СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ГЕМАГГЛЮТИНИНУ ВИРУСА ГРИППА А
METHOD OF DETECTING ANTIBODIES TO INFLUENZA A VIRUS HEMAGGLUTININ

Изобретение относиться к ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к способам определения антител к гемагглютининам вируса гриппа птиц.
Известен способ выявления антител к вирусу гриппа А, основанный на иммуноферментном анализе (ИФА) (Инструкция к «Набору для выявления антител к вирусу гриппа птиц (ВГП) методом иммуноферментного анализа». НПО «Авивак» Биологические ветеринарные препараты в России: вакцины, сыворотки, диагностикумы: Справочник. / Е.А.Романов. - Казань: Рутен, 2005. - С.486-489»). Способ заключается в связывании специфических антител к вирусу гриппа с вирусным антигеном, сорбированным на дне лунок полистиролового планшета, последующим выявлением количества связавшихся антител с использованием конъюгата - антивидовых антител и ферментной метки.
К недостаткам способа можно отнести не очень высокую специфичность (обусловленную высокой чувствительностью метода) и невозможность использования ИФА-тест системы для тестирования крови животных и птицы разных видов.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому и взятым за прототип является способ обнаружения антител к гемагглютинину вируса гриппа в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) (П.Ф.Здровский, М.И. Соколов. «Руководство по лабораторной диагностике вирусных и риккетсиозных бактерий». / М.: «Медицина», 1965 г., С.250-251). Для проведения реакции используют суспензию эритроцитов кур и суспензию вируса гриппа с гемагглютинационной активностью 4 гемагглютинационные единицы (ГАЕ), после предварительной инкубации вируса с различными разведениями тестируемых сывороток в реакционную смесь вносят эритроциты и после инкубации определяют предельный титр антител, тормозящий гемагглютинацию вируса. Однако данный способ характеризуется значительной трудоемкостью, необходимостью титровать сыворотки крови, невозможностью длительного хранения используемых эритроцитов. Эритроцитарную массу в связи с этим невозможно поставлять вместе с набором, поэтому свойства эритроцитов, а следовательно, и результаты реакции в разных лабораториях нередко различаются.
Техническим результатом заявляемого решения является обнаружение антител к гемагглютинину вируса гриппа А.
Поставленная техническая задача решается тем, что в способе, включающем отбор проб крови, выявление антител к гемагглютинину вируса гриппа А, согласно изобретению для выявления антител к гемагглютинину вируса гриппа А первоначально для проведения реакции выделяют из эритроцитов эритроцитарные рецепторы к гемагглютинину вируса гриппа А и иммобилизируют их в лунках микропланшета, а к вирусным частицам «пришивают» ферментную метку.
Сущность изобретения заключается также в том, что в случае положительной реакции при наличии в исследуемых пробах сывороток крови антител к вирусу гемагглютинина птиц при добавлении субстрата для ферментной метки оптическая плотность в лунке ниже, чем в лунке с отрицательным контролем.
Способ осуществляют следующим образом.
Предварительное получение реагентов:
Получение эритроцитарных рецепторов к ВГП А (вирусу гриппа птиц):
1. Берут 50 мл стабилизированной гепарином крови птиц, отмывают эритроциты физиологическим раствором путем центрифугирования трехкратно.
2. Элюируют поверхностные мембранные белки путем инкубации эритроцитарной массы с 20 мл 1 мМ раствора ЭДТА с 0,5М NaCl при перемешивании при температуре +5°С в течение 3 ч. Клетки осаждают центрифугированием, надосадочную жидкость используют для дальнейшей работы.
3. Проводят диализ элюата против 0,1 М карбоната бикарбонатного буфера с pH 8.0, в течение 3 часов двухкратно при температуре +5°С и немедленно используют для сорбции в лунках полистироловых микропланшет.
4. Проводят сорбцию эритроцитарных рецепторов на полистирол в течение 16 ч при +5°С, отмывают несвязавшиеся белки 0,05 М фосфатно-солевым буфером (PBS) и вносят в лунки по 100 мкл блокирующего буфера: 0,01 М TBS с 1% альбумином, через 30 минут инкубации при комнатной температуре промывают лунки микропланшета от блокирующего буфера 0,01М TBS pH 7,2-7,4 и высушивают микропланшет. Микропланшет в сухом месте при +5°С может храниться в течение года.
Получение конъюгата вируса гриппа А с щелочной фосфатазой теленка:
1. Ресуспендируют суспензию вируса гриппа А до концентрации 32 гемаглютинирующих единицы (ГАЕ) в 1 мл 0,01 М TBS, pH 7,2-7,4.
2. Добавляют 100 ед. ЩФ (щелочной фосфатазы).
3. Вносят 40 мкл 1% раствора глютарового альдегида
4. Инкубируют 2-3 ч.
5. Вносят 80 мкл 1 М раствора аланина.
6. Инкубируют 2-3 ч при комнатной температуре.
7. Проводят диализ препарата против 0,01 М TBS, pH 7,2-7,4.
8. Разводят препарат конъюгата до концентрации 8 ГАЕ.
Материал: пробы сыворотки крови
Сыворотки крови, разведенные 50 мМ трис-HCl, pH 7,4-7,2 в соотношении 1:10 в количестве 100 мкл, вносят в лунки микропланшета и смешивают со 100 мкл конъюгата ВГП/ЩФ (вирус гриппа/щелочная фосфатаза) и инкубируют 1 час при комнатной температуре.
150 мкл смеси сывороток с конъюгатом переносят в лунки микропланшета с предварительно адсорбированными на нем эритроцитарными рецепторами к ВГП и инкубируют 30 минут.
После инкубации жидкость из лунок удаляют. Планшет 2-х кратно промывают трис-HCl буфером и один раз дистиллированной водой.
Количество конъюгата, связавшегося с рецепторами, определяют по активности щелочной фосфатазы. Субстрат нитрофенилфосфата в присутствии щелочной фосфатазы превращается в нитрофенол, что приводит к окрашиванию раствора в лунке, для этого к глициновому буферу (0,05 М, pH 10,4) добавляют в соотношении 4:1 27,6 мМ раствор нитрофенилфосфата. Смесь вносят в лунки планшета в количестве 150 мкл.
Планшет инкубируют при 37°С 30 минут. Реакцию останавливают добавлением 150 мкл 0,2 М раствора NaOH.
Пробы фотометрируют на вертикальном спектрофотометре с использованием светофильтра 405 нм.
Для иллюстрации способа приведены примеры.
Пример 1. Изучали зависимость между титром антител к ВГП А в РТГА и оптической плотностью при использовании предложенного способа. Сыворотки с заведомо известными титрами антител в РТГА к ВГП A H5N1 протестировали предлагаемым нами способом.
Таблица 1
Титры сыворотки в РТГА
Оптическая плотность
1:320
0,274
1:160
0,293
1:80
0,318
1:40
0,323
Отрицат. контроль
0,51
Исследования показали возможность адекватной замены РТГА предлагаемым нами способом (таблица 1), так как коэффициент корреляции между оптической плотностью в предлагаемой реакции и титром антител в РТГА составил -0,97.
Пример 2. Способность коньюгата ВГП/ЩФ, используемого в предлагаемом способе, связываться со специфическими антителами проверяли также методом блот-гибридизации. Для этой цели десятикратные разведения положительной к ВГП H5/N1 сыворотки с начальным титром а РТГА 1:320 и заведомо отрицательные на ВГП сыворотки наносили на блот и гибридизировали с полученным конъюгатом. Как показали результаты проведенного теста конъюгат связывался со специфической сывороткой в разведении не менее 1:32 и не связывался с заведомо отрицательными на ВГП H5/N1 сыворотками.
Пример 3. Для изучения специфичности предложенного нами способа было подготовлено 2 системы для детекции гемагглютининов Н5 и Н3. Сыворотки крови птиц с заведомо известными титрами в РТГА протестировали на наличие антител к гемагглютининам Н5 и Н3 ВГП А (таблица 2).
Из таблицы 2 видно, что предлагаемый способ позволяет получать такие же результаты, как и при использовании прототипа, однако заявляемый способ характеризуется большей простотой и технологичностью постановки реакции, возможностью отказаться от использования эритроцитов, свойства которых варьируют от партии к партии, заменив их сорбированными в лунках микропланшета эритроцитарными рецепторами.
Таблица 2
Вид птицы
Тип контроля
H5N1
H3N2
Предлагаемый способ
РТГА
Предлагаемый способ
РТГА
Сыворотки крови кур
Положит. контроль Н5
1:16
1:16
отрицательно
отрицательно
Положит. контроль Н5
1:2
1:2
отрицательно
отрицательно
Положит. контроль H3
отрицательно
отрицательно
1:236
1:236
Положит. контроль Н3.
отрицательно
отрицательно
1:16
1:16
Положит. контроль Н3.
отрицательно
отрицательно
1:16
1:16
Сыворотки крови уток
Положит. контроль Н5
1:64
1:64
1:16
1:16
Положит. контроль Н5
1:16
1:16
отрицательно
отрицательно
Положит. контроль Н5
1:2
1:2
отрицательно
отрицательно
Положит. контроль Н3.
отрицательно
отрицательно
>1:236
>1:236
Положит. контроль Н3.
отрицательно
отрицательно
1:128
1:128
Техническим результатом заявленного изобретения является обнаружение антител к гемагглютинину вируса гриппа А.