Бактерии рода Klebsiella в этиологической структуре бактериальных Оки: оценка их патогенности на уровне фено- и генотипа

Бактерии рода Klebsiella в этиологической структуре бактериальных оки: оценка их патогенности на уровне фено- и генотипа

Е.В. Анганова1, 2 (eva.irk@mail.ru), А.В. Духанина2, Е.Д. Савилов1, 2

1ГБОУ ДПО «Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования»

2Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека Сибирского отделения РАМН, Иркутск

Резюме

В статье показан статистически значимый рост удельного веса бактерий рода Klebsiella в этиологической структуре возбудителей острых кишечных инфекций у детей Иркутской области в 2000 - 2010 годах. Установлено, что эти бактерии обладали гемолитической, адгезивной, ДНК-активностью и персистентным потенциалом. Частота встречаемости ряда фенотипических признаков у клебсиелл оказалась значимо выше по сравнению с другими энтеробактериями. Также штаммы Klebsiella характеризовались наличием генетических детерминант патогенности, ответственных за адгезию S-типа и 1-го типа, продукцию гемолизинов и синтез желе-зорегулируемого белка. У штаммов Klebsiella spp. отмечен самый широкий набор маркеров патогенности среди энте-робактерий всех исследованных видов (sfaA, sfaG, fimA, hlyB, hlyB, irp-2).

Ключевые слова: острые кишечные инфекции, клебсиеллы, биологические свойства, «острова» патогенности

Bacteria of the Genus Klebsiella in the Etiological Structure of Bacterial Acute Intestinal Infections and Assessment of Their Pathogenicity on the Phenotype and Genotype Level

E.V. Anganova1,2 (eva.lrk@mall.ru), A.V. Dukhanina2, E.D. Savilov12

1The State Budgetary Educational Institution of Additional Professional Training «Irkutsk State Medical Academy of Postgraduate Education»

2Scientific Centre of the Family Health and Human Reproduction Problems, Siberian Branch Russian Academy of Medical Sciences, Irkutsk Abstract

In article showed statistically significant growth of relative density of bacteria of sort Klebsiella in etiologic structure of activators of acute enteric infections at children in Irkutsk region for the 2000 - 2010. It is established that Klebsiella possess hemolytic, adhesive, DNase activity, potential of persistence. The incidences of a number of phenotypic traits in Klebsiella was significantly higher compared to other enterobacteria. Also, Klebsiella were characterized by the presence of genetic determinants of pathogenicity, responsible for the adhesion of S-type and type 1, production of hemolysins and synthesis of iron regulated protein. The strains Klebsiella spp. had the widest range of markers of pathogenicity among all studied species of Enterobacteriaceae (sfaA, sfaG, fimA, hlyB, hlyB, irp-2).

Key words: acute enteric infections, Klebsiella, biological properties, pathogenicity«islands»

Введение

Среди острых кишечных инфекций (ОКИ) установленной этиологии в последние годы существенно возрастает частота инфекций клебсиеллезной этиологии, причем преимущественно среди детей, у которых при ОКИ частота высеваемости клебсиелл колеблется от 21 до 74% [5]. По мнению Н.В. Воро-тынцевой и Л.Н. Мазанковой [4], среди ОКИ, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами (УПМ), клебсиеллезы, наряду с протеозами и энтеро-бактериозами, встречаются наиболее часто. Одной из причин распространенности клебсиелл среди условно-патогенных микроорганизмов, выделяемых при ОКИ, является их патогенный потенциал. Исследованиями ряда авторов, в частности С.В. Фиалки-

ной [7], показано присутствие у клебсиелл факторов патогенности, реализующихся на различных этапах инфекционного процесса. По данным В.М. Фролова с соавт. [8], клебсиеллы могут вызывать не только среднетяжелые, но и тяжелые формы ОКИ.

цель работы - анализ значимости энтеробакте-рий рода Klebsiella в составе условно-патогенных микроорганизмов, выделяемых от детей с ОКИ, оценка их фенотипических проявлений (ферментативная активность и персистентный потенциал) и распространенности генетических детерминант патогенности.

Материалы и методы

Анализ многолетней динамики частоты встречаемости условно-патогенных микроорганизмов раз-

ных видов в этиологической структуре бактериальных ОКИ проведен с использованием данных Управления Роспотребнадзора по Иркутской области за 2000 - 2010 годы (около 6 тыс. штаммов). Культуры энтеробактерий были выделены из фекалий детей, больных ОКИ, находящихся на лечении в Иркутской областной инфекционной больнице. Биологические свойства микроорганизмов (адгезивная и гемолитическая активность, продукция ДНКазы, потенциал персистенции) определяли по общепринятым методикам [2, 9]. Всего исследовано 924 штамма энтеробактерий, из них штаммов Klebsiella spp. - 272. Для проведения молекулярно-генетических исследований использовали образцы ДНК штаммов условно-патогенных микроорганизмов, полученные из бактериальных суспензий суточной агаровой культуры. Исследовано 175 образцов ДНК, в том числе Klebsiella spp. - 50. Для амплификации использовали стандартный набор «Ам-плиСент-1» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора), ам-плификатор Mastercycler (фирма Eppendorf, Германия). Подбор температуры отжига осуществляли экспериментальным путем, а также используя данные литературы [2]. На один образец готовили 15 мкл реакционной смеси: 5x PCR-буфер 3 мкл; MgSO4 - 1 мкл; dNTP - 1 мкл; олигонуклеотидные прайме-ры - по 1 мкл; Tag-полимераза - 0,2 мкл; исследуемая проба - 5 мкл; деионизированная вода - 2,8 мкл. В работе использовали праймеры к ряду генов, обнаруженных в составе «островков» патоген-ности E. coli, контролирующих адгезию S-типа (sfaA, sfaG), 1-го типа (fim A), продукцию гемолизинов (hlyA, hlyB), синтез железорегулируемого белка (irp-2) и капсулообразование (kpsMT) ([1,2,7]. Праймеры синтезированы в НПФ «Литех» (Москва). Анализ продуктов ПЦР проводили гель-электрофорезом в ага-розе. ДНК окрашивали бромистым этидием. Использовали маркер молекулярного веса ДНК Gene Ruler

100 bp DNA Ladder. Результаты фиксировали с применением видеосистемы гель-документирования.

Статистическую обработку материалов проводили следующим образом: определение многолетней динамики - с применением уравнения параболы первого порядка; корреляционный анализ - с помощью коэффициента корреляции Пирсона; значимость различий полученных показателей - с использованием критерия Стьюдента с предварительной их проверкой на нормальность распределения[6].

Результаты и обсуждение

Установлено, что этиологическая структура условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от больных ОКИ в 2000 - 2010 годах, была представлена преимущественно бактериями нескольких родов семейства Enterobacteriaceae - Proteus, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter и Morganella. Изучение динамики частоты их встречаемости за анализируемый период показало, что из всех доминирующих видов УПМ только для штаммов Klebsiella spp. было характерно статистически значимое (Р < 0,01) увеличение доли в этиологической структуре острых кишечных инфекций (рис. 1).

Так, доля бактерий рода Klebsiella в начале анализируемого периода (2000 г.) составляла около 10%, в 2001 году и в 2006 отмечалось снижение, а с 2007 года - выраженное увеличение с достижением в 2010 максимального уровня за весь анализируемый период (четвертая часть в составе всех УПМ - 24,4 ± 1,9%).

Более того, среднемноголетние темпы прироста удельного веса бактерий рода Klebsiella в составе микроорганизмов, выделенных при острых кишечных инфекциях, оказались самыми высокими среди всех представителей энтеробактерий и составили 14,3%.

В ходе настоящих исследований проведено изучение биологической активности условно-

Рисунок 1.

Многолетняя динамика частоты встречаемости Klebsiella spp. в этиологической структуре бактериальных ОКИ, обусловленных УПМ

патогенных бактерий. Установлено, что около половины штаммов Klebsiella spp. обладали гемолитической и адгезивной активностью, продуцировали ДНКазу, а также демонстрировали значительный персистентный потенциал - антилизоцимная активность (АЛА) выявлена у 61,7 ± 2,9% штаммов. Следует также отметить, что Klebsiella spp. характеризовались среди различных представителей энтеробактерий, выделенных от больных ОКИ, статистически более высокой (P < 0,05) частотой встречаемости гемолитической активности (47,1 ± 3,0%). Для сравнения укажем, что среди штаммов Enterobacter spp. и M. morganii гемолитическая активность выявлена у пятой части протестированных штаммов, среди Proteus spp. и Citrobacter spp. - у четвертой части. Кроме того, представители рода Klebsiella продемонстрировали и более высокие (P < 0,05) персистент-ный потенциал (по сравнению с Enterobacter spp. и Proteus spp.) и уровень продукции ДНКазы (по сравнению с Enterobacter spp., Citrobacter spp. и M. morganii). В то же время адгезивная активность Klebsiella spp. оказалась ниже, чем у Enterobacter spp. и Proteus spp.

Следует отметить неоднородность клебсиелл разных видов по их фенотипическим проявлениям. Так, у штаммов K. pneumoniae по сравнению с K. oxytoca отмечалась значимо более высокая (P < 0,05) частота встречаемости гемолитической (57,1 ± 3,2% и 20,0 ± 6,3% соответственно) и ДНКазной (44,8 ± 3,2% и 27,5 ± 7,1% соответственно) активности. Различия в уровнях адгезивной активности и свойствах персистенции у этих двух штаммов также имели место, однако не носили статистически значимого характера (рис. 2).

Коллекция из 50-ти клинических штаммов Klebsiella spp. протестирована на наличие у них ну-клеотидных последовательностей генов, ассоциированных с продукцией гемолизинов, адгезивной активностью, синтезом железорегулируемо-

го белка и капсулообразованием. Искомые генетические детерминанты патогенности были выявлены у 16 штаммов клебсиелл (32%), в том числе у K. pneumoniae - 11 штаммов (220%), K. oxytoca - 5 штаммов (10%).

Сравнение частоты встречаемости генетических маркеров патогенности у клинических штаммов доминирующих видов энтеробактерий, выделяемых при ОКИ, показало, что их распространенность среди Klebsiella spp., а также Citrobacter spp. и Enterobacter spp. оказалась примерно одинаковой (третья часть штаммов указанных видов). У Proteus spp. и M. morganii генетические детерминанты патогенности встречались значимо реже (P < 0,05).

У штаммов Klebsiella spp. был выявлен самый широкий (среди энтеробактерий исследованных видов) набор маркеров патогенности (hlyA, hlyB, sfaA, sfaG, fim A, irp-2) (рис. 3).

Как видно из представленного рисунка, у Klebsiella spp. наибольшая частота обнаружения была характерна для sfaG-гена, ответственного за адгезию S-типа (16%), и для hlyA-гена, ассоциируемого с продукцией гемолизинов (14%). При этом среди K. pneumoniae чаще обнаруживались генетические маркеры генов sfaG и hlyA, а среди K. oxytoca - hlyB-гена.

Нуклеотидных последовательностей генов, контролирующих капсулообразование (kpsMT), среди Klebsiella spp., так же как и среди УПМ других видов, выделенных от больных ОКИ, не обнаружено.

Клинические штаммы энтеробактерий, протестированные на наличие генетических маркеров патогенности (n = 175), были выделены при среднетяжелом (94,9%), легком (1,7%) и тяжелом (3,4%) течении острых кишечных инфекции. При этом штаммы, несущие данные детерминанты, выявлены только при среднетяжелых и тяжелых формах ОКИ. Следует отметить, что среди острых кишечных инфекций, обусловленных энте-

Рисунок 2.

Фенотипические проявления штаммов K. pneumoniae и K. oxytoca, выделенных из фекалий больных ОКИ

Рисунок 3.

Частота обнаружения фрагментов генов «островков» патогенности среди Klebsiella spp., выделенных от больных ОКИ

робактериями, несущими нуклеотидные последовательности генов «островов» патогенности (n = 41), тяжелое течение ОКИ встречалось значимо чаще (P < 0,05), чем среди инфекций, сопровождающихся выделением штаммов, не обладающих данными детерминантами (n = 134): 12,2 и 0,7% соответственно. При тяжелом течении ОКИ были выделены штаммы K. pneumoniae, S. оdorifera, C. koseri и E. intermedius. При этом штаммы K. pneumoniae, полученные от больных с тяжелым течением ОКИ, характеризовались наличием нуклеотидных последовательностей гена высокой патогенности (irp-2), а также генов, ответственных за продукцию гемолизинов (hlyA и hlyB); от больных со сред-нетяжелым течением ОКИ - маркеров генов sfaG, sfaA и fimA.

Выводы

1. В 2000 - 2010 годах отмечен статистически значимый (Р < 0,01) рост частоты встречаемости штаммов рода Klebsiella в составе микроорганизмов, выделяемых из фекалий детей, больных острыми кишечными инфекциями, находящихся на лечении в Иркутской областной инфекционной больнице.

2. Клебсиеллы характеризовались значительным потенциалом патогенности: около половины штаммов обладали гемолитической, адгезивной активностью, продуцировали ДНКа-зу, у 61,7 ± 2,9% отмечен персистентный потенциал.

3. У штаммов Klebsiella spp. обнаружены генетические детерминанты патогенности, ответственные за адгезивную активность S-типа (sfaA, sfaG), 1-го типа (fim A), продукцию гемолизинов (hlyB, hlyB) и синтез железорегулируемого белка (irp-2). Наибольшая частота встречаемости была характерна для гена sfaG. Среди энтеро-бактерий всех исследованных видов самый широкий набор маркеров патогенности отмечен у Klebsiella spp.

4. Штаммы Klebsiella spp., выделенные при тяжелом течении ОКИ, характеризовались наличием нуклеотидных последовательностей генов hlyA, hlyB, а также гена высокой патогенности - irp-2.

5. Клинические штаммы K. pneumoniae и K. oxytoca проявили неоднородность по фено- и генотипи-ческим признакам.

Литература

1. Бондаренко В.М. «Острова» патогенности бактерий // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2001. № 4. С. 67 - 74.

2. Бондаренко В.М., Фиалкина С.В., Лысенко Т.И. и др. Генетические детерминанты патогенности E. coli, изолированных из мочи и фекалий детей с различными клиническими вариантами инфекции мочевой системы // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2004. № 4. С. 3 - 7.

3. Бухарин О.В. Метод определения антилизоцимной активности микроорганизмов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1984. № 2. С. 27, 28.

4. Воротынцева Н.В., Мазанкова Л.Н. Острые кишечные инфекции у детей. - М.: Медицина, 2001. - 480 с.

Евтодиенко В.Г. Этиологический фактор при острых кишечных инфекциях: Матер. VIII Съезда ЭМИП. Т. 2. - М., 2002. С. 169. Савилов Е.Д., Мамонтова Л.М., Астафьев В.А. и др. Применение статистических методов в эпидемиологическом анализе. - М.: МЕДпресс-информ, 2004. - 112 с.

Фиалкина С.В. Генетические детерминанты патогенности клинических штаммов Klebsiella pneumoniae: Автореф. дис. ... к.б.н. - М., 2004. - 24 с.

Фролов В.М., Ющук Н.Д., Пересадин Н.А. Клинико-иммунологические особенности и лечение кишечной инфекции клебсиеллезной этиологии // Инфекционные болезни. 1994. С. 67 - 70. Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований: Учебное пособие / Под. ред. А.С. Лабинской, Л.П. Блинковой, А.С. Ещиной. - М.: Медицина, 2005. - 600 с.