СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ПРЕЖДЕВРЕМЕННЫХ РОДОВ ИНФЕКЦИОННОГО ГЕНЕЗА
METHOD FOR PREDICTION OF PRETERM DELIVERY OF INFECTIOUS GENESIS

Предлагаемое изобретение относится к акушерству и, в частности, касается прогнозирования преждевременных родов инфекционного генеза.
Преждевременные роды в значительной мере определяют перинатальную заболеваемость и смертность. На долю недоношенных детей приходится 60-70% ранней неонатальной смертности (Кулаков В.И., Мурашко Л.Е. Преждевременные роды. М: Медицина, 2002, с.5).
Оценить вероятность наступления преждевременных родов очень сложно. Жалоб на тянущие боли в нижних отделах живота недостаточно для отнесения пациенток в группу высокого риска по развитию преждевременных родов (King J.F., Grant A., Keirse M.J., Chalmers I. Betamimetics in preterm labour: An overview of the randomized controlled trials. Br J Obstet Gynaecol. 1988; 95: 211-222).
Известен способ прогнозирования преждевременных родов инфекционного генеза путем определения экспрессии гена Toll-подобного рецептора-2 (TLR-2) в слизистой цервикального канала (Ганковская Л.В., Макаров О.В., Бахарева И.В., Ганковская О.А., Романовская В.В. Способ прогнозирования преждевременных родов, RU 2334233, 20.09.08), однако данный способ не имеет точных пороговых значений. Кроме того, имеется большой разброс абсолютных значений показателей экспрессии TLR-2. Чувствительность метода составляет 70%. Этот способ принят за ближайший аналог.
Основная роль в иммунной защите организма беременной женщины отводится врожденному иммунитету (Макаров О.В., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Ганковская О.А. Невынашивание беременности, инфекция, врожденный иммунитет, Москва, «ГЭОТАР-Медиа», 2007, с.176).
Важную роль в защите репродуктивной системы женщины от инфекционных агентов играют противомикробные пептиды. Они экспрессируются в слизистой оболочке половых путей (Кокряков В.Н. Очерки о врожденном иммунитете. СПб.: Наука, 2006: 261). Дефензины обладают прямым противомикробным действием.
Уровень β-дефензина 1 (HBD 1) в слизистой шейки матки определяет возможность проникновения инфекционного агента из влагалища в матку.
Снижение экспрессии гена HBD 1 не позволяет обеспечивать достаточный барьер для инфекционных агентов в шейке матки, что приводит к восходящему инфицированию и развитию преждевременных родов. На основании этих данных показатель экспрессии гена HBD 1 клетками слизистой оболочки цервикального канала был выбран для прогнозирования преждевременных родов.
Нами была поставлена задача поиска прогностических факторов для преждевременных родов инфекционного генеза. Наиболее удачным материалом для исследования мы посчитали эпителий цервикального канала в связи с легкостью забора, малой инвазивностью, пограничным положением, обеспечивающим барьер для инфекции между влагалищем и шейкой матки. Высокой информативностью для определения экспрессии гена HBD-1 является полимеразная цепная реакция в реальном времени.
Задача изобретения - усовершенствование прогнозирования преждевременных родов для определения оптимальной тактики ведения беременных группы высокого инфекционного риска.
Техническим результатом предлагаемого способа является повышение точности прогнозирования преждевременных родов с возможностью выбора адекватного профилактического лечения и увеличение арсенала средств прогнозирования.
Технический результат достигается за счет определения экспрессии гена HBD 1 эпителиоцитами цервикального канала методом ПЦР в реальном времени в период начиная с 28 недели беременности.
3
3
3
3
3
Было обследовано 53 беременных. Из них 33 беременных, поступивших в родильный дом с диагнозом «угроза преждевременных родов», у которых было выявлено носительство урогенитальных инфекций и 20 здоровых беременных женщин (контроль) в сроках 28-32 недели беременности. Из 33 женщин основной группы 15 родили преждевременно, остальные 18 благополучно доносили беременность до срока. При изучении уровня экспрессии гена HBD 1 были получены следующие результаты. Средний уровень экспрессии HBD 1 слизистой цервикального канала в группе женщин, родивших преждевременно, был достоверно ниже среднего уровня этого показателя у пациенток, родивших в срок (17,17±3,26×10кДНК по сравнению с 119,6±69,03×10 кДНК; р<0,05 по критерию Манна-Уитни) (фиг.1. Средний уровень экспрессии HBD1 в слизистой цервикального канала у обследованных женщин (количество копий × 10)). При пороговом значении экспрессии HBD1 25,0×10 кДНК чувствительность прогнозирования преждевременных родов составила 86,7%, то есть из всех женщин, родивших преждевременно, у 86,7% уровень экспрессии HBD-1 был ниже 25,0×10 кДНК. Полученные данные дали возможность использовать полученные цифровые значения изученного показателя для прогнозирования преждевременных родов инфекционного генеза. Чувствительность предложенного способа в сравнении с ближайшим аналогом представлена на фиг.2.
3
3
3
Способ осуществляется следующим образом. Клетки эпителия цервикального канала начиная с 28 недели беременности получают при помощи цервикальной цитощетки. Из клеток выделяют РНК. Затем проводят обратную транскрипцию (синтез кДНК на матрице РНК) с последующей ПЦР в реальном времени. Количество копий кДНК определяют относительно 1×10 копий к ДНК β-актина. Если в клетках эпителия определяют уровень экспрессии гена противомикробного пептида β-дефензина 1 ниже 25,0×10копий кДНК относительно 10 копий кДНК β-актина, прогнозируют преждевременные роды.
Заявленный способ поясняется на следующих конкретных примерах.
Пример 1 (Здоровая беременная, контрольная группа)
Беременная Ц., 27 лет с диагнозом: II срочные роды. Отеки. Осмотр родовых путей.
На учете в ЖК состояла с 14 недель беременности, условия жизни средние. Соматические заболевания: в. оспа, краснуха. Менструальная функция с 13 лет, регулярная через 24 дня по 5 дней. При обследовании методом ПЦР амбулаторно инфекций не выявлено. Данная беременность 3-я, наступила самопроизвольно, в анамнезе 1 срочные роды без особенностей и 1 самопроизвольный выкидыш. Беременность осложнилась токсикозом 1 половины, анемией. Поступила в стационар в сроке 38-39 недель беременности в родах. Продолжительность родов 7 часов 20 минут, безводный промежуток 5 часов. Родилась живая доношенная девочка 3450 г, 51 см, с оценкой по шкале Апгар на 1 минуте 8 баллов, на 5 минуте 9 баллов. Ребенок выписан вместе с матерью на 4 сутки.
Для изучения экспрессии гена HBD1 была использована методика, состоящая из нескольких этапов: получение клеток цервикального канала, выделение из полученных клеток РНК, обратная транскрипция (синтез на матрице РНК кДНК) и проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени (Херингтон С., Макги Дж. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. М.: Мир, 1999).
Стерильным ватным тампоном аккуратно удаляют слизь из цервикального канала. Клетки слизистой цервикального канала берут цервикальной цитощеткой и отмывают от слизи культуральной средой Игла. Клеточную суспензию осаждают с помощью центрифугирования (1500 об/мин, 10 мин). Осадок, содержащий клетки цервикального канала, разбавляют культуральной средой Игла объемом 100 мкл и используют в работе.
К полученным клеточным суспензиям добавляют равный объем лизирующего гуанидинтиоционатного буфера (4М гуанидинтиоционат (ДиаМ, РФ), 0,25 мМ цитрат Na pH 7 (Sigma, США), 0,5% лаурилсаркозин (Serva, США), 0,1М 2-меркаптоэтанол (Merck, ФРГ)). Лизат, полученный через 15 минут инкубации при комнатной температуре, смешивают с 14 мкл AcONa 3М, pH 5,0 (Реахим, РФ), затем добавляют 1/2 общего объема фенола (pH 5,2) и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин. Далее в пробирку с образцом добавляют 1/3 общего объема хлороформа и 20 мкл ацетата Na, встряхивают в течение 5 мин и центрифугируют при 10000 об/мин в течение 10 мин. Водную фазу отбирают в пробирку с 140 мкл изопропилового спирта и проводят инкубацию при температуре -70°С в течение 4-х часов. Далее пробы центрифугируют при 10000 об/мин в течение 10 минут. Осадок промывают 200 мкл 80% этилового спирта, растворяют в 20 мкл дистиллированной (без РНК) воды и хранят при -70°С. Количество полученной РНК оценивают с помощью электрофоретического разделения в 0,8% агарозном геле в присутствии маркеров с известной молекулярной массой (0,1-0,5 мкг).
В реакции обратной транскрипции используют 0,2 мкг РНК. Реакционная смесь содержит dNTP в концентрации 2,5 мM каждого нуклеотида (СибЭнзим, РФ), 10 нмолей random гексамеров (Синтол, РФ), 10 нмолей HBD1-специфического праймера (Синтол, РФ) и 10 ед. ревертазы М-MLV (СибЭнзим, РФ). Проводят отжиг random гексамеров и специфического праймера на матрице мРНК при температуре 75°С в течение 3-х мин. Остальные компоненты реакции добавляют при температуре +4°С. Дальнейшую инкубацию проводят при температуре 37°С в течение 1 ч, инактивацию фермента проводят при 94°С в течение 5 мин. Полученную кДНК хранят при -70°С.
В качестве контроля прохождения реакции обратной транскрипции и для стандартизации метода используют ПЦР-систему на определение экспрессии гена бета-актина.
3
Полимеразную цепную реакцию в реальном времени проводят с использованием наборов реактивов для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBR Green I (Синтол, Россия) и специфических праймеров. В готовую смесь добавляют по 2 мкл кДНК, полученной после реакции обратной транскрипции. Условия прохождения ПЦР со специфическими праймерами к гену бета-актину и гену HBD1 были смоделированы с помощью программы VectorNTI 8,0 в соответствии с последовательностями мРНК, опубликованными в базе данных Gene Bank. Отрицательным контролем служит проба с реакционной смесью, не содержащая мРНК. ПЦР в реальном времени проводят на приборе АНК-16 (Синтол, РФ) по следующей схеме (94°С 15 с и 60°С 50 с) 40 циклов. Полученные результаты анализируют с помощью лицензированной программы, прилагающейся к прибору АНК-16. Расчет количества копий кДНК гена бета-актина и HBD1 проводится относительно разработанных ранее калибровочных прямых. Количество копий кДНК исследуемого гена определяли относительно 1×10 копий кДНК гена бета-актина.
3
3
У данной пациентки показатель экспрессии HBD1 составил 166,0×10кДНК (более 25,0×10 кДНК - срочные роды).
Пример 2 (носитель урогенитальной инфекции, преждевременные роды)
Беременная М., 34 года с диагнозом: II преждевременные роды в сроке 34-35 недель. Дефект плаценты. Эпидуральная анестезия. Ручное обследование стенок полости матки. Осмотр родовых путей.
На учете в ЖК состояла с 9 недель беременности, условия жизни средние. Соматические заболевания: хр. тонзиллит (ремиссия). Менструальная функция с 14 лет, регулярная через 28 дней по 5 дней. При обследовании методом ПЦР амбулаторно во время беременности выявлен уреаплазмоз. Данная беременность 4-я, наступила самопроизвольно, в анамнезе 1 срочные роды без особенностей и 2 мед. аборта без осложнений. Беременность осложнилась ОРВИ с повышением температуры до 38°С в первом триместре, угрозой выкидыша. Поступила в стационар в сроке 33 недели беременности с диагнозом «угроза преждевременных родов». При поступлении взята проба на HBD1. Несмотря на проведение сохраняющей терапии в сроке 34-35 недель развилась родовая деятельность. Роды проведены под эпидуральной анестезией. Продолжительность родов 5 часов 20 минут, безводный промежуток 3 часа. Родилась живая недоношенная девочка 1980 г., 45 см, с оценкой по шкале Апгар на 1 минуте 7 баллов, на 5 минуте 8 баллов. Ребенок находился в детском отделении с диагнозом «СДР, гипоксически-ишемическое поражение ЦНС. Церебральная гипоксия 1 степени. Недостаточность питания». Женщина выписана на 5 сутки после проведения курса антибактериальной терапии. Ребенок переведен на второй этап выхаживания.
3
3
У данной пациентки показатель экспрессии HBD1 составил 8,3×10кДНК (менее 25,0×10 кДНК - преждевременные роды).
Пример 3 (носитель УГИ, срочные роды)
Беременная П., 31 года с диагнозом: II срочные роды. ЭКО. Отеки. Микоплазмоз. Осмотр родовых путей.
На учете в ЖК состояла с 10 недель беременности, условия жизни средние. Соматические заболевания: хр. холецистит (ремиссия). Менструальная функция с 13 лет, регулярная через 30 дней по 5 дней. При обследовании методом ПЦР амбулаторно выявлен микоплазмоз. Данная беременность 4-я, наступила путем ЭКО (непроходимость маточных труб), в анамнезе 1 срочные роды без особенностей и 2 мед. аборта без осложнений. Беременность протекала без осложнений. Роды начались самопроизвольно. Продолжительность родов 6 часов, безводный промежуток 2 часа. Родился живой доношенный мальчик 2970 г, 50 см, с оценкой по шкале Апгар на 1 минуте 8 баллов, на 5 минуте 9 баллов. Ребенок выписан вместе с матерью на 4 сутки после родов.
3
3
Показатель экспрессии HBD1 46,9×10 кДНК (более 25,0×10 кДНК - роды в срок)
Пример 4. Беременная Д., 24 лет, поступила в стационар с диагнозом: «Беременность 28-29 недель. Головное предлежание. Угроза преждевременных родов. Носительство вируса простого герпеса, цитомегаловируса».
Из анамнеза: Менструальная функция с 14 лет, регулярная через 28 дней по 5 дней. При обследовании методом ПЦР выявлено носительство ВПГ, ЦМВ. Данная беременность 2-я, наступила самопроизвольно, в анамнезе 1 медицинский аборт. Беременность осложнилась токсикозом 1 половины, анемией.
3
При поступлении осуществили взятие материала слизистой цервикального канала. Экспрессия гена HBD-1 слизистой цервикального канала составила 38,9×10 кДНК. Согласно предлагаемому нами критерию пациентка не отнесена к группе высокого риска преждевременных родов.
В дальнейшем женщина родила в срок доношенную девочку 3580 г, 53 см, с оценкой по шкале Апгар 8/9 баллов.
Пример 5. Пациентка Б, 32 лет, поступила в стационар с диагнозом: «Беременность 28-29 недель. Головное предлежание. Угроза преждевременных родов. Носительство вируса простого герпеса».
Из анамнеза: Менструальная функция с 14 лет, регулярная через 28 дней по 4 дня. При обследовании методом ПЦР выявлено носительство ВПГ. Данная беременность 2-я, наступила самопроизвольно, в анамнезе 1 самопроизвольный выкидыш в малом сроке беременности. Беременность осложнилась анемией.
3
При поступлении осуществили взятие материала слизистой цервикального канала. Экспрессия гена HBD-1 слизистой цервикального канала у нее составила 13,8×10 кДНК. Согласно предлагаемому нами критерию пациентка отнесена к группе высокого риска преждевременных родов.
В дальнейшем у пациентки произошли преждевременны роды в сроке 34 недели, родилась живая недоношенная девочка 2100 г, 46 см, с оценкой по шкале Апгар 6/7 баллов.
Таким образом, предложенный способ удобен в применении и высоко информативен, чувствительность методики достаточно высока и превосходит аналогичные способы. Заявленное изобретение позволит осуществлять прогнозирование преждевременных родов и отбор пациенток для профилактической терапии с помощью конкретного критерия. Использование данного изобретения будет способствовать более объективному прогнозированию преждевременных родов и позволит снизить затраты на лечение женщин группы низкого риска.