СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММЫ ФЛАВОНОИДОВ В ЛИСТЬЯХ БОЯРЫШНИКА КРОВАВО-КРАСНОГО
METHOD FOR QUANTIFYING THE AMOUNT OF FLAVONOIDS IN SIBERIAN HAWTHORN LEAVES

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в центрах контроля качества лекарственных средств и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного определения суммы флавоноидов в листьях боярышника кроваво-красного (Crataegus sanguinea Pall).
Действующая система контроля качества лекарственных препаратов требует постоянного усовершенствования подходов к стандартизации биологически активных соединений (БАС) с использованием современных методов анализа и актуальных данных об их физико-химических, спектральных и фармакологических свойствах, позволяющих объективно и селективно определять содержание целевых веществ (1).
Сырье боярышника (плоды, листья, цветки) широко используются в отечественной и зарубежной медицине (2).
Известен способ количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в листьях боярышника кроваво-красного с использованием дифференциальной спектрофотометрии (3). Данная методика включает такие стадии как двухкратную экстракцию сырья 80% этиловым спиртом в соотношении «сырье-экстрагент» 1:200, реакцию комплексообразования с хлоридом алюминия, измерение оптической плотности электронного спектра испытуемого раствора при аналитической длине волны 409 нм и расчет содержания суммы флавоноидов на основе значений оптической плотности комплекса государственного стандартного образца рутина с алюминием хлоридом.
Данный метод взят нами в качестве прототипа. Недостатками этого метода являются низкая специфичность, неполнота экстракции (экстрагент выбран не оптимальный), трудоемкость методики и невозможность определения в анализируемом сырье суммы флавоноидов в пересчете на вещество, специфическое для листьев боярышника кроваво-красного.
Таким образом, целью изобретения является разработка способа количественного определения суммы флавоноидов в листьях боярышника кроваво-красного.
Техническим результатом является создание способа количественного определения суммы флавоноидов в листьях боярышника кроваво-красного в пересчете на 2''-O-рамнозид витексина.
Технический результат достигается тем, что экстракцию сырья осуществляют однократно, в качестве экстрагента используют этиловый спирт в концентрации 70%, количественное определение суммы флавоноидов в листьях боярышника кроваво-красного проводят при длине волны 392 нм в пересчете на 2''-O-рамнозид витексина; содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на 2''-O-рамнозид витексина и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:
где:
D - оптическая плотность испытуемого раствора;
o
D - оптическая плотность раствора стандартного образца 2''-O-рамнозид витексина;
m - масса сырья, г;
o
m - масса стандартного образца 2''-O-рамнозид витексина, г;
W - потеря в массе при высушивании в процентах,
в случае отсутствия стандартного образца 2''-O-рамнозид витексина для расчета целесообразно использовать теоретическое значение его удельного показателя поглощения, равное 232:
где:
D - оптическая плотность испытуемого раствора;
m - масса сырья, г;
o
m - масса стандартного образца 2''-O-рамнозид витексина, г;
232 - удельный показатель поглощения  стандартного образца 2''-O-рамнозид витексина при 392 нм;
W - потеря в массе при высушивании в процентах.
В наших исследованиях было проанализировано сырье листьев боярышника кроваво-красного, из которого в ходе колоночной хроматографии был выделен 2''-O-рамнозид витексина. Нами было установлено, что данное вещество является доминирующим и специфическим для листьев боярышника кроваво-красного, химическая формула 2''-O-рамнозид витексина представлена на фигуре 1 (приложение 1).
При изучении спектральных характеристик было выявлено, что именно 2''-O-рамнозид витексина определяет характер кривой поглощения водно-спиртового извлечения из листьев боярышника кроваво-красного. Данный факт продемонстрирован на фигуре 2 (приложение 2), где кривая 1 показывает электронный спектр раствора водно-спиртового извлечения из листьев боярышника кроваво-красного, а кривая 2 - электронный спектр раствора 2''-O-рамнозид витексина. На графике видно, что кривая поглощения раствора водно-спиртового извлечения повторяет форму кривой раствора 2''-O-рамнозид витексина.
Кроме того, было определено что в случае использования дифференциальной спектрофотометрии (при добавлении в качестве комплексообразующего вещества раствора хлорида алюминия) максимумы поглощения извлечения из листьев боярышника кроваво-красного и раствора 2''-O-рамнозид витексина коррелируют между собой.
Так, на фигуре 3 (приложение 3) представлены электронные спектры при дифференциальной спектрофотометрии раствора 2''-O-рамнозид витексина, а на фигуре 4 (приложение 4) - электронные спектры при дифференциальной спектрофотометрии раствора водно-спиртового извлечения из листьев боярышника кроваво-красного. Кривая 1 на фигуре 3 и фигуре 4 демонстрирует исходный раствор 2''-O-рамнозид витексина или исходный раствор водно-спиртового извлечения из листьев боярышника кроваво-красного соответственно, а кривая 2 - раствор 2''-O-рамнозид витексина в присутствии алюминия хлорида или раствор водно-спиртового извлечения из листьев боярышника в присутствии алюминия хлорида соответственно. На фигурах видно, что в варианте дифференциальной спектрофотометрии максимумы поглощения раствора 2''-O-рамнозид витексина и водно-спиртового извлечения находятся в области 392 нм. Данный факт позволяет проводить спектрофотометрическое определение суммы флавоноидов в листьях боярышника кроваво-красного при аналитической длине волны 392 нм.
Также нами было изучено влияние экстрагента на процесс экстракции. В таблице 1 (приложение 5) представлена зависимость выхода флавоноидов листьев боярышника кроваво-красного от концентрации экстрагента. В результате эксперимента в качестве оптимального экстрагента нами был выбран 70% этиловый спирт, так как выход действующих веществ из сырья при его использовании максимален.
Далее нами был изучен вопрос относительно продолжительности экстракции на кипящей водяной бане, в таблице 2 (приложение 6) представлена зависимость выхода флавоноидов листьев боярышника кроваво-красного от времени экстракции на кипящей водяной бане, при этом было выбрано время экстракции 60 минут.
В таблице 3 (приложение 7) представлена зависимость выхода флавоноидов листьев боярышника кроваво-красного от соотношения «сырье-экстрагент». Из таблицы видно, что максимальный выход действующих веществ наблюдается при соотношении «сырье-экстрагент» 1:50, по этой причине данное соотношение было выбрано нами в качестве оптимального.
Учитывая, что увеличение числа операций по пробоподготовке ведет к возрастанию ошибки, выбор сделан в пользу одностадийного процесса экстракции с подтверждением требуемой точности количественного определения.
Таким образом, было определено, что оптимальными параметрами экстракции являются: однократное извлечение 70% этиловым спиртом на кипящей водяной бане в течение 60 минут в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:50.
Принимая по внимание тот факт, что доминирующими и специфическим для листьев боярышника кроваво-красного является 2''-O-рамнозид витексина, а максимумы поглощения раствора 2''-O-рамнозид витексина и водно-спиртового извлечения листьев боярышника кроваво-красного находятся в области 392 нм, целесообразным является определение содержания суммы флавоноидов в пересчете на 2''-O-рамнозид витексина при длине волны 392 нм.
Способ реализуется следующим образом.
Аналитическую пробу сырья боярышника кроваво-красного измельчают до размера частиц 2 мм. Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 70% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 60 минут. Затем колбу закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через рыхлый комочек ваты или фильтр с красной полосой и остужают в течение 30 минут (извлечения из листьев).
Испытуемый раствор для анализа суммы флавоноидов готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки 70% этиловым спиртом (испытуемый раствор).
Раствор сравнения готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу на 25 мл, доводят объем раствора до метки 70% этиловым спиртом (раствор сравнения).
Для расчета содержания суммы флавоноидов готовят раствор стандартного образца 2''-O-рамнозид витексина, добавляют к нему 3% спиртовой раствор алюминия хлорида, измеряют оптическую плотность окрашенного комплекса при аналитической длине волны 392 нм и определенное значение оптической плотности используют в формуле расчета.
Приготовление раствора стандартного образца 2''-O-рамнозид витексина.
Около 0,02 г (точная навеска) 2''-O-рамнозид витексина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 96% этиловом спирте. Затем содержимое колбы доводят 96% этиловым спиртом до метки (раствор А 2''-O-рамнозид витексина). После чего 1 мл раствора А 2''-O-рамнозид витексина помещают в мерную колбу на 25 мл, добавляют 1 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида, затем доводят объем раствора до метки 70% этиловым спиртом. Раствор сравнения готовят следующим образом: 1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу на 25 мл, доводят объем раствора до метки 70% этиловым спиртом.
Измерение оптической плотности проводят при длине волны 392 нм через 40 минут после приготовления всех растворов.
Содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на 2''-O-рамнозид витексина и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:
где:
D - оптическая плотность испытуемого раствора;
o
D - оптическая плотность раствора стандартного образца 2''-O-рамнозид витексина;
m - масса сырья, г;
o
m - масса стандартного образца 2''-O-рамнозид витексина, г;
W - потеря в массе при высушивании в процентах,
в случае отсутствия стандартного образца 2''-O-рамнозид витексина для расчета целесообразно использовать теоретическое значение его удельного показателя поглощения, равное 232:
где:
D - оптическая плотность испытуемого раствора;
m - масса сырья, г;
o
m - масса стандартного образца 2''-O-рамнозид витексина, г;
232 - удельный показатель поглощения  стандартного образца 2''-O-рамнозид витексина при 392 нм;
W - потеря в массе при высушивании в процентах.
Предлагаемый способ поясняется следующими примерами.
Пример 1.
Аналитическую пробу сырья боярышника кроваво-красного измельчают до размера частиц 2 мм (заготовлено в г.Самаре, Ботанический сад, май 2017 г.). 1,38 г измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 70% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 60 минут. Затем колбу закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через рыхлый комочек ваты или фильтр с красной полосой и остужают в течение 30 минут (извлечения из листьев).
Испытуемый раствор для анализа суммы флавоноидов готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки 70% этиловым спиртом (испытуемый раствор).
Раствор сравнения готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу на 25 мл, доводят объем раствора до метки 70% этиловым спиртом (раствор сравнения).
Для расчета содержания суммы флавоноидов готовят раствор стандартного образца 2''-O-рамнозид витексина, добавляют к нему 3% спиртовой раствор хлорида алюминия, измеряют оптическую плотность окрашенного комплекса при длине волны 392 нм и определенное значение оптической плотности используют в формуле расчета.
Приготовление раствора стандартного образца 2''-O-рамнозид витексина.
0,0199 г 2''-O-рамнозид витексина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 96% этиловом спирте. Затем содержимое колбы доводят 96% этиловым спиртом до метки (раствор А 2''-O-рамнозид витексина). После чего 1 мл раствора А 2''-O-рамнозид витексина помещают в мерную колбу на 25 мл, добавляют 1 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида, затем доводят объем раствора до метки 70% этиловым спиртом. Раствор сравнения готовят следующим образом: 1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу на 25 мл, доводят объем раствора до метки 70% этиловым спиртом.
Измерение оптической плотности проводят при длине волны 392 нм через 40 минут после приготовления всех растворов.
Содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на 2''-O-рамнозид витексина и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:
где:
0,7345 - оптическая плотность испытуемого раствора;
0,3697 - оптическая плотность раствора стандартного образца 2''-O-рамнозид витексина;
1,3833 - масса сырья, г;
0,0199 - масса стандартного образца 2''-O-рамнозид витексина, г.
10 - потеря в массе при высушивании в процентах.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на 2''-O-рамнозид витексина = 3,18%.
Пример 2.
При необходимости определения суммы флавоноидов в листьях боярышника кроваво-красного в отсутствии стандартного образца 2''-O-рамнозид витексина, необходимо провести все действия из примера 1 до приготовления раствора стандартного образца 2''-O-рамнозид витексина.
После измерения оптической плотности извлечения из листьев боярышника кроваво-красного при длине волны 392 нм, содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на 2''-O-рамнозид витексина и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле, используя теоретическое значение удельного показателя поглощения 2''-O-рамнозид витексина, равное 232:
где:
0,7345 - оптическая плотность испытуемого раствора;
1,3833 - масса сырья, г;
o
m- масса стандартного образца 2''-O-рамнозид витексина, г;
232 - удельный показатель поглощения  стандартного образца 2''-O-рамнозид витексина при 392 нм;
10 - потеря в массе при высушивании в процентах.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на 2''-O-рамнозид витексина = 3,18%, что совпадает со значением, полученном в примере 1.
Все результаты были статистически обработаны. Ошибка единичного количественного определения составила ±2,85%.
Таким образом, предлагаемый способ количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на 2''-O-рамнозид витексина в листьях боярышника кроваво-красного с использованием дифференциальной спектрофотометрии разработан впервые для данного вида сырья и обладает следующими преимуществами:
1. Разработанный метод является более специфичным и селективным, а также позволяет проводить экстракцию сырья однократно, поскольку в качестве экстрагента используется 70% этиловый спирт, позволяющий исчерпывающе извлекать целевые вещества (флавоноиды).
2. Пересчет суммы флавоноидов идет на доминирующее и специфическое для листьев боярышника кроваво-красного - 2''-O-рамнозид витексина.
3. Ошибка единичного определения предлагаемого способа составляет ±2,85%, тогда как в случае способа прототипа она достигает ±3,73%, что свидетельствует об объективности разработанного способа.
Этот способ можно применять в центрах контроля качества лекарственных средств, на фармацевтических предприятиях и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного анализа листьев боярышника кроваво-красного (Crataegus sanguinea Pall).
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ:
1. Куркин В.А. Фармакогнозия. Учебник для студентов фармацевтических вузов (факультетов). - 3-е изд., перераб. и доп. - Самара: ООО «Офорт»; ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России, 2016. - 1279 с.
2. Куркин В.А. Основы фитотерапии: учебное пособие. - Самара: ООО «Офорт»; ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава», 2009. - 963 с.
3. Хасанова С.Р. Экспериментально-теоретическое обоснование создания и стандартизации лекарственных растительных препаратов с антиоксидантной активностью: дисс. … доктор фарм. наук. - Уфа: Башкирский государственный медицинский университет, 2016. - 462 с.