РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКИ ROBO2, КОМПОЗИЦИИ, СПОСОБЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

1. Рекомбинантный белок рецептора окольного пути Roundabout 2 (ROBO2), содержащий (i) часть внеклеточного домена ROBO2, и (ii) домен иммуноглобулина, где указанная часть внеклеточного домена ROBO2, по существу, состоит из пре–последовательности ROBO2, подобной иммуноглобулину 1 (Ig1), первого иммуноглобулин–подобного домена (Ig1), междоменного линкера, расположенного между первым и вторым иммуноглобулин–подобными доменами (междоменного линкера Ig1–Ig2); второго иммуноглобулин–подобного домена (Ig2) и междоменного линкера, расположенного между вторым и третьим иммуноглобулин–подобными доменами (междоменного линкера Ig2–Ig3).
2. Рекомбинантный ROBO2 по п. 1, где указанная часть внеклеточного домена ROBO2, по существу, состоит из аминокислотных остатков 1–203 в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1.
1
2
1
2
3
4
3. Рекомбинантный белок ROBO2 по п. 1 или 2, где указанный домен иммуноглобулина представляет собой Fc–домен IgA, IgA, IgD, IgE, IgM, IgG, IgG, IgG или IgG.
1
4. Рекомбинантный белок ROBO2 по п. 3, где указанный Fc–домен представляет собой Fc–домен человеческого IgG.
1
5. Рекомбинантный белок ROBO2 по п. 4, где указанный Fc–домен человеческого IgG содержит замены L234A, L235A и G237A (Eu–нумерация) и не содержит K447 (Eu–нумерация).
6. Рекомбинантный белок ROBO2 по п. 5, где указанный Fc–домен содержит аминокислотные остатки 210–440 в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1.
7. Рекомбинантный белок ROBO2 по п. 2 или по любому из пп. 3–6, если они зависят от п.2, где указанные аминокислотные остатки 1–203 в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1 являются смежными с указанным доменом иммуноглобулина.
8. Рекомбинантный белок ROBO2 по п. 2 или по любому из пп. 3–6, если они зависят от п.2, где указанные аминокислотные остатки 1–203 в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1 связаны с указанным доменом иммуноглобулина посредством линкера.
9. Рекомбинантный белок ROBO2 по п. 8, где указанным линкером является пептидильный линкер, содержащий приблизительно от 1 до 30 аминокислотных остатков.
10. Рекомбинантный белок ROBO2 по п. 9, где указанный пептидильный линкер выбран из группы, состоящей из:
a) богатого глицином пептида;
b) пептида, содержащего глицин и серин;
n
с) пептида, имеющего последовательность (Gly–Gly–Ser), где n равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 (SEQ ID NO: 22); и
d) пептида, имеющего последовательность (Gly–Gly–Gly–Gly–Ser)n, где n равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 (SEQ ID NO: 23).
2
11. Рекомбинантный белок ROBO2 по п. 10, где указанным пептидильным линкером является (Gly–Gly–Ser) (SEQ ID NO: 15).
12. Рекомбинантный белок рецептора окольного пути Roundabout 2 (ROBO2)–Fc, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NО: 1.
13. Рекомбинантный белок рецептора окольного пути Roundabout 2 (ROBO2)–Fc, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NО: 1.
14. Рекомбинантный белок ROBO2–Fc по п. 12, содержащий аминокислотную последовательность, кодируемую плазмидной вставкой, депонированной в ATCC и имеющей регистрационный номер ATCC No. PTA–124008.
D
15. Рекомбинантный белок ROBO2 по любому из предшествующих пунктов, где указанный белок связывается с SLIT2 с K, равной или менее, чем: приблизительно 10 нМ, приблизительно 5 нМ, приблизительно 2 нМ, приблизительно 1 нМ, приблизительно 900 пМ, приблизительно 800 пМ, приблизительно 700 пМ, приблизительно 600 пМ, приблизительно 500 пМ, приблизительно 400 пМ, приблизительно 300 пМ, приблизительно 250 пМ, приблизительно 200 пМ, приблизительно 150 пМ, приблизительно 100 пМ, приблизительно 50 пМ, приблизительно 40 пМ, приблизительно 30 пМ, приблизительно 25 пМ, приблизительно 20 пМ, приблизительно 15 пМ, приблизительно 10 пМ, приблизительно 5 по меньшей мере или приблизительно 1 пМ.
D
D
16. Рекомбинантный белок ROBO2 по любому из предшествующих пунктов, где указанный белок связывается с SLIT2 с K, которая по меньшей мере приблизительно в 2 раза, приблизительно в 4 раза, приблизительно в 6 раз, приблизительно в 8 раз, приблизительно в 10 раз, приблизительно в 20 раз, приблизительно в 40 раз, приблизительно в 60 раз, приблизительно в 80 раз, приблизительно в 100 раз, приблизительно в 120 раз, приблизительно в 140 раз, приблизительно в 160 раз ниже, чем величина K для связывания ROBO1 с SLIT2.
D
D
17. Рекомбинантный белок ROBO2 по любому из предшествующих пунктов, где указанный белок связывается с SLIT2 с K, которая по меньшей мере приблизительно в 2 раза, приблизительно в 4 раза, приблизительно в 6 раз, приблизительно в 8 раз, приблизительно в 10 раз, приблизительно в 20 раз, приблизительно в 40 раз, приблизительно в 60 раз, приблизительно в 80 раз, приблизительно в 100 раз, приблизительно в 120 раз, приблизительно в 140 раз, приблизительно в 160 раз ниже, чем величина K для связывания белка ROBO1–Fc с SLIT2.
D
18. Рекомбинантный белок ROBO2 по любому из пп 15–17, где указанную K измеряют с помощью поверхностного плазмонного резонанаса (ППР), необязательно на устройстве Biacore T200.
D
19. Рекомбинантный белок ROBO2 по любому из пп 15–17, где указанную K измеряют с помощью биослойной интерферометрии (БСИ), необязательно на устройстве ForteBio Octet.
20. Рекомбинантный белок ROBO2 по любому из предшествующих пунктов, где указанный белок ингибирует связывание SLIT и ROBO2 и/или ингибирует ROBO2–зависимую активность SLIT–N.
50
21. Рекомбинантный белок ROBO2 по любому из предшествующих пунктов, где указанный белок имеет полумаксимальную ингибирующую концентрацию (IC), составляющую не более, чем приблизительно 15 нМ, приблизительно 13 нМ, приблизительно 11 нМ, приблизительно 9 нМ, приблизительно 7 нМ, приблизительно 6 нМ, приблизительно 5 нМ, приблизительно 4 нМ, приблизительно 3 нМ, приблизительно 2 нМ, приблизительно 1 нМ, как было определено с помощью анализа методом гомогенной флуоресценции с временным разрешением (HTRF) на ингибирование связывания ROBO2 с SLIT2.
50
22. Рекомбинантный белок ROBO2 по любому из пп. 1–20, где указанный белок имеет полумаксимальную ингибирующую концентрацию (IC) не более, чем приблизительно 75 нМ, приблизительно 65 нМ, приблизительно 55 нM, приблизительно 45 нМ, приблизительно 35 нМ, приблизительно 25 нM, приблизительно 15 нМ, приблизительно 5 нМ, как было оценено путем определения SLIT2–N–опосредуемого ингибирования миграции нервных клеток.
23. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую рекомбинантный белок ROBO2 по любому из пп. 1–22.
24. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п. 23, где указанная молекула содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 21.
25. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 23 или 24.
26. Клетка–хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п. 23.
27. Фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный белок ROBO2 по любому из пп. 1–22 и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
28. Способ лечения болезни почек, включающий введение индивидууму, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества рекомбинантного белка ROBO2 по любому из пп. 1–22.
29. Способ по п. 28, где указанной болезнью почек является гломерулит, фокальный сегментарный гломерулярный склероз (ФСГС) или нефропатия.
30. Рекомбинантный белок ROBO2 по любому из пп. 1–22 для его применения в способе лечения болезни почек.
31. Рекомбинантный белок ROBO2 для применения по п.30, где указанной болезнью почек является гломерулит, фокальный сегментарный гломерулярный склероз (ФСГС) или нефропатия.
32. Применение рекомбинантного белка ROBO2 по любому из пп. 1–22 в целях приготовления лекарственного препарата для лечения болезни почек.
33. Применение по п. 32, где указанной болезнью почек является гломерулит, фокальный сегментарный гломерулярный склероз (ФСГС) или нефропатия.