СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ЛАКТОФЕРРИНА ИЗ МОЛОЧНОГО СЫРЬЯ
METHOD FOR LACTOFERRIN ISOLATION AND PURIFICATION FROM DAIRY RAW MATERIALS

Область техники.
Изобретение относится к молочной, биотехнологической, медицинской, фармацевтической, пищевой промышленности. Предлагается хроматографический одностадийный промышленный способ выделения и очистки коровьего лактоферрина из молочного сырья, позволяющий одномоментно извлечь не менее 90% содержащегося в нем лактоферрина, свободного от лактопероксидазы и эндотоксинов, активного в отношении микроорганизмов, с использованием ионообменного сорбента на основе гидрофильного макропористого акрилового полимера. Изобретение позволяет селективно получить высокоочищенный лактоферрин, с сохранением его биологической (бактерицидной) активности, при этом молочное сырье, используемое для получения лактоферрина, остается пригодным для дальнейшей переработки в пищевой промышленности.
Уровень техники.
В пищевой (молочной) промышленности общепринятым методом выделения лактоферрина из молока и молочного сырья является хроматография.
Из уровня техники известен способ производства лактоферрина из молочного сырья (Патент RU 2579661). Способ подразумевает экстракцию молочного сырья на катионообменной смоле с использованием концентрированного раствора хлорида натрия. Получают раствор основного молочного белка, содержащий лактоферрин, лактопероксидазу и другие примеси. Проводят очистку раствора основного молочного белка на катионообменной смоле, уравновешенной ацетатным буфером с концентрацией 50 мМ при значениях рН от 4 до 9. Элюирование осуществляют растворами ацетатного буфера с концентрацией 50 мМ при разных концентрациях раствора хлорида натрия - от 0,02 до 1,5 М. Отличием данного способа от заявляемого является наличие большего количества ступеней очистки и тот факт, что оставшееся сырье может быть не пригодно для дальнейшего использования в пищевой промышленности. Недостатком является тот факт, что в качестве сырья используют молоко, которое не подвергалось обработке при температуре выше чем 55°C.
Известен способ очистки молочного сырья с целью получения лактоферрина, состоящий из сорбции белков на ионообменнике, хроматографического их разделения, элюирования, определения фракций с оптической плотностью при длине волны 280 нм более 0,1 ед., проведение диализа полученной белковой фракции против физиологического раствора, фосфатного буфера или дистиллированной воды. Стабилизацию и микробиологическую очистку осуществляется микрофильтрацией через полупроницаемые мембраны 0,22-0,45 мкм. Недостатком данного изобретения является относительная трудоемкость, связанная с поэтапным проведением очистки белка, а также невозможность вторичного использования молочного сырья для употребления в пищу (Патент RU 2366294).
Известен способ очистки молочного сырья с целью получения лактоферрина (Патент RU 2400106). Способ включает в себя очистку молочного сырья, сепарирование, осаждение казеина, двухступенчатую ультрафильтрацию, хроматографическое разделение белков, диализ, микрофильтрацию с селективностью пор 0,2-0,3 мкм, смешивание выделенных монофракций в соотношении, аналогичном их содержанию в свежевыдоенном коровьем молоке, лиофильную сушку. На первой ступени ультрафильтрации осуществляют выделение из сыворотки иммуноглобулиновой фракции через мембраны 100 кДа. Повторной ультрафильтрации через мембраны 30 кДа подвергают пермеат. Полученный при этом концентрат белков подвергают ионообменной хроматографии, илюируя градиентом NaCl от 0,35 до 1 М с получением лактоферриновой и лактопероксидазной фракций. Недостатком данного изобретения является относительная трудоемкость, связанная с поэтапным проведением очистки белка, необходимость от отделении балластных белков, а также невозможность вторичного использования молочного сырья для употребления в пищу.
Известен способ получения лактоферрина из женского молока, включающий обезжиривание, удаление казеинов, фракционирование сульфатом аммония, диализ и лиофилизацию целевого продукта. Фракционирование ведут ступенчато: сначала добавляют сульфат аммония до концентрации 35-45% от насыщения, осадок удаляют, затем к супернатанту добавляют сульфат аммония до концентрации 70-80% от насыщения, а перед диализом осадок от фракционирования растворяют в дистиллированной воде, инкубируют с 1,3-3,7 М хлоридом натрия при рН 3,6-4,4 и удаляют образующийся осадок при помощи фильтрования (Патент RU 1709606). Недостатком данного изобретения является относительная трудоемкость, связанная с поэтапным проведением очистки целевого белка, а также невозможность вторичного использования молочного сырья для употребления в пищу.
Известен также способ получения лактоферрина из творожной или подсырной сыворотки методом ионообменной хроматографии с использованием ионообменной целлюлозы. Способ заключается в следующем: молочную сыворотку, полученную при производстве творога кислотным или кислотно-сычужным способами, нейтрализуют до pH 6,5 раствором гидроокиси натрия, центрифугируют для отделения иммуноглобулинов и фосфата кальция; далее подготовленную сыворотку подают на колонку с сорбентом карбоксиметилцеллюлозой, уравновешенной буферным раствором pH 6,5, содержащим 50 ммоль натрия фосфорнокислого. Элюирование лактоферрина проводят с помощью 0,05М фосфатного буфера, содержащего 1,0 М хлористого натрия. Полученный раствор обессоливают ультрафильтрацией, подвергают микрофильтрации и лиофильно высушивают (ТИ, ТУ 9224-001-93467423-06). Недостатком этого способа является то, что в качестве сырья используется творожная или подсырная сыворотка, содержание лактоферрина в которой крайне ограничено, а также то, что получаемый лактоферрин в своем составе содержит примеси других сывороточных белков.
Из уровня техники известна также технология получения рекомбинантного лактоферрина человека из молока коз-продуцентов (патент RU 2554742). Способ включает ионообменную хроматографию на сильном катионообменнике, элюирование лактоферрина в градиенте натрия хлористого 0,3-1,0 М, обессоливание, лиофильное высушивание. Способ отличается тем, что в качестве молочного сырья используют молоко трансгенных коз, хроматографию проводят на сильном катионообменнике, несущем сульфопропильные группы, используют натрий-ацетатный буфер, применяют ступенчатую промывку сорбента 20 мМ натрий-ацетатным буфером pH 7,0, содержащим 0,3 М натрия хлористого и 10% этанола для удаления связанного с лактоферрином ЛПС.
Наиболее близким к заявляемому является способ получения лактоферрина из сырого коровьего молока, которое пропускают через хроматографическую колонку с сорбентом (прототип, патент RU 23902531). Способ предусматривает использование молока в качестве молочного сырья; хроматографию лактоферрина проводят в колонке с сорбентом карбоксиметилцеллюлозой, уравновешенным 0,05 М натрий-фосфатным буфером при pH 7,7, элюирование лактоферрина проводят 0,05 М натрий-фосфатным буфером pH 7,7 в градиенте концентраций хлорида натрия 0,1-1,2 М, при элюировании собирают фракции раствора лактоферрина с оптической плотностью 0,5 ед. при длине волны 280 нм и направляют их на вторую хроматографию с аналогичными параметрами, а затем выделенные фракции направляют на ультрафильтрацию, обессоливание и лиофилизацию. Способ позволяет получить нативный лактоферрин чистотой не менее 98%. Недостатком данного изобретения является относительная трудоемкость, связанная с поэтапным проведением очистки целевого белка, а также невозможность вторичного использования молочного сырья для употребления в пищу.
2
2
2
Известен способ получения концентрата лактоферрина, который предусматривает использование альтернативного метода мембранной адсорбции (Plate et al., 2006). Предварительную обработку сыворотки на микрофильтрационной установке проводят для выделения нерастворимых частиц и молочного жира, препятствующих работе катионобменных мембранных модулей. Пермеат, получаемый на стадии микрофильтрации, направляют на мембранный адсорбер. Активные группы, расположенные на внутренней поверхности ионообменных мембран, представляют собой радикалы сульфоновой кислоты. Мембранные модули выпускают в различном исполнении размерами от 15 см (0,41 мл) до 8 м (2,2 л) каждый. Динамическая обменная емкость спирального мембранного модуля (15 витков) по лактоферрину составляет 0,2 мг/см (7,3 мг/мл). Недостатком данного способа является высокая стоимость импортных мембранных кассет и возможность попадания частиц мембранных волокон в молочное сырье в процессе выделения белка.
Известен способ очистки молочного сырья (Патент RU 2400106). Способ включает в себя очистку молочного сырья, сепарирование, осаждение казеина, двухступенчатую ультрафильтрацию, хроматографическое разделение белков, диализ, микрофильтрацию с селективностью пор 0,2-0,3 мкм, смешивание выделенных монофракций в соотношении, аналогичном их содержанию в свежевыдоенном коровьем молоке, лиофильную сушку. При этом на первой ступени ультрафильтрации осуществляют выделение из сыворотки иммуноглобулиновой фракции через мембраны 100 кДа. Повторной ультрафильтрации через мембраны 30 кДа подвергают пермеат. Полученный при этом концентрат белков подвергают ионообменной хроматографии, иллюируя градиентом NaCl от 0,35 до 1 М с получением лактоферриновой и лактопероксидазной фракций. Смешивание полученных фракций - иммуноглобулиновой, лактоферриновой и лактопероксидазной осуществляют в соотношении 91:5:4. Особенностью является то, что способ не предусматривает разделение фракций и получение чистого лактоферрина.
Известен способ получения ферментов из группы гидролаз и оксидаз, лактоферрина и альбумина (RU 2013144910). Способ отличается тем, что при проведении процесса по гибкой технологии с использованием одного и того же технологического оборудования в виде сорбционных колон с макропористым сульфокатионитом при варьировании условий выделения и очистки можно получить различные целевые субстанции с высоким выходом. Экстракцию проводят водными растворами с различным pH и ионной силой в течение 0,5-3,0 часов, в качестве элюента используют раствор аммиака с pH 9,0-11,0 различной ионной силы.
Таким образом, технических решений, совпадающих с совокупностью существенных признаков заявляемого изобретения, из уровня техники не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности, как «новизна».
Термины и определения
- Под термином «молочное сырье» подразумевается любое сырье, выбранное из группы: цельное молоко, полуобезжиренное молоко, обезжиренное молоко, пахта, молозиво, молоко с пониженным и низким содержанием жира, не содержащее жира молоко, молочная сыворотка (молочная плазма), в том числе после удаления казеина, напиток на молочной основе, йогурт, в том числе замороженный йогурт, питьевой йогурт, сливки, концентрат молочных белков. Температура молочного сырья не должна превышать 60 градусов по Цельсию.
- Под термином «сорбент» подразумевается сильнокислотный ионообменный сорбент на основе гидрофильного акрилового макропористого полимера со средним размером частиц 160 мкм, несущий сульфопропильные группы.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Сравнение технологических способов извлечения коровьего лактоферрина.
Фиг. 2. Сорбент - гидрофильный акриловый макропористый полимер со средним размером частиц 160 мкм, несущий сульфопропильные группы, под микроскопом. Видно, что по размеру частицы сорбента достаточно однородны, что обеспечивает его удовлетворительные гидродинамические свойства.
Фиг. 3. Кривая роста штамма - клинического изолята Staphylococcus aureus при использовании коровьего лактоферрина по сравнению с контролем.
Фиг 4. Идентификация целевого белка. Электрофорез: 1 - стандарты (слева указаны положения стандартных белков с известной молекулярной массой в кДа), 2 и 3 - полученные образцы коровьего лактоферрина; Вестерн-блот (4-6): 4 и 5 - полученные образцы коровьего лактоферрина, 6 - стандарт коровьего лактоферрина (Sigma Aldrich)
Раскрытие изобретения.
Предложенный способ экономически выгоден при промышленном использовании, существенно сокращает время выделения целевого белка и позволяет эффективно избавляться от балластных белков. Существенным преимуществом является также тот факт, что предложенный способ сохраняет кондиционность молочного сырья с целью его дальнейшей промышленной переработки.
Лактоферрин является бактерицидным белком. Его получают в промышленных условиях и используют для производства продуктов функционального и диетического питания, в том числе детского, различных гигиенических средств и большого числа парафармацевтических продуктов медицинского назначения. Современные технологии выделения коровьего лактоферрина из коровьего молока используют двухступенчатую хроматографию, при которой лактоферрин снимается с сорбента совместно с лактопероксидазой (ЛПС), после следует стадия их разделения, что непременно приводит к технологическим потерям целевого белка, увеличивает время технологического процесса и повышает финансовые затраты.
Одностадийный способ выделения коровьего лактоферрина позволяет существенно упростить технологию его получения из молочного сырья. Как известно, в коровьем молоке чрезвычайно мала доля коровьего лактоферрина (около 0,1 г/л), что диктует обработку больших объемов молочного сырья при промышленной обработке.
В основе предлагаемого способа выделения лактоферрина из молочного сырья лежит использование специального сорбента, удовлетворяющего следующим свойствам:
а) сорбент должен быть сильным катионообменником, содержащим сульфопропильные группы, для более быстрого и прочного связывания белка. Это позволяет пропускать молочное сырье через сорбент с большими скоростями, поскольку известно, что количественная сорбция белка напрямую зависит от скорости прокачивания через него раствора белка;
б) сорбент должен обладать хорошими гидродинамическими свойствами, позволяющими работать на большой скорости;
в) достаточной механической прочностью;
г) высокой сорбционной емкостью.
В предложенной технологии выделения и очистки используется колонка с сильнокислотным ионообменным сорбентом на основе гидрофильного макропористого акрилового полимера, содержащего сульфопропильные группы, уравновешенным 20 мМ натрий-фосфатным буфером, с pH 7,5. Используемый сорбент представляет собой гидрофильный акриловый макропористый полимер, удовлетворяющий вышеописанным свойствам, со средним размером частиц 160 мкм (Фиг. 2). Он обладает хорошей сорбционной емкостью (20 мг Лф/мл сорбента), гидродинамическими свойствами, позволяющими работать на больших скоростях (50-100 см/ч), а также механической прочностью, позволяющей выдерживать возникающее на этих скоростях давление.
Способ выделения и очистки лактоферрина из молочного сырья заключается в следующем. Сначала проводят элюцию лактопероксидазы с использованием буфера, содержащего 0,25 М NaCl, затем проводят удаление липополисахаридов путем промывки сорбента буфером с 0,25 М NaCl и 10% этанола с последующей элюцией лактоферрина в градиенте 0,25-1,0 М NaCl. Полученные фракции белков обессоливают и высушивают. Молоко, прошедшее через хроматографическую колонку, не изменяет свой состав и пригодно для дальнейшей переработки на традиционные продукты (Таблица 1).
Поскольку лактоферрин способен связываться с эндотоксинами (липополисахаридами, фрагментами клеточной стенки грамотрицательных бактерий), то одновременно была решена задача удаления липополисахаридов из образцов лактоферрина, что способствует сохранению его противомикробной активности.
Предложенная технология выделения лактоферрина с использованием ионообменного сорбента на основе гидрофильного макропористого акрилового полимера удовлетворяет всем перечисленным требованиям и, будучи одностадийным процессом, позволяет снизить промышленные расходы более чем на 30%. При этом обеспечивается высокий уровень извлечения лактоферрина высокой степени чистоты, свободного от эндотоксинов, с высокой бактерицидной и бактериостатической активностью, при этом молочное сырье остается пригодным для дальнейшей переработки на традиционные продукты в пищевой промышленности.
Сравнение большинства способов с предложенным способом выделения лактоферрина представлено на Фиг. 1.
Технический результат, проявляющийся при использовании предложенного способа выделения и очистки лактоферрина, заключается в получении высокоочищенного лактоферрина с чистотой не менее 95% из молока и (или) молочного сырья за счет применения одностадийной хроматографической технологии с использованием сорбента на основе гидрофильного акрилового макропористого полимера со средним размером частиц 160 мкм, несущего сульфопропильные группы, включая элюцию лактопероксидазы с использованием буфера, содержащего 0,25 М NaCl, удаление липополисахаридов путем промывки сорбента буфером с 0,25 М NaCl и 10% этанола, элюцию лактоферрина в градиенте 0,25-1,0 М NaCl с последующим обессоливанием и высушиванием фракции целевого белка.
Другим техническим результатом заявляемого способа выделения и очистки лактоферрина является расширение арсенала средств указанного назначения.
Заявляемые существенные признаки, предопределяющие получение указанного технического результата, явным образом не следуют из уровня техники, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности, как «изобретательский уровень».
Условие патентоспособности «промышленная применимость» подтверждено на примерах конкретного применения, которыми заявляемое изобретение проиллюстрировано, но не исчерпано.
Примеры осуществления изобретения
Пример 1. Выделение и очистка лактоферрина из молочного сырья
10 л обезжиренного коровьего молока пропускают через колонку с сорбентом (100 мл), уравновешенным 20 мМ натрий-фосфатным буфером pH 7,5, содержащим 0,1 М натрия хлористого со скоростью 50-100 см/ч. После промывки уравновешивающим буфером (3 объема колонки) проводят элюирование лактопероксидазы 20 мМ натрий-фосфатным буфером pH 7,5, содержащим 0,25 М натрия хлористого, затем проводят промывку сорбента 20 мМ натрий-фосфатным буфером pH 7,5, содержащим 0,25 М натрия хлористого и 10% этилового спирта (2 объема колонки). Элюцию коровьего лактоферрина проводят в градиенте натрия хлористого 0,25-1,0 М. Фракции, содержащие коровий лактоферрин и лактопероксидазу, обессоливают диализом или ультрафильтрацией или гельфильтрацией, лиофильно высушивают. Получают целевой белок чистотой 95%, свободный от эндотоксинов с сохраненной бактерицидной активностью.
Пример 2. Оценка противомикробной и противогрибковой активности лактоферрина
Оценка противомикробной активности выполнена в отношении штамма - клинического изолята Staphylococcus aureus. Использовали автоматизированную систему контроля роста микроорганизмов в режиме реального времени. Выделение и культивирование штамма микроорганизма проводили в соответствии с использованием ранее описанного стандартного протокола (Давыдова с соавт., 2013).
Исследование динамики роста микроорганизмов проводили в двух параллелях, что отражалось на графиках кривых роста бактериальных популяций в присутствии лактоферрина бычьего. В качестве контроля оценивали рост бактерий, который характеризовался наступлением логарифмической фаз роста через 2-3 часа и достигал максимума с переходом в стационарную фазу роста через 12 часов от начала культивирования. Показатель стационарной фазы роста был достоверно выше (от 6,0 до 7,2 OD), чем при использовании лактоферрина. При исследовании концентраций препарата (10 мг/мл и выше) в первые 1-3 суток после внесения лактоферрина роста бактерий не наблюдалось или он сильно запаздывал по сравнению с контролем (Фиг. 3).
Дополнительно проводили оценку бактерицидной и антигрибковой активности полученного по способу лактоферрина в отношении S. sangius, P. gingivalis и С. albicans. Аналогично результатам вышеописанного эксперимента лактоферрин также демонстрирует высокую ингибирующую активность.
Пример 3. Идентификация целевого белка
Для проверки образцов лактоферрина разделяли гельэлектрофорезом в денатурирующих условиях. Вырезали мембрану (Hybond-P, Amersham Biosciences) по размеру геля. Смачивали ее метанолом, промывали дистиллированной водой. Уравновешивали мембрану и гель в буфере для переноса TGB с метанолом (25 мМ Tris-HCl, 250 мМ глицин, 20% метанол) в течение 15 минут на качалке. Помещали мембрану и гель в кассету для мокрого переноса BioRad Mini Trans-Blot Cell. Проводили перенос в течение часа при охлаждении и силе тока 350 мА. После переноса мембрану помещали в 5% сухое нежирное молоко, разведенное в PBS-Т (1×PBS, 0,1% Tween-20). Инкубировали 1 час на качалке при комнатной температуре. Мембрану помещали в раствор очищенных поликлональных антител с 3% молоком в PBS-T. Мембрану инкубировали с раствором вторичных антител, специфично узнающих кроличьи иммуноглобулины, с 3% молоком в PBS-T. Промывали PBS-T на качалке при комнатной температуре 20 минут, затем еще два раза по 5 минут. Проявляли, используя Amersham ECL Plus Western Blotting Detection System (GE Healthcare), после чего получали изображение с помощью гельдокументационной системы, что свидетельствует о наличии высокоочищенного целевого белка (Фиг. 4).
Пример 4. Сравнительное исследование молочного сырья до и после его прохождения через хроматографическуто колонку.
Сравнительное исследование молочного сырья до и после его прохождения через хроматографическую колонку с сорбентом. Данные приведены в таблице 1.
Сравнение данных молока в процессе выделения коровьего лактоферрина показало, что состав молочного сырья не претерпевает каких-либо значимых изменений, кроме содержания самого лактоферрина. После прохождения через хроматографическую колонку с сорбента не вымывается нежелательных примесей. По приведенным анализам молочное сырье после выделения лактоферрина соответствует нормативной документации на молоко TP ТС 033/2013 и TP ТСЧ 021/2011 и пригодно для использования в переработке на традиционные молочные продукты.
Список используемой литературы
1. Давыдова М.М., Плахтий Л.Я. Царёв В.Н. Методы микробиологического исследования, применяемые в стоматологии // в кн. Микробиология, вирусология иммунология полости рта / под ред. Проф. В.Н. Царёва. - М.: ГЭОТАР-Медиа. - 2013. - С. 223-268).
2. Plate K, Beutel S, Buchholz Н, Demmer W, , Reif O, Ulber R, Scheper T. Isolation of bovine lactoferrin, lactoperoxidase and enzymatically prepared lactoferricin from proteolytic digestion of bovine lactoferrin using adsorptive membrane chromatography. J Chromatogr A. 2006 Jun 2; 1117 (1): 81-6.