Исследование контрлатерального сустава при моделировании аваскулярного некроза головки бедренной кости в эксперименте на кроликах

http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2226-7425-2017-19-11-49-53

УДК 616.71-002.4: 616.718.41

ИССЛЕДОВАНИЕ КОНТРЛАТЕРАЛЬНОГО СУСТАВА ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ АВАСКУЛЯРНОГО НЕКРОЗА ГОЛОВКИ БЕДРЕННОЙ КОСТИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ НА КРОЛИКАХ

Корыткин А.А., Захарова Д.В., Орлинская Н.Ю., Тенилин Н.А., НовиковаЯ.С.

ФГБУ Приволжский федеральный медицинский исследовательский центр, г. Нижний Новгород, Российская Федерация

Аннотация. Выполнено исследование по изучению контрлатерального сустава при моделировании аваскулярного некроза головки бедренной кости на кроликах. Моделирование очага аваскулярного некроза осуществлялось путем введения 0,3-0,4 мл 96% этанола в головку бедренной кости лабораторного животного при использовании малотравматичного доступа, схожего с хирургическим доступом, применяющимся для лечения пациентов с аваскулярным некрозом головки бедренной кости. Место инъекции этанолом закрывали воском, операционное поле промывали физиологическим раствором для удаления остатков спирта. Установлено, что через 14 суток после введения этанола в головке бедренной кости контрлатерального сустава наблюдается компенсаторная реакция - утолщение костных балок, что, предположительно, связано с увеличением нагрузки на контрлатеральный тазобедренный сустав в послеоперационном периоде. Через 28 и 60 суток после воздействия спиртом отмечено отсутствие гистологических, анатомических и функциональных изменений в контрлатеральном суставе, сохраняется естественная активность животного. Используемая модель не оказывает патологического влияния на контрлатеральный сустав, который можно использовать как контрольный при исследовании новых способов лечения аваскулярного некроза головки бедренной кости и методов влияния на репаративные процессы в тазобедренном суставе. Ключевые слова: контрлатеральный сустав, экспериментальная модель аваскулярного некроза головки бедренной кости, гистологическое исследование.

Введение. Аваскулярный некроз головки бедренной кости (АНГБК) - широко распространенное заболевание тазобедренного сустава. В США ежегодно диагностируется до 600 тысяч новых случаев данной патологии, причём половина пациентов, обращающихся за медицинской помощью, относится к трудоспособной категории населения [1]. В Российской Федерации до 5% дегенеративно-дистрофических поражений тазобедренного сустава приходится на пациентов с АНГБК [2].

В настоящее время проблема лечения пациентов с аваскулярным некрозом головки бедренной кости остается актуальной, о чем свидетельствует неослабевающее внимание к ней специалистов. Существует множество вариантов органосохраняющего и радикального хирургического лечения АНГБК, среди которых различают соге-декомпрессию, корригирующие остеотомии, ресерфейсинг или поверхностное эндо-протезирование, тотальное эндопротезирование и некоторые другие. Однако, окончательного решения в терапии аваскулярного некроза головки бедренной кости, гарантирующего удовлетворительные результаты, на сегодняшний момент нет, и проблема его лечения

требует дальнейшего изучения [3]. Экспериментальные исследования на моделях АНГБК суставов лабораторных животных позволят совершенствовать имеющиеся, разрабатывать и внедрять в практику новые замещающие костные дефекты материалы, способы профилактики и лечения обозначенной патологии.

Известно большое количество моделей остео-некроза головки бедренной кости, которые можно разделить на лекарственные, хирургические и комбинированные. Авторами описываются методики моделирования аваскулярного некроза путём введения различных веществ: липополисахарида и метилпреднизо-лона, жидкого азота, раствора адреналина, суспензии металлического серебра и других [4, 5, 6]. Также для моделирования АНГБК выполняют оперативные вмешательства: удаление надкостницы, перевязку мышц проксимального отдела бедра или круглой связки, иссечение капсулы сустава [6, 7].

В настоящее время широко используется способ моделирования стероид-ассоциированного аваскуляр-ного некроза головки бедренной кости у лабораторных животных, осуществляемый путем внутривенных инъ-

екций липополисахарида дважды через сутки в количестве 10 мкг/кг массы тела, и внутримышечного введения метилпреднизолона трижды через сутки в количестве 20 мг/кг массы тела кролика [4]. Существует методика моделирования АНГБК путем проведения курса внутрисуставных инъекций 0,1-0,3 мл 0,1% раствора адреналина в течение месяца через каждые 6 часов [5]. Схожий способ моделирования аваскулярного некроза проксимального эпифиза бедренной кости включает введение в ткани тазобедренного сустава адреналина в дозе 0,5 мл ежедневно в течение 30 суток, дополнительно с 15-го дня введения гормона осуществляют тракции на тазобедренный сустав: ежедневные сгибания и разгибания конечности в количестве 10 раз по 3 повторения в течение двух недель [6].

Описываются методы моделирования АНГБК путем создания условий для нарушения кровоснабжения питающих головку бедренной кости сосудов, среди которых известен способ создания модели аваскулярного некроза за счет введения в эпифиз бедренной кости 1 мл смеси этилового спирта и хлористого кальция. Также был описан способ формирования аваскулярного некроза головки бедренной кости в эксперименте, включающий введение в субэпифизарную зону бедренной кости тромбовара, за счет чего происходило развитие локальной гиперкоагуляции с нарушением венозного оттока и формирование АНГБК. Применяется способ моделирования аваскулярного некроза эпифизов костей блокированием микроциркулятор-ного русла, достигаемым за счет введения суспензии металлического серебра в одну из артерий, питающих тазобедренный сустав, с дальнейшей перегрузкой оперированной нижней конечности, создаваемой путем ахиллотомии на противоположной стороне [6].

Среди хирургических способов моделирования АНГБК применяются модели остеонекроза, создаваемые путем наложения вокруг бедренной кости хомута из нержавеющей стали, за счёт чего повышается внут-рикостное давление, или включающие вскрытие тазобедренного сустава с круговым пересечением его капсулы и круглой связки, и последующим удалением надкостницы по всему периметру шейки бедренной кости [6].

Большинство предлагаемых оперативных методов моделирования аваскулярного некроза являются технически сложными и высоко инвазивными, изменяют ориентацию структур сустава, а, следовательно, и биомеханику движений, а при АНГБК, индуцированном лекарственными веществами, возможен системный эффект вводимых препаратов на организм экспериментального животного. Кроме того, авторы не акцентируют внимание на состоянии контрлатерального сустава, часто слепо используя его в качестве контрольного, или моделируют аваскулярный некроз головки

бедренной кости билатерально, что исключает нормальные нагрузки и также искажает конечный результат исследования.

При планировании исследований по изучению свойств композитных материалов, факторов роста сосудов и лекарственных препаратов, применяемых для профилактики и лечения АНГБК в экспериментах на лабораторных животных важно изучать состояние контрлатерального сустава для исключения системного эффекта используемых средств.

Цель исследования - изучить контрлатеральный сустав при моделировании аваскулярного некроза головки бедренной кости в эксперименте.

Материалы и методы. Моделирование аваскулярного некроза головки бедренной кости проводили на 17 кроликах в возрасте 6±1 месяцев с массой тела 3500±500 грамм следующим образом: выполняли разрез кожных покровов в проекции заднего края большого вертела, послойное разведение мышц, рассечение капсулы сустава, вывих головки бедренной кости с одномоментным пересечением круглой связки. Затем в головку бедренной кости кролика с помощью шприца вводили 0,3-0,4 мл 96% спирта, место инъекции закрывали воском, операционное поле промывали физиологическим раствором для удаления остатков этанола. На завершающем этапе производили вправление головки бедренной кости в анатомическую позицию с послойным ушиванием раны [8].

Экспериментальные животные были разделены на три группы: А - кролики, которые выводились из эксперимента через 14 суток, Б - кролики, которые выводились из эксперимента через 28 суток, и В - кролики, которые выводились из эксперимента через 60 суток после воздействия спиртом по описанной методике. Головки бедренных костей фиксировали в 10% формалине, декальцинировали в растворе Биодек, подвергали обезвоживанию в спиртах восходящей концентрации, помещали в ксилол и заливали в парафин. Осуществляли стандартную гистологическую проводку на аппарате «Excelsior ES», изготовливали парафиновые блоки с использованием заливочной станции «HistoStar» и получали серийные срезы толщиной 4-6 микрон микротомом «Microm HM 325» (Thermo Scientific). Срезы головок бедренных костей окрашивали гематоксилином и эозином. Для морфометриче-ской обработки материала применяли микроскоп Leica DM 2500, оценку гистопатологических изменений проводили при увеличении Х 50 и Х 200.

Исследование было одобрено решением локального этического комитета Приволжского федерального медицинского исследовательского центра (протокол № 6 от 20.05.2016). Лабораторные животные содержались в стандартных условиях. Все болезненные манипуляции над кроликами осуществлялись под

обезболиванием, эксперимент проводился в соответствии с методическими рекомендациями «Деонтология медико-биологического эксперимента» с соблюдением правил гуманного обращения с животными «Report of the AVMA Panel on Euthanasia».

Результаты. Через 28 суток после введения в головку бедренной кости кроликов 96% этанола по описанной схеме в тазобедренных суставах, на которых осуществлялось моделирование аваскулярного некроза, были зафиксированы начальные проявления АНГБК. Головки бедренных костей сохраняли сферичную форму, однако поверхность суставного хряща была деформирована. На микропрепаратах прослеживались нечеткие границы субхондральных костных пластинок. В спонгиозе присутствовали лакуны без костных структур, обрамленные нежизнеспособными

костными балками. Таким образом, гистологически было подтверждено, что очаг аваскулярного некроза формировался через 4 недели после введения этанола.

При макроскопическом исследовании экспериментальных препаратов, полученных у лабораторных животных группы А через 14 суток после воздействия 96% этиловым спиртом, головка бедренной кости контрлатерального тазобедренного сустава визуально была интактна, трофика хряща не нарушена. Головка бедренной кости сохраняла анатомически правильную сферичную форму, дефекты суставного хряща отсутствовали, его поверхность оставалась гладкой и матовой. На разрезе губчатое вещество головки бедренной кости было равномерным, патологические изменения отсутствовали (рис. 1).

Рис.1. Фрагменты головки бедренной кости контрлатерального сустава кролика группы А

При гистологическом исследовании микропрепаратов головки бедренной кости контрлатерального тазобедренного сустава кроликов группы А отмечены несущественные изменения, а именно, утолщение костных балок (рис. 2 а). Субхондральная субламинарная

спонгиоза головки бедренной кости с нормальной архитектоникой костных структур, плотность клеточных элементов нормального строения (рис. 2 б).

А

Б

Рис. 2. Микропрепараты головки бедренной кости контрлатерального сустава кролика группы А. Окраска гематоксилин-эозином. Увеличение х 50: а - участок энхондрального остеогенеза, утолщение костной

балки; б - субламинарная спонгиоза

Макропрепараты головки бедренной кости контрлатерального тазобедренного сустава кроликов группы Б через 28 суток после воздействия спиртом сохраняли правильную анатомическую форму, губчатое вещество на разрезе располагалось равномерно. При

гистологическом исследовании костные балки в спон-гиозном слое головки бедренной кости оставались неизмененными. Хрящ головки бедренной кости был в нормальном состоянии с сохраненной архитектоникой (рис. 3 а) и плотностью костных элементов в костных балках (рис. 3 б).

Рис. 3. Микропрепараты головки бедренной кости контрлатерального сустава кролика группы Б. Окраска гематоксилин-эозином. Увеличение х 200: а - нормальная архитектоника хряща; б - костная балка

Головки бедренной кости контрлатерального сустава лабораторных животных группы В через 60 суток после воздействия спиртом макро- и микроскопически оставались интактными с нормальной архитектоникой суставного хряща и костных структур (рис. 4).

Не было обнаружено каких-либо признаков изменений тканей, составляющих контрлатеральный тазобедренный сустав.

Рис. 4. Микропрепарат головки бедренной кости контрлатерального сустава кролика группы В. Окраска гематоксилин-эозином. Увеличение х 200

Заключение. Используемая в эксперименте модель аваскулярного некроза головки бедренной кости путем воздействия 96% спиртом является малотравматичной и практически повторяет хирургический доступ, применяемый в клинической практике при органосохраня-ющей терапии пациентов с АНГБК. При ее использовании сохраняется естественная активность лабораторных животных, отсутствует системный эффект на контрлатеральный сустав.

При гистологическом исследовании головки бедренной кости сустава, противоположного тому, на котором моделировался аваскулярный некроз, через 14 суток после введения 96% этанола наблюдалась компенсаторная реакция - утолщение костных балок, что могло быть связано с перераспределением массы тела животного на не оперированную конечность и увеличением нагрузки на сустав в послеоперационном периоде. Через 28 и 60 суток после воздействия спиртом гистологических, анатомических и функциональных изменений в контрлатеральном тазобедренном суставе обнаружено не было. Перегрузка контрлатерального сустава и системный эффект от воздействия этанолом отсутствовали.

Так как очаг аваскулярного некроза формируется через 4 недели от момента введения 96% спирта в головку бедренной кости кролика, то контрлатеральный сустав можно использовать в качестве контрольного при моделировании АНГБК по предложенной методике в эксперименте, что позволит на доклиническом этапе отработать применение новых материалов для заполнения костных дефектов и методов влияния на репаративные процессы в тазобедренном суставе.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

[1] Autologous bone marrow mesenchymal stem cells associated with tantalum rod implantation and vascularized iliac grafting for the treatment of end-stage osteonecrosis of the femoral head / D. Zhao [et al.] // BioMed Research International. 2015. Vol. 2015. P. 1-9.

[2] Шушарин А.Г., Половинка М.П., Прохоренко В.М. Асептический некроз головки бедренной кости: варианты консервативного лечения и результаты // Фундаментальные исследования. 2014. № 10 (2). С. 428-435.

[3] Лечение остеонекроза головки бедра / И.Ф. Ахтямов [и др.]. Казань, 2013. 176 с.

[4] Model establishment, MRI and pathological features of early steroid-induced avascular necrosis of femoral head in rabbit / L. Zhang [et al.] // Zhongguo Xiu Fu Chong Jian

Wai Ke Za Zhi. 2015. Vol. 29, № 10. P. 1240-1243.

[5] Беренштейн С.С. Способ моделирования асептического некроза головки бедренной кости // Ортопедия, травматология. 1993. № 2. С. 35-36.

[6] Способ моделирования асептического некроза головки бедренной кости / Г.В. Слизовский [и др.] // Мать и дитя в Кузбассе. 2017. № 1. С. 33-36.

[7] Попов И.В. Современные взгляды на этиологию, патогенез и принципы лечения остеохондропатии головки бедренной кости - болезни Легга-Кальве-

Пертеса (обзор литературы) // Травматология и ортопедия России. 2002. № 2. С. 59-66.

[8] Экспериментальная модель аваскулярного некроза головки бедренной кости / А.А. Корыткин, Д.В. Захарова, Н.Ю. Орлинская, С.Н. Бугров, Н.А. Тенилин, Я.С. Новикова // Современные проблемы науки и образования. 2017. № 4. URL: http://www.science-education.ru/article/view?id=26712 (дата обращения: 08.09.2017).

A STUDY OF THE CONTRALATERAL JOINT IN THE MODELING OF A VASCULAR NECROSIS OF THE FEMORAL HEAD IN THE EXPERIMENT ON RABBITS

Korytkin A.A., Zakharova D.V., Orlinskaya N.Yu., Tenilin N.A., Novikova Ya.S.

Privolzhsky Federal Research Medical Centre, Nizhny Novgorod, Russian Federation

Annotation. A study to examine contralateral joint while inducing avascular necrosis of the femoral head in rabbits was performed. The modeling of avascular necrosis locus was carried out by infusing femoral head with 96% ethanol. Surgical exposure was less invasive and like one we are using in our everyday practice. The injection site was closed with wax, the wound then was rinsed with saline to remove remaining ethanol. A compensatory reaction was observed in the femoral head of the contralateral joint - thickening of trabeculae of spongy bone after 14 days after administration of ethanol, which supposedly is related to an increase in load in contralateral hip joint during postoperative period. After 28 and 60 days since the injection of ethanol histological, anatomical and functional changes in the contralateral joint were not found, the animal remained healthy and active. The technique we used did not negatively impact the contralateral joint, which can serve as a control in further studies of new methods of treatment of avascular necrosis of femoral head.

Key words: contralateral joint, experimental model of avascular necrosis of the femoral head, histological investigation.

REFERENCES

[1] Autologous bone marrow mesenchymal stem cells associated with tantalum rod implantation and vascularized iliac grafting for the treatment of end-stage osteonecrosis of the femoral head / D. Zhao [et al.] // BioMed Research International. 2015. Vol. 2015. P. 1-9.

[2] Shusharin A.G., Polovinka M.P., Prokhorenko V.M. Aseptic necrosis of femoral head: options for conservative treatment and results // Fundamental research. 2014. № 10 (2). P. 428-435. (in Russian).

[3] Treatment of osteonecrosis of the femoral head / I.F. Akhtyamov [et al.]. Kazan, 2013. 176 p. (in Russian).

[4] Model establishment, MRI and pathological features of early steroid-induced avascular necrosis of femoral head in rabbit / L. Zhang [et al.] // Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 2015. Vol. 29, № 10. P. 1240-1243.

[5] Berenshtein S.S. A method of modeling aseptic necrosis of the femoral head // Orthopedics, traumatology. 1993. № 2.

P. 35-36. (in Russian).

[6] A method of modeling aseptic necrosis of the femoral head / G.V. Slizovskiy [et al.] // Mother and baby in Kuzbass. 2017. № 1. P. 33-36.

[7] Popov I.V. Modern views on etiology, pathogenesis and principles of treatment of the osteochondropathy of the femoral head - Legg-Calve-Perthes disease (literature overview) // Traumatology and Orthopedics of Russia. 2002. № 2. P. 59-66. (in Russian).

[8] The experimental model of avascular necrosis of the femoral head / A.A. Korytkin, D.V. Zakharova, N.Yu. Orlinskaya, S.N. Bugrov, N.A. Tenilin, Ya.S. Novikova // Modern problems of science and education. 2017. № 4. URL: http://www.science-education.ru/article/view?id=26712 (accessed: 08.09.2017). (in Russian).

Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК