ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВЫХ ИЗОЛЯТОВ ИЗ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE В УСЛОВИЯХ КОМПЛЕКСНОЙ ПЕРЕРАБОТКИ

УДК

Гапоян О.Г. Красноштанова А.А.

ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВЫХ ИЗОЛЯТОВ ИЗ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CERE VISIAE В УСЛОВИЯХ КОМПЛЕКСНОЙ ПЕРЕРАБОТКИ

Гапоян Ольга Геннадьевна, студентка 3 курса факультета биотехнологии и промышленной экологии; Красноштанова Алла Альбертовна, доктор химических, доцент, профессор кафедры биотехнологии, e-mail: aak28@yandex.ru;

Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия, 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20

Комплексная переработка биомассы пекарских дрожжей включает в себя три основных стадии -денуклеинизацию, выделение белковых изолятов, выделение ¡5-глюканов. Последние представляют особую ценность в медицине из-за их способности оказывать иммуномодулирующее и противовоспалительное действие на организм человека. Подобная обработка в перспективе позволяет получить максимально чистый препарат fi-глюканов совместно с нуклеиновой фракцией, производные которой также оказывают иммуномодулирующее действие на организм человека, и белковой фракцией, добавление которой к продуктам питания повышает их питательную ценность, поэтому исследуют все новые технологические приемы в этой области. В данной работе денуклеинизированную биомассу пекарских дрожжей подвергали кислотному гидролизу серной и ортофосфорной кислотой для сравнения эффективности условий такого гидролиза в получении белковых изолятов дрожжей. В частности, были определены оптимальное время гидролиза и соответствующая ему степень экстракции.

Ключевые слова: дрожжи, глюканы, белковые изоляты, экстракция белка.

EXTRACTION OF PROTEIN ISOLATES FROM YEAST SACCHAROMYCES CEREVISIAE UNDER CONDITIONS OF MULTISTAGE TREATMENT

Gapoyan O.G., Krasnoshtanova A. A.

D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia

Multistage treatment of the baker's yeast biomass consists of three stages - denucleinization, extraction ofprotein fraction, extraction of fi-glucan, the former being extremely valuable for its immunogenic and anti-inflammatory properties. In the perspective, multistage treatment can allow the obtainment of pure fi-glucan fraction as well as nucleotide fraction that possesses same immunogenic properties and protein fraction that can enhance nutritional value of food, so new methods of implementing such treatment are being tested. In this work, we examined the effectiveness of acid hydrolysis in the extraction ofprotein isolates from denuclearized baker's yeast. In particular, optimal time of hydrolysis and corresponding degree of extraction.

Keywords: yeast, glucan, protein isolate, hydrolysis.

Введение

В последнее десятилетие интерес медицинского сообщества к препаратам Р-глюканов возрос. Это связано с увеличением числа исследований, подтверждающих иммуномодулирующее и противовоспалительное действие Р-глюканов, их способность снижать холестерин [1], что дает основания использовать их в качестве лекарственных средств или пищевых добавок.

Р-глюкан представляет собой по-разному разветвленные полимеры глюкозы, связанные несколькими разновидностями Р-гликозидной связи. Эти полимеры в достаточном количестве содержатся в клеточных стенках микроорганизмов и злаковых растений, поэтому разрабатываются все новые технологии получения Р-глюканов из различного сырья, в том числе из дрожжей Saccharomyces сегвугягае. Использование этих дрожжей как источника глюкана имеет следующие преимущества: - возможность в использования в качестве сырья отработанную биомассу спиртового производства

[2], что потенциально может удешевить процесс и сократить его длительность;

- хорошая изученность и долгая практика применения в пищевой промышленности пекарских дрожжей, что упрощает время оценки безопасности и аллергенности препаратов, полученных на их основе [3];

- возможность многоцелевого использования биомассы, например, для выделения нуклеиновых кислот или белковых изолятов.

В стандартной схеме выделение Р-глюканов, чаще всего экстракцией, следует за предобработкой биомассы с извлечением из нее нуклеиновой и белковой фракций. Одно из преимуществ подобной обработки - получение наиболее чистого препарата. Предобработку проводят как щелочной экстракцией [4], так и ферментативным гидролизом, экстракцию Р-глюканов - обработкой различными реагентами: от кислот до комплексных соединений, например, этанолом, уксусной и соляной кислотами, раствором гипохлорита натрия самим по себе или с последующей обработкой диметилсульфоксидом [5].

Интересное направление исследований -совмещение физических и химических методов воздействия, при которых увеличивается площадь реакции и, соответственно, ее эффективность, например, обработку ферментами проводят последовательно с обработкой ультразвуком [6], а щелочной гидролиз проводят в условиях повышенного давления [7].

В нашем случае использовалась денуклеинизированная биомасса пекарских дрожжей, поэтому целью работы была оценка эффективности ее очистки от белковой фракции в условиях комплексной переработки с получением белковых изолятов, которые представляют ценность сами по себе ввиду содержания в биомассе дрожжей витаминов групп В, Б, Е, К, микроэлементов в биоусвояемой форме, природного антиоксиданта -производного глутатиона, а также ввиду полного аминокислотного состава [8].

Белковые изоляты находят широкое применение в промышленности. В биотехнологических производствах их используют как компоненты питательных сред для повышения питательной ценности последних. Для той же цели белковые изоляты добавляют в продукты питания, например, хлеб. В хлебе подобные добавки играют двойную роль, т.к. позволяют снижать время созревания хлебного теста. Интересно заметить, что при использовании, например, биомассы остаточных пивных дрожжей в пищевых целях, ее обязательно денуклеинизируют для уменьшения риска накопления мочевой кислоты [9].

Материалы и методы

Объектом исследования являлась дрожжевая биомасса производства «САФ-ЛЕВЮР», предварительно подвергнутая денуклеинизации в присутствии диаммонийфосфата (ДАФ) в течение 2 часов при 90С, содержащая 26% сухих веществ (СВ) и 17,2% сырого протеина (СВ) в расчете на СВ.

Для определения белка в растворе использовали биуретовый метод [10]. Содержание сырого протеина определяли микрометодом Къельдаля [11]. Определение фосфат-ионов проводили методом Фиске-Субарроу [Там же].

Экспериментальная часть

Анализ состава денуклеинизированной биомассы показал, что она содержит 69,1% ДАФ в расчете на СВ, поэтому перед извлечением из нее белка необходимо было провести ее отмывку от соли. На первом этапе работы была определена оптимальная кратность отмывки. Для этого каждый раз денуклеинизированную биомассу смешивали с дистиллированной водой в объемном соотношении 1:5, перемешивали на магнитной мешалке в течение

на 30 минут (скорость вращения - 1200 мин-1), после чего промывные воды отделяли

центрифугированием (15 мин, 20°С, 6000 об/мин). В промывных водах определяли содержание фосфат-ионов, а в биомассе - сырого протеина согласно вышеизложенным методикам. Полученные результаты приведены в таблице 1.

Таблица 1. Результаты промывки денуклеинизированной биомассы

№ Содержание Содержание Содержание

отмывки СВ, % СП, % к СВ ДАФ, % к

СВ

1 26 17,2 69,1

2 25 22,7 59,6

3 28 33,1 41,6

4 26 48,4 16,0

5 27 53,6 2,2

6 28 56,8 1,3

По данным таблицы видно, что оптимальная кратность отмывки - 5 раз. Дальше содержание ДАФ в расчете на СВ изменяется несущественно.

Таким образом, по результатам проведенных исследований была получена промытая денуклеинизированная биомасса, содержащая 53,29% сырого протеина в расчете на СВ. Ее использовали в дальнейших исследованиях для извлечения белкового изолята методом кислотной экстракции, так как в отличие от ферментативного он отличается быстротой и более низкой стоимостью. Относительно жесткие условия экстракции, при которых разрушается часть соединений, имеющих пищевую ценность, в нашем случае не играют большой роли, т.к. биомасса последовательно перерабатывается в рамках комплексной переработки. Выбор серной и фосфорной кислот был обусловлен их малым расходом для достижения требуемого значения рН. Кроме того, фосфат-ионы являются биогенными.

При проведении экспериментов сравнивали эффективность гидролиза биомассы серной и ортофосфорной кислотой с точки зрения оптимизации времени процесса, обеспечивающего максимальный выход белка в раствор. Для этого 5 г биомассы смешивали с 20 мл дистиллированной воды, рН суспензии устанавливали на уровне 2 серной или ортофосфорной кислотой. Экстракцию проводили при температуре 90°С с отбором проб через 15, 30, 45, 60, 120 мин. Пробы центрифугировали в течение 15 минут при 6000 об/мин. В супернатантах определяли содержание белка биуретовым методом и рассчитывали выход белка в процентах от содержания сырого протеина в биомассе. Полученные результаты приведены на рис. 1.

О 20 40 60 80 100 120 1ган

Рис. 1 Динамика экстракции белка из денуклеинизированной биомассы хлебопекарных дрожжей. Экстрагент: 1 - серная кислота 2 - ортофосфорная кислота

Из приведенных данных видно, что сернокислотный экстрагент является более эффективным, достигаемая степень экстракции 42-44%. Оптимальное время экстракции - 1 час, т.к. при увеличении продолжительности процесса выход белка в раствор практически не увеличивается.

Выводы

Установлена наилучшая кратность отмывки денуклеинизированной в присутствии ДАФ биомассы дрожжей от соли равная 5. Проведено сравнение эффективности экстракции белка из отмытой биомассы серной и ортофосфорной кислотами. Данные показали, что лучше использовать серную кислоту и проводить экстракцию в течение одного часа, причем степень экстракции составила 42%. Однако такой результат не является оптимальным, и в дальнейшем следует исследовать и другие методы выделения белковых изолятов, например, обработку ферментами.

Список литературы

1. Efficacy and safety of oral and inhalation commercial beta-glucan products: Systematic review of randomized controlled trials / N. Markovina, I. Banjari, V. B. Popovic et. at. // Clinical Nutrition. - 2020. - Vol. 39, №1. - P. 40-48.

2. Казимирова Е.А., Землякова Е.С. Обоснование совершенствования технологии получения белкового гидролизата из остаточных пивных дрожжей // Вестник науки и образования Северо-Запада России. - 2017. -№2. - С. 1-9.

3. Scientific opinion on the safety of 'yeast beta-glucan' as a Novel food ingredient // EFSA journal. -2011. - Vol.9, № 5. - 22 p.

4. Bacha U. Nutraceutical, Anti-Inflammatory, and Immune Modulatory Effects of P-Glucan Isolated from Yeast // BioMed Research International. - 2017. - 14 p.

5. Extraction of P-glucan from Saccharomyces cerevisiae: Comparison of different extraction methods and in vivo assessment of immunomodulatory effect in mice / PENGKUMSRI, Noppawat et al. // Food Sci. Technol (Campinas). - 2017. - Vol.37. - P.124-130.

6. Tam T. M. Optimization of Peta-glucan extraction from waste brewer's yeast Saccharomyces cerevisiae using autolysis, enzyme, ultrasonic and combined enzyme - ultrasonic treatment / T.M. Tam, N.Q. Duy, N.P. Minh et. at. // American Journal of Research Communication. - 2013. - Vol.1, №11. - P. 149-158.

7. Tian X., Yang P., Jiang W. Effect of Alkali Treatment Combined with High Pressure on Extraction Efficiency of P-d-Glucan from Spent Brewer's Yeast // Springer Science+Business Media B.V.- 2017. - Vol. 10.

8. Куцакова В.Е., Шкотова Т.В., Ефимова С.В. Способ получения белкового ингредиента из остаточных пивных дрожжей со свойствами сорбента микотоксинов для хлебопекарного производства // Научный журнал НИУ ИТМО. Серия «Процессы и аппараты пищевых производств». -2015. - №1. - С. 105-109.

9. Технология переработки остаточных пивных дрожжей для использования в хлебопекарном производстве / В.Е. Куцакова, Т.В. Шкотова, С.В. Ефимова и др. // Пиво и напитки. - 2014. - №5. - С. 28-31.

10. Белодед, А. В. Химия биологически активных соединений. Практикум [Текст]: учебное пособие / А. В. Белодед. - М.: РХТУ им. Д.И. Менделеева, Б. г. - 87 с.

Практикум по биохимии: Учеб. Пособие / Под ред. С. Е. Северина, Г.А. Соловьевой. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Изд-во МГУ, 1989. - 509 с