ПРИМЕНЕНИЕ ПЕПТИДА Arg-Pro-Gly-Pro В КАЧЕСТВЕ ПРОТИВОВИРУСНОГО СРЕДСТВА ДЛЯ ЖИВОТНЫХ
ADMINISTRATION OF Arg-Pro-Gly-Pro PEPTIDE AS ANTIVIRAL AGENT FOR ANIMALS

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии и касается применения пептида Arg-Pro-Gly-Pro в качестве противовирусного средства для животных.
Разработка новых противовирусных препаратов всегда актуальна в связи с широким распространением вирусных заболеваний. Кроме того, в последние годы наблюдается популяционное снижение иммунитета, связанное с ухудшением среды обитания, что также способствует увеличению вирусных заболеваний.
Известен способ профилактики и лечения вирусных инфекций, включающий применение лекарственного средства [Ридостин, Циклоферон, Даларгин, Гриппферон, Арбидол-Лэнс, Ацикловир-Акри]. Однако данный известный способ не во всех случаях эффективен.
Пептид Arg-Pro-Gly-Pro известен из публикации [RU 2286166 С1 от 27.10.2006]. Однако в указанной публикации данный пептид используется в качестве средства, обладающего антикоагулярно-фибринолитической, антитромбоцитарной и антитромболитической активностью. Из данной публикации не следует, что указанный пептид может быть использован в качестве противовирусного средства. Таким образом, ранее из уровня техники не только не было известно применения указанного пептида в качестве противовирусного средства, но указанное применение не следовало из уровня техники. Следовательно, предложенное изобретение является, как новым относительно существующего уровня техники, так и соответствующим условию изобретательский уровень.
Из уровня техники известно противовирусное средство, представляющее собой пептид Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro [RU 2337703 С1 от 10.11.2008]. Данная публикация является наиболее близким аналогом заявленного изобретения. Недостатком ближайшего аналога является большая длина пептида, что повышает затраты на синтез указанного пептида. Недостатком указанного средства также является необходимость вводить его внутрибрюшинно.
Техническим результатом, достигаемым при реализации настоящего изобретения, является расширение ассортимента противовирусных лекарственных средств, повышение эффективности профилактики и лечения вирусных инфекций, снижение стоимости препарата за счет значительного упрощения синтеза предлагаемого тетрапептида Arg-Pro-Gly-Pro вместо гептапептида Селанк.
Указанный технический результат достигается тем, что тетрапептид Arg-Pro-Gly-Pro применяют в качестве средства профилактики и лечения инфекционных заболеваний вирусной этиологии (грипп, вирус энцефаломиокардита мышей).
Достигается указанный технический результат за счет того, что в способе профилактики и лечения вирусных инфекций, предусматривающем применение лекарственного средства, в качестве лекарственного средства используют указанный тетрапептид путем удобного введения его 0,1-1,1%-ного раствора в суточной дозе 0,2-5 мг/сутки на мышь в течение 2-3 дней. Собственными исследованиями было установлено, что препарат на основе указанного тетрапептида способен подавлять репродукцию вирусов гриппа, вируса энцефаломиокардита мышей и может быть применен для профилактики и лечения инфекционных заболеваний, вызванных вирусами, не оказывая при этом неблагоприятного побочного действия. Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение.
Пример 1.
Исследование противовирусной активности тетрапептида Arg-Pro-Gly-Pro при экспериментальной инфекции, вызванной вирусом энцефаломиокардита (ВЭМК) in vivo
-5
Опыты проводились на мышах - белых беспородных самцах весом 14-16 г. Действие каждого пептида проверялось на 10-и мышах. Оценивалась выживаемость мышей в каждой группе через 14 дней после заражения при введении препаратов (10 М) внутрибрюшинно одновременно с вирусом энцефаломиокардита (ВЭМК).
Полученные результаты приведены в таблице 1.
Исходя из полученных данных в исследованиях in vivo можно заключить, что изученные пептиды обладали выраженной противовирусной активностью в малых концентрациях.
Таблица 1
Выживаемость мышей под действием тетрапептида Arg-Pro-Gly-Pro, введенного внутрибрюшинно одновременно с заражением вирусом энцефаломиокардита (ВЭМК)
№
Пептиды
% выживаемости
1
Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro
20
2
Arg-Pro-Gly-Pro
100
3
Pro-Gly-Pro
80
4
Arg-Pro
40
5
Gly-Pro
60
6
контроль
20
Далее, представляло интерес изучить действие пептида в разных концентрациях при разных способах введения мышам, зараженным ВЭМК. Исследования проводились на белых беспородных мышах весом 14-16 г - по 5 мышей на каждую точку. Животных инфицировали ВЭМК в дозе 100 LD 50. Тетрапептид Arg-Pro-Gly-Pro в концентрациях 1%; 0,5%; 0,2%; 0,1% вводили животным внутрибрюшинно, интраназально, перорально по 0,2 мл/мышь в момент заражения. В качестве консерванта раствор содержал нипагин с концентрацией 0,09-0,11% раствора.
Контрольную группу составляли мыши, зараженные гриппом и получавшие плацебо. Срок наблюдения - 15 дней.
Противовирусный эффект пептида оценивали по выживаемости мышей (% выживаемости, % защиты, средняя гармоническая величина времени жизни).
Оценку активности пептида проводили, учитывая:
1) среднюю гармоническую величину времени жизни для каждой группы мышей, включающую в себя информацию обо всех особях, вычисляемую по формуле:
1
1
2
2
a
a
1/τ=(X/t+Х/t+…+X/t):n, где t - день гибели животных, Х - количество погибших животных в день t, а - день наблюдения; n - количество животных в группе (5 мышей);
2) кратность защиты (КЗ) - кратность уменьшения количества заболевших и павших животных в опытной группе по сравнению с контролем, вычисляемую по формуле:
КЗ=% павших животных в контрольной группе/% павших животных в опытной группе;
3) индекс эффективности препарата (ИЭ), вычисляемый по формуле: ИЭ=[(КЗ-1)/КЗ]×100%.
Результаты экспериментов по проверке противогриппозной активности препаратов представлены в таблицах 2-3.
Из представленных данных (таблица 2) видно, что тетрапептид Arg-Pro-Gly-Pro 1% при введении мышам внутрибрюшинно защищал от действия вируса энцефаломиокардита (ВЭМК) 40% животных. Использование пептида в концентрации 0,5% было эффективно при всех способах введения. Введение пептида в концентрации 0,2% - при внутрибрюшинном введении животным защищало 20% мышей. Применение тетрапептида Arg-Pro-Gly-Pro 0,1% приводило к защите также 40% животных от инфекции при пероральном и интраназальном способах введения. Исходя из данных, показывающих % выживших животных, и средней продолжительности жизни мышей, были отмечены наиболее эффективные способы и дозы применения тетрапептида:
Arg-Pro-Gly-Pro 1% (в/б);
0,2% (p/os; i/n; в/б);
0,1% (p/os, i/n).
Показано, что применение тетрапептида Arg-Pro-Gly-Pro по 0,2 мл/мышь 0,1-1% раствор (0,2-5 мг/мышь) с консервантом в виде нипагина с концентрацией 0,09-0,11% при разных способах использования способствовало увеличению срока жизни животных в ряде случаев на 4,5-8,5 дней.
Таблица 2
Противовирусная активность тетрапептида Arg-Pro-Gly-Pro в разных концентрациях при введении его in vivo в/бр, i/n и per/os
Способ введения пептида
Концентрация пептида
% выживаемости
% защиты
τ*
Arg-Pro-Gly-Pro
per/os
1%
0
0
6,17
i/n
1%
0
0
6,45
в/бр
1%
40
40
10,0
per/os
0,5%
20
20
8,06
i/n
0,5%
20
20
7,41
в/бр
0,5%
40
40
8,33
per/os
0,2%
0
0
5,56
i/n
0,2%
0
0
5,49
в/бр
0,2%
20
20
6,54
per/os
0,1%
40
40
9,80
i/n
0,1%
40
40
8,33
в/бр
0,1%
20
20
6,25
КОНТРОЛЬ ВЭМК
100 LD50
0
0
5,35
Примечание: *τ - средняя гармоническая величина времени жизни животных.
Таблица 3
Оценка эффективности тетрапептида Arg-Pro-Gly-Pro при гриппе
Схема введения пептида
Доза пептида
КЗ*
ИЭ** %
Arg-Pro-Gly-Pro
per/os
1%
1,0
0
i/n
1%
1,0
0
в/бр
1%
1,67
40
per/os
0,5%
1,25
20
i/n
0,5%
1,25
20
в/бр
0,5%
1,67
40
per/os
0,2%
1,0
0
i/n
0,2%
1,0
0
в/бр
0,2%
1,25
20
per/os
0,1%
1,67
40
i/n
0,1%
1,67
40
в/бр
0,1%
1,25
20
Контроль вируса
100LD50
1,0
0
Примечание: *КЗ - кратность защиты; **ИЭ - индекс эффективности препарата.
Расчет индекса эффективности (ИЭ) пептида при гриппе показал (таблица 3), что при введении тетрапептида Arg-Pro-Gly-Pro ИЭ=40% при использовании 1% и 0,5% при в/бр, а также 0,1% при per/os и i/n он также эффективно защищал животных.
Определение противовирусной активности тетрапептида Arg-Pro-Gly-Pro при разных схемах введения его животным
Исследование противовирусной активности пептидов при экспериментальной инфекции, вызванной вирусом энцефаломиокардита мышей (ВЭМК) in vivo.
Были проведены исследования эффективности ряда пептидов при инфекции, вызванной вирусом энцефаломиокардита мышей (ВЭМК) in vivo при введении пептида мышам по схемам:
профилактика -
1) за 24 часов до заражения,
2) 2 дня подряд за 24 и 48 часов до заражения;
лечение -
1) через 24 часа после заражения,
2) через 24 и 48 часов после заражения,
3) 3 раза подряд через 24, 48 и 72 часа после заражения.
Arg-Pro-Gly-Pro 0,1% i/n.
Заражение проводили вирусом энцефаломиокардита мышей (ВЭМК) в дозе 100 LD50.
Результаты по изучению противовирусной активности тетрапептида при разных схемах введения в отношении вируса гриппа на модели экспериментальной инфекции, вызванной ВЭМК у мышей, представлены в таблице 4. Показано, что тетрапептид защищал животных от действия ВЭМК. Выживших животных было при профилактической схеме введения тетрапептида до 50% больше по сравнению с контролем и до 60% - при использовании тетрапептида для лечения мышей.
Таблица 4
Выживаемость мышей под действием тетрапептида Arg-Pro-Gly-Pro при разных схемах введения при заражении мышей вирусом энцефаломиокардита (ВЭМК)
Пептид
% выживаемости
Arg-Pro-Gly-Pro профилактика 1-разовое введение
60
Arg-Pro-Gly-Pro профилактика 2-разовое введение
70
Arg-Pro-Gly-Pro Лечение 1-разовое введение
60
Arg-Pro-Gly-Pro Лечение 2-разовое введение
70
Arg-Pro-Gly-Pro Лечение 3-разовое введение
80
контроль
20
Полученные данные показали, что наибольший противовирусный эффект в отношении ВЭМК достигался при введении тетрапептида дважды до заражения или в течение трех дней после заражения мышей.