Способ микробиологической продукции химозина быка с использованием рекомбинантного штамма Pichia pastoris, содержащего синтетический ген варианта химозина с коэкспрессией фактора HAC1
METHOD FOR MICROBIOLOGICAL PRODUCTION OF BOVINE CHYMOSIN USING RECOMBINANT STRAIN OF PICHIA PASTORIS CONTAINING SYNTHETIC GENE OF CHYMOSIN VARIANT WITH CO-EXPRESSION OF HAC1 FACTOR

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ продукции рекомбинантного химозина за счет использования рекомбинантной плазмиды GS115/pPICZa-Chym. Предложен способ активации, получения и очистки рекомбинантного химозина Bos taurus из штамм-продуцента Pichia pastoris. Изобретение позволяет получить рекомбинантный химозин Bos taurus с высокой концентрацией и степенью очистки более 90%.
Изобретение относится к области индустриальной биотехнологии и может быть использовано в пищевой промышленности для получения препарата химозина, используемого для приготовления сыра.
Химозин (КФ 3.4.23.4) является аспартатной эндопептидазой, обладающей специфической протеолитической активностью в отношении пептидной связи Phe105-Met106 [1]. Результатом протеолитической активности химозина является формирование молочного сгустка, что имеет чрезвычайное значение для сыроделия и пищевой промышленности. Штаммы-продуценты на основе Aspergillus niger [2] и Kluyveromyces lactis [3] активно используются в современной промышленности для продукции рекомбинантного химозина. Создание эффективных штамм-продуцентов ферментов на основе Pichia pastoris является важной прикладной задачей промышленной биотехнологии [4, 5].
Цель работы -  получение высокоэффективного штамма-продуцента химозина в P. pastoris и разработка методов выделения и очистки для использования в промышленной биотехнологии.
Ранее были предприняты шаги в разработке штамм-продуцентов рекомбинантного химозина на основе P. pastoris. Была оптимизирована нуклеотидная последовательность для экспрессии в P. pastoris [6], получены клоны штамм-продуцентов [7], разработаны методы культивирования при использовании технического глицерина [8]. Однако достигнутые уровни продуктивности штамм-продуцентов не соответствуют достигнутым уровням в промышленных штаммах-продуцентах A. niger и K. lactis.
Существующие методы позволяют оптимизировать штаммы-продуценты P. pastoris с нескольких сторон:
- оптимизация метаболомики с увеличением выхода промежуточных интермедиатов и конечных метаболитов;
- улучшение механизма геномных интеграций, позволяющее увеличить эффективность встраивания экспрессионных кассет;
- оптимизация мультикопийных инсерций методами генетической инженерии; геномное редактирование методами CRISPR/Cas9;
- коэкспрессия генов для улучшения внутриклеточного транспорта и секреции;
- коэкспрессия шаперонов для улучшения белкового фолдинга [9].
Существуют технологические подходы, позволяющие увеличить уровень экспрессии рекомбинантных белков за счет коэкспрессии с ранее изученными транскрипционными факторами. Так, транскрипционный фактор Fhl1p является недавно открытым положительным регулятором процессинга рРНК и экспрессии генов рибосомных белков у дрожжей. Показано, что оверэкспрессия гена Fhl1p в рекомбинантных штаммах Pichia pastoris- продуцирующих фитазу и пектиназу на 20-35% повышает выработку целевых ферментов.  В основе этого эффекта лежит стимулирующее действие Fhl1p на трансляцию мРНК, секрецию белков и некоторые процессы центрального углеродного и энергетического метаболизма -  гликолиз, цикл трикарбоновых кислот.
Оверэкспрессия целевых белков в клетках дрожжей зачастую приводит к накоплению неправильно свернутых и дефектных белков в цитоплазме и эндоплазматическом ретикулуме.  В результате процессы деления клеток, биосинтеза и экспорта белков замедляются, активируются различные стрессовые ответы, в том числе, протеасом-зависимая деградация неправильно-свернутых белков и так называемый ответ клетки на неправильно-свернутые белки (unfolded protein response - UPR). UPR вызывает арест трансляции, деградацию дефектных белков, накопление шаперонов. Индуктором UPR генов является фактор транскриции HAC1. Показано, что сверхэкспрессия гена HAC1 стимулирует процессы экспорта и созревания целевых белков в рекомбинантных штаммах дрожжей и грибов.
Предложен альтернативный метод экспрессии рекомбинантного прохимозина за счет генетической конструкции GS115/pPICZa-Chym, обеспечивающей биосинтез и секрецию прохимозина в сочетании с коэкспрессией транскрипционного фактора HAC1 за счет генетической конструкции GS115/pPIC9-HAC1, позволяющей получать экспрессию рекомбинантного прохимозина с высоким уровнем продукции.
Целью изобретения является создание генетических конструкций GS115/pPICZa-Chym, GS115/pPIC9-HAC1 и их совместное использование при трансформации в метилотрофные дрожжи P. pastoris c целью получения эффективного штамм-продуцента рекомбинантного прохимозина.
Пример 1. Способ микробиологического синтеза прохимозина. Посевной материал, представляющий собой клетки рекомбинантного штамма-продуцента GS115/pPICzA-Chym1, подготавливают путем инкубации в течение 15-24 часов при температуре 29°С на среде YPD при постоянной аэрации на термостатируемой качалке (250 об/мин). Затем выросшую культуру переносят в соотношении 1:200 (по объему) в среду BMMY (мас.%: пептон - 2, дрожжевой экстракт - 1, метанол - 0,5, фосфатный буфер рН=6.6 - до 100 mM, вода - остальное) до ОД600=1.
Процесс биосинтеза ведут в колбах Эрленмейера, содержащих 20 мл среды BMMY, в течение 96 часов в ротационном шейкере-термостате (200-250 об/мин), при температуре 28°C. Каждые 24 часа проводят индукцию метанолом, путем асептического добавления 50% раствора метанола в пробирки, до конечной концентрации 0,5%. По истечении 96 часов биомассу отделяют центрифугированием. Наличие рекомбинантного прохимозина в культуральной среде определяют при энзиматического теста после активации прохимозина в составе супернатанта путем кислотной обработки. Уровень продукции прохимозина выражают в международных казеиновых единицах (IMCU/мл, МКЕ/мл). Уровень синтеза прохимозина заявляемым способом составляет не менее 20 МКЕ/мл культуральной жидкости.
Пример 2.  Дизайн синтетического гена сплайсированного варианта HAC1.
При помощи праймеров pPiGAPR (5’-TGTTTCGAATTGATAGTTGTTCAATTGATTGAAATAGGG-3') и pPiGAPSac (5’-GGTGAGCTCAGATCTCTGCTACTCTGGTCCCAAGTGAA-3’) был амплифицирован нативный ген GAP-промотора. ПЦР проводилась при условиях: начальная денатурация - 30 с/98°С, 30 циклов [10 c/98°С, 30 с/68°С, 30 с/72°С], финальный цикл - 5 минут/72°С.
Для получения нативного гена HAC1 были амплифицированы экзон 1 при помощи праймеров F-HAC1 (5’-TGAACAACTATCAATTCGAAACACAGATCGCAGAAAATGCCCG-3’) и HAC1-SPL2 (5’-GTAAATGGTGCTGCTGGATGATGCAACCGATTCGAC-3’) и экзон 2 при помощи праймеров HAC1-SPL1 (5’-TTGCATCATCCAGCAGCACCATTTACCGCTAATGCA-3’) R-HAC_Age (5’-GTACCGGTACCCAAAAAGAATGAAAACGACCC-3’) при условиях начальная денатурация - 30 с/98°С, 30 циклов [10 c/98°С, 60 с/72°С], финальный цикл - 5 минут/72°С.
Объединение GAP-промотора и экзонов проводилось при помощи ПЦР без праймеров (начальная денатурация - 30 с/98°С, 10 циклов [10 c/98°С, 30 с/62°С, 30 с/72°С], финальный цикл - 5 минут/72°С для слияния трех фрагментов, с последующей ПЦР при использовании полученного фрагмента и праймеров pPiGAPSac (5’-GGTGAGCTCAGATCTCTGCTACTCTGGTCCCAAGTGAA-3’) и R-HAC_Age (5’-GTACCGGTACCCAAAAAGAATGAAAACGACCC-3’) при условиях… 30 с/98°С, 30 циклов [10 c/98°С, 60 с/72°С], финальный цикл - 5 минут/72°С. Конечным продуктом стал сплайсированный ген HAC1, обладающий функциональной активностью, с GAP-промотором. Сплайсированый ген HAC1 был вставлен в вектор pPIC9-HAC1 по сайтам рестрикции SacI/AgeI.
Пример 3. Конструирование плазмиды GS115/ pPIC9-HAC1 для экспрессии фактора HAC1 в P. pastoris под контролем GAP-промотора.
Вектор pPIC9 с встроенным сплайсированным вариантом гена HAC1 был предварительно линеаризован по сайту рестрикции Nco I. Для создания экспрессионного штамма использовали клетки штамма GS115, ранее трансфецированные вектором GS115/pPICzA-Chym1.
Приготовление электрокомпетентных клеток осуществляли согласно протоколу трансформации. После электропорации клетки инкубировали 1 ч при 30°С в 1.0 мл 1 М сорбитола и высевали на чашки с агаризованной средой MD, содержащей: глюкозу - 2 %, YNB без гистидина 1,34%, 1,5% агар и зеоцин 200 мкг/мл.
Пример 4. Сравнение уровня экспрессии прохимозина при экспрессии прохимозина в присутствии и в отсутствии коэкспрессии фактора HAC1.
Посевной материал, представляющий собой клетки рекомбинантного штамма-продуцента, подготавливают путем инкубации в течение 15-24 часов при температуре 29°С на среде YPD при постоянной аэрации на термостатируемой качалке (250 об/мин). Затем выросшую культуру переносят в соотношении 1:200 (по объему) в среду BMMY (мас.%: пептон - 2, дрожжевой экстракт - 1, метанол - 0,5, фосфатный буфер рН=6.6 - до 100 mM, вода - остальное) до ОД600=1.
Процесс биосинтеза ведут в колбах Эрленмейера, содержащих 20 мл среды BMMY, в течение 96 часов в ротационном шейкере-термостате (200-250 об/мин), при температуре 28°C. Каждые 24 часа проводят индукцию метанолом, путем асептического добавления 50% раствора метанола в пробирки, до конечной концентрации 0,5%. По истечении 96 часов биомассу отделяют центрифугированием. Наличие рекомбинантного прохимозина в культуральной среде определяют при энзиматического теста после активации прохимозина в составе супернатанта путем кислотной обработки. Уровень продукции прохимозина выражают в международных казеиновых единицах (IMCU/мл, МКЕ/мл). Уровень синтеза прохимозина без коэкспрессии вектора GS115/pPIC9-HAC1 составил 18 IMCU/мл, в то время как штамм-продуцент, несущий вектора GS115/pPICzA-Chym1 и GS115/pPIC9-HAC1, обладал активностью 25 IMCU/мл, что на 40% выше чем в контрольном штамме без коэкспрессии фактора HAC1.
Источники информации
1. Беленькая С.В., Балабова Д.В., Белов А.Н., Коваль А.Д., Щербаков Д.Н., Ельчанинов В.В. // Прикл. биохимия и микробиология. 2020. Т. 56. № 4. С. 315-326.
2. Bodie E.A., Armstrong G.L., Dunn-Coleman N.S. // Enzyme Microb. Technol. 1994. V. 16. № 5. P. 376-382.
3. Van den Berg J.A., van der Laken K.J., van Ooyen A.J., Renniers T.C., Rietveld K., Schaap A., Brake A.J., Bishop R.J., Schultz K., Moyer. D. // Nat. Biotechnol. 1990. V. 8. № 2. P. 135-139.
4. Noseda D.G., Recúpero M.N., Blasco M., Ortiz G.E., Galvagno M.A. // Protein Expr. Purif. 2013. V. 92. № 2. P. 235-244.
5. Noseda D.G., Blasco M., Recúpero M., Galvagno M.Á. // Protein Expr. Purif. 2014. V. 104. P. 85-91.
6. Noseda D.G., Recúpero M., Blasco M., Bozzo J., Galvagno. M.Á. // Protein Expr. Purif. 2016. V. 123. P. 112-121.
7. Peña D.A., Gasser B., Zanghellini J., Steiger M.G., Mattanovich D. // Metab. Eng. 2018. V. 50. P. 2-15.
8. Higgins D.R., Busser K., Comiskey J., Whittier P.S., Purcell T.J., Hoeffler J.P. // Methods Mol. Biol. 1998. V.103. P. 41-53.
9. Dunn-Coleman N.S., Bloebaum P., Berka R.M., Bodie E., Robinson N., Armstrong G., Ward M., Przetak M., Carter G.L., LaCost R. // Nat. Biotechnol. 1991. V. 9. № 10. P. 976-981.
--->
<120>  Рекомбинантная ДНК, кодирующая вариант предшественника химозина быка Chym1, рекомбинантная плазмида pPICzA-Chym1, обеспечивающая синтез Chym1 в клетках Pichia pastoris и штамм Pichia pastoris GS115 /p PICzA-Chym1 - продуцент рекомбинантного химозина Chym1
<130>  001
<210>  1
<211>  1098
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<221>  CDS
<222>  (1213)..(2311)
<223>  Синтетический ген прохимозина быка
<400>GCTGAAATTACTAGAATCCCATTGTATAAGGGTAAATCTTTGAGAAAGGCTTTGAAAGAACATGGTTTGTTGGAGGATTTCTTGCAAAAGCAACAATACGGTATCTCTTCTAAGTACTCTGGTTTCGGTGAAGTTGCTTCTGTTCCATTGACTAACTACTTGGATTCTCAATACTTCGGTAAAATCTACTTGGGTACTCCACCTCAAGAGTTTACTGTTTTGTTCGATACTGGTTCTTCTGATTTCTGGGTTCCTTCTATCTACTGTAAGTCTAACGCTTGTAAGAACCATCAAAGATTCGATCCAAGAAAGTCTTCTACTTTCCAAAACTTGGGTAAACCTTTGTCTATTCACTATGGTACTGGTTCTATGCAAGGTATTTTGGGTTACGATACTGTTACTGTTTCTAACATCGTTGATATTCAACAAACTGTTGGTTTGTCTACTCAAGAACCTGGAGATGTTTTTACTTACGCTGAGTTCGATGGTATTTTGGGTATGGCTTATCCATCTTTGGCTTCTGAATACTCTATCCCTGTTTTCGATAACATGATGAACAGACATTTGGTTGCTCAAGATTTGTTCTCTGTTTACATGGATAGAAACGGTCAAGAGTCTATGTTGACTTTGGGTGCTATTGATCCATCTTACTATACTGGTTCTTTGCACTGGGTTCCTGTTACTGTTCAACAATACTGGCAATTCACTGTTGATTCTGTTACTATTTCTGGTGTTGTTGTTGCTTGTGAGGGTGGTTGTCAAGCTATTTTGGATACTGGTACTTCTAAGTTGGTTGGTCCATCTTCTGATATCTTGAACATCCAACAAGCTATTGGTGCTACTCAAAACCAATACGGTGAATTTGATATCGATTGTGATAACTTGTCTTACATGCCTACTGTTGTTTTCGAGATTAATGGTAAAATGTACCCATTGACTCCTTCTGCTTACACTTCTCAAGATCAAGGTTTTTGTACTTCTGGTTTCCAATCTGAAAATCACTCTCAAAAGTGGATTTTGGGAGATGTTTTTATTAGAGAGTACTACTCTGTTTTCGATAGAGCTAACAATTTGGTTGGTTTGGCTAAAGCTATTTAA
<130>  002
<210>  2
<211>  918
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<221>  CDS
<222>  (1021)..(1939)
<223>  транскрипционный фактор НАС1
<400>GAAAATGCCCGTAGATTCTTCTCATAAGACAGCTAGCCCACTTCCACCTCGTAAAAGAGCAAAGACGGAAGAAGAAAAGGAGCAGCGTCGAGTGGAACGTATCCTACGTAATAGGAGAGCGGCCCATGCTTCCAGAGAGAAGAAACGAAGACACGTTGAATTTCTGGAAAACCACGTCGTCGACCTGGAATCTGCACTTCAAGAATCAGCCAAAGCCACTAACAAGTTGAAAGAAATACAAGATATCATTGTTTCAAGGTTGGAAGCCTTAGGTGGTACCGTCTCAGATTTGGATTTAACAGTTCCGGAAGTCGATTTTCCCAAATCTTCTGATTTGGAACCCATGTCTGATCTCTCAACTTCTTCGAAATCGGAGAAAGCATCTACATCCACTCGCAGATCTTTGACTGAGGATCTGGACGAAGATGACGTCGCTGAATATGACGACGAAGAAGAGGACGAAGAGTTACCCAGGAAAATGAAAGTCTTAAACGACAAAAACAAGAGCACATCTATCAAGCAGGAGAAGTTGAATGAACTTCCATCTCCTTTGTCATCCGATTTTTCAGACGTAGATGAAGAAAAGTCAACTCTCACACATTTAAAGTTGCAACAGCAACAACAACAACCAGTAGACAATTATGTTTCTACTCCTTTGAGTCTTCCGGAGGATTCAGTTGATTTTATTAACCCAGGTAACTTAAAAATAGAGTCCGATGAGAACTTCTTGTTGAGTTCAAATACTTTACAAATAAAACACGAAAATGACACCGACTACATTACTACAGCTCCATCAGGTTCCATCAATGATTTTTTTAATTCTTATGACATTAGCGAGTCGAATCGGTTGCATCATCCAGCAGCACCATTTACCGCTAATGCATTTGATTTAAATGACTTTGTATTCTTCCAGGAATA
<---