Цитогенетические исследования в международной программе ВОЗ по изучению медицинских последствий аварии на Чернобыльской АЭС

РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ

Цитогенетические исследования в международной программе ВОЗ по изучению медицинских последствий аварии на Чернобыльской АЭС *

Сушкевич Г.Н.

Всемирная организация здравоохранения, Женева, Швейцария

В работе представлен обзор основных подходов, связанных с использованием цитогенетических методов в медико-биологических исследованиях, в частности, в программах и проектах ВОЗ по изучению медицинских последствий аварии на Чернобыльской АЭС. Особо подчеркнут вклад известного радиобиолога и генетика Н.В.Лучника в развитие теории и практики анализа аберраций хромосом.

Cytogenetic studies in WHO International Programme on the Health Effects of the Chernobyl Accident

Souchkevitch G.N.

World Health Organization, Geneva, Switzerland

The paper presents a review of main approaches related to use of cytogenetic methods in biomedical studies, in particular, in progammes and projects of WHO for investigation of medical consequences of the Chernobyl accident. The paper stresses the contribution of prominent radiobiologist and geneticist N.V.Luchnik to development of the theory and practice of chromosome aberrations analysis.

Радиационная цитогенетика, одним из ярких представителей которой является Н. В. Лучник, внесла значительный вклад в развитие радиобиологии и радиационной медицины. Этот вклад особенно ощутим в разработке следующих научных направлений, нацеленных на изучение биологических эффектов радиации [1] и прикладного использования достижений радиационной цитогенетики:

1. Теоретическая радиобиология:

- природа кривых доза-эффект;

- эффекты мощности дозы и фракционирования дозы;

- эффекты линейной передачи энергии.

2. Понимание роли хромосомных аберраций в механизме развития следующих радиобиологических эффектов:

- гибель клеток;

- мутации;

- канцерогенез.

3. Изучение цитогенетических радиобиологических эффектов на молекулярном уровне.

4. Биологическая дозиметрия и реконструкция доз.

5. Оптимизация лучевой терапии.

6. Развитие новых технологий для цитогенетического анализа.

ВОЗ, будучи международным учреждением, призванным, в первую очередь, оказывать практическую помощь национальным органам здравоохранения в улучшении здоровья населения и уменьшении медицинских последствий техногенных и естественных катастроф, основное внимание уделяет возможности прикладного использования научных достижений. Применительно к проблеме изучения влияния на здоровье людей радиационного облучения вследствие аварии в Чернобыле ВОЗ придает большое значение возмож-

Работа была представлена на конференции “Хромосомы и радиация”, посвященной памяти известного радиобиолога и генетика, профессора Н.В.Лучника, 21-22 января 1997 г., Обнинск.

ности использования методов биологической дозиметрии, включая и те, которые основаны на изучении хромосомных аберраций, для реконструкции индивидуальных доз у лиц, подвергшихся радиационному воздействию. Вместе с тем, преследуя практические цели, ВОЗ не упускает возможности расширить и научное знание. Такой подход в полной мере проявляется в Международной программе ВОЗ по уменьшению медицинских последствий чернобыльской аварии. Эта программа широко известна под названием АЙФЕКА (английское произношение сокращенного названия программы - IPHECA - International Programme on the Health Effects of the Chernobyl Accident).

АЙФЕКА была инициирована ВОЗ в мае 1991 года. Первая, экспериментальная или пилотная, фаза этой программы, которая выполнялась ВОЗ совместно с Министерствами здравоохранения и профильными институтами Белоруссии, России и Украины, практически завершилась к концу 1994 года. Она включала 5 проектов, направленных на раннее выявление рака щитовидной железы у детей, облученных в результате аварии (проект "Щитовидная железа”), лейкозов у жителей загрязненных радионуклидами территорий (проект "Гематология”), повреждений головного мозга у детей, облученных in utero (проект "Повреждение головного мозга in utero”), стоматологических заболеваний у населения Белоруссии, подвергшегося воздействию радиации (проект "Стоматология”). Еще один проект ("Эпидемиологический регистр”) предусматривал оказание помощи Национальным чернобыльским регистрам в сборе, хранении, передаче и анализе эпидемиологической информации в пострадавших от аварии районах.

Важность дозиметрических исследований и реконструкции индивидуальных доз у пациентов с лейкозом или раком щитовидной железы, а также коллективных доз у жителей загрязненных территорий была признана с самого начала выполнения программы АЙФЕКА. В период пилотной фазы программы эти исследования проводились в рамках "поддерживающей активности", целью которой являлись сбор и верификация данных о дозах на щитовидную железу, реконструкция индивидуальных доз внутреннего и внешнего облучения, ретроспективная оценка доз облучения всего тела.

Результаты выполнения первой фазы программы АЙФЕКА были опубликованы ВОЗ в 1995 году в виде обобщающего доклада, предназначенного для широкой аудитории [2], и в 1996 году как научный доклад для ученых и специалистов [3].

Одним из подходов в решении задач биологической дозиметрии, которые использовались на пилотной фазе АЙФЕКА, являлось изучение нестабильных и стабильных хромосомных аберраций у пострадавшего от аварии населения. Проведение таких исследований базировалось на

предшествующем знании о возможности использования метода изучения хромосомных аберраций для оценки дозы облучения. Впервые такой подход был использован Bender и Gooch [4] для оценки дозы облучения у трех пострадавших от аварии в Hanford, USA. Возможности хромосомной дозиметрии расширились с внедрением метода FISH (fluorescence in situ hybridization), позволяющим ускорить счет и повысить точность определения симметричных транслокаций и вставок (insertions). Значительный вклад в развитие биологической дозиметрии по изучению хромосомных аберраций внесли работы Н.В. Лучника. При этом особую ценность в плане приложения к чернобыльской ситуации приобретают его исследования по эффектам малых доз радиации на хромосомы. В одной из работ Н.В.Лучника, опубликованной в 1983 году [5], отмечено, что дозы радиации в диапазоне

0,1-0,3 Гр вызывают более выраженный эффект, регистрируемый по аберрациям хромосом в лимфоцитах человека, чем это можно было предвидеть, экстраполируя на этот диапазон доз результаты, полученные при умеренных дозах. Механизм такого аномального эффекта радиации в диапазоне малых доз Н.В.Лучник связал с возможной индукцией и/или ингибицией процесса репарации под влиянием радиации. Таким образом, были все предпосылки к включению в программу АЙФЕКА цитогенетических исследований с тем, чтобы используя предшествующий опыт, получить новое знание о "хромосомной " дозиметрии в диапазоне малых доз.

С целью оказания помощи радиационным цитогенетикам Белоруссии, России и Украины в проведении цитогенетических исследований ВОЗ закупил и направил в три страны специальное оборудование (таблица). Кроме того, ВОЗ оказал финансовую поддержку участникам исследований в изучении новых цитогенетических методов в ведущих зарубежных лабораториях.

Цитогенетические исследования для целей биологической дозиметрии проводились А.В.Се-ванькаевым с сотрудниками в рамках пилотной фазы АЙФЕКА в 1992-1993 гг. Результаты этих исследований включены в Научный отчет ВОЗ [3]. Анализ частоты нестабильных хромосомных аберраций был осуществлен у двух групп населения, пострадавшего от чернобыльской аварии. В первую группу вошло 229 детей, проживающих в Калужской области, для которых имелись данные прямых измерений доз излучения радиойода в щитовидной железе. Вторая группа включала детей (521), проживающих в Брянской области на территориях с различным уровнем загрязнения радионуклидами (в среднем от 147 до 955 кБк/м). У 8 человек была изучена также частота стабильных хромосомных аберраций. Следует отметить основные выводы, которые легли в основу даль-

нейшего развития дозиметрического направления цитогенетических исследований в программе АЙФЕКА. Эти выводы следующие:

- через 6 лет после аварии частота нестабильных аберраций - дицентриков и циклических колец - у детей с облученной щитовидной железой, а также у тех, которые проживают на загрязненных радионуклидами территориях, выше чем аналогичные показатели у детей адекватных контрольных групп;

- не обнаружено корреляции между величиной дозы в щитовидной железе (в диапазоне 0-5 Гр) и частотой нестабильных аберраций;

- частота нестабильных аберраций у обследованных лиц коррелирует с уровнем загрязнения территорий 137Сэ;

- исследование частоты нестабильных и, особенно, стабильных хромосомных аберраций является перспективным в плане возможной ретроспективной оценки доз цитогенетическими методами.

Таблица

Оборудование, направленное ВОЗ в Белоруссию, Россию и Украину для проведения цитогенетических исследований в рамках АЙФЕКА

Оборудование Ввод в действие Место установки

Цитоскан 1992 МРНЦ РАМН, Обнинск, Россия

Цитовижин 1995 Институт генетики, Минск, Белоруссия

Цитовижин 1995 НЦРМ, Киев, Украина

Как было отмечено выше, пилотные проекты АЙФЕКА практически завершились в 1994 году. В связи с этим Руководящий программный комитет принял решение о включении в программу новых проектов, которые бы базировались на опыте и результатах исследований, полученных на пилотной фазе.

В настоящее время АЙФЕКА включает 3 проекта:

- "Реконструкция дозы";

- "Ликвидатор";

- "Международный проект “Щитовидная железа".

Как видно, дозиметрические исследования в постпилотную фазу АЙФЕКА выделены в самостоятельный проект "Реконструкция дозы". Его основной целью является разработка рекомендаций по общим подходам и соответствующей технологии для реконструкции индивидуальных и/или групповых доз внешнего и внутреннего облучения с тем, чтобы были созданы совместимые базы дозиметрических данных, которые могли бы быть использованы в эпидемиологических исследованиях для изучения радиационного риска в результате чернобыльской аварии.

Специфическими задачами проекта "Реконструкция дозы" являются следующие:

- обзор имеющихся дозиметрических сведений в существующих базах данных и оценка их качества,

- выявление провалов знаний в области дозиметрии, имеющей отношение к чернобыльской аварии,

- рекомендация подходящей и эффективной дозиметрической методологии для ретроспективной оценки облучения,

- создание общей формы и методологии формирования дозиметрической базы данных,

- разработка технологии реконструкции индивидуальных доз внешнего и внутреннего облучения, включая спецификацию неопределенностей,

- реконструкция индивидуальной дозы у пациентов с лейкозом, раком щитовидной железы и другими болезнями, представляющими интерес для эпидемиологических исследований.

Цитогенетические исследования в проекте "Реконструкция дозы" рассматриваются как неотъемлемый компонент комплексного подхода к реконструкции доз, включающего физическую и биологическую дозиметрию, а также специальное дозиметрическое расследование на основе специального опросника. В протоколе проекта "Реконструкция дозы", разработанного специалистами Белоруссии, России и Украины при участии международных экспертов и ВОЗ, отмечается, что анализ стабильных транслокаций в лимфоцитах с использованием метода FISH является одним из потенциальных подходов к расширению современных знаний о накопленной дозе радиации у населения, пострадавшего вследствие аварии в Чернобыле.

Основная цель проекта "Ликвидатор" состоит в оказании помощи национальным органам здравоохранения в улучшении диагностики, лечения и реабилитации лиц, принимавших участие в ликвидации последствий аварии в Чернобыле. Проект включает эпидемиологический и клинический раз-

делы. Несмотря на гуманитарный характер данного проекта, в нем предусмотрено выполнение задач, направленных на расширение научного знания в области биологических эффектов малых доз радиации, индикаторов радиационного воздействия на организм, оценки радиационного риска, сравнительного изучения различных методов биологической дозиметрии и других аспектов фундаментальной радиобиологии и радиационной медицины. В связи с этим стандартный протокол проекта, разработанный международными экспертами, включая представителей трех пострадавших от аварии государств и ВОЗ, включает широкий спектр клинических и лабораторных исследований, в том числе и цитогенетических. В частности, предусмотрены следующие тесты:

- анализ хромосомных аберраций в лимфоцитах и клетках костного мозга;

- анализ микроядер в лимфоцитах;

- проточная цитометрия ДНК;

- исследование соматических мутаций.

В рамках проекта "Ликвидатор" выполняется субпроект "Оксидативный стресс у ликвидаторов. Профилактика оксирадикал-зависимых заболеваний антиоксидантами". В этом субпроекте применяются цитогенетические подходы к определению кластогенных факторов в плазме ликвидаторов. В настоящее время идентифицированы отдельные компоненты кластогенных факторов (рисунок). Они, в частности, включают продукты перекисного окисления липидов, цитокины, особенно фактор некроза опухоли, необычные нуклеотиды, в которых аденин деаминируется в гипоксантин. Эти компоненты, освобождающиеся клетками под воздействием супероксидных радикалов, стимулируют компетентные клетки, такие как моноцитарные макрофаги и нейтрофилы, к дальнейшей продукции супероксидных радикалов. В результате этого развивается оксидативный стресс, при котором постоянно образующиеся свободные оксирадика-лы вызывают генотоксические эффекты. Образование кластогенных факторов не является специфическим признаком радиационного поражения. Аналогичная ситуация характерна для многих хронических заболеваний. I.Emerit [6] из университета Пьера и Марии Кюри, Париж, Франция разработала тест определения кластогенных факторов в плазме ликвидаторов по их способности вызывать хромосомные аберрации в лимфоцитах доноров ^F-test, clastogenic factor test). На первом совещании экспертов ВОЗ (Париж, 20-21 сентября 1996 г.), посвященном проблеме оксидативного стресса у ликвидаторов, были представлены данные об увеличении у ликвидаторов уровня класто-генных факторов, изученных вышеописанным методом (Н.Оганесян и соавт., А.Никифоров и соавт.,

I.Emerit). В других докладах (Ю.Антипкин и соавт.,

А.Цыб и соавт., О.Пятак и соавт., А.Шефель) сообщалось о высоком уровне у ликвидаторов продуктов перекисного окисления липидов и низком уровне антиоксидантной активности, т.е. приводились косвенные свидетельства наличия у них внутренних условий для образования кластогенных факторов. Использование в качестве профилактических средств различных антиоксидантов сопровождалось уменьшением уровня кластогенных факторов у ликвидаторов и улучшением клинического состояния.

На вышепоименованном совещании экспертов были разработаны стандартизованные подходы к дальнейшим кооперативным исследованиям кла-стогенных факторов и оксидативного стресса у ликвидаторов, а также клинических испытаний различных антиоксидантов для отбора наиболее эффективных из них и последующего включения в комплекс реабилитационного лечения.

"Международный проект “Щитовидная железа", выполняемый в настоящее время в рамках программы АЙФЕКА, представляет собой продолжение пилотного проекта "Щитовидная железа". Его основной целью является изучение причины резкого увеличения числа рака щитовидной железы у жителей загрязненных радионуклидами территорий, особенно у тех, кто был ребенком в момент аварии. Одним из подходов для достижения этой цели является изучение генетической предрасположенности к радиационно-индуцированному раку щитовидной железы, которая, возможно, связана с нарушением механизма репарации ДНК. Для того чтобы проводить хорошо координированные исследования по этиологии радиогенного рака щитовидной железы в рамках данного проекта, ВОЗ основал сеть сотрудничающих центров, которые базируются в профильных научных учреждениях Англии, Белоруссии, Германии, Италии, Польши, Франции, Швейцарии, Швеции и Японии. Кроме того, в проекте участвуют специализированное учреждение ВОЗ - Международное агентство по исследованию рака (МАИР) и Европейский центр по окружающей среде. Для этой же цели ВОЗ совместно с Европейской комиссией, Медицинским фондом имени Сасакавы и Национальным институтом здоровья, США инициировал переговоры по созданию Международного банка тканей рака щитовидной железы, который явился бы центром для верификации диагноза, обучения специалистов и выполнения научных исследований.

Таким образом, цитогенетические исследования на уровне хромосом и ДНК занимают важное место в программе ВОЗ по изучению медицинских последствий чернобыльской аварии. Их выполнение, как и всей программы АЙФЕКА, в значительной степени зависит от достаточности внебюджетного финансирования.

ПОВРЕЖДАЮЩИЙ ФАКТОР

ОКСИДАТИВНЫЙ СТРЕСС

ПОВЫШЕНИЕ УРОВНЯ ОКСИРАДИКАЛОВ

ХРОМОСОМНЫЕ АБЕРРАЦИИ

Рис. Формирование оксидативного стресса после радиационного воздействия.

ВОЗ предпринимает все усилия к тому, чтобы АЙФЕКА нашла финансовую поддержку как со стороны правительств трех наиболее пострадавших от аварии стран - Белоруссии, России и Украины, так и правительств других государств и отдельных доноров.

Реализации этих усилий в значительной степени способствует Резолюция ВОЗ 49.22, принятая Всемирной ассамблеей здравоохранения 25 мая 1996 года, которая призывает все страны-члены ВОЗ (их около 200) к активному участию в Международной программе по уменьшению медицинских последствий аварии на Чернобыльской АЭС и ее дальнейшей поддержке, включая финансовую помощь.

Литература

1. Bender M.A. Cytogenetics Research in Radiation Biology//Stem Cells. - 1995. - V. 13, supplement 1. - P. 172-181.

2. WHO. Health Consequences of the Chernobyl Accident. Results of the IPHECA pilot projects and related national programmes. Summary Report, 1995, Geneva.

3. WHO. Health Consequences of the Chernobyl Accident. Results of the IPHECA pilot projects and related national programmes. Scientific Report, 1996, WHO/EHG 95.19, Geneva.

4. Bender M.A., Gooch P.C. Somatic Chromosome Aberrations Induced by Human Whole-body Irradiation: The “Recuplex” criticality accident//Radiat. Res. - 1966. -V. 29. - P. 569-582.

5. Luchnik N.V. Dose Response Relation for Chromosomal Aberrations in Irradiated Human Lymphocytes//Biological effects of low-level radiation. Proceedings of an international symposium. IAEA/WHO, Venice, Italy, 11-15 April 1983. IAEA Vienna, p. 199-207.

6. Emerit I. Clastogenic Factors: Detection and Assay //Methods in Enzymology. - 1990. - V. 186. - P. 555-564.