Композиции, относящиеся к мутантному токсину CLOSTRIDIUM DIFFICILE, и способы их применения

1. Иммуногенная композиция для индукции нейтрализующих антител против токсина A Clostridium difficile, содержащая эффективное количество мутантного токсина A Clostridium difficile, включающего глюкозилтрансферазный домен, имеющий по меньшей мере две мутации, находящиеся в положениях аминокислот 101, 269, 272, 285, 287, 269, 272, 460, 462, 541 или 542, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1, и цистеинпротеазный домен, имеющий по меньшей мере одну мутацию, находящуюся в положениях 700, 589, 655, 543, или в любой их комбинации, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1, по сравнению с соответствующим токсином A Clostridium difficile дикого типа.
2. Композиция по п. 1, где мутация представляет собой неконсервативную аминокислотную замену.
3. Композиция по п. 2, где замена включает замену аланина.
4. Композиция по любому из п.п. 1-3, где токсин A Clostridium difficile дикого типа включает последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью SEQ ID NO: 1.
5. Композиция по п. 4, где токсин A Clostridium difficile дикого типа включает последовательность, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью SEQ ID NO: 1.
6. Композиция по п. 5, где токсин A Clostridium difficile дикого типа включает SEQ ID NO: 1.
7. Композиция по п. 1, где глюкозилтрансферазный домен включает SEQ ID NO: 29.
8. Композиция по п. 7, где глюкозилтрансферазный домен включает по меньшей мере две неконсервативные мутации, находящиеся в положениях 101, 269, 272, 285, 287, 269, 272, 460, 462, 541 или 542 аминокислот SEQ ID NO: 29 или в любой их комбинации.
9. Композиция по п. 1, где цистеинпротеазный домен включает SEQ ID NO: 32.
10. Композиция по п. 9, где цистеинпротеазный домен включает неконсервативную мутацию, находящуюся в положениях 1, 47, 113, 158 SEQ ID NO: 32 или в любой их комбинации.
11. Композиция по п. 1, где мутантный токсин A Clostridium difficile включает SEQ ID NO: 4.
12. Композиция по п. 1, где мутантный токсин A Clostridium difficile включает SEQ ID NO: 84.
13. Композиция по п. 1, где мутантный токсин A Clostridium difficile включает SEQ ID NO: 7.
14. Композиция по п. 1, где мутантный токсин A Clostridium difficile включает SEQ ID NO: 83.
15. Иммуногенная композиция для индукции нейтрализующих антител против токсина A Clostridium difficile, содержащая эффективное количество полипептида SEQ ID NO: 4.
16. Иммуногенная композиция для индукции нейтрализующих антител против токсина A Clostridium difficile, содержащая эффективное количество полипептида SEQ ID NO: 84.
17. Иммуногенная композиция для индукции нейтрализующих антител против токсина A Clostridium difficile, содержащая эффективное количество полипептида SEQ ID NO: 7.
18. Иммуногенная композиция для индукции нейтрализующих антител против токсина A Clostridium difficile, содержащая эффективное количество полипептида SEQ ID NO: 83.
19. Композиция по любому из пп. 1 или 15-18, где композиция проявляет пониженную цитотоксичность по сравнению с соответствующим токсином А Clostridium difficile дикого типа.
20. Выделенный полипептид для индукции нейтрализующих антител против токсина A Clostridium difficile, включающий SEQ ID NO: 84.
21. Выделенный полипептид для индукции нейтрализующих антител против токсина В Clostridium difficile, включающий SEQ ID NO: 86.
22. Выделенный полипептид для индукции нейтрализующих антител против токсина A Clostridium difficile, включающий SEQ ID NO: 83.
23. Выделенный полипептид для индукции нейтрализующих антител против токсина В Clostridium difficile, включающий SEQ ID NO: 85.
24. Иммуногенная композиция для индукции нейтрализующих антител против токсина В Clostridium difficile, содержащая эффективное количество мутантного токсина В Clostridium difficile, включающего глюкозилтрансферазный домен, имеющий по меньшей мере две мутации, находящиеся в положениях аминокислот 102, 286, 288, 270, 273, 384, 461, 463, 520 или 543 в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 2, и цистеинпротеазный домен, имеющий по меньшей мере одну мутацию, находящуюся в положениях 698, 653, 587, 544 или в любой их комбинации, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 2 по сравнению с соответствующим токсином В Clostridium difficile дикого типа.
25. Композиция по п. 24, где мутация представляет собой неконсервативную аминокислотную замену.
26. Композиция по п. 25, где замена включает замену аланина.
27. Композиция по любому из п.п. 24-26, где токсин В Clostridium difficile дикого типа включает последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью SEQ ID NO: 2.
28. Композиция по п. 27, где токсин В Clostridium difficile дикого типа включает последовательность, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью SEQ ID NO: 2.
29. Композиция по п. 28, где токсин В Clostridium difficile дикого типа включает SEQ ID NO: 2.
30. Композиция по п. 24, где глюкозилтрансферазный домен включает SEQ ID NO: 31.
31. Композиция по п. 30, где глюкозилтрансферазный домен включает по меньшей мере две неконсервативные мутации, находящиеся в положениях аминокислот 102, 286, 288, 270, 273, 384, 461, 463, 520 или 543 SEQ ID NO: 31.
32. Композиция по п. 24, где цистеинпротеазный домен включает SEQ ID NO: 33.
33. Композиция по п. 32, где цистеинпротеазный домен включает неконсервативную мутацию, находящуюся в положениях 1, 44, 110, 155 SEQ ID NO: 33 или в любой их комбинации.
34. Композиция по п. 24, где мутантный токсин В Clostridium difficile включает SEQ ID NO: 6.
35. Композиция по п. 24, где мутантный токсин В Clostridium difficile включает SEQ ID NO: 86.
36. Композиция по п. 24, где мутантный токсин В Clostridium difficile включает SEQ ID NO: 8.
37. Композиция по п. 24, где мутантный токсин В Clostridium difficile включает SEQ ID NO: 85.
38. Композиция по п. 24, где композиция распознается нейтрализующим антителом против токсина В или его связывающим фрагментом.
39. Иммуногенная композиция для индукции нейтрализующих антител против токсина В Clostridium difficile, содержащая эффективное количество полипептида SEQ ID NO: 6.
40. Иммуногенная композиция для индукции нейтрализующих антител против токсина В Clostridium difficile, содержащая эффективное количество полипептида SEQ ID NO: 86.
41. Иммуногенная композиция для индукции нейтрализующих антител против токсина В Clostridium difficile, содержащая эффективное количество полипептида SEQ ID NO: 8.
42. Иммуногенная композиция для индукции нейтрализующих антител против токсина В Clostridium difficile, содержащая эффективное количество полипептида SEQ ID NO: 85.
43. Композиция по любому из п.п. 24 и 39-41, где композиция проявляет пониженную цитотоксичность по сравнению с соответствующим токсином В Clostridium difficile дикого типа.
44. Рекомбинантная клетка или ее потомство, экспрессирующая(ее) мутантный токсин А, содержащая SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, либо нуклеиново-кислотную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 7.
45. Рекомбинантная клетка или ее потомство, экспрессирующая(ее) мутантный токсин В, содержащая SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, либо нуклеиново-кислотную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 8.
46. Рекомбинантная клетка или ее потомство, экспрессирующая(ее) мутантный токсин А, содержащая нуклеиново-кислотную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 84.
47. Рекомбинантная клетка или ее потомство, экспрессирующая(ее) мутантный токсин В, содержащая нуклеиново-кислотную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 86.
48. Рекомбинантная клетка или ее потомство, экспрессирующая(ее) мутантный токсин А, содержащая нуклеиново-кислотную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 83.
49. Рекомбинантная клетка или ее потомство, экспрессирующая(ее) мутантный токсин В, содержащая нуклеиново-кислотную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 85.
50. Рекомбинантная клетка по п. 44 или 45, имеющая происхождение от грамположительной бактериальной клетки.
51. Рекомбинантная клетка по пп. 44, 45 или 46 имеющая происхождение от клетки Clostridium difficile.
52. Рекомбинантная клетка по любому из пп. 44-49, где отсутствует эндогенный полинуклеотид, кодирующий токсин.
53. Клетка по п. 52, имеющая происхождение от клетки Clostridium difficile, выбранной из группы, состоящей из Clostridium difficile 1351, Clostridium difficile 3232, Clostridium difficile 7322, Clostridium difficile 5036, Clostridium difficile 4811 и Clostridium difficile VPI 11186.
54. Клетка по n. 53, представляющая собой клетку Clostridium difficile VPI 11186.
55. Клетка по n. 54, где ген споруляции клетки Clostridium difficile инактивирован.
56. Клетка по п. 55, где ген споруляции включает ген spo0A или ген spollE.
57. Способ продуцирования мутантного токсина Clostridium difficile, включающий культивирование рекомбинантной клетки или ее потомства по любому из пп. 50-56 в условиях, подходящих для экспрессии полинуклеотида, кодирующего мутантный токсин Clostridium difficile.
58. Способ по п. 57, где в клетке отсутствует эндогенный полинуклеотид, кодирующий токсин.
59. Способ по п. 57, дополнительно включающий выделение мутантного токсина Clostridium difficile.
60. Иммуногенная композиция для индукции нейтрализующих антител против токсинов Clostridium difficile, содержащая эффективное количество мутантного токсина, полученного способом по любому из пп. 57-59.
61. Антитело или связывающий фрагмент антитела, обладающее(ий) нейтрализующей активностью в отношении токсинов Clostridium difficile, включающее(ий) аминокислотные последовательности гипервариабельных участков (CDR) тяжелой цепи, указанные в SEQ ID NO: 41 (CDR Н1), SEQ ID NO: 42 (CDR H2) и SEQ ID NO: 43 (CDR Н3), и аминокислотные последовательности CDR легкой цепи, указанные в SEQ ID NO: 38 (CDR L1), SEQ ID NO: 39 (CDR L2) и SEQ ID NO: 40 (CDR L3), специфичное(ый) к иммуногенной композиции, содержащей SEQ ID NO: 4, где остаток метионина в положении 1 возможно отсутствует, или SEQ ID NO: 7, где остаток метионина в положении 1 возможно отсутствует.
62. Антитело или связывающий фрагмент антитела по п. 61, где антитело или связывающий фрагмент антитела содержит тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 36.
63. Композиция, обладающая нейтрализующей активностью в отношении токсинов Clostridium difficile, содержащая комбинацию двух или более чем двух антител или связывающих фрагментов антител, выбранных из любого антитела или связывающего фрагмента антитела по любому из п.п. 61-62, в эффективном количестве.
64. Антитело или связывающий фрагмент антитела, обладающее(ий) нейтрализующей активностью в отношении токсинов Clostridium difficile, содержащее(ий) легкие и тяжелые цепи, выбранные из SEQ ID NO: 49 и 55, или SEQ ID NO: 60 и 66, или SEQ ID NO: 71 и 77, специфичные к иммуногенной композиции, содержащей SEQ ID NO: 6, где остаток метионина в положении 1 возможно отсутствует, или SEQ ID NO: 8, где остаток метионина в положении 1 возможно отсутствует.
65. Антитело или связывающий фрагмент антитела, обладающее(ий) нейтрализующей активностью в отношении токсинов Clostridium difficile, включающее(ий) аминокислотные последовательности гипервариабельных участков (CDR) тяжелой цепи, указанные в SEQ ID NO: 51 (CDR Н1), SEQ ID NO: 52 (CDR H2) и SEQ ID NO: 53 (CDR Н3), и аминокислотные последовательности CDR легкой цепи, указанные в SEQ ID NO: 57 (CDR L1), SEQ ID NO: 58 (CDR L2) и SEQ ID NO: 59 (CDR L3).
66. Антитело или связывающий фрагмент антитела, обладающее(ий) нейтрализующей активностью в отношении токсинов Clostridium difficile, включающее(ий) аминокислотные, последовательности гипервариабельных участков (CDR) тяжелой цепи, указанные в SEQ ID NO: 62 (CDR Н1), SEQ ID NO: 63 (CDR H2) и SEQ ID NO: 64 (CDR Н3), и аминокислотные последовательности CDR легкой цепи, указанные в SEQ ID NO: 68 (CDR L1), SEQ ID NO: 69 (CDR L2) и SEQ ID NO: 70 (CDR L3).
67. Антитело или связывающий фрагмент антитела, обладающее(ий) нейтрализующей активностью в отношении токсинов Clostridium difficile, включающее(ий) аминокислотные последовательности гипервариабельных участков (CDR) тяжелой цепи, указанные в SEQ ID NO: 73 (CDR Н1), SEQ ID NO: 74 (CDR H2) и SEQ ID NO: 75 (CDR Н3), и аминокислотные последовательности CDR легкой цепи, указанные в SEQ ID NO: 79 (CDR L1), SEQ ID NO: 80 (CDR L2) и SEQ ID NO: 81 (CDR L3).
68. Композиция, обладающая нейтрализующей активностью в отношении токсинов Clostridium difficile, содержащая комбинацию двух или более чем двух антител или связывающих фрагментов антител, выбранных из любого антитела или связывающего фрагмента антитела по любому из п.п. 65-67, в эффективном количестве.