Рекомбинантное антитело, фармацевтический препарат, диагностический препарат, способ идентификации антитела-кандидата, способ лечения, профилактики и способ диагностики субъектов, потенциально подверженных риску заражения или страдающих от инфекций, вызванных штаммами Е. coli с множественной лекарственной устойчивостью
RECOMBINANT ANTIBODY, PHARMACEUTICAL PREPARATION, DIAGNOSTIC PREPARATION, METHOD FOR IDENTIFYING CANDIDATE ANTIBODY, METHOD OF TREATING, PREVENTING AND DIAGNOSING SUBJECTS SUSCEPTIBLE TO RISK OF INFECTION OR SUFFERING INFECTIONS CAUSED BY MULTIDRUG-RESISTANT STRAINS OF E.COLI

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение касается антитела, специфически связывающегося с антигеном O25b (липополисахаридом) штаммов Е.coli с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ).
Уровень техники
Липополисахарид (ЛПС) является наиболее распространенным антигеном на поверхности энтеробактериальных патогенов. Обычно, ЛПС состоит из трех фрагментов: i) Липида А (также известного как эндотоксин), ii) олигосахаридов кора и iii) О-антигена. Последний состоит из повторяющихся субъединиц на основе 3-6 cахаров (в зависимости от серотипа). Липид А и олигосахариды кора (ОК) являются довольно консервативными в рамках одного вида энтеробактерий, тем не менее, их доступность для антител ограничена. С другой стороны, О-антигены являются высоко доступными, но отличаются сильным структурным разнообразием (для E. coli выявлено около 180 различных О-типов).
Способность антител связываться с поверхностными О-антигенами Е.coli может быть использована как для диагностики (например, для целей О-типирования при проведении эпидемиологических исследований), так и для создания терапевтических средств. Тем не менее, учитывая их огромную структурную изменчивость, а также широкий спектр защиты, использование специфических антител к О-антигену является трудоемким процессом.
Инфекции внекишечной локализации, вызванные Е.coli, являются частой причиной высокой заболеваемости и смертности. Штаммы Е.coli с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), выявляемые в последнее время, составляют значительную часть от всех инфекций, вызванных Е.coli.
Возможности терапии заболеваний, вызванных указанными штаммами с МЛУ, становятся весьма ограниченными вследствие развившейся у бактерий устойчивости к большинству клинически значимых классов антибиотиков. Именно по этой причине, обладают большими перспективами в будущем альтернативные терапевтические методы, например, пассивная иммунизация с использованием моноклональных антител (MAT, mAbs).
В последние годы хорошо изученная клональная линия штамма Е.coli с МЛУ, а именно: ST131-O25b:H4, выявлялась примерно в 10% случаев всех внекишечных инфекций, вызванных Е.coli, а также почти в половине случаев инфекций, вызванных штаммами Е.coli с МЛУ (Peirano et al. Int J Antimicrob Agents 2010 Apr; 35(4):316-21; Rogers et al. J Antimicrob Chemother 2011 Jan; 66(1):1-14; Woodford et al. FEMS Microbiol Rev 2011 Sep; 35(5):736-55.). Штаммы, относящиеся к данной линии, показывают незначительную гетерогенность и, поэтому, с точки зрения антигенного репертуара, их можно считать очень подобными. Подавляющее большинство штаммов, относящихся к данной линии, экспрессируют антиген O25b и, следовательно, специфический ген (содержащий локус синтеза ЛПС), кодирующий ферменты для синтеза указанного антигена, может быть использован для идентификации этого клона (Clermont et al. J Antimicrob Chemother 2008 May; 61(5):1024-8.). Другая возможность заключается в использовании реакции агглютинации с сывороткой, типирующей O25, и, хотя О-антиген этой линии отличается от классического антигена O25 (поэтому он и был назван как O25b), он предложен для установления генетических различий. Однако, сыворотка, типирующая O25, не дает возможности отличить между собой клоны O25 без МЛУ и клоны O25b с МЛУ.
Rogers et al. (J Antimicrob Chemother 2011 Jan; 66(1):1-14) описывают способ идентификации штамма Е.coli O25b-ST13 при помощи трех главных характеристик, а именно: их серогруппы (O25b), филогенетической группы (В2) и типа нуклеотидной последовательности (генетической линии) (ST131). Уточнение каждой изданных характеристик помогает в идентификации разных подтипов. Описано разнообразие молекулярных техник, например, мультилокусное секвенирование (MLST), методы ПЦР для быстрого обнаружения, ПЦР повторяющихся экстрагенных палиндромов и гель-электрофорез в пульсирующем поле (PFGE). Поликлональные антисыворотки (индуцированные против штамма O25а), включающие различные иммуноглобулины, используются для определения антигена O25, но не для дифференцировки подтипов.
Jadhav et al. (PLOS ONE 2011; 6(3):e18063) описывают характеристики вирулентности и генетическое сродство штаммов, которые были позитивны по подгруппе O25b, связанной с B2-O25b-ST131-CTX-M-15 вирулентным штаммом или штаммом с множественной устойчивостью. Были проанализированы и классифицированы клинические изоляты от человека и получены профили маркеров вирулентности. Штаммы, позитивные O25, были идентифицированы путем серотипирования с использованием поликлональной антисыворотки к О-антигенам - от O1 до O173. Штаммы, позитивные O25, дополнительно подвергали генотипированию при помощи аллель-специфического анализа ПЦР, нацеленного на локус гена подгруппы rfbO25b.
Mora et al. (Int. J. Antimicrobial Agents 2011; 37(1):16-21) описывают появление некоторых клональных подгрупп среди клинических изолятов Е.coli, экспрессирующих СТХ-М-14, и среди них - O25b:H4-B2-ST131. О-типирование производилось при помощи специфической поликлональной антисыворотки.
Clermont et al. (J Antimicrob Chemother 2008 May; 61(5):1024-8) раскрывают аллель-специфический pabB анализ ПЦР, специфический по отношению к клону ST131 Е.coli, позитивному O25b.
Szijarto et al. (FEMS Microbiol Lett 2012; 332:131-6) описывают молекулярное типирование штамма Е.coli, изолированного по признаку структуры кора молекулы ЛПС.Тип кора изолятов был установлен методом ПЦР с использованием праймеров к целевым генам в коровой части оперона и специфичных, соответственно, для типов коров R1-4 и K-12.
Раскрытие изобретения
Целью настоящего изобретения является создание антитела с улучшенной специфичностью, направленного против штаммов Е.coli с МЛУ и предназначенного для терапии инфекций, вызванных штаммами Е.coli, экспрессирующими молекулу ЛПС антигена O25b. Также, целью изобретения является создание средств и методов для более быстрой и более надежной диагностики бактерий Е.coli с МЛУ.
Данная цель решается при помощи предмета настоящего изобретения. Согласно изобретению речь идет о выделенном антителе, которое специфически связывается с антигеном O25b штаммов Е.coli с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ).
В особенности, настоящее изобретение касается моноклонального антитела.
В особенности, настоящее изобретение предлагает антитело, способное специфически связываться только с антигеном O25b, или обладающим перекрестной реактивностью и способном связываться с общим для антигенов O25а и O25b эпитопом.
В одном из примеров осуществления настоящего изобретения, последнее раскрывает антитело, обладающее перекрестной специфичностью и способное связываться с антигенами O25b, O25 и O25а, то есть обладающего равной, более высокой, подобной или отличающейся аффинностью (родством связывания).
В особом варианте осуществления настоящего изобретения, антитело по настоящему изобретению предпочтительно связывается с антигеном O25b, чем с O25а-антигеном Е.coli, или по меньшей мере обладает одинаковым родством связывания к обоим антигенам.
В зависимости от конкретного исполнения, связывающая способность антитела к антигену O25b по меньшей мере в два раза выше, чем к антигену O25а, в частности, связывающая способность по отношению к антигенами O25b и O25а отличается по меньшей мере в два раза, или по меньшей мере в три раза, или по меньшей мере в четыре раза, или по меньшей мере в пять раз, или даже в десять раз, то есть, для антитела по настоящему изобретению характерна разница в родстве связывания и/или авидности.
Частный аспект настоящего изобретения касается специфического связывания с антигеном O25b; при этом, антитело по настоящему изобретению характеризуется более высокой связывающей способностью к антигену O25b по сравнению со связывающей способностью к тому же антигену у поликлональной сыворотки, индуцированной против штаммов Е.coli, позитивных O25 или O25а, определяемой при помощи иммуноанализа, предпочтительнее иммуноблоттингом, ИФА или иными иммунологическими методами. В частности, разница в родстве связывания может отличаться по меньшей мере в два раза, или по меньшей мере в три раза, или по меньшей мере в четыре раза, или по меньшей мере в пять раз, или даже по меньшей мере в 10 раз.
В частности, антиген O25b, являющийся мишенью для антитела по изобретению, превалирует в некоторых или большинстве, а еще более точно присутствует в подавляющем большинстве штаммов ST131.
В частности, эпитоп, распознаваемый антителом, присутствует на поверхности клеток как капсулированных, так и некапсулированных штаммов ST131-O25b:H4, то есть мутантных штаммов.
Следующий частный вариант настоящего изобретения касается антитела, центр связывания которого находится в полноразмерном варианте антитела, или во фрагменте антитела, содержащим по меньшей мере один домен, включающий в себя сайт связывания; при этом, речь идет предпочтительно об антителе, отобранным из группы, включающей антитела, полученные от мыши, ламы, кролика, козы, коровы, химерные, гуманизированные или человеческие антитела, антитела из одних тяжелых цепей, Fab, Fd, scFv и однодоменные антитела типа VH, VHH или VL, предпочтительно человеческие или мышиные антитела класса IgG.
-7
-8
Следующий частный вариант изобретения касается антитела, обладающего аффинностью связывания по отношению к антигену O25b с константой диссоциации (КД) меньшей чем 10М, предпочтительно меньшей чем 10М, определенной для антитела в мономерном состоянии.
Следующий частный вариант изобретения касается антитела, демонстрирующего бактерицидный потенциал in vitro в образце сыворотки, содержащей живые дикие штаммы Е.coli с МЛУ.
Следующий частный вариант изобретения касается антитела, стимулирующего поглощение живых диких штаммов Е.coli с МЛУ фагоцитирующими клетками in vitro.
Следующий частный вариант изобретения касается антитела, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело, обозначенное как 8D5-1G10 или 8D10-C8.
Следующий частный вариант изобретения касается антитела, которое включает в себя тот же сайт связывания, что и антитело, обозначенное как 8D5-1G10 или 8D10-C8.
Следующий частный вариант изобретения касается выделенного антитела, которое специфически связывается с антигеном O25b штаммов Е.coli с МЛУ, и которое содержит антиген-связывающий сайт антитела 8D5-1G10, или которое является или получено из антитела 8D5-1G10, или его функционально активного варианта; при этом предпочтительно, чтобы антитело 8D5-1G10 характеризовалось:
а) вариабельной областью легкой цепи, произведенной клеткой-хозяином, депонированной под номером DSM 26763;
и/или
б) вариабельной областью тяжелой цепи, произведенной клеткой-хозяином, депонированной под номером DSM 26762;
в) или вариабельной областью, находящейся в функционально активном варианте (а) и/или (б).
В соответствии с частным вариантом осуществления, антитело по изобретению представляет собой антитело 8D5-1G10 или его функционально активный вариант.
Другие антитела по изобретению включают антитела, обозначенные как 6D1-1B2 и 8A1-1G8. Они являются клонами с последовательностями гипервариабельных участков (CDR), подобными 8D5-1G10, при этом они также понимаются как функционально активные варианты CDR.
В частности, антитело, обозначенное как 8D5-1G10, состоит из легкой цепи, включающей вариабельную область, закодированную кодирующей последовательностью на плазмиде, введенной в клетку-хозяина Е.coli, депонированной под номером DSM 26763, и тяжелой цепи, включающей вариабельную область, закодированную кодирующей последовательностью на плазмиде, введенной в клетку-хозяина Е.coli, депонированных под номером DSM 26762.
Следующий частный вариант изобретения касается антитела по изобретению, полученного из антитела 8D5-1G10, в котором:
- вариабельная область легкой цепи закодирована на плазмиде, введенной в клетку-хозяина Е.coli, депонированной под номером DSM 26763, или в его функционально активный вариант; и/или
- вариабельная область тяжелой цепи закодирована на плазмиде, введенной в клетку-хозяина Е.соli, уложенной на хранение под номером DSM 26762, или в его функционально активный вариант.
Следующий частный вариант изобретения касается антитела по изобретению, полученного из антитела, в котором:
- вариабельная область легкой цепи синтезируется клеткой-хозяином, депонированной под номером DSM 26763, или его функциональным вариантом; и/или
- вариабельная область тяжелой цепи синтезируется клеткой-хозяином, депонированной под номером DSM 26762, или его функциональным вариантом.
Следующий частный вариант изобретения касается выделенного антитела, которое специфически связывается с эпитопом, общим для антигенов O25а и O25b, и которое включают антиген-связывающий сайт антитела 8D10-C8, или которое получено из антитела 8D10-C8, или является функционально активным вариантом антитела 8D10-C8, при этом предпочтительно, чтобы 8D10-C8 характеризовалось:
а) вариабельной областью легкой цепи, произведенной клеткой- хозяином, депонированной под номером DSM 28171; и/или
б) вариабельной областью тяжелой цепи, произведенной клеткой-хозяином, депонированной под номером DSM 28172;
в) или функционально активный вариант по (а) и/или (б).
В соответствии с уточняющим вариантом осуществления, антитело представляет собой антитело 8D10-C8, или его функционально активный вариант.
В частности, антитело, обозначенное как 8D10-C8, состоит из легкой цепи, включающей вариабельную область, закодированной кодирующей последовательностью на плазмиде, введенной в клетку-хозяина Е.coli, депонированной под номером DSM 28171, и тяжелой цепи, включающей вариабельную область, закодированной кодирующей последовательностью на плазмиде, введенной в клетку-хозяина Е.coli, депонированной под номером DSM 28172.
Следующий частный вариант изобретения касается антитела, полученного из антитела 8D10-C8, в котором:
- вариабельная область легкой цепи закодирована на плазмиде, введенной в клетку-хозяина Е.coli, депонированной под номером DSM 28171, или его функционально активным вариантом; и/или
- вариабельная область тяжелой цепи закодирована на плазмиде, введенной в клетку-хозяина Е.coli, депонированной под номером DSM 28172, или его функционально активным вариантом.
Следующий частный вариант изобретения касается антитела, полученного из антитела, в котором:
- вариабельная область легкой цепи синтезируется клеткой-хозяином, депонированной под номером DSM 28171, или его функционально активным вариантом; и/или
- вариабельная область тяжелой цепи синтезируется штаммом-продуцентом, депонированным под номером DSM 28172, или его функционально активным вариантом.
В частности, под функционально активным вариантом понимается вариант гипервариабельного участка (CDR), включающий аминокислотные последовательности области CDR или точнее петли CDR и имеющий как минимум 60% степень идентичности аминокислотной последовательности, предпочтительно 70%, 80% или 90% степень идентичности.
В частности, антитело по настоящему изобретению получено из подобных антител с использованием соответствующих последовательностей CDR или мутантов CDR, включая функционально активные варианты CDR, например, с 1-й, 2-мя или 3-мя точечными мутациями в одной петле CDR.
В частности, функционально активный вариант отличается от родительского антитела по меньшей мерой одной точечной мутацией в аминокислотной последовательности, предпочтительнее в области CDR, где количество точечных мутаций в каждой из аминокислотных последовательностей равно 0, 1, 2 или 3.
В соответствии со следующим особым вариантом, настоящее изобретение касается плазмиды, содержащей нуклеотидную последовательность
А
- кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела, обозначенной как 8D5-1G10-LC, находящейся в клетке-хозяине, депонированной под номером DSM 26763; и/или
- кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела, обозначенной как 8D5-1G10-HC, находящейся в клетке-хозяине, депонированной под номером DSM 26762;
или Б
- кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела 8D10-C8-LC, находящейся в клетке-хозяине, депонированной под номером DSM 28171; и/или
- кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела, обозначенной как 8D10-C8-HC, находящейся в клетке-хозяине, депонированной под номером DSM 28172.
Следующий особый вариант осуществления настоящего изобретения касается экспрессионной кассеты, содержащей кодирующую последовательность для экспрессии легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела по изобретению, где экспрессионная кассета или кодирующая последовательность получены из плазмиды, выбранной из группы плазмид по изобретению.
Следующий особый вариант изобретения касается способа получения антител по настоящему изобретению, при котором клетка-хозяин подвергается трансформации при помощи плазмиды по настоящему изобретению или экспрессионной кассеты по настоящему изобретению.
Следующий особый вариант настоящего изобретения касается клетки-хозяина, включающей плазмиду по настоящему изобретению или экспрессионную кассету по настоящему изобретению. В частности, клетка-хозяин депонирована под номером
А
DSM 26763 и/или DSM 26762;
или Б
DSM 28171 и/или DSM 28172.
Особый вариант осуществления изобретения относится к способу получения антитела по настоящему изобретению, при котором клетку-хозяин по настоящему изобретению культивируют или поддерживают в условиях, позволяющих получать указанное антитело.
В соответствии со следующим особым вариантом осуществления настоящее изобретение предусматривает способ идентификации антитела-кандидата, который включает:
(а) получение образца, содержащего антитело или антител-продуцирующую клетку и
(б) оценку связывания антитела или антитела, произведенного образцом с антител-продуцирующей клеткой, с эпитопом, распознаваемым антителом, обозначенным как 8D5-1G10 или 8D10-С8, где позитивная реакция между антителом и эпитопом позволяет идентифицировать антитело как антитело-кандидат.
Следующий особый вариант осуществления настоящего изобретения касается способа идентификации антитела-кандидата, который включает:
(а) получение образца, содержащего антитело или антител-продуцирующую клетку и
(б) оценку связывания антитела или антитела, произведенного образцом с антигеном O25b штамма ST131-O25b:H4 или антигеном O25 штамма Е.coli без МЛУ или антигеном O25а, где именно специфическая позитивная реакция между антителом и антигеном O25b, а не реакция с антигенами O25 или O25а, позволяет идентифицировать антитело как антитело-кандидат.
В частности, антитело-кандидат может быть отнесено к группе антител, обладающих протекторными свойствами, которые могут применяться для терапевтических целей, или к группе антител, используемых для целей диагностики.
При этом, следующий особый вариант осуществления настоящего изобретения касается способа получения антитела по изобретению, который включает:
(а) создание антител а-кандидата, идентифицированного в соответствии с изобретением и
(б) получение моноклонального антитела или гуманизированной или человеческой форм антитела-кандидата, или их производного с такой же специфичностью связывания с эпитопом, как и у антитела-кандидата.
Следующий особый вариант осуществления изобретения касается способа получения антитела по изобретению, который включает:
(а) иммунизацию животных эпитопом, распознаваемым антителом, обозначенным как 8D5-1G10 или 8D10-C8;
(б) формирование иммортализированных клеточных линий из выделенных В-клеток;
(в) отбор клеточных линий, полученных по п. б) для идентификации клеточной линии, производящей моноклональное антитело, связываемое с эпитопом и
(г) получение моноклонального антитела или гуманизированной или человеческой форм антитела, или их производного с той же специфичностью связывания с эпитопом, как и у моноклонального антитела.
Следующий особый вариант осуществления настоящего изобретения касается способа получения антитела по изобретению, который включает:
(а) иммунизацию животных антигеном O25b штамма ST131-O25b:Н4 и выделение В-клеток, производящих антитела;
(б) формирование иммортализированных клеточных линий из выделенных В-клеток;
(в) отбор клеточной линии, производящей моноклональное антитело, которое предпочтительно связывается с O25-антигеном, чем с антигенами O25 или O25а Е.coli; и
(г) получение моноклонального антитела или гуманизированной или человеческой форм антитела, или их производного с той же специфичностью связывания с эпитопом, как и у моноклонального антитела.
Следующий особый вариант осуществления настоящего изобретения касается применения антитела по изобретению по медицинскому назначению. Более точно, антитело, при таком применении, предназначено для применения при лечении субъектов, которые могут быть подвержены риску заражения или страдают от инфекций, вызванных штаммами Е.coli с МЛУ и заключается в предписании больному эффективного количества антитела с целью ограничения инфекции или улучшения болезненного состояния, вызванного указанной инфекцией, предпочтительно для лечения или профилактики пиелонефритов, вторичных бактериемий, сепсиса, перитонитов, менингитов и вентиляторных пневмоний (пневмоний, вызываемых искусственной вентиляцией легких (ИВЛ)).
Точнее, предлагается антитело для киллинга штамма Е.coli с МЛУ, предпочтительно штамма ST131-O25b:H4, независимо от типа капсульного полисахарида, экспрессируемого штаммом.
В соответствии с особым вариантом настоящего изобретения дополнительно предусматривается способ лечения, при котором лечится субъект, который может быть подвержен риску заражения или страдает от инфекций, вызванных штаммами Е.coli с МЛУ. Вышеуказанный способ лечение предусматривает введение субъекту эффективного количества антитела с целью ограничения инфекции или улучшения болезненного состояния, вызванного указанной инфекцией. Предпочтительно, таким способом лечения может быть способ лечения или профилактики пиелонефритов, вторичных бактериемий, сепсиса, перитонитов, менингитов и вентиляторных пневмоний.
Более точно, предлагается антитело для киллинга штаммов Е.coli с МЛУ, предпочтительно штамма ST131-O25b:H4, независимо от типа капсульного полисахарида, экспрессируемого штаммом.
В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения предлагается способ иммунотерапии при помощи антитела по изобретению, которое может эффективно защитить от бактериального заражения, что уже доказано на различных животных моделях.
Антитело может специфически нейтрализовать смертельную дозу эндотоксина, присутствующего в крови. Указанная функциональная активность может быть продемонстрирована на соответствующей модели in vivo (заражение очищенным ЛПС - липополисахаридом, эндотоксином).
Более точно, антитело является эффективным против штаммов Е.coli с МЛУ через активацию комплемент-обусловленного киллинга, что уже доказано на модели in vitro при помощи сывороточного бактерицидного теста (SBA), например, с как минимум 20% ростом бактерицидности по сравнению с контрольными образцами (без антител или контроль с добавкой нерелевантных моноклональных антител (МАТ)).
Более точно, антитело является эффективным против штаммов Е.coli с МЛУ - через активацию антител-опосредованного фагоцитоза, например, как это продемонстировано на модели in vitro при помощи опсоно-фагоцитарной реакции (ОРК), например, с как минимум 20% уменьшением поглощения начальных количеств бактерий или 20% снижением количества КОЕ по сравнению с контрольными образцами (без антител или контроль с добавкой нерелевантного МАТ).
Более точно, антитело является эффективным против штаммов Е.coli с МЛУ, проявляя активность, нейтрализующую эндотоксин, например, как это продемонстрировано на модели in vitro при помощи ЛАЛ-теста (теста с использованием лизата амебоцитов мечехвоста (Limulus)psven - реагента для определения содержания эндотоксинов в фармпрепаратах) или теста с использованием в качестве гена-репортера толл-подобного рецептора 4 (TLR-4), например, с как минимум 20% снижением активности эндотоксина в сравнении с контрольными образцами (без антител или контроль с добавкой нерелевантного МАТ).
В соответствии с частным вариантом осуществления изобретения, антитело назначают для приема больным парентеральным или мукозальным (через слизистую оболочку) путями.
В соответствии с дополнительным вариантом настоящее изобретение предусматривает фармацевтический препарата на основе антитела по изобретению, предпочтительными путями введения которого являются парентеральный или мукозальный пути. Указанный препарат дополнительно может включать фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
В соответствие с еще одним дополнительным вариантом, настоящее изобретение предусматривает антитело, которое применяется для диагностики у субъекта инфекций, вызванных Е.coli, и точнее - штаммами с МЛУ, экспрессирующими молекулу липополисахарида (ЛПС) антигена O25b, такими как инфекции верхних и нижних мочевых путей, включая циститы и уретриты, восходящие и гематогенные пиелонефриты, особенно у пациентов с диабетом, а также бактериемии, сепсис, перитониты или бактериальные колонизации желудочно-кишечного тракта.
Более точно, антитело предусмотрено для использования в соответствии с изобретением, по которому системная инфекция у субъекта, вызванная Е.coli с МЛУ, определяется ex vivo после контакта образца жидкостей, отобранного из организма указанного субъекта с антителом, где специфическая иммунная реакция свидетельствует о наличии инфекции.
Более точно, под образцом жидкости, отобранном из организма, подвергаемом тестированию на специфическую иммунную реакцию, понимаются образцы, полученные из мочи, крови, изолятов из крови или гемокультур, аспиратов, мокроты, промывных жидкостей у интубированных субъектов или кала.
Более точно, диагностическое применение в соответствии с настоящим изобретением касается определения серотипа Е.coli in vitro по чистой культуре Е.coli, извлеченной из клинической пробы.
В соответствии со следующим вариантом осуществления настоящее изобретение предусматривает диагностический препарат на основе антитела по изобретению или содержащего антитело с меткой и/или дополнительный диагностический реагенте меткой, например, специфически распознаваемый антителом или иммунным комплексом антитела с соответствующим антигеном-мишенью, и/или твердую фазу для иммобилизации по меньшей мере одного антитела и диагностического реагента. Диагностический препарат может быть предложен в виде набора компонентов, например, включающего такие составные части, как:
а) препарат для диагностики на основе антитела, и/или
б) дополнительный диагностический реагент,
и/или твердую фазу для иммобилизации по меньшей мере одного антитела и диагностического реагента, либо в качестве отдельного компонента, либо в качестве носителя для любого из компонентов по п. а) и/или б), указанных выше.
Предпочтительные диагностические тесты по изобретению базируются, например, на реакции агглютинации между антителом по изобретению, иммобилизированном на твердой фазе, например, латексных гранулах, золотых частицах и т.д., и бактерией, экспрессирующей антиген O25b, или свободным (или выделенным) антигеном O25b, полученным из образцов для тестирования.
Некоторые диагностические тесты могут включать два различных антитела с различной специфичностью и/или сродством связывания с антигенами O25b и/или O25а, то есть позволяют различить указанные антигены между собой.
В соответствии с еще одним вариантом осуществления, настоящее изобретение предусматривает способ сопровождающей диагностики с целью определения инфекции у субъекта с штаммом Е.coli с МЛУ посредством диагностики по изобретению или способов диагностики по изобретению для обеспечения обоснования лечения терапевтическими средствами, действующими против такой инфекции, например, использования иммунотерапии, в том числе терапии при помощи антитела по изобретению.
В соответствии с еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения предусматривается способ чувствительной диагностики у постели субъекта с штаммом E. соli с МЛУ путем определения свободных молекул ЛПС, например, из клинической пробы, где количество живых бактерий ограничено. Более точно, чувствительностью в данном способе является величина, меньшая, чем 100 нг, предпочтительно меньшая, чем 10 нг молекул ЛПС.
В соответствии со следующим вариантом осуществления изобретения, предлагается выделенный эпитопа, распознаваемый антителом, обозначенным как 8D5-1G10 или 8D10-C8. Такой эпитоп может состоять из одинарного эпитопа или смеси эпитопов, содержащей варианты эпитопов, каждый из которых распознается специфическим антителом, обозначенным как 8D5-1G10 или 8D10-C8. Более точно, эпитоп для распознавания антителом 8D10-C8 является общим и преобладающим в структуре обоих антигенов - O25b и O25а. Таким образом, антитело считается кросс-специфичным, но предпочтительно связывающееся с антигеном O25b по меньшей мере равным связыванию с антигеном O25а.
В соответствии со следующим вариантом осуществления настоящего изобретения предлагается иммуноген, который включает:
(а) эпитоп по изобретению;
(б) необязательно эпитопы, изначально не связанные с указанным эпитопом по п. (а) и
(в) носитель.
Уточняя, носитель представляет собой фармацевтически приемлемый носитель, предпочтительно буфер и/или адъювантные вещества.
Иммуноген по настоящему изобретению предпочтительно предлагается в виде вакцины, предпочтительно для парентерального введения.
Более точно, иммуноген по изобретению предлагается для применения медицинского назначения. Еще в большей мере уточняя, - для лечения субъектов путем назначения эффективного количества указанного иммуногена с целью защиты субъекта от инфекции, вызываемой штаммами Е.coli с МЛУ, или для профилактики указанного инфекционного заболевания.
Точнее, иммуноген по изобретению предлагается с целью вызова защитного иммунного ответа.
В соответствии со следующим вариантом осуществления настоящего изобретения, предлагается способ лечения, при котором лечится субъект, у которого устанавливается риск заражения штаммом Е.coli с МЛУ. Указанный способ лечения включает введение субъекту эффективного количества иммуногена с целью профилактики инфекции, в частности, профилактики в отношении патогенных штаммов Е.coli с МЛУ.
В соответствии со следующим вариантом осуществления настоящего изобретения предлагается выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по изобретению, или кодирующая эпитоп по изобретению.
Краткое описание чертежей
Фигура 1: Окрашивание поверхности клеток различных штаммов ST131:O25b, экспрессирующих антигены O25b, O25а, или 02 при помощи специфического (с или без кросс-реактивности к антигену O25а) к O25b моноклонального антитела (МАТ).
Фигура 2: Реактивность различных МАТ и кроличьей сыворотки, типирующей O25 в отношении очищенных молекул ЛПС антигенов O25а и O25b, определенная методом иммуноблоттинга.
Фигура 3: (а): Структура повторяющегося звена антигена O25b из Е.coli. (б): структура повторяющегося звена антигена O25а из Е.coli (также обозначаемого как O25, иногда обозначаемого как O25(a)), для сравнения (Kenne et al, 1985).
Фигура 4: Обнаружение антигена O25b, экспрессируемого штаммами Е.coli, путем проведения реакции агглютинации с использованием MAT 8D5-1G10, иммобилизированного на латексных гранулах.
Фигура 5: Обнаружение растворимого антигена O25b путем проведения реакции агглютинации с использованием MAT 8D5-1G10, иммобилизированного на латексных гранулах.
Фигура 6: Защита, обеспеченная путем пассивной иммунизации мышей при помощи мышиных МАТ, специфических O25b, против последующего внутривенного заражения клиническим изолятом с ST131:O25b.
Фигура 7: Комплемент-зависимый бактериальный киллинг при посредничестве МАТ, специфических O25b.
Осуществление изобретения
Используемый здесь термин "антитело" относится к полипептидам или белкам, которые состоят или содержат домены антитела, а именно константные и/или вариабельные домены тяжелой и/или легкой цепи иммуноглобулинов, с или без линкерной последовательности. Полипептиды могут рассматриваться в качестве доменов антитела в том случае, если они включают в себя бета-баррельную структуру, состоящую как минимум из двух бета-баррелей домена антитела, связанных последовательностью петли. Домены антитела могут иметь нативную или модифицированную путем мутагенеза или дериватизации структуру, например, с целью изменения антиген-связывающих свойств или других свойств, таких как стабильность или функциональные свойства, или таких как связывание с Fc-рецепторами - FcRn и/или Fcgamma.
2
Антитело, используемое здесь, имеет специфический сайт связывания к одному или нескольким антигенам или к одному или нескольким эпитопам таких антигенов, и конкретно включает в себя сайт связывания в CDR-области с единственным вариабельным доменом антитела, таким как VН, VL или VHH, или сайт связывания с двумя вариабельными доменами антитела, такими как пара VL/VH; антитело включает в себя доменную пару VL/VH и константные домены, такие как Fab, F(ab'), (Fab), scFv, Fv, или является полноразмерным антителом.
2
Используемый здесь термин "антитело" относится, в частности, к форматам антител, включающих в себя или состоящих из единственного вариабельного домена антитела, такого как VH, VL или VHH, или комбинации вариабельного и/или постоянного домена антитела, с или без линкерной последовательности или шарнирной области, включая пару вариабельных доменов антитела, таких как пара VL/VH; антитело, включающее в себя или состоящее из доменной пары VL/VH и постоянных доменов, таких как тяжелые цепи антител, Fab, F(ab'), (Fab), scFv, Fd, Fv, или полноразмерное антитело, например, антитело типа IgG (например, подтипы IgG1, IgG2, IgG3, и IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE, или IgM. Термин "полноразмерное антитело" может быть использован по отношению к любой молекуле антитела, включающей в себя как минимум большую часть Fc-домена и другие домены, обычно присутствующие в мономере антитела естественного происхождения. Эта фраза используется здесь для того, чтобы подчеркнуть тот факт, что молекула антитела, в частности, не является фрагментом антитела.
Конкретно, термин "антитело" относится к антителам в изолированной форме, например, практически освобожденным от других антител, направленных против других антигенов-мишеней, или присутствия доменов антитела с иной структурной организацией. Тем не менее, выделенное антитело может быть включено в комбинированный препарат, содержащий комбинацию выделенных антител, например, как минимум с одним другим моноклональным антителом или фрагментом антитела, имеющими различную специфичность.
Термин "антитело" может быть применен к антителам животного происхождения, включая человеческий вид, таким как антитела млекопитающих, включая человека, мышей, кроликов, коз, лам, коров и лошадей, или птичьим, например, куриным.
Термин "антитело" дополнительно применяется к химерных антителам, содержащим оригинальные секвенции от различных видов, таких как секвенции мышиного и человеческого происхождения.
Термин "химерный" применяется по отношению к таким антителам, в которых какой-то один участок в каждой из аминокислотных последовательностей, находящихся в тяжелой и легкой цепях, является гомологичным соответствующим последовательностям в антителах, полученных из конкретных видов или принадлежащих определенному классу, а оставшийся сегмент цепи соответствует последовательностям из других видов или классов. Обычно, вариабельная область обоих цепей (легкой и тяжелой) имитирует вариабельные области, полученные от одного из видов млекопитающих, тогда как константные участки гомологичны секвенциям антител, полученных из других видов. Например, вариабельная область может быть получена из известных к настоящему времени источников легко доступных В-клеток или из гибридом организмов-хозяев нечеловеческого происхождения в комбинации с постоянными областями, полученными, например, из препаратов клеток человека.
Термин "антитело" дополнительно применяется к гуманизированным антителам.
Используемый здесь термин "гуманизированный" применяется по отношению к антителам, в молекуле которых имеется антиген-связывающий сайт, полученный из нечеловеческих иммуноглобулинов, при этом оставшаяся структура иммуноглобулина фактически основана на структуре и/или последовательности человеческого иммуноглобулина. Антиген-связывающий сайт может полностью состоять из вариабельных последовательностей доменов, соединенных с постоянными доменами или содержать только определяющие комплементарные области (CDR), "привитые" на соответствующие каркасные области вариабельных последовательностей доменов. Антиген-связывающий сайт может быть дикого или модифицированного типа, например, с одной или более аминокислотными заменами, предпочтительно модифицированный таким образом, чтобы как можно полнее напоминать человеческие иммуноглобулины. Некоторые формы гуманизированных антител сохраняют все CDR-последовательности (например мышиное гуманизированное антитело, которое содержит все шесть CDR-областей из мышиного антитела). Другие формы имеют одну или более CDR-областей, отличающихся от находящихся в оригинальном антителе.
Термин "антитело" дополнительно применяется по отношению к человеческим антителам.
Используемый здесь термин "человеческий" применяется по отношению к антителам, в которых присутствуют вариабельные и константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулиназародышевой линии человека. Человеческое антитело по изобретению может включать аминокислотные участки, не закодированные в последовательностях иммуноглобулина зародышевой линии человека (например, полученные в результате случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или соматических мутаций in vivo), например, в CDR-области. Человеческие антитела включают антитела, полученные из библиотек иммуноглобулинов человека или животных, трансгенных по одному или нескольким человеческим иммуноглобулинам.
Термин конкретно применяется к антителам, относящимся к любым классам или подклассам. Антитела, в зависимости от аминокислотной последовательности константного домена своих тяжелых цепей, могут быть отнесены к основным классам антител, таким как IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, a некоторые из них дополнительно могут быть подразделены на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2.
Термин дополнительно применяется к моноклональным или поликлональным антителам, конкретно, к рекомбинантному антителу, причем термин относится ко всем антителам или структурам антител, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены рекомбинантным способом, например, из антител, происходящих от животных, например, млекопитающих, включая человека, которые содержат гены или последовательности различного происхождения, например, химерные, гуманизированные или гибридомные антитела. Дополнительные примеры относятся к антителам, выделенным из клетки-хозяина, трансформированной для целей экспрессии антитела или антителам, выделенным из рекомбинантной, комбинаторной библиотеки антител или доменов антител или антителам, полученным, экспрессированным, созданным или выделенным любыми другими средствами, которые включают сплайсинг гена антитела последовательности с другими последовательностями ДНК.
При этом, термин "антитело" относится также к производным антител, в частности, к функционально активным производным. Под производным антитела понимается любая комбинация одного или нескольких доменов антитела или антител и/или слитого белка, у которого любой домен антитела по изобретению может быть слит по любому положению с одним или несколькими другими белками, такими как другие антитела, например, связанная структура, включающая CDR-петли, полипептидный рецептор, или только лиганды, каркасные белки, энзимы, токсины и т.п. Производное антитела может быть получено путем ассоциации или связывания с другими веществами при помощи различных химических методов, таких как ковалентное присоединение, электростатическое взаимодействие, образование дисульфидной связи и т.п. Другие вещества, связывающиеся с антителом, могут представлять собой липиды, углеводы, нуклеиновые кислоты, органические и неорганические молекулы или любые их комбинации (например, ПЭГ, пролекарства или лекарства). В конкретном варианте реализации, под производным понимается антитело, содержащее дополнительную метку для реализации специфического взаимодействия с биологически приемлемым соединением. Конкретные ограничения по отношению к меткам, используемым в настоящем изобретении, отсутствуют, поскольку это не оказывает какого-либо приемлемого или негативного влияния на связывание антитела с мишенью. Примеры таких подходящих меток включают в себя следующие: His, Мус, FLAG, Strep, Calmodulin, GST, MBP и S. В другом конкретном варианте реализации, антитело представляет собой производное, включающее метку. Термин "метка" по настоящему изобретению относится к определяемому компоненту или композиции, которые прямо или непрямо связаны с антителом, в результате чего появляется "меченое" антитело. Метка может быть обнаружена сама по себе, например, как радиоизотопные или флуоресцентные метки, или, в случае энзимной метки, она может катализировать химическую перестройку указанного компонента или композиции, которая может быть измерена.
Предпочтительные производные, рассматриваемые в рамках настоящего изобретения, являются функционально активными антителами, связывающимися с антигеном, предпочтительно обладающие потенциалом уничтожения в отношении штаммов Е.coli с МЛУ или их эндотоксина, что, например, может быть обнаружено при помощи сывороточного бактерицидного теста (SBA), опсоно-фагоцитарной реакции (ОРК) или ЛАЛ-теста; или обладающие защитным действием против бактериального заражения или летальной дозы эндотоксина в крови.
Под рассматриваемыми здесь антителами, полученными из родительского антитела или последовательности антитела, понимаются мутанты или варианты, полученные, например, in silico, или при помощи генной инженерии, или химическими дериватизацией или синтезом.
Конкретно, антитело, полученное из антитела по изобретению, может включать как минимум одну или несколько CDR-областей или CDR-вариантов, что делает его функционально активным - избирательно связывающимся с антигеном O25b, например, с конкретным или преимущественным связыванием с антигеном O25b.
При этом, термин "антитело" относится также к вариантам антитела.
Используемый здесь термин "вариант" относится, в частности, к мутантным антителам или фрагментам антител, например, полученным методами мутагенеза, в частности, делецией, обменом или введением вставок в конкретную аминокислотную последовательность или область, или полученным методом химической дериватизации аминокислотной последовательности, например, в константных доменах, для повышения стабильности антитела, эффекторной функций или периода полураспада, или в вариабельных доменах для улучшения антиген-связывающих свойств, например, методом аффинного созревания. Для проведения мутагенеза может быть использован любой из известных способов, включая метод точечных мутаций по желаемым позициям, например, при помощи методов рандомизации. В некоторых случаях позиции выбираются случайным образом, например, либо по любой из возможных аминокислот или отбором предпочтительных аминокислот для рандомизации аминокислотной последовательности. Термин "мутагенез" относится к любым технологиям, применяемым в данной области для изменения полинуклеотидной последовательности. К предпочтительным видам мутагенеза относятся: мутагенез путем использования ПЦР, характеризующийся высокой частотой ошибок, или насыщающий мутагенез, или любой другой метод сайт-направленного мутагенеза.
Уточняя, термин "вариант" должен охватывать функционально активные варианты.
Под используемым здесь термином "функционально активный вариант" антитела понимается антитело, содержащее измененную последовательность (родительского антитела или родительской последовательности), например, путем вставки, делеции или замены одной или нескольких аминокислот, например, при помощи рекомбинантных методов или химической дериватизации одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности, или нуклеотидов в нуклеотидной последовательности, или одного или обоих дистальных концов последовательности, причем проведенные модификации не влияют на активность антитела по изобретению (в частности, не ухудшают). В случае сайта связывания, обладающего специфической активностью к выбранному целевому антигену, функционально активный вариант антитела по-прежнему будет обладать заранее заданной специфичностью связывания, хотя и возможно измененной, например, могут измениться тонкая специфичность по отношению к специфическому эпитопу, аффинность, авидность, константы скорости связывания (Касс, Коп) или диссоциации (Кдисс., Koff) и т.д. Более точно, функционально активный вариант антитела по изобретению обладает способностью к связыванию с антигеном O25b и специфичностью и селективностью связывания предпочтительно с антигеном O25b, а не с другими антигенами Е.coli, например, связывается с антигеном O25b и не связывается с антигеном O25а Е.coli, или незначительно связывается с антигеном; или кросс-специфичностью, то есть связывается с обоими антигенами - O25b и O25а, но не связывается с другими антигенами Е.coli.
Функционально активные варианты могут быть получены, например, путем изменения последовательности родительского антитела, например, антитела, включающего такой же сайт связывания, что и антитела, обозначенные как 6D1-1B2, 8A1-1G8, 8D5-1G10 или 8D10-C8, но с модификациями в пределах области антитела за исключением сайта связывания, или производного из родительского антитела, которым может быть любое из следующих антител: 6D1-1B2, 8A1-1G8, 8D5-1G10 или 8D10-C8 путем модификации в сайте связывания, но без ухудшения антиген-связывающей способности и предпочтительно имеющее подобную биологическую активность, что и родительское антитело, включая способность к специфическому и селективному связыванию с антигеном O25b, например, связывание с антигеном O25b и отсутствие связывания с антигеном O25а Е.coli, или незначительное связывание с антигеном O25а, или кросс-специфичностью, то есть связывание с обоими антигенами - O25b и O25а, но отсутствие связывания с другими антигенами Е.coli. В некоторых случаях, функционально активные варианты могут дополнительно обладать способностью к комплемент-обусловленному киллингу, определяемому в сывороточно бактерицидном тесте (SBA), и/или в некоторых случаях дополнительно обладать способностью к антител-обусловленному фагоцитозу, определяемому в опсоно-фагоцитарном тесте (ОРК), и/или в некоторых случаях дополнительно обладать эндотоксин-нейтрализующей активностью в ЛАЛ-тесте, например, по существу с такой же биологической активностью в отношении целевого штамма Е.coli с МЛУ, которая определяется при помощи методов анализа специфичности связывания или функциональных тестов.
Например, функционально активные варианты антител 6D1-1B2 и 8А1-1G8 имеют по существу такую же или подобную аффинность, как и антитело 8D5-1G10 (см. таблицу ниже).
Используемый здесь термин "по существу такая же биологическая активность" относится к активности, которая по существу составляет как минимум 50%, как минимум 60%, как минимум 50%, как минимум 60%, как минимум 70%, как минимум 80%, как минимум 90%, как минимум 95%, как минимум 98% или даже как минимум 100% или как минимум 110%, или как минимум 120%, или как минимум 130%, или как минимум 140%, или как минимум 150%, или как минимум 160%, или как минимум 170%, или как минимум 180%, или как минимум 190%, например, даже 200% от активности, определяемой для родительского антитела.
Предпочтительные варианты или производные, как описано здесь, являются функционально активными с точки зрения антиген-связывающей способности, предпочтительно обладают специфической способностью к связыванию с антигеном O25b и не способны связываться с другими антигенами Е.coli, например, связываются с антигеном O25b и не связываются с антигеном O25а Е.coli, или незначительно связываются с антигеном O25а; или кросс-специфичностью, то есть связываются с обоими антигенами - O25b и O25а, например, предпочтительно связываются с антигеном O25b, а не с антигеном O25а; или обладают более высокой аффинностью связывания с антигеном O25b по сравнению с существующей поликлональной типирующей сывороткой, индуцированной против штаммов, несущих антиген O25 (025а). Предпочтительные варианты не связываются с другими антигенами Е.соli, причем разница в величинах Кдисс. составляет как минимум 2 logs, предпочтительно 3 logs и в некоторых случаях дополнительно обладают способностью к комплемент-обусловленному киллингу, определяемому в сывороточно бактерицидном тесте (SBA), что ведет к значительному уменьшению количества бактерий по сравнению с контрольными образцами, не содержащими антитело; и/или в некоторых случаях дополнительно обладают способностью к антител-обусловленному фагоцитозу, определяемому в опсоно-фагоцитарном тесте (ОРК), что ведет к значительному уменьшению числа бактерий по сравнению с контрольными образцами, не содержащими антитело; и/или в некоторых случаях дополнительно обладают эндотоксин-нейтрализующей активностью, определяемой в ЛАЛ-тесте или при помощи ТLR4-опосредованного сигнального пути, что ведет к значительному уменьшению свободных молекул ЛПС по сравнению с контрольными образцами, не содержащими антитело, например, по существу с такой же биологической активностью в отношении целевого штамма Е.coli с МЛУ, определяемой при помощи методов анализа специфичности связывания или функциональных тестов. Значительное уменьшение аналитов (анализируемых показателей), наблюдаемое в различных тестах, означает уменьшение как минимум на 50%, предпочтительно как минимум на 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98%, вплоть до полного 100% исчезновения (+/- 1%).
В предпочтительном варианте исполнения функционально активный вариант родительского антитела:
а) является биологически активным фрагментом антитела, содержащим как минимум 50% последовательности молекулы, предпочтительно как минимум 60%, как минимум 70%, как минимум 80%, как минимум 90%, или как минимум 95% и больше, наиболее предпочтительно как минимум 97%, 98% или 99%;
б) является производным антитела с как минимум одной аминокислотной заменой, включением, и/или делецией, при этом функционально активный вариант имеет последовательность, идентичную всей молекуле или ее части, включая антитела с как минимум 50% идентичностью, как минимум 60%, как минимум 70%, как минимум 80%, еще более предпочтительно как минимум 90% и даже как минимум 95% и наиболее предпочтительно как минимум 97%, 98% или 99%; и/или
в) состоит из антитела или его функционально активного варианта, которое дополнительно содержит как минимум одну гетерологичную аминокислоту или нуклеотид, в полипептидной и нуклеотидной последовательностях, соответственно.
В одном из предпочтительных вариантов исполнения изобретения, функционально активный вариант антитела по изобретению является по сути вариантом, идентичным описанному выше, но отличающимся по полипептидной или нуклеотидной последовательности, поскольку он получен из гомологичных последовательностей от различных видов. Здесь они называются как варианты естественного происхождения или аналоги.
Термин "функционально активный вариант" также включает аллельные варианты естественного происхождения, а также мутанты или любые другие не встречающиеся в природе варианты. Как общеизвестно в данной области, аллельный вариант является альтернативной формой (поли-) пептида, в которой произошла замена, делеция или добавление одной или нескольких аминокислот, что при этом не ведет в значительной степени не влияет на биологическую активность полипептида.
Функционально активные варианты могут быть получены путем изменения аминокислотной или нуклеотидной последовательности полипептида, например, при помощи одной или нескольких точечных мутаций, причем при изменении последовательности сохраняется функция, присущая нативным полипептидной или нуклеотидной последовательностям, в случае использования в комбинации по изобретению. Под такими изменениями в последовательностях понимаются, но не ограничиваются этим, (консервативные) замены, добавления, делеции, мутации и вставки.
Специфическими функционально активными вариантами являются CDR- варианты. CDR-вариант означает аминокислотную последовательность, в которой произошло изменение, как минимум, одной аминокислоты в CDR-области, причем указанная модификация может быть произведена химическим путем или путем частичного изменения аминокислотной последовательности, что дает на выходе вариант с сохраненными биологическими характеристиками по сравнению с нативной последовательностью. Частичное изменение аминокислотной последовательности в CDR-области может быть произведено путем делеции или замены одной или нескольких аминокислот, например, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот, или путем добавления или вставки одной или нескольких аминокислот, например, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот, или путем химической дериватизации одной или нескольких аминокислот, например, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот, или комбинацией указанных способов. Замены в аминокислотных остатках могут быть консервативными заменами, например, замена гидрофобной аминокислоты на альтернативную гидрофобную аминокислоту.
Консервативными заменами также являются такие, которые существуют в рамках семейства аминокислот, с родственными внутри семейства боковыми цепями и химическими свойствами. Примеры таких семейств включают в себя аминокислоты, у которых боковые цепи могут быть основными, кислотными, неполярными алифатическими, неполярными ароматическими, незаряженными полярными, маленькими или большими полярными и т.д.
Под точечной мутацией, в частности, понимается генно-инженерная модификация полинуклеотида, приводящая к экспрессии аминокислотной последовательности, отличающейся от нативной, при помощи замены, или обмена, делеции или вставки одной и более одиночной (не стоящих подряд) или дублета аминокислот, состоящих из различных аминокислот.
Предпочтительные точечные мутации заключаются в обмене аминокислотами с такой же полярностью и/или зарядом. С этой точки зрения, под аминокислотами понимаются 20 встречающихся в природе аминокислот, закодированных при помощи 64 триплетов кодонов. Указанные 20 аминокислот можно разделить на такие, которые обладают нейтральными, положительными или отрицательными зарядами:
"Нейтральные" аминокислоты приводятся ниже вместе с их трехбуквенным обозначением и однобуквенным кодом, а также полярностью:
Алании: (Ala, А) неполярная, нейтральная;
Аспарагин: (Asn, N) полярная, нейтральная;
Цистеин: (Cys, С) неполярная, нейтральная;
Глутамин: (Gin, Q) полярная, нейтральная;
Глицин: (Gly, G) неполярная, нейтральная;
Изолейцин: (lle, l) неполярная, нейтральная;
Лейцин: (Leu, L) неполярная, нейтральная;
Метионин: (Met, М) неполярная, нейтральная;
Фенилаланин: (Phe, F) неполярная, нейтральная;
Пролин: (Pro, Р) неполярная, нейтральная;
Серии: (Ser, S) полярная, нейтральная;
Треонин: (Thr, Т) полярная, нейтральная;
Триптофан: (Trp, W) неполярная, нейтральная;
Тирозин: (Тyr, Y) полярная, нейтральная;
Валин: (Val, V) неполярная, нейтральная, и
Гистидин: (His, Н) полярная, положительная (10%) нейтральная (90%).
"Положительно" заряженными аминокислотами являются следующие:
Аргинин: (Arg, R) полярная, положительная; и
Лизин: (Lys, К) полярная, положительная.
"Отрицательно" заряженными аминокислотами являются следующие:
Аспарагиновая кислота: (Asp, D) полярная, отрицательная; и
Глутаминовая кислота: (Glu, Е) полярная, отрицательная.
Под "процентом (%) идентичности аминокислотной последовательности" по отношению к последовательности антитела и гомологов, описанных здесь, понимается процент аминокислотных остатков в последовательности кандидата, которые идентичны аминокислотным остаткам в выбранной полипептидной последовательности, после выравнивания последовательности и введения гэпов (пробелов), если это необходимо для достижения максимального процента идентичности последовательности, и без учета любых консервативных замен как части идентичности последовательностей. Специалисты в данной области могут определить соответствующие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания на протяжении полной длины сравниваемых последовательностей.
Под вариантом антитела, в частности, понимаются гомологи, аналоги, фрагменты, модификации или варианты со специфическим профилем гликозилирования, например, произведенные гликоинжинирингом, и которые являются функциональными и могут служить примером функциональных эквивалентов, например, по параметрам связывания со специфической мишенью или наличием определенных функциональных свойств.
Антитело по настоящему изобретению может как обладать, так и не обладать Fc-эффекторной функцией. Предпочтительно, чтобы антитело обладало Fc-эффекторной функцией и являлось функционально активным в сывороточно бактерицидном тесте (SBA) и/или опсоно-фагоцитарном тесте (ОРК). Специфические антитела могут быть лишены Fc-фрагмента, и либо состоят из доменов антитела, не содержащих Fc-часть или Fcgamma рецептор-связывающий сайт, или включают домены, лишенные Fc-эффекторной функции, например, в результате модификаций, уменьшающих Fc-эффекторные функции. Альтернативные антитела могут быть сконструированы таким образом, чтобы их Fc-эффекторные функции были усилены, в частности, для повышения их ОРК и/или SBA активности.
Такие модификации могут быть осуществлены при помощи мутагенеза, например, в результате мутаций в Fcgamma рецептор-связывающем сайте или при помощи дериватизирующих средств или агентов, с целью нарушения ADCC- и/или CDC-активности формата антитела, что проявится в уменьшении и/или повышении Fc-эффекторной функции.
Под значительным снижением Fc-эффекторной функции обычно понимается как минимум 10% снижение функции по сравнению с нативным (диким типом) форматом, предпочтительно как минимум 5% снижение, измеренное по ADCC- и/или CDC-активности. Под значительным повышением Fc-эффекторной функции обычно понимается как минимум 10% повышение по сравнению с нативным (диким типом) форматом, предпочтительно как минимум 20%, 30%, 40% или 50%, измеренное по ADCC- и/или CDC- активности.
Под термином "гликоинженерные" варианты, применяемым в отношении последовательности антитела, должны пониматься гликозилированные варианты, обладающие измененными иммуногенными свойствами, ADCC- и/или CDC-активностью, полученными в результате гликоинжинеринга. У всех антител имеются углеводные структуры, находящиеся на консервативных позициях в константных областях тяжелой цепи, при этом каждый изотип обладает отличающимся массивом N-связанных углеводных структур, которые с различной силой влияют на белковую конструкцию, секрецию или функциональную активность. Антитела класса IgG1 являются гликопротеинами, имеющими законсервированный N-связанный сайт гликозилирования Asn297 в каждом СН2-домене. Двухкомпонентный комплекс из двухантенных олигосахаридов, присоединенных к Asn297, располагается между СН2-доменами, образуя обширные контакты с полипептидной сетью, и его наличие имеет существенное значение для реализации таких эффектор-опосредованных функций антитела, как антитело-зависимый комплимент-опосредованный бактериальный киллинг или поглощение фагоцитами. Удаление N-гликана в N297, например, в результате мутации N297, например в А, или Т299, обычно ведет к дегликозилированию форматов антитела с редуцированием эффекторной функцией.
Основные различия в гликозилировании антител наблюдаются между клеточными линиями, и при выращивании данной клеточной линии в различных условиях культивирования проявляются даже самые незначительные различия. Обычно, бактериальные клетки экспрессируют негликозилированные антитела. Для СНО-клеткок с тетрациклин-регулируемой экспрессией β(1,4)-N- ацетилглюкозаминилтрансферазы III (GnTIII) и гликозилтрансферазой, катализирующей образованием бисектного GlcNAc, показано изменение функциональной (ADCC) активности (Umana et al., 1999, Nature Biotech. 17: 176-180). Помимо выбора клеток-хозяев, другие факторы также влияют на процесс гликозилирования при рекомбинантной продукции антител, включая режим роста, состав питательной среды, плотность культуры, оксигенация, рН, схемы очистки и т.п.
Термин "антиген-связывающий сайт" или "сайт связывания" относится к части антитела, участвующий в процессе связывания антигена. Антиген-связывающий сайт образован аминокислотными остатками N-конечных терминальных вариабельных ("V") областей тяжелой ("Н") и/или легкой ("L") цепей, или их вариабельными доменами. Три высоко дивергентных участка в пределах V областей тяжелой и легкой цепей, называемые "гипервариабельными областями", располагаются между более консервативными фланкирующими участками, известными как каркасные области [антиген-связывающий сайт предоставляет поверхность, которая соответствует трехразмерной поверхности связанного эпитопа или антигена], и гипервариабельными областями, известными как "области, определяющие комплементарность", или "CDRs". Сайт связывания включен в CDR-область и называется здесь как "CDR-связывающий сайт".
Термин "антиген", используемый здесь попеременно с терминами "мишень" и "целевой антиген/антиген-мишень", относится к целевой молекуле или ее фрагменту, распознаваемым сайтом связывания антитела. Конкретно, к таким фрагментам антигена относят такие подструктуры как, например, полипептидная ил и углеводная структуры, как правило называемые "эпитопы", например, В-клеточные эпитопы или Т-клеточный эпитоп, которые являются иммуногенными и могут быть распознаны этим сайтом связывания. Специфические антигены, такие как антигены O25b или O25а, представлены в виде выделенных антигенов или также в форме клеток Е.coli или клеточных фракций.
Используемый здесь термин "эпитоп", в частности, относится к молекулярной структуре, которая может полностью выполнять роль специфического связывающего партнера или его части в сайте связывания антитела. Эпитоп может быть естественного или искусственного происхождения и может складываться из углевода, пептидной структуры, жирной кислоты, органического, биохимического или неорганического соединения, их дериватов или любых комбинаций. Если эпитоп включен в пептидную структуру, такую как пептид, полипептид или белок, он обычно содержит как минимум 3 аминокислоты, предпочтительно от 5 до 40 аминокислот, и более предпочтительно около 10-20 аминокислот. Эпитопы могут также иметь как линейную, так и пространственную структуру. Линейный эпитоп включает одиночный сегмент примарной последовательности полипептида или углеводной цепи. Линейный эпитоп может быть смежным или перекрывающимся. Конформационные эпитопы включают в себя аминокислоты или углеводы, вместе образующие третичную структуру полипептида, и аминокислоты, не обязательно смежные друг с другом в линейной последовательности. Конкретно, относительно полипептидных антигенов, конформационный или перекрывающийся эпитоп характеризуются присутствием двух или более отдельных аминокислотных остатков, стоящих далеко друг от друга в первичной последовательности, но соединенных в общую структуру на поверхности молекулы, когда полипептид сворачивается в нативный белок/антиген.
Используемый термин "эпитоп", в частности, относится к одиночному эпитопу, распознаваемому антителом, или смеси вариантов эпитопа, каждый из которых распознается антителом, конкретно распознающим мишень, например, эпитоп, конкретно распознаваемый антителом, отобранным из группы, содержащей антитела, обозначенные как 6D1-1B2, 8A1-1G8, 8D5-1G10 и 8D10-C8. Конкретно, эпитоп, являющийся мишенью для антитела, отобранного из группы, содержащей 6D1-1B2, 8A1-1G8, 8D5-1G10 и 8D10-C8, является углеводным эпитопом.
Под термином "экспрессия" понимается следующее. Для целей экспрессии могут быть использованы молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие желаемую кодирующую последовательность для экспрессии продукта, например, описываемого здесь антитела, и контролирующие последовательности, такие как, например, промотер в оперативной связи. Трансформированные или трансфицированные клетки-хозяева с этими последовательностями способны производить закодированные в них белки. Для того, чтобы прошла трансформация, система экспрессии должна быть включена в вектор; однако, соответствующая ДНК может быть также внедрена и в хромосому клетки-хозяина. Конкретно, термин относится к клетке-хозяину и, при определенных условиях, к совместимому вектору, например, предназначенному для экспрессии белка, закодированного чужеродной ДНК, включенной в вектор, и внедренный в клетку-хозяина.
Кодирующая ДНК - это последовательность нуклеотидов ДНК, кодирующая отдельную аминокислотную последовательность для отдельного полипептида или белка, например, антитела. Промотер ДНК - это последовательность нуклеотидов ДНК, которая инициирует, регулирует, опосредует или контролирует экспрессию кодирующей ДНК. Промотер ДНК и кодирующая ДНК могут находиться в одном гене или разных генах, и могут происходить из одного и того же или различных организмов. Рекомбинантные векторы клонирования часто включают одну или более систем репликации для клонирования или экспрессии, один или более маркеров для отбора в клетке-хозяине, например устойчивость к антибиотикам, и одну или несколько экспрессионных кассет.
Используемый здесь "вектор" определяется как ДНК-последовательности, которые необходимы для транскрипции клонированных рекомбинантных нуклеотидных последовательностей, например, рекомбинантных генов, и трансляции их мРНК в подходящем организме хозяина.
Термин "экспрессирующая кассета" относится к кодирующей ДНК-последовательности или сегменту ДНК с кодом экспрессии продукта по изобретению, которая может быть инсертирована в вектор около сайтов рестрикции. Сайты рестрикции кассеты служат для обеспечения инсерции кассеты в правильную рамку считывания. Как правило, чужеродная ДНК вставлена около одного или нескольких сайтов рестрикции векторной ДНК и затем в составе вектора внедрена в клетку-хозяина. Сегмент или последовательность ДНК, имеющая вставленную или добавленную ДНК, например, в виде экспрессирующего вектора, может также называться как "ДНК-конструкт".
Экспрессирующие векторы включают экспрессирующую кассету и обычно дополнительно содержат один собственный ориджин для автономной репликации в клетке-хозяине или геномный сайт инсерции, один или несколько селектируемых маркеров (например, ген синтеза аминокислоты и ген, наделяющий устойчивостью к антибиотикам, таким как зеоцин, канамицин, G418 или гидромицин), ряд сайтов узнавания рестриктазами, соответствующую последовательность промотора и терминатора транскрипции, функционально связанных между собой. Используемый здесь термин "вектор" также относится к автономно реплицируемым нуклеотидным последовательностям, а также к нуклеотидным последовательностям, внедренным в геном. Обычным типом вектора является "плазмида", которая, как правило, является автономной молекулой двухцепочечной ДНК или двухцепочечной ДНК, которая легко может принимать дополнительную ДНК (чужеродную), которая может быть легко встроена в подходящую клетку-хозяина. Плазмидный вектор часто содержит кодирующую ДНК, промотер ДНК и один или несколько сайтов рестрикции для вставки чужеродных ДНК. Конкретно, термины "вектор" или "плазмида" относятся к переносчику, при помощи которого ДНК- или РНК-последовательности (например, чужеродный ген) могут быть внедрены в клетку-хозяина, чтобы в с трансформированной таким образом клетке-хозяине создать условия для экспрессии (например, транскрипции или трансляции) внедренной последовательности.
Используемый здесь термин "клетка-хозяин" относится к первичной клетке, трансформированной для продукции частично рекомбинантного белка, например, антитела по изобретению, а также к ее потомкам. Следует понимать, что не все потомки являются полностью идентичными родительской клетке (из-за искусственных или случайных мутаций или различных условий среды), однако, такие измененные потомки охватываются указанным выше термином при условии сохранения такой же функциональности, как и у оригинальных трансформированных клеток. Термин "линия клеток хозяина" относится к клеточной линии клеток-хозяина, используемой для экспрессии рекомбинантного гена с целью производства рекомбинантных полипептидов, таких как рекомбинантные антитела. Используемый здесь термин "клеточная линия" относится к установленному клону конкретного типа клеток, который приобрел способность к пролиферации в течение продолжительного периода времени. Такие клеточная линия или линия клеток хозяина может быть сохранена в виде клеточной культуры и/или культивироваться для продукции рекомбинантного полипептида.
Под "иммунным ответом" на композицию, например, иммуногенную композицию, определяемую здесь также как "иммуноген", содержащую антиген или эпитоп или вакцину, описанную здесь, понимается развитие в клетке-хозяине или субъекте клеточного и/или антител-опосредованного иммунного ответа на композицию или целевую вакцину. Обычно, такой ответ включает продукцию субъектом антител, В-клеток, Т-клеток, Т-хелперов, Т-супрессоров и/или цитотоксических Т-клеток, направленных конкретно против антигенов, включенных в композицию или целевую вакцину.
Под "защитным иммунным ответом" понимается такой терапевтический иммунный ответ, который развивается в ответ на полученный из патогена антиген, и который каким-то образом может защищать, улучшать, лечить или как минимум сдерживать симптомы заболевания, развитие побочных реакций или прогрессию. Конкретно, защитный иммунный ответ запускается с целью обеспечения более лучшего результата в случае естественного заражения инфекцией или токсином по сравнению с неиммунизированной популяцией.
Иммуноген или иммуногенная композиция обычно включают в себя антиген или эпитоп и носитель, а также может содержать адъювант. Термин "адъювант" относится к компоненту, который при введении с антигеном усиливает и/или переключает иммунный ответ на антиген, но при назначении в выделенном виде подобный иммунный ответ не вызывает. Адъюванты могут усиливать иммунный ответ при помощи различных механизмов, включая рекрутирование лимфоцитов, стимуляцию В- и/или Т-клеток и стимуляцию макрофагов. В качестве носителей, например, могут использоваться липосомы или катионные пептиды; в качестве адъювантов - алюминия фосфат или алюминия гидроксид, MF59 или CpG-олигонуклеотид.
Используемый здесь термин "выделенный" или "выделение" относится к нуклеиновой кислоте, антителу или другому компоненту, причем такие компоненты отделены от среды, в которой они обычно находятся и существуют "по существу в чистой форме". "Выделенный" не обязательно означает исключение искусственных или синтетических смесей с другими компонентами или материалами, или присутствия примесей, которые не мешают фундаментальной активности и могут присутствовать, например, из-за неполной очистки. В частности, под выделенными молекулами нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению также понимаются молекулы, синтезированные химическим путем.
По отношению к нуклеиновым кислотам по изобретению, термин "выделенная нуклеиновая кислота" используется следующим образом. Применяемый в отношении ДНК термин относится к молекуле ДНК, которая отделена от последовательностей, с которыми она природно ассоциирована в геноме организма, от которого она произошла. Например, "выделенная нуклеиновая кислота" может включать молекулу ДНК, внедренную в вектор, например, плазмиду или вирусный вектор, или внедренную в геномную ДНК прокариотической или эукариотической клетки или клетки-хозяина. В случае употребления термина по отношению к РНК, термин "выделенная нуклеиновая кислота" относится преимущественно к молекуле РНК, кодируемой выделенной молекулой ДНК, определенной выше. В качестве альтернативы, термин может относиться к молекуле РНК, которая в достаточной степени отделена от других нуклеиновых кислот, с которыми она ассоциирована в своем натуральном состоянии (например, в клетках или тканях). "Выделенная нуклеиновая кислота" (ДНК или РНК) может дополнительно представлять собой молекулу, полученную непосредственно биологическим или химическим путем и отделенную от других компонентов, присутствующих в процессе ее производства.
По отношению к полипептидам или белкам, например, антителам или эпитопам по изобретению, термин "выделенный" конкретно относится к компонентам, которые освобождены или по существу освобождены от материалов, с которыми они естественным образом связаны, например, с компонентами, присутствующим в естественной среде или среде, из которой они выделены (например, клеточной культуры), когда такой препарат получен путем рекомбинантной ДНК-технологии, реализуемой in vitro или in vivo. Выделенные компоненты могут быть объединены с растворителями или адъювантами и все еще могут быть выделенными - например, полипептиды ил полинуклеотиды могут быть смешаны с фармацевтически приемлемыми носителями или наполнителями для использования в диагностических или лечебных целях. В частности, выделенное антитело по изобретению отличается от препаратов поликлональной сыворотки, индуцированной против штаммов O25(a), поскольку оно представлено в изолированной и очищенной форме, предпочтительно представлено в виде препарата, содержащего выделенное антитело в качестве единственного активного начала (активной субстанции). Это не исключает, однако того, что выделенное антитело может представлять собой комбинированный препарат, содержащий ограниченное количество дополнительных хорошо определенных (выделенных) антител. Выделенные антитела могут быть также представлены на твердом, полужидком или жидком носителе, например, могут быть иммобилизированы на гранулах.
Используемые здесь термины "нейтрализующий" или "нейтрализация" в самом широком смысле относятся к любой молекуле, которая ингибирует патоген, такой как штамм E. coli с МЛУ, из объекта, подвергшегося инфицированию, или ингибирует производство патогеном высокоактивных белковых токсинов, которые способствуют распространению инфекции, или ингибирует токсины из поврежденных или целевых клеток субъекта, независимо от механизма реализации нейтрализации. Нейтрализация может быть достигнута, например, при помощи антитела, которое ингибирует связывание и/или взаимодействие эндотоксина штамма E. coli с МЛУ с его родственным рецептором на целевых клетках (например, связывание с TLR4-рецептором). Нейтрализация может дополнительно заключаться в выведении молекул эндотоксина из циркуляции путем Fc-опосредованных эффекторных функций.
Нейтрализующий потенциал обычно определяется при помощи стандартного метода, например, ЛАЛ-теста, где ингибирование биологической активности эндотоксина может быть измерено, например, колориметрически.
Под термином "штаммы Е.coli с МЛУ" следует понимать следующее: Инфекции, вызванные Е.coli c множественной лекарственной устойчивостью, в значительной степени обусловлены клональной линией ST131-O25b:H4, которая возникла только в последнее десятилетие и стала глобально присутствующим доминантным и устойчивым клоном. Под термином штаммы Е.coli с МЛУ, в частности, понимаются такие штаммы, которые проявляют устойчивость к трем и более классам антибиотиков, например, к следующим агентам/группам: пенициллины, цефалоспорины, аминогликозиды, тетрациклин, нитрофураны, триметоприм (и их комбинации), фосфомицин, хлорамфеникол, азтреонам, тигециклин.
Кислый капсульный полисахарид (КПС, CPS) - это толстый слизеобразный слой полисахаридов, который окружает большинство патогенных штаммов Е.coli. Удивительно, но специфический эпитоп, распознаваемый антителом по изобретению, будет конкретно находиться в обоих типах штаммов с МЛУ - капсулированном и некапсулированном.
Антитела, уничтожающие или нейтрализующие штаммы Е.coli с МЛУ, мешают патогенам или патогенным реакциям и, таким образом, ограничивают или защищают от инфекции и/или улучшают течение инфекционной болезни, или ингибируют патогенез штаммов Е.coli с МЛУ, в частности диссеминацию и репликацию в или пределах стерильных отделов/тканях хозяина. В этой связи, под термином "защитное антитело" понимаются антитела, которые отвечают за иммунитет против инфекционных агентов, который, в свою очередь, может быть активным и пассивным. В частности, защитные антитела, описанные здесь, могут быть использованы в терапевтических целях, например, для профилактики или терапии, для предупреждения, улучшения, лечения или как минимум частичной остановки симптомов заболевания, побочных эффектов или прогрессии вызванного патогеном заболевания. В частности, защитные антитела способны уничтожать или препятствовать репликации живых клеток Е.coli, например, путем индукции реакций SBA или ОРК, или удалять указанные бактериальные клетки или их молекулы ЛПС с тех участков тела, которые по медицинским показаниям должны быть стерильны (например, в случае заражения). В другом варианте, профилактически назначаемые антитела ингибируют процесс наступления инфекции (например, распространение Е.coli из нестерильных отделов тела в стерильные) при помощи одного из вышеуказанных или иных механизмов.
Используемый здесь термин "антиген O25b" относится к молекуле ЛПС О-антигена, структура которого приведена в примере 2 и на Фигуре 3 (а). Структура подобна, но с отличиями, структуре антигена O25(a). Под O25b здесь следует понимать серотип, близкий, но отличающийся от O25а (см. Фигуру 3 (а)).
Используемый здесь термин "антиген O25" относится к антигену, полученному из пентасахаридного повторяющегося звена, описанного Кеnnе et al. (Кеnnе L, Lindberg В, Madden JK, Lindberg AA, Gemski P Jr. Structural studies of the Escherichia coli O-antigen 25. Carbohydr Res. 28; 122(2):249-56, 1983). Перед открытием антигена O25b, термин O25 являлся синонимом для 025а, описанного здесь (см. Фигуру 3 (b)).
Термин "антиген O25а" понимается здесь как синоним для антигена O25.
Используемый здесь термин "рекомбинантный" означает "полученный в результате генной инженерии". Рекомбинантный хозяин, в частности, означает клетку, включающую экспрессирующий вектор или клонирующий вектор, или если она подверглась модификации при помощи генной инженерии, то клетку, включающую рекомбинантную нуклеотидную последовательность, например, чужеродную клетке-хозяину нуклеотидную последовательность. Рекомбинантный белок получают путем экспрессии соответствующей рекомбинантной нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. Используемый здесь термин "рекомбинантное антитело" относится к антителам, которые получены, экспрессированы, созданы или изолированы при помощи рекомбинантных методов, такие как (а) антитела животного происхождения (например, мышь), трансгенные или трансхромосомальные с включением генов иммуноглобулинов человека или приготовленные с помощью гибридом (б) антитела, изолированные из хозяйский клеток, которые были трансформированы так, чтобы экспрессировать антитело, например, из трансфектомы, (в) антитела, изолированные из рекомбинантных, комбинаторных человеческих библиотек антител, и (г) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или изолированные другими способами, предполагающими сплайсинг генов иммуноглобулинов человека на другие ДНК-последовательности. Такие рекомбинантные антитела охватывают антитела, созданные генно-инженерным путем, включая перестановки и мутации, возникающие, например, во время созревания антител.
Используемый здесь термин "специфичность" или "специфическое связывание" относится к реакции связывания, которая является определяющей в отношении родственного целевого лиганда в гетерогенной популяции молекул. Таким образом, при указанных условиях (например, условиях иммуноанализа), антитело, в частности, связывается со своей конкретной мишенью и не связывается в значительном количестве с другими молекулами, присутствующими в образце. Специфическое связывание означает, что связывание является селективным по отношению к мишени с определенными характеристиками, с высокой, средней или низкой аффинностью или авидностью, по выбору. Селективность связывания обычно достигается, когда константа связывания или позднего/динамического связывания отличается как минимум в 10 раз (то есть разница составляет как минимум 1 log), предпочтительно разница в 100 раз (то есть разница составляет как минимум 2 logs), и более, предпочтительно как минимум в 1000 раз (то есть, разница составляет как минимум 3 logs). Термины "специфичность" или "специфическое связывание" также применяются в отношении связывающих агентов, которые связываются с одними или несколькими молекулами, например, в отношении связывающих веществ, обладающих кросс-специфичностью.
Антитело по изобретению, в частности, характеризуется селективным связыванием только в отношении антигена O25b, или преимущественно связывается антигеном O25b, чем с антигеном O25а, или связывается с антигеном O25b с аффинностью, превышающей аффинность связывания с антигеном O25b поликлональной сыворотки, индуцированной против штаммов O25а. Таким образом, антитело по изобретению следует понимать как антитело с избирательным связыванием этих антигенов, например, с как минимум подобной аффинностью, или более высокой аффинностью, например, с разницей в аффинности и Кдисс. (константа диссоциации), составляющей как минимум 1 log, предпочтительно как минимум 2 logs, более предпочтительно как минимум 3 logs. Такие антитела, селективно связывающиеся с антигеном O25b, чем с антигеном O25а, предпочтительно используются с диагностическими или лечебными целями. Для некоторых диагностических целей антитело, в частности, используется для связывания антигена O25b, что поддается количественному определению.
Использование термина "имеющий такую же специфичность", "имеющий такой же сайт связывания" или "связывающий такой же эпитоп" означает, что эквивалентные моноклональные антитела обладают такой же или по существу такой же, то есть близкой иммунореактивностью (связыванием), и конкурируют за связывание с заранее выбранной целевой связывающей последовательностью. Относительная специфичность молекулы антитела в отношении конкретной мишени может быть соответственно определена при помощи конкурентных методов, например, как описано у Harlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988).
Используемый здесь термин "субъект" относится к теплокровным млекопитающим, в частности, к человеку. В частности, медицинское использование изобретения или соответствующего метода лечения относится к субъекту, нуждающемуся в профилактике или лечении болезненного состояния, вызванного штаммом Е.coli с МЛУ или страдающего от заболевания, в том числе, на ранних и поздних стадиях болезни. Термин "пациент" включает человека и других млекопитающих субъектов, которые получают профилактическое или терапевтическое лечение. Под термином "лечение" следует понимать оба метода лечения - профилактическое и терапевтическое.
Субъект, например, подвергается обработке с целью профилактики или терапии болезненных состояний, вызванных штаммом Е.coli с МЛУ. В частности, субъект подвергается лечению, когда существует риск инфекции или развития такого заболевания или рецидива заболевания, или когда субъект страдает от такой инфекции и/или заболевания, ассоциированного с такой инфекцией.
Более точно, термин "профилактика" относится к превентивным мерам, которые охватывают методы предупреждения развития дальнейшего развития болезни (блокирование патогенеза) или профилактические меры, уменьшающие риск развития патологического процесса.
Более точно, способ лечения, предупреждения или замедления болезненного состояния у субъекта, описанного выше, означает метод вмешательства в патогенез штамма Е.colic МЛУ, являющегося возбудителем заболевания.
Используемый здесь термин "по существу чистый" или "очищенный" относится к препарату, включающему как минимум 50% (весовое отношение), предпочтительно как минимум 60%, 70%, 80%, 90% или 95% соединения, такого как молекула нуклеиновой кислоты или антитело. Чистота измеряется методами, подходящими для соединения (например, хроматографическими методами, гель-электрофорезом, ВЭЖХ и т.п.).
Термин "терапевтически эффективное количество", используемое здесь наравне с терминами "эффективное количество" или "достаточное количество" соединения, например, антитела или иммуногена по настоящему изобретению, означает количество или активность, достаточные для того, чтобы при назначении субъекту вызывать у него полезные или желаемые результаты, включая клинические результаты, и, по существу, использование термина "эффективное количество" или его синонимов зависит от контекста, в котором они используются.
Эффективное количество означает такое количество соединения, которое является достаточным для лечения, предупреждения или ингибирования такого заболевания или расстройства. В контексте заболевания, терапевтически эффективное количество антитела, описанное здесь, в частности, используется для лечения, модуляции, ослабления, обратного развития или влияния на заболевание или состояние, преимущества от использования которого базируются на ингибировании патогенеза штамма Е.coli с МЛУ, например, ингибировании адгезии и колонизации слизистых поверхностей, неконтролируемой репликации внутри стерильных отделов организма, а также токсического воздействия бактериальных продуктов на хозяйские клетки.
Количество соединения, которое соответствует такому эффективному количеству, будет зависеть от различных факторов, таких как конкретный препарат или соединение, технология изготовления лекарственного средства, способ введения, тип заболевания или расстройства, характеристики субъекта или хозяина, которые будут подвергнуты лечению, но, однако, которые могут быть определены рутинным способом специалистом в данной области.
Антитело или иммуноген по настоящему изобретению могут быть использованы с профилактической целью для ингибирования инфекции, вызванной штаммом Е.coli с МЛУ, или в терапевтических целях для лечения инфекции, вызванной штаммом Е.coli с МЛУ, в частности, инфекций, вызванных штаммами Е.coli с МЛУ, которые известны своей устойчивостью, или которые, в случае конкретного субъекта, являются устойчивыми к лечению другими традиционными антибиотиками.
Терапевтически активное количество антитела, описанного здесь, назначаемое человеческому пациенту, который в нем нуждается, может, в частности, быть в диапазоне 0,5-500,0 мг, предпочтительно 1-400 мг, еще более предпочтительно до 300 мг, до 200 мг, до 100 мг или до 10 мг, хотя более высокие дозы могут быть назначены, например, для лечения острых состояний.
Кроме того, лечебный или профилактический режим для субъекта при помощи терапевтически активного количества антитела по настоящему изобретению может включать однократное введение, или в качестве альтернативы серию введений. Например, антитело может вводиться как минимум один раз за год, как минимум один раз за полгода или как минимум один раз в месяц. Тем не менее, в другом варианте исполнения изобретения, антитело может быть введено субъекту примерно в диапазоне от одного раза в неделю до ежедневного приема для данного режима лечения.
Продолжительность курса лечения зависит от разных факторов, таких как тяжесть заболевания, острое или хроническое течение заболевания, возраст пациента, концентрация и активность формата антитела. Следует также иметь в виду, что эффективная дозировка, используемая для лечения или профилактики, может быть повышена или снижена при использовании конкретного лечебного или профилактического режима. Изменения дозировки производятся на основании результатов стандартных диагностических методов, известных в данной области. В некоторых случаях, может потребоваться назначение антитела в течение более длительного периода.
Эффективное количество иммуногена, описанного здесь, которое назначается пациенту с риском развития болезненного состояния, связанного с штаммом Е.coli с МЛУ, может конкретно лежать в диапазоне 1-15 мг/кг на один прием.
Например, иммуноген может быть назначен в качестве первой дозы с последующей одной или более ревакцинирующими дозами, в течение определенных временных рамок, в соответствии с методикой иммунизации (вакцинации) по технологии первичного форсирования (prime-boost strategy) для индукции длительного эффективного иммунного ответа против инфекции, ассоциированной с штаммом Е.coli с МЛУ. Предпочтительный график иммунизации может включать назначение трех доз, например, первой дозы в первый день, сразу, второй дозы на 4-50 день и третьей дозы на 10-100 день, предпочтительно в первый день, 28 и 90 дни. В соответствии с предпочтительным ускоренным графиком, иммунизацию ведут в первый, 7 и 14 дни. Ускоренные графики могут быть использованы для профилактики, например, у пациентов, ждущих плановой операции. В качестве адъюванта обычно используются квасцы, например, фосфаты или гидроксиды алюминия.
Таким образом настоящий предмет изобретения базируется на раскрытии мышиного моноклонального антитела, высоко специфичного к O25b. Такие антитела обладают высоким потенциалом в качестве диагностического агента для идентификации штаммов с МЛУ, принадлежащих к линии SТ 131. Кроме того, в частности, после соответствующей гуманизации, эти моноклональные антитела подходят для использования в профилактике (например, для групп высокого риска) и лечения инфекций Е.coli, вызванных штаммами ST 131-O25b:H4.
Углеводные антигены O25b и O25 (025а) считались идентичными или очень близкими на том основании, что иммунная сыворотка против антигена O25 рутинно использовалась для диагностической идентификации штаммов Е.coli, экспрессирующих антигены O25b. Генетическая основа синтеза О-антигена в штаммах ST131 изучена не полностью, однако, специфический ген в rfb-кластере (кодирующий синтез О-антиген) лежит в основе идентификации штаммов O25b методами на базе ПЦР. Кроме того, до сегодняшнего дня отсутствуют данные, говорящие о различии между антигенами O25(a) и O25b.
Удивительно, но антитело по изобретению может, конкретно, связывать антиген O25b и, конкретно, различать между собой антигены O25b и O25а.
Для того, чтобы подтвердить генетическое различие между антигенами O25b и O25а, экспрессируемыми штаммами Е.coli, из коммерчески доступного штамма No.81009 (Szijarto et al., FEMS Microbiol Lett, 2012, 332:131-6) при помощи метода секвенирования сегментов ДНК под названием "блуждающая затравка" или "праймер-опосредованной прогулка", начинающегося с олигонуклеотидов, специфичных к фланкирующим генам: grid и galF, был секвенирован /fb-генный кластер, кодирующий синтез О-антигена. Длина конечного контига rfb-оперона состоит из 11,300 п.н., и он обладает лишь частичной гомологичностью к контигу, кодирующему ферменты синтеза антигена O25 (регистрация в НЦБИ/NCBI под номером GU014554). Оказалось, что сегмент, длиной 2043 п.н., находящийся на 3'-конце O25b rfb-оперона, не является гомологичным соответствующей области в O25 rfb-оперона, где данный сегмент заменен последовательностью длиной 6267 п. н., кодирующей синтез и транспорт фукозы.
Структура повторяющего звена (ПЗ) О-специфической полисахаридной цепи липополисахарида (ЛПС), выделенного из штамма ST 131 Е.coli, была детально изучена в очищенной фракции, собранной из олигосахаридов кора с заменой одного повторяющегося звена (ПЗ). ПЗ молекулы ЛПС из штамма ST 131 является О-ацетилированным пентасахаридом со структурой, представленной на Фиг. 3.
Фактически, структура ПЗ О-ПС штамма ST 131 отличается от ПЗ ЛПС штамма O25, описанного Кеnnе et al. (Kеnnе, Lindberg et al., Carbohydr Res. 1983 Oct 28; 122(2):249-56) и, пo имеющимся у авторов настоящего изобретения сведениям, является новым О-серотипом среди липополисахаридов Е.coli (Stenutz et al. FEMS Microbiol Rev. 2006 May; 30(3):382-403. Review). Кроме того, ранее у  V. et al., в рамках проведения генетических анализов, были описаны предварительные результаты, полученные при помощи MALDI-TOF масс-спектрометрии и анализа состава (анализ cахаров и метилации) полисахаридов кора, выделенных из ЛПС штамма ST131, поддерживаемого штамма типа K-12, (Szijarto et al, FEMS Microbiol Lett, 2012, 332:131-6). Было показано, что ЛПС из штамма LPS ST131 состоит из двух основных коровых олигосахаридных (ОС) гликоформ. Тип гликоформы зависит от присутствия или отсутствия О-специфического полисахарида (ПС). Превалирующей гликоформой незамещенного кора ПС является усеченная версия олигосахаридов кора K-12, которая лишена→7)-α-Нерр-(1→6)-α-Сlср-дисахарида. Присутствие этого дисахарида обуславливает разницу между О-ПС замещенным и незамещенным кором ОС.
В соответствии со специфическим аспектом изобретения, настоящее изобретение представляет антитело, специфически связывающееся с эпитопом, специфическим O25b, например, с таким же эпитопом, с которым связывается антитело 8D5-1G10 или любое из антител, обозначенных как 6D1-1В2 или 8A1-1G8, или 8D10-C8, причем термин включает варианты, по существу связывающиеся с таким же эпитопом; или включающие такой же сайт связывания, что и антитело 8D5-1G10 или любое из антител, обозначенных как 6D1-1B2 или 8A1-1G8, или 8D10-C8, причем термин включает также варианты, содержащие такой же самый сайт связывания. Антитела, обозначенные как 6D1-1В2, 8A1-1G8, 8D5-1G10, будут, в частности, содержать сайт связывания, специфически дифференцирующий между собой антигены O25b и O25а, и связывающиеся только с антигеном O25b. Антитело, обозначенное как 8D10-С8 будет, в частности, включать кросс-специфический сайт связывания, связывающийся как с антигеном O25b, так и с антигеном O25а, предпочтительно связывающийся с антигеном O25b, чем с антигеном O25а.
Если в отношении антител заявляется, что они "связываются с одним и тем же эпитопом" или "содержат один и тот же сайт связывания" или обладают "по существу одними и теми же связывающими" характеристиками, это означает, что они являются перекрестно-конкурирующими антителами, то есть только одно антитело может связываться с эпитопом в данный момент времени, то есть, одно антитело препятствует связыванию или модулирующему эффекту другого антитела.
Используемый здесь термин "конкурирующий" или "перекрестно конкурирующий" в отношении антитела означает, что если первое антитело или его антиген-связывающий участок конкурирует за связывание со своим эпитопом со вторым антителом или его антигенсвязывающим участком, то связывание первого эпитопа с когнатным ему эпитопом снижается детектируемым образом в присутствии второго антитела по сравнению со связыванием первого антитела в отсутствии второго антитела.
Противоположное (утверждение), то есть связывание второго антитела со своим эпитопом также детектируемым образом снижается в присутствии первого антитела, может быть верно, но необязательно. То есть, первое антитело может ингибировать связывание второго антитела со своим эпитопом, но второе антитело может не ингибировать связывание первого антитела со своим соответствующим эпитопом. Тем не менее, если каждое антитело детектируемым образом ингибирует связывание другого антитела со своим когнатным эпитопом, либо до такой же, более высокой, либо меньшей степени, говорят, что антитела "перекрестно конкурируют" друг с другом за связывание соответствующего(их) им эпитопа(ов). Настоящее изобретение охватывает применение как конкурирующих, так и перекрестно конкурирующих антител.
Термин "конкурентность" означает здесь величину относительного ингибирования, превышающую примерно 30%, что определяется конкурентным методом ИФА, например, как это описано в разделе Примеры. Может быть желательным установление более высокого порога относительного ингибирования в качестве критерия для подходящего уровня конкурирования, особенно в контексте, когда, например, анализ на конкурентность используется для отбора или скрининга новых антител, направленных на предполагаемую функцию связывания O25b. Таким образом, например, возможно установления критерия для конкурентного связывания, где относительное ингибирование будет определяться как минимум 40%, или как минимум 50%, как минимум 60%, как минимум 70%, как минимум 80%, как минимум 90% или даже минимум 100%, для того, чтобы можно было высказать предположение о достаточной конкурентности антитела.
Более точно, здесь предлагается антитело, содержащее вариабельную область одного из антител, обозначенных как 6D1-1B2, 8A1-1G8, 8D5-1G10, или 8D10-С8, в частности, как минимум с одной из CDR-последовательностей, предпочтительно как минимум с 2, как минимум с 3, как минимум с 4, как минимум 5 или как минимум с 6 CDR-последовательностями антитела, отобранного из группы, состоящей из антител 6D1-1B2, 8A1-1G8, 8D5-1G10 и 8D10-C8, или их CDR-вариантов, которые являются функционально активными вариантами. Более конкретно, здесь предлагается антитело, обозначенное как 6D1-1B2, 8A1-1G8, 8D5-1G10, или 8D10-C8.
Более точно, антитело, обозначенное как 8D5-1G10 или 8D10-C8, или их любые функционально активные варианты, могут быть произведены с использованием депонированного материала или при помощи нуклеотидной последовательности их содержащей, например, из одной из плазмид и/или депонированных клеток-хозяина.
В соответствии с частным вариантом осуществления изобретения, антитело 8D5-1G10 или его функционально эквивалентный вариант могут быть получены из антитела, включающего вариабельную область, закодированную любой плазмидой, внедренной в депонированные клетки-хозяина под номерами DSM 26763 и/или DSM 26762; например, используя частичную или (точечную) мутированную CDR-последовательность из депонированного материала для производства специфического антитела или его функционально активного варианта.
В соответствии с другим частным вариантом осуществления изобретения, антитело 8D5-1G10 или его функционально активный вариант могут быть получены из вариабельной области антитела или с использованием данной области, произведенной клеткой-хозяином, депонированной под номером DSM 26763 и/или DSM 26762, например, используя частичную последовательность, например, одну или несколько CDR-последовательностей, полученных из депонированного материала для производства специфического антитела или его функционально активного варианта.
Более точно, вариант антитела 6D1-1B2 или 8A1-1G8 является CDR-функционально активным вариантом антитела 8D5-1G10, например, с частичной альтерацией в как минимум одной из CDR-последовательностей.
В соответствии с частным вариантом осуществления изобретения, антитело 8D10-C8 или его функционально активный вариант могут быть получены из антитела, содержащего вариабельную область, закодированную на любой плазмиде, внедренной в клетку-хозяина, депонированную под номером DSM 28171 и/или DSM 28172, например, используя частично или (точечно) мутированную CDR-последовательности, полученные из депонированного материала для производства специфического антитела или его функционально активного варианта.
В соответствии с другим частным вариантом осуществления изобретения, антитело 8D10-C8 или его функционально активный вариант могут быть получены из вариабельной области антитела или с использованием данной области, произведенных клеткой-хозяином, депонированной под номерами DSM 28171 и/или DSM 28172, например, используя, частичную последовательность, например, одну или несколько CDR-последовательностей из депонированного материала для производства специфического антитела или его функционально активного варианта.
В определенных вариантах, настоящее изобретение относится к такому варианту антител, предпочтительно моноклональных антител, более предпочтительно мышиных, гуманизированных или человеческих антител, которые включают тяжелую и легкую цепи, где любая из тяжелых цепей или вариабельная область VH или соответствующие CDR-области содержат аминокислотную последовательность, полученную из соответствующей плазмиды, и/или из депонированной клетки-хозяина.
В определенных вариантах, настоящее изобретение относится к такому варианту антител, предпочтительно моноклональных антител, более предпочтительно мышиных, гуманизированных или человеческих антител, которые включают тяжелую и легкую цепи, где любая из тяжелых цепей или вариабельная область VL или соответствующие CDR-области содержат аминокислотную последовательность, полученную из соответствующей плазмиды и/или из депонированной клетки-хозяина.
В определенных вариантах, настоящее изобретение относится к такому варианту антител, предпочтительно моноклональных антител, более предпочтительно мышиных, гуманизированных или человеческих антител, которые включают тяжелую и легкую цепи, где любая из тяжелых цепей или вариабельные области VH/VL или соответствующие CDR-области содержат аминокислотную последовательность, полученную из депонированных соответствующей плазмиды и/или из клеток-хозяина.
В определенных вариантах, настоящее изобретение также относится к такому варианту антител, включающим соответствующие последовательности связывания, такие как и/или CDR-последовательности, полученные из уложенного на хранение материала, для которого связывающие последовательности (например, любая CDR-последовательность) включают последовательности, которые имеют как минимум 60%, как минимум 70%, или как минимум 80%, или как минимум 90%, или как минимум 95%, или как минимум 99% степень идентичности аминокислотной последовательности, полученной из депонированного материала, при этом, такой вариант является функционально активным вариантом.
В соответствии с описанным здесь, один вариант осуществления настоящего изобретения относится к молекулам антитела, характеризующимся, например, по их способности конкурировать с моноклональными антителами 8D5-1G10 или 8D10-C8 относительно связывания с O25b-антигеном. Любое из антител 6D1-1B2, 8A1-1G8 или 8D5-1G10, то есть антител, являющихся мышиными антителами типа IgG3, и антитело 8D10-C8, являющееся мышиным антителом типа IgG2b, являются антителами, которые несут легкие цепи каппа, которые были выделены и охарактеризованы авторами настоящего изобретения. Вариабельные области доменов антител 8D5-1G10 или 8D10-C8 экспрессируются депонированным материалом, как описано в настоящем изобретении. Таким образом, связывающие характеристики определяются легкой и тяжелыми цепями, а VL/VH-домены антитела 8D5-1G10 или 8D10-C8 полностью раскрыты в настоящем изобретении, что дает возможность их использования в качестве родительского антитела или для сравнения с функционально активными вариантами или конкурирующими антителами по настоящему изобретению.
Зрелый вариабельный домен тяжелой цепи 8D5-1G10 (8D5-1G10-HC) производится, например, с использованием клетки-хозяина DSM 26762 или соответствующей информационной последовательности, закодированной на плазмиде.
Зрелый вариабельный домен легкой цепи 8D5-1G10 (8D5-1G10-LC), например, производится, с использованием клетки-хозяина DSM 26763 или соответствующей информационной последовательности, закодированной на плазмиде.
Зрелый вариабельный домен тяжелой цепи 8D10-C8 (8D10-C8-HC) производится, например, с использованием клетки-хозяина DSM 28172 или соответствующей информационной последовательности, закодированной на плазмиде.
Зрелый вариабельный домен легкой цепи 8D10-C8 (8D10-C8-LC) производится, например, с использованием клетки-хозяина DSM 28171 или соответствующей информационной последовательности, закодированной на плазмиде.
Неодинаковая аффинность связывания, то есть предпочтительное связывание с антигеном O25b, чем с другими антигенами Е. соli, например, любыми углеводными антигенами, кроме антигена O25, или любыми антигенами кора, которая предпочтительно как минимум в 10 раз высшая, например, 10-кратная разница в Кдисс., предпочтительно как минимум 100-кратная, более предпочтительно как минимум 1000-кратная.
Неодинаковая аффинность связывания, то есть преимущественное связывание с антигеном O25b, которая, в частности, как минимум в 5 раз, как минимум в 6 раз, как минимум в 7 раз, как минимум в 8 раз, более предпочтительно как минимум в 9 раз или как минимум в 10 раз высшая, по сравнению с коммерческим типом сыворотки, таким как Е.coli O25-типирующая антисыворотка с высоким титром из Statens Serum Institut (No.81369).
Неодинаковая аффинность связывания, то есть преимущественное связывание с антигеном O25b, чем с антигеном O25а, которая, в частности, как минимум в 1,5 раза, или как минимум в 2 раза, или как минимум в 3 раза, или как минимум в 4 раза, или как минимум в 5 раз, или как минимум в 6 раз, или как минимум в 7 раз, или как минимум в 8 раз, или как минимум в 9 раз, или как минимум в 10 раз высшая.
D
-7
-8
-9
-10
Предпочтительные антитела по настоящему изобретению связываются с любыми указанными индивидуальными антителами, в частности с антигеном O25b, с высокой аффинностью, в частности с высокой и/или низкой скоростью диссоциации или высокой авидностью связывания. Аффинность связывания обычно характеризуется в терминах концентрации антитела, при которой будет занята половина антиген-связывающих сайтов, и известна как константа диссоциации (Кдисс., Kd или K). Обычно, высокая аффинность связывания характеризуется Кдисс.<10М, в некоторых случаях, например, с терапевтическими целями, принято использовать более высокую аффинность, характеризующуюся, например, Кдисс.<10 М, предпочтительно Кдисс.<10 М, еще более предпочтительно Кдисс.<10 М.
-6
-7
Тем не менее, в особо предпочтительном варианте настоящего изобретения, средняя аффинность связывания с антигенам означает аффинность, например, с Кдисс. менее 10 и до 10 М, например, в случае связывания с как минимум двумя антигенами.
При необходимости, в соответствии с настоящим изобретением могут быть представлены связывающие вещества со средней аффинностью, предпочтительно в сочетании с процессом созревания аффинности.
Созревание аффинности - это процесс, при котором производятся антитела с повышенным сродством к целевому антигену. Внесение изменений в структуру антител, в том числе, при помощи мутагенеза в отношении аминокислот или путем соматической рекомбинации последовательностей в сегментах гена иммуноглобулина, вариантах сайта связывания с антигеном, позволяет получить и отобрать антитела с повышенной аффинностью. Аффинность зрелых антител может на насколько порядков log превышать аффинность родительского антитела. Процессу созревания аффинности могут подвергаться как одиночные родительские антитела, так и пул антител с близкой аффинностью связывания к антигену-мишени, рассматриваемых в качестве родительских структур, которые могут подвергнуться изменениям с целью получения одиночных зрелых антител или зрелого пула антител, соответственно.
-7
-8
-9
-10
-11
Предпочтительная аффинность зрелого варианта антитела по изобретению превышает аффинность связывания (родительского антитела) как минимум в 10 раз, предпочтительно как минимум в 100 раз. Созревание аффинности может быть использовано в ходе селекционных кампаний, использующих соответствующие библиотеки родительских молекул, либо в отношении антител, имеющих среднюю аффинность связывания, для получения антитела по изобретению, имеющему специфические мишень-связывающие свойства, а именно аффинность связывания с Кдисс.<10 М. В ином варианте, аффинность может быть повышена еще сильнее путем созревания аффинности антитела в соответствии с изобретением для получения более высоких значений, соответствующих Кдисс. менее 10 М или менее 10 М, предпочтительно менее 10 М или даже менее 10 М, более предпочтительно в диапазоне пикомолей.
Вариант осуществления настоящего изобретения относится к антителу по изобретению, характеризующемуся специфической антибактериальной функциональной активностью, а именно комплемент-обусловленным бактериальным киллингом и опсон-фагоцитарным поглощением и киллингом.
Фагоцитарные эффекторные клетки могут быть активированы через иной путь активации при помощи активации системы комплемента. Антитела, которые связываются с поверхностью антигенов микроорганизмов, привлекают первый компонент системы комплемента при помощи своей Fc-области и инициируют активацию "классической" системы комплемента. Это приводит к стимуляции фагоцитарных эффекторных клеток, которые, в конечном итоге, убивают бактерию-мишень при помощи комплемента и антителозависимых механизмов защиты (КЗЦ, CDC).
В соответствии с конкретным вариантом осуществления изобретения, антитело по изобретению обладает цитотоксической активностью в присутствии иммунных эффекторных клеток, что может быть измерено при помощи стандартных методов SBA или ОРК. Цитотоксическая активность, определенная при помощи методов SBA или ОРК, может быть показана для антитела по настоящему изобретению в том случае, если существует значительное увеличение бактерицидной активности (в %) по сравнению с контролем. Бактерицидная активность, измеренная при помощи методов SBA или ОРК, предпочтительно выражается в абсолютных % увеличения активности, где данный показатель предпочтительно выше чем 5%, более предпочтительно выше чем 10%, еще более предпочтительно выше чем 20%, 30%, 40% или 50%.
Антитела по настоящему изобретению могут быть идентифицированы или получены путем метода гибридом. При таком способе мышь или другое подходящее животное-хозяин, например, хомячок, иммунизируется для стимуляции продукции лимфоцитов, которые производят или способны производить антитела, которые будут, в частности, связывать белок, использованный для иммунизации. Альтернативный вариант предусматривает, что лимфоциты могут быть иммунизированы in vitro. Лимфоциты сливают с клетками миеломы в присутствии подходящего фактора, вызывающего слияние клеток, такого как полиэтиленгликоль, в форму гибридомной клетки.
Культурную среду, в которой растут гибридомные клетки, анализируют на продукцию моноклональных антител, направленных против антигена. Предпочтительно, связывающая специфичность антител, произведенных гибридомой, определяется иммунопреципитацией или in vitro методами оценки связывания, например, радиоиммунным методом (РИМ, RIA) или методом ИФА.
Например, антитела по настоящему изобретению могут быть получены из первичных (родительских) антител, полученных, например, путем иммунизации мышей некапсулированным мутантом репрезентативного ST131-O25b:H4 штамма No.81009 (например, 81009Δkps::kan), в котором kps-кластер (кодирующий синтез капсулы) заменен кассетой, кодирующей устойчивость к канамицину. Образцы сыворотки, полученные от мышей, затем подвергаются анализу, и селезенки мышей, показывающие повышенный титр антител типа IgG против O25b-антигена (в ИФА и вестернблоттинге), могут быть использованы для генерации гибридомы. Затем, при помощи субклонирования могут быть получены клоны гибридомы, которые секретируют антитела, специфические в отношении антигенов O25b, а также связывающиеся с поверхностью живых диких штаммов Е.coli, экспрессирующих антигены O25b. Затем, такие моноклональные антитела могут быть очищены от супернатантов гибридомы для последующего тестирования их специфического связывания с антигеном O25b и, возможно, их дифференциальной аффинности связывания, а именно предпочтительного связывания с антигеном O25b, чем с антигеном O25а, и инжиниринга антител для диагностических и терапевтических целей.
В некоторых случаях, при скрининге против отдельных антигенов возникают дифференциально связывающиеся антитела, называемые здесь также как селективные антитела. Для повышения вероятности выделения дифференциально связывающихся клонов можно воспользоваться множественным селекционным давлением при повторяющемся скрининге против различных антигенов. Альтернативным способом является специальная стратегия отбора моноклональных антител, использующая O25b- и O25а-компоненты или другие антигены Е.coli.
Рекомбинантный антиген (антигены) может быть использован для отбора антител из библиотек антител, например, библиотеки антител посредством дрожжевого дисплея.
В любом случае, селективное связывание может быть дополнительно улучшено путем оптимизации антитела методами, хорошо известными в данной области. Например, некоторые области в вариабельных областях иммуноглобулиновых цепей, описанных здесь, могут быть предметом одной или нескольких стратегий оптимизации, в том числе, методом комбинирования легкой цепи, сайт-специфическим введением мутаций, слиянием CDR и методом прямого мутагенеза выбранных CDR- и/или каркасных областей.
Методы скрининга для идентификации антител с желаемыми связывающими свойствами могут быть реализованы с помощью технологий дисплеев (с использованием фага, бактерии, дрожжей или клеток млекопитающих). Реактивность может быть оценена при помощи ИФА, вестернблоттингом или методом окрашивания поверхности с проточной цитометрией, например, с использованием стандартных методов.
После того, как будут идентифицированы дифференциально связывающиеся антитела с желаемыми свойствами, могут быть определены доминантный эпитоп или эпитопы, распознаваемые антителами. Методы картирования эпитопов являются хорошо известными в данной области и раскрыты, например, в Epitope Mapping: A Practical Approach, Westwood and Hay, eds., Oxford University Press, 2001.
Картирование эпитопа касается идентификации эпитопа, с которым связывается антитело. Существует много способов, хорошо известных в данной области, для определения местоположения эпитопов на белках-антигенах, в том числе, при помощи кристаллографического анализа комплекса антитело-антиген, конкурентного метода анализа, экспрессионного анализа фрагментов гена и методов анализа, базирующихся на синтетических пептидах. Термин антитело, которое "связывается с таким же эпитопом" относится здесь к антителу, понимаемому следующим образом. Когда два антитела распознают эпитопы, являющиеся идентичными или стерически перекрывающимися, о них говорят, что они связываются с одними и теми же или по существу одними и теми же эпитопами. Широко используемыми методами для определения того, если два антитела связываются с идентичными или стерически перекрывающимися эпитопами, являются методы конкурентного анализа, которые могут использоваться для обнаружения любого показателя в любой форме с использованием либо меченого антигена, либо меченого антитела. Как правило, антиген иммобилизуют в 96-луночный планшет, а способность немеченых антител блокировать связывание меченых антител измеряют с использованием радиоактивных или ферментных меток.
После того, как идентифицированы антитела с желаемыми связывающими свойствами, такие антитела, в том числе, фрагменты антител, могут быть произведены методами, хорошо известными в данной области, в том числе, например, гибридомными или рекомбинантными ДНК-технологиями.
Рекомбинантные моноклональные антитела могут быть, например, произведены рекомбинантной клеткой-хозяином, в которую в виде хорошо известного экспрессирующего рекомбинантного вектора внедрили изолированную заранее ДНК вместе с кодирующими последовательностями для экспрессии белка, например, в виде плазмиды по изобретению или экспрессирующей кассеты (экспрессирующих кассет), включающих нуклеотидные последовательности, кодирующие последовательности антитела. В качестве рекомбинантной клетки-хозяина могут выступать прокариотические и эукариотические клетки-хозяева, такие как описаны ранее.
В соответствии с конкретным вариантом, настоящее изобретение относится к нуклеотидной последовательности, которая может быть использована для генетических манипуляций с целью гуманизирования антитела или изменения его аффинности, или других характеристик антитела. Например, константная область может быть сконструирована таким образом, чтобы как можно полнее напоминать человеческие константные области, чтобы избежать иммунного ответа в случае использования антитела для клинических испытаний или для лечения человека. Может быть желательным подвергнуть последовательность антитела генетической модификации, чтобы получить более высокую аффинность к целевому антигену O25b и более высокую эффективность против штаммов Е.coli с МЛУ. Для специалиста в данной области является очевидным, что одно или несколько изменений, внесенных в пол и нуклеотидную последовательность, по-прежнему позволяют создать антитело, обладающее аффинностью связывания с целевым антигеном O25b.
Обычно, различные методы, используемые для производства молекул антитела, хорошо известны. Патент США No.6331415 (Cabilly et al.), например, описывает метод рекомбинантного синтеза антител, тяжелая и легкая цепи которых экспрессируются одновременно из одного вектора или разных векторов в одной клетке. Wibbenmeyer et al., (1999, Biochim Biophys Acta 1430(2):191-202) и Lee and Kwak (2003, J. Biotechnology 101:189-198) описывают производство моноклональных антител из отдельно синтезируемых легкой и тяжелой цепей при помощи плазмид, экспрессированных из различных культур Е.coli. Разнообразные другие технологии, касающиеся производства антител, представлены, например, у Harlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Lab или at или у Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988).
По желанию, антитело по изобретению, например, 8D5-1G10 или 8D10-С8, или соответствующий сайт связывания или CDR-область, могут быть секвенированы, и полинуклеотидная последовательность или вариант последовательности затем могут быть клонированы в вектор для экспрессии или культивирования. Последовательность, кодирующая антитело, может быть сохранена в векторе в клетке-хозяине, размноженная культура которого затем может быть сохранена в замороженном виде для использования в будущем. Производство рекомбинантных моноклональных антител в культуре клеток может быть осуществлена путем клонирования генов антитела из В-клеток с помощью известных в данной области методов.
В другом варианте, изобретение предлагает выделенную нуклеиновую кислоту, включающую в себя последовательность, кодирующую рекомбинантное антитело по настоящему изобретению.
В другом варианте, изобретение предлагает выделенную нуклеиновую кислоту, включающую в себя последовательность, кодирующую производство рекомбинантного эпитопа по настоящему изобретению или молекулу, включающую такой эпитоп по изобретению. Однако, эпитоп по изобретению также может быть получен синтетическим путем, например, при помощи любых методов синтеза, хорошо известных в данной области.
Нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или эпитоп, может обладать любыми подходящими характеристиками и включать любые подходящие черты или их комбинации. Так, например, нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или эпитоп, может быть в форме ДНК, РНК, или их гибрида, и может включать не встречающиеся в природе основания или модифицированный каркас, например, фософоротиоатный каркас, что улучшает стабильность нуклеиновой кислоты, или оба перечисленных варианта. Нуклеиновая кислота преимущественно может быть включена в экспрессирующую кассету, вектор или плазмиду по изобретению, включающие дополнительные функции, которые способствуют желаемой экспрессии, репликации и/или отбору целевой клетки (клеток). Примеры таких функций включают компоненты репликационного ориджина, переключателя гена, промотора, энхансера, последовательности полиаденилирования и терминации и т.п., многочисленные примеры которых хорошо известны.
Настоящее изобретение также относится к рекомбинантному ДНК-конструкту, включающему одну или несколько нуклеотидных последовательностей, описанных здесь. Эти рекомбинантные конструкты используются в соединении с векторами, такими как плазмида, фагемида, фаг или вирусный вектор, в которые вставлена молекула ДНК, кодирующая любое антитело по изобретению.
Моноклональные антитела производятся при помощи любого метода для производства молекул антител в перевиваемой культуре клеток. Примеры подходящих методов для получения моноклональных антител включают гибридомные методы по Kohler et al. (1975, Nature 256: 495-497) и метод получения В-клеточной гибридомы человека (Kozbor, 1984, J. Immunol. 133: 3001; and Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications pp 51-63 (Marcel Dekker, Inc., 1987)).
Кроме того, изобретение относится к фармацевтическим композициям, которые включают антитело или иммуноген, описанные здесь, и фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество. Эти фармацевтические композиции могут быть назначены в соответствии с настоящим изобретением в виде болюсной инъекции или инфузии или медленной инфузии. Под фармацетивчески приемлемыми носителями понимаются такие, которые хорошо известны в настоящей области.
Фармацетивчески приемлемые носители обычно включают любой из подходящих растворителей, дисперсионной среды, связующих, антибактериальных и противогрибковых агентов, изотонических и задерживающих всасывание агентов и т.п., которые являются физиологически совместимыми с антителом или соответствующей композицией или комбинацией, предлагаемыми по изобретению. Дополнительные примеры фармацевтически приемлемых носителей включают стерильную воду, физиологический раствор, физиологический раствор, забуференный фосфатом, декстрозу, этанол и т.п., а также комбинации любых из них.
В одном таком варианте, антитело может быть скомбинировано с одним или несколькими носителями, соответствующими желаемому пути введения, например, антитела могут быть смешаны с любым из следующих веществ: лактоза, сахароза, крахмал, сложные эфиры целлюлозы и алкановых кислот, стеариновая кислота, тальк, стеарат магния, оксид магния, натриевые и кальциевые соли фосфорной или серной кислот, камедь, желатин, натрия альгинат, поливинилпирролидон, поливиниловый спирт, и при желании могут быть дополнительно таблетированы или закапсулированы для традиционного пути введения. В другом варианте, антитело может быть растворено в физиологическом растворе, воде, полиэтиленгликоле, коллоидных растворах карбоксиметилцеллюлозы, этаноле, масле (кукурузном, арахисовом, хлопковом или кунжутном), трагакантовой камеди и/или различных буферах. Являются хорошо известными в данной области также и другие носители, адъюванты и способы введения. Носитель может включать материал с контролируемым высвобождением, такой как глицерил моностерат или глицерил дистеарат, или воск, или другие материалы, хорошо известные в данной области.
Дополнительные фармацевтически приемлемые носители, хорошо известные в данной области, описаны, например, в REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES. К жидким лекарственным формам относят растворы, эмульсии или суспензии, которые могут включать вспомогательные вещества, такие как суспендирующие агенты, солюбилизаторы, ПАВ, консерванты и хелатирующие агенты.
Под фармацевтическими композициями понимаются такие, в которые введены антитело или иммуноген по настоящему изобретению, и рецептура которых включает один или несколько терапевтических агентов. Стабильные рецептуры антитела или иммуногена по изобретению готовят для хранения путем смешивания упомянутого иммуноглобулина, имеющего желаемую степень чистоты, вместе с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, вспомогательными веществами или стабилизаторами, в лиофилизированной форме или в виде водных растворов. Рецептуры для последующего введения in vivo являются, в частности, стерильными, предпочтительно в форме стерильных водных растворов. Это легко достигается путем фильтрации через стерильные мембранные фильтры или другими методами. Антитело и другие терапевтически активные агенты, раскрытые здесь, могут быть также созданы в виде иммунолипосом и/или заключены в микрокапсулы.
Введение фармацевтической композиции, включающей антитело или иммуноген по настоящему изобретению, может быть осуществлено различными путями, в том числе, перорально, подкожно, внутривенно, интраназально, интраотакально, трансдермально, через слизистую оболочку (мукозально) или местно, например, в виде гелей, бальзамов, лосьонов, кремов и т.д., внутрибрюшинно, внутримышечно, внутрилегочно, например, при помощи ингаляционных технологий или систем для пульмональной доставки, вагинально, парентерально, ректально или интраокулярно.
Варианты рецептур для парентерального введения включают такие, которые подходят для подкожного, внутримышечного или внутривенного введения, например, в виде стерильных растворов, эмульсий или суспензий.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, антитело или иммуноген по изобретению являются единственным терапевтическим агентом, который вводится субъекту, например, для лечебной или профилактической монотерапии.
Другая возможность предусматривает, что антитело или иммуноген по изобретению назначаются в комбинации с одним или несколькими терапевтическими или профилактическими агентами, включая, но не ограничиваясь, например, антибиотиками, стероидами и нестероидными ингибиторами воспаления и/или терапией на базе другого антитела, например, при использовании антибактериальных или противовоспалительных агентов.
Комбинированная терапия используется, в частности, в качестве стандартного режима при лечении инфекции, вызванной штаммом Е.coli с МЛУ, и может включать антибиотики, например, тигециклин, линезолид, метициллин и/или ванкомицин.
В комбинированной терапии, антитело может быть назначено в виде смеси или сопутствующим образом в сочетании с одним или несколькими терапевтическим режимами, например, либо до, одновременно или после сопутствующей терапии.
Профилактическое введение иммуногенов в некоторых случаях может быть осуществлено в виде вакцины, включающей иммуноген по настоящему изобретению, то есть моновалентной вакцины. Однако, может быть использована и мультивалентная вакцина, включающая различные иммуногены для индукции иммунного ответа против одинаковых или различных антигенов-мишеней.
Биологические свойства антитела, иммуногена или соответствующих фармацевтических препаратов по изобретению могут быть охарактеризованы в экспериментах ex vivo на клетках, тканях или целом организме. Как это известно в данной области, лекарства часто тестируются in vivo на животных, включая, но не ограничиваясь такими животными, как мыши, крысы, кролики, собаки, кошки, свиньи и мартышки, для оценки эффективности лекарства против заболевания или на модели заболевания, или для измерения фармакокинетики, фармакодинамики, токсичности и других свойств. Животные могут быть использованы и для моделирования заболеваний. Терапевтические агенты часто тестируются на мышах, включая, но не ограничиваясь такими линиями, как nude, SCID, xenograft или трансгеннные (включая knockins и knockouts). Такие эксперименты могут предоставить значимые данные для определения потенциала антитела, используемого для терапии или профилактики, с соответствующим периодом полувыведения, эффекторной функции, (крос-) нейтрализующей активностью и/или иммунным ответом при пассивной или активной иммунотерапии. Для тестирования может быть использован любой организм, предпочтительно, из класса млекопитающих. Например, из-за их близкого генетического сходства к человеку, для терапевтических моделей могут быть использованы приматы и мартышки, и на них могут быть протестированы эффективность, токсичность, фармакокинетика, фармакодинамика, период полураспада или другие свойства агента или композиции, введенных субъекту. Тесты на людях, в конечном итоге, необходимы для регистрации агентов в качестве лекарств, и такие эксперименты безусловно предполагаются (в будущем). Поэтому, антитело, иммуноген или соответствующие фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть протестированы на людях для определения их терапевтической или профилактической эффективности, токсичности, иммуногенности, фармакокинетики и/или других клинических свойств.
Изобретение также предлагает антитело, применяемое для диагностических целей, например, для использования в методах обнаружения или количественного определения уровня бактериальной нагрузки или в качестве иммунореагента или мишени в жидком биологическом образце.
Изобретение также предлагает способы диагностики для оценки степени заражения или инфекции, вызванной штаммом Е.coli с МЛУ в биологическом образце, например, бактериальной нагрузки в образце с штаммом Е.coli с МЛУ, таком как образец жидкости организма, включая стадию контакта образца с антителом по изобретению. Антитело по изобретению может быть использовано в любом известном методе анализа, таком как метод конкурентного связывания, прямой и непрямой сэндвич-анализ, метод иммунопреципитации и ИФА.
Предпочтительный диагностический анализ проводят следующим образом. Специфические к целевому антигену антитела иммобилизируют на латексных гранулах и инкубируют с бактерией, присутствующей в или изолированной из жидкостей организма. Положительная реакция может быть обнаружена невооруженным глазом по окрашиванию латексных гранул в присутствии соответствующего когнатного антигена, экспрессированного на поверхности бактерии.
Жидкости организма, используемые в соответствии с настоящим изобретением, включают такие биологические образцы от субъекта, как экстракты тканей, мочу, кровь, сыворотку, кал и слизь.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, метод включает контактирование твердой подложки с избытком определенного типа фрагмента антитела (которое, в частности, образует комплекс с мишенью) в условиях, позволяющих антителу прикрепляться к поверхности твердой подложки. Полученная таким образом твердая подложка, к которой прикреплено антитело, контактирует с образцом биологической жидкости, что ведет к связыванию антитела с мишенью в образце биологической жидкости и образованию комплекса мишень-антитело. Комплекс может быть помечен обнаруживаемым маркером. В другом варианте, могут быть помечены либо мишень, либо антитело еще до образования комплекса. Например, определяемый маркер (метка) может быть соединен с антителом. Указанный комплекс потом может быть обнаружен и количественно определен, что, в свою очередь, позволяет определить концентрацию мишени в образце биологической жидкости.
Для конкретного применения антитело по изобретению связано с меткой или репортерной группой, отобранными из группы молекул, таких как органические молекулы, меченые ферменты, радиометки, цветные метки, флуоресцентные метки, хромогенные метки, люминесцентные метки, гаптены, дигоксигенин, биотин, комплексы металлов, коллоидное золото и их смеси. Антитела, связанные с метками и репортерными группами, могут быть использованы, например, в системах анализа или диагностических методах, например, для диагностики инфекции, вызванной штаммами Е.coli с МЛУ, или болезненных состояний, с ними ассоциированных.
Антитело по изобретению может быть соединено с другими молекулами для целей легкого обнаружения указанного конъюгата, например, методом ИФА и в тестах по изучению связывающих свойств.
Другой вариант настоящего изобретения предусматривает набор, включающий антитело, которое может включать, в дополнение к одному или нескольким антителам, различные диагностические или терапевтические агенты. Набор может также включать инструкции по применению антитела для использования в качестве диагностического и лечебного способов. Такие инструкции могут быть, например, представлены для устройства, включенного в набор, например, для инструментов или устройства для приготовления биологического образца для диагностических целей, например, для сепарации клеток- и/или протеинсодержащей фракции перед определением уровня нагрузки штаммами Е.coli с МЛУ для диагностики заболевания. Предпочтительно, такой набор включает антитело и диагностический агент или реагент, который может быть использован в одном или нескольких диагностических методах, описанных здесь. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, набор включает антитело, например, в лиофилизированной форме, необязательно включая инструкции и среду для восстановления лиофилизата и/или в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем (носителями), которые могут быть смешаны перед использованием инъекционной формы непосредственно перед введением.
Антитела, обозначенные как 8В5-1G10 и 8D10-C8, более конкретно, их легкие цепи и/или тяжелые цепи, далее характеризуются при помощи биологического материала, депонированного в "DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen" (MascheroderWeg 1b/lnhoffenstraβe 7B, 38124 Braunschweig (DE)).
Под депонированным материалом понимается трансформированная культура Е.coli, содержащая плазмиду, клонированную со вставкой интересующего гена. Интересующие гены представляют собой вариабельные домены тяжелых и легких цепей мышиного моноклонального антитела 8D5-1G10 (IgG3) и тяжелых и легких цепей мышиного моноклонального антитела 8D10-C8 (IgG2b).
DSM 26763 является клеткой-хозяином вида Е.coli, трансформированной с плазмидой, включающей вариабельный домен, кодирующий последовательность легкой цепи (8D5-1G10-LC) антитела 8D5-1G10. Escherichia coli 8D5-1G10-VL=DSM 26763, дата депонирования: 15 января 2013, депозитор: Арзанис Байэусайнс ГмбХ (Arsanis Biosciences GmbH), Вена, Австрия.
DSM 26762 является клеткой-хозяином вида Е.coli, трансформированной с плазмидой, включающей вариабельный домен, кодирующий последовательность тяжелой цепи (8D5-1G10-HC) антитела 8D5-1G10. Escherichia coli 8D5-1G10-VH=DSM 26762, дата депонирования: 15 января 2013, депозитор: Арзанис Байэусайнс ГмбХ (Arsanis Biosciences GmbH), Вена, Австрия.
DSM 28171 является клеткой-хозяином вида Е.coli, трансформированной с плазмидой, включающей вариабельный домен, кодирующий последовательность легкой цепи (8D10-C8-LC) антитела 8D10-С8. Escherichia coli 8D10-C8-VL=DSM 28171, дата депонирования: 11 декабря 2013; депозитор: Арзанис Байэусайнс ГмбХ (Arsanis Biosciences GmbH), Вена, Австрия.
DSM 28172 является клеткой-хозяином вида Е.coli, трансформированной с плазмидой, включающей вариабельный домен, кодирующий последовательность тяжелой цепи (8D10-C8-HC) антитела 8D10-С8. Escherichia coli 8D10-C8-VH=DSM 28172, 11 декабря 2013, депозитор: Арзанис Байэусайнс ГмбХ (Arsanis Biosciences GmbH), Вена, Австрия.
Объектами следующих определений являются желаемые варианты осуществления по настоящему изобретению:
1. Выделенное антитело, специфически связывающееся с антигеном O25b штаммов Е.coli с МЛУ.
2. Антитело в соответствии с определением 1, которое обладает кросс-специфическим связыванием с антигенами O25b и O25 и/или предпочтительно связывается с антигеном O25b, чем с антигеном O25а Е.coli, с аффинностью, более высокой по сравнению со связыванием с антигеном O25b поликлональной сыворотки, индуцированной против антигена O25 (в настоящее время известного и называемого здесь как O25а) штаммов Е.coli, определяемой при помощи методов иммуноанализа, предпочтительно речь идет об антителе, обладающим как минимум эквивалентной аффинностью по отношению к обоим антигенам - O25b и O25а, определяемой методами иммуноанализа, предпочтительно иммуноблоттингом, ИФА или другими иммунологическим методами.
3. Антитело в соответствии с определением 1 и 2, для которого антиген O25b преобладает в одном или более штаммах ST131-O25b:H4.
4. Антитело в соответствии с определением 1 и 3, для которого эпитоп, распознаваемый антителом, представлен на поверхности как некапсулированных, так и капсулированных штаммов ST131-O25b:H4.
5. Антитело в соответствии с определениями 1-4, имеющее сайт связывания в структуре полноразмерного антитела моноклонального антитела или фрагмента антитела, включающим в себя как минимум один домен, несущий сайт связывания, при этом, речь идет об антителе, отобранным из группы, включающей антитела, полученные от мыши, ламы, кролика, козы, коровы, химерные, гуманизированные или человеческие антитела, антитела из одних тяжелых цепей, Fab, Fd, scFv и однодоменные антитела типа VH, VHH или VL, предпочтительно человеческие или мышиные антитела класса IgG.
-7
-8
6. Антитело в соответствии с определениями 1-5, обладающее аффинностью связывания к антигену O25b с Кдисс. менее 10М, предпочтительно менее 10М.
7. Антитело в соответствии с определениями 1-6, которое демонстрирует бактерицидный потенциал in vitro в образце сыворотки, содержащей живые дикие штаммы Е.coli с МЛУ, и/или которое стимулирует поглощение живых диких МЛУ-штаммов Е.coli при помощи фагоцитов in vitro.
8. Антитело в соответствии с определениями 1-7, где речь идет об антителе, связывающемся с тем же самым эпитопом, что и антитело, обозначенное как 8D5-1G10 или 8D10-C8.
9. Антитело в соответствии с определениями 1-8, где речь идет об антителе, включающем в себя тот же самый сайт связывания, то и антитело, обозначенное как 8D5-1G10 или 8D10-C8.
10. Антитело в соответствии с определениями 1-9, где речь идет об антителе, которое получено из антитела, которое характеризуется следующей вариабельной областью, которая:
- получена из клетки-хозяина, депонированной под номером DSM 26763 и/или DSM 26762, или его функционально активного варианта или
- получена из клетки-хозяина, депонированной под номером DSM 28171 и/или DSM 28172, или его функционально активного варианта.
11. Антитело в соответствии с определением 10, включающее
А
(а) вариабельную область легкой цепи, произведенной клеткой-хозяином, депонированной под номером DSM 26763 и/или
(б) вариабельную область тяжелой цепи, произведенной клеткой-хозяином, депонированной под номером DSM 26762;
(в) или функционально активный вариант по (а) и/или (б)
или Б
(а) вариабельной областью легкой цепи, произведенной клеткой-хозяином, депонированной под номером DSM 28171 и/или
(б) вариабельной областью тяжелой цепи, произведенной клеткой-хозяином, депонированной под номером DSM 28172;
(в) или функционально активный вариант по (а) и/или (б).
12. Антитело в соответствии с определениями 10 или 11, где под функционально активным вариантом понимается CDR-вариант, имеющий как минимум 60% степень идентичности аминокислотной последовательности.
13. Антитело в соответствии с определениями 10-12, в соответствии с которыми функционально активный вариант отличается от родительского антитела по как минимум одной точечной мутации в аминокислотной последовательности, предпочтительно в CDR-области, где количество мутаций в каждой из аминокислотных последовательностей равно 0, 1, 2 или 3.
14. Плазмида, включающая нуклеотидную последовательность
А
- кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела, обозначенной как 8D5-1G10-LC, находящейся в клетке-хозяине, депонированной под номером DSM 26763 и/или
- кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела, обозначенной как 8D5-1G10-HC, находящейся в клетке-хозяине, депонированной под номером DSM 26762;
или Б
- кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела 8D10-C8-LC, находящейся в клетке-хозяине, депонированной под номером DSM 28171; и/или
- кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела, обозначенной как 8D10-C8-HC, находящейся в клетке-хозяине, депонированной под номером DSM 28172.
15. Экспрессирующая кассета, включающая кодирующую последовательность легкой и/или тяжелой цепей антитела в соответствии с определениями 1-13, причем речь идет об экспрессирующей кассете или кодирующей последовательности, полученной из плазмиды в соответствии с определением 14.
16. Способ получения антитела в соответствии с определениями 1-13, при котором клетка-хозяин подвергается трансформации при помощи плазмиды в соответствии с определением 14 или экспрессирующей кассеты в соответствии с определением 15.
17. Клетка-хозяин, включающая плазмиду в соответствии с определением 14 или экспрессирующую кассету в соответствии с определением 15.
18. Клетка-хозяин в соответствии с определением 17, которая депонирована
А
- под номером DSM 26763 и/или DSM 26762;
или Б
- под номером DSM 28171 и/или DSM 28172.
19. Способ получения антитела в соответствии с определениями 1-13, при котором клетка-хозяин в соответствии с определениями 17 и 18 культивируется или поддерживается в условиях, позволяющих производить указанное антитело.
20. Способ идентификации антитела-кандидата, включающий:
(а) получение образца, содержащего антитело или антител-продуцирующую клетку; и
(б) оценку связывания антитела или антитела, произведенного образцом с антител-продуцирующей клеткой, с эпитопом, распознаваемым антителом, обозначенным как 8D5-1G10 или 8D10-C8, где позитивная реакция между антителом и эпитопом позволяет идентифицировать антитело как антитело-кандидат.
21. Способ идентификации антитела-кандидата, включающий:
(а) получение образца, содержащего антитело или антител-продуцирующую клетку, и
(б) оценку связывания антитела или антитела, произведенного образцом, с антигеном O25b штамма ST131-O25b:H4 или антигеном O25 штамма Е.coli без МЛУ или антигеном O25а, где именно специфическая позитивная реакция между антителом и антигеном O25b, а не реакция с антигенами O25 или O25а позволяет идентифицировать антитело как антитело-кандидат.
22. Способ получения антитела в соответствии с определениями 1-13, включающий:
(а) создание антитела-кандидата, идентифицированного в соответствии с определениями 20 или 21, и
(б) получение моноклонального антитела, или гуманизированной или человеческой форм антитела-кандидата, или их производного с такой же специфичностью связывания с эпитопом, как и у антитела-кандидата.
23. Способ получения антитела в соответствии с определениями 1-13, включающий:
(а) иммунизацию животных эпитопом, распознаваемым антителом, обозначенным как 8D5-1G10 или 8D10-C8;
(б) формирование иммортализированных клеточных линий из выделенных В-клеток;
(в) отбор клеточных линий, полученных по п. б) для идентификации клеточной линии, производящей моноклональное антитело, связываемое с эпитопом, и
(г) получение моноклонального антитела, или гуманизированной или человеческой форм антитела, или их производного с той же специфичностью связывания с эпитопом, как и у моноклонального антитела.
24. Способ получения антитела в соответствии с определениями 1-13, включающий:
(а) иммунизацию животных антигеном O25b штамма ST131-O25b:H4 и выделение В-клеток, производящих антитела;
(б) формирование иммортализированных клеточных линий из выделенных В-клеток;
(в) отбор клеточной линии, производящей моноклональное антитело, которое предпочтительно связывается с антигеном O25b, чем с антигеном O25а Е.coli, и
(г) получение моноклонального антитела, или гуманизированной или человеческой форм антитела, или их производного с той же специфичностью связывания с эпитопом, как и у моноклонального антитела.
25. Антитело в соответствии с определениями 1-13, предназначенное для использования при лечении субъектов, которые могут быть подвержены риску заражения или страдают от инфекций, вызванных штаммами Е.coli с МЛУ, включая введение субъекту эффективного количества антитела с целью ограничения инфекции или улучшения болезненного состояния, вызванного указанной инфекцией, предпочтительно для лечения или профилактики пиелонефритов, вторичных бактериемий, сепсиса, перитонитов, менингитов и вентиляторной пневмонии.
26. Антитело в соответствии с определением 25, предлагаемое для киллинга штаммов Е.coli с МЛУ, предпочтительно штамма ST131-O25b:H4, независимо от типа капсульного полисахарида, экспрессируемого штаммом.
27. Антитело для использования в соответствии с определениями 25 или 26, которое назначается парентерально или через слизистую оболочку (мукозально).
28. Фармацевтический препарат на основе антител в соответствии с определениями 1-13, предпочтительно содержащий парентеральный или мукозальный составы и необязательно включающий фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
29. Антитело в соответствии с определениями 1-13 для диагностического применения с целью определения у субъекта наличие инфекции, вызванной Е.coli, в особенности штаммами с МЛУ, экспрессирующими молекулу ЛПС антигена O25b, таких как инфекции верхних и нижних мочевых путей, включая циститы и уретриты, восходящие и гематогенные пиелонефриты, особенно у пациентов с диабетом, а также бактериемии, сепсис, перитониты или бактериальная колонизация желудочно-кишечного тракта.
30. Антитело для применения в соответствии с определением 29, по которому системная инфекция у субъекта, вызванная Е.coli с МЛУ, определяется ex vivo после контакта образца жидкостей, отобранного из организма указанного субъекта с антителом, где специфическая иммунная реакция свидетельствует о наличии инфекции.
31. Антитело для применения в соответствии с определениями 29 или 30, где речь идет об образце жидкости, отобранном из организма, подвергаемом тестированию на специфическую иммунную реакцию, понимаются образцы, полученные из мочи, крови, изолятов из крови или гемокультур, аспиратов, мокроты, промывных жидкостей у интубированных субъектов или кала.
32. Антитело в соответствии с определениями 29-31, где серотип Е.coli определяется in vitro по чистой культуре Е.coli, извлеченной из клинической пробы.
33. Диагностический препарат на основе антитела в соответствии с определениями 1-13, или содержащего антитело с меткой и/или дополнительный диагностический реагент с меткой и твердую фазу для иммобилизации как минимум одного антитела и диагностического реагента.
34. Выделенный эпитоп, распознаваемый антителом, обозначенным как 8D5-1G10 или 8D10-C8.
35. Иммуноген, включающий:
(а) эпитоп в соответствии с определением 34;
(б) или дополнительные эпитопы, изначально не связанные с указанным эпитопом по п. (а) и
(в) носитель.
36. Иммуноген в соответствии с определением 35, где носитель является фармацевтически приемлемым носителем, предпочтительно включающим буфер и/или адъювантные вещества.
37. Иммуноген в соответствии с определениями 35 и 36 предпочтительно предлагается в виде вакцины для парентерального применения.
38. Иммуноген в соответствии с определениями 35-37, для применения при лечении субъектов путем назначения эффективного количества указанного иммуногена с целью защиты субъекта от инфекции, вызываемой штаммами Е.coli с МЛУ, или при профилактике указанного инфекционного заболевания.
39. Иммуноген в соответствии с определением 38, для формирования защитных иммунных реакций.
40. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело в соответствии с определениями 1-13 или эпитоп в соответствии с определением 35.
Приведенное выше описание будет более понятным со ссылкой на следующие примеры. Такие примеры, однако, являются просто характерными методами, использованными для реализации одного ли нескольких вариантов исполнения настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: антитела, специфические к O25b
Производится некапсулированный мутант репрезентативного ST131-O25b:Н4 штамма No.81009 (81009Δkps::kan, [Szijarto et al, FEMS Microbiol Lett, 2012, 332:131-6]) путем замены Aps-кластера (кодирующего синтез капсулы) кассетой, кодирующей устойчивость к канамицину. Сублетальные дозы живых или формальдегид-инактивированных клеток этого мутантного штамма были использованы для 4-кратной иммунизации мыши с двухнедельными интервалами. Затем были получены и проанализированы образцы мышиной сыворотки, и селезенка мышей, показавших высокие титры антител типа IgG против антигена O25b (в ИФА, иммуноблоттингом и окрашиванием поверхностей), была использована для генерации гибридомы. Затем, при помощи субклонирования были получены клоны гибридомы, которые секретировали антитела, специфические в отношении чистых антигенов O25b, а также связывающиеся с поверхностью живых диких штаммов Е.coli, экспрессирующих антигены O25b. Эти моноклональные антитела были очищены от супернатантов гибридом для последующего тестирования.
Как изображено на Фиг. 1, все антитела связались с несколькими различными клиническими изолятами, определенными как штаммы ST131-O25b:Н4, независимо от экспрессированного капсулярного полисахарида (К5, К2, или неизвестные K-типы). На основании данных по связыванию со штаммами, экспрессирующими антиген O25а, были идентифицированы два типа моноклональных антител. Одна группа представлена моноклональными антителами 8D5-1G10, не связывающимся с поверхностью штаммов типа O25а, в то время как другая группа представлена моноклональными антителами типа 8D10-C8, которые обладают кросс-реактивностью по отношению к штаммам типа O25а. Однако, ни одно из моноклональных антител не может связываться с каким-либо штаммами Е.coli, экспрессирующими посторонние антигены, например, 02 (Фиг. 1), или другие О-типы (не представлены).
Специфичность моноклональных антител была дополнительно подтверждена при помощи метода иммуноблоттинга с использованием чистого ЛПС (Фигура 2). Оба моноклональных антитела распознают молекулы ЛПС из штаммов ST131, содержащих антиген O25b, и в то же время различаются по своей кросс-реактивности в отношении ЛПС антигенов O25а. В то время, как моноклональное антитело 8D5-1G10 реагирует исключительно с антигеном O25b, моноклональное антитело 8D10-C8 обладало кросс-реактивностью по отношению к антигену O25а. Эту наблюдаемую кросс-реактивность сравнивали с активностью коммерческой сывороткой, типирующей O25 (Statens Serum Institut, Е.coli O25-антисыворотка с высоким титром, No.81369), рутинно используемой для идентификации штаммов ST131:O25b. Коммерческая кроличья сыворотка показывает явное предпочтение по связыванию антигенов O25а, чем ЛПС антигенов O25b. В отличие от этого, мышиное моноклональное антитело 8D10-C8 реагирует с молекулой ЛПС антигена O25b как минимум с такой же интенсивностью, как и с молекулами O25а. Последующий количественный анализ показал, что величина коэффициента интенсивности связывания с O25b по сравнению с O25а как минимум в 10 раз выше в случае моноклонального антитела 8D10-С8 по сравнению с коммерческой типирующей сывороткой.
Все приведенные выше данные позволяют предположить, что существует два типа моноклональных тел, специфических O25b, - то есть таких, которые обладают высокой специфичностью к O25b, и таких, которые распознают общий для антигенов O25а и O25b эпитоп. Следовательно, данные данного примера подтверждают, что структура O25b действительно отличается от классического O25 (то есть O25а) антигена. Уточнение новой структуры субъединицы O25b было произведено так, как описано в Примере 2.
Вариабельные домены тяжелой (VH) и легкой (VL) цепей моноклональных антител, специфических O25b, были амплифицированы из клонов гибридомы методом ПЦР с обратной транскрипцией с использованием вырожденных праймеров тяжелой и легкой цепей и затем секвенированы. Последовательности были проанализированы при помощи программы BLAST с использованием базы данных Ig, а также программы IMGT/V-QUEST, и CDR-области были определены в соответствии с номенклатурой Кэбота (Kabat).
Вариабельные последовательности легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела 8D5-1G10 были клонированы в соответствующие векторы, которые были использованы для трансформирования клетки-хозяина Е.coli, депонированной в DSMZ под No.: DSM 26763 и DSM 26762.
Вариабельные последовательности легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела 8D10-C8 были клонированы в соответствующие векторы, которые были использованы для трансформирования клетки-хозяина Е.coli, депонированной в DSMZ под No.: DSM 28171 and DSM 28172.
Пример 2: Структурный анализ антигена O25b
ЛПС из Е.coli штамм ST131 был выделен при помощи горячего фенола, насыщенного водой, очищен при помощи диализа, обработан протеиназой К и подвергнут ультрацентрифугированию. Средний выход препаратов ЛПС составил 2,61% от сухой бактериальной массы. ЛПС был проанализирован при помощи метода электрофореза в полиакриламидном геле с лаурилсульфатом натрия, показавшего наличие фракций, состоящих из коровых олигосахаридов с различным количеством замещенных олигосахаридных повторяющихся звеньев, а также незамещеннных коровых олигосахаридов. О-специфический полисахарид и различные олигосахаридные компоненты были выделены путем мягкого кислотного гидролиза при помощи гель-фильтрации на Bio-Gel Р-10. Состав фракций был проанализирован методом анализа cахаров и метилацией, методами ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии MALDI-TOF.
Структура повторяющихся звеньев О-специфического полисахарида была определена по фракции, состоящей из корового полисахарида, замещенного по одному единственному повторяющемуся звену. Анализ моносахаридов показал присутствие Rha, Glc, Gal, Hep и небольшое количество GlcN. Эквимолярные количества производных терминального Rhap, терминального Glcp, 3,6-замещенного Glcp и 3-замещенного Rhap со следовыми количествами 3-замещенного GlcpN были идентифицированы и соотнесены с повторяющимися звеньями О-специфического полисахарида. Остальные частично метилированные альдитол ацетаты 7-замещенного Нерр, 6-замещенного Glcp, 2-замещенного Glcp, терминального Galp, 3,6-замещенного Glcp и терминального Нерр составляли коровью олигосахариды типа K-12. Производные 3,4-замещенного Нерр, 3,4,7-замещенного Нерр и Kdo не могли быть определены методами стандартной метилации и анализа cахаров из-за замещения Р и PPEtn и присутствия карбоксильной группы, соответственно.
1
13
1
13
3
3
Структура повторяющегося звена О-специфического полисахарида для липополисахарида (ЛПС) штамма ST131 была определена при помощи ЯМР-спектроскопии. Полное соотнесение О-специфического полисахарида Н и С резонансов было достигнуто после объединения информации, полученной из экспериментов COSY, TOCSY и NOESY, а также HSQC-DEPT, НМВС и HSQC-TOCSY. Спектр Н, С HSQC-DEPT содержал сигналы 13 аномерных протонов и атомов углерода и одной Kdo спин-системы. Эти сигналы производились коровыми олигосахаридами, а также одним повторяющимся звеном О-специфического полисахарида. В области высокого поля получен один сигнал О-ацетильной группы, один сигнал СН для N-ацетильной группы, а также два смещенные в сторону высокого поля сигналы для СН, характерные для 6-дезокси cахаров (Rha). Спектры свидетельствуют о тетрадекасахаридной структуре исследованных олигосахаридов. Из-за высокой гетерогенности, обусловленной Р, РР, м PEtn, полные спиновые системы восьми cахаров невосстанавливающегося конца были полностью проанализированы с упором на структуру повторяющегося звена и ее связи с коровыми олигосахаридами типа K-12.
Межостаточные связи между соседними сахарными остатками были выявлены в экспериментах NOESY и НМВС. Спектры НМВС демонстрировали перекрестные пики между аномерным протоном и атомом углерода около положения связывания и между аномерным атомом углерода и протоном около позиции связывания, позволило подтвердить последовательность сахарных остатков в невосстанавливающейся области полисахарида.
На основании этих измерений было определено повторяющееся звено полисахарида, специфического O25b (Фиг. 3 (а)), которое является пентасахаридом с →3)-β-GlcpNAc (остаток K) в качестве остатка повторяющегося звена, замещающего первый остаток корового олигосахарида: →7)-α-Нерр (остаток L). Из-за возможного загрязнения более длинных фракций полисахарида, было невозможно определить положение замещения первого повторяющегося звена последующим повторяющимся звеном О-специфической полисахаридной цепи. Причем без дополнительных детальных структурных анализов этих фракций, может быть исключено присутствие GlcNAc в последующих повторяющихся звеньях в качестве а-аномера (как это ранее сообщалось для некоторых полисахаридов Е.coli).
Молекулярные массы корового олигосахарида, корового олигосахарида с одним замещенным повторяющимся звеном и повторяющего звена О-специфического полисахарида были установлена методикой масс-спектрометрии MALDI-TOF (данные не представлены). Все спектры были интерпретированы, исходя из объясненной настоящей структуры повторяющегося звена липополисахарида штамма ST131 и ранее идентифицированных гликоформ коровых олигосахаридов типа K-12 (Duda et al. Microbiology. 2011 Jun; 157(Pt6):1750-60. doi: 10.1099/mic. 0.046912-0. Epub 2011 Mar 3; Muller-Loennies et al. J Biol Chem. 2003 Sep 5; 278(36):34090-101. Epub 2003 Jun 20). Анализы спектров низкого разрешения фракций, содержащих коровый олигосахарид, замещенный коротким О-специфическим полисахаридом, проведенные по вышеупомянутой методике масс-спектрометрии MALDI-TOF, демонстрировали наличие кластеров ионов со следующими преобладающими ионами: m/z 2797.2, m/z 3659.6, m/z 4522.0 и m/z 5383.6, соотнесенные с коровым олигосахаридом (с Р и PPEtn), замещенным по 1, 2, 3 и 4 повторяющимся звеньям, соответственно. Средняя разность масс между этими ионами составила 862.1 Да и соответствует рассчитанной средней массе повторяющегося звена О-специфического полисахарида (861.8 Да, ПЗ-Н2O).
С учетом молекулярной массы повторяющегося звена и сравнительных результатов масс-спектрометрии для других фракций, здесь показано наличие более длинной гликоформы корового олигосахарида, содержащей →7)-α-Hepp-(1→6)-α-Glcp дисахарид, замещающий первое повторяющееся звено во внешней области кора (Фиг. 3 (а)). Было показано, что липополисахарид штамма ST131 состоит из двух основных коровых гликоформ олигосахарида. Тип гликоформы зависит от наличия или отсутствия О-специфического полисахарида. Преобладающей гликоформой в незамещенном коровом олигосахаридом является усеченная версия корового олигосахарида типа K-12, лишенная →7)-α-Hepp-(1→6)-α-Glcp дисахарида. Такой дисахарид определяет разницу между О-специфическим полисахаридом, замещенным коровым олигосахаридом и незамещенным коровым олигосахаридом.
Пример 3: Диагностическое исследование E. coli на специфичность O25b.
8
Моноклональное антитело 8D5-1G10, специфическое O25b, иммобилизировали на латексных гранулах с диаметром частиц 1 мкм (от фирмы Polysciences) в соответствии с инструкциями производителя. Иммобилизированные гранулы были протестированы на предмет их способности агглютинировать различные штаммы Е.coli. Петля бактерий (прим. 10 КОЭ) была смешана с 10 мкм 1% суспензией моноклонального антитела, иммобилизированного на латексных гранулах и фосфатно-солевым буфером. Как это видно на Фиг. 4, штаммы Е.coli, экспрессирующие антигены O25b, показывают сильную агглютинирующую реакцию, развивающуюся после аккуратного перемешивания в течение нескольких секунд. Напротив, штаммы Е.coli, экспрессирующие антигены O25а или 02, не агглютинируют с тем же самым реагентом. Таким образом, данный гипотетический диагностический реагент является более специфическим, нежели реагент, применяемый в настоящее время в данной области для проведения пробы агглютинации (например, поликлональная кроличья сыворотка против O25), используемая для детекции O25b (и O25а)-положительных Е.coli.
Кроме того, поскольку при проведении пробы на агглютинацию с коммерческой анти-025 сывороткой рекомендуется использовать инактивированные теплом (то есть лизированными) клетки Е.coli, в этом примере было проверено, не обладают ли моноклональные антитела, способные специфически связываться с O25b, - как очищенные, так иммобилизированные на латексных гранулах - более высокой чувствительностью, то есть проверена их способность связывать живые клетки Е.coli в присутствии интактных капсульных полисахаридов. Была проверена широкая панель клинических изолятов O25b, и результаты, касающиеся некоторых репрезентативных штаммов, представлены в Табл. 1. Были отмечены два аспекта улучшенной чувствительности: i) репрезентативные штаммы No.1 и No.2 были способны агглютинировать как со свободными, так и иммобилизированными на латексных бусинах моноклональными антителами, специфически связывающими с O25b в неинактивированном теплом виде (то есть в виде живых бактерий, полученных из чашки с агаром), в то время как для проведения реакции агглютинации с коммерческой кроличьей сывороткой O25 требуется предварительное тепловое инактивирование бактерий (лизис); ii) репрезентативные штаммы No.3 и No.4 даже в инактивированном теплом виде не были способны к агглютинации с коммерческой сывороткой, в то время как эти же самые лизаты давали положительный результат с очищенным моноклональным антителом 8D5-1G10. Важно отметить, что то же самое антитело, иммобилизированное на латексных гранулах, дает положительную реакцию агглютинации с нативными бактериальными клетками. Эти результаты демонстрируют более высокую чувствительность иммобилизированных на латексных гранулах моноклональных антител при проведении пробы на агглютинацию, которая подтверждается тем фактом, что все O25b-положительные штаммы Е.coli, протестированные до сих пор, давали положительную агглютинацию с этим реагентом без какой-либо предварительной обработки (то есть без получения инактивированных теплом лизатов). Кроме того, использование этого реагента в качестве диагностического средства для обнаружения O25b-экспрессирующих бактерий имеет преимущество перед технологиями на базе ПЦР, поскольку дает положительный результат только с бактериями, экспрессирующим антиген-мишень. К примеру, репрезентативный штамм No.5 в таблице 1 был положительным в отношении O25b-специфического гена при использовании метода ПЦР - рутинного метода диагностики, однако, был негативным в любых пробах на агглютинацию. Этот штамм был представлен, чтобы продемонстрировать грубый фенотип липополисахарида (без экспрессии О-антигенов), поэтому результаты, полученные методом ПЦР, можно рассматривать как ложно положительные. Возможность избежать таких ложно положительных результатов имеет особенно важное значение в том случае, когда такие методы используются для сопровождающей диагностики, например, для отбора пациентов, инфицированных штаммами Е.coli, экспрессирующими O25b, и которые могли быть иметь выгоду от специфических терапевтических подходов в отношении O25b.
Также, был изучен предел определения свободных молекул O25b липополисахаридов при помощи моноклональных антител, иммобилизированных на латексных гранулах. Различные количества высокоочищенного O25b липополисахарида в диапазоне от 1 до 1000 нг были инкубированы с 10 мкл 1% суспензией гранул в фосфатно-солевом буфере. Как это продемонстрировано на Фиг. 5, была отмечена дозозависимая реакция агглютинации: самые лучшие результаты были получены для свободного липополисахарида в количестве 100 нг, агглютинация по-прежнему детектируется при 1000 или 10 нг, и не детектируется для 1 нг свободного O25b липополисахарида.
Табл. 1: Сравнение результатов реакции агглютинации, полученных для различных штаммов O25b при использовании коммерческой O25-типирующей сыворотки и O25b-специфического моноклонального антитела 8D5-1G10.
Пример 4: Антибактериальный эффект O25b-специфического МАТ
8
Потенциал защитных свойств моноклональных антител, специфичных к антигену O25b (с и без кросс-реактивности к O25а) был изучен на модели летальной бактериемии у мышей. Группы из 5 мышей получили 100 мкг очищенного 8D5-1G10 или 8D10-C8, интраперитонеально. Через 24 часа мыши были внутривенным путем заражены летальной дозой (предварительно определенной в пилотном эксперименте) штамма Е.coli No.81009 (2×10КОЭ/мышь), экспрессирующего антиген O25b. Летальность мышей оценивалась ежедневно в течение 3 недель. На Фиг. 6 приведены объединенные результаты 2-х независимых экспериментов с близкими исходами. В то время, как 90% мышей, "иммунизированных" фосфатно-солевым буфером, поддались инфекции, оба изучаемых моноклональных антитела показали статистически (тест Логранка) значимое увеличение выживаемости после 3-недельного постинфекционного периода наблюдений.
5
4
Чтобы подтвердить эти in vivo данные, бактерицидный эффект очищенных моноклональных антител был проверен in vitro. 2 мл культуры штамма Е.coli No.81009, находящейся в середине логарифмического роста, были дважды промыты фосфатно-солевым буфером и ресуспендированы до создания конечной концентрации 5×10 КОЭ/мл. 10 мкл данной бактериальной суспензии предварительно инкубировались в течение 15 минут при температуре 4°С с 4 мкг соответствующих моноклональных антител, разведенных в 40 мкл среды RPMI-1640, дополненной буфером с 3% человеческим альбумином. Затем, к реакционной среде добавили 50 мкл объединенной человеческой сыворотки (предварительно абсорбированной со штаммом Е.coli No.81009) и смесь снова подвергли инкубированию при температуре 37°С в течение 1, 2 и 3 часов. Финальное количество КОЭ и концентрация антител в реакционной среде составили 5×10 КОЭ/мл и 40 мкг/мл, соответственно, в общем объеме 100 мкл. Аликвоты объемом 10 мкл были высеяны на пластины со средой TSB для последующего подсчета колоний в определенные временные промежутки.
Как показано на Фиг. 7, оба исследуемых моноклональных антитела были способны в значительной степени снижать количество КОЭ через 3 часа от начала исследования. В отличие от этого, бактерии, смешанные с нерелевантными моноклональными антителами, или в отсутствии добавки моноклональных антител, демонстрируют постоянный рост в данной среде. В случае, если в образцах сыворотки был инактивирован комплемент (после 30 мин. инкубации при температуре 56°С), бактериальный киллинг при помощи любого моноклонального антитела не наблюдался (данные не представлены). Эти результаты демонстрируют тот факт, что оба моноклональных антитела, специфических к антигену O25b могут запускать комплемент-обусловленный бактерицидный эффект.