КОМПОЗИЦИИ ПРОБИОТИКОВ И ПРЕБИОТИКОВ
PROBIOTIC AND PREBIOTIC COMPOSITIONS

Область техники
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к пробиотикам и композициям, содержащим пробиотики, которые могут быть эффективны при лечении человека и/или животных.
Уровень техники
Новорожденные животные и животные в условиях (интенсивной) фермерской деятельности в частности, предрасположены к бактериальным и другим инфекциям, таким как вирусные инфекции. Указанные инфекции могут приводить к диарее, ассоциированной с потерей массы и, в тяжелых случаях, даже к гибели новорожденного. Например, несколько лет назад в разных географических зонах Испании на свинофермах были описаны случаи диареи у новорожденных поросят. Предполагается, что указанная диарея является симптомом у данных животных, а причинный фактор указанного симптома иногда трудно локализовать. Во многих случаях диареи у новорожденных поросят, например, можно выделить возможные нежелательные/неблагоприятные бактериальные штаммы, такие как Escherichia coli, один или в сочетании с Clostridium perfringens или Clostridium difficile, но диарея обычно выявляется сразу после рождения, и стандартные процедуры лечения и профилактики часто не эффективны. В других случаях диарею вызывают, например, вирусные инфекции, такие как инфекции, вызванные ротавирусом, коронавирусом, норовирусом, аденовирусом и/или астровирусом.
Без привязки к какой-либо конкретной теории предполагается, что причинным фактором может быть дисбактериоз (также называемый дисбиозом). Под дисбактериозом понимают состояние дисбаланса микроорганизмов в организме. У сельскохозяйственных животных, в частности свиней, дисбактериоз может быть вызван беспорядочным применением антибиотиков в ходе поддержания здоровья свиноматки, которое вызывает изменения в кишечной микрофлоре у новорожденных поросят.
В свете указанных недостатков применения антибиотиков, их применение в скотоводческих хозяйствах рекомендуется уменьшать. С другой стороны, тогда могут потребоваться альтернативные способы лечения новорожденных животных, которые заменили бы часто применяемые антибиотики.
Поскольку с 2005 года Европейский Союз (ЕС) рекомендует сократить применение антибиотиков в качестве ускорителей роста при выращивании свиней (с поправками в Регламенте (ЕС) №378/2005 от 4 марта 2005 г.), заводчики животных стремятся к альтернативам, которые могут улучшить общее состояние здоровья (сельскохозяйственных) животных, в частности на ранних этапах жизни. Авторы настоящего изобретения предлагают решение данной проблемы, и указанное решение описано ниже. Таким образом, настоящее изобретение решает несколько проблем, обусловленных способами, применяемыми на текущем уровне техники, и положительные эффекты подробно описаны ниже.
Сущность изобретения
Согласно первому аспекту настоящее изобретение относится к композиции, содержащей по меньшей мере штамм, депонированный в испанской коллекции типовых культур под номером СЕСТ 8700 (AqSynRMH69).
Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей смесь микроорганизмов, причем микроорганизмы принадлежат к штаммам Lactobacillus plantarum и Lactobacillus reuteri, и необязательно включает по меньшей мере один микроорганизм, принадлежащий к роду Lactobacillus (предпочтительно за исключением микроорганизмов, принадлежащих к штамму Lactobacillus fermentum и Lactobacillus mucosae, предпочтительно указанным микроорганизмам соответствуют номера СЕСТ 8347 (AqSynJ12) и СЕСТ 8349 (AqSynJ55)), Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus и/или Weisella для применения при реализации способа лечения человека или животного.
Lactobacillus fermentum СЕСТ 8347 (AqSynJ12) и Lactobacillus mucosae СЕСТ 8349 (AqSynJ55) были переданы на хранение компанией « CYL S.L.» в СЕСТ (испанская коллекция типовых культур,  Espanola de Cultivos Tipo (СЕСТ), Universidad de Valencia, Parc Cientific Universitat de ,  Escardino, 9, 46980 Paterna (Валенсия, Испания)) 16 мая 2013 г.
Согласно предпочтительному варианту реализации композиция согласно настоящему изобретению включает две молочнокислые бактерии, которым соответствуют номера СЕСТ 8700 (AqSynRMH69) и СЕСТ 8350 (AqSynJ59), которые были переданы на хранение в СЕСТ ( de Cultivos Tipo (СЕСТ), Universidad de Valencia, Parc  Universitat de , , 9, 46980 Paterna (Валенсия, Испания)) компанией « CYL S.L.»
Согласно одному варианту реализации в композиции согласно настоящему изобретению каждый штамм удовлетворяет по меньшей мере следующему условию а., и предпочтительно одновременно условиям а., и b., и наиболее предпочтительно одновременно трем условиям а., b. и с:
a. демонстрирует антимикробную активность, подтвержденную по меньшей одной из следующих зон подавления роста: (i) 10 мм или более, например, 13 мм или более, для Salmonella, (ii) 9 мм или более, предпочтительно 10 мм или более, для Listeria monocytogenes, (iii) 9 мм или более, предпочтительно 10 мм или более, для Staphyloccocus aureus, (iv) 10 мм или более, например, 18 мм или более, для Escherichia coli;
b. способен сохранять по существу такую же жизнеспособность в течение 3-часовой инкубации при рН=3,5, или, в качестве альтернативы при рН=2,5;
c. способен сохранять по существу такую же жизнеспособность в течение 4-часовой инкубации в присутствии 0,45% экстракта желчи, предпочтительно при рН=8.
Под "жизнеспособными организмами" могут понимать организмы и любые стадии их жизни, которые являются живыми. Следовательно, под штаммом, который «способен сохранять по существу такую же жизнеспособность», могут понимать штамм, который способен выживать и оставаться живым при определенных условиях, например, что 50% КОЕ (колониеобразующих единиц), например, 50%, или 60%, или 70%, или 75%, или 80%, или 95%, 99% или более, например, 100% КОЕ живые (жизнеспособные) после воздействия определенных условий (например, 3-часовой инкубации при рН=3,5, или в качестве альтернативы при рН=2,5, и/или 4-часовой инкубации в присутствии 0,45% экстракта желчи, предпочтительно при рН=8).
Композиция согласно настоящему изобретению в любом из ее вариантов может быть предназначена для применения при реализации способов лечения человека или животного, например, при реализации способа лечения или профилактики диареи. В данном случае диарея может быть вызвана вирусной инфекцией. Кроме того или в качестве альтернативы, композиция согласно настоящему изобретению в любом из ее вариантов, предназначенная для применения при реализации способов лечения человека или животного, может применяться для увеличения массы новорожденного млекопитающего (предпочтительно поросенка). Указанную композицию можно вводить млекопитающему, предпочтительно новорожденному млекопитающему, предпочтительно новорожденному животному и более предпочтительно поросенку.
Также согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, предпочтительно бактерия, и более предпочтительно молочнокислая бактерия. Предложенным согласно настоящему изобретению микроорганизмом является штамм СЕСТ 8700 (AqSynRMH69), который был передан на хранение в СЕСТ (Spanish Type Cultures Collection,  de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Parc  Universitat de , , 9, 46980 Paterna (Валенсия, Испания)) компанией «AQUILON CYL S.L.» 10 сентября 2014 г.
Номера AqSyn в скобках, которые можно применять как синонимы для каждого из штаммов, были присвоены штаммам авторами настоящего изобретения.
Предпочтительно композиция согласно настоящему изобретению содержит штамм СЕСТ 8700 (AqSynRMH69) и по меньшей мере один дополнительный штамм. Предпочтительно по меньшей мере один дополнительный штамм выбирают из штаммов, принадлежащих к роду Lactobacillus (предпочтительно за исключением микроорганизмов, принадлежащих к штамму Lactobacillus fermentum и Lactobacillus mucosae, предпочтительно указанным микроорганизмам соответствуют номера СЕСТ 8347 (AqSynJ12) и СЕСТ 8349 (AqSynJ55)), Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus и/или Weisella.
Согласно предпочтительным вариантам реализации указанная композиция содержит, или в качестве альтернативы состоит из по меньшей мере одного из следующих штаммов: СЕСТ 8700 (AqSynRMH69) и СЕСТ 8350 (AqSynJ59). Необязательно, композиция может содержать дополнительные штаммы. Предпочтительно, указанная композиция не содержит дополнительного штамма. Следовательно, предпочтительная композиция содержит микроорганизмы, которые включают СЕСТ 8700 (AqSynRMH69) и СЕСТ 8350 (AqSynJ59) (а именно, композиция содержит следующие микроорганизмы СЕСТ 8700 (AqSynRMH69) и СЕСТ 8350 (AqSynJ59), и она может содержать также дополнительные компоненты, которые не являются микроорганизмами).
Предпочтительно микроорганизмы, содержащиеся в композиции согласно настоящему изобретению, являются устойчивыми к антибиотикам, как более подробно описано ниже.
В любом случае под термином «содержит» могут необаятельно понимать, что присутствуют дополнительные штаммы бактерий, или что никаких дополнительных штаммов бактерий нет. Даже если никаких дополнительных штаммов бактерий нет, термин «содержит» может необязательно относиться к дополнительным другим ингредиентам, т.е. к тому, что присутствуют любые ингредиенты, отличные от бактерии.
Штамм СЕСТ 8350 (AqSynJ59) был передан на хранение в СЕСТ (Spanish Type Cultures Collection,  de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Parc  Universitat de , , 9, 46980 Paterna (Валенсия, Испания)) компанией «AQUILON CYL S.L» 16 мая 2013 г.
Термин «лечение» или «терапия» включает способы и профилактики, и лечения заболевания, поскольку оба варианта направлены на поддержание или восстановление здоровья. Независимо от происхождения боли, дискомфорта или нетрудоспособности, их облегчение путем введения соответствующего агента должно подразумеваться в качестве терапии или терапевтического применения в контексте настоящей заявки.
Согласно некоторым вариантам реализации композицию согласно настоящему изобретению можно применять, например, при реализации способа лечения человека или животного, например, способа лечения или профилактики диареи и/или для увеличения массы новорожденного млекопитающего и/или способа ускорения роста новорожденного млекопитающего. Предпочтительно, указанную композицию можно применять при реализации способа лечения животного, например, способа лечения или профилактики диареи и/или для увеличения массы новорожденного млекопитающего и/или способа ускорения роста новорожденного млекопитающего, такого как новорожденный поросенок. Диарея может быть вызвана бактерией и/или вирусной инфекцией (а именно, бактериальная инфекция и/или вирусная инфекция может быть причиной диареи у новорожденного млекопитающего).
Композиция согласно настоящему изобретению особенно подходит для лечения или профилактики патологического состояния у млекопитающего, такого, как описано выше, например, диареи и/или инфекции, такой как бактериальная инфекция и/или вирусная инфекция. Согласно некоторым вариантам реализации указанное патологическое состояние может быть выбрано из диареи, вызванной бактериальной инфекцией (включая коллибациллез), диареи новорожденных, вызванной Clostridium difficile, Clostridium perfringens типа А и С. Согласно некоторым вариантам реализации указанное патологическое состояние может быть выбрано из диареи, вызванной вирусной инфекцией, такой как инфекция, вызванная, ротавирусом, коронавирусом, норовирусом, аденовиурсом и/или астровирусом, предпочтительно инфекции, вызванные ротавирусом и/или коронавирусом. Также можно вводить указанную композицию животным, страдающим диареей, даже если (еще) не было подтверждено, что причиной указанной диареи является (бактериальная и/или вирусная) инфекция. Также композицию согласно настоящему изобретению можно вводить до того, как у животного возникнет диарея и/или инфекция, чтобы предотвратить диарею и/или инфекцию.
Краткое описание фигур
Фиг. 1: Зоны подавления роста, пример для иллюстрации.
Фиг. 2: % пометы с диареей.
Фиг. 3: % пометы, подвергнутые лечению.
Подробное описание изобретения
В нижеследующем подробном описании раскрываются специфические и/или предпочтительные варианты индивидуальных свойств изобретения. Также настоящее изобретение предполагает в качестве конкретных предпочтительных вариантов реализации те варианты реализации, которые генерируются при сочетании двух или более специфических и/или предпочтительных вариантов, описываемых для двух или более свойств настоящего изобретения.
Если явно не указано другое, термин «.включающий» в контексте настоящего документа означает, что помимо членов перечня, который дан в пределах термина «включающий», могут необязательно присутствовать и другие члены. Однако в качестве специфического варианта реализации настоящего изобретения предполагается, что термин «включающий» следует понимать как «состоящий из».
Если явно не указано другое, все указания на относительные количества в настоящей заявке делаются на основании масса/масса. Указания относительных количеств компонента, характеризуемого родовым термином, как предполагается, должны относиться к полному количеству всех специфических вариантов или членов, охватываемых указанным родовым термином. Если указано, что определенный компонент, определяемый родовым термином, содержится в определенном относительном количестве, и если указанный компонент дополнительно охарактеризован, как специфический вариант или член, охватываемый общим термином, это означает, что никаких других вариантов или членов, охватываемых родовым термином, дополнительно не присутствует, так что полное относительное количество компонентов, охватываемых родовым термином, превышало бы указанное относительное количество; более предпочтительно, ни одного другого варианта или члена, охватываемого родовым термином, вообще не присутствует.
В настоящей заявке под термином «приблизительно» понимают значение ±1% от его значения, или под термином «приблизительно» понимают значение ±2% от его значения, или под термином «приблизительно» понимают значение ±5% от его значения, или под термином «приблизительно» понимают значение ±10% от его значения, или под термином «приблизительно» понимают значение ±20% от его значения, или под термином «приблизительно» понимают значение ±30% от его значения; предпочтительно под термином «приблизительно» понимают точно указанное значение (±0%).
В настоящем изобретении объединена концепция пробиотиков и пребиотиков, которая в результате дает синбиотики. Авторы настоящего изобретения открыли новый терапевтический диапазон бактерии и композиций, обладающих иммуномодулирующим действием. Микроорганизмы или композиции согласно настоящему изобретению можно вводить на ранних сроках жизни животного, такого как поросенок. Таким образом, изобретение относится к продуктам и композициям, которые могут быть полезны в животноводстве. Фактическое важное наблюдение, доказанное приведенными здесь примерами, состоит в том, что лечение пробиотиками по меньшей мере так же эффективно и, наиболее вероятно, лучше (по сравнению со стандартным лечением антибиотиками), в том что касается продуктивности лечения антибиотиками. Вклад авторов изобретения имеет огромное экономическое влияние, и из-за общей стоимости лечения, и из-за давления законодательства и влияния на окружающую среду.
Микроорганизмы, предпочтительно бактерии, которые можно применять согласно настоящему изобретению, являются бактериями с полезными эффектами. Предпочтительно они включают молочнокислых бактерий. Согласно настоящему изобретению можно применять даже не бактериальные штаммы микроорганизмов, если они удовлетворяют критериям отбора а. – с., перечисленным ниже. Например, известно, что также пробиотическими свойствами обладают некоторые дрожжи.
Хотя описанные в настоящей заявке функциональные параметры являются наиболее важными критериями отбора того, насколько подходит тот или иной штамм микроорганизмов, все же предпочтительны молочнокислые бактерии. Молочнокислые бактерии (МКБ) включают клад грамположительных, устойчивых к кислоте бактерий, которые объединены по их общим метаболическим и физиологическим характеристикам. Указанные бактерии, обнаруживаемые в природе в разлагающихся растениях и молочных продуктах, а также в экскрементах животных, в качестве основного конечного метаболического продукта ферментации углеводов вырабатывают молочную кислоту. Молочнокислые бактерий обычно считаются безопасными (статус GRAS) благодаря их повсеместному присутствию в пище и их вкладу в здоровую микрофлору на слизистых оболочках млекопитающих. Молочнокислые бактерии предпочтительно выбраны из рода Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus, и Weisella. Предпочтительны бактерии из рода Lactobacillus и/или Enterococcus. Предпочтительны бактерии Lactobacillus. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения микроорганизмы, относящиеся к штамму Lactobacillus fermentum и Lactobacillus mucosae, могут не присутствовать в композиции согласно настоящему изобретению. В частности, согласно одному варианту реализации настоящего изобретения, микроорганизмы, относящиеся к Lactobacillus fermentum СЕСТ 8347 (AqSynJ12) и Lactobacillus mucosae СЕСТ 8349 (AqSynJ55) могут не присутствовать в композиции, согласно настоящему изобретению.
Бактерии, предпочтительные для целей настоящего изобретения, предпочтительно являются грамположительными и каталаза-негативными. Узнать, является ли бактерия грамположительной, можно при помощи стандартных технологий, известных в технике. Окрашивание по Граму включает последовательное окрашивание разными «красителями» (красками) и отмывку образца с целью проверить, является ли он положительным или отрицательным. Является ли бактерия каталаза-негативной, определяют следующим образом: проба на каталазу включает добавление перекиси водорода к пробе культуры или скошенному агару. Если рассматриваемая бактерия вырабатывает каталазу, она будет преобразовывать перекись водорода, и будет образовываться газообразный кислород. Появление газа вызывает образование пузырьков, и такие пузырьки показывают, что результат пробы положительный (каталаза-позитивная бактерия).
Предпочтительные для целей настоящего изобретения молочнокислые бактерии предпочтительно способны расти на среде MRS (Man Rogosa Sharpe), и более предпочтительно на закисленном агаре MRS, как описано ниже. Среда MRS была создана для способствования росту молочнокислых бактерий, особенно штаммов Lactobacillus. Предполагается, что она не благоприятствует росту подавляющего большинства грамотрицательных бактерий. Однако на MRS в конечном счете могут расти бактерии кроме молочнокислых бактерий, и, следовательно, рекомендуется или даже необходимо проверять, что колонии относятся к грамположительным и каталаза-негативным бактериям.
Предпочтительные для целей настоящего изобретения молочнокислые бактерии могут быть бактериями-пробиотиками. Наиболее распространенный термин «пробиотика» был введен в 1998 году Фуллером, который описал его как «пищевая добавка из живых микробов, которая благоприятно влияет на животное-хозяина, улучшая баланс микрофлоры кишечника». Как правило, пробиотики являются живыми микроорганизмами. Предполагается, что разные пробиотики обладают разным действием в кишечнике, и следовательно, разные пробиотики могут действовать совместно, обеспечивая благоприятный эффект. В других источниках под пробиотиками понимают те микроорганизмы, для которых уже было подтверждено влияние на здоровье человека или животных. Критерии отбора для пробиотиков опубликованы в: "Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health и Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria", Food и Agriculture Organization of the United Nations и World Health Organization, 2001, Кордова, Аргентина. Преимущества применения живых бактерий было подробно описано.
В последние годы была введена концепция «пребиотиков»; пребиотики представляют собой неперевариваемые компоненты пищи, которые увеличивают рост специфических микроорганизмов в желудочно-кишечном тракте. «Синбиотики» представляют собой композиции, содержащие по меньшей мере один пробиотик и по меньшей мере один пребиотик. Понятно, что такие композиции стимулируют рост полезных бактерий (например, пробиотиков). В качестве примера для иллюстрации ферментированные молочные продукты часто рассматривают как синбиотики, поскольку они содержат живые бактерии и источники пищи, нужные им. Хотя полезные свойства, ассоциированные с пребиотиками и пробиотиками, благоприятны, исследователи предостерегают от того, чтобы делать общие выводы, поскольку полезные свойства варьируют в зависимости от типа и количества потребляемого пре- и пробиотика, а также от специфических сочетаний специфических пробиотиков со специфическими пребиотиками. Таким образом, мощные синбиотики основаны на сочетании специфических штаммов бактерий-пробиотиков с тщательно подобранными пробиотиками. Они могут приносить значимую пользу здоровью млекопитающих.
Специфические пробиотики, пребиотики и синбиотики были предложены для применения у человека, и критерии отбора пробиотиков описаны, например, в «Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health и Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria", Food и Agriculture Organization of the United Nations и World Health Organization, 2001, Кордоба, Аргентина.
В настоящем изобретении применяются микроорганизмы, в частности бактерии, которые потенциально демонстрируют пользу для здоровья животных, в частности сельскохозяйственных животных. Предпочтительно животное является домашним, одомашненным или животным, которое само по себе не является домашним или одомашненным (т.е. дикое), но которое относится к тому же виду или роду, что и домашнее животное. Например, дикая свинья может быть включена в данное определение, поскольку она относится к тому же виду, что и домашняя свинья. Некоторые примеры домашних животных, которых можно лечить, включают без ограничений собак, кошек и других домашних животных, лошадей, коров, цыплят и другую домашнюю птицу, свиней, овец, коз. Более предпочтительно животное относится к подотряду свинообразных. Подотряд свинообразные (также называется Suiformes) является линией млекопитающих, которая включает свиней и пекарей из семейств Suidae и Tayassuidae. Свинья, дикая или домашняя, может быть особенно предпочтительной.
Штаммы, которые подходят для реализации настоящего изобретения (именно те, которые могут содержаться в композиции согласно настоящему изобретению) могут быть идентифицированы, как описано далее.
Первый этап установления штаммов согласно настоящему изобретению: выделение отдельных штаммов
На первом этапе выделяют пробу, содержащую микроорганизмы (предпочтительно бактерии). Может подойти любой источник микроорганизмов, который в самом широком смысле может быть любой нестерильной пробой из природы. Источником может быть организм (домашних) животных, таких как молодые животные в возрасте до 30 дней, или их матери. В качестве альтернативы источником может быть организм диких животных (например, дикие кабаны), например, пробы, отобранные у пойманных диких кабанов. Подходящие источники включают молозиво животных-маток (например, свиноматок), пробы мекония новорожденных животных (например, поросят), мазки с кишечной стенки домашних или диких животных или природные молочнокислые бактерии из кишечника.
Микроорганизмы (например, бактерии), содержащиеся в пробе, можно выращивать на среде для роста, хорошо известной в технике как подходящей для роста кишечных микроорганизмов, например, среда MRS. Микроорганизмы можно наносить штрихами, что позволяет выделить отдельные колонии. Отдельные колонии можно собирать, и впоследствии размножать на соответствующей среде для роста (например, на той же среде, которую применяли изначально).
Штаммы указанных отдельных колоний необязательно исследуют путем окрашивания по Граму при помощи способов, известных в технике (и отбирают, если они грамположительны) и/или исследуют на наличие активности каталазы, как описано выше (и отбирают, если они каталаза-негативные).
Второй этап установления штаммов согласно настоящему изобретению: исследования in vitro Чтобы быть отобранным как полезный в рамках настоящего изобретения, штамм микроорганизма, полученный предпочтительно из первого этапа, описанного выше, должен удовлетворять по меньшей мере одному из следующих критериев, которые сначала перечислены здесь, а затем более подробно разбираются ниже:
a. Активность в отношении нежелательных бактерий;
b. Устойчивость к кислоте;
c. Устойчивость к солям желчных кислот;
Расположение пунктов а-с указывает на приоритетность; т.е. наиболее желательно, чтобы был удовлетворен критерий а., еще более желательно, чтобы был удовлетворен критерий а. и b., и наиболее предпочтительно, чтобы все критерии а.-с. были удовлетворены. Критерии отбора подробно разобраны ниже.
а. Активность в отношении нежелательных бактерий
Выполняет скрининг нежелательных бактерий in vitro. «Нежелательными» являются бактерии, выбранные из следующей одной или более бактерий: штаммы: Salmonella, Listeria monocytogenes, Staphyloccocus aureus и Escherichia coli. Предпочтительно, штаммом Salmonella является Salmonella enterica, более предпочтительно кишечная Salmonella, серотип Typhimurium.
Активность в отношении нежелательных бактерий оценивают при помощи пробы по пятнам на площадке, которая описана ниже. Жидкие культуры, выращенные за одну ночь (MRS), каждого штамма, который требуется оценить, наносят в виде отдельных пятен по 10 мкл на агар MRS и инкубируют при 30°С в течение 24 ч в анаэробных условиях. После инкубации на чашки Петри наносят 7 мл полужидкого агара BHI (0,7%), в который засеяна одна из нежелательных бактерий (1%, 1 мл выращиваемой в течение ночи культуры в 100 мл среды). В отдельные чашки Петри, содержащие один конкретный штамм, который требуется оценить, наносят один штамм нежелательной бактерии, соответственно. Каждую такую пробу проводят в трех экземплярах. После инкубации в течение 24 часов при оптимальной температуре для нежелательной бактерии или вблизи нее (причем в технике известна оптимальная температура роста для каждой нежелательной бактерии, которые здесь упоминаются) образцы исследуют на предмет признаков подавления роста. С этой целью сначала проверяли, присутствует ли зона подавления роста. Если она присутствует, оптическим способом измеряют диаметр зоны подавления роста. В тех случаях, когда зона подавления роста появляется, но не имеет точной круглой формы, измерение зоны подавления роста проводят по правилу измерения наименьшего диаметра зоны подавления роста. В результате определяют среднее арифметическое для трех экспериментов, и проверяют, удовлетворен ли следующий критерий.
КРИТЕРИЙ: для штамма, чтобы он был отобран как положительный, должно быть удовлетворено по меньшей мере одно из следующих условий [(i), (ii), (iii), (iv)]:
(i) Для Salmonella, зона подавления роста 10 мм или более, например, 13 мм или более.
(ii) Для Listeria monocytogenes, зона подавления роста 9 мм или более, например, 10 мм или более.
(iii) Для Staphyloccocus aureus, зона подавления роста 9 мм или более, например, 10 мм или более.
(iv) Для Escherichia coli, зона подавления роста 10 мм или более, например, 18 мм или более.
9 мм или более включает 10 мм или более, 11 мм или более, 12 мм или более, 13 мм или более, 14 мм или более, 15 мм или более, 16 мм или более, 17 мм или более, 18 мм или более, 19 мм или более, 20 мм или более, 21 мм или более, 22 мм или более, 23 мм или более, 24 мм или более, 25 мм или более, 26 мм или более, 27 мм или более, 28 мм или более, 29 мм или более, 30 мм или более, 31 мм или более, 32 мм или более, 33 мм или более, 34 мм или более, 35 мм или более.
10 мм или более включает 11 мм или более, 12 мм или более, 13 мм или более, 14 мм или более, 15 мм или более, 16 мм или более, 17 мм или более, 18 мм или более, 19 мм или более, 20 мм или более, 21 мм или более, 22 мм или более, 23 мм или более, 24 мм или более, 25 мм или более 26 мм или более, 27 мм или более, 28 мм или более, 29 мм или более, 30 мм или более, 35 мм или более.
13 мм или более включает 14 мм или более, 15 мм или более, 16 мм или более, 17 мм или более, 18 мм или более, 19 мм или более, 20 мм или более, 19 мм или более, 20 мм или более, 25 мм или более, 30 мм или более.
18 мм или более включает 19 мм или более, 20 мм или более, 21 мм или более, 22 мм или более, 23 мм или более, 24 мм или более, 25 мм или более, 26 мм или более, 27 мм или более, 28 мм или более, 29 мм или более, 30 мм или более, 35 мм или более.
Также композицию, содержащую несколько штаммов, можно оценивать по перечисленным выше критериям, и такая композиция, чтобы ее отобрали, должна быть пригодной для любой из областей применения, описываемых в настоящей заявке, должна удовлетворять по меньшей мере одному, и более предпочтительно всем критериям [(i), (ii), (iii), (iv)]. Также можно ожидать, что такую композицию можно должным образом приготовить путем сочетания отдельных штаммов микроорганизмов, из которых каждый удовлетворяет по меньшей мере одному критерию (i), (ii), (iii), (iv); но так ли это, необходимо проверять экспериментально.
5
В качестве альтернативы, для определения зон подавления роста можно применять пробу на диффузию в лунке с агаром. Данный процесс исключает любые следовые количества молочной кислоты, которые могут образовываться в бульоне MRS с низким содержанием глюкозы путем нейтрализации бесклеточной надосадочной жидкости. Культуры штаммов, которые требовалось исследовать, в стационарной фазе, выращенные в анаэробных условиях, отбирают посредством центрифугирования (5000g/20 мин/4°С), и рН бесклеточной надосадочной жидкости корректируют до 6,5 при помощи 1М NaOH. Надосадочную жидкость стерилизуют посредством фильтрации (0,20 мм; Millipore Ltd., Хердфоршир, Англия). Бесклеточную надосадочную жидкость (30 мкл) добавляют в лунки диаметром 7 мм, вырезанные в агаре, куда засеяно [приблизительно] 10 колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл нежелательных бактерий, перечисленных в (i), (ii), (iii), (iv). Затем чашки Петри с агаром инкубируют при 30°С в течение 24 часов. Измеряют диаметр зон подавления роста вокруг лунок, и критериями отбора служат критерии, указанные под номерами (i), (ii), (iii), (iv) выше, из которых по меньшей мере один должен быть удовлетворен, чтобы штамм был отобран как положительный.
Для информации: описанные выше пробы основаны на пробах, описанных у Kawai et al., 2004. Applied и Environmental Microbiology 70(5): 2906-2911; Dortu et al., 2008. Letters in Applied Microbiology, 47: 581-586; Hata et al., 2009. International Journal of Food Microbiology, 137: 94-99, Awaisheh 2009. Food Pathogens и Disease 6 (9): 1125-1132.).
b. Устойчивость к кислоте
8
Кислоту можно рассматривать как имитацию желудочного сока, и устойчивость к ней можно проверять следующим образом. 10 мкл первичной суспензии в MRS с концентрацией 6-8×10 КОЕ/мл каждого штамма суспендируют в подкисленной MRS (рН=3,5, или в качестве альтернативы рН=2,5), подкисленной путем добавления соответствующего количества 12 Н НСl) и инкубируют при 37°С и взбалтывании со скоростью 110 об/мин. Пробы оценивают по количеству колоний (КОЕ/мл) через 0, 3 и 6 часов. Для определения устойчивости к кислоте можно применять любой другой способ, известный специалистам в данной области техники.
КРИТЕРИИ: Штамм должен быть способен сохранять по существу такую же жизнеспособность (по меньшей мере 50%, или по меньшей мере 55%, или по меньшей мере 60%, или по меньшей мере 70%, или по меньшей мере 75%, или по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 95% КОЕ после пробы по сравнению с уровнем до пробы, наиболее предпочтительно по меньшей мере 50% КОЕ после пробы по сравнению с уровнем до пробы) в течение 3-часовой инкубации в указанной среде. Для сравнения: аналогичный протокол кратко описан у Huang et al., International Journal of Food Microbiology 91: 253-260).
c. Устойчивость к солям желчных кислот
8
Моделирование естественных условий в тонком кишечнике млекопитающих. Устойчивость к солям желчных кислот можно оценивать следующим образом: 100 мкл первичной суспензии в MRS в концентрации 6-8×10 КОЕ/мл штамма бактерий суспендируют в растворе, моделирующем сок тонкого кишечника (например, MRS при рН=8 (рН корректируют путем добавления NaOH) и 0,45% экстракта желчи (экстракт желчи, свиной. B8631-100G. SIGMA-ALDRICH)) и инкубируют при 37°С при взбалтывании со скоростью 110 об/мин. Пробы оценивали по количеству колоний (КОЕ/мл) через 1, 2 и 4 часа. Для определения устойчивости к солям желчных кислот можно применять любой другой способ, известный специалистам в данной области техники.
КРИТЕРИЙ: Потери жизнеспособности не происходит (или по существу не происходит потери жизнеспособности, т.е. предпочтительно 50% или более КОЕ, например, 50%, или 60%, или 70%, или 75%, или 80%, или 95% или более КОЕ) после воздействия модельного сока тонкого кишечника (0,45% солей желчных кислот, необязательно при рН=8) в течение 4 часов. Аналогичный протокол кратко описан у Huang et al, International Journal of Food Microbiology 91: 253-260.
Необязательно штаммы, которые требуется идентифицировать как положительные по перечисленным выше критериям а.-с., можно также оценивать по их прилипанию к поверхности эпителия и стойкости в желудочно-кишечном тракте животных (например, свиней). Предполагается, что штаммы с хорошими свойствами прилипания будут вести себя наилучшим образом.
Необязательно штаммы, которые требуется идентифицировать как положительные по перечисленным выше критериям а.-с., дополнительно оценивают по их профилю устойчивости к антибиотикам, например, в пробе на минимальную концентрацию антибиотика (проба с микропланшетом VetMIC), и/или проводят пробу на генотипическую устойчивость посредством ПЦР в отношении разных генов устойчивости ( et al., 2010. Antonie van Leeuwenhoek 97: 189-200). Предполагается, что бактерии без устойчивости к антибиотикам (отсутствие или неактивность/утрата функции генов устойчивости) подходят для применения у сельскохозяйственных животных больше всего.
Согласно одному предпочтительному варианту реализации по меньшей мере один штамм, и предпочтительно все штаммы, содержащиеся в композиции, удовлетворяют критериям а.-с., приведенным выше. Кроме того, что касается критерия а., по меньшей мере один штамм, и предпочтительно все штаммы, содержащиеся в композиции, обладают всеми из перечисленных ниже видов противомикробной активности, что подтверждается зонами подавления роста, определяемыми в пробе по пятнам на площадке: (i) зона подавления роста для Salmonella 10 мм или более, (ii) зона подавления роста для Listeria 9 мм или более, (iii) зона подавления роста для Staphylococcus aureus 9 мм или более, (iv) зона подавления роста для Escherichia coli 10 мм или более.
Согласно настоящему изобретению предложена композиция, содержащая по меньшей мере один штамм, депонированный в испанской коллекции типовых культур Spanish Type Cultures Collection,  de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Parc  Universitat de , , 9,46980 Paterna (Валенсия, Испания) под номером СЕСТ 8700 (AqSynRMH69), переданный на хранение компанией AQUILON CYL S.L. 10 сентября 2014 г. Композиция согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать по меньшей мере один штамм микроорганизмов, например, по меньшей мере один, или по меньшей мере два, или по меньшей мере три, или по меньшей мере четыре, или по меньшей мере пять, или по меньшей мере шесть, или по меньшей мере семь, или по меньшей мере восемь и т.д., причем каждый последующий штамм обладает по меньшей мере одним из следующих видов противомикробной активности, подтверждаемой зонами подавления роста, определяемыми в пробе по пятнам на площадке: (i) зона подавления роста для Salmonella 10 мм или более, (ii) зона подавления роста для Listeria monocytogenes 9 мм или более, (iii) зона подавления роста для Staphyloccocus aureus 9 мм или более, (iv) зона подавления роста для Escherichia coli 10 мм или более.
Указанный по меньшей мере один дополнительный штамм, содержащийся в композиции, может предпочтительно быть выбран из штаммов, относящихся к группе, состоящей из рода Lactobacillus (предпочтительно за исключением Lactobacillus fermentum (предпочтительно СЕСТ 8347 (AqSynJ12)) и Lactobacillus mucosae (предпочтительно СЕСТ 8349 (AqSynJ55)), Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus и/или Weisella.
Например, указанная композиция включает или, в качестве альтернативы, состоит из СЕСТ 8700 (AqSynRMH69) и по меньшей мере одного, и предпочтительно одного штамма, выбранного из группы, состоящей из: СЕСТ 8163 (AqSyn04); СЕСТ 8165 (AqSyn06); СЕСТ 8164 (AqSyn09); СЕСТ 8166 (AqSyn10), СЕСТ 8347 (AqSynJ12); СЕСТ 8348 (AqSynJ17); СЕСТ 8349 (AqSynJ55) и СЕСТ 8350 (AqSynJ59).
СЕСТ 8163 (AqSyn04); СЕСТ 8165 (AqSyn06); СЕСТ 8164 (AqSyn09); СЕСТ 8166 (AqSyn10), СЕСТ 8347 (AqSynJ12); СЕСТ 8348 (AqSynJ17); СЕСТ 8349 (AqSynJ55) и СЕСТ 8350 (AqSynJ59) все были переданы на хранение в СЕСТ (Spanish Type Cultures Collection,  de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Parc  Universitat de , , 9, 46980 Paterna (Валенсия, Испания)) компанией AQUILON CYL S.L.
CECT 8163 (AqSyn04); CECT 8165 (AqSyn06); CECT 8164 (AqSyn09) и СЕСТ 8166 (AqSyn10) были переданы 20 июня 2012 г. СЕСТ 8347 (AqSynJ12); СЕСТ 8348 (AqSynJ17); СЕСТ 8349 (AqSynJ55) и СЕСТ 8350 (AqSynJ59) были переданы 16 мая 2013 г.
СЕСТ 8700 (AqSynRMH69): Lactobacillus reuteri
СЕСТ 8163 (AqSyn04): Lactobacillus reuteri
CECT 8165 (AqSyn06): Lactobacillus reuteri
CECT 8164 (AqSyn09): Enterococcus faecium
СЕСТ 8166 (AqSyn10): Enterococcus faecium
CECT 8347 (AqSynJ12): Lactobacillus fermentum
CECT 8348 (AqSynJ17): Lactobacillus reuteri
CECT 8349 (AqSynJ55): Lactobacillus mucosae
CECT 8350 (AqSynJ59): Lactobacillus plantarum
Например, согласно предпочтительному варианту реализации композиция согласно настоящему изобретению, содержащая штамм, депонированный в испанской коллекции типовых культур под номером СЕСТ 8700 (AqSynRMH69), дополнительно содержит штамм, депонированный в испанской коллекции типовых культур под номером СЕСТ 8350 (AqSynJ59). Указанная композиция может не содержать никаких других штаммов.
Согласно более предпочтительному варианту реализации композиция содержит два штамма микроорганизмов. Предпочтительно, одним из штаммов является СЕСТ 8700 (AqSynRMH69). Даже более предпочтительно, композиция согласно настоящему изобретению содержит или в качестве альтернативы состоит из двух микроорганизмов, например, из двух штаммов. Предпочтительно, указанными двумя микроорганизмами являются штамм, депонированный в испанской коллекции типовых культур под номером СЕСТ 8700 (AqSynRMH69), и штамм, депонированный в испанской коллекции типовых культур под номером СЕСТ 8350 (AqSynJ59). Согласно данному варианту реализации указанная композиция может также содержать другие компоненты, которые не являются микроорганизмами, а именно композиция может содержать дополнительные компоненты (такие как компоненты, описанные ниже), но предпочтительно указанная композиция не содержит дополнительных штаммов, помимо СЕСТ 8350 (AqSynJ59) и СЕСТ 8700 (AqSynRMH69).
Соответственно, композиция согласно настоящему изобретению может содержать смесь микроорганизмов, причем указанные микроорганизмы относятся к штаммам Lactobacillus plantarum и Lactobacillus reuteri. Необязательно композиция согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать по меньшей мере один микроорганизм, относящийся к роду Lactobacillus (предпочтительно за исключением Lactobacillus fermentum СЕСТ 8347 (AqSynJ12)) и Lactobacillus mucosae СЕСТ 8349 (AqSynJ55)), Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus и/или Weisella. Необязательно композиция согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать по меньшей мере один микроорганизм, относящийся к роду Lactobacillus (предпочтительно за исключением микроорганизмов, относящихся к штаммам Lactobacillus fermentum и Lactobacillus mucosae) Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus и/или Weisella.
Согласно предпочтительному варианту реализации композиция согласно настоящему изобретению содержит смесь микроорганизмов, причем смесь состоит из по меньшей мере одного штамма Lactobacillus plantarum и по меньшей мере одного штамма Lactobacillus reuteri. Согласно более предпочтительному варианту реализации композиция согласно настоящему изобретению содержит смесь микроорганизмов, причем смесь состоит из по меньшей мере одного штамма Lactobacillus plantarum и одного штамма Lactobacillus reuteri. Предпочтительный штамм Lactobacillus plantarum является штаммом СЕСТ 8350 (AqSynJ59). Предпочтительный штамм Lactobacillus reuteri является штаммом СЕСТ 8700 (AqSynRMH69). Согласно даже более предпочтительному варианту реализации композиция согласно настоящему изобретению содержит смесь микроорганизмов, причем смесь состоит из СЕСТ 8350 (AqSynJ59) и СЕСТ 8700 (AqSynRMH69).
Предполагается, что разные штаммы могут обладать разным действием в кишечнике, и, следовательно, разные штаммы могут действовать совместно, обеспечивая полезный эффект.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере один из штаммов, содержащихся в композиции согласно настоящему изобретению, например, один, и/или два, и/или три, и/или четыре, и/или пять, и/или шесть, и/или семь, и/или восемь штаммов, содержащихся в композиции, и предпочтительно все из штаммов, содержащихся в композиции, не проявляют устойчивости к антибиотикам, а именно они не способны выживать после воздействия соответствующих стандартных лечебных антибиотиков.
Например, согласно одному варианту реализации указанная композиция содержит или, в качестве альтернативы, состоит из штаммов СЕСТ 8700 (AqSynRMH69) и СЕСТ 8350 (AqSynJ59), не обладающих устойчивостью к антибиотикам.
В целях различения устойчивых и чувствительных штаммов Подкомиссия Европейской администрации по продовольственной безопасности по добавкам и продуктам или веществам, применяемым для кормления животных (FEEDAP), определяет пороговые микробиологические значения. Пороговые микробиологические значения устанавливают путем изучения распределения MIC избранных противомикробных средств в популяциях бактерий, относящихся к отдельной таксономической единице (штамм или род). Часть популяции, которая явно отклоняется от нормальных чувствительных популяций, классифицируют как устойчивую. Пороговые микробиологические значения, которые можно применять для оценки устойчивости к антибиотикам штаммов согласно настоящему изобретению, - это значения, определенные в «Руководстве по оценке чувствительности бактерий к противомикробным средствам медицинского и ветеринарного значения» Подкомиссии Европейской администрации по продовольственной безопасности (EFSA) по добавкам и продуктам или веществам, применяемым для кормления животных (FEEDAP), Парма, Италия. EFSA Journal 2012;10(6): 2740.
Оценку минимальной ингибирующей концентрации (MIC) in vitro, направленную на оценку устойчивости к антибиотикам, можно проводить для всех предложенных штаммов. Можно оценивать следующие антибиотики: ампициллин, ванкомицин, гентамицин, канамицин, стрептомицин, эритромицин, клиндамицин, тетрациклин и хлорамфеникол.
Другой ингредиент (или другие ингредиенты), которые могут присутствовать в композиции согласно настоящему изобретению, ни коим образом не ограничены. Согласно предпочтительному аспекту в композиции согласно настоящему изобретению содержится по меньшей мере одно соединение-пребиотик, т.е. в качестве другого ингредиента. В соответствии с самой широкой концепцией пребиотиками являются все источники питательных веществ, которые могут метаболизировать пробиотики. Предпочтительно пребиотики не перевариваются или плохо перевариваются млекопитающими. Таким образом, после употребления млекопитающим неперевариваемые пребиотики могут проходить через тонкий кишечник и поступать в толстый кишечник, стимулируя рост пробиотиков в данном компартменте. Таким образом, пребиотики могут служить источником пищи пробиотикам. Предполагается, что пребиотики, многие из которых являются неперевариваемыми углеводами, способствуют росту пробиотиков в кишечнике. Пребиотики содержатся в природных источниках, таких как лук, цельные злаки, бананы, чеснок, мед, лук-порей, артишоки, обогащенные продукты питания и напитки, а также пищевые добавки. Пребиотики хорошо известны в технике, и когда их применяют в настоящем изобретении, никаких ограничений на пребиотики как таковые нет. Однако согласно предпочтительным вариантам реализации по меньшей мере один продукт-пребиотик в композиции выбран из следующих соединений и композиций: неперевариваемые углеводы, бета-глюканы, олигосахарид маннан, инулин, олигофруктоза, галактоолигосахариды (ГОС), лактулоза, лактосахароза, галактотриоза, фрукто-олигосахарид (ФОС), целлобиоза, целлодекстрины, циклодекстрины, мальтиол, лактиол, гликозил-сахароза, витамин Е или его вариант (причем варианты выбраны из альфа, бета, гамма, дельта-токоферолов, токотриенолов и токомоноэнолов). Необязательно могут быть предпочтительны олигосахариды маннан и/или инулин.
Например, композиция согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать загустители и/или комплементарные кормы/питательные вещества. Например, композиция согласно настоящему изобретению может содержать один или более загустителей (загустители, а именно вещества, которые могут повышать вязкость жидкости, не изменяя существенно ее свойств, и которые могут улучшать суспензию из других ингредиентов или эмульсию, которые повышают стабильность продукта), например, полисахариды (пектин, растительные камеди и/или крахмалы) или белки. Например, композиция согласно настоящему изобретению дополнительно содержит растительные камеди, такие как алгинин, камедь плодов рожкового дерева, ксантановую камедь и/или гуаровую камедь, предпочтительно ксантановую камедь и/или гуаровую камедь. Например, композиция может содержать растительные камеди, такие как ксантановая камедь и гуаровая камедь, в количестве приблизительно 0,1-0,5%, предпочтительно приблизительно 0,3% масса/масса (0,3 грамма загустителя (например, растительные камеди, такие как ксантановая камедь и гуаровая камедь) на 100 мл.
Кроме того, композиция согласно настоящему изобретению может содержать дополнительные корма (питательные вещества), такие как, например, молочные продукты, сахара и т.д. Указанная композиция может содержать сухое обезжиренное молоко в количестве приблизительно 0,5-2% масса/объем, предпочтительно 1% масса/объем. Также композиция может содержать сахар (предпочтительно сахарозу) в количестве приблизительно 0,1%-1% масса/объем, предпочтительно 0,5% масса/объем.
Кроме того, композиция согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать раствор для инфузий, такой как солевой раствор в воде (вода с NaCl). Например, композиция может содержать воду с приблизительно 0,9% NaCl масса/объем в качестве раствора для инфузий.
Согласно одному варианту реализации композиция согласно настоящему изобретению содержит или, в качестве альтернативы, состоит из следующих компонентов:
Что касается композиций согласно настоящему изобретению, которые могут содержать разные штаммы, возможен любой процентный состав смеси. Процентный состав смеси выражают в колониеобразующих единицах (КОЕ), который должным образом определяют перед смешиванием индивидуальных штаммов. Согласно одному варианту реализации отношение штаммов может быть равным или не равным, например, 1:(0,1-1) для композиции, содержащей два штамма, 1:(0,1-10):(0,1-10) для композиции, содержащей три штамма, 1:(0,1-10):(0,1-10):(0,1-10) для композиции, содержащей четыре штамма и т.д. Например, соотношение в композиции, содержащей два штамма, может быть от 1:2 до 2:1. Согласно другому варианту реализации соотношения штаммов приблизительно или по существу равные, например, 1:1 для композиции, содержащей два штамма, 1:1:1 для композиции, содержащей три штамма, 1:1:1:1 для композиции, содержащей четыре штамма и т.д. Указанную композицию можно получить путем смешивания соответствующего количества бактерий (которое определяется по количеству колоний) каждого штамма, который требуется включить в композицию. Штаммы, которые требуется включить, могут быть представлены в виде биомассы отдельных штаммов, причем каждый из них, например, в форме лиофилизата. В том случае, если разные биомассы имеют разные концентрации (КОЕ/г), применяют соответствующее количество (г) каждого из них, чтобы желаемая композиция содержала желаемое КОЕ каждого штамма. Такие примеры приведены ниже.
8
9
Согласно предпочтительному варианту реализации, когда композиция содержит или в качестве альтернативы состоит из двух штаммов, соотношение штаммов приблизительно или по существу равно, например, 1:1. Например, композиция согласно настоящему изобретению может содержать или, в качестве альтернативы, состоять из штамма AqSynJ59 - Lactobacillus plantarum и штамма AqSynRMH69-Lactobacillus reuteri в соотношении 1:1, или, например, более или приблизительно 5×10 КОЕ каждого из перечисленных выше штаммов (например, всего более или приблизительно 10 КОЕ в композиции).
Также согласно настоящему изобретению предложено применение композиции согласно настоящему изобретению при реализации способа лечения человека и/или животного.
Таким образом, композицию согласно настоящему изобретению можно применять при реализации способа лечения (после клинических проявлений заболевания (например, диареи)) и/или для профилактики (до клинических проявлений заболевания (например, диареи)). Может быть предпочтительно лечение животного, млекопитающего и/или домашнего животного в частности. Предпочтительно, животное является животным, отличным от человека, и более предпочтительно животное из подотряда свинообразных (подотряд Suina (также называемый Suiformes) является линией млекопитающих, которая включает свиней и пекарей из семейств Suidae Tayassuidae). Свиньи, дикие или домашние, могут быть особенно предпочтительны. Также они включают свиней, которые живут в полудиких условиях, т.е. расы домашних свиней, которые живут большую часть своей жизни на улице и сами находят себе пропитание. Указанной композицией может быть композиция, содержащая по меньшей мере один из перечисленных выше депонированных штаммов. Согласно другому варианту реализации композицию согласно настоящему изобретению можно вводить человеку.
Композицию согласно настоящему изобретению можно применять при реализации способа для лечения человека или животного, которые описаны выше. Указанный способ лечения человека или животного может быть способом увеличения массы у новорожденного млекопитающего, предпочтительно поросенка. Дополнительно и/или в качестве альтернативы способ лечения человека или животного может быть способом стимулирования роста новорожденного животного, предпочтительно, поросенка. Дополнительно и/или в качестве альтернативы способ лечения человека или животного может быть способом лечения или профилактики диареи у новорожденного млекопитающего, предпочтительно поросенка. Диарея может быть вызвана бактериальной инфекцией. Диарея может быть вызвана не бактериальной инфекцией, такой как вирусная инфекция и/или паразит. Указанный способ лечения человека или животного может быть способом лечения или профилактики лечения, например, бактериальной инфекции и/или вирусной инфекции. Кроме того, композицию согласно настоящему изобретению можно вводить перед выявлением симптомов, чтобы предупредить развитие патологического состояния у человека и/или животного, например, диареи и/или инфекции, например, бактериальной инфекции и/или вирусной инфекции.
Композицию согласно настоящему изобретению можно предпочтительно применять при реализации способа лечения животного. Предпочтительно указанное животное является сельскохозяйственным животным, и сельскохозяйственные животные включают без ограничений лошадей, коров, цыплят и другую домашнюю птицу, свиней, овец, коз. Более предпочтительно, указанное животное относится к подотряду свинообразные, даже более предпочтительно является поросенком. Данный способ лечения животного может быть способом увеличения массы новорожденного млекопитающего, предпочтительно поросенка. Дополнительно и/или в качестве альтернативы указанный способ лечения животного может быть способом стимулирования роста новорожденного млекопитающего, предпочтительно поросенка. Дополнительно и/или в качестве альтернативы указанный способ лечения животного может быть способом лечения или профилактики диареи у новорожденного млекопитающего, предпочтительно поросенка. Диарея может быть вызвана бактериальной инфекцией. Диарея может быть вызвана вирусной инфекцией или любой другой причиной. Кроме того, композицию согласно настоящему изобретению можно вводить перед выявлением симптомов, чтобы предупредить развитие патологического состояния у животного, такого как, например, диареи и/или инфекции, например, бактериальной инфекции и/или вирусной инфекции.
Композицию согласно настоящему изобретению можно с пользой вводить новорожденному млекопитающему, предпочтительно поросенку, даже если (еще) нет клинических проявлений заболевания (например, диареи). Например, композицию согласно настоящему изобретению можно с пользой вводить здоровым новорожденным млекопитающим, предпочтительно поросятам.
Композицию согласно настоящему изобретению можно вводить здоровым новорожденным млекопитающим, предпочтительно поросятам, которые:
- Демонстрируют проявления диареи.
- (Еще) не демонстрируют клинических проявлений диареи, но инфицированы бактерией и/или вирусом, которые потенциально могут вызывать диарею.
- Здоровы.
Предпочтительно, человек и/или животное, которые нуждаются в лечении композицией согласно настоящему изобретению, не подвергаются никакому другому лечению; предпочтительно, указанных человека и/или животное не лечат антибиотиками.
Антибиотики являются лекарственными препаратами, применяемыми для лечения и/или профилактики инфекций, таких как бактериальные инфекции.
Согласно предпочтительному варианту реализации композицию согласно настоящему изобретению вводят новорожденным детям и/или животным (предпочтительно, поросятам) на ранних сроках после рождения, а именно в первые 30 дней после рождения, предпочтительно в первые 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2 дня после рождения, и более предпочтительно в первые 2 дня (48 часов) после рождения или в первый день (24 часа) после рождения. Предпочтительно композицию согласно настоящему изобретению вводят один раз в первые 48 часов после рождения, даже более предпочтительно в первые 24 часа после рождения, например, сразу же (незамедлительно) после рождения. Композицию согласно настоящему изобретению можно вводить два раза; один раз в первый день после рождения, а второй раз во второй день после рождения.
Как было описано выше, в композиции согласно настоящему изобретению содержится по меньшей мере (например, один), например, по меньшей мере два (например, два), например, по меньшей мере три, например, по меньшей мере четыре или более четырех разных штаммов микроорганизмов (наиболее предпочтительно два), предпочтительно бактерий и более предпочтительно молочнокислых бактерий, выбранных в соответствии по меньшей мере с одним, и предпочтительно всеми тремя критериями а.-с., которые описаны выше. В случае композиции, предназначенной для применения при реализации способа лечения человека и/или животного, описанного выше, каждый микроорганизм, предпочтительно бактерия и более предпочтительно молочнокислая бактерия должны удовлетворять по меньшей мере одному из критериев а.-с. (активность в отношении нежелательных бактерий; устойчивость к кислоте; устойчивость к солям желчных кислот), которые описаны выше. Что касается критерия а., вышеуказанная минимальная зона подавления роста предпочтительно наблюдается для всех желаемых бактерий (i)-(iv). Предпочтительно микроорганизмы, предпочтительно бактерии и более предпочтительно молочнокислые бактерии, содержащиеся в композиции согласно настоящему изобретению, должны удовлетворять нескольким (например, а. и b.) и предпочтительно всем из критериев (а.-с.), перечисленных выше. Кроме того, предпочтительно, по меньшей мере один (например, один), например, по меньшей мере два (например, два), например, по меньшей мере три, например, по меньшей мере четыре или более четырех разных штаммов микроорганизмов (наиболее предпочтительно два), предпочтительно бактерий и более предпочтительно молочнокислых бактерий, содержащихся в композиции согласно настоящему изобретению (подходящих для применения при реализации способа лечения человека и/или животного), не обладают устойчивостью к антибиотикам, а именно они не способны выживать после воздействия соответствующих стандартных лечебных антибиотиков. Композицию пробиотиков или композицию синбиотиков можно применять при реализации указанного способа для лечения человека и/или животного (т.е., одна композиция содержит по меньшей мере одно соединение-пребиотик).
Композиция согласно настоящему изобретению предпочтительно содержит живые микроорганизмы, предпочтительно бактерии.
Авторы настоящего изобретения показали, что введение композиции согласно настоящему изобретению в любом ее варианте в нужное время (а именно, на ранних сроках после рождения, как описано выше) оказывает сильное воздействие на то, как организм новорожденного ребенка или животного (предпочтительно поросенка) может бороться с дисбактериозом разной этиологии. Например, авторы изобретения показали, что чтобы композиция проявляла лучшее действие при лечении человека и/или животного, например, при лечении или профилактике диареи, композицию следует предпочтительно вводить на ранних сроках после рождения, например, в первые 30 дней после рождения (предпочтительно в первые 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2 дня после рождения, и более предпочтительно в первые 2 дня после рождения или в первый день (24 часа) после рождения). Даже более предпочтительно композицию согласно настоящему изобретению вводят в первые два дня после рождения, например, один раз в первые 48 часов после рождения и/или например, в первый день после рождения (24 часа) и/или во второй день после рождения. Композицию можно вводить (необязательно дополнительно) в третий день после рождения. Предпочтительно композицию согласно настоящему изобретению вводят один раз в первые 48 часов после рождения, даже более предпочтительно в первые 24 часа после рождения, например, сразу после рождения. Необязательно, особенно если у животного и/или человека наблюдаются симптомы диареи и/или инфекции, вторую дозу композиции пробиотиков вводят через 24 часа после первой дозы.
Подходит любой путь введения, но пероральное введение может быть предпочтительным. Наиболее часто дозу вводят каждому животному прямо в ротовую полость, чтобы убедиться, что животное проглотило дозу. В качестве альтернативы композиция может быть предложена в форме пищевой добавки, т.е. ежедневно добавляться в корм животного.
Указанная композиция может быть в любой форме, например, лиофилизированной, жидкой или распыленной форме. Если для приготовления композиции применяют, например, лиофилизированную бактерию, то указанную предварительную композицию лиофилизированных бактерий можно повторно гидратировать, например, стерильным изотоническим раствором хлорида натрия или стерильной водой, или стерильной средой для роста, так что можно получить готовую композицию с желаемой общей концентрацией (КОЕ/мл).
7
8
9
10
11
9
9
8
9
Для более простого применения композиция может быть в дозированной форме. Например, каждая доза может содержать 10 или более, 10 или более, 10 или более, 10 или более, 10или более колониеобразующих единиц (КОЕ) микроорганизмов (предпочтительно бактерий); может быть предпочтительна доза 10 или более. Доза может варьировать по объему в диапазоне от 0,1 до 100 мл, предпочтительно от 0,2 до 50 мл, более предпочтительно от 0,5 до 20 мл, более предпочтительно от 1,0 до 10 мл, более предпочтительно от 1,5 до 5 мл, и даже более предпочтительно (по существу) 2 мл. Доза 2 мл, содержащая 10 или более КОЕ, может быть особенно предпочтительной. В том случае, когда композиция содержит два штамма, доза 2 мл может предпочтительно содержать 5-10 КОЕ каждого штамма (а именно всего 10КОЕ на дозу).
Можно вводить любое количество доз, и специалист в данной области техники может выбрать продолжительность лечения в соответствии с потребностями соответствующей фермы. Согласно одному конкретному варианту реализации общее количество вводимых животному доз составляет 10 или менее, например, любое количество, выбранное из следующего перечня: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или любого диапазона, сочетающего любое одно из указанных количеств (за исключением 10) с любым одним из указанных количеств, при условии что второе число больше (например, 1-3 дозы).
Например, по меньшей мере одну дозу вводят животному в первые 48 часов после рождения. Например, животному в первые 48 часов после рождения вводят одну дозу. Например, единственную дозу животному вводят сразу после рождения (в первые 24 часа после рождения). Необязательно, предпочтительно, если животное демонстрирует симптомы диареи и/или инфекции, вторую дозу вводят животному через 24 часа после первой дозы. Необязательно впоследствии через 24 часа после второй дозы можно ввести третью дозу через 24 часа после второй дозы, и т.д.
Может быть предпочтительно всего две дозы на животное. Согласно предпочтительному варианту реализации первую дозу вводят в первые 24 часа после рождения (день 1 после рождения), а вторую дозу вводят в последующие 24 часа (день 2 после рождения).
Необязательно, может быть только две дозы. Согласно другому варианту в дальнейшем вводят дополнительные дозы, например, третью дозу на третий день после рождения и/или четвертую дозу на четвертый день после рождения и т.д.
8
Предпочтительно каждая из доз содержит по меньшей мере два штамма. Предпочтительно указанными двумя штаммами являются СЕСТ 8700 (AqSynRMH69) и СЕСТ 8350 (AqSynJ59), и их вводят в дозе 2 мл, содержащей 5⋅10 КОЕ каждого штамма (а именно штаммы в соотношении, выраженном в колониеобразующих единицах (КОЕ) 1:1), в первые 48 часов после рождения, например, в первые 24 часа после рождения, предпочтительно сразу после рождения. Вторую и/или третью дозу можно необязательно вводить в первые 48 часов после рождения и/или в третий день после рождения. Например, одну дозу можно вводить сразу после рождения (в первые 24 часа) и необязательно вторую дозу вводят через 24 часа после первой дозы, а именно в течение второго дня после рождения, особенно если наблюдаются симптомы диареи и/или инфекции. Третью дозу можно необязательно вводить на третий день после рождения. Их предпочтительно вводят млекопитающим, предпочтительно новорожденным поросятам.
8
Предпочтительно каждая из доз содержит по меньшей мере два штамма. Предпочтительно указанными двумя штаммами являются СЕСТ 8700 (AqSynRMH69) и СЕСТ 8350 (AqSynJ59), и их вводят в дозе 2 мл, содержащей 5⋅10 КОЕ каждого штамма (а именно штаммы в соотношении, выраженном в колониеобразующих единицах (КОЕ) 1:1), в первый и второй день после рождения. Необязательно на третий день после рождения можно вводить третью дозу. Их предпочтительно вводят млекопитающим, предпочтительно новорожденным поросятам.
Композиция согласно настоящему изобретению особенно подходит для лечения или профилактики патологического состояния у человека и/или животного, предпочтительно новорожденного млекопитающего, которые описаны выше, такого как диарея, бактериальная инфекция, вирусная инфекция или дисбактериоз. Указанная инфекция может быть или может включать инфекцию пищеварительного тракта. Такая инфекция может быть вызвана любой бактерией, такой как, например, Escherichia coli, одна или в сочетании с Clostridium perfringens или с Clostridium difficile. Другие возбудители могут включать Salmonella, Listeria monocytogenes, Staphyloccocus aureus. Согласно некоторым вариантам реализации патологическое состояние может быть выбрано из диареи, вызванной бактериальными инфекциями (включая колибациллез), диареи новорожденных, вызванной Clostridium difficile, Clostridium perfringens типа А и С. Также можно лечить стрептококковый менингит.
Инфекция может быть вызвана любым вирусом, таким как ротавирус, коронавирус, норовирус, аденовирус и/или астровирус, предпочтительно ротавирусом и/или коронавирусом.
Также можно вводить композицию животным, страдающим диареей или с риском развития диареи, даже если (бактериальная и/или вирусная) инфекция (еще) не подтверждена как причинный фактор указанной диареи. Животными с риском развития диареи можно считать тех животных, которые живут (или родились) на территориях, на которых диарея наблюдалась в последние 12 месяцев, 6 месяцев, 3 месяца или 1 месяц.
Композицию согласно настоящему изобретению также можно вводить до того, как у человека и/или животного разовьются какие-либо симптомы диареи и/или какой-либо инфекции, чтобы предупредить развитие диареи и/или инфекции.
Специалист в данной области техники способен определить симптомы диареи и/или любой инфекции у человека и/или животного. Например, симптомы могут включать водянистую диарею, водянистый/жидкий (пастообразный) стул, боль, легкие системные признаки, такие как пирексия, анорексия и/или сонливость, слабость, ухудшение/усугубление общего состояния организма, похудение и др. На диарею и/или инфекцию может указывать любой другой симптом, свидетельствующий о ненормальном поведении.
Композицию согласно настоящему изобретению можно также вводить, если у человека и/или животного нет симптомов диареи и/или инфекции, а именно здоровому человеку и/или животному.
8
Согласно предпочтительному варианту реализации композиция согласно настоящему изобретению содержит, или в качестве альтернативы состоит из СЕСТ 8700 (AqSynRMH69) и СЕСТ 8350 (AqSynJ59), и ее вводят в дозе 2 мл, содержащей 5⋅10 КОЕ каждого штамма новорожденному животному, предпочтительно новорожденному поросенку два раза - один в первый день после рождения, а второй - во второй день после рождения (например, через 24 часа после введения первой дозы). Указанная композиция может быть предназначена для применения при реализации способа лечения новорожденных поросят, в частности при реализации способа лечения и/или профилактики диареи, предпочтительно вызванной инфекцией, такой как бактериальная инфекция и/или вирусная инфекция. Также указанную композицию можно вводить здоровым новорожденным поросятам (а именно поросятам без симптомов диареи и/или инфекции). Кроме того, композицию можно также применять при реализации способа увеличения массы и/или стимулирования роста новорожденного животного, предпочтительно новорожденного поросенка.
Результаты авторов изобретения подтверждают благоприятное действие применения продуктов и композиций согласно настоящему изобретению. Как показано ниже в примерах, подтверждающих концепцию, смертность явно была ниже, чем в другие недели, когда проводилась только стандартная терапия антибиотиками (см. Примеры). Таким образом, предпочтительно композицию согласно настоящему изобретению вводят животным, которые в то же время не получают антибиотика(ов).
Также согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм - штамм СЕСТ 8700 (AqSynRMH69). Предполагается, что данный штамм обладают пробиотическими свойствами, и, следовательно, может называться пробиотиком. Штамм был выделен авторами настоящего изобретения по критериям отбора, описанным выше. СЕСТ означает испанскую коллекцию типовых культур, тогда как номера AqSyn в скобках, которые можно применять как синонимы для каждого штамма, были присвоены штаммам авторами настоящего изобретения. Бактерию оценивали и показали, что она удовлетворяет по меньшей мере одному из критериев, а.-с., перечисленных выше.
При подборе дополнительных штаммов с полезными свойствами согласно настоящему изобретению может быть достаточно, чтобы любой такой штамм, чтобы он был отобран как подходящий в рамках настоящего изобретения, удовлетворял по меньшей мере одному из критериев, а.-с., перечисленных выше. Также согласно настоящему изобретению предложена композиция, содержащая по меньшей мере один, например, один, предпочтительно по меньшей мере два, например, два, более предпочтительно по меньшей мере три, например, три, более предпочтительно по меньшей мере четыре, например, четыре, в качестве альтернативы по меньшей мере пять, например, пять, в качестве альтернативы по меньшей мере шесть, например, шесть, в качестве альтернативы по меньшей мере семь, например, семь, в качестве альтернативы по меньшей мере восемь, например, восемь. Предполагается, что разные штаммы обладают разным действием на кишечник, и, следовательно, разные штаммы могут вместе обеспечивать благоприятное действие.
ПУНКТЫ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ (I)
1. Композиция, содержащая по меньшей мере штамм, депонированный в испанской коллекции типовых культур под номером СЕСТ 8700 (AqSynRMH69).
2. Композиция по п. 1, дополнительно содержащая по меньшей мере один штамм микроорганизмов, отличающаяся тем, что каждый дополнительный штамм обладает по меньшей мере одной из следующих видов противомикробной активности, доказанной наличием зон угнетения роста, определяемых в пробе по пятнам на площадке: (i) 10 мм или более для Salmonella, (ii) 9 мм или более для Listeria monocytogenes, (iii) 9 мм или более для Staphyloccocus aureus, (iv) 10 мм или более для Escherichia coli.
3. Композиция по любому из пп. 1-2, отличающаяся тем, что по меньшей мере один дополнительный штамм выбирают из штаммов, относящихся к роду Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus и/или Weisella.
4. Композиция по любому из пп. 1-3, отличающаяся тем, что композиция дополнительно содержит штамм, депонированный в испанской коллекции типовых культур под номером СЕСТ 8350 (AqSynJ59).
5. Композиция по п. 4, отличающаяся тем, что композиция содержит два штамма микроорганизмов, и отличающаяся тем, что два микроорганизма включают штамм, депонированный в испанской коллекции типовых культур под номером СЕСТ 8700 (AqSynRMH69), и штамм, депонированный в испанской коллекции типовых культур под номером СЕСТ 8350 (AqSynJ59).
6. Композиция по любому из пп. 2-5, отличающаяся тем, что оба штамма присутствуют в композиции в соотношении, выраженном в колониеобразующих единицах (КОЕ), приблизительно от 1:2 до 2:1.
7. Композиция по п.6, отличающаяся тем, что оба штамма присутствуют в композиции в соотношении в колониеобразующих единицах (КОЕ) приблизительно 1:1.
8. Композиция по любому из пп. 1-7, отличающаяся тем, что по меньшей мере один штамм, и предпочтительно все штаммы, содержащиеся в композиции, не обладают устойчивостью к антибиотикам.
9. Композиция по любому из пп. 1-8, отличающаяся тем, что по меньшей мере один штамм, и предпочтительно все штаммы, содержащиеся в композиции, способны сохранять по существу одинаковую жизнеспособность в течение 3-часовой инкубации при рН 3,5.
10. Композиция по любому из пп. 1-9, отличающаяся тем, что по меньшей мере один штамм, и предпочтительно все штаммы, содержащиеся в композиции, способны сохранять по существу одинаковую жизнеспособность в течение 4-часовой инкубации в присутствии 0,45% экстракта желчи.
11. Композиция по любому из пп. 1-10, отличающаяся тем, что по меньшей мере один штамм, и предпочтительно все штаммы, содержащиеся в композиции, обладают всеми из перечисленных ниже видов противомикробной активности, что подтверждается зонами подавления роста, определяемыми в пробе по пятнам на площадке: (i) зона подавления роста для Salmonella 10 мм или более, (ii) зона подавления роста для Listeria monocytogenes 9 мм или более, (iii) зона подавления роста для Staphyloccocus aureus 9 мм или более, (iv) зона подавления роста для Escherichia coli 10 мм или более.
12. Композиция по любому из пп. 1-11 для применения при реализации способа лечения человека и/или животного.
13. Композиция по п. 12, для применения при реализации способа лечения животного.
14. Композиция, содержащая смесь микроорганизмов, отличающаяся тем, что микроорганизмы относятся к штамму Lactobacillus plantarum и Lactobacillus reuteri, и необязательно включающая по меньшей мере один микроорганизм, относящийся к роду Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus и/или Weisella, для применения при реализации способа лечения человека или животного.
15. Композиция, содержащая смесь микроорганизмов, отличающаяся тем, что микроорганизмы относятся к штамму Lactobacillus plantarum и Lactobacillus reuteri, и необязательно включающая по меньшей мере один микроорганизм, относящийся к роду Lactobacillus (за исключением следующих микроорганизмов: СЕСТ 8347 (AqSynJ12) и СЕСТ 8349 (AqSynJ55)), Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus и/или Weisella, для применения при реализации способа лечения человека или животного.
16. Композиция, содержащая смесь микроорганизмов, отличающаяся тем, что микроорганизмы относятся к штамму Lactobacillus plantarum и Lactobacillus reuteri, и необязательно включающая по меньшей мере один микроорганизм, относящийся к роду Lactobacillus (за исключением микроорганизмов, относящихся к штаммам Lactobacillus fermentum и Lactobacillus mucosae) Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus и/или Weisella, для применения при реализации способа лечения человека или животного.
17. Композиция для применения по любому из пп. 12-16, отличающаяся тем, что смесь микроорганизмов состоит из микроорганизмов, относящихся к штаммам Lactobacillus plantarum и Lactobacillus reuteri.
18. Композиция для применения по любому из пп. 12-17, отличающаяся тем, что по меньшей мере один штамм, и предпочтительно все штаммы обладают по меньшей мере одним из перечисленных ниже видов противомикробной активности, что подтверждается зонами подавления роста, определяемыми в пробе по пятнам на площадке: (i) зона подавления роста для Salmonella 10 мм или более, (ii) зона подавления роста для Listeria monocytogenes 9 мм или более, (iii) зона подавления роста для Staphyloccocus aureus 9 мм или более, (iv) зона подавления роста для Escherichia coli 10 мм или более.
19. Композиция для применения по любому из пп. 12-18, отличающаяся тем, что по меньшей мере один штамм, и предпочтительно все штаммы, содержащиеся в композиции, не обладают устойчивостью к антибиотикам.
20. Композиция для применения по любому из пп. 12-19, отличающаяся тем, что по меньшей мере один штамм, и предпочтительно все штаммы, содержащиеся в композиции способны сохранять по существу одинаковую жизнеспособность в течение 3-часовой инкубации при рН 3,5.
21. Композиция для применения по любому из пп. 12-20, отличающаяся тем, что по меньшей мере один штамм, и предпочтительно все штаммы, содержащиеся в композиции способны сохранять по существу одинаковую жизнеспособность в течение 4-часовой инкубации в присутствии 0,45% экстракта желчи.
22. Композиция для применения по любому из пп. 12-21, отличающаяся тем, что данную композицию вводят человеку или животному в первые 30 дней после рождения.
23. Композиция для применения по п. 22, отличающаяся тем, что данную композицию вводят человеку или животному в первые 14 дней после рождения.
24. Композиция для применения по п. 23, отличающаяся тем, что данную композицию вводят человеку или животному в первые 7 дней после рождения.
25. Композиция для применения по п. 24, отличающаяся тем, что данную композицию вводят человеку или животному в первые 2 дня после рождения.
26. Композиция для применения по любому из пп. 12-25, отличающаяся тем, что способ предназначен для лечения или профилактики диареи.
27. Композиция для применения по п. 26, отличающаяся тем, что диарея вызвана инфекцией, такой как бактериальная и/или вирусная инфекция, предпочтительно бактериальной инфекцией.
28. Композиция для применения по любому из пп. 12-27, отличающаяся тем, что способ предназначен для лечения животного из подотряда свинообразных, собак, кошек, лошадей, коров, домашней птицы, овец и/или коз.
29. Композиция по любому из пп. 1-11, или композиция для применения по любому из пп. 12-28, отличающаяся тем, что композиция дополнительно содержит по меньшей мере один продукт-пребиотик.
30. Композиция по п. 29, отличающаяся тем, что по меньшей мере один продукт-пребиотик выбран из следующих соединений и композиций: бета-глюканы, олигосахариды маннан, инулин, олигофруктоза, галактоолигосахариды (ГОС), лактулоза, лактосахароза, галактотриоза, фрукто-олигосахарид (ФОС), целлобиоза, целлодекстрины, циклодекстрины, мальтиол, лактиол, гликозил-сахароза, витамин Е или его вариант (причем варианты выбраны из альфа, бета, гамма, дельта-токоферолов, токотриенолов и токомоноэнолов), среди которых предпочтительны олигосахариды маннан, бета-глюканы и/или инулин.
31. Композиция по любому из пп. 1-11, или композиция для применения по любому из пп. 12-30, отличающаяся тем, что композиция предназначена для перорального введения.
32. Композиция по любому из пп. 1-11, или композиция для применения по любому из пп. 12-31, отличающаяся тем, что композиция находится в лиофилизированной, жидкой или распыленной форме.
9
33. Композиция по любому из пп. 1-11, или композиция для применения по любому из пп. 12-32, отличающаяся тем, что композиция представлена в дозированной форме, и отличающаяся тем, что каждая доза содержит приблизительно 10 колониеобразующих единиц (КОЕ).
34. Композиция по любому из пп. 1-11, или композиция для применения по любому из пп. 12-33, отличающаяся тем, что композицию вводят в виде однократной дозы.
35. Композиция по п. 34, отличающаяся тем, что композицию вводят в первые 48 часов после рождения.
36. Композиция по п. 35, отличающаяся тем, что композицию вводят в первые 24 часа после рождения.
37. Композиция по п. 36, отличающаяся тем, что композицию вводят сразу после рождения.
38. Композиция по любому из пп. 1-11, или композиция для применения по любому из пп .12-33, отличающаяся тем, что композицию вводят в составе двух доз.
39. Композиция по п. 38, отличающаяся тем, что первую дозу вводят в первые 24 часа после рождения, а вторую дозу вводят в последующие 24 часа.
40. Композиция по п. 39, отличающаяся тем, что вторую дозу вводят, только если животное и/или человек демонстрируют симптомы диареи и/или инфекции (например, водянистую диарею, водянистый/жидкий (пастообразный) стул, боль и/или легкие системные признаки общего патологического состояния, похудение и т.д.).
41. Композиция по любому из пп. 1-11, или композиция для применения по любому из пп. 12-40, отличающаяся тем, что композицию применяют для лечения или профилактики бактериальной инфекции, такой как диарея, вызванная бактериальными инфекциями (включая коллибациллез), диарея новорожденных, вызванная Clostridium difficile, Clostridium perfringens типа А и С.
42. Штамм, депонированный в испанской коллекции типовых культур под номером СЕСТ 8700 (AqSynRMH69).
ПУНКТЫ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ (II)
1. Композиция, содержащая по меньшей мере штамм, депонированный в испанской коллекции типовых культур под номером СЕСТ 8700 (AqSynRMH69).
2. Композиция по п. 1, дополнительно содержащая по меньшей мере один штамм микроорганизмов, отличающаяся тем, что каждый дополнительный штамм обладает по меньшей мере одним из перечисленных ниже видов противомикробной активности, что подтверждается зонами подавления роста, определяемыми в пробе по пятнам на площадке: (i) зона подавления роста для Salmonella 10 мм или более, (ii) зона подавления роста для Listeria monocytogenes 9 мм или более, (iii) зона подавления роста для Staphyloccocus aureus 9 мм или более, (iv) зона подавления роста для Escherichia coli 10 мм.
3. Композиция по п. 2, отличающаяся тем, что по меньшей мере один дополнительный штамм выбран из штаммов, относящихся к роду Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus и/или Weisella.
4. Композиция по любому из пп. 1-3, отличающаяся тем, что указанная композиция дополнительно содержит штамм, депонированный в испанской коллекции типовых культур под номером СЕСТ 8350 (AqSynJ59).
5. Композиция по п. 4, отличающаяся тем, что композиция содержит два штамма микроорганизмов, и отличающаяся тем, что указанные два микроорганизма являются штаммом, депонированным в испанской коллекции типовых культур под номером СЕСТ 8700 (AqSynPvMH69) и штаммом, депонированным в испанской коллекции типовых культур под номером СЕСТ 8350 (AqSynJ59).
6. Композиция по п. 5, отличающаяся тем, что оба штамма присутствуют в композиции в соотношении (выраженном в колониеобразующих единицах (КОЕ)) от 2:1 до 1:2.
7. Композиция по любому из пп. 1-6, отличающаяся тем, что по меньшей мере один штамм, и предпочтительно все штаммы, содержащиеся в композиции, не обладают устойчивостью к антибиотикам.
8. Композиция по любому из пп. 1-7, отличающаяся тем, что по меньшей мере один штамм, и предпочтительно все штаммы, содержащиеся в композиции способны сохранять по существу одинаковую жизнеспособность в течение 3-часовой инкубации при рН 3,5.
9. Композиция по любому из пп. 1-8, отличающаяся тем, что по меньшей мере один штамм, и предпочтительно все штаммы, содержащиеся в композиции способны сохранять по существу одинаковую жизнеспособность в течение 4-часовой инкубации в присутствии 0,45% экстракта желчи.
10. Композиция по любому из пп. 1-9, отличающаяся тем, что по меньшей мере один штамм, и предпочтительно все штаммы, содержащиеся в композиции, обладают всеми из перечисленных ниже видов противомикробной активности, что подтверждается зонами подавления роста, определяемыми в пробе по пятнам на площадке: (i) зона подавления роста для Salmonella 10 мм или более, (ii) зона подавления роста для Listeria monocytogenes 9 мм или более, (iii) зона подавления роста для Staphyloccocus aureus 9 мм или более, (iv) зона подавления роста для Escherichia coli 10 мм или более.
11. Композиция по любому из пп. 1-10 для применения при реализации способа лечения животного и/или человека.
12. Композиция, содержащая смесь микроорганизмов, отличающаяся тем, что указанные микроорганизмы относятся к штаммам Lactobacillus plantarum и Lactobacillus reuteri, и необзятально включая по меньшей мере один микроорганизм, относящийся к роду Lactobacillus (за исключением микроорганизмов Lactobacillus fermentum СЕСТ 8347 (AqSynJ12) и Lactobacillus mucosae СЕСТ 8349 (AqSynJ55)) Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus и/или Weisella, для применения при реализации способа лечения животного и/или человека.
13. Композиция для применения по любому из пп. 11-12, отличающаяся тем, что указанный способ предназначен для лечения или профилактики диареи.
14. Композиция по любому из пп. 1-10, или композиция для применения по любому из пп. 11-13, отличающаяся тем, что указанную композицию вводят по меньшей мере в составе одной дозы в первые 48 часов после рождения.
15. Штамм, депонированный в испанской коллекции типовых культур под номером СЕСТ 8700 (AqSynRMH69).
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1
Материалы и методы
4
2
4
2
2
4
Среда MRS: среду MRS готовили в соответствии с рецептом, полученным из испанской коллекции типовых культур (СЕСТ; www.cect.org). следующим образом: пептон 10,0 г., говяжий экстракт 10,0 г., экстракт дрожжей 5,0 г, глюкоза 20,0 г, цитрат аммония 2,00 г, ацетат натрия 5,00 г, MgSO.7HO 0,20 г, MnSO.HO 0,05 г, KНРO 2,00 г, [порошок агара (только для твердой среды) 15 г], дистиллированная вода 1 л.
2
4
BHI (сердечно-мозговой экстракт): среду готовили в соответствии с рецептом, полученных из испанской коллекции типовых культур (СЕСТ; www.cect.org). следующим образом: экстракт мозга телят сухой 12,5 г, экстракт говяжьего сердца сухой 5,0 г, протеозопептон 10,0 г, глюкоза 2,0 г, NaCl 5,0 г, HNaPO 2,5 г, дистиллированная вода 1 л, [порошок агара (только для твердой среды) 15 г].
Лечение антибиотиками: обычно на каждой свиноферме новорожденных поросят лечат антибиотиками и, возможно, добавками железа. Как правило, на каждой свиноферме разные «стандарты» лечения своих животных (обычно они проводят инъекции дозы антибиотика и добавки железа при рождении). В описанных ниже экспериментах применяли стандартное лечение, принятое на соответствующей ферме. Как правило, антибиотики также применяют эпизодически при диарее, хромоте, респираторных симптомах и многих других фактах, повседневно у поросят без полного установленного протокола.
Пример 1А: Источник штаммов
Штаммы бактерий выделяли и идентифицировали следующим образом.
Выделение штаммов бактерий СЕСТ 8350 (AqSynJ59) и СЕСТ 8700 (AqSynRMH69) проводили из смывов с кишечной стенки поросят.
Образцы выращивали в аэробных и анаэробных условиях на чашках Петри с агаром со средой De Man, Rogosa, Sharpe (MRS) в течение 24 часов при 37°С, и выделяли грамположительные, каталаза-негативные колонии разной морфологии. Все колонии относились к штаммам бактерий. Каждый выделенный штамм амплифицировали посредством ПЦР (полимеразной цепной реакции) с применением ПЦР-праймеров, направленных на область спейсера рРНК 16S/23S, как описано у Berthier и Ehrlich, 1998. FEMS Microbiology Letters 161: 97-106.
После амплификации и электрофореза четко дифференцированные полосы очищали и секвенировали. Посредством секвенирования указанные штаммы соотносили со штаммами бактерий.
1.1 Описание свойств и отбор штаммов
1. Lactobacillus plantarum (AqSynJ59)
2. Lactobacillus reuteri (AqSynRMH69)
Испытания in vitro в соответствии с критериями а.-с., описанными выше в разделе «испытания по отбору in vitro», выявили два штамма с особенно полезными свойствами.
а. Подавление роста разных патогенов: отобранные штаммы показывают противомикробную активность, выявляемую по меньшей мере по одной из следующих зон подавления роста: 10 мм или более для Salmonella, 9 мм или более для Listeria monocytogenes, 9 мм или более Staphyloccocus aureus и 10 мм или более для Escherichia coli.
Результаты для AqSynJ59 и AqSynRMH69 перечислены ниже.
Как можно видеть из приведенной выше таблицы, отобранные штаммы из кишечника поросенка удовлетворяют критериям отбора а.-с., описанным выше.
b. устойчивость к рН: оба штамма способны сохранять по существу одинаковую жизнеспособность в течение 3-часовой инкубации при рН=3,5.
с. Устойчивость к солям желчных кислот. Оба штамма способны сохранять по существу одинаковую жизнеспособность в течение 4-часовой инкубации в присутствии 0,45% экстракта желчи.
Кроме того, перечисленные выше штаммы не обладают устойчивостью к антибиотикам.
Испытание in vitro на минимальную ингибирующую концентрацию (MIC), направленное на оценку устойчивости к антибиотикам, проводили для перечисленных выше штаммов (AqSynJ59 и AqSynRMH69). Оцениваемые антибиотики включали следующие: ампициллин, ванкомицин, гентамицин, канамицин, стрептомицин, клиндамицин, тетрациклин и хлорамфеникол.
Пороговые микробиологические значения, которые применяли для оценки устойчивости к антибиотикам штаммов согласно настоящему изобретению, - это значения, определенные в «Руководстве по оценке чувствительности бактерий к противомикробным средствам медицинского и ветеринарного значения» Подкомиссия Европейской администрации по продовольственной безопасности (EFSA)по добавкам и продуктам или веществам, применяемым для кормления животных (FEEDAP), Парма, Италия. EFSA Journal 2012; 10(6): 2740.
Устойчивость к антибиотикам с пороговыми значениями EFSA в сравнении с результатами MIC для каждой бактерии:
*: Чувствительный;
**: Устойчивый.
LSM=среда для оценки чувствительности LAB, состоящая из смеси бульона IST (Oxoid laboratories) (90%) и бульона MRS (10%) с рН, скорректированной до 6,7. Оба штамма можно считать неустойчивыми к антибиотикам, рекомендованным EFSA, следовательно, их можно применять в качестве добавок для «пищевой промышленности» кормов для животных.
Пример 1В: Получение композиции пробиотиков согласно настоящему изобретению
Штаммы СЕСТ 8350 (AqSynJ59) и СЕСТ 8700 (AqSynRMH69), которые удовлетворяют критериям а.-с., перечисленным в описании и подтвержденным, как описано выше, включали в композиции пробиотиков и оценивали в полевых испытаниях. Каждый из штаммов AqSynJ59 и AqSynRMH69 выращивали в бульоне MRS для культивирования посредством ферментации, отбирали и лиофилизировали. Жизнеспособность готового продукта оценивали по количеству колоний.
Получали композицию, содержащую все два из указанных штаммов. Получали следующую композицию:
8
Композиция: (5×10 КОЕ каждого штамма в 2 мл)
Все штаммы применялись в лиофилизированной форме.
9
Композицию получали путем смешивания одинакового количества бактерий (определяли по количеству колоний (соответствующие значения в г указаны выше)) каждого штамма, который требовалось включить в композицию, и полученную таким образом повторно гидратировали изотоническим раствором хлорида натрия, чтобы готовая композиция содержала 10 КОЕ (суммарно всех штаммов, содержащихся в ней) в дозе 2 мл.
Пример 1С: Полевое испытание
Диарею у новорожденных поросят выявляли на свиноводческой ферме на севере Испании, где испытывали продукт из двух штаммов.
Основным подразделением фермы является «родильный блок». Каждый родильный блок включает 24 помета. В эксперименте 12 пометов содержали в стандартных условиях фермы (контрольная группа, которой требовалось применение антибиотиков и питательных смесей для тех поросят, которые демонстрировали признаки диареи). Другие 12 пометов получали только композицию пробиотиков компании «», без дополнительного применения антибиотиков в случае диареи (все поросята получали перорально одну дозу композиции (2 мл), которая описана выше, в первый день после рождения (сразу после рождения)). Вторую дозу (2 мл) композиции вводили на второй день после рождения (через 24 часа после введения первой дозы), только тем животным из группы, которые демонстрировали симптомы диареи). Животные, получавшие композицию пробиотиков, не получали антибиотики ни в один из моментов времени (хотя они подвергались лечению, состоящему в добавлении питательных веществ в рацион, таких же как животные на стандартном лечении (контрольная группа), в том случае, если они проявляли симптомы диареи). За животными наблюдали с рождения до 20-го дня жизни.
9
8
Композиция пробиотиков, применяемая в данном исследовании, представляла собой смесь двух штаммов Lactobacillus, AqSynJ59: Lactobacillus plantarum и AqSynRMH69: Lactobacillus reuteri, содержащая 10 КОЕ на дозу 2 мл (5×10 КОЕ каждого штамма), как описано выше.
Лечение в контрольной группе проводили антибиотиками, а именно в/м инъекциями амоксициллина в дозе 5 мг на кг, которые проводили, когда наблюдались симптомы. У поросят в данной контрольной группе проводили такое лечение один раз в день в те дни, когда наблюдалась диарея, тогда как животные с диареей в группе, получавшей композицию пробиотиков компании «», (которая описана выше), не получали антибиотиков ни в один момент времени.
Схема эксперимента
A. Количество живых новорожденных в помете
B. Гибель после рождения
C. Диарея: подсчитывают на один помет, с количественной оценкой следующих критериев:
0. - Инфицировано <25% животных: в перинатальной зоне нет явных признаков загрязненных животных, и нет мягких экскрементов на полу или стенках.
1. - Некоторый процент диареи: изредка в помете наблюдаются загрязненные животные, некоторое количество мягких экскрементов на полу.
2. - Большинство животных (>75%) демонстрируют диарею и измененное физическое состояние, загрязненные животные и мягкие экскременты н полу.
D. Лечение: число поросят на помет и дни, когда они получают препараты (антибиотики, питательные вещества, уголь, регидратацию и т.д.).
Краткий обзор результатов
* Показатель лечения на помет = (леченные пометы × кол-во дней лечения/12).
Выводы:
Исследуемая композиция лучше, чем стандартная практика при профилактике и лечении диареи у поросят;
a) Полностью устраняет потребность в антибиотиках
b) Уменьшает потребность в дополнительных средствах лечения - не антибиотиках
c) Уменьшает частоту диареи в целом
d) Уменьшает частоту тяжелой диареи
e) Уменьшает частоту смертей в связи с диареей
f) Увеличивает среднюю массу при взвешивании
g) Очень значимо уменьшает экономическое влияние эпидемий диареи при стандартных условиях ухода в коммерческом использовании (больше кг на животное, меньше смертей, меньше затрат на лечение, меньшее влияние на окружающую среду, меньше времени на уход за животными).
ПРИМЕР 2
Материалы и методы для примера 2, как и для источника штаммов, такие же, как описаны в примере 1 («Материалы и методы» и «Пример 1А: источник штаммов»).
Пример 2А: Получение композиции пробиотиков согласно настоящему изобретению
В композицию пробиотиков включали штаммы СЕСТ 8350 (AqSynJ59) и СЕСТ 8700 (AqSynRMH69), удовлетворяющие критериям а.-с., перечисленным в описании и подтвержденным, как описано выше (в «Примере 1: Источник штаммов»), и испытывали ее в полевых испытаниях.
Каждый из штаммов AqSynJ59 и AqSynRMH69 выращивали в бульоне MRS для культивирования посредством ферментации, отбирали и лиофилизировали. Жизнеспособность готового продукта оценивали по количеству колоний.
Получали композицию, содержащую все два из указанных штаммов. Получали следующую композицию ("AQ1202-PigLife" или "PigLife" или "AQ1202"):
Дополнительный корм:
Продукт (которому дали название "AQ1202-PigLife", также именуемый «PigLife» или "AQ1202"), состоит из замороженной-высушенной смеси двух молочнокислых бактерии и разных питательных веществ для создания суспензии для перорального введения новорожденным поросятам. Продукт смешивали в помещениях компании «», и упаковывали во флаконы объемом 100 мл. Данный препарат предназначен для разведения в 100 мл раствора для инфузий непосредственно перед применением.
9
Композицию получали путем смешивания одинакового количества бактерий (определяется по количеству колоний (соответствующие значения в КОЕ приведены выше) каждого штамма, который требовалось включить в композицию, и полученную таким образом композицию повторно гидратировали изотоническим раствором хлорида натрия, чтобы готовая композиция содержала 10 КОЕ (суммарно всех штаммов, содержащихся в ней) в дозе 2 мл.
Пример 2В: Полевые испытания
Цель данного примера состоит в оценке применения композиции пробиотиков согласно настоящему изобретению у поросят после рождения, когда поросята особенно уязвимы в плане дисбактериоза и диареи.
Продукт из двух штаммов ("AQ1202-PigLife" или "PigLife") оценивали на коммерческих фермах (всего 5) с периодическими вспышками диареи разной (известной или неизвестной) этиологии. Указанные коммерческие фермы были расположены в разных местах Испании (Арагон, Кастилия и Леон, Каталония). Во всех из них внедрены системы интенсивного свиноводства, включая программы оплодотворения, уход за беременными свиноматками, блоки опороса и отлучения поросят от матери. Некоторые из них включают переходные стойла для животных, которые ожидают перевода в откормочное хозяйство. Эксперименты проводили по официальной лицензии, включающей применение экспериментальных зоотехнических добавок в полевых испытаниях.
Группы животных:
• Группа лечения пробиотиками (AQ1202-PigLife)
• Контрольная группа (без лечения - без манипуляций)
После опороса (первый день жизни) все поросята в лечебной группе перорально получали дозу 2 мл композиции пробиотиков AQ1202-PigLife (AQ1202). Данные регистрировались с опороса до 20-го дня. Оценивали следующие показатели:
• Оценка зоотехнических параметров
- Количество рожденных поросят: всего рожденных и рожденных живыми (смертность - отлученные от матери поросята)
- Масса поросят (когда возможно)
- Оценка экскрементов
• 0: нормальные экскременты
• 1: Легкая диарея; у потомства выявляются некоторые случаи диареи
• 2: Тяжелая диарея; диарея у большинства поросят
- Оценка лечения: регистрация подвергающихся лечению пометов и свиноматок.
Фермы 1-4
На ферме 3 наблюдали за двумя разными партиями опороса:
Эксперимент 1: октябрь 2014 г. (Ферма 3.1)
Эксперимент 2: май 2015 г. (Ферма 3.2)
В настоящем исследовании регистрировались данные из 135 контрольных и 104 получавших PigLife пометов.
Всего было прослежено 1710 контрольных и 1136 получавших препарат поросят с опороса до 20-го дня.
На фермах 1-4 было показано, что диарея реагировала на лечение антибиотиками, то есть она была бактериальной природы.
- Смертность (%) (общая смертность, включая диарею и задавленных поросят)
- Диарея (также см. Фигуру 2)
*только один помет с продолжительностью диареи два дня.
- Лечение
Ферма 1
Больные пометы лечили амоксициллином + линкомицином, этиологическое лечение (матери) и тиамулином + колистином (Colimutina, SP Veterinaria) + перорально раствор для инфузий, симптоматическое лечение у поросят.
Ферма 2
Применяемые антибиотики включали энрофлоксацин для матерей (он попадал к поросятам с молоком), поросят или обоих. Больным поросятам проводили пероральную регидратацию и вводили активированный уголь.
Ферма 3
В случаях диареи среди пометов больных поросят лечели энрофлоксацином (Alsir, Norvet). Матерей лечили маброфлоксацином (Marbocyl, ). Колимицин + раствор для инфузий для поросят с симптомами.
Ферма 4
Свиноматкам, чей помет страдал диареей, вводили энрофлоксацин. Лечение могло длиться три дня, если это было необходимо. В качестве профилактики всем поросятам на данной ферме вводили одну дозу Цефтиофура (Naxcel, Zoetis) в первый день жизни.
Вводимые дозы были следующие:
Амоксициллин: 15 мг/кг, внутримышечная инъекция (в/м)
Линкомицин: 5-10 мг/кг в питьевой воде
Энрофлоксацин; 2.5 мг/кг внутримышечная инъекция
Марбофлоксацин: 2 мг/кг внутримышечная инъекция
Колимицин: 0.5 г/л (питьевая вода)
Цефтиофур: 5 мг/кг, внутримышечная инъекция
Колимутина: 0,156 мг колистиметана натрия + 12,35 мг тиамулина гибрида фумарата/кг; 0,1 мл/кг внутримышечная инъекция.
Результаты показаны в таблице ниже и на Фигуре 3:
*Только один помет подвергнут лечению однажды.
Выводы по фермам 1-4
Композиция пробиотиков согласно настоящему изобретению (AQ1202) уменьшает смертность на фермах с эпизодами стойкой диареи (вызванной бактериальной инфекцией в случае ферм 1-4), как можно видеть из приведенной выше таблицы и Фигуры 2. Введение данной композиции уменьшает потребность в лекарственных препаратах, включая антибиотики. Приведенная выше таблица и Фигура 3 показывают снижение процента подвергнутых лечению пометов (включая лечение антибиотиками), которые принимали композицию пробиотиков согласно настоящему изобретению (AQ1202).
Ферма 5
На ферме 5 диарея имела не бактериальную природу. Диарея не реагировала на лечение антибиотиками. В конце была диагностирована ротавирусная инфекция, которая была причиной диареи новорожденных поросят, в соответствии с диагнозом, который сообщил фермер.
Данный эксперимент проводили на коммерческой свиноферме, расположенной в Арагоне (Испания) с поголовьем 750 свиноматок.
Поскольку в первой половине июня 2014 г. на ферме были стойкие эпизоды диареи новорожденных поросят, где процент пораженных пометов достигал 95% в мае указанного года. Смертность росла, пока не достигла 35% от живых новорожденных поросят. Было очень интенсивное применение антибиотиков против Enterobacteriaceae и Clostridium, которое длилось более 6 месяцев, но дало скудные результаты.
Когда в качестве этиологии был раскрыт инфекционный гастроэнтерит и эпидемическая диарея свиней (эпидемическая диарея свиней, Coronaviruses), был поставлен клинический диагноз ротавирус свиней. Следовательно, диарея на ферме 5 была вызвана вирусной инфекцией, ротавирусом свиней.
Ротавирусная инфекция была подтверждена ПЦР-диагностикой, проведенной внешней диагностической лабораторией (Лаборатория GSP, Каталония, Испания). Вследствие высокого процента диареи, наблюдаемого в стаде, и низкой эффективности первых средств лечения фермер решил систематически вводить продукт (композицию согласно настоящему изобретению, AQ1202) всем поросятам с мая по декабрь 2014 г.
С тех пор как проводилось лечение, смертность снизилась до 5%, и частота диареи была снижена в пометах до 20%.
Результаты показаны ниже.
Лечение:
В случае диареи:
• КАРБОВЕТ (продукт Carbovet является термоструктутрируемым (неактивированным) растительным древесным углем, получаемым из специально отобранного французского дуба.
• СУЕРОМИН (внутрибрюшинная регидратация гипертоническим раствором; состав: глюкоза 25 г, фруктоза 25 г, хлорид 2,62 г., натрия 1,57 г, калий 80 мг, магний 20 мг, кальций 40 мг; вспомогательных веществ до 1000 мл).
Всем животным:
• AQ1202-PigLife
1/5-30/6: 1-2 дозы на поросенка
1/7-31/12: 3 поросенка
• Железо: Одна доза (приблизительно 150 мг, внутримышечно) на поросенка, в любой из дней жизни 3-8.
В данном исследовании было прослежено 983 помета (с мая по декабрь 2014 г.), с мая по декабрь 2014 г. (см. таблицу ниже). Все поросята в каждом помете получали AQ1202-PigLife (композиция согласно настоящему изобретению).
* Карбовет и/или Суеромин;
** Один препарат = 1 доза карбовета и/или суеромина;
Карбовет: 10 g/animal, via oral;
Сукеромин: от 20 до 80 мл/кг внутрибрюшинно или подкожно.
Композицию пробиотиков вводили всем поросятам в пометах. Процент подвергнутых лечению пометов, который был непосредственно связан с наблюдаемой диареей у животных, снизился с 95% до 5% во время непрерывного применения композиции пробиотиков согласно настоящему изобретению (AQ1202 - PigLife). Карбовет и суеромин (симптоматические препараты) вводили только слабым животным и животным с диареей. Что касается процента отлученных от матери поросят, наблюдалась тенденция к возрастанию. Фермер отметил до 0,7% больше поросят, отлученных от матери, на помет, с тех пор как стал применять композицию пробиотиков.