СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СМЕСИ НАСЫЩЕННЫХ УГЛЕВОДОРОДОВ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИМ ПУТЕМ
MICROBIOLOGICAL METHOD OF PRODUCING MIXTURE OF SATURATED HYDROCARBONS

Предлагаемое изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способам получения насыщенных тяжелых углеводородов (парафинов) на основе микроорганизмов. Парафины могут быть использованы в легкой промышленности, в медицине, а также в качестве углеводородного сырья для получения биотоплива.
2
2
Известны способы получения жидких углеводородов химическими методами из органических продуктов с использованием СО и Н (патент №4670472 и №1401814 кл. С07С 1/04). Недостатком известных способов является использование дорогостоящих металлоксидных катализаторов, проведение реакций при высоких температурах и давлении.
Возможны способы получения газообразного топлива путём метанового сбраживания органических веществ в присутствии стимуляторов метаногенеза, в качестве которых могут выступать соединение ацетата никеля (II) с этилендиамином или соединение никеля (II) с глицерином. Известно, что водород оказывает стимулирующее действие на процесс метаногенеза. Также метан можно получать путем термофильного метанового брожения ацетонобутиловой барды в присутствии стимуляторов метаногенеза, в качестве которых используют метанол, хлористый кобальт, уксусную кислоту. В качестве сырья для получения метана также можно использовать обычный бытовой мусор. Путем сбраживания в течение 8-10 дней при 55°С в герметичной емкости образуется биогаз. Помимо мусора, метан можно получать путем воздействия на уголь метаногенным консорциумом микроорганизмов непрерывным прокачиванием культуральной среды через скважины и емкость, в которую помещен метаногенный консорциум микроорганизмов с культуральной средой. Результатом переработки угля данным способом являются биогаз и водоугольное топливо (Самуилов В.Д., Олескин А.В. Технологическая биоэнергетика. М., 1994, С.154-159).
Микроорганизмы - это не единственный способ получения метана, с успехом для этих целей можно использовать растения. В пресных водах тропиков и субтропиков широко распространено многолетнее растение водный гиацинт (Eichhornia crassipes), способный к быстрому вегетативному размножению. В этих и даже более умеренных широтах (например, во Франции) налаживают культивирование водного гиацинта для последующей его переработки в биогаз (Холл Д., Кумбс Дж., Хиггинс И. Энергия и биотехнология Биотехнология. Принципы и применение. М., 1988. С.35-90).
2
2
Известны способы получения небольших количеств углеводородов из клеток отдельных видов растений и микроорганизмов (Санадзе Г.А. Выделение растениями летучих органических веществ. Изд-во АН СССР, М., 1957; Максимова Г.Н., Воробьева Г.И. и др. Ж. «Микробиологический синтез, 1967, №5, С.10-11). Одноклеточные фототрофные организмы характеризуются высокими скоростями роста и являются перспективным сырьем для получения углеводородов из газовой смеси СО и Н и органического субстрата (Волова Т.Г. и др. Исследование физиолого-биохимических свойств зеленой водоросли Botriococcus braunii. Доклады РАН, 1998, т.361, №2, С.256-259).
Известен способ получения нефтяных углеводородов из твердых горючих ископаемых при обработке их бактериями рода Thiobacillus или Thiospaera в присутствии доноров водорода и в широком диапазоне температур и рН среды (Курашов В.М., Сахно Т.В. Микробиологический способ получения углеводородов нефти и отдельных углеводородных фракций из твердых горючих ископаемых. Патент РФ №2180919, кл. С12Р 5/00, C12R 1/01).
14
25
2
2
Известен способ получения внеклеточных жидких углеводородов С-С с использованием сульфатредуцирующих бактерий с использованием газовой смеси СO и H и органического субстрата в виде лактата кальция и дрожжевого экстракта.
22
8
10
8
10
15
22
17
18
20
22
Наиболее близким по технической сущности и ожидаемому результату является способ получения смеси углеводородов состава С 15-C. из биомассы дрожжей рода Candida при выращивании на сложных органических средах и на минеральных средах с глюкозой. Культуру С. tropicalis К-17 выращивают на разных субстратах: 1 - на глюкозе; 2 - на октане (C); 3 - на декане (С). Посевным материалом во всех опытах служила суспензия клеток, выращенных в течение трех суток на минеральной среде с 1% равнообъемной смеси химически чистых н-алканов C-С. В данных опытах культивирование дрожжей на средах с углеводородами и глюкозой проводили в герметически закрытых сосудах. Биомассу для анализа отбирали в стационарной фазе роста. Из отмытых водой клеток углеводороды с липидами экстрагировали смесью органических растворителей (гексан-этиловый спирт) и разделяли на колонке с силикагелем марки АСК. Определение состава остаточных углеводородов проводили на газовом хроматографе «Цвет-4» при 250°. Применяли колонку (100×0,3 см) с хромосорбом W, неподвижная фаза - 15%-ный «Апиезон L». Газ-носитель - Не, давление на входе - 0,5 атм, на выходе - атмосферное. Идентификацию углеводородов выполняли путем сравнения полученных хроматограмм с хроматограммами искусственной калибровочной смеси и по графикам зависимости логарифмов удерживаемых объемов от числа углеродных атомов. Суммарное содержание углеводородов в клетках дрожжей С. tropicalis К-17, культивируемых на различных субстратах, различается между собой. Количество углеводородов в клетках, выращенных в одинаковых условиях на н-алканах, выше (0,240-0.400 % к сухой биомассе), чем на глюкозе (0,165%). Качественный состав внутриклеточных углеводородов во всех опытах оказался довольно однородным и включал н-алканы от C до С. На всех исследованных субстратах в клетках дрожжей в максимальном количестве накапливаются н-алканы C-С. Количество синтезируемых клеткой н-алканов с большим числом углеродных атомов в молекуле (С-С) закономерно уменьшается.
8
10
16
18
17
20
Синтез отдельных углеводородов при выращивании на глюкозе и легких углеводородов идет несколько иначе. При культивировании на н-алканах (C и С) он сдвинут в сторону преимущественного синтеза С-C; на глюкозе же в большом количестве образуются н-алканы С-С.
8
10
15
22
Таким образом, клетки дрожжей при выращивании на легких н-алканах - октане (C) и декане (С) обладают способностью при недостаточном количестве кислорода синтезировать тяжелые углеводороды от С до C (Квасников Е.И., Соломко Э.Ф., Мельник Я.В. Синтез тяжелых углеводородов при выращивании дрожжей на низкомолекулярных н-алканах. // Микробиология, 1972. Т. XLI, вып.3. С.560-561).
Недостатком способа является недостаточный выход целевых продуктов и их однородный качественный состав, использование дорогостоящих компонентов питательной среды культивирования - глюкозы и/или низкомолекулярных н-алканов.
Техническим результатом изобретения является удешевление способа получения целевых углеводородов, увеличение их выхода и более разнообразный состав.
3
2
4
4
4
Поставленная цель достигается тем, что в качестве штамма-продуцента углеводородов используется микроскопический гриб Hypomyces rosellus ВКПМ F-242. Продуцент культивируют на питательных средах состава (в %): отходы зерноперерабатывающей промышленности - 2-20: NaNO - 0,1-0,5; КНРО - 0,05-0,1; MgSO - 0,05-0,1; FeSO - 0,0001-0,001; остальное - вода. показатель рН исходной питательной среды поддерживают в пределах 6,0-6,2. Выращивание гриба проводят при температуре 20-25°С в течение 4-6 суток; экстракцию смеси насыщенных углеводородов ведут липидной фракции, выделенной из культуральной жидкости гриба Hypomyces rosellus ВКПМ F-242 неполярными органическими растворителями. Полученные экстракты упаривают.
В качестве неполярного органического растворителя используют гексан, петролейный эфир, бензол и хлороформ.
Анализ компонентного состава полученной смеси насыщенных углеводородов проводят с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ), газожидкостной хроматографии и методом хромато-масс-пектроскопии. Выделение углеводородов из липидной фракции проводят на силуфоловых пластинках в системе растворителей петролейный эфир - диэтиловый эфир - уксусная кислота (80:20:1). Выявляют пятна с Rf=0,22 - (1,3 диглицериды) - следы; Rf=0,4 - (жирные кислоты) - следы; Rf=0,96 - (углеводороды) - около 90%. В результате проведения колоночной хроматографии на силикагеле получают фракции липидов, которые далее анализируют на газожидкостном хроматографе, а также методом хромато-масс-пектроскопии.
Существенные отличия предлагаемого способа.
В предлагаемом способе в качестве компонентов питательной среды для культивирования продуцента насыщенных углеводородов используются целлюлозосодержащие отходы зерноперерабатывающей промышленности, а в известном способе дорогостоящие компоненты, такие как глюкоза и низкомолекулярные алканы.
Преимущества предлагаемого способа
13
35
15
22
Способ позволяет получать из культуры микофильного гриба Hypomyces rosellus насыщенные углеводороды состава C-С, получение которых ранее в литературе не описано. Описанным ранее способом получают только углеводороды состава С-С.
Способ поясняется примерами.
Пример 1. Штамм Hypomyces rosellus ВКПМ F-242 выращивают в колбах Эрленмеера емкостью 500 мл, содержащих 100 мл питательной среды, где в качестве единственного источника углерода используют отруби пшеничные. Питательную среду состава (в %):
отруби пшеничные (или ржаные) 3-10;
3
NaNO - 0,1-0,5;
2
4
КНРO - 0,05-0,1;
4
MgSO - 0,05-0,1;
4
FeSO - 0,0001-0,001;
Вода - остальное;
13
35
показатель рН исходной питательной среды - 6,0-6,2; засевают посевным материалом, выращенным на сусле 4° по Баллингу в количестве 3-5 объемных %. Выращивание гриба ведут в глубинных условиях в колбах на круговых качалках (200-220 об/мин) при температуре 20-25°С в течение 2, 4 и 6 суток. Липидные фракции выделяют из культуральной жидкости неполярным органическим растворителем - гексаном, взятым в объеме 200 мл. Объемное соотношение культуральная жидкость:растворитель = 1:2. Экстракт упаривают на роторном испарителе. Выход углеводородов составляет 30-36% в расчете на сухую биомассу. Целевой продукт представляет собой смесь насыщенных углеводородов фракции С-С.
Пример 2. Штамм Hypomyces rosellus ВКПМ F-242 выращивают в колбах Эрленмеера емкостью 500 мл, содержащих 100 мл питательной среды, где в качестве единственного источника углерода используют овсяную шелуху.
Питательную среду состава (в %):
Овсяная шелуха - 10-20;
3
NaNO - 0,5;
2
4
КНРO - 0,1;
4
MgSO - 0,05;
4
FeSO - 0,0001-0,001;
Вода остальное;
13
35
показатель рН исходной питательной среды - 6,0-6,2; засевают посевным материалом, выращенным на сусле 4° по Баллингу в количестве 3-5 объемных %. Выращивание гриба ведут в глубинных условиях в колбах на круговых качалках (200-220 об/мин) при температуре 20-25°С в течение 2, 4 и 6 суток. Липидные фракции выделяют из культуральной жидкости петролейным эфиром, взятым в объеме 200 мл. Объемное соотношение культуральная жидкость:растворитель = 1:2. Экстракт упаривают на роторном испарителе. Выход углеводородов составляет 18-22% в расчете на сухую биомассу. Целевой продукт представляет собой смесь насыщенных углеводородов фракции С-С.
Пример 3. Штамм Hypomyces rosellus ВКПМ F-242 выращивают в колбах Эрленмеера емкостью 500 мл, содержащих 100 мл питательной среды, где в качестве единственного источника углерода используют солому злаковых культур.
Питательную среду состава (в %):
Солома - 10-20;
3
NaNO - 0,5;
2
4
КНРO - 0,1;
4
MgSO - 0,05;
4
FeSO - 0,0001-0,001;
Вода остальное;
13
35
показатель рН исходной питательной среды - 6,0-6,2; засевают посевным материалом, выращенным на сусле 4° по Баллингу в количестве 3-5 объемных %. Выращивание гриба ведут в глубинных условиях в колбах на круговых качалках (200-220 об/мин) при температуре 20-25°С в течение 2, 4 и 6 суток. Липидные фракции выделяют из культуральной жидкости бензолом, взятым в объеме 200 мл.. Объемное соотношение культуральная жидкость:растворитель = 1:2. Экстракт упаривают на роторном испарителе. Выход углеводородов равен 28-30% в расчете на сухую биомассу. Целевой продукт представляет собой смесь насыщенных углеводородов фракции С-С.
Пример 4. Штамм Hypomyces rosellus ВКПМ F-242 выращивают в колбах Эрленмеера емкостью 500 мл, содержащих 100 мл питательной среды, где в качестве единственного источника углерода используют сахарозу.
Питательную среду состава (в %):
Сахароза - 2-4;
3
NaNO - 0,3;
2
4
КНРO - 0,1;
4
MgSO - 0,05;
4
FeSO - 0,0001-0,001;
Вода - остальное;
17
36
показатель рН исходной питательной среды - 6,0-6,2; засевают посевным материалом, выращенным на сусле 4° по Баллингу в количестве 3-5 объемных %. Выращивание гриба ведут в глубинных условиях в колбах на круговых качалках (200-220 об/мин) при температуре 20-25°С в течение 2, 4 и 6 суток. Липидные фракции выделяют из культуральной жидкости хлороформом, взятым в объеме 200 мл. Объемное соотношение культуральная жидкость: растворитель =1:2. Экстракт упаривают на роторном испарителе. Общий выход углеводородов незначителен и на 6 сутки не превышает 10% в расчете на сухую биомассу. Целевой продукт представляет собой смесь насыщенных углеводородов фракции С-С.
Примеры
Показатели
Выход в расчете на сухую биомассу, %
Качественный состав углеводородов
Источник углерода в составе питательной среды
Продуцент углеводородов
Прототип
на н-алканах - 0,240-0,400; на глюкозе - 0,165
С<sub>15</sub>-С<sub>22</sub>
Глюкоза, октан, декан
Candida tropicalis штамм К-17
Пример 1
30-36
С<sub>13</sub>-С<sub>35</sub>
Отруби пшеничные или ржаные
Hypomyces rosellus штамм ВКПМ F-242
Пример 2
18-22
С<sub>13</sub>-С<sub>35</sub>
Овсяная шелуха
-«-
Пример 3
28-30
C<sub>13</sub>-С<sub>35</sub>
Солома
-«-
Пример 4 (сравнительный)
10
С<sub>17</sub>-С<sub>36</sub>
Сахароза
-«-