Исследование разрешающей способности изоэлектрического фокусирования методами математического моделирования

УДК 004.942

ИССЛЕДОВАНИЕ РАЗРЕШАЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОГО ФОКУСИРОВАНИЯ МЕТОДАМИ МАТЕМАТИЧЕСКОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ

© 2011 г. Л.В. Сахарова

Филиал Морской государственной академии The branch of Admiral Ushakov

имени адмирала Ф.Ф.Ушакова, Maritime State Academy,

г. Ростов-на-Дону Rostov-on-Don

Представлена математическая модель изоэлектрического фокусирования (ИЭФ) водного раствора амфолитов-носителей в электролитической ячейке цилиндрической формы. Модель позволила сделать теоретические выводы о способах повышения разрешающей способности метода путем оптимизации состава смеси и устранения неравномерностей pH и проводимости в электрофоретической камере (ЭК).

Ключевые слова: ИЭФ; математическая модель; амфолит; разрешающая способность.

The article is devoted to the mathematical modeling of Isoelectric Focusing (IEF) aqueous solution of ampholytes in the cylinder electrophoretic cell. The model allow to make theoretical conclusions about ways of raising the IEF solvability by means of optimization the mixture composition and elimination the pH and conductivity irregularity in the electrophoretic cell.

Keywords: IEF; mathematical model; ampholyte; solvability.

Введение

Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) является одним из наиболее эффективных и универсальных методов идентификации и фракционирования многокомпонентных химически и биологически активных смесей при помощи электрического поля. При ИЭФ в электрофоретической камере (ЭК) естественным либо искусственным способом создается неоднородная по рН среда. В результате разделяемые амфолиты (аминокислот, имеющих основные и кислотные группы) фокусируются в зонах с нулевой скоростью миграции.

Важнейшими проблемами ИЭФ являются создание устойчивого градиента рН и повышение разрешающей способности метода.

Устойчивость градиента напрямую зависит от равномерности электропроводности электролита в объеме колонки. В идеале электропроводность должна быть постоянной на протяжении всего градиента, так как её неравномерность вызывает локальный перегрев электролита и, как следствие, его конвекционное перемешивание. Участки с низкой электропроводностью вызывают существенное падения напряжения, что приводит к ослаблению поля, а значит, к уменьшению разрешения метода на других участках градиента.

Электрохимическая проблема полного разделения амфолитов связана, в первую очередь, с построением адекватных моделей математических моделей распределения концентраций и рН внутри ЭК. Классическая теория гауссовского распределения аминокислот вызывает активные споры с самого момента своего создания [1]. Практика подтверждает, что гауссово распределение применимо к очень широкому классу

амфолитов; вместе с тем для отдельных амфолитов-носителей при ИЭФ было обнаружено несимметричное концентрационное распределение [2]. В недавних работах [3, 4] представлены результаты, ставящие в целом под сомнение универсальность гипотезы о гауссовском распределении концентраций. В них при высоких плотностях тока получено «аномальное» распределение, при котором отдельные профили концентраций в них имеют «негауссовский», «прямоугольный» вид.

Таким образом, в плане исследования разрешающей способности ИЭФ можно выделить две основные задачи современного математического моделирования. Первая - это создание моделей, позволяющих исследовать зависимость проводимости и градиента ИЭФ от параметров системы (т.е. ячейки и электролита), изучить механизм возникновения их неравномер-ностей и обозначить пути их устранения. Вторая задача - конструирование моделей, позволяющих изучить причины возникновения несимметричных концентрационных распределений, отличных от классических гауссовских распределений и сформулировать теоретические предпосылки их преодоления.

Решению перечисленных задач и посвящена данная статья.

Теоретический анализ

Модель построена на основе классических математических моделей электрофореза [5, 6], трактующих электролит как односкоростной многокомпонентный континуум. В электрофоретическую камеру (ЭК), представляющую собой цилиндр длиной I и радиусом г, помещен водный раствор N амфолитов в исходных количествах тк, к = 1, 2,...,N . Для каждого из амфолитов известны его константы рК([к),

рК(^), а также коэффициент миграции цк. Предполагается, что температура Т внутри ЭК постоянна. Под воздействием постоянного тока плотности J в ЭК сформировался равновесный градиент рН . Предполагается, что реакции диссоциации к -го амфолита в растворе описываются реакциями:

ЫН3+ RCOOH » ЫН2RCOOH + Н + , ЫН2RCOOH » ЫН2RCOO- + Н + ; где ЫН+RCOOH , ЫН2RCOO- , ЫН2RCOOH - положительный, отрицательный и «нейтральный» ионы амфолита с молярными концентрациями 5к, 5- , 50. Аналитическая концентрация амфолита определяется формулой: 5к = + 50 +5-1. В равновесном состоянии концентрации рассмотренных ионов амфолита связаны с его аналитической концентрацией формулами:

5к =ак 5 к; 5-1 = а-15 к; 50 = (1 -а-1)5 к ;

af =

H2

1 K(k ) Kf) + K(k ) H+H 2

af =

K

7 Кк)Кк) + К1(к )Н+Н2 где ак и а2 - степени диссоциации амфолита.

Концентрация гидроксил-ионов связывается с концен-

к2

трацией ионов водорода уравнением ОН = —,

Н

к1 = 10-14 - ионное произведение воды.

Стационарное распределение концентраций описывается системой уравнений в безразмерных переменных

N

J = Е

k=1

-eV5f +5k(af -a\)E = 0; -DkV((af-a-i )5k) + ^k (

ak +a 2 )5kE

- DH VH + ^hHE + DOH V

X (ak-a-1)5k + H - OH = 0:

k=1 l

S|5k (x)Jx = wk , k = 1,2,..., N ,

Численный эксперимент

Решение поставленной задачи осуществлялось численными методами. Решение включало в себя следующие этапы: 1) математическое преобразование исходной системы к более рациональной форме; 2) переход к экспоненциальной форме решения для исключения отрицательных лишенных физического смысла решений; 3) составление алгоритма решения краевой задачи на базе модифицированного метода Ньютона, методов Рунге - Кутта, а также метода движения по параметру; 4) составление и отладка программы на языке Turbo Pascal 7.0 с использованием стандартного модуля Graph; 5) проверка адекватности модели асимптотическими методами [7].

Программа предусматривает варьирование исходных данных (параметров электролитической ячейки, числа амфолитов, их электролитических параметров); исследование динамики заданной системы ИЭФ от плотности тока посредством создания серии наглядных рисунков (на которых изображаются профили амфолитов, рН и проводимость sp ); постоянный

контроль над скоростью процесса исследования посредством выбора шага движения по параметру.

Результаты и их обсуждение

В расчетах были использованы характеристики амфолитов-носителей, приведенные в работе [1] (таблица). Расчеты проводились в следующих предположениях: длина ячейки, l = 2 (дм); радиус ячейки, r = 0,2 (дм); T = 298 (К). Количества всех амфолитов одинаковы, Mk = 0,1 (моль). Плотность тока измерялась в А/дм.кв.

Характеристики амфолитов-носителей

где £ - площадь поперечного сечения колонки, цк -коэффициент миграции.

Уравнение (1) есть уравнение потока концентрации, который равен нулю в стационарном случае и при отсутствии потока вещества на границах ЭК. Соотношение (2) соответствует обобщенному, т. е. с учетом диффузии, закону Ома. Уравнение (3) есть уравнение электронейтральности. Интегральное условие (4) означает, что в любой момент времени суммарно количество всех трех форм амфолита неизменно и равно тк .

Решение интегро-краевой задачи (1) - (4) позволяет найти распределение концентраций 5к (х) и распределение рН (х) = - ^ Н (х).

Амфолит pKk ) pk 2k ) PI ApK Коэффициенты подвижности х104

Asp 1,88 3,65 2,77 1,77 2,97

М-АБК 3,12 4,74 3,93 1,62 3,01

а - OH-Asn 2,31 7,17 4,74 4,86 2,95

а - Asp-His 3,02 6,82 4,92 3,80 2,11

Tyr-Tyr 3,52 7,68 5,60 4,16 1,56

IsoGln 3,81 7,88 5,85 4,07 2,96

His-His 6,80 7,80 7,30 1,00 1,49

His-Gly 6,27 8,57 7,42 2,30 2,40

His 6,00 9,17 7,59 3,17 2,85

ß-Ala-His 6,83 9,51 8,17 2,68 2,30

Tyr-Arg 7,55 9,80 8,68 2,25 1,58

Пример 1. Существование «аномальных» режимов ИЭФ. Для расчетов были произвольным образом выбраны пять амфолитов с pH > 7 : His-His, His-

Gly, His, P-Ala-His, Tyr-Arg.. Как следует из таблицы, для рассматриваемой системы Ap/j=0,12; ApI2=0,17;

ApI3=0,58; ApI4=0,51, т.е. изоточки распределены

неравномерно по pH , с убывающим шагом.

Как следует из приведенных ниже графиков, при плотности тока J = 0,0005 расслоение незначительно, и ни один из амфолитов не достиг еще своего изо-электрического состояния (рис. 1a). При плотности тока J = 0,002 на профиле /З-Ala-His отчетливо проявляется максимум, указывающий на достижение амфолитом изоэлектрической точки (рис. 16), прослеживается появление максимума на профиле His. При J = 0,007 (рис. 1в), изоэлектрического состояния достигают все пять амфолитов, причем профиль fi-Ala-His имеет вид стандартного гауссовского распределения, в то время как профили His-Gly и His асимметричны; график pH монотонно возрастает, в то время как проводимость убывает. При J = 0,027 (рис. 1г) на профиле Tyr-Arg появляется плато, утрачивает сходство с гауссовским распределением, а значит, система входит в «аномальный» режим, характеризующийся «негауссовскими» распределениями

i;, моль/л

1.0"

концентраций. При J = 0,235 (рис. 1д) такие «плато» видны уже на всех пяти профилях; амфолиты расслаиваются на полосы одинаковой ширины, имеющие вид правильных прямоугольников для His, /З-Ala-His, Tyr-Arg. Наконец, при J = 1,323 (рис. 1е) мы видим практически полное расслоение амфолитов - прямоугольные области, внутри которых pH и sp постоянны.

Пример 2. Влияние неравномерностей на распределение амфолитов. Произвольным образом выбраны пять амфолитов с pH < 7 : Asp, м-АБК, а -Asp-His, Tyr-Tyr, IsoGln. Как следует из таблицы, Др/1 = 1,16; ApI 2 = 0,99; ApI3= 0,68; ApI4= 0,25, т.е.

распределение крайне неравномерно.

Рис. 2a показывает, что расслоение амфолитов достигнуто не полностью (м-АБК, а - OH-Asn, а также Tyr-Tyr, IsoGln выделяются только в виде смесей), профили амфолитов частично перекрывают друг друга.

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 l, дм

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 l, дм б

2,0

2,0

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 l, дм моль/л в

0 2,0

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 l, дм моль/л г

i—.

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 l, дм д

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 l, дм е

Рис. 1

0

i;, моль/л

2,4

моль/л

I

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 l, дм а

моль/л

2,7

0

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 l, дм б

моль/л

2,4

±

т

I

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 l, дм

0,2 0,4 0,6 0,8

1,0

г

1,2 1,4 1,6 l, дм

Рис. 2

Графики асимметричны, т.е. ни один из них не имеет вида гауссовского распределения. Графики рН и зр имеют неравномерности и изломы, что означает труднореализуемость эксперимента на практике из-за локального перегрева и конвекции.

На рис. 2б в предыдущей системе при сохранении неизменными всех прочих условий амфолит м-АБК был заменен а - ОН-Азп. Таким образом, распределение приобрело вид: Ар/1= 1,97; Др12 = 0,18; Др!3 = = 0,68; Др14 = 0,25, профили амфолитов имели еще более асимметричный вид. При этом общая картина улучшилась, однако а - ОН-Азп и а - Азр-Шз по-прежнему выделяются только в виде смесей.

На рис. 2в была предпринята попытка «выравнивания» профилей с помощью замены амфолита под номером 2 неким гипотетическим амфолитом с параметрами рК1~2) = 2,3, рК22) = 4,5, р1 = 3,4, обеспечивающими равномерное возрастание рК{(к), рК 2к), р1 : Ар11=0,63; Ар12 =1,52; Др13=0,68; Ар14 =0,25. Как показали чертежи, внесенное изменение действительно привело к относительному «выравниванию» профилей амфолитов и их полному расслоению.

На рис. 2г рассмотрена система из шести амфолитов: м-АБК, а - Азр-Шз, IsoGln, Шз-Шз, Туг-А Шз, т.е. Ар11 = 1,0; Др12 = 0,9; Др13 = 1,5; Др14 = 0,3; Др15 = 1,1. Как следует из графиков, профили His-His

и Tyr-Arg перекрываются на всём интервале своего распределения, что означает возможность их выделения лишь в виде смеси. Очевидно, что это связано с очень малым значением ApI4 . В то же время для м-

АБК, а - Asp-His, IsoGln, His имеет место полное расслоение.

Таким образом, графическое исследование системы ИЭФ позволяет сделать вывод: асимметрия профилей амфолитов и невозможность разделения амфо-литов могут быть вызваны исключительно неравномерностью распределения амфолитов по параметрам pK((k-1, pK2-1 в отсутствии прочих возмущающих факторов.

Пример 3. Влияние параметров распределения на равномерность градиента pH и внутреннего сопротивления ЭК. На рис. 3а,б рассмотрена система из восьми абстрактных амфолитов: pIH =7; ApI = = 0,05; ApK =2; цk = 2,1е-7; Mk =5.e-2.Таким образом, значения pi заполняют интервал от 7,0 до 7,4. Для средних плотностей тока рис. 3 а имеют место классические гауссовские кривые, пологий и гладкий градиент pH , постоянное значение у . При высоких и сверхвысоких плотностях тока рис. 3 б наблюдается «аномальный» режим: «прямоугольные» профили концентраций, ступенчатый график pH . Однако внутреннее сопротивление ЭК (sp) в данном примере практически постоянно.

0

в

1,9

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 l, дм в

моль/л

т —1 п ПГ г

1

1,9

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 l, дм б

моль/л

лп

1Л_

1ПЛПГ

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 l, дм

г

Рис. 3

i;, моль/л

1,9

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 l, дм моль/л а

1,9

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 l, дм моль/л б

ТППГТТТ"

0

—'

i I 1

Li

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 l, дм и 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 l, в г

дм

Рис. 4

0

0

На рис. 3 в,г рассмотрена система из восьми ам-фолитов pIн = 4; ApI = 0,5; ApK = 2, т.е. значения pI заполняют интервал от 4,0 до 7,5. Динамика профилей амфолитов остается неизменной по сравнению с предыдущим случаем. Однако динамика рH и sp претерпевает существенные изменения: при средних плотностях тока рис. 3в на обоих графиках наблюдаются «волны» в местах пересечения двух соседних гауссовских кривых. В «аномальных» режимах рис. 3д график рH приобретает уже знакомый «ступенчатый» вид, а графику sp соответствует кусочно-постоянная функция с точками возврата в местах соприкосновения соседних зон амфолитов.

На рис. 4 a,б представлена система с прежними значениями pIн = 4; ApI = 0,5; однако в данном случае ApK = 3 . Из графиков следует, что увеличение ApI приводит к выравниванию графиков рH и у для

средних плотностей тока.

На рис. 4 в,г изменены коэффициенты миграции; цк = 2.]£ - 7, если к = 2m +1; цк == 4.^ - 7 , если к = 2m . Существенные изменения в этом случае приобретает график sp, который для средних плотностей тока рис. 3 в имеет ярко выраженный волнообразный вид; при этом минимумы приходятся на пики амфоли-тов с нечетными номерами, а максимумы - с четными. Проявляется и неравномерность профилей амфо-литов: профили с нечетными номерами более пологие. Для сверхвысоких плотностей, соответствующих «аномальным» режимам рис. 3 г неравномерности профилей стираются, а график sp приобретает вид

ломаной, совершающей поступательно-возвратные колебания. Профиль рH существенных изменений не

претерпевает.

Выводы

Построенная математическая модель позволяет посредством движения по параметру получить исчерпывающую информацию о зависимости динамики заданной системы ИЕФ от плотности электрического тока J.

Модель обнаруживает качественное соответствие с общепринятыми математическими моделями ИЭФ при низких и средних плотностях тока. Получаемые её посредством профили концентраций амфолитов при средних плотностях тока имеют вид стандартных гауссовских распределений.

Вместе с тем проведенные расчеты показывают, что при достижении сверхвысоких плотностей тока наблюдаются «аномальные» (негауссовские) режимы ИЭФ: профили концентраций амфолитов теряют

Поступила в редакцию

сходство с гауссовским распределением, обеспечивающим равномерное распределение: вначале максимумы на них трансформируются в «плато», а затем сами профили приобретают вид прямоугольников, вплотную примыкающих друг к другу; градиенты рH и sp при этом имеют ступенчатый вид, что приводит к понижению разрешающей способности метода. Таким образом, эксперимент ИЭФ должен проводиться, по возможности, при средних плотностях тока.

В то же время, как показывает численный эксперимент, существенные искажения гауссовского распределения наблюдаются в случае неравномерности распределения pK^), pKf). На практике это означает, что разрешающая способность метода может быть существенно повышена путем выбора амфолитов с равномерным распределением констант диссоциации.

Также установлено, что необходимым условием высокой разрешающей способности эксперимента ИЭФ является подбор амфолитов с максимально близкими коэффициентами миграции.

Таким образом, построенная модель может быть использована для оптимизации практического эксперимента, приводящей к увеличению разрешающей способности метода ИЭФ.

Литература

1. Rigetti P.G. Isoelectric focusing: Theory, Methodology and Application. Elsevier Biomedical Press, Amsterdam; New York; Oxford, 1983. 386.

2. Gelsema J.W., De Ligny C.L. Comparison of the specific conductivities, buffer, capacities and molecular weights of focused ampholine, servalyte and pharmalyte carrier ampholytes used in isoelectric focusing // Jornal of Chromatography. 1979. № 178. P. 550 - 554.

3. Mosher R.A., Thormann W. High-resolution computer simulation of the dynamics of isoelectric focusing using carrier ampholytes: The post-separation stabilizing phase revisited // Electrophoresis. 2007. № 23. P. 1803 - 1814.

4. Thormann W., Mosher R.A. High-resolution computer simulation of the dynamics of isoelectric focusing using carrier ampholytes: Focusing with concurrent electrophoretic mobilization is an isotachophoretic process. Research Article // Electrophoresis. 2006. № 27. P. 968 - 983.

5. Бабский В.Г., Жуков М.Ю., Юдович В.И. Математическая теория электрофореза: применение к методам фракционирования биополимеров. Киев, 1983. 202 с.

6. Жуков М.Ю. Массоперенос электрическим полем. Ростов н/Д., 2005. 216 с.

7. Sakharova L.V., Vladimirov V.A., Zhukov M.Yu. Anomalous pH-gradient in Ampholyte Solution. - arXiv: 0902.3758vl [physics.chem-ph] 21 Feb. 2009.

18 апреля 2011 г.

Сахарова Людмила Викторовна - канд. техн. наук, доцент, Филиал Морской государственной академии имени адмирала Ф.Ф.Ушакова, г. Ростов-на-Дону. Тел. (8863)269-44-96. E-mail: L_Sakharova@mail.ru

Sakharova Ludmila Victorovich - Candidate of Technical Sciences, assistant professor, the branch of Admiral Usha-kov Maritime State Academy, Rostov-on-Don. Ph. (8863)269-44-96. E-mail: L_Sakharova@mail.ru