Природные гликозаминогликаны и их химическая модификация

ПРИРОДНЫЕ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНЫ И ИХ ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ

ПОНЕДЕЛЬКИНА Ирина Юрьевна,

кандидат химических наук, старший научный сотрудник'

одиноков

Виктор Николаевич,

член-корреспондент АН РБ, заведующий лабораторией*

Гликозаминогликаны (GAG) являются гете-рополисахаридами линейного строения [I - 3] (см. рис. I). К кислым GAG относятся гиалу-роновая кислота (НА), хондроитинсульфат А (хондроитин-4-сульфат, CS-4), хондроитинсульфат С (хондроитин-6-сульфат, CS-6), хондроитинсульфат В (дерматансульфат, DS), гепарин (НЕР) и гепарансульфаты, степень сульфатированности которых меньше, чем НЕР. В нативном виде гликозаминогликаны (за

* Институт нефтехимии и катализа РАН.

исключением гиалуроновой кислоты) являются протеогликанами и характеризуются наличием галактозилгалактозилксилозной вставки между углеводной и белковой областями.

Клетками различных органов дифференцированно синтезируются определенные типы гликозаминогликанов. Гиалуроновая кислота продуцируется в специализированных формах фибробластов (хондробластах и остеобластах), обнаруживается в комплексе с белками в межклеточном матриксе соединительной ткани всех высших животных и может быть выделена из них экстракцией разбавленными щелочами, фенолом, трихлоруксусной кислотой. НА была также получена с помощью НА-продуцирующих бактерий. Биологическая активность гиалуроновой кислоты существенно зависит от ее молекулярной массы, которая варьирует от нескольких сотен до 10 миллионов Дальтон (Мср ~1-2 млн Да); она участвует в гомеостазе тканей, стерическом регулировании проникновения каких-либо субстанций, специфически связывается с белками межклеточного матрикса и на поверхности клетки. Такое взаимодействие является важным для образования хрящевой ткани, процессов клеточной пролиферации, морфогенеза и эмбрионального развития, а также при воспалении и онкологических заболеваниях.

Хондроитинсульфаты, подобно НА, генерируются фибробластами. СБ-4 находится преимущественно в хрящах, костях и роговице глаза, СБ-6 локализован в сухожилиях, связках, межпозвоночных дисках, ОБ содержится в коже, сухожилиях и связках. Протеогликаны ОБ (М ~100 кДа) принимают участие в организации и ориентации коллагеновых фибрилл, что является важнейшей функцией ОБ. В процессе формирования соединительной ткани ОБ метаболизируется из СБ-4 путем эпиме-ризации глюкуроновой кислоты в идуроновую. Неполной реакцией эпимеризации объясняет-

соон

..GlcA-IM 1 —3)-GlcNAc-p-(l—4).

NHAc CS-4

GlcA-|í-( 1 —3)-GalNAc4S- (i-< 1—4)...

SO,H

OH oso.H

COOH

М1Л с i

CS-6 I

..GlcA-|i-( 1 —3)-GalNAc6S- |i-( 1 —4)...

Ido A- a-( 1 —3 )-GalNAc4S- 1 —4). PS0,H

о

OSO,H /n

s HEP

R -SO,H / Ac (-3:1) .ldoA2S-a-( 1—4)-GlcNS6S/GlcNAc6S- a-( 1—4)..

Рис. I. Кислые GAG

ся гетерогенность состава DS: в зависимости от вида ткани DS содержит до 20% глюкуро-новой кислоты. CS (М-10-60 кДа) различаются звеньями уроновых кислот и положением сульфогрупп.

Гепарин локализован в печени, легких, селезенке и щитовидной железе, его биосинтез осуществляется тучными клетками, в зависимости от вида органов и тканей, а также способов выделения, имеет молекулярную массу от 3 до 900 кДа. Для HEP характерна гетерогенность состава. В процессе биосинтеза цепи GAG конверсия b-D-глюкуроната в a-L-идуронат in vivo происходит с помощью специфичной для HEP CS-эпимеразы. Примерно на одну треть молекула HEP состоит из пен-тасахаридных фрагментов с 2,3,6-трисульфа-тированным D-глюкозамином, сайтом для специфического связывания с протеином плазмы антитромбином III, выполняющим важную роль в каскадном механизме свертывания крови.

Гликозаминогликаны в медицинской практике зарекомендовали себя лекарственными средствами. Высокомолекулярная гиа-луроновая кислота (М~106 Да) входит в состав вискоэластичных гелей «Provisk» (Швеция) и

«Healon» (Канада), применяющихся в офталь-мохирургии при операциях экстракции катаракты, является действующим веществом в пленках «Seprafilm» для предупреждения спаечной болезни брюшины. Гидрогель на основе комплексной соли НА с хлоридом железа (III) (0.5% PeCl3) предложен в качестве барьерного материала (фирма «Этикон») и предназначается для профилактики спаечной болезни в абдоминальной хирургии [32]. Низкомолекулярной НА пропитываются салфетки «Гиаплюс» (г. Тула), использующиеся для лечения ожоговой болезни. Лекарственное средство «Куриозин» (Гедеон Рихтер, Венгрия), представляющее собой цинковую соль НА, используется для лечения трофических язв и угрей, препарат «Цистистат» восстанавливает функции слизистой оболочки мочевого пузыря при интерстициальном цистите. НА является составным компонентом косметических кремов и тоников для стимуляции роста волос. Запатентовано применение в лечении герпеса и псориаза, а также для изготовления суппозиториев различного назначения. Установлено, что НА даже в простых смесях усиливает абсорбцию лекарств и проникновение

протеинов через слизистые оболочки, а эффективность нестероидных противовоспалительных средств (диклофенака и др.) заметно улучшается в сочетании с НА.

Хондроитинсульфаты входят в состав мази «Хондроксид» для лечения остеоартритов, являются действующим веществом препаратов «Румалон» (для лечения ревматоидных артритов), «Хонсурид» (для ускорения репаратив-ных процессов), «Алфлутоп» (противовоспа-

ные соли. Комплексы HEP с катионными красителями находят применение в медицине. Нанесение HEP на поверхность кровеносных сосудов, предварительно обработанную ме-тиленовым синим, позволяет зафиксировать его для последующего проявления атромбо-генного действия в течение 3 - S суток после хирургической операции по удалению атеро-матозных склеротических бляшек (операции эндартерэктомии) (рис. 2) [S, 6].

(CHJJ1

A ip е Dtp oi алные +

сцсн^к

SO, I Ц tor- о

J. J. J, J. J, J

—?—3P-7—7"—.--- ---' --- --——^

коллаген и гликозаминогликаны соединительной ткани

чад.сг

нссн^

Рис. 2. Фиксация гепарина на поверхности соединительной ткани посредством красителя метиленового синего

лительного и обезболивающего средства при разных формах остеоартроза) и «Фемидан» (для восстановления эластичности и упругости кожи).

Гепарин известен в качестве антикоагулян-тного и антитромботического средства, применяется внутривенно при операциях на сосудах и внутрибрюшинно малыми дозами для профилактики тромбообразования или спаечной болезни брюшины. Гепариновую мазь, в состав которой входит анестезин, применяют наружно при поверхностных тромбофлебитах и язвах конечностей, тромбозе геморроидальных вен для уменьшения воспалительных процессов. Выявлены антибактериальные, антивирусные, противовоспалительные и противоопухолевые свойства гепарина, он проявляет аффинность к У3-домену гликопротеина 120 (др 120), одного из белков оболочки вириона ВИЧ, и оказывает ингибирующее действие на рост и репликацию вируса. Открыты новые терапевтические свойства кортизона в комбинации с HEP: при их совместном применении ингибируется ангиогенез и рост опухолей.

Как полисахариды анионной природы гликозаминогликаны легко образуют комплекс-

Интраоперационная атромбогенная обработка артерий в зоне эндартерэктомии 1%-м раствором метиленового синего и стандартным раствором гепарина предотвращает процессы образования пристеночного тромба, уменьшает воспалительную реакцию сосудистой стенки в ответ на повреждение, ускоряет естественную эндотелизацию дефекта интимы (внутренней эндотелиальной оболочки сосуда). Предложенный способ атромбогенной обработки артерий позволяет сократить частоту послеоперационных осложнений (эмбо-лизации, рестенозов и тромбозов) с 32,S% до 10,3%, т.е. в 3,2 раза (р<0,01) [6, 7].

Химическая модификация может придать гликозаминогликанам дополнительные терапевтические возможности и значительно изменить физико-химические и биологические свойства модифицированных GAG (биодоступность, биодеградируемость), существенно расширить области их применения как самостоятельных лекарственных препаратов, так и в качестве адъювантов [4].

Для изменения функциональности гиалуро-новой кислоты2применяют катализируемое нитроксильным радикалом 2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидиноксилом (TEMPO) окисление ее

он

:оон

но.

о но

Л

он

\IIVl

NaOCl-NaBr-TEMPO

:оон

соон

о

рН 10.2,0±2 »С

Звено Звено

D-глюкуроновой N-ацегил-кислоты D-глюкозамина

НА

первичных спиртовых групп до карбоксильных с помощью гипохлоритов в присутствии гало-генидов щелочных металлов [8, 9]:

Окисленная таким путем гиалуроновая кислота (карбокси-НА) приобретает хорошую растворимость в воде, большее по сравнению с природной НА сродство к красителям (например, метиленовому синему), проявляет повышенную ферментоустойчивость in vitro к действию тестикулярной гиалуронидазы (лидазы). При концентрации фермента 3 у.е./мл, близкой к концентрации в сыворотке крови человека, карбокси-НА практически не деградирует по сравнению с интактной НА [9], что может быть полезным при разработке лекарственных средств пролонгированного действия.

Одним из наиболее перспективных методов химической модификации GAG по карбоксильной группе является конъюгация с пер-

ГООН

соон

о

но,

н3с, и,с

но.

о но

он NHAf

Звено N-ацетил-

D-глюкозаминуроновой

кислоты

карбокси-НА

вичными аминами в присутствии карбодиими-дов. Для синтеза амидов в водной среде чаще всего используется конденсирующий реагент 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодии-мид (ЕЭС) [10 - 13].

Модификация гликозаминогликанов и кар-бокси-НА различными фармакозначимыми аминами в присутствии ЕЭС приводит, в зависимости от природы амина и соотношения реагентов, к конъюгатам с различной степенью конверсии карбоксигрупп в амидные. В структуре карбокси-НА активность карбоксильных групп в звене М-ацетилглюкозамину-роновой кислоты выше, чем в звене О-глюку-роновой кислоты.

В качестве аминов использованы S-амино-салициловая (1а), 4-аминосалициловая (1Ь), антраниловая (1с) и п-аминобензойная (1ф кислоты, п- (1е) и о-аминофенол (1^, п-ами-

Схема I

-сн,

-N=ON

ED С

rOXHR

CONHR.

ОН

карбокси-НА

NHAc

+ rnh2

la-1

H20, pH 4.7-4.8, 20-22 °C

'O*

HO

'O HO

О

он

\ IIAc

2a-1

.-. IllJUl

-t\ -(' ^COOH

Oli

la

воспалительное) туберкулезное) триптофана)

имикробь

Т=Г

он lg (антимикробное) lh (антимикробное) li (местно- lj (местно-

lf

триптоЛана) i * conh-

<An'NxC4> А

[I :i

И

-HN-CH,CH,S03H 1 m

нобензолсульфамид (стрептоцид) (Ig), п-ами-нобензолсульфацетамид-натрий (сульфацил-натрий) (Ih), этиловый эфир п-аминобензой-ной кислоты (анестезин) (Ii), b-диэтиламино-этиловый эфир2п-аминобензойной кислоты (новокаин) (Ij), 1-фенил-2,3-диметил-4-амино-пиразолон-S (4-аминоантипирин) (Ik), гидра-зид изоникотиновой кислоты (изониазид) (II), 2-аминоэтансульфоновая кислота (таурин, Im). Получены соответствующие амиды 2а-т (схема 1). Подобные амиды синтезированы и с другими GAG [11,12].

Конъюгат гиалуроновой кислоты с S-ами-носалициловой кислотой проявляет противовоспалительные свойства [14], конъюгаты гли-козаминогликанов с 4-аминоантипирином (структурным аналогом анальгина) обладают анальгезирующим действием [1S]. Конъюгат гепарина с таурином, наряду с антикоагулянт-ной, обнаруживает противовоспалительную и противоопухолевую активность [16].

Все конъюгаты НА и карбокси-НА проявляют повышенную ферментоустойчивость in vitro к действию тестикулярной гиалурони-дазы, которая зависит от природы и содержания остатка амина. Для конъюгатов природ-

Схема 2

,0

NHK

СН,

CONHCH(COOH)(CH ,),CH,NHC0-C ^ ^

О

СН

з

СН

Конъюгат гепарина с ибупрофеном

oso.h

СИ,

соон

tshr

гепарин

AL-лизин

tshr

O^ClSHCHCCH^CHjlSH С(К)Н

конъюгат гепарина с лизином

но

II

о

n nh гемисукцинат AZT

NHS

^ о/^О

N-OCO(CH,)X06Y у жт

\/ N-гидроксисукцин-

1 имидный эфир

n

3 гемисукцината AZT

oso.h

4 jtsh

.. ..А

tshr 5' () n о

o=c:nhc:h(c:h2)3c:h2nhc:(c:h2)2c:

I

соон

о о

конъюгат гепарина с AZT

ной НА с увеличением содержания остатка амина биодеградируемость понижается по сравнению с интактной НА. Для карбокси-НА наблюдается обратная зависимость.

В синтезе конъюгатов GAG с фармакозна-чимыми кислотами в качестве реакцион-носпособных ацилирующих интермедиатов используются сукцинимидные эфиры кислот (NHS-эфиры), получаемые действием Х-гид-роксисукцинимида (NHS) на соответствующую кислоту. Предварительно GAG сочетается с диамином, выполняющим роль спейсера. С помощью такой методологии через лизиновый спейсер получены конъюгаты гепарина с противовоспалительным средством ибупрофеном и анти-ВИЧ агентом -азидотимидином (AZT) (схема 2) [17].

Конъюгат гепарина с ибупрофеном является перспективным средством, обладающим антикоагулянтной, противовоспалительной, противоопухолевой и антиметастатической активностью. Конъюгат с AZT может найти применение в профилактических мероприятиях по предотвращению распространения ВИЧ-инфекции.

Таким образом, природные гликозаминогликаны могут применяться в качестве полимерной матрицы для ковалентного связывания лекарственных субстанций. Конъюгация с ними повышает стабильность, снижает токсичность, позволяет регулировать фар-макокинетику, пролонгировать терапевтическое действие лекарств. Модифицированные гликозаминогликаны могут дать новое поколение лекарственных средств направленного действия.

Литература

1. Vercruysse K.P., Prestwich G.D. // Therapeutic Drug Carrier Systems. 1998. V. IS(S). P. S13 - SSS.

2. Chemistry and Biology of Hyaluronan. H.G. Garg, C.A. Hales (Editors). Elsevier Ltd. 2004.

3. Chemistry and Biology of Heparin and Heparan Sulfate H.G. Garg, R.J. Linhardt and C.A. Hales (Editors). Elsevier Ltd. 200S.

4. ПонеделькинаИ.Ю., ЛукинаE.C., ОдинокоеB.H. Кислые гликозаминогликаны и их химическая модификация //Биоорган. химия. 2008, Т. 34, № 1. С. S -28 (обзор).

5. Понеделькина И.Ю. Органические комплексы тиазиновых и акридиновых красителей с лекарственными препаратами: Дис. ... канд. хим. наук. Уфа, 2000.

6. ИжбульдинРИ. Местная профилактика ранних реокклюзий при выполнении открытой эндартерэк-томии из магистральных артерий: Дис. ... канд. мед. наук. 1998.

7. Ижбульдин Р.И., Понеделькина И.Ю. Комплекс метиленового синего в сосудистой хирургии // Башк. хим. журнал. 2007. Т. 14. С. 131 - 134.

8. Jiang В., Drouet Е., Milas М., Rinaudo М. Study on ТЕМРО-mediated selective oxidation of hyaluronan and effects of salts on the reaction kinetics // Carbohydr. Res. 2000. V. 327. Р. 4SS - 461.

9. Понеделькина И.Ю., Одинокое B.H., Саитга-лина Э.А., Джемилее У.М. Устойчивость in vitro окисленной гиалуроновой кислоты к тестикулярной гиалуронидазе // Доклады АН (Биохимия). 2007. Т. 417. № 4. С. 1 - 3.

10. Понеделькина И.Ю., Одинокое B.H., Вахру-шееа Е.С., Голикоеа М.Т., Халилое Л.М., Джемилее У.М. Модификация гиалуроновой кислоты ароматическими аминокислотами // Биоорган. химия. 200S. Т. 31. № 1. С. 90 - 9S.

11. ПонеделькинаИ.Ю., Одинокое B.H.,ЛукинаЕ.С., Тюмкина Т.В., Халилое Л.М., Джемилее У.М. Химическая модификация гепарина // Биоорган. химия. 2006. Т.32. № S. С. S24 - S29.

12. Понеделькина И.Ю., Одинокое B.H., Лукина Е.С., Джемилее У.М. Конъюгация хондроитин-сульфатов с аминами //Биоорган. химия. 2008. Т. 34. № S. С. 704 - 710.

13. Хайбрахманоеа Э.А. Окисление гликозами-ногликанов в карбоксипроизводные и их конъюгация с аминами: Дис. ... канд. хим. наук. Уфа, 2008.

14. Понеделькина И.Ю., Хасаное А.Г., Куна-фин М. С., Мрих О.В. и др. Способ получения модифицированной гиалуроновой кислоты // Пат. РФ № 2191782 (2002).

15. Понеделькина И.Ю., Одинокое B.H. Лукина Е. С. и др. Способ получения модифицированных гликозаминогликанов, обладающих анальгези-рующими свойствами // Пат. РФ № 2283320 (2006).

16. Лукина Е.С. Конъюгация гликозаминоглика-нов с аминами и карбоновыми кислотами: Дис. . канд. хим. наук. Уфа, 2007.

17. Понеделькина И.Ю., Одинокое B.H., Саит-галина Э.А., Лукина Е.С., Джемилее У.М. Конъюгация 3И-азидо-3И-дезокситимидина с гепарином // Доклады АН. 2008. Т. 419. № 4. С. S12 - S14.