АНТИТЕЛО К CD73 ЧЕЛОВЕКА
ANTIBODY TO HUMAN CD73

Уровень техники настоящего изобретения
[0001]
Настоящее изобретение относится к антителу к CD73 человека, которое является пригодным в качестве активного ингредиента фармацевтической композиции.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
[0002]
CD73 (Экто-5’-нуклеотидаза) является ферментом, который катализирует распад АМФ (аденозинмонофосфата) до аденозина. CD73 представляет собой GPI-заякоренный белок, присутствующий на поверхности клеточной мембраны в виде димера, и экспрессируется в различных тканях, например, лимфоцитах, эндотелиальных клетках, толстой кишке, головном мозге, почке, печени, легких, сердце и т. п. Кроме того, сообщалось, что CD73 отщепляется от поверхности клеточной мембраны лимфоцита и существует в виде растворимого CD73, и при этом растворимый CD73 также обладает ферментативной активностью, обеспечивающей распад АМФ. Поскольку аденозин, который образуется при распаде АМФ, подавляет функции клеток иммунной системы, таких как T-клетки, CD73 играет важную роль в регуляции иммунного ответа (Arterioscler Thromb Vasc Biol., Vol. 28, p. 18-26, 2008) (Trends Mol Med., Vol. 19, p. 355-367, 2013) (Eur J Immunol., Vol. 45, p. 562-573, 2015).
[0003]
Что касается связи с патологическим состоянием, было подтверждено, что CD73 экспрессируется в клеточной линии рака толстой кишки (Mediators Inflamm., ID статьи 879895, 2014). Кроме того, сообщалось, что у пациента с раком толстой кишки уровень экспрессии CD73 повышен в раковых тканях по сравнению с таковым в нормальных тканях, и в случае пациентов с высоким уровнем экспрессии CD73 наблюдается более низкая общая доля выживших по сравнению с пациентами с низким уровнем экспрессии CD73 (J Surg Oncol., Vol. 106, p. 130-137, 2012).
[0004]
Что касается других форм рака, было подтверждено, что CD73 экспрессируется в клеточных линиях рака надпочечников, рака молочной железы, злокачественной меланомы, мультиформной глиобластомы, рака яичника, медуллобластомы и рака мочевого пузыря, и активность CD73 повышена при раке молочной железы, раке желудка, раке поджелудочной железы, хроническом миелоидном лейкозе, кожной Т-клеточной лимфоме и глиобластоме (Pharmacol Ther., Vol. 87, p. 161-173, 2000) (Biomed Res Int., ID статьи 460654, 2014). Кроме того, сообщалось, что уровень экспрессии CD73 повышен при раке головы и шеи и раке щитовидной железы, или что экспрессия CD73 приводит к ускорению пролиферации раковых клеток при раке предстательной железы (Trends Mol Med., Vol. 19, p. 355-367, 2013).
[0005]
Ингибирование ферментативной активности CD73, который обеспечивает распад АМФ, ассоциировано с активацией противоопухолевого иммунитета за счет восстановления подавленных функций клеток иммунной системы, таких как T-клетка, и, следовательно, CD73 изучается в качестве мишени для лечения рака. Кроме того, известно, что антитело к CD73 с такой ингибирующей фермент активностью проявляет противоопухолевую активность в животных моделях (непатентный документ 1).
[0006]
Проводится множество исследований в отношении антитела, которое ингибирует ферментативную активность CD73 человека (патентный документ 1, патентный документ 2, патентный документ 3 и непатентный документ 1). Описанное в патентном документе 1 и непатентном документе 1MEDI9447 характеризуется действием, при котором наблюдают колоколообразную кривую ингибирования растворимого CD73. Несмотря на то, что началось испытание I фазы по MEDI9447 в отношении солидных форм рака, эффект лечения в клинике все еще не был подтвержден, включая даже антитела, описанные в патентном документе 2 и патентном документе 3.
[0007]
Известна слитая структура на основе антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и цитокина, которая называется иммуноцитокином, и проводится множество исследований по активации противоопухолевого иммунитета (Curr Opinion in Immunol., Vol. 40, p. 96-102, 2016). [0008]
Что касается примеров цитокинов, которые обладают способностью к активации противоопухолевого иммунитета, проводятся исследования IL-7 и IL-21, однако сообщается, что IL-7 и IL-21 могут проявлять токсичность при введении IL-7 и IL-21 человеку в высоких дозах (Clin Cancer Res., Vol. 16, p. 727-735, 2010) (Clin Cancer Res., Vol. 13, p. 3630-3636, 2007).
Предшествующий уровень техники
Патентный документ
[0009]
[Патентный документ 1] WO 2016/075176
[Патентный документ 2] WO 2016/055609
[Патентный документ 3] WO 2016/081748
Непатентный документ
[0010]
[Непатентный документ 1] “mAbs” (США), 8 (3); 454-467, 2016
Раскрытие настоящего изобретения
Проблемы, решаемые настоящим изобретением
[0011]
Целью настоящего изобретения является обеспечение антитела к CD73 человека.
Способы решения проблем
[0012]
В результате осуществления авторами настоящего изобретения интенсивных творческих исследований по получению антитела к CD73 человека было получено антитело к CD73 человека CDS-1, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 31-35 SEQ ID NO: 2, CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 50-66 SEQ ID NO: 2, и CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 99-112 SEQ ID NO: 2, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 24-34 SEQ ID NO: 4, CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 50-56 SEQ ID NO: 4, и CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 89-98 SEQ ID NO: 4 (пример 1), и было обнаружено, что антитело связывается с CD73 человека (пример 2), ингибирует ферментативную активность CD73 человека (примеры 3 и 4) и восстанавливает АМФ-зависимо подавленные функции T-клеток человека (пример 5). Эти результаты позволили получить вышеописанное антитело к CD73 человека по настоящему изобретению и завершить тем самым настоящее изобретение.
[0013]
Таким образом, настоящее изобретение относится к нижеследующим пунктам [1]-[31].
[1]
Антитело к CD73 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие:
вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 31-35 SEQ ID NO: 2, CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 50-66 SEQ ID NO: 2, и CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 99-112 SEQ ID NO: 2; и
вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 24-34 SEQ ID NO: 4, CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 50-56 SEQ ID NO: 4, и CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 89-98 SEQ ID NO: 4.
[2]
Антитело к CD73 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в [1], содержащие вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 1-123 SEQ ID NO: 2, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 1-109 SEQ ID NO: 4.
[3]
Антитело к CD73 человека, описанное в [1] или [2], выбранное из группы, состоящей из нижеследующих (a) и (b):
(a) антитело к CD73 человека, содержащее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4; и
(b) антитело к CD73 человека, полученное в результате посттрансляционной модификации антитела к CD73 человека из (a).
[4]
Антитело к CD73 человека, описанное в [3], выбранное из группы, состоящей из нижеследующих (a) и (b):
(a) антитело к CD73 человека, содержащее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4; и
(b) антитело к CD73 человека, содержащее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 1-452 SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4.
[5]
Антитело к CD73 человека, описанное в [4], содержащее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4.
[6]
Антитело к CD73 человека, описанное в [4], содержащее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 1-452 SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4.
[7]
Слитая структура, в которой антитело к CD73 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в любом из [1]-[6], слиты с другими пептидом или белком.
[8]
Модифицированная структура, в которой антитело к CD73 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в любом из [1]-[6], связываются с модифицирующим средством.
[9]
Слитая структура, описанная в [7], выбранная из группы, состоящей из нижеследующих (a)-(e):
(a) слитая структура, содержащая тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 7, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4;
(b) слитая структура, содержащая тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 10, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4;
(c) слитая структура, содержащая тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 13;
(d) слитая структура, содержащая тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 15; и
(e) слитая структура, полученная в результате посттрансляционных модификаций слитых форм из (a)-(d).
[10]
Полинуклеотид, выбранный из группы, состоящей из нижеследующих (a) и (b):
(a) полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в [2]; и
(b) полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в [2].
[11]
Полинуклеотид, описанный в [10], выбранный из группы, состоящей из нижеследующих (a) и (b):
(a) полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела, описанного в [5]; и
(b) полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую легкую цепь антитела, описанного в [5].
[12]
Полинуклеотид, описанный в [11], выбранный из группы, состоящей из нижеследующих (a) и (b):
(a) полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую тяжелую цепь слитой структуры, описанной в [9]; и
(b) полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую легкую цепь слитой структуры, описанной в [9].
[13]
Вектор экспрессии, содержащий нижеследующие (a) и/или (b):
(a) полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в [2]; и
(b) полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в [2].
[14]
Вектор экспрессии, описанный в [13], содержащий нижеследующие (a) и/или (b):
(a) полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела, описанного в [5]; и
(b) полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую легкую цепь антитела, описанного в [5].
[15]
Вектор экспрессии, описанный в [14], содержащий нижеследующие (a) и/или (b):
(a) полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую тяжелую цепь слитой структуры, описанной в [9]; и
(b) полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую легкую цепь слитой структуры, описанной в [9].
[16]
Клетка-хозяин, выбранная из группы, состоящей из нижеследующих (a)-(d):
(a) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в [2];
(b) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в [2];
(c) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в [2], и полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в [2]; и
(d) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в [2], и вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в [2].
[17]
Клетка-хозяин, описанная в [16], выбранная из группы, состоящей из нижеследующих (a)-(d):
(a) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела, описанного в [5];
(b) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую легкую цепь антитела, описанного в [5];
(c) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела, описанного в [5], и полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую легкую цепь антитела, описанного в [5]; и
(d) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела, описанного в [5], и вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую легкую цепь антитела, описанного в [5].
[18]
Клетка-хозяин, описанная в [17], выбранная из группы, состоящей из нижеследующих (a)-(d):
(a) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую тяжелую цепь слитой структуры, описанной в [9];
(b) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую легкую цепь слитой структуры, описанной в [9];
(c) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую тяжелую цепь слитой структуры, описанной в [9], и полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую легкую цепь слитой структуры, описанной в [9]; и
(d) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую тяжелую цепь слитой структуры, описанной в [9], и вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую легкую цепь слитой структуры, описанной в [9].
[19]
Способ получения антитела к CD73 человека, его антигенсвязывающего фрагмента и слитой структуры на основе любого из них, причем способ предусматривает:
культивирование клетки-хозяина, выбранной из группы, состоящей из нижеследующих (a)-(c), для экспрессии антитела к CD73 человека, его антигенсвязывающего фрагмента и слитой структуры на основе любого из них:
(a) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в [2], и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в [2];
(b) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в [2], и вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в [2]; и
(c) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в [2], и клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в [2].
[20]
Способ получения антитела к CD73 человека или слитой структуры на его основе, предусматривающий:
культивирование клетки-хозяина, выбранной из группы, состоящей из нижеследующих (a)-(c), для экспрессии антитела к CD73 человека или слитой структуры на его основе:
(a) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела, описанного в [5], и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь антитела, описанного в [5];
(b) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела, описанного в [5], и вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь антитела, описанного в [5]; и
(c) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела, описанного в [5], и клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь антитела, описанного в [5].
[21]
Способ получения слитой структуры на основе антитела к CD73 человека, предусматривающий:
культивирование клетки-хозяина, выбранной из группы, состоящей из нижеследующих (a)-(c), для экспрессии слитой структуры на основе антитела к CD73 человека:
(a) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь слитой структуры, описанной в [9], и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь слитой структуры, описанной в [9];
(b) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь слитой структуры, описанной в [9], и вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь слитой структуры, описанной в [9]; и
(c) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь слитой структуры, описанной в [9], и клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь слитой структуры, описанной в [9].
[22]
Фармацевтическая композиция, содержащая антитело к CD73 человека, описанное в [3], и фармацевтически приемлемый наполнитель.
[23]
Фармацевтическая композиция, описанная в [22], которая представляет собой фармацевтическую композицию для предупреждения или лечения рака.
[24]
Способ предупреждения или лечения рака, предусматривающий введение терапевтически эффективного количества антитела к CD73 человека, описанного в [3].
[25]
Антитело к CD73 человека, описанного в [3], которое предназначено для применения в предупреждении или лечении рака.
[26]
Применение антитела к CD73 человека, описанного в [3], для изготовления фармацевтической композиции для предупреждения или лечения рака.
[27]
Фармацевтическая композиция, содержащая слитую структуру, описанную в [9], и фармацевтически приемлемый наполнитель.
[28]
Фармацевтическая композиция, описанная в [27], которая представляет собой фармацевтическую композицию для предупреждения или лечения рака.
[29]
Способ предупреждения или лечения рака, предусматривающий введение терапевтически эффективного количества слитой структуры, описанной в [9].
[30]
Слитая структура, описанная в [9], для применения в предупреждении или лечении рака.
[31]
Применение слитой структуры, описанной в [9], для изготовления фармацевтической композиции для предупреждения или лечения рака.
Эффекты настоящего изобретения
[0014]
Антитело к CD73 человека по настоящему изобретению обладает активностью в отношении ингибирования ферментативной активности CD73 человека, и его можно применять в качестве средства для предупреждения или лечения рака.
Краткое описание чертежей
[0015]
[Фиг. 1] Фиг. 1 представляет собой изображение, на котором представлена ингибирующая фермент активность CDS-1, MEDI9447, 6E1 и CD73.4IgG2CS-IgG1.1f в отношении белка CD73 человека.
[Фиг. 2] Фиг. 2 представляет собой изображение, на котором представлено восстановление функций T-клеток человека благодаря CDS-1, MEDI9447, 6E1 и CD73.4IgG2CS-IgG1.1f, с применением продукции некоторого количества IFNγ из T-клеток человека в качестве критерия оценки.
[Фиг. 3] Фиг. 3 представляет собой изображение, на котором представлено восстановление функций T-клеток человека благодаря CDS-1, MEDI9447, 6E1 и CD73.4IgG2CS-IgG1.1f, с применением пролиферации T-клеток человека в качестве критерия оценки.
Варианты осуществления настоящего изобретения
[0016]
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно.
[0017]
Существует пять классов антител, IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Основную структуру молекулы антитела составляют тяжелые цепи с молекулярной массой 50000-70000 и легкие цепи с молекулярной массой 20000-30000 в каждом из классов в целом. Тяжелая цепь, как правило, состоит из полипептидной цепи, содержащей примерно 440 аминокислот, имеет отличительную структуру для каждого из классов, и обозначается как Igγ, Igμ, Igα, Igδ и Igε, что отвечает IgG, IgM, IgA, IgD и IgE соответственно. Кроме того, в классе IgG имеется четыре подкласса IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и соответствующие им тяжелые цепи обозначаются как Igγ1, Igγ2, Igγ3 и Igγ4. Легкая цепь, как правило, состоит из полипептидной цепи, содержащей 220 аминокислот, и для нее известны два типа, тип L и тип K, и они обозначаются как Igλ и Igκ. В контексте пептидной конфигурации основной структуры молекул антител две гомологичные тяжелые цепи и две гомологичные легкие цепи соединены дисульфидными связями (связь S-S) и нековалентными связями, и их молекулярная масса составляет 150000-190000. Два типа легких цепей могут образовывать пару с любой тяжелой цепью. Соответствующие молекулы антител обычно состоят из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей.
[0018]
Что касается внутрицепочечных связей S-S, четыре из связей S-S присутствуют в тяжелой цепи (пять в μ- и ε-цепях), и две из них присутствуют в легкой цепи; на 100-110 аминокислотных остатков образуется одна петля, и такая пространственная структура является схожей среди петель, и называется структурной единицей или доменом. Домен, расположенный на аминоконцевой стороне (N-концевой стороне) как тяжелой цепи, так и легкой цепи, аминокислотная последовательность которого не является константной даже в случае образца из того же класса (подкласса) одного и того же вида животного, называется вариабельной областью, и соответствующие домены называются вариабельной областью тяжелой цепи (или VH) и вариабельной областью легкой цепи (или VL). Аминокислотная последовательность с карбоксиконцевой стороны (C-концевой стороны) от вариабельной области является фактически константной в каждом классе или подклассе, и называется константной областью. Соответствующие домены константной области представлены как CH1, CH2, CH3 или CL по порядку со стороны вариабельной области соответственно.
[0019]
Антигенсвязывающий участок антитела состоит из VH и VL, и специфичность связывания зависит от аминокислотной последовательности этого участка. С другой стороны, виды биологической активности, такие как связывание с элементами системы комплемента и различными эффекторными клетками, отражают различия в структурах константной области в каждом классе Ig. Следует понимать, что изменчивость вариабельных областей легких цепей и тяжелых цепей в основном ограничена тремя небольшими гипервариабельными областями, присутствующими в обеих цепях, и эти области называют определяющими комплементарность областями (CDR: CDR1, CDR2 и CDR3 с N-концевой стороны). Остальная часть вариабельной области называется каркасной областью (FR) и является относительно константной.
[0020]
Различные антигенсвязывающие фрагменты, предусматривающие VH и VL антитела, также обладают антигенсвязывающей активностью, и репрезентативные примеры такого антигенсвязывающего фрагмента включают одноцепочечный фрагмент вариабельной области (scFv), Fab, Fab’ и F(ab’)2. Fab является фрагментом моновалентного антитела, который состоит из легкой цепи и фрагмента тяжелой цепи, содержащего VH, CH1-домен и часть шарнирной области. Fab’ является фрагментом моновалентного антитела, который состоит из легкой цепи и фрагмента тяжелой цепи, содержащего VH, CH1-домен и часть шарнирной области, и при этом часть шарнирной области включает цистеиновые остатки, образующие связь S-S между тяжелыми цепями. F(ab’)2-фрагмент является фрагментом бивалентного антитела, в котором два Fab’-фрагмента соединены связью S-S между тяжелыми цепями в шарнирной области. Кроме того, scFv является фрагментом моновалентного антитела, который состоит из VH и VL, соединенных друг с другом посредством линкера.
[0021]
С использованием обозначения согласно нумерации по Kabat или EU-индексу (Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, пятое издание, публикация NIH № 91-3242, 1991 г), номер аминокислотного остатка антитела, применяемого в настоящем описании, может быть определен в соответствии с системой нумерации.
[0022]
<Антитело к CD73 человека по настоящему изобретению>
Антитело к CD73 человека по настоящему изобретению включает антитело к CD73 человека или его антигенсвязывающий фрагмент со следующими характеристиками.
Антитело к CD73 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 31-35 SEQ ID NO: 2, CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 50-66 SEQ ID NO: 2, и CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 99-112 SEQ ID NO: 2, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 24-34 SEQ ID NO: 4, CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 50-56 SEQ ID NO: 4, и CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 89-98 SEQ ID NO: 4.
[0023]
Согласно одному варианту осуществления антитело к CD73 человека по настоящему изобретению включает следующее антитело к CD73 человека или его антигенсвязывающий фрагмент:
антитело к CD73 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 1-123 SEQ ID NO: 2, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 1-109 SEQ ID NO: 4.
[0024]
В качестве константной области тяжелой цепи антитела к CD73 человека по настоящему изобретению может быть выбрана любая константная область Igγ, Igμ, Igα, Igδ или Igε. Например, Igγ может быть выбрана из Igγ1, Igγ2, Igγ3 или Igγ4. В качестве одного варианта осуществления константная область тяжелой цепи представляет собой константную область Igγ1. Например, константная область тяжелой цепи представляет собой константную область Igγ1 человека.
[0025]
Константная область тяжелой цепи антитела к CD73 человека по настоящему изобретению может предусматривать мутации с целью снижения активности в виде антителозависимой клеточной цитотоксичности или активности в виде комплементзависимой цитотоксичности антитела. L234A представляет собой замену лейцина в аминокислотном положении 234 на аланин в константной области Igγ1 человека в соответствии с EU-индексом. L235A представляет собой замену лейцина в аминокислотном положении 235 на аланин в константной области Igγ1 человека в соответствии с EU-индексом. P331S представляет собой замену пролина в аминокислотном положении 331 на серин в константной области Igγ1 человека в соответствии с EU- индексом. Примеры константной области Igγ1 человека с мутациями по аминокислотам L234A, L235A и P331S включают константную область Igγ1 человека, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 124-453 SEQ ID NO: 2. Известно, что мутации обуславливают снижение активности в виде антителозависимой клеточной цитотоксичности или активности в виде комплементзависимой цитотоксичности антитела (Mol Immunol., Vol. 29, p. 633-639, 1992) (J Immunol., Vol. 164, p. 4178-4184, 2000).
[0026]
В качестве константной области легкой цепи антитела к CD73 человека по настоящему изобретению может быть выбрана любая константная область Igλ или Igκ. В качестве одного варианта осуществления константная область легкой цепи представляет собой константную область Igκ. Например, константная область легкой цепи представляет собой константную область Igκ человека. Примеры константной области Igκ человека включают константную область Igκ человека, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 110-215 SEQ ID NO: 4.
[0027]
Согласно одному варианту осуществления антитело к CD73 человека по настоящему изобретению представляет собой антигенсвязывающий фрагмент, которым является scFv, Fab, Fab’ или F(ab’)2.
[0028]
Согласно одному варианту осуществления антитело к CD73 человека по настоящему изобретению представляет собой антитело к CD73 человека, содержащее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4.
[0029]
Известно, что, если антитело экспрессируется в клетках, антитело подвергается модификации после трансляции. Примеры посттрансляционной модификации включают расщепление по лизину на C-конце тяжелой цепи карбоксипептидазой; модификацию глутамина или глутаминовой кислоты на N-конце тяжелой цепи и легкой цепи с образованием пироглутаминовой кислоты путем пироглутаминирования; гликозилирование; окисление; дезамидирование; и гликирование, и известно, что такие посттрансляционные модификации происходят среди различных антител (Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 97, p. 2426-2447, 2008).
[0030]
Антитело к CD73 человека по настоящему изобретению включает антитело к CD73 человека, которое представляет собой антитело, полученное в результате посттрансляционной модификации, или его антигенсвязывающий фрагмент. Антитело, полученное в результате посттрансляционной модификации, включает антитело, содержащее полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности антитела, полученного в результате посттрансляционной модификации. Примеры антитела к CD73 человека по настоящему изобретению, которое представляет собой антитело, полученное в результате посттрансляционной модификации, включают антитела к CD73 человека, которые подверглись пироглутаминированию на N-конце вариабельной области тяжелой цепи и/или делеции лизина на C-конце тяжелой цепи. Из уровня техники известно, что такая посттрансляционная модификация вследствие пироглутаминирования на N-конце и делеция лизина на C-конце не оказывают какого-либо влияния на активность антитела (Analytical Biochemistry, Vol. 348, p. 24-39, 2006).
[0031]
Согласно одному варианту осуществления антитело к CD73 человека по настоящему изобретению, полученное в результате посттрансляционной модификации, представляет собой следующее антитело к CD73 человека:
антитело к CD73 человека, содержащее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 1-452 SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4.
[0032]
В настоящем описании «антитело к CD73 человека» означает антитело, связывающееся с CD73 человека. Связывается ли «антитело к CD73 человека» с CD73 человека подтверждают с применением известного способа измерения активности связывания. Примеры способа измерения активности связывания включают способ с использованием ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA) и т. д. В случае применения ELISA, например, белок CD73 человека (например, BPS Bioscience Inc., 71184) иммобилизуют на планшете для ELISA, и в него добавляют тестируемое антитело для проведения реакции. После проведения реакции, осуществляют реакцию с вторичным антителом, таким как антитело к IgG, меченное ферментом, таким как пероксидаза хрена (HRP) и т. п. После проведения реакции осуществляют промывку, а затем можно подтвердить, связывается ли тестируемое антитело с CD73 человека путем идентификации связывания вторичного антитела посредством измерения активности с применением реагента, позволяющего выявлять активность (например, в случае мечения HRP, TMB + субстрат-хромоген (Dako Ltd.)). В качестве способа специфического измерения можно применять способ, описанный в примере 2 ниже.
[0033]
Антитело к CD73 человека по настоящему изобретению включает, помимо связывающегося с CD73 человека, антитело, связывающееся с CD73, происходящим из организма других животных (например, CD73 обезьяны), при условии, что антитело связывается с CD73 человека.
[0034]
В качестве способа оценки активности антитела к CD73 человека по настоящему изобретению, можно оценивать ингибирующую фермент активность в отношении CD73 человека. В качестве способов оценки такой активности можно применять, например, способы, описанные в примерах 3 и 4 ниже. Антитело к CD73 человека по настоящему изобретению включает антитело, которое связывается с CD73 человека и обладает ингибирующей фермент активностью в отношении CD73 человека.
[0035]
Кроме того, в качестве способа оценки активности антитела к CD73 человека по настоящему изобретению, можно оценивать активность восстановления АМФ-зависимо подавленных функций T-клеток человека. В качестве способа оценки такой активности можно применять способ, раскрытый в примере 5, который будет описан далее. Антитело к CD73 человека по настоящему изобретению включает антитело, которое связывается с CD73 человека и обладает активностью в отношении восстановления АМФ-зависимо подавленных функций T-клеток человека.
[0036]
Антитело к CD73 человека по настоящему изобретению без труда может быть получено специалистом в данной области с применением известного в данной области способа исходя из информации о последовательностях VH и VL по настоящему изобретению, раскрытой в настоящем описании. Антитело к CD73 человека по настоящему изобретению особым образом не ограничивается, и оно может быть получено в соответствии со способом, описанным в разделе <Способ получения антитела к CD73 человека по настоящему изобретению или слитой структуры по настоящему изобретению, и антитело к CD73 человека или слитая структура на его основе, которые могут быть получены с помощью указанного способа>, описанном ниже.
[0037]
Антитело к CD73 человека по настоящему изобретению по необходимости дополнительно очищают, составляют в соответствии с традиционным способом, и его можно применять для предупреждения или лечения рака. Формы рака, которые являются мишенями для предупреждения или лечения в настоящем изобретении, особым образом не ограничиваются, при этом примеры форм рака включают рак легкого, рак толстой кишки, адренокортикальный рак, рак молочной железы, злокачественную меланому, глиобластому, рак яичника, медуллобластому, рак мочевого пузыря, рак желудка, рак поджелудочной железы, хронический миелоидный лейкоз, кожную Т-клеточную лимфому, глиобластому, рак головы и шеи, рак щитовидной железы или рак предстательной железы.
[0038]
<Слитая структура и модифицированная структура по настоящему изобретению>
Любой специалист в данной области сможет получить слитую структуру, в которой антитело к CD73 человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению слиты с другими пептидом или белком, или также сможет получить модифицированную структуру, с которой связывается модифицирующее средство, с применением антитела к CD73 человека по настоящему изобретению. Слитая структура и модифицированная структура по настоящему изобретению включают слитую структуру, в которой антитело к CD73 человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению слиты с другими пептидом или белком, или модифицированную структуру, с которой связывается модифицирующее средство, при условии, что слитая структура или модифицированная структура связывается с CD73 человека. Другие пептиды или белки, применяемые для слияния, особым образом не ограничиваются, и их примеры включают сывороточный альбумин человека, различные пептиды-метки, искусственный пептид с мотивом в виде петли, мальтоза-связывающие белки, глутатион-S-трансферазу, различные токсины, цитокин, хемокин, другие пептиды или белки, способные инициировать мультимеризацию и т.п. Применяемое для модификации модифицирующее средство особым образом не ограничивается, и его примеры включают полиэтиленгликоль, углеводные цепи, фосфолипиды, липосомы, низкомолекулярные соединения и т.п. Слияние или модификация могут представлять собой прямое слияние или прямую модификацию, и могут представлять собой слияние или модификацию посредством произвольного линкера. Слитая структура по настоящему изобретению включает слитую структуру, в которой антитело к CD73 человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению слиты с цитокином. Применяемый в слитой структуре по настоящему изобретению цитокин не ограничивается цитокином, встречающимся в природе, и может представлять собой вариант, обладающий определенной функцией. Согласно одному варианту осуществления включенный в слитую структуру по настоящему изобретению цитокин представляет собой интерлейкин-7 (IL-7), интерлейкин-21 (IL-21) или их вариант. Кроме того, применяемый в слитой структуре по настоящему изобретению цитокин может представлять собой вариант, полученный путем снижения биологической активности IL-7 или IL-21.
[0039]
В слитой структуре по настоящему изобретению тяжелая цепь включает тяжелую цепь антитела, содержащегося в слитой структуре, и другие пептид или белок, с которыми слита тяжелая цепь. В слитой структуре по настоящему изобретению легкая цепь включает легкую цепь антитела, содержащегося в слитой структуре, и другие пептид или белок, с которыми слита легкая цепь.
[0040]
IL-7 представляет собой цитокин, который выполняет функцию лиганда по отношению к рецептору IL-7. Сообщалось, что IL-7 способствует выживанию, пролиферации и дифференцировке Т-клеток, В-клеток и т. п. (Curr Drug Targets., Vol. 7, p. 1571-1582, 2006). В настоящем изобретении IL-7 включает IL-7, встречающийся в природе, и вариант, обладающий определенной функцией. Согласно одному варианту осуществления IL-7 является IL-7 человека. В настоящем изобретении IL-7 человека включает IL-7 человека, встречающийся в природе, и вариант, обладающий определенной функцией. Согласно одному варианту осуществления IL-7 человека выбран из группы, состоящей из нижеследующих (1)-(3): (1) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную под номером доступа NP_000871. 1, и обладающий функцией IL-7 человека, (2) полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, в которой 1-10 аминокислот подвергнуты делеции, замене, вставке и/или добавлению, в аминокислотной последовательности, представленной под номером доступа NP_000871.1, и обладающий функцией IL-7 человека, и (3) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, характеризующуюся 90% или более идентичностью с аминокислотной последовательностью, представленной под номером доступа NP_000871.1, и обладающий функцией IL-7 человека. Согласно одному варианту осуществления применяемый в настоящем изобретении IL-7 человека представляет собой полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной под номером доступа NP_000871.1. В данном случае функция IL-7 человека заключается в обеспечении выживания, пролиферации и дифференцировки различных иммунных клеток человека.
[0041]
IL-21 представляет собой цитокин, который выполняет функцию лиганда по отношению к рецептору IL-21. Сообщалось, что IL-21 способствует выживанию, пролиферации и дифференцировке Т-клеток, В-клеток и т. п. (Cancer Lett., Vol. 358, p. 107-114, 2015). В настоящем изобретении IL-21 включает IL-21, встречающийся в природе, и вариант, обладающий определенной функцией. Согласно одному варианту осуществления IL-21 является IL-21 человека. В настоящем изобретении IL-21 человека включает IL-21 человека, встречающийся в природе, и вариант, обладающий определенной функцией. Согласно одному варианту осуществления IL-21 человека выбран из группы, состоящей из нижеследующих (1)-(3): (1) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную под номером доступа NP_068575. 1, и обладающий функцией IL-21 человека, (2) полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, в которой 1-10 аминокислот подвергнуты делеции, замене, вставке и/или добавлению, в аминокислотной последовательности, представленной под номером доступа NP_068575.1, и обладающий функцией IL-21 человека, и (3) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, характеризующуюся 90% или более идентичностью с аминокислотной последовательностью, представленной под номером доступа NP_068575.1, и обладающий функцией IL-21 человека. Согласно одному варианту осуществления применяемый в настоящем изобретении IL-21 человека представляет собой полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной под номером доступа NP_068575.1. В данном случае функция IL-21 человека заключается в обеспечении выживания, пролиферации и дифференцировки различных иммунных клеток человека.
[0042]
Слитая структура по настоящему изобретению также включает слитую структуру, полученную в результате посттрансляционной модификации. Примеры посттрансляционной модификации включают различные посттрансляционные модификации, описанные в разделе <Антитело к CD73 человека по настоящему изобретению>.
[0043]
Согласно одному варианту осуществления слитая структура по настоящему изобретению представляет собой слитую структуру, выбранную из группы, состоящей из нижеследующих (a)-(e):
(a) слитая структура, содержащая тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 7, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4;
(b) слитая структура, содержащая тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 10, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4;
(c) слитая структура, содержащая тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 13;
(d) слитая структура, содержащая тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 15; и
(e) слитая структура, полученная в результате посттрансляционной модификации слитой формы (a)-(d).
[0044]
Согласно одному варианту осуществления слитая структура по настоящему изобретению, которая представляет собой слитую структуру, полученную в результате посттрансляционной модификации, является следующей слитой структурой:
слитая структура, содержащая тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 1-452 SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 13.
[0045]
Согласно одному варианту осуществления слитая структура по настоящему изобретению, которая представляет собой слитую структуру, полученную в результате посттрансляционной модификации, является следующей слитой структурой:
слитая структура, содержащая тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 1-452 SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 15.
[0046]
<Полинуклеотид по настоящему изобретению>
Полинуклеотид по настоящему изобретению включает полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую VH антитела к CD73 человека по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую VL антитела к CD73 человека по настоящему изобретению.
[0047]
Согласно одному варианту осуществления полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую VH антитела к CD73 человека по настоящему изобретению, представляет собой полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую VH, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 1-123 SEQ ID NO: 2.
[0048]
Примеры полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую VH, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 1-123 SEQ ID NO: 2, включают полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность из нуклеотидов под номерами 1-369 SEQ ID NO: 1.
[0049]
Согласно одному варианту осуществления полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую VL антитела к CD73 человека по настоящему изобретению, представляет собой полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую VL, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 1-109 SEQ ID NO: 4.
[0050]
Примеры полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую VL, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 1-109 SEQ ID NO: 4, включают полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность из нуклеотидов под номерами 1-327 SEQ ID NO: 3.
[0051]
Полинуклеотид по настоящему изобретению включает полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела к CD73 человека по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь антитела к CD73 человека по настоящему изобретению.
[0052]
Согласно одному варианту осуществления полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела к CD73 человека по настоящему изобретению, представляет собой полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2.
[0053]
Примеры полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, включают полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1 или 11.
[0054]
Согласно одному варианту осуществления полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь антитела к CD73 человека по настоящему изобретению, представляет собой полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4.
[0055]
Примеры полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4, включают полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 3 или 8.
[0056]
Полинуклеотид по настоящему изобретению включает полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь слитой структуры по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь слитой структуры по настоящему изобретению.
[0057]
Согласно одному варианту осуществления полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь слитой структуры по настоящему изобретению, представляет собой полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 7.
[0058]
Примеры полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 7, включают полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 5 или 6.
[0059]
Согласно одному варианту осуществления полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь слитой структуры по настоящему изобретению, представляет собой полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4.
[0060]
Примеры полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4, включают полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 3 или 8.
[0061]
Согласно одному варианту осуществления полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь слитой структуры по настоящему изобретению, представляет собой полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 10.
[0062]
Примеры полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 10, включают полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9 или 16.
[0063]
Согласно одному варианту осуществления полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь слитой структуры по настоящему изобретению, представляет собой полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2.
[0064]
Примеры полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, включают полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1 или 11.
[0065]
Согласно одному варианту осуществления полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь слитой структуры по настоящему изобретению, представляет собой полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 13.
[0066]
Примеры полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 13, включают полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 12.
[0067]
Согласно одному варианту осуществления полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь слитой структуры по настоящему изобретению, представляет собой полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 15.
[0068]
Примеры полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 15, включают полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 14.
[0069]
Полинуклеотид по настоящему изобретению без труда может быть получен специалистом в данной области с применением известного в данной области способа исходя из нуклеотидной последовательности. Например, полинуклеотид по настоящему изобретению можно синтезировать с применением известного в данной области способа синтеза генов. В качестве способа синтеза генов можно применять различные способы, такие как способ синтеза генов антител, описанный в WO90/07861, известный специалисту в данной области.
[0070]
<Вектор экспрессии по настоящему изобретению>
Вектор экспрессии по настоящему изобретению включает вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую VH антитела к CD73 человека по настоящему изобретению, вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую VL антитела к CD73 человека по настоящему изобретению, и вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую VH антитела к CD73 человека по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую VL антитела.
[0071]
Вектор экспрессии по настоящему изобретению включает вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела к CD73 человека по настоящему изобретению, вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь антитела к CD73 человека по настоящему изобретению, и вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела к CD73 человека по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь антитела.
[0072]
Вектор экспрессии по настоящему изобретению включает вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь слитой структуры по настоящему изобретению, вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь слитой структуры по настоящему изобретению, и вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь слитой структуры, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь слитой структуры.
[0073]
Применяемые для экспрессии полинуклеотида по настоящему изобретению векторы экспрессии особым образом не ограничиваются, при условии, что полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела к CD73 человека или слитой структуры по настоящему изобретению, и/или полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь антитела к CD73 человека или слитой структуры по настоящему изобретению, может экспрессироваться в различных клетках-хозяевах, относящихся к эукариотическим клеткам (например, клеткам животных, клеткам насекомых, клеткам растений и дрожжей) и/или прокариотическим клеткам (например, Escherichia coli), и могут быть получены кодируемые ними полипептиды. Примеры вектора экспрессии включают плазмидные векторы, вирусные векторы (например, на основе аденовируса или ретровируса) и т. п. Согласно одному варианту осуществления в качестве вектора экспрессии можно применять pEE6.4 или pEE12.4 (Lonza Biologics, Inc.).
[0074]
Вектор экспрессии по настоящему изобретению может включать промотор, который функционально связан с полинуклеотидом по настоящему изобретению. Примеры промотора для экспрессии полинуклеотида по настоящему изобретению с использованием клеток животных включают происходящей из вируса промотор, такой как CMV, RSV или SV40, промотор гена актина, промотор гена EF (фактора элонгации) 1α и промотор гена белка теплового шока. Примеры промоторов для экспрессии полинуклеотида по настоящему изобретению у бактерий (например, Escherichia) включают промотор trp, промотор lac, промотор λPL и промотор tac. Кроме того, примеры промоторов для экспрессии полинуклеотида по настоящему изобретению у дрожжей включают промотор гена GAL1, промотор гена GAL10, промотор гена PH05, промотор гена PGK, промотор гена GAP и промотор гена ADH.
[0075]
В случае применения клетки животного, клетки насекомого или клетки дрожжей в качестве клетки-хозяина, вектор экспрессии по настоящему изобретению может включать старт-кодон и стоп-кодон. В этом случае вектор экспрессии по настоящему изобретению может содержать энхансерную последовательность, нетранслируемую область на 5’-конце и 3’-конце генов, кодирующих антитело по настоящему изобретению или тяжелую цепь или легкую цепь, сигнальную последовательность для секреции, границу сплайсинга, сайт полиаденилирования или реплицируемую единицу. Если в качестве клетки-хозяина применяют Escherichia coli, вектор экспрессии по настоящему изобретению может содержать старт-кодон, стоп-кодон, терминаторную область и реплицируемую единицу. В этом случае вектор экспрессии по настоящему изобретению может содержать селективный маркер (например, гены резистентности к тетрациклину, гены резистентности к ампициллину, гены резистентности к канамицину, гены резистентности к неомицину или гены дигидрофолатредуктазы), который обычно применяется в соответствии с назначением.
[0076]
<Трансформированная клетка-хозяин по настоящему изобретению>
Трансформированная клетка-хозяин по настоящему изобретению включает клетку-хозяина, трансформированную вектором экспрессии по настоящему изобретению, которая выбрана из группы, состоящей из нижеследующих (a)-(d):
(a) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую VH антитела к CD73 человека по настоящему изобретению;
(b) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую VL антитела к CD73 человека по настоящему изобретению;
(c) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую VH антитела к CD73 человека по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую VL антитела; и
(d) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую VH антитела к CD73 человека по настоящему изобретению, и вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую VL антитела.
[0077]
Трансформированная клетка-хозяин по настоящему изобретению включает клетку-хозяина, трансформированную вектором экспрессии по настоящему изобретению, которая выбрана из группы, состоящей из нижеследующих (a)-(d):
(a) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела к CD73 человека по настоящему изобретению;
(b) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь антитела к CD73 человека по настоящему изобретению;
(c) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела к CD73 человека по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь антитела к CD73 человека по настоящему изобретению; и
(d) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела к CD73 человека по настоящему изобретению, и вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь антитела.
[0078]
Трансформированная клетка-хозяин по настоящему изобретению включает клетку-хозяина, трансформированную вектором экспрессии по настоящему изобретению, которая выбрана из группы, состоящей из нижеследующих (a)-(d):
(a) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь слитой структуры по настоящему изобретению;
(b) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь слитой структуры по настоящему изобретению;
(c) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь слитой структуры по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь слитой структуры; и
(d) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь слитой структуры по настоящему изобретению, и вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь слитой структуры.
[0079]
Примеры трансформированной клетки-хозяина по настоящему изобретению включают клетку-хозяина, трансформированную вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела к CD73 человека по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь антитела, и клетку-хозяина, трансформированную вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела к CD73 человека по настоящему изобретению, и вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь антитела.
[0080]
Трансформированная клетка-хозяин особым образом не ограничивается, при условии, что клетка-хозяин подходит для подлежащего применению вектора экспрессии, трансформируется вектором экспрессии и может экспрессировать антитело или слитую структуру. Примеры трансформированной клетки-хозяина включают различные клетки, такие как естественные клетки или искусственно созданные клетки, которые обычно применяют в области, к которой относится настоящее изобретение (например, клетки животных (например, клетки CHO-K1SV), клетки насекомых (например, Sf9), бактерий (например, Escherichia), дрожжей (например, Saccharomyces или Pichia) и т. п.). Согласно одному варианту осуществления клеточные линии, такие как клетки CHO-K1SV, клетки CHO-DG 44, клетки HEK293, клетки NS0 и т. п., можно применять в качестве трансформированной клетки-хозяина.
[0081]
Способ трансформации клетки-хозяина особым образом не ограничивается, и, например, можно применять кальций-фосфатный способ или способ с использованием электропорации.
[0082]
<Способ получения антитела к CD73 человека по настоящему изобретению или слитой структуры по настоящему изобретению, и антитело к CD73 человека или слитая структура на его основе, которые могут быть получены с помощью указанного способа>
Способ получения антитела к CD73 человека по настоящему изобретению или слитой структуры по настоящему изобретению включает способ получения антитела к CD73 человека, его антигенсвязывающего фрагмента или слитой структуры на основе любого из них путем культивирования клетки-хозяина (клеток-хозяев), выбранной (выбранных) из группы, состоящей из нижеследующих (a)-(c), для экспрессии антитела к CD73 человека, его антигенсвязывающего фрагмента или слитой структуры на основе любого из них:
(a) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую VH антитела к CD73 человека по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую VL антитела;
(b) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую VH антитела к CD73 человека по настоящему изобретению, и вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую VL антитела; и
(c) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую VH антитела к CD73 человека по настоящему изобретению, и клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую VL антитела.
[0083]
Способ получения антитела к CD73 человека по настоящему изобретению или слитой структуры по настоящему изобретению включает способ получения антитела к CD73 человека или слитой структуры на его основе путем культивирования клетки-хозяина (клеток-хозяев), выбранной(выбранных) из группы, состоящей из нижеследующих (a)-(c), для экспрессии антитела к CD73 человека или слитой структуры на его основе:
(a) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела к CD73 человека по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь антитела;
(b) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела к CD73 человека по настоящему изобретению, и вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь антитела; и
(c) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела к CD73 человека по настоящему изобретению, и клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь антитела.
[0084]
Способ получения слитой структуры по настоящему изобретению включает способ получения слитой структуры на основе антитела к CD73 человека путем культивирования клетки-хозяина(клеток-хозяев), выбранной(выбранных) из группы, состоящей из нижеследующих (a)-(c), для экспрессии слитой структуры на основе антитела к CD73 человека:
(a) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь слитой структуры по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь слитой структуры;
(b) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь слитой структуры по настоящему изобретению, и вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь слитой структуры; и
(c) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь слитой структуры по настоящему изобретению, и клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь слитой структуры.
[0085]
Способ получения антитела к CD73 человека по настоящему изобретению или слитой структуры по настоящему изобретению особым образом не ограничивается, при условии, что он предусматривает стадию культивирования трансформированных клеток-хозяев по настоящему изобретению для экспрессии антитела к CD73 человека, антигенсвязывающего фрагмента или слитой структуры на основе любого из них. Примеры применяемых в способе клеток-хозяев включают трансформированные клетки-хозяева по настоящему изобретению, описанные выше.
[0086]
Трансформированную клетку-хозяина можно культивировать с помощью известных способов. Условия культивирования, например, температуру, pH культуральной среды и продолжительность культивирования выбирают соответствующим образом. В случае, когда клетка-хозяин представляет собой клетку животного, примеры культуральной среды включают культуральную среду MEM, дополненную примерно 5%-20% фетальной телячьей сывороткой (Science, Vol. 130, p. 432-437, 1959), культуральную среду DMEM (Virology, Vol. 8, p. 396, 1959), культуральную среду RPMI1640 (J. Am. Med. Assoc., Vol. 199, p. 519, 1967) и культуральную среду 199 (Exp. Biol. Med., Vol. 73, p. 1-8, 1950). pH культуральной среды составляет предпочтительно примерно 6-8, и культивирование обычно осуществляют при примерно 30°C-40°C в течение от примерно 15 часов до 336 часов, при воздушной вентиляции и перемешивании, если необходимо. В случае, когда клетка-хозяин представляет собой клетку насекомого, в качестве культуральной среды можно применять, например, культуральную среду Грейса (Proc Natl Acad Sci USA., Vol. 82, p. 8404, 1985), дополненную фетальной телячьей сывороткой. pH культуральной среды составляет, например, примерно 5-8, и культивирование обычно осуществляют при примерно 20°C-40°C в течение от примерно 15 часов до 100 часов, при воздушной вентиляции и перемешивании, если необходимо. В случае, когда клетка-хозяин представляет собой Escherichia coli или дрожжевую клетку, в качестве культуральной среды подходит, например, жидкая культуральная среда, дополненная источником питательных веществ. Питательная культуральная среда включает источник углерода, источник неорганического азота или источник органического азота, необходимого для роста трансформированной клетки-хозяина. Примеры источника углерода включают глюкозу, декстран, растворимый крахмал и сахарозу, а примеры источника неорганического азота или источника органического азота включают аммонийные соли, нитратные соли, аминокислоты, жидкий кукурузный экстракт, пептон, казеин, мясной экстракт, соевый жмых и картофельный экстракт. При необходимости, могут быть включены другие питательные вещества (например, неорганические соли (например, хлорид кальция, дигидрофосфат натрия и хлорид магния), витамины) и антибиотики (например, тетрациклин, неомицин, ампициллин и канамицин). pH культуральной среды составляет, например, примерно 5-8. В случае, когда клетка-хозяин представляет собой Escherichia coli, примеры культуральной среды включают культуральную среду LB и культуральную среду M9 (Molecular. Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Vol. 3, A2.2). Культивирование обычно осуществляют при примерно 14°C-43°C в течение от примерно 3 часов до 24 часов, при воздушной вентиляции и перемешивании, если необходимо. В случае, когда клетка-хозяин представляет собой дрожжевую клетку, в качестве культуральной среды можно применять, например, минимальную среду Буркхолдера (Proc Natl Acad Sci USA., Vol. 77, p. 4505, 1980). Культивирование обычно осуществляют при примерно 20°C-35°C в течение от примерно 14 часов до 144 часов, при воздушной вентиляции и перемешивании, если необходимо. Путем осуществления культивирования вышеописанным способ, обеспечивается возможность экспрессии антитела к CD73 человека по настоящему изобретению.
[0087]
Способ получения антитела к CD73 человека по настоящему изобретению или слитой структуры по настоящему изобретению дополнительно может предусматривать извлечение, выделение или очистку антитела к CD73 человека, его антигенсвязывающего фрагмента или слитой структуры на основе любого из них, в дополнение к культивированию трансформированной клетки-хозяина по настоящему изобретению для экспрессии антитела к CD73 человека, его антигенсвязывающего фрагмента или слитой структуры на основе любого из них. Примеры способа выделения или очистки включают способы на основе применения растворимости, такие как высаливание и способ на основе осаждения растворителем, способы на основе применения различий в молекулярной массе, такие как диализ, ультрафильтрация и гель-фильтрация, способы на основе применения электрического заряда, такие как ионообменная хроматография и хроматография с гидроксиапатитом, способы с применением специфической аффинности, такие как аффинная хроматография, способы на основе применения различий в гидрофобности, такие как обращенно-фазная хроматография, и способы на основе применения различий в изоэлектрической точке, такие как электрофорез с изоэлектрическим фокусированием. Согласно одному варианту осуществления антитело, накопленное в супернатанте культуры, можно очищать с помощью различных типов хроматографии, например, колоночной хроматографии с применением колонки с белком A или колонки с белком G.
[0088]
Антитело к CD73 человека по настоящему изобретению или слитая структура по настоящему изобретению также включают антитело к CD73 человека и его антигенсвязывающий фрагмент или слитую структуру на основе любого из них, полученные с помощью способа получения антитела к CD73 человека по настоящему изобретению или слитой структуры по настоящему изобретению.
[0089]
<Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению>
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению включает фармацевтическую композицию, содержащую антитело к CD73 человека по настоящему изобретению, его антигенсвязывающий фрагмент или слитую структуру по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемые наполнители. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть получена с помощью способа, обычно применяемого с приемлемыми наполнителями, то есть приемлемыми наполнителями для лекарственного препарата или носителями для лекарственного препарата, обычно применяемыми в данной области. Примеры лекарственных форм фармацевтических композиций включают лекарственное средство для парентерального применения, такое как инъекционное лекарственное средство, и лекарственное средство для капельного введения, и их можно вводить путем внутривенного введения, подкожного введения и т.п. При получении лекарственного средства можно применять наполнители, носители и добавки в соответствии с лекарственными формами в фармацевтически приемлемом диапазоне.
[0090]
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может включать множество видов антител к CD73 человека по настоящему изобретению. Например, настоящее изобретение также включает фармацевтическую композицию, содержащую антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые не подвергаются делеции лизина на C-конце и пироглутаминированию на N-конце, и/или антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые подверглись делеции лизина на C-конце и/или пироглутаминированию на N-конце.
[0091]
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может включать множество видов слитой структуры по настоящему изобретению. Например, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению также включает фармацевтическую композицию, содержащую слитую структуру, которая не подвергается делеции лизина на C-конце и пироглутаминированию на N-конце, и/или слитую структуру, которая подверглась делеции лизина на C-конце и/или пироглутаминированию на N-конце.
[0092]
Согласно одному варианту осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит антитело к CD73 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 1-123 SEQ ID NO: 2, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 1-109 SEQ ID NO: 4, и антитело к CD73 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, полученные в результате посттрансляционной модификации антитела к CD73 человека или его антигенсвязывающего фрагмента.
[0093]
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению также включает фармацевтическую композицию, содержащую антитело, в котором лизин на C-конце тяжелой цепи удален, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые подверглись пироглутаминированию на N-конце, антитело, в котором лизин на C-конце тяжелой цепи удален, и которое подверглось пироглутаминированию на N-конце, и/или антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат лизин на C-конце тяжелой цепи и не подвергаются пироглутаминированию на N-конце.
[0094]
Согласно одному варианту осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую антитело к CD73 человека, содержащее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4, антитело к CD73 человека, содержащее полинуклеотид, состоящий из последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность антитела, полученного в результате посттрансляционной модификации антитела к CD73 человека, и фармацевтически приемлемый наполнитель.
[0095]
Согласно одному варианту осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую слитую структуру на основе антитела к CD73 человека, содержащую тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 7, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4, слитую структуру, содержащую полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности слитой структуры, полученной в результате посттрансляционной модификации слитой структуры, и фармацевтически приемлемый наполнитель.
[0096]
Согласно одному варианту осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую слитую структуру на основе антитела к CD73 человека, содержащую тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 10, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4, слитую структуру, содержащую полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности слитой структуры, полученной в результате посттрансляционной модификации слитой структуры, и фармацевтически приемлемый наполнитель.
[0097]
Согласно одному варианту осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую слитую структуру на основе антитела к CD73 человека, содержащую тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 13, слитую структуру, содержащую полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности слитой структуры, полученной в результате посттрансляционной модификации слитой структуры, и фармацевтически приемлемый наполнитель.
[0098]
Согласно одному варианту осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую слитую структуру на основе антитела к CD73 человека, содержащую тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 15, слитую структуру, содержащую полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности слитой структуры, полученной в результате посттрансляционной модификации слитой структуры, и фармацевтически приемлемый наполнитель.
[0099]
Количество добавляемого в состав антитела к CD73 человека, слитой структуры и модифицированной структуры по настоящему изобретению варьируется в зависимости от степени выраженности симптомов пациента, возраста пациента, лекарственной формы подлежащего применению лекарственного средства, титра связывания для антитела и т. п., и, например, можно применять добавляемое количество от примерно 0,001 мг/кг до 100 мг/кг.
[0100]
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно применять в качестве средства для лечения рака.
[0101]
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению включает фармацевтическую композицию для предупреждения или лечения рака, содержащую антитело к CD73 человека, слитую структуру или модифицированную структуру по настоящему изобретению. Кроме того, настоящее изобретение включает способ лечения или предупреждения рака, предусматривающий введение терапевтически эффективного количества антитела к CD73 человека, слитой структуры или модифицированной структуры по настоящему изобретению. Кроме того, настоящее изобретение включает антитело к CD73 человека, слитую структуру и модифицированную структуру по настоящему изобретению для применения в предупреждении или лечении рака. Кроме того, настоящее изобретение включает применение антитела к CD73 человека, слитой структуры и модифицированной структуры по настоящему изобретению для изготовления фармацевтической композиции для предупреждения или лечения рака. Формы рака, которые являются мишенями для предупреждения или лечения в настоящем изобретении, особым образом не ограничиваются, при этом примеры форм рака включают рак легкого, рак толстой кишки, адренокортикальный рак, рак молочной железы, злокачественную меланому, глиобластому, рак яичника, медуллобластому, рак мочевого пузыря, рак желудка, рак поджелудочной железы, хронический миелоидный лейкоз, кожную Т-клеточную лимфому, глиобластому, рак головы и шеи, рак щитовидной железы или рак предстательной железы.
[0102]
Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приведены конкретные примеры, на которые делаются ссылки, однако они являются лишь примерами, и не ограничивают настоящее изобретение.
[Примеры]
[0103]
Если не указано иное, тесты осуществляют в соответствии с известными способами. Кроме того, что касается частей, где применяются коммерчески доступные реагенты или наборы, тесты осуществляли в соответствии с инструкциями к коммерчески доступным продуктам.
[0104]
[Пример 1: получение антитела к CD73 человека]
Антитело к CD73 человека получали с применением мыши, созданной с помощью технологии разработки моноклональных антител человека «VelocImmune» (технология создания антител VelocImmune (VelocImmune antibody technology); Regeneron Pharmaceuticals, Inc. (Патент США № 6596541)). Полученное по технологии антитело представляет собой химерное антитело, у которого вариабельная область происходит из антитела человека, а константная область происходит из антитела мыши. Полученную с помощью VelocImmune мышь иммунизировали адъювантом для стимуляции иммунной реакции, вместе с белком CD73 человека. Белок CD73 человека был получен с помощью следующей методики. К 3’-концу нуклеотидной последовательности с номерами оснований 1-1641 гена CD73 человека (ORIGENE Technologies, Inc., RC209568) добавляли нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность His-метки (His × 6), и стоп-кодон, с помощью метода генетической инженерии с применением гена, введенного в вектор для экспрессии в клетках млекопитающих, в качестве вектора экспрессии. Вектором экспрессии трансфицировали клетку Expi293F™ (Thermo Fisher Scientific Inc.), и слитый белок, полученный путем слияния CD73 человека и His-метки (белок CD73 человека-His), очищали из выделенного супернатанта. Очищенным белком CD73 человека- His несколько раз иммунизировали мышь, а затем в соответствии с традиционным способом получали гибридому. С применением антитела, очищенного из супернатанта гибридомы, отбирали клон гибридомы, продуцирующий антитело, характеризующееся функцией ингибирования ферментативной активности CD73 человека. Затем гены, кодирующие тяжелую цепь и легкую цепь антитела из гибридомы, клонировали. Что касается клонирования генов, в соответствии с традиционным способом генные последовательности антитела в виде кДНК, полученной на основе экстрагированной РНК гибридомы, анализировали, и осуществляли определение последовательностей. Кроме того, анализировали аминокислотную последовательность, и обращались к базе данных по Kabat et al. (Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, пятое издание, публикация NIH № 91-3242, 1991) для определения последовательности CDR и последовательности FR. С целью улучшения физических свойств и стабильности, FR тяжелой цепи и легкой цепи некоторых клонов заменяли на FR тяжелой цепи и легкой цепи других антител человека, соответственно. Последовательности VH и VL с замененной последовательностью антитела соответственно связывали с константной областью Igγ1 человека (в некоторых клонах, константной областью Igγ1 человека, предусматривающей мутации по аминокислотам L234A, L235A и P331S) и константной областью Igκ1 человека с помощью способа ПЦР, вставляли в вектор GS (Lonza Biologics, Inc.), который представляет собой вектор для экспрессии в клетках млекопитающих, конструируя тем самым вектор экспрессии. В частности, гены, кодирующие сигнальные последовательности (Protein Eng., Vol. 1, p. 499-505, 1987), и гены константной области Igγ1 человека соответственно лигировали с 5’- концом и 3’-концом генов вариабельной области тяжелой цепи антитела, а затем гены тяжелой цепи вставляли в вектор GS pEE6.4. Кроме того, гены, кодирующие сигнальные последовательности (Protein Eng., Vol. 1, p. 499-505, 1987), и гены константной области κ- цепи человека соответственно лигировали с 5’-концом и 3’-концом генов вариабельной области легкой цепи, а затем гены легкой цепи вставляли в вектор GS pEE12.4.
[0105]
При применении вектора экспрессии, содержащего последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела, и последовательность, кодирующую легкую цепь антитела, очищенное антитело получали из линии с транзиентной экспрессией или стабильной экспрессией. Что касается транзиентной экспрессии, в частности, обоими векторами экспрессии для вышеописанных тяжелой цепи антитела и легкой цепи антитела трансфицировали клетки CHOKISV (Lonza Biologics, Inc.) с применением MaxCyte STX (торговое название) (MaxCyte Inc.), и культивировали в течение приблизительно 7 дней. Супернатанты культуры после транзиентной экспрессии или стабильной экспрессии очищали с применением MabSelect SuRe (GE Healthcare Japan Corporation), Vivapure (торговое название) Q Maxi H (Sartorius Group) и т. п, с получением тем самым очищенных антител.
[0106]
В результате отбора из ряда очищенных антител клонов, характеризующихся функцией ингибирования ферментативной активности CD73 человека, было обнаружено, что антитело к CD73 человека с названием CDS-1 характеризуется наиболее выраженной функцией ингибирования ферментативной активности.
[0107]
Нуклеотидная последовательность, кодирующая от остатка номер 1 вариабельной области тяжелой цепи CDS-1, в соответствии с нумерацией по Kabat, до C-конца константной области, представлена SEQ ID NO: 1, аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представлена SEQ ID NO: 2, нуклеотидная последовательность, кодирующая от остатка номер 1 вариабельной области легкой цепи антитела, в соответствии с нумерацией по Kabat, до C-конца константной области, представлена SEQ ID NO: 3, и аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представлена SEQ ID NO: 4.
[0108]
VH CDS-1 состоит из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 1-123 SEQ ID NO: 2, CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи соответственно состоят из аминокислотных последовательностей из аминокислот под номерами 31-35, 50-66 и 99-112 SEQ ID NO: 2. VL антитела состоит из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 1-109 SEQ ID NO: 4, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи соответственно состоят из аминокислотных последовательностей из аминокислот под номерами 24-34, 50-56 и 89-98 SEQ ID NO: 4.
[0109]
Была получена слитая структура, в которой IL-7 человека слит с C-концевой стороной тяжелой цепи CDS-1, и названа CDS-3. Нуклеотидная последовательность, кодирующая от остатка номер 1 вариабельной области тяжелой цепи CDS-3, в соответствии с нумерацией по Kabat, до C-конца константной области, и IL-7 человека посредством линкера, представлена SEQ ID NO: 5 и 6, аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представлена SEQ ID NO: 7, нуклеотидная последовательность, кодирующая от остатка номер 1 вариабельной области легкой цепи слитой структуры, в соответствии с нумерацией по Kabat, до C-конца константной области, представлена SEQ ID NO: 3 и 8, аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представлена SEQ ID NO: 4, и тяжелая цепь CDS-3 состоит из аминокислотных последовательностей, в которых аминокислотная последовательность IL-7 человека, состоящая из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 464-615 SEQ ID NO: 7, слита с C-концевой стороной тяжелой цепи CDS-1 посредством линкера, состоящего из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 454-463 SEQ ID NO: 7.
[0110]
Была получена слитая структура, в которой вариант IL-7 человека слит с C-концевой стороной тяжелой цепи CDS-1, и названа CDS-6. Нуклеотидная последовательность, кодирующая от остатка номер 1 вариабельной области тяжелой цепи CDS-6, в соответствии с нумерацией по Kabat, до C-конца константной области, и вариант IL-7 человека посредством линкера, представлена SEQ ID NO: 9 и 16, аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представлена SEQ ID NO: 10, нуклеотидная последовательность, кодирующая от остатка номер 1 вариабельной области легкой цепи слитой структуры, в соответствии с нумерацией по Kabat, до C-конца константной области, представлена SEQ ID NO: 3 и 8, и аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представлена SEQ ID NO: 4 соответственно. Тяжелая цепь CDS-6 состоит из аминокислотных последовательностей, в которых аминокислотная последовательность варианта IL-7 человека, состоящая из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 464-615 SEQ ID NO: 10, слита с C-концевой стороной тяжелой цепи CDS-1 посредством линкера, состоящего из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 454-463 SEQ ID NO: 10.
[0111]
Была получена слитая структура, в которой IL-21 человека слит с C-концевой стороной легкой цепи CDS-1, и названа CDS-7. Нуклеотидная последовательность, кодирующая от остатка номер 1 вариабельной области тяжелой цепи CDS-7, в соответствии с нумерацией по Kabat, до C-конца константной области, представлена SEQ ID NO: 11, аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представлена SEQ ID NO: 2, нуклеотидная последовательность, кодирующая от остатка номер 1 вариабельной области легкой цепи слитой структуры, в соответствии с нумерацией по Kabat, до C-конца константной области, и IL-21 посредством линкера, представлена SEQ ID NO: 12, и аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представлена SEQ ID NO: 13. Легкая цепь CDS-7 состоит из аминокислотных последовательностей, в которых аминокислотная последовательность IL-21 человека, состоящая из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 226-358 SEQ ID NO: 13, слита с C-концевой стороной легкой цепи CDS-1 посредством линкера, состоящего из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 216-225 SEQ ID NO: 13.
[0112]
Была получена слитая структура, в которой вариант IL-21 человека слит с C- концевой стороной легкой цепи CDS-1, и названа CDS-8. Нуклеотидная последовательность, кодирующая от остатка номер 1 вариабельной области тяжелой цепи CDS-8, в соответствии с нумерацией по Kabat, до C-конца константной области, представлена SEQ ID NO: 11, аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представлена SEQ ID NO: 2, нуклеотидная последовательность, кодирующая от остатка номер 1 вариабельной области легкой цепи слитой структуры, в соответствии с нумерацией по Kabat, до C-конца константной области, и вариант IL-21 посредством линкера, представлена SEQ ID NO: 14, и аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представлена SEQ ID NO: 15. Легкая цепь CDS-8 состоит из аминокислотных последовательностей, в которых аминокислотная последовательность варианта IL-21 человека, состоящая из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 226-358 SEQ ID NO: 15, слита с C-концевой стороной легкой цепи CDS-1 посредством линкера, состоящего из аминокислотной последовательности из аминокислот под номерами 216-225 SEQ ID NO: 15.
[0113]
Очищенные CDS-3, CDS-6, CDS-7 и CDS-8 были получены в соответствии с вышеописанным способом.
[0114]
Исходя из информации, представленной на фиг. 1C и фиг. 1D патентного документа 1, получали вектор экспрессии, экспрессирующий антитело под названием MEDI9447. Исходя из информации, представленной SEQ ID NO: 21 и 22 патентного документа 2, получали вектор экспрессии, экспрессирующий антитело под названием 6E1. Исходя из информации, представленной SEQ ID NO: 133 и 102 патентного документа 3, получали вектор экспрессии, экспрессирующий антитело под названием CD73.4IgG2CS-IgG1.1f. Гены, кодирующие сигнальные последовательности, вставляли в такие векторы экспрессии в соответствии с традиционным способом.
[0115]
Очищенные MEDI9447, CD73.4IgG2CS-IgG1.1f и 6E1 получали в соответствии с традиционным способом, и применяли их для сравнения.
[0116]
По результатам анализа аминокислотной модификации очищенных CDS-1, CDS-7 и CDS-8, в большинстве очищенных антител происходила делеция лизина на C-конце тяжелой цепи.
[0117]
По результатам анализа аминокислотной модификации очищенного CDS-3, тяжелая цепь имела последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 7, а легкая цепь имела последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 4.
[0118]
По результатам анализа аминокислотной модификации очищенного CDS-6, легкая цепь имела последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 4. Поскольку углеводные цепи в тяжелой цепи не были полностью вырезаны, тип аминокислотной модификации не может быть указан.
[0119]
[Пример 2: оценка активности связывания антитела к CD73 человека с белком CD73 человека]
С целью оценки активности связывания полученных в примере 1 CDS-1, CDS-3, CDS-6, CDS-7 и CDS-8 с CD73 человека осуществляли ELISA с применением белка CD73 человека. Белок CD73 человека (BPS Bioscience Inc., 71184), разведенный в PBS (Life Technologies, Inc.) до концентрации 4 мкг/мл, добавляли в 384-луночный планшет с прозрачными лунками MaxiSorp (Thermo Fisher Scientific Inc.) в количестве 20 мкл/лунку, а затем иммобилизовали в течение ночи при температуре 4°C. На следующий день лунки один раз промывали раствором для промывки (Tris-забуференный солевой раствор (TBS), содержащий 0,05% Tween-20) и добавляли туда Blocking One (Nacalai tesque, Inc.) в количестве 100 мкл/лунку для блокировки при комнатной температуре в течение 30 минут. Лунки снова один раз промывали раствором для промывки, и добавляли в них полученные в примере 1 очищенное CDS-1, очищенное CDS-3, очищенное CDS-6, очищенное CDS-7 или очищенное CDS-8 в количестве 20 мкл/лунку соответственно. Эти очищенные антитела разводили с применением рабочего буфера, полученного путем смешивания одинакового количества PBS и Blocking One, и разведение осуществляли в 12 шагов с 10 мкг/мл до 56 пг/мл. Полученный продукт реагировал при комнатной температуре в течение 1 часа, а затем его промывали три раза раствором для промывки. К нему добавляли 20 мкл/лунку перекрестно адсорбированного антитела к тяжелой и легкой цепи IgG человека (Bethyl Laboratories Inc., A80-219P), которое было разведено в 4000 раз рабочим буфером, и полученный продукт реагировал при комнатной температуре в течение 1 часа. Полученный продукт три раза промывали раствором для промывки, и добавляли к нему 20 мкл/лунку TMB + субстрат-хромоген (DAKO Ltd., S1599). Спустя 5 минут к нему добавляли 20 мкл/лунку 1 M серной кислоты (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), и останавливали реакцию. Значения поглощения при 450 нм и 540 нм измеряли на Infinite M200 PRO (TECAN Inc.), и рассчитывали значения EC50 для CDS-1, CDS-3, CDS-6, CDS-7 и CDS-8 в отношении белка CD73 человека. При расчете значений ЕС50, ордината соответствует разнице в измеренных значениях поглощения при 450 нм и 540 нм, а абсцисса соответствует значению концентрации антитела. Кроме того, измеряемое значение, в случае, когда измеряемое значение может быть определено как достигшее значения сходимости с повышением концентрации антитела из формы сигмоидальной кривой, изображенной на графике, принимали за 100%, а измеряемое значение, в случае, когда измеряемое значение может быть определено как достигшее значения сходимости с понижением концентрации антитела, принимали за 0%. Этот анализ осуществляли независимо, и значения EC50 рассчитывали с помощью регрессии 4-параметрической логистической кривой (таблица 1).
[Таблица 1]
EC50 (нг/мл)
Первичное
Вторичное
CDS-1
3,9
8,8
CDS-3
Не осуществляли
20,9
CDS-6
Не осуществляли
19,6
CDS-7
Не осуществляли
20,1
CDS-8
Не осуществляли
23,9
[0120]
В результате было обнаружено, что CDS-1, CDS-3, CDS-6, CDS-7 и CDS-8 связываются с белком CD73 человека.
[0121]
[Пример 3: оценка ингибирующей фермент активности антитела к CD73 человека в отношении белка CD73 человека]
С целью оценки ингибирования антителами CDS-1, CDS-3, CDS-6, CDS-7 и CDS-8, полученными в примере 1, ферментативной активности CD73 человека, осуществляли ферментный анализ с применением белка CD73 человека. В этом примере для сравнения применяли MEDI9447, CD73.4IgG2CS-IgG1.1f и 6E1. 25 мМ Tris-забуференный солевой раствор, содержащий 5 мМ хлорида магния, готовили с использованием соляной кислоты с получением pH 7,5, и использовали в качестве буфера для анализа. Белок CD73 человека (R&D Systems, Inc., 5795), приготовленный с использованием буфера для анализа так, чтобы конечная концентрация была доведена до 15 нг/мл, очищенное CDS-1, очищенное CDS-3, очищенное CDS-6, очищенное CDS-7, очищенное CDS-8, очищенное MEDI9447, очищенное CD73.4IgG2CS-IgG1.1f или очищенное 6E1, разведенные в буфере для анализа, добавляли в 96-луночный планшет для анализа с лунками с прозрачным дном (Corning, Inc.) в количестве 20 мкл/лунку соответственно, и полученный продукт реагировал при комнатной температуре в течение 30 минут. Эти очищенные антитела разводили с применением буфера для анализа, и разведение осуществляли за 11 шагов так, чтобы конечная концентрация была доведена до диапазона от 20 мкг/мл до 0,339 нг/мл. В количестве 20 мкл/лунку добавляли АМФ (SIGMA-ALDRICH Corporation, A1752-1G), разведенный в буфере для анализа так, чтобы конечная концентрация была доведена до 30 мкM, и полученный продукт реагировал при комнатной температуре в течение 45 минут. В него добавляли 60 мкл/лунку ацетонитрила для остановки реакции, и измеряли концентрацию аденозина с помощью LC/MS (LC: Shimadzu Corporation SIL-HTc или Waters Corporation Acquity UPLC I-Class, колонка: Agilent Technologies, Inc. ZORBAX SB-Aq 1,8 мкм 2,1×30 мм, MS: AB Sciex Ltd. API4000). Исходя из измеренной концентрация аденозина, оценивали ингибирование антителом CDS-1 и т.д. ферментативной активности CD73 человека на основе измеренных значений EC50. При расчете значений EC50, ордината соответствует измеренному значению концентрации аденозина, а абсцисса соответствует значению концентрации антитела. Кроме того, значение концентрации аденозина, в случае, когда значение концентрации аденозина может быть определено как достигшее значения сходимости с повышением концентрации антитела из формы сигмоидальной кривой, изображенной на графике, принимали за 100%, а значение концентрации аденозина, в случае когда значение концентрации аденозина может быть определено как достигшее значения сходимости с понижением концентрации антитела, принимали за 0%. Этот анализ осуществляли независимо, и значения EC50 рассчитывали с помощью регрессии 4- параметрической логистической кривой (таблица 2). Как описано в непатентном документе 1, MEDI9447 характеризовалось действием, при котором наблюдали колоколообразную кривую ингибирования (фиг. 1). Кроме того, значение сходимости для CD73.4IgG2CS- IgG1.1f было выше, чем значение сходимости для значения концентрации аденозина с повышением концентрации антитела CDS-1.
[Таблица 2]
EC50 (нг/мл)
Первичное
Вторичное
CDS-1
16,8
9,2
CDS-3
Не осуществляли
19,4
CDS-6
Не осуществляли
20,4
CDS-7
Не осуществляли
17,5
CDS-8
Не осуществляли
21,1
[0122]
В результате было обнаружено, что CDS-1, CDS-3, CDS-6, CDS-7 и CDS-8 ингибируют ферментативную активность белков CD73 человека.
[0123]
[Пример 4: оценка ингибирующей фермент активности антитела к CD73 человека в клетках, экспрессирующих CD73 человека]
С целью оценки ингибирования антителами CDS-1, CDS-3, CDS-6, CDS-7 и CDS-8, полученными в примере 1, ферментативной активности CD73 человека, осуществляли ферментный анализ с применением раковой клеточной линии NCI-H1373 (ATCC: CRL-5866), эндогенно экспрессирующей CD73 человека. Клетки NCI-H1373 суспендировали в PBS (Life Technologies, Inc.) и добавляли в 96-луночный планшет с лунками с V-образным дном (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) в количестве 30 мкл/лунку так, чтобы конечная концентрация клеток была доведена до 4 × 104 клеток/лунку. Сразу после этого добавляли соответственно очищенное CDS-1, очищенное CDS-3, очищенное CDS-6, очищенное CDS-7 или очищенное CDS-8 в количестве 10 мкл/лунку. Эти очищенные антитела разводили с применением PBS, и разведение осуществляли за 11 шагов так, чтобы конечная концентрация была доведена до диапазона от 50,0 мкг/мл до 0,847 нг/мл. По завершении реакции при комнатной температуре в течение 30 минут, добавляли АМФ (SIGMA- ALDRICH Corporation, A1752-1G) в количестве 10 мкл/лунку так, чтобы конечная концентрация была доведена до 180 мкM. По завершении реакции при комнатной температуре в течение 30 минут, планшет центрифугировали при температуре 4°C при 340 × g. Из планшета после центрифугирования 15 мкл/лунку супернатанта переносили в новый подготовленный 96-луночный планшет с лунками с V-образным дном (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), и добавляли в него 15 мкл/лунку ацетонитрила. Измеряли концентрацию аденозина с помощью LC/MS (описано в примере 3), и ингибирование антителами CDS-1, CDS-3, CDS-6, CDS-7 и CDS-8 ферментативной активности CD73 человека на основе измеренных значений EC50. Этот анализ осуществляли независимо, и значения EC50 рассчитывали с помощью способа измерения, описанного в примере 3 (таблица 3).
[Таблица 3]
EC50 (нг/мл)
Первичное
Вторичное
CDS-1
785
579
CDS-3
Не осуществляли
455
CDS-6
Не осуществляли
678
CDS-7
Не осуществляли
712
CDS-8
Не осуществляли
750
[0124]
В результате было обнаружено, что CDS-1, CDS-3, CDS-6, CDS-7 и CDS-8 ингибируют ферментативную активность CD73 человека в клетках NCI-H1373.
[0125]
[Пример 5: оценка эффекта антитела к CD73 человека в отношении восстановления АМФ-зависимо подавленных функций T-клеток человека]
С целью оценки эффекта полученного в примере 1 CDS-1 в отношении восстановления АМФ-зависимо подавленных функций T-клеток человека осуществляли анализ с применением T-клеток человека, экспрессирующих CD73 человека. В этом анализе можно оценить антитело, которое активирует противоопухолевый иммунитет путем восстановления подавленных АМФ функций иммунных клеток, с применением в качестве критерия оценки восстановления функций T-клеток человека. В этом примере для сравнения применяли MEDI9447, CD73.4IgG2CS-IgG1.1f и 6E1. T-клетки человека были выделены из популяции мононуклеарных клеток периферической крови человека (AllCells, LLC) с применением набора для выделения общей популяции T-клеток (Pan T Cell Isolation Kit) (Miltenyi Biotec Ltd., 130-096-535), их суспендировали в культуральной среде TexMACS™ (Miltenyi Biotec Ltd., 130-097-196), и добавляли в 96-луночный планшет с лунками с плоским дном (AGC TECHNO GLASS Co., Ltd.) в количестве 50 мкл/лунку так, чтобы конечная плотность клеток была доведена до 1 × 105 клеток/лунку. Сразу после этого к ним добавляли соответственно очищенное CDS-1, очищенное MEDI9447, очищенное 6E1 или очищенное CD73.4IgG2CS-IgG1.1f в количестве 25 мкл/лунку. Эти очищенные антитела разводили с применением культуральной среды TexMACS™, и разведение осуществляли за 12 шагов так, чтобы конечная концентрация была доведена до диапазона от 15 мкг/мл до 0,05 нг/мл. Кроме того, добавляли АМФ (SIGMA-ALDRICH Corporation) в количестве 50 мкл/лунку так, чтобы конечная концентрация была доведена до 250 мкM. Сразу после этого к нему добавляли гранулы Dynabeads с антителами к CD3/CD28 для активации T-клеток человека (Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28) (Thermo Fisher Scientific Inc., 11131D) в количестве 50 мкл/лунку так, чтобы конечная концентрация была доведена до 1×105 гранул dynabeads/лунку. Затем добавляли культуральную среду TexMACS™ так, чтобы объем реакционного раствора в каждой лунке составлял 200 мкл, и культивировали в инкубаторе с 5% CO2 при температуре 37°C в течение 3 дней. Через 3 дня собирали 100 мкл супернатанта культуры, и измеряли в супернатанте концентрацию интерферона гамма (IFNγ) с использованием протокола для набора AlphaLISA (торговое название) для иммунологического анализа IFNγ (AlphaLISA IFNγ Immunoassay Kit) (PerkinElmer Inc., AL217C). Кроме того, для анализа пролиферации T-клеток человека в вышеописанный планшет, из которого отбирали 100 мкл супернатанта, добавляли 20 мкл/лунку реагента CellTiter-Blue, согласно протоколу для анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Blue (торговое название) (CellTiter-Blue Cell Viability Assay) (Promega K.K., G8081). Через 4 часа в каждой лунке измеряли флуоресценцию (длина волны возбуждения 560 нм/длина волны флуоресценции 590 нм) с применением EnVisionTM (PerkinElmer Inc.). Эффект CDS-1 в отношении восстановления АМФ-зависимо подавленных функций T- клеток человека оценивали исходя из рассчитанных значений EC50 с использованием концентрации IFNγ и пролиферации T-клеток человека в качестве критерия оценки. При расчете значений EC50, ордината соответствует значению концентрации IFNγ или значению флуоресценции, рассчитанным из измеренного значения, а абсцисса соответствует значению концентрации антитела. Кроме того, измеряемое значение, в случае когда значение концентрации IFNγ может быть определено как достигшее значения сходимости с повышением концентрации антитела из формы сигмоидальной кривой, изображенной на графике, принимали за 100%, а измеряемое значение, в случае когда значение концентрации IFNγ или значение флуоресценции может быть определено как достигшее значения сходимости с понижением концентрации антитела, принимали за 0%. Значения EC50 рассчитывали с помощью регрессии 4-параметрической логистической кривой с применением значения концентрации IFNγ и пролиферации T-клеток человека в качестве критерия оценки (таблица 4). Среди сравниваемых объектов, значение сходимости для CD73.4IgG2CS-IgG1.1f было более низким, чем значение сходимости для значения концентрации IFNγ и значения пролиферации T-клеток человека с повышением концентрации антитела CDS-1, и для MEDI9447 не наблюдали сигмоидальную кривую, при этом значения EC50 для MEDI9447 и CD73.4IgG2CS-IgG1.1f, которые можно сравнить с таковыми CDS-1, не могли быть рассчитаны (фиг. 2 и фиг. 3).
[Таблица 4]
EC50 (нг/мл)
IFNγ
Пролиферации T-клеток
CDS-1
5,8
23,2
6E1
131,6
357,3
[0126]
В результате было обнаружено, что CDS-1 обладает более выраженной функцией восстановления АМФ-зависимо подавленных функций Т-клеток, по сравнению с любым из антител MEDI9447, 6E1, CD73.4IgG2CS-IgG1.1f, активируя при этом противоопухолевый иммунитет.
[0127]
[Пример 6: оценка эффекта CDS-3 и CDS-6 в отношении биологической активности IL-7]
С целью оценки эффекта полученных в примере 1 CDS-3 и CDS-6 в отношении биологической активности IL-7 осуществляли анализ с применением клеточной линии 2E8 (ATCC:TIB-239), характеризующейся дозозависимой активностью пролиферации в результате добавления IL-7 человека. В этом примере в качестве отрицательного контроля применяли изотипический контроль в виде IgG1 человека (EnzoLife Sciences Inc., ALX-804-133-C100). В качестве культуральной среды применяли среду Дульбекко в модификации Искова (SIGMA-ALDRICH Corporation, I3390), содержащую раствор L-глутамина (SIGMA- ALDRICH Corporation), 2-меркаптоэтанол (Thermo Fisher Scientific Inc.) и инактивированную 20% фетальную телячью сыворотку (HyClone Inc.). В 384-луночный планшет с лунками с плоским дном (Thermo Fisher Scientific Inc.) в количестве 10 мкл/лунку добавляли соответственно очищенное CDS-3, очищенное CDS-6 или рекомбинантное IL-7 человека (Peprotech Inc., 200-07). Очищенное CDS-3, очищенное CDS-6 и рекомбинантный IL-7 человека разводили с применением культуральной среды, молекулярная масса очищенного CDS-3 и очищенного CDS-6 составляла 180000, и разведение осуществляли за 11 шагов так, чтобы конечная концентрация была доведена до диапазона от 100 нМ до 0,001 нМ. Клетки 2E8 суспендировали в культуральной среде и добавляли в количестве 40 мкл/лунку так, чтобы конечная плотность клеток была доведена до 2×104 клеток/лунку. Сразу после этого полученный продукт культивировали в инкубаторе с 5% CO2 при температуре 37°C в течение 3 дней. С целью анализа пролиферации клеток спустя 3 дня в вышеописанный планшет добавляли 50 мкл/лунку реагента CellTiter-Glo, согласно протоколу для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo (торговое название) (CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay) (Promega K.K., G7573), и в каждой лунке измеряли интенсивность люминесценции с применением ARVO-HTS (PerkinElmer Inc.). Исходя из измеренной интенсивности люминесценции оценивали активность пролиферации клеток в случае очищенного CDS-3, очищенного CDS-6 и рекомбинантного IL-7 человека на основе рассчитанных значений EC50. При расчете значений EC50, ордината соответствует интенсивности люминесценции, а абсцисса соответствует значению концентрации лекарственного средства. Кроме того, для построения сигмоидальной кривой значение интенсивности люминесценции для 100 нМ рекомбинантного IL-7 человека принимали за 100%, а значение интенсивности люминесценции для отрицательного контроля принимали за 0%. Значения EC50 для очищенного CDS-3, очищенного CDS-6 и рекомбинантного IL-7 человека, рассчитанные с помощью регрессии 4-параметрической логистической кривой, составляли 0,050 нМ, 1,8 нМ и 0,051 нМ.
[0128]
В результате было обнаружено, что CDS-3 и CDS-6 проявляют эффект в отношении биологической активности IL-7. Кроме того, было обнаружено, что эффект CDS-6 в отношении биологической активности IL-7 ниже, чем таковой в случае CDS-3.
[0129]
[Пример 7: оценка эффекта CDS-7 и CDS-8 в отношении биологической активности IL-21]
С целью оценки эффекта полученных в примере 1 CDS-7 и CDS-8 в отношении биологической активности IL-21 осуществляли анализ с применением клеточной линии человека Ramos (ATCC: CRL-1596), в которой фосфорилирование STAT3 индуцируется IL-21 человека зависимым от концентрации образом. Клетки Ramos высевали в чашку с применением культуральной среды RPMI (SIGMA-ALDRICH Corporation, R8758), и культивировали в инкубаторе с 5% CO2 при температуре 37°C в течение 16 часов. После сбора клетки Ramos суспендировали в вышеописанной культуральной среде и высевали в 96-луночный планшет (Nippon Genetics Co., Ltd., 35800) в количестве 45 мкл/лунку так, чтобы конечная плотность клеток была доведена до 2 × 105 клеток, и добавляли в него соответственно очищенное CDS-7, очищенное CDS-8 или рекомбинантный IL-21 человека (Peprotech Inc., 200-21) в количестве 5 мкл/лунку для проведения реакции. Очищенное CDS-7, очищенное CDS-8 или рекомбинантный IL-21 человека разводили с применением PBS (Life Technologies, Inc.), молекулярная масса очищенного CDS-7 и очищенного CDS-8 составляла 180000, и разведение осуществляли за 11 шагов так, чтобы конечная концентрация была доведена до диапазона от 1200 нМ до 0,02 нМ, или осуществляли за 10 шагов так, чтобы конечная концентрация была доведена до диапазона от 400 нМ до 0,02 нМ. По завершении реакции при температуре 37°C в течение 30 минут, все количество переносили в 96-луночный планшет с лунками с круглым дном (Corning Inc., 351177), в который предварительно было добавлено 200 мкл/лунку буфера для фиксации I (Fix Buffer I) (BD Biosciences, Inc., 557870), и проводили реакцию при температуре 37°C в течение 10 минут для фиксации клеток. После осуществления промывки красящим буфером добавляли 200 мкл/лунку буфера для пермеабилизации III (Perm Buffer III) (BD Biosciences, Inc., 558050), проводили реакцию на льду в течение 30 минут для обеспечения пермеабилизации. В качестве красящего буфера применяли буфер для окрашивания (FBS) (Stain Buffer (FBS)) (BD Biosciences, Inc., 554656). Полученный продукт промывали вышеописанным красящим буфером и суспендировали, фосфорилированный STAT3 окрашивали с применением PE-меченного антитела мыши к Stat3 (pY705) (PE Mouse Anti- Stat3 (pY705)) (BD Biosciences, Inc., 562072), а затем измеряли интенсивность флуоресценции клеток с применением FACSArray™ (BD Biosciences, Inc.). В качестве интенсивности флуоресценции применяли среднее геометрическое значение MFI. Исходя из измеренной интенсивности флуоресценции определяли значения EC50 для очищенного CDS-7, очищенного CDS-8 и рекомбинантного IL-21 человека, и оценивали индуцированную фосфорилированием STAT3 активность. При расчете значений EC50, ордината соответствует измеренной интенсивности флуоресценции, а абсцисса соответствует значению концентрации лекарственного средства. Кроме того, значение интенсивности флуоресценции, которое может быть определено как достигшее значения сходимости с повышением концентрации лекарственного средства из формы сигмоидальной кривой, изображенной на графике, принимали за 100%, а значение интенсивности флуоресценции, которое может быть определено как достигшее значения сходимости с понижением концентрации лекарственного средства, принимали за 0%. Значения EC50 для очищенного CDS-7, очищенного CDS-8 и рекомбинантного IL-21 человека, рассчитанные с помощью регрессии 4-параметрической логистической кривой, составляли 1,3 нМ, 28,3 нМ и 8,0 нМ.
[0130]
В результате было обнаружено, что CDS-7 и CDS-8 проявляют эффект в отношении биологической активности IL-21. Кроме того, было обнаружено, что эффект CDS-8 в отношении биологической активности IL-21 ниже, чем таковой в случае CDS-7.
Промышленная применимость
[0131]
Ожидается, что антитело к CD73 человека и слитая структура по настоящему изобретению будут пригодными для предупреждения или лечения рака. Кроме того, способ получения полинуклеотида, вектора экспрессии, трансформированной клетки-хозяина или антитела по настоящему изобретению является пригодным для получения антитела к CD73 человека и слитой структуры.
[Перечень последовательностей в развернутой форме]
[0132]
В заголовке номер <223> в следующем перечне последовательностей представлено описание «искусственной последовательности». В частности, нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO: 1 и 3 перечня последовательностей, соответственно представляют собой нуклеотидные последовательности, кодирующие от остатка номер 1 вариабельной области до C-конца константной области тяжелой цепи и легкой цепи CDS-1, в соответствии с нумерацией по Kabat, аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 2 и 4 перечня последовательностей, соответственно представляют собой аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи, кодируемых SEQ ID NO: 1 и 3, нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO: 5 или 6 перечня последовательностей, представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую от остатка номер 1 вариабельной области до C-конца константной области тяжелой цепи CDS-3, в соответствии с нумерацией по Kabat, и IL-7 человека посредством линкера, и аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO: 7 перечня последовательностей, представляет собой аминокислотную последовательность тяжелой цепи, кодируемой SEQ ID NO: 5 или 6. Нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO: 8, представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую от остатка номер 1 вариабельной области до C-конца константной области легкой цепи CDS-3, в соответствии с нумерацией по Kabat. Нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO: 9 или 16 перечня последовательностей, представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую от остатка номер 1 вариабельной области до C-конца константной области тяжелой цепи CDS-6, в соответствии с нумерацией по Kabat, и вариант IL-7 человека, аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO: 10 перечня последовательностей, представляет собой аминокислотную последовательность тяжелой цепи, кодируемой SEQ ID NO: 9 или 16. Нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO: 11 перечня последовательностей, представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую от остатка номер 1 вариабельной области до C-конца константной области тяжелой цепи CDS-7, в соответствии с нумерацией по Kabat. Нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO: 12 перечня последовательностей, представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую от остатка номер 1 вариабельной области до C-конца константной области легкой цепи CDS-7, в соответствии с нумерацией по Kabat, и IL-21 человека посредством линкера, и аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO: 13 перечня последовательностей, представляет собой аминокислотную последовательность легкой цепи, кодируемой SEQ ID NO: 12. Нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO: 14 перечня последовательностей, представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую от остатка номер 1 вариабельной области до C-конца константной области легкой цепи CDS-8, в соответствии с нумерацией по Kabat, и вариант IL-21 человека посредством линкера, и аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO: 15 перечня последовательностей, представляет собой аминокислотную последовательность легкой цепи, кодируемой SEQ ID NO: 14.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>
АСТЕЛЛАС ФАРМА ИНК.
<120>
АНТИТЕЛО К CD73 ЧЕЛОВЕКА
<130>
A17013A00
<150>
JP2016-241503
<151>
2016-12-13
<160>
16
<170>
PatentIn version 3.5
<210>
1
<211>
1362
<212>
ДНК
<213>
Искусственная последовательность
<220>
<223>
Тяжелая цепь антитела к CD73 человека
<220>
<221>
КОДИРУЮЩАЯ ОБЛАСТЬ
<222>
(1)..(1362)
<400>
1
gag gtg cag ttg gtc gaa agt ggc gga gga ctc gta cag cca ggt ggg
48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1
5
10
15
tca ctg cgt ctg tcc tgt gct gca tct ggg ttt acc ttc gat gac tat
96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20
25
30
gcc atg cac tgg gtt cga caa gct cct ggc aaa ggc ctt gaa tgg gtg
144
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35
40
45
agt ggg atc aac tgg aat agc gac aac atc gac tat gcc gac tct gtg
192
Ser Gly Ile Asn Trp Asn Ser Asp Asn Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50
55
60
aaa ggc cgc ttt acc att agc cgg gat aac tcc aag aac act ctg tat
240
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65
70
75
80
ctg cag atg aat agc ctc aga gca gag gat aca gcc gtc tac tac tgc
288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85
90
95
gcc aag gat agg agg aag tac tcc aat tct ccc ggt gct ttc gac ata
336
Ala Lys Asp Arg Arg Lys Tyr Ser Asn Ser Pro Gly Ala Phe Asp Ile
100
105
110
tgg ggt cag gga aca ctg gtt act gtg tcc tca gcc tcc acc aag ggc
384
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115
120
125
cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc
432
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130
135
140
aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg
480
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145
150
155
160
acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc
528
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165
170
175
ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctt agt agc gtg gtg
576
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180
185
190
acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg
624
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195
200
205
aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa
672
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210
215
220
tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa gcc
720
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
225
230
235
240
gct ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc
768
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245
250
255
ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg
816
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260
265
270
agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg
864
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275
280
285
gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc
912
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290
295
300
acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg
960
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305
310
315
320
aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc
1008
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325
330
335
agc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca
1056
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340
345
350
cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag
1104
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355
360
365
gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc
1152
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370
375
380
gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg
1200
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385
390
395
400
cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc
1248
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405
410
415
acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc
1296
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420
425
430
gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc
1344
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435
440
445
ctg tct ccg ggt aaa tga
1362
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210>
2
<211>
453
<212>
БЕЛОК
<213>
Искусственная последовательность
<220>
<223>
Синтетическая Структура
<400>
2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1
5
10
15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20
25
30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35
40
45
Ser Gly Ile Asn Trp Asn Ser Asp Asn Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50
55
60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65
70
75
80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85
90
95
Ala Lys Asp Arg Arg Lys Tyr Ser Asn Ser Pro Gly Ala Phe Asp Ile
100
105
110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115
120
125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130
135
140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145
150
155
160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165
170
175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180
185
190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195
200
205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210
215
220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
225
230
235
240
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245
250
255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260
265
270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275
280
285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290
295
300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305
310
315
320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325
330
335
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340
345
350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355
360
365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370
375
380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385
390
395
400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405
410
415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420
425
430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435
440
445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210>
3
<211>
648
<212>
ДНК
<213>
Искусственная последовательность
<220>
<223>
Легкая цепь антитела к CD73 человека
<220>
<221>
КОДИРУЮЩАЯ ОБЛАСТЬ
<222>
(1)..(648)
<400>
3
gac ata cag atg act cag tca ccc agt tcc ctt tct gcc agt gtg gga
48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1
5
10
15
gat agg gtc act atc acc tgt aga gcc agc cag atc att ggc cca tgg
96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ile Ile Gly Pro Trp
20
25
30
ttg gct tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gca ccc aag ctg ctc atc
144
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35
40
45
tat cga gct tcc tct ctg gaa tcc ggt gtt cct tcc cgc ttt agc ggt
192
Tyr Arg Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50
55
60
tca ggg agt gga acc gac ttc aca ctg acc att agc tct ctg caa cct
240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65
70
75
80
gag gat ttc gcc acg tac tac tgc cag cag tac aac agc tat tct ccc
288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Pro
85
90
95
tgg aca ttt ggc caa ggc aca aag gtg gag atc aag cgg act gtg gct
336
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100
105
110
gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag ttg aaa tct
384
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115
120
125
gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat ccc aga gag
432
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130
135
140
gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc
480
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145
150
155
160
cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc tac agc ctc
528
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165
170
175
agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa cac aaa gtc
576
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180
185
190
tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag
624
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195
200
205
agc ttc aac agg gga gag tgt tag
648
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
215
<210>
4
<211>
215
<212>
БЕЛОК
<213>
Искусственная последовательность
<220>
<223>
Синтетическая Структура
<400>
4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1
5
10
15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ile Ile Gly Pro Trp
20
25
30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35
40
45
Tyr Arg Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50
55
60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                 70                 75                 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Pro
85
90
95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100
105
110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115
120
125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130
135
140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145                150                155                160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165
170
175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180
185
190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195
200
205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
215
<210> 5
<211> 1848
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Тяжелая цепь слитой формы антитела к CD73 человека и IL-7
<400> 5
gaagtacagt tggtcgaaag cggaggaggg ctggttcagc ctggcggctc actcagactg      60
tcatgcgctg cctctgggtt tacattcgac gattatgcca tgcattgggt acgacaggca     120
ccaggcaaag ggctggagtg ggtttctggg attaactgga atagcgataa tatcgactat     180
gccgactctg taaaggggcg ctttactatc agtcgggaca atagtaagaa tacgctctat     240
ctgcagatga atagcctgag agcagaagat accgctgtgt actactgtgc caaagaccgg     300
cgtaagtaca gtaactctcc tggtgccttt gacatctggg gacagggcac tcttgttacc     360
gtgagcagcg catctaccaa aggtccctca gtctttcccc tcgctcctag ttctaagtcc     420
acatcaggtg gaactgccgc tttgggttgc ctggtaaagg actactttcc cgagcctgtt     480
acagtgagct ggaactccgg agctctgaca tccggtgtgc acacatttcc tgccgttctt     540
cagtcctcag ggctgtattc cttgtcctca gtggttacag tgcccagcag tagtctgggg     600
acacagacat acatttgcaa tgtgaatcac aagccaagta acactaaggt cgataagaag     660
gtcgagccca aaagttgcga taagacccat acttgtccac cttgtcctgc tcctgaggcc     720
caggaggcc cttctgtgtt cctgtttcca cccaaaccca aggacactct gatgattagc     780
cggacgccag aggtgacctg tgttgtggtt gatgtctctc acgaggaccc agaagtgaaa     840
ttcaactggt acgtcgacgg cgtggaagtg cacaatgcca aaaccaagcc acgcgaggag     900
cagtacaaca gcacctatcg ggtggtgagc gtgttgactg tgctgcatca agattggctg     960
aatggaaagg agtacaagtg taaggtgtct aacaaggcac tgcccgcaag catcgaaaag    1020
accatcagta aggctaaggg ccagcccagg gaaccacagg tctacaccct gccaccttcc    1080
cgtgacgagt tgaccaagaa ccaggtgtca cttacgtgct tggtgaaagg cttctatccc    1140
tccgacattg ccgtagaatg ggaaagcaat gggcaacccg agaataacta caaaacaact    1200
ccacccgtcc ttgattctga cggttccttc ttcctctatt ccaaactgac tgtcgataaa    1260
tctcgatggc aacagggcaa tgtcttttct tgtagtgtga tgcatgaagc attgcataac    1320
cactacaccc agaagtccct gtctttgtcc cctgggaaag gaggcggtgg atccggtggt    1380
ggcggctcag attgcgacat agaaggcaag gacggcaaac agtatgagtc cgtcctgatg    1440
gtgtccattg atcagctgct ggattctatg aaggaaatcg gaagcaactg cctgaacaat    1500
gagtttaact tcttcaaacg acacatctgt gatgccaaca aagagggcat gtttctcttc    1560
agagccgcta ggaaactgag gcagtttctc aagatgaact ccactggcga cttcgatctg    1620
caccttctga aggtatcaga ggggaccaca atactgctga actgcaccgg ccaagtcaag    1680
ggtcgcaagc ccgctgccct tggagaagct caacccacca aaagcctgga agagaacaaa    1740
tccctcaagg agcagaagaa actcaacgac ctgtgctttc tcaagaggct ccttcaggag    1800
attaagacct gttggaataa gatccttatg gggacaaaag agcactga                 1848
<210> 6
<211> 1848
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Тяжелая цепь слитой формы антитела к CD73 человека и IL-7
<220>
<221> КОДИРУЮЩАЯ ОБЛАСТЬ
<222> (1)..(1848)
<400> 6
gaa gtg cag ctg gtg gaa tct ggc ggc gga ctg gtg cag cct ggc gga        48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1              5                  10                 15
tct ctg aga ctg tct tgt gcc gcc tcc ggc ttc acc ttc gac gac tac        96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20
25
30
gct atg cac tgg gtg cga cag gcc cct ggc aag gga ctg gaa tgg gtg       144
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35
40
45
tcc ggc atc aac tgg aac tcc gac aac atc gac tac gcc gac tcc gtg       192
Ser Gly Ile Asn Trp Asn Ser Asp Asn Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50
55
60
aag ggc cgg ttc acc atc tcc cgg gac aac tcc aag aac acc ctg tac
240
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65
70
75
80
ctg cag atg aac tcc ctg cgg gcc gag gac acc gcc gtg tac tac tgc
288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85
90
95
gcc aag gac cgg cgg aag tac tcc aac tct cct ggc gcc ttc gac atc
336
Ala Lys Asp Arg Arg Lys Tyr Ser Asn Ser Pro Gly Ala Phe Asp Ile
100
105
110
tgg ggc cag ggc aca ctc gtg acc gtg tcc tct gct tcc acc aag ggc
384
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115
120
125
ccc tcc gtg ttt cct ctg gcc cct tcc agc aag tcc acc tct ggc gga
432
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130
135
140
aca gcc gct ctg ggc tgc ctc gtg aag gac tac ttc ccc gag ccc gtg
480
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145
150
155
160
aca gtg tct tgg aac tct ggc gcc ctg act tct ggc gtg cac acc ttc
528
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165
170
175
cct gct gtg ctg cag tct agc ggc ctg tac tcc ctg tcc tcc gtc gtg
576
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180
185
190
act gtg ccc tcc agc tct ctg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg
624
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195
200
205
aac cac aag ccc tcc aac acc aag gtg gac aag aag gtg gaa ccc aag
672
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210
215
220
tcc tgc gac aag acc cac acc tgt ccc cct tgt cct gcc cct gaa gct
720
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
225
230
235
240
gct ggc ggc cct tct gtg ttt ctg ttc ccc cca aag cct aag gac acc
768
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245
250
255
ctg atg atc tcc cgg acc ccc gaa gtg acc tgc gtg gtg gtg gat gtg
816
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260
265
270
tcc cac gag gac cct gaa gtg aag ttc aat tgg tac gtg gac ggc gtg
864
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275
280
285
gaa gtg cac aac gcc aag acc aag cct aga gag gaa cag tac aac tcc
912
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290
295
300
acc tac cgg gtg gtg tcc gtg ctg acc gtg ctg cat cag gac tgg ctg
960
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305
310
315
320
aac ggc aaa gag tac aag tgc aag gtg tcc aac aag gcc ctg ccc gcc
1008
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325
330
335
tcc atc gaa aag acc atc tcc aag gcc aag ggc cag ccc cgg gaa ccc
1056
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340
345
350
cag gtg tac aca ctg ccc cct agc agg gac gag ctg acc aag aac cag
1104
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355
360
365
gtg tcc ctg acc tgt ctc gtg aaa ggc ttc tac ccc tcc gat atc gcc
1152
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370
375
380
gtg gaa tgg gag agc aac ggc cag ccc gag aac aac tat aag acc acc
1200
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385
390
395
400
ccc cct gtg ctg gac tcc gac ggc tca ttc ttt ctg tac tcc aag ctg
1248
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405
410
415
aca gtg gac aag tcc cgg tgg cag cag ggc aac gtg ttc tcc tgc agc
1296
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420
425
430
gtg atg cac gag gcc ctg cac aac cac tac acc cag aag tcc ctg tcc
1344
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435
440
445
ctg tct ccc gga aaa ggc ggc gga gga tcc ggc gga ggc gga tct gat
1392
Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
450
455
460
tgt gac atc gag ggc aag gac ggc aag cag tac gag agc gtg ctg atg
1440
Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met
465
470
475
480
gtg tcc atc gac cag ctg ctg gac agc atg aag gaa atc ggc tcc aac
1488
Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn
485
490
495
tgc ctg aac aac gag ttc aac ttc ttc aag cgg cac atc tgc gac gcc
1536
Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala
500
505
510
aac aaa gaa ggc atg ttc ctg ttt aga gcc gcc aga aag ctg cgg cag
1584
Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln
515
520
525
ttc ctg aag atg aac agc acc ggc gac ttc gac ctg cat ctg ctg aaa
1632
Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys
530
535
540
gtg tcc gag ggc acc acc atc ctg ctg aac tgt acc ggc caa gtg aag
1680
Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys
545
550
555
560
ggc aga aag cct gct gct ctg ggc gag gcc cag cct acc aag tcc ctg
1728
Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu
565
570
575
gaa gag aac aag agc ctg aaa gag cag aag aaa ctg aac gac ctg tgc
1776
Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys
580
585
590
ttc ctg aag cgg ctg ctg cag gaa atc aag acc tgc tgg aac aag att
1824
Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile
595
600
605
ctg atg ggc acc aaa gag cac tga
1848
Leu Met Gly Thr Lys Glu His
610
615
<210>
7
<211>
615
<212>
БЕЛОК
<213>
Искусственная последовательность
<220>
<223>
Синтетическая Структура
<400>
7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1
5
10
15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20
25
30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35
40
45
Ser Gly Ile Asn Trp Asn Ser Asp Asn Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50
55
60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65
70
75
80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85
90
95
Ala Lys Asp Arg Arg Lys Tyr Ser Asn Ser Pro Gly Ala Phe Asp Ile
100
105
110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115
120
125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130
135
140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145
150
155
160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165
170
175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180
185
190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195
200
205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210
215
220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
225
230
235
240
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245
250
255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260
265
270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275
280
285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290
295
300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305
310
315
320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325
330
335
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340
345
350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355
360
365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370
375
380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385
390
395
400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405
410
415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420
425
430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435
440
445
Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
450
455
460
Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met
465
470
475
480
Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn
485
490
495
Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala
500
505
510
Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln
515
520
525
Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys
530
535
540
Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys
545
550
555
560
Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu
565
570
575
Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys
580
585
590
Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile
595
600
605
Leu Met Gly Thr Lys Glu His
610
615
<210> 8
<211> 648
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Легкая цепь слитой формы антитела к CD73 человека и IL-7
<400> 8
gacatccaga tgacccagtc cccctccagc ctgtctgctt ccgtgggcga cagagtgacc      60
atcacctgtc gggcctccca gatcatcggc ccttggctgg cttggtatca gcagaagcct     120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacaga gcctcctccc tggaatccgg cgtgccctcc     180
agattctccg gctctggctc tggcaccgac tttaccctga ccatcagctc cctgcagccc     240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaactcct actccccctg gaccttcggc     300
cagggcacca aggtggaaat caagcggacc gtggccgctc cctccgtgtt catcttccca     360
ccttccgacg agcagctgaa gtccggcacc gcttctgtcg tgtgcctgct gaacaacttc     420
tacccccgcg aggccaaggt gcagtggaag gtggacaacg ccctgcagtc cggcaactcc     480
caggaaagcg tgaccgagca ggactccaag gacagcacct actccctgtc ctccaccctg     540
accctgtcca aggccgacta cgagaagcac aaggtgtacg cctgcgaagt gacccaccag     600
ggcctgtcta gccccgtgac caagtctttc aaccggggcg agtgctag                  648
<210> 9
<211> 1848
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Тяжелая цепь слитой формы антитела к CD73 человека и IL-7 мутантная
<220>
<221> КОДИРУЮЩАЯ ОБЛАСТЬ
<222> (1)..(1848)
<400> 9
gaa gtg cag ctg gtg gaa tct ggc ggc gga ctg gtg cag cct ggc gga        48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1              5                  10                 15
tct ctg aga ctg tct tgt gcc gcc tcc ggc ttc acc ttc gac gac tac        96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20
25
30
gct atg cac tgg gtg cga cag gcc cct ggc aag gga ctg gaa tgg gtg       144
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35
40
45
tcc ggc atc aac tgg aac tcc gac aac atc gac tac gcc gac tcc gtg
192
Ser Gly Ile Asn Trp Asn Ser Asp Asn Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50
55
60
aag ggc cgg ttc acc atc tcc cgg gac aac tcc aag aac acc ctg tac
240
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65
70
75
80
ctg cag atg aac tcc ctg cgg gcc gag gac acc gcc gtg tac tac tgc
288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85
90
95
gcc aag gac cgg cgg aag tac tcc aac tct cct ggc gcc ttc gac atc
336
Ala Lys Asp Arg Arg Lys Tyr Ser Asn Ser Pro Gly Ala Phe Asp Ile
100
105
110
tgg ggc cag ggc aca ctc gtg acc gtg tcc tct gct tcc acc aag ggc
384
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115
120
125
ccc tcc gtg ttt cct ctg gcc cct tcc agc aag tcc acc tct ggc gga
432
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130
135
140
aca gcc gct ctg ggc tgc ctc gtg aag gac tac ttc ccc gag ccc gtg
480
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145
150
155
160
aca gtg tct tgg aac tct ggc gcc ctg act tct ggc gtg cac acc ttc
528
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165
170
175
cct gct gtg ctg cag tct agc ggc ctg tac tcc ctg tcc tcc gtc gtg
576
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180
185
190
act gtg ccc tcc agc tct ctg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg
624
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195
200
205
aac cac aag ccc tcc aac acc aag gtg gac aag aag gtg gaa ccc aag
672
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210
215
220
tcc tgc gac aag acc cac acc tgt ccc cct tgt cct gcc cct gaa gct
720
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
225
230
235
240
gct ggc ggc cct tct gtg ttt ctg ttc ccc cca aag cct aag gac acc
768
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245
250
255
ctg atg atc tcc cgg acc ccc gaa gtg acc tgc gtg gtg gtg gat gtg
816
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260
265
270
tcc cac gag gac cct gaa gtg aag ttc aat tgg tac gtg gac ggc gtg
864
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275
280
285
gaa gtg cac aac gcc aag acc aag cct aga gag gaa cag tac aac tcc
912
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290
295
300
acc tac cgg gtg gtg tcc gtg ctg acc gtg ctg cat cag gac tgg ctg
960
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305
310
315
320
aac ggc aaa gag tac aag tgc aag gtg tcc aac aag gcc ctg ccc gcc
1008
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325
330
335
tcc atc gaa aag acc atc tcc aag gcc aag ggc cag ccc cgg gaa ccc
1056
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340
345
350
cag gtg tac aca ctg ccc cct agc agg gac gag ctg acc aag aac cag
1104
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355
360
365
gtg tcc ctg acc tgt ctc gtg aaa ggc ttc tac ccc tcc gat atc gcc
1152
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370
375
380
gtg gaa tgg gag agc aac ggc cag ccc gag aac aac tat aag acc acc
1200
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385
390
395
400
ccc cct gtg ctg gac tcc gac ggc tca ttc ttt ctg tac tcc aag ctg
1248
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405
410
415
aca gtg gac aag tcc cgg tgg cag cag ggc aac gtg ttc tcc tgc agc
1296
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420
425
430
gtg atg cac gag gcc ctg cac aac cac tac acc cag aag tcc ctg tcc
1344
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435
440
445
ctg tct ccc gga aaa ggc ggc gga gga tcc ggc gga ggc gga tct gat
1392
Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
450
455
460
tgt gac atc gag ggc aag gac ggc aag cag tac gag agc gtg ctg atg
1440
Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met
465
470
475
480
gtg tcc atc gac cag ctg ctg gac agc atg aag gaa atc ggc tcc aac
1488
Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn
485
490
495
tgc ctg aac aac gag ttc aac ttc ttc aag cgg cac atc tgc gac gcc
1536
Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala
500
505
510
aac aaa gaa ggc atg ttc ctg ttt aga gcc gcc aga aag ctg cgg cag
1584
Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln
515
520
525
ttc ctg aag atg aac agc acc ggc gac ttc gac ctg cat ctg ctg gcc
1632
Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Ala
530
535
540
gtg tcc gag ggc acc acc atc ctg ctg aac tgt acc ggc caa gtg aag
1680
Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys
545
550
555
560
ggc aga aag cct gct gct ctg ggc gag gcc cag cct acc aag tcc ctg
1728
Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu
565
570
575
gaa gag aac aag agc ctg aaa gag cag aag aaa ctg aac gac ctg tgc
1776
Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys
580
585
590
ttc ctg aag cgg ctg ctg cag gaa atc gcc acc tgc tgg aac aag att
1824
Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Ala Thr Cys Trp Asn Lys Ile
595
600
605
ctg atg ggc acc aaa gag cac tga
1848
Leu Met Gly Thr Lys Glu His
610
615
<210>
10
<211>
615
<212>
БЕЛОК
<213>
Искусственная последовательность
<220>
<223>
Синтетическая Структура
<400>
10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1
5
10
15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20
25
30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35
40
45
Ser Gly Ile Asn Trp Asn Ser Asp Asn Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50
55
60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65
70
75
80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85
90
95
Ala Lys Asp Arg Arg Lys Tyr Ser Asn Ser Pro Gly Ala Phe Asp Ile
100
105
110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115
120
125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130
135
140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145
150
155
160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165
170
175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180
185
190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195
200
205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210
215
220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
225
230
235
240
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245
250
255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260
265
270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275
280
285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290
295
300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305
310
315
320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325
330
335
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340
345
350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355
360
365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370
375
380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385
390
395
400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405
410
415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420
425
430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435
440
445
Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
450
455
460
Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met
465
470
475
480
Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn
485
490
495
Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala
500
505
510
Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln
515
520
525
Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Ala
530
535
540
Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys
545                550                555                560
Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu
565
570
575
Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys
580
585
590
Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Ala Thr Cys Trp Asn Lys Ile
595
600
605
Leu Met Gly Thr Lys Glu His
610
615
<210> 11
<211> 1362
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Тяжелая цепь слитой формы антитела к CD73 человека и IL-21
<400> 11
gaagtgcagc tggtggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg      60
tcttgtgccg cctccggctt caccttcgac gactacgcta tgcactgggt gcgacaggcc     120
cctggcaagg gactggaatg ggtgtccggc atcaactgga actccgacaa catcgactac     180
gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtac     240
ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caaggaccgg     300
cggaagtact ccaactctcc tggcgccttc gacatctggg gccagggcac actcgtgacc     360
gtgtcctctg cttccaccaa gggcccctcc gtgtttcctc tggccccttc cagcaagtcc     420
acctctggcg gaacagccgc tctgggctgc ctcgtgaagg actacttccc cgagcccgtg     480
acagtgtctt ggaactctgg cgccctgact tctggcgtgc acaccttccc tgctgtgctg     540
cagtctagcg gcctgtactc cctgtcctcc gtcgtgactg tgccctccag ctctctgggc     600
acccagacct acatctgcaa cgtgaaccac aagccctcca acaccaaggt ggacaagaag     660
gtggaaccca agtcctgcga caagacccac acctgtcccc cttgtcctgc ccctgaagct     720
gctggcggcc cttctgtgtt tctgttcccc ccaaagccta aggacaccct gatgatctcc     780
cggacccccg aagtgacctg cgtggtggtg gatgtgtccc acgaggaccc tgaagtgaag     840
ttcaattggt acgtggacgg cgtggaagtg cacaacgcca agaccaagcc tagagaggaa     900
cagtacaact ccacctaccg ggtggtgtcc gtgctgaccg tgctgcatca ggactggctg     960
aacggcaaag agtacaagtg caaggtgtcc aacaaggccc tgcccgcctc catcgaaaag    1020
accatctcca aggccaaggg ccagccccgg gaaccccagg tgtacacact gccccctagc    1080
agggacgagc tgaccaagaa ccaggtgtcc ctgacctgtc tcgtgaaagg cttctacccc    1140
tccgatatcg ccgtggaatg ggagagcaac ggccagcccg agaacaacta taagaccacc    1200
ccccctgtgc tggactccga cggctcattc tttctgtact ccaagctgac agtggacaag    1260
tcccggtggc agcagggcaa cgtgttctcc tgcagcgtga tgcacgaggc cctgcacaac    1320
cactacaccc agaagtccct gtccctgagc cccggcaagt ga                       1362
<210>
12
<211>
1077
<212>
ДНК
<213>
Искусственная последовательность
<220>
<223>
Легкая цепь слитой формы антитела к CD73 человека и IL-21
<220>
<221>
КОДИРУЮЩАЯ ОБЛАСТЬ
<222>
(1)..(1077)
<400>
12
gat atc cag atg aca cag tct cct agt tcc ttg tcc gct agc gtt ggt
48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1
5
10
15
gac cgt gtg acc ata acc tgt cga gct agc cag att att ggg cca tgg
96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ile Ile Gly Pro Trp
20
25
30
ctt gcc tgg tat cag cag aag cct ggt aaa gca ccc aag ctc ctc atc
144
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35
40
45
tat aga gcc agc tct ctg gaa tcc ggg gtg cca tca cgg ttc tct gga
192
Tyr Arg Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50
55
60
tct ggc tct ggc acc gac ttt acc ctg aca att tcc tcc ctt caa ccc
240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65
70
75
80
gag gac ttt gcc aca tac tac tgc cag cag tac aac tcc tac agt ccc
288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Pro
85
90
95
tgg acc ttt ggc caa ggc acc aaa gtg gag atc aag cgc acc gta gct
336
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100
105
110
gcc cct tcc gtg ttc atc ttt cca cca agt gat gaa cag ctc aag tca
384
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115
120
125
ggg act gcc tct gtt gta tgc ctg ctc aat aac ttc tat ccc aga gaa
432
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130
135
140
gcc aag gtc caa tgg aag gtg gac aat gct ctg cag tct ggg aat agc
480
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145
150
155
160
cag gaa tcc gtt act gag caa gat tcc aaa gac tcc act tac tcc ttg
528
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165
170
175
tca tct aca ctg acc ctc tca aaa gca gac tac gaa aag cac aaa gtg
576
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180
185
190
tat gcc tgt gag gtc aca cac caa ggc ctc agc agt ccc gtc acc aag
624
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195
200
205
agc ttc aac aga ggg gag tgt ggc ggt gga gga tcc gga ggc ggt ggc
672
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210
215
220
agt cag gga cag gat cgc cac atg atc cgt atg agg caa ctg att gat
720
Ser Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp
225
230
235
240
atc gtt gac cag ctg aag aac tac gtg aac gat ctt gtc ccc gag ttt
768
Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe
245
250
255
ctt cct gct cct gag gac gtg gag aca aac tgt gaa tgg agc gca ttt
816
Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe
260
265
270
tcc tgc ttc cag aaa gca cag ctg aaa tct gct aat acg ggc aat aac
864
Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn
275
280
285
gag cgg ata atc aac gtg tca atc aag aaa ctg aaa cgc aaa cct cca
912
Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro
290
295
300
tca acg aat gca ggg agg cga cag aag cat agg ctg aca tgt ccc tct
960
Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser
305
310
315
320
tgc gac tcc tat gag aag aag cct ccc aag gag ttc ttg gaa cga ttc
1008
Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe
325
330
335
aag agt ttg ctg cag aag atg att cac cag cat ctg agt agc cgg act
1056
Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr
340
345
350
cat gga agc gaa gat agc tga
1077
His Gly Ser Glu Asp Ser
355
<210>
13
<211>
358
<212>
БЕЛОК
<213>
Искусственная последовательность
<220>
<223>
Синтетическая Структура
<400>
13
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1
5
10
15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ile Ile Gly Pro Trp
20
25
30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35
40
45
Tyr Arg Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50
55
60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65
70
75
80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Pro
85
90
95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100
105
110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115
120
125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130
135
140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145
150
155
160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165
170
175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180
185
190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195
200
205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210
215
220
Ser Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp
225
230
235
240
Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe
245
250
255
Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe
260
265
270
Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn
275
280
285
Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro
290
295
300
Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser
305
310
315
320
Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe
325
330
335
Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr
340
345
350
His Gly Ser Glu Asp Ser
355
<210>
14
<211>
1077
<212>
ДНК
<213>
Искусственная последовательность
<220>
<223>
Легкая цепь слитой формы антитела к CD73 человека и IL-21 мутантная
<220>
<221>
КОДИРУЮЩАЯ ОБЛАСТЬ
<222>
(1)..(1077)
<400>
14
gat atc cag atg aca cag tct cct agt tcc ttg tcc gct agc gtt ggt
48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1
5
10
15
gac cgt gtg acc ata acc tgt cga gct agc cag att att ggg cca tgg
96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ile Ile Gly Pro Trp
20
25
30
ctt gcc tgg tat cag cag aag cct ggt aaa gca ccc aag ctc ctc atc
144
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35
40
45
tat aga gcc agc tct ctg gaa tcc ggg gtg cca tca cgg ttc tct gga
192
Tyr Arg Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50
55
60
tct ggc tct ggc acc gac ttt acc ctg aca att tcc tcc ctt caa ccc
240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65
70
75
80
gag gac ttt gcc aca tac tac tgc cag cag tac aac tcc tac agt ccc
288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Pro
85
90
95
tgg acc ttt ggc caa ggc acc aaa gtg gag atc aag cgc acc gta gct
336
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100
105
110
gcc cct tcc gtg ttc atc ttt cca cca agt gat gaa cag ctc aag tca
384
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115
120
125
ggg act gcc tct gtt gta tgc ctg ctc aat aac ttc tat ccc aga gaa
432
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130
135
140
gcc aag gtc caa tgg aag gtg gac aat gct ctg cag tct ggg aat agc
480
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145
150
155
160
cag gaa tcc gtt act gag caa gat tcc aaa gac tcc act tac tcc ttg
528
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165
170
175
tca tct aca ctg acc ctc tca aaa gca gac tac gaa aag cac aaa gtg
576
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180
185
190
tat gcc tgt gag gtc aca cac caa ggc ctc agc agt ccc gtc acc aag
624
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195
200
205
agc ttc aac aga ggg gag tgt ggc ggt gga gga tcc gga ggc ggt ggc
672
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210
215
220
agt cag gga cag gat cgc cac atg atc cgt atg agg caa ctg att gat
720
Ser Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp
225
230
235
240
atc gtt gac cag ctg aag aac tac gtg aac gat ctt gtc ccc gag ttt
768
Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe
245
250
255
ctt cct gct cct gag gac gtg gag aca aac tgt gaa tgg agc gca ttt
816
Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe
260
265
270
tcc tgc ttc cag aaa gca cag ctg aaa tct gct aat acg ggc aat aac
864
Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn
275
280
285
gag cgg ata atc aac gtg tca atc aag aaa ctg aaa gcc aaa cct cca
912
Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Ala Lys Pro Pro
290
295
300
tca acg aat gca ggg agg cga cag aag cat agg ctg aca tgt ccc tct
960
Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser
305
310
315
320
tgc gac tcc tat gag aag aag cct ccc aag gag ttc ttg gaa cga ttc
1008
Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe
325
330
335
aag agt ttg ctg cag aag atg att cac cag cat ctg agt agc cgg act
1056
Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr
340
345
350
cat gga agc gaa gat agc tga
1077
His Gly Ser Glu Asp Ser
355
<210>
15
<211>
358
<212>
БЕЛОК
<213>
Искусственная последовательность
<220>
<223>
Синтетическая Структура
<400>
15
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1
5
10
15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ile Ile Gly Pro Trp
20
25
30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35
40
45
Tyr Arg Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50
55
60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65
70
75
80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Pro
85
90
95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100
105
110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115
120
125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130
135
140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145                150                155                160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165
170
175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180
185
190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195
200
205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210
215
220
Ser Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp
225                230                235                240
Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe
245
250
255
Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe
260
265
270
Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn
275
280
285
Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Ala Lys Pro Pro
290
295
300
Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser
305                310                315                320
Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe
325
330
335
Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr
340
345
350
His Gly Ser Glu Asp Ser
355
<210> 16
<211> 1848
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Тяжелая цепь слитой формы антитела к CD73 человека и IL-7 мутантная
<400> 16
gaagtacagt tggtcgaaag cggaggaggg ctggttcagc ctggcggctc actcagactg      60
tcatgcgctg cctctgggtt tacattcgac gattatgcca tgcattgggt acgacaggca     120
ccaggcaaag ggctggagtg ggtttctggg attaactgga atagcgataa tatcgactat     180
gccgactctg taaaggggcg ctttactatc agtcgggaca atagtaagaa tacgctctat     240
ctgcagatga atagcctgag agcagaagat accgctgtgt actactgtgc caaagaccgg     300
cgtaagtaca gtaactctcc tggtgccttt gacatctggg gacagggcac tcttgttacc     360
gtgagcagcg catctaccaa aggtccctca gtctttcccc tcgctcctag ttctaagtcc     420
acatcaggtg gaactgccgc tttgggttgc ctggtaaagg actactttcc cgagcctgtt     480
acagtgagct ggaactccgg agctctgaca tccggtgtgc acacatttcc tgccgttctt     540
cagtcctcag ggctgtattc cttgtcctca gtggttacag tgcccagcag tagtctgggg     600
acacagacat acatttgcaa tgtgaatcac aagccaagta acactaaggt cgataagaag     660
gtcgagccca aaagttgcga taagacccat acttgtccac cttgtcctgc tcctgaggcc     720
gcaggaggcc cttctgtgtt cctgtttcca cccaaaccca aggacactct gatgattagc     780
cggacgccag aggtgacctg tgttgtggtt gatgtctctc acgaggaccc agaagtgaaa     840
ttcaactggt acgtcgacgg cgtggaagtg cacaatgcca aaaccaagcc acgcgaggag     900
cagtacaaca gcacctatcg ggtggtgagc gtgttgactg tgctgcatca agattggctg     960
aatggaaagg agtacaagtg taaggtgtct aacaaggcac tgcccgcaag catcgaaaag    1020
accatcagta aggctaaggg ccagcccagg gaaccacagg tctacaccct gccaccttcc    1080
cgtgacgagt tgaccaagaa ccaggtgtca cttacgtgct tggtgaaagg cttctatccc    1140
tccgacattg ccgtagaatg ggaaagcaat gggcaacccg agaataacta caaaacaact    1200
ccacccgtcc ttgattctga cggttccttc ttcctctatt ccaaactgac tgtcgataaa    1260
tctcgatggc aacagggcaa tgtcttttct tgtagtgtga tgcatgaagc attgcataac    1320
cactacaccc agaagtccct gtctttgtcc cctgggaaag gaggcggtgg atccggtggt    1380
ggcggctcag attgcgacat agaaggcaag gacggcaaac agtatgagtc cgtcctgatg    1440
gtgtccattg atcagctgct ggattctatg aaggaaatcg gaagcaactg cctgaacaat    1500
gagtttaact tcttcaaacg acacatctgt gatgccaaca aagagggcat gtttctcttc    1560
agagccgcta ggaaactgag gcagtttctc aagatgaact ccactggcga cttcgatctg    1620
caccttctgg ccgtatcaga ggggaccaca atactgctga actgcaccgg ccaagtcaag    1680
ggtcgcaagc ccgctgccct tggagaagct caacccacca aaagcctgga agagaacaaa    1740
tccctcaagg agcagaagaa actcaacgac ctgtgctttc tcaagaggct ccttcaggag    1800
attgccacct gttggaataa gatccttatg gggacaaaag agcactga                 1848
<---