ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ И ДОСТУПНОСТИ ЦИКЛИЧЕСКОГО АДЕНОЗИНМОНОФОСФАТА В ОРГАНИЗМЕ И ЕЕ ПОЛУЧЕНИЕ
PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR CYCLIC ADENOSIN-PHONESPHATE CONTENT AND AVAILABILITY INCREASE IN ORGANISM AND ITS PRODUCTION

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, в частности к медицинскому препарату для перорального применения и продуктам здорового питания.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Эрл Уилбур Сазерленд младший, ученый, получивший в 1971 г. Нобелевскую премию в области физиологии и медицины, открыл механизм действия циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) в клетках. Эдмонд Г. Фишер и Эдвин Г. Кребс, ученые, получившие в 1992 г. Нобелевскую премию в области физиологии и медицины, также открыли механизм цАМФ→РКА (протеинкиназа А, цАМФ-зависимая протеинкиназа) в клетках. Эрик Кандел, ученый, получивший в 2000 г. Нобелевскую премию в области физиологии и медицины, также открыл механизм цАМФ→РКА→CREB (белок, связывающийся с реагирующим на цАМФ элементом) в клетках. Очевидно, что существует абсолютнаяи оченьважная взаимосвязь между относительными функциями цАМФ и человеческой физиологией и медициной. Например, с тех пор как Эрик Кандел открыл, что механизм образования кратковременной памяти и долговременной памяти зависит от сигнального пути цАМФ→РКА→CREB (путь сигнальной трансдукции вторичного мессенджера) в клетках, и получил Нобелевскую премию, ученые считают данные результаты ключевыми для разработки улучшающих память лекарственных средств. Ученые постоянно стремятся и пытаются разработать лекарственное средство для быстрой активации пути сигнальной трансдукции цАМФ→РКА→CREB в клетках мозга для улучшения памяти, улучшения способности к обучению, предотвращения и лечения нейродегенеративных заболеваний, таких как амнезия, деменция, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и т.п., а также для дополнительного предотвращения и лечения других заболеваний (таких как депрессия), связанных с низким содержанием цАМФ и низкой доступностью цАМФ в организмах. Однако несмотря на то что Эрл Уилбур Сазерленд младший получил Нобелевскую премию по физиологии и медицине более 30 лет назад, в продаже нет медицинского препарата, подходящего для долговременного применения у людей, с низкой вероятностью развития побочных эффектов и высокой эффективностью.
В современной технологии выведенные на рынок антидепрессантные лекарственные средства, например, селективные ингибиторы обратного захвата серотонина (SSEI), ингибиторы обратного захвата серотонина-норэпинефрина (SNRI) и ингибиторы обратного захвата норэпинефрина-дофамина (NDRI) и т.п., ингибируют обратный захват нейротрансмиттеров-первичных мессенджеров, таких как 5-гидрокситриптамин (5-НТ), норэпинефрин (NE), дофамин (DA) и т.п., у пациентов с депрессией, у которых концентрация нейротрансмиттера-первичного мессенджера ниже, чем у людей без депрессии. После того как концентрация нейротрансмиттера-первичного мессенджера и его комбинации с рецептором сместится к нормальным уровням, это может позволить сместить к нормальному уровень продукции трансмиттера-вторичного мессенджера для цАМФ в клетках пациента. Однако сильные побочные эффекты и низкая частота ремиссии делает антидепрессантные лекарственные средства нежелательными. Таким образом, не сообщалось о том, что здоровые люди длительное время принимали лекарственные средства для лечения депрессии с целью улучшения памяти.
Национальный институт психиатрии (NIMH) Национальных институтов здравоохранения (NIH) США потратил 35 миллионов долл. США и 6 лет на исследование частоты ремиссии (исследование STAR*D) при приеме 5 характерных типов антидепрессантных лекарственных средств SSRI (Celexa, Zoloft, Wellbutrin, Effexor и Buspar) более чем 2800 пациентами с депрессией. Отчет об исследовании показал, что частота ремиссии в случае каждого лекарственного средства составила лишь приблизительно 30%, и потребовалось в среднем 6-7 недель для ослабления симптомов депрессии. Более того, для выведенных на рынок антидепрессантных фармацевтических препаратов характерны разные уровни побочных эффектов, таких как повышение частоты суицидов, головная боль, головокружение, вертиго, бессонница, гиперсомния, шум в ушах, жажда, отвращение к пище, повышенный аппетит, повышенная масса тела, повышенное кровяное давление, расстройство желудка, отрыжка, тошнота, рвота, диспепсия, диарея, запор, боли в ногах, кожная сыпь, озноб, судороги, гипергидроз, отек, утрата либидо и импотенция и т.п. В последние годы такие антидепрессантные фармацевтические препараты, как Prozac, стали серьезной социальной проблемой. В 2004 г. Управление по контролю пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA) дополнительно указало, что фармацевтические компании должны изменить этикетки для продуктов так, чтобы в инструкциях для 32 основных антидепрессантных фармацевтических препаратов на рынке были четко указаны побочные эффекты и предупреждения, а также обратило внимание врачей и медсестер на то, что данные фармацевтические препараты могут повышать частоту суицидов среди детей и подростков.
На протяжении ряда лет ученые мировой фармацевтической промышленности постоянно стремятся разработать более безопасный и более эффективный фармацевтический препарат с низкой вероятностью развития побочных эффектов, который может действовать непосредственно на рецептор нейротрансмиттера-первичного мессенджера, для более быстрого повышения продукции и доступности внутриклеточных трансмиттеров-вторичных мессенджеров для цАМФ, позволяя предотвращать и лечить заболевания, связанные с низким уровнем внутриклеточного цАМФ. Rolipram, ингибитор фосфодиэстеразы 4 (PDE4), относится к типу лекарственных средств, действие которых опосредовано пострецепторным механизмом, и результаты экспериментов также указывают на то, что Rolipram обладает значительным антидепрессантным эффектом, поскольку цАМФ, генерируемый в клетках, расщепляется PDE4. Таким образом, при ингибировании PDE4 доступность цАМФ повышается. Однако введение Rolipram не широко распространено, поскольку Rolipram может вызывать побочные эффекты, такие как тяжелая рвота и т.п.
Автор изобретения разработал фармацевтическую композицию, которая получена с использованием в качестве сырьевых материалов трех природных растений - женьшеня, лакрицы и ююбы - для устранения недостатков предшествующего уровня техники. Фармацевтическая композиция не только повышает уровень цАМФ в клетках, но также ингибирует PDE4, снижая расщепление цАМФ, повышая доступность цАМФ и повышая концентрацию нейротрансмиттеров DA и NE в мозгу. Фармацевтическая композиция в высокой степени безопасна для долгосрочного применения. Она подходит для лечения пациентов с депрессией, которые должны принимать медицинский препарат в течение длительного времени, а также подходит для предотвращения и лечения заболеваний, связанных с низкими уровнями внутриклеточного цАМФ и дефицитом нейротрансмиттеров DA и NE. Однако эффективное количество компонентов, способных повышать генерацию и доступность цАМФ, в каждой партии природных растений может отличаться вследствие различных факторов, таких как период роста, место происхождения, время сбора урожая и условия хранения, климатические изменения, температура, дожди и воздействие солнца и т.п. Таким образом, чем лучше определены активные компоненты, тем большее число активных компонентов можно проконтролировать и ввести в состав, так чтобы эффективность и безопасность фармацевтической композиции сохраняли постоянство от партии к партии, позволяя улучшить контроль качества (т.е. химический состав, производство и контроль (СМС)) фармацевтической композиции. Более того, при более точном определении типов гинзенозидов среди активных компонентов диапазон приобретаемых сырьевых материалов можно расширить без снижения поставок. Иными словами, наряду с корнями, стеблями и листьями женьшеня можно использовать и данные части других растений (таких как Panax notoginseng и Panax quinquefolius), также содержащие различные типы гинзенозидов. Таким образом, автор изобретения постоянно стремится находить более точно определенные основные эффективные компоненты и их механизмы действия на основе результатов первоначальных исследований, чтобы стимулировать контроль качества (т.е. CMC) фармацевтической композиции и расширять список мест происхождения приобретаемых сырьевых материалов. Он успешно разработал фармацевтическую композицию, имеющую более четко определенные основные эффективные компоненты, содержащие гинзенозиды Rg1 и Rb1, глицирризиновую кислоту (или глицирретиновую кислоту) и цАМФ ююбы, причем фармацевтическая композиция представляет собой лекарственное средство, действие которого опосредовано пострецепторным механизмом, направленное на множество мишеней, причем гинзенозиды Rg1 и Rb1 являются основными активными компонентами, повышающими экспрессию мозгового нейротрофического фактора (BDNF).
Однако если наряду с гинзенозидами Rg1 и Rb1, содержащимися в корнях, стеблях и листьях растений (таких как женьшень, Panax notoginseng, Panax quinquefolius и т.п.), имеются другие типы гинзенозидов, позволяющие решить проблемы с поставкой/недостаточностью гинзенозидов Rg1 и Rb1 и обеспечением эффективности вышеописанной фармацевтической композиции, доступность основных активных компонентов в природных растениях можно дополнительно повысить, а затраты - снизить. Кроме того, вышеописанная фармацевтическая композиция включает кислоты, полученные из солодки, которые могут снижать рвотные симптомы, если у лица имеется склонность к рвоте при приеме лакрицы. Наличие данной проблемы подтверждали врачи традиционной китайской медицины с древних времен.
Таким образом, изобретение автора настоящего изобретения связано с устранением вышеописанных ограничений предшествующего уровня техники.
ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Для преодоления недостатков предшествующего уровня техники в настоящем изобретении описана фармацевтическая композиция, включающая в качестве основных активных компонентов гинзенозиды (Rg1, Rb1 и Re), глицирризиновую кислоту и цАМФ ююбы, предназначенная для быстрого повышения содержания и доступности цАМФ в организме. В частности, в настоящем изобретении описан фармацевтический препарат для перорального применения или продукт здорового питания, который может дополнительно повышать доступность основных активных компонентов в природных растениях, снижать затраты, усиливать путь сигнальной трансдукции цАМФ/PKA/CREB путем обеспечения стабильного качества таких продуктов и усиления экспрессии BDNF.
Схема фармацевтической композиции в настоящем изобретении представляет собой результат работы автора изобретения. Поскольку на предшествующем уровне техники было доказано, что гинзенозиды Rg1 и Rb1 могут повышать экспрессию BDNF в организме, гинзенозиды Rg1 и Rb1 можно использовать для разработки основных активных компонентов родственных фармацевтических препаратов. Однако гинзенозиды Rg1 и Rb1 на современном уровне технологии невозможно синтезировать искусственно, и, следовательно, их необходимо получать из корней, стеблей и листьев природных растений, таких как женьшень, Panax notoginseng, Panax quinquefolius и т.п. Так как существует более 30 типов гинзенозидов, для дополнительного повышения доступности основных активных компонентов в природных растениях и снижения затрат автор изобретения добавил в гинзенозиды Rg1 и Rb1 гинзенозид Re, а также добавил глицирризиновую кислоту (или глицирретиновую кислоту) и цАМФ ююбы с образованием основных активных компонентов для получения фармацевтической композиции. После проведения значительного числа экспериментов было доказано, что фармацевтическая композиция настоящего изобретения может повышать концентрацию цАМФ в гиппокампе, повышать активность РКА, стимулировать уровень фосфорилирования CREB и ингибировать активность PDE в гиппокампе у нормальных крыс через 8 часов после введения им фармацевтической композиции. В эксперименте с хроническим повторяющимся стрессом концентрация цАМФ, активность РКА, экспрессия фосфорилирования CREB и экспрессия BDNF у мышей, которым вводили фармацевтическую композицию, были значительно выше, чем у мышей в контрольной группе, которым не вводили фармацевтическую композицию, и экспрессия цАМФ и РКА в гиппокампе, BDNF в сыворотке и моноаминовые нейротрансмиттеры (например, 5-НТ, NE, DA и т.п.) в гипоталамусе мышей, которым вводили препарат, были значительно выше, чем у «контрольных» мышей. Таким образом, было доказано, что фармацевтическая композиция в настоящем изобретении может быстро повышать содержание и доступность цАМФв организме. Очевидно, что фармацевтическая композиция в настоящем изобретении демонстрирует высокую эффективность, повышает доступность основных активных компонентов природных растений и снижает затраты в сравнении с предшествующим уровнем техники, а также позволяет эффективно проводить контроль качества (т.е. СМС). Более того, фармацевтическая композиция в настоящем изобретении подходит для людей по всему миру, поскольку она с высокой степенью безопасна для долгосрочного применения, подходит для лечения пациентов с депрессией, нуждающихся в длительном введении, и позволяет предотвращать и лечить заболевания, связанные с низкой экспрессией цАМФ и BDNF, а также недостаточностью нейротрансмиттеров DA и NE в мозгу (например, нейродегенеративных заболеваний, таких как амнезия, деменция, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и т.п., и таких заболеваний, как псориаз, рак и т.п., при которых в организме и клетках пациентов наблюдается низкий уровень цАМФ). Однако поскольку фармацевтическая композиция включает кислоту, полученную из солодки, она может индуцировать рвотные симптомы, если пациент имеет склонность к рвоте при приеме лакрицы (наличие этой проблемы подтверждают врачи традиционной китайской медицины с древних времен). Тем не менее врачи традиционной китайской медицины также с древних времен подтверждают, что имбирь является прекрасным противорвотным продуктом питания. Таким образом, дополнительное добавление имбирного порошка или его экстракта к фармацевтической композиции настоящего изобретения устраняет недостатки предшествующего уровня техники.
В настоящем изобретении описана фармацевтическая композиция, которая быстро повышает содержание и доступность цАМФ в организме, причем ее получают с использованием сырьевых материалов, содержащих активные компоненты, включая гинзенозиды (Rg1, Rb1 и Re), глицирризиновую кислоту, цАМФ ююбы и т.п.
Фармацевтическая композиция, описанная в настоящем описании и формуле изобретения, способная быстро повысить содержание и доступность цАМФ в организме, представляет собой ключевое содержание настоящего изобретения. После публикации настоящего изобретения специалист в данной области может вносить изменения в вышеописанные лекарственные средства с использованием распространенных методик, и это является обычной технической деятельностью специалиста в данной области. Таким образом, любые замены подпадают в рамки объема, защищенного настоящим изобретением.
Вышеописанные цели и преимущества настоящего изобретения будут очевидны специалистам в данной области после изучения представленных ниже подробных описаний и приложенных чертежей.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На Фиг. 1 представлена блок-схема, на которой показан способ получения фармацевтической композиции в соответствии с первым предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения.
На Фиг. 2 представлена блок-схема, на которой показан способ получения фармацевтической композиции в соответствии со вторым предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения.
На Фиг. 3 представлена блок-схема, на которой показан способ получения фармацевтической композиции в соответствии с третьим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения.
На Фиг. 4 представлена блок-схема, на которой показан способ получения фармацевтической композиции в соответствии с четвертым предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения.
На Фиг. 5 представлена диаграмма, на которой показан уровень цАМФ в гиппокампе крыс через 8 часов после введения им фармацевтической композиции.
На Фиг. 6 представлена фотография гель-электрофореза, на которой показана активность цАМФ-зависимой РКА (дорожки слева направо: дорожки 1-4 - физиологический раствор, дорожки 5-8 - Пароксетин, дорожки 9-11 - вариант осуществления 1, дорожка 12 - положительный контроль, и дорожка 13 - отрицательный контроль).
На Фиг. 7 представлена диаграмма, на которой показана активность цАМФ-зависимой РКА в гиппокампе крыс через 8 часов после введения им фармацевтической композиции.
На Фиг. 8 представлена диаграмма, на которой показан уровень р-CREB в гиппокампе крыс через 8 часов после введения им фармацевтической композиции.
На Фиг. 9 показано воздействие варианта осуществления 1 на концентрацию цАМФ в гиппокампе мышей с повторяющимся стрессом.
На Фиг. 10 показано воздействие варианта осуществления 1 на активность РКА в гиппокампе мышей с хроническим стрессом.
На Фиг. 11 показано воздействие варианта осуществления 1 на фосфорилирование CREB в гиппокампе мышей с хроническим стрессом.
На Фиг. 12 показано воздействие варианта осуществления 1 на уровень BDNF в гиппокампе мышей с хроническим стрессом.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Здесь будет представлено конкретное описание настоящего изобретения со ссылкой на представленные ниже варианты осуществления. Следует отметить, что представленные ниже описания предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения даны в настоящем документе только для целей иллюстрации и описания. Они никоим образом не являются исчерпывающими или ограничивающими точной описанной формой.
Для достижения цели настоящего изобретения технические схемы настоящего изобретения конкретно описаны следующим образом.
В настоящем изобретении описана фармацевтическая композиция, которая быстро повышает содержание и доступность цАМФ в организме, причем ее получают с использованием основных активных компонентов, включающих гинзенозиды (Rg1, Rb1 и Re), глицирризиновую кислоту и циклический аденозинмонофосфат ююбы (цАМФ ююбы).
Пример 1
Фармацевтическую композицию для быстрого повышения содержания и доступности цАМФ в организме в настоящем изобретении получают с использованием фармацевтической композиции, включающей гинзенозиды (Rg1, Rb1 и Re), глицирризиновую кислоту или глицирретиновую кислоту и цАМФ ююбы.
Пример 2
Фармацевтическую композицию для быстрого повышения содержания и доступности цАМФ в организме в настоящем изобретении
получают с использованием фармацевтической композиции, включающей 2-26 весовых частей гинзенозидов (Rg1, Rb1 и Re), 3-48 весовых частей глицирризиновой кислоты или глицирретиновой кислоты и 0,002-0,5 весовой части цАМФ ююбы.
Пример 3
Фармацевтическую композицию в настоящем изобретении получают с использованием фармацевтической композиции, включающей 4-13 весовых частей гинзенозидов (Rg1, Rb1 и Re), 5-16 весовых частей глицирризиновой кислоты или глицирретиновой кислоты и 0,01-0,1 весовой части цАМФ ююбы.
Пример 4
Фармацевтическая композиция в настоящем изобретении дополнительно включает водный экстракт имбиря.
Пример 5
Фармацевтическая композиция в настоящем изобретении может включать фармакологически приемлемые носители или добавки, а также может производиться в фармацевтической дозированной форме для перорального применения, известной в фармацевтической отрасли, такой как таблетка, капсула, порошок и т.п.
Пример 6
Фармацевтическую композицию в настоящем изобретении можно производить в виде фармацевтического препарата, продукта здорового питания или пищевой добавки для быстрого повышения содержания и доступности цАМФ в организме.
Для достижения целей настоящего изобретения способы получения фармацевтической композиции описаны следующим образом.
Способ 1
Экстракты, содержащие гинзенозиды (Rg1, Rb1 и Re), глицирризиновую кислоту (или глицирретиновую кислоту) и цАМФ ююбы соответственно, экстрагированные из женьшеня, лакрицы и ююбы, служат в качестве сырьевых материалов для производства фармацевтической композиции для быстрого повышения содержания и доступности цАМФ в организме в соответствии с настоящим изобретением. Альтернативно фармацевтическую композицию настоящего изобретения получают из подготовленных сырьевых материалов, содержащих гинзенозиды (Rg1, Rb1 и Re), глицирризиновую кислоту (или глицирретиновую кислоту) и цАМФ ююбы.
Способ 2
Фармацевтическую композицию в настоящем изобретении производят с использованием сырьевых материалов, включающих 2-26 весовых частей гинзенозидов (Rg1, Rb1 и Re), 3-48 весовых частей глицирризиновой кислоты (или глицирретиновой кислоты) и 0,002-0,5 весовой части цАМФ ююбы.
Способ 3
Фармацевтическую композицию в настоящем изобретении производят с использованием сырьевых материалов, включающих 4-13 весовых частей гинзенозидов (Rg1, Rb1 и Re), 5-16 весовых частей глицирризиновой кислоты (или глицирретиновой кислоты) и 0,01-0,1 весовой части цАМФ ююбы.
Способ 4
Фармацевтическая композиция в настоящем изобретении дополнительно включает водный экстракт имбиря.Способ 5
Фармацевтическая композиция в настоящем изобретении может включать фармакологически приемлемые носители или добавки, а также может производиться в фармацевтической дозированной форме для перорального применения, известной в фармацевтической отрасли, такой как таблетка, капсула, порошок и т.п.
Способ 6
Продукт здорового питания или пищевую добавку для быстрого повышения содержания и доступности цАМФ в организме в соответствии с настоящим изобретением производят с использованием сырьевых материалов в соответствии со стандартами управления пищевыми продуктами или стандартами изготовления/производства продуктов здорового питания.
ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано, как представлено ниже, путем комбинирования фигур с предпочтительными вариантами осуществления.
Вариант осуществления 1
На Фиг. 1, которая представляет собой блок-схему, показан способ получения фармацевтической композиции в соответствии с первым предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения. На Фиг. 1 40 кг женьшеня измельчают, а затем экстрагируют при нагревании с использованием 70% раствора этанола. Спиртовой экстракт разделяют, очищают с использованием колоночной хроматографии и высушивают с получением 1,42 кг экстракта женьшеня, содержащего 270 г гинзенозида
176,9 г Rb1 и приблизительно 44,7 г Re) (стадия 101). Более того, 15 кг лакрицы измельчают и затем вымачивают при комнатной температуре в течение 12 часов. Вымоченную лакрицу подвергают экстракции, используя вываривание и осаждение спиртом, концентрируют и высушивают, получая 3,1 кг экстракта лакрицы, содержащего 307 г глицирризиновой кислоты (стадия 102). Кроме того, 10 кг ююбы измельчают, а затем вымачивают в воде при комнатной температуре, после чего вымоченную ююбу подвергают экстракции, используя вываривание и осаждение спиртом, с получением экстракта ююбы, который дополнительно подвергают абсорбции и разделению, последовательно используя макропористые смолы OU-2 и МЕ-2, и высушивают. Получают экстракт ююбы (40 г), содержащий 0,752 г цАМФ ююбы, который служит сырьевым материалом для получения фармацевтической композиции настоящего изобретения (стадия 103). После этого 144 г экстракта женьшеня, 300 г экстракта лакрицы и 3,6 г экстракта ююбы, полученные вышеописанным способом, распыляют и смешивают, получая 447,6 г фармацевтической композиции (содержащей 27,4 г гинзенозида Rg1+Rb1+Re, 29,7 г глицирризиновой кислоты и 0,067 г цАМФ ююбы) в примере 1 в настоящем изобретении (стадия 104).
Вариант осуществления 2
На Фиг. 2, которая представляет собой блок-схему, показан способ получения фармацевтической композиции в соответствии со вторым предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения. Как показано на Фиг. 2, 120 г экстракта женьшеня (стадия 201), 200 г экстракта лакрицы (стадия 202) и 0,5 г экстракта ююбы (стадия 203),
полученных в варианте осуществления 1, распыляют и смешивают с получением 320,5 г фармацевтической композиции (содержащей 22,8 г гинзенозида Rg1+Rb1+Re, 19,8 г глицирризиновой кислоты и 0,009 г цАМФ ююбы) примера 2 в настоящем изобретении (стадия 204).
Вариант осуществления 3
На Фиг. 3, которая представляет собой блок-схему, показан способ получения фармацевтической композиции в соответствии с третьим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения. Как показано на Фиг. 3, 3,6 г полученного гинзенозида Rg1 с чистотой 90% (стадия 301), 3,2 г полученного гинзенозида Re с чистотой 90% (стадия 302), 15,6 г полученного гинзенозида Rb1 с чистотой 90% (стадия 303), 26 г глицирретиновой кислоты с чистотой 96% (стадия 304) и 10 г экстракта ююбы, полученных в варианте осуществления 1 (стадия 305), распыляют и смешивают с получением 58,4 г фармацевтической композиции (содержащей 22,4 г гинзенозида Rg1+Rb1+Re, 26 г глицирретиновой кислоты и 0,188 г цАМФ ююбы) примера 3 в настоящем изобретении (стадия 306).
Вариант осуществления 4
На Фиг. 4, которая представляет собой блок-схему, показан способ получения фармацевтической композиции в соответствии с четвертым предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения. Как показано на Фиг. 4, 100 г фармацевтической композиции примера 1 в настоящем изобретении, полученной в варианте осуществления 1 (стадия 401), и 35 г доступного в продаже экстракта имбиря (стадия 402) смешивают с получением 135 г фармацевтической композиции примера 4 в настоящем изобретении (стадия 403).
Эксперимент 1. Эксперимент на животных по оценке влияния на путь сигнальной трансдукции цАМФ/PKA/CREB через 8 часов после введения нормальным крысам фармацевтической композиции варианта осуществления 1.
Через 8 часов после внутрижелудочного введения крысам фармацевтического препарата варианта осуществления 1 извлекали их гиппокампы. Изменения уровней цАМФ и фосфо-CREB (p-CREB) в гиппокампе определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), изменения активности цАМФ-зависимой РКА определяли с помощью биолюминесцентного анализа, а изменения активности PDE определяли с помощью флуоресцентного способа. Через 8 часов после введения фармацевтической композиции варианта осуществления 1 проявляется молекулярный фармакологический механизм, причем концентрация цАМФ повышается в течение краткого периода времени, таким образом усиливая активность цАМФ-зависимой РКА, стимулируется уровень фосфорилирования CREB, а также ингибируется активность PDE в гиппокампе. Экспериментальные данные статистически анализировали и строили графики с использованием программного обеспечения Origin Pro 7.5.
1. Материалы для эксперимента
1.1 Экспериментальные животные: 70 (семьдесят) здоровых самцов крыс линии SD с массой тела 180-200 г приобретали в компании Vital River Laboratories (VRL), г. Пекин.
2
4
2
4
2
4
2
4
1.2 Реагенты: лекарственное средство для положительного контроля - антидепрессант пароксетина гидрохлорид (№партии: 08030078, Zhong Mei Tianjin Smith Kline pharmaceuticals Co. Ltd.); набор Parameter™ Cyclic AMP Assay Kit, KGE002 (R&D Systems, Inc., США); набор ELISA DuoSet 1С Human/Mouse/Rat Phospho-CREB (S133), DYC2510-2 (R&D Systems, Inc., CIF); набор PepTag Assay for Non-Radioactive Detection of cAMP-Dependent Protein Kinase Kit, V5340 (Promega Corporation, США); набор PDE-Glo™ Phosphodiesterase Assay Kit, VI361 (Promega Corporation, США); набор Pierce™ BCA Protein Assay Kit, 23227 (Pierce Biotechnology, США); стандарты, такие как цАМФ и аденозин, были приобретены в Национальном институте по проблемам управления продуктами и лекарствами, Китай; химические реактивы, такие как NaHPO, NaHPO, KHPO, КС1, NaCl, MgCl, Tris-основание, Tris-HCl и т.п., представляли собой биохимические реагенты для клеточных культур, приобретенные в компании Sigma, США; реагенты, такие как Е-64, апротинин, леупептин, пепстатин А, фенилметилсульфонилфторид (PMSF), NaF, этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), этиленгликольтетрауксусная кислота (EGTA), дитиотреитол (DTT), NaVO, пирофосфат натрия, агароза, глицерин ит.п., относились к классу высокочистых и были приобретены в компании BioBasic Inc., Канада; ацетонитрил и метанол (для ВЭЖХ, Merck & Co., Inc., Германия); сверхчистая вода (чистая вода Milli-Q); и фармацевтическая композиция варианта осуществления 1.
1.3 Оборудование для эксперимента: FlexStation 3, многорежимный считыватель для микропланшет (Molecular Devices Corp., США); Waters 600Е, оборудование для высокоэффективной жидкостной хроматографии (включая насос для четырехкомпонентных смесей, встроенный в линию дегазатор, автоматический пробоотборник, термостат для колонок и УФ-детектор; Waters Corp., США); центрифуга с охлаждением (Backmen Coulter, Inc., США); электронный ультразвуковой гомогенизатор (Ultrasound Technology Inc., США);прибор для электрофореза (Beijing Liuyi Instrument Factory, Китай); устройство для визуализации гелей (SYN GENE); низкотемпературный морозильник (SANYO Electric Co., Ltd., Япония); и одноканальная и 8-канальная пипетки mLine (Biohit, Финляндия).
2. Введение: адаптивное кормление через трое суток; крыс случайным образом делили на три группы и маркировали следующим образом: группа А - физиологический раствор, группа В - Пароксетин и группа С - вариант осуществления 1. Таблетки пароксетина гидрохлорида измельчали, готовили суспензию с конкретной концентрацией с использованием сверхчистой воды и вводили крысам внутрижелудочно в дозе 5 мг/кг. Фармацевтическую композицию варианта осуществления 1 готовили в виде раствора с конкретной концентрацией с использованием сверхчистой воды и вводили внутрижелудочно крысам в дозе 50 мг/кг. Крысам из группы, получающей физиологический раствор, вводили эквивалентный объем 0,9% физиологического раствора. Всех крыс взвешивали и маркировали пикриновой кислотой перед введением, и все лекарственные средства вводили после предварительного нагрева до 37°C в течение 30 минут.
3. Сбор тканей: через 8 часов после введения препаратов экспериментальным животным из групп А, В и С крыс анестезировали этиловым эфиром и умерщвляли путем вскрытия бедренных артерий. Мозги извлекали из головы и помещали на лед, отбирали гиппокамп и осторожно разделяли на три части. Каждую часть помещали в предварительно маркированную криопробирку 1,5-мл с цветной завинчивающейся крышкой, точно взвешивали, быстро замораживали в жидком азоте в течение 15 минут и затем помещали в холодильник при -80°C для дальнейшего использования.
4. Анализ образцов
4.1 Определение уровня цАМФ в гиппокампе крысы Образец ткани гиппокампа размораживали и промывали небольшим количеством физиологического раствора и затем добавляли лизирующий клетки раствор (концентрированный раствор разводили для использования в 5 раз), входящий в набор, в соотношении 1:20 (вес : объем (г : мл)). Образец гомогенизировали в электронном ультразвуковом гомогенизаторе в течение 30 секунд, центрифугировали при 10000 об/мин в течение 5 минут при 4°C. Супернатант помещали в цветную предварительно маркированную пробирку Eppendorf 1,5-мл и хранили в коробке со льдом для тестирования. Анализ образца проводили с использованием набора Parameter™ Cyclic AMP Assay ELISA (R&D Systems, Inc, CILIA). Образец размораживали до комнатной температуры и определяли уровень цАМФ в образце с использованием конкурентного анализа ELISA. Значение оптической плотности (OD) образца определяли при 450 нм с использованием многорежимного считывателя для микропланшет, а уровень цАМФ в образце рассчитывали по стандартной кривой.
4.2 Определение активности цАМФ-зависимой РКА в гиппокампе крысы Образец ткани гиппокампа размораживали и промывали небольшим количеством физиологического раствора, а затем добавляли буфер для экстракции РКА (полученный в соответствии с составом в руководстве производителя) в соотношении 1:10 (вес : объем (г : мл)). Образец гомогенизировали в электронном ультразвуковом гомогенизаторе в течение 30 секунд, центрифугировали при 10000 об/мин в течение 5 минут при 4°C. Супернатант переносили в цветную предварительно маркированную пробирку Eppendorf 1,5-мл и хранили в коробке со льдом для тестирования. Образец анализировали с помощью набора PepTag Assay for Non-Radioactive Detection of cAMP-Dependent Protein KinaseKit (Promega Corporation, США). В соответствии с руководством пользователя в наборе предварительно смешанный реактив добавляли в 8 предварительно маркированных пробирок для ПЦР 200-мкл, и в соответствующую пробирку добавляли по 9 мкл каждого образца. Пробирки перемешивали на вортексе, центрифугировали и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 30 минут, а затем помещали в прибор для ПЦР для инактивации фермента при 98°C в течение 5 минут. Определение положительного контроля и отрицательного контроля выполняли вместе с тестируемыми образцами в соответствии с руководством пользователя. Получали 0,8% агарозный гель и в лунки агарозного геля помещали по 10 мкл каждого образца после ферментативной денатурации. Электрофорез проводили при 100 В и 130 мА в течение 30 минут. Буфер для электрофореза представлял собой 50 мМ буфер Tris-HCl (рН 8,0). После электрофореза агарозный гель извлекали из прибора и фотографировали с помощью устройства для визуализации гелей. Агарозный гель помещали в УФ-анализатор, вырезали пятна, соответствующие фосфорилированному пептиду PepTag A1, и помещали в предварительно маркированную криопробирку 1,5-млс цветной завинчивающейся крышкой. Агарозный гель нагревали до плавления и добавляли чистую воду до объема 250 мкл. Горячую агарозу объемом 125 мкл быстро переносили в другую предварительно маркированную пробирку Eppendorf 1,5-мл и добавляли 75 мкл солюбилизирующего гель раствора и 50 мкл ледяной уксусной кислоты. Смесь интенсивно перемешивали и 200 мкл смеси добавляли в 96-луночный планшет для микротитрования. Агароза в направлении положительного электрода в отрицательном контроле была пустым образцом. Флуоресцентный анализ проводили на многорежимном считывателе для микропланшет при длине волны возбуждающего излучения 586 нм и длине волны испускаемого излучения 592 нм. Интенсивность флуоресценции образца указывает на активность РКА.
4.3 Определение уровня p-CREB в гиппокампе крысы Анализ образцов проводили с помощью набора DuoSet IС Human/Mouse/Rat Phospho-CREB (SI 33) ELISA Kit (R&D Systems, Inc, США). Образец ткани гиппокампа размораживали и промывали небольшим количеством физиологического раствора, а затем добавляли раствор для гомогенизации ткани (полученный в соответствии с инструкцией для IС Diluent №6 в руководстве производителя) в соотношении 1:20 (вес : объем (г : мл)). Смесь гомогенизировали в электронном ультразвуковом гомогенизаторе в течение 30 секунд, центрифугировали при 10000 об/мин в течение 5 минут при 4°C, супернатант переносили в цветную предварительно маркированную пробирку Eppendorf 1,5-мл и хранили в коробке со льдом для тестирования. Уровень p-CREB в образце определяли с помощью сэндвич-ELISA в соответствии с руководством пользователя в наборе. Значение OD образца определяли при 450 нм с использованием многорежимного считывателя для микропланшет, а уровень p-CREB в образце вычисляли по стандартной кривой.
4.4 Определение общего белка в гиппокампе крысы Для более точного вычисления количества р-СКЕВ на миллиграмм белка в образце важно определить количество общего белка в образце. Супернатант, полученный после гомогенизации и центрифугирования ткани во время эксперимента с определением p-CREB, разводили PBS в 25 раз, формируя тестируемые образцы. В соответствии с руководством пользователя в наборе Pierce™ ВСА Protein Assay Kit значение OD образца определяли при 450 нм с использованием многорежимного считывателя для микропланшет и использовали бычий сывороточный альбумин (BSA) в качестве стандарта. Количество общего белка в образце определяли по стандартной кривой.
4.5 Определение активности PDE Влияние фармацевтической композиции варианта осуществления 1 на активность PDE в гиппокампе крысы определяли с помощью биолюминесцентного анализа с использованием набора PDE-Glo™ Phosphodiesterase Assay Kit (Promega Corporation, США).
4.5.1 Получение раствора для медицинского применения Готовили фармацевтическую композицию варианта осуществления 1 с концентрациями 0,02 мг/мл, 0,05 мг/мл и 1,0 мг/мл.
2
4.5.2 Получение образца после промывки конкретного количества ткани гиппокампа небольшим количеством физиологического раствора добавляли реакционный буфер PDE-Glo™ Reaction Buffer (Tris-HC1 40 мМ, MgCl 10 мМ бычьего сывороточного альбумина (BSA) 0,1 мг/мл с добавлением PMSF 1 мМ, леупептина 2 мкМ/мл, апротинина 2 мкМ/мл и Е-64 2 мкМ/мл) в соотношении 1:10 (вес : объем (г : мл)). Смесь гомогенизировали в электронном ультразвуковом гомогенизаторе и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 5 минут при 4°C, и супернатант использовали в качестве ферментного раствора.
4.5.3 Протокол биолюминесцентного анализа выполняли по способу, предложенному в руководстве пользователя. Для получения раствора для ферментативной реакции 1 мкл раствора для медицинского применения добавляли к 1,5 мкл ферментного раствора с получением общего объема 2,5 мкл. Раствор субстрата 2,5 мкл, содержащий 2 мкмоль цАМФ, добавляли к 2,5 мкл смеси, реакционную смесь перемешивали и проводили реакцию при 37°C в течение 30 минут. Затем добавляли 2,5 мкл стоп-раствора, содержащего 3-изобутил-1-метилксантин (IBMX) (сильный ингибитор PDE), и перемешивали. Добавляли 2,5 мкл тестируемого раствора и перемешивали. Взаимодействие реакционной смеси осуществляли при комнатной температуре в течение 20 минут. И, наконец, к реакционной смеси добавляли 10 мкл люминесцентного реагента, а взаимодействие осуществляли при комнатной температуре в течение 10 минут. Биолюминесценцию определяли с помощью многорежимного считывателя для микропланшет.
5. Результаты эксперимента
5.1 Уровень цАМФ в гиппокампе крыс Концентрацию цАМФ в гомогенате гиппокампа крысы определяли с помощью ELISA. Уровень цАМФ, содержащегося в ткани гиппокампа, получали путем деления веса проанализированного образца ткани на концентрацию цАМФ, и результаты представляли в пмоль/г ткани (как показано на Фиг. 5).
*
См. Фиг. 5. Уровень цАМФ в ткани гиппокампа крыс в группе варианта осуществления 1 был значительно повышен в сравнении с группой, получавшей физиологический раствор, и группой, получавшей Пароксетин (P<0,05, n=10).
5.2 Активность цАМФ-зависимой РКА в гиппокампе крыс после ферментативной реакции образцы анализировали с помощью электрофореза в агарозномгеле, проявляли на приборе для визуализации гелей и приблизительно анализировали.
Как показано на Фиг. 6, фосфорилированный пептид A1 имеет отрицательный заряд и движется к положительному электроду, тогда как нефосфорилированный пептид A1 имеет положительный заряд и движется к отрицательному электроду. Данные два пептида отделяли друг от друга. Повышение яркости пятна фосфорилированного пептида A1 (перемещающегося к положительному электроду) указывает на то, что в образце уровень фосфорилирования и активности цАМФ-зависимой РКА выше. Как показано на Фиг. 6, яркость пятна в группе варианта осуществления 1 выше, чем в группе, получавшей физиологический раствор, и в группе, получавшей Пароксетин.
Пятна на агарозном геле вырезали, расплавляли и определяли объем расплавленного геля. Активность цАМФ-зависимой РКА в гиппокампе крысы определяли при помощи флуоресцентного анализа и представляли в виде интенсивности флуоресценции (как показано на Фиг. 7).
*
См. Фиг. 7. Через 8 часов после введения активность цАМФ-зависимой РКА в гиппокампе крысы из группы варианта осуществления 1 была значительно выше в сравнении с группой, получавшей пустой образец, и группой, получавшей Пароксетин (P<0,05, n=10).
5.3 Уровень p-CREB в гиппокампе крысы Концентрацию общего белка в образце гомогената гиппокампа крысы определяли по способу ВСА, чтобы оценить количество р-CREB на мкг общего белка. Затем определяли концентрацию p-CREB в образце гомогената гиппокампа крысы анализом сэндвич-ELISA, и значение p-CREB (пг)/общий белок (мкг) отражало уровень p-CREB в гиппокампе крысы (данные показаны на Фиг. 8).
См. Фиг. 8. Через 8 часов после введения уровень p-CREB в гиппокампе крысы в группе варианта осуществления 1 была значительно выше в сравнении с группой, получавшей физиологический раствор, и группой, получавшей Пароксетин (n=10).
*
5.4 Влияние фармацевтической композиции на активность PDE в гиппокампе крысы Активность PDE в гиппокампе крысы и ингибирование активности PDE in vitro после введения определяли с помощью биолюминесцентного анализа. Активность PDE определяли по интенсивности свечения. Более высокая в сравнении с контрольной группой интенсивность свечения указывает на более высокую активность PDE, а более низкая интенсивность свечения указывает на ингибирование активности PDE. Результаты измерений показывают, что фармацевтическая композиция (0,5 мг/мл) в группе варианта осуществления 1 значительно ингибировала активность PDE в гиппокампе крысы в сравнении с контрольной группой, получавшей пустой образец (P<0,05, n=4).
6. Вывод
(1) Через 8 часов после внутрижелудочного введения в группе крыс, получавших вариант осуществления 1, уровень цАМФ в гиппокампе был значительно выше в сравнении с группой, получавшей физиологический раствор, и группой, получавшей Пароксетин, активность цАМФ-зависимой РКА была значительно повышена, и уровень p-CREB также был повышен.
*
(2) Эксперименты демонстрируют, что фармацевтическая композиция варианта осуществления 1 может осуществлять свои фармакологические функции через сигнальный путь вторичного мессенджера цАМФ и может быстро инициировать путь цАМФ-PKA-CREB (p-CREB) через 8 часов после введения (со статистически значимым отличием (P<0,05) от группы, получавшей физиологический раствор, и группы, получавшей Пароксетин).
(3) Через 8 часов после введения Пароксетин - лекарственное средство, являющееся положительным контролем, не мог инициировать сигнальный путь цАМФ-PKA-CREB (p-CREB).
(4) Результат эксперимента также указывает на то, что активность PDE может значительно ингибироваться при введении средней дозы фармацевтической композиции в варианте осуществления 1. Поскольку PDE представляет собой фермент, инактивирующий цАМФ, ингибирование PDE может приводить к повышению уровня цАМФ в гиппокампе крысы.
Эксперимент 2. Эксперимент на животных по оценке влияния на путь сигнальной трансдукции цАМФ/PKA/CREB и экспрессию BDNF после введения фармацевтической композиции варианта осуществления 1 мышам с хроническим стрессом в течение 10 суток.
1. Влияние фармацевтической композиции варианта осуществления 1 на концентрацию цАМФ в гиппокампе мышей с повторяющимся стрессом (см. Фиг. 9).
*
Результаты, представленные на Фиг. 9, показывают, что концентрация цАМФ в гиппокампе мышей, которым вводили фармацевтическую композицию варианта осуществления 1, значительно выше, чем у мышей в контрольной группе, которым композицию не вводили (P<0,05).
2. Влияние фармацевтической композиции варианта осуществления 1 на активность РКА в гиппокампе мышей с повторяющимся стрессом (см. Фиг. 10).
*
Результаты, представленные на Фиг. 10, показывают, что активность РКА в гиппокампе мышей, которым вводили фармацевтическую композицию варианта осуществления 1, значительно выше, чем у мышей в контрольной группе, которым композицию не вводили (P<0,05).
3. Влияние фармацевтической композиции варианта осуществления 1 на фосфорилирование CREB в гиппокампе мышей с повторяющимся стрессом (см. Фиг. 11)
Результаты, представленные на Фиг. 11, показывают, что фосфорилирование CREB в гиппокампе мышей, которым вводили фармацевтическую композицию варианта осуществления 1, значительно выше, чем у мышей в контрольной группе, которым композицию не вводили.
4. Влияние фармацевтической композиции варианта осуществления 1 на экспрессию BDNF в гиппокампе мышей с повторяющимся стрессом (см. Фиг. 12)
Результаты, представленные на Фиг. 12, показывают, что экспрессия BDNF в гиппокампе мышей, которым вводили фармацевтическую композицию варианта осуществления 1, значительно выше, чем у мышей в контрольной группе, которым композицию не вводили.
Эксперимент 3. Эксперимент на животных по оценке влияния на экспрессию цАМФ и РКА в гиппокампе, BDNF в сыворотке и NE, DA и 5НТ в гипоталамусе после введения фармацевтической композиции варианта осуществления 1 в течение 21 суток крысам с хроническим стрессом.
1. Влияние фармацевтической композиции варианта осуществления 1 на концентрацию цАМФ в гиппокампе и коре крыс с хроническим стрессом (см. таблицу 1).
2. Воздействие фармацевтической композиции варианта осуществления 1 на уровень РКА в гиппокампе крыс с хроническим стрессом (см. таблицу 2).
3. Воздействие фармацевтической композиции варианта осуществления 1 на уровень BDNF в сыворотке крыс с хроническимстрессом (см. таблицу 3).
4. Воздействие фармацевтической композиции варианта осуществления 1 на экспрессию моноаминовых нейротрансмиттеров в гипоталамусе крыс с хроническим стрессом (см. таблицу 4).
5. Вывод
*
Экспрессия цАМФ и РКА в гиппокампе, BDNF в сыворотке и моноаминовых нейротрансмиттеров (5-НТ, NE и DA) в гипоталамусе крыс, которым вводили фармацевтическую композицию варианта осуществления 1, значительно превышает экспрессию в контрольной группе, в которой не вводили композицию (P<0,05).
Эксперимент 4. Эксперимент на животных для оценки антидепрессантной фармакодинамики варианта осуществления 1
1. Поведенческий эксперимент на животных
Автор изобретения провел поведенческие эксперименты на животных, включая эксперимент с подвешиванием за хвост на мышах, эксперимент с принудительным плаванием на крысах, эксперимент с принудительным плаванием на мышах, эксперимент с длительной непредсказуемой стимуляцией на крысах, эксперимент с удалением обонятельных луковиц на крысах и других животных, в соответствии с патогенетическим механизмом и клиническими симптомами депрессии.
1.1 Фармацевтическую композицию варианта осуществления 1 вводили мышам внутрижелудочно в дозе 20 мг/кг/сутки, 40 мг/кг/сутки и 80 мг/кг/сутки (крысам - в дозе 15 мг/кг/сутки, 30 мг/кг/сутки и 60 мг/кг/сутки) в течение одной недели для определения воздействия на экспериментальную депрессию, причем в группе средней дозы (40 мг/кг/сутки у мышей и 30 мг/кг/сутки у крыс), а также в группе положительного контроля (Пароксетин) наблюдали значительное снижение времени неподвижности в экспериментах с подвешиванием за хвост на мышах, с принудительным плаванием на мышах и с принудительным плаванием на крысах. Данные показывают статистически значимое отличие в сравнении с контрольной группой (P<0,05).
1.2 Фармацевтическую композицию варианта осуществления 1 вводили внутрижелудочно крысам в модели с хроническим непредсказуемым умеренным стрессом (CUMS) в дозе 15 мг/кг/сутки, 30 мг/кг/сутки и 60 мг/кг/сутки в течение 21 последовательных суток. Результаты показывают, что в сравнении с нормальной группой крысы в модели CMUS набирали массу тела медленно, потребление сахарозы значительно снижалось (P<0,01), горизонтальные движения и вертикальные движения значительно уменьшались (P<0,01), а число ошибок в испытаниях с прыжками на крысах значительно повышалось (P<0,01). В сравнении с контрольной группой прибавка массы тела в группе низкой дозы варианта осуществления 1 и в группе положительного контроля (Пароксетин) значительно повышалась, потребление сахарозы в обеих группах значительно возрастало (P<0,01), горизонтальные движения и вертикальные движения в обеих группах значительно увеличивались (P<0,01), а число ошибок в испытании с прыжками на крысах значительно снижалось (P<0,01 в группе низкой дозы и P<0,01 в группе положительного контроля (Пароксетин)).
1.3 Фармацевтическую композицию варианта осуществления 1 вводили внутрижелудочно крысам в модели с удалением обонятельных луковиц в дозе 15 мг/кг/сутки, 30 мг/кг/сутки и 60 мг/кг/сутки в течение 24 последовательных суток. В тесте «открытого поля» высокая доза варианта осуществления 1 в сравнении с контрольной группой значительно улучшала уменьшение горизонтальных движений и вертикальных движений, вызванное удалением обонятельных луковиц. Положительный контроль (Пароксетин 3 мг/кг/сутки) также значительно улучшал уменьшение горизонтальных движений и вертикальных движений, вызванное удалением обонятельных луковиц. В эксперименте с пассивным избеганием высокая доза и средняя доза варианта осуществления 1 значительно улучшали снижение способности к обучению и запоминанию у крыс, вызванное удалением обонятельной луковицы, в сравнении с контрольной группой.
2. Эксперименты на животных в модели с взаимодействием
Автор изобретения провел поведенческие эксперименты, включая эксперименты на модели с индуцированными резерпином эффектами (резкое снижение температуры тела, акинезия и блефароптоз) у мышей, эксперимент с индуцированным серотонином дрожанием головы на мышах и других животных, соответствующие патогенетическому механизму и клиническим симптомам депрессии.
2.1 Фармацевтическую композицию варианта осуществления 1 вводили внутрижелудочно мышам в дозе 20 мг/кг/сутки, 40 мг/кг/сутки и 80 мг/кг/сутки (крысам - в дозе 15 мг/кг/сутки, 30 мг/кг/сутки и 60 мг/кг/сутки) в течение одной недели. Индуцированные резерпином резкое снижение температуры тела, акинезия и блефароптоз у мышей могут значительно снижаться при введении фармацевтической композиции варианта осуществления 1, что указывает на то, что воздействие варианта осуществления 1 в отношении экспериментальной депрессии может быть связан с воздействием моноаминовых нейротрансмиттеров. Количество встряхиваний головы у мышей, получавших инъекцию серотонина, может значительно повышаться, что указывает на то, что антидепрессантный эффект варианта осуществления 1 может быть связан с ингибированием моноаминоксидазы (МАО). Более того, поскольку результаты экспериментов показывают, что фармацевтическая композиция варианта осуществления 1 не оказывает значительного воздействия на произвольную активность мышей, фармацевтическая композиция варианта осуществления 1 не оказывает стимулирующего эффекта на центральную нервную систему.
3. Результаты экспериментов по основным фармакодинамическим антидепрессантным параметрам сведены ниже (см. таблицу 5).
4. Вывод: Фармацевтическая композиция варианта осуществления 1 демонстрирует в рамках эксперимента значительное воздействие в отношении депрессии.
Результаты различных экспериментов показывают следующее.
*
(*
(1) Через 8 часов после внутрижелудочного введения крысам фармацевтической композиции варианта осуществления 1 уровень цАМФ в гиппокампе значительно повышался, активность РКА значительно усиливалась (P<0,05), уровень p-CREB также повышался, а активность PDE4 значительно снижалась P<0,05) в сравнении группой, получавшей физиологический раствор, и группой, получавшей Пароксетин.
(2) После внутрижелудочного введения фармацевтической композиции варианта осуществления 1 мышам с хроническим стрессом в течение 10 суток сниженные вследствие повторяющегося стресса уровни цАМФ и РКА в гиппокампе значительно повышались, стимулируя экспрессию CREB и BDNF в гиппокампе мышей.
(3) После внутрижелудочного введения фармацевтической композиции варианта осуществления 1 крысам с хроническим стрессом в течение 21 суток сниженные вследствие повторяющегося стресса уровни цАМФ и РКА повышались, стимулируя экспрессию моноаминовых нейротрансмиттеров, включая BDNF в сыворотке, NE и 5-НТ в гипоталамусе и т.п., тогда как уровень GSC снижался.
(4) Фармацевтическая композиция варианта осуществления 1 демонстрирует в рамках эксперимента значительное воздействие в отношении депрессии.
Ниже описаны сферы действия заявки на фармацевтическую композицию настоящего изобретения для быстрого повышения содержания и доступности цАМФ in vivo.
1. Фармацевтическая композиция настоящего изобретения для быстрого повышения содержания и доступности цАМФ in vivo может включать фармакологически приемлемые добавки.
2. Фармацевтическую композицию настоящего изобретения для быстрого повышения содержания и доступности цАМФ in vivo можно производить в виде известных дозированных форм, таких как порошок, капсула, таблетка и т.п.
3. Фармацевтическую композицию настоящего изобретения для быстрого повышения содержания и доступности цАМФ in vivo можно производить в виде лекарственного средства, продукта здорового питания или пищевой добавки, предназначенных для профилактики и лечения заболеваний, вызванных низкой доступностью и низким уровнем цАМФ в организме и клетках, для повышения уровня BDNF, активации сигнального пути цАМФ/PKA/CREB в клетках, повышения уровня нейротрансмиттеров, таких как DA, NE и 5-НТ, и улучшения памяти.
Существуют дополнительные варианты осуществления, описанные ниже.
Вариант осуществления 1. Фармацевтическая композиция настоящего изобретения для повышения содержания и доступности циклического аденозинмонофосфата в организме, включающая первый основной компонент, включающий гинзенозиды Rg1, Rb1 и Re; второй основной компонент, включающий кислоту из солодки, выбранную из группы, состоящей из глицирризиновой кислоты, глицирретиновой кислоты и их комбинации; и третий основной компонент, включающий циклический аденозинмонофосфат ююбы.
Вариант осуществления 2. В фармацевтической композиции по варианту осуществления 1 фармацевтическая композиция включает 2-26 весовых частей гинзенозидов Rg1 и Rb1, 3-48 весовых частей кислоты из солодки и 0,002-0,5 весовой части циклического аденозинмонофосфата ююбы.
Вариант осуществления 3. В фармацевтической композиции по варианту осуществления 1 или 2 фармацевтическая композиция включает 4-13 весовых частей гинзенозидов Rg1 и Rb1, 5-16 весовых частей кислоты из солодки и 0,01-0,1 весовой части циклического аденозинмонофосфата ююбы.
Вариант осуществления 4. В фармацевтической композиции по одному из вариантов осуществления 1-3 фармацевтическая композиция включает фармакологически приемлемый носитель, добавку или их комбинацию.
Вариант осуществления 5. В фармацевтической композиции по одному из вариантов осуществления 1-4 фармацевтическая композиция имеет дозированную форму, выбранную из группы, состоящей из таблетки, капсулы, порошка, пилюли, пудры, раствора, микрокапсулы, суспензии, эмульсии, частицы, капельной пилюли, катышка и фармакологической дозированной формы медицинского препарата для перорального введения.
Вариант осуществления 6. В фармацевтической композиции по одному из вариантов осуществления 1-5 фармацевтическую композицию производят в виде лекарственного средства, продукта здорового питания или пищевой добавки, которые используют для предотвращения и лечения низкой доступности и содержания цАМФ в организме и клетке, усиления сигнального пути цАМФ/PKA/CREB в клетке, усиления экспрессии BDNF, повышения содержания нейротрансмиттеров DA, NE и 5НТ или улучшения памяти.
Вариант осуществления 7. В фармацевтической композиции по одному из вариантов осуществления 1-6 фармацевтическая композиция дополнительно включает четвертый основной компонент, выбранный из имбиря, экстракта имбиря или их комбинации.
Вариант осуществления 8. Фармацевтическая композиция для повышения доступности циклического аденозинмонофосфата в организме, включающая первый основной компонент, включающий гинзенозиды Rg1, Rb1 и Re; второй основной компонент, включающий кислоту из солодки, выбранную из группы, состоящей из глицирризиновой кислоты, глицирретиновой кислоты и их комбинации; и третий основной компонент, включающий циклический аденозинмонофосфат ююбы.
Вариант осуществления 9. Способ получения фармацевтической композиции для повышения содержания циклического аденозинмонофосфата в организме, включающий получение первого основного компонента, причем первый основной компонент включает гинзенозиды Rg1, Rb1 и Re; получение второго основного компонента, причем второй основной компонент включает кислоту из солодки, выбранную из группы, состоящей из глицирризиновой кислоты, глицирретиновой кислоты и их комбинации; и получение третьего основного компонента, причем третий основной компонент включает циклический аденозинмонофосфат ююбы, для производства фармацевтической композиции.
Хотя настоящее изобретение было описано применительно к вариантам осуществления, которые в настоящее время считаются наиболее практичными и предпочтительными, следует понимать, что настоящее изобретение не должно быть ограничено описанными вариантами осуществления. Таким образом, предполагается, что оно охватывает различные модификации и аналогичные конфигурации, соответствующие сущности и объему приложенной формулы изобретения, которые должны соответствовать самой широкой интерпретации так, чтобы включать все такие модификации и аналогичные структуры.
Промышленная применимость
1. Фармацевтическая композиция настоящего изобретения для быстрого повышения содержания и доступности цАМФ in vivo может включать фармакологически приемлемые добавки.
2. Фармацевтическую композицию настоящего изобретения для быстрого повышения содержания и доступности цАМФ in vivo можно производить в виде известных дозированных форм, таких как порошок, капсула или таблетка.
3. Фармацевтическую композицию настоящего изобретения для быстрого повышения содержания и доступности цАМФ in vivo можно производить в виде лекарственного средства, продукта здорового питания или пищевой добавки, используемых для предотвращения и лечения заболеваний, вызванных низкой доступностью и содержанием цАМФ в организме и клетках, усиления сигнального пути цАМФ/PKA/CREB в клетках, усиления экспрессии BDNF, повышения содержания нейротрансмиттеров DA, NE и 5-НТ или улучшения памяти.