Способ и набор для иммуноферментного определения количественного содержания антитоксических противодифтерийных IgG антител в сыворотках крови людей
METHOD AND A KIT FOR AN IMMUNOENZYMOMETRIC ASSAY OF THE QUANTITATIVE CONTENT OF ANTITOXIC ANTI-DIPHTHERIA IGG ANTIBODIES IN HUMAN SERUM

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для диагностики антитоксических противодифтерийных антител в сыворотках крови людей (детей и взрослых): здоровых, больных, вакцинированных АКДС-вакциной, АД-М анатоксином, бактерионосителей возбудителя дифтерии.
Известен способ определения антитоксических противодифтерийных антител методом реакции пассивной гемагглютинации (РПГА), который используется в РФ. Для этого применяется «Диагностикум эритроцитарный дифтерийный жидкий». РПГА основана на образовании иммунных агглютинатов в результате взаимодействия специфических антител с антигеном (анатоксин), фиксированным на поверхности эритроцитов барана. Метод предусматривает получение нагруженных антигеном носителей: обработка эритроцитов барана, сенсибилизация дифтерийным анатоксином. Следующая стадия - внесение сенсибилизированных дифтерийным анатоксином эритроцитов в исследуемую сыворотку. Если в ней содержатся противодифтерийные антитоксические антитела, происходит агглютинация. Реакцию агглютинации учитывают визуально. БИОМЕД им. И.И. Мечникова. 2008, 4 с.
К недостаткам метода РПГА можно отнести его невысокую чувствительность, а также выявление суммарных антител разных изотипов.
Известен способ, позволяющий определять количественное содержание противодифтерийных антитоксических антител в сыворотках крови людей с использованием коммерческой иммуноферментной тест-системы (ИФА), используемой в мировой практике. Достоинством данной тест-системы по сравнению с РПГА является использование предварительно сорбированного на лунках планшета антигена (анатоксина), длительно сохраняемого в обычных условиях, а также наличие готовой калибровочной пробы с известной концентрацией IgG, переведенной в МЕ/мл, позволяющей определять содержание специфических IgG в количественных относительных единицах МЕ/мл. VaccZyme Diphtheria Toxoid IgG Enzyme Immunoassay Kit. Instructions for use. Version 16. The Binding Site Group Ltd. 2009, 11 p., Diphtheria IgG ELISA. Enzyme immunoassay for the quantitative determination of IgG antibodies against Diphtheria in human serum and plasma. Instructions for use. IBL International GMBH. 2011, 6 p.
Недостатком описанных способов является выражение получаемых результатов в относительных качественных (РПГА) и относительных количественных (ИФА) показателях содержания антитоксических антител в сыворотках.
Наиболее близкими к предложенному изобретению по технической сущности и достигаемым результатам являются способ и набор для иммуноферментного анализа, позволяющие определять количественное содержание антитоксических IgG в абсолютных показателях (мкг/мл). Выделяют специфические антитоксические противодифтерийные IgG антитела из γ-глобулиновой фракции сывороток крови человека с помощью метода аффинной хроматографии. В основе данного метода лежит способность биологически активных веществ связывать специфически и обратимо другие вещества. Аффинная хроматография включает несколько этапов. Хроматографическую колонку заполняют носителем (активированная бромцианом сефароза), ковалентно связанным с лигандом (очищенный дифтерийный анатоксин). Затем через колонку пропускают анализируемую смесь веществ (γ-глобулиновую фракцию сывороток крови человека, содержащую противодифтерийные антитоксические IgG). В результате за счет биоспецифического взаимодействия образуется комплекс иммобилизованного лиганда со специфическими антителами. Остальные компоненты проходят через колонку, не задерживаясь. Специфически адсорбированное вещество (противодифтерийные антитоксические IgG) освобождается из комплекса после промывания буфером с кислым рН. Фирсова Т.Н. Противодифтерийные антитоксические и антибактериальные антитела в сыворотках крови людей. Автореф. дис. на соиск. уч. ст. к.б.н. М., 2012, 36 с.
К недостаткам можно отнести те, что этапы подготовки набора и проведения ИФА не являются оптимальными: по времени и условиям инкубации при проведении ИФА, стабильности и безопасности используемых реагентов.
Технической задачей заявленного изобретения является разработка способа и набора для иммуноферментного определения количества антитоксических противодифтерийных антител (IgG) в сыворотках крови людей в мкг/мл, обладающего хорошей воспроизводимостью результатов, специфичностью, чувствительностью, а также более коротким временем проведения анализа.
Техническим результатом, достигаемым от реализации заявленного изобретения, является повышение специфичности, чувствительности и воспроизводимости результатов, а также сокращение времени проведения анализа.
Технический результат достигается тем, что в способе иммуноферментного определения количественного содержания антитоксических противодифтерийных IgG антител в сыворотках крови людей, согласно изобретению, в лунки планшета с сорбированным антигеном в концентрации 10 мкг/мл вносят стандартный калибровочный образец, содержащий антитоксические противодифтерийные IgG антитела в концентрации 80 мкг/мл, полученный в результате выделения специфических антитоксических противодифтерийных IgG антител из у-глобулиновой фракции пула сывороток крови с помощью метода аффинной хроматографии, и исследуемые образцы сывороток крови людей, инкубируют при температуре 37°С в течение 30 мин в термошейкере с частотой 700 об/мин, выливают и четырехкратно промывают содержимое лунок фосфатно-солевым буферным раствором с Твин-20, затем вносят конъюгат фермента пероксидазы хрена с антителами кролика против IgG человека в разведении 1:16000, проводят инкубацию при температуре 37°С в течение 30 мин в термошейкере с частотой 700 об/мин, выливают и четырехкратно промывают содержимое лунок фосфатно-солевым буферным раствором с детергентом Твин-20, вносят раствор тетраметилбензидина в качестве субстратного буферного раствора, инкубируют при комнатной температуре в темноте в течение 15 мин, вносят в качестве стоп-реагента во все лунки планшета 2 М-ный раствор серной кислоты, выявляют образовавшиеся иммунные комплексы при длине волны 450 нм и проводят расчет количественного содержания антитоксических противодифтерийных IgG антител в исследуемых сыворотках по калибровочному графику, построенному с помощью данных об оптической плотности и концентрации последовательных двукратных разведений стандартного калибровочного образца и с учетом разведения исследуемых образцов.
Тем самым достигается более достоверное определение количественного содержания антитоксических противодифтерийных IgG антител в сыворотках крови человека в мкг/мл предлагаемым иммунным ферментативным способом.
Технический результат достигается также тем, что набор для осуществления способа определения антитоксических противодифтерийных IgG антител в сыворотках крови человека содержит:
- полистироловый плоскодонный планшет с сорбированным антигеном в концентрации 10 мкг/мл - 1 шт.;
- стандартный калибровочный образец с содержанием антитоксических противодифтерийных IgG антител в концентрации 80 мкг/мл, полученный в результате выделения специфических антитоксических противодифтерийных IgG антител из γ-глобулиновой фракции пула сывороток крови с помощью метода аффинной хроматографии
- 1 фл.;
- конъюгат фермента пероксидазы хрена с антителами кролика против IgG человека - 1 фл.;
- концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с детергентом Твин 20 - 1 фл.;
- раствор тетраметилбензидина- 1 фл.;
- стоп-реагент - 1фл.;
- инструкция - 1 шт.
В основе предлагаемого способа лежит стандартный калибровочный образец с заведомо известной концентрацией антитоксических противодифтерийных IgG антител (мкг/мл), который получен в результате выделения специфических антитоксических противодифтерийных IgG антител из γ-глобулиновой фракции пула сывороток крови с помощью метода аффинной хроматографии. Концентрация антитоксических противодифтерийных IgG антител в стандартном образце составляет 80 мкг/мл.
Выделяют специфические антитоксические противодифтерийные IgG антитела из γ-глобулиновой фракции сывороток крови человека с помощью метода аффинной хроматографии, описанного в прототипе. На Фиг. 1 приведена схема выделения антитоксических противодифтерийных IgG антител с помощью аффинной хроматографии. В качестве матрицы используется активированная бромцианом сефароза. На нее сорбируется лиганд - очищенный дифтерийный анатоксин. На колонку наносится γ-глобулиновая фракция, затем не связавшиеся с антигеном антитела отмываются. После чего проводят элюцию специфических антител, связавшихся с лигандами-антигенами, на которых сорбировалась фракция специфических иммуноглобулинов. Сбор фракций антитоксических противодифтерийных антител IgG прекращается, когда кривая оптической плотности выходит на постоянное минимальное значение.
Количественное содержание выделенных из γ-фракции антитоксических противодифтерийных IgG антител (в полученных после аффинной хроматографии фракциях) проводят иммуноферментным анализом с помощью коммерческого набора «IgG общий - ИФА - БЕСТ» (фирма «Вектор-Бест») в условиях, описанных в прототипе. Для этого сначала калибровочные образцы с известной концентрацией IgG антител и анализируемые образцы фракций инкубируются в лунках стрипированного планшета с иммобилизованными моноклональными антителами (МКАТ) к IgG. Затем связавшийся в лунках IgG обрабатывают конъюгатом МКАТ к IgG с пероксидазой хрена. Проводят выявление образовавшихся иммунных комплексов цветной реакцией с раствором тетраметилбензидина, измеряют оптическую плотность образцов. Используя калибровочный график, рассчитывают количественное содержание антитоксических IgG в анализируемых фракциях в мг/мл. По результатам анализа для последующей работы отбирают фракции с наибольшей концентрацией антитоксических IgG, которые служат стандартным калибровочным образцом для заявляемого способа и набора. Получают стандартный образец с концентрацией антитоксических противодифтерийных IgG антител 80 мкг/мл.
В результате реализации заявленного способа и набора для его осуществления достигается высокая корреляция показателей выявляемых антитоксических противодифтерийных IgG антител (в мкг/мл) и импортной тест-системой ИФА (в МЕ/мл) по сравнению с ранее известной по прототипу, когда сравнивали данные, получаемые с помощью двух тест-систем и определяли корреляционную связь между ними с помощью коэффициента корреляции Пирсона. Корреляция определяет степень, с которой значения двух переменных пропорциональны друг другу. Корреляция высокая, если на графике зависимость можно представить прямой линией (с положительным или отрицательным углом наклона). Если значение коэффициента корреляции находится в диапазоне 0,9-1, то это говорит о сильной корреляционной зависимости.
Изобретение также поясняется примерами его осуществления
Пример 1. Сравнение количественного содержания противодифтерийных антитоксических антител, выявляемых с помощью разработанного набора и коммерческой тест-системы ИФА (фирмы «Binding Site», Италия).
Исследование антитоксических антител проводили в сыворотках крови 40 здоровых взрослых людей в возрасте 18-50 лет. Для сравнения показателей уровня антитоксических противодифтерийных антител, определенных с помощью двух наборов ИФА, использовали корреляционный анализ, включающий определение коэффициента корреляции Пирсона и построение диаграммы рассеяния. Зайцев Т.М. Методика биометрических расчетов. М: Наука, 1973. - С. 89.
Метод корреляционного анализа подтвердил правомерность использования обеих тест-систем для выявления содержания антитоксических антител в абсолютных (мкг/мл) или относительных (МЕ/мл) показателях. Оптимизация условий проведения каждой стадии создания предлагаемого набора и постановки ИФА привела к повышению чувствительности реакции. На фиг. 2 представлена диаграмма рассеяния показателей антитоксических противодифтерийных антител, выявленных в сыворотках крови здоровых взрослых людей с помощью коммерческой тест-системы и разработанного набора. Коэффициент корреляции Пирсона составил 0,967, в то время как ранее разработанная тест-система обеспечивала менее высокую степень корреляции с показателями, выявляемыми с помощью импортного набора (коэффициент корреляции Пирсона составлял 0,873).
Таким образом, показатели выявленных антитоксических противодифтерийных IgG антител в сыворотках крови здоровых взрослых людей по предлагаемому способу более достоверно коррелируют с показателями коммерческой тест-системы, чем показатели антитоксических противодифтерийных IgG, определенных по известному способу.
Пример 2. Определение количественного содержания антитоксических противодифтерийных IgG антител в сыворотках крови здоровых взрослых людей в возрасте от 20 лет и старше (проживающих в РФ) с помощью разработанного набора.
Изучение антитоксических противодифтерийных IgG антител проводили в 67 сыворотках крови.
Определение противодифтерийных IgG антител в сыворотках крови здоровых взрослых людей включает в себя следующие стадии:
1) в полистироловый плоскодонный планшет с сорбированным антигеном (дифтерийный анатоксин) в концентрации 10 мкг/мл, вносят стандартный калибровочный образец с концентрацией антитоксических противодифтерийных IgG антител 80 мкг/мл и исследуемые образцы. Для промывания планшета и для разведения стандартного калибровочного образца, исследуемых образцов и конъюгата используют фосфатно-солевой буферный раствор с Твин-20 рН 7,5 (производства Pierce ThermoFisher Scientific, США), для приготовления которого к 50 мл концентрата фосфатно-солевого буферного раствора с Твин-20 добавляют 950 мл дистиллированной воды. В первые два стрипа планшета вносят последовательные двукратные разведения стандартного калибровочного образца: в лунки А1 и А2 - по 200 мкл образца с разведением 1:4, в лунки B1 -G1 и B2-G2 - по 100 мкл фосфатно-солевого буферного раствора с детергентом Твин-20 (ФСБ+Твин-20); переносят из лунок А1 и А2 по 100 мкл раствора в В1 и В2 соответственно, из В1 и В2 в С1 и С2 и т.д. при тщательном перемешивании содержимого. В лунках H1 и Н2 находится чистый ФСБ+Твин-20 - эти лунки являются отрицательным контролем; исследуемые образцы сывороток вносят в разведении 1:20 в двукратной повторности;
2) планшет закрывают крышкой и инкубируют при температуре 37°С в течение 30 мин в термошейкере с частотой 700 об/мин;
3) содержимое лунок удаляют, планшет четырехкратно промывают ФСБ+Твин-20, сушат; во все лунки вносят по 100 мкл раствора, содержащего конъюгат фермента пероксидазы хрена с антителами кролика против IgG человека в разведении 1:16000 (производства «Сорбент Лтд», допустимо использование конъюгатов других производителей с аналогичными характеристиками). Для разведения используют фосфатно-солевой буферный раствор с детергентом Твин-20 (ФСБ+Твин-20);
4) планшет закрывают крышкой и инкубируют при температуре 37°С в течение 30 мин в термошейкере с частотой 700 об/мин;
5) содержимое лунок удаляют, планшет четырехкратно промывают ФСБ+Твин-20, сушат. Во все лунки вносят по 100 мкл раствора тетраметилбензидина (готовая коммерческая субстратная смесь, содержащая стабилизированный раствор 3,3', 5,5'-тетраметилбензидина, ThermoFisher Scientific, США), кат.№34028); инкубируют планшет в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте;
6) останавливают ферментативную реакцию внесением во все лунки по 100 мкл 2 М-ного раствора серной кислоты в качестве стоп-реагента;
7) через 2 мин измеряют оптическую плотность при длине волны 450 нм. По калибровочному графику, построенному с помощью данных об оптической плотности и концентрации последовательных двукратных разведений стандартного калибровочного образца, содержащего 80 мкг/мл антитоксических IgG, рассчитывают количественное содержание антитоксических IgG в мкг/мл в исследуемых образцах с учетом их разведения.
В табл. 1 представлены результаты определения количественного содержания антитоксических IgG в изучаемых сыворотках. С увеличением возраста показатели концентрации антитоксических противодифтерийных IgG в крови здоровых взрослых людей уменьшаются. Высокая концентрация антитоксических антител отмечается в крови взрослых 20-30 лет (89,0±8,0 мкг/мл).
Пример 3. Определение количественного содержания антитоксических IgG в сыворотках крови здоровых взрослых людей в возрасте от 20 лет и старше (проживающих в Италии) с помощью разработанного набора. Изучение антитоксических антител проводили в 41 сыворотке крови. Этапы постановки аналогичны этапам из примера 2.
В табл. 2 представлены результаты определения количественного содержания антитоксических антител в изучаемых сыворотках. С возрастом концентрация антитоксических IgG в крови здоровых взрослых людей уменьшаются. Повышенная концентрация антитоксических антител также, как и в РФ, отмечается в крови взрослых 20-30 лет (51,5±16,0 мкг/мл).
Из приведенных примеров следует, что разработанные способ и набор могут быть использована для выявления защитных титров антитоксических IgG в сыворотках крови людей бактериологическими лабораториями инфекционных больниц и диагностическими центрами, а также для проведения мониторинга популяционного противодифтерийного иммунитета среди определенных контингентов людей (дети, подростки, взрослые), предусмотренных санитарно-эпидемиологическими правилами Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека РФ.