СПОСОБ ОЦЕНКИ СТЕПЕНИ ПОВРЕЖДЕНИЯ ПОЧЕЧНОЙ ПАРЕНХИМЫ У ДЕТЕЙ С ПУЗЫРНО-МОЧЕТОЧНИКОВЫМ РЕФЛЮКСОМ
METHOD FOR DETERMINATION OF DEGREE OF RENAL PARENCHYMA DAMAGE IN CHILDREN WITH VESICOURETERIC REFLUX

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может быть использовано в урологии и нефрологии.
В настоящее время остается открытым вопрос, касающийся, прежде всего, малоинвазивных методов диагностики степени нефросклероза у детей с пузырно-мочеточниковым рефлюксом (ПМР).
Относительно диагностики склеротических изменений в почках на фоне рефлюкса, арсенал методов невелик. Причем каждый из методов имеет свои недостатки, которые необходимо учитывать особенно для пациентов младшей возрастной группы.
Хорошо известен способ экскреторной урографии, основанный на рентгенологической оценке состояния функционирующей паренхимы, однако чувствительность этого метода очень низка в оценке степени нефросклероза. Метод не позволяет объективно оценить морфофункциональное состояние почечной паренхимы. Кроме того, данный метод является инвазивным, а аллергические и токсические реакции на введение йодсодержащих препаратов ограничивают использование этого способа [Roth K., Koo Н., Spottswood S., Chan J. Obstructive uropathy: an important cause of chronic renal failure in children / K.Roth, Н.Koo, S.Spottswood, J. Chan // Clin. Pediatr. - 2002. - Vol.41(5). - P.309-314]. В исследовании Захаркиной Е.В. показано, что при использовании различных по осмолярности рентгеноконтрастных средств имеется их существенное влияние на тубулярный эпителий, которое сопровождается повышением выделения мембраносвязанных ферментов (N-ацетил-β-D-глюкозаминидазы) [Захаркина Е.В. Влияние рентгеноконтрастных препаратов на функцию почек при пиелонефрите у детей / Е.В.Захаркина // Педиатрия. - 2008. - Т.87, №4. - С.27-31].
Благодаря своей относительной безопасности, быстроте проведения, экономичности, высокой точности ультразвуковое исследование (УЗИ) широко используется у детей для выявления структуры и размеров паренхимы и собирательной системы почек [Becker A.M. Postnatal evaluation of infants with an abnormal antenatal renal sonogram / A.M.Becker // Current Opinion in Pediatrics. - 2009. - Vol.21. - P.207-213]. Однако УЗИ позволяет улавливать склеротические изменения в почках, когда они достаточно выражены [Gallo F., Schenone M., Giberti С. Ureteropelvic Junction Obstruction: Which Is the Best Treatment Today? / F.Gallo, M.Schenone, C.Giberti // J. Laparoendoscopic advanced surgical techniques. - 2009. - Vol.19 (5). - P.657-662]. Кроме того, данный метод не позволяет определить степень вовлечения паренхимы в склеротический процесс.
Радиоизотопные методы диагностики позволяют определить степень и объем функционирующей паренхимы по индексу интегрального захвата радиофармпрепарата [Хворостов И.Н., Зоркин С.Н., Смирнов И.Е. Тактика лечения пузырно-мочеточникового рефлюкса у детей // Бюллетень Волгоградского научного центра РАМН 4/2009; Фомин Д.К. Диагностика обструктивных уропатий у детей методами ядерной медицины: Автореф. дис. докт. мед. наук. - M., 2008. - 44 с.]. Недостатками данного способа является инвазивность, высокая степень лучевого повреждения других органов, а также дороговизна использования изотопного оборудования. Кроме того, для детей младшей возрастной группы требуется анестезиологическое пособие. Все это ограничивает использование данного способа для диагностики рубцовых изменений в почке.
Метод чрескожной пункционной биопсии почечной паренхимы с последующим гистологическим исследованием биоптата позволяет увидеть разрастание коллагеновых волокон в интерстиции. Отрицательным моментом этого способа является, прежде всего, инвазивность, сложность, высокая опасность травматизации, осложнения, отсутствие точного выбора участка ткани, а также невозможность оценить степень повреждения почечной паренхимы. Этими недостатками и определяется ограниченность этого метода в диагностике склеротических изменений в почке.
Наиболее близким к предлагаемому способу является способ определения повреждения почечной паренхимы путем исследования микроальбуминурии. Микроальбуминурия - уровень альбумина в моче 30-300 мг/сут, который не определяется при помощи классических методов исследования. По имеющимся литературным данным, сведения относительно определения уровня повреждения нефрона по наличию альбумина в моче неоднозначны. Ряд авторов установили, что уровень альбумина в пределах 30-300 мг/сут является ранним и доступным маркером повреждения проксимальных канальцев, и сделали заключение: выявление микроальбуминурии позволяет диагностировать ранние стадии нефросклероза, которые не определяются другими доступными методами [Herget-Rosental S., Poppen D., et al. Prognostic Value of tabular Proteinuria and Enzymuria in nNonoliguric Acute Tubular Necrosis / S. Herget-Rosental, D. Poppen, et al. // Clin. Chem. - 2004. - Vol. 50. - P.552-558]. Необходимо отметить, что альбумин - среднемолекулярный белок (молекулярная масса - 66 кДа). Появление его в моче свидетельствует о повреждении прежде всего клубочков почек. Повреждение клубочков развивается как компенсаторный механизм в ответ на гибель значительного количества нефронов. Гиперфильтрация оставшихся клубочков ведет к появлению диагностически значимого уровня данного белка в моче. Таким образом, микроальбуминурия указывает на выраженное повреждение паренхимы почек и появляется на поздних этапах склеротического процесса. Представленные данные других авторов показали высокую чувствительность теста на определение уровня микроальбуминурии 19,1 мг/л и более для диагностики РН как основного маркера фиброза [Махачев Б.М., Корсунский А.А и соавт. Клиническое значение определения белков в моче для ранней диагностики рефлюкс-нефропатии у детей // «Нефрология и диализ». - 2005. - Т.7, №1. - С.88-93]. Следует отметить, что при ретроградном токе мочи первичным является повреждение дистальных канальцев с последующим вовлечением клубочкового аппарата, что свидетельствует о появлении микроальбуминурии лишь при грубых изменениях в почечной паренхиме. Также необходимо заметить, что микроальбуминурия возможна и при отсутствии патологического процесса в почках. Так, ее появление может быть обусловлено потреблением большого количества белка либо физическими нагрузками. В ходе другого исследования было установлено, что уровень микроальбуминурии 15,1±0,23 мг/л/24 часа характерен для пациентов с ПМР, но без нефросклероза, тогда как при наличии признаков РН этот уровень находился в пределах 31,7±0,62 мг/л/24 [Зорин И.В., Вялкова А.А. Параметры микроальбуминурии у пациентов с ПМР и рефлюкс-нефропатией // Материалы Международной школы и научно-практической конференции по детской нефрологии «Актуальные проблемы детской нефрологии». - Оренбург. - 2010. - С.301-302]. Остается нерешенным вопрос о том, как оценивать уровень микроальбуминурии, находящийся в интервале от 14,87 мг/л/24 до 32,32 мг/л/24. Проанализировав работы по определению мочевой экскреции альбумина, остается неясным тот уровень альбумина, начиная с которого можно говорить о признаках нефросклероза. Также определение мочевой экскреции альбумина не позволяет оценить степень повреждения почечной паренхимы. Отсутствуют данные относительно корреляционной связи степени повреждения почечной паренхимы по уровню микроальбуминурии и степени рефлюкса. Кроме того, ряд исследователей доказали, что определение микроальбуминурии не позволяет выделить ее в качестве раннего маркера РН [Konda R., Sato H., Sakai K. et al. Urinary excretion of vascular endothelial growth factor is increased in children with reflux nephropathy / R.Konda, H.Sato, K.Sakai, et al. // Nephron Clin. Pract. - 2004. - Vol.98 (3). - P.73-8].
Таким образом, сведения относительно мочевой экскреции альбумина, претендующего на рассмотрение его в качестве раннего маркера повреждения почечной паренхимы, неоднозначны. Кроме того, исследуемая фракция белка в моче не позволяет оценить степень повреждения паренхимы почек. Отсутствуют данные, касающиеся определения корреляционной связи между степенью ретроградного заброса мочи и выраженностью тубулоинтерстициального повреждения.
Задачей данного изобретения является разработка неинвазивного, точного, простого способа диагностики степени повреждения почечной паренхимы у детей с ПМР.
В результате проведенного нами исследования впервые было выполнено количественное определение в моче π-глутатион-s-трансферазы (π-GST) у практически здоровых детей и количественное определение в моче π-GST у пациентов с различной степенью рефлюкса, а также на основании полученных данных выделено 3 степени повреждения почечной паренхимы.
π-GST - многофункциональное семейство ферментов глютатион-S-трансферазы, которое играет существенную роль в катализе канцерогенов, липидов, продуктов оксидативного стресса, генотоксических метаболитов путем конъюгации и нейтрализации их электрофильных участков SH-группой глютатиона. В результате каталитической реакции образуются водорастворимые компоненты с их последующей элиминацией из клетки. Такая детоксикация играет важную роль в обеспечении резистентности клеток к перекисному окислению липидов, алкилированию белков, π-GST является индикатором повреждения дистальных канальцев в ответ на действие различных факторов. Данный фактор вырабатывается в ответ на минимальную гипоксию, которая может формироваться в результате различных патологических состояний [McMahon, Blaithin A. Urinary glutathione S-transferases in the pathogenesis and diagnostic evaluation of acute kidney injury following cardiac surgery: a critical review / McMahon, A.Blaithin // Current Opinion in Critical Care. - 2010. - Vol.16 (6). - P.550-555].
В основе нашего исследования положен анализ уровня мочевой экскреции π-GST у 63 детей с различными степенями ПМР. Средний возраст больных составил 2,6±2,5 лет. Группу контроля составили 20 практически здоровых детей без патологии мочевыделительной системы.
Констатация пузырно-мочеточникового рефлюкса производилась на основании данных ультразвукового исследования почек и мочевого пузыря до и после микции с доплерографией сосудов почек. Скрининговым методом диагностики патологического заброса мочи считали микционную цистоуретрографию. Градация рефлюкса по степеням проводилось в соответствии с международной 5-й степенной классификацией рефлюкса (1966 г.). Для оценки функции почек применялась экскреторная урография. С четырех лет для оценки функции почек использовался метод динамической нефросцинтиграфии с определением скорости клубочковой фильтрации. При выявлении вторичного характера рефлюкса план обследования дополнялся исследованием уродинамики при помощи урофлоуметрии и цистометрии.
Всем пациентам для оценки степени выраженности склеротических процессов проводилось исследование π-GST методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью тест-систем «ARGUTUS MEDICAL» (Ирландия, Дублин) на иммуноферментном анализаторе Stat Fax 2010 (Stat Fax США). Забор мочи производился до начала лечения. Образцы мочи центрифугировали при 5000 об/мин в течение 15 минут, а надосадочную жидкость замораживали и хранили при температуре - 18 градусов Цельсия до проведения анализа. Аналогично было проведено замораживание образцов мочи контрольной группы.
Статистический анализ результатов обследования и лечения пациентов проведен с использованием пакета прикладных программ Statistica 8.0 for Windows корпорации StatSoft-Russia (2009).
Проанализировав результаты исследования, нами впервые были определены значения π-GST у практически здоровых детей, а также в зависимости от степени повреждения почечной паренхимы ее значения у пациентов с рефлюксом. У практически здоровых детей показатели π-GST были следующими: М=0,48 мкг/л, SD=0,25. Значения колебались в пределах от 0,01 до 0,86 мкг/л.
Таблицы отражают уровень π-GST в моче у пациентов с 1, 2 и 3 степенями повреждения почечной паренхимы.
Как видно из таблицы 1, уровень π-GST в моче у детей с 1 степенью повреждения почечной паренхимы был значительно повышен по отношению к группе контроля (контроль - М=0,48 мкг/л, SD=0,25; до лечения М=2,13 мкг/л, SD=1,21, p<0,002). Уровень π-GST в моче у детей со 2 степенью повреждения почечной паренхимы до лечения рефлюкса был достоверно выше по сравнению с контрольной группой (контроль - М=0,48 мкг/л, SD=0,25; исходно М=8,45 мкг/л, SD=11,22, p<0,0001). Показатели π-GST в моче у детей с 3 степенью повреждения почечной паренхимы до лечения были достоверно выше по сравнению с группой контроля (контроль - М=0,48 мкг/л, SD=0,25; до операции М=34,28 мкг/л, SD=16,92, p<0,002).
Из таблицы 2 видно, что исходные показатели π-GST у пациентов со 2 степенью повреждения почечной паренхимы были достоверно выше показателей π-GST у пациентов с 1 степенью и достигали максимальных значений у детей с 3 степенью повреждения паренхимы.
Проанализировав полученные нами результаты, было отмечено, что в группе пациентов с 1 степенью повреждения почечной паренхимы преобладала II степень рефлюкса, в группе пациентов со 2 степенью повреждения почечной паренхимы - III степень рефлюкса, в группе пациентов с 3 степенью повреждения почечной паренхимы - IV степень рефлюкса.
Полученные данные могут быть включены в алгоритм обследования пациентов с ПМР для объективной оценки степени повреждения почечной паренхимы с помощью неинвазивного и простого метода, что чрезвычайно важно для педиатрической практики.
Клинические примеры
12
9
9
1. Каплун Вика, 3 лет 2 месяцев, поступила в детское урологическое отделение с диагнозом: Врожденный порок развития мочевыделительной системы. Двусторонний пузырно-мочеточниковый рефлюкс II степени. Хронический обструктивный пиелонефрит, неактивная фаза. Из анамнеза: в течение года двукратные обострения пиелонефрита. Исходные клинико-лабораторные данные: OAK: эритроциты - 4,79×10/л, гемоглобин - 114 г/л, гематокрит - 32,1, лейкоциты 7,1×10/л, палочкоядерные - 5%, сегментоядерные - 57%, эозинофилы - 1%, лимфоциты - 30%, моноциты - 7%, тромбоциты - 287×10/л, ЛИИ=0,05, ИЯС=0,09, ЛИ=0,48, ИИР=4,4; биохимический анализ крови: общий белок - 82 г/л, альбумино-глобулиновый коэффициент - 0,97; ОАМ: реакция - кислая, плотность = 1012, эритроциты 0 в поле зрения, лейкоциты 2-3 в поле зрения, белок отрицательный. Уровень мочевой экскреции маркеров повреждения почечной паренхимы: π-GST - 2,3 мкг/л. При выполнении микционной цистоуретрографии выявлен двусторонний пассивный и активный рефлюкс с обеих сторон II степени. По данным УЗИ почек и мочевого пузыря размеры почки слева 60 мм × 26,0 мм, паренхима - 13 мм, размеры лоханки - 4,5 мм; справа размеры почки 59 мм × 27 мм, паренхима - 13 мм, размеры лоханки - 5,9 мм. По данным доплерометрического исследования сосудов почек - гемодинамически значимых нарушений нет. По данным экскреторной урографии - выведение контраста своевременно с обеих сторон.
Несмотря на отсутствие косвенных признаков склеротического процесса в почечной паренхиме по данным стандартного комплекса обследования пациента с ПМР, отмечалось повышение уровня π-GST, что отражает повреждение почечной паренхимы уже при небольшой степени рефлюкса и соответствует 1 степени повреждения почечной паренхимы.
12
9
9
2. Коротенко Екатерина, 7 мес, поступила в детское урологическое отделение с диагнозом: Врожденный порок развития мочевыделительной системы. Двусторонний активный и пассивный пузырно-мочеточниковый рефлюкс III степени. Хронический обструктивный пиелонефрит, неактивная фаза. Фоновая патология: лимфатико-гипопластический диатез. Рахит II, подострое течение. Сопутствующая патология: полидефицитная анемия легкой степени. Исходные клинико-лабораторные данные: OAK: эритроциты - 3,9×10/л, гемоглобин - 95 г/л, гематокрит - 38,9, лейкоциты 7,3×10/л, палочкоядерные - 1%, сегментоядерные - 27%, эозинофилы - 0%, лимфоциты - 67%, моноциты - 2%, тромбоциты - 254×10/л, ЛИИ=0,2, ИЯС=0,04, ЛИ=3,3, ИИР=35; биохимический анализ крови: общий белок - 62,2 г/л, альбумино-глобулиновый коэффициент - 0,97; ОАМ: реакция - слабокислая, плотность=1015, эритроциты 0 в поле зрения, лейкоциты 1-2 в поле зрения, белок отрицательный. Уровень мочевой экскреции маркеров повреждения почечной паренхимы: π-GST - 12,1 мкг/л. При выполнении микционной цистоуретрографии выявлен двусторонний пассивный и активный рефлюкс с обеих сторон III степени с расширением дистального отдела мочеточника справа до 0,8 мм, слева до 0,5 мм. По данным УЗИ почек и мочевого пузыря размеры почки слева 55,9 мм × 26,0 мм, паренхима - 9,6 мм, размеры лоханки - 2,3 мм × 2,4 мм; справа размеры почки 54,4 мм × 25,2 мм, паренхима - 9,3 мм, размеры лоханки - 5,7 мм × 6,2 мм. По данным доплерометрического исследования сосудов почек - гемодинамически значимых нарушений нет. По данным экскреторной урографии - выведение контраста замедлено с обеих сторон.
Несмотря на значимую степень рефлюкса, изменений со стороны УЗИ почек с доплерографическим исследованием сосудов почек зарегистрировано не было. Замедление эвакуации контраста не позволяет говорить о степени повреждения почечной паренхимы. Уровень π-GST в моче значительно повышен по сравнению с его показателями у практически здоровых детей и пациентов с 1 степенью повреждения почечной паренхимы.
12
9
9
3. Амонс Наталья, 5 лет 5 месяцев, поступила в детское урологическое отделение с диагнозом: Врожденный порок развития мочевыводящей системы. Удвоение левой почки. Пузырно-мочеточниковый рефлюкс IV степени в нижний сегмент слева. Состояние после эндоскопической коррекции рефлюкса в нижний сегмент левой почки биостабильным препаратом. Хронический обструктивный пиелонефрит в стадии ремиссии. Исходные клинико-лабораторные данные: OAK: эритроциты - 3,95×10/л, гемоглобин - 112 г/л, гематокрит - 32,6, лейкоциты 4,1×l0/л, палочкоядерные - 2%, сегментоядерные - 39%, эозинофилы - 1%, лимфоциты - 53%, моноциты - 2%, тромбоциты - 232×10/л, ЛИИ=0,38, ИЯC=0,05, ЛИ=1,3, ИИР=10,8; биохимический анализ крови: общий белок - 72,3 г/л, альбумино-глобулиновый коэффициент - 0,95; ОАМ: реакция - кислая, плотность=1015, эритроциты 0 в поле зрения, лейкоциты 0-1 в поле зрения, белок отрицательный. Уровень мочевой экскреции маркеров повреждения почечной паренхимы: π-GST - 28,36 мкг/л. При выполнении микционной цистоуретрографии выявлен пассивный и активный рефлюкс в нижний сегмент левой удвоенной почки IV степени. По данным УЗИ почек и мочевого пузыря размеры почки слева 102 мм × 43,0 мм, паренхима- 12,1 мм, размеры верхней лоханки до микции - 6,9 мм × 9,1 мм, после - 4,0 мм × 3,4 мм; размеры нижней лоханки до микции - 8,1 мм × 10,9 мм, после - 7,7 мм × 10,6 мм; справа размеры почки 76 мм × 29,7 мм, паренхима - 11,3 мм, размеры лоханки - 5,1 мм × 4,1 мм. По данным доплерометрического исследования сосудов почек - гемодинамически значимых нарушений нет. По данным динамической нефросцинтиграфии - выведение радиофармпрепарата замедлено слева. Выполнена операция на пузырно-мочеточниковом сегменте в объеме реимплантации слева по методике Коэна.
Из приведенного примера видно, что изменений со стороны УЗИ почек с доплерографическим исследованием сосудов почек зарегистрировано не было. Замедление эвакуации радиофармпрепарата не позволяет говорить о степени повреждения почечной паренхимы. Уровень π-GST в моче значительно повышен по сравнению с его показателями у практически здоровых детей и пациентов с 1 и 2 степенями повреждения почечной паренхимы и соответствует 3 степени повреждения паренхимы почек.
Таким образом, как видно из описания способа и приведенных примеров, предлагаемый способ обладает рядом преимуществ, такие как неинвазивность, простота, точность. Нами впервые были определены значения π-GST у практически здоровых детей, которые колебались в пределах от 0,01 до 0,86 мкг/л. Впервые дана оценка степени повреждения почечной паренхимы у детей с рефлюксом различной степени. Установлена корреляция степени повреждения почечной паренхимы и степени рефлюкса. Полученные нами сведения позволяют выявить изменения в почечной паренхиме даже при минимальной степени рефлюкса. Кроме того, эти данные позволят объективно оценить проводимое лечение, улучшить результаты лечения детей с данной патологией и предотвратить формирование почечной недостаточности в раннем детском возрасте, а уточнение механизмов инициации нефросклероза даст возможность открыть новые направления и перспективы в лечении больных с врожденными анатомическими и функциональными нарушениями мочевыводящих путей.
Таблица 1
Уровень π-GST в моче у пациентов с различными степенями повреждения почечной паренхимы
Показатель
Группа контроля (n=20)
1 степень (n=20)
2 степень (n=23)
3 степень (n=20)
М
SD
М
SD
p-level
М
SD
p-level
М
SD
p-level
π-GST µg/L
0,48
0,25
2,31
1,20
0,002
8,45
11,22
0,0001
34,28
16,92
0,002
Таблица 2
Сравнительный анализ π-GST в моче у пациентов с различными степенями повреждения почечной паренхимы
Показатель
1 степень (n=20)
2 степень (n=23)
3 степень (n=20)
М
SD
М
SD
p*-level
М
SD
р*-level
p**-level
π-GST, µg/L
2,31
1,20
8,45
11,22
0,001
34,28
16,92
0,002
0,002
Примечание:
М - среднее;
SD - среднеквадратичное стандартное отклонение, указывающее на разброс данных по интервалу значения признака относительно среднего;
p-level - уровень достоверности (критерий Вилкоксона) различий по отношению к показателям контрольной группы;
p*-level - уровень достоверности (критерий Вилкоксона) различий по отношению к показателям 1 группы;
p**-level - уровень достоверности (критерий Вилкоксона) различий по отношению к показателям 2 группы.