СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ И КОРРЕКЦИИ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ
METHOD FOR PREVENTION AND CORRECTION OF CYTOGENETIC DISORDER

Изобретение относится к медицине, в частности, к фармакологии и клинической токсикологии, и может быть использовано для профилактики и коррекции цитогенетических нарушений,
Известны способы профилактики мутагенных эффектов воздействия на организм алкилирующего соединения циклофосфана (Новицкий В.В., Хлусова М.Ю., Терновая С.В., Саратиков А.С. Антимутагенное средство. Заявка на изобретение 2000118409 от 10.07.2000, патент RU 2189232 С2; Орещенко А.В., Дурнев А.Д., Кулакова А.В. Способ антимутагенного воздействия на организм. Заявка на изобретение 99108592/14, 30.04.1999, патент RU 2145869 C1).
Известные способы заключаются в том, что одновременно с воздействием на организм циклофосфана вводят антимутагены: дипептид аспартам (аспартата и фенилаланина), индуктор интерферона - йодантипирин или антиоксиданты). Изобретения позволяют снизить проявления мутагенного эффекта воздействия циклофосфана.
Недостатком известных способов является то, что в мутагенные эффекты высокотоксичных алкилирующих агентов изучены лишь в модельных опытах с применением циклофосфана. Это позволяет лишь косвенно оценить цитогенетические нарушения в соматических клетках млекопитающих и выявить возможность их коррекции с помощью фармакопейных средств.
Целью изобретения явилось обеспечение возможности профилактики и коррекции нарушений цитогенетическом аппарате.

Цель достигается тем, объектам с цитогенетическими изменениями назначают препарат Глутоксим.

Препарат Глутоксим бис-(гамма-L-глутамил)-L-цистеинил-глицнн динатриевая соль из группы химически чистых низкомолекулярных иммуностимуляторов пептидной природы разрешен к клиническому применению в качестве иммуномодулирующего, гепатопротекторного и гемопоэтического препарата. Per. Уд. Р N 002010/01 от 29.09.2008. Глутоксим.

Глутоксим применяют у взрослых как средство профилактики и лечения вторичных иммунодефицитных состояний, ассоциированных с радиационными, химическими и инфекционными факторами, для восстановления подавленных иммунных реакций и угнетенного состояния костномозгового кроветворения; для повышения устойчивости организма к разнообразным патологическим воздействиям - инфекционным агентам, химическим и/или физическим факторам (интоксикация, радиация и т.д.); как гепатопротекторное средство; для потенцирования лечебных эффектов антибактериальной терапии хронических заболеваний; для профилактики послеоперационных гнойных осложнений. (Справочник Видаль Лекарственные препараты в России: Справочник. М.: АстраФармСервис, - 2009 г. - 1760 с.).

В табл.1 представлено влияние препарата Глутоксим на выход хромосомных аберраций в клетках костного мозга животных с ипритной.
В табл.2 представлена частота реципрокных транслокаций в сперматогониях крыс.

Способ реализуют следующим образом, объектам с цитогенетическими изменениями назначают препарат Глутоксим.
Для получения модели цитогенетических нарушений мы подвергнули животных воздействию азотистого иприта в субтоксических дозах и показали, (табл.1), что иприт вызывает значимые изменения в генетическом аппарате клеток костного мозга. Это проявилось в увеличении числа миелоцитов с хромосомными аберрациями (с 2,4% - в контроле до 14,5% - в опыте), то есть уровень хромосомных аберраций возрос более чем в 6 раз.
В основе методики наших наблюдений лежит регистрация структурных повреждений хромосом, которые возникают на различных стадиях митотического цикла клетки и в своем развитии доходят до стадии метафазы.
Хромосомные аберрации исследовали в миелокариоцитах по методике Форда и Хамертона (Ford C.E., Hamerton J.L. Chromosomes of five rodent species // Nature. - 1956. - Vol.31. - P.247-254).

Для изучения возможности профилактики цитогенетических нарушений животным, подвергнутым воздействию азотистого иприта в субтоксических дозах 3-х кратно вводили с защитно-лечебной целью синтетический низкомолекулярный гексапептид - фармакопейный препарат Глутоксим. Применение изучаемого фармсредства способствовало уменьшению (более, чем 2 раза по сравнению с уровнем ипритного контроля) количества хромосомных аберраций в клетках костного мозга и реципропных транслокаций в сперматогониях. Такого рода данные свидетельствуют о достаточно высокой антимутагенной активности фармакологического средства Глутоксим. Проведенные исследования иллюстрируются следующими примерами.

Глутоксим - лекарственная форма для инъекций (3%) в дозе 30 мг/кг вводили внутрибрюшинно 1 раз в сутки в течение 3 суток. Начало введения - за 1 сутки до затравки и в течение 2 суток после.

Оценку посттоксического мутагенеза и антимутагенных свойств препарата Глутоксим проводили с помощью теста хромосомных аберраций в клетках костного мозга экспериментальных животных.
Через 24 часа после последнего введения Глутоксима или физиологического раствора животных забивали. За 1 час до забоя крысам внутрибрюшинно вводили колхицин (фирмы "Serva") в дозе 4,8 мкг/г массы тела животного. Приготовление препаратов костного мозга производили через 24 ч после последнего введения препарата по методу, описанному А.М. Малашенко и Г.Н. Золотаревой (Малашенко A.M. Определение мутагенности химических соединений (генетический скрининг) на лабораторных мышах (мет. указания). М., 1977, 12 с.), а также Орловым и Чудиновской (Орлов В.П., Г.А. Чудиновская, Е.П. Крюкова. Исследование хромосомных наборов млекопитающих. Мет. руководство. М., Наука, 1976, 15 с.). Для этого за 2 ч до забоя животным внутрибрюшинно вводили 0,2 мл раствора колхицина (фирмы "Serva") в дозе 4,8 мкг/г массы тела.
Крыс забивали методом цервикальной дислокации, быстро выделяли большеберцовые кости и вымывали костный мозг подогретой до 37°С средой N 199 в центрифужную пробирку с 10 мл той же среды. Пробирки с суспензией центрифугировали при 150 g в течение 6 мин. Надосадочную жидкость сливали, а к осадку добавляли 8 мл подогретого (до 37°С) 0,56% раствора хлористого калия. Клетки тщательно ресуспендировали и помещали в термостат при 37°С на 20 мин, после чего вновь подвергали центрифугированию. Недосадочную жидкость удаляли, оставляя ее около 0,3 мл. После тщательного перемешивания к осадку добавляли 6-8 мл охлажденного фиксатора, состоящего из ледяной уксусной кислоты и метанола (в соотношении 1:3). Смесь готовили перед фиксацией и хранили в холодильнике. Пробирки закрывали пробками, содержимое их перемешивали встряхиванием и помещали в холодильник на 10-15 мин. Затем суспензию вновь центрифугировали и добавляли 5-6 мл свежего фиксатора. Эту процедуру повторяли 2-3 раза.
Перед приготовлением препаратов суспензию центрифугировали при 150 g в течение 6 мин. Надосадочную жидкость удаляли, а к осадку добавляли 1 мл свежего фиксатора и ресуспендировали. Затем на обезжиренные, влажные и охлажденные предметные стекла наносили 8-10 капель суспензии. Фиксатор выжигали в пламени горелки, а стекла подсушивали на воздухе.
Окраску препаратов осуществляли раствором азур-эозина по Романовскому-Гимза в течение 40 мин. Краску готовили непосредственно перед применением смешиванием 10 мл дистиллированной воды, 5 мл 0,1% раствора азура, 2 мл 0,1% раствора эозина и 0,25 мл 5% бикарбоната натрия. После этого стекла промывали проточной водой и высушивали на воздухе.
Анализ препаратов проводили с помощью микроскопа фирмы "Leika" (Германия) с иммерсионным объективом (увеличение 25×100×1,25), для чего отбирали неразрушенные клетки округлой формы с хорошим разбросом и без наложений хромосом. От каждого животного анализировали не менее 100 метафаз, всего на вариант опыта - 500-600 клеток. Учитывали процент клеток с аберрациями хромосом, число одиночных фрагментов, парных фрагментов, хроматидных обменов. Метафазы анализировали на наличие в них хромосомных аберраций по рекомендациям ВОЗ.
Для анализа хромосомных аберраций считались пригодными следующие метафазные пластинки: все хромосомы четко окрашены, количество их не превышало 43 и было не меньше 40; не допускался анализ метафазных пластинок, содержащих большое количество наложений, особенно продольных.
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью сравнения распределений по t критерию Стъюдента.

Было выявлено увеличение числа миелоцитов с хромосомными аберрациями (с 2,4%-в контроле до 14,5% - в опыте), то есть уровень хромосомных аберраций возрос более чем в 6 раз. Защитно-лечебное 4-кратное введение препарата Глутоксим в дозе 10 мг/кг вызывало существенное (в среднем в 2 раза) снижение количества клеток с аберрациями хромосом. Следует подчеркнуть, что во всех группах исследования встречаются 2 типа аберраций - одиночные и парные фрагменты, в группе животных, подвергнутых воздействию иприта в субтоксических дозах нами обнаружены редкие для спонтанного фона аберрации - транслокации. Такого рода данные подтверждают общепринятые представления о высокой мутагенной активности алкилирующих агентах, к которым относится иприт. Частота аберраций в группе животных, получавших препарат Глутоксим (табл.1), практически, сравнима с уровнем аберраций на фоне введения физиологического раствора (негативный контроль) и колеблется от 0,4% до 1,2%. Это соответствует среднестатистическому спонтанному уровню аберраций (1%), характерному для данного вида животных.

Для доказательства возможности лечения цитогенетических нарушений мы исследовали влияние препарата Глутоксим на генетический аппарат половых клеток животных после воздействия иприта в субтоксических дозах.
Чувствительность половых клеток к воздействию химических агентов исследована не достаточно. В настоящей работе исследовали последствия воздействия иприта в субтоксическолй дозе на сперматогонии. Интерес к этой стадии вызван следующим обстоятельством; - мутации, возникающие в результате воздействия химических агентов на исследуемые клетки могут сохранятся весь репродуктивный период особи (Lyon M.F., Phillips R.J.S. Bailey H.I. Mutagenic effects of mouse spermatogonia. I. Specific locus mutation rates, - Mutat. Res., 1972b, vol.15, №2, p.185-.) и могут привести к возникновению генетических нарушений у потомства.
Индуцированный мутагенез представляет реальную опасность для жизни и здоровья человека, поскольку вновь возникающие мутации оказывают негативное влияние на приспособленность популяции в целом и здоровье пораженного индивидуума в отдельности (Leonard A.L incidence de la civilisatiion industrielle sur le patromoine genetique de 1 homme // Rev. Quest Sci.. - 1981. - 152. - P.385-).
Практически десятая часть населения отягощена грузом наследственных заболеваний (Leonard A. L incidence de la civilisatiion industrielle sur Ie patromoine genetique de l homme // Rev. Quest Sci.. - 1981. - 152. - P.385-).
Дальнейшее увеличение, даже незначительное, уровня мутирования может привести к прогрессивному накоплению и распространению вновь возникающих мутаций (Шалп У.Дж. Медицинские аспекты увеличения генетического груза в результате действия мутагенов окружающей среды // Генетические последствия загрязнения окружающей среды. - М.: Наука, 1977. - С.31-).
Имеются данные, что от 74% до 94% хромосомных болезней является следствием мутаций, возникающих в половых клетках здоровых родителей [Бочков Н.П. Чеботарев А.И. Наследственность человека и мутагены внешней среды. - М.: Медицина, 1989. - 270 с.]. Некоторые их них проявятся в первом поколении, но большая часть мутации рецессивные (Kaplan R.W. Mutationen fur die Evolution // Naturwiss. Rdsch.. - 1984. - 37. - P.125-.), накопление которых ведет к неуклонному увеличению наследственных заболеваний [Бочков Н.П. Чеботарев А.И. Наследственность человека и мутагены внешней среды. - М.: Медицина, 1989. - 270 с., Hisako О., Shaw W., Takahashi F. Et al. Chromosome fragility of lymphocytes from breast cancer patients in relation to epidemiologic data // Jap.J. Cacner Res. - 1988 - V.79, N.7 - P.1024-1030).
Общеизвестно, что классические протекторы химического мутагенеза мало эффективны для защиты половых клеток от воздействия алкилирующих токсикантов в малых дозах. Это связано не только с тем, что протективные вещества не проникают в достаточных концентрациях через гематотестикулярный барьер, но и с высокой чувствительностью гетерогенной популяции сперматогониев к воздействию различных повреждающих факторов (в том числе токсикантов).

В последнее время актуальна разработка фармакологических средств, эффективных в условиях нелетального воздействия на организм различных токсикантов с целью предотвращения и/или/ ослабления мутагенных нарушений в половых клетках. Более предпочтительными могут явиться соединения - естественные метаболические регуляторы, системные цитопротекторы, к которым в полной мере можно отнести препарат Глутоксим.
Термином реципрокные транслокации (РТ) обозначают взаимные обмены участками негомологичных хромосом. Этот тип хромосомных аберраций не отсеивается при делении клеток, доходит до стадии спермиев и, как хорошо известно, может явиться причиной ряда наследственных болезней.
Цитологически частоту РТ в стволовых сперматогониях исследуют обычно не ранее чем через 45 дней после воздействия, то есть в постстерильный период, в сперматоцитах на стадии диакинеза-метафазы первого мейотического деления на постоянных воздушно-сухих препаратах, приготовленных по методике, предложенной Ивенсом, Фордом и соавт (Evans E.P., Brecon G., Ford C.C. An air drying method for meiotic preparations from mammalian tests. - Cytogenetics, 1964, vol.2, p.289-., Ford C.E. Meiosis in mammals. - In: Comparative mammalian cytogenetics. B. etc.: Spring. - Verl., 1969, p.91-).
Самцов белых беспородных крыс забивали путем смещения шейных позвонков. Семенники извлекали, освобождали от оболочки, измельчали в 2,2%-ном растворе цитрата натрия. Обрывки тканей и оболочек семенных канальцев осаждали центрифугированием в течение 30 секунд при 500 об/мин. Надосадочную жидкость подвергали повторному центрифугированию в течение 5 мин. Осадок ресуспендировали в 1%-ном растворе цитрата натрия для гипотонической обработки 9-10 мин. После повторного центрифугирования клетки фиксировали в смеси метилового спирта и уксусной кислоты (3:1) с добавлением 2-капель хлороформа. После двухкратной смены фиксатора 2 капли суспензии клеток в фиксаторе наносили на предметное стекло и просушивали под лампой. Препараты окрашивали уксуснокислым лактоорсеином.
Анализ сперматоцитов проводили на стадии диакинеза-метафазы 1 мейотического деления (Searle A.G., Ford E.C., Eans R.P. et al. Theinduction of translocations inmousespermatozoa. I.Kineticsof dose response with acute X-irradiation. - Mutat. Res., 1974, vol.22, №2, p.157).
От каждого самца анализировали, как правило, не менее 200 метафаз. В норме на этой стадии сперматоциты содержат 21 бивалент, образованные при конъюгации гомологичных хромосом. В случае наличия РТ хромосомы с танслоцированными участками при конъюгации образуют мультивалентные конфигурации из трех, четырех и более хромосом в виде «колец» или «цепей». Общее число бивалентов в этом случае меньше 21. Чаще всего наблюдаются конфигурации в виде квадривалентов, указывающие на наличие одной РТ. Иногда в метафазе присутствуют ассоциации из трех и более бивалентов или имеются два и больше квадривалента, что указывает на наличие двух или более РТ.
Статистическую обработку данных проводили с использованием критерия Стьюдента для малых выборок, при этом за величину выборки принимали число исследованных семенников.

Схема проведения эксперимента: затравка и введение антимутагена - препарата Глутоксим была такой же как и описана в примере 1.

В качестве критерия антимутагенной эффективности препарата Глутоксим был использован тест оценки реципрокных транслокаций в половых клетках (сперматогониях) экспериментальных животных.
В каждой группе опыта использовали по 5 самцов крыс, от каждого животного анализировали по 200 метафаз. Забой животных и изготовление препаратов осуществляли через 50 суток после воздействия.
Результаты представлены в табл.2.
В результате проведенных исследований было выявлено, что частота возникновения РТ у животных контрольной группы, затравленных ипритом возрастает по сравнению с интактными животными более чем в 8 раз (с 0,4% до 3,8%). Защитно-лечебное применение препарата Глутоксим способствовало достоверному угнетению мутагенеза в половых клетках экспериментальных животных, подвергнутых воздействию иприта. Так количество половых клеток с реципрокными транслокациями уменьшилось почти в 2 раза (с 3,8 до 1,6%). Необходимо отметить, что введение интактным животным 50%-ного спирта (растворитель иприта) приводит к умеренному росту мутагенных нарушений в половых клетках животных.
На основании вышеизложенного можно заключить, что:
- воздействие иприта в субтоксических дозах сопровождается увеличением количества генетических нарушений в половых клетках экспериментальных животных.

- защитно-лечебное введение препарата Глутоксим в дозах 30 мг/кг 3-кратно (в течение 1 суток до- и двукратно после ипритной затравки в субтоксических дозах) существенно (в среднем в 2 раза) снижает выход хромосомных аберраций в клетках костного мозга и уменьшал (почти в 2 раза) количество реципрокных транслокаций в половых клетках - сперматогониях экспериментальных животных.
Предлагаемый способ может явиться основой для разработки новых методических подходов к повышению эффективности диспансерного наблюдения и реабилитации персонала объектов хранения и уничтожения химического оружия.
Таблица 2
Вариант опыта
Контроль (интактные животные)
Иприт
Глутоксим + Иприт
Контроль C<sub>2</sub>H<sub>5</sub>OH
% клеток с РТ
0.4+0.1
3.8+0.5*
1.6+0.4**
1.5+0.4*
Примечание-
* - различия статистически достоверны по сравнению с контролем;
** - различия статистически достоверны по сравнению с группой животных, затравленных ипритом;
РТ - реципрокные транслокации