СПОСОБЫ ХАРАКТЕРИЗАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ НА ТВЕРДЫХ И ПОЛУТВЕРДЫХ СРЕДАХ
METHOD OF CHARACTERISING MICROORGANISMS ON SOLID AND SEMI-SOLID MEDIA

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ
Данная заявка претендует на приоритет в отношении предварительной заявки на патент США №61/122925, озаглавленной "Methods for Characterization of Microorganisms on Solid or Semi-Solid Media", поданной 16 декабря 2008, которая включена в данную заявку.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способам и системам для обнаружения, мониторинга, характеризации и/или идентификации микроорганизмов на твердых или полутвердых средах.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Микроорганизмы, выделенные с целью клинической диагностики, а также выделенные для мониторинга заражения пищевых продуктов, тканей медицинского назначения и окружающей среды, часто необходимо охарактеризовать, чтобы определить соответствующую реакцию на присутствие обнаруженных организмов. Традиционные автоматические фенотипические анализы идентификации, такие как системы Vitek, Phoenix™ и Microscan, или ручные фенотипические тесты, такие как API, требуют, чтобы микроорганизмы находились в соответствующей фазе роста и были свободны от интерферирующих сред и продуктов крови с целью получения надежных результатов. Эти системы используют колонии, выращенные в течение 16-24 часов на твердых средах, после чего из колоний получают стандартизованные суспензии, а затем тесты действительной характеризации требуют еще 4-24 часа инкубации для их завершения.
Методы оптической спектроскопии, такие как собственная флуоресценция (СФ), инфракрасная спектроскопия (FTIR) или рамановская спектроскопия, обладают потенциалом, дающим возможность для идентификации микроорганизмов очень быстро, но продемонстрированы только для работы на "чистых" суспензиях микроорганизмов. В публикациях описаны методы СФ для характеризации микроорганизмов только для очень ограниченных групп микроорганизмов, или такие методы, которые требуют дополнительных измерений, например, событий специфичного связывания, чтобы дать возможность функциональной характеризации. Прямое исследование микроорганизмов на ростовой среде считали проблематичным вследствие предполагаемого большого вклада самой среды в спектрограмму.
Настоящее изобретение преодолевает проблемы уровня техники за счет разработки способов, при котором можно спектроскопическим путем различать микроорганизмы, исследуемые непосредственно на флуоресцентных твердых и/или полутвердых ростовых средах, включая высоко флуоресцентные среды.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении предложены способы обнаружения, мониторинга, характеризации и/или идентификации микроорганизмов на твердых и/или полутвердых средах. Характеризация охватывает как широкую категоризацию или классификацию микроорганизмов, так и действительную идентификацию отдельного вида. Как используют в данной заявке, "идентификация" означает определение, к какому семейству, роду, виду и/или штамму принадлежит ранее неизвестный микроорганизм, например, идентификацию ранее неизвестного микроорганизма на уровне семейства, рода, вида и/или штамма. Способы, раскрытые в данной заявке, дают возможность обнаружения, характеризации и/или идентификации микроорганизмов быстрее, чем предшествующие методы, что приводит в результате к более быстрым диагнозам (например, у субъекта, страдающего инфекцией или подозреваемого на инфекцию), а также идентификации зараженных материалов (например, пищевых продуктов и фармацевтических препаратов). Стадии, включенные в способы по изобретению, можно осуществлять в короткой временной рамке с получением клинически релевантной информации для действия. В некоторых формах осуществления быстро растущие организмы можно обнаружить и идентифицировать всего за несколько часов. Более медленно растущие организмы можно обнаружить и идентифицировать быстрее, чем с помощью предшествующих методов, с получением результатов в полезной временной рамке. Одну стадию идентификации/характеризации можно осуществить за несколько минут или менее. Эти способы также позволяют обнаружить, осуществить мониторинг, охарактеризовать и/или идентифицировать множественные типы микроорганизмов (например, различные классы и/или виды) одновременно (например, в смешанных культурах). Предпочтительно в некоторых формах осуществления способы по изобретению можно осуществить in situ без разрушения колонии, сохраняя, таким образом, колонию для дальнейших тестов или применений. Кроме того, способы по изобретению могут быть частично или полностью автоматизированы, снижая, таким образом, риск обращения с инфекционными материалами и/или заражения образцов.
Первый аспект изобретения относится к способам характеризации и/или идентификации микроорганизма на твердой или полутвердой среде, включающим:
(a) исследование одной или более чем одной колонии на твердой или полутвердой среде с получением измерений собственной флуоресценции (СФ), характеристических для микроорганизма в колонии; и
(b) характеризацию и/или идентификацию микроорганизма в колонии на основании измерений собственной флуоресценции (СФ).
Другой аспект изобретения относится к способам обнаружения и характеризации микроорганизма на твердой или полутвердой среде, включающим:
(a) сканирование среды, о которой известно, что она содержит или может содержать одну или более чем одну колонию микроорганизма, для локализации колоний, присутствующих на среде;
(b) исследование одной или более чем одной колонии, локализованной на стадии (а), с получением измерений собственной флуоресценции (СФ), характеристических для микроорганизма в колонии; и
(c) обнаружение, характеризацию и/или идентификацию микроорганизма в колонии на основании измерений собственной флуоресценции (СФ).
Следующий аспект изобретения относится к способам характеризации и/или идентификации микроорганизма в образце, включающим:
(a) выращивание микроорганизма, присутствующего в образце, на твердой или полутвердой среде с получением по меньшей мере одной колонии;
(b) исследование одной или более чем одной колонии на среде с получением измерений собственной флуоресценции (СФ), характеристических для микроорганизма; и
(c) характеризацию и/или идентификацию микроорганизма в колонии на основании полученных измерений.
Дополнительный аспект изобретения относится к способам обнаружения присутствия микроорганизма в образце, включающим:
(a) получение образца, о котором известно, что он содержит или может содержать микроорганизм;
(b) выращивание микроорганизма, присутствующего в образце, на твердой или полутвердой среде; и
(c) локализацию любых колоний, присутствующих на среде, путем проведения поточечного сканирования твердой или полутвердой среды с получением измерений собственной флуоресценции (СФ);
где присутствие одной или более чем одной колонии, которая локализована с помощью полученных измерений, указывает на то, что микроорганизм присутствует в образце.
В одной форме осуществления изобретение относится к системе для обнаружения, характеризации и/или идентификации микроорганизма на твердой или полутвердой среде, где эта система включает спектрофотометр и фокусирующие оптические устройства, такие как система линз или микроскоп. В других формах осуществления эта система дополнительно включает механизм для сканирования поверхности среды и/или механизм для контроля окружающей среды (например, инкубации) этой среды.
В другой форме осуществления колонию можно исследовать с получением измерений, которые можно использовать, чтобы обнаружить, охарактеризовать и/или идентифицировать микроорганизмы колонии (например, колонию можно исследовать, используя спектроскопию). Микроорганизмы можно охарактеризовать и/или идентифицировать путем сравнения измерений (например, спектра) колонии с подобными измерениями (например, спектра или спектров), снятыми с известных микроорганизмов. В другой форме осуществления колонию можно исследовать неинвазивным путем (например, внутри герметично закрытой чашки Петри). Способность непосредственно характеризовать и/или идентифицировать микроорганизмы, содержащиеся в колонии (например, внутри герметично закрытой чашки Петри) без дополнительного обращения с ними повышает безопасность идентификации микроорганизмов.
Еще в одной другой форме осуществления спектроскопическое исследование основано на собственных характеристиках микроорганизмов (например, собственной флуоресценции). В других формах осуществления спектроскопическое исследование отчасти основано на сигналах, полученных от дополнительных агентов, которые добавляют в течение способов по изобретению, и они взаимодействуют со специфичными микроорганизмами или группами микроорганизмов.
В другой форме осуществления способы дополнительно включают стадию выделения колонии, ресуспендирования колонии и проведения дополнительных тестов идентификации и/или характеризации (например, лекарственной устойчивости, факторов вирулентности, антибиограммы).
Настоящее изобретение объяснено более подробно в приведенных в данной заявке графических материалах и в описании, изложенном ниже.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На ФИГ.1A-1D показаны спектры с не инокулированных чашек с кровяным агаром (ВАР) без мембраны (А) или ВАР с черной решетчатой полиэфирсульфоновой мембраной Pall Metricel (Pall) (В), черной мембраной из смешанных сложных эфиров Whatman (WME) (С) или трековой поликарбонатной черной мембраной Whatman (WPC) (D), наложенной на поверхность среды.
На ФИГ.2А-2С показаны спектры с колоний на мембране WME на ВАР, полученные с ЕСЗ (А) и SA1 (В), и результаты вычитания спектра ЕСЗ из спектра SA1 (С).
На ФИГ.3A-3D показаны спектры с колоний на ВАР без мембраны, полученные с ЕС1 (А), SA1 (В), EF1 (С) и РА1 (D).
На ФИГ.4A-4F показаны трехмерные диаграммы сканирований СФ поточечного поиска с прогона F, где высота равна интенсивности флуоресценции. Диаграммы показывают измерения, снятые через 6 ч (А), 8 ч (В), 10 ч (С), 12 ч (D), 16 ч (Е) и 24 ч (F).
На ФИГ.5А-5В показано изображение в увеличенном масштабе ВАР с прогона F через 24 ч (А) и контурное изображение интенсивности флуоресценции при поисковом сканировании через 12 ч, показывающие соответствующие локализации колоний (В).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение может быть осуществлено в различных формах и не должно рассматриваться как ограниченное формами осуществления, изложенными в данной заявке. Вероятнее, эти формы осуществления представлены таким образом, чтобы данное описание было тщательным и полным и полностью передавало объем изобретения специалистам в данной области техники. Например, признаки, проиллюстрированные в отношении одной формы осуществления, могут быть включены в другие формы осуществления, а признаки, проиллюстрированные в отношении конкретной формы осуществления, могут быть удалены из этой формы осуществления. Кроме того, различные вариации и дополнения к формам осуществления, предложенным в данной заявке, которые не отклоняются от настоящего изобретения, будут очевидны специалистам в данной области техники в свете настоящего описания.
Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют то же значение, которое общепринято понимают обычные специалисты в области техники, к которой принадлежит данное изобретение. Терминология, используемая в описании изобретения в данной заявке, предназначена только для целей описания конкретных форм осуществления и не предназначена для ограничения изобретения.
Определения
Как используют в данной заявке, единственное число может означать одно или более чем одно. Например, "клетка" может означать единственную клетку или множество клеток.
Как используют в данной заявке, "и/или" также относится к любой или ко всем возможным комбинациям одного или более чем одного из сопутствующих перечисленных пунктов и включает их, а также отсутствие комбинаций при интерпретации в альтернативе ("или").
Кроме того, термин "примерно", как используют в данной заявке по отношению к измеримому значению, такому как количество соединения или агента, доза, время, температура и тому подобное, подразумевают как охватывающий вариации ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, ±0,5% или даже ±0,1% указанного количества.
Как используют в данной заявке, термин "микроорганизм" предназначен для включения организмов, которые являются в целом одноклеточными, которые можно размножать и держать в лаборатории, включающие, но не ограниченные ими, грамположительные или грамотрицательные бактерии, дрожжи, плесневые грибы, паразиты и молликуты. Не ограничивающие примеры грамотрицательных бактерий по данному изобретению включают бактерии следующих родов:
Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Campylobacter, Haemophilus, Morganella, Vibrio, Yersinia, Acinetobacter, Stenotrophomonas, Brevundimonas, Ralstonia, Achromobacter, Fusobacterium, Prevotella, Branhamella, Neisseria, Burkholderia, Citrobacter, Hafhia, Edwardsiella, Aeromonas, Moraxella, Brucella, Pasteurella, Providencia и Legionella. He ограничивающие примеры грамположительных бактерий по данному изобретению включают бактерии следующих родов: Enterococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Bacillus, Paenibacillus, Lactobacillus, Listeria, Peptostreptococcus, Propionibacterium, Clostridium, Bacteroides, Gardnerella, Kocuria, Lactococcus, Leuconostoc, Micrococcus, Mycobacteria и Corynebacteria. He ограничивающие примеры дрожжей и плесневых грибов по данному изобретению включают дрожжи и плесневые грибы из следующих родов: Cuida, Cryptococcus, Nocardia, Penicillium, Alternaria, Rhodotorula, Aspergillus, Fusarium, Saccharomyces и Trichosporon. He ограничивающие примеры паразитов по данному изобретению включают паразиты из следующих родов: Trypanosoma, Babesia, Leishmania, Plasmodium, Wucheria, Brugia, Onchocerca и Naegleria. He ограничивающие примеры молликутов по данному изобретению включают молликуты из следующих родов: Mycoplasma и Ureaplasma.
Как используют в данной заявке, термины "колония" и "микроколония" относятся к множеству или к популяции микроорганизмов, которые находятся в тесном приближении друг к другу, которые лежат на поверхности, и которые являются клональными потомками в результате репликации in situ одного предкового микроорганизма. Как правило, "колония" видима для человеческого глаза и типично составляет более 50 мкм, 60 мкм, 80 мкм или 100 мкм в диаметре. Однако, как используют в данной заявке, если не указано иное, термин "колония" подразумевают как включающий и колонии, имеющие диаметр 50 мкм или более, и "микроколонии", имеющие диаметр 50 мкм или менее. В других формах осуществления настоящее изобретение направлено на сканирование, обнаружение, характеризацию и/или идентификацию микроорганизмов в "микроколонии". Как используют в данной заявке, размер "микроколонии" может находиться в интервале от примерно 2 мкм до примерно 50 мкм или от примерно 10 мкм до примерно 50 мкм. "Микроколония" обычно слишком мала, чтобы быть видимой невооруженным глазом (например, менее чем примерно 50 мкм в диаметре).
Как используют здесь, термины "сканировать" или "сканирование" относятся к поиску предопределенной области по систематической или предопределенной схеме или случайным образом, чтобы локализовать что-либо, представляющее интерес (например, колонию микроорганизма). Например, твердую или полутвердую среду можно "сканировать" путем перемещения сфокусированного пучка света над поверхностью по систематической или предопределенной схеме или случайным образом, чтобы обнаружить, локализовать или иначе почувствовать колонию микроорганизма. В альтернативной форме осуществления твердую или полутвердую среду можно перемещать по систематической или предопределенной схеме или случайным образом относительно пучка света, чтобы обнаружить, локализовать или иначе почувствовать колонию микроорганизма. В соответствии с данной формой осуществления источник света типично имеет диаметр пучка менее чем примерно 0,5 мм, менее чем примерно 0,2 мм или менее чем примерно 0,1 мм. В другой форме осуществления диаметр пучка составляет от примерно 5 мкм до примерно 500 мкм, от примерно 10 мкм до примерно 100 мкм или от примерно 20 мкм до примерно 80 мкм.
В одной форме осуществления "сканирование" может включать поточечное "сканирование" твердой или полутвердой среды. В соответствии с данной формой осуществления источник света (например, лазерный луч) можно перемещать к первой точке на твердой или полутвердой среде и осуществлять стадию сканирования или исследования для обнаружения и/или характеризации любых колоний микроорганизмов, которые могут присутствовать. Альтернативно твердую или полутвердую среду можно перемещать относительно источника света, так чтобы проводить поточечное сканирование твердой или полутвердой среды. Затем источник света (например, лазерный луч) или твердую или полутвердую среду можно перемещать так, чтобы можно было сканировать и/или исследовать вторую точку. Этот процесс поточечного сканирования можно продолжать до тех пор, пока поточечный поиск данной области поиска не будет завершен. Областью поиска может быть вся поверхность твердой или полутвердой среды (например, чашка со средой) или ее субпопуляция.
В другой форме осуществления поточечный поиск можно проводить от точки к точке вдоль линейной траектории (например, продольной прямой линии через среду). Затем источник света или среду можно сдвигать на вторую продольную линию и проводить поточечный поиск вдоль линейной траектории второй продольной линии. Эту поточечную и построчную схему поиска (или сканирование по типу решетки) можно проводить до завершения данной области поиска. Областью поиска может быть вся поверхность твердой или полутвердой среды (например, чашка со средой) или ее субпопуляция. В другой форме осуществления сканирование может представлять собой непрерывное сканирование (то есть непрерывное поточечное сканирование).
В настоящем изобретении предложены способы обнаружения, мониторинга, характеризации и/или идентификации микроорганизмов на твердой и/или полутвердой среде. Эти быстрые способы дают возможность обнаружения, характеризации и/или идентификации микроорганизмов быстрее, чем предшествующие методы, что приводит в результате к более быстрым диагнозам (например, у субъекта, страдающего инфекцией или подозреваемого на инфекцию), характеризации и/или идентификации зараженных материалов (например, пищевых продуктов, источников воды и фармацевтических препаратов). Стадии, включенные в способы по изобретению, от получения образца до характеризации/идентификации микроорганизмов, можно осуществлять в короткой временной рамке с получением клинически релевантной информации для действия. В некоторых формах осуществления способы по изобретению можно осуществить менее чем примерно за 72 часа, например, менее чем примерно за 18, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 часов или 1 час. В некоторых формах осуществления стадии идентификации можно осуществить менее чем за 60 минут, например, менее чем примерно за 50, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2 минуты или 1 минуту. Эти способы можно использовать, чтобы охарактеризовать и/или идентифицировать любой микроорганизм, который описан в данной заявке. В одной форме осуществления микроорганизм представляет собой бактерию. В другой форме осуществления микроорганизм представляет собой дрожжи. В другой форме осуществления микроорганизм представляет собой плесневый гриб. Способы можно использовать, чтобы обнаружить, провести мониторинг, охарактеризовать и/или идентифицировать множественные типы микроорганизмов, например, микроорганизмы различных видов, родов, семейств, порядков, классов, типов и/или царств. В одной форме осуществления способы по изобретению дают возможность характеризации и/или идентификации некоторых или всех различных типов микроорганизмов, присутствующих в образце, например, в смешанной культуре. В других формах осуществления способы можно использовать, чтобы охарактеризовать и/или идентифицировать два или более чем два различных типа бактерий, два или более чем два различных типа дрожжей, два или более чем два различных типа плесневых грибов или два или более чем два различных типа смеси бактерий, дрожжей и/или плесневых грибов. Обнаружение каждого из множественных типов микроорганизмов можно осуществить одновременно или почти одновременно. Кроме того, способы по изобретению могут быть частично или полностью автоматизированными, снижая посредством этого риск обращения с инфекционными материалами и/или заражения образцов.
Первый аспект изобретения относится к способам характеризации и/или идентификации микроорганизма на твердой или полутвердой среде, включающим:
(a) исследование одной или более чем одной колонии на среде с получением измерений собственной флуоресценции (СФ), характеристических для микроорганизма в колонии; и
(b) характеризацию и/или идентификацию микроорганизма в колонии на основании полученных измерений.
Другой аспект изобретения относится к способам обнаружения, характеризации и/или идентификации микроорганизма на твердой или полутвердой среде, включающим:
(а) сканирование среды, о которой известно, что она содержит или может содержать одну или более чем одну колонию микроорганизма, для локализации колоний, присутствующих на среде;
(b) исследование одной или более чем одной колонии, локализованной на стадии (а), с получением измерений собственной флуоресценции (СФ), характеристических для микроорганизма в колонии; и
(c) характеризацию и/или идентификацию микроорганизма в колонии на основании полученных измерений.
Следующий аспект изобретения относится к способам характеризации и/или идентификации микроорганизма в образце, включающим:
(a) выращивание микроорганизма, присутствующего в образце, на твердой или полутвердой среде с получением по меньшей мере одной колонии;
(b) исследование одной или более чем одной колонии на среде с получением измерений собственной флуоресценции (СФ), характеристических для микроорганизма; и
(c) характеризацию и/или идентификацию микроорганизма в колонии на основании полученных измерений.
Дополнительный аспект изобретения относится к способам обнаружения присутствия микроорганизма в образце, включающим:
(a) получение образца, о котором известно, что он содержит или может содержать микроорганизм;
(b) выращивание микроорганизма, присутствующего в образце, на твердой или полутвердой среде; и
(c) локализацию любых колоний, присутствующих на среде, путем сканирования среды с получением измерений собственной флуоресценции (СФ);
где присутствие одной или более чем одной колонии, которая локализована с помощью полученных измерений, указывает на то, что микроорганизм присутствует в образце.
Образцы, которые можно тестировать способами по изобретению, включают как клинические, так и неклинические образцы, в которых присутствие и/или рост микроорганизма известно или подозреваемо, а также образцы материалов, которые обычно или время от времени тестируют на присутствие микроорганизмов. Количество используемого образца может значительно варьировать в зависимости от универсальности и/или чувствительности способа. Получение образца можно осуществить с помощью любого набора методик, известных специалистам в данной области техники.
Клинические образцы, которые можно тестировать, включают любой тип образца, типично тестируемого в клинических и/или исследовательских лабораториях, включая, но не ограничиваясь ими, кровь, сыворотку, плазму, фракции крови, суставную жидкость, мочу, семенную жидкость, слюну, фекалии, цереброспинальную жидкость, содержимое желудка, вагинальные секреции, гомогенаты тканей, пунктаты костного мозга, костные гомогенаты, мокроту, пунктаты, мазки и промывные воды мазков, другие жидкости организма и тому подобное.
Настоящее изобретение находит применение как в исследованиях, так и в ветеринарных и медицинских областях применения. Подходящими субъектами, от которых могут быть получены клинические образцы, обычно являются субъекты млекопитающих, но может быть и любое животное. Термин "млекопитающее", как используют в данной заявке, включает, но не ограничен ими, людей, приматов, не являющихся человеком, крупный рогатый скот, овец, коз, свиней, лошадей, кошек, собак, кроликов, грызунов (например, крыс или мышей) и т.д. Субъекты-люди включают новорожденных, детей, подростков, взрослых и пожилых субъектов. Субъекты, от которых могут быть получены образцы, включают без ограничения млекопитающих, птиц, рептилий, амфибий и рыб.
Неклинические образцы, которые можно тестировать, включают вещества, охватывающие, но не ограниченные ими, пищевые продукты, напитки, фармацевтические препараты, косметические изделия, воду (например, питьевую воду, не питьевую воду и сточные воды), балласты морской воды, воздух, почву, бытовые стоки, растительный материал (например, семена, листья, стебли, корни, цветы, плоды), препараты крови (например, тромбоциты, сыворотку, плазму, фракции лейкоцитов и т.д.), образцы донорских органов или тканей, образцы биологического оружия и тому подобное. Способ также особенно хорошо пригоден для тестирования в реальном времени для мониторинга уровней заражения, контроля процесса, контроля качества и тому подобного в промышленных условиях.
Объем образца должен быть достаточно большим, чтобы получить одну или более чем одну колонию при высеве на среду. Соответствующие объемы будут зависеть от источника образца и предполагаемого уровня микроорганизмов в образце. Например, клинический мазок из инфицированной раны будет содержать более высокий уровень микроорганизмов на объем, чем образец питьевой воды, подлежащий тестированию на заражение, поэтому может быть необходим меньший объем материала мазка по сравнению с образцом питьевой воды. Как правило, размер образца может составлять по меньшей мере примерно 50 мл, например, 100 мл, 500 мл, 1000 мл или более. В других формах осуществления образец может быть меньшим, чем примерно 50 мл, например, меньшим, чем примерно 40 мл, 30 мл, 20 мл, 15 мл, 10 мл, 5 мл, 4 мл, 3 мл или 2 мл. В некоторых формах осуществления размер образца может составлять примерно 1 мл или менее, например, примерно 750 мкл, 500 мкл, 250 мкл, 100 мкл, 50 мкл, 25 мкл, 10 мкл, 5 мкл, 1 мкл, 0,5 мкл, 0,1 мкл или менее. Для форм осуществления, в которых размер образца велик, образец можно фильтровать (например, через фильтровальную мембрану) и/или концентрировать способами, хорошо известными в данной области техники (например, центрифугированием, выпариванием и т.д.), чтобы уменьшить объем и/или собрать любые микроорганизмы в образце. Микроорганизмы, собранные на фильтровальной мембране, можно ресуспендировать и помещать на твердые или полутвердые среды, либо фильтровальную мембрану можно помещать непосредственно на полутвердые среды.
Образцы, подлежащие тестированию, помещают на подходящую среду и инкубируют в условиях, которые способствуют росту микроорганизмов. Среда может быть выбрана на основании типа(ов) микроорганизмов, известных как находящиеся или подозреваемых в образце. Подходящие ростовые среды для различных микроорганизмов хорошо известны специалистам в данной области техники. Ростовая среда может представлять собой любую среду, которая обеспечивает соответствующие питательные вещества и ограничивает перемещение микроорганизмов (то есть обеспечивает локализованный рост). В некоторых формах осуществления среда может представлять собой полутвердую среду, такую как агар, желатин, альгинат, каррагенан или пектин. Подходящие среды включают среды, обладающие различными функциями, которые хорошо известны специалистам в данной области техники, включая без ограничения среды для общих целей, селективные среды, дифференциальные среды и/или хромогенные среды. Среды могут быть выбраны и/или подобраны так, чтобы можно было получить значимые измерения (например, измерения СФ). Примеры подходящих полутвердых сред включают без ограничения агар А С, агар для Acetobacter, акрифлавин-цефтазидимовый агар, агар для актиномицетов, агар для выделения актиномицетов, агар для выделения аэромонад, анаэробный агар, анаэробный кровяной агар, анаэробный агар TVLS, агар APT, маннитный агар Эшби, агар для дифференциации аспергилла, агар ASS, агар для Aureus, азидный кровяной агар, лактозный агар В.Т.В., агар для бацилл, агар Бэрда-Паркера, агар BiGGY (висмут-сульфит-глицин-глюкоза-дрожжевой экстракт), желчь-эскулиновый агар, желчь-эскулин-азидный агар, крахмальный агар с желчными солями и бриллиантовым зеленым, висмут-сульфитный агар, кровяной агар, кровяной агар SLMB, агар BPL, агар с сердечно-мозговым настоем, пивной агар, агар с бриллиантовым зеленым, желчный агар с бриллиантовым зеленым, лактоза-сахарозный агар с бриллиантовым зеленым и феноловым красным, БРОЛАЦИН агар, БРОЛАЦИН агар с MUG, агар для бруцелл, агар BSM, забуференный угольный агар с дрожжевым экстрактом, агар с казеинатом кальция, селективный агар для кампиллобактеров, агар для идентификации Candida, казеиново-дрожжевой агар с магнием, агар CASO, агар САТС (агар с цитратом, азидом, твином и карбонатом натрия), селективный агар для Bacillus cereus, питательный агар с цетримидом, агар Чепмена-Стоуна, лактозный агар с китайским синим, агар для хламидоспор, цитратный агар Кристенсена, мочевинный агар Кристенсена, цитратный агар, агар CLED (бессолевая лактозная питательная среда с цистином), агар для клостридий, агар для Clostridium difficile, агар для кишечной палочки, колумбийский агар, колумбийский кровяной агар, агар на отваре из кукурузной муки, агар на отваре из кукурузной муки с пептоном и дрожжевым экстрактом, СРС-агар, агар CRAMP (кислый агар с Конго красным), агар Чапека-Докса, агар D.T.M., минимальный агар Дэвиса, агар DCLS (агар с дезоксихолатом, цитратом, лактозой и сахарозой), дезоксихолат-цитратный агар, агар для тестирования на ДНКазу, Эндо агар DEV (лактоза-сульфитный агар с фуксином), желатиновый агар DEV, питательный агар DEV, декстроза-казеин-пептоновый агар, декстроза-крахмальный агар, агар DHL, агар с дихлораном и бенгальским розовым, агар для определения токсигенности дифтерийных микроорганизмов, агар для тестирования на ДНКазу с толуидином, агар для Е. coli, агар MUG для Е. coli O157:H7, агар ЕСС, селективный агар ЕСС, агар ECD, агар ECD MUG, агар ЕМВ (эозин - метиленовый синий), Эндо агар, агар для Enterobacter sakazakii, агар для Enterococcus faecium, селективный агар для Enterococcus, железосодержащий агар с эскулином, обогащенный агар, агар для грибов, агар "Микобио", агар по Гесснеру, лактозный агар по Гесснеру, железосодержащий агар с желатином, солевой агар с желатином, агар для подсчета количества микроорганизмов, глюкозный агар с бромкрезоловым пурпурным, агар GSP, агар "Гектоен энтерик", канамицин-эскулин-азидный агар, агар Кармали для кампиллобактеров, стрептококковый агар KF, агар Кинга, селективный агар для Klebsiella, агар Клиглера, агар KRANEP (роданид калия-актидон-азид натрия), агар Кундрата, агар для Lactobacillus bulgaricus, лактозный агар ТТС, агар LB (Луриа - Бертани), агар Лейфсона, агар Левина ЕМВ, агар для листерий, подтверждающий агар для листерий моно, дифференциальный агар для листерий моно, селективный агар для листерий, лактозолакмусовый агар, агар LL, агар LPM (агар с литием, фенилэтанолом и моксалактамом), дифференциальный агар LS, верхний агар L-top, агар Луриа, железосодержащий агар с лизином и аргинином, железосодержащий агар с лизином, агар М для энтерококков, агар М-17, агар МакКонки, агар МакКонки с кристаллическим фиолетовым, хлоридом натрия и 0,15% желчных солей, агар МакКонки с MUG, агар МакКонки с сорбитом, солодовый агар, солодово-пептонный агар, маннит-солевой агар с феноловым красным, агар МакБрайда, агар МакКланга-Тобе, агар М-СР, мясо-печеночный агар, селективный агар для энтерококков с мембранным фильтром, глюкуронидный агар с лактозой и мембраной, агар M-Endo, агар M-Endo LES, агар MeReSa, агар М-FC, агар Middlebrook 7H10, агар Middlebrook 7H11, молочный агар, агар для Mitis salivarius, агар MM, модифицированный забуференный угольный агар, агар МОХ, агар MRS, агар MS.0157, агар М-ТЕС, агар Мюллера-Хинтона, триптоно-соевый агар с MUG, агар для микоплазмы, очищенный агар, питательный агар, питательный желатин, питательный агар для OF теста, агар OGY, агар OGYE, агар с апельсиновым соком, оксфордский агар, селективный агар для листерий PALCAM, агар с пентахлорфенолом, бенгальским розовым и дрожжевым экстрактом, агар с пептоном и дрожжевым экстрактом, пептонизированный молочный агар, агар для Clostridium perfringens, декстрозный агар с феноловым красным, лактозный агар с феноловым красным, мальтозный агар с феноловым красным, сахарозный агар с феноловым красным, тартратный агар с феноловым красным, фосфатный агар с фенолфталеином, фенилаланиновый агар, агар для определения количества микроорганизмов посевом на чашки Петри, агар для определения количества микроорганизмов посевом на чашки Петри с MUG, агар PLET, индикаторный агар РМ, картофельно-декстрозный агар, картофельно-глюкозный агар с бенгальским розовым, картофельно-глюкозо-сахарозный агар, маннитный агар Pril, агар для псевдомонад, агар R-2A, агар Raka-Ray, агар для быстрорастущих энтерококков, усиленный клостридиальный агар, агар с рисовым экстрактом, агар Рогоза, агар Рогоза SL, агар с бенгальским розовым, агар с хлорамфениколом и бенгальским розовым, агар S.F.P., агар Сабуро с 2% глюкозой, агар Сабуро с 4% глюкозой, агар Сабуро с декстрозой, агар Сабуро с глюкозой и хлорамфениколом, агар для сальмонелл, агар для сальмонелл по Онозу, хромогенный агар для сальмонелл, агар SD, селективный агар, селективный агар для патогенных грибов, агар SFP, агар S-Gal/LB, агар Шептона, цитратный агар Симмонса, обезжиренный молочный агар, агар с сорбиновой кислотой, агар со спиртовым голубым, агар SPS, SS-агар, стандартный питательный агар № 1, агар для стафилококков, селективный агар для стрептококков, агар для выделения Streptococcus thermophilus, сульфатный агар API, железосульфитный агар, агар ТВХ, агар TCBS (питательный агар с тиосульфатом натрия, цитратом, бромтимоловым синим и сахарозой), агар TCMG, агар Tergitol-7, агар Тейера и Мартина, агар для кислотолюбивых бацилл, агар Тинсдаля, агар с томатным соком, агар с глицерилтрибутиратом, трехсахарный железосодержащий агар, триптический соевый агар, триптоновый агар, триптоноглюкозный агар, триптоноглюкозный агар с дрожжевым экстрактом, триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом, триптоновый агар с дрожжевым экстрактом, триптозный агар, агар TSC (агар с триптозой, сульфитом и циклосерином), агар TSN, универсальный пивной агар, агар UTI (для обнаружения инфекций мочевого тракта), агар Вибрио, сахарозный агар для Vibrio parahaemolyticus, агар с желчью и фиолетовым красным, агар с желчью, фиолетовым красным и глюкозой, агар с желчью, фиолетовым красным и лактозой, агар с желчью, фиолетовым красным, лактозой и декстрозой, агар для культур с витамином Bi2, агар Фогеля-Джонсона, агар VRB MUG (агар с фиолетовым красным, желчью и MUG), анаэробный агар по Уилкинсу-Чалгрену, агар Вильсона - Блера, дифференциальный агар WL (агар Валлерштейна), питательный агар WL, сусло-агар, агар XLD (агар с ксилозой, лизином и дезоксихолатом), агар XLT4 (ксилозо-лизиновый агар с тиосульфатом натрия), дрожжевой агар, агар с дрожжевым экстрактом, дрожжевой солодовый агар, дрожжевой маннитный агар, агар для выделения Yersinia, селективный агар для Yersinia, агар YGC, агар YPAD, агар YPDG, агар YPG и агар YT. В одной форме осуществления твердая или полутвердая среда может, кроме того, содержать одну или более чем одну дополнительную добавку, которая усиливает или иначе повышает измерения собственной флуоресценции (СФ) колонии микроорганизма на твердой или полутвердой среде. Подходящие добавки для усиления собственной флуоресценции могут включать один или более чем один белковый гидролизат, аминокислоты, мясные и растительные экстракты, источники углеводов, буферные агенты, восстанавливающие агенты, факторы роста, кофакторы ферментов, минеральные соли, добавки металлов, восстановительные соединения, хелатирующие агенты, фотосенсибилизирующие агенты, гасители, восстановительные агенты, окислительные агенты, детергенты, сурфактанты, дезинфицирующие агенты, селективные агенты, метаболические ингибиторы или их комбинации.
В других формах осуществления среда может представлять собой фильтр (например, фильтровальную мембрану или фильтр из стекловолокна), например, который накладывают на поверхность полутвердой среды. В других формах осуществления фильтр накладывают на материал (например, поглощающий слой), который повергнут воздействию жидкой среды (например, смочен в ней). В некоторых формах осуществления образец (например, образец большого объема) можно пропускать через фильтр, чтобы собрать любые микроорганизмы, присутствующие в образце. Затем фильтр можно поместить на поверхность ростовой среды и инкубировать в подходящих условиях для роста микроорганизма. Подходящие фильтровальные мембраны хорошо известны специалистам в данной области техники и включают любую мембрану, пригодную для сбора микроорганизмов и/или способную поддерживать рост микроорганизмов. Примеры материалов мембран включают без ограничения целлюлозу, смешанный сложный эфир целлюлозы, нитроцеллюлозу, поливинилхлорид, нейлон, политетрафторэтилен, полисульфон, полиэфирсульфон, поликарбонат черный и черный смешанный сложный эфир, включая любую их комбинаций. Фильтры имеют размер пор, подходящий для фильтрования жидкостей и/или сбора микроорганизмов, например, от примерно 1 до примерно 25 мкм для дрожжей и от примерно 0,05 мкм до примерно 2 мкм, например, от примерно 0,2 мкм до примерно 1 мкм для бактерий.
В некоторых формах осуществления среда может быть представлена в чашке Петри, например, чашке с стандартным микробиологическим агаром. В некоторых формах осуществления чашка может представлять собой многолуночный планшет, имеющий, например, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 32, 48, 64, 96, 128 или большее число лунок на планшет для тестирования множества образцов. Чашка может быть изготовлена из любого подходящего материала для выращивания микроорганизмов, например, полистирола или стекла. Чашка необязательно имеет крышку. Если исследование колоний происходит, когда крышка находится на месте, крышка и/или чашка может содержать по меньшей мере одну область, которая прозрачна по меньшей мере для части ультрафиолетового, видимого и/или ближнего инфракрасного спектра, чтобы дать возможность исследования через крышку и/или чашку.
В способах по изобретению выражения "выращивание микроорганизмов, присутствующих в образце, на твердой или полутвердой среде" и "образец помещают на среду" включает любой способ приведения образца в контакт со средой, такой, что микроорганизмы, присутствующие в образце, могут расти и образовывать колонии. В некоторых формах осуществления образец помещают на поверхность твердой или полутвердой среды. В других формах осуществления образец можно смешивать со средой в жидком состоянии, а затем давать возможность затвердеть (например, залить в чашки), так чтобы какие-либо колонии, которые вырастают, были заключены в среду. В другой форме осуществления образец можно смешивать с обезвоженной средой, так чтобы среда подвергалась регидратации, а затем дать возможность затвердеть.
В одной форме осуществления твердая или полутвердая находится на дне контейнера, содержащего микроорганизмы, суспендированные в жидкости над средой. Затем с контейнером можно проводить манипуляции (например, центрифугировать), чтобы поместить микроорганизмы на среду. Затем жидкость можно удалить и инкубировать среду для роста колоний. Например, образец крови можно ввести в пробирку для гемокультуры, содержащую жидкую ростовую среду и твердую или полутвердую среду на дне. Затем культуральную пробирку центрифугируют, чтобы поместить микроорганизмы на твердую или полутвердую среду (необязательно после лизиса эритроцитов), жидкость удаляют, и микроорганизмы выращивают, обнаруживают и/или идентифицируют в соответствии со способами по изобретению.
Как только образец помещен на среду (например, путем рассева жидкого образца на среде, используя стандартные микробиологические методы, и/или путем помещения фильтровальной мембраны на полутвердую среду), среду инкубируют в условиях, подходящих для роста микроорганизмов, присутствующих в образце. Соответствующие условия хорошо известны специалистам в данной области техники и будут зависеть от микроорганизмов и от среды. Среду можно инкубировать при температуре от примерно 20°С до примерно 50°С, например, от примерно 25°С до примерно 45°С, например, примерно 37°С. Время инкубации достаточно для появления обнаружимых колоний (визуально или спектроскопическим путем) и будет зависеть от микроорганизма(ов), температуры, среды, уровня питательных веществ и других условий, которые определяют скорость роста. В некоторых формах осуществления время инкубации может составлять примерно 12 часов или менее, например, примерно 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 часа или 1 час или менее. В некоторых формах осуществления, как, например, в условиях медленного роста или с медленно растущими микроорганизмами (например, микобактериями), время инкубации может составлять примерно 12 часов или более, например, примерно 18, 24, 36, 48 часов или 72 часа или более. В некоторых формах осуществления среду инкубируют в термостате, и среду извлекают из термостата один или более чем один раз и помещают в аппарат, чтобы обнаружить и/или идентифицировать какие-либо колонии, растущие на среде. В других формах осуществления среду можно инкубировать непосредственно в аппарате, используемом для обнаружения и/или идентификации колоний, например, в термостатированном держателе для планшетов.
В одном аспекте изобретение относится к исследованию колонии микроорганизмов на твердой или полутвердой среде для получения СФ измерений, которые идентифицируют микроорганизм, составляющий колонию. В одной форме осуществления исследование проводят с помощью флуоресцентной спектроскопии. Исследование можно проводить неинвазивным способом, то есть колонию можно исследовать при условии, что она остается интактной на среде. В другой форме осуществления чашка, содержащая среду и колонию, остается герметично закрытой (например, крышку не удаляют) на протяжении всего исследования. В соответствии с данной формой осуществления чашка или ее часть может состоять из материала, который прозрачен для света (например, по меньшей мере части ближнего инфракрасного (NIR; 700 нм - 1400 нм), ультрафиолетового (UV; 190 нм - 400 нм) и/или видимого (VIS; 400 нм - 700 нм) света (спектра). Примеры подходящих материалов включают без ограничения акриловый полимер, метакрилат, кварц, аморфный кварц, сапфир, циклоолефиновый сополимер (СОС) и/или циклоолефиновый полимер (СОР) (например, Zeonex (Zeonex, San Diego, CA)). Способность к обнаружению и/или идентификации микроорганизмов неинвазивным способом, необязательно в сочетании с удерживанием чашки в закрытом состоянии на протяжении всего процесса идентификации, а также автоматизация некоторой части или всего метода снижает риск при обращении с микроорганизмами, которые являются или могут быть инфекционными и/или вредными, а также риск заражения образца. Кроме того, способность к идентификации микроорганизмов путем прямого исследования без дополнительной обработки осадка (например, суспендирования и пересева и/или других анализов идентификации) значительно увеличивает скорость, с которой можно проводить идентификацию. В других формах осуществления колонию суспендируют в растворе и необязательно удаляют из среды перед исследованием. В другой форме осуществления колонию суспендируют в растворе после исследования in situ, а затем можно проводить дальнейшее исследование. Например, методы, такие как реакция латекс-агглютинации или автоматизированные тесты фенотипической идентификации, которые можно применять к изолированным микроорганизмам, но не к колонии микроорганизмов на среде, можно осуществлять на суспендированных микроорганизмах.
В некоторых формах осуществления спектроскопию можно использовать для анализа свойств собственной флуоресценции микроорганизмов, например, свойства, присутствующего в микроорганизме в отсутствие дополнительных агентов, таких как красители, контрастные вещества, связывающие агенты и т.д. В других формах осуществления, в дополнение к анализу СФ, спектроскопию можно также использовать для анализа одного или более чем одного внешнего свойства микроорганизмов, например, свойства, которое может быть обнаружено только с помощью дополнительных агентов. Спектроскопическое исследование можно осуществлять любым методом, известным специалистам в данной области техники как эффективный для обнаружения и/или идентификации одного или более чем одного внутреннего или внешнего свойства микроорганизмов. Например, для идентификации микроорганизмов в осадках можно использовать флуоресценцию с фронтальной установкой (где возбуждающий и испускаемый свет входит и выходит из одной и той же оптической поверхности, и, если образец в целом является оптически толстым, возбуждающий свет проникает в образец на очень короткое расстояние (см., например, Eisinger, J., and J.Flores, "Front-face fluorometry of liquid samples," Anal. Biochem. 94:15 (1983)). В настоящем изобретении можно также использовать другие формы измерения, такие как эпифлуоресценция, измерения отражения, поглощения и/или рассеяния.
В одном аспекте изобретения спектроскопию осуществляют, используя фокусирующую оптику, такую как система линз или микроскоп, установленную таким образом, чтобы дать возможность наблюдений в ультрафиолетовом, видимом и инфракрасном диапазоне, функционально связанную со спектрофотометром (например, с использованием оптических волокон). В одной форме осуществления среду (например, в чашке) помещают на предметный столик микроскопа, где ее можно как исследовать с помощью источника возбуждения, так и наблюдать визуально (например, через микроскоп). В одной форме осуществления с чашкой можно манипулировать вручную для локализации колоний для исследования, либо путем перемещения самой чашки, либо перемещения предметного столика микроскопа, в котором зафиксирована чашка. В другой форме осуществления предметный столик микроскопа регулируется автоматически (например, столик с электроприводом), так чтобы чашку, зафиксированную в предметном столике, можно было сканировать (например, по установленной схеме, предназначенной для покрытия всей сканируемой секции). В другой форме осуществления среду удерживают стационарно, тогда как сфокусированный световой пучок, такой как лазер, сканируют на протяжении всей среды, и испускаемый свет определяют путем визуализирующего или не визуализирующего детектора. В следующей форме осуществления микроскоп может содержать термостат для чашек с температурным контролем (например, водяную баню), так что чашку можно оставлять под микроскопом и исследовать в процессе инкубации среды.
В одном аспекте изобретения источник возбуждения направлен на одну колонию для проведения СФ измерений. Эта колония в момент исследования может иметь любой размер, если он достаточно большой, чтобы провести точное измерение. В одной форме осуществления колонию можно исследовать, когда она не обнаружима человеческим глазом. Например, колонию можно исследовать, когда эту колонию составляют менее чем примерно 10000 микроорганизмов, например, менее чем примерно 5000, 1000, 500, 400, 300, 200 или 100 микроорганизмов. В других формах осуществления колонию можно исследовать, когда эта колония имеет диаметр менее чем примерно 1000 мкм или длину менее чем примерно 1000 мкм по ее самому длинному измерению (если колония не является округлой). Например, колонию можно исследовать, когда колония составляет примерно 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 50 или 25 мкм или менее. В одной форме осуществления возбуждающий пучок меньше в диаметре, чем исследуемая колония, так что весь пучок может быть направлен на колонию, и среда по существу не интерферирует с измерением СФ. В некоторых формах осуществления возбуждающий пучок имеет диаметр менее чем примерно 1000 мкм, например, менее чем примерно 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 50 или 25 мкм. Как размер возбуждающего пучка, так и размер испускаемого пучка можно регулировать, например, с использованием микроотверстий. В некоторых формах осуществления возбуждающий пучок направлен на центр колонии. В других формах осуществления возбуждающий пучок направлен на другие части колонии (например, на край и/или вблизи него), где микроорганизмы могут находиться в другом состоянии роста и/или метаболизма, чем в центре колонии. В следующей форме осуществления возбуждающий пучок может быть направлен на некоторую глубину внутрь колонии, например, с использованием конфокальной микроскопии.
Источник освещения колонии, или источник возбуждения, может быть выбран из любого числа подходящих источников света, как известно специалистам в данной области техники. Можно использовать любую часть электромагнитного спектра, которая дает применимые данные. Источники света, способные к испусканию в ультрафиолетовом, видимом и/или ближнем инфракрасном спектре,
а также в других частях электромагнитного спектра, могут быть использованы и известны специалистам в данной области техники. Например, источники света могут представлять собой континуальные лампы, такие как дейтериевая или ксеноновая дуговая лампа для генерирования ультрафиолетового света и/или галогенная лампа накаливания с вольфрамовой нитью для генерирования видимого/ближнего инфракрасного возбуждения. Эти источники света дают широкий диапазон испускания, и ширина спектральной полосы для конкретных длин волн может быть уменьшена с использованием поляризационно-интерференционных светофильтров, призм и/или оптических решеток, как хорошо известно в данной области техники.
Альтернативно множество узкополосных источников света, таких как светодиоды и/или лазеры, могут быть мультиплексированы в пространстве, чтобы обеспечить мультиволновой источник возбуждения. Например, доступны светодиоды от 190 нм до более 900 нм, и эти источники имеют ширину спектральной полосы 20-40 нм (полная ширина при половине максимума). Лазеры доступны в дискретных длинах волн, от ультрафиолетовых до ближних инфракрасных, и могут быть использованы в способах мультиплексирования, хорошо известных специалистам в данной области техники.
Спектральную селективность любого из источников света можно улучшить путем использования средств спектрального выделения, таких как монохроматор со сканированием. Можно использовать другие способы выделения, которые известны специалистам в данной области техники, такие как акустико-оптический настраиваемый фильтр, жидкокристаллический настраиваемый фильтр, ряд поляризационно-интерференционных светофильтров, спектрограф с призмой и т.д., а также в любой комбинации. Соображения при выборе спектрального дискриминатора учитывают как диапазон регулируемости, так и уровень селективности. Для иллюстрации, например, дискриминатор может использовать диапазон длин волн 300 - 800 нм с селективностью 10 нм. Эти параметры, как правило, определяют оптимальный метод, необходимый для достижения диапазона регулируемости, а также селективности.
Типично источник света приводит в результате к возбуждению образца с последующим измерением испускания флуоресценции от образца в предопределенные моменты времени,или непрерывно. Подобным образом, отраженный свет от взаимодействия источника возбуждения с образцом можно измерить для получения требуемых данных для обнаружения и/или характеризации.
Испускание от образца можно измерить любыми подходящими средствами спектрального выделения, наиболее предпочтительно используя спектрометр. Спектрометр может представлять собой монохроматор со сканированием, который определяет специфичные длины волн испускания, где выход монохроматора определяется фотоэлектронным умножителем, и/или спектрометр может иметь конфигурацию в виде спектрографа визуализации, где выход определяется матрицей детекторов визуализации, такой как матрица детекторов с зарядовой связью (ПЗС-матрица). В одной форме осуществления дискриминатор дает возможность наблюдения сигнала флуоресценции и/или рассеяния с помощью средств фотодетектирования (таких как фотоэлектронный умножитель, лавинный фотодиод, ПЗС-матрица детекторов и/или электронная умножительная матрица детекторов с зарядовой связью (ЭУПЗС)).
Спектроскопический метод используют для получения измерений, которые предпочтительно получают в виде матрицы измерений возбуждения-испускания (МВИ). Как используют в данной заявке, МВИ определяют как интенсивность люминесцентного спектрального испускания флуоресцентных веществ в зависимости от длины волны, как возбуждения, так и испускания, и она включает полный спектр или его подгруппу, где подгруппа может содержать единственную или множественные пары возбуждения/испускания. Кроме того, поперечный срез МВИ с фиксированной длиной волны возбуждения можно использовать, чтобы показать спектры испускания для конкретной длины волны возбуждения, а поперечный срез МВИ с фиксированной длиной волны испускания можно использовать, чтобы показать спектры возбуждения для образца. В одной форме осуществления множественные МВИ измеряют более чем при одной специфичной паре длин волн возбуждения-испускания, например, по меньшей мере при 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50 или при большем числе специфичных пар длин волн возбуждения-испускания. В некоторых формах осуществления измеренное число пар длин волн возбуждения-испускания достаточно для определения точного вида микроорганизма, например, от примерно 5 до примерно 30 пар, например, от примерно 10 до примерно 20 пар длин волн. В других формах осуществления число пар длин волн возбуждения-испускания достаточно, чтобы по меньшей мере частично идентифицировать микроорганизм, например, чтобы получить достаточно полезной информации для действия, например, информации, достаточной для идентификации классификационной группы, как описано ниже. Например, подходящее число пар длин волн возбуждения-испускания, чтобы обеспечить полезную информацию для действия, такую как классификационная группа, может составлять от примерно 2 до примерно 8 пар, например, от примерно 3 до примерно 5 пар.
В соответствии с изобретением контрольные измерения снимают для колоний известных микроорганизмов, что, таким образом, дает возможность корреляции измеренных тестируемых данных с характеризацией интересующих микроорганизмов, используя различные математические методы, известные специалистам в данной области техники. Например, данные от образцов можно сравнивать с базовым уровнем или с контрольными измерениями, используя системы программного обеспечения, известные специалистам в данной области техники. Более конкретно данные можно анализировать с помощью ряда методов многовариантного анализа, такого как, например, общий дискриминационный анализ (GDA), частичный дискриминационный анализ наименьших квадратов (PLSDA), частичная регрессия наименьших квадратов, анализ главных компонентов (РСА), параллельный факторный анализ (PARAFAC), анализ нейронных сетей (NNA) и/или метод опорных векторов (SVM). Эти методы можно использовать, чтобы классифицировать неизвестные, представляющие интерес микроорганизмы на релевантные группы на основе существующей номенклатуры и/или на встречающиеся в природе группы на основе метаболизма, патогенности и/или вирулентности организма, при разработке системы мониторинга, определения и/или характеризации организма, как описано выше.
Еще в одной другой форме осуществления не спектроскопические измерения с системы обнаружения, такие как периоды времени обнаружения и скорости роста, можно использовать, чтобы способствовать характеризации и/или идентификации микроорганизмов из колонии. Кроме того, измерения, снятые с фотографического изображения твердых или полутвердых сред, могут обеспечить ценную информацию по характеризации и/или идентификации микроорганизмов в колонии, такую как размер, форма, цвет и плотность колонии.
В некоторых формах осуществления изобретения характеризация и/или идентификация микроорганизмов в колонии необязательно включает идентификацию точного вида. Характеризация охватывает как широкую категоризацию или классификацию биологических частиц, так и действительную идентификацию отдельного вида. Классификация микроорганизма из колонии может включать определение фенотипических и/или морфологических характеристик микроорганизма. Например, характеристика биологических частиц может быть выполнена на основании наблюдаемых различий, таких как состав, форма, размер, кластеризация и/или метаболизм. В некоторых формах осуществления классификация интересующих биологических частиц может не требовать предшествующих знаний характеристик данной биологической частицы, но требует только соответствующих корреляций с эмпирическими измерениями, что, таким образом, делает этот способ более универсальным и легко приспосабливаемым, чем способы, основанные на событиях специфичного связывания или метаболических реакциях. Как используют в данной заявке, "идентификация" означает определение, к какому семейству, роду, виду и/или штамму принадлежит ранее неизвестный микроорганизм, например, идентификацию ранее неизвестного микроорганизма на уровне семейства, рода, вида и/или штамма.
В некоторых случаях характеризация охватывает модели классификации, которые обеспечивают достаточно полезную информацию для действия, которое нужно предпринять. Как используют в данной заявке, предпочтительные модели классификации включают группировку в одно или более чем одно из приведенного ниже: (1) группы по Граму; (2) клинические группы по Граму; (3) терапевтические группы; (4) функциональные группы и (5) группы собственной естественной флуоресценции.
(1) Группы по Граму: В пределах классификации групп по Граму микроорганизмы могут быть помещены в одну из трех широких категорий классификации на основе их реакции окрашивания по Граму и общего размера, где эти группы выбраны из одной или более чем одной из приведенных ниже: (а) грамположительные микроорганизмы, которые окрашиваются в темно-синий цвет при окрашивании по Граму; (б) грамотрицательные микроорганизмы, которые окрашиваются в красный цвет при окрашивании по Граму; и (в) дрожжевые клетки, которые окрашиваются в темно-синий цвет при окрашивании по Граму, но представляют собой очень большие округлые клетки, которые отличаются от бактерий по их морфологическим характеристикам и размеру.
(2) Клинические группы по Граму: Группы по Граму можно дополнительно разделить на несколько подкатегорий, представляющих различающиеся морфологические признаки. Эти подкатегории включают всю релевантную клиническую информацию, сообщаемую квалифицированным клиническим лаборантом, и, таким образом, дают более высокий уровень идентификации, чем положительная или отрицательная реакция по Граму. Эта конкретная классификация очень полезна, поскольку она исключает проблемы, основанные на качестве штамма по Граму и/или на уровне квалификации лаборанта, исследующего мазок, за счет предоставления эквивалентной клинически релевантной информации автоматизированной системой. Более конкретно подкатегории микроорганизмов, основанные на этой модели классификации, могут быть выбраны из одной или более чем одной из приведенных ниже: (а) кокки, которые представляют собой маленькие округлые клетки; (б) диплококки, которые представляют собой две маленькие округлые клетки, соединенные вместе; (в) палочки, которые имеют прямоугольную форму; и (г) бациллы, которые имеют палочковидную форму. Примеры этих подкатегорий, которые могут быть подтверждены дополнительной морфологической информацией, включают: (i) грамположительные кокки; (ii) грамположительные кокки в цепочках; (iii) грамположительные кокки в кластерах (то есть кластеров в форме "виноградной грозди"); (iv) грамположительные диплококки; (v) грамположительные палочки; (vi) грамположительные палочки с эндоспорами; (vii) грамотрицательные палочки; (viii) грамотрицательные коккобациллы; (ix) грамотрицательные диплококки; (х) дрожжи и (xi) мицелиальные грибы.
(3) Терапевтические группы: Терапевтические группы включают множество видов микроорганизмов, которые при выделении из конкретных типов образцов лечат одним и тем же классом антибиотиков или смесью антибиотиков (ссылка:
"Sanford Guide to Antimicrobial Therapy 2008"). Во многих случаях идентичность на видовом уровне не требуется врачу, чтобы обеспечить переход от первоначальной эмпирической терапии к более направленной терапии, поскольку более чем один вид можно лечить одним и тем же антибиотиком(ами) выбора. Этот уровень классификации корректно помещает эти микроорганизмы "одного и того же лечения" в единые терапевтические категории. Примеры данного уровня характеризации включают способность отличать высоко резистентные виды Enterobacteriacae (ЕВ) от чувствительных видов ЕВ (Enterobacter spp. от Е.соli) или резистентные к флуконазолу виды Candida (С.glabrata и С.kruzei) от чувствительных видов Candida (С.albicans и С. parapsilosis) и т.д.
(4) Функциональные группы: В соответствии с изобретением микроорганизмы могут быть также помещены в несколько групп на основе сочетания метаболических, вирулентных и/или фенотипических характеристик. Не ферментативные организмы можно четко отличить от ферментативных. Кроме того, виды микроорганизмов, которые продуцируют гемолизины, можно группировать отдельно от не гемолитических видов. В некоторых случаях эти группы представляют более широкие категории, чем уровень рода (например, бактерии группы кишечной палочки, грамотрицательные не ферментативные палочки), в некоторых случаях на уровне рода (например, Enterococcus, Candida), и в некоторых случаях ближе к дискриминации видового уровня (например, коагулаза-отрицательные стафилококки, альфа-гемолитические стрептококки, бета-гемолитические стрептококки, коагулаза-положительные стафилококки, то есть S. aureus).
(5) Группы собственной естественной флуоресценции ("СФ"):
Микроорганизмы могут быть также помещены в категории на основании их естественной тенденции к группировке вместе на основе характеристик их собственной и/или внутренней флуоресценции. Некоторые из этих групп могут быть общими с категориями терапевтических и функциональных групп. Эти группировки могут включать индивидуальные виды, такие как E.faecalis, S.pyogenes или Р.aeruginosa, которые обладают характеристическими СФ признаками и/или могут содержать небольшие группы организмов с относительно консервативными СФ признаками, такие как группы К.pneumoniae-K.oxytoca или E.aerogenes и С.freundii.
В дополнение к измерению внутренних свойств микроорганизмов (таких как собственная флуоресценция) в целях идентификации способы по настоящему изобретению могут дополнительно включать использование дополнительных агентов-идентификаторов, чтобы способствовать процессу идентификации. Агенты, которые связываются со специфичными микроорганизмами, такие как аффинные лиганды, можно использовать для разделения микроорганизмов, для идентификации класса или вида микроорганизма (например, посредством связывания с уникальным поверхностным белком или рецептором) и/или для идентификации характеристики микроорганизма (например, устойчивости к антибиотикам). Полезные агенты-идентификаторы включают без ограничения моноклональные и поликлональные антитела и их фрагменты (например, анти-Еар для идентификации S. aureus), нуклеиново-кислотные зонды, антибиотики (например, пенициллин, ванкомицин, полимиксин В), аптамеры, пептидные миметики, связывающие белки фагового происхождения, лектины, биомаркеры врожденного иммунитета хозяина (белки острой фазы, LPS-связывающий белок, CD 14, маннозосвязывающий лектин, Toll-подобные рецепторы), белки иммунной защиты (например, дефензины, кателицидины, протеогрины, магаинины), бактериоцины (например, лантибиотики, такие как низин, мерсацидин, эпидермин, галлидермин и плантарицин С, и пептиды класса II), бактериофаги и красители, избирательные для нуклеиновых кислот, липидов, углеводов, полисахаридов, капсул/слизи или белков, включая любую их комбинацию. Если сам агент не дает обнаружимого сигнала, этот агент может быть меченым, чтобы давать обнаружимый сигнал, например, путем конъюгации агента с маркером (например, видимым или флуоресцентным). Маркеры включают без ограничения флуоресцентные, люминесцентные, фосфоресцирующие, радиоактивные и/или колориметрические соединения. Агент можно добавлять к микроорганизмам на любой стадии в способах по изобретению, например, когда образец помещают на среду, и/или после обнаружения колоний. В некоторых формах осуществления присутствие и/или количество агента в колонии можно определить во время исследования колонии. Другие полезные агенты-идентификаторы включают субстраты для ферментов микроорганизмов, хелатирующие агенты, детергенты, сурфактанты, дезинфицирующие агенты (например, спирты, гипохлорит натрия, пероксид водорода) и токсичные соединения (например, азид натрия, цианид калия) и ингибиторы метаболизма, такие как циклогексамид и т.д. Подобным образом, многие флуоресцентные соединения для измерения жизнеспособности, метаболизма и/или мембранного потенциала клеток микроорганизмов можно использовать в качестве агента-идентификатора в настоящем изобретении.
В одном аспекте изобретения способ может дополнительно включать стадию выделения микроорганизма(ов) из колонии и проведения дополнительных тестов. Выделенный микроорганизм(ы) можно суспендировать в подходящей среде, например, в физиологическом растворе. Как только микроорганизм(ы) суспендирован, его можно подвергать любым дополнительным тестам, которые желательны, как должно быть известно специалистам в данной области техники, и как описано выше. В частности, можно проводить любой тест, для которого требуются чистые образцы микроорганизмов, с суспендированным микроорганизмом(амии). В некоторых формах осуществления можно проводить дополнительные тесты идентификации/характеризации. Примеры тестов идентификации включают Vitek 2, тесты амплифицированных и не амплифицированных нуклеиновых кислот (NAT), хромогенные анализы и реакции латекс-агглютинации, иммунологические анализы (например, использование меченых первых или вторых антител или других лигандов), масс-спектрометрию (например, MALDI-TOF масс-спектрометрию) и/или другие оптические методы, такие как инфракрасная спектроскопия (FTIR) или рамановская спектроскопия. Можно также проводить дополнительные тесты характеризации, такие как лекарственная устойчивость, антибиограммы и/или факторы вирулентности. Дополнительная характеризация может составлять часть теста, который был начат во время первоначальных стадий идентификации способа. Например, определение устойчивого к метициллину S.aureus можно начать путем добавления к образцу пенициллина, меченного флуоресцентной меткой, перед выращиванием колоний. Затем присутствие и/или количество связанного пенициллина можно определить, например, в колонии или в микроорганизмах, выделенных из колонии. В некоторых формах осуществления один или более чем один дополнительный тест можно провести в пределах той же системы, в которой проводят стадии идентификации, например, в том же аппарате. В одной форме осуществления конкретные дополнительные тесты могут быть выбраны из ряда доступных тестов на основании проведенной идентификации.
В одном, аспекте изобретения некоторые или все стадии способа могут быть автоматизированными. Как используют в данной заявке, термин "автоматизированный" означает контролируемый компьютером. В одной форме осуществления различные стадии определения и корреляции испускания флуоресценции автоматизированы, и информация, полученная в результате осуществления способов, автоматически используется для заполнения базы данных. В следующих формах осуществления другие стадии в способе, такие как обнаружение и/или исследование колоний, могут быть также автоматизированными. Автоматизация стадий способов дает возможность более эффективно протестировать большее число образцов и снижает риск ошибок человека при обращении с образцами, которые могут содержать вредные и/или инфекционные микроорганизмы, а также уменьшает вероятность заражения образцов и/или воздействия пользователя на образцы. В одной форме осуществления изобретение относится к системе для обнаружения и/или идентификации микроорганизма на твердой или полутвердой среде, где данная система включает спектрофотометр и фокусирующую оптику, такую как система линз или микроскоп. В других формах осуществления эта система дополнительно включает механизм для сканирования поверхности среды и/или механизм для контроля окружения (например, инкубации) среды.
2
Один аспект изобретения относится к обнаружению колонии на твердой или полутвердой среде. За обнаружением необязательно следует идентификация/характеризация микроорганизмов в колонии. В одной форме осуществления среду, на которую помещен образец, вручную сканируют на присутствие колоний. В одной форме осуществления колонии можно обнаружить визуально невооруженным глазом. В других формах осуществления колонии можно обнаружить, используя микроскоп. Например, среду можно наблюдать под микроскопом, когда среду, расположенную на предметном столике микроскопа, вручную перемещают под объективом микроскопа, чтобы сканировать часть среды на присутствие колоний. Среду можно перемещать путем манипулирования с самой средой (например, перемещения чашки, содержащей среду) или перемещения предметного столика, на котором помещена среда. В других формах осуществления сканирование осуществляют автоматически. В одной форме осуществления предметный столик микроскопа с электроприводом можно программировать на перемещение среды под объективом по схеме поиска через всю поверхность среды, так что индивидуальные участки среды можно наблюдать поочередно. В другой форме осуществления среду удерживают стационарно, тогда как сфокусированный пучок света, такой как лазер, сканируют через среду, и испускаемый свет обнаруживают с помощью визуализирующего или не визуализирующего детектора. В одной форме осуществления среду можно разделить на равные участки (например, примерно по 100, 250, 500 или 1000 мкмили более) в соответствии с размером возбуждающего пучка, и предметный столик микроскопа можно перемещать ступенчато с таким минимальным шагом, чтобы помещать каждый участок под объектив для исследования. В другой форме осуществления среду можно наблюдать на колонии в большом масштабе (например, всю чашку или большую ее часть (например, половины, трети, четверти, десятые доли или менее)). В любой форме осуществления локализацию колоний можно определять на карте, созданной в результате сканирования среды. В одной форме осуществления предметный столик микроскопа можно программировать на перемещение к каждой обнаруженной колонии поочередно для получения СФ спектра каждой колонии. В одной форме осуществления ручное или автоматическое сканирование можно повторять через регулярные интервалы (например, каждые 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 или 12 часов или более) для мониторинга появления и/или роста колоний. В одной форме осуществления изобретения среду сканируют, используя видимый свет для обнаружения колоний, например, колоний, которые являются достаточно большими, чтобы они были видны под микроскопом. В другой форме осуществления среду освещают таким образом, чтобы обнаружить внутреннее свойство микроорганизмов (например, СФ). Пики СФ над фоновым уровнем среды указывают на присутствие колоний. Например, можно построить карту флуоресценции среды, например, путем использования сканирующего возбуждающего пучка (такого как лазер) и простого не визуализирующего детектора. В другой форме осуществления можно использовать большую площадь визуализации, используя устройство съемки/получения изображения (например, камеру или сканер, такие как ПЗС линейный матричный сканер, ПЗС однострочная камера, ПЗС камера с двумерной матрицей, сканирующая лазерная камера или другое устройство), как описано в WO 03/022999 и патентах США №№5912115, 6153400 и 6251624.
В некоторых формах осуществления изобретения способы обнаружения можно также использовать для обнаружения присутствия микроорганизма(ов) в образце с идентификацией или без идентификации обнаруженного микроорганизма. В некоторых формах осуществления изобретения способы обнаружения можно использовать для мониторинга образцов на заражение микроорганизмом, например, пищевых продуктов, фармацевтических препаратов, питьевой воды и т.д. В одной форме осуществления способы обнаружения можно осуществлять в периодически повторяющейся системе для постоянного мониторинга на заражение, например, раз в месяц, раз в неделю, раз в сутки, раз в час или по любой другой схеме периодичности. В другой форме осуществления образцы можно тестировать по необходимости, например, когда подозревают заражение или необходимо подтвердить отсутствие заражения. В следующих формах осуществления способы обнаружения можно осуществлять, чтобы посмотреть присутствие микроорганизма в клиническом образце, например, из раны или гемокультуры. Например, образец можно отбирать из гемокультуры в определенные моменты времени и осуществлять способ обнаружения на образце, чтобы определить, является ли гемокультура положительной. В одной форме осуществления образец можно отбирать в установленный момент времени после инокуляции культуры, например, через 24 часа после инокуляции, чтобы определить, является ли гемокультура положительной. В другой форме осуществления образцы можно отбирать из гемокультуры регулярно, например, каждые 12, 6, 4, 2 часа, 1 час или 0,5 часа, для идентификации положительных гемокультур в пределах короткого промежутка времени как обнаружимо положительные. В некоторых формах осуществления способов обнаружения за стадией обнаружения могут необязательно следовать способы идентификации/характеризации, которые описаны в данной заявке. В других формах осуществления способы обнаружения частично или полностью автоматизированы, в частности, для форм осуществления, включающих повторяющийся мониторинг образцов.
В некоторых формах осуществления способы по изобретению можно осуществлять с животными или растительными клетками вместо микроорганизмов. В частности, животные клетки (например, клетки млекопитающих, птиц, насекомых) или растительные клетки, которые могут расти в виде колоний, скоплений или других трехмерных структур, или которые растут на трехмерных субстратах, можно обнаружить, провести мониторинг, охарактеризовать и/или идентифицировать, используя методы, раскрытые в данной заявке. Примеры подходящих клеток, которые растут в виде трехмерных колоний, включают без ограничения стволовые клетки, фибробласты и опухолевые клетки.
Настоящее изобретение описано более подробно в приведенных ниже примерах, которые предложены для иллюстрации и никоим образом не предназначены для ограничения изобретения. Использованы стандартные методы, хорошо известные в данной области техники, или методы, конкретно описанные ниже.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1. Получение спектров от колоний на чашках и мембранах Проводили тесты, чтобы определить, могут ли быть получены полезные спектры от колоний непосредственно на чашках с кровяным агаром (ВАР; триптический соевый агар с 5% овечьей кровью) с черными мембранами и без них (Таблица 1). Колонии Е. соli (ЕС), S. aureus (SA), Е faecalis (EF) и Р. aeruginosa (PA) выращивали, как указано в таблице 2, и спектры снимали через УФ микроскоп (10Х объектив), соединенный оптоволоконным адаптером со спектрометром Fluorolog 3 (Horiba Jobin Yvon, Edison NJ) и ФЭУ детектором. МВИ (матрицу возбуждения -испускания) снимали в диапазоне длин волн возбуждения (Ех)=260-550 нм и испускания (Ет)=280-600 нм, каждые 5 нм с шириной щели = 5 нм. Где указано, область исследования была сужена путем помещения 1 мм микроотверстия на пути возбуждения, что приводило в результате к наблюдаемой области 0,1 мм. Без микроотверстия круги возбуждения и испускания, которые проектировались на колонии, были равны примерно 1 мм в диаметре. Образцы, которые были включены в каждый прогон теста, указаны в таблице 2.
Таблица 1
Прогон теста
А1
A2
A3
А4
В1
В2
Примерный диаметр колонии (мм)
0,4
Контроль
0,2-0,35
1,0-3,0
1,0-3,0
1,0-3,0
Мембрана
Pall
Все
WME
Нет
Нет
WME
Диаметр пучка ЕМ (мм)
0,1
0,1
0,1
0,1
1,0
1,0
Время исследования (сек)
1
0,5
0,5
0,5
0,1
0,1
Мембраны:
Нет = Овечий кровяной агар (SBA)
Pall = черная полиэфирсульфоновая мембрана с решеткой Pall Metricel на SBA
WPC = трековая мембрана из черного поликарбоната Whatman на SBA
WME = черная мембрана из смешанного эфира Whatman на SBA
Таблица 2
А1
ЕС1 = АТСС 25922 25 ч @ температура окружающей среды (AT) на черной полиэфирсульфоновой мембране с решеткой Pall Metricel Black на чашке SBA. Примерный диаметр целой колонии занимает ~ 3 точки решетки, микроотверстие покрывало примерно 1/4-1/5 диаметра колонии и 1/20 площади колонии.
А2
Плоский ВАР и каждая мембрана на ВАР
A3
ЕС3 = АТСС 25922 в течение ночи (0/N) @ температура окружающей среды (AT) + 4 ч @ 36°С с получением колонии диаметром 350 микрон на мембране WME
SA1 = АТСС 25923 O/N @ КГ + 4 ч @ 36°С с получением колонии диаметром 200 микрон на мембране WME
А4
ЕС2 = АТСС 25922 O/N колония @ 36°С на ВАР
SA2 = АТСС 25923 O/N колония @ 36°С на ВАР
EF1 = АТСС 29212 O/N колония @ 36°С на ВАР
РА1 = АТСС 27853 O/N колония @ 36С на ВАР
В1
ЕС1 = АТСС 25922 O/N колония @ 36°С на ВАР, колония = 2,3 мм в диаметре
ЕС2 = АТСС 25922 O/N колония @ 36°С, колония = 2,3 мм в диаметре, ширина щели = 3 нм
SA1 = АТСС 25923 O/N колония @ 36°С на ВАР, колония = 2,0 мм в диаметре
EF1 = АТСС 29212 O/N колония @ 36°С на ВАР, колония = 1,2 мм в диаметре
РА1 = АТСС 27853 O/N колония @ 36°С на ВАР, колония = 3,0 мм в диаметре
В2
ЕС1 = АТСС 25922 O/N колония @ 36°С на мембране WME на SBA, диаметр колонии = 2,0 мм
ЕС2 = АТСС 25922 O/N колония @ 36°С на мембране WME на SBA, диаметр колонии = 1,6 мм
SA1 = АТСС 25923 O/N колония @ 36°С на мембране WME на SBA, диаметр колонии =1,2 мм
SA2 = АТСС 25923 O/N колония @ 36°С, диаметр колонии = 1,2 мм, время исследования = 0,05 сек, щели = 2,5 нм
SA3 = АТСС 25923 O/N колония @ 36°С, диаметр колонии = 1,2 мм, время исследования =0,1 сек, щели = 3,0 нм
SA4 = АТСС 25923 O/N колония @ 36°С на мембране WME на SBA, диаметр колонии =1,1 мм
SA5 = АТСС 25923 O/N колония @ 36°С на мембране WME на SBA, диаметр колонии =1,2 мм
EF1 = АТСС 29212 O/N колония @ 36°С на мембране WME на SBA, диаметр колонии =1,0 мм
РА1 = АТСС 27853 O/N колония @ 36°С на мембране WME на SBA, диаметр колонии = 1,1 мм
Спектры с прогона теста А2 не инокулированных чашек показаны на фиг.1A-1D. На вертикальной оси на каждой фигуре указан диапазон Ех (возбуждения), а на горизонтальной оси показан диапазон Ет (испускания). Спектры были получены с ВАР (фиг.1А), мембраны Pall (фиг.1В), мембраны WME (фиг.1C) и мембраны WPC (фиг.1D) без микроорганизмов. Первым наблюдением было различие фоновой флуоресценции между мембранами Pall и Whatman и ВАР. Неожиданно черная мембрана Pall сильно флуоресцировала в областях спектра, ранее обнаруженных как важные для классификации суспензий микроорганизмов, значительно больше, чем непокрытый ВАР. Однако мембрана WME вообще давала наименьшую фоновую флуоресценцию.
Спектры с прогона теста A3 колоний на мембране WME на ВАР показаны на фиг.2А-2С. Спектры были получены с ЕСЗ (фиг.2А) и SA1 (фиг.2В), и результат вычитания спектра ЕСЗ из спектра SA1 показан на фиг.2С. Спектры колоний показывают четкие различия между S. aureus и Е. соli. Тот факт, что некоторые участки спектра выше для Е. соli, а другие выше для S. aureus, показывают, что различия присутствуют в общей схеме, а не просто являются различиями в шкале интенсивности.
Спектры с прогона теста В1 колоний на ВАР без мембраны показаны на фиг.3A-3D. Спектры были получены с ЕС1 (фиг.ЗА), SA1 (фиг.3В), EF1 (фиг.ЗС) и РА1 (фиг.3D). Хотя другие параметры измерения дают значительно более высокие интенсивности, чем спектры A3, и несмотря на измерение непосредственно на ВАР без черной мембраны, относительные схемы все же подобны для соответствующих видов бактерий.
Эти эксперименты показали, что спектры собственной флуоресценции колоний могут быть получены через микроскоп непосредственно на ВАР с помощью и без помощи черной мембраны для уменьшения фоновой флуоресценции, и наблюдаемые схемы были характеристическими для различных типов микроорганизмов.
ПРИМЕР 2. Сканирование на микроколонии через микроскоп
Проводили тесты, чтобы определить, можно ли локализовать колонии, растущие под микроскопом на предметном столике с электроприводом, путем использования поточечных измерений СФ и получить СФ спектры, автоматически снятые с каждой обнаруженной колонии. УФ микроскоп был соединен со спектрометром Fluorolog 3 (Horiba Jobin Yvon, Edison NJ), который служил в качестве источника возбуждения флуоресценции и устройства для измерения испускания, посредством оптоволоконных кабелей. Предметный столик микроскопа с электроприводом был оборудован компактным термостатом для чашки, сконструированным со спиральными трубками, оборудованным циркулирующей водяной баней, установленной на 36°С. Термостат был также оборудован окном, прозрачным для УФ света, изготовленным из кварцевого покровного стекла. Различные агаровые среды инокулировали методом рассева Е. соli АТСС 25922 (ЕС) и/или S. aureus АТСС 25923 (SA), как указано в таблице 3. В некоторых прогонах использовали светоизоляционный материал, либо черную смешанную эфирную мембрану Whatman (WME), либо уголь, чтобы уменьшить флуоресценцию, идущую от самой среды.
После инокуляции предметный столик микроскопа с электроприводом программировали на периодическое перемещение по чашке с агаром в решетке поиска и измерение флуоресценции в каждой точке с одной или более чем одной парой длин волн возбуждения/испускания. Fluorolog 3 программировали, устанавливая ширину щели на 10 нм, и время исследования устанавливали на 500 мс (прогоны теста А-Е) или 1000 мс (прогоны теста F-H). Возбуждающий пучок, проектируемый на поверхность агара, был ограничен до приблизительного диаметра 0,1 мм путем помещения микроотверстия в возбуждающем пучке внутри микроскопа. В соответствии с этим размером пучка предметный столик микроскопа ступенчато перемещался с шагом 0,1 мм, так что 10 шагов покрывало расстояние 1 мм. Возбуждающий пучок не был ограничен микроотверстием, но микроскоп был экранирован во время измерений, чтобы предотвратить обнаружение какого-либо постороннего света, который не был генерирован возбуждающим пучком.
Для прогонов теста G и Н был разработан алгоритм, чтобы автоматически вычислять локализацию растущих колоний. Для прогона Н программа была дополнительно улучшена, чтобы все колонии, которые были обнаружены, запускали перемещение предметного столика микроскопа к их положениям в последовательности и снятие их СФ спектров. Снятые спектры представляли собой подгруппу полной матрицы сканирования, которая включала 300 точек МВИ, выбранных, чтобы уменьшить время, требующееся для снятия. Также для экономии времени прибор был запрограммирован на снятие спектров не более 10 колоний.
Таблица 3
Переменные для каждого прогона теста
Прогон
Бактерии
Поисковые длины волн
Шаги площади
Время сканирова ния
Среды
А
ЕС
305-365 & 440-525
59×60
87 мин
WME-SBA
В
ЕС
305-365 & 440-525
68×68
115 мин
WME-SBA
С
ЕС
305-365
71×71
125 мин
TSA с 2% масс/масс угля
D
ЕС
440-525
100×100
122 мин
TSA с 2% масс/масс угля
Е
ЕС
305-365
97×97
115 мин
SBA
F
EC&SA
440-525
72×73
111 мин
SBA
G
EC&SA
305-365
61×61
46 мин
SBA
Н
EC&SA
440-525
70×70
61 мин
SBA
При прогоне А возникла проблема с прибором, которая остановила прогон после 6 ч, и за это время колоний не было обнаружено.
Прогон В показал только одну колонию выше фоновой флуоресценции через 8 ч, 2 четко видимых через 10 ч и 3 через 12 ч и позже. Различия между сигналами колоний и фоном было больше при 440-525 нм (приблизительно 4× фон), чем при 305-365 нм (приблизительно 2× фон).
В прогоне С не было колоний в пределах области сканирования вследствие низкого инокулума.
Прогон D показал 1 колонию через 8 ч и 3 через 10 ч и позже.
В прогоне Е исходно не было колоний в поле зрения. Одна колония выросла по краям поля через 12 ч, 3 через 14 ч и позже.
Прогон F со смешанным инокулумом показал 10 колоний, определенных как ЕС, через 8 ч, дополнительно 3 SA через 10 ч и еще 2 SA спустя большее время, чем 12ч. Трехмерные диаграммы поточечных поисковых сканирований СФ прогона F показаны на фиг.5A-5F, где высота соответствует интенсивности флуоресценции. На диаграммах показаны измерения, снятые через 6 ч, когда наблюдали первую обнаруженную колонию (фиг.4А), через 8 ч (фиг.4В), через 10 ч (фиг.4С), через 12 ч (фиг.4D), через 16 ч (фиг.4Е) и через 24 ч (фиг.4F). Примечательно, что все колонии, видимые через 8 ч, представляли собой Е. соli, тогда как дополнительные колонии, видимые через 10 ч и позже, представляли собой S. aureus. Изображение ВАР в увеличенном масштабе из прогона F через 24 ч показано на фиг.5А с выделенной областью поискового сканирования. Контурное изображение интенсивности флуоресценции с поискового сканирования через 12ч, показывающее соответствующие локализации колоний, показано на фиг.5В.
Прогон G показал 1 колонию ЕС через 8 ч и 2 колонии ЕС через 9 ч. В результате ошибки прибора снятие было остановлено через 10 ч и через 12ч, но было вновь запущено через 12 ч, и было обнаружено 5 колоний; 2 ЕС и 3 SA. Алгоритм обнаружения колоний успешно идентифицировал локализацию всех 5 колоний.
Прогон Н имел конденсат на окне наблюдения, который интерферировал со всеми сканированиями до 9 ч, и в это время было обнаружено 3 колонии ЕС и сняты спектры. Те же 3 ЕС были обнаружены на последующих сканированиях, и начиная с 13 ч было также обнаружено 4 колонии SA и сняты спектры.
Экспериментальные результаты показывают, что собственную флуоресценцию можно использовать для обнаружения присутствия и числа микроколоний микроорганизмов во время их роста непосредственно на чашках с агаром, как с использованием, так и без использования мембраны, блокирующей фон, или угля. Кроме того, как только колонии локализованы, относительно просто снять полные спектры микроколоний in situ для классификации.
ПРИМЕР 3. Классификация колоний микроорганизмов на чашках с агаром
Проводили тесты, чтобы определить, можно ли классифицировать колонии микроорганизмов на основании СФ спектров, снятых непосредственно на чашке с агаром, когда они растут.
Снятие спектров осуществляли по матрице возбуждения (Ех) и испускания (Еm) длин волн 260-580 нм и 260-680 нм, соответственно, в подгруппе 300 точек МВИ, выбранной, чтобы уменьшить требующееся время для снятия. Кроме того, все длины волн отражения (где Ех=Еm) также считывали. Для флуоресценции ширина щелей была установлена на 5 нм полосы пропускания, и время интегрирования составляло 1000 мс. Каждое 300-точечное снятие занимало примерно 8,1 мин до завершения.
В таблице 4 перечислены протестированные микроорганизмы, которые включали 6 изолятов каждого из 20 видов суммарно для 120 тестов. При использовании указания группировок, иных, чем по видам, термин клиническая группа по Граму (ClinGram) относится к уровню классификации, возможному для высококвалифицированного исследователя, считывающего штамм по Граму, не только положительного, отрицательного или дрожжей (таблица 5). Например, стафилококки являются грамположительными кокками в кластерах, тогда как многие стрептококки являются грамположительными кокками в цепочках.
Таблица 4
Грамотрицательные
Грамположительные
Дрожжи
A. baumanii, 6 изолятов
S. aureus, 6 изолятов
С. tropicalis, 6 изолятов
Е. aerogenes, 6 изолятов
S. epidermidis, 6 изолятов
С. glabrata, 6 изолятов
Е cloacae, 6 изолятов
S. pneumoniae, 6 изолятов
С. albicans, 6 изолятов
Е. соli, 6 изолятов
Е. faecium, 6 изолятов
К. pneumoniae, 6 изолятов
Е. faecalis, 6 изолятов
Р. aeruginosa, 6 изолятов
S. pyogenes, 6 изолятов
S. maltophilia, 6 изолятов
S. agalactiae, 6 изолятов
S. marcescens, 6 изолятов
В. subtilis, б изолятов
В. cereus, 6 изолятов
В таблице 5 показаны результаты моделирования классификации путем прямого ступенчатого линейного дискриминационного анализа с перекрестной проверкой "исключением по одному". Перекрестная проверка "исключением по одному" была выбрана, поскольку она эффективно использует малые группы данных, оценивая результаты так, как, если бы число "неизвестных" тестировали наравне с "испытательной" группой, без необходимости в повторении дважды, как для многих критериев. В таблицах "число стадий ДА" относится к числу выполненных стадий дискриминационного анализа, которые могут соответствовать или не соответствовать действительному числу точек МВИ, использованных для получения указанных результатов. Обычно число стадий равно числу точек ЕхЕm в модели, но иногда число точек модели меньше, если точки были вероятнее исключены, чем добавлены во время некоторых стадий.
Поскольку дискриминационный анализ может "найти" ложные корреляции в случайных флуктуациях данных, давая значительное число по существу "фоновых" точек данных, перекрестная проверка незаменима для оценки действительного успеха данной модели классификации. Как правило, результаты без перекрестной проверки будут склонны к верным на 100% при возрастающем числе стадий, тогда как результаты с перекрестной проверкой поднимутся до пика, а затем упадут. Модель с числом стадий, близким к пику перекрестной проверки, можно считать оптимизированной для данной группы данных. В таблице 5 показаны результаты каждого прогона модели классификации, как с перекрестной проверкой, так и без нее, в точке, где результаты перекрестной проверки оптимизированы.
Классификацию для каждого микроорганизма с помощью дискриминационного анализа считали корректной, если модели первого выбора классификации были действительно идентичны микроорганизму, независимо от того, как близко могли находиться другие выборы. Показано также число и процент микроорганизмов, для которых действительная идентичность находится среди 3 лучших выборов модели классификации, что указывает на хорошую предсказательную, хотя еще несовершенную, модель классификации.
Спектры с колоний четко показывают потенциал классификации микроорганизмов. Вероятно, в данных имеется некоторый фон, на что указывает тот факт, что результаты улучшились в результате группирования 2 соседних точек ExEm. Два известных фактора, вносящих вклад в фоновые данные, имеют происхождение от несоответствующего расположения пучка измерения на колониях и низких уровней света, достигающего детектора через прибор. Для данного исследования расположение возбуждающего пучка на центре колоний камерой микроскопа было затруднено, поскольку освещение, доступное для визуализации, было не оптимальным. Действительно, расположение определяли как неточное в некоторых случаях, которые были скорректированы, но вероятно, что другие неправильные расположения остались незамеченными. Фон в самом сигнале флуоресценции был также большим, поскольку количество энергии флуоресценции, достигающее детекторов, было более чем в 1000 раз ниже, чем для суспензий микроорганизмов. Это было следствием конфигурации оптического волокна и микроскопа, который является гибким инструментом для исследований, но не оптимизированным для данного типа измерений. Оптическая система, разработанная для этой задачи, может легко преодолеть эту проблему.
Таблица 5
Классифика ционная группа
Число стадий ДА
Число (%) корректных без перекрестной проверки
Число (%) корректных с перекрестной проверкой
Число (%) в пределах 3 лучших выборов с перекрестной оценкой
Группированные точки МВИ
Вид
30
118 98,3%
86 71,7%
108 90,0%
1
Вид
18
113 94,2%
94 78,3%
114 95,0%
2
ClinGram
18
118 98,3%
112 93,3%
118 98,3%
2
ПРИМЕР 4. Улучшенная классификация колоний с меньшим фоном
Проводили тесты, чтобы определить, может ли лучшее расположение и повышенный проходящий свет улучшить классификацию колоний микроорганизмов с собственной флуоресценцией. Эксперимент Примера 3 повторяли с тем же оборудованием и теми же штаммами микроорганизмов, но модифицированным способом. Снятие спектров осуществляли в том же диапазоне длин волн возбуждения (Ех) и испускания (Еm) (Ех=260-580 нм, Еm=260-680 нм), но с другой подгруппой из 312 длин волн, которая охватывает те же ключевые области спектра, но больше способствует группированию значений, чем предшествующая подгруппа. Основное соображение использования подгрупп состоит в том, чтобы уменьшить время, требующееся для снятия спектров с настоящим оборудованием. Ширина щелей монохроматора была увеличена до 7 нм полосы пропускания по сравнению с прежними 5 нм, что увеличило измеренную флуоресценцию приблизительно в 2 раза. Время исследования сохранили при 1000 мс, и каждое снятие занимало примерно 9,8 мин до завершения.
В таблице 6 показаны результаты моделирования классификации путем прямого ступенчатого линейного дискриминационного анализа с перекрестной проверкой "исключением по одному". Как и ранее, классификацию считали верной, если первый выбор модели классификации был действительно идентичен микроорганизму независимо от того, как близко могли находиться другие выборы. Качество классификации на видовом уровне показано на основании индивидуальных точек данных (без группирования), группирования 3 соседних считываний флуоресценции по схеме "L" на матрице ЕхЕm и группирования 4 соседних точек ЕЕМ в квадрате. Также показана классификация на уровне клинических групп по Граму с группированием "3L".
Изменения способа к улучшению соответствия считываний флуоресценции в сочетании с увеличенным пропускаемым светом повысили успех классификации. Из основных усовершенствований лучшее расположение, вероятно, вносит больший вклад в улучшение качества, чем увеличенный пропускаемый свет, и вероятно, что считывания флуоресценции более чем с одного положения в каждой колонии можно использовать для дальнейшего повышения точности классификации. Ограничения настоящего оборудования дали возможность только небольшого 2-кратного увеличения сигнала без уменьшения спектрального разрешения или существенного увеличения времени сканирования, и очевидно, что еще присутствует значительный фон считывания в спектрах флуоресценции.
Фон считывания частично преодолен за счет группирования соседних точек, которое не обладало положительным эффектом на другие факторы, влияющие на успех классификации, но соответственно уменьшает спектральное разрешение. То, что группирование помогает, также указывает на то, что спектральным разрешением можно в некоторой степени пожертвовать, чтобы улучшить фон считывания в оптимизированной системе. Улучшение при группировании, однако было не столь большим, как различие между этими данными и результатами предшествующего способа, что, вероятно, показывает, что расположение измерения играет более значительную роль. Дальнейшие усовершенствования в успехе классификации могут быть достигнуты при автоматизированном расположении и оптимизированных оптических устройствах, что находится в пределах компетенции обычного специалиста в данной области техники.
Описанное выше является иллюстративным для настоящего изобретения и не должно быть истолковано как ограничивающее его. Изобретение определено приведенной ниже формулой изобретения, в которую включены ее эквиваленты. Все публикации, заявки на патенты, патенты, патентные публикации и любые другие ссылки, цитируемые в данной заявке, полностью включены посредством ссылки на положения, релевантные для предложения и/или параграфа, в котором приведена ссылка.
Таблица 6
Классифика ционная группа
Число стадий ДА
Число (%) корректных без перекрестной проверки
Число (%) корректных с перекрестной проверкой
Число (%) в пределах 3 лучших выборов с перекрестной оценкой
Группированные точки МВИ
Вид
28
120 100%
105 87,5%
116 96,7%
1
Вид
40
120 100%
109 90,8%
113 94,2%
3
Вид
40
120 100%
107 89,2%
117 97,5%
4
ClinGram
28
120 100%
119 99,2%
120 100,0%
3