ФЕРМЕНТАТИВНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ
FERMENTATIVE PRODUCTION OF ORGANIC COMPOUNDS

Настоящее изобретение касается ферментативного получения органических соединений по меньшей мере с 3 атомами углерода или по меньшей мере с 2 атомами углерода и по меньшей мере 1 атомом азота с использованием содержащей сахар среды, включающей в себя по меньшей мере часть не содержащих крахмала твердых компонентов источника крахмала, для культивирования микроорганизмов.
Содержащие сахар жидкие среды представляют собой основной источник питательных веществ для множества способов ферментации; используемые микроорганизмы метаболизируют содержащиеся в средах сахара и при этом получают конечные органические продукты. Палитра синтезируемых таким образом продуктов микробного метаболизма, т.е. органических соединений, включает при этом, например, летучие низкомолекулярные соединения, как то: этанол, нелетучие продукты метаболизма, например аминокислоты, витамины и каротиноиды, а также множество других веществ.
Для таких общеизвестных способов ферментации с использованием микроорганизмов в зависимости от условий процесса используют различные источники углерода. Разнообразные варианты включают в себя чистую сахарозу, мелассу из свекловичного и тростникового сахара, так называемые „high test molasses" (высокосахаристые мелассы, обращенные тростниково-сахарные мелассы), вплоть до глюкозы из гидролизатов крахмала. Кроме того, для биотехнологического производства л-лизина в качестве дополнительных субстратов, применение которых возможно в технических масштабах, применяют уксусную кислоту и этанол (Pfefferle et al., Biotechnogical Manufacture of Lysine, Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Vol.79 (2003), 59-112).
На использовании указанных источников углерода основаны различные методы и способы ферментативного производства нелетучих продуктов микробного метаболизма на базе сахара. На примере л-лизина Pfefferle et al. (указ. соч.) описывают эти процессы с точки зрения развития штаммов, процесса и промышленного производства.
Важный источник ферментативного производства продуктов микробного метаболизма, опосредованного микроорганизмами, - это крахмал. Прежде чем его можно будет использовать как источник углерода в ферментации, на предшествующих этапах реакции его необходимо подвергнуть сжижению и осахариванию. Крахмал для этих целей получают из натурального крахмалсодержащего сырья, как то: картофеля, маниока, злаков, например, пшеницы, кукурузы, ячменя, ржи, тритикале или риса, обычно прошедших предварительную очистку (мойку), а затем ферментативным способом сжижают и осахаривают, чтобы использовать его затем собственно в ферментации для производства желаемых продуктов метаболизма.
Помимо использования источников крахмала, прошедших такую предварительную очистку, описано также применение источников крахмала, не прошедших предварительную обработку, для создания источников углерода для ферментативного производства продуктов микробного метаболизма. Обычно крахмалсодержащее сырье при этом сначала измельчают размолом. Измельченный продукт затем подвергают сжижению и осахариванию. Поскольку этот измельченный продукт, естественно, состоит помимо крахмала еще и из ряда не содержащих крахмала компонентов, оказывающих отрицательное влияние на ферментацию, эти компоненты перед ферментацией обычно отделяют. Отделение можно проводить либо непосредственно после размола (международная заявка WO 02/277252; патенты Японии JP 2001-072701; JP 56-169594; патент КНР CN 1218111), после сжижения (международная заявка WO 02/277252; патент КНР CN 1173541) или после осахаривания (патент КНР CN 1266102; Beukema et al.: Production of fermentation syrups by enzymatic hydrolysis of potatoes; potatoe saccharification to give culture medium (Conference Abstract), Symp. Biotechnol. Res. Neth. (1983), 6; NL83 02229). Во всех вариантах, однако, в ферментации используют гидролизат крахмала высокой очистки.
В более новых технологиях используют, в частности, улучшенные методы, которые должны обеспечить возможность очищать, например, сжиженные и осахаренные растворы крахмала перед ферментацией (патент Японии JP 57159500) и ферментационные среды из возобновляемых ресурсов (европейский патент ЕР 1205557).
С другой стороны, широко известно масштабное применение необработанных источников крахмала при ферментативном производстве биоэтанола. При этом источники крахмала, обычно - целые зерна злаков, сначала подвергают сухому измельчению, а затем гидролизуют содержащую крахмал часть источника крахмала с использованием ферментов. При этом гидролиз можно проводить как прерывистым образом, например, в котлах с мешалкой, так и непрерывно, например, в сопловых котлах. Описания соответствующих процессов приведены, например, в „The Alcohol Textbook - A reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries", Jaques et al. (Hg.). Nottingham Univ. Press 1995, ISBN 1-8977676-735, Kapitel 2, S.7-23, и в McAloon et al., „Determining the cost of producing ethanol from corn starch and lignocel-lulosic feedstocks", NREL/TP-580-28893, National Renewable Energy Laboratory, October 2000.
Поскольку при ферментативном производстве этанола биологического происхождения конечный продукт получают дистилляцией, использование источников крахмала в неочищенной форме после процессов сухого размола не представляет особой проблемы. При использовании же способа сухого размола для производства нелетучих продуктов микробного метаболизма возникает проблема, состоящая в потоке твердого вещества, вносимого сахарным раствором в ферментацию, поскольку оно может как отрицательно сказаться на ферментации, например, с точки зрения скорости кислородного обмена используемых микроорганизмов или их потребности в кислороде (ср. Mersmann, A. et al.: Selection and Design of Aerobic Bioreactors, Chem. Eng. Technol. 13 (1990), 357-370), так и существенно осложнить последующую переработку.
Кроме того, из-за внесения твердых веществ уже при создании крахмалсодержащей суспензии возможно достижение критических величин вязкости используемой среды, ввиду чего гомогенное перемешивание, например, суспензии, содержащей более 30 мас.% кукурузной муки в воде, невозможно (Industrial Enzymology, 2. Aufl., T. Godfrey, S. West, 1996). Поэтому концентрация глюкозы при использовании обычных технологий ограничена. С точки зрения ферментативного синтеза биоэтанола это неважно, поскольку ввиду токсичности получаемого продукта для дрожжей, применяемых для ферментации, реакция при более высоких концентрациях все равно невозможна.
При ферментативном производстве иных органически продуктов метаболизма, нежели этанол, подавать на ферментацию содержащие сахар среды с низкой концентрацией сахара в принципе невыгодно, поскольку это ведет к непропорционально высокому разбавлению ферментационного бульона, а следовательно, падает достижимая конечная концентрация итогового продукта, что, с одной стороны, вызывает повышение расходов при его получении из ферментационной среды, а кроме того, снижается объемно-временной выход. Эти соображения особенно важны в том случае, когда гидролизат крахмала, приготовленный для крупномасштабного производства биоэтанола, который обычно содержит сахар или глюкозу в низких концентрациях, примерно до 30 или 33 %, частично необходимо подавать на дополнительную ферментацию в малом объеме для производства других химикатов.
Ввиду этих сложностей и ограничений способы сухого размола, которые широко применяют для производства биоэтанола, не имеют до сих пор заметного экономического значения при ферментативном синтезе других продуктов метаболизма, нежели этанол.
На настоящий момент имеются описания попыток переноса концепции сухого размола и принципиальных преимуществ, связанных с этим способом, на производство продуктов микробного метаболизма в промышленных масштабах только при использовании маниока в качестве источника крахмала. Так, в патенте Японии JP 2001/275693 описан способ ферментативного производства аминокислот, при котором в качестве источника крахмала используют очищенные от кожуры клубни маниока, которые размалывают в сухом виде. Для проведения процесса по этому способу, однако, необходимо задать в продукте помола размер частиц не ≤150 мкм. При используемой для этого фильтрации перед сжижением/осахариванием имеющегося крахмала и последующей ферментацией отделяют часть использованного продукта помола, включая не содержащие крахмала компоненты. При этом способе получают умеренные концентрации сахара. Подобный способ описан в японском патенте JP 2001/309751, который направлен на получение кормовых добавок, содержащих аминокислоты.
Повышения концентрации сахара в применяемой для ферментации жидкой среде можно достичь при использовании для осахаривания продуктов размола, включающих в основном твердые не содержащие крахмала компоненты источника крахмала, с помощью способа описанного фирмой заявителем в международной заявке WO 2005/116228 (РСТ/ЕР 2005/005728). Неожиданно оказалось, что перед ферментацией нет необходимости в отделении содержащихся в источнике крахмала твердых, не содержащих крахмала компонентов. Схожий способ с применением источников крахмала, который выбирают из зерен злаков, описан в европейском патенте РСТ/ЕР 2006/066057 (старой немецкой заявке на патент DE 102005042541.0) фирмы-заявителя. Для непрерывной подготовки содержащих сахар сред с высокой концентрацией сахара этот способ, однако, сравнительно дорог.
Таким образом, задача настоящего изобретения состояла в том, чтобы предложить еще один способ синтеза органических соединений посредством ферментации, который не требовал бы предварительного отделения или хотя бы не требовал предварительного полного отделения имеющихся в источнике крахмала твердых компонентов, не содержащих крахмала. В частности, способ должен предоставлять возможность непрерывного гидролиза крахмального компонента источника крахмала. Кроме того, он должен отличаться тем, чтобы применяемые среды были просты в обращении, а их применение в ферментации не было связано со сложностями. В особенности же способ должен позволять использовать в качестве источника крахмала (крахмалсодержащего сырья) зерновые.
Неожиданно было обнаружено, что способ ферментативного производства органических соединений, несмотря на свойственное ему большое количество вносимых твердых веществ, можно эффективно применять, если готовить необходимый для ферментации сахар в форме водной среды, которую получают посредством:
i) измельчения источника крахмала (крахмалсодержащего сырья) с получением измельченного продукта, включающего по меньшей мере часть не содержащих крахмала твердых компонентов источника крахмала;
ii) суспендирование измельченного продукта в жидкости на основе воды в таком количестве, чтобы получить в результате в суспензии содержание сухой массы от по меньшей мере 45 мас.%,
iii) гидролиза крахмальной составляющей продукта помола посредством сжижения и, при необходимости, последующего осахаривания, причем получают водную среду М, которая содержит гидролизованные крахмальные компоненты источника крахмала и по меньшей мере часть не содержащих крахмала твердых компонентов источника крахмала, причем гидролиз включает в себя нагрев суспензии продукта помола путем подачи в суспензию водяного пара до температур, превышающих температуру клейстеризации крахмала, содержащегося в измельченном продукте.
Предметом изобретения, таким образом, является способ производства по меньшей мере одного органического соединения по меньшей мере с 3 атомами углерода или с по меньшей мере 2 атомами углерода и по меньшей мере одним атомом азота посредством ферментации, включающий в себя помимо этапов i) и ii) следующие этапы:
iii) гидролиз крахмальной составляющей измельченного продукта посредством сжижения и, при необходимости, последующего осахаривания, причем получают водную среду М, которая содержит гидролизованные крахмальные компоненты крахмалсодержащего сырья и по меньшей мере часть не содержащих крахмала твердых компонентов крахмалсодержащего сырья; и
iv) применение водной среды М, полученной на стадии iii), в ферментации для культивирования микроорганизма, способного к повышенному производству органического соединения;
причем на стадии iii) суспензию, полученную на этапе ii), нагревают путем подачи в суспензию водяного пара до температур, превышающих температуру клейстеризации крахмала, содержащегося в измельченном продукте.
Несмотря на высокое содержание сухой массы в используемой для гидролиза суспензии, проведение гидролиза способом согласно изобретению возможно без сложностей, при этом получают соответственно высокую концентрацию пригодных к метаболизации сахаров. При этом, что неожиданно, не играет никакой роли, находится ли сахар после гидролиза в форме моно- или дисахаридов или же в форме олигосахаридов (декстринов). Высокое содержание твердых, не включающих крахмала компонентов источника крахмала в полученной среде, неожиданным образом не мешает ферментации. К тому же посредством способа согласно изобретению удается в основном избежать проблем, обусловленных вязкостью, возникновение которых возможно при сжижении источника крахмала (крахмалсодержащего сырья), когда концентрация измельченного продукта высока. Поскольку высокое содержание сухой массы в ферментационной среде сопровождается высокой концентрацией пригодных к метаболизации сахаров, эту среду можно особо благоприятным образом использовать в ферментации на этапе подкормки, благодаря чему избегают нежелательного разбавления или по меньшей мере значительно его снижают. Разумеется, получаемая согласно изобретению среда М также пригодна в качестве источника сахара в порционной фазе ферментации.
Термины "крахмальная часть" и "крахмальный компонент" здесь и ниже употребляются как синонимы.
В отношении получаемой на стадии iii) водной среды М термины «водная среда», «жидкая среда» и «содержащая сахар жидкость на основе воды», а также «водный гидролизат крахмала» употребляются как синонимы.
Термин „сжижение" здесь и ниже означает гидролитическую деградацию крахмала до олигосахаридов, в частности - до декстринов.
Термины „осахаривание" и „осахаривать" здесь и ниже означают гидролиз декстринов до моносахаридов, в частности, до таких моносахаридов, как глюкоза. Под «осахаривающим ферментом» ниже подразумевают фермент, гидролизующий декстрины до моносахаридов.
Под термином «декстрин» здесь и ниже подразумевают олигосахариды, полученные гидролитической деградацией крахмала, которые состоят из 3-18, в особенности из 6-12 моносахаридных мономеров, в частности из мономеров глюкозы.
Термины „содержание эквивалентов глюкозы" и „концентрация сахаров" означают общую концентрацию в среде моносахаридов, дисахаридов и олигосахаридов, потенциально доступных для ферментации. Термин «эквиваленты глюкозы» включает в себя также отличающиеся от глюкозы пригодные к метаболизации сахара или сахарные мономеры.
Термины „производящий с превышением" и „повышенное производство" здесь и ниже применяют к микроорганизму, чтобы охарактеризовать его свойство производить один или несколько продуктов своего метаболизма в количестве, которое превосходит таковое, необходимое для размножения микроорганизма, благодаря чему в ферментационной среде идет обогащение, причем обогащение может быть внутриклеточным или внеклеточным.
Источниками крахмала для размола являются в первую очередь сухие плоды или семена зерновых, которые в сухом состоянии характеризуются долей крахмала не менее 40 мас.%, а предпочтительно - не менее 50 мас.%. Таковые имеются во многих широкомасштабно культивируемых на сегодняшний день злаковых растениях, как то: кукурузе, пшенице, овсе, ячмене, ржи, тритикале, рисе и в различных сортах проса, например сорго и белом сорго. Предпочтительно выбирать источник крахмала из группы, включающей зерна кукурузы, ржи, тритикале и пшеницы. В принципе, способ согласно изобретению можно также применять и с использованием аналогичных источников крахмала, как, например, смеси различных содержащих крахмал плодов или семян зерновых.
Для получения содержащей сахар жидкой среды на стадии i) конкретный источник крахмала, с добавлением жидкости, например, воды, или без такового, размалывают, предпочтительно без добавления жидкости. Возможно также сочетание сухого размола с последующим мокрым размолом.
Для сухого размола, как правило, используют молотковые дробилки, роторные мельницы или вальцовые дробилки, для мокрого размола пригодны смесители, шаровые мельницы с мешалкой, циркуляционные мельницы, дисковые мельницы, мельницы с кольцевой камерой, вибрационные или планетарные мельницы. В принципе, возможно использование и других мельниц. Необходимое для мокрого размола количество жидкости специалист может определить в процессе опытов. Обычно его задают так, чтобы содержание сухого вещества находилось в пределах от 10 до 20 мас.%.
Размолом (измельчениием) задают величину зерна (частиц), пригодную для последующих этапов способа. При этом оказалось целесообразно, чтобы при размоле, особенно в случае сухого размола, продукт помола, получаемый на этапе i), содержал частицы муки, т.е. компоненты в виде частиц, с размером в пределах от 100 до 630 мкм в количестве от 30 до 100 мас.%, предпочтительно - от 40 до 95 мас.%, а особо предпочтительно - от 50 до 90 мас.%. Целесообразно, чтобы полученный продукт помола содержал 50 мас.% частиц муки размером более 100 мкм. Как правило, по меньшей мере 95 мас.% полученных при размоле частиц муки обладают размером менее 2 мм. Измерение размера частиц при этом проводят посредством ситового анализа с использованием вибрационной анализирующей машины. Малый размер частиц принципиально выгоден для достижения высокого выхода продукции. Слишком малый размер частиц, однако, может вызвать проблемы, в частности, ввиду образования комьев (агломерации) при подмешивании продукта помола во время сжижения или последующей обработки, например, при сушке твердых веществ после этапа ферментации.
Для обозначения видов муки обычно используют степень помола или тип муки, причем они соотносятся друг с другом так, что с ростом степени помола возрастает также и характеристическое число типа муки. Степень помола соответствует весу полученной муки относительно 100 частей размалываемого материала. В то время как на начальных этапах размола получают чистую и наиболее тонкую муку, например, из внутренней части зерна, при дальнейшем размоле, то есть при возрастании степени помола, возрастает доля грубых волокон и пленчатость (доля оболочек), а доля крахмала при этом уменьшается. Степень размола, следовательно, отображается также в так называемых типах муки, которые указывают в числах и используют для классификации муки, особенно муки злаковых, и которые основаны на содержании в муке золы (так называемая шкала зольности). Типы муки или номер типа при этом означает количество зол (минеральных веществ) в мг, которое остается при сжигании 100 г сухой муки. Для муки злаковых более высокий номер типа означает более высокую степень помола, поскольку внутренняя часть зерна злаковых содержит ок. 0,4 мас.%, а оболочка, напротив - ок. 5 мас.% зол. Следовательно, при более низкой степени помола мука злаковых состоит преимущественно из измельченного эндосперма, т.е. крахмалистой части зерен злаковых; при более высокой степени помола мука злаковых содержит также измельченный алейроновый слой зерен злаковых, богатый белком, а в случае продуктов грубого дробления - еще и компоненты зародышей, содержащие белок и жир, а также оболочек семян, содержащих грубые волокна и золы. Для целей согласно изобретению предпочтительны виды муки с высокой степенью помола либо высоким числом типа. Если в качестве источника крахмала используют злаковые, то предпочтительно размалывать и подвергать дальнейшей обработке целые неочищенные зерна, при необходимости - после предварительного механического отделения зародышей и лузги.
Согласно изобретению используемый продукт помола содержит по меньшей мере часть, предпочтительно - не менее 20 мас.%, в частности - не менее 50 мас.%, в специальных случаях - не менее 90 мас.%, а в весьма специальных случаях - не менее 99 мас.%, имеющихся в размолотых зернах злаков не содержащих крахмал твердых компонентов, соответственно степени помола. При расчете относительно содержащих крахмал компонентов продукта помола (и соответственно относительно количества доступного для метаболизации сахара в среде М) доля не содержащих крахмал твердых компонентов предпочтительно составляет не менее 10 мас.%, в частности - не менее 15 мас.%, например, от 15 до 75 мас.%, а в особых случаях - от 20 до 60 мас.%.
Затем продукт помола на стадии ii) смешивают с жидкостью на основе воды, например, с чистой водой, рециркулированной водой из процесса, например, из последующей ферментации, или со смесью этих жидкостей, при этом получают водную суспензию. Этот процесс часто называют получением пульпы.
Как правило, с жидкостью на водной основе смешивают такое количество источника крахмала и измельченного продукта, чтобы полученная суспензия содержала по меньшей мере 45 мас.%, во многих случаях - по меньшей мере 50 мас.%, в особенности - по меньшей мере 55 мас.%, в специальных случаях - по меньшей мере 60 мас.%, например, 45 - 80 мас.%, предпочтительно - от 50 до 75 мас.%, в частности - от 55 до 70 мас.%, а в особенности - от 60 до 70 мас.% сухой массы.
В принципе, возможно предварительно подогреть жидкость на водной основе, используемую для создания суспензии из твердого продукта помола, до несколько повышенной температуры, например, в пределах от 40 до 70°С. Предпочтительно выбирать температуру жидкости так, чтобы полученная суспензия имела температуру ниже температуры клейстеризации крахмала, предпочтительно по меньшей мере на 5 К ниже температуры клейстеризации. Целесообразно, чтобы температура суспензии не превышала 60°С, в частности 55°С.
Создание суспензии продукта помола, имеющего форму частиц, в жидкости на водной основе можно поводить как прерывистым, так и непрерывным способом в обычных для этого устройствах, например, прерывистым способом в смесителях с мешалками или в смесительных устройствах для смешения твердых веществ с жидкостями, работающих непрерывно, например, в смесителях, работающих по принципу ротора и статора.
Для проведения гидролиза водную суспензию, содержащую измельченный продукт, сначала нагревают до температуры, превышающей температуру клейстеризации крахмала, который содержится в источнике крахмала или в продукте помола, путем введения водяного пара. Необходимая для этого в случае конкретного вида крахмала температура известна специалисту (см. цитированную вначале „The Alcohol Textbook - A reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries", Kapitel 2, S.11) или может быть определена специалистом в процессе рутинных опытов. Обычно нагрев проводят до температуры, которая превышает конкретную температуру клейстеризации по меньшей мере на 10 К, в особенности - по меньшей мере на 20 К, например на величину от 10 до 100 K, в частности - на 20-80 K. В частности, суспензию нагревают до температур, лежащих в пределах от 90 до 150°С, и в особенности - в пределах от 100 до 140°С.
Пар, используемый для нагрева, как правило, представляет собой перегретый водяной пар, температура которого составляет по меньшей мере 105°С, в особенности - по меньшей мере 110°С, например от 110 до 210°С. Целесообразно вводить пар в суспензию под повышенным давлением. Соответственно, предпочтительное давление пара составляет по меньшей мере 1,5 бар, например от 1,5 до 16 бар, в особенности - от 2 до 12 бар.
Введение водяного пара в суспензию, как правило, осуществляют так, чтобы он поступал под избыточным давлением, предпочтительно - под избыточным давлением, составляющим от 1 до 10 или 11 бар, в частности - от 1,5 до 5 бар и предпочтительно с высокой скоростью. Благодаря введению пара суспензия мгновенно нагревается до температур более 90°С, то есть до температур, превышающих температуру клейстеризации.
Нагревание водяным паром целесообразно проводить в устройстве, работающем непрерывно, в которое непрерывно же под определенным давлением подают суспензию, причем давление определяют на основе вязкости суспензии, скорости подачи и геометрических характеристик устройства, а в области ввода суспензии в устройство подают через регулируемое сопло горячий пар под давлением, избыточным по сравнению с давлением подачи. Благодаря тому что пар подают под избыточным давлением, происходит не только нагрев суспензии, но в нее еще и поступает механическая энергия, способствующая дальнейшему измельчению частиц продукта помола, обеспечивающая особо равномерное введение энергии и, соответственно, дающая в итоге особо равномерную клейстеризацию гранулярных частиц крахмала в продукте помола. Обычно такие устройства имеют форму трубы. Целесообразно осуществлять подачу пара в направлении продольной оси устройства, имеющего форму трубы. Ввод суспензии, как правило, осуществляют под углом, составляющим по меньшей мере 45° к ней, или перпендикулярно. Регулируемое сопло обычно имеет форму конуса, сужающегося в направлении потока пара. В этом сопле расположена игла или - на штоке, подвижном в продольном направлении - конус. Игла или конус и конусообразное сопло образуют щель. Сдвигая иглу или шток в продольном направлении, можно достаточно просто регулировать размер щели и, следовательно, площадь сечения выходного отверстия сопла, управляя скоростью подачи пара.
Кроме того, обычно эти устройства оснащены трубой-смесителем, в которую суспензия поступает, выходя из устройства после введения пара. Эта труба-смеситель обычно расположена в направлении подачи пара и перпендикулярно направлению загрузки. Совместно с соплом труба-смеситель, как правило, образует щель, через которую перемещается суспензия. При транспортировке эта щель обеспечивает воздействие на суспензию дополнительных усилий сдвига, которые таким образом повышают ввод в суспензию механической энергии. Труба-смеситель может быть размещена с возможностью сдвига в продольном направлении. Сдвигая трубу-смеситель, можно легко регулировать размер щелевого отверстия и, соответственно, перепад давления в устройстве.
На нынешнем уровне техники такие устройства известны под названием «сопловых котлов» (Jet-Kocher), например, устройство, представленное в „The Alcohol Textbook", гл. 2, в указанном месте, фигура 13, и представлены на рынке, например, под наименованием darg HYDROHEATER производства фирмы Hydro Thermal Corp. Waukesha WI, USA.
При непрерывном проведении реакции суспензию, обработанную водяным паром, затем, как правило, направляют в постреакционную зону, чтобы продолжить желатинизацию крахмальных компонентов. Давление в постреакционной зоне повышено, абсолютное давление обычно находится в пределах от 2 до 8 бар. Температуры в постреакционной зоне лежат обычно в пределах от 90 до 150°С. Время пребывания в постреакционной зоне может в зависимости от температуры суспензии составлять от 1 мин до 4 ч. Обычно постреакционные зоны имеют форму трубы или колонны. В одной из форм исполнения постреакционная зона имеет форму вертикально расположенной колонны. При этом суспензию, покинувшую устройство для обработки паром, помещают в верхнюю часть колонны и извлекают из нижней части. В другой форме исполнения изобретения постреакционная зона имеет форму трубы.
После выхода из постреакционной зоны в суспензии, как правило, понижают давление, а затем проводят сжижение. Обычно понижение давления проводят как мгновенное испарение, чтобы охладить суспензию - предпочтительно до температуры ниже 100°С, в особенности - ниже 85°С. Сжижение переведенного таким образом в растворимую форму крахмала проводят затем, как правило, в отдельной реакционной емкости. Сжижение можно проводить описанным выше способом.
Можно проводить сжижение обычным способом. Как правило, сжижение на этапе ii) проводят в присутствии по меньшей мере одного сжижающего крахмал фермента, который, как правило, выбирают из α-амилаз. Равным образом можно использовать другие сжижающие крахмал ферменты, которые активны и стабильны в этих условиях реакции.
Для сжижения крахмальной доли в продукте помола можно в принципе использовать все сжижающие крахмал ферменты, в частности α-амилазы (класс ферментов ЕС 3.2.1.1), например, α-амилазы, которые получают из Bacillus lichenformis или Bacillus staerothermophilus, а в особенности таковые, применяемые для сжижения материалов, получаемых способом сухого размола в процессе производства биоэтанола. Предпочтительные ферменты обладают температурной стабильностью, т.е. даже при нагреве до температур, превышающих температуру клейстеризации, они не теряют своей ферментативной активности. Пригодные для сжижения α-амилазы также представлены на рынке, например, от фирмы Novozymes под торговым названием Termamyi 120 л, Тур л; или от фирмы Genencor под обозначением Spezyme. Также можно использовать для сжижения сочетание различных α-амилаз.
Целесообразно выбирать количество сжижающего крахмал фермента, в частности α-амилазы, так, чтобы добиться быстрой и полной деградации крахмала до олигосахаридов. Общее количество сжижающего крахмал фермента, в частности α-амилазы, обычно лежит в пределах от 0,002 до 3,0 мас.%, предпочтительно - от 0,01 до 1,5 мас.%, а особо предпочтительно - от 0,02 до 0,5 мас.%, от общего количества используемого источника крахмала, α-амилазу (или используемый фермент, сжижающий крахмал) можно заранее помещать в реакционную емкость или добавлять на этапе сжижения.
2
4
3
4
Для оптимизации эффективности α-амилазы (или используемого фермента, сжижающего крахмал) этап ii) целесообразно проводить по меньшей мере на протяжении некоторого времени при величине рН, оптимальной для сжижающего фермента, обычно - при величине рН, лежащей в слабокислой области, предпочтительно между 4,0 и 7,0, особо предпочтительно - от 5,0 до 6,5, причем обычно в начале этапа ii) или перед ним устанавливают величину рН; эту величину целесообразно контролировать и при необходимости корректировать во время сжижения. Установку величины рН предпочтительно проводить с помощью разбавленных минеральных кислот, например НSO или НРO, либо же с помощью разведенных щелочей, как то: водного раствора едкого натра (NaOH) или едкого кали (КОН).
2+
2+
2
Для стабилизации используемых ферментов можно при необходимости отрегулировать концентрацию ионов Ca, например, доводя ее с помощью CaCl до оптимальной для конкретного фермента величины. Надлежащие концентрации специалист может определить в процессе рутинных опытов. Если в качестве α-амилазы используют, например, термамил, то целесообразно довести концентрацию Ca в жидкой среде до величины, например, от 10 до 100 частей на миллион, предпочтительно - от 20 до 80 частей на миллион и особо предпочтительно - от 30 до 70 частей на миллион, причем данные в частях на миллион относятся к весу и означают г/1000 кг.
Для полного расщепления крахмала до декстринов реакционную смесь выдерживают при заданной температуре, пока тест на крахмал с использованием йода или, при необходимости, иной тест на наличие крахмала не даст отрицательный или в основном отрицательный результат. При необходимости в реакционную смесь при этом можно ввести еще одну или несколько порций α-амилазы, например, в пределах от 0,001 до 0,5 мас.%, а предпочтительно - от 0,002 до 0,2 мас.% от общего количества используемого источника крахмала.
В предпочтительной форме исполнения изобретения по меньшей мере часть или же все количество, по меньшей мере 50 %, в особенности - по меньшей мере 80 % общего количества или же все количество сжижающего крахмал фермента вводят в суспензию продукта помола в жидкости на водной основе до нагревания водяным паром. Таким образом осуществляют сжижение уже во время нагрева до температур, превышающих температуру клейстеризации. Нагрев водяным паром и постреакционную фазу проводят соответственно этому. Без последующего сжижения в отдельном реакционном сосуде можно обойтись. Целесообразно, однако, все же проводить такое сжижение в целях полноты деградации крахмала до декстринов.
Таким образом получают водный гидролизат крахмала, содержащий сжиженную крахмальную долю продукта помола, как правило - декстрины и, возможно, прочие олигосахариды и моно- или дисахариды, а также не содержащие крахмала компоненты продукта помола, в особенности - твердые, не содержащие крахмала компоненты использованного для сжижения продукта помола.
Этот гидролизат можно непосредственно подавать на ферментацию для синтеза органического соединения как водную среду М. Нередко, однако, его подвергают еще и осахариванию. Осахаривание можно проводить аналогично известным на нынешнем техническом уровне способам осахаривания.
Осахаривание можно проводить непрерывным или прерывистым способом. Для этого сжиженную среду обычно полностью осахаривают в специальном баке осахаривания, прежде чем подать ее, например, на следующий этап, на ферментацию. Для этого продукт на водной основе, полученный после сжижения, обрабатывают вызывающим осахаривание ферментом, обычно - глюкоамилазой, в обычных для этого условиях.
Для осахаривания декстринов (т.е. олигосахаридов) в принципе можно применять все глюкоамилазы (класс ферментов ЕС 3.2.1.3), в частности глюкоамилазы, полученные из Aspergilus, а в особенности таковые, применяемые для осахаривания материалов, получаемых способом сухого размола в процессе производства биоэтанола. Пригодные для сжижения α-амилазы также представлены на рынке, например, от фирмы Novozymes под торговым названием Dextrozyme GA; или от Genencor под обозначением Optidex. Также можно использовать сочетание различных осахаривающих ферментов, например различных глюкоамилаз.
Осахаривающий фермент добавляют в полученный после сжижения содержащий декстрины гидролизат обычно в количестве от 0,001 до 5,0 мас.%, предпочтительно - от 0,005 до 3,0 мас.%, а особо предпочтительно - от 0,01 до 1,0 мас.% от общего количества использованного источника крахмала.
Как правило, осахаривание проводят в области температурного оптимума осахаривающего фермента или чуть ниже его, например, при температуре от 50 до 70°С, предпочтительно - от 60 до 65°С. Целесообразно сначала довести водный продукт сжижения до этой температуры, а затем добавить фермент, вызывающий осахаривание. Целесообразно до добавления осахаривающего фермента, например глюкоамилазы, довести величину рН водного гидролизата до величины, лежащей в диапазоне оптимальной эффективности используемой глюкоамилазы, предпочтительно в пределах от 3,5 до 6,0; особо предпочтительно - от 4,0 до 5,5 и крайне предпочтительно - от 4,0 до 5,0.
После добавления осахаривающего фермента содержащую декстрины суспензию целесообразно выдерживать на протяжении некоторого времени, например от 2 до 72 часов или более, в той мере, в которой это необходимо, в особенности - от 5 до 48 часов, при заданной температуре, причем происходит осахаривание декстринов до моносахаридов. Прогресс осахаривания можно отслеживать известными специалисту методами, например ВЭЖХ, ферментными тестами или стержнями для теста на глюкозу. Осахаривание завершено, когда концентрация моносахаридов в основном прекращает расти или начинает опять уменьшаться.
Поскольку для производства водного гидролизата используют продукт помола, который в основном содержит все компоненты источника крахмала, или по меньшей мере, кроме крахмала, еще и часть твердых не содержащих крахмал компонентов (т.е. полного отделения не содержащих крахмал твердых компонентов источника крахмала не проводят), водный гидролизат, полученный после сжижения и, при необходимости, осахаривания, включает в себя также часть или все количество не содержащих крахмала твердых компонентов источника крахмала. Нередко этим обусловлено поступление из плода зерновых доли фитата, которой нельзя пренебречь. Чтобы избежать вызванного этим ингибирующего действия, в гидролизат целесообразно добавить по меньшей мере одну фитазу, прежде чем подать содержащую сахар жидкую среду на этап ферментации. Добавление фитазы можно осуществлять до сжижения или осахаривания, во время таковых или после них, если она обладает достаточной температурной стабильностью для данного этапа. Можно применять любые фитазы в той мере, в которой их активность в условиях реакции по крайней мере не подвергается существенным ограничениям. Предпочтительны фитазы с температурной устойчивостью (Т50) выше 50°С и особо предпочтительно - выше 60°С. Количество фитазы составляет обычно от 1 до 10000 единиц/кг источника крахмала, а в особенности - от 10 до 4000 ед./кг источника крахмала.
Для повышения общего выхода сахара либо же для получения свободных кислот в реакционную смесь во время производства содержащей сахар жидкой среды можно, помимо указанных, добавлять другие ферменты, например, пуллуланазы, целлюлазы, гемицеллюлазы, глюканазы, ксиланазы, глюкозидазы или протеазы. Добавление этих ферментов может положительно сказаться на вязкости, т.е. снизить ее (например, ввиду расщепления длинноцепочечных глюканов и/или (арабино-)ксиланов), обеспечить высвобождение пригодных для метаболизации глюкозидов и высвобождение крахмала. Использование протеаз дает аналогичные положительные результаты, причем дополнительно могут выделяться аминокислоты как факторы роста для ферментации.
В другой форме исполнения изобретения осахаривание перед ферментацией не проводят вообще или проводят лишь частично. Тогда осахаривание по меньшей мере частично проходит во время ферментации, т.е. in situ. Например, возможен такой образ действий, при котором осахаривают часть содержащихся в жидкой среде декстринов, например, в пределах от 10 до 90 мас.%, а особенно - в пределах от 20 до 80 мас.% от общей массы декстринов (или исходного крахмала), а полученную жидкую среду, содержащую сахар, используют в ферментации. В ферментационной среде в таком случае может происходить дальнейшее осахаривание in situ. Также возможно проведение осахаривания без использования отдельного бака осахаривания непосредственно в ферментаторе.
Осахаривание по месту можно проводить с добавлением осахаривающих ферментов, как описано выше, либо же в отсутствие таковых ферментов, поскольку многие микроорганизмы в состоянии сами метаболизировать олигосахариды. При этом микроорганизмы либо поглощают декстрины как таковые и метаболизируют их, либо гидролизуют после предварительного осахаривания собственными осахаривающими ферментами штамма, например собственными глюкоамилазами штамма, а затем метаболизируют. Особо целесообразно в последнем случае, что во время ферментации происходит автоматическое согласование скорости осахаривания, в особенности высвобождения глюкозы, с потребностями микроорганизмов, с одной стороны, посредством количества биомассы, а с другой стороны - уровня экспрессии собственных осахаривающих ферментов штамма.
Преимущества осахаривания по месту состоят, с одной стороны, в снижении капиталовложений, а с другой - благодаря замедленному высвобождению глюкозы можно при необходимости заранее создать повышенную концентрацию в порции (Batch) без того, чтобы наступило ингибирование или изменение метаболизма используемых микроорганизмов. В случае E.coli повышенная концентрация глюкозы ведет, например, к образованию органических кислот (ацетата), в то время как Saccharomyces cerevisae в этом случае, например, переключается на сбраживание, хотя в вентилируемых ферментаторах достаточно кислорода (эффект Крэбтри). Замедленное высвобождение глюкозы можно обеспечить, регулируя концентрацию глюкоамилазы. Благодаря этому можно подавить вышеупомянутые эффекты, и можно заранее разместить больше субстрата.
Полученный после сжижения и, при необходимости, проведенного осахаривания водный гидролизат, т.е. среда М, обладает обычно содержанием сухой массы в по меньшей мере 45 мас.%, во многих случаях - по меньшей мере 50 мас.%, в особенности - по меньшей мере 55 мас.%, в специальных случаях - не менее 60 мас.%, например, от 45 до 80 мас.%, предпочтительно - от 50 до 75 мас.%, в частности - от 55 до 70 мас.%, а в особенности - от 60 до 70 мас.%. Соответственно, рассчитанная в эквивалентах глюкозы концентрация сахара в водной среде М, как правило, составляет по меньшей мере 35 мас.%, во многих случаях - по меньшей мере 40 мас.%, в особенности - по меньшей мере 45 мас.%, в специальных случаях - по меньшей мере 50 мас.%, например, от 35 до 70 мас.%, в частности - от 40 до 65 мас.%, в частности - от 45 до 60 мас.%, а в особенности - от 50 до 60 мас.% от общей массы среды М.
Содержащиеся в полученной среде М эквиваленты глюкозы представлены, в зависимости от способов работы, в форме моно- или олигосахаридов, в частности декстринов. Основной компонент представляет собой обычно моносахариды, как то: гексозы и пентозы, например глюкозу, фруктозу, маннозу, галактозу, сорбозу, ксилозу, арабинозу и рибозу, в особенности - глюкозу или олигосахариды этих моносахаридов. Доля отличных от глюкозы моносахаридов в среде М, в свободной форме или в виде компонентов олигосахаридов, может варьировать в зависимости от используемого источника крахмала и имеющихся в его составе не содержащих крахмала компонентов, а посредством вариантов применения способа, например, посредством включения компонентов клетчатки ввиду добавления целлюлаз, на нее можно влиять. Обычно доля глюкозы, в свободной или связанной форме, составляет среди эквивалентов глюкозы среды М величину в пределах от 50 до 99 мас.%, в частности - от 75 до 97 мас.%, а в особенности - от 80 до 95 мас.% от общего количества эквивалентов глюкозы.
Полученную на стадии iii) водную среду М используют согласно изобретению на стадии iv) для ферментативного синтеза желательного органического соединения. Для этого среду М подают на ферментацию, где она служит для культивации используемых в ферментации микроорганизмов. Конкретное органическое соединение получают при этом в виде летучего или нелетучего продукта микробного метаболизма.
Как правило, содержащую декстрины среду М, прежде чем подавать ее на ферментацию, охлаждают до температуры ферментации, обычно в пределах от 32 до 37°С.
Содержащую декстрины водную среду М перед ферментацией можно при необходимости стерилизовать, при этом микроорганизмы уничтожают, как правило, термическим или химическим способом. Для этого водную среду М обычно нагревают до температур выше 80°С. Уничтожение или лизис клеток можно проводить непосредственно перед ферментацией. Для этого на лизис или уничтожение (микроорганизмов) подают всю содержащую сахар жидкую среду М. Его можно осуществлять, например, термическим или химическим способом. В рамках способа согласно изобретению, однако, оказалось, что проводить этап стерилизации, описанный здесь, перед ферментацией нет необходимости, но гораздо более целесообразным оказалось такой этап стерилизации не проводить. Соответственно к предпочтительной форме исполнения изобретения относится способ, при котором жидкую среду М, полученную на стадии iii), непосредственно, т.е. без предварительной стерилизации, подают на ферментацию.
При ферментации происходит метаболизация сахара, имеющегося в среде. Постольку присутствующие в среде сахара находятся в форме олигосахаридов, в частности в форме декстринов, микроорганизмы поглощают и метаболизируют их либо как таковые, либо же после предшествующего осахаривания с помощью добавленных или присущих штамму осахаривающих ферментов, в частности глюкоамилаз. Если осахаривающие ферменты не добавляют, а содержащиеся в среде сахара находятся в форме олигосахаридов, в частности декстринов, осахаривание сжиженных крахмальных компонентов происходит параллельно метаболизации микроорганизмами сахаров, в частности моносахарида глюкозы.
Ферментация может проходить известным специалисту обычным образом. Для этого, как правило, культивируют конкретный желательный микроорганизм в полученной описанным здесь способом жидкой среде.
Процесс ферментации может проходить как прерывисто (порционный способ. Batch) так и «полунепрерывно» (Fed-Batch, порционный способ с подпиткой, включай порционный способ с подпиткой и промежуточным изъятием продукта), причем предпочтителен полунепрерывный способ.
Из среды М, полученной способом согласно изобретению, или обычного источник сахара, т.е. пригодных к метаболизации моно-, дисахаридов - и/или олигосахаридов, или сред, которые содержат пригодные к метаболизации моно-, дисахариды - и/или олигосахариды, можно, например, при необходимости после разбавления водой и добавления обычных компонентов среды, как то: буферных растворов, питательных солей, источников азота, например, сульфата аммония, мочевины и т.д., сложных питательных компонентов, включая аминокислоты, как то: экстрактов дрожжей, пептонов, CSL и им подобных, создать инокулят (затравку) с желаемыми микроорганизмами и обеспечить их размножение в условиях ферментации, пока не будет достигнуто желательное для ферментации состояние равновесия. При этом происходит метаболизация содержащегося в ферментационной среде сахара и образование желаемого продукта метаболизма (так называемый порционный способ работы или порционная фаза).
При порционном способе работы с подпиткой следом за порционной фазой, например, когда общая концентрация сахара становится ниже определенной величины, в ферментационную среду непрерывно или прерывистым способом добавляют среду М.
Типичная форма исполнения способа согласно изобретению - это порционный способ с подпиткой, включающий в себя следующие стадии:
v) культивация микроорганизма, способного к повышенному производству органического соединения в водной ферментационной среде F; и
vi) добавление среды М к ферментационной среде F, в которой микроорганизмы, избыточно производящее органическое соединение, метаболизируют содержащиеся в среде М гидролизованные крахмальные компоненты, т.е. сахара.
На стадии v) можно, например, сначала довести обычную содержащую сахар среду, как правило, раствор глюкозы, разводя ее жидкостью на основе воды, в частности, водой, до надлежащей концентрации сахара и добавить обычные для ферментации компоненты среды, как то: буферные растворы, питательные соли, источники азота, например, сульфат аммония, мочевину и т.д., сложные питательные компоненты, включая аминокислоты, как то: экстракты дрожжей, пептоны, CSL и им подобные. При этом соотношение количества сахара к жидкости целесообразно, как правило, выбирать так, чтобы общая концентрация моносахаридов в ферментационной среде F составляла менее 6 мас.%, например, в пределах от > 0 до 5 мас.%, будучи рассчитана в эквивалентах глюкозы относительно общей массы ферментационной среды F. В созданной таким образом порционной среде осуществляют инокуляцию желаемого микроорганизма и проводят его размножение в порционной среде (ферментационной среде F) при условиях ферментации, пока не будет достигнуто желательное для ферментации состояние равновесия. При этом происходит метаболизация помещенного в ферментационную среду F сахара и образование желаемого продукта метаболизма.
Добавление водной среды М на стадии vi) к ферментационной среде F поддерживает проведение процесса ферментации, и происходит накопление продукта метаболизма, производимого микроорганизмом в избыточном количестве, в ферментационном бульоне. При этом объемное соотношение добавляемой среды М к имеющейся порционной среде, содержащей микроорганизмы (ферментационной среде F), в общем случае находится в пределах от примерно 1:10 до 10:1, а предпочтительно - от 1:5 до 5:1 и, в частности, - в пределах от 1:1 до 5:1. Содержание сахара в ферментационном бульоне можно, в частности, регулировать скоростью подачи содержащей сахар жидкой среды. Как правило, скорость подачи задают так, чтобы содержание моносахаридов в ферментационной среде находилось в пределах от > 0 мас.% до примерно 5 мас.%, а в частности - чтобы оно не превосходило величину 3 мас.%.
В предпочтительной форме исполнения в состав ферментационной среды F на этапе v) (т.е. в данном случае порционной среды) входят в основном среда М, способные к избыточному производству органического соединения микроорганизмы, питательные соли, обычные вспомогательные вещества, как то: основания или буферные растворы, и при необходимости - вода для разбавления. Для этого среду М следует при необходимости разбавить до желательной концентрации сахара, например, до концентрации в пределах от 0,1 до 10 мас.%, рассчитанной в эквивалентах глюкозы относительно общей массы среды М, и непосредственно использовать ее для создания ферментационной среды F (порционной среды).
Концентрация сахара в содержащей декстрины среде, используемой для поддержания ферментации согласно стадии vi), обычно выше, ее поддерживают, например, в упомянутых выше пределах, чтобы минимизировать разбавление ферментационной среды F.
Целесообразно действовать таким образом, чтобы создать среду М на водной основе с более высокой концентрацией сахара, например, по меньшей мере 40 мас.%, в частности - по меньшей мере 45 мас.%, а в особенности - по меньшей мере 50 мас.%, рассчитанной в эквивалентах глюкозы относительно общей массы среды М. Эту среду М затем используют, с одной стороны, на этапе v) после разбавления водой для создания порционной среды (ферментационной среды F), а с другой стороны - на стадии vi) для добавления в ферментационную F.
Подразумевается, что согласно изобретению в порционной фазе и/или в порционной фазе с подпиткой большая часть используемого при ферментации и метаболизируемого сахара, предпочтительно по меньшей мере 60 мас.%, в особенности - по меньшей мере 70 мас.%, происходит из среды М. В одной из форм исполнения изобретения часть используемого при ферментации и метаболизируемого сахара, например, от 1 до 50 мас.%, в частности - от 5 до 40 мас.%, а в особенности - от 10 до 30 мас.%, происходит из обычных источников сахара. К обычным источникам сахара относятся моно- и дисахариды, например глюкоза и сахароза, но также и среды, содержащие пригодные к метаболизации моно-, дисахариды и/или олигосахариды в концентрации по меньшей мере 50 мас.%, и в основном не содержащие нерастворимых в воде твердых веществ - например глюкозные сиропы, сахарозные сиропы, сгущенные соки, мальтозные сиропы, декстриновые сиропы, а также продукты - отходы сахарного производства (мелассы), в особенности мелассы из производства свекловичного сахара, но также и таковые из производства тростникового сахара.
С помощью способа согласно изобретению можно ферментативным способом производить летучие и нелетучие, в частности, нелетучие продукты микробного метаболизма по меньшей мере с 3 атомами углерода или с по меньшей мере 2 атомами углерода и по меньшей мере одним атомом азота.
При этом под нелетучими продуктами микробного метаболизма подразумевают соединения, которые в общем случае невозможно удалить из ферментационного бульона путем дистилляции, не подвергнув их разрушению. Эти соединения, как правило, характеризуются точкой кипения выше температуры кипения воды, нередко выше 150°С, а в особенности - выше 200°С при нормальном давлении. Как правило, это соединения, которые при нормальных условиях (298 K, 101,3 кПа) находятся в твердом агрегатном состоянии.
Возможно, однако, также использовать водную среду М в ферментации для производства нелетучих продуктов микробного метаболизма, которые при нормальном давлении характеризуются точкой плавления ниже температуры кипения воды или/и обладают маслянистой консистенцией.
6
12
Термин «нелетучие продукты микробного метаболизма» в данном случае включает в себя, в частности, органические монокарбоновые, ди- и трикарбоновые кислоты, предпочтительно с 3-10 атомами углерода, несущие при необходимости одну или несколько, например, 1, 2, 3 или 4 гидроксильные группы, например, винную кислоту, итаконовую кислоту, янтарную кислоту, пропионовую кислоту, молочную кислоту, 3-гидроксипропионовую кислоту, фумаровую кислоту, малеиновую кислоту, 2,5-фурандикарбоновую кислоту, глутаровую кислоту, левулиновую кислоту, глюконовую кислоту, аконитовую и диаминопимелиновую кислоту, лимонную кислоту; протеиногенные и непротеиногенные аминокислоты, например, лизин, глутамат, метионин, фенилаланин, аспарагиновую кислоту, триптофан и треонин; пуриновые и пиримидиновые основания; нуклеозиды и нуклеотиды, например, никотинамидадениндинуклеотид (NAD) и аденозин-5′-монофосфат (АМФ); липиды; насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты, предпочтительно с 10-22 атомами углерода, например, γ-линоленовую кислоту, дигомо-γ-линоленовую кислоту, арахидоновую кислоту, эйкозопентаеновую кислоту и докозогексаеновую кислоту; диолы, предпочтительно с 3-8 атомами углерода, например, пропандиол и бутандиол; многоатомные спирты с 3 или более, например, 3, 4, 5 или 6 гидроксильными группами, например, глицерин, сорбитол, манитол, ксилитол и арабинитол; более длинноцепочечные спирты по меньшей мере с 4 атомами углерода, например, имеющие 4-22 атома углерода, например, бутанол; углеводы, например, гиалуроновую кислоту и трегалозу; ароматические соединения, например, ароматические амины, ванилин и индиго; витамины и провитамины, например, аскорбиновую кислоту, витамин В, витамин B и рибофлавин, кофакторы и так называемые нутрицевтики; белки, например, ферменты, как то: амилазы, пектиназы, кислые, гибридные или нейтральные целлюлазы, эстеразы, например, липазы, панкреазы, протеазы, ксиланазы и оксидоредуктазы, как то лакказу, каталазу и пероксидазу, глюканазы, фитазы; каротиноиды, например, ликопин, β-каротин, астаксантин, зеаксантин и кантаксантин; кетоны, предпочтительно с 3-10 атомами углерода и, при необходимости, одной или несколькими гидроксильными группами, например, ацетон и ацетоин; лактоны, например, γ-бутинолактон, циклодекстрины, биополимеры, например, полигидроксиацетат, полиэфиры, например, полилактид, полисахариды, полиизопреноиды, полиамиды; а также предшественники и производные упомянутых соединений. Прочие соединения, представляющие собой нелетучие продукты микробного метаболизма, описаны Gutcho в Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973), ISBN:0818805086.
В понятие "кофактор" включены небелковые соединения, необходимые для проявления нормальной активности фермента. Эти соединения могут быть органическими или неорганическими; молекулы кофакторов согласно изобретению - предпочтительно органические. Примеры таких молекул - это НАД и никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ); предшественник этих кофакторов - ниацин.
Понятие "нутрицевтик" включает в себя пищевые добавки, укрепляющие здоровье растений и животных, в особенности человека. Примеры таких молекул - это витамины, антиоксиданты и определенные липиды, например, многократно ненасыщенные жирные кислоты.
Производимые продукты метаболизма в особенности относятся к ферментам, аминокислотам, витаминам, дисахаридам, алифатическим монокарбоновым и дикарбоновым кислотам с 3-10 атомами углерода, алифатическим гидроксикарбоновым кислотам с 3-10 атомами углерода, кетонам с 3-10 атомами углерода, алканолам с 4-10 атомами углерода и алкандиолам с 3-10 атомами углерода, а в особенности - с 3-8 атомами углерода.
Специалисту понятно, что соединения, произведенные ферментативным путем согласно изобретению, получают в каждом случае в форме оптического изомера, производимого данными микроорганизмами (если существуют различные энантиомеры). Так, например, аминокислоты, как правило, получают в форме л-изомеров.
Использование в ферментации тех или иных микроорганизмов определяют в каждом случае известным образом через конкретный продукт метаболизма, как это в подробностях описано ниже. Они могут быть природного происхождения или продуктами генетической модификации. Примеры надлежащих микроорганизмов и способов ферментации приведены в нижеследующей таблице А:
В предпочтительных формах исполнения изобретения синтезируемое органическое соединение выбирают из группы, включающей органические монокарбоновые, ди- и трикарбоновые кислоты, предпочтительно с 3-10 атомами углерода, несущие при необходимости гидроксильные группы, протеиногенные и непротеиногенные аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания; нуклеозиды и нуклеотиды, липиды; насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты; диолы с 4-10 атомами углерода, многоатомные спирты с 3 или более гидроксильными группами, более длинноцепочечные спирты по меньшей мере с 4 атомами углерода, углеводы, ароматические соединения, витамины, провитамины, кофакторы, нутрицевтики, белки, каротиноиды, кетоны с 3-10 атомами углерода, лактоны, биополимеры и циклодекстрины.
Первая предпочтительная форма исполнения изобретения касается применения получаемой согласно изобретению содержащей сахар жидкой среды в ферментативном синтезе ферментов, как то: фитаз, ксиланаз или глюканаз.
Вторая предпочтительная форма исполнения изобретения касается применения получаемой согласно изобретению содержащей сахар жидкой среды в ферментативном синтезе аминокислот, как то: лизина, метионина, треонина и глутамата.
Еще одна предпочтительная форма исполнения изобретения касается применения получаемой согласно изобретению содержащей сахар жидкой среды в ферментативном синтезе витаминов, как то: пантотеновой кислоты и рибофлавина, их предшественников и производных.
Прочие предпочтительные формы исполнения изобретения касаются применения получаемой согласно изобретению содержащей сахар жидкой среды в ферментативном синтезе
- монокарбоновых, ди- и трикарбоновых кислот, особенно алифатических моно-карбоновых, ди- и трикарбоновых кислот с 3-10 атомами углерода, как то: пропионовой, фумаровой и янтарной кислоты,
- алифатических гидроксикарбоновых кислот с 3-10 атомами углерода, например, молочной кислоты;
- более длинноцепочечных алканолов, как это указано выше, в частности, алканолов с 4-10 атомами углерода, например, бутанола;
- диолов, как указано выше, в частности, алкандиолов с 3-10, а в особенности с 3-8 атомами углерода, например, пропандиола;
- кетонов, как указано выше, в частности, кетонов с 3-10 атомами углерода, например, ацетона; и
- углеводов, как указано выше, в особенности дисахаридов, например, трегалозы.
Еще в одной особо предпочтительной форме исполнения продукт метаболизма, производимый микроорганизмами при ферментации, - это полигидроксиалканоаты, например, поли-3-гидроксибутират и сополиэфиры с другими органическими гидро-ксикарбоновыми кислотами, например, 3-гидроксивалериановой кислотой, 4-гидроксимасляной кислотой и другими, описанные, например, у Steinbüchel (а.а.O.), например, также длинноцепочечные (иногда называемые «более длинноце-почечными», гидроксикарбоновые кислоты, например 3-гидроксиоктановая кислота, 3-гидроксидекановая и 3-гидрокситетрадекановая кислота, а также их смеси. Для проведения ферментации в этом случае можно использовать условия и способы работы, аналогичные тем, которые были описаны для других источников углерода, например, в S.Y.Lee, Plastic Bacteria Progress and prospects for polyhydroxyalkanoate production in bacteria, Tibtech, Bd. 14, (1996), S.431-438.
В предпочтительной форме исполнения применяемые в ферментации микроорганизмы, соответственно, выбирают среди натуральных или рекомбинантных микроорганизмов, пригодных к производству по меньшей мере одного из следующих продуктов метаболизма:
- ферментов, как то: фитаз, ксиланаз или глюканаз;
- аминокислот, например, лизина, метионина или треонина;
- витаминов, например, пантотеновой кислоты и рибофлавина, их предшественников и/или производных;
- дисахаридов, например трегалозы;
- алифатических монокарбоновых и дикарбоновых кислот с 3-10 атомами углерода, например, пропионовой кислоты, фумаровой и янтарной кислоты;
- алифатических гидроксикарбоновых кислот с 3-10 атомами углерода, например, молочной кислоты;
- полигидроксиалканоатов, например, поли-3-гидроксибутирата и сополиэфира 3-гидроксимасляной кислоты;
- кетонов с 3-10 атомами углерода, например, ацетона;
- алканолов с 4-10 атомами углерода, например, бутанола; и алкандиолов с 3-8 атомами углерода, как, например, пропандиола.
Подходящие микроорганизмы обычно выбирают из родов Gattungen Corynebacterium, Bacillus, Ashbya, Escherichia, Aspergillus, Alcaligenes, Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Lactobacillus, Propionibacterium, Rhizopus и Clostridium, в частности, из штаммов Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Ashbya gossypii, Escherichia coli, Aspergillus niger или Alcaligenes latus, Anaerobiospirillum succiniproducens, Actinobacillus succinogenes, Lactobacillus delbrückii, Lactobacillus leichmannii, Propionibacterium arabinosum, Propionibacterium schermanii, Propionibacterium freudenreichii, Clostridium propionicum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium acetobutylicum, Rhizopus arrhizus и Rhizopus oryzae.
В предпочтительной форме исполнения микроорганизм, используемый в ферментации, - это штамм из рода Corynebacterium, в частности, штамм Corynebacterium glutamicum. В особенности же подразумевается штамм рода Corynebacterium, a именно Corynebacterium glutamicum, который избыточно производит аминокислоту, а именно лизин, метионин или глутамат.
В предпочтительной форме исполнения микроорганизм, используемый в ферментации, - это штамм из рода Escherichia, в частности, штамм Escherichia coli. В особенности же подразумевается штамм рода Escherichia, а именно Escherichia coli, который избыточно производит аминокислоту, а именно лизин, метионин или треонин.
В особо предпочтительной форме исполнения продукт метаболизма, производимый микроорганизмами при ферментации, - это лизин. Для проведения ферментации в этом случае можно использовать условия и способы работы, аналогичные тем, которые были описаны для других источников углерода, например, в соответствующих местах у Pfefferle et al. и в патенте США US 3708395. В принципе возможна работа как в непрерывном, так и в прерывистом (Batch или Fed-Batch, порционном или с подпиткой) режиме, а предпочтителен режим с подпиткой.
Еще в одной особо предпочтительной форме исполнения продукт метаболизма, производимый микроорганизмами при ферментации, - это метионин. Для проведения ферментации в этом случае можно использовать условия и способы работы, аналогичные тем, которые были описаны для других источников углерода, например, в международных заявках WO 03/087386 и WO 03/100072.
Еще в одной особо предпочтительной форме исполнения продукт метаболизма, производимый микроорганизмами при ферментации, - это пантотеновая кислота. Для проведения ферментации в этом случае можно использовать условия и способы работы, аналогичные тем, которые были описаны для других источников углерода, например, в международной заявке WO 01/021772.
Еще в одной особо предпочтительной форме исполнения продукт метаболизма, производимый микроорганизмами при ферментации, - это рибофлавин. Для проведения ферментации в этом случае можно использовать условия и способы работы, аналогичные тем, которые были описаны для других источников углерода, например, в международной заявке WO 01/011052, германском патенте DE 19840709, международной заявке WO 98/29539, европейском патенте ЕР 1186664 и в Fujioka, К.: New biotechnology for riboflavin (vitamin B2) and character of this riboflavin. Fragrance Journal (2003), 31(3), 44-48.
Еще в одной особо предпочтительной форме исполнения продукт метаболизма, производимый микроорганизмами при ферментации, - это фумаровая кислота. Для проведения ферментации в этом случае можно использовать условия и способы работы, аналогичные тем, которые были описаны для других источников углерода, например, в Rhodes et al. Production of Fumaric Acid in 20-л Fermentors, Applied Microbiology, 1962, 10 (1), 9-15.
Еще в одной особо предпочтительной форме исполнения продукт метаболизма, производимый микроорганизмами при ферментации, - это янтарная кислота. Для проведения ферментации в этом случае можно использовать условия и способы работы, аналогичные тем, которые были описаны для других источников углерода, например, в Int. J. Syst. Bacteriol. 26, 498-504 (1976); в европейском патенте ЕР 249773 (1987), изобретатели: Lemme и Datta; патенте США US 5504004 (1996), изобретатели: Guettler, Jain и Soni; Arch. Microbiol. 167, 332 -342 (1997); Guettler MV, Rumler D, Jain MK., Actinobacillus succinogenes sp. nov., a novel succinic-acid-producing strain from the bovine rumen. Int J Syst Bacteriol. 1999 Jan; 49 Pt 1:207-16; патенты США US 5723322, US 5573931, US 5521075, международная заявка WO 99/06532, патенты США US 5869301 или US 5770435.
Еще в одной особо предпочтительной форме исполнения продукт метаболизма, производимый микроорганизмами при ферментации, - это фитаза. Для проведения ферментации в этом случае можно использовать условия и способы работы, аналогичные тем, которые были описаны для других источников углерода, например, в международной заявке WO 98/55599.
При ферментации получают ферментационный бульон, который помимо желательного продукта микробного метаболизма содержит образовавшуюся при ферментации биомассу, не прошедшие метаболизацию компоненты сжиженного раствора крахмала и, в частности, не содержащие крахмала твердые компоненты источника крахмала, как, например, волокна и не использованные сахара, а также не использованные буферные и питательные соли. Эту жидкую среду в настоящей заявке также называют ферментационным бульоном, причем ферментационный бульон включает в себя также добавленную содержащую декстрины среду (1), в которой прошло лишь частичное или неполное ферментативное преобразование содержащихся в ней сахаров, т.е. частичная или неполная метаболизация микробами пригодных к употреблению сахаров (например, моно- и дисахаридов).
Перед изоляцией или обеднением продукта микробного метаболизма или же отделением летучих компонентов ферментационного бульона при необходимости описанным выше способом проводят этап стерилизации.
Особая форма исполнения (I) настоящего изобретения касается способа, при котором в ферментационном бульоне обедняют или выделяют из него по меньшей мере один продукт микробного метаболизма. Летучие компоненты ферментационного бульона затем в основном удаляют, при этом получают твердый или частично твердый белковый состав. Полное описание проведения такого способа и получаемого при этом белкового состава являются предметом международной заявки WO 2005/116228 (РСТ/ЕР 2005/005728) фирмы-заявителя, на которую дана ссылка в отношении прочих подробностей.
Изоляцию из ферментационного бульона или обеднение в нем продукта метаболизма, т.е. органического соединения по меньшей мере с 3 атомами углерода или по меньшей мере с 2 атомами углерода и по меньшей мере с 1 атомом азота (в дальнейшем также - «конечного продукта»), осуществляют, как правило, таким образом, чтобы изолировать от ферментационного бульона или обеднить в нем содержание по меньшей мере одного продукта метаболизма настолько, чтобы содержание этого продукта метаболизма в остаточном ферментационном бульоне составляло не более 20 мас.%, в частности - не более 10 мас.%, в особенности - не более 5 мас.%, а крайне желательно - не более 2,5 мас.%, в каждом случае - от общего веса остаточного ферментационного бульона,
Изоляцию из ферментационного бульона или обеднение содержания в нем продукта метаболизма можно осуществлять в один или несколько этапов. Важным этапом при этом является отделение от ферментационного бульона его твердых компонентов. Его можно проводить перед изоляцией конечного продукта или после нее. Как для выделения ценных веществ, так и для отделения твердых веществ, т.е. разделения твердой и жидкой фаз, в отрасли известны обычные методы, которые также включают в себя шаги грубой и тонкой очистки ценных веществ, а также регулировки свойств (например, описано в Belter, P. A, Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnology, John Wiley & Sons (1988), и Ullmann′s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5. Aufl. auf CD-ROM, Wiley-VCH).
В целях выделения конечного продукта целесообразно действовать следующим образом: вначале удалить из ферментационного бульона твердые компоненты, например, посредством центрифугирования или фильтрования, а затем выделить конечный продукт из жидкой фазы, например, путем кристаллизации, осаждения, адсорбции или дистилляции. В качестве альтернативы можно также выделять конечный продукт непосредственно из ферментационного бульона, например, применяя хроматографические способы или экстракцию. Среди хроматографических способов следует особо упомянуть ионообменную хроматография, при которой конечный продукт можно избирательно выделить на хроматографической колонке. В этом случае отделение твердых веществ от остаточного ферментационного бульона целесообразно проводить, например, декантацией, выпариванием или/и сушкой.
В случае летучих или маслянистых соединений, как правило, необходимо контролировать максимальные температуры во время обработки, в особенности - во время сушки. Также целесообразно получать эти соединения, осуществляя их формирование в псевдотвердой форме на адсорбентах. Пригодные в этих целях адсорбенты приведены, например, в международной заявке WO 2005/116228 (РСТ/ЕР 2005/005728) фирмы-заявителя. Примеры соединений, которые таким образом целесообразно производить способом согласно изобретению, это γ-линоленовая кислота, дигомо-γ-линоленовая кислота, арахидоновая кислота, эйкозопентаеновая кислота и докозогексаеновая кислота, а также пропионовая кислота, молочная кислота, пропандиол, бутанол и ацетон. Эти соединения в псевдотвердом виде также рассматривают в смысле настоящего изобретения как нелетучие продукты микробного метаболизма в твердой форме.
Еще одна особая форма исполнения (II) касается способа, при котором проводят полноценное удаление летучих компонентов из ферментационного бульона без предварительного выделения нелетучего продукта микробного метаболизма или обеднения его содержания и, при необходимости, без предварительного отделения твердых компонентов, причем получают твердую рецептуру нелетучего продукта микробного метаболизма. Подробное описание к проведению такого способа приведено в европейском патенте РСТ/ЕР 2006/066057 (старая немецкая заявка на патент DE 10 2005 042 541.0) фирмы-заявителя.
«Полноценное» означает, что после удаления летучих компонентов остается твердый или хотя бы частично твердый остаток, который при необходимости можно перевести в твердую форму добавлением твердых веществ. Как правило, это означает удаление летучих компонентов до остаточного содержания влаги, не превышающего 30 мас.%, часто не более 20 мас.%, а особенно - не более 15 мас.%. Обычно же представляется целесообразным удалять из ферментационного бульона его летучие компоненты до остаточной влажности в пределах от 0,2 до 30 мас.%, предпочтительно - от 1 до 20 мас.%, особо предпочтительно - от 2 до 15 мас.% и крайне предпочтительно 5 до 15 мас.% от определенного после сушки общего веса твердых компонентов. Содержание остаточной влажности можно определить обычными, известными специалисту методами, например, с помощью термогравиметрии (Hemminger et al., Methoden der thermischen Analyse, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg. 1989).
Получение из ферментационного бульона на этапе с) нелетучего продукта (нелетучих продуктов) метаболизма в твердой форме, при необходимости после вышеупомянутого предварительного отделения, проводят в один, два или три шага, в частности, в виде одно- или двухшагового процесса. Как правило, по меньшей мере один, в частности, завершающий шаг получения продукта метаболизма в твердой форме включает в себя этап сушки.
При работе в один шаг летучие компоненты ферментационного бульона, при необходимости после вышеупомянутого предварительного отделения, удаляют, пока не будет достигнуто желаемое остаточное содержание влаги.
При работе в два или несколько шагов ферментационный бульон, при необходимости после вышеупомянутого предварительного отделения, вначале подвергают сгущению (повышают его концентрацию), например, посредством фильтрации (микрофильтрации, ультрафильтрации) или термическим способом, выпаривая часть летучих компонентов. Доля летучих компонентов, которую удаляют на этом этапе, составляет, как правило, от 10 до 80 мас.%, а в особенности - от 20 до 70 мас.% от общего веса летучих компонентов ферментационного бульона. На одном или нескольких последующих шагов процесса удаляют остальные летучие компоненты ферментационного бульона, пока не будет достигнуто желаемое остаточное содержание влаги.
Согласно этой форме исполнения (II) удаление летучих компонентов жидкой среды проводят в основном без предварительного обогащения или, тем паче, изоляции основного продукта. Следовательно, при удалении летучих компонентов ферментационного бульона нелетучий продукт метаболизма большей частью не удаляют вместе с летучими компонентами жидкой среды; он остается в получаемом остатке вместе с основным количеством, а в особенности - со всем количеством остальных твердых компонентов ферментационного бульона. Согласно изобретению, однако, возможно, что часть - предпочтительно небольшая - желаемого нелетучего продукта микробного метаболизма, как правило, максимум 20 мас.%, например, от 0,1 до 20 мас.%, предпочтительно не более 10, а в особенности - не более 5 мас.%, особо предпочтительно - максимум 2,5 мас.% и крайне предпочтительно - максимум 1 мас.% от общей сухой массы продукта метаболизма, при удалении летучих компонентов ферментационного бульона удаляют вместе с таковыми. В особо предпочтительной форме исполнения желаемый нелетучий продукт микробного метаболизма по меньшей мере на 90 мас.%, в частности - не менее, чем на 95 мас.%, в особенности - на 99 мас.%, а крайне предпочтительно - на 100 мас.%, в каждом случае от общей сухой массы продукта метаболизма, в виде твердого вещества остается в смеси с полученной после удаления летучих компонентов частью или совокупностью твердых компонентов ферментационной среды.
Если это желательно, то перед удалением летучих компонентов можно удалить из ферментационного бульона часть, например, от 5 до 80 мас.%, а особенно от 30 до 70 мас.%, не содержащих крахмала твердых, т.е. нерастворимых компонентов, например, посредством центрифугирования или фильтрации. При необходимости проводят такое предварительное разделение, чтобы удалить крупные твердые частицы, которые не содержат нелетучих продуктов микробного метаболизма или содержат очень малые их количества. Для предварительной фильтрации можно использовать обычные методы, известные специалисту, например, с использованием крупноячеистых сит, сеток, дырчатых пластин или подобных устройств. При необходимости можно также провести удаление крупных твердых частиц в центробежном сепараторе. Используемые для этого устройства, как то: декантаторы, центрифуги, седиканторы и сепараторы также известны специалисту. Таким образом получают твердый или, например, пастообразный остаток, который содержит нелетучий продукт метаболизма и нелетучие, как правило, твердые, не содержащие болизма и нелетучие, как правило, твердые, не содержащие крахмала компоненты источника крахмала или, по меньшей мере большую их часть, нередко по меньшей мере 90 мас.% или все количество твердых не содержащих крахмала компонентов.
Посредством добавления вспомогательных рецептурных средств, как то: носителей и покрывающих материалов, связывающих средств и прочих добавок можно известным как таковой образом целенаправленно регулировать свойства высушенного и находящегося в смеси с твердыми компонентами ферментации продукта метаболизма с точки зрения различных параметров, например, содержания действующего вещества, зернистости, формы частиц, склонности к пылеобразованию, гигроскопичности, стабильности, в особенности лежкости, цвета, запаха, текучести, склонности к агломерации, электростатического заряда, чувствительности к свету и температуре, механической прочности и пригодности к редиспергированию.
К применяемым обычно вспомогательным рецептурным средствам относятся, например, связующие средства, материалы-носители, средства, модифицирующие порошкообразование или текучесть, а также красители, биоциды, диспергаторы, пеногасители, средства, регулирующие вязкость, кислоты, щелочи, антиоксиданты, стабилизаторы ферментов, ингибиторы ферментов, адсорбаты, жиры, жирные кислоты, масла или смеси таковых. Такие вспомогательные рецептурные средства целесообразно применять, в частности, в качестве средств, способствующих сушке при использовании способов формирования смесей и сушки, как то: распылительной сушки, сушки в вихревом слое и низкотемпературной сушки. В связи с дальнейшими подробностями дана ссылка на европейский патент РСТ/ЕР 2006/066057 (старая заявка DE 102005042541.0).
В зависимости от конкретных требований данного продукта метаболизма, а также в зависимости от свойств использованных добавок доля вышеупомянутых дополнительных веществ и, при необходимости, прочих добавок, например, материалов оболочек, может широко варьировать и находиться в пределах, например, в пределах от 0,1 до 80 мас.%, а особенно - в пределах от 1 до 30 мас.%, в каждом случае от общего веса готовой рецептуры продукта или смеси веществ.
Добавлять вспомогательные рецептурные средства можно до дополнительной обработки ферментационного бульона (называемой также формулированием продукта или «дизайном твердых веществ»), во время ее или по ее окончании, а в особенности - во время сушки. Добавление вспомогательных рецептурных средств до дополнительной обработки ферментационного бульона или продукта метаболизма может быть особенно целесообразно для улучшения пригодности к обработке веществ или продуктов, подлежащих этой обработке. Вспомогательные рецептурные средства можно добавлять как к продукту метаболизма, получаемому в твердой форме, так и к раствору или суспензии, содержащей таковой, например, по окончании ферментации непосредственно в ферментационный бульон или перед сушкой в раствор или суспензию, получаемые в процессе дополнительной обработки, перед завершающим этапом сушки.
Так, например, вспомогательные вещества можно, перемешивая, вводить в суспензию продукта микробного метаболизма; такую суспензию можно также наносить на материал-носитель, например, путем распыления или подмешивания. Добавление вспомогательных рецептурных средств во время сушки может играть роль, например, если раствор или суспензию, содержащие продукт метаболизма, распыляют. Добавление вспомогательных рецептурных средств после сушки производят, например, в особенности при покрытии высушенных частиц специальными составами (слоями). Прочие вспомогательные вещества можно добавлять в продукт как после сушки, так и после, возможно, имеющего место этапа покрытия.
Удаление летучих компонентов из ферментационного бульона осуществляют известным как таковой способом, используя обычные методы отделения твердой фазы от жидкой, включая фильтрационные методы и способы выпаривания летучих компонентов жидких фаз. Такие способы, которые могут также включать этапы грубой очистки концентрата, а также этапы дополнительной обработки описаны, например, в Belter, P.A, Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnology, John Wiley & Sons (1988), и Ullmann′s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5. Aufl. auf CD-ROM, Wiley-VCH. Известные специалисту и применимые в рамках формулирования продукта или дополнительной обработки по окончании ферментации способы, аппаратура, вспомогательные вещества, а также общие и особые формы исполнения также описаны в европейских патентах ЕР 1038 527, ЕР 0648 076, ЕР 835613, ЕР 0219 276, ЕР 0394 022, ЕР 0547 422, ЕР 1088 486, ЕР 0758 018 и международных заявках WO 98/55599, WO 92/12645.
В первом варианте этой формы исполнения (II) нелетучий продукт микробного метаболизма, постольку, поскольку он содержится в жидкой фазе в растворенном виде, переводят из жидкой фазы в твердую, например, путем кристаллизации или осаждения. Затем осуществляют отделение нелетучих твердых компонентов, включая продукт метаболизма, от жидких компонентов, например, посредством центрифугирования, декантации или осаждения. Подобным же образом можно отделить маслянистые продукты метаболизма, причем конкретные маслянистые продукты ферментации переводят в твердую форму добавлением адсорбентов, например, кремниевой кислоты, силикагелей, глин и активированного угля.
Во втором предпочтительном варианте этой формы исполнения (II) летучие компоненты удаляют выпариванием. Выпаривание можно осуществлять способами, известными как таковые. Примеры надлежащих способов для выпаривания летучих компонентов - это распылительная сушка, сушка или агломерация в вихревом слое, сушка с замораживанием, поточная или контактная сушка, а также экструзионная сушка. Также возможно сочетание упомянутых способов с формообразующими технологиями, как то: экструзией, зернением или производством окатышей. В последних случаях предпочтительно использовать содержащие продукт метаболизма смеси веществ, частично или в основном прошедшие предварительную сушку.
В предпочтительной форме исполнения удаление летучих компонентов ферментационного бульона включает в себя распылительную сушку или сушку в вихревом слое, включая гранулирование в вихревом слое. Для этого ферментационный бульон, при необходимости - после предварительного разделительного этапа для отделения грубых частиц, не содержащих нелетучих продуктов микробного метаболизма или же содержащих их в незначительном количестве - подают в одну или несколько установок для распылительной сушки или сушки в вихревом слое. Транспортировку или подачу нагруженного твердыми веществами ферментационного бульона целесообразно осуществлять с помощью обычных транспортных устройств для жидкостей, содержащих твердые вещества, например, насосов, в частности - эксцентриковых шнековых насосов (например, от фирмы Delasco PCM) или насосов высокого давления (например, от фирмы LEWA Herbert Ott GmbH).
Проведение ферментации с использованием содержащей сахар жидкой среды согласно изобретению можно также проводить таким образом, при котором
vii) от полученной на этапе iii) среды М, которая включает в себя не содержащие крахмал твердые компоненты источника крахмала, отбирают часть, составляющую не более 50 мас.%, например, в пределах от 5 до 45 мас.%, от общего веса, а остаток подают на ферментацию для производства первого продукта метаболизма (А), например, нелетучего продукта метаболизма (А) в твердой форме или летучего продукта метаболизма (А); а
viii) ту (отобранную) часть, отделив от нее полностью или частично не содержащие крахмал твердые компоненты источника крахмала, подвергают ферментации для создания второго продукта метаболизма (В), который идентичен продукту метаболизма (А) или отличен от него.
В случае отделения не содержащих крахмала твердых компонентов согласно vii) содержание твердого вещества в остающейся доле среды М должно составлять не более 50 мас.%, предпочтительно - не более 30 мас.%, особо предпочтительно - максимум 10 мас.% и крайне предпочтительно - максимум 5 мас.%. Особо предпочтительно в этом случае перед ферментацией для производства второго продукта метаболизма (В) отделить все твердые вещества.
Такой способ работы позволяет использовать в отдельной ферментации согласно vii) микроорганизмы, требующие выполнения определенных минимальных условий, например, относительно скорости кислородного обмена. Такими микроорганизмами, используемыми в отдельной ферментации согласно viii) могут быть, например, Bacillus species, предпочтительно - Bacillus subtilis. К соединениям, производимым такими микроорганизмами в отдельной ферментации, относятся, в частности, витамины, кофакторы и нутрицевтики, пуриновые и пиримидиновые основания, нуклеозиды и нуклеотиды, липиды, насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты, ароматические соединения, белки, каротиноиды, в особенности - витамины, кофакторы и нутрицевтики, белки и каротиноиды, а специфически - рибофлавин и пантотенат кальция.
Предпочтительный вариант этого способа работы означает параллельное производство одинаковых продуктов (А) и (В) в двух отдельных ферментациях. Это целесообразно, в частности, в тех случаях, когда к одному и тому же продукту метаболизма в различных его применениях предъявляют различные требования по чистоте. Соответственно первый продукт метаболизма (А), например, предназначенную для использования в качестве кормовой добавки аминокислоту, например, лизин, метионин, треонин или глутамат производят с использованием содержащего твердые вещества ферментационного бульона, а второй такой же продукт метаболизма (В), например, такую же аминокислоту, но предназначенную уже для использования в качестве пищевой добавки, производят с использованием ферментационного бульона, содержание твердых веществ в котором понижено согласно viii). Благодаря полному или частичному отделению не содержащих крахмала твердых компонентов можно снизить затраты на очистку при последующей обработке продукта метаболизма, область применения которого требует более высокой чистоты, например, в качестве пищевой добавки.
Еще в одной предпочтительной форме исполнения такого способа работы можно действовать, например, следующим образом. Запускают ферментацию, предпочтительно в большом объеме, для производства продуктов метаболизма А, например, аминокислот, в частности, лизина, метионина, глутамата или треонина, лимонной кислоты или этанола, например, по способу, описанному в международной заявке WO 2005/116228 (РСТ/ЕР 2005/005728) или РСТ/ЕР 2006/066057 (старая германская заявка DE 102005042541.0) или согласно способам, известным для ферментативного производства биоэтанола. Согласно vii) изымают часть среды М, полученной на этапе iii). Часть, изъятую согласно vii), можно согласно viii) полностью или частично очистить обычными способами, например, центрифугированием или фильтрацией, от твердых веществ, в зависимости от потребностей ферментации для производства В. Полученную при этом среду М, полностью или частично освобожденную от твердых веществ, подают согласно viii) на ферментацию для производства продукта метаболизма В. Поток твердого вещества, отделенный согласно viii) целесообразно возвращать в поток среды М для ферментации в большом объеме.
Если продукт микробного метаболизма (А), получаемый при ферментации в крупном объеме, представляет собой этанол, то концентрация моно-, дисахаридов или олигосахаридов в полученной после этапа iii) среде М соответствует таковой, обычной для ферментативного производства этанола (биоэтанола), например, в пределах от 25 до 33 мас.%. Отделение твердых веществ согласно этапу viii) проводят в соответствии с требованиями, предъявляемыми ферментацией для производства конкретного продукта метаболизма В.
В предпочтительной форме исполнения этого способа работы продуктом метаболизма В, производимым микроорганизмами во время ферментации, является рибофлавин. При проведении ферментации в этом случае можно применять условия и способы работы, аналогичные тем, что были описаны для других источников углерода, например, в международных заявках WO 01/011052 и WO 98/29539, германском патенте DE 19840709, европейском патенте ЕР 1186664 и Fujioka, K.: New biotechnology for riboflavin (vitamin B2) and character of this riboflavin. Fragrance Journal (2003), 31(3), 44-48.
Для проведения работ по этому варианту способа запускают ферментацию, предпочтительно в большом объеме, для производства продуктов метаболизма А, например, аминокислот, в частности, лизина, метионина, глутамата или треонина, лимонной кислоты или этанола, как описано выше. Согласно vii) изымают часть полученной после стадии in) среды М, а согласно viii) полностью или частично освобождают ее от твердых веществ обычными способами, например, центрифугированием или фильтрацией. Полученную при этом среду М, полностью или частично освобожденную от твердых веществ, подают согласно viii) на ферментацию для производства продукта метаболизма В, в данном случае рибофлавина. Поток твердого вещества, отделенный согласно viii), целесообразно возвращать в поток среды М для ферментации в большом объеме.
Дальнейшую обработку полученного таким образом согласно viii) содержащего рибофлавин ферментационного бульона можно проводить, применяя условия и способы работы, аналогичные тем, что были описаны для других источников углерода, например, в германских патентах DE 4037441, DE 3819745, европейских патентах ЕР 464582 и ЕР 438767. После лизирования клеточной массы проводят отделение рибофлавина, присутствующего в кристаллической форме, предпочтительно путем декантирования. Другие способы отделения твердых веществ, например, фильтрование, также возможны. Затем рибофлавин сушат, предпочтительно с помощью распылительных сушилок и сушилок с вихревым слоем. В качестве альтернативы содержащую рибофлавин ферментационную смесь, полученную согласно viii) обрабатывают, применяя условия и способы работы, аналогичные тем, что были описаны в европейских патентах ЕР 1048668 и ЕР 730034. В этом случае после пастеризации ферментационный бульон центрифугируют, а остающуюся фракцию, содержащую твердые вещества, обрабатывают минеральной кислотой. Образовавшийся рибофлавин фильтруют из кислой водной среды, при необходимости отмывают, а затем сушат.
Еще в одной предпочтительной форме исполнения этого способа работы продуктом метаболизма В, производимым микроорганизмами во время ферментации, является пантотеновая кислота. При проведении ферментации в этом случае можно применять условия и способы работы, аналогичные тем, что были описаны для других источников углерода, например, в международной заявке WO 01/021772.
Для реализации этого варианта способа можно действовать, например, как описано выше для рибофлавина. Жидкую среду М, содержащую сахар, предварительно очищенную согласно vii), предпочтительно в основном освобожденную от твердых веществ, подают согласно viii) на ферментацию для производства пантотеновой кислоты. При этом особые преимущества дает сниженная по сравнению с содержащей твердые вещества жидкой средой вязкость. Отделенный поток твердого вещества целесообразно возвращать в поток среды М для ферментации в большом объеме.
Дальнейшую обработку полученного таким образом согласно viii) содержащего пантотеновую кислоту ферментационного бульона можно проводить, применяя условия и способы работы, аналогичные тем, что были описаны для других источников углерода, например, в европейском патенте ЕР 1050219 и международной заявке WO 01/83799. После пастеризации ферментационного бульона остающиеся твердые вещества отделяют, например, центрифугированием или фильтрованием. Фильтрат после отделения твердых веществ частично выпаривают, при необходимости добавляют к нему хлорид кальция и сушат, в частности, распылением.
Отделенные твердые вещества получают в рамках идущего параллельно процесса ферментации в большом объеме вместе с конкретным желаемым нелетучим продуктом микробного метаболизма (А).
После сушки и/или формулирования в продукт могут быть добавлены целые или размолотые семена зерновых, предпочтительно кукуруза, пшеница, ячмень, просо, тритикале и/или рожь.
Нижеследующие примеры служат для иллюстрации отдельных аспектов настоящего изобретения, однако ни в коем случае не накладывает ограничений.
Примеры
I. Размол крахмалсодержащего сырья (источника крахмала)
Используемые ниже материалы помола были изготовлены следующим образом. Целые кукурузные зерна полностью размололи с применением роторной мельницы. С использованием различных ударных механизмов, путем помола и встроенных сит при этом получили три различные степени тонкости. Ситовый анализ материала помола с помощью лабораторного вибрационного сита (вибрационный анализатор: Retsch Vibrotronic Тур VE1; время просеивания 5 мин; амплитуда: 1,5 мм) дал результаты, приведенные в таблице 1.
Таблица 1
Номер эксперимента
Т 70/03
Т 71/03
Т 72/03
<2 мм/%
99,4
100
100
<0,8 мм/%
66
100
99
<0,63 мм/%
58,6
98,5
91
<0,315 мм/%
48,8
89
65
<0,1 мм/%
25
9,6
<0,04 мм/%
8
3,2
Общее количество материала помола
20кг
11,45кг
13,75 кг
II. Ферментативное сжижение и осахаривание крахмала
II.1) Сжижение в сопловом котле
2+
2
Для непрерывного сжижения кукурузной муки, полученной сухим размолом, установлены два котла с мешалками объемом в sind 250 л, пульпу кукурузной муки из которых попеременно, с интервалом в один час, подают в сопловой котел. Стандартную закладку в этих котлах осуществляют, помещая в них 117 кг воды, к которой добавляют α-амилазу, например, Termamyl SC, в концентрации 0,10 масс-% (от использованного количества муки). Затем в несколько этапов при температуре ок. 45°С добавляют 133 кг кукурузной муки и перемешивают. После установления концентрации Са в 50 частей на миллион, например, добавлением СаСl, устанавливают величину рН в диапазоне между 5,6 и 5,8. После введения всех компонентов суспензию кукурузной муки интенсивно перемешивают вплоть до использования в сопловом котле. Затем эту суспензию подают в сопловой котел со скоростью 250 кг/ч под давлением 5 бар. Нагрев суспензии кукурузной муки выше температуры клейстеризации, до 105°С, осуществляют параллельной подачей пара со скоростью 25 кг/ч (7,5 бар). В трубе-реакторе, присоединенной после соплового котла, часть клейстеризованного крахмала деградирует до декстринов, причем время пребывания составляет 5 мин (1-е сжижение). Затем температуру реакционной смеси выпариванием снижают до 90°С, при этом отходит ок. 5 кг/ч пара. Затем во второй трубе-реакторе при 90°С на протяжении 100 мин осуществляют второе сжижение до полной деградации крахмала до декстринов. Полученную реакционную смесь затем посредством повторного выпаривания с потерей воды ок. 14 кг/ч охлаждают до температуры осахаривания, составляющей 61°С.
II.2) Осахаривание
2
4
Часть полученной в 11.1) реакционной смеси подвергли осахариванию в эксперименте. Для этого ок. 1000 г реакционной смеси переместили в котел с мешалкой и при постоянном перемешивали поддерживали температуру 61°С. Перемешивание продолжали в течение всего эксперимента. После доведения рН с помощью HSO до величины 4,3 добавили 17,9 г (15,2 мл) Dextrozyme GA (Novozymes A/S). Температуру поддерживали ок. 3 ч, причем прохождение реакции отслеживали с помощью ВЭЖХ. В итоге концентрация глюкозы составила 420 г/кг.
III. Штамм
fbr
ATCC13032 lysC
fbr
В некоторых из нижеследующих примеров использовали модифицированный штамм Corynebacterium glutamicum, который под обозначением АТСС13032 lysC был описан в международной заявке WO 05/059144.
Пример 1
Разжиженный и осахаренный гидролизат кукурузной муки (водная среда М), который был изготовлен согласно прописи II, задействовали в опытах со встряхиванием колб с использованием Corynebacterium glutamicum.
Штамм
fbr
Использовали модифицированный дикий тип с регуляцией аспартокиназы по принципу обратной связи АТСС13032 lysC.
Изготовление инокулята
610
После посева на стерильный полноценный агар с аминокислотами из казеина (состав: см. таблицу 1; 20 мин при 121°С) клетки инкубировали ночь при 30°С. Затем клетки соскоблили с пластинок и ресуспендировали в солевой среде. 25 мл среды (см. таблицу 2) в 250-мл конических колбах с двумя дефлекторами в каждом случае привили таким количеством среды, чтобы оптическая плотность OD при 610 нм достигла величины 0,5.
Таблица 1:
состав полноценного агара с аминокислотами из казеина
Концентрация
Компонент
10,0 г/л
D-глюкоза
2,5 г/л
NaCl
2,0 г/л
мочевина
5,0 г/л
Bacto Pepton (Difco)
5,0 г/л
экстракт дрожжей (Difco)
5,0 г/л
экстракт говядины (Difco)
20,0 г/л
аминокислоты казеина
20,0 г/л
агар
Изготовление ферментационного бульона
Состав среды в колбах приведен в Таблице 2. Опыт проводили трижды.
Таблица 2:
Среда в колбах для получения лизина с Corynebactehum glutamicum
Гидролизат кукурузной муки
143 г/л
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
20
г/л
Мочевина
5
г/л
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
0,113
г/л
K<sub>2</sub>НРO<sub>4</sub>
0,138
г/л
ACES
52
г/л
MOPS
21
г/л
лимонная кислота × Н<sub>2</sub>O
0,49
г/л
3,4-дигидроксибензойная кислота
3,08
мг/л
NaCl
2,5
г/л
KCl
1
г/л
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
0,3
г/л
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
25
мг/л
MnSO<sub>4</sub>·4-6Н<sub>2</sub>О
5
мг/л
ZnCl<sub>2</sub>
10
мг/л
CaCl<sub>2</sub>
20
мг/л
Н<sub>3</sub>ВО<sub>3</sub>
150
мкг/л
CoCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O
100
мкг/л
CuCl<sub>2</sub>·2Н<sub>2</sub>O
100
мкг/л
NiSO<sub>4</sub>·6H<sub>2</sub>O
100
мкг/л
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·2Н<sub>2</sub>О
25
мкг/л
биотин (витамин Н)
1050
мкг/л
Гидролизат кукурузной муки
143 г/л
тиамин × НСl (витамин B<sub>1</sub>)
2100
мкг/л
никотинамид
2,5
мкг/л
пантотеновая кислота
125
мкг/л
цианокобаламин (витамин B<sub>12</sub>)
1
мкг/л
4-аминобензойная кислота (РАВА; витамин H<sub>1</sub>)
600
мкг/л
фолиевая кислота
1,1
мкг/л
пиридоксин (витамин B<sub>6</sub>)
30
мкг/л
рибофлавин (витамин В<sub>2</sub>)
90
мкг/л
CSL
40
мкг/л
рН*
6,85
* устанавливают разбавленным водным раствором NaOH
После прививки колбы инкубировали в увлажняемом шкафу-шейкере в течение 48 ч при 30°С в движении (200 об./мин). После прерывания ферментации определили концентрацию глюкозы и лизина с помощью ВЭЖХ. ВЭЖХ провели с помощью прибора 1100 Series LC System производства Agilent. ВЭЖХ позволяет квантифицировать образовавшуюся аминокислоту на Agilent 1100 Series LC System.
Предколоночная дериватизация ортофталевым альдегидом позволяет квантифицировать образовавшуюся аминокислоту, разделением смеси аминокислот осуществляют колонкой Hypersil AA производства Agilent.
В конце эксперимента концентрация глюкозы составляла 1,2 г/л. Средняя концентрация лизина была 11,4 г/л.
Пример 2:
Разжиженный и осахаренный гидролизат кукурузной муки (водная среда М), который был изготовлен согласно прописи II, задействовали в опытах со встряхиванием колб с использованием Aspergillus niger.
Штамм
Производящий фитазу штамм Aspergillus niger с 6 копиями гена phyA от Aspergillus ficuum под контролем промотора glaA был создан аналогично подробно описанному в международной заявке WO 98/46772 производству NP505-7. В качестве контроля использовали штамм с 3 модифицированными ампликонами glaA (аналогично ISO 505), но без интегрированного полигенного экспрессирующего кластера phyA.
Изготовление инокулята
20 мл среды предварительной культуры (см. в таблице 3) в 100-мл конических колбах с одним дефлектором в каждом случае привили 100 мкл замороженной культуры и инкубировали 24 ч при 34°С в движении (170 об./мин) в увлажняемом шкафу-шейкере.
Таблица 3:
Состав среды предварительной культуры
Компонент
Концентрация
глюкоза
30,0 г/л
пептон из казеина
10,0 г/л
экстракт дрожжей
5,0 г/л
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
1,0 г/л
MgSO<sub>4</sub>·7Н<sub>2</sub>O
0,5 г/л
ZnCl<sub>2</sub>
30 мг/л
CaCl<sub>2</sub>
20 мг/л
MnSO<sub>4</sub>·1Н<sub>2</sub>O
9 мг/л
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
3 мг/л
Tween 80
3,0 г/л
пенициллин
50000 ЕД/л
стрептомицин
50 мг/л
рН*
5,5
* устанавливают разбавленной серной кислотой
50 мл среды главной культуры (см. в таблице 4) в 250-мл конических колбах с одним дефлектором в каждом случае привили 5 мл предварительной культуры.
Изготовление ферментационного бульона:
Состав среды в колбах приведен в Таблице 4. Использовали по две колбы каждой пробы.
Таблица 4:
Среда в колбах.
Гидролизат кукурузной муки
166 г/л
Пептон из казеина
25,0 г/л
Экстракт дрожжей
12,5 г/л
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
1,0 г/л
K<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
2,0 г/л
MgSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
0,5 г/л
ZnCl<sub>2</sub>
30 мг/л
CaCl<sub>2</sub>
20 мг/л
MnSO<sub>4</sub>×1H<sub>2</sub>O
9 мг/л
FeSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
3 мг/л
пенициллин
50000 ЕД/л
стрептомицин
50 мг/л
рН*
5,6
* устанавливают разбавленной серной кислотой
2
4
После прививки колбы инкубировали в увлажняемом шкафу-шейкере в течение 6 суток при 34°С в движении (170 об./мин). После прерывания ферментации активность фитазы определили с использованием фитиновой кислоты в качестве субстрата и на надлежащем уровне активности фитазы (стандарт: 0,6 ЕД/мл) в буфере состава: 250 мМ уксусной кислоты / ацетата натрия / Tween 20 (0,1 мас.%), рН 5,5. Тест был стандартизирован для применения на микротитровальных пластинах (МТР). 10 мкл раствора фермента смешали с 140 мкл 6,49 мМ раствора фитата в 250 мМ ацетатном буфере (ацетат натрия), рН 5,5 (фитат: додеканатриевая соль фитиновой кислоты). После одного часа инкубации при 37°С реакцию остановили добавлением равного объема (150 мкл) трихлоруксусной кислоты. Аликвоту этой смеси (20 мкл) перенесли в 280 мкл раствора, содержащего 0,32 N HSO, 0,27 мас.% молибдата аммония и 1,08 мас.% аскорбиновой кислоты. Затем инкубировали 25 минут при 50°С. Поглощение света синим раствором измеряли при длине волны 820 нм.
В конце эксперимента была получена активность фитазы 433 FTU/мл.
Пример 3:
Разжиженный и осахаренный гидролизат кукурузной муки, а также гидролизат муки из зерна пшеницы и гидролизат ржаной муки (водная среда М), которые были изготовлены согласно прописи II, задействовали в опытах со встряхиванием колб с использованием Ashbya gossypii.
Штамм
Штамм Ashbya gossypii ATCC10895 (Schmidt et al., Mikrobiology 142: 411-417, 1996).
Изготовление инокулята
После посева на стерильный HMG агар (см. в таблице 5) и инкубировали 72 ч при 28°С.
Таблица 5:
Состав HMG агара
Компонент
Концентрация
D-глюкоза
4,0 г/л
экстракт дрожжей
5,0 г/л
Солодовая вытяжка
10,0 г/л
Агар
30,0 г/л
рН
7,2
50 мл среды предварительной культуры (см. в таблице 6) в 250-мл конических инкубировали в петлей для посева клеток и инкубировали 24 ч при 28°С в ротационном шейкере.
Таблица 6:
Состав среды предварительной культуры
Компонент
Концентрация
Пептон-Бакто
10,0 г/л
экстракт дрожжей
1,0 г/л
Myo-Инозитол
0,3 г/л
D-глюкоза
10,0 г/л
рН
7,0
Ферментация:
50 мл среды (Таблица 7) в 250 мл конической колбе для встряхивания прививали 5 мл предварительной культуры.
Таблица 7:
Состав среда в колбах
Компонент
Концентрация
Колбы 1-4
Колбы 5-8
Колбы 9-12
Гидролизат кукурузной муки
26,2 г/л
0 г/л
0 г/л
Гидролизат пшеничной муки
0 г/л
29,2 г/л
0 г/л
Гидролизат ржаной муки
0 г/л
0 г/л
33 г/л
Пептон-Бакто
10,0 г/л
Экстракт дрожжей
1,0 г/л
Mуo-Инозитол
0,3 г/л
рН
7.0
После прививки колбы инкубировали в увлажняемом шкафу-шейкере в течение 6 суток при 28°С.
Концентрацию рибофлавин определяли ВЭЖХ оборудованной колонкой Zorbax Eclipse XDB-C18 и детектором на диодной матрице. Результаты приведены в Таблице 8.
Таблица 8:
концентрация рибофлавина, полученная в эксперименте в конической колбе.
Среда
Рибофлавин
Гидролизат кукурузной муки
2,7±0,5
Гидролизат пшеничной муки
2,2±0,4
Гидролизат ржаной муки
2,7±0,1
Пример 4.
Разжиженный и осахаренный гидролизат кукурузной муки, а также гидролизат муки из зерна пшеницы и гидролизат ржаной муки (водная среда М), которые был изготовлены согласно прописи II, задействовали в опытах со встряхиванием колб для получения пантотеновой кислоты с использованием штамма Bacillus strain.
Штамм
Bacillus PA824 (описан WO 02/061108).
Изготовление инокулята
42 мл среды предварительной культуры (см. в Таблице 9) в 250-мл конических колбах прививали с 0,4 мл замороженной культуры и инкубировали 24 ч при 43°С в ротационном шейкере.
Ферментация:
42 мл продуцирующей среды (Таблица 10) в 250 мл конической колбе для встряхивания прививали с 1 мл предварительной культуры и инкубировали 24 ч при 43°С в ротационном шейкере.
Концентрацию глюкозы и пантотеновой кислоты определяли ВЭЖХ.
Таблица 9:
Состав среды предварительной культуры
Компонент
Концентрация
Мальтоза
28,6 г/л
Соевая мука
19,0 г/л
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
7,6 г/л
Na-глутамат
4,8 г/л
Na-цитрат
0,95 г/л
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
9,5 г/л
MnCl<sub>2</sub>·4Н<sub>2</sub>O
1,9 г/л
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
1,4 г/л
CoCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O
1,9 г/л
CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O
0,2 г/л
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O
0,7 г/л
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·3H<sub>2</sub>O
15,2 г/л
MgCl<sub>2</sub>·6Н<sub>2</sub>O
0,9 г/л
CaCl<sub>2</sub>·2Н<sub>2</sub>O
0,09 г/л
MOPS
59,8 г/л
рН
7,2 г/л
Таблица 10:
Состав продуцирующей среды
Компонент
Концентрация
Колбы 1-3
Колбы 4-6
Колбы 7-9
Гидролизат кукурузной муки
75 г/л
0 г/л
0 г/л
Гидролизат пшеничной муки
0 г/л
84 г/л
0 г/л
Гидролизат ржаной муки
0 г/л
0 г/л
94 г/л
Соевая мука
19,0 г/л
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
7,6 г/л
Na-глутамат
4,8 г/л
Na-цитрат
0,95 г/л
FeSO<sub>4</sub>·7Н<sub>2</sub>O
9,5 г/л
MnCl<sub>2</sub>·4Н<sub>2</sub>O
1,9 г/л
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
1,4 г/л
CoCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O
1,9 г/л
CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O
0,2 г/л
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·2Н<sub>2</sub>O
0,7 г/л
КН<sub>2</sub>РO<sub>4</sub>·3H<sub>2</sub>O
15,2 г/л
MgCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O
0,9 г/л
CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O
0,09 г/л
MOPS
59,8 г/л
pH
7,2 г/л
Результаты: Конечные концентрации глюкозы и пантотеновой кислоты показаны в Таблице 11.
Таблица 11:
концентрация рибофлавина, полученная в эксперименте в конической колбе.
Среда
Глюкоза / г/л
пантотеновая кислота
Гидролизат кукурузной муки
0,0±0,0
1,7±0,0
Гидролизат пшеничной муки
0,1±0,1
1,9±0,1
Гидролизат ржаной муки
0,1±0,1
2,0±0,2
Пример 5.
Разжиженный и осахаренный гидролизат кукурузной муки (водная среда М), который был изготовлен согласно прописи II, задействовали в опытах со встряхиванием колб для получения янтарной кислоты с использованием штамма Actinobacillus succinogenes.
Штамм
Actinobacillus succinogenes ATCC55618.
Ферментация:
2
50 мл продуцирующей среды (Таблица 12) в 250 мл конической колбе для встряхивания прививали с 1 мл замороженной культуры. Перед закрытием колбы удалили кислород при помощи орошения с СO. Колбу инкубировали 46 ч при 37°С в ротационном шейкере.
Концентрацию глюкозы и янтарной кислоты определяли ВЭЖХ.
Таблица 12:
Состав продуцирующей среды
Компонент
Концентрация
Гидролизат кукурузной муки
262 г/л
NaCl
0,1 г/л
КН<sub>2</sub>РO<sub>4</sub>
0,3 г/л
MgCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O
20 г/л
CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O
20 г/л
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
0,1 г/л
Биотин
200 мг/л
Кукурузный сироп
15,0 г/л
10% экстракт дрожжей
15,0 г/л
MgCO<sub>3</sub>
80,0 г/л
Результаты: В конце культивации концентрации глюкозы составляла 30,1±1,2 г/л и концентрация пантотеновой кислоты составляла 43,3±1,1 г/л.