Метод иммуно-ПЦР: перспективы использования

ИММУНОЛОГИЯ № 1, 2014

ЛИТЕРАТУРА

1. Marodi L. Neonatal innate immunity to infectious agents. Infect. Immunol. 2006; 74 (4): 1999-2006.

2. MarchantA., GoldmanM. T cell-mediated immune responses in human newborns: ready to learn? clin. Exp. Immunol. 2005; 141 (1): 10-8.

3. LadE., YinX., RobeyE. Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection. Nature Immunol. 2006; 7 (4): 338-43.

4. Harris J., Hazenberg M., Poulin J., Higuero-Alhina D., Schmidt D., GotwayM. et al. Multiparameter evaluation of human thymic function: interpretation and caveats. Clin. Immunol. 2005; 115 (2): 138-46.

5. HarrisD., SchumacherM., Locascio J., Besencon F., Olson G., DeLuca D. et al. Phenotypic and functional immaturity of human umbilical cord blood T lymphocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996; 89 (21): 10006-10.

6. Lau J., Magee F., Qiu Z., Hoube J., Von Dadelszen P., Lee S.Chorioamnionitis with a fetal inflammatory response is associated with higher neonatal mortality, morbidity, and resource use than chorioamnionitis displaying a maternal inflammatory response only. Am. J. Obstetr. Gynecol. 2005;193 (3): 708-13.

7. LynchH., Goldberg G., ChidgeyA., Van den BrinkM., BoydR., Sem-powski G. Thymic involution and immune reconstitution. Trends Immunol. 2009; 30 (7): 366-73.

8. Jeppesen D., Hasselbalch H., Lisse I., Ersb0ll A., Engelmann M. T-lymphocyte subsets, thymic size and breastfeeding in infancy. Pe-diatr. Allergy Immunol. 2004; 15 (2): 127-32.

9. Toti P., De Felice C., Stumpo M., SchurfeldK., Di Leo L., Vatti R. et al. Acute thymic involution in fetuses and neonates with chorioamni-onitis. Hum. Pathol. 2000; 31 (9): 1121-8.

10. Glavina-DurdovM., Springer O., Capkun V., Saratlija-Novakovic Z., Rozic D., Barle M. The grade of acute thymus involution in neonates correlates with the duration of acute illness and with the percentage of lymphocytes in peripheral blood smear. Pathological study. Biol. Neonate. 2003; 83 (4): 229-34.

11. de Felice C., Toti P., Musard M., Peruzzi L., Paffetti P., Pasqui L.

et al. Early activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal-axis in very-low-birth-weight infants with small thymus at birth. J. Matern. Fetal Neonatal Med. 2008; 21 (4): 251-4.

12. Jobe A. Mechanisms to explain surfactant response. Biol. Neonate. 2006; 89: 298-302.

13. Varga I., Uhrinova A., Toth F., Mistinova J. Assessment of the thymic morphometry using ultrasound in full-term newborns. Surg. Radiol. Anat. 2011; 33 (8): 689-95.

14. Ngom P., Solon J., Moore S., Morgan G., Prentice A., Aspinall R. Thymic function and T cell parameters in a natural human experimental model of seasonal infectious diseases and nutritional burden. J. Biomed. Science. 2011; 18: 41-4.

15. Rosen D., Lee J., CuttittaF., Rafiqi F., Degan S., Sunday M. Accelerated thymic maturation and autoreactive T cells in bronchopulmonary dysplasia. Am. J. Respir. crit. care Med. 2006; 174: 75-83.

16. Parel Y., Chizzolini C. CD4+ CD8+ double positive (DP) T cells in health and disease. Autoimmun. Rev. 2004; 3 (3): 215-20.

17. Sakaguchi S. Naturally arising Foxp3-expressing cD25+ cD4+ regulatory T cells in immunological tolerance to self and non-self. Nature Immunol. 2005; 6 (4): 345-52.

18. D’Alessio F., Tsushima K., Aggarwal N., West E., Willett M. CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury. J. clin. Invest. 2009; 119: 2898-913.

19. Bilate A, Lafaille J. Induced cD4+Foxp3+ Regulatory T cells in immune tolerance. Annu. Rev. Immunol. 2012; 30: 733-58.

20. Sakaguchi S., MiyaraM., Costantino C., Hafler D. FOXP3+ regulatory T cells in the human immune system. Nature Rev. Immunol. 2010; 10: 490-500.

21. Geenen V. Thymus-dependent T cell tolerance of neuroendocrine functions: principles, reflections, and implications for tolerogenic/negative self-vaccination. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2006; 1088: 284-96.

22. GarciaM. The importance ofthe nurse cells and regulatory cells in the control of T lymphocyte responses. BioMed Research International. 2013, Article ID 352414, 15 pages, 2013. doi:10.1155/2013/352414.

Поступила 21.03.13

МЕТОДЫ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 616.9-022-078.33

А.В. Маерле1, И.В. Сергеев1, Л.П. Алексеев1

метод иммуно-пцр: перспективы использования

1ФГБУ ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России, 115478, г. Москва

Использование методов иммуноферментного анализа (ИФА) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) в лабораторной диагностике сложно переоценить. Специфичность ИФА и высокая чувствительность ПЦР были совмещены в методе иммуно-ПЦР Использование фрагмента ДНК в качестве метки для детекции взаимодействия антигенантитело позволило увеличить чувствительность детекции в 10-10 000 по сравнению с таковой при методе ИФА. Иммуно-ПЦР является высокочувствительным методом определения очень малых количеств антигена и антител.

Ключевые слова: иммуно-ПЦР, иммуноферментный анализ, перспективы использования.

A.V Maerle1,1.V Sergeev1, L.P. Alekseev1

IMMUNO-PCR METHOD: PROSPECT OF APPLICATION

Federal state institution State research center Institute of immunology, 115478, Moscow

Application of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) and polymerase chain reaction (PCR) could hardly be overestimated. Specificity of ELISA and sensitivity of PCR were combined in method, termed immuno-PCR. Using DNA fragment as a reporter for antigen-antibody reaction permits to increase the sensitivity of detection 10-10000-fold compared to analogous ELISA. Immuno-PCR is a high-sensitive method for detection of very small amounts of antigens and antibodies.

Key words: Immuno-PCR method, immunosorbent assays, prospect of application

Маерле Артем Владимирович

- 44 -

МЕТОДЫ

Иммуноферментный анализ (ИФА) и полимеразная цепная реакция (ПЦР) являются одними из самых распространенных лабораторных диагностических методов. ИФА - универсальный метод определения широкого спектра антигенов, точнее любых объектов, способных вызвать иммунную реакцию с образованием специфических антител [1]. Метод ИФА был предложен в начале 1970-х годов тремя независимыми группами исследователей: Engvall и Perlmann в Швеции, van Weemen и Schuur в Нидерландах и Rubenstein и соавт. в США. Антиген или антитело, вступающее в иммунную реакцию, метится ферментом. По превращению субстрата ферментом можно судить о количестве вступившего во взаимодействие компонента реакции антиген-антитело. Чувствительность ИФА позволяет определять малые количества антигена (нанограммы) в пробе [2]. Высокая специфичность взаимодействия антиген-антитело, удобство детекции результатов этого взаимодействия способствовали повсеместному распространению ИФА, превращению в рутинный, высокоспецифичный метод детекции широкого спектра антигенов и антител.

Кроме ИФА, использующего в качестве метки фермент, были разработаны радиоиммунный, флюоресцентноиммунный анализ и иммуно-ПЦР, в которых в качестве метки использовали радиоактивные изотопы, флюоресцентные красители и молекулы ДНК соответственно.

Иммуно-ПЦР представляет собой метод, который сочетает преимущества ИФА и ПЦР. ПЦР - метод, позволяющий добиться значительного повышения малых концентраций определенных фрагментов ДНК и РНК в биологическом материале. На сегодняшний день ПЦР является одним из самых популярных методов диагностики инфекционных возбудителей. Это объясняется очень высокой чувствительностью метода, который в идеальных условиях способен обнаружить одну молекулу ДНК в образце [3]. В методе иммуно-ПЦР использование амплификации ДНК-метки для усиления сигнала позволило превзойти чувствительность ИФА на 2-5 порядков при сохранении широкого спектра применимости метода [4]. Базируясь на принципах ИФА и ПЦР, данный метод не требует специфического оборудования, кроме оборудования, необходимого для проведения иммунохимической реакции и детекции наработки продукта ПЦР. Иммуно-ПЦР является инструментом для обнаружения очень малого количества антигена, недоступного для анализа ИФА, в том числе на ранних стадиях инфицирования или в случае невозможности применения методов концентрирования или культуральных методов [5].

В 1992 г. T. Sano и соавт. [6] предложили метод, позволяющий повысить чувствительность твердофазного ИФА. Главная идея метода заключалась в использовании фрагмен-

та одноцепочечной ДНК и ПЦР для детекции взаимодействия антиген-антитело. Для связывания сигнальной молекулы ДНК и детектирующего антитела была предложена химерная молекула стрептавидина и белка А, которая была сконструирована годом ранее [7]. Белок А - белок, выделенный с поверхности клеточной стенки золотистого стафилококка, который с высокой аффинностью связывает IgG1, IgG2 и IgG4 человека, а также IgG2a, IgG2b и IgG3 мыши; с умеренной аффинностью - IgM, IgA и IgE человека, а также IgG3 и IgG1 мыши [8]. Стрептавидин же в свою очередь обладает высокой аффинностью к биотину (константа диссоциации комплекса стрептавидин-биотин порядка 10-14 моль/л). Введение биотина во фрагмент одноцепочечной ДНК производили ферментативными методами.

Для апробации метода выбрали бычий сывороточный альбумин в качестве исследуемого антигена. Иммуно-ПЦР проводили в соответствии с протоколом твердофазного ИФА. Вместо детектирующего антитела с ферментом использовали биотинилированную линейную плазмиду (pUC19), связанную с химерной молекулой стрептавидина и белка А (рис. 1). Продукты ПЦР анализировали с помощью гель-электрофореза. Результаты проведенных испытаний показали высокую чувствительность детекции модельного антигена - до 580 молекул антигена в пробе. Таким образом, чувствительность иммуно-ПЦР в данном эксперименте была в 105 раз больше в сравнении с твердофазным ИФА [6].

Благодаря своей высокой чувствительности метод иммуно-ПЦР продолжил развитие особенно в области обнаружения белковых молекул, содержание которых в образцах мало и лежит вне пределов обнаружения методом ИФА.

Одним из самых важных направлений дальнейшего развития метода, предложенного T. Sano и соавт., был поиск стратегий в области связывания антител и сигнальных молекул ДНК.

В 1993 г. V Ruzicka и соавт. предложили заменить химерную молекулу стрептавидина и белка А на коммерчески доступный авидин [9]. На основе данной методики была предложена процедура количественного определения углеводных опухольспецифичных антигенов в крови. На примере ганглио-зида GM3, экспрессируемого на поверхности ряда раковых клеток, была показана возможность детекции крайне малых количеств раковых клеток (до 10 клеток в пробе) в периферической крови донора [10].

Модифицированный формат иммуно-ПЦР был предложен

H. Zhou и соавт. [11] и назван универсальным иммуно-ПЦР. Этот метод основан на последовательном присоединении к

Рис. 1. Схематическое изображение метода иммуно-ПЦР, предложенного T. Sano.

Аг - антиген; Ат - антитело против антигена; 1 - химерная молекула стрептавидина и белка А; 2 - биотинилированная линейная плазмида.

Рис. 2. Схематическое изображение универсального метода иммуно-ПЦР, предложенного H. Zhou и соавт.

Аг - антиген; Ат - антитело, меченное биотином; 1 - стрептавидин; 2 -биотинилированная ДНК-метка.

- 45 -

ИММУНОЛОГИЯ № 1, 2014

биотинилированному комплексу антиген-антитело стрепта-видина и биотинилированной ДНК-метки (рис. 2). В данной концепции устранялся ряд недостатков предложенных ранее методов: использование универсального иммуно-ПЦР стало возможно как в прямом, так и сэндвич-формате, снижено неспецифическое связывание, обусловленное использованием авидина, а также сокращено время проведения анализа.

Преимущества универсального метода иммуно-ПЦР позволили ему найти свое место в исследованиях. В настоящее время выпускается коммерческий набор реагентов, дающий исследователям возможность увеличить чувствительность уже разработанной системы на базе специфических антител с помощью универсального метода иммуно-ПЦР. В данном наборе используют антитела к биотину, связанные с сигнальной молекулой ДНК [12].

Универсальный метод иммуно-ПЦР был применен в ряде исследований для детекции вирусных антигенов, бактериальных антигенов, специфических антител, прионов, онкомаркеров и бактериальных токсинов. Далее приведены сведения о некоторых разработках в области иммуно-ПЦР.

В число маркеров инфицирования вирусом гепатита В входят поверхностный антиген гепатита В (HbsAg), сердцевинный антиген гепатита В (HBcAg), е-антиген гепатита В (HBeAg), антитела к данным антигенам и вирусная ДНК. Метод иммуно-ПЦР на данный момент был адаптирован для определения двух антигенов гепатита В: HbsAg и HBcAg.

В одной из первых работ на базе универсального метода иммуно-ПЦР достигнута впечатляющая чувствительность определения поверхностного антигена гепатита В (HbsAg) в человеческой сыворотке. Разработанный метод был выполнен в сэндвич-формате, использовал в качестве ДНК-метки биотнилированный фрагмент гена вируса катаральной лихорадки овец (1442 пар оснований) и позволил определять до 0,5 пг антигена в сывороточной пробе [13].

R. Monjezi и соавт. предложили определение сердцевинного антигена гепатита В (HBcAg) методом иммуно-ПЦР с использованием технологии фагового дисплея [14]. Как показано в работе R. Bredehorst и соавт. [15], концентрация сердцевинного антигена гепатита В в сыворотке прямо пропорциональна уровню вирусной ДНК и может быть использована в качестве маркера вирусной нагрузки. В своей работе R. Monjezi и соавт. использовали рекомбинантный бактериофаг М13, взаимодействующий с HBcAg, детектируемой меткой являлась ДНК самого бактериофага. Полученная система позволяет достоверно определять до 10 нг поверхностного антигена гепатита В в образцах сыворотки.

J. Barletta и соавт. создали, а в дальнейшем и модернизировали систему для определения антигена P24 вируса иммунодефицита человека-1 как маркера вирусной нагрузки. Максимальная чувствительность определения вирусной РНК в плазме пациента методом ПЦР составляет 50 копий вирусной РНК на 1 мл. Использование универсальной иммуно-ПЦР позволило определять до 3 • 104 антигенов P24 на 1 мл образца, что соответствует 20 вирионам на 1 мл [16]. В дальнейших исследованиях для детекции ДНК использовали ПЦР в реальном времени, что увеличило чувствительность до 103 антигенов P24 на 1 мл образца (одной вирусной частицы на 1 мл) [17].

Грамотрицательная бактерия Burkholderia pseudomallei патогенна для человека и вызывает мелиоидоз. Золотым стандартом диагностики заражения данной бактерией являются культуральные методы, которые требуют 3-4 дня для инкубации. Такая задержка в лечении мелиоидоза может быть фатальна для пациента [18]. Самым распространенным методом серологического определения мелиоидоза является реакция гемагглютинации, однако данный метод недостаточно чувствителен. Показано, что у около половины пациентов, у которых в дальнейшем культуральные методы дали положительный результат, был отрицательный результат в реакции гемагглютинации [19]. A. Cooper и соавт. предложили систему на основе иммуно-PCR для определения антител к антигенам ранней фазы заражения Burkholderia pseudomallei [20]. Для

апробации данной системы были отобраны 11 образцов сыворотки пациентов с подтвержденным мелиоидозом, из которых 5 дали отрицательный результат в реакции гемагглютинации, и 6 образцов сыворотки здоровых людей. В результате проведения анализа все образцы сыворотки пациентов с подтвержденным мелиоидозом были признаны сероположительными. Разница в пороговых циклах (ct), определенных для сыворотки пациентов с мелиоидозом и для контрольной группы, была статистически достоверна (р < 0,05).

Другими бактериальными антигенами в качестве мишеней для разработки тест-систем иммуно-ПЦР были следующие:

- группоспецифический углевод клеточной стенки Streptococcus pyogenes (стрептококка группы А); предел обнаружения составил 10 бактериальных клеток в образце [21];

- белок A - белок, экспрессируемый на поверхности клеточной стенки золотистого стафилококка [22].

В 1994 г J. Ren и соавт. разработали систему обнаружения опухольассоциированного маркера MG7-Ag на основе иммуно-ПЦР [23]. В дальнейшем данная группа исследователей на основе разработанной системы провела определение уровня циркулирующего антигена MG7 в сыворотке пациентов с карциномой желудка, карциномой пищевода, карциномой толстой кишки, карциномой печени, карциномой яичника и карциномой легкого [24]. В качестве контрольной группы использовали сыворотки пациентов с нераковыми заболеваниями, в том числе с хроническим гастритом и хроническим колитом, а также сыворотки здоровых лиц. MG7-Ag был обнаружен в 82,8% образцов сыворотки пациентов с раком желудка (168 из 198), что коррелирует с результатами иммуногистохимического определения экспрессии MG7-Ag в тканях пациентов. На основе результатов количественного определения продукта амплификации ДНК-метки установлено, что уровень циркулирующего MG7-Ag значительно выше в сыворотках пациентов с метастазами. В дальнейшем эта система была испытана в качестве инструмента мониторинга рака желудка в популяции высокого риска [25]. Из 2710 участников мониторинга 148 (5,46%) были определены как MG7-Ag положительные. Чувствительность тест-системы иммуно-ПЦР составила 77,5% (31 из 40 подтвержденных биопсией случаев рака желудка). Специфичность составила 95,62% (2553 из 2670 случаев без рака желудка дали отрицательный результат).

Связывающий гепарин EGF-подобный фактор роста (HB-EGF) - белок, участвующий в опосредуемой макрофагами стимуляции пролиферации клеток, митоген в отношении фибробластов и гладкомышечных клеток. В ряде работ показана сильная корреляция экспрессии данного белка с клиническими проявлениями рака яичников [26, 27]. Noriyuki Kasai и соавт. разработали систему на основе иммуно-ПЦР для определения растворимого связывающего гепарин EGF-подобного фактора роста в человеческой сыворотке [28]. Использование моноклональных антител, нейтрализующих активность HB-EGF, в качестве связывающих антител позволило определять исключительно активную форму белка в человеческой сыворотке. Чувствительность данной системы определения активной формы HB-EGF составила 5 пг/мл. Результаты измерений уровня HB-EGF в двух группах (20 пациентов с раком яичников и 20 здоровых лиц) показали достоверное различие в уровне белка у здоровых лиц и пациентов с раком яичников. Средние значения составили 5,36 и 28,6 пг/мл соответственно. Полученные результаты позволяют Noriyuki Kasai и соавт. заключить, что растворимый связывающий гепарин EGF-подобный фактор роста может являться диагностическим биомаркером рака яичников [28].

Прочими объектами исследований стали:

- ботулотоксин А; нейротоксин белковой природы, вырабатываемый бактериями Clostridium botulinum; чувствительность детекции нейротоксина была увеличена в 105 раз по сравнению с таковой при твердофазном ИФА [29];

- фактор некроза опухоли а

- 46 -

МЕТОДЫ

[30]; также была показана возможность определять уровень ФНОа у больных язвенным колитом и болезнью Крона; полученная средняя концентрация ФНОа в сыворотке (36 больных доноров) - 7,8 нг/л - оказалась повышенной в 300 раз по сравнению с таковой у здоровых лиц и была на порядок ниже чувствительности твердофазного ИФА [31].

- IgM II фазы против Coxiella burneti [32]; заражение Coxiella burneti (полиморфная, грамотрицательная бактерия) приводит к Ку-лихорадке (коксиеллез); высокая чувствительность разработанной системы иммуно-ПЦР дает возможность более раннего детектирования возбудителя и, соответственно, корректировки лечения заболевания;

- метод иммуно-ПЦР также был адаптирован для обнаружения трансгенного белка CrylAb; данный белок, продуцируемый Bacillus thuringiensis, обладает инсектицидным свойством, способен уничтожать ряд чешуекрылых насекомых-вредителей в стадии личинки; благодаря этому свойству уже разработан ряд сельскохозяйственных культур, несущих CrylAb ген; в ходе данной работы достигнута чувствительность определения белка CrylAb - 100 пг/мл пробы [33].

Одним из направлений развития метода был переход от твердой фазы для иммобилизации антигенов и антител к жидкой фазе, содержащей наночастицы. Такой подход позволил предотвратить неспецифическое связывание, которое происходит при использовании классической твердой фазы (микропланшет) [34]. В 2002 г был предложен новый метод, названный bio-barcode amplification assay, в котором наночастицы используют в качестве носителя для ДНК и антител [35, 36]. Как было показано J. Barletta и соавт., использование наночастиц помимо увеличения пределов обнаружения позволяет сократить количество отмывок и инкубационных шагов [17]. Кроме того, большая площадь поверхности наночастиц ускоряет взаимодействие антител, фиксированных на наночастице, с целевым антигеном. Данный метод дает возможность проводить детекцию антигенов в различных видах образцов (включая фекалии, гомогенизированные ткани и пр.) без предварительной очистки и с высокой чувствительностью [37].

В 2011 г. J. Perez и соавт. описали метод для выявления респираторного синцитиального вируса, в котором помимо магнитных частиц использовали наночастицы золота. Комплекс антиген-магнитная частица был обнаружен комплексом антитело-ДНК, фиксированным на золотых наночастицах размером 15 нм. Высвобождение гибридизованных молекул ДНК проведено посредством нагрева. Количество гибридизованного ДНК определено количественным методом ПЦР. Использование этого метода позволило увеличить пределы обнаружения вируса в 4000 раз по сравнению с ИФА и в 4 раза по сравнению с ПЦР в реальном времени [38].

К сожалению, метод иммуно-ПЦР не нашел широкого применения в работах отечественных исследователей, что вызывает удивление. Ведь метод не требует специфического оборудования, многие лаборатории оснащены современными 96-луночными детектирующими амплификаторами, в том числе отечественного производства.

Резюмируя вышесказанное, можно говорить о том, что иммуно-ПЦР является высокочувствительным методом обнаружения вирусных и бактериальных антигенов, специфических антител, цитокинов, прионов и бактериальных токсинов. Основой данного метода является специфичность взаимодействия антител и объектов исследования. С целью достижения высокой чувствительности метода используют ПЦР для амплификации сигнальной молекулы ДНК. Применение новых технологий, в том числе магнитных и золотых наночастиц, метода фагового дисплея делает метод иммуно-ПЦР перспективным в лабораторной диагностике. Благодаря новым технологиям возможны автоматизация проведения анализа, упрощение процедуры пробоподготовки, сокращение времени проведения анализа.

ЛИТЕРАТУРА

2. Егоров А.М., Осипов А.П. и др. Теория и практика иммуноферментного анализа. М. 1991.

REFERENCES

1. Lequin R.M. Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Clin. Chem. 2005; 51: 2415-8.

2. Egorov A.M., Osipov A.P. et al. Theory and practice of immune-enzyme analysis / M.; 1991 (in Russian).

3. Lagally E.T., Medintz I., Mathies R.A. Single-molecule DNA amplification and analysis in an integrated microfluidic device. Analyt. Chem. 2001; 73 (3): 565-70.

4. Malou N., Raoult D. Immuno-PCR: a promising ultrasensitive diagnostic method to detect antigens and antibodies. Trends Microbiol. 2011; 19: 295-302.

5. Houpikian P., Raoult D. Diagnostic methods current best practices and guidelines for identification of difficult-to-culture pathogens in infective endocarditis. Infect. Dis. Clin. N. Am. 2002; 16: 377-92.

6. Sano T. et al. Immuno-PCR: very sensitive antigen detection by means of specific antibody-DNA conjugates. Science. 1992; 258: 120-2.

7. Sano T., Cantor C.A. Streptavidin-Protein a Chimera that allows one-step production of a variety of Specific Antibody Conjugates. Nature Biotechnol. 1991; 9: 1378-81.

8. Vidal M.A., Bernabeu C., Conde F.P. Binding of human immunoglobulin M to Staphylococcus aureus bearing protein A. Immunol. Lett. 1982; 4 (6): 311-5.

9. Ruzicka V. et al. Immuno-PCR with a commercially available avidin system. Science. 1993; 260: 698-9.

10. Zhang Z. et al. Cellular immuno-PCR. Detection of a carbohydrate tumor marker. Am. J. Pathol. 1998; 152: 1427-32.

11. Zhou H. et al. Universal immuno-PCR for ultra-sensitive target protein detection. Nucleic Acids Res. 1993; 21: 6038- 9.

12. AdlerM. et al. Detection of rotavirus from stool samples using a standardized immuno-PCR (Imperacer) method with end-point and real-time detection. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005; 333: 1289-94.

13. MaiaM. et al. Development of a two-site immuno-PCR assay for hepatitis B surface antigen. J. Virol. Meth. 1995; 52: 273-86.

14. Razieh Monjezi et al. Detection of hepatitis B virus core antigen by phage display mediated TaqMan real-time immuno-PCR. J. Virol. Meth. 2013; 187: 121-6.

15. BredehorstR., von Wulffen H., Granato C. Quantitation of hepatitis B virus (HBV) core antigen in serum in the presence of antibodies to HBV core antigen, comparison with assays of serum HBV DNA, DNA polymerase, and HBV e antigen. J. Clin. Microbiol. 1985; 21: 593-8.

16. Barletta J.M. et al. Lowering the detection limits of HIV-1 viral load using real-time immuno-PCR for HIV-1 p24 antigen. Am. J. Clin. Pathol. 2004; 122: 20-7.

17. Barletta J., Bartolome A., Constantine N.T. Immunomagnetic quantitative immuno-PCR for detection of less than one HIV-1 virion. J. Virol. Meth. 2009; 157; 122-32.

18. LimmathurotsakulD., PeacockS. J. Melioidosis: a clinical overview. Br. Med. Bull. 2011; 99: 125-39.

19. HarrisP.N.A., WilliamsN.L., Morris J.L., KetheesanN., NortonR.E. Evidence of Burkholderia pseudomallei-specific immunity in patient sera persistently nonreactive by the indirect hemagglutination assay. Clin. Vaccine Immunol. 2011; 18: 1288-91.

20. Cooper A. et al. ELISA and immuno-polymerase chain reaction assays for the sensitive detection of melioidosis. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2013; 75: 135-8.

21. Liang H. et al. A highly sensitive immuno-PCR assay for detecting Group A Streptococcus. J. Immunol. Meth. 2003; 279: 101-10.

22. Su-Hua Huang, Tsung-Chain Chang. Detection of Staphylococcus aureus by a sensitive immuno-PCR assay. Clin. Chem. 2004; 50 (9): 1673-4.

23. Ren J., Fan D.M., Zhou S.J., Zhang X.Y., Yang A.G., Li M.F. et al. Establishment of immuno-PCR technique for the detection of tumor associated antigen MG7-Ag on the gastric cancer cell line. Chung Hua Chung Liu Tsa Chih. 1994; 16: 147-50.

24. Ren J., Chen Z., Juan S.J., Yong X.Y., Pan B.R., Fan D.M. Detection of circulating gastric carcinoma-associated antigen MG7-Ag in human sera using an established single determinant immuno-poly-merase chain reaction technique. Cancer. 2000; 88: 280-5.

25. Zhang L., Ren J., Pan K. et al. Detection of gastric carcinoma-asso-

- 47 -

ИММУНОЛОГИЯ № 1, 2014

ciated MG7-Ag by serum immuno-PCR assay in a high-risk Chinese population, with implication for screening. Int. J. Cancer, 2009; 126: 469-73.

26. Miyamoto S, HirataM, Yamazaki A. et al. Heparin-binding EGF-like growth factor is a promising target for ovarian cancer therapy. Cancer Res. 2004; 64; 5720-7.

27. Tanaka Y., Miyamoto S., Suzuki S.O. et al. Clinical significance of heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor and a disintegrin and metalloprotease 17 expression in human ovarian cancer. Clin. Cancer Res. 2005; 11: 4783-92.

28. Noriyuki Kasai et al. Soluble heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF) detected by newly developed immuno-PCR method is a clear-cut serological biomarker for ovarian cancer. Am. J. Transl. Res. 2012; 4 (4): 415-21.

29. Hai-Yuan Chao et al. A highly sensitive immuno-polymerase chain reaction assay for Clostridium botulinum neurotoxin type A. Toxi-con. 2004; 43: 27-34.

30. Kaori Saito et al. Detection of human serum tumor necrosis factor-a in healthy donors, using a highly sensitive immuno-PCR assay. Clin. Chem. 1999; 45 (5): 665-9.

31. Momoko Komatsu et al. Tumor necrosis factor-a in serum of patients

with inflammatory bowel disease as measured by a highly sensitive immuno-PCR. Clin. Chem. 2001; 47: 1297-301.

32. Malou N., Renvoise A., Nappez C., RaoultD. Immuno-PCR for the early serological diagnosis of acute infectious diseases: the Q fever paradigm. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2012; 31 (8): 1951-60.

33. Kumar R. A real-time immuno-PCR assay for the detection of transgenic Cry1Ab protein. Eur. Food Res. Technol. 2012; 234: 101-8.

34. AdlerM. et al. Sensitivity by combination: immuno-PCR and related technologies. Analyst. 2008; 133: 702-18

35. Nam J.M. et al. Bio-barcodes based on oligonucleotide-modified nanoparticles. J. Am. Chem. Soc. 2002; 124: 3820-1.

36. Nam J.M. et al. Nanoparticle-based bio-bar codes for the ultrasensitive detection of proteins. Science. 2003301, 1884-6.

37. Monteiro L., Gras N., Megraund F. Magnetic immuno-PCR assay with inhibitor removal for direct detection of Helicobacter pylori in human feces. J. Clin. Microbiol. 2001; 3778-80.

38. Perez J.W. et al. Detection of respiratory syncytial virus using nanoparticle amplified immuno-polymerase chain reaction. Analyt. Bio-chem. 2011; 410: 141-8.

Поступила 09.04.13

ОБЗОРЫ

© Г.О. ГУДИМА, Н.И. ИЛЬИНА, 2013 УДК 616-056.43

Г.О. Гудима, Н.И. Ильина

аллергия. фундаментальные проблемы и практические вопросы

ФГБУ Государственный научный центр Институт иммунологии ФМБА России, 115478, г. Москва

Представлен краткий обзор материалов международного конгресса EAACI-WAo-2013 (22-26 июня 2013 г., Милан, Италия), посвященного обсуждению генетических и молекулярных основ патогенеза иммунных и аллергических заболеваний, совершенствованию их диагностики и лечения. Проанализированы современные направления исследований в области клинической иммунологии и аллергологии, даны обновленные практические рекомендации.

Ключевые слова: патогенез, иммунопатология, аллергия, астма, атопический дерматит, лекарственная аллергия, пищевая аллергия, аллергенспецифическая иммунотерапия.

G.O. Gudima, N.I. Ilina

ALLERGY. BASIC PRoBLEMS AND PRACTICAL QUESTIoNS

fsbi national researh centre institute of immunology, federal medical-biological agency, Moscow, Russian federation

Brief review of World congress EAACI-WAo-2013 (June 22-26, 2013, Milan, Italy), where genetic and molecular basis of pathogenesis of immunopathology and allergy and also the improvement of its diagnostics and treatment were discussed. Directions of modern investigations in clinical immunology and allergology are analyzed, renewed practical recommendations are presented.

Key words: pathogenesis, immunopathology, allergy, asthma, atopic dermatitis, drug allergy, food allergy, allergen specific immunotherapy

Распространенность аллергических заболеваний очень высока и в зависимости от региона может составлять 35% и более. Аллергия представляет собой одну из важнейших проблем современного мирового и отечественного здравоохранения, и вопросам ее изучения, профилактики и лече-

Гудима Георгий Олегович, зав. лаб. физиологии иммунитета и аллергии ФГБУ ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России; 115478. Москва, Каширское шоссе, д. 24, корп. 2; e-mail: goudi-ma@mail.ru

ния посвящаются крупные международные и национальные научно-медицинские мероприятия.

22-26 июня 2013 г. в Милане состоялся объединенный конгресс Всемирной аллергологической организации и Европейской академии аллергологии и клинической иммунологии (WAO-EAACI Congress, 2013). В его работе приняли участие около 7700 делегатов более чем из 90 стран, в том числе делегация Российской ассоциации аллергологов и клинических иммунологов.

На церемонии открытия конгресса были вручены награды ведущим мировым исследователям в области клиниче-

- 48 -