СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ МЕЛИОИДОЗА И САПА МЕТОДОМ ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗА
METHOD OF IMMUNOELECTROPHORETIC DIFFERENTIATION OF MELIOIDOSIS AND FAP AGENTS

Изобретение относится к медицине и касается дифференциальной диагностики возбудителей особо опасных инфекций мелиоидоза (Burkholderia pseudomallei) и сапа (Burkholderia mallei).
Среди более 20 видов рода Burkholderia микроорганизмы В.pseudomallei и В.mallei имеют важное медицинское значение, так как являются возбудителями тяжелых заболеваний человека и животных - мелиоидоза и сапа. Эти бактерии относятся ко второй группе бактериологической опасности. Несмотря на различия в инфекционном процессе, вызванном этими микробами, по многим фенотипическим признакам, в том числе по антигенному составу, - это очень близкие микроорганизмы. Неоднократно высказывалось предложение считать возбудителя сапа биоваром возбудителя мелиоидоза. Поэтому эти бактерии диагностируются одинаково до установления факта, что исследуемый микроорганизм относится к группе pseudomallei (в неё входят возбудители сапа и мелиоидоза). Затем, для определения вида, применяют тесты, основанные на следующих фенотипических различиях B.pseudomallei и B.mallei: возбудитель сапа не способен расти на твердых питательных средах при температуре 42°С и при концентрации в питательной среде антибиотика гентамицина более 4 мкг/мл, B.pseudomallei при этих условиях растёт; возбудитель сапа неподвижен, так как не имеет жгутиков, возбудитель мелиоидоза подвижен, так как имеет на поверхности клетки жгутик (лофотрих). (Илюхин В.И., Поповцева Л.Д., Пивень Н.Н. Идентификация Pseudomonas pseudomallei // Лаб. дело. - 1983. - №7. - С.61-62).
В диагностике инфекций мелиоидоза и сапа применялись и применяются серологические реакции (агглютинация, реакция связывания комплемента, реакция непрямой гемагглютинации), с использованием иммунных сывороток к клеточным антигенам B.pseudomallei и B.mallei. При этом дифференцировать возбудители мелиоидоза и сапа не удалось. Использование иммунолюминесцентного метода на основе полученных моноклональных антител против клеточного антигена B.mallei позволило дифференцировать возбудителей мелиоидоза и сапа (Мелиоидоз // Сборник научных трудов под редакцией Н.Г.Тихонова./ Волгоград: Нижневолжское кн. изд-во, 1995 г. - 8-26 с.).
Наиболее близким аналогом предлагаемого способа является применение мелиоидозной антижгутиковой сывороткой в реакции агглютинации для дифференциации B.pseudomallei и B.mallei. Этот способ описан в ряде статей Алексеева В.В, Бондарева И.Н., Зыкина Л.Ф., которые были опубликованы в сборнике «Вопросы противоэпидемической защиты» (НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи. - 1977 г., вып.27. - С.54-71) под названием «Индикация возбудителя мелиоидоза на основе антител к жгутиковому антигену». Для постановки реакции агглютинации авторами была применена кроличья антисыворотка к жгутиковому антигену B.pseudomallei, который был получен с большими трудовыми затратами. Специфичность антижгутиковой сыворотки повышали адсорбцией высушенными клетками гомологичного штамма и B.mallei. Процесс производства диагностического препарата и сам способ при этом значительно усложняются. Однако описаны штаммы B.pseudomallei, не имеющие на поверхности клеток жгутиков. Вероятно дифференцирование безжгутиковых вариантов B.pseudomallei и штаммов B.mallei вышеописанной антижгутиковой сывороткой будет затруднено.
Целью изобретения является разработка способа дифференциации возбудителей мелиоидоза (B.pseudomallei) и сапа (B.mallei) на основе иммуноэлектрофореза их антигенов с иммунной кроличьей сывороткой к антигенам B.pseudomallei.
Поставленная цель достигается постановкой иммуноэлектрофореза с внеклеточными антигенами анализируемых штаммов B.pseudomallei и B.mallei и использованием в качестве иммунной сыворотки полученную кроличью антисыворотку против внеклеточных антигенов типичного штамма B.pseudomallei С141.
Для получения иммунной сыворотки используются внеклеточные (экстрацеллюлярные) антигены (ЭЦА), штамма B.pseudomalei С141, содержащие полный состав антигенов с молекулярными массами 18, 24, 28 и 34 кDа. ЭЦА выделяют из смыва бактериальной массы 0,9 М раствором NaCl, выращенной в течение 18 ч при 37°С после высева на F - агар "Difco", США, покрытый целлофаном, суточной культуры этого штамма. Смыв очищают от микробных клеток центрифугированием при 8000 g и фильтрацией через фильтр с размером пор 0,45 мкм. Стерилизацию ЭЦА проводят фильтрацией через фильтр с размером пор 0,22 мкм и заливкой охлажденным до -40°С ацетоном (до концентрации ацетона 75% от общего объёма). Ацетон из осажденных ЭЦА удаляют центрифугированием при 8000 g и высушиванием под тягой. Полученные внеклеточные антигены подвергают бактериологическому и биологическому контролю на стерильность. Сухие ЭЦА хранят в холодильнике и используют для иммунизации кроликов. Животных иммунизируют в два цикла, которые включают четырехкратное в течение месяца введение антигена, каждое из которых имеет в сумме 2 мл смеси, состоящей из 1 мл раствора ЭЦА (1 мг/мл) и 1 мл неполного адъюванта Фрейнда, и состоит из инъекций по 0,2 мл внутрикожно паравертебрально в 10 точек каждому животному с интервалами между введениями - 7 суток, между циклами - 30 суток. Кровь забирают из сердца при титре в реакции иммунодиффузии 1:32 и выше. В качестве антигенов анализируемого штамма используются ЭЦА, которые получают путем посева суточной культуры анализируемого штамма на агар (F - агар "Difco", США), покрытый целлофаном, выращивания в течение 18 ч при 37°С, смывания 0,9 М раствором NaCl бактериальной массы, удаления из смыва клеток центрифугированием при 8000 g и фильтрацией через фильтр с размером пор 0,45 мкм, осаждением из смыва с одновременной стерилизацией ЭЦА охлажденным до -40°С ацетоном (концентрация ацетона 75%), удаления ацетона центрифугированием при 8000 g в течение 25 мин. Полученные ЭЦА растворяют в 0,9 М растворе NaCl, добавляют мертиолят натрия в соотношении 1:10000 и используют для анализа. Иммуноэлектрофорез (ИЭФ) проводят в пластинах 1% агарозы с использованим веронал-мединалового буфера с pH 8,6. В лунки вносят внеклеточные антигены анализируемых штаммов B.mallei и B.pseudomallei. ИЭФ проводят с охлаждением пластин в течение 2,5 ч при напряжении 4 в/см. Затем в траншеи вносят антисыворотку против ЭЦА B.pseudomallei С141. Наличие линий преципитации в анодной и катодной областях геля указывает на наличие в геле антигенов возбудителей мелиоидоза. Отсутствие линий преципитации в аналогичных зонах геля указывает на внесение в лунку ЭЦА возбудителей сапа.
Примеры конкретного выполнения, подтверждающие осуществление предлагаемого способа.
Пример 1. Получение ЭЦА штамма B.pseudomallei С141
9
Для получения внеклеточных антигенов культуру B.pseudomallei С141 выращивают на твердой питательной среде (F - агар "Difco", США) при 37°С в течение 18 часов и приготавливают из неё взвесь 10 микробных клеток в 1 мл 0,9% раствора NaCl pH 7,2. F - агар "Difco", США стерильно заливают в стерилизатор, покрывают стерильным целлофаном и наносят на целлофан 8 мл ранее полученной взвеси бактерий B.pseudomallei С141. Стерилизатор помещают на 18 часов в термостат с температурой 37°С. Выросшую на целлофане бактериальную массу смывают 32 мл 0,9% раствора NaCl pH 7,2, осторожно перемешивают до получения гомогенной смеси и центрифугируют 25 мин при 8000 g. Затем супернатант отбирают и фильтруют через фильтр с размером пор 0,45 мкм для удаления оставшихся бактериальных клеток. Окончательную стерилизацию проводят на фильтре с размером пор 0,22 мкм и осаждением охлажденным до -40°С ацетоном при конечной концентрации растворителя 75%. Контроль стерильности проводят бактериологическим и биологическим методами. Осадок, представленный внеклеточными антигенами, освобождают от ацетона центрифугированием 25 мин при 8000 g и высушиванием под тягой. Высушенные фильтраты до применения хранят в холодильнике при +4°С.
Пример 2. Получение иммунной кроличьей сыворотки к внеклеточным антигенам штамма B.pseudomallei С141.
Для получения гипериммунной сыворотки используют кроликов массой 2-3 кг в возрасте до двух лет. Животных иммунизируют за два цикла введений ЭЦА. Для одного введения используют смесь 1 мл раствора внеклеточных антигенов B.pseudomallei С141 в 0,9% NaCl, рН 7,2 (концентрация - 1,0 мг/мл) и 1 мл неполного адъюванта Фрейнда ("Difco" США). Иммунизирующую смесь вводят путём инъекций паравертебрально внутрикожно в 10 точек по 0,2 мл. Интервалы между введениями составляют 7 суток, между циклами - 30 суток. Активность сывороток определяют после каждого цикла в РИД в геле с ЭЦА. Кровь забирают при титре сыворотки >=1:32. Для подавления роста микрофлоры в сыворотку добавляют мертиолят натрия в соотношении 1:10000 и ампулируют по 0,2-0,5 мл. Затем часть сыворотки сублимационно высушивают, часть хранят в холодильнике при +4°С.
Пример 3. Дифференциация B.pseudomallei и B.mallei в иммуноэлектрофорезе с использованием антисыворотки против ЭЦА штамма B.pseudomallei С141.
Иммуноэлектрофорез (ИЭФ) проводят на стеклянных пластинах размером 8×8 см, предварительно покрытых пленкой агарозы, что облегчает заливку геля 1% агарозы на веронал-мединаловом буфере. В лунки, вырезанные в геле, вносят антигены. В качестве основного буфера для электрофореза используют веронал-мединалового буфер pH 8,6 с ацетатом кальция. Стекла с гелем укладывают в прибор для электрофореза на охлаждаемый до 4°С столик, к краям геля прикладывают мостики из фильтровальной бумаги (6 слоев). Мостики обильно смачивают буфером. Электрофорез проводят при стабилизированном токе при градиенте напряжения в геле 4 В/см. Рядом с лункой вводят лидирующий свидетель (бромфеноловый синий). Электрофорез проводят до тех пор, пока свидетель не отходит на 2 см от центра стекла. После остановки электрофореза в агарозном геле вдоль направления электрофореза вырезают траншеи, в которые заливают цельные сыворотки. Через 12 часов стекла анализируют «под косым» светом. Наличие линий преципитации в анодной и катодной областях геля указывает на наличие в геле антигенов возбудителей мелиоидоза. Отсутствие аналогичных антигенов в аналогичных зонах геля указывает на факт внесения в лунку возбудителя сапа. Иммуноэлектрофореграммы представлены на фиг.1.
Пример 4. Характеристика внеклеточных антигенов штамма B.pseudomallei С141 методом электрофоретического анализа в ПААГ с ДСН.
Для анализа состава внеклеточных белков штамма B.pseudomallei С141 проводят разделение их на фракции электрофорезом в 10% ПААГ с ДСН по Laemmli (1970 г.) в пластинах размером 6x8 см, толщиной 0,75 мм, используя прибор для вертикального электрофореза. При подготовке проб сухие фильтраты растворяют в лизирующем растворе рН 6,8 (0,0625 М трисаминометан-Сl, 2% ДСН, 10% глицерин, 5% 2-меркаптоэтанол) в концентрации 8 мг/мл, кипятят 10 мин, центрифугируют 25 мин при 8000 g. Супернатант используют в опытах. В качестве эталонов молекулярной массы используют набор маркерных белков фирмы «Amersham», США (мол.м. от 14 до 94 KDa). Белки окрашивают кумасси G-250 и серебром (метод Oakley et al., 1980). Электрофореграммы фотографируют и денситометрируют. Анализ полученных электрофореграмм позволяет установить, что в составе белкового спектра внеклеточного фильтрата имеются 2 белковые фракции, окрашиваемые Кумасси G-250 с мол.м. 28 и 34 Ша. При применении метода окраски серебром выявляются две фракции с мол.м. 28 и 34 Ша, как и при окраске Кумасси G-250 и две дополнительные фракции с мол. м 18 и 24 Ша (фиг.2).
Таким образом, разработан способ дифференциации B.pseudomallei и В.mallei, возбудителей мелиоидоза и сапа, относящихся к особо опасным инфекциям, за счет применения в иммуноэлектрофорезе нового диагностического препарата - преципитирующей антисыворотки против внеклеточных антигенов B.pseudomallei С141 и применения в качестве анализируемых антигенов ЭЦА, который отличает простота исполнения, наглядность, отсутствие потребности в сложном оборудовании. Может применяться как дополнительное средство диагностики в комплексе мер по выявлению возбудителей мелиоидоза и сапа.
Полученная сыворотка дает более четкие линии преципитации только с возбудителем мелиоидоза как при электрофорезе, так и при реакции иммунодиффузии.