СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ АНТИРЕТРОВИРУСНОЙ ТЕРАПИИ ПРИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ
METHOD OF PREDICTING EFFICIENCY OF ANTIRETROVIRAL THERAPY IN CASE IN HIV-INFECTION

Изобретение относится к медицине, разделу инфекционные болезни, ВИЧ-инфекция. Массовый подъем заболеваемости в России и Приморском крае, связанный с быстрым распространением инфекции в среде потребителей инъекционных наркотиков, пришелся на 1991-2001 годы [1, 9, 14]. Учитывая особенности патогенеза ВИЧ-инфекции и среднюю продолжительность сроков появления клинических и лабораторных признаков иммунодефицита (5-8 лет), следует ожидать значительного роста числа людей, нуждающихся в специфическом противовирусном лечении - антиретровирусной терапии (АРВТ) [11]. Антиретровирусная терапия на сегодняшний день представляет собой эффективный способ подавления активности ВИЧ. АРВТ позволяет на неопределенно долгий срок продлить жизнь инфицированному ВИЧ человеку [5, 12]. Однако полностью удалить вирус из организма невозможно, в связи с чем пациент нуждается в пожизненном приеме препаратов. Другая проблема, связанная с АРВТ, - резистентность ВИЧ [5, 13]. Кроме этого остро встает вопрос об организации своевременной и адекватной противотуберкулезной помощи пациентам с ВИЧ-инфекцией. Лечение туберкулеза, сочетанного с ВИЧ-инфекцией, в современных условиях является глобальной проблемой. Концепция ко-патогенеза, при которой иммунная активация, вызванная возбудителем туберкулеза, стимулирует вирусную репликацию и ухудшает прогноз ВИЧ-инфекции, предопределяет поиск методов одновременного воздействия на ВИЧ и микобактерию туберкулеза с нормализацией функции иммунной системы [4, 8]. Однако чрезмерная иммунная активация Т-лимфоцитов иммуностимуляторами может приводить к быстрому истощению иммунной системы ВИЧ-инфицированного пациента, что сведет на нет эффективность антиретровирусных препаратов [3, 13]. Можно предположить, что в данной ситуации найти «золотую середину» поможет дальнейшее изучение иммунологических маркеров сочетанной инфекции ВИЧ и туберкулеза.
Известен способ определения эффективности АРВТ при ВИЧ-инфекции, включающий определение уровня РНК ВИЧ в крови с помощью полимеразной цепной реакции ПЦР до лечения и через 1-3 месяца от начала АРВТ(5). Однако указанный способ не может являться достоверным критерием эффективности АРВТ при развитии синдрома иммунного восстановления, при котором наблюдается в большинстве случаев летальный исход.
Известен способ определения эффективности АРВТ при ВИЧ-инфекции, включающий мониторинг клинического статуса в динамике лечения(5). Недостаток данного способа заключается в том, что при ВИЧ-инфекции нередко клинические симптомы и синдромы протекают атипично, не отражая истинную картину изменений в организме.
Известен способ определения эффективности АРВТ при ВИЧ-инфекции, влючающий исследование уровня СД4+-лимфоцитов в крови методом проточной цитометрии до лечения и через 1-3 месяца после начала АРВТ. (Клинические рекомендации. ВИЧ-инфекция и СПИД. Под ред. В.В.Покровского. М: ГЭОТАР-Медиа, 2006. 128 с.). Недостаток данного способа заключается в том, что, несмотря на значительное повышение содержания СД4+-лимфоцитов в крови, происходит активация антигенов оппортунистических инфекций (синдром иммунного восстановления) с последующей генерализацией, приводящей к смерти.
При проведении анализа имеющейся научной и патентной информации не обнаружено сведений, относящихся к использованию способа прогнозирования эффективности АРВТ при ВИЧ-инфекции методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА.)
Задача изобретения - разработка способа прогнозирования эффективности АРВТ при ВИЧ-инфекции с использованием иммунологических маркеров АРВТ и статистического моделирования максимальной и длительной супрессии репликации ВИЧ, восстановления и сохранения функции иммунной системы и, как следствие этого, отсутствия прогрессирования заболевания и продление жизни.
Технический результат - повышение точности прогнозирования эффективности АРВТ при ВИЧ-инфекции (и сочетанной инфекции ВИЧ и туберкулеза) за счет контроля иммунного статуса больного.
Для достижения указанного технического результата в способе прогнозирования эффективности антиретровирусной терапии (АРВТ) при ВИЧ-инфекции, включающем оценку клинических данных, определяют комплекс иммунологических показателей цитокинов методом твердофазного иммуноферментного анализа: растворимый рецептор белка 55 некроза опухоли альфа (РРр55 ФНО-α), растворимый рецептор белка 75 некроза опухоли альфа (РРр75 ФНО-α), растворимый рецептор интерлейкина - 6 (РР ИЛ-6), устанавливают уровни цитокинов и при показателях растворимого рецептора белка 55 некроза опухоли альфа (РРр55 ФНО-α) от 768,72 до 1323,87 пг/мл, растворимого рецептора белка 75 некроза опухоли альфа (РРр75 ФНО-α) от 4335,48 до 6001,86 пг/мл и растворимого рецептора интерлейкина -6 (РР ИЛ-6) от 1770,77 до 3800,31 пг/мл прогнозируют благоприятное клиническое течение ВИЧ-инфекции через 1-3 месяца от начала антиретровирусной терапии. Данный способ применим при прогнозировании АРВТ при ВИЧ-инфекции, а также при сочетанной инфекции ВИЧ и туберкулеза.
Выбор комплекса указанных цитокинов основан на данных, полученных в процессе сопоставительного анализа содержания цитокинов в динамике у больных с отсутствием прогрессирования заболевания и с ухудшением состояния и умерших.
Диапазон показателей указанных цитокинов дополнительно уточнен методом статистического моделирования.
При проведении анализа имеющейся научной и патентной информации не обнаружено сведений, относящихся к использованию способа прогнозирования эффективности АРВТ при ВИЧ-инфекции методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА).
Статистическое моделирование включает применение простой и множественной линейной регрессии, полиноминальной регрессии, логистической регрессии и методов, которые используют в исследовании [2, 6]. Все эти методы опираются на генерирование математической модели, описывающей взаимосвязь между двумя переменными или более. Исчерпывающий вывод компьютерного анализа для логистической регрессии включает по каждой независимой переменной оценку коэффициента логистической регрессии со стандартной ошибкой, оценку отношения шансов (т.е. экспоненту коэффициента) с доверительным интервалом для ее истинной величины и статистический критерий Вальда (проверяющий нулевую гипотезу о том, что относительный риск, связанный с этой переменной, равен единице) и относящееся сюда значение достигнутого уровня значимости «р» [7, 10]. Эту информацию используют для того, чтобы определить, влияет ли каждая переменная на интересующую зависимую переменную, и количественно определить степень этого влияния. Можно также использовать процедуры автоматического выбора предикторов, как при множественной линейной регрессии, чтобы выбрать лучшую комбинацию независимых переменных.
Объектом исследования были 90 пациентов, получавших АРВТ: 40 больных с ВИЧ-ассоциированным туберкулезом (1 группа) в возрасте от 19 до 53 лет (в среднем 27,3±3,3 года; 85% мужчин) и 50 больных с ВИЧ-инфекцией без туберкулеза (2 группа) от 20 до 55 лет (в среднем 26,3±4,8 лет; 80% мужчин). При этом у всех больных, включенных в 1-ю группу, туберкулез выявлен на фоне ВИЧ-инфекции, показания для назначения АРВТ появились во время получения противотуберкулезной терапии. Предполагаемая давность инфицирования ВИЧ, определяемая периодом времени с момента появления фактора риска, составляла от 5 до 7 лет. У 10% больных определить время инфицирования не представлялось возможным. В 85% случаев инфицирование происходило парентеральным путем. Диагноз туберкулеза у больных первой группы выставлен на основании комплексного клинико-рентгенологического, бактериоскопического и бактериологического исследований. Преобладали инфильтративные формы - 17 пациентов (42,5%) и диссеминированные - 13 (33,7%). Очаговый туберкулез обнаружен у 10 больных (25%). Большинство больных диссеминированным туберкулезом (9), а также 2 больных с инфильтративным туберкулезом легких находились в продвинутой IVB стадии ВИЧ-инфекции. Все больные с ВИЧ-инфекцией, сочетанной с туберкулезом, получали специфическую противотуберкулезную терапию в соответствии со стандартными режимами терапии туберкулеза, утвержденными приказом Минздрава России №109 от 21.03.03 г. «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации». Большинство пациентов (65,1%) лечились 4-5 препаратами, в число которых входили рифампицин, стрептомицин, изониазид, этамбутол, пиразинамид, канамицин, фтивазид, цепрофлоксацин. 20,2% больных получали 3 противотуберкулезных препарата. Как правило, курс интенсивной химиотерапии составлял 2-3 месяца с продолжением химиотерапии 2-3 препаратами до 4-12 месяцев. У больных с ВИЧ-ассоциированным туберкулезом антиретровирусная терапия (АРВТ) проводилась на фоне противотуберкулезного лечения. АРВТ была назначена впервые по совокупности клинико-иммунологических показаний (уровень CD4+ ниже 200 в мкл и наличие вторичных заболеваний) и включала в себя препараты первой линии по рекомендуемым схемам. При этом у большинства больных (65,1%) уровень вирусной нагрузки составлял более 60 тысяч копий в мл. Основной целью назначения АРВТ являлась максимальная и длительная супрессия репликации ВИЧ, восстановление и сохранение функции иммунной системы и, как следствие этого, отсутствие прогрессирования заболевания и продление жизни. АРВТ включала в себя препараты первой линии в соответствии с рекомендациями Федерального научно-методического центра профилактики и борьбы со СПИДом - 2 препарата из группы нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ (НИОТ) (зидовудин или фосфазид + ламивудин или диданозин) и один препарат из группы ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ (ННИОТ) (ифавиренц или невирапин) или из группы ингибиторов протеазы ВИЧ (ИП) (лопинавир/ритонавир или нелфинавир или атазанавир) [5]. При назначении АРВТ учитывали сведения о взаимодействии антиретровирусных и противотуберкулезных препаратов с ингибиторами протеаз (индинавир, нельфинавир, лопинавир/ритонавир) и ненуклеозидными ингибиторами обратной транскриптазы (невирапин), которые могли привести к усилению токсичности противотуберкулезных и неэффективности противовирусных препаратов [4, 9].
Наиболее распространенными клиническими проявлениями среди пациентов, включенных в исследование, как с ВИЧ-инфекцией, ассоциированной с туберкулезом, так и без него до назначения АРВТ были лихорадка в 84,3% и 87,2% случаях соответственно, слабость в 89,5% и 84,8% случаях, персистирующая генерализованная лимфаденопатия в 38,6% и 42,1% случаях и нарушения сна в 87,5% и 80,3%. Артралгии беспокоили половину больных как в группе с сочетанной инфекцией (55,6%), так и в группе с моноинфекцией (49,4%). Поражения респираторного тракта имели преимущественное распространение среди пациентов с ВИЧ-инфекцией, сочетанной с туберкулезом, и проявлялись продуктивным кашлем в 78,5% случаев, против 38,2% у пациентов с ВИЧ-инфекцией без туберкулеза, одышкой в 66,7% и 23,7% случаях соответственно, физикальными изменениями в легких в виде ослабления дыхания и хрипов в 77,3% и 32,6%.
Способ осуществляется следующим образом.
Для этого периферическую кровь (5 мл) забирали шприцем из локтевой вены, центрифугировали при 3000 об/мин на холоде в течение 10 мин. Сыворотку разливали по 0,5 мл в эпиндорфы, замораживали и хранили до использования при - 76°С.
В ходе обследования изучали содержание цитокинов (ФНО-α, ИЛ-6, ИЛ-10 и их растворимых рецепторов РРр55 ФНО-α (I типа), РРр75 ФНО-α (II типа), РР ИЛ-6) до лечения и через 3 месяца от начала АРВТ в сыворотке крови пациентов методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием диагностических наборов (R&D Diagnostics Inc., USA) с чувствительностью 1 пг/мл.
Расчеты количества цитокинов дополнительно проводили путем построения калибровочной кривой с помощью компьютерной программы и выражали в пг/мл. Контрольную группу составили 50 практически здоровых лиц того же возраста и пола.
Результаты исследования
На фоне проводимой антиретровирусной терапии у большинства больных обеих групп к 3 месяцу наблюдения значительно улучшилось самочувствие: в 2,5 раза реже отмечался астеновегетативный, в 1,5 раза реже бронхолегочный синдром, в 1,2 раза потеря веса, в 2 раза реже грибковые и вирусные поражения кожи и слизистых. Из числа больных, включенных в 1-ю группу, у 25 (62,5%) пациентов отмечена положительная динамика - новых оппортунистических заболеваний не регистрировалось. В течение туберкулезного процесса (у всех больных имелись очаговые и инфильтративные формы) наблюдалось клиническое и рентгенологическое улучшение. У 3 (7,5%) больных динамики не зарегистрировано - клинико-рентгенологическая картина туберкулеза была без изменений, отмечались рецидивы кандидоза ротоглотки, гнойные инфекции кожи (не исключено, что эти проявления связаны с внутривенным употреблением наркотических препаратов). Ухудшение течения туберкулезного процесса отмечено у 12 (30%) пациентов - развились более тяжелые формы туберкулезного процесса (диссеминация (66,7%), фиброзно-кавернозные поражения (16,7%)), внелегочные локализации (туберкулезный менингит (25%), лимфаденит (33,3%), перитонит (8,3%)). Из них умерли 7 (17,5%) пациентов: в течение 1 мес от начала лечения - 2 больных, от 1 до 3 мес - еще 2 больных и через 3 мес - 3 больных. Причинами смерти больных с сочетанной патологией явились внелегочные проявления туберкулеза, симптомы СПИДа (распространенный кандидоз, кахексия), острая легочно-сердечная недостаточность на фоне туберкулеза легких. У 78,7% больных 2-й группы улучшение состояния сопровождалось отсутствием как новых, так и рецидивов оппортунистических заболеваний. Только у 5 пациентов (12,5%) регистрировались рецидивы кандидоза ротоглотки, мочевыводящих путей. 4 больных (10%) умерло на протяжении от 1 до 3 месяцев лечения АРВТ (сепсис, бактериальный менингоэнцефалит, распространенный кандидоз, кахексия).
w
При изучении динамики цитокинов через три месяца от начала АРВТ было установлено, что у пациентов с ВИЧ-инфекцией без туберкулеза на фоне АРВТ во всех стадиях (IVБ, IVB) существенной динамики показателей уровня ФНО-α не зафиксировано (p>0,05) (табл.1).
Таблица 1
Иммунные показатели у больных с ВИЧ-инфекцией на фоне антиретровирусной терапии
Исследованные показатели, М±m, пг/мл (норма)
Сроки
Стадия заболевания
IV Б
IV В
ФНО-α(0,95±0,32)
До лечения
44,32±16,15***
50,40±4,28***
Через 3 мес
56,20±3,28***
62,61±14,36***
Pw
>0,05
>0,05
РРр55 ФНО-α(390,11±38,04)
До лечения
794,50±42,40***
700,00±40,52***
Через 3 мес
1025,50±150,80***
1708,20±107,50***
Pw
<0,046
<0,024
РРр75 ФНО-α(2673,36±58,0)
До лечения
6700,90±986,50***
9743,20±264,30***
Через 3 мес
5121,30±436,0***
7422,50±342,40***
Pw
>0,05
<0,05
ИЛ-6(1,99±0,53)
До лечения
9,37±2,80**
30,41±8,61***
Через 3 мес
4,58±5,02**
14,61±7,93
Pw
<0,05
<0,05
РР ИЛ-6(3120,0±18,0)
До лечения
2336,70±128,10*
2606,21±152,50*
Через 3 мес
1301,40±426,20***
1488,7±489,40**
Pw
<0,02
<0,048
CD4+, %(38,5±0,9)
До лечения
21,7±1,7***
14,9±2,8***
Через 3 мес
28±1,1*
23,56±2,5*
Pw
<0,02
<0,05
Примечание: p<sub>w</sub> - статистическая достоверность различий на фоне терапии (критерий Вилкоксона). Статистическая достоверность различий с группой контроля: р<0,05 - *; р<0,01 - **; р<0,001 - ***.
w
w
Тогда как у больных с ВИЧ-инфекцией, ассоциированной с туберкулезом, на стадиях IVБ, IVB уровень ФНО-α имел тенденцию к увеличению, но статистически значимо был отличен от показателей до лечения только в IVB стадии (p<0,048) (табл.2). Это, вероятно, обеспечивает увеличение функциональной активности цитотоксических Т-лимфоцитов в противовирусном и антибактериальном иммунитете. В то время как у пациентов с IVБ стадией ВИЧ-инфекции, сочетанной с туберкулезом, различий в показателях ФНО-α до и после лечения не установлено (p>0,05).
Таблица 2
Иммунные показатели у больных с ВИЧ-инфекцией, ассоциированной с туберкулезом, на фоне антиретровирусной терапии
Исследованные показатели, М±m, пг/мл (норма)
Сроки
Стадия заболевания
IV Б
IV В
ФНО-α(0,95±0,32)
До лечения
39,62±15,03**
49,70±17,25**
Через 3 мес
60,83±5,34***
74,97±5,00***
Pw
>0,05
<0,048
РРр55 ФНО-α(390,11±38,04)
До лечения
640,82±30,00***
794,90±20,30***
Через 3 мес
1345,60±387,20***
2419,40±90,33***
Pw
<0,032
<0,018
РРр75 ФНО-α(2673,36±58,0)
До лечения
10084,32±966,40***
11963,72±586,00***
Через 3 мес
11426,44±438,30***
13446,41±347,21***
Pw
>0,05
<0,048
ИЛ-6(1,99±0,53)
До лечения
29,31±7,60***
35,18±9,16***
Через 3 мес
25,11±9,71***
29,57±18,40
Pw
>0,05
>0,05
РР ИЛ-6(3120,0±18,0)
До лечения
4682,70±308,40***
4572,31±381,20***
Через 3 мес
2238,70±484,80
1011,60±180,7**
Pw
<0,048
<0,02
CD4+, %(38,5±0,9)
До лечения
22,6±1,7***
26,7±2,5***
Через 3 мес
30±3,1**
33,56±2,2*
Pw
<0,02
<0,05
Примечание: p<sub>w</sub> - статистическая достоверность различий на фоне терапии (критерий Вилкоксона). Статистическая достоверность различий с группой контроля: р<0,05 - *; р<0,01 - **; р<0,001 - ***.
Как свидетельствуют наши исследования, несмотря на значительное повышение исследуемых рецепторов по сравнению с нормальными значениями во всех группах больных, уровень РР ФНО-α II типа снижался через 3 месяца после лечения у больных ВИЧ-инфекцией IVБ стадией, тогда как у пациентов с ВИЧ-ассоциированным туберкулезом не изменялся. Уровень рецептора РРр55 ФНО-α в группе больных с ВИЧ-инфекцией IVB, ассоциированной с туберкулезом, на фоне лечения в 3,5 раза превысил значения до лечения (2419,40±90,33 пг/мл против 794,90±20,30 пг/мл, соответственно, pw<0,018) в то время как у пациентов с аналогичной стадией ВИЧ-инфекции без туберкулеза - в 2,5 раза (1708,20±107,50 пг/мл против 700,00±40,52 пг/мл, соответственно, pw<0,024), что свидетельствует о выраженном его шеддинге в условиях АРВТ, что может приводить к изменению цитотоксических и проапоптотических эффектов ФНО-α. Циркулирующий РРр55 ФНО-α может играть важную роль в качестве эндогенного модулятора активности ФНО-α при ВИЧ-инфекции, а также индуктора синтеза соответствующих провоспалительных медиаторов лимфоцитарного (ИЛ-2, ИФН-γ) и макрофагального происхождения (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8 и др.). Вероятно, редкие формы туберкулезного процесса на фоне ВИЧ-инфекции, характеризующиеся фиброзом и капсуляцией туберкулем, связаны с иммунодефицитом и утратой способности организма формировать туберкулезную гранулему со специфической клеточной трансформацией и соединительно-тканными изменениями, тем самым способствуя диссеминации и генерализации туберкулеза. Содержание ИЛ-6 у пациентов с ВИЧ-ассоциированным туберкулезом на фоне АРВТ имело тенденцию через 3 месяца лечения к снижению во всех стадиях заболевания без достоверной значимости (р>0,05), в то время как у больных с ВИЧ-инфекцией без туберкулеза этот показатель на фоне лечения снижался почти в 2 раза (р<0,05). Параллельно уровень РР ИЛ-6 в первой группе по мере лечения снижался и в большей степени у пациентов в IVB стадии. У пациентов с ВИЧ-инфекцией без туберкулеза также наблюдалось снижение показателя РР ИЛ-6 через три месяца после начала АРВТ.
w
w
w
w
Анализируя содержание исследуемых цитокинов в динамике у умерших больных, было обнаружено существенное статистически значимое различие параметров до лечения и в процессе АРВТ как при коинфекции, так и при моноинфекции. Дисбаланс цитокинов проявлялся прежде всего у пациентов с ВИЧ-инфекцией, сочетанной с туберкулезом, в виде увеличения в 2 раза содержания ФНО-α на фоне АРВТ, по сравнению с результатами, полученными до лечения (p<0,02) (табл.3). При этом почти также в 2 раза увеличивался уровень его растворимого рецептора I типа (P<0,048) и умеренно снижался уровень РР ФНО-α II типа, который до лечения составлял 6426,54±424,53 пг/мл и через 1-3 месяца от начала АРВТ - 4312,33±286,91 пг/мл, что статистически значимо было отличным (P<0,02), не достигая нормальных значений (р<0,01). Уровень ИЛ-6 до лечения значительно превосходил показания нормальных значений (р<0,01) и имел тенденцию к нарастанию на фоне АРВТ. В то время как содержание его растворимых рецепторов на фоне АРВТ, напротив, прогрессивно снижалось по сравнению с показателями до лечения, что значительно отличалось от показателей у здоровых (р<0,001). Аналогичные изменения в динамике исследуемых параметров наблюдались и у пациентов с моноинфекцией с разницей лишь в отсутствие прогрессивного нарастания уровня ФНО-α в динамике по сравнению с показателями до лечения (p>0,05).
Таблица 3
Иммунные показатели у умерших больных на фоне антиретровирусной терапии
Исследованные показатели М±m, пг/мл (норма)
Сроки
Группы обследованных
ВИЧ/ТБ (n=7)
ВИЧ (n=4)
ФНО-α(0,95±0,32)
До лечения
88,38±12,58***
104,09±3,63***
Через 1-3 мес
158,02±19,72***
107,33±18,66***
Pw
<0,02
>0,05
PPI ФНО-α(390,11±38,04)
До лечения
712,10±56,08***
673,30±58,66***
Через 1-3 мес
1175,62±343,50***
1409,40±362,80***
Pw
<0,048
<0,048
РРII ФНО-α(2673,36±58,0)
До лечения
6426,54±424,52***
11047,82±486,0***
Через 1-3 мес
4312,33±286,91**
9272,30±526,10**
Pw
<0,02
<0,05
ИЛ-6(1,99±0,53)
До лечения
45,34±11,26***
49,66±4,10***
Через 1-3 мес
63,80±10,20***
69,66±13,10*
Pw
<0,048
<0,048
РР ИЛ-6(3120,0±18,0)
До лечения
2178,30±127,90***
1848,50±176,00***
Через 1-3 мес
1500,50±140,30***
999,30±287,20***
Pw
<0,02
<0,02
CD4+, %(38,5±0,9)
До лечения
15,2±2,7***
13,6±1,1***
Через 1-3 мес
20,5±7,4***
19,5±6,1***
Pw
<0,02
<0,02
Примечание: p<sub>w</sub> - статистическая достоверность различий на фоне терапии (критерий Вилкоксона). Статистическая достоверность различий с группой контроля: р<0,05 - *; р<0,01-**; р<0,001-***.
Статистическое прогнозирование эффективности АРВТ включало построение математической модели с использованием клинических и иммунологических показателей, которая позволяла бы прогнозировать клиническое течение и исход заболевания [7, 10]. Для выявления иммунологических показателей, значимых для благоприятного клинического течения ВИЧ-инфекции и исхода на фоне АРВТ, был использован дискриминантный анализ, который позволил построить правило прогноза и выявить из набора параметров наиболее информативные [2, 6]. Для этой цели применялась пошаговая процедура, в которой на каждом шаге построения модели дискриминации просматривались все переменные и находили те из них, которые вносили наибольший вклад в различие между совокупностями. Эти переменные включали в модели на текущих шагах и строились переходы к следующим. Одновременно для математического анализа формировались группы больных по выраженности клинических проявлений, исходам «выжил-умер», необходимость учета которых возникла с тем, что при разделении умерших больных на группы ВИЧ-инфекции с наличием или отсутствием туберкулезного процесса статистического различия по иммунологическим показателям получено не было. Все признаки клинических параметров оценены по степени выраженности в баллах по шкале Г.И.Марчука [7] в нашей модификации и представлены в таблице 4. Проводили суммирование баллов по каждому клиническому признаку у обследованных больных. Обозначились две группы с наиболее благоприятным, имеющим выраженность каждого клинического проявления от 0 до 2 баллов, и менее желательным течением ВИЧ-инфекции (от 3 баллов и более) в рамках нашей модели. К указанным в таблице 4 клиническим признакам добавлены исходы, оцененные также в баллах («выжил» - плюс 10 баллов и «умер» - минус 10 баллов). Группа с наиболее благоприятным течением заболевания характеризовалась статистически значимым меньшим средним значением уровня выраженности клинических проявлений по сравнению с группой с менее желательным исходом через 1-3 месяца от начала АРВТ (30,54±2,9 и 59,67±5,7 баллов по шкале Г.И.Марчука, р<0,05); меньшей длительностью лихорадки от начала лечения (29,61±4,8 и 60,2±10,2, р<0,05), меньшим количеством оппортунистических инфекций (1,5±0,23 и 3,6±1,3, р<0,05), соответственно, а также отсутствием летальных исходов против 27,5% в группе с менее желательным исходом ВИЧ-инфекции в рамках нашей модели.
Таблица 4
Схема балльной оценки клинических данных у ВИЧ-инфицированных с использованием шкалы Г.И.Марчука [7]
Признаки
Баллы
1
2
3
4
Длительность болезни
1-2 года
3-4 года
5-6 лет
7 и более лет
Температура, °С
До 37
37-37,2
37,2-37,5
37,5 и более
Аппетит
Нет изменений
Умеренно снижен
Резко снижен
Отсутствует
Слабость
Нет
Умеренная
Выраженная
Адинамия
Увеличение печени(правая доля)
Нет
На 1-2 см
На 2-3 см
На 3 и > см
Увеличение селезенки (по длиннику)
Нет
До 1 см
До 2 см
До 2 и > см
Лимфаденопатия
Нет
Единичные региональные лимфоузлы
Группы региональных лимфоузлов
Все группы лимфоузлов
Энцефалопатия по психометрическим тестам (стадии)
Нет
Латентная
I-II
II
Головная боль
Нет
Слабая
Умеренная
Выраженная
Кашель, одышка
Нет
Невыраженные
Умеренные
Выраженные
Хрипы
Нет
Единичные
Умеренные
Множественные
Вирусное поражение кожи, слизистых
Нет
Скудное
Умеренное
Обильное
Грибковое поражение кожи, слизистых
Нет
Скудное
Умеренное
Обильное
Бактериальное поражение кожи, слизистых
Нет
Скудное
Умеренное
Обильное
Потеря веса
Нет
До 5 кг
До 10 кг
>10 кг
Результат пошагового дискриминантного анализа всех иммунологических показателей для оценки прогноза клинического течения ВИЧ-инфекции, проводимого инструментами SPSS 15, представлен в таблице 5. Наряду с тестовой величиной, в качестве которой служит лямбда Уилкса, применялся простой дисперсионный анализ.
Таблица 5
Результаты теста на статистическую значимость между переменными в сравниваемых группах с разными исходами заболевания на фоне АРВТ
Иммунологическиепоказатели
Лямбда Уилкса
F
Р
ФНО-α, пг/мл
0,982
1,318
0,254
РРр55 ФНО-α, пг/мл
0,296
23,518
0,000
РРр75 ФНО-α, пг/мл
0,612
8,873
0,004
ИЛ-6, пг/мл
0,970
2,876
0,093
РР ИЛ-6, пг/мл
0,502
9,962
0,002
CD4+, %
0,990
0,949
0,333
Из представленной таблицы видно, что для переменных, кроме ФНО-α, ИЛ-6 и CD4+, имело место значимое различие между группами. Известно, что величина лямбды Уилкса может изменяться в диапазоне от 0 до 1, причем чем она ближе к 0, тем точнее дискриминация. Проведена оценка качества проведенного дискриминирования - для прогнозирования состояния группы с благоприятным течением она составила 100%. Из установленного дискриминантным анализом перечня иммунологических показателей статистически значимые различия распределения имели показатели РРр55 ФНО-α (лямбда Уилкса = 0,296, F=23,518, p=0), РРр75 ФНО-α (лямбда Уилкса = 0,612, F=8,873, p=0,004) и РР ИЛ-6 (лямбда Уилкса = 0,502, F=9,962, p=0,002). Полученные результаты позволяют говорить об информативности использования указанных иммунологических показателей для прогнозирования исходов течения ВИЧ-инфекции через 1-3 месяца от начала лечения АРВТ. Была установлена также статистическая значимость различий по этим иммунологическим показателям в сравниваемых клинических группах с использованием критериев Манна-Уитни U (р<0,01), Вальда (р<0,05), Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилки (р<0,05). Определены, с учетом параметров описательной статистики, интервалы данных иммунологических показателей через 1-3 месяца от начала АРВТ, ассоциирующиеся с наиболее благоприятным («+») и менее желательным («-«) (по шкале Г.И.Марчука, 1991) течением ВИЧ-инфекции (табл.6). В группе с наиболее благоприятным течением ВИЧ-инфекции на фоне АРВТ для показателя РРр55 ФНО-α это соответствовало 768,721-1323,872 пг/мл, для РРр75 ФНО-α - 4335,483-6001,864 пг/мл, для РР ИЛ-6 - 1770,769-3800,312 пг/мл (n=60, при 80% интерперцентильном диапазоне). Следовательно, указанные интервалы можно рассматривать как желательный результат для соответствующих иммунологических показателей через 1-3 месяца от начала АРВТ.
Таблица 6
Параметры описательной статистики групп пациентов с ВИЧ-инфекцией через 1-3 месяца от начала АРВТ при различных исходах лечения
Статистические показатели
Исходы заболевания
Иммунологические показатели
РРр55 ФНО-α
РРр75 ФНО-α
РР ИЛ-6
Число наблюдений
+
60
60
60
-
30
30
30
Средняя
+
1003,391
5043,528
2231,376
-
1500,523
9000,563
1498,457
Стандартное отклонение
+
229,2781
473,4567
464,2876
-
388,6291
457,3483
287,2765
Стандартная ошибка
+
166,8769
262,3764
196,8761
-
142,2538
253,6325
105,8534
Медиана
+
991,2875
5089,376
2249,5210
-
1478,223
8892,396
1561,021
Минимум (10% персентиль)
+
768,721
4335,483
1770,769
-
1089,894
7898,472
1100,108
Максимум (90% персентиль)
+
1323,872
6001,864
3800,312
-
1997,562
9932,264
1906,965
На основании проведенного исследования и статистического анализа можно заключить, что комплекс иммунологических показателей, включающих определение содержания уровней РРр55 ФНО-α, РРр75 ФНО-α и РР ИЛ-6 (пг/мл) в высокой степени значим и достаточен для осуществления прогноза исхода лечения ВИЧ-инфекции через 1-3 месяца от начала терапии. Интервалы их содержания ассоциированы с наиболее благоприятным клиническим течением ВИЧ-инфекции (прогнозом минимального уровня полиорганной дисфункции, минимальной длительности лихорадки, минимального количества оппортунистических инфекций и минимального риска летального исхода заболевания). Таблица 7 суммирует информацию о каждой переменной в модели.
Таблица 7
Показатели соотношений между исходами АРВТ больных ВИЧ-инфекцией и иммунологическими показателями (переменные) через 1-3 месяца от ее начала с использованием анализа множественной логистической регрессии
Переменная
Оценка параметра
Стандартная ошибка
Хи-квадрат Вальда
Достигнутый уровень значимости
Отношение шансов
95% доверительного интервала для отношения шансов
ФНО-α
0,5089
0,4456
1,3431
0,2430
1,665
(0,71-3,91)
РРр55 ФНО-α
0,7910
0,3871
4,1753
0,0410
2,206
(1,03-4,71)
РРр75 ФНО-α
1,6357
0,6028
7,3625
0,0067
5,133
(1,57-16,73)
ИЛ-6
0,0062
0,0204
0,0911
0,7628
1,006
(0,97-1,05)
РР ИЛ-6
1,1924
0,7111
2,8122
0,0935
3,295
(0,82-13,28)
CD4+
0,0146
0,0929
0,1239
0,8865
1,120
(1,01-1,87)
0,7910
Результаты означают, что показатели РРр55 ФНО-α (р=0,04), РРр75 ФНО-α (р=0,007) в указанных выше диапазонах независимо связаны с благоприятным исходом. Пациенты по параметру РРр55 ФНО-α в диапазоне от 768,721 до 1323,872 пг/мл имеют шанс благоприятного исхода в 2,21 раза больше (е), чем пациенты с другими величинами по данному показателю после учета других параметров. Другими словами, шанс благополучного исхода у этих пациентов повышается на 121%. Верхний предел доверительного интервала для этих отношений шансов показывает, что этот показатель может составлять 371%. Эта связь может быть отражением иммунологической перестройки организма на фоне АРВТ. Кроме того, показатель РР ИЛ-6 в диапазоне значений от 1770,769 до 3800,312 пг/мл может быть связан с положительным исходом заболевания на фоне лечения. Хотя это значимо в малой степени (р=0,0935), доверительный интервал включает достаточно высокое значение для отношения шансов, равное 13,28. Наоборот, нет указания на независимую связь между показателем ФНО-α и положительным исходом болезни на фоне АРВТ, что наводит на мысль, что эта переменная, судя по критерию хи-квадрат Пирсона, связана с негативным исходом заболевания, поскольку определено влияние АРВТ на уровень изучаемого показателя у умерших больных. Статистически значимой связи между уровнем ИЛ-6, CD4+ и исходом болезни нет. Однако отношение шансов, при этом, означает, что риски негативных исходов увеличиваются на 0,6% и 0,86% соответственно.
Полученные результаты легли в основу разработанного нами алгоритма оценки эффективности лечения АРВТ ВИЧ-инфицированных (см. чертеж).
Клинические примеры успешного и неуспешного лечения пациентов с ВИЧ-инфекцией, сочетанной с туберкулезом.
Пример 1. Больная О. 32 лет, потребитель наркотиков внутривенно с 2000 г., иммуноблот положительный с 2001 г.Состоит на учете в ГУЗ ККЦ СПИД с 2006 г. Диагноз: ВИЧ-инфекция IVB стадии, прогрессирование на фоне АРВТ. Туберкулез периферических лимфоузлов (шейной группы справа). Туберкулез внутригрудных лимфоузлов бронхопульмональной группы справа. Генитальный герпес, непрерывно-рецидивирующее течение. Конъюнктивит глазницы. Анемия смешанной этиологии средней степени тяжести. Хронический вирусный гепатит С, латентная фаза. В течение 7 мес больная трижды поступала в СПИД-центр. Диагноз туберкулеза был установлен при первой госпитализации на основании жалоб на высокую температуру тела, увеличение шейных лимфатических узлов преимущественно справа, их болезненность. Данные томографии средостения: увеличение бронхопульмональных лимфоузлов справа в S2, Sax единичные мелкие очаги. Фтизиатром назначено лечение туберкулеза: стрептомицин, рифампицин, пиразинамид, изониазид. CD4 составляло 140 кл./мкл, ВН ВИЧ 66691 коп./мл. АРВТ не назначалась в связи низким гемоглобином (68 г/л). Назначена профилактика кандидоза, лечение анемии. Через 1 месяц поступает с жалобами на интенсивную, мучительную боль и отек в области правого глаза. На компьютерной томограмме - тромбоз кавернозного синуса. Больная прооперирована, удален глаз. После операции развился конъюнктивит глазницы. Проводилась антибактериальная терапия, лечение туберкулеза, профилактика и лечение кандидоза. Больная продолжала отказываться от АРВТ. Проведена работа психотерапевта. CD4 51 кл./мкл, ВН ВИЧ - 1540052 коп./мл. После получения согласия от пациентки назначена схема ВААРТ с учетом анемии (Hb 103 г/л), наличия хронического гепатита С, туберкулеза: никавир + ламивудин + стокрин (ифавиренц). Больная строго соблюдала режим, приверженность высокая, переносимость препаратов хорошая. Получала гепатопротекторы, витамины, лечение герпеса противовирусными препаратам, лечение анемии. Через 1 месяц уровень CD4 - 69 кл./мкл, ВН - 992891 коп./мл, уровень АЛТ сохранялся нормальным. При оценке статуса цитокинов получены следующие данные: РРр55 ФНО-α (968,625 пг/мл), РРр75 ФНО-α (5335,483 пг/мл) и РР ИЛ-6 (2770,380 пг/мл), что позволило предопределить неплохой прогноз эффективности АРВТ и продолжить терапию. Через 6 месяцев: CD4+ - 200 кл./мкл, ВН - 265 коп./мл, АЛТ - норма, Hb-140 г/л, СОЭ - 20 мм/ч. Периферические лимфоузлы уменьшились, прибавила в весе, улучшилось общее самочувствие. Лечение продолжается.
Пример 2. Больная Л. 23 лет, заболела в марте 2005 года, когда были обнаружены инфильтративные изменения в легких, расценивавшиеся как пневмония, проходила лечение в многопрофильном стационаре. В мае 2005 года установлен диагноз инфильтративного туберкулеза нижней доли правого легкого в фазе распада,
МБТ (+). Одновременно выявлены ВИЧ-инфекция и вирусный гепатит С. Путь инфицирования парентеральный, из анамнеза известно, что в 2000 году в течение 10 месяцев употребляла героин. Была госпитализирована в противотуберкулезный диспансер, где получала стандартную туберкулостатическую терапию с мая 2005 года по ноябрь 2005 года с очень быстрой положительной динамикой. В ноябре 2005 года была выписана под наблюдение противотуберкулезного диспансера. Какие туберкулостатики получала после выписки, неизвестно, но основной курс был прерван в июне 2006 года по неизвестным причинам. Ухудшение самочувствия с июля 2006 года, когда появились боли в горле, повышение температуры до 38,0-39,0°С ежедневно, потливость по ночам, сухой кашель. Лечилась в поликлинике, наблюдалась терапевтом, лор-врачом, прошла курс антибактериальной терапии (внутримышечно цефазолин, ампициллин в таблетках) без эффекта. Направлена 20.07.2006. в больницу с диагнозом: Инфильтративный туберкулез в фазе рассасывания. ВИЧ-инфекция. Хронический вирусный гепатит С, обострение. При осмотре состояние средней тяжести, на слизистой щек, небе, языке кандидозные налеты, шейные и подмышечные лимфатические узлы до 1,0 см, тахикардия до 94 уд./мин, в легких жесткое дыхание, хрипов не слышно. На R-грамме легких правосторонняя остаточная нижнедолевая пневмония. Осмотрена фтизиатром, данных за реактивацию туберкулеза нет, остаточная пневмония сомнительна. У пациентки не исключается неспецифическая пневмония. Назначается цефтриаксон по 2,0 г 2 раза в сутки внутримышечно 5 дней, инфузионная терапия, нистатин в таблетках. Данная терапия без эффекта, сохраняется фебрильная температура. К терапии добавляется бисептол-480 3 таблетки 3 раза в сутки, т.к. не исключается пневмоцистная пневмония, но без эффекта. Подозревается реактивация туберкулезного процесса, повторно консультируется фтизиатром, назначается с 10.08.2006 года противотуберкулезная терапия: изониазид 0,6, пиразинамид 1,5, этамбутол 1,6. Появляется тенденция к снижению температуры, но сохраняются периодические подъемы до 38,0°С. С 16.08.2006, на 6-й день туберкулостатической терапии добавляется преднизолон в таблетках, 40 мг в сутки. После этого температура нормализуется.
s
9
При обследовании: в клиническом анализе крови палочкоядерный сдвиг влево; в иммунограмме CD4 11% - 189 кл./мкл, CD8 67% - 1123 кл./мкл, СD4/СД8 - 0,17; вирусная нагрузка более 750000 коп./мл; МБТ в мокроте не обнаружены; кровь на ИФА с туберкулиновым антигеном - отрицательна; посевы крови - отрицательны; ликвор - белок 0,28 г/л, цитоз, 93% лимфоцитов, сахар - 3,45 ммоль/л, ВК-пленка не обнаружена; билирубин 10 мкмоль/л; АЛТ - 77 е/л; ACT 68 е/л; токсоплазмоз IgG - положительные; ЦМВИ IgG - положительные; HBAg и HBcorAb общие - отрицательные; HCVAb - отрицательные. При ультразвуковом исследовании выявляются диффузные изменения печени и поджелудочной железы. 26.08.2006 переводится в тубдиспансер с диагнозом: ВИЧ-инфекция IVБ стадии. Орофарингеальный кандидоз. Реактивация инфильтративного туберкулеза легких. Хронический токсоплазмоз, латентная стадия. Цитомегаловирусная инфекция, латентная стадия. Сопутствующий диагноз: аутоиммунный тиреоидит, эрозия шейки матки, хронический вирусный гепатит С минимальной активности. В тубдиспансере устанавливается диагноз «Туберкулез внутригрудных лимфатических узлов в фазе инфильтрации, МВТ (+)», МВТ выявляются бактериоскопически 11.09.2006 в анализе бронхиальных смывов. Продолжается туберкулостатическая терапия: изониазид 0,8, пиразинамид 1,5, этамбутол 1,6, канамицин 1,0, преднизолон 25 мг. Самочувствие хорошее, но сохраняются периодические подъемы температуры до 38,0°С. С 30.08.06 по 09.09.06 года (10 дней) получает АРВТ: эпивир + видекс + калетра. С 05.09.06 (6-е сутки АРВТ): слабость, потемнение мочи, боли в правом подреберье, туберкулостатическая терапия уменьшена, оставлены этамбутол 1,6 и канамицин 1,0, с 08.09.2006 (9-й день АРВТ): желтуха кожи, АЛТ 1,42 ммоль/л, билирубин 160 мкмоль/л. 09.09.2006 АРВТ остановлена. 10.09.06 года выполняется рентгенография грудной клетки, где свежих очаговых и инфильтративных изменений не определяется. 13.09.2006 переведена в городскую больницу с подозрением на токсический гепатит. При поступлении состояние тяжелое, желтуха яркая, печень и селезенка увеличены. В связи с выраженными признаками печеночной недостаточности переводится в отделение реанимации. Выполняется рентгенография грудной клетки 20.09.2006 года, при которой выявляется легочная диссеминация. Осматривается фтизиатром, ставится диагноз «Милиарный туберкулез легких в фазе инфильтрации». Туберкулостатическая терапия усиливается: к этамбутолу 1,6 и канамицину 1,0 добавляются изониазид 0,6, рифампицин 0,45. Состояние прогрессивно ухудшается, нарастают признаки печеночно-почечной недостаточности. При обследовании: общий билирубин - 485 мкмоль/л; АЛТ - 31 е/л; ACT - 167 е/л; креатинин - 0,431 ммоль/л; протромбиновый индекс - 40%; лейкоциты 52,4*10/л; ликвор - белок 0,30 г/л, цитоз, лимфоциты - 12,3%.
При исследовании цитокинового статуса получены следующие результаты: РРр55 ФНО-α (208,695 пг/мл), РРр75 ФНО-α (15375,183 пг/мл) и РР ИЛ-6 (22770,930 пг/мл), что заведомо ассоциировалось с отсутствием эффективности лечения.
Устанавлен диагноз: ВИЧ-инфекция, 4 В стадия. Генерализованный туберкулез с полиорганным поражением (легких, печени, почек, кишечника). Атипичный микобактериоз. Орофарингеальный кандидоз.
Сопутствующий диагноз: Хронический вирусный гепатит С, цирротическая стадия. Портальная гипертензия. Отечно-асцитическй синдром. 25.09.2006 года наступает смерть.
Патологоанатомический диагноз: ВИЧ-инфекция в стадии СПИДа. Орофарингеальный кандидоз. Генерализованный туберкулез с поражением легких, почек, печени, лимфатических узлов, селезенки. Очаговый базальный менингит. Множественная дистрофия миокарда. Гидроперикардит. Острая сердечно-сосудистая недостаточность.
9
3
4
8
19
16+
Пример 3. Пациентка А., 28 лет. Состоит на диспансерном учете по ВИЧ-инфекции с февраля 2006 г. В апреле 2007 г. поступила в стационар ККЦ СПИД с жалобами на повышение температуры до 39-40°С, слабость, дискомфорт за грудиной, снижение массы тела на 9 кг (более 10%). Общее состояние тяжелое, обусловлено интоксикацией. R-графия - легочной рисунок в прикорневых зонах и базальномедиальных отделах обогащен. Корни уплотнены, структурны, очаговых и инфильтративных теней не выявлено. Проба Манту - отрицательная, бактериоскопия мокроты, мочи и испражнений на микобактерию туберкулеза - отрицательная, на КТ органов брюшной полости - гепатосленомегалия, признаки холецистита. Иммунограмма: лейкоциты - 3,9×10/л, лимфоциты - 605 (15,5%), СД - 327 (54,1%), СД - 94 (15,6%), СД - 232 (38,4%), СД - 85 (14%), СД- 118 (19,6%), ИРИ - 0,4. Вирусная нагрузка ВИЧ - 280335 коп./мл. Назначена терапия туберкулеза ex evantibus и ВААРТ. Назначено повторное рентгенологическое обследование через 1 мес от начала по ступления в стационар. Заключение: легочный рисунок усилен, деформирован, обогащен за счет сосудистого компонента по мелкоячеистому типу, корни структурны. Консультирован повторно фтизиатром, туберкулез исключен. При обследовании цитокинов через 1 месяц после начала терапии были обнаружены следующие их значения - РРр55 ФНО-α (1030,231 пг/мл), РРр75 ФНО-α (5003,245 пг/мл) и РР ИЛ-6 (2710,650 пг/мл), что соответствовало критериям, связанным с благоприятным исходом, и в дальнейшем, был зафиксирован хороший прогноз эффективности терапии, что проявлялось в купировании клинических симптомов, снижении вирусной нагрузки.
Таким образом определены цитокины и их интервалы при ВИЧ-инфекции, ассоциирующиеся с благоприятным исходом на фоне лечения АРВТ препаратами. Способ достаточно объективно достоверен, позволяет определить иммунологические маркеры АРВТ, позволяет определить эффективность АРВТ у ВИЧ-инфицированных больных, а также при сочетанной инфекции ВИЧ и туберкулеза за счет контроля иммунного статуса больного
Литература
1. Белозеров Е.С., Змушко Е.И. ВИЧ-инфекция. 2-е изд. СПб.: Питер, 2003. 368 с.
2. Гланц С. Медико-биологическая статистика/пер. с англ. М.: Практика, 1998. 459 с.
3. Калинина Н.М., Кетлинский С.А. Иммунология ВИЧ-инфекции. Иммунодефицитные состояния. Под. Ред. B.C.Смирнова, И.С.Фрейдлин. СПб., изд. «Фолиант». 2000. С.411-445.
4. Карачунский М.А. Туберкулез при ВИЧ-инфекции. Проблемы туберкулеза. 2000. №1. С.47-52.
5. Клинические рекомендации. ВИЧ-инфекция и СПИД. Под ред. В.В.Покровского. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. 128 с.
6. Лядов В.Р. Основы теории вероятностей и математической статистики. СПб.: Фонд «Инициатива», 1998. 200 с.
7. Марчук Г.И. Математические модели в иммунологии. Вычислительные методы и эксперименты. М.: Наука, 1991. 299 с.
8. Материалы научно-практической конференции с международным участием «Проблемы туберкулеза у больных ВИЧ-инфекцией». 18-19 апреля 2007 г. Москва. 120 с.
9. Некрасов С.П. Оказание противотуберкулезной помощи больным ВИЧ-инфекцией в Приморском крае. Материалы науч.-практ. конф. с междунар. участием «Проблемы туберкулеза у больных ВИЧ-инфекцией». Москва. 2007. С.38-39.
10. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. М.: Медиасфера, 2006. 306 с.
11. Сельцовский А.П., Ющук Н.Д., Поляков С.В. Социально-экономические последствия распространения ВИЧ-инфекции в России. М. 2002. 56 с.
12. Bartlett J.G, Gallant J.E. Medical Management of HIV-Infection Edition 2004. Johns Hopkins University. 2004. 450 p.
13. Blumberg H.M., Leonard M.K, Jasmer R.M. Update on the treatment of tuberculosis and latent tuberculosis infection. JAMA. 2005. Jun 8;293(22):2776-84.
14. Govor O.V.. A study of the trend in basic epidemiological indicators for tuberculosis in Primorye. European Respiratoru Journal. 2004. Vol.24., Supp.48. P. 194.