УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЙ СПОСОБ ДЕКОНТАМИНАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ПУТЕМ РАЗДЕЛЕНИЯ И ИНАКТИВАЦИИ
IMPROVED METHOD FOR DECONTAMINATING BIOLOGICAL MATERIAL BY SEPARATION AND INACTIVATION

Область техники
Настоящее изобретение относится к области деконтаминации (деконтаминации) биологических материалов. Предложен новый способ инактивации биологических материалов, в частности, от вирусных, бактериальных или прионных форм, основанный на принципах разделения и инактивации.
Уровень техники
Хорошо известно, что обеззараживание, в частности, от вирусов и бактерий или прионов, составляет основную проблему при дезинфекции биологических материалов. В частности, но не исключительно, указанная проблема наблюдается на конечных стадиях промышленных способов очистки целевых молекул из крови, мочи или культуральных сред. Фактически, чувствительность целевых молекул биологического происхождения к химической или физической обработке в общем случае делает невозможным применение жестких методик дезинфекции, из-за риска повреждения указанной целевой молекулы или снижения ее активности до очень низких уровней. В частности, хорошо известно, что заражение вирусами без оболочки (безоболочечными вирусами) и прионами представляет собой трудноразрешимую проблему. В случае заражения вирусами существует несколько методик деконтаминации: их обычно описывают как методики инактивации или разделения. Примерами методик инактивации вирусов являются тепловые способы обработки (например, пастеризация, лиофилизация, применение сухого тепла), применение растворителей в качестве детергентов и воздействие очень низкого или высокого рН. Примерами методик разделения вирусов являются способы осаждения (например, в этаноле, полиэтиленгликоле), виды хроматографии (ионообменная, аффинная, гидрофобного взаимодействия, обращенно-фазовая) и нанофильтрация.
10
10
Необходимо проводить соответствующие валидационные исследования, с целью подтверждения эффективности методики деконтаминации: указанные исследования требуют введения в материал известного количества инфекционного агента в начале процесса (так называемая «добавка») и детектирования присутствия остаточного количества такого агента в конце процесса; количество введенного инфекционного агента измеряют в десятичной логарифмической шкале (log), и выражают эффективность как логарифмический показатель снижения количества патогена. В идеале, для целей регулирования, методика очистки должна показывать эффективность деконтаминации от вирусов по меньшей мере 12-15 log. В основе такой эффективности должны лежать различные стадии очистки, основанные на различных принципах. Однако в некоторых способах очистки трудно добиться такого результата по причине ограниченной применимости вышеуказанных методик в промышленном масштабе, или по причине агрессивности их воздействия на целевой материал.
Гораздо труднее устранить заражение прионами, которые менее изучены и в последнее время вызывают обеспокоенность в связи с биобезопасностью.
Действительно, благодаря природе и малым размерам, для прионов не эффективны многие способы разделения, эффективные в отношении вирусов, и их инактивацию трудно обеспечить. Воздействие сильно щелочных растворов и индуцированная мочевиной денатурация входят в число известных методик, вызывающих существенную инактивацию прионов. Такие методики часто повреждают целевой материал и трудно применимы в промышленных масштабах.
В заявке на патент ЕР-А-1593688 описана методика, в которой применяют комбинацию разделения и инактивации биологического материала: в пробирках для ультрацентрифугирования разделяют следующие слои растворов с понижающейся плотностью: мочевины высокой плотности (инактивирующая нижняя фаза), сахарозы (промежуточная фаза или «прокладка») и раствора очищаемого биологического материала (верхняя фаза); пробирку центрифугируют, дисперсный загрязняющий материал, находящийся в верхней фазе, мигрирует через промежуточную фазу и достигает нижней фазы, в которой инактивируется; верхнюю фазу, обеззараженную указанным путем, после центрифугирования собирают как надосадочную жидкость. Указанная методика обеспечивает преимущество комбинации двух различных способов деконтаминации (разделения и инактивации); однако было доказано, что она трудно применима на практике и обладает ограниченной эффективностью, особенно на промышленном уровне: действительно, система жидкостей, состоящая из трех слоев смешивающихся водных растворов, разделенных только благодаря различным плотностям, весьма нестабильна, ее трудно создать/сохранить, указанная система восприимчива к нарушениям слоев после незначительных манипуляций с пробиркой; при переходе к промышленному масштабу это приводит к отбраковыванию многих пробирок с неудовлетворительным расслоением; в качестве альтернативы, заполнение необходимо осуществлять очень медленно, и также ускорение и торможение в ходе центрифугирования следует осуществлять очень осторожно, чтобы избежать нарушения расслоения.
В свою очередь, полное устранение промежуточного слоя могло бы обеспечить получение более простой двухслойной системы, в которой два раствора были бы лучше разделимы благодаря разнице плотностей, что в целом улучшило бы стабильность системы; однако в этом случае наблюдался бы прямой контакт между биологическим материалом и денатурирующим раствором, что, возможно, привело бы к тому, что увеличение выхода, обусловленное большей стабильностью двухслойной системы, было бы утрачено по причине нежелательного снижения активности биологического материала.
Наконец, трудно найти для промежуточной фазы альтернативу сахарозе, например, способную образовывать промежуточную фазу, более отделенную от двух соседних фаз: фактически, более высокая отделенность между двумя фазами влечет за собой риск снижения возможности миграции бактериального/вирусного/прионного материала сквозь различные фазы, таким образом, ограничивая его попадание в нижний инактивирующий раствор; кроме того, поиск других веществ, помимо сахарозы, (например, синтетических веществ, растворителей, и т.д.) также ограничен с точки зрения их возможного отрицательного воздействия на стабильность/активность биологического материала.
В свете существующих на настоящий момент решений и их ограничений, существует значительная потребность в новых способах деконтаминации биологического материала, которые легче и быстрее осуществимы, особенно в промышленном масштабе, и обеспечивают возможность эффективного деконтаминации биологического материала, без потери его активности и с обеспечением возможности выделения с высоким выходом.
Краткое описание изобретения
Авторами настоящего изобретения предложен новый способ деконтаминации биологического материала, который эффективно удовлетворяет вышеуказанные потребности.
Данный способ по существу включает создание трехслойной жидкой системы (a-b-с), в которой слои различаются между собой по свойствам плотности и/или смешиваемости; верхний слой (а) содержит водный раствор биологического материала для деконтаминации; нижний слой (с) содержит раствор, инактивирующий указанные вирусы, прионы или бактерии; в основе настоящего изобретения, по существу, лежит идентификая нового промежуточного слоя (b), расположенного между указанными верхним и нижним слоями, который способен максимизировать стабильность трехслойной системы на всех стадиях способа деконтаминации (т.е. во время получения трехслойной системы, во время ее переноса в систему центрифугирования, во время центрифугирования и на стадии сбора белковых надосадочных жидкостей), без ограничения каким-либо образом миграции загрязняющего агента (контаминанта) в нижний слой, и без нарушения стабильности биологического материального объекта способа. В способе согласно настоящему изобретению три вышеуказанных слоя имеют различные плотности, таким образом, что (а)<(b)<(с); промежуточный слой состоит из органического растворителя (или смеси растворителей), не смешивающегося по меньшей мере с верхним слоем.
Настоящее изобретение охватывает применение некоторых предпочтительных органических растворителей, преимущественно применяемых в определенных объемных отношениях. Также согласно настоящему изобретению предложено определенное указание на разность плотностей между слоями, в частности между слоями (а) и (b), подходящую для поддержания стабильности системы и одновременного сохранения эффективности деконтаминации и биологической активности материального объекта деконтаминации.
Подробное описание изобретения
Согласно настоящему изобретению, термин «разделение» относится к отделению дисперсного элемента (загрязняющего агента) от содержащей его жидкой фазы (раствора биологического материала). Термин «инактивация» относится к снижению или устранению активности указанных контаминантов (загрязняющих агентов).
Согласно настоящему изобретению, термин «несмешивающийся», относящийся к несмешиваемости двух слоев жидкостей, применяют в широком смысле для определения слоев жидкостей, которые по причине различия в гидрофильных/липофильных свойствах, плотности и/или поверхностном натяжении всегда сохраняют четкое разделение фаз (при комнатных температуре и давлении и в условиях покоя): при возможном механическом воздействии (встряхивание, перемешивание, центрифугирование и т.д.) такие слои не образуют устойчивую гомогенную смесь друг с другом, а полностью возвращаются к исходному разделению и расслоению на две фазы по прошествии соответствующего времени в покое.
Термин «частично смешивающиеся», относящийся к смешиваемости двух или более слоев жидкостей, в настоящем описании предназначен описывать слои, которые по причине близких гидрофильных/липофильных свойств, плотности и/или поверхностного натяжения не демонстрируют четкого разделения фаз (при комнатных температуре и давлении и в условиях покоя): при возможном механическом воздействии (встряхивание, перемешивание, центрифугирование и т.д.) такие слои частично образуют устойчивую гомогенную смесь друг с другом, так что даже по прошествии соответствующего времени в покое не происходит возвращения к исходному разделению и расслоению, по меньшей мере полного, а именно, две фазы остаются частично смешанными и/или взаимопроникающими.
Биологический материал, который можно применять в способе согласно настоящему изобретению, не имеет никаких ограничений с точки зрения его химической структуры и/или биологической активности. Единственным ограничением является то, что он должен быть растворим (или сделан растворимым при помощи соответствующих разбавителей) в воде или водном растворе: это существенно важно, поскольку способ разделения согласно настоящему изобретению основан на возможности отделения дисперсных контаминантов (вирусов, прионов или бактерий), осаждаемых путем центрифугирования, от биологического материала, растворенного в растворе, причем последний извлекается в виде надосадочной жидкости. Особый интерес вызывают биологические материалы, относящиеся к одному или более из следующих классов: аминокислоты, белки, ферменты, гормоны, цитокины, кофакторы, витамины, химические медиаторы и т.д. Предпочтительными примерами таких материалов являются ФСГ, ЛГ, ХГЧ, тестостерон, прогестерон, эстрадиол, гормон щитовидной железы Т3 и/или Т4, инсулин, глюкагон, гастрин, соматостатин, соматотропин, гормон роста, пролактин, ренин, ангиотензиноген, ангиотензин, гонадотропин, кортизол, адренокортикотропный гормон (АКТГ), модифицированные аминокислоты, L-ДОФА, дофамин, эпинефрин, норэпинефрин, серотонин, гистамин, ГАМК, их производные и т.д. Особенно предпочтительными биологическими материалами являются фолликулостимулирующий гормон (СГ), лютеинизирующий гормон (ЛГ), хорионический гонадотропин человека (ХГЧ), гормоны щитовидной железы, т.е. трииодтиронин (Т3) и/или тироксин (Т4), прогестерон, тестостерон и их производные. Биологический материал может также представлять собой физиологическую жидкость, содержащую целевые молекулы, растворенные или растворимые в ней, которые необходимо отделить от дисперсного материала; примерами физиологической жидкости являются кровь, плазма, моча, амниотическая жидкость, спинномозговая жидкость и т.д.
Контаминанты, которые в способе согласно настоящему изобретению можно отделить от биологических материалов, представляют собой дисперсные контаминанты, в частности, вирусы, прионы или бактерии. Термин «контаминант», однако, включает любой другой дисперсный материал, который может быть ассоциирован с биологическим материалом, даже нетоксичный для человека или животных (например, материалы в суспензии, порошки и т.д.); такие дисперсные материалы в любом случае являются нежелательными, если они содержатся в готовом биологическом продукте, поскольку они снижают его титр.
Верхний слой (а), применяемый в настоящем изобретении, содержит водный раствор выбранного биологического материала. В зависимости от степени растворимости в воде указанного материала, раствор, составляющий слой (а) может, возможно, содержать солюбилизирующие разбавители; другие примеры возможных применяемых разбавителей включают буферные агенты и регулирующие тоничность агенты, применяемые для оптимизации условий консервирования раствора выбранного биологического материала; такие разбавители, исключительно произвольные, не оказывают существенного влияния на стабильность биологического материала при его контакте с промежуточным слоем (b); авторами настоящего изобретения было экспериментально проверено, что промежуточный слой согласно настоящему изобретению никоим образом не модифицирует активность биологического материала в соседнем слое (а). Ионные вещества, такие как, например, хлорид натрия или глицерин, можно применять в качестве регулирующих плотность агентов.
Слой (а) представляет собой слой с самой низкой плотностью, который отделяется на верхней поверхности многослойной системы; кроме этого условия, для этого слоя не требуется каких-либо абсолютных значений плотности; тем не менее, поскольку он представляет собой водный раствор, плотность часто будет близка или несколько выше плотности воды; ориентировочные эталонные значения плотности указанного слоя (а) составляют от 1,001 до 1,050; возможны более высокие значения, в зависимости от типа применяемого биологического материала (т.е. физиологической жидкости).
Промежуточный слой (b) содержит органический растворитель или более одного (взаимосмешивающихся) растворителя, смешанных между собой; такие растворители (или смеси растворителей) должны быть несмешивающимися с водным раствором слоя (а), а также обладать плотностью, промежуточной между плотностями слоев (а) и (с), чтобы обеспечить возможность соответствующего расслоения промежуточного слоя. Преимущественно, плотность слоя (b) по меньшей мере на 0,025 мг/мл выше, чем плотность слоя (а); авторами настоящего изобретения было экспериментально проверено, что такого различия в плотностях достаточно, чтобы гарантировать стабильное отделение слоя (а) от остальных слоев в трехслойной системе; напротив, определенного верхнего предела для разности плотностей слоев (а) и (b) не существует, с учетом того, что чем выше указанная разность плотностей, тем более стабильной является система на различных стадиях способа; подходящее верхнее эталонное значение для вышеуказанной разности плотностей составляет примерно 0,3 мг/мл. Следовательно, разность плотностей между слоями (а) и (b) предпочтительно варьирует от 0,030 до 0,3 мг/мл. Понятно, что максимальное значение плотности, выбранное для слоя (b), всегда должно быть ниже, чем значение плотности, выбранное для слоя (с). Кроме вышеуказанных условий, неограничительные эталонные диапазоны плотностей (абсолютные значения) для слоя (b) составляют от 1,07 до 1,20.
2-4
По сравнению с отдельными растворителями, применение смеси растворителей в слое (b) обеспечивает преимущество, заключающееся в более легком изменении характеристик плотности. Удобные результаты можно получить при смешивании органического растворителя с высокой плотностью с органическим растворителем с низкой плотностью в подходящих соотношениях для получения плотности, промежуточной между инактивирующим раствором и обеззараживаемым раствором. Предпочтительно, возможно применение в качестве составляющих для слоя (b) смеси галогенированного алифатического органического растворителя с ароматическим органическим растворителем, причем указанные растворители находятся в объемных соотношениях от 1:0,5 до 1:4, или предпочтительно от 1:0,8 до 1:3. Предпочтительными примерами галогенированных алифатических органических растворителей являются: метилхлорид, метиленхлорид, хлороформ, четыреххлористый углерод; предпочтительными примерами ароматических органических растворителей являются бензол, толуол, С алкилбензол (например, этилбензол, пропилбензол и их изомеры), ксилол и их производные. Особенно предпочтительными растворителями являются хлороформ и толуол; неограничительными примерами их смесей являются смеси в соотношениях 1:1, 1:1,5 и 1:2.
Авторы настоящего изобретения также проверили, может ли контакт между фазой (а) и органическими растворителями в фазе (b) привести к частичной денатурации биологического материала, с возможным нежелательным снижением его активности. Такие исследования показали полностью отрицательный результат, то есть показали, что хотя фаза (b) сильно отличается от фазы (а) (оптимизированной для консервирования биологического материала), она никоим образом не оказывает отрицательного влияния на активность указанного материала.
Нижний слой (с) содержит раствор с более высокой плотностью, чем слои (а) и (b); он содержит вещество, способное инактивировать вирусный, прионный или бактериальный материал, который после центрифугирования попадает в контакт с указанным слоем. Отсутствуют ограничения по выбору инактивирующего вещества; его можно удобно выбирать из веществ, известных для применения в способах деконтаминации путем инактивации; выгодно также применять указанное вещество для придания слою (с) выбранной плотности: примерами таких веществ являются сильно концентрированные растворы мочевины; или сильно концентрированные растворы гидроксида щелочного металла, например, NaOH. Предпочтительными примерами являются растворы мочевины с концентрацией по меньшей мере 6 М и рН по меньшей мере 8,0; или растворы гидроксида щелочного металла с концентрацией по меньшей мере 0,5 М; ограничения на максимальную концентрацию или рН таких растворов отсутствуют, с учетом того, что увеличение концентрации (или щелочности) усиливает инактивирующую мощность слоя (с); однако подходящие применимые растворы мочевины имеют концентрацию в диапазоне от 7 М до 9 М, при рН от 8,0 до 11,0, предпочтительно, равном 9,5; подходящие диапазоны для раствора NaOH находятся от 1 М до 2 М. Инактивирующие растворы, например, раствор мочевины, могут содержать подходящий буферный агент, например, Трис-Cl, для поддержания рН в заданном диапазоне; кроме того, они могут содержать подходящие агенты, воздействующие на дисульфидные мостики (например, дитиотреитол), для облегчения денатурации белковых компонентов загрязняющих агентов. Также можно применять регулирующие плотность агенты, например, NaCl, NaBr или глицерин (также как в фазах (а) и/или (b), при желании).
В отличие от поверхности раздела между слоями (а) и (b), поверхность раздела между слоями (b) и (с) не имеет критической важности, а именно, не требуется, чтобы плотности слоев (b) и (с) сильно различались; согласно настоящему изобретению, фактически достаточно осуществить минимальное разделение фаз, составляющих слои (b) и (с); такое слабое разделение не является недостатком, но даже дополнительным преимуществом: фактически, это способствует миграции, в ходе центрифугирования, вирусных, прионных или бактериальных частиц из промежуточного слоя (b) в слой (с), где протекает реакция инактивации. Возможное частичное смешивание фаз (b) и (с) после центрифугирования, даже постоянное, не представляет собой проблему для настоящего изобретения, поскольку эти фазы представляют собой отходы способа; напротив, обеззараженный биологический материал остается в слое (а): последний остается постоянно отделенным после центрифугирования и легко собирается в виде надосадочной верхней фазы; возможный нежелательный обратный поток загрязняющего материала в слой (а) также предотвращается благодаря разнице в смешиваемости/плотности между слоем (а) и стальными двумя слоями.
Кроме вышеуказанных условий, неограничительные примеры эталонных значений плотности (абсолютные значения) для слоя (с) составляют от 1,08 до 1,30.
Способ разделения/инактивации осуществляют с использованием следующих стадий:
(i) в пробирку для ультрацентрифугирования последовательно помещают слои (с), (b), (а);
(ii) центрифугируют пробирку, подготовленную на стадии (i);
(iii) собирают слой (а) в виде надосадочной жидкости, содержащий обеззараженный биологический материал.
Стадии (i) и (iii) удобно осуществлять при помощи шприца или эквивалентного устройства для заполнения/отбора, предпочтительно, выполненного с возможностью применения в промышленном масштабе. Пробирки для ультрацентрифугирования можно выбрать из коммерчески доступных, отдавая предпочтение тем, внутренняя поверхность которых инертна к органическим растворителям, например, с тефлоновой внутренней поверхностью. Стадию (ii) осуществляют путем центрифугирования, с широким диапазоном величин G и продолжительности (обычно в диапазоне от 50,000 до 70,000 G, в течение времени от 30 минут до 2 часов); возможны отклонения от указанных величин ив зависимости от конкретных характеристик применяемого биологического материала и предполагаемой нагрузки загрязняющим агентом. Во время ультрацентрифугирования дисперсные контаминанты, содержащиеся в биологическом продукте и первоначально находящиеся в слое раствора (а), под действием их массы продвигаются ко дну пробирки, т.е. проходят через слой (b) и накапливаются в слое (с), где они инактивируются при контакте с инактивирующим раствором, содержащимся в нем; в зависимости от применяемых условий центрифугирования, контаминанты могут оставаться взвешенными в слое (с) или концентрироваться в виде осадка на дне пробирки. Способ деконтаминации завершается отбором надосадочной жидкости после центрифугирования, содержащей раствор обеззараженного биологического продукта; его можно консервировать в виде раствора, жидкого или замороженного, или можно извлекать в твердой форме после удаления жидкой фазы; для этих целей применяют более мягкие методики (например, лиофилизация или медленное выпаривание) для сохранения активности биологического продукта; более быстрые/жесткие условия, например, кипячение, можно применять в случае, если биологические продукты являются достаточно стабильными.
Резюмируя, настоящее изобретение обеспечивает возможность значительного усовершенствования известных способов разделения и инактивации, результатом чего является способ, легко применимый в промышленном масштабе, с высоким выходом продукта, который в высокой степени сохраняет биологическую активность обеззараживаемого материала. В частности, промежуточный слой с характеристиками, описанными в настоящем изобретении, позволяет получить особенно стабильную слоистую трехфазную систему, которая никоим образом не препятствует миграции вирусных, прионных или бактериальных частиц в нижнюю фазу в ходе центрифугирования; в частности, благодаря характеристикам несмешиваемости промежуточной фазы, она может иметь плотность, только незначительно превышающую плотность верхнего слоя, содержащего продукт, что приводит к гораздо более легкой миграции бактериальных/вирусных/прионных частиц в нижележащую инактивирующую фазу; сам промежуточный слой, хотя и сильно отличающийся от раствора биологического материала, не повреждает биологическую активность последнего.
Ниже настоящее изобретение описано при помощи следующих неограничительных примеров.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Получение инактивирующей фазы (слой (с))
Получали инактивирующие растворы на основе мочевины и на основе NaOH.
Растворы мочевины дополнительно содержали 0,5 М буферного агента Трис-Cl при 9,5 рН, дитиотреитол (ДТТ, конц. 10 мМ) и, необязательно, NaBr в качестве регулирующего плотность агента.
Растворы NaOH готовили с использованием 1 М NaOH и глицерина в качестве регулирующего плотность агента.
Пример 2: Получение промежуточной фазы (слой (b))
Получали растворы на основе хлороформа и толуола в соотношениях 1:1, 1:1,5 и 1:2.
Температура кипения хлороформа 61°С,
Температура кипения толуола 110°С.
В качестве сравнения готовили промежуточный раствор на основе водного раствора сахарозы, согласно известному уровню техники (ЕР 1593688).
Модулирование плотности требует применения большого количества сахарозы, поэтому получают сильно концентрированные растворы, неподходящие для контакта с растворами, содержащими интересующие биологические молекулы.
Пример 3: Получение раствора биологического материала (слой (а))
В качестве эталона биологического материала готовили растворы бычьего сывороточного альбумина (БСА) с концентрацией от 5 до 20 мг/мл, с NaCl или без него. Полученные растворы имели следующие характеристики:
Затем проверяли легкость расслоения полученных растворов поверх растворов слоя (b), описанных в предыдущем примере.
ДА = желаемое расслоение,
НЕТ = белковый раствор плотнее промежуточной фазы и тонет.
Пример 4 Испытание на биологическую активность
Для проверки, может ли длительный контакт между белковой водной фазой (а) и промежуточной органической фазой (b) оказывать отрицательное влияние на активность ФСГ, готовили различные небольшие пробирки с промежуточным раствором (b), с которым расслаивали различные растворы ФСГ. Образцы инкубировали в холодильнике в течение 18 ч, после чего определяли активность ФСГ по сравнению с исходной активностью каждого раствора. Подробности, касающиеся состава растворов и выделения ФСГ, показаны в следующей таблице.
Сокращенные обозначения: NaOH = гидроксид натрия; NaCl = хлорид натрия; NaBr = бромид натрия; ДТТ = дитиотреитол; Трис = трис-(гидроксиметил)-аминометан; БСА = бычий сывороточный альбумин.
На основании вышеуказанной таблицы можно отметить, что ФСГ не был поврежден (± вариации в несколько процентов проистекают из природы применяемого исследования).