СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ КАНЦЕРОГЕННОГО ДЕЙСТВИЯ МЕТИЛНИТРОЗОМОЧЕВИНЫ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ
METHOD OF PREVENTING CANCEROGENIC ACTION OF METHYLNITROSOUREA IN EXPERIMENTAL ANIMALS

Изобретение относится к профилактической медицине, экспериментальной онкологии, фармакологии, патологической физиологии и служит обоснованием для исследования возможности применения соединений из группы пищевых полифенолов при профилактике онкологической патологии в группах риска возникновения злокачественных новообразований.
На основании сопоставления результатов эпидемиологических, лабораторных и клинических исследований выявлено снижение риска возникновения многих хронических заболеваний неинфекционной природы, включая некоторые виды онкологической патологии с дефицитом в пищевом рационе макро- и микронутриентов, а также минорных биологически активных компонентов.
На сегодняшний день разработано и нашло широкое практическое применение большое число биологически активных добавок к пище, содержащих природные биоактивные соединения. В последнее время все больше научных фактов свидетельствует в пользу необходимости обогащения пищевого рациона биофлавоноидами, изотиацианатами (т.н. фитохемопротекторами). Одним из наиболее перспективных классов биологически активных компонентов пищи являются различные средства полифенольной структуры. Оценка роли отдельных соединений данной структуры в предупреждении возникновения различных неоплазий, включая РМЖ, является предметом активного исследования и дебатов. Фенольные соединения проявляли антиканцерогенный эффект у животных на различных моделях экспериментального канцерогенеза (Inano Н., 2002; Huang АС, 2008). В опытах in vitro в культуре раковых клеток человека показано, что ряд фитохемопротекторов запускают в этих клетках процесс самоуничтожения, что позволяет предположить способность приостанавливать неконтролируемый рост злокачественных клеток (Kampa М., 2007; Hour Т.С., 2002).
Целью настоящего исследования явилось изучение возможного влияния соединения полифенольной структуры куркумина, получаемого из растения Curcuma longa, на возникновение индуцированных опухолей молочной железы у крыс.
Наиболее близким является способ профилактики канцерогенного действия метилнитрозомочевины (Беспалов В.Г., Лидак М.Ю. Антиканцерогенный эффект ортофена и индометацина у крыс и мышей с индуцированными опухолями различных органов // Экспер. онкол. - 1992. - Т.26, №1. - С.36-40), взятый нами за прототип, заключающийся в подкожном введении метилнитрозомочевины в ткань всех 12 молочных желез, однократно, по 1 мг канцерогена на железу, в сочетании с ортофеном и индометацином в дозе 25 мг/кг корма в качестве антиканцерогенов, которые вводят с кормом в течение всего эксперимента.
Недостатком этого прототипа является неизбирательное ингибирование циклооксигеназы данными препаратами с развитием значительного числа побочных эффектов, наиболее значимым из которых является ульцерогенное действие.
Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа профилактики канцерогенного действия метилнитрозомочевины у экспериментальных животных, включающего применение полифенольного соединения куркумина в фазу промоции канцерогенеза, когда происходит процесс трансформации здоровой клетки в опухолевую.
Решение этой задачи обеспечивает значительное снижение канцерогенного действия метилнитрозомочевины, что выражается в достоверном ингибировании частоты развития опухолей молочной железы при удлинении латентного периода их возникновения в опытной группе по сравнению с контрольной, а также снижении темпов роста возникших новообразований и увеличении продолжительности жизни животных.
Для достижения этого технического результата заявляемого изобретения (способ профилактики канцерогенного действия метилнитрозомочевины у экспериментальных животных) подкожное введение метилнитрозомочевины в сочетании с антиканцерогеном, который начинают вводить с первого дня эксперимента с кормом одновременно с метилнитрозомочевиной, метилнитрозомочевину в дозе 2,5 мг на крысу в 0,2 мл воды для инъекций вводят пятикратно с интервалом в одну неделю в течение 1,5 месяцев в ткань одной и той же молочной железы у основания левой передней лапки, а в качестве антиканцерогена дают с кормом куркумин в дозе 200 мг/кг корма 4 раза в неделю в течение 8 месяцев.
Предлагаемый способ отличается от прототипа тем, что метилнитрозомочевину в дозе 2,5 мг на железу вводят пятикратно, а в качестве антиканцерогена дают с кормом соединение из группы растительных полифенолов куркумин, который по сравнению с неизбирательными ингибиторами циклооксигеназы практически нетоксичен и не вызывает развития побочных эффектов при наличии антиканцерогенной активности, сопоставимой с активностью препаратов данной группы. Заявляемый способ является эффективным, экономически выгодным и легковоспроизводимым.
По имеющимся у авторов сведениям, совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения неизвестна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию "новизна".
По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется выше указанная возможность получения способа профилактики канцерогенного воздействия метилнитрозомочевины у экспериментальных животных, включающего введение в качестве антиканцерогена соединения полифенольной структуры куркумина в дозе 200 мг/кг корма четыре раза в неделю с первого дня на протяжении всего эксперимента (в течение 8 месяцев) одновременно с подкожными инъекциями метилнитрозомочевины в ткань молочной железы пятикратно с интервалом в одну неделю (в течение 1,5 месяцев), что позволяет сделать вывод о соответствии критерию "изобретательский уровень".
Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легковоспроизводимом способе профилактики канцерогенного воздействия метилнитрозомочевины путем применения соединения полифенольной структуры куркумина, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию "промышленная применимость". Данный способ осуществляется следующим образом.
Опухоли молочной железы индуцировали путем пятикратного с интервалом в одну неделю подкожного введения метилнитрозомочевины в область одной и той же молочной железы у основания левой передней лапки в дозе 2,5 мг на крысу в 0,2 мл воды для инъекций (суммарная доза канцерогена составила 12,5 мг на крысу).
Всех павших и забитых в конце эксперимента животных подвергали полной аутопсии. После вскрытия внимательно изучали внутренние органы на предмет наличия метастазов. В протоколе вскрытия отмечались локализация, размеры, консистенция, границы, цвет и внешний вид опухоли на разрезе. Гистологическую верификацию опухолей осуществляли после фиксации материала в 10% растворе нейтрального формалина и окраски срезов толщиной 5-6 мкм гематоксилином и эозином. При морфологическом анализе опухолей молочной железы основывались на классификации опухолей лабораторных животных, предложенной Международным агентством по изучению рака.
Влияние препаратов на динамику канцерогенеза оценивали с помощью хронометрии латентного периода развития опухолей от момента введения канцерогена до выявления опухолевого узелка, по изменению частоты возникновения опухолей, темпов роста опухолей, а также продолжительности жизни и выживаемости животных в опытной группе по сравнению с контролем. Выявление опухолевых узлов определялось пальпацией, и по мере их роста каждые 2 недели производилось измерение и вычисление объема по формуле: V=a×b×c×π/6.
Темпы роста оценивали по проценту торможения, индексу эффективности и коэффициенту активности.
Процент торможения рассчитывали по формуле:
Т%=Vk-V/Vk×l00%,
где Vk - средний объем опухолей в контрольной группе; V - средний объем опухолей в опытной группе.
Индекс эффективности определяли как Vk/V.
Коэффициент активности рассчитывали по формуле:
1
0
1
1
1
0
K=1-lnF(t)-ln F(t)/lnF(t)-lnF(t),
0
1
где t - время до воздействия модифицирующего фактора; t - время определения эффекта;
1
F - показатель роста опухолей в опытной группе; F - показатель роста опухолей в контрольной группе.
2
Результаты исследований обрабатывали статистически. Для оценки степени достоверности полученных различий в сравниваемых группах пользовались критериями t Стьюдента, Манна-Уитни и χ.
Сущность заявляемого способа подтверждена графически, макроскопически и морфологически (для наглядности изменений в органах приводятся макро- и микрофотографии).
Фиг.1. Опухоль молочной железы, индуцированная у крыс N-метил-N-нитрозомочевиной.
Фиг.2. Низкодифференцированная аденокарцинома долькового типа.
Фиг.3. Умеренно-дифференцированная солидно-криброзная аденокарцинома.
Пример. Опыты проведены на 45 крысах - самках линии Вистар массой 100-120 г. Первой - контрольной группе животных (n=25 крыс) вводили только канцероген. Животные опытной группы получали с первого дня эксперимента одновременно с канцерогеном в качестве пищевой добавки с кормом куркумин в дозе 200 мг/кг корма 4 раза в неделю на протяжении всего эксперимента.
Применение куркумина не отразилось на общем состоянии животных, их поведении, потреблении корма и воды. В обеих группах физиологическое состояние и поведенческие реакции крыс не имели каких-либо различий. Нарастание массы тела происходило равномерно по мере роста животных вне зависимости от экспериментальных воздействий.
Пятикратное подкожное введение МНМ индуцировало развитие опухолей молочной железы (фиг.1) у животных как контрольной, так и опытной групп. Гистологически большая часть опухолей идентифицированы как аденокарциномы (фиг.2 и 3). Метастазирования развившихся опухолей нами обнаружено не было.
Результаты проведенного исследования представлены в таблицах 1-3. Первые опухоли на месте введения канцерогена появились на 15 неделе эксперимента в контрольной группе животных (табл.1). Общая частота возникновения опухолей в данной группе составила 90,9%. Средний срок обнаружения опухолей был равен 154±8,9 суток. Применение диеты, обогащенной куркумином, оказывало позитивное влияние на динамику канцерогенеза, что выражалось удлинением сроков возникновения опухолей и значительным снижением частоты возникновения ОМЖ.
Табл.1
Влияние куркумина и винирестрола на возникновение опухолей молочной железы, индуцированных у крыс N-нитрозо-N- метилмочевиной
Группа воздействие
Эффективное число крыс
Число животных с опухолями молочной железы на день эксперимента, абс./%
105 дней
119 дней
133 дня
147 дней
161 день
175 дней
189 дней
203 дня
217 дней
231 день
245 дней
МНМ (контроль)
22
4/
6/
8/
9/
13/
16/
18/
18/
19/
19/
20/
18%
27%
36%
40%
59%
72%
81%
81%
86%
86%
90,9%
МНМ + куркумин
20
-
-
1/
1/
2/
2/
4/
5/
1/
1/
8/
5%
5%
10%
10%
20%
25%
35%
35%
40%
Первая опухоль в подопытной группе животных появилась на 19 неделе эксперимента. Среднее время появления опухолей в группе с куркумином составило 194,2±16,1 суток (p<0,05). Число животных, у которых развились ОМЖ, снизилось с 90,9% у животных контрольной группы до 40% в подопытной группе. Индекс Айбела в контроле был равен 0,59, в опытной группе - 0,20.
Средняя продолжительность жизни животных с опухолями молочной железы в контрольной группе была равна 31,8±2,5 дням и уступала аналогичным показателям в опытной группе 48,1±9,3 дня в группе с куркумином (p<0,05). Согласно критериям экспериментальной онкологии, воздействие считается эффективным, если продолжительность жизни опытных животных увеличивается не менее чем на 20%. В условиях нашего опыта продолжительность жизни животных, получавших куркумин, была увеличена на 51%. (табл.2) (p<0,05).
3
3
В группе с куркумином были достоверно снижены по сравнению с контрольной группой темпы роста опухолей. Средний размер опухолей в данной группе через два месяца после регистрации опухолевых узлов был равен 5,8±1,06 см против 12±3,06 см в контрольной группе (p<0,005). Индекс эффективности и коэффициент активности в группе, получавшей куркумин, свидетельствовали о значительном опухолеингибирующем эффекте изучаемого соединения (табл.3).
Табл.3
Оценка противоопухолевой активности куркумина по отношению к индуцированным ОМЖ у крыс на основании определения процента торможения (Т/%), индекса эффективности (ИЭ) и коэффициента активности (Ка).
Группа
Критерий
Недели после появления опухоли
2
4
8
МНМ + куркумин
Т
40%
47,2%
51,7%
ИЭ
1,6
1,9
2
Ка
0,38
0,47
0,52
Таким образом, в условиях проведенного эксперимента куркумин оказывал тормозящее влияние на индуцированный канцерогенез молочной железы, что проявилось в статистически достоверном снижении частоты возникновения новообразований, торможении сроков их возникновения и увеличении продолжительности жизни животных подопытных групп, что свидетельствует о возможности его использования в онкопрофилактической практике.