ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОР НА ОСНОВЕ ПРОИЗВОДНОГО БАКТЕРИОХЛОРИНА p, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОДНОГО БАКТЕРИОХЛОРИНА p И СПОСОБ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ РАКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭТОГО ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРА
PHOTOSENSITISER BASED ON BACTERIOCHLORIN p DERIVATIVE, METHOD OF OBTAINING BACTERIOCHLORIN p DERIVATIVE AND METHOD OF PHOTODYNAMIC THERAPY OF CANCER WITH APPLICATION OF SAID PHOTOSENSITISER

Настоящее изобретение относится к медицине, а более конкретно - к фотосенсибилизаторам (ФС) и способам фотодинамической терапии (ФДТ) опухолей с их использованием.
Метод ФДТ основан на применении фотосенсибилизаторов, которые обладают способностью селективно накапливаться в опухоли и при последующем световом облучении патологического участка катализировать образование цитотоксических агентов, главным образом, синглетного кислорода.
Для повышения эффективности ФДТ опухолей больших размеров необходимы фотосенсибилизаторы с интенсивным поглощением в спектральной области "окна прозрачности биологической ткани" - 710-850 нм. Однако при ФДТ пигментных опухолей (например, меланомы) с использованием фотосенсибилизаторов, длина волны поглощения которых меньше 780 нм, высокое поглощение меланином света в этой спектральной области может превысить поглощение света фотосенсибилизатором. Это приведет к тому, что свет будет поглощаться преимущественно меланином, вызывая разогрев клеток меланомы, а доля энергии, поглощенная молекулами фотосенсибилизатора, окажется недостаточной для эффективной фотодинамической реакции. Если же увеличить дозу вводимого фотосенсибилизатора для повышения его поглощения, то суммарное поглощение фотосенсибилизатора и меланина станет настолько высоким, что фотодинамическому воздействию будет подвергнут лишь поверхностный слой опухоли, тогда как более глубокие слои меланомы подвергаться этому воздействию не будут, особенно при значительных размерах опухоли. Такое воздействие не только не приведет к разрушению опухоли, но, наоборот, может инициировать ее дальнейший рост. Поэтому для эффективной фотодинамической терапии меланомы и других пигментных опухолей необходимо использовать фотосенсибилизаторы, длина волны поглощения которых превышает 780 нм.
35
40
6
6
Известен фотосенсибилизатор, представляющий собой наноструктурированную водную дисперсию на основе производного бактериохлорина p-метилового эфира оксима N-метоксициклоимида бактериохлорина p CHNO. Известен также способ ФДТ, включающий системное введение этого фотосенсибилизатора с последующим облучением патологического участка оптическим излучением в спектральном диапазоне 790-810 нм через 0,15-0,6 часа после введения фотосенсибилизатора [Меерович И.Г., Грин М.А., Меерович Г.А., Ципровский А.Г., Масс О.А., Журов А.В., Барканова С. В., Борисова Л.М., Оборотова Н.А., Лощенов В.Б., Барышников А.Ю., Миронов А.Ф. Новые фотосенсибилизаторы ближнего инфракрасного диапазона на основе производных бактериохлорина p: предварительные результаты изучения in vivo. (2006) Российский Биотерапевтический Журнал, т.5, №2, с.73-76]. Вышеуказанные фотосенсибилизатор и способ фотодинамической терапии являются ближайшими аналогами настоящего изобретения.
35
40
6
6
35
40
6
6
35
40
6
6
Недостатки известных фотосенсибилизатора и способа ФДТ связаны с тем, что, во-первых, концентрация СННО в опухоли достаточно быстро (менее чем за 1 час) снижается, что делает необходимым проведение сеанса ФДТ в достаточно короткое время (через 0,15-0,6 часа после введения), когда концентрация еще достаточно высока. Необходимость проведения ФДТ в таком коротком временном интервале создает определенные трудности, например, при лечении множественных опухолей. Во-вторых, в этом интервале времени низка селективность накопления CHNO в опухоли по отношению к нормальным тканям (индекс селективности не превышает 1.3), то есть концентрация CHNO высокая и в опухоли, и в прилегающих нормальных тканях. Проведение ФДТ в этом интервале времени может оказать нежелательное разрушающее воздействие на прилегающие к опухоли нормальные ткани.
35
40
6
6
Известен способ получения производного бактериохлорина p-метилового эфира оксима N-метоксициклоимида бактериохлорина р CHNO [Mironov A.F., Grin M.A., Tsiprovskiy A.G. J. Porphyrins Phthalocyanines. 2002, 6, 358], представляющий собой двухстадийный процесс, на первой стадии которого получают оксим N-гидроксициклоимида бактериохлорина p при обработке бактериопурпурина раствором сильного нуклеофила в пиридине, в качестве которого используют хлоргидрат гидроксиламина. Вторая стадия включает обработку полученного оксима N-гидроксициклоимида бактериохлорина р диазометаном с получением метилового эфира оксима N-метоксициклоимида.
Известный способ получения производного бактериохлорина р является ближайшим аналогом заявляемого способа.
К недостаткам известного способа следует отнести его технологическую сложность, связанную с двухстадийностью технологического процесса и необходимостью контроля каждой из реакций, последующих очисток полупродуктов и конечных продуктов процесса, а также недостаточно высокий общий выход. Использование диазометана, являющегося газообразным, высокотоксичным и взрывоопасным веществом, существенно ограничивает возможность промышленной реализации данной технологической схемы и делает ее потенциально опасной.
В настоящем изобретении решается задача обеспечения высокой эффективности и избирательности действия фотодинамической терапии опухолей большого размера и пигментных опухолей, включая меланому, путем создания фотосенсибилизатора на основе производного бактериохлорина р, способа получения этого производного бактериохлорина р и способа проведения фотодинамической терапии с использованием этого фотосенсибилизатора.
Дополнительно решается задача упрощения и повышения безопасности способа получения субстанции фотосенсибилизатора.
38
46
6
6
Задача решается тем, что в качестве фотосенсибилизатора предлагается наноструктурированная водная дисперсия на основе метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р CHNO со структурной формулой:
Задача решается также тем, что наноструктурированная водная дисперсия на основе метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р представляет собой липосомальную дисперсию на основе лецитина и холестерина, а метиловый эфир O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р включен в липидный бислой липосом.
Задача решается также тем, что наноструктурированная водная дисперсия дисперсия на основе метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р представляет собой мицеллярную дисперсию с поверхностно-активным веществом - блок-сополимером оксиэтилена и оксипропилена.
Задача решается также тем, что наноструктурированная водная дисперсия дисперсия на основе метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина p представляет собой Кремофорную наноэмульсию.
Задача решается тем, что в способе получения метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р, включающем воздействие сильного нуклеофила на производное бактериохлорофилла а, в качестве производного бактериохлорофилла а используют метиловый эфир бактериопурпурина в основном растворителе (пиридине или другом органическом растворителе с добавлением органического основания для нейтрализации соляной кислоты), в качестве сильного нуклеофила используют хлоргидрат этоксиамина, взятый в 1,5-кратном избытке по отношению к метиловому эфиру бактериопурпурина, реакцию проводят при комнатной температуре в течение 72-80 часов и завершают после смещения спектрального максимума поглощения реакционной смеси до 802 нм.
Задача решается тем, что в способе фотодинамической терапии, включающем системное введение фотосенсибилизатора и облучение патологического участка оптическим излучением в спектральном диапазоне 790-810 нм, в качестве фотосенсибилизатора используют наноструктурированную водную дисперсию на основе метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р, а облучение осуществляют через 0,7-5 часов после введения.
Предлагаемый способ получения субстанции метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р осуществляют одностадийной реакцией по нижеприведенной схеме, обрабатывая метиловый эфир бактериопурпурина 1,5-кратным избытком хлоргидрата этоксиамина.
Реакцию проводят в течение 72-80 часов при спектрофотометрическом контроле, об окончании реакции судят по смещению спектрального максимума поглощения реакционной смеси до 802 нм.
1
Строение полученного соединения 2 доказано электронной, ИК-, Н ЯМР-спектроскопией, а также подтверждено данными масс-спектрометрии (MALDI).
1
Для оценки динамики, уровня и селективности накопления метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р в тканях используют группу из 7 мышей F с внутримышечно перевитой опухолью Эрлиха. Концентрацию метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р в опухоли оценивают чрескожно методом спектроскопии диффузного рассеяния с использованием спектроанализатора "ЛЭСА-01-Биоспек" по пропорциональному ей уровню интегрального поглощения в ткани. Концентрацию метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина p в нормальной ткани измеряют в контралатеральной зоне левой лапы животных. На основе полученных данных рассчитывают значения индекса селективности накопления метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина p в опухоли по отношению к нормальной ткани.
38
46
6
6
Предлагаемый способ фотодинамической терапии осуществляют следующим образом: внутривенно вводят фотосенсибилизатор, представляющий собой наноструктурированную водную дисперсию на основе метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р CHNO, через определенное время в интервале 0,7-5 часов после введения производят облучение патологического участка оптическим излучением в спектральном диапазоне 790-810 нм.
Эффективность ФДТ оценивают по динамике роста объема опухолей, значения которого определяют по формуле
оп
1
2
3
V=π×D×D×D/6,
1
2
3
где D, D и D - три взаимно перпендикулярных диаметра опухоли.
Эффективность ФДТ оценивают также по значениям индексов торможения роста опухоли (ТРО), рассчитанным по значениям объема опухоли в опытной группе, подвергавшейся ФДТ, и контрольной группе.
оп(контроль)
оп(опыт)
оп(контроль)
ТРО={(V-V/V)}×100%.
Эффективность ФДТ оценивают также по значениям индекса увеличения продолжительности жизни животных (УПЖ) в опытной группе, подвергавшейся ФДТ, по отношению к контрольной группе.
(контроль)
(опыт)
(контроль)
УПЖ={(<L>-<L>)/<L>)}×100%,
(опыт)
(контроль)
где <L> и <L> - средняя продолжительность жизни в опытной (после ФДТ) и контрольной группах.
Сущность изобретения поясняется Фиг.1-5.
На Фиг.1 приведены зависимости интегрального поглощения метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р в опухоли Эрлиха (1) и нормальной ткани (2), пропорционального его концентрации, после внутривенного введения в виде липосомальной дисперсии.
На Фиг.2 приведены зависимости интегрального поглощения метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р в опухоли Эрлиха (1) и нормальной ткани (2), пропорционального его концентрации, после внутривенного введения в виде мицеллярной дисперсии с поверхностно-активным веществом - блок-сополимером оксиэтилена и оксипропилена.
На Фиг.3 приведены зависимости интегрального поглощения метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина p в опухоли Эрлиха (1) и нормальной ткани (2), пропорционального его концентрации, после внутривенного введения в виде Кремофорной наноэмульсии.
Из приведенных на Фиг.1-3 результатов следует, что высокие значения концентрации метилового эфира этоксиоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р в опухоли достигаются в интервале времени 0,7-5 часов после введения (Фиг.1-3).
1
2
На Фиг.4 приведены динамика роста (А) меланомы В 16 в контрольной (1) и опытной (2) группах мышей BDF после проведения ФДТ с фотосенсибилизатором на основе метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р и индекс торможения роста опухолей (Б) (доза субстанции 1 мг/кг массы тела животного, плотность мощности 220 мВт/см, время облучения 20 мин).
1
На Фиг.5 приведена динамика выживаемости мышей BDF с меланомой В 16 в контрольной (1) и опытной (2) группах после ФДТ с фотосенсибилизатором на основе метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина p.
Ниже приведены конкретные примеры получения метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р, фотосенсибилизатора на основе липосомальной, мицеллярной и Кремофорной дисперсий этой субстанции и способа фотодинамической терапии с использованием этого фотосенсибилизатора.
ПРИМЕР 1. Получение метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р.
К раствору 60 мг (0,1 ммоль) метилового эфира бактериопурпурина в 20 мл пиридина добавляют 27 мг (0,28 ммоль) хлоргидрата этоксиамина, растворенного в 10 мл пиридина. Реакцию проводят при комнатной температуре. Ход реакции контролируют спектрофотометрически, отбирая каждые 30 минут по 0,2 мл реакционной смеси, которую экстрагируют хлороформом, промывают водой и высушивают сульфатом натрия. Полноту протекания реакции контролируют по смещению основной полосы поглощения Q в электронном спектре продукта до 802 нм. Время реакции 72 ч. Продукт очищают с помощью препаративной ТСХ на силикагеле в системе хлороформ-метанол (12:1). Выход O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р 19,4 мг (63%).
max
3
Электронный спектр в хлороформе, λ, нм (ε/10): 368.5, 420.5, 542.5, 802 (35.4).
+
Масс-спектр (MALDI), m/z: 668.8 (M).
-1
ИК (KBr, ν, см): 1737, 1699, 1668, 1621, 1521, 1400
1
2
1
2
2
3
3
2
3
Н ЯМР (CDCl, δ, м.д.): 8.61 (Н, с, 5-Н), 8.55 (Н, с, 10-Н), 8.37 (Н, с, 20-Н), 5.18 (Н, д, 17-Н), 4.52 (4Н, м, O-CH2-СН3), 4.20 (2H, m, 7-H, 18-H), 4.02 (Н, m, 8-H), 3.62 (3Н, с, 12-СН), 3.57 (3Н, m, 17-CH), 3.27 (3Н, с, 2-СН), 2.72 (3Н, с, 3-СН3), 2.38 (4Н, m, 17-CH2, 17-СН2), 1.96 (2Н, m, 8-CH2), 1.79 (3Н, m, 7-СН3), 1.62 (9Н, m, 18-CH3, O-СН2-CH3), 1.10 (3H, t, 8-CH3), -0.035 (1H, s, NH), -0.25 (1H, s, NH).
ПРИМЕР 2. Получение метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р.
К раствору 60 мг (0,1 ммоль) метилового эфира бактериопурпурина в 25 мл хлористого метилена добавляют 29 мг (0,30 ммоль) хлоргидрата этоксиамина, растворенного в 10 мл хлористого метилена, и 20 мкл триэтиламина. Реакцию проводят при комнатной температуре. Ход реакции контролируют спектрофотометрически, отбирая каждые 20 минут по 0,2 мл реакционной смеси. Полноту протекания реакции контролируют по смещению основной полосы поглощения Q в электронном спектре до 802 нм. Время реакции 80 ч. Продукт очищают с помощью препаративной ТСХ на силикагеле в системе хлороформ-метанол (12:1). Выход метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина p 27 мг (49%).
ПРИМЕР 3. Получение липосомальной дисперсии метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р.
38
46
6
6
Смешивают 676 мг фосфатидилхолина (лецитина яичного чистотой >98%) и 81 мг холестерина, переносят в круглодонную колбу вместимостью 250 мл и растворяют в 50 мл хлороформа. К раствору добавляют 5,4 мг метоксиполи-(2000)-этиленгликольфосфатидилэтаноламина в 5 мл хлороформа и перемешивают 10 минут. 5 мг CHNO растворяют в 10 мл хлороформа, добавляют к реакционной смеси и перемешивают, после чего упаривают на роторном испарителе до полного испарения хлороформа с получением однородной аморфной пленки. В колбу добавляют 10 мл дистиллированной воды и ресуспендируют пленку энергичным встряхиванием до получения однородной дисперсии. Дисперсию переносят в стеклянный флакон и подвергают ультразвуковой обработке в течение 30 мин. Для унификации и уменьшения размеров везикул полученную липосомальной дисперсию экструдируют.
ПРИМЕР 4. Получение мицеллярной дисперсии метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р с использованием поверхностно активного вещества - блок-сополимера оксиэтилена и оксипропилена «Эмуксол-268».
Растворяют 5 мг метилового эфира оксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р в 6 мл хлороформа. К 5 мл 4%-ного (масс.) раствора «Эмуксола-268» в дистиллированной воде с температурой 41-43°С при перемешивании с барботированием азотом прибавляют приготовленный раствор метилового эфира оксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р в хлороформе порциями по 1 мл, добавляя каждую последующую порцию после полного испарения хлороформа из предыдущей. После добавления полного объема раствора субстанции в хлороформе и удаления остатков хлороформа током азота дисперсию охлаждают, доводят дистиллированной водой до первоначального объема и фильтруют через мембранный фильтр "Millipore" с размером пор 0,22 мкм.
ПРИМЕР 5. Получение наноэмульсии метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина p с использованием Кремофора.
Растворяют 5 мг метилового эфира этоксиоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р в 6 мл хлороформа. К 5 мл 4%-ного (масс.) раствора Кремофора в дистиллированной воде с температурой 41-43°С при перемешивании с барботированием азотом прибавляют приготовленный раствор метилового эфира оксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р в хлороформе порциями по 1 мл, добавляя каждую последующую порцию после полного испарения хлороформа из предыдущей. После добавления полного объема раствора субстанции в хлороформе и удаления остатков хлороформа током азота наноэмульсию охлаждают, доводят дистиллированной водой до первоначального объема и фильтруют через мембранный фильтр "Millipore" с размером пор 0,22 мкм.
ПРИМЕР 6. Фотодинамическая терапия меланомы В 16 с использованием фотосенсибилизатора на основе метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р.
1
2
2
Фотодинамическую терапию с использованием фотосенсибилизатора на основе наноэмульсии метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р в 4%-ном Кремофоре проводят на группе из 7 мышей BDF с меланомой В16, перевитой подкожно на наружную поверхность бедра задней лапы. Вторая группа из 8 мышей - контрольная. Фотосенсибилизатор вводят животным в хвостовую вену однократно на 7 день роста опухоли в дозе 1 мг метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р на килограмм массы тела животного. Через 1 час после введения препарата сенсибилизированные опухоли облучают с помощью терапевтического лазерного аппарата для фотодинамической терапии ЛФД-800/01-Биоспек с длиной волны 797 нм, плотностью мощности излучения 220 мВт/см, плотностью дозы 120 Дж/см. Результаты исследований приведены на Фиг.4, 5. Из них следует, что в опытной группе, подвергавшейся ФДТ, среднее по группе значение объема опухоли увеличивается очень медленно по отношению к объему опухоли контрольной группы. Наблюдается выраженный некроз опухоли, прилегающие к опухоли здоровые ткани практически не повреждены. Индекс торможения роста опухоли (ТРО) достигает 91%, индекс увеличения продолжительности жизни (УПЖ) превышает 61%.
Таким образом, заявляемые фотосенсибилизатор, представляющий собой наноструктурированную водную дисперсию на основе метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р, полученного по заявляемому способу, и способ фотодинамической терапии с использованием этого фотосенсибилизатора обеспечивают эффективное лечение опухолей больших размеров, в том числе меланомы, и высокую избирательность терапевтического действия за счет селективного накопления фотосенсибилизатора в опухоли. При этом получение метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р осуществляется одностадийным способом, в котором не используются газообразные, высокотоксичные и взрывоопасные реагенты, что значительно упрощает технологию получения этой субстанции в промышленных условиях и делает ее безопасной.