ШТАММ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ ГУАРА Ensifer aridi RCAM05276 - АЗОТФИКСИРУЮЩИЙ СИМБИОНТ ГУАРА
NODULE BACTERIAL GUAR BACTERIA ENSIFER ARIDI RCAM05276 - NITROGEN-FIXING GUAR SYMBIONT

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к технологии инокуляции семян гуара перед посевом с помощью бактериальных удобрений.
Гуар или циамопсис четырехкрыльниковый (Cyamopsis tetragonoloba) - однолетняя зернобобовая культура, представляющая собой травянистое растение семейства Бобовые (Fabaceae). Растения высотой от 70 см до 2 м, в тропических условиях растения достигают 3 м и более. Стебель прочный, ко времени созревания древеснеющий. Мощная стержневая система корней дает возможность растению получать достаточное количество питательных веществ и влаги их глубоких слоев почвы.
Семена гуара состоят на 20-22% из оболочек, на 44-46% из зародыша и на 32-36% из эндосперма. В эндосперме семян гуара содержится ценное вещество - гуаровая камедь, в состав которой входит до 85% галактоманнана, 12% воды, 5% белка, 2% не растворимого в кислоте осадка или сырых волокон, 0,7% золы, 0,7% жир. (https://glavagronom.ru/articles/Guar-cennost-zernobobovoj-kultury-i-perspektivy-proizvodstva-v-Rossii).
Зеленые бобы гуара могут служить ценным пищевым продуктом (в настоящее время используется гуаровая мука и немолотый гранулированный корм), но наиболее востребовано это растение как источник гуаровой камеди, которая представляет собой полисахарид галактоманнан, образованный галактозой и маннозой.
В настоящее время гуаровая камедь нашла широкое применение в нефтегазовой, пищевой промышленности, а также в косметической, фармацевтической, легкой промышленности и других отраслях экономики, так как она является сильным и гелеобразующим агентом с регулируемой вязкостью, зависящей от температуры, времени и концентрации. В частности, камедь, благодаря способности в малых количествах образовывать гели с холодной водой, надежно суспензирует бентонитовую глину в буровом растворе и ограничивает потери воды. Наличие ее в пищевых продуктах способствует уменьшению аппетита, снижению уровня насыщенных жиров и холестерина в организме. Более 10 лет назад гуаровая камедь, как пищевая добавка Е 412, была разрешена для ввоза в Россию и относится к группе стабилизаторов, эмульгаторов и загустителей в пищевой промышленности. Так как она проявляет гипогликемические свойства и уменьшает всасывание глюкозы в крови, это позволяет использовать гуаровую камедь при лечении и профилактике диабета.
В сельском хозяйстве и биотехнологии предлагается использовать камедь в составе термостабильной биоразлагаемой среды средах для хранения биологических материалов, в том числе биоинкулянтов (US 2004022860, 2004; NZ 506484, 2003;), где она поддерживает активность биологических материалов после хранения в течение нескольких месяцев, а также в составе биоудобрений (CN 106966812, 2007; RU 2516991, 2012).
Гуар, в основном, выращивают в Индии, однако из-за высокого спроса на камедь это растение пытаются культивировать в других районах с подходящим климатом: в США, Судане, Афганистане, Кении, Пакистане, Австралии, а также на юге России. В РФ полевой опыт по возделыванию гуара был начат в 2013 г.: для этих целей была отведена экспериментальная делянка в 3 га в хозяйстве агрофирмы «Красный сад» Азовского района Ростовской области. Температурный режим Приазовья для новой культуры оказался вполне подходящим и уже в следующем году они получили первый урожай - пусть небольшой, но вполне достаточный для того, чтобы обеспечить себя посевным материалом.
Проведенные исследования показали, что гуар, как и другие бобовые культуры, вступает в симбиоз с азотфиксирующими бактериями, в результате чего за вегетационный период накапливает в почве около 60 кг азота на гектаре и улучшается структура почвы. Вместе с тем известно, что продуктивность бобовых культур зависит не только от климатических условий, но и от эффективности симбиоза с ризобиями, которая в том числе определяется азотфиксирующей активностью и конкурентоспособностью микросимбионтов, а также их комплементарностью к определенному сорту. Использование клубеньковых бактерий для инокуляции растений особенно важно при интродукции на новые места обитания, поэтому для успешного выращивания гуара в России необходимы специфические штаммы-микросимбионты.
Выпускаемые в России инокулянты, содержащие штаммы клубеньковых бактерий, в частности, ризоторфин (Рекомендации по возделыванию многолетних трав на семена. ВРАСХН, ВНИИ кормов, М. 1998, С. 6) создаются на основе селекционных штаммов бактерий конкретной высеваемой культуры и для использования с гуаром не предназначены. Применение инокулянтов для выращивания гуара в проанализированной научно-технической литературе отсутствует.
Предпосылками для создания микросимбионтов для гуара являются проведенные авторами работы по выделению и идентификации микроорганизмов из корневых клубеньков растений гуара (И.Г. Кузнецова, А.Л. Сазанова и др. Сельскохозяйственная биология, 2018, том 53, №6, с. 1285-1293), где были идентифицированы бактерии Bradyrhizobium elkanii. Данная работа является наиболее близким решением по отношению к заявляемому изобретению. Вместе с тем эффективность использования этих микроорганизмов при выращивании гуара, как показали проведенные авторами эксперименты, недостаточно высока, что ставит вопрос о поиске более эффективных симбионтов.
Технической задачей являлось поиск более эффективных микроорганизмов для воздействия на развитие гуара, способных образовывать эффективный азотфиксирующий симбиоз с гуаром.
Технический результат достигался использованием для данной цели штамма Ensifer aridi 717, который был депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения при ФГБНУ ВНИИСХМ (Санкт-Петербург) 04.12.2019 с регистрационным номером RCAM 05276.
Штамм характеризуется следующими свойствами.
Наименование: клубеньковые бактерии гуара {Cyamopsis tetragonolobd) Ensifer aridi
Номер штамма: 717
Происхождение штамма: ФГБНУ ВНИИСХМ (Санкт-Петербург, Пушкин). Выделен из клубенька растения гуара (Cyamopsis tetragonoloba), произрастающего в провинции Гоа, Индия. Белимов А.А., Сафронова В.И., 2019 г.
Методы идентификации: секвенирование гена 168 рРНК (ФГБНУ ВНИИСХМ, Сазанова А.Л., Кузнецова И.Г.)
Морфолого - культуральные и биохимические признаки. Штрих на среде YMA умеренный, слизистый, блестящий. На МПА растет, Молоко с лакмусом подщелачивает. Колонии на 3 сутки, беловатые, округлые, слизистые, с ровным краем, диаметр 1-3 мм.
Результаты секвенирования гена 16S рРНК
Патогенность. Непатогенный штамм.
Способ хранения. Штамм выращивают на маннитно-дрожжевом агаре (YMA) при 28°C. Температура хранения +4°C. Пересев один раз в 6 месяцев. Долгосрочное хранение - в криоконсервированном состоянии при -80°C на среде TY с 15% глицерином.
Характеристика штамма. Азотфиксирующий микросимбионт гуара (Cyamopsis tetragonoloba).
2
4
Штамм получали следующим образом. Семена гуара (Cyamopsis tetragonoloba), полученные в ФГБНУ ФИЦ Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова, скарифицировали и поверхностно стерилизовали в 98% HSO в течение 10 мин, затем тщательно промывали стерильной водопроводной водой и проращивали на фильтровальной бумаге в чашках Петри при температуре 25°C в темноте в течение 3 дней. Проростки переносили в пластиковые сосуды (10 сосудов, 4 проростка в сосуд), содержащие 100 г стерильного вермикулита. В каждый сосуд добавляли 5 мл водных вытяжек, полученных из образцов почв, собранных в 2018 году в провинции Гоа (Индия).
-2
-1
-2
-1
-2
-1
Растения культивировали в течение 46 дней в фитокомнате с относительной влажностью 60% и четырехуровневым режимом освещенности/температуры: ночь (темнота, 18°C, 8 часов), утро (200 мкмоль мс, 20°C, 2 часа), день (400 мкмоль мс, 23°C, 12 ч), вечер (200 мкмоль мс, 20°C, 2 ч). Для освещения использовались лампы L 36W/77 FLUORA (Osram, Германия). По окончании эксперимента корни растений вынимали из вермикулита и промывали водопроводной водой. Образовавшиеся клубеньки отделяли от корней, поверхностно стерилизовали 1 мин в 70% этаноле и гомогенизировали в стерильной водопроводной воде. Штаммы ризобий были выделены из гомогенатов клубеньков путем посева на агаризованную модифицированную маннитно-дрожжевую среду с добавлением 0.5% янтарной кислоты. Штаммы выращивались при 28°C.
Эффективность и промышленную применимость штамма иллюстрировали следующим примером.
Пример 1. Для инокуляции семян гуара использовали водные суспензии (10 Е7 кл./ мл) изолированных клубеньковых бактерий в количестве 10 мл в сосуд. Суспензии бактерий вносили на семена сразу после посева, что в дальнейшем позволяло корням прорастающих семян контактировать с бактериями. Для каждого варианта опыта использовали по 8 растений.
-2
-1
-2
-1
-2
-1
Растения культивировали в течение 46 дней в фитокомнате с относительной влажностью 60% и четырехуровневым режимом освещенности/температуры: ночь (темнота, 18°C, 8 часов), утро (200 мкмоль мс, 20°C, 2 часа), день (400 мкмоль мс, 23°C, 12 ч), вечер (200 мкмоль мс, 20°C, 2 ч). По окончании эксперимента растения вынимали из сосудов, корни промывали водопроводной водой и подсчитывали количество образовавшихся клубеньков. Азотфиксирующую активность клубеньков определяли ацетиленовым методом. Для этого корни помещали в герметичные флаконы, добавляли ацетилен в концентрации 10% и инкубировали 1 сутки при 25°C. Реакцию останавливали добавлением 2,5% раствора формалина и определяли содержание этилена на газовом хроматографе GC-2014 (Shimadzu, Япония). Побеги растений высушивали и использовали для определения содержания в них общего азота с помощью автоматического анализатора Kjeltec 8200 («FOSSAnalytical», Дания). Полученные результаты приведены в таблице 1.
Полученные результаты показали, что заявляемый штамм образует эффективный азотфиксирующий симбиоз с растениями гуара и повышает их массу и содержание азота в большей степени, чем штаммы Bradyrhizobium elkanii 499 и Bradyrhizobium elkanii 500.