ЯМР-спектроскопия тканей головного мозга и разработка способа определения концентрации метаболитов

ЯМР-СПЕКТРОСКОПИЯ ТКАНЕЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА И РАЗРАБОТКА СПОСОБА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ

МЕТАБОЛИТОВ Ю.И. Неронов, З.М. Гарайбех, В.К. Иванов

В работе анализируются возможные источники погрешности определения методом ЯМР-спектроскопии концентрации N-ацетиласпартата в тканях белого вещества головного мозга. Разработано программное обеспечение, которое позволяет минимизировать систематические погрешности и определять концентрацию N-ацетиласпартата с ошибкой несколько процентов.

ЯМР-спектроскопия высокого разрешения позволяет регистрировать сигналы от низкомолекулярных соединений in vivo, если временная химическая стабильность молекул превышает 0.01 сек. По этой причине в биологических тканях, содержащих тысячи сложных соединений, молекулярные группы которых участвуют в процессах химического синтеза и распада, лишь некоторые достаточно стабильные низкомолекулярные соединения могут регистрироваться ЯМР-спектрометром.

Современные ЯМР-томографы с высоким полем, как правило, комплектуют приставками для ЯМР-спектроскопии (например, томограф Magnetom-Vision с полем 1,5 Тл, установленный в ЦНИРРИ, Санкт-Петербург). Это позволяет выполнять сравнительный анализ ряда доступных для регистрации веществ, образующихся в результате процессов метаболизма (метаболитов). Однако для определения концентраций таких веществ с указанием погрешности результатов требуется разработка специальной экспериментальной методики и дополнительного программного обеспечения.

Особый интерес представляет концентрация в тканях мозга N-ацетиласпартата (NAA). Это соединение необходимо тканям для обеспечения передачи нервных импульсов. Для нормального состояния тканей белого вещества головного мозга концентрация NAA, вероятно, может служить мерой развитости нейронных сетей. Но исследования в этом направлении напрямую зависят от возможности повысить точность определения концентрации.

Рис. 1. Выбор области для накопления спектра

Для оценки возможных возрастных изменений были обследованы здоровые добровольцы от 19-и до 60-и лет. Применялась методика STEAM 10.0/5000/64 (интервалы между импульсом возбуждения и ЯМР-сигналом ТE = 10 мс; интервалы времени между высокочастотными импульсами ТR = 5000 мс; число повторных запусков для суммирования ЯМР-сигналов NA = 64) c использованием режима подавления сигналов воды [1].

Для определения абсолютных концентраций из этих же областей головного мозга накапливались сигналы от протонов растворителя (Н2О). Повторно использовалась та же импульсная последовательность с выключенным режимом

подавления ЯМР-сигнала воды, 16-разрядные АЦП регистрировали при этом и слабые сигналы метаболитов.

Перед накоплением данных выполнялась тщательная минимизация градиентов магнитного поля в области исследования для каждого добровольца. Область исследования выбиралась в форме "куба" (20x20x20 мм3) и размещалась в тканях белого вещества мозга (рис. 1). Спектральная информация накапливалась в виде числовых массивов по 1024 числа в шкале времени, которые затем пересылались для тщательной обработки на персональный компьютер.

Рис. 2. ЯМР-спектр белого вещества головного мозга, накопленный при

ТЕ=10 мс. По вертикали - относительные единицы; по горизонтали -химический сдвиг в миллионных долях (ppm) традиционной для ЯМР шкалы относительно тетраметилсилана. Интенсивные сигналы регистрируются от молекулярных соединений: N-ацетиласпартата - NAA (2.01, 2.48, 2.60, 2.64 ppm), фосфорокреатина - PCr (3.03, 3.94 ppm), холина - Cho (3.22 ppm), миоинозитола ml (3.56 ppm); более слабые сигналы регистрируются от таурина

(3.36 ppm), глютамата (2.11, 2.18, 2.28, 2.36, 3.77 ppm) и от липидных соединений. Для сравнения на спектре представлен также сигнал от протонов воды, уменьшенный по амплитуде в 1000 раз. Время накопления спектра:

ТА = 5 min 6 sec

Метаболиты, характерные для тканей белого вещества мозга здоровых людей, регистрировались на спектрах, восстановленных Фурье-преобразованием. На рис. 2 демонстрируются разрешающие возможности используемого нами прибора: аппаратурное разрешение AB/B = 3 х 10-8 не уступает лучшим приборам такого класса.

Если обеспечено постоянство коэффициента усиления аппарата в режимах накопления спектра и сигнала воды, то последующая совместная обработка накопленных ЯМР-сигналов х-метаболитов и Н2О позволяет определять абсолютные концентрации метаболитов (метод, который используется в Институте экспериментальной медицины, г. Прага, M.Hajek(ом) и др.). Однако сопоставление литературных данных и наша практика показывает, что результаты определения концентрации, как правило, содержат систематические погрешности, которые зависят как от методики получения исходных числовых массивов, так и от способа обработки данных.

Для расчета концентрации х-метаболита применяют следующее соотношение:

с(х) = C(H2O) S(x)NP(H20)exp[-TE/Г2(H20)] , 2 S (H20) Np( x )exp[-TE / T 2( x)]

где С(Н2О) = 40 Моль/литр - число молей молекул воды в исследуемой ткани (внутриклеточная вода; ЯМР-сигналы от молекул воды, входящих в состав биополимеров, не регистрируются данной методикой); S(x) - интенсивность (площадь) протонного сигнала х-метаболита; S(Н2О) - интенсивность сигнала от протонов воды ткани; Np(H20) = 2 - число протонов в молекуле воды; Np(x) - число эквивалентных протонов в молекулярной группе х-метаболита (Np(NAA) = 3 для основного сигнала -СНз-группы NAA); T2(x) - время спин-спиновой релаксации протонов; T2(H20) -время спин-спиновой релаксации протонов воды.

Сомножитель, содержащий отношение экспонент, характеризует поправку на уменьшение ЯМР-сигналов за время ТЕ из-за спин-спиновой релаксации (Т2). Однако постоянная Т2 может быть разной у разных пациентов, и, чтобы уменьшить влияние на точность результатов этого сомножителя, следует использовать минимальный параметр ТЕ, который допустим в режиме локального спектрального анализа: ТЕ=10 мс. При таком параметре сомножитель с отношением экспонент (1) может изменить результат не более чем на несколько процентов.

С другой стороны, при ТЕ=10 мс начинают проявляться более короткоживущие молекулярные соединения. Сигналы некоторых из них (например, глютамат и глютамин) расположены в той же частотной области, что и сигнал NAA (рис. 2). При этом концентрация этих веществ в тканях может быть непостоянной. По этой причине возникают систематические погрешности при определении площади сигнала NAA. Кроме этого, при ТЕ=10 мс ЯМР-сигнал от Н2О имеет существенно более сложную форму - кроме основной составляющей (внутриклеточная вода), присутствуют компоненты от протонов воды с широким спектром.

В широкой части ЯМР-спектра Н2О частично проявляются при ТЕ=10 мс те молекулы воды, которые вступают во взаимодействие с биополимерами. Кроме этого, частично проявляются процессы обмена протонами между молекулами Н2О и группами R-0H, R-NH различных соединений (см., например, [2]).

Отношение площадей сигналов S(NAA)/S(H20) можно определить как отношение A(NAA)Àv(NAA) /A(H20)Av(H20), где А(х) - амплитуда сигнала после Фурье-преобразования, Лу(х) - ширина сигнала. С целью минимизации погрешности была разработана такая методика определения концентрации NAA, которая не требует вычисления ширины сигнала. Ширина сигнала определяется эффективным временем спин-спиновой релаксации как Av(x) = 1/( п T2*(x)). Следовательно, для определения концентрации NAA можно использовать следующее соотношение:

C

2 '3A(H20)T2*(NAA) 2 2

Поскольку накопление спектра и накопление сигнала воды выполняется при одинаковой настройки спектрометра, то выражение для Т2*(х) в первом приближении будет иметь общее слагаемое уЛВ, описывающее уширение сигналов из-за неоднородности магнитного поля:

1/T2*(H20) = 1/T2(H20) + уЛВ,

1/T2*

Общее слагаемое уЛВ можно исключить из двух выражений (3). Используя преобразование, можно показать, что в формуле (2) вместо постоянной Т2 допустимо использовать постоянную Т2*. Причем при ТЕ=10 мс вносимая погрешность из-за приближенности выражений (3) не будет превышать 1 %.

Из каждого исходного числового массива (1024 числа) для Фурье-преобразования мы использовали 500 чисел. Этого было достаточно, поскольку за интервал времени

0.5 с ЯМР-сигналы уменьшаются до шумового фона. Процедура Фурье-преобразования в нашей программе повторяется для каждого массива (1024 числа) несколько раз. Первый спектр получали с учетом начальных чисел исходного массива, а каждый следующий начинался с отбросом начальных 10 чисел и учетом для Фурье-преобразования следующих 500 чисел исходного числового массива. Поскольку оцифровка на томографе проводилась с интервалом включения АЦП 1 мс, то каждому отбросу начальных 10 чисел соответствует дополнительная "задержка" в регистрации ЯМР-сигнала на 0.01 с.

30 т

25-. 20 \

5 ^

А

А

I I I I I I I I | I I I I I I I I I | I I I

0 500 1000

I I I I I | I I I I I I I I I | I I I I I I I I I | I I I I I I I I I | I I I

1500 2000 2500 3000

.....И I I

3500

......

4000

Рис. 3. Последовательность ЯМР-сигналов от протонов Н20 и ЫДД, полученная при исключении начальных чисел от 0 (первая пара сигналов) до 90 (последняя пара сигналов). По вертикали - относительная амплитуда, по горизонтали -последовательность сигналов с "задержкой" регистрации

Полученная таким образом последовательность ЯМР-сигналов после десяти Фурье-преобразований представлена на рис. 3. Как видим, уменьшение амплитуды сигналов как воды, так и КАА достаточно хорошо соответствует уменьшению по экспоненциальному закону А(/) = А0ехр(^/Г2*). Для определения Ао(х) и Т2*(х) использовалась процедура минимизации квадратичных отклонений для серии ЯМР-сигналов. Найденные постоянные Ао(х) и Т2*(х) далее использовались для вычисления С(х). При исключении из вычислительной процедуры начальных чисел исходного массива уменьшаются ЯМР-сигналы от протонов таких соединений, как глютамат, глютамин (из-за их более коротких констант Т2), соответственно уменьшается их влияние на погрешность определения С(х).

Используя вместо соотношения (1) соотношение (2), мы исключаем погрешности, связанные с погрешностями определения площадей асимметричных сигналов КАА и воды. Результаты расчетов по соотношению (2) представлены в табл. 1, концентрации даны в единицах ммоль/литр. Разработанный нами способ позволил обрабатывать спектры как с подавлением, так и без подавления сигнала воды. Указанная в табл. 1 для С(х) погрешность вычислялась по следующему выражению:

Д =

100

I (А(Г}) - А)2

N -1.5

где АI - амплитуда у'-ого сигнала, А(ф - амплитуда у'-ого сигнала, вычисленная по соотношению А(^) = А0ехр(-^/Г2*), суммирование квадратичных отклонений под корнем выполняли N раз, N - число использованных ЯМР-сигналов.

Основная погрешность связана с обработкой сигналов КЛЛ: А(КЛЛ) > А(Н2О). Для обследованных добровольцев вычисленная нами концентрация КЛЛ отличается незначительно. Сравним наши данные, например, с данными группы [5], которые были получены на аппарате Бгцкег МеёБр Б200 с полем 2 Тл для мужчины 62 лет: С(КЛЛ) = 11.12 шМ/Ь .

Таблица 1

J4s FLle-и возраст C*

1 NS-19 9.48 (+/- 6 %) 10.2 (+/-6%) 0.93

2 KZ-2Ü 12.6 (+/- 3 %) 12.7 (+/-4%) 0.99

3 DR-2Ü 12.1 (+/- 2 %) 11.6 (+/-2%) 1.04

4 GZ-22 11.4 (+/-7%) 9.6 (+/-4%) 1.19

5 AR-32 11.3 (+/-3 %) 10.1 (+/- 3 %) 1.12

6 BR-60 11.9 (+/-2%) 12.8 (+/- 2 %) 0.93

7 NR-6Ü 10.5 (+/-4%) 10.6 (+/- 2 %) 0.99

Среднее 11.33 11.10 1.02

N-ацетиласпартат является молекулярным соединением, которое требуется в данной среде для обеспечения передачи импульсов по нервным тканям [3, 4], и его концентрация, вероятно, пропорциональна средней плотности аксонов, дендритов и нервных клеток в белом веществе мозга. Как известно, число нервных клеток с возрастом уменьшается. Однако имеется и другая, противоположная тенденция [3]: число связей (дендритов) у активно функционирующего нейрона увеличивается с возрастом. Можно ожидать, что такая возрастная динамика плотности нейронных сетей будет отражаться на концентрации метаболитов, регистрируемых техникой ЯМР. Для более подробного обсуждения результатов потребуется накопление аналогичных данных для разных возрастных групп добровольцев. При определении С(№АА) необходимо использовать такие методики, которые, как и в представленном нами варианте, позволяют минимизировать влияние систематических погрешностей.

Литература

1. Frahm J., Michaelis T., Verboldt K.D., Bruhn H., Gyngell V.L., Hanicke W. Improvements in Localized Proton NMR Spectroscopy of Human Brain // J. Magnetic Resonance. V. 90. 1990. 464-473.

2. Неронов Ю.И., Рахимов З.. Исследование протонного обмена в растворах Н2О-С2Н5ОН-С5D5N // ЖСХ. 1971. Том 12, № 3. С. 392-396.

3. Фишбах Дж. Психика и мозг // Scientific American. 1992. Том 11,12. С. 10-20.

4. Тютин Л.А., Рохлин Г.Д., Неронов Ю.И., Руденко Д.И., Стуков Л.А. Протонная магнитно-резонансная спектроскопия головного мозга // Магнитно-резонансная томография в клинической практике. СПб: Изд. ЦНИРРИ, 1996. С. 67-71.

5. Rose S.E., Chalk J.D., Galloway G.J., Doddrell D.M.. Detection of dimethyl sulfone in the human brain by in vivo proton MRS // Magnetic Resonance Imaging. 2000. V. 18. P. 95-98.