Межвидовой перенос ядра: непреодолимый природный барьер или временное техническое препятствие?

Новости клеточных технологий

кальциевых волн и кальциевых пиков, и помимо этого были способны давать начало эндотелиальным клеткам и клеткам гладкой мускулатуры сосудов.

Каким образом \ЛЛ;1 + клетки соотносятся с ТЬх18+ клетками, неясно, так как авторы работы не анализировали их на предмет экспрессии ТЬх18. В действительности, они отличаются лишь способностью образовывать эндотелий сосудов: \ЛЛ;1 + клетки могут дифференцироваться в эндотелиальные элементы, а ТЬх18+ — нет. К сожалению, пока не создано общей картины экспрессии стадиеспецифических маркеров, позволяющей получить исчерпывающее представление о кардиоми-огенезе, и говорить о ТЬх18+ и \ЛЛ;1 + клетках как о самостоятельных клеточных популяциях, по-видимому,

преждевременно. Скорее, они представляют собой различные стадии коммитирования уже известных клеток-предшественниц. Также сомнительна их перспективность для клеточной терапии.

Неясно также, насколько видоспецифична экспрессия некоторых из описанных маркеров. Обсуждаемые эксперименты были проведены на мышах, однако более ранние работы на куриных эмбрионах показали иные результаты, свидетельствующие о том, что клетки проэпикарда вовсе не дифференцируются в кардио-миоциты in vivo [14—18]. Это ставит под сомнение о возможность экстраполяции данных, полученных на экспериментальных объектах, на эмбриогенез сердца человека.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Olson Е. N. A decade of discoveries in cardiac biology. Nature Med. 2004; 10: 467-74.

2. Srivastava D. Making or breaking the heart: from lineage determination to morphogenesis. Cell 2006; 126: 1037—48.

3. Murry C.E., Field L.J., Menasche P. Cell-based cardiac repair: reflections at the 10-year point. Circulation 2005; 112: 3174—83.

4. Buckingham М., Meilhac S., Zaffran S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Rev. Genet. 2005; 6: 826-35.

5. Cai C.-L., Liang X., Shi Y. et al. Isl1 identifies a cardiac progenitor population that proliferates prior to differentiation and contributes a majority of cells to the heart. Dev. Cell 2003; 5: 877-89.

6. Kelly R., Evans S.M. The secondary/anterior heart field. Heart Development and Regeneration teds Rosenthal, N. S. Harvey R. P.] [Academic, San Diego, in the press],

7. Mikawa T., Fischman D. A. Retroviral analysis of cardiac morphogenesis: discontinuous formation of coronary vessels. Proc. Natl Acad. Sci. USA 1992; 89: 9504-8.

8. Mikawa T., Gourdie R.G. Pericardial mesoderm generates a population of coronary smooth muscle cells migrating into the heart along with ingrowth of the epicardial organ. Dev. Biol. 1996; 174: 221—32.

9. Gittenberger-de Groot A.C., Vrancken Peeters M.P., Mentink M.M., Gourdie R.G., Poelmann R.E. Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions. Circ. Res. 1998; 82: 1043-52.

10. Lepilina A., Coon A.N., Kikuchi K. et al. A dynamic epicardial injury

response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell 2006; 127: 607—19.

11. Kraus F., Haenig B., Kispert A. Cloning and expression analysis of the mouse T-box gene Tbx18. Mech. Dev. 2001; 100: 83—6.

12. Pwrez-Pomares J.M., Carmona R., GonzBlez-lriarte M. et al. Origin of coronary endothelial cells from epicardial mesothelium in avian embryos. Int. J. Dev. Biol. 2002; 46: 1005—13.

13. Smart N.. Risebro C.A., Melville A.A. et al. Thymosin b4 induces adult epicardial progenitor mobilization and neovascularization. Nature 2007; 445: 177-82.

14. Wilm B., Ipenberg A., Hastie N.D., Burch J.B., Bader D.M. The serosal mesothelium is a major source of smooth muscle cells of the gut vasculature. Development 2005; 132: 5317—28.

15. Merki E., Zamora M., Raya A. et al. Epicardial retinoid X receptor a is required for myocardial growth and coronary artery formation. Proc. Natl Acad. Sci. USA 2005; 102: 18455-60.

16. Gittenberger-de Groot A.C., Vrancken Peeters M.P., Mentink M.M., Gourdie R.G., Poelmann R. E. Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions. Circ. Res. 1998; 82: 1043-52.

17. Dettman R.W., Denetclaw W.J., Ordahl C.P., Bristow J. Common epicardial origin of coronary vascular smooth muscle, perivascular fibroblasts, and intermyocardial fibroblasts in the avian heart. Dev. Biol. 1998; 193: 169-81.

18. Mikawa T., Gourdie R.G. Pericardial mesoderm generates a population of coronary smooth muscle cells migrating into the heart along with ingrowth of the epicardial organ. Dev. Biol. 1996; 174: 221—32.

Подготовила А.С. Григорян По материалам: Cai C.-L., Martin J.C., Sun Y. et al. A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells. Nature 2008; 454: 104-8. Zhou B„ Ma Q„ Rajagopal S., Wu S.W. et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte

lineage in the developing heart. Nature 2008:453:109-14

Межвидовой перенос ядра: непреодолимый природный барьер или временное техническое препятствие?

Клонирование методом переноса ядра (somatic cell nuclear transfer, SCNT) с целью получения эмбриональных стволовых клеток ИСК) человека сталкивается с серьезными морально-этическими проблемами, связанными с использованием женских овоцитов [1 ]. Так, если исследования ЭСК приведут к их рутинному использованию в клинической практике, то овоциты могут стать своего рода товаром, а женщины попадут под особое давление. Кроме того, отдаленные последствия самой процедуры получения овоцитов у женщин-доноров (к примеру, связанные с многократной гормональной стимуляцией) пока не ясны. К настоящему моменту предложено несколько альтернатив, позволяющих не привлекать овоциты для получения ЭСК. Во-первых, — это

отказ от использования овоцитов вообще и переход от технологии переноса ядра к направленному перепрограммированию генома за счет активации экспрессии определенных генов (получение 1РБ-клеток). Во-вторых, — индукция дифференцировки овоцитов из стволовых клеток другого происхождения. В-третьих, попытки применения овоцитов от других видов животных (т. н. межвидовой БСЫТ, 1БСЫТ).

В своем классическом варианте метод БСЫТ заключается в пересадке ядра (кариопласта) соматической клетки в предварительно энуклеированную яйцеклетку (цитопласт), находящуюся в профазе II деления мейо-за. Благодаря данной технологии к настоящему моменту удалось клонировать многие виды животных, а также

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, N» 4, 2008

А

Новости клеточных технологий

получить бластоцисты человека [2]. В случае iSCNT источником кариопласта и цитопласта являются клетки, происходящие от различных видов животных, но в этом случае эффективность метода значительно снижается, и успешное репродуктивное клонирование остается возможным лишь при использовании близкородственных видов [3]. Эмбрионы, полученные с помощью процедуры iSCNT, способны развиваться до стадии бластоцисты и в некоторых случаях давать начало культуре ЭСК.

Причина низкой жизнеспособности и нарушений развития таких межвидовых гибридов лежит в несовместимости цитоплазматических факторов (мРНК и белков) овоцита и вводимого генетического материала, который содержится в ядре соматической клетки. Хотя генная транскрипция в клетках сформированного зародыша может наблюдаться уже на самых ранних стадиях деления [4], за эмбриональное развитие длительное время (вплоть до 16-клеточной стадии у коровьего эмбриона) в основном отвечают продукты, заранее накопленные в овоците. Полагают, что явление «перепрограммирования» ядра, наблюдаемое при SCNT, зависит именно от этих овоцитарных факторов.

Кроме того, несовместимость цитоплазмы и ядра в межвидовых гибридных эмбрионах, приводящая в итоге к их гибели, во многом связана с присутствием в цитоплазме эмбриональных клеток чужеродного митохондриального генома. Как и в случае переноса ядра, трансфер митохондрий из клеток животного одного вида в лишенные митохондрий клетки животного другого вида может быть успешен лишь у близкородственных видов. Например, в клеточных линиях человека, не содержащих митохондрий, «приживаются» и функционируют митохондрии из клеток шимпанзе и гориллы, чего, однако, не происходит с митохондриями орангутана [3]. Более того, в период имплантации экспрессия минорных антигенов гистосовместимости, кодируемых «чужеродной» митохондриальной ДНК, потенциально может приводить к иммуноопосредованному отторжению гибридного эмбриона.

Полагают, что в межвидовых гибридных эмбрионах происходит дисрегуляция генной экспрессии вследствие несовместимости цитопласта и кариопласта. Известно, к примеру, что активация ядра (активация генной транскрипции в клетках эмбриона после оплодотворения) у разных видов происходит в различные моменты развития [4], что может отражаться на процессах перепрограммирования ядра в межвидовых гибридах. Тем не менее, до настоящего времени характер транскрипции генов, задействованных в контроле эмбриогенеза в межвидовых SCNT-гибридах не анализировался. Особый интерес в этом случае представляет исследование экспрессии генов, контролирующих недифференцированный статус эмбриональных клеток, вовлеченных в адгезионные взаимодействия во время образования морулы и бластоцисты, а также отвечающих за первичную клеточную специализацию в бластоцисте.

Какое влияние оказывают чужеродные цитоплазматические факторы на активацию и динамику генной экспрессии в межвидовых гибридных эмбрионах? На этот вопрос попытались ответить китайские исследователи под руководством H.Z. Sheng и D.Y. Chen, которые для анализа выбрали три центральных регулятора плюрипо-тентности — транскрипционные факторы 0ct4, Sox2 и Nanog, а также Е-кадгерин — адгезивную молекулу, необходимую для формирования бластоцисты (установления адгезионных контактов в трофобласте). При этом источником цитопласта служил овоцит коровы, а генетический

материал принадлежал фибробласту человека. Подходящие для эксперимента незрелые овоциты отбирались по морфологическим критериям (гомогенность цитоплазмы, наличие нескольких слоев фолликулярных клеток), после чего клетки культивировались до достижения зрелого состояния. В эксперименте использовали овоциты, находящиеся в метафазе II деления мейоза. После обработки цитохалазином В проводилась аспирация митотических хромосом и первого полярного тельца с помощью микропипетки. Затем в перивителлиновое пространство энуклеированного овоцита помещали человеческий фибробласт. Слияние цитоплазматических мембран полученного гибридного комплекса проводилось с помощью электрофузионной системы. Через 3 часа гибридные эмбрионы подвергались химической активации иономицином и культивировались на монослое мышиных эмбриональных фибробластов.

Успешность процедуры !БСЫТ подтверждалась на стадии 16-клеточного эмбриона методом качественной ПЦР с использованием праймеров к специфическим последовательностям генома человека и коровы (соответственно альфоидная и А1и-подобная последовательности). Анализ экспрессии мРНК транскрипционных факторов человека Ск±4, Бох2 и 1Мапод, а также Е-кад-герина проводили методом обратнотранскриптазной ПЦР (ОТ-ПЦР). В качестве «референсной» экспрессии анализировалась экспрессия гена р-актина человека, а положительным контролем ОТ-ПЦР служила экспрессия

р

века и коровы. Последовательность амплифицирован-ных ПЦР -продуктов была затем подтверждена путем секвенирования.

Всего было осуществлено 28 опытов по переносу ядра, в результате которых исследователи получили 3315 гибридных эмбрионов. Из них 8-клеточной стадии достигли 21,4% гибридов, 16-клеточной — 9%, стадии бластоцисты — 0,87% (29 гибридов). Сама технология получения таких цитоплазматических гибридов оказалась высоко эффективной: абсолютное большинство проанализированных 16-клеточных гибридных зародышей содержало геном человека, о чем свидетельствовало присутствие характерных альфоидных повторов.

Экспрессия генов человека 0й4, Бох2, 1Мапод и Е-кад-герина анализировалась сразу после слияния клеток, на 2-, 4-, 8-, 16-клеточной стадиях, стадии морулы и бластоцисты. Интересно, что уже на одноклеточной стадии у некоторых гибридов был отмечен низкий уровень экспрессии 0й4 (2 из 24) и Бох2 (3 из 47). По словам авторов, экспрессия факторов транскрипции 0й4 и Бох2 может также наблюдаться в фибробластах еще перед слиянием. Действительно, в литературе имеют место сообщения о том, что в некоторых дифференцированных клетках может отмечаться слабая, но устойчивая экспрессия этих генов плюрипотентности [5]. Тем не менее, значимость подобной экспрессии не ясна, и, более того, это может быть результатом амплификации присутствующих в геноме псевдогенов, что, в частности, было недавно показано для 0й4 [6].

Активация генной транскрипции в гибридных эмбрионах происходила при переходе от 8-клеточной к 16-клеточной стадии развития: на обеих стадиях отмечалась выраженная экспрессия всех четырех исследуемых генов. Это позволило авторам сделать вывод о том, что время активации эмбрионального генома определяется факторами, происходящими от клетки-донора цитопласта, т. е. коровьего овоцита. У эмбриона человека запуск генной транскрипции происходит несколько

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, N» 4, 2008

Новости клеточных технологий

раньше, чем у крупного рогатого скота — при переходе от 4- к 8-клеточной стадии [7].

Тем не менее, генная экспрессия в полученных гибридных эмбрионах была неоднородной и, по-видимому, носила случайный характер. В то время как в одних гибридных клетках отмечалась выраженная экспрессия всех четырех генов, в других обнаруживались лишь некоторые транскрипты либо экспрессия вовсе не была выявлена. Следует заметить, что нарушение экспрессии 0ct4 и других функционально схожих генов обнаружено и в клетках эмбрионов, клонированных «классическим» методом, без использования межвидового переноса ядра [8]. Далее авторы отмечают, что более выраженный потенциал эмбриона к дальнейшему развитию отражается в более активной экспрессии генов 0ct4, Sox2, Nanog и Е-кадгерина (все гибриды, достигшие стадии бластоцисты, экспрессировали указанные гены). Если же генетический материал гибридной клетки недостаточно активирован, то эмбриогенез останавливался.

Авторы данной работы не ставили своей целью получить линию ЭСК из эмбриобласта гибридных бластоцист. В 2003 г. эта исследовательская группа уже опубликовывала результаты схожего эксперимента, где в качестве донора цитоплазмы вместо коровьего овоцита выступал овоцит кролика [9]. Происхождение полученных таким образом ЗСК человека было подтверждено с помощью цитогенетических методов, ПЦР -анализа и иммуноцитохимии. Однако гибридные ЗСК, дифференцировавшиеся в клетки трех зародышевых листков in vitro, не вызывали развития тератом после введения иммунодефицитным мышам, что, как известно, имеет основное значение для доказательства их плюрипотентного статуса [3].

ЛИТЕРАТУРА:

1. McLaren A. A scientist’s view of the ethics of human embryonic stem cell research. Cell Stem Cell 2007; 1: 23—6.

2. French A.J., Adams C.A., Anderson L.S. Fibroblasts development of human cloned blastocysts following somatic cell nuclear transfer [SCNT) with adult fibroblasts. Stem Cells 2DD8; 26: 485-93.

3. Tecirlioglu R.T., Guo J., Trounson A.O. Interspecies somatic cell nuclear transfer and preliminary data for horse-cow/mouse iSCNT. Stem Cell Rev. 2DD6; 2(41: 277-87.

4. Flamatani Т., Ко M.Sh., Yamada M. et al. Global gene expression profiling of preimplantation embryos. Flum. Cell 2DD6; 19C3): 98-117.

5. Takeda J., Seino S., Bell G.l. Fluman 0ct3 gene family: cDNA sequences, alternative splicing, gene organization, chromosomal location, and expression at low levels in adult tissues. Nucleic Acids Res. 1992; 20: 4613-20.

В статье также не уточняется, каким образом анализировался профиль экспрессируемых генов на более поздних предимплантационных стадиях (морула, бластоциста), на которых начинаются процессы клеточной специализации. Очевидно, что экспрессия транскрипционных регуляторов плюрипотентности будет отличаться в клетках трофобласта и внутренней клеточной массы. Например, известно, что экспрессия 0ct4 значительно снижена в клетках трофобласта человека [10].

Пока не ясно, какое влияние может оказывать присутствие митохондриальной ДНК овоцита на характер и время экспрессии плюрипотентных генов в гибридных эмбрионах. Интересно также отметить, что в этой работе для интеграции ядра фибробласта в цитоплазму овоцита использовали слияние, что предполагает попадание митохондрий фибробласта в гибридный эмбрион. Вопрос о том, каким образом происходит совмещение двух митохондриальных геномов в одной клетке, и как это влияет на развитие зародыша и генную экспрессию в ходе эмбриогенеза, пока остается открытым.

Одна из задач будущих исследований — анализ дифференциального вклада различных факторов гибридной несовместимости в глобальные перестройки генной экспрессии в межвидовых гибридах. Вероятно, что за нарушенное перепрограммирование генома и дефектное развитие гибридного зародыша ответственные лишь некоторые факторы овоцитарной цитоплазмы. В результате, генетическая модификация овоцитов перед процедурой iSCNT сможет снизить последствия гибридной несовместимости и сделать получение пациент-специ-фических ЗСК человека с помощью описанной технологии реальной возможностью.

6. Liedtke S., Enczmann J., Waclawczyk S. et al. 0ct4 and its pseudogenes confuse stem cell research. Cell Stem Cell 2DD7; 1[4): 364-6.

7. Braude P., Bolton V., Moore S. Human gene expression first occurs between the four- and eight-cell stages of preimplantation development. Nature 1988; 332(61631: 459-61.

8. Bortvin A., Eggan K., Skaletsky H. et al. Incomplete reactivation of 0ct4-related genes in mouse embryos cloned from somatic nuclei. Devel. 2003; 130t8]: 1673-80.

9. Chen Y., He Z.X., Liu A. et al. Embryonic stem cells generated by nuclear transfer of human somatic nuclei into rabbit oocytes. Cell Res. 2003; 13t4]: 251-63.

10. Hansis C., Grifo J.A., Krey L.C. Oct-4 expression in inner cell mass and trophectoderm of human blastocysts. Mol. Hum. Reprod. 2000; 6t111: 999-1004.

Подготовил AA. Лелявский

По материалам: Li F„ Cao H„ Zhang Q, et al. Activation of Human Embryonic Gene Expression in Cytoplasmic Hybrid Embryos Constructed between Bovine Oocytes and Human Fibroblasts,

Cloning Stem Cells 9008:10(3): 297-306

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, hl< 4, 2008

А