Токсичность никеля для тионовых бактерий

Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2010. Вып. 1. С. 167-174 Химия

УДК 597/846.21+841.11:573.4

Токсичность никеля для тионовых бактерий *

Л.И. Ахметов, А.Г. Быков, М.Б. Вайнштейн, Т.З. Есикова,

А.Е. Филонов, Л.Н. Крылова, С. Мортазави

Аннотация. Изучено ингибирующее влияние никеля на две культуры бактерий рода Acidithiobacillus. Показана их различная резистентность к никелю и общее для них ингибирование хромом. Разработан подход увеличения резистентности бактерий к высоким концентрациям никеля путем экзогенной изоляции плазмид, содержащих гены устойчивости. Полученные результаты могут быть применены при биоремедиации загрязненных тяжелыми металлами биотопов и промышленном извлечении тяжелых металлов из руд с помощью бактерий.

Ключевые слова: никель, хром, токсичность, Acidithiobacillus, Pseudomonas, плазмиды.

Введение

Одним из наиболее прогрессивных методов добычи ценных металлов из бедных руд является гидрометаллургия с использованием биовыщелачивания тионовыми бактериями. Такое выщелачивание металлосодержащих руд, как и всякое растворение тяжелых металлов, сопровождается повышением их концентрации в воде и почвах окружающих биотопов. Высокая концентрация тяжелых металлов не только угрожает состоянию окружающей среды, но и снижает активность промышленных штаммов микроорганизмов в промышленных процессах биовыщелачивания.

Таким образом, устойчивость бактерий к добываемым из руд тяжелым металлам, в частности, никелю и хрому, представляет собой важный и интересный объект изучения как для промышленной гидрометаллургии и геомикробиологии, так и для обеспечения экологической безопасности биотопов, затронутых добычей металлов [1].

Известно, что генный детерминант cnr кодирует бактериальную устойчивость к никелю [2,3], который может находиться на плазмидах — внехро-

* Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» (госконтракт №02.740.11.0040) и МНТЦ (проект №3624).

мосомной ДНК, способной к автономной репликации [2,4]. Использование подобных генетических инструментов представляется перспективным при получении штаммов микроорганизмов, способных к высокоэффективному выщелачиванию никеля из никелевых руд.

Материалы и методы

Культуры микроорганизмов. В опытах по влиянию высоких концентраций растворенных металлов на тионовые бактерии были использованы следующие культуры ацидофильных тионовых бактерий.

Acidithiobacillus albertensis DSM 14366: грамотрицательная палочка, подвижная за счет полярных жгутиков; рост в аэробных условиях наблюдается при рН 2.0-4.5, оптимум при рН 3.5-4.0 и температуре 25-30°С; является облигатным хемолитотрофом, в качестве источника энергии использует окисление тиосульфата, сульфидов и элементной серы с образованием сульфата, снижая рН не способна окислять двухвалентное железо.

A. thiooxidans (Thiobacillus concretevorus) DSM 8345: грамотрицательная палочка, подвижная за счет единственного полярного жгутика; является облигатным хемолитотрофом, в качестве источника энергии использует окисление тиосульфата, сульфидов, тетратионата и элементной серы с образованием сульфата и снижением рН до 1.0. Оптимальными условиями развития являются рН 2-3 и температура 28-30°С.

Роды Acidithiobacillus и Pseudomonas принадлежат к близким группам, поэтому в опытах с переносом плазмид были использованы Pseudomonas putida BS394 и P. putida КТ2442. Штаммы псевдомонад являются грамотри-цательными подвижными, прямыми или изогнутыми палочками размером

0.8-0.9 х 1.5—3.0 мкм, аэробы, хемоорганотрофы. Растут на стандартных богатых питательных средах, оптимум рН для роста 6.0-8.0.

Образцы сульфидной никелевой руды. Использованные в работе как источник неизвестной аборигенной микрофлоры, устойчивой к высоким концентрациям никеля, образцы сульфидной никелевой руды (CanO-A и CanO-C) были предоставлены организацией CANMET, Канада.

Культивирование. Культуры тионовых бактерий выращивали на классической агаризованной среде для ацидофильных тиобацилл рода Acidithiobacillus [5-7], смывали жидкой средой того же состава и разливали по пробиркам, содержащим различные концентрации солей, культивировали при 24°С и постоянном перемешивании (180 об/мин) на орбитальной качалке в течение 10-12 суток. В экспериментах использовали следующие конечные концентрации NÍCI2 или Na2CrO4: 0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25 и 1.5 %.

В опытах с переносом плазмид резистентности к никелю бактерии выращивали на среде Лурия-Бертани [8]. Для селективного культивирования использовали устойчивость штаммов к антибиоткам: P. putida KT2442 — устойчивость к канамицину (0.1 г/л), P. putida BS394 — устойчивость к гентамицину (0.05 г/л).

Для эндогенной изоляции плазмид в пробирки с минеральной средой Эванса [9] (2 мл) помещали образец никелевой руды и 108 КОЕ (колониеобразующих единиц)/мл свежих клеток штамма-акцептора и оставляли в термостате при 28°С на 3 суток. После этого делали высевы на чашки с богатой агаризованной средой Лурия-Бертани с добавлением NiCl2. Концентрация хлорида никеля для P. putida BS394 составляла 5 и 12 мМ, для P. putida КТ2442 — 10 и 17 мМ.

Экзогенную изоляцию плазмид проводили на чашках с богатой агаризо-ванной средой Лурия-Бертани без и с добавлением NiCl2 (при концентрации 1 мМ для P. putida BS394 и 5 мМ для P. putida KT2442). Для этого образец руды (0.5 г) компактно помещали в центр чашки Петри и туда же добавляли 200 мкл свежей бактериальной суспензии реципиента (концентрация клеток 1010 КОЕ/ мл). Для получения свежей культуры реципиентный штамм подращивали в течение 12 ч в 5 мл жидкой среды Лурия-Бертани. После этого чашки инкубировали при 28°С в течение 5 суток. Затем делали высевы на чашки с богатой агаризованной средой Лурия-Бертани с добавлением NiCl2, как описано выше.

Количественный учет бактерий. Количественный учет бактерий проводили: для тионовых бактерий — прямым полсчетом клеток при микро-скопировании в камере Горяева, для псевдомонад — по числу КОЕ.

Результаты и их обсуждение

Добавление в среду NiCl2 до конечной концентрации 1% не оказывало влияния на рост бактерий A. albertensis DSM 14366. Численность клеток в контрольном варианте и соответствующих вариантах эксперимента через 12 суток культивирования практически не отличалась. Увеличение концентрации соли в ростовой среде до 1.25-1.5% приводило к замедлению роста бактерий по сравнению с контролем, т.е. оказывало незначительное ингибирующее влияние на рост бактерий (табл. 1). Рост бактерий сопровождался снижением величины рН жидкой среды за счет окисления серных соединений до сульфат-иона; изменение величины рН происходило тем больше, чем ниже была концентация никеля, что подтверждает его ингибирующее влияние (рис. 1).

В отличие от солей никеля добавление в среду Na2CrO4 даже в незначительном количестве оказывало токсическое действие на бактерии A. alberten-sis DSM 14366. Рост бактерий во всех вариантах эксперимента отсутствовал. Более того, численность бактерий при концентрациях соли хрома в среде 0.1 и 0.25% уменьшалась на 1-2 порядка по сравнению с начальной, а при дальнейшем увеличении концентрации хрома в среде наблюдали гибель клеток (табл. 1).

Рост бактерий A. concretevorus DSM 8345 в присутствии даже низких концентраций NiCl2 отсутствовал. При повышении концентрации соли в среде до 1.0% наблюдалось даже снижение количества клеток по сравнению

Таблица 1

Изменение численности бактерий A. albertensis DSM 14366 при различных концентрациях Ni или Cr в среде

Концентрация соли Ni или Cr, % Число клеток в 1 мл

NiCl2 через 12 сут Na2CrO4 через 12 сут

0.00 2,35х109 2,35х109

0.10 2,13 х 109 6,22х107

0.25 2,43х109 1,01 х 107

0.50 2,31 х109 менее 1,0 х107

0.75 2,15х109 менее 1,0 х107

1.00 1,98 х109 менее 1,0 х107

1.25 1,20 х109 менее 1,0 х107

1.50 6,23х108 менее 1,0 х107

Динамика изменения рН при разных содержаниях NiCb в среде как показатель влияния никеля на активное образование сульфат-иона бактериями A. albertensis DSM 14366

с началом эксперимента, что является дополнительным свидетельством токсичного влиянии высоких концентраций никеля на бактерии (табл. 2).

Как и в случае с A. albertensis DSM14366, хром оказывал на A. con-cretevorus DSM 8345 более сильное ингибирующее воздействие. Рост бактерий отсутствовал во всех вариантах с добавлением соли хрома, количество клеток через 10 суток культивирования уменьшилось на 1-2 порядка и более по сравнению с началом эксперимента (табл. 2).

Полученные результаты предположили также необходимость следующего этапа исследований: проверку возможности повышения бактерий резистентности бактерий к тяжелым металлам путем горизонтального переноса гена устойчивости, что важно как для получения улучшенных промышлен-

Таблица 2

Изменение численности бактерий A. concretevorus DSM 8345 при различных концентрациях Ni или Cr в среде (исходная численность

1,76х108 кл/мл)

Концентрация соли Ni или Cr, % Число клеток в 1 мл

NiCl2 через 12 сут Na2CrO4через 12 сут

0.00 6,35х108 6,35х108

0.10 1,23x10 1,23х107

0.25 2,23х108 менее 1,0 х107

0.50 8,31х107 менее 1,0 х107

0.75 9,15х107 менее 1,0 х107

1.00 6,98х107 менее 1,0 х107

ных штаммов, так и при прогнозировании динамики видового разнообразия микробных сообществ загрязненных тяжелыми металлами биотопов.

Проверку возможности повышения устойчивости к никелю проводили на модельном объекте — потенциальном промежуточном хозяине для переноса плазмид резистентности — на представителях рода Pseudomonas. Исходным материалом для изоляции плазмид резистентности к никелю служили аборигенные бактерии сульфидных никелевых руд.

Исходно было предположено, что ряд аборигенных бактерий являются носителями плазмид устойчивости к тяжелым металлам. Для выделения этих плазмид были поставлены эксперименты с двумя образцами никелевых руд [10]. Неизвестные аборигенные тионовые бактерии рассматривались как потенциальные доноры плазмид с генами резистентности к никелю, тогда как в качестве реципиентов использовали штаммы Pseudomonas putida BS394 (маркеры — ауксотрофность по цистеину, устойчивость к гентамицину) и P. putida КТ2442 (маркеры — устойчивость к канамицину, флюоресценция белка Gfp, дающего характерное зеленое свечение на среде Лурия-Бертани при УФ-облучении, 254 нм). Проводили эндогенную и экзогенную изоляцию плазмид, которые используют в тех случаях, когда не удается выделить и затем культивировать плазмидосодержащие культуры. При экзогенной изоляции [11,12] смешивают штамм-реципиент и природный субстрат с аборигенными микроорганизмами и культивируют смесь на соответствующей питательной среде, после чего проводят выделение и селекцию трансконъюгант-ных клонов штамма-реципиента. В случае эндогенной изоляции плазмид штамм-реципиент непосредственно вносят в природный субстрат, какое-то время инкубируют и затем выделяют и селектируют трансконъюгантные клоны реципиента.

В ходе экспериментов по эндогенной изоляции плазмид из микрофлоры никелевых руд ни в одном случае не наблюдалось роста колоний штаммов-акцепторов на агаризованных средах, что свидетельствовало об отсутствии переноса и экспрессии плазмид с генами резистентности к никелю в данных штаммах.

При экзогенной изоляции плазмид с добавлением NÍCI2 в с богатую агари-зованную среду Лурия-Бертани (при концентрации 1 мМ для P. putida BS394 и 5 мМ для P. putida KT2442) удалось выделить трансконъюганты штамма КТ2442 в случае внесения никелевых руд CanT-A и CanT-C, которые были расчищены на среде Лурия-Бертани с повышенным содержанием хлорида никеля (18 мМ). При дальнейшем изучение устойчивости удалось добиться того, что трансконъюганты штамма КТ2442 переносили содержание никеля в среде до концентрации 40 мМ и сохраняли способность к росту. Таким образом, за счет экзогенной изоляции природных плазмид резистентности к никелю удалось повысить устойчивость штамма псевдомонады в 4 раза (с минимальной ингибирующей концентрации никеля в среде 10 мМ до 40 мМ), что согласуется с ранее полученными данными [4]. Сиунова с соавторами [4] перенесли плазмиду устойчивости к кобальту и никелю из штамма Pseudomonas sp. BS501(pBS501) в штамм Pseudomonas aureofaciens BS1393, повысив в итоге порог минимальной ингибирующей концентрации никеля в среде Лурия-Бертани с 2 мМ до 8 мМ.

Заключение

Полученные результаты показали, что разные виды тионовых бактерий даже в пределах одного рода имеют различную резистентность к тяжелым металлам. Это означает, что для промышленного биовыщелачивания должна проводиться предварительная селекция видов и штаммов. Экспериментально показано, что A. concretevorus не годится для промышленного биовыщелачивания как хрома, так и никеля, а A. albertensis может быть успешно применен для добычи никеля. Высокая степень ингибирования данных тиобацилл никелем и хромом подтверждает экологическую опасность этих металлов.

Кроме того, разработан подход к увеличению резистентности бактерий к высоким концентрациям никеля путем экзогенной изоляции плазмид, который может быть использован для получения улучшенных штаммов с последующим их применением при биовыщелачивании металлов.

Список литературы

1. Stoppel R., Schlegel H.G. Nickel-resistant bacteria from anthropogenically nickel-polluted and naturally nickel-percolated ecosystems // Appl. Environ. Microbiol. 1995. V.61, №6. P.2276-2285.

2. Grass G., Große C., Nies D.H. Regulation of the cnr cobalt and nickel resistance determinant from Ralstonia sp. strain CH34 // J. Bacteriol. 2000. V.182, №5. P.1390-1398.

3. Cnr-подобный оперон в штамме Comamonas sp., кодирующий устойчивость к кобальту и никелю / Т.В. Сиунова [и др.] // Генетика. 2009. Т.45, №3. С.336-341.

4. Продукция феназиновых антибиотиков у штамма Pseudomonas aureofaciens, содержащего плазмиду резистентности к кобальту и никелю / Т.В. Сиунова [и др.] // Микробиол. 2002. Т.71, №6. С.778-785.

5. Isolation and characterization of a new acidophilic Thiobacillus species (T. albertis) / R.D. Bryant [et al.] // Can. J. Microbiol. 1983. V.29. P.1159-1170.

6. A new strain Acidithiobacillus albertensis BY-05 for bioleaching of metal sulfides ores / J. Xia [et al.] // Transact. Nonferrous Metals Soc. China. 2007. V.17, №1. P.168-175.

7. Kelly D.P., Wood A. Reclassification of some species of Thiobacillus to the newly designated genera Acidithiobacillus gen. nov., Halothiobacillus gen. nov. and Thermithiobacillus gen. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. V.50. P.511-516.

8. Carhart G., Hegeman G. Improved method of selection for mutants of Pseudomonas putida // Appl. Microbiol. 1975. V.30, №6. P.1046.

9. Evans C.G.T., Herbert D., Tempest D.B. The continiuous cultivation of microorganisms. 2. construction of a chemostat // Methods Microbiol. 1970. V.2. P.277-327.

10. Isolation of plasmids of nickel resistance from indigenous thiobacteria inhabiting nickel ores / A. Filonov [et al.] // The 3rd Congress of European Microbiologists. Gothenburg, Sweden, June 28-July 2, 2009.

11. Complete nucleotide sequence of an exogenously isolated plasmid, pLB1, involved in gamma-hexachlorocyclohexane degradation / R. Miyazaki [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. 2006. V.72, №11. P.6923-6933.

12. Influence of temperature on survival and conjugative transfer of multiple antibiotic-resistant plasmids in chicken manure and compost microcosms / J. Guan [et al.] // Poult. Sci. 2007. V.86, №4. P.610-613.

Ахметов Ленар Имаметдинович (akhmetovscience@rambler.ru), к.б.н., научный сотрудник, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.

Быков Александр Геннадьевич (agbykov@rambler.ru), магистрант, Пущин-ский государственный университет, старший лаборант-исследователь, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.

Вайнштейн Михаил Борисович (m_vainshtein@rambler.ru), д.б.н., профессор, ректор, Пущинский государственный университет, зам. директора, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.

Есикова Татьяна Зигфридовна (tesikova@mail.ru), к.б.н., старший научный сотрудник, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.

Филонов Андрей Евгеньевич (filonov.andrey@rambler.ru), к.б.н., доцент, Пущинский государственный университет, старший научный сотрудник, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.

Крылова Любовь Николаевна (krulov@yandex.ru), к.т.н., старший научный сотрудник, Московский институт стали и сплавов.

Мортазави Савиз (Saviz.Mortazavi@NRCan-RNCan.gc.ca), инженер-исследователь, Канадский центр инеральных и энергетических технологий, Оттава, Канада.

Nickel toxicity for thionic bacteria

L.I. Akhmetov, A.G. Bykov, M.B. Vainshtein, T.Z. Esikova,

A.E. Filonov, L.N. Krylova, S. Mortazavi

Abstract. The inhibiting effects of nickel on two bacterial cultures of Acidithiobacillus genus were studied. Their different resistance to nickel and common acute inhibition by chrome was shown. The approach to increasing the resistance of bacteria to high nickel concentrations by exogenous isolation of plasmids bearing nickel resistance genes was developed. The results obtained can be applied in bioremediation of biotopes polluted with heavy metals and industrial bioleaching of heavy metals from the ores.

Keywords : nickel, chrome, toxicity, Acidithiobacillus, Pseudomonas, plasmids.

Akhmetov Lenar (akhmetovscience@rambler.ru), candidate of biological sciences, researcher, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of RAS, Pushchino.

Bykov Alexander (agbykov@rambler.ru), undergraduate student, Pushchino State University, senior technician, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of RAS, Pushchino.

VainshteAn Mikhail (m_vainshtein@rambler.ru), doctor of biological sciences, professor, rector, Pushchino State University, deputy director, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of RAS, Pushchino.

Esikova Tatiana (tesikova@mail.ru), candidate of biological sciences, senior researcher, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of RAS, Pushchino.

Filonov Andrey (filonov.andrey@rambler.ru), candidate of biological sciences, associate professor, Pushchino State University, senior researcher, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganismsof RAS, Pushchino.

Krylova Lubov (krulov@yandex.ru), candidate of technical sciences, senior researcher, Moscow Institute of Steel and Alloys.

Mortazavi Saviz (Saviz.Mortazavi@NRCan-RNCan.gc.ca), design engineer, Canada Centre for Mineral and Energy Technology, Ottava, Canada.

Поступила 20.10.2009