Применение метода радиального гемолиза для выявления антител к вирусам гриппа птиц a(H5N1) и пандемическому вирусу a(H1N1)pdm09

иммунология

© коллектив авторов, 2012

удк 616.921.5-078.33

Е. м. Бойцеховская, в. С. вакин, А. А. васильева, Е. в. Кузнецова, в. З. Кривицкая, А. А. Соминина

применение метода радиального гемолиза для выявления антител к вирусам гриппа птиц A(H5N1) И пандемическому вирусу A(H1N1)pdm09

ФГБУ НИИ гриппа Минздравсоцразвития РФ, Санкт-Петербург

Выполнены исследования, показавшие возможность успешного использования реакции радиального гемолиза (РРГ) для анализа прививочного иммунитета у людей к новым штаммам вируса гриппа серотипа А - A(H5N1) и A(H5N2). РРГ дает четкие результаты при введении в гемолитическую систему эритроцитов лошади или барана вместо применявшихся ранее эритроцитов кур. Метод сочетает высокую чувствительность в сравнении с реакциями торможения гемаг-глютинации (РТГА) и микронейтрализации - коэффициент корреляции 0,84-0,85 и полное отсутствие влияния ингибиторов на результаты реакции.

При изучении иммунного ответа переболевших пандемическим вирусом A(HlNl)pdm09 РРГ показала не только преимущественное при пандемии выявление антител к вирусу-возбудителю (67%), но и избирательно повышенную чувствительность в зоне низкотитражных (1:20) сывороток в РТГА, что важно при исследовании уровня антител на ранних сроках заболе-

Таким образом, РРГ остается надежным инструментом оценки количественных и качественных показателей гуморального иммунитета у заболевших и привитых новыми штаммами вируса гриппа людей.

Ключевые слова: радиальный гемолиз, вирус гриппа птиц, пандемический вирус

Ye. M. Voytsekhovskaya, VS. Vakin, A.A. Vasilyeva, Ye.V. Kuznetsova, V.Z. Krivitskaya, A.A. Sominina THE APPLICATION OF RADIAL HEMOLYSIS TECHNIQUE IN DETECTION OF ANTIBODIES TO AVIAN INFLUENZA VIRUS A (H5N1) AND PANDEMIC VIRUS A (H1N1) PDM09 The article discusses the results of study that demonstrated the possibility of successful application of radial hemolysis reaction in analyzing the human inoculation immunity to new strains ofinfluenza virus serotype A - A (H5N1) andA (H5N2). The radial hemolysis reaction provides accurate results on introduction of erythrocytes of horse or sheep into hemolytic system instead of erythrocytes of hens applied previously. The technique combines high sensitivity (in comparison with reactions of hemagglutination-inhibition and micro-neutralization, correlation coefficient 0.84-0.85) and total absence of inhibitors impact on the reaction results. During the investigation of immune response of patients who had pandemic virus A (H1N1) pdm09, radial hemolysis reaction demonstrated not only primary detection of antibodies to virus-agent (67%) during pandemic, but also elective heightened sensibility in the zone of low titer serums (1:20) in hemagglutination-inhibition reaction. These characteristics are very important in analysis of antibodies levels at early stages of disease. The radial hemolysis reaction continues to be a reliable instrument in evaluating qualitative and quantitative indicators of humoral immunity in ill patients and persons inoculated with new strains of human influenza virus.

Key words: radial hemolysis, avian influenza virus, pandemic virus

Реакция радиального гемолиза (РРГ) - модификация метода локального гемолиза. N. Jeme и А. Nordin [16] была введена в практику вирусологии G. Schild и соавт. [21] и широко применялась для изучения постгриппозного гуморального иммунитета и антигенных связей вирусов гриппа [11, 17, 19].

В первых работах по изучению РРГ основным звеном в индикаторной гемолитической системе служили эритроциты кур с химически прикрепленным к ним вирусом гриппа. Часть авторов [20] использовала для РРГ традиционный для локального гемолиза вид эритроцитов - эритроциты барана, что в тот период не давало значительных преимуществ в эффективности метода.

В НИИ гриппа МЗ СССР в 80-90-е годы прошлого века эта реакция под названием «реакция пассивного радиального гемолиза» (РПРГ) была методически освоена вначале с куриными

Для корреспонденции:

Войцеховская Елена Михайловна, ст. науч. сотр.

Адрес: 197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 15/17

Телефон: (812)234-62-65

E-mail: elenavoicex@gmail.ru

эритроцитами [7, 8] и далее широко использовалась как РРГ с введением в систему гемолиза эритроцитов барана для изучения поствакцинального иммунитета у привитых людей [2, 3].

В связи с появлением новых потенциально опасных для человека вирусов гриппа птиц - А(Н5№), А(Н7П7) и др. -эритроциты кур становятся менее чувствительным инструментом в обычных диагностических реакциях (реакция гемагглютинации - РГА, реакция торможения гемагглюти-нинации - РТГА) вследствие иной специфичности новых штаммов к сиаловым рецепторам [15, 18] в сравнении с человеческими вирусами гриппа.

Одновременно возобновились попытки ввести в диагностику методы РГА и РТГА, но с применением в индикаторной системе эритроцитов лошади [22, 23] и вернуть в практику метод РРГ [10, 14, 24].

В лаборатории биотехнологии диагностических препаратов НИИ гриппа, где РРГ прежде использовалась для оценки штаммовых различий у вирусов гриппа, был проведен ряд экспериментов по применению реакции радиального гемолиза с новыми вирусами гриппа птиц.

Эти эксперименты с введением в реакцию радиального гемолиза эритроцитов кур показали низкую чувствитель-

ность вследствие неполного гемолиза в зонах, поэтому методика РРГ требовала дальнейшего усовершенствования.

В задачу исследования входила проверка возможности адаптации метода РРГ для диагностики вирусов гриппа птиц (сероподтипы H5N1 и H5N2) и повышения эффективности реакции при введении в индикаторную систему эритроцитов лошади.

Помимо этого, изучались показатели РРГ при оценке гуморального иммунитета у людей в период пандемии к референс-штамму пандемического гриппа А/Калифорния/07/09 (H1N1) pdm09 в сравнении с сезонными вирусами гриппа серотипа А.

Материалы и методы. 1. Материалы. Вирусы. В связи с высоким уровнем патогенности природных изолятов для исследований были взяты реассортантные и вакцинные штаммы:

- А/Брисбен/59/07 (H1N1),

- А/Брисбен/10/07 (H3N2),

- А/Индонезия/05/2005 (H5N1),

- A/NIBRG-14(H5N1),

- А/Утка/Потсдам/86/92 (H5N2),

- А/Калифорния/07/09(НШ1)рат09.

Эритроциты. Эритроциты кур применяли в РГА, РТГА

и РРГ.

Эритроциты барана служили для сравнения при постановке РРГ традиционным способом [4].

Эритроциты лошади использовали для РГА, РТГА и реакции радиального гемолиза как наиболее вероятные альтернативные и, возможно, более чувствительные к вирусам птиц клетки крови.

Сыворотки. Исследовали сыворотки вакцинированных или переболевших гриппом людей. Для освобождения от ингибиторов сыворотки обрабатывали рецепторразрушающим энзимом (RDE фирмы «Denka Seiken Со, LTD», Токио, Япония) в соответствии с рекомендациями ВОЗ или прогревали при 560С в течение 30 мин.

Комплемент. В качестве комплемента в РРГ использовали стандартный препарат «Комплемент сухой», выпускаемый ФГУП НПО «Микроген» в ампулированной форме (ампулы по 1,0 мл).

Агароза. При подготовке агарозного покрытия для РРГ применяли агарозу фирмы «Sigma» - А9539 для молекулярно-биологических целей.

2. Методы. Реакции гемагглютинации и торможения ге-магглютинации. РГА и РТГА выполнялись в соответствии с Методическими рекомендациями НИИ гриппа [4].

Реакция микронейтрализации. Реакция микронейтрализации (РМН) ставилась по методике, представленной в методических рекомендациях, разработанных в ФГБУ НИИ гриппа Минздравсоцразвития РФ [5] (утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Г. Г. Онищенко от 03.06.09 № 01/7752-9-34).

Реакция радиального гемолиза. РРГ проводили по методике, приведенной в методических рекомендациях НИИ гриппа [1].

Эритроциты барана, трижды отмытые 0,01М ФСБ (рН), обрабатывали 5 • 10-4 М раствором перйодата калия при перемешивании. К осадку эритроцитов добавляли равный объем раствора КЮ4, смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 10 мин, центрифугировали при 1300 g в течение 15 мин и разводили ФСБ до 25% концентрации. Затем к эритроцитам добавляли вирус в соотношении 500-1000 ГЕ/0,2 мл. Смесь перемешивали, осаждали и ресуспендиро-вали в ФСБ.

Осадок сенсибилизированных эритроцитов разводили ФСБ до 25% концентрации и разливали по пробиркам по 0,2 мл. В каждую пробирку добавляли по 0,1 мл комплемента и 2,6 мл 1,5% раствора агарозы, смесь быстро перемешивали и переносили в иммунопластины или на предметные стекла. После полного застывания геля в нем вырезали 2 ряда лунок

диаметром 3 мм, агар из лунок удаляли пипеткой. Пластины хранили в течение 3-4 дней при 40С.

Контрольные пластины готовили из эритроцитов той же серии тем же способом, исключая этап добавления вируса.

При постановке РРГ в лунки вносили по 10 мкл парных сывороток в разведении 1:10. Увеличение диаметра зоны гемолиза на 1 мм во второй сыворотке по отношению к первой считали достоверным.

Статистическая обработка данных. В работе применялся метод корреляционного анализа для установления связи между применяемыми методами (РТГА, РМН, РРГ) при оценке гуморального иммунитета [6]. Корреляционные связи между РМН и РРГ (табл. 1), РТГА и РРГ (табл. 2) вычисляли по формуле:

Е ! • с!

X у ^ =-

Е !2 • !2

х у 5

где ^ - коэффициент корреляции; х, у - коррелируемые ряды (РТГА и РРГ, РМН и РРГ); ! - отклонение от среднеарифметического I ряда; ! - отклонение от среднеарифметического II ряда; Е - знак суммы.

Результаты и обсуждение. 1. Использование эритроцитов лошади и барана в РРГ для определения антител к вирусам гриппа птиц A(H5N1), A(H5N2).

В опытах сравнительного исследования наряду с РРГ были использованы традиционные серологические тесты: РТГА и РМН, рекомендованные ВОЗ для оценки поствакцинального гуморального иммунитета.

Выявление А(Н5№)-специфичных антител в РРГ было проведено на материалах парных сывороток от волонтеров, привитых одним из вариантов вакцин на основе вирусов А(Н5№), А(Н5№). В качестве антигена в РРГ и реакциях сравнения применялся штамм А/Индонезия/05/2005(Н5№).

Таблица 1

сравнительные данные по определению Ат к вирусу гриппа А/индонезия/05/2005(И5Ш) различными методами

Номер парных сывороток Значения титров в РТГА Значения титров в РМН* Размер зон гемолиза в РРГ*, диаметр, мм**

1 < 10/80 < 10/320 0/6

2 < 10/80 < 10/160 0/5

3 < 10/80 < 10/320 0/8

4 < 10/40 < 10/320 0/8

5 < 10/80 < 10/320 0/8

6 < 10/80 < 10/160 0/5

Примечание. Здесь и в табл. 2: * - ряды сравнения для определения коэффициента корреляции, ** - 0 - полное отсутствие зоны гемолиза.

Таблица 2

сравнительные данные по выявлению Ат к вирусу гриппа А/17/Утка/Потсдам/86/92(H5N2) различными методами

Номер парных сывороток Значения титров в РТГА Значения титров в РМН Размер зон гемолиза в РРГ*, диаметр, мм**

1 < 10/160 < 10/320 0/6

2 < 10/320 < 10/320 0/7

3 < 10/320 < 10/320 0/7

4 < 10/160 < 10/80 0/6

5 < 10/160 < 10/160 0/5

6 < 10/160 < 10/320 0/6

Таблица 3

Частота выявления сероконверсий н5-специфичных антител в сыворотках волонтеров после двукратной иммунизации вакциной против вируса гриппа А/индонезия/05/2005 (ЖШ), по данным различных серологических реакций

Антиген, использованный в реакции Частота (в %) выявления сероконверсий в реакциях

РМН РТГА радиального гемолиза

с эритроцитами барана с эритроцитами лошади

А/Индонезия/05/2005 А(Н5Ш) 100 70 70 50

МВЯО-14 А/Вьетнам/1194/2004 А(Н5Ш) 100 55 60 30

А/17/Утка/Потсдам/86/92 А(Н5Ш) 80 45 35 20

РРГ при оценке иммуногенности вакцины на основе штамма А/Индонезия/05/2005 с эритроцитами лошади оказалась достаточно информативной реакцией при сравнении с традиционными серологическими методами - РТГА и РМН (см. табл. 1).

Сходные данные были получены при оценке иммуногенности вакцины из вируса А/17/Утка/Потсдам/86/92 Н5№ (см. табл. 2).

Таким образом, РРГ позволяла четко выявлять приросты антител в сыворотках привитых во всех случаях сероконверсий, определенных в РТГА и РМН.

Размер зон гемолиза в РРГ коррелировал с титрами антител в РТГА и МН. Коэффициенты корреляции (0,84-0,85) отражали высокую степень соответствия сравниваемых величин в сопоставляемых рядах. Корреляцию титров антител (АТ) в стандартных серологических реакциях РТГА и РРГ отмечали многие исследователи [9], что ставит эти реакции в один ряд по диагностической ценности. Показано, что при соблюдении ряда условий штаммоспецифическая чувствительность РРГ превышала таковую при анализе в РТГА и РИНА [12, 21].

Сравнительный анализ результатов РТГА с использованием лошадиных эритроцитов и РРГ - с эритроцитами барана и лошади - по выявлению Н5-специфичных АТ был проведен при исследовании парных сывороток, полученных от 20 волонтеров до и после двукратной иммунизации вакциной, приготовленной из вируса гриппа А(Н5№), штамм А/ Индонезия/05/2005 (содержание ГА 30 мкг/ доза).

Полученные результаты показали, что формирование АТ, специфичных к различным субклайдам вируса гриппа А(Н5), выявлялось приблизительно с одинаковой частотой в РРГ (при использовании эритроцитов барана) и РТГА. При использовании в РРГ эритроцитов лошади Н5-антитела в сыворотках привитых выявляли на 20-25% реже, чем в РТГА. При этом РМН оставалась наиболее чувствительным методом (табл. 3).

Анализ результатов РРГ показал, что с ее помощью уверенно выявляются изменения уровня формирующихся АТ в отношении вирусов гриппа птиц А(Н5№), А(Н5№). РРГ достаточно успешно проходит с введением в индикаторную систему эритроцитов лошади и барана, однако с эритроцитами барана частота выявления сероконверсий была отчетливо выше (на 20-30%).

Таким образом, РРГ в предложенной модификации может служить ценным дополнением к обычным серологическим реакциям (РТГА, РМН) как инструмент диагностики в изучении новых вирусов гриппа птиц - сероподтипов Н5№, Н5№.

2. Применение РРГ для выявления АТ к вирусу А(НШ1) р/^т09. Возможности РРГ в сравнительных экспериментах объективно отражать иммунный статус привитых людей получили подтверждение при изучении сывороток заболевших в период последней пандемии гриппа 2009-2010 гг.

Сыворотки от больных были получены в период с сентября по декабрь 2010 г. Для сравнения эти сыворотки были

Таблица 4

сравнительные данные исследования сывороток заболевших людей в эпидемический период 2010 г. в ррг и ртгА

№/п/п А/Калифорния/07/09 А(НШ1^т09 А/Брисбен/59/07 А(НШ1) А/Брисбен/10/07 А(Н3Ш) Диагноз

РТГА РРГ РТГА РРГ РТГА РРГ

1 10/10 0/0 10/20 0/0* 10/40 0/5 Н3Ш

2 10/20 0/5 < 10/10 0/0 20/20 0/0* (Н1Ш^т09

3 < 10/10 0/5 < 10/<10 0/0 10/20 0/4* Н3Ш

4 < 10/10 0/0 20/20 0/0* 10/10 0/0* -

5 10/10 0/5 < 10/10 0/0* 10/10 0/0* (Н1Ш^т09

6 10/20 0/5 20/20 0/0* < 10/< 10 0/0 (Н1Ш^т09

7 20/20 0/0 < 10/1280 0/7 80/80 4/4 НШ1

8 40/80 4/4 20/20 0/0* 40/80 4/5 Н3Ш

9 20/40 0/0 80/80 4/4 80/160 5/6 Н3Ш

10 40/80 4/4 320/320 6/6 160/160 8/8 -

11 80/320 5/7 40/40 0/0* 40/40 0/0* (Н1Ш^т09

12 40/80 4/4 < 10/10 0/0* 80/160 4/5 Н3Ш

13 20/20 0/0* 40/80 0/4 20/40 0/0* НШ1

14 20/80 4/6 40/40 0/0* 20/40 0/0* (Н1Ш^т09

15 10/20 0/0* 40/160 4/6 80/80 4/4 НШ1

Число приростов АТ 2 6 2 3 1 5

Примечание. *- сыворотки с наличием ингибиторов по данным РТГА.

изучены в РРГ и РТГА, где антигенами служили референс-штамм пандемического вируса гриппа - А/Калифорния/07/09 (Н1N1)pdm09 и указанные выше сезонные штаммы вируса гриппа подтипов А(Н1Ш) и А(Н3№).

Сравнение данных РРГ и РТГА показало, что РРГ позволяет отчетливо дифференцировать приросты антител при гриппе, вызванном пандемическим и сезонным вирусами гриппа А(НЖ1) (табл. 4). Весьма ценно, что с помощью РРГ оказалось возможным выявить отчетливые приросты антител к пандемическому вирусу при отрицательных результатах РТГА (№ 2-3, 5-6). Ранее на более высокую степень чувствительности РРГ при определении низких концентраций АТ в сыворотках вакцинированных вирусом гриппа В указывал А. Goodeve [13]. По его данным, в РРГ уровень 50% защиты привитых от гриппа соответствовал разведению сыворотки 1:20 в РТГА.

Частота выявления сероконверсий в ответ на первичную инфекцию пандемическим вирусом гриппа в РРГ и РТГА составила 40 и 15% соответственно. Синхронных конверсии к сезонному вирусу в РРГ зарегистрировано не было, что свидетельствует о высокой специфичности реакции. Конверсии к сезонному вирусу гриппа А(НШ1) были выявлены у трех других больных гриппом, у двух из них - одновременно и в РТГА. Таким образом, при анализе поступивших 15 сывороток от больных ГПЗ в период эпидемического сезона 2010 г. с помощью РРГ этиологический диагноз был поставлен в 10 (67%) из 15, в РТГА - в 5 (33%) случаях, что, несомненно, свидетельствует о большей чувствительности РРГ.

В тех случаях, где приросты антител формировались за счет ингибиторов сывороток, РРГ позволяет оценить истинные уровни АТ к вирусам гриппа, поскольку на ее результаты не влияют в отличие от РТГА неспецифические ингибиторы. Такая возможность вытекает из особенности постановки РРГ, где к комплексу антиген-антитело присоединяется комплемент [21], и таким образом только наличие специфического комплекса обусловливает гемолиз.

Заключение. На ряде примеров была показана возможность успешного использования реакции радиального гемолиза для анализа иммунного ответа у привитых людей и иммунизированных животных к новым штаммам вируса гриппа А серо-подтипов Н5№, Н5№. РРГ дает четкие результаты при введении в индикаторную систему эритроцитов лошади или барана. Показана возможность применения РРГ для анализа иммунного ответа на новый пандемический штамм А(Н1N1)pdm09. РРГ сочетает высокую чувствительность с устойчивостью к воздействию неспецифических ингибиторов, ее данные четко коррелируют с результатами других методов серологического обследования, но в ряде случаев РРГ по чувствительности опережает традиционные тесты (РТГА).

К числу достоинств РРГ относится отсутствие необходимости титрования сывороток, что снижает трудоемкость анализа.

Таким образом, РРГ является надежным инструментом оценки качественных и количественных показателей (зоны гемолиза) гуморального иммунитета у переболевших гриппом и привитых вакцинами людей.

ЛИТЕРАТУРА

1. Олейникова Е. В., Соминина А. А., Каторгина Л. Г. и др.// Ускоренная лабораторная диагностика острых респираторных вирусных инфекций: Метод. рекоменд. - Алма-Ата, 1987. - С. 35.

2. Соминина А. А., Войцеховская Е. М., Васильева Р. И. // Сб. трудов НИИ охраны здоровья матери и ребенка. - Ашхабад, 1986. - С. 25-30.

3. Соминина А. А., Войцеховская Е. М., Зощенкова Н. Я. и др. // Микробиол. журнал. - Киев, 1989. - Т. 51 (4). - С. 54-59.

4. Соминина А. А., Бурцева Е. И., Лобова Т. Г. и др. // Выделение вирусов гриппа в клеточных культурах и куриных эмбрионах и их идентификация. Метод, рекоменд. - СПб, 2006.

5. Соминина А. А., Кривицкая В. З., Третьякова Н. В. и др. // Выявление антител к вирусам гриппа A(H5N1) в сыворотках людей и животных при естественной инфекции и вакцинальном процессе в реакции нейтрализации: Метод. рекоменд. - М., 2009.

6. Шляхов Э. Н. // Практическая эпидемиология. - Кишинев, 1986.

- С. 93.

7. Юркова Г. Е. // Эпидемиология и диагностика гриппа и других ОРЗ: Сб. науч. трудов. - Ленинград, 1982. - С. 61-66.

8. Юркова Г. Е., Свердлов А. Б., Громова М. К. // Иммунитет и неспецифическая резистентность к гриппу и другим ОРЗ: Сб. науч. трудов. - Ленинград, 1984. - С. 95-103.

9. Al-Khayatt R., Jennings R., Potter C. W. // J. Hyg. - 1984. - Vol. 93 (2). - P. 301-312.

10. BanzhoffA., GaspariniR., Eaghi-PasiniF. et al. // PLoS One. - 2009.

- Vol. 4 (2). - e4384.

11. Callow K. A., Beare A. S. // J. Infection and Im^nity. - 1976. - Vol. 13. - P. 1-8.

12. FarrohiKh., FarrohiF. K., Noble G. R. et al. // J. of Clin. Microbiol.

- 1977. - Vol. 5. - P. 353-360.

13. Goodeve A. C., Jennings R., Potter C. W. // J. Biol. Stand. - 1983. -Vol. 11 (4). - P. 289-296.

14. Guo Y. J., WangM., Zhang Y. et al. // Zhonghua Shi Yan He Lin Ch-uang Bing Du Xue Za Zhi. - 2006. - Vol. 20 (2). - P. 3-6.

15. Но Т., Suzuki Y., MitnaulL. et al. // Virology. - 1997. - Vol. 227 (2).

- P. 492-499.

16. JerneN. K., Nordin A. A. // J. Science. - 1963. - Vol. l40 (3565). - P. 405.

17. Mancini G., Donatelli I., Arangio-Ruiz G. et al. // J. Hyg. - 1983. -Vol. 91 (1). - P. 157-162.

18. Morishita Т., Nobusawa E., Nakajima K. et al. // J. Gen. Virol. -1996. - Vol. 77. - P. 2499-2506.

19. Oxford J. S., Schild G. C. // J. Hyg. - 1979. - Vol. 82 (1). - P. 5161.

20. Russel S. M., McCahon D., Beare A. S. // J. Gen. Virol. - 1975. - Vol. 27 (1). - P. 1-21.

21. Schild G. C., Pereira M. S., Chakraverty P. // Bull. World Health Organ. - 1975. - Vol. 52 (1). - P. 43-50.

22. Stephenson I., Wood J. M., Nicholson K. G. et al. // J. Med. Virol. -2003. - Vol. 70 (3). - P. 391-398.

23. Treanor J. J., Campbell J. D., Zangwill K. M. et al. // N. Engl. J. Med.

- 2006. - Vol. 354 (13). - P. 1343-1351.

24. Van Damme P., Arnou R., Kafeja F. et al. // BMC Infect. Dis. - 2010.

- Vol. 10. - P. 134.

Поступила 01.12.11