СИНЕРГЕТИЧЕСКАЯ ПРОТИВОМИКРОБНАЯ КОМПОЗИЦИЯ (ВАРИАНТЫ)
SYNERGETIC ANTIMICROBIAL COMPOSITION (VERSIONS)

Настоящая заявка в соответствии с 35 U.S.С. $119(e) претендует на приоритет предварительной заявки на патент U.S. №61/273529, зарегистрированной 5 августа 2009 г., и предварительной заявки на патент U.S. №61/331423, зарегистрированной 5 мая 2010 г.
Настоящее изобретение относится к комбинациям биоцидов, а именно к комбинациям, обладающим активностью, которая превышает сумму активностей входящих в нее противомикробных соединений при их индивидуальном применении.
Применение комбинаций, включающих по меньшей мере два противомикробных соединения, может дать возможность расширять потенциальные рынки, уменьшать используемые концентрации и стоимость, а также снижать уровень отходов. В некоторых случаях поступающие в продажу противомикробные соединения не позволяют эффективно бороться с микроорганизмами (обеспечивать эффективный контроль микроорганизмов) даже при их применении в высоких концентрациях, что обусловлено низкой активностью в отношении определенных типов микроорганизмов, например микроорганизмов, обладающих устойчивостью к определенным противомикробным соединениям. Иногда применяют комбинации различных противомикробных соединений для обеспечения общего контроля микроорганизмов в конкретных условиях конечного применения. Например, в US №6197805 описана комбинация 3-йод-2-пропинилбутилкарбамата (IPBC) и 2-(метоксикарбониламино)бензимидазола, однако в этом процитированном документе не предложена ни одна из комбинаций, заявленных в настоящем изобретении. Кроме того, существует необходимость в разработке дополнительных комбинаций противомикробных соединений, обладающих повышенной активностью в отношении различных штаммов микроорганизмов для обеспечения эффективного контроля микроорганизмов, прежде всего при их применении в составе сухих пленочных покрытий. В основу настоящего изобретения была положена задача разработать такие дополнительные комбинации противомикробных соединений.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к синергетической противомикробной композиции, содержащей: (а) 3-йод-2-пропинилбутилкарбамат и (б) флуометурон; в которой массовое соотношение 3-йод-2-пропинилбутилкарбамата и флуометурона составляет от 10:1 до 1:10.
Настоящее изобретение относится также к синергетической противомикробной композиции, содержащей: (а) 3-йод-2-пропинилбутилкарбамат, (б) флуометурон и (в) 4,5-дихлор-2-н-октил-4-изотиазолин-3-он (DCOIT), в которой массовое соотношение 3-йод-2-пропинилбутилкарбамата и флуометурона составляет от 3:1 до 1:2, и массовое соотношение 3-йод-2-пропинилбутилкарбамата и 4,5-дихлор-2-н-октил-4-изотиазолин-3-она составляет от 8:1 до 4:1.
Настоящее изобретение относится также к синергетической противомикробной композиции, содержащей: (а) 3-йод-2-пропинилбутилкарбамат, (б) флуометурон и (в) дийодметил-пора-толилсульфон (DIMTS), в которой массовое соотношение 3-йод-2-пропинил-бутилкарбамата и флуометурона составляет от 3:1 до 1:2, и массовое соотношение 3-йод-2-пропинилбутилкарбамата и дийодметил-пара-толилсульфона составляет от 8:1 до 4:1.
Настоящее изобретение относится также к синергетической противомикробной композиции, содержащей: (а) флуометурон и (б) 2-н-октил-4-изотиазолин-3-он (OIT), в которой массовое соотношение флуометурона и OIT составляет от 1:1 до 1:2.
Настоящее изобретение относится также к синергетической противомикробной композиции, содержащей: (а) флуометурон и (б) пиритион цинка (ZPT), в которой массовое соотношение флуометурона и ZPT составляет от 10:1 до 1:15.
Настоящее изобретение относится также к синергетической противомикробной композиции, содержащей: (а) флуометурон и (б) тиабендазол (TBZ), в которой массовое соотношение флуометурона и TBZ составляет от 10:1 до 1:15.
Настоящее изобретение относится также к синергетической противомикробной композиции, содержащей: (а) флуометурон и (б) дийодметил-пара-толилсульфон (DIMTS), в которой массовое соотношение флуометурона и DIMTS составляет от 10:1 до 1:15.
Подробное описание изобретения
В контексте настоящего описания перечисленные ниже понятия имеют указанные ниже значения, если из контекста ясно не следует иное. Флуометурон представляет собой 1,1-диметил-3-(α,α,α-трифтор-мета-толил)мочевину. Понятие «противомикробное соединение» относится к соединению, обладающему способностью ингибировать рост или контролировать рост микроорганизмов; в качестве противомикробных соединений можно применять бактерициды, бактеристатики, фунгициды, фунгистатики, альгициды и альгистатики в зависимости от применяемого уровня доз, системных условий и требуемого уровня контроля микроорганизмов. Понятие «микроорганизм» включает, например, грибы (такие как дрожжевые и плесневые грибы), бактерии и водоросли. В настоящем описании используются следующие сокращения: част./млн обозначает массовые части на миллион (мас./мас.), мл обозначает миллилитр, АТСС обозначает Американскую коллекцию типовых культур и МПК обозначает минимальную подавляющую концентрацию. Если не указано иное, то температуры даны в градусах Цельсия (°С), а проценты представляют собой массовые проценты (мас.%). Процентные содержания противомикробных соединений в композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, даны в пересчете на общую массу действующих веществ в композиции, т.е. самих противомикробных соединений, без учета каких-либо количеств растворителей, носителей, диспергирующих средств, стабилизаторов или иных материалов, которые могут присутствовать в композиции.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых противомикробная композиция содержит IPBC и флуометурон, массовое соотношение IPBC и флуометурона составляет от 8:1 до 1:7, предпочтительно от 6:1 до 1:5, предпочтительно от 5:1 до 1:5; предпочтительно от 6:1 до 1:4, предпочтительно от 5:1 до 1:4; предпочтительно от 4:1 до 1:4; предпочтительно от 5:1 до 1:3; предпочтительно от 4:1 до 1:3.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых противомикробная композиция содержит IPBC, флуометурон и DCOIT, массовое соотношение IPBC и флуометурона составляет от 2:1 до 1:2; предпочтительно от 3:1 до 1:1; предпочтительно от 2:1 до 1:1; массовое соотношение IPBC и DCOIT составляет от 7:1 до 4:1; предпочтительно от 8:1 до 5:1; предпочтительно от 7:1 до 5:1; предпочтительно от 6:1 до 5:1.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых противомикробная композиция содержит IPBC, флуометурон и DIMTS, массовое соотношение IPBC и DIMTS составляет от 2:1 до 1:2; предпочтительно от 3:1 до 1:1; предпочтительно от 2:1 до 1:1; массовое соотношение IPBC и DIMTS составляет от 7:1 до 4:1; предпочтительно от 8:1 до 5:1; предпочтительно от 7:1 до 5:1; предпочтительно от 6:1 до 5:1.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых противомикробная композиция содержит флуометурон и ZPT, массовое соотношение флуометурона и ZPT составляет от 10:1 до 1:12, предпочтительно от 8:1 до 1:12, предпочтительно от 10:1 до 1:10; предпочтительно от 8:1 до 1:10, предпочтительно от 7:1 до 1:10; предпочтительно от 6:1 до 1:10.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых противомикробная композиция содержит флуометурон и TBZ, массовое соотношение флуометурона и TBZ составляет от 10:1 до 1:12, предпочтительно от 8:1 до 1:12, предпочтительно от 10:1 до 1:10; предпочтительно от 8:1 до 1:10, предпочтительно от 7:1 до 1:10; предпочтительно от 6:1 до 1:10.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых противомикробная композиция содержит флуометурон и DIMTS, массовое соотношение флуометурона и DIMTS составляет от 10:1 до 1:12, предпочтительно от 8:1 до 1:12, предпочтительно от 10:1 до 1:10; предпочтительно от 8:1 до 1:10, предпочтительно от 7:1 до 1:10; предпочтительно от 6:1 до 1:10.
В некоторых вариантах осуществления изобретения противомикробные комбинации, предлагаемые в настоящем изобретении, включают в состав жидких композиций, прежде всего в состав дисперсий полимеров в водных средах. Биоцидные комбинации особенно пригодны для предохранения строительных материалов, таких, например, как адгезивы, уплотняющий состав, соединения, применяемые для склейки, герметик, обшивочный лист и т.д., краски, покрытия, полимеры, пластмассы, синтетический и натуральный каучук, продукты из бумаги, листы из стекловолокна, изоляционный материал, системы для наружной изолирующей отделки, рулонные кровельные материалы и материалы для настилки полов, строительные штукатурные растворы, материалы из древесины и древесно-пластмассовые композиционные материалы. В некоторых вариантах осуществления изобретения противомикробные композиции представляют собой латексные краски или другие жидкие композиции для нанесения покрытия, которые содержат биоцидные комбинации, предлагаемые в настоящем изобретении. Биоцидные комбинации можно применять для предохранения сухих пленочных покрытий, образующихся после нанесения краски или другой жидкой композиции для нанесения покрытий. В некоторых вариантах осуществления изобретения противомикробная композиция представляет собой акриловую латексную краску, которая содержит одну или несколько биоцидных комбинаций, предлагаемых в настоящем изобретении, или сухое пленочное покрытие, образовавшееся после нанесения краски на поверхность.
Как правило, содержание действующего вещества в биоцидных комбинациях, предлагаемых в настоящем изобретении, необходимое для контроля роста микроорганизмов, составляет от 100 до 10000 част./млн. В некоторых вариантах осуществления изобретения действующие вещества, входящие в композицию, присутствуют в количестве, составляющем по меньшей мере 300 част./млн, в других вариантах в количестве, составляющем по меньшей мере 500 част./млн, в других вариантах в количестве, составляющем по меньшей мере 600 част./млн, в других вариантах в количестве, составляющем по меньшей мере 700 част./млн. В некоторых вариантах осуществления изобретения действующие вещества, входящие в композицию, присутствуют в количестве, составляющем не более чем 8000 част./млн, в других вариантах в количестве, составляющем не более чем 6000 част./млн, в других вариантах в количестве, составляющем не более чем 5000 част./млн, в других вариантах в количестве, составляющем не более чем 4000 част./млн, в других вариантах в количестве, составляющем не более чем 3000 част./млн, в других вариантах в количестве, составляющем не более чем 2500 част./млн, в других вариантах в количестве, составляющем не более чем 2000 част./млн, в других вариантах в количестве, составляющем не более чем 1800 част./млн, в других вариантах в количестве, составляющем не более чем 1600 част./млн. Указанные выше концентрации представляют собой концентрации в жидкой композиции, содержащей биоцидные комбинации; уровни биоцидов в сухом пленочном покрытии должны быть более высокими.
Под объем настоящего изобретения подпадает также способ предупреждения роста микроорганизмов в строительных материалах, прежде всего в сухих пленочных покрытиях, заключающийся в том, что в материалы вносят любую из заявленных биоцидных комбинаций.
Флуометурон можно объединять более чем с одним соединением, выбранным из группы, включающей IPBC, DCOIT, OIT, ZPT, DIMTS и TBZ, с получением синергетических комбинаций, содержащих три или большее количество компонентов, которые не представлены в настоящем описании.
Примеры
2
Приготовление образца: Приготавливали образцы белой акриловой латексной краски, свободной от биоцидов, в виде аликвот объемом по 50 мл. Затем добавляли каждый биоцид до достижения необходимой концентрации действующего вещества в краске. Осуществляли тестирование при следующих общих концентрациях биоцидов: 750, 1500, 2500 и 5000 част./млн. После добавления биоцидов каждый образец перемешивали вручную в течение как минимум 30 с, после чего в течение 3 мин осуществляли смешение с помощью шейкера-миксера для красок (типа RED DEVIL). Каждый из образцов краски, а также контрольный образец (не содержащий биоцид), использовали для нанесения с помощью аппликатора типа Bird Bar пленок толщиной 3 мила (1 мил = 0,001 дюйма) на черные пластиковые панели из сополимера винилхлорида/ацетата (фирма LENETA, Мава, шт. Нью-Джерси). Панели тщательно сушили в течение 5 дней, избегая воздействия прямых солнечных лучей. Из каждой панели вырезали квадратные диски (15 мм) и использовали в качестве субстрата при проведении тестов на эффективность в отношении грибов и водорослей. Этот размер образца позволял иметь агаровую границу при помещении диска-образца в лунку тест-планшета.
Условия тестирования: Для поддержания роста микроорганизмов применяли соответствующие среды (3н. среду Болда (BOLD) для хлорофитов, BG-11 для цианобактерий и PDA для грибов). При оценке эффективности в отношении водорослей тест-планшеты выдерживали при комнатной температуре (25-26°С) в условиях циклического изменения света и темноты в течение 3 недель. В тестах с контрольным заражением грибами планшеты выдерживали при 30°С в течение трех недель. По окончании периода инкубации проводили балльную оценку образцов, подсчитывая процент площади, на которой визуально обнаружен рост микроорганизмов.
Инокулят водорослей
Организмы
Сокращение
Тип
Среда для тестирования
Gleocapsa sp.
Gs
ATCC 29159
одноклеточные колониальные цианобактерий
BG-11
Oscillatoria sp.
Os
ATCC 29135
нитчатые цианобактерий
BG-11
Nostoc commune
Nc
CCAP 1453/29
одноклеточные ценобиальные хлорофиты
BOLD
Trentepohlia aurea + Trentepohlia odorata
Ta + To
UTEX LB 429 + CCAP 483/4
нитчатые хлорофиты
BOLD
Организмы
Сокращение
Тип
Среда для тестирования
Chlorella sp.UTEX + Chlorella kessleri
Cs + Ck
ATCC 30582 + ATCC 11468
одноклеточные хлорофиты
BOLD
Calothrix parientina
Cp
UTEX LB 1952
нитчатые цианобактерии
BOLD
Инокулят грибов
Организмы
Сокращение
ATCC №
Среда для роста и тестирования
Aspergillus niger
An
9642
PDA
Penicillium funiculosum
Pf
11797
PDA
Cladosporium herbarum
Ch
11281
PDA
Aureobasidium pullulans
Ap
9348
PDA
Trichoderma viride
Tv
32630
PDA
Alternaria alternata
Aa
20084
PDA
Stachybotris chartarum
Sc
208877
PDA
Оценка эффективности в отношении водорослей - модифицированный метод ASTM 5589
8
ASTM 5589 представляет собой стандартный ускоренный метод тестирования (standard accelerated test method), предназначенный для оценки устойчивости различных покрытий (включая краски) к повреждению водорослями. Для его приспособления к условиям высокопроизводительного скрининга масштаб метода был уменьшен путем перехода от чашек Петри к 12-луночным планшетам. С помощью пары стерильных пинцетов помещали один образец в центр агаровой пробки (наверх) окрашенной стороной вверх. Каждую лунку инокулировали с использованием 150 мкл конкретного организма (1×10 КОЕ/мл), обращая внимание на то, чтобы вся поверхность (пленка краски, а также окружающий ее агар) была равномерно покрыта. Планшеты инкубировали в течение трехнедельного периода времени при комнатной температуре (25-26°С) в условиях циклического чередования фаз света (светильники модели OTT-Lite №OTL4012P, 40 Вт, 26 клм) и темноты. По окончании каждой недели оценивали общую покрытую площадь, при этом определение процента покрытой площади проводили, округляя результат до 5%. При проведении оценки пластин отмечали зоны ингибирования.
Тестирование для оценки эффективности в отношении грибов - модифицированный метод ASTM 5590
6
ASTM 5590 представляет собой стандартный ускоренный метод тестирования, предназначенный для оценки устойчивости различных покрытий (включая краски) к повреждению грибами. Для его приспособления к условиям высокопроизводительного скрининга масштаб метода был уменьшен путем перехода от чашек Петри к 12-луночным планшетам. Для проведения теста агаровую пробку помещали на дно каждой лунки стерильного 12-луночного планшета. С помощью пары стерильных пинцетов помещали один образец в центр агаровой пробки (наверх) окрашенной стороной вверх. Каждую лунку инокулировали с использованием 150 мкл конкретного организма (1×10КОЕ/мл), обращая внимание на то, чтобы вся поверхность (пленка краски, а также окружающий ее агар) была равномерно покрыта. Планшеты инкубировали в течение трехнедельного периода времени при 30°С во влажных условиях. Через две недели опыта по окончании каждой недели оценивали общий процент покрытой площади и регистрировали, округляя результат до 5%.
Коэффициент синергизма (SI)
Величину SI рассчитывали согласно методу, описанному у F.C.Kull и др., Applied Microbiology, том 9, 1961. При создании настоящего изобретения величину SI рассчитывали на основе приведенной ниже формулы с использованием минимальной подавляющей концентрации, которую определяли на основе процента ингибирования индивидуальным биоцидом каждого тестируемого микроорганизма.
SI=Qa/QA+Qб/QB+Qв/QB+…
Qa обозначает концентрацию биоцида А при его применении в составе смеси;
QA обозначает концентрацию биоцида А при его применении индивидуально;
Qб обозначает концентрацию биоцида Б при его применении в составе смеси;
QБ обозначает концентрацию биоцида Б при его применении индивидуально;
Qв обозначает концентрацию биоцида В при его применении в составе смеси;
QB обозначает концентрацию биоцида В при его применении индивидуально.
Если рассчитанная по данной формуле величина SI<1, то это означает, что смесь биоцидов обладает синергетическим действием.
Пример 1
Данное исследование проводили для изучения эффективности смесей IPBC и флуометурона в диапазоне массовых соотношений IPBC и флуометурона (Fluo) от 4:1 до 1:1. Установлено, что указанные смеси обладали очень высоким уровнем синергизма в отношении широкого спектра грибов и водорослей. Каждая протестированная смесь обладала синергетическим действием в отношении по меньшей мере одного организма при всех протестированных соотношениях IPBC и флуометурона. Результаты, полученные после выдерживания в течение трех недель, представлены в таблице 1 (для водорослей) и в таблице 2 (для грибов).
Таблица 1(водоросли)
Cs + Ck
Nc
Ср
Та + То
Gs
Os
смесь IPBC:Fluo (1:1)
общая конц., част./млн
1500
750
1500
2500
750
750
% ингибирования
95
97,5
97,5
87,5
100
95
SI
1,5
0,75
1,3
2,17
1
0,65
смесь IPBC:Fluo (2:1)
общая конц., част./млн
1500
750
1500
2500
750
750
% ингибирования
95
100
95
92,5
100
100
SI
1,33
0,67
1,07
1,78
1
0,53
смесь IPBC:Fluo (3:1)
общая конц., част./млн
1500
750
1500
2500
750
750
% ингибирования
100
95
100
92,5
95
97,5
SI
1,25
0,63
0,95
1,58
1
0,48
смесь IPBC:Fluo (4:1)
общая конц., част./млн
2500
750
1500
1500
750
750
% ингибирования
97,5
100
100
90
100
95
SI
2
0,6
0,88
0,88
I
0,44
IPBC
общая конц., част./млн
1500
1500
2500
2500
750
750
% ингибирования
97,5
87,5
97,5
85
95
70
флуометурон
общая конц., част./млн
750
750
750
750
750
1500
% ингибирования
100
100
100
95
95
95
Таблица 2(грибы)
Ар
Ch
Pf
An
Аа
Tv
смесь IPBC.Fluo (1:1)
общая конц., част./млн
1500
750
1500
750
750
750
% ингибирования
97,5
100
100
100
100
100
S1
0,6
0,65
1,3
0,65
0,65
0,75
смесь IPBC:FIuo (2:1)
общая конц., част./млн
1500
750
1500
750
750
750
% ингибирования
100
100
100
100
97,5
100
SI
0,6
0,77
1,53
0,77
0,77
0,83
смесь IPBC:Fluo (3:1)
общая конц., част./млн
750
750
1500
750
750
750
% ингибирования
100
97,5
100
100
100
97,5
SI
0,3
0,83
1,65
0,83
0,83
0,88
смесь IPBC:FIuo (4:1)
общая конц., част./млн
750
750
1500
750
750
750
% ингибирования
100
100
100
97,5
100
95
SI
0,3
0,86
1,72
0,86
0,86
0,9
IPBC
общая конц., част./млн
2500
750
750
2500
750
750
% ингибирования
97,5
75
97,5
97,5
97,5
90
флуметсулам
общая конц., част./млн
2500
2500
2500
2500
2500
1500
% ингибирования
97,5
90
97,5
35
25
57,5
Пример 2
Данное исследование проводили для изучения эффективности смесей IPBC и флуометурона в диапазоне массовых соотношений IPBC и флуометурона (Fluo) от 1:2 до 1:3. Установлено, что указанные смеси обладали очень высоким уровнем синергизма в отношении широкого спектра грибов и водорослей.
Каждая протестированная смесь обладала синергетическим действием в отношении по меньшей мере одного организма при всех протестированных соотношениях IPBC и флуометурона. Результаты, полученные после выдерживания в течение трех недель, представлены в таблице 3 (для водорослей) и в таблице 4 (для грибов).
Таблица 3(водоросли)
Cs + Ck
Nc
Ср
Та + То
Gs
Os
смесь IPBC:Fluo (1:3)
общая конц., част./млн
1500
750
750
750
2500
2500
% ингибирования
95
97,5
95
85
52,50
72,5
SI
0,3
0,83
0,82
0,88
1
2,33
смесь IPBC:Fluo (1:2)
общая конц., част./млн
2500
750
750
750
2500
750
% ингибирования
90
95
90
87,5
50
65
SI
0,5
0,77
0,77
0,83
1
0,37
IPBC
общая конц., част./млн
5000
2500
2500
1500
2500
1500
% ингибирования
90
90
90
82,5
50
62,5
флуометурон
общая конц., част./млн
5000,00
750
750
750
2500
2500
% ингибирования
90,00
90
95
82,5
42,5
62,5
Таблица 4(грибы)
Ар
Ch
Pf
An
Аа
Tv
смесь IPBC:FIuo (1:3)
общая конц., част./млн
750
750
750
750
1500
750
% ингибирования
70
82,5
72,5
90
62,5
72,5
SI
0,79
0,41
0,24
0,24
0,3
0,24
смесь IPBC:Fluo (1:2)
общая конц., част./млн
750
750
750
750
750
750
% ингибирования
95
87,5
82,5
85
82,5
82,5
SI
0,72
0,38
0,27
0,27
0,15
0,27
IPBC
общая конц., част./млн
750
1500
1500
1500
5000
1500
% ингибирования
60
75
60
80
50
72,5
флуметсулам
общая конц., част./млн
5000
5000
5000
5000
5000
5000
% ингибирования
0
0
27,5
0
0
0
Пример 3: Трехкомпонентные смеси биоцидов
Как продемонстрировано в таблицах 5 и 6, такие смеси также обладали синергетическим действием в отношении различных организмов при всех протестированных массовых соотношениях
Таблица 5(водоросли)
Cs + Ck
Nc
Ср
Та + То
Gs
Os
смесь IPBC:Fluo:DCOIT (6:3:1)
общая конц., част./млн
750
750
1500
2500
1500
1500
% ингибирования
75
97,5
87,5
90
67,5
80
SI
0,32
0,58
0,88
1,27
0,75
0,65
смесь IPBC:Fluo:DCOIT (5:5:1)
общая конц., част./млн
1500
1500
1500
1500
1500
750
% ингибирования
95
85
97,5
95
80
95
SI
0,64
0,68
0,83
0,82
0,65
0,98
смесь IPBC:Fluo:DIMTS (6:3:1)
общая конц., част./млн
1500
1500
1500
1500
1500
750
% ингибирования
70
75
77,5
82,5
77,5
95
SI
0,54
0,99
0,88
0,72
0,75
0,28
смесь IPBC:Fluo:DIMTS (5:5:1)
общая конц., част./млн
750
750
1500
1500
750
750
% ингибирования
80
100
95
90
75
97,5
SI
0,3
0,6
1,14
0,78
0,32
0,25
IPBC
общая конц., част./млн
2500
2500
5000
2500
1500
2500
% ингибирования
70
80
80
72,5
80
77,5
флуометурон
общая конц., част./млн
2500
750
750
1500
5000
5000
% ингибирования
80
85
90
62,5
67,5
82,5
DCOIT
общая конц., част./млн
1500
750
1500
1500
2500
750
% ингибирования
70
82,5
75
72,5
77,5
80
DIMTS
общая конц., част./млн
2500
5000
1500
2500
2500
1500
% ингибирования
70
80
85
62,5
80
80
Таблица 6(грибы)
Ар
Ch
Pf
An
Аа
Tv
Sc
смесь IPBC:FIuo:DCOIT (6:3:1)
общая конц., част./млн
750
1500
750
750
2500
750
1500
% ингибирования
82,5
100
90
750
95
100
85
SI
0,3
0,57
0,3
0,24
0,65
0,42
0,48
смесь IPBC:Fluo:DCOIT (5:5:1)
общая конц., част./млн
750
750
750
750
750
750
1500
Ар
Ch
Pf
An
Аа
Tv
Sc
% ингибирования
97,5
72,5
82,5
100
100
97,5
50
SI
0,3
0,29
0,3
0,22
0,22
0,39
0,44
смесь IPBC:Fluo:DIMTS (6:3:1)
общая конц., част./млн
750
750
1500
1500
2500
750
750
% ингибирования
97,5
100
77,5
100
90
95
72,5
SI
0,39
0,37
0,64
0,65
0,63
0,42
0,33
смесь IPBC:Fluo:DIMTS (5:5:1)
общая конц., част./млн
750
2500
750
750
2500
750
1500
% ингибирования
97,5
82,5
92,5
87,5
90
80
75
SI
0,39
1,21
0,32
0,3
0,71
0,39
0,59
IРВС
общая конц., част./млн
2500
2500
2500
2500
5000
1500
2500
% ингибирования
87,5
80
70
75
100
62,5
82,5
флуометурон
общая конц., част./млн
2500
2500
2500
5000
2500
2500
5000
% ингибирования
80
72,5
70
75
82,5
72,5
65
DCOIT
общая конц., част./млн
2500
500
2500
5000
5000
2500
5000
% ингибирования
77,5
67,5
82,5
75
87,5
60
32,5
DIMTS
общая конц., част./млн
2500
750
1500
750
2500
750
750
% ингибирования
77,5
72,5
82,5
75
77,5
90
50
Пример 4: Дополнительные смеси биоцидов
Применяли те же организмы и среды для роста, которые описаны в предыдущих примерах.
2
Приготовление образцов: В свободную от биоцидов белую акриловую латексную краску добавляли биоциды индивидуально или смесь биоцидов до достижения максимальной общей концентрации тестируемого действующего вещества/действующих веществ. Затем эту краску разводили свободной от биоцидов акриловой латексной краской в диапазоне концентраций от 75 до 12,5 мас.%, получая требуемые для тестирования концентрации. В зависимости от типа смесей биоцидов общие концентрации биоцидов варьировались от 200 до 5000 част./млн. После добавления биоцидов или после разведения каждый образец перемешивали вручную в течение по меньшей мере одной минуты до достижения однородного состояния. Каждый из образцов краски, а также контрольный образец (не содержащий биоцида), использовали для нанесения с помощью аппликатора типа Bird Bar пленок толщиной 3 мила (1 мил = 0,001 дюйма) на черные пластиковые панели из сополимера винилхлорида/ацетата (фирма LENETA, Мава, шт. Нью-Джерси). Панели тщательно сушили в течение по меньшей мере 2 дней, избегая воздействия прямых солнечных лучей. Из каждой панели вырезали квадратные диски (0,5 кв. дюйма, 13 мм) и использовали в качестве субстрата при проведении тестов на эффективность в отношении грибов и водорослей. Этот размер образца позволял иметь агаровую границу при помещении диска-образца в лунку тест-планшета. Каждый образец тестировали с дублированием.
Условия тестирования: Для поддержания роста микроорганизмов применяли соответствующие среды (3н. среду Болда (BOLD) для хлорофитов, BG-11 для цианобактерий и PDA для грибов). При оценке эффективности в отношении водорослей тест-планшеты выдерживали при комнатной температуре (25-26°С) в условиях циклического изменения света и темноты в течение четырех недель. В тестах с контрольным заражением грибами планшеты выдерживали при 30°С в течение четырех недель. По окончании периода инкубации проводили балльную оценку образцов, подсчитывая процент площади, на которой визуально обнаружен рост микроорганизмов.
Оценка эффективности в отношении водорослей - модифицированный метод ASTM 5589
6
6
ASTM 5589 представляет собой стандартный ускоренный метод тестирования, предназначенный для оценки устойчивости различных покрытий (включая краски) к повреждению водорослями. Для его приспособления к условиям высокопроизводительного скрининга масштаб метода был уменьшен путем перехода от чашек Петри к 6-луночным планшетам. С помощью пары стерильных пинцетов помещали один образец в центр агаровой пробки (наверх) окрашенной стороной вверх. Инокуляты водорослей приготавливали путем смешения взятых в одинаковых концентрациях (1×10 КОЕ/мл) и одинаковых объемах (в зависимости от количества предназначенных для инокуляции образцов) выращенных в одинаковых условиях организмов. В этом опыте применяли смесь цианобактерий Gloeocapsa sp.и Oscillatoria sp., выращенных на средах BG-11. Одноклеточные хлорофиты Chlorella sp., Chlorella kessleri и Nostoc commune смешивали и выращивали на средах BOLD. Нитчатые водоросли Trentepohlia aurea, Trentepohlia odorata и Calotrix parientina смешивали и выращивали на средах BOLD. Каждую лунку инокулировали с использованием 400 мкл смеси организмов (1×10 КОЕ/мл), обращая внимание на то, чтобы вся поверхность (пленка краски, а также окружающий ее агар) была равномерно покрыта. Планшеты инкубировали в течение четырехнедельного периода времени при комнатной температуре (25-26°С) в условиях циклического чередования фаз света (светильники модели OTT-Lite №OTL4012P, 40 Вт, 26 клм) и темноты. По окончании каждой недели оценивали общую покрытую площадь, при этом определение процента покрытой площади проводили, округляя результат до 5%. При проведении оценки пластин отмечали зоны ингибирования.
Тестирование для оценки эффективности в отношении грибов - модифицированный метод ASTM 5590
6
6
ASTM 5590 представляет собой стандартный ускоренный метод тестирования, предназначенный для оценки устойчивости различных покрытий (включая краски) к повреждению грибами. Для его приспособления к условиям высокопроизводительного скрининга масштаб метода был уменьшен путем перехода от чашек Петри к 6-луночным планшетам. Для проведения теста агаровую пробку помещали на дно каждой лунки стерильного 6-луночного планшета. С помощью пары стерильных пинцетов помещали один образец в центр агаровой пробки (наверх) окрашенной стороной вверх. Инокуляты грибов приготавливали путем смешения взятых в одинаковых концентрациях (1×10КОЕ/мл) и одинаковых объемах (в зависимости от количества предназначенных для инокуляции образцов) выращенных в одинаковых условиях организмов. Cladosporium herbarum применяли в смеси с Aureobasidium pullulans. Aspergillus niger применяли в смеси с Penicillium funiculosum. Alternaria alternata применяли в смеси Trichoderma viride. Каждую лунку инокулировали с использованием 400 мкл смеси организмов (1×10 КОЕ/мл), обращая внимание на то, чтобы вся поверхность (пленка краски, а также окружающий ее агар) была равномерно покрыта. Планшеты инкубировали в течение четырехнедельного периода времени при 30°С во влажных условиях. Через две недели опыта по окончании каждой недели оценивали общий процент покрытой площади и регистрировали, округляя результат до 5%. Результаты представлены ниже в таблицах 7-11.
Таблица 7Результаты оценки синергизма комбинации флуометурон:ОСОIТ
Аа + Ар
Ср + То + Та
Cs + Ck + Nc
Gs + Os
смесь Fluo:DCOIT (2,2:1)
общая конц., част./млн
2737,5
912,5
2737,5
912,5
% ингибирования
100
100
100
100
SI
1,4
1,0
3,0
3,0
смесь Fluo:DCOIT (2,9:1)
общая конц., част./млн
2521,9
1681,5
1681,25
420,3
% ингибирования
100
100
100
100
SI
1,1
1,8
1,8
1,4
смесь Fluo:DCOIT (4,3:1)
общая конц., част./млн
3075
3075
3075
384,37
% ингибирования
100
100
100
100
SI
1,2
3,0
3,0
1,2
смесь Fluo:DCOIT (1,1:1)
общая конц., част./млн
1200
600
600
1200
% ингибирования
100
82,5
92,5
87,5
SI
<0,8
0,8
0,8
4,0
смесь Fluo:DCOIT (1:1,8)
общая конц., част./млн
1325,3
1331,25
1331,25
887,5
% ингибирования
100
100
100
100
SI
1,1
1,9
1,9
3,0
смесь Fluo:DCOIT (1:10)
общая конц., част./млн
1625
632,5
632,5
1265
% ингибирования
1,4
100
100
100
SI
1,0
1,9
4,4
флуометурон
общая конц., част./млн
5000
1250
1250
312,5
% ингибирования
0
100
100
100
DCOIT
общая конц., част./млн
862,5
575
575
287,5
% ингибирования
100
100
100
100
Примечание: Поскольку максимальная концентрация флуометурона, протестированная в данном опыте при изучении его действия в отношении грибов, составляла 5000 част./млн, то указанную концентрацию использовали при расчете ожидаемого коэффициента SI. Уточнение путем использования символа «меньше чем» (<) включали только в соответствующие данные, SI<1.
NE обозначает, что при протестированной концентрации не была достигнута конечная точка.
Таблица 8Результаты оценки синергизма комбинации флуометурон:OIT
Аа + Ар
An + Pf
Ch + Tv
Ср + То + Та
Cs + Ck + Nc
Gs + Os
смесь Fluo:OIT (1:1)
общая конц., част./млн
3000
750
750
2250,5
1500
2250
% ингибирования
100
100
100
100
100
100
SI
1,4
<0,9
0,9
1,7
1,2
4,4
смесь Fluo:OIT (1:2)
общая конц., част./млн
1500
1500
1500
3000
2250
1500
% ингибирования
100
100
100
100
100
100
SI
<0,9
2,3
2,3
2,3
1,7
2,3
смесь Fluo:OIT (1:3)
общая конц., част./млн
2250
1500
1500
3000
3000
1500
% ингибирования
100
100
100
100
100
100
SI
1,4
2,6
2,6
2,3
2,3
2,0
смесь Fluo:OIT (1:5)
общая конц., част./млн
2700
2700
2700
3600
2500
2400
% ингибирования
100
100
100
100
100
100
S1
1,8
5,1
5,1
1,9
1,9
2,8
смесь FIuo:OIT (3:1)
общая конц., част./млн
2400
2400
1800
1800
1200
% ингибирования
100
100
100
100
100
SI
NE
1,7
1,7
1,4
1,4
6,3
смесь Fluo:OIT (2:1)
общая конц., част./млн
1350
1350
1975
1350
1350
% ингибирования
100
100
100
100
100
SI
NE
1,2
1,2
1,6
1,1
3,2
флуометурон
общая конц., част./млн
5000
5000
5000
1250
1250
312,5
% ингибирования
0
0
0
100
100
100
OIT
общая конц., част./млн
1350
450
450
1350
1350
1350
% ингибирования
100
100
50
50
100
100
Таблица 9Результаты оценки синергизма комбинации флуометурон:ZPT
Аа + Ар
An + Pf
Ср + То + Та
Cs + Ck + Nc
Gs + Os
смесь Fluo.ZPT (1:1)
общая конц., част./млн
NE
750
750
1500
750
% ингибирования
100
100
100
100
SI
<0,4
0,9
1,2
1,8
смесь Fluo:ZPT (1:3)
общая конц., част./млн
1500
1500
750
1500
750
% ингибирования
100
100
100
100
100
SI
<0,5
1,0
1,1
1,2
1,5
смесь Fluo:ZPT (1:5)
общая конц., част./млн
1500
1500
750
750
750
% ингибирования
100
100
100
100
100
S1
<0,6
1,1
1,1
0,6
1,4
смесь Fluo:ZPT (1:10)
общая конц., част./млн
2750
1375
687,5
687,5
687,5
% ингибирования
100
100
100
100
100
SI
1,1
1,0
1,1
0,6
1,2
смесь Fluo:ZPT (6:1)
общая конц., част./млн
NE
2800
600
725
725
% ингибирования
100
100
100
100
SI
<0,8
0,2
0,6
2,2
смесь Fluo:ZPT (4:1)
общая конц., част./млн
NE
2437,5
1625
1625
787,5
% ингибирования
100
100
100
100
SI
<0,8
1,6
1,3
2,3
смесь Fluo:ZPT (2:1)
общая конц., част./млн
750
2250
2250
1500
750
% ингибирования
100
100
100
100
100
SI
<0,2
<0,9
2,4
1,2
2,0
флуометурон
общая конц., част./млн
5000
5000
1250
1250
312,5
% ингибирования
0
0
100
100
100
DCOIT
общая конц., част./млн
2500
1250
625
1250
625
% ингибирования
100
100
100
100
100
Таблица 10Результаты оценки синергизма комбинации флуометурон:тиабендазол (TBZ)
Аа + Ар
An + Pf
Ch + Tv
Cp + To + Ta
Cs + Ck + Nc
Gs + Os
смесь Fluo:TBZ (1:1)
общая конц., част./млн
4000
3000
500
2000
4000
2000
% ингибирования
80
90
100
95
100
100
SI
<0,9
2,7
<0,5
0,9
2,4
3,4
смесь Fluo: TBZ (1:3)
общая конц., част./млн
4000
2000
500
500
4000
1000
% ингибирования
100
90
100
100
100
100
SI
1,0
2,5
<0,6
0,2
2,4
1,0
смесь Fluo: TBZ (1:5)
общая конц., част./млн
3000
2000
500
NE
NE
3000
% ингибирования
100
90
100
100
SI
<0,8
2,7
<0,7
2,1
смесь Fluo: TBZ (1:7)
общая конц., част./млн
4000
4000
501
4000
NE
NE
% ингибирования
100
90
100
100
SI
1,0
5,7
<0,7
1,1
смесь Fluo:TBZ (1:10)
общая конц., част./млн
NE
2887
517,25
3850
3850
NE
% ингибирования
90
100
100
100
SI
4,3
<0,8
1,0
1,7
смесь Fluo:TBZ (6:1)
общая конц., част./млн
NE
NE
1750
1750
1750
2625
% ингибирования
100
100
100
100
SI
<0,7
1,3
1,3
7,3
смесь Fluo:TBZ (4:1)
общая конц., част./млн
2812,5
NE
1875
458
1875
1875
% ингибирования
80
100
100
100
100
SI
<0,7
<0,9
0,3
1,4
4,9
смесь Fluo:TBZ (2:1)
общая конц., част./млн
2812,5
NE
468,75
468,75
3750
1875
% ингибирования
80
100
100
100
100
SI
<0,6
<0,3
0,3
2,5
4,1
флуометурон
общая конц., част./млн
5000
5000
5000
1250
1250
312,5
% ингибирования
0
0
0
100
100
100
TBZ
общая конц., част./млн
3750
625
2500
1875
1250
1875
% ингибирования
80
100
50
95
100
100
Таблица 11Результаты оценки синергизма комбинации флуометурон:Б1МТ8
Аа + Ар
An + Pf
Ср + То + Та
Cs + Ck + Nc
Gs + Os
смесь Fluo:DIMTS (1:1)
общая конц., част./млн
2250
750
750
2250
750
% ингибирования
100
100
95
100
100
SI
1,1
<0,7
0,5
1,8
1,4
смесь Fluo:DIMTS (1:3)
общая конц., част./млн
1500
750
1500
1500
NE
% ингибирования
100
100
100
100
SI
1,1
<0,9
0,9
1,2
смесь Fluo:DIMTS (1:5)
общая конц., част./млн
1500
1500
1500
750
NE
% ингибирования
100
100
100
100
SI
1,1
2,1
0,9
0,6
смесь Fluo:DIMTS (1:7)
общая конц., част./млн
750
750
750
750
1500
% ингибирования
100
100
100
100
100
SI
<0,5
1,1
0,4
0,6
1,3
смесь Fluo:DIMTS (1:10)
общая конц., част./млн
1500
750
750
750
3000
% ингибирования
100
100
100
100
100
SI
1,1
1,1
0,4
0,6
2,4
смесь Fluo:DIMTS (6:1)
общая конц., част./млн
NE
1400
NE
725
1400
% ингибирования
100
100
100
SI
<0,6
0,6
3,9
смесь Fluo:DIMTS (4:1)
общая конц., част./млн
NE
812,5
2250
2250
1625
% ингибирования
100
95
100
100
SI
<0,4
1,7
1,8
4,3
смесь Fluo:DIMTS (2:1)
общая конц., част./млн
NE
750
2250
750
750
% ингибирования
100
100
100
100
SI
<0,5
1,6
0,6
1,7
флуометурон
общая конц., част./млн
5000
5000
1250
1250
312,5
% ингибирования
0
0
100
100
100
DIMTS
общая конц., част./млн
1250
1250
1875
1250
1875
% ингибирования
100
100
95
100
100