Способ отбора коров-реципиентов в процессе проведения технологии трансплантации эмбрионов
METHOD OF SELECTION OF RECIPIENT COWS IN EMBRYO TRANSPLANTATION TECHNOLOGY

Изобретение относится к воспроизводству сельскохозяйственных животных, а именно к области репродукции крупного рогатого скота, и может быть использовано в научной и практической работе по управлению физиологией размножения животных.
Технология трансплантации эмбрионов представляет собой производственный цикл, включающий поэтапно выполняемые технологические процессы с использованием комплекса методов и оборудования. Технологические этапы данной технологии включают: отбор высокопродуктивных коров-доноров эмбрионов, отбор коров-реципиентов, в качестве которых могут быть использованы беспородные и низкопродуктивные животные, стимуляцию полиовуляции у коров-доноров и их искусственное осеменение, извлечение эмбрионов у доноров и оценку качества эмбрионов, криоконсервацию эмбрионов (при необходимости), пересадку эмбрионов реципиентам, учет результатов трансплантации.
Отбор коров в качестве реципиентов осуществляют в процессе проведения технологии трансплантации эмбрионов в соответствии с требованиями инструкций и руководств по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота, являющихся обязательными для применения. В таких документах регламентированы классические критерии отбора коров-реципиентов, основанные на следующих показателях: реципиенты (коровы и телки) должны быть клинически здоровы, с нормальной физиологией половой системы без патологии родовых путей, должны иметь крепкую конституцию и хорошее развитие по живой массе, не ниже требований стандарта породы (возраст телок 16-18 мес., масса 350-380 кг), при этом, нельзя использовать в качестве реципиентов животных мелких пород для трансплантации эмбрионов от пород более крупных по массе (Инструкция по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота. Сайт Интернет: http://docs.cntd.ru/document/456072882, 2019 г.). Далее по тексту отбор коров в качестве реципиентов в соответствии с вышеперечисленными критериями отбора упоминается как «отбор коров-реципиентов по ветеринарным и зоотехническим характеристикам».
На технологическом этапе пересадки эмбрионов, как правило, одному реципиенту пересаживают один свежеполученный или заморожено-оттаянный эмбрион. На 21-25-й день от дня пересадки проводят диагностику стельности, являющуюся показателем результативности данного технологического этапа, при этом, наличие стельности свидетельствует о наличии приживляемости эмбриона, отсутствие стельности - об отсутствии приживляемости эмбриона. В соответствии с данными животноводческих хозяйств, реализующих программы трансплантации эмбрионов, показатель приживляемости трансплантированных эмбрионов колеблется, в среднем, в пределах 40-60% (при пересчете на всех использованных коров-реципиентов) и лишь в отдельных случаях достигает более высокого процента - 60-70% (Эффективность пересадки эмбрионов у телок-рецепиентов с высоким адаптивным потенциалом // Макаров А.В., Бригида А.В., Сорокин В.И., Скачкова О.А., Ковальчук С.Н. // Ветеринария и кормление №4, 2018). Однако, несмотря на недостаточно высокий уровень приживляемости пересаживаемых эмбрионов, потребность в применении технологии трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота год от года продолжает возрастать. Например, в 2017 году, по данным AETE (Association of embryo technology in Europe), осуществлено 181922 пересадок, что является самым высоким показателем за всю историю эмбриотрансфера в европейских странах, занимающихся трансплантацией эмбрионов крупного рогатого скота (для сравнения в ретроспективе выполнено: в 2016 году - около 130000 пересадок, в 2015 году - 126808 пересадок, в 2014 году - 137802 пересадок).
В последнее десятилетие проблема приживляемости пересаженных эмбрионов, развитие которых определяется результатом многих реакций и межклеточных взаимодействий, остается одной из ведущих и активно изучается в связи с поиском новых путей, позволяющих повысить результативность программ трансплантации эмбрионов. Сообщалось об известных на сегодняшний день факторах, снижающих показатели приживляемости эмбрионов после их переноса в репродуктивные органы реципиентов, к которым относят: несоответствие синхронности полового цикла между донором и реципиентом при пересадке свежеполученных эмбрионов, а также асинхронность стадии развития эмбриона с половым циклом реципиента - при трансплантации замороженно-оттаянных зародышей (Effect of oestrous synchrony between embryo donors and recipients, embryo quality and state on the pregnancy rate in beef cattle Автор:: Rodrigues, M. С. C.; Bonotto, A. L. M.; Acosta, D. A. V.; с соавторами. REPRODUCTION IN DOMESTIC ANIMALS Том: 53 Выпуск: 1 Стр.: 152-156 Опубликовано: FEB 2018 №2). Следующими факторами, приводящими к ранней эмбриональной гибели трансплантированных эмбрионов, являются: низкий уровень жизнеспособности эмбриона, генетическая несовместимость эмбриона с реципиентом, повышенные концентрации простагландина (PG) F2a в организме реципиента после переноса эмбриона, стресс-факторы, связанные с условиями содержания и кормления реципиента (в частности, жара, жажда, голод, болезни, усталость), воспалительные процессы в организме реципиента (мастит, пневмония, хромота, заболевания репродуктивных органов) (Flunixin meglumine improves pregnancy rate in embryo recipient beef cows with an excitable temperament. Автор:: Kasimanickam, R. K.; Hall, J. В.; Estill, С. Т.; с соавторами. THERIOGENOLOGY Том: 107 Стр.: 70-77 Опубликовано: FEB 2018). Помимо того, исследователями выявлено множество других факторов, влияющих на приживляемость пересаженных эмбрионов, например, наблюдалась более низкая частота стельности у коров-реципиентов с буйным темпераментом по сравнению с коровами со спокойным темпераментом (Kasimanickam, R. Calm Temperament Improves Reproductive Performance of Beef Cows / R. Kasimanickam, M. Asay, S. Schroeder, V. Kasimanickam, J.M. Gay, J.P. Kastelic, J.B. Hall, W.D. Whittier // Reproduction in Domestic Animals, 2014. Vol. 49, №6. https://doi.org/10.1111/rda.12436). Категория доноров (корова или телка), от которой получен эмбрион, также является фактором, влияющим на приживляемость трансплантированного эмбриона у коровы-реципиента: эмбрионы, полученные от телок-доноров, имели более низкую жизнеспособность после переноса реципиентам по сравнению с эмбрионами, полученными от доноров-коров (Donor category and seasonal climate associated with embryo production and survivalin multiple ovulation and embryo transfer programs in Holstein cattle Автор:: Vieira, L. M.; Rodrigues, C. A.; Mendanha, M. F.; с соавторами. THERIOGENOLOGY Том: 82 Выпуск: 2 Стр.: 204-212 Опубликовано: JUL 15 2014).
Оценка суммарного эффекта многочисленных факторов, разнонаправленно влияющих на процесс приживляемости пересаженного эмбриона, является сложной и трудноприменимой в ветеринарной практике хозяйств. Вместе с тем, наряду с классическими методами отбора коров-реципиентов, дополнительные критерии отбора коров с высоким уровнем приживляемости трансплантируемых эмбрионов могли бы дать возможность своевременно корректировать тактику ведения мероприятия по пересадке эмбрионов, выранжировывая животных с диагностированным отсутствием приживляемости эмбриона, и, тем самым повышая результативность мероприятия по трансплантации эмбрионов. Технологический этап отбора коров-реципиентов является важным элементом, от результативности проведения которого во многом зависят показатели стельности и наличие рожденных телят у коров-реципиентов. В данной ситуации остается актуальным необходимость повышения эффективности отбора коров-реципиентов в процессе проведения технологии трансплантации эмбрионов у крупного рогатого скота.
Известен способ, согласно которому отбор телок-реципиентов в процессе проведения технологии трансплантации эмбрионов выполняют с учетом таких критериев, как показатели качества желтого тела (КЖТ) и клинико-физиологических проявлений эструса (индекс КФПЭ) при нехирургическом методе пересадки эмбрионов крупного рогатого скота (прототип - Эффективность пересадки эмбрионов у телок-рецепиентов с высоким адаптивным потенциалом // Макаров А.В., Бригида А.В., Сорокин В.И., Скачкова О.А., Ковальчук С.Н. // Ветеринария и кормление №4, 2018, стр. 25-27). В данном способе на основании результатов исследований, проведенных с участием животных, отобранных в качестве потенциальных телок-реципиентов в соответствии с ветеринарными и зоотехническими характеристиками, показано, что при проведении отбора возможно осуществить прогнозирование приживляемости пересаживаемого замороженно-оттаянного эмбриона, учитывая показатель КЖТ и индекс КФПЭ, и, в зависимости от полученного результата прогнозирования либо использовать животное в качестве реципиента, либо исключить его из процесса проведения технологии трансплантации эмбрионов. В конечном итоге, возможно достичь достаточно высокого уровня приживляемости эмбрионов (не менее 68%). У реципиента диагностируют клинико-физиологические проявления признаков эструса (признаки половой охоты): рефлекс неподвижности, набухание вульвы, гиперемия слизистой, наличие слизи (течка), попытки садки, постовуляторные кровяные выделения. День, в который эти признаки выявлены, регистрируют как нулевой день полового цикла, от которого отсчитывают седьмой день полового цикла (день пересадки эмбриона). Для выполнения прогнозирования приживляемости пересаживаемого эмбриона у реципиента на нулевой день полового цикла определяют индекс КФПЭ, получаемый на основании оценки выявленных признаков половой охоты (клинико-физиологических проявлений признаков эструса) с использованием бальной системы, представленной в таблице 1 прототипа, в которой каждый из таких признаков имеет соответствующий балл: рефлекс неподвижности (30 баллов), набухание вульвы (10 баллов), гиперемия слизистой (10 баллов), наличие слизи (течка) (15 баллов), попытки садки (20 баллов), постовуляторные кровяные выделения (15 баллов). Во время прихода обследуемого реципиента в половую охоту регистрируют выявленные признаки половой охоты и присваивают им соответствующие баллы, при суммировании которых получают индекс КФПЭ. На 7-й день полового цикла у реципиента непосредственно перед пересадкой эмбриона выполняют эхографическую визуализацию желтого тела, расположенного на поверхности яичника, с использованием оборудования для ультразвукового исследования, посредством которого осуществляют морфометрические измерения желтого тела, а именно такого параметра как длина желтого тела. Измеренную длину желтого тела фиксируют согласно следующей классификации качества желтого тела (КЖТ): КЖТ-1 (≤1,2 см); КЖТ-2 (1,2-2,0 см); КЖТ-3 (≥2,0 см). Затем показатели индекса КФПЭ и КЖТ, полученные у обследуемого реципиента, сопоставляют с значениями индекса КФПЭ и КЖТ, отраженными в таблице 2 прототипа, в которой представлены показатели результативности приживляемости эмбрионов (в процентном выражении). Согласно данным таблицы 2 прототипа, возможно прогнозирование вероятности «наличие» приживляемости пересаживаемых эмбрионов: 1) при значении показателя КЖТ-1 (≤1,2 см) и КФПЭ, равного 100, или 85, или 80 и менее, так как при аналогичном показателе КЖТ были прижиты эмбрионы у 30,8% реципиентов с КФПЭ=100, у 66,7% реципиентов с КФПЭ=85, у 30,0% реципиентов с КФПЭ=80 и менее; 2) при значении показателя КЖТ-2 (1,2-2,0 см) и КФПЭ, равного 85, или 80 и менее, так как при аналогичном показателе КЖТ были прижиты эмбрионы у 68,0% реципиентов с КФПЭ=85 и у 28,6% реципиентов с КФПЭ=80 и менее; 3) при значении показателя КЖТ-3 (≥2,0 см) и КФПЭ, равного 85, так как были прижиты эмбрионы у 42,9% реципиентов. При иных значениях КФПЭ и КЖТ прогнозируют вероятность отсутствия приживляемости эмбрионов, пересаживаемых корове-реципиенту. На основании полученного результата прогнозирования становится возможным принятие решения об отборе животного в качестве реципиента для участия в процессе проведения технологии трансплантации эмбрионов или же о его выранжировке и исключению из данного мероприятия.
Недостатком способа-прототипа является то, что при проведении отбора коров-реципиентов вычисление индекса КФПЭ у находящейся в половой охоте коровы может привести к его недостаточной точности, так как диагностировать большое количество разнородных признаков половой охоты (клинико-физиологические проявления признаков эструса) достаточно сложно, поскольку они проявляются либо вместе, либо по-отдельности на протяжении всего периода прихода коровы в половую охоту. Кроме того, определение такого морфометрические параметра, как длина желтого тела, без учета его объемных характеристик снижает информативность метода. Это все вместе приводит к снижению точности результата прогнозирования приживляемости пересаживаемого эмбриона, и, как следствие к снижению точности отбора коров-реципиентов, имеющих высокий уровень приживляемости пересаживаемых эмбрионов.
Техническим результатом изобретения является повышение точности отбора животных с высоким уровнем приживляемости пересаживаемых эмбрионов реципиентам.
Технический результат достигается тем, что способ отбора коров-реципиентов в процессе проведения технологии трансплантации эмбрионов заключается в том, что у потенциальной коровы-реципиента выполняют прогнозирование приживляемости пересаживаемого эмбриона, и, в зависимости от результата прогнозирования, животное либо отбирают для использования в качестве реципиента, либо проводят его выранжировку, при этом, для выполнения указанного прогнозирования у коровы-реципиента на нулевой день полового цикла выполняют диагностику половой охоты на предмет выявления клинико-физиологических проявлений признаков эструса (признаки половой охоты) «рефлекс неподвижности» и «течка» среди всех проявившихся в течение этого нулевого дня признаков половой охоты, а на 7-й день полового цикла непосредственно перед пересадкой эмбриона выполняют эхографическую визуализацию яичника и желтого тела с использованием оборудования для ультразвукового исследования, посредством которого осуществляют морфометрические измерения параметров яичника и желтого тела, в котором согласно изобретению, при выполнении прогнозирования приживляемости пересаживаемого эмбриона у потенциальной коровы-реципиента выявляемые во время проведения диагностики признаки половой охоты «рефлекс неподвижности» и «течка» учитывают только в случае, если они оба были проявлены в течение нулевого дня полового цикла, при этом, результат диагностики выражают показателем «наличие» или показателем «отсутствие» совокупности признаков «рефлекс неподвижности и течка», а морфометрические измерения параметров яичника и желтого тела на 7-й день полового цикла состоят в том, что морфометрически измеряют объем желтого тела и объем яичника, выполняют расчет отношения объема желтого тела к объему яичника в процентном выражении (расчетный показатель), после чего значения расчетного показателя и показателя, полученного в результате диагностики, совместно используют в качестве прогностических критериев, и, при значении расчетного показателя 31% - 50% и показателя «наличие» совокупности признаков «рефлекс неподвижности и течка» прогнозируют вероятность «наличие приживляемости эмбриона», при которой животное отбирают для использования в качестве реципиента в процессе проведения технологии трансплантации эмбрионов, помимо того, вероятность «отсутствие приживляемости эмбриона» прогнозируют при следующих значениях расчетного показателя и показателя, полученного в результате диагностики: при значении расчетного показателя 30% и менее независимо от полученного показателя «наличие» или показателя «отсутствие» совокупности признаков «рефлекс неподвижности и течка», при значении расчетного показателя 31% - 50% и показателя «отсутствие» совокупности признаков «рефлекс неподвижности и течка», при значении расчетного показателя более 50% независимо от показателя «наличие» или показателя «отсутствие» признаков половой охоты, при этом, при спрогнозированной вероятности «отсутствие приживляемости эмбриона» осуществляют выранжировку животного и исключают его из процесса проведения технологии трансплантации эмбрионов.
Способ отбора коров-реципиентов в процессе проведения технологии трансплантации эмбрионов (далее - способ отбора, патентуемый способ) предназначен для применения у коров, предварительно отобранных в качестве реципиентов (далее - потенциальная корова-реципиент) в соответствии с ветеринарными и зоотехническими характеристиками, у которых зарегистрировано начало естественного или индуцированного полового цикла, соответствующего нулевому дню полового цикла (приход коровы в половую охоту). Следует отметить, что в практической деятельности хозяйств наиболее распространен способ регистрации нулевого дня полового цикла по большинству проявившихся клинико-физиологических признаков эструса (признаки половой охоты), к которым относят следующие признаки: повышенная двигательная активность, отказ от корма, рефлекс неподвижности, частое мычание, потливость, снижение молочной продуктивности, течка, гиперемия слизистой, попытки садок, набухание вульвы, постовуляторные кровяные выделения.
Для осуществления патентуемого способа у коровы-реципиента выполняют прогнозирование приживляемости пересаживаемого эмбриона и, в зависимости от результата прогнозирования, животное либо отбирают для использования в качестве реципиента, либо проводят его выранжировку. Для этого у реципиента в течение нулевого дня полового цикла проводят диагностику половой охоты на предмет выявления клинико-физиологических проявлений признаков эструса (признаки половой охоты) «рефлекс неподвижности» и «течка» среди всех проявившихся в течение этого нулевого дня признаков половой охоты, на основании которых был зарегистрирован нулевой день полового цикла. При выполнении диагностики применяют сочетанно визуальный, вагинальный и ректальный способы выявления половой охоты, 3 раза в сутки: в утренние, дневные и в вечерние часы. Полученные данные документируют. Учитывают признаки половой охоты «рефлекс неподвижности» и «течка» только в случае, если они оба были проявлены в течение нулевого дня полового цикла, при этом, результат диагностики выражают показателем «наличие» совокупности признаков «рефлекс неподвижности и течка». Если выявлен только признак «рефлекс неподвижности», а «течка» не выявлена, то результат диагностики выражают показателем «отсутствие» совокупности признаков «рефлекс неподвижности и течка». Аналогично тому, если зафиксирована только «течка», а «рефлекс неподвижности» отсутствует, то результат диагностики также выражают показателем «отсутствие» совокупности признаков «рефлекс неподвижности и течка». Признаки половой охоты «рефлекс неподвижности» и «течка» учитывают в рамках патентуемого способа только в совокупности (если они оба были проявлены в течение нулевого дня полового цикла) в связи с тем, что они являются главными при установлении факта прихода коровы в половую охоту, поскольку «рефлекс неподвижности» свидетельствует о ее готовности к спариванию, а наличие признака «течка» - о формировании благоприятной маточной среды для оплодотворения коровы. Отсутствие проявления одного из указанных признаков в нулевой день полового цикла свидетельствует о сбое гормонального фона в организме животного, и, как следствие, о нарушении протекания полового цикла, что может привести к последующей эмбриональной гибели пересаженного зародыша.
Полученный показатель «наличие» (или «отсутствие) совокупности признаков «рефлекс неподвижности и течка» документируют и затем переходят к следующему этапу процесса прогнозирования, осуществляемому на 7-й день полового цикла непосредственно перед пересадкой эмбриона. Для пересадки эмбриона выбор 7-го дня полового цикла обусловлен тем, что этот день полового цикла является оптимальным днем для работ по пересадке эмбриона реципиенту по причине того, что пересаживаемые эмбрионы получают от коров-доноров только на седьмой день полового цикла. Вследствие этого, для сохранения жизнеспособности эмбриона в репродуктивных органах реципиента необходимо соблюдать синхронизацию полового цикла реципиента и стадию развития эмбриона. Для цели прогнозирования в рамках патентуемого способа на 7-й день полового цикла непосредственно перед пересадкой эмбриона у коровы-реципиента выполняют эхографическую визуализацию яичника и желтого тела с использованием оборудования для ультразвукового исследования, посредством которого осуществляют морфометрические измерения параметров яичника и желтого тела. При этом, до момента процедуры пересадки эмбриона должен быть обеспечен период времени, предшествующий началу пересадки и достаточный для проведения этого исследования, на реализацию которого необходимо, в среднем, 10-30 минут. В данный промежуток времени у коровы-реципиента проводят упомянутое ультразвуковое исследование с использованием УЗИ-сканера с линейным датчиком, например: Tringa Linear («ESA OTES р.А», Италия), EASI SCAN E4 («BCF Technology», Великобритания), Kaixin KX5200 («Xuzhou Kaixin Electronic Instrument Co., Ltd», Китай). Затем при помощи графического редактора (программа, позволяющая обрабатывать и редактировать цифровые изображения на компьютере), например, ImageJ (National Institute of Health, США), AutoCAD (Autodesk, Inc., США) проводят постпроцессинговую морфометрию полученного ультразвукового изображения, на котором схематично отображают проекции структур желтого тела и яичника и определяют их объемы с помощью функции обвода или эллипса, которая позволяет вычислять объем в одной плоскости сканирования. Проводят вычисление отношения объема желтого тела к объему яичника в процентном выражении (расчетный показатель). Полученное значение расчетного показателя фиксируют документально.
Затем значение показателя, полученного в результате диагностики половой охоты, и значение расчетного показателя совместно используют в качестве предикторных критериев. Для этого вычисленное значение расчетного показателя, сопоставляют с значением показателя «наличие» (или «отсутствие») совокупности признаков «рефлекс неподвижности и течка» в прогностической таблице 1, в которой отражена корреляционная связь предикторых критериев с тем или иным значением вероятности приживляемости эмбрионов, и подбирают соответствующий им показатель прогнозируемой вероятности приживляемости, который выражен в двух наименованиях показателей: «вероятность наличия приживляемости» и «вероятность отсутствия приживляемости».
Как видно из прогностической таблицы (таблица 1) результат прогнозирования, определенный как «вероятность наличия приживляемости» (столбец 2, строка 2) возможен только при значении расчетного показателя 31% - 50% (столбец 1, строка 2) и при значении показателя, полученного в результате диагностики, определенного как «наличие» совокупности признаков «рефлекс неподвижности и течка». При таком полученном результате прогнозирования принимают решение об отборе животного для использования в качестве реципиента в процессе проведения технологии трансплантации эмбрионов. При всех других комбинациях значений расчетного показателя и показателя, полученного в результате диагностики, прогнозируют «вероятность отсутствия приживляемости», при которых принимают решение о проведении мероприятия по выранжировке животного и исключают его из процесса проведения технологии трансплантации эмбрионов.
Проводилось исследование, в процессе которого были отобраны в качестве реципиентов коровы мясного и молочного направлений продуктивности в количестве 250 голов (в соответствии с ветеринарными и зоотехническими характеристиками). Коровы были отобраны в экспериментальную группу реципиентов по следующим ветеринарным и зоотехническим характеристикам: не имеющие селекционной ценности, отобранные не ранее, чем за 60-70 дней после отела, без признаков нарушения обмена веществ (ожирение, дистрофия и т.д.), с отсутствием признаков патологий гениталий и инфекционных заболеваний (бруцеллез, туберкулез, вирусные респираторные заболевания, лейкоз, трихомоноз, вибриоз, ящур и др.). Для индуцирования полового цикла животным был введен в соответствии с инструкцией по применению препарат простагландинового ряда F2α «Эстрофан» (Инструкция к препарату «Эстрофан», производитель АО «Биовета», Чешская Республика, сайт Интернет: http://www.veterinarka.ru/vetmedicaments/estrofan.html, 2019 г.). После введения препарата «Эстрофан» половая охота у всех животных исследуемой группы наступила через 48-72 часов, как это было предписано инструкцией по применению препарата. У каждого из экспериментальных животных индивидуально был выявлен факт прихода в половую охоту с использованием общепринятых методов выявления признаков половой охоты («Признаки половой охоты. Приложение №1», «Основные способы выявления половой охоты у коров и телок. Приложение №2» к Условиям применения биотехнологических методов искусственного осеменения племенных коров и телок, утвержденным приказом Минсельхоза России от 18 марта 2016 года N 102. http://pravo.gov.ru/proxy/ips/?docbody=&nd=102407825&intelsearch=21.07.2016%2C+N+0001201607220043, 2019 г.). При этом, применяли сочетанно визуальный, вагинальный и ректальный способы выявления половой охоты, 3 раза в сутки: в утренние, дневные и в вечерние часы. Документально фиксировали результаты исследований. Факт прихода животного в половую охоту регистрировали как нулевой день полового цикла, от которого был проведен отсчет 7-го дня полового цикла, предназначенный для пересадки эмбриона.
В рамках данного исследования у каждой из коров-реципиентов на 7-й день ее полового цикла до начала процедуры пересадки эмбриона была выполнена эхографическая визуализация яичника и желтого тела с использованием оборудования для ультразвукового исследования, посредством которого были осуществлены морфометрические измерения параметров яичника и желтого тела. При этом, использовали УЗИ-сканер Tringa Linear («ESA OTES р.А», Италия) с линейными датчиками (рабочая частота - 7,5 МГц). Фиксировали черно-белые ультразвуковые изображения репродуктивных органов. Провели постпроцессинговую обработку с использованием графического редактора ImageJ (National Institute of Health, США) и морфометрически измерили объем желтого тела и объем яичника. У каждой коровы-реципиента выполнили расчет отношения объема желтого тела к объему яичника в процентном выражении (расчетный показатель). При проведении данного ультразвукового исследования был определен период времени, израсходованный на проведение этого исследования и вычисление расчетного показателя, и было выявлено, что на выполнение данных действий, предшествующих началу пересадки эмбриона реципиенту, было использовано, в среднем, 10-30 минут.
Далее, непосредственно после окончания проведения ультразвукового исследования были проведены работы по пересадке эмбрионов (по одному эмбриону на одну корову-реципиента). Эмбрион пересаживали в рог матки ипсилатерально желтому телу. Процедуру трансплантации эмбрионов осуществляли с использованием жесткого шприца-катетера модификации Кассу, изготовленного под стандартные соломинки-пайеты объемом 0,25 или 0,5 мл. Для трансплантаций использовали замороженно-оттаянные семидневные эмбрионы, полученные методом in vivo, отличного и хорошего качества на стадии развития морула и бластоциста. Порода доноров эмбрионов - герефорд. Диагностику стельности проводили на 21-25-й день после пересадки эмбриона. Для эхографической визуализации плода использовали УЗИ - сканер Kaixin КХ5200 («Xuzhou Kaixin Electronic Instrument Co., Ltd», Китай) с линейным датчиком. В качестве рабочей частоты использовали 7,5 Мгц. Все эхографические изображения репродуктивных органов фиксировали в черно-белом цвете. Наличие стельности свидетельствовало о наличии приживляемости эмбриона, а отсутствие стельности - об отсутствие приживляемости эмбриона.
Результаты проведенного исследования представлены в таблице 2. Для лучшей градации результатов исследования значения расчетного показателя в таблице 2 изложили в диапазонах с шагом в 10% (столбец 1). В рамках этих диапазонов отразили общее количество коров, у которых было получено соответствующее значение их индивидуального расчетного показателя (столбец 2). Кроме того, эти животные (сгруппированные в рамках указанных диапазонов) были сгруппированы в соответствии с показателем «наличие» или «отсутствие» признаков «рефлекс неподвижности и течка», проявленных в совокупности на нулевой день полового цикла (столбец 3). Количество коров-реципиентов, ранжированных по наличию или отсутствию признаков «рефлекс неподвижности и течка», изложено в столбце 4, при этом, указанное количество коров равняется количеству пересаженных эмбрионов, так как одной корове был пересажен один эмбрион. Результат приживляемости трансплантированных эмбрионов приведен в столбцах 5 и 6. При этом, в столбце 5 указано количество прижившихся эмбрионов (шт.) из расчета на всех коров, количество которых приведено в столбце 4, а в столбце 6 указаны показатели столбца 5, исчисленные в процентном выражении.
Как видно из таблицы 2, при значении расчетного показателя (отношение объема желтого тела к объему яичника в процентном выражении) 30% и менее при показателе «наличие» (равно, как и при показателе «отсутствие») признаков половой охоты «рефлекс неподвижности и течка», проявленных в совокупности, свидетельствует об отсутствии приживляемости. Значение расчетного показателя в диапазоне 31 - 50% при показателе «наличие» признаков половой охоты «рефлекс неподвижности и течка», проявленных в совокупности, свидетельствует о наличии высокого (более 50%) уровня приживляемости (67,2-75,2%), что в рамках настоящего исследования трактуется как вероятность наличия приживляемости. Однако, в этом же диапазоне расчетного показателя 31-50%, но при показателе «отсутствие» признаков половой охоты «рефлекс неподвижности и течка», проявленных в совокупности, приживляемость пересаженных эмбрионов составляла 9,5-17,7%, что является критически низким (менее 20%) уровнем приживляемости эмбрионов и в рамках настоящего исследования трактуется как вероятность отсутствия приживляемости. Повышение значения расчетного показателя более 50% при показателе «наличие» (равно, как и при показателе «отсутствие») признаков половой охоты «рефлекс неподвижности и течка», проявленных в совокупности, как показано в таблице 2, свидетельствует об отсутствии приживляемости. На основании результатов исследования, отраженных в таблице 2 была составлена вышеприведенная прогностическая таблица (таблица 1), при помощи которой выполняют прогнозирование вероятности наличия или отсутствия приживляемости трансплантированного эмбриона у коровы-реципиента, и, в зависимости от результата прогнозирования, производят отбор животного для участия в мероприятии по проведению технологии трансплантации эмбрионов.
Примеры.
Пример 1. Корова №24351, казахская белоголовая порода (мясное направление продуктивности), возраст 4 года, была отобрана в состав группы потенциальных коров-реципиентов по ветеринарным и зоотехническим характеристикам. Для повышения эффективности отбора был проведен патентуемый способ. На нулевой день полового цикла, который был зарегистрирован через 48 часов после введения препарата простагландинового ряда F2α «Эстрофан» в соответствии с его инструкцией с целью вызывания (индуцирования) половой охоты, у данной коровы-реципиента начали проводить прогнозирование приживляемости пересаживаемого эмбриона. В течение этого нулевого дня проводили диагностику половой охоты на предмет выявления наличия признака «рефлекс неподвижности» и признака «течка» среди всех проявившихся в этот день признаков половой охоты. Результат диагностики зафиксировали как «отсутствие» совокупности признаков «рефлекс неподвижности и течка». На седьмой день полового цикла за 15 минут до начала пересадки эмбриона провели эндоректальное исследование яичника с желтым телом с использованием метода ультразвуковой эхографии. Использовали УЗИ-сканер Tringa Linear («ESA OTES р.А», Италия) с линейными датчиками (рабочая частота - 7,5 МГц), фиксировали черно-белые ультразвуковые изображения репродуктивных органов. Провели постпроцессинговую обработку данных изображений с использованием графического редактора ImageJ (National Institute of Health, США), морфометрически измерили объем желтого тела и объем яичника. На основании полученных данных вычислили расчетный показатель (отношение объема желтого тела к объему яичника в процентном выражении), который составил 45,4%. Согласно прогностической таблице (таблица 1), данный показатель соответствовал прогнозируемой вероятности приживляемости, выраженной показателем «вероятность отсутствия приживляемости». При данном результате прогнозирования был сделан вывод о том, что данная корова (потенциальный реципиент), согласно патентуемому способу отбора должна быть подвергнута выранжировке и исключена из процесса проведения технологии трансплантации эмбрионов. Для подтверждения сделанного вывода после завершения патентуемого способа провели процедуру пересадки эмбриона в верхнюю треть рога матки с использованием шприц-катетера модификации Кассу. На 24-й день от дня пересадки эмбриона провели диагностику стельности с использованием метода ультразвуковой эхографии. Использовали УЗИ-сканер Tringa Linear («ESA OTES р.А», Италия) с линейными датчиками (рабочая частота - 7,5 МГц). Результат обследования показал отсутствие стельности, свидетельствующей об отсутствии приживляемости трансплантированного эмбриона, что подтвердило сделанные в процессе отбора выводы о том, что корова должна подлежать выранжировке и исключению из процесса проведения технологии трансплантации эмбрионов.
Пример 2. Телка симментальской породы №35462 (мясо-молочное направление продуктивности), возраст 14 месяцев, была отобрана в состав потенциальных коров-реципиентов по ветеринарным и зоотехническим характеристикам. Для повышения эффективности отбора был проведен патентуемый способ. На нулевой день полового цикла, который был зарегистрирован через 56 часов после введения препарата простагландинового ряда F2α «Эстрофан» в соответствии с его инструкцией с целью вызывания (индуцирования) половой охоты, у данной телки-реципиента начали проводить прогнозирование приживляемости пересаживаемого эмбриона. В течение этого нулевого дня проводили диагностику половой охоты на предмет выявления наличия признака «рефлекс неподвижности» и признака «течка» среди всех проявившихся в этот день признаков половой охоты. Результат диагностики зафиксировали как «наличие» совокупности признаков «рефлекс неподвижности и течка». На седьмой день полового цикла за 20 минут до начала пересадки эмбриона провели эндоректальное исследование яичника с желтым телом с использованием метода ультразвуковой эхографии. Использовали УЗИ-сканер Tringa Linear («ESA OTES р.А», Италия) с линейными датчиками (рабочая частота - 7,5 МГц), фиксировали черно-белые ультразвуковые изображения репродуктивных органов. Провели постпроцессинговую обработку данных изображений с использованием графического редактора ImageJ (National Institute of Health, США), морфометрически измерили объем желтого тела и объем яичника. На основании полученных данных вычислили расчетный показатель (отношение объема желтого тела к объему яичника в процентном выражении), который составил 31,8%. Согласно прогностической таблице (таблица 1), данный показатель соответствовал прогнозируемой вероятности приживляемости, выраженной показателем «вероятность наличия приживляемости». При данном результате прогнозирования был сделан вывод о том, что данная телка (потенциальный реципиент), согласно патентуемому способу, должна быть отобрана для использования в качестве реципиента в процессе проведения технологии трансплантации эмбрионов. Для подтверждения сделанного вывода после завершения патентуемого способа провели процедуру пересадки эмбриона в верхнюю треть рога матки с использованием шприц-катетера модификации Кассу. На 24-й день от дня пересадки эмбриона провели диагностику стельности с использованием метода ультразвуковой эхографии. Использовали УЗИ-сканер Tringa Linear («ESA OTES р.А», Италия) с линейными датчиками (рабочая частота - 7,5 МГц). Результат обследования показал наличие стельности, свидетельствующей о наличии приживляемости трансплантированного эмбриона, что подтвердило сделанные в процессе отбора выводы о том, что корова должна быть отобрана для использования в качестве реципиента в процессе проведения технологии трансплантации эмбрионов.
Пример 3. Телка голштинской породы №35462 (молочное направление продуктивности), возраст 15 месяцев, была отобрана в состав потенциальных коров-реципиентов по ветеринарным и зоотехническим характеристикам. Для повышения эффективности отбора был проведен патентуемый способ. На нулевой день полового цикла, который был зарегистрирован через 72 часа после введения препарата простагландинового ряда F2α «Эстрофан» в соответствии с его инструкцией с целью вызывания (индуцирования) половой охоты, у данной коровы-реципиента начали проводить прогнозирование приживляемости пересаживаемого эмбриона. В течение этого нулевого дня проводили диагностику половой охоты на предмет выявления наличия признака «рефлекс неподвижности» и признака «течка» среди всех проявившихся в этот день признаков половой охоты. Результат диагностики зафиксировали как «наличие» совокупности признаков «рефлекс неподвижности и течка». На седьмой день полового цикла за 10 минут до начала пересадки эмбриона провели эндоректальное исследование яичника с желтым телом с использованием метода ультразвуковой эхографии. Использовали УЗИ-сканер Tringa Linear («ESA OTES р.А», Италия) с линейными датчиками (рабочая частота - 7,5 МГц), фиксировали черно-белые ультразвуковые изображения репродуктивных органов. Провели постпроцессинговую обработку данных изображений с использованием графического редактора ImageJ (National Institute of Health, США), морфометрически измерили объем желтого тела и объем яичника. На основании полученных данных вычислили расчетный показатель (отношение объема желтого тела к объему яичника в процентном выражении), который составил 28,5%. Согласно прогностической таблице (таблица 1), данный показатель соответствовал прогнозируемой вероятности приживляемости, выраженной показателем «вероятность отсутствия приживляемости». При данном результате прогнозирования был сделан вывод о том, что данная корова (потенциальный реципиент), согласно патентуемому способу отбора должна быть подвергнута выранжировке и исключена из процесса проведения технологии трансплантации эмбрионов. Для подтверждения сделанного вывода после завершения патентуемого способа провели процедуру пересадки эмбриона в верхнюю треть рога матки с использованием шприц-катетера модификации Кассу. На 24-й день от дня пересадки эмбриона провели диагностику стельности с использованием метода ультразвуковой эхографии. Использовали УЗИ-сканер Tringa Linear («ESA OTES р.А», Италия) с линейными датчиками (рабочая частота - 7,5 МГц). Результат обследования показал отсутствие стельности, свидетельствующей об отсутствии приживляемости трансплантированного эмбриона, что подтвердило сделанные в процессе отбора выводы о том, что корова подлежит выранжировке и исключению из процесса проведения технологии трансплантации эмбрионов.
Пример 4. Корова породы герефорд №35462 (мясное направление продуктивности), возраст 3 года, была отобрана в состав потенциальных коров-реципиентов по ветеринарным и зоотехническим характеристикам. Для повышения эффективности отбора был проведен патентуемый способ. На нулевой день полового цикла, который был зарегистрирован через 72 часа после введения препарата простагландинового ряда F2α «Эстрофан» в соответствии с его инструкцией с целью вызывания (индуцирования) половой охоты, у данной коровы-реципиента начали проводить прогнозирование приживляемости пересаживаемого эмбриона. В течение этого нулевого дня проводили диагностику половой охоты на предмет выявления наличия признака «рефлекс неподвижности» и признака «течка» среди всех проявившихся в этот день признаков половой охоты. Результат диагностики зафиксировали как «наличие» совокупности признаков «рефлекс неподвижности и течка». На седьмой день полового цикла за 15 минут до начала пересадки эмбриона провели эндоректальное исследование яичника с желтым телом с использованием метода ультразвуковой эхографии. Использовали УЗИ-сканер Tringa Linear («ESA OTES р.А», Италия) с линейными датчиками (рабочая частота - 7,5 МГц), фиксировали черно-белые ультразвуковые изображения репродуктивных органов. Провели постпроцессинговую обработку данных изображений с использованием графического редактора ImageJ (National Institute of Health, США), морфометрически измерили объем желтого тела и объем яичника. На основании полученных данных вычислили расчетный показатель (отношение объема желтого тела к объему яичника в процентном выражении), который составил 56,9%. Согласно прогностической таблице (таблица 1), данный показатель соответствовал прогнозируемой вероятности приживляемости, выраженной показателем «вероятность отсутствия приживляемости». При данном результате прогнозирования был сделан вывод о том, что данная корова (потенциальный реципиент), согласно патентуемому способу отбора должна быть подвергнута выранжировке и исключена из процесса проведения технологии трансплантации эмбрионов. Для подтверждения сделанного вывода после завершения патентуемого способа провели процедуру пересадки эмбриона в верхнюю треть рога матки с использованием шприц-катетера модификации Кассу. На 24-й день от дня пересадки эмбриона провели диагностику стельности с использованием метода ультразвуковой эхографии. Использовали УЗИ-сканер Tringa Linear («ESA OTES р.А», Италия) с линейными датчиками (рабочая частота - 7,5 МГц). Результат обследования показал отсутствие стельности, свидетельствующей об отсутствии приживляемости трансплантированного эмбриона, что подтвердило сделанные в процессе отбора выводы о том, что корова подлежит выранжировке и исключению из процесса проведения технологии трансплантации эмбрионов.
Таким образом, предлагаемый способ с высокой долей информативности позволяет прогнозировать уровень приживляемости пересаживаемых эмбрионов, что дает возможность проводить наиболее эффективно отбор коров-реципиентов для использования в процессе проведения технологии трансплантации эмбрионов.