Лазерная флуориметрия белков-индикаторов состояния живой системы (на примере сывороточных альбуминов)

ЛАЗЕРНАЯ ФЛУОРИМЕТРИЯ БЕЛКОВ-ИНДИКАТОРОВ СОСТОЯНИЯ ЖИВОЙ СИСТЕМЫ

А. А. Банишев, Е. А. Ширшин, В. В. Фадеев Московский государственный университет, физический факультет, кафедра квантовой электроники

e-mail: eshirshin@mail.ru,

В работе впервые, с использованием предложенного авторами алгоритма, определены истинные значения молекулярных фотофизических параметров триптофановых остатков в одно- и двухтриптофановых белках - на примере сывороточного альбумина человека и бычьего сывороточного альбумина. Алгоритм базируется на одновременно используемых методах нелинейной и кинетической лазерной флуориметрии. Показана возможность ипользования альбуминов в плазме крови в качестве молекулярных дескрипторов состояния организма. Полученный результат открывает новые возможности в диагностике живых систем, а также других объектов содержащих одиночные флуорофоры или локализованные пары флуорофоров.

Данная работа является этапом создания методики диагностики состояния живой системы, основанной на применении молекулярных дескрипторов — молекул (в данном случае - белков), чьи характеристики известным образом зависят от факторов окружающей среды. В качестве канала получения информации предлагается использовать лазерно-индуцируемую флуоресценцию и определяемые по ней фотофизические параметры флуорофоров.

Методы флуоресцентной спектроскопии белковых молекул широко используются при изучении процессов в свободных белках и биологических системах [1]. Эти методы позволяют устанавливать физико-химические свойства белковых систем (например, выявлять структуру белок-содержащего комплекса [24] или следить за функциональной активностью белков в системе [5]), изучать изменения в микроокружении собственных флуорофоров белка [2] и т.д.

Естественными флуорофорами в белках являются остатки трех аминокислот - триптофана, тирозина и фенилаланина, из которых триптофановая флуоресценция дает наиболее богатую информацию о свойствах макромолекулы [1]. Поэтому, триптофан используется в качестве естественной "метки-репортера", флуоресценция которой может дать представление об изменении свойств молекулы белка при различных воздействиях.

Однако традиционные методы линейной флуоресцентной спектроскопии обладают ограниченными информационными возможностями в анализе природных флуоресцирующих объектов из-за их низкой избирательности (полосы флуоресценции большинства сложных органических соединений при комнатной температуре широкие и бесструктурные). Эти ограничения становятся особенно ощутимыми при анализе белковой флуоресценции, так как на флуоресценцию триптофана, находящегося в матрице белка, могут оказывать влияние сразу несколько факторов. Более того, белковая молекула может содержать несколько остатков триптофана, различающихся микроокружением и степенью интегрированности в белковую матрицу [1]. Таким образом, данных, получаемых традиционными методами флуоресцентной спектроскопии, зачастую недостаточно для понимания структурной организации белков и использования их как дескрипторов живых систем. Возможности анализа могут быть значительно расширенны применением лазерных методов (таких как нелинейная [6] и кинетическая [7] лазерная флуориметрия), которые в дополнение к традиционным флуоресцентным параметрам, описывающим форму и положение полос флуоресценции, позволяют определять фотофизические параметры флуорофоров (время жизни возбуждённого состояния, сечение поглощения, скорость переноса энергии и др.), причем в условиях дефицита априорной информации, обязательной в классических методах [8]. Эти параметры могут быть использованы в качестве диагностических признаков.

В данной работе предложен и развит подход, основанный на использовании методов лазерной флуориметрии и позволяющий экспериментально определять индивидуальные фотофизические параметры флуорофоров белков, содержащих, соответственно, один (на примере, альбумина из сыворотки крови человека, HSA ) и два (на примере, бычьего сывороточного альбумина, BSA) триптофановых остатка. В последнем, в принципе, возможен перенос энергии возбуждения между триптофановыми остатками внутри одной макромолекулы белка и, следовательно, раствор этого белка является примером ансамблей локализованных донорно-акцепторных пар.

Основная роль альбумина - участие в поддержании коллоидно-осмотического (онкотического) давления плазмы и объема циркулирующей крови, а также транспорт и депонирование различных веществ [9]. Он связывает неполярные вещества, такие как билирубин и жирные кислоты, холестерин, является переносчиком ряда гормонов. Гормоны, связанные с альбумином находятся в неактивной, но легко мобилизуемой форме. Около 40 % кальция плазмы обратимо связывается с альбумином, находясь в подвижном равновесии с физиологически активным ионизированным кальцием плазмы. В состояниях, сопровождающихся значительным снижением содержания альбумина в плазме, общее содержание веществ, которые связываются с альбумином, уменьшается, хотя концентрация физиологически активных фракций веществ может быть в пределах нормы, и клинические изменения не возникают. Многие лекарственные вещества, поступающие в организм, связываются с альбумином, например, антибиотики, салицилаты, варфарин, клофибрат и др.

Нарушение конформации молекулы альбумина, например, вызванное повреждением белка, приводит к частичной или полной потере функций молекулы, в результате чего на молекулярном уровне возникают физико-химические изменения, которые приводят к развитию патологических процессов в организме. Разработка методов диагностики, в частности флуоресцентных, которые могли бы использоваться в профилактике различных заболеваний, является актуальной задачей современной медицины. Флуоресценция альбумина в плазме крови может служить естественным индикатором состояния организма, если её характеристики и определяемые по ним фотофизические параметры флуорофоров зависят от состояния молекулы.

В работе предложена и реализована методика определения фотофизических параметров флуорофоров в одно- и двухтриптофановых альбуминах. Методика основана на решении обратных задач, входными данными в которых являются зависимости интенсивности флуоресценции от интенсивности возбуждающего лазерного излучения (кривая насыщения флуоресценции) и от времени задержки момента регистрации флуоресценции (строба приёмника) относительно лазерного импульса (кривая кинетики флуоресценции). Определены истинные значения сечений поглощения флуорофоров, времён жизни их возбуждённых состояний и скоростей переноса энергии между триптофановыми остатками (последнее, естественно, только для BSA).

Предложенная методика, основанная на измерении фотофизических параметров флуорофоров белков in vivo, может применяться для изучения процессов в живых системах, а значения фотофизических параметров, полученные для конкретных объектов (белков альбуминов), использованных в работе, - для диагностики конкретных биологических систем, содержащих эти белки. Для подтверждения этого прогноза необходимо исследовать зависимости этих параметров от подлежащих контролю характеристик живой системы, что будет задачей следующего этапа разработки предложенного метода диагностики.

1. Е. А. Пермяков, Метод собственной люминесценции белка, Наука, Москва, 2003, с. 72

2. И. М. Кузнецова, К. К. Туроверов, Цитология, 40, 747 (1998).

3. A.K. Gaigalas, K.D. Cole, S. Bykadi, and Paul DeRose, Photocem. and Photobiol., 83, 1 (2007).

4. S. Kumar and R. Swaminathan, J. Chem. Sci., 119, 141 (2007).

5. L.Yu. Brovko, E.Yu Cherednikova, A.Yu. Chikishev, Biospectroscopy, 5,378

6. V.V. Fadeev, T.A. Dolenko, E.M. Filippova, Opt. Com., 166, 25 (1999).

7. А. А. Банишев, Д. В. Маслов, В. В. Фадеев, Приборы и техника эксперимента, 49, 430 (2006).

8. А. А. Банишев, Е. П. Вржещ, Д. В. Дмитриенко, В. Л. Друца, Д. В. Маслов, В. З. Пащенко, Е. А. Ширшин, П. В. Вржещ, В. В. Фадеев, Биофизика, 52, 792

9. Theodore Peters Jr, All About Albumin: Biochemistry, Genetics, and Medical Applications, (San Diego, CA: Academic Press, 1996), p. 121.

The true molecular photophysical parameters' values of tryptophan residues in single-tryptophan-containing and two-tryptophan-containing proteins (by the example of human serum albumin and bovine serum albumin) have been determined for the first time with the use of authors' suggested algorithm. The algorithm is based on simultaneous use of nonlinear and kinetic laser fluorimetry. A possibility of albumines' usage as molecular descriptors of organism's state has been shown. The obtained result opens up new approaches in monitoring of living systems and other objects, containing single fluorophores and localized pairs of fluorophores.