ПАНЕЛИ ДИСКРЕТНЫХ МИКРООКРУЖЕНИЙ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР, СПОСОБЫ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ТАКИХ ПАНЕЛЕЙ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

1. Панель, имеющая дискретные объемы микроокружений клеточной культуры, обладающие различными свойствами, влияющими на поведение инкапсулированных клеток, в особенности, на пролиферацию, образование колоний, дифференциацию, миграцию или их комбинации.
2. Панель по п. 1, в которой дискретные объемы микроокружений клеточной культуры включают гидрогели.
3. Панель по любому из пп. 1 или 2, в которой по меньшей мере, два из дискретных объемов микроокружения клеточной культуры различно подвержены деградации под действием протеиназ, предпочтительно, матриксных металлопротеиназ.
4. Панель по п. 1, в которой, по меньшей мере, два из дискретных объемов микроокружения клеточной культуры:
i) включают различные факторы внеклеточного матрикса, предпочтительно выбираемые из группы, состоящей из пептидов, белков, полисахаридов и их комбинаций; наиболее предпочтительно те, которые выбирают из группы, состоящей из ламининов, коллагенов, эластинов, фибронектина, эластина, протеогликанов, полисахаридов, не представляющих собой протеогликаны, матрицеллюлярных белков, матрицеллюлярных белков типа SPARC (кислый и богатый цистеинами секретируемый белок), тенасцинов, тромбоспондинов и их комбинаций; и/или
ii) включают различные факторы межклеточного взаимодействия, предпочтительно выбираемые из группы, состоящей из пептидов, белков, полисахаридов и их комбинаций; наиболее предпочтительно, из кадгеринов, селектинов, молекул клеточной адгезии (САМ), в особенности, ICAM и VCAM, компонентов системы трансмембранной клеточной сигнализации или их комбинаций; и/или
iii) включают различные факторы клеточной сигнализации, предпочтительно выбираемые из следующей группы: факторы роста или морфогены развития, наиболее предпочтительно, выбираемые из следующей группы: адреномедуллин (AM), ангиопоэтин (Ang), аутокринный фактор миграции, костные морфогенетические белки (BMP), нейротрофический фактор из тканей мозга (BDNF), эпидермальный фактор роста (EGF), эритропоэтин (ЕРО), фактор роста фибробластов (FGF), нейротрофический фактор глиальной клеточной линии (GDNF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцит-макрофаг колониестимулирующий фактор (GM-CSF), фактор роста и дифференцировки-9 (GDF9), фактор роста гепатоцитов (НGF), фактор роста из гепатомы (HDGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF), фактор ингибирования лейкоза (LIF), стимулирующий миграцию фактор, миостатин (GDF-8), нейротрофины, в особенности фактор роста нервов (NGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), тромбопоэтин (ТРО), трансформирующий фактор роста альфа (TGF-α), трансформирующий фактор роста бета (TGF-β), фактор некроза опухолей-альфа (TNF-α), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), плацентарный фактор роста (P1GF), цитокины, хемокины и их комбинации; и/или
iv) имеют различную жесткость.
5. Панель по п. 1, в которой микроокружения клеточных культур строятся из молекул-предшественников, способных к образованию поперечных связей в совместимой с клетками реакции (совместимых с клетками реакциях), на основании:
образования ковалентной связи, которую выбирают из группы, состоящей из энзиматических реакций, предпочтительно зависящих от активированного фактора трансглутаминазы XIIIa, и неэнзиматических и/или некаталитических реакций, предпочтительно, реакции присоединения по Михаэлю; и/или
образования нековалентной связи.
6. Панель по п. 1, в которой микроокружения клеточных культур строятся из линейных или разветвленных гидрофобных полимеров, наиболее предпочтительно, разветвленных молекул поли (этиленгликоля).
7. Способ изготовления панели по пп. 1-6, включающий следующие стадии:
a) обеспечение одной или нескольких молекул-предшественников гидрогеля;
b) комбинирование и распределение различных комбинаций молекул-предшественников гидрогеля в соответствии со стадией а) на дискретных объемах подложки, предпочтительно, на многолуночном планшете;
c) добавление к указанным дискретным объемам указанной подложки одной или нескольких биологически активных молекул и присоединение указанных молекул или, по меньшей мере, к одной присутствующей молекуле-предшественнику гидрогеля, или к гидрогелю, образованному на стадии е), или обеспечение для них свободной диффузии;
d) добавление клеток на/в указанные дискретные объемы подложки; и
e) сшивание указанных молекул-предшественников гидрогеля с образованием гидрогелевого матрикса.
8. Способ по п. 7, в котором на стадии с) добавляют одну или несколько биологически активных молекул, которые выбирают из следующей группы: факторы внеклеточного матрикса, факторы межклеточного взаимодействия и факторы системы клеточных сигналов.
9. Комбинаторный способ тестирования влияния композиций гидрогеля на характер клеточного роста, включающий:
a) обеспечение одной или нескольких молекул-предшественников гидрогеля;
b) комбинирование и распределение различных комбинаций молекул-предшественников гидрогеля в соответствии со стадией а) на/в дискретные объемы подложки, предпочтительно, многолуночного планшета;
c) последующее добавление к указанным дискретным объемам указанной подложки одной или нескольких биологически активных молекул и присоединение указанных молекул или, по меньшей мере, к одной из присутствующих молекул-предшественников гидрогеля, или к гидрогелю, образованному на стадии е), или обеспечение для них свободной диффузии;
d) добавление клеток на/в указанные дискретные объемы подложки;
e) сшивание указанных молекул-предшественников гидрогеля с образованием гидрогелевого матрикса;
f) обеспечение роста указанных клеток в указанных дискретных объемах указанного гидрогелевого матрикса;
g) мониторинг указанных клеток на протяжении стадии f) с течением времени;
h) определение поведения для различных микроокружений клеточных культур, в котором поведение предпочтительно выбирают из группы, состоящей из степени пролиферации, образования колоний, дифференциации, миграции или их комбинаций;
i) при необходимости, определение синергетических и/или антагонистических эффектов друг на друга биологически активных молекул и/или механических свойств и/или чувствительности к энзиматической деградация дискретного микроокружения клеточных культур, предпочтительно, под действием протеиназ;
j) при необходимости, идентификация специфической композиции гидрогеля или диапазона композиций гидрогеля, определяющих поведение конкретных клеток;
k) при необходимости, выделение клеток, по меньшей мере, из одного гидрогелевого микроокружения клеточных культур для дальнейшего анализа, предпочтительно, фенотипического анализа, или для непрерывного культивирования клеток или пассирования.
10. Комбинаторный способ по п. 9, в котором одну или несколько биологически активных молекул стадии с) выбирают из следующей группы: факторы внеклеточного матрикса, факторы межклеточного взаимодействия и факторы системы клеточных сигналов.
11. Набор компонентов для изготовления панели, имеющей дискретные объемы гидрогеля, по любому из пп. 1-6, включающий в качестве компонентов:
a) одну или несколько молекул-предшественников гидрогеля;
b) одну или несколько биологически активных молекул;
c) необязательно, по меньшей мере, один сшивающий агент для молекул-предшественников а); и
d) инструкции по применению указанных компонентов, предпочтительно в соответствии со способом по любому из пп. 7-10.
12. Набор по п. 11, в котором:
молекулу (молекулы) компонента b) выбирают из следующей группы: факторы внеклеточного матрикса, факторы межклеточного взаимодействия и/или факторы системы клеточных сигналов; и/или
фактор XIIIa включают в качестве компонента с).
13. Набор по любому из пп. 11 или 12, в котором молекулы-предшественники гидрогеля компонента а) включают или состоят из молекул поли(этиленгликоля) с разветвленной структурой.
14. Набор по п. 11, в котором, по меньшей мере, две молекулы-предшественники гидрогеля обеспечивают в качестве компонента а), которые способны к образованию поперечных связей под действием фермента, предпочтительно, включенного в качестве компонента с); предпочтительно, одна, по меньшей мере, из двух молекул-предшественников гидрогеля фунционализована глутамин-несущим пептидным субстратом, а другая лизин-несущим пептидным субстратом для сшивающего фермента, и трансглутаминазу фактор XIIIa включают в качестве компонента с).
15. Набор по п. 11, в котором, по меньшей мере, молекулы-предшественники гидрогеля компонента а) обеспечивают заранее поставленными в лунки многолуночного планшета в существенно непрореагировавшей форме, предпочтительно, в сухой форме.