Исследование корригирующих свойств клеток пуповинной крови человека при острой гемической гипоксии в эксперименте

Оригинальные исследования

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование корригирующих свойств клеток пуповинной крови человека при острой гемической гипоксии в эксперименте

ТА Федорова, ГА. Шевелева, B.C. Акиньшина, М.В. Аппалуп, В.Н. Верясов Федеральное государственное учреждение «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова Росмедтехнологий»

Research of umbilical cord cells’ correcting potential in experimental acute hemic hypoxy

ТА. Fedorova. G.A. Sheveleva, VS. Akinshina, M.V. Appalup. V.N. Veryasov

Federal Statement Institution «Scientific Center for Obstetrics, Gynaecology and Perynatology named by V.l. Kulakov Rosmedtehnologii»

В настоящее время внимание клиницистов привлекает возможность использования методов клеточной терапии и, в частности, ядросодержащих клеток пуповинной крови человека (ЯСК ПК) для лечения ряда патологических состояний. Интересными представляются разнообразные экспериментальные модели исследования свойств человеческих ЯСК ПК, введенных животным. Поскольку патогенетической основой многих заболеваний является гипоксия, целью настоящего исследования явилось изучение в эксперименте возможных корригирующих свойств ЯСК ПК при острой гемической гипоксии. Экспериментальные исследования выполнены на 24 неинбредных белых крысах-самках, разделенных на 3 группы: 1-я группа — кровопотеря 30% ОЦК без лечения, 2-я группа — кровопотеря 30% и введение ЯСК ПК и 3-я группа — интактные животные (контроль). Ядросодержащие клетки из ПК человека выделяли методом центрифугирования на градиенте плотности фиколл-верографина, отмывали и разводили до10Б кл/мл в 1 мл физиологического раствора, исходя из чего доза ЯСК составила в среднем 4 x10е на 1 кг массы тела животного. Введение ЯСК ПК проводили через 3 часа после создания кровопотери, все показатели исследовали на 5-е сутки после острой гемической гипоксии. На 5-й день наблюдения у животных подопытных групп было отмечено достоверное по сравнению с контролем снижение уровня гемоглобина и эритроцитов. Однако в группе, получившей ЯСК, показатели красной крови достоверно превышают таковые у крыс с нелеченной анемией. Интересно, что число лейкоцитов в группе, получившей ЯСК ПК, было выше не только по сравнению с параллельной группой, но и с контролем. По данным биохимического анализа крови, метаболические нарушения практически отсутствовали в группе, получившей ЯСК ПК, тогда как у крыс 1-й группы на 5-е сутки они сохранялись. Результаты исследования поведенческой активности самок по тестам «открытое поле», «грумминг» и «норковый рефлекс» продемонстрировали статистически значимое снижение двигательной и эмоциональной активности животных вследствие кровопотери, тогда как у животных, получивших ЯСК, наблюдалась не только нормализация параметров, но даже относительная активизация в 85% случаев! Приведенные результаты свидетельствуют в пользу выраженного антигипоксического эффекта ЯСК ПК, выяснение механизма которого требует дальнейших исследований.

Ключевые слова: пуповинная кровь, ядросодержащие клетки, гипоксия.

Today different clinical spetialists has a great interest to a possibility of cell therapy, particularly to human umbilical cord blood nucleated cells (UCB NC) use for the treatment of different pathologies. Different experimental models seems to be interesting for human UCB NC effects in animals. As hypoxy is the pathogenetic basis of different pathological statements, the study was aimed to research a possible correcting potential of human UCB NC for acute hemic hypoxy in rats. Experimental groups included 24 nonimbread white female rats devided as following: group 1 —bloodloss 30% of circulating blood volume (CBV) without any treatment, group 2 — bloodloss 30% of CBV with human UCB NC transfusion and group 3 — intact (control) rats. Low-density UCB NC were isolated by density centrifugation over ficoll-verographin, washed out and diluted to 10s cells/ml in 1 ml of isotonic NaCI solution, middle dose of UCB PC was 4x10s cells per kilo animal's body weight. Transfusion of UCB PC concentrate were performed 3 hours after bloodloss, all laboratory tests — at 5tf’ day after acute hypoxy modeling. At the 5tf’ day of hypoxy the significant decrease of haemoglobin and red blood cells levels was registered. But in group 2 with UCB PC transfusion compared values were statistically significantly higher. Interesting, that white blood cells level in group with UCB PC was significantly higher than not only in group 1 but even in control group. Biochemical blood analysis at 5th day revealed moderate methabolic disorders in rats after bloodloss (group 1), unlike rats of group 2, demonstrated normal biochemical parameters. Results of behavioural tests, such as «open field», «grooming» and «hole reflex» demonstrated significant decrease of motorial and emotional activity in group 1 unlike group 2, demonstrated some activisation in 85% of cases. Thus, data introdused above evidently shows the antyhypoxic effect of UCB PC, which investigation needs the further studies.

Keywords: umbilical cord blood, umbilical cord blood nucleated cells, hypoxy.

В настоящее время все большее внимание клиницистов привлекает возможность использования методов клеточной терапии и, в частности, ядросодержащих кле-

e-mail: mariappalup@mail.ru

ток пуповинной крови человека (ЯСК ПК) для лечения ряда патологических состояний. Наиболее часто ЯСК ПК рассматриваются как возможный альтернативный

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 2, 2009

Оригинальные исследования

источник компенсации дефицита гемопоэза или полного его замещения при тяжелых заболеваниях системы кроветворения, печени, почек, иммунной системы и др.[1—2]. В основе этого направления научно-практической деятельности лежат многочисленные работы зарубежных и отечественных авторов, показавшие мощный гемопоэтический потенциал клеток пуповинной крови. Кроме того, пуповинная кровь является наиболее онтогенетически молодым из всех практически доступных и этически приемлемых источников прогениторных клеток, а незрелость иммунной системы новорожденного обуславливает низкую частоту развития тяжелой реакции «трансплантат против хозяина» [5—7]. Также немаловажна слабо выраженная коммитированность клеток пуповинной крови, в связи с чем они демонстрируют существенную пластичность.

Несмотря на имеющиеся клинические и экспериментальные данные о трансплантации клеток пуповинной крови, существует еще много нерешенных вопросов, касающихся их применения при том или ином заболевании, характере и тяжести побочных эффектов. Именно поэтому наиболее интересными представляются разнообразные экспериментальные модели исследования свойств человеческих ЯСК ПК.

Патогенетической основой многих заболеваний, связанных с нарушением функций дыхательной, сердечно-сосудистой систем, а также транспортной функции крови, является гипоксия. Именно поэтому целью настоящего исследования явилось изучение в эксперименте возможных корригирующих свойств ЯСК ПК при острой гемической гипоксии.

Материал и методы

Экспериментальные исследования выполнены на 24 неинбредных белых крысах-самках, массой 235—250 г. Для изучения корригирующих свойств ЯСК ПК у крыс моделировали острую гемическую гипоксию, с развитием в последующем постгеморрагического состояния, путем получения крови в количестве 30% от ОЦК из подъязычных вен. Каждому животному, вошедшему в основную группу, ЯСК ПК человека вводили в хвостовую вену в количестве 1x108 ЯСК ПК, суспензированных в 1 мл физиологического раствора. Таким образом, доза ЯСК ПК составила в среднем 4x10е ЯСК ПК на 1 кг массы тела животного, что, по данным литературы, соответствовало средней дозе ЯСК ПК, вводимой человеку при восстановлении гемопоэза [3].

Методика выделения ядросодержащих клеток

пуповинной крови

Ядросодержащие клетки из ПК выделяли медом центрифугирования на градиенте плотности фиколл-верогра-фина (р-1,007) в течение 30 мин. при 500 д. Клетки интерфазного кольца переносили в пробирку и отмывали центрифугированием, концентрацию клеток определяли с помощью камеры Горяева и разводили до 108 кл/мл в физиологическом растворе. При этом иммунофенотип клеток соответствовал нормативным показателям для ПК ССйЗ - 50430%; Сй4 - 30-40%; Сй8 - 20^ 30%; С019 - 15^20%; С016 - 3-6%).

Предварительно, для принятия решения о сроках введения ЯСК и выведения животных, была взята группа из 5 самок, которым через 5 час. после кровопотери вводили ЯСК и подвергали выведению на 3-и сут. Основная группа крыс состояла из 19 самок. ЯСК ПК вводили спустя 3 час. после кровопотери, вывод осуществляли на 5-е сут.

Все животные были разделены на 3 группы: 1-я — группа сравнения — крысы, перенесшие кровопотерю и не получавшие никакой терапии; 2-я — основная группа — крысы, которым после кровопотери вводили концентрат ЯСК ПК; 3-я — контрольная группа — интактные животные.

Перед созданием острой гемической гипоксии и перед эвтаназией животных обследовали. Изучали поведенческие реакции в тесте «открытое поле» и «норковый» рефлекс, характеризующие локомоторную, эмоциональную и поисково-исследовательскую активность. Регистрировали горизонтальную (количество пересеченных квадратов) и вертикальную (количество стоек) активность, грумминг (почесывание), норковый рефлекс (количество исследованных отверстий). Учитывали прирост массы тела. Исследовали состав периферической крови: определяли содержание гемоглобина, лейкоцитов и эритроцитов. После декапитации оценивали метаболические изменения в организме по ряду биохимических показателей крови. В плазме периферической крови определяли содержание ферментов АЛТ, АСТ, креатинина, мочевины и щелочной фосфатазы (ЩФ).

Результаты и обсуждение

Результаты предварительных опытов показали, что при исследовании поведенческих реакций в тесте «открытое поле» у животных группы сравнения, перенесших кровопотерю без последующей терапии наблюдалось снижение количества «стоек» до 2,0±0 (в контроле — 6,6±1,1, р<0,05), «груминга» до 1,5±0,5 (в контроле — 5,8±0,9, р<0,05) и подавление исследовательского рефлекса до 1,0±0,4 (в контроле — 7,7±1,1, р<0,05). В основной группе, получившей ЯСК ПК, отмечено снижение количества «стоек» до 4,3 ±1,1 и уменьшение активности «норкового рефлекса», которые были достоверно менее выраженными по сравнению с таковыми у крыс, не получивших терапию. Масса тела крыс обеих подопытных групп к 3-м сут. наблюдения достоверно не изменялась.

Исследование состава периферической крови показало снижение содержания гемоглобина у животных обеих групп исследования, статистически достоверно отличающееся от контроля, однако в группе, получившей ЯСК ПК на 3-и сут. оно составило 6,5±2,8 г/%, тогда как в группе сравнения — 9,9±1,6 г/%. Аналогичной была и динамика числа эритроцитов.

В 1-й группе (кровопотеря) наблюдалась лишь тенденция к понижению АСТ и повышению ЩФ, но из-за малой выборки и большого разброса в показателях, также, как и во 2-й группе достоверного отличия от контроля не отмечено.

Учитывая представленные выше данные предварительного эксперимента, было решено провести основной эксперимент по следующей схеме: введение ЯСК через 3 час. после создания кровопотери и исследование всех показателей на 5-е сут. после острой гемической гипоксии и развития постгеморрагического состояния.

Результаты наблюдений показали, что средняя масса тела самок обеих подопытных групп имела тенденцию к снижению за счет отсутствия прироста, а у некоторых животных — за счет ее снижения на 5—8 г, в то время как в контрольной группе масса тела животных к 5-м сут. увеличивалась (табл. 1). Достоверных изменений данного показателя не отмечено.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 2, 2009

Оригинальные исследования

Таблица 1. Масса тела крыс в ходе эксперимента, г

1-я группа (кровопотеря) 2-я группа (кровопотеря + ЯСК ПК) Контрольная группа

Число 6 7 6

животных

Исходно 247,5±8,1 249,3±8,4 246,7±7,1

S-e сут. 250,0±8,1 249,5±7,0 2SS,8±8,3

Примечание: р>0,05 во всех случаях.

Основным звеном патогенеза гемической гипоксии является абсолютное снижение содержания в крови гемоглобина и эритроцитов, обуславливающее нарушение ее газотранспортной функции. По исходному состоянию гемоконцентрационных показателей, группы подопытных животных исходно достоверно не различались. На 5-е сут. наблюдения у животных подопытных групп было отмечено достоверное по сравнению с контролем снижение уровня гемоглобина и эритроцитов. Однако в группе, получившей ЯСК ПК, показатели красной крови достоверно превышают таковые у крыс с нелеченной анемией. Интересно, что число лейкоцитов в группе, получившей ЯСК ПК было выше не только по сравнению с параллельной группой, но и с контролем (табл. 2). Приведенные данные могут свидетельствовать как о приживлении и циркуляции введенных клеток, так и отражать эффект так называемой цитокиновой стимуляции гемопоэза, либо о суммировании этих эффектов.

Таблица 2. Показатели состава крови подопытных животных на 5-е сут.

Показатель 1-я группа (X = 6) 2-я группа (X = 7) Контрольная группа

НЬ, г/% 13,9±0,7* 15,9±0,4 18,9±0,4

Эритроциты, х1012/мл S10,8±28,2* 64S,4±22,8** 694,0±26,8

Лейкоциты, х106/мл 9,61±0,8 10,24±0,6 10,1±0,6

Примечание: * — р<0,05 по отношению к контролю; ** — р<0,05 достоверно по отношению к группе с кровопоте-рей [р<0,05).

Крайне важным патогенетическим звеном гипоксии являются гемодинамические расстройства и метаболические нарушения, развивающиеся как следствие кислородного голодания. По данным биохимического исследования плазмы крови крыс, перенесших кровопотерю, отмечалось достоверное увеличение концентрации АСТ и ЩФ по сравнению как с контролем, так и с группой, получившей ЯСК ПК. Другие исследованные ферменты находились в этой группе на уровне контроля.

В группе, получившей трансфузии ЯСК ПК, на 5-е сут. после кровопотери метаболические нарушения практически отсутствовали, содержание анализируемых ферментов оставалось на уровне контроля.

Эти данные демонстрируют существенное нарушение функции печени при выраженной гипоксии, развившейся у животных вследствие кровопотери. Отсутствие

аналогичных нарушений у животных, получивших сразу после кровотечения ЯСК ПК, свидетельствует о протек-тивном действии ядросодержащих клеток в отношении формирования «порочного» круга метаболических изменений, запускаемого острой циркуляторной и гемической гипоксией (табл. 3).

Таблица 3. Результаты биохимического исследования плазмы крови крыс на 5-е сутки после кровопотери и введения КПК

Показатель 1-я группа (X = 6) 2-я группа (X = 7) Контрольная группа

АЛТ, ед/л 72,6±3,8 64,7±2,9 68,3±3,6

АСТ, ед/л 302,3±15,1* 229,2±11,1** 228,8±14,5

Креатинин, мкмоль/л 40,6±1,0 40,0±0,7 41,4±0,6

Мочевина, мкмоль/л 5,8±0,3 6,1±0,2 5,8±0,3

ЩФ, ед/л 699,3±16,1* 637,4±15,8** 619,5±11,9

Примечание: * — достоверно по отношению к контролю [р<0,05); ** — достоверно по отношению к группе с кровопо-терей [р<0,05).

Крайне интересными оказались результаты исследования поведения самок по тесту «открытое поле», выявившие статистически значимое снижение двигательной и эмоциональной активности животных вследствие развития у них постгеморрагического состояния. Об этом свидетельствовало уменьшение количества пробегов, стоек и «грумминга» у животных 1-й группы. Кроме того, отмечалось снижение познавательной активности — характерное для гипоксических состояний подавление норкового рефлекса.

Во второй группе животных подобные изменения практически отсутствовали или были незначительными, о чем свидетельствовало приближение выраженности исследуемых реакций к показателям контрольной группы.

Под влиянием кровопотери менялась и координация поведенческих реакций в тесте «открытое поле». У контрольных животных в 67% случаев наблюдалось соответствие между повышенным числом «пробегов» и увеличенным количеством «стоек». В группе с кровопотерей процент животных с такими проявлениями был снижен более чем вдвое — 33%, тогда как в группе, получившей ЯСК ПК наблюдалась не только нормализация параметров, но даже относительная активизация животных — 85% из них проявили повышенную активность (табл. 4).

Приведенные результаты эксперимента позволяют сделать вывод, что ядросодержащие клетки пуповинной крови человека, введенные сразу после моделирования острой массивной кровопотери в эксперименте на крысах, обеспечивают достаточно выраженный антигипо-ксический эффект, способствуя снижению тяжести пост-геморрагических изменений. Выяснение механизма действия этих клеток требует проведения дальнейших исследований. В частности, крайне важно установить, является ли повышение числа эритроцитов в крови крыс следствием колониеобразующей активности человеческих клеток — предшественников эритроцитов либо введенный концентрат обладает своеобразным неспецифическим действием, опосредованным влиянием цитокинов на костный мозг или другие органы крыс.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 2, 2009

Оригинальные исследования

Таблица 4. Особенности поведенческих реакций

Показатель I-я группа N = 6 2-я группа N = 7 Контрольная группа

Перебежки Фон Опыт 38,0±6,9 24,6±2,6* 29,0±4,0 42,3±4,1** 3S,3±7,6 37,6±4,3

Стойки Фон Опыт 4,0±1,9 3,0±1,1* D4 D3 0D1D ±± D6 D4 14 D2 D1 ±1 ±1 D0 D6 4D6D

Грумминг Фон Опыт 3,4±0,9S 2,6±0,8* DS D4 1D0D ±± D3 D8 4D3D D4 D9 2D0D ±± DS D8 6DSD

Норковый рефлекс Фон Опыт 4,6±1,3 3,8±1,2* 4D0±0D9 8,0±1,4** D2 D1 ±1 ±1 DS D7 4D7D

Примечание: * — достоверно по отношению к контролю [р<0,05); ** — достоверно по отношению к группе с кровопо-терей [р<0,05).

ЛИТЕРАТУРА

1. Абдулкадыров К.М., Романенко Н.А., Старков Н.Н. Получение и клиническое применение периферических гемопоэтических стволовых клеток из пуповинной крови. Вопросы онкологии 2000; 46С5): 513-20.

2. Стрижаков А.Н., Мхеидзе Д.М., Тимохина Е.В., Гришина В.В. Пуповинная кровь — источник стволовых клеток. Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии 2DD3; 4С2]: 33-7.

3. Arcese W., Aversa F., Bandini G. et al. Clinical use of allogeneic haematopoietic stem cells from sources other than bone marrow. Haematol.

Несомненно, судьба трансплантируемых клеток, тем более в ксеногенной системе, исключительно интересна, и тот факт, что они еще функционируют в организме крысы через 5 сут., не вызывает сомнения. Более того, исключительно важен их тропизм к определенным тканям: селезенка, лимфатические узлы, печень, и, особенно — костный мозг. Учитывая положительные результаты начального этапа нашей работы, приведенные выше, данная группа задач станет обьектом дальнейших исследований.

Следует обратить особое внимание на то, что, несмотря на малое количество наблюдений, проведенных в предварительном эксперименте, его результаты дают основания полагать, что для того, чтобы клетки пуповинной крови начали «работать» в случае острой геми-ческой и циркуляторной гипоксии, необходимо более продолжительное, чем 3 сут., время их пребывания в организме реципиента.

1998; 83: 159-82.

4. Clapp D.W., Williams D.A. The use of umbilical cord blood as a cellular source for correction of genetic diseases affecting the hematopoietic system. Stem Cells 2DD1; 6C19): 492-9.

5. Broxmeyer H.E., Douglas G.W., Hangoc G. et al. Human umbilical cord blood as a potential source of transplantable hematopoietic stem/ progenitor cells. PNAS USA 1989; 86: 3828—32.

6. Gluckman E.G., Roch V., Chastang C. Use of cord blood cells for banking and transplant. The Oncologist 1997; 2: 340—3.

Поступила 11.05.2009

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, hl< 2, 2009

А