ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЕ НАПИТКИ И ДРУГИЕ ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ, ПРОИЗВОДИМЫЕ ИЗ СПИРТНЫХ НАПИТКОВ НА ОСНОВЕ АГАВЫ
ENERGY DRINKS AND OTHER FOOD ADDITIVES PRODUCED FROM AGAVE-BASED ALCOHOLIC BEVERAGES

Родственные заявки
[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет в отношении предварительной патентной заявки США № 62/071179, поданной 16 сентября 2014 г., и предварительной патентной заявки США № 62/231592, поданной 10 июля 2015 г., причем содержание этих заявок во всей своей полноте включается в настоящий документ посредством ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
[0002] Настоящее изобретение предлагает безалкогольные модификации спиртных напитки на основе агавы, в частности, разнообразных видов текилы, которые являются пригодными для использования в лечении различных состояний посредством ингибиторов моноаминооксидазы (MAO), содержащихся в этих напитках.
Уровень техники
[0003] Существуют многочисленные документы, описывающие изготовление дистиллированных спиртных напитков из агавы. Например, подробное описание изготовления текилы из кактуса агавы приводит книга «Переработка и аромат текилы», Pedro A. Vazquez-Landaverde и Miriam G. Rodriguez-Olvera, Исследовательский центр прикладных наук и передовых технологий Национального объединенного политехнического института Керетаро, Белый холм 141, Симатарио, город Керетаро, штат Керетаро, Мексика 76090; 2012 г. Американское химическое общество; Интернет: //pubs.acs.org., дата публикации в сети: 16 июля 2012 г. [doi: 10.1021/bk-2012-1104.ch015, в книге «Химия аромата вина и других спиртных напитков; Qian, M., и др., серия материалов симпозиумов Американского химического общества; Американское химическое общество: Вашингтон (округ Колумбия, США), 2012 г., причем содержание данных документов включается в настоящий документ посредством ссылки в отношении описания обработки исходных материалов на основе агавы, брожения, перегонки и выдержки. Вкратце, стебли кактуса агава подвергают нагреванию для гидролиза сложных сахаров, а затем резанию и дроблению для выделения сиропа. Сироп затем разбавляют водой для получения подходящего разбавления для засевания дрожжами. После брожения полученную культуру перегоняют, получая дистиллят. Дистиллят продают как текилу под различными многочисленными фирменными наименованиями. Однако дистиллят можно выдерживать перед упаковкой и продажей.
[0004] В приведенной выше литературе содержится следующее конкретное описание:
[0005] Спелая агава, очищенная от листьев (называется «пифия») разрезается на половинки, четверти или большее число частей, что упрощает ее спекание в печи в течение 48 часов или обработку в автоклаве в течение 12 часов при температуре от 106 до 116°C. Задача этой термической обработки заключается в том, чтобы гидролизовать сложные сахара, такие как инулин и крахмал, и получить глюкозу и фруктозу для упрощения брожения. Сахара образуют, главным образом, этанол, и при брожении этого субстрата образуются многочисленные другие соединения. В результате термической обработки пифии образуются, главным образом, соединения, которые образуются в реакции Майяра (Maillard), такие как фураны, пираны, альдегиды, а также соединения азота и серы. Наиболее распространенные соединения Майяра представляют собой метил-2-фуроат, 2,3-дигидрокси-3,5-дигидро-6-метил-4(H)-пиран-4-он и 5-гидроксиметилфурфураль. Пиразины также представляют собой важную группу химических соединений, которые образуются в реакциях Майяра. Наиболее распространенные пиразины представляют собой 2,5-диметилпиразин и триметилпиразин.
[0006] Другие продукты термического разложения образуются в результате стадии спекания. После спекания пифия содержит свободные жирные кислоты, имеющие короткие и длинные углеродные цепи, вероятно, вследствие гидролиза ацилглицеринов, p-β-циклоцитраля и β-дамасценона, являются вероятными продуктами разложения каротеоидов, в то время как 4-метил-5-(2-гидроксиэтил)-тиазол представляет собой продукт разложения аминокислоты тиамина. Фенолы, такие как п-крезол и 4-этилфенол, представляют собой продукты разложения фенольных кислот.
[0007] Когда пифия спекается, она направляется на установки для резания и дробления, где из нее выделяется весь сироп, содержащий в высокой концентрации сахара и большинство соединений. Получаемое в результате пюре агавы часто промывают, чтобы улучшить извлечение сахаров.
[0008] Нет сомнения в том, что брожение представляет собой наиболее важную и сложную стадию переработки агавы. Сиропы, содержащие 100% агавы или смеси, разбавляются водой для достижения уровня от 12 до 14°BRIX (от 80 до 100 г сахара/л). Брожение происходит в термостатируемых резервуарах при 30°C, хотя некоторые процессы осуществляются при комнатной температуре, которая может быть переменной в зависимости от времени года. Брожение зависит полностью от метаболизма дрожжей и в меньшей степени от молочнокислых и уксуснокислых бактерий. В плесени агавы обнаружено множество штаммов дрожжей, в числе которых наиболее важными являются пекарские дрожжи (Saccharomyces cerevisiae) и винные дрожжи (Kloeckera africana). В процессе метаболизма дрожжи превращают углеводы, аминокислоты, жирные кислоты и другие органические соединения в этанол, глицерин, диоксид углерода и в меньшей степени в альдегиды, кетоны, высшие спирты, органические кислоты и сложные эфиры, которые называются «побочные продукты брожения» или «родственные соединения». Высшие спирты, также называемые «сивушные масла» вследствие своего солодового и горелого запаха, образуются в результате разложения аминокислот через кетокислоты (2-оксокислоты). Наиболее важные соединения представляют собой 1-пропанол, 2-метил-l-пропанол, 2-метил-бутанол, 3-метил-бутанол и 2-фенилэтанол, причем последний имеет аромат, напоминающий розу. Синтез жирных кислот внутри дрожжевых клеток производит, главным образом, насыщенные жирные кислоты, имеющие неразветвленные цепи, содержащие четное число от 4 до 18 атомов углерода, и образование в небольших количествах жирных кислот, содержащих нечетное число атомов углерода, зависит от условий брожения. Жирные кислоты могут реагировать со спиртами, образуя сложные эфиры.
[0009] Брожение происходит в течение от 18 до 24 часов при температуре от 30 до 35°C. Когда температура процесса составляет 35°C, летучие соединения образуются в большем количестве, чем при 30°C. Кроме того, было обнаружено, что дополнительный источник азота изменяет образование соединений дрожжами в процессе брожения, хотя данный эффект различается в зависимости от используемого источника азота. Когда добавляются в смеси 20 аминокислот, дрожжи штамма K1 Kloeckera africana способны производить и выдерживать этанол в более высоких концентрациях, в то время как увеличивается образование некоторых сложных эфиров, спиртов, ацетальдегида и α-терпинеола. Когда Saccharomyces cerevisiae используется в плесени, и его дополняют сульфат натрия и аминокислоты, концентрация амиловых спиртов и изобутанола уменьшается, в то время как концентрация пропанола и ацетальдегида увеличивается.
[0010] Когда брожение завершается, и содержание спирта достигает приблизительно 15 об.%, наступает время перегонки. Масса после брожения нагревается в котлах из меди или нержавеющей стали при температуре от 78 до 80°C, и, таким образом, осуществляется испарение спирта. Пары конденсируются в охлаждаемом змеевике, и собирается дистиллят. Концентрация спирта в первом дистилляте достигает приблизительно 25 об.%, и требуется вторая перегонка, также называемая «ректификация», чтобы концентрация этанола достигла уровня, составляющего приблизительно 55 об.%. Жидкость затем разбавляется водой до содержания спирта, составляющего от 38 до 40 об.%. Поскольку большинство соединений являются летучими, они испаряются вместе с этанолом в процессе перегонки. В процессе перегонки могут быть выделены различные фракции летучих веществ или «погоны». Головной погон содержит высоколетучие соединения, такие как ацетальдегид и этилацетат, в то время как хвостовой погон содержит химические соединения, имеющие более высокие температуры кипения, такие как сложные эфиры этилового спирта и жирных кислот, имеющих длинные цепи. Поскольку обе эти фракции являются нежелательными, они могут отделяться от среднего погона. Метанол содержится в хвостовой фракции, несмотря на свою низкую температуру кипения. Этиллактат, уксусная кислота и фурфураль также дистиллируются в хвостовой фракции. Изобутиловый и изоамиловый спирты представляют собой головные продукты, н-пропиловый спирт содержится в средней фракции, а фенилэтиловый спирт представляет собой хвостовой продукт.
[0011] Тепло играет важную роль в образовании соединений в процессе перегонки. Вследствие этого оказывается возможным осуществление некоторых реакций разложения, в результате которых образуются альдегиды, кетоны, фураны, соединения серы, пиразины и фенолы.
[0012] Ректифицированный дистиллят, разбавленный водой до содержания этанола, составляющего 40%, можно выдерживать в течение от двух месяцев до трех лет в дубовых бочках. Альдегиды испаряются и/или образуют ацетали. В процессе выдерживания в деревянных бочках летучие соединения, такие как ванилин, гваякол, эвгенол, крезол и другие фенольные соединения переходят из древесины в дистиллят, улучшая аромат. Сложные эфиры этилового спирта образуются не только в процессе брожение, но также и в процессе выдержки. Было обнаружено, что сложные эфиры могут образовываться последовательно в течение процесса выдержки посредством этерификации жирных кислот этанолом в высоких концентрациях.
[0013] Приведенное выше описание является таким, как приведено в цитируемом выше документе. Было определено широкое разнообразие и множество соединений, которые представляют собой компоненты экстрактов агавы и/или изготовленных из них спиртных напитков; однако насколько известно заявителю, не было понятным, что напитки, обычно продаваемые как текила или другие производные агавы, проявляют активность ингибирования MAO. Поскольку известно, что ингибиторы MAO могут использоваться как средства для подъема настроения, антидепрессанты или средства для лечения других разнообразных заболеваний, включая болезнь Паркинсона (Parkinson), безалкогольный «энергетический напиток», который содержит неалкогольные компоненты этих напитков, является пригодным для использования в данных целях.
Сущность изобретения
[0014] Как отмечено выше, настоящее изобретение использует преимущество присутствия ингибиторов MAO в спиртных напитках, изготовленный из экстрактов агавы. Ингибиторы MAO могут присутствовать в исходном экстракте или образуются в процессе брожения или образуются в процессе перегонки или выдержки и их сочетаний. В частности, заявитель показал, что удаление спирта из этих имеющихся в продаже спиртных напитков посредством воздействия вакууме уничтожает, по меньшей мере, в некоторой степени активность ингибирования MAO. Таким образом, композиции согласно настоящему изобретению должны изготавливаться из этих спиртных напитков способами, которые сохраняют эти летучие компоненты. Эти способы включают обратный осмос, дистилляционную колонку с вращающимся конусом и другие способы, которые не приводят к потере летучих соединений.
[0015] Соответственно, согласно одному аспекту настоящего изобретения, предлагается композиция, изготовленная посредством осуществления обратного осмоса или другого способа сохранения летучих компонентов в произведенном из агавы спиртном напитке. Согласно одному варианту осуществления, спиртной напиток на основе агавы изготавливают, производя нагревание стеблей кактуса агава для гидролиза сложных сахаров; резание и дробление нагретых стеблей для выделения сиропа; разбавление вышеупомянутого сиропа водой до уровня от 12 до 14°BRIX и засевание дрожжами; брожение засеянного разбавленного сиропа для получения продукта брожения; и перегонка продукта брожения для получения дистиллята.
[0016] Настоящее изобретение также предлагает способы лечения состояний, отличающихся чрезмерной активностью MAO посредством введения нуждающемуся в этом пациенту эффективного для такого лечения количества композиции согласно настоящему изобретению. Это является особенно актуальным в случае депрессии или болезни Паркинсона.
[0017] Кроме того, настоящее изобретение предлагает способ анализа активности ингибирования MAO в присутствии этанола. Присутствующий в значительных количествах этанол воздействует на результаты анализа. Соответственно, стандартные анализы, в которых не учитывается присутствие спирта, предоставляют вводящие в заблуждение результаты.
[0018] Таким образом, согласно еще одному аспекту настоящего изобретения, предлагается способ анализа ингибиторов MAO в присутствии этанола, причем данный способ включает добавление в анализируемый образец никотинамидадениндинуклеотида и алкогольдегидрогеназы. Более конкретно, анализ включает добавление в анализируемый образец эффективного для субстрата количества дигидробромида кинурамина, вместе с никотинамидадениндинуклеотидом и алкогольдегидрогеназой; добавление MAO A или MAO B; инкубацию при 37°C; прекращение реакции посредством сильного основания и оценка результатов при длине волны возбуждения 310 нм и длине волны излучения 405 нм.
Краткое описание чертежей
[0019] Фиг. 1 представляет результаты анализа активности ингибирования MAO в текиле, имеющей различные сроки выдержки, путем использования стандартного имеющегося в продаже аналитического набора.
[0020] Фиг. 2 представляет результаты анализа активности ингибирования MAO в текиле различных марок, имеющей различные сроки выдержки, путем использования кинурамина в качестве субстрата.
[0021] Фиг. 3 представляет результаты анализа ингибирования MAO путем использования кинурамина в качестве субстрата после разделения текилы на различные фракции.
[0022] Фиг. 4 представляет график, иллюстрирующий активность ингибирования MAO в различных колоночных фракциях на основании анализа кинурамина.
[0023] Фиг. 5 представляет результаты анализа ингибирования MAO в образце текилы, подвергнутой обратному осмосу, и сравнивает активность концентрата и активность фильтрата.
Варианты осуществления изобретения
[0024] Предмет настоящего изобретения представляют собой безалкогольные формы спиртных напитков, изготовленных из экстрактов растения агавы. Эти спиртные напитки представляют собой пульке, текила, мескаль, сотол, баканора или другие продукты брожения сахаров, произведенных их растения агавы. Согласно настоящему изобретению, спирт удаляется в таких условиях, в которых сохраняются другие летучие соединения.
[0025] Эти композиции проявляют свойства ингибирования моноаминооксидазы (MAO) и, таким образом, являются пригодными для использования в качестве средств поднятия настроения, антидепрессантов или средств для лечения определенных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона. Настоящее изобретение также предлагает способ квалификации и изготовления или смешивания различных экстрактов для выбора желательного эффекта физиологического стимулятора или антидепрессанта в целях использования в качестве энергетического напитка и/или средство поднятия настроения посредством анализа активности MAO в присутствии спирта. Согласно аспекту средства квалификации/оценки настоящего изобретения, различные напитки на основе агавы получают оценки ингибирования моноаминооксидазы (MAO) для каждой формы MAO, A+B, которые выражаются как процентное ингибирование по отношению к контрольному образцу, в котором отсутствует ингибитор. Примерные оценки, которые получают мескаль, текила, баканора, сотол и пульке, представлены в примере 6. Пример 7 представляет аналогичные результаты, когда анализируются фракции, получаемые посредством обратного осмоса.
[0026] Как представлено в настоящем документе, различные произведенные из агавы напитки можно анализировать непосредственно по их содержанию ингибиторов MAO A и MAO B. Это делает возможным систему оценки, в которой результаты для конкретного напитка могут быть нанесены на этикетку. Различные напитки могут получать оценки по шкале на основании своего содержания, например, по сравнению с другими марками такого же напитка. Оценки могут присваиваться для сочетаний ингибиторов MAO A и MAO B или для каждого из них индивидуально. Таким образом, для шкалы от 1 до 10, в которой 10 представляет собой высшую оценку, и 1 представляет собой низшую оценку, напиток, который проявляет 80% ингибирование MAO A по сравнению с 40% ингибированием, которое проявляет конкурирующая марка в таком же анализе, может получить оценку 9 по сравнению с оценкой 5 для напитка, проявляющего менее высокую активность. Корреляция ингибирования с определенной шкалой может быть построена, чтобы обеспечивать полезную информацию для потребителя. Разумеется, используемая шкала или выбранная оценка не обязательно должна составлять от 1 до 10, но может быть произвольным образом выбрана любая другая шкала, такая как шкала от A до F.
[0027] В анализах MAO, используемых для измерения процентного ингибирования, являются приемлемыми образцы с высокими концентрациями этанола. Способ анализа согласно настоящему изобретению является необходимым для точного измерения ингибирования активности MAO и должен быть приемлемым для образцов, содержащих более чем 40% этанола, который представляет собой основной компонент рассматриваемых образцов, которые подлежат оценке. Интервал содержания спирта, который, как правило, имеют дистиллированные спиртные напитки на основе агавы, составляет от 6% для пульке до приблизительно 60% для некоторых сортов текилы и мескаля, но более часто встречающиеся образцы имеют содержание спирта, составляющее 40% (80 пруф). Вследствие летучести некоторых (но не всех) ингибиторов MAO в напитках, произведенных на основе агавы, оказывается особенно важным, чтобы этанол не испарялся из образца при пониженном давлении или посредством перегонки при атмосферном давлении.
[0028] Композиции согласно настоящему изобретению могут использоваться в качестве пищевых добавок и/или включаться в пищевые продукты или лекарственные средства, или использоваться для лечения депрессии, болезни Паркинсона или общего недомогания. Композиция может также использоваться в качестве дополнения или заместителя кофе или в декофеинизированных продуктах. С композициями могут смешиваться два или более носителей, вспомогательных веществ и/или разбавителей, которые являются приемлемыми в фармацевтическом или пищевом отношении. Таким образом, как правило, композиции согласно настоящему изобретению могут быть включены в соки или другие безалкогольные напитки, такие как кола или ароматизированная фруктами содовая вода, или они могут потребляться в чистом виде. Композиции могут также включаться в пищевые продукты, такие как не подлежащие варке жидкости, например, салатные приправы, и потребляться вместе с твердыми компонентами салата. Количества композиций, которые потребляют или принимают пациенты, в высокой степени зависит от характера состояния, подлежащего лечению, а также от концентраций ингибиторов MAO, которые определены для присутствия в самой композиции. В технике известны уровни ингибиторов MAO, которые являются пригодным для использования по различным медицинским показаниям, и эти рекомендации могут выполняться. Для использования в качестве пищевых добавок данный вопрос является предметом решения диетолога или другого лечащего врача.
[0029] Таким образом, настоящее изобретение предлагает пищевые продукты и напитки, которые содержат композицию согласно настоящему изобретению, в количествах, эффективных для обеспечения желательного физиологического эффекта.
[0030] Один успешный способ удаления этанола из напитка, представляющего собой исходный материал, представляет собой обратный осмос (ОО). Мембрана ОО, имеющая отсечение молекулярной массы, составляющее приблизительно 100 дальтон, отделяет этанол от ингибиторов MAO, которые производятся микроорганизмами или в процессе перегонки, или ингибиторов, которые могут естественным образом присутствовать в исходном материале. Выделение ингибиторов MAO осуществляется без использования вакуума или перегонки. Таким образом, композиции согласно настоящему изобретению можно изготавливать, например, осуществляя разбавление дистиллированной водой 0,75 л текилы (или другого дистиллированного напитка на основе агавы) до объема от 7,5 до 75 л, в зависимости от конечной желательной концентрации этанола. Например, 0,75 л текилы, имеющей крепость 80 пруф (содержание спирта 40 об.%) разбавляется до 7,5 л, и в результате этого получается разбавленный материал, содержащий 4 об.% спирта. Разбавленная текила циркулирует в блоке обратного осмоса, который оборудован мембраной, имеющей отсечение молекулярной массы, составляющей приблизительно 100 дальтон (RO MINI от компании Tangent Membranes, Inc.), в которой разбавленный материал обратно концентрируется до объема 0,75 л. Дополнительное уменьшение содержания этанола достигается посредством повторного разбавления материала до 7,5 л или большего объема и продолжения циркуляции в блоке ОО. Для изготовления композиции, такой как энергетический напиток согласно настоящему изобретению, разбавление и последующая циркуляция могут продолжаться до тех пор, пока продукт не будет рассматриваться как безалкогольный. Тогда активные ингибиторы MAO будут содержаться в концентрированной безалкогольной части, и в них могут затем добавляться витамины, минеральные вещества, аминокислоты, белок или кофеин, если это желательно, и они могут включаться в другие композиции пищевых продуктов или напитков, как указано выше.
[0031] Важный аспект создания композиций согласно настоящему изобретению, заключается в том, что некоторые ингибиторы MAO представляют собой летучие соединения, и если композиция образуется, например, посредством испарения этанола при нагревании в процессе перегонки или при пониженном давлении, происходит потеря незаменимых ингибиторов MAO.
[0032] Следующие примеры представлены, чтобы проиллюстрировать, но не ограничивать настоящее изобретение.
Пример 1
Анализ различных сортов текилы с использованием имеющихся в продаже аналитических средств
[0033] Товарный набор для анализа активности MAO использовали, чтобы исследовать образцы различных имеющихся в продаже сортов текилы или мескаля, S1, S1 DW, S2 и S3. Набор, который приобретали у компании Sigma-Aldrich (каталожный номер MAK136), представлял собой набор для определения активности моноаминооксидазы, который включает известные ингибирующие MAO соединения, клоргилин и паргилин, в качестве контрольных образцов и тирамин в качестве ферментного субстрата. Пероксидаза хрена также включается в данный набор, чтобы взаимодействовать с пероксидом водорода, который производится в результате окисления тирамина, чтобы реагировал присутствующий индикатор, Amplex красный. Действие MAO A и/или B создает каскад событий, которые вызывают флуоресцентное излучение. S1 и S3 представляют собой образцы текилы, причем S1 представляет собой выдержанный вариант S3, и S1 DW представляет собой восстановленный дистиллированной водой образец S1 после высушивания в потоке аргона. S2 представляет собой образец мескаля, который изготовлен из разновидностей агавы, не представляющих собой голубую агаву. DW представляет собой дистиллированную воду. Данные флуоресценции пересчитываются в процентное ингибирование по отношению к буферному контрольному образцу, в котором отсутствует ингибитор. известный ингибитор MAO A, клоргилин, и известный ингибитор MAO B, паргилин, включаются в набор в качестве контрольных образцов. Как представлено на фиг. 1, в зависимости от образца, может достигаться селективное ингибирование MAO A или B.
Пример 2
Исследование различных сортов текилы с использованием в анализе только кинурамина
[0034] В данном примере осуществляется другой анализ, в котором в качестве субстрата и аналитического индикатора используется только кинурамин. В данном анализе кинурамин используется в качестве субстрата для MAO, причем он представляет собой субстрат как для MAO A, так и для MAO B. Таким образом, данный способ является более желательный, потому что исключаются воздействия на пероксидазу или спектральные помехи. В результате окисления кинурамина происходит изменение оптической плотности при 360 нм и 320 нм. Продукт также является флуоресцентным, и его можно обнаружить по увеличению интенсивности излучения при 400 нм, когда длина волны возбуждения составляет 320 нм.
[0035] Анализ осуществляли, используя прозрачные полистирольные 96-луночные планшеты, согласно следующей процедуре: в лунки добавляли фосфатный буферный раствор (205 мкл/100 мМ/pH 7,2), а затем по 20 мкл образца каждого экстракта и контрольного образца ингибитора клоргилина (для MAO A) и паргилина (для MAO B) при концентрации 10 мкМ. Рекомбинантный белок MAO A и MAO B человека (0,5 мг/мл) приобретали у компании Coming, и для каждого анализа использовали по 3 мкг данного белка. Некоторые анализы осуществляли, используя не содержащий белок контрольный образец, который также поставляла компания Corning. Ингибитор(ы), буферный раствор и белки подвергали предварительной инкубации в устройстве PowerWave™ для считывания показаний оптической плотности планшетов при 37°C в течение 10 минут. Кинурамин в качестве субстрата затем добавляли в каждую лунку, и планшет продолжали инкубировать при 37°C в течение 30 минут. Показания оптической плотности с планшета считывали при 360 нм, и изменение поглощения от нулевого момента времени до 30 минут вычисляли и пересчитывали в процентное ингибирование. Образцы текилы S40, S41, S42 представляют собой сорта Blanco, Reposado и Afiejo, соответственно, от одного и того же производителя на стадиях выдержки 0, 1 и 2. Образцы S1 и S3 представляют собой такие же сорта текилы, как в примере 1, и S2 представляет собой мескаль. Процентное ингибирование вычисляется на основании изменения оптической плотности при 360 нм в течение времени от 0 до 30 минут.
[0036] Результаты представлены на фиг. 2. (В качестве образца (DJ1942) была использована текила одного сорта, содержащая 40% этанола, которую исследовали для определения помех при анализе без алкогольдегидрогеназы и NAD, и были обнаружены помехи.)
Пример 3
Воздействие выдержки
[0037] Кинураминовый анализ использовали для исследования трех образцов текилы S40, S41, S42, имеющих различные сроки выдержки, и сравнения экстрактов этих образцов в воде и дихлорметане. После выдержки текила проявляет повышенную активность ингибирования MAO по сравнению с более свежими дистиллятами, как представлено на фиг. 3.
Пример 4
Фракционирование ингибиторов MAO по активности
[0038] Текилу (1750 мл) разбавляли до 5000 мл деионизированной водой и разделяли на три части, причем каждую часть экстрагировали дихлорметаном (4 × 100 мл). Экстракты объединяли, промывали деионизированной водой (2 × 100 мл) и высушивали над безводным сульфатом натрия. Объем образца уменьшали до 10 мл посредством испарения растворителя с использованием роторный испаритель, а затем добавляли сухой диоксид кремния, и растворитель удаляли при комнатной температуре. Содержащий адсорбированный образец диоксид кремния в сухом виде загружали в колонку с диоксидом кремния, имеющую объем слоя 50 мл, и на колонке осуществляли градиентную хроматографию с использованием гексана и этилацетата (100% гексан, 90: 10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80, 10:90, 100% этилацетат). В процессе колоночной хроматографии получали фракции объемом 7 мл. Образцы анализировали следующим способом.
[0039] Анализы для MAO A и B осуществляли, используя черные 96-луночные планшеты (#7205) Thermo Scientific™, причем для каждого анализа использовали 1 мкл образца, растворенного в диметилсульфоксиде (DMSO), 87 мкл буферного раствора, содержащего 100 мМ фосфата калия и имеющего pH 7,4, 3 мкл концентрированного раствора 0,75 мМ кинурамина. На каждый планшет помещали серию контрольных образцов, содержащих только DMSO без ингибитора, 1 мкл раствора 50 мкМ клоргилина в DMSO в качестве контрольного образца для ингибирования MAO A и 1 мкл раствора 50 мкМ паргилина в DMSO в качестве контрольного образца для ингибирования MAO B. При оптимизации анализов в некоторых случаях на планшетах использовалась не содержащая белок серия.
[0040] Рекомбинантные MAO A и MAO B человека (Corning, SUPERSOMES™) добавляли в лунки для каждого соответствующего анализа в количестве 750 нг белка в 9 мкл буферного раствора.
[0041] Планшет инкубировали при 37°C в течение 30 минут, а затем в каждую лунку добавляли по 100 мкл 2н NaOH. Считывание планшета осуществляли, используя флуоресцентный спектрофотометр при длине волны возбуждения 310 и длине волны излучения 405.
[0042] Чтобы определить ингибирующую активность колоночных фракций, 25 мкл каждой фракции помещали в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и испаряли досуха в устройстве Savant™ SpeedVac™. В каждую пробирку добавляли DMSO (5 мкл), и 1 мкл отбирали для анализа активности ингибирования MAO A и B согласно описанному выше способу. Фиг. 4 представляет активности ингибирования MAO A и B собранных фракций.
[0043] Значительное ингибирование MAO наблюдается для фракций 6-13.
Пример 5
Изготовление масел, содержащих ингибиторы MAO
[0044] Текилу (100 мл) разбавляли до 200 мл деионизированной водой и экстрагировали дихлорметаном (3 × 50 мл). Экстракты объединяли и пропускали через колонку, содержащую безводный сульфат натрия. Растворитель испаряли, используя роторный испаритель, и получали 30 мг масла. Образцы полученного масла ингибировали MAO A на 75% и MAO B на 87%.
[0045] Текилу (100 мл) разбавляли до 200 мл деионизированной водой и экстрагировали дихлорметаном (3 × 50 мл). Экстракты объединяли и пропускали через колонку, содержащую безводный сульфат натрия. Растворитель удаляли посредством испарения, используя устройство Kuderna Danish, нагреваемое на водяной бане при 70°C, и в результате получали 17 мг масла. Образцы полученного масла проявляли ингибирование MAO A на 55% и ингибирование MAO B на 88%.
Пример 6
Непосредственный анализ различных образцов текилы
[0046] Как обсуждается выше, образцы, проявляющие активность ингибирования MAO, не должны испаряться при пониженном давлении; в противном случае соединения будут испаряться совместно с этанолом. Таким образом, образцы должны анализироваться без испарения этанола, чтобы исключить потери соединений, ингибирующих MAO, и чтобы точно классифицировать активность ингибирования MAO для анализируемого продукта. Анализы осуществляли, используя черные 96-луночные планшеты (#7205) Thermo Scientific™, следующим образом.
[0047] Для каждого анализа использовали 5 мкл образца, 0,975 мкг дигидробромида кинурамина, 0,75 мкмоль никотинамидадениндинуклеотида (NAD) в полном объеме 93 мкл 100 мМ фосфатно-солевого буферного раствора, имеющего pH 7,4.
[0048] Алкогольдегидрогеназу разбавляли до 0,25 единиц/мл и в лунки добавляли по 3 мкл раствора. Планшеты инкубировали при температуре от 25 до 37°C в течение 15 минут.
[0049] Рекомбинантные MAO A и B человека (Corning), поставляемые в концентрации 5 мг/мл, помещали во флаконы в виде аликвот по 20 мкл каждый и разбавляли для анализа, используя 246 мкл буферного раствора, а затем по 4 мкл MAO каждого типа добавляли в соответствующие лунки.
[0050] Планшеты инкубировали при 37°C в течение 30 минут, а затем добавляли 2 н NaOH (100 мкл), и считывание планшетов осуществляли при длине волны возбуждения 310 и длине волны излучения 405 нм.
[0051] Используя данный анализ, исследовали различные образцы текилы и получали результаты, представленные в таблице 1.
Таблица 1
Оценки различных произведенных из агавы напитков
Фирменное наименование
Ингибирование MAO A (%)
Ингибирование MAO B (%)
Suerte Blanco
5
6
Suerte Reposado
7
12
Suerte Anejo
14
19
Qui Blanco
33
7
Don Julio 70th Anniversary
12
6
Grand Patron Piedra
32
49
Don Julio Blanco
9
8
Don Julio Repesado
18
22
Don Julio Anejo
10
26
Don Julio 1942
18
35
Patron Silver Roca
39
11
Patron Roca Anejo
21
40
Patron Grand Platinum
38
9
Esperanto
36
4
Avion Silver
31
7
1800 Silver
11
11
Cuervo Silver
-1
4
Cuervo Gold
4
40
«Cheap» Mezcal
43
2
«Expensive» Mezcal
40
8
Ketel One Vodka
-2
-2
Jaegermeister
49
55
Tres Generacion
15
41
Клоргилин/паргилин (положительный контрольный образец)
97
82
DMSO (отрицательный контрольный образец)
2
1
DMSO (отрицательный контрольный образец)
-2
-1
Ингибитор (положительный контрольный образец)
98
96
Ингибитор (положительный контрольный образец)
98
95
Пример 7
Воздействие обратного осмоса (ОО)
[0052] Устройство ОО Mini от Tangent Membranes, Inc., оборудованное фильтром, обеспечивающим номинальное отсечение по молекулярной массе, составляющее приблизительно 100 дальтон, использовали для отделения этанола от текилы при сохранении соединений, ингибирующих MAO. Здесь 1,5 л текилы Anejo (DJA) разбавляли до 15 л дистиллированной водой и циркулировали в устройстве ОО Mini до тех пор, пока объем снова не уменьшался до 1,5 л. Анализировали активность ингибирования MAO для 10, 20, 30 и 40 мкл концентрированного образца и фильтрата (фиг. 5).
[0053] Как представлено на фиг. 5, концентрат сохраняет ингибиторы MAO A и B, в то время как ингибиторы MAO не присутствуют в фильтрате, который содержит только этанол и воду из разбавленного образца.
[0054] Таблица 2 представляет результаты, которые показывают различные напитки, а также разбавленная текила в качестве исходного материала (разбавленный контрольный образец ОО), первый концентрат ОО, второй концентрат ОО, первый фильтрат ОО и второй фильтрат ОО). Анализ ингибирования MAO для фильтратов показал, что они проявляют меньшую активность ингибирования, в то время как концентрат сохраняет основную активность.
Таблица 2
Образец
Ингибирование MAO A (%)
Ингибирование MAO B (%)
Kirkland Anejo (марка Costco)
23
32
Milagro Anejo
26
23
Don Julio Anejo
17
32
Don Julio 1942
19
35
Pulque
14
26
Sotol
71
58
Milagro Barrel Res Anejo
27
15
Разбавленный контрольный образец ОО
17
35
Первый концентрат ОО
23
52
Второй концентрат ОО
34
49
Первый фильтрат ОО
10
7
Второй фильтрат ОО
3
8
Клоргилин/Паргилин
97
83
DMSO
1
1