Бактерицидное противоожоговое биодеградируемое средство на основе фармацевтической композиции коллагена с лактоферрином, способы получения (варианты) и свойства
BACTERICIDAL ANTI-BURN BIODEGRADABLE AGENT BASED ON A COLLAGEN PHARMACEUTICAL COMPOSITION WITH LACTOFERRIN, METHODS OF PRODUCING (VERSIONS) AND PROPERTIES

Область техники.
Изобретение относится к медицине, а именно - к экспериментальной и клинической хирургии, трансплантологии, дерматологии, комбустиологии и может применяться в качестве раневого покрытия для лечения ожогов и комбинированных ран. Предлагается средство, названное «ЛАКТОКОЛ», выполненное в форме раневого покрытия. Для этого используется фармацевтическая композиция из коллагена и лактоферрина. Коллаген обеспечивает надежное укрытие раневой поверхности от внешнего инфицирования, способствует ускоренному заживлению ран, как биодеградируемый материал не требует удаления первичной повязки, а лактоферрин, обладающий бактерицидной активностью, препятствует развитию патогенных микроорганизмов, в том числе, антибиотикустойчивых, попавших на раневую поверхность в момент травматического воздействия. Предшествующий уровень техники.
Создание покровного материала для лечения ожогов различной степени и распространенности, а также комбинированных ран, имеет большую историю. Первостепенной при этом являлась задача защиты пораженной поверхности кожного дефекта, необходимой для эффективной борьбы с шоком, плазмопотерей и развитием вторичной инфекции от внешнего инфицирования. Однако до настоящего времени покрытия для лечения ожогов, недостаточно эффективны в случае инфицирования раневой поверхности в момент травмы.
Количество зарегистрированных раневых покрытий довольно велико: привычные текстильные материалы (марля, сетка, трикотаж, нетканое полотно), пленкообразующие композиции из искусственных материалов, губки, гидроколлоиды, гели, порошки, пасты, и др. Традиционные текстильные перевязочные материалы обеспечивают лишь надежную механическую защиту, но, поглощая раневое отделяемое, они становятся благоприятной средой для развития патогенной микрофлоры. Кроме того, они прилипают к ране, причиняют боль при смене повязки и т.д.
Принципиально новым методом лечения термических ожогов явилось использование синтетических материалов на основе различных полимеров. Они являются альтернативой перевязочным средствам на текстильной основе, поскольку хорошо защищают рану от внешних воздействий, моделируются на раневой поверхности, плотно к ней прилегают, обеспечивают требуемый парообмен и фиксируются на ране без применения специальных средств, кроме того, могут применяться вместе с некоторыми фитосредствами, или биологически активными неорганическими веществами. Наличие в их составе лекарственных белков, проблематично, а использование, в частности, лактоферрина, по техническим причинам практически невозможно. Поэтому синтетические повязки при проведении патентного поиска нами не рассматривались, за исключением тех, которые имели биологическую компоненту, например, содержали в своем составе коллаген.
Биологические покрытия для ожоговых ран - это самостоятельная группа повязок представлена широким спектром биологических материалов. В процессе патентного поиска мы рассмотрели известные биологические ожоговые повязки на предмет наличия в них каких-либо указаний на присутствие лактоферрина, в том числе, специально для повязок, созданных на основе коллагена.
Известно биологическое раневое покрытие из «обесклеточенной» кожи свиньи (Патент РФ №2478403). Технологическими недостатками этого биологического раневого покрытия являются его неудовлетворительные механические качества: плохая эластичность, трудности моделирования покрытия на ранах со сложным рельефом кожи, расширение после сушки кожных пор и, как следствие этого - ослабление трансдермального барьера. Данное изобретение отличается от заявляемого составом и способом получения.
Известно раневое покрытие «Коллахит» на основе коллаген-хитозанового комплекса (Патент RU №2108114). Данное раневое покрытие отличается по составу (не содержит лактоферрина), а также отличается по исполнению. Недостатком данного раневого покрытия является то, что оно не обладает бактерицидными и иммуномодулирующими свойствами, которые присущи лактоферрину.
Известно и другое раневое покрытие на основе коллаген-хитозанового комплекса (Патент RU №2254145). Изобретение применяется для лечения кожных дефектов. Оно представляет собой покрытие в виде губки, геля, коллоидного раствора, или пленки. Изобретение отличается по составу от заявляемого и не содержит бактерицидного белка лактоферрина.
Известно биодеградируемое раневое покрытие и способ его получения (Патент RU №2519158). Покрытие выполнено в виде пленки, содержит хитозан, глицерин, церулоплазмин, L-аспарагиновую кислоту. Недостатком является невозможность использования для лечения инфицированных ран. Данное покрытие отличается от заявляемого составом и способом получения.
Известен способ местного лечения ран с помощью биологической повязки, содержащей живые клетки линии диплоидных фибробластов человека (Патент №2526811). Способ предусматривает применение повязки, которая содержит полимерное основание из гидрофобной перфорированной кремнийорганической пленки, покрытой слоем коллагена типа I, и живых диплоидных клеток человека - фибробластов линии М-20. Данное раневое покрытие отличается по составу (не содержит лактоферрин), а также отличается по исполнению. Недостатком данного изобретения является то, что это раневое покрытие не обладает бактерицидным и иммуномодулирующим свойством, которые присущи лактоферрину.
Известна биорассасываемая матрица, состоящая из нативного, нереконструированного коллагена I, используемая для заполнения дефектов мягких и твердых тканей, в качестве имплантата, а также лечения, репарации или замещения ткани (Патент RU №2353397). Изобретение обеспечивает создание биорассасываемой коллагеновой матрицы, состоящей из нативного нереконструированного коллагена I типа, которая имеет структуру коллагеновых волокон, идентичную природной коллагенсодержащей ткани, обладает значительными прочностными свойствами и может служить в качестве матрицы для роста, направленной регенерации, улучшения трофики и структуры мягких и твердых тканей. Данное изобретение отличается от заявляемого применением (используется не для лечения ран, а для заполнения дефектов мягких и твердых тканей) и составом (не содержит лактоферрин), а также способом получения.
Известны пористые губки (авторское свидетельство СССР №561564) для лечения ран, созданные на основе коллагена, смеси желатина, хитозана и формальдегида (патент КНР №1097980); желатина и формальдегида с добавлением антибиотиков (патент РФ №2033149); целлюлозы и хитозана (патент JP 0376029); коллагена и хитозана (патент РСТ №8504413). Недостатком в использовании всех перечисленных раневых покрытий является низкая клиническая эффективность.
Известно использование прозрачной полиэтиленовой перфорированной пленки с нанесением на ее внутреннюю поверхность пудры, содержащей 95% талька и 5% смеси 11 антибиотиков и антисептика. Смесь дополнительно могла содержать порошок на основе водорастворимого кератина (белок, получаемый из шерсти) при равном соотношении компонентов смеси. Эта пленка имела весьма ограниченное использование вследствие отсутствие какого-либо типа фиксации и неравномерности распределения повязки на раневой поверхности, что приводило к нарушению правильности ее расположения и необходимости удаления из раны вместе с раневым отделяемым.
Известно изобретение (патент RU №2126693), в котором, помимо коллагена, в состав включен цитохром С, экстрагируемый из сердец крупного рогатого скота. Недостатком этого покрытия является то, что используется дефицитный природный материал, который не может широко применяться для получения раневых покрытий, кроме того, он не показал заявленной эффективности в клинических условиях.
Известно ранозаживляющее покрытие на основе коллагена и облепихового масла (патент RU №602185), названное «Облекол». В эксперименте, в условиях моделирования ран и язв, «Облекол» оказался эффективнее чистой коллагеновой пленки. Однако, при разного рода ранах, особенно осложненных инфекцией, при послеожоговых язвах, трофических язвах, пролежнях и других хронических повреждениях кожного покрова, облепиховое масло, как бактериостатик, было не эффективно. При использовании этого средства народной медицины требовалась дополнительная антибактериальная терапия. Назначение данной пленки по этим показаниям было признано нецелесообразным.
Известны раневые покрытия, содержащие коллаген и иные биологически активные субстанции. Например, стимулирующий рост тканей метилурацил (патент RU №2226406; Бегма А.Н. и др., 2014). Использование метилурацила совместно с коллагеном, в раневой хирурги распространения не получило. Коллагеновые пластины с метилурацилом не были рекомендованы для детей в возрасте до 3 лет, при беременности и во время периода лактации. Противопоказания к применению метилурацила были при гиперчувствительности к этому препарату, наличию в ране избыточных грануляций и индивидуальной непереносимости. Они были противопоказаны при комплексном лечении поверхностных повреждений у пожилых людей, когда воспроизводство собственного коллагена было снижено. Тогда метилурацил начали выпускать в виде свечей (суппозитории), таблеток и мазей.
Известна двухслойная пленочная система, показавшая хорошую стимулирующую способность к регенерации новой живой ткани (патент США US 5994325 A). Материал содержал в качестве верхнего слоя тонкую пленку из сшитого полидиметилсилоксана марки «Silastic Medical А», обладающую высокой проницаемостью для воды и кислорода. Нижний слой этого материала состоял из интерполимерного комплекса на основе коллагена и глюкозаминоглюкана-хондроитин-6-сульфата и был получен лиофильным высушиванием смеси растворов полимеров. Для улучшения процесса регенерации в этот нижний слой вводили клетки эндотелия. Недостатком покрытия являлось индивидуальная непереносимость отдельных компонентов.
Известна противоожоговая повязка КОЛЛОСТ - биопластический материал коллагенового происхождения (патент №2353397). Представляет собой сочетание коллагена, полученного из кожи крупного рогатого скота. Как утверждают авторы, этот материал практически идентичен коллагену человеческого организма, поэтому не вызывает отторжения. КОЛЛОСТ активно участвует в процессе регулирования уровня протеолитических ферментов, активирует остеокласты. Благодаря такому воздействию на организм, у пациентов значительно улучшаются и ускоряются регенеративные процессы - восстанавливается эпителиальная, эпидермальная и эндотелиальная ткани. В ходе исследований было выявлено, что представленный биологический материал способствует активации процесса синтезирования эндогенного коллагена.
В отличие от представляемой в настоящей заявке противоожоговой композиции «ЛАКТОКОЛ», противоожоговая мембрана КОЛЛОСТ, перед применением должна сначала проходить подготовительный этап (необходимо поместить ее в раствор натрия хлорида (стерильный) для размягчения). Если имеются показания к проведению антибиотикотерапии, то указанный раствор заменяется на антибиотики или антисептики - это может быть связано, например, с имеющимися гнойными процессами в очаге поражения. После того как мембрана будет размягчена, специалист должен точно определить ее необходимый размер - нельзя допускать, чтобы данным материалом были покрыты здоровые участки кожи. Но, в тоже время, необходимо придерживаться правила «2 см» - края материала должны «обхватывать» границы пораженного участка. После накладывания и закрепления мембраны КОЛЛОСТ, рану покрывают стерильной повязкой. Нельзя допускать полного высыхания перевязочного материала, поэтому необходимо наложить повязку с использованием любого подходящего раствора - например, антибиотика, антисептика. Противоожоговая повязка КОЛЛОСТ лишена основных главных преимуществ «ЛАКТОКОЛА», который может использоваться без какой-либо предварительной подготовки для обработки бытовых, производственных и военных ожоговых поражений и несет в своем составе белок лактоферрин, обладающий универсальным бактерицидным действием против широкого круга патогенных микроорганизмов, в том числе и антибиотикустойчивых.
Известно использование «напыления» на раневую поверхность порошка лактоферрина, однако при этом еще потребуется укрытие раны от внешнего инфицирования, а затем травмирующее снятие этого покрытия, которое может быть выполнено и на основе коллагена, или иного покровного материала, для того, чтобы обеспечить введение новых порций лактоферрина, по мере начала развития внутренней раневой инфекции [TakayamaY1, et.al., 2012).
Таким образом, технических решений, совпадающих с совокупностью существенных признаков заявляемого изобретения, из уровня техники не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности, как «новизна».
Термины и определения
Под термином «раневое покрытие» подразумевается любое покрытие на рану, традиционно используемое в рутинной медицинской практике, выбранное из группы, не ограничивающей представленное изобретение: гели; перевязочные пакеты; лечебные салфетки; пластыри (фиксирующие и покровные); тампоны; пластины; лечебные губки, в т ч желатиновые абсорбируемые, желатиново-крахмальные, коллагеновые, альгинатные (альгипор); иные специализированные повязки и приемлемые аппликативные формы для применения на раневых поверхностях.
Под термином «лактоферрин» подразумевается полноразмерный высокоочищенный белок лактоферрин, полученный из природного сырья (женское молоко, коровье молоко), либо «Неолактоферрин», выделенный из молока генно-инженерных коз. В последнем случае он представлен комплексом лактоферринов козы (10%) и биоаналога лактоферрина человека (90%).
В настоящей заявке на изобретение под термином «коллаген» подразумевается высокоочищенный белок коллаген природного происхождения фармацевтически приемлемого качества, I, III и других типов.
Краткое описание фигур, чертежей.
Фигура 1. Кривая высвобождение лактоферрина из коллагенового материала. Фигура 2. Кривая роста штамма - клинического изолята Staphylococcus aureus при использовании коллагеновых пластин с разными концентрациями лактоферринов (бычьего - bLf, или «Неолактоферрина» - hLf)
Основание для осуществления изобретения.
В ранее предложенных для покрытия утраченного кожного покрова при ожогах, химических и механических, открытых и закрытых травмах применяли различные биологические материалы: аллогенную кожу, амниотическую оболочку плода, кожу животных, а также фрагменты отделов кишечника и брюшины, комбинированные синтетические и биологические материалы. Широкого практического применения в хирургической клинике для лечения ожогов они не получили.
Самостоятельным противомикробным лечебным эффектом такие материалы не обладают. Между тем, наличие в покровном материале средств с бактерицидным действием, жизненно необходимой, как в остром периоде ожогового поражения, так и при лечении труднозаживающих, особенно открытых ран. В связи с этим, возникла идея создания принципиально нового покровного биодеградируемого материала для лечения ожогов на основе коллагена и бактерицидного белка лактоферрина.
В авторском коллективе, участников настоящей разработки (Институт биологии гена РАН, Первый московский государственный медицинский университет им. Сеченова) в разное время были проведены научно-исследовательские работы, которые в представленной заявке на изобретение были объединены в противоожоговое покрытие «Лактокол».
Кроме того, в ожоговом Центре НИИ скорой помощи им. Склифосовского, был накоплен положительный опыт использования в качестве покровного материала для ожоговых ран коллагеновых повязок, которые в клинических условиях продемонстрировали противовоспалительное действие, стимуляцию репаративных процессов в ранах, ускорение роста и созревания грануляционной ткани и эпитализации. На основании этих исследований были получены два патента (патенты RU №2314129, RU №2455997).
Несмотря на относительную популярность, сам коллаген, к сожалению, не обладает бактерицидными свойствами, что существенно снижало область применения таких раневых покрытий, особенно инфицированных ожоговых ран. Такими свойствами обладает белок природного происхождения лактоферрин. Он демонстрирует широкий спектр биологических активностей, наибольшую ценность из которых представляют его бактерицидные и иммуномодулирующие свойства.
Бактерицидные свойства лактоферрина связаны с тем, что он аккумулирует железо, которое необходимо для жизнедеятельности патогенных бактерий (в природных жидкостях насыщенность лактоферрина железом составляет 12-15%), разрушает полисахаридную оболочку как грамм-отрицательных, так и грамм-положительных бактерий. При этом лактоферрин эффективен также против антибиотикустойчивых форм патогенных микроорганизмов. У бактерий отсутствуют генетические механизмы адаптации к этому белку. Кроме того, лактоферрин в разы усиливает действие антибиотиков на патогенную микрофлору (Drago-Serrano et al., 2017; Femandes & Carter, 2017; Giansanti et al., 2016; Bruni et al., 2016).
В нашей стране первые исследования биологических активностей лактоферрина были начаты девяностые годы прошлого века в Московском онкологическом институте им. Герцена, где исследовался природный лактоферрин человека полученный из женского молока. Он не мог иметь промышленного значения из-за дефицита женского молока, а в настоящее время запрещен к клиническому использованию (Приложение 5а к СанПиН 2.3.2.1078-01, утвержденным Постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 14 ноября 2001 г. N 36) по причине возможности передачи инфекционной патологии: Спид, гепатит. В настоящее время не производится.
Лактоферрин, полученный из коровьего молока промышленно выпускается в ряде стран и для этого белка был разработан способ его получения и очистки, делающего его пригодным для наружного использования (патенты RU 2579661, RU 2390253, RU 2634859).
В Институте биологии гена РАН, впервые в мировой практике была разработана опытно-промышленная технология получения биоаналога лактоферрина человека (патенты RU №2491343, №2553515, №2554742), для которого была показана его идентичность природному белку человека и его биобезопасность. Лактоферрин стимулирует клетки иммунной системы (Черноусов А.Д. и др., 2013), что способствует усилению естественного иммунитета. Известно, что на начальной стадии воспалительного раневого процесса лактоферрин вызывает повышение производства провоспалительных цитокинов, что усиливает инфильтрацию нейтрофилов и макрофагов в очаги пораженных тканей. При этом, наряду с обеспечением противовоспалительного эффекта, нейтрализуется избыточный естественный иммунный ответ (D. Legrand, 2016). Лактоферрин способствует активации образования грануляционной ткани, ангиогенеза и реэпитализации тканевого дефекта путем усиления пролиферации и миграции фибробластов и кератиноцитов. В последнее десятилетие представление о физиологической роли лактоферрина существенно пополнились, и его стали рассматривать не только как противоинфекционный агент, но и как многофункциональный фактор тканевой дифференцировки и активации клеток. Эти свойства лактоферрина на клеточном уровне реализуются, по крайней мере, за счет нескольких механизмов. Во-первых, при непосредственном проникновении лактоферрина в клетки-предшественники за счет протеиновой части рецептора к липидам низкой плотности (LPR1) (Curran CS et.al., 2006;), во-вторых, при воздействии лактоферрина на активационные киназы (МАРК) и, наконец, активация клеток происходит при взаимодействии лактоферрина с Toll-рецепторами или их функциональными аналогами - рецепторами «молекул опасности» (Oh SM et.al., 2004).
В связи тем, что активация лактоферрином влияет на пролиферацию и дифференцировку клеток различного происхождения, биологическая активность лактоферрина может быть эффективно использована для обеспечения сложного и динамического процесса заживления ран, который требует регулирования взаимодействия различных типов клеток, в том числе, нейтрофилов, макрофагов иммунных клеток, кератиноцитов, фибробластов и эндотелиальных клеток (Садчиков П.Е. и др., 2016). Тонкий молекулярный механизм проявления биологических активностей лактоферрина до конца не изучен. Предполагают, что он взаимодействует со специфическими тканевыми и клеточными рецепторами (Rosa L. et.al., 2017).
В Институт регенеративной медицины Первого московского государственного медицинского университета им. Сеченова был накоплен большой опыт создания коллагеновых пластин (патенты RU 2396984, RU 2127128, RU 2287333, RU 2314129, RU 2455997, RU 2385726, RU 2308960).
Заживление раны начинается с гемостаза и сопровождается воспалительной фазой, при которой происходит нейтрализация попавших в рану бактерий и очищение ее от остатков пораженных клеток и внеклеточных фрагментов матрицы кожи, посредством инфильтрации нейтрофилов и макрофагов в раневую область. Результаты исследований на животных свидетельствует о том, что местное введение лактоферрина увеличивает скорость заживления ран кожи у взятых в эксперимент здоровых мышей с травматическими воздействиями и диабетическими язвами за счет увеличения производства противоспалительных цитокинов, которые усиливают естественную инфильтрацию нейтрофилов и макрофагов в раневую область. Из разрушающихся нейтрофилов в рану выделяется содержащийся в них лактоферрин реципиента. Сочетанность действия эндогенного и экзогенного лактоферрина способствует очищению раны от попавших в нее при травме бактерий, предупреждая развитие инфекционного процесса. Затем начинается пролиферация кератиноцитов и миграция их в раневую область, завершающаяся постепенным закрытием раневого дефекта (Pattamatta et al., 2013; Takayama & Aoki, 2012; Tang et al., 2010; Weinberg, 2007).
При язвах - одного из наиболее распространенных разрушительных осложнений диабета, в условиях хронического течения процесса заживления раны, возникает чрезмерная воспалительная реакция, присоединение бактериальной инфекции, что часто приводит к гангрене и необходимости ампутации стопы. В рандомизированных клинических исследованиях показано, что лактоферрин ускоряет заживление раневого дефекта (Lyons et al., 2007). Аналогичный эффект отмечен и в других исследованиях (Engelmayer & Varadhachary, 2003; Engelmayer et al. 2008;  et al., 2015). Показано, что применение лактоферрина на биопленках является удачным вариантом в случае его аппликативного использования (Ammons &  2013).
Предлагаемая в настоящей заявке фармацевтическая композиция, содержащая коллаген с лактоферрином, представляет собой раневое покрытие, которое, как установлено, постепенно лизируется (биодеградирует) и постепенно высвобождает включенный в его состав лактоферрин. За счет этого биологически активного бактерицидного белка стимулируются процессы ранозаживления и обеспечивается антибактериальный эффект. Источником природного лактоферрина является молоко животных, или полученный биотехнологическим путем биоаналог лактоферрина человека. Созданы технологии позволяющие производить этот белок из биологического сырья промышленным способом, что открывает возможность его широкого медицинского использования.
Лактоферрин обладает комплексом биологических свойств, ускоряющих процессы заживления ран, и одновременно проявляет высокую антибактериальную активность. Он не токсичен, не вызывает морфологических и биохимических изменений крови, не проявляет эмбрионотоксического и тератогенного действия, что позволило считать его биологически безопасным для использования у детей и взрослых.
Для придания других фармакологических свойств в состав коллагенового покрытия дополнительно можно будет вводить соответствующие биологически активные или лекарственные вещества, дополнительные антисептики и др., благодаря отсутствию противопоказаний его какой-либо возможной несовместимости с ними.
При обширных поверхностных ожогах IIIa степени (площадь ожогов более 20% поверхности тела) течение раневого процесса чревато возникновением гнойных осложнений, расплавлением струпа, интоксикацией, развитием ожоговой болезни, когда под влиянием бактериальной инвазии погибают придатки кожи - источники ожидаемой эпителизации, что требует других подходов к лечению ожоговых ран.
Известны средства для лечения ран, основой которых является коллаген, например, коллагеновые губки, разнообразные повязки на основе коллагена с добавлением антисептиков (Г.И. Назаренко и др., 2002). Однако эти повязки имеют ограниченное применение из-за недостаточности клинической эффективности, особенно при лечении ожоговых ран.
Наиболее близким техническим решением является способ лечения ожогов IIIa степени с помощью повязок из нативного коллагена на перфорированных пленочных покрытиях (Р.Д. Бодун, кан. дисс. «Применение биопокрытия с дермальным нативным коллагеном при лечении ожогов II-III степени», Саратов, 2004). При лечении такой повязкой эпителизация ожоговых ран наступает на 15-16 сутки после травмы и на 5-6 суток раньше, чем происходит самостоятельная эпителизация раны.
Описание изобретения
Задачей настоящего изобретения является разработка нового раневого покрытия, для целей ускорения процессов ранозаживления за счет ускорения эпителизации и одновременно обладающего бактерицидными свойствами.
В качестве основы для раневого покрытия предлагается фармацевтическая композиция, состоящая из коллагена и лактоферрина, в эффективном количестве при следующем соотношении (масс. %): лактоферрин 3,0-10,0%, коллаген 90,0-97,0%. Данное средство (предлагаемое торговое наименование «ЛАКТОКОЛ») может применяться для лечения ожогов, комбинированных ран, язв. Оно может обеспечить защиту открытой раны от внешнего инфицирования, а содержащийся в нем лактоферрин, постепенно выходя в рану, будет препятствовать развитию в ней инфекционного процесса, способствовать стимуляции активности клеток иммунной системы и эпителизации раневого дефекта.
Средство «ЛАКТОКОЛ» обладает следующими основными свойствами:
• Сохраняются физико-химические параметры лактоферрина и его исходная биологическая активность.
• Установлена оптимальная концентрация используемого лактоферрина.
• Выход бактерицидного лактоферрина в рану происходит постепенно, в течение первых суток при промокании «ЛАКТОКОЛА» раневым экссудатом.
• Запаянное в пластиковую оболочку, сохраняет свои биологические свойства не менее двух лет. При хранении в сухом виде в диапазоне температур 4-25°С.
• Благодаря своей эластичности (гибкости) повторяют форму раневой поверхности.
Технический результат заключается в том, что впервые получено раневое покрытие (средство «ЛАКТОКОЛ»), которое обладает ранозаживляющим и бактерицидным свойством. Оно обеспечит сокращение срока заживления ран, удобно в практическом использовании, обеспечивает длительное его сохранение, не имеет противопоказаний и биобезопасно. Разработана система микробиологического контроля качества средства «ЛАКТОКОЛ».
Идея создать покровный материал для ран на основе коллагена и лактоферрина оказалась революционной. Были известно, что многие белки имеют тенденцию к агрегации с макромолекулами коллагена, но часто эти процессы бывают необратимыми и зависят от природы белков, их концентрации, типа растворителя, солей, ионов металлов, кислот, оснований, показателя рН, температуры и других факторов. В случае с лактоферрином этого не случилось. Напротив, была обнаружена возможность диссоциации лактоферрина, скорость высвобождения которого зависит от скорости резорбции коллагеновой основы в ране, под влиянием промокания экссудатом. Высвобождаемый лактоферрин сохраняет присущие ему противомикробные и противогрибковые свойства.
Заявляемые признаки, предопределяющие получение вышеуказанного технического результата, явно не следуют из уровня техники, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности, как «изобретательский уровень».
Условие патентоспособности «промышленная применимость» подтверждено на примерах конкретных исследований, которыми заявляемое изобретение проиллюстрировано, но не исчерпано.
Примеры осуществления изобретения
Пример 1. Способ получения фармацевтической композиции и средства «ЛАКТОКОЛ» (вариант 1)
К 1 кг 1% раствора диспергированного коллагена добавляют 3,0-10,0% лактоферрина (300-1000 мг лактоферрина), растворенного в 100 мл дистиллированной воды. Концентрация лактоферрина 10% определяется его максимальной бактерицидной активностью, а нижний предел 3,0% определяется минимальным бактерицидным эффектом. Перемешивают до получения однородной массы. Полученную смесь разливают в кюветы с толщиной слоя 7-9 мм и помещают в камеру сублимационной сушки.
Далее получают само изделие, содержащее фармацевтическую композицию, для раневого покрытия. Для этого проводят замораживание полученного продукта до температуры -25°С, следует сублимационная сушка при вакууме 0,1 мм ртутного столба и температуре конденсатора -60°С. Продолжительность сушки в указанных условиях составляет 24 часа, с последующей досушкой при температуре 45°С. Полученное изделие в виде сухой губки разрезают на пластины 90×90 мм или другие приемлемые размеры и упаковывают в двойные полимерные пакеты, стерилизуют облучением дозой 25 кГр.
Стерильные коллагеновые губки с лактоферрином представляют собой раневое покрытие, готовое к медицинскому применению.
Пример 2. Способ получения фармацевтической композиции и средства «ЛАКТОКОЛ» (вариант 2)
К 1 кг 1% раствора диспергированного коллагена добавляют 300 мг лактоферрина, растворенного в 100 мл дистиллированной воды и 50 мг глутарового альдегида. Перемешивают. Далее осуществляют те же технологические приемы, как в примере 1.
Структурирование сухой губки глутаровым альдегидом с последующим удалением несвязанных альдегидов повышает сроки рассасывания коллагена и высвобождения лактоферрина. Глутаровый альдегид способствует также получению пластины более высокой плотности, которую удобно накладывать на рану.
Пример 3. Способ получения фармацевтической композиции и средства «ЛАКТОКОЛ» (вариант 3)
Полученную в Примере 1 сухую губку помещают в пары формальдегида и выдерживают 4 час при температуре 20°С. Губку переносят в вакуум камеру и выдерживают 24 часа до отсутствия в губках свободного формальдегида. Как и в примере 2, структурирование сухой губки формальдегидом с последующим удалением несвязанных альдегидов повышает сроки резорбции коллагена и высвобождения лактоферрина.
Пример 4. Оценка времени высвобождения лактоферрина из фармацевтической композиции и средства «ЛАКТОКОЛ»
3
Полученные как в Примерах 1,2 и 3 сухие губки размером ~1 см, содержащие по 20 мг лактоферрина, помещают в цилиндрические пробирки с 1 мл фосфатного буфера с добавлением 0,01% твина 20 (детергента) и выдерживают при 37°С. Отбирают пробы через 2, 4, 8, 20 часов инкубирования с перемешиванием жидкой фазы при отборе проб. Концентрацию белка в растворе определяют по Бредфорду. Калибровка осуществляется по чистому лактоферрину, растворенному в фосфатном буфере с добавлением 0,01% твина 20 (детергента) (Фиг. 1).
Скорость высвобождения лактоферрина зависит от скорости резорбции коллагеновой основы, под влиянием промокания. В экспериментальных условиях это время растягивалось до 24 часов.
Пример 5. Оценка противомикробной и противогрибковой активности фармацевтической композиции и средства «ЛАКТОКОЛ»
Оценка противомикробной активности в качестве примера, приведена в отношении штамма - клинического изолята Staphylococcus aureus. Выделение и культивирование штамма микроорганизма проводили в соответствии с использованием известного стандартного протокола (Давыдова с соавт., 2013). Для сохранности жизнеспособных микроорганизмов в процессе их транспортировки в лабораторию использовали транспортную среду М306 Stuart Transport Medium (Himedia, In.). Первичный посев осуществляли на питательную среду M144 (Himedia, In.) с добавлением крови. Посевы помещали в термостат при 37оС на 48 часов и в анаэростат на 7 суток.
После получения и идентификации чистых культур, в экспериментальной части использовали биореактор «Реверс-Спиннер RTS-1» (BioSan, Латвия). Данная система предназначена для культивирования микроорганизмов и оценки их роста в режиме реального времени. Интерпретацию результатов проводили по изменению оптической плотности OD при длине волны λ=850 нм. Для культивирования микроорганизмов в биореакторе использовались жидкие питательные среды Brain Heart Infusion Broth (M210) производства HiMedia Laboratories Pvt. Limited (In.). Для получения воспроизводимых результатов для биореактора использовали пробирки 50 мл по типу Falcon с крышкой без мембраны (BioSan, Латвия).
Определение чувствительности выделенных штаммов микроорганизмов осуществляли с помощью метода серийных разведений, разработанной на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии МГМСУ им. А.И. Евдокимова, которая заключалась в следующем. Исследуемые агенты (коллагеновые пластины, содержащие лактоферрин), разводили в 10 мл питательной среды, которая в дальнейшем использовалась для культивирования микроорганизмов. Общий объем в каждой пробирке доводили до 20 мл. Соответственно густота взвеси до начала эксперимента составляла 102 КОЕ/мл, что примерно соответствовало оптической плотности OD 0,2.
Для микроорганизмов использовались свои настройки биореактора:
-1
-1
Staphylococcus aureus (Temperature: 37°С; RPM: 1600 min; Measurement freq.: 3 h; Rev. Spin period: 3 sec; Volume: 20 ml λ,: 850 nm)
Для культивирования микроорганизмов в биореакторе использовали пробирки 50 мл с мембранным фильтром (TubeSpin, SW).
Расчетные показатели проб лактоферрина, используемые в ходе эксперимента следующие: четыре образца коллагеновых пластин, содержащих, соответственно, по 0,04 г и по 0,08 г лактоферрина из коровьего молока (bLf) и биоаналога лактоферрина человека из молока генноинженерных коз (hLf), в виде кубика коллагеновой пластины (V=1 см3).
Для каждого эксперимента, отдельно, в стерильных пробирках объемом 15 мл, готовили бактериальную взвесь в общем количестве 5 мл. Оптическую плотность полученной взвеси, измеряли с помощью денситометра DEN-1B (BioSan, Латвия), которая для каждого эксперимента составила 2,82±0,3 McF.
В каждом эксперименте проводили культивирование в пяти разных пробирках:
I проб. - Контроль роста;
II проб. - микробная взвесь Staphylococcus aureus+0,04 г hLF измельченного;
III проб. - микробная взвесь Staphylococcus aureus+0,08 г hLF измельченного;
IV проб. - микробная взвесь Staphylococcus aureus+0,04 г bLF измельченного;
V проб. - микробная взвесь Staphylococcus aureus+0,08 г bLF измельченного.
Для осуществления культивирования, в каждую пробирку объемом 50 мл, добавляли 20 мл питательной среды и вносили заранее подготовленную бактериальную взвесь в количестве 0,5 мл, затем в пробирки II, III, IV, V добавляли измельченный кубик лактоферрина и плотно закрывали крышкой.
Исследование динамики роста микроорганизмов проводили в четырех параллелях, что отражалось на графиках кривых роста бактериальных популяций в присутствии пластин с bLf и hLf. В качестве контроля оценивали рост бактерий, который характеризовался наступлением короткой лаг-фазой (до 2 часов), ускоренный рост практически сразу перешел в экспоненциальную фазу, и к 4-ому часу культивирования скорость бактериального прироста значительно выросла. В присутствие коллагена с bLf (II и III) и hLf (IV и V) скорость прироста бактериальных популяций существенно снизилась. Был отмечен плавный переход в стационарную фазу на 14 час культивирования. Общее время культивирования для всех образцов - 36 часов (Фиг 1).
Дополнительно проводили оценку бактерицидной и антигрибковой активности полученных коллагеновых пластин с лактоферрином в отношении Str. agalactiae и С.albicans. Аналогично результатам вышеописанного эксперимента, пластины с лактоферрином также демонстрирует видимую ингибирующую активность.
Таким образом, микробиологический анализ подтвердил, что лактоферрин, высвобождаемый при, оказывают заметный антибактериальный эффект, что необходимо в процессе заживления ран и ожогов, особенно инфицированных.
Таким образом, анализ конкретных примеров использования фармацевтической композиции коллагена с лактоферрином по заявляемому техническому решению, а также сопоставление результатов тестов с таковыми у известных технических решений, позволяет утверждать, что заявляемое средство «ЛАКТОКОЛ» обладает высокими антисептическими свойствами в отношении подавляющего большинства грамположительных и грамотрицательных бактерий, фунгицидными свойствами в отношении грибов и обеспечивает эффективный антибактериальный эффект за счет лактоферрина, высвобождаемого при резорбции коллагеновой губки, что необходимо в процессе заживления ран и ожогов, особенно инфицированных. Также заявляемое средство «ЛАКТОКОЛ» является достаточно доступным по экономическим соображениям.
Источники информации, принятые во внимание при составлении заявки:
1. Бегма А.Н. и др. Опыт применения коллагеновых повязок и губок Метуракол в хирургической практике. «РМЖ», 2014, №17, с. 1248.
2. Takayama Yl, Aoki R., Roles of lactoferrin on skin wound healing, Biochem Cell Biol. 2012 Jun; 90(3):497-503. doi: 10.1139/o11-054. Epub 2012 Feb 14].
3. Drago-Serrano ME, Campos-Rodriguez R, Carrero JC, de la Garza M. Lactoferrin: Balancing Ups and Downs of Inflammation Due to Microbial Infections. Int J Mol Sci. 2017 Mar 1; 18(3).
4. Fernandes KE, Carter DA. The Antifungal Activity of Lactoferrin and Its Derived Peptides: Mechanisms of Action and Synergy with Drugs against Fungal Pathogens. Front Microbiol. 2017 Jan 18; 8:2.
5. Giansanti F, Panella G, Leboffe L, Antonini G. Lactoferrin from Milk: Nutraceutical and Pharmacological Properties. Pharmaceuticals (Basel). 2016 Sep 27; 9(4).
6. Bruni N, Capucchio MT, Biasibetti E, Pessione E, Cirrincione S, Giraudo L, Corona A, Dosio F. Antimicrobial Activity of Lactoferrin-Related Peptides and Applications in Human and Veterinary Medicine. Molecules. 2016 Jun 11; 21(6).
7. Черноусов А.Д., Никонова М.Ф., Шарова Н.И., Митин А.Н., Литвина М.М., Садчиков П.Е., Гольдман И.Л., Ярилин А.А., Садчикова Е.Р. (2013) Неолактоферрин как стимулятор врожденного и адаптивного иммунитета. Acta Naturae. 5: 78-84
8. D. Legrand, Overview of lactoferrin as a natural immune modulator, J. Pediatr. 173 (Suppl) (2016) S10-15.
9. Curran CS, Demick KP, Mansfield JM. Lactoferrin activates macrophages via TLR4-dependent and -independent signaling pathways. Cell Immunol. 2006; 242(1):23-30.
10. Садчиков П.Е., Гольдман И.Л., Разин С.В., Черноусов А.Д., Алексеева Л.И., Садчикова Е.Р. Молекулярный механизм влияния лактоферрина на костеобразование. Критический обзор. Остеопороз и остеопатии. 2016; 3:12-22.
11. Oh SM, Руо CW, Kim Y, Choi SY. Neutrophil lactoferrin upregulates the human p53 gene through induction of NF-kappaB activation cascade. Oncogene. 2004; 23(50):8282-9.
12. Rosa L., Cutone A., Lepanto MS., Paesano R., Valenti P. Lactoferrin: A Natural Glycoprotein Involved in Iron and Inflammatory Homeostasis. Int J Mol Sci. 2017 Sep 15; 18(9). pii: E1985. doi: 10.3390/ijms18091985.
13. Pattamatta U, Willcox M, Stapleton F, Garrett Q. Bovine lactoferrin promotes corneal wound healing and suppresses IL-1 expression in alkali wounded mouse cornea. Curr Eye Res. 2013 Nov; 38(11):1110-7.
14. Takayama Y, Aoki R. Roles of lactoferrin on skin wound healing. Biochem Cell Biol. 2012 Jun; 90(3):497-503.
15. Tang L, Cui T, Wu JJ, Liu-Mares W, Huang N, Li J. A rice-derived recombinant human lactoferrin stimulates fibroblast proliferation, migration, and sustains cell survival. Wound Repair Regen. 2010 Jan-Feb; 18(1):123-31.
16. Weinberg ED. Antibiotic properties and applications of lactoferrin. Curr Pharm Des. 2007; 13(8):801-11Lyons ТЕ, Miller MS, Serena T, Sheehan P, Lavery L, Kirsner RS, Armstrong DG, Reese A, Yankee EW, Veves A. Talactoferrin alfa, a recombinant human lactoferrin promotes healing of diabetic neuropathic ulcers: a phase 1/2 clinical study. Am J Surg. 2007 Jan; 193(l):49-54.
17. Engelmayer, J, Varadhachary, A. Properties and Application of Recombinant Human Lactoferrin to Enhance Healing of Diabetic Wounds. Wounds. 2003; 15(9).
18. Engelmayer J, Blezinger P, Varadhachary A. Talactoferrin stimulates wound healing with modulation of inflammation. J Surg Res. 2008 Oct; 149(2):278-86. Ammons MC,  Mini-review: Lactoferrin: a bioinspired, anti-biofilm therapeutic. Biofouling. 2013; 29(4):443-55.
19.  AJ, Gluud C, Nicola S, Simancas-Racines D, Reveiz L, Oliva P,  J. Growth factors for treating diabetic foot ulcers. Cochrane Database Syst Rev. 2015 Oct 28; (10).
20. Г.И. Назаренко, И.Ю. Сугурова, С.П. Глянцев, «Рана. Повязка. Больной», М., Медицина, 2002
21. Р.Д. Бодун, кан. дисс. «Применение биопокрытия с дермальным нативным коллагеном при лечении ожогов II-III степени», Саратов, 2004.
22. Давыдова М.М., Плахтий Л.Я., Царев В.Н. Методы микробиологического исследования, применяемые в стоматологии // в кН. Микробиология, вирусология иммунология полости рта / под ред. Проф. В.Н. Царёва. - М.: ГЭОТАР-Медиа. - 2013. - С. 223-268).