СПОСОБ ОТБОРА КЛЕТКИ, СПОСОБНОЙ К ДЛИТЕЛЬНОМУ ПРОДУЦИРОВАНИЮ

1. Способ отбора клеточного клона, включающий следующие этапы:
а) определение CpG-сайта в промоторной нуклеиновой кислоте с помощью способа, включающего следующие этапы:
1) отдельное выделение ДНК по меньшей мере из 10 культивированных клеток, каждая из которых имеет такую скорость продукции полипептида после культивирования в течение 30 поколений в отсутствие селективного агента, которая составляет менее 90% от скорости продукции клетки после первого поколения культивирования,
2) модификация цитозина в выделенной ДНК путем обработки бисульфитом,
3) выявление CpG-сайта в промоторной нуклеиновой кислоте, функционально связанной со структурным геном, кодирующим полипептид, с частотой метилирования по меньшей мере 0,2 на основе ДНК, полученной на этапе 2) и выявление тем самым CpG-сайта,
б) определение частоты метилирования CpG-сайта, определенного на этапе а), в клеточном клоне, который содержит нуклеиновую кислоту, содержащую структурный ген, кодирующий полипептид, функционально связанный с промоторной нуклеиновой кислотой, которая является такой же, как на этапе а), на основании по меньшей мере 10 копий нуклеиновой кислоты или 10 клеток, полученных при его культивировании,
в) выбор клеточного клона, в котором частота метилирования, определенная на этапе б), в два раза ниже среднего показателя, полученного при определении метилирования цитозина в не-CpG-сайте, или
выбор клеточного клона, в котором частота метилирования, определенная на этапе в), составляет менее 5%.
2. Способ отбора клеточного клона, включающий следующие этапы:
а) определение для каждого из по меньшей мере одного клеточного клона, содержащего нуклеиновую кислоту, которая содержит структурный ген, кодирующий полипептид, функционально связанную с промоторной нуклеиновой кислотой, которая имеет нуклеиновокислотную последовательность SEQ ID №01 частоты метилирования CpG-сайта в позиции, выбранной среди позиций 80, 96, 425, 437, 563 и 591 в SEQ ID №01, на основе метилирования, определенного по меньшей мере для 10 копий промоторной нуклеиновой кислоты или по меньшей мере 10 клеток, полученных при культивировании каждого клеточного клона,
б) выбор клеточного клона, в котором определенная частота метилирования составляет менее 5%.
3. Способ по п.1, характеризующийся тем, что определение включает следующие этапы:
1) выделение ДНК из каждого клеточного клона,
2) индивидуальное выполнение для каждой выделенной ДНК полимеразной цепной реакции, специфической к метилированию,
3) определение с помощью результатов, полученных на этапе в-2), частоты метилирования CpG-сайта.
4. Способ по п.3, характеризующийся тем, что этап 2) представляет собой
2) индивидуальное выполнение для каждой выделенной ДНК специфической к метилированию полимеразной цепной реакции со специфическим праймером и универсальным праймером.
5. Способ по п.3, характеризующийся тем, что этап 2) представляет собой
2) индивидуальное расщепление выделенной ДНК рестрикционным ферментом и проведение для каждой расщепленной ДНК специфической к метилированию полимеразной цепной реакции со специфическим праймером и универсальным праймером.
6. Способ по п.4, характеризующийся тем, что этап 2) представляет собой
2) индивидуальное расщепление выделенной ДНК рестрикционным ферментом и проведение для каждой расщепленной ДНК специфической к метилированию полимеразной цепной реакции со специфическим праймером и универсальным праймером.
7. Способ по п.2, характеризующийся тем, что определение включает следующие этапы:
1) выделение ДНК из каждого клеточного клона,
2) индивидуальное выполнение для каждой выделенной ДНК полимеразмой цепной реакции, специфической к метилированию,
3) определение с помощью результатов, полученных на этапе в-2), частоты метилирования CpG-сайта.
8. Способ по п.7, характеризующийся тем, что этап 2) представляет собой
2) индивидуальное выполнение для каждой выделенной ДНК специфической к метилированию полимеразной цепной реакции со специфическим праймером и универсальным праймером.
9. Способ по п.7, характеризующийся тем, что этап 2) представляет собой
2) индивидуальное расщепление выделенной ДНК рестрикционным ферментом и проведение для каждой расщепленной ДНК специфической к метилированию полимеразной цепной реакции со специфическим праймером и универсальным праймером.
10. Способ по п.8, характеризующийся тем, что этап 2) представляет собой
2) индивидуальное расщепление выделенной ДНК рестрикционным ферментом и проведение для каждой расщепленной ДНК специфической к метилированию полимеразной цепной реакции со специфическим праймером и универсальным праймером.
11. Способ по любому из пп.1 и 3-6, характеризующийся тем, что промоторная нуклеиновая кислота имеет последовательность SEQ ID №01 или содержит ее фрагмент или вариант, а CpG-сайт выбран среди позиций 80, 96, 425, 437, 563 и 591 из SEQ ID №01 или соответствующих им позиций во фрагменте или варианте.
12. Способ по любому из пп.3-10, характеризующийся тем, что праймеры независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из SEQ ID №№06-20.
13. Способ по любому из пп.3-10, отличающийся тем, что праймеры выбраны из группы, состоящей из SEQ ID №11, 14 и 15, универсальный праймер имеет последовательность SEQ ID №09, а специфический к метилированию праймер выбран из группы, состоящей из SEQ ID №17, 18 и 19.
14. Способ по любому из пп.3-10, характеризующийся тем, что универсальные праймеры имеют последовательности SEQ ID №09 и 11, а специфические к метилированию праймеры имеют последовательности SEQ ID №11 и 18.
15. Способ по любому из пп.1-10, характеризующийся тем, что клеточный клон представляет собой клеточный клон СНО.
16. Способ получения полипептида, включающий следующие этапы:
а) выбор клеточного клона с помощью способа в соответствии с пп.1-15,
б) культивирование выбранного клеточного клона, и
в) выделение полипептида из культуральной среды и/или из клетки и получение тем самым полипептида.
17. Способ по п.16, характеризующийся тем, что включает следующие этапы перед этапом а):
а-3) получение клетки млекопитающего, но не человека,
а-2) трансфекция полученной клетки нуклеиновой кислотой, содержащей структурный ген, кодирующий полипептид, функционально связанной с промоторной нуклеиновой кислотой,
а-1) i) возможно, культивирование и размножение трансфицированного клеточного клона в присутствии селективного агента, ii) отдельное сохранение трансфицированных клеток, и iii) культивирование отдельных сохраненных трансфицированных клеток в присутствии селективного агента.
18. Набор, содержащий
а) реагент для модификации неметилированного цитозина в CpG-сайте, и
б) праймер, выбранный среди SEQ ID №13, 16, 17, 18, 19 и 20.