Материал для кератопластики
KERATOPLASTY MATERIAL

Изобретение относится к области медицины или ветеринарии и более конкретно к офтальмологии и может быть использовано в хирургическом лечении заболеваний роговицы, путем замещения мутных или воспаленных слоев роговицы или всей роговицы.
Предшествующий уровень техники.
Материал для кератопластики используется для замещения поврежденных слоев роговицы при дистрофических, дегенеративных, воспалительных заболеваниях, а также после травм или ожогов. При этом материал для кератопластики должен быть прозрачен, должен обеспечивать другие оптические параметры (сферичность, оптическая сила, зеркальность), необходимые для восстановления функции зрения. Также материал для кератопластики не должен обладать антигенностью, должен быть стерилен. Прочность его должна позволять осуществлять надежную, герметичную фиксацию к тканям реципиента с помощью микрохирургических швов. Известно, что лучшим материалом для кератопластики является свежая донорская роговица. Однако не всегда возможно своевременное получение донорского материала, существует проблема отторжения донорского материала, которую не всегда удается решить даже применением   препаратов, подавляющих иммунитет. Существуют определенные риски инфицировать реципиента в случае заражения донора латентными инфекциями или инфекциями не выявленными в так называемый «светлый промежуток» или серонегативный период. Кроме того, существуют поражения роговицы, которые дают крайне низкий процент приживления свежей донорской роговицы, например, при термических и химических ожоговых бельмах.
Проблемы частично решаются путем использования в качестве материала для кератопластики децеллюлизированной роговицы домашних животных (Protectively Decellularized Porcine Cornea versus Human Donor Cornea for Lamellar Transplantation Weiyun Shi, et al. Adv. Funct. Mater., 2019, 1902491). Однако децеллюлизированную роговицу животных можно использовать только для послойной кератопластики, что сужает круг заболеваний, при которых можно осуществлять кератопластику. Кроме того, децеллюлизированную роговицу сложно интегрировать в слои реципиента, т. к. она непредсказуемо изменяет свою толщину, вследствие отека, которым не удается управлять в нужной степени.  Для сквозного восстановления прозрачности переднего отрезка глаза применяются кератопротезы, наиболее эффективные из них известны как бостонские кератопротезы, которые имеют в своей конструкции деталь из донорской роговицы (последняя модификация описана в United States Patent Application Publication Pub. No.: US 2019 / 0151077 A1 Chodosh  et al. Pub. Date :May 23, 2019). Однако при их изготовлении применяются синтетические материалы, которые склонны к отторжению тканями больного. Известны случаи расплавления роговицы реципиента после применения этого кератопротеза. Известен также кератопротез с роговичным компонентом, в котором для повышения стойкости роговичной части к биодеградации применяли раствор дубящих веществ в виде смеси формалина и глютаральдегида (Борзенок С.А. и соавт. Патент РФ №2204247 от 11.27.2001 г.) Однако, известна токсичность применяемых веществ и их относительно недолговечное дубящее действие на ткани, имплантированные в организм человека. Кератопротез не нашел практического применения. Известно также решение, в котором свиную роговицу использовали при послойной пересадке роговицы в эксперименте, как каркасный материал для восстановления поврежденной роговицы после ее децеллюлизации. Для этого свежую свиную роговицу обрабатывали 0,5% натрия додецил сульфатом (НДС) в течение 24 часов при температуре 4 градуса Цельсия (Kunpeng Pang, Liqun Du, Xinyi Wu, A rabbit anterior cornea replacement derived from a cellular porcine cornea matrix, epithelial cells and keratocytes. J. Biomaterials, n.31 (2010) P. 7257 – 7265). Это решение также подразумевает использование полученной роговицы только в качестве материала для послойной кератопластики. Кроме того, при применении такого материала при ожоговых или неоваскулярных бельмах нельзя гарантировать успех, так как предлагаемый материал не может противостоять неоваскуляризации и инфильтрации мигрирующими воспалительными клетками, что приводит к образованию вторичного бельма.
Другими авторами в целях устранения неоваскуляризации и деградации материала для кератопластики предложено заселять ацеллюлярную свиную роговицу слоями амниотического эпителия (Hailang Luo, Yongbo Lu, Tiantian Wu, Mi Zhang, Yongjie Zhang, Yan Jin. Construction of tissue-engineered cornea composed of amniotic epithelial cells and acellular porcine cornea for treating corneal alkali burn. J. Biomaterials n 34 (2013) 6748-6759. Однако этот материал также не нашел практического применения.
Наиболее близким решением является материал, который получают в результате осуществления способа, в котором для увеличения устойчивости к биодеградации роговичного материала для кератопластики применяли УФ кросслинкинг в диапазоне 370 нм в сочетании с пропитыванием роговицы фотомедиатором – рибофлавином (Мороз З.И. и соавт. Патент РФ 2381649 от 02.12.2008). Этот   материал для кератопластики обладает повышенной прочностью и повышенной устойчивостью к биодеградации, однако улучшение указанных характеристик незначительно, т. к. модификация материала происходит слишком поверхностно. Этот материал более подробно описан в диссертации М.В.Гороховой (М.В.Горохова. Кератопластика с использованием кросслинкинг модифицированного донорского материала у пациентов с язвами роговицы. Диссертация на соискание степени канд. мед. наук, М., 2017, 132 С) и представляет из себя донорскую роговицу, в которой коллагеновые структуры подверглись УФ кросслинкингу с наружной стороны и в которой сохранены клеточные элементы в виде кератоцитов и эндотелиальных клеток. Роговица уплотнена. Этот модифицированный материал принят нами за прототип изобретения. Однако степень уплотнения этого материала не достаточна, чтобы устранить отек материала, в течение суток указанный материал утолщался из-за отека до 800 мкм (при норме 500-600 мкм), а дополнительное поступление воды составляло до 17 весовых %, что снижает прозрачность и биосовместимость материала.
Задачей изобретения является увеличение прозрачности, прочности, стойкости к биодеградации и снижение антигенности материала для кератопластики.
Техническим результатом при использовании данного изобретения является   разработка материала  для кератопластики, который прозрачен, не мутнеет при контакте с тканями и внутриглазной жидкостью реципиента, отлично фиксируется швами без их прорезания, сохраняет другие оптические свойства в виде стабильной и точной оптической силы, сферичности, гладкости и регулярности  поверхности, не подвергается иммунному отторжению, хорошо интегрируется в структуры глаза реципиента и не деградирует со временем.
Технический результат достигается тем, что материал для кератопластики, полученный из роговичной части донорского глаза человека или животного, и представляющий собой децеллюлизированную роговицу слоистой структуры, которая образована фиксированным прессованным роговичным коллагеном, до 90% которого находится в стекловидном состоянии, причем содержание стекловидного коллагена в поверхностных слоях выше, чем в средних слоях, содержание воды в гидратированном состоянии в материале не превышает 71 весового процента, физическая плотность материала не менее 1,3 г/см³,    прозрачность материала при этом  не менее 50% по отношению к воздуху.
Материал для кератопластики получают в асептических условиях из донорского глазного яблока человека или животного (свинья, корова, лошадь и т. п.) ножницами или трепаном выкраивают роговицу, очищают ее от эпителия и десцеметовой мембраны. Для увеличения прозрачности кератопластического материала и получения его по толщине сопоставимым с роговицей реципиента материал прессуют, а затем высушивают. После высушивания материал подвергают фиксации одним или сочетанием нескольких из известных способов: химическим, радиационным, ультрафиолетовым кросслинкингом в диапазоне А, В или С, оптическим в видимом диапазоне или методом дегидротермического кросслинкинга.
Материал для кератопластики представляет собой роговичную часть глаза, которая представлена децеллюлизированной роговицей слоистой структуры. Расстояние между ламелями, образуемыми волокнистыми структурами коллагена составляют 10- 90% от расстояния между таковыми нативной роговичной ткани. При равном диаметре с нативной роговицей, предлагаемый материал имеет меньшую толщину. При этом плотность упаковки коллагена в материале для кератопластики превышает плотность нативного роговичного коллагена. Все это повышает прозрачность материала. Удельный вес материала не меньше 1,3 г/см³ и может достигать 2,0 г/см³ и более. Приведенные выше показатели свидетельствуют о том, что коллагеновые структуры становятся более компактными и слои коллагена сближаются друг с другом.  Содержание воды не превышает 71 весового %, при содержании воды в нативной роговицы от 75 до 80% (в среднем 78%), так как часть воды отжимается при прессовании. Кросслинкинг приводит к уменьшению количества полярных фенильных группировок коллагеновых молекул, что снижает способность материала поглощать воду извне. Кроме того, при прессовании из роговицы отжимаются гликозаминогликаны, которые обладают способностью удерживать в тканях воду. Коэффициент светопропускания материала (прозрачность) относительно воздуха составляет не менее 50%. Это позволяет получать в послеоперационном периоде достаточно высокую остроту зрения. Сопротивление растяжению в 10-ти процентном диапазоне у предлагаемого материала по сравнению с нативной роговицей выше до 300%.   Толщина материала для кератопластики составляет от 10 до 500 мкм. Материал может обладать кривизной с радиусом кривизны от 25 до 50 дптр с концентричным расположением коллагеновых слоев (фиг.1). Возможен вариант плоского материала с параллельным расположением слоев (фиг.2). Угол смачивания поверхности роговицы от 30 до 90 градусов. Указанные характеристики материала достигаются за счет того, что в  прессованном роговичном коллагене,  дополнительно образованы равномерно распределенные межцепочечные образования из пептидных мостиков между карбоксильными  группами аспартилглутамиловых остатков одной цепи коллагена и имино группами лизиловых остатков соседней цепи коллагена, а на обоих поверхностях имеются два поверхностных слоя с повышенной концентрацией поперечных межколлагеновых сшивок, образованных ковалентными связями на месте фенильных групп, ароматических аминокислот коллагеновых макромолекул.
В  гидратированном (смоченном в воде) состоянии содержание воды в нем не превышает 71 весового % и материал более однороден по сравнению с нативной роговицей за счет уменьшения  в нем   обводненных прослоек между слоями коллагена, при этом в поверхностных слоях фибриллы коллагена в его слоях расположены более хаотично, чем в его центральных слоях, за счет частичного стеклования коллагена, в центральных слоях  фибриллы  также сближены, но расположены более регулярно за счет меньшего стеклования коллагена.
Материал спрессован и высушен, что обеспечивает максимальное сближение слоев роговичного коллагена и самих молекул коллагена. При осуществлении в процессе изготовления предлагаемого материала известной процедуры фиксации материала за счет кросслинкинга молекул коллагена или любым другим известным способом, в таком материале процесс сшивки коллагеновых структур протекает значительно эффективнее и образующиеся новые связи формируются в большем количестве. Материал приобретает более компактную структуру, более гидрофобен, поэтому меньше мутнеет при контакте с влагой после имплантации в ткани глаза реципиента. При этом не имеет значения какой тип фиксации применяют при формировании данного материала. Это может быть ультрафиолетовый кросслинкинг в диапазоне А, В или С, химический кросслинкинг с использованием дубящих веществ типа формальдегида, глютаральдегида или даже дегидротермический кросслинкинг воздействием высокой температурой и т. п. Предпочтительной является комбинация дегидротермического кросслинкинга с УФ кросслинкингом. Кроме увеличенной прозрачности прессованного кератопластического материала, он по толщине сопоставим с роговицей реципиента, так как он не отекает, так как это происходит со свежим или консервированным донорским материалом в раннем послеоперационном периоде. Поэтому предлагаемый материал гораздо более удобен для хирурга во время его имплантации. Обладает меньшей антигенностью, так как в прессованном материале присутствует минимум водорастворимых активных белковых и полисахаридных компонентов, материала ядер и клеточной цитоплазмы чужеродного организма.
Ниже рассматривается техническая сущность   и признаки   материала для кератопластики.
Изобретение поясняется фигурами (фиг.1-6).
На фиг.1 схематически в разрезе изображен материал для кератопластики
На фиг.2 – схематически в разрезе изображен вариант плоского материала для кератопластики,
На фиг.3 – гистологический срез материала для кератопластики
На фиг.4 - Фотография среза роговицы. Крио срез
На фиг.5 – Оптическая когерентная томография материала. На обеих поверхностях материала определяется уплотнение в виде белых слоев.
На фиг.6 – Этап кератопластики с применением предлагаемого материала.
В асептических условиях из трупного глазного яблока человека или млекопитающего животного (свинья, корова, лошадь и т.п.) ножницами или трепаном выкраивают роговицу  Асептические условия позволяют избежать контаминации материала, что в дальнейшем улучшает его свойства биосовместимости после стерилизации, за счет отсутствия эндотоксинов на поверхности материала. Полученную роговицу очищают от эпителия и десцеметовой мембраны с эндотелиальными клетками. Этим достигается снижение антигенности.   После этого роговицу прессуют.  Это позволяет децеллюлизировать материал за счет выдавливания активных водорастворимых компонентов роговицы, что снижает антигенность. Эта процедура отжимает свободную воду, водорастворимые не коллагеновые белки, другие водорастворимые соединения и водосодержащие гликозаминогликаны из межклеточного матрикса роговицы, содержание воды в готовом материале для кератопластики становится не более 71 весовых % и материал более однороден по сравнению с нативной роговицей за счет уменьшения  в нем   обводненных прослоек между слоями коллагена, но сохраняет нативную слоистую структуру, которая обеспечивает достаточную прочность материала. Коллагеновые слои материала уплотняются за счет уменьшения расстояния между ними (фиг.3), что улучшает в дальнейшем качество фиксации за счет химического, термического или фото-кросслинкинга, проводимых на следующих этапах, повышает прозрачность и прочность материала. Физическая плотность или удельный вес материала не менее 1,3 г/см³. В дальнейшем это обеспечивает то, что при контакте с водой материал для кератопластики не мутнеет. В процессе кросслинкинга формируются равномерно распределенные межцепочечные ковалентные связи. Равномерность вновь образованных связей обусловлена регулярностью расположения в коллагеновой цепи аминокислот участвующих в процессе дальнейшего   кросслинкинга.   Кроме того, эта операция позволяет получить материал для кератопластики соизмеримый по толщине с роговицей реципиента, потому что после   кросслинкинга прессованный материал не набухает в послеоперационном периоде, что улучшает его способность к приживлению и исключает прорезывание хирургических швов. При этом материал характеризуется еще и тем, что в поверхностных слоях фибриллы коллагена расположены более хаотично, чем в его основной массе. Это обусловлено стеклованием поверхностных слоев материала и обеспечивает более высокие оптические качества предлагаемого материала. В результате материал приобретает дополнительно две зоны повышенной плотности коллагена на обеих поверхностях (фиг. 4, 5), его количество в поверхностных слоях выше, чем в средних слоях, что еще больше увеличивает не только прозрачность материала, но и его биосовместимость, так как слои повышенной плотности обладают повышенной защитной, барьерной функцией.
Работа с материалом осуществляется следующим образом. Материал для кератопластики в условиях стерильной операционной помещают на подложку и хирургическим трепаном или фемтосекундным лазером выкраивают трансплантат требуемых размеров. Затем трепанируют патологически измененную роговицу реципиента, помещают выкроенный по размеру материал для кератопластики в операционное ложе, накладывают направляющие швы держалки и ушивают материал по кругу узловыми или непрерывными швами (фиг.6).
Для пояснения сущности изобретения приводим примеры конкретного выполнения.
Пример № 1: Пациент С-а, 50 лет. Поступил в клинику с диагнозом: Гнойная язва роговицы ОД.  Первая попытка замещения пораженных гнойной язвой слоев роговицы свежим донорским материалом была безуспешна – материал полностью расплавился. Принято решение для повторной операции применить заявляемый материал для кератопластики.  Материал с содержанием воды 60% и плотностью 1,8 г/см³ использовали при замещении расплавленных слоев роговицы при ее гнойной язве. Прозрачность материала 60%. Трепаном выкроили из материала для кератопластики  трансплантат диаметром 7 мм, зачистили дно язвы, наложили 4 направляющих шва 9-0 и герметизировали трансплантат 12-ю узловыми швами 9-0. Через 2 недели  после кератопластики заявляемым  материалом наблюдается полная эпителизация поверхности материала для кератопластики, его интеграция и частичная васкуляризация. Приживление полупрозрачное.
Пример № 2.  В ветеринарную клинику обратились с собакой с посттравматическим гнойным кератитом. При осмотре: роговица мутная в центре дефект, десцеметоцеле. Осуществлено покрытие дефекта мороженной, неконсервированной донорской роговицей, через неделю покрытие расплавилось. Принято решение провести повторную пластику с материалом для кератопластики.   Материал использовали при замещении расплавленных слоев роговицы при ее гнойной язве. Трепаном выкроили из материала для кератопластики с содержанием воды 71% и плотностью 1,5 г/см³ трансплантат диаметром 6,5 мм. Прозрачность материала 50%. Материал на 10 % находится в стекловидном состоянии. Затем зачистили дно язвы, наложили 4 направляющих шва 9-0 и герметизировали трансплантат 12-ю узловыми швами 9-0. Веки животного зашили. Через 2 недели сняли швы с век, после кератопластики заявляемым материалом наблюдается полная эпителизация поверхности материала для кератопластики, его интеграция и частичная васкуляризация. Приживление полупрозрачное. Сняты роговичные швы, через неделю глаз спокоен, материал интегрировался в ткани глаза.
Пример № 3. Пациент Г-в, возраст 25 лет, обратился в клинику с диагнозом кератоконус левого глаза IV стадии. Острота зрения 0,05 с максимальной коррекцией.  При осмотре наружные слои роговицы в центре мутные, сохраняется прозрачность глубоких слоев роговицы. Принято решение провести замену наружных слоев роговицы материалом для кератопластики.   Материал использовали для глубокой послойной кератопластики. Прозрачность материала 90%. Трепаном выкроили из материала для кератопластики с содержанием воды 50% и плотностью 2,0 г/см³ трансплантат диаметром 7 мм, наложили 4 направляющих шва и непрерывный шов 10-0. Швы держалки удалили. Через 1 неделю наблюдается полная эпителизация поверхности материала для кератопластики, его интеграция. Приживление прозрачное, острота зрения без коррекции 0,9-1,0.
Пример № 4. Пациент Г-в, возраст 25 лет, обратился в клинику с диагнозом: ожоговые бельма обоих глаз. При осмотре: все слои роговицы в центре мутные, отмечается васкуляризация бельма. Острота зрения: движение руки у лица. Принято решение провести сквозную кератопластику материалом для кератопластики.  Трепаном выкроили из материала для кератопластики, содержащего 90% коллагена в стекловидном состоянии, трансплантат диаметром 7 мм, наложили 4 направляющих шва и непрерывный шов полипропиленом 10-0. Швы держалки удалили. Через 2 недели наблюдается полная эпителизация поверхности материала для кератопластики, его интеграция. Приживление прозрачное, острота зрения с коррекцией 0,4.