КЛЕТКИ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЕ РЕЦЕПТОР ПАРАТИРЕОИДНОГО ГОРМОНА 1, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
CELLS EXPRESSING PARATHYROID HORMONE 1 RECEPTOR, AND THEIR USE

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Данная заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США №62/353,993, поданной 23 июня 2016 г., и №62/445,636, поданной 12 января 2017 г., которые тем самым полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0002] Настоящее изобретение в целом относится к области стволовых клеток, в том числе к выделению стволовых клеток и культивированию стволовых клеток. В частности, настоящее изобретение относится к применению плюрипотентных стволовых клеток, экспрессирующих рецептор паратиреоидного гормона типа 1, для применения в целях улучшения фертильности, стимулирования роста волос, улучшения или профилактики состояний кожи, облегчения или профилактики заболеваний костей, облегчения или профилактики дегенерации желтого пятна и облегчения или профилактики аутоиммунных заболеваний. Указанные стволовые клетки называют полученными из периферической крови плюрипотентными стволовыми клетками (PBD-PSC).
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] Стволовые клетки человека представляют собой примитивные, незрелые, неспециализированные плюрипотентные клетки-предшественники, обладающие способностью делиться в течение неопределенных периодов времени и давать начало новым или специализированным клеткам, которые способны давать начало множеству линий зрелых клеток человека. Стволовые клетки обнаружены почти во всех тканях организма, включая костный мозг, кости, мышцы, печень, мозг, жировую ткань, кровь и кожу.
[0004] Стволовые клетки необходимы для организма, поскольку они выступают в качестве системы восстановления, которая делает возможным рост и обновление клеток во время травм, заболеваний или повреждений клеток. Например, фибробласты, которые представляют собой стволовые клетки кожи, восстанавливают повреждения кожи, включая порезы кожи. Остеобласты, которые являются стволовыми клетками кости, восстанавливают повреждение костей, включая переломы костей.
[0005] Стволовые клетки можно применять в различных отраслях медицины путем восстановления популяции клеток многих типов тканей и восстановления физиологических и анатомических функций. Такие применения включают аллогенную регенеративную клеточную терапию, аутологичную регенеративную клеточную терапию, тканевую инженерию и регенеративную лекарственную терапию.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ
[0006] Настоящее изобретение относится к популяции плюрипотентных клеток, которые экспрессируют рецептор паратиреоидного гормона типа 1 (RTH1R) и способны при культивировании дифференцироваться в эктодерму, мезодерму и энтодерму, и в настоящей заявке упоминаются как плюрипотентные стволовые клетки из периферической крови (PBD-PSC).
[0007] Некоторые варианты реализации относятся к популяции клеток, содержащей PBD-PSC, и такую популяцию клеток идентифицируют, характеризируют и/или выделяют в присутствии RTH1R. В некоторых вариантах реализации популяцию стволовых клеток, содержащую PBD-PSC, выделяют из жировой ткани, костного мозга, периферической крови, фолликулярной жидкости женских яичников или мужской семенной жидкости (плазмы) или их комбинаций. В некоторых вариантах реализации популяцию стволовых клеток, содержащую PBD-PSC, выделяют из млекопитающих, включая человека, домашних или сельскохозяйственных животных, таких как собаки, кошки, верблюды, лошади, крупный рогатый скот, свиньи, овцы или козы.
[0008] В некоторых вариантах реализации PBD-PSC в популяции клеток, экспрессирующие RTH1R, имеют диаметр 2,5-4,5 мкм, например диаметр, составляющий 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4 или 4,5 мкм или диаметр в диапазоне, определенном любыми двумя из вышеуказанных значений. В некоторых вариантах реализации популяция стволовых клеток, содержащая PBD-PSC, образует при культивировании эмбриоидоподобные тельца (структуры). В некоторых вариантах реализации популяция стволовых клеток, содержащая PBD-PSC, дифференцируется в зародышевые слои эктодермы, мезодермы и/или энтодермы при культивировании в подходящей среде для индукции.
[0009] В некоторых вариантах реализации популяция выделенных клеток, содержащая PBD-PSC, экспрессирует классические маркеры CD. В некоторых вариантах реализации PBD-PSC, экспрессирующие RTH1R, являются положительными по CD90 и/или CD133; положительными/отрицательными по CD29, CD34, CD105 и/или CD106; и/или отрицательными по SSEA-3, CD200 и/или CD45. В некоторых вариантах реализации популяция стволовых клеток, содержащая PBD-PSC, экспрессирует Sox2 и Oct4.
[0010] В некоторых вариантах реализации PBD-PSC культивируют с одним или более пептидами. В некоторых вариантах реализации пептид представляет собой белок внеклеточного матрикса (ВКМ), цитокин, фактор роста или антиген. В некоторых вариантах реализации белок ВКМ включает, например, протеогликаны, не являющиеся протеогликанами полисахариды или волокна, и может включать, например, хондроитинсульфат, гепарансульфат, кератансульфат, гиалуроновую кислоту, агрин, нидоген, коллаген, эластин, энтактин, фибронектин, ламинин, перлекан, общий белок и/или фрагменты белка. В некоторых вариантах реализации цитокин(ы) представляе(ю)т собой, например, лимфокины, интерлейкины и хемокины, которые могут включать, например, цитокин интерлейкин (TL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13), интерферон (IFN-α, IFN-β и IFN-γ), фактор некроза опухоли (TNFα и TNF-β, колониестимулирующий фактор (GM-CSF и M-CSF) или их комбинацию. В некоторых вариантах реализации фактор роста включает, например, эпидермальный фактор роста (EGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), фактор роста фибробластов (FGF и bFGF), трансформирующий фактор роста (TGF-α и TGF-β 1, 2 и 3), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), фактор роста гепатоцитов (HGF), фактор роста кератиноцитов (KGF), фактор роста нервов (NGF), эритропоэтин (ЭПО) или инсулиноподобные факторы роста (IGF-I и IGF-II) или их комбинацию. В некоторых вариантах реализации PBD-PSC культивируют с ретиноевой кислотой и/или с одним или более производными ретиноевой кислоты.
[0011] В некоторых вариантах реализации PBD-PSC трансфицируют одним или более гетерологичными генами, кодирующими пептид. В некоторых вариантах реализации пептид представляет собой белок внеклеточного матрикса (ВКМ), цитокин, фактор роста или антиген. В некоторых вариантах реализации белок ВКМ включает, например, протеогликаны, не являющиеся протеогликанами полисахариды или волокна, и может включать, например, хондроитинсульфат, гепарансульфат, кератансульфат, гиалуроновую кислоту, агрин, нидоген, коллаген, эластин, энтактин, фибронектин, ламинин, перлекан, общий белок и/или фрагменты белка. В некоторых вариантах реализации цитокин включает, например, лимфокины, интерлейкины и хемокины, которые могут включать, например, цитокин интерлейкин (IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13), интерферон (IFN-α, IFN-β и IFN-γ), фактор некроза опухоли (TNFα и TNF-β), или колониестимулирующий фактор (GM-CSF и M-CSF), или их комбинацию. В некоторых вариантах реализации фактор роста включает, например, эпидермальный фактор роста (EGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), фактор роста фибробластов (FGF и bFGF), трансформирующий фактор роста (TGF-α и TGF-β 1, 2 и 3), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), фактор роста гепатоцитов (HGF), фактор роста кератиноцитов (KGF), фактор роста нервов (NGF), эритропоэтин (ЭПО) или инсулиноподобные факторы роста (IGF-I и IGF-II) или их комбинацию.
[0012] В некоторых вариантах реализации PBD-PSC нацелены на конкретный участок или область внутри организма, ткани или органа. В некоторых вариантах реализации PBD-PSC привлекает в целевой участок гиперэкспрессия паратиреоидного гормона (ПТГ) и/или гиперэкспрессия связанного с паратиреоидным гормоном белка (ПТГ-сБ) в данной области. ПТГ и ПТГ-сБ действуют как хемоаттрактанты для PBD-PSC. В некоторых вариантах реализации PBD-PSC привлекает в участок или область высокая концентрация ПТГ и/или ПТГ-сБ. В некоторых вариантах реализации высокая концентрация или поступление (инфлюкс) ПТГ и/или ПТГ-сБ является результатом гиперэкспрессии, нативной экспрессии и/или искусственного внесения.
[0013] Варианты реализации также включают антитело или его связывающий домен, специфичный к RTH1R или PBD-PSC. В некоторых вариантах реализации антитело или связывающий домен представляет собой моноклональное антитело или его связывающий фрагмент или поликлональное антитело или его связывающие фрагменты. В некоторых вариантах реализации антитело или его связывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело или его гуманизированный связывающий фрагмент.
[0014] Варианты реализации также включают способы выделения популяции плюрипотентных стволовых клеток, где популяция стволовых клеток содержит PBD-PSC, которые экспрессируют RTH1R. В некоторых вариантах реализации способ включает приведение в контакт образца, содержащего популяцию клеток, которая содержит PBD-PSC, с антителом или его связывающим фрагментом, специфичным к RTH1R (предпочтительно связанным с подложкой или поверхностью, такой как гранула, мембрана, фильтр, контейнер), чтобы сформировать популяцию связанных клеток (например, популяцию стволовых клеток). В некоторых вариантах реализации способ дополнительно включает выделение популяции связанных с антителами клеток (например, популяции стволовых клеток). В некоторых вариантах реализации способ включает высвобождение популяции связанных клеток (например, популяции стволовых клеток) от антитела или его связывающего фрагмента. В некоторых вариантах реализации способ дополнительно включает приведение в контакт образца, содержащего антитело/его связывающий фрагмент, популяцию клеток (например, популяцию стволовых клеток) с магнитными гранулами, поверхностью или подложкой (например, магнитные гранулы, поверхность, подложка, мембрана или фильтр могут содержать иммобилизованные или связанные антитела или их связывающие фрагменты, специфичные для RTH1R). В некоторых вариантах реализации способ включает применение к образцу магнитного поля и/или центрифугирования, благодаря чему выделяют популяцию связанных с антителом/его связывающим фрагментом клеток (например, популяцию стволовых клеток).
[0015] Другие варианты реализации включают способы применения PBD-PSC для лечения или облегчения или подавления расстройства, заболевания или болезненного состояния, где расстройство, заболевание или болезненное состояние представляет собой бесплодие, заболевание волос или кожи, такое как потеря волос, истончение волос, заболевание костей, рак, неврологическое заболевание, аутоиммунные заболевания или их комбинацию. В некоторых вариантах реализации субъекта, страдающего от одного или более заболеваний, идентифицируют путем клинической или диагностической оценки одной или более из вышеуказанных расстройств, заболеваний или болезненных состояний, и указанному индивиду вводят популяцию стволовых клеток, содержащую PBD-PSC, при этом популяцию стволовых клеток, содержащих PBD-PSC, вводят внутривенно, внутриартериально, подкожно, чрескожно, интравитреально, интраокулярно, субконъюнктивально, ретробульбарно, суборбитально или местно, или комбинацией вышеуказанных способов. В некоторых вариантах реализации лечение или облегчение расстройства, заболевания или болезненного состояния приводит к облегчению, улучшению, обеспечения регрессии или регрессии расстройства. В некоторых вариантах реализации внутриартериальные инъекции включают инъекцию в маточную, поджелудочную или яичниковую артерию или их комбинации.
[0016] Некоторые варианты реализации, предложенные в настоящей заявке, относятся к способу улучшения, облегчения, обеспечения регрессии, подавления или лечения диабета. В некоторых вариантах реализации способ включает введение эффективного количества композиции. В некоторых вариантах реализации композиция включает выделенную популяцию плюрипотентных стволовых клеток, выделенных, как описано в настоящей заявке. В некоторых вариантах реализации композиция включает выделенную популяцию плюрипотентных стволовых клеток, как описано в настоящей заявке, для нуждающегося в них субъекта. В некоторых вариантах реализации диабет представляет собой диабет 1 типа. В некоторых вариантах реализации композицию вводят внутриартериально в панкреатическую артерию. В некоторых вариантах реализации композицию вводят один раз каждые 12 недель. В некоторых вариантах реализации введение композиции снижает объем среднесуточного применения инсулина субъектом. В некоторых вариантах реализации среднесуточное применение инсулина снижается на 2-10%, 5-20%, 10-30%, 20-40%, 30-50%, 40-60%, 50-70%, 60-80%, 70-90% или 80-100% или в пределах диапазона, определенного любыми двумя из вышеуказанных процентов.
[0017] Некоторые варианты реализации, предложенные в настоящей заявке, относятся к способу снижения среднесуточной дозы инсулина у субъекта, страдающего диабетом. В некоторых вариантах реализации способ включает введение эффективного количества композиции. В некоторых вариантах реализации композиция включает выделенную популяцию плюрипотентных стволовых клеток, выделенных по способу, описанному в настоящей заявке. В некоторых вариантах реализации композиция включает выделенную популяцию плюрипотентных стволовых клеток, как описано в настоящей заявке, для нуждающегося в них субъекта. В некоторых вариантах реализации диабет представляет собой диабет 1 типа. В некоторых вариантах реализации композицию вводят внутриартериально в панкреатическую артерию. В некоторых вариантах реализации композицию вводят один раз каждые 12 недель. В некоторых вариантах реализации введение композиции снижает среднесуточное применение инсулина субъектом на 2-10%, 5-20%, 10-30%, 20-40%, 30-50%, 40-60%, 50-70%, 60-80%, 70-90% или 80-100% или в пределах диапазона, определенного любыми двумя из вышеуказанных процентов.
[0018] Некоторые варианты реализации, предложенные в настоящей заявке, относятся к способу выращивания выделенной популяции плюрипотентных стволовых клеток на матрице. В некоторых вариантах реализации способ включает выделение популяции плюрипотентных стволовых клеток из образца описанным здесь способом с помощью приведения в контакт матрицы из нановолокон с выделенными плюрипотентными стволовыми клетками и выращивания выделенных плюрипотентных стволовых клеток на матрице из нановолокон. В некоторых вариантах реализации получают матрицу, содержащую плюрипотентные стволовые клетки. В некоторых вариантах реализации матрица из нановолокон содержит полимерные волокна, включая, например, полидиметилсилоксан, полиглицерин себацат, поликапролактон, полимолочную кислоту, полигликолевую кислоту, целлюлозу, альгинат, агар, агарозу, коллаген I, коллаген IV, гиалуроновую кислоту, фибрин, поли-L-лактид или сополимер молочной и гликолевой кислот. В некоторых вариантах реализации полимерные волокна получены методом электроспиннинга. В некоторых вариантах реализации толщина полимерных волокон находится в диапазоне от 200 до 700 мкм (например, 200, 300, 400, 500, 600 или 700 мкм или в пределах диапазона, определенного любыми двумя из вышеуказанных значений толщины). В некоторых вариантах реализации плюрипотентные стволовые клетки связаны с матрицей и находятся в ней в течение 2-40 минут (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 35 или 40 минут или в пределах диапазона, определенного любыми двумя из вышеуказанных значений). В некоторых вариантах реализации матрицу, содержащую плюрипотентные стволовые клетки, используют для инъекции в суставы или кости. В некоторых вариантах реализации матрицу, содержащую плюрипотентные стволовые клетки, применяют для покрытия раны без повязки или с повязкой, которая может содержать гель.
[0019] Соответственно, некоторые аспекты, описанные в настоящей заявке относятся к следующим вариантам:
[0020] 1. Плюрипотентная стволовая клетка, характеризующаяся тем, что указанная клетка экспрессирует рецептор паратиреоидного гормона типа 1 (RTH1R), имеет диаметр от 2,5 до 4,5 мкм, например 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4 или 4,5 мкм или имеет диаметр в пределах диапазона, определенного любыми двумя из вышеуказанных значений, образует эмбриоидоподобные тельца при культивировании и способна к дифференцировке в эктодерму, мезодерму и энтодерму при культивировании.
[0021] 2. Плюрипотентная стволовая клетка по варианту 1, где популяцию клеток культивируют с одним или более пептидами.
[0022] 3. Плюрипотентная стволовая клетка по варианту 2, где пептид представляет собой белок внеклеточного матрикса (ВКМ), цитокин, фактор роста или антиген.
[0023] 4. Плюрипотентная стволовая клетка по любому из вариантов 1-3, где плюрипотентную стволовую клетку культивируют с ретиноевой кислотой и/или с одним или более производным ретиноевой кислоты.
[0024] 5. Плюрипотентная стволовая клетка по любому из вариантов 1-4, где плюрипотентная стволовая клетка трансфицирована гетерологичным геном, кодирующим пептид.
[0025] 6. Плюрипотентная стволовая клетка по варианту 5, где пептид представляет собой белок внеклеточного матрикса (ВКМ), цитокин, фактор роста или антиген.
[0026] 7. Плюрипотентная стволовая клетка по любому из вариантов 1-6, где плюрипотентная стволовая клетка выделена из периферической крови, семенной жидкости и/или фолликулярной жидкости яичников.
[0027] 8. Выделенная популяция плюрипотентных стволовых клеток, присутствующая в периферической крови, семенной жидкости и фолликулярной жидкости яичников, которые:
экспрессируют рецептор паратиреоидного гормона типа 1 (RTH1R);
имеют диаметр от 2,5 до 4,5 мкм, такой как 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4 или 4,5 мкм или диаметр в диапазоне, определенном любыми двумя из вышеуказанных значений.
образуют эмбриоидоподобные тельца при культивировании; и
способны к дифференцировке в эктодерму, мезодерму и энтодерму при культивировании.
[0028] 9. Выделенная популяция плюрипотентных стволовых клеток по варианту 8, где популяция клеток является:
положительной по CD90 и CD 133;
положительной/отрицательной по CD29, CD34, CD105 и CD106; а также отрицательной по SSEA-3, CD200 и CD45.
[0029] 10. Выделенная популяция плюрипотентных стволовых клеток по вариантам 8-9, где популяция клеток экспрессирует Sox2 и Oct4.
[0030] 11. Выделенная популяция плюрипотентных стволовых клеток по любому из вариантов 8-10, где выделенная популяция плюрипотентных стволовых клеток получена от человека, лошади, собаки или верблюда.
[0031] 12. Выделенная популяция плюрипотентных стволовых клеток по любому из вариантов 8-11, где популяцию клеток культивируют с пептидом.
[0032] 13. Выделенная популяция плюрипотентных стволовых клеток по варианту 12, где пептид представляет собой белок внеклеточного матрикса (ВКМ), цитокин, фактор роста или антиген.
[0033] 14. Выделенная популяция плюрипотентных стволовых клеток по любому из вариантов 8-13, где плюрипотентную стволовую клетку культивируют с ретиноевой кислотой и/или с одним или более производным ретиноевой кислоты.
[0034] 15. Выделенная популяция плюрипотентных стволовых клеток по любому из вариантов 8-14, где плюрипотентная стволовая клетка трансфицирована гетерологичным геном, кодирующим пептид.
[0035] 16. Выделенная популяция плюрипотентных стволовых клеток по варианту 15, где пептид представляет собой белок внеклеточного матрикса (ВКМ), цитокин, фактор роста или антиген.
[0036] 17. Антитело, специфичное к рецептору паратиреоидного гормона типа 1 (RTH1R) на стволовых клетках.
[0037] 18. Антитело по варианту 17, где антитело представляет собой моноклональное антитело.
[0038] 19. Антитело по любому из вариантов 17-18, где антитело представляет собой гуманизированное антитело.
[0039] 20. Способ выделения популяции стволовых клеток, как описано в любом из вариантов 1-16, способ включает:
приведение в контакт образца, содержащего популяцию стволовых клеток, с антителом, специфичным к RTH1R, с образованием связанной с антителом стволовой клетки;
выделение связанной с антителом стволовой клетки; и
высвобождение стволовой клетки от антитела.
[0040] 21. Способ по варианту 20, дополнительно включающий:
приведение в контакт образца, содержащего связанную с антителом стволовую клетку, с магнитными гранулами; и
применение магнитного поля, с помощью которого выделяют связанную с антителом стволовую клетку.
[0041] 22. Способ по любому из вариантов 20-21, в котором образец получают из образца, выбранного из группы, состоящей из жировой ткани, костного мозга, периферической крови, семенной жидкости, фолликулярной жидкости яичников и их комбинаций.
[0042] 23. Способ по любому из вариантов 20-22, в котором выделенная популяция стволовых клеток содержит стволовые клетки, имеющие диаметр 2,5 мкм и экспрессирующие CD-маркеры стволовых клеток.
[0043] 24. Способ по любому из вариантов 20-23, где выделенная популяция стволовых клеток содержит стволовые клетки, которые выделены в количествах, составляющих по меньшей мере или равных 10000, 50000, 100000, 500000, 1000000, 5000000 или 10000000 клеток/мл образца ткани, или в количестве в пределах диапазона, определенного любыми двумя из вышеуказанных значений.
[0044] 25. Способ выделения популяции плюрипотентных стволовых клеток, как описано в любом из вариантов 1-16, способ включает:
получение периферической крови от индивидуума;
приведение в контакт периферической крови с экстракорпоральной пористой мембраной, сконфигурированной для захвата популяции плюрипотентных стволовых клеток, как описано в любом из вариантов 1-16;
применение к периферической крови и мембране центробежной силы или силы тяжести или давления;
захват популяции плюрипотентных стволовых клеток;
сбор прошедшей через мембрану крови; и
реинфузию прошедшей через мембрану крови в индивидуума.
[0045] 26. Способ по варианту 25, в котором захваченную популяцию плюрипотентных стволовых клеток готовят для последующей реинфузии индивидууму.
[0046] 27. Способ выделения популяции стволовых клеток, как описано в любом из вариантов 1-16, способ включает:
приведение в контакт образца, содержащего популяцию стволовых клеток, с антителом к CD45; и
удаление клеток, не связанных с антителом к CD45.
[0047] 28. Способ по варианту 27, в котором образец представляет собой периферическую кровь, плазму или лизат тромбоцитов.
[0048] 29. Способ по любому из вариантов 27-28, где выделенная популяция стволовых клеток содержит стволовые клетки, которые выделены в количествах приблизительно 10000, 50000, 100000, 500000, 1000000, 5000000 или 10000000 клеток/мл образца ткани, или в количестве в пределах диапазона, определенного любыми двумя из вышеуказанных значений.
[0049] 30. Способ улучшения фертильности у субъекта, включающий:
выбор субъекта, нуждающегося в улучшении фертильности; и
введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества выделенной популяции плюрипотентных стволовых клеток, которая выделена способом по любому из вариантов 20-29, или выделенной популяции плюрипотентных стволовых клеток по любому из вариантов 1-16.
[0050] 31. Способ по варианту 30, где плюрипотентные стволовые клетки являются аутологичными.
[0051] 32. Способ по любому из вариантов 30-31, в котором терапевтически эффективное количество представляет собой количество, достаточное для того, чтобы вызвать детектируемое улучшение функции яичников, качества ооцитов, толщины эндометрия, рецептивности эндометрия или комбинации вышеуказанного.
[0052] 33. Способ по любому из вариантов 30-32, в котором терапевтически эффективное количество выделенной популяции плюрипотентных стволовых клеток вводят с помощью инъекции в тестикулы или матку.
[0053] 34. Способ по любому из вариантов 30-32, в котором терапевтически эффективное количество выделенной популяции плюрипотентных стволовых клеток вводят субъекту внутривенно в маточную артерию, чтобы способствовать утолщению и рецептивности стенки эндометрия.
[0054] 35. Способ по варианту 34, в котором толщина стенки эндометрия возрастает по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% или 80% или более или в пределах диапазона, определенного любыми двумя из вышеуказанных процентов.
[0055] 36. Способ по любому из вариантов 30-32, в котором терапевтически эффективное количество выделенной популяции плюрипотентных стволовых клеток вводят субъекту внутривенно в яичниковую артерию, чтобы увеличить количество и качество яйцеклеток.
[0056] 37. Способ по любому из вариантов 30-36, в котором плюрипотентные стволовые клетки выделяют из образца, выбранного из группы, состоящей из жировой ткани, костного мозга, периферической крови, семенной жидкости, фолликулярной жидкости яичников и/или их комбинаций.
[0057] 38. Способ нацеливания популяции плюрипотентных стволовых клеток, выделенных способом по любому из вариантов 20-29, или выделенной популяции плюрипотентных стволовых клеток по любому из вариантов 1-16 на представляющую интерес область, включающий экспрессию в указанной области связанного с паратиреоидным гормоном белка.
[0058] 39. Способ увеличения выработки кожного коллагена и/или эластина в области кожи у субъекта, включающий введение терапевтически эффективного количества композиции, содержащей выделенную популяцию плюрипотентных стволовых клеток, которая выделена способом по любому из вариантов 20-29, или содержащей выделенную популяцию плюрипотентных стволовых клеток по любому из вариантов 1-16.
[0059] 40. Способ по варианту 39, в котором композицию вводят с помощью одной или более подкожной инъекции.
[0060] 41. Способ по любому из вариантов 39-40, в котором повышенная выработка кожного коллагена и/или эластина уменьшает мелкие морщины, уменьшает морщины, увеличивает сияние или увеличивает упругость кожи и/или способствует комбинациям вышеперечисленного.
[0061] 42. Способ подавления потери волос или стимуляции роста волос, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества композиции, содержащей выделенную популяцию плюрипотентных стволовых клеток, которая выделена способом по любому из вариантов 20-26, или содержащей выделенную популяцию плюрипотентных стволовых по любому из вариантов 1-16.
[0062] 43. Способ по варианту 42, в котором композицию вводят субъекту чрескожно.
[0063] 44. Способ по варианту 42, в котором композицию вводят субъекту подкожно с помощью инъекции.
[0064] 45. Способ улучшения, облегчения, обеспечения регрессии или лечения заболевания кости, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества композиции, содержащей выделенную популяцию плюрипотентных стволовых клеток, которая выделена способом по любому из вариантов 20-29, или содержащей выделенную популяцию плюрипотентных стволовых клеток по любому из вариантов 1-16.
[0065] 46. Способ по варианту 45, в котором заболевание костное представляет собой повреждение кости.
[0066] 47. Способ по варианту 46, в котором повреждение кости представляет собой перелом кости.
[0067] 48. Способ по варианту 47, в котором перелом кости представляет собой перелом остистого отростка.
[0068] 49. Способ по варианту 45, в котором заболевания кости представляет собой остеопороз.
[0069] 50. Способ по варианту 45, в котором заболевание кости представляет собой остеопению.
[0070] 51. Способ по любому из вариантов 45-50, в котором композицию вводят субъекту подкожно с помощью инъекции.
[0071] 52. Способ по любому из вариантов 45-50, в котором композицию вводят субъекту внутривенно.
[0072] 53. Способ по любому из вариантов 45-50, в котором композицию вводят субъекту внутриартериально.
[0073] 54. Способ по варианту 53, в котором композицию вводят в одну или более маточную, панкреатическую или яичниковую артерию.
[0074] 55. Способ улучшения, облегчения, подавления, обеспечения регрессии или лечения неврологического заболевания, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества композиции, содержащей выделенную популяцию плюрипотентных стволовых клеток, которая выделена способом по любому из вариантов 20-29, или содержащей выделенную популяцию плюрипотентных стволовых клеток по любому из вариантов 1-16.
[0075] 56. Способ улучшения, облегчения, подавления, обеспечения регрессии или лечения метастазирующей карциномы, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества композиции, содержащей выделенную популяцию плюрипотентных стволовых клеток, которая выделена способом по любому из вариантов 20-29, или содержащей выделенную популяцию плюрипотентных стволовых клеток по любому из вариантов 1-16.
[0076] 57. Способ профилактики, лечения, подавления, предотвращения или облегчения аутоиммунного заболевания, включающий идентификацию нуждающегося в этом субъекта и введение указанному субъекту эффективного количества композиции, содержащей выделенную популяцию плюрипотентных стволовых клеток, которая выделена способом по любому из вариантов 20-29, или содержащей выделенную популяцию клеток, содержащую стволовые клетки по любому из вариантов 1-16.
[0077] 58. Полученные из периферической крови плюрипотентные стволовые клетки (PBD-PSC) для применения в качестве лекарственного средства.
[0078] 59. Способ улучшения, подавления, облегчения, обеспечения регрессии или лечения диабета, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества композиции, содержащей выделенную популяцию плюрипотентных стволовых клеток, которая выделена способом по любому из вариантов 20-29, или содержащей выделенную популяцию плюрипотентных стволовых клеток по любому из вариантов 1-16.
[0079] 60. Способ по варианту 59, в котором диабет представляет собой диабет 1 типа.
[0080] 61. Способ по любому из вариантов 59-60, в котором композицию вводят субъекту внутриартериально в панкреатическую артерию.
[0081] 62. Способ по любому из вариантов 59-61, в котором композицию вводят один раз каждые 12 недель.
[0082] 63. Способ по любому из вариантов 59-62, в котором введение композиции снижает количество среднесуточного применения инсулина субъектом.
[0083] 64. Способ по варианту 63, в котором среднесуточное применение инсулина снижается на приблизительно 2-10%, 5-20%, 10-30%, 20-40%, 30-50%, 40-60%, 50-70%, 60-80%, 70-90% или 80-100% или в пределах диапазона, определенного любыми двумя из вышеуказанных процентов.
[0084] 65. Способ снижения среднесуточной дозы инсулина у субъекта, страдающего диабетом, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества композиции, содержащей выделенную популяцию плюрипотентных стволовых клеток, которая выделена способом по любому из вариантов 20-29, или включающий выделенную популяцию плюрипотентных стволовых клеток по любому из вариантов 1-16.
[0085] 66. Способ по варианту 65, в котором диабет представляет собой диабет 1 типа.
[0086] 67. Способ по любому из вариантов 65-66, в котором композицию вводят субъекту внутриартериально в панкреатическую артерию.
[0087] 68. Способ по любому из вариантов 65-67, в котором композицию вводят один раз каждые 12 недель.
[0088] 69. Способ по любому из вариантов 65-68, в котором введение композиции снижает среднесуточное применение инсулина субъектом на приблизительно 2-10%, 5-20%, 10-30%, 20-40%, 30-50%, 40-60%, 50-70%, 60-80%, 70-90% или 80-100% или в пределах диапазона, определенного любыми двумя из вышеуказанных процентов.
[0089] 70. Способ выращивания выделенной популяции плюрипотентных стволовых клеток на матрице, включающий:
выделение популяции плюрипотентных стволовых клеток из образца способом по любому из вариантов 20-29;
приведение в контакт матрицы из нановолокон с выделенными плюрипотентными стволовыми клетками; и
выращивание выделенных плюрипотентных стволовых клеток на матрице из нановолокон;
при этом получают матрицу, содержащую плюрипотентные стволовые клетки.
[0090] 71. Способ по варианту 70, в котором матрица из нановолокон содержит полимерные волокна, включая, например, полидиметилсилоксан, полиглицерин себацат, поликапролактон, полимолочную кислоту, полигликолевую кислоту, целлюлозу, альгинат, агар, агарозу, коллаген I, коллаген IV, гиалуроновую кислоту, фибрин, поли-L-лактид и/или сополимер молочной и гликолевой кислот.
[0091] 72. Способ по варианту 71, в котором полимерные волокна получены методом электроспиннинга.
[0092] 73. Способ по любому из вариантов 71-72, в котором толщина полимерных волокон составляет по меньшей мере или равна 200, 300, 400, 500, 600 или 700 мкм, или находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя из вышеуказанных значений толщины.
[0093] 74. Способ по любому из вариантов 70-73, в котором плюрипотентные стволовые клетки связаны с матрицей и находятся в ней в течение приблизительно 2-40 минут.
[0094] 75. Способ по любому из вариантов 70-74, в котором матрицу, содержащую плюрипотентные стволовые клетки, применяют для инъекции в суставы или кости.
[0095] 76. Способ по любому из вариантов 70-74, в котором матрицу, содержащую плюрипотентные стволовые клетки, применяют для покрытия раны.
[0096] 77. Способ улучшения, облегчения, обеспечения регрессии, подавления или лечения дегенерации желтого пятна, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества композиции, содержащей выделенную популяцию плюрипотентных стволовых клеток, которая выделена способом по любому из вариантов 20-29, или содержащей выделенную популяцию плюрипотентных стволовых клеток по любому из вариантов 1-16.
[0097] Способ по варианту 77, в котором дегенерация желтого пятна представляет собой сухую или влажную дегенерацию желтого пятна.
[0098] Способ по любому из вариантов 77-78, в котором композицию вводят путем внутривенной, интравитреальной, интраокулярной, субконъюнктивальной, ретробульбарной или суборбитальной инъекции.
[0099] Способ по любому из вариантов 77-79, в котором композицию вводят один раз каждые 12 недель.
[0100] Способ по любому из вариантов 77-80, в котором введение композиции улучшает остроту зрения у субъекта.
[0100] Способ по варианту 81, в котором остроту зрения улучшают до приблизительно 20/20, 20/30, 20/40, 20/50, 20/60, 20/70, 20/80, 20/90, или 20/100, или в пределах диапазона, определенного любыми двумя из вышеуказанных значений.
[0102] Эти признаки вкупе с другими признаками, приведенными в настоящей заявке далее, станут ясными в ходе чтения последующего описания чертежей и подробного описания.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0103] В дополнение к признакам, описанным выше, дополнительные признаки и варианты будут понятны из следующих описаний чертежей и примерных вариантов реализации. Следует понимать, что на этих чертежах изображены типичные варианты реализации, и они не предназначены для ограничения объема изобретения.
[0104] На Фигуре 1 показана характеристика PBD-PSC, описанных в настоящей заявке. Результаты проточной цитометрии клеток, положительных по рецептору паратиреоидного гормона 1 (RTH1R), после центрифугирования и фильтрования при 800 х g (панель А), 1000 х g (панель В) и 1200 х g (панель С).
[0105] На Фигуре 2 показана характеристика PBD-PSC, описанных в настоящей заявке, с помощью проточной цитометрии. RTHlR-положительные клетки периферической крови показаны на панели А. На панели В приведено сравнение RTHlR-положительных клеток и CD133-положительных клеток. На панели С приведено сравнение CD133-положительных клеток и CD90-положительных клеток. На панели D приведено сравнение SSЕА4-положительных клеток и CD45-положительных клеток.
[0106] На Фигуре 3 показана характеристика RTH1R-положительных клеток из фолликулярной жидкости яичника после центрифугирования и фильтрования. На панели А показаны RTH1R-положительные клетки. На панели В приведено сравнение RTH1R-положительных клеток и CD133-положительных клеток. На панели С приведено сравнение RTH1R-положительных клеток и CD90-положительных клеток.
[0107] На Фигурах 4А-4С показана характеристика RTH1R-положительных клеток из фолликулярной жидкости яичника и периферической крови. На Фигуре 4А изображены PTHR-положительные клетки, на Фигуре 4В изображены CD133-положительные клетки, а на Фигуре 4С представлены PTHR/CD90-положительные клетки.
[0108] На Фигурах 5А-5Е приведена микрофотография PBD-PSC, описанных в настоящей заявке, с окрашиванием антителами к рецептору ПТГ (Фигура 5A), CD90 (Фигура 5В), CD133 (Фигура 5С) SSEA-4 (Фигура 5D) и CD45 (Фигура 5Е)
[0109] На Фигуре 6 приведена микрофотография PBD-PSC, описанных в настоящей заявке. Стволовые клетки имеют диаметр 2,5-4,5 мкм и несут плюрипотентный маркер стволовых клеток, зонд Киото 1.
[0110] Фигура 7 представляет собой микрофотографию, показывающую, что PBD-PSC при культивировании образуют эмбриоидоподобные тельца, что свидетельствует о том, что эти клетки являются очень примитивными и мощными стволовыми клетками.
[0111] На Фигуре 8 показана генетическая экспрессия PBD-PSC, при этом маркеры стволовых клеток детектировали с помощью обычной РТ-ПЦР. Дорожка 1 - маркер длины ДНК, дорожка 2 - контрольный GAPDH1, дорожка 3 - детекция Sox2, а дорожка 4 - детекция Oct4.
[0112] На Фигуре 9 показаны микрофотографии PBD-PSC из разных животных источников; лошади, собаки и верблюда.
[0113] На Фигуре 10 показан способ разработки уникальных моноклональных антител, которые нацеливают уникальный маркер на PBD-PSC. Моноклональное антитело можно применять для отбора специфических плюрипотентных стволовых клеток в целях диагностики и лечения.
[0114] Фигура 11 иллюстрирует один из вариантов реализации способа выделения PBD-PSC. Образец, содержащий стволовые клетки (гомогенат ткани, периферическая кровь или другие источники стволовых клеток, как описано в настоящей заявке), контактирует с моноклональными антителами, разработанными, как показано на Фигуре 10. В смесь добавляют магнитные гранулы и применяют магнитное поле. Вводят водный буфер, и выделяют PBD-PSC.
[0115] На Фигуре 12 проиллюстрирован способ выделения PBD-PSC в экстракорпоральной системе. Периферическая кровь от субъекта проходит через экстракорпоральную мембрану, предпочтительно пористую мембрану, сконфигурированную для захвата PBD-PSC. Для захвата и сбора PBD-PSC к периферической крови прикладывают центробежную или гравитационную силу. Необязательно после удаления PBD-PSC из периферической крови прошедшую через мембрану кровь повторно вводят субъекту.
[0116] На Фигуре 13 проиллюстрирован процесс, играющий роль в старении организма. Внешние воздействия действуют вместе с внутренними воздействиями, вызывая геномные, эпигеномные и протеомные изменения, приводящие к функциональному ухудшению. Это, в свою очередь, приводит к дисфункции тканей и старению организма.
[0117] На Фигуре 14 показана типичная прогрессия стволовых клеток. Молодые стволовые клетки способны давать здоровое потомство. Однако по мере старения стволовых клеток их потомки начинают функционировать хуже из-за потери специфичности клеточной линии, истощения из-за потери самообновления, истощения из-за старения и злокачественной трансформации.
[0118] Фигура 15 иллюстрирует отрицательную корреляцию между PTHR-положительными стволовыми клетками на мл плазмы (ось Y) по возрасту субъекта (ось X).
[0119] Фигура 16 иллюстрирует генетические и эпигенетические изменения, которые происходят со временем в любой данной популяции стволовых клеток в организме.
[0120] Фигура 17 иллюстрирует свойства раковых стволовых клеток (РСК), включая устойчивость РСК к химиотерапии и лучевой терапии.
[0121] Фигура 18 иллюстрирует сравнение факторов в крови молодого организма и крови старого организма по способности активировать стволовые клетки и омолаживать органы в клетках старых мышей. Факторы в крови старого организма, по-видимому, ингибируют регенерационную способность у молодых мышей.
[0122] На Фигуре 19 показано, что со временем и в ходе репликации стволовые клетки проявляют повышенные эффекты старения. Однако эффекты старения, испытываемые стволовыми клетками в течение хронологической и репликативной продолжительности жизни, можно обратить вспять путем лечения, описанного здесь.
[0123] На Фигурах 20A-20D представлены электронные микрофотографии полученных от здорового мужчины PBD-PSC, выращенных на матрице из нановолокон. На микрофотографиях показаны PBD-PSC на матрице в ходе времени, на временных точках 0 минут (Фигура 20А), 5 минут (Фигура 20В), 30 минут (Фигура 20С) и 120 минут (Фигура 20D).
[0124] На фигуре 21 показан пример лечения кожи с применением препарата PBD-PSC в качестве мезотерапевтического средства для противодействия преждевременному старению кожи путем увеличения наличия кожного коллагена и эластина. Измерения кожного коллагена и эластина были сделаны перед лечением в день 0 и через 30 дней после лечения.
[0125] На Фигуре 22 показан пример лечения волосяных фолликулов и кожи головы с применением препарата PBD-PSC с целью вызвать рост волос, на фигуре изображен рост фолликула до лечения и через 10 недель после лечения.
[0126] На Фигурах 23А-23С показаны изображения после лечения перелома остистого отростка с применением варианта реализации способа лечения PBD-PSC. На Фигуре 23А показан перелом до лечения. На Фигуре 23В показано лечение перелома шейного отдела во фронтальной плоскости с применением лечения PBD-PSC. На левом изображении показан перелом до лечения, а на правом изображении показан перелом через 4 месяца после лечения PBD-PSC. На Фигуре 23С показано лечение перелома шейного отдела в сагиттальной плоскости с применением лечения PBD-PSC. На левом изображении показан перелом до лечения, а на правом изображении показан перелом через 4 месяца после лечения PBD-PSC.
[0127] На Фигуре 24 показаны эффекты остеопороза. На левом изображении вид в разрезе нормальной здоровой кости. На правом изображении показан разрез кости с остеопорозом, демонстрирующий увеличенную пористость и уменьшенную плотность кости.
2
[0128] На Фигуре 25 отображена плотность кости субъекта, страдающего тяжелым остеопорозом. На верхней панели показано изменение плотности кости в поясничном отделе позвоночника после однократной инфузии PBD-PSC. На нижней панели показано изменение плотности кости в левом бедре после однократной инфузии PBD-PSC. На оси Y обозначена плотность кости в г/см, а на оси X обозначено время.
[0129] На Фигуре 26 показано изменение плотности кости и Т-показателя у субъекта с остеопенией. На верхней панели показано изменение плотности кости и Т-показателя в поясничном отделе позвоночника после однократной терапии PBD-PSC. На нижней панели показано изменение плотности кости и Т-показателя в левом бедре после однократной терапии PBD-PSC.
[0130] На Фигуре 27 показано примерное лечение истончения эндометрия с применением внутриматочной артериальной инъекции PBD-PSC. Изображение до лечения демонстрирует высокий уровень истончения эндометрия, в то время как изображение после лечения демонстрирует, что истончение в значительной степени исчезло.
[0131] На Фигуре 28 показан пример лечения легочных метастаз с применением PBD-PSC. На фигуре приведен КТ-снимок метастаз в легких через 30 дней (слева) и через 129 дней (справа) после трансплантации аллотрансплантата PBD-PSC, и показана полная ремиссия метастаз через 129 дней после трансплантации.
[0132] На Фигуре 29 показано уменьшение среднего применения инсулина после введения доз PBD-PSC. Две дозы PBD-PSC вводили двум субъектам, 17-летнему мужчине и 16-летней женщине, в недели 1 и 13. Наблюдается снижение среднесуточного применения инсулина после терапии PBD-PSC.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0133] В нижеследующем подробном описании сделана ссылка на прилагаемые чертежи, которые составляют его часть. В чертежах одинаковые символы, как правило, определяют одни и те же компоненты, если контекст не диктует иное. Иллюстративные варианты реализации, описанные в подробном описании, чертежах и формуле изобретения, не предназначены для ограничения. Можно использовать другие варианты реализации и можно вносить другие изменения, не отклоняясь от сущности или объема объекта изобретения, представленного здесь. Нетрудно понять, что аспекты настоящего описания, как в целом описано в настоящей заявке и проиллюстрировано на Фигурах, могут быть составлены, заменены, скомбинированы, разделены и спроектированы с самыми различными конфигурациями, все из которых явным образом составляют часть данного описания.
[0134] Полученные из периферической крови плюрипотентные стволовые клетки (PBD-PSC), представляют собой очень маленькие стволовые клетки диаметром 2,5-4,5 мкм, например, составляют 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4 или 4,5 мкм в диаметре, или же их диаметр находится в диапазоне, определенном любыми двумя из вышеуказанных значений. PBD-PSC являются очень примитивными стволовыми клетками, которые обладают высоким потенциалом в отношении дифференцировки во множество специализированных линий. Соответственно, PBD-PSC обладают высоким потенциалом для применения в сферах регенеративной медицины и, в частности, в антивозрастной терапии. В частности, PBD-PSC являются мощным инструментом для ряда применений, включая, например, аллогенную регенеративную клеточную терапию, при которой для дифференцировки используют донорские клетки, способные высвобождать факторы роста для восстановления поврежденной ткани; аутологичную регенеративную клеточную терапию, при которой собственные клетки пациента используют для перепрограммирования, разрастания и/или дифференцировки с целью лечения поврежденной ткани путем постоянной интеграции в ткань; и тканевую инженерию, при которой собственные клетки пациента помещают на каркас для создания новой ткани, которую затем пересаживают в поврежденную ткань с целью восстановления ткани. Для PBD-PSC характерен высокий уровень экспрессии RTH1R. Соответственно, согласно некоторым аспектам в настоящей заявке PBD-PSC также называют RTH1R-положительными стволовыми клетками.
Определения
[0135] Если не указано иное, технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют то же значение, под которым их обычно понимают средние специалисты в области техники, к которой относится настоящее изобретение. См., например, Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989). В целях настоящего изобретения ниже определены следующие термины.
[0136] Единственное число в настоящем описании относится к одному или более чем одному (например, по меньшей мере одному) грамматическому объекту. Например, "элемент" означает один элемент или более чем один элемент.
[0137] «Приблизительно» относится к количеству, уровню, значению, численности, частоте, проценту, величине, размеру, объему, массе или длине, варьирующим на 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1% от эталонных количества, уровня, значения, численности, частоты, процента, величины, размера, объема, массы или длины.
[0138] В данной заявке, если контекст не требует иного, слова «содержат», «содержит» и «содержащий» следует понимать как подразумевающие включение указанного этапа или элемента или группы этапов или элементов, но не исключение любого другого этапа или элемента, или группы этапов, или элементов.
[0139] «Состоящий из» означает содержащий и ограниченный тем самым, что следует из фразы «состоящий из». Таким образом, фраза «состоящий из» указывает на то, что перечисленные элементы необходимы или обязательны, и что никакие другие элементы не могут присутствовать. «Состоящий по существу из» означает включение всех элементов, перечисленных после данной фразы, и ограничение другими элементами, которые не препятствуют или способствуют активности или действию, указанным в описании для перечисленных элементов. Таким образом, фраза «состоящий по существу из» указывает на то, что перечисленные элементы необходимы или обязательны, но что другие элементы являются необязательными и могут присутствовать или не присутствовать в зависимости от того, влияют ли они фактически или не влияют на активность или действие перечисленных элементов.
[0140] В некоторых вариантах реализации «чистоту» любого взятого агента (например, агента, представляющего собой антитело, связывающее полипептид) в композиции можно определить точно. Например, некоторые композиции могут содержать агент с чистотой по меньшей мере 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%, включая все десятичные дроби между ними, как измерено, например, но никоим образом не ограничиваясь тем самым, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), хорошо известной формы колоночной хроматографии, часто используемой в биохимии и аналитической химии для разделения, идентификации и количественного определения соединений.
[0141] В настоящем описании термины «функция» и «функциональный» и тому подобные относятся к биологической, ферментативной или терапевтической функции.
[0142] Термин «выделенный» означает материал, который по существу не содержит компонентов, которые обычно сопровождают его в его естественном состоянии. Например, «выделенная стволовая клетка» или «выделенная популяция стволовых клеток» при использовании в настоящей заявке включает стволовую клетку или популяцию стволовых клеток, очищенные от материала образца, в том числе от других клеток, детрита или чужеродного материала образца в его естественном состоянии. Альтернативным образом, «выделенная стволовая клетка» или «выделенная популяция стволовых клеток» и тому подобное в настоящем описании включают в себя in vitro, экстракорпоральное или другое выделение и/или очистку клетки или популяции клеток от их естественной среды и от связи с другими компонентами образца или материала, в котором это происходит. В некоторых вариантах реализации «выделенный» означает, что компонент не имеет значимой связи с субстанциями in vivo.
rd
th
rd
rd
[0143] В практике осуществления данного изобретения будут использовать, если особо не указано иное, находящиеся в пределах уровня техники стандартные методы молекулярной биологии и технологию рекомбинантной ДНК, многие из которых описаны ниже с иллюстративной целью. Такие методы подробно описаны в литературе. См., например, Sambrook, el al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3 Edition, 2000); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. 1 & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications (P. Herdewijn, ed., 2004); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Nucleic Acid Hybridization: Modern Applications (Buzdin and Lukyanov, eds., 2009); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Freshney, R.I. (2005) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 5 Ed. Hoboken NJ, John Wiley & Sons; B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (3 Edition 2010); Farrell, R., RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization (3 Edition 2005).
2
[0144] В настоящем описании термин «антитело» включает поликлональные антитела, моноклональные антитела (в том числе полноразмерные антитела, которые имеют иммуноглобулиновый участок Fc), композиции антител с полиэпитопной специфичностью, полиспецифические антитела (например, биспецифичные антитела, диатела и одноцепочечные молекулы, а также фрагменты антител (например, Fab или F (ab') и Fv). Структуру и свойства различных классов антител см., например, в Basic and Clinical Immunology, 8th Edition, Daniel P. Sties, Abba I. Terr and Tristram G. Parsolw (eds), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, стр. 71 и глава 6.
[0145] В некоторых вариантах реализации предложено антитело к PBD-PSC. В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой моноклональное или поликлональное антитело. В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой гуманизированное антитело. «Выделенное антитело» представляет собой антитело, которое не связано со связанными с ним в естественной среде компонентами, включая другие связанные с ним в естественной среде антитела, сопутствующие ему в нативном состоянии, и которое не содержит других белков тех же биологических видов. Кроме того, выделенное антитело экспрессируется клеткой других биологических видов или не встречается в природе. Термин «гуманизированное антитело» включает все антитела, которые имеют один или более вариабельных и константных участков, полученных из последовательностей иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело представляет собой антитело, которое получено от вида, не являющегося человеком, в котором определенные аминокислоты в каркасных и константных доменах тяжелых и легких цепей подвергнуты мутации таким образом, чтобы избежать или исключить иммунный ответ у людей. Альтернативным образом, гуманизированное антитело можно получить путем слияния константных доменов из антитела человека с вариабельными доменами вида, не являющегося человеком. Химерное антитело относится к антителу, которое содержит одну или более участков из одного антитела и один или более участков из одного или более других антител. Кроме того, фрагменты антител можно получить без каких-либо сложностей. Таким образом, согласно настоящему описанию, предложены антитела к PBD-PSC и их фрагменты.
[0146] В настоящем описании термин «лечение» относится к вмешательству, осуществляемому в ответ на заболевание, расстройство или физиологическое состояние, выраженное у субъекта, в частности у субъекта, страдающего от связанного с возрастом заболевания или заболевания, выраженного в дегенерации ткани или клеточных эффектах. Такие заболевания могут включать, но не ограничиваются ими, заболевания кожи, потерю волос и заболевания волос, диабет, включая диабет 1 типа, костные заболевания и травмы, включая остеопороз, остеопению и/или переломы костей, бесплодие, злокачественные опухоли, аутоиммунные заболевания, дегенерацию желтого пятна и другие заболевания, включающие потерю регенерации, среди прочих расстройств, описанных в настоящей заявке и известных в данной области техники. Цель лечения может включать, но не ограничивается тем самым, одно или более из облегчения или профилактики симптомов, замедления или остановки прогрессирования или ухудшения заболевания, расстройства или состояния и ремиссии заболевания, расстройства или состояния. В некоторых вариантах реализации «лечение» относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или предупреждающим мерам. К числу тех, кто нуждается в лечении, относятся те, кто уже страдает от заболевания или расстройства или нежелательного физиологического состояния, а также те, у кого необходимо предотвратить заболевание или расстройство или нежелательное физиологическое состояние. Например, в некоторых вариантах реализации лечение уменьшает, облегчает или устраняет симптом(ы) заболевания(й). В настоящем описании термин «профилактика» относится к любой активности, которая уменьшает бремя заболевания у индивидуума, у которого позже проявятся симптомы заболевания. Это может происходить на уровне первичной, вторичной и/или третичной профилактики, где: а) первичная профилактика позволяет избежать развития симптомов/расстройств состояния; б) вторичные профилактические мероприятия направлены на ранние стадии лечения состояния/заболевания/симптома, тем самым расширяя возможности для вмешательств по предотвращению прогрессирования состояния/заболевания/симптома и появления симптомов; и в) третичная профилактика уменьшает негативное воздействие уже установленного состояния/заболевания/симптома, например, путем восстановления функции и или ослабления любого состояния/заболевания/симптома или связанных с ним осложнений.
[0147] Термин «терапевтически эффективное количество» используют для обозначения количества активного соединения или фармацевтического агента, которое вызывает указанный биологический или лекарственный ответ. Например, терапевтически эффективное количество соединения может представлять собой количество, необходимое для предотвращения, ослабления или облегчения симптомов заболевания или для продления жизни субъекта, которого подвергают терапии. Эта реакция может происходить в ткани, системе, животном или человеке и включает смягчение признаков или симптомов заболевания, подлежащего лечению. Определение терапевтически эффективного количества находится в пределах компетенции специалистов в данной области техники с учетом предложенного в настоящем описании, изобретения. Необходимое в качестве дозы терапевтически эффективное количество соединений, описанных в настоящей заявке, будет зависеть от пути введения, типа подвергаемого лечению животного, в том числе человека, и физических характеристик определенного рассматриваемого животного. Дозу можно адаптировать для достижения желаемого эффекта, но она будет зависеть от таких факторов, как масса, диета, сопутствующий прием лекарственных средств и от других факторов, которые будут приняты во внимание специалистами в данных областях медицины.
[0148] В настоящем описании термин «остеопороз» относится к состоянию, для которого характерно уменьшение костной массы и нарушение структуры кости, что приводит к повышенной ломкости кости и повышенному риску перелома, а также к пониженной кальцификации или плотности кости. Остеопороз представляет собой истончение костей с уменьшением костной массы из-за истощения содержания кальция и костного белка. Пациенты с остеопорозом имеют аномальную прочность костей, что приводит к увеличению риска перелома. Перелом может быть в виде разлома (как при переломе бедра) или коллапса (как при компрессионном переломе позвоночника). Обычные области, где происходят вызванные остеопорозом переломы, - позвоночник, бедра и запястья, хотя переломы также могут происходить в других участках скелета. Неконтролируемый остеопороз может приводить к изменениям осанки, физическим отклонениям и снижению подвижности. Остеопороз можно выявить с помощью измерения минеральной плотности кости. В настоящем описании термин «остеопения» относится к дисбалансу между образованием кости и резорбцией кости, причем скорость резорбции превышает скорость образования, тем самым отрицательно влияя на биологическую и структурную целостность кости, что приводит к снижению кальцификации или плотности кости.
[0149] В настоящем описании термин «сахарный диабет» относится к заболеванию, вызванному относительным или абсолютным отсутствием инсулина, приводящим к неконтролируемому углеводному обмену, которое обычно упрощенно называют «диабетом», хотя сахарный диабет не следует путать с несахарным диабетом. В настоящем описании «диабет» относится к сахарному диабету, если не указано иное. «Диабетическое состояние» включает преддиабет и диабет. Диабет 1 типа (иногда называемый «инсулинозависимый диабет» или «ювенильный диабет») представляет собой аутоиммунное заболевание, для которого характерно разрушение β-клеток поджелудочной железы, приводящее к полному или почти полному отсутствию инсулина. При диабете 2 типа (СД2; иногда его называют «инсулиннезависимый диабет» или «диабет у взрослых») организм не реагирует на инсулин, хотя он присутствует. В настоящем описании термин «метаболическое заболевание» используют для обозначения диабета 1 типа, диабета 2 типа, преддиабета и осложнений диабета.
[0149] Симптомы диабета включают: чрезмерную жажду (полидипсия); частое мочеиспускание (полиурия); чрезмерный голод или постоянное поглощение пищи (полифагия); необъяснимую потерю веса; наличие глюкозы в моче (глюкозурия); усталость или слабость; изменения в зрении; онемение или покалывание в конечностях (руки, ноги); медленно заживающие раны или язвы; и аномально высокую частоту инфекции. Диабет можно клинически диагностировать по концентрации глюкозы в плазме натощак (ГПН), превышающей или равной 7,0 ммоль/л (126 мг/дл), или по концентрации глюкозы в плазме, превышающей или равной 11,1 ммоль/л (200 мг/л), приблизительно через два часа после перорального теста на переносимость глюкозы (OGTT) с нагрузкой 75 г.
Используемый здесь термин «потеря волос (облысение)» относится к выпадению волос с кожи головы или ослаблению или истончению волос. Выражение «предотвращение потери волос» означает предотвращение и подавление такой потери волос, а выражение «стимулирование роста волос» означает стимулирование образования новых волос или поддержание здорового роста существующих волос.
[0152] «Повреждение кожи» или «нарушение кожи» в настоящем описании может относиться к повреждению кожи, которое может быть вызвано старением, повреждением в результате действия солнца, раком, нарушением кожи или кожными заболеваниями, которые могут вызывать раздражение кожи. Не ограничиваясь этим, «кожные заболевания» и/или «кожные заболевания» могут включать глубокие морщины, неферментативное гликозилирование кожи, повреждение в результате действия солнца, повреждение в результате курения, фиброз кожи, угри солнечные (акне Майорка), конглобатные угри, угри косметические (косметическое акне), молниеносные угри (острое фебрильное язвенное акне), келоидные затылочные угри (келоидальное акне, сосочковый дерматит головы, фолликулит келоидальный, келоидный затылочный фолликулит, келоидное затылочное акне), разбросанные красные папулы на лбу у взрослых, медикаментозные угри, некротические угри (оспоподобные угри), вульгарные угри, угри с отеком лица (солидный отек лица), блефарофимоз, эритематозно-телеангиэктатическую розацеа (сосудистая розацеа), экскориированные угри (утрикарные угри), железистую розацеа, гнатофима, грамотрицательную розацеа, гранулематозный периоральный дерматит, болезнь «красного носа», ринофиму, гранулематозный периоральный дерматит, галогеновые угри, гнойный гидраденит (инверстные угри, пиодермальные свищи, болезнь Вернейля), идиопатическую асептическую гранулему лица, детские угри, люпоидную розацеа (гранулематозную розацеа, микропапулезную туберкулодермию, розацеоподобный туберкулоид Левандовского), милиарную диссеминированную волчанку лица, метофиму, неонатальные угри (угревая сыпь новорожденных, неонатальные угри, неонатальный цефалический пустулез), профессиональные угри, «масляные» угри, глазную розацеа (офтальмологическая розацеа, офтальмозацеа), отофиму, периорфициальный дерматит, устойчивый отек при розацеа (хронический эритрематозный отек в верхней части лица, болезнь Морбигана, лимфидема при розацеа), фиматозную розацеа, помадные угри, папулезно-пустулезную розацеа (воспалительная розацеа), абсцедирующий подрывающий перифолликулит головы (подрывающий фолликулит кожи головы, подрывающий фолликулит, абсцедирующий и подрывающий перифолликулит Гоффмана), периоральный дерматит, периорбитальный дерматит (периокулярный дерматит), лицевую пиодермию (молниеносная розацеа), ринофиму, розацеа (розовые угри), конгоблатную розацеа, синдром синовит-акне-пустулез-гиперостоз-остеомиелит (синдром SAPHO), стероидную розацеа, смоляные угри, рак кожи, тропические угри, псориаз, в том числе бляшечный псориаз, каплевидный псориаз, обратный псориаз, пустулезный псориаз, эритродермический псориаз, ногтевой псориаз, и/или псориатический артрит, и/или их комбинации и/или варианты. В некоторых вариантах реализации, описанных в настоящей заявке, предложен способ лечения, подавления, профилактики или облегчения заболевания или болезненного состояния у нуждающегося в этом субъекта. У субъекта может быть заболевание или болезненное состояние, описанное в настоящей заявке.
[0153] «Заболевания волос и кожи головы» представляют собой заболевания, которые поражают волосы и кожу головы и также описаны в настоящей заявке. Заболевания, которые поражают волосы и кожу головы, могут включать, но не ограничиваются ими: алопецию, андрогенную алопецию, гирсутизм, заболевания волосяного стержня, воспаление, акромегалию, экзему, псориаз, импетиго, атопический дерматит, болезнь Дарье и/или фолликулит. Распространенные причины заболеваний кожи головы могут включать, но не ограничиваются ими: акромегалию, атопический дерматит, болезнь Дарье, экзему, синдром ломкой Х-хромосомы, импетиго, пахидермопериостоз, псориаз и/или синдром Розенталя-Клопфера. В некоторых вариантах реализации, описанных в настоящей заявке, предложен способ лечения, подавления, профилактики или облегчения заболевания или болезненного состояния у нуждающегося в этом субъекта. У субъекта может быть заболевание, поражающее кожу и кожу головы. В некоторых вариантах реализации субъект страдает алопецией, андрогенной алопецией, гирсутизмом, заболеваниями волосяного стержня, воспалением, акромегалией, экземой, псориазом, импетиго, атопическим дерматитом, болезнью Дарье и/или фолликулитом. В некоторых вариантах реализации субъект страдает акромегалией, атопическим дерматитом, болезнью Дарье, экземой, синдромом хрупкой Х-хромосомы, импетиго, пахидермопериостозом, псориазом и/или синдромом Розенталя-Клопфера. В некоторых вариантах реализации протокол включает введение лекарственной формы нуждающемуся в этом субъекту. В некоторых вариантах реализации лекарственная форма представляет собой крем для волос, гель для волос, лосьон для кожи головы, шампунь, кондиционер, спрей для волос или мусс для волос.
[0154] «Заболевания ногтей» представляют собой расстройства или заболевания, которые затрагивают ноготь, ногтевое ложе или область кутикулы, и также описаны в настоящей заявке. Заболевания, которые поражают ноготь и прилегающие участки кожи, такие как кутикула, могут привести к инфекции или воспалению, которые могут потребовать медицинской помощи. Заболевания, при которых развивается инфекция ногтей, ногтевого ложа и/или кутикулы, могут включать, но не ограничиваются ими: онихоз, онихокриптоз, ониходистрофию, онихогрифоз, онихолизис, онихомадезис, онихомикоз, дерматофитный онихомикоз, онихофоз, онихоптоз, онихорексис, паронихию, койлонихию, подногтевую гематому, онихоматрикому, пузырчатку ногтя, эритронихию и/или меланонихию. В некоторых вариантах реализации, описанных в настоящей заявке, предложен способ лечения, подавления, профилактики или облегчения заболевания или болезненного состояния у нуждающегося в этом субъекта. У субъекта может быть заболевание или болезненное состояние, затрагивающее ногти, ногтевое ложе и/или кутикулу. В некоторых вариантах реализации субъект страдает алопецией, андрогенной алопецией, гирсутизмом, заболеваниями волосяного стержня, воспалением, акромегалией, экземой, псориазом, импетиго, атопическим дерматитом, болезнью Дарье и/или фолликулитом. В некоторых вариантах реализации субъект страдает от онихоза, онихокриптоза, ониходистрофии, онихогрифоза, онихолизиса, онихомадезиса, онихомикоза, дерматофитного онихомикоза, онихофоза, онихоптоза, онихорексиса, паронихии, койлонихии, подногтевой гематомы, онихоматрикомы, пузырчатки ногтя, эритронихии и/или меланонихии. В некоторых вариантах реализации лечение, подавление, профилактика или облегчение включает введение лекарственной формы нуждающемуся в этом субъекту. В некоторых вариантах реализации лекарственная форма представляет собой крем для кожи, лосьон, крем для кутикулы или лак для ногтей.
[0155] «Аутоиммунные заболевания» или «аутоиммунные расстройста» в контексте настоящей заявки описывают заболевания, вызванные иммунным ответом против собственных клеток или тканей организма. Аутоиммунные заболевания приводят к разрушению одного или более типов тканей организма, аномальному росту органа или органов или изменениям функции или функций органа. Заболевания могут затрагивать только один тип органа или ткани или могут затрагивать несколько органов и типов тканей. Кроме того, человек может испытывать одно или более аутоиммунных расстройств одновременно. Органы и ткани, которые обычно подвержены аутоиммунным заболеваниям, включают компоненты крови, такие как эритроциты, кровеносные сосуды, соединительные ткани, эндокринные железы, такие как щитовидная железа или поджелудочная железа, мышцы, суставы и/или кожу.
[0156] Аутоиммунные заболевания часто подразделяют на два основных типа: (1) системные аутоиммунные заболевания (например, заболевания, которые повреждают многие органы или ткани), и (2) локализованные аутоиммунные заболевания (например, заболевания, которые повреждают только один орган или ткань). Однако эффект локализованных аутоиммунных заболеваний может быть системным из-за косвенного воздействия на другие органы и системы организма. Системные аутоиммунные заболевания включают без ограничения: ревматоидный артрит, который может поражать суставы и, возможно, легкие и кожу; волчанку, включая системную красную волчанку (СКВ), которая может поражать кожу, суставы, почки, сердце, мозг и/или эритроциты, а также другие ткани и органы; склеродермию, которая может поражать кожу, кишечник и/или легкие; синдром Шёгрена, который может поражать слюнные железы, слезные железы и/или суставы; синдром Гудпасчера, который может поражать легкие и/или почки; гранулематоз Вегенера, который может поражать носовые пазухи, легкие и/или почки; ревматическую полимиалгию, которая может поражать крупные группы мышц, и/или височный артериит/гигантоклеточный артериит, который может поражать артерии головы и/или шеи. Локализованные аутоиммунные заболевания включают без ограничения: Сахарный диабет 1 типа, поражающий панкреатические островки; тиреоидит Хашимото и/или болезнь Грейвса, поражающие щитовидную железу; целиакия, болезнь Крона и/или язвенный колит, поражающие желудочно-кишечный тракт; рассеянный склероз (PC) и синдром Гийена-Барре, которые поражают центральную нервную систему; болезнь Аддисона, поражающая надпочечники; первичный желчный склероз, склерозирующий холангит и/или аутоиммунный гепатит, поражающие печень; и феномен Рейно, который может поражать пальцы рук, ног, нос, уши. Дополнительные примеры аутоиммунных расстройств включают: пернициозную анемию; болезнь Аддисона; дерматомиозит; миастению гравис (МГ); синдром Рейтера; пузырчатку обыкновенную; склеродермию и/или синдром CREST; аутоиммунную гемолитическую анемию; аутоиммунную тромбоцитопеническую пурпуру; анкилозирующий спондилоартрит; васкулит; и/или боковой амиотрофический склероз (болезнь Лу Герига).
[0157] Симптомы аутоиммунных расстройств могут широко варьироваться в зависимости от типа заболевания. Обычно наблюдаемые симптомы или болезненные состояния включают: усталость, головокружение, недомогание и/или лихорадку. Другие симптомы или болезненные состояния, которые могут наблюдаться при одном или более аутоиммунных заболеваниях, включают: озноб, потерю веса, кожную сыпь, васкулит, полиартралгию, частичную потерю волос, язвы в полости рта и/или носа, увеличение лимфатических узлов, проблемы с желудком, генерализованную боль, которая может быть локализована в суставах в случае артрита, увеличение желез, в том числе щитовидной железы в случае болезни Грейвса, учащенное сердцебиение, кожные волдыри и/или поражения кожи, мышечную слабость. В некоторых вариантах реализации лечение, подавление, профилактика или облегчение включает введение субъекту лекарственной формы с целью профилактики, лечения или облегчения аутоиммунного заболевания. В некоторых вариантах реализации лечение, подавление, профилактика или облегчение включает введение лекарственной формы для лечения симптома аутоиммунного заболевания.
[0158] Термин «дегенерация желтого пятна» в настоящем описании относится к дегенерации центральной части сетчатки, макулы, что может привести к ухудшению зрения или потере зрения в центре поля зрения. Дегенерацию желтого пятна можно охарактеризовать как возрастную дегенерацию желтого пятна (ВДЖП), которая может включать сухую дегенерацию желтого пятна или влажную дегенерацию желтого пятна (также называемую неоваскулярной или экссудативной дегенерацией желтого пятна). В некоторых вариантах реализации лечение, подавление, профилактика или облегчение дегенерации желтого пятна включает введение субъекту лекарственной формы с целью профилактики, лечения, подавления или облегчения дегенерации желтого пятна. В некоторых вариантах лекарственную форму можно вводить внутривенно. В некоторых вариантах реализации внутривенное введение полезно в качестве терапии других заболеваний в дополнение к лечению дегенерации желтого пятна. В некоторых вариантах реализации лекарственную форму можно вводить в глаз посредством интравитреальной, суборбитальной, ретробульбарной, интраокулярной, субконъюнктивальной или другой глазной инъекции. В некоторых вариантах реализации лечение, подавление, профилактика или облегчение включает введение лекарственной формы для лечения симптома дегенерации желтого пятна. Для введения в глаз или рядом с глазом композицию вводят в количестве 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мкл или в количестве, находящемся в диапазоне, определенном любыми двумя из вышеуказанных объемов. Для введения в глаз или рядом с глазом концентрацию лекарственной формы подбирают таким образом, чтобы при каждом введении количество PBD-PSC, которое вводят или обеспечивают нуждающемуся в этом субъекту, составляло 1000, 5000, 10000, 50000, 100000, 500000, 1000000, 2000000, 3000000, 4000000, 5000000, 6000000, 7000000, 8000000, 9000000, 10000000, 50000000 или 100000000 клеток/мкл или количество, находящееся в пределах диапазона, определенного любыми двумя из вышеуказанных количеств клеток на мкл.
[0159] В настоящем описании «субъект» относится к животному, такое как позвоночное, предпочтительно млекопитающее. Термин «млекопитающее» определяет особь, принадлежащую к классу млекопитающих, и включает, без ограничения, людей, домашних и сельскохозяйственных животных, а также животных в зоопарках, спортивных животных или домашних питомцев, таких как овцы, собаки, лошади, кошки или коровы. В некоторых вариантах реализации субъект представляет собой мышь или крысу. В некоторых вариантах реализации субъект представляет собой человека. «Субъект» включает любое животное, которое проявляет симптом или подвержено риску проявления симптома одного или более расстройств, описанных в настоящей заявке. Подходящие субъекты (пациенты) включают лабораторных животных (таких как мышь, крыса, кролик или морская свинка), сельскохозяйственных животных и домашних животных или домашних питомцев (таких как кошка или собака). Включены не являющиеся людьми приматы и/или, предпочтительно, пациенты, являющиеся людьми.
[0160] «Фармацевтически приемлемые» носители представляют собой носители, которые являются нетоксичными для клетки или млекопитающего, подвергаемых их воздействию, в используемых дозировках и концентрациях. «Фармацевтически приемлемые» носители могут представлять собой, но не ограничиваются ими, органические или неорганические, твердые или жидкие наполнители, которые подходят для выбранного способа применения, такого как пероральное применение или инъекция, и вводятся в форме обычного фармацевтического препарата, такого как твердое вещество, например таблетки, гранулы, порошки, капсулы и/или жидкость, например раствор, эмульсия или суспензия. Часто физиологически приемлемый носитель представляет собой водный буферный раствор, такой как фосфатный буфер или цитратный буфер. Физиологически приемлемый носитель также может содержать один или более из следующих компонентов: антиоксиданты, в том числе аскорбиновую кислота, полипептиды с низкой молекулярной массой (менее чем приблизительно 10 остатков), белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон, аминокислоты или углеводы, в том числе глюкоза, манноза или декстрины, хелатообразующие агенты, такие как ЭДТА, сахарные спирты, такие как маннит или сорбит, солеобразующие противоионы, такие как натрий, и неионные поверхностно-активные вещества, такие как Tween™, полиэтиленгликоль (ПЭГ) и/или Pluronics™. К носителям также можно добавить вспомогательное вещество, стабилизатор, эмульгатор, смазку, связывающее вещество, регулятор рН, изотонический агент и другие стандартные добавки.
[0161] Фармацевтически приемлемый или подходящий носитель может содержать другие соединения, о которых известно, что они полезны при нарушениях состояния ЖК трака (например, антиоксиданты, такие как витамин С, витамин Е, селен или цинк); или пищевую композицию. Пищевая композиция может представлять собой, но не ограничивается ими, молоко, йогурт, творог, сыр, кисломолочные продукты, ферментированные продукты на основе молока, мороженое, ферментированные продукты на основе зерновых, порошки на основе молока, смеси для детского питания, таблетки, жидкие бактериальные суспензии, сухую пероральную добавку или жидкую пероральную добавку.
Стволовые клетки
[0162] «Стволовые клетки» в настоящем описании относятся к клеткам, которые в подходящих условиях способны дифференцироваться в другие типы клеток, обладающие определенной специализированной функцией (например, «полностью дифференцированные» клетки), в то время как в других подходящих условиях они способны к самообновлению и сохранению в недифференцированном мультипотентном или плюрипотентном состоянии, как подробно описано ниже. «Клетка» в настоящем описании относится к отдельной клетке, а также к популяции (например, более одной) клеток. Популяция может быть чистой популяцией, содержащей один тип клеток. Альтернативным образом популяция может содержать более одного типа клеток. Стволовые клетки предпочтительно представляют собой PBD-PSC, полученные, например, из периферической крови, жировой ткани, костного мозга, фолликулярной жидкости женских яичников и/или мужской семенной жидкости.
[0163] «Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из периферической крови» (или «PBD-PSC»), в настоящем описании относятся к клетке или популяции клеток, для которых характерно то, что клетки имеют диаметр 2,5-4,5 мкм, например, диаметр, составляющий 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4 или 4,5 мкм или диаметр в диапазоне, определенном любыми двумя из вышеуказанных значений и высокий уровень экспрессии RTH1R. В настоящем описании как PBD-PSC также обозначают RTH1R-положительные стволовые клетки, RTH1R-положительные клетки или RTH1R-положительные PSC. PBD-PSC являются положительными по CD90 и CD133; положительными/отрицательными по CD29, CD34, CD105 и/или CD106; и отрицательными по SSEA-3, CD200 и CD45. В некоторых вариантах реализации стволовые клетки экспрессируют Sox2 и Oct4. Хотя название предполагает, что стволовые клетки получены из периферической крови, PBD-PSC также можно получить из других источников, где их можно обнаружить во множестве, в том числе из периферической крови, жировой ткани, костного мозга, фолликулярной жидкости женских яичников и/или мужской семенной жидкости. В некоторых вариантах реализации PBD-PSC присутствуют в популяции клеток. В некоторых вариантах реализации популяция клеток содержит дополнительные стволовые клетки и/или эндотелиальные клетки и/или другие регенерирующие клетки. В некоторых вариантах реализации PBD-PSC содержатся в популяциях клеток, которые имеют клетки, не являющиеся регенерирующими клетками, например, жировые клетки, клетки кожи, костные клетки, мышечные клетки и/или клетки из женской или мужской репродуктивной системы, такие как клетки стенки матки или семенника. В некоторых вариантах реализации выделенные PBD-PSC добавляют обратно или смешивают с популяцией клеток, которая может содержать дополнительные регенерирующие клетки или может содержать нерегенерирующие клетки, например жировые клетки, клетки кожи, мышечные клетки, костные клетки или клетки женской или мужской репродуктивной системы, такие как клетки матки или клетки семенника.
[0164] Клетки можно получать из образца периферической крови методами центрифугирования, фильтрования, лизирования и выделения. Центрифугирование можно проводить при ускорении 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400 или 2500 G, или с центробежной силой, которая находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя из вышеуказанных значений. Центрифугирование может включать различные циклы для выделения желаемого компонента периферической крови. Например, первый этап центрифугирования можно применять для выделения слоя плазмы, что делают при низкой скорости центрифугирования, например, при 100, 200, 300, 400 или 500 G, или при центробежной силе, которая находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя из вышеуказанных значений. Выделенный слой плазмы затем, чтобы выделить тромбоциты, можно подвергнуть центрифугированию при более высокой скорости, такой как, например, 800, 900, 1000, 1100, 1200 G или выше, или при центробежной силе, которая находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя из вышеуказанных значений. Тромбоциты выпадают в осадок, и осадок можно выделить и суспендировать. Ресуспендированные тромбоциты можно подвергнуть фильтрованию для удаления детрита или нежелательного материала, например, на фильтре, имеющем поры размером 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 2, 3, 4, или 5 мкм или поры размером в пределах диапазона, определенного любыми двумя из вышеуказанных значений. Затем тромбоциты можно подвергнуть лизису для получения лизата тромбоцитов, который можно дополнительно выделить или очистить центрифугированием и/или фильтрованием. Лизис можно проводить с помощью различных методов, в том числе, например, лизиса на основе реактивов, физического разрушения (обработка ультразвуком). PBD-PSC можно выделить из лизата тромбоцитов при контакте лизата тромбоцитов с помощью отрицательного отбора (например, контакта лизата тромбоцитов с антителом, таким как анти-CD45-антитело, для того чтобы связать клетки, отличные от PBD-PSC) или с помощью положительного отбора (например, контакта лизата тромбоцитов с антителом, таким как антитело к рецептору РТН, для того чтобы связать PBD-PSC).
[0165] Наиболее примитивными зародышевыми клетками в семенниках взрослых млекопитающих являются сперматогониальные стволовые клетки (ССК); а основной функциональной единицей в яичнике считаются первичные фолликулы (ПФ). Однако эту центральную догму недавно модифицировали благодаря идентификации PBD-PSC в половых железах млекопитающих. Эти стволовые клетки более примитивны, чем ССК, а также принимают участие в постнатальном нео-оогенезе в яичниках и образовании первичного фолликула. PBD-PSC плюрипотентны по своей природе, и для них характерны Oct-4A в ядре, SSEA-4 на клеточной поверхности и другие маркеры плюрипотентности, такие как Nanog, Sox2 и/или TERT. Считается, что PBD-PSC являются потомками эпибластных стволовых клеток и, возможно, первичных половых клеток, которые сохраняются в зрелом возрасте и подвержены асимметричному делению, чтобы пополнять половые клетки гонад в течение всей жизни. Настоящее описание касается роли PBD-PSC в бесплодии, восстановлении эндометрия, суперовуляции и патогенезе различных репродуктивных заболеваний, таких как ПКЯ, эндометриоз, рак. Некоторые варианты реализации, предложенные в настоящей заявке, относятся к новым направлениям исследований, позволяющим лучше понять различные репродуктивные процессы и раковые заболевания. В некоторых вариантах реализации PBD-PSC имеют отношение к регенеративной медицине, научно-практическим исследованиям и клинических применениям в области репродукции человека.
[0166] Существующая догма о том, что самка рождается с фиксированным количеством яйцеклеток, была поставлена под сомнение благодаря обнаружению в яичниках взрослых млекопитающих стволовых клеток. Накоплены данные в поддержку пролиферации стволовых клеток яичников (СКЯ), поддержания культуры, формирования кластеров половых клеток, дифференцировки в ооциты и образования первичного фолликула с использованием различных стратегий.
[0167] При анализе методом проточной цитометрии выявили СКЯ более 8 мкм, являющиеся DDX1-положительными, которые считают эквивалентными сперматогониальным стволовым клеткам (ССК) в семенниках. При анализе мазков из яичников и семенников, полученных после ферментативного расщепления, идентифицировали PBD-PSC. Как указано выше, PBD-PSC и СКЯ/ССК отличаются друг от друга по размеру и экспрессии ОСТ-4. PBD-PSC экспрессируют маркеры плюрипотентности, в том числе ОСТ-4 в ядре, тогда как СКЯ/ССК экспрессируют ОСТ-4 в цитоплазме, что указывает на дифференцированное состояние. PBD-PSC можно изучить с помощью проточной цитометрии как клетки небольшого размера, являющиеся LIN-/CD45-/Sca-1+. PBD-PSC составляют 0,02±0,008, 0,03±0,017 и 0,08±0,03% от общего количества клеток в нормальных, подвергнутых химической абляции и подвергнутых химической абляции после обработки ФСГ яичниках мыши, соответственно.
[0168] Вращение или центрифугирование в ходе обработки клеток, полученных после ферментативного расщепления ткани яичника на скорости 1000 G (вместо 1200 об/мин), позволяет с уверенностью детектировать PBD-PSC методом проточной цитометрии. Соответственно, в некоторых процедурах PBD-PSC получают способом, в котором ткань яичника ферментативно расщепляют или подвергают механической обработке для высвобождения PBD-PSC, а указанные PBD-PSC выделяют с помощью центрифугирования при 900, 950, 975 или 1000 G. или при центробежной силе, которая находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя из вышеуказанных значений.
[0169] «Рецептор паратиреоидного гормона типа 1» (или «RTH1R») представляет собой белок, экспрессируемый на PBD-PSC, который функционирует как рецептор паратиреоидного гормона (ПТГ) и связанного с паратиреоидным гормоном белка (ПТГ-сБ). ПТГ и ПТГ-сБ действуют как хемоаттрактанты к PBD-PSC и, следовательно, полезны для направленного взаимодействия PBD-PSC с определенной желательной областью внутри организма.
[0170] «Клеточная культура» или «культивируемая клетка» в настоящем описании относится к клеткам или тканям, которые содержат, культивируют или выращивают в искусственной среде in vitro, например в среде в емкости. В этот термин входят непрерывные клеточные линии (например, с бессмертным фенотипом), первичные клеточные культуры, конечные клеточные линии (например, нетрансформированные клетки) и любая другая популяция клеток, поддерживаемая in vitro. В связи с этим первичная клетка представляет собой клетку, которую непосредственно получают из ткани или органа животного, включая человека, в отсутствие культуры. Обычно, хотя и не обязательно, первичная клетка способна пройти десять или менее пересевов in vitro до старения и/или прекращения пролиферации.
[0171] «Недифференцированный» в настоящем описании относится к культивируемым клеткам, если значительная часть (по меньшей мере 20% и, возможно, более 50% или 80%) клеток и их отпрысков в популяции проявляют морфологические характеристики недифференцированных клеток, которые отличают их от дифференцированных клеток, происходящих от эмбриона или взрослой особи. Клетки рассматривают как пролиферирующие в недифференцированном состоянии, если они проходят по меньшей мере одно удвоение популяции в течение периода культивирования, составляющего по меньшей мере 3 недели, сохраняя при этом после указанного периода культивирования по меньшей мере приблизительно 50% или ту же долю клеток, имеющих характерные маркеры или морфологические характеристики недифференцированных клеток.
[0172] «Суспензия клеток» в настоящем описании относится к культуре клеток, в которой большинство клеток свободно плавают в среде, обычно в культуральной среде (системе), и клетки плавают как отдельные клетки, как кластеры клеток и/или как агрегаты клеток. Другими словами, клетки выживают и размножаются в среде, не будучи прикрепленными к твердому или полутвердому субстрату. «Адгезирующие клетки» в настоящем описании относится к клетке или популяции клеток, которая адгезирует с субстратом или поверхностью.
[0173] «Система культивирования» в настоящем описании относится к условиям культивирования, способствующим поддержанию и размножению PBD-PSC. Термин обозначает комбинацию элементов, которая может включать основную среду (среда для культивирования клеток, обычно содержащая определенный базовый раствор, который содержит соли, сахара и аминокислоты) и добавку заменителя сыворотки. Культуральная система может дополнительно содержать другие элементы, такие как, помимо прочего, компонент внеклеточного матрикса (ВКМ), дополнительную сыворотку или заменитель сыворотки, культуральную (питательную) среда и другие экзогенно добавленные факторы, которые в совокупности обеспечивают подходящие условия, поддерживающие рост PBD-PSC, поддержание культуры клеток, дифференцировку клеток или экспрессию различных молекул. В соответствующем контексте термин «культуральная система» также охватывает культивируемые в ней клетки.
[0174] В настоящем описании культуральная система PBD-PSC включает стволовые клетки, культивируемые в присутствии белка, такого как белок внеклеточного матрикса, цитокин, фактор роста или антиген. Конкретные примеры включают эпидермальный фактор роста (EGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), фактор роста фибробластов (FGF и bFGF), трансформирующий фактор роста (TGF-α и TGF-β 1, 2 и 3), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), фактор роста гепатоцитов (HGF), фактор роста кератиноцитов (KGF), фактор роста нервов (NGF), эритропоэтин (ЭПО), инсулиноподобные факторы роста (IGF-I и IGF-II), цитокин интерлейкин (IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13), интерферон (IFN-α, IFN-β и IFN-γ), фактор некроза опухоли (TNFα и TNF-β), или колониестимулирующий фактор (GM-CSF и M-CSF), инсулин, паратиреоидный гормон, фибронектин, витронектин, тенасцин, тромбоспондин, желатин, фибриллин, мерозин, анхорин, хондронектин, линкерный белок, костный сиалопротеин, остеокальцин, остеопонтин, эпинектин, калинин, коллагеназу, коллаген, эластин, ламинин, агрин, нидоген и/или энтактин или их варианты и/или комбинации. В некоторых вариантах реализации PBD-PSC культивируют с ретиноевой кислотой и/или с одним или более производными ретиноевой кислоты, или с другими малыми молекулами.
[0175] «Генные продукты» в настоящем описании относятся к продукту гена, трансфицированного в клетку или популяцию клеток. Трансфицированный ген может кодировать, например, белок, такой как белок внеклеточного матрикса, цитокин, фактор роста или антиген. Конкретные примеры включают эпидермальный фактор роста (EGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), фактор роста фибробластов (FGF и bFGF), трансформирующий фактор роста (TGF-α и TGF-β 1, 2 и 3), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), фактор роста гепатоцитов (HGF), фактор роста кератиноцитов (KGF), фактор роста нервов (NGF), эритропоэтин (ЭПО), инсулиноподобные факторы роста (IGF-I и IGF-II), цитокин интерлейкин (IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13), интерферон (IFN-α, IFN-β и IFN-γ), фактор некроза опухоли (TNFα и TNF-β), или колониестимулирующий фактор (GM-CSF и M-CSF), инсулин, паратиреоидный гормон, фибронектин, витронектин, тенасцин, тромбоспондин, желатин, фибриллин, мерозин, анхорин, хондронектин, линкерный белок, костный сиалопротеин, остеокальцин, остеопонтин, эпинектин, калинин, коллагеназу, коллаген, эластин, ламинин, агрин, нидоген и/или энтактин или их варианты и/или комбинации.
[0176] «Клеточный маркер» в настоящем описании относится к любому фенотипическому признаку клетки, который можно использовать для ее характеристики или для того чтобы отличить ее от других типов клеток. Маркер может представлять собой белок (включая секретируемые белки, белки клеточной поверхности или внутренние белки; либо синтезируемые, либо поглощаемые клеткой); нуклеиновую кислоту (такую как мРНК или проявляющая ферментативную активность молекула нуклеиновой кислоты) или полисахарид. Включены детерминанты всех таких клеточных компонентов, которые выявляют с помощью антител, лектинов, зондов или реакции амплификации нуклеиновых кислот, специфичных для интересующего типа клеток. Маркеры также можно идентифицировать с помощью биохимического или ферментного анализа, который зависит от функции генного продукта. С каждым маркером связан ген, который кодирует транскрипт, и события, которые приводят к экспрессии маркера. Считают, что экспрессия маркера происходит преимущественно в недифференцированной либо дифференцированной популяции клеток, если его экспрессия находится на уровне, который по меньшей мере в 5 раз выше (в отношении общего генного продукта, измеренного в анализе на антитела или ПЦР) или в 5 раз чаще (в отношении положительных клеток в популяции). В значительной степени более предпочтительны маркеры, чья экспрессия в 10, 100 или 10000 раз выше или чаще.
[0177] В некоторых вариантах реализации предложена популяция стволовых клеток, где популяция стволовых клеток содержит PBD-PSC. Как показано на Фигуре 6, PBD-PSC имеют диаметр 2,5-4,5 мкм, такой как 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4 или 4,5 мкм или диаметр в диапазоне, определенном любыми двумя из вышеуказанных значений. Кроме того, для клеток характерна экспрессия RTH1R. PBD-PSC при культивировании образуют эмбриоидоподобные тельца, как показано на Фигуре 7, и способны к дифференцировке в эктодерму, мезодерму и энтодерму при культивировании. В некоторых вариантах реализации клетки экспрессируют классические CD-маркеры. PBD-PSC являются положительными по CD90 и CD133; положительными/отрицательными по CD29, CD34, CD105 и/или CD106; и отрицательными по SSEA-3, CD200 и CD45. Кроме того, как показано на Фигуре 8, PBD-PSC экспрессируют Sox2 и Oct4. Также PBD-PSC являются положительными по SSEA-4 и CXCR-4. PBD-PSC являются+/- по Lin Cocktail, Sca-1 и Lgr5.
[0178] PBD-PSC обнаружены в различных популяциях животных помимо человека, включая, например, лошадей, собак и верблюдов, как показано на Фигуре 9. Кроме того, PBD-PSC необязательно можно культивировать с одним или более пептидами, такими как белок ВКМ, цитокин, фактор роста или антиген.
[0179] В некоторых вариантах реализации предложено антитело к PBD-PSC. В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой моноклональное или поликлональное антитело. В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой гуманизированное антитело. «Выделенное антитело» представляет собой антитело, которое не связано со связанными с ним в естественной среде компонентами, включая другие связанные с ним в естественной среде антитела, сопутствующие ему в нативном состоянии, и которое не содержит других белков тех же биологических видов. Кроме того, выделенное антитело экспрессируется клеткой других биологических видов или не встречается в природе. Термин «гуманизированное антитело» включает все антитела, которые имеют один или более вариабельных и константных участков, полученных из последовательностей иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело представляет собой антитело, которое получено от вида, не являющегося человеком, в котором определенные аминокислоты в каркасных и константных доменах тяжелых и легких цепей подвергнуты мутации таким образом, чтобы избежать или исключить иммунный ответ у людей. Альтернативным образом, гуманизированное антитело можно получить путем слияния константных доменов из антитела человека с вариабельными доменами вида, не являющегося человеком.
Способы выделения PBD-PSC
[0180] Некоторые варианты реализации относятся к способам выделения PBD-PSC из образца субъекта. Субъектом может быть человек или другое млекопитающее, такое как домашнее животное, животное-компаньон или сельскохозяйственное животное. В некоторых вариантах реализации субъект представляет собой лошадь, собаку, кошку или верблюда. В некоторых вариантах реализации образец представляет собой периферическую кровь, жировую ткань, костный мозг, фолликулярную жидкость яичника или семенную жидкость. В некоторых вариантах реализации образец контактирует с антителом к PBD-PSC. В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой антитело к RTH1R. В некоторых вариантах реализации антитело связано с магнитной гранулой, что способствует выделению антитела и отделению его от образца. В таких случаях к образцу применяют магнитное поле, и магнитную гранулу, связанную с комплексом антитело-PBD-PSC, отделяют от смеси образца. В некоторых вариантах реализации образец промывают сепарационным буфером и выделяют PBD-PSC. В некоторых вариантах реализации для присоединения магнитных гранул к антителу применяют авидин или стрептавидин и биотин.
[0181] В некоторых вариантах реализации PBD-PSC выделяют экстракорпорально. Одним из таких подходов является получение от субъекта цельной крови или плазмы и введение ее в экстракорпоральную систему, содержащую мембрану, подложку или гранулу, предпочтительно пористую мембрану, сконфигурированную для захвата PBD-PSC, например мембраной, гранулой или подложкой, содержащей антитело к RTH1R или его связывающий фрагмент, прикрепленное(ый) или иммобилизованное(ый) на указанной мембране, подложке или грануле. Антитело к RTH1R или его связывающий фрагмент, прикрепленное(ый) или иммобилизованное(ый) на указанной мембране, подложке или грануле, можно ввести в картридж, который сконфигурирован для вставки или сборки в устройстве для диализа или рециркуляции крови. В некоторых вариантах реализации к мембране прикладывают центробежную или гравитационную силу или давление, что вызывает прохождение цельной крови через мембрану, опору или гранулу с сохранением PBD-PSC, которые захватывает мембрана, подложка или гранула. В некоторых вариантах реализации прошедшую через мембрану кровь вводят субъекту повторно. В некоторых вариантах реализации выделенные PBD-PSC готовят для последующей реинфузии или введения индивидууму.
[0182] В некоторых вариантах реализации количество PBD-PSC, выделенных из образца субъекта, составляет 1000, 5000, 10000, 100000, 100000, 500000, 1000000, 2000000, 3000000, 4000000, 5000000, 6000,000, 7000000, 8000000, 9000000, 10000000, 50000000 или 100000000 клеток/мл образца (периферическая кровь, гомогенат ткани и т.д.), или количество, которое находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя из вышеуказанных количеств.
Способы использования PBD-PSC
[0183] Аспекты настоящего изобретения относятся к первому медицинскому применению PBD-PSC. Соответственно, некоторые варианты реализации относятся к PBD-PSC для применения в качестве лекарственного средства. Некоторые варианты реализации, представленные в настоящем изобретении, относятся к применению PBD-PSC для лечения или облегчения бесплодия, расстройств кожи, потери волос, злокачественных карцином, расстройств костей, неврологических расстройств и/или аутоиммунных расстройств. В этих способах PBD-PSC и/или популяцию клеток, содержащую PBD-PSC, вводят или обеспечивают выбранному или идентифицированному субъекту, например субъекту, выбранному или идентифицированному для получения терапевтического средства, которое лечит или облегчает бесплодие, заболевание кожи, потерю волос, злокачественные карциномы, заболевания костей, неврологические заболевания и/или аутоиммунные заболевания. Выбор и/или идентификацию такого нуждающегося в этом субъекта можно сделать с помощью клинической оценки и/или диагностического теста.
[0184] В некоторых вариантах реализации выделенные PBD-PSC вводят субъекту, который страдает бесплодием, например субъекту, выбранному и/или идентифицированному в качестве нуждающегося в лечении бесплодия или терапевтическом средстве, которое облегчает бесплодие. В некоторых вариантах реализации выбранный или идентифицированный субъект ранее предпринимал экстракорпоральное оплодотворение и/или внутрицитоплазматическую инъекцию сперматозоидов (ЭКО/ИКСИ), но безуспешно. В некоторых вариантах реализации выбранный или идентифицированный субъект не страдает синдромом поликистозных яичников (СПКЯ). В некоторых вариантах реализации выделенные PBD-PSC или популяцию клеток, содержащую PBD-PSC, вводят указанному субъекту посредством внутриартериальной инъекции в маточную артерию. В некоторых вариантах реализации PBD-PSC вводят внутривенно. В некоторых вариантах реализации терапия PBD-PSC увеличивает толщину эндометрия, рецептивность эндометрия, количество ооцитов, качество ооцитов, функцию яичников или количество эстрадиола или комбинации вышеперечисленного.
[0185] В некоторых вариантах реализации выделенные PBD-PSC или популяцию клеток, содержащую PBD-PSC, вводят субъекту, которого выбрали или идентифицировали как субъекта, страдающего нарушением кожи, например субъекту, выбранному и/или идентифицированному в качестве нуждающегося в лечении кожного заболевания или терапевтическом средстве, которое облегчает кожное заболевание. В некоторых вариантах реализации субъекта идентифицируют или выбирают как субъекта, страдающего от кожного заболевания, такого как старение кожи, которое привело к появлению морщин, потере эластичности или потере сияния кожи. В некоторых вариантах реализации субъекта идентифицируют или выбирают как субъекта, страдающего от потери кожного коллагена и/или потери кожного эластина, или имеющего или желающего удалить мелкие морщины и/или морщины. В некоторых вариантах реализации PBD-PSC вводят местно с помощью крема или лосьона. В некоторых вариантах реализации PBD-PSC вводят подкожно или трансдермально. В некоторых вариантах реализации терапия PBD-PSC увеличивает кожный коллаген и эластин и уменьшает мелкие морщины, уменьшает морщины, увеличивает сияние или увеличивает упругость кожи или способствует комбинациям вышеперечисленного.
[0186] В некоторых вариантах реализации выделенные PBD-PSC или популяцию клеток, содержащую PBD-PSC, вводят субъекту, которого выбрали или идентифицировали как субъекта, страдающего заболеванием кости, например субъекту, выбранному и/или идентифицированному в качестве нуждающегося в лечении заболевания кости или терапевтическом средстве, которое облегчает течение заболевания кости. В некоторых вариантах реализации заболевание кости представляет собой повреждение кости, перелом кости, перелом остистого отростка, остеопению или остеопороз или их комбинации. В некоторых вариантах реализации композицию вводят подкожно, внутривенно или внутриартериально идентифицированному или выбранному субъекту. В некоторых вариантах реализации введение PBD-PSC приводит к повышению плотности кости, восстановлению повреждения кости или их комбинациям.
[0187] В некоторых вариантах реализации выделенные PBD-PSC или популяцию клеток, содержащую PBD-PSC, вводят субъекту, которого выбрали или идентифицировали как субъекта, страдающего неврологическим заболеванием, например субъекту, выбранному и/или идентифицированному в качестве нуждающегося в лечении неврологического заболевания или терапевтическом средстве, которое облегчает неврологическое заболевание. В некоторых вариантах реализации неврологическое заболевание представляет собой мозжечковую атаксию. В некоторых вариантах реализации PBD-PSC вводят подкожно, внутривенно или внутриартериально идентифицированному или выбранному субъекту. В некоторых вариантах реализации введение PBD-PSC приводит к улучшению неврологического заболевания.
[0188] В некоторых вариантах реализации выделенные PBD-PSC или популяцию клеток, содержащую PBD-PSC, вводят субъекту, которого выбрали или идентифицировали как субъекта, страдающего метастазирующей карциномой или другим злокачественным новообразованием, например субъекту, выбранному и/или идентифицированному в качестве нуждающегося в лечении метастазирующей карциномы или злокачественного новообразования или терапевтическом средстве, которое облегчает метастазирующую карциному или злокачественное новообразование. В некоторых вариантах реализации метастазирующая карцинома представляет собой легочные метастазы. В некоторых вариантах реализации PBD-PSC вводят подкожно, внутривенно или внутриартериально идентифицированному или выбранному субъекту. В некоторых вариантах реализации введение PBD-PSC приводит к улучшению злокачественного новообразования или метастазирующей карциномы.
[0189] В некоторых вариантах реализации выделенные PBD-PSC или популяцию клеток, содержащую PBD-PSC, вводят субъекту, которого выбрали или идентифицировали как субъекта, страдающего аутоиммунным заболеванием, или имеющего выраженные симптомы аутоиммунного заболевания. В некоторых вариантах реализации аутоиммунное заболевание представляет собой одно или более расстройств, идентифицированных или описанных в настоящей заявке. В некоторых вариантах реализации PBD-PSC вводят подкожно, внутривенно или внутриартериально идентифицированному или выбранному субъекту. В некоторых вариантах реализации введение PBD-PSC приводит к улучшению неврологического заболевания.
[0190] В некоторых вариантах реализации PBD-PSC выделяют у донора и трансплантируют реципиенту, который нуждается в лечении PBD-PSC. В некоторых вариантах реализации донором является молодой субъект. В некоторых вариантах реализации реципиент старше и нуждается в соответствующем лечении. В некоторых вариантах реализации реципиент может страдать от описанного в настоящей заявке заболевания. В некоторых вариантах реализации реципиент может страдать от эффектов старения. В некоторых вариантах реализации клетки донора могут соответствовать или не соответствовать с тканью или кровью клеток донора, но реципиент может получать лечение без последствий от несовпадающего донора. На Фигурах 13-19 в общих чертах изображено применение клеток донора для обеспечения реципиенту антивозрастного эффекта.
[0191] Соответственно, в некоторых вариантах реализации препарат PBD-PSC, полученный в соответствии с изложенным в настоящей заявке руководством, содержит очищенные PBD-PSC. В некоторых вариантах реализации препарат дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель, белок, такой как белок внеклеточного матрикса, цитокин, фактор роста или антиген. В некоторых вариантах реализации вышеуказанные препараты полезны для лечения, профилактики, облегчения или подавления кожного заболевания, такого как любое одно или более из следующих расстройств: глубокие морщины, неферментативное гликозилирование кожи, повреждение в результате действия солнца, повреждение в результате курения, фиброз кожи, угри солнечные (акне Майорка), конглобатные угри, угри косметические (косметическое акне), молниеносные угри (острое фебрильное язвенное акне), келоидные затылочные угри (келоидальное акне, сосочковый дерматит головы, фолликулит келоидальный, келоидный затылочный фолликулит, келоидное затылочное акне), разбросанные красные папулы на лбу у взрослых, медикаментозные угри, некротические угри (оспоподобные угри), вульгарные угри, угри с отеком лица (солидный отек лица), блефарофимоз, эритематозно-телеангиэктатическую розацеа (сосудистая розацеа), экскориированные угри (утрикарные угри), железистую розацеа, гнатофима, грамотрицательную розацеа, гранулематозный периоральный дерматит, болезнь «красного носа», ринофиму, гранулематозный периоральный дерматит, галогеновые угри, гнойный гидраденит (инверстные угри, пиодермальные свищи, болезнь Вернейля), идиопатическую асептическую гранулему лица, детские угри, люпоидную розацеа (гранулематозную розацеа, микропапулезную туберкулодермию, розацеоподобный туберкулоид Левандовского), милиарную диссеминированную волчанку лица, метофиму, неонатальные угри (угревая сыпь новорожденных, неонатальные угри, неонатальный цефалический пустулез), профессиональные угри, «масляные» угри, глазную розацеа (офтальмологическая розацеа, офтальмозацеа), отофиму, периорфициальный дерматит, устойчивый отек при розацеа (хронический эритрематозный отек в верхней части лица, болезнь Морбигана, лимфидема при розацеа), фиматозную розацеа, помадные угри, папулезно-пустулезную розацеа (воспалительная розацеа), абсцедирующий подрывающий перифолликулит головы (подрывающий фолликулит кожи головы, подрывающий фолликулит, абсцедирующий и подрывающий перифолликулит Гоффмана), периоральный дерматит, периорбитальный дерматит (периокулярный дерматит), лицевую пиодермию (молниеносная розацеа), ринофиму, розацеа (розовые угри), конгоблатную розацеа, синдром синовит-акне-пустулез-гиперостоз-остеомиелит (синдром SAPHO), стероидную розацеа, смоляные угри, рак кожи, тропические угри, псориаз, в том числе бляшечный псориаз, каплевидный псориаз, обратный псориаз, пустулезный псориаз, эритродермический псориаз, ногтевой псориаз, и/или псориатический артрит, и/или их комбинации и/или варианты.
[0192] На Фигуре 13 представлена схематичная диаграмма, на которой изображено общее снижение функциональных возможностей стволовых клеток в результате старения. Многочисленные воздействия влияют совместно, приводя к функциональному снижению, включая, например, внешние и внутренние воздействия. Внешние воздействия могут включать, например, воспалительные цитокины или повышенные активаторы Wnt. Внутренние воздействия включают метаболическую дисфункцию. Эти воздействия влияют на молекулярные эффекторы, такие как активные формы кислорода, что приводит к геномным, эпигеномным и/или протеомным изменениям, ведущим к функциональному снижению стволовых клеток, что еще больше усугубляет негативные внутренние воздействия. Кроме того, функциональное снижение приводит к дисфункции тканей и старению организма, что еще больше усугубляет внешние воздействия, приводя к эффектам старения.
[0193] На Фигуре 14 показано потомство стволовых клеток в отношении молодых стволовых клеток, которые испытывают меньше негативных воздействий, а также старых стволовых клеток, которые испытывают большее количество внутренних и внешних воздействий, что приводит к эффектам старения. На Фигуре 15 показана сильная тенденция к отрицательной корреляции количества PBD-PSC с возрастом пациентов.
[0194] Изобретение в целом раскрыто в настоящей заявке с использованием утвердительных выражений при описании многочисленных вариантов реализации. Изобретение также включает варианты реализации, в которых полностью или частично исключен предмет изобретения, такой как вещества или материалы, этапы способа и условия, протоколы или процедуры. Таким образом, несмотря на то что изобретение в целом не выражено в настоящей заявке в отношении того, что изобретение не включает в себя аспекты, которые явным образом не исключены в изобретении, они тем не менее раскрыты в настоящей заявке.
ПРИМЕРЫ
[0195] Некоторые аспекты вариантов реализации, обсуждаемых выше, детальней описаны в следующих примерах, которые никоим образом не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. Специалистам в данной области техники будет понятно, что в объем изобретения входит множество других вариантов реализации, описанных выше и в формуле изобретения.
Пример 1
Получение антител к PBD-PSC.
[0196] Следующий пример демонстрирует способ разработки моноклональных антител (мАт) к PBD-PSC.
[0197] На Фигуре 10 представлена общая процедура разработки моноклональных антител к PBD-PSC. На этапе 1 мышь иммунизируют PBD-PSC с помощью инъекции мыши стволовых клеток. Селезенка мыши вырабатывает плазматические клетки, которые секретируют антитела к стволовым клеткам. На этапе 2 отбирают клетки миеломы, неспособные вырабатывать антитела. На этапе 3 селезенку мыши удаляют, а плазматические клетки из селезенки выделяют и смешивают с клетками миеломы. Вызывают слияние клеток, которое приводит к образованию гибридом. На этапе 4 клетки переносят в гипоксантин-аминоптерин-тимидиновую (ГAT) среду. Неслившиеся плазматические клетки и неслившиеся клетки миеломы погибают. Наконец, на этапе 5 гибридомы, которые вырабатывают антитела, специфичные к плюрипотентным стволовым клеткам, отбирают и выращивают в большом объеме.
Пример 2
Выделение PBD-PSC из крови или ткани
[0198] Следующий пример демонстрирует способ выделения PBD-PSC.
[0199] Образец получают от субъекта. Образец может содержать периферическую кровь, жировую ткань, костный мозг, фолликулярную жидкость яичников или семенную плазму, или их комбинации. Как показано на Фигуре 11, образец смешивают с мАт к PBD-PSC. Моноклональное антитело может представлять собой, например, антитело к RTH1R. В некоторых вариантах реализации для разделения комплекса мАт-PBD-PSC можно включить магнитные гранулы. В некоторых вариантах реализации для присоединения магнитных гранул к антителу применяют авидин или стрептавидин и биотин. В этом случае применяют магнитное поле, а образец промывают для удаления несвязавшегося супернатанта. PBD-PSC высвобождают из мАт с помощью промывочного буфера, и выделяют клетки.
Пример 3
Выделение PBD-PSC из периферической крови
[0200] Следующий пример демонстрирует способ выделения PBD-PSC из периферической крови с применением экстракорпоральной системы.
[0201] Субъект или донор подключен к экстракорпоральному устройству. Цельную кровь берут у донора и направляют в экстракорпоральное устройство, как показано на Фигуре 12. Устройство содержит пористую мембрану, через которую проходит кровь. Кровь может проходить через мембрану под действием центробежной или гравитационной силы, а в это время PBD-PSC выделяют или захватывают на мембране. Таким образом PBD-PSC выделяют из цельной крови. Можно провести реинфузию прошедшей через мембрану крови в индивидуума. PBD-PSC выделяют в количестве от 1000 до 100000000 клеток/мл образца. В некоторых вариантах реализации выделенные PBD-PSC готовят для последующей реинфузии или введения индивидууму.
Пример 4
Рост PBD-PSC на матрице из нановолокон
[0202] Следующий пример демонстрирует способ роста PBD-PSC на матрице из нановолокон.
[0203] PBD-PSC были выделены у 55-летнего здорового мужчины и выращены на матрице из нановолокон. Электронные микрофотографии матрицы из нановолокон, на которой выращены PBD-PSC, показаны на Фигуре 20А (0 мин), Фигуре 20В (5 мин; вверху, увеличение в 1200 раз; снизу, увеличение в 5000 раз), на Фигуре 20С (30 мин; вверху, 1200) увеличение х; снизу, увеличение 5000 х) и Фигуре 20D (120 мин). PBD-PSC связаны с матрицей и находятся в ней в течение 5-30 минут.
[0204] Матрицу из нановолокон изготовляли из волокон толщиной от 200 до 700 мкм, полученных методом электроспиннинга из поликапролактона (PCL). Волокна разрушали в порошок с помощью лазера. Комбинаторное применение этой матрицы может включать в себя инъекцию в суставы и кости (такую как применения при переломах и в стоматологии) или размещение на ране.
Пример 5
Лечение кожи с применением PBD-PSC
[0205] В следующем примере показан способ обработки кожи для улучшения коллагена и эластина с применением препарата PBD-PSC.
[0206] Препарат PBD-PSC применяли для решения проблемы старения кожи. Аутологичный PBD-PSC получали у субъекта и применяли в качестве мезотерапевтического средства для противодействия преждевременному старению кожи путем увеличения кожного коллагена и эластина. Как показано на Фигуре 21, количество как коллагена, так и эластина увеличивалось за промежуток времени от предварительной обработки (день 0) до 30 дней после обработки. Кроме того, как показано в Таблице 1, данные косметических измерений стареющей кожи после лечения улучшились.
[0207] Эти результаты показывают, что препарат PBD-PSC полезен для улучшения эффектов старения кожи благодаря увеличению кожного коллагена и эластина, что уменьшает мелкие морщины и увеличивает сияние и упругость.
Пример 6
Рост волос с применением PBD-PSC
[0208] В следующем примере показан способ лечения потери волос или усиления роста волос с применением препарата PBD-PSC.
[0209] Субъекту, страдающему от потери волос, обеспечили аутологичный препарат PBD-PSC. Как показано на Фигуре 22, через 10 недель после обработки препаратом PBD-PSC рост волос значительно увеличился. Этот результат демонстрирует эффективность препаратов PBD-PSC для применения в усилении роста волос. Препарат PBD-PSC содержит очищенные или выделенные PBD-PSC и дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель. Препарат может дополнительно содержать белок, фактор роста или другой агент.
Пример 7
PBD-PSC для лечения переломов костей
[0210] В следующем примере показано, что PBD-PSC полезны при лечении переломов костей.
[0211] На Фигурах 23А-23С показано изображение перелома кости. Субъектом является 50-летний пациент с незаживающим переломом остистого отростка С-7. Перелом обрабатывали лекарственной формой, содержащей PBD-PSC, через 9 месяцев после травмы. PBD-PSC вводили внутривенно и локально вблизи перелома кости.
[0212] На Фигуре 23В показано изображение перелома шейного отдела позвоночника в коронарной плоскости, сделанное с помощью компьютерной томографии. На левом изображении показан перелом до лечения. Субъекта лечили препаратом PBD-PSC, как описано выше, с внутривенными и местными инъекциями. Через четыре месяца после лечения (правый снимок) перелом полностью зажил. На Фигуре 23 показано изображение перелома шейного отдела позвоночника в саггитальной плоскости, сделанное с помощью компьютерной томографии. На левом изображении показан перелом до лечения. Через четыре месяца после лечения (правый снимок) перелом полностью зажил.
Пример 8
PBD-PSC для лечения остеопороза
[0213] В следующем примере показано, что PBD-PSC полезны при лечении остеопороза.
[0214] Препараты PBD-PSC полезны при лечении остеопороза. Остеопороз обычно возникает у пожилых людей из-за большей чем в норме потери костной ткани. В этом примере пожилой субъект женского пола демонстрировал прогрессирующую потерю костной ткани в постменопаузе, как показано в Таблице 2.
2
Все измерения минеральной плотности кости (г/см)
[0215] Субъекта лечили препаратом, содержащим PBD-PSC. После лечения потеря костной массы прекратилась как в поясничном отделе, так и в бедренной кости. Фактически, как показано в таблице, плотность кости не только прекратила снижение, но и увеличилась через 86 месяцев после лечения PBD-PSC. Эти данные демонстрируют полезность PBD-PSC при лечении остеопороза благодаря улучшению плотности кости.
Пример 9
PBD-PSC для улучшения при остеопорозе
[0216] В следующем примере показано улучшение при остеопорозе у 65-летнего субъекта при введении PBD-PSC.
2
2
2
2
[0217] У 65-летней пациентки с тяжелым остеопорозом поясничного отдела позвоночника и левого бедра после однократной инфузии PBD-PSC наблюдали небольшое улучшение плотности кости поясничного отдела позвоночника. Как показано на Фигуре 25, плотность костей в поясничном отделе увеличилась с 0,641 до 0,647 (1,6%) г/см. Благоприятное действие инфузии PBD-PSC несколько ослабело через девять месяцев после инфузии (0,643 г/см), что указывает на то, что повторная инфузия с интервалами в 6 месяцев может поддерживать или сохранять благоприятное действие первичной инфузии. Плотность левой бедренной кости после инфузии PBD-PSC снизилась с 0,650 до 0,619 (-4,77%) г/см. Однако впоследствии плотность кости медленно падала до 0,611 (-1,3%) г/см, указывая на то, что инфузия остановила резкое снижение плотности кости в левом бедре.
Пример 10
PBD-PSC для лечения остеопении
[0218] В следующем примере показано, что PBD-PSC полезны при лечении остеопении.
2
2
2
2
[0219] Препараты PBD-PSC полезны при лечении остеопении. Остеопения - это состояние, при котором минеральная плотность кости ниже нормальной, с Т-показателем от -1,0 до -2,5. В этом примере у субъекта женского пола в возрасте 75 лет с остеопенией поясничного отдела позвоночника и левого бедра продемонстрировано значительное улучшение Т-показателей минеральной плотности кости после однократной терапии PDB-PSC. Как показано на Фигуре 26, Т-показатель в поясничном отделе позвоночника (верхний график) увеличился с -2,4 до -1,5 (улучшение на 37,5%) с сопутствующим увеличением плотности кости с 0,79 г/см до 1,004 г/см. Т-показатель в левом бедре (нижний график) увеличился с -1,7 до -1,2 (улучшение на 29,4%) с сопутствующим увеличением плотности кости с 0,66 г/см до 0,851 г/см.
Пример 11
PBD-PSC для улучшения фертильности
[0218] В следующем примере показано, что PBD-PSC полезны для улучшения фертильности.
[0221] Чтобы определить, полезны ли PBD-PSC для улучшения фертильности, приготовляли аутологичный препарат PBD-PSC. Препарат вводили внутриартериально в маточную артерию субъекта с обширным истончением эндометрия. Как показано на Фигуре 27, после лечения PBD-PSC, истончение эндометрия значительно улучшилось. Таким образом, PBD-PSC полезны для улучшения истончения эндометрия.
[0222] Чтобы определить, является ли терапия PBD-PSC полезной для улучшения фертильности, терапию PBD-PSC применяли у субъектов, которые ранее испытывали бесплодие. Женщины, которые ранее предпринимали попытки экстракорпорального оплодотворения/ внутрицитоплазматической инъекции сперматозоидов (ЭКО/ИКСИ), и у которых не было синдрома поликистозных яичников (СПКЯ) и было как минимум четыре повторных неудачи ЭКО/ИКСИ, получали внутривенную терапию PBD-PSC. В таблице 3 приведены результаты терапии PBD-PSC.
[0223] Эти результаты демонстрируют что терапия PBD-PSC улучшает количество исходов для женщин, ранее испытывавших бесплодие, по сравнению с предыдущими попытками ЭКО/ИКСИ.
[0224] Кроме того, в исследовании, в которое вошло 226 субъектов, женщины, которые предпринимавшие одну попытку ЭКО, имели более низкое количество успешных исходов ЭКО (41,3%), чем те, кто сочетал терапию PBD-PSC с ЭКО (81,6%), как показано в таблице 4.
[0225] Кроме того, инъекция PBD-PSC внутриматочной артерии при истончении эндометрия у 17 бесплодных женщин с предыдущей неудачей имплантации показывает увеличение толщины эндометрия и улучшение исходов фертильности, как показано в Таблице 5. Средняя толщина эндометрия у 17 женщин до лечения составляла 4,67 мм, а средняя толщина после лечения составляла 7,75 мм (увеличение на 3,08 мм; увеличение на 66%).
[0226] Взятые вместе, и результаты демонстрируют статистически значимые эффекты терапии PBD-PSC в отношении улучшения фертильности. В частности, терапия привела к детектируемому улучшению функции яичников, количества и качества ооцитов, толщины эндометрия и рецептивности эндометрия.
Пример 12
PBD-PSC при лечении неврологических расстройств
[0227] В следующем примере показано, что PBD-PSC полезны при лечении неврологических расстройств.
[0228] Чтобы определить, эффективна ли терапия PBD-PSC при лечения неврологических расстройств, аутологичные стволовые клетки выделяли у субъекта, страдающего прогрессирующей мозжечковой атаксией. Церебеллярная атаксия может возникать в результате многих заболеваний и проявляется в симптомах неспособности координировать равновесие, походку, конечности и движения глаз. Поражения мозжечка могут вызывать асинергию, дисметрию, дисдиадохокинезию, дизартрию и атаксию позы и походки. Нарушения наблюдаются при движениях на той же стороне тела, где находится очаг поражения (ипсилатерально). Лечащие врачи часто используют визуальное наблюдение за людьми, выполняющими двигательные задачи, чтобы найти признаки атаксии. Существует множество причин мозжечковой атаксии, включая, среди прочего, аутоиммунную реакцию по отношению к клеткам Пуркинье или другим нервным клеткам в мозжечке, васкулит ЦНС, рассеянный склероз, инфекции, кровотечение, опухоли, непосредственное повреждение, токсины (например, алкоголь) и генетические нарушения. После дифференцированного диагноза решили, что у субъекта наблюдалась алкогольная мозжечковая атаксия. С момента постановки диагноза субъект прекратил употреблять алкоголь. Субъект страдал от прогрессирующей или тяжелой неспособности координировать равновесие и в среднем падал пять раз в день. Предыдущие программы интенсивной реабилитации не смогли остановить прогрессирование, и прием буспирона в течение месяцев практически не дал положительного эффекта.
[0229] После получения информированного согласия пациентка согласилась на терапию введением аутологичных PBD-PSC. Взяли периферическую кровь, и в течение 24-часового периода выделили PBD-PSC с применением магнитного антитела, позитивной селекции RTH1R, CD90 и CD133 и негативной селекции CD45. Затем проводили подготовительную обработку клеток ретиноевой кислотой, богатым собственными тромбоцитами лизатом и плазмой в течение 18 часов. Клетки вводили внутривенно в течение 45 минут.
[0230] Через семь дней пациентка заметила улучшение своего состояния, поскольку снизилась неспособность координировать равновесие, и в течение восьмого дня она не падала. За восьминедельный период пациентка испытала только одно падение. Побочные эффекты от терапии не наблюдались. Этот пример показывает эффективность терапии PBD-PSC при лечении мозжечковой атаксии.
Пример 13
PBD-PSC при лечении злокачественного новообразования
[0231] В следующем примере показано, что PBD-PSC полезны при лечении злокачественного новообразования.
[0232] 50-летний пациент с рефрактерной метастазирующей почечно-клеточной карциномой в легком, у которого был подходящий знакомый донор, получал инфузии аллотрансплантата PBD-PSC от сиблинга с идентичной группой крови. Пациент получал три инфузии донорских плюрипотентных стволовых клеток каждый месяц в течение трех месяцев.
[0233] Как показано на Фигуре 28, через 30 дней после трансплантации легочные метастазы (стрелки) хорошо видны. Через 129 дней после трансплантации легочные метастазы в значительной степени исчезают. Пациент имел полный ответ, оставался в состоянии ремиссии и испытал полную регрессию метастаз.
[0234] Этот пример демонстрирует эффективность терапии PBD-PSC при индукции устойчивой регрессии метастазирующей почечно-клеточной карциномы у пациентов, у которых не было ответа на обычную иммунотерапию.
Пример 14
PBD-PSC при лечении диабета 1 типа
[0235] В следующем примере показано, что PBD-PSC полезны при лечении диабета первого типа.
[0236] 17-летнему мужчине и 16-летней женщине, страдающим диабетом 1 типа, сделали две инфузии PBD-PSC с помощью инъекции в поджелудочную артерию. Первое вливание провели на 1-й неделе, а второе - на 13-й неделе.
[0237] На Фигуре 29 показано среднесуточное применение инсулина в ходе времени с недельными интервалами. Как показано на Фигуре 29, среднесуточное применение инсулина снизилось после первоначальной инфузии PBD-PSC и еще раз снизилось после второй инфузии PBD-PSC.
[0238] Этот пример демонстрирует эффективность терапии PBD-PSC в снижении среднесуточного применения (потребления) инсулина пациентами, страдающими диабетом 1 типа.
Пример 15
PBD-PSC при лечении дегенерации желтого пятна
[0239] В следующем примере показано, что PBD-PSC полезны при лечении дегенерации желтого пятна.
2
[0240] Двести мл периферической крови взяли у 71-летней пациентки с сухой дегенерацией желтого пятна с помощью обычной пункции вены. В качестве антикоагулянта применяли цитрат натрия. Показатель оценки остроты зрения пациентки перед лечением составлял 20/200 баллов для одного глаза и 20/500 баллов для другого глаза. Субъект был официально признан слепым и не мог водить машину. PBD-PSC выделили, применив комбинацию центрифугирования (в центрифуге с вращающимся ротором) и фильтрования. Кровь сначала центрифугировали в течение 10 минут при 300 g. Удаляли слой плазмы и центрифугировали в течение еще 10 минут при 800 g. Супернатант плазмы снова центрифугировали при 1100 g в течение 10 минут. Слой клеток на дне удаляли и помещали в 5 мл стерильного физиологического раствора и ресуспендировали. Раствор суспендированных клеток затем фильтровали через фильтр 5 мкм. Двадцать пять мкл супернатанта (который все еще содержит тромбоциты) отбирали и подвергали ультразвуковой обработке и ультразвуку 40-60 мегагерц в течение 20 минут для лизирования тромбоцитов. Затем лизат тромбоцитов для удаления дебриса подвергали центрифугированию в течение 2500 мин в течение 15 минут. Лизат, обогащенный тромбоцитами, дополнительно фильтровали через фильтр 0,22 мкм для удаления дебриса. Затем лизат с тромбоцитами добавляли к клеткам, которые были суспендированы в физиологическом растворе, и помещали в стерильный культуральный планшет, дно которого было покрыто антителами к CD45 человека. Затем планшет помещали в охлажденный инкубатор при 4°С с 5% CO на 24 часа. Жидкость удаляли через 24 часа и подвергали фильтрованию еще 5 мкм. Затем фильтрат (приблизительно 30 мл) вводили пациенту внутривенно в течение 10 минут. Анализ фильтрата показал в общей сложности приблизительно 9 миллионов клеток на мл, из которых средний размер клеток составлял 4,3 мкм в диаметре. Анализ с помощью проточной цитометрии показал, что более 90% клеток были CD133-положительными и ПТГ-рецептор-положительными. Менее 1% клеток были CD45-положительными.
[0241] Оценка остроты зрения, продемонстрированной пациенткой через три месяца после введения ее клеток PBD-PSC, активированных лизатом с тромбоцитами, составила 20/40 баллов в одном глазу и 20/50 баллов в другом глазу. Субъект больше не был официально признан слепым и получил новую возможность видеть. Субъект теперь может водить машину и выполнять повседневные действия без посторонней помощи. После шести месяцев введения ее собственных PBD-PSC улучшение остроты зрения у нее было устойчивым.
[0242] По меньшей мере в некоторых из ранее описанных вариантов реализации один или более элементов, применяемых в варианте реализации, можно взаимозаменяемо применять в другом варианте реализации, если такая замена технически осуществима. Специалистам в данной области техники будет понятно, что в вышеописанных способах и структурах можно сделать различные другие опущения, дополнения и модификации, не отклоняясь от объема изобретения. Все такие модификации и изменения предназначены для попадания в объем изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения.
[0243] Что касается использования по существу в настоящем описании любых терминов в единственном и/или множественном числе, специалисты в данной области техники могут переводить из множественного числа в единственное число и/или из единственного числа во множественное число, в зависимости от контекста и/или применения. Различные перестановки единственного/множественного числа могут быть понятным образом изложены здесь в целях ясности изложения.
[0244] Специалистам в данной области техники будет понятно, что в целом термины, используемые в настоящем описании, и особенно в прилагаемой формуле изобретения (например, тексты прилагаемой формулы изобретения), обычно следует понимать как "открытые" термины (Например, термин «включающий» следует интерпретировать как «включающий, но не ограничивающийся тем самым», термин «имеющий» следует интерпретировать как «имеющий по меньшей мере», термин «включает» следует интерпретировать как «включает, но не ограничивается тем самым» и т.д.). Кроме того, специалистам в данной области техники будет понятно, что, если в описании формулы предполагается конкретное количество, такое предположение будет явно указано в формуле изобретения, и в случае отсутствия такого указания такого предположения нет. Например, чтобы помочь пониманию, прилагаемая в дальнейшем формула может содержать использование вводных выражений «по меньшей мере один» и «один или более» для введения описания формулы. Однако не следует считать, что использование таких выражений означает, что описание пунктов формулы в единственном числе ограничивает любой конкретный пункт, содержащий такое описание формулы, вариантами реализации, содержащими только одно такое описание, даже если тот же самый пункт включает вводные выражения «один или более» или «по меньшей мере один» и единственное число (например, единственное число следует истолковывать как «хотя бы один» или «один или более»). Кроме того, даже если в формуле изобретения явно перечислено конкретное количество, специалисты в данной области техники поймут, что такое перечисление следует интерпретировать как означающее по меньшей мере указанное количество (например, простое упоминание «двух повторений», без других объяснений означает не менее двух повторений или два или более повторения). Кроме того, в тех случаях, когда использовано выражение, аналогичное «по меньшей мере одно из А, В и С и т.д.», как правило, такая конструкция предназначена для того чтобы специалист в данной области техники понял выражение (например, «система, имеющая по меньшей мере один из А, В и С», будет включать, не ограничиваясь тем самым, системы, которые имеют один А, один В, один С, А и В совместно, А и С совместно, В и С совместно и/или А, В и С совместно и т.д.). В тех случаях, когда использовано выражение, аналогичное «по меньшей мере одно из А, В и С и т.д.», как правило, такая конструкция предназначена для того чтобы специалист в данной области техники понял выражение (например, «система, имеющая по меньшей мере один из А, В или С», будет включать, не ограничиваясь тем самым, системы, которые имеют один А, один В, один С, А и В совместно, А и С совместно, В и С совместно и/или А, В и С совместно и т.д.). Специалистам в данной области техники также будет понятно, что практически любое разделительное слово и/или выражение, представляющие два или более альтернативных термина, будь то в описании, формуле изобретения или чертежах, следует понимать как охватывающие возможность включения одного из терминов, любого из терминов или обоих терминов. Например, фразу «А или В» следует понимать как включающую возможность «А» или «В» или «А и В.»
[0245] Кроме того, если признаки или аспекты изобретения описаны в терминах групп Маркуша, специалисты в данной области техники поймут, что изобретение также тем самым описано в терминах любого отдельного члена или подгруппы членов группы Маркуша.
[0246] Как будет понятно специалисту в данной области техники, для любых и всех целей, таких как предоставление письменного описания, все описанные в настоящей заявке диапазоны также охватывают любые и все возможные поддиапазоны и комбинации поддиапазонов. Любой из перечисленных диапазонов легко можно распознать как в достаточной степени описывающий и позволяющий разбить тот же диапазон по меньшей мере на равные половины, трети, четверти, пятые, десятые доли и т.д. В качестве неограничивающего примера каждый диапазон, обсуждаемый в настоящем описании, можно легко разбить на нижнюю треть, среднюю треть и верхнюю треть и т.д. Специалисту в данной области техники также будет понятно, что все выражения, такие как «до», «по меньшей мере», «более чем», «менее чем» и тому подобные включают перечисленное количество и относятся к диапазонам, которые можно впоследствии разбить на поддиапазоны, как обсуждалось выше. Наконец, как будет понятно специалисту в данной области техники, диапазон включает в себя каждый отдельный элемент. Так, например, группа, имеющая 1-3 пункта, относится к группам, имеющим 1, 2 или 3 пункта. Подобным образом группа, имеющая 1-5 пунктов, относится к группам, имеющим 1, 2, 3, 4 или 5 пунктов и так далее.
[0247] В то время как в настоящей заявке описаны различные аспекты и варианты реализации, специалистам в данной области техники будут понятны другие аспекты и варианты реализации. Различные аспекты и варианты реализации, описанные в настоящей заявке, служат для иллюстративных целей и не являются ограничительными, при этом истинный объем и сущность изобретения указаны в следующей формуле изобретения.