2-Амино-1-(4-бромфенил)-5-(3,3-диметил-2-оксобутилиден)-4-оксо-4,5-дигидро-1Н-пиррол-3-карбоксамид, проявляющий цитотоксическую активность в отношении опухолевых клеток человека
2-AMINO-1-(4-BROMOPHENYL)-5-(3,3-DIMETHYL-2-OXOBUTYLIDENE)-4-OXO-4,5-DIHYDRO-1H-PYRROL-3-CARBOXAMIDE EXHIBITING CYTOTOXIC ACTIVITY AGAINST HUMAN TUMORAL CELLS

Заявляемое соединение относится к области медицины, производным 2-аминопиррола, а именно к новому биологически активному 2-амино-1-(4-бромфенил)-5-(3,3-диметил-2-оксобутилиден)-4-оксо-4,5-дигидро-1Н-пиррол-3-карбоксамиду I, имеющему формулу:
,
который может найти применение в медицине в качестве лекарственного противоопухолевого препарата.
Задачей изобретения является получение 2-амино-1-(4-бромфенил)-5-(3,3-диметил-2-оксобутилиден)-4-оксо-4,5-дигидро-1Н-пиррол-3-карбоксамида (2-АБФПК), который может быть использован в медицине в качестве действующего вещества лекарственного препарата для лечения опухолевых заболеваний.
Ближайшим структурным аналогом к заявленному соединению являются соединения общей формулы II, проявляющие противоопухолевую, антиоксидантную активность и описаны в патенте:
2-Амино-1-арил-5-(3,3-диметил-2-оксо-бутилиден)-4-оксо-N-(тиазол-5-ил)-4,5-дигидро-1Н-пиррол-3-карбоксамиды, проявляющие противоопухолевую и антирадикальную активность, способ их получения и фармацевтическая композиция на их основе: патент на изобретение РФ №2605091 по заявке 2015117807: МПК C07D 417/12, А61К 31/427, А61Р 35/00 / С.С. Зыкова, С.В. Бойчук, Н.М. Игидов, Т.Ф. Одегова, А.В. Захматов, А.Р. Галембикова, Б.Р. Рамазанов. - Заявл. 12.05.2015.
В качестве прототипа биологической активности нами взят противоопухолевый препарат - паклитаксел [Патент №2059631, МПК C07D 305/14, А61К 31/195. Производные таксола и фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой активностью: №91 5010248: заявл. 29.11.1991: опубл. 10.05.1996 / Валентино Дж. Стелла, Абрахам Е. Мэтью].
50
LD паклитаксела в тесте острой токсичности составляет 48 мг/кг.
Заявляемое соединение 2-АБФПК в тесте острой токсичности на мышах при внутрибрюшинном введении в виде суспензии в 2% крахмальной слизи имеет токсичность более 1000 мг/кг [Колла В.Э., Сыропятов Б.Я. Дозы лекарственных средств и химических соединений для лабораторных животных, М.: Медицина, 1998, 263 с.]
Целью предлагаемого изобретения является биологическая активность не описанного 2-амино-1-(4-бромфенил)-5-(3,3-диметил-2-оксобутилиден)-4-оксо-4,5-дигидро-1H-пиррол-3-карбоксамида (I, 2-АБФПК) проявляющего цитотоксическую активность в отношении опухолевых клеток человека. Поставленная цель достигается получением 2-амино-1-(4-бромфенил)-5-(3,3-диметил-2-оксобутилиден)-4-оксо-4,5-дигидро-1Н-пиррол-3-карбоксамида (I) взаимодействием 4-(4-бромфениламино)-2-трет-бутил-5-оксо-2,5-дигидрофуран-2-илацетата (II) с цианоацетамидом в присутствии триэтиламина в среде толуола по схеме:
пл
13
9
3
3
аром
аром
-1
1
Методика получения 2-амино-1-(4-бромфенил)-5-(3,3-диметил-2-оксобутилиден)-4-оксо-4,5-дигидро-1Н-пиррол-3-карбоксамида. 1.84 г (0.005 моль) 2-трет-бутил-4-(4-бромфениламино)-2,5-дигидро-5-оксофуран-2-илацетата (I) и 0.42 г (0.005 моль) цианоацетамида растворяли при нагревании в 90 мл толуола, добавляли 0.5 г (0.005 моль) триэтиламина, кипятили в течение 20 минут. Выпавший осадок отфильтровывали и перекристаллизовывали из этанола. Получали 1.04 г (62%) кристаллического вещества (I) с Т 209-210°С. CHBrNO. ИК-спектр, ν/см, вазелиновое масло: 3414 (NH), 3309 (NH), 1689 (С=O), 1673 (С=O), 1621 (C=N, С=С). Спектр ЯМР Н, δ, м.д.: 1.09 с (9Н, (t-Bu), 5.61 с (1Н, СН), 6.87 уш. с (1Н, NH), 7.34 уш. с (1Н, NH), 7.40 д (2Н, J 8.6 Гц), 7.79 д (2Н, J 8.4 Гц), 8.18 уш. c (1H, NH), 8.51 уш. с (1Н, NH).
13
Спектр ЯМР С, δ, м.д.: 26.12, 44.12, 88.59, 110.08, 122.64, 128.08, 128.78, 131.05, 131.81, 133.29, 140.64, 165.07, 166.24, 176.02, 207.75.
Заявляемое соединение представляет собой светло-желтое кристаллическое вещество, растворимое в ДМФА, уксусной кислоте, при нагревании - в этиловом спирте, устойчивое при хранении. Далее проводили контроль степени чистоты соединения при помощи тонкослойной хроматографии (ТСХ). Степень чистоты составила более 98%.
Сравнение цитотоксической активности паклитаксела и 2-АБФПК было проведено по общепринятой методике: были приготовлены маточные растворы в ДМСО. Маточный раствор прототипа готовили следующим образом: 1 мг паклитаксела (Sigma-algrich T7191) в 1,17 мл ДМСО (Хеликон, Am-O231-0.1) с конечной концентрацией 1 мМ. 2-АБФПК растворяли также в ДМСО, маточный раствор готовили растворением 0,013 г 2-АБФПК в 1,25 мл ДМСО с конечной концентрацией 5 мМ и 10 мМ.
Паклитаксел и 2-АБФПК добавляли к культурам опухолевых клеток клеточных линий лейомиосаркомы (SK-LMS-1), рабдомиосаркомы (RD), фибросаркомы (НТ1080), остеосаркомы (U2OS), рака молочной железы (НСС1806), а также гастроинтестинальных опухолей (GIST).
Изобретение подтверждается следующими графическими материалами, на которых представлено:
На фиг. 1 - результаты световой микроскопии клеток гастроинтестинальной стромальной опухоли (GIST - T1-R) под действием 2-АБФПК и паклитаксела (положительный контроль) в течение 24 часов культивирования.
На фиг. 2 - уровень экспрессии расщепленной формы ПАРП в клетках ГИСО под действием 2-АБФПК, паклитаксела и винбластина.
При изучении морфологических изменений опухолевых клеток человека под действием 2-АБФПК было обнаружено изменение их формы. Опухолевые клетки приобретали округлую форму, что соответствует их селективному накоплению в митозе. Аналогичные изменения наблюдались при инкубации опухолевых клеток с прототипом паклитакселом (Фигура 1), относящихся к группе препаратов - "митотических ядов", вызывающих необратимую полимеризацию тубулина, остановку деления клеток в М-фазе клеточного цикла и последующий запуск апоптоза вследствие незавершенности процессов деления.
Методом колориметрического MTS-теста была выявлена половинная ингибирующая доза (IC50) для 2-АБФПК в отношении разных опухолевых клеточных линий и нетрансформированных фибробластов человека (Табл. 1). Важно отметить, что цитотоксичность данного соединения была существенно выше в отношении большинства исследованных опухолевых клеточных линий (за исключением остео- и фибросаркомы) по сравнению с нетрансформированными клетками, что может свидетельствовать о потенциально высоком "терапевтическом окне" у исследуемого соединения. Важно также отметить, что соединение было также эффективным в отношении опухолевых клеток человека, резистентных к прототипу - паклитакселу, а также препаратам сравнения - иматинибу мезилату (см. Таблицу 1).
Для дальнейшего исследования механизмов цитотоксической активности соединения АБФПК была исследована их способность индуцировать клеточную гибель по механизму апоптоза. С этой целью был проанализирован уровень экспрессии расщепленной формы поли-АДФ-рибоза-полимеразы (ПАРП), являющийся традиционным маркером программированной клеточной гибели. Для клеток ГИСО был показан дозозависимый про-апоптотический эффект соединения 2-АБФПК, аналогичный эффекту паклитаксела и превышающий таковой у винбластина. Уровень экспрессии расщепленной формы ПАРП в клетках ГИСО под действием 2-АБФПК, паклитаксела и винбластина представлен на Фигуре 2. Уровень экспрессии белка актина иллюстрирует равную белковую нагрузку в исследуемых образцах. Аналогичные данные были получены на других клеточных линиях ГИСО, сарком и рака молочной железы.
Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что 2-АБФПК оказывает цитотоксический эффект в отношении широкого спектра опухолевых клеток человека, индуцируя их гибель по механизму апоптоза.