Использование ПЦР для идентификации и межвидового дифференцирования возбудителей сапа и мелиоидоза

Итак, на примере применения вейвлет-анализа показаны некоторые возможности этого математического аппарата, позволяющего выявить и наглядно показать улучшение разрешающей способности изображения наноструктур при электронной и зондовой микроскопии.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Гонсалес Р., Вудс Р., Эддинс С. Цифровая обработка изображений в среде МЛТЬЛБ. М.: Техносфера; 2006. 616 с.

2. Смоленцев Н.К. Основы теории вейвлетов. Вейвлеты в МЛТЬЛБ. М.: ДМК Пресс; 2005. 304 с.

3. Добеши И. Десять лекций по вейвлетам. Ижевск: НИЦ «Регулярная и хаотическая динамика»; 2001. 464 с.

N.P.Konnov, Yu.P.Volkov, M.N.Kireev,

O.S.Kuznetsov

APPLICATION OF WAVELET-ANALYSIS FOR IMAGE FILTRATION IN ELECTRONIC AND PROBE MICROSCOPY

Russian Anti-Plague Research Institute “Microbe", Saratov State Technical University

The review presents the results of application of the programs of discrete and stationary wavelet-analysis for filtration of object image from noise and for the increase of its resolution capability in electronic and probe microscopy.

Key words: wavelet-analysis, electronic and probe microscopy.

Поступила 03.11.07.

УДК 616.982.27+616.982.27-039:616-07

Д.А.Чухланцев, И.В.Маракулин, И.В.Дармов

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПЦР ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ И МЕЖВИДОВОГО ДИФФЕРЕНЦИРОВАНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ САПА И МЕЛИОИДОЗА

ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России», Киров

Проведена оценка возможности идентификации и дифференцирования возбудителей сапа и мелиоидоза методом ПЦР с использованием различных нуклеотидных последовательностей патогенных буркхолдерий. Выбраны праймеры, перспективные для включения в состав тест-системы, предназначенной для выявления ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза в пробах из окружающей среды и в биологических материалах.

Ключевые слова: сап, мелиоидоз, выявление, дифференциация, ПЦР.

Несмотря на успехи практической медицины в борьбе с инфекционными заболеваниями, в природе сохраняются резервуары сапной и мелиоидозной инфекций, а значит и вероятность заражения людей в эндемичных районах.

Симптоматика этих заболеваний, особенно на начальных стадиях болезни, весьма разнообразна и не имеет характерных признаков [4, 5]. В связи с этим клиническая диагностика сапа и мелиоидоза значительно затруднена и должна подтверждаться результатами лабораторных исследований.

Методы лабораторной диагностики сапа и мелиоидоза, основанные на бактериологическом и иммунологических методах исследования, позволяют с высокой достоверностью выявлять возбудителей сапа и мелиоидоза, однако занимают длительное время, либо недостаточно специфичны.

Использование полимеразной цепной реакции позволяет упростить проведение диагностических исследований, а главное, значительно сократить время анализа проб.

Публикации, посвященные разработке тест-систем для выявления возбудителей сапа и мелиоидоза методом ПЦР: появились давно, однако возможности исследователей значительно ограничивала недостаточность информации об организации генома этих возбудителей и близкородственных им микроорганизмов.

В последние годы интерес исследователей к возбудителям сапа и мелиоидоза значительно вырос.

Это нашло отражение и в увеличении числа работ по секвенированию геномов этих микроорганизмов и установлению связи отдельных генов с факторами патогенности этих возбудителей. Накопление данных об организации генома микроорганизмов рода ВигккоШвпа позволило также ближе подойти к решению вопроса дифференцирования возбудителей сапа и мелиоидоза методом ПЦР.

Достоверные результаты по дифференцированию возбудителей сапа и мелиоидоза могут быть получены при использовании риботипирования, ПЦР с произвольными праймерами, определения полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, метода мультилокусного сиквенс-типирования [2, 3, 4, 5]. Тем не менее, сложность и трудоемкость этих исследований не позволяют применять их в обычных диагностических лабораториях.

Дифференциация возбудителей сапа и мелиоидоза методом ПЦР - достаточно сложная задача. Анализ литературных данных показывает, что их генетическое сходство очень велико. Высказывается даже предположение о том, что возбудители сапа и мелиоидоза являются разными штаммами одного вида, а не отдельными видами микроорганизмов [2]. Однако, выявленные к настоящему времени различия в организации генома возбудителей сапа и мелиоидоза позволяют предположить, что решение вопроса дифференцирования патогенных буркхолдерий методом ПЦР возможно [8].

Целью данной работы являлась оценка эффек-

тивности выявления возбудителей сапа и мелиоидоза с помощью выбранных специалистами ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» олигонуклеотидных праймеров, а также оценка возможности дифференциации этих возбудителей на основе описанных в литературе различий в последовательностях генов системы «quorum sensing» и lôS-рРНК [6, 9].

Материалы и методы

Для идентификации патогенных буркхолдерий использованы выбранные специалистами ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» олигонуклеотидные праймеры, предназначенные для выявления различных генетических детерминант возбудителей сапа и мелиоидоза.

Оценку возможности дифференциации возбудителей сапа и мелиоидоза проводили с использованием праймеров, описанных в работе P.Oyston и соавт. [6], а также с помощью олигонуклеотидных затравок, выбранных нами на основе различий в последовательностях генов системы «quorum sensing» Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei и ^S-рРНК. Праймеры синтезированы специалистами ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» фосфоа-мидитным методом с последующей очисткой их методом ВЭЖХ.

Для оценки праймеров в ПЦР использовали препараты ДНК B. mallei штаммов Ц-5, 5584, Иванович, Будапешт, B. pseudomallei штаммов С-141, Duc-V, Dalat а также 9 штаммов Burkholderia cepacia, выделенных от больных людей и 9 штаммов разных видов, принадлежащих к роду Рseudomonas (P bo-visepticum, P. aeruginosa, P. pseudoalcali genes, P. alli-cola, P. testosteroni, P. stutzeri, P. putida, P. fluorescens, P. marginata).

Обеззараживание исследуемых проб осуществляли в соответствии с требованиями санитарных правил (СП 1.3.1285-03). Подготовку проб для анализа методом ПЦР осуществляли с использованием «Набора для подготовки проб к исследованиям методом ПЦР» производства ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России».

Результаты и обсуждение

При выборе генетических детерминант, предназначенных для выявления возбудителей инфекционных заболеваний, общепринятым является использование консервативных нуклеотидных последовательностей, а также генов, обеспечивающих проявление микроорганизмами патогенных свойств.

В работах по идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза использовали последовательности генов, кодирующих ^S-рРНК и 23S-рРНК, которые, по данным литературы, являются наиболее консервативными участками генома различных микроорганизмов, а также последовательности генов капсулярного полисахарида 1 типа, вклад которого в виру-

лентность возбудителей сап и мелиоидоза показан в ряде научных публикаций [1, 7].

В ходе исследований было установлено, что использование в ПЦР праймеров, выбранных на основе последовательности генов, кодирующих ^S-рРНК и генов капсулярного полисахарида 1 типа, обеспечивает выявление в анализируемой пробе ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза в концентрации, соответствующей 102 м.к. в 1 мл пробы, при отсутствии ложноположительных реакций с ДНК близкородственных видов микроорганизмов. Аналогичные результаты были получены и при использовании праймеров, выбранных на основе последовательности гена, кодирующего 23S-рРНК. Однако ПЦР с использованием этих праймеров обеспечивала выявление в анализируемой пробе ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза в концентрации, соответствующей 103 м.к. в 1 мл пробы, что согласуется с литературными данными.

Эффективность выявления ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза с использованием выбранных праймеров была также подтверждена при исследовании биопроб, взятых от лабораторных животных, зараженных возбудителями сапа. При исследовании в ПЦР проб тканей легких, печени и селезенки инфицированных животных (обезьян Papio hamadryas), во всех случаях были получены положительные результаты.

Исследования генетической организации ^S-рРНК различных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза, проведенные зарубежными исследователями, позволили выявить различия в нуклеотидных последовательностях B. mallei и B. pseudomallei [2]. Выявленные различия незначительны, тем не менее авторы предложили использовать их для дифференцирования B. mallei и B. pseudomallei.

Выбранные с учетом этих различий праймеры В16-1, 2 не позволяли дифференцировать B. mallei и B. pseudomallei. Образование специфического ам-плификата наблюдали при проведении ПЦР с ДНК как возбудителя сапа, так и возбудителя мелиоидоза.

Больший, по нашему мнению, интерес представляет одна из последних работ F.M.Thibault и соавт., посвященная изучению генетической организации системы «quorum sensing» возбудителей сапа и мелиоидоза [8]. Авторами показано, что организация этой части генома сапного микроба в значительной мере отлична от системы «quorum sensing» возбудителя мелиоидоза. Главное отличие заключается в отсутствии у возбудителя сапа генов bpmI2 и bpmR2, присутствующих в геноме возбудителя мелиоидоза [8].

Для оценки возможности использования указанных различий в структуре геномов возбудителей сапа и мелиоидоза для дифференциации этих видов микроорганизмов нами были выбраны и синтезированы праймеры, комплементарные последовательностям генов bpmI2 и bpmR2, а также ^S-рРНК. Результаты исследований, проведенных с использованием синтезированных праймеров, представлены в таблице,

Оценка специфичности праймеров с использованием препаратов ДНК, выделенных из различных видов микроорганизмов

Наличие амплификата при проведении ПЦР с праймерами ...

Штаммы B16-1 BpmI2-11 BpmI2-21 BpmI2-31 BpmI2-f BpmR2-f

B16-2 BpmI2-12 BpmI2-22 BpmI2-32 BpmI2-r BpmR2-r

B. mallei Ц-5 + - - - - -

B. mallei 5584 + + + + + +

B. mallei Иванович + + + + + +

B. mallei Будапешт + - - - - -

B. pseudomallei С-141 + + + + + +

B. pseudomallei Duc-V + + + + + +

B. pseudomallei Dalat + + + + + +

B. cepacia Б-306 - - - - - -

B. cepacia Б-506 - - - - - -

B. cepacia Б-402 - - - - - -

B. cepacia Б-0499 - - - - - -

B. cepacia L-14 - - - - - -

B. cepacia L-98 - - - - - -

B. cepacia L-95 - - - - - -

B. cepacia L-97 - - - - - -

B. cepacia L-89 - - - - - -

P. bovisepticum - - - - - -

P. aeruginosa - - - - - -

P. pseudoalcaligenes - - - - - -

P. allicola - - - - - -

P. marginata - - - - - -

P. testosteroni - - - - - -

P. stutzeri - - - - - -

P. putida 1 - - - - - -

P. putida 2 - - - - - -

E. coli 803 - - - - - -

из которой видно, что праймеры, комплементарные последовательностям генов bpmI2 и bpmR2 не позволяют достоверно дифференцировать возбудителей сапа и мелиоидоза, поскольку специфический амплификат образуется не только при использовании ДНК возбудителя мелиоидоза, но и ДНК штаммов возбудителя сапа. Однако использованные праймеры позволяют дифференцировать отдельные штаммы возбудителя сапа, в том числе и высоковирулентный штамм Ц-5 B. mallei, который широко используется при проведении экспериментальных исследований. При анализе проб ДНК близкородственных и гетерологичных видов микроорганизмов образования специфических амплификатов не наблюдали, а чувствительность ПЦР с использованием данных праймеров составляла 102 м.к. в 1 мл исследуемой пробы.

Дифференцировать B. mallei и B. pseudomallei на основе описанных в литературе различий в последовательностях генов 168-рРНК и системы «quorum sensing» нам не удалось. Данные о специфичности праймеров, выбранных на основе нуклеотидных последовательностей системы бактериального кворума генов B. mallei и B. pseudomallei указывают на значительные отличия в организации системы бактериаль-

ного кворума у разных штаммов B. mallei.

В результате выполненных исследований была показана возможность использования для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза нуклеотидных последовательностей генов 168-рРНК и генов, коди -рующих капсулярный полисахарид 1 типа B. mallei и B. pseudomallei. Чувствительность ПЦР-анализа с выбранными праймерами составляет 102 м.к. в 1 мл исследуемой пробы. Выбранные праймеры перспективны для включения в состав тест-системы, предназначенной для выявления ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза в пробах из окружающей среды и в биологических материалах.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Мелиоидоз. Сб. науч. тр. под ред. акад. Н.Г Тихонова. Волгоград: Ниж.-Волж. кн. изд-во; 1995. 224 с.

2. Godoy D., Randle G., Simpson A.J. et al. Multilocus sequence typing and evolutionary relationships among the causative agents of melioidosis and glanders, Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei. J. Clin. Microbiol. 2QQ3; 41:2Q68-79.

3. Haase A., Melder A., Smith-Vaughan H., Kemp D., Currie B. RAPD analysis of isolates of Burkholderiapseudomallei from patients with recurrent melioidosis. Epidemiol. Infect. 1995; 115(1):115-21

4. Inglis T.J., O’Reilly L., Foster N., Clair A., Sampson J. Comparison of rapid, automated ribotyping and DNA macrorestriction analysis of Burkholderia pseudomallei. J. Clin. Microbiol. 2QQ2;

40(9):3198-203.

5. Leelayuwat C., RomphrukA., LulitanondA., Trakulsomboon S., Thamlikitkul V. Genotype analysis of Burkholderia pseudomallei using randomly amplified polymorphic DNA (RAPD): indicative of genetic differences amongst environmental and clinical isolates. Acta Trop. 2000; 77(2):229-37.

6. Oyston P., Ulrich R., Jeddelon J. Пат. No. 60/396 W02004006857. Glanders/Meliodosis Vaccines. США.

7. Reckseidler S.L., DeShazer D., Sokol P.A., Woods D.E. Detection of Bacterial Virulence Genes by Subtractive Hybridization: Identification of Capsular Polysaccharide of Burkholderia pseudomallei as a Major Virulence Determinant. Infect. Immun. 2001; 69(1):34-4.

8. Thibault F.M., Valade E., Vidal D.R. Identification and discrimination of Burkholderia pseudomallei, B. mallei, and B. thailan-densis by real-time PCR targeting type III secretion system genes. J. Clin. Microbiol. 2004 Dec;42(12):5871--4.

9. Tyler S.D., Strathdee C.A., Rozee K.R., Johnson W.M. 0ligonucleotide primers designed to differentiate pathogenic

seudomonads on the basis of the sequencing of genes coding for 6S-23S rRNA internal transcribed spacers. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1995; 2(4):448-53.

D.A.Chuhlantsev, I.V.Marakulin,

I.V.Darmov

Application of PCR for Identification and Interspecific Differentiation of Glanders and Melioidosis Etiological Agents

The 48h Central Scientific Research Institute of the RF Ministry of Defens,

Kirov

Assessed were possibilities of identification and differentiation of glanders and melioidosis etiological agents by means of PCR method using different nucleotide sequences of the pathogenic Burkholderia.

Primers perspective for inclusion in the test-system assigned for detection of glangers and melioidosis etiological agents DNA in environmental samples and biological materials were selected.

Key words: glanders, melioidosis, detection, differentiation, PCR.

nocTynn^a 26.02.08.

КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ

УДК 616.981.452

Л.В.Самойлова

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ РАЗВИТИЯ КЛИНИЧЕСКИХ ФОРМ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ЧУМЫ ПРИ АЭРОГЕННОМ И ПОДКОЖНОМ ЗАРАЖЕНИИ ВИРУЛЕНТНЫМИ ШТАММАМИ Y. PESTIS И ИХ ИЗОГЕННЫМИ ВАРИАНТАМИ С РАЗЛИЧНЫМ ПЛАЗМИДНЫМ ПРОФИЛЕМ

ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов

Представлены обобщенные результаты сравнительных исследований по развитию экспериментальной чумы у лабораторных животных после аэрогенного и подкожного заражения вирулентными штаммами Y. pestis (pFra+, pCad+, pPst+, ряш+) и их изогенными вариантами с утратой pFra и/или pPst. В зависимости от пути передачи инфекции и дозы возбудителя один и тот же штамм и его изогенные варианты вызывает как легочную, так и бубонно-септическую форму чумы у лабораторных животных. Показано, что у лабораторных животных, зараженных аэрогенно и подкожно изогенными вариантами Y. pestis, лишенными плазмид pPst или pPst/pFra, выращенными при 28 °С на агаре Хоттингера, развивается затяжной инфекционный процесс.

Ключевые слова: чумной микроб, штамм, изогенный вариант, аэрогенное заражение, легочная чума.

В связи с успехами в области молекулярной биологии, расшифровкой генома возбудителя чумы, характеристикой вирулентности в зависимости от генотипа возбудителя стал возникать вопрос, особенно в последние два десятилетия, о роли генотипа возбудителя чумы в развитии той или иной клинической формы болезни. Однако к настоящему времени влияние детерминант вирулентности У. pestis на развитие легочной формы чумы не установлено.

В связи с этим проведено обобщение результатов исследований по определению роли генотипа чумного микроба в развитии легочной формы чумы. Для этого были получены изогенные варианты вирулентных штаммов возбудителя с различными наборами двух собственных плазмид чумного микроба (рБга и рР81) при сохранении всеми вариантами плазмиды pCad.

Штаммы. Использовали три вирулентных штамма У. pestis 231, 358, 629М и изогенные варианты штаммов 358 и 629М, утратившие собственные

плазмиды рБга и/или рР8І. Изогенные варианты получали путем направленного конструирования в отделе генетики РосНИПЧИ «Микроб». Штаммы выращивали при 28 °С на агаре Хоттингера, рН 7,2±0,2.

Аэрогенно заражали морских свинок весом 300-350 г и беспородных белых мышей весом от 20 до 25 г в аэродинамической камере и рассчитывали аспирационную дозу по методике Л.В. Самойловой и Н.И.Николаева [1, 3]. Подкожное заражение проводили общепринятым методом. После заражения вели наблюдение в течение 14 дней и подсчитывали ьб50 и СТ50 (50 % летальная доза для аэрогенного заражения) штаммов по формуле Кербера. Бактериологическое, морфологическое и гистологическое исследования проводили общепринятыми методами. Все исследования проводили в соответствии с Инструкцией по режиму работы с аэрозолями возбудителей особо опасных инфекций (1976) и СП 1.3.12.85-03 «Безопасность работы с микроорга-