СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОСТАВА ИНДИВИДУАЛЬНЫХ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ВЕЗИКУЛ В КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
METHOD OF DETERMINING COMPOSITION OF INDIVIDUAL EXTRACELLULAR VESICLES IN HUMAN BLOOD

Изобретение относится к области медицины, а именно к клеточной и молекулярной технологии, и может быть использовано в медицинских исследованиях в кардиологии для изучения состава индивидуальных внеклеточных везикул в крови человека.
Долгое время атеросклероз рассматривался как болезнь накопления, вызываемая отложением липидов в стенке сосудов. Отложение липидов в субэндотелий сосудов нередко наблюдается очень рано, уже в 25-30 лет. Однако образующиеся при этом так называемые fatty streaks являются обратимым поражением и, как правило, располагаются не в тех участках коронарного русла, где чаще всего в последующем возникают зрелые атеросклеротические бляшки. Кроме того, простое накопление липидов не могло объяснить и сложность строения атеросклеротической бляшки. Между тем, сложность строения бляшек известна со времен Вирхова, когда было выяснено, что в их состав входят различные клеточные компоненты, в том числе большое количество гладкомышечных клеток. Для объяснения этих фактов была сформулирована альтернативная гипотеза R. Ross и L. Harker [Faggiotto A, Ross R, Harker L. Studies of hypercholesterolemia in the nonhuman primate. I. Changes that lead to fatty streak formation. Arteriosclerosis. - 1984. - №4. - P. 323-340; Ross R, Harker L. Hyperlipidemia and atherosclerosis. Science. - 1976. - Vol. 193. - P. 1094-1100] о том, что пусковым фактором атеросклероза является повреждение эндотелия с последующей активацией тромбоцитов. Последние выделяют факторы роста, вызывающие миграцию гладкомышечных клеток в субэндотелиальное пространство. Это сопровождается нарушением свойств эндотелия, адгезией к его поверхности лейкоцитов и тромбоцитов. Моноциты проходят через эндотелиальную выстилку и превращаются в макрофаги. Одновременно в месте повреждения накапливаются лимфоциты и тучные клетки. Параллельно происходит миграция гладкомышечных клеток из медии в субэндотелий и изменение их фенотипа (дедифференцировка).
Обе теории удалось объединить после того, как в последние 10-15 лет были получены многочисленные данные о ключевой роли иммунных факторов, в частности воспаления, в возникновении и развитии атеросклероза.
В целом развитие атеросклеротической бляшки обычно рассматривается как реакция организма на отложение в сосудистой стенке инородной субстанции - модифицированных липопротеинов. Предполагается, что вначале иммунная система пытается уничтожить чужеродный объект, в частности путем его фагоцитоза макрофагами [Kruth HS Sequestration of aggregated low-density lipoproteins by macrophages. Curr Opin Lipidol. - 2002. - №13. - P. 483-488]. Макрофаги поглощают липопротеиды, однако это приводит к гибели самих фагоцитов и формированию очага некроза [Geng YJ, Libby Р (2002) Progression of atheroma: A struggle between death and procreation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. - 2002. - №22. - P. 1370-1380], сопровождаемого образованием капсулы. В результате создается структура, очень напоминающая обычный абсцесс - некроз, изолированный от остальных тканей соединительнотканной капсулой.
Дальнейшее развитие атеросклеротической бляшки определяется активностью иммунного ответа, в частности воспалением. Если преобладает синтез соединительной ткани гладкомышечными клетками, то капсула надежно изолирует ядро. Такая бляшка получила название стабильной. Она не провоцирует внутрисосудистое тромбообразование и, соответственно, не является непосредственной причиной острого инфаркта миокарда. Если же капсула истончается, то формируется так называемая нестабильная бляшка. Ее покрышка может лопнуть, что приведет к контакту с кровью тромбогенного ядра бляшки и формированию внутрисосудистого тромба. Этот механизм является основной причиной коронарного тромбоза и острого инфаркта миокарда.
Причины дестабилизации и разрушения бляшки, несмотря на их важность, остаются в значительной степени неизвестными. Одним из таких факторов является расщепление коллагена металлопротеазами, выделяемыми из макрофагов. Однако причины активации самих макрофагов также малоизвестны.
Другие известные процессы, как местные, так и системные, коррелируют с нестабильностью бляшек [Libby Р Inflammation in atherosclerosis. Nature. - 2002. - Vol. 420. - P. 868-874; Dollery CM, Libby P. Atherosclerosis and proteinase activation. Cardiovasc Res. - 2006. - Vol. 69. - Р. 625-635]. Так, в серии работ показано, что повышение уровня воспалительных цитокинов в крови коррелирует с риском развития острого инфаркта миокарда и инсульта [Ait-Oufella Н, Taleb S, Mallat Z, Tedgui A. Cytokine network and T cell immunity in atherosclerosis. Semin Immunopathol. - 2009. - Vol. 31. - P. 23-33; Hartvigsen K, Chou MY, Hansen LF, Shaw PX, Tsimikas S, et al. The role of innate immunity in atherogenesis. J Lipid Res. - 2009. - Vol. 50. - P. S388-S393; Handersson J, Libby P, Hansson GK. Adaptive immunity and atherosclerosis. Clin Immunol. - 2010. - Vol. 134. - Р. 33-46].
Одним из важных компонентов процессов воспаления и коагуляции являются мембранные везикулы, эндогенные переносчики транспортных белков и нуклеиновых кислот между клетками [Heijnen H.F.G., Schiel А.Е., Fijnheer R., Geuze H.J., Sixma J.J., et al. Activated Platelets Release Two Types of Membrane Vesicles: Microvesicles by Surface Shedding and Exosomes Derived From Exocytosis of Multivesicular Bodies and alpha - Granules. Blood. - 1999. - Vol. 94. - P. 3791-3799]. Среди них выделяют 2 основных типа: микровезикулы и экзосомы, они отличаются по размеру (от 30 до 5000 нм), содержимому и механизмам образования. В недавнем исследовании было показано, что микровезикулы (размерами от 100 до 1000 нм) в атеросклеротических бляшках могут индуцировать пролиферацию Т клеток, а также что макрофагальные микровезикулы могут захватывать иммуноглобулины. Микровезикулы, выделяемые из бляшек, экспрессируют на своей поверхности главный комплекс гистосовместимости (МНС) и активируют CD4+ Т-лимфоциты, вероятно, взаимодействуя локально с В-лимфоцитами, которые образуют иммуноглобулины против антигенов бляшек [Mayr М, Grainger D, Mayr U, et al. Proteomics, metabolomics, and immunomics on microparticles derived from human atherosclerotic plaques. Circ Cardiovasc Genet. - 2009. - Vol. 2. - P. 379-388]. Таким образом, помимо важного фактора, определяющего тромбогенность бляшек, экзосомы играют ранее неизвестную роль в активации тканевых воспалительных процессов. Кроме того, ранние исследования иммунной системы показали, что экзосомы (размерами 40-100 нм), образующиеся из целого ряда различных иммунных клеток, могут содержать такие молекулы, как МНС класса II, молекулу костимуляции CD8, функционально связанный антиген лимфоцитов и молекулы межклеточной адгезии, которые влияют на различные иммунологические процессы, включающие активацию Т-клеток [Sprent J. Direct stimulation of naive T cells by antigen-presenting cell vesicles. Blood Cells Mol. Dis. - 2005. - Vol. 35. - P. 17-20] и созревание дендритных клеток [Skokos D., Botros H.G., Demeure C., Morin J., Peronet R., et al. Mast cell-derived exosomes induce phenotypic and functional maturation of dendritic cells and elicit specific immune responses in vivo. J. Immunol. - 2003. - Vol. 170. - Р. 3037-3045]. Эти эффекты вносят важный вклад в формирование и созревание атеросклеротических бляшек.
Вышеизложенная концепция о ведущей роли иммунных процессов в развитии атеросклероза, хотя и является общепринятой и основывается на довольно большом количестве клинических и экспериментальных данных, не отвечает на многие принципиальные вопросы. С ответами на эти вопросы связаны не только понимание фундаментальных вопросов развития атеросклероза, но и разработка профилактических и терапевтических подходов к лечению атеросклероза.
Известен способ выделения экзосом, в котором проводилось выделение фракции везикул малого размера (экзосом) из биологических тканей и сред. В способе используются объем-исключающие полимеры для преципитации экзосом из биологических образцов, что позволяет изолировать экзосомы с помощью низкоскоростного центрифугирования или фильтрования. Также описано дальнейшее разделение экзосом на фракции после преципитации [Патент США № WO 2013158203 А1, опубл. 24.10.2013]. Однако дальнейшее определение этой фракции везикул по отдельности не представляется возможным в связи с их малыми размерами, анализ проводится в массиве всех везикул. Кроме того, процесс выделения везикул с использованием описанных в способе наборов приводит к удалению из сред организма большого спектра везикул за счет ступеней тромбообразования in vitro, преципитации, фильтрования и центрифугирования, что изменяет реальный состав внеклеточных везикул в исследуемой среде.
По данным литературы методы выделения внеклеточных везикул из тканей человека без их предварительной фиксации для анализа с помощью проточной цитометрии приводят к активации клеток ткани и выделению ими дополнительного пула везикул, что искажает достоверность исследования. Известны способы исследования внеклеточных везикул в жидких биологических средах организма человека, однако данные способы позволяют либо исследовать фиксированные везикулы в небольших количествах (электронная микроскопия, атомно-силовая микроскопия, рамановская спектроскопия), либо нефиксированные везикулы в общем массиве данных без анализа фенотипических характеристик индивидуальных везикул (с помощью импедансной и светорассеивающей проточной цитометрии, динамического рассеяния света и анализа дзета-потенциала). Методики для определения фенотипических характеристик массива индивидуальных внеклеточных везикул в крови человека не разработаны.
Lacroix и соавт. предложили использовать стратегию гейтирования с использованием набора бус Megamix и широкоугольного лазера FSC, что позволило детектировать везикулы размерами около 100 нм [Lacroix R. Overcoming limitations of microparticle measurement by flow cytometry. Semin. Thromb. Hemost. - 2010. - Vol. 36. - P. 807-818]. Van der Pol и соавт. проводили проточную цитометрию везикул из крови человека, настраивая лазеры проточного цитометра по кремниевым бусам размерами 89 нм и 203 нм с известным индексом рефрактерности [Van Der Pol Е. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. J Thromb Haemost. - 2012. - Vol. 10(5). - P. 919-930].
Однако в описанных исследованиях детекция проходила в общем массиве везикул. Затем, учитывая линейность концентрации относительно количества везикул, рассчитывались параметры одной везикулы. Эти методы не позволяли напрямую анализировать состав индивидуальных везикул человека. При этом определенные клеточные антигены в массиве везикул не отражают реально существующее распределение этих антигенов на индивидуальных везикулах и не могут быть напрямую связаны с физиологическим состоянием пациента. В связи с этим необходима была разработка способа определения индивидуальных везикул в крови человека для оценки их вклада в патогенез атеросклероза.
Описаны исследования состава внеклеточных везикул в крови с помощью проточной цитометрии с определением везикул по данным прямого и бокового светорассеяния, при этом для калибровки проточного цитометра используют частицы полистироловых или латексных микросфер размерами менее 500 нм [Chandler W.L., Yeung W., Tait J.F.. A new microparticle size calibration standard for use in measuring smaller microparticles using a new flow cytometer. J Thromb Haemost. - 2011. - Vol. 9. - P. 1216-1224]. Однако разрешающая способность подобных методов не превышает 300 нм, что не позволяет анализировать большой пул внеклеточных везикул размерами менее 300 нм и не дает возможности получить полноценный результат по распределению всех типов везикул.
В ходе проведения исследования (лаборатория атеротромбоза МГМСУ им. А.И. Евдокимова по теме «Иммунные и вирусные механизмы атерогенеза») был взят за основу известный способ определения индивидуальных экзосом с помощью наночастиц и проточной цитометрии [Arakelyan A. Ivanova О., Vasilieva Е., Grivel J-C., Margolis L. Analysis of antigenic composition of single nano-sized extra-cellular vesicles in blood. J Extracell Vesicles. - 2014. - Vol. 3. - P. 16-18/jev.v3.24214.]. Важно отметить, что экзосомы являются одной из фракций внеклеточных везикул размерами около 30-150 нм, что меньше разрешающей способности проточного цитофлуориметра. В связи с этим детекция индивидуальных везикул с помощью проточной цитометрии по их размерам по боковому и прямому светорассеянию невозможна, и антигенная структура внеклеточных везикул, в большинстве исследований охарактеризована лишь массовым анализом. В связи с приведенными особенностями методика определения индивидуальных экзосом в крови была взята за основу для разработки способа определения всех фракций индивидуальных внеклеточных везикул.
Способ определения индивидуальных экзосом в крови человека с помощью наночастиц и проточной цитометрии заключается в том, что в качестве материала для определения экзосом используют образцы крови от здоровых добровольцев. Для предотвращения избыточной активации тромбоцитов для анализа экзосом используется только кровь, взятая из периферической вены во вторую по счету вакуумную пробирку с 3,2% раствором цитрата натрия. Образцы крови хранят при комнатной температуре не более 15 минут.
Затем для получения плазмы, обедненной тромбоцитами, пробирки с кровью центрифугируют 15 мин при ускорении 3000g. Из пробирки отбирается верхняя фракция - плазма крови, свободная от тромбоцитов. В дальнейшем раствор плазмы замораживается и хранится при температуре не выше -80°C в течение не менее 6 часов. Для продолжения исследования плазму размораживают при комнатной температуре.
Следующим этапом проводится выделение и концентрирование экзосом из плазмы с помощью стандартного набора с раствором тромбопластина.
Далее проводится связывание экзосом с магнитными наночастицами (МНЧ) размерами 15 нм, состоящими из оксида железа и покрытыми карбоксильными группами. Эти частицы на предварительном этапе конъюгируют с антителами, специфичными к поверхностным антигенам экзосом (CD9, CD63 или CD81). Для этого 1 мг МНЧ инкубируется 10 минут при комнатной температуре в 200 мкл активирующего буфера, содержащего 1.7 mM 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида и 0.76 mM N-гидроксисульфосукцинимида. После активации 500 мкл связывающего буфера добавляют к магнитным наночастицам, в полученную суспензию немедленно добавляют 1 мг очищенных антител. После двухчасовой инкубации в термомиксере при комнатной температуре при перемешивании реакция останавливается добавлением 10 мкл раствора гашения и проводится 2 отмывки моющим буфером с использованием магнитного сепаратора при 4°C. Конъюгированные с антителами МНЧ растворяют в 2 мл буфера хранения и хранят при 4°C в концентрации 0.5 мг/мл оксида железа. Затем МНЧ, конъюгированные с антителами, метятся 5 мкг флуоресцентного Fab-фрагмента иммуноглобулина G козлиных антител, специфичных к иммуноглобулинам мыши, в течение 30 минут при комнатной температуре при перемешивании. Для удаления свободного Fab-фрагмента проводится 2 отмывки МНЧ в 300 мкл фосфатного буфера на 100 kDa микроцентрифужных колонках осаждением в течение 5 минут при ускорении 1100g. Далее конъюгированные с антителами и меченные Fab-фрагментом МНЧ растворяют в первоначальном объеме.
Подготовленные таким образом комплексы МНЧ, меченных Fab-фрагментами и конъюгированных с антителами, инкубируют с концентратом экзосом из плазмы крови в течение часа при температуре 40 °C. Затем окрашивают раствор комбинацией моноклональных антител, специфичных к интересующим клеточным антигенам на поверхности экзосом, инкубируя раствор в течение 20 минут при комнатной температуре при перемешивании. Для контроля специфичности окрашивания, к половине раствора с комплексами МНЧ-экзосомы добавляют не специфичные антитела, а флуоресцентные изотипические контроли (которые не связываются с экзосомами), которые также используют для анализа на проточном цитометре.
Затем проводится выделение образовавшихся комплексов МНЧ-экзосомы-антитело с помощью магнитных колонок в сильном магнитном поле для их очистки от свободных флуоресцентных антител. После иммобилизации меченных антителами комплексов МНЧ-экзосомы в магнитном поле, проводится трехкратное промывание магнитных колонок моющим раствором, содержащим фосфатный буфер, 0,5% BSA, 2 мМ ЭДТА, для удаления не связавшихся флуоресцентных антител. Следующим этапом содержимое колонки вымывается вне магнитного поля, растворяется в 400 мкл фосфатного буфера и фиксируется добавлением 200 мкл 4% параформальдегида. Полученные МНЧ-экзосомы комплексы, меченные антителами, используются для анализа на проточном цитометре. Для подсчета абсолютного количества событий и возможности определения концентрации экзосом в образце в каждую пробирку непосредственно перед анализом на проточном цитометре добавляют 50 мкл полистереновых частиц известной концентрации (в диапазоне 1000±100 микросфер/мкл). Этот способ выбран за прототип.
Недостаток данного способа заключается в том, что при обработке крови происходит выделение только отдельного типа внеклеточных везикул - экзосом. Остальные типы внеклеточных везикул удаляются из раствора в процессе выделения. Более того, при выделении экзосом и их концентрировании с помощью существующих стандартных наборов с раствором тромбопластина происходит значимое изменение концентрации и соотношения различных типов везикул за счет образования микротромба, внутрь которого удаляется большинство тромбоцитарных экзосом и других внеклеточных везикул. Кроме того, для анализа минорных фракций внеклеточных везикул недостаточно проводить первичное выделение везикул с помощью МНЧ, конъюгированных с антителами, специфичными к общим поверхностным антигенам экзосом.
Задачей изобретения является определение состава индивидуальных внеклеточных везикул в крови человека.
Технический результат заключается в определении состава всех фракций индивидуальных внеклеточных везикул (EVs) в крови человека для дальнейшего изучения их роли в патогенезе атеросклероза и процессе дестабилизации атеросклеротических бляшек.
Это достигается за счет того, что для проведения анализа используют плазму крови, обедненную тромбоцитами, не проходящую предварительную обработку, а для анализа минорных фракций внеклеточных везикул проводят их концентрирование за счет использования МНЧ с антителами, специфичными к поверхностным маркерам, характерным для этих фракций везикул.
Из способа выделения внеклеточных везикул был удален этап концентрации и выделения экзосом с помощью стандартного раствора с тромбопластином, после чего проводился анализ всех типов внеклеточных везикул, взятых напрямую из обедненной тромбоцитами плазмы крови человека. За счет исключения из протокола этапа концентрирования экзосом с помощью раствора тромбопластина не происходило образование микротромба и удаление тромбоцитарных внеклеточных везикул из раствора.
Кроме того, для анализа минорных фракций внеклеточных везикул проводилось их концентрирование за счет использования МНЧ с антителами, специфичными к поверхностным маркерам, характерным для этих фракций везикул (например, CD31 - для анализа преимущественно эндотелиальных везикул, CD41 - для анализа тромбоцитарных везикул и т.д.).
Результаты экспериментов демонстрировали менее чем 1% неспецифического окрашивания при соотношении с окраской изотипическим контролем. Для оценки эффективности способа проводили выделение определенной фракции везикул с помощью МНЧ, конъюгированных с антителами к CD81, их окрашивание с помощью антител к любому другому поверхностному маркеру. Затем измеряли точное количество позитивных событий (несущих данный маркер везикул) с помощью проточного цитометра. На втором этапе повторно выделяли ту же фракцию везикул из остаточного раствора с помощью МНЧ, конъюгированных с антителами к CD81, окрашивали их тем же флуоресцентным антителом и повторно проводили измерение количества позитивных событий с помощью проточного цитометра к любому другому поверхностному маркеру. При повторном анализе мы обнаруживали менее 0,1% от общего количества исследуемых везикул, таким образом, эффективность предлагаемого способа составляет 99,9%.
Для оценки специфичности разработанного способа разделяли подготовку EVs на 2 фракции, которые по отдельности окрашивались различными цветами. Затем объединяли две фракции и выполняли все этапы нашего способа. Агрегаты везикул при анализе на проточном цитометре должны были быть положительными по обеим окраскам. При анализе результатов определили, что образуется менее 9% агрегатов. Таким образом, более 90% событий, определенных проточным цитометром, являются индивидуальными везикулами, что подтверждает специфичность разработанного способа.
Способ осуществляется следующим образом: в качестве материала для определения внеклеточных везикул используют образец крови пациента, взятый из периферической вены во вторую по счету вакуумную пробирку с 3,2% раствором цитрата натрия, образец крови хранят при комнатной температуре не более 15 минут; пробирки с кровью центрифугируют 15 мин при ускорении 3000g, отбирают верхнюю фракцию, получая плазму, обедненную тромбоцитами; после чего раствор плазмы замораживают, хранят при температуре не выше -80°C не менее 6 часов до продолжения исследования; затем плазму размораживают при комнатной температуре; после чего проводят связывание EVs, взятых из подготовленной плазмы крови, с МНЧ размерами 15 нм, предварительно конъюгированными с антителами, специфичными к различным поверхностным антигенам везикул, как общим (CD81, CD63, МНС-1), так и более специфичным (CD31, CD41 и др.) для концентрирования минорных фракций везикул, и меченными 5 мкг флуоресцентного Fab-фрагмента иммуноглобулина G козлиных антител, специфичных к иммуноглобулинам мыши; для связывания EVs с МНЧ их инкубируют в течение часа при температуре 4°C; затем окрашивают полученный раствор МНЧ-EVs комбинацией моноклональных антител, специфичных к интересующим клеточным антигенам на поверхности внеклеточных везикул, инкубируя раствор в течение 20 минут при комнатной температуре при перемешивании; при этом к половине растворов с комплексами МНЧ-EVs добавляют не специфичные антитела, а флуоресцентные изотипические контроли; далее проводят иммобилизацию комплексов МНЧ-EVs-антитело с помощью магнитных колонок в сильном магнитном поле и трехкратное промывание магнитных колонок моющим раствором, содержащим фосфатный буфер, 0,5% BSA, 2 мМ ЭДТА, после чего содержимое колонки вымывают вне магнитного поля, растворяют в 400 мкл фосфатного буфера и фиксируют добавлением 200 мкл 4% параформальдегида; далее в каждую пробирку перед анализом на проточном цитометре добавляют 50 мкл полистереновых частиц известной концентрации (в диапазоне 1000±100 микросфер/мкл); полученные МНЧ-EVs комплексы, меченные антителами, анализируют на проточном цитометре, определяя различные по фенотипу фракции индивидуальных внеклеточных везикул.
Пример №1
В качестве источника исследуемого материала была взята плазма крови пациента мужского пола 58 лет. Кровь была взята из периферической вены во вторую по счету вакуумную пробирку с 3,2% раствором цитрата натрия. Образец крови хранился при комнатной температуре 5 минут. Затем образцы крови были центрифугированы в течение 15 мин при ускорении 3000g. Из пробирок была отобрана верхняя фракция - плазма крови, свободная от тромбоцитов. Раствор плазмы был заморожен и хранился до последующего анализа в течение 2 недель при температуре -83°С. Далее образцы плазмы разморозили при комнатной температуре.
Затем образцы плазмы были разделены на 3 части, и проводилось связывание EVs напрямую из плазмы крови с 3 типами МНЧ, соответственно. Использовались 3 типа МНЧ, которые на подготовительном этапе были конъюгированы с антителами, специфичными к общему поверхностному маркеру CD63 и к более узким маркерам CD31 и CD41, соответственно, и были мечены 5 мкг флуоресцентного Fab-фрагмента иммуноглобулина G козлиных антител, специфичных к иммуноглобулинам мыши. Для связывания EVs с МНЧ, меченными Fab-фрагментами и конъюгированными с антителами, образцы EVs в плазме крови инкубировали с комплексами МНЧ в течение часа при температуре 4°С.
Следующим этапом растворы были окрашены комбинацией моноклональных антител, специфичных к клеточным антигенам на поверхности внеклеточных везикул: для везикул, конъюгированных с МНЧ-CD31, - с антителами к CD41a и CD63; для везикул, конъюгированных с МНЧ-CD41, - с антителами к CD31 и CD63; для везикул, конъюгированных с МНЧ-CD63, - с антителами к CD31 и CD41a. К половине образцов с комплексами МНЧ-EVs добавили не специфичные антитела, а флуоресцентные изотипические контроли. Все растворы инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре при перемешивании.
Далее была проведена иммобилизация образовавшихся комплексов МНЧ-EVs-антитело с помощью магнитных колонок в сильном магнитном поле и трехкратное промывание магнитных колонок моющим раствором, содержащим фосфатный буфер, 0,5% BSA, 2 мМ ЭДТА. Затем содержимое колонок вымыли вне магнитного поля, растворили в 400 мкл фосфатного буфера и фиксировали добавлением 200 мкл 4% параформальдегида. Для подсчета абсолютного количества событий в каждую пробирку непосредственно перед анализом на проточном цитометре добавили 50 мкл полистереновых частиц концентрации 1013 микросфер/мкл. Полученные МНЧ-EVs комплексы, меченные антителами, использовали для анализа на проточном цитометре.
При анализе результатов на проточном цитометре все события были разделены на 4 разные популяции, различающиеся флуоресценцией специфических антител. Для MNP-CD31-EVs это были популяции: Q1 CD41a+CD63-; Q2 CD41a+CD63+; Q3 CD41a-CD63+. Для MNP-CD41-EVs это были популяции: Q1 CD31+CD63-; Q2 CD31+CD63+; Q3 CD31-CD63+. Для MNP-CD63-EVs это были популяции: Q1 CD31-CD41a+; Q2 CD31+CD41a+; Q3 CD31+CD41a-.
Абсолютная концентрация везикул плазмы рассчитывали следующей формулой:
Абсолютная концентрация микровезикул = (Общее количество микровезикул × конечная концентрация полистереновых частиц)/(Общее количество полистереновых частиц).
Конечную концентрацию частиц для подсчета объема рассчитывали, исходя из заводской информации о лоте полистереновых частиц с учетом фактора разведения 1/13.
У пациента определены следующие количества везикул.
Для MNP-CD31-EVs: 4144,6 EVs/мкл CD41a+CD63+; 41247,8 EVs/мкл CD41a+CD63-; 172,0 EVs/мкл CD41a-CD63+.
Для MNP-CD41-EVs: 2537,4 EVs/мкл CD31+CD63+; 19637,2 EVs/мкл CD31+CD63-; 807,1 EVs/мкл CD31-CD63+.
Для MNP-CD63-EVs: 12324,2 EVs/мкл CD31+CD41a+; 62,3 EVs/мкл CD31+CD41a-; 12925,5 EVs/мкл CD31-CD41a+.
Таким образом, у пациента определено значимое увеличение концентрации спектра индивидуальных внеклеточных везикул.