Повышение биологической активности иммобилизованных антител в иммуноферментных сэндвич-методах путем адсорбции при низких значениях рН

Повышение биологической активности иммобилизованных антител в иммуноферментных сэндвич-методах путем адсорбции при низких значениях рн

Д.А. Яковлева1, Ю.Н. Тараканова1, Д.А. Дмитриев1, Ю.С. Массино1, М.Б. Смирнова2, О.Л. Сегал2, О.Н. Фартушная1, Г.И. Коляскина3, В.Ф. Лавров1, А.Д. Дмитриев1

1 НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва

2 Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва

3 НЦ психического здоровья РАМН, Москва

Резюме

Проведена проверка некоторых распространенных представлений об оптимальных условиях пассивной адсорбции моноклональных антител (МКА) на твердую фазу при конструировании иммуноферментных сэндвич-методов определения антигенов. С помощью панели, включающей 40 МКА к различным рекомбинантным белкам (НВэА^ и др.), проведен анализ влияния рН адсорбирующего буфера на антигенсвязывающую активность иммобилизованных МКА. Продемонстрирована более высокая антигенс-вязывающая активность 14-ти из 40 МКА при их адсорбции в кислом глициновом буфере (рН 2,8) по сравнению с адсорбцией в натрий-фосфатном (рН 7,5) или карбонатном (рН 9,5) буфере. Использование МКА к НВэА^, показавших наиболее выраженный усиливающий эффект после адсорбции при рН 2,8 (коэффициент кривой связывания с меченым антигеном увеличился в 2,4 раза), позволило на порядок уменьшить минимальную достоверно определяемую дозу антигена в сэндвич-методе тестирования НБэА^ и сконструировать пригодную для клинического применения тест-систему. Усиливающий эффект был связан с лучшей сохранностью иммобилизованных МКА после адсорбции при рН 2,8 в условиях неизменной поверхностной концентрации молекул иммуноглобулинов. Описанный подход значительно расширяет выбор пар антител для создания эффективного сэндвич-метода за счет повышения биологической активности иммобилизованных МКА.

Ключевые слова: НВэА^, сэндвич-метод, рН, монокло-нальные антитела, иммобилизованные антитела, адсорбция антител

The Increase of Biological Activity of Immobilized Antibodies by Adsorption at Low pH in Sandwich ELISA

D.A. Yakovleva1, Yu.N. Tarakanova1, D.A. Dmitriev1, Yu.S. Massino1, M.B. Smirnova2, O.L. Segal2, O.N. Fartushnaya1, G.I. Kolyaskina3, V.F. Lavrov1, A.D. Dmitriev1

1 I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow

2 Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology, Russian Academy of Sciences, Moscow

3 Scientific Center for Mental Health, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow

Abstract

The study reexamined some widespread opinions concerning the immobilization of monoclonal antibodies (mAbs) onto the surface of solid phase by passive adsorption in antigen capture ELISA. The effect of coating buffer pH on antigen-binding activity of immobilized mAbs was examined using of the panel of 40 mAbs against different recombinant proteins (HBsAg and others). It was found that 14 of 40 tested antibodies maximized their antigen capture capacity after adsorption in acid glycine buffer (pH 2.8) if compared with phosphate (pH 7.5) or carbonate (pH 9.5) buffers. The use of anti-HBsAg mAbs, showing the strongest enhancement effect after adsorption at pH 2.8 (the 2.4 fold increase of the coefficient of binding curve obtained with enzyme-labeled antigen) allowed to achieve the 7 - 10 fold decrease of the minimal detection limit for HBsAg in sandwich ELISA and construct clinically efficient diagnostic system. The enhancement effect was due to the better conservation of mAbs antigen capture ability at acid pH. The use of acid coating buffer may extend the choice of optimal antibody «matched pairs» for sandwich ELISA. Key words: HBsAg, sandwich ELISA, pH, monoclonal antibodies, immobilized antibodies, antibodies adsorption

Введение

С целью повышения эффективности иммобилизации моноклональных антител (МКА) на твердой фазе, например на поверхности иммунных планшетов в иммуноферментном сэндвич-методе определения антигенов, часто используется метод их пас-

сивной адсорбции. Однако при этом возможно возникновение ряда проблем, так как 90 - 99% МКА в результате адсорбции утрачивают антигенсвязыва-ющую активность [2, 9]. Вместе с тем поверхностная концентрация биологически активных и высокоаффинных МКА является одним из важнейших

факторов, определяющих эффективность твердофазных диагностических систем. В этой связи актуален поиск простых и доступных методов оптимизации пассивной адсорбции МКА на твердую фазу.

Свойства буферов, которые используются для адсорбции МКА на поверхность полистироловых планшетов в твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА), оказывают существенное влияние на процесс пассивной адсорбции [5]. При этом отсутствуют систематические исследования о влиянии рН адсорбирующих буферов на биологическую активность иммобилизованных антител. Как правило, для адсорбции МКА используют натрий-фосфатный (рН 7,5) и карбонатный (рН 9,5) буферы. Однако в более ранних исследованиях были описаны антитела, которые лучше сохраняли свою активность, если их адсорбировали в буферах с рН ~3 [3, 8].

цель настоящей работы - проверка некоторых распространенных представлений об оптимальных условиях пассивной адсорбции моноклональ-ных антител (МКА) на твердую фазу при конструировании иммуноферментных сэндвич-методов определения антигенов.

Материалы и методы

В исследовании использовали иммунные планшеты фирмы Nunc (MaxiSorp, Дания), стрептави-динпероксидазу фирмы Biosource (США) и LC-LC-биотин фирмы Pearce (США). Прочие реактивы были получены из фирмы Sigma (США). Рекомби-нантные белки (р24 вируса иммунодефицита человека 1 (ВИЧ-1), соге-белок р23 вируса гепатита С (ВГС)) и поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg, S-полипептид) серотипа ayw произведены НПО «Диагностические системы» (г. Нижний Новгород). Рекомбинантный тропонин Т человека получен компанией «Евроген» (Москва). Биотинилиро-вание белков проводили, следуя рекомендациям фирмы Pearce (США). Белки конъюгировали с пе-роксидазой хрена по методу П.К. Накане [6].

Получение моноклональных антител к ре-комбинантным белкам. Гибридомы, секретирую-щие МКА к рекомбинантным белкам, получали, как описано ранее [4, 7]. Для дальнейшей работы отбирали гибридомы, антитела которых давали окрашивание в ИФА при связывании с иммобилизованными антигенами при разведении культуральных су-пернатантов в 2 - 3 х 104 раз. Положительные гибридомы клонировали не менее трех раз. Получение и очистку МКА из асцитной жидкости проводили с помощью хроматографии на ДЕАЕ-сефарозе, как описано ранее [4, 7].

определение антигенсвязывающей активности иммобилизованных антител. Для адсорбции очищенных МКА на поверхности иммунных планшетов (3 мкг/мл, 100 мкл на лунку, ночь при комнатной температуре) использовали три различных адсорбирующих буфера: 0,05 М глицин-HCl-буфер, рН 2,8; 0,05 М натрий-фосфатный буфер,

рН 7,5, и 0,05 М натрий-гидрокарбонатный буфер, рН 9,5. Планшеты инкубировали (120 минут, 37 оС) с серийными разведениями антигенов (0 - 64 нг/мл), меченных биотином или пероксидазой хрена. Антигены разводили в 0,025 М натрий-фосфатном буфере (рН 7,5), содержащем 0,15 М №С!, 0,2% БСА и 0,05% твина 20 (ЕШ-буфер). После отмывки дистиллированной водой в лунки добавляли стрепта-видинпероксидазу (50 нг/мл, 100 мкл на лунку), растворенную в том же буфере (но содержащем 1% казеина вместо БСА). После инкубации (30 минут при 37 оС) и отмывки иммунные комплексы окрашивали тетраметилбензидином (ТМБ). Окрашивание регистрировали на плашечном сканере «Уни-план» («Пикон», Россия) при 450 нм.

определение относительного количества антител, иммобилизованных на поверхности иммунных планшетов. Биотинилированные МКА 18С8 адсорбировали на поверхности иммунных планшетов, как указано выше. После серии отмывок планшеты инкубировали с серией разведений стрептавидинпероксидазы (0 - 16 нг/мл) в ЕШ-буфере с казеином (100 мкл на лунку, 45 минут, 37 оС). Стрептавидин-биотиновые комплексы выявляли, как описано выше.

Процедура сэндвич-метода тестирования HBsAg. Планшеты насыщали при комнатной температуре в течение ночи МКА 18С8, растворенными в 0,05 М глицин-НС!-буфере, рН 2,8, или 0,05 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,5 (3 мкг/мл, 200 мкл на лунку). Инкубационная смесь с конечным объемом 200 мкл включала 150 мкл стандарта (0,012 - 1,6 нг/мл), разведенного в сыворотке крови, заведомо не содержащей HBsAg, и 50 мкл раствора конъюгата МКА 18С8 с пероксидазой хрена в ЕШ-буфере (1,5 мкг/мл). Планшеты инкубировали 1,5 часа при 42 оС, ополаскивали четыре-пять раз дистиллированной водой и выявляли иммунные комплексы, как описано выше.

результаты и обсуждение

В настоящей работе процесс адсорбции антител на твердую фазу изучали с использованием 40 МКА (продуктов секреции различных гибридом), специфичных к четырем различным рекомбинантным белкам, в том числе к HBsAg (10 МКА), соге-белку р23 вируса гепатита С (7 МКА), белку р24 ВИЧ-1 (11 МКА) и тропонину Т человека (12 МКА).

Данные МКА были выбраны для исследования на основании следующих критериев. Во-первых, антитела эффективно связывались в твердофазном ИФА с соответствующими иммобилизованными антигенами; во-вторых, антитела сохраняли

Рисунок 1.

Связывание меченых антигенов с моноклональными антителами, иммобилизованными на поверхность иммунных планшетов при нейтральных, кислых и щелочных значениях рН:

а) связывание меченного биотином белка р24 ВИЧ-1 с адсорбированными антителами клона Р6;

б) связывание меченного биотином белка р23 к ^т-белку вируса гепатита С с адсорбированными антителами клона С11;

в) связывание HBs-антигена, конъюгированного с пероксидазой хрена, с адсорбированными антителами клона 18С8;

г) связывание меченного биотином тропонина Т человека с адсорбированными антителами клона Т7.

р24-биотин, нг/ил р23-биотин, нг/мл

HBsAg-HRP, нг/мл

Л рН 2,8

о рН 7,5

А рН 9,5

/ о

/ °

. А^ "

/о "" у=0,029х

JT - -к у = 0,020х

¿JA-А у = 0,006х

О 20 40 60 80

Тропонин-Т- биотин, нг/мл

полностью или весьма существенно утрачивали способность связывать антиген после адсорбции на твердую фазу, что делало их непригодными для изучения биологической активности антител.

Для анализа влияния рН адсорбирующего буфера на антигенсвязывающую активность иммо-

билизованных МКА иммунные планшеты насыщали антителами, растворенными в трех различных буферах: 0,05 М глицин-НС1-буфере, рН 2,8; 0,05 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,5, и 0,05 М натрий-гидрокарбонатном буфере, рН 9,5. Прочие условия (концентрация МКА в адсорбирующем

буфере и др.) были одинаковыми (см. «Материалы и методы»). К сорбированным антителам добавляли нарастающие количества меченых антигенов: биотинилированных белков р24 ВИЧ-1, соге-белка р23 вируса гепатита С и тропонина Т; HВsAg был конъюгирован с пероксидазой хрена. Типичные примеры полученных в этих опытах кривых связывания приведены на рисунке 1. Эффективность связывания меченого антигена с иммобилизованными антителами (аналитическая чувствительность метода) характеризуется коэффициентами кривых связывания (значения коэффициентов указаны на рис. 1).

В результате проведенных опытов было показано, что замена «классических» адсорбирующих буферов (натрий-фосфатного, рН 7,5, и карбонатного, рН 9,5) на кислый глициновый буфер (рН 2,8) приводила к существенному увеличению (в 1,5 - 2,4 раза) антигенсвязывающей активности 14-ти из 40-ка (35%) тестированных антител: трех из десяти МКА к HBsAg; четырех из семи МКА к белку р23 ВГС; трех из одиннадцати МКА к белку р24 ВИЧ-1 и четырех из двенадцати антитропони-новых МКА. Наблюдаемый усиливающий эффект (проиллюстрированный на рис. 1) был воспроизведен в трех и более экспериментах. Однако анти-генсвязывающая активность остальных 26-ти проанализированных МКА из нашей панели после адсорбции при рН 2,8 резко ухудшалась или не изменялась. Следует добавить, что ни с одним из тестированных нами МКА не наблюдалось увеличения антигенсвязывающей активности после ад-

сорбции в карбонатном буфере при рН 9,5 (по сравнению с натрий-фосфатным буфером, рН 7,5) (см. рис. 1). Реакция МКА на изменение рН при адсорбции не зависела от изотипа ^ (данные не приводятся).

Усиливающий эффект, обусловленный адсорбцией МКА в кислом буфере, был особенно выражен в случае анти-HBsAg МКА 18С8 (см. рис. 1-в): коэффициент кривой связывания увеличивался в 2,4 раза по сравнению с антителами, адсорбированными при рН 7,5 (сравнить кривые и на рис. 1-в). Тот же эффект наблюдали и при использовании цитратного буфера с рН 2,8 (данные не приводятся).

Мы предположили, что усиливающий эффект, наблюдаемый в реакциях с некоторыми МКА после их адсорбции на твердую фазу при кислых значениях рН, может быть связан со следующими факторами:

1) при кислых значениях рН (2,8) на поверхности иммунных планшетов адсорбируется большее, чем при нейтральных и щелочных значениях, количество молекул антител, при неизменности их функциональной активности;

2) адсорбция в буфере с рН 2,8 приводит к лучшему сохранению функциональной активности МКА, а их поверхностная концентрация не изменяется.

Чтобы выяснить, какое из этих двух предположений является правильным, мы сравнили связывание стрептавидинпероксидазы с биотинилиро-ванными анти-HBsAg МКА 18С8, адсорбирован-

Рисунок 2.

Связывание стрептавидинпероксидазы с меченными биотином антителами клона 18С8, адсорбированными на поверхность иммунных планшетов при нейтральных, кислых и щелочных значениях рН. Биотинилированные антитела клона 18С8

у =0,086х у =0,082х у =0,079х

О 4 8 12 16 Стрепгавидинпероксидаза, нгЛш

ными на твердую фазу при трех различных рН: 2,8; 7,5 и 9,5 (концентрация МКА во всех адсорбирующих буферах составляла 3 мкг/мл) (рис. 2). Относительную поверхностную концентрацию МКА оценивали по коэффициентам кривых связывания стрептавидинпероксидазы с антителами (см. рис. 2). Кривые связывания стрептавидин-пероксидазы с биотинилированными МКА 18С8, адсорбированными при разных значениях рН, совпали (см. рис. 2). В совокупности данные, приведенные на рисунках 1-в и 2, указывают, что при рН 2,8; 7,5 и 9,5 к твердой фазе прикреплялось одинаковое количество молекул МКА, однако молекулы антител, адсорбированных в кислом буфере (2,8), лучше сохраняли антигенс-вязывающую активность.

Гетерогенность МКА в отношении их реакции на уменьшение рН адсорбирующего буфера может быть обусловлена различиями в заряде и степени гидрофобности вариабельных участков антител. Эти факторы могут определять ориентацию и конформационное состояние молекул антител на твердой фазе - в зависимости от условий их адсорбции.

МКА 18С8 с наиболее выраженной «ацидо-фильностью» использовали для конструирования сэндвич-метода тестирования HBsAg. Следует заметить, что после адсорбции при кислых значениях рН эти антитела показывали наиболее высокую способность связывать антиген - при сравнении с МКА к HBsAg всей панели антител, имевшейся в нашем распоряжении (данные не приводятся). Напротив, адсорбция при рН 7,5 или 9,5 маскиро-

вала потенциальные преимущества МКА 18С8 как инструмента для «улавливания» антигенов.

Эффективные детектирующие антитела для сорбированных антител 18С8 подбирали путем тестирования конъюгатов всех имеющихся в нашем распоряжении анти-HBsAg МКА с пероксидазой хрена (16 МКА, включая те, которые инактивиро-вались после адсорбции на твердую фазу). Анализ всех возможных комбинаций показал, что наиболее эффективным является сэндвич-метод, основанный на иммобилизованных МКА 18С8 (адсорбированных при рН 2,8) и детектирующих МКА Р4Р3 (стандартные кривые, получаемые с помощью данного ИФА, представлены на рис. 3). Для сконструированного нами сэндвич-метода определили минимальную достоверно определяемую концентрацию антигена при п = 5 (превалирование поглощения при тестируемой концентрации над поглощением, даваемым нулевым стандартом, ± 3 среднеквадратичных отклонения). Указанный параметр измеряли после адсорбции МКА 18С8 при рН 7,5 и 2,8 с использованием трех независимо полученных препаратов детектирующих МКА Р4Р3 (конъюгатов антител с пероксидазой). После адсорбции МКА 18С8 при рН 7,5 данный параметр составил 0,1; 0,17 и 0,11 нг/мл (для трех различных препаратов конъюгатов). В то же время после адсорбции антител при рН 2,8 тот же показатель снизился до 0,014; 0,017 и 0,013 нг/мл. Следовательно, очень простой методический прием - адсорбция антител при рН 2,8 - позволил уменьшить минимальную достоверно определяемую концентрацию прак-

Рисунок 3.

Калибровочные кривые в сэндвич-методе тестирования HBsAg (сорбируемые антитела 18С8 - детектирующие антитела F4F3) при нейтральных и кислых значениях рН адсорбции антител 18С8.

Антитела клона 18С8

1,5

О сорбция при рН 7,5  сорбция при рН 2,8

0,3 Q6 0,9 1,2 1,5 HBsAg, нг/мл

тически на порядок. В дальнейшем показана ва-лидность данного сэндвич-метода, предназначенного для клинического определения HBsAg [1].

Выводы

Использование адсорбирующих буферов с кислым значением рН в процессе оптимизации и конструирования сэндвич-методов определения антигенов: • во многих случаях способствует достижению более значительной поверхностной концен-

трации биологически активных МКА на твердой фазе - важнейшего условия высокой аналитической чувствительности подобного рода систем;

обеспечивает лучшую сохранность антигенсвя-зывающих свойств более чем 30% МКА - кандидатов на роль иммобилизованных антител; значительно расширяет возможности выбора комплементарных пар антител для создания эффективного сэндвич-метода. ш

Литература

1. Яковлева Д.А., Дмитриев А.Д., Дмитриев Д.А. и др. Использование рН-чувствительных иммобилизованных моноклональных антител для оптимизации иммуноферментного сэндвич-метода определения HBsAg вируса гепатита В // Журн. микробиол. 2010. № 2. С. 85 - 89.

2. Butler J.E. Solid supports In enzyme-linked Immunosorbent assay and other solid-phase immunoassays // Methods Mol. Med. 2004. V. 94. С. 333 - 372.

3. Cuvelier A., Bourguignon J., Muir J.F. et al. Substitution of carbonate by acetate buffer for IgG coating in sanwhich ELISA // J. Immunoassay. 1996. V. 17. Р. 371 - 382.

4. Dmitriev A.D., Factor M.I., Segal O.L. Western blot analysis of human and rat serotonin transporter in platelets and brain using site-specific

antibodies: evidence that transporter undergoes endoproteolytlc cleavage // Clin. Chlm. Acta. 2005. V. 356. P. 76 - 94.

5. Khan M.N., Findlay J.W.A. Ligand-binding assay: development, validation and implementation in the drug development arena. Wiley, New Jersey, 2010.

6. Nakane RK., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugation // J. Histochem. Cytochem. 1974. V. 22. P 1084 - 1091.

7. Nikulina V.A., Kizim E.A., Massino Y.S. et al. Synergistic effects in antigen-capture ELISA using three monoclonal antibodies directed at different epitopes of the same antigen // Clin. Chim. Acta. 2000. V. 299. P 25 - 44.

8. Sponholtz D.K. Immunoassays in microplate wells: optimization of binding by passive adsorption / IVD Technology. 1995, March. P. 1 - 4.

9. Qian W., Yao D., Yu F. et al. Immobilization of antibodies on ultraflat polystyrene surfaces // Clin. Chem. 2000. V. 46. P. 1456 - 1463.

информация роспотребнадзора

об итогах надзора за клещевым вирусным энцефалитом в эпидсезон 2011 года

письмо от 23.11.2011 года № 01/14820-1-32

В эпидемический сезон 2011 года в 68 субъектах РФ в лечебно-профилактические учреждения обратились более 570 тыс. пострадавших от укусов клещами, из них 120 тыс. детей (на 26% больше, чем в 2010 г.), что говорит о сохраняющейся неблагополучной эпидемиологической ситуации.

По данным сезонного мониторинга, зарегистрирован 3471 случай заболевания клещевым вирусным энцефалитом (КВЭ), 444 - среди детей. Диагноз лабораторно подтвержден в 89% случаев. Показатель заболеваемости -2,45 на 100 тыс. населения (на 13,8% выше, чем в 2010 г.).

В 2011 году зарегистрировано 34 смертельных исхода КВЭ (в 2010 г. - 34), из них один у подростка 17 лет. Максимальное количество летальных исходов (13 случаев) зарегистрировано в Уральском ФО, из них 6 - в Челябинской области.

По данным управлений Роспотребнадзора в субъектах РФ, в 2011 году экспресс-диагностика клещей на наличие вируса КЭ осуществлялась в 62 субъектах в 173 лабораториях. Положительные результаты на зараженность ВКЭ по РФ составили 5,3%, из них вирусоформность клещей, снятых с людей, - 6,1%, из объектов окружающей среды -3,1%. Среди ФО более всего инфицированных клещей снято с людей в Приволжском федеральном округе - 9,3%.

Наибольшее количество инфицированных клещей в субъектах РФ выявлено: в Алтайском крае - 21,8%, Удмуртской Республике - 19,3%, Кировской области - 14%, Республике Бурятия - 15,6%, Республике Тыва - 12,7%, Кемеровской области - 11,8%, Республике Марий Эл -11%, Томской области - 10,7%, Республике Коми - 10%.

Наибольшее количество зараженных вирусом КЭ клещей из объектов внешней среды зарегистрировано: в Но-

восибирской области - 16%, Республике Алтай - 12,2%, Республике Коми - 11,7%, Республике Бурятия - 10,3%.

Сложившееся неблагополучие по КВЭ, наряду с другими причинами, обусловлено сокращением объемов вакцинации и экстренной иммунопрофилактики. В 2011 году в РФ на закупку вакцины было выделено финансовых средств на 18,9% меньше, чем запланировано, в том числе в Забайкальском крае - на 46,5%, областях Свердловской -53,3% и Ленинградской - 89%, Республике Удмуртия - 87%, Ямало-Ненецком АО - 82,3%, Приморском крае - 81,6%.

Из числа обратившихся в ЛПУ по поводу укусов клещами привитыми оказались 9,2% (в 2010 г. - 8,7%), из них 20% - дети (в 2010 г. - 23%), при повсеместной регистрации заболеваемости КВЭ в Уральском и Сибирском федеральных округах.

На территории, где случаи КЭ в сезон 2011 года регистрировались повсеместно, из всех обратившихся в Уральском ФО было привито 17% граждан (как и в предыдущем году), в Сибирском ФО - 9% граждан (в 2010 г. - 8,4%); в Красноярском крае (наибольшее число случаев КВЭ) - менее 10%. В Свердловской области серопрофилактику получили 38% пострадавших (в 2010 г. - 39%). В 2011 году всего по стране привито 2 798 100 человек (на 7,3% меньше, чем в предыдущем году), в том числе детей - 912 085 (на 10,8% меньше значений прошлого года).

В субъектах Российской Федерации не уделяется должного внимания вопросам гигиенического воспитания населения, пропаганде в средствах массовых коммуникаций мер профилактики клещевого вирусного энцефалита, в том числе применения высокоэффективных акарицидно-репеллентных средств защиты от клещей.

Руководитель Г.Г. Онищенко