Способ диагностики племенной ценности свиней породы дюрок с использованием разработанной тест-системы по гену LEPR
METHOD FOR DIAGNOSING THE BREEDING VALUE OF DUROC PIGS USING THE DEVELOPED LEPR GENE TEST SYSTEM

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и животноводству, а именно к способам отбора животных в свиноводстве для диагностики племенной ценности свиней породы дюрок на ранних этапах развития.
Существенный научный и практический интерес уделяется разработке способов, позволяющих оценивать продуктивность животных не только по фенотипическому проявлению признаков, но и непосредственно на генетическом уровне.
Известно, что к числу таких способов относится тестирование однонуклеотидных замен (SNP тестирование), которые расположены в генах, имеющих влияние на биохимические и физиологические процессы в организме. Ассоциативные связи между генотипами SNP и продуктивными качествами свиней могут быть использованы в качестве генетических маркеров при отборе и подборе животных. В отцовской породе свиней, используемой в системе гибридизации в целях повышения скороспелости, среднесуточного прироста, длины туловища у товарных гибридов важным является оценка племенной ценности производителей. Поэтому для диагностики племенной ценности свиней породы дюрок, необходимо выделить генетические факторы, влияющие на откормочные и мясные качества животных.
Известен способ оценки плодовитости свиней пород ландрас и крупная белая, включающий выделение ДНК, амплификацию фрагмента гена LIF с использованием праймеров  и  рестрикцию амплифицированного фрагмента гена LIF эндонуклеазой рестрикции Dralll, определение генотипов и отбор животных с генотипом AA/LIF, причем один фрагмент размером 407 п. н. соответствует генотипу АА, два фрагмента размером 266-и 144 н.п.- генотипу ВВ, три фрагмента 407-, 266- и 144 н.п.- генотипу АВ (Патент РФ №2634404, МПК А01К 67/02, C12Q 1/68, 26.10.2017, Бюл.№30).
Отличительная особенность способа заключается в том, что он разработан для оценки репродуктивных качеств свиней и направлен на повышение их воспроизводительных функций. Также в отличие от предлагаемого нашего способа использовался ген-маркер другого направления оценки продуктивности - воспроизводительной.
Известен способ раннего отбора свиней по толщине шпика на основании комплексного генотипа по ДНК-маркерам, включающий определение количества G аллелей, обуславливающих увеличение толщины шпика, причем при оценке учитывают комплексный генотип по ДНК-маркерам IGF2, MC4R, CCKAR. (Патент РФ №2744594, МПК А01К 67/02, опубл. 11.03.2021, Бюл. №8) - прототип.
Недостатком способа является то, что он позволяет осуществлять оценку племенной ценности молодняка только по одному показателю мясной продуктивности - толщине шпика, поэтому он не может считаться достаточно эффективным. Чтобы получить наиболее расширенные результаты для проведения оценки племенной ценности свиней и раннего отбора животных, этого недостаточно. Также в отличие от нашего способа исследования проведены на материнских породах свиней (ландрас и крупная белая порода), нами же проведены исследования на отцовской породе свиней (дюрок). Это обуславливает различное наследование признаков продуктивности и различную передачу их потомству. Основной же недостаток прототипа заключается в целенаправленном увеличении показателя толщины шпика, в то время как все свиноводческие компании мира стремятся разводить свиней с повышенной мясностью и сниженной толщиной шпика. Это подкрепляется многочисленными исследованиями в области свиноводства. (Романцова, С.С. Результативность прогноза продуктивности у свиней / С.С. Романцова, Н.С. Крючкова // Лучшая исследовательская работа 2021 г.: сборник статей Международного научно-исследовательского конкурса, Петрозаводск, 13 декабря 2021 года. - Петрозаводск: Международный центр научного партнерства «Новая Наука» (ИП Ивановская И.И.), 2021. - С.492-501.; Рудь, А. И. Послеубойная оценка мясных характеристик туш свиней / А. И. Рудь, А. В. Быканов // Свиноводство. - 2011. - №7. - С.4-7.; Третьякова, О. Л. Анализ откормочных и мясных качеств чистопородного молодняка / О. Л. Третьякова, В. С.Бондаренко // Вестник Донского государственного аграрного университета. - 2018. - №1-1(27). - С.23-31. и др.)
Задача предлагаемого нами изобретения - создание эффективного способа диагностики племенной ценности свиней породы дюрок, генетически предрасположенных к более высоким показателям энергии роста, конверсии корма и выхода мясной части туш.
Задача изобретения достигается применением разработанной тест-системы по гену LEPR на основе SNP тестирования путем определения генетического потенциала племенной ценности (выраженной в способности передавать высокие показатели скороспелости, среднесуточного прироста, длины туловища и низкого показателя толщины шпика потомкам) свиней на основе тестирования SNP, расположенного в 4 интроне гена LEPR (гена рецептора лептина), методом ПЦР-ПДРФ.
Технический результат изобретения достигается использованием способа в качестве разработанной тест-системы по гену LEPR на основе SNP тестирования, позволяющего определять влияние гена LEPR на откормочные и мясные качества свиней породы дюрок, выявлять и закреплять «желательные» генотипы, связанные с высокими показателями продуктивности, что способствует снижению затрат на выращивание племенного молодняка свиней породы дюрок.
Способ разработан для определения аллелей и генотипов гена LEPR с помощью полимеразной цепной реакции на основании специфичных праймеров. Предлагаемый нами способ позволяет проводить отбор ремонтного поголовья (ремонтных хрячков и свинок) на этапе от рождения и до получения оценки по собственной продуктивности, помогая оптимизировать затраты на проведение оценки ремонтного поголовья по откормочным и мясным качествам, сокращая расходы на дорогостоящие реагенты и время диагностики.
Ген LEPR - (ген рецептора лептина), участвует в регуляции веса тела и пищевого поведения, повышает энергетический обмен и использование жиров в нем. Лептин - это пептидный гормон, синтезирующийся адипоцитами (липоцитами, клетками жировой ткани). Гормон секретируется в кровь и влияет на энергетический обмен и сгорание жиров в организме. Лептин является продуктом гена лептина, секретируется в жировой ткани и является сигнальной молекулой, вырабатываемой гипоталамусом. Его механизм действия заключается в передаче в гипоталамус информации о массе тела и жировом обмене. Ген LEPR является сильным геном -кандидатом для детерминирования откормочных и мясных качеств.
В процессе работы тест-системы по гену LEPR определяется полиморфизм данного гена в позиции 6 хромосомы свиньи в участке (Sw1881) q33-q35. Полиморфизм анализируемого Hpall сайта рестрикции приводит к образованию двух аллелей: А (с фрагментом 2000 н.п) и В (с фрагментами 1450 и 550 н.п.).
В результате исследований выявлено, что наличие у свинок генотипа АВ по гену LEPR связано с лучшими показателями скороспелости, среднесуточного прироста, длины туловища и толщины шпика. У хрячков высокие показатели продуктивности длины туловища и среднесуточного привеса связаны с генотипом ВВ по гену LEPR. Также генотип ВВ был связан с результативными показателями толщины шпика. Результаты этого исследования показывают, что выявлено положительное влияние гена LEPR / Hpall на продуктивные качества свиней, что позволяет использовать разработанный метод в качестве тест-системы, как способ диагностики племенной ценности свиней породы дюрок.
Особенностью заявленного нами изобретения является применение способа непосредственно для мясных пород дюрок путем определения генотипов по SNP, влияющих на мясные и откормочные качества животных.
Многолетняя селекция породы дюрок на повышение откормочной и мясной продуктивности, привела к формированию у них некоторых морфофизиологических особенностей, которые отличают их от других пород. Установлено, что количество энергии в жире у свиней породы дюрок откладывается меньше, чем у свиней крупной белой породы. Датская порода дюрок получила широкое распространение во многих странах мира. Животные характеризуются компактным туловищем, окорок широкий, уши средней величины, оброслость нормальная. Животные крепкой конституции и достаточно устойчивы к различным неблагоприятным факторам внешней среды, хорошо приспособлены к условиям содержания. Свиней данной породы используют в системах гибридизации на заключительном этапе скрещивания.
Способ осуществляется следующим образом. По результатам молекулярно - генетических тестов (SNP тестирования), проводимых методом ПЦР с последующим рестрикционным анализом продуктов амплификации (метод ПЦР-ПДРФ), определяют аллельные варианты и генотипы SNP гена LEPR. Для этого выделяют ДНК из пробы ткани с ушной раковины животного с применением набора реагентов DIAtom DNA Prep 100 (ООО «НПФ Генлаб») или любым другим стандартным методом. Возможно использование других тканей или клеток животного (кровь, волосяные луковицы, сперма и др.). Проводят амплификацию интересующего фрагмента (2000 п.н.) гена LEPR с использованием специализированных праймеров  в следующем режиме: предварительная денатурация - 5 мин при 94°С; 35 циклов, денатурация 94°С - 30 с, отжиг 61°С - 45 с, элонгация 72°С - 2 мин (35 циклов) с, заключительная элонгация при 72°С- 10 мин.
Рестрикцию амплифицированного фрагмента гена LEPR производят с применением эндонуклеазы рестрикции Hpall. Размер полученных рестрикционных фрагментов определяют методом электрофореза в 1%- ном агарозном геле с добавлением бромистого этидия, и в зависимости от длины фрагментов устанавливают генотип индивидуально у каждого животного. Один фрагмент размером 2000 н.п, соответствует генотипу АА, два фрагмента размером 1450 и 550 н.п.- генотипу ВВ, три фрагмента 2000, 1450, и 550 н.п.- генотипу АВ. Результаты SNP- LEPR теста вносят в электронную базу племенного учета и при оценке плодовитости в качестве дополнительного критерия используют генотип АВ I LEPR, наличие которого свидетельствует о генетической предрасположенности свинок к лучшим показателям скороспелости, среднесуточного прироста, длины туловища и толщины шпика. Наличие генотипа ВВ по гену LEPR у хрячков связано с лучшими показателями среднесуточного прироста, длины туловища и толщины шпика. По результатам теста можно проводить оценку откормочных и мясных качеств свиней породы дюрок и отбирать животных, генетически предрасположенных к более высоким показателям племенной ценности в раннем возрасте. Что позволяет сократить экономические затраты.
Таким образом, представленный способ SNP- LEPR тестирования позволяет более эффективно проводить диагностику племенной ценности свиней, т.к. учитывает генетические факторы, влияющие на откормочные и мясные функции организма. Изобретение иллюстрируется следующим примером.
2
Пример. Контрольное использование предложенного способа по разработанной тест-системе для определения полиморфизма гена LEPR было проведено и апробировано в ЗАО «Племзавод-Юбилейный» Ишимского района Тюменской области на 55 свиньях породы дюрок. Для проведения молекулярно-генетических исследований у животных были отобраны образцы ткани с ушной раковины площадью 1 см (ушные выщипы). Влияние генотипов на откормочные и мясные качества оценивали по показателям скороспелости (дн), толщине шпика (мм), длине туловища (см) и среднесуточному приросту (г) по результатам контрольного выращивания до живой массы 100 кг согласно «Инструкции по бонитировке» от 2009 года.
ДНК выделяли с применением набора реагентов DIAtom DNA Prep 100 (ООО «НПФ Генлаб»). Анализ проводился методом ПЦР-ПДРФ (полимеразной цепной реакции - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов). ПЦР проводили на амплификаторе «Терцик».
Амплификацию фрагмента (2000 п. н., включающего 4 интрон) гена LEPR проводили с использованием прямого и обратного праймеров 5'-GGAAGGCATTTGTTTCAGCAGTAA-3', 5'-CAAGTCCTCTTTCATCCAGCACTG-3' соответственно, в следующем режиме: предварительная денатурация - 5 мин при 94°С; денатурация 94°С -30 с, отжиг 61°С - 45 с, элонгация 72°С - 2 мин (35 циклов), заключительная элонгация при 72°С- 10 мин.
Размер полученных рестрикционных фрагментов и генотипы определяли методом электрофореза в 1%-ном агарозном геле с добавлением бромистого этидия. Визуализацию электрофореграмм проводили на трансиллюминаторе в УФ свете. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ гена LEPR/Hpall в 1% агарозном геле представлена на Фиг. 1, где 1, 2, 3,8, 10, 11, 13, 15-генотип AB (2000, 1450, 550 н.п.); 4,5,7, 12, 16, 17 -генотип ВВ (1450 и 550 н.п.); 6, 14 - генотип АА (2000 н.п.); 9, 18 - ДНК-маркер 100 bp (СибЭнзим)).
Статистическую обработку данных проводили в М. Excel «Пакет анализа» по стандартным методикам. Исследование выявило частоту генотипов у свинок 53,8 (ВВ), 38,5 (АВ) и 7,7 (АА)%. У хрячков установлено наличие двух генотипов - АВ и ВВ, частота их составила 58,8% и 41,2% соответственно.
В результате проведенных нами исследований по откормочным и мясным качествам свинок породы дюрок в зависимости от генотипов гена LEPR установлено наличие достоверного влияния LEPR на наследование комплексных признаков: скороспелости, толщины шпика, длины туловища и среднесуточного прироста (табл.1).
Свинки породы дюрок с генотипом АВ I LEPR отличались лучшими показателями в сравнении с другими генотипами АА и ВВ по скороспелости на 11 и 4 дня, толщине шпика - на 3,6 и 2,5 мм, длине туловища - на 4,4 и 0,6 см и среднесуточному приросту - на 180,4 и 88 г, соответственно.
Хрячки породы дюрок, имеющие «желательный» генотип ВВ (табл.2) отличаются от животных с генотипами АВ лучшими показателями длины туловища на 0,6 см, среднесуточного прироста на 34,9 г, толщины шпика - на 0,3 мм.
Таким образом, разработанный способ может быть использован для выявления животных, являющихся носителями желательных генотипа АВ у свинок гена LEPR, ассоциированного с мясными и откормочными качествами свиней породы дюрок. У хрячков установлен «желательный» генотип ВВ. Предложенный способ применим в генетике сельскохозяйственных животных для выявления полиморфизма гена LEPR свиней, с целью последующего использования полученных результатов в разведении и селекции свиней на повышение показателей откормочных и мясных качеств. Способ позволяет повысить отлаженную точность в селекционной работе и надежность в генетическом потенциале племенных свиней.
Способ подбора свиней по данной тест - системе апробирован на предприятии ЗАО «Племзавод-Юбилейный».
Полученные результаты дают основание для применения разработанных методик в племенных свиноводческих хозяйствах в качестве тест-систем для диагностики племенной ценности свиней. Селекционное давление на стадо в племенных предприятиях позволяет получать новое поколение ремонтных хрячков с улучшенными показателями по основным селекционным признакам: скороспелости, среднесуточному привесу, длине туловища и меньшей толщине шпика. Для качественного улучшения стада хряков-производителей необходимо как можно раньше провести оценку и отбор ремонтного молодняка.