Влияние предварительной активации дрожжей пероксидом водорода на их адаптацию к осмотическому стрессу

Т. А. Ямашев, О. А. Решетник ВЛИЯНИЕ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ АКТИВАЦИИ ДРОЖЖЕЙ ПЕРОКСИДОМ ВОДОРОДА НА ИХ АДАПТАЦИЮ К ОСМОТИЧЕСКОМУ СТРЕССУ

Ключевые слова: дрожжи, активация, пероксид водорода, осмотический стресс.

Исследовано явление формирования устойчивости хлебопекарных дрожжей Saccharomyces cerevisiae к действию стрессора - хлорида натрия в результате предварительной обработки нелетальными концентрациями пероксида водорода. Показано, что дрожжи, обработанные 0,5-3,0 мМраство-рами пероксида водорода сохраняли более высокую бродильную активность в стрессовых условиях (3 % раствор NaCl) по сравнению с контролем.

Keywords: yeast, activation, hydrogene peroxide, osmotic stress.

The phenomenon of formation of sustainability of baker's yeast Saccharomyces cerevisiae to the action of stressor (sodium chloride) as a result of pretreatment of non-lethal concentrations of hydrogen peroxide is studied. Shown that yeast treated with 0,5-3,0 mM hydrogen peroxide solution retains a higher fermentation activity in stressful conditions (3% solution of NaCl) compared with control.

Дрожжи в пищевых производствах могут подвергаться действию различных неблагоприятных факторов, вызывающих у них состояние стресса. К наиболее частым видам стрессов относятся следующие: стресс новой среды, осмотический стресс и кислотный стресс. Воздействие стрессоров снижает бродильную активность дрожжей, что негативно влияет на органолептические и физико-химические показатели пищевых продуктов и их выход.

Высокие концентрации электролитов снижают активность воды за счет гидратации ионов, вызывают отток воды из клетки, агрегацию белков за счет усиления гидрофобных взаимодействий, препятствуют электростатическому взаимодействию внутри и/или между макромолекулами все это вызывает у клеток дрожжей состояние осмотического стресса. Адаптационный ответ на данный стресс может быть различным: поглощение осмолитов из внешней среды, синтез осмолитов, откачка ионов натрия из внутриклеточного пространства и замена их на ионы калия Na+/K+ насос, изменение состава клеточной стенки, цитоплазматической мембраны и других клеточных структур [1,2].

Существуют две стратегии адаптации к гиперосмотическому стрессу.

1. Стратегия «соль внутри», когда осмотическое давление среды уравновешивается высокими внутриклеточными концентрациями солей. Основным внутриклеточным катионом является ион калия (К+), а анионом - ион хлора Cl". Ион калия в значительно меньшей степени связывает воду по сравнению с ионом натрия, что позволяет клеткам осуществлять метаболические процессы. Аминокислотный состав белков при использовании данной стратегии претерпевает существенные изменения, увеличивается доля остатков кислых аминокислот (глутаминовой и аспарагиновой), расположенных, как правило, на поверхности белка. Заряженные кислые группы сильно гидратируются и обеспечивают защиту белка от агрегации. В качестве противоионов, необходимых для компенсации боль-

шого количества отрицательных зарядов и поддержания метаболически активного состояния, используются ионы калия. Вследствие чего микроорганизмы, использующие данную стратегию, нуждаются в высоких концентрациях солей для поддержания своей жизнедеятельности [3].

2. Микроорганизмы поддерживают низкие концентрации солей в цитоплазме и аккумулируют соединения - осмолиты, которые либо синтезируются внутри клетки, либо поступают из внешней среды. Осмолиты - это небольшие гидрофильные органические молекулы совместимые с клеточным содержимым (глицерин, трегалоза, сахароза, пролин, маннит, бетаин и т.д.), способствующие поддержанию клеточного объема и защищающие белки и мембраны от неблагоприятных факторов (повышение концентрации солей, нагревание, высушивание и т.д.). Избыток ионов солей активно откачивается в окружающую среду при помощи специальных транспортных систем [3, 4].

Под действием высоких концентраций NaCl у дрожжей S. cerevisiae усиливается экспрессия генов, вовлеченных в углеводный обмен и производство энергии [5]. В условиях осмотического стресса дрожжи S. cerevisiae синтезируют и аккумулируют осмолиты -глицерин и трегалозу [2, 6].

Из данных литературы известно, что при обработке клеток нелетальными дозами различных стрессоров у них развивается устойчивость к более высоким концентрациям этих веществ [4, 6, 7, 8]. Предобработка дрожжей S. cerevisiae низкими концентрациями пероксида водорода (0,4 мМ) повышала их устойчивость к более высоким, ингибирующим рост необработанных клеток, концентрациям Н2О2 [8]. Часто наблюдается явление перекрестной устойчивости, когда действие одного стрессора повышает резистентность микроорганизмов к другим [2, 6, 7, 9, 10]. Ранее нами также были получены данные о положительном влиянии низких концентраций пероксида водорода на повышение устойчивости дрожжей S. cerevisiae к органическим кислотам, высшим спиртам и этанолу в условиях спиртового брожения [11, 12, 13]. В связи, с чем представилось целесообразным провести исследования влияния обработки дрожжей нелетальными концентрациями пероксида водорода на их бродильную активность в условиях осмотического стресса.

Экспериментальная часть

Объект исследования - дрожжи хлебопекарные прессованные (ОАО Буинский сахарный завод).

Количество образующегося при брожении углекислого газа определяли волюмометрическим методом на приборе Яго-Островского по количеству вытесняемого насыщенного раствора хлорида натрия, в котором углекислый газ не растворяется.

При определении количества выделяющегося углекислого газа дрожжи помещали в питательную среду, состав которой был приближен к составу хлебобулочного изделия с повышенным содержанием сахара (20 % сахарозы, 1,5 % NaCl). Для создания стрессовых условий концентрацию NaCl повышали до 3 %. Эксперимент проводили в двух вариантах:

1) дрожжи после активации отделяли центрифугированием (5000 об/мин, 15 мин) и вносили в виде навески, ресуспензированной в водопроводной воде, чтобы исключить влияние пероксида водорода на газообразование;

2) дрожжи не отделяли от активирующего раствора ввиду того, что на производстве центрифугирование проводить нецелесообразно, и вносили в виде суспензии.

В контрольном опыте раствор пероксида водорода заменяли водопроводной водой.

Результаты и их обсуждение

Экспериментальные данные по образованию углекислого газа и интенсивности его выделения в среде с повышенной концентрацией NaCl (3 %) представлены на рис. 1, 2, 3.

Время, мин

- -О - 0 мМ пероксида водорода —— 0,5 мМ пероксида водорода —&— 3,0 мМ пероксида водорода —О— 5,0 мМ пероксида водорода

Рис. 1 - Образование углекислого газа культурой дрожжей S. cerevisiae, предобрабо-танных пероксидом водорода в течение 30 мин в условиях повышенной концентрации NaCl

0 55 65 75 85 95 105 115 125 135 145

Время. мин

-0-0 мМ пероксида водорода —— 0,5 мМ пероксида водорода —Л— 3,0 мМ пероксида водорода —О— 5,0 мМ пероксида водорода

Рис. 2 - Образование углекислого газа культурой дрожжей S. cerevisiae, предобрабо-танных пероксидом водорода в течение 60 мин в условиях повышенной концентрации NaCl

Время, мин

0 мМ пероксида водорода —— 0,5 мМ пероксида водорода

-Л- 3,0 мМ пероксида водорода

Рис. 3 - Образование углекислого газа культурой дрожжей S. еегег1я1ае, предобрабо-танных пероксидом водорода в течение 30 мин в условиях повышенной концентрации N80!

Повышенная концентрация хлорида натрия незначительно снижала объем выделившегося углекислого газа. В целом общая картина сохранилась: дрожжи, не подвергнутые центрифугированию синтезировали больше углекислого газа, а 30 минутная обработка оказывалась предпочтительней 60 минутной. Бродильная активность дрожжей активированных пероксидом водорода была выше, чем у контрольных.

Существенную роль в осмопротекции играют низкомолекулярные белки, сходные с «белками теплового шока» [1]. Синтез низкомолекулярных белков аналогичной структуры происходит и при других видах стрессов. Это укладывается в концепцию «общего адаптационного синдрома», согласно которой в ответ на действие различных стрессоров клетка применяет универсальные механизмы защиты. Существованием подобных механизмов объясняется и явление перекрестной устойчивости, когда обработка клеток нелетальными концентрациями одного стрессора повышает их резистентность к действию другого стрессора. Так, мягкая тепловая обработка (60 мин при 37 °С) или обработка низкими дозами оксидантов (0,5 мМ Н2О2 или 0,05 мМ менадиона (супероксидгенерирующий агент)) повышали устойчивость дрожжей Уаггон’га 11ро1уИеа к высокой температуре. Инкубация дрожжей в условиях слабого теплового воздействия повышала их резистентность к действию 120 мМ раствора пероксида водорода [14].

Показанное повышение осмоустойчивости свидетельствует о кросспротекторном действии нелетальных концентраций пероксида водорода на клетки дрожжей.

Литература

1. Плакунов, В.К. Множественный стресс у микроорганизмов - зло или благо? / В.К. Плакунов, О.В. Гейдебрехт, О.В. Шелемех // Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградского. Вып. XII: Юбилейный сборник к 70-летию Института / Отв. ред. В.Ф. Гальченко. - М.: Наука, 2004. - С. 361-375.

2. Hohmann, S. Osmotic stress signaling and osmoadaptation in yeasts / S. Hohmann // Microbiol. Mol. Biol. Rev. - 2002. - Vol. 66, № 2. - P. 300-372.

3. Деткова, Е.Н. Осмоадаптация галоалкалофильных бактерий: роль осморегуляторов и возможности их практического применения / Е.Н. Деткова, Ю.В. Болтянская // Микробиология. - 2007. -Т. 76. - № 5. - С. 581-593.

4. Воробьева, Л.И. Стрессоры, стрессы и выживаемость бактерий (обзор) / Л.И. Воробьева // Прикладная биохимия и микробиология. - 2004. - Т. 40. - № 3. - С. 261-269.

5. Hirasawa, T. Comparative analysis of transcriptional responses to saline stress in the laboratory and brewing strains of Saccharomyces cerevisiae with DNA microarray / T. Hirasawa [et all.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2006. - Vol. 70, № 3. - P. 346-357.

6. Бирюкова, Е.Н. Устойчивость дрожжей Yarrowia lipolytica к окислительному стрессу / Е.Н. Бирюкова [и др.] // Микробиология. - 2006. - Т. 75. - № 3. - С. 293-298.

7. Николаев, Ю.А. Внеклеточные факторы адаптации бактерий к неблагоприятным условиям среды / Ю.А. Николаев // Прикладная биохимия и микробиология. - 2004. - Т. 40. - № 4. -С. 387-397.

8. Davies, J.M. Transient adaptation to oxidative stress in yeast / J.M. Davies, C.V. Lowry, K.J. Davies // Arch. Biochem. Biophys. - 1995. - Vol. 317, № 1. - P. 1-6.

9. Rodrigues-Pousada, C. The yeast stress response role of the Yap family of b-ZIP transcription factors / C. Rodrigues-Pousada, T. Nevitt, R. Menezes // FEBS Journal. - 2005. - Vol. 272, № 11. -P. 2639-2647.

10. Chen, D. Global Transcriptional Responses of Fission Yeast to Environmental Stress / D. Chen [et all.] // Molecular Biology of the Cell. - 2003. - Vol. 14, № 1. - P. 214-229.

11. Ямашев, Т.А. Антимикробная обработка ржаного замеса в технологии этилового спирта / Т.А. Ямашев [и др.] // Вестник Казанского технологического университета. - 2006. - № 4. - С. 169175.

12. Ямашев, Т.А. Дезинфекция пшеничного замеса на стадии гидротермической обработки / Т.А. Ямашев [и др.] // Производство спирта и ликероводочных изделий. - 2006. - № 4. - С. 13-15.

13. Ямашев, Т.А. Влияние пероксида водорода на микробиологические и физико-химические показатели полупродуктов спиртового производства / Т.А. Ямашев [и др.] // Производство спирта и ликероводочных изделий. - 2008. - № 2. - С. 9-12.

14. Бирюкова, Е.Н. Адаптация дрожжей Yarrowia lipolytica к тепловому воздействию / Е.Н. Бирюкова [и др.] // Микробиология. - 2007. - Т. 76. - № 2. - С. 184-190.

© Т. А. Ямашев - канд. техн. наук, доц. каф. технологии пищевых производств ЮТУ; О. А. Решетник - д-р техн. наук, профессор, зав. каф. технологии пищевых производств КГТУ,

reshetnik@kstu.ru.