Способ приготовления клеточных блоков на основе эксфолиативного материала шейки матки и цервикального канала
METHOD OF PREPARING CELL BLOCKS BASED ON CERVICAL EXFOLIATIVE MATERIAL AND CERVICAL CANAL

Изобретение относится к области биологии и медицины, в частности, к гистологии и патологической анатомии. Способ может быть использован для лабораторной диагностики неопластических процессов, а также и других заболеваний шейки матки у гинекологических больных с помощью гистологического и иммуногистохимического исследования клеточных блоков из полученного не инвазивным путем эксфолиативного материала шейки матки и цервикального канала. Осуществление изобретения обеспечивает повышение достоверности скрининга и диагностики дисплазий и рака шейки матки.
При применяющемся в настоящее время цитологическом исследовании мазков шейки матки имеются такие затрудняющие диагностику недостатки, как загрязнение фона исследуемого препарата элементами воспаления, эритроцитами, наличие некротизированных клеток и артефактов, затруднения имеются при верификации единичных опухолевых клеток, имеющихся в препарате. Трудности цитологической диагностики обусловлены отсутствием стандартизации забора материала и приготовления препарата, что снижает эффективность цитологического исследования на 40-80%, а количество ложноотрицательных результатов варьирует от 6 до 55% [1].
Предложен способ диагностики степени дисплазий шейки матки по материалу эксцизионных биоптатов шейки матки - Патент РФ №2704966, опубликованный 01.11.2019 г. Суть способа заключается в том, что проводится гистологическое исследование биоптатов шейки матки и дополнительно к нему - иммуногистохимическое исследование материала с определением маркеров Ki-67, р16 INK4a, Cyclin D1 в покровном эпителии и в железах [2]. Недостатком данного способа является выполнение инвазивных оперативных вмешательств для получения материала. При этом возможен риск развития серьезных осложнений, связанных с хирургическим вмешательством (кровотечение, септические осложнения и другие), а также требуется проведение дополнительных предоперационных обследований. К выполнению этих хирургических операций имеется ряд противопоказаний: молодой возраст пациентов, инфекционно-воспалительные заболевания мочеполовой сферы и некоторые другие.
Описан способ повышения достоверности диагностики рака яичников с помощью использования метода клеточных блоков: Патент РФ №2640189, опубликован 26.12.2017 г. - «Способ комплексной морфологической диагностики рака яичников», данное изобретение принято за прототип. Суть способа заключается в том, что цитологический препарат получают из клеточной суспензии, которую готовят путем добавления к клеточному осадку экссудата брюшной полости, питательной среды 199, центрифугирования в течение 8 минут при скорости 1000 об/мин. При этом происходит удаление фоновых элементов, разделение клеток на фракции и получение монослойных цитологических препаратов, которые используют для цитологического и иммуноцитохимического исследований. Для получения гистологических препаратов из экссудата брюшной полости или из смыва брюшной полости, полученного путем лапароцентеза под контролем ультразвука или пункции заднего свода влагалища в количестве не менее 0,3 см3 в центрифужной пробирке накапливают клеточный осадок. К этому осадку добавляют раствор ренампластина, а к образовавшемуся сгустку - 10% нейтральный забуференный раствор формалина. После этого клеточный сгусток переносят в гистологический мешочек, который помещают в кассету для гистологической проводки и последовательно обрабатывают в растворах дегидратантов в промежуточных смесях. Затем материал переносят в парафин, в результате чего получают клеточный блок и производят его нарезку микротомом. Полученные срезы переносят на предметное стекло для традиционного гистологического и иммуногистохимического окрашивания, после этого осуществляют дегидратацию и депарафинизацию с заключением под покровное стекло для микроскопического исследования. На основе комплексного морфологического исследования (гистологического и иммуногистохимического) устанавливают гистологический диагноз [3]. Указанный способ применяется для диагностики рака яичников.
Заявляемое изобретение направлено на повышение достоверности диагностики дисплазий и рака шейки матки и значительно отличается от описанных аналогов и прототипа. Задачей заявляемого изобретения является получение образцов эксфолиативного материала шейки матки и цервикального канала простым не инвазивным способом (соскоб) с обеспечением высокого качества диагностики для повышения достоверности скрининга и выявления дисплазий и рака шейки матки.
Поставленная задача решается с помощью приготовления клеточных блоков из эксфолиативного материала шейки матки и цервикального канала с последующим гистологическим и иммуногистохимическим исследованием. При этом клеточный осадок накапливают в центрифужной пробирке с помощью центрифугирования первичного полученного образца, к полученному осадку добавляют раствор желатина для образования сгустка, затем к образовавшемуся сгустку добавляют 10% нейтральный забуференный раствор формалина. После этого клеточный сгусток переносят в гистологический мешочек, который помещают в кассету для гистологической проводки, выполняют проводку материала, переносят его в парафин, получают клеточный блок, приготовляют парафиновые срезы для гистологической и иммуногистохимической окраски с последующим заключением под предметное стекло и микроскопическим исследованием.
Предлагаемый способ имеет следующие существенные отличия от известных аналогов и прототипа по характеру исследуемого материала и технике приготовления клеточных блоков для исследования: 1) впервые для приготовления клеточных блоков используется эксфолиативный материал шейки матки и цервикального канала, полученный путем соскоба клеток гинекологической цервикальной щеточкой и помещенный в пластиковый контейнер с транспортно-фиксирующей средой (смесь формалина и спирта); 2) максимально возможное количество транспортно-фиксирующей среды удаляют, оставшийся клеточный материал со средой переносят в центрифужную пробирку, пробирки помещают в центрифугу на 10 минут при 1500 об./мин.; 3) после центрифугирования сливают надосадочную жидкость и к полученному осадку добавляют в соотношении 1:1 раствор желатина в концентрации 6%, нагретого на водяной бане до 50 градусов по Цельсию, клеточный осадок с желатином перемешивают пластиковой палочкой и ставят в морозильную камеру на 5 минут при температуре -20 градусов по Цельсию; 4) полученный комочек желатина с клеточным материалом помещают в 10% раствор формалина не менее, чем на 24 часа, после этого готовят гистологические препараты для гистологических и иммуногистохимических исследований, обеспечивающих повышение достоверности скрининга и диагностики дисплазий и рака шейки матки.
Способ осуществляется следующим образом.
Эксфолиативный материал шейки матки и цервикального канала получали гинекологической цервикальной щеткой, вводили кончик щеточки в наружный маточный зев и поворачивали его вокруг своей оси на 360°, помещали щеточку в контейнер с транспортной средой (смесь этилового спирта и формалина - 20 мл) и направляли в лабораторию для исследования. В лаборатории переносили максимально возможное количество биоматериала с цервикальной щетки в транспортно-фиксирующую среду. В течение 20 минут отстаивали раствор с клеточным содержимым и после его осаждения собирали над скопившимся клеточным материалом надосадочную жидкость, оставляя ее в объеме равном осадку. После содержимое контейнера и оставшуюся часть транспортной среды перемешивали пластиковой палочкой и переносили жидкий материал в центрифужную пробирку. Пробирку помещали в центрифугу на 10 минут при 1500 об./мин. После центрифугирования к полученному осадку, предварительно слив надосадочную жидкость, добавляли в соотношении 1:1 раствор желатина в концентрации 6%, нагретого на водяной бане до 50 градусов по Цельсию. Осадок с желатином перемешивали пластиковой палочкой и ставили в морозильную камеру на 5 минут при температуре - 20 градусов по Цельсию. Затем в пробирку с помощью дозатора приливали 10% раствор формалина объемом, который полностью покрывает поверхность желатина с клеточным материалом, и оставляли пробирку при температуре 22-24 градуса по Цельсию на 60 минут. Далее сливали формалин и приливали в пробирку дистиллированную воду в таком же объеме, как формалин, на 30 минут. После сливали воду и выкладывали сформированный комочек желатина с клеточным материалом из пробирки в кассету и помещали в 10% раствор формалина не менее, чем на 24 часа. Затем выполняли проводку и заливку в парафин эксфолиативного материала с последующим приготовлением гистологических срезов для окрашивания гематоксилином и эозином и иммуногистохимического окрашивания.
Сущность изобретения «Способ приготовления клеточных блоков на основе эксфолиативного материала шейки матки и цервикального канала» поясняется графическими материалами, которые представлены на микрофотографиях:
Фиг. 1. Группа клеток цилиндрического эпителия в цитологическом препарате, приготовленном традиционным методом. Окраска азур-эозином. Ув. ×400.
Фиг. 2. Клетки цилиндрического эпителия с подлежащей тканью в гистологическом препарате, приготовленном из материала клеточного блока. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. ×400.
Фиг. 3. Клетки цилиндрического эпителия и лейкоцитарный инфильтрат в препарате, приготовленном из материала клеточного блока при иммуногистохимическом окрашивании с антителами к Cytokeratin 8/18 (5D3). Ув. ×400.
Использование заявляемого изобретения позволяет получать щадящим не инвазивным доступным методом оптимальные клеточные образцы эксфолиативного материала шейки матки и цервикального канала для последующего гистологического и иммуногистохимического исследования, что обеспечивает повышение достоверности скрининга и диагностики рака шейки матки.
Технический результат заключается в следующем: 1) из эксфолиативного материала шейки матки и цервикального канала, полученного не инвазивным способом, приготовляют клеточный осадок, на основе которого затем готовят клеточные блоки для последующего гистологического исследования материала, что обеспечивает возможность повышения достоверности результата исследований для диагностики дисплазий и рака шейки матки; 2) с помощью приготовления клеточных блоков из материала соскобов из эксфолиативного материала шейки матки и цервикального канала, полученного не инвазивным способом, приготовляют клеточный осадок, на основе которого затем готовят клеточные блоки для последующего иммуногистохимического исследования материала с использованием моноклональных антител, что обеспечивает возможность уточнения результата гистологического исследования и значительное повышение достоверности диагностики дисплазий и рака шейки матки.
Сущность заявляемого изобретения заключается в том, что полученный доступным не инвазивным способом материал соскобов шейки матки, который в настоящее время исследуется на цитологических мазках, используется для приготовления клеточных блоков с последующим заливкой материала в парафин. Это позволяет использовать полученный диагностический материал для последующего гистологического и иммуногистохимического исследования с использованием моноклональных антител, что существенно повышает возможности и достоверность диагностики предопухолевых процессов и рака шейки матки, выявления степени интраэпителиальной неоплазии, гистогенеза и степени дифференцировки опухоли, прогноза заболевания, что имеет крайне важное значение при выборе метода и схем терапии, оценки эффективности проводимого лечения и позволяет своевременно диагностировать рецидив заболевания.
Использование в клинической онкологической, гинекологической и лабораторной практиках заявляемого способа обеспечивает повышение достоверности диагностики предопухолевых процессов и рака шейки матки. Применяемая в данном способе технология изготовления морфологических образцов обеспечивает:
- возможность изготовления гистологических препаратов из клеточных блоков, полученных из эксфолиативного материала шейки матки и цервикального канала, и проведение гистологического и иммуногистохимического исследований с моноклональными антителами;
- использование клеточных блоков и иммуногистохимического исследования эксфолиативного материала шейки матки и цервикального канала повышает достоверность диагностики предопухолевых процессов, рака шейки матки и его местных рецидивов.
Преимущество изобретения заключается в том, что для выполнения гистологического и иммуногистохимического исследования не требуется проведения инвазивных манипуляций, получение образцов для исследования можно повторять без вреда для здоровья женщины, диагностическая ценность изготовляемых препаратов выше, чем при проведении цитологических исследований материала шейки матки, применяемого в настоящего времени, что особенно важно при выявлении неопластических процессов.
Источники информации
1. Дисплазия шейки матки - этиопатогенез, диагностика, оптимальная тактика лечения / под ред. А.Э. Протасова, Т.И. Дзюбий, Г.А. Раскин, Н.И. Тапильская, И.Е. Зазерская, Э.Д. Хаджиева Учебное пособие. - СПб.: 2014. - 22 с.
2. Бурцев Д.В., Димитриади Т.А., Холодная Т.О. Способ диагностики степени дисплазий шейки матки. 2019. Патент РФ №2704966. Опубликован 01.11.2019 г.
3. Леонов М.Г., Беляева С.А., Ершова Я.Х.-Б. Способ комплексной морфологической диагностики рака яичников. - М., 2017. Патент РФ №2640189. Опубликован 26.12.2017 г. Прототип.