Способ экстракции флавоноидов из растительного сырья
METHOD FOR EXTRACTING FLAVONOIDS FROM PLANT-BASED RAW MATERIALS

Изобретение относится к фармакологии и медицине и может быть использовано для экстракции флавоноидов из растительного сырья с использованием глубоких эвтектических растворителей, которые биодеградируемы, безопасны, стабильны, их производство доступно и легко осуществимо, а эффективность экстракции сопоставима с известными органическими растворителями.
Известен способ экстракции флавоноидов из растительного сырья [А.Ж. Абилхан и др. Экстракция флавоноидов из лабазника вязолистного в условиях микроволнового излучения. XX Международная научно-практическая конференция имени профессора Л.П. Кулева. Теоретические и прикладные аспекты фармации и биотехнологии], согласно которому в качестве растительного сырья используют лабазник вязолистный, который предварительно измельчают и пропускают через сито с диаметром отверстий 0,5 мм, а в качестве экстрагента для извлечения флавоноидов используют водно-спиртовые смеси различной концентрации.
Недостатком способа является относительно низкая безопасность, вызванная применением экстрагента в виде водно-спиртовой смеси.
5
Наиболее близким по технической сущности к предложенному является способ холодной водной экстракции флавоноидов из лекарственного растительного сырья [RU 2453322, C1, A61K 36/00, 20.06.2012], заключающийся в том, что, экстракцию проводят при напряжении электрического поля 5 В и частотой 10 Гц при перемешивании в течение 30-60 мин.
Недостатком способа является относительно низкая эффективность экстракции и относительно высокая сложность, вызванная необходимостью формирования электрического поля.
Известны также способы получения глубоких эвтектических растворителей, обладающих высокой безопасностью применения, например, [Облучинская Е.Д. и др. Глубокие природные эвтектические растворители как альтернативные экстрагенты для извлечения флоротанинов бурых водорослей. Химико-фармацевтический журнал. Том 53, №3, 2019], заключающегося в том, что используют смесь природных компонентов L-молочной кислоты, бетаина, холина хлорида, яблочной кислоты, глюкозы и глицерина, которые смешивают в определенных молярных соотношениях и нагревают до температуры 50°С при постоянном перемешивании до образования прозрачной жидкости в виде конечного продукта.
Задачей, которая решается в изобретении, направлена на разработку способов эффективной экстракции флавоноидов из растительного сырья с использованием глубоких эвтектических растворителей, получаемых из растительного сырья и обладающих безопасностью применения.
Требуемый технический результат заключается в повышении эффективности экстракции флавоноидов из растительного сырья и расширении арсенала технических средств для экстракции флавоноидов из растительного сырья, обеспечивающих безопасность применения конечного продукта.
Поставленная задача решается, а требуемый технический результат достигается тем, что смешивают исходные природные компоненты из сбора растительной композиции, состоящего из травы пустырника сердечного, травы зверобоя продырявленного, травы мелиссы лекарственной и травы тимьяна ползучего в соотношении 4:2,5:2,5:1, которые измельчают до размера частиц 2-3 мм, добавляют 40% раствор эвтектического растворителя, полученного на основе бетаина гидрохлорида и пропиленгликоля в мольном соотношении 1:3, и после смешивания нагревают до 60°С на водяной бане с постоянным помешиванием до образования однородной прозрачной жидкости в виде конечного продукта.
На чертеже представлены:
на фиг. 1 - содержание флавоноидов (мг/г) в экстрактах из растительного сбора на основе 50% (m/m) водных растворов DESs;
на фиг. 2 - выход флавоноидов из растительного материала в зависимости от концентрации DES;
на фиг. 3 - содержание флавоноидов (мг/г) в экстрактах из растительного сбора на основе 40% водного раствора DES-20, полученных при различных температурах.
Для оценки эффективности предложенного глубокого эвтектического растворителя для экстракции флавоноидов из растительного сырья в сопоставлении их экстракции с известными растворителями были проведены соответствующие исследования.
Материалы и методы.
Экстракцию флавоноидов проводили из сбора растительной композиции, состоящей из травы пустырника сердечного (пустырника обыкновенного) (Leonurus cardiaca L.), травы зверобоя продырявленного {Hypericumperforatum L.), травы мелиссы лекарственной {Melissa officinalis L.) и травы тимьяна ползучего (чабреца) (Thymus serpyllum L.) в соотношении 4: 2,5: 2,5: 1, измельченных до размера частиц 2-3 мм. Лекарственные растения были доставлены из Северо-Кавказского филиала Ботанического сада Всероссийского научно-исследовательского института лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР). Данный сбор обладает седативными свойствами благодаря содержанию флавоноидов, основным из которых является рутин, что было доказано валидированными методами.
Холина битартрат (Mw=253,25) и бетаина гидрохлорид (Mw=153,61) получены из Suzhou Vitajoy Biotech Co., Китай, яблочная кислота (Mw=134,1) доставлена из Anhui Sealong Biotechnology, Китай, молочная кислота (Mw=90,08), лимонная кислота (Mw=192,1), щавелевая кислота (Mw=90,04), глюкоза (Mw=180,16), пропиленгликоль (Mw=76,09), глицерин (Mw=92,09) и порошок рутина (>94.0%) предоставлены компанией Sigma Aldrich, Китай, люминия хлорид получен от PanReac AppliChem, спирт этиловый 96% - от ООО «Константа-Фарм М», кислота уксусная ледяная - от компании «АльфаХим».
Для изготовления различных комбинаций глубоких эвтектических растворителей был использован тепловой метод. Компоненты смешивали в определенных мольных соотношениях в стеклянной конической колбе, закрывали пробкой и нагревали при 60°С на водяной бане до образования однородной прозрачной жидкости (60-90 мин), устойчивой и стабильной при комнатной температуре.
В данном эксперименте нами получен 21 глубокий эвтектический растворитель. Их описание и состав приведены в таблице 1. Изготовленные DESs представляют собой вязкие прозрачные жидкости.
Около 2 г (точная навеска) исследуемого сырья помещали в коническую колбу вместимостью 250 мл, прибавляли 30 мл полученного глубокого эвтектического растворителя, колбу закрывали пробкой. Затем колбу нагревали при температуре 60°С в течение 1 ч, содержимое перемешивали с помощью магнитной мешалки. Колбу охлаждали до комнатной температуры, содержимое колбы фильтровали через бумажный складчатый фильтр (синяя лента) для дальнейшего анализа.
Все экстракты на основе DESs были получены в одинаковых условиях: соотношение сырье: экстрагент - 1:15 г/мл, время экстракции - 1 ч., температура экстракции - 60°С. Для первоначального скрининга экспериментальных образцов DESs, представленных в таблице 1, изготовлены их 50% (m/m) водные растворы. Усовершенствование процесса экстрагирования осуществлялось после выбора оптимального DES по параметрам содержания воды в растворе DES (30, 40, 50, 60 и 70%) и температуры экстракции (50, 60, 70, 80°С).
Для оценки суммарного содержания флавоноидов в полученных извлечениях был использован метод дифференциальной спектрофотометрии, основанный на реакции комплексообразования флавоноидов с ионами трехвалентных металлов - Al, Zr, Ga и др., и обладающий большей селективностью по сравнению с прямым спектрофотометрическим методом.
В результате реакции комплексообразования с алюминия хлоридом происходит батохромный сдвиг полосы поглощения флавоноидов с 330-350 нм до 390-410 нм, что позволяет количественно обнаружить искомые действующие вещества по оптической плотности растворов в этой области спектра.
При добавлении 5% раствора хлорида алюминия в 70% этиловом спирте к раствору изучаемого извлечения в его спектре наблюдается максимум поглощения, который совпадает с максимумом поглощения раствора рутина с хлоридом алюминия. Это определило выбор длины волны 410±2 нм как характеристической для количественного определения содержания флавоноидов в полученных с помощью глубоких эвтектических растворителей экстрактах.
Измерения проводились на спектрофотометре Shimadzu UV-1800.
Все эксперименты проводились в трех повторностях. Статистическую обработку осуществляли с использованием программного пакета STATISTICA 8.0 (StatSoft). Статистически значимыми признавались различия при р<0.05.
Для оценки эффективности DESs для извлечения флавоноидов был протестирован 21 глубокий эвтектический растворитель на предмет эффективности экстракции флавоноидов из растительного сбора на основе травы пустырника, травы зверобоя, травы мелиссы и травы чабреца. Эффективность процесса извлечения БАВ изучена в сравнении с экстрактами, полученными на основе 70% спирта этилового, 96% спирта этилового и воды как наиболее часто применяемых экстрагентов для флавоноидов. Вязкость изготовленных DESs снижена их разбавлением 50% воды (m/m). В качестве акцептора протона выступали холина битартрат или бетаина гидрохлорид, в качестве донора - органические кислоты, спирты и сахара.
Данные по извлечению флавоноидов из сбора растительной композиции приведены на фиг. 1 и отображены в таблице 2.
Как видно из графика фиг. 1, способность DES к извлечению флавоноидов зависит от состава конкретного экстрагента. Для DESs, основу которых составлял холина битартрат как акцептор протона, извлекающая способность оказалась в целом ниже, чем для DESs на основе бетаина гидрохлорида. Возможно, это обусловлено особенностью возникновения водородных связей между компонентами DES. Хлорид-анион - более сильный акцептор протонов, чем ион битартрата, Доказано, что флавоноиды конкурируют с донорами протонов в составе DES за образование водородных связей. Чем больше образуется водородных связей в структуре DES, тем большее количество флавоноидов может взаимодействовать с компонентами растворителя и извлекаться из растительного материала. Кроме того, больший размер аниона битартрата по сравнению с хлорид-ионом может способствовать возникновению стерических препятствий к образованию водородных связей.
Важное значение играет и тип донора протонов. Целевые экстрагируемые соединения - флавоноиды, обладающие слабыми кислотными свойствами за счет свободных фенольных гидроксильных групп и поэтому хорошо растворимые в растворах щелочей. DESs, базирующиеся на органических кислотах как донорах протона, имеют более кислую среду и поэтому хуже извлекают флавоноиды, чем DESs, включающие спирты в качестве доноров протонов. Этот эффект доказывает тот факт, что именно DESs на основе полиолов и гликолей (ПЭГ-400, глицерина, пропиленгликоля) обладают наилучшей экстрагирующей способностью. Кроме того, по-видимому, образуемые органическими кислотами водородные связи более устойчивы, и экстрагируемым флавоноидам труднее заместить их в составе растворителя, т.е. энтальпия сольватации полиолов в составе DESs более экзотермична и выгодна для извлечения целевых соединений их растительного материала.
Таким образом, оптимальным экстрагентом для извлечения флавоноидов из растительной композиции является DES-20 на основе бетаина гидрохлорида и пропиленгликоля в мольном соотношении 1:3. С помощью данного экстрагента удалось извлечь 9,48±0,02 мг/г сухого сырья флавоноидов в пересчете на рутин, что составляет 97,7% от количественного содержания флавоноидов в водно-этанольном (70%) экстракте, взятом в качестве стандарта.
Исследован и эффект содержания воды в составе DES на его экстрагирующую способность. Получены DESs на основе бетаина гидрохлорида - пропиленгликоля в мольном соотношении 1:3 (DES-20), содержащие 30,40, 50, 60 и 70% воды (m/m), которые использовали в качестве экстрагентов флавоноидов из растительного сбора. Экстракция осуществлялась при температуре 60°С в течение 1 ч при соотношении сырье: экстрагент 1:15 г/мл.
Выход флавоноидов из растительного материала в зависимости от концентрации DES графически представлен на фиг. 2.
Как следует из анализа графика, с разбавлением DES экстрагирующая способность растворителя сначала увеличивается, что может быть вызвано повышением полярности растворителя, а также уменьшением его вязкости. Это облегчает процесс диффузии согласно уравнению Стокса-Эйнштейна:
где D - коэффициент диффузии, k - постоянная Больцмана, Т -абсолютная температура, η - вязкость среды, R - гидродинамический радиус молекулы.
Однако, после определенного значения дальнейшее увеличение содержания воды приводит к уменьшению выхода флавоноидов из растительного сырья, что можно объяснить разрывом существующих водородных связей и нарушением надмолекулярной структуры DES.
Таким образом, было установлено, что оптимальное содержание воды в DES на основе бетаина гидрохлорида и пропиленгликоля (мольное соотношение 1:3) составляет 60%.
Влияние температуры на процесс экстракции флавоноидов
Чтобы определить оптимальную температуру экстракции, была осуществлена экстракция флавоноидов из сбора растительной композиции при температурах 50, 60, 70 и 80°С. Эффект, оказываемый температурой на извлечение БАВ, представлен на фиг. 3.
Повышение температуры экстракции, с одной стороны, ведет к увеличению скорости диффузии, но, с другой стороны, приводит к разрушению флавоноидов как термолабильных соединений.
Экстракцию флавоноидов из растительного сбора проводили с помощью 40% раствора DES-20 на основе бетаина гидрохлорида - пропиленгликоля (мольное соотношение 1:3) при температурах 50, 60, 70 и 80°С в течение 1 ч. На основании полученных экспериментальных данных было установлено, что оптимальная температура, позволяющая извлечь из сырья и сохранить наибольшее количество флавоноидов, составляет 60°С.
Альтернативную экстракцию флавоноидов проводили из сбора растительной композиции, состоящей из травы пустырника сердечного (пустырника обыкновенного) (Leonurus cardiaca L.), травы зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.), травы мелиссы лекарственной (Melissa officinalis L.) и травы тимьяна ползучего (чабреца) (Thymus serpyllum L.) в соотношении 4: 2,5: 2,5: 1, измельченных до размера частиц 2-3 мм.
Результаты исследований показали, что наилучшим экстрагентом для флавоноидов из сбора растительной композиции, состоящей из травы пустырника, травы зверобоя, травы мелиссы и травы чабреца, оказался DES на основе бетаина гидрохлорида и пропиленгликоля в мольном соотношении 1:3. Оптимизация условий процесса, а именно экстракция 40% раствором DES-20 при температуре 60°С, позволила добиться увеличения выхода флавоноидов из растительного сырья: количественное содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин составило 10,09 мг/г сухого сырья, что превышает выход флавоноидов при классическом методе экстракции 70% этиловым спиртом (9,7 мг/г сухого сырья). Таким образом, можно прийти к заключению, что предложенный экологичный и безопасный способ экстракции БАВ из растительного материала перспективен и может являться достойной альтернативой классическим методам экстракции органическими растворителями.
Предложенный способ обеспечивает повышение эффективности экстракции флавоноидов из растительного сырья и расширении арсенала технических средств для экстракции флавоноидов из растительного сырья, обеспечивающих безопасность применения конечного продукта.