Способ получения химерных животных и "чистых линий" животных
METHOD FOR OBTAINING OF CHIMERIC ANIMALS AND "PURE LINES" OF ANIMALS

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам слияния эмбриональных клеток, конкретно к лазерному слиянию бластомеров, и может быть использовано для повышения эффективности реконструирования эмбрионов.
Многие болезни человека определяются наследственностью. На современном уровне развития медицины диагностика и лечение подобных заболеваний требует создания и изучения моделей таких болезней. Создание моделей болезни позволит понять механизм возникновения и развития патологии, выявить роль различных генов в этом процессе. Для разработки моделей болезни требуются модельные животные. Наиболее подходит для этих целей лабораторная мышь. Поэтому разработка эффективных технологий получения чистых линий генетически модифицированных мышей является сегодня крайне актуальной проблемой биомедицины.
В настоящее время широко известно несколько способов слияния клеток. Первоначально при реконструировании животных клеток использовали химический способ слияния клеток - путем воздействия либо полиэтиленгликолем (Eglitis М.А. Formation of tetraploidmouseblastocysts following blastomere fusion with polyethyleneglycol. J. Exp. Zool. 1980, 213(2), 309-313; Spindle A. Polyethylene glycol induced fusion of two-cell mouse embryo blastomeres. Exp. Cell. Res. 1981, 131(2), 465-470), либо инактивированным вирусом Сендай (O'Neill G.T., Speirs S., Kaufman M.H. Sex-chromosome constitution of postimplantation tetraploid mouse embryos. Cytogenet Cell Genet. 1990, 53(4), 191-195). Этот способ имел существенные недостатки, поэтому велись поиски новых более приемлемых способов слияния клеток.
В настоящее время широко известно несколько способов слияния клеток. Первоначально при реконструировании животных клеток использовали химический способ слияния клеток - путем воздействия либо полиэтиленгликолем (Eglitis М.А. Formation of tetraploid mouse blastocysts following blastomere fusion with polyethylene glycol. J. Exp. Zool. 1980, 213(2), 309-313; Spindle A. Polyethylene glycol induced fusion of two-cell mouse embryo blastomeres. Exp. Cell. Res. 1981, 131(2), 465-470), либо инактивированным вирусом Сендай (O'Neill G.T., Speirs S., Kaufman M.H. Sex-chromosome constitution of postimplantation tetraploid mouse embryos. Cytogenet Cell Genet. 1990, 53(4), 191-195). Этот способ имел существенные недостатки, поэтому велись поиски новых более приемлемых способов слияния клеток.
Наименее травматичным вмешательством в клетку являются оптические способы воздействия. Одним из первых это предложил и осуществил с помощью сфокусированного ультрафиолетового излучения известный биофизик С.С. Чахотин (Чахотин С.С. Цитология. 1959. T. 1, N.6, с. 614-626). С появлением лазеров оптические приемы воздействия на клетку получили дальнейшее развитие (Сахаров В.Н. Успехи соврем, биологии. 1972. Т. 73, N.2, с. 231-249; Liov L. et al. Hum. Reprod. 1996. V. 11, p. 1273-1280). Однако для слияния эмбриональных клеток лазерные технологии начали применяться лишь недавно. Получены данные успешного лазерного слияния мышиных ооцитов с соматическими кумулюсными клетками (А.К. Шахбазян, А.В. Карменян и др. ДАН, Клет. Биол. 2009, том 429, N. 4, с. 550-553) и позднее бластомеров двухклеточного партеногенетического эмбриона свиней (Kuetemeyer К. et al. J. Biomed. Opt. 2011, 16(8), 088001).
Недостатком известного технического решения следует признать отсутствие технологии получения химерных животных и «чистых линий» животных.
Указанное техническое решение принято в качестве ближайшего аналога.
Техническая задача, решаемая посредством разработанного способа, состоит в обеспечении возможности получения чистых линий генетически модифицированных животных и химерных животных.
Технический результат, получаемый при реализации разработанного способа за счет одновременного использования трех лазеров обеспечивает возможность быстрого и технологичного введения стволовых клеток с модифицированным геномом в эмбрион мыши на различных стадиях развития и с разной плоидностью бластомеров в один этап, что обеспечивает получение сразу чистых линий с более высокой эффективностью, без потери времени и затрат на последующее скрещивание химер для выведения чистых линий.
Для достижения указанного технического результата предложено использовать разработанный способ получения химерных животных и «чистых линий» животных Согласно разработанному способу первоначально действием ультракоротких лазерных импульсов выполняют слияние двух бластомеров эмбриона путем облучения участка естественного контакта, затем несколькими импульсами диодного лазера выполняют прокол размером 10-12 мкм блестящей оболочки эмбриона в области максимально удаленной от бластомеров, посредством действия ИК-лазера, в полученный прокол действием ИК-лазера помещают предварительно модифицированные эмбриональные стволовые клетки.
Все указанные операции преимущественно выполняют под микроскопом.
Слияние бластомеров эмбриона предпочтительно осуществляют действием ультракоротких лазерных импульсов при длительности импульса 100 фс, частоте повторения 80 МГц, длине волны 800 нм, энергии 1,5 нДж при времени экспозиции 20 мс.
Прокол блестящей оболочки эмбриона обычно осуществляют диодным лазером с длиной волны 1,48 мкм при мощности в предметной плоскости 80 мВт и длительности экспозиции 15 мс.
Оптический захват модифицированных стволовых клеток и введение их под блестящую оболочку эмбриона преимущественно осуществляют действием ИК-лазера с длиной волны 790 нм при мощности в предметной плоскости 10-15 мВт.
Как следует из опыта работы, выше приведенные режимы обработки не являются единственно возможными.
Предлагаемый способ на примере мышиных эмбрионов осуществляют следующим образом.
Мышиные эмбрионы на стадии 4-х клеток либо непосредственно доставали из яйцевода, либо культивировали in vitro до стадии 4-х клеток из зиготы или из двухклеточных эмбрионов. Четырехклеточные мышиные эмбрионы помещали в экспериментальную камеру, составленную из двух покровных стекол.
0
0
n
n
n
11
11
2
n
11
2
12
2
Воздействие ультракоротких лазерных импульсов (длительность 100 фс, длина волны 780 нм, частота следования импульсов 80 МГц) с модой Гаусса фокусировали объективом 60х, NA=0,7 в пятно, размеры которого характеризуются следующими параметрами: перетяжка лазерного пучка W=0.61λ/NA=0.68 мкм и параметром Релея = 1.86 мкм (k=2p/l волновое число). Изменение морфологии объекта после лазерного воздействия регистрировали в виде видеофайла с использованием камеры Sony Exwave HAD. Быстрые временные изменения размера области возмущения, создаваемые ультракороткими лазерными импульсами, измеряли по уровню потерь света лазерного диода (405 нм, 100 мкВт), сфокусированного в область перетяжки фемтосекундного лазера с использованием фотоумножителя и цифрового осциллографа Wave Surfer MSO 64MXs-BLecRoy. Локализация лазерного воздействия обусловлена тем, что длина волны 780 нм попадает в область прозрачности биологической ткани и линейное поглощение света пренебрежимо мало. При энергиях фемтосекундного импульса от 0.5 нДж до 2 нДж интенсивность лазерного света можно оценить, как интенсивность от 3.4×10 до 13.6×10 Вт/см соответственно. При такой интенсивности прозрачный на длине волны 780 нм ооцит поглощает n квантов света с вероятностью P=σI где n≥2, σсечение поглощения для n-фотонного процесса. Поглощение энергии лазерного импульса наибольшее в области максимальной интенсивности, т.е. вблизи фокуса объектива от 3.4 10 Вт/см и выше. Порог пробоя воды фемтосекундным импульсом лежит в диапазоне от 6.6 до 9.0 10 Вт/см. Изображение одного из эмбрионов вывели на экран монитора и нашли визуально область наиболее плотного контакта двух или трех бластомеров внутри эмбриона, для чего с использованием лазерного пинцета эмбрион поворачивали и перемещали. Для лазерного облучения визуально выбрали точку по возможности ближе к середине линии плотного контакта бластомеров. Для слияния двух или трех бластомеров внутри 4-х клеточного эмбриона достаточно однократного облучения выбранной точки последовательностью фемтосекундных лазерных импульсов с длиной волны 800 нм при частоте повторения 80 МГц с мощностью 0,06-0,12 Вт и длительностью последовательности 10-30 мс. Все манипуляции проводили в среде M2.
В данной работе в мультиплексном лазерном манипуляторе использовали инвертированный оптический микроскоп (O1ympusIX71). В поле микроскопа через объектив с высокой числовой апертурой заводили лазерное излучение от двух лазеров. Использовали объективы ЛОМО МФЛЮАР 100×/1.3 или OlympusLCAchN 40x/0.55 Ph2. Сфокусированное излучение титан-сапфирового непрерывного лазера 790 нм в предметной плоскости, где находится исследуемый образец, выполняло роль "оптического пинцета". Пространственные манипуляции над клетками проводили путем их перемещения относительно фокального пятна при движении предметного столика. Перемещение предметного столика осуществляли либо "вручную" либо с использованием позиционных пьезодвигателей, причем, в последнем случае, обеспечивалась точность перемещений, близкая к десяти нанометрам. Визуальный контроль осуществляли с использованием видеокамеры (Sony Exwave HAD). Установка также была оснащена спектрометром с фотоприемниками для регистрации спектров флуоресценции объекта исследования.
-1
Непрерывный диодный лазер с контролируемой экспозицией, длина волны 1.48 мкм, мощность в поле микроскопа 80 мВт использовали для проведения микрохирургических операций с блестящей оболочкой эмбриона и получения отверстия с таким расчетом, чтобы возможно было в образовавшееся отверстие ввести стволовые клетки диаметром порядка 10 мкм. Параметры лазерного пучка в поле микроскопа были оценены в рамках теории распространения гауссовского пучка: перетяжка 2w0=1.22 λ/NA, где NA числовая апертура; z0=(πw0)2/λ. Для апертуры NA=1.3 параметры пучка составляли w0=0.69 мкм, z0=1.02 мкм, при NA=0.55-w0=1.64 мкм, z0=5.7 мкм. Коэффициент поглощения воды для длины волны 1.48 мкм составляет 0.003 см. Оценка температуры разогрева в области перетяжки дает величину близкую к 75°C. Экспериментально показано, что при этих параметрах воздействия эффективно происходит перфорация блестящей оболочки эмбриона и существенно отрицательного воздействия на эмбрион операция перфорации не оказывает.
-9
-1
На следующем этапе с использованием непрерывного титан-сапфирового лазера 790 нм выполняли оптический захват модифицированных эмбриональных стволовых клеток и их перемещение под блестящую оболочку эмбриона через полученное ранее отверстие. Параметры гауссовского пучка в поле микроскопа при NA=1.3 w0=0.37 мкм, z0=0.55 мкм и при NA=0.55 w0=0.88 мкм, z0=3.1 мкм. Коэффициент поглощения воды для этой длины волны пренебрежимо мал и составляет порядка 10 см.
2
Далее эти эмбрионы культивировали в CO инкубаторе в среде до стадии вылупляющейся бластоцисты. Успешность эксперимента подтверждалась путем окрашивания ядерной ДНК витальным красителем Хекст 33342 и наблюдением флуоресценции в УФ-свете. Жизнеспособность экспериментальных эмбрионов оценивали культивированием in vitro до стадии бластоцисты.