СПОСОБ РАСЧЕТА ДОЗЫ ДЕКСАМЕТАЗОНА ДЛЯ РАЗРАБОТКИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ МОДЕЛИ ИММУНОСУПРЕССИИ НА МЫШАХ
METHOD FOR CALCULATING DOSE OF DEXAMETHAZONE FOR DEVELOPMENT OF BIOLOGICAL MODEL OF IMMUNOSUPPRESSION IN MICE

Данное изобретение относится к области фармакологии, иммунологии, экспериментальной медицины и решает проблему разработки модели иммуносупрессии на различных видах лабораторных животных с целью проведения научных исследований.
Востребованность биологических моделей животных с состоянием иммуносупрессии неоспорима. С использование биологической модели на животном можно воспроизвести заболевание, характерное как для самого животного, так и для человека, изучить патогенез, течение и варианты исхода заболевания. Биологические модели широко используются в генетике, физиологии, онкологии, трансплантологии, фармакологии. Доклинические испытания новых иммунобиологических, антибактериальных, противовирусных, химиопрепаратов и т.д. на животных, предшествуют клиническим и являются неотъемлемым этапом их регистрации как в России, так и за рубежом.
Одним из наиболее распространенных вариантов биологической модели, используемой в экспериментальной медицине, является модель иммуносупрессии. Ее используют для оценки действия противоопухолевых препаратов, иммуномодуляторов, при разработке моделей антропонозных инфекций и т.д. Среди распространенных моделей применяют как известные инбредные линии мышей (СВА, гибриды первого поколения F1 - СВА х С57В1/6 и др.), так и нелинейных мышей, состояние иммуносупрессии у которых вызывают введением лекарственных препаратов, обладающих цитостатическим эффектом (циклофосфаном, азатиоприном, циклофосфамидом и др.) [И.М. Бальхаев, Л.Н. Шантанова, И.К. Иванова Фармакотерапевтическая эффективность «Полифитатотона» при азатиоприновой иммуносупрессии // Вестник Бурятского государственного университета. Спецвыпуск С. 2012. С. 49-52; Э.К. Асембаева, А.Г. Галстян, С.А. Хуршудян, Д.Е. Нурмуханбетова, М.Т. Велямов. Разработка технологии и исследование иммунобиологических кисломолочного продукта на основе верблюжьего молока // Вопросы питания. 2017. Т. 86. №6. С. 67-72].
В начале экспериментальной работы на животных всегда встает вопрос: «Как правильно рассчитать дозу препарата для животного для успешного создания состояния иммуносупрессии?». Однако в большинстве проанализированных работ, посвященных использованию модели иммуносупрессии, отсутствуют данные, каким образом был проведен расчет дозы цитостатика, препарата из группы глюкокортикоидов и т.д. для введения их животным [Б.А. Шабалин, В.Ю. Охапкина, И.В. Дармов, С.Л. Кузнецов. Изучение патогенных свойств возбудителей бруцеллеза в условиях искусственной иммуносупрессии // Проблемы особо опасных инфекций. 2010. Вып. 103. С. 60-62; С.А. Кащенко, А.А. Захаров. Особенности морфоструктуры предстательной железы и семенных пузырьков животных периода выраженных старческих изменений при циклофосфомид-индуцированной иммуносупрессии // Крымский журнал экспериментальной и клинической медицины. 2018. Т. 8. №3. С. 35-42; С.А. Кащенко, Д.В. Мосин. Структурные и органометрические изменения щитовидной железы крыс в условиях иммуносупрессии и иммуномодуляции на ранних сроках воздействия // Ульяновский медико-биологический журнал. 2019. №1. С. 110-118; И.В. Бобрышева. Морфологические особенности тимуса крыс периода выраженных старческих изменений при иммуносупрессии, вызванной введением циклофосфамида. // Ульяновский медико-биологический журнал. 2016. №2. С. 125-131; В.Ю. Охапкина, Н.В. Пяткова, Г.В. Барамзина, О.О. Фоменков, А.К. М.Н. Барышев. Способ моделирования брюшного тифа на мелких лабораторных животных с искусственной иммуносупрессией // Патент RU 2716753 С1 от 16.03.2020]. Даже в отношении одного и того же препарата (циклофосфамида) в двух из представленных работ в отношении одного вида животного (крысы), при одинаковом способе введения, авторы используют разные дозы. В первом случае 1,5 мг/кг веса крысы в/м в течение 10 дней (общая доза составляет 150 мг/кг) [Кащенко С.А. Захаров А.А. Особенности морфоструктуры предстательной железы и семенных пузырьков животных периода выраженных старческих изменений при циклофосфомид-индуцированной иммуносупрессии // Крымский журнал экспериментальной и клинической медицины. 2018. Т. 8. №3]. Во втором случае - 200 мг/кг тела животного, однократно, в/м [И.В. Бобрышева. Морфологические особенности тимуса крыс периода выраженных старческих изменений при иммуносупрессии, вызванной введением циклофосфамида. // Ульяновский медико-биологический журнал. 2016. №2. С. 125-131]. Суммарная доза циклофосфомида в результате отличается в двух опытах на 50 мг/кг, что составляет 25-30%. В отдельных работах присутствует экспериментальное подтверждение, что вводимая доза препарата обеспечила достоверное снижение иммунологических показателей [И.М. Бальхаев, Л.Н. Шантанова, И.К. Иванова. Фармакологическая эффективность «Полифитотона» при азатиоприновой иммуносупрессии // Вестник Бурятского государственного университета. Спецвыпуск. С. 49-52; В.Ю. Охапкина, Н.В. Пяткова, Г.В. Барамзина, О.О. Фоменков, А.К. М.Н. Барышев. Способ моделирования брюшного тифа на мелких лабораторных животных с искусственной иммуносупрессией // Патент RU 2716753 С1 от 16.03.2020].
Все вышесказанное обосновывает целесообразность разработки способа расчета доз препаратов, обладающих подавляющим действием на иммунную систему животных, для создания биологической модели иммуносупрессии, с целью использования ее для различных экспериментальных исследований в фундаментальной медицине.
Наиболее близким к заявленному изобретению относится подход, используемый в работе Скарновича М.О. с соавт. по расчету доз индуктора интерферона (Ридостина) и ингибитора нейроменидазы (озельтамивира) [М.О. Скарнович, Л.Н. Шишкина, А.Н. Сергеев, А.С. Кабанов, Н.А. Мазуркова, Е.Д. Даниленко, В.И. Масычева, И.Г. Дроздов Способы профилактики и лечения заболеваний, вызванных вирусом гриппа птиц A/H5N1, с использованием индуктора интерферона и ингибитора нейроминидазы // Патент RU 2398596 С2 от 10.09.10.]. Преимуществом данной работы является то, что авторы при изучении действия вышеуказанных иммуномодуляторов на животных провели пересчет соотношения дозы препарата для мыши и человека, используя сравнительные данные по интенсивности обмена веществ и скорость метаболизма введенного препарата у мыши и человека. Подобный подход позволил достигнуть наиболее высокой эффективности, пониженной токсичности и хорошей переносимости Ридостина с ингибитором нейраминидазы Тамифлю и создать более оптимальную схемы их введения в организм с целью профилактики и лечения вирусных заболеваний, вызванных современными штаммами субтипа H5N1 вируса гриппа птиц.
Однако данный подход не позволяет говорить о возможности его использования для расчета доз препаратов, подавляющих иммунитет, для создания доказательной модели иммуносупрессии на животных, так как были оценены препараты с противоположным механизмом действия, а именно, стимулирующие противовирусный иммунитет. Кроме того, основной целью данной работы было создание эффективного способа профилактики и лечения вирусных заболеваний, вызванных современными штаммами субтипа H5N1 вируса гриппа птиц, а не стандартизация способа расчета доз препаратов для животных, используемых в качестве биологических моделей.
Отсутствие разработанных подходов к расчету доз препаратов, обладающих подавляющих действием на иммунную систему, алгоритма пересчета доз с учетом видового различия, уровень востребованности лабораторной модели иммуносупрессии для проведения различных экспериментальных исследований в области фундаментальной медицины обосновывает актуальность работы.
Технический результат изобретения - разработка способа расчета дозы дексаметазона для создания биологической модели иммуносупрессии на мышах.
Технический результат достигается: путем теоретического обоснования подхода к выбору исходной дозы препарата иммуносупрессора, который применяется для подавления иммунитета у человека (пороговая, среднетерапевтическая, максимальная терапевтическая, токсическая); способа перерасчета дозы препарата, применяемой у человека, на животное с учетом поверхности и массы тела животного, разницы межвидового метаболизма; непосредственно расчета дозы дексаметазона с учетом анализа теоретических данных; проведение экспериментальной оценки показателей иммунитета у нелинейных белых мышей на фоне использования дексаметазона в теоретически обоснованной дозе.
В работе использовали 40 аутбредных мышей самцов массой 20 г., полученных из питомника ФГБОУ ВО Кировский ГМУ Минздрава России, г. Киров. Все работы с животными проводили в соответствии с морально-этическими принципами проведения биомедицинских экспериментов на животных, сформулированными Международным советом медицинских научных обществ (CIOMS) и Хельсинкской декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (2000 г.).
Для создания состояния иммуносупрессии применяли дексаметазон по 4 мг/мл в ампулах (АО «Научно-производственный центр «ЭЛЬФА», Россия).
Оценку иммунного статуса мышей проводили, определяя уровень относительного и абсолютного количества лимфоцитов крови, а также фагоцитарный индекс нейтрофилов периферической крови.
Определение уровня содержания лимфоцитов относительно лейкоцитов (в процентном соотношении) в периферической крови животных проводили на проточном цитофлуориметре BD FACSCantoTMII (BD Biosciences, США), оборудованном двухлазерной оптической системой (488 нм и 633 нм), с использованием моноклональных антител торговой марки BD Pharmingen™ - CD3-APC, CD45-PerCP-Cy5.5, CD8A РЕ-Су7, CD19-PE, CD4-FITC, CD 16/32, немеченные. Абсолютное количество лейкоцитов (количество клеток в одном мкл крови - кл./мкл) определяли методом кондуктометрии с гидродинамическим фокусированием на гематологическом анализаторе XT-4000i (Sysmex Corporation, Япония) с использованием стандартного комплекта реагентов. Абсолютное количество популяций и субпопуляций лимфоцитов рассчитывали от известного, определенного на геманализаторе абсолютного количества лейкоцитов, используя относительные значения содержания соответствующих клеток (выраженные в процентах), определенные методом проточной цитофлуориметрии, принимая при этом лейкоциты за 100%.
Кровь брали в забуференный раствор, содержащий антикоагулянт K2EDTA. Перед проведением исследования кровь смешивали с очищенными крысиными IgG 2b антимышиными моноклональными антителами к CD16/CD32 для блокировки Fc-рецептора, затем - обрабатывали по стандартной процедуре «связывание с моноклональными антителами + лизирование без фиксации и отмывания».
Для определения фагоцитарной активности нейтрофилов использовали частицы латекса размером 0,8 мкм («Sigma-Aldrich», США). Латекс предварительно разводили раствором Хенкса в 10 раз. Гепаринизированную кровь смешивали с готовым раствором латекса в соотношении 2:1. Инкубацию смеси проводили в течение 30 минут с трехкратным перемешиванием через каждые 10 минут. По окончанию инкубации делали мазки, фиксировали их раствором Май-Грюнвальда, после чего окрашивали азур-эозином. Используя микроскоп («Микмед-2», Россия) определяли фагоцитарный индекс - процент клеток, участвующих в фагоцитозе.
Расчет средних значений и доверительных интервалов проводили с помощью программы «Statistica 7.0». Перед расчетом достоверности различий между средними арифметическими величинами, при уровне значимости 95%, проведена проверка того, что полученные экспериментальные данные подчиняются нормальному закону распределения и дисперсии выборок незначительно отличаются одна от другой.
На первом этапе провели обоснование подхода к выбору исходной дозы препарата иммуносупрессора, которая бы могла достоверно снизить показатели иммунитета.
Среди используемых в фармакологии понятий о дозах препаратов, достоверного эффекта, в данном случае, эффекта снижения иммунитета, можно достигнуть используя максимальную суточную дозу. Эта доза не достигает минимальной токсической дозы, условно принимается за наибольшую допустимую дозу, разрешенную к применению в медицинской практике. Максимальная суточная доза не вызывает в организме патологические изменения, что свойственно для токсических доз, соответственно, не приведет к развитию нежелательных нарушений со стороны функции внутренних органов, и формированию побочных эффектов у создаваемой модели иммуносупрессии, что могло бы нежелательно отразится на ее использование в дальнейших научных исследованиях.
В качестве препарата для разработки модели иммуносупрессора нами был выбран дексаметазон. Среди других иммуносупрессоров (цитостатиков, антибиотиков с иммуносупрессивной активностью), которые наиболее часто используются для разработки лекарственной модели иммуносупрессии, он обладает наименьшими побочными эффектами. Если выбирать среди глюкокортикоидов (преднизолона, гидрокортизона), то он обладает преимуществом по фармакокинетике среди вышеперечисленных [Эндокринология: национальное руководство / под ред. И.И. Дедова, Г.А. Мельниченко. 2-е изд., М.: ГЭОТАР-Медиа, 2016. 1112 с]. Его активность значительно выше (0,5 мг дексаметазона соответствуют примерно 3,5 мг преднизолона, 15 мг гидрокортизона), период полувыведения для экспериментального маневра, например, для приживаемости микроорганизма на фоне сохраняющейся иммуносупрессии, больше и составляет 48-72 ч [Справочник лекарственных веществ. URL: https://www.vidal.ru/dmgs/dexamethasone_222 (дата обращения 09.07.2020].
Суточная доза дексаметазона для человека для внутримышечного и внутривенного введения составляет 0,5-10 мг/сут. Следовательно, 10 мг/сут это максимальная суточная доза относительно, которой следуют проводить дальнейшие расчеты. Средняя масса человека составляет 70 кг. Исходя из этого, рассчитываем дозу на килограмм массы тела, которая составляет 0,143 мг/кг/сут.
Далее проведем перерасчет дозы дексаметазона, применяемой у человека, на животное, с учетом поверхности и массы тела животного, разницы межвидового метаболизма. Соотношение между массой и площадью поверхности тела человека и экспериментальных животных представлено в таблице 1.
Известно, что чем меньше животное, тем быстрее протекают у него биохимические процессы. Если необходимо провести перерасчет дозы с животного на человека после, например, доклинического испытания препарата на предмет его токсичности, то необходимо разделить дозу, полученную для животного на коэффициент перерасчета (ЮТ). В нашем случае необходимо создать модель иммуносупрессии на животном, поэтому необходимо провести перерасчет дозы, определенной для человека, умножив ее на ЮТ [Гуськова Т.А. Доклиническое токсикологическое изучение лекарственных средств как гарантия безопасности проведения их клинических исследований // Токсикологический вестник. №5 (104). 2010. С. 2-5]. При этом КП рассчитывают по формуле 1.
В таблице 2 представлены значения КП дозы препарата для человека массой тела 70 кг на животных разных видов.
Представленные в таблице 2 КП доз препарата для животных относительно доз для человека, по данным Трахенберга И.М. и соавт., свидетельствуют о том, что интенсивность обмена веществ и скорость метаболизма введенного препарата у мыши, крысы, морской свинки, кролика и обезьяны с определенной массой тела (согласно табл. 1) в 11,87, в 5,9, в 4,67, в 3,21 и в 3,16 раза, соответственно, выше чем у человека. Таким образом, увеличение доз на соответствующие КП при введении препаратов вышеперечисленным животным относительно доз тех же препаратов при введении человеку просто необходимо для наблюдения и сравнения эффектов, вызываемых конкретным препаратом у соответствующих животных и человека [И.М. Трахтенберг, Р.Е. Сова, В.О. Шефтель, Ф.А. Оникиенко. Проблема нормы в токсикологии (современные представления и методические подходы, основные параметры и константы). Москва: Медицина, 1991. 208 с.].
Далее приступили непосредственно к разработке модели иммуносупрессии на нелинейных белых мышах с использованием дексаметазона.
Дексаметазон выпускается в ампулах по 4 мг/мл, таким образом в 100 мкл препарата содержится 400 мкг препарата. Из данных представленных в таблице 2 суточная доза дексаметазона для мышей массой 20 г. составляет 0,034 мг/животное/сут. Для стандартности воспроизведения результатов, а также для повышения достоверности создания модели иммуносупрессии, в последующих экспериментах, мы приняли решение разводить препарат не в 11,76 раз (чтобы получить дозу 0,034 мг/животное/сутки-Dl, см. табл. 2), а ровно в 10, получая, таким образом относительно исходной концентрации дексаметазона 400 мкг в 100 мкл, концентрацию 40 мкг в 100 мкл (0,041 мг/животное/сутки- доза D2, см. табл. 2). Таким образом, для создания модели иммуносупрессии на нелинейных белых мышах нами была использована доза дексаметазона (D3) на 20%, превышающая рассчитанную дозу (D2) с учетом КП (см. табл. 2).
В работе использовали 20 нелинейных белых мышей самцов массой 20 г.
На первом этапе провели определение фоновых показателей уровня содержания в периферической крови абсолютного и относительного количества лимфоцитов методом проточной цитофлуориметрии (у 10-ти животных в группе №1), а также оценили фоновую фагоцитарную активность нейтрофилов по фагоцитарному индексу методом микроскопии (у 10-ти животных в группе №2). Разделение на две группы было проведено по этическим соображениям, так как у каждой мыши необходимо было взять кровь из периорбитальной области пятикратно, а безопасный объем крови, который можно забрать от одного животного составляет 50 мкл. Поэтому группу №1 далее использовали для проведения исследований на проточном цитофлуориметре, а группу №2 - для определения ФИ.
Каждому животному в группе №1 и №2 вводили трехкратно по 0,1 мл дексаметазона, содержащему 40 мкг вещества, внутрибрюшинно. Оценку иммунологических показателей проводили на 4-й (1-е определение), 8-й (2-е определение), 12-й (3-е определение) и 16-й день (4-е определение) после последнего введения препарата. Для этого забирали кровь у животных из периорбитальной области в объеме 50 мкл.
Протокол исследования, поясняется фиг. 1, представляющей собой последовательность гистограмм, используемых на проточном цитофлуориметре BD FACSCantoTMII (BD Biosciences, США), для определения относительного содержания клеток.
Динамика уровня содержания лимфоцитов периферической крови животных, а также ФИ на фоне введения дексаметазона, представлены в таблице 3.
Из данных, представленных в таблице 3, следует, что на фоне введения дексаметазона достоверно снижается общее количество лимфоцитов как в абсолютном, так и в относительном количестве, как за счет Т-, так и за счет В лимфоцитов. Снижение абсолютного количества лимфоцитов происходит преимущественно за счет Т-лимфоцитов, среди последних - за счет Т-лимфоцитов хелперов. Статистическая значимость различий абсолютных и относительных значений Т-хелперов в сравнении с контролем на 4, 8, и 12 день после начала введения дексаметазона составляет от р≤0,05 до р≤0,01 (таблица 3). Динамика относительных показателей клеток соответствует абсолютным значениям и свидетельствует о сформировавшемся состоянии иммунодефицита в организме животных на фоне введения дексаметазона по выбранной схеме. Максимальное достоверное снижение лимфоцитов отмечено на 4-8 день с постепенным повышением абсолютных и относительных значений на 12-16 день от начала эксперимента (1-й день введения дексаметазона).
Функциональная активность фагоцитов, определенная по проценту данных клеток, участвующих в фагоцитозе, максимально снижена на 4 и 8 день от начала эксперимента, достоверность различий в сравнении с фоном сохраняется до 16 дня исследования, имея тенденцию к восстановлению.
Период с 4 по 8 день от начала введения препарата наиболее благоприятен для приживаемости возбудителей антропонозных инфекций, анализа действия иммуностимуляторов и других экспериментальных исследований с использованием биологической модели иммуносупрессии. На 16-й день значения большинства показателей у животных достоверно не отличались от фоновых.
Таким образом, результаты исследований, проведенные на нелинейных белых мышах, подтвердили обоснованность расчета дозы дексаметазона - 0,04 мг на животное в сутки, которое при ежедневном трехкратном внутрибрющинном введении обеспечивает достоверное снижение показателей клеточного иммунитета, являющееся необходимым условием для разработки модели иммуносупрессии.
Изобретение иллюстрируется примером, подтверждающим правильность разработанного способа расчета дозы дексаметазона, трехкратное введение которой внутрибрюшинно в дозе 0,04 мг на животное в сутки позволяет создать состояние иммуносупрессии в организме животного и обеспечить приживаемость в организме нелинейных мышей возбудителя антрапонозной инфекции, в норме, вызывающий инфекцию только в организме человека.
Исследование проведено в рамках Грантовой программы ФГБОУ ВО Кировский ГМУ Минздрава России «Университетский научный грант» в рамках проекта №1-1.2/2020».
9
Работу провели на 20 белых нелинейных мышах, которых разделили на две группы: 1-я группа животных (опытная - 10 мышей) получала дексаметазон в обоснованной дозе 40 мг на животное в сутки в течение трех дней внутрибрюшинно; с 4 по 8 день (пятикратно) от момента последнего введения дексаметазона животным опытной группы перорально при помощи шприца с припаенным круглам наконечником, имеющим отверстие, вводили чистую культуру Н. pillory в объеме 0,2 мл в концентрации 1×10 кл./мл. 2-я группа животных (контрольная - 10 мышей) не получала дексаметазон. Данной группе животных с 4 по 8 день от начала эксперимента вводили препарат Н. pillory в той же концентрации и по той же схеме, что и животным в 1 -й группе. До начала эксперимента у животных в группе №1 определяли фоновые иммунологические показатели, далее кровь из периорбитальной области в объеме 50 мкл брали в динамике на 4, 8,12 и 16 день от начала эксперимента.
На 9-й день мышей из опытной и контрольной группы подвергли эвтаназии. У каждого животного выделяли желудок, и проводили гомогенизацию тканей органа, используя небольшое количество стерильного раствора натрия хлорида, стерильную керамическую ступку и пестик. 100 мкл полученной суспензии тканей желудка, полученной от каждого животного, засевали на отдельно взятую чашку Петри с колумбийским агаром и антибиотиками (ванкомицином и амфотирицином). Засеянные чашки Петри ставили в эксикатор, где были созданы микроаэрофильные условия (5% O2, 5-10% CO2, 85-90% N2). Посевы инкубировали в термостате в течение 5 суток при температуре 37°С. Через трое суток на всех чашках Петри, засеянных материалом, полученным от опытных животных, наблюдали рост непрозрачных, выпуклых колоний размером 0,5-2 мм, похожих на капли росы. По результатам микроскопии мазков, сделанных из выросших колоний, были обнаружены тонкие, изогнутые грамм-отрицательные палочки размером от 2 до 4 мм. При биохимическом исследовании чистой культуры выявлена положительная уреазная, оксидазная и каталазная активность, характерная для данного микроорганизма. Кроме этого, принадлежность культуры, выделенной из биологического материала животных опытной группы животных к Н. pillory была подтверждена при тестировании чистой культуры с использованием иммунохроматографической тест-системы «РЭД Helicobacter pylori» (Россия).
На чашках Петри, засеянных биологическим материалом, полученным от животных контрольной группы, роста колоний Н. pillory выявлено не было.
В таблице 4 представлены результаты оценки показателей клеточного иммунитета у животных, находящихся в эксперименте.
Данные, представленные в таблице 4, подтверждают развитие состояния иммуносупрессии, при введении теоретически и экспериментально обоснованной дозы дексаметазона, которое наиболее выражено в период 4-8 день. В данный период максимально снижен уровень лимфоцитов, преимущественно за счет Т-лимфоцитов, а именно, за счет Т-лимфоцитов хелперов. Также отмечается снижение функциональной активности фагоцитов (ФИ). К 12 дню отмечается тенденция к подъему показателей. Большинство показателей достоверно не отличаются от фоновых на 16 день исследования.
Экспериментально созданное состояние иммуносупрессии наиболее благоприятно для приживаемости некоторых микроорганизмов, которые является возбудителем антропонозной инфекции, в нашем случае хеликобактериоза. Н. pillory, который в естественных условиях способен паразитировать только в организме человека. Доказанная приживаемость Н. pillory в нашем примере, еще раз, кроме иммунологических данных, подтверждает правильность разработанного способа расчета дозы дексаметазона для создания модели иммуносупрессии.
Техническим результатом изобретения является разработка способа расчета дозы дексаметазона для получения модели иммуносупрессии на нелинейных белых мышах, позволяющая проецировать его на другие виды лабораторных животных (крысу, морскую свинку, кролика и обезьяну).