Интерлейкин-6 как возможный регулятор интрафолликулярных Foxp3+-регуляторных T-клеток у женщин в цикле экстракорпорального оплодотворения

© Коллектив авторов, 2019

Хонина Н.А.1, 2, Андреева Е.А.1, Тихонова М.А.1, Баторов Е.В.1, Останин А.А.1, Пасман Н.М.2, Черных Е.Р.1.

Интерлейкин-6 как возможный регулятор интрафолликулярных Рохр3+-регуляторных T- клеток у женщин в цикле экстракорпорального оплодотворения

1 ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии», 630099, г. Новосибирск, Россия

2 ФГАОУ ВО «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет», 630090, г. Новосибирск, Россия

Регуляторные Еохр3+-Т-клетки (Treg) участвуют в индукции толерантности к аллоантигенам плода и формировании физиологической иммуносупрессии при беременности. Однако механизмы, влияющие на их содержание, особенно на ранних этапах репродуктивного процесса, до конца не выяснены. Данная работа посвящена исследованию связи между концентрацией ИЛ-6 и регуляторными Foxp3+-клетками в фолликулярной жидкости (ФЖ) женщин с различными параметрами фоликуло-/оогенеза, бластуляции и исходами экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). В исследование включили 53 женщин с бесплодием, проходивших лечение методом ЭКО. Сбор образцов ФЖ из доминантных фолликулов проводили с помощью трансвагинальной ультразвуковой аспирации. Концентрацию ИЛ-6 в ФЖ оценивали методом проточной флюориметрии (Bio-Plex Protein Assay System, Bio-Rad, США). Относительное содержание CD4+Foxp3+- и СБ4Рохр3+-Т-клеток оценивали методом проточной цитометрии. Полученные данные показали, что повышенное содержание ИЛ-6 в ФЖ регистрируют у женщин с высоким числом фолликулов, ооцитов, низким качеством бластоцист и отрицательным исходом ЭКО. При этом высокое содержание в ФЖ ИЛ-6 сопряжено с низким количеством интрафолликулярных СD4-Foxp3+-клеток, относительное содержание которых обратно коррелирует с концентрацией ИЛ-6. В то же время взаимосвязь ИЛ-6 с количеством CD4+Foxp3+-Т-клеток не выявлена. Таким образом, одной из причин снижения числа СD4-Foxp3+-клеток, играющих позитивную роль в регуляции ранних репродуктивных процессов, может являться высокая концентрация ИЛ-6 в ФЖ.

Ключевые слова: FoxP3+ Т-клетки; ИЛ-6; фолликулярная жидкость; ЭКО; бесплодие

Статья поступила 01.02.2019. Принята в печать 16.02.2019.

Для цитирования: Хонина Н.А., Андреева Е.А., Тихонова М.А., Баторов Е.В., Останин А.А., Пасман Н.М., Черных Е.Р. Интерлейкин-6 как возможный регулятор интрафолликулярных Foxp3+-регуляторных T-клеток у женщин в цикле экстракорпорального оплодотворения. Иммунология. 2019; 40 (2): 30-37. doi: 10.24411/02064952-2019-12005.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Для корреспонденции

Хонина Наталья Алексеевна -доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории клеточной иммунотерапии ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии», Новосибирск, Россия E-mail: nkhonina@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-6757-3896

Khonina N.A.1' 2, Andreeva E.A.1, Tikhonova M.A.1, Batorov E.V.1, Ostanin A.A.1, Pasman N.M.2, Chernykh E.R.1

Interleukin-6 as a possible regulator of intrafollicular Foxp3+ T-cells in women undergoing IVF treatmen

1 Institute of Fundamental and Clinical Immunology, 630099, Novosibirsk, Russia

2 Novosibirsk State University, 630090, Novosibirsk, Russia

Regulatory Foxp3+ T cells (Treg) are involved in the induction of tolerance to fetal alloantigens and the formation of physiological immunosuppression during pregnancy. However, the mechanisms affecting their content, especially in the early stages of the reproductive process, remain unclear. This paper is devoted to the study of the relationship between the concentration of IL-6 and regulatory Foxp3+ T cells in the follicular fluid (FF) of women with different parameters of folliculo/oogenesis, blastulation and IVF outcomes. The study included 53 women with infertility undergoing IVF program. Collection of FF samples from dominant follicles was performed using transvaginal ultrasonic aspiration. The concentration of IL-6 in FF was assessed by flow fluorimetry (Bio-Plex Protein Assay System, Bio-Rad, USA). The relative content of CD4+Foxp3+ and CD4-Foxp3+ T cells was assessed by flow cytometry.

For correspondence

Khonina Natalia A. - MD, PhD, Leading Research Associate, Laboratory of Cellular Immunotherapy, Institute of Fundamental and Clinical Immunology, Novosibirsk, Russia E-mail: nkhonina@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-6757-3896

The data obtained showed that increased IL-6 content in the FF is registered in women with a high number of follicles, oocytes, poor blastocyst quality and a negative IVF outcome. At the same time, the high content of IL-6 in FF is associated with a low number of intrafollicular CD4-FoxP3+ cells, which inversely correlates with the concentration of IL-6. At the same time, the relationship of IL-6 with the number of CD4+FoxP3+ T cells was not detected. Thus, one of the reasons for the decrease in the number of CD4-FoxP3+ cells that play a positive role in regulating early reproductive processes may be a high concentration of IL-6 in the FF.

Keywords: Foxp3+ T cells; IL-6; follicular fluid; IVF; infertility

Received 01.02.2019. Accepted 16.02.2019.

For citation: Khonina N.A., Andreeva E.A., Tikhonova M.A., Batorov E.V., Ostanin A.A., Pasman N.M., Chernykh E.R. Interleukin-6 as a possible regulator of intrafollicular FoxP3+ T-cells in women undergoing IVF treatmen. Immunologiya. 2019; 40

Acknowledgments. The study had no sponsorship.

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Интерлейкин-6 (ИЛ-6) относится к цитокинам, имеющим важное значение при воспалительном ответе. Одной из мишеней ИЛ-6 является регуляция баланса Рохр3+-регуляторных T-клеток (Treg) и ИЛ-17-продуцирующих Т-хелперов (Th17) [1], играющих ключевую роль соответственно в иммуно-супрессии и в воспалении [2]. Так, недавние исследования показали, что ИЛ-6 in vitro и in vivo подавляет генерацию Бохр3+-Трег из наивных Т-клеток, смещая баланс в сторону Th17 [3-6].

Возможная причастность ИЛ-6 к нарушению генерации Treg при беременности подтверждается данными о том, что снижение соотношения Treg/Th17 в крови женщин с привычным невынашиванием ассоциировано с повышенным уровнем в сыворотке крови ИЛ-6 [7]. Высокий уровень ИЛ-6 в фолликулярной жидкости (ФЖ) женщин, включенных в программу экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), негативно сказывается на исходах ЭКО [8]. Однако связан ли этот эффект с уменьшением Трег не ясно, поскольку данные о Treg в зависимости от исходов ЭКО немногочисленны, противоречивы и касаются исключительно субпопуляции СБ4+-Т-клеток [9] В то же время проведенные нами исследования показали, что повышенное количество фолликулов при стимуляции яичников, низкое качество ооцитов и бластоцист и негативные результаты ЭКО ассоциированы с низким содержанием Бохр3+-Т-клеток ФЖ. Причем эти изменения касаются клеток с фенотипом СБ4-Рохр3+-Т-клеток, т. е. локализованных в субпопуляции СБ8+-Т-клеток [10].

Согласно данным литературы, количество CD4+-Treg подвержено циклическим изменениям и возрастает в позднюю лютеиновую фазу еще до момента имплантации эмбриона [11, 12]. Также показано, что наряду с иммуносупрессорной активностью Treg способствуют инвазии трофобласта и ремоделированию тканей [13]. Учитывая эти данные, можно полагать, что аналогично CD4+Foxp3+-Т-клеткам CD4-Foxp3+-Т-клетки, являясь субпопуляцией Treg, также могут играть важную роль в регуляции ранних этапов репродукции, и негативный эффект повышенных концентраций ИЛ-6 в ФЖ может опосредоваться через подавление генерации

CD4"Foxp3+-Treg. Чтобы проверить это предположение в настоящей работе была исследована связь между концентрацией ИЛ-6 и Foxp3+-Treg в ФЖ женщин с различными параметрами фоликуло-/оогенеза, бластуляции и исходами ЭКО.

Материал и методы

В исследование включены 53 женщины с бесплодием, проходившие лечение методом ЭКО. Забор материала осуществляли на базе ООО «Клиника профессора Пасман», последующие исследования ФЖ проводили на базе НИИ фундаментальной и клинической иммунологии (НИИФКИ). Все исследования выполняли после письменного информированного добровольного согласия. Возраст женщин с бесплодием варьировал от 20 до 45 лет (медиана - 34,0), длительность бесплодия - от 1 года до 18 лет (медиана - 5,0). Первичное бесплодие диагностировали у 52%, вторичное - у 48% женщин. Процедура ЭКО проведена у 42% женщин, интрацитоплаз-матическая инъекция сперматозоида (IntraCytoplasmic Sperm Injection, ICSI, ИКСИ) - у 58%. Через 36 ч с момента введения триггера овуляции ооциты извлекали с помощью трансвагинальной ультразвуковой аспирации и собирали образцы ФЖ из доминантных фолликулов. В случае видимой контаминации образцов ФЖ кровью исследование не выполняли. Образцы ФЖ центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10 мин. Надоса-дочную жидкость собирали, замораживали и хранили при температуре -80 °С. Концентрацию ИЛ-6 в ФЖ оценивали методом проточной флюориметрии на 2-лу-чевом лазерном автоматизированном анализаторе (Bio-Plex Protein Assay System, Bio-Rad, США) с использованием коммерческих тест-систем в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Относительное содержание субпопуляций Т-клеток (CD4+Foxp3+ и CD4-Foxp3+) в образцах ФЖ оценивали методом проточной цитометрии, используя, анти-CD4 (PerCP, BD Biosciences, США) и анти-Foxp3 (PE, BD Biosciences, США) моноклональные антитела. Фиксацию и пер-меабилизацию клеток для оценки внутриклеточной экспрессии Foxp3 проводили после инкубации клеток с моноклональными антителами против поверхностных

2%  '"Иг 'У -"1 3%

-Леи. •.  7 Фщжъ- • ' ¿'сДЧА!',' •• • 20%

э

1024-

768 А

512 -

256 -\

ip

256

512

768

1024

Э

104"

103"

102-

101-

100

2%

язяии*

г ^гК^'1; г.

100

-1 I I I I II !

101

3%

20%

102 CD4-PerCP

103

104

Рис. 1. Цитометрическая характеристика популяций Рохр3+-Т-клеток в фолликулярной жидкости женщин в цикле экстракорпорального оплодотворния

А - представлено общее лимфоцитарное облако из которого они выделены; Б - СБ4+Гохр3+- и СВ4¥охр3+-Т-клетки (3 и 2% соответственно). Представлены данные репрезентативного наблюдения

0

0

CD4-антигенов; использовали коммерческий набор растворов для фиксации/пермеабилизации Transcription Factor Buffer Set в соответствии с инструкцией производителя (BD Biosciences, США). Исследование проводили по общепринятой методике с использованием параметров прямого и бокового светорассеяния и флюоресценции по каналам FL-2 (РЕ), FL-3 ^erCP), (BD FACS Calibur, CellQuest Software, США) (рис. 1). В тексте относительное содержание CD4+Foxp3+- и CD4-Foxp3+-T-клеток представлено в виде процента от количества лимфоцитов.

Качество эмбрионов морфологически оценивали по принятой классификации Gardner. Наступление беременности регистрировали при значениях хориони-ческого гонадотропина > 5 Ед/мл на 14-й день после эмбриотрансфера. Индекс оплодотворения (ИО) рассчитывали исходя из формулы: ИО = количество оплодотворенных ооцитов/количество полученных ооцитов. Показатели статистически обрабатывали с использованием программы Statistica 6.0. Данные представлены в виде медианы (Ме) и интерквартильного диапазона (IQR, 25-75% квартили). Для выявления значимых различий сравниваемых показателей использовали непараметрический [/-критерий Манна-Уитни. Различия считали достоверными при уровне значимости p < 0,05.

Результаты

Известно, что терапевтический потенциал ЭКО во многом определяется состоянием овариального резерва, а также качеством полученных ооцитов и эмбрионов [14]. Поскольку ранее нами было показано, что при проведении ЭКО у женщин с высоким количеством фолликулов, низким качеством ооцитов и эмбрионов, а также с негативными исходами ЭКО отмечалось низкое содержание Foxp3+-Treg, важно было выяснить, связано ли это с более высоким содержанием в ФЖ ИЛ-6.

Исследование ИЛ-6 показало, что все образцы ФЖ женщин со стимулированной овуляцией содержали детектируемые концентрации данного цитокина, медианный уровень которого составлял 20,4 пг/мл 10-85,5 /мл). При этом следует отметить, что индивидуальные значения ИЛ-6 отличались широким разбросом, варьируя в диапазоне от 8,0 до 1890 пг/мл (рис. 2).

При сравнении женщин с различным содержанием овуляторных фолликулов отмечено, что концентрация ИЛ-6 в группе с высоким количеством фолликулов (> 12) была наиболее высокой (табл. 1), в 6 раз превышая медианный уровень ИЛ-6 у женщин с низким ова-риальным резервом (< 6), тогда как значимых различий в содержании Бохр3+-Т-клеток в зависимости от числа фолликулов не выявлено.

1900

1800 300

140120 100 8060 40 20 0

Л Л Л

Рис. 2. Уровень ИЛ-6 в фолликулярной жидкости женщин в цикле экстракорпорального оплодотворения. Данные представлены в виде медианы и индивидуальных значений

Таблица 1. Содержание ИЛ-6 и Treg в фолликулярной жидкости женщин с различными эмбриологическими показателями

Параметры n ИЛ-6 (пг/мл) n СБ4ЕохР3+, % n СБ4+ЕохР3+, %

Ме (LQ-UQ) Ри Ме (LQ-UQ) Ри Ме (LQ-UQ) Ри

Количество фолликулов:

< 6 17 10 (10-12) 1-2 = 0,2 11 4,5 (2,5-6,5) 1-2 = 0,4 11 2,0 (1,0-4,0) 1-2 = 0,6

6-12 27 29 (10-94) 2-3 = 0,4 25 2,3 (1,3-4,3) 2-3 = 0,6 25 2,0 (1,3-4,0) 2-3 = 0,1

> 12 25 60 (10-103) 1-3 = 0,01 23 3,0 (1,0-5,0) 1-3 = 0,2 23 1,6 (1,0-3,0) 1-3 = 0,4

Количество ооцитов:

< 4 7 10 (10-55) 1-2 = 0,6 3 11,0 (2,0-20,0) 1-2 = 0,14 3 3,0 (0,6-4,0) 1-2 = 0,7

4-8 31 12 (10-55) 2-3 = 0,7 27 3,0 (1,0-7,0) 2-3 = 0,03 27 2,0 (1,0-3,8) 2-3 = 0,9

> 8 31 55 (10-103) 1-3 = 0,2 28 2,0 (1,0-3,0) 1-3 = 0,01 28 1,9 (1,0-3,0) 1-3 = 0,3

Индекс оплодотворения:

1,0-0,75 37 11 (10-55) 1-2 = 0,1 36 4,1 (2,0-7,0) 1-2 = 0,04 36 2,0 (1,0-4,0) 1-2 = 0,3

< 0,75 31 43

Качество бластоцист:

Высокое (класс А+В) 34 20 (10-66) 1-2 = 0,03 32 4,1 (2,0-7,0) 1-2 = 0,04 32 3,0 (1,0-4,1) 1-2 = 0,04

Низкое

Примечание. Здесь и в табл. 2 данные представлены в виде медианы и интерквартильного диапазона.

Сравнение показателей ИЛ-6 в ФЖ женщин с различным количеством ооцитов, полученных при трансвагинальной пункции яичников, показало, что содержание ИЛ-6 у женщин с высоким количеством ооцитов (> 8) было выше, чем в группе с низким количеством яйцеклеток (< 4), хотя эти различия и не были статистически значимыми. Повышенный уровень ИЛ-6 у женщин с высоким количеством ооцитов ассоциировался с достоверно более низким содержанием в ФЖ СБ4-Рохр3+-клеток и в виде тенденции СБ4+Рохр3+-клеток.

Поскольку полученные при пункции ооциты обладали различной способностью к оплодотворению, мы также сравнили содержание ИЛ-6 в группах женщин с различными индексами оплодотворения (ИО). Концентрация ИЛ-6 у женщин с более низким ИО (< 0,75) ооцитов была в среднем в 4 раза выше (ри = 0,1), чем в группе с высоким ИО (0,75-1,0) и ассоциировалась с достоверно меньшим содержанием СБ4-Рохр3+-клеток.

На следующем этапе проведен анализ связи ИЛ-6 с эмбриологическим показателем - качеством бластоци-сты. Характеристика бластоцисты на 5-е сутки развития дает основание судить об успешном запуске генома эмбриона и является одним из основных факторов, влияющих на имплантацию эмбриона и наступление беременности. На основании показателей качества бластоцист женщины были разделены на 2 группы - с высоким (классы А + В) и низким качеством бластоцист (класс С). Из данных табл. 2 видно, что в ФЖ женщин с низким качеством бластоцист концентрация ИЛ-6 5-кратно превышала медианные значения оппозитной группы (ри = 0,03),

при этом относительное содержание как СБ4-Рохр3+, так и СБ4+Рохр3+-11^ было достоверно ниже (ри = 0,04).

В завершение был проведен ретроспективный анализ уровня ИЛ-6 у женщин с различными исходами ЭКО: с наступившей и прогрессирующей беременностью (клиническая беременность); с наступившей, но не развивающейся беременностью (биохимическая беременность) и с отрицательным исходом ЭКО (отсутствие беременности). Концентрация ИЛ-6 в группе с негативным исходом достоверно превышала таковую в группе с клинической беременностью и ассоциировалась с наименьшим количеством СБ4Рохр3+-Т-клеток. Уровень ИЛ-6 в ФЖ женщин с биохимической беременностью также был выше, чем в группе с наступившей и прогрессирующей беременностью, хотя различия проявлялись на уровне тренда и не были сопряжены со значимыми различиями в содержании СБ4Рохр3+-Т-клеток.

Учитывая выявленную сопряженность между высоким уровнем ИЛ-6 и низким количеством СБ4Рохр3+-Т-клеток в ФЖ женщин с высоким количеством фолли-кулов/ооцитов, низким качеством ооцитов и бластоцист и негативным исходом ЭКО, а у женщин с низким качеством бластоцист - дополнительно с низким количеством СБ4+Рохр3+-Т-клеток, на заключительном этапе работы проанализирована корреляционная связь между указанными показателями.

Как видно из рис. 3, между концентрацией ИЛ-6 и количеством СБ4 Рохр3+-Т-клеток выявлялась обратная корреляционная зависимость, наиболее выраженная у женщин с большим количеством фолликулов (рис. 3, А) (г = -0,54; ри = 0,02), низким качеством бластоцист

Таблица 2. Содержание ИЛ-6 и Тге§ в фолликулярной жидкости женщин с различными исходами экстракорпорального оплодотворения

Параметр Клиническая беременность (п = 15) Биохимическая беременность (п = 18) Отрицательный исход (п = 16) Ри

1 2 3

ИЛ-6, пг/мл 10,0 (10,0-54,6) 48,8 (10,0-103,2) 29,6 (10,0-85,5) Р1-2 = 0,1 Р13 = 0,04 Р2-3 = 0,7

СБ4+РохР3+, % 2,0 (1,0-3,7) 3,0 (1,0-4,0) 1,6 (1,0-3,0) Р12 = 0,46 Р1 з = 0,98 Р2-3 = 0,52

СБ4-РохР3+, % 4,2 (1,6-7,0) 3,0 (2,0-4,0) 1,0 (1,0-3,0) Р12 = 0,83 Р13 = 0,04 Р-з = 0,92

(см. рис. 3, В) (г = -0,62; ри = 0,07) и отрицательным исходом ЭКО (см. рис. 3, Г) (г = -0,55; ри = 0,05). Корреляционная зависимость между числом СБ4Рохр3+-Т-клеток и ИЛ-6 у женщин с максимальным числом ооцитов (см. рис. 3, Б) была менее выраженной и проявлялась в виде тенденции (г = -0,36; ри = 0,1). При этом концентрация ИЛ-6 не кор-

релировала с количеством СБ4+Рохр3+-Т-клеток. Так, даже в группе с низким качеством блатоцист, в которой выявлялись одновременно высокое содержание ИЛ-6 и низкое количество СБ4+Рохр3+-Т-клеток, коэффициент корреляции между указанными параметрами составил г = 0,22; Ри = 0,76.

Рис. 3. Корреляционные связи ИЛ-6 и СБ4-РохР3+-Т-клеток в фолликулярной жидкости женщин в цикле экстракорпорального оплодотворения

А - связь показателей в подгруппе женщин с большим количеством фолликулов

Обсуждение

Эффективность ЭКО в настоящее время не превышает 33-40%, около трети всех беременностей прерывается на ранних сроках [14, 15]. Причины неудачных попыток ЭКО связывают с низким качеством ооцитов и бластоцист, низкой рецептивностью эндометрия и нарушением механизмов иммунологической толерантности. Учитывая участие иммунной системы в регуляции всех этапов репродуктивного процесса, включая фолликуло-/оогенез [16, 17], исследование иммунных биомаркеров, ассоциированных с исходом ЭКО, представляет значительный интерес как в научном, так и в прикладном аспектах.

Полученные данные демонстрируют, что в программе ЭКО женщины с наличием прогностически неблагоприятных факторов (высокое количество фолликулов и ооцитов, низкое качество бластоцист) и отсутствием беременности характеризуются более высоким содержанием в ФЖ ИЛ-6, что сопряжено с низким количеством интрафолликулярных СБ4Рохр3+-Т-клеток, относительное содержание которых обратно коррелирует с концентрацией ИЛ-6. При этом обратная взаимосвязь ИЛ-6 с количеством Бохр3+-Т-клеток проявляется исключительно в отношении субпопуляции СБ4--, но не СБ4+-Т-клеток.

Повышенный уровень ИЛ-6 в ФЖ женщин с более низким качеством ооцитов согласуется с данными Т. АШп и соавт. [8], которые рассматривают ИЛ-6 как негативный регулятор оогенеза, поскольку его высокий уровень связан с низким качеством ооцитов, не способных к оплодотворению. Аналогично выявленная в настоящем исследовании негативная ассоциация высокого уровня ИЛ-6 в ФЖ с низким качеством бластоцист и отрицательным исходом ЭКО, подтверждается работами других авторов [18].

В литературе также обсуждается важная роль Тге§ в контроле над процессом имплантации эмбриона и развитием беременности. Известно, что Тге§ подавляют Т-клеточный иммунный ответ, направленный против ал-лоантигенов эмбриона [19, 20], сдерживают воспаление: поддерживают сосудистое ремоделирование и способствуют инвазии трофобласта [13]. Снижение количества Тге§ или их функциональной активности обнаруживается при бесплодии неясного генеза, привычном невынашивании [21, 22], а также при поздних осложнениях беременности, включая преэклампсию и синдром задержки развития плода [23-25]. Тем не менее данные о сопряженности Тге§ с исходами ЭКО представлены

единичными публикациями с неоднозначными результатами. Так, по данным J. Zhou и соавт. [26], повышенное содержание в периферической крови CD4+CD25+Foxp3+-Т-клеток при проведении ЭКО ассоциировалось с более высокими показателями беременности, в том числе завершенной родами, тогда как по данным V. Schlossberger и соавт. [9] содержание CD4+CD25+Foxp3+-Treg в периферической крови женщин в зависимости от исхода ЭКО не различалось. При этом важно отметить, что содержание Treg в ФЖ женщин при проведении ЭКО, а тем более их взаимосвязь с уровнем ИЛ-6, ранее не исследовалась.

Известно ингибирующее действие ИЛ-6 на диф-ференцировку CD4+Тег, его клиническая значимость продемонстрирована при аутоиммунной патологии [3] и привычном невынашивании [7]. Однако в настоящем исследовании впервые продемонстрирована обратная связь между ИЛ-6 и содержанием СD4-Foxp3+-Т-клеток, представляющих, вероятно, субпопуляцию CD8+Treg. Согласно данным литературы, CD8+Treg у человека экс-прессируют Foxp3, несут на своей поверхности молекулы CD25, CD122, CD103, CTLA-4, CD39, CD73, LAG-3 и FasL; продуцируют ИЛ-10, TGF-P, ИЛ-34 и ИЛ-3; не экспрессируют маркеры активации (CD28, CD127) и подавляют пролиферацию CD4+ и/или CD8+ эффекторных Т-лимфоцитов, в том числе аллореактивных Т-клеток [27-29]. Процесс овуляции рассматривается как воспалительная реакция, при которой возрастает продукция провоспалительных цитокинов, в том числе ИЛ-2 [30]. Поскольку СD8+Foxp3+-Т-клетки лучше отвечают на низкие дозы ИЛ-2, чем CD4+Foxp3+-Treg [28], эти клетки могут иметь пролиферативное преимущество и первыми накапливаться в ФЖ к моменту овуляции. Учитывая также, что генерация CD8+Treg индуцируется TGF-P1 [31], а ИЛ-6 подавляет TGF-0-индуцированную дифференцировку Treg [3], присутствие в ФЖ высоких доз ИЛ-6 может оказывать ингибирующее действие и на накопление CD8+Treg.

Полученные данные косвенно свидетельствуют в пользу того, что интрафолликулярные Treg с фенотипом CD4Foxp3+ играют позитивную роль в регуляции ранних репродуктивных процессов, и одной из возможных причин недостаточности этих клеток может быть повышенный уровень ИЛ-6 в ФЖ. Об этом свидетельствуют результаты корреляционного анализа. Однако доказательства прямого или опосредованного эффекта ИЛ-6 на CD4Foxp3+-Т-клетки требуют дальнейших исследований.

Литература

1. Ryba-Stanislawowska M., Skrzypkowska M., Mysliwska J., Mysliwiec M. The serum IL-6 profile and Treg/Th17 peripheral cell populations in patients with type 1 diabetes. Mediators Inflamm. 2013; 2013: 205284. doi: 10.1155/2013/ 205284.

2. Korn T., Mitsdoerffer M., Croxford A.L., Awasthi A. et al. IL-6 controls Th17 immunity in vivo by inhibiting the conversion of conventional T cells into Foxp3+ regulatory T cells. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2008; 105 (47): 18 460-5. doi: 10.1073/pnas.0809850105.

3. Kimura A., Kishimoto T. IL-6: regulator of Treg/Th17 balance. Eur. J. Immunol. 2010; 40 (7): 1830-5. doi: 10.1002/eji.201040391.

4. Fujimoto M., Nakano M., Terabe F., Kawahata H. et al. The influence of excessive IL-6 production in vivo on the development and function of Foxp3+ regulatory T cells. J. Immunol. 2011; 186 (1): 3240. doi: 10.4049/ jimmunol.0903314.

5. Lin G., Wang J., Lao X., Wang J. et al. Interleukin-6 inhibits regulatory T cells and improves the proliferation and cytotoxic activity of cytokine-induced killer cells. J. Immunother. 2012; 35 (4): 337-43. doi: 10.1097/CJI.0b013e318255ada3.

6. Nakagawa T., Tsuruoka M., Ogura H., Okuyama Y. et al. IL-6 positively regulates Foxp3+CD8+ T cells in vivo. Int. Immunol. 2010; 22 (2): 129-39. doi: 10.1093/intimm/dxp119.

7. Zhu L., Chen H., Liu M., Yuan Y. et al. Treg/Th17 cell imbalance and IL-6 profile in patients with unexplained recurrent spontaneous abortion. Reprod. Sci. 2017; 24 (6): 882-90. doi: 10.1177/1933719116670517.

8. Altun T., Jindal S., Greenseid K., Shu J. et al. Low follicular fluid IL-6 levels in IVF patients are associated with increased likelihood of clinical pregnancy. J. Assist. Reprod. Genet. 2011. 28 (3): 245-51. doi: 10.1007/s10815-010-9502-8.

9. Schlossberger V., Schober L., Rehnitz J., Schaier M. et al. The success of assisted reproduction technologies in relation to composition of the total regulatory T cell (Treg) pool and different Treg subsets. Hum. Reprod. 2013; 28 (11): 3062-73. doi: 10.1093/humrep/det316.

10. Андреева Е.А., Хонина Н.А., Тихонова М.А., Баторов Е.В. и др. Регуляторные Т-клетки в фолликулярной жидкости у женщин, проходящих лечение по программе ЭКО. Мед. иммунология. 2018; 20 (5): 657-66.

11. Arruvito L., Sotelo A.I., Billordo A., Fainboim L.A. Physiological role for inducible FOXP3(+) Treg cells. Lessons from women with reproductive failure. Clin. Immunol. 2010; 136 (3): 43241. doi: 10.1016/j.clim.2010.05.002.

12. Hosseini S., Shokri F., Pour A.S., Jeddi-Tehrani M. et al. A shift in the balance of T17 and Treg cells in menstrual blood of women with unexplained recurrent spontaneous abortion. J. Reprod. Immunol. 2016; 116: 13-22. doi: 10.1016/j.jri.2016.03.001.

13. Du M.R., Guo P.F., Piao H.L., Wang S.C. et al. Embryonic trophoblasts induce decidual regulatory T cell differentiation and maternal-fetal tolerance through thymic stromal lymphopoietin instructing dendritic cells. J. Immunol. 2014; 15 (192): 1502-11. doi: 10.4049/jimmunol.1203425.

14. Крстич Е.В., Крстич М., Юдаев В.Н. Влияние качества ооцитов и состояния овариального резерва на терапевтический потенциал экстракорпорального оплодотворения у пациенток позднего репродуктивного возраста. Альманах клин. мед. 2014; 31: 70-5.

15. Zhang М., Bu Т., Tian H.-Q., Li X. et al. Analysis of factors influencing the cumulative pregnancy outcome of In Vitro fertilization-embryo transfer in women aged 35 years and older with normal ovarian reserve. Reprod Dev Med. 2017; 1 (4): 204-9. doi: 10.4103/2096-2924.224913.

16. Ye H., Li X., Zheng T., Liang X. et al. The effect of the immune system on ovarian function and features of ovarian germline stem cells. Springerplus. 2016; 5 (1): 990. doi: 10.1186/s40064-016-2390-3.

17. Kollmann Z., Schneider S., Fux M., Bersinger N.A., von Wolff M. Gonadotrophin stimulation in IVF alters the immune cell profile in follicular fluid and the cytokine concentrations in follicular fluid and serum. Hum. Reprod. 2017; 32 (4): 820-31. doi: 10.1093/humrep/ dex005.

18. Hammadeh M.E., Fischer-Hammadeh C., Amer A.S., Rosenbaum P. et al. Relationship between cytokine concentration in serum and preovulatory follicular fluid and in vitro fertilization/ intracytoplasmic sperm injection outcome. Chem. Immunol. Allergy. 2005; 88: 80-97. doi: 10.1159/000087822.

References

1. Ryba-Stanislawowska M., Skrzypkowska M., Mysliwska J., Mysliwiec M. The serum IL-6 profile and Treg/Th17 peripheral cell populations in patients with type 1 diabetes. Mediators Inflamm. 2013; 2013: 205284. doi: 10.1155/2013/ 205284.

2. Korn T., Mitsdoerffer M., Croxford A.L., Awasthi A., et al. IL-6 controls Th17 immunity in vivo by inhibiting the conversion of conventional T cells into Foxp3+ regulatory T cells. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2008; 105 (47): 18 460-5. doi: 10.1073/pnas.0809850105.

3. Kimura A., Kishimoto T. IL-6: regulator of Treg/Th17 balance. Eur. J. Immunol. 2010; 40 (7): 1830-5. doi: 10.1002/eji.201040391.

4. Fujimoto M., Nakano M., Terabe F., Kawahata H., et al. The influence of excessive IL-6 production in vivo on the development and function of Foxp3+ regulatory T cells. J. Immunol. 2011; 186 (1): 32-40. doi: 10.4049/ jimmunol.0903314.

19. Zenclussen M.L., Thuere C., Ahmad N., Wafula P.O. et al. The persistence of paternal antigens in the maternal body is involved in regulatory T-cell expansion and fetal-maternal tolerance in murine pregnancy. Am. J. Reprod. Immunol. 2010; 63 (3): 200-8. doi: 10.1111/j.1600-0897.2009.00793.x.

20. Lee S.K., Kim C.J., Kim D.-J., Kang J.-H. Immune cells in the female reproductive tract. Immune Network. 2015; 15 (1): 16-26. doi: 10.4110/in.2015.15.1.16.

21. Jiang R., Yan G., Xing J., Wang Z. et al.. Abnormal ratio of CD57+ cells to CD56+ cells in women with recurrent implantation failure. Am. J. Reprod. Immunol. 2017; 78 (5): e12777. doi: 10.1111/ aji.1708.

22. Shima T., Sasaki Y., Itoh M., Nakashima A. et al. Regulatory T cells are necessary for implantation and maintenance of early pregnancy but not late pregnancy in allogeneic mice. J. Reprod. Immunol. 2010; 85 (2): 121-9. doi: 10.1016/j.jri.2010.02.006.

23. Robertson S.A., Care A.S., Moldenhauer L.M. Regulatory T cells in embryo implantation and the immune response to pregnancy. J. Clin. Invest. 2018; 128 (10): 4224-35. doi: 10.1172/ JCI122182.

24. Nehar-Belaid D., Courau T., Dérian N., Florez L. et al. Regulatory T cells orchestrate similar immune evasion of fetuses and tumors in mice. J. Immunol. 2016; 196 (2): 678-90. doi: 10.4049/ jimmunol.1501834.

25. Rahimzadeh M., Norouzian M., Arabpour F., Naderi N. Regulatory T-cells and preeclampsia: an overview of literature. Expert Rev. Clin. Immunol. 2016; 12 (2): 209-27. doi: 10.1586/1744666X.2016.1105740.

26. Zhou J., Wang Z., Zhao X., Wang J. et al. An increase of Treg cells in the peripheral blood is associated with a better in vitro fertilization treatment outcome. Am. J. Reprod. Immunol. 2012; 68 (2): 100-6. doi: 10.1111/j.1600-0897.2012.01153.x.

27. Vieyra-Lobato M.R., Vela-Ojeda J., Montiel-Cervantes L., Lopez-Santiago R. et al. Description of CD8+ regulatory T lymphocytes and their specific intervention in graft-versus-host and infectious diseases, autoimmunity and cancer. J. Immunol. Res. 2018; 2018: 3758713. doi: 10.1155/2018/3758713.

28. Churlaud G., Pitoiset F., Jebbawi F., Lorenzon R. et al. Human and mouse CD8+CD25+FOXP3+ regulatory T cells at steady state and during Interleukin-2 therapy. Front. Immunol. 2015; 6: 171. doi: 10.3389/fimmu.2015.00171.

29. Patterson S.J., Pesenacker A.M., Wang A.Y., Gillies J. et al. T regulatory cell chemokine production mediates pathogenic T cell attraction and suppression. J. Clin. Invest. 2016; 126 (3): 1039-51. doi: 10.1172/JCI83987.

30. Oakley O.R., Kim H.Y., El-Amouri I., Lin P.P. et al. Periovulatory leukocyte infiltration in the rat ovary. Endocrinology. 2010; 151 (9): 4551-9. doi: 10.1210/en.2009-1444.

31. Wu M.., Chen X., Lou J., Zhang S. et al. TGF-ß1 contributes to CD8+ Treg induction through p38 MAPK signaling in ovarian cancer microenvironment. Oncotarget. 2016; 7 (28): 44 534-44. doi: 10.18632/oncotarget.10003.

5. Lin G., Wang J., Lao X., Wang J., et al. Interleukin-6 inhibits regulatory T cells and improves the proliferation and cytotoxic activity of cytokine-induced killer cells. J. Immunother. 2012; 35 (4): 337-43. doi: 10.1097/CJI.0b013e318255ada3.

6. Nakagawa T., Tsuruoka M., Ogura H., Okuyama Y., et al. IL-6 positively regulates Foxp3+CD8+ T cells in vivo. Int. Immunol. 2010; 22 (2): 129-39. doi: 10.1093/intimm/dxp119.

7. Zhu L., Chen H., Liu M., Yuan Y., et al. Treg/Th17 cell imbalance and IL-6 profile in patients with unexplained recurrent spontaneous abortion. Reprod. Sci. 2017; 24 (6): 882-90. doi: 10.1177/1933719116670517.

8. Altun T., Jindal S., Greenseid K., Shu J., et al. Low follicular fluid IL-6 levels in IVF patients are associated with increased likelihood of clinical pregnancy. J. Assist. Reprod. Genet. 2011. 28 (3): 245-51. doi: 10.1007/s10815-010-9502-8.

9. Schlossberger V., Schober L., Rehnitz J., Schaier M., et al. The success of assisted reproduction technologies in relation to composition of the total regulatory T cell (Treg) pool and different Treg subsets. Hum. Reprod. 2013; 28 (11): 3062-73. doi: 10.1093/humrep/det316.

10. Andreeva E.A., Khonina N.A., Tikhonova M.A., Batorov E.V., et al. Regulatory T cells in follicular fluid of women undergoing IVF treatment. Meditsinskaya immunologiya. 2018; 20

11. Arruvito L., Sotelo A.I., Billordo A., Fainboim L.A. Physiological role for inducible FOXP3(+) Treg cells. Lessons from women with reproductive failure. Clin. Immunol. 2010; 136 (3): 432-41. doi: 10.1016/j. clim.2010.05.002.

12. Hosseini S., Shokri F., Pour A.S., Jeddi-Tehrani M., et al. A shift in the balance of T17 and Treg cells in menstrual blood of women with unexplained recurrent spontaneous abortion. J. Reprod. Immunol. 2016; 116: 13-22. doi: 10.1016/j.jri.2016.03.001.

13. Du M.R., Guo P.F., Piao H.L., Wang S.C., et al. Embryonic trophoblasts induce decidual regulatory T cell differentiation and maternal-fetal tolerance through thymic stromal lymphopoietin instructing dendritic cells. J. Immunol. 2014; 15 (192): 1502-11. doi: 10.4049/ jimmunol.1203425.

14. Krstic E.V., Krstic M., Yudaev V.N. Effect of oocytes quality and ovarian reserve on the therapeutic potential of in vitro fertilization in patients of late reproductive age. Almanakh klinicheskoy meditsiny. 2014; 31: 70-5.

15. Zhang M., Bu T., Tian H.-Q., Li X., et al. Analysis of factors influencing the cumulative pregnancy outcome of In Vitro fertilization-embryo transfer in women aged 35 years and older with normal ovarian reserve. Reprod Dev Med. 2017; 1 (4): 204-9. doi: 10.4103/20962924.224913.

16. Ye H., Li X., Zheng T., Liang X., et al. The effect of the immune system on ovarian function and features of ovarian germline stem cells. Springerplus. 2016; 5 (1): 990. doi: 10.1186/s40064-016-2390-3.

17. Kollmann Z., Schneider S., Fux M., Bersinger N.A., von Wolff M. Gonadotrophin stimulation in IVF alters the immune cell profile in follicular fluid and the cytokine concentrations in follicular fluid and serum. Hum. Reprod. 2017; 32 (4): 820-31. doi: 10.1093/humrep/dex005.

18. Hammadeh M.E., Fischer-Hammadeh C., Amer A.S., Rosenbaum P., et al. Relationship between cytokine concentration in serum and preovulatory follicular fluid and in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection outcome. Chem. Immunol. Allergy. 2005; 88: 80-97. doi: 10.1159/000087822.

19. Zenclussen M.L., Thuere C., Ahmad N., Wafula P.O., et al. The persistence of paternal antigens in the maternal body is involved in regulatory T-cell expansion and fetal-maternal tolerance in murine

pregnancy. Am. J. Reprod. Immunol. 2010; 63 (3): 200-8. doi: 10.1111/j.1600-0897.2009.00793.x.

20. Lee S.K., Kim C.J., Kim D.-J., Kang J.-H. Immune cells in the female reproductive tract. Immune Network. 2015; 15 (1): 16-26. doi: 10.4110/in.2015.15.1.16.

21. Jiang R., Yan G., Xing J., Wang Z., et al. Abnormal ratio of CD57+ cells to CD56+ cells in women with recurrent implantation failure. Am. J. Reprod. Immunol. 2017; 78 (5): e12777. doi: 10.1111/aji.1708.

22. Shima T., Sasaki Y., Itoh M., Nakashima A., et al. Regulatory T cells are necessary for implantation and maintenance of early pregnancy but not late pregnancy in allogeneic mice. J. Reprod. Immunol. 2010; 85 (2): 121-9. doi: 10.1016/j.jri.2010.02.006.

23. Robertson S.A., Care A.S., Moldenhauer L.M. Regulatory T cells in embryo implantation and the immune response to pregnancy. J. Clin. Invest. 2018; 128 (10): 4224-35. doi: 10.1172/JCI122182.

24. Nehar-Belaid D., Courau T., Dérian N., Florez L., et al. Regulatory T cells orchestrate similar immune evasion of fetuses and tumors in mice. J. Immunol. 2016; 196 (2): 678-90. doi: 10.4049/jimmunol.1501834.

25. Rahimzadeh M., Norouzian M., Arabpour F., Naderi N. Regulatory T-cells and preeclampsia: an overview of literature. Expert Rev. Clin. Immunol. 2016; 12 (2): 209-27. doi: 10.1586/1744666X.2016.1105740.

26. Zhou J., Wang Z., Zhao X., Wang J., et al. An increase of Treg cells in the peripheral blood is associated with a better in vitro fertilization treatment outcome. Am. J. Reprod. Immunol. 2012; 68 (2): 100-6. doi: 10.1111/j.1600-0897.2012.01153.x.

27. Vieyra-Lobato M.R., Vela-Ojeda J., Montiel-Cervantes L., LopezSantiago R., et al. Description of CD8+ regulatory T lymphocytes and their specific intervention in graft-versus-host and infectious diseases, autoimmunity and cancer. J. Immunol. Res. 2018; 2018: 3758713. doi: 10.1155/2018/3758713.

28. Churlaud G., Pitoiset F., Jebbawi F., Lorenzon R., et al. Human and mouse CD8+CD25+FOXP3+ regulatory T cells at steady state and during Interleukin-2 therapy. Front. Immunol. 2015; 6: 171. doi: 10.3389/ fimmu.2015.00171.

29. Patterson S.J., Pesenacker A.M., Wang A.Y., Gillies J., et al. T regulatory cell chemokine production mediates pathogenic T cell attraction and suppression. J. Clin. Invest. 2016; 126 (3): 1039-51. doi: 10.1172/JCI83987.

30. Oakley O.R., Kim H.Y., El-Amouri I., Lin P.P., et al. Periovulatory leukocyte infiltration in the rat ovary. Endocrinology. 2010; 151 (9): 45519. doi: 10.1210/en.2009-1444.

31. Wu M.., Chen X., Lou J., Zhang S., et al. TGF-ß1 contributes to CD8+ Treg induction through p38 MAPK signaling in ovarian cancer microenvironment. Oncotarget. 2016; 7 (28): 44 534-44. doi: 10.18632/ oncotarget.10003.