СПОСОБ ОЦЕНКИ ДИНАМИКИ И ПОЛНОТЫ РЕТРАКЦИИ (КОНТРАКЦИИ) КРОВЯНОГО СГУСТКА
METHOD FOR ASSESSING DYNAMICS AND COMPLETE RETRACTION (STABILIZATION) OF BLOOD CLOT

Предлагаемое изобретение относится к области удовлетворения жизненных потребностей человека, может быть использовано в медицине, биологии и ветеринарии для анализа ретракции/контракции (сжатия) кровяного сгустка в образцах крови и диагностики.
Известен [1] способ определения времени ретракции кровяного сгустка, когда небольшую дозу крови помещают в чечевицеобразную кювету, устанавливают в термостат и пропускают через нее (кровь) световой поток, попадающий затем на фотоэлектрический датчик. Время ретракции определяют по начальному отрезку кривой, генерируемой фотоэлектрическим датчиком. Недостатками способа [1] являются недостаточная информативность вследствие того, что анализируется единственный параметр - время ретракции, невоспроизводимость результата диагностики и недостаточная достоверность результата диагностики из-за отсутствия стандартных условий постановки теста, неудовлетворительно большая (≈60 мин) продолжительность процессов свертывания крови и активации тромбоцитов. Недостатки ограничивают область применения способа.
Известен анализатор гемокоагуляции [2]. Цельную кровь помещают в кювету с несмачиваемой поверхностью, благодаря чему в процессе ретракции сгусток отстает от стенок. Сгусток удерживается между дном кюветы и поплавком, сочлененным с измерительным преобразователем; сила сжатия сгустка (контрактильная или сократительная сила тромбоцитов) перемещает поплавок вниз. При перемещении поплавка создается электродвижущая сила, которую регистрируют в виде кривой - ретрактограммы. Недостатками способа [2] являются неудовлетворительно большая продолжительность (≈90 мин) процедуры вследствие отсутствия активации свертывания крови и тромбоцитов, низкая чувствительность анализатора, неудовлетворительная воспроизводимость и достоверность результатов вследствие отсутствия стандартизации условий проведения анализа. Недостатки ограничивают область применения способа [2].
Известен способ [3], когда кровь отбирают в пробирку с 3,8% раствором цитрата натрия, центрифугируют при 800g в течение 5 минут для получения богатой тромбоцитами плазмы, которую рекальцифицируют хлоридом кальция (конечная концентрация 5 мМ) и активируют тромбином (конечная концентрация 1 ЕД./мл). Для предотвращения прилипания сгустка к стенкам пробирки реакционную смесь помещают в силиконированную (с несмачиваемой поверхностью) стеклянную пробирку и инкубируют, например, при плюс 37°C. Через 60 мин не включенную в сгусток жидкую часть образца взвешивают и рассчитывают соотношение между массой сгустка и реакционной смеси. Недостатками способа являются отсутствие учета существенного влияния (роли) участвующих в формировании сгустка и его ретракции эритроцитов и лейкоцитов, а также неудовлетворительная длительность и сложность процедуры определения. Недостатки способа [3] делают результаты его применения малоинформативным и малодостоверным, что существенно ограничивает область применения способа [3].
Наиболее близким к предлагаемому изобретению, по существу прототипом, является способ [4]. Взятие крови производят в пробирки, содержащие 3,2% раствор цитрата натрия. Кровь рекальцифицируют внесением хлорида кальция в конечной концентрации 10 мМ и активируют свертывание тромбином в концентрации 2 ЕД./мл. Для предотвращения прилипания сгустка к стенке образец помещают в силиконированные (с несмачиваемой поверхностью) стеклянные пробирки и наблюдают ретракцию. Ретрагированные сгустки фотографируют через 90 мин для расчета финального результата (в процентах) ретракции.
Недостатками прототипа [4] являются неудовлетворительная длительность процесса определения ретракции по способу и низкая информативность для диагностики в связи с отсутствием критериев оценки динамических характеристик ретракции кровяного сгустка. Это существенно ограничивает область применения прототипа.
Целью заявляемого изобретения является расширение перечня средств диагностики болезней и патологических состояний, повышение воспроизводимости и достоверности результата анализа процесса ретракции кровяного сгустка, сокращение продолжительности процесса исследования, повышение производительности труда аналитика, расширение области применения диагностических средств.
Цели достигают тем, что производят взятие пробы крови пациента в содержащие цитрат натрия емкости, берут двухканальную измерительную кювету, внутреннюю поверхность кюветы ополаскивают детергентом - раствором Тритона Х-100 на хлориде натрия, затем удаляют остатки детергента, в цитратную кровь добавляют хлорид кальция и тромбин, кровь переносят в измерительную кювету, которую помещают в предварительно прогретую термостатируемую камеру, где в автоматическом режиме фоторегистрируют и фиксируют изменение размеров двумерного изображения сгустка крови, по результатам фиксации строят кинетическую кривую (график) зависимости изменения площади S проекции сгустка от времени t, по построенной кривой определяют и оценивают параметры динамики ретракции (контракции) сгустка крови, при этом характеризующие процесс средние значения - конечной степени ретракции сгустка крови здоровых доноров, равное 51,9%; лаг-период, равный 72,6 с; время достижения сгустка  от исходного размера - 344,7 с; время достижения сгустка  от конечного размера - 348,5 с; величину площади под кинетической кривой 785,2 у.е.; среднюю скорость ретракции 0,041 у.е./с принимают за норму, при отклонениях от указанных норм - диагностируют патологическое состояние системы гемостаза пациента. При уменьшении конечной степени ретракции от нормы, увеличении лаг-периода, увеличении времени достижения 1/4 от исходного размера сгустка, увеличении времени достижения 1/2 от конечной степени сжатия сгустка, увеличении площади под кинетической кривой, уменьшении средней скорости ретракции по сравнению с нормой диагностируют патологическое состояние системы гемостаза пациента - высокую вероятность ишемического инсульта и принимают безотлагательные меры медицинской помощи. Частоту замеров и общее время измерения изменяют настройками прибора. Изменение размеров двумерного изображения сгустка крови регистрируют и фиксируют каждые 15 секунд в течение 20 минут. Образование сгустка и активацию тромбоцитов стимулируют добавлением к рекальцифицированной цитратной крови свежеразмороженного раствора тромбина до конечной концентрации 1 ЕД./мл. С использованием кинетической кривой ретракции определяют дополнительные параметры процесса ретракции сгустка крови. С использованием кинетической кривой ретракции определяют конечную степень ретракции сгустка. С использованием кинетической кривой ретракции определяют лаг-период. С использованием кривой ретракции определяют время сжатия сгустка на 1/4 от исходного размера. С использованием кинетической кривой ретракции определяют время достижения 1/2 от конечного сжатия сгустка. С использованием кинетической кривой ретракции определяют площадь под кривой. С использованием кинетической кривой ретракции определяют среднюю скорость ретракции.
Заявляемое изобретение осуществляют, например, следующим путем.
Производят взятие пробы крови пациента в емкости, например в вакуумные пробирки, содержащие 3,2% цитрата натрия, например, фирмы BD Vacutainer (Becton, Dickinson and company, США), в соотношении 9:1 (кровь/цитрат натрия) по объему. Берут измерительную кювету, например, производства компании ГемаКор, Россия. Перед исследованием внутреннюю поверхность кюветы ополаскивают детергентом, например 4%-ным раствором Тритона Х-100 на 150 мМ хлориде натрия с последующим удалением видимых остатков детергента - для предотвращения прилипания сгустка крови к стенкам кюветы. Цитратную кровь (в которую для предохранения от свертывания крови введен цитрат натрия), например, в количестве 400 мкл, переносят в пластиковую пробирку и добавляют 0,4 М хлорида кальция до конечной концентрации 2 мМ и получают рекальцифицированную цитратную кровь. Образование сгустка и активацию тромбоцитов стимулируют добавлением к рекальцифицированной нитратной крови свежеразмороженного раствора тромбина 50 ЕД./мл (например, производства фирмы Sigma, США) до конечной концентрации 1 ЕД./мл, тщательно перемешивают и сразу переносят 80 мкл образца в измерительную кювету. Кювету помещают в предварительно прогретую до плюс 37°C термостатируемую камеру прибора "Регистратор Тромбодинамики" (производства фирмы «ГемаКор», Россия), разработанного для видеорегистрации пространственного свертывания плазмы крови [5] и включают автоматическую фоторегистрацию. Прибор фиксирует изменение во времени размера двумерного изображения сгустка (размера проекции изображения сгустка), например сгустка размером 12×7 мм, через фиксированные промежутки времени, например через каждые 15 с в течение 1200 с (20 мин).
По мере необходимости или для исследовательских целей частоту замеров и общее время измерения изменяют настройками прибора. Например, для диагностики с высокой вероятностью ишемического инсульта оптимальным является наблюдение за характером изменения размера проекции изображения сгустка крови в течение (1200±120) с.
Строят изображенный на Фиг. график (кинетическую кривую КК) зависимости изменения площади S проекции сгустка крови от времени t и рассчитывают параметры процесса, например лаг-период (время, необходимое для уменьшения площади проекции сгустка не более чем на 5% от исходной), продолжительность времени сжатия сгустка на 1/4 от исходного размера, продолжительность времени достижения 1/2 от конечного размера, конечную степень ретракции сгустка в % (величина, отражающая разницу между начальной и конечной площадями проекции сгустка в %), площадь SK под кривой (в условных единицах, далее по тексту у.е.), среднюю скорость ретракции.
На Фиг.: S - площадь проекции сгустка крови; t - время (с), продолжительность времени оценки динамики изменения площади S (в %) проекции сгустка крови; КК - кинетическая кривая; SK - площадь проекции кровяного сгустка в условных единицах (у.е.); 1 - лаг-период; 2 - период времени сжатия сгустка на 1/4 от исходного размера; 3 - период времени сжатия сгустка на 1/2 от конечного размера; 4 - конечная (по истечении 20 мин) степень ретрации кровяного сгустка, % от исходного; 5 - усредненная по результатам исследования множества пациентов и принятая за норму кинетическая кривая (КК) зависимости изменения (во времени) площади S проекции сгустка крови здоровых людей. 6 - кинетическая кривая (КК) контракции кровяного сгустка, отображающая результат действия непрямого антикоогулянта - Варфарина; 7 - кинетическая кривая процесса контракции кровяного сгустка больных в острой фазе ишемического инсульта (ИИ).
На Фиг. видно (кривая 6), что под действием Варфарина КК смещается с существенным (до 20%) увеличением площади SK. Это свидетельствует о полезном действии и оптимальности дозировки препарата Варфарин. Неизменность или несущественное (на ≤5% от принятой за норму показателей принимающих Варфарин пациентов) изменение площади SK свидетельствует о неоптимальности дозировки Варфарина и/или неэффективности его действия. Согласно этой информации, рекомендуется дополнительное обследование, например - анализ чувствительности пациента к данному препарату, изменение дозы применяемого препарата и консультации кардиолога, сосудистого хирурга или гематолога для внесения соответствующих поправок в процесс лечения и повышения его результативности.
На Фиг. показана усредненная (по многим пациентам) кинетическая кривая (7) ретракции кровяного сгустка больных в острой фазе ишемического инсульта через 1200 с от начала исследования (ретракции). Видно, что КК ретракции крови больных ишемическим инсультом лежит существенно выше кинетической кривой 5 результатов процесса ретракции здоровых людей. Кинетическая кривая (КК) ретракции крови здоровых людей ограничивает существенно меньшую площадь SK. Соответственно, КК больных в острой стадии ишемичекого инсульта ограничивает существенно большую (по сравнению со здоровыми людьми) площадь SK (под КК), что показывает снижение степени ретракции (сжатия) сгустка крови (по сравнению с нормой) и отражает механизм патогенеза этого заболевания. Изменение показателей ретракции у больных ишемическим инсультом имеет существенное значение для достоверной диагностики заболевания и прогнозирования результатов лечения. По характеру изменения показателей ретракции кровяного сгустка оперативнее, чем с применением аналогов и прототипа, с высокой достоверностью диагностируют острую стадию ишемичекого инсульта, оказывают неотложную медицинскую помощь, чем ослабляют или предотвращают развитие тяжелых последствий болезни.
Ниже представлены средние значения расчетных параметров, характеризующих ход процесса ретракции, полученных на образцах крови 71 здоровых людей и принятых за норму: 1) конечная степень ретракции сгустка = 51,9% (конечный размер сжимающегося сгустка в % от начального размера сгустка); 2) лаг-период = 72,6 с; 3) время, за которое сгусток сжимается на 1/4 от исходного размера = 344,7 с; 4) время достижения 1/2 от конечного размера сжимающегося сгустка = 348,5 с; 5) площадь под кривой SK = 785,2 у.е.; 6) средняя скорость ретракции = 0,041 у.е./с.
Отклонения от указанных норм свидетельствуют о патологическом состоянии системы гемостаза организма пациента. Поскольку движущей силой ретракции сгустка являются тромбоциты, заявляемый способ используют прежде всего как тест для характеристики их (тромбоцитов) количества и функционального состояния. Снижение (по сравнению с нормой) или отсутствие ретракции сгустка свидетельствует о наличии патологии - возможных заболеваниях пациента: болезни Верльгофа, тромбоцитопении, эритремии, тромбастении Гланцмана и других тромбоцитопатий. Например, при снижении количества тромбоцитов до 110 тыс./мкл наблюдается падение степени ретракции сгустка до 14% (происходит уменьшение размера сгустка на 14% по сравнению с его (сгустка) размером в начале процесса ретракции) при норме 51,9%.
При получении таких патологических (отклоняющихся от нормы) результатов дополнительно проводят развернутый анализа крови с лейкоформулой и консультацией гематолога. Совместное определение кинетики ретракции и проведения анализа крови с лейкоформулой позволяет произвести дифференциальную (уточненную, различительную) диагностику заболеваний системы гемостаза пациента, при которой достоверно устанавливают патологию тромбоцитарного звена.
Помимо тромбоцитов, ретракция сгустка зависит от других компонентов крови, таких как фибриноген, про- и антикоагулянты, комплемент, антитела. Например, оцениваемая по заявляемому способу динамика ретракции кровяного сгустка зависит от активности фактора XIIIa, что позволяет диагностировать врожденные и/или приобретенные нарушения функции фактора XIIIa. Так, при снижении активности фактора XIIIa наблюдают следующие изменения средних параметров: 1) конечная степень ретракции сгустка, характеризуемая величиной S (%), снижается до 33% (в норме 51,9%), 2) время, за которое сгусток сжимается на 1/4 от исходного размера, увеличивается до 753 с (в норме 344,7 с); 3) площадь под кривой увеличивается до 950 у.е. (в норме 785, 2 у.е.); 4) средняя скорость ретракции уменьшается до 0,026 у.е./с (в норме 0,041 у.е./с). В то же время лаг-период и время достижения 1/2 от конечного размера меняются несущественно. При наблюдении описанных изменений ретракции рекомендуется оценка плазменных факторов - количества и активности фактора XIIIa. Таким образом, заявляемый способ в сочетании с измерением активности отдельных плазменных факторов свертывания крови, например - фактора XIIIa, позволяет достоверно выявить различные виды патологии, связанные с функционированием коагуляционного гемостаза.
Кроме того, заявляемый способ позволяет осуществлять контроль терапии (процесса лечения) антикоагулянтами. Например, у принимающих антикоагулянты непрямого действия, например Варфарин, пациентов в сравнении с нормой наблюдается достоверное изменение следующих показателей (указаны средние значения при терапии Варфарином): 1) конечная степень ретракции сгустка снижается до 30% (в норме 51,9%); 2) время, за которое сгусток сжимается на 1/4 от исходного размера, увеличивается до 875 с (в норме 344,7 с); 3) площадь под кривой увеличивается до 960 у.е. (в норме 785,2 у.е.); 4) средняя скорость ретракции уменьшается до 0,024 у.е./с (в норме 0,041 у.е./с). В то же время лаг-период и время достижения 1/2 от конечного размера изменяются несущественно (≤5%). Если изменения показателей ретракции при применении Варфарина не наблюдаются либо не соответствуют указанным, то рекомендуется дополнительное обследование, например анализ чувствительности пациента к данному препарату, изменение концентрации применяемого препарата и консультация кардиолога для внесения соответствующих поправок в процесс лечения и повышения его результативности. Таким образом, заявляемое изобретение способствует повышению достоверности диагностики, выбору оптимального курса лечебного процесса и повышению его (лечебного процесса) результативности.
Предлагаемый способ применим в комплексной диагностике заболеваний, связанных с образованием внутрисосудистых тромбов. Динамика ретракции сгустков крови оказывается информативной в случаях, когда большинство тестов оценки гемостаза нечувствительны (бесполезны для диагностики) и показатели коагулограммы находятся в пределах нормальных значений. Например, при ишемическом инсульте при использовании заявляемого способа наблюдаются отклонения от нормальных значений следующих параметров: 1) конечная степень ретракции сгустка крови уменьшается в пределах 22% (в норме 51,9%); 2) лаг-период увеличивается в пределах 365 с (по сравнению с нормой 72,6 с); 3) время, за которое сгусток сжимается на 1/4 от исходного размера, увеличивается (по сравнению с нормой 344,7 с) в пределах 870 с; 4) время достижения 1/2 от конечной степени сжатия сгустка увеличивается в пределах 710 с (в норме 348,5 с); 5) площадь SK под кривой увеличивается в пределах 1030±103 у.е. (в норме 785,2 у.е.); 6) средняя скорость ретракции уменьшается в пределах 0,021 у.е./с (в норме 0,041 у.е./с). В то же время результаты скрининговых тестов (активированного частичного тромбопластинового времени, протромбинового и тромбинового времени) остаются в пределах нормы. Выявляемое только с применением заявляемого способа отклонение от нормальных показателей у пациентов данной группы свидетельствует о высокой вероятности инсульта и необходимости безотлагательного медицинского вмешательства для предотвращения образования тромба (сгустка) в сосудах головного мозга.
Заявляемый способ показал высокую полезность при осуществлении его (способа) в условиях межрегионального специализированного стационарного медицинского учреждения кардиологического профиля.
Имеющая существенное клиническое значение (высокоинформативная) и выполняемая известными способами оценка процесса ретракции кровяного сгустка не получила распространения в клинико-диагностических лабораториях вследствие отсутствия быстрого, стандартизированного и простого в исполнении методического подхода. По этим причинам выявляемые известными способами показатели степени ретракции сгустка крови разнородны, имеют существенный разброс - до 80%, поэтому несопоставимы и мало пригодны для сравнения. Поэтому этот лабораторный параметр (оценка ретракции сгустка крови, получаемый ранее известными способами) оставался малопригодным для достоверной диагностики патологии, что объясняет его отсутствие в медицинской практике.
Заявляемый способ избавлен от влияния субъективных факторов, например квалификации работника, от уровня его физического и психологического состояния - так как основан на процессах, выполняемых с минимальным и несущественным вмешательством человека (оператора), а именно фотографической фиксации в автоматизированном режиме серии изображений ретрагирующего сгустка (двухмерной проекции сгустка крови) с последующей компьютерной обработкой и расчетом параметров процесса. Полученные результаты избавлены от влияния субъективных факторов, поэтому - объективны. Объективность значений измеренных показателей процесса ретракции кровяного сгустка, безусловно, повышает достоверность результатов обследования, способствует повышению достоверности результатов диагностики заболеваний, повышению результативности лечебного процесса и качества жизни пациентов. Заявляемый способ от прототипа отличается доступностью и простотой осуществления, позволяет быстрее (оперативно, в течение не более 20 мин) оценить динамику процесса ретракции кровяного сгустка, диагностировать патологию и принять безотлагательные меры медицинской помощи для предотвращения необратимых последствий заболевания. В отличие от прототипа, заявляемый способ более информативен, поскольку оценивает динамику ретракции характеризующими ее объективными, с минимальным вмешательством человека, параметрами, причем - определяемыми путем стандартизованного процесса.
Применение предлагаемого способа способствует повышению качества, точности, достоверности и воспроизводимости результата диагностики, существенному (более чем четырехкратному - с 90 до 20 мин) сокращению затрачиваемого на анализ времени, расширению области применения способов и средств оценки ретракции кровяного сгустка, осуществлению текущего контроля результативности процесса лечения и его коррекции, проведению комплексной дифференциальной диагностики, повышению качества лечебной деятельности и качества жизни пациента. Осуществляемая по заявляемому способу оценка ретракции кровяного сгустка избавлена от недостатков предшественников и позволяет ввести в медицинскую практику новый способ, способствующий повышению достоверности диагностики, повышению результативности лечебного процесса. Использованием заявляемого способа существенно повышается производительность труда аналитика и расширяется область применения диагностических средств. Итогом применения заявляемого способа является повышение качества жизни людей.
Предлагаемое изобретение удовлетворяет критериям новизны, так как при определении уровня техники не обнаружено средство, которому присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, перечисленным в формуле изобретения, включая характеристику назначения.
Способ диагностики имеет изобретательский уровень, поскольку не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками данного изобретения, и не установлена известность влияния отличительных признаков на указанный технический результат.
Заявленное техническое решение можно реализовать в промышленном производстве диагностического оборудования, в деятельности организаций здравоохранения, животноводства и науки посредством использования известных стандартных технических устройств и оборудования. Это соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям.
Источники информации
6
1. Авторское свидетельство (а.с.) SU 186625. МПК А61В 10/00. Способ определения времени ретракции кровяного сгустка. Приоритет от 23.04.1962. Опубликовано 01.01.1966. Описание а.с.
5
2. Авторское свидетельство SU 1555669. МПК G01N 33/48. Анализатор гемокоагуляции. Приоритет от 22.06.1987. Опубл. 07.04.1990. Описание а.с.
3. Kasahara K., Souri M., Kaneda М., (et al.). Impaired clot retraction in factor XIII A subunit-deficient mice. Blood. 2010; 115(6): 1277-9.
4. Aleman M.M., Bymes J.R., Wang J.G., (et al.). Factor XIII activity mediates red blood cell retention in venous thrombi. J. Clin. Invest. 2014; 124(8): 3590-600.
5. Soshitova N.P., Karamzin S.S., Balandina A.N., (et al.). Predicting prothrombotic tendencies in sepsis using spatial clot growth dynamics. Blood Coagul Fibrinolysis. 2012; 23(6): 498-9.