СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ СПЕРМАТОГЕНЕЗА
METHOD FOR STIMULATION OF SPERMATOGENESIS

Область техники
Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для стимуляции восстановления мужской фертильности, в том числе при лечении нарушений фертильности, вызванной врожденным или приобретенным нарушением функции сперматогенной ткани семенников.
Уровень техники
Наиболее типичными проявлениями дисфункции органов мужской половой сферы является импотенция и мужское бесплодие, одной из основных причин которых могут служить нарушения сперматогенеза и сниженный уровень мужских половых гормонов. Подобные нарушения могут носить первичный характер или проявляться вторично как последствия иных заболеваний, в частности простатита или венерических заболеваний. По степени тяжести неблагоприятных социальных последствий ВОЗ поставила проблему мужского бесплодия сразу вслед за проблемами онкологических и сердечно-сосудистых заболеваний.
Лечение нарушений мужской половой функции очень часто носит симптоматический характер. Из уровня техники известно, что наиболее распространенным способом лечения андрогенной недостаточности, связанной с нарушениями сперматогенеза, является гормонотерапия, в первую очередь, с использованием тестостерона и его синтетических аналогов. Однако в большинстве случаев гормонотерапия не приводит к полному восстановлению нормальной репродуктивной и сексуальной функций, кроме того, наблюдаемый эффект от лечения является кратковременным.
Известен способ лечения андрогенной недостаточности при вторичном гипогонадизме путем трансплантации пациенту гипофизарно-гипоталамического комплекса (Кирпатовский И.Д., «Очерки по хирургической андрологии», М., 1989 г.). К недостаткам способа относятся высокая сложность операции и труднодоступность трупного донорского аллотрансплантата.
Другим известным способом лечения андрогенной недостаточности методом трансплантации является пересадка донорского яичка на сосудистых связях (Хирургическая коррекция эндокринной импотенции, И.Д. Кирпатовский, Д.Л. Горбатюк). Однако сложность и травматичность оперативного вмешательства, необходимость проведения иммуносупрессивной терапии, а также необходимость использования труднодоступного трупного или донорского материала делают этот метод малоприменимым.
Из уровня техники известны способы лечения больных с нарушением мужской половой функции методом трансплантации клеток Лейдига через семенной канатик (Патенты РФ №№2200010, 2200012). Задачей изобретений является снижение травматичности и повышение приживаемости клеточного трансплантата. Поставленная задача достигается способом лечения больных с нарушениями мужской половой функции, заключающимся в том, что вводят 1,0 мл 2,5% суспензии гидрокортизона ацетата в толщу мошоночного отдела семенного канатика или проводят многократные инфузии озонированного физиологического раствора, а затем имплантируют не менее 2 млн. жизнеспособных клеток Лейдига эмбрионального происхождения. Недостатком этих способов является недостаточное восстановление фертильности.
Из уровня техники известен способ восстановления репродуктивных функций яичников с помощью введения мезенхимных стволовых/стромальных клеток (МСК), выделенных из кожи (CN 103816184). Однако, неизвестно, насколько этот способ может быть применен для лечения мужского бесплодия, поскольку механизмы образования женских и мужских половых клеток значительно различаются.
Другим источником стволовых и прогениторных клеток, которые могут быть использованы для профилактики и лечения инфертильности, является плацента, для этой же цели предлагается использовать экстракт плаценты (KR 20120022327). Однако, в указанном способе описаны методы получения данных препаратов, в то время как способы их применения по заявленным показаниям не раскрыты.
Наиболее близким к заявленному решению можно считать способ лечения мужского и женского бесплодия с помощью введения в системный кровоток или в репродуктивный тракт аутологичных стволовых и прогениторных клеток, выделенных из костного мозга, периферической крови или стромально-васкулярной фракции жировой ткани и секретирующих фактор роста гепатоцитов (HGF) (AU 2011100703). Введение клеток может быть дополнено приемом специфического синтетического пептидного препарата, который в дозе более 1 мкг должен связываться с HGF и активировать его. Однако, в отношении стимуляции сперматогенеза ключевая роль HGF, секретируемого вводимыми клетками, не доказана. Кроме того, не определена эффективная доза клеточного материала, в то же время с учетом предполагаемого механизма действия и путей введения клеток необходимо вводить огромное количество клеток для достижения эффекта, что связано со значительными затратами ресурсов на подготовку препарата и сопряжено с повышенным риском осложнений.
Раскрытие изобретения
Задачей изобретения является создание нового способа лечения мужского бесплодия посредством восстановления сперматогенеза, за счет инъекционного введения биоматериала, обладающего комплексным воздействием на клетки сперматогенного эпителия и клетки яичка, поддерживающие сперматогенез.
Техническим результатом, на достижение которого направлено заявленное изобретение, является повышение эффективности восстановления сперматогенеза путем инъекционного введения в ткани яичка под белочную оболочку комбинированного биоматериала, безопасно и эффективно стимулирующего восстановление сперматогенеза за счет комплексного сбалансированного действия факторов роста и других биологически активных молекул, секретируемых мезенхимными стволовыми/стромальными клетками (МСК) человека в культуральную среду, не содержащую ксеногенных компонентов.
Безопасность способа достигается путем использования бесклеточных низкоиммуногенных компонентов и малотравматичной процедуры введения. Эффективность способа обеспечивается за счет содержания в секретоме МСК факторов, необходимых для поддержания роста, повышения выживаемости и восстановления функции сперматогенных клеток, а также клеток, поддерживающих сперматогенез (клетки Сертоли, клетки Лейдига). Так, большое значение для жизнедеятельности сперматогенных стволовых клеток имеют такие факторы как нейротрофический фактор из глиальных клеток (GDNF), основный фактор роста фибробластов (FGF-2), фактор ингибирования лейкемии (LIF) и другие (Oatley Jon М., Brinster Ralph L., 2008; Park M.H., 2016). Например, для активации процессов дифференцировки сперматогенных стволовых клеток требуется повышение уровня FGF-2 и GDNF. Ключевым фактором, секретируемым клетками Сертоли, которые поддерживают клетки сперматогенного эпителия в семенных канальцах, является GDNF. В работах, посвященных изучению морфогенеза яичек, показано, что фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) не стимулирует образование семенных канальцев и новых кровеносных сосудов, однако приводит к увеличению количества канальцев, содержащих сперматогонии, что указывает на протективную роль VEGF по отношению к сперматогенным стволовым клеткам (Dores С, Dobrinski I., 2014). Таким образом, использование по отдельности факторов роста, даже обладающих положительным действием на сперматогенные стволовые клетки, не позволяет эффективно стимулировать весь процесс сперматогенеза. Предлагаемый в данном изобретении способ включает в себя введение биоматериала, обладающего комплексным воздействием на клетки сперматогенного эпителия и клетки яичка, поддерживающие сперматогенез, за счет многофункционального действия факторов роста и других биологически активных молекул, секретируемых МСК человека и входящих в состав указанного биоматериала.
Поставленная задача решается тем, что способ стимуляции сперматогенеза включает в себя введение под белочную оболочку яичка биоматериала, содержащего смесь из активного компонента и основы, где в качестве активного компонента использована кондиционированная среда, содержащая продукты секреции мультипотентных МСК человека. При этом способ получения биоматериала включает в себя культивирование МСК человека до 4-5 пассажа в среде, поддерживающей рост недифференцированных мезенхимных клеток человека, отмывку клеток буферным раствором, кондиционирование МСК в бессывороточной и лишенной продуктов животного происхождения среде роста, отбор среды культивирования, содержащей продукты секреции МСК человека, очистку от остатков клеток для получения кондиционированной среды, содержащей продукты секреции МСК человека, включающие ключевые для сперматогенеза факторы роста: GDNF в концентрации не менее 50 пкг/мл, VEGF в концентрации не менее 200 пкг/мл, FGF basic в концентрации не менее 0,3 пкг/мл, определяемые методом иммуноферментного анализа, и смешивание кондиционированной среды с коллагеном.
3
2
2
2
2
2
Культивирование может быть осуществлено в культуральных флаконах или чашках Петри (фирмы Corning или аналогичные), при этом клетки выращивают на плоской подложке с плотностью 5-15*10/см в среде роста в объеме 0,1-0,2 мл/см в условиях CO инкубатора при 37±1°С, 5%-ом содержании СО и относительной влажности ≥95% в течение 7±1 дней. В качестве буферного раствора для отмывки клеток от компонентов среды роста используют раствор Хэнкса (фирмы ПанЭко или аналогичный), при этом отмывку клеток осуществляют трех-пятикратным размещением клеток в упомянутый раствор из расчета 0,1-0,2 мл раствора на см клеток на 5-10 минут. Для кондиционирования используют бессывороточную и лишенную продуктов животного происхождения среду роста, в качестве последней может быть использована DMEM с низким содержанием глюкозы (HyClone, USA) или другая среда роста, поддерживающая жизнеспособность МСК человека (не ниже 70%) в течение всего срока кондиционирования и пригодная для терапевтического применения. Удаление из среды культивирования остатков клеток (клеточного дебриса) может быть реализовано центрифугированием, например, при 5000±10 об/мин, температуре 6±2°С в течение 10 минут.
Для повышения эффективности биоматериала кондиционированная среда может быть дополнительно концентрирована в 10-50 раз с помощью ультрафильтрации через мембраны из регенерированной целлюлозы с указанным отсечением 5-10 кДа в центрифужных картриджах (Millipore или аналогичные) или с помощью системы фильтрации в тангенциальном потоке Minim II (Life Sciences), используя ультрафильтрационные кассеты (Minimate TFF capsule, PALL, 5-10 кДа) или аналогичные.
Для получения кондиционированной среды нами использованы МСК человека, отвечающие за репарацию и регенерацию тканей и органов как в норме, так и при повреждениях. Одним из наиболее богатых источников МСК у человека является жировая ткань. МСК могут быть легко выделены в результате ферментативной обработки образцов жировой ткани, полученной в результате косметической липосакции или в ходе хирургического удаления жирового отложения. Культивирование изолированных МСК ЖТ приводит к получению относительно гомогенной популяции мультипотентных стромальных фибробластоподобных клеток.

В заявляемом изобретении могут быть использованы МСК, полученные самостоятельно по любому известному из уровня техники способу (см. Пример 1), так и в виде коммерческих препаратов МСК, имеющих сертификат качества и предназначенных, в том числе, для клинического применения, например, такие как продукт АТСС (АТСС PCS-500-011), представляющий собой МСК человека, выделенные из липоаспирата, культивированные до 2 пассажа и подвергнутые криоконсервации, или аналогичные.
Ранее на моделях ишемии конечности и инфаркта миокарда и подкожно имплантированного матригеля у животных нами было показано, что локальное и системное введение МСК ЖТ способствует увеличению количества сосудов в тканях с нарушенным кровоснабжением, приводит к улучшению кровотока в этих тканях и уменьшению или исчезновению симптомов ишемии. Кроме того, нами было выявлено, что введение МСК ЖТ способствует прорастанию нервных окончаний в подкожно имплантированный матригель и улучшает восстановление периферических нервов после травматического повреждения. Согласно данным наших исследований и работ других научных коллективов, основным механизмом, лежащим в основе регенеративного эффекта МСК ЖТ, является продукция этими клетками широкого спектра биологически активных цитокинов и факторов роста, ускоряющих процессы заживления и восстановления тканей после повреждения. Нами показано, что МСК ЖТ человека продуцируют ключевые факторы, такие как GDNF, VEGF, FGF2, HGF и др., необходимые для поддержания роста, повышения выживаемости и восстановления функции сперматогенных клеток, а также клеток, поддерживающих сперматогенез (клетки Сертоли, клетки Лейдига). Каждый из этих факторов может оказывать положительное влияние на некоторые процессы, влияющие на эффективность восстановления сперматогенеза: так, GDNF необходим для поддержания пула недифференцированных ССК, FGF2 участвует в регуляции дифференцировки ССК в зрелые формы сперматозоидов, VEGF и FGF2 являются проангиогенными факторами роста и оказывают трофический эффект на клетки яичка. Однако использование этих факторов роста по отдельности не позволяет эффективно стимулировать весь процесс сперматогенеза. В то же время использование кондиционированной среды, содержащей в том числе комплекс указанных выше факторов, секретированных МСК ЖТ человека, позволяет добиться восстановления процесса дифференцировки клеток сперматогенного эпителия и их созревания в конечные формы сперматозоидов (при этом в придатках увеличивается как общее число сперматозоидов, так и их подвижная фракция), уменьшения выраженности гипотрофии крипторхированных яичек, значительного снижения числа атрофичных и склерозированных канальцев, а также положительного воздействия на клетки Сертоли и клетки Лейдига, что приводит к восстановлению уровня андрогенов. Таким образом, комплексное воздействие этих факторов обеспечивает улучшенный синергетический эффект предлагаемого способа. При этом эффективная концентрация этих факторов может быть значительно ниже, чем при использовании их по отдельности. В данном изобретении предлагается использовать для стимуляции сперматогенеза биоматериал на основе кондиционированной среды, содержащей секретируемые МСК человека GDNF в концентрации не менее 50 пкг/мл, VEGF в концентрации не менее 200 пкг/мл, FGF basic в концентрации не менее 0,3 пкг/мл, определяемые методом иммуноферментного анализа. При этом использование в составе биоматериала концентрированной кондиционированной среды с более высокой концентрацией указанных факторов позволяет добиться лучшего клинического эффекта.
Для введения под белочную оболочку яичка используют смесь продуктов секреции МСК человека с коллагеновым гелем в качестве удобного биосовместимого носителя. Для этого неконцентрированную или концентрированную кондиционированную среду, содержащую продукты секреции МСК человека, смешивают с 2-3% коллагеновым гелем на основе коллагена I типа, источником которого могут быть ткани крупного рогатого скота, свиньи или человека. При этом на один объем геля добавляют не более одного объема кондиционированной среды. Пропорции активного компонента и коллагенового геля в смеси должны обеспечивать, с одной стороны, сохранение смеси в жидком состоянии в течение срока, достаточного для подготовки и проведения инъекции биоматериала в яички, с другой стороны, быструю (в течение 1-2 минут), полимеризацию смеси после введения в яички для формирования локального коллагенового «депо» с последующим постепенным высвобождением продуктов секреции МСК человека, содержащихся в биоматериале. В частном случае, реализуемом в данном изобретении, нами был использован 2,5% коллагеновый гель, который при смешивании с неконцентрированной кондиционированной средой в соотношении 1:1 или с концентрированной кондиционированной средой в соотношении 4:1 удовлетворял указанным требованиям. В других случаях могут быть использованы отличающиеся пропорции. Дополнительно к смеси может быть добавлен раствор фибронектина (до максимальной конечной концентрации 0,3 мг/мл) или другие компоненты (например, гепарин) для замедления высвобождения из геля факторов роста. После добавления всех нужных компонентов пробирки быстро перемешивают вортексированием, центрифугируют в течение минуты и набирают смесь в стерильный инсулиновый шприц. Полученный биоматериал хранят при температуре 2-8°С, не допуская полимеризации геля, и используют для введения под белочную оболочку яичка в течение 30 минут.
Объем введения биоматериала под белочную оболочку яичка по предлагаемому способу должен быть достаточным для достижения терапевтической эффективности и в то же время не вызывать избыточной травматизации тканей яичка. В частном случае, реализуемом в данном изобретении, мы вводили 100±10 мкл биоматериала в яички экспериментальных животных (крыс), что является достаточным для достижения терапевтического эффекта и не приводит к сдавлению тканей паренхимы яичка. Для применения у человека указанная доза может быть пересчитана известным способом по соотношению масс яичек.
В результате осуществления данного изобретения получают эффективную стимуляцию сперматогенеза путем локального однократного введения в яички биоматериала на основе продуктов секреции МСК человека. Способ может быть использован для лечения мужской инфертильности.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется графическими материалами.
Фигура 1. Фотография, демонстрирующая внешний вид нормального (слева) и крипторхированного (справа) яичка.
Фигура 2. Диаграмма, отражающая динамику массы крипторхированных яичек после их низведения в мошонку в различных группах экспериментальных животных. Данные представлены в виде медиана (25-, 75-процентили). * - р<0,05 (при сравнении с группой контроля Гель+ДМЕМ).
Фигура 3. А - Атрофичные канальцы в крипторхированных яичках через 1 месяц после низведения (контрольная серия). Б - восстановление сперматогенного эпителия через 1 месяц после низведения с введением в яичко концентрированной КС МСК ЖТ. Окраска гематокислином и эозином, ув. 200х и 400х соответственно.
Фигура 4. Общее количество (А) и количество подвижных сперматозоидов (Б), выделенных из придатка яичка в исследуемых группах (тыс.на 1 придаток). Данные представлены в виде медиана (25-, 75-процентили). * - р<0,05 (при сравнении с группой контроля Гель+ДМЕМ).
Осуществление изобретения
Ниже представлено подробное описание изобретения на примерах конкретного выполнения, которые демонстрируют практическую осуществимость изобретения, но не ограничивают возможность осуществления изобретения с помощью иных средств и методов.
Пример 1. Получение МСК жировой ткани человека.
МСК выделяют из подкожного жирового отложения здоровых доноров обоих полов. Клетки выделяют из материала, полученного при проведении малого хирургического вмешательства под местной анестезией или в ходе плановых хирургических операций. Хирургический материал (15 г жировой ткани, взятой из околопупочной области или другой области локализации подкожного жира) помещают в одноразовую пробирку с буфером HBSS (HyClone) содержащим 5-ти кратную концентрацию антибиотика 500 ед/мл (HyClone).
В стерильных условиях культурального бокса биоптат фрагментируют до однородной массы, используя стерильные инструменты, после чего подвергают его ферментативной обработке в растворе, содержащем среду AdvanceSTEM™ (HyClone) /500 ед/мл антибиотика (HyClone), 200 ед/мл коллагеназы I типа и диспазы (40 ед/ml) (Worthington Biochemical) (соотношение объема ферментов и жира должно быть 1:1:1), при 37°С в течение 30-45 минут при постоянном помешивании. По окончании инкубации к образцу добавляют равный объем среды с сывороткой и фильтруют через нейлоновые мембраны с размером пор 100 мкм (BD). Профильтрованную суспензию центрифугируют в течение 5 мин при 200g, после чего супернатант полностью удаляют. Осадок клеток подвергают обработке буфером для лизиса эритроцитов (BD) до покраснения раствора, после чего центрифугируют в течение 5 мин при 200g. Супернатант полностью удаляют, а осажденные клетки ресуспендируют в среде роста МСК. Для культивирования мезенхимных клеток используют среду AdvanceSTEM™ support expansion and maintenance of undifferentiated human MSCs (HyClone) в сочетании с добавлением 10% раствора добавок AdvanceSTEM™ Stem Cell Growth Supplement (HyClone) и 100 ед/мл антибиотика (HyClone). Эта среда была разработана фирмой-производителем (HyClone) для культивирования недифференцированных МСК, в частности клеток, происходящих из жировой ткани, без добавления сыворотки (http://www.thermo.com).
2
Выделенные МСК высевают в концентрации 200 тыс.в мл в чашках Петри и культивируют в среде роста в инкубаторе при 37°С и при 5%-ой концентрации СО. При достижении 80% монослоя МСК ЖТ (0 пассаж) замораживают в жидком азоте и хранят в мастер-банке для дальнейшего использования с целью наработки среды.
Для наработки среды МСК ЖТ масштабируют. Перед снятием с поверхности культурального пластика клетки трехкратно промывают раствором Версена. Затем наносят в каждую чашку по 1 мл реагента для диссоциации клеток HyQTase (HyClone). При приобретении клетками округлой формы и откреплении их от подложки в каждую культуральную емкость вносят по 9 мл среды роста и интенсивно пипетируют клеточную суспензию. Затем клетки рассевают в соотношении 1:4.
Пример 2. Получение кондиционированной среды, содержащей продукты секреции МСК жировой ткани человека.
3
2
2
2
3
2
2
2
Для получения кондиционированной среды МСК ЖТ наращивают до 2-5 пассажа. МСК ЖТ человека добавляют в количестве 5-15*10/см в культуральные емкости для выращивания эукариотических клеток, после прикрепления промывают культуральные сосуды с клетками солевым раствором Хэнкса (Панэко, Россия) (в количестве 0,1-0,2 мл/см трижды по 10 минут) и заполняют их свежей средой роста для кондиционирования в количестве 0,1-0,2 мл/см. В качестве последней используют универсальную среду роста для разных типов клеток DMEM with Low Glucose (HyClone, USA). Затем клетки культивируют в условиях СО инкубатора при 37±1°С, 5%-ом содержании СО и относительной влажности ≥95% в течение 7 суток. В качестве культуральных емкостей для выращивания эукариотических клеток используют культуральные флаконы или чашки Петри (фирмы Corning или аналогичные), при этом клетки выращивают на плоской подложке плотностью 5-15*10/см.
Пример 3. Очистка и концентрирование кондиционированной среды, содержащей продукты секреции МСК жировой ткани человека, методом ультрафильтрации.
Кондиционированную среду, содержащую все продукты секреции МСК ЖТ человека (КС МСК ЖТ), собирают в стерильные емкости для центрифугирования, центрифугируют при (5000±10) об/мин, температуре (6±2)°С, в течение 10 минут для удаления клеточного дебриса. Полученный супернатант отбирают в новые стерильные емкости объемом 250-500 мл. При необходимости кондиционированную среду концентрируют в 10-50 раз с помощью ультрафильтрации через мембраны из регенерированной целлюлозы с указанным отсечением 5-10 кДа в центрифужных картриджах (Millipore или аналогичные) или с помощью системы фильтрации в тангенциальном потоке Minim II (Life Sciences), используя ультрафильтрационные кассеты (Minimate TFF capsule, PALL, 5-10 кДа) или аналогичные. При невозможности соблюсти стерильность при проведении ультрафильтрации очищенную среду подвергают микрофильтрации. Фильтрацию очищенной среды осуществляют через одноразовые стерильные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, обеспечивающие стерилизацию продукта. Среду подают на фильтры перистальтическим насосом. Фильтрат собирают в стерильную полипропиленовую емкость.
Пример 4. Метод оценки концентрации ключевых факторов, опосредующих стимулирующие сперматогенез эффекты кондиционированной среды, содержащей продукты секреции МСК жировой ткани человека.
Оценку содержания GDNF, VEGF и FGF basic (FGFb) в КС МСК ЖТ проводят методом иммуноферментного анализа (ELISA). В растворе должны определяться VEGF в концентрации не менее 200 пкг/мл, GDNF в концентрации не менее 50 пкг/мл, FGF basic в концентрации не менее 0,3 пкг/мл.
Оценка содержания VEGF с использованием набора фирмы R&D Systems Human VEGF Quantikine ELISA Kit.
Для определения концентрации VEGF методом ELISA используют коммерческий набор фирмы R&D Systems (Human VEGF Quantikine ELISA Kit, cat#DVE00) или аналогичный.
Используя стандартизированный раствор VEGF, готовят калибровочные пробы известной концентрации так, чтобы проба №1 содержала 500 пг/мл VEGF, каждая последующая содержала VEGF в 2 раза меньше. Проба №0 должна содержать только раствор Sample Diluent. Исследуемые образцы в количестве 100 мкл, а также стандартизированные образцы раствора VEGF троекратно наносят в лунки 96-ти луночного планшета и инкубируют на шейкере в течение 12 часов при 4°С. Планшет отмывают буфером Wash Buffer, и в каждую из лунок добавляют по 100 мкл биотинилированных мышиных моноклональных антител против VEGF человека. Через 3 часа инкубации планшеты отмывают, как описано выше. В каждую лунку наносят по 100 мкл раствора комплекса стрептавидин-пероксидаза хрена. Через 1 час планшет тщательно промывают и вносят в каждую лунку по 100 мкл прилагаемого к набору раствора субстрата ТМВ/Е. Планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут, затем в каждую из лунок добавляют по 100 мкл стоп-буфера, и оценивают реакцию на спектрофотометре ELISA READER MICROPLATE READER Spectra при длине волны 450 нм. В качестве референсного используют уровень оптической плотности при длине волны 570 нм. Работу на аппарате осуществляют в соответствии с инструкцией.
Оценка содержания GDNF с использованием набора фирмы Cusabio Human GDNF ELISA Kit.
Для определения концентрации GDNF методом ELISA используют коммерческий набор фирмы Cusabio или аналогичный.
Используя стандартизированный раствор GDNF, готовят калибровочные пробы известной концентрации так, чтобы проба №1 содержала 1000 пг/мл GDNF, каждая последующая содержала GDNF в 2 раза меньше. Проба №0 должна содержать только раствор Sample Diluent. Исследуемые образцы в количестве 100 мкл, а также стандартизированные образцы раствора GDNF троекратно наносят в лунки 96-ти луночного планшета и инкубируют на шейкере в течение 12 часов при 4°С. Планшет отмывают буфером Wash Buffer, и в каждую из лунок добавляют по 100 мкл биотинилированных мышиных моноклональных антител против GDNF человека. Через 3 часа инкубации планшет отмывают, как описано выше. В каждую лунку наносят по 100 мкл раствора комплекса стрептавидин-пероксидаза хрена. Через 1 час планшет тщательно промывают и вносят в каждую лунку по 100 мкл прилагаемого к набору раствора субстрата ТМВ/Е. Планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут, затем в каждую из лунок добавляют по 100 мкл стоп-буфера, и оценивают реакцию на спектрофотометре ELISA READER MICROPLATE READER Spectra при длине волны 450 нм. В качестве референсного используют уровень оптической плотности при длине волны 570 нм. Работу на аппарате осуществляют в соответствии с инструкцией.
Оценка содержания FGFb с использованием набора фирмы R&D Systems Human FGF basic Quantikine ELISA Kit
Для определения концентрации FGFb методом ELISA используют коммерческий набор фирмы R&D Systems (Human FGF basic Quantikine ELISA Kit, cat#DFB50) или аналогичный.
Используя стандартизированный раствор FGFb, готовят калибровочные пробы известной концентрации так, чтобы проба №1 содержала 500 пг/мл FGFb, каждая последующая содержала FGFb в 2 раза меньше. Проба №0 должна содержать только раствор Sample Diluent. Исследуемые образцы в количестве 100 мкл, а также стандартизированные образцы раствора FGFb троекратно наносят в лунки 96-ти луночный планшет и инкубируют на шейкере в течение 12 часов при 4°С. Планшет отмывают буфером Wash Buffer, и в каждую из лунок добавляют по 100 мкл биотинилированных мышиных моноклональных антител против FGFb человека. Через 3 часа инкубации планшет отмывают, как описано выше. В каждую лунку наносят по 100 мкл раствора комплекса стрептавидин-пероксидаза хрена. Через 1 час планшет тщательно промывают и вносят в каждую лунку по 100 мкл прилагаемого к набору раствора субстрата ТМВ/Е. Планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут, затем в каждую из лунок добавляют по 100 мкл стоп-буфера, и оценивают реакцию на спектрофотометре ELISA READER MICROPLATE READER Spectro при длине волны 450 нм. В качестве референсного используют уровень оптической плотности при длине волны 570 нм. Работу на аппарате осуществляют в соответствии с инструкцией.
Пример 5. Получение биоматериала на основе кондиционированной среды, содержащей продукты секреции МСК жировой ткани человека, и коллагена I типа
Все процедуры проводят в ламинарном шкафу II уровня биологической защиты с соблюдением правил асептики, сохраняя все компоненты при температуре 4°С. В стерильные 1,5 мл пробирки вносят по 50 мкл 2-3% коллагенового геля (ООО «ИМТЕК» или аналогичного), выделенного из тканей крупного рогатого скота, свиней или других источников и содержащего коллаген I типа. Затем к гелю добавляют 50 мкл неконцентрированной КС МСК ЖТ. В другом варианте изобретения к гелю добавляют 50 мкл концентрированной в 10-50 раз КС МСК ЖТ. Дополнительно к смеси может быть добавлен раствор фибронектина (до конечной концентрации 0,3 мг/мл) для замедления высвобождения из геля факторов роста. После добавления всех нужных компонентов содержимое пробирки быстро перемешивают вортексированием, центрифугируют в течение минуты и набирают смесь в стерильный инсулиновый шприц. Полученный биоматериал хранят при температуре 2-8°С, не допуская полимеризации геля, и используют для введения в течение 30 минут.
Пример 6. Использование биоматериала для стимуляции восстановления сперматогенеза на модели экспериментального крипторхизма
Эксперименты выполняли на 40 половозрелых крысах-самцах, породной группы Wistar, в возрасте 3,5-4,0 месяца, стандартных весовых характеристик. Все эксперименты выполняли в соответствии с требованием Хельсинкского соглашения о гуманном обращении с животными. Этим животным выполняли моделирование двухстороннего абдоминального крипторхизма. Для этого яички выводили из мошонки в брюшную полость через паховый канал (что у крыс не вызывает трудностей в связи с широким просветом канала) и фиксировали к брюшной стенке в области латеральных каналов узловым швом атравматической нитью «Prolene» 4/0, проведенной через дистальный полюс яичка, чтобы избежать возможного блокирования сообщения между выносящими семенными канальцами и придатком яичка. При этом обращали особое внимание на исключение возможности захватывания швом семявыносящего протока и кровеносных сосудов. Через 2 недели производили низведение яичек в мошонку путем удаления фиксирующей лигатуры и смещения яичек в паховый канал. Известно, что при этом сроке выдерживания яичек в брюшной полости происходят выраженные, но потенциально обратимые нарушения сперматогенеза. Затем перед низведением под белочную оболочку яичек пункционно с помощью инсулинового шприца вводили образцы биоматериала, содержащие КС МСК ЖТ и коллагеновый гель. В группе «КС доза 1» для получения биоматериала к коллагеновому гелю (50 мкл) добавляли 50 мкл неконцентрированной КС МСК ЖТ, в группе «КС доза 2» - 30 мкл раствора фибронектина (1 мг/мл, ООО «ИМТЕК») и 20 мкл концентрированной в 25 раз КС МСК ЖТ. В качестве отрицательного контроля 50 мкл 2,5% бычьего коллагенового геля смешивали с 30 мкл раствора фибронектина (1 мг/мл) и 20 мкл среды DMEM-LG. Контролем также служила группа крыс без терапии. Оценку выраженности развившихся повреждений в яичках после 2-недельного пребывания в брюшной полости оценивали через 1 и 3 месяца после их низведения. Для этого удаляли яички с придатками и определяли их весовые характеристики. Также забирали образцы ткани яичек для гистологического исследования, которое проводили по стандартной методике с окраской гистологических срезом гематоксилином и эозином. Выраженность нарушения сперматогенеза оценивали по уровню его блокировки (определение наиболее зрелых клеточных форм в семенных канальцах), а также определению доли запустевших и склерозированных семенных канальцев. Придатки яичка гомогенизировали в растворе 5% глюкозы в соотношении ткань/раствор 1:10 с последующим определением в надосадочной жидкости количества активно-подвижных и неподвижных сперматозоидов в камере Горяева по стандартной методике анализа спермограммы.
Одним из негативных процессов, происходящих в крипторхированных яичках, является уменьшение их массы (гипотрофия). На использованной модели экспериментального крипторхизма после 2-недельного пребывания в брюшной полости масса яичек уменьшалась в среднем с 1,98±0,09 г до 0,82±0,06 г (р<0,001) (Фиг. 1). Через 1 месяц после низведения в контрольных сериях, а также в опытах с введением в яичко геля с неконцентрированной КС масса органов практически не изменилась, тогда как в опытах с введением концентрированной КС возросла в среднем до 1,05-1,1 г (Фиг. 2). Через 3 месяца после низведения масса яичек в контрольной серии и в опытах с неконцентрированной КС возрастала незначительно (различия с данными при низведении яичек и через 1 месяц статистически незначимы), тогда как после введения геля с концентрированной КС масса яичек продолжала возрастать достоверно, превышая значения в других опытах (р<0,05).
При гистологической оценке состояния сперматогенеза через 1 месяц после ликвидации двухстороннего абдоминального крипторхизма было установлено, что в контрольной серии (без терапии) наблюдались резко выраженные нарушения с развитием блока созревания сперматозоидов уже на ранних стадиях. Так, даже темные сперматогонии А (начальные предшественники сперматозоидов) выявлялись только в 60% случаев, а более зрелые сперматогонии Б и сперматоциты 1-го порядка обнаруживались только в 20% препаратах. Более зрелые формы (сперматоциты 2 порядка, сперматозоиды) отсутствовали во всех случаях (табл. 1). То есть, у этих животных развивался блок сперматогенеза на уровне сперматогоний или сперматоцитов 1-го порядка. В серии опытов с введением геля, содержащего неконцентрированную КС МСК ЖК, отмечалось некоторое улучшение сперматогенеза: темные сперматогонии А обнаружены во всех исследованных препаратах, но более зрелые клеточные формы встречались также редко или отсутствовали. Значительное улучшение состояния яичка отмечено в сериях, где использовали коллагеновый гель с концентрированной КС МСК ЖТ. В этих опытах выявляли завершенный сперматогенез (до стадии сперматозоидов).
При количественном анализе распределения разных типов клеток сперматогенного эпителия (табл. 2) выявили резкое обеднение канальцев всеми видами клеток как в контрольной серии, так и в опытах с введением неконцентрированной КС (доза 1) (Фиг. 3А). В других сериях клеточная популяция в значительной степени восстанавливалась, как в отношении стволовых и прогениторных клеток (сперматогонии А), так и в отношении более дифференцированных клеточных форм, вплоть до зрелых сперматозоидов (Фиг. 3Б).
В контрольной серии опытов выявляли значительное количество канальцев, полностью лишенных эпителиальной выстилки. Число пустых (атрофичных) канальцев в этой группе составило 63,24±5,16 канальцев на единицу условной площади препарата. В серии с ДМЕМ их количество было примерно таким же - 64,26±3,15. В то же время в опытах с введением геля с КС разных концентраций количество атрофичных канальцев было значительно меньше - 7,28±0,26 и 3,18±0,24, 0 канальцев на единицу условной площади соответственно.
Через 3 месяца после низведения крипторхированных яичек во всех сериях отмечено улучшение сперматогенеза. Недифференцированные и малодифференцированные клеточные формы (светлые и темные сперматогонии А) практически полностью восстановились. Даже в контрольной серии в отдельных препаратах выявляли завершенный до стадии сперматозоидов сперматогенез, однако в большинстве случаев он был заблокирован на уровне сперматоцитов 1-го и 2-го порядка (табл. 3). В сериях опытов с введением геля с неконцентрированной КС и ДМЕМ ситуация мало отличалась от контрольной серии. В то же время в опытах с концентрированной КС (доза 2) выявляли завершенный сперматогенез в большинстве случаев.
Количественное определение различных клеточных популяций в семенных канальцах подтвердило восстановление популяции недифференцированных и малодифференцированных клеток (табл. 4). Не выявили достоверных различий между количеством светлых и темных сперматогоний А между всеми группами опытов. В то же время степень восстановления популяции сперматогоний Б в контрольной серии оказалась достоверно ниже, чем в опытных сериях. Количество более зрелых форм также в контроле в целом было меньше, чем в других сериях.
Статистическая значимость различий - как в табл. 2.
Количество атрофичных канальцев через 3 месяца в контрольной серии существенно не изменилось по сравнению со сроком 1 месяц, составив 75,26±6,17 канальцев на единицу условной площади препарата, так же, как и в опытах с ДМЕМ - 52,12±2,19. В остальных сериях их количество продолжало уменьшаться, составив в серии гель + КС доза 1 0,03±0,01 и КС доза 2 - 0,78±0,13 канальцев на единицу площади препарата.
Было также изучено влияние исследуемого биоматериала на функцию крипторхированных яичек путем определения количества сперматозоидов, выделенных из придатка яичка, и их подвижности. Результаты показали, что у интактных крыс из придатка выделяли в среднем 61,375 (51,187; 71,562) тысяч клеток на придаток. Из них сохраняли подвижность после выделения в среднем 693 750 (534375; 853125) сперматозоидов. Через 1 месяц после низведения яичек во всех сериях выявили резкое уменьшение как общего количества, так и подвижных сперматозоидов на 88-100% (Фиг. 4). При этом при введении биоматериала с КС МСК ЖТ отмечали некоторое увеличение общего количества выделенных сперматозоидов при сравнении с контрольными опытами, тогда как в отношении подвижных клеток различий не выявили. Иная картина наблюдалась через 3 месяца после низведения крипторхированных яичек. При этом сроке наблюдения отмечено значительное возрастание как общего количества, так и подвижных сперматозоидов при введении биоматериала с КС МСК ЖТ, причем наибольший прирост этих показателей был получен в серии с использованием концентрированной КС (Фиг. 4).
Таким образом, предлагаемый в изобретении способ стимуляции сперматогенеза отличается безопасностью, которая достигается путем использования бесклеточных низкоиммуногенных компонентов и малотравматичной процедуры введения, и эффективностью, обеспечиваемой комплексным воздействием содержащихся в секретоме МСК факторов, необходимых для поддержания роста, повышения выживаемости и восстановления функции сперматогенных клеток, а также клеток, поддерживающих сперматогенез, комбинированных с коллагеном в качестве удобного биосовместимого носителя для формирования локального «депо» после введения под белочную оболочку яичка.