СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫМ И АНТИФИБРОТИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ В ЛЕГОЧНОЙ ТКАНИ ПРИ ЦИТОСТАТИЧЕСКОМ ВОЗДЕЙСТВИИ
AGENT POSSESSING ANTI-INFLAMMATORY AND ANTIFIBROTIC ACTION IN PULMONARY TISSUE, AND CYTOSTATIC ACTION

Изобретение относится к области медицины, а именно к пульмонологии, и может быть использовано для фармакологической коррекции воспаления и фиброза в легочной ткани, развивающихся при назначении цитостатиков.
Одним из серьезных осложнений цитостатической химиотерапии является интерстициальная пневмония, которая может приводить к идиопатическому фиброзу легких. Идиопатический фиброз легких, хроническое прогрессирующее заболевание неясной этиологии, характеризуется развитием воспаления, интерстициального фиброза и нарастающей дыхательной недостаточностью с неблагоприятным исходом [1]. Терапия фиброза легких направлена главным образом на профилактику быстрого прогрессирования заболевания, а не на его предупреждение. Для этого в настоящее время используют глюкокортикостероиды, часто в комбинации с цитостатическими агентами, антиоксиданты (N-ацетилцистеин), антифиброзные средства (D-пеницилламин, колхицин) [2].
Задачей, решаемой данным изобретением, является расширение арсенала средств, обладающих противовоспалительным и антифибротическим действием в легочной ткани при цитостатическом воздействии.
Поставленная задача достигается применением резерпина в качестве средства, обладающего противовоспалительным и антифибротическим действием в легочной ткани при цитостатическом воздействии.
Новым в предлагаемом изобретении является использование курсового введения резерпина после введения цитостатика.
Нами впервые выявлена способность резерпина препятствовать развитию воспаления и фиброза в легочной ткани, развивающихся при использовании цитостатических препаратов.
Применение резерпина по новому назначению стало возможным благодаря выявленному авторами его новому свойству препятствовать развитию воспаления и фиброза в легочной ткани при введении цитостатиков.
Основным фармакологическим свойством резерпина является его симпатолитическое действие. Препарат, действуя на варикозные утолщения адренергических нервных окончаний, депонируется в мембранах везикул, нарушает вход дофамина в везикулы (и, следовательно, синтез норадреналина) и обратный захват норадреналина везикулами. Содержание норадреналина в везикулах снижается, уменьшается выделение норадреналина на нервные импульсы. Вследствие симпатолитического действия резерпин снижает стимулирующее влияние симпатической иннервации на сердце и кровеносные сосуды [3]. Действие резерпина распространяется и на ЦНС. Первоначально до появления современных нейролептиков препарат применяли для лечения психических заболеваний. В настоящее время резерпин используют в качестве антигипертензивного средства в ранних стадиях артериальных гипертензий, он также входит в состав ряда комбинированных лекарственных средств и применяется в качестве фармакологического агента при экспериментальных исследованиях [3]. На моделях невротических воздействий и миелосупрессий показана эффективная коррекция резерпином нарушений гемопоэза, в частности грануломоноцитарного и лимфоидного ростков кроветворения [4, 5].
Воспаление и фиброз легочного интерстиция, воздухоносных пространств, следующая за ними дезорганизация структурно-функциональных единиц паренхимы легких приводят к нарушению газообмена и развитию дыхательной недостаточности [6]. Считается, что развитие фиброза легких может быть обусловлено аномально активированными альвеолярными эпителиальными клетками, которые вырабатывают медиаторы, стимулирующие образование фибробластов и миофибробластов [7]. В очагах воспаления фибробласты и миофибробласты выделяют избыточное количество коллагена, способствующего, в свою очередь, рубцеванию и разрушению архитектуры легких. Предполагают, что адренергическая система может контролировать синтез коллагена в легких [8]. Кроме того, установлено, что развитие воспалительного процесса в легочной ткани при блеомицин-индуцированном фиброзе легких влияет на количество адренорецепторов в легких [9].
Отличительные признаки проявили в заявляемой совокупности новые свойства явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и не очевидные для специалиста. Идентичной совокупности признаков не обнаружено в проанализированной патентной и научно-медицинской литературе.
Изобретение может быть использовано для повышения устойчивости легочной ткани к воспалению и отложению фибротических масс при химиотерапии в эксперименте и клинике.
Исходя из вышеизложенного, заявляемое изобретение соответствует критериям патентоспособности изобретения «Новизна», «Изобретательский уровень» и «Промышленная применимость».
Предлагаемое действие резерпина изучено в экспериментах на 7-8 недельных мышах линии C57BL/6J в количестве 155 штук. Животные первой категории, инбредные мыши, получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН (сертификат имеется). Использование животных в экспериментах обосновано и согласовано с Комиссией по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН.
Изобретение будет понятно из следующего описания и приложенного к нему рисунка 1.
На рис.1 изображено легкое мыши, при окрашивании ткани легкого гематоксилином и эозином: а - интактной, б - получавшей блеомицин, в - получавшей резерпин на фоне моделирования фиброза; легкое мыши, при окрашивании ткани легкого по Ван-Гизону на соединительную ткань: г - интактной; д - получавшей блеомицин; е - получавшей резерпин на фоне моделирования фиброза.
Изобретение осуществляют следующим образом.
2
Фиброз легкого моделировали однократным интратрахеальным введением 80 мкг блеомицина («Блеомицетин», ОАО «Лэнсфарм», Россия) в 30 мкл физиологического раствора. Контрольным животным в аналогичных условиях вводили эквивалентный объем физиологического раствора (контроль). Блеомицин относится к группе противоопухолевых антибиотиков. Его механизм действия до конца не выяснен, хотя известно, что он способен подавлять синтез нуклеиновых кислот (преимущественно ДНК) и белка. Препарат активен в отношении клеток, находящихся как в митотическом цикле, так и вне его, но проявляет большую активность в фазе G. Основное токсическое действие цитостатик оказывает на легкие: вызывает пневмонию, фибротические изменения в паренхиме легких [3].
Резерпин ("Sigma", США) вводили внутрибрюшинно на 1-7, 9, 11, 13-е сутки после введения блеомицина в дозе 1 мг/кг внутрибрюшинно. Сроки введения и доза резерпина подобраны экспериментальным путем как наиболее оптимальные для моделирования истощения депо катехоламинов в нервной системе. Объем вводимого раствора составил 100 мкл. Непосредственно перед использованием препарат растворяли в стерильном физиологическом растворе. В качестве фона использовали интактных животных (интактный контроль).
2
На 7, 14, 21, 25 и 60 сут после введения блеомицина мышей умерщвляли передозировкой СО, изучали морфологическую картину легких. Для гистологического исследования кусочки легких фиксировали в 10% формалине. По стандартной гистологической методике выполняли проводку материала, заливали объекты исследования в парафиновые блоки, с которых делали гистологические срезы толщиной 5 мкм. Депарафинированные срезы окрашивали гематоксилин-эозином и по Ван-Гизону на соединительную ткань [10]. С помощью компьютерного графического анализа на стандартной площади гистологического среза измеряли площадь коллагеновых волокон в ткани легкого. Затем вычисляли долю этих показателей от стандартной площади среза.
На 7, 14, 21, 25 сут после введения блеомицина у животных определяли показатели периферической крови и костномозгового кроветворения стандартными гематологическими методами. Культуральными методами в костном мозге изучали содержание колоний гранулоцито-эритроидно-макрофагально-мегакариоцитарного типа (КОЕ-ГЭММ), состоящих из 4 различных типов гемопоэтических клеток (эритрокариоцитов, гранулоцитов, макрофагов и мегакариоцитов) и гранулоцитарных ассоциаций (КОЕ-Г) [11].
Математическую обработку результатов производили с применением стандартных методов вариационной статистики. Достоверность различий оценивали с использованием непараметрического U критерия Манна-Уитни.
Пример.
При окрашивании ткани легкого гематоксилином и эозином выявляется развитие отека межальвеолярных перегородок, инфильтрация интерстиция альвеол нейтрофилами, лимфоцитами, макрофагами и плазматическими клетками, что приводит к значительному нарушению гистоархитектоники легочной ткани мышей, получавших блеомицин (рис.1б). В стенках альвеол наблюдается венозное полнокровие и кровоизлияния. В просвете альвеол появляются плазматические клетки, нейтрофильные и эозинофильные лейкоциты, альвеолярные макрофаги, гистиоциты. В центральных отделах органа встречаются участки, где легочный рисунок отсутствует, часть альвеол эмфизематозно расширена.
При окрашивании легкого по Ван-Гизону на соединительную ткань в интерстиции альвеол мышей, получавших блеомицин, отмечается усиление образования коллагеновых волокон и прогрессирующее разрастание соединительной ткани (рис.1д). На 7 сут эксперимента соединительная ткань располагается в основном периваскулярно и перибронхиально, содержание соединительной ткани составляет 1,98±0,28% от площади ткани легкого (табл.1). На 14, 21 сут опыта наблюдается диффузное распространение фибротических масс. Картина пневмофиброза наиболее выражена на 25 сут наблюдения (рис.1д), когда содержание коллагеновых волокон составляет 5,45±0,74% от площади ткани легкого (табл.1).
Резерпин снижает интенсивность воспаления в блеомициновых легких мышей на протяжении всего периода наблюдения. Так, в условиях введения резерпина отек эпителия и гиперемия альвеолярных перегородок снижается, при этом сохраняется воздушность легочной ткани (рис.1в). Клеточная инфильтрация оказывается преимущественно перибронхиальной и периваскулярной. В отличие от мышей блеомицинового контроля у животных, получавших цитостатик и резерпин, отмечается незначительный выход воспалительных клеток в просвет альвеол. Одновременно с подавлением воспалительной реакции резерпин препятствует распространению фибротических масс в легких (рис.1е, табл.1).
Таблица 1
Содержание соединительной ткани (% от площади ткани) в легких мышей линии C57BL/6J в условиях интратрахеального введения блеомицина и курсового назначения резерпина на фоне моделирования фиброза легких (M±m)
Сроки исследования, сутки
Блеомицин
Блеомицин + резерпин
Интактный контроль
1,03±0,20
7
1,98±0,26 *
1,33±0,06 *&
14
3,09±0,23 *
2,94±0,27 *
21
3,02±0,44 *
2,75±0,42 *
25
5,45±0,74 *
3,85±0,58 *&
40
3,47±0,21 *
2,58±0,30 *
60
2,77±0,25 *
1,59±0,39 &
Примечание: отмечена достоверность (Р<0,05) различия показателя: от интактного контроля - *, от блеомицинового контроля - &.
Изучение реакций системы крови при пневмофиброзе позволило выявить, что наряду с активацией воспалительного процесса в легочной ткани инсталляция блеомицина вызывает лейкоцитоз в периферической крови (3, 14 сут). Повышение общего количества лейкоцитов было связано с повышением количества лимфоцитов (3 сут) и нейтрофилов (3, 7, 14 сут) (табл.2). Увеличение содержания нейтрофильных гранулоцитов (3, 7, 21, 25 сут) и лимфоцитов (7, 14, 21 сут) регистрируется и в костном мозге (табл.4).
Таблица 2
Динамика содержания общего количества лейкоцитов, нейтрофильных гранулоцитов и лимфоцитов (×10<sup>9</sup> клеток/л) в периферической крови у мышей в условиях введения блеомицина <img file="00000001.tif" he="6" wi="16" img-content="undefined" img-format="tif" />
Сроки исследов., сутки
Общее количество лейкоцитов
Нейтрофильные гранулоциты
Лимфоциты
Интактный контроль
13,90±1,44
2,01±0,35
10,54±1,25
3
17,40±1,22 *
3,07±0,37 *
13,11±1,08 *
7
14,75±1,34
3,20±0,57 *
10,60±0,99
14
16,58±1,37 *
3,04±0,40 *
12,3±1,11
21
14,40±1,30
2,01±0,62
11,61±0,63
25
15,20±0,53
2,97±0,26
11,35±0,30
Примечание: * достоверность различия от интактного контроля (Р<0,05).
Резерпин отменяет нейтрофильный лейкоцитоз (3, 7 сут) и лимфоцитоз (3, 7, 14, 21 сут) в периферической крови мышей с пневмофиброзом (табл.2, 3). Аналогичным образом резерпин действует на костномозговые клетки: препарат уменьшает количество нейтрофильных гранулоцитов (3, 21, 25 сут) и лимфоцитов (7, 14, 21 сут) до уровня интактного контроля (табл.4, 5).
Пневмофиброз сопровождается увеличением количества гранулоцито-эритроидно-макрофагально-мегакариоцитарных (3 сут) и гранулоцитарных (3, 7, 14, 21 сут) клеток-предшественников в костном мозге (табл.6). Под влиянием резерпина происходит уменьшение содержания КОЕ-ГЭММ (3, 7 сут) и КОЕ-Г (3, 7, 14 сут) по сравнению с животными, получавшими только блеомицин (табл.6).
Таблица 3
Влияние резерпина на динамику содержания общего количества лейкоцитов, нейтрофильных гранулоцитов и лимфоцитов (×10<sup>9</sup> клеток/л) в периферической крови у мышей в условиях введения блеомицина <img file="00000002.tif" he="6" wi="16" img-content="undefined" img-format="tif" />
Сроки исследования, сутки
Общее количество лейкоцитов
Нейтрофильные гранулоциты
Лимфоциты
Интактный контроль
13,9±1,44
2,01±0,35
10,54±1,25
3
12,40±1,22 &
2,30±0,29 &
9,03±0,98 &
7
10,20±0,41 &
1,91±0,19 &
7,16±0,38 &
14
12,70±0,80
2,76±0,40
8,66±0,79 &
21
3,38±1,13 *, &
2,20±1,10
1,16±0,01 *, &
25
14,75±2,18
2,97±0,58
10,96±1,73
Примечание: * достоверность различия от интактного контроля (Р<0,05), & достоверность различия у мышей в условиях введения блеомицина.
Таблица 4
Динамика содержания общего количества кариоцитов, нейтрофильных гранулоцитов и лимфоцитов в костном мозге (×10<sup>6</sup> клеток/бедро) у мышей в условиях введения блеомицина <img file="00000002.tif" he="6" wi="16" img-content="undefined" img-format="tif" />
Сроки исследования, сутки
Общее количество кариоцитов
Нейтрофильные гранулоциты
Лимфоциты
Незрелые
Зрелые
Интактный контроль
10,10±0,85
0,65±0,13
4,29±0,34
2,55±0,3
3
14,39±0,55 *
1,36±0,19 *
7,06±0,14 *
2,78±0,23
7
12,48±1,46
1,02±0,15 *
5,21±0,68
3,47±0,37 *
14
14,39±1,18 *
0,77±0,07
5,31±0,48
4,24±0,53 *
21
15,36±0,71 *
1,26±0,11 *
6,34±0,17 *
4,34±0,34 *
25
12,29±0,84
1,11±0,13 *
5,82±0,49
2,71±0,22
Примечание: * достоверность различия от интактного контроля (Р<0,05).
Таблица 5
Влияние резерпина на динамику содержания общего количества кариоцитов, нейтрофильных гранулоцитов и лимфоцитов в костном мозге (×10<sup>6</sup> клеток/бедро) у мышей в условиях введения блеомицина <img file="00000002.tif" he="6" wi="16" img-content="undefined" img-format="tif" />
Сроки исследов., сутки
Общее количество кариоцитов
Нейтрофильные гранулоциты
Лимфоциты
Незрелые
Зрелые
Интактные животные
10,1±0,85
0,65±0,13
4,29±0,34
2,55±0,3
3
11,61±0,78 &
1,09±0,12
5,34±0,46 &
2,18±0,28
7
11,44±0,49
1,02±0,12
4,70±0,38
2,33±0,23 &
14
12,76±1,13
0,64±0,12
6,53±0,72
2,22±0,43 &
21
9,36±0,14 &
0,71±0,15 &
3,93±0,40 &
2,58±0,18 &
25
10,44±1,20
0,68±0,16 &
4,41±0,98
2,45±0,86
Примечание: * достоверность различия от интактного контроля (Р<0,05), & достоверность различия у мышей в условиях введения блеомицина.
Таблица 6
Влияние резерпина на содержание КОЕ-ГЭММ и КОЕ-Г (×10<sup>5</sup> клеток) в костном мозге мышей в условиях введения блеомицина <img file="00000002.tif" he="6" wi="16" img-content="undefined" img-format="tif" />
Сроки исследования, сутки
КОЕ-ГЭММ
КОЕ-Г
Физ. раствор
Резерпин
Физ. раствор
Резерпин
Интактный контроль
2,50±0,43
2,50±0,43
1,00±0,26
1,00±0,26
3
10,17±0,98 *
4,00±0,43 *&
9,33±1,94 *
3,33±0,45 *&
7
2,00±0,37
0,67±0,11 *&
5,67±0,84 *
2,33±0,32 *&
14
0,83±0,18 *
0,17±0,07 *&
2,83±0,48 *
0,33±0,21 *
21
3,17±0,31
2,00±0,46
6,67±1,36 *
7,17±0,88 *
Примечание: * достоверность различия от интактного контроля (Р<0,05), & достоверность различия у мышей в условиях введения блеомицина.
Таким образом, применение резерпина на фоне введения блеомицина препятствует развитию воспалительной реакции в интерстиции легких и отложению фибротических масс. Противовоспалительный эффект связан с угнетением активности кроветворных клеток-предшественников гранулоцито-эритроидно-макрофагально-мегакариоцитарного и гранулоцитарного типа.
Литература
1. Илькович М.М., Новикова Л.Н., Сперанская А.А. Идиопатический фиброзирующий альвеолит // Участковый терапевт - 2009. - №6. - С.1-3.
2. Андреева И.И. Фиброзирующие альвеолиты. В кн.: Саперов В.Н., Андреева И.И., Мусалимова Г.Г. (ред.) Практическая пульмонология. Чебоксары: Изд-во Чуваш. гос. ун-та; 2007. С.511-514.
3. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Пособие для врачей. - 15-е изд., перераб., испр. и доп. - М.: «Новая волна», Издатель Умеренков, 2008. - С.453-454, 1003-1004.
4. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Провалова Н.В., Скурихин Е.Г., Суслов Н.И. Роль нервной системы в регуляции кроветворения. - Томск: Изд-во Том. ун-та, 2004. - С.87-90.
5. Дыгай A.M., Хмелевская Е.С., Скурихин Е.Г., Першина О.В., Андреева Т.В., Ермакова Н.Н. Особенности регуляции катехоламинами стромальных предшественников и стволовых кроветворных клеток при цитостатической миелосупрессии // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2011. - Т.152, №12. - С.665-671.
6. Мостовая И.Д., Каредина B.C., Лучанинова В.Н. Морфофункциональная характеристика слизистой оболочки бронхиального дерева и альвеолярной ткани в динамике экспериментальной пневмонии // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2007. - №1. - С.18-20.
7. King Т.Е., Pardo A. Selman М. Idiopathic pulmonary fibrosis // LANCET. - 2011. - V.378, №9807. - P.1949-1961.
8. Berg R.A., Moss J., Baum B.J., Crystal R.G. Regulation of Collagen Production by the (β-Adrenergic System // Journal of Clinical Investigation. - 1981. - V.67, May. - P.1457-1462.
9. Giri S.N., Sanford D.A., Jr., Robinson T.W., Tyler N.K. Impairment in coupled beta-adrenergic receptor and adenylate cyclase system during bleomycin-induced lung fibrosis in hamsters // Exp Lung Res. - 1987. - V.13, №4. - P.401-416.
10. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. - СПб: Медицина, 1969. - С.14, 36-38, 58, 98-100, 163, 170.
11. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск, 1992. - 264 с.