ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ АНАЛИЗА ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ АНТИТЕЛ ПРОТИВ PD-1 И АНТИТЕЛ ПРОТИВ PD-L1
TEST SYSTEM FOR ANALYSING FUNCTIONAL ACTIVITY OF ANTIBODIES AGAINST PD-1 AND ANTIBODIES AGAINST PD-L1

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области биотехнологии и биоинженерии, в частности к тест-системам и их применению для анализа функциональной активности антител против PD-1 (aPD-1) и антител против PD-L1 (aPD-L1).
Уровень техники
Одним из наиболее перспективных подходов к активации терапевтического противоопухолевого иммунитета является блокада ингибиторных иммунных контрольных точек. Ингибиторные иммунные контрольные точки – это система механизмов, которые регулируют активацию иммунного ответа, препятствуя запуску аутоиммунных процессов, а также модулируют его, уменьшая вызванные иммунными клетками повреждения в органах и тканях. Опухолевые клетки могут использовать такие контрольные точки для предотвращения активации опухоль-специфических лимфоцитов, таким образом, приобретая устойчивость к действию иммунной системы. Поскольку многие из иммунных контрольных точек инициируются лиганд-рецепторными взаимодействиями, они могут блокироваться агентами, которые ингибируют эти взаимодействия. Одним из примеров таких агентов являются антитела против PD-1 (рецептор запрограммированной клеточной смерти 1) или антитела против PD-L1 (лиганда рецептора запрограммированной клеточной смерти 1).
+
PD-1 – белок, присутствующий преимущественно на активированных T-лимфоцитах. Взаимодействие PD-1 (PD-1-положительных) лимфоцитов с клетками, несущими его природные лиганды PD-L1 или PD-L2 (лиганды рецептора запрограммированной клеточной смерти 1 и 2), блокирует активацию лимфоцитов (Freeman, G.J., Long, A.J., Iwai, Y., Bourque, K., Chernova, T., Nishimura, H., Fitz, L.J., Malenkovich, N., Okazaki, T., Byrne, M.C., Horton, H.F., Fouser, L., Carter, L., Ling, V., Bowman, M.R., Carreno, B.M., Collins, M., Wood, C.R., Honjo, T. (2000) Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation, J. Exp. Med., 192, 1027–1034, doi: 10.1084/jem.192.7.1027; Latchman, Y., Wood, C.R., Chernova, T., Chaudhary, D., Borde, M., Chernova, I., Iwai, Y., Long, A.J., Brown, J.A., Nunes, R., Greenfield, E.A., Bourque, K., Boussiotis, V.A., Carter, L.L., Carreno, B.M., Malenkovich, N., Nishimura, H., Okazaki, T., Honjo, T., Sharpe, A.H., Freeman, G.J. (2001) PD-L2 is a second ligand for PD-1 and inhibits T cell activation, Nat. Immunol., 2, 261–268, doi: 10.1038/85330). Это происходит вследствие образования комплекса PD-1 со своим лигандом, что вызывает ингибирование CD3-зависимой активации Т-лимфоцита (Sheppard, K.A., Fitz, L.J., Lee, J.M., Benander, C., George, J.A., Wooters, J., Qiu, Y., Jussif, J.M., Carter, L.L., Wood, C.R., Chaudhary, D. (2004) PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta, FEBS Lett., 547, 37–41, doi: 10.1016/j.febslet.2004.07.083). Известны белки, с которыми взаимодействует PD-1, и сигнальные каскады, на которые он влияет, но последовательность молекулярных взаимодействий, определяющих его активность, четко не определена (Bardhan, K., Anagnostou, T., Boussiotis, V.A. (2016) The PD1 : PD-L1/2 Pathway from Discovery to Clinical Implementation, Front. Immunol., 7, 550, doi: 10.3389/fimmu.2016.00550; Arasanz, H., Gato-Canas, M., Zuazo, M., Ibanez-Vea, M., Breckpot, K., Kochan, G., Escors, D. (2017) PD1 signal transduction pathways in T cells, Oncotarget, 8, 51936–51945, doi: 10.18632/oncotarget.17232). Такой механизм ингибирования иммунного ответа служит защитой от чрезмерной активации Т-лимфоцитов и развития аутоиммунных реакций, но в то же время может препятствовать развитию иммунного ответа на опухолевые клетки (Alsaab, H.O., Sau, S., Alzhrani, R., Tatiparti, K., Bhise, K., Kashaw, S.K., Iyer, A.K. (2017) PD-1 and PD-L1 Checkpoint Signaling Inhibition for Cancer Immunotherapy: Mechanism, Combinations, and Clinical Outcome, Front. Pharmacol., 8, 561, doi: 10.3389/fphar.2017.00561).
Блокирование взаимодействия PD-1/PD-L1, но не PD-1/PD-L2 с целью отмены негативной иммунной регуляции является одной из наиболее успешных стратегий борьбы с рядом онкологических заболеваний. В 2014 году были зарегистрированы первые терапевтические антитела против PD-1, в 2016 – против PD-L1 (Gong. J., Chehrazi-Raffle, A., Reddi, S., Salgia, R. (2018) Development of PD-1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy: a comprehensive review of registration trials and future considerations, J. Immunother. Cancer, 6, 8, doi: 10.1186/s40425-018-0316-z). К концу 2018 года зарегистрировано более 2000 клинических исследований препаратов, блокирующих взаимодействие PD-1/PD-L1 (Tang, J., Yu, J.X., Hubbard-Lucey, V.M., Neftelinov, S.T., Hodge, J.P., Lin, Y. (2018) Trial watch: The clinical trial landscape for PD1/PDL1 immune checkpoint inhibitors, Nat. Rev. Drug Discov., 17, 854–855, doi: 10.1038/nrd.2018.210).
Для характеристики терапевтических препаратов необходим метод определения их функциональной активности. Такой метод должен отражать механизм действия и позволять количественно сравнивать препараты между собой (Rockville, M.D. (2012) United States Pharmacopeia and National Formulary (USP 35-NF 30), United States Pharmacopeial Convention, 1032, 5160–5174).
Из уровня техники известен традиционный метод оценки противоопухолевых эффектов блокады моноклональных антител с использованием моделей животных путем фенотипического анализа опухолевых масс у мышей с опухолями среднего времени выживания, общей выживаемости мышей и т.д. (Lindauer, A., Valiathan, C., Mehta, K., Sriram, V., de Greef, R., Elassaiss-Schaap, J., & de Alwis, D. (2016) Translational Pharmacokinetic/Pharmacodynamic Modeling of Tumor Growth Inhibition Supports Dose-Range Selection of the Anti-PD-1 Antibody Pembrolizumab. CPT: Pharmacometrics & Systems Pharmacology, 6(1), 11–20. doi:10.1002/psp4.12130). Однако, такой анализ требует очень высоких денежных и временных затрат.
Из уровня техники известны методы, основанные на использовании первичных клеток человека (Carven Gregory John, Dulos Gradus Johannes, Elassaiss-Schaap Jeroen (2012), Bioassays for determining PD-1 modulation, WIPO, WO2012018538). Однако, они являются неудобными и плохо воспроизводимыми (Hsieh, Y.T., Aggarwal, P., Cirelli, D., Gu, L., Surowy, T., Mozier, N.M. (2017) Characterization of FcγRIIIA effector cells used in in vitro ADCC bioassay: Comparison of primary NK cells with engineered NK-92 and Jurkat T cells, J. Immunol. Methods, 441, 56–66, doi: 10.1016/j.jim.2016.12.002).
Наиболее близкой к заявляемому изобретению является система для определения активности антител против PD-1 или антител против PD-L1, содержащая: (а) эффекторную клетку, представляющую на своей поверхности рецептор иммунной контрольной точки (ICR), Т-клеточный рецептор (TCR) и содержащую репортерный ген; и (b) антигенпрезентирующую клетку, представляющую на своей поверхности активатор Т-клеточного рецептора и лиганд иммунной контрольной точки (ICL); где ICR и ICL образуют комплекс ICR / ICL при взаимодействии. В ней в качестве активатора Т-клеточного рецептора использованы трансмембранные антитела против CD3 (Cong, M., Cheng Z.J., Karassina, N., Grailer, J., Fan, F. (2015) Systems and methods for assessing modulators of immune checkpoints, WIPO, WO2016081854). Однако, в данной системе отсутствует возможность варьирования концентрации активатора TCR для оптимизации системы. Если экспрессия встроенного репортерного гена не удовлетворяет требованиям, то необходимо делать линию антигенпрезентирующих клеток заново, что занимает несколько месяцев и требует дополнительных денежных затрат.
Таким образом, целью данной работы стала разработка новой эффективной системы тестирования антител против PD-1 и антител против PD-L1, а также способа анализа антител против PD-1 и антител против PD-L1 с помощью данной тест-системы. Изобретение позволяет избежать дополнительных генно-инженерных работ, что делает его удобным в применении, и как следствие сократить временные и денежные затраты. Кроме того, изобретение позволяет оценивать ингибирующее влияние PD-1 на активацию CAR-T клеток, опосредованную химерным антигенным рецептором (CAR). Подход может быть использован при разработке препаратов на основе CAR для определения кандидатов CAR, ингибирующее влияние PD-1 на которые является минимальным.
Краткое описание изобретения
В заявляемом изобретении представлены тест-система и набор, предназначенные для анализа функциональной активности антител против PD-1 и антител против PD-L1. Изобретение также включает в себя применение указанных тест-системы и набора, способ анализа и способ оценки функциональной активности антител против PD-1 и антител против PD-L1 с использованием данной тест-системы.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к тест-системе для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, содержащая:
а. эффекторные репортерные клетки, имеющие на своей поверхности функциональный CD3 комплекс или его производное, PD-1, и содержащие репортерный ген под контролем CD3-зависимого промотора,
б. клетки-мишени, представляющие на своей поверхности PD-L1,
в. Активатор CD3-зависимого сигнального каскада,
где активатор CD3-зависимого сигнального каскада представляет собой биспецифическое антитело, способное связываться с CD3 комплексом.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к тест-системе для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, содержащей:
а. эффекторные репортерные клетки, имеющие на своей поверхности производное функционального CD3 комплекса, активатор CD3-зависимого сигнального каскада, PD-1, и содержащие репортерный ген под контролем CD3-зависимого промотора,
б. клетки-мишени, представляющие на своей поверхности PD-L1,
где производным функционального CD3 комплекса и активатором CD3-зависимого сигнального каскада одновременно является химерный антигенный рецептор, включающий в себя домен CD3.
В некоторых вариантах биспецифическое антитело, способное связываться с CD3 комплексом, представляет собой растворимое антитело.
В некоторых вариантах биспецифическое антитело, способное связываться с CD3 комплексом, представляет собой биспецифическое анти-CD3/анти-TAA антитело (aCD3/aTAA), в частности анти-CD3/анти-CD19 антитело, анти-CD3/анти-CD20 антитело.
В некоторых вариантах эффекторные репортерные клетки представляют собой Т-лимфоциты, в частности клетки Jurkat.
В некоторых вариантах клетки-мишени представляют собой Raji или CHO-K1.
В некоторых вариантах репортерный ген выбран из гена, кодирующего флюоресцентный или люминесцентный белок, в частности люциферазу.
В некоторых вариантах CD3-зависимый промотор выбран из NFAT-чувствительного промотора или NF-кB-чувствительного промотора.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к набору для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, содержащему описанную выше тест-систему и при необходимости инструкцию.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению описанной выше тест-системы для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению описанного выше набора для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, включающему:
а. добавление к описанной выше тест-системе антитела против PD-1 или антитела против PD-L1,
б. инкубацию,
в. измерение интенсивности сигнала продукта экспрессии репортерного гена,
г. обработку полученных данных.
В некоторых вариантах обработка полученных данных в описанном выше способе включает установление значения ЕС50 антитела против PD-1 или антитела против PD-L1.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу определения функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, включающему:
а. добавление к описанной выше тест-системе антитела против PD-1 или антитела против PD-L1,
б. инкубацию,
в. измерение интенсивности сигнала продукта экспрессии репортерного гена,
г. обработку полученных данных, в том числе установление значения ЕС50 антитела против рецептора PD-1 или антитела против лиганда PD-L1,
д. расчет отношения экспериментально определенной EC50 стандартного образца, активность которого принимают за 100%, к экспериментально определенной EC50 сравниваемого антитела против рецептора PD-1 или антитела против лиганда PD-L1, умноженного на 100%.
Краткое описание чертежей
+
Фиг. 1. Способы активации CD3 для системы тестирования ингибиторов взаимодействия PD-1/PD-L1. а – Эффекторная клетка имеет TCR, специфичный к комплексу пептид/MHC клетки-мишени. Их взаимодействие приводит к CD3-зависимой активации эффекторной клетки. б – Суперантиген связывает TCR эффекторной клетки и MHC-II антигенпрезентирующей клетки, имитируя взаимодействие TCR/MHC. в – Растворимые aCD3ε при взаимодействии с CD3 эффекторной клетки вызывают ее CD3-зависимую активацию. г – Трансмембранные aCD3ε, представленные на клетке активаторе, при контакте с эффекторной клеткой взаимодействуют с CD3 эффекторных клеток и вызывают в их CD3-зависимую активацию. д – В эффекторной клетке, имеющей CAR против TAA, содержащий сигнальный домен CD3ζ, при контакте с TAA (TAA положительной) клеткой-мишенью активируются CD3-зависимые сигнальные каскады. е – При контакте клетки-мишени с эффекторной клеткой связанное с TAA биспецифическое антитело против CD3 и TAA связывается с CD3 эффекторной клетки, что приводит к ее CD3-зависимой активации.
Фиг. 2. Сравнение эффективности CD3-зависимой стимуляции NFAT-сигнального каскада растворимыми активирующими агентами. Суспензию, состоявшую из указанной комбинации клеток Jurkat NFAT-FLuc PD-1 (J-PD-1), Raji (R), Raji PD-L1 (R-PD-L1), инкубировали в присутствии одного из активирующих агентов в указанной концентрации, а также в присутствии (+aPD-1), либо в отсутствие (–aPD-1) aPD-1 в концентрации 50 мкг/мл. Эффективность активации оценивали по уровню синтеза люциферазы путем измерения люминесценции.
Фиг. 3. Зависимость активации репортерной системы от концентрации aCD3/aTAA. В клеточном тесте использовали суспензию клеток Jurkat NFAT-FLuc PD-1 (Jurkat-PD-1), содержавшую (кривые 2 и 3), либо не содержавшую (кривая 1) клетки Raji PD-L1 (Raji-PD-1). В случае кривой 3 – к клеткам добавляли в aPD-1 в концентрации 50 мкг/мл. В качестве активирующего агента использовали aCD3/aTTA1. Относительная активация (кривая 4) – отношение интенсивности люминесценции кривой 3 к кривой 2 для соответствующих концентраций aCD3/aTAA.
Фиг. 4. Зависимость активации репортерной системы от концентрации aCD3/aTAA. В клеточном тесте использовали суспензию клеток Jurkat NFAT-FLuc PD-1 (Jurkat-PD-1), содержавшую (кривые 2 и 3), либо не содержавшую (кривая 1) клетки Raji PD-L1 (Raji-PD-1). В случае кривой 3 – к клеткам добавляли в aPD-1 в концентрации 50 мкг/мл. В качестве активирующего агента использовали aCD3/aTАA2. Относительная активация (кривая 4) – отношение интенсивности люминесценции кривой 3 к кривой 2 для соответствующих концентраций aCD3/aTAA.
Фиг. 5. Зависимость активации репортерной системы от концентрации aPD-1 в присутствии различных активирующих агентов. В клеточном тесте использовали суспензию клеток Jurkat NFAT-FLuc PD-1 (кривые 1–3), либо Jurkat NFAT-FLuc PD-1 CAR (кривая 4) с добавлением клеток Raji PD-L1 (кривые 1, 2 и 4), либо CHO PDL1 tmaCD3 (кривая 3). В случае кривых 1 и 2 суспензия клеток содержала, соответственно, aCD3/aTAA1 и aCD3/aTAA2 в концентрации 1 нг/мл. Результаты приведены в значениях интенсивности люминесценции.
Фиг. 6. Зависимость активации репортерной системы от концентрации aPD-1 в присутствии различных активирующих агентов. В клеточном тесте использовали суспензию клеток Jurkat NFAT-FLuc PD-1 (кривые 1–3), либо Jurkat NFAT-FLuc PD-1 CAR (кривая 4) с добавлением клеток Raji PD-L1 (кривые 1, 2 и 4), либо CHO PDL1 tmaCD3 (кривая 3). В случае кривых 1 и 2 суспензия клеток содержала, соответственно, aCD3/aTAA1 и aCD3/aTAA2 в концентрации 1 нг/мл. Результаты приведены в единицах относительной активации. Относительную активацию определяли как отношение интенсивности люминесценции при данной концентрации aPD-1 к интенсивности люминесценции в варианте без добавления aPD-1 для каждого активатора.
Фиг. 7. Исследование специфичности репортерной системы. В клеточном тесте использовали aPD-1 (1), либо aPD-L1 (2), либо aCTLA4 (3), либо aHER2 (4) в указанных концентрациях. Исследование проводили согласно методике, описанной в разделе «функциональные тесты».
Фиг. 8. Использование разработанного клеточного теста для оценки специфической активности aPD-1 и aPD-L1. В клеточном тесте использовали aPD-1, исходные (1), либо проинкубированные в течении 1 ч при температуре 50 °С (2), 70 °С (3), либо 90 °С (4). Для вариантов (1–3) указаны соответствующие значения EC50. Исследование проводили согласно методике, описанной в разделе «функциональные тесты».
Фиг. 9. Использование разработанного клеточного теста для оценки специфической активности aPD-1 и aPD-L1. В клеточном тесте aPD-L1, исходные (1), либо проинкубированные в течении 1 ч при температуре 50 °С (2), 70 °С (3), либо 90 °С (4). Для вариантов (1–3) указаны соответствующие значения EC50. Исследование проводили согласно методике, описанной в разделе «функциональные тесты».
Фиг. 10. Исследование линейного диапазона тест-системы. Сравнение ожидаемой и экспериментально определенной активности aPD-1. Измеряли EC50 заранее подготовленных разведений (в диапазоне концентраций 50 – 200 % относительно стандарта, активность которого принимали за 100%) антител. Экспериментально определенную активность рассчитывали, как отношение экспериментально определенной EC50 стандарта к EC50 для данной концентрации, умноженное на 100%.
Фиг. 11. Исследование линейного диапазона тест-системы. Сравнение ожидаемой и экспериментально определенной активности aPD-L1. Измеряли EC50 заранее подготовленных разведений (в диапазоне концентраций 50 – 200 % относительно стандарта, активность которого принимали за 100%) антител. Экспериментально определенную активность рассчитывали, как отношение экспериментально определенной EC50 стандарта к EC50 для данной концентрации, умноженное на 100%.
Фиг. 12. Схема работы тест-системы для оценки функциональной активности aPD-1 и aPD-L1, основанная на использовании бисфецифических aCD3/aTAA. а – Система без добавления ингибиторов взаимодействия PD-1/PD-L1. При контакте эффекторной клетки и клетки-мишени aCD3/aTAA, связавшиеся с TAA клетки-мишени, взаимодействуют с CD3 эффекторной клетки, что активирует ее CD3-зависимый NFAT сигнальный каскад. При этом происходит взаимодействие PD-1 эффекторной клетки с PD-L1 клетки-мишени, что ингибирует активацию CD3-зависимого NFAT сигнального каскада. б – Добавленные в систему aPD-1 или aPD-L1 (в) связываются со своей мишенью, что блокирует взаимодействие PD-1/PD-L1 и реактивирует CD3-зависимый NFAT сигнальный каскад.
Определения и общие методы
Если иное не определено в настоящем документе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, будут иметь значения, которые обычно понятны специалистам в данной области.
Кроме того, если по контексту не требуется иное, термины в единственном числе включают в себя термины во множественном числе, и термины во множественном числе включают в себя термины в единственном числе. Как правило, используемая классификация и методы культивирования клеток, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики, аналитической химии, химии органического синтеза, медицинской и фармацевтической химии, а также гибридизации и химии белка и нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Ферментативные реакции и способы очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителя, как это обычно осуществляется в данной области, или как описано в настоящем документе.
PD-1 является ингибиторным членом семейства рецепторов CD28, которое включает в себя также CD28 (Cluster of Differentiation 28), CTLA-4 (Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4), ICOS (Inducible T-cell COStimulator) и BTLA (B- and T-lymphocyte attenuator). PD-1 экспрессируется активированными В-клетками, Т-клетками и миелоидными клетками (Agata et al., supra; Okazaki et al. (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82; Bennet et al. (2003) J Immunol 170: 711-8). PD-1 является трансмембранным белком типа I 55 кДа, который является частью суперсемейства генов Ig (Agata et al. (1996) Int Immunol 8: 765-72). PD-1 содержит мембранопроксимальный иммунорецепторный ингибирующий мотив на основе тирозина (ITIM) и мембранодистальный мотив переключения на основе тирозина (ITSM) (Thomas, M.L. (1995) J Exp Med 181: 1953-6; Vivier, E и Daeron, M (1997) Immunol Today 18: 286-91). PD-1, хотя и является структурно сходным с CTLA-4, лишен мотива MYPPPY, который является критическим для связывания В7-1 и В7-2. Были идентифицированы два лиганда для PD-1, PD-L1 и PD-L2, которые, как было показано, отрицательно регулируют активацию Т-клеток после связывания с PD-1 (Freeman et al. (2000) J Exp Med 192: 1027-34; Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2: 261-8; Carter et al. (2002) Eur J Immunol 32: 634-43). Как PD-L1, так и PD-L2 являются гомологами В7, которые связываются с PD-1, но не связываются с другими членами семейства CD28.
+
+
PD-L1, также известный как кластер дифференцировки 274 (CD274) или гомолог 1 B7 (B7-H1), является трансмембранным белком 1 типа, массой 40 кДа. Состоит из 3 доменов: внеклеточного, представленного Ig V и C-подобными доменами (220), трансмембранного (21) и внутриклеточного (31). Он играет важную роль в супрессии иммунной системы в период беременности, при пересадке чужеродной ткани, некоторых заболеваниях, например, при гепатите. В нормальных условиях, в ответ на собственные антигены, в лимфатических узлах и селезенке аккумулируется некоторое количество антиген-специфичных CD8 Т-эффекторных клеток, с целью предотвращения аутоиммунного процесса, формируются PD-1/PD-L1 или B7-1/PD-L1 комплексы, это приводит к передаче ингибиторного сигнала, снижающего пролиферацию данных CD8 T-клеток в лимфоузлах. Таким образом PD-1/PD-L-взаимодействие является одним из ключевых в развитии иммунной толерантности.
Под термином «тест-система» в контексте данного изобретения подразумевается смесь компонентов для проведения анализа активности антител. Причем данная смесь может быть помещена в любое подходящее для этого устройство или емкость (микросферы, биочип, аналитические полоски, аффинные колонки, планшеты, пробирки и пр.).
Термин «набор» объединяет все комплектующие, в том числе саму тест-систему и при необходимости инструкцию проведения анализа.
Термин «антитело» или «иммуноглобулин» (Ig), как использовано в данном описании, включает целые антитела и любой антигенсвязывающий фрагмент (т.е. «антигенсвязывающую часть») или его отдельные цепи. Термин «антитело» используется здесь в самом широком смысле и конкретно охватывает человеческие, нечеловеческие (например, мышиные) и гуманизированные моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, моноспецифические антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), одноцепочечные антитела и фрагменты антител, если они проявляют желаемую биологическую активность. Антитела могут существовать как интактные иммуноглобулины, так и в виде модификаций различных форм, например, FabFc2, Fab, Fv, Fd, (FabN)2, Fv фрагмент, содержащий только легкие и тяжелые цепи вариабельных регионов, одноцепочечного антитела (например, scFv) и тому подобное. Тяжелая и легкая цепи Fv могут быть получены из одного и того же антитела или различных антител, тем самым производя химерную область Fv. Антитело может быть животного (в частности, мыши или крысы) или человеческого происхождения, может быть химерным или гуманизированным. «Антитела» согласно изобретению могут представлять собой антитела любого класса (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, предпочтительно IgG) или подкласса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2, предпочтительно IgG1).
Термин «антигенсвязывающая часть» антитела или «антигенсвязывающий фрагмент» (или просто «часть антитела» или «фрагмент антитела»), как использовано в данном описании, относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном. Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может выполняться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, включенных в термин «антигенсвязывающая часть» антитела, включают (i) Fab-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH 1; (ii) F(ab’)2-фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd- фрагмент, состоящий из доменов VH и CH 1; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH в едином плече антитела, (v) dAb-фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), который состоит из домена VH/VHH; и (vi) выделенная определяющая комплементарность области (CDR). Кроме того, две области Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются разными генами, они могут быть соединены при помощи рекомбинантных способов с использованием синтетического линкера, который дает возможность получать их в виде единой белковой цепи, в которой области VL и VH спариваются с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Предполагается, что такие одноцепочечные молекулы также включены в термин «антигенсвязывающая часть» антитела. Такие фрагменты антител получают с использованием общепринятых способов, известных специалистам в данной области, и эти фрагменты подвергают скринингу таким же образом, как и интактные антитела.
Выражение «функциональная активность» по отношению к антителу или антигенсвязывающему фрагменту против PD-1 или PD-L1 по данному изобретению означает способность связываться с PD-1 или PD-L1 и препятствовать образованию комплекса PD-1/PD-L1.
Термин «биспецифичное антитело» или «биспецифический антигенсвязывающий фрагмент» означает антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащие антигенсвязывающий домен или антигенсвязывающие домены, которые способны к специфическому связыванию с двумя различными эпитопами на одной биологической молекуле или способны к специфическому связыванию с эпитопами на двух различных биологических молекулах. Биспецифичное антитело также упоминается в настоящем документе, как обладающее «двойной специфичностью» или как являющееся антителом с «двойной специфичностью».
Термин «моноклональное антитело» или «mAb» относится к антителу, которое синтезировано и выделено отдельной клональной популяцией клеток. Клональная популяция может быть клональной популяцией иммортализованных клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммортализованные клетки в клональной популяции являются гибридными клетками, гибридомами, которые обычно получают путем слияния отдельных В-лимфоцитов от иммунизированных животных с отдельными клетками лимфоцитарной опухоли. Гибридомы представляют собой тип сконструированных клеток и не встречаются в природе.
Термин «растворимое антитело» относится к антителу, которое исходно является компонентом раствора. В отличие от трансмембранного антитела, которое исходно представлено на поверхности клеточной мембраны.
Термин «ED50» («EC50») (50% эффективная доза/концентрация) относится к концентрациям препарата, при которых измеряемый максимально возможный биологический эффект достигается на 50% (может включать цитотоксичность).
Термин «эффекторные клетки», используемый здесь, обозначает клетки, которые представляют на своей поверхности TCR, CD3, CAR, рецепторы Fc-фрагмента антител (FcR), B-клеточный рецептор (BCR), содержащие ITAM сигнальные мотивы, и осуществляют эффекторные функции. Примером природных эффекторных клеток являются T-лимфоциты, натуральные киллеры (NK), моноциты и т.д. Природные эффекторные клетки могут быть выделены из их природного источника, например, из цельной крови или PBMC. Также этот термин относится к другим клеткам, представляющим на своей поверхности TCR, CD3, CAR, FcR, BCR или их производные, содержащие ITAM сигнальные мотивы.
Термин «клетка-мишень», используемый здесь, обозначает клетку, с которой специфично связывается эффекторная клетка, что обеспечивает активацию ее эффекторных функций. Такие клетки представляют на своей поверхности главный комплекс гистосовместимости (MHC), другие трансмембранные или мембранно-связанные соединения, специфично связывающие TCR, CD3, FcR, CAR, BCR или их производные эффекторных клеток напрямую или опосредованно другими соединениями. Примером таких клеток могут быть B-лимфоциты, моноциты, дендритные клетки, иммортализованные клеточные линии и т.д.
Термин «репортерный ген», используемый здесь, относится к гетерологичному гену, кодирующему репортерный белок, экспрессия которого находится под контролем регулируемого промотора, и продукт экспрессии которого может быть с легкостью определен и подвергнут количественной оценке, когда конструкцию, содержащую этот ген, вводят в ткани или клетки. Примеры репортерных белков, известных и используемых в данной области техники, включают люциферазу (Luc), зеленый флюоресцентный белок (GFP), хлорамфеникол-ацетилтрансферазу (САТ), β-галактозидазу (LacZ), β-глюкуронидазу (Gus), секретируемую эмбриональную щелочную фосфатазу (SEAP) и подобные. Гены селективных маркеров могут также считаться репортерными генами.
Термины «промотор» и «промоторная последовательность» используются взаимозаменяемо и относятся к последовательности ДНК, способной к контролированию экспрессии кодирующей последовательности. Источниками промоторных последовательностей могут служить природные гены или комбинации их участков, отвечающих за контроль его экспрессии. Также промоторы могут включать и сегменты синтетической ДНК. Квалифицированным в данной области техники специалистам понятно, что различные промоторы могут управлять экспрессией гена в различных тканях или типах клеток, или на различных стадиях развития, или в ответ на различные условия окружающей среды или физиологические условия. Промоторы, обеспечивающие стабильную экспрессию гена в большинстве периодов времени, обычно именуют «конститутивными промоторами». Промоторы, которые вызывают экспрессию гена в специфическом типе клеток, обычно именуют «клеточноспецифическими» или «тканеспецифическими» промоторами. Промоторы, которые вызывают экспрессию гена на специфической стадии развития или клеточной дифференциации, обычно именуют «специфичными в отношении развития промоторами» или «специфичными в отношении клеточной дифференциации промоторами». Промоторы, которые индуцируются и вызывают экспрессию гена после воздействия или обработки клетки агентом, биологической молекулой, химическим веществом, лигандом, светом и подобными, которые индуцируют промотор, обычно именуют «индуцибельными промоторами» или «регулируемыми промоторами». Дополнительно признается, что, поскольку в большинстве случаев точные границы регуляторных последовательностей не вполне определены, фрагменты ДНК различных длин могут иметь одинаковую промоторную активность.
Промоторная последовательность обычно ограничена на своем 3' конце местом инициации транскрипции и простирается выше (в 5' направлении) с включением элементов, необходимых для инициации транскрипции на уровнях, определяемых выше фона. Внутри промоторной последовательности будут обнаруживаться место инициации транскрипции (подходящим образом определяемое, например, с помощью картирования с использованием нуклеазы S1), а также белоксвязывающие домены (консенсусные последовательности), ответственные за связывание РНК-полимеразы.
Термин «функциональный CD3 комплекс», используемый здесь, относится к комплексу, представленному на поверхности эффекторной клетки и включающему в себя хотя бы одну субъединицу CD3 или ее производное, содержащее ITAM сигнальные мотивы, которые способны обеспечить активацию CD3-зависимых сигнальных каскадов. Производные CD3 комплекса – полипептиды, имеющие в своем составе аминокислотную последовательность белков, составляющих CD3 комплекс, или ее фрагменты.
Термин «CD3» относится к мультипротеиновому комплексу на поверхности Т-лимфоцитов, являющемуся основным корецептором Т-клеточного рецептора. У млекопитающих образован 6 субъединицами: CD3γ, CD3δ, двумя CD3ε и двумя CD3ζ. В функции комплекса CD3 входит передача сигналов в клетку, а также стабилизация Т-клеточного рецептора на поверхности мембраны. Один из белков кластера дифференцировки.
Термин «CD3-зависимый промотор» относится к промотору, который при активации одного или нескольких CD3-зависимых сигнальных каскадов обеспечивает экспрессию гена, который он контролирует.
Термин «CD3-зависимый сигнальный каскад» относится к сигнальным каскадам, которые активируются в ответ на стимуляцию TCR, субъединиц CD3 или их производных, содержащих ITAM сигнальные мотивы. Примерами являются NFAT, NF-κB, Ras/MAPK, PKC и другие сигнальные каскады.
Термин «опухоль-ассоциированный антиген» (TAA, опухолевый антиген) относится к антигенам, продуцируемым раковыми клетками и способным вызвать иммунный ответ организма. Эта способность делает опухолевые антигены важнейшим целевым объектом иммунотерапии рака. Кроме того, эти антигены являются одними из онкомаркеров, определяемых в диагностике рака.
В организме опухолевые антигены являются результатом измененного генома раковой клетки. Из-за этих изменений возникают чуждые организму продукты генов или даже белки, которые, к примеру, существуют только в эмбриональный период развития. Эти чужеродные продукты – опухолевые антигены – могут находиться в цитоплазме клетки или на её поверхности, а также и во внеклеточном пространстве.
Термин «NFAT» (ядерный фактор активированных T-лимфоцитов) относится к белкам семейства NFAT, которые являются факторами транскрипции, и клеточная локализация которых зависит от их фосфорилирования. В фосфорилированной форме NFAT локализуется в цитоплазме, при дефосфорилировании, вызванном, например, активацией CD3, происходит его переход в ядро, где он специфично связывается с определенными последовательностями ДНК в промоторах генов, что приводит к активации их экспрессии.
Выражение «NFAT-чувствительный промотор» или «NF-κB-чувствительный промотор» относится к промоторам, содержащим последовательности ДНК, с которыми специфично связываются соответствующие транскрипционные факторы, что активирует экспрессию генов, которые контролируются соответствующими промоторами.
Термин «NF-κB» (ядерный фактор энхансера легкой цепи активированных B-лимфоцитов) относится к семейству белков NF-κB, которые являются факторами транскрипции, и клеточная локализация которых зависит от их фосфорилирования. В дефосфорилированной форме NF-κB локализуется в цитоплазме, при фосфорилировании NF-κB, вызванном, например, активацией CD3, происходит его переход в ядро, где он специфично связывается с определенными последовательностями ДНК в промоторах генов, что приводит к активации их экспрессии.
Термин «CAR» (химерный антигенный рецептор) относится к рекомбинантному гибридному белку, сочетающему фрагмент антитела, обладающему способностью избирательно связываться с конкретными антигенами, и сигнализирующие домены, способные активировать клетки, представляющие его на своей поверхности.
Термин «CAR-T» относится к Т-клеткам, представляющим CAR на своей поверхности.
Выражение «стандартный образец» относится к препарату, охарактеризованному по определенным параметрам, который используется в качестве препарата сравнения для определения аналогичных параметров исследуемых образцов.
Подробное описание изобретения
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к тест-системе для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, содержащей:
а. эффекторные репортерные клетки, имеющие на своей поверхности функциональный CD3 комплекс или его производное, PD-1, и содержащие репортерный ген под контролем CD3-зависимого промотора,
б. клетки-мишени, представляющие на своей поверхности PD-L1,
в. Активатор CD3-зависимого сигнального каскада,
где активатор CD3-зависимого сигнального каскада представляет собой биспецифическое антитело, способное связываться с CD3 комплексом.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к тест-системе для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, содержащей:
а. эффекторные репортерные клетки, имеющие на своей поверхности производное функционального CD3 комплекса, активатор CD3-зависимого сигнального каскада, PD-1, и содержащие репортерный ген под контролем CD3-зависимого промотора,
б. клетки-мишени, представляющие на своей поверхности PD-L1,
где производным функционального CD3 комплекса и активатором CD3-зависимого сигнального каскада одновременно является химерный антигенный рецептор, включающий в себя домен CD3.
+
Тест-система для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1 должна состоять из эффекторных PD-1 клеток и PD-L1. Функция PD-1-опосредованного ингибирования CD3-зависимой активации подразумевает, что эффекторная клеточная линия должна иметь функциональный CD3 комплекс на поверхности. Для оценки уровня CD3-зависимой активации и степени ее ингибирования удобно использовать репортерную систему, например, на основе использования репортерных генов, в качестве которых могут быть использованы гены, кодирующие флюоресцентный (GFP, RFP, BFP и т.д.) или люминесцентный (FLuc, RLuc, GLuc и т.д.) белок, в частности люциферазу светляка. Экспрессия репортерного гена должна осуществляться под контролем CD3-зависимого промотора. PD-1 при взаимодействии с PD-L1 способен подавлять NFAT и NF-κB сигнальные каскады, активируемые CD3 (Jutz, S., Leitner, J., Schmetterer, K., Doel-Perez, I., Majdic, O., Grabmeier-Pfistershammer, K., Paster, W., Huppa, J.B., Steinberger, P. (2016) Assessment of costimulation and coinhibition in a triple parameter T cell reporter line: Simultaneous measurement of NF-κB, NFAT and AP-1, J. Immunol. Methods, 430, 10–20, doi: 10.1016/j.jim.2016.01.007).
В некоторых вариантах репортерный ген выбран из гена, кодирующего флюоресцентный или люминесцентный белок. В некоторых вариантах осуществления репортерный ген представляет собой люциферазу, бета-лактамазу, CAT, SEAP, флюоресцентный белок, генный продукт и др. В некоторых вариантах осуществления люциферазу выбирают из таковых, обнаруженных у Omphalotus olearius, светлячков (например, Photinus pyralis), Renilla reniformi, их мутантов, их частей, их вариантов и любых другие ферменты люциферазы, подходящие для описанных систем и способов.
В некоторых вариантах CD3-зависимый промотор выбран из NFAT-чувствительного промотора или NF-кB-чувствительного промотора. Использование NFAT сигнального пути предпочтительнее, т.к. NF-κB сигнальный путь имеет множество других способов активации, т.е. является менее специфичным маркером CD3-зависимой активации (Pahl, H.L. (1999) Activators and target genes of Rel/NF-kappaB transcription factors, Oncogene, 18, 6853–6866, doi: 10.1038/sj.onc.1203239; Rao, A., Luo, C, Hogan, P.G. (1997) Transcription factors of the NFAT family: regulation and function, Annu. Rev. Immunol., 15, 707–747, doi: 10.1146/annurev.immunol.15.1.707; Vaeth, M., Feske, S. (2018) NFAT control of immune function: New Frontiers for an Abiding Trooper, F1000Res., 7, 260, doi: 10.12688/f1000research.13426.1). Также могут быть использованы Ras/MARK-чувствительный промотор, PKC-чувствительный промотор.
NFAT-чувствительный промотор представляет собой последовательность ДНК, которая содержит одну или несколько последовательностей, с которой специфично связывается NFAT. При связывании NFAT-чувствительного промотора с фактором транскрипции NFAT (например, NFATcl, NFATc2, NFATc3, NFATc4 или NFAT5) транскрипция связанных последовательностей нуклеиновых кислот (например, нижестоящих генов) усиливается. Одним из примеров последовательности ДНК, специфично связываемой NFAT, является GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT (SEQ ID NO: 1) В некоторых вариантах осуществления промотор NFAT содержит повторы SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления промотор NFAT содержит один или несколько элементов ответа NFAT, имеющих по меньшей мере 50% (например, больше 50%, больше 60%, больше 70%, больше 80%, больше 90%, больше 95% и диапазоны в них) идентичность последовательности с SEQ ID NO: 1, где элементы ответа NFAT связываются с фактором транскрипции семейства NFAT для усиления транскрипции ассоциированных (например, нисходящих) генов.
Для функциональных клеточных тестов предпочтительно использование иммортализованных клеточных линий, позволяющих избежать проблем с точностью и воспроизводимостью результатов, присущих методам анализа c использованием первичных клеток (Hsieh, Y.T., Aggarwal, P., Cirelli, D., Gu, L., Surowy, T., Mozier, N.M. (2017) Characterization of FcγRIIIA effector cells used in in vitro ADCC bioassay: Comparison of primary NK cells with engineered NK-92 and Jurkat T cells, J. Immunol. Methods, 441, 56–66, doi: 10.1016/j.jim.2016.12.002). Также это позволяет при помощи методов генной и клеточной инженерии создавать клетки с необходимым фенотипом.
В некоторых вариантах осуществления эффекторная клетка представляет собой Т-клетку, включая, но не ограничиваясь этим, клетки Jurkat, HuT-78, CEM, Molt-4 и т.д. В частности, предъявленным требованиям удовлетворяет человеческая клеточная линия Т-клеточного происхождения Jurkat, которая более 30 лет успешно используется в исследовании процессов CD3-зависимой активации. На ее основе в рамках данной работы создали стабильную клеточную линию Jurkat NFAT-FLuc PD-1, экспрессирующую ген, кодирующий PD-1, и содержащую в геноме репортерный ген, кодирующий люциферазу светляка под контролем NFAT-чувствительного промотора.
+
Помимо эффекторных клеток тест-система должна включать в себя PD-L1 и активатор CD3-зависимого сигнального каскада. Наиболее физиологичным является использование PD-L1 (PD-L1-положительных) клеток-мишеней в качестве носителя PD-L1. В качестве клеток-мишеней могут быть использованы любые клетки, представляющие на своей поверхности PD-L1. В одном из вариантов воплощения изобретения клетки-мишени представляют собой производные клеточной линии Raji или CHO-K1, представляющие на своей поверхности PD-L1.
В качестве активатора CD3-зависимого сигнального каскада могут быть использованы биспецифическое антитело, способное связываться с CD3 комплексом, или CAR, включающий в себя домен CD3. CAR, являющийся производным CD3 комплекса, представляется на поверхности эффекторных репортерных клеток, одновременно является и активатором CD3-зависимого сигнального каскада.
В некоторых вариантах биспецифическое антитело, способное связываться с CD3 комплексом, представляет собой растворимое антитело. Т.е. растворимое биспецифическое антитело в данном варианте является отдельным компонентом тест-системы.
В некоторых вариантах биспецифическое антитело, способное связываться с CD3 комплексом, представляет собой биспецифическое анти-CD3/анти-TAA антитело, в частности, анти-CD3/анти-CD19, анти-CD3/анти-CD20.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к набору для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, содержащему описанную выше тест-систему и при необходимости инструкцию.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению описанной выше тест-системы для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению описанного выше набора для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, включающему:
а. добавление к описанной выше тест-системе антитела против PD-1 или антитела против PD-L1,
б. инкубацию,
в. измерение интенсивности сигнала продукта экспрессии репортерного гена,
г. обработку полученных данных.
В некоторых вариантах обработка полученных данных в описанном выше способе включает установление значения ЕС50 антитела против PD-1 или антитела против PD-L1. Экспериментально определенную активность рассчитывали, как отношение экспериментально определенной EC50 стандарта к EC50 проверяемого объекта для данной концентрации, умноженное на 100%.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу определения функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, включающему:
а. добавление к тест-системе по п. 1 антитела против PD-1 или антитела против PD-L1,
б. инкубацию,
в. измерение интенсивности сигнала продукта экспрессии репортерного гена,
г. обработку полученных данных, в том числе установление значения ЕС50 антитела против PD-1 или антитела против PD-L1,
д. расчет отношения экспериментально определенной EC50 стандартного образца, активность которого принимают за 100%, к экспериментально определенной EC50 сравниваемого антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, умноженного на 100%.
Такие анализы могут проводиться с использованием систем, способов, устройств, робототехники и другого оборудования, известного в данной области техники. Например, клетки-мишени и эффекторные клетки совместно культивируют в 96- или 384-луночных планшетах, и робототехнику используют для эффективного введения библиотеки тестируемых антител и для обнаружения сигнала репортера. В некоторых вариантах осуществления предоставляются компоненты, композиции, устройства, оборудование и т.д. (например, вместе с описанными здесь компонентами анализа (например, эффекторными клетками и клетками-мишенями)) для проведения анализов. В некоторых вариантах осуществления компоненты могут включать питательные среды, сыворотку, питательные добавки (например, достаточные для совместного культивирования клеток-мишеней и эффекторных клеток), буферы, репортерный субстрат (например, люциферин, коелентеразин или их производные и т.д.) средства контроля или стандартные образцы (например, положительные контроли, о которых известно, что они ингибируют взаимодействия PD-1 с PD-L1) и т.д.
2
В некоторых вариантах осуществления предусмотрены культуральные колбы и флаконы, микроцентрифужные пробирки, микропланшеты, включающие 96- и 384-луночные планшеты, считыватели, водяную баню, CO-инкубатор, одноканальные и многоканальные пипетки и т.д. В некоторых вариантах осуществления предусмотрены робототехника для анализов с высокой пропускной способностью (например, выдача реагентов, организация образцов, обнаружение репортерных генов и т.д.), инструменты для обнаружения репортерных генов (например, флюориметр, люминометр, спектрофотометр, планшеты Taqman, ELISA и т.д.) и т.д.
В некоторых вариантах осуществления все или часть компонентов для выполнения анализа, описанного в данном документе, предоставляются в виде набора. Компоненты могут быть в отдельных контейнерах, которые упакованы вместе или отдельно для удобства или других соображений. В некоторых вариантах осуществления компоненты (например, клетки-мишени, эффекторные клетки и т.д.) предоставляются в заранее определенных количествах в соответствии с размером и / или количеством анализов, которые пользователь намеревается выполнить. В некоторых вариантах осуществления также предусмотрены принадлежности (например, сосуды, чашки и т.д.), инструкции, другие компоненты (например, буферы, контроли, носитель, субстрат для репортерного белка и т.д.) и т.д.
Тест-система может быть использована на стадии разработки aPD-1 и aPD-L1 для сравнения кандидатов, оценки их стабильности, а также характеристики серий терапевтического препарата для подтверждения их эквивалентности, требующей в большинстве случаев соответствия 80–125% активности относительно стандартного образца.
Возможно дополнительное улучшение параметров данной тест-системы, например, за счет снижения фонового сигнала путем использования дестабилизированной версии репортерного белка люциферазы.
Примеры
Материалы и методы.
Реактивы
Среды DMEM/F12 и RPMI-1640 («ПанЭко», Россия); инактивированная эмбриональная бычья сыворотка («Gibco», США); классические моноклональные антитела против PD-1 человека, PD-L1 человека, цитотоксического Т-лимфоцит-ассоциированного белка 4 (CTLA4) человека (aCTLA4), рецептора эпидермального фактора роста человека 2 (HER2) (aHER2), биспецифические моноклональные антитела против CD3 человека и опухоль-ассоциированного антигена человека 1 (aCD3/aTAA1) и 2 (aCD3/aTAA2) («BIOCAD», Россия); мышиное моноклональное антитело против CD3 человека, клон HIT3a («BD», США); набор для детекции активности люциферазы ONE-Glo («Promega», США); стафилококковый энтеротоксин Б (SEB) («Toxin Technology», США).
Клеточные линии.
Клетки Jurkat, Raji и CHO-K1 культивировали при 37 °С в атмосфере с 5% CO2 в соответствующей питательной среде с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, в случае клеток Jurkat, Raji – в среде RPMI-1640, в случае CHO-K1 – в среде DMEM/F12. Все клеточные линии, использованные для инженерии, а также полученные на их основе репортерные линии, были протестированы на отсутствие контаминации микоплазмами набором VenorTM GeM Mycoplasma Detection Kit, PCR-based («Sigma Aldrich», США).
Пример 1
Создание генетических конструкций
Плазмидный вектор pOGI_NFAT-FLuc создан на основе вектора pOGI («BIOCAD», Россия), он содержит ген, кодирующий люциферазу светляка Photinus pyralis (FLuc), под контролем минимального промотора интерлейкина 2 (IL-2), содержащего 3 копии последовательностей, связывающих ядерный фактор активированных T-лимфоцитов (NFAT), а также экспрессионную кассету с геном устойчивости к гигромицину.
Плазмидные вектора pSX_tmaCD3, pSX_PD-1 и pSX_PD-L1 созданы на основе вектора pSX («BIOCAD», Россия). pSX_tmaCD3 содержит ген, кодирующий антитело OKT3 в формате одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv), слитое с трансмембранным доменом рецептора тромбоцитарного фактора роста, под контролем цитомегаловирусного (CMV) промотора, а также экспрессионную кассету с геном устойчивости к пуромицину. pSX_PD-1 содержит ген, кодирующий PD-1 человека, под контролем CMV промотора, а также экспрессионную кассету с геном устойчивости к генетицину (неомицину). pSX_PD-L1 содержит ген, кодирующий PD-L1 человека, под контролем CMV промотора, а также экспрессионную кассету с геном устойчивости к генетицину (неомицину).
Пример 2
Создание стабильных клеточных линий
Клеточную линию Jurkat NFAT-FLuc создали путем электропорации клеток Jurkat вектором pOGI_NFAT-FLuc с последующей селекцией клеток на гигромицине Б. Из них отобрали резистентные клоны, показавшие максимальное увеличение экспрессии люциферазы при добавлении aCD3.
Клеточную линию Jurkat NFAT-FLuc PD-1 создали электропорацией клеток Jurkat NFAT-FLuc вектором pSX_PD-1 с последующей селекцией на генетицине. Целевые клоны отбирали по максимальному содержанию PD-1 на поверхности клеток, которое определяли с помощью проточного цитофлуориметра Guava 12HT («Millipore», США) после окрашивания клеток aPD-1.
Клеточную линию Raji PD-L1 создали электропорацией клеток Raji вектором pSX_PD-L1 с последующей селекцией на генетицине. Целевые клоны отбирали по максимальному содержанию PD-L1 на поверхности клеток, которое определяли методом проточной цитофлуориметрии после окрашивания клеток aPD-L1.
Клеточную линию Jurkat NFAT-FLuc PD-1 CAR создали трансдукцией клеток Jurkat NFAT-FLuc PD-1 лентивирусными частицами, кодирующими химерный антигенный рецептор (CAR), соединенный пептидным линкером T2A с зеленым флюоресцентным белком (GFP) («BIOCAD», Россия). Пул клеток анализировали на наличие GFP-позитивных клеток методом проточной цитофлуориметрии.
Клеточную линию CHO PD-L1 tmaCD3 создали трансфекцией клеток CHO-K1 вектором pSX_PD-L1 и pSX_tmaCD3 с последующей селекцией на генетицине и пуромицине. Клоны скринировали с помощью флюоресцентно меченных антител против PD-L1 и Fc-фрагмента антител человека методом проточной цитофлуориметрии. Целевые клоны отбирали по максимальному содержанию PD-L1 и трансмембранных aCD3 (tmaCD3) на поверхности клеток, которое определяли методом проточной цитофлуориметрии окрашиванием клеток aPD-L1 и антителами против Fc-фрагмента антител человека.
Пример 3
Функциональные тесты
Тесты проводили в белых культуральных 96-луночных планшетах для работы с люминесценцией («SPL Life Sciences», Республика Корея). Если не указано другое, суспензия содержала 50 000 клеток Jurkat NFAT-FLuc PD-1 и 25 000 клеток Raji PDL1 на лунку и aCD3/aTAA1 в концентрации 1 нг/мл. В случае замены клеток Jurkat NFAT-FLuc PD-1 клетками Jurkat NFAT-FLuc PD-1 CAR, их количество также составляло 50 000 клеток на лунку. В случае замены клеток Raji PD-L1 клетками Raji, либо CHO PD-L1 tmaCD3, их количество также составляло 25 000 клеток на лунку. Конечный объем клеточной суспензии в лунке составлял 100 мкл, все компоненты суспензии готовили в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки. После добавления всех компонентов планшеты инкубировали в течение 16 ч при 37 °С в атмосфере с 5% CO2, далее измеряли интенсивность люминесценции в лунках с использованием набора ONE-Glo и планшетного ридера SPARK 20M («Tecan», Швейцария).
Пример 4
Обработка данных
Для построения кривых зависимости величины активации клеток от концентрации указанного в эксперименте антитела использовали 4-х параметрическую логистическую аппроксимирующую функцию. Уравнение функции выглядит следующим образом:
,
где x – концентрация антитела, в нг/мл; max – верхняя асимптота; min – нижняя асимптота; Hillslope – параметр кривизны; EC50 – значение полуэффективной концентрации, в нг/мл.
Аппроксимацию и построение графиков проводили в программном пакете SigmaPlot, (SYSTAT Software). Из аппроксимирующего уравнения кривой определяли параметр полуэффективной концентрации (EC50). Измерения всех экспериментальных точек проводили как минимум в двух повторах. Точки, приведенные на рисунках, соответствуют среднему значению по всем повторам, планки погрешностей, приведенные на рисунках, – значениям стандартного отклонения для соответствующих повторов.
Пример 5
Выбор варианта активации CD3
В ходе данной работы рассмотрены несколько вариантов активации CD3, которые могут быть использованы в тест-системе (фиг. 1):
1. Взаимодействие T-клеточного рецептора (TCR) со специфичным ему комплексом пептида и главного комплекса гистосовместимости (MHC) является способом активации, наиболее близким к природному механизму действия (фиг. 1, а).
2. Суперантигены способны одновременно связывать β-цепь TCR с MHC класса 2 (MHC-II), что имитирует узнавание TCR комплекса MHC/пептид (фиг. 1, б). В качестве примера суперантигена в работе использовали SEB (стафилококковый энтеротоксин Б).
3. Растворимые активирующие антитела против CD3ε наиболее часто используют для активации CD3 (фиг. 1, в).
4. Трансмембранные антитела против CD3ε, представленные на клетках-мишенях, обычно используют в описанных тест-системах для aPD-1 и aPD-L1 (фиг. 1, г).
+
5. CAR (CAR-положительные) эффекторные клетки могут оказаться интересной альтернативой для тестирования aPD-1 и aPD-L1. Внутриклеточная часть CAR обычно включает в себя сигнальный домен CD3ζ, который обеспечивает активацию сигнальных каскадов, аналогичных полноразмерному CD3 комплексу (фиг. 1, д). Есть сообщения об усилении эффекта CAR-T терапии при ее совмещении с блокаторами PD-1/PD-L1.
6. Биспецифические aCD3/aTAA являются еще одним вариантом активации CD3 (фиг. 1, е). В одном из вариантов воплощения изобретения TAA (опухоль-ассоциированный антиген человека) выбран из TAA1 или TAA2, где TAA1 является CD20, TAA2 является CD19,
Активация, опосредованная взаимодействием TCR с комплексом MHC/пептид, сложна с точки зрения практической реализации относительно других подходов и далее рассматриваться в данной работе не будет.
+
Для определения оптимального варианта активации CD3 при разработке тест-системы сначала сравнили только растворимые активаторы: aCD3, aCD3/aTAA1, aCD3/aTAA2 и SEB (фиг. 2). Активаторы CD3 оценивали по двум параметрам: абсолютная активация (интенсивность люминесценции образца в системе, содержащей эффекторные клетки, клетки-мишени, активатор и aPD-1) и относительная активация (отношение интенсивности люминесценции образцов, содержащих эффекторные клетки, клетки-мишени, активатор и aPD-1, к интенсивности люминесценции аналогичных образцов, не содержащих aPD-1). Абсолютная активация тест-системы на основе aCD3/aTAA1 и aCD3/aTAA2 примерно в 2–3 раза больше, чем на основе aCD3 и SEB. При этом стоит отметить, что концентрации aCD3 и SEB, используемые в исследовании, превышают концентрацию биспецифических антител 1000 и 100 раз соответственно. Растворимые aCD3, в отличие от других описанных выше активаторов CD3, вызывают активацию всех эффекторных клеток, а не только тех, которые непосредственно взаимодействуют с клетками-мишенями. При использовании PD-L1 клеток-мишеней опосредованное PD-1 подавление CD3-зависимой активации происходит не во всех эффекторных клетках. Это приводит к повышению фонового уровня сигнала в системе и, как следствие, низкому значению относительной активации. Относительная активация для тест-системы с использованием aCD3/aTAA1 и aCD3/aTAA2 составляет примерно 5–6 раз, aCD3 – 1,5 раза, SEB – 2 раза. Таким образом, aCD3 и SEB уступают биспецифическим антителам по абсолютной и относительной активации и не рассматривались в дальнейших исследованиях. Также суперантигены являются токсинами, что делает их использование нежелательным, если есть альтернативные варианты.
Преимущество растворимых активаторов CD3 по сравнению с трансмембранными активирующими молекулами заключается в возможности подбора их оптимальной концентрации, что делает систему более гибкой (фиг. 3, фиг. 4). Максимальную кратность увеличения интенсивности люминесценции при добавлении aPD-1 наблюдали в диапазоне 0,1–1 нг/мл для обоих aCD3/aTAA. Для экспериментов использовали концентрацию aCD3/aTAA 1 нг/мл, при которой сохраняется максимальный уровень относительной активации и наблюдаются более высокие абсолютные значения интенсивности люминесценции.
+
+
Далее мы сравнили 4 тест-системы, основанные на одном из следующих вариантов активации: двух вариантов aCD3/aTAA, клеток-мишеней с трансмембранным aCD3 (антителом против CD3) или CAR эффекторных клеток (фиг. 5, фиг. 6). По значениям абсолютной активации вариант с использованием CAR эффекторных клеток примерно в 5 раз превосходит варианты, основанные на aCD3/aTAA и клетках-мишенях с трансмембранным aCD3. Относительная активация в вариантах с aCD3/aTAA превосходит варианты с использованием трансмембранных молекул в 2-3 раза. При этом по относительной активации тест-система с использованием aCD3/aTAA1 превосходит систему на основе aCD3/aTAA2.
Экспериментально показали, что из всех проверенных вариантов максимальная относительная активация при добавлении aPD-1 наблюдается при использовании биспецифических aCD3/aTAA в качестве активаторов CD3 (фиг. 2, фиг. 5, фиг. 6). Кроме того, к преимуществам их использования можно отнести низкий фоновый сигнал (в отличие от aCD3), исключение дополнительных генно-инженерных работ (в отличие от CAR и tmaCD3), нетоксичность (в отличие от суперантигенов).
Тест-система, содержащая CAR качестве активаторов CD3, хоть и требует больше генно-инженерных работ по сравнению с тест-системой, содержащей биспецифические aCD3/aTAA антитела качестве активаторов CD3, позволяет оценивать ингибирующее влияние PD-1 на CAR-опосредованную активацию CAR-T клеток. Потенциально подход может быть использован для разработки препаратов на основе CAR.
Пример 6
Характеристика тест-системы
Для доказательства специфичности выбранной тест-системы ее использовали для тестирования aPD-1, aPD-L1, aCTLA4 и aHER2 (фиг. 7). В выбранной тест-системе подавление CD3-зависимой активации обеспечивается наличием PD-1 на эффекторных клетках и PD-L1 на клетках-мишенях. Реактивация NFAT-зависимой экспрессии гена, кодирующего FLuc, происходит при добавлении aPD-1 или aPD-L1, но не aCTLA4 или aHER2, используемых в качестве отрицательного контроля. Кривые зависимости интенсивности люминесценции образцов от концентрации антител могут быть описаны 4-х параметрическим логистическим уравнением, что позволяет сравнивать исследуемые препараты по значениям EC50.
Пример 7
Исследование стабильности образцов aPD-1 и aPD-L1
По 50 мкл исходных растворов aPD-1 и aPD-L1 (c концентрацией 25 мг/мл) инкубировали в микропробирках объемом 200 мкл в ПЦР-амплификаторе («Bio-Rad», США) в течение 1 ч при указанных температурах. Исследование проводили как описано в примере 3 «Функциональные тесты».
Для определения способности тест-системы различать препараты ингибиторов PD-1/PD-L1 с различной активностью мы использовали препараты aPD-1 и aPD-L1, которые были подвергнуты термическому стрессу (фиг. 8, фиг. 9). Наблюдается прямая зависимость между значениями EC50 и температуры, при которой были проинкубированы препараты. Таким образом система способна различать препараты aPD-1 и aPD-L1 с различным уровнем активности и может быть успешно использована для определения их стабильности.
Пример 8
Исследование линейного диапазона тест-системы.
Для сравнения ожидаемой и экспериментально определенной активности aPD-1 и aPD-L1 готовили разведения данных препаратов в концентрациях 200%, 140%, 70% и 50% относительно концентрации стандартного образца, максимальная конечная концентрация которого в тесте составляла 100 мкг/мл, его активность принимали за 100%. Исследование проводили, как описано в разделе «Функциональные тесты». Экспериментально определенную активность рассчитывали, как отношение экспериментально определенной EC50 стандарта к экспериментально определенной EC50 для данной концентрации, умноженное на 100%.
Тест-система может быть использована, если активность исследуемого образца совпадает с диапазоном, в котором система сохраняет линейную зависимость активности препарата от его концентрации. Для определения линейности тест-системы в диапазоне 50–200% были использованы препараты aPD-1 и aPD-L1 с ожидаемой активностью 50%, 70%, 100%, 140% и 200% относительно стандарта, активность которого принимали за 100% (фиг. 10, фиг. 11). Показано, что их активность в эксперименте схожа с ожидаемой. Система является линейной в диапазоне 50–200% относительно активности стандарта для aPD-1 и aPD-L1.
Таким образом, разработанная тест-система, содержащая биспецифические aCD3/aTAA антитела в качестве активаторов CD3 (фиг. 12), характеризуется максимальной относительной активацией при добавлении aPD-1 среди всех проверенных вариантов (фиг. 2, фиг. 5, фиг. 6). Кроме того, к преимуществам ее использования можно отнести низкий фоновый сигнал (в отличие от aCD3), исключение дополнительных генно-инженерных работ (в отличие от CAR и tmaCD3), нетоксичность (в отличие от суперантигенов).