МУТАЦИИ ФЕРМЕНТА CRISPR, УМЕНЬШАЮЩИЕ НЕЦЕЛЕВЫЕ ЭФФЕКТЫ

1. Сконструированный белок CRISPR, где:
белок объединяется в комплекс с молекулой нуклеиновой кислоты, предусматривающей РНК, с образованием комплекса CRISPR,
где, находясь в комплексе CRISPR, молекула нуклеиновой кислоты нацеливается на один или несколько целевых полинуклеотидных локусов,
причем белок содержит по меньшей мере одну модификацию по сравнению с немодифицированным белком,
где комплекс CRISPR, содержащий модифицированный белок, характеризуется измененной активностью по сравнению с комплексом, содержащим немодифицированный белок.
2. Сконструированный белок CRISPR по п. 1, где измененная активность предусматривает измененное свойство связывания в отношении молекулы нуклеиновой кислоты, предусматривающей РНК, или целевых полинуклеотидных локусов, измененную кинетику связывания в отношении молекулы нуклеиновой кислоты, предусматривающей РНК, или целевых полинуклеотидных локусов, или измененную специфичность связывания в отношении молекулы нуклеиновой кислоты, предусматривающей РНК, или целевых полинуклеотидных локусов по сравнению с нецелевыми полинуклеотидными локусами.
3. Сконструированный белок CRISPR по п. 1 или 2, где измененная активность предусматривает повышенную эффективность нацеливания или сниженное нецелевое связывание.
4. Сконструированный белок CRISPR по любому из пп. 1-3, где измененная активность предусматривает модифицированную активность расщепления.
5. Сконструированный белок CRISPR по п. 4, где модифицированная активность расщепления предусматривает повышенную активность расщепления в отношении целевых полинуклеотидных локусов.
6. Сконструированный белок CRISPR по п. 4, где модифицированная активность расщепления предусматривает сниженную активность расщепления в отношении целевых полинуклеотидных локусов.
7. Сконструированный белок CRISPR по любому из пп. 4-6, где модифицированная активность расщепления предусматривает сниженную активность расщепления в отношении нецелевых полинуклеотидных локусов.
8. Сконструированный белок CRISPR по любому из пп. 4-6, где модифицированная активность расщепления предусматривает повышенную активность расщепления в отношении нецелевых полинуклеотидных локусов.
9. Сконструированный белок CRISPR по любому из предыдущих пунктов, где измененная активность предусматривает измененные кинетические свойства хеликазы.
10. Сконструированный белок CRISPR по любому из предыдущих пунктов, где модифицированный белок CRISPR содержит модификацию, которая изменяет связывание белка с молекулой нуклеиновой кислоты, предусматривающей РНК, или нитью, содержащей целевые полинуклеотидные локусы, или нитью, содержащей нецелевые полинуклеотидные локусы.
11. Сконструированный белок CRISPR по любому из предыдущих пунктов, где модифицированный белок CRISPR содержит модификацию, которая изменяет образование комплекса CRISPR.
12. Сконструированный белок CRISPR по любому из предыдущих пунктов, где модифицированный белок CRISPR содержит модификацию, которая изменяет нацеливание молекулы нуклеиновой кислоты на полинуклеотидные локусы.
13. Сконструированный белок CRISPR по любому из пп. 10-12, где модификация предусматривает мутацию в участке белка, который связывается с молекулой нуклеиновой кислоты.
14. Сконструированный белок CRISPR по любому из пп. 10-12, где модификация предусматривает мутацию в участке белка, который связывается с нитью, содержащей целевые полинуклеотидные локусы.
15. Сконструированный белок CRISPR по любому из пп. 10-12, где модификация предусматривает мутацию в участке белка, который связывается с нитью, содержащей нецелевые полинуклеотидные локусы.
16. Сконструированный белок CRISPR по любому из пп. 10-15, где модификация или мутация предусматривают сниженный положительный заряд в участке белка, который связывается с молекулой нуклеиновой кислоты, предусматривающей РНК, или нитью, содержащей целевые полинуклеотидные локусы, или нитью, содержащей нецелевые полинуклеотидные локусы.
17. Сконструированный белок CRISPR по любому из пп. 10-15, где модификация или мутация предусматривают сниженный отрицательный заряд в участке белка, который связывается с молекулой нуклеиновой кислоты, предусматривающей РНК, или нитью, содержащей целевые полинуклеотидные локусы, или нитью, содержащей нецелевые полинуклеотидные локусы.
18. Сконструированный белок CRISPR по любому из пп. 10-15, где модификация или мутация предусматривают повышенный положительный заряд в участке белка, который связывается с молекулой нуклеиновой кислоты, предусматривающей РНК, или нитью, содержащей целевые полинуклеотидные локусы, или нитью, содержащей нецелевые полинуклеотидные локусы.
19. Сконструированный белок CRISPR по любому из пп. 10-15, где модификация или мутация предусматривают повышенный отрицательный заряд в участке белка, который связывается с молекулой нуклеиновой кислоты, предусматривающей РНК, или нитью, содержащей целевые полинуклеотидные локусы, или нитью, содержащей нецелевые полинуклеотидные локусы.
20. Cконструированный белок CRISPR по любому из пп. 10-19, где модификация или мутация повышают стерическое несоответствие между белком и молекулой нуклеиновой кислоты, предусматривающей РНК, или нитью, содержащей целевые полинуклеотидные локусы, или нитью, содержащей нецелевые полинуклеотидные локусы.
21. Сконструированный белок CRISPR по любому из пп. 10-19, где модификация или мутация предусматривают замену Lys, His, Arg, Glu, Asp, Ser, Gly или Thr.
22. Сконструированный белок CRISPR по любому из пп. 10-19, где модификация или мутация предусматривают замену на Gly, Ala, Ile, Glu или Asp.
23. Сконструированный белок CRISPR по любому из пп. 10-19, где модификация или мутация предусматривают аминокислотную замену в связывающей бороздке.
24. Сконструированный белок CRISPR по любому из пп. 10-19, где связывающая бороздка находится между доменами RuvC и HNH.
25. Сконструированный белок CRISPR по любому из пп. 10-19, где модификация или мутация предусматривают мутацию в домене RuvCI, RuvCIII, RuvCIII или HNH.
26. Сконструированный белок CRISPR по любому из пп. 10-19, где модификация или мутация предусматривают аминокислотную замену в одном или нескольких из положений 12, 13, 63, 415, 610, 775, 779, 780, 810, 832, 848, 855, 861, 862, 866, 961, 968, 974, 976, 982, 983, 1000, 1003, 1014, 1047, 1060, 1107, 1108, 1109, 1114, 1129, 1240, 1289, 1296, 1297, 1300, 1311 и 1325 в соответствии с нумерацией аминокислотных положений SpCas9.
27. Сконструированный белок CRISPR по п. 26, где модификация или мутация в положении 63, 415, 775, 779, 780, 810, 832, 848, 855, 861, 862, 866, 961, 968, 974, 976, 982, 983, 1000, 1003, 1014, 1047, 1060, 1107, 1108, 1109, 1114, 1129, 1240, 1289, 1296, 1297, 1300, 1311 или 1325 предусматривают замену на аланин.
28. Сконструированный белок CRISPR по п. 26, где модификация или мутация в положении 12 предусматривают замену на аспарагиновую кислоту.
29. Сконструированный белок CRISPR по п. 26, где модификация или мутация в положении 13 предусматривают замену на изолейцин.
30. Сконструированный белок CRISPR по п. 26, где модификация или мутация в положении 610 предусматривают замену на глицин.
31. Сконструированный белок CRISPR по п. 26, где модификация или мутация в положении 799 предусматривают замену на лейцин.
32. Сконструированный белок CRISPR по п. 26, где модификация или мутация в положении 1129 предусматривают замену на глутаминовую кислоту.
33. Сконструированный белок CRISPR по п. 26, где модификация или мутация предусматривают K775A, E779L, Q807A, R780A, K810A, R832A, K848A, K855A, K862A, K961A, K968A, K974A, R976A, H983A, K1000A, K1014A, K1047A, K1060A, K1003A, S1109A, H1240A, K1289A, K1296A, H1297A, K1300A, H1311A или K1325A.
33. Сконструированный белок CRISPR по п. 26, где модификация или мутация предусматривают R783A и A1322T, или R780A и K810A, или R780A и K855A, или R780A и R976A, или K848A и R976A, или K855A и R976A, или R780A и K848A, или K810A и K848A, или K848A и K855A, или K810A и K855A, или H982A и R1060A, или H982A и R1003A, или K1003A и R1060A, или R780A и H982A, или K810A и H982A, или K848A и H982A, или K855A и H982A, или R780A и K1003A, или K810A и R1003A, или K848A и K1003A, или K848A и K1007A, или R780A и R1060A, или K810A и R1060A, или K848A и R1060A, или R780A и R1114A, или K848A и R1114A, или R63A и K855A, или R63A и H982A, или H415A и R780A, или H415A и K848A, или K848A и E1108A, или K810A и K1003A, или R780A и R1060A, или K810A и R1060A, или K848A и R1060A.
35. Сконструированный белок CRISPR по п. 26, где модификация или мутация предусматривают H982A, K1003A и K1129E, или R780A, K1003A и R1060A, или K810A, K1003A и R1060A, или K848A, K1003A и R1060A, или K855A, K1003A и R1060A, или H982A, K1003A и R1060A, или R63A, K848A и R1060A, или T13I, R63A и K810A, или G12D, R63A и R1060A.
36. Сконструированный белок CRISPR по п. 26, где модификация или мутация предусматривают R63A, E610G, K855A и R1060A, или R63A, K855A, R1060A и E610G.
37. Сконструированный белок CRISPR по любому из предыдущих пунктов, где белок предусматривает белок CRISPR II типа.
38. Сконструированный белок CRISPR по любому из предыдущих пунктов, где белок CRISPR предусматривает белок CRISPR от организма из рода, включающего Streptococcus, Campylobacter, Nitratifractor, Staphylococcus, Parvibaculum, Roseburia, Neisseria, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerochaeta, Lactobacillus, Eubacterium или Corynebacter.
39. Сконструированный белок CRISPR по любому из предыдущих пунктов, где белок предусматривает белок Cas9.
40. Сконструированный белок CRISPR по любому из предыдущих пунктов, где белок CRISPR предусматривает химерный белок Cas9, содержащий первый фрагмент от первого ортолога Cas9 и второй фрагмент от второго ортолога Cas9, и при этом первый и второй ортологи Cas9 являются различными.
41. Сконструированный белок CRISPR по п. 40, где по меньшей мере один из первого и второго ортологов Cas9 предусматривает Cas9 от организма, включающего Streptococcus, Campylobacter, Nitratifractor, Staphylococcus, Parvibaculum, Roseburia, Neisseria, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerochaeta, Lactobacillus, Eubacterium или Corynebacter.
42. Сконструированный белок CRISPR по любому из предыдущих пунктов, где белок CRISPR содержит один или несколько доменов, представляющих собой сигнал ядерной локализации (NLS).
43. Сконструированный белок CRISPR по любому из предыдущих пунктов, где белок CRISPR содержит по меньшей мере два или более NLS.
44. Сконструированный белок CRISPR по любому из предыдущих пунктов, где белок CRISPR содержит один или несколько гетерологичных функциональных доменов.
45. Сконструированный белок CRISPR по п. 44, где один или несколько гетерологичных функциональных доменов предусматривают один или несколько доменов активации транскрипции.
46. Сконструированный белок CRISPR по п. 45, где домен активации транскрипции предусматривает VP64.
47. Сконструированный белок CRISPR по п. 44, где один или несколько гетерологичных функциональных доменов предусматривают один или несколько доменов репрессии транскрипции.
48. Сконструированный белок CRISPR по п. 47, где домен репрессии транскрипции предусматривает домен KRAB или домен SID.
49. Сконструированный белок CRISPR по п. 44, где один или несколько гетерологичных функциональных доменов предусматривают один или несколько нуклеазных доменов.
50. Сконструированный белок CRISPR по п. 49, где нуклеазный домен предусматривает Fok1.
51. Сконструированный белок CRISPR по п. 44, где один или несколько гетерологичных функциональных доменов характеризуются одной или несколькими из следующих видов активности: метилазной активностью, деметилазной активностью, активностью в отношении активации транскрипции, активностью в отношении репрессии транскрипции, активностью фактора освобождения транскрипта, активностью в отношении модификации гистонов, нуклеазной активностью, активностью расщепления однонитевой РНК, активностью расщепления двухнитевой РНК, активностью расщепления однонитевой ДНК, активностью расщепления двухнитевой ДНК и активностью связывания нуклеиновой кислоты.
52. Сконструированный белок CRISPR по любому из предыдущих пунктов, где белок CRISPR кодируется нуклеотидной последовательностью, которая является кодон-оптимизированной для экспрессии в эукариотическом организме.
53. Композиция, содержащая сконструированный белок CRISPR по любому из предыдущих пунктов.
54. Система, содержащая сконструированный белок CRISPR по любому из предыдущих пунктов и молекулу нуклеиновой кислоты, предусматривающую РНК.
55. Векторная система, содержащая один или несколько векторов, где один или несколько векторов содержат:
a) первый регуляторный элемент, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей сконструированный белок CRISPR по любому из предыдущих пунктов; и
b) второй регуляторный элемент, функционально связанный с одной или несколькими нуклеотидными последовательностями, кодирующими одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты, предусматривающих направляющую РНК, содержащую направляющую последовательность, tracr-последовательность и парную tracr-последовательность, где компоненты (a) и (b) находятся в одном и том же или в разных векторах.
56. Выделенная эукариотическая клетка, содержащая систему по п. 54 или 55.
57. Способ модулирования экспрессии гена, где способ включает введение сконструированного белка CRISPR или системы по любому из предыдущих пунктов в клетку.
58. Способ по п. 59, где клетка является эукариотической или прокариотической клеткой.
59. Способ по п. 59, где способ осуществляют ex vivo или in vitro.
60. Способ лечения заболевания, нарушения или инфекции у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение эффективного количества сконструированного белка CRISPR или композиции по любому из предыдущих пунктов.
61. Способ изменения экспрессии представляющего интерес локуса генома в клетке млекопитающего, включающий
приведение клетки в контакт с композицией по любому из пп. 1-55, и за счет чего осуществляется доставка вектора и обеспечивается образование комплекса CRISPR-Cas и его связывание с мишенью, и
определение того, была ли изменена экспрессия локуса генома.
62. Способ по п. 6, который предусматривает обеспечение расщепления геномной ДНК, что приводит в результате к сниженной транскрипции гена.
63. Способ по п. 6, где изменение экспрессии предусматривает редактирование генома.
64. Способ по п. 6, где изменение экспрессии предусматривает повышение экспрессии продукта гена.
65. Способ по п. 6, где изменение экспрессии предусматривает модификацию продукта гена.
66. Выделенная клетка, характеризующаяся экспрессией локуса генома, измененной в результате осуществления способа по любому из пп. 6-10, где экспрессия является измененной в сравнении с клеткой, в отношении которой не осуществляли способ изменения экспрессии локуса генома.
67. Выделенная линия клеток, полученная исходя из клетки по п. 11.
68. Способ модифицирования представляющего интерес целевого локуса, причем способ включает доставку в указанный локус не встречающейся в природе или сконструированной композиции, содержащей белок Cas9 по любому из пп. 1-52 и один или несколько компонентов на основе нуклеиновой кислоты, где белок Cas9 образует комплекс с одним или несколькими компонентами на основе нуклеиновой кислоты, и после связывания комплекса с представляющим интерес целевым локусом белок Cas9 индуцирует модификацию представляющего интерес целевого локуса.
69. Способ по п. 13, где представляющий интерес целевой локус находится в клетке.
70. Способ по п. 14, где клетка является эукариотической клеткой.
71. Способ по п. 14, где клетка является клеткой животного или человека.
72. Способ по п. 14, где клетка является растительной клеткой.
73. Способ по п. 13, где представляющий интерес целевой локус содержится в молекуле ДНК in vitro.
74. Способ по любому из пп. 13-18, где указанную не встречающуюся в природе или сконструированную композицию, содержащую белок Cas9 и один или несколько компонентов на основе нуклеиновой кислоты, доставляют в клетку в виде одной или нескольких полинуклеотидных молекул.
75. Способ по любому из пп. 13-18, где белок Cas9 содержит один или несколько сигналов ядерной локализации (NLS).
76. Способ по любому из пп. 19-20, где одна или несколько полинуклеотидных молекул содержатся в одном или нескольких векторах.
77. Способ по любому из пп. 19-21, где одна или несколько полинуклеотидных молекул содержат один или несколько регуляторных элементов, функционально сконфигурированных для обеспечения экспрессии белка Cas9 и/или компонента(компонентов) на основе нуклеиновой кислоты, где один или несколько регуляторных элементов необязательно предусматривают индуцируемые промоторы.
78. Способ по любому из пп. 19-22, где одна или несколько полинуклеотидных молекул или один или несколько векторов содержатся в системе доставки.
79. Способ по любому из пп. 19-23, где систему или одну или несколько полинуклеотидных молекул доставляют посредством частиц, везикул или одного или нескольких вирусных векторов.
80. Способ по п.24, где частицы предусматривают липид, сахар, металл или белок.
81. Способ по п.24, где везикулы предусматривают экзосомы или липосомы.
82. Способ по п.24, где один или несколько вирусных векторов предусматривают одно или несколько из аденовируса, одного или нескольких лентивирусов или одного или нескольких аденоассоциированных вирусов.
83. Способ по любому из пп. 13-24, который представляет собой способ модифицирования клетки, линии клеток или организма путем манипуляции с одной или несколькими целевыми последовательностями в представляющих интерес локусах генома.
84. Клетка, полученная в результате осуществления способа по п.28, или ее потомство, где клетка содержит модификацию, не присутствующую в клетке, в отношении которой не осуществляли способ.
85. Клетка по п. 29 или ее потомство, где клетка, в отношении которой не осуществляли способ, содержит аномалию, а клетка, полученная в результате осуществления способа, характеризуется устраненной или скорректированной аномалией.
86. Продукт клетки, полученный из клетки или ее потомства по п.29, где продукт является модифицированным по своей природе или количеству по сравнению с продуктом клетки, полученным из клетки, в отношении которой не осуществляли способ.
87. Продукт клетки по п.31, где клетка, в отношении которой не осуществляли способ, содержит аномалию, и при этом продукт клетки отражает аномалию, которая устраняется или корректируется с помощью способа.
88. In vitro, ex vivo или in vivo клетка-хозяин или линия клеток или их потомство, содержащие систему, содержащую белок Cas9 по любому из пп. 1-52 и один или несколько компонентов на основе нуклеиновой кислоты, где белок Cas9 образует комплекс с одним или несколькими компонентами на основе нуклеиновой кислоты, и после связывания комплекса с представляющим интерес целевым локусом белок Cas9 индуцирует модификацию представляющего интерес целевого локуса.
89. Клетка-хозяин или линия клеток или их потомство по п.33, где клетка является эукариотической клеткой.
90. Клетка-хозяин или линия клеток или их потомство по п.34, где клетка является клеткой животного.
91. Клетка-хозяин или линия клеток или их потомство по п.34, где клетка является клеткой человека.
92. Клетка-хозяин, линия клеток или их потомство по п.34, предусматривающие стволовую клетку или линию стволовых клеток.
93. Клетка-хозяин или линия клеток или их потомство по п.34, где клетка является растительной клеткой.
94. Способ получения растения с модифицированным представляющим интерес признаком, кодируемым представляющим интерес геном, причем указанный способ включает приведение растительной клетки в контакт с системой по любому из пп. 54-55 или осуществление в отношении растительной клетки способа по любому из пп. 68-83, за счет чего обеспечивается либо модифицирование, либо введение указанного представляющего интерес гена, и регенерацию растения из указанной растительной клетки.
95. Способ идентификации представляющего интерес признака у растения, причем указанный представляющий интерес признак кодируется представляющим интерес геном, причем указанный способ включает приведение растительной клетки в контакт с системой по любому из пп. 54-55 или осуществление в отношении растительной клетки способа по любому из пп. 68-83, за счет чего обеспечивается идентификация указанного представляющего интерес гена.
96. Способ по п.40, дополнительно включающий введение идентифицированного представляющего интерес гена в растительную клетку, или линию растительных клеток, или растительную идиоплазму и получение из них растения, в результате чего растение содержит представляющий интерес ген.
97. Способ по п.41, где у растения проявляется представляющий интерес признак.
98. Частица, содержащая систему по любому из пп. 54-55.
99. Частица по п.43, где частица содержит белок Cas9 по любому из пп. 1-52, причем белок находится в комплексе с направляющей РНК.
100. Частица по п.43, где частица содержит eSpCas9(1.1) в комплексе с направляющей РНК.
101. Комплекс, молекула нуклеиновой кислоты, предусматривающая РНК, или белок по п. 1, где комплекс, молекула нуклеиновой кислоты, предусматривающая РНК, или белок конъюгированы по меньшей мере с одним сахарным фрагментом, необязательно N-ацетилгалактозамином (GalNAc), в частности, с трехразветвленным GalNAc.
102. Комплекс, компонент на основе нуклеиновой кислоты или белок по п. 68, где комплекс, компонент на основе нуклеиновой кислоты или белок конъюгированы по меньшей мере с одним сахарным фрагментом, необязательно N-ацетилгалактозамином (GalNAc), в частности, с трехразветвленным GalNAc.
103. Способ улучшения специфичности системы CRISPR путем обеспечения сконструированного белка CRISPR с модификацией по любому из пп. 1-36.
104. Применение сконструированного белка CRISPR для улучшения специфичности системы CRISPR, где белок CRISPR является модифицированным согласно любому из пп. 1-36.