ВАКЦИННЫЙ ШТАММ ВИРУСА ГРИППА В/60/ВИСКОНСИН/2010/125
VACCINATING INFLUENZA VIRUS STRAIN B/60/WISCONSIN/2010/125

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в практическом здравоохранении для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма вируса гриппа типа В, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus В, В/60/Висконсин/2010/125.
В результате появления в циркуляции нового эпидемического штамма вируса гриппа, принадлежащего к антигенной линии Ямагата - В/Висконсин/1/2010, известный вакцинный штамм В/60/Брисбен/08/83 антигенной линии Виктория - прототип [Патент РФ №2422517, опубл. 27.06.2011. БИ №18] - утратил антигенную актуальность и вследствие этого не может вызвать защитную реакцию во время эпидемии, вызванной В/Висконсин/1 /2010-подобными штаммами вируса гриппа.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма В/Висконсин/1/2010 для живой гриппозной вакцины на основе эпидемического вируса актуальной антигенной разновидности. Вакцина должна быть пригодна для взрослых и для детей, то есть соответствовать нормативным требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП Р№003224/01-050210 на живую гриппозную вакцину для интраназального применения. Для его подготовки были использованы два родительских штамма вируса гриппа: эпидемический штамм вируса гриппа линии Ямагата - В/Висконсин/1/2010 и безвредный для человека холодоадаптированный донор аттенуации В/СССР/60/69.
Применяемые в настоящее время штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации (рекомбинации) эпидемически актуальных вирусов с холодоадаптированными штаммами - донорами аттенуации [Александрова Г.И. Применение метода генетической рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа. Вопр. вирусол. 1977. №4. С.387-395].
Донор аттенуации В/СССР/60/69 - холодоадаптированный (ca) и температурочувствительный (ts) штамм вируса гриппа, разрешенный для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л.,1968. С.66-83]. Донор аттенуации В/СССР/60/69 был получен из эпидемического вируса гриппа В/СССР/69 методом холодовой адаптации [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. СПб.: Наука. 1994. 151 с.], в результате чего он стал безвредным для человека, т.е. приобрел способность бессимптомно размножаться в верхних дыхательных путях привитых лиц, вызывая выработку полноценного противовирусного иммунитета.
Цель реассортации - получить штамм с вакцинной формулой генома 6:2. Обычно гены, кодирующие поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального циркулирующего эпидемического (пандемического) штамма, а шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, M, NS) - от безвредного донора аттенуации.
Важным в создании каждого нового вакцинного штамма является, чтобы этот новый по составу двух генов (гемагглютинина и нейраминидазы) штамм приобрел свойства, присущие вакцинным штаммам для живой гриппозной вакцины. Для этого необходимо получить чистый клон с формулой генома 6:2 с сочетанием следующих полезных признаков: температурочувствительность и холодоустойчивость репродукции в развивающихся куриных эмбрионах и аттенуацию (безвредность) для лабораторных животных.
Получение вакцинного штамма. Вакцинный штамм В/60/Висконсин/2010/125 получен методом генетической реассортации эпидемического вируса В/Висконсин/1/2010 с донором аттенуации В/СССР/60/69 путем одновременного инфицирования развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах, с последующей трехкратной селекцией клонов с заданными свойствами при пониженной до 25°С температуре инкубации в присутствии антисыворотки к донору аттенуации. Клоны дополнительно очищены пятикратным клонированием методом предельных разведений в присутствии антисыворотки к донору аттенуации при пониженной (25°С) и оптимальной (32°С) температурах инкубации. Чистые клоны проверены по фенотипическим характеристикам (ts- ca-фенотип) и по формуле генома на соответствие требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам.
Для анализа состава генома полученных реассортантов использовали следующие методы:
а) Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА), позволяющую определить принадлежность поверхностного антигена - гемагглютинина (НА) одному из родительских вирусов, то есть установить специфичность вакцинного штамма [Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа. МУК 3.3.2.1758-03].
б) Микс-ПЦР анализ ДНК копий генов [Киселева И.В. с соавт. Анализ состава генома штаммов сезонной и пандемической живой гриппозной вакцины. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011. №4. С.29-36], основанный на различиях в размерах соответствующих амплифицируемых фрагментов генов донора аттенуации или «дикого» вируса.
Для каждого фрагмента генома эпидемического штамма вируса гриппа В/Висконсин/1/2010 и донора аттенуации В/СССР/60/69 были подобраны пары праймеров, специфичных соответственно только для донора аттенуации или только для вируса «дикого» типа (табл.1).
Таким образом, «да-нет» результаты, регистрируемые в электрофорезе ПЦР-продуктов, позволяют четко установить принадлежность исследуемого гена и оценить степень чистоты вакцинного препарата.
Амплифицированные фрагменты ДНК визуализировали электрофорезом в 1.7%-ном агарозном геле, содержащем 0.5 мкг/мл этидиума бромида. Это позволило четко дифференцировать принадлежность генов исследуемого реассортантного штамма к эпидемическому вирусу гриппа В В/Висконсин/1/2010 или донору аттенуации В/СССР/60/69.
Антигенная характеристика вакцинного штамма. Гемагглютинин (НА) полученного авторами вакцинного штамма В/60/Висконсин/2010/125 в РТГА идентичен эпидемическому вирусу В/Висконсин/1/2010, антисывороткой к которому полностью нейтрализуется. Микс-ПЦР методом установлено, что вакцинный штамм В/60/Висконсин/2010/125 унаследовал нейраминидазу (NA) - от эпидемического вируса В/Висконсин/1/2010.
Таблица 1. Праймеры, использованные для анализа генома реассортантного вакцинного штамма В/60/Висконсин/2010/125, полученного при скрещивании эпидемического вируса гриппа В/Висконсин/1/2010 с донором аттенуации В/СССР/60/69.
Ген
Вирус
Позиция нуклеотида<sup>3</sup>
Длина фрагмента
Прямой праймер (F)
Обратный праймер (R)
Последовательность праймера (5'→3')
Длина праймера
Последовательность праймера (5'→3')
Длина праймера
РВ2
WT<sup>1</sup>
987-1910
923
AGACAAAGACAAAGATTTGGAC
22
CCTTAATTTTGGTGGTGAGAAACAA
25
B60<sup>2</sup>
805-1030
225
TGATTGTAGCTTGTAGGAAAATAG
24
GATATTCTCTTTAGTTCAAGCCTC
24
РВ1
WT
1409-1830
421
ACGACTTTTACCGAACATGTAAAT
24
YAAGTTTCTCAAATTGTAAATGTTG
25
B60
525-1171
646
AGATATCATTGATTCATTGGACAAA
25
CTTCATTATATCTTTCTAATGGTATAT
27
PA
WT
694-1106
412
GTYCTCATAGGRGAAGAAGATG
22
GGTTTTCTGTAAYTCGTTACTC
22
B60
1920-2237
317
AAAGCACTAAGAGTAATATTCACC
24
TACCAAATTGAGCGCTATGCTC
22
НА
WT
194^84
290
CTYATTTTGCAAATCTCAAAGGAACAAR
28
TGTAGGGTCCTCCTGGTGCHT
21
B60
504-823
319
TTGCCCTAACGTTACCAATGGGAAA
25
CAACAACAATTCTGCCGCTTTGTTT
25
NP
WT
995-1209
214
GAYCTAACCCTGCTTGCTCGT
21
AATTGYGATTTRTCYTTTGCATCA
24
B60
1164-1784
620
TTTCCATATTAAGAATGGGAGACA
24
AACGTACTGAAACAGTCACAGC
22
NA
WT
470-841
371
GGGGGATACTACAATGGAACAAGAG
25
TTTTATTATTCGGCCCTCTCGAATC
25
B60
871-1109
238
TACTGAAGAATGCACATGCGGGTTC
25
CAAATCCTCCTTTGATGCCTCCAAG
25
M
WT
486-1137
651
AGCATCACATTCACACAGGGCT
22
ACGGGGCTGCAACTTATTTGA
21
B60
920-374
546
AAGGCCACGAAAGCTCAGCAT
21
GTTTATTGTCTCTTTATTTGGATT
24
NS
WT
764-1032
268
AACTCACTCTTCGAGCGTCTTA
22
CCTTCATTTCATACAATGTTTCTAAT
26
B60
369-804
435
CAACTAGCAACTGTCCAAACTG
22
GGCTTTGAATGTCCTTCATCAAA
23
<sup>1</sup>Эпидемический родительский вирус гриппа В/Висконсин/1/2010.
<sup>2</sup>Донор аттенуации В/СССР/60/69.
<sup>3</sup>Позиция нуклеотида представлена с 5'-конца «+» цепи РНК.
Формула генома. Формула генома 6:2 вакцинного штамма В/60/Висконсин/2010/125 подтверждена методом микс-ПЦР с помощью специфических праймеров, то есть вакцинный штамм В/60/Висконсин/2010/125 унаследовал шесть генов, кодирующих внутренние белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), от донора аттенуации В/СССР/60/69, а гены, кодирующие поверхностные белки (НА, NA) - от эпидемического вируса В/Висконсин/1/2010. Доказательством получения вакцинного штамма с заданной формулой генома служат результаты микс-ПЦР, приведенные на фиг.1 и в таблице 2.
На фиг.1 в качестве примера представлен электрофорез в 1.7%-ном агарозном геле, содержащем 0.5 мкг/мл этидиума бромида, амплифицированных фрагментов гена, кодирующего нейраминидазу (NA). 1-я дорожка - маркер молекулярного веса; 2-я дорожка - NA эпидемического вируса гриппа В/Висконсин/1/2010 с праймерами, специфичными для донора аттенуации В/СССР/60/69; 3-я и 8-я дорожки - NA эпидемического вируса гриппа В/Висконсин/1/2010 с праймерами, специфичными для эпидемического вируса гриппа В/Висконсин/1/2010; 4-я дорожка - NA вакцинного штамма В/60/Висконсин/2010/125 с праймерами, специфичными для эпидемического вируса гриппа В/Висконсин/1/2010; 5-я и 7-я дорожки - NA донора аттенуации В/СССР/60/69 с праймерами, специфичными для донора аттенуации В/СССР/60/69; 6-я дорожка - NA донора аттенуации В/СССР/60/69 с праймерами, специфичными для эпидемического вируса гриппа В/Висконсин/1/2010.
Микс-ПЦР позволил четко установить принадлежность гена, кодирующего нейраминидазу исследуемого реассортантного вакцинного штамма, к эпидемическому вирусу гриппа В В/Висконсин/1/2010.
Результаты анализа всех генов вакцинного штамма В/60/Висконсин/2010/125 представлены в табл.2.
Таблица 2. Состав генома реассортантного вакцинного штамма В/60/Висконсин/2010/125, полученного на основе эпидемического вируса В/Висконсин/1/2010 и донора аттенуации В/СССР/60/69
Ген
Принадлежность гена одному из родительских вирусов
Донор аттенуации
Эпидемический вирус
Вакцинный штамм
РВ2
В/СССР/60/69
В/Висконсин/1/2010
В/СССР/60/69
РВ1
В/СССР/60/69
В/Висконсин/1/2010
В/СССР/60/69
РА
В/СССР/60/69
В/Висконсин/1/2010
В/СССР/60/69
НА
В/СССР/60/69
В/Висконсин/1/2010
В/Висконсин/1/2010
NP
В/СССР/60/69
В/Висконсин/1/2010
В/СССР/60/69
NA
В/СССР/60/69
В/Висконсин/1/2010
В/Висконсин/1/2010
М
В/СССР/60/69
В/Висконсин/1/2010
В/СССР/60/69
NS
В/СССР/60/69
В/Висконсин/1/2010
В/СССР/60/69
10
50
10
50
Оценку фенотипических свойств вакцинного штамма В/60/Висконсин/2010/125 проводили путем его параллельного титрования в РКЭ при разных температурах. Вакцинный штамм В/60/Висконсин/2010/125 в развивающихся куриных эмбрионах обладает выраженным температурочувствительным и холодоадаптированным фенотипом, идентичным фенотипу донора аттенуации В/СССР/60/69. Установлено, что вакцинный вирус является температурочувствительным (ts фенотип) - его инфекционная активность при температуре 38°С составила<1.7 log ЭИД/мл, и холодоадаптированным (са фенотип) - инфекционная активность при пониженной до 26°С температуре инкубации составила 6.2 log ЭИД/мл, что свидетельствует о его безвредности для человека, поскольку по этим показателям он идентичен донору аттенуации В/СССР/60/69. Фенотипические свойства вакцинного штамма В/60/Висконсин/2010/125 не изменились после его пятикратного пассирования при использовании больших заражающих доз, что свидетельствует о генетической стабильности препарата (табл.3).
Таблица 3. Фенотипические свойства вакцинного штамма В/60/Висконсин/2010/125 до и после его пассирования в развивающихся куриных эмбрионах
Вирус
Титр, log<sub>10</sub> ЭИД<sub>50</sub>/мл
Фенотип
32°С
26°С
38°С
В/Висконсин/1/2010 (эпидемический вирус)
9.0
1.7
<1.7
ts, non-ca
В/СССР/60/69 (донор аттенуации)
8.9
6.4
<1.7
ts, СА
В/60/Висконсин/2010/125, до пассирования
8.7
6.2
<1.7
ts, СА
В/60/Висконсин/2010/125, 5-й пассаж в РКЭ
8.9
6.3
<1.7
ts, са
50
Оценку токсичности (безвредность для лабораторных животных) вакцинного штамма В/60/Висконсин/2010/125 проводили в соответствии с Руководством по доклиническому изучению новых фармакологических веществ [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общей редакцией Р.У.Хабриева. - М., 2005. - 832 с.] путем внутрибрюшинного введения вирусного материала мышам. Для этого группе из 20 мышей (самцов и самок линии СВА весом 18-20 г.) вводили внутрибрюшинно 0,5 мл вируссодержащей аллантоисной жидкости с титром 8.0 lg ЭИД/мл и оценивали патогенность вируса по проценту выживших мышей в течение 14 дней после введения вируса. Животным контрольной группы вводили плацебо - физиологический раствор. Вакцинный штамм В/60/Висконсин/2010/125 в эксперименте на мышах оказался полностью безвредным -100% мышей выжили в течение всего периода наблюдения. Отмечена прибавка в весе животных при их 100%-ной выживаемости (табл.4).
Таблица 4. Результаты изучения безвредности вакцинного штамма В/60/Висконсин/2010/125 после его внутрибрюшинного введения мышам
Пол
Препарат
Выжило к 14-му дню наблюдения
Прибавка веса, гр.
Самцы
Вакцинный штамм
10/10
1.4
Самки
10/10
1.5
Самцы
Плацебо
10/10
1.5
Самки
10/10
1.3
В результате проведенных доклинических исследований установлено, что заявляемый вакцинный штамм живой гриппозной вакцины В/60/Висконсин/2010/125 характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса В/Висконсин/1/2010, структурой генома 6:2, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, генетической стабильностью, а также характерной для донора аттенуации температурочувствительностью и холодоадаптированностью, что коррелирует с аттенуацией для человека. Штамм аттенуирован и безвреден для мышей.
Морфология штамма полиморфная, типичная для вируса гриппа.
Все это отражено в прилагаемом ниже Паспорте штамма.
Таким образом, вакцинный штамм В/60/Висконсин/2010/125 по биологическим свойствам соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП Р№003224/01-050210 на живую гриппозную вакцину для интраназального применения для взрослых и для детей и действующему Приказу Минздрава РФ от 07.08.1998 №156/79 «О подготовке новых вакцинных производственных и диагностических штаммов вируса гриппа и их внедрении в производство вакцин и диагностических препаратов».
Полученный штамм В/60/Висконсин/2010/125 депонирован 31.10.2011 в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И.Ивановского» Минздравсоцразвития России (ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Минздравсоцразвития России, Россия RU, 123098, город Москва, улица Гамалеи, 16) под №2723 и имеет характеристики, представленные в паспорте штамма.
ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА
10
50
Инфекционная активность штамма В/60/Висконсин/2010/125 при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32°С в течение 72 часов - 8.7 log ЭИД/мл. Гемагглютинирующая активность - 1:128.
Штамм проявляет генетическую стабильность фенотипических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).
Полезным свойством вакцинного штамма вируса гриппа В/60/Висконсин/2010/125 является его пригодность для наработки живой гриппозной вакцины. Предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа В/60/Висконсин/2010/125 может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста.
ПАСПОРТ ШТАММА
1. Название штамма: В/60/Висконсин/2010/125
2. ИЭМ идентификационный №: BW/125/105/817
3. Серия: №1
4. Тип/подтип: линия Ямагата
5. Метод подготовки: классическая реассортация в куриных эмбрионах
6. Родительские вирусы
6.1. Эпидемический вирус: В/Висконсин/1/2010; CDC ID# 2010730255
6.2. Донор аттенуации: В/СССР/60/69
7. Число пассажей в процессе реассортации:
Е9 (скрещивание, три селективных пассажа и пять клонирований предельными разведениями)
8. Состав генома: Гены РВ2, РВ 1, PA, NP, М и NS - от донора аттенуации;гены НА и NA - от эпидемического вируса (формула генома 6:2)
9. Характеристика штамма до лиофилизации
9.1. Оптимальные условия репродукции: 32°С, 72 часа
9.2. Гемагглютинирующая активность: 1:128 с 1.0% куриными эритроцитами
10
50
9.3. Инфекционная активность при оптимальной температуре 32°С: 8.7 log ЭИД/мл
9.4. Чувствительность к неспецифическим γ-ингибиторам сыворотки крови лошади и морской свинки: чувствителен
50
9.5. ts маркер (температурочувствительность репродукции; инфекционная активность при температуре 38°С):<1.7 lg ЭИД/мл (ts фенотип)
50
9.6 са маркер (холодоустойчивость репродукции; инфекционная активность при температуре 26°С): 6.2 lg ЭИД/мл (са фенотип).
10. Характеристика штамма после лиофилизации
10.1. Объем материала в ампуле: 0.5 мл
10
50
10.2. Инфекционная активность при оптимальной температуре 32°С: 7.7 log ЭИД/мл
10.3. Гемагглютинирующая активность: 1:64 с 1.0% куриными эритроцитами
11. Антигенная специфичность
11.1. Гемагглютинин: идентичен вирусу В/Висконсин/1/2010 по данным РТГА
11.2. Нейраминидаза: идентична вирусу В/Висконсин/1 /2010 по данным микс-ПЦР
12. Токсикологические исследования in vivo (острая токсичность):
Не токсичен после внутрибрюшинного заражения мышей
13. Контроль стерильности:
Стерилен
14. Контроль на присутствие посторонних вирусов:
Посторонние вирусы отсутствуют