Способ подтверждения аутентичности вареных колбасных изделий
BOILED SAUSAGE PRODUCTS AUTHENTICITY CONFIRMATION METHOD

Заявляемое техническое решение относится к области контроля качества вареных колбасных изделий по их протеомному профилю. Техническое решение может использоваться в пищевой и перерабатывающей промышленности, а также в системе технического контроля в научных, производственных, учебных и сертификационных лабораториях.
Известен способ идентификации белков в протеомных исследованиях с помощью технологии масс-спектрометрии MALDI TOF MS (Claydon, A.J., Grundy Н.Н., Charlton A.J., Romero M.R. Identification of novel peptides for horse meat speciation in highly processed foodstuffs // Food Add. Cont. Part A - Chem. Anal. Contr. Expos. Risk Assessm. 2015, 32(10): 1718-1729). Способ основан на идентификации белков и пептидов при получении одномерных электрофореграмм
Недостатком способа является подавление большинства анализируемых белков с потерей функциональной активности в следствии применения денатурирующих агентов, таких как додецил сульфат натрия или мочевины, которые используются при фракционировании белков методом одномерного электорофореза. В результате чего снижается достоверность аутентичности вареных колбасных изделий.
Известен метод двумерного электрофореза по О'Фарреллу для изучения белков скелетных мышц свиней и коров (Saisekhar Y., Reddy P.M. Use of Troponin for Species Identification of Cattle and Buffalo Meats // J. Food Sci. Technol., 1995, vol. 32, no. 1, pp. 68-70). Метод основан на получении общего профиля всех белков. Однако данными методами невозможно идентифицировать аутентичность белкового продукта по общему пулу белков происхождения.
Известен метод целенаправленного изучения белков теплового шока в мышцах свиней и коров методом двумерного электрофореза. Метод основан на определении постоянной и индуцибельной изоформе Hsp70 в скелетных мышцах свиней, (Van Laack R.L., Faustman С., Sebranek J.G.. Pork quality and the expression of stress protein Hsp70 in swine // J. Anim. Sci. 1993. Vol. 71. P. 2958-2964). Недостатком указанного способа является невозможность полной аутентичной идентификации по одному маркерному белку сложного белкового объекта, подвергнутого тепловой обработке.
Известен метод определения протеома длиннейшей мышцы спины свиней (m. longissimus lumborum) (Terlouw С.Pig Longissimus lumborum proteome: Part II: Relationships between protein content and meat quality // Meat Sci. 2008. Vol. 80(4). P. 982-996), суммарно включавший 220 белковых фракций. Метод основан на получении общего профиля всех белков и позволяет устанавливать существование тендерных различий в белковых профилях и давать оценку изменения белкового состава, оказывающего влияние на качество мяса. Однако данный метод не позволяет осуществлять однозначную идентификацию гомогенной смеси субстратов на основе животного сырья, подвергнутой тепловой обработке.
Известны также методы видовой идентификации мяса и мясной продукции методами жидкостной хроматографии, масс-спектроскопии, ИФА, ПЦР, в том числе, идентификация тканеспецифичных белков соединительной ткани комплексным методом, объединяющим пептидный фингерпринт и жидкостную хроматографию. Эти методы устанавливают ряд видоспецифичных белков, сохраняющихся в конечных мясных продуктах (пептиды HSP27, H-FABP, АТФ-синтаза, субъединица 1-цитохромного bc-комплекса), что дает возможность использования указанных белков в качестве потенциальных биомаркеров. Недостатком данных способов является перекрестная совпадающая идентификация разных филогенетических видов сырья, по достаточно узкому набору выявленных биомаркеров, что делает невозможным однозначную видоспецифическую идентификацию.
Е. REED с соавторами (США) в качестве маркера иммунного статуса предлагают сравнительный анализ фрагмента 5 килодальтон (kDa) комплемента С4 анафилотоксина (С4А) опытного и контрольного образцов животных тканей, при этом в качестве маркерных также предлагаются Аполипопротеин А1 и/или терминальный фрагмент альфа-1-анти-химотрипсина С (AACT) (United States Patent Application №2017 0030928 A1). Недостатком предлагаемого решения представляется ограниченность возможностей измерения - способ пригоден только для исследований нативных тканей-биоптатов.
Наиболее близким по совокупности существенных признаков к заявляемому способу техническим решением, принимаемым за прототип является способ идентификации меченых белков (Пат. US 20050233399 А1). В данном способе используются аффинно-меченые реакционно-способные реагенты, которые позволяют селективно выделять пептидные фрагменты или продукты реакции с данным белком (например, продуктами ферментативной реакции) из сложных смесей). При этом методе фрагмент белка одного или нескольких скелетных меченых белков или аффинно-меченых фрагментов белка секвенируют с помощью тандемной масс-спектрометрии для идентификации белка или фрагмента белка. Недостатками прототипа являются получение ложного результата вследствие перекрестного наложения белков, высокая стоимость и трудоемкость метода.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое техническое решение, является способ подтверждения аутентичности вареных колбасных изделий, обеспечивающий высокую достоверность аутентификации, применимость для выявления фальсификации вареных колбасных изделий, снижение трудоемкости и стоимости исследований.
Решение данной задачи, с достижением указанного технического результата обеспечивается тем, что из полиакриламидного геля извлекаются маркерные белки, с последующей масс-спектрометрической идентификацией, на: Тропомиозин альфа 1 (свинина), Тропомиозин альфа 1 (говядина), Миозиновая легкая цепь (говядина), Белок подобный легкой цепи миозина 3 (свинина), фосфорилируемые легкие цепи миозина MLC1f (свинина), фосфорилируемые легкие цепи миозина MYL1 (говядина), Мышечная енолаза (свинина), Мышечная енолаза (говядина), М-цепь креатинфосфокиназы (свинина), М-цепь креатинфосфокиназы (говядина), Фруктозобисфосфат альдолаза А (свинина) Гомолог говядины, Фруктозобисфосфат альдолаза А (говядина), Глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа (свинина), Глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа (говядина), Миоглобин (свинина), Миоглобин (говядина); полученная двумерная электрофореграмма геля сравнивается с двумерной электрофореграммой геля эталонного образца.
Выбор маркерных белков Тропомиозин альфа 1 (свинина), Тропомиозин альфа 1 (говядина), Миозиновая легкая цепь (говядина), Белок подобный легкой цепи миозина 3 (свинина), фосфорилируемые легкие цепи миозина MKC1f (свинина), фосфорилируемые легкие цепи миозина MYL1 (говядина), Мышечная енолаза (свинина), Мышечная енолаза (говядина), М-цепь креатинфосфокиназы (свинина), М-цепь креатинфосфокиназы (говядина), Фруктозобисфосфат альдолаза А (свинина) Гомолог говядины, Фруктозобисфосфат альдолаза А (говядина), Глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа (свинина), Глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа (говядина), Миоглобин (свинина), Миоглобин (говядина) объясняется их стабильностью в технологии приготовления вареных колбасных изделий. Использование иного состава маркерных белков, согласно научным исследованиям, не обеспечивало достижение технического результата, прежде в обеспечении точности аутентификации.
Заявляемый способ подтверждения аутентичности вареных колбасных изделий по их протеомному профилю иллюстрируется схемой определения аутентичности вареных колбасных изделий на фиг. 1. Вареное колбасное изделие подвергают двумерному электрофорезу в полиакриламидном геле. Извлекаются маркерные белки с последующей масс-спектрометрической идентификациейя, с использованием например автоматической системы распознавания белков по международной автоматической базе данных. Идентификация осуществляется в отношении следующих маркерных белков: Тропомиозин альфа 1 (свинина), Тропомиозин альфа 1 (говядина), Миозиновая легкая цепь (говядина), Белок подобный легкой цепи миозина 3 (свинина), фосфорилируемые легкие цепи миозина MLC1f (свинина), фосфорилируемые легкие цепи миозина MYL1 (говядина), Мышечная енолаза (свинина), Мышечная енолаза (говядина), М-цепь креатинфосфокиназы (свинина), М-цепь креатинфосфокиназы (говядина), Фруктозобисфосфат альдолаза А (свинина) Гомолог говядины, Фруктозобисфосфат альдолаза А (говядина), Глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа (свинина), Глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа (говядина), Миоглобин (свинина), Миоглобин (говядина). Затем двумерная электрофореграмма геля исследуемого образца сравнивается с эталонной электрофореграммой геля вареного колбасного изделия.
На Фиг. 2. (а, б, в) демонстрируется подтверждение применимости выбранного метода для подтверждения аутентичности вареных колбасных изделий по протеомному профилю. Так на двумерной электрофореграмме (а) образца колбасы вареной подтверждается присутствие только свинины и говядины в соответствии с рецептурой; на 2-ДЭ (б и в) обнаруживаются также не заявленные компоненты - немышечные белки (соевые) и белок курицы, что отмечено пунктирными прямоугольниками. При этом, присутствие дополнительных белков дает менее интенсивное окрашивание других белков в маркерной группе, означающее весомое количество не заявленных белков в образце при неизменном общем содержании белка в пробе.