УСТРОЙСТВО ДЛЯ СОЗДАНИЯ ТКАНЕИНЖЕНЕРНОЙ КОНСТРУКЦИИ НА ОСНОВЕ ТКАНЕИНЖЕНЕРНОЙ МАТРИЦЫ И КЛЕТОЧНЫХ КОМПОНЕНТОВ

Настоящее устройство относится к медицинской биотехнологии и тканевой инженерии и предназначено для создания многокомпонентного аналога кожных покровов, применимого для терапии ран и ожогов.
В настоящее время задача быстрого и адекватного закрытия пораженной поверхности, например, при ранах и ожогах, стоит очень остро. Ситуации, где нормальные аутотрансплантаты не могут использоваться, чтобы заменить поврежденную кожу, обычно, приводят к увеличению риска летальности, продленному сроку пребывания в стационаре и увеличению расходов на выздоровление больного. Безусловно, потребность в спроектированных искусственно заменителях или аналогах кожи очень велика и исследования в этой области ведутся очень активно. За последние годы был достигнут существенный прогресс в развитии и клиническом использовании полученных методом биоинженерии эквивалентов различных слоев кожи. Использование готовых биоинженерных материалов, или выработка достаточных количеств биологических материалов, чтобы помочь быстрому закрытию раны - это, как правило, единственный способ помочь пациентам со значительной потерей кожи.
Современные подходы в лечении обширных ран включают использование культуры аутогенных кератиноцитов и полученных методом биоинженерии заменителей кожи. Тканеинженерные заменители кожи должны быть безопасны для пациента, клинически эффективны и удобны в применении. Такие биоматериалы должны быть биоразлагаемыми, поддерживать восстановление кожи, иметь похожие физические и механические свойства с кожей. Также биоматериал для восстановления кожи должен облегчать боль, предотвращать потерю влаги и тепла, и защитить рану от инфекции. Большим преимуществом биологических заменителей кожи является доступная стоимость, простота использования и способность длительно храниться.
В настоящее время нет доступных биозаместителей кожи с данными свойствами и имеющих функциональное и анатомическое сходство с кожей, а те биоматериалы, которые используются в клиниках для заживления ран, как правило, лишь частично восстанавливают функциональность кожи и требуют использования при лечении дополнительных лекарственных средств и продуктов для достижения положительного результата. Получение многокомпонентных аналогов кожных покровов в настоящее время по-прежнему остается нерешенной проблемой, в т.ч., вследствие отсутствия адекватных эффективных устройств для заселения тканеинженерных матриц культурами соответствующих клеток. Различные эквиваленты кожи, а также способы их получения и применения за последние несколько лет описаны, например, в следующих патентах: US 8114670, US 8043614, RU 2464987, RU 2461622, RU 2342164 и др.
Из предшествующего уровня техники известно устройство по патенту US 6730510 (опубл. 4.05.2004 г., МКИ С12М 3/04 (20060101); С12М 1/22 (20060101)., которое может служить биореактором для культивирования клеток Устройство включает в себя основание, образующее колодец, предназначенный для помещения питательной среды, чашу с нижней стенкой, снабженной тонкой мембраной, которая остается в колодце и на которой размещают биологический материал, и твердую крышку, расположенную над колодцем и над чашей. Мембрана находится в контакте с питательной средой, залитой в колодец. Предпочтительно, крышка имеет два герметизируемых отверстия для введения и/или удаления материала из чаши и колодца. Крышка включает в себя газопроницаемую мембрану для вентиляции. Устройство значительно снижет угрозу загрязнения и культуральной среды и допускает автоматизацию управления. К недостаткам этого устройства следует отнести невозможность одновременного культивирования разных клеток.
В американском патенте US 6607910 (опубл. 19.08.2004 г., МКИ C12N 5/06 (20060101); С12М 001/12) описан двухкамерный перфузионный реактор для культивирования клеток, обеспечивающий интенсивный перенос питательной среды и удаление отходов и/или ценных биопродуктов, например, белков, гормонов, факторов роста и моноклональных антител без повреждения культуры клеток. Клетки и ткани, находящиеся в камере роста, суспендируются в среде роста за счет вращения реактора и отделены от камеры питания пористой мембраной. Питательная среда и газы поступают через мембрану из камеры питания в камеру роста. Диспергирование питательной среды по поверхности мембраны осуществляется за счет ее подвода к центру мембраны и отвода с периферической части мембраны с возвратом в центральную часть. Камера питания постоянно подпитывается свежей средой или рециркулируется для поддержания постоянной концентрации специфических компонентов среды или тестируемых компонентов, например, лекарственных средств, факторов роста. Предложенный двухкамерный реактор дает возможность прикрепления к мембране различных типов человеческих клеток и получения эквивалентов различных тканей человека. Одним из недостатков данного устройства является отсутствие возможности одновременного независимого культивирования клеток разного типа и нанесения их на разные стороны тканеинженерной матрицы.
В качестве прототипа выбрано устройство для культивирования клеток и заселения ими трубчатой тканеинженерной конструкции по патенту на ПМ RU 117434 (опубл. 27.06.2012 г., МПК С12М 3/00), представляющее собой герметичную трехмодульную камеру, изготовленную по типу «сосуд в сосуде», состоящую из двух независимых контуров для подачи питательной среды и клеточной массы, при этом во внутреннем контуре закреплена тканеинженерная матрица, а поддержание и контроль необходимых условий жизнедеятельности клеточной массы, заселяющей матрицу, осуществляется за счет использования системного блока управления и термостата.
Недостатком известного устройства является сложность в сборке и использовании тканеинженерной матрицы с низкими механическими характеристиками. Разрыв в центральной части внутреннего контура устройства ограничивает его применение из-за возможного провисания тканеинженерной матрицы и разрушения при работе. При этом в прототипе заявляется лишь последовательное послойное заселение тканеинженерной матрицы клетками.
Техническим результатом предлагаемой полезной модели является расширение технологических возможностей устройства за счет одновременного контролируемого заселения обеих сторон тканеинженерной матрицы различными культурами клеток, в частности, фибробластами, такими как фибробласты кожи человека, с одной стороны, и кератиноцитами, культивированными для последующего формирования эпидермального слоя, с другой стороны.
Для этого предложено устройство для создания тканеинженерной конструкции на основе тканеинженерной матрицы и клеточных компонентов, включающее герметичный разборный коаксиальный двухконтурный реактор, каждый из контуров которого служит для независимой подачи соответствующей питательной среды, размещенный в термостате, и системный блок управления, оснащенный двумя перистальтическими насосами, фильтрами, блоками поддержания и контроля уровня кислорода и углекислого газа в средах и системами замены питательной среды, при этом системный блок управления соединен с реактором при помощи двух независимых сосудов-трубок, образующих внешний и внутренний контуры реактора, а часть внутреннего контура реактора, служащая для закрепления на ней тканеинженерной матрицы, выполнена проницаемой для питательной среды и клеточного компонента.
При этом проницаемая часть внутреннего контура является перфорированной или изготовлена из сетчатого материала.
На фигуре показана схема устройства, где
1 - тканеинженерная матрица
2 - разборный коаксиальный двухконтурный реактор
3 - торцевая крышка
4 - термостат
5 - торцевая крышка
6 - уплотняющие кольца
7 - трубчатая часть внутреннего контура
8 - трубчатая часть внешнего контура
9 - системный блок управления
10 - перистальтический насос внешнего контура
11 - перистальтический насос внутреннего контура
12 - блок поддержания и контроля уровня кислорода и углекислого газа во внешнем контуре
13 - блок поддержания и контроля уровня кислорода и углекислого газа во внутреннем контуре
14 - система замены питательной среды внешнего контура
15 - система замены питательной среды внутреннего контура
Устройство для культивирования клеток и одновременного двухстороннего заселения ими тканеинженерной матрицы включает разборный коаксиальный двухконтурный реактор 2, состоящий из четырех независимых деталей: двух торцевых крышек 3, 5, снабженных силиконовыми уплотняющими прокладками, цилиндрической части 8 внешнего контура и трубчатой части 7 внутреннего контура, и размещенный в термостате 4 для поддержания заданной температуры. Тканеинженерную матрицу 1 закрепляют зажимами или уплотняющими кольцами 6 на сплошных участках трубчатой части 7 внутреннего контура, прилегающих к проницаемому участку трубчатой части 7 внутреннего контура, герметично зафиксированной в торцевых крышках 3 и 5. Закрепление осуществляют таким образом, чтобы тканеинженерная матрица полностью перекрывала проницаемую часть внутреннего реактора. В зависимости от типоразмера заселяемой тканеинженерной матрицы устанавливают трубчатую часть внутреннего контура с соответствующей длиной проницаемого участка. Детали герметично соединяют между собой при помощи резьбовых соединений и силиконовых прокладок.
Подача и циркуляция питательной среды осуществляется с помощью двух перистальтических насосов 10 и 11, которые соответственно осуществляют циркуляцию питательной среды по внутреннему 7 и внешнему 8 контурам. Внутренний контур 7 за счет проникновения питательной среды и клеточной массы через отверстия проницаемого участка обеспечивает заселение клетками первого типа внутренней поверхности тканеинженерной матрицы, а внешний контур 8 обеспечивает заселение клетками второго типа внешней поверхности тканеинженерной матрицы. Кроме того, системный блок управления 9 оснащен блоками поддержания и контроля уровня кислорода и углекислого газа в средах 12, 13 и системами замены питательной среды 14, 15, которые при необходимости позволяют брать контрольные пробы и проводить замену питательной среды.
Технический результат достигается за счет использования в устройстве разборного герметичного коаксиального двухконтурного биореактора 2, часть внутреннего контура которого, служащая для закрепления на ее поверхности тканеинженерной матрицы 1, выполнена проницаемой для питательной среды и клеточного компонента, а сама матрица 1 выполнена из волокнистого полимерного материала, в частности, нетканого биоразлагаемого материала. Каждый из контуров реактора служит для независимой подачи соответствующей питательной среды, содержащей клетки первого или второго типа. При этом поддержание и контроль необходимых условий жизнедеятельности клеточной массы осуществляется за счет использования системного блока управления 9 и термостата 4.
Использование волокнистого полимерного материала в качестве тканеинженерной матрицы 1 позволяет расширить технологические возможности заявленного устройства в отношении создания многокомпонентного аналога кожного покрова.
Предлагаемое устройство представляет собой замкнутую систему, состоящую из разборного герметичного коаксиального двухконтурного биореактора 2 для одновременного двухстороннего заселения клетками разных типов тканеинженерной матрицы 1 из волокнистого полимерного материала, в частности, нетканого биоразлагаемого материала, соединенного с системным блоком управления 9 при помощи двух независимых сосудов-трубок, образующих внешний и внутренний контуры, по которым циркулируют соответствующие питательные среды, обогащенные кислородом и углекислым газом и содержащие клеточную массу первого или второго типа. Трубки для контуров изготавливают из гибких синтетических материалов и соединяют с блоком управления 9.
Реактор 2 выполнен из четырех узлов, герметично соединяемых друг с другом при помощи уплотняющих прокладок и резьбовых соединений. Трубчатая часть внутреннего контура 7 имеет центральный участок, который проницаем для питательной среды и клеточного компонента. Размер проницаемого участка зависит от размера тканеинженерной матрицы 1, используемой для получения многокомпонентного аналога кожных покровов. Концы трубчатой части внутреннего контура 7, проходящие через отверстия в торцевых крышках 3, 5, снабженных герметизирующими прокладками, используются для подключения к системному блоку управления 9 при помощи трубок из гибких синтетических материалов. Цилиндрическая часть внешнего контура 8 снабжена оливками для подключения к системному блоку управления 9 при помощи трубок из гибких синтетических материалов. Проницаемый участок внутреннего контура обертывают в один или несколько слоев тканеинженерной матрицей 1, размер которой немного превышает размер проницаемого участка. Края тканеинженерной матрицы 1 закрепляют на сплошных участках трубчатой части внутреннего контура 7, прилегающих к проницаемому участку. По внутреннему контуру при помощи одного перистальтического насоса 11 циркулирует питательная среда, содержащая клеточную массу первого типа. Заселение клетками первого типа внутренней поверхности тканеинженерной матрицы 1 происходит за счет проникновения питательной среды и клеточной массы через отверстия проницаемого участка внутреннего контура. Заселение клетками второго типа внешней поверхности тканеинженерной матрицы 1 происходит за счет циркуляции питательной среды, содержащей клеточную массу второго типа, по внешнему контуру реактора. Циркуляция по внешнему контуру осуществляется при помощи второго перистальтического насоса 10. Реактор 2 изготавливают из стекла, медицинской стали или синтетических материалов, разрешенных к применению в медицине, например, поликарбоната со специальным антиадгезионным покрытием. Реактор 2 помещают в термостат 4 с переменной температурой для поддержания условий жизнедеятельности клеток.
Системный блок управления 9 предлагаемого устройства состоит из двух независимых модулей управления, каждый из которых содержит перистальтический насос, блок замены питательной среды и блок подачи углекислого газа и кислорода. Один из модулей связан с внутренним контуром реактора, а другой, соответственно, с внешним контуром реактора. При этом блоки замены питательной среды представляет собой два герметичных сосуда для внутреннего 15 и внешнего контура 14 соответственно, каждый из которых снабжен двумя трубками с вентилями для забора и подачи питательной среды. Для предупреждения загрязнения, трубки снабжены двумя сменными бактериологическими фильтрами.
Таким образом, тканеинженерная матрица 1 из волокнистого полимерного материала, помещенная внутрь реактора 2 на проницаемый участок внутреннего контура, омывается с внутренней стороны одним питательным раствором, содержащим клеточный материал первого типа, а с внешней стороны - другим питательным раствором, содержащим клеточный материал второго типа, из двух независимых контуров (внешнего и внутреннего). При помощи системного блока управления 9 осуществляется контроль, и при необходимости замена состава питательного раствора в процессе культивирования клеток разного типа на разных сторонах тканеинженерной матрицы 1 без перемещения ее в другой сосуд, что исключает связанные с этим опасности заражения и механического повреждения объекта. Конструкция реактора 2, в частности, трубчатый внутренний контур с проницаемым для питательной среды и клеточного компонента участком, позволяет одновременно заселять разные стороны тканеинженерной матрицы 1 любого размера клетками разных типов, а использование мягких силиконовых прокладок 6 для закрепления тканеинженерной матрицы на внутреннем контуре позволяет защитить ее от повреждения. В качестве тканеинженерной матрицы 1 может быть использован волокнистый полимерный материал, в частности, нетканый биоразлагаемый материал, состоящий из нановолокон или микроволокон, полученных методом электродинамического формования из расплава или раствора полимера. Применение тканеинженерной матрицы 1 из биоразлагаемого материала позволяет избежать необходимости повторного оперативного вмешательства с целью удаления компонентов тканеинженерной конструкции после пересадки. Кроме того, структура поверхности волокон и размер пор нетканого волокнистого материала обеспечивают хорошее распластывание клеток и их пролиферацию.