SCCmec-типирование метициллинoрезистентных штаммов Staphylococcus aureus, выделенных от госпитализированных и амбулаторных пациентов в Казани

УДК 615.33.015.8.07

SCCmec-типирование метициллинoрезистентных штаммов Staphylococcus aureus, выделенных от госпитализированных и амбулаторных пациентов в Казани

Ю.А. Тюрин, Л.Т. Баязитова, О.Ф. Тюпкина, Р.С. Фассахов

ФБУН «Казанский НИИ эпидемиологии и микробиологии» Роспотребнадзора, Казань, Россия

Цель. Сравнение генотипов метициллино-резистентных S. aureus по SCCmec комплексу у различных по источнику выделения штаммов.

Материалы и методы. В исследование был включен 191 штамм S. aureus. Штаммы выделены в 2007-2011 гг. от амбулаторных и госпитализированных пациентов, проходивших лечение и обследование в условиях специализированной поликлиники ФБУН КНИИЭМ Роспотребнадзора и многопрофильного стационара г. Казани. Чувствительность к оксациллину определяли по стандартам NCCLS, МПКд0 оксациллина - по МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». Генотипирование S. aureus проводили по протоколу, представленному в Методических рекомендациях Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2006. Идентификацию типов SCCmec осуществляли методом ПЦР-амплификации с использованием

12 пар праймеров (олигонуклеотидов), синтезированных в ЗАО «Синтол» (Москва).

Результаты. Из 166 выделенных от 56 амбулаторных пациентов штаммов S. aureus 27,1% составили метициллинорезистентные изоляты. Из 25 штаммов, выделенных от пациентов, госпитализированных в травматологическое отделе-нияе РКБ г. Казани, 56,0% идентифицированы как метициллинорезистентные. При генотипиро-вании MRSA, выделенных от амбулаторных пациентов, во всех случаях выявлен IV тип SCCmec, а у штаммов, выделенных от пациентов травматологического отделения - II тип SCCmec.

Выводы. Выявлены генотипические различия по типу SCCmec между MRSA штаммами, выделенными от амбулаторных и госпитализированных пациентов.

Ключевые слова: нозокомиальные MRSA, внебольничные MRSA, генотипирование SCCmec.

Контактный адрес:

Юрий Александрович Тюрин

Эл. почта: immunolab@yandex.ru

SCCmec Typing of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Strains Isolated from Inpatients and Outpatients in Kazan

Yu.A. Tyurin, L.T. Bayazitova, O.F. Tyupkina, R.S. Fassakhov

Kazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Kazan, Russia

Objective. To compare genotypes (by mec complex) of methicillin-resistant S. aureus (MRSA) isolated from different patient populations.

Material and Methods. A total of 191 S. aureus strains were included in the study. These strains were isolated during the period of 2007-2011 from patients examined and treated in a specialized outpatient clinic and patients hospitalized to the Republic Teaching Hospital in Kazan. Susceptibility to oxacillin was determined according to NCCLS standards, and MIC90 for oxacillin was determined according to Guidance 4.2.189004 «Antimicrobial susceptibility testing». Genotyping of S. aureus was performed according to the Federal Center of Hygiene and Epidemiology guidelines (2006). SCCmec

Введение

Ежегодно в США почти у 2 млн госпитализированных пациентов развиваются различные вну-трибольничные инфекции, в том числе вызванные MRSA [1]. В России при отсутствии систематического исследования распространённости внеболь-ничных и госпитальных штаммов MRSA оценить истинные масштабы этого явления достаточно трудно. Необходимо отметить, что, начиная с 90-х годов прошлого века, одним из наиболее значимых возбудителей внутрибольничных инфекций является S. aureus. Золотистый стафилококк лидирует в этиологии хирургических инфекций в ожоговых и травматологических отделениях, а также занимает второе место среди возбудителей ангиогенных инфекций, развивающихся у пациентов в стационарах и во внебольничных условиях [2]. Не меньшую актуальность сегодня в ряде стран представляют инфекции, вызываемые внебольничными штаммами метициллинорезистентных стафилококков у амбулаторных пациентов.

Учитывая рост числа как госпитальных, так и внебольничных инфекций, вызванных метицилли-норезистентными штаммами S. aureus, а также объективные трудности в эпидемиологическом плане при разграничении этих штаммов, исследования по генотипированию метициллинорезистентности у штаммов, циркулирующих среди различных групп пациентов в г. Казани, представляют практическую актуальность.

Цель выборочного исследования: сравнить генотипы SCCmec комплекса у различных по источнику

types were identified by PCR assay using 12 pairs of primers («Sintol», Moscow).

Results. Of 166 strains isolated from 56 outpatients, 27.1% were identified as MRSA. Of 25 strains isolated from hospitalized patients (trauma unit), 56.0% were identified as MRSA. Genotyping showed that MRSA strains obtained from outpatients harbored SCCmec type IV, and MRSA strains obtained from trauma unit patients harbored SCCmec type II.

Conclusions. There were found genotypic differences in SCCmec type between MRSA strains from outpatients and MRSA strains from hospitalized patients.

Key words: hospital-acquired MRSA, community-acquired MRSA, SCCmec typing.

выделения MRSA штаммов для идентификации их происхождения.

Материалы и методы

В выборочное исследование был включен 191 клинический штамм Staphylococcus aureus. Штаммы выделены в 2007-2011 гг. от амбулаторных и стационарных пациентов, проходивших лечение и обследование в условиях специализированной поликлиники ФБУН КНИИЭМ Роспотребнадзора и многопрофильного стационара г. Казани. Первичную идентификацию S. aureus осуществляли морфологическими и биохимическими методами.

Штаммы MRSA, выделенные от амбулаторных пациентов, получены при исследовании биоматериала со слизистой и кожи пациентов, который получали со слизистой носа и носовых ходов на уровне нижней носовой раковины, участков гладкой кожи лица, верхних конечностей и туловища.

Штаммы MRSA, выделенные от госпитальных пациентов, отобраны с инфицированных ран и очагов поражения кожи больных с ожогами в многопрофильном стационаре г. Казани.

В качестве референс-штаммов использовали Staphylococcus aureus M307, Staphylococcus aureus M 258, Staphylococcus aureus 252, Staphylococcus aureus 720, Staphylococcus aureus E84/5528/1, Staphylococcus aureus И-78 (табл.1). Штаммы, использованные для контроля определения чувствительности к антибактериальным препаратам, и ген амплификации SCCmec были получены из ГКПМ ГИСК им. Л.А. Тарасевича (Москва, Россия).

Таблица 1. Референс-штаммы Staphylococcus aureus, использованные в исследовании

Штаммы Характеристика

MRSA 2S2 SCCmec II, TnSS4

S. aureus M307 SCCmec I

S. aureus И-78 SCCmec I

S. aureus Е84/ББ28/1 SCCmec III

S. aureus M2S8 SCCmec IV

Чувствительность к оксациллину определяли в соответствии со стандартами NCCLS [3], а определение минимальной подавляющей концентрации (МПК) оксациллина - по Методическим указаниям 4.2.1890-04. «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» [4].

Генотипирование Staphylococcus aureus проводили по протоколу, представленному в методических рекомендациях Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора (2006) [5]. Экстракцию геномной ДНК из штаммов осуществляли по протоколам коммерческих наборов ZR Genomic DNA II Kit™. Идентификацию

типов SCCmeс осуществляли методом ПЦР-амплификации с использованием 12 пар прайме-ров (олигонуклеотидов), синтезированных в ЗАО «Синтол», Москва (табл. 2). На первом этапе определяли специфичность набора генов, кодирующих синтез рекомбиназ (ccr-тип 1, 2, 3 и 5). Затем определяли набор генов, входящих в состав комплекса mec (класс А или класс В), с применением праймеров MecI и IS272 (см. табл. 2). Результаты амплификации, с определением этих наборов генов, позволили идентифицировать наличие SCCmec I, II и III типов. Для идентификации присутствия SCCmec IV a, b, c и d использовали праймеры IS272, а также T-IVa - T-IVd, при выявлении SCCmec V типа дополнительно использовали праймеры T-V и сст-type S (см. табл. 2).

ПЦР проводили с использованием стандартного состава реакционной смеси, объем одной пробы составлял 20 мкл. Праймеры вносили в конечной концентрации 300 нмоль, концентрация ДНК-матрицы - до 10 нг. Детекцию праймер-специфи-ческих ампликонов проводили в 2% агарозном геле методом горизонтального электрофореза с использованием интеркалирующего красителя этидиум бромида и маркеров (Fermentas, DNA Ladder). Для визуализации результатов применя-

Таблица 2. Наборы праймеров, использованных для идентификации типов SCCmec

Название праймера Тип идентифицируемого SCCmec Нуклеотидная последовательность (S'-3') Размер ампликона п. н.

T-IVa SCCmecIVa GCCTTATTCGAAGAAACCG CTACTCTTCTGAAAAGCGTCG 776

T-IVb SCCmeclVb TCTGGAATTACTTCAGCTGC AAACAATATTGCTCTCCCTC 493

T-IVc SCCmecIVc ACAATATTTGTATTATCGGAGAGC TTGGTATGAGGTATTGCTGG 200

T-IVd SCCmec IVd CTCAAAATACGGACCCCAATACA TGCTCCAGTAATTGCTAAAG 880

T-V SCCmecV GAACATTGTTACTTAAATGAGCG TGAAAGTTGTACCCTTGACACC 330

MecA147 Ген mec A GTGAAGATATACCAAGTGATT ATGCGCTATAGATTGAAAGGAT 1S0

ecr-type 1 SCCmec I ATTGCCTTGATAATAGCCTCT AACCTATATCATCAATCAGTACGT 700

ecr-type 2 SCCmec II ATTGCCTTGATAATAGCCTCT TAAAGGCATCAATGCACAAACACT 1000

сст-type 3 SCCmec III ATTGCCTTGATAATAGCCTCT AGCTCAAAAGCAAGCAATAGAAT 1600

MecI Класс А mec CAAGTGATTTGAAACCGCCT CAAAAGGACTGGACTGGAGTCCAAA 180

IS272 Класс B mec ACCGCCACTCATAACATAAGGAA TATACCAACCCGACAAC 2000

сст-type Б SCCmecV ATG-AAT TCAAAGAGGATGGC GATTTAGAATTGTCGTGATTGC 336

ли транслюминатор (Vilber Lourmat, SCX-15 M, Франция).

Результаты исследования

Распределение и характеристика штаммов S. aureus, выделенных от госпитализированных и амбулаторных пациентов, представлены в табл. 3.

У амбулаторных пациентов со слизистой носоглотки и кожи были выделены 166 штаммов S. aureus. Нозологическая структура амбулаторных пациентов, колонизированных золотистым стафилококком, включала в себя пациентов с атопическим дерматитом (n=28), аллергическим ринитом (n=16) и неаллергическим ринитом (n=12). В группе амбулаторных пациентов частота выявления MRSA, по данным фенотипической идентификации, составила 27,1% от всех исследованных штаммов (см. табл. 3). Характерной особенностью выделенных штаммов в данной группе пациентов было преобладание (72,9%) метициллиночувствительных штаммов (MSSA), по сравнению с группой госпитализированных пациентов (44,0%).

Штаммы S. aureus, выделенные с кожи и раневого отделяемого госпитализированных больных, характеризовались преобладанием метициллино-резистентных изолятов (56,0%). Примечательно, что некоторые штаммы, выделенные как от амбулаторных, так и госпитальных пациентов феноти-пически были чувствительны к оксациллину, при этом молекулярно-генетический анализ ДНК выявил праймер-специфические ампликоны mecA гена: это отмечено в 30,1% случаев для амбулаторных и в 64,0% - для госпитальных изолятов (см. табл. 3).

На втором этапе исследования проведено моле-кулярно-генетическое типирование позитивных по mecA гену ДНК штаммов и установлены типы SCCmec кассет.

Изучение генотипа всех выделенных MRSA штаммов от пациентов амбулаторного и госпиталь-

15

30

45

60

75

90 %

SCCmec II

SCCmec III

SCCmec IVa

SCCmec IVc

SCCmec IVd

Не типируются

| | амбулаторные штаммы | | госпитальные штаммы

Распределение типов SCCmec в геноме выделенных штаммов MRSA при выборочном исследовании пациентов

ного профиля при одномоментном исследовании позволило выявить существенные типовые различия (рисунок). Распределение типов SCCmec кассет показало, что штаммы, выделенные от амбулаторных пациентов, содержали в своем составе генетические элементы SCCmec IV a, c и й типов, тогда как в метициллинорезистентных штаммах, выделенных от пациентов госпитального профиля, были идентифицированы только SCCmec кассеты II типа.

При определении МПК90 оксациллина для всех генотипированных MRSA штаммов нами установлено, что высокие показатели МПК90 оксациллина были характерны только для штаммов, выделенных от госпитализированных пациентов (МПК90 >0,256 мг/л), получавших интенсивную антибактериальную терапию с применением антибиотиков широкого спектра действия, тогда как низкие пока-

Таблица 3. Результаты определения чувствительности к оксациллину и идентификации тесА гена у штаммов, выделенных от пациентов двух групп

Штаммы, абс. ч

Группы пациентов фенотипические генотипические

MRSA MSSA ген mec A

Амбулаторные

Всего ... 166

Госпитализированные

Всего ... 25

0

Таблица 4. МПК оксациллина для штаммов в зависимости от типа SCCmec

Тип мобильного SCCmec элемента Штаммы S. aureus, абс. число

амбулаторная группа госпитальная группа

MRSA МПК90, мг/л MRSA МПК90, мг/л

II mec-комплекс A - - 16 0,256

III mec-комплекс A - - - -

IVa mec-комплекс B 6 0,008 - -

IVc mec-комплекс B 23 0,032 - -

IVd mec-комплекс B 18 0,008-0,016 - -

Не типируемые 2 0,008 - -

Всего ... 49

затели МПК90 (от 0,008 до 0,032 мг/л) выявлялись у штаммов, выделенных от пациентов амбулаторного профиля (табл. 4).

Обсуждение результатов

Генетической характеристикой всех MRSA и MRSE штаммов, независимо от генотипов SCCmec элемента, является наличие гена mecA, обуславливающего устойчивость данных штаммов к бета-лактамным антибиотикам, и генов ссг-комплекса, которые кодируют белки, осуществляющие экс-цизию и сайт-специфическую интеграцию mecA в геном стафилококков [6]. Мобильные генетические элементы SCCmec, к которым относятся кассеты IV и V типов, могут переноситься от одних штаммов S. aureus к другим относительно свободно, по сравнению с SCCmec кассетами I, II и III типов, как правило, не обладающих мобильностью [7]. Необходимо отметить, что штаммы, содержащие SCCmec IV и V типов в составе своего генома, вследствие выраженной мобильности и способности к горизонтальному переносу, представляют большую эпидемиологическую опасность при распространении MRSA и передаче данного признака между стафилококками, колонизирующими организм человека.

Мобильные генетические элементы SCCmec I, II и III типов присутствуют, как правило, в госпитальных клонах метициллинорезистентных стафилококков (HA-MRSA) и характеризуются нали-

чием генов устойчивости к антибиотикам других групп (аминогликозидам, тетрациклинам, макролидам) [8].

В настоящее время молекулярно-генетическими методами установлено, что существует достаточно чёткая зависимость между принадлежностью MRSA к определённому генетическому «бэкграунду» и содержанием определённого типа SCCmec в ДНК [9]. Штаммы, содержащие SCCmec IV типа, относятся к наиболее многочисленной клональной группе CC8. Эта группа включает такие эпидемически родственные штаммы и клоны, как EMRSA-2, -6, -12, -13 и -14, распространённые в Великобритании, США, Германии, Франции и Нидерландах [10]. Необходимо отметить, что SCCmec IV типа нередко выявляются у S. epidermidis, являющихся представителями нормальных грамположительных коло-низатов кожи и слизистых человека, что предполагает возможность передачи данного мобильного элемента от S. epidermidis к S. aureus [11-13].

Таким образом, изоляты метициллинорези-стентных штаммов золотистых стафилококков, выделенные от пациентов госпитального профиля, в составе своего генома содержали SCCmec кассеты II типа, характерные для госпитальных клонов MRSA, а у штаммов, выделенных от амбулаторных пациентов, идентифицирован IV тип SCCmec элемента, присутствующий у большинства изолятов так называемых внебольничных MRSA (CA-MRSA) [14].

Литература

1. Chambers H. The Changing epidemiology of Staphylococcus aureus? Emerg Inf Dis 2001; 7:178-82.

2. Сабирова Е.В., Гординская Н.А., Абрамова Н.В., Некаева Е.С. Антибиотикорезистентность нозокоми-альных штаммов Staphylococcus spp., выделенных в

ожоговом центре в 2002-2008 гг. Клин Микробиол Антимикроб Химиотер 2010; 12(1):77-81.

3. National Committee for Clinical Labotatory Standards. Performance Standards for Antimicrobial Susseptibility Testing; Fourteenth Informational Supplement. NCCLS document M100-S14.2004-.-24(1).

4. Определение чувствительности микроорганизмов к

антибактериальным препаратам. Методические указания МУК 4.2.1890-04., Москва, Минздрав России.

5. Метициллинрезистентные Staphylococcus aureus - возбудители внутрибольничных инфекций: идентификация и генотипирование. Методические рекомендации — М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, 2006. 43 с.

6. Katayama J., Ito T., Hiramatsu K. A new class of genetic element, staphylococcus cassette chromosome mec, encodes methicillin resistance in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 2000; 44:1549-55.

7. Robinson D. A., Enright M.C. Evolutionary models of the emergence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47:3926-34.

8. Palavecino E. Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections. Clin Lab Med 2004; 24:403-18.

9. Fey P.D., Said-Salim B., Rupp M. E., et al. Comparative molecular analysis of community- or hospital-acquired

methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemotherb 2003; 47:196-203.

10. Okuma K., Iwakawa K., TurnidgeJ. D., et al. Dissemination of new methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in the community. J Clin Microbiol 2002; 40:4289-94.

11. Chambers H. F. Tracking the spread of CMRSA. APUA Newsletter 2003; 21(2):1.

12. Wielders C. L., Brisse S., de Graaf-Miltenburg L. A, et al. In-vivo transfer of mecA DNA to Staphylococcus aureus. Lancet 2001; 357:1674-75.

13. Hiramatsu K., Longzhu C., Kuroda M., Ito T. The emergence and evolution of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Trend Microbiol 2001; 9:486-93.

14. Страчунский Л.С., Белькова Ю.А., Дехнич А.В. Внебольничные MRSA - новая проблема антибио-тикорезистентности. Клин Микробиол Антимикроб Химиотер 2005; 7(1):32-3.