрифужный пробирки (без силикона). Гексафлюороизопропанол затем выпаивают в струе аргона. Полученную пептидную пленку высушивают в вакууме в течение 10 мин и хранят при -80°С до применения.
1-42
2.4.1. Исследование агрегирования Аβ
1-42
1-42
1-42
Для исследования опосредованного антителом подавления агрегирования Аβ, антитело, предварительно разведенное в ФСБ, и раствор для исследования, содержащий приведенные ниже компоненты, получают в пробирках без силикона: 3,3 или 0,33 мкмоля предварительно разведенного антитела, 10 мкмолей тиофлавина Т, 33 мкмоля Аβ и 8,2% ДМСО. Следовательно, итоговые мольные соотношения антитела к Аβ составляют 1:10 и 1:100. Также получают соответствующие контрольные растворы. Растворы затем инкубируют в течение 24 ч при 37°С и спектральную флуоресценцию (в относительных единицах флуоресценции - ОЕФ) считывают в шести повторах в черных 384-луночных планшетах (фирма Perkin-Elmer) на спектрофлуорометре Perkin-Elmer FluoroCount. Подавление агрегирования или дезагрегирование выражают в виде среднего процента подавления или дезагрегирования, соответственно, при сопоставлении с контролем по следующему уравнению:
<mrow><mi>П</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>ц</mi><mi>е</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mo>=</mo><mfrac><mtable columnalign="left"><mtr><mtd><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>О</mi><mi>Е</mi><mi>Ф</mi><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mi>п</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>о</mi><mi>ж</mi><mi>и</mi><mi>т</mi><mi>е</mi><mi>л</mi><mi>ь</mi><mi>н</mi><mi>о</mi><mi>г</mi><mi>о</mi><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mi>к</mi><mi>о</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>я</mi><mtext> </mtext><mo>−</mo><mtext> </mtext><mi>О</mi><mi>Е</mi><mi>Ф</mi><mtext> </mtext><mi>о</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>и</mi><mi>ц</mi><mi>а</mi><mi>т</mi><mi>е</mi><mi>л</mi><mi>ь</mi><mi>н</mi><mi>о</mi><mi>г</mi><mi>о</mi><mtext> </mtext><mi>к</mi><mi>о</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>я</mi></mrow><mo>)</mo></mrow><mo>−</mo></mtd></mtr><mtr><mtd><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>О</mi><mi>Е</mi><mi>Ф</mi><mtext> </mtext><mi>о</mi><mi>б</mi><mi>р</mi><mi>а</mi><mi>з</mi><mi>ц</mi><mi>а</mi><mtext> </mtext><mi>п</mi><mi>о</mi><mi>д</mi><mi>а</mi><mi>в</mi><mi>л</mi><mi>е</mi><mi>н</mi><mi>и</mi><mi>я</mi><mtext> </mtext><mi>А</mi><msub><mi>β</mi><mrow><mn>1</mn><mo>−</mo><mn>42</mn></mrow></msub><mtext> </mtext><mo>−</mo><mtext> </mtext><mi>О</mi><mi>Е</mi><mi>Ф</mi><mtext> </mtext><mi>о</mi><mi>б</mi><mi>р</mi><mi>а</mi><mi>з</mi><mi>ц</mi><mi>а</mi><mtext> </mtext><mi>б</mi><mi>е</mi><mi>з</mi><mtext> </mtext><mi>А</mi><msub><mi>β</mi><mrow><mn>1</mn><mo>−</mo><mn>42</mn></mrow></msub></mrow><mo>)</mo></mrow></mtd></mtr></mtable><mrow><mi>п</mi><mi>о</mi><mi>д</mi><mi>а</mi><mi>в</mi><mi>л</mi><mi>е</mi><mi>н</mi><mi>и</mi><mi>я</mi><mtext> </mtext><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>О</mi><mi>Е</mi><mi>Ф</mi><mtext> </mtext><mi>п</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>о</mi><mi>ж</mi><mi>и</mi><mi>т</mi><mi>е</mi><mi>л</mi><mi>ь</mi><mi>н</mi><mi>о</mi><mi>г</mi><mi>о</mi><mtext> </mtext><mi>к</mi><mi>о</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>я</mi><mtext> </mtext><mo>−</mo><mtext> </mtext><mi>О</mi><mi>Е</mi><mi>Ф</mi><mtext> </mtext><mi>о</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>и</mi><mi>ц</mi><mi>а</mi><mi>т</mi><mi>е</mi><mi>л</mi><mi>ь</mi><mi>н</mi><mi>о</mi><mi>г</mi><mi>о</mi><mtext> </mtext><mi>к</mi><mi>о</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>я</mi></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow></mfrac><mo>×</mo><mn>100</mn><mi>%</mi></mrow>
1-42
1-42
Антитело ACI-11-Ab-9 проявляет существенное подавление агрегирования Аβ относительно контроля. При мольном соотношении антитела к Аβ 1:100 среднее ингибирование составляет в среднем 34% (3 независимых эксперимента), причем при мольном соотношении 1:10 подавление составляет 69% (2 независимых эксперимента).
1-42
1-42
Антитело ACI-12-Ab-11 также проявляет существенное подавление агрегирования Аβ относительно контроля. При мольном соотношении антитела к Аβ 1:100 среднее ингибирование составляет в среднем 30% (2 независимых эксперимента), причем при мольном соотношении 1:10 подавление составляет 66% (2 независимых эксперимента).
1-42
2.4.2. Исследование дезагрегирования Аβ
1-42
1-42
Для анализа способности моноклонального антитела к дезагрегированию используют флуоресцентный анализ с применением тиофлавина Т (ThT), который специфически связывает фибриллярные молекулы Аβ, и затем интенсивность флуоресцентной эмиссии коррелирует с количеством Аβ филаментов, имеющихся в растворе.
1-42
1-42
1-42
Для исследования опосредованного антителом дезагрегирования ранее агрегированного Аβ, низкомолекулярный Аβ, полученный согласно описанному выше, получают в виде 110 мкМ раствора в 27% ДМСО и 1х ФСБ. Этот раствор затем агрегируют при 37°С в течение 24 ч, после чего добавляют: 3,3 или 0,33 мкМ предварительно разведенного антитела и 10 мкМ тиофлавина Т. Это приводит к мольному соотношению 1:10 и 1:100 антитела к Аβ в 8,2% ДМСО. Этот раствор затем инкубируют в течение дополнительных 24 ч при 37°С. Затем измеряют спектральную флюоресценцию и рассчитывают процент дезагрегирования, описанный выше.
1-42
1-42
Антитело ACI-11-Ab-9 показывает существенное дезагрегирование ранее агрегированного Аβ в анализе дезагрегирования. При мольном соотношении антитела к Аβ 1:100 дезагрегирование в среднем составляет 22% (3 независимых эксперимента), хотя при мольном соотношении 1:10 дезагрегирование составляет 52% (3 независимых эксперимента).
1-42
1-42
Антитело ACI-12-Ab-11 также показывает существенное дезагрегирование ранее агрегированного Аβ в анализе дезагрегирования. При мольном соотношении антитела к Аβ 1:100 дезагрегирование в среднем составляет 18% (2 независимых эксперимента), хотя при мольном соотношении 1:10 дезагрегирование составляет 54% (2 независимых эксперимента).
1-42
1-42
Из указанных выше результатов следует, что антитела ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 проявляют двойную функциональность при взаимодействии с Аβ филаментами, которая заключается в том, что оба антитела способны ингибировать агрегирование Аβ 1.42 и способны дезагрегировать ранее сформированные волокна Аβ.
1-42
1-42
Пример 2.5. Взаимодействия ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 Исследуют взаимодействия между антителами ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 и амилоидным пептидом Аβ, используя резонанс поверхностного плазмона. Определяют связывание антитела мыши с мономерами или фибриллами Аβ.
1-42
1-42
1-42
1-42
1-42
Все эксперименты по резонансу поверхностного плазмона проводят на приборе Biacore X (фирма Biacore АВ). Реагенты для иммобилизации (EDC, NHS и этаноламин), сенсорные чипы СМ5 и SA, а также текущий буфер и буфер для образцов HBS-EP получают от фирмы Biacore АВ. Натрий ацетат (10 мМ, pH 5,0) используют в качестве соединяющего буфера для повышения связывания. Фибриллярный пептид Аβ (фирма BAchem) получают добавлением буфера ФСБ к Аβ до конечной концентрации 3 мг/мл и емкости оставляют при 37°С на 7 суток. Фибриллярный пептид Аβ соединяют с сенсорным чипом СМ5, содержащим связанную с поверхностью матрицу из карбоксиметилдекстрана. Биотинилированный мономерный пептид Аβ (фирма Bachem) соединяют с сенсорным чипом SA, состоящим из матрицы из карбоксиметилдекстрана с ковалентно присоединенным страптавидином. Обычно четыре или пять концентраций моноклонального антитела исследуют серийными разведениями, используя текущий буфер. Впрыскивания проводят, начиная с самой низкой концентрации и пропускают через проточные кюветы 1 и 2 при скорости тока 30 мкл/мин в течение 3 мин. Проточную кювету 2 не изменяют и ответы вычитают из проточной кюветы 1 для коррекции аппаратурного шума и массы рефракторных изменений. После завершения впрыскиваний поверхности немедленно промывают текущим буфером в течение 5 мин. Для удаления связанного антитела с Аβ фибрилл регенерируют поверхность путем впрыскиваний 10 мМ NaOH. Проводят кинетический анализ, используя алгоритмы для численного интегрирования и глобального анализа с применением программного обеспечения BIAevaluation 3.0. Кривые, полученные при впрыскивании определяемого в анализе вещества в разных концентрациях, накладывают и исходные данные доводят до нуля. Для подгонки кривой все данные согласовывают одновременно с гомогенным комплексом 1:1.
Определяют связывание антител мыши ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 с амилоидом.
Пример 2.6. Связывание моноклональных антител АСI-11-Ab-9 и АСI-12-Ab-11 с амилоидными волокнами
Для анализа молекулярного связывания участка антител АСI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 с ранее сформированными волокнами проводят отрицательно контрастированную трансмиссионную электронную микроскопию.
1-42
Антитела АСI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 соединяют с 8 нм коллоидным золотом по методике Slot JW, Geuze HJ (1985). Для совместного инкубирования амилоидных 1-42 (Аβ) волокон, 6,65 мкМ волокон инкубируют в течение 24 ч при комнатной температуре с антителом, меченым золотом, в мольном соотношении 1:100. Впоследствии 5 мкл образца инкубируют на свежей испускающей свет медной сетке (ячейка 200), покрытой парлодий/С пленкой в течение 45 сек, промывают трижды водой и 1 раз 2% свежеприготовленным и фильтрованным уранил ацетатом. Образцы окрашивают 2% уранил ацетатом в течение 15-20 сек. Избыток красителя на сетке отсасывают и затем высушивают на воздухе. Приготовляют по три сетки каждого образца. Сетки анализируют с помощью электронного трансмиссивного микроскопа Hitachi 7000.
Пример 2.7. Фракционирование ультрацентрифугированием в градиенте плотности
1-42
Способности моноклональных антител АСI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 к ингибированию полимеризации Api.42 волокон и дезагрегировнанию Аβ-волокон исследуют ультрацентрифугированием в градиенте плотности (Rzepecki и др., 2004), основанным на распределении полученных пептидных волокон разного размера после инкубирования с антителами и без антител с последующим анализом SDS-PAGE осаждения на ранее полученном градиенте (OptiPrep™). Одновременный анализ популяций ранее сформированных Аβ-волокон, способностей к дезагрегированию и ингибированию агрегирования совместно инкубируемых антител и связывание антител с волокнами являются очевидными преимуществами этих способов.
1-42
1-42
1-42
Для ингибирования агрегирования Аβ мономеры Аβ инкубируют с моноклональныма антителами ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 при двух разных мольных соотношениях (мольное содержание мономера Аβ в тридцать или сто раз выше мольного содержания моноклонального антитела) с конечной концентрацией Аβ 50 мкМ. После 24 ч инкубирования при 37°С образцы наслаивают поверх ступенчатого градиента Optiprep™ и пробирки центрифугируют при 259000 g в течение 3 ч при 4°С. Собирают 15 фракций (по 140 мкл каждая), из которых фракция 1 наименее плотная фракция градиента от дна, а фракция 15 самая плотная фракция от дна градиента. Осадок также отбирают. Собранные фракции анализируют SDS-PAGE и окрашивают серебром. Концентрация АР1.42 для исследования ингибирования в пять раз ниже, чем для исследования дезагрегирования, что снижает кинетику агрегирования амилоида и обеспечивает измерение в линейной фазе.
1-42
1-42
Для дезагрегирования ранее сформированных фибрилл Аβ путем совместного инкубирования с моноклональными антителами ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 (при двух разных мольных соотношениях 1:30 и 1:100, mAb+мономер Аβ с итоговой концентрацией Аβ 246 мкМ), образцы инкубируют в течение 24 ч при 37°С. Через 24 ч образцы фракционируют ультрацентрифугированием и разделяют методом SDS-PAGE, описанным выше и ранее (Rzepecki и др., 2004).
1-42
1-42
Пример 2.8. Флуоресцентное исследование для оценки подавления агрегирования Аβ филаментов и дезагрегирования ранее сформированных Аβ филаментов путем совместного инкубирования с моноклональными антителами АС1-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11, соответственно
BIS-ANS флуоресцентный анализ
1-42
1-42
1-42
Для оценки способности моноклональных антител к ингибированию проводят флуоресцентное исследование BIS-ANS (LeVine, 2002), которое специфически выявляет мономерную или нефибриллезную популяцию Аβ филаментов. До флуоресцентного измерения мономеры Аβ предварительно инкубируют либо с буфером (контроль), либо с моноклональными антителами ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 (мольное соотношение моноклональных антител к пептиду Аβ составляет 1:100) в течение 14 ч при 37°С. Единицы относительной флуоресценции автоматически записывают, и результаты выражают в процентах в виде изменений относительно контроля.
Пример 2.9. Описание методом ЯМР и методом флуоресценции взаимодействия моноклональных антител ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 с Немеченым В-амилоидным пептидом
13
Для оценки возможного механизма, с помощью которого mAb растворяет ранее сформированные волокна или ингибирует формирование волокон, проводят сопоставление метода флуоресцентного исследования с применением Th-T и метода ЯМР в твердом теле U-C Tyr10 и Vа112-меченого β-амилоидного 1.42 пептида. Следовательно, цель настоящего исследования заключается в анализе спектроскопией ЯМР в твердом теле перехода β-слоя в β-амилоидном пептиде, и в присутствии моноклонального антитела, и для прямого сравнения со способностью к дезагрегированию, измеренной методом флуоресцентного исследования с применением Th-T.
1-42
1-42
α
β
13
13
Спектроскопии ЯМР в твердом теле не только определяет переход во вторичной структуре, но также позволяет локализовать домены Аβ-пептида, которые определяют структурный переход. Метод ЯМР в твердом теле подтвердил свою применимость для решения указанной задачи, поскольку способствует определению структуры Аβ-волокон (Petkova и др., 2004, Petkova и др., 2002). В частности корреляция С и С химического сдвига с вторичной структурой (Cornilescu и др., 1999, Luca и др., 2001, Iwadate и др, 1999) является полезным инструментом для анализа изменения вторичной структуры пептида.
12
10
Синтез меченого пептида, включающего С предварительно меченый валин в положении 12 (Val) и С предварительно меченый тирозин в положении 10 (Tyr), осуществляют по протоколу синтеза Fmoc. Идентичность и чистоту пептида подтверждают масс-спектроскопией MALDI. Меченый β-амилоидный пептид (1-42) используют для получения волокон путем инкубирования пептидного раствора в буфере ФСБ в течение 1 недели при 37°С. Главная проблема - плохая растворимость амилоидного β-пептида в буфере ФСБ, может быть решена следующим образом: величина pH буфера ФСБ временно повышается малыми количествами аммония для растворения амилоидного β-пептида. Исходную величину pH буфера ФСБ восстанавливают инкубированием образца в присутствии большего объема ФСБ, используя способность аммония улетучиваться.
Для измерения воздействия антител на изменение β-слоя, раствор волокон инкубируют с антителом в течение 24 ч при 37°С и для ЯМР, и для Th-T анализа. Для сравнения в реальном масштабе времени аликвоту одного и того же раствора используют для анализа Th-T флуоресценции, а оставшийся раствор лиофилизируют для измерений методом ЯМР.
13
Способность антител АС1-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 к дезагрегированию исследуют путем совместного культивирования с ранее сформированным, С-меченными амилоидными β-волокнами, используя флуоресцентный анализ Th-T.
Для исследования различий между ФСБ (контроль) и mAb инкубированием, каждый спектр распутывают, используя программу PeakFit (www.systat.com/-products/PeakFit). Линии подобраны с помощью смешанной процедуры подгонки (Lorentzian/Gaussian).
Пример 2.10. Воздействие антител АС1-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 на амилоидные волокна
1-42
12.1. Модификация конформации Аβ волокон и инициация дезагрегирования после связывания антител ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11
1-42
1-42
13
Для оценки возможного механизма, с помощью которого антитело дезагрегирует ранее сформированные бета-амилоидные волокна (Аβ), проводят сопоставление тиофлавин Т (Th-T) флуоресцентного анализа, который проводят для измерения дезагрегирования, и метода ЯМР в твердом теле, который проводят для измерения вторичной конформации U-C Tyr10 и Va112-меченого Аβ пептида, анализируя вторичную конформацию.
Пример 2.11. Картирование эпитопа моноклональных антител ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11
1-42
1-42
1-28
17-40
1-40
1-42
Картирование эпитопа моноклональных антител ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 проводят методом ELISA, используя пептидную библиотеку, включающую в общей сложности 33 биотинилированных пептида, покрывающих полную аминокислотную (аа) последовательность Аβ (фирма Mimotopes, Clayton Victoria, Австралия, продажа от фирмы ANAWA Trading SA, Wangen, Швейцария). Пептиды в пептидной библиотеке состоят из 8, 9 или 10 аминокислот. Биотинилированный полный пептид Аβ (последовательность человека) используют в качестве положительного контроля (фирма Bachem, Bubendorf, Швейцария). Кроме того, более длинные пептиды, охватывающие Аβ, Аβ, Аβ и Аβ, используют для определения более широкой области, с которой эти антитела могут связаться. Эти 4 пептида также биотинилированы (фирма Anaspec, продажа от фирмы ANAWA Trading SA, Швейцария). Картирование эпитопа проводят по инструкциям производителя (фирма Mimotopes). Вкратце, планшеты, покрытые страптавидином (фирма NUNC, Roskilde, Дания), блокируют 0,1% БСА в ФСБ в течение ночи при 4°С. После промывки ФСБ-0,05% Твин 20 на планшеты в течение 1 ч при комнатной температуре наносят покрытие разными пептидами из библиотеки, разведенными в 0,1% БСА, 0,1% азиде натрия в ФСБ до конечной концентрации 10 мкМ. После промывки планшеты инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре с разными антителами, разведенными до 10 мкг/мл для антител АС1-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 в 2% БСА, 0,1% азиде натрия в ФСБ. Планшеты опять промывают и инкубируют со щелочной фосфатазой, объединенной с козьим антителом против IgG мыши (фирма Jackson Immunresearch West Grove, Пенсильвания, США) в течение 1 ч при комнатной температуре. После заключительного промывания планшеты инкубируют с фосфатазным субстратом (pNPP, Sigma-Aldrich, Сэнт-Луис, Миссури, США) и считывают через 3 ч инкубирования при 405 нм, используя ридер для планшетов ELISA.
1-42
1-42
Было установлено, что антитело ACI-11-Ab-9 существенным образом связывается с Аβ, но не связывается с какими-либо другими пептидами из библиотеки. Следовательно, антитело должно иметь более 8 аминокислот для связывания с эпитопом, и/или антитело ACI-11-Ab-9 может распознать конформационный эпитоп, который имеется только в целой последовательности Аβ.
1-42
Антитело ACI-12-Ab-11 также проявляет существенное связывание с Аβ, но подобно ACI-11-Ab-9, антитело ACI-12-Ab-11 не связывается с каким-либо из более коротких пептидов из пептидной библиотеки.
1-42
Чтобы определить, могут ли антитела ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 распознавать другие Аβ пептиды, оценивают связывание с Аβ1-28, Аβ17-40, Аβ1-40 и Аβ.
1-42
ACI-11-Ab-9 проявляет существенное связывание с Аβ1-28, Аβ1-40, Аβ, но не проявляет какого-либо связывания с Аβ17-40.
Вместе эти результаты означают, что эпитоп антитела ACI-11-Ab-9 лежит в области 1-28 в Аβ, и что эпитоп или длиннее 8 аминокислот, и/или связывание с Аβ зависит от конформации Аβ.
1-42
ACI-12-Ab-11 проявляет существенное связывание с Аb1-40 и Аb1-42, но не проявляет какого-либо связывания с Аβ1-28 или с Аβ17-40. Таким образом, ACI-12-Ab-11 может связываться только с Aβ1-40 и Аβ полной длины, но не с какими-либо более короткими пептидами Аβ. Эти результаты означают, что эпитоп, который распознается антителом ACI-12-Ab-11, зависит от конформации Аβ, поскольку Аβ даже из 24 или 28 аминокислот недостаточны для связывания антитела.
Пример 2.12. Влияние пассивной вакцинации антителами ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 на нагрузку амилоида в мозге у однократно трансгенных hAPP мышей
1-42
Для оценки in vivo способности моноклональных антител ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 связать растворимый амилоид и очистить от него мозг, 6-месячных однократно трансгенных hAPP мышей, подобранных по полу и возрасту, используют для исследования пассивной иммунизации разными дозами. Нагрузку растворимого амилоида анализируют в конце исследования по мозгу животных, исследуя Аβ 1-40 и Аβ методом ELISA (фирма TGC, Германия).
1-42
1-42
Животным, по 8-13 животных на группу, вводят с интервалом в одну неделю две инъекции моноклонального антитела в количестве 100, 300 и 1000 мкг в 200 мкл ФСБ, причем инъекция только одного ФСБ является контролем. Через сутки после второй инъекции животных умерщвляют для биохимического анализа растворимой амилоидной фракции. Для подсчета количества Аβ1-40 человека и Аβ человека в растворимой фракции гомогенатов мозга и/или в спинномозговой жидкости (СМЖ) используют коммерчески доступные наборы для фермент-связанного иммуносорбентного анализа (Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay - ELISA) (h амилоид β 40 или β 42 ELISA высокой чувствительности, фирма TGC, Швейцария). Анализ ELISA проводят по протоколу производителя. Вкратце, стандарты (разведения синтетических Аβ 1-40 или Аβ) и образцы получают в 96-луночном полипропиленовом планшете, не связывающем белки (фирма Greiner, Германия). Разведения стандарта с конечной концентрацией 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,3 и 15,6 пг/мл и образцы получают в образце растворителя, поставляемого в наборе ELISA, до конечного объема 60 мкл. Поскольку уровни амилоида у мышей повышаются с возрастом, и поскольку реальная оценка может быть получена при считывании образцов в рамках линейной части стандартной кривой, образцы для анализа Аβ 40 разводят 2:3, образцы для анализа Аβ 42 не разводят.
1-42
Образцы, стандарты и пустые пробы (50 мкл) добавляют в планшет из полистирола с покрытием анти-Аβ (иммобилизованное антитело избирательно распознает С-конец антигена) дополнительно с селективным конъюгатом анти-Аβ-антитело (биотинилированное выявляемое антитело) и инкубируют в течение ночи при 4°С для того, чтобы допустить формирование комплекса антитело-амилоид-антитело. На следующий день добавляют конъюгат стрептавидина-пероксидазы, через 30 мин добавляют смесь ТМВ/пероксид, что приводит к конверсии субстрата в окрашенный продукт и интенсивность окраски измеряют с помощью фотометрии на ELISA-ридере с фильтром 450 нм. Количественную оценку содержания Аβ в образцах получают путем сравнения поглощения со стандартной кривой, полученной с синтетическим Аβ 1-40 или Аβ. Данные выражают в виде индивидуальных изменений относительно средней контрольной величины (в проценте к контролю).
Пример 2.13. Влияние хронического пассивного введения ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 на нагрузку бляшек у дважды трансгенных мышей hAPPxPS1
Для оценки in vivo способности моноклональных антител ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 связывать и уменьшать амилоидные бляшки в мозге, дважды трансгенных мышей hAPPxPSl в возрасте 3,5 месяцев, подобранных по полу и возрасту, используют в течение 4 месяцев в исследовании постоянной пассивной иммунизации. Амилоидные бляшки анализируют в конце исследования методами гистохимии мозга животных путем связывания тиофлавина S.
15 трансгенных животных получают 16 еженедельных инъекций 500 мкг моноклонального антитела в ФСБ. 15 животным вводят инъекцией только ФСБ в качестве контроля. Все инъекции вводят внутрибрюшинно. При умерщвления мышей анестезируют и промывают через сердце физиологической сывороткой при 4°С для удаления крови из сосудов мозга. Затем мозг удаляют из черепной коробки, а задний мозг и передний мозг разделяют ножом в корональном/фронтальном разрезе. Передний мозг ровно разделяют на левую и правую полусферу, используя сагиттальный скальпель. Одну полусферу фиксируют в течение ночи в 4% параформальдегиде для гистологического исследования. Сагиттальные вибратомные срезы (40 мкм) нарезают для свободного плавающего инкубирования и хранят при 4°С до окрашивания в ФСБ с 0,1% азидом натрия. Пять срезов на разных уровнях окрашивают для выявления плотных бляшек тиофлавином S. Срезы всех используемых животных рандомизируют для окрашивания и подсчитывают «вслепую». Для визуализации используют микроскоп Leica DMR, оборудованный камерой Sony DXC-9100P, и анализируют, используя программное обеспечение Leica Q-Win. Интенсивность света и установку конденсора для микроскопа сохраняют постоянными на протяжении всего процесса анализа изображений. Все полученные изображения обрабатывают на одной и той же компьютерной подпрограмме для сведения к минимуму предвзятости исследователя. Для всех анализов выбирают одинаковую пороговую плотность срезов. Область основания выбирают для автоматического подсчета амилоидной нагрузки при окрашивании тиофлавином S.
Пример 2.14. Влияние пассивной вакцинации антителами ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 на емкость памяти у однократно трансгенных мышей hAPP
Для оценки in vivo способности антител АСI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-ll модифицировать или повышать когнитивную функциональность, однократно трансгенных мышей hAPP в возрасте 9 месяцев, подобранных по полу и возрасту, используют в исследовании пассивной иммунизации. Непространственное распознавание измеряют в конце периода иммунизации с помощью задачи распознавания нового объекта (new Object Recognition Task-ORT).
12,13
Животным, по 12 животных на группу, вводят дважды внутрибрюшинной инъекцией по 400 мкг моноклонального антитела в 200 мкл ФСБ, причем инъекция только одного ФСБ является контролем. Через сутки после второй инъекции когнитивную емкость исследуют с помощью задачи распознавания нового объекта (new Object Recognition Task - ORT). Для регистрации ORT мышей помещают на 10 мин в зону оценки поведения и оставляют с новым неизвестным объектом. Время исследования записывают. Через 3 ч тех же животных переносят в ту же зону на второй сеанс, но им предъявляют старый, ранее ими исследованный, объект, а также дополнительно новый объект. Опять записывают время исследования животными обоих объектов, а получаемый когнитивный индекс рассчитывают в виде соотношения времени исследования нового объекта относительно общего времени исследования, и выражают в виде пропорциональных изменений к контролю.
1-42
Пример 2.15. Предпочтительное связывание моноклонального антитела мыши с высокомолекулярными протофибриллярными обогащенными олигомерами фракциями Аβ пептида сверх низкомолекулярных мономеров по сравнению с низкомолекулярными мономерами
1-42
1-42
Связывание моноклональных антител мыши против амилоида бета с низкомолекулярным мономерным Аβ и более высокомолекулярным протофибриллярным олигомер-обогащенными препаратом пептида Аβ может быть выполнено, используя метод ELISA.
1-42
1-42
1-42
Высокоразрешающую хроматографию по размеру молекул (size exclusion chromatography - SEC) с использованием двух SEC колонок, Superdex 75 HR 10/30 (диапазон 3-70 кДа) и Superose 6 HR 10/30 (диапазон 5-5,000 кДа), используют для получения Аβ пептидных фракций, состоящих из высокомолекулярных протофибриллярных, обогащенных олигомерами и низкомолекулярными мономерными препаратами пептида Аβ. Затем получаемые элюаты окрашивают уранилацетатом и исследуют трансмиссивной электронной микроскопией высокого разрешения при 100 кВ для контроля структурной морфологии фракций Аβ.
1-42
Затем проводят анализ ELISA путем нанесения фракций Аβ на планшет для анализа высокого связывания в концентрации 2 мкМ на ночь. Планшеты с нанесением затем блокируют 1,0% БСА и антитело ACI-24-Ab-3 (мышь EJ1A9) добавляют в серийное разведение, начиная с 20 мкг/мл. Также используют серийное разведение стандартного антитела (6Е10, фирма Chemicon). Антитело против IgG мыши, конъюгированное со щелочной фосфатазой, и 4-нитрофенилфосфат используют для выявления связывания. Планшеты считывают при 405 нм. Все условия исследуют с повтором с коэффициентом вариации <0,2.
1-42
Пример 2.16. Связывание моноклонального антитела ACI-12-Ab-11 (клон FK2A6A6) с обогащенными мономерами и олигомерами фракциями пептида Аβ
1-42
1-42
Оценивают связывание анти-Аβ дополнительного антитела ACI-12-Ab-11 (клон: FK2A6A6) с мономерами и олигомерами пептида Аβ. До применения в исследовании антитело хранят при -80°С. Пептид Аβ (W.M.Keck Facility, Йельский университет) хранят в виде лиофильного порошка до дня использования. Все другие материалы от фирмы Sigma-Aldrich (фирма Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Швейцария) если не указано иначе.
1-42
1-42
1-42
1-42
1-42
Для получения мономерных и высокомолекулярных фракций с улучшенным обогащенным олигомером пептидом Аβ, используют улучшенную методологию с применением высокоразрешающей хроматографии по размеру молекул (size exclusion chromatography - SEC). Две колонки SEC, Supelco TSK G4000PW-XL (диапазон: 10-1500 кДа, фирма Sigma) и Superose 6 HR 10/30 (диапазон 5-5000 кДа, фирма GE Healthcare Bio-Sciences АВ Уппсала, Швеция) используют для получения пептидных фракций Аβ, обогащенных низкомолекулярными мономерными и высокомолекулярными олигомерными фракциями. Получаемые SEC элюаты затем окрашивают уранилацетатом и исследуют трансмиссивной электронной микроскопией высокого разрешения при 100 кВ для контроля структурной морфологии фракций Аβ (данные не представлены). Для исследования связывания антитела с фракциями Аβ используют метод ELISA. Фракции Аβ наносят в планшеты для анализа высокого связывания в количестве 2,2 мкМ в ФСБ в течение 2 ч. Планшеты с покрытием затем промывают пять раз 0,05% твин-20 в ФСБ и блокируют 1,0% БСА. Анти-Аβ антитела, включая контрольное антитело (6Е10), добавляют к серийному разведению, начиная с указанных концентраций. Антитело против IgG мыши, соединенное со щелочной фосфатазой (фирма Jackson ImmunoResearch, Suffolk, Великобритания), и 4-нитрофенилфосфат используют для выявления связывания. Планшеты считывают при 405 нм после 14 ч инкубирования при комнатной температуре. Анализ повторяют трижды.
1-42
1-42
1-42
Фиг.16 показывает среднюю (°SEM) оптическую плотность (ОП), полученную в трех отдельных исследованиях методом ELISA. Антитело АСI-12-Ab-11 показывает повышенное связывание с Аβ фракцией, обогащенной олигомерами, по сравнению с фракцией, не обогащенной олигомерами, и состоящей преимущественно из Аβ мономеров (фиг.16А). Для сравнения контрольное антитело 6Е10 связывается одинаково хорошо с обеими фракциями Аβ (Фиг.16Б). Таблицы 2.4 и 2.5 показывают величины ОП, полученные в анализах ELISA 1, 2 и 3 для антител ACI-12-Ab-11 и 6Е10, соответственно.
1-42
Эти результаты показывают, что антитело ACI-12-Ab-11 (клон: FK2A6A6) проявляет повышенное связывающее сродство с олигомер-обогащенными фракциями APi_42 по сравнению с мономерными Аβ.
Пример 2.17. Влияние антител ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 на апоптоз культивируемых ганглиозных клеток сетчатки (ГКС)
Для оценки in vitro способности моноклональных антител ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 снижать гибель ганглиозных клеток сетчатки (ГКС), связанную с глазными заболеваниями, ассоциированными с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированными со связанными с амилоидом бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов, используют культивируемые ганглиозные клетки сетчатки, выделенные из крыс или мышей.
Для получения клеток животных анестезируют, удаляют глаза, сетчатку нарезают и инкубируют в растворе папаина 2 мг/мл в течение 25 мин при 37°С для разрушения внеклеточного матрикса. К концу обработки клетки промывают трижды средой для культивируемых ганглиозных клеток сетчатки в присутствии ингибитора протеазы для остановки действия папаина. Затем ткань растирают путем быстрого пропускания через пастеровскую пипетку до получения диспергированных клеток. Коммерческий счетчик Coulter используют для определения плотности клеток в суспензии перед культивированием клеток в смеси 95% воздуха/5% СO2 при 37°С.
Для имитации повреждения, вызванного глазным заболеванием, ассоциированным с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированным со связанными с амилоидом-бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов, и оценки превентивного действия мноклональных антител ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 клетки инкубируют с L-глутаматом в течение трех суток в присутствии или отсутствии моноклонального антитела АС1-11-Ab-9 или ACI-12-Ab-11. Клетки, отдельно инкубировавшиеся в буфере, служат контролем.
Для определения выживания ГКС в конце периода инкубирования клетки фиксируют 3,7% формальдегидом в фосфатно солевом буфере (ФСБ) при комнатной температуре в течение 30 мин, промывают трижды в ФСБ и инкубируют в течение 1 ч в ФСБ, содержащем специфические маркеры ГКС Thy 1.1 или NF-L антитело. Антитело затем удаляют путем промывки и инкубируют клетки в течение 30 мин с флуоресцентно мечеными вторичными козьими антителами против мышиного IgG, козьими антителами против кроличьего IgG или кроличьим антителом против козьего IgG. К концу инкубирования клетки промывают, окрашивают в течение 5 мин раствором DAPI и промывают. Выжившие клетки ГКС подсчитывают с помощью флуоресцентной микроскопии и число клеток, имеющихся после инкубирования с моноклональным антителом ACI-11-Ab-9 или ACI-12-Ab-11, сравнивают с контролем.
Пример 2.18. Влияние антител ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 на апоптоз ганглиозных клеток сетчатки (ГКС) in vivo
Для оценки in vivo способности моноклональных антител ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 снижать гибель ганглиозных клеток сетчатки (ГКС) у индивидуумов с глазными заболеваниями, ассоциированными с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированными со связанными с амилоидом бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов, крыс и мышей используют в течение 2-16 недель исследования индуцированного внутриглазного давления (ВГД). Гибель ганглиозных клеток сетчатки (ГКС) измеряют в конце исследования по визуальному анализу in vivo и гистологическим анализом в конце исследования.
Для имитации повышения внутриглазного давления, ассоциированного с определенными глазными заболеваниями, ассоциированными с патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно ассоциированными со связанными с амилоидом бета патологическими нарушениями/изменениями в тканях зрительной системы, например, с деградацией нейронов, в частности с глаукомой, животных сначала анестезируют внутрибрюшинно кетамином (75 мг/кг) и ксилазином (5 мг/кг), а также местно глазными каплями 1% пропаракаина. Затем используют два других метода для искусственного повышения ВГД в одном глазу (односторонне) у крыс и мышей. По одному методу анестезированные животные получают инъекцию туши в переднюю камеру глаза с последующей индуцированной лазером фотокоагуляцией красителя в трабекулярной сети диодным лазером с помощью лампы с узким пучком с длиной волны 532 нм перпендикулярно трабекулам и параллельно радужной оболочке. В виде начальной обработки животные получают по 40-50 пятнышек размером 50 мкм, 0,4 Вт длительностью 0,6 сек. По второму методу для искусственного повышения ВГД анестезированные животные получают инъекцию 50 мкл гипертонического солевого раствора в эписклеральные вены одного глаза, используя микроиглу с усилием, достаточным для обесцвечивания вены.
Для измерения ВГД используют коммерческий ручной тонометр (фирма TonoLab). Проводят измерения у животных, находящихся под действием анестезии, и получают среднюю величину по 12 считываниям непосредственно перед обработкой лазером и через 1, 4 и 7 суток после обработки, и затем еженедельно на протяжении эксперимента. Если с интервалом 1 неделя разница ВГД между двумя глазами животного составляет менее 6 мм Hg, животных в дальнейшее исследование не включают.
Для оценки превентивного воздействия моноклональных антител АСI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 на апоптоз ГКС половина животных, получающих ВГД-индуцирующую обработку, получает инъекцией в стекловидное тело или внутривенно моноклональное АСI-11-Ab-9 или ACI-12-Ab-11 ко времени повышения ВГД. Другая половина животных служит контролем. Функциональные ГКС по всей сетчатки глаз с оценкой ВГД отображают и подсчитывают, а затем сравнивают с количеством, имеющимся в другом глазу того же животного. Разница в количестве ГКС по двум глазам представляет клетки, которые были утрачены в результате повышения ВГД в прооперированном глазу. Анализ изменений дифференцирующей величины помогает в идентификации защитных действий, вызванных моноклональным антителом ACI-11-Ab-9 или ACI-12-Ab-11.
Количество ГКС измеряют путем гистологического анализа по конечным точкам через 2, 4, 8 и 16 недель после индуцированного повышения ВГД. Сетчатку, полученную от животных, фиксируют в 4% параформальдегиде, и окрашивают срезы или весь препарат, используя специфический для ГКС маркер Brn3b. Многочисленные исследования показывают, что утрата окрашивания Вrn3b коррелирует с утратой функции у ГКС. Для подтверждения точности нанесения гистологической ГКС метки, может быть применен указанный метод в соединении с обратным нанесением метки глазного нерва из ЦНС с DiASP или Fluorogold в подгруппе животных для идентификации ГКС, которые поддерживают интактный функциональный аксон, не утративший соединения с мишенями в мозге.
В качестве второго заключительного исследования также измеряют апоптоз ГКС в подгруппе глаз. Флуоресцентно меченый аннексии V используют для нанесения метки на апоптозные клетки путем инъекции в глазное тело белка за один час до умерщвления животного. Сетчатки обрабатывают согласно указанному выше, и визуализацию аннексина V осуществляют в сочетании с визуализацией при заключительном гистологическом исследовании.
42
Пример 3. Подавление связывания Аβ-АроЕ4
42
Оценивают связывание аполипопротеина Е (АроЕ4) с амилоидом и способность моноклональных антител по настоящему изобретению ингибировать взаимодействие между АроЕ4 и пептидом Аβ.
42
42
42
Рекомбинантный аполипопротеин человека АроЕ4 разводят до 200 нМ в ФСБ и хранят в аликвотах объемом 0,5 мл при -80°С. Ресуспендируют 1 мг пептида Аβ-биотин в 20 мкл ДМСО и затем в 1980 мкл ФСБ/0,1% БСА/0,1% азиде натрия для получения конечного раствора 0,5 мг/мл. Анализ ELISA применяют для определения связывания rhApoE4 с Аβ. Для этого rhApoE4 (100 нМ) инкубируют в течение 3 ч при 37°С с Аβ-биотин (1 мкМ) чтобы допустить связывание белка с пептидом. Смесь наносят на планшет, покрытый стрептавидином, который предварительно промывают трижды буфером ФСБТ (ФСБ + 0,05% Tween 20). После 1 ч инкубирования при комнатной температуре планшет промывают 3 раза ФСБТ и блокируют в течение ночи при 4°С ФСБ, содержащим 0,1% БСА. Связанный АроЕ4 выявляют с помощью мышиного IgG1 антитела против АроЕ человека, используемого в разведении 1:3000 в ФСБ и нанесенного на планшет, в течение 2,5 ч при комнатной температуре. Планшет промывают 4 раза ФСБТ и затем инкубируют 1 ч при комнатной температуре с выявляемым антителом, против мышиного IgG, соединенного со щелочной фосфатазой в разведении 1:5000 в ФСБ. После последнего промывания 4х ФСБТ планшеты инкубируют в течение 5,5 ч с субстратом щелочной фосфатазы pNPP (субстрат фосфатазы, гексагидрат динатриевой соли 4-нитрофенилфосфата; Phosphatase substrate, 4-Nitrophenyl phosphate Disodium salt Hexahydrate - pNPP) и считывают при 405 нм, используя ридер для планшет ELISA. Результаты эксперимента представлены на фиг.17.
42
42
42
42
Анализ ELISA проводят путем получения 8 раз двукратных разведений смеси rhApoE4 (150 нМ) и Аβ-биотина (1,5 мкМ). Добавляют следующие отрицательные контроли: (1) только один rhApoE4; (2) Аβ-биотин; и (3) rnАроЕ4-Аβ-биотин (протокол без мышиного анти-АроЕ4). Фиг.18 показывает, что положительный сигнал получают, только если присутствует и rhApoE4, и Аβ-биотин, и если соблюдают полный протокол ELISA.
42
42
42
42
Для оптимизации концентраций rhApoE4 и Аβ-биотина в анализе разведения rhApoE4 (например, 150 нМ) тестируют при постоянной концентрации Аβ-биотина (например, нормальной: 1,5 мкМ избыточной: 15 мкМ). Фиг.19 показывает, что избыток Аβ-биотина разбавляет сигнал анализа ELISA, поскольку меньше Аβ-биотина, объединенного с rhApoE4, связывается с планшетом. Основываясь на этом анализе, выбирают оптимальную концентрацию rhApoE4.
42
42
42
42
Концентрацию Аβ-биотина в исследовании оптимизируют, используя константную концентрацию rhApoE4, составляющую 100 нМ. Разведения Аβ-биотина (например, со стартовой концентрации 1,5 мкМ (разведенной до пониженных концентраций, например, до более низкой концентрации 1500 нМ)) исследуют методом ELISA. Основываясь на результатах, представленных на фиг.20, выбрана оптимальная концентрация 1 мкМ Аβ-биотина для определения влияния моноклональных антител на связывание rhApoE4 с Аβ-биотином.
42
42
42
42
42
Воздействие одного или нескольких антител по настоящему изобретению на связывание rhApoE4 с Аβ-биотином оценивают, используя описанный выше анализ ELISA, но дополнительно включают антитело по настоящему изобретению в связывающуюся смесь перед нанесением. Например, могут быть применены двукратные разведения антитела, начиная с концентрации 50 мкг/мл. Включение антитела может быть в момент первого комбинирования АроЕ4 и Аβ-биотина или может быть позднее (например, через несколько часов) первого комбинирования АроЕ4 и Аβ-биотина. В указанном выше случае оценивают способность антитела по настоящему изобретению предупреждать или ингибировать взаимодействие АроЕ4 и Аβ-биотина, причем в последнем случае оценивают способность антитела прерывать ранее существовавший комплекс между АроЕ4 и Аβ-биотином.
Таблицы
Таблица 1.1
Антитела и антигенные конструкции, применяемые для увеличения указанных антител.
mAb мыши
Клон
Изотип
Антиген/ Последовательность
Линкер
Якорь
Адъювант
mACI-24-Аb3
EJ1A9
IgGl
Аβ<sub>1-15</sub>
-
Пальмитиновая кислота
Липид А
Таблица 1.2.
Связывание Аβ пептидов с антителом ACI-24-Ab-3. Результаты выражены в виде оптической плотности за вычетом фоновых 25 значений.
Пептид
Антитело ACI-24-Ab-3
1-281
Среднее значение
0,13
Стандартное отклонение
0,08
Средняя квадратическая ошибка
0,06
17-40<sup>1</sup>
Среднее значение
-0,23
Стандартное отклонение
0,07
Средняя квадратическая ошибка
0,05
1-40<sup>1</sup>
Среднее значение
0,90
Стандартное отклонение
0,22
Средняя квадратическая ошибка
0,16
<sub>1-42</sub>А<sup>1</sup>
Среднее значение
0,31
Стандартное отклонение
0,35
Средняя квадратическая ошибка
0,24
<sub>1-42</sub>В<sup>2</sup>
Среднее значение
0,27
Стандартное отклонение
0,07
Средняя квадратическая ошибка
0,05
<sup>1</sup> Пептид от фирмы Anaspec
<sup>2</sup> Пептид от фирмы Bachem
Таблица 1.3.
Связывание антитела ACI-24-Ab-3 с 33 перекрывающимися
пептидами Аβ 1.42 по данным анализа методом ELISA.
Пептид
Антитело
ACI-24-Ab-3
1
0,32
2
0,26
3
0,37
4
0,36
5
0,32
6
0,34
7
0,30
8
0,21
9
0,19
10
0,20
11
0,23
12
0,34
13
0,23
14
0,30
15
0,32
16
0,34
17
0,31
18
0,30
19
0,30
20
0,22
21
0,21
22
0,21
23
0,20
24
0,18
25
0,23
26
0,25
27
0,26
28
0,26
29
0,27
30
0,29
31
0,31
32
0,31
33
0,26
Аβ<sub>1-42</sub>
0,36
Аβ<sub>1-42</sub>
0,36
Аβ<sub>1-42</sub>
0,35
Таблица 1.4.
Связывание антитела ACI-24-Ab-3 (EJ1A9 мыши) с высокомолекулярными протофибриллярными и низкомолекулярными мономерными препаратами пептида Аβ<sub>1-42</sub>.
ACI-24-Ab-3 (мкг/мл)
Препарат пептида Аβ<sub>1-42</sub>
Разница ОП
Протофибриллы (О.П.)
Низкомолекулярные мономеры (О.П.)
20
3,765
1,946
1,82
10
2,546
0,836
1,71
5
1,629
0,619
1,01
2,5
1,101
0,331
0,77
1,25
0,642
0,295
0,35
0,6250
0,457
0,177
0,28
0,3125
0,253
0,143
0,11
0,1563
0,167
0,115
0,05
Таблица 1.5.
Связывание контрольного антитела 6Е10 с высокомолекулярными протофибриллярными и низкомолекулярными мономерами препаратами пептида Аβ<sub>1-42</sub>.
6Е10 (мкг/мл)
Препарат пептида Аβ<sub>1-42</sub>
Разница ОП
Протофибриллы (О.П.)
Низкомолекулярные мономеры (О.П.)
1
2,550
2,677
0,13
0,5
1,998
2,126
0,13
0,25
1,442
1,563
0,12
0,125
0,863
0,999
0,14
0,0625
0,544
0,574
0,03
0,0313
0,286
0,329
0,04
0,0156
0,201
0,207
0,01
0,0078
0,116
0,133
0,02
Таблица 1.6.
Связывание антитела ACI-24-Ab-3 (EJ1A9 мыши) с обогащенными олигомерами и мономерами препаратами пептида Аβ<sub>1-42</sub>.
Разведение антитела
Мономеры (ОП)
Олигомеры (ОП)
Анализ 1
Анализ 2
Анализ 3
Средняя величина
Средняя квадратическая ошибка
Анализ 1
Анализ 2
Анализ 3
Средняя величина
Средняя квадратическая ошибка
1:1
2,03
0,95
1,82
1,60
0,33
2,74
3,65
3,13
3,17
0,26
1:2
1,17
0,57
1,16
0,97
0,20
1,84
3,26
2,25
2,45
0,42
1:4
0,83
0,37
0,86
0,69
0,16
1,16
2,62
1,57
1,79
0,43
1:8
0,55
0,24
0,56
0,45
0,10
0,84
1,87
1,10
1,27
0,31
1:16
0,39
0,15
0,34
0,29
0,07
0,59
1,22
0,69
0,83
0,20
1:32
0,28
0,10
0,23
0,20
0,05
0,31
0,73
0,42
0,49
0,13
1:64
0,22
0,10
0,18
0,17
0,04
0,27
0,41
0,32
0,33
0,04
1:128
0,18
0,10
0,18
0,15
0,03
0,21
0,24
0,28
0,24
0,02
<sup>а</sup> ОП - оптическая плотность при 405 нм
<sup>b</sup> Начальное разведение для антитела ACI-24-Ab-3 (клон: ЕJ1А9) составляет 30 мкг/мл
Таблица 1.7.
Связывание контрольного антитела 6Е10 с обогащенными олигомерами и мономерами препаратами пептида Аβ<sub>1-42</sub>.
Разведение антитела
Мономеры (ОП)
Олигомеры (ОП)
Анализ 1
Анализ 2
Анализ 3
Средняя величина
Средняяквадратическая ошибка
Анализ 1
Анализ 2
Анализ 3
Средняя величина
Средняя квадратическая ошибка
1:1
3,67
3,77
4,04
3,83
0,11
3,36
3,67
3,89
3,64
0,15
1:2
3,30
3,48
4,00
3,59
0,21
3,39
3,55
3,83
3,59
0,13
1:4
3,00
3,29
3,52
3,27
0,15
3,10
3,37
3,64
3,37
0,16
1:8
2,67
3,00
2,80
2,82
0,10
2,73
2,99
3,23
2,98
0,15
1:16
1,78
1,94
2,23
1,98
0,13
1,78
1,92
2,07
1,92
0,08
1:32
1,18
1,34
1,54
1,36
0,10
1,27
1,30
1,40
1,32
0,04
1:64
0,81
0,94
1,08
0,94
0,08
0,93
0,88
0,95
0,92
0,02
1:128
0,64
0,75
0,86
0,75
0,06
0,62
0,61
0,66
0,63
0,02
<sup>а</sup> ОП - оптическая плотность при 405 нм
<sup>b</sup> Начальное разведение для антитела 6Е10 составляет 0,5 мкг/мл
Таблица 2.1.
Антитела и антигенные конструкции, применяемые для повышения указанных антител.
mAb мыши
Клон
Антиген/Последовательность
Линкер
Якорь
Адъювант
АСI11-Ab-9
FG1F9E4
Ар22-35
ПЭГ
DSPE
Липид А
ACI-12-Ab-11
FK2A6A6
АР29-40
ПЭГ
DSPE
Липид А
Таблица 2.2.
Связывание пептидов Аβ с антителами ACI-11-Ab-9 и АCI2-Ab-11. Результаты выражены в виде ОП за вычетом фона.
Пептид
Антитело
Антитело
АСI-11-Ab-9
ACI-12-Ab-11
1-28<sup>1</sup>
Среднее значение
0,53
-0,02
Стандартное отклонение
0,06
0,00
Средняя квадратическая ошибка
0,04
0,00
17-40<sup>1</sup>
Среднее значение
0,02
-0,02
Стандартное отклонение
0,04
0,01
Средняя квадратическая ошибка
0,03
0,00
1-40<sup>1</sup>
Среднее значение
1,02
0,62
Стандартное отклонение
0,39
0,18
Средняя квадратическая ошибка
0,27
0,13
<sub>1-42</sub>А<sup>1</sup>
Среднее значение
0,78
0,44
Стандартное отклонение
0,12
0,15
Средняя квадратическая ошибка
0,08
0,11
<sub>1-42</sub>В<sup>2</sup>
Среднее значение
1,54
1,07
Стандартное отклонение
0,38
0,20
Средняя квадратическая ошибка
0,27
0,14
<sup>1</sup> Пептид от фирмы Anaspec
<sup>2</sup> Пептид от фирмы Bachem
Таблица 2.3.
Связывание антител ACI-11-Ab-9 и ACI-12-Ab-11 с 33 перекрывающимися пептидами А61.42 по данным анализа методом ELISA.
Пептид
Антитело
Антитело
ACI-11-Ab-9
ACI-12-Ab-11
1
0,10
0,10
2
0,10
0,10
3
0,12
0,11
4
0,11
0,10
5
0,11
0,10
6
0,11
0,10
7
0,11
0,10
8
0,11
0,10
9
0,11
0,10
10
0,13
0,10
11
0,11
0,11
12
0,24
0,21
13
0,17
0,15
14
0,16
0,12
15
0,14
0,10
16
0,14
0,14
17
0,13
0,12
18
0,11
0,10
19
0,10
0,10
20
0,10
0,10
21
0,10
0,09
22
0,10
0,10
23
0,11
0,10
24
0,10
0,10
25
0,11
0,11
26
0,12
0,12
27
0,13
0,12
28
0,12
0,11
29
0,20
0,11
30
0,11
0,11
31
0,12
0,11
32
0,12
0,11
33
0,11
0,11
Аβ<sub>1-42</sub>
0,80
0,69
Аβ<sub>1-42</sub>
0,81
0,69
Аβ<sub>1-42</sub>
0,80
0,69
Таблица 2.4.
Связывание антитела ACI-12-Ab-11 (клон: FK2A6A6) с обогащенными олигомерами и мономерами препаратами пептида Аβ 1.42.
Разведение
Мономеры (ОП)
Олигомеры (ОП)
антитела
Анализ 1
Анализ 2
Анализ 3
Средняя величина
Средняяквадратическая ошибка
Анализ 1
Анализ 2
Анализ 3
Средняя величина
Средняя квадратическая ошибка
1:1
1,60
1,04
1,37
1,34
0,16
2,24
1,85
2,27
2,12
0,14
1:2
0,85
0,51
0,75
0,70
0,10
1,33
1,04
1,32
1,23
0,10
1:4
0,53
0,30
0,45
0,43
0,07
0,70
0,64
0,80
0,71
0,05
1:8
0,29
0,18
0,25
0,24
0,03
0,44
0,42
0,47
0,44
0,02
1:16
0,25
0,12
0,18
0,18
0,04
0,30
0,25
0,28
0,28
0,01
1:32
0,19
0,10
0,14
0,14
0,03
0,20
0,16
0,20
0,18
0,01
1:64
0,15
0,09
0,13
0,12
0,02
0,19
0,14
0,16
0,16
0,01
1:128
0,14
0,09
0,12
0,12
0,02
0,16
0,14
0,15
0,15
0,01
<sup>а</sup> ОП - оптическая плотность при 405 нм
<sup>b</sup> Начальное разведение для антитела АСI-12-Ab-12 (клон: FK2A6A6) составляет 40 мкг/мл
Таблица 2.5.
Связывание контрольного антитела 6Е10 с обогащенными олигомерами и мономерами препаратами пептида Аβ<sub>1-42</sub>.
Разведение антитела
Мономеры (ОП)
Олигомеры (ОП)
Анализ 1
Анализ 2
Анализ 3
Средняя величина
Средняяквадратическая ошибка
Анализ 1
Анализ 2
Анализ 3
Средняя величина
Средняя квадратическая ошибка
1:1
3,67
3,77
4,04
3,83
0,11
3,36
3,67
3,89
3,64
0,15
1:2
3,30
3,48
4,00
3,59
0,21
3,39
3,55
3,83
3,59
0,13
1:4
3,00
3,29
3,52
3,27
0,15
3,10
3,37
3,64
3,37
0,16
1:8
2,67
3,00
2,80
2,82
0,10
2,73
2,99
3,23
2,98
0,15
1:16
1,78
1,94
2,23
1,98
0,13
1,78
1,92
2,07
1,92
0,08
1:32
1,18
1,34
1,54
1,36
0,10
1,27
1,30
1,40
1,32
0,04
1:64
0,81
0,94
1,08
0,94
0,08
0,93
0,88
0,95
0,92
0,02
1:128
0,64
0,75
0,86
0,75
0,06
0,62
0,61
0,66
0,63
0,02
<sup>а</sup> ОП - оптическая плотность при 405 нм
<sup>b</sup> Начальное разведение для антитела 6Е10 составляет 0,5 мкг/мл
Объекты депонирования
Представленные ниже линии клеток гибридом были депонированы в коллекции Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) в Брауншвейге по адресу: Mascheroder Weg 1 В, 38124 Braunschweig, в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры:
Обозначение линии гибридомы
Обозначение антитела
Дата депонирования
Номер объекта депонирования
EJ1A9
ACI-24-Ab-3
May 25, 2007
DSM АСС2844
FG1F9E4
АСI-11-Ab-9
May 25,2007
DSM АСС2845
FK2A6A6
ACI-12-Ab-11
May 25, 2007
DSM АСС2846
Литература
1. Bard F., Cannon C., Barbour R., Burke R.L., Games D., Grajeda H., Guido T., Hu K., Huang J., Johnson-Wood K., Khan K., Kholodenko D., Lee M., Lieberburg I., Motter R., Nguyen M., Soriano F., Vasquez N., Weiss K., Welch B., Seubert P., Schenk D., Yednock T. Nature Med, 6, 2000, cc.916-919.
2. Barghorn S., Nimmrich V., Striebinger A., Krantz C, Keller P., Janson B., Bahr M., Schmidt M, Bitner R.S., Harlan J., Barlow E., Ebert U., Hillen H. Globular amyloid beta-peptid oligomer - a homogenous and stable neuropathological protein in Alzheimer's disease. J Neurochem 95, 2005, cc.834-847.
3. Baschong W., Wrigley N.G. Small colloidal gold conjugated to Fab fragments or to immunoglobulin G as high-resolution labels for electron microscopy: a technical overview. J Electron Microsc Tech 14, 1990, cc.313-323.
4. Blond, Goldberg. PNAS, 84(5), 1987, cc.1147-1151.
5. Cornilescu G., Delaglio F., Bax A. J.Biomol.NMR; 13, 1999, cc. 289-302.
6. Burdick D. и др. Assembly and aggregation properties of synthetic Alzheimer's A4/beta amyloid peptide analogs. J. Biol. Chem. 267, 1992, cc. 546-554.
7. DeMattos, Bales K.R., Cummins D.J., Dodart J.C., Paul S.M., Holtzmann D.M. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 2001, cc. 8850-8855.
8. Dewachter I., Van D.J., Smeijers L., Gilis M., Kuiperi C., Laenen I., Caluwaerts N., Moechars D., Checler F., Vanderstichele H., Van L.F. Aging increased amyloid peptide and caused amyloid plaques in brain of old APP/V717I transgenic mice by a different mechanism than mutant presenilinl. J Neurosci 20, 2000, cc.6452-6458.
9. Dewachter I., Reverse D., Caluwaerts N., Ris L., Kuiperi C, Van den H.C., Spittaels K., Umans L., Serneels L., Thiry E., Moechars D., Mercken M., Godaux E., Van Leuven F. Neuronal deficiency of presenilin 1 inhibits amyloid plaque formation and corrects hippocampal long-term potentiation but not a cognitive defect of amyloid precursor protein [V717I] transgenic mice. J Neurosci 22, 2002, cc.3445-3453.
10. Glenner, Wong. Biochem Biophys Res Comml29, 1984, cc.885-890.
11. Harlow, Lane, в кн.: «Antibodies: A Laboratory Manual», 1988, h3a-bo Cold Spring Harbor Laboratory, Hbio-HopK.
12. Heneka M.T., Sastre M., Dumitrescu-Ozimek L., Dewachter I., Walter J., Klockgether T., Van L.F. Focal glial activation coincides with increased BACE1 activation and precedes amyloid plaque deposition in APP[V717I] transgenic mice. J Neuroinflammation 2, 2005, c.22.
13. Hodgson h ap., Bio/Technoloy, 9, 1991, c.421.
14. Iwadate M., Asakura T., Williamson M.P., J.Biomol.NMR; 13, 1999, cc.199-211.
15. Kirschner D.A., Abraham C, Selkoe D.J, X-ray diffraction from intraneuronal paired helical filaments and extraneuronal amyloid fibers in Alzheimer disease indicates cross-beta conformation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 1986, cc.503-507.
16. Khaw B.A. h up., J. Nucl. Med. 23, 1982, cc.1011-1019.
17. Kennedy J.H. h ap., Clin. Chim. Acta 70, 1976, cc.1-31.
18. Klein W.L., Abeta toxicity in Alzheimer's disease: globular soluble polymeric amyloid beta (ADDLs) as new vaccine and drug targets. Neurochem Int 41(5), 2002, cc.345-352.
19. Kohler, Milstein, Nature 256, 1975, cc.495-497.
20. LeVine H. III, Arch Biochem Biophys 404, 2002, cc.106-115.
21. Luca и др., 2001.
22. McGeer и др., 1994.
23. Moechars D., Dewachter I., Lorent K., Reverse D., Baekelandt V., Naidu A., Tesseur I., Spittaels K., Haute C.V., Checler F., Godaux E., Cordell B., Van L.F. Early phenotypic changes in transgenic mice that overexpress different mutants of amyloid precursor protein in brain. J Biol Chem 274, 1999, cc.6483-6492.
24. Nelson R., Eisenberg D. Recent atomic models of amyloid fibril structure. Curr. Opin. Struct. Biol., 2006.
25. Nicolau C, Greferath R., Balaban T. S., Lazarte J.E., Hopkins R. J. (2002), Proc Natl Acad Sci USA 99, 2002, cc.2332-2337.
26. Queen и др., Proc. Natl Acad Sci USA, 86, 1989, cc.10029-10032.
27. Pearson W.R. Methods in Enzymology 183, 1990, cc.63-98.
28. Petkova A.T., Buntkowsky G., Dyda F., Leapman R.D., Yau W.M., Tycko R. J.Mol.Biol. 335, 2004, cc. 247-260.
29. Petkova A.T., Ishii Y., Balbach J.J., Antzutkin O.N., Leapman R.D., Delaglio F., Tycko R. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 99, 2002, cc. 16742-16747.
30. Rousseaux et al. Methods Enzymology, изд-во Academic Press, 121, 1986, cc. 663-669.
31. Rzepecki P., Nagel-Steger L., Feuerstein S., Linne U., Molt O., Zadmard R., Aschermann K., Wehner M., Schrader T., Riesner D. J Biol Chem 279, 2004, cc.47497-47505.
32. Sambrook и др. в кн.: «Molecular Biology: A Laboratory Manual», 1989, H3A-bo Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Hbio-HopK.
33. Schenk D., Barbour R., Dunn W., Gordon G., Grajeda H., Guido T., Hu K., Huang J., Smith S.O., Bormann B.J. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 1995, cc.488-491.
34. Schenk и др., 1999.
35. Schurs A.H. W. M. и др. Clin. Chim Acta 81, 1977, cc.1-40.
36. Selkoe D.J. Toward a comprehensive theory for Alzheimer's disease. Hypothesis: Alzheimer's disease is caused by the cerebral accumulation and cytotoxicity of amyloid beta-protein. Ann. N.Y. Acad. Sci. 924, 2000, cc. 17-25.
37. Slot J.W., Geuze H.J. A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry. Eur J Cell Biol 38, 1985, cc.87-93.
38. Smith, Waterman, Advances in Applied Mathematics 2, 1981, cc.482-489.
39. Van dA.. I, Wera S., Van L.F., Henderson S.T. A ketogenic diet reduces amyloid beta 40 and 42 in a mouse model of Alzheimer's disease. Nutr Metab (Lond), 2, 2005, c.28.
40. Wagner и др. Journal of Liposome Research 12(3), 2002, cc.259-270.
41. Ye J., Dave U. P., Grishin N. V., Goldstein J. L., Brown M. S. Proc Natl Acad Sci USA 97, 2000, cc.5123-5128.
42. Zrein и др. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 5(1), 1998, cc.45-49.
43. Experimental Eye Research 78, 2004, cc.243-256.
44. WO 2004/058258
45. WO 96/1359
46. WO 96/29605