Подбор и анализ условий агрегации клеток микроорганизмов

УДК 541.18.041.2:661.185

Р. И. Юсупова, М. В. Потапова, Е. М. Кулагина

ПОДБОР И АНАЛИЗ УСЛОВИЙ АГРЕГАЦИИ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ

Ключевые слова: биосуспензия, культуральная жидкость, агрегация, поверхностное натяжение.

Изучены свойства системы «клетка - среда». Подобраны оптимальные концентрации клеток, при которых биосуспензия остается устойчивой. Проведены исследования влияния рН на поверхностное натяжение дрожжевых систем.

Keywords: bio-suspension, cultural liquid, aggregation, surface tensiorn.

We studied the properties of the "cell - environment". Optimal concentration of cells in which bio-suspension remains stable. Investigated the effect of pH on surface tension of yeast systems.

Суспензии представляют собой

седиментационно неустойчивые системы с твердой дисперсной фазой и жидкой дисперсионной средой. Систему, состоящую из клеток микроорганизмов, находящихся в жидкости, можно рассматривать как биосуспензию, в которой дисперсной фазой являются клетки микроорганизмов, а дисперсионной средой - культуральная жидкость или буферный раствор [1-5]. Микробная суспензия характеризуется следующими параметрами: дисперсностью, хорошо развитой межфазной поверхностью, числом клеток, весом биомассы. У бактериальных и дрожжевых суспензий велика удельная поверхность, равная отношению межфазной поверхности к объему дисперсной фазы [6]. Это приводит к интенсивному обмену веществ с окружающей средой и обуславливает свойственную микроорганизмам высокую степень метаболизма. Поверхностно-активные вещества метаболического происхождения могут формировать межфазные слои. Для биосуспензий существуют два межфазных слоя - на границе воздух - культуральная жидкость и поверхность клетки - среда (культуральная жидкость).

Экспериментально присутствие ПАВ в культуральной жидкости может быть определено по зависимости: поверхностное натяжение - рН среды [7, 8]. Такой путь основан на предположении о том, что поверхностное натяжение биосуспензии на границе с воздухом определяется концентрацией свободных ПАВ и не зависит от присутствия клеток. Для этого концентрация клеток подбиралась таким образом, чтобы поверхностное натяжение клетка -среда соответствовало поверхностному натяжению культуральной жидкости, отделенной от клеток.

Исследования проводились с дрожжевой культурой этанолокисляющих дрожжей Candida lambica, когда рост клеток завершен, что позволяет рассматривать биосуспензию как условно стационарную коллоидную систему.

Предварительно была проанализирована устойчивость дрожжевых суспензий в культуральной жидкости и в модельных системах: цитратно-фосфатном буфере и дистиллированной воде, поскольку до настоящего времени единых представлений о процессе клеточной агрегации не выработано. В дальнейшем для исследования агрегации клеток микроорганизмов в присутствии флокулянтов необходимо знать свойства систем «

клетки - среда», а также поведение на межфазной границе, что и явилось целью данной работы.

Для оценки устойчивости биосуспензий по аналогии с дисперсными системами спектрофотометрически контролировали изменение мутности (т) изучаемой системы, рис. 1. Возрастание мутности свидетельствует об агрегации частиц, что позволяет следить за развитием процесса в системе до седиментации частиц.

т, см -1

О 40 80 120 160 200 240 280

Рис. 1 - Кинетические зависимости мутности системы «клетки - культуральная жидкость» при различных концентрациях клеток: 1 - 4,6 • 105 кл\мл; 2 - 9,2 • 104 кл\мл; 3 - 4,6 • 104 кл\мл; 4 - 2,3 • 104 кл\мл; 5 - 1,15 104 кл\мл

Полученные зависимости для исходной суспензии независимо от среды, показывают, что существенного изменения мутности системы не происходит в течение четырех часов. Это свидетельствует о том, что клетки за это время остаются свободно-дисперсными и седиментционно устойчивыми. Проведенные микроскопические исследования состояния клеток в системе подтверждают этот вывод. После четырех часов наступает седиментация клеток. Аналогично ведут себя и более разбавленные системы (кривые 2, 3). При дальнейшем разбавлении (снижения числа клеток) (кривые 4, 5) система становится устойчивой и за время опыта седиментация практически отсутствует. Таким образом, были подобраны оптимальные концентрации клеток в системах, содержащих 2,3-104 кл/мл при которых суспензия остается длительное время устойчивой.

Аналогичные зависимости при тех же концентрациях получены в системе «клетки - вода» и «клетки - цитратно-фосфатный буфер».

Поверхностное натяжение на границе раздела жидкость - газ определялось в зависимости от времени формирования адсорбционного слоя методом Вильгельми [9]. Исходная оптическая плотность (Б) подбиралась таким образом, чтобы исследуемая суспензия сохраняла устойчивость во времени (Б=0,4 ^ 0,8). Проведены исследования влияния рН на поверхностное натяжение изучаемых дрожжевых систем. По аналогии с синтетическими полиамфолитами [10], имеющими в своей цепи как кислотные, так и основные группы и проявляющими максимальную поверхностную активность в изоэлектрическом состоянии можно предположить, что минимальные значения поверхностного натяжения будут соответствовать

изоэлектрическому состоянию белков в системе (рис. 2).

микроорганизмов, ионный состав среды, физиологическое состояние и возраст клеток, наличие гидратных оболочек и т. д. [11 - 15].

<7-10 , Дкк

00

t, -хае

Рис. 3 - Кинетическая зависимость поверхностного натяжения системы «клетки -культуральная жидкость» в процессе

культивирования

Рис. 2 - Зависимость поверхностного натяжения системы «клетки - культуральная жидкость» от

рН

Зависимость поверхностного натяжения по мере роста культуры дрожжей Candida lambica представлена на рис. 3. Видно, что установление равновесных значений поверхностного натяжения происходит за время 100 минут и более, что свидетельствует о сложных взаимодействиях на границе раздела фаз. Длительность времени установления поверхностного натяжения говорит о том, что межфазный слой образуется макромолекулами высокомолекулярных

соединений, например белками. Низкие значения поверхностного натяжения свидетельствуют о заполнении межфазной границы жидкость - газ поверхностно-активными соединениями

метаболического происхождения, активность которых к стационарной фазе роста клеток достигает максимума (например, жирные кислоты и их соли, обладающие способностью снижать с). Величина с понижается на 20 Дж/м2 по сравнению с поверхностным натяжением исходного состояния системы.

На агрегативную устойчивость клеток микроорганизмов влияют различные факторы: заряд клеток, изменение температуры, изменение рН, состав и свойства среды в которой находятся клетки

Рис. 4 - Кинетические зависимости поверхностного натяжения: 1 - раствор питательных солей; 2 - система «клетки - вода»; 3 - культуральная жидкость

Синтетическая питательная среда для выращивания дрожжей, состоящая из солей: КН4И2Р04, ]^04-7И20, К2НР04, №2НР04-12Н20 обладает поверхностным натяжением

приблизительно равным поверхностному натяжению воды (рис 4, кривая 1). Снижение значений поверхностного натяжения системы «клетки - вода» (кривая 2) по-видимому, можно связать с выбросом из клеток поверхностно -активных веществ и десорбцией с клеточной поверхности продуктов метаболизма. Кривая 3 представляет зависимость поверхностного натяжения культуральной жидкости, отделенной от клеток дрожжей. Вид кривой позволяет говорить о поверхностной активности.

Таким образом, был проведен подбор условий для дальнейшего изучения и проведения флокуляции биосуспензии полимерными агентами.

Литература

1. Я. Я. Шкоп, Н. В. Фомченко, Агрегация клеток микроорганизмов в процессе разделения микробных

суспензий, ОНТИТЭИ микробиопром, Москва, 1981. 56 с.

2. А. Я. Тесленко, Т. Ф. Гирфанова, Ю.В. Медведев, Концентрирование суспензий микроорганизмов с помощью флокулянтов. ВНИИСЭНТИ, Москва, 1984. 48 с.

3. Е. Д. Щукин, А. В. Перцов, Е. А. Амелина, Коллоидная химия. МГУ, Москва, 1982. 348 с.

4 Р. И. Юсупова, М. В. Потапова А. И. Курмаева, Е. М. Кулагина, В. П. Барабанов, Вестник Казанского технологического университета, 4, 186-189

5. Р. И. Юсупова, М. В. Потапова А. И. Курмаева, Е. М. Кулагина, В. П. Барабанов, Вестник Казанского технологического университета, 4, 189-192

6. Г. Шлегель, Общая микробиология. Мир, Москва, 1987. 502 с.

7. А. А. Трапезников, В. Г. Винс, Т. Ю. Широкова, Коллоидный журнал,. 43, 2, 323-329

8. Р. А. Кульман. В кн. Макромолекулы на границе раздела фаз. Наукова Думка, Киев, 1971. С. 31-39

9. А. Е. Файнерман, Ю. С Липатов., В. М. Кулик, Л. Н. Вологина, Коллоидный журнал, 32, 4, 620 - 623

10. E. A. Bekturov, S. E. Kudaibergenov, S. R. Rafikov, J. Macromol. Sci. - Rev. Macromol. Chem. Phys., 30, 2, 233303

11. А. И. Курмаева, Р. И. Юсупова В.П. Барабанов, Е. Н. Осипова, Л. И. Ведихина, И. Р. Манюров, М. В. Потапова, Коллоидный журнал, 53, 5, 866-873

12. S. Sampermans, J. Mortier, E. V. Soares, J. Appl. Microbiol, 98, 525-531,

13. P. Moradas - Ferreira, P.A. Fernandes, M.J. Costa, Colloids Surface, B, .2, 159-164

14. C. D. Powell, D. E. Quain, K. A. Smart, FEMS Yeast Researt, 3, 49-157

15. S. P. Strand, M. S Vandvik, K. M. Varum, K. 0stgaard. Biomacromolecules, 2, 1, 126-133

© Р. И. Юсупова - к.х.н., зав. лаб. каф. физической и коллоидной химии института полимеров КНИТУ, М. В. Потапова -к.х.н., доцент той же кафедры, Е. М. Кулагина - к.х.н., доцент той же кафедры, kyllen@mail.ru.

© R. I Yusupova - PhD (Chem.), Department of Physical and Colloid Chemistry KNRTU; M. V. Potapova - PhD (Chem.), Associate Professor, Department of Physical and Colloid Chemistry KNRTU; E. M. Kulagina - PhD (Chem.), Associate Professor, Department of Physical and Colloid Chemistry KNRTU, kyllen@mail.ru.