Новая система организации скрининга на противоопухолевую активность

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ

19

ИНТЕРНАЛИЗАЦИЯ ЛИПОСОМ, НЕСУЩИХ УГЛЕВОДНЫЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ, КЛЕТКАМИ МЕЛАНОМЫ

Е.Л. Водовозова, A.B. Феофанов, А.И. Назарова, Р.В. Холоденко, Г.П. Гаенко, Н.В. Бовин, Юл.Г. Молотковский Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва

Ранее мы использовали явление суперэкспрессии мембранных лектинов на поверхности малигнизирован-ных клеток для адресной доставки цитотоксических ли-посом. Получены положительные результаты лечения (увеличение продолжительности жизни, торможение скорости роста опухоли) на моделях мышей с экспериментальным лейкозом Р-388, карциномой легкого Льюис, а также на модели мышей с высокой частотой спонтанного развития аденокарциномы молочной железы. В данной работе проведено сравнительное изучение процессов интернализации опухолевыми клетками in vitro липосом, несущих на поверхности специфические углеводные детерминанты (векторы), и контрольных ЛИПОСОМ с неактивным пентаолом аминоглюцитом. Механизм эн-доцитоза влияет на внутриклеточный транспорт и метаболизм лекарственных липосом, что определяет эффективность действия доставленного ими препарата. Мы включаем препараты в липидный биспой липосом в виде синтетических биодеградируемыхлипофильных предшественников, которые при взаимодействии с клеткой, очевидно, ведут себя аналогично другим липидным компонентам мембраны липосом.

Углеводную специфичность клеток мышиной меланомы М3 определяли визуальным скринингом связывания с флюоресцеинмечеными полиакриламидными гликоконъюгатами. В качестве векторов для липосом синтезированы липофильные гликоконъюгаты,

несущие трисахарид А и тетрасахарид сиалил-Ье-шэ X. Флюоресцентномеченные по липидному бислою липосомы диаметром 100-120 нм получали экструзией смеси из природных фосфолипидов, мембранного ро-даминильного зонда (0,5 мол %) и углеводных векторов или контрольного гликоконъюгата (2 мол %). По данным проточной цитофлуориметрии, векторные липосомы (эффективнее контрольных примерно на 20 %) связывались с клетками меланомы на первых минутах инкубации. С помощью конфокальной микроспектроф-люориметрии показано, что эндоцитоз векторных липосом также происходит быстрее (в 1,5 раза через 30 мин в среде с сывороткой). Влияние векторов на связывание и эндоцитоз липосом опухолевыми клетками показано в экспериментах с ингибированием эндоци-тоза метил-Ь-циклодекстрином. При нагружении липидного бислоя (10 мол %) диглицеридным производным метотрексата цитотоксическая активность векторных липосом существенно (до 10 раз) превышала таковую для контрольных. Таким образом, механизм интернализации опухолевыми клетками липосом, оснащенных углеводными векторами, обеспечивает высокую эффективность действия препарата, доставленного в виде липофильного предшественника в мембране липосом.

Работа выполнена при поддержке Международного научно-технического центра, проект N0. 1781.

НОВАЯ СИСТЕМА ОРГАНИЗАЦИИ СКРИНИНГА НА ПРОТИВООПУХОЛЕВУЮ АКТИВНОСТЬ

Г.К. Герасимова, Г.Н. Апрышко, А.Ю. Барышников ГУРОНЦим. H.H. Блохина РАМН, Москва

С 1980 г. в РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН существует трехступенчатая система отбора новых веществ с противоопухолевыми свойствами: 1) прескрининг in vitro на культурах опухолевых клеток человека разного гистогенеза; 2) скрининг in vivo на перевиваемых опухолях мышей или крыс; 3) углубленное изучение in vivo с использованием перевиваемых, индуцированных опухолей животных и гетеротрансплантатов опухолей человека на бестимусных мышах. Для соединений, специфическая активность которых требует специального изучения, создано 5 модификаций основной скрининговой системы:

1) система отбора веществ природного происхождения;

2) система отбора веществ для лечения гормоночувствительных опухолей;

3) система выявления антиметастатической активности препаратов;

4) система отбора препаратов для лечения опухолей головного мозга;

5) система отбора in vitro-in vivo соединений для фотодинамической терапии.

Эта методология позволила разработать и передать на клинические испытания 10 отечественных противоопухолевых препаратов в современных лекарственных формах. Успехи молекулярной биологии последнего времени существенно расширили понимание процессов злокачественной трансформации и под-

№2/томЗ/2004

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

20

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ

держания злокачественного фенотипа, причин лекарственной устойчивости, патогенеза процесса метаста-зирования. Это позволило выявить новые молекулярные мишени для препаратов, в том числе специфичные для опухолевой клетки. Расшифровка генома человека с последующим анализом данных методами биоинформатики, системной биологии приведет в ближайшем будущем к значительному увеличению количества потенциальных мишеней для действия препаратов. Это потребует нового подхода к поиску перспективных фармакологических агентов. Другая причина необходимости изменения в подходах к разработке препаратов - экономическая. Уже сейчас для разработки нового препарата требуется 10-15 лет и около 500 миллионов долларов США. При этом до 80 % этих средств могут быть потрачены на неудачные решения в процессе доклинического и клинического этапов разработки препарата.

В докладе будет представлена новая организация начальных этапов отбора соединений с противоопухолевой активностью, учитывающая современные

представления о рациональном подходе к созданию новых препаратов:

• оценка перспективности предлагаемых для изучения соединений in silico с использованием компьютерных баз данных по противоопухолевым соединениям; прогнозирование их фармакологических эффектов с помощью специальных компьютерных систем; составление программы скрининга;

• тестирование соединений in vitro-in vivo в специальных тест-системах с идентифицированными мишенями (оценка цитотостатических и токсических свойств, индукция апоптоза, индукция дифферен-цировки, антиангиогенные и другие эффекты);

• разработка препарата на основе отобранного перспективного соединения, ориентированного на определен-ныемолекулярныемишени(предклиническоеизучение противоопухолевыхитоксическихэффектов).

Все этапы исследований контролируются Советом Экспертов по разработке новых противоопухолевых лекарств, в состав которого входят ведущие специалисты РОНЦ РАМН.

СОВЕРШЕНСГВОВАНИЕПОДХОДОВКОТБОРУ СОЕДИНЕНИИ, ОБЛАДАЮПЩХАНтаМЕТАСГАТИЧЕСКОЙАКТИВНОСГЬЮ: ИНВАЗИВНЫЙТЕСГ

С. М. Киселев1, Н.В. Хонинова1, Л.Ф. Морозова1, A.B. Аклеев2, А.М. Козлов1, А.Ю. Барышников1 1 ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН, Москва 2ФГУ Уральский научно-практический центр радиационной медицины

Цель и задачи. Разработка модифицированной методики проведения инвазивного теста для оценки антиметастатической активности противоопухолевых препаратов и отбора потенциальных ингибиторов метастазирования с патогенетической направленностью действия.

Материалы и методы. В экспериментах использованы клетки меланомы человека, выделенные из образцов тканей больных при хирургической операции. Тест проводили в 24-луночных планшетах со вставочными ячейками, разделяющими лунку на две половины полупроницаемой полимерной РЕТ-мемб-раной (диаметр пор - 8 мкм). В качестве субстанции, формирующей барьер, использовали матригель (смесь соединительнотканных белков - ламинина, фибро-нектина, коллагена-IV типа и т.д.). Опухолевые клетки, прошедшие через мембрану, покрытую полиме-ризованным матригелем, фиксировали и окрашивали по Лейшману. Число опухолевых клеток, прошедших через барьер, подсчитывали под микроскопом.

Результаты и обсуждение. Моделирование процесса инвазии опухолевых клеток через исскусственно созданную базальную мембрану - одна из наиболее информативных in vitro тест-систем, которая позволяет провести интегральную оценку активности соедине-

ний в отношении совокупности биологических процессов, задействованных в процессе метастазирования. Модифицирована методика подготовки полимерных мембран с матригелем (смесью соединительнотканных белков, которая при полимеризации в соответствующих условиях образует структуру, сходную со структурой базальной мембраны), что позволяет получать равномерный слой геля, исключающий прямую миграцию клеток через поры. Оптимизированы условия подготовки клеток к тесту, включая плотность клеток (30 тыс. на 1 см2 поверхности мембраны), высаживаемых на мембрану для предотвращения кластеризации. Изучено влияние различных хемоаттрактан-тов (сыворотки, ростовых факторов и кондиционных сред) на временные характеристики проведения теста. На основе модифицированной методики отобрана линия клеток меланомы человека, обладающая наибольшей инвазивной активностью, которая будет использована в качестве модельной для проведения скрининга соединений на предмет выявления антиметастатической активности.

Выводы. Модифицирована методика проведения инвазивного теста, позволяющая на более рациональной основе подходить к отбору соединений, обладающих антиметастатической активностью.

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

№2/томЗ/2004