Т-КЛЕТКИ, ПЕРЕНАЦЕЛЕННЫЕ В ОТНОШЕНИИ CD123-СПЕЦИФИЧНОГО ХИМЕРНОГО АНТИГЕННОГО РЕЦЕПТОРА, И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
T CELLS RE-TARGETED WITH RESPECT TO CD123-SPECIFIC CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR, AND METHODS FOR USE THEREOF

Притязание на приоритет
[0001] Эта заявка испрашивает приоритет патентной заявки США №13/844048, поданной 15 марта 2013 года, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте, включая графические материалы.
Государственный интерес
[0002] Данное изобретение было сделано при поддержке правительства грантами NIH Р50 СА107399, Р01 СА030206 и М01 RR0004. Правительство имеет определенные права на данное изобретение.
Предшествующий уровень техники
[0003] Острый миелоидный лейкоз (acute myeloid leukemia, AML) представляет собой заболевание, характеризующееся быстрой пролиферацией незрелых миелоидных клеток в костном мозге, что приводит к нефункциональному гемопоэзу [1]. Подходы к лечению острого миелоидного лейкоза (AML) первой линии оставались практически без изменений в течение почти 50 лет, и AML остается заболеванием с плохим прогнозом. Хотя стандартная индукционная химиотерапия может индуцировать полную ремиссию, у многих пациентов в конечном итоге развиваются рецидивы, и они умирают от этого заболевания [2]. Таким образом, разработка новых терапевтических средств для лечения AML имеет решающее значение.
[0004] Аллогенная трансплантация гемопоэтических клеток позволяет достичь излечения заболевания у отдельных пациентов и подчеркивает восприимчивость AML к иммунотерапии донорского происхождения. Кроме того, альфа-цепь рецептора интерлейкина 3 (CD123) была идентифицирована как потенциальная иммунотерапевтическая мишень, так как она сверхэкспрессируется при AML по сравнению с нормальными гемопоэтическими стволовыми клетками.
[0005] Последние достижения в иммунофенотипировании AML-клеток выявили несколько AML-связанных антигенов клеточной поверхности, которые могут выступать в качестве мишеней для будущих терапевтических препаратов [3]. Действительно, были описаны доклинические исследования с использованием антител, нацеленных на CD44, CD47, Т-клеточный иммуноглобулин-муцин-3 (TIM-3) и альфа-цепь рецептора интерлейкина 3 (IL-3Rα; CD123), для лечения AML, и они продемонстрировали перспективную противолейкемическую активность на мышиных моделях [3, 4]. CD123 экспрессируется на различных злокачественных опухолях, включая острый и хронический миелоидный лейкоз, волосатоклеточный лейкоз, В-клеточный острый лимфобластный лейкоз и новообразования из бластных плазмоцитоидных дендритных клеток. Кроме того, CD123, как правило, не экспрессируется на нормальных гемопоэтических стволовых клетках, благодаря чему CD123 является идеальной иммунотерапевтической мишенью. Кроме того, были завершены два испытания CD123-специфичных терапевтических препаратов в I фазе, при этом оба препарата продемонстрировали хороший профиль безопасности (ClinicalTrials.gov ID: NCT00401739 и NCT00397579). К сожалению, эти препараты, нацеленные на CD123, имели ограниченную эффективность, подтверждая, что альтернативные и более мощные лекарственные препараты, нацеленные против CD123, могут потребоваться для соблюдения противолейкемической активности.
[0006] Возможным более мощным альтернативным терапевтическим средством для лечения AML является применение Т-клеток, экспрессирующих химерные антигенные рецепторы (chimeric antigen receptor, CAR), которые перенацеливают Т-клеточную специфичность в отношении опухолеспецифических антигенов (tumor associated antigen, ТАА) клеточной поверхности МНС-независимым способом [5]. В большинстве случаев CAR включают одноцепочечный вариабельный фрагмент (single-chain variable fragment, scFv) из моноклонального антитела, слитый с сигнальным доменом CD3ζ, и могут включать костимуляторный эндодомен [5]. Несколько групп разработали CAR, нацеленные на различные антигены, для лечения В-клеточных злокачественных новообразований [6-10], и многие продолжают оценивать CAR-экспрессирующие Т-клети в I фазе клинических испытаний [11-15]. Напротив, CAR-инженерные Т-клетки для лечения AML остаются редкими [16, 17].
[0007] Хотя современные режимы лечения AML позволяют достичь у некоторых пациентов полного ответа, у многих из них в конечном итоге развиваются рецидивы, что подчеркивает необходимость новых терапевтических средств, которые смогут привести к более стойким ответам. В настоящее время разрабатываются различные иммунотерапевтические средства, нацеленные на AML, в том числе антиген-специфические цитотоксические Т-лимфоциты, аллореактивные натуральные киллеры и вакцины на основе дендритных клеток. Например, Ока и его коллеги показали, что вакцинация пептидом 1 опухоли Вильмса может привести к клиническому и иммунологическому ответу у пациентов с AML [33]. Тем не менее, эти нацеленные терапевтические средства являются HLA-зависимыми. Поэтому желательно было бы разработать нацеленный терапевтический агент, например, CAR, который может перенацеливать Т-клеточную специфичность для селективного воздействия на AML-клетки HLA-независимым образом.
Краткое описание изобретения
[0008] Семейство химерных антигенных рецепторов (CAR), содержащих СD123-специфичный scFv, было разработано для нацеливания на различные эпитопы на CD123. В некоторых воплощениях такой ген химерного антигенного рецептора CD123 (CD123CAR) включает анти-CD123-scFv-область, слитую в рамке считывания с модифицированной шарнирной областью IgG4, содержащей изменение в спейсерной области IgG4, которое устраняет Fc-рецепторное связывание. В одном воплощении модифицированная шарнирная область IgG4 включает замену S228P, замену L235E и, возможно, замену N297Q. Ген CD123CAR также включает по меньшей мере один костимуляторный сигнальный домен; а также сигнальный домен дзета-цепи Т-клеточного рецептора (Т cell receptor, TCR). В некоторых воплощениях ген CD123CAR включает нуклеотидную последовательность, выбранную среди SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4. В других воплощениях ген CD123CAR кодирует аминокислотную последовательность, которая включает SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12.
+
[0009] В соответствии с воплощениями, описанными ниже, гены CD123CAR могут быть частью экспрессионной кассеты, которая вставлена в вектор (например, в вирусный вектор). Таким образом, популяция человеческих Т-клеток может быть трансдуцирована вектором, в результате чего Т-клетки экспрессируют гены CD123CAR. При экспрессии в здоровых донорских Т-клетках (CD4/CD8) CD123CAR перенацеливают Т-клеточную специфичность и опосредованную мощную эффекторную активность в отношении клеточных линий CD123, а также первичных образцов от пациентов с AML. CD123CAR-T-клетки существенно не изменяют образование колоний гранулоцитов/макрофагов и эритроидных колоний in vitro, подтверждая дифференциальный эффект на AML-клетки в отличие от клеток иммунной системы.
[0010] Кроме того, Т-клетки, полученные от пациентов с активным AML, могут быть модифицированы для экспрессии генов CD123CAR и способны лизировать аутологичные AML-бласты in vitro. Эти результаты подтверждают, что CD123CAR-трансдуцированные Т-клетки могут быть использованы в качестве иммунотерапии для лечения высокого риска AML. Таким образом, согласно некоторым воплощениям предусмотрены способы лечения AML у субъекта, где такие способы включают этап введения субъекту первой популяции Т-клеток, трансдуцированных первым геном CD123CAR. Способы также могут включать дополнительный этап введения субъекту первой популяции Т-клеток, трансфицированных первым геном CD123CAR, в комбинации со второй популяцией Т-клеток, трансдуцированных вторым геном CD123CAR. В некоторых воплощениях первый ген CD123CAR включает нуклеотидную последовательность, выбранную среди SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4. Второй ген CD123CAR также может включать нуклеотидную последовательность, выбранную среди SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, тем не менее, нуклеотидная последовательность второго гена CD123CAR может не быть такой же, как выбранная для первого гена CD123CAR. Это приводит к комбинированному лечению AML с использованием двух или более чем двух различных популяций Т-клеток, трансдуцированных CD123CAR, которые могут вызвать синергический эффект по сравнению с использованием одной популяции Т-клеток, трансдуцированных CD123CAR.
Краткое описание графических материалов
[0011] На фиг. 1 показано, что СD123-специфичные CAR могут быть экспрессированы в человеческих Т-клетках от здорового донора. (А) Схема CAR, содержащего модифицированную шарнирную область IgG4, модифицированный трансмембранный и внутриклеточный сигнальный домен CD28 и сигнальный домен CD3ζ. Также указана последовательность рибосомального проскока Т2А и маркер трансдукции укороченный EGFR (рецептора эпидермального фактора роста, EGFRt). (В) Репрезентативный фенотип ложно-трансдуцированных и трансдуцированных лентивирусом Т-клеток, полученных от одного здорового донора. После иммуномагнитной селекции и одного цикла размножения CAR-модифицированные Т-клетки метили биотинилированным анти-Fc-антителом или биотинилированным анти-EGFR-антителом, а затем РЕ-конъюгированным стрептавидином и анти-TCRα/β, анти-CD4 или анти-CD8 и анализировали путем проточной цитометрии. Расположение по квадрантам основано на мечении изотипических контролей, и указан процент клеток, попадающих в каждый квадрант.(С) Экспрессия указанных маркеров клеточной поверхности на Т-клеточных линиях от трех различных здоровых доноров с последующей иммуномагнитной селекцией и одним циклом размножения. Данные представляют собой средние значения ± SEM.
+
+
-
+
-
-
[0012] На фиг. 2 показано, что СD123-специфичные CAR-экспрессирующие Т-клетки лизируют CD123-экспрессирующие опухолевые клеточные линии. (А) Проточная цитометрия клеток 293Т, временно трансфицированных для экспрессии CD123 (наверху, черная линия) или CD19 (внизу, черная линия). Исходные ложно-трансдуцированные 293Т-клетки метили либо анти-CD123-, либо анти-CD19-антителом (серая заштрихованная, наверху и внизу), чтобы определить фоновые уровни экспрессии. (В) Специфическая цитотоксичность CD123-CAR-экспрессирующих Т-клеток (26292 и 32716) против 293Т-клеток, экспрессирующих либо CD123 (293T-CD123), либо CD19 (CD19-293T), в анализе высвобождения хрома. Данные представляют средние значения от трех лунок + SD. (С) Проточная цитометрия CD123 на линии AML-клеток KG1a, линии EBV-трансформированных LCL-клеток и линии CML-клеток К562. В каждой гистограмме указан процент клеток, положительных на СD123-окрашивание (черная линия), в сравнении с изотипическими контролями (серая заштрихованная). (D) Специфическая цитотоксичность CD123-CAR-T-клеток (26292 и 32716) против клеточной линии CD19CD123 LCL и клеточной линии CD19CD123 KG1a в анализе высвобождения хрома. ОКТ3-экспрессирующие клеточные линии LCL (LCL-OKT3) и CD19CD123 К562 были использованы в качестве положительной и отрицательной контрольных клеточных линий, соответственно. Данные представляют собой средние значения от трех лунок + SD.
[0013] На фиг. 3 показано, что СD123-специфичные Т-клетки высвобождают INF-γ и TNF-α и пролиферируют в ответ на СD123-экспрессирующие клетки-мишени. CD123-CAR-T-клетки или контрольные парные Т-клетки от трех здоровых доноров культивировали совместно с указанными клеточными линиями в течение 24 часов в соотношении Е:Т=10:1, и высвобождение INF-γ и TNF-α количественно оценивали с помощью методики Luminex multiplex bead. (В) Парные CFSE-меченные CD19- или СD123-специфичные Т-клетки культивировали совместно с указанными стимуляторными клеточными линиями в течение 96 часов в соотношении Е:Т=2:1 и анализировали с помощью проточной цитометрии по разведению CFSE. Нестимулированные Т-клетки (заштрихованные гистограммы) использовали в качестве контролей базальной пролиферации Т-клеток.
-
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
-
+
+
[0014] На фиг. 4 показана активация множественных CD4 и CD8 эффекторных функций CD123-специфичными CAR с последующим совместным культивированием с первичными AML-образцами. Парные CAR-инженерные Т-клетки совместно культивировали в течение шести часов с тремя различными первичными образцами от пациентов с AML (AML 179, 373 и 605) и анализировали на наличие поверхностной экспрессии CD107a и внутриклеточной продукции INF-γ и TNF-α. (А, столбчатые диаграммы) Процент DAPICD3CD8EGFRt-клеток, экспрессирующих CD107a. Данные представляют собой средние значения + S.D. (А, круговые диаграммы). Фракции CD3CD8EGFRt-клеток, подвергающихся дегрануляции и продуцирующи INF-γ и/или TNF-α, нанесены на круговые диаграммы. (В) Данные популяции DAPICD3CD4EGFRt из того же эксперимента, который описан в А и В. (С) Парные CFSE-меченные CD19- или CD123-специфичные Т-клетки культивировали совместно с указанными стимуляторными клетками в течение 72 часов в соотношении Е:Т=2:1 и анализировали с помощью проточной цитометрии по разведению CFSE в популяции DAPICD3EGFRt. Клеточные линии LCL и 562 служат положительными и отрицательными 27 контролями, соответственно. Пре-B-ALL 802 является первичным образцом от пациента, дважды положительным на CD19 и CD123. Расположение по квадрантам основано на нестимулированных Т-клетках.
51
+
[0015] На фиг. 5 показано, что первичные AML-клетки являются специфической мишенью CD123-специфичных Т-клеток. (А) Парные CD19- или CD123-специфичные Т-клетки в течение 4 часов культивировали совместно с Cr-меченными CD34 первичными AML-образцами в соотношении Е:Т=25:1. Клеточные линии LCL и К562 служат положительным и отрицательным контролем, соответственно. Пре-B-ALL 802 является первичным образцом от пациента, дважды положительным на CD19 и CD123. Данные представляют собой средние значения от трех лунок + S.D. (В) Специфический лизис AML-бластов в трех первичных образцах от пациентов с AML в (А). Данные представляют собой средние значения ± SEM. *р<0,05 и **р<0,0005 с помощью непарного t-теста Стьюдента, сравнивающего 26292 и 32716 c CD19R.
+
+
[0016] На фиг. 6 показано влияние CD123-CAR-экспрессирующих Т-клеток на нормальные и лейкемические клетки-предшественники in vitro. (А и В) Клети пуповинной крови CD34 (СВ) (n=3) были CD34-иммуномагнитным образом выбраны и культивированы совместно либо с CD19-, либо с CD123-специфичными парными Т-клетками, либо только со средой (необработанные) в течение 4 часов в соотношении Е:Т=25:1. Затем клетки высевали в полутвердую метилцеллюлозную культуру предшественников на 14-18 дней и оценивали наличие гранулоцитарно-макрофагальных колониеобразующих единиц (granulocyte-macrophage colony forming unit, CFU-GM, А) и эритроидных единиц, образующих "взрывообразные" колонии (burst forming unit erythroid, BFU-E, В). Проценты нормированы по CD19-специфическим Т-клеточным контролям. Данные представляют собой средние значения ± SEM для трех различных образцов СВ. (С) CD34 первичные образцы от пациентов с AML (AML 493, 519 или 545) были иммуномагнитным образом выбраны и культивированы совместно либо с CD19-, либо с CD123-специфичными парными Т-клетками, либо только со средой (необработанные) в течение 4 часов в соотношении Е:Т=25:1. Затем клетки высевали в полутвердую метилцеллюлозную культуру предшественников на 14-18 дней и оценивали наличие лейкемических колониеобразующих единиц (CFU-L). Проценты нормированы по CD19-специфическим Т-клеточным контролям. Данные представляют собой средние значения ± SEM для трех различных первичных образцов от пациентов с AML. *р<0,05 с помощью непарного t-теста Стьюдента, сравнивающего 26292 и 32716 с CD19R. (D) Комбинированное образование колоний СВ из (А) или AML-клеток из (С), обработанных CD123-нацеленной CAR-конструкцией (26292 или 32716), нормированное по CD19R. *р<0,05 с помощью непарного t-теста Стьюдента.
51
+
51
[0017] На фиг. 7 показано, что CD123-CAR-перенацеленные Т-клетки, полученные от пациентов с AML, специфически лизируют аутологичные бласты in vitro. (А) Т-клетки от трех пациентов с AML были трансдуцированы лентивирусным вектором для экспрессии CAR CD19R, 26292 или 32716. Показаны Т-клеточные линии от AML 722 через 19 дней после трансдукции. (В) Экспрессия CD123 на клетках-мишенях, используемых в анализе высвобождения Cr. Указан процент СD123-клеток и индекс относительной флуоресценции (relative fluorescence index, RFI) каждого образца. (С) Результаты 4-часовых анализов аутологичного киллинга (уничтожения) с использованием Т-клеток, полученных из образцов от трех пациентов с AML, в качестве эффекторов и Cr-меченных аутологичных CD34-обогащенных бластов в качестве клеток-мишеней. Данные представляют собой средние значения от трех лунок + S.D.
[0018] На фиг. 8 изменение размера опухоли показано путем биолюминесцентной визуализации мышей NSG, которым после введения линии AML-клеток KG1a, модифицированных для экспрессии люциферазы светлячка (день 5), в течение пяти дней вводили CD123CAR-трансдуцированные Т-клетки (26292), содержащие либо мутации S228P+L235E, либо мутации S228P+L235E+N297Q.
[0019] На фиг. 9 показана схема химерного антигенного рецептора (CAR), имеющего антиген-специфическую одноцепочечную Fv-область, шарнирную область, костимуляторный сигнальный домен и сигнальный домен дзета-цепи Т-клеточного рецептора в соответствии с некоторыми воплощениями (изображение из Urba WJ and Longo DL N Engl J Med 2011; 365: 754-757).
[0020] На фиг. 10 показана схема конструкции 32716CAR, имеющей мутацию L235E и мутацию S228P ("32716CAR(S228P+L235E)"), вместе с нуклеотидной последовательностью конструкции 32716CAR(S228P+L235E) (SEQ ID NO: 1 - антисмысловая нить (верхняя пронумерованная нить); SEQ ID NO: 5 - смысловая нить (нижняя непронумерованная нить)) и аминокислотной последовательностью конструкции 32716CAR(S228P+L235E) (SEQ ID NO: 9) в соответствии с некоторыми воплощениями. Мутации выделены жирным шрифтом.
[0021] На фиг. 11 показана схема конструкции 26292CAR, имеющей мутацию L235E и мутацию S228P ("26292CAR(S228P+L235E)"), вместе с нуклеотидной последовательностью конструкции 26292CAR(S228P+L235E) (SEQ ID NO: 2 - антисмысловая нить (верхняя пронумерованная нить); SEQ ID NO: 6 - смысловая нить (нижняя непронумерованная нить)) и аминокислотной последовательностью конструкции 26292CAR(S228P+L235E) (SEQ ID NO: 10) в соответствии с некоторыми воплощениями. Мутации выделены жирным шрифтом.
[0022] На фиг. 12 показана схема конструкции 32716CAR, имеющей мутацию L235E, мутацию S228P и мутацию N297Q ("32716CAR(S228P+L235E+N297Q)"), вместе с нуклеотидной последовательностью конструкции 32716CAR(S228P+L235E+N297Q) (SEQ ID NO: 3 - антисмысловая нить (верхняя пронумерованная нить); SEQ ID NO: 7 - смысловая цепь (нижняя непронумерованная нить)) и аминокислотной последовательностью конструкции 32716CAR(S228P+L235E+N297Q) (SEQ ID NO: 11) в соответствии с некоторыми воплощениями. Мутации выделены жирным шрифтом и подчеркнуты. Код основания R в IUPAC соответствует А или G, а код основания Y в IUPAC соответствует Т или С.
[0023] На фиг. 13 показана схема конструкции 26292CAR, имеющей мутацию L235E, мутацию S228P и мутацию N297Q ("26292CAR(S228P+L235E+N297Q)"), вместе с нуклеотидной последовательностью конструкции 26292CAR(S228P+L235E+N297Q) (SEQ ID NO: 4 - антисмысловая нить (верхняя пронумерованная нить); SEQ ID NO: 8 - смысловая нить (нижняя непронумерованная нить)) и аминокислотной последовательностью конструкции 26292CAR(S228P+L235E+N297Q) (SEQ ID NO: 12) в соответствии с некоторыми воплощениями. Мутации выделены жирным шрифтом. Код основания R в IUPAC соответствует А или G, а код основания Y в IUPAC соответствует Т или С.
-
-
+
-
-
+
-
-
+
[0024] На фиг. 14 показана экспрессия CD123 в первичных образцах AML и пуповинной крови. (А) Репрезентативный пример экспрессии CD123 на первичных AML-клетках. Клетки гейтировали по популяции DAPIродCD34 и оценивали экспрессию CD123 (черный - изотипический контроль, красный - анти-CD123). (В) Процент CD123-положительных клеток, экспрессированных в популяции DAPIродCD34. Каждая точка представляет собой отдельный образец. (С) Относительный показатель флуоресценции (RFI) CD123 в популяции DAPIродCD34. RFI рассчитывается путем деления медианы анти-CD123-клеток на медиану меченых клеток изотипического контроля. (D) Наложение гистограмм экспрессии CD123 на клетках AML 605 (красный), AML 722 (синий) и образца пуповинной крови (серый). Изотипический контроль показан черным цветом.
+
+
+
+
+
+
[0025] На фиг. 15 показана стратегия гейтирования, используемая для исследования активации множественных эффекторных функций CD123-специфичными Т-клетками в ответ на инкубацию с первичными образцами от пациентов с AML. Стратегия гейтирования для полихроматической проточной цитометрии для определения Т-клеточных эффекторных функций показана для CD123-CAR- (на основе 26292) Т-клеток после совместного культивирования с AML 373. (А) Начальное гейтирование установлено на CD3-клетки. (В) Вторичное гейтирование, установленное с помощью флуоресценции минус один контроль, установлено на EGFRt-клетки. (С) Третичное гейтирование установлено на CD4- и CD8-популяции. (D) Финальное гейтирование установлено на CD107a-клетки. (Е) Продукция IFN-γ и TNF-α в популяциями CD107a. Квадранты установлены с помощью меченых образцов изотипического контроля. В каждом квадранте отмечены проценты.
-
+
+
[0026] На фиг. 16 показано, что CFSE разводят в обеих популяциях, CD4 и CD8, CAR-экспрессирующих Т-клеток. Субпопуляции клеток CD4 (А) и CD8 (В) показаны на фиг. 5С. После первоначального гейтирования на DAPICD3EGFRt-клетки анализировали клетки CD4 и CD8 по разведению CFSE после совместного культивирования с первичными образцами от пациентов с AML. Расположение по квадрантам основано на нестимулированных Т-клетках.
Подробное описание изобретения
[0027] Некоторые воплощения данного изобретения описаны подробно с помощью конкретных примеров, последовательностей и графических материалов. Перечисленные воплощения не предназначены для ограничения изобретения этими воплощениями, поскольку подразумевается, что изобретение охватывает все альтернативы, модификации и эквиваленты, которые могут быть включены в объем данного изобретения, определенный формулой изобретения. Специалисту в данной области будут очевидны многочисленные способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в данном документе, которые могут быть использованы в осуществлении данного изобретения на практике.
[0028] В некоторых воплощениях предложен ген, кодирующий опухолеспецифический химерный антигенный рецептор (CAR). Согласно некоторым воплощениям этот ген кодирует CD123-специфичный CAR (CD123CAR). Ген CD123CAR включает одноцепочечную анти-CD123-Fv-область (scFv) и один или более чем один из следующих доменов: шарнирную область, костимуляторный сигнальный домен, внутриклеточный сигнальный домен или их комбинацию.
[0029] В некоторых воплощениях ген CD123CAR может включать, но не ограничиваясь ими, одноцепочечную анти-CD123-Fv-область (scFv), шарнирную область, возможно, по меньшей мере один костимуляторный сигнальный домен и, возможно, внутриклеточный сигнальный домен.
[0030] В некоторых воплощениях ген CD123CAR может включать, но не ограничиваясь ими, одноцепочечную анти-CD123-Fv-область (scFv), шарнирную область, по меньшей мере один костимуляторный сигнальный домен и внутриклеточный сигнальный домен (фиг. 9).
[0031] Анти-CD123-scFv-область может включать нуклеотидную последовательность, которая при экспрессии может связывать эпитоп CD123. В некоторых воплощениях анти-CD123-scFv-область включает нуклеотид, который кодирует VH- и VL-домен рекомбинантных иммунотоксинов (recombinant immunotoxin, RIT) 26292 32716 и [18]. Ген CD123CAR, который нацелен на 26292, и ген CD123CAR, который нацелен на 32716, также упоминаются в данном документе как 26292CAR и 32716CAR, соответственно. В некоторых воплощениях анти-CD123-scFv-область может включать нуклеотидную последовательность, выбранную среди следующих:
нуклеотиды 82-814 из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 для 32716CAR; или
нуклеотиды 82-792 из SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4 для 26292CAR.
[0032] Указанные нуклеотидные последовательности кодируют аминокислотные последовательности, выбранные среди следующих:
остатки 23-266 из SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 11 при использовании в 32716CAR; или
остатки 23-259 из SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 12 при использовании в 26292CAR.
[0033] В некоторых воплощениях анти-CD123-scFv-область может быть модифицирована для улучшения связывания или для снижения иммуногенности. Например, в одном аспекте анти-CD123-scFv-область может быть гуманизированной анти-CD123-scFv-областью.
[0034] Шарнирная область может включать по меньшей мере часть иммуноглобулина (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), которая находится между доменами СН2-СН3. В некоторых воплощениях шарнирная область представляет собой модифицированную шарнирную область. Модифицированная шарнирная область может иметь одну или более чем одну аминокислотную замену или модификацию, которая способствует снижению влияния CD123CAR "мимо мишени", тем самым увеличивая его специфичность и эффективность. Термины "аминокислотная модификация" или "аминокислотная замена" или "замена", используемые в данном документе, означают аминокислотную замену, вставку и/или делецию в последовательности белка или пептида. Термины "аминокислотная замена" или "замена", используемые в данном документе, означают замену аминокислоты в определенной позиции в исходной пептидной или белковой последовательности на другую аминокислоту. Например, замена S228P относится к вариантному белку или пептиду, в котором серин в позиции 228 заменен пролином.
[0035] Аминокислотные замены могут быть получены путем мутации, например, конкретный кодон в нуклеиновокислотной последовательности, кодирующей белок или пептид, заменен на кодон, кодирующий другую аминокислоту. Такую мутацию, как правило, получают путем наименьшего из возможных нуклеотидных изменений. Замена такого рода может быть сделана для того, чтобы изменить аминокислоту в образующемся белке неконсервативным образом (т.е. путем изменения кодона аминокислоты, принадлежащей к группе аминокислот, имеющих определенный размер или характеристику, на кодон аминокислоты, принадлежащей к другой группе) или консервативным образом (т.е., путем изменения кодона аминокислоты, принадлежащей к группе аминокислот, имеющих определенный размер или характеристику, на кодон аминокислоты, принадлежащей к той же группе). Такая консервативным замена, как правило, приводит к меньшим изменениям в структуре и функции полученного белка.
[0036] Ниже приведены примеры различных групп аминокислот:
- Аминокислоты с неполярными R-группами: аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, триптофан, метионин
- Аминокислоты с незаряженными полярными R-группами: глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин, глутамин
- Аминокислоты с заряженными полярными R-группами (отрицательно заряженные при рН 6,0): аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота
- Основные аминокислоты (положительно заряженные при рН 6,0): лизин, аргинин, гистидин (при рН 6,0)
[0037] Другая группа может состоять из аминокислот с фенильными группами: фенилаланин, триптофан, тирозин.
[0038] Другое группирование может быть проведено в соответствии с молекулярной массой (т.е. размером R-групп), как показано ниже:
Глицин
75
Аланин
89
Серин
105
Пролин
115
Валин
117
Треонин
119
Цистеин
121
Лейцин
131
Изолейцин
131
Аспарагин
132
Аспарагиновая кислота
133
Глутамин
146
Лизин
146
Глутаминовая кислота
147
Метионин
149
Гистидин (при рН 6,0)
155
Фенилаланин
165
Аргинин
174
Тирозин
181
Триптофан
204
[0039] В некоторых воплощениях модифицированная шарнирная область получена из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 и включает один или более чем один аминокислотный остаток, замещенный аминокислотным остатком, отличающимся от присутствующего в немодифицированной шарнирной области. Один или более чем один замещенный аминокислотный остаток выбран среди одного или более чем одного из аминокислотных остатков в позициях: 220, 226, 228, 229, 230, 233, 234, 235, 234, 237, 238, 239, 243, 247, 267, 268, 280, 290, 292, 297, 298, 299, 300, 305, 309, 218, 326, 330, 331, 332, 333, 334, 336, 339 или их комбинаций, но не ограничиваясь ими.
[0040] В некоторых воплощениях модифицированная шарнирная область получена из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 и включает, но не ограничиваясь ими, одну или более чем одну из следующих аминокислотных замен: C220S, C226S, S228P, C229S, P230S, Е233Р, V234A, L234V, L234F, L234A, L235A, L235E, G236A, G237A, P238S, S239D, F243L, P247I, S267E, H268Q, S280H, K290S, K290E, K290N, R292P, N297A, N297Q, S298A, S298G, S298D, S298V, Т299А, Y300L, V305I, V309L, Е318А, K326A, K326W, K326E, L328F, A330L, А330, A331S, P331S, I332E, Е333А, E333S, E333S, K334A, A339D, A339Q, P396L или их комбинаций (50).
[0041] В некоторых воплощениях модифицированная шарнирная область получена из шарнирной области IgG4, имеющей следующую аминокислотную последовательность:
Позиция 219 ESKYGPPCPS CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ EDPEVQFNWY Позиция 279 VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK Позиция 339
AKGQPREPQV YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL Позиция 399 DSDGSFFLYS LTVDKSRWQ EGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSLGK (SEQ ID NO: 13)
[0042] В некоторых воплощениях модифицированная шарнирная область получена из IgG4 и включает один или более чем один аминокислотный остаток, замещенный на аминокислотный остаток, отличающийся от присутствующего в немодифицированной шарнирной области. Один или более чем один замещенный аминокислотный остаток выбран среди одного или более чем одного из аминокислотных остатков в позициях: 220, 226, 228, 229, 230, 233, 234, 235, 234, 237, 238, 239, 243, 247, 267, 268, 280, 290, 292, 297, 298, 299, 300, 305, 309, 218, 326, 330, 331, 332, 333, 334, 336, 339 или их комбинаций, но не ограничиваясь ими.
[0043] В некоторых воплощениях модифицированная шарнирная область получена из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 и включает, но не ограничиваясь ими, одну или более чем одну из следующих аминокислотных замен: 220S, 226S, 228Р, 229S, 230S, 233Р, 234А, 234V, 234F, 234А, 235а, 235Е, 236А, 237А, 238S, 239D, 243L, 247I, 267Е, 268Q, 280Н, 290S, 290Е, 290N, 292Р, 297А, 297Q, 298А, 298g, 298D, 298V, 299А, 300L, 305I, 309L, 318А, 326А, 326W, 326Е, 328F, 330L, 330S, 331S, 331S, 332Е, 333А, 333S, 333S, 334а, 339D, 339Q, 396L или их комбинаций, где аминокислота в немодифицированной шарнирной области замещена указанными выше аминокислотами в указанной позиции.
[0044] В некоторых воплощениях модифицированная шарнирная область IgG4 включает, но не ограничиваясь ими, замену серина (S) на пролин (Р) в позиции 228 (S228P), замену глутаминовой кислоты (Е) на лейцин (L) в позиции 235 (L235E), замену глутамина (Q) на аспарагин (N) в позиции 297 (N297Q). В некоторых воплощениях модифицированная шарнирная область IgG4 может включать нуклеотидную последовательность, выбранную среди следующих:
нуклеотиды 814-1500 из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 для 32716CAR; или
нуклеотиды 793-1479 из SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4 для 26292CAR.
[0045] Указанные нуклеотидные последовательности кодируют аминокислотные последовательности, выбранные среди следующих:
остатки 267-495 из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 при использовании в 32716CAR; или
остатки 260-488 из SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4 при использовании в 26292CAR.
[0046] В одном воплощении модифицированная шарнирная область IgG4 включает замену S228P и замену L235E ("S228P+L235E") (см. фиг. 10 и 11). В другом воплощении модифицированная шарнирная область IgG4 включает замену S228P, замену L235E и замену N297Q ("S228P+L235E+N297Q") (см. фиг. 12 и 13).
[0047] В некоторых воплощениях шарнирная область может быть модифицирована путем замены Fc-спейсерной области в C123CAR на спейсер, не способный к Fc-связыванию, например, на шарнирную область CD8a. Альтернативно, Fc-спейсер шарнирной области может быть удален. Такие замены будут уменьшать или устранять Fc-связывание.
[0048] Термин "позиция", используемый в данном документе, представляет расположение в последовательности белка. Позиции могут быть пронумерованы последовательно или в соответствии с утвержденным форматом, например, позиция по Kabat, или позиция по ЕС, или индекс ЕС по Kabat. Для всех позиций, обсуждаемых в данном документе, нумерация осуществляется в соответствии с индексом ЕС или схемой нумерации ЕС (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, полностью включен в данный документ посредством ссылки). Индекс ЕС, или индекс ЕС по Kabat, или схема нумерации ЕС, относится к нумерации антитела по ЕС (Edelman et al., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63: 78-85, полностью включен в данный документ посредством ссылки). Позиции по Kabat, хорошо известные в данной области, могут отличаться от позиций по ЕС для данной позиции. Например, замены S228P и L235E, описанные выше, относятся к позициям по ЕС. Тем не менее, эти замены могут также соответствовать позициям по Kabat 241 (S241P) и 248 (L248E) [21].
[0049] Костимуляторный сигнальный домен может включать любой подходящий костимуляторный домен, включая, но не ограничиваясь ими, костимуляторный домен 4-1ВВ, костимуляторный домен ОХ-40, костимуляторный домен CD27 или костимуляторный домен CD28. В соответствии с воплощениями, описанными в данном документе, CD123CAR может включать по меньшей мере один костимуляторный сигнальный домен. В одном аспекте CD123CAR имеет один костимуляторный сигнальный домен, или он может включать два или более двух костимуляторных сигнальных доменов, таких как описанные выше. В другом аспекте костимуляторный домен может быть составлен из одного костимуляторного домена, такого как описанные выше, или, альтернативно, он может быть составлен из двух или более чем двух костимуляторных доменов в двух или более позициях. Альтернативно, в некоторых воплощениях CD123CAR не включает костимуляторный сигнальный домен.
[0050] В одном воплощении CD123CAR включает костимуляторный сигнальный домен, который является костимуляторным доменом CD28. Сигнальный домен CD28 может включать модифицированный трансмембранный домен CD28. В одном воплощении такой модифицированный трансмембранный домен CD28 имеет одну или более чем одну аминокислотную замену или модификацию, включая, но не ограничиваясь ими, замену лейцина-лейцина (LL) на глицин-глицин (GG) в аминокислотных остатках 530-531 из SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 12; или остатках 523-524 из SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 13 (например, RLLH → RGGH [22]). В некоторых воплощениях модифицированный костимуляторный сигнальный домен может включать нуклеотидную последовательность, выбранную среди следующих:
нуклеотиды 1501-1707 из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 для 32716CAR; или
нуклеотиды 1480-1686 из SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4 для 26292CAR.
[0051] Указанные нуклеотидные последовательности кодируют аминокислотные последовательности, выбранные среди следующих:
остатки 498-564 из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 при использовании в 32716CAR; или
остатки 489-557 из SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4 при использовании в 26292CAR.
[0052] Внутриклеточный сигнальный домен может включать любой подходящий Т-клеточный рецепторный (TCR) комплекс, часть его сигнального домена. В некоторых воплощениях внутриклеточный сигнальный домен является сигнальным доменом дзета-цепи (цепи ζ) TCR. В некоторых воплощениях сигнальный домен ζ-цепи может включать нуклеотидную последовательность, выбранную среди следующих:
нуклеотиды 1717-2052 из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 для 32716CAR; или
нуклеотиды 1696-2031 из SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4 для 26292CAR.
[0053] Указанные нуклеотидные последовательности кодируют аминокислотные последовательности, выбранные среди следующих:
остатки 568-679 из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 при использовании в 32716CAR;
остатки 561-672 из SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4 при использовании в 26292CAR.
[0054] Таким образом, в соответствии с воплощениями, описанными выше, ген CD123CAR может включать нуклеотидную последовательность, выбранную среди SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4. В других воплощениях ген CD123CAR может кодировать аминокислотную последовательность, выбранную среди SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12 (фиг. 10, 11, 12, 13).
Экспрессия генов CD123CAR и трансдукция Т-клеток
[0055] В некоторых воплощениях ген CD123CAR является частью экспрессионной кассеты. В некоторых воплощениях экспрессионная кассета может - в дополнение к гену CD123CAR - также включать вспомогательный ген. При экспрессии Т-клеткой вспомогательный ген может служить маркером селекции трансдуцированных Т-клеток, маркером отслеживания in vivo или суицидным геном для трансдуцированных Т-клеток.
[0056] В некоторых воплощениях вспомогательный ген представляет собой ген усеченного EGFR (EGFRt). EGFRt может быть использован в качестве неиммуногенного инструмента селекции (например, иммуномагнитной селекции с использованием биотинилированного цетуксимаба в комбинации с анти-биотиновыми микрогранулами для обогащения Т-клеток, которые были трансдуцированы лентивирусными конструкциями, содержащими EGFRt), маркера для отслеживания (например, анализа путем проточной цитометрии для отслеживания приживления Т-клеток) и суицидного гена (например, с помощью Цетуксимаб/Эрбитукс-опосредованной антителозависимой цитотоксичности (antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC)). Пример гена усеченного EGFR (EGFRt), который может быть использован в соответствии с воплощениями, описанными в данном документе, описан в международной патентной заявке PCT/US2010/055329, содержание которой включено в данный документ посредством ссылки, как если бы она полностью была изложена в данном документе. В других воплощениях вспомогательный ген представляет собой ген усеченного CD19 (CD19t).
[0057] В другом воплощении вспомогательный ген представляет собой индуцируемый суицидный ген. Суицидный ген представляет собой рекомбинантный ген, который вызывает у клеток, экспрессирующих этот ген, запрограммированную клеточную гибель или опосредованный антителами вывод в заданное время. В одном воплощении индуцируемый суицидный ген, который может быть использован в качестве вспомогательного гена, представляет собой индуцируемый ген каспазы 9 (см. Straathof et al. (2005) An inducible caspase 9 safety switch for T-cell therapy. Blood. June 1; 105(11): 4247-4254, содержание которой включено в данный документ посредством ссылки, как если бы она была полностью изложена в данном документе).
[0058] В некоторых воплощениях экспрессионная кассета, которая включает ген CD123CAR, описанный выше, может быть встроена в вектор для доставки - путем трансдукции или трансфекции - в клетку-мишень. Может быть использован любой подходящий вектор, например, бактериальный вектор, вирусный вектор или плазмида. В некоторых воплощениях вектор представляет собой вирусный вектор, выбранный среди ретровирусного вектора, лентивирусного вектора, поксвирусного вектора, аденовирусного вектора или аденоассоциированного вирусного вектора. В некоторых воплощениях вектор может трансдуцировать популяцию здоровых Т-клеток. Успешно трансдуцированные или трансфицированные клетки-мишени экспрессируют один или более чем один ген, который является частью экспрессионной кассеты.
[0059] Таким образом, одна или более чем одна популяция Т-клеток может быть трансдуцирована геном CD123CAR. В некоторых воплощениях ген CD123CAR включает нуклеотидную последовательность, выбранную среди SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4. Соответственно, в некоторых воплощениях трансдуцированные Т-клетки экспрессируют ген CD123CAR, который кодирует аминокислотную последовательность, выбранную среди SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12 (фиг. 10, 11, 12, 13). Трансдуцированные Т-клетки могут быть получены от донора или могут быть получены от субъекта, имеющего AML и нуждающегося в лечении AML. В некоторых воплощениях трансдуцированные Т-клетки используются в адоптивной иммунотерапии для лечения AML.
[0060] Кроме того, одна или более чем одна популяция Т-клеток может быть частью фармацевтически приемлемой композиции для доставки для введения субъекту. В дополнение к CD123CAR-трансдуцированным Т-клеткам фармацевтически эффективная композиция может включать один или более чем один фармацевтически эффективный носитель. Термин "фармацевтически приемлемый носитель", используемый в данном документе, относится к фармацевтически приемлемому материалу, композиции или носителю, которые участвуют в реализации или транспортировке лекарственного агента, представляющего интерес, из одной ткани, органа или части тела в другую ткань, орган или часть тела. Такой носитель может содержать, например, жидкий, твердый или полутвердый наполнитель, растворитель, поверхностно-активный агент, разбавитель, эксципиент, адъювант, связующий агент, буфер, агент, способствующий растворению, растворитель, материал для инкапсулирования, секвестрант (изолирующий агент), диспергирующий агент, консервант, смазку, разрыхлитель, загуститель, эмульгатор, противомикробный агент, антиоксидант, стабилизирующий агент, краситель или какую-либо их комбинацию.
[0061] Каждый компонент носителя является "фармацевтически приемлемый" в том смысле, что он должен быть совместимым с другими ингредиентами композиции и должен быть пригоден для контакта с какой-либо тканью, органом или частью тела, с которой он может встретиться, и это означает, что он не должен нести риска токсичности, раздражения, аллергической реакции, иммуногенности или любого другого осложнения, которое чрезмерно превышает его терапевтический эффект.
[0062] Некоторые примеры материалов, которые могут служить в качестве фармацевтически приемлемых носителей, включают: (1) сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза; (2) крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; (3) целлюлозу и ее производные, такие как натрий-карбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза и ацетат целлюлозы; (4) порошкообразный трагакант; (5) солод; (6) природные полимеры, такие как желатин, коллаген, фибрин, фибриноген, ламинин, декорин, гиалуроновая кислота, альгинат и хитозан; (7) тальк; (8) эксципиенты, такие как масло какао и воски для суппозиториев; (9) масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, сафлоровое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло; (10) гликоли, такие как пропиленгликоль; (11) полиолы, такие как глицерин, сорбит, маннит и полиэтиленгликоль; (12) сложные эфиры, такие как триметилен карбонат, этилолеат и этиллаурат; (13) агар; (14) буферные агенты, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; (15) альгиновую кислоту (или альгинат); (16) апирогенную воду; (17) изотонический раствор; (18) раствор Рингера; (19) спирт, такой как этиловый спирт и пропановый спирт; (20) фосфат-буферные растворы; (21) термопласты, такие как полимолочная кислота, полигликолевая кислота, (22) полиэфиры, такие как поликапролактон; (23) самоорганизующиеся пептиды; и (24) другие нетоксичные совместимые вещества, используемые в фармацевтических составах, такие как ацетон.
[0063] Фармацевтические композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для физиологических условий, такие как агенты для подведения рН и буферные агенты, агенты для регуляции токсичности и т.п., например, ацетат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, лактат натрия и т.п.
[0064] В одном воплощении фармацевтически приемлемый носитель представляет собой водный носитель, например забуференный физиологический раствор и т.п. В некоторых воплощениях фармацевтически приемлемый носитель представляет собой полярный растворитель, например ацетон и спирт.
[0065] Концентрация СD123CAR-трансдуцированных Т-клеток в этих составах может широко варьировать и будет выбрана в первую очередь на основании объема жидкости, вязкости, размера органа, массы тела и т.п. в соответствии с конкретным выбранным способом введения и потребностями биологической системы.
[0066] В некоторых воплощениях популяции Т-клеток, трансдуцированных геном CD124CAR (т.е. СD124CAR-трансдуцированные Т-клетки), такие как описанные в данном документе клетки, используемые в способах нацеливания и уничтожения AML-клеток, могут быть выращены в культуре клеток. В некоторых аспектах этого воплощения способ может быть использован in vitro или в условиях исследования для изучения роли CD123 в этиологии AML или для оценки нацеливающих способностей новых СD123CAR-конструкций.
Лечение AML с помощью СD123CAR-трансдуцированных Т-клеток
[0067] В соответствии с некоторыми воплощениями гены CD123CAR и популяции Т-клеток, которые трансдуцированы генами CD123CAR, такие как описаны выше, могут быть использованы в способах лечения AML у субъекта. Такие способы могут включать этап введения субъекту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одной популяции Т-клеток, трансдуцированных по меньшей мере одним геном CD123CAR. В этих воплощениях популяция CD123CAR-трансдуцированных Т-клеток экспрессирует один или более чем один ген CD123CAR, такой как описанные выше. В некоторых воплощениях Т-клетки трансдуцированы и экспрессируют генную конструкцию 32716CAR (S228P+L235E+N297Q) (фиг. 12) или генную конструкцию 26292CAR (S228P+L235E+N297Q) (фиг. 13). Когда такие клетки вводят при адоптивной иммунотерапии, трансдуцированные Т-клетки специфически нацелены и лизируют СD123-экспрессирующие клетки (например, AML-клетки) in vivo, тем самым обеспечивая их терапевтический эффект по устранению раковых клеток. Как описано в приведенных ниже примерах, генные конструкции CD123CAR, имеющие мутации S228P и L235E в шарнирной области, обеспечивают достаточную защиту от эффектов "мимо мишени", давая достаточный ответ в культивируемых клетках in vitro. Тем не менее, эти данные не должны быть экстраполированы на эффект этих конструкций in vivo. Исследователи часто придают большое значение данным in vitro относительно переноса эффекта какой-либо терапии на данные in vivo. Иногда данные in vitro действительно совпадают с данными in vivo. Тем не менее, эта корреляция является непредсказуемой, потому как фиг. 8 показывает, что генные конструкции CD123CAR (S228P+L235E) (фиг. 10-11), которые показали высокоэффективный противоопухолевый эффект in vitro, не имеют таких же эффектов in vivo. Поэтому в шарнирной области была сделана дополнительная мутация (N297Q) для получения конструкций CD123CAR (S228P+L235E+N297Q). В отличие от генных конструкций CD123CAR (S228P+L235E) введение этих конструкций привело к значительному снижению лейкемической нагрузки.
[0068] Популяция или популяции Т-клеток, трансдуцированных геном или генами CD123CAR, которые могут быть использованы в соответствии с описанными здесь способами, могут быть введены с помощью любого подходящего пути введения, отдельно или как часть фармацевтической композиции. Путь введения может относиться к любому пути введения, известному в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, внутричерепной, парентеральный или трансдермальный. "Парентеральный" относится к пути введения, который, как правило, связан с инъекцией, включая подглазничную, инфузию, внутриартериальную, внутрисуставную, внутрисердечную, внутрикожную, внутримышечную, внутрибрюшинную, внутрилегочную, интраспинальную, интрастернальную, интратекальную, внутриопухолевую, внутриматочную, внутривенную, субарахноидальную, субкапсулярную, подкожную, чрезслизистую или транстрахеальную. В некоторых воплощениях трансдуцированные Т-клетки вводят внутривенно или интратекально.
st
[0069] Термин "эффективное количество", используемый в данном документе, относится к количеству агента, соединения, лекарственного препарата или терапии, которое производит нужный эффект. Например, популяция клеток может контактировать с эффективным количеством агента, соединения, лекарственного препарата или терапии для изучения их влияния in vitro (например, на культуру клеток) или для получения желаемого терапевтического эффекта ех vivo или in vitro. Эффективное количество агента, соединения, лекарственного препарата или терапии может быть использовано для получения у субъекта терапевтического эффекта, такого как профилактика или лечение целевого состояния, облегчение симптомов, связанных с состоянием, или получение желаемого физиологического эффекта. В таком случае эффективное количество соединения является "терапевтически эффективным количеством", "терапевтически эффективной концентрацией" или "терапевтически эффективной дозой". Точное эффективное количество или терапевтически эффективное количество представляет собой количество композиции, которое даст наиболее эффективные результаты в плане эффективности лечения у данного субъекта или в популяции клеток. Это количество будет варьировать в зависимости от целого ряда факторов, включая, но не ограничиваясь ими, характеристики соединения (включая активность, фармакокинетику, фармакодинамику и биодоступность), физиологическое состояние субъекта (включая возраст, пол, тип и стадию заболевания, общее физическое состояние, чувствительность к данной дозе и тип лекарства) или клеток, природу фармацевтически приемлемого носителя или носителей в составе, а также способ введения. Также эффективное или терапевтически эффективное количество может варьировать в зависимости от того, вводится ли соединение отдельно или в комбинации с другим соединением, лекарственным препаратом или другим терапевтическим способом или подходом к лечению. Специалисты в клинической и фармакологической области смогут определить эффективное количество или терапевтически эффективное количество путем стандартных экспериментов, а именно путем мониторинга реакции клетки или субъекта на введение соединения и подведение дозировки, соответственно. Дополнительные указания см. в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21 Edition, Univ. of Sciences in Philadelphia (USIP), Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2005, который включен в данный документ посредством ссылки, как если бы он был полностью изложен в данном документе. Агенты, соединения или способы лечения, которые могут быть использованы в эффективном количестве или терапевтически эффективном количестве для получения нужного эффекта в соответствии с воплощениями, описанными в данном документе, могут включать, но не ограничиваясь ими, ген CD123CAR, экспрессионную кассету, которая включает ген CD123CAR, вектор, который доставляет экспрессионную кассету, включающую ген CD123CAR, в клетку-мишень, такую как Т-клетка, и популяцию Т-клеток, трансдуцированных геном CD123CAR.
[0070] Термин "лечение" состояния может относиться к предотвращению состояния, замедлению начала или скорости развития состояния, снижению риска развития этого состояния, профилактике или замедлению развития симптомов, связанных с состоянием, уменьшению или прекращению проявления симптомов, связанных с состоянием, получению полной или частичной регрессии состояния или к какой-либо их комбинации. Лечение может также означать профилактическое лечение состояния.
[0071] Термин "субъект", используемый в данном документе, относится к человеку или животному, включая всех млекопитающих, таких как приматы (особенно высшие приматы), овцы, собаки, грызуны (например, мыши или крысы), морские свинки, козы, свиньи, кошки, кролики и коровы. В некоторых воплощениях субъектом является человек.
[0072] В некоторых воплощениях способы лечения AML могут включать этап введения терапевтически эффективного количества первой популяции Т-клеток, трансдуцированных первым геном CD123CAR, в комбинации с терапевтически эффективным количеством второй популяции Т-клеток, трансдуцированных вторым геном CD123CAR.
[0073] В других воплощениях CD123CAR-трансдуцированные Т-клетки могут быть введены в комбинации с одним или более чем одним дополнительным противораковым терапевтическим подходом. Термины "в комбинации" или "в комбинации с", используемые в данном документе, означают "в ходе лечения" того же рака у того же субъекта с использованием двух или более агентов, лекарственных препаратов, терапевтических подходов, процедур, схем лечения, способов лечения или их комбинаций в любом порядке. Они включают одновременное введение, а также введение, разнесенное во времени на несколько дней. Такое комбинированное лечение также может включать более чем одно введение одного или более чем одного агента, терапевтического препарата, процедуры, схемы лечения и способа лечения. Кроме того, введение двух или более агентов, лекарственных препаратов, терапевтических подходов, процедур, схем лечения, способов лечения или их комбинация могут быть осуществлены одинаковыми или разными путями введения.
[0074] Дополнительные противораковые терапевтические подходы, которые могут быть использованы в соответствии со способами, описанными в данном документе, могут включать одну или более чем одну противораковую процедуру, способ лечения, противораковые лекарственные препараты или их комбинации. В некоторых воплощениях CD123CAR-трансдуцированные Т-клетки могут быть введены в комбинации с одной или более чем одной противораковой процедурой или лечебным подходом, включая, но не ограничиваясь ими, трансплантацию стволовых клеток (например, трансплантацию костного мозга или трансплантацию стволовых клеток периферической крови с использованием аллогенных стволовых клеток, аутологичных стволовых клеток; или немиелоаблативную трансплантацию), лучевую терапию или хирургическую резекцию. В других воплощениях CD123CAR-трансдуцированные Т-клетки могут быть введены в комбинации с одним или более чем одним противораковым терапевтическим подходом или лекарством, которые могут быть использованы для лечения AML, включая, но не ограничиваясь ими, химиотерапевтические и другие противораковые лекарственные препараты, иммунотерапевтические препараты, нацеленные терапевтические препараты или их комбинации.
[0075] Химиотерапевтические и другие противораковые препараты, которые могут быть введены в комбинации с CD123CAR-трансдуцированными Т-клетками в соответствии с воплощениями, описанными в данном документе, включают, но не ограничиваясь ими, полностью транс-ретиноевую кислоту (all-trans-retinoic acid, ATRA), триоксид мышьяка, антрациклиновые антибиотики и их фармацевтически приемлемые соли (например, доксорубицина гидрохлорид, даунорубицина гидрохлорид, идарубицин, митоксантрон), алкилирующие агенты (например, циклофосфамид, ларомустин), антиметаболические аналоги (цитарабин, 6-тиогуанин, 6-меркаптопурин, метотрексат), деметилирующие агенты (например, децитабин, 5-азацитидин), ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот (например, гидроксимочевина), ингибиторы топоизомеразы (например, этопозид), алкалоиды барвинка (например, сульфат винкристина) или их комбинации (например, "ADE", которая представляет собой комбинированную терапию, которая включает комбинацию цитарабина (Ara-С), даунорубицина гидрохлорида и этопозида).
[0076] Иммунотерапевтические средства, которые могут быть введены в комбинации с CD123CAR-трансдуцированными Т-клетками в соответствии с воплощениями, описанными в данном документе, включают, но не ограничиваясь ими, иммуномодулирующие реагенты (например, ингибиторы STAT3, леналидомид) и терапевтические моноклональные антитела. Терапевтические моноклональные антитела могут быть сконструированы для нацеливания на (i) один или более чем один AML-антиген, включая, но не ограничиваясь ими, CD33 (например, гемтузумаб, линтузумаб), MUC1 (например, кантузумаб равтанзин, кливатузумаб тетраксетан, пемтумомаб); (ii) В-клеточный антиген (например, ритуксимаб, офатумумаб); или сосудистый модулятор, такой как VEGF или VEGFR (например, алацизумаб пегол, бевацизумаб, икрукумаб, рамуцирумаб, ранибизумаб).
[0077] Нацеленные терапевтические средства, которые могут быть введены в комбинации с CD123CAR-трансдуцированными Т-клетками в соответствии с воплощениями, описанными в данном документе, включают, но не ограничиваясь ими, ингибиторы тирозинкиназы (иматиниб, дазатиниб, нилотиниб, сунитиниб), ингибиторы фарнезилтрансферазы (например, типифарниб), ингибиторы FLT и ингибиторы с-Kit (или CD117) (иматиниб, дазатиниб, нилотиниб).
Пример 1: CD123CAR-трансдуцированные Т-клетки обладают высокой цитолитической активностью и множественными эффекторными функциями против AML in vitro
Материалы и методы
[0078] Клеточные линии. Если не указано иное, то все клеточные линии поддерживали в среде RPMI 1640 (Irvine Scientific) с добавлением 2 мМ L-глутамина, 25 мМ HEPES и 10% инактивированной нагреванием FCS (Hyclone), далее именуемой полной средой (complete medium, СМ). Мононуклеарные клетки периферической крови (peripheral blood mononuclear cell, PBMC) были трансформированы вирусом Эпштейна-Барр для получения лимфобластоидных клеточных линий (lymphoblastoid cell line, LCL), как описано ранее [19]. Клетки LCL-ОКТ3 экспрессируют мембранный ОКТ3 и растут в СМ, дополненной 0,4 мг/мл гигромицина [20]. Клетки К562 были получены из АТСС и культивированы в соответствии с рекомендациями. Клетки KG1a (любезно предоставленные доктором Ravi Bhatia) поддерживали в IMDM (Irvine Scientific) с 25 мМ HEPES, 4 мМ L-глутамина (Irvine Scientific) и 20% FCS. Клетки 293Т (подарок от Center for Biomedicine and Genetics at City of Hope) поддерживали в DMEM + 10% инактивированной нагреванием FCS.
[0079] Первичные образцы AML. Первичные образцы AML были получены из периферической крови пациентов (в данном документе они называются образцами AML ID №№179. 373, 493, 519, 545, 559, 605, 722 и 813). Характеристики образцов приведены в таблице 1 ниже.
[Таблица 1 на следующей странице]
[0080] Проточная цитометрия. Конъюгированные с флуорохромом изотипические контроли, анти-CD4, анти-CD8, анти-Т-клеточный рецептор αβ (TCRαβ), анти-CD123 (9F5), анти-CD34 (8G12) и анти-CD38 (HIT2) были приобретены у BD Biosciences. Биотинилированный анти-Fc был приобретен у Jackson ImmunoResearch Laboratories. Биотинилированный цетуксимаб (Эрбитукс) был приобретен в аптеке СОН и был описан ранее [20]. Биотинилированные анти-CD2, анти-CD3, анти-CD7, анти-CD10, анти-CD11b, анти-CD19, анти-CD33 и анти-CD235A были приобретены у eBioscience. Сбор данных проводили на FACSCalibur, LSRII (BD Biosciences) или MACSQuant Analyzer (Miltenyi Biotec) и анализировали с помощью FCS Express, версия 3 (программное обеспечение De Novo Software).
[0081] Трансфекция клеток 293Т с помощью CD123. кДНК CD123 амплифицировали из CD123-pMD18-T (Sino Biological Inc.) путем полимеразной цепной реакции с использованием праймеров (CD123-F: 5'-ATAAGGCCTGCCGCCACCATGGTCCTCCTTTGGCTCACG-3' и CD123-R 5'-ATAGCTAGCTCAAGTTTTCTGCACGACCTGTACTTC-3'). ПЦР-продукт клонировали в pMGPac с использованием сайтов рестрикции Stul и Nhel. Клетки 293Т трансфицировали с помощью Lipofectamine 2000 (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя. Через 24 часа после трансфекции экспрессию CD123 подтверждали путем проточной цитометрии.
[0082] Создание лентивирусных векторов. Для создания CAR-конструкций, используемых в данном исследовании, оптимизированные по кодонам последовательности ДНК, кодирующие цепи VH и VL, модифицированную шарнирную область IgG4 и модифицированный трансмембранный домен CD28 (RLLH→RGGH [22]), синтезировали (GENEART) и клонировали в CD19RCAR-T2AEGFRt_epHIV7 [20] с помощью сайтов рестрикции Nhel и Rsrll, чтобы заменить CD19RCAR. Лентивирус получали путем трансфекции клеток 293Т лентивирусным вектором и упаковочными векторами pCMV-Rev2, pCHGP-2 и pCMV-G с помощью набора для трансфекции клеток млекопитающих CalPhosTM (Clontech). Эти CAR-конструкции 26292 и 32716 также упоминаются в данном документе как 26292CAR (S228P+L235E) или 26292CAR (S228P+L235E+N297Q) (фиг. 11 и 13) и 32716CAR (S228P+L235E) или 32716CAR (S228P+L235E+N297Q) (фиг. 10 и 12). Лентивирусные супернатанты собирали через 24, 48 и 72 часа после трансфекции и концентрировали путем ультрацентрифугирования.
[0083] Трансдущия РВМС от здороых доноров и пациентов с AML. Неидентифицированные РВМС получали от давших согласие здоровых доноров и пациентов согласно протоколам, утвержденным экспертным советом. Т-клетки от здоровых доноров активировали с помощью ОКТ3 (30 нг/мл) в СМ, дополняемой 3 раза в неделю 25 Ед/мл IL-2 и 0,5 нг/мл IL-15 (далее называемой также Т-клеточной средой). Через 72 часа после активации Т-клетки спинокулировали лентивирусом с MOI=3 путем центрифугирования в течение 30 минут при 800 g и 32°С. Экспрессию CAR анализировали путем проточной цитометрии через 12-14 дней после лентивирусной трансдукции. EGFRt-экспрессирующие Т-клетки обогащали, как описано ранее [20]. Т-клетки размножали в Т-клеточной среде с помощью способа быстрого размножения [23].
+
[0084] Для генетической модификации Т-клеток от пациентов с AML размороженные образцы периферической крови или продукты афереза стимулировали с помощью Dynabeads Human T-Expander CD3/CD28 (Life Technologies) в соотношении 3:1 частицы : CD3-клетки в Т-клеточной среде. Через 72 часа после стимуляции частицами клетки спинокулировали лентивирусом с MOI=3. Частицы удаляли через 9-14 дней после начальной стимуляции с помощью магнита DynaMag™-50 (Life Technologies) и Т-клетки поддерживали в Т-клеточной среде. CAR-экспрессирующие Т-клеточные линии, полученные от пациентов с AML, не выбирали иммуномагнитным способом до использования в киллинг-анализе.
[0085] Анализ пролиферации с CFSE. Т-клетки метили 0,5 мкМ сукцинимидиловым эфиром карбоксифлуоресцеина (carboxyfluoroscein succinimidyl ester CFSE; Molecular Probes) в соответствии с инструкциями производителя. Меченые Т-клетки культивировали совместно со стимуляторными клетками в соотношении Е:Т=2:1 или без них в СМ, дополненной 10 Ед/мл IL-2. Через 72-96 часов клетки собирали и метили биотинилированным цетуксимабом, а также пропидия иодидом или DAPI, чтобы исключить из анализа мертвые клетки. Образцы анализировали путем проточной цитометрии, чтобы оценить пролиферацию живых EGFRt-положительных клеток, по разведению CFSE.
51
3
[0086] Анализ высвобождения хрома и анализ секреции цитокинов. Клетки-мишени метили в течение 1 часа Cr (PerkinElmer), промывали пять раз и аликвотировали в трех повторах с 5×10 клеток/лунка с эффекторными клетками в различных соотношениях эффектора к мишени (Е:Т). После 4-часового совместного культивирования супернатанты собирали и измеряли радиоактивность с помощью гамма-счетчика или TopCount (PerkinElmer). Процент специфического лизиса рассчитывали, как описано ранее [24]. Продукцию цитокинов после 24-часового совместного культивирования при отношении Е:Т=10:1 измеряли, как описано ранее [25].
[0087] CD107a-дегрануляция и внутриклеточная продукция цитокинов. Т-клетки культивировали совместно с клетками-мишенями при Е:Т=2:1 в течение шести часов при 37°С в присутствии GolgiStop™ (BD Biosciences) и анти-CD107a-клона Н4А3 или изотипического контрольного антитела. По завершении шестичасовой инкубации клетки собирали, промывали и окрашивали анти-CD3, CD4, CD8 и биотинилированным цетуксимабом с последующим вторичным окрашиванием РЕ-конъюгированным стрептавидином. Затем клетки фиксировали и пермеабилизовали (Cytofix/Cytoperm™ BD Biosciences) в соответствии с инструкциями производителя и метили анти-IFN-γ (BD Biosciences, клон В27) и анти-TNF-α (BD Biosciences, клон MAb11). Сбор данных проводили с использованием анализатора MACSQuant (Miltenyi Biotec), а анализ проводили с использованием FCS Express Version 3 (De Novo Software).
+
3
+
3
3
+
3
[0088] Анализ колониеобразующих клеток. CD34-клетки из мононуклеарных клеток пуповинной крови (cord blood, СВ) или первичных образцов AML были выбраны с помощью колонки для иммуномагнитного разделения (Miltenyi Biotech). 10 CD34-СВ-клеток совместно культивировали с 25×10 эффекторных клеток в течение 4 часов до посева на полутвердую метилцеллюлозную культуру предшественников в повторных лунках [26]. Через 14-18 дней пересчитывали гранулоцитарно-макрофагальные колониеобразующие единицы (CFU-GM) и эритроидные единицы, образующие "взрывообразные" колонии (BFU-E). Для AML-образцов 5×10 CD34-AML-клеток совместно культивировали с 125×10 эффекторных клеток в течение 4 часов до посева на полутвердую метилцеллюлозную культуру предшественников в повторных лунках.
[0089] Статистический анализ. Статистический анализ проводили с использованием Graphpad Prism v5.04. Непарный t-тест Стьюдента использовали для выявления значимых различий между исследуемыми группами.
Результаты
Создание CD123CAR-экспрессирующих Т-клеток
[0090] Для перенацеливания Т-клеточной специфичности были разработаны лентивирусные векторы, кодирующие CD123 CAR. Каждый из CAR включает кодон-оптимизированные последовательности, кодирующие одну из двух CD123-специфичных scFv, 26292 и 32716 [18], соответственно. scFv слиты в рамке считывания с человеческой Fc-областью IgG4, костимуляторной областью CD28 и сигнальным доменом CD3ζ. Сразу за последовательностью CAR следует последовательность рибосомального проскока Т2А и маркер трансдукции - укороченный человеческий EGFR (EGFRt) (фиг. 1А). ОКТ3-стимулированные РВМС от здоровых доноров трансдуцировали лентивирусным вектором, и CAR-экспрессирующие Т-клетки выделяли путем иммуномагнитной селекции с использованием биотинилированного антитела Эрбитукс с последующим вторичным мечением антибиотиновыми магнитными частицами. После одного цикла REM выделенные клетки анализировали путем проточной цитометрии на наличие поверхностной экспрессии CAR и Т-клеточного фенотипа. Экспрессия как Fc, так и EGFRt была больше 90% в созданных Т-клеточных линиях от трех здоровых доноров, и конечные Т-клеточные продукты состояли из смеси CD4- и CD8-положительных Т-клеток (фиг. 1В, 1С).
CD123-CAR-T-клетки специфически нацелены на CD123-экспрессирующие опухолевые клеточные линии
+
-
[0091] Для подтверждения специфичности CD123-CAR-T-клеток проверяли способность генетически модифицированных Т-клеток лизировать клетки 293Т, временно трансфицированые для экспрессии CD123 (293T-CD123; фиг. 2А). Обе полученные CD123-CAR-T-клеточных линии эффективно лизировали 293T-CD123, но не клетки 293Т, временно трансфицированные для экспрессии CD19, демонстрируя специфическое распознавание CD123 (фиг. 2В). Далее, цитолитическую емкость CD123-специфичных Т-клеток in vitro исследовали в отношении опухолевых клеточных линий, эндогенно экспрессирующих CD123. Экспрессию CD123 на клеточных линиях LCL и KG1a подтверждали с помощью проточной цитометрии (фиг. 2С). Обе CD123-специфичные Т-клеточные линии эффективно лизировали целевые линии LCL и KG1a, но не клеточную линию CD123-K562 (фиг. 2С). Парные CD19-специфичные Т-клетки эффективно лизировали мишени CD19LCL, но не мишени CD19KG1a или К562 (фиг. 2D). Ложно-трансдуцированные исходные клетки лизировали только положительный контроль, клеточную линию LCL-OKT3 (фиг. 2D).
CD123-CAR-T-клетки активируют множественные эффекторные функции при совместном культивировании с CD123-положительными клетками-мишенями
+
+
+
[0092] Чтобы исследовать эффекторную функцию CD123-специфичных Т-клеток, измеряли секрецию IFN-γ и TNF-α с последующим совместным культивированием с различными опухолевыми клеточными линиями. Т-клеточные продукты, экспрессирующие CD123-CAR, продуцировали как IFN-γ, так и TNF-α при совместном культивировании с CD123-клетками-мишенями, в то время как парные CD19-специфические Т-клетки секретировали эти цитокины только при совместном культивировании с клеточными линиями CD19LCL или LCL-OKT3 (фиг. 3А). Кроме того, обе CD123-специфичные Т-клеточные линии пролиферировали при совместном культивировании с любой из клеточных линий CD123LCL, LCL-OKT3 или KG1a, но не с клеточной линией CD123-K562 (фиг. 3В). Напротив, парные CD19-CAR-экспрессирующие Т-клетки пролиферировали только при совместном культивировании с LCL или LCL-OKT3 (фиг. 3В).
CD123-CAR-T-клетки активируют множественные эффекторные функции при совместном культивировании с первичными образцами AML
+
+
[0093] Сверхэкспрессия CD123 на первичных образцах AML хорошо задокументирована [27-29] и подтверждена в данном исследовании (фиг. 14). Многогранные Т-клеточные ответы имеют решающее значение для надежного иммунного ответа на инфекции и вакцины, а также могут играть роль в противоопухолевой активности CAR-перенацеленных Т-клеток [30]. Для исследования способности CD123-CAR-T-клеток активировать множественные эффекторные пути против первичных образцов AML инженерные Т-клетки культивировали совместно с тремя различными образцами от пациентов с AML (179, 373 и 605) в течение 6 часов и оценивали повышающую регуляцию CD107a и продукцию IFN-γ и TNF-α с помощью полихроматической проточной цитометрии (стратегия гейтирования показана на фиг. 15). Мобилизация CD107a клеточной поверхности наблюдалась как в CD4-, так и в CD8-компартментах CD123-специфичных Т-клеток, в то время как парные CD19R-T-клетки не показывали заметной дегрануляции против первичных образцов AML (фиг. 4А, столбчатые диаграммы). Кроме того, субпопуляции CD107aCD123-CAR-T-клеток также продуцировали либо IFN-γ, либо TNF-α, либо оба цитокина (фиг. 4А, круговые диаграммы). Эта многофункциональная реакция наблюдалась как для популяции CD4, так и для популяции CD8 (фиг. 4А и 4В). Кроме того, исследовали способность CAR-инженерных Т-клеток пролиферировать в ответ на совместное культивирование с первичными образцами AML. Обе CD123-специфичные Т-клеточные линии были способны к пролиферации после совместного культивирования с образцами AML 813 или пре-B-ALL-802 (фиг. 4С). Пролиферация наблюдалось в обеих популяциях CD4 и CD8 (фиг. 16). Парные CD19-специфические Т-клетки пролиферировали при совместном культивировании с CD19 пре-B-ALL-802, но не при совместном культивировании с AML 813.
CD123-CAR-экспрессирующие Т-клетки нацелены на первичные клетки AML in vitro
CD123-специфичные Т-клетки не устраняют формирование колоний клетками пуповинной крови in vitro
[0094] Учитывая, что CD123 экспрессируется на общих миелоидных предшественниках (common myeloid progenitor, CMP) [31], было исследовано влияние инженерных Т-клеток на способность образцов нормальной пуповинной крови (СВ), обогащенных CD34, формировать колонии. Формирование миелоидных и эритроидных колоний образцами СВ существенно не снижалось после 4-часового совместного культивирования с CD123-CAR-экспрессирующими Т-клетками в соотношении Е:Т=25:1 по сравнению с парными CD19R-CAR-T-клетками (фиг. 6А и 6В). Далее исследовали способность CD123-специфичных Т-клеток ингибировать рост первичных клоногенных клеток AML in vitro. Обе CD123-CAR-T-клеточные линии значительно уменьшали формирование лейкемических колоний по сравнению с парными CD19R-T-клетками (фиг. 6С). Примечательно, что CD123-специфичные Т-клетки имели большее влияние на формирование лейкемических колоний по сравнению с формированием нормальных миелоидных колоний (фиг. 6D, снижение на 69% по сравнению со снижением на 31%, соответственно).
Т-клетки от пациентов с AML могут быть генетически модифицированы для экспрессии CD123 CAR и специфически нацелены на аутологичные опухолевые клетки.
51
[0095] Полученные от пациентов с AML Т-клетки, как известно, плохо реполяризуют актин и образуют дефектные иммунные синапсы с аутологичными бластами [32]. Кроме того, насколько мы знаем, CAR-экспрессирующие Т клетки, полученные от пациентов с AML, до сих пор не описаны. Поэтому определяли, могут ли Т-клетки от пациентов с AML быть генетически модифицированы для экспрессии CD123 CAR. Криоконсервированные РВМС (AML 605 и AML 722) или продукт афереза (AML 559) стимулировали CD3/CD28-частицами и трансдуцировали лентивирусами для экспрессии либо из CD123 CAR, либо CD19R контрольного CAR. Т-клетки, полученные из образцов всех трех пациентов, экспрессировали 26292 CAR (эффективность трансдукции 40-65%), 32716 CAR (эффективность трансдукции 46-70%) и CD19R CAR (для оценки способности CD123-специфичных Т-клеток уничтожать первичные клетки AML Т-клетки, экспрессирующие парные CD19R CAR или CD123 CAR, совместно культивировали с CD34-обогащенным первичным образцом от пациента с AML в 4-часовом анализе высвобождения Cr. В отличие от парных CD19R-T-клеток, обе CD123-CAR-T-клеточные линии сильно лизировали все анализируемые первичные образцы от пациентов с AML (фиг. 5А). Кроме того, в то время как между цитолитической способностью CD123-CAR-экспрессирующих Т-клеток не было отмечено никаких статистических различий, обе CD123-специфичные Т-клетки продемонстрировали значительное усиление цитотоксичности по сравнению с парными CD19R-CAR-T-клетками (5В).
51
[0096] (Эффективность трансдукции 23-37%). Характерный пример фенотипа CAR-T-клеток, полученных от пациентов с AML, показан на фиг. 7А. Далее проверяли цитолитический потенциал CAR-T-клеток, полученных от пациентов с AML, против аутологичных CD34-обогащенных клеток-мишеней, в 4-часовом анализе высвобождения Cr. Все аутологичные CD34-обогащенные клетки экспрессировали CD123, хотя с различным процентном и интенсивностью (фиг. 7В). Т-клетки, полученные от AML 605 и 722, эффективно лизировали аутологичные бласты, в то время как Т-клетки, полученные от AML 559, демонстрировали низкие уровни лизиса аутологичных бластов, вероятно, из-за низкой и гетерогенной экспрессии CD123 на бластах AML 559 (фиг. 7С).
Обсуждение
51
+
+
[0097] Воплощения, описанные в данном документе, включают создание двух новых CD123-нацеленных CAR с использованием scFv из рекомбинантных иммунотоксинов (recombinant immunotoxin, RIT), 26292 и 32716, которые связывают различные эпитопы и имеют аналогичные аффинности связывания с CD123 [18]. При экспрессии популяцией Т-клеток эти CD123-нацеленные CAR перенацеливают Т-клеточную специфичность в отношении клеток, экспрессирующих CD123. Используя стандартный 4-часовой анализ высвобождения хрома-51 (Cr), Т-клетки здорового донора, которые были спроектированы для экспрессии CD123 CAR, эффективно лизировали CD123-клеточные линии и первичные образцы от пациентов с AML. Кроме того, обе CD123-CAR-T-клеточные линии активировали множественные эффекторные функции после совместного культивирования с клеточными линиями CD123 и первичными образцами от пациентов с AML. Кроме того, CD123-нацеленные Т-клетки существенно не уменьшали число гранулоцитарно-макрофагальных колониеобразующих единиц (CFU-GM) и эритроидных единиц, образующих "взрывообразные" колонии (BFU-E) из пуповинной крови (СВ) по сравнению с CD19-CAR-T-клетками. Примечательно, что в то время как CD19-специфические Т-клетки оказали небольшое влияние на формирование лейкемических колоний первичных образцов AML, CD123-нацеленные Т-клетки значительно снижали формирование лейкемических колоний in vitro. Было также показано, что Т-клетки, полученные от пациентов с AML, могут экспрессировать CD123 CAR и лизировать аутологичные бласты in vitro.
+
[0098] Т клетки, экспрессирующие любой из двух CD123-специфичных CAR, могут специфически лизировать CD123-экспрессирующие клеточные линии и первичные образцы от пациентов с AML и активировать множественные эффекторные функции антигенспецифическим образом in vitro, показывая, что оба эпитопа являются потенциальными мишенями для лечения. Между CD123-CAR-инженерными Т-клеточными линиями не наблюдалось никаких серьезных различий в отношении уничтожения целевых клеток, секреции цитокинов или пролиферации при совместном культивировании с CD123-клетками. Одно из возможных объяснений этого заключается в том, что связывающие аффинности CD123-специфичных scFv, используемых в CD123-CAR, находятся в наномолярном диапазоне и отличаются менее чем в 3 раза и, следовательно, scFv не дают никакого существенного преимущества в связывании целевого антигена [18].
+
[0099] Экспрессия множества антигенов клеточной поверхности на клетках AML была хорошо задокументирована [4, 27, 34]. Ориентация некоторых из этих антигенов на CAR-экспрессирующие Т-клетки может быть невозможной. Например, AML-ассоциированный антиген TIM-3 экспрессируется на подгруппе истощенных Т-клеток [35, 36] и нацеливание на TIM-3 с помощью CAR-инженерных Т-клеток может привести к аутолизу генетически модифицированных клеток. Кроме того, CD47 экспрессируется повсеместно [37] и, таким образом, вряд ли может быть мишенью CAR-инженерных Т-клеток. Антиген дифференциации CD33 преимущественно экспрессируется на миелоидных клетках, и иммунотерапевтические средства, нацеленные на CD33, такие как гемтузумаб озогамицин, антитела, связывающие CD33/CD3-биспецифические Т-клетки, и CD33 CAR в настоящее время используются в клинических и доклинических условиях [17, 38, 39]. Как и TIM-3, CD33 экспрессируется на подгруппе Т-клеток, что делает его неидеальной мишенью для терапии, основанной на CAR [40]. Кроме того, антилейкемическая активность CD33-нацеливающих терапевтических средств часто сопровождается медленным восстановлением кроветворения и цитопении, вероятно, в результате экспрессии CD33 на долгоживущих самообновляющихся нормальных гемопоэтических стволовых клетках (hematopoietic stem cell, HSC) [41]. Кроме того, гепатотоксичность является распространенным побочным эффектом CD33-нацеленного лечения и, возможно, является результатом непреднамеренного нацеливания на CD33 клетки Купфера [42].
+
+
[00100] Экспрессия CD123 отсутствует на Т-клетках, преимущественно ограничена клетками миелоидного происхождения [43], и большей частью отсутствует на HSC [27]. Вместе, эти наблюдения делают CD123 привлекательной мишенью для CAR-опосредованной Т-клеточной терапии. Терапевтические средства, специфические для CD123, проявляют благоприятные профили безопасности в первой фазе испытаний (ClinicalTrials.gov ID: NCT00401739 и NCT00397579). К сожалению, эти терапевтические средства не смогли индуцировать реакцию у подавляющего большинства пациентов. В CD123-CAR-экспрессирующие Т-клетки, полученные в данном исследовании, демонстрируют мощный цитолитический потенциал in vitro против CD123 клеточных линий и первичных образцов AML. Исследования, описанные ниже, показывают, что первичные образцы от пациентов с высоким риском AML, были чувствительны к цитотоксичности, опосредованной CD123-CAR-Т-клетками. В совокупности, в небольшой когорте первичных образцов, используемой для краткосрочных анализов цитотоксичности, образцы от пациентов с AML, которые демонстрировали высокий риск постановки диагноза и/или химиорезистентность, были чувствительны к CD123-CAR-уничтожению аналогично тому, что наблюдалось в экспериментах с использованием клеточных линий CD123. Дальнейший анализ будет необходим для того, чтобы подтвердить, что эти результаты справедливы для увеличенной когорты образцов.
+
+
+
+
[00101] Многофункциональные Т-клеточные ответы коррелируют с контролем вирусной инфекции и могут быть важными в противоопухолевом CAR-T-клеточном ответе [44]. Действительно, пациенты, реагирующие на CD19-CAR-T-клеточную терапию, имеют обнаруживаемые Т-клеточные ответы (т.е. дегрануляцию, секреция цитокинов или пролиферацию) после терапии в ответ на CD19 мишени ex vivo [11, 12, 14]. В приведенных ниже примерах была показана функциональность CD123-CAR-экспрессирующих Т-клеток путем анализа повышающей регуляции CD107a, продукции цитокинов и пролиферации CD123-специфичных Т-клеток в ответ на обе CD123 клеточные линии и первичные AML-образцы. Кроме того, многофункциональность наблюдалось в обоих компартментах, как CD4, так и CD8, что может способствовать устойчивой противолейкемической активности и повышать противолейкемическую активность в опухолевом микроокружении [45, 46]. Включение других костимуляторных доменов, таких как 4-1ВВ, и применение "более молодых" менее дифференцированных Т-клеток может усилить CD123-CAR-ответы и являются предметом активных исследований [9, 47].
-
+
-
-
+
-
[00102] Кроме того, CD123-специфичные Т-клетки не подавляют нормальное образование колоний предшественников - даже при Е:Т=25:1. Экспрессия CD123 на клетках родCD34CD38 является отличительной чертой общей миелоидной клетки-предшественника и, таким образом, вероятно, является мишенью CD123-CAR-T-клеток [31]. В то время как при инкубации СВ-клеток с CD123-специфичными Т-клетками наблюдалось уменьшение относительного процента колоний миелоидного происхождения, снижение было не значительно меньше, чем у парных CD19R-CAR-T-клеток. Возможно, что ограниченный размер образца объясняет этот результат, и дальнейшие эксперименты могут выявить значительное снижение в образовании CFU-GM в образцах пуповинной крови, обработанных CD123-CAR-T-клетками. Кроме того, 4-часовое совместное культивирование Т-клеток и СВ-клеток перед посевом может быть недостаточно длительным периодом, чтобы наблюдать эффект формирования нормальной колонии миелоидного предшественника, и более долгие периоды инкубации могут снизить число наблюдаемых колоний миелоидного происхождения. Тем не менее, в той же методике, что использовалась для СВ-клеток, наблюдалось существенное уменьшение числа образованных лейкемических колоний, когда CD34-обогащенные первичные образцы от пациентов с AML инкубировали с CD123-CAR-Т-клетками, подтверждая, что 4-часовая инкубация является достаточной, чтобы наблюдать эффект между формированием лейкемических и нормальных колоний. Альтернативно, более низкая относительная экспрессия CD123 на СВ-клетах по сравнению с AML-клетками частично может быть результатом неспособности CD123-CAR-T-клеток изменять формирование колоний миелоидного происхождения in vitro. Хотя другие показали, что CD123 экспрессируется только в небольшой части родCD34CD38 HSC, а два клинических испытания в I фазе с использованием агентов, нацеленных на CD123, не выявили долгосрочной миелосупрессии, необходимы дальнейшие исследования, чтобы оценить влияние CD123-CAR-T-клеточной терапии на кроветворение. Для того чтобы контролировать нежелательные токсичности "мимо мишени", в лентивирусную конструкцию был включен EGFRt для обеспечения абляции CAR-экспрессирующих Т-клеток. Другие стратегии для модуляции CAR-T-клеточной активности, такие как индуцируемое каспазой 9 переключение на апоптоз [48] или электропорация мРНК CAR [49], также вызывают большой интерес, учитывая потенциал для уничтожения нормальных клеток, экспрессирующих CD123.
+
[00103] Кроме того, было показано, что криоконсервированные РВМС от пациентов с активным AML, могут быть генетически модифицированы для экспрессии CD123-CAR и обладают сильной цитолитической активностью против аутологичных лейкемических бластов в 2/3 образцов. В то время как CD123-CAR-экспрессирующие Т-клетки от AML 559 не способны лизировать аутологичные бласты, которые экспрессируют низкие уровни CD123, эти CAR-T-клетки лизировали клеточные линий CD123LCL и KG1a (данные не показаны), подтверждая, что созданные Т-клетки имеют потенциал нацеливания на CD123-экспрессирующих клетки-мишени. По нашим сведениям это первая демонстрация того, что Т-клетки, полученные от пациента с AML, могут быть спроектированы для экспрессии CAR и демонстрируют перенацеленную антигенспецифическую цитотоксичность против аутологичных бластов.
+
-
[00104] В совокупности результаты этих исследований, описанных в приведенных ниже примерах, показывают, что CD123-CAR-T-клетки могут различать клетки CD123 и CD123 и могут активировать множественные Т-клеточные эффекторные функции против панели образцов от пациентов с высоким риском первичного AML. Следует отметить, что CD123-специфичные Т-клетки существенно не изменяли нормальное формирование колоний предшественников, но значительно снижали рост клоногенных миелоидных лейкемических предшественников in vitro. Также было показано, что Т-клетки, полученные от пациентов с AML, могут быть генетически модифицированы для экспрессии CD123-специфичных CAR и могут лизировать аутологичные бласты in vitro. Таким образом, CD123-CAR-T-клетки являются перспективным кандидатом для иммунотерапии AML.
Пример 2: задержка лейкемической прогрессии CD123-CAR-трансдуцированными Т-клетками in vivo
[00105] Конструкции CD123-CAR. Конструкции 26292CAR (S228P+L235E) и 32716CAR (S228P+L235E) были созданы, как описано в примере 1 выше. Также были созданы две дополнительные CD123-CAR-конструкции, которые включали дополнительную мутацию в шарнирной области IgG4 в позиции 297 (N297Q) для каждого scFv ("26292CAR(S228P+L235E+N297Q)" и "32716CAR(S228P+L235E+N297Q)") (фиг. 12 и 13, мутации выделены жирным шрифтом и подчеркнуты).
6
+
[00106] Мышам NSG имплантировали опухолевые клетки AML (день 0), на 5-й день водили 5,0×10 CAR-T-клеток, экспрессирующих либо 26292CAR(S228P+L235E), либо 26292CAR(S228P+L235E+N297Q), и контролировали лейкемическую прогрессию путем биолюминесцентной визуализации. Как показано на фиг. 8, у мышей, получавших Т-клетки, трансдуцированные 26292CAR(S228P+L235E), лейкемическая нагрузка прогрессировала на 8-й день по сравнению с днем введения, подтверждая, что клетки, трансдуцированные конструкцией CD123CAR, содержащей мутации шарнирной области в позициях S228P и L235E, не имели никакого эффекта in vivo. Напротив, мыши, получавшие Т-клетки, трансдуцированные 26292CAR(S228P+L235E+N297Q), продемонстрировали уменьшение размера опухолей по сравнению с днем введения, подтверждая, что добавление мутации в шарнирную область в позиции 297 (N297Q) дает конструкцию CD123CAR, которая может задерживать лейкемическую прогрессию in vivo.
Ссылки
Ссылки, патенты и опубликованные патентные заявки, перечисленные ниже, и все ссылки, приведенные в указанном выше описании, включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме, как если бы они полностью были изложены в данном документе.
1. Eaves, C.J. and R.K. Humphries, Acute myeloid leukemia and the Wnt pathway. N Engl J Med, 2010. 362(24): p. 2326-7.
2. Dohner, H., et al., Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults: recommendations from an international expert panel, on behalf of the European LeukemiaNet. Blood, 2010. 115(3): p. 453-74.
3. Majeti, R., Monoclonal antibody therapy directed against human acute myeloid leukemia stem cells. Oncogene, 2011. 30(9): p. 1009-19.
4. Kikushige, Y., et al., TIM-3 is a promising target to selectively kill acute myeloid leukemia stem cells. Cell Stem Cell, 2010. 7(6): p. 708-17.
5. Jena, В., G. Dotti, and L.J. Cooper, Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor-specific chimeric antigen receptor. Blood, 2010. 116(7): p. 1035-44.
6. Cooper, L.J., et al., T-cell clones can be rendered specific for CD19: toward the selective augmentation of the graft-versus-B-lineage leukemia effect. Blood, 2003. 101(4): p. 1637-44.
7. Hudecek, M., et al., The B-cell tumor-associated antigen ROR1 can be targeted with T cells modified to express a ROR1-specific chimeric antigen receptor. Blood, 2010. 116(22): p. 4532-41.
8. Kochenderfer, J.N., et al., Construction and preclinical evaluation of an anti-CD19 chimeric antigen receptor. J Immunother, 2009. 32(7): p. 689-702.
9. Milone, M.C., et al., Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo. Mol Ther, 2009. 17(8): p. 1453-64.
10. Brentjens, R.J., et al., Eradication of systemic B-cell tumors by genetically targeted human T lymphocytes co-stimulated by CD80 and interleukin-15. Nat Med, 2003. 9(3): p. 279-86.
11. Brentjens, R.J., et al., Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory Bcell leukemias. Blood, 2011. 118(18): p. 4817-28.
12. Kochenderfer, J.N., et al., B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric antigen-receptor-transduced T cells. Blood, 2011.
13. Savoldo, В., et al., CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients. J Clin Invest, 2011. 121(5): p. 1822-6.
14. Kalos, M., et al., T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced Leukemia. Sci Transl Med, 2011. 3(95): p. 95ra73.
15. Till, B.G., et al., CD20-specific adoptive immunotherapy for lymphoma using a chimeric antigen receptor with both CD28 and 4-1BB domains: pilot clinical trial results. Blood, 2012.
16. Peinert, S., et al., Gene-modified T cells as immunotherapy for multiple myeloma and acute myeloid leukemia expressing the Lewis Y antigen. Gene Ther, 2010. 17(5): p. 678-86.
17. Dutour, A., et al., In Vitro and In Vivo Antitumor Effect of Anti-CD33 Chimeric Receptor-Expressing EBV-CTL against CD33 Acute Myeloid Leukemia. Adv Hematol, 2012. 2012: p. 683065.
18. Du, X., M. Ho, and I. Pastan, New immunotoxins targeting CD123, a stem cell antigen on acute myeloid leukemia cells. J Immunother, 2007. 30(6): p. 607-13.
19. Pelloquin, F., J.P. Lamelin, and G.M. Lenoir, Human В lymphocytes mmortalization by Epstein-Barr virus in the presence of cyclosporin A. In Vitro Cell Dev Biol, 1986. 22(12): p. 689-94.
20. Wang, X., et al., A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells. Blood, 2011. 118(5): p.1255-63.
21. Reddy, M.P., et al., Elimination of Fc receptor-dependent effector functions of a modified IgG4 monoclonal antibody to human CD4. J Immunol, 2000. 164(4): p. 1925-33.
22. Nguyen, P., I. Moisini, and T.L. Geiger, Identification of a murine CD28 dileucine motif that suppresses single-chain chimeric T-cell receptor expression and function. Blood, 2003. 102(13): p. 4320-5.
23. Jensen, M.C., et al., Human T lymphocyte genetic modification with naked DNA. Mol Ther, 2000. 1(1): p. 49-55.
24. Riddell, S.R. and P.D. Greenberg, The use of anti-CD3 and anti-CD28 monoclonal antibodies to clone and expand human antigen-specific T cells. J Immunol Methods, 1990. 128(2): p. 189-201.
25. Brown, C.E., et al., Recognition and killing of brain tumor stem-like initiating cells by CD8+ cytolytic T cells. Cancer Res, 2009. 69(23): p. 8886-93.
26. Bhatia, R., et al., Abnormal function of the bone marrow microenvironment in chronic myelogenous leukemia: role of malignant stromal macrophages. Blood, 1995. 85(12): p. 3636-45.
27. Jordan, C.T., et al., The interleukin-3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells. Leukemia, 2000. 14(10): p. 1777-84.
28. Jin, L., et al., Monoclonal antibody-mediated targeting of CD123, IL-3 receptor alpha chain, eliminates human acute myeloid leukemic stem cells. Cell Stem Cell, 2009. 5(1): p. 31-42.
29. Munoz, L., et al., Interleukin-3 receptor alpha chain (CD123) is widely expressed in hematologic malignancies. Haematologica, 2001. 86(12): p. 1261-9.
30. Seder, R.A., P.A. Darrah, and M. Roederer, T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nat Rev Immunol, 2008. 8(4): p. 247-58.
31. Manz, M.G., et al., Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proc Natl Acad Sci USA, 2002. 99(18): p. 11872-7.
32. Le Dieu, R., et al., Peripheral blood T cells in acute myeloid leukemia (AML) patients at diagnosis have abnormal phenotype and genotype and form defective immune synapses with AML blasts. Blood, 2009. 114(18): p. 3909-16.
33. Oka, Y., et al., Induction of WT1 (Wilms' tumor gene)-specific cytotoxic T lymphocytes by WT1 peptide vaccine and the resultant cancer regression. Proc Natl Acad Sci USA, 2004. 101(38): p. 13885-90.
34. Majeti, R., et al., CD47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells. Cell, 2009. 138(2): p. 286-99.
35. Golden-Mason, L., et al., Negative immune regulator Tim-3 is overexpressed on T cells in hepatitis С virus infection and its blockade rescues dysfunctional CD4+ and CD8+ T cells. J Virol, 2009. 83(18): p. 9122-30.
36. Jin, H.T., et al., Cooperation of Tim-3 and PD-1 in CD8 T-cell exhaustion during chronic viral infection. Proc Natl Acad Sci USA, 2010. 107(33): p. 14733-8.
37. Brown, E.J. and W.A. Frazier, Integrin-associated protein (CD47) and its ligands. Trends Cell Biol, 2001. 11(3): p. 130-5.
38. Walter, R.B., et al., Acute myeloid leukemia stem cells and CD33-targeted immunotherapy. Blood, 2012. 119(26): p. 6198-208.
39. Aigner, M., et al., T lymphocytes can be effectively recruited for ex vivo and in vivo lysis of AML blasts by a novel CD33/CD3-bispecific BiTE((R)) antibody construct. Leukemia, 2012.
40. Hernandez-Caselles, Т., et al., A study of CD33 (SIGLEC-3) antigen expression and function on activated human T and NK cells: two isoforms of CD33 are generated by alternative splicing. J Leukoc Biol, 2006. 79(1): p. 46-58.
41. Sievers, E.L., et al., Efficacy and safety of gemtuzumab ozogamicin in patients with CD33-positive acute myeloid leukemia in first relapse. J Clin Oncol, 2001. 19(13): p. 3244-54.
42. Tsimberidou, A.M., et al., The role of gemtuzumab ozogamicin in acute leukaemia therapy. Br J Haematol, 2006. 132(4): p. 398-409.
43. Sato, N., et al., Expression and factor-dependent modulation of the interleukin-3 receptor subunits on human hematopoietic cells. Blood, 1993. 82(3): p. 752-61.
44. Appay, V., D.C. Douek, and D.A. Price, CD8+ T cell efficacy in vaccination and disease. Nat Med, 2008. 14(6): p. 623-8.
45. Moeller, M., et al., Sustained antigen-specific antitumor recall response mediated by gene-modified CD4+ T helper-1 and CD8+ T cells. Cancer Res, 2007. 67(23): p. 11428-37.
46. Schietinger, A., et al., Bystander killing of cancer requires the cooperation of CD4(+) and CD8(+) T cells during the effector phase. J Exp Med, 2010. 207(11): p. 2469-77.
47. Gattinoni, L., et al., A human memory T cell subset with stem cell-like properties. Nat Med, 2011. 17(10): p. 1290-7.
48. Straathof, K.C., et al., An inducible caspase 9 safety switch for T-cell therapy. Blood, 2005. 105(11): p. 4247-54.
49. Yoon, S.H., et al., Adoptive immunotherapy using human peripheral blood lymphocytes transferred with RNA encoding Her-2/neu-specific chimeric immune receptor in ovarian cancer xenograft model. Cancer Gene Ther, 2009. 16(6): p. 489-97.
50. Strohl, W.R., Optimization of Fc-mediated effector functions of monoclonal antibodies. Curr Op Biotech. 2009. 20: 685-691.