КЛЕТКА ХОЗЯИН, СОДЕРЖАЩАЯ ВЕКТОР ДЛЯ ПРОДУЦИРОВАНИЯ БЕЛКОВ, ТРЕБУЮЩИХ ГАММА-КАРБОКСИЛИРОВАНИЯ

1. Клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, требующий гамма-карбоксилирования, и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, и вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую витамин К-эпоксидоредуктазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, где данная клетка-хозяин дополнительно содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую γ-глутамилкарбоксилазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии.
2. Клетка-хозяин по п.1, где
указанная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, требующий гамма-карбоксилирования, и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, содержит первый промотор, и
указанная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая витамин К-эпоксидоредуктазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, содержит второй промотор,
где первый промотор является в достаточной степени более сильным, чем второй промотор, так что белок, требующий гамма-карбоксилирования, и витамин К-эпоксидоредуктаза экспрессируются в соотношении по меньшей мере 10:1.
3. Клетка-хозяин по п.2, где первый промотор является в достаточной степени более сильным, чем второй промотор, так что белок, требующий гамма-карбоксилирования, и витамин К-эпоксидоредуктаза экспрессируются в соотношении по меньшей мере 5:1.
4. Клетка-хозяин по п.1, где первый промотор представляет собой немедленный-ранний промотор человеческого цитомегаловируса (hCMV), и второй промотор представляет собой ранний промотор SV40.
5. Клетка-хозяин по п.1, где молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая γ-глутамилкарбоксилазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, дополнительно содержит третий промотор, где первый промотор является в достаточной степени более сильным, чем третий промотор, так что белок, требующий гамма-карбоксилирования, и γ-глутамилкарбоксилаза экспрессируются в соотношении по меньшей мере 10:1.
6. Клетка-хозяин по п.5, где первый промотор является в достаточной степени более сильным, чем третий промотор, так что белок, требующий гамма-карбоксилирования, и γ-глутамилкарбоксилаза экспрессируются в соотношении по меньшей мере 5:1.
7. Клетка-хозяин по любому из пп.5 и 6, где третий промотор представляет собой ранний промотор SV40.
8. Клетка-хозяин по п.1, где указанная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, требующий гамма-карбоксилирования, и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая γ-глутамилкарбоксилазу, находятся в одном векторе экспрессии.
9. Клетка-хозяин по п.1, где молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, требующий гамма-карбоксилирования, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая витамин К-эпоксидоредуктазу, и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая γ-глутамилкарбоксилазу, находятся в одном векторе экспрессии.
10. Клетка, которая модифицирована генно-инженерным образом для экспрессии (1) белка, который требует гамма-карбоксилирования, и (2) витамин К-эпоксидоредуктазы, где белки (1) и (2) экспрессируются в соотношении от 10:1 до 500:1.
11. Клетка по п.10, где белки (1) и (2) экспрессируются в соотношении от 5:1 до 500:1.
12. Клетка по любому из п.1 или 10, где белок, который требует гамма-карбоксилирования, выбран из группы, состоящей из фактора свертывания крови VII, фактора свертывания крови FVII, фактора свертывания крови IX, фактора свертывания крови FIX, протромбина, фактора свертывания крови II, фактора свертывания крови FII, фактора свертывания крови X, фактора свертывания крови FX и их активированных форм FVIIa, FIXa, FXа, протеаз змеиного яда, подобных фактору X, белка С, белка S, белка Z, костного Gla белка, матриксного Gla белка, белка 6, специфичного для задержки роста.
13. Клетка по любому из п.1 или 10, где белок, который требует гамма-карбоксилирования, представляет собой фактор свертывания крови, зависимый от витамина К.
14. Клетка по любому из п.1 или 10, где белок, который требует гамма-карбоксилирования, представляет собой фактор IX.
15. Клетка по любому из п.1 или 10, где белок, который требует гамма-карбоксилирования, представляет собой фактор X.
16. Клетка по любому из п.1 или 10, где белок, который требует гамма-карбоксилирования, представляет собой протеазы змеиного яда, подобные фактору X.
17. Клетка по любому из п.1 или 10, где белок, который требует гамма-карбоксилирования, представляет собой протромбин.
18. Клетка по любому из п.1 или 10, где белок, который требует гамма-карбоксилирования, представляет собой фактор VII.
19. Клетка по любому из п.1 или 10, которая представляет собой клетку млекопитающего.
20. Генетически модифицированная эукариотическая клетка-хозяин, содержащая:
(1) полинуклеотид, кодирующий белок витамин К-эпоксидоредуктазу, где указанная кодирующая последовательность белка витамин К-эпоксидоредуктазы функциональным образом связана с последовательностями контроля экспрессии, обеспечивающими экспрессию белка витамин К-эпоксидоредуктаза указанной клеткой;
(2) полинуклеотид, кодирующий белок, требующий карбоксилирования белком γ-глутамилкарбоксилазой, функциональным образом связанный с последовательностями контроля экспрессии, обеспечивающими экспрессию указанного белка, требующего карбоксилирования, указанной клеткой; и
(3) полинуклеотид, кодирующий гамма-глутамилкарбоксилазу.
21. Генетически модифицированная эукариотическая клетка-хозяин по п.20, которая способна экспрессировать белок витамин К-эпоксидоредуктазу и белок, требующий карбоксилирования, в соотношении по меньшей мере 1:5.
22. Генетически модифицированная эукариотическая клетка-хозяин по п.20 или 21, дополнительно содержащая молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую γ-глутамилкарбоксилазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии.
23. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, требующий гамма-карбоксилирования, и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, и молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую витамин К-эпоксидоредуктазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии.
24. Вектор по п.23, где
указанная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, требующий гамма-карбоксилирования, и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, содержит первый промотор, и
указанная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая витамин К-эпоксидоредуктазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, содержит второй промотор,
где первый промотор является в достаточной степени более сильным, чем второй промотор, так что белок, требующий гамма-карбоксилирования, и витамин К-эпоксидоредуктаза экспрессируются в соотношении по меньшей мере 5:1.
25. Вектор по п.24, где первый промотор представляет собой немедленный-ранний промотор человеческого цитомегаловируса (hCMV), и второй промотор представляет собой ранний промотор SV40.
26. Вектор по п.24, дополнительно содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую γ-глутамилкарбоксилазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии.
27. Вектор по п.26, где указанная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая γ-глутамилкарбоксилазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, дополнительно содержит третий промотор, где первый промотор является в достаточной степени более сильным, чем третий промотор, так что белок, требующий гамма-карбоксилирования, и γ-глутамилкарбоксилаза экспрессируются в соотношении по меньшей мере 5:1.
28. Вектор по п.24, где третий промотор представляет собой ранний промотор SV40.
29. Вектор по любому из пп.23-28, где белок, который требует гамма-карбоксилирования, выбран из группы, состоящей из фактора свертывания крови VII, фактора свертывания крови FVII, фактора свертывания крови IX, фактора свертывания крови FIX, протромбина, фактора свертывания крови II, фактора свертывания крови FII, фактора свертывания крови X, фактора свертывания крови FX и их активированных форм FVIIa, FIXa, FXа, протеаз змеиного яда, подобных фактору X, белка С, белка S, белка Z, костного Gla белка, матриксного Gla белка, белка 6, специфичного для задержки роста.
30. Способ получения гамма-карбоксилированного белка, включающий (1) культивирование клетки, экспрессирующей рекомбинантный белок, который требует гамма-карбоксилирования, витамин К-эпоксидоредуктазу и γ-глутамилкарбоксилазу, и (2) выделение гамма-карбоксилированного белка.
31. Способ по п.30, где указанная клетка экспрессирует белок, который требует гамма-карбоксилирования, и витамин К-эпоксидоредуктазу в соотношении по меньшей мере 10:1 при условиях, подходящих для экспрессии обоих белков.
32. Способ получения фармацевтической композиции, пригодной для индукции свертывания крови или стимуляции повышенного или пониженного свертывания крови, включающий очистку активного карбоксилированного белка, полученного согласно любому из пп.30 и 31, и смешивание очищенного карбоксилированного белка с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями или эксципиентами.