КОГОРТЫ БИОМАРКЕРОВ МОЧИ, ПРОФИЛЬ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
URINE BIOMARKER COHORTS, GENE EXPRESSION SIGNATURES  AND METHODS OF USE THEREOF

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США № 61/862630, поданной 6 августа 2013 года, содержание которой включено в настоящий документ путем ссылки в полном объеме.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[0002] В целом, настоящее изобретение относится к области анализов на биомаркеры, в частности, к определению профиля экспрессии генов в образцах мочи.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] Развитие знаний о генетических и эпигенетических изменениях, происходящих в раковых клетках, делает возможным распознавать, характеризовать, а также проводить мониторинг опухолей с помощью анализа последовательностей нуклеиновых кислот, связанных с опухолями, и их профилей. Эти изменения можно наблюдать путем детекции любого из разнообразных биомаркеров злокачественных новообразований. Для детекции таких биомаркеров и для получения важной информации для пациентов, врачей, клиницистов и исследователей используют различные анализы молекулярной диагностики. До настоящего времени такие анализы преимущественно проводили на раковых клетках, полученных в результате хирургического удаления опухолевой ткани, или из ткани, полученной при биопсии.
[0004] Однако, возможность проведения таких исследований с использованием образца жидкости организма зачастую более желательна, чем с использованием образцов ткани пациента. Менее инвазивный подход при использовании образца биологической жидкости имеет огромное значение с точки зрения материального и нематериального удобства для пациента, возможности проведения мониторинга на протяжении заболевания, а также возможности получения профилей экспрессии, даже если клетки ткани труднодоступны, например, как в случае предстательной железы. Для образцов в последнем случае, ранее описанные способы сбора требуют проведения ректального исследования предстательной железы (DRE) или массажа предстательной железы для того, чтобы обеспечить поступления в мочу достаточного количества клеточной жидкости из предстательной железы. Образцы, собранные без проведения DRE или массажа предстательной железы, показывают низкий уровень детекции таких биомаркеров.
[0005] Таким образом, существует необходимость в новых неинвазивных способах детекции биомаркеров, например, биомаркеров в микровизикулах мочи, для обеспечения диагностики, прогнозирования, проведения мониторинга или выбора терапии заболевания или другого расстройства предстательной железы. В частности, существует необходимость в неинвазивных способах, при которых не требуется проведение DRE или массажа предстательной железы перед взятием образца мочи и нет необходимости в стадии получения образца, включающей выделение клеточного осадка из образцов мочи.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0006] Настоящее изобретение относится к способам детекции одного или нескольких биомаркеров в микровизикулах мочи для обеспечения диагностики, прогнозирования, проведения мониторинга или выбора терапии заболевания, такого как, например, рак, в частности, заболевание или другое расстройство предстательной железы у индивида. Способ включает получение у индивида произвольного образца мочи; экстракцию мРНК из образца, детекцию уровня экспрессии мРНК PCA3 и ERG; и нормализацию уровня экспрессии мРНК PCA3 и ERG с KLK3 или с SPDEF. Способ дополнительно включает обработку выходного значения для нормализации уровня экспрессии мРНК PCA3 и ERG, используя заранее определенную формулу; и сравнение выходного значения с заранее определенной величиной порога отсечения, которая была определена с помощью кривой ROC, построенной на основе сочетания PCA3 и ERG, для проведения различия между индивидом с высоким риском возникновения рака и индивидом с низким риском возникновения рака. Кроме того, эти способы позволяют идентифицировать индивида с высоким риском рака предстательной железы с высоким индексом Глисона (GS) (например, индекс Глисона (GS)>6), по сравнению с индивидом с низким риском рака предстательной железы с высоким GS. Например, индивиды, у которых выходное значение, больше или, в некоторых вариантах осуществления, равно заранее определенной величине порога отсечения, которая определена с помощью кривой ROC, построенной на основе сочетания PCA3 и ERG, имеют высокий риск рака предстательной железы с высоким индексом GS, тогда как индивиды, у которых выходное значение ниже заранее определенной величины порога отсечения, имеют низкий риск рака предстательной железы с высоким GS. Таким образом, эти способы могут использоваться для проведения различия между индивидами с высоким риском рака предстательной железы с высоким GS и индивидами с низким риском рака предстательной железы с высоким GS.
[0007] Изобретение относится к способу диагностики, прогнозирования, проведению мониторинга или выбора терапии нуждающегося в этом индивида, состоящему из стадий получения у индивида произвольного образца мочи; экстракции одной или нескольких мРНК из образца; детекции уровня экспрессии мРНК PCA3 и ERG; нормализации уровня экспрессии мРНК PCA3 и ERG с эталонным геном; обработки выходного значения путем использования нормализованных уровней экспрессии мРНК PCA3 и ERG по заранее определенной формуле; и сравнения выходного значения с заранее определенной величиной порога отсечения, которая определена с помощью кривой ROC, построенной на основе сочетания мРНК PCA3 и мРНК ERG, для проведения различия между индивидом с высоким риском рецидивирующего рака и индивидом с низким риском рецидивирующего рака.
[0008] В способах, раскрытых в настоящем описании, используется образец мочи индивида мужского пола, например, образец с объемом первой порции мочи от 25 до 40 мл. Для способов, раскрытых в настоящем описании, не требуется проведение ректального исследования предстательной железы (DRE), и предпочтительно, используемые в этих способах образцы мочи являются образцами пациентов, которым не проводили DRE.
[0009] В некоторых вариантах осуществления уровень PSA пациента определен. В некоторых вариантах осуществления способы используют для анализа образцов пациентов с PSA в «серой зоне», имеющих уровень PSA, равный от 2 до 10 нг/мл. В некоторых вариантах осуществления пациентом является индивид мужского пола в возрасте по меньшей мере 50 лет.
[0010] В некоторых вариантах осуществления образец пациента анализируют, используя следующий алгоритм:
[0011] В некоторых вариантах осуществления баллы по шкале EXO106 используют для прогнозирования низкого риска развития рака предстательной железы или высокого риска развития рака предстательной железы у пациента. Например, пациентов, у которых балл по шкале EXO106 меньше 10, как вычислено с помощью приведенного выше алгоритма, идентифицируют как имеющих низкий риск развития рака предстательной железы, а пациентов, у которых балл по шкале EXO106 равен 10 или выше, идентифицируют как имеющих высокий риск развития рака предстательной железы.
[0012] В некоторых вариантах осуществления баллы по шкале EXO106 используют для прогнозирования низкого риска развития рака предстательной железы с высоким индексом Глисона (GS) или высокого риска развития рака предстательной железы с высоким GS у пациента. Например, пациентов, у которых балл по шкале EXO106 меньше 10, как вычислено с помощью приведенного выше алгоритма, идентифицируют как имеющих низкий риск развития рака предстательной железы с высоким GS, а пациентов, у которых балл по шкале EXO106 равен 10 или выше, идентифицируют как имеющих высокий риск развития рака предстательной железы с высоким GS.
[0013] В некоторых вариантах осуществления способы по настоящему изобретению дополнительно включают выделение микровезикулярной фракции из произвольного образца мочи и экстракцию нуклеиновой кислоты из микровезикулярной фракции.
[0014] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает определение уровня экспрессии AMACR, BIRC5, HOXC6 и/или SPARCL1. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает детекцию уровня экспрессии AMACR, BIRC5, HOXC6 и/или SPARCL1 и обработку выходного значения на основании сочетания PCA3, ERG и AMACR, BIRC5, HOXC6 и/или SPARCL1.
[0015] В любом из указанных выше способах перед экстракцией нуклеиновой кислоты в образец мочи добавляют известное количество Q-бета частиц. Определяют уровень экспрессии гена-мишени Q-бета и определенный уровень экспрессии сравнивают с известным количеством Q-бета частиц.
[0016] Изобретение относится к способу диагностики, прогнозирования, проведения мониторинга и выбора терапии расстройства у индивида, включающему стадии: (a) получения у индивида микровезикулярной фракции из образца мочи; (b) экстракции одной или нескольких нуклеиновых кислот из микровезикулярной фракции; и (c) анализа экстрагированных нуклеиновых кислот для детекции наличия, отсутствия или уровня экспрессии PCA3 и ERG. В свежих образцах мочи, а также в образцах мочи, которые были заранее заморожены и разморожены эти маркеры детектируются на постоянном уровне. Предпочтительно, образец мочи составляет 40 мл или 20 мл. Более предпочтительно, образцы мочи представляют собой первую порцию мочи объемом 40 мл из мочевого пузыря или первую порцию мочи объемом 20 мл из мочевого пузыря. Детекция этих маркеров репродуцируется в образцах одного и того же пациента, а также в образцах различных пациентов.
[0017] Изобретение также относится к способу, дополнительно включающему стадию детекции уровня экспрессии эталонного гена и определения нормализованных относительно уровня экспрессии биомаркеров, где относительный уровень экспрессии биомаркеров представляет собой соотношение между уровнем экспрессии биомаркера и уровнем экспрессии эталонного гена, и где индивида идентифицируют как страдающего расстройством, таким как рак, или имеющим повышенный риск его развития, если относительный уровень экспрессии биомаркера выше величины порога отсечения экспрессии биомаркера. В некоторых вариантах осуществления биомаркер представляет собой по меньшей мере ERG и PCA3. В некоторых вариантах осуществления биомаркер представляет собой по меньшей мере ERG и PCA3 и по меньшей мере один другой биомаркер, выбранный из группы, состоящей из AMACR, BIRC5, HOXC6, SPARCL1 и их сочетаний. В некоторых вариантах осуществления эталонный ген представляет собой ген, специфический для предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления эталонный ген представляет собой KLK3 или SPDEF, или их сочетание. В некоторых вариантах осуществления эталонный ген представляет собой KLK3. В некоторых вариантах осуществления эталонный ген представляет собой ген «домашнего хозяйства», такой, например, GAPDH.
[0018] В некоторых вариантах осуществления площадь под кривой (AUC), полученную на основе ROC-кривой (операционная характеристика приемника (ROC)) для каждого уровня биомаркера или балла, полученного при комбинировании биомаркеров, обрабатывают, используя результаты биомаркеров как контролей, так и биомаркеров больных пациентов. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления значение AUC, полученное на основе Roc-кривой для каждого уровня биомаркера или балла, полученного на основе комбинирования биомаркеров, составляет выше 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8. Предпочтительно, значение AUC составляет выше 0,7. Специалист в данной области без труда сможет максимально улучшить диагностическую точность уровня биомаркера или комбинации биомаркеров путем проведения анализа порога отсечения, принимая во внимание чувствительность, специфичность, прогностическую ценность отрицательного результата (NPV), прогностическую ценность положительного результата (PPV), отношение правдоподобия положительного результата (PLR) и отношение правдоподобия отрицательного результата (NLR), необходимых для клинической ценности. Результаты для биомаркеров или результаты для комбинации биомаркеров анализируют любым из различных способов. В некоторых вариантах осуществления результаты анализируют, используя одномерный анализ или одновариантный анализ (SV). В некоторых вариантах осуществления результаты анализируют, используя мультивариантный анализ (MV). Примеры обоих анализов, SV и MV, биомаркеров и/или когорты биомаркеров показаны в таблицах ниже.
[0019] В некоторых вариантах осуществления эталонным геном является ген, специфичный для предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления эталонный ген представляет собой KLK3 или SPDEF, или их сочетание. В некоторых вариантах осуществления эталонный ген представляет собой ген «домашнего хозяйства», например, GAPDH.
[0020] Биомаркеры и комбинации биомаркеров (также называемые в настоящем документе как когорты биомаркеров) могут быть использованы в способах диагностики, прогнозирования, проведения мониторинга и выбора терапии расстройства, такого как рак, в том числе, агрессивный рак. В некоторых вариантах осуществления биомаркеры и комбинации биомаркеров могут быть использованы для корреляции биомаркера и/или когорты экспрессии с вероятность того, что индивид страдает агрессивным злокачественным новообразованием или имеет риск его развития, на основе определенного уровня экспрессии и/или профиля экспрессии. В некоторых вариантах осуществления биомаркеры и комбинации биомаркеров могут быть использованы для корреляции биомаркера и/или когорты экспрессии с вероятность того, что индивид страдает рецидивирующим злокачественным новообразованием или имеет риск его развития, на основании определенного уровня экспрессии и/или профиля экспрессии. В некоторых вариантах осуществления биомаркеры и комбинации биомаркеров могут быть использованы для корреляции биомаркера и/или когорты экспрессии с вероятность того, что индивид страдает агрессивным раком предстательной железы или имеет риск его развития, на основании определенного уровня экспрессии и/или профиля экспрессии. Биомаркеры и комбинации биомаркеров могут быть использованы для корреляции биомаркера и/или когорты экспрессии с индексом Глисона у индивида. Например, уровень экспрессии биомаркера и/или когорты можно использовать для определения индекса Глисона у индивида на основании определенного уровня экспрессии и/или профиля экспрессии. Например, уровень экспрессии PCA3 и ERG можно использовать для определения того факта, что у индивида индекс Глисона выше 6. Биомаркеры и комбинации биомаркеров могут быть использованы для корреляции биомаркера и/или когорты экспрессии с вероятностью того, что индивиду будет необходима радикальная простатэктомия, на основании определенного уровня экспрессии и/или профиля экспрессии.
[0021] В некоторых вариантах осуществления расстройством является рак. Например, рак представляет собой рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак мочеполовой системы, например, рак предстательной железы, рак почки, рак мочевого пузыря или метастатическое злокачественное новообразование, которое поражает мочеполовые органы. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование представляет собой агрессивное злокачественное новообразование. Например, в некоторых вариантах осуществления расстройство представляет собой агрессивный рак предстательной железы, агрессивный рак почки или агрессивный рак мочевого пузыря.
[0022] Нуждающийся индивид страдает раком, например, агрессивным раком или имеет риск его развития. В некоторых вариантах осуществления индивид страдает раком предстательной железы или имеет риск его развития. В некоторых вариантах осуществления индивид не имеет риска развития рака предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления индивид страдает раком предстательной железы и у него определен конкретный индекс Глисона. Например, в некоторых вариантах осуществления у индивида определен индекс Глисона выше или равный 7. В некоторых вариантах осуществления у индивида определен индекс Глисона, выше или равный 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9. В некоторых вариантах осуществления у индивида определен индекс Глисона, который находится в диапазоне от 1 до 10, от 1 до 9, от 1 до 8, от 1 до 7, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3, от 1 до 2, от 2 до 10, от 2 до 9, от 2 до 8, от 2 до 7, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4, от 2 до 3, от 3 до 10, от 3 до 9, от 3 до 8, от 3 до 7, от 3 до 6, от 3 до 5, от 3 до 4, от 4 до 10, от 4 до 9, от 4 до 8, от 4 до 7, от 4 до 6, от 4 до 5, от 5 до 10, от 5 до 9, от 5 до 8, от 5 до 7, от 5 до 6, от 6 до 10, от 6 до 9, от 6 до 8, от 6 до 7, от 7 до 10, от 7 до 9, от 7 до 8, от 8 до 10, от 8 до 9 или от 9 до 10. В некоторых вариантах осуществления у индивида проведена простатэктомия, например, радикальная простатэктомия, или у него имеется риск проведения простатэктомии, например, радикальной простатэктомии.
[0023] Индивидом является, например, мужчина с клиническим подозрением на рак предстательной железы, например, на основании результатов исследования PSA и/или DRE. В некоторых вариантах осуществления в анамнезе у индивида была имеется биопсия с отрицательным результатом. В некоторых вариантах осуществления в анамнезе у индивида нет биопсии с отрицательным результатом. В некоторых вариантах осуществления индивиду рекомендована повторная биопсия. В некоторых вариантах осуществления индивиду рекомендована первичная, или первая, биопсия.
[0024] В некоторых вариантах осуществления индивиду рекомендована простатэктомия или она запланирована. В некоторых вариантах осуществления индивид имеет гистологически подтвержденный ацинарный тип (то есть, типичный) рака предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления рак предстательной железы является локализованным. В некоторых вариантах осуществления рак предстательной железы является локально распространенным.
[0025] В некоторых вариантах осуществления индивид не страдает заболеванием, таким как инфекционное заболевание, например, гепатит (все типы) и/или ВИЧ, и/или оно у него не предполагается. В некоторых вариантах осуществления в анамнезе у индивида нет параллельно протекающей опухоли почек и/или мочевого пузыря. В некоторых вариантах осуществления индивид ранее не получал или одновременно не получал никакой неоадъювантной или фокальной терапии рака предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления индивид ранее не получал или одновременно не получал никакой неоадъювантной или фокальной терапии, включая андроген-заместительную терапию, в течение шести месяцев до взятия образца мочи.
[0026] Маркеры и/или комбинации маркеров, описанные в настоящем документе, могут быть использованы в различных наборах, например, в диагностическом наборе, который можно использовать для исследования образцов мочи различных пациентов. В некоторых вариантах осуществления перед исследованием образца с помощью набора образец мочи концентрируют, например, с помощью стадии фильтрационной концентрации. Результаты могут быть обработаны, используя различные способы, включая устройства для быстрого считывания данных кПЦР.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0027] На фигурах 1A и 1B представлена серия схематических иллюстраций, изображающих рабочую схему исследования образцов когорты 7 пациентов в день 1 (фигура 1A) и в день 2 (фигура 1B).
[0028] На фигуре 2A графически изображена плотность распределения величин Ct Q бета, при детекции в 258 образцах когорты 7. Ось Y представляет плотность, а ось Х представляет собой величину Ct.
[0029] На фигуре 2B показан диаграмма размаха, на которой изображена плотность распределения величин Ct Q бета, как определено для 258 образцов когорты 7. Ось X представляет собой величину Ct.
[0030] Фигуры 3A и 3B представляют собой два графика, на которых показана корреляция значений AUC PCA3 при нормализации с KLK3 для объема образца каждого пациента когорты 7. На фигуре 3A, ось Y представляет собой значения AUC, а ость X представляет собой каждый образец когорты 7. На фигуре 3B, ось Y представляет собой объем образца, а ось X представляет собой каждый образце когорты 7. Легенда указывает клиники, из которых был получен каждый образец. На фигурах 3A и 3B показано, что AUC PCA3 (нормализован с KLK3) улучшается от <0,65 до >0,7, если объемы донорных образцов ограничены только 20 мл. На этих фигурах видно, что AUC в высокой степени зависит от объема образца.
[0031] Фигуры 4A и 4B представляют собой два графика, изображающих ROC-кривую, на основе анализа экспрессии ERG, нормализованного с KLK3, (не учтен, фигура 4A) и на основе анализа экспрессии PCA3 (фигура 4B), нормализованного с KLK3, в образцах пациентов когорты 7, в которых объем образца был меньше или равен 100 мл (N=236). На обоих фигурах ось X представляет собой специфичность; ось Y представляет собой чувствительность.
[0032] Фигуры 5A и 5B представляют собой два графика, изображающих ROC-кривую, на основе анализа экспрессии ERG, нормализованного с KLK3, (не учтен, фигура 5A) и на основе анализа экспрессии PCA3 (фигура 5B), нормализованного с KLK3, в образцах пациентов когорты 7, в которых объем образца был меньше или равен 40 мл (N=189). На обоих фигурах ось X представляет собой специфичность; ось Y представляет собой чувствительность.
[0033] Фигуры 6A и 6B представляют собой два графика, изображающих ROC-кривую, на основе анализа экспрессии ERG, нормализованного с KLK3, (не ограничен, фигура 6A) и на основе анализа экспрессии PCA3 (фигура 6B), нормализованного с KLK3, в образцах пациентов когорты 7, в которых объем образца был меньше или равен 20 мл (N=122). На обоих фигурах ось X представляет собой специфичность; ось Y представляет собой чувствительность.
[0034] Фигура 7 представляет собой график, изображающий ROC-кривую, на основе анализа экспрессии ERG и PCA3, нормализованного с KLK3, в образцах пациентов когорты 7, в которых объем образца был меньше или равен 100 мл (N=236). Анализ экспрессии ERG был учтен. На обоих фигурах ось X представляет собой специфичность; ось Y представляет собой чувствительность.
[0035] Фигура 8 представляет собой график, изображающий ROC-кривую, на основе анализа экспрессии ERG и PCA3, нормализованного с KLK3, в образцах пациентов когорты 7, в которых объем образца был меньше или равен 40 мл (N=189). Анализ экспрессии ERG был учтен. На обоих фигурах ось X представляет собой специфичность; ось Y представляет собой чувствительность.
[0036] Фигура 9 представляет собой график, изображающий ROC-кривую, на основе анализа экспрессии ERG и PCA3, нормализованного с KLK3, в образцах пациентов когорты 7, в которых объем образца был меньше или равен 20 мл (N=122). Анализ экспрессии ERG был учтен. На обоих фигурах ось X представляет собой специфичность; ось Y представляет собой чувствительность.
[0037] Фигура 10 представляет собой серию четырех таблиц, на которых показан анализ данных 2×2 когорты 7, используя заранее определенную формулу и величины пороговых значений модели, которые использовали для ранее полученных данных когорты 5. (Чувс.=чувствительность; Спец.=специфичность; NPV=прогносвическая ценность отрицательного результата; PPV=прогностическая ценность положительного результата; С5=контора 5; С7=контора 7). Значения, установленные для данных С5, были удовлетворительны при применении к С7, несмотря на некоторые различия между С5 и С7, такие как, например, протокол экстракции и химическую структуру зондов. Объемы когорты С5, как правило, были ниже, объемов С6, большинство образцов имело объем 40 мл.
[0038] Фигура 11 представляет собой диаграмму размаха, показывающую распределение величин Ct для детектированных генов (AMACR, BIRC5, ERG, НОХС6, KLK3, РСА4, QBETA, SPARCL1 И SPDEF) в каждом образце группы (пул образцов из Германии=пул контрольных образцов, пациенты=пациенты когорты 7, эталон=эталонные контроли и RT-контроли-контроли с обратной транскриптазой).
[0039] Фигура 12 представляет собой график сравнения значений AUC, полученных с помощью одновариантного анализа для каждого указанного гена (РСА3, ERG, AMACR, ВIRC5, НОХС6, SPARCL1 и SPDEF) в образцах с маленьким объемом (20 мл) со значениями AUC всех образов. Все CI и CI, объемом 20 мл, указывают на 95% доверительный интервал для AUC для «всех образцов» и «образцов, объемом 20 мл», соответственно. Ось У представляет собой значения AUG; ось X представляет собой каждый тестируемый ген.
[0040] Фигура 13 представляет собой график, на котором показаны значения AUC, полученные с помощью одновариантного анализа для каждого указанного гена (AMACR, BIRC5, ERG, НОХС6, KLK3, РСА3, SPARCL1 и SPDEF) и сравнение значений AUС в следующих подгруппах: нормализованные с SPDEF или KLK3; учтенные и нормализованные с SPDEF или KLK3; образцы всех объемов и образцы с маленькими объемами; и число копий до значений Ct.
[0041] Фигуры 14А и 14В представляют собой два графика, на которых представлено сравнение анализа когорты 5 (С5) и когорты 7 (С7) с помощью анализа на трех генах. На Фигуре 14А показано сравнение С5 и С7 для всех образцов. На Фигуре 14B показано сравнение С5 и С7 образцов с маленьким объемом. FTO=модель на 3-х генах, где не используется РСА3. FTO относится к модели на трех генах, в которой не используется РСА3.
[0042] Фигура 15 представляет собой график, на котором показаны значения AUC, полученные на аналитической модели на 3-х генах, указанной комбинации следующих генов: AMACR, BIRC5, ERG, HOXC6, KLK3, PCA3 SPARCL1, и SPDEF; и сравнение значений AUC в следующих подгруппах: нормализованные с SPDEF или KLK3; учтенные и нормализованные с SPDEF или KLK3; образцы со всеми объемами и образцы с маленькими объемами; и число копий к величинам Ct.
[0043] Фигура 16 представляет собой график, на котором иллюстративно показано распределение баллов по шкале EXO106 в когорте пациентов, где n=453 образцов, среднее PSA=5,3 нг/мл и 80% образцов 2<PSA<10 нг/мл.
[0044] На Фигуре 17 графически показана AUC для EXO106 в режиме на пациентах с любым индексом Глисона в сравнении с AUC при стандартном лечении (SOC).
[0045] Фигуры 18A и 18B представляет собой серии графиков, изображающих EXO106 в режиме с квартилем, то есть, процентное содержание образцов, идентифицированных как положительные с помощью биопсии, по баллам по шкале EXO106 квартиль.
[0046] Фигура 19 представляет собой графическое изображение балла EXO106 в режиме для рака предстательной железы с высоким баллом, например, с индексом Глисона больше 6.
[0047] Фигура 20 представляет собой графическое изображение балла EXO106 в режиме на основе индекса Глисона в подгруппах.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0048] Биомаркеры, злокачественных новообразований, включают, например, специфические мутации в последовательностях генов (Cortez and Calin, 2009; Diehl et al., 2008; Network, 2008; Parsons et al., 2008), положительную и отрицательную регуляцию мРНК и экспрессии мкРНК (Cortez and Calin, 2009; Itadani et al., 2008; Novakova et al., 2009), варианты сплайсинга мРНК, изменения в профиле метилирования ДНК (Cadieux et al., 2006; Kristensen and Hansen, 2009), амплификацию и делецию геномных областей (Cowell and Lo, 2009) и абберантную экспрессию повторяющихся последовательностей ДНК (Ting et al., 2011). С помощью различных диагностических молекулярных анализов, таких как мутационный анализ, анализ статуса метилирования геномной ДНК и анализ экспрессии генов, можно детектировать эти биомаркеры и представлять важную информацию пациентам, врачам, клиницистами и исследователям. До настоящего времени, такие анализы преимущественно проводили на злокачественных клетках, полученных при хирургическом удалении опухолевой ткани или из ткани, полученной при биопсии. Например, посредством анализа на биопсию ранее было показано, что PCA3, TMPRSS2:ERG и ERG дифференциально экспрессируются при раке предстательной железы по сравнению со здоровой тканью предстательной железы (Bussemakers et al., 1999; Petrovics et al., 2005; Tomlins et al., 2005).
[0049] Однако, возможность проведения таких исследований с использованием образца жидкости организма зачастую является более желательной, чем с использованием образца ткани пациента. Менее инвазивный подход при использовании образца биологической жидкости имеет огромное значение с точки зрения материального и нематериального удобства для пациента, возможности проведения мониторинга на протяжении заболевания, а также возможности получения профилей экспрессии, даже если клетки ткани труднодоступны, например, как в случае предстательной железы.
[0050] Ранее исследовалась возможность обнаружения маркеров рака предстательной железы, таких как PSA (также называется KLK3), PCA3, TMPRSS2:ERG и ERG, используя образцы мочи (Hessels et al., 2007; Laxman et al., 2008; Laxman et al., 2006; Nguyen et al., 2011; Рис et al., 2010; Rostad et al., 2009; Salami et al., 2011; Tomlins et al., 2005). Однако способы сбора таких образцов, описанные ранее, требуют проведения ректального исследования предстательной железы (DRE) или массажа предстательной железы, для того чтобы обеспечить поступления в мочу достаточного количества клеточной жидкости из предстательной железы. Образцы, собранные без проведения DRE или массажа предстательной железы, показывают низкий уровень детекции таких биомаркеров. Например, уровень детекции для TMPRSS2:ERG составил приблизительно 69% при проведении DRE, и лишь приблизительно 24% без проведения DRE (Rostad et al., 2009).
[0051] Фактически, для существующих в настоящее время способов сбора образцов для анализа мочи на биомаркеры рака предстательной железы требуется применение DRE с постоянным осуществлением давления средней силы на всю пальпируемую поверхность предстательной железы, с 3-х кратными поглаживающими надавливаниями на предстательную железу с каждой стороны, сильным давлением на предстательную железу по направлению снизу вверх и от края к середине (где поверхность углубления предстательной железы составляет от 0,5 до 1 см) для каждой доли три раза (Deras et al., 2008; Hessels et al., 2007; Laxman et al., 2008; Laxman et al., 2006; Nguyen et al., 2011; Рис et al., 2010; Salami et al., 2011).
[0052] Кроме того, для описанного ранее способа получения образца требуется выделение клеточного осадка из образца мочи, полученного после проведения DRE, посредством центрифугирования (Hessels et al., 2007; Laxman et al., 2008; Laxman et al., 2006; Nguyen et al., 2011; Rostad et al., 2009; Salami et al., 2011).
[0053] Большое число проведенных ранее исследований позволяет предположить, что DRE является важной стадией для сбора достаточного количества материала РНК при неинвазивных генетических анализах предстательной железы (Deras et al., 2008; Hessels et al., 2007; Laxman et al., 2008; Laxman et al., 2006; Nguyen et al., 2011; Рис et al., 2010; Rostad et al., 2009; Salami et al., 2011; Tomlins et al., 2011). В некоторых из этих исследований, требуется обработка образцов мочи в пределах 4 часов после сбора (Deras et al., 2008; Tomlins et al., 2011).
[0054] В отличие от этих ранее известных способов сбора образцов и способов детекции биомаркеров в моче, способы, представленные в настоящем документе, не требуют ни проведения DRE или массажа предстательной железы перед сбором образца мочи, ни стадию обработки образцов, включающую выделение клеточного осадка из образцов мочи. В этих новых неинвазивных способах используют микровизикулы мочи для детекции биомаркеров, способствующих диагностики, прогнозированию, проведению мониторинга или выбору терапии заболевания или другого расстройства предстательной железы. Микровизикулы, высвобождаемые опухолевыми клетками, можно использовать для определения генетического статуса опухоли (Skog et al., 2008). Также см. WO 2009/100029, WO 2011/009104, WO 2011/031892 и WO 2011/031877.
[0055] Микровезикулы высвобождаются эукариотическими клетками, или «почкуются» из плазматической мембраны, наружу клеток. Эти мембранные везикулы гетерогенны по размеру и имеют диаметр в диапазоне приблизительно от 10 нм до приблизительно 5000 нм. Все мембранные везикулы, высвобождаемые клетками, размер которых меньше 0,8 мкм в диаметре, обозначают общим понятием «микровезикулы», как в настоящем документе.
[0056] Настоящее изобретение основано на неожиданном обнаружении, что микровизикулы мочи содержат биомаркеры заболевания или другого расстройства предстательной железы у индивида. Таким образом, образец мочи пациента может быть проанализирован на детекцию биомаркеров заболевания или другого расстройства предстательной железы у индивида.
[0057] В способах, приведенных в настоящем документе, производные образцы мочи индивидов собирали без проведения ректального исследования предстательной железы (DRE) или массажа предстательной железы перед сбором мочи. Образцы мочи имеют объем 60 мл, 50 мл, 40 мл, 30 мл, 20 мл, 15 мл или 10 мл. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления образцы мочи имеют объем 40 мл или 20 мл. В некоторых вариантах осуществления образцы мочи могут иметь объем от 1 до 40 мл, от 1 до 35 мл, от 1 до 30 мл, от 1 до 25 мл, от 1 до 20 мл, от 1 до 15 мл, от 1 до 10 мл, от 1 до 5 мл, от 5 до 40 мл, от 5 до 35 мл, от 5 до 30 мл, от 5 до 25 мл, от 5 до 20 мл, от 5 до 15 мл, от 5 до 10 мл, от 10 до 40 мл, от 10 до 35 мл, от 10 до 30 мл, от 10 до 25 мл, от 10 до 20 мл, от 10 до 15 мл, от 15 до 40 мл, от 15 до 35 мл, от 15 до 30 мл, от 15 до 25 мл, от 15 до 20 мл, от 20 до 40 мл, от 20 до 35 мл, от 20 до 30 мл, от 20 до 25 мл, от 25 до 40 мл, от 25 до 35 мл, от 25 до 30 мл, от 30 до 40 мл, от 30 до 35 мл, или от 35 до 40 мл.
[0058] В предпочтительном варианте осуществления образец мочи представляет собой первую порцию мочи из мочевого пузыря, которая также известна как «утренняя» моча. Первая порция мочи содержит максимальную концентрацию микровезикул из предстательной железы и, таким образом, анализ первой порции мочи дает максимальный сигнал биомаркеров предстательной железы. Как показано в настоящем документе, диагностическая точность биомаркеров, используемых для диагностики и прогнозирования рака предстательной железы, повышается при уменьшении объема образца первой порции мочи. Полученные сведения, как описано в настоящем документе, указывают на то, что объем первой порции мочи, равный 40 мл или 20 мл, дает максимальную диагностическую точность (то есть, значения AUC). Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления образцы мочи представляет собой первую порцию мочи объемом 40 мл или менее, полученную из мочевого пузыря. Например, образцы мочи представляет собой первую порцию мочи объемом 20 мл, полученную из мочевого пузыря.
[0059] Образцы мочи, которые не подходят для использования в наборах и/или способах, раскрытых в настоящем описании, включают такие образцы, которые не хранились и/или не перевозились должным образом. Например, образцы не следует хранить при комнатной температуре (например, 15-25°C) в течение длительного времени. В некоторых вариантах осуществления образцы не следует хранить при комнатной температуре (например, 15-25°C) в течение более 24 часов. В некоторых вариантах осуществления образцы не следует хранить при комнатной температуре (например, 15-25°C) в течение более 36 часов. В некоторых вариантах осуществления образцы не следует хранить при комнатной температуре (например, 15-25°C) в течение более чем 48 часов. Образцы не следует хранить при температуре замерзания (например, 2-8°C) в течение длительного времени. Например, образцы не следует хранить при температуре замерзания (например, 2-8°C) в течение свыше 21 суток. В некоторых вариантах осуществления образцы не следует хранить при температуре замерзания (например, 2-8°C) в течение свыше 30 суток. Как правило, образцы могут быть заморожены (например, ≤70°C) на неопределенный период времени. Образцы следует перевозить на хладоэлементах или на сухом льду, если образец заморожен.
[0060] Образцы мочи, которые не подходят для использования в наборах и/или способах, раскрытых в настоящем описании, включают образцы с чрезмерным содержанием крови.
[0061] Время сбора образцов мочи может также изменяться в зависимости от различных вариантов применения. Образец может быть собран в любое время в качестве разового образца мочи. Разовый образец мочи может подходить для анализов на биомаркеры, если количество биомаркеров в микровезикулах для анализа, не слишком изменяется в течение суток. В других случаях, собирают 24-ех часовой образец мочи, если количество маркеров в микровезикулах для анализа изменяется, и 24-ех часовой объем мочи может уменьшить такой эффект изменения. Еще в других случаях, собирают серию образцов мочи для исследования изменения количества биомаркеров в микровезикулах. Сбор серии образцов можно проводить в определенный интервал времени, например, каждые 6 часов, или по определенному плану, например, до или после терапевтического вмешательства.
[0062] В способах, представленных в настоящем документе, образцы мочи представляет собой первую порцию мочи, предварительно обработанную с помощью способа, включающего по меньшей мере одну стадию фильтрации. Например, используют фильтр с пропускной способность (0,8 микрон) для удаления клеток и клеточного осадка. После такой фильтрации может следовать стадия ультрафильтрации для удаления растворителя и низкомолекулярных аналитов с сохранением микровезикул. Используемые для первичной фильтрации фильтры могут быть любого размера, который подходит для удаления клеток и клеточного осадка, например, любого размера свыше 0,22 микрон. Для выделения микровизикул мочи затем проводят стадию концентрирования фильтрацией предварительно обработанных образцов, где используется фильтр с пороговым значением молекулярной массы для сохранения и концентрирования микровезикул, диаметр которых выше 10 нм. Например, образец затем концентрируют до объема менее 1 мл, предпочтительно, 100-200 мкл. Например, пороговая величина молекулярной массы составляет по меньшей мере 100 кДа.
[0063] В некоторых вариантах осуществления способ предварительной обработки и обработки образца мочи включает следующие стадии. Во-первых, проводят обработку порции образца мочи, например, объемом по меньшей мере 20 мл, с помощью фильтра размером 0,8 мкм. Например, если объем образца составляет ≤50 мл, по меньшей мере 20 мл набирают в шприц, который присоединен к фильтру размером 0,8 мкм, а затем выпускают в чистый сосуд, например, чистую пробирку объемом 50 мл. Если объем образца мочи составляет ≥50 мл, то образец фильтруют, используя фильтр-бутылку с размером фильтра 0,8 мкм, и в некоторых вариантах осуществления используют отсос для прохождения образца через фильтр-бутылку. Затем, независимо от начального объема образца, отфильтрованную мочу в чистом сосуде помещают на импульсное встряхивающее устройство на несколько секунд, например, на 1-2 секунды. Отфильтрованную мочу затем хранят до начала фильтрационной концентрации.
[0064] Порцию отфильтрованной мочи, например, 15 мл, затем обрабатывают, используя фильтр для концентрации (FC). После того, как отфильтрованную мочу с помощью пипетки переносят в камеру FC (то есть, в верхнюю камеру FC-сосуда), можно добавить определенную концентрацию внутреннего контроля, например, внутренний контроль с Q-бета бактериофагом (Attostar, Catalog #BAC200). FC-сосуд затем центрифугируют, например, на роторной центрифуге с плавающим барабаном, и крутят в течение 5 минут при 4500×g при комнатной температуре (например, 20-25°C). Если образец не удалось полностью отфильтровать (>500 мкл ультраконцентрата остается в FC), то следует провести еще раз центрифугирование FC-сосуда в течение 2-5 минут. Образцы, которые показывают минимальные сигналы фильтрата (>10 мл ультраконцентрата остается в FC), следует отбраковать.
[0065] Образец затем вынимают из центрифуги, и фильтрат (то есть, жидкость на дне FC-сосуда) удаляют. Ультраконцентрат затем ресуспендируют с 5 мл оставшейся отфильтрованной мочи и с 10 мл 1×PBS. Образец равномерно перемешивают, например, переворачивая FC-сосуд 3-4 раза. FC-сосуд затем центрифугируют, например, на роторной центрифуге с плавающим барабаном, и крутят в течение 5 минут при 4500×g при комнатной температуре (например, 20-25°C). Образец затем вынимают из центрифуги, и фильтрат удаляют.
[0066] На первой стадии промывки ультраконцентрат ресуспендируют в 15 мл 1×PBS. Образец равномерно перемешивают, например, переворачивая FC-сосуд 3-4 раза. FC-сосуд затем центрифугируют, например, на роторной центрифуге с плавающим барабаном, и крутят в течение 5 минут при 4500×g при комнатной температуре (например, 20-25°C).
[0067] На второй стадии промывки ультраконцентрат ресуспендируют в 15 мл 1×PBS. Образец равномерно перемешивают, например, переворачивая FC-сосуд 3-4 раза. FC-сосуд затем центрифугируют, например, на роторной центрифуге с плавающим барабаном, и крутят в течение 7 минут при 4500×g при комнатной температуре (например, 20-25°C). Ожидаемый объем ультраконцентрата равен 100-200 мкл. Если объем образца больше 250 мкл, то затем FC-сосуд крутят дополнительные 5 минут при 4500×g при комнатной температуре.
[0068] После выделения и концентрации микровизикул мочи образцы предварительно обрабатывают ингибитором РНКазы, перед экстракцией нуклеиновой кислоты, для предупреждения ферментного расщепления экстрагированной РНК и для повышения качества экстракта. Необязательно, образцы можно промывать по меньшей мере один раз с помощью подходящего буфера для дополнительного насыщения или очистки микровезикулярной фракции. В некоторых вариантах осуществления образцы дважды промывают, используя подходящий буфер для дополнительного насыщения или очистки микровезикулярной фракции. РНК экстрагируют из микровезикул способом, включающим лизис микровезикул, пропуск лизата через РНК-связывающую колонку и элюирование РНК из РНК-связывающей колонки, в подходящих условиях, предусмотренных для получения препаратов РНК высокого качества. Необязательно, концентрированные микровезикулы лизируют на фильтре, используя стадию предварительной обработки. Эти препараты РНК высокого качества обеспечивают основанную на анализе мочи молекулярную диагностику рака предстательной железы и другие расстройства предстательной железы.
[0069] В некоторых вариантах осуществления в верхнюю камеру FC-сосуда добавляют 4 мкл ингибитора РНКазы. Сосуд затем встряхивают в боковом направлении для обеспечения полного суспендирования ингибитора РНКазы. Образец затем инкубируют вместе с ингибитором РНКазы в течение 2-3 минут при комнатной температуре (например, 15-25°C). Затем в каждый образец добавляют буфер для лизиса РНК, например, буфер для лизиса РНК Promega (Catalog #Z3051), содержащий 2% 1-триглицерин, в объеме 250 мкл. Образец затем быстро встряхивают на устройстве для встряхивания и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 минуты.
[0070] Затем на дно FC-сосуда помещают пипетку (осторожно, чтобы не дотронуться или не задеть боковые поверхности сосуда или фильтра) и переносят 150 мкл раствора (то есть, образец+ингибитор РНКазы) в сосуд объемом 2 мл без РНКазы. Эту стадию повторяют до тех пор, пока весь образец не будет взят и перенесен в сосуд объемом 2 мл без РНКазы. Выделенная микровезикулярная фракция затем готова для экстракции нуклеиновой кислоты, например, экстракции РНК.
[0071] Затем в сосуд объемом 2 мл добавляют изопропанол в объеме 150 мкл, и раствор перемешивают пипеткой. Лизат переносят на колонку для экстракции, и колонку для экстракции центрифугируют в течение 30 секунд при 13000×g. Колонку для экстракции затем переносят в новую пробирку для сбора, и повторяют центрифугирование в течение 30 секунд при 13000×g и перенос из колонки для экстракции в новую пробирку для сбора повторяют до тех пор, пока весь лизат не будет перенесен. Затем в пробирку для сбора добавляют раствор для промывки РНК (буфер RWA) от Promega (Catalog #Z309B-C) в объеме 500 мкл, и пробирку центрифугируют в течение 30 секунд при 13000×g. Образец затем переносят в новую пробирку для сбора, в пробирку для сбора добавляют 300 мкл буфера RWA, и пробирку для сбора затем центрифугируют в течение 2 минут при 13000×g. Образец затем переносят в новую пробирку для сбора, и пробирку для сбора затем центрифугируют в течение 2 минут при 13000×g. Содержимое пробирки для сбора затем переносят в пробирку Eppendorf объемом 1,5 мл, которая свободна от РНКазы ДНКазы. Содержимое пробирки затем элюируют, используя 16 мкл воды без нуклеазы, например, воду без нуклеазы от Promega (Catalog #P119E) и центрифугируют в течение 1 минуты при 13000×g.
[0072] Экстрагированная из микровезикулярной фракции РНК может затем хранится при ≤-70°C в морозильнике с ультранизкой заморозкой.
[0073] Способы, описанные в настоящем документе, могут включать использование контрольной частицы для определения или оценки качества выделения микровезикул и/или экстракции нуклеиновой кислоты из микровезикул. Контрольные частицы, в совокупности относятся к частицам с размером микровезикул, которые добавляют в некоторых точках выделения микрочастиц или в процессе экстракции нуклеиновой кислоты, где частицы содержат контрольные нуклеиновые кислоты, такие как ДНК или РНК. Конкретно, контрольные нуклеиновые кислоты содержат по меньшей мере один ген-мишень для анализа или измерения для определения выделенного количества контрольных частиц во время процесса выделения или экстракции.
[0074] Предпочтительно, контрольная частица представляет собой Q-бета бактериофаг, называемый в настоящем документе «Q-бета частицей». Q-бета частица, используемая в способах, описанных в настоящем документе, может быть природной вирусной частицей или может быть рекомбинантым или сконструированным вирусом, в котором по меньшей мере один компонент вирусной частицы (например, часть генома или белок оболочки) синтезируют с помощью методик рекомбинантной ДНК или молекулярной биологии, известных в данной области. Q-бета является представителем семейства левивирусов, отличающегося линейным одноцепочечным РНК-геномом, который состоит из 3 генов, кодирующих четыре вирусных белка: белок оболочки, белок созревания, белок лизиса и РНК-репликазу. В виду того, что их размер сходен со средним размером микровезикул, Q-бета может быть без труда очищен из биологического образца, используя те же способы очистки, которые используются для выделения микровезикул, как описано в настоящем документе. Кроме того, простота одноцепочечной генной структуры вируса Q-бета дает преимущества его использования в качестве контроля в анализах амплификации нуклеиновой кислоты. Q-бета частица содержит контрольный ген-мишень или контрольную последовательность-мишень для детекции или измерения количества Q-бета частиц в образце. Например, контрольный ген-мишень представляет собой ген белка оболочки Q-бета. После добавления Q-бета частиц в образец мочи или выделение микровезикул мочи, нуклеиновые кислоты Q-бета частицы экстрагируют вместе с нуклеиновыми кислотами из микровезикул и/или образца мочи, используя способы экстракции, описанные в настоящем документе. Детекцию контрольного гена-мишени Q-бета можно проводить с помощью анализа ОТ-ПЦР, например, одновременно с интересующими биомаркерами (то есть, BIRC5, ERG и SPARCL1). Для определения числа копий можно использовать стандартную кривую по меньшей мере 2, 3 или 4 известных концентраций в 10-кратном разведении контрольного гена-мишени. Число копий, которое было определено, и количество Q-бета частиц, которое было добавлено, можно сравнивать для определения качества процесса выделения и/или экстракции.
[0075] В некоторых вариантах осуществления наборы и/или способы, раскрытые в настоящем описании, используют Q-бета частицу, которая содержит по меньшей мере часть, например, по меньшей мере 10 нуклеотидов, по меньшей мере 20 нуклеотидов, по меньшей мере 30 нуклеотидов, по меньшей мере 40 нуклеотидов, по меньшей мере 50 нуклеотидов, по меньшей мере 100 нуклеотидов, по меньшей мере 150 нуклеотидов, по меньшей мере 200 нуклеотидов, по меньшей мере 250 нуклеотидов, по меньшей мере 300 нуклеотидов, по меньшей мере 350 нуклеотидов, по меньшей мере 400 нуклеотидов, по меньшей мере 450 нуклеотидов и/или по меньшей мере 500 нуклеотидов или больше, последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:1:
AAACGGTTCTTGTGACCCATCCGTTACTCGCCAGGCATATGCTGACGTGACCTTTTCGTTCACGCAGTATAGTACCGATGAGGAACGAGCTTTTGTTCGTACAGAGCTTGCTGCTCTGCTCGCTAGTCCTAGCGTCCTCAGTTAGATCCTTATCAGATTCTTGGACCAACAAGTAGCCGCCTTGCAAATCCAGGCAGTGGCCAGATCCAGCTTTGGCAGTTCCTCCTGGAGCTCCTGTCGGACAGCTCCCGGTCGGATGTGCTGCTGGAGCCCTTCCGCCGCGGTGTCATGGAGAAACTCCAGCTGGGCCCAGAGATTCTGCAGCGGGAAAACCTGTCCGTGACGTGGATTGGTGCTGCACCCCTCATCCTGTCTCGGATTGTGGGAGGCTGGGAGTGCGAGAAGCATTCCCAACCCTGGCAGGTGCTTGTGGCCTCTCGTGGCAGGGCAGTCTGCGGCGGTGTTCTGGTGCACCCCCAGTGGGTCCTCACAGCTGCCCACTGCATCAGGAACAAAAGCGTGATCTTGCTGGGTCGGCACAGC (SEQ ID NO: 1).
[0076] В некоторых вариантах осуществления Q-бета частицы добавляют в образец мочи перед экстракцией нуклеиновой кислоты. Например, Q-бета частицы добавляют в образец мочи перед ультрафильтрацией и/или после стадии предварительной фильтрации.
[0077] В некоторых вариантах осуществления в образец мочи добавляют 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 1000 или 5000 копий Q-бета частиц. В некоторых вариантах осуществления в образец мочи добавляют 100 копий Q-бета частиц. Число копий Q-бета частиц может быть рассчитано на основании способности Q-бета бактериофага инфицировать клетки-мишени. Таким образом, число копий Q-бета частиц коррелирует с колониеобразующими единицами Q-бета бактериофага.
[0078] Способы, приведенные в настоящем документе, могут быть использованы для индивидов, у которых подозревают наличие рака предстательной железы, например, в виду повышенного PSA, данных DRE или любого другого принятого в данной области способа диагностики рака предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления способы, приведенные в настоящем документе, могут быть использованы для индивидов, у которых ранее не проводилась какая-либо диагностика, такая как анализ PSA, DRE или любой другой принятый в данной области способ диагностики рака предстательной железы.
[0079] Способы, приведенные в настоящем документе, указывают на связь биомаркеров в микровизикулах мочи и обнаруживаемым раком предстательной железы, как определено с помощью биопсии предстательной железы. Биопсия предстательной железы является современным стандартом диагностики рака предстательной железы, но риск, связанный с проведением биопсии предстательной железы является существенным, особенно с учетом того, что в Соединенных Штатах ежегодно проводят один миллион биопсий. Нередкими являются боль, кровотечение, задержка мочеиспускания и инфекции мочевыводящих путей, при этом могут возникать тяжелые инфекции опасные для жизни.
[0080] Способы, описанные в настоящем документе, относятся к способам неинвазивного анализа уровня экспрессии РНК транскриптов, связанных с злокачественным новообразованием, в образцах мочи или микровизикулах мочи. В частности, способы используют для детекции экспрессии мРНК по меньшей мере PCA3 и ERG в образцах мочи. мРНК ERG может включать одну или несколько изоформ ERG, в том числе ERG1, ERG2, ERG3, ERG4, ERG5, ERG6, ERG7, ERG8, ERG9, изоформу 1 ERG, специфическую для рака предстательной железы (EPC1), и изоформу 2 ERG, специфическую для рака предстательной железы (EPC2). Как показано в настоящем документе, определение уровня экспрессии PCA3 и ERG в микровизикулах мочи обеспечивает его высокую чувствительность и специфичность в качестве биомаркера рака предстательной железы и других расстройств предстательной железы у индивидов, которым ранее проводили биопсию предстательной железы (называются в настоящем документе когорта с биопсией или когорта пациентов). В некоторых вариантах осуществления совместно детектируют 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более биомаркеров.
[0081] В некоторых вариантах осуществления наборы и/или способы, раскрытые в настоящем описании, используют для детекции мРНК ERG, имеющей по меньшей мере часть, например, по меньшей мере 10 нуклеотидов, по меньшей мере 20 нуклеотидов, по меньшей мере 30 нуклеотидов, по меньшей мере 40 нуклеотидов, по меньшей мере 50 нуклеотидов, по меньшей мере 100 нуклеотидов, по меньшей мере 150 нуклеотидов, по меньшей мере 200 нуклеотидов и/или по меньшей мере 250 нуклеотидов или более, следующей последовательности нуклеиновой кислоты:
CAGTCGAAAGCTGCTCAACCATCTCCTTCCACAGTGCCCAAAACTGAAGACCAGCGTCCTCAGTTAGATCCTTATCAGATTCTTGGACCAACAAGTAGCCGCCTTGCAAATCCAGGCAGTGGCCAGATCCAGCTTTGGCAGTTCCTCCTGGAGCTCCTGTCGGACAGCTCCAACTCCAGCTGCATCACCTGGGAAGGCACCAACGGGGAGTTCAAGATGACGGATCCCGACGAGGTGGCCCGGCGCTGGGGAGAGCGGAAGAGCAAACCCAACATGAACTACGATAAGCTCAGCCGCGCC (SEQ ID NO: 2).
[0082] Как показано в настоящем документе, PCA3 и ERG анализировали с помощью одномерного анализа и было показано, что каждый ген самостоятельно (при нормализации с эталонным геном, таким как KLK3) имеет высокую диагностическую точность (значения AUC выше 0,6). Анализ, описанный в настоящем документе, показывает, что PCA3 и ERG имеют большую диагностическую значимость, если нормализованный уровень экспрессии определяют для обоих, а не по отдельности.
[0083] В некоторых вариантах осуществления наборы и/или способы, раскрытые в настоящем описании, используют для детекции мРНК PCA3, имеющей по меньшей мере часть, например, по меньшей мере 10 нуклеотидов, по меньшей мере 20 нуклеотидов, по меньшей мере 30 нуклеотидов, по меньшей мере 40 нуклеотидов, по меньшей мере 50 нуклеотидов, по меньшей мере 100 нуклеотидов, по меньшей мере 150 нуклеотидов, по меньшей мере 200 нуклеотидов, по меньшей мере 250 нуклеотидов, по меньшей мере 300 нуклеотидов, по меньшей мере 350 нуклеотидов, по меньшей мере 400 нуклеотидов и/или по меньшей мере 450 нуклеотидов или более, последовательности нуклеиновой кислоты
GGGAGACGAAUUGGGCCCUCUAGAUGCAUGCUCGAGCGGCCGCCAGUGUGAUGGAUAUCUGCAGAAUUCGCCCUUAUUGUCUCCUCAGUGACACAGGGCUGGAUCACCAUCGACGGCACUUUCUGAGUACUCAGUGCAGCAAAGAAAGACUACAGACAUCUCAAUGGCAGGGGUGAGAAAUAAGAAAGGCUGCUGACUUUACCAUCUGAGGCCACACAUCUGCUGAAAUGGAGAUAAUUAACAUCACUAGAAACAGCAAGAUGACAAUAUAAUGUCUAAGUAGUGACAUGUUUUUGCACAUUUCCAGCCCCUUUAAAUAUCCACACACACAGGAAGCACAAAAGGAAGCACAGAGAUCCCUGGGAGAAAUGCCCGGCCACCUGCGGCCGCAAGCUUGGAUCCGAAUUCCUGUGUGAAAUUGUUAUCCGCUCACAAUUCCACACAACAUACGAGCCGGAAGCAUAAAGUGUAAAGCCUGGGGUGCCUAAUGA (SEQ ID NO: 3).
[0084] В некоторых вариантах осуществления наборы и/или способы, раскрытые в настоящем описании, используют для детекции мРНК ERG, имеющей по меньшей мере часть, например, по меньшей мере 10 нуклеотидов, по меньшей мере 20 нуклеотидов, по меньшей мере 30 нуклеотидов, по меньшей мере 40 нуклеотидов, по меньшей мере 50 нуклеотидов, по меньшей мере 100 нуклеотидов, по меньшей мере 150 нуклеотидов, по меньшей мере 200 нуклеотидов и/или по меньшей мере 250 нуклеотидов или более, последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:2, и мРНК PCA3, имеющей по меньшей мере часть, например, по меньшей мере 10 нуклеотидов, по меньшей мере 20 нуклеотидов, по меньшей мере 30 нуклеотидов, по меньшей мере 40 нуклеотидов, по меньшей мере 50 нуклеотидов, по меньшей мере 100 нуклеотидов, по меньшей мере 150 нуклеотидов, по меньшей мере 200 нуклеотидов, по меньшей мере 250 нуклеотидов, по меньшей мере 300 нуклеотидов, по меньшей мере 350 нуклеотидов, по меньшей мере 400 нуклеотидов и/или по меньшей мере 450 нуклеотидов или более, последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:3.
[0085] В некоторых вариантах осуществления наборы и/или способы, раскрытые в настоящем описании, используют для детекции мРНК ERG, имеющей полноразмерную последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:2, и мРНК PCA3, имеющей полноразмерную последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:3.
[0086] Дополнительные комбинации биомаркеров можно использовать вместе с PCA3 и ERG, где 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более дополнительных генов могут иметь высокую диагностическую значимость в качестве биомаркеров злокачественного новообразования, такого как агрессивное злокачественное новообразование или рак предстательной железы. Примеры этих дополнительных генов включают AMACR, BIRC5, HOXC6 и SPARCL1.
[0087] В некоторых вариантах осуществления наборы и/или способы, раскрытые в настоящем описании, используют для детекции мРНК AMACR, имеющей по меньшей мере часть, например, по меньшей мере 10 нуклеотидов, по меньшей мере 20 нуклеотидов, по меньшей мере 30 нуклеотидов, по меньшей мере 40 нуклеотидов, по меньшей мере 50 нуклеотидов, по меньшей мере 100 нуклеотидов, по меньшей мере 150 нуклеотидов, по меньшей мере 200 нуклеотидов, по меньшей мере 250 нуклеотидов, по меньшей мере 300 нуклеотидов, по меньшей мере 350 нуклеотидов, по меньшей мере 400 нуклеотидов, по меньшей мере 450 нуклеотидов и/или по меньшей мере 500 нуклеотидов или более, последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:37 или SEQ ID NO:38:
AMACR человека, вариант 1 транскрипта, мРНК (SEQ ID NO:4)
GGGGCGTGGCGCCGGGGATTGGGAGGGCTTCTTGCAGGCTGCTGGGCTGGGGCTAAGGGCTGCTCAGTTTCCTTCAGCGGGGCACTGGGAAGCGCCATGGCACTGCAGGGCATCTCGGTCGTGGAGCTGTCCGGCCTGGCCCCGGGCCCGTTCTGTGCTATGGTCCTGGCTGACTTCGGGGCGCGTGTGGTACGCGTGGACCGGCCCGGCTCCCGCTACGACGTGAGCCGCTTGGGCCGGGGCAAGCGCTCGCTAGTGCTGGACCTGAAGCAGCCGCGGGGAGCCGCCGTGCTGCGGCGTCTGTGCAAGCGGTCGGATGTGCTGCTGGAGCCCTTCCGCCGCGGTGTCATGGAGAAACTCCAGCTGGGCCCAGAGATTCTGCAGCGGGAAAATCCAAGGCTTATTTATGCCAGGCTGAGTGGATTTGGCCAGTCAGGAAGCTTCTGCCGGTTAGCTGGCCACGATATCAACTATTTGGCTTTGTCAGGTGTTCTCTCAAAAATTGGCAGAAGTGGTGAGAATCCGTATGCCCCGCTGAATCTCCTGGCTGACTTTGCTGGTGGTGGCCTTATGTGTGCACTGGGCATTATAATGGCTCTTTTTGACCGCACACGCACTGGCAAGGGTCAGGTCATTGATGCAAATATGGTGGAAGGAACAGCATATTTAAGTTCTTTTCTGTGGAAAACTCAGAAATTGAGTCTGTGGGAAGCACCTCGAGGACAGAACATGTTGGATGGTGGAGCACCTTTCTATACGACTTACAGGACAGCAGATGGGGAATTCATGGCTGTTGGAGCAATAGAACCCCAGTTCTACGAGCTGCTGATCAAAGGACTTGGACTAAAGTCTGATGAACTTCCCAATCAGATGAGCATGGATGATTGGCCAGAAATGAAGAAGAAGTTTGCAGATGTATTTGCAGAGAAGACGAAGGCAGAGTGGTGTCAAATCTTTGACGGCACAGATGCCTGTGTGACTCCGGTTCTGACTTTTGAGGAGGTTGTTCATCATGATCACAACAAGGAACGGGGCTCGTTTATCACCAGTGAGGAGCAGGACGTGAGCCCCCGCCCTGCACCTCTGCTGTTAAACACCCCAGCCATCCCTTCTTTCAAAAGGGATCCTTTCATAGGAGAACACACTGAGGAGATACTTGAAGAATTTGGATTCAGCCGCGAAGAGATTTATCAGCTTAACTCAGATAAAATCATTGAAAGTAATAAGGTAAAAGCTAGTCTCTAACTTCCAGGCCCACGGCTCAAGTGAATTTGAATACTGCATTTACAGTGTAGAGTAACACATAACATTGTATGCATGGAAACATGGAGGAACAGTATTACAGTGTCCTACCACTCTAATCAAGAAAAGAATTACAGACTCTGATTCTACAGTGATGATTGAATTCTAAAAATGGTTATCATTAGGGCTTTTGATTTATAAAACTTTGGGTACTTATACTAAATTATGGTAGTTATTCTGCCTTCCAGTTTGCTTGATATATTTGTTGATATTAAGATTCTTGACTTATATTTTGAATGGGTTCTAGTGAAAAAGGAATGATATATTCTTGAAGACATCGATATACATTTATTTACACTCTTGATTCTACAATGTAGAAAATGAGGAAATGCCACAAATTGTATGGTGATAAAAGTCACGTGAAACAGAGTGATTGGTTGCATCCAGGCCTTTTGTCTTGGTGTTCATGATCTCCCTCTAAGCACATTCCAAACTTTAGCAACAGTTATCACACTTTGTAATTTGCAAAGAAAAGTTTCACCTGTATTGAATCAGAATGCCTTCAACTGAAAAAAACATATCCAAAATAATGAGGAAATGTGTTGGCTCACTACGTAGAGTCCAGAGGGACAGTCAGTTTTAGGGTTGCCTGTATCCAGTAACTCGGGGCCTGTTTCCCCGTGGGTCTCTGGGCTGTCAGCTTTCCTTTCTCCATGTGTTTGATTTCTCCTCAGGCTGGTAGCAAGTTCTGGATCTTATACCCAACACACAGCAACATCCAGAAATAAAGATCTCAGGACCCCCCAGCAAGTCGTTTTGTGTCTCCTTGGACTGAGTTAAGTTACAAGCCTTTCTTATACCTGTCTTTGACAAAGAAGACGGGATTGTCTTTACATAAAACCAGCCTGCTCCTGGAGCTTCCCTGGACTCAACTTCCTAAAGGCATGTGAGGAAGGGGTAGATTCCACAATCTAATCCGGGTGCCATCAGAGTAGAGGGAGTAGAGAATGGATGTTGGGTAGGCCATCAATAAGGTCCATTCTGCGCAGTATCTCAACTGCCGTTCAACAATCGCAAGAGGAAGGTGGAGCAGGTTTCTTCATCTTACAGTTGAGAAAACAGAGACTCAGAAGGGCTTCTTAGTTCATGTTTCCCTTAGCGCCTCAGTGATTTTTTCATGGTGGCTTAGGCCAAAAGAAATATCTAACCATTCAATTTATAAATAATTAGGTCCCCAACGAATTAAATATTATGTCCTACCAACTTATTAGCTGCTTGAAAAATATAATACACATAAATAAAAAAATATATTTTTCATTTCTATTTCATTGTTAATCACAACTACTTACTAAGGAGATGTATGCACCTATTGGACACTGTGCAACTTCTCACCTGGAATGAGATTGGACACTGCTGCCCTCATTTTCTGCTCCATGTTGGTGTCCATATAGTACTTGATTTTTTATCAGATGGCCTGGAAAACCCAGTCTCACAAAAATATGAAATTATCAGAAGGATTATAGTGCAATCTTATGTTGAAAGAATGAACTACCTCACTAGTAGTTCACGTGATGTCTGACAGATGTTGAGTTTCATTGTGTTTGTGTGTTCAAATTTTTAAATATTCTGAGATACTCTTGTGAGGTCACTCTAATGCCCTGGGTGCCTTGGCACAGTTTTAGAAATACCAGTTGAAAATATTTGCTCAGGAATATGCAACTAGGAAGGGGCAGAATCAGAATTTAAGCTTTCATATTCTAGCCTTCAGTCTTGTTCTTCAACCATTTTTAGGAACTTTCCCATAAGGTTATGTTTTCCAGCCCAGGCATGGAGGATCACTTGAGGCCAAGAGTTCGAGACCAGCCTGGGGAACTTGGCTGGACCTCCGTTTCTACGAAATAAAAATAAAAAAATTATCCAGGTATGGTGGTGTGTGCCTGTAGTCCTATCTACTCAAGGGTGGGGCAGGAGGATCACTTGAGCCCAGGAATTTGAGGCCACAGTGAATTAGGATTGCACCACTGCACTCTAGCCCAGGCAACAGAACAAGAACCTGTCTCTAAATAAATAAATAAAAATAATAATAATAAAAAAGATGTTTTCCCTACAA (SEQ ID NO: 4)
AMACR человека, вариант 1 транскрипта, мРНК (SEQ ID NO:37)
GGGGCGTGGCGCCGGGGATTGGGAGGGCTTCTTGCAGGCTGCTGGGCTGGGGCTAAGGGCTGCTCAGTTTCCTTCAGCGGGGCACTGGGAAGCGCCATGGCACTGCAGGGCATCTCGGTCGTGGAGCTGTCCGGCCTGGCCCCGGGCCCGTTCTGTGCTATGGTCCTGGCTGACTTCGGGGCGCGTGTGGTACGCGTGGACCGGCCCGGCTCCCGCTACGACGTGAGCCGCTTGGGCCGGGGCAAGCGCTCGCTAGTGCTGGACCTGAAGCAGCCGCGGGGAGCCGCCGTGCTGCGGCGTCTGTGCAAGCGGTCGGATGTGCTGCTGGAGCCCTTCCGCCGCGGTGTCATGGAGAAACTCCAGCTGGGCCCAGAGATTCTGCAGCGGGAAAATCCAAGGCTTATTTATGCCAGGCTGAGTGGATTTGGCCAGTCAGGAAGCTTCTGCCGGTTAGCTGGCCACGATATCAACTATTTGGCTTTGTCAGGTGGAAGGAACAGCATATTTAAGTTCTTTTCTGTGGAAAACTCAGAAATTGAGTCTGTGGGAAGCACCTCGAGGACAGAACATGTTGGATGGTGGAGCACCTTTCTATACGACTTACAGGACAGCAGATGGGGAATTCATGGCTGTTGGAGCAATAGAACCCCAGTTCTACGAGCTGCTGATCAAAGGACTTGGACTAAAGTCTGATGAACTTCCCAATCAGATGAGCATGGATGATTGGCCAGAAATGAAGAAGAAGTTTGCAGATGTATTTGCAGAGAAGACGAAGGCAGAGTGGTGTCAAATCTTTGACGGCACAGATGCCTGTGTGACTCCGGTTCTGACTTTTGAGGAGGTTGTTCATCATGATCACAACAAGGAACGGGGCTCGTTTATCACCAGTGAGGAGCAGGACGTGAGCCCCCGCCCTGCACCTCTGCTGTTAAACACCCCAGCCATCCCTTCTTTCAAAAGGGATCCTTTCATAGGAGAACACACTGAGGAGATACTTGAAGAATTTGGATTCAGCCGCGAAGAGATTTATCAGCTTAACTCAGATAAAATCATTGAAAGTAATAAGGTAAAAGCTAGTCTCTAACTTCCAGGCCCACGGCTCAAGTGAATTTGAATACTGCATTTACAGTGTAGAGTAACACATAACATTGTATGCATGGAAACATGGAGGAACAGTATTACAGTGTCCTACCACTCTAATCAAGAAAAGAATTACAGACTCTGATTCTACAGTGATGATTGAATTCTAAAAATGGTTATCATTAGGGCTTTTGATTTATAAAACTTTGGGTACTTATACTAAATTATGGTAGTTATTCTGCCTTCCAGTTTGCTTGATATATTTGTTGATATTAAGATTCTTGACTTATATTTTGAATGGGTTCTAGTGAAAAAGGAATGATATATTCTTGAAGACATCGATATACATTTATTTACACTCTTGATTCTACAATGTAGAAAATGAGGAAATGCCACAAATTGTATGGTGATAAAAGTCACGTGAAACAGAGTGATTGGTTGCATCCAGGCCTTTTGTCTTGGTGTTCATGATCTCCCTCTAAGCACATTCCAAACTTTAGCAACAGTTATCACACTTTGTAATTTGCAAAGAAAAGTTTCACCTGTATTGAATCAGAATGCCTTCAACTGAAAAAAACATATCCAAAATAATGAGGAAATGTGTTGGCTCACTACGTAGAGTCCAGAGGGACAGTCAGTTTTAGGGTTGCCTGTATCCAGTAACTCGGGGCCTGTTTCCCCGTGGGTCTCTGGGCTGTCAGCTTTCCTTTCTCCATGTGTTTGATTTCTCCTCAGGCTGGTAGCAAGTTCTGGATCTTATACCCAACACACAGCAACATCCAGAAATAAAGATCTCAGGACCCCCCAGCAAGTCGTTTTGTGTCTCCTTGGACTGAGTTAAGTTACAAGCCTTTCTTATACCTGTCTTTGACAAAGAAGACGGGATTGTCTTTACATAAAACCAGCCTGCTCCTGGAGCTTCCCTGGACTCAACTTCCTAAAGGCATGTGAGGAAGGGGTAGATTCCACAATCTAATCCGGGTGCCATCAGAGTAGAGGGAGTAGAGAATGGATGTTGGGTAGGCCATCAATAAGGTCCATTCTGCGCAGTATCTCAACTGCCGTTCAACAATCGCAAGAGGAAGGTGGAGCAGGTTTCTTCATCTTACAGTTGAGAAAACAGAGACTCAGAAGGGCTTCTTAGTTCATGTTTCCCTTAGCGCCTCAGTGATTTTTTCATGGTGGCTTAGGCCAAAAGAAATATCTAACCATTCAATTTATAAATAATTAGGTCCCCAACGAATTAAATATTATGTCCTACCAACTTATTAGCTGCTTGAAAAATATAATACACATAAATAAAAAAATATATTTTTCATTTCTATTTCATTGTTAATCACAACTACTTACTAAGGAGATGTATGCACCTATTGGACACTGTGCAACTTCTCACCTGGAATGAGATTGGACACTGCTGCCCTCATTTTCTGCTCCATGTTGGTGTCCATATAGTACTTGATTTTTTATCAGATGGCCTGGAAAACCCAGTCTCACAAAAATATGAAATTATCAGAAGGATTATAGTGCAATCTTATGTTGAAAGAATGAACTACCTCACTAGTAGTTCACGTGATGTCTGACAGATGTTGAGTTTCATTGTGTTTGTGTGTTCAAATTTTTAAATATTCTGAGATACTCTTGTGAGGTCACTCTAATGCCCTGGGTGCCTTGGCACAGTTTTAGAAATACCAGTTGAAAATATTTGCTCAGGAATATGCAACTAGGAAGGGGCAGAATCAGAATTTAAGCTTTCATATTCTAGCCTTCAGTCTTGTTCTTCAACCATTTTTAGGAACTTTCCCATAAGGTTATGTTTTCCAGCCCAGGCATGGAGGATCACTTGAGGCCAAGAGTTCGAGACCAGCCTGGGGAACTTGGCTGGACCTCCGTTTCTACGAAATAAAAATAAAAAAATTATCCAGGTATGGTGGTGTGTGCCTGTAGTCCTATCTACTCAAGGGTGGGGCAGGAGGATCACTTGAGCCCAGGAATTTGAGGCCACAGTGAATTAGGATTGCACCACTGCACTCTAGCCCAGGCAACAGAACAAGAACCTGTCTCTAAATAAATAAATAAAAATAATAATAATAAAAAAGATGTTTTCCCTACAA (SEQ ID NO: 37)
AMACR человека, вариант 1 транскрипта, мРНК (SEQ ID NO:38)
GGGGCGTGGCGCCGGGGATTGGGAGGGCTTCTTGCAGGCTGCTGGGCTGGGGCTAAGGGCTGCTCAGTTTCCTTCAGCGGGGCACTGGGAAGCGCCATGGCACTGCAGGGCATCTCGGTCGTGGAGCTGTCCGGCCTGGCCCCGGGCCCGTTCTGTGCTATGGTCCTGGCTGACTTCGGGGCGCGTGTGGTACGCGTGGACCGGCCCGGCTCCCGCTACGACGTGAGCCGCTTGGGCCGGGGCAAGCGCTCGCTAGTGCTGGACCTGAAGCAGCCGCGGGGAGCCGCCGTGCTGCGGCGTCTGTGCAAGCGGTCGGATGTGCTGCTGGAGCCCTTCCGCCGCGGTGTCATGGAGAAACTCCAGCTGGGCCCAGAGATTCTGCAGCGGGAAAATCCAAGGCTTATTTATGCCAGGCTGAGTGGATTTGGCCAGTCAGGAAGCTTCTGCCGGTTAGCTGGCCACGATATCAACTATTTGGCTTTGTCAGGTGTTCTCTCAAAAATTGGCAGAAGTGGTGAGAATCCGTATGCCCCGCTGAATCTCCTGGCTGACTTTGCTGGTGGTGGCCTTATGTGTGCACTGGGCATTATAATGGCTCTTTTTGACCGCACACGCACTGGCAAGGGTCAGGTCATTGATGCAAATATGGTGGAAGGAACAGCATATTTAAGTTCTTTTCTGTGGAAAACTCAGAAATTGAGTCTGTGGGAAGCACCTCGAGGACAGAACATGTTGGATGGTGGAGCACCTTTCTATACGACTTACAGGACAGCAGATGGGGAATTCATGGCTGTTGGAGCAATAGAACCCCAGTTCTACGAGCTGCTGATCAAAGGACTTGGACTAAAGTCTGATGAACTTCCCAATCAGATGAGCATGGATGATTGGCCAGAAATGAAGAAGAAGTTTGCAGATGTATTTGCAGAGAAGACGAAGGCAGAGTGGTGTCAAATCTTTGACGGCACAGATGCCTGTGTGACTCCGGTTCTGACTTTTGAGGAGGTTGTTCATCATGATCACAACAAGGAACGGGGCTCGTTTATCACCAGTGAGGAGCAGGACGTGAGCCCCCGCCCTGCACCTCTGCTGTTAAACACCCCAGCCATCCCTTCTTTCAAAAGGGATCCTTTCATAGGAGAACACACTGAGGAGATACTTGAAGAATTTGGATTCAGCCGCGAAGAGATTTATCAGCTTAACTCAGATAAAATCATTGAAAGTAATAAGGCTGGTAGCAAGTTCTGGATCTTATACCCAACACACAGCAACATCCAGAAATAAAGATCTCAGGACCCCCCAGCAAGTCGTTTTGTGTCTCCTTGGACTGAGTTAAGTTACAAGCCTTTCTTATACCTGTCTTTGACAAAGAAGACGGGATTGTCTTTACATAAAACCAGCCTGCTCCTGGAGCTTCCCTGGACTCAACTTCCTAAAGGCATGTGAGGAAGGGGTAGATTCCACAATCTAATCCGGGTGCCATCAGAGTAGAGGGAGTAGAGAATGGATGTTGGGTAGGCCATCAATAAGGTCCATTCTGCGCAGTATCTCAACTGCCGTTCAACAATCGCAAGAGGAAGGTGGAGCAGGTTTCTTCATCTTACAGTTGAGAAAACAGAGACTCAGAAGGGCTTCTTAGTTCATGTTTCCCTTAGCGCCTCAGTGATTTTTTCATGGTGGCTTAGGCCAAAAGAAATATCTAACCATTCAATTTATAAATAATTAGGTCCCCAACGAATTAAATATTATGTCCTACCAACTTATTAGCTGCTTGAAAAATATAATACACATAAATAAAAAAATATATTTTTCATTTCTATTTCATTGTTAATCACAACTACTTACTAAGGAGATGTATGCACCTATTGGACACTGTGCAACTTCTCACCTGGAATGAGATTGGACACTGCTGCCCTCATTTTCTGCTCCATGTTGGTGTCCATATAGTACTTGATTTTTTATCAGATGGCCTGGAAAACCCAGTCTCACAAAAATATGAAATTATCAGAAGGATTATAGTGCAATCTTATGTTGAAAGAATGAACTACCTCACTAGTAGTTCACGTGATGTCTGACAGATGTTGAGTTTCATTGTGTTTGTGTGTTCAAATTTTTAAATATTCTGAGATACTCTTGTGAGGTCACTCTAATGCCCTGGGTGCCTTGGCACAGTTTTAGAAATACCAGTTGAAAATATTTGCTCAGGAATATGCAACTAGGAAGGGGCAGAATCAGAATTTAAGCTTTCATATTCTAGCCTTCAGTCTTGTTCTTCAACCATTTTTAGGAACTTTCCCATAAGGTTATGTTTTCCAGCCCAGGCATGGAGGATCACTTGAGGCCAAGAGTTCGAGACCAGCCTGGGGAACTTGGCTGGACCTCCGTTTCTACGAAATAAAAATAAAAAAATTATCCAGGTATGGTGGTGTGTGCCTGTAGTCCTATCTACTCAAGGGTGGGGCAGGAGGATCACTTGAGCCCAGGAATTTGAGGCCACAGTGAATTAGGATTGCACCACTGCACTCTAGCCCAGGCAACAGAACAAGAACCTGTCTCTAAATAAATAAATAAAAATAATAATAATAAAAAAGATGTTTTCCCTACAA (SEQ ID NO: 38).
[0088] В некоторых вариантах осуществления наборы и/или способы, раскрытые в настоящем описании, используют для детекции мРНК BIRC5, имеющей по меньшей мере часть, например, по меньшей мере 10 нуклеотидов, по меньшей мере 20 нуклеотидов, по меньшей мере 30 нуклеотидов, по меньшей мере 40 нуклеотидов, по меньшей мере 50 нуклеотидов, по меньшей мере 100 нуклеотидов, по меньшей мере 150 нуклеотидов, по меньшей мере 200 нуклеотидов, по меньшей мере 250 нуклеотидов, по меньшей мере 300 нуклеотидов, по меньшей мере 350 нуклеотидов, по меньшей мере 400 нуклеотидов, по меньшей мере 450 нуклеотидов и/или по меньшей мере 500 нуклеотидов или более, последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:39 или SEQ ID NO:40:
BIRC5 человека, вариант 1 транскрипта, мРНК (SEQ ID NO:5)
CCCAGAAGGCCGCGGGGGGTGGACCGCCTAAGAGGGCGTGCGCTCCCGACATGCCCCGCGGCGCGCCATTAACCGCCAGATTTGAATCGCGGGACCCGTTGGCAGAGGTGGCGGCGGCGGCATGGGTGCCCCGACGTTGCCCCCTGCCTGGCAGCCCTTTCTCAAGGACCACCGCATCTCTACATTCAAGAACTGGCCCTTCTTGGAGGGCTGCGCCTGCACCCCGGAGCGGATGGCCGAGGCTGGCTTCATCCACTGCCCCACTGAGAACGAGCCAGACTTGGCCCAGTGTTTCTTCTGCTTCAAGGAGCTGGAAGGCTGGGAGCCAGATGACGACCCCATAGAGGAACATAAAAAGCATTCGTCCGGTTGCGCTTTCCTTTCTGTCAAGAAGCAGTTTGAAGAATTAACCCTTGGTGAATTTTTGAAACTGGACAGAGAAAGAGCCAAGAACAAAATTGCAAAGGAAACCAACAATAAGAAGAAAGAATTTGAGGAAACTGCGGAGAAAGTGCGCCGTGCCATCGAGCAGCTGGCTGCCATGGATTGAGGCCTCTGGCCGGAGCTGCCTGGTCCCAGAGTGGCTGCACCACTTCCAGGGTTTATTCCCTGGTGCCACCAGCCTTCCTGTGGGCCCCTTAGCAATGTCTTAGGAAAGGAGATCAACATTTTCAAATTAGATGTTTCAACTGTGCTCTTGTTTTGTCTTGAAAGTGGCACCAGAGGTGCTTCTGCCTGTGCAGCGGGTGCTGCTGGTAACAGTGGCTGCTTCTCTCTCTCTCTCTCTTTTTTGGGGGCTCATTTTTGCTGTTTTGATTCCCGGGCTTACCAGGTGAGAAGTGAGGGAGGAAGAAGGCAGTGTCCCTTTTGCTAGAGCTGACAGCTTTGTTCGCGTGGGCAGAGCCTTCCACAGTGAATGTGTCTGGACCTCATGTTGTTGAGGCTGTCACAGTCCTGAGTGTGGACTTGGCAGGTGCCTGTTGAATCTGAGCTGCAGGTTCCTTATCTGTCACACCTGTGCCTCCTCAGAGGACAGTTTTTTTGTTGTTGTGTTTTTTTGTTTTTTTTTTTTTGGTAGATGCATGACTTGTGTGTGATGAGAGAATGGAGACAGAGTCCCTGGCTCCTCTACTGTTTAACAACATGGCTTTCTTATTTTGTTTGAATTGTTAATTCACAGAATAGCACAAACTACAATTAAAACTAAGCACAAAGCCATTCTAAGTCATTGGGGAAACGGGGTGAACTTCAGGTGGATGAGGAGACAGAATAGAGTGATAGGAAGCGTCTGGCAGATACTCCTTTTGCCACTGCTGTGTGATTAGACAGGCCCAGTGAGCCGCGGGGCACATGCTGGCCGCTCCTCCCTCAGAAAAAGGCAGTGGCCTAAATCCTTTTTAAATGACTTGGCTCGATGCTGTGGGGGACTGGCTGGGCTGCTGCAGGCCGTGTGTCTGTCAGCCCAACCTTCACATCTGTCACGTTCTCCACACGGGGGAGAGACGCAGTCCGCCCAGGTCCCCGCTTTCTTTGGAGGCAGCAGCTCCCGCAGGGCTGAAGTCTGGCGTAAGATGATGGATTTGATTCGCCCTCCTCCCTGTCATAGAGCTGCAGGGTGGATTGTTACAGCTTCGCTGGAAACCTCTGGAGGTCATCTCGGCTGTTCCTGAGAAATAAAAAGCCTGTCATTTCAAACACTGCTGTGGACCCTACTGGGTTTTTAAAATATTGTCAGTTTTTCATCGTCGTCCCTAGCCTGCCAACAGCCATCTGCCCAGACAGCCGCAGTGAGGATGAGCGTCCTGGCAGAGACGCAGTTGTCTCTGGGCGCTTGCCAGAGCCACGAACCCCAGACCTGTTTGTATCATCCGGGCTCCTTCCGGGCAGAAACAACTGAAAATGCACTTCAGACCCACTTATTTCTGCCACATCTGAGTCGGCCTGAGATAGACTTTTCCCTCTAAACTGGGAGAATATCACAGTGGTTTTTGTTAGCAGAAAATGCACTCCAGCCTCTGTACTCATCTAAGCTGCTTATTTTTGATATTTGTGTCAGTCTGTAAATGGATACTTCACTTTAATAACTGTTGCTTAGTAATTGGCTTTGTAGAGAAGCTGGAAAAAAATGGTTTTGTCTTCAACTCCTTTGCATGCCAGGCGGTGATGTGGATCTCGGCTTCTGTGAGCCTGTGCTGTGGGCAGGGCTGAGCTGGAGCCGCCCCTCTCAGCCCGCCTGCCACGGCCTTTCCTTAAAGGCCATCCTTAAAACCAGACCCTCATGGCTACCAGCACCTGAAAGCTTCCTCGACATCTGTTAATAAAGCCGTAGGCCCTTGTCTAAGTGCAACCGCCTAGACTTTCTTTCAGATACATGTCCACATGTCCATTTTTCAGGTTCTCTAAGTTGGAGTGGAGTCTGGGAAGGGTTGTGAATGAGGCTTCTGGGCTATGGGTGAGGTTCCAATGGCAGGTTAGAGCCCCTCGGGCCAACTGCCATCCTGGAAAGTAGAGACAGCAGTGCCCGCTGCCCAGAAGAGACCAGCAAGCCAAACTGGAGCCCCCATTGCAGGCTGTCGCCATGTGGAAAGAGTAACTCACAATTGCCAATAAAGTCTCATGTGGTTTTATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (SEQ ID NO:5)
BIRC5 человека, вариант 2 транскрипта, мРНК (SEQ ID NO:39)
CCCAGAAGGCCGCGGGGGGTGGACCGCCTAAGAGGGCGTGCGCTCCCGACATGCCCCGCGGCGCGCCATTAACCGCCAGATTTGAATCGCGGGACCCGTTGGCAGAGGTGGCGGCGGCGGCATGGGTGCCCCGACGTTGCCCCCTGCCTGGCAGCCCTTTCTCAAGGACCACCGCATCTCTACATTCAAGAACTGGCCCTTCTTGGAGGGCTGCGCCTGCACCCCGGAGCGGATGGCCGAGGCTGGCTTCATCCACTGCCCCACTGAGAACGAGCCAGACTTGGCCCAGTGTTTCTTCTGCTTCAAGGAGCTGGAAGGCTGGGAGCCAGATGACGACCCCATGCAAAGGAAACCAACAATAAGAAGAAAGAATTTGAGGAAACTGCGGAGAAAGTGCGCCGTGCCATCGAGCAGCTGGCTGCCATGGATTGAGGCCTCTGGCCGGAGCTGCCTGGTCCCAGAGTGGCTGCACCACTTCCAGGGTTTATTCCCTGGTGCCACCAGCCTTCCTGTGGGCCCCTTAGCAATGTCTTAGGAAAGGAGATCAACATTTTCAAATTAGATGTTTCAACTGTGCTCTTGTTTTGTCTTGAAAGTGGCACCAGAGGTGCTTCTGCCTGTGCAGCGGGTGCTGCTGGTAACAGTGGCTGCTTCTCTCTCTCTCTCTCTTTTTTGGGGGCTCATTTTTGCTGTTTTGATTCCCGGGCTTACCAGGTGAGAAGTGAGGGAGGAAGAAGGCAGTGTCCCTTTTGCTAGAGCTGACAGCTTTGTTCGCGTGGGCAGAGCCTTCCACAGTGAATGTGTCTGGACCTCATGTTGTTGAGGCTGTCACAGTCCTGAGTGTGGACTTGGCAGGTGCCTGTTGAATCTGAGCTGCAGGTTCCTTATCTGTCACACCTGTGCCTCCTCAGAGGACAGTTTTTTTGTTGTTGTGTTTTTTTGTTTTTTTTTTTTTGGTAGATGCATGACTTGTGTGTGATGAGAGAATGGAGACAGAGTCCCTGGCTCCTCTACTGTTTAACAACATGGCTTTCTTATTTTGTTTGAATTGTTAATTCACAGAATAGCACAAACTACAATTAAAACTAAGCACAAAGCCATTCTAAGTCATTGGGGAAACGGGGTGAACTTCAGGTGGATGAGGAGACAGAATAGAGTGATAGGAAGCGTCTGGCAGATACTCCTTTTGCCACTGCTGTGTGATTAGACAGGCCCAGTGAGCCGCGGGGCACATGCTGGCCGCTCCTCCCTCAGAAAAAGGCAGTGGCCTAAATCCTTTTTAAATGACTTGGCTCGATGCTGTGGGGGACTGGCTGGGCTGCTGCAGGCCGTGTGTCTGTCAGCCCAACCTTCACATCTGTCACGTTCTCCACACGGGGGAGAGACGCAGTCCGCCCAGGTCCCCGCTTTCTTTGGAGGCAGCAGCTCCCGCAGGGCTGAAGTCTGGCGTAAGATGATGGATTTGATTCGCCCTCCTCCCTGTCATAGAGCTGCAGGGTGGATTGTTACAGCTTCGCTGGAAACCTCTGGAGGTCATCTCGGCTGTTCCTGAGAAATAAAAAGCCTGTCATTTCAAACACTGCTGTGGACCCTACTGGGTTTTTAAAATATTGTCAGTTTTTCATCGTCGTCCCTAGCCTGCCAACAGCCATCTGCCCAGACAGCCGCAGTGAGGATGAGCGTCCTGGCAGAGACGCAGTTGTCTCTGGGCGCTTGCCAGAGCCACGAACCCCAGACCTGTTTGTATCATCCGGGCTCCTTCCGGGCAGAAACAACTGAAAATGCACTTCAGACCCACTTATTTCTGCCACATCTGAGTCGGCCTGAGATAGACTTTTCCCTCTAAACTGGGAGAATATCACAGTGGTTTTTGTTAGCAGAAAATGCACTCCAGCCTCTGTACTCATCTAAGCTGCTTATTTTTGATATTTGTGTCAGTCTGTAAATGGATACTTCACTTTAATAACTGTTGCTTAGTAATTGGCTTTGTAGAGAAGCTGGAAAAAAATGGTTTTGTCTTCAACTCCTTTGCATGCCAGGCGGTGATGTGGATCTCGGCTTCTGTGAGCCTGTGCTGTGGGCAGGGCTGAGCTGGAGCCGCCCCTCTCAGCCCGCCTGCCACGGCCTTTCCTTAAAGGCCATCCTTAAAACCAGACCCTCATGGCTACCAGCACCTGAAAGCTTCCTCGACATCTGTTAATAAAGCCGTAGGCCCTTGTCTAAGTGCAACCGCCTAGACTTTCTTTCAGATACATGTCCACATGTCCATTTTTCAGGTTCTCTAAGTTGGAGTGGAGTCTGGGAAGGGTTGTGAATGAGGCTTCTGGGCTATGGGTGAGGTTCCAATGGCAGGTTAGAGCCCCTCGGGCCAACTGCCATCCTGGAAAGTAGAGACAGCAGTGCCCGCTGCCCAGAAGAGACCAGCAAGCCAAACTGGAGCCCCCATTGCAGGCTGTCGCCATGTGGAAAGAGTAACTCACAATTGCCAATAAAGTCTCATGTGGTTTTATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (SEQ ID NO:39)
BIRC5 человека, вариант 3 транскрипта, мРНК (SEQ ID NO:40)
CCCAGAAGGCCGCGGGGGGTGGACCGCCTAAGAGGGCGTGCGCTCCCGACATGCCCCGCGGCGCGCCATTAACCGCCAGATTTGAATCGCGGGACCCGTTGGCAGAGGTGGCGGCGGCGGCATGGGTGCCCCGACGTTGCCCCCTGCCTGGCAGCCCTTTCTCAAGGACCACCGCATCTCTACATTCAAGAACTGGCCCTTCTTGGAGGGCTGCGCCTGCACCCCGGAGCGGATGGCCGAGGCTGGCTTCATCCACTGCCCCACTGAGAACGAGCCAGACTTGGCCCAGTGTTTCTTCTGCTTCAAGGAGCTGGAAGGCTGGGAGCCAGATGACGACCCCATTGGGCCGGGCACGGTGGCTTACGCCTGTAATACCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGCGGATCACGAGAGAGGAACATAAAAAGCATTCGTCCGGTTGCGCTTTCCTTTCTGTCAAGAAGCAGTTTGAAGAATTAACCCTTGGTGAATTTTTGAAACTGGACAGAGAAAGAGCCAAGAACAAAATTGCAAAGGAAACCAACAATAAGAAGAAAGAATTTGAGGAAACTGCGGAGAAAGTGCGCCGTGCCATCGAGCAGCTGGCTGCCATGGATTGAGGCCTCTGGCCGGAGCTGCCTGGTCCCAGAGTGGCTGCACCACTTCCAGGGTTTATTCCCTGGTGCCACCAGCCTTCCTGTGGGCCCCTTAGCAATGTCTTAGGAAAGGAGATCAACATTTTCAAATTAGATGTTTCAACTGTGCTCTTGTTTTGTCTTGAAAGTGGCACCAGAGGTGCTTCTGCCTGTGCAGCGGGTGCTGCTGGTAACAGTGGCTGCTTCTCTCTCTCTCTCTCTTTTTTGGGGGCTCATTTTTGCTGTTTTGATTCCCGGGCTTACCAGGTGAGAAGTGAGGGAGGAAGAAGGCAGTGTCCCTTTTGCTAGAGCTGACAGCTTTGTTCGCGTGGGCAGAGCCTTCCACAGTGAATGTGTCTGGACCTCATGTTGTTGAGGCTGTCACAGTCCTGAGTGTGGACTTGGCAGGTGCCTGTTGAATCTGAGCTGCAGGTTCCTTATCTGTCACACCTGTGCCTCCTCAGAGGACAGTTTTTTTGTTGTTGTGTTTTTTTGTTTTTTTTTTTTTGGTAGATGCATGACTTGTGTGTGATGAGAGAATGGAGACAGAGTCCCTGGCTCCTCTACTGTTTAACAACATGGCTTTCTTATTTTGTTTGAATTGTTAATTCACAGAATAGCACAAACTACAATTAAAACTAAGCACAAAGCCATTCTAAGTCATTGGGGAAACGGGGTGAACTTCAGGTGGATGAGGAGACAGAATAGAGTGATAGGAAGCGTCTGGCAGATACTCCTTTTGCCACTGCTGTGTGATTAGACAGGCCCAGTGAGCCGCGGGGCACATGCTGGCCGCTCCTCCCTCAGAAAAAGGCAGTGGCCTAAATCCTTTTTAAATGACTTGGCTCGATGCTGTGGGGGACTGGCTGGGCTGCTGCAGGCCGTGTGTCTGTCAGCCCAACCTTCACATCTGTCACGTTCTCCACACGGGGGAGAGACGCAGTCCGCCCAGGTCCCCGCTTTCTTTGGAGGCAGCAGCTCCCGCAGGGCTGAAGTCTGGCGTAAGATGATGGATTTGATTCGCCCTCCTCCCTGTCATAGAGCTGCAGGGTGGATTGTTACAGCTTCGCTGGAAACCTCTGGAGGTCATCTCGGCTGTTCCTGAGAAATAAAAAGCCTGTCATTTCAAACACTGCTGTGGACCCTACTGGGTTTTTAAAATATTGTCAGTTTTTCATCGTCGTCCCTAGCCTGCCAACAGCCATCTGCCCAGACAGCCGCAGTGAGGATGAGCGTCCTGGCAGAGACGCAGTTGTCTCTGGGCGCTTGCCAGAGCCACGAACCCCAGACCTGTTTGTATCATCCGGGCTCCTTCCGGGCAGAAACAACTGAAAATGCACTTCAGACCCACTTATTTCTGCCACATCTGAGTCGGCCTGAGATAGACTTTTCCCTCTAAACTGGGAGAATATCACAGTGGTTTTTGTTAGCAGAAAATGCACTCCAGCCTCTGTACTCATCTAAGCTGCTTATTTTTGATATTTGTGTCAGTCTGTAAATGGATACTTCACTTTAATAACTGTTGCTTAGTAATTGGCTTTGTAGAGAAGCTGGAAAAAAATGGTTTTGTCTTCAACTCCTTTGCATGCCAGGCGGTGATGTGGATCTCGGCTTCTGTGAGCCTGTGCTGTGGGCAGGGCTGAGCTGGAGCCGCCCCTCTCAGCCCGCCTGCCACGGCCTTTCCTTAAAGGCCATCCTTAAAACCAGACCCTCATGGCTACCAGCACCTGAAAGCTTCCTCGACATCTGTTAATAAAGCCGTAGGCCCTTGTCTAAGTGCAACCGCCTAGACTTTCTTTCAGATACATGTCCACATGTCCATTTTTCAGGTTCTCTAAGTTGGAGTGGAGTCTGGGAAGGGTTGTGAATGAGGCTTCTGGGCTATGGGTGAGGTTCCAATGGCAGGTTAGAGCCCCTCGGGCCAACTGCCATCCTGGAAAGTAGAGACAGCAGTGCCCGCTGCCCAGAAGAGACCAGCAAGCCAAACTGGAGCCCCCATTGCAGGCTGTCGCCATGTGGAAAGAGTAACTCACAATTGCCAATAAAGTCTCATGTGGTTTTATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (SEQ ID NO: 40).
[0089] В некоторых вариантах осуществления наборы и/или способы, раскрытые в настоящем описании, используют для детекции мРНК HOXC6, имеющей по меньшей мере часть, например, по меньшей мере 10 нуклеотидов, по меньшей мере 20 нуклеотидов, по меньшей мере 30 нуклеотидов, по меньшей мере 40 нуклеотидов, по меньшей мере 50 нуклеотидов, по меньшей мере 100 нуклеотидов, по меньшей мере 150 нуклеотидов, по меньшей мере 200 нуклеотидов, по меньшей мере 250 нуклеотидов, по меньшей мере 300 нуклеотидов, по меньшей мере 350 нуклеотидов, по меньшей мере 400 нуклеотидов, по меньшей мере 450 нуклеотидов и/или по меньшей мере 500 нуклеотидов или более, последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:41:
HOXC6 человека, варианта 1 транскрипта, мРНК (SEQ ID NO:6)
1TTTTGTCTGTCCTGGATTGGAGCCGTCCCTATAACCATCTAGTTCCGAGTACAAACTGGAGACAGAAATAAATATTAAAGAAATCATAGACCGACCAGGTAAAGGCAAAGGGATGAATTCCTACTTCACTAACCCTTCCTTATCCTGCCACCTCGCCGGGGGCCAGGACGTCCTCCCCAACGTCGCCCTCAATTCCACCGCCTATGATCCAGTGAGGCATTTCTCGACCTATGGAGCGGCCGTTGCCCAGAACCGGATCTACTCGACTCCCTTTTATTCGCCACAGGAGAATGTCGTGTTCAGTTCCAGCCGGGGGCCGTATGACTATGGATCTAATTCCTTTTACCAGGAGAAAGACATGCTCTCAAACTGCAGACAAAACACCTTAGGACATAACACACAGACCTCAATCGCTCAGGATTTTAGTTCTGAGCAGGGCAGGACTGCGCCCCAGGACCAGAAAGCCAGTATCCAGATTTACCCCTGGATGCAGCGAATGAATTCGCACAGTGGGGTCGGCTACGGAGCGGACCGGAGGCGCGGCCGCCAGATCTACTCGCGGTACCAGACCCTGGAACTGGAGAAGGAATTTCACTTCAATCGCTACCTAACGCGGCGCCGGCGCATCGAGATCGCCAACGCGCTTTGCCTGACCGAGCGACAGATCAAAATCTGGTTCCAGAACCGCCGGATGAAGTGGAAAAAAGAATCTAATCTCACATCCACTCTCTCGGGGGGCGGCGGAGGGGCCACCGCCGACAGCCTGGGCGGAAAAGAGGAAAAGCGGGAAGAGACAGAAGAGGAGAAGCAGAAAGAGTGACCAGGACTGTCCCTGCCACCCCTCTCTCCCTTTCTCCCTCGCTCCCCACCAACTCTCCCCTAATCACACACTCTGTATTTATCACTGGCACAATTGATGTGTTTTGATTCCCTAAAACAAAATTAGGGAGTCAAACGTGGACCTGAAAGTCAGCTCTGGACCCCCTCCCTCACCGCACAACTCTCTTTCACCACGCGCCTCCTCCTCCTCGCTCCCTTGCTAGCTCGTTCTCGGCTTGTCTACAGGCCCTTTTCCCCGTCCAGGCCTTGGGGGCTCGGACCCTGAACTCAGACTCTACAGATTGCCCTCCAAGTGAGGACTTGGCTCCCCCACTCCTTCGACGCCCCCACCCCCGCCCCCCGTGCAGAGAGCCGGCTCCTGGGCCTGCTGGGGCCTCTGCTCCAGGGCCTCAGGGCCCGGCCTGGCAGCCGGGGAGGGCCGGAGGCCCAAGGAGGGCGCGCCTTGGCCCCACACCAACCCCCAGGGCCTCCCCGCAGTCCCTGCCTAGCCCCTCTGCCCCAGCAAATGCCCAGCCCAGGCAAATTGTATTTAAAGAATCCTGGGGGTCATTATGGCATTTTACAAACTGTGACCGTTTCTGTGTGAAGATTTTTAGCTGTATTTGTGGTCTCTGTATTTATATTTATGTTTAGCACCGTCAGTGTTCCTATCCAATTTCAAAAAAGGAAAAAAAAGAGGGAAAATTACAAAAAGAGAGAAAAAAAGTGAATGACGTTTGTTTAGCCAGTAGGAGAAAATAAATAAATAAATAAATCCCTTCGTGTTACCCTCCTGTATAAATCCAACCTCTGGGTCCGTTCTCGAATATTTAATAAAACTGATATTATTTTTAAAACTTTA (SEQ ID NO:6)
HOXC6 человека, варианта 2 транскрипта, мРНК (SEQ ID NO:41)
AACTTTTTATTGTGGTTTGTCCGTTCCGAGCGCTCCGCAGAACAGTCCTCCCTGTAAGAGCCTAACCATTGCCAGGGAAACCTGCCCTGGGCGCTCCCTTCATTAGCAGTATTTTTTTTAAATTAATCTGATTAATAATTATTTTTCCCCCATTTAATTTTTTTTCCTCCCAGGTGGAGTTGCCGAAGCTGGGGGCAGCTGGGGAGGGTGGGGATGGGAGGGGAGAGACAGAAGTTGAGGGCATCTCTCTCTTCCTTCCCGACCCTCTGGCCCCCAAGGGGCAGGAGGAATGCAGGAGCAGGAGTTGAGCTTGGGAGCTGCAGATGCCTCCGCCCCTCCTCTCTCCCAGGCTCTTCCTCCTGCCCCCTTCTTGCAACTCTCCTTAATTTTGTTTGGCTTTTGGATGATTATAATTATTTTTATTTTTGAATTTATATAAAGTATATGTGTGTGTGTGTGGAGCTGAGACAGGCTCGGCAGCGGCACAGAATGAGGGAAGACGAGAAAGAGAGTGGGAGAGAGAGAGGCAGAGAGGGAGAGAGGGAGAGTGACAGCAGCGCTCGGACGTCCTCCCCAACGTCGCCCTCAATTCCACCGCCTATGATCCAGTGAGGCATTTCTCGACCTATGGAGCGGCCGTTGCCCAGAACCGGATCTACTCGACTCCCTTTTATTCGCCACAGGAGAATGTCGTGTTCAGTTCCAGCCGGGGGCCGTATGACTATGGATCTAATTCCTTTTACCAGGAGAAAGACATGCTCTCAAACTGCAGACAAAACACCTTAGGACATAACACACAGACCTCAATCGCTCAGGATTTTAGTTCTGAGCAGGGCAGGACTGCGCCCCAGGACCAGAAAGCCAGTATCCAGATTTACCCCTGGATGCAGCGAATGAATTCGCACAGTGGGGTCGGCTACGGAGCGGACCGGAGGCGCGGCCGCCAGATCTACTCGCGGTACCAGACCCTGGAACTGGAGAAGGAATTTCACTTCAATCGCTACCTAACGCGGCGCCGGCGCATCGAGATCGCCAACGCGCTTTGCCTGACCGAGCGACAGATCAAAATCTGGTTCCAGAACCGCCGGATGAAGTGGAAAAAAGAATCTAATCTCACATCCACTCTCTCGGGGGGCGGCGGAGGGGCCACCGCCGACAGCCTGGGCGGAAAAGAGGAAAAGCGGGAAGAGACAGAAGAGGAGAAGCAGAAAGAGTGACCAGGACTGTCCCTGCCACCCCTCTCTCCCTTTCTCCCTCGCTCCCCACCAACTCTCCCCTAATCACACACTCTGTATTTATCACTGGCACAATTGATGTGTTTTGATTCCCTAAAACAAAATTAGGGAGTCAAACGTGGACCTGAAAGTCAGCTCTGGACCCCCTCCCTCACCGCACAACTCTCTTTCACCACGCGCCTCCTCCTCCTCGCTCCCTTGCTAGCTCGTTCTCGGCTTGTCTACAGGCCCTTTTCCCCGTCCAGGCCTTGGGGGCTCGGACCCTGAACTCAGACTCTACAGATTGCCCTCCAAGTGAGGACTTGGCTCCCCCACTCCTTCGACGCCCCCACCCCCGCCCCCCGTGCAGAGAGCCGGCTCCTGGGCCTGCTGGGGCCTCTGCTCCAGGGCCTCAGGGCCCGGCCTGGCAGCCGGGGAGGGCCGGAGGCCCAAGGAGGGCGCGCCTTGGCCCCACACCAACCCCCAGGGCCTCCCCGCAGTCCCTGCCTAGCCCCTCTGCCCCAGCAAATGCCCAGCCCAGGCAAATTGTATTTAAAGAATCCTGGGGGTCATTATGGCATTTTACAAACTGTGACCGTTTCTGTGTGAAGATTTTTAGCTGTATTTGTGGTCTCTGTATTTATATTTATGTTTAGCACCGTCAGTGTTCCTATCCAATTTCAAAAAAGGAAAAAAAAGAGGGAAAATTACAAAAAGAGAGAAAAAAAGTGAATGACGTTTGTTTAGCCAGTAGGAGAAAATAAATAAATAAATAAATCCCTTCGTGTTACCCTCCTGTATAAATCCAACCTCTGGGTCCGTTCTCGAATATTTAATAAAACTGATATTATTTTTAAAACTTTAAAA (SEQ ID NO: 41).
[0090] В некоторых вариантах осуществления наборы и/или способы, раскрытые в настоящем описании, используют для детекции мРНК SPARCL1, имеющей по меньшей мере часть, например, по меньшей мере 10 нуклеотидов, по меньшей мере 20 нуклеотидов, по меньшей мере 30 нуклеотидов, по меньшей мере 40 нуклеотидов, по меньшей мере 50 нуклеотидов, по меньшей мере 100 нуклеотидов, по меньшей мере 150 нуклеотидов, по меньшей мере 200 нуклеотидов, по меньшей мере 250 нуклеотидов, по меньшей мере 300 нуклеотидов, по меньшей мере 350 нуклеотидов, по меньшей мере 400 нуклеотидов, по меньшей мере 450 нуклеотидов и/или по меньшей мере 500 нуклеотидов или более, последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43 или SEQ ID NO:44:
SPARCL1 человека, вариант 1 транскрипта, мРНК (SEQ ID NO:7)
AAAAATGCATAAAGAGCCAAGTGCTTATATTCTGGCCAAGTTATGAGGCTCTGAGAACAAGAGCTTGAGGGGAAGACTGTTAACCCCATCCACGCCACCAGAATTAGCTCTTTCCCTTTTGGTTTGCAAGCACTGCCTGTAAAGCCCTCGCATGAGAGGCCAGCCTGCTAGGGAAATCCAGGAATCTGCAACAAAAACGATGACAGTCTGAAATACTCTCTGGTGCCAACCTCCAAATTCTCGTCTGTCACTTCAGACCCCCACTAGTTGACAGAGCAGCAGAATTTCAACTCCAGTAGACTTGAATATGCCTCTGGGCAAAGAAGCAGAGCTAACGAGGAAAGGGATTTAAAGAGTTTTTCTTGGGTGTTTGTCAAACTTTTATTCCCTGTCTGTGTGCAGAGGGGATTCAACTTCAATTTTTCTGCAGTGGCTCTGGGTCCAGCCCCTTACTTAAAGGCCATAAGATGTTTTATTGAAAGAAACTTTCAATATCAAGTAATCCAACCAACCTTCTAAGATAAGCCTTTTCCTTCAACACAAAGAAGTGCATTTTGCCAAATCTGGAAAGCATGAAGACTGGGCTTTTTTTCCTATGTCTCTTGGGAACTGCAGCTGCAATCCCGACAAATGCAAGATTATTATCTGATCATTCCAAACCAACTGCTGAAACGGTAGCACCTGACAACACTGCAATCCCCAGTTTAAGGGCTGAAGCTGAAGAAAATGAAAAAGAAACAGCAGTATCCACAGAAGACGATTCCCACCATAAGGCTGAAAAATCATCAGTACTAAAGTCAAAAGAGGAAAGCCATGAACAGTCAGCAGAACAGGGCAAGAGTTCTAGCCAAGAGCTGGGATTGAAGGATCAAGAGGACAGTGATGGTCACTTAAGTGTGAATTTGGAGTATGCACCAACTGAAGGTACATTGGACATAAAAGAAGATATGAGTGAGCCTCAGGAGAAAAAACTCTCAGAGAACACTGATTTTTTGGCTCCTGGTGTTAGTTCCTTCACAGATTCTAACCAACAAGAAAGTATCACAAAGAGAGAGGAAAACCAAGAACAACCTAGAAATTATTCACATCATCAGTTGAACAGGAGCAGTAAACATAGCCAAGGCCTAAGGGATCAAGGAAACCAAGAGCAGGATCCAAATATTTCCAATGGAGAAGAGGAAGAAGAAAAAGAGCCAGGTGAAGTTGGTACCCACAATGATAACCAAGAAAGAAAGACAGAATTGCCCAGGGAGCATGCTAACAGCAAGCAGGAGGAAGACAATACCCAATCTGATGATATTTTGGAAGAGTCTGATCAACCAACTCAAGTAAGCAAGATGCAGGAGGATGAATTTGATCAGGGTAACCAAGAACAAGAAGATAACTCCAATGCAGAAATGGAAGAGGAAAATGCATCGAACGTCAATAAGCACATTCAAGAAACTGAATGGCAGAGTCAAGAGGGTAAAACTGGCCTAGAAGCTATCAGCAACCACAAAGAGACAGAAGAAAAGACTGTTTCTGAGGCTCTGCTCATGGAACCTACTGATGATGGTAATACCACGCCCAGAAATCATGGAGTTGATGATGATGGCGATGATGATGGCGATGATGGCGGCACTGATGGCCCCAGGCACAGTGCAAGTGATGACTACTTCATCCCAAGCCAGGCCTTTCTGGAGGCCGAGAGAGCTCAATCCATTGCCTATCACCTCAAAATTGAGGAGCAAAGAGAAAAAGTACATGAAAATGAAAATATAGGTACCACTGAGCCTGGAGAGCACCAAGAGGCCAAGAAAGCAGAGAACTCATCAAATGAGGAGGAAACGTCAAGTGAAGGCAACATGAGGGTGCATGCTGTGGATTCTTGCATGAGCTTCCAGTGTAAAAGAGGCCACATCTGTAAGGCAGACCAACAGGGAAAACCTCACTGTGTCTGCCAGGATCCAGTGACTTGTCCTCCAACAAAACCCCTTGATCAAGTTTGTGGCACTGACAATCAGACCTATGCTAGTTCCTGTCATCTATTCGCTACTAAATGCAGACTGGAGGGGACCAAAAAGGGGCATCAACTCCAGCTGGATTATTTTGGAGCCTGCAAATCTATTCCTACTTGTACGGACTTTGAAGTGATTCAGTTTCCTCTACGGATGAGAGACTGGCTCAAGAATATCCTCATGCAGCTTTATGAAGCCAACTCTGAACACGCTGGTTATCTAAATGAGAAGCAGAGAAATAAAGTCAAGAAAATTTACCTGGATGAAAAGAGGCTTTTGGCTGGGGACCATCCCATTGATCTTCTCTTAAGGGACTTTAAGAAAAACTACCACATGTATGTGTATCCTGTGCACTGGCAGTTTAGTGAACTTGACCAACACCCTATGGATAGAGTCTTGACACATTCTGAACTTGCTCCTCTGCGAGCATCTCTGGTGCCCATGGAACACTGCATAACCCGTTTCTTTGAGGAGTGTGACCCCAACAAGGATAAGCACATCACCCTGAAGGAGTGGGGCCACTGCTTTGGAATTAAAGAAGAGGACATAGATGAAAATCTCTTGTTTTGAACGAAGATTTTAAAGAACTCAACTTTCCAGCATCCTCCTCTGTTCTAACCACTTCAGAAATATATGCAGCTGTGATACTTGTAGATTTATATTTAGCAAAATGTTAGCATGTATGACAAGACAATGAGAGTAATTGCTTGACAACAACCTATGCACCAGGTATTTAACATTAACTTTGGAAACAAAAATGTACAATTAAGTAAAGTCAACATATGCAAAATACTGTACATTGTGAACAGAAGTTTAATTCATAGTAATTTCACTCTCTGCATTGACTTATGAGATAATTAATGATTAAACTATTAATGATAAAAATAATGCATTTGTATTGTTCATAATATCATGTGCACTTCAAGAAAATGGAATGCTACTCTTTTGTGGTTTACGTGTATTATTTTCAATATCTTAATACCCTAATAAAGAGTCCATAAAAATCCAAATGCTT (SEQ ID NO: 7)
SPARCL1 человека, вариант 2 транскрипта, мРНК (SEQ ID NO:42)
AAAAATGCATAAAGAGCCAAGTGCTTATATTCTGGCCAAGTTATGAGGCTCTGAGAACAAGAGCTTGAGGGGAAGACTGTTAACCCCATCCACGCCACCAGAATTAGCTCTTTCCCTTTTGGTTTGCAAGCACTGCCTGTAAAGCCCTCGCATGAGAGGCCAGCCTGCTAGGGAAATCCAGGAATCTGCAACAAAAACGATGACAGTCTGAAATACTCTCTGGTGCCAACCTCCAAATTCTCGTCTGTCACTTCAGACCCCCACTAGTTGACAGAGCAGCAGAATTTCAACTCCAGTAGACTTGAATATGCCTCTGGGCAAAGAAGCAGAGCTAACGAGGAAAGGGATTTAAAGAGTTTTTCTTGGGTGTTTGTCAAACTTTTATTCCCTGTCTGTGTGCAGAGGGGATTCAACTTCAATTTTTCTGCAGTGGCTCTGGGTCCAGCCCCTTACTTAAAGATCTGGAAAGCATGAAGACTGGGCTTTTTTTCCTATGTCTCTTGGGAACTGCAGCTGCAATCCCGACAAATGCAAGATTATTATCTGATCATTCCAAACCAACTGCTGAAACGGTAGCACCTGACAACACTGCAATCCCCAGTTTAAGGGCTGAAGCTGAAGAAAATGAAAAAGAAACAGCAGTATCCACAGAAGACGATTCCCACCATAAGGCTGAAAAATCATCAGTACTAAAGTCAAAAGAGGAAAGCCATGAACAGTCAGCAGAACAGGGCAAGAGTTCTAGCCAAGAGCTGGGATTGAAGGATCAAGAGGACAGTGATGGTCACTTAAGTGTGAATTTGGAGTATGCACCAACTGAAGGTACATTGGACATAAAAGAAGATATGAGTGAGCCTCAGGAGAAAAAACTCTCAGAGAACACTGATTTTTTGGCTCCTGGTGTTAGTTCCTTCACAGATTCTAACCAACAAGAAAGTATCACAAAGAGAGAGGAAAACCAAGAACAACCTAGAAATTATTCACATCATCAGTTGAACAGGAGCAGTAAACATAGCCAAGGCCTAAGGGATCAAGGAAACCAAGAGCAGGATCCAAATATTTCCAATGGAGAAGAGGAAGAAGAAAAAGAGCCAGGTGAAGTTGGTACCCACAATGATAACCAAGAAAGAAAGACAGAATTGCCCAGGGAGCATGCTAACAGCAAGCAGGAGGAAGACAATACCCAATCTGATGATATTTTGGAAGAGTCTGATCAACCAACTCAAGTAAGCAAGATGCAGGAGGATGAATTTGATCAGGGTAACCAAGAACAAGAAGATAACTCCAATGCAGAAATGGAAGAGGAAAATGCATCGAACGTCAATAAGCACATTCAAGAAACTGAATGGCAGAGTCAAGAGGGTAAAACTGGCCTAGAAGCTATCAGCAACCACAAAGAGACAGAAGAAAAGACTGTTTCTGAGGCTCTGCTCATGGAACCTACTGATGATGGTAATACCACGCCCAGAAATCATGGAGTTGATGATGATGGCGATGATGATGGCGATGATGGCGGCACTGATGGCCCCAGGCACAGTGCAAGTGATGACTACTTCATCCCAAGCCAGGCCTTTCTGGAGGCCGAGAGAGCTCAATCCATTGCCTATCACCTCAAAATTGAGGAGCAAAGAGAAAAAGTACATGAAAATGAAAATATAGGTACCACTGAGCCTGGAGAGCACCAAGAGGCCAAGAAAGCAGAGAACTCATCAAATGAGGAGGAAACGTCAAGTGAAGGCAACATGAGGGTGCATGCTGTGGATTCTTGCATGAGCTTCCAGTGTAAAAGAGGCCACATCTGTAAGGCAGACCAACAGGGAAAACCTCACTGTGTCTGCCAGGATCCAGTGACTTGTCCTCCAACAAAACCCCTTGATCAAGTTTGTGGCACTGACAATCAGACCTATGCTAGTTCCTGTCATCTATTCGCTACTAAATGCAGACTGGAGGGGACCAAAAAGGGGCATCAACTCCAGCTGGATTATTTTGGAGCCTGCAAATCTATTCCTACTTGTACGGACTTTGAAGTGATTCAGTTTCCTCTACGGATGAGAGACTGGCTCAAGAATATCCTCATGCAGCTTTATGAAGCCAACTCTGAACACGCTGGTTATCTAAATGAGAAGCAGAGAAATAAAGTCAAGAAAATTTACCTGGATGAAAAGAGGCTTTTGGCTGGGGACCATCCCATTGATCTTCTCTTAAGGGACTTTAAGAAAAACTACCACATGTATGTGTATCCTGTGCACTGGCAGTTTAGTGAACTTGACCAACACCCTATGGATAGAGTCTTGACACATTCTGAACTTGCTCCTCTGCGAGCATCTCTGGTGCCCATGGAACACTGCATAACCCGTTTCTTTGAGGAGTGTGACCCCAACAAGGATAAGCACATCACCCTGAAGGAGTGGGGCCACTGCTTTGGAATTAAAGAAGAGGACATAGATGAAAATCTCTTGTTTTGAACGAAGATTTTAAAGAACTCAACTTTCCAGCATCCTCCTCTGTTCTAACCACTTCAGAAATATATGCAGCTGTGATACTTGTAGATTTATATTTAGCAAAATGTTAGCATGTATGACAAGACAATGAGAGTAATTGCTTGACAACAACCTATGCACCAGGTATTTAACATTAACTTTGGAAACAAAAATGTACAATTAAGTAAAGTCAACATATGCAAAATACTGTACATTGTGAACAGAAGTTTAATTCATAGTAATTTCACTCTCTGCATTGACTTATGAGATAATTAATGATTAAACTATTAATGATAAAAATAATGCATTTGTATTGTTCATAATATCATGTGCACTTCAAGAAAATGGAATGCTACTCTTTTGTGGTTTACGTGTATTATTTTCAATATCTTAATACCCTAATAAAGAGTCCATAAAAATCCAAATGCTT (SEQ ID NO: 42)
SPARCL1 человека, вариант 3 транскрипта, мРНК (SEQ ID NO:43)
AAAAATGCATAAAGAGCCAAGTGCTTATATTCTGGCCAAGTTATGAGGCTCTGAGAACAAGAGCTTGAGGGGAAGACTGTTAACCCCATCCACGCCACCAGAATTAGCTCTTTCCCTTTTGGTTTGCAAGCACTGCCTGTAAAGCCCTCGCATGAGAGGCCAGCCTGCTAGGGAAATCCAGGAATCTGCAACAAAAACGATGACAGTCTGAAATACTCTCTGGTGCCAACCTCCAAATTCTCGTCTGTCACTTCAGACCCCCACTAGTTGACAGAGCAGCAGAATTTCAACTCCAGTAGACTTGAATATGCCTCTGGGCAAAGAAGCAGAGCTAACGAGGAAAGGGATTTAAAGAGTTTTTCTTGGGTGTTTGTCAAACTTTTATTCCCTGTCTGTGTGCAGAGGGGATTCAACTTCAATTTTTCTGCAGTGGCTCTGGGTCCAGCCCCTTACTTAAAGATCTGGAAAGCATGAAGACTGGGCTTTTTTTCCTATGTCTCTTGGGAACTGCAGCTGCAATCCCGGTGAAAAGGAGATAAGAAGCAAAGGAGCAAACCAAACCTAATATGAATCCTGTACTTTGGCCAGAAGCCGTGGCTCACATCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCAAGACAAATGCAAGATTATTATCTGATCATTCCAAACCAACTGCTGAAACGGTAGCACCTGACAACACTGCAATCCCCAGTTTAAGGGCTGAAGCTGAAGAAAATGAAAAAGAAACAGCAGTATCCACAGAAGACGATTCCCACCATAAGGCTGAAAAATCATCAGTACTAAAGTCAAAAGAGGAAAGCCATGAACAGTCAGCAGAACAGGGCAAGAGTTCTAGCCAAGAGCTGGGATTGAAGGATCAAGAGGACAGTGATGGTCACTTAAGTGTGAATTTGGAGTATGCACCAACTGAAGGTACATTGGACATAAAAGAAGATATGAGTGAGCCTCAGGAGAAAAAACTCTCAGAGAACACTGATTTTTTGGCTCCTGGTGTTAGTTCCTTCACAGATTCTAACCAACAAGAAAGTATCACAAAGAGAGAGGAAAACCAAGAACAACCTAGAAATTATTCACATCATCAGTTGAACAGGAGCAGTAAACATAGCCAAGGCCTAAGGGATCAAGGAAACCAAGAGCAGGATCCAAATATTTCCAATGGAGAAGAGGAAGAAGAAAAAGAGCCAGGTGAAGTTGGTACCCACAATGATAACCAAGAAAGAAAGACAGAATTGCCCAGGGAGCATGCTAACAGCAAGCAGGAGGAAGACAATACCCAATCTGATGATATTTTGGAAGAGTCTGATCAACCAACTCAAGTAAGCAAGATGCAGGAGGATGAATTTGATCAGGGTAACCAAGAACAAGAAGATAACTCCAATGCAGAAATGGAAGAGGAAAATGCATCGAACGTCAATAAGCACATTCAAGAAACTGAATGGCAGAGTCAAGAGGGTAAAACTGGCCTAGAAGCTATCAGCAACCACAAAGAGACAGAAGAAAAGACTGTTTCTGAGGCTCTGCTCATGGAACCTACTGATGATGGTAATACCACGCCCAGAAATCATGGAGTTGATGATGATGGCGATGATGATGGCGATGATGGCGGCACTGATGGCCCCAGGCACAGTGCAAGTGATGACTACTTCATCCCAAGCCAGGCCTTTCTGGAGGCCGAGAGAGCTCAATCCATTGCCTATCACCTCAAAATTGAGGAGCAAAGAGAAAAAGTACATGAAAATGAAAATATAGGTACCACTGAGCCTGGAGAGCACCAAGAGGCCAAGAAAGCAGAGAACTCATCAAATGAGGAGGAAACGTCAAGTGAAGGCAACATGAGGGTGCATGCTGTGGATTCTTGCATGAGCTTCCAGTGTAAAAGAGGCCACATCTGTAAGGCAGACCAACAGGGAAAACCTCACTGTGTCTGCCAGGATCCAGTGACTTGTCCTCCAACAAAACCCCTTGATCAAGTTTGTGGCACTGACAATCAGACCTATGCTAGTTCCTGTCATCTATTCGCTACTAAATGCAGACTGGAGGGGACCAAAAAGGGGCATCAACTCCAGCTGGATTATTTTGGAGCCTGCAAATCTATTCCTACTTGTACGGACTTTGAAGTGATTCAGTTTCCTCTACGGATGAGAGACTGGCTCAAGAATATCCTCATGCAGCTTTATGAAGCCAACTCTGAACACGCTGGTTATCTAAATGAGAAGCAGAGAAATAAAGTCAAGAAAATTTACCTGGATGAAAAGAGGCTTTTGGCTGGGGACCATCCCATTGATCTTCTCTTAAGGGACTTTAAGAAAAACTACCACATGTATGTGTATCCTGTGCACTGGCAGTTTAGTGAACTTGACCAACACCCTATGGATAGAGTCTTGACACATTCTGAACTTGCTCCTCTGCGAGCATCTCTGGTGCCCATGGAACACTGCATAACCCGTTTCTTTGAGGAGTGTGACCCCAACAAGGATAAGCACATCACCCTGAAGGAGTGGGGCCACTGCTTTGGAATTAAAGAAGAGGACATAGATGAAAATCTCTTGTTTTGAACGAAGATTTTAAAGAACTCAACTTTCCAGCATCCTCCTCTGTTCTAACCACTTCAGAAATATATGCAGCTGTGATACTTGTAGATTTATATTTAGCAAAATGTTAGCATGTATGACAAGACAATGAGAGTAATTGCTTGACAACAACCTATGCACCAGGTATTTAACATTAACTTTGGAAACAAAAATGTACAATTAAGTAAAGTCAACATATGCAAAATACTGTACATTGTGAACAGAAGTTTAATTCATAGTAATTTCACTCTCTGCATTGACTTATGAGATAATTAATGATTAAACTATTAATGATAAAAATAATGCATTTGTATTGTTCATAATATCATGTGCACTTCAAGAAAATGGAATGCTACTCTTTTGTGGTTTACGTGTATTATTTTCAATATCTTAATACCCTAATAAAGAGTCCATAAAAATCCAAATGCTT (SEQ ID NO: 43)
SPARCL1 человека, вариант 4 транскрипта, мРНК (SEQ ID NO:44)
AAAAATGCATAAAGAGCCAAGTGCTTATATTCTGGCCAAGTTATGAGGCTCTGAGAACAAGAGCTTGAGGGGAAGACTGTTAACCCCATCCACGCCACCAGAATTAGCTCTTTCCCTTTTGGTTTGCAAGCACTGCCTGTAAAGCCCTCGCATGAGAGGCCAGCCTGCTAGGGAAATCCAGGAATCTGCAACAAAAACGATGACAGTCTGAAATACTCTCTGGTGCCAACCTCCAAATTCTCGTCTGTCACTTCAGACCCCCACTAGTTGACAGAGCAGCAGAATTTCAACTCCAGTAGACTTGAATATGCCTCTGGGCAAAGAAGCAGAGCTAACGAGGAAAGGGATTTAAAGAGTTTTTCTTGGGTGTTTGTCAAACTTTTATTCCCTGTCTGTGTGCAGAGGGGATTCAACTTCAATTTTTCTGCAGTGGCTCTGGGTCCAGCCCCTTACTTAAAGATCTGGAAAGCCATGAACAGTCAGCAGAACAGGGCAAGAGTTCTAGCCAAGAGCTGGGATTGAAGGATCAAGAGGACAGTGATGGTCACTTAAGTGTGAATTTGGAGTATGCACCAACTGAAGGTACATTGGACATAAAAGAAGATATGAGTGAGCCTCAGGAGAAAAAACTCTCAGAGAACACTGATTTTTTGGCTCCTGGTGTTAGTTCCTTCACAGATTCTAACCAACAAGAAAGTATCACAAAGAGAGAGGAAAACCAAGAACAACCTAGAAATTATTCACATCATCAGTTGAACAGGAGCAGTAAACATAGCCAAGGCCTAAGGGATCAAGGAAACCAAGAGCAGGATCCAAATATTTCCAATGGAGAAGAGGAAGAAGAAAAAGAGCCAGGTGAAGTTGGTACCCACAATGATAACCAAGAAAGAAAGACAGAATTGCCCAGGGAGCATGCTAACAGCAAGCAGGAGGAAGACAATACCCAATCTGATGATATTTTGGAAGAGTCTGATCAACCAACTCAAGTAAGCAAGATGCAGGAGGATGAATTTGATCAGGGTAACCAAGAACAAGAAGATAACTCCAATGCAGAAATGGAAGAGGAAAATGCATCGAACGTCAATAAGCACATTCAAGAAACTGAATGGCAGAGTCAAGAGGGTAAAACTGGCCTAGAAGCTATCAGCAACCACAAAGAGACAGAAGAAAAGACTGTTTCTGAGGCTCTGCTCATGGAACCTACTGATGATGGTAATACCACGCCCAGAAATCATGGAGTTGATGATGATGGCGATGATGATGGCGATGATGGCGGCACTGATGGCCCCAGGCACAGTGCAAGTGATGACTACTTCATCCCAAGCCAGGCCTTTCTGGAGGCCGAGAGAGCTCAATCCATTGCCTATCACCTCAAAATTGAGGAGCAAAGAGAAAAAGTACATGAAAATGAAAATATAGGTACCACTGAGCCTGGAGAGCACCAAGAGGCCAAGAAAGCAGAGAACTCATCAAATGAGGAGGAAACGTCAAGTGAAGGCAACATGAGGGTGCATGCTGTGGATTCTTGCATGAGCTTCCAGTGTAAAAGAGGCCACATCTGTAAGGCAGACCAACAGGGAAAACCTCACTGTGTCTGCCAGGATCCAGTGACTTGTCCTCCAACAAAACCCCTTGATCAAGTTTGTGGCACTGACAATCAGACCTATGCTAGTTCCTGTCATCTATTCGCTACTAAATGCAGACTGGAGGGGACCAAAAAGGGGCATCAACTCCAGCTGGATTATTTTGGAGCCTGCAAATCTATTCCTACTTGTACGGACTTTGAAGTGATTCAGTTTCCTCTACGGATGAGAGACTGGCTCAAGAATATCCTCATGCAGCTTTATGAAGCCAACTCTGAACACGCTGGTTATCTAAATGAGAAGCAGAGAAATAAAGTCAAGAAAATTTACCTGGATGAAAAGAGGCTTTTGGCTGGGGACCATCCCATTGATCTTCTCTTAAGGGACTTTAAGAAAAACTACCACATGTATGTGTATCCTGTGCACTGGCAGTTTAGTGAACTTGACCAACACCCTATGGATAGAGTCTTGACACATTCTGAACTTGCTCCTCTGCGAGCATCTCTGGTGCCCATGGAACACTGCATAACCCGTTTCTTTGAGGAGTGTGACCCCAACAAGGATAAGCACATCACCCTGAAGGAGTGGGGCCACTGCTTTGGAATTAAAGAAGAGGACATAGATGAAAATCTCTTGTTTTGAACGAAGATTTTAAAGAACTCAACTTTCCAGCATCCTCCTCTGTTCTAACCACTTCAGAAATATATGCAGCTGTGATACTTGTAGATTTATATTTAGCAAAATGTTAGCATGTATGACAAGACAATGAGAGTAATTGCTTGACAACAACCTATGCACCAGGTATTTAACATTAACTTTGGAAACAAAAATGTACAATTAAGTAAAGTCAACATATGCAAAATACTGTACATTGTGAACAGAAGTTTAATTCATAGTAATTTCACTCTCTGCATTGACTTATGAGATAATTAATGATTAAACTATTAATGATAAAAATAATGCATTTGTATTGTTCATAATATCATGTGCACTTCAAGAAAATGGAATGCTACTCTTTTGTGGTTTACGTGTATTATTTTCAATATCTTAATACCCTAATAAAGAGTCCATAAAAATCCAAATGCTT (SEQ ID NO:44).
[0091] В некоторых вариантах осуществления наборы и/или способы, раскрытые в настоящем описании, используют для детекции (i) мРНК ERG, имеющей по меньшей мере часть, например, по меньшей мере 10 нуклеотидов, по меньшей мере 20 нуклеотидов, по меньшей мере 30 нуклеотидов, по меньшей мере 40 нуклеотидов, по меньшей мере 50 нуклеотидов, по меньшей мере 100 нуклеотидов, по меньшей мере 150 нуклеотидов, по меньшей мере 200 нуклеотидов и/или по меньшей мере 250 нуклеотидов или более, последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:2, (ii) мРНК PCA3, имеющей по меньшей мере часть, например, по меньшей мере 10 нуклеотидов, по меньшей мере 20 нуклеотидов, по меньшей мере 30 нуклеотидов, по меньшей мере 40 нуклеотидов, по меньшей мере 50 нуклеотидов, по меньшей мере 100 нуклеотидов, по меньшей мере 150 нуклеотидов, по меньшей мере 200 нуклеотидов, по меньшей мере 250 нуклеотидов, по меньшей мере 300 нуклеотидов, по меньшей мере 350 нуклеотидов, по меньшей мере 400 нуклеотидов и/или по меньшей мере 450 нуклеотидов или более, последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:3, и (iii) по меньшей мере часть по меньшей мере одной другой мРНК, выбранной из группы, состоящей из (1) мРНК AMACR, имеющей по меньшей мере часть, например, по меньшей мере 10 нуклеотидов, по меньшей мере 20 нуклеотидов, по меньшей мере 30 нуклеотидов, по меньшей мере 40 нуклеотидов, по меньшей мере 50 нуклеотидов, по меньшей мере 100 нуклеотидов, по меньшей мере 150 нуклеотидов, по меньшей мере 200 нуклеотидов, по меньшей мере 250 нуклеотидов, по меньшей мере 300 нуклеотидов, по меньшей мере 350 нуклеотидов, по меньшей мере 400 нуклеотидов, по меньшей мере 450 нуклеотидов и/или по меньшей мере 500 нуклеотидов или более, последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:37 или SEQ ID NO:38; (2) мРНК BIRC5, имеющей по меньшей мере часть, например, по меньшей мере 10 нуклеотидов, по меньшей мере 20 нуклеотидов, по меньшей мере 30 нуклеотидов, по меньшей мере 40 нуклеотидов, по меньшей мере 50 нуклеотидов, по меньшей мере 100 нуклеотидов, по меньшей мере 150 нуклеотидов, по меньшей мере 200 нуклеотидов, по меньшей мере 250 нуклеотидов, по меньшей мере 300 нуклеотидов, по меньшей мере 350 нуклеотидов, по меньшей мере 400 нуклеотидов, по меньшей мере 450 нуклеотидов и/или по меньшей мере 500 нуклеотидов или более, последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:39 или SEQ ID NO:40; (3) мРНК HOXC6, имеющей по меньшей мере часть, например, по меньшей мере 10 нуклеотидов, по меньшей мере 20 нуклеотидов, по меньшей мере 30 нуклеотидов, по меньшей мере 40 нуклеотидов, по меньшей мере 50 нуклеотидов, по меньшей мере 100 нуклеотидов, по меньшей мере 150 нуклеотидов, по меньшей мере 200 нуклеотидов, по меньшей мере 250 нуклеотидов, по меньшей мере 300 нуклеотидов, по меньшей мере 350 нуклеотидов, по меньшей мере 400 нуклеотидов, по меньшей мере 450 нуклеотидов и/или по меньшей мере 500 нуклеотидов или более, последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:41; и (4) SPARCL1 мРНК, имеющей по меньшей мере часть, например, по меньшей мере 10 нуклеотидов, по меньшей мере 20 нуклеотидов, по меньшей мере 30 нуклеотидов, по меньшей мере 40 нуклеотидов, по меньшей мере 50 нуклеотидов, по меньшей мере 100 нуклеотидов, по меньшей мере 150 нуклеотидов, по меньшей мере 200 нуклеотидов, по меньшей мере 250 нуклеотидов, по меньшей мере 300 нуклеотидов, по меньшей мере 350 нуклеотидов, по меньшей мере 400 нуклеотидов, по меньшей мере 450 нуклеотидов и/или по меньшей мере 500 нуклеотидов или более, последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, или SEQ ID NO:44.
[0092] В некоторых вариантах осуществления наборы и/или способы, раскрытые в настоящем описании, используют для детекции мРНК ERG, имеющей полноразмерную последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:2, мРНК PCA3, имеющей полноразмерную последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:3, и по меньшей еще одной мРНК, выбранной из группы, состоящей из мРНК AMACR, имеющей полноразмерную последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:37 или SEQ ID NO:38, мРНК BIRC5, имеющей полноразмерную последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:39 или SEQ ID NO:40, мРНК HOXC6, имеющей полноразмерную последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:41, и мРНК SPARCL1, имеющей полноразмерную последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43 или SEQ ID NO:44.
[0093] Уровень экспрессии мРНК определяли, используя любую из множества методик, принятых в данной области. Например, величины Ct (пороговый цикл) для каждого биомаркера в микровизикулах мочи определяют с помощью анализа ОТ-кПЦР. В анализе ПЦР в реальном времени положительную реакцию определяют по накоплению флуоресцентного сигнала. Величину Ct определяют как число циклов, требуемых для того, чтобы флуоресцентный сигнал пересек порог (то есть, превысил фоновый уровень). Уровни Ct обратно пропорциональны количеству мишеневой нуклеиновой кислоты в образце (то есть, чем меньше уровень Ct, тем больше количество мишеневой нуклеиновой кислоты в образце).
[0094] В некоторых вариантах осуществления рассчитывают число копий детектируемых генов (то есть, PCA3 и ERG). Количество копий также может быть количественно оценено с помощью анализа ОТ-кПЦР одной или нескольких нуклеиновых кислот, экстрагированных из микровизикул мочи. Специалист в данной области может без труда определить число копий известными в данной области способами, например, используя калибровочную кривую.
[0095] Для получения калибровочной кривой в одном и том же планшете анализируют серии разведений известного числа копий кДНК синтетической последовательности РНК, идентичной детектируемому гену, в качестве анализируемых образцов для тех же генов. Сравнивая величины Ct образцов с величинами Ct калибровочной кривой может быть определено точное количество копий последовательностей в анализируемых образцах. Соотнося величины Ct образцов со значениями калибровочных кривых в одном и том же планшете способ «нормализует» различия в проведении анализа, связанные с различной точностью пипетирования, эффективностью компонентов анализа (например, ферментов, зондов, праймеров, dNTP и тому подобное), эффективностью термоциклического прибора кПЦР (например, фильтров, температуры и тому подобное) и других изменений, которые могут возникнуть в разных планшетах.
[0096] В способах, приведенных в настоящем документе, гены, уровни экспрессии которых используют для расчета относительных уровней экспрессии, в совокупности называют «эталонные гены». Эталонный ген, используемый для определения адекватности образца в отношении микровезикулярной РНК, представляет собой ген, который, как правило, обнаруживается в микровизикулах мочи, например, гены «домашнего хозяйства» или гены, специфические для предстательной железы. Уровень экспрессии этих эталонных генов используют для нормализации количества детектируемого сигнала для контроля изменчивости в количестве выделенных микропузырьков между образцами. Например, в способах, приведенных в настоящем документе, эталонный ген, используемый для нормализации экспрессии PCA3 и ERG, может быть геном KLK3, кодирующим простатический специфический антиген (PSA), или собственно антигеном PSA, или SPDEF. Эталонный ген может быть геном, специфическим для предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления эталонный ген может быть нетканевым геном «домашнего хозяйства», например, GAPDH. В способах, приведенных в настоящем документе, анализ относительной экспрессии, или нормализации, осуществляют путем вычитания величины Ct гена-маркера, специфичного для предстательной железы (например, KLK3), из величин Ct, полученных для PCA3 и ERG, с получением так называемого ΔCt. Число копий рассчитывают путем построения кривой следующей формулы
Ct=b+a*log10(калибруемые_копии)
по известным калибровочным точкам серий разведений в планшете с получением «калибровочной кривой». Число копий для образцов затем рассчитывают по формуле:
Копии_образцов=10^((Ct_образец-b)/a).
Такой расчет числа копий проводят независимо для каждого гена-маркера (например, PCA3 и/или ERG), а также для эталонного гена (например, KLK3 или SPDEF). «Нормализацию» сигнала, полученного от гена-маркера (например, PCA3 и/или ERG) затем получали путем деления числа копий гена-маркера на число копий эталонного гена (например, ERG/SPDEF, ERG/KLK3, PCA3/SPDEF и ERG/SPDEF).
[0097] В некоторых вариантах осуществления в наборах и/или способах, раскрытых в настоящем описании, используется эталонный ген, содержащий мРНК KLK3, имеющей по меньшей мере часть, например, по меньшей мере 10 нуклеотидов, по меньшей мере 20 нуклеотидов, по меньшей мере 30 нуклеотидов, по меньшей мере 40 нуклеотидов, по меньшей мере 50 нуклеотидов, по меньшей мере 100 нуклеотидов, по меньшей мере 150 нуклеотидов, по меньшей мере 200 нуклеотидов и/или по меньшей мере 250 нуклеотидов или более, следующей последовательности нуклеиновой кислоты:
TTGTCTTCCTCACCCTGTCCGTGACGTGGATTGGTGCTGCACCCCTCATCCTGTCTCGGATTGTGGGAGGCTGGGAGTGCGAGAAGCATTCCCAACCCTGGCAGGTGCTTGTGGCCTCTCGTGGCAGGGCAGTCTGCGGCGGTGTTCTGGTGCACCCCCAGTGGGTCCTCACAGCTGCCCACTGCATCAGGAACAAAAGCGTGATCTTGCTGGGTCGGCACAGCCTGTTTCATCCTGAAGACACAGGCCAGGTATTTCAGGTCAGCCACAGCTTCCCACACCCGCTCTACGATATGAGCC (SEQ ID NO:8).
[0098] В некоторых вариантах осуществления в наборах и/или способах, раскрытых в настоящем описании, используется эталонный ген, содержащий мРНК SPDEF, имеющей по меньшей мере часть, например, по меньшей мере 10 нуклеотидов, по меньшей мере 20 нуклеотидов, по меньшей мере 30 нуклеотидов, по меньшей мере 40 нуклеотидов, по меньшей мере 50 нуклеотидов, по меньшей мере 100 нуклеотидов, по меньшей мере 150 нуклеотидов, по меньшей мере 200 нуклеотидов, по меньшей мере 250 нуклеотидов, по меньшей мере 300 нуклеотидов, по меньшей мере 350 нуклеотидов, по меньшей мере 400 нуклеотидов, по меньшей мере 450 нуклеотидов и/или по меньшей мере 500 нуклеотидов или более, следующей последовательности нуклеиновой кислоты:
GGGAGACGAAUUGGGCCCUCUAGAUGCAUGCUCGAGCGGCCGCCAGUGUGAUGGAUAUCUGCAGAAUUCGCCCUUAUUUAAGUAGUGACAUGUUUUUGCACAUUUCCAGCCCCUUUAAAUAUCCACACACACAGGAAGCACAAAAGGAAGCACAGAGAUCCCUGGGAGAAAUGCCCGGCCCUGGGUGGGGAUGUGCUGCACGCCCACCUGGACAUCUGGAAGUCAGCGGCCUGGAUGAAAGAGCGGACUUCACCUGGGGCGAUUCACUACAAAUCUGGAAAGCAUGAAGACUGGGCUUUUUUUCCUAUGUCUCUUGGGAACUGCAGCUGCAAUCCCGACAAAUGCAAGAUUAUUAUCUGAUCAUUCCAAACCAACUGCUGAAACGGUAGCACCAGUUGCCCAGAUAACUGUGACGAUGGACUAUGCACCAAUGGUUGCAAGUACGAAGAUCUCUAUAGUAACUGUAAAAGUUUGAAGCUCACAUUAACCUGUAAACAUCAGUUGGUCAGGGACAGUUGCAAAAGGACCACCGCAUCUCUACAUUCAAGAACUGGCCCUUCUUGGAGGGCUGCGCCUGCACCCCGGAGCGGAUGGCCGAGGCUGGCUUCAUCCACUGCCCCACUGAGAACGAGCCAGACUUGACCUGCGGCCGCAAGCUUGGAUCCGAAUUCCUGUGUGAAAUUGUUAUCCGCUCACAAUUCCACACAACAUACGAGCCGGAAGCAUAAAGUGUAAAGCCUGGGGUGCCUAAUGA (SEQ ID NO: 9).
[0099] Можно также провести анализ и сравнение относительных, или нормализованных, уровней экспрессии PCA3 и ERG и эталонного гена, используя любую из множества методик, принятых в данной области. Например, ROC-анализ (операционная характеристика приемника (ROC)) можно проводить в отношении PCA3 и ERG, и, необязательно, по меньшей мере в отношении еще одного биомаркера, где уровень экспрессии измеренных биомаркеров дает значение площади под кривой (AUC) для каждого измеренного биомаркера. Roc-aнализы биомаркеров можно осуществлять по отдельности, то есть как отдельные маркеры, или в комбинации для анализа линейной регрессии. Комбинации биомаркеров с высоким диагностическим значением в качестве биомаркеров, как описано в настоящем документе, с высокой диагностической эффективностью имеют значения AUC, полученные на основе ROC-кривых, свыше 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8. Предпочтительно, биомаркер или комбинация биомаркеров имеет значение AUC свыше 0,7. Например, комбинация PCA3 и ERG дает значение AUC свыше 0,7.
[0100] Roc-кривая представляет собой широко используемый инструмент для оценки дифференциальной и диагностической эффективности биомаркера. Если значение биомаркера при некоторых наблюдениях отсутствует, то анализ ROC, основанный исключительно на полном наборе данных, теряет эффективность из-за уменьшения размера выборки образцов, и что более важно, происходит потенциальное смещение выборки. Таким образом, в случае, если значение биомаркера отсутствует, то применяют метод подстановок.
[0101] Площадь под кривой (AUC), полученная на основе ROC- кривой (операционная характеристика приемника (ROC)), для каждого уровня биомаркера или баллы, полученные при сочетании биомаркеров, обрабатывают, используя результаты биомаркеров как контролей, так и больных. Специалист в данной области без труда сможет максимально улучшить диагностический индекс точности уровня биомаркера или комбинации биомаркеров путем проведения анализа порога отсечения, принимая во внимание чувствительность, специфичность, прогностическую ценность отрицательного результата (NPV), прогностическую ценность положительного результата (PPV), отношение правдоподобия положительного результата (PLR) и отношение правдоподобия отрицательного результата (NLR), необходимых для клинической ценности.
[0102] Получение ROC-кривых и анализ популяции образцов, используют для оценки величины порога отсечения, используемой для проведения различия между различными подгруппами индивидов. Например, по величине порога отсечения можно проводить различие межу индивидами с высоким риском рецидивирующего злокачественного новообразования и индивидами с низким риском рецидивирующего злокачественного новообразования. В некоторых вариантах осуществления по величине порогового значения можно проводить различие между индивидами со злокачественным новообразованием и индивидами, не имеющих его. В некоторых вариантах осуществления по величине порога отсечения можно проводить различие между индивидами с неагрессивным и индивидами с агрессивным злокачественным новообразованием. В некоторых вариантах осуществления, по величине порога отсечения можно проводить различие между индивидами с раком предстательной железы с высоким индексом Глисона (например, GS>6) и пациентами с раком предстательной железы с низким индексом Глисона.
[0103] Как описано в настоящем документе, нормализованные уровни экспрессии PCA3 и EGF, определенные в образце мочи индивида, обрабатывают в отношении выходного значения для проведения различия между индивидами подгрупп. В некоторых вариантах осуществления нормализованные уровни экспрессии PCA3 и ERG определяют, используя KLK3 в качестве эталонного гена, следующим образом:
ERG
ERG
KLK3
ΔCt=Ct- Ct
PCA3
PCA3
KLK3
ΔCt=Ct- Ct
Значения ΔCt ERG и PCA3 затем используют в математической формуле с получением выходного значения. Примером формулы для получения выходного значения является следующая формула:
ERG
PCA3
Выходное значение=(ΔCt×0,233)+(ΔCt×0,446)
[0104] В случае числа копий выходное значение исследования рассчитывается следующим образом:
PCA3
KLK3 или SPDEF
ERG
Выходное значение=Копия /Копия × Coeff+Copy/
KLK3 или SPDEF
Копия × Coeff,
PCA3
KLK3
SPDEF
ERG
KLK3 или SPDEF
где коэффициент может быть равен, например, 1 (единице). В случае, если коэффициент является одинаковым, то все гены делают одинаковый относительный вклад в выходное значение. В некоторых вариантах осуществления коэффициенты отличаются для каждого гена-маркера, что указывает на то, что каждый ген-маркер делает различный вклад в выходное значение и, следовательно, в вероятность положительной биопсии. При одном подходе коэффициенты могут быть определены путем подгонки уравнения: выходное значение=копия/копияyили × Coeff+копия/копия × Coeff к существующему набору данных с помощью линейной регрессии.
[0105] Как показано в примерах, приведенных в настоящем описании, с помощью сочетания PCA3 и ERG можно проводить специфическое различие между отрицательной биопсией и положительной биопсией индивидов с чувствительностью, равной 77,8%, и специфичностью, равной 61,8%. Эти значения указывают на силу сочетаний генов-биомаркеров, раскрытых в настоящем описании, в качестве чувствительных и специфических диагностических биомаркеров злокачественного новообразования, например, рака предстательной железы.
[0106] Термин «индивид» предназначен для описания всех животных, у которых показано наличие или у которых предполагается наличие микровезикул, содержащих нуклеиновые кислоты, и/или циркулирующих в моче нуклеиновых кислот. В конкретном варианте осуществления индивидом является млекопитающее; например, человек или примат, собака, кошка, лошадь, корова или другое фермерское животное, или грызун (например, мышь, крыса, морская свинка и тому подобное).
Получение микровезикулярной фракции из образца мочи
[0107] Способы получения микровизикулярной фракции из образца мочи описаны в настоящей заявке, а также в научных публикациях и патентных заявках (Chen et al., 2010; Miranda et al., 2010; Skog et al., 2008). См. также WO 2009/100029, WO 2011/009104, WO 2011/031892 и WO 2011/031877. Эти публикации включены в настоящее описание путем отсылки к их описаниям, относящимся к способам и методикам выделения микровезикул или их фракции. Эти способы могут включать стадии оценки целостности РНК выделенной фракции миковезикул, например, путем определения уровня экспрессии 18S и 28S РНК в пределах фракции.
[0108] Например, способы получения микровезикул с помощью дифференциального центрифугирования описаны в документе Raposo et al. (Raposo et al., 1996), документе Skog et al.(Skog et al., 2008) и в документе Nilsson et al.(Nilsson et al., 2009). Способы анионного обмена и/или гель-проникающей хроматографии описаны в патентах США 6899863 и 6812023. Способы с градиентом плотности сахарозы или электрофореза огранелл описаны в патенте США 7198923. Способ клеточного сортинга с магнитной активацией (MACS) описан в документе Taylor и Gercel-Taylor (Taylor and Gercel-Taylor, 2008). Способ наномерного ультрацентрифугирования описан в документе Cheruvanky et al. (Cheruvanky et al., 2007). Кроме того, микровезикулы могут быть идентифицированы и выделены из жидкости организма индивида с помощью технологии микрочипов, при которой используется микрожидкостная платформа для разделения микровезикул, полученных из опухолей (Chen et al., 2010). Каждая из вышеуказанных ссылок включена в настоящее описание путем ссылки для раскрытия этих способов.
[0109] В одном из вариантов осуществления способов, раскрытых в настоящем описании, микровезикулы, выделенные из мочи, насыщены микровезикулами клеток простаты или опухолевыми клетками. Так как микровезикулы часто несут на поверхности молекулы, такие как антигены их донорных клеток, то молекулы на поверхности могут быть использованы для идентификации, выделения и/или насыщения микровезикул специфических донорных типов клеток (Al-Nedawi et al., 2008; Taylor and Gercel-Taylor, 2008). Таким образом, микровезикулы различных клеточных популяций могут быть проанализированы на содержание нуклеиновых кислот. Например, опухолевые (злокачественные и доброкачественные) микровезикулы несут поверхностные антигены, связанные с опухолью, и могут быть детектированы, выделены и/или насыщены посредством этих поверхностных антигенов, связанных с опухолью. В одном из примеров поверхностный антиген представляет собой адгезивную молекулу эпителиальных клеток (EpCAM), которая специфична для микровезикул, карциномы легких, колоректального рака, рака молочной железы, предстательной железы, головы и шеи и рака печеночного происхождения, но исключая клетки гематологического происхождения (Balzar et al., 1999; Went et al., 2004).
[0110] Кроме того, специфичные микровезикулы опухоли, могут быть охарактеризованы по отсутствию поверхностных маркеров, например, CD80 и CD86. В этих случаях, микровезикулы с маркерами, такими как CD80 и CD86, могут быть исключены из дальнейшего анализа специфических маркеров опухолей. Такое исключение может быть достигнуто различными способами, например, аффинной эксклюзионной хроматографией.
[0111] Получение фракций микровезикул из предстательной железы может быть осуществлено, например, используя антитела, аптамеры, аналоги аптомеров или молекулярно импринтированные полимеры, специфичные в отношении желаемого поверхностного антигена. В некоторых вариантах осуществления поверхностный антиген является специфичным для типа злокачественного новообразования. В некоторых вариантах осуществления поверхностный антиген является специфичным для клеточного типа, которые не обязательно представляет собой карциному.
[0112] В одном из вариантов осуществления способ разделения микровезикул на основе клеточных антигенов, представлен в патенте США 7198923. Как описано, например, в патенте США 5840867 и 5582981, WO/2003/050290 и в публикации Johnson et al. (Johnson et al., 2008), аптамеры и их аналоги специфически связываются с поверхностными молекулами и могут использоваться в качестве инструмента для разделения с целью получения микровезикул в зависимости от типа клеток. Молекулярно-импринтировые полимеры также специфически распознают поверхностные молекулы, как описано, например, в патенте США 6525154, 7332553 и 7384589 и в публикации Bossi et al. (Bossi et al., 2007) и являются инструментом для получения и выделения микровезикул в зависимости от типа клеток. Каждая из вышеуказанных ссылок включена в настоящее описание для раскрытия этих методов.
[0113] В способах, описанных в настоящем документе, образец мочи может быть предварительно обработан на одной или нескольких стадиях фильтрации или центрифугирования для удаления клеточного остатка и других немикровезикулярных веществ. Например, образец мочи может быть отфильтрован через 0,8 мкм-овый фильтр. Необязательно, фильтрат, полученный после прохождения через 0,8 мкм-овый фильтр, может быть дополнительно отфильтрован через 0,22 мкм-овый фильтр. Для выделения микровезикул мочи предварительно обработанные образцы затем концентрируют, используя стадию фильтрационной концентрации. Эта стадия включает использование фильтра, которые имеет молекулярную предельную величину для сохранения и концентрирования микровезикул, диаметром больше 10 нм. Например, образец затем концертируют до объема меньше 1 мл, предпочтительно, 100-200 мкл. Например, молекулярный предел по массе составляет по меньшей мере 100 кДа. Предпочтительно, молекулярный предел по массе составляет 100 кДа.
Экстракция нуклеиновой кислоты из микровезикул
[0114] Методы экстракции нуклеиновой кислоты в целом основаны на методиках, хорошо известных в данной области. Специалисты в данной области смогут выбрать конкретную методику экстракции, подходящую для конкретного биологического образца. Примеры методик экстракции приведены в патентных публикациях WO 2009/100029, US 201/00196426, US 2011/0003704, US 2011/0053157, WO 2011/009104 и WO 2011/031892. Эти публикации включены в настоящий документ путем ссылки для раскрытия проведения методов и методик экстракции нуклеиновых кислот из микровезикул.
[0115] В способах, описанных в настоящем документе, после выделения микровезикул и их очистки, но перед лизисом микровезикул и выделения нуклеиновой кислоты, в образец добавляют ингибитор РНказы для предотвращения нежелательной деградации нуклеиновых кислот после экстракции. Микровезикулы лизируют в присутствии ингибитора РНКазы. Затем к РНК-связывающей колонке добавляют лизат при таких условиях, известных в данной области, при которых РНК микровезикул связывается с колонкой. Необязательно, колонку промывают для повышения количества и выхода РНК. Затем РНК элюируют при таких в условиях, известных в данной области, при которых проводят сбор РНК высокого качества.
[0116] В некоторых вариантах осуществления количество экстрагированных нуклеиновых кислот может быть оценено путем детекции рибосомальной 18S и 28S РНК и путем определения их соотношения. Отношение 18S:28S рРНК предпочтительно составляет приблизительно от 1:1 до приблизительно 1:2; более предпочтительно, приблизительно 1:2.
[0117] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты могут быть экстрагированы из образцов мочи без выделения или очистки микровезикулярной фракции.
Детекция биомаркеров нуклеиновой кислоты
[0118] Детекцию биомаркеров можно осуществлять на экстрагированных нуклеиновых кислотах большим числом различных путей и основываясь на множестве аспектов. В некоторых вариантах осуществления детекцию биомаркеров нуклиновых кислот из одного или нескольких образцов мочи проводят для получения всего профиля или части профиля экстрагированных нуклеиновых кислот.
[0119] Профиль, в качестве используемого в настоящем документе термина, относится к набору конкретных признаков коллекции нуклеиновых кислот, который может быть определен с помощью количественного или качественного анализа одной или нескольких аминокислот, содержащихся в микровезикулах или в фракции микровезикул, выделенных из образца мочевины индивида. Эталонный профиль в настоящем документе определен как профиль, полученный у независимого индивида или группы индивидов, или у того же индивида в различные точки времени.
[0120] Нуклеиновые кислоты в микровезикулах могут быть нуклеиновыми кислотами одного или нескольких типов, примеры которых приведены в настоящем документе.
[0121] Нуклеиновые кислоты могут быть РНК. РНК могут кодирующей РНК, например, матричной РНК, которая может кодировать белки. РНК может быть также некодирующей РНК (нкРНК), например, рибосомальной РНК, транспортной РНК, микроРНК и другими некодирующими транскриптами, которые могут происходить из геномной ДНК. Эти некодирующие РНК транскрипы могут включать транскрипты, которые транскрибированы из сателлитных повторов; и транспозоны, которые могут быть транспозонами ДНК или ретротранспозонами. Предпочтительно, нуклеиновыми кислотами являются мРНК.
[0122] Нуклеиновые кислоты могут быть ДНК. ДНК может быть одноцепочечной ДНК, которая является обратным транскриптом РНК, например, кДНК. Обратная транскрипция обычно опосредуется обратной транскриптазой, кодируемой геном обратной транскриптазы в клетке. ДНК также может быть одноцепочечной ДНК, которая образуется в процессе репликации ДНК. Геномная ДНК реплицируется в ядре при делении клетки. Некоторые реплицированные ДНК могут отрываться от своей матрицы, экспортироваться из ядра и упаковываться в микровезикулы. ДНК, кроме того, может быть фрагментами двуцепочечной ДНК.
[0123] Кроме того, ДНК может быть некодирующей ДНК (нкДНК). Геном человека содержит только приблизительно 20000 генов, кодирующих белок, что составляет меньше 2% от всего генома. Отношение некодирующих и кодирующих белок последовательностей ДНК повышается как функция сложности развития (Mattick, 2004). Прокариоты имеют меньше 25% нкДНК, простые эукариоты имеют от 25 до 50%, более сложные многоклеточные организмы, такие как растения и животные, имеют более 50% нкDNA, а человек имеет приблизительно 98,5% нкДНК (Mattick, 2004).
[0124] Некоторая часть нкДНК генома транскрибируется в нкРНК. нкРНК вовлечены в большое число важных процессов в клетке, например, ферменты (рибозимы), связывающиеся специфически с белками (аптамерами) и регулирующие активность генов и на уровне транскрипции, и на посттранскрипционном уровне.
[0125] Профиль нуклеиновых кислот может быть получен путем аализа нуклеиновых кислот, полученных из выделенных микровезикул в соответствии со стандартными протоколами уровня техники. Например, анализ ДНК может быть осуществлен одним или несколькими различными способами, известными в данной области, включая анализ с использованием микроматрицы для определения вида нуклеиновой кислоты в экстракте, количественную ПЦР для измерения уровня экспрессии генов, секвинирование ДНК для обнаружения мутаций в генах и анализ бисульфитного метилирования для детекции характера метилирования генов.
[0126] Для получения профилей, в некоторых случаях, можно проводить анализ данных. Такой анализ данных может быть осуществлен, например, с помощью кластерного анализа, метода главных компонент, линейного дискриминантного анализа, анализа кривой операционной характеристики приемника, бинарного анализа, регрессивного анализа пропорциональных рисков Кокса, метода опорных векторов и рекурсивной функции удаления (SVM-РСЕ), классификации по ближайшей центроиде, доказательного анализа или сочетания любых вышеупомянутых аналитических методик.
[0127] В еще одном примере, анализ РНМ может быть осуществлен с помощью цифрового метода анализа экспрессии генов (DGE) (Lipson et al., 2009). В еще одном примере анализа РНК может быть ферментативно расщеплена и превращена в одноцепочечную кДНК, которую затем можно проанализировать, секвенируя на аппарате для секвенирования ДНК, например, одномолекулярный секвинатор HeliScope™ от Helicos BioSciences, как описано в публикации Ting et al. (Ting et al., 2011).
[0128] В других примерах, перед последующей амплификацией может быть проведена обратная транскрипция РНК в комплементарную ДНК (кДНК). Такая обратная транскрипция может быть осуществлена самостоятельно или в сочетании со стадией амплификации. Одним из примеров способа, объединяющего стадии обратной транскрипции и амплификации, является полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), которая дополнительно может быть модифицирована как количественная, например, количественная ОТ-ПЦР, как описано в патенте США номер 5639606, который включен в настоящий документ путем ссылки на это описание. Еще в одном примере способ включает две отдельные стадии: первую стадию обратной транскрипции для преобразования РНК в кДНК, и вторую стадию количественного определения кДНК, используя количественную ПЦР.
[0129] Способы амплификации нуклеиновых кислот включают, но ими не ограничиваются, полимеразную цепную реакцию (ПЦР) (патент США 5219727) и ее варианты, такие как полимеразная реакция in situ (патент США номер 5538871), количественная полимеразная цепная реакция (патент США номер 5219727), гнездовая полимеразная цепная реакция (патент США номер 5556773), самоподдерживающаяся репликация последовательностей и ее варианты (Guatelli et al., 1990), транскрипционно-опосредованная амплификационная система и ее варианты (Kwoh et al., 1989), Qb-репликаза и ее варианты (Miele et al., 1983), холодная ПЦР (, анализ BEAM (Li et al., 2006) и другие способы амплификации нуклеиновых кислот, после чего следует детекция амплифицированных молекул, используя методики, известные специалистам в данной области. Особенно эффективными являются такие системы детекции, которые разработаны для детекции молекул нуклеиновых кислот, если такие молекулы присутствуют в очень небольшом числе. Приведенные выше ссылки включены в настоящее изобретение для информации об этих методах.
[0130] В некоторых вариантах осуществления стадию амплификации нуклеиновой кислоты не проводят. Неамплифицированные нуклеиновые кислоты могут быть проанализированы с помощью количественной ПЦН (ОТ-ПЦР) или проанализированы напрямую, например, посредством секвинирования следующего поколения или технологией NanoString.
[0131] Анализ нуклеиновых кислот, присутствующих в выделенных микровезикулах, может быть количественным и/или качественным. При количественном анализе измеряют уровни экспрессии, либо относительный, либо абсолютный, интересующих специфических нуклеиновых кислот в выделенных микровезикулах способами, известным в данной области и описанными в настоящем документе. При качественном анализе идентифицируют тип интересующих нуклеиновых кислот в выделенных микровезикулах, дикий тип или варианты, способами, известными в данной области.
[0132] В некоторых вариантах осуществления детекция биомаркеров нуклеиновых кислот включает детекцию на наличие или отсутствие одной или набора генетических аберраций. Термин “генетическая аберрация” используется в настоящем документе в отношении количества нуклеиновых кисло, а также вариантов нуклеиновых кислот в микровезикулах, содержащих нуклеиновые кислоты. Конкретно, генетические аберрации включают, но ими не ограничиваются, сверхэкспрессию гена (например, онкогена) или набора генов, пониженную экспрессию гена (например, гена опухолевого супрессора, такого как p53 или RB) или набора генов, альтернативную продукцию сплайсированных вариантов гена или набора генов, варианты числа копий гена (CNV) (например, двойные ДНК (Hahn, 1993), модификации нуклеиновых кислот (например, метилирование, ацетилирование и фосфорилирование), единичные нуклеотидные полиморфизмы (SNP) (например, полиморфизмы в элементах Alu), хромосомные перестановки (например, инверсии, делеции и дубликации) и мутации (вставки, делеции, дупликации, миссенс-кодоны, нонсенс-кодоны, синонимы и другие нуклеотидные изменения) генов или набора генов, где мутации, в большинстве случаев, в конечном счете, влияют на активность и функцию генных продуктов, что приводит к альтернативным вариантам транскрипции и сплайсинга и/или изменениям уровня экспрессии генов, или к комбинациям любых из вышеперечисленных изменений.
[0133] Генетические абберации можно обнаружить во многих типах нуклеиновых кислот. Определение таких генетических аббераций можно проводить с помощью различных методик, известных специалисту в данной области. Например, уровень экспрессии нуклеиновых кислот, альтернативные варианты сплайсинга, хромосомные перестройки и число копий гена можно определять с помощью анализа с микроматрицами (см., например, патенты США номер 6913879, 7364848, 7378245, 6893837 и 6004755) и количественной ПЦР. Изменения в числе копий можно детектировать, например, путем анализа генотипирования всего генома с использованием технологии Infinium Infinium II или путем выравнивания генома человека с использованием микроматрицы CGH (Steemers et al., 2006).
[0134] Модификации нуклеиновых кислот могут быть проанализированы способами, описанными, например, в патенте США номер 7186512 и в патентной публикации WO/2003/023065. Профили метилирования могут определены, например, с помощью анализа метилирования ДНК на панели для злокачественных новообразований OMA003 с использованием технологии Illumina.
[0135] SNP и мутации могут быть детектированы путем гибридизации с аллель-специфическими зондами, путем ферментных методов детекции мутаций, химическим расщеплением гетеродуплексов с ошибочным спариванием (Cotton et al., 1988), рибонуклеазным расщеплением оснований с ошибочным спариванием (Myers et al., 1985), масс-спектрометрией (патенты США номер 6994960, 7074563 и 7198893), секвенированием нуклеиновой кислоты, одноцепочечным конформационным полиморфизмом (SSCP) (Orita et al., 1989), электрофорезом в градиенте денатурирующего геля (DGGE) (Fischer and Lerman, 1979a; Fischer and Lerman, 1979b), электрофорезом в геле с температурным градиентом (TGGE) (Fischer anf Lerman, 1979a; Fischer and Lerman, 1979b), полиморфизмом длинных рестрикционных фрагментов (RFLP) (Kan and Dozy, 1978a; Kan and Dozy, 1978b), анализом лигирования олигонуклеотидом (OLA), аллель-специфической ПЦР (ASPCR) (патент США номер 5639611), лигазной цепной реакцией (LCR) и ее вариантами (Abravaya et al., 1995; Landegren et al., 1988; Nakazawa et al., 1994), проточным цитометрическим гетеродуплексным анализом (WO/2006/113590) и их комбинациями/модификациями.
[0136] В некоторых вариантах осуществления детекцию мутаций проводят с помощью рестрикционного фермента, который разрезает только один вариант биомаркера, но не разрезает другие варианты биомаркера. Как известно в данной области, рестрикционные ферменты правильно распознают конкретные полинуклеотидные участки, а изменение одного или нескольких нуклеотидов в пределах полинуклеотидного участка скорей всего сделает полинуклеотид нераспознаваемым и не разрезаемым для фермента. По существу, детекция одного из вариантов биомаркеров может быть упрощена путем отрезания нескольких или всех других вариантов, которые могут распознаваться этим ферментом. Вариант для детекции может быть вариантом дикого типа или мутантным вариантом.
[0137] Уровни генной экспрессии могут быть определены с помощью методики (Velculescu et al., 1995) серийного анализа генной экспрессии (SAGE) , количественной ПЦР, количественной ПЦР с обратной транскрипцией, анализом на микроматрицах и секвинированием ДНК следующего поколения, как хорошо известно в данной области.
[0138] В целом, способы анализа генетических аббераций описаны во множестве публикаций, не ограничиваясь теми, которые цитированы в настоящем документе, и они доступны для специалистов в данной области. Подходящий способ анализа будет зависеть от специфических целей анализа, состояния/анамнеза пациента, и от конкретного вида злокачественного новообразования(ий), заболеваний и других расстройств, подлежащих обнаружению, мониторингу и лечению.
Биомаркеры, связанные с заболеваниями или другими расстройствами
[0139] Большое число биомаркеров может быть связано с наличием или отсутствием заболевания или других расстройств у индивида. Следовательно, детекция на наличие или отсутствие таких биомаркеров в экстракте нуклеиновой кислоты выделенных микровезикул, согласно способам, описанным в настоящем документе, может способствовать диагностике, прогнозированию или проведению мониторинга прогресса или рецидива заболевания или другого расстройства у индивида.
[0140] ERG, как используется в настоящем изобретении, относится к гену, также называемому гомолог онкогена v-ets вируса E26 эритробластоза и к любым другим идентифицированным изоформам. Например, изоформы ERG включают ERG1, ERG2, ERG3, ERG4, ERG5, ERG6, ERG7, ERG8 и ERG9. ERG также может относится к изоформе 1 гена ERG, специфической для рака предстательной железы ERG (EPC1), и изоформе 2 гена ERG, специфической для рака предстательной железы (EPC2). ERG, или любая изоформа ERG, может использоваться в качестве биомаркера рака предстательной железы.
[0141] PCA3, как используется в настоящем документе, также относится к гену, который также известен как DD3, и к любой идентифицированной изоформе, и может использоваться в качестве биомаркера рака предстательной железы.
[0142] Было обнаружено, что большое число биомаркеров влияет на выбор терапии конкретного пациента. Детекция на наличие или отсутствие таких биомаркеров в экстракте нуклеиновой кислоты выделенных микровезикул, согласно способам, описанным в настоящем документе, может способствовать выбору терапии у конкретного пациента.
Подгруппы пациентов
[0143] Настоящее изобретение относится к способам детекции одного или нескольких биомаркеров в образцах мочи индивида для установления диагноза, прогнозирования, проведения мониторинга и выбора терапии заболевания, такого как, например, злокачественное новообразование, в частности агрессивное злокачественное новообразование.
[0144] Выбор индивида для выделения микровезикул осуществляется специалистом в данной области на основе анализ одного или нескольких различных факторов. Такими учитываемыми факторами являются либо наличие в семейном анамнезе индивида конкретного заболевания (например, злокачественного новообразования), генетической предрасположенности к такому заболеванию, повышенного риска наличия такого заболевания, физиологические симптомы, которые указывают на предрасположенность, либо влияние окружающих факторов. Влияние окружающий факторов включает стиль жизни, воздействие агентов, которые вызывают или способствуют развитию заболевания, например, атмосферные факторы, территориальные факторы, вода и питание. Другие причины для выбора индивида для проведения способов, описанных в настоящем документе, включают наличие в анамнезе заболевания, недавно диагностированного заболевания до лечения или после лечения, недавно прошедшего лечение заболевания (или получающего лечение в настоящее время) или находящегося в ремиссии или в процессе восстановления после заболевания.
[0145] Злокачественное новообразование диагностированное, контролируемое или другим образом оцениваемое способами по настоящему изобретению может быть любым видом злокачественного новообразования или предракового состояния. К нему относятся, но ими не ограничиваются, эпителиальные виды рака, такие как рак легкого, рак яичника, рак шейки матки, рак эндометрия, рак молочной железы, рак мозга, рак толстой кишки и рак предстательной железы. Также к нему относятся желудочно-кишечный рак, рак головы и шеи, немелкоклеточный рак легкого, рак нервной системы, рак сетчатки, рак кожи, рак печение, рак поджелудочной железы, рак почек, рак половых органов и рак мочевого пузыря, меланома и лейкоз. Кроме того, способы и композиции по настоящему изобретению равнозначным образом могут использоваться для обнаружения, диагностики и прогнозирования немалигнизирующих опухолей у индивида (например, нейробластомы, менингиомы и шванномы). Злокачественное новообразование может быть агрессивным. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование представляет собой урогенитальный рак, такой как рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак почки и метастазирующий рак, который поражает мочеполовую систему.
[0146] Настоящее изобретение относится к биомаркерам, которые имеют значительную диагностическую и прогностическую ценность у различных подгрупп пациентов. Пациенты страдают злокачественными новообразованиями, например, раком предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления один или несколько биомаркеров детектируют у пациентов, у которых проведена радикальная простатэктомия. В некоторых вариантах осуществления один или несколько биомаркеров детектируют у пациентов с установленным индексом Глисона. В некоторых вариантах осуществления один или несколько биомаркеров детектируют у пациентов, которые экспрессируют ERG, или у пациентов, у которых выявлено злокачественное новообразование, инициируемое экспрессией ERG. Такие пациентов называют в настоящем описании «экспрессирующие ERG». Наличие ERG или экспрессии ERG выше конкретной заранее известной величины указывает на злокачественные новообразования, инициируемые экспрессией ERG. В некоторых вариантах осуществления один или несколько биомаркеров детектируют у пациентов, которые не экспрессируют ERG, или у пациентов, у которых выявлено злокачественное новообразование, не инициируемое экспрессией ERG. Такие пациентов называют в настоящем описании «неэкспрессирующие ERG».
[0147] Система оценки Глисона широко используется в данной области в качестве параметра для прогноза, часто используемого в сочетании с другими прогностическими факторами и исследованиями, рака предстательной железы. Образцы биопсии предстательной железы оценивают, например, с помощью микроскопа, и патоморфолог определяет балл на основании структурных характеристик опухоли предстательной железы. Балл по шкале Глисона основан на степени потери нормальной структуры железистой тканью (например, форма, размер и дифференциация железы). Образцу присваивается показатель наиболее распространенного образца опухоли и второй показатель следующего распространенного образца опухоли. Это может быть первичный или наиболее распространенный образец или вторичный, или второй, наиболее распространенный образец, которые могут быть идентифицированы; альтернативно, может быть присвоен только один показатель. Баллы по шкале Глисона связаны со следующими признаками:
Балл 1 - Рак предстательной железы напоминает нормальную ткань предстательной железы. Железа имеет небольшой размер, хорошо оформлена и имеет плотную структурную решетку.
Балл 2 - Ткань железы все еще хорошо оформлена, но она имеет больший размер и больше ткани между железистыми структурами.
Балл 3 - Ткань железы все еще узнаваема, но клетки темнее. При высокой степени малигнизации некоторые из этих клеток покидают железу и начинают поражать окружающую ткань.
Балл 4 - В ткани распознаются несколько железистых структур. Большинство клеток поражают окружающую ткань.
Балла 5 - В ткани не распознаются железистые структуры. Обычно на всех протяженности окружающих тканей находят просто пласты клеток.
[0148] Два показателя, суммируемые вместе с получением индекса Глисона, также называют суммой по шкале Глисона. Индекс от 2 до 4 является очень низким по шкале агрессивного рака. Индекс от 5 до 6 указывает на умеренную агрессивность рака. Индекс 7 указывает на среднюю агрессивность рака. Индекс от 8 до 10 свидетельствует об агрессивном типе рака.
[0149] Другие системы бальной оценки для разделения неагрессивных форм рака от агрессивных форм рака для других типов злокачественных новообразований, например, рака мочевого пузыря и рака почек, хорошо известны в данной области.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Материалы и методы:
[0150] Последовательности праймеров/зондов: В наборах и способах детекции когорт биомаркеров мочи использовали следующие последовательности праймеров/зондов. В таблице 1 ниже используют следующие аббревиатуры: зонды от Integrated DNA Technologies обозначены как «IDT,» 5’-FAM относится к 5’-репортерному красителю, «3IABkFQ» относится к гасителю 3’-IowaBlack и «ZEN» относится к гасителю in-sequence-ZEN™ от IDT.
Таблица 1.Последовательности праймера/зонда
Мишень
Обозначения
Последовательность/Модификации
SPDEF
0881_SPDEF_e3-4_fF_IDT
CCACCTGGACATCTGGAAG (SEQ ID NO:10)
SPDEF
0884_SPDEF_e3-4_r1_IDT
AATCGCCCCAGGTGAAGT(SEQ ID NO:11)
SPDEF
0883_SPDEF_e3-4_p_ZEN
/56-FAM/CGG CCT GGA/ZEN/TGA AAG AGC G/3IABkFQ/(SEQ ID NO:12)
ERG
0498_ERG_ex11-12_IDT_f(ERG LDT F1)
GCGTCCTCAGTTAGATCCTTATCAG (SEQ ID NO:13)
ERG
0499_ERG_ex12-13_IDT_R(ERG LDT R1)
CTGGCCACTGCCTGGATT(SEQ ID NO:14)
ERG
0500_ERG_ex12_IDT_FAM_ZEN_зонд
/56-FAM/CTT GGA CCA /ZEN/ACA AGT AGC CGC CTT GC/3IABkFQ/(SEQ ID NO:15)
PCA3
0539_PCA3_ex3-4_злкч_IDT_f
GCA CAT TTC CAG CCC CTT TA(SEQ ID NO:16)
PCA3
0540_PCA3_ex3-4_злкч_IDT_r
GGC ATT TCT CCC AGG GAT CT(SEQ ID NO:17)
PCA3
0541_PCA3_ex3-4_злкч_IDT_FAM_ZEN_зонд
/56-FAM/CAC ACA GGA /ZEN/AGC ACA AAA GGA AGC /3IABkFQ/(SEQ ID NO:18)
Q бета
0545_Qбета_P3_IDT_f
AAC GGT TCT TGT GAC CCA TC(SEQ ID NO:19)
Q бета
0546_Qбета_P3_IDT_r
CGA ACA AAA GCT CGT TCC TC(SEQ ID NO:20)
Q бета
0547_Qбета_P3_Tm69_IDT_FAM_ZEN_зонд
/56-FAM/CGC CAG GCA /ZEN/TAT GCT GAC GTG /3IABkFQ/(SEQ ID NO:21)
KLK3
0535_KLK3_LDT_ex1-2_P3_f (KLK3 LDT F1)
CCTGTCCGTGACGTGGAT(SEQ ID NO:22)
KLK3
0536_KLK3_LDT_ex1-2_P3_r (KLK3 LDT R)
CAGGGTTGGGAATGCTTCT(SEQ ID NO:23)
KLK3
0538_KLK3_ex1-2_P3_Tm70_FAM_ZEN_зонд
/56-FAM/CGG ATT GTG /ZEN/GGA GGC TGG GA/3IABkFQ/(SEQ ID NO:24)
TMPRSS:ERG
0949_TMPRSS-ERG_SL_F
GCC TGG AGC GCG GCA G(SEQ ID NO:25)
TMPRSS:ERG
0951_TMPRSS-ERG_SL_R2
GCA CAC TCA AAC AAC GAC TG(SEQ ID NO:26)
TMPRSS:ERG
0955_TMPRSS-ERG_SL_P1
/56-FAM/AGC CTT ATC /ZEN/AGT TGT GAG TGA GGA C/3IABkFQ/(SEQ ID NO:27)
AMACR
0508_AMACR_ex1-2_LDT_f
GCCGCGGTGTCATGG(SEQ ID NO:28)
AMACR
0509_AMACR_ex2_LDT_r
TTTCCCGCTGCAGAATCTC(SEQ ID NO:29)
AMACR
0510_AMACR_353_IDT_FAM_ZEN_зонд
/56-FAM/AGA AAC TCC /ZEN/AGC TGG GCC CA/3IABkFQ/(SEQ ID NO:30)
BIRC5
0582_BIRC5_P3_e1-2_F
GGA CCA CCG CAT CTC TAC AT(SEQ ID NO:31)
BIRC5
0583_BIRC5_P3_e1-2_R
GTC TGG CTC GTT CTC AGT GG(SEQ ID NO:32)
BIRC5
0584_BIRC5_P3_e1-2_IDT_FAM_ZEN_зонд
/56-FAM/CTT CTT GGA /ZEN/GGG CTG CGC CT/3IABkFQ/(SEQ ID NO:33)
SPARCL1
0585_SPARCL1_P3-2_f
TCT GGA AAG CAT GAA GAC TGG (SEQ ID NO:34)
SPARCL1
0586_SPARCL1_P3-2_R
TGC TAC CGT TTC AGC AGT TG (SEQ ID NO:35)
SPARCL1
0587_SPARCL1_P3-2_IDT_FAM_ZEN_зонд
/56-FAM/CTG CAG CTG /ZEN/CAA TCC CGA CA/3IABkFQ/(SEQ ID NO:36)
Пример 2: получение образцов пациентов когорты 7
[0151] Образцы когорты пациентов использовали для идентификации биомаркеров, которые могут использоваться для детекции рака предстательной железы на основании нуклеиновых кислот, экстрагированных из микровезикул мочи. В этом исследовании регистрировали когорту пациентов из 258 индивидов, обозначенную этом примере как «когорта 7». Из 258 индивидов у 196 была проведена первичная биопсия, а у 59 - повторная биопсия. Из группы с первичной биопсией у 87 пациентов были положительные результаты биопсии, а у 109 пациентов были отрицательные результаты биопсии. Из группы с повторной биопсией у 15 пациентов были положительные результаты биопсии, а у 44 были отрицательные результаты биопсии.
[0152] Объемы образцов мочи изменялись от 20 до 100 мл. Распределение первичного объема образцов мочи у пациентов было следующим: объем образца (V) равен 20 мл (то есть, V=20 мл), 21% пациентов (n=55); объем образца свыше 20 мл, меньше или равен 40 мл (то есть, 20 мл<V≤40 мл), 27% пациентов (n=70); или объем образца равен свыше 40 мл (то есть, V>40 мл), 52% пациентов (n=133).
[0153] Образцы мочи когорты 7 анализировали, как показано на фигурах 1A и 1B. Например, образцы мочи собирали и фильтровали через фильтр размером 0,8 мкм для того, чтобы отделить клети и другой клеточный осадок от микровезикул, и насыщенные микрочастицами фракции замораживали при -80°C. Первую аликвоту каждого образца (S1) дополнительно обрабатывали. Дополнительные стадии обработки могут включать центрифугирование, концентрацию через фильтрационный концентратор, 1-2 стадии промывки и/или добавление ингибитора РНКазы. Необязательно, перед выделением микрочастиц или экстрацией нуклеиновых кислот для определения количества выделения или экстракции нуклеиновых кислот к образцам могут быть добавлены контрольные частицы, такие как Q-бета частицы. Например, 18 индивидов были исключены из исследования из-за ошибок с контролем Q-бета.
[0154] Конкретно, образец мочи сначала фильтровали, и фильтрат удаляли. Добавляли контроль с Q-бета частицами при подходящей концентрации (например, 100 копий) к аликвоте отфильтрованных образцов мочи (например, 15 мл). Аликвоту затем пропускают через фильтрационный концентратор, и фильтрат удаляют Ультраконцентрат ресуспендируют со второй аликвотой отфильтрованных образцов мочи (например, 5 мл отфильтрованной мочи) и пропускают через фильтрационный концентратор. Ультраконцентрат затем промывают по меньшей мере один раз (например, два раза) и повторно центрифугируют в фильтрационном концентраторе. Добавляют ингибитор РНКазы к ультраконцентрату, расположенному в верхней камере фильтрационного концентратора, и инкубируют при комнатной температуре, например, в течение 2-3 минут. К образу затем напрямую добавляют буфер для лизиса и инкубируют в течение 1 минуты. Лизат затем переносят в другой контейнер для продолжения экстрации нуклеиновой кислоты.
[0155] Из образцов затем экстрагируют нуклеиновую кислоту, используя способы, хорошо известные в данной области, и условия, подходящие для выхода РНК высокого качества. 12 мкл экстрагированной РНК анализируют на профиль с помощью BioAnalyzer. Проводят обратную транскрипцию экстрагированной РНК в кДНК (набор для синтеза кДНК SUPERSCRIPT VILO, Life Technologies). Количественную ПЦР в реальном времени проводили на образцах кДНК для определения экспрессии гена PCA3, ERG, KLK3 и Qbeta (2 мкл на ген). Для каждого планшета кПЦР была представлена калибровочная стандартная кривая.
[0156] Последовательности паймеров и зондов можно найти в таблице 1.
Пример 3: Анализ экспрессии гена ERG и PSA3
[0157] Проводили множественный анализ, используя результаты генной экспрессии эксперимента кПЦР. РОС-кривые получали на основе дельта Ct или числа копий относительно нормализующего гена KLK3. Отсечение можно использовать для получения пропущенных значений. РОС-анализ PCA3, c использованием KLK3 в качестве гена для нормализации, давал значение AUC, равное 0,727 (Фигура 3). ROC-анализ PCA3 и ERG давал повышенные значения AUC, равные 0,756 (Фигура 4). В других экспериментах геном для нормализации был SPDEE (Фигура 13) и значения AUC, полученные из анализа, используя нормализацию SPDEF, показали, что KLK3 и SPDEF давали эквивалентные результаты.
[0158] Значения модели, или выходные данные, для экспрессии генов PCA3 и ERG также были рассчитаны для каждого примера, используя следующую формулу, которую устанавливали из данных анализа различных когорт пациентов (Когорта 5):
ERG
PCA3
Значение модели=(ΔCt × 0,233)+(ΔCt × 0,446)
ERG
ERG
KLK3
PCA3
PCA3
KLK33
где ΔCt=Ct - Ct; ΔCt=Ct - Ct
Выбирали величину порога отсечения модели, например, величина порога отсечения в этом примере была 4,7, и диагностическую точность использованной комбинации PCA3 и ERG с величиной порога отсечения модели, равной 4,7, определяли по анализу 2×2 и анализу Глисона (Фигура 10).
[0159] Результаты анализа 2×2, используя экспрессию генов PCA3 и ERG для каждого объема образца подгруппы когорты 7, суммированы в Таблицах 2a, 3a и 4a. Сочетание PCA3 и ERG превышает 84% чувствительность для идентификации рака предстательной железы в образцах, которые были выявлены как положительные по данным биопсии. В частности, данные показали, что объем образцов мочи, равный 20 мл, давал лучшую диагностическую точность, имея чувствительность 83,6% и специфичность 58,7%. Этот способ также имел высокую прогностическую ценность отрицательного результата, равную 79,4%, и прогностическую ценность положительного результата, равную 53,4%.
[0160] Дальнейший анализ включал распределение образцов по индексу Глисона, как показано в таблицах 2b, 3b и 4b, и анализа квартиля, как показано в таблицах 2d, 2е, 3d, 3e, 4d и 4e. Конкретно, образцы пациентов с индексом Глисона, равным 6 или выше, были верно идентифицированы в 70% образцов.
Пример 4: Модель на трех генах, включая PCA3
[0161] Мультивариантный анализ осуществляли, используя набор генов, включая PCA3. Как показано на Фигуре 15, PCA3-содержащие модели (то есть, PCA3 и ERG плюс дополнительный ген, такой как AMACR, BIRC5, HOXC6 и SPARCL1) неизменно превосходят модели на трех генах FTO, которые не содержат PCA3. Используемыми эталонными генами могут быть KLK3 или SPDEF, на что указывают постоянные значения AUC, полученные при использовании любого гена для нормализации, на Фигуре 15.
[0162] Как было показано, модели на трех генах также имеют улучшенные значения AUC при использовании образов с малым объемом (то есть, 20 мл) по сравнению со всеми образцами (Фигура 15).
Пример 5: Оптимальный объем образца мочи
[0163] Образцы мочи пациентов когорты 7 изменялись от 20 до 100 мл. Распределение образцов с объемами 20 мл или меньше, 40 мл или меньше, но больше 20 мл, и больше 40 мл в когорте 7 показано на Фигуре 1.
[0164] Выделяли микровезикулы, экстрагировали РНК и определяли экспрессию генов биомаркеров, как описано в Примерах 1 и 2. Биостатистический анализ биомаркеров (то есть, PCA3, ERG) в когорте 7 осуществляли путем получения AUC и ROC-графиков на основе числа копий и экспрессии генов, нормализованной по KLK3, для всех образцов в когорте. На Фигуре 3 показано, что AUC, полученное из анализа экспрессии PCA3, имеет высокую зависимость от объема образца. Например, образцы, которые показали AUC больше 0,70, были образцами с объемом менее 40 мл. Наоборот, образцы, которые показали AUC в области от 0,60 до 0,65, были образцами с объемом 40 мл или больше. На фигуре 12 показан однофакторный анализ каждого указанного гена (PCA3, ERG, AMACR, BIRC5, HOXC6, SPARCL1 и SPDEF) и полученные значения AUC для образцов объемом 20 мл или менее сравнивали с полученными значениями AUC для всех образцов. Эти результаты показывают, что образцы объемом 20 мл или менее дают повышенные значения AUC, что указывает на то, что диагностическая ценность одного гена увеличивается в образцах мочи с маленьким объемом. SPDEF представляет собой эталонный ген, используемый для нормализации, и, следовательно, значения AUC не улучшаются при еще меньшем объеме образца.
[0165] Анализ экспрессии биомаркера на число копий, а не значения Ct, также показал, что образцы с меньшим объемом (20 мл) дают улучшенные значения AUC по сравнению со всеми образцами (Фигура 13).
Пример 6. Бальная оценка образцов пациента и подтверждение их статистической достоверности.
[0166] В ходе исследований, описанных в настоящем документе, использовали образцы, отвечавшие следующим критериям: (i) только первая биопсия; (ii) возраст пациент ≥50 лет; (iii) уровень PSA в «серой зоне», в диапазоне от 2 до 10 нг/мл; и (iv) объем полученной мочи от 20 до 49 мл. Образцы пациентов «в cерой зоне» PSA выбирали на том основании, что пациентам с высокими уровнями PSA почти всегда проводят биопсию, а пациентам с низкими уровнями PSA, как правило, только рекомендуют проведение биопсии по другим, не связанным с уровнями PSA, причинам.
[0167] Образцы пациента оценивали в баллах на соответствие с лабораторно-разработанной бальной оценкой (LDT), называемой в настоящем документе шкала EXO106, используя следующий алгоритм:
где количество копий вычисляли, используя программное обеспечение RGQ (Qiagen) для каждого гена, используя однопланшетную калибровочную кривую, и где величина порога отсечения составляла 10. В случае, когда баллы по шкале EXO106 были меньше 10, то баллы связывали с низким риском развития рака предстательной железы. В случае, когда баллы по шкале EXO106 больше или равны 10, то баллы связывали с высоким риском развития рака предстательной железы.
PCPTRC
[0168] Следует отметить, что баллы масштабировались умножением на 1,83 и смещались добавлением 16,92 для преобразования баллов EXO106 в более применимый и удобный диапазон значений. Это масштабирование и смещение, тем не менее, не влияло на бальную оценку. Преобразование шкалы EXO106 помещало большую часть данных в диапазон от 0 до 30, но без ограничения баллов на любом из концов шкалы (то есть, отдельные образцы могут иметь баллы вне этого диапазона). Алгоритм для расчета баллов по шкале EXO106 был сконфигурирован таким образом, что прогностическая ценность отрицательных результатов (NPV) по шкале EXO106 при величине порога отсечения 10 была больше NPV калькулятора риска рака предстательной железы (PCPTRC), где величина порога отсечения NPV было выбрано таким образом, что прогнозирует по меньшей мере 30% пациентов, как отрицательные. Алгоритм для шкалы EXO106 также был разработан таким образом, что доля пациентов, спрогнозированных как отрицательные (то есть, количество баллов по шкале EXO106 менее 10) составляла по меньшей мере 30%.
[0169] Приведенное в качестве примера распределение баллов по шкале EXO106 в когорте пациентов, называемой в настоящем документе когорта 8 (то есть, C8, n=453 образца, среднее значение PSA=5,3 нг/мл, и 80% образцов, где 2<PSA<10 нг/мл) показано на фигуре 16. AUC для шкалы EXO106 в режиме на пациентах с любым индексом Глисона в сравнении с AUC при стандартном лечении (SOC), показана на фигуре 17, где AUC для SOC=0,595; AUC для EXO106=0,738; и AUC для EXO106+SOC=0,764. Когорта пациентов, использованная на фигуре 17, имела следующие характеристики: все образцы были «в серой зоне» PSA, все были только из первой биопсии и все были из образцов мочи с маленьким объемом. EXO106 в режиме с квартилем, то есть, процентное содержание образцов, идентифицированных как положительные с помощью биопсии, по баллам по шкале EXO106 квартиль, показано на фигурах 18A и 18B. Опять же, эти образцы были получены от пациентов с любым индексом Глисона.
[0170] Эффективность балла EXO106 для рака предстательной железы с высоким баллом, то есть, с индексом Глисона больше 6, показана на Фигуре 19, а анализ эффективности балла EXO106 на основе индекса Глисона в подгруппах показан на Фигуре 20.
[0171] Таким образом, балл EXO106 может использоваться для прогнозирования заболевания предстательной железы с высоким баллом, например, заболевания с индексом Глисона больше 6. Обычно, совокупность образцов первой биопсии и повторной биопсии очень различны и их анализ должен проводиться раздельно.
[0172] Несмотря на то, что настоящее изобретение было описано со ссылкой на определенные варианты осуществления, возможно большое число модификаций, изменений и уточнений, не отходя от сущности и не выходя за рамки настоящего изобретения, как описано выше и как заявлено в прилагаемой формуле изобретения. Таким образом, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретными описанными вариантами осуществления, но, что оно приведено в полном объеме, которому оно соответствует по закону.
Таблица 2a.Анализ 2×2 когорты 7 (V≤100 мл, N=236)
Величина пороговых значений модели
8,5
BX ПОЛОЖ.
BX ОТРИЦ.
ПОЛОЖ.ТЕСТ
72
69
51,1%
PPV
ОТРИЦ.ТЕСТ
21
74
77,9%
NPV
77,4%
51,7%.
ЧУВСТ.
СПЕЦ.
Таблица 2b.Анализ индекса Глисона когорты 7 (V≤100 мл, N=236)
Глисон*
# Пропущено
% Пропущено
Определено
6
11
29%
27
3+4=7
6
21%
22
4+3=7
2
13%
13
8
0
0%
3
9
1
13%
7
10
1
100%
0
Таблица 2c.Анализ когорты 7 (V≤100 мл, N=236)
% ПОЛОЖ.ТЕСТ
59,7%
% ОТРИЦ.ТЕСТ
40,3%
Таблица 2d.Квартильный анализ когорты 7 (V≤100 мл, N=236)
ГруппаГлисона
% Положительной биопсии
Квартиль 1
Квартиль 2
Квартиль 3
Квартиль 4
0,40-6,70
6,70-8,20
8,20-9,40
9,40-13,60
Процент
N
Процент
N
Процент
N
Процент
N
6
39,5%
15
26,3%
10
21,1%
8
13,2%
5
3+4=7
35,7%
10
39,3%
11
7,1%
2
17,9%
5
4+3=7
60,0%
9
26,7%
4
6,7%
1
6,7%
1
8
0,0%
0
66,7%
2
33,3%
1
0,0%
0
9
62,5%
5
0,0%
0
25,0%
2
12,5%
1
10
0,0%
0
0,0%
0
0,0%
0
100,0%
1
Таблица 2e.Квартильный анализ когорты 7 (V≤100 мл, N=236)
Квартиль 1
Квартиль 2
Квартиль 3
Квартиль 4
0,40-6,70
6,70-8,20
8,20-9,40
9,40-13,60
%Bx Полож
N
%Bx Полож
N
%Bx Полож
N
%Bx Полож
N
60,9%
64
46,6%
58
26,9%
52
21,0%
62
Таблица 3a.Анализ 2×2 когорты 7 (V≤40 мл, N=189)
Величина пороговых значений модели
8,5
BX ПОЛОЖ.
BX ОТРИЦ.
ПОЛОЖ.ТЕСТ
61
52
54,0%
PPV
ОТРИЦ.ТЕСТ
17
59
77,6%
NPV
78,2%
53,2%
ЧУВСТ.
СПЕЦ.
Таблица 3b.Анализ индекса Глисона когорты 7(V≤40 мл, N=189)
Глисон
# Пропущено
% Пропущено
Определено
6
8
26%
23
3+4=7
6
24%
19
4+3=7
2
17%
10
8
0
0%
2
9
0
0%
7
10
1
100%
0
Таблица 3c.Анализ когорты 7 (V≤40 мл, N=189)
% ПОЛОЖ.ТЕСТ
59,8%
% ОТРИЦ.ТЕСТ
40,2%
Таблица 3d.Квартильный анализ когорты 7 (V≤40 мл, N=189)
ГруппаГлисона
% Положительной биопсии
Квартиль 1
Квартиль 2
Квартиль 3
Квартиль 4
0,70-6,70
6,70-8,20
8,20-9,70
9,70-13,60
Процент
N
Процент
N
Процент
N
Процент
N
6
38,7%
12
29,0%
9
19,4%
6
12,9%
4
3+4=7
32,0%
8
40,0%
10
8,0%
2
20,0%
5
4+3=7
58,3%
7
25,0%
3
8,3%
1
8,3%
1
8
0,0%
0
50,0%
1
50,0%
1
0,0%
0
9
71,4%
5
0,0%
0
28,6%
2
0,0%
0
10
0,0%
0
0,0%
0
0,0%
0
100,0%
1
Таблица 3e.Квартильный анализ когорты 7 (V≤40 мл, N=189)
Квартиль 1
Квартиль 2
Квартиль 3
Квартиль 4
0,70-6,70
6,70-8,20
8,20-9,70
9,70-13,60
%Bx Полож
N
%Bx Полож
N
%Bx Полож
N
%Bx Полож
N
65,3%
49
50,0%
46
24,0%
50
25,0%
44
Таблица 4a.Анализ 2×2 когорты 7 (V≤20 мл, N=122)
Величина пороговых значений модели
8,5
BX ПОЛОЖ.
BX ОТРИЦ.
ПОЛОЖ.ТЕСТ
42
26
61,8%
PPV
ОТРИЦ.ТЕСТ
12
42
77,8%
NPV
77,8%ЧУВСТ.
61,8%СПЕЦ.
Таблица 4b.Анализ индекса Глисона когорты 7 (V≤20 мл, N=122)
Глисон
# Пропущено
% Пропущено
Определено
6
7
28%
18
3+4=7
3
20%
12
4+3=7
2
25%
6
8
0
0%
1
9
0
0%
5
10
0
#DIV/0!
0
Таблица 4c.Анализ когорты 7 (V≤20 мл, N=122)
% ПОЛОЖ.ТЕСТ
55,7%
% ОТРИЦ.ТЕСТ
44,3%
Таблица 4d. Квартильный анализ когорты 7 (V≤20 мл, N=122)
ГруппаГлисона
% Положительной биопсии
Квартиль 1
Квартиль 2
Квартиль 3
Квартиль 4
2,20-6,70
6,70-8,20
8,20-9,40
9,40-13,60
Процент
N
Процент
N
Процент
N
Процент
N
6
40,0%
10
28,0%
7
20,0%
5
12,0%
3
3+4=7
26,7%
4
46,7%
7
13,3%
2
13,3%
2
4+3=7
62,5%
5
12,5%
1
12,5%
1
12,5%
1
8
0,0%
0
0,0%
0
100,0%
1
0,0%
0
9
80,0%
4
0,0%
0
20,0%
1
0,0%
0
10
<sup>r</sup>#DIV/0!
0
<sup>r</sup>#DIV/0!
0
<sup>r</sup>#DIV/0!
0
<sup>r</sup>#DIV/0!
0
Таблица 4e.Квартильный анализ когорты 7 (V≤20 мл, N=122)
Квартиль 1
Квартиль 2
Квартиль 3
Квартиль 4
2,20-6,70
6,70-8,20
8,20-9,40
9,40-13,60
%Bx Полож
N
%Bx Полож
N
%Bx Полож
N
%Bx Полож
N
79,3%
29
50,0%
30
35,7%
28
17,1%
35
Ссылки
Al-Nedawi, K., B. Meehan, J. Micallef, V. Lhotak, L. May, A. Guha, and J. Rak. 2008. Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFRvIII by microvesicles derived from tumour cells. Nat Cell Biol. 10:619-24.
Balzar, M., M.J. Winter, C.J. de Boer, and S.V. Litvinov. 1999. The biology of the 17-1A antigen (Ep-CAM). J Mol Med. 77:699-712.
Bossi, A., F. Bonini, A.P. Turner, and S.A. Piletsky. 2007. Molecularly imprinted polymers for the recognition of proteins: the state of the art. Biosens Bioelectron. 22:1131-7.
Bussemakers, M.J., A. van Bokhoven, G.W. Verhaegh, F.P. Smit, H.F. Karthaus, J.A. Schalken, F.M. Debruyne, N. Ru, and W.B. Isaacs. 1999. DD3: a new prostate-specific gene, highly overexpressed in prostate cancer. Cancer Res. 59:5975-9.
Chen, C., J. Skog, C.H. Hsu, R.T. Lessard, L. Balaj, T. Wurdinger, B.S. Carter, X.O. Breakefield, M. Toner, and D. Irimia. 2010. Microfluidic isolation and transcriptome analysis of serum microvesicles. Lab Chip. 10:505-11.
Cheruvanky, A., H. Zhou, T. Pisitkun, J.B. Kopp, M.A. Knepper, P.S. Yuen, and R.A. Star. 2007. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. Am J Physiol Renal Physiol. 292:F1657-61.
Cotton, R.G., N.R. Rodrigues, and R.D. Campbell. 1988. Reactivity of cytosine and thymine in single-base-pair mismatches with hydroxylamine and osmium tetroxide and its application to the study of mutations. Proc Natl Acad Sci U S A. 85:4397-401.
Cowell, J.K., and K.C. Lo. 2009. Application of oligonucleotides arrays for coincident comparative genomic hybridization, ploidy status and loss of heterozygosity studies in human cancers. Methods Mol Biol. 556:47-65.
Deras, I.L., S.M. Aubin, A. Blase, J.R. Day, S. Koo, A.W. Partin, W.J. Ellis, L.S. Marks, Y. Fradet, H. Rittenhouse, and J. Groskopf. 2008. PCA3: a molecular urine assay for predicting prostate biopsy outcome. J Urol. 179:1587-92.
Furusato, B., C.L. Gao, L. Ravindranath, Y. Chen, J. Cullen, D.G. McLeod, A. Dobi, S. Srivastava, G. Petrovics, and I.A. Sesterhenn. 2008. Mapping of TMPRSS2-ERG fusions in the context of multi-focal prostate cancer. Mod Pathol. 21:67-75.
Guatelli, J.C., K.M. Whitfield, D.Y. Kwoh, K.J. Barringer, D.D. Richman, and T.R. Gingeras. 1990. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 87:1874-8.
Hahn, P.J. 1993. Molecular biology of double-minute chromosomes. Bioessays. 15:477-84.
Hessels, D., F.P. Smit, G.W. Verhaegh, J.A. Witjes, E.B. Cornel, and J.A. Schalken. 2007. Detection of TMPRSS2-ERG fusion transcripts and prostate cancer antigen 3 in urinary sediments may improve diagnosis of prostate cancer. Clin Cancer Res. 13:5103-8.
Johnson, S., D. Evans, S. Laurenson, D. Paul, A.G. Davies, P.K. Ferrigno, and C. Walti. 2008. Surface-immobilized peptide aptamers as probe molecules for protein detection. Anal Chem. 80:978-83.
Kwoh, D.Y., G.R. Davis, K.M. Whitfield, H.L. Chappelle, L.J. DiMichele, and T.R. Gingeras. 1989. Transcription-based amplification system and detection of amplified human immunodeficiency virus type 1 with a bead-based sandwich hybridization format. Proc Natl Acad Sci U S A. 86:1173-7.
Laxman, B., D.S. Morris, J. Yu, J. Siddiqui, J. Cao, R. Mehra, R.J. Lonigro, A. Tsodikov, J.T. Wei, S.A. Tomlins, and A.M. Chinnaiyan. 2008. A first-generation multiplex biomarker analysis of urine for the early detection of prostate cancer. Cancer Res. 68:645-9.
Laxman, B., S.A. Tomlins, R. Mehra, D.S. Morris, L. Wang, B.E. Helgeson, R.B. Shah, M.A. Rubin, J.T. Wei, and A.M. Chinnaiyan. 2006. Noninvasive detection of TMPRSS2:ERG fusion transcripts in the urine of men with prostate cancer. Neoplasia. 8:885-8.
Li, J., L. Wang, H. Mamon, M.H. Kulke, R. Berbeco, and G.M. Makrigiorgos. 2008. Replacing PCR with COLD-PCR enriches variant DNA sequences and redefines the sensitivity of genetic testing. Nat Med. 14:579-84.
Lipson, D., T. Raz, A. Kieu, D.R. Jones, E. Giladi, E. Thayer, J.F. Thompson, S. Letovsky, P. Milos, and M. Causey. 2009. Quantification of the yeast transcriptome by single-molecule sequencing. Nat Biotechnol. 27:652-8.
Mattick, J.S. 2004. RNA regulation: a new genetics? Nat Rev Genet. 5:316-23.
Miele, E.A., D.R. Mills, and F.R. Kramer. 1983. Autocatalytic replication of a recombinant RNA. J Mol Biol. 171:281-95.
Myers, R.M., Z. Larin, and T. Maniatis. 1985. Detection of single base substitutions by ribonuclease cleavage at mismatches in RNA:DNA duplexes. Science. 230:1242-6.
Nguyen, P.N., P. Violette, S. Chan, S. Tanguay, W. Kassouf, A. Aprikian, and J.Z. Chen. 2011. A panel of TMPRSS2:ERG fusion transcript markers for urine-based prostate cancer detection with high specificity and sensitivity. Eur Urol. 59:407-14.
Nilsson, J., J. Skog, A. Nordstrand, V. Baranov, L. Mincheva-Nilsson, X.O. Breakefield, and A. Widmark. 2009. Prostate cancer-derived urine exosomes: a novel approach to biomarkers for prostate cancer. Br J Cancer. 100:1603-7.
Orita, M., H. Iwahana, H. Kanazawa, K. Hayashi, and T. Sekiya. 1989. Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformation polymorphisms. Proc Natl Acad Sci U S A. 86:2766-70.
Orozco, A.F., and D.E. Lewis. 2010. Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma. Cytometry A. 77:502-14.
Palanisamy, N., B. Ateeq, S. Kalyana-Sundaram, D. Pflueger, K. Ramnarayanan, S. Shankar, B. Han, Q. Cao, X. Cao, K. Suleman, C. Kumar-Sinha, S.M. Dhanasekaran, Y.B. Chen, R. Esgueva, S. Banerjee, C.J. LaFargue, J. Siddiqui, F. Demichelis, P. Moeller, T.A. Bismar, R. Kuefer, D.R. Fullen, T.M. Johnson, J.K. Greenson, T.J. Giordano, P. Tan, S.A. Tomlins, S. Varambally, M.A. Rubin, C.A. Maher, and A.M. Chinnaiyan. 2010. Rearrangements of the RAF kinase pathway in prostate cancer, gastric cancer and melanoma. Nat Med. 16:793-8.
Petrovics, G., A. Liu, S. Shaheduzzaman, B. Furusato, C. Sun, Y. Chen, M. Nau, L. Ravindranath, A. Dobi, V. Srikantan, I.A. Sesterhenn, D.G. McLeod, M. Vahey, J.W. Moul, and S. Srivastava. 2005. Frequent overexpression of ETS-related gene-1 (ERG1) in prostate cancer transcriptome. Oncogene. 24:3847-52.
Raposo, G., H.W. Nijman, W. Stoorvogel, R. Liejendekker, C.V. Harding, C.J. Melief, and H.J. Geuze. 1996. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. J Exp Med. 183:1161-72.
Rice, K.R., Y. Chen, A. Ali, E.J. Whitman, A. Blase, M. Ibrahim, S. Elsamanoudi, S. Brassell, B. Furusato, N. Stingle, I.A. Sesterhenn, G. Petrovics, S. Miick, H. Rittenhouse, J. Groskopf, D.G. McLeod, and S. Srivastava. 2010. Evaluation of the ETS-related gene mRNA in urine for the detection of prostate cancer. Clin Cancer Res. 16:1572-6.
Rostad, K., O.J. Hellwinkel, S.A. Haukaas, O.J. Halvorsen, A.M. Oyan, A. Haese, L. Budaus, H. Albrecht, L.A. Akslen, T. Schlomm, and K.H. Kalland. 2009. TMPRSS2:ERG fusion transcripts in urine from prostate cancer patients correlate with a less favorable prognosis. APMIS. 117:575-82.
Salami, S.S., F. Schmidt, B. Laxman, M.M. Regan, D.S. Rickman, D. Scherr, G. Bueti, J. Siddiqui, S.A. Tomlins, J.T. Wei, A.M. Chinnaiyan, M.A. Rubin, and M.G. Sanda. 2011. Combining urinary detection of TMPRSS2:ERG and PCA3 with serum PSA to predict diagnosis of prostate cancer. Urol Oncol.
Skog, J., T. Wurdinger, S. van Rijn, D.H. Meijer, L. Gainche, M. Sena-Esteves, W.T. Curry, Jr., B.S. Carter, A.M. Krichevsky, and X.O. Breakefield. 2008. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10:1470-6.
Steemers, F.J., W. Chang, G. Lee, D.L. Barker, R. Shen, and K.L. Gunderson. 2006. Whole-genome genotyping with the single-base extension assay. Nat Methods. 3:31-3.
Taylor, D.D., and C. Gercel-Taylor. 2008. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol Oncol. 110:13-21.
Ting, D.T., D. Lipson, S. Paul, B.W. Brannigan, S. Akhavanfard, E.J. Coffman, G. Contino, V. Deshpande, A.J. Iafrate, S. Letovsky, M.N. Rivera, N. Bardeesy, S. Maheswaran, and D.A. Haber. 2011. Aberrant overexpression of satellite repeats in pancreatic and other epithelial cancers. Science. 331:593-6.
Tomlins, S.A., S.M. Aubin, J. Siddiqui, R.J. Lonigro, L. Sefton-Miller, S. Miick, S. Williamsen, P. Hodge, J. Meinke, A. Blase, Y. Penabella, J.R. Day, R. Varambally, B. Han, D. Wood, L. Wang, M.G. Sanda, M.A. Rubin, D.R. Rhodes, B. Hollenbeck, K. Sakamoto, J.L. Silberstein, Y. Fradet, J.B. Amberson, S. Meyers, N. Palanisamy, H. Rittenhouse, J.T. Wei, J. Groskopf, and A.M. Chinnaiyan. 2011. Urine TMPRSS2:ERG Fusion Transcript Stratifies Prostate Cancer Risk in Men with Elevated Serum PSA. Sci Transl Med. 3:94ra72.
Tomlins, S.A., D.R. Rhodes, S. Perner, S.M. Dhanasekaran, R. Mehra, X.W. Sun, S. Varambally, X. Cao, J. Tchinda, R. Kuefer, C. Lee, J.E. Montie, R.B. Shah, K.J. Pienta, M.A. Rubin, and A.M. Chinnaiyan. 2005. Recurrent fusion of TMPRSS2 and ETS transcription factor genes in prostate cancer. Science. 310:644-8.
Velculescu, V.E., L. Zhang, B. Vogelstein, and K.W. Kinzler. 1995. Serial analysis of gene expression. Science. 270:484-7.
Went, P.T., A. Lugli, S. Meier, M. Bundi, M. Mirlacher, G. Sauter, and S. Dirnhofer. 2004. Frequent EpCam protein expression in human carcinomas. Hum Pathol. 35:122-8.
Wong, M.L., and J.F. Medrano. 2005. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39:75-85.
Zhang, M., D.E. Latham, M.A. Delaney, and A. Chakravarti. 2005. Survivin mediates resistance to antiandrogen therapy in prostate cancer. Oncogene. 24:2474-82.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Exosome Diagnostics, Inc.
<120>  КОГОРТА БИОМАРКЕРОВ МОЧИ, ПРОФИЛЬ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И СПОСОБЫ ИХ
ПРИМЕНЕНИЯ
<130>  EXOS-016/001WO 322142-2117
<140>  PCT/US2014/049946
<141>  2014-08-06
<150>  US 61/862630
<151>  2013-08-06
<160>  44
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  543
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химически синтезированная Q бета частица
<400>  1
aaacggttct tgtgacccat ccgttactcg ccaggcatat gctgacgtga ccttttcgtt    60
cacgcagtat agtaccgatg aggaacgagc ttttgttcgt acagagcttg ctgctctgct   120
cgctagtcct agcgtcctca gttagatcct tatcagattc ttggaccaac aagtagccgc   180
cttgcaaatc caggcagtgg ccagatccag ctttggcagt tcctcctgga gctcctgtcg   240
gacagctccc ggtcggatgt gctgctggag cccttccgcc gcggtgtcat ggagaaactc   300
cagctgggcc cagagattct gcagcgggaa aacctgtccg tgacgtggat tggtgctgca   360
cccctcatcc tgtctcggat tgtgggaggc tgggagtgcg agaagcattc ccaaccctgg   420
caggtgcttg tggcctctcg tggcagggca gtctgcggcg gtgttctggt gcacccccag   480
tgggtcctca cagctgccca ctgcatcagg aacaaaagcg tgatcttgct gggtcggcac   540
agc                                                                 543
<210>  2
<211>  300
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  2
cagtcgaaag ctgctcaacc atctccttcc acagtgccca aaactgaaga ccagcgtcct    60
cagttagatc cttatcagat tcttggacca acaagtagcc gccttgcaaa tccaggcagt   120
ggccagatcc agctttggca gttcctcctg gagctcctgt cggacagctc caactccagc   180
tgcatcacct gggaaggcac caacggggag ttcaagatga cggatcccga cgaggtggcc   240
cggcgctggg gagagcggaa gagcaaaccc aacatgaact acgataagct cagccgcgcc   300
<210>  3
<211>  386
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  3
gggagacgaa gggccccaga gcagccgagc ggccgccagg gaggaacgca gaacgcccag    60
ccccaggaca cagggcggac accacgacgg caccgagacc aggcagcaaa gaaagacaca   120
gacaccaagg cagggggaga aaaagaaagg cgcgacacca cgaggccaca cacgcgaaag   180
gagaaaaaca cacagaaaca gcaagagaca aaaagcaaga ggacaggcac accagcccca   240
aaaccacaca cacaggaagc acaaaaggaa gcacagagac ccgggagaaa gcccggccac   300
cgcggccgca agcggaccga accgggaaag accgccacaa ccacacaaca acgagccgga   360
agcaaaagga aagccggggg ccaaga                                        386
<210>  4
<211>  3352
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  4
ggggcgtggc gccggggatt gggagggctt cttgcaggct gctgggctgg ggctaagggc    60
tgctcagttt ccttcagcgg ggcactggga agcgccatgg cactgcaggg catctcggtc   120
gtggagctgt ccggcctggc cccgggcccg ttctgtgcta tggtcctggc tgacttcggg   180
gcgcgtgtgg tacgcgtgga ccggcccggc tcccgctacg acgtgagccg cttgggccgg   240
ggcaagcgct cgctagtgct ggacctgaag cagccgcggg gagccgccgt gctgcggcgt   300
ctgtgcaagc ggtcggatgt gctgctggag cccttccgcc gcggtgtcat ggagaaactc   360
cagctgggcc cagagattct gcagcgggaa aatccaaggc ttatttatgc caggctgagt   420
ggatttggcc agtcaggaag cttctgccgg ttagctggcc acgatatcaa ctatttggct  480
ttgtcaggtg ttctctcaaa aattggcaga agtggtgaga atccgtatgc cccgctgaat   540
ctcctggctg actttgctgg tggtggcctt atgtgtgcac tgggcattat aatggctctt   600
tttgaccgca cacgcactgg caagggtcag gtcattgatg caaatatggt ggaaggaaca   660
gcatatttaa gttcttttct gtggaaaact cagaaattga gtctgtggga agcacctcga   720
ggacagaaca tgttggatgg tggagcacct ttctatacga cttacaggac agcagatggg   780
gaattcatgg ctgttggagc aatagaaccc cagttctacg agctgctgat caaaggactt   840
ggactaaagt ctgatgaact tcccaatcag atgagcatgg atgattggcc agaaatgaag   900
aagaagtttg cagatgtatt tgcagagaag acgaaggcag agtggtgtca aatctttgac   960
ggcacagatg cctgtgtgac tccggttctg acttttgagg aggttgttca tcatgatcac   1020
aacaaggaac ggggctcgtt tatcaccagt gaggagcagg acgtgagccc ccgccctgca   1080
cctctgctgt taaacacccc agccatccct tctttcaaaa gggatccttt cataggagaa   1140
cacactgagg agatacttga agaatttgga ttcagccgcg aagagattta tcagcttaac   1200
tcagataaaa tcattgaaag taataaggta aaagctagtc tctaacttcc aggcccacgg   1260
ctcaagtgaa tttgaatact gcatttacag tgtagagtaa cacataacat tgtatgcatg   1320
gaaacatgga ggaacagtat tacagtgtcc taccactcta atcaagaaaa gaattacaga   1380
ctctgattct acagtgatga ttgaattcta aaaatggtta tcattagggc ttttgattta   1440
taaaactttg ggtacttata ctaaattatg gtagttattc tgccttccag tttgcttgat   1500
atatttgttg atattaagat tcttgactta tattttgaat gggttctagt gaaaaaggaa   1560
tgatatattc ttgaagacat cgatatacat ttatttacac tcttgattct acaatgtaga   1620
aaatgaggaa atgccacaaa ttgtatggtg ataaaagtca cgtgaaacag agtgattggt   1680
tgcatccagg ccttttgtct tggtgttcat gatctccctc taagcacatt ccaaacttta   1740
gcaacagtta tcacactttg taatttgcaa agaaaagttt cacctgtatt gaatcagaat   1800
gccttcaact gaaaaaaaca tatccaaaat aatgaggaaa tgtgttggct cactacgtag   1860
agtccagagg gacagtcagt tttagggttg cctgtatcca gtaactcggg gcctgtttcc   1920
ccgtgggtct ctgggctgtc agctttcctt tctccatgtg tttgatttct cctcaggctg   1980
gtagcaagtt ctggatctta tacccaacac acagcaacat ccagaaataa agatctcagg   2040
accccccagc aagtcgtttt gtgtctcctt ggactgagtt aagttacaag cctttcttat   2100
acctgtcttt gacaaagaag acgggattgt ctttacataa aaccagcctg ctcctggagc   2160
ttccctggac tcaacttcct aaaggcatgt gaggaagggg tagattccac aatctaatcc   2220
gggtgccatc agagtagagg gagtagagaa tggatgttgg gtaggccatc aataaggtcc   2280
attctgcgca gtatctcaac tgccgttcaa caatcgcaag aggaaggtgg agcaggtttc   2340
ttcatcttac agttgagaaa acagagactc agaagggctt cttagttcat gtttccctta   2400
gcgcctcagt gattttttca tggtggctta ggccaaaaga aatatctaac cattcaattt   2460
ataaataatt aggtccccaa cgaattaaat attatgtcct accaacttat tagctgcttg   2520
aaaaatataa tacacataaa taaaaaaata tatttttcat ttctatttca ttgttaatca   2580
caactactta ctaaggagat gtatgcacct attggacact gtgcaacttc tcacctggaa   2640
tgagattgga cactgctgcc ctcattttct gctccatgtt ggtgtccata tagtacttga   2700
ttttttatca gatggcctgg aaaacccagt ctcacaaaaa tatgaaatta tcagaaggat   2760
tatagtgcaa tcttatgttg aaagaatgaa ctacctcact agtagttcac gtgatgtctg   2820
acagatgttg agtttcattg tgtttgtgtg ttcaaatttt taaatattct gagatactct   2880
tgtgaggtca ctctaatgcc ctgggtgcct tggcacagtt ttagaaatac cagttgaaaa   2940
tatttgctca ggaatatgca actaggaagg ggcagaatca gaatttaagc tttcatattc   3000
tagccttcag tcttgttctt caaccatttt taggaacttt cccataaggt tatgttttcc   3060
agcccaggca tggaggatca cttgaggcca agagttcgag accagcctgg ggaacttggc   3120
tggacctccg tttctacgaa ataaaaataa aaaaattatc caggtatggt ggtgtgtgcc   3180
tgtagtccta tctactcaag ggtggggcag gaggatcact tgagcccagg aatttgaggc   3240
cacagtgaat taggattgca ccactgcact ctagcccagg caacagaaca agaacctgtc   3300
tctaaataaa taaataaaaa taataataat aaaaaagatg ttttccctac aa           3352
<210>  5
<211>  2655
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  5
cccagaaggc cgcggggggt ggaccgccta agagggcgtg cgctcccgac atgccccgcg    60
gcgcgccatt aaccgccaga tttgaatcgc gggacccgtt ggcagaggtg gcggcggcgg   120
catgggtgcc ccgacgttgc cccctgcctg gcagcccttt ctcaaggacc accgcatctc   180
tacattcaag aactggccct tcttggaggg ctgcgcctgc accccggagc ggatggccga   240
ggctggcttc atccactgcc ccactgagaa cgagccagac ttggcccagt gtttcttctg   300
cttcaaggag ctggaaggct gggagccaga tgacgacccc atagaggaac ataaaaagca   360
ttcgtccggt tgcgctttcc tttctgtcaa gaagcagttt gaagaattaa cccttggtga   420
atttttgaaa ctggacagag aaagagccaa gaacaaaatt gcaaaggaaa ccaacaataa   480
gaagaaagaa tttgaggaaa ctgcggagaa agtgcgccgt gccatcgagc agctggctgc   540
catggattga ggcctctggc cggagctgcc tggtcccaga gtggctgcac cacttccagg   600
gtttattccc tggtgccacc agccttcctg tgggcccctt agcaatgtct taggaaagga   660
gatcaacatt ttcaaattag atgtttcaac tgtgctcttg ttttgtcttg aaagtggcac   720
cagaggtgct tctgcctgtg cagcgggtgc tgctggtaac agtggctgct tctctctctc   780
tctctctttt ttgggggctc atttttgctg ttttgattcc cgggcttacc aggtgagaag   840
tgagggagga agaaggcagt gtcccttttg ctagagctga cagctttgtt cgcgtgggca   900
gagccttcca cagtgaatgt gtctggacct catgttgttg aggctgtcac agtcctgagt   960
gtggacttgg caggtgcctg ttgaatctga gctgcaggtt ccttatctgt cacacctgtg   1020
cctcctcaga ggacagtttt tttgttgttg tgtttttttg tttttttttt tttggtagat   1080
gcatgacttg tgtgtgatga gagaatggag acagagtccc tggctcctct actgtttaac   1140
aacatggctt tcttattttg tttgaattgt taattcacag aatagcacaa actacaatta   1200
aaactaagca caaagccatt ctaagtcatt ggggaaacgg ggtgaacttc aggtggatga   1260
ggagacagaa tagagtgata ggaagcgtct ggcagatact ccttttgcca ctgctgtgtg   1320
attagacagg cccagtgagc cgcggggcac atgctggccg ctcctccctc agaaaaaggc   1380
agtggcctaa atccttttta aatgacttgg ctcgatgctg tgggggactg gctgggctgc   1440
tgcaggccgt gtgtctgtca gcccaacctt cacatctgtc acgttctcca cacgggggag   1500
agacgcagtc cgcccaggtc cccgctttct ttggaggcag cagctcccgc agggctgaag   1560
tctggcgtaa gatgatggat ttgattcgcc ctcctccctg tcatagagct gcagggtgga   1620
ttgttacagc ttcgctggaa acctctggag gtcatctcgg ctgttcctga gaaataaaaa   1680
gcctgtcatt tcaaacactg ctgtggaccc tactgggttt ttaaaatatt gtcagttttt   1740
catcgtcgtc cctagcctgc caacagccat ctgcccagac agccgcagtg aggatgagcg   1800
tcctggcaga gacgcagttg tctctgggcg cttgccagag ccacgaaccc cagacctgtt   1860
tgtatcatcc gggctccttc cgggcagaaa caactgaaaa tgcacttcag acccacttat   1920
ttctgccaca tctgagtcgg cctgagatag acttttccct ctaaactggg agaatatcac   1980
agtggttttt gttagcagaa aatgcactcc agcctctgta ctcatctaag ctgcttattt   2040
ttgatatttg tgtcagtctg taaatggata cttcacttta ataactgttg cttagtaatt   2100
ggctttgtag agaagctgga aaaaaatggt tttgtcttca actcctttgc atgccaggcg   2160
gtgatgtgga tctcggcttc tgtgagcctg tgctgtgggc agggctgagc tggagccgcc   2220
cctctcagcc cgcctgccac ggcctttcct taaaggccat ccttaaaacc agaccctcat   2280
ggctaccagc acctgaaagc ttcctcgaca tctgttaata aagccgtagg cccttgtcta   2340
agtgcaaccg cctagacttt ctttcagata catgtccaca tgtccatttt tcaggttctc   2400
taagttggag tggagtctgg gaagggttgt gaatgaggct tctgggctat gggtgaggtt   2460
ccaatggcag gttagagccc ctcgggccaa ctgccatcct ggaaagtaga gacagcagtg   2520
cccgctgccc agaagagacc agcaagccaa actggagccc ccattgcagg ctgtcgccat   2580
gtggaaagag taactcacaa ttgccaataa agtctcatgt ggttttatct aaaaaaaaaa   2640
aaaaaaaaaa aaaaa                                                    2655
<210>  6
<211>  1681
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  6
ttttgtctgt cctggattgg agccgtccct ataaccatct agttccgagt acaaactgga    60
gacagaaata aatattaaag aaatcataga ccgaccaggt aaaggcaaag ggatgaattc   120
ctacttcact aacccttcct tatcctgcca cctcgccggg ggccaggacg tcctccccaa   180
cgtcgccctc aattccaccg cctatgatcc agtgaggcat ttctcgacct atggagcggc   240
cgttgcccag aaccggatct actcgactcc cttttattcg ccacaggaga atgtcgtgtt   300
cagttccagc cgggggccgt atgactatgg atctaattcc ttttaccagg agaaagacat   360
gctctcaaac tgcagacaaa acaccttagg acataacaca cagacctcaa tcgctcagga   420
ttttagttct gagcagggca ggactgcgcc ccaggaccag aaagccagta tccagattta   480
cccctggatg cagcgaatga attcgcacag tggggtcggc tacggagcgg accggaggcg   540
cggccgccag atctactcgc ggtaccagac cctggaactg gagaaggaat ttcacttcaa   600
tcgctaccta acgcggcgcc ggcgcatcga gatcgccaac gcgctttgcc tgaccgagcg   660
acagatcaaa atctggttcc agaaccgccg gatgaagtgg aaaaaagaat ctaatctcac   720
atccactctc tcggggggcg gcggaggggc caccgccgac agcctgggcg gaaaagagga   780
aaagcgggaa gagacagaag aggagaagca gaaagagtga ccaggactgt ccctgccacc   840
cctctctccc tttctccctc gctccccacc aactctcccc taatcacaca ctctgtattt   900
atcactggca caattgatgt gttttgattc cctaaaacaa aattagggag tcaaacgtgg   960
acctgaaagt cagctctgga ccccctccct caccgcacaa ctctctttca ccacgcgcct   1020
cctcctcctc gctcccttgc tagctcgttc tcggcttgtc tacaggccct tttccccgtc   1080
caggccttgg gggctcggac cctgaactca gactctacag attgccctcc aagtgaggac   1140
ttggctcccc cactccttcg acgcccccac ccccgccccc cgtgcagaga gccggctcct   1200
gggcctgctg gggcctctgc tccagggcct cagggcccgg cctggcagcc ggggagggcc   1260
ggaggcccaa ggagggcgcg ccttggcccc acaccaaccc ccagggcctc cccgcagtcc   1320
ctgcctagcc cctctgcccc agcaaatgcc cagcccaggc aaattgtatt taaagaatcc   1380
tgggggtcat tatggcattt tacaaactgt gaccgtttct gtgtgaagat ttttagctgt   1440
atttgtggtc tctgtattta tatttatgtt tagcaccgtc agtgttccta tccaatttca   1500
aaaaaggaaa aaaaagaggg aaaattacaa aaagagagaa aaaaagtgaa tgacgtttgt   1560
ttagccagta ggagaaaata aataaataaa taaatccctt cgtgttaccc tcctgtataa   1620
atccaacctc tgggtccgtt ctcgaatatt taataaaact gatattattt ttaaaacttt   1680
a                                                                   1681
<210>  7
<211>  3012
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  7
aaaaatgcat aaagagccaa gtgcttatat tctggccaag ttatgaggct ctgagaacaa    60
gagcttgagg ggaagactgt taaccccatc cacgccacca gaattagctc tttccctttt   120
ggtttgcaag cactgcctgt aaagccctcg catgagaggc cagcctgcta gggaaatcca   180
ggaatctgca acaaaaacga tgacagtctg aaatactctc tggtgccaac ctccaaattc   240
tcgtctgtca cttcagaccc ccactagttg acagagcagc agaatttcaa ctccagtaga   300
cttgaatatg cctctgggca aagaagcaga gctaacgagg aaagggattt aaagagtttt   360
tcttgggtgt ttgtcaaact tttattccct gtctgtgtgc agaggggatt caacttcaat   420
ttttctgcag tggctctggg tccagcccct tacttaaagg ccataagatg ttttattgaa   480
agaaactttc aatatcaagt aatccaacca accttctaag ataagccttt tccttcaaca   540
caaagaagtg cattttgcca aatctggaaa gcatgaagac tgggcttttt ttcctatgtc   600
tcttgggaac tgcagctgca atcccgacaa atgcaagatt attatctgat cattccaaac   660
caactgctga aacggtagca cctgacaaca ctgcaatccc cagtttaagg gctgaagctg   720
aagaaaatga aaaagaaaca gcagtatcca cagaagacga ttcccaccat aaggctgaaa   780
aatcatcagt actaaagtca aaagaggaaa gccatgaaca gtcagcagaa cagggcaaga   840
gttctagcca agagctggga ttgaaggatc aagaggacag tgatggtcac ttaagtgtga   900
atttggagta tgcaccaact gaaggtacat tggacataaa agaagatatg agtgagcctc   960
aggagaaaaa actctcagag aacactgatt ttttggctcc tggtgttagt tccttcacag   1020
attctaacca acaagaaagt atcacaaaga gagaggaaaa ccaagaacaa cctagaaatt   1080
attcacatca tcagttgaac aggagcagta aacatagcca aggcctaagg gatcaaggaa   1140
accaagagca ggatccaaat atttccaatg gagaagagga agaagaaaaa gagccaggtg   1200
aagttggtac ccacaatgat aaccaagaaa gaaagacaga attgcccagg gagcatgcta   1260
acagcaagca ggaggaagac aatacccaat ctgatgatat tttggaagag tctgatcaac   1320
caactcaagt aagcaagatg caggaggatg aatttgatca gggtaaccaa gaacaagaag   1380
ataactccaa tgcagaaatg gaagaggaaa atgcatcgaa cgtcaataag cacattcaag   1440
aaactgaatg gcagagtcaa gagggtaaaa ctggcctaga agctatcagc aaccacaaag   1500
agacagaaga aaagactgtt tctgaggctc tgctcatgga acctactgat gatggtaata   1560
ccacgcccag aaatcatgga gttgatgatg atggcgatga tgatggcgat gatggcggca   1620
ctgatggccc caggcacagt gcaagtgatg actacttcat cccaagccag gcctttctgg   1680
aggccgagag agctcaatcc attgcctatc acctcaaaat tgaggagcaa agagaaaaag   1740
tacatgaaaa tgaaaatata ggtaccactg agcctggaga gcaccaagag gccaagaaag   1800
cagagaactc atcaaatgag gaggaaacgt caagtgaagg caacatgagg gtgcatgctg   1860
tggattcttg catgagcttc cagtgtaaaa gaggccacat ctgtaaggca gaccaacagg   1920
gaaaacctca ctgtgtctgc caggatccag tgacttgtcc tccaacaaaa ccccttgatc   1980
aagtttgtgg cactgacaat cagacctatg ctagttcctg tcatctattc gctactaaat   2040
gcagactgga ggggaccaaa aaggggcatc aactccagct ggattatttt ggagcctgca   2100
aatctattcc tacttgtacg gactttgaag tgattcagtt tcctctacgg atgagagact   2160
ggctcaagaa tatcctcatg cagctttatg aagccaactc tgaacacgct ggttatctaa   2220
atgagaagca gagaaataaa gtcaagaaaa tttacctgga tgaaaagagg cttttggctg   2280
gggaccatcc cattgatctt ctcttaaggg actttaagaa aaactaccac atgtatgtgt   2340
atcctgtgca ctggcagttt agtgaacttg accaacaccc tatggataga gtcttgacac   2400
attctgaact tgctcctctg cgagcatctc tggtgcccat ggaacactgc ataacccgtt   2460
tctttgagga gtgtgacccc aacaaggata agcacatcac cctgaaggag tggggccact   2520
gctttggaat taaagaagag gacatagatg aaaatctctt gttttgaacg aagattttaa   2580
agaactcaac tttccagcat cctcctctgt tctaaccact tcagaaatat atgcagctgt   2640
gatacttgta gatttatatt tagcaaaatg ttagcatgta tgacaagaca atgagagtaa   2700
ttgcttgaca acaacctatg caccaggtat ttaacattaa ctttggaaac aaaaatgtac   2760
aattaagtaa agtcaacata tgcaaaatac tgtacattgt gaacagaagt ttaattcata   2820
gtaatttcac tctctgcatt gacttatgag ataattaatg attaaactat taatgataaa   2880
aataatgcat ttgtattgtt cataatatca tgtgcacttc aagaaaatgg aatgctactc   2940
ttttgtggtt tacgtgtatt attttcaata tcttaatacc ctaataaaga gtccataaaa   3000
atccaaatgc tt                                                       3012
<210>  8
<211>  300
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  8
ttgtcttcct caccctgtcc gtgacgtgga ttggtgctgc acccctcatc ctgtctcgga    60
ttgtgggagg ctgggagtgc gagaagcatt cccaaccctg gcaggtgctt gtggcctctc   120
gtggcagggc agtctgcggc ggtgttctgg tgcaccccca gtgggtcctc acagctgccc   180
actgcatcag gaacaaaagc gtgatcttgc tgggtcggca cagcctgttt catcctgaag   240
acacaggcca ggtatttcag gtcagccaca gcttcccaca cccgctctac gatatgagcc   300
<210>  9
<211>  586
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  9
gggagacgaa gggccccaga gcagccgagc ggccgccagg gaggaacgca gaacgcccaa    60
agaggacagg cacaccagcc ccaaaaccac acacacagga agcacaaaag gaagcacaga   120
gacccgggag aaagcccggc ccggggggga ggcgcacgcc caccggacac ggaagcagcg   180
gccggagaaa gagcggacca ccggggcgac acacaaacgg aaagcagaag acgggcccag   240
ccgggaacgc agcgcaaccc gacaaagcaa gaaacgacac caaaccaacg cgaaacggag   300
caccaggccc agaaacggac gaggacagca ccaagggcaa gacgaagacc aagaacgaaa   360
aggaagccac aaaccgaaac acagggcagg gacaggcaaa aggaccaccg caccacacaa   420
gaacggcccc ggagggcgcg ccgcaccccg gagcggaggc cgaggcggcc accacgcccc   480
acgagaacga gccagacgac cgcggccgca agcggaccga accgggaaag accgccacaa   540
ccacacaaca acgagccgga agcaaaagga aagccggggg ccaaga                  586
<210>  10
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химически синтезированная последовательность праймера
<400>  10
ccacctggac atctggaag                                                  19
<210>  11
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химически синтезированная последовательность праймера
<400>  11
aatcgcccca ggtgaagt                                                   18
<210>  12
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химически синтезированная последовательность зонда
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(1)
<223>  конъюгирована с 5' 6-FAM
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (9)..(10)
<223>  внутренний ZEN гаситель
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (19)..(19)
<223>  конъюгирована с 3' Iowa Black(r) FQ
<400>  12
cggcctggat gaaagagcg                                                  19
<210>  13
<211>  25
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химически синтезированная последовательность праймера
<400>  13
gcgtcctcag ttagatcctt atcag                                           25
<210>  14
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химически синтезированная последовательность праймера
<400>  14
ctggccactg cctggatt                                                   18
<210>  15
<211>  26
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химически синтезированная последовательность зонда
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(1)
<223>  конъюгирована с 5' 6-FAM
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (9)..(10)
<223>  внутренний ZEN гаситель
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (26)..(26)
<223>  конъюгирована с 3' Iowa Black(r) FQ
<400>  15
cttggaccaa caagtagccg ccttgc                                          26
<210>  16
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химически синтезированная последовательность праймера
<400>  16
gcacatttcc agccccttta                                                 20
<210>  17
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химически синтезированная последовательность праймера
<400>  17
ggcatttctc ccagggatct                                                 20
<210>  18
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химически синтезированная последовательность зонда
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(1)
<223>  конъюгирована с 5' 6-FAM
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (9)..(10)
<223>  внутренний ZEN гаситель
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (24)..(24)
<223>  конъюгирована с 3' Iowa Black(r) FQ
<400>  18
cacacaggaa gcacaaaagg aagc                                            24
<210>  19
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химически синтезированная последовательность праймера
<400>  19
aacggttctt gtgacccatc                                                 20
<210>  20
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химически синтезированная последовательность праймера
<400>  20
cgaacaaaag ctcgttcctc                                                 20
<210>  21
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химически синтезированная последовательность зонда
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(1)
<223>  конъюгирована с 5' 6-FAM
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (9)..(10)
<223>  внутренний ZEN гаситель
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (21)..(21)
<223>  конъюгирована с 3' Iowa Black(r) FQ
<400>  21
cgccaggcat atgctgacgt g                                               21
<210>  22
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химически синтезированная последовательность праймера
<400>  22
cctgtccgtg acgtggat                                                   18
<210>  23
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химически синтезированная последовательность праймера
<400>  23
cagggttggg aatgcttct                                                  19
<210>  24
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химически синтезированная последовательность зонда
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(1)
<223>  конъюгирована с 5' 6-FAM
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (9)..(10)
<223>  внутренний ZEN гаситель
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (20)..(20)
<223>  конъюгирована с 3' Iowa Black(r) FQ
<400>  24
cggattgtgg gaggctggga                                                 20
<210>  25
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химически синтезированная последовательность праймера
<400>  25
gcctggagcg cggcag                                                     16
<210>  26
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химически синтезированная последовательность праймера
<400>  26
gcacactcaa acaacgactg                                                 20
<210>  27
<211>  25
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химически синтезированная последовательность зонда
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(1)
<223>  конъюгирована с 5' 6-FAM
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (9)..(10)
<223>  внутренний ZEN гаситель
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (25)..(25)
<223>  конъюгирована с 3' Iowa Black(r) FQ
<400>  27
agccttatca gttgtgagtg aggac                                           25
<210>  28
<211>  15
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химически синтезированная последовательность праймера
<400>  28
gccgcggtgt catgg                                                      15
<210>  29
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химически синтезированная последовательность праймера
<400>  29
tttcccgctg cagaatctc                                                  19
<210>  30
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химически синтезированная последовательность зонда
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(1)
<223>  конъюгирована с 5' 6-FAM
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (9)..(10)
<223>  внутренний ZEN гаситель
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (9)..(10)
<223>  внутренний ZEN гаситель
<400>  30
agaaactcca gctgggccca                                                 20
<210>  31
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химически синтезированная последовательность праймера
<400>  31
ggaccaccgc atctctacat                                                 20
<210>  32
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химически синтезированная последовательность праймера
<400>  32
gtctggctcg ttctcagtgg                                                 20
<210>  33
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химически синтезированная последовательность зонда
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(1)
<223>  конъюгирована с 5' 6-FAM
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (9)..(10)
<223>  внутренний ZEN гаситель
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (20)..(20)
<223>  конъюгирована с 3' Iowa Black(r) FQ
<400>  33
cttcttggag ggctgcgcct                                                 20
<210>  34
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химически синтезированная последовательность праймера
<400>  34
tctggaaagc atgaagactg g                                               21
<210>  35
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химически синтезированная последовательность праймера
<400>  35
tgctaccgtt tcagcagttg                                                 20
<210>  36
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химически синтезированная последовательность зонда
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(1)
<223>  конъюгирована с 5' 6-FAM
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (9)..(10)
<223>  внутренний ZEN гаситель
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (20)..(20)
<223>  конъюгирована с 3' Iowa Black(r) FQ
<400>  36
ctgcagctgc aatcccgaca                                                 20
<210>  37
<211>  3191
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  37
ggggcgtggc gccggggatt gggagggctt cttgcaggct gctgggctgg ggctaagggc    60
tgctcagttt ccttcagcgg ggcactggga agcgccatgg cactgcaggg catctcggtc   120
gtggagctgt ccggcctggc cccgggcccg ttctgtgcta tggtcctggc tgacttcggg   180
gcgcgtgtgg tacgcgtgga ccggcccggc tcccgctacg acgtgagccg cttgggccgg   240
ggcaagcgct cgctagtgct ggacctgaag cagccgcggg gagccgccgt gctgcggcgt   300
ctgtgcaagc ggtcggatgt gctgctggag cccttccgcc gcggtgtcat ggagaaactc   360
cagctgggcc cagagattct gcagcgggaa aatccaaggc ttatttatgc caggctgagt   420
ggatttggcc agtcaggaag cttctgccgg ttagctggcc acgatatcaa ctatttggct   480
ttgtcaggtg gaaggaacag catatttaag ttcttttctg tggaaaactc agaaattgag   540
tctgtgggaa gcacctcgag gacagaacat gttggatggt ggagcacctt tctatacgac   600
ttacaggaca gcagatgggg aattcatggc tgttggagca atagaacccc agttctacga   660
gctgctgatc aaaggacttg gactaaagtc tgatgaactt cccaatcaga tgagcatgga   720
tgattggcca gaaatgaaga agaagtttgc agatgtattt gcagagaaga cgaaggcaga   780
gtggtgtcaa atctttgacg gcacagatgc ctgtgtgact ccggttctga cttttgagga   840
ggttgttcat catgatcaca acaaggaacg gggctcgttt atcaccagtg aggagcagga   900
cgtgagcccc cgccctgcac ctctgctgtt aaacacccca gccatccctt ctttcaaaag   960
ggatcctttc ataggagaac acactgagga gatacttgaa gaatttggat tcagccgcga   1020
agagatttat cagcttaact cagataaaat cattgaaagt aataaggtaa aagctagtct   1080
ctaacttcca ggcccacggc tcaagtgaat ttgaatactg catttacagt gtagagtaac   1140
acataacatt gtatgcatgg aaacatggag gaacagtatt acagtgtcct accactctaa   1200
tcaagaaaag aattacagac tctgattcta cagtgatgat tgaattctaa aaatggttat   1260
cattagggct tttgatttat aaaactttgg gtacttatac taaattatgg tagttattct   1320
gccttccagt ttgcttgata tatttgttga tattaagatt cttgacttat attttgaatg   1380
ggttctagtg aaaaaggaat gatatattct tgaagacatc gatatacatt tatttacact   1440
cttgattcta caatgtagaa aatgaggaaa tgccacaaat tgtatggtga taaaagtcac   1500
gtgaaacaga gtgattggtt gcatccaggc cttttgtctt ggtgttcatg atctccctct   1560
aagcacattc caaactttag caacagttat cacactttgt aatttgcaaa gaaaagtttc   1620
acctgtattg aatcagaatg ccttcaactg aaaaaaacat atccaaaata atgaggaaat   1680
gtgttggctc actacgtaga gtccagaggg acagtcagtt ttagggttgc ctgtatccag   1740
taactcgggg cctgtttccc cgtgggtctc tgggctgtca gctttccttt ctccatgtgt   1800
ttgatttctc ctcaggctgg tagcaagttc tggatcttat acccaacaca cagcaacatc   1860
cagaaataaa gatctcagga ccccccagca agtcgttttg tgtctccttg gactgagtta   1920
agttacaagc ctttcttata cctgtctttg acaaagaaga cgggattgtc tttacataaa   1980
accagcctgc tcctggagct tccctggact caacttccta aaggcatgtg aggaaggggt   2040
agattccaca atctaatccg ggtgccatca gagtagaggg agtagagaat ggatgttggg   2100
taggccatca ataaggtcca ttctgcgcag tatctcaact gccgttcaac aatcgcaaga   2160
ggaaggtgga gcaggtttct tcatcttaca gttgagaaaa cagagactca gaagggcttc   2220
ttagttcatg tttcccttag cgcctcagtg attttttcat ggtggcttag gccaaaagaa   2280
atatctaacc attcaattta taaataatta ggtccccaac gaattaaata ttatgtccta   2340
ccaacttatt agctgcttga aaaatataat acacataaat aaaaaaatat atttttcatt   2400
tctatttcat tgttaatcac aactacttac taaggagatg tatgcaccta ttggacactg   2460
tgcaacttct cacctggaat gagattggac actgctgccc tcattttctg ctccatgttg   2520
gtgtccatat agtacttgat tttttatcag atggcctgga aaacccagtc tcacaaaaat   2580
atgaaattat cagaaggatt atagtgcaat cttatgttga aagaatgaac tacctcacta   2640
gtagttcacg tgatgtctga cagatgttga gtttcattgt gtttgtgtgt tcaaattttt   2700
aaatattctg agatactctt gtgaggtcac tctaatgccc tgggtgcctt ggcacagttt   2760
tagaaatacc agttgaaaat atttgctcag gaatatgcaa ctaggaaggg gcagaatcag   2820
aatttaagct ttcatattct agccttcagt cttgttcttc aaccattttt aggaactttc   2880
ccataaggtt atgttttcca gcccaggcat ggaggatcac ttgaggccaa gagttcgaga   2940
ccagcctggg gaacttggct ggacctccgt ttctacgaaa taaaaataaa aaaattatcc   3000
aggtatggtg gtgtgtgcct gtagtcctat ctactcaagg gtggggcagg aggatcactt   3060
gagcccagga atttgaggcc acagtgaatt aggattgcac cactgcactc tagcccaggc   3120
aacagaacaa gaacctgtct ctaaataaat aaataaaaat aataataata aaaaagatgt   3180
tttccctaca a                                                        3191
<210>  38
<211>  2603
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  38
ggggcgtggc gccggggatt gggagggctt cttgcaggct gctgggctgg ggctaagggc    60
tgctcagttt ccttcagcgg ggcactggga agcgccatgg cactgcaggg catctcggtc   120
gtggagctgt ccggcctggc cccgggcccg ttctgtgcta tggtcctggc tgacttcggg   180
gcgcgtgtgg tacgcgtgga ccggcccggc tcccgctacg acgtgagccg cttgggccgg   240
ggcaagcgct cgctagtgct ggacctgaag cagccgcggg gagccgccgt gctgcggcgt   300
ctgtgcaagc ggtcggatgt gctgctggag cccttccgcc gcggtgtcat ggagaaactc   360
cagctgggcc cagagattct gcagcgggaa aatccaaggc ttatttatgc caggctgagt   420
ggatttggcc agtcaggaag cttctgccgg ttagctggcc acgatatcaa ctatttggct   480
ttgtcaggtg ttctctcaaa aattggcaga agtggtgaga atccgtatgc cccgctgaat   540
ctcctggctg actttgctgg tggtggcctt atgtgtgcac tgggcattat aatggctctt   600
tttgaccgca cacgcactgg caagggtcag gtcattgatg caaatatggt ggaaggaaca   660
gcatatttaa gttcttttct gtggaaaact cagaaattga gtctgtggga agcacctcga   720
ggacagaaca tgttggatgg tggagcacct ttctatacga cttacaggac agcagatggg   780
gaattcatgg ctgttggagc aatagaaccc cagttctacg agctgctgat caaaggactt   840
ggactaaagt ctgatgaact tcccaatcag atgagcatgg atgattggcc agaaatgaag   900
aagaagtttg cagatgtatt tgcagagaag acgaaggcag agtggtgtca aatctttgac   960
ggcacagatg cctgtgtgac tccggttctg acttttgagg aggttgttca tcatgatcac   1020
aacaaggaac ggggctcgtt tatcaccagt gaggagcagg acgtgagccc ccgccctgca   1080
cctctgctgt taaacacccc agccatccct tctttcaaaa gggatccttt cataggagaa   1140
cacactgagg agatacttga agaatttgga ttcagccgcg aagagattta tcagcttaac   1200
tcagataaaa tcattgaaag taataaggct ggtagcaagt tctggatctt atacccaaca   1260
cacagcaaca tccagaaata aagatctcag gaccccccag caagtcgttt tgtgtctcct   1320
tggactgagt taagttacaa gcctttctta tacctgtctt tgacaaagaa gacgggattg   1380
tctttacata aaaccagcct gctcctggag cttccctgga ctcaacttcc taaaggcatg   1440
tgaggaaggg gtagattcca caatctaatc cgggtgccat cagagtagag ggagtagaga   1500
atggatgttg ggtaggccat caataaggtc cattctgcgc agtatctcaa ctgccgttca   1560
acaatcgcaa gaggaaggtg gagcaggttt cttcatctta cagttgagaa aacagagact   1620
cagaagggct tcttagttca tgtttccctt agcgcctcag tgattttttc atggtggctt   1680
aggccaaaag aaatatctaa ccattcaatt tataaataat taggtcccca acgaattaaa   1740
tattatgtcc taccaactta ttagctgctt gaaaaatata atacacataa ataaaaaaat   1800
atatttttca tttctatttc attgttaatc acaactactt actaaggaga tgtatgcacc   1860
tattggacac tgtgcaactt ctcacctgga atgagattgg acactgctgc cctcattttc   1920
tgctccatgt tggtgtccat atagtacttg attttttatc agatggcctg gaaaacccag   1980
tctcacaaaa atatgaaatt atcagaagga ttatagtgca atcttatgtt gaaagaatga   2040
actacctcac tagtagttca cgtgatgtct gacagatgtt gagtttcatt gtgtttgtgt   2100
gttcaaattt ttaaatattc tgagatactc ttgtgaggtc actctaatgc cctgggtgcc   2160
ttggcacagt tttagaaata ccagttgaaa atatttgctc aggaatatgc aactaggaag   2220
gggcagaatc agaatttaag ctttcatatt ctagccttca gtcttgttct tcaaccattt   2280
ttaggaactt tcccataagg ttatgttttc cagcccaggc atggaggatc acttgaggcc   2340
aagagttcga gaccagcctg gggaacttgg ctggacctcc gtttctacga aataaaaata   2400
aaaaaattat ccaggtatgg tggtgtgtgc ctgtagtcct atctactcaa gggtggggca   2460
ggaggatcac ttgagcccag gaatttgagg ccacagtgaa ttaggattgc accactgcac   2520
tctagcccag gcaacagaac aagaacctgt ctctaaataa ataaataaaa ataataataa   2580
taaaaaagat gttttcccta caa                                           2603
<210>  39
<211>  2537
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  39
cccagaaggc cgcggggggt ggaccgccta agagggcgtg cgctcccgac atgccccgcg    60
gcgcgccatt aaccgccaga tttgaatcgc gggacccgtt ggcagaggtg gcggcggcgg   120
catgggtgcc ccgacgttgc cccctgcctg gcagcccttt ctcaaggacc accgcatctc   180
tacattcaag aactggccct tcttggaggg ctgcgcctgc accccggagc ggatggccga   240
ggctggcttc atccactgcc ccactgagaa cgagccagac ttggcccagt gtttcttctg   300
cttcaaggag ctggaaggct gggagccaga tgacgacccc atgcaaagga aaccaacaat   360
aagaagaaag aatttgagga aactgcggag aaagtgcgcc gtgccatcga gcagctggct   420
gccatggatt gaggcctctg gccggagctg cctggtccca gagtggctgc accacttcca   480
gggtttattc cctggtgcca ccagccttcc tgtgggcccc ttagcaatgt cttaggaaag   540
gagatcaaca ttttcaaatt agatgtttca actgtgctct tgttttgtct tgaaagtggc   600
accagaggtg cttctgcctg tgcagcgggt gctgctggta acagtggctg cttctctctc   660
tctctctctt ttttgggggc tcatttttgc tgttttgatt cccgggctta ccaggtgaga   720
agtgagggag gaagaaggca gtgtcccttt tgctagagct gacagctttg ttcgcgtggg   780
cagagccttc cacagtgaat gtgtctggac ctcatgttgt tgaggctgtc acagtcctga   840
gtgtggactt ggcaggtgcc tgttgaatct gagctgcagg ttccttatct gtcacacctg   900
tgcctcctca gaggacagtt tttttgttgt tgtgtttttt tgtttttttt tttttggtag   960
atgcatgact tgtgtgtgat gagagaatgg agacagagtc cctggctcct ctactgttta   1020
acaacatggc tttcttattt tgtttgaatt gttaattcac agaatagcac aaactacaat   1080
taaaactaag cacaaagcca ttctaagtca ttggggaaac ggggtgaact tcaggtggat   1140
gaggagacag aatagagtga taggaagcgt ctggcagata ctccttttgc cactgctgtg   1200
tgattagaca ggcccagtga gccgcggggc acatgctggc cgctcctccc tcagaaaaag   1260
gcagtggcct aaatcctttt taaatgactt ggctcgatgc tgtgggggac tggctgggct   1320
gctgcaggcc gtgtgtctgt cagcccaacc ttcacatctg tcacgttctc cacacggggg   1380
agagacgcag tccgcccagg tccccgcttt ctttggaggc agcagctccc gcagggctga   1440
agtctggcgt aagatgatgg atttgattcg ccctcctccc tgtcatagag ctgcagggtg   1500
gattgttaca gcttcgctgg aaacctctgg aggtcatctc ggctgttcct gagaaataaa   1560
aagcctgtca tttcaaacac tgctgtggac cctactgggt ttttaaaata ttgtcagttt   1620
ttcatcgtcg tccctagcct gccaacagcc atctgcccag acagccgcag tgaggatgag   1680
cgtcctggca gagacgcagt tgtctctggg cgcttgccag agccacgaac cccagacctg   1740
tttgtatcat ccgggctcct tccgggcaga aacaactgaa aatgcacttc agacccactt   1800
atttctgcca catctgagtc ggcctgagat agacttttcc ctctaaactg ggagaatatc   1860
acagtggttt ttgttagcag aaaatgcact ccagcctctg tactcatcta agctgcttat   1920
ttttgatatt tgtgtcagtc tgtaaatgga tacttcactt taataactgt tgcttagtaa   1980
ttggctttgt agagaagctg gaaaaaaatg gttttgtctt caactccttt gcatgccagg   2040
cggtgatgtg gatctcggct tctgtgagcc tgtgctgtgg gcagggctga gctggagccg   2100
cccctctcag cccgcctgcc acggcctttc cttaaaggcc atccttaaaa ccagaccctc   2160
atggctacca gcacctgaaa gcttcctcga catctgttaa taaagccgta ggcccttgtc   2220
taagtgcaac cgcctagact ttctttcaga tacatgtcca catgtccatt tttcaggttc   2280
tctaagttgg agtggagtct gggaagggtt gtgaatgagg cttctgggct atgggtgagg   2340
ttccaatggc aggttagagc ccctcgggcc aactgccatc ctggaaagta gagacagcag   2400
tgcccgctgc ccagaagaga ccagcaagcc aaactggagc ccccattgca ggctgtcgcc   2460
atgtggaaag agtaactcac aattgccaat aaagtctcat gtggttttat ctaaaaaaaa   2520
aaaaaaaaaa aaaaaaa                                                  2537
<210>  40
<211>  2724
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  40
cccagaaggc cgcggggggt ggaccgccta agagggcgtg cgctcccgac atgccccgcg    60
gcgcgccatt aaccgccaga tttgaatcgc gggacccgtt ggcagaggtg gcggcggcgg   120
catgggtgcc ccgacgttgc cccctgcctg gcagcccttt ctcaaggacc accgcatctc   180
tacattcaag aactggccct tcttggaggg ctgcgcctgc accccggagc ggatggccga   240
ggctggcttc atccactgcc ccactgagaa cgagccagac ttggcccagt gtttcttctg   300
cttcaaggag ctggaaggct gggagccaga tgacgacccc attgggccgg gcacggtggc   360
ttacgcctgt aataccagca ctttgggagg ccgaggcggg cggatcacga gagaggaaca   420
taaaaagcat tcgtccggtt gcgctttcct ttctgtcaag aagcagtttg aagaattaac   480
ccttggtgaa tttttgaaac tggacagaga aagagccaag aacaaaattg caaaggaaac   540
caacaataag aagaaagaat ttgaggaaac tgcggagaaa gtgcgccgtg ccatcgagca   600
gctggctgcc atggattgag gcctctggcc ggagctgcct ggtcccagag tggctgcacc   660
acttccaggg tttattccct ggtgccacca gccttcctgt gggcccctta gcaatgtctt   720
aggaaaggag atcaacattt tcaaattaga tgtttcaact gtgctcttgt tttgtcttga   780
aagtggcacc agaggtgctt ctgcctgtgc agcgggtgct gctggtaaca gtggctgctt   840
ctctctctct ctctcttttt tgggggctca tttttgctgt tttgattccc gggcttacca   900
ggtgagaagt gagggaggaa gaaggcagtg tcccttttgc tagagctgac agctttgttc   960
gcgtgggcag agccttccac agtgaatgtg tctggacctc atgttgttga ggctgtcaca   1020
gtcctgagtg tggacttggc aggtgcctgt tgaatctgag ctgcaggttc cttatctgtc   1080
acacctgtgc ctcctcagag gacagttttt ttgttgttgt gtttttttgt tttttttttt   1140
ttggtagatg catgacttgt gtgtgatgag agaatggaga cagagtccct ggctcctcta   1200
ctgtttaaca acatggcttt cttattttgt ttgaattgtt aattcacaga atagcacaaa   1260
ctacaattaa aactaagcac aaagccattc taagtcattg gggaaacggg gtgaacttca   1320
ggtggatgag gagacagaat agagtgatag gaagcgtctg gcagatactc cttttgccac   1380
tgctgtgtga ttagacaggc ccagtgagcc gcggggcaca tgctggccgc tcctccctca   1440
gaaaaaggca gtggcctaaa tcctttttaa atgacttggc tcgatgctgt gggggactgg   1500
ctgggctgct gcaggccgtg tgtctgtcag cccaaccttc acatctgtca cgttctccac   1560
acgggggaga gacgcagtcc gcccaggtcc ccgctttctt tggaggcagc agctcccgca   1620
gggctgaagt ctggcgtaag atgatggatt tgattcgccc tcctccctgt catagagctg   1680
cagggtggat tgttacagct tcgctggaaa cctctggagg tcatctcggc tgttcctgag   1740
aaataaaaag cctgtcattt caaacactgc tgtggaccct actgggtttt taaaatattg   1800
tcagtttttc atcgtcgtcc ctagcctgcc aacagccatc tgcccagaca gccgcagtga   1860
ggatgagcgt cctggcagag acgcagttgt ctctgggcgc ttgccagagc cacgaacccc   1920
agacctgttt gtatcatccg ggctccttcc gggcagaaac aactgaaaat gcacttcaga   1980
cccacttatt tctgccacat ctgagtcggc ctgagataga cttttccctc taaactggga   2040
gaatatcaca gtggtttttg ttagcagaaa atgcactcca gcctctgtac tcatctaagc   2100
tgcttatttt tgatatttgt gtcagtctgt aaatggatac ttcactttaa taactgttgc   2160
ttagtaattg gctttgtaga gaagctggaa aaaaatggtt ttgtcttcaa ctcctttgca   2220
tgccaggcgg tgatgtggat ctcggcttct gtgagcctgt gctgtgggca gggctgagct   2280
ggagccgccc ctctcagccc gcctgccacg gcctttcctt aaaggccatc cttaaaacca   2340
gaccctcatg gctaccagca cctgaaagct tcctcgacat ctgttaataa agccgtaggc   2400
ccttgtctaa gtgcaaccgc ctagactttc tttcagatac atgtccacat gtccattttt   2460
caggttctct aagttggagt ggagtctggg aagggttgtg aatgaggctt ctgggctatg   2520
ggtgaggttc caatggcagg ttagagcccc tcgggccaac tgccatcctg gaaagtagag   2580
acagcagtgc ccgctgccca gaagagacca gcaagccaaa ctggagcccc cattgcaggc   2640
tgtcgccatg tggaaagagt aactcacaat tgccaataaa gtctcatgtg gttttatcta   2700
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa                                          2724
<210>  41
<211>  2081
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  41
aactttttat tgtggtttgt ccgttccgag cgctccgcag aacagtcctc cctgtaagag    60
cctaaccatt gccagggaaa cctgccctgg gcgctccctt cattagcagt atttttttta   120
aattaatctg attaataatt atttttcccc catttaattt tttttcctcc caggtggagt   180
tgccgaagct gggggcagct ggggagggtg gggatgggag gggagagaca gaagttgagg   240
gcatctctct cttccttccc gaccctctgg cccccaaggg gcaggaggaa tgcaggagca   300
ggagttgagc ttgggagctg cagatgcctc cgcccctcct ctctcccagg ctcttcctcc   360
tgcccccttc ttgcaactct ccttaatttt gtttggcttt tggatgatta taattatttt   420
tatttttgaa tttatataaa gtatatgtgt gtgtgtgtgg agctgagaca ggctcggcag   480
cggcacagaa tgagggaaga cgagaaagag agtgggagag agagaggcag agagggagag   540
agggagagtg acagcagcgc tcggacgtcc tccccaacgt cgccctcaat tccaccgcct   600
atgatccagt gaggcatttc tcgacctatg gagcggccgt tgcccagaac cggatctact   660
cgactccctt ttattcgcca caggagaatg tcgtgttcag ttccagccgg gggccgtatg   720
actatggatc taattccttt taccaggaga aagacatgct ctcaaactgc agacaaaaca   780
ccttaggaca taacacacag acctcaatcg ctcaggattt tagttctgag cagggcagga   840
ctgcgcccca ggaccagaaa gccagtatcc agatttaccc ctggatgcag cgaatgaatt   900
cgcacagtgg ggtcggctac ggagcggacc ggaggcgcgg ccgccagatc tactcgcggt   960
accagaccct ggaactggag aaggaatttc acttcaatcg ctacctaacg cggcgccggc   1020
gcatcgagat cgccaacgcg ctttgcctga ccgagcgaca gatcaaaatc tggttccaga   1080
accgccggat gaagtggaaa aaagaatcta atctcacatc cactctctcg gggggcggcg   1140
gaggggccac cgccgacagc ctgggcggaa aagaggaaaa gcgggaagag acagaagagg   1200
agaagcagaa agagtgacca ggactgtccc tgccacccct ctctcccttt ctccctcgct   1260
ccccaccaac tctcccctaa tcacacactc tgtatttatc actggcacaa ttgatgtgtt   1320
ttgattccct aaaacaaaat tagggagtca aacgtggacc tgaaagtcag ctctggaccc   1380
cctccctcac cgcacaactc tctttcacca cgcgcctcct cctcctcgct cccttgctag   1440
ctcgttctcg gcttgtctac aggccctttt ccccgtccag gccttggggg ctcggaccct   1500
gaactcagac tctacagatt gccctccaag tgaggacttg gctcccccac tccttcgacg   1560
cccccacccc cgccccccgt gcagagagcc ggctcctggg cctgctgggg cctctgctcc   1620
agggcctcag ggcccggcct ggcagccggg gagggccgga ggcccaagga gggcgcgcct   1680
tggccccaca ccaaccccca gggcctcccc gcagtccctg cctagcccct ctgccccagc   1740
aaatgcccag cccaggcaaa ttgtatttaa agaatcctgg gggtcattat ggcattttac   1800
aaactgtgac cgtttctgtg tgaagatttt tagctgtatt tgtggtctct gtatttatat   1860
ttatgtttag caccgtcagt gttcctatcc aatttcaaaa aaggaaaaaa aagagggaaa   1920
attacaaaaa gagagaaaaa aagtgaatga cgtttgttta gccagtagga gaaaataaat   1980
aaataaataa atcccttcgt gttaccctcc tgtataaatc caacctctgg gtccgttctc   2040
gaatatttaa taaaactgat attattttta aaactttaaa a                       2081
<210>  42
<211>  2910
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  42
aaaaatgcat aaagagccaa gtgcttatat tctggccaag ttatgaggct ctgagaacaa    60
gagcttgagg ggaagactgt taaccccatc cacgccacca gaattagctc tttccctttt   120
ggtttgcaag cactgcctgt aaagccctcg catgagaggc cagcctgcta gggaaatcca   180
ggaatctgca acaaaaacga tgacagtctg aaatactctc tggtgccaac ctccaaattc   240
tcgtctgtca cttcagaccc ccactagttg acagagcagc agaatttcaa ctccagtaga   300
cttgaatatg cctctgggca aagaagcaga gctaacgagg aaagggattt aaagagtttt   360
tcttgggtgt ttgtcaaact tttattccct gtctgtgtgc agaggggatt caacttcaat   420
ttttctgcag tggctctggg tccagcccct tacttaaaga tctggaaagc atgaagactg   480
ggcttttttt cctatgtctc ttgggaactg cagctgcaat cccgacaaat gcaagattat   540
tatctgatca ttccaaacca actgctgaaa cggtagcacc tgacaacact gcaatcccca   600
gtttaagggc tgaagctgaa gaaaatgaaa aagaaacagc agtatccaca gaagacgatt   660
cccaccataa ggctgaaaaa tcatcagtac taaagtcaaa agaggaaagc catgaacagt   720
cagcagaaca gggcaagagt tctagccaag agctgggatt gaaggatcaa gaggacagtg   780
atggtcactt aagtgtgaat ttggagtatg caccaactga aggtacattg gacataaaag   840
aagatatgag tgagcctcag gagaaaaaac tctcagagaa cactgatttt ttggctcctg   900
gtgttagttc cttcacagat tctaaccaac aagaaagtat cacaaagaga gaggaaaacc   960
aagaacaacc tagaaattat tcacatcatc agttgaacag gagcagtaaa catagccaag   1020
gcctaaggga tcaaggaaac caagagcagg atccaaatat ttccaatgga gaagaggaag   1080
aagaaaaaga gccaggtgaa gttggtaccc acaatgataa ccaagaaaga aagacagaat   1140
tgcccaggga gcatgctaac agcaagcagg aggaagacaa tacccaatct gatgatattt   1200
tggaagagtc tgatcaacca actcaagtaa gcaagatgca ggaggatgaa tttgatcagg   1260
gtaaccaaga acaagaagat aactccaatg cagaaatgga agaggaaaat gcatcgaacg   1320
tcaataagca cattcaagaa actgaatggc agagtcaaga gggtaaaact ggcctagaag   1380
ctatcagcaa ccacaaagag acagaagaaa agactgtttc tgaggctctg ctcatggaac   1440
ctactgatga tggtaatacc acgcccagaa atcatggagt tgatgatgat ggcgatgatg   1500
atggcgatga tggcggcact gatggcccca ggcacagtgc aagtgatgac tacttcatcc   1560
caagccaggc ctttctggag gccgagagag ctcaatccat tgcctatcac ctcaaaattg   1620
aggagcaaag agaaaaagta catgaaaatg aaaatatagg taccactgag cctggagagc   1680
accaagaggc caagaaagca gagaactcat caaatgagga ggaaacgtca agtgaaggca   1740
acatgagggt gcatgctgtg gattcttgca tgagcttcca gtgtaaaaga ggccacatct   1800
gtaaggcaga ccaacaggga aaacctcact gtgtctgcca ggatccagtg acttgtcctc   1860
caacaaaacc ccttgatcaa gtttgtggca ctgacaatca gacctatgct agttcctgtc   1920
atctattcgc tactaaatgc agactggagg ggaccaaaaa ggggcatcaa ctccagctgg   1980
attattttgg agcctgcaaa tctattccta cttgtacgga ctttgaagtg attcagtttc   2040
ctctacggat gagagactgg ctcaagaata tcctcatgca gctttatgaa gccaactctg   2100
aacacgctgg ttatctaaat gagaagcaga gaaataaagt caagaaaatt tacctggatg   2160
aaaagaggct tttggctggg gaccatccca ttgatcttct cttaagggac tttaagaaaa   2220
actaccacat gtatgtgtat cctgtgcact ggcagtttag tgaacttgac caacacccta   2280
tggatagagt cttgacacat tctgaacttg ctcctctgcg agcatctctg gtgcccatgg   2340
aacactgcat aacccgtttc tttgaggagt gtgaccccaa caaggataag cacatcaccc   2400
tgaaggagtg gggccactgc tttggaatta aagaagagga catagatgaa aatctcttgt   2460
tttgaacgaa gattttaaag aactcaactt tccagcatcc tcctctgttc taaccacttc   2520
agaaatatat gcagctgtga tacttgtaga tttatattta gcaaaatgtt agcatgtatg   2580
acaagacaat gagagtaatt gcttgacaac aacctatgca ccaggtattt aacattaact   2640
ttggaaacaa aaatgtacaa ttaagtaaag tcaacatatg caaaatactg tacattgtga   2700
acagaagttt aattcatagt aatttcactc tctgcattga cttatgagat aattaatgat   2760
taaactatta atgataaaaa taatgcattt gtattgttca taatatcatg tgcacttcaa   2820
gaaaatggaa tgctactctt ttgtggttta cgtgtattat tttcaatatc ttaataccct   2880
aataaagagt ccataaaaat ccaaatgctt                                    2910
<210>  43
<211>  3019
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  43
aaaaatgcat aaagagccaa gtgcttatat tctggccaag ttatgaggct ctgagaacaa    60
gagcttgagg ggaagactgt taaccccatc cacgccacca gaattagctc tttccctttt   120
ggtttgcaag cactgcctgt aaagccctcg catgagaggc cagcctgcta gggaaatcca   180
ggaatctgca acaaaaacga tgacagtctg aaatactctc tggtgccaac ctccaaattc   240
tcgtctgtca cttcagaccc ccactagttg acagagcagc agaatttcaa ctccagtaga   300
cttgaatatg cctctgggca aagaagcaga gctaacgagg aaagggattt aaagagtttt   360
tcttgggtgt ttgtcaaact tttattccct gtctgtgtgc agaggggatt caacttcaat   420
ttttctgcag tggctctggg tccagcccct tacttaaaga tctggaaagc atgaagactg   480
ggcttttttt cctatgtctc ttgggaactg cagctgcaat cccggtgaaa aggagataag   540
aagcaaagga gcaaaccaaa cctaatatga atcctgtact ttggccagaa gccgtggctc   600
acatctgtaa tcccagcact ttgggaggcc aagacaaatg caagattatt atctgatcat   660
tccaaaccaa ctgctgaaac ggtagcacct gacaacactg caatccccag tttaagggct   720
gaagctgaag aaaatgaaaa agaaacagca gtatccacag aagacgattc ccaccataag   780
gctgaaaaat catcagtact aaagtcaaaa gaggaaagcc atgaacagtc agcagaacag   840
ggcaagagtt ctagccaaga gctgggattg aaggatcaag aggacagtga tggtcactta   900
agtgtgaatt tggagtatgc accaactgaa ggtacattgg acataaaaga agatatgagt   960
gagcctcagg agaaaaaact ctcagagaac actgattttt tggctcctgg tgttagttcc   1020
ttcacagatt ctaaccaaca agaaagtatc acaaagagag aggaaaacca agaacaacct   1080
agaaattatt cacatcatca gttgaacagg agcagtaaac atagccaagg cctaagggat   1140
caaggaaacc aagagcagga tccaaatatt tccaatggag aagaggaaga agaaaaagag   1200
ccaggtgaag ttggtaccca caatgataac caagaaagaa agacagaatt gcccagggag   1260
catgctaaca gcaagcagga ggaagacaat acccaatctg atgatatttt ggaagagtct   1320
gatcaaccaa ctcaagtaag caagatgcag gaggatgaat ttgatcaggg taaccaagaa   1380
caagaagata actccaatgc agaaatggaa gaggaaaatg catcgaacgt caataagcac   1440
attcaagaaa ctgaatggca gagtcaagag ggtaaaactg gcctagaagc tatcagcaac   1500
cacaaagaga cagaagaaaa gactgtttct gaggctctgc tcatggaacc tactgatgat   1560
ggtaatacca cgcccagaaa tcatggagtt gatgatgatg gcgatgatga tggcgatgat   1620
ggcggcactg atggccccag gcacagtgca agtgatgact acttcatccc aagccaggcc   1680
tttctggagg ccgagagagc tcaatccatt gcctatcacc tcaaaattga ggagcaaaga   1740
gaaaaagtac atgaaaatga aaatataggt accactgagc ctggagagca ccaagaggcc   1800
aagaaagcag agaactcatc aaatgaggag gaaacgtcaa gtgaaggcaa catgagggtg   1860
catgctgtgg attcttgcat gagcttccag tgtaaaagag gccacatctg taaggcagac   1920
caacagggaa aacctcactg tgtctgccag gatccagtga cttgtcctcc aacaaaaccc   1980
cttgatcaag tttgtggcac tgacaatcag acctatgcta gttcctgtca tctattcgct   2040
actaaatgca gactggaggg gaccaaaaag gggcatcaac tccagctgga ttattttgga   2100
gcctgcaaat ctattcctac ttgtacggac tttgaagtga ttcagtttcc tctacggatg   2160
agagactggc tcaagaatat cctcatgcag ctttatgaag ccaactctga acacgctggt   2220
tatctaaatg agaagcagag aaataaagtc aagaaaattt acctggatga aaagaggctt   2280
ttggctgggg accatcccat tgatcttctc ttaagggact ttaagaaaaa ctaccacatg   2340
tatgtgtatc ctgtgcactg gcagtttagt gaacttgacc aacaccctat ggatagagtc   2400
ttgacacatt ctgaacttgc tcctctgcga gcatctctgg tgcccatgga acactgcata   2460
acccgtttct ttgaggagtg tgaccccaac aaggataagc acatcaccct gaaggagtgg   2520
ggccactgct ttggaattaa agaagaggac atagatgaaa atctcttgtt ttgaacgaag   2580
attttaaaga actcaacttt ccagcatcct cctctgttct aaccacttca gaaatatatg   2640
cagctgtgat acttgtagat ttatatttag caaaatgtta gcatgtatga caagacaatg   2700
agagtaattg cttgacaaca acctatgcac caggtattta acattaactt tggaaacaaa   2760
aatgtacaat taagtaaagt caacatatgc aaaatactgt acattgtgaa cagaagttta   2820
attcatagta atttcactct ctgcattgac ttatgagata attaatgatt aaactattaa   2880
tgataaaaat aatgcatttg tattgttcat aatatcatgt gcacttcaag aaaatggaat   2940
gctactcttt tgtggtttac gtgtattatt ttcaatatct taatacccta ataaagagtc   3000
cataaaaatc caaatgctt                                                3019
<210>  44
<211>  2670
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  44
aaaaatgcat aaagagccaa gtgcttatat tctggccaag ttatgaggct ctgagaacaa    60
gagcttgagg ggaagactgt taaccccatc cacgccacca gaattagctc tttccctttt   120
ggtttgcaag cactgcctgt aaagccctcg catgagaggc cagcctgcta gggaaatcca   180
ggaatctgca acaaaaacga tgacagtctg aaatactctc tggtgccaac ctccaaattc   240
tcgtctgtca cttcagaccc ccactagttg acagagcagc agaatttcaa ctccagtaga   300
cttgaatatg cctctgggca aagaagcaga gctaacgagg aaagggattt aaagagtttt   360
tcttgggtgt ttgtcaaact tttattccct gtctgtgtgc agaggggatt caacttcaat   420
ttttctgcag tggctctggg tccagcccct tacttaaaga tctggaaagc catgaacagt   480
cagcagaaca gggcaagagt tctagccaag agctgggatt gaaggatcaa gaggacagtg   540
atggtcactt aagtgtgaat ttggagtatg caccaactga aggtacattg gacataaaag   600
aagatatgag tgagcctcag gagaaaaaac tctcagagaa cactgatttt ttggctcctg   660
gtgttagttc cttcacagat tctaaccaac aagaaagtat cacaaagaga gaggaaaacc   720
aagaacaacc tagaaattat tcacatcatc agttgaacag gagcagtaaa catagccaag   780
gcctaaggga tcaaggaaac caagagcagg atccaaatat ttccaatgga gaagaggaag   840
aagaaaaaga gccaggtgaa gttggtaccc acaatgataa ccaagaaaga aagacagaat   900
tgcccaggga gcatgctaac agcaagcagg aggaagacaa tacccaatct gatgatattt   960
tggaagagtc tgatcaacca actcaagtaa gcaagatgca ggaggatgaa tttgatcagg   1020
gtaaccaaga acaagaagat aactccaatg cagaaatgga agaggaaaat gcatcgaacg   1080
tcaataagca cattcaagaa actgaatggc agagtcaaga gggtaaaact ggcctagaag   1140
ctatcagcaa ccacaaagag acagaagaaa agactgtttc tgaggctctg ctcatggaac   1200
ctactgatga tggtaatacc acgcccagaa atcatggagt tgatgatgat ggcgatgatg   1260
atggcgatga tggcggcact gatggcccca ggcacagtgc aagtgatgac tacttcatcc   1320
caagccaggc ctttctggag gccgagagag ctcaatccat tgcctatcac ctcaaaattg   1380
aggagcaaag agaaaaagta catgaaaatg aaaatatagg taccactgag cctggagagc   1440
accaagaggc caagaaagca gagaactcat caaatgagga ggaaacgtca agtgaaggca   1500
acatgagggt gcatgctgtg gattcttgca tgagcttcca gtgtaaaaga ggccacatct   1560
gtaaggcaga ccaacaggga aaacctcact gtgtctgcca ggatccagtg acttgtcctc   1620
caacaaaacc ccttgatcaa gtttgtggca ctgacaatca gacctatgct agttcctgtc   1680
atctattcgc tactaaatgc agactggagg ggaccaaaaa ggggcatcaa ctccagctgg   1740
attattttgg agcctgcaaa tctattccta cttgtacgga ctttgaagtg attcagtttc   1800
ctctacggat gagagactgg ctcaagaata tcctcatgca gctttatgaa gccaactctg   1860
aacacgctgg ttatctaaat gagaagcaga gaaataaagt caagaaaatt tacctggatg   1920
aaaagaggct tttggctggg gaccatccca ttgatcttct cttaagggac tttaagaaaa   1980
actaccacat gtatgtgtat cctgtgcact ggcagtttag tgaacttgac caacacccta   2040
tggatagagt cttgacacat tctgaacttg ctcctctgcg agcatctctg gtgcccatgg   2100
aacactgcat aacccgtttc tttgaggagt gtgaccccaa caaggataag cacatcaccc   2160
tgaaggagtg gggccactgc tttggaatta aagaagagga catagatgaa aatctcttgt   2220
tttgaacgaa gattttaaag aactcaactt tccagcatcc tcctctgttc taaccacttc   2280
agaaatatat gcagctgtga tacttgtaga tttatattta gcaaaatgtt agcatgtatg   2340
acaagacaat gagagtaatt gcttgacaac aacctatgca ccaggtattt aacattaact   2400
ttggaaacaa aaatgtacaa ttaagtaaag tcaacatatg caaaatactg tacattgtga   2460
acagaagttt aattcatagt aatttcactc tctgcattga cttatgagat aattaatgat   2520
taaactatta atgataaaaa taatgcattt gtattgttca taatatcatg tgcacttcaa   2580
gaaaatggaa tgctactctt ttgtggttta cgtgtattat tttcaatatc ttaataccct   2640
aataaagagt ccataaaaat ccaaatgctt                                    2670