СПОСОБ ИММУНОТЕРАПИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА
METHOD OF IMMUNOTHERAPY MALIGNANT TUMORS OF BRAIN

Изобретение относится к медицине, а именно к способам лечения онкологических заболеваний, и может быть использовано в иммунотерапии злокачественных внутримозговых опухолей головного мозга.
Существует два подхода к иммунотерапии злокачественных опухолей -неспецифическая и антиген-специфическая иммунотерапия.
В рамках первого подхода наиболее широко в настоящее время используются цитокины при лечении опухолей различной локализации. Так, известен способ лечения полипов желудка (патент РФ №2111007, МПК А61К 38/20, опубл. 20.05.1998 г.), в котором используют иммунокорригирующую терапию с помощью лейкинферона, который вводят в подслизистый слой желудка, сочетая местное лечение лейкинфероном с введением его в прямую кишку.
Однако полипы желудка относятся к доброкачественным заболеваниям, и местное введение лейкинферона в данном способе было направлено на усиление лейкоцитарно-макрофагальной инфильтрации в области роста полипа, что может приводить к нарушению его кровоснабжения или к развитию неспецифических иммунных реакций, блокирующих дальнейший рост доброкачественной опухоли. При злокачественных опухолях такой подход может оказаться неэффективным, поскольку не позволяет индуцировать специфический противоопухолевый иммунный ответ.
В рамках второго подхода известен способ лечения опухолей головного мозга (патент РФ №2192263, МПК А61К 35/14, опубл. 10.11.2002 г.), заключающийся в генерации ex vivo дендритных клеток из моноцитов периферической крови в присутствии ростовых факторов и последующей процедуры электрокорпорации внутрь клеток для доставки антигенного материала, приготовленного из фрагментов опухоли пациента. Полученные таким образом дендритные клетки вводят подкожно, дополнительно проводят иммуномодуляцию, используя активированные с помощью фитогемагглютинина лимфоциты больного.
Данный подход позволяет стабилизировать состояние больного по шкале социальной адаптации Карновского и достичь 5-месячного периода, свободного от прогрессии опухоли. Однако при этом способе не в полном объеме задействуются существующие в организме механизмы противоопухолевой защиты.
Известен способ, при котором используется комбинированный подход, сочетающий в себе элементы неспецифической и антиген-специфической иммунотерапии (патент РФ №2197985, МПК А61К 38/20, 10.02.2003 г.). В этом случае послеоперационная локорегиональная (в ложе удаленной опухоли) иммунотерапия аутологичными лимфокин-активированными киллерными клетками (ЛАК-клетками) в сочетании с интерлейкином-2 человека (ИЛ-2) комбинируется с введением цитотоксических лимфоцитов, стимулированных опухолевым антигеном в присутствии ИЛ-2, после чего проводится курс иммунотерапии аутологичными иммуностимулирующими факторами.
Однако при этом способе для генерации цитотоксических лимфоцитов не используются «профессиональные» антиген-презентирующие клетки (дендритные клетки), и отсутствуют доказательства индукции эффективного противоопухолевого специфического иммунного ответа, за счет чего достигается улучшение качества жизни и увеличение продолжительности безрецедивного периода у больных с внутримозговыми опухолями.
Наиболее близким к предлагаемому подходу является способ иммунотерапии злокачественных опухолей головного мозга (патент РФ №2262941, МПК А61К 35/16, опубл. 27.10.2005). Способ характеризуется тем, что после удаления злокачественной опухоли головного мозга последовательно проводят курсы: цитокинотерапии, включающей в себя 3 внутримышечные инъекции лейкинферона с интервалом 48 ч, адаптивной иммунотерапии ЛАК-клетками, генерированными в присутствии ИЛ-2. При этом ЛАК-клетки вводят в ложе удаленной опухоли в комбинации с ИЛ-2 в виде 2 процедур с интервалом 24 ч. Затем проводят курс адоптивной иммунотерапии цитотоксическими лимфоцитами (ЦТЛ), генерированными путем культивирования мононуклеарных клеток периферической крови больного с дендритными клетками, предварительно нагруженными опухолевым антигеном, в присутствии рекомбинантного ИЛ-2. Курс состоит из двукратного введения полученных таким образом клеток с интервалом 48 ч в ложе удаленной опухоли в комбинации с ИЛ-2.
У данного метода несмотря на доказанную его эффективность имеются недостатки.
Во-первых, для заготовки ЛАК-клеток и дендритных клеток требуется дооперационная гемоэксфузия в объеме ~300 мл для приготовления лейковзвеси, что у больных в тяжелом состоянии может дополнительно усугубить течение заболевания.
Во-вторых, большинство пациентов на этапе предшествующем хирургическому лечению и непосредственно после операции получают большие дозы синтетических глюкокортикостероидов (ГКС) в дозе от 16 до 32 мг/сут, что необходимо для снятия перифокального отека и нивелирования неврологического дефицита. Одним из побочных действий ГКС является иммуносупрессия (подавление иммунитета), что снижает эффективность проводимой иммунотерапии.
В-третьих, для осуществления локорегионального введения ЛАК-клеток требуется установка катетера в ложе удаленной опухоли, что может приводить к таким явлениям как ликворея с развитием послеоперационных осложнений в виде менингита, энцефалита или вентрикулита, которые представляют потенциальный риск для жизни больного.
В-четвертых, сам протокол указанного вида комбинированной терапии достаточно сложен в техническом исполнении.
В-пятых, для получения антигенного материала необходим фрагмент удаленной во время операции опухоли, что не позволяет проводить терапию больным, прооперированным на других клинических базах или пациентам с рецидивом, которым хирургическое лечение не проводится в силу противопоказаний.
Задача (технический результат) заявляемого изобретения: создать способ лечения злокачественных опухолей головного мозга, свободный от вышеописанных недостатков.
Поставленная задача решается тем, что в способе иммунотерапии злокачественных опухолей головного мозга, включающем проведение курса вакцинотерапии дендритными клетками, нагруженными опухолевым антигеном в виде подкожных инъекций в сочетании с подкожными инъекциями ИЛ-2, согласно предлагаемому изобретению нагружение дендритных клеток осуществляют пулированными опухолевыми антигенами (0,1 мг/мл) во время часовой инкубации при 37°C, при этом пулированный опухолевый антиген для нагрузки дендритных клеток получают из фрагментов аллогенных опухолей пациентов с аналогичным гистологическим вариантом опухоли, удаленной во время нейрохирургического вмешательства, для чего суспензию выделенных опухолевых клеток подвергают 5-кратному замораживанию/ размораживанию, затем опухолевый материал центрифугируют, надосадок собирают и определяют концентрацию антигенного материала (в мг/мл по белку); нагружение дендритных клеток осуществляют в присутствии азоксимер бромида; затем ДК криоконсервируют до последующего использования.
Использование аллогенного опухолевого материала позволяет усилить иммуногенность вакцины, поскольку аллоантигены являются дополнительным активационным сигналом, что подтверждается усилением реакции трансплантат против опухоли при проведении аллогенных трансплантаций костного мозга у пациентов с гематологическими опухолями (Boeck S., Hamann M., Pihusch V., Heller Т., Diem Н., Rolf В., Pihusch R., Kolb H.J., Pihusch M. (2006). Kinetics of dendritic cell chimerism and T cell chimerism in allogeneic stem cell recipients. Bone Marrow Transplantation, Vol. 37, No. 1,, pp. 57-64 и Chan G.W., Gorgun G., Miller K.B., Foss F.M. (2003). Persistence of host dendritic cells after transplantation is associated with graft-versus-host disease. Biology of Blood and Marrow Transplantation, Vol. 9, No. 3, pp. 170-176). Кроме того, использование аллогенного источника опухолевых антигенов делает иммунотерапию более доступной, менее затратной и уменьшает количество инвазивных процедур.
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.
Генерируют дендритные клетки из прилипающей фракции мононуклеарных клеток периферической крови в присутствии индукторов дифференцировки рекомбинантного интерферона альфа человека (IFNα) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF). Из фрагментов аллогенных опухолей пациентов с аналогичным гистологическим вариантом опухоли, удаленной во время нейрохирургического вмешательства, выделяют опухолевые клетки. Суспензию выделенных опухолевых клеток подвергают 5-кратнму замораживанию/размораживанию. Опухолевый материал центрифугируют, надосадок собирают и определяют концентрацию антигенного материала (в мг/мл по белку). Далее дендритные клетки нагружают в течение 1 ч пулированным опухолевым антигеном (0,1 мг/мл) при 37°C, в присутствии азоксимер бромида (2 нг/мл). Дендритные клетки криоконсервируют до последующего использования. Курс вакцинотерапии полученными дендритными клетками проводят в виде подкожных вакцинаций в сочетании с подкожными инъекциями ИЛ-2 в качестве адъюванта в межлопаточную область.
Пример конкретного выполнения.
6
°
2
Дендритные клетки генерируют согласно методике, описанной Delia BS и соавт., с некоторыми модификациями (Delia BS, Nicola S, Riva A, Biasin M, Clerici M, Villa ML: Functional repertoire of dendritic cells generated in granulocyte macrophage-colony stimulating factor and interferon-alpha. J Leukoc Biol. 2004, 75: 106-116. 10.1189/jlb.0403154). Для генерации дендритных клеток (ДК) в стерильный флакон, содержащий раствор гепарина (из расчета 50 Ед/мл), забирают 200 мл венозной крови больного, отстаивают в термостате при 37°C в течение 40 мин. Собранную лейковзвесь собирают в отдельный флакон, центрифугируют при 1500 об/мин 7 мин. Осажденные клетки лейковзвеси разводят фосфат-забуференным физиологическим раствором, наслаивают на градиент плотности фиколла-верографина (р=1,076) и центрифугируют в течение 20 мин при 3000 об/мин. Собранные из интерфазы мононуклеарные клетки (МНК) двукратно отмывают фосфат-забуференным физиологическим раствором и однократно в культуральной среде RPMI-1640, дополненной 0,3 мг/мл L-глютамина, 5 мМ HEPES-буфера, 100 мкг/мл гентамицина. Выделенные МНК в концентрации 3×10 клеток/мл инкубируют в полной культуральной среде, дополненной 1% аутоплазмы. Затем неприлипшую фракцию удаляют, а оставшиеся клетки инкубируют в полной культуральной среде в присутствии GM-CSF (Sigma-Aldrich, 40нг/мл), IFNα (Роферон-А, Roche, Швейцария 1000 Ед/мл) и 2,5% сыворотки крови плодов коровы (БиолоТ, Санкт-Петербург) в течение 3 суток при 37C в CO-инкубаторе
6
Сгенерированные ДК нагружают (пульсируют) пулированными опухолевыми антигенами (0,1 мг/мл) в течение 1 ч при 37°C. Нагруженные антигеном ДК индуцируют к созреванию путем 24-часового культивирования с азоксимер бромидом (Полиоксидоний, НПО ПетроваксФарм, Москва) в дозе 2 нг/мл. После дозревания клетки отмывают, аликвотируют по 5×10 /пробирку, криоконсервируют в растворе, содержащем 10% DMSO и 90% альбумина, и хранят в морозильной камере (SanyoUltraLow) при -80°C до последующего использования. Общее время получения ДК, нагруженных аллогенными пулированными опухолевыми антигеном, составляет таким образом 4 суток. Антигенный материал для нагрузки дендритных клеток, получают из фрагментов аллогенных опухолей пациентов с аналогичным гистологическим вариантом опухоли, удаленной во время нейрохирургического вмешательства. Суспензию выделенных опухолевых клеток подвергают 5-кратному замораживанию/размораживанию (соответственно, в жидком азоте и при 37°C), затем опухолевый материал центрифугируют, надосадок собирают и определяют концентрацию антигенного материала (в мг/мл по белку). Полученный раствор опухолевых антигенов хранят в замороженном виде.
+
-
+
+
+
+
Качество ДК вакцин оценивают по чистоте генерируемых ДК с учетом экспрессии линейных маркеров, HLA-DR и CD86 методом проточной цитофлюориметрии. Для этого ДК инкубируют с анти-HLA-DR и анти-СБ86 мАТ (BD Bioscience, США) и исследуют на анализаторе FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с использованием программы CellQuest (Becton Dickinson, США). Полученные ДК содержат не менее 70% HLA-DR, Lin (CD3, CD20, CD56) клеток, среди которых доля CD86 составляет 50% и более. Стерильность и жизнеспособность (на основе окрашивания препаратов трипановым синим) оценивают перед каждым введением клеток. Жизнеспособность размороженных ДК составляет во всех случаях более 85%.
6
После нейрохирургического вмешательства и удаления опухолевого субстрата больному проводят курс антигенспецифической терапии из 4-6 подкожных инъекций ДК (5×10 клеток), нагруженных пулированными опухолевыми антигенами с 2-недельным интервалом (общей продолжительностью до 3 мес).
В качестве адъюванта используют рекомбинантный интерлейкин 2 (Ронколейкин, ООО НПК «Биотех» Санкт-Петербург), который вводят подкожно в дозе 250000 ЕД. Вакцинацию проводят подкожно в межлопаточную область в 4 точки, интерлейкин-2 вводят аналогичным образом в 4 точки рядом с местом введения вакцины.
Данный способ лечения злокачественных внутримозговых опухолей головного мозга был проверен в клинических условиях на базе нейрохирургического отделения НИИ травматологии и ортопедии им Я.Л. Цивьяна МЗ РФ, г. Новосибирск и на базе Клиники Иммунопатологии Института фундаментальной и клинической иммунологии (НИИФКИ). Предложенным способом было пролечено 15 больных (10 мужчин и 5 женщин в возрасте от 20 до 65 лет) с гистологически верифицированным диагнозом анапластической астроцитомы и глиобластомы. Всем больным было проведено оперативное лечение - была выполнена максимально возможная резекция опухоли, которая осуществлялась в пределах визуально определяемых границ. После краниотомии в проекции опухоли под увеличением от ×5 до ×10 патологический опухолевый субстрат удаляли с использованием микрохирургической техники и ультразвукового аспиратора. Затем осуществляли тщательный гемостаз и производили пластику твердой мозговой оболочки аллотрансплантатом. В послеоперационном периоде проводилась иммунотерапия в соответствии с разработанным способом. Курсовое лечение по разработанному протоколу было хорошо переносимым и не сопровождалось развитием каких-либо побочных или токсических реакций.
3
+
Оценку противоопухолевого иммунного ответа проводили перед началом курса вакцинаций и по окончании лечения. Интенсивность антигенспецифического клеточного ответа оценивали in vitro в 5-суточных культурах по уровню пролиферации МНК (пролиферативный тест) больных в ответ на стимуляцию пулированным опухолевым антигеном (0,1 мг/мл) Неспецифический ответ оценивали в 3-суточных культурах по уровню пролиферации МНК в ответ на стимуляцию конканавалином А (15 мкг/мл; Sigma, USA). Пролиферативный ответ оценивали радиометрически по включению Н тимидина, вносимого в лунки за 18 ч до конца культивирования в дозе 1 мккю/лунку. А также проводили определение специфического клеточного иммунного ответа на опухолевые антигены в тесте дегрануляции CD8 клеток в процессе проведения вакцинаций.
+
Известно, что после вакцинации активируются специфические CD8 клетки. Эти клетки содержат лизосомальные гранулы с цитолитическими белками. Если у больных в ходе лечения возрастает ответ на опухолевые антигены в пролиферативном тесте и повышается количество специфических цитотоксических (CD8, CD107a) клеток, то целесообразно назначить повторный курс вакцинации по той же методике.
Таким образом, использование предложенного способа позволяет эффективно индуцировать противоопухолевый иммунный ответ у больных со злокачественными опухолями головного мозга.
Клинический пример, поясняющий данный способ лечения злокачественных опухолей головного мозга.
Больная Ч., 63 года, ИБ №101573, находилась в клинике нейрохирургии с диагнозом: Продолженный рост глиобластомы (Grade IV) левой височной доли. Состояние после комбинированного лечения глиобластомы (Grade IV) левой височной доли: микрохирургическое удаление объемного образования левой височной доли от 28.09.15 г., 15 курсов химиотерапии темозоломидом от 2016 г.
Поступила в клинику нейрохирургии №1 НИИТО 11.01.2017 с жалобами на снижение памяти, нарушение речи и письма, умеренные головные боли. Анамнез заболевания: Считает себя больной с 14 сентября 2015 г., когда у больной случился эпизод резкого подъема давления, появился шум в ушах, головокружение и головные боли. 16 сентября 2015 г. приступ повторился, пациентка была госпитализирована в неврологическое отделение по месту жительства. При обследовании на МРТ было выявлено объемное внутримозговое образование левой височной доли. В неврологическом статусе интактна. 28.09.15 г., выполнено оперативное лечение: микрохирургическое удаление объемного образования левой височной доли под нейронавигационным контролем. Заключение гистологического исследования - глиобластома (Grade IV). Была выписана из стационара в удовлетворительном состоянии с оценкой по шкале Карновского 90 баллов. На протяжении 2015 г. - 2016 г. прошла 15 курсов химиотерапии темозоломидом. С середины декабря 2016 г. стала чувствовать ухудшение состояния, снижение памяти, головные боли, речевые нарушения. Выполнено МРТ исследование головного мозга, на котором обнаружен рецидив внутримозговой опухоли левой височной доли. В неврологическом статусе без неврологического дефицита. 12.01.2017 на базе НИИТО выполнена реоперация: микрохирургическое удаление объемного образования левой височной доли с применением нейрофизиологического мониторинга. Заключение гистологического заключения - глиобластома (Grade IV). Была выписана из стационара в удовлетворительном состоянии с оценкой по шкале Карновского 80 баллов.
После нейрохирургического вмешательства больной проведена иммунотерапия по предложенному способу. 12.01.2017 проведена гемоэксфузия в объеме 300 мл крови для генерации ДК-клеток.
6
20.01.2017 проведена повторная гемоэксфузия в объеме 300 мл крови для генерации ДК. На 4 сутки ДК нагружены пулированным антигеном (лизат клеток опухоли), полученным из фрагментов аллогенных опухолей пациентов с аналогичным гистологическим вариантом опухоли и криоконсервированных до востребования. Курс вакцинотерапии в виде подкожных инъекций дендритных клеток (10×10), ИЛ-2 (Ронколейкин по 250000 ЕД) начат 14.03.2017 г. Проведено 6 вакцинаций с интервалом в 2 недели (14.03; 28.03; 11.04; 25.04; 10.05 и 24.05.2017 г.).
АГ
АГ
Исходный уровень антигенспецифического противоопухолевого иммунного ответа в пролиферативном тесте определяли перед началом курса вакцинаций и после 3-х инъекций. До начала терапии Индекс стимуляции антигена (ИВ) составлял 1,2 расч.ед. После 3-х подкожных вакцинаций у больной появился специфический противоопухолевый иммунный ответ, который регистрировался по увеличению пролиферативного ответа мононуклеаров пациентки на опухолевый антиген. 23.03.2017, накануне выписки больной из стационара, индекс антигенной стимуляции (ИВ) составлял 2,5 расч.ед.
После повторной операции до мая 2017 года состояние пациентки стабильное, без нарастания неврологического дефицита. Больная находится под диспансерным наблюдением, данных за рецидив нет. Отмечается регресс общемозговой симптоматики в виде уменьшения частоты головных болей. Общая продолжительность жизни составила 20 месяцев, при медиане больных с глиобластомой 15 месяцев. Оценка по шкале Карновского - 80 баллов.
Исходя из вышеизложенного, можно прийти к выводу, что данный метод используемой сочетанной иммунотерапии, состоящий из локорегионального введения и вакцинотерапии дендритными клетками, позволяет эффективно индуцировать специфический противоопухолевый иммунный ответ у пациентов со злокачественными опухолями головного мозга, что сопровождается улучшением качества жизни больных, увеличением продолжительности общего и безрецедивного периодов жизни.