Сравнительная оценка изолированного и сочетанного действия доксорубицина и озона на жизнеспособность нормальных и злокачественных клеток печени

К.Н. Конторщикова, А.В. Алясова, Т.А. Мищенко, М.В. Ведунова, Е.С. Макарова

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ИЗОЛИРОВАННОГО И СОЧЕТАННОГО ДЕЙСТВИЯ ДОКСОРУБИЦИНА И ОЗОНА НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ НОРМАЛЬНЫХ И ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ

Нижегородская государственная медицинская академия, Нижний Новгород, Россия

В эксперименте изучалось влияние химиопрепарата доксорубицина и озона на жизнеспособность нормальных Chang liver (Ch.l.) и злокачественных SK-HEP-1 клеток печени в культуре. Установлено сходное повышение свободнорадикального окисления при действии озона и доксорубицина как изолированно, так и в сочетании. Показано, что наибольшей цитотоксичностью обладает доксорубицин в отношении как нормальных, так и злокачественных клеток. Озон как изолированно, так и в комбинации с доксорубицином также проявлял выраженную цитотоксичность. Кислород, напротив, повышал показатель жизнеспособности анализируемых клеток, но в сочетании с доксорубицином также подавлял ферментативную активность.

Ключевые слова: культуры клеток, доксорубицин, озон, выживаемость

An experimental work was done to study the influence of doxorubicin and oxidants (oxygen and ozone) on viability of cultural normal Chang liver (Ch.l.) cells and malignant SK -HEP-1 cells. It found similar increase in free radical oxidation in normal and malignant cells of the liver as in the action of ozone and doxorubicin. Doxorubicin was shown to have the highest cytotoxicity, both for normal and malignant cells. Ozone was found to produce marked cytotoxicity when used isolated and in combination with doxorubicin. Oxygen, on the contrary, improved the viability index of the analyzed cells, though in combination with doxorubicin it inhibited enzymatic activity. The received results make it possible to adjust the ozone dose and the route of its administration in various tumor localizations.

Key words: cell culture, doxorubicin, ozone, viability

Введение. В более ранних исследованиях в эксперименте на животных при оценке патоморфоза злокачественной опухоли определены дозы доксорубицина и озона [1]. В то же время механизмы действия этих факторов непосредственно на злокачественные клетки неизвестны. Целью данной работы явилось изучение влияния доксорубицина и озона на показатели жизнеспособности злокачественных клеток печени.

Материалы и методы. В работе использовались две культуры клеток: злокачественные и для сравнения нормальные. 1/. культивированные клетки нормальной печени человека Chang liver (Ch.l.), культивирование осуществлялось в среде Игла МЕМ с солями Эрла (ПанЭко) с добавлением 10% сыворотки эмбриональной телячьей (ПанЭко), оптимальная плотность 0,5 -1,0 х 105 клеток/мл; 2/. культивированные клетки аденокарциномы печени человека SK-HEP-1, морфология: эпителиоподобная, культивирование осуществлялось в среде Игла МЕМ с солями Эрла (ПанЭко) с добавлением 10% сыворотки эмбриональной телячьей (ПанЭко) и 1% заменимых аминокислот (ПанЭко), оптимальная плотность 2,0 -4,0 х 106 клеток/см2. Поддержание жизнеспособности культур проводилось в СО2-инкубаторе, при 5% содержании СО2. Эксперимент проводился на 3-5 пассаже. Клетки рассаживали на 48-ми или 6-ти луночные планшеты. При достижении 60% монослоя проводили замену культуральной среды, на которых клетки выращивались на испытуемые (далее обозначаются как а, б, в, г, д). Среда а готовилась добавлением химиопрепарата доксорубицина в дозе 0,004 мг. Среда б - введение 150 мл кислорода; среда в - введение 150 мл озоно-кислородной смеси с концентрацией озона 25 мг/л,

среда г - сочетанное введение 150 мл кислорода и доксорубицина 0,004 мг; среда д - введение озоно-кислородной смеси и доксорубицина 0,004 мг. Среды б и г явились контролем, для сред в и д, поскольку вводится озоно-кислодная смесь. Озоно-кислородная газовая смесь поступала со скоростью 1 л/мин в течение 5 минут из генератора озона Квазар (Нижний Новгород). Через 48 часов культивирования клеточная среда убиралась, клетки промывались полифосфатным буфером PBS (pH=7,4) и заливались 250 мл смеси Версен (0,02%) : трипсин (0,25%) (3:1). Через 10 минут инкубации в СО2-инкубаторе клетки пипетировали и добавляли в каждую лунку по 250 мл 8% формальдегида. После этого подсчитывали количество клеток на автоматическом анализаторе Septer (Millipore).

Одним из важнейших эффектов озона является влияние его на про- и антиоксидантный баланс клеток (Конторщикова К.Н., Перетягин С.П., 2006), что непосредственным образом определяет их жизнеспособность. В связи с этим был проведен анализ свободно-радикального окисления клеточной суспензии. Для этого ее трижды промывали забуференным физиологическим раствором и замораживали при -20 градусов. Интенсивность свободнорадикального окисления измеряли по показателям индуцированной хемилюминесценции (ХЛ) на аппарате БХЛ-07 (Нижний Новгород): Imax - максимальная интенсивность свечения, S - cветосумма хемилюминесценции за 30 секунд, S/Imax, tg (-2 альфа) - относительные показатели, характеризующие общую антиоксидантную систему защиты (Кузьмина Е.И., 1983).

Проверка на жизнеспособность основана на восстановлении клетками солей тетразолия МТТ (Sigma,США) [3]. В основе метода лежит реакция восстановления желтой соли тетразолия (бромида-3 -(4,5 -диметилтиазол-2-ил-2,5 -дифенилтетразолий)) оксидоредуктазами живых клеток до пурпурных кристаллов формазана [2]. Клеточная среда убиралась, клетки промывались раствором PBS (рН=7,4) в каждую ячейку вносили по 300 мкл раствора МТТ бромида (концентрация 0,25 мг/мл в PBS (рН=7,4)). Инкубировали в условиях СО2-инкубатора в течение 30 минут. Далее раствор МТТ удаляли и клетки заливали для разрушения клеточных мембран изопропанолом-2. Через 10 минут измеряли оптическую плотность (А) при 570 и 620 нм. За контроль принимали изменение оптической плотности интактных культур.

Полученные результаты были статистически обработаны с помощью пакета прикладных программ Biostat и представлены в виде М±о, где М -среднее, g - среднее квадратичное отклонение. Коэффициенты достоверности рассчитывались по критерию Стьюдента (t).

Результаты. При анализе свободнорадикального окисления четко продемонстированы более значимые исходные показатели ХЛ в нормальных клетах печени по сравнению со злокачественными в 1,5 - 2 раза (табл. 1 и табл. 2). Особенно отличаются показатели, характеризующие антиоксидантную систему защиты (почти в 2 раза). Введение в культуральную среду кислорода практически не изменяло состояние свободнорадикального окисления, что проявлялось в неизменности параметров ХЛ.

Введение озоно-кислородной смеси статистически значимо повышало уровень показателей Imax в 1,4 раза и S в 2 раза. Увеличение параметра tg указывало на снижение антиоксидантной защиты. Сходным образом изменялись показатели ХЛ и при введении доксорубицина, хотя причина активации свободнорадикального окисления, естественно была связана с интоксикацией, а не с введением окислителей. Комбинированное введение доксорубицина и кислорода практически не изменяло измеряемые показатели, характерные для доксорубицина. Сочетание доксорубицина и озона вызывало значимо выраженное повышение уровня Imax (в 1,9 раза) и tg (в 1,8 раза), что свидетельсвовало о снижении антиоксидантной защиты.

В злокачественных клетках также имело место свободнорадикальное окисление, но уровень интенсивности был в среднем в 2 раза ниже, чем в нормальных клетках печени (табл. 2). При контакте клеток с доксорубицином проявилась выраженная цитотоксичность в отношении как нормальных клеток печени (показатель жизнеспособности 3,5%), так злокачественных (показатель жизнеспособности 1,56%). При анализе действия окислителей выявлены прямо противоположные эффекты на жизнеспособность клеток кислорода и озона.

Обработка культуральной среды кислородом повышала ферментативную активность как нормальных (до 104%), так и злокачественных (до 115%).

Таблица 1. Показатели хемилюминесценции в культуре клеток нормальной печени человека _Chang liver (Ch.l.)_

Факторы Imax S S/Imax tg

Интактные 251,6 ± 15,7 584,7 ± 71,4 2,31± 0,61 -150,7± 25,3

а. доксорубицин 364,7 ± 39,8* 1187,3 ± 89,3* 3,25± 0,42 -171,69±31,8

б. кислород 284,6± 31,8 685,9 ± 51,9 2,54± 0,51 -130,9± 21,7

в. озон 346,4 ± 48,4* 1119,8 ± 82,7* 3,23 ± 0,82 -173,1± 31,6

г. доксорубицин +кислород 337,7 ± 45,2* 1112,8 ± 90,9* 3,0 ± 0, 55 -166,1 ± 34,9

д. доксорубицин + озон 456,4 ± 43,1* 1074 ± 89,1* 3,01± 0,56 -272,3± 45,7*

* - различия статистически значимы по сравнению с интактными клетками

Таблица 2. Показатели хемилюминесценции культуры злокачественных клеток человека SK-

HEP-1

Факторы Imax S S/Imax tg

Интактные 128,6 ± 11,7 338,7 ± 21,4 2,63± 0,31 -72,8± 21,1

а. доксорубицин 336,4 ± 21,8* 867,6 ± 49,3* 2,57± 0,42 -184,6±21,8*

б. кислород 143,6± 26,8 386,9 ± 51,1 2,08± 0,51 -77,7± 11,7

в. озон 327,4 ± 43,4* 843,8 ± 62,1* 2,57 ± 0,62 -178,1± 21,6*

г. доксорубицин +кислород 245,3 ± 55,2* 676,8 ± 56,1* 2,75± 0, 55 -135,6 ± 34,1*

д. доксорубицин + озон 289,6± 23,9* 683,1± 61,2* 2,35± 0,56 -172,3± 25,7*

* - различия статистически значимы по сравнению с интактными клетками

Это свидетельствовало о том, что кислород не изменял состав среды для клеточной культуры, что не мешало им расти. Напротив, дополнительный кислород по принципу обратной связи активировал оксидоредуктазы. Введение в культуральную среду озоно-кислородной смеси вызывало активацию свободнорадикального окисления в клетках и образование продуктов взаимодействия озона с биоорганическими соединениями (озониды). Эти продукты, по всей видимости, повреждали клеточные мембраны, что проявлялось снижением показателей жизнеспособности (4,54% - для нормальных клеток и 16,5% - для злокачественных клеток печени). Количественные различия нормальных и злокачественных клеток можно объяснить обнаруженной нами более высоким уровнем антиоксидантной защиты в злокачественных клетках. Сочетанное влияние доксорубицина и кислорода показало, что более выраженное действие характерно для нормальных клеток, чем для злокачественных с их высокой антиоксидантной защитой. Сочетание доксорубицина и озона сопровождалось снижением жизнеспособности как нормальных клеток до 7,9%, так и злокачественных до 2,6%. Отличие этих показателей от тех, что получено при действии изолированного введения доксорубицина и

окислителей связано, по всей видимости, с взаимодействием этих факторов между собой и компонентами клеток, в том числе и с антиоксидантами.

Таблица 3. Показатели жизнеспособности нормальных и злокачественных клеток печени человека при воздействии окислителей и доксорубицина

Фактор воздействия Нормальные клетки печени Злокачественные клетки печени

Кислород 103,2 ±9,7 % 112±17,3%

Озон 4,54±2,7 % 15,7±5,0 %

Доксорубицин 3,6 ± 2,3 % 1,56±0,9%

Доксорубицин + кислород 4,6 ±1,4% 16,5±3,2%

Доксорубицин + озон 7,9±3,2% 2,6±1,8%

Интактные клетки 100±6,4% 100 ±7,9%

Вывод. Учитывая, что эффект озона сопоставим с действием доксорубицина на клетки, можно подбирать способы введения озона в зависимости от локализации опухоли (парентерально или непосредственно в опухоль).

Список литературы:

1. Алясова А.В., Конторщикова К.Н., Терентьев И.Г., Иванова И.П., Кузнецов С.С., Сазанов А.И. Влияние низких терапевтических концентраций озонированного физиологического раствора на терапевтический патоморфоз опухоли в эксперименте // Современные технологии в медицине. 2010. №4. С. 27-31.

2. Аникина Л.В., Пухов С.А.,Добровская Е.С., Афанасьева С.В.,Клочков С.Г. Сравнительное определение жизнеспособности клеток с помощью ММТ и ресазурина //Фундаментальные исследования. 2014. N12-7. С.1423-1427.

3. Кузьмина Е.И., Нелюбин А.С., Щенникова М.К. Применение индуцированной ХЛ для оценок свободно-радикальных реакций в биологических субстратах // Биохимия и биофизика микробиологов. - 1983. - С. 41-48.

4. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxity assays // J. Immunol. Methods. 1983. Vol. 65. P. 55-63.