АНТИТЕЛО ПРОТИВ ЛИПОАРАБИНОМАННАНА И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗЫВАЕМОЙ КИСЛОТОУСТОЙЧИВЫМИ БАКТЕРИЯМИ, С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АНТИТЕЛА
ANTIBODY AGAINST LIPOARABINOMANNAN AND IMMUNOASSAY OF INFECTIONS CAUSED BY ACID-FAST BACILLI, USING ANTIBODY

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, которое специфически связывается с липоарабиноманнаном кислотоустойчивых бацилл, таких как бацилла туберкулеза, и, конкретно, к одноцепочечному антителу (scFv) и его мультивалентному антителу.
Настоящее изобретение дополнительно относится к способу обнаружения кислотоустойчивых бацилл с использованием антител, конкретно, к способу диагностирования туберкулеза или способу диагностики туберкулеза; и реагенту для обнаружения кислотоустойчивой бациллы (например, реагенту для обнаружения туберкулеза), и набору для обнаружения кислотоустойчивой бациллы (например, набору для диагностики туберкулеза), которые предназначены для использования в вышеуказанном способе.
Настоящее изобретение дополнительно относится к способу определения лечебного эффекта в отношении туберкулеза противотуберкулезного лекарственного средства с использованием антитела; и набору для определения лечебного эффекта в отношении туберкулеза противотуберкулезного лекарственного средства, которые предназначены для использования в вышеуказанном способе.
Уровень техники
Туберкулез представляет собой инфекционное заболевание, которое досаждает людям в течение нескольких тысяч лет, и по оценкам, ¼ взрослого населения Европы в девятнадцатом веке умерло от туберкулеза. Благодаря улучшению жизненного уровня и открытию антибиотиков в двадцатом веке, туберкулез был практически искоренен в промышленных странах в 1950-е годы. Однако туберкулез все еще свирепствует как периодически повторяющееся заболевание. В настоящее время оценивают, что одна треть населения мира инфицирована туберкулезной бациллой (скрытая форма туберкулеза). Утверждают, что общее количество пациентов с впервые выявленным туберкулезом в мире составляет 9,4 миллиона, и оценивают, что 2 миллиона пациентов среди них умирают от него. В настоящее время, приблизительно 95% пациентов с активной формой туберкулеза живут в развивающихся странах, и 99% людей, которые умирают от туберкулеза, сконцентрированы в развивающихся странах.
В 1990-х годах, мировое сообщество осознало снова, что число случаев заболевания туберкулезом все еще продолжает возрастать, таким образом, туберкулез становится самым серьезным инфекционным заболеванием, становящимся центральной проблемой в развивающихся странах, требующей принятия полномасштабных мер. Мероприятия против туберкулеза проводятся в условиях глобального сотрудничества, такого как развертывание Непосредственно Наблюдаемого Лечения, с Сокращенным Курсом (DOTS), в наибольшей степени под эгидой Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ), основание “Партнерства для Прекращения Туберкулеза” для принятия мер при сотрудничестве стран, которых эта проблема непосредственно касается, стран, предоставляющих помощь, и организация помощи, и основание “Фонда Борьбы со СПИД, Туберкулезом и Малярией” как системы для предоставления финансовой поддержки. Многие из существующих технологий, которые применяют в качестве контрмер против туберкулеза, обычно применялись в течение нескольких десятков лет, без каких-либо улучшений. Следовательно, существует острая потребность в разработке новых технологий, которые являются эффективными в развивающихся странах.
При диагностики туберкулеза, наиболее важно обнаружить инфекцию туберкулезной бациллы на ранней стадии, чтобы начать терапию. В частности, поскольку пациенты, которые находятся в состоянии выделения бактерий, имеют крайне высокий риск распространения инфекции на окружающих людей, необходимо лечить этих пациентов в изолированном окружении, без какого-либо контакта с окружающими людьми. В качестве теста для этого существует “Бактериологический анализ туберкулеза” и тест на мазок мокроты, описанный в нем, применяют наиболее часто.
Тест мазка мокроты представляет собой метод для непосредственного наблюдения и обследования образца мазка мокроты под микроскопом (прямая микроскопия образца мазка мокроты), и был установлен Робертом Кохом более столетия назад. Микобактерий идентифицируют в клиническом тестируемом образце посредством окрашивания патогена туберкулеза. Метод диагностики туберкулеза, применяемый в настоящее время, был установлен посредством практического использования технологии, применяемой Кохом. Тест на туберкулезную бациллу в мазке является стандартным методом для диагностики туберкулеза в развивающихся странах, и его также применяют в качестве референтного при оценке эффективности осуществления нового метода тестирования.
Метод генной амплификации был установлен в качестве метода, который имеет более высокую чувствительность, чем тест мазка мокроты. Метод генной амплификации представляет собой метод для увеличения специфичного фрагмента ДНК по типу цепной реакции с использованием ДНК-полимеразы. Принцип этого метода состоит в амплификации ДНК, которая предназначена для тестирования, с использованием ДНК, подлежащей амплификации, одной пары ДНК-праймеров, которые являются комплементарными последовательностям по обоим концам ДНК, и термостойкой ДНК-полимеразы, и осуществлении повторяющихся температурных изменений. Несмотря на то что метод генной амплификации является удовлетворительным с позиций чувствительности, трудно применять данный метод в развивающихся странах вследствие пригодности к эксплуатации, оборудования и затрат.
В качестве последней глобальной тенденции, вследствие распространения туберкулеза, резистентного к множеству лекарственных средств, интерес направлен в сторону необходимости теста культуры и теста с амплификацией нуклеиновой кислоты. Однако, среди разнообразных бактериологических методов диагностики, которые существуют, тест мазка мокроты (прямой микроскопии мокроты) все еще считают центральным ядром стратегий контрмер против туберкулеза. Особенно в бедных ресурсами развивающихся странах, в которых распространяется туберкулез, тест мазка мокроты является не только эффективным диагностическим методом, но также играет важную роль в качестве средства для определения терапевтического эффекта.
Как описано выше, несмотря на то что тест мазка мокроты является ядром базовой стратегии борьбы с туберкулезом, количество работников, которые проводят бактериологическое исследование, во многих развивающихся странах является абсолютно недостаточным, и считают, что профессиональные качества таких работников являются проблематичными. Поскольку эффективность этого теста зависит от квалификации лаборантов, ежедневное обучение и контроль качества являются существенными, а они являются причинами для чрезмерного увеличения общих затрат. В дополнение, развивающиеся страны имеют много проблем с социальной инфраструктурой, решение которых требуется для улучшения лабораторного окружения, инструментов тестирования, технологий тестирования и т.п. Эти факторы становятся запутанными сложным образом, и в результате, неблагоприятно влияют на качество теста в немалой степени.
Кроме того, поскольку тест мазка мокроты является тестом для обнаружения и идентификации кислотоустойчивых бацилл, но не методом обнаружения туберкулезных бацилл, с помощью этого теста невозможно идентифицировать туберкулезные бациллы.
Что касается терапии туберкулеза в развитых странах, то терапию с использованием химического средства инициируют после идентификации туберкулезной бациллы; в то время как программу DOTS, осуществляемую в развивающихся странах, терапию с использованием химического средства, начинают, когда кислотоустойчивую бациллу обнаруживают в тесте мазка мокроты без идентификации туберкулезной бациллы. В настоящем описании, несмотря на то, химические средства, используемые для инфекции туберкулезных бацилл и инфекции нетуберкулезных туберкулезных кислотоустойчивых бацилл, являются различными, терапию проводят для нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл, в основном, применяя химическое средство для туберкулезной бациллы, поскольку лекарственное средство с высоким терапевтическим эффектом для нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл не было разработано. Следовательно, пациент должен нести риск побочных эффектов от химического средства. Представительные примеры рисков, на которые было обращено внимание, включают серьезные побочные эффекты, такие как снижение функции печени и потеря зрения, и распространение резистентных к лекарственному средству нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл.
Как описано выше, несмотря на существование нескольких проблем в известной до настоящего времени диагностике туберкулеза и его терапии, метод тестирования мазка мокроты, разработанный Кохом в 1882 г., все еще применяется сейчас для диагностики туберкулеза без каких-либо крупных улучшений. С целью решения проблем в развивающихся странах и вновь появляющихся странах, касающихся социальной инфраструктуры, необходимой для лабораторного окружения, инструментов для тестирования, технологий тестирования и т.д.; возможными являются две меры, т.е. “установление высокочувствительного и низкозатратного метода тестирования, который позволяет проводить высокопроизводительную обработку образцов, собранных в ограниченных местах, укомплектованных энергоснабжением и оборудованием” или “установление Пункта оказания помощи при тестировании (РОСТ), который является высокочувствительным, быстрым, простым и низкозатратным и, который осуществляет работу без использования инструментария, который требует энергоснабжения”.
Системы энергоснабжения и оборудование в развивающихся странах и вновь возникающих странах, также размещаются, если они находятся в очень ограниченной области. Дополнительно, центры тестирования, которые осуществляют относительно прогрессивные тесты, уже существуют в такой области, и некоторые здоровые пациенты могут использовать эти службы. Посредством использования таких центров тестирования, проблемы, такие как лабораторное оборудование, инструменты для тестирования, технологии тестирования и человеческие ресурсы, могут быть решены. В таком случае, необходимо транспортировать пациента или образец мокроты из места медицинского обследования в центр тестирования. Существуют несколько основных ограничений при транспортировке образцов мокроты, используемых для теста с амплификацией нуклеиновой кислоты или теста с культурой. Чтобы предотвратить загрязнение и рост нежелательных микробов, образцы должны быть немедленно помещены в холодильник после сбора мокроты, подлежащей транспортировке. Кроме того, поскольку для теста с культурой важно содержать бактерии в состоянии способности к росту, больше мер предосторожности требуется при сравнении с генетическим тестированием. Дополнительно, так как оба теста не могут осуществляться, когда с образцом проводят операцию по стерилизации, такую как тепловая обработка, образцы должны транспортироваться в строго контролируемом состоянии. Поскольку система, с помощью которой можно манипулировать такими ограничениями, включенная в транспорт образца, не установлена в развивающихся странах и вновь возникающих странах, важно установить аналитический тест, способный к обнаружению даже в образцах, прошедших операцию по стерилизации, применяемую к ним.
При реализации РОСТ важно обеспечить анализ в условиях клиники в течение короткого периода времени без использования специального оборудования и инструментов. Технология, применяемая наиболее часто для РОСТ, представляет собой иммунохроматографический тест (ИХТ). В целом, считается, что ИХТ уступает методам иммунологического анализа, таким как ELISA, по чувствительности. Следовательно, если проблемы должны решаться с использованием РОСТ, будет важным установить аналитическую систему, способную к обнаружению с высокой чувствительностью. Кроме того, в случае с РОСТ, поскольку работникам трудно предпринять меры по предотвращению инфекции посредством использования безопасных кабинетов и т.п., применяемых в центрах тестирования, существенной является стерилизационная обработка для снижения риска инфекции от образца.
Следовательно, является необходимым установить аналитический тест, способный к обнаружению с высокой чувствительностью в стерилизованных образцах для “установления высокочувствительного и низкозатратного метода тестирования, который обеспечивает высокопроизводительную обработку образцов, собранных в ограниченных местах, укомплектованных энергоснабжением и оборудованием” и “установление Пункта оказания помощи при тестировании (РОСТ), который является высокочувствительным, быстрым, простым и низкозатратным и, который осуществляет работу без использования инструмента, который требует энергоснабжения”. Чтобы это сделать, важным является выбор целевого антигена. В качестве антигенов, специфичных для туберкулезных бацилл, сообщают о белковых антигенах, таких как Ag85. Однако, поскольку белковые антигены являются быстроразрушаемыми и усваиваемыми in vivo, с ними едва ли может быть получена тонкая чувствительность.
Основные антигены у кислотоустойчивых бацилл включают гликолипиды, которые являются основными составными частями клеточных мембран и клеточных стенок. Гликолипидные антигены считаются одним из типов перспективных целевых антигенов, поскольку они являются высокоустойчивыми in vivo. Среди них, ЛАМ составляет 15% от компонентов бактериальной клетки, и представляет собой антиген, который привлекает внимание также с позиций его количества. Существует несколько сообщений о создании PoAb и MoAb с целью обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл в живых образцах (см. Непатентные литературные источники 1-4 (НПЛ 1-4)). В двух из этих сообщений, применяют ELISA для обнаружения липоарабиноманнана (далее в настоящем описании, также именуемого “ЛАМ”) в мокроте или моче. Однако, основные структуры ЛАМов у кислотоустойчивых бацилл являются почти одинаковыми, за исключением небольшого различия, наблюдаемого в структуре маннозной верхушки. В частности, у Mycobacterium avium, которая является бактерией, вызывающей инфекции кислотоустойчивыми бациллами наиболее часто, находясь на втором месте после туберкулезной бациллы, структура маннозной верхушки является почти такой же, как и у туберкулезной бациллы (см. непатентная литература 5 (НПЛ 5)). Следовательно, существует потребность в моноклональном антителе, способном специфически обнаруживать ЛАМ туберкулезной бациллы среди кислотоустойчивых бацилл.
Список цитируемых источников
Непатентная литература
NPL 1: Aharona Glatman-Freedman et al., “Monoclonal antibodies to surface antigens of Mycobacterium tuberculosis and their use in a modified Enzyme-Linked Immunosorbent Spot Assay for detection of Mycobacteria,” Journal of Clinical Microbiology, Nov. 1996, pp. 2795-2802.
NPL 2: Lenka M. Pereira Arias-Bouda et al., “Development of antigen detection assay for diagnosis of tuberculosis using sputum samples,” Journal of Clinical Microbiology, June 2000, pp. 2278-2283.
NPL 3: Beston Hamasur et al., “Rapid diagnosis of tuberculosis by detection of acid-fast bacillary lipoarabinomannan in urine,” Journal of Microbiological Methods, 45, 2001, pp. 41-52.
NPL 4: C. Boehme et al., “Detection of acid-fast bacillary lipoarabinomannan with an antigen-capture ELISA in unprocessed urine of Tanzanian patients with suspected tuberculosis”, Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 99, 2005, pp. 893-900.
NPL 5: Lipoarabinomannans: from structure to biosynthesis. Jérôme Nigou, Martine Gilleron, Germain Puzo, Biochimie 85 (2003) 153-166.
NPL 6: Winter et al., Annu. Rev. Immunol., 12:433, 1994.
NPL 7: K. Zuberbühler, Protein Engineering, Design & Selection, 22, 169 (2009).
Сущность изобретения
Техническая проблема
Целью настоящего изобретения является получение моноклонального антитела, которое специфически связывается с липоарабиноманнаном (далее в настоящем описании иногда называемым “ЛАМ”) кислотоустойчивых бацилл, таких как бацилла туберкулеза, и, конкретно, одноцепочечное антитело (scFv) и его мультивалентное антитело.
Еще одной целью настоящего изобретения является способ обнаружения кислотоустойчивых бацилл с использованием антитела или способ диагностики туберкулеза, реагент для обнаружения кислотоустойчивой бациллы (например, реагент для диагностики туберкулеза) и набор для обнаружения кислотоустойчивой бациллы (например, набор для диагностики туберкулеза) с использованием способа.
Дополнительной целью настоящего изобретения является способ определения лечебного эффекта в отношении туберкулеза противотуберкулезного лекарственного средства с использованием антител; и набор для определения лечебного эффекта в отношении туберкулеза противотуберкулезного лекарственного средства, которые предназначены для использования в вышеуказанном способе.
Решение проблемы
Посредством разработки метода получения или селекции подходящих иммунного животного, иммуногена и MoAb, авторы настоящего изобретения успешно разработали антитело и способ анализа, который может различать ЛАМ кислотоустойчивых бацилл от ЛАМ других бактерий или мембранных антигенов, структурно сходных с ним и специфически обнаруживать ЛАМ кислотоустойчивых бацилл с высокой чувствительностью, которая сравнима с чувствительностью методов обнаружения с амплификацией генов. Дополнительно, авторы настоящего изобретения успешно разработали антитело, которое может различать ЛАМ туберкулезных бацилл и ЛАМ кислотоустойчивых нетуберкулезных бацилл, и специфически обнаруживать ЛАМ туберкулезных бацилл.
Таким образом, настоящее изобретение включает следующие варианты осуществления.
(I) Моноклональное антитело (I-1), которое специфически связывается с липоарабиноманнаном (ЛАМ) кислотоустойчивых бацилл.
(I-1) Моноклональное антитело, которое является способным к связыванию с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, антитело, приведенное в любом из (А)-(С) ниже:
(А) моноклональное антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, соединенные через линкер, вариабельную область тяжелой цепи, содержащую тяжелые цепи CDR1-CDR3, показанные в (а)-(с) ниже, и легкие цепи, содержащие CDR1-CDR3, показанные в (d)-(f) ниже:
(а) тяжелая цепь CDR1, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1,
(b) тяжелая цепь CDR2, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2,
(c) тяжелая цепь CDR3, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3,
(d) легкая цепь CDR1, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4,
(e) легкая цепь CDR2, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:5, и
(f) легкая цепь CDR3, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6,
(B) моноклональное антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, соединенные через линкер, вариабельную область тяжелой цепи, содержащую тяжелые цепи CDR1-CDR3, показанные в (g)-(i) ниже, и легкие цепи, содержащие CDR1-CDR3, показанные в (j)-(l) ниже:
(g) тяжелая цепь CDR1, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:31,
(h) тяжелая цепь CDR2, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:32,
(i) тяжелая цепь CDR3, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:33,
(j) легкая цепь CDR1, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:34,
(k) легкая цепь CDR2, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:35 и
(l) легкая цепь CDR3, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:36 и
(C) моноклональное антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, соединенные через линкер, вариабельную область тяжелой цепи, содержащую тяжелые цепи CDR1-CDR3, показанные в (m)-(o) ниже, и легкие цепи, содержащие CDR1-CDR3, показанные в (p)-(r) ниже:
(m) тяжелая цепь CDR1, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:47,
(n) тяжелая цепь CDR2, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:48,
(o) тяжелая цепь CDR3, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:49,
(p) легкая цепь CDR1, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:50,
(q) легкая цепь CDR2, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:51 и
(r) легкая цепь CDR3, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:52.
(I-2) Моноклональное антитело в соответствии с (I-1), где вариабельная область тяжелой цепи моноклонального антитела из (А) состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:7.
(I-3) Моноклональное антитело в соответствии с (I-1) или (I-2), где вариабельная область тяжелой цепи моноклонального антитела из (А) состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:8.
(I-4) Моноклональное антитело в соответствии с любым из от (I-1) до (I-3), где линкер моноклонального антитела из (А) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11.
(I-5) Моноклональное антитело в соответствии с любым из от (I-1) до (I-4), где моноклональное антитело из (А) состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12.
(I-6) Моноклональное антитело в соответствии с любым из от (I-1) до (I-5), где моноклональное антитело из (А) способно к специфическому связыванию с ЛАМ туберкулезной бациллы, предпочтительно, туберкулезной бациллы человека (M. tuberculosis).
(I-7) Моноклональное антитело в соответствии с (I-1), где вариабельная область тяжелой цепи моноклонального антитела из (В) состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:37.
(I-8) Моноклональное антитело в соответствии с (I-1) или (I-7), где вариабельная область легкой цепи моноклонального антитела из (В) состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:38.
(I-9) Моноклональное антитело в соответствии с любым из (I-1), (I-7) и (I-8), где линкер моноклонального антитела из (В) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:40.
(I-10) Моноклональное антитело в соответствии с любым из (I-1) и (I-7)-(I-9), где моноклональное антитело из (В) состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:39.
(I-11) Моноклональное антитело в соответствии с (I-1), где вариабельная область тяжелой цепи моноклонального антитела из (С) состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:53.
(I-12) Моноклональное антитело в соответствии с (I-1) или (I-11), где вариабельная область легкой цепи моноклонального антитела из (С) состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:54.
(I-13) Моноклональное антитело в соответствии с любым из (I-1), (I-11) и (I-12), где линкер моноклонального антитела из (С) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11.
(I-14) Моноклональное антитело в соответствии с любым из (I-1) и (I-11)-(I-13), где моноклональное антитело из (С) состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:30.
(I-15) Моноклональное антитело в соответствии с любым из (I-1) и (I-7)-(I-14), где моноклональное антитело из (В) или (С) способно специфически связываться с нетуберкулезной кислотоустойчивой бациллой.
(I-16) Моноклональное антитело в соответствии с любым из (I-1)-(I-15), где моноклональное антитело из любого из (А)-(С) является моновалентным или бивалентным антителом.
(II) Способ иммунизации животного, не являющегося человеком, для продуцирования моноклонального антитела, которое специфически связывается с липоарабиноманнаном (ЛАМ) кислотоустойчивых бацилл, и способ получения моноклонального антитела.
(II-1) Способ иммунизации животного, не являющегося человеком, для продуцирования моноклонального антитела, которое специфически связывается с липоарабиноманнаном (ЛАМ) кислотоустойчивых бацилл, способ, включающий введение БЦЖ в качестве иммуногена животному, не являющемуся человеком, чтобы индуцировать гуморальный иммунный ответ на БЦЖ.
(II-2) Способ в соответствии с (II-1), где животное, не являющееся человеком, представляет собой кролика или цыпленка.
(II-3) Способ в соответствии с (II-1) или (II-2), где кислотоустойчивая бацилла представляет собой туберкулезную бациллу, предпочтительно, туберкулезную бациллу человека (M. tuberculosis).
(II-4) Способ получения моноклонального антитела, которое специфически связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, способ, включающий стадии:
введения БЦЖ в качестве иммуногена животному, не являющемуся человеком, чтобы индуцировать гуморальный иммунный ответ на БЦЖ и продуцировать антитело, которое связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл; и
сбор клеток, которые продуцируют антитело из животного, не являющегося человеком.
(II-5) Способ получения моноклонального антитела, которое специфически связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, способ, включающий стадии:
введения BCG в качестве иммуногена животному, не являющемуся человеком, чтобы индуцировать гуморальный иммунный ответ на БЦЖ;
получения мРНК, кодирующей антитело, которое связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл из животного, не являющегося человеком;
получения кДНК с использованием мРНК в качестве матрицы; и
сбора моноклональных антител, которые специфически связываются с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл посредством метода фагового дисплея с использованием кДНК.
(II-6) Способ в соответствии с (II-4) или (II-5), где животное, не являющееся человеком, представляет собой кролика или цыпленка.
(II-7) Способ в соответствии с любым из (II-4)-(II-6), где кислотоустойчивая бацилла представляет собой туберкулезную бациллу, предпочтительно, туберкулезную бациллу человека (M. tuberculosis).
(II-8) Способ в соответствии с любым из (II-4)-(II-7), где моноклональное антитело, которое специфически связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, представляет собой моноклональное антитело в соответствии с любым из (I-1)-(I-12).
(II-9) Способ в соответствии с любым из (II-4)-(II-8), где моноклональное антитело, которое специфически связывается с ЛАМ туберкулезной бациллы, предпочтительно, туберкулезной бациллы человека (M. tuberculosis), представляет собой моноклональное антитело из (А) в соответствии с любым из (I-1)-(I-6).
(II-10) Способ получения моноклонального антитела, которое специфически связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, способ, включающий стадии:
введения комплекса ЛАМ и моноклонального антитела из (А) в соответствии с любым из (I-1)-(I-6) в качестве иммуногена животному, не являющемуся человеком, для индуцирования гуморального иммунного ответа на комплекс; и получения антитела, которое связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл; и
сбора клеток, которые продуцируют антитело, из животного, не являющегося человеком.
(II-11) Способ получения моноклонального антитела, которое специфически связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, способ, включающий стадии:
введения комплекса ЛАМ и моноклонального антитела из (А) в соответствии с любым из (I-1)-(I-6) в качестве иммуногена животному, не являющемуся человеком, для индуцирования гуморального иммунного ответа на комплекс;
получения мРНК, кодирующей антитело, которое связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, из животного, не являющегося человеком;
получения кДНК с использованием мРНК в качестве матрицы; и
сбора моноклонального антитела, которое специфически связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, посредством метода фагового дисплея с использованием кДНК.
(II-12) Способ в соответствии с (II-10) или (II-11), где моноклональное антитело, которое специфически связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, представляет собой моноклональное антитело из (В) в соответствии с любым из (I-1) и (I-7)-(I-12).
(III) Способ обнаружения кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, туберкулезной бациллы.
(III-1) Способ обнаружения кислотоустойчивой бациллы, предпочтительно, туберкулезной бациллы, способ, включающий стадии:
(1) приведения моноклонального антитела в соответствии с любым из (I-1)-(I-16) в контакт с биологическим образцом индивида; и
(2) проведения анализа на кислотоустойчивую бациллу, предпочтительно, туберкулезную бациллу, которая существует в образце, с использованием, в качестве показателя, реакции связывания между моноклональным антителом и ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы.
(III-2) Способ в соответствии с (III-1), где в способе обнаружения туберкулезной бациллы используют моноклональное антитело из (А) в соответствии с любым из (I-1)-(I-6).
Среди приведенных выше способов обнаружения, способ обнаружения туберкулезной бациллы может быть перефразирован как способ диагностики туберкулеза у пациентов (способ диагностики туберкулеза).
(IV) Реагент для диагностики туберкулеза и набор для диагностики туберкулеза.
(IV-1) Реагент для диагностики туберкулеза, содержащий моноклональное антитело из (А) в соответствии с любым из (I-1)-(I-6).
(IV-2) Набор для диагностики туберкулеза, содержащий моноклональное антитело из (А) в соответствии с любым из (I-1)-(I-6) в качестве реагента для обнаружения туберкулеза.
(V) Способ измерения содержания липоарабиноманнана кислотоустойчивых бацилл (ЛАМ).
(V-1) Способ измерения содержания ЛАМ кислотоустойчивых бацилл в тестируемом образце, включающий стадии:
(1) приведения моноклонального антитела в соответствии с любым из (I-1)-(I-6) в контакт с тестируемым образцом, который может содержать кислотоустойчивую бациллу; и
(2) проведения анализа на ЛАМ кислотоустойчивых бацилл в тестируемом образце с использованием реакции связывания между моноклональным антителом и ЛАМ кислотоустойчивых бацилл в качестве показателя.
(V-2) Способ в соответствии с (V-1), который представляет собой способ качественной оценки ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, включающий обнаружение ЛАМ кислотоустойчивых бацилл как на стадии (2), или представляет собой способ количественной оценки ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, включающий количественное определение ЛАМ кислотоустойчивых бацилл как на стадии (2).
(V-3) Способ в соответствии с (V-1) или (V-2), где кислотоустойчивая бацилла представляет собой туберкулезную бациллу, предпочтительно, туберкулезную бациллу человека (M. tuberculosis).
(V-4) Способ в соответствии с (V-3), где моноклональное антитело представляет собой моноклональное антитело из (А) в соответствии с любым из (I-1)-(I-6).
(VI) Реагент для обнаружения липоарабиноманнана (ЛАМ) кислотоустойчивых бацилл или набор для его обнаружения.
(VI-1) Реагент для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, содержащий моноклональное антитело в соответствии с любым из (I-1)-(I-16).
(VI-2) Реагент для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, содержащий моноклональное антитело из (А) в соответствии с любым из (I-1)-(I-6).
(VI-3) Реагент в соответствии с (VI-2), где кислотоустойчивая бацилла представляет собой туберкулезную бациллу, предпочтительно, туберкулезную бациллу человека (M. tuberculosis).
(VI-4) Набор для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, содержащий моноклональное антитело в соответствии с любым из (I-1)-(I-16) в качестве реагента для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл.
(VI-5) Набор для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл в соответствии с (VI-4), где моноклональное антитело представляет собой моноклональное антитело из (А) в соответствии с любым из (I-1)-(I-6).
(VI-6) Набор для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл в соответствии с (VI-5), где кислотоустойчивая бацилла представляет собой туберкулезную бациллу, предпочтительно, туберкулезную бациллу человека (M. tuberculosis).
(VII) Анализ с использованием стерилизованного образца
(VII-1) Способ определения присутствия или отсутствия инфекции кислотоустойчивыми бациллами в тестируемом образце, включающий стадии:
(1) стерилизации тестируемого образца кипячением, предпочтительно, автоклавированием;
(2) приведения моноклонального антитела в соответствии с любым из (I-1)-(I-16), предпочтительно, моноклонального антитела из (А) или (В) в соответствии с любым из (I-1)-(I-6) или (I-7)-(I-10), в контакт со стерилизованным образцом; и
(3) проведения анализа на ЛАМ кислотоустойчивых бацилл в тестируемом образце с использованием реакции связывания между моноклональным антителом и ЛАМ кислотоустойчивых бацилл в качестве показателя; и
(4) определения того, что тестируемый образец инфицирован кислотоустойчивой бациллой, когда ЛАМ кислотоустойчивых бацилл обнаруживается в тестируемом образце.
(VII-2) Способ в соответствии с (VII-1), где моноклональное антитело представляет собой моноклональное антитело из (А) или (В) в соответствии с любым из (I-1)-(I-6) или (I-7)-(I-10), и кислотоустойчивая бацилла представляет собой туберкулезную бациллу.
(VIII) Способ определения лечебного эффекта противотуберкулезного лекарственного средства в отношении туберкулеза.
(VIII-1) Способ определения лечебного эффекта противотуберкулезного лекарственного средства в отношении туберкулеза, включающий стадии:
(1) приведения моноклонального антитела из (А) в соответствии с любым из (I-1)-(I-6) в контакт с обоими тестируемыми образцами до и после введения противотуберкулезного лекарственного средства;
(2) проведения анализа ЛАМ туберкулезной бациллы в тестируемых образцах до и после введения противотуберкулезного лекарственного средства с использованием реакции связывания между моноклональным антителом и ЛАМ туберкулезной бациллы в качестве показателя; и
(3) определения того, что противотуберкулезное лекарственное средство имеет лечебный эффект в отношении туберкулеза, когда ЛАМ туберкулезной бациллы обнаруживается в тестируемом образце перед введением противотуберкулезного лекарственного средства и, когда ЛАМ туберкулезной бациллы не обнаруживается в тестируемом образце после введения противотуберкулезного лекарственного средства.
(VIII-2) Способ определения лечебного эффекта противотуберкулезного лекарственного средства в отношении туберкулеза, включающий стадии:
(1) приведения моноклонального антитела из (А) в соответствии с любым из (I-1)-(I-6) в контакт с обоими тестируемыми образцами до и после введения противотуберкулезного лекарственного средства;
(2) количественного определения ЛАМ туберкулезной бациллы в тестируемых образцах до и после введения противотуберкулезного лекарственного средства с использованием реакции связывания между моноклональным антителом и ЛАМ туберкулезной бациллы в качестве показателя; и
(3) сравнения количества ЛАМ туберкулезной бациллы в тестируемом образце после введения противотуберкулезного лекарственного средства (измерение после введения) с количеством ЛАМ туберкулезной бациллы в тестируемом образце перед введением противотуберкулезного лекарственного средства (измерение перед введением); и определения того, что противотуберкулезное лекарственное средство имеет лечебный эффект в отношении туберкулеза, когда результат измерения после введения ниже результата измерения перед введением, и определения того, что противотуберкулезное лекарственное средство не имеет лечебного эффекта в отношении туберкулеза, когда результат измерения после введения не ниже результата измерения перед введением.
(IX) Набор для определения лечебного эффекта противотуберкулезного лекарственного средства в отношении туберкулеза.
(IX) Набор для определения лечебного эффекта противотуберкулезного лекарственного средства в отношении туберкулеза, содержащий моноклональное антитело из (А) в соответствии с любым из (I-1)-(I-6).
(X) Устройство для обнаружения кислотоустойчивых бацилл (туберкулезной бациллы).
(Х-1) Устройство для обнаружения кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, туберкулезной бациллы, содержащее поглощающий раствор фрагмент, образованный из материала, способного к переносу тестируемого образца посредством капиллярного действия, поглощающий раствор фрагмент, содержащий:
(1) часть для сбора образца для поглощения и сбора тестируемого образца;
(2) часть с мечеными антителами, являющуюся подложкой для меченого моноклонального антитела в соответствии с любым из (I-1)-(I-16), которое специфически реагирует с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл;
(3) часть для определения, включающая часть отображения результата тестирования,
(а) на которой иммобилизовано немеченое моноклональное антитело в соответствии с любым из (I-1)-(I-16), которое специфически реагирует с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл; и
(4) часть для поглощения раствора для поглощения остающегося раствора тестируемого образца, которая прошла через часть для сбора образца, часть с мечеными антителами и часть для определения.
(Х-2) Устройство для обнаружения кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, туберкулезной бациллы в соответствии с (Х-1), где часть для определения (3) дополнительно содержит часть для контроля отображения (b), на которой иммобилизовано немеченое антитело, которое реагирует с меченым моноклональным антителом в соответствии с любым из (I-1)-(I-16), причем часть для контроля отображения расположена отдельно от части отображения результата тестирования (а).
(Х-3) Устройство для обнаружения кислотоустойчивых бацилл в соответствии с (Х-1) или (Х-2), где моноклональное антитело представляет собой моноклональное антитело из (А) в соответствии с любым из (I-1)-(I-6), и кислотоустойчивая бацилла представляет собой туберкулезную бациллу, предпочтительно, туберкулезную бациллу человека (M. tuberculosis).
Преимущественные эффекты изобретения
В соответствии с настоящим изобретением, кислотоустойчивые бациллы, которые существуют в биологическом образце индивида (мокроте, слюне, крови, промывной жидкости из легких, желудочном соке, моче, фекалиях, коже или панкреатическом соке) могут быть отличены от других бактерий и специфически обнаружены. Способ обнаружения кислотоустойчивых бацилл в соответствии с настоящим изобретением имеет чувствительность и специфичность, которые сравнимы с чувствительностью и специфичностью способов обнаружения с использованием генной амплификации. Поскольку способ обнаружения кислотоустойчивых бацилл в соответствии с настоящим изобретением может определить количество кислотоустойчивых бацилл в живом организме, лечебный эффект по отношению к кислотоустойчивым бациллам, особенно при туберкулезе, может подвергаться мониторингу. Дополнительно, способ обнаружения кислотоустойчивых бацилл в соответствии с настоящим изобретением может надежно и точно обнаруживать кислотоустойчивые бациллы даже в стерилизованных целевых образцах проб в течение по меньшей мере одной недели после стерилизации. Следовательно, даже в области, не имеющей специальной системы транспортировки образцов для предотвращения инфекции, образцы, если они простерилизованы, могут перемещаться посредством общих систем транспортировки, таких как почта.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, туберкулезная бацилла, которая существует в биологическом образце пациента с туберкулезом, может быть отличена от нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл и специфически обнаружена. Следовательно, с помощью настоящего изобретения можно диагностировать инфекцию туберкулезной бациллы с высокой точностью. Кроме того, с высокой точностью могут быть определены лечебные эффекты противотуберкулезных лекарственных средств у пациентов с туберкулезом.
Краткое описание чертежей
[ФИГ. 1] На фиг. 1 (А) и (В) представлены обе диаграммы, показывающие (вид сбоку) принципы работы устройства для обнаружения туберкулезной бациллы (устройства для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы) настоящего изобретения. Диаграмма (А) показывает режим работы, при котором часть для определения (3) имеет только часть для отображения результата тестирования (а), и диаграмма (В) показывает режим работы, при котором часть для определения (3) имеет как часть для отображения результата тестирования (а), так и часть контроля отображения (b). Условные обозначения на фигуре указывают следующее. 10: подложка, 21: образующая лист часть для сбора образца (1), 22: образующая лист часть меченого антитела (2), 23: образующая лист часть для определения (3), 24: образующая лист часть для поглощения раствора (4), (а) часть для отображения результата тестирования, (b) часть для контроля отображения, (1) часть для сбора образца, (2) часть для меченого антитела, (3) часть для определения, (4): часть для поглощения образца, Р: стрелка, показывающая направление потока тестируемого образца. (То же самое применяется к фиг. 2.)
[ФИГ. 2] Фиг. 2 показывает (вид в перспективе) один режим работы устройства для обнаружения туберкулезной бациллы (устройства для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы) по настоящему изобретению.
[ФИГ. 3] Фиг. 3 показывает результат измерения титра антител в крови кроликов, каждого из которых подкожно иммунизировали с использованием вакцины БЦЖ или убитыми бактериальными клетками H37Ra, посредством метода ELISA с использованием антигенных планшетов с иммобилизованными на них ЛАМ M. tuberculosis (--) и ЛАМ M. avium (-●-) (Ссылочный Пример 1 (2)). (А) показывает результат у кроликов, иммунизированных вакциной БЦЖ, и (В) показывает результат у кроликов, иммунизированных убитыми бактериальными клетками H37Ra.
[ФИГ. 4] Фиг. 4 показывает аминокислотные последовательности scFv, имеющих реактивность к ЛАМ. Более конкретно, сделано сравнение между верхним рядом, показывающим аминокислотную последовательность (SEQ ID NO:30) scFv (Myco-scFv), полученную из клеток селезенки кролика, иммунизированного убитыми бактериальными клетками H37Ra и нижним рядом, показывающим аминокислотную последовательность (SEQ ID NO:12) scFv (TB-scFv), полученную из клеток селезенки кролика, иммунизированного вакциной БЦЖ, вместе c соответствующими положениями областей CDR1-CDR3 в вариабельных областях тяжелой цепи, линкера и областей CDR1-CDR3 в вариабельных областях легкой цепи. Следует отметить, что по отношению к линкерной последовательности, имеющей четыре сериновых остатка, связанных с ее N-концом, аминокислотная область на N-концевой стороне показывает область VH, а область на С-концевой стороне показывает область VL.
[ФИГ. 5] Фиг. 5 показывает результат оценки реактивности TB-scFv по отношению к ЛАМ. Реактивность TB-scFv к ЛАМ, полученных из кролика, иммунизированного вакциной БЦЖ, оценивали с помощью ELISA, используя планшеты, с иммобилизованными на них ЛАМ из M. tuberculosis и ЛАМ из M. avium. На ФИГ. 5 “” указывает на реактивность против ЛАМ M. tuberculosis, а “●” указывает на реактивность против M. avium.
[Фиг. 6] Фиг. 6 показывает результат оценки обнаружения с помощью ELISA ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и обнаружения с помощью ELISA ЛАМ туберкулезной бациллы. Реактивность против ЛАМ при обнаружении ЛАМ кислотоустойчивых бацилл с помощью ELISA и при обнаружении ЛАМ туберкулезной бациллы с помощью ELISA оценивали, используя очищенный ЛАМ из M. tuberculosis и ЛАМ из M. avium. На фиг. 6 “●” указывает на реактивность против ЛАМ M. tuberculosis при обнаружении ЛАМ кислотоустойчивых бацилл с помощью ELISA, “” указывает на реактивность против ЛАМ M. avium при обнаружении ЛАМ кислотоустойчивых бацилл с помощью ELISA, “○” указывает на реактивность против ЛАМ M. tuberculosis при обнаружении ЛАМ туберкулезной бациллы с помощью ELISA, “” указывает на реактивность против ЛАМ M. avium при обнаружении ЛАМ туберкулезной бациллы с помощью ELISA.
[ФИГ. 7] Фиг. 7 показывает результат оценки комбинации антител. Оценку комбинации антител проводили с использованием обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл с помощью ELISA и обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы с помощью ELISA, применяя клинические изоляты кислотоустойчивых бацилл. Реактивность против каждого из штаммов показана с помощью плотности цвета. На фиг. 7, myco указывает на результаты обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл с помощью ELISA, а ТВ указывает на результаты обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы с помощью ELISA.
[ФИГ. 8] Фиг. 8 показывает результаты оценки иммунохроматографического теста обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и иммунохроматографического теста обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы. Реактивность против ЛАМ при иммунохроматографическом тесте обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и при иммунохроматографическом тесте обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, оценивали, используя очищенный ЛАМ из M. tuberculosis (А и В) и ЛАМ из M. avium (C и D). На каждой из фигур “myco” указывает на результат обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл при иммунохроматографическом тесте, а “ТВ” указывает на результат обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы при иммунохроматографическом тесте.
[ФИГ. 9] Фиг. 9 показывает титр антител против ЛАМ в антисыворотке цыплят (Пример 5). На фиг. 9, “-●-” указывает на реактивность против очищенного ЛАМ штамма Аояма В туберкулезной бациллы (M. tuberculosis), а “--” указывает на реактивность против очищенного ЛАМ M. avium.
[ФИГ. 10] Фиг. 10 показывает аминокислотную последовательность одноцепочечного антитела G3-scFv, выделенного из библиотеки scFv курицы, вместе с положениями областей CDR1, CDR2 и CDR3 в вариабельной области тяжелой цепи, области GS-линкера и областями CDR1, CDR2 и CDR3 в вариабельной области легкой цепи.
[ФИГ. 11] Фиг. 11 показывает реактивность обнаружения ЛАМ методом ELISA с использованием бивалентного антитела (Пример 7). На ФИГ. 11 “-●-” указывает на реактивность против БЦЖ в методе обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы с применением ELISA, а “--” указывает на реактивность против БЦЖ в методе обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацил с применением ELISA.
[ФИГ. 12] Фиг. 12 показывает чувствительность обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацил с применением ELISA с использованием бивалентного антитела (Пример 8). На чертеже таблица представляет собой сравнение чувствительности обнаружения между тестом с использованием амплификации нуклеиновой кислоты (NAAT) и обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацил с применением ELISA.
[ФИГ. 13] Фиг. 13 показывает результат теста на перекрестную реактивность для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацил с применением ELISA по отношению к бактериям полости рта (Пример 9). На чертеже, “Na” означает бактериальные клетки N. asteroides, “Nf” означает бактериальные клетки N. farcinica, “Sg” означает бактериальные клетки Streptomyces, “Ca” означает бактериальные клетки C. albicans, “Ai” означает бактериальные клетки Actinomycete и “Tp” означает бактериальные клетки T. paurometabolum. В настоящем описании показаны результаты обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацил с применением ELISA, проведенного с использованием ЛАМ, экстрагированного из каждого типа этих культивированных клеток и культивированных бактериальных клеток БЦЖ.
[ФИГ. 14] Фиг. 14 показывает реактивность против клинических изолятов кислотоустойчивых бацил в методе обнаружения ЛАМ с применением ELISA с использованием бивалентного антитела (Пример 10). На чертеже, “A” показывает результаты анализа 38 клинических изолятов туберкулезной бациллы, а “B” показывает результаты анализа 29 штаммов нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл (23 штамма M. avium, 6 штаммов M. intracellulare). Как для А, так и для В, на чертеже, черные столбцы представляют результаты анализа на обнаружение ЛАМ кислотоустойчивых бацил с применением ELISA, а белые столбцы представляют результаты анализа на обнаружение ЛАМ туберкулезной бациллы с применением ELISA. Из 29 штаммов нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл на В № 1-23 представляют результаты для 23 штаммов M. avium, а номера 24-29 являются результатами для M. intracellulare.
[ФИГ. 15] Фиг. 15 показывает отношения (значение для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацил с применением ELISA/значение для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы с применением ELISA) реактивности при обнаружении ЛАМ кислотоустойчивых бацил с применением ELISA и обнаружении ЛАМ туберкулезной бациллы с применением ELISA.
[ФИГ. 16] Фиг. 16 показывает реактивность против клинических образцов мокроты при обнаружении ЛАМ туберкулезной бациллы с применением ELISA (левый чертеж) и обнаружении ЛАМ кислотоустойчивых бацилл с применением ELISA с использованием бивалентного антитела (правый чертеж) (Пример 11). На чертеже “I” показывает результаты группы образцов, у которых обнаружена отрицательная реакция в тесте с мокротой, “II” показывает результаты образцов, которые являются “недостаточными” в тесте с мокротой, и у которых обнаружена отрицательная реакция в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты, “III” показывает результаты группы образцов, у которых обнаружена отрицательная реакция в тесте с мокротой и положительная реакция в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты, “IV” показывает результаты образцов, которые являются “недостаточными” в тесте с мокротой, и у которых обнаружена положительная реакция в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты, “V” показывает результаты группы образцов, которые имели балльную оценку 1+ в тесте с мокротой, “VI” показывает результаты группы образцов, которые имели балльную оценку 2+ в тесте с мокротой, и “VII” показывает результаты группы образцов, которые имели балльную оценку 3+ в тесте с мокротой. Следует отметить, что образцы, балльная оценка которых была равна и выше чем 1+ в тесте с мокротой, все имели положительную реакцию в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты. Кроме того, пунктирные линии показывают условные значения.
[ФИГ. 17] Фиг. 17 показывает корреляцию между числом бактериальных клеток и концентрацией ЛАМ, обнаруженного при обнаружении ЛАМ с помощью ELISA (Пример 11). На чертеже “I” показывает результаты группы образцов, у которых обнаружена отрицательная реакция в тесте с мокротой и отрицательная реакция в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты, “II” показывает результаты группы образцов, у которых обнаружена отрицательная реакция в тесте с мокротой и положительная реакция в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты, “III” показывает результаты группы образцов, которые являются “недостаточными” в тесте с мокротой, и у которых обнаружена положительная реакция в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты, “IV” показывает результаты группы образцов, которые имели балльную оценку 1+ в тесте с мокротой, “V” показывает результаты группы образцов, которые имели балльную оценку 2+ в тесте с мокротой, и “VI” показывает результаты группы образцов, которые имели балльную оценку 3+ в тесте с мокротой. Следует отметить, что образцы, балльная оценка которых была равна и выше, чем 1+ в тесте с мокротой, все имели положительную реакцию в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты. Кроме того, линия в каждой из групп образцов указывает среднее значение концентрации ЛАМ.
[ФИГ. 18] Фиг. 18 показывает устойчивость ЛАМ кислотоустойчивых бацилл против стерилизационной обработки. Белые столбцы показывают результаты анализа бактериальных клеток, которые не были стерилизованы, черные столбцы показывают результаты анализа бактериальных клеток, которые кипятили при 100°С в течение 30 минут, и серые столбцы показывают результаты анализа бактериальных клеток, которые стерилизовали паром высокого давления (автоклавировали при 121°С в течение 15 минут) (Пример 12).
[ФИГ. 19] Фиг. 19 показывает стабильность ЛАМ при хранении после стерилизационной обработки паром высокого давления (автоклавирования). Белые столбцы показывают результаты анализа бактериальных клеток немедленно после стерилизационной обработки паром высокого давления, а черные столбцы показывают результаты анализа бактериальных клеток, которые были оставлены при 25°С в течение 7 дней после стерилизационной обработки паром высокого давления (Пример 12).
Описание вариантов осуществления
(I) Моноклональное антитело, которое специфически связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл
Туберкулезные бациллы принадлежат к роду Mycobacterium семейства Mycobacteriaceae и представляют собой тип бактериальной группы, именуемой вместе с другими бактериями, принадлежащими к роду Mycobacterium, кислотоустойчивые бациллы. Однако, туберкулезные бациллы отличаются от других кислотоустойчивых бацилл (нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл) по тому факту, что они могут расти при 37°С, но не при 28°С и по тому факту, что они имеют термостойкую каталазу. Известны четыре типа туберкулезных бацилл, т.е. туберкулезная бацилла (Mycobacterium tuberculosis, туберкулезная бацилла человека), бычья туберкулезная бацилла (M. bovis, бычья туберкулезная бацилла, бычья бацилла), Mycobacterium africanum (M. africanum), и туберкулезная бацилла серой полевки (M. microti). Среди них, туберкулезная бацилла человека (M. tuberculosis) является патогенной для человека в качестве бактерии, вызывающей туберкулез, а M. bovis и M. africanum инфицируют человека в редких случаях. M. microti не является патогенной для человека. Кроме того, БЦЖ получают посредством ослабления M. bovis через последовательное длительное субкультивирование, и применяют в качестве вакцины (вакцины с ослабленными живыми бактериями) для предотвращения туберкулеза.
Моноклональное антитело (далее в настоящем описании также именуемое как “MoAb”), которое является предметом (основным пунктом формулы) настоящего изобретения, представляет собой антитело, которое различает и специфически распознает кислотоустойчивые бациллы среди других бактерий, существующих in vivo. Более конкретно, оно является антителом, которое различает липоарабиноманнан (ЛАМ) кислотоустойчивых бацилл от других подобных ЛАМ антигенов или бактерий и специфически связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл. ЛАМ, описанный в настоящем описании, представляет собой один из основных липогликанов, образующих клеточные мембраны и клеточные стенки бактерий у рода Mycobacterium (кислотоустойчивых бацилл), включающего туберкулезные бациллы. Обычно, ЛАМ включает якорный остаток маннозилфосфатидилинозита (МФИ), сахарный остов, содержащий центральную часть из D-маннана и домен D-арабинана и покрывающий мотив. Однако, в зависимости от типа бактерий, существуют различия по количеству остатков сахара (например, маннозы), включенных в молекулу, разветвленной структуре сахарной цепи, числу ацильных групп и типу жирных кислот, образующих ацильные группы.
Конкретно, MoAb по настоящему изобретению включает антитело со структурой, в которой вариабельная область тяжелой цепи, содержащая тяжелую цепь CDR1-CDR3 следующих (а)-(с) и вариабельная область легкой цепи, содержащая легкую цепь CDR1-CDR3 следующих (d)-(f), соединены через линкер. Для удобства это MoAb также называют “MoAb1”.
(а) Тяжелая цепь CDR1, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1,
(b) Тяжелая цепь CDR2, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2,
(c) Тяжелая цепь CDR3, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3,
(d) Легкая цепь CDR1, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4,
(e) Легкая цепь CDR2, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:5, и
(f) Легкая цепь CDR3, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6.
Кроме того, особенным образом, MoAb по настоящему изобретению включает антитело со структурой, в которой вариабельная область тяжелой цепи, содержащая тяжелую цепь CDR1-CDR3 следующих (g)-(i), и вариабельная область легкой цепи, содержащая легкую цепь CDR1-CDR3 следующих (j)-(l), соединены через линкер. Для удобства это MoAb также называют “MoAb2”.
(g) Тяжелая цепь CDR1, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:31,
(h) Тяжелая цепь CDR2, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:32,
(i) Тяжелая цепь CDR3, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:33,
(j) Легкая цепь CDR1, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:34,
(k) Легкая цепь CDR2, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:35, и
(l) Легкая цепь CDR3, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:36.
Еще дополнительно, особенным образом, MoAb по настоящему изобретению включает антитело со структурой, в которой вариабельная область тяжелой цепи, содержащая тяжелую цепь CDR1-CDR3 следующих (m)-(o), и вариабельная область легкой цепи, содержащая легкую цепь CDR1-CDR3 следующих (p)-(r), соединены через линкер. Для удобства это MoAb также называют “MoAb3”.
(m) тяжелая цепь CDR1, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:47,
(n) тяжелая цепь CDR2, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:48,
(o) тяжелая цепь CDR3, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:49,
(p) легкая цепь CDR1, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:50,
(q) легкая цепь CDR2, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:51, и
(r) легкая цепь CDR3, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:52.
В настоящем описании, “CDR” представляет собой сокращение от “Области определения комплементарности”, называемой также областью, определяющей комплементарность. CDR являются областями, которые существуют в вариабельной области иммуноглобулина, и представляют собой области, глубоко вовлеченные в специфическое связывание антитела с антигеном. Среди них, “CDR тяжелой цепи” относится к CDR, которая существует в вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, а “CDR легкой цепи” относится к CDR, которая существует в вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина.
Вариабельная область тяжелой цепи представляет собой область, содержащую CDR1-CDR3 тяжелой цепи, а вариабельная область легкой цепи представляет собой область, содержащую CDR1-CDR3 легкой цепи. Несмотря на то что не существует конкретного ограничения на порядок расположения этих CDR1-CDR3, предпочтительно, как в вариабельной области тяжелой цепи, так и в вариабельной области легкой цепи, CDR1, CDR2 и CDR3 расположены в этом порядке в направлении от N-концевой стороны до С-концевой стороны непрерывно или через другие аминокислотные последовательности.
Вариабельная область тяжелой цепи и/или вариабельная область легкой цепи MoAb по настоящему изобретению могут иметь, в качестве других аминокислотных последовательностей, аминокислотную последовательность, называемую каркасной областью (далее в настоящем описании, просто именуемую “FR”) в области в описанных выше вариабельных областях, исключая CDR1-CDR3, описанные выше. Аминокислотная последовательность FR может являться аминокислотной последовательностью, являющейся производной из каркасной области (FR) вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, ее варианта или ее частичной модификации, полученной посредством введения сайта распознавания рестрикционного фермента по одной части аминокислотной последовательности, являющейся производной из FR.
В вариабельных областях тяжелой цепи иммуноглобулина, например, область между N-концом вариабельной области тяжелой цепи и CDR1, описанной выше, определяют как “FR1”, область между CDR1 и CDR2 определяют как “FR2”, область между CDR2 и CDR3 определяют как “FR3”, область между CDR3 и С-концом вариабельной области тяжелой цепи определяют как “FR4”. Аналогично, в вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, например, область между N-концом вариабельной области легкой цепи и CDR1 определяют как “FR1”, область между CDR1 и CDR2 определяют как “FR2”, область между CDR2 и CDR3 определяют как “FR3”, и область между CDR3 и С-концом вариабельной области определяют как “FR4”.
Эти FR имеют функцию линкера, соединяющего каждую из описанных выше CDR1, CDR2 и CDR3, которые являются важными в качестве последовательностей распознавания антигена и представляют собой области, способствующие образованию трехмерной конформации вариабельных областей.
В MoAb1 по настоящему изобретению, вариабельная область тяжелой цепи, предпочтительно, имеет аминокислотную последовательность из 119 аминокислотных остатков SEQ ID NO:7, а вариабельная область легкой цепи, предпочтительно, имеет аминокислотную последовательность из 112 аминокислотных остатков SEQ ID NO:8. В SEQ ID NO:7, показывающей аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, область от N-конца до 30-ой аминокислоты соответствует “FR1” вариабельной области тяжелой цепи, область аминокислот от 31-ой аминокислоты до 35-ой аминокислоты соответствует “CDR1” (SEQ ID NO:1) вариабельной области тяжелой цепи, область аминокислот от 36-ой аминокислоты до 49-ой аминокислоты соответствует “FR2”, область аминокислот от 50-ой аминокислоты до 65-ой аминокислоты соответствует “CDR2” (SEQ ID NO:2), область аминокислот от 66-ой аминокислоты до 96-ой аминокислоты соответствует “FR3”, область аминокислот от 97-ой аминокислоты до 106-ой аминокислоты соответствует “CDR3” (SEQ ID NO:3), и область аминокислот от 107-ой аминокислоты до 119-ой аминокислоты соответствует “FR4”.
Кроме того, в SEQ ID NO:8, показывающей аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи MoAb1 по настоящему изобретению, область от N-конца до 23-ей аминокислоты соответствует “FR1” вариабельной области легкой цепи, область аминокислот от 24-ой аминокислоты до 36-ой аминокислоты соответствует “CDR1” (SEQ ID NO:4) вариабельной области легкой цепи, область аминокислот от 37-ой аминокислоты до 51-ой аминокислоты соответствует “FR2”, область аминокислот от 52-ой аминокислоты до 58-ой аминокислоты соответствует “CDR2” (SEQ ID NO:5), область аминокислот от 59-ой аминокислоты до 89-ой аминокислоты соответствует “FR3”, область аминокислот от 90-ой аминокислоты до 102-ой аминокислоты соответствует “CDR3” (SEQ ID NO:6), и область аминокислот от 103-ей аминокислоты до 112-ой аминокислоты соответствует “FR4”.
В MoAb2 по настоящему изобретению, вариабельная область тяжелой цепи, предпочтительно, имеет аминокислотную последовательность из 130 аминокислотных остатков, приведенных в SEQ ID NO:37, а вариабельная область легкой цепи, предпочтительно, имеет аминокислотную последовательность из 116 аминокислотных остатков SEQ ID NO:38. В SEQ ID NO:37, показывающей аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, область от N-конца до 35-ой аминокислоты соответствует “FR1” вариабельной области тяжелой цепи, область аминокислот от 36-ой аминокислоты до 40-ой аминокислоты соответствует “CDR1” (SEQ ID NO:31) вариабельной области тяжелой цепи, область аминокислот от 41-ой аминокислоты до 54-ой аминокислоты соответствует “FR2”, область аминокислот от 55-ой аминокислоты до 74-ой аминокислоты соответствует “CDR2” (SEQ ID NO:32), область аминокислот от 75-ой аминокислоты до 106-ой аминокислоты соответствует “FR3”, область аминокислот от 107-ой аминокислоты до 119-ой аминокислоты соответствует “CDR3” (SEQ ID NO:33), и область аминокислот от 120-ой аминокислоты до 130-ой аминокислоты соответствует “FR4”.
Кроме того, в SEQ ID NO:38, показывающей аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи MoAb2 по настоящему изобретению, область от N-конца до 20-ой аминокислоты соответствует “FR1” вариабельной области легкой цепи, область аминокислот от 21-ой аминокислоты до 28-ой аминокислоты соответствует “CDR1” (SEQ ID NO:34) вариабельной области легкой цепи, область аминокислот от 29-ой аминокислоты до 44-ой аминокислоты соответствует “FR2”, область аминокислот от 45-ой аминокислоты до 51-ой аминокислоты соответствует “CDR2” (SEQ ID NO:35), область аминокислот от 52-ой аминокислоты до 83-ей аминокислоты соответствует “FR3”, область аминокислот от 84-ой аминокислоты до 95-ой аминокислоты соответствует “CDR3” (SEQ ID NO:36), и область аминокислот от 96-ой аминокислоты до 116-ой аминокислоты соответствует “FR4”.
В MoAb3 по настоящему изобретению, вариабельная область тяжелой цепи, предпочтительно, имеет аминокислотную последовательность из 121 аминокислотного остатка SEQ ID NO:53, а вариабельная область легкой цепи, предпочтительно, имеет аминокислотную последовательность из 110 аминокислотных остатков SEQ ID NO:54. В SEQ ID NO:53, показывающей аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, область от N-конца до 30-ой аминокислоты соответствует “FR1” вариабельной области тяжелой цепи, область аминокислот от 31-ой аминокислоты до 35-ой аминокислоты соответствует “CDR1” (SEQ ID NO:47) вариабельной области тяжелой цепи, область аминокислот от 36-ой аминокислоты до 49-ой аминокислоты соответствует “FR2”, область аминокислот от 50-ой аминокислоты до 65-ой аминокислоты соответствует “CDR2” (SEQ ID NO:48), область аминокислот от 66-ой аминокислоты до 96-ой аминокислоты соответствует “FR3”, область аминокислот от 97-ой аминокислоты до 108-ой аминокислоты соответствует “CDR3” (SEQ ID NO:49), и область аминокислот от 109-ой аминокислоты до 121-ой аминокислоты соответствует “FR4”.
Кроме того, в SEQ ID NO:54, показывающей аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи MoAb3 по настоящему изобретению, область от N-конца до 23-ей аминокислоты соответствует “FR1” вариабельной области легкой цепи, область аминокислот от 24-ой аминокислоты до 34-ой аминокислоты соответствует “CDR1” (SEQ ID NO:50) вариабельной области легкой цепи, область аминокислот от 35-ой аминокислоты до 49-ой аминокислоты соответствует “FR2”, область аминокислот от 50-ой аминокислоты до 56-ой аминокислоты соответствует “CDR2” (SEQ ID NO:51), область аминокислот от 57-ой аминокислоты до 87-ой аминокислоты соответствует “FR3”, область аминокислот от 88-ой аминокислоты до 100-ой аминокислоты соответствует “CDR3” (SEQ ID NO:52), и область аминокислот от 101-ой аминокислоты до 110-ой аминокислоты соответствует “FR4”.
Поскольку преимущественные эффекты MoAb1 и MoAb2 по настоящему изобретению не являются предметом компромисса, возможно вводить мутацию в любую из аминокислотных последовательностей, соответствующих FR1-FR4 вариабельной области тяжелой цепи, приведенных в SEQ ID NO:7, 37 и 53 и аминокислотных последовательностей, соответствующих FR1-FR4 вариабельной области легкой цепи, приведенных в SEQ ID NO:8, 38 и 54. В настоящем описании, если не упоминается иным образом, конкретно, “преимущественные эффекты MoAb1, MoAb2 и MoAb3 по настоящему изобретению” означает связывание с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и, предпочтительно, означает специфическое связывание с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл. В частности, “преимущественный эффект MoAb1 по настоящему изобретению” означает связывание с ЛАМ туберкулезной бациллы, предпочтительно, означает специфическое связывание с ЛАМ туберкулезной бациллы. Несмотря на то что не существует конкретного ограничения также по числу мутаций, которые могут быть введены, число введенных мутаций может быть установлено таким образом, что идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью перед мутацией составляет 85% или выше, предпочтительно, 90% или выше, более предпочтительно, 95% или выше и, особенно предпочтительно, 98% или выше. Следует отметить, что введение мутации, описанное в настоящем описании, может включать замещение, делецию и ввод аминокислоты. Кроме того, сайт распознавания рестрикционного фермента может быть введен в FR1 вариабельной области тяжелой цепи и/или FR4 вариабельных областей легкой/тяжелой цепи.
,
Кроме того, FR1-FR4 вариабельной области тяжелой цепи и FR1-FR4 вариабельной области легкой цепи, указанные в MoAb1 и MoAb3, все представляют собой аминокислотные последовательности, полученные из кроликов, в то время как FR1-FR4 вариабельной области тяжелой цепи и FR1-FR4 вариабельной области легкой цепи, указанные в MoAb2, все представляют собой аминокислотные последовательности, полученные из цыплят. Однако, поскольку преимущественный эффект MoAb по настоящему изобретению не является предметом компромисса, может применяться каркасная область, полученная из любого вида животных. Примеры таких видов животных могут включать, но конкретно не ограничиваются перечисленными, людей, кроликов, цыплят, лошадей, коров, коз, овец, собак, мышей, хомяков и крыс. Аминокислотные последовательности, предпочтительно, получают от кроликов, цыплят или людей и, более предпочтительно, от людей. Следует отметить, что аминокислотные последовательности полученных от людей FR1-FR4 являются известными в данной области (Kabat, et al. US Department of Health AND human Services, NIH (1991), USA), и описаны, например, на вебсайте NCBI.
n
n
MoAb по настоящему изобретению имеет структуру, в которой вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи, имеющие описанную выше конфигурацию, соединены через линкер. В отношении “линкера” в настоящем описании не существует конкретного ограничения, поскольку преимущественный эффект MoAb по настоящему изобретению не является предметом компромисса, и его примеры могут включать пептид, имеющий линкерную последовательность, образованную из аминокислотной последовательности, чье число аминокислотных остатков обычно составляет приблизительно от 8 до 30, предпочтительно, приблизительно от 8 до 20 и, более предпочтительно, приблизительно от 8 до 15. Примеры предпочтительных линкерных последовательностей включают, но ими не ограничены, линкерную последовательность GS {(Gly-Gly-Gly-Ser: SEQ ID NO:9), (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser: SEQ ID NO:10); n является числом повторов] или т.п. Предпочтительно, в качестве линкера применяют пептид, имеющий последовательность с 1-3 (n является целым числом от 1 до 3) повторами такой линкерной последовательности GS. В Примерах, описанных позже, в качестве линкера применяют пептид (Пример 1), имеющий последовательность (GGGGSGGGGSGGGGS: SEQ ID NO:11) с тремя повторами линкерной последовательности GS и пептид (Пример 6), имеющий еще одну другую последовательность (GGGGSGGDGSGGGGS: SEQ ID NO:40).
Предпочтительным осуществлением MoAb1 по настоящему изобретению может быть одноцепочечное антитело, состоящее из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12. Кроме того, предпочтительным осуществлением MoAb2 может быть одноцепочечное антитело, состоящее из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:39. Кроме того, предпочтительным осуществлением MoAb3 может быть одноцепочечное антитело, состоящее из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:30.
Такие моноклональные антитела по настоящему изобретению включают антитело, которое отличает и специфически распознает туберкулезную бациллу от нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл. Более конкретно, они включают антитело, которое различает липоарабиноманнан (ЛАМ) туберкулезной бациллы от ЛАМ нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл и специфически связывается с ЛАМ туберкулезной бациллы. Примеры моноклональных антител могут включать MoAb1, описанное выше. Туберкулезная бацилла, которая различается от нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл и специфически распознается MoAb1 по настоящему изобретению, является, предпочтительно, туберкулезной бациллой человека (M. tuberculosis) и бычьей туберкулезной бациллой (M. bovis), и, более предпочтительно, является туберкулезной бациллой человека (M. tuberculosis).
Когда реакцию против ЛАМ туберкулезной бациллы сравнивают посредством метода конкуренции, можно утверждать, что специфическое связывание по отношению к ЛАМ туберкулезной бациллы происходит, когда требуемое количество ЛАМ нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл составляет 10-кратное или более количество от количества ЛАМ туберкулезной бациллы. Кроме того, когда ЛАМ обнаруживают посредством складывания в сэндвич иммобилизованного антитела и антитела обнаружения, MoAb по настоящему изобретению может быть определено, как имеющее более предпочтительную специфичность связывания по отношению к ЛАМ туберкулезной бациллы, если реактивность к ЛАМ нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл была снижена до 1/100 от реактивности к ЛАМ туберкулезной бациллы.
125
125
Аффинность антитела может быть легко измерена с помощью известной до настоящего времени технологии, например, измерения изотермы насыщения связывания I-меченого IgG или его фрагмента или посредством анализа нелинейной регрессии с использованием гомологичного замещения IgG немеченым IgG, как описано Motilsky в Analyzing Data with GraphPad Prizm (1999)), GraphPad Software Inc., San Diego, CA. Другие методы, известные в области, могут применяться для измерения, и метод, может представлять собой, например, метод, описанный в Scatchard et al. Ann. NY Acd. Sci., 51, 660 (1949).
MoAb по настоящему изобретению может продуцироваться в соответствии с, но не ограничиваясь лишь им, методом фагового дисплея (G. Smith, Science, 228, 1315 (1985)) с использованием туберкулезной бациллы в качестве антигена. В настоящем описании, примеры туберкулезных бацилл могут включать описанную выше туберкулезную бациллу (Mycobacterium tuberculosis, туберкулезная бацилла человека), бычью туберкулезную бациллу (M. bovis, бычья туберкулезная бацилла, бычья бацилла), Mycobacterium africanum (M. africanum), и туберкулезную бациллу серой полевки. Туберкулезная бацилла (Mycobacterium tuberculosis, туберкулезная бацилла человека), бычья туберкулезная бацилла (M. bovis, бычья туберкулезная бацилла, бычья бацилла) и Mycobacterium africanum являются предпочтительными, и бычья туберкулезная бацилла является более предпочтительной. Как описано выше, БЦЖ получают посредством ослабления бычьей туберкулезной бациллы (M. bovis) через последовательное долговременное субкультивирование.
Способ получения MoAb по настоящему изобретению с помощью фагового дисплея с использованием БЦЖ в качестве антигена описан в “Примерах”. Как описано выше, признак MoAb по настоящему изобретению состоит в различении и специфическом распознавании кислотоустойчивых бацилл от других бактерий, таких как бактерии полости рта, и, более конкретно, различении ЛАМ кислотоустойчивых бацилл от ЛАМ-подобных антигенов других бактерий и специфическом связывании с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл. Признак представляет собой, предпочтительно, различение туберкулезной бациллы от нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл и специфическое распознавание туберкулезной бациллы, и, более конкретно, различение ЛАМ туберкулезной бациллы от ЛАМ нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл и, конкретно, связывание с ЛАМ туберкулезной бациллы. Такое MoAb может продуцироваться с использованием БЦЖ в качестве иммуногена.
Следует отметить, что, как описано выше, БЦЖ представляет собой ослабленный штамм, получаемый из бычьей туберкулезной бациллы (M. bovis), и относится к бактериям, имеющим антигенность, но не имеющим токсичности или имеющим сниженную токсичность против человека. Однако, в настоящем изобретении, не только такую, но и вакцину БЦЖ, полученную с использованием бактерий, также называют “БЦЖ”.
Кроме того, моноклональное антитело по настоящему изобретению включает мультивалентное антитело, которое представляет собой одноцепочечное антитело, описанное выше. Несмотря на то что мультивалентные антитела включают бивалентные антитела, тривалентные антитела и тетравалентные антитела, бивалентные антитела являются предпочтительными. Эти мультивалентные антитела могут продуцироваться в соответствии с известным до настоящего времени методом (Непатентная Литература 7: K. Zuberbuhler, Protein Engineering, Design & Selection, 22, 169 (2009)). Конкретно, мультивалентное антитело может продуцироваться посредством, например, в случае бивалентного антитела, соединения генов тяжелой цепи и легкой цепи одноцепочечного антитела с использованием гена константной области, клонирования соединенных генов в вектор, способный к экспрессии его в клетках млекопитающих, трансформации клеток млекопитающих с вектором, включающим гены, и культивирования клеток.
(II) Способ иммунизации животного, не являющегося человеком, для получения моноклонального антитела, которое специфически связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы, и способ получения моноклонального антитела
Настоящее изобретение также относится к способу иммунизации животного, не являющегося человеком, для получения MoAb, которое специфически связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, и способу получения MoAb с использованием способа иммунизации. Более предпочтительно, настоящее изобретение относится к способу иммунизации животного, не являющегося человеком, для получения MoAb, которое специфически связывается с ЛАМ туберкулезной бациллы, и способу получения MoAb с использованием способа иммунизации.
(II-1) Способ иммунизации
Основные структуры ЛАМ кислотоустойчивых бацилл являются почти одинаковыми за исключением незначительных различий, распознаваемых в структуре маннозной верхушки. При получении антитела против такого ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, общепринятым является иммунизировать животное, не являющееся человеком, с использованием стандартного штамма туберкулезной бациллы человека, такого как H37Rv в качестве иммуногена. Посредством такого исполнения, может быть получено антитело, которое обширно реагирует с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл.
С другой стороны, когда животное, не являющееся человеком, иммунизируют с использованием в качестве иммуногена БЦЖ, т.е. ослабленного штамма, полученного из бычьей туберкулезной бациллы (M. bovis), или вакцины, полученной из него; возможно получать высокоспецифичное антитело, которое специфически связывается с ЛАМ туберкулезной бациллы, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы человека, посредством различения его от ЛАМ нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл. Настоящее изобретение в качестве предпочтительного осуществления относится к способу иммунизации животного, не являющегося человеком, с использованием БЦЖ в качестве иммуногена (иммунизирующего антигена), в качестве способа иммунизации для получения MoAb, которое специфически связывается с ЛАМ туберкулезной бациллы человека.
В настоящем описании, животное, не являющееся человеком, может представлять собой животное, отличное от человека, и его примеры включают млекопитающих, таких как мышь, крыса, хомяк, морская свинка, кролик, обезьяна, собака, коза, овца, свинья, лошадь и корова, и птиц, таких как курица, утка, индейка и перепелка. Млекопитающие (небольшие животные), такие как мышь, крыса, хомяк, морская свинка и кролик являются более предпочтительными.
Способ иммунизации по настоящему изобретению для получения MoAb, которое специфически связывается с ЛАМ туберкулезной бациллы, характеризуется иммунизацией животного, не являющегося человеком с использованием БЦЖ в качестве иммуногена (иммунизирующего антигена); и технология иммунизации не является конкретно ограниченной, а способ известный в данной области, может быть выбран соответствующим образом для использования.
Его примеры включают способ введения посредством подкожной, внутривенной или интраабдоминальной инъекции БЦЖ вместе с, при необходимости, адъювантом. Подкожное введение является предпочтительным. Примеры адъюванта могут включать, но не ограничены лишь приведенными, полный адъювант Фрейнда и неполный адъювант Фрейнда. Следует отметить, что введение БЦЖ, предпочтительно, осуществляют приблизительно от 2 до 5 раз с интервалом в приблизительно 2 недели после первого введения (первой иммунизации).
Клетки селезенки животного, не являющегося человеком, иммунизированного таким образом, являются применимыми в качестве клеток для продуцирования антитела, которое является высокоспецифичным к ЛАМ туберкулезной бациллы, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы человека. Селезенку удаляют из иммунизированного животного, не являющегося человеком, в течение от свыше десяти дней до нескольких месяцев после первой иммунизации БЦЖ, и применяют для продуцирования и получения антитела, которое является высокоспецифичным к ЛАМ туберкулезной бациллы, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы человека.
Конкретно, например, клетки (продуцирующие антитело клетки), полученные из селезенки, удаленной из животного, не являющегося человеком, гибридизируют с клетками миеломы в соответствии с известным до настоящего времени способом, применяя способ с полиэтиленгликолем или электрическую стимуляцию, и культивируют клетки в селекционной среде НАТ для получения гибридом. Затем посредством скрининга среди гибридом, может быть получена гибридома, которая продуцирует антитело, которое связывается с ЛАМ туберкулезной бациллы, применяя известный до настоящего времени способ, такой как анализ с ограничивающим разбавлением, гибридома, которая продуцирует MoAb, которое является высокоспецифичным к ЛАМ туберкулезной бациллы. Посредством культивирования с помощью известного до настоящего времени способа гибридомы, клонированной таким образом, является возможным приготовить и получить MoAb, которое является высокоспецифичным к ЛАМ желательной туберкулезной бациллы, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы человека.
Вне зависимости от туберкулезной бациллы или нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл, примеры способа приготовления и получения MoAb, которое селективно связывается с ЛАМ широкого ряда кислотоустойчивых бацилл, могут включать способ выбора антитела с использованием комплекса ЛАМ и полученного выше антитела, которое является высокоспецифичным к ЛАМ туберкулезной бациллы, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы человека. В данном случае, технология иммунизации не является конкретно ограниченной, и способ, известный в данной области, может быть выбран соответствующим образом для использования. Следует отметить, что “комплекс”, как описан в настоящем описании, относится к образованию комплекса антиген-антитело из ЛАМ и антитела, которое является высокоспецифичным к ЛАМ туберкулезной бациллы, и генерация комплекса может быть подтверждена посредством анализа с использованием ELISA.
(II-2) Способ получения MoAb, которое специфически связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы
MoAb, которое специфически связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, туберкулезной бациллы, может быть получено с использованием животного, не являющегося человеком (иммунизированного животного, не являющегося человеком), которое было иммунизировано описанным выше способом иммунизации.
Примеры таких способов могут включать способ удаления селезенки из иммунизированного животного, не являющегося человеком, как описано выше, получения клеток (клеток, продуцирующих антитело) из удаленной селезенки, гибридизации клеток с клетками миеломы в соответствии с известным до настоящего времени способом, с использованием полиэтиленгликоля или электрической стимуляции для получения гибридом, выбора, из полученных гибридом, гибридом, которые продуцируют MoAb, которое специфически связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, туберкулезной бациллы, и культивирование гибридомы. Таким образом, возможно подготовить и получить MoAb, которое является высокоспецифичным к ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, туберкулезной бациллы, более предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы человека. В настоящем описании, культивирование гибридомы может проводиться внутрибрюшинно у животного, не являющегося человеком, такого как мышь или кролик, или может проводиться in vitro с использованием чашки или т.п. В первом способе, т.е. культивировании гибридомы у животного, не являющегося человеком, асцит животного, не являющегося человеком, собирают после культивирования, и желательное MoAb выделяют и очищают от асцита. Во втором способе, культивировании гибридомы in vitro, желательное MoAb выделяют и очищают от культуральной жидкой среды, полученной после культивирования. Примеры способа очистки моноклонального антитела могут включать способ, когда подклассом антитела является IgG, аффинную хроматографию с использованием белка А.
Кроме того, MoAb, которое специфически связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, туберкулезной бациллы, может также быть получено с использованием метода фагового дисплея, разработанного в последние годы (Непатентная Литература 6: Winter et al., Annu. Rev. Immunol., 12: 433, 1994). Конкретно, селезенку удаляют из иммунизированного животного, не являющегося человеком, которое иммунизируют описанным выше способом, общую РНК или мРНК получают из удаленной селезенки, кДНК получают, используя РНК в качестве матрицы, и получают гены одноцепочечных антител (scFv: фрагмент вариабельной области с одиночной цепью), кодирующие вариабельные области антител. В настоящем описании, по отношению к вариабельным областям антител, поскольку каждая из них включает две области из вариабельной области тяжелой цепи (область VH) и вариабельной области легкой цепи (область LH), любой пептидный линкер может быть включен между областью VH и областью LH. Пептидный линкер может представлять собой, например, как описано в (I), пептид, имеющий линкерную последовательность, образованную из аминокислотной последовательности из приблизительно от 8 до 30 аминокислотных остатков, и примеры такой линкерной последовательности включают линкерную последовательность GS.
Гены клонируют в фагемидный вектор и вводят в Escherichia coli, которую затем инфицируют фагом для обеспечения экспрессии антител scFv на фаговых капсулах (получение библиотеки фагового дисплея scFv).
Когда в качестве иммуногена (иммунизирующего антигена) применяют БЦЖ в способе иммунизации животного, не являющегося человеком, возможно получать и продуцировать моноклональное антитело (антитело scFv), которое специфически связывается с ЛАМ туберкулезной бациллы, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы человека, посредством осуществления биопэннинга с библиотекой фагового дисплея scFv, экспрессирующей антитела scFv, используя БЦЖ, который использовали в качестве иммунизирующего антигена, и последовательного осуществления биопэннинга с использованием планшета с антигеном, имеющего твердую фазу с ЛАМ туберкулезной бациллы, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы человека.
Дополнительно, в качества способа выбора MoAb (одноцепочечного антитела), которое является высокоспецифичным к ЛАМ микобактерий, возможно получать и продуцировать одноцепочечное антитело (антитело scFv), которое селективно связывается с ЛАМ широкого ряда кислотоустойчивых бацилл независимо от того, являются ли они туберкулезными бациллами или нетуберкулезными кислотоустойчивыми бациллами, посредством осуществления биопэннинга с библиотекой фагового дисплея scFv, экспрессирующей антитела scFv, используя комплекс антитело-антиген, в котором ЛАМ захватывается носителем, имеющим антитело против ЛАМ, в качестве твердой фазы.
Следует отметить, что в отношении получения общей РНК или мРНК, получения кДНК, субклонирования в фагемид, введения в Escherichia coli, инфицирования фагом, и способа скрининга (биопэннинга) моноклонального антитела (антитела scFv), которое специфически связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы и, более предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы человека; могут применяться способы, известные в данной области, и более конкретно, описанные выше стадии могут проводиться с использованием описанных ниже Примеров в качестве ссылки.
(III) Способ обнаружения кислотоустойчивых бацилл, конкретно туберкулезной бациллы, и используемое в нем устройство для обнаружения кислотоустойчивой бациллы (в частности, туберкулезной бациллы)
MoAb по настоящему изобретению, описанное выше, может применяться для обнаружения кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, туберкулезной бациллы. Другими словами, посредством использования MoAb по настоящему изобретению возможно определить является или нет индивид носителем кислотоустойчивых бацилл, в частности, туберкулезной бациллы. Другими словами, возможно диагностировать/тестировать инфицирован или не инфицирован индивид кислотоустойчивыми бациллами, в частности, туберкулезной бациллой.
Обнаружение (диагностика/тестирование) кислотоустойчивых бацилл, в частности, туберкулезной бациллы по настоящему изобретению может проводиться посредством следующих стадий (1) и (2).
(1) стадии приведения MoAb по настоящему изобретению в контакт с биологическим образцом (тестируемым образцом) индивида; и
(2) стадии проведения анализа на туберкулезную бациллу, которая существует в тестируемом образце, с использованием в качестве показателя реакции связывания между MoAb по настоящему изобретению и ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, в частности, ЛАМ туберкулезной бациллы.
Биологический образец индивида (тестируемый образец), который приводится в контакт с MoAb по настоящему изобретению на стадии (1), может представлять собой биологический образец, в котором существуют кислотоустойчивые бациллы, в частности, туберкулезная бацилла, и примеры биологического образца могут включать мокроту, слюну, кровь (сыворотку, плазму), промывную жидкость из легких, желудочный сок, мочу, фекалии, кожу и панкреатический сок и т.д. Биологический образец, предпочтительно, представляет собой мокроту, слюну или кровь, и более предпочтительно, является мокротой или слюной.
В настоящем описании, индивид, которого подвергают анализу, является, предпочтительно, человеком, однако, отличающиеся от человека животные, такие как лошадь, корова, коза, овца, собака, курица, мышь, хомяк и крыса, могут также использоваться в качестве индивида.
Условие, при котором MoAb по настоящему изобретению и биологический образец приводятся в контакт друг с другом, не ограничивается конкретно, поскольку представляет собой условие, при котором реакция связывания между MoAb по настоящему изобретению и ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы не является предметом компромисса, и применяют общее условие для иммунной реакции. Примеры такого способа могут включать вызывание сосуществования MoAb по настоящему изобретению и биологического образца, содержащего кислотоустойчивые бациллы, предпочтительно, туберкулезные бациллы, при температурном состоянии, составляющем, как правило, 45°С или ниже, предпочтительно, приблизительно от 4 до 40°С и, более предпочтительно, приблизительно от 25 до 40°С; и оставление или инкубирование смеси в течение приблизительно 0,5-40 часов и, предпочтительно, приблизительно 1-20 часов. Кроме того, не существует также конкретного ограничения на растворитель, применяемый в реакции связывания, и его рН, постольку поскольку он не оказывает неблагоприятного эффекта на реакцию; и, в соответствии с известным до настоящего времени методом или подобно ему, буфер (например, цитратный буфер, фосфатный буфер, трис-солевой буфер, ацетатный буфер и т.д.) может использоваться таким образом, что рН становится равным приблизительно 5-9.
Стадия (I) может проводиться в состоянии, при котором MoAb по настоящему изобретению является иммобилизованным (находится в твердой фазе), (состояние, при котором MoAb связано с твердым носителем). Такая иммобилизация включает случаи, когда MoAb по настоящему изобретению являются связанными с твердым носителем как съемным образом, так и несъемным образом.
В качестве твердого носителя, используемого для иммобилизации MoAb, могут использоваться разнообразные носители, обычно используемые в данной области, и их примеры могут включать широкий ряд изделий, таких как палочки, шарики, планшеты (включая микропланшеты), пробирки и т.п., образованные из разнообразных материалов, таких как стекло, целлюлозный порошок, Сефадекс, Сефароза, полистирол, фильтровальные бумаги, карбоксиметилцеллюлоза, нитроцеллюлоза, ионообменные смолы, декстран, пластиковые пленки, пластиковые трубки, найлон, стеклянные шарики, шелк, сополимеры полиамина-метилвинилового эфира-малеиновой кислоты, сополимеры аминокислот, сополимеры этилена-малеиновой кислоты.
Метод иммобилизации не имеет конкретного ограничения, и может использоваться как физическая связь, так и химическая связь, в зависимости от разнообразных твердых носителей. Его примеры могут включать: химические реакции, такие как диазо-метод в качестве метода ковалентного связывания, пептидные методы (метод производного кислота-амид, метод карбоксилхлоридной смолы, метод карбодиимидной смолы, метод производного малеинового ангидрида, метод изоцианатного производного, метод полисахарида, активированного цианогенбромидом, метод карбонатного производного целлюлозы и метод с использованием реагента для конденсации), метод алкилирования, методы связывания носителя с использованием сшивающего реагента (например, с использованием глутаральдегида, гексаметиленизоцианата или т.п. в качестве сшивающего реагента) и метод связывания носителя с использованием реакции Уги; методы ионной связи с использованием носителя, такого как ионообменные смолы; и методы физической адсорбции с использованием, в качестве носителя, пористого стекла, такого как стеклянные шарики.
32
125
На стадии (2), MoAb по настоящему изобретению может применяться в меченом состоянии с использованием любого метящего вещества. В настоящем описании, примеры вещества, несущего метку, могут включать: ферменты, такие как пероксидаза хрена (HRP) и щелочная фосфатаза; флуоресцентные вещества, такие как изоцианат флуоресцеина и родамин; радиоактивные вещества, такие как Р и I; красящие вещества (вещество окрашивания), такие как латекс, включающий природный каучуковый латекс и синтетический латекс, такой как полистироловый латекс, окрашенный металлическими коллоидами, такими как коллоид золота и белый коллоид, или пигментами из красного, синего или т.п.; и хемилюминесцентные вещества. Мечение MoAb этими метящими веществами может проводиться в соответствии со способом, известным до настоящего времени, в зависимости от разнообразных метящих веществ.
Стадия (2) представляет собой стадию обнаружения/анализа иммунного комплекса (вещества из связанных антигена-антитела), полученного посредством реакции связывания между MoAb по настоящему изобретению и ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы. В настоящем описании, обнаружение/анализ иммунного комплекса (вещества из связанных антигена-антитела) и условия для него не являются конкретно ограниченными, и могут применяться метод и условия, идентичные или подобные общепринятому методу иммунологического анализа. Конкретно, в зависимости от типа метящего вещества, применяемого для мечения MoAb, могут использоваться разнообразные методы, которые, как правило, применяются для иммунохимического анализа, такие как, например, радиоизотопный иммунологический анализ (метод РИА), метод ELISA, метод флуоресцентных антител, метод локального гемолиза в геле, споттинг-метод, метод агглютинации, метод Ухтерлони и т.д. (например, см. стр. 30-53 в “Hybridoma method and monoclonal antibody”, опубликованном R&D planning K.K., 5 Марта, 1982 г.). С точки зрения чувствительности и простоты, стадию (2) проводят в соответствии с методом ELISA и, более предпочтительно, сэндвич-методом.
Например, когда используют твердофазный сэндвич-метод, мишень анализа, которая является кислотоустойчивой бациллой, предпочтительно, туберкулезной бациллой, может быть проанализирована в тестируемом образце, например, следующим образом.
Сначала, биологический образец (например, мокрота, слюна или кровь и т.д.) добавляют в качестве тестируемого образца, содержащего мишень анализа, которой является кислотоустойчивая бацилла, предпочтительно, туберкулезная бацилла, к включенному в твердую фазу антителу, полученному иммобилизацией (включающей разъединяемую иммобилизацию) антитела, которое вызывает специфическую реакцию антиген-антитело с ЛАМ мишени анализа-кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, туберкулезной бациллы для обеспечения протекания реакции антиген-антитело. Далее, несвязанные вещества удаляют посредством, например, промывки; антитело, которое вызывает специфическую реакцию антиген-антитело с ЛАМ мишени анализа-кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, туберкулезной бациллы, добавляют для обеспечения протекания реакции с мишенью анализа-бактериями в веществе из связанных антигена-антитела, генерированном выше; и вещество из связанных антигена-антитела (комплекс “антитело-кислотоустойчивая бацилла-антитело” и, предпочтительно, комплекс “антитело-туберкулезная бацилла-антитело”), генерированное в реакции, обнаруживают (качественное измерение) или его количество измеряют (количественное измерение). Для данного способа, в настоящем изобретении, MoAb, предпочтительно, MoAb1 по настоящему изобретению, применяют в качестве антитела, которое вызывает специфическую реакцию антиген-антитело с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, туберкулезной бациллы.
Анализ вещества из связанных антигена-антитела (комплекса “антитело-кислотоустойчивая бацилла-антитело” и, предпочтительно, комплекса “антитело-туберкулезная бацилла-антитело”) может быть просто проведен посредством использования антитела (меченого антитела), которое метят любым из метящих веществ, описанных выше в качестве одного из антител (MoAb, предпочтительно, MoAb1 по настоящему изобретению) применяемого для проведения реакции антиген-антитело с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, туберкулезной бациллы. Для обеспечения более простого проведения анализа, например, возможно применять иммунохроматографию с использованием антитела, меченого окрашенными частицами латекса или т.п., таким как коллоид золота и т.д. Квалифицированный специалист в данной области будет хорошо осведомлен о выборе различных средств для этих методов анализа и их модификаций, и настоящее изобретение может быть реализовано с помощью одного из этих методов (см. “Clinical Test Method Manual” Kanehara Shuppan, 1995, и т.д.).
Способ может быть проведен с использованием, например, устройства для обнаружения кислотоустойчивой бациллы, предпочтительно, устройства для обнаружения туберкулезной бациллы (далее в настоящем описании, также называемого “устройство для обнаружения”), имеющего следующую структуру. Устройство для обнаружения представляет собой устройство для определения существования кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, туберкулезной бациллы, в жидкости организма (включая мокроту, слюну и мочу) человека или животного, т.е. определения присутствия или отсутствия инфицирования кислотоустойчивыми бациллами, предпочтительно, туберкулезной бациллой; и включает поглощающий раствор фрагмент, образованный из материала, способного к переносу тестируемого образца посредством капиллярного действия.
Поглощающий раствор фрагмент включает:
(i) часть для сбора образца для поглощения и сбора тестируемого образца;
(ii) часть с мечеными антителами, являющуюся подложкой для меченого антитела против ЛАМ туберкулезной бациллы (MoAb по настоящему изобретению), которое специфически реагирует с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл; предпочтительно, туберкулезной бациллы, в тестируемом образце;
(iii) часть для определения, включающая часть отображения результата тестирования, описанную следующим образом;
(а) часть отображения результата тестирования, на которой иммобилизовано немеченое антитело против ЛАМ туберкулезной бациллы (MoAb по настоящему изобретению), которое специфически реагирует с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл; предпочтительно, туберкулезной бациллы, и
(iv) часть для поглощения раствора для поглощения остающегося раствора тестируемого образца, которая прошла через часть для сбора образца, часть с мечеными антителами и часть для определения.
Следует отметить, что (iii) часть для определения включает дополнительно к (а) части отображения результата тестирования, часть для контроля отображения (b), расположенную отдельно от нее, описанную следующим образом:
(b) часть для контроля отображения, на которой иммобилизовано немеченое антитело против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (MoAb по настоящему изобретению), предпочтительно, немеченое антитело против ЛАМ туберкулезной бациллы (MoAb1 по настоящему изобретению), которое реагирует с меченым антителом против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (MoAb по настоящему изобретению), предпочтительно, немеченым антителом против ЛАМ туберкулезной бациллы (MoAb1 по настоящему изобретению).
С помощью устройства для обнаружения, возможно определить существование кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, туберкулезной бациллы, в тестируемом образце по присутствию или отсутствию окрашивания (а) части отображения результата тестирования.
Устройство для обнаружения по настоящему изобретению включает поглощающий раствор фрагмент, образованный из материала, способного к переносу тестируемого образца посредством капиллярного действия или хроматографического действия (в настоящем изобретении их именуют как “капиллярное действие” в целом). Поглощающий раствор фрагмент может представлять собой фрагмент, который является пластинчатым (далее в настоящем описании называемый “пластинчатый фрагмент”), и пластинчатый фрагмент может быть образован из одиночного листа или может быть образован из множества слоев пластин, сложенных в стопку или соединенных друг с другом. Альтернативно, поглощающий раствор фрагмент может принимать разнообразные формы, способные к поглощению и передаче жидкости посредством капиллярного действия, такие как фрагмент в форме длинного и тонкого бруска или т.п. Следует отметить, что устройство для обнаружения по настоящему изобретению может дополнительно включать поддерживающий корпус для поддержки поглощающего раствор фрагмента.
Материал для поглощающего раствор фрагмента не является ограниченным конкретно, поскольку: материал имеет пористую структуру или капиллярную структуру, обеспечивающую проницаемость растворителя (воды, сыворотки, мочи и других биологических образцов), тестируемого компонента (кислотоустойчивых бацилл, таких как туберкулезная бацилла) и комплекса (например, комплекса [кислотоустойчивые бациллы, такие как туберкулезная бацилла] меченого антитела против ЛАМ туберкулезной бациллы (MoAb1 по настоящему изобретению), и туберкулезной бациллы, или комплекса [меченое антитело-туберкулезная бацилла-антитело] указанного комплекса и немеченого антитела против ЛАМ туберкулезной бациллы (MoAb1 по настоящему изобретению), включающего тестируемый компонент; и материал обеспечивает, когда тестируемый образец, содержащий тестируемый компонент наносят (собирают, капают, добавляют) на (1) часть для сбора образца, тестируемый образец переносится (распространяется) внутрь пористой структуры или капиллярной структуры даже тогда, когда тестируемый образец получает антитело против ЛАМ туберкулезной бациллы (MoAb1 по настоящему изобретению) и комплекс (меченое антитело-туберкулезная бацилла) во время переноса. Его примеры могут включать описанный выше твердый носитель. Из описанных выше, органический пористый корпус является предпочтительным. Следует отметить, что примеры органического пористого корпуса могут включать природные волокна, такие как целлюлоза, производные целлюлозы, такие как нитроцеллюлоза и полусинтетические волокна, такие как ацетат целлюлозы, волоконные агрегаты, образованные из синтетических волокон, таких как полиэтилен, полипропилен, найлон и сложный полиэфир, пористый полипропилен, пористый полистирол, пористый полиметилметакрилат, пористый найлон, пористый полисульфон, пористые фторсодержащие смолы и пористые синтетические смолы, такие как поливинилиденфторид, имеющие введенную в них гидрофильную группу. Природные волокна, такие как целлюлоза и производные целлюлозы, такие как нитроцеллюлоза и полусинтетические волокна, такие как ацетат целлюлозы, являются предпочтительными.
Не существует никакого конкретного ограничения по размеру поглощающего раствор фрагмента; и его предпочтительный размер имеет ширину (длину короткой стороны), равную приблизительно от 2 до 20 мм, предпочтительно, в интервале приблизительно от 4 до 10 мм, и длину (длину длинной стороны), равную от 20 до 200 мм, предпочтительно, в интервале от 30 до 150 мм.
Ниже, устройство для обнаружения в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения будет описано со ссылкой на чертежи.
(А) и (В) на фиг. 1 показывают одно воплощение устройства для обнаружения по настоящему изобретению. (А) и (В) на фиг. 1 представляют собой диаграммы, являющиеся видом сбоку устройства для обнаружения по настоящему изобретению. В устройстве для обнаружения, поглощающий раствор фрагмент включает часть для сбора образца (1) для сбора (добавления) тестируемого образца; часть с мечеными антителами (2), часть для определения (3), имеющая часть отображения результата тестирования (а) и часть для поглощения раствора (4) для поглощения остающегося раствора тестируемого образца, который прошел через часть для сбора образца, часть с мечеными антителами и часть для определения. (В) на фиг. 1 показывает устройство для обнаружения, включающее, на части для определения (3) часть для контроля отображения (b) в дополнение к части отображения результата тестирования (а).
Несмотря на то что в примере, показанном на фиг. 1, поглощающий раствор фрагмент представляет собой пластинчатый фрагмент, образованный из множества фрагментов листов, пластинчатый фрагмент может быть образован из одиночного листа однородного материала или может быть образован как одиночный лист в целом, но из множества фрагментов листов из одинакового или различных материалов. Следует отметить, что цельный лист может быть образован из множества листов или может иметь часть, которая является частично образованной из множества листов.
В примере, показанном на фиг. 1, пластинчатый фрагмент приклеен на поддерживающий корпус (подложку) 10. Пластинчатый фрагмент включает, последовательно от одной концевой стороны к другой концевой стороне в направлении длинной стороны, лист 21, образующий часть для сбора образца (1), лист 22, образующий часть с меченым антителом (22), лист 23, образующий часть для определения (3), и лист 24, образующий часть для поглощения раствора (4). Кроме того, как показано на ФИГ. 2, возможно иметь конфигурацию, в которой концевая часть листа 21 перекрывает концевую часть листа 22, концевая часть листа 22 перекрывает концевую часть листа 23 и концевая часть листа 23 перекрывает концевую часть листа 24. Посредством такой конфигурации, движение раствора может быть сделано плавным.
Часть для сбора образца (1) представляет собой часть (часть для подачи тестируемого образца) для поглощения и сбора тестируемого образца, который является мишенью анализа. Примеры тестируемого образца могут включать биологический образец индивида, который является мишенью анализа настоящего изобретения.
Как показано на фиг. 1 и фиг. 2, часть для сбора образца (1) может быть расположена в концевой части (ведущем конце) пластинчатого фрагмента.
Часть с меченым антителом (2) образуется в контакте с задним концом части для сбора образца (1), как описано выше (фиг. 1) или образована в состоянии частичного перекрывания с частью для сбора образца (1) (фиг. 2). Часть с меченым антителом (2) включает, разъединяемым образом, антитело, которое специфически реагирует и связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бактерий, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы, содержащимся в тестируемом образце. Конкретно, устройство для обнаружения по настоящему изобретению включает, на листе 22, образующем часть с меченым антителом (2) разъединяемым образом, антитело против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (MoAb по настоящему изобретению), предпочтительно, антитело против ЛАМ туберкулезной бациллы (MoAb1 по настоящему изобретению), которое специфически связывается, посредством реакции антиген-антитело, с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы. В настоящем описании, MoAb по настоящему изобретению применяют в состоянии, в котором оно мечено любым из описанных выше несущих метку веществ, т.е. как меченое антитело против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченое MoAb по настоящему изобретению), а MoAb1 применяют как меченое антитело против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченое MoAb1 по настоящему изобретению).
Среди материалов, принятых в пластинчатом фрагменте, часть с меченым антителом (2), предпочтительно, образуют из гидрофильного и водопоглощающего материала, который включает меченое антитело против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченое MoAb по настоящему изобретению), предпочтительно, меченое антитело против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченое MoAb1 по настоящему изобретению), разъединяемым образом, которое реагирует с тестируемым компонентом (кислотоустойчивыми бациллами, предпочтительно, туберкулезной бациллой) в тестируемом образце, который продвинулся из части для сбора образца (1) для образования комплекса антиген-антитело (комплекс ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и меченого антитела против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченого MoAb по настоящему изобретению), предпочтительно, комплекса ЛАМ туберкулезной бациллы и меченого антитела против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченого MoAb1 по настоящему изобретению). Материал имеет свойство, обеспечивающее движение комплекса в направлении, показанного стрелкой Р на фиг. 1, в ассоциации с движением тестируемого образца к части для определения (3).
Следует отметить, что не существует ограничения по методу обеспечения в качестве подложки части с меченым антителом (2), разъединяемым образом, для меченого антитела против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченого MoAb по настоящему изобретению), предпочтительно, меченого антитела против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченого MoAb1 по настоящему изобретению); и его примеры включают метод импрегнирования части с меченым антителом (2) раствором, содержащим меченое MoAb по настоящему изобретению, предпочтительно, меченое MoAb1 по настоящему изобретению, и метод закрепления такого раствора на части с меченым антителом (2). Кроме того, с целью обеспечения для тестируемого компонента (кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, туберкулезной бациллы), содержащихся в тестируемом образце, полного связывания с частью с меченым антителом (2), предпочтительно, обеспечивать для части с меченым антителом (2) выполнение функции подложки для избыточного количества меченого MoAb по настоящему изобретению, предпочтительно, меченого MoAb1 по настоящему изобретению.
Часть для определения (3) представляет собой часть для дальнейшего переноса, к части для поглощения раствора (4), тестируемого образца, который продвинулся из части для сбора образца (1) через часть с меченым антителом (2). Часть для определения (3) включает, в ее области переноса, часть (часть отображения результата тестирования (а)) для захвата специфического компонента (комплекса ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и меченого антитела против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченого MoAb по настоящему изобретению), предпочтительно, комплекса ЛАМ туберкулезной бациллы и меченого антитела против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченого MoAb1 по настоящему изобретению)), содержащегося в тестируемом образце, который переносился, и отображения результата захвата. Поскольку возможно определить существование или отсутствие существования микобактерий, предпочтительно, туберкулезной бациллы, на основании результата, отображенного на части отображения результата тестирования (а) в тестируемом образце; область, включающую часть для отображения (а), называют “часть для определения (3)”.
В дополнение к части для отображения результата тестирования (а), устройство для обнаружения по настоящему изобретению может включать часть контроля отображения (b) в части определения (3). Следует отметить, что часть отображения результата тестирования (а) и часть контроля отображения (b) последовательно расположены с интервалом, установленным между ними.
Иммобилизованным на части отображения результата тестирования (а) в избыточном количестве является немеченое антитело (немеченое антитело против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл), которое специфически реагирует с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, немеченое антитело (немеченое антитело против ЛАМ туберкулезной бациллы), которое специфически реагирует с ЛАМ туберкулезной бациллы. Следовательно, кислотоустойчивые бациллы, которые связались с меченым MoAb по настоящему изобретению, предпочтительно, туберкулезная бацилла, которая связалась с меченым MoAb1 по настоящему изобретению, посредством реакции антиген-антитело на части с меченым антителом (2) захватываются на части отображения результата тестирования (а) в состоянии комплекса с меченым MoAb по настоящему изобретению, предпочтительно, меченым MoAb1 по настоящему изобретению; и окрашивание, отнесенное к метящему веществу проявляется с интенсивностью, которая зависит от захваченного количества.
Следует отметить, что антитело против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, образующее немеченое антитело против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, MoAb по настоящему изобретению, которое специфически связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (MoAb по настоящему изобретению) может применяться аналогично. Кроме того, так и антитело против ЛАМ туберкулезной бациллы, образующее немеченое антитело против ЛАМ туберкулезной бациллы, MoAb1 по настоящему изобретению, которое специфически связывается с ЛАМ туберкулезной бациллы (MoAb1 по настоящему изобретению) может применяться аналогично.
Иммобилизованным на части контроля отображения (b) является предварительно определенное количество немеченого антитела (второго антитела), которое реагирует с меченым антителом против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченым MoAb по настоящему изобретению), предпочтительно, меченым антителом против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченым MoAb1 по настоящему изобретению), включенным в часть с меченым антителом (2). Часть контроля отображения (b) может быть расположена отдельно от части отображения результата тестирования (а) в направлении движения (направление р на ФИГ. 1) тестируемого образца в порядке от части отображения результата тестирования (а) к части контроля отображения (b). Иммобилизованным на части контроля отображения (b) в избыточном количестве является избыточное количество немеченого антитела (второго антитела), которое реагирует с меченым антителом против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченым MoAb по настоящему изобретению), предпочтительно, антителом против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченым MoAb1 по настоящему изобретению), содержащемся в тестируемом образце, который продвинулся через предшествующий фрагмент листа.
Следовательно, на части контроля отображения (b), меченое антитело против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченое MoAb по настоящему изобретению), предпочтительно, антитело против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченое MoAb1 по настоящему изобретению), которое отсоединилось от части с меченым антителом (2) и высвободилось в тестируемый образец, захватывается, и окрашивание, отнесенное к метящему веществу для меченого антитела против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченого MoAb по настоящему изобретению), антитела против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченого MoAb1 по настоящему изобретению), проявляется с интенсивностью, которая зависит от количества второго антитела, иммобилизованного на части контроля отображения (b).
В настоящем описании, немеченое антитело (второе антитело) является достаточным, если оно является антителом, которое связывается с меченым антителом против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченым MoAb по настоящему изобретению), предпочтительно, антителом против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченым MoAb1 по настоящему изобретению). Несмотря на то что такое немеченое антитело (второе антитело) не является ограниченным, например, могут использоваться ЛАМ-связывающий белок кислотоустойчивых бацилл, анионные частицы и т.п.
Анализ на туберкулезную бациллу с использованием устройства для определения по настоящему изобретению осуществляют, используя в качестве показателя, присутствие или отсутствие окрашивания на части отображения результата тестирования (а) части для определения (3). В этот момент, при необходимости, возможно использовать для определения присутствия или отсутствия окрашивания на части контроля отображения (b) части для определения (3). Даже тогда, когда окрашивание не является распознаваемым на части отображения результата тестирования (а), если окрашивание может быть распознано на части контроля отображения (b), анализ был проведен должным образом и результат анализа может быть определен как отрицательный. Однако, когда окрашивание не является распознаваемым на части контроля отображения (b), это указывает на то, что анализ не был проведен правильно, и результат части отображения результата тестирования (а) не может использоваться для определения как отрицательный.
Среди материалов, принятых для пластинчатого фрагмента, часть для определения (3), предпочтительно, образована из гидрофильного и водопоглощающего материала, который может продвигать тестируемый образец, содержащий разнообразные компоненты к части для поглощения раствора (4) посредством капиллярного действия, и имеет свойство устойчивой иммобилизации немеченого антитела против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченого MoAb по настоящему изобретению), предпочтительно, антитела против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченого MoAb1 по настоящему изобретению) на части отображения результата тестирования (а) или иммобилизации немеченого антитела (второго антитела) на части контроля отображения (b).
Часть для поглощения раствора (4) представляет собой часть для поглощения остающегося раствора тестируемого образца, который продвинулся в направлении стрелки Р от части для сбора образца (1) через часть с меченым антителом (2) и часть для определения (3) (часть отображения результата тестирования (а) или часть отображения результата тестирования (а) и часть контроля отображения (b)). Следовательно, среди материалов, принятых для пластинчатого фрагмента, часть для поглощения раствора (4), предпочтительно, образована из гидрофильного и абсорбентного материала и, более предпочтительно, материала, имеющего свойство не отталкивать поглощенный раствор, или эластичного материала. Конкретно, примеры такого материала могут включать нетканые материалы, такие как фильтровальные бумажные изделия и гидрофильные волокна, и ламинированные изделия из фильтровальной бумаги и нетканых материалов также могут применяться.
Несмотря на то что устройство для обнаружения по настоящему изобретению в-основном включает пластинчатый фрагмент, имеющий описанную выше конфигурацию, также является возможным включать подложку 10 в дополнение к пластинчатому фрагменту. Для подложки 10 не существует конкретного ограничения, поскольку она имеет конфигурацию и материал, способный к удерживанию пластинчатого фрагмента. Например, она может представлять собой пластинчатую подложку, ламинированную на задней поверхности (поверхности нижнего слоя) пластинчатого фрагмента, подлежащего применению, или подложка в форме корпуса для размещения пластинчатого фрагмента.
Примеры пластинчатой подложки могут включать листы, сделанные из разнообразных пластиков (пластиковых листов), твердых бумажных изделий, листов, изготовленных из металлов (включая сплав), таких как алюминий, многослойные бумажные изделия, полученные посредством склеивания вместе (приклеивания друг к другу) многослойных листов из, например, из гетерогенной бумаги или бумаги такого же качества, изделия, полученные посредством склеивания вместе (приклеивания друг к другу) пластикового листа и бумаги, изделия, полученные посредством склеивания вместе (приклеивания друг к другу) бумаги и металлического листа, изделия, полученные посредством склеивания вместе (приклеивания друг к другу) пластикового листа, бумаги и металлического листа, и бумаги, имеющие на них покрытие, такое как герметик и т.п. Предпочтительно подложка имеет функцию водонепроницаемости.
Подложка в форме корпуса, предпочтительно, представляет собой влагонепроницаемый материал, такой как поливинилхлорид, полипропилен, полиэтилен, полистирол, полимеры акриловой кислоты и т.п.; но изделие, сделанное из бумаги, может также применяться, если водоотталкивающая обработка осуществляется на его поверхности. На корпусе, предпочтительно, образовано по меньшей мере “окно для сбора раствора”, соответствующее части для сбора образца (1) пластинчатого фрагмента, помещенного в корпус, “окно для отображения определения”, соответствующее части отображения результата тестирования (а) части для определения (3), и “окно для контроля отображения”, соответствующее части контроля отображения (b). Следует отметить, что “окно для отображения определения” и “окно для контроля отображения” могут быть образованы индивидуально или могут быть образованы в виде одиночного окна.
Чтобы применять устройство для обнаружения по настоящему изобретению, включающее пластинчатый фрагмент, описанный выше, сначала, часть для сбора образца (1) импрегнируют тестируемым образцом. Посредством этого действия, тестируемый образец, поглощаемый частью для сбора образца (1), проходит через пластинчатый фрагмент посредством капиллярного действия, и сначала достигает части с меченым антителом (2), служащей подложкой, разъединяемым образом, для меченого антитела против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченого MoAb по настоящему изобретению), предпочтительно, антитела против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченого MoAb1 по настоящему изобретению). В настоящем описании, посредством реакции антиген-антитело, тестируемый компонент (туберкулезная бацилла) в тестируемом образце специфически связывается с меченым антителом против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченым MoAb по настоящему изобретению), предпочтительно, антителом против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченым MoAb1 по настоящему изобретению). Далее, тестируемый образец достигает части отображения результата тестирования (а) части для определения (3), будучи сопровождаемым “комплексом кислотоустойчивых бацилл и меченого антитела против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченого MoAb по настоящему изобретению)” (“комплексом туберкулезной бациллы и антитела против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченого MoAb1 по настоящему изобретению)”) и “избыточным меченым антителом против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченым MoAb по настоящему изобретению), которое не связывается с туберкулезной бациллой” (“избыточным меченым антителом против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченым MoAb1 по настоящему изобретению), которое не связывается с туберкулезной бациллой”). Поскольку немеченое антитело против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (MoAb по настоящему изобретению), которое специфически связывается с кислотоустойчивыми бациллами, предпочтительно, немеченое антитело против ЛАМ туберкулезной бациллы (MoAb1 по настоящему изобретению), которое специфически связывается с туберкулезной бациллой, устойчиво иммобилизуют на части отображения результата тестирования (а); “меченое антитело против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченое MoAb по настоящему изобретению), которое специфически связалось с кислотоустойчивыми бациллами”, предпочтительно, “меченое антитело против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченое MoAb1 по настоящему изобретению), которое специфически связалось с туберкулезной бациллой”, в тестируемом образце захватывается и накапливается. В результате, часть отображения результата тестирования (а) проявляет окрашивание с интенсивностью, которая зависит от количества кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, туберкулезных бацилл, содержащихся в тестируемом образце, на основании метящего вещества в захваченном меченом антителе против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченом MoAb по настоящему изобретению), предпочтительно, в захваченном меченом антителе против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченом MoAb1 по настоящему изобретению). Вместе с этим, присутствие или отсутствие и количественная пропорция кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, туберкулезной бациллы, в тестируемом образце могут быть обнаружены.
Далее, тестируемый образец достигает части контроля отображения (b) части определения (3), будучи сопровождаемый “избыточным меченым антителом против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченым MoAb по настоящему изобретению), которое не связалось с кислотоустойчивыми бациллами”, предпочтительно, “избыточным меченым антителом против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченым MoAb1 по настоящему изобретению), которое не связалось с туберкулезной бациллой”. Поскольку второе антитело (немеченое антитело), которое связывается с меченым антителом против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченым MoAb по настоящему изобретению), предпочтительно, второе антитело (немеченое антитело), которое связывается с меченым антителом против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченым MoAb1 по настоящему изобретению), является устойчиво иммобилизованным на части контроля отображения (b) в определенном количестве; меченое антитело против кислотоустойчивых бацилл (меченое MoAb по настоящему изобретению), предпочтительно, меченое антитело против туберкулезной бациллы (меченое MoAb1 по настоящему изобретению), которое избыточно включено в тестируемый образец захватывается и накапливается. В результате, часть контроля отображения (b) проявляет окрашивание с интенсивностью, которая зависит от количества второго антитела (или количества меченого антитела, которое связалось со вторым антителом), иммобилизованном на часть контроля отображения (b).
Отличные от тех, что описаны выше, могут быть сделаны разнообразные модификации устройства для обнаружения по настоящему изобретению без отступления от объема притязаний настоящего изобретения. К устройству для обнаружения по настоящему изобретению возможно прикрепить спецификационный документ, описывающий, как использовать устройство для обнаружения и способ определения, и, таким образом, настоящее изобретение предоставляет набор для определения, который представляет собой комплект, включающий спецификационный документ и устройство для обнаружения.
(IV) Средство для диагностики туберкулеза или набор для диагностики
Способ обнаружения кислотоустойчивой бациллы и устройство для обнаружения кислотоустойчивой бациллы, описанные выше, применяют для обнаружения существования кислотоустойчивых бацилл в биологическом образце индивида. В частности, когда MoAb1 по настоящему изобретению применяют в качестве моноклонального антитела, туберкулезная бацилла может являться иллюстрацией предпочтительного примера кислотоустойчивых бацилл. Таким образом, способ обнаружения кислотоустойчивой бациллы и устройство для обнаружения кислотоустойчивой бациллы, описанные выше, применяют для диагностики присутствия или отсутствия инфицирования кислотоустойчивыми бациллами, в особенности, туберкулезной бациллой.
Следовательно, MoAb, предпочтительно, MoAb1 по настоящему изобретению, описанное выше, является применимым как средство для диагностики туберкулеза, и настоящее изобретение относится к средству для диагностики туберкулеза, содержащему MoAb, предпочтительно, MoAb1 по настоящему изобретению. MoAb по настоящему изобретению может быть разъединяемым образом или неразъединяемым образом иммобилизовано на любом твердом носителе или может быть мечено любым метящим веществом.
Кроме того, когда способ обнаружения кислотоустойчивых бацилл, в частности, туберкулезной бациллы, по настоящему изобретению подлежит осуществлению, способ может быть проведен просто посредством применения набора для диагностики туберкулеза, содержащего в качестве реагента для обнаружения туберкулезной бациллы, MoAb, предпочтительно, MoAb1 по настоящему изобретению. Следовательно, настоящее изобретение относится к набору для диагностики туберкулеза для осуществления способа обнаружения туберкулеза. Набор для диагностики туберкулеза представляет собой набор реагентов для анализа обнаружения туберкулезной бациллы, существующей в тестируемом образце, с использованием реакции антиген-антитело. Является достаточным, когда набор содержит MoAb, предпочтительно, MoAb1 по настоящему изобретению; и набор может включать устройство для обнаружения туберкулезной бациллы, описанное выше, второе антитело, которое реагирует с MoAb, предпочтительно, MoAb1 по настоящему изобретению; и реагент для обнаружения антитела и т.п. Кроме того, для удобства проведения анализа, набор для диагностики может дополнительно включать подходящий реакционный раствор, раствор для разбавления, промывочный раствор, раствор для остановки реакции, реагент для измерения меченой активности и т.п.
(V) Аналитический тест на ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (конкретно, ЛАМ туберкулезной бациллы) и средство для обнаружения или набор для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (конкретно, ЛАМ туберкулезной бациллы)
MoAb по настоящему изобретению представляет собой антитело, которое специфически распознает липоарабиноманнан (ЛАМ) кислотоустойчивых бацилл и связывается с ним. Следовательно, способ обнаружения кислотоустойчивой бациллы по настоящему изобретению, описанный выше, может также применяться для анализа ЛАМ кислотоустойчивых бацилл.
Конкретно, аналитический тест на ЛАМ кислотоустойчивых бацилл по настоящему изобретению может проводиться посредством следующих стадий:
(1) стадии приведения MoAb по настоящему изобретению в контакт с тестируемым образцом, который может содержать кислотоустойчивые бациллы;
(2) стадии аналитического теста на ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, которые существуют в тестируемом образце, с использованием, в качестве показателя, реакции связывания между MoAb по настоящему изобретению и ЛАМ кислотоустойчивых бацилл.
Эти стадии (1) и (2) являются стадиями, соответствующими соответственно стадиям (1) и (2), приведенным в “(III) Способ обнаружения кислотоустойчивых бацилл, конкретно туберкулезной бациллы и кислотоустойчивой бациллы и устройство для определения кислотоустойчивой бациллы (в частности, туберкулезной бациллы) используемое в нем”, описанном выше, и описание, предоставленное выше в (III), может также использоваться в настоящем описании в качестве ссылки. В дополнение, аналитический тест на ЛАМ кислотоустойчивых бацилл может осуществляться аналогично с использованием устройства для обнаружения кислотоустойчивых бацилл, приведенном в (III), описанном выше (следует отметить, что в этом случае, возможно перефразировать его как “устройство для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл”).
Следует отметить, что в отношении MoAb по настоящему изобретению, поскольку MoAb1 представляет собой антитело, которое специфически распознает липоарабиноманнан (ЛАМ) туберкулезной бациллы и связывается с ним, способ обнаружения кислотоустойчивой бациллы по настоящему изобретению, описанный выше, может также применяться в качестве способа обнаружения туберкулезной бациллы для аналитического теста на ЛАМ туберкулезной бациллы.
В настоящем описании, аналитический тест на ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы, включает качественное измерение для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы, и количественное измерение для измерения количества ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы. Примеры количественного измерения могут включать, но не ограничены лишь приведенными, метод создания заранее стандартной кривой по результатам реакции между MoAb по настоящему изобретению и известным количеством ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы, и вычисления неидентифицированного количества ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы, содержащегося в тестируемом образце по стандартной кривой.
При таком анализе, MoAb по настоящему изобретению является применимым в качестве реагента для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, и настоящее изобретение относится к средству для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, содержащему MoAb по настоящему изобретению в качестве реагента для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл. Конкретно, MoAb1 по настоящему изобретению является применимым в качестве реагента для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, и настоящее изобретение относится к средству для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, содержащему MoAb1 по настоящему изобретению в качестве реагента для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы. Эти MoAb по настоящему изобретению могут быть разъединяемым образом или неразъединяемым образом иммобилизованы на любом твердом носителе или могут быть мечены любым метящим веществом.
Когда аналитический тест на ЛАМ кислотоустойчивых бацилл по настоящему изобретению подлежит осуществлению, анализ может быть проведен просто посредством применения набора для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, включающего MoAb по настоящему изобретению в качестве реагента для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл. Кроме того, когда аналитический тест на ЛАМ туберкулезной бациллы по настоящему изобретению подлежит осуществлению, анализ может быть проведен просто посредством применения набора для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, включающего среди MoAb по настоящему изобретению, MoAb1, в качестве реагента для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы.
Следовательно, настоящее изобретение относится к набору для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл для проведения анализа на ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, в частности, набору для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы для проведения анализа на ЛАМ туберкулезной бациллы. Набор для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл для проведения анализа на ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, в частности, набор для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, представляет собой набор реагентов для анализа на обнаружение ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, в частности, туберкулезной бациллы, существующих в тестируемом образце, с использованием реакции антиген-антитело. Набор для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл включает MoAb по настоящему изобретению. Является достаточным, когда набор для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы включает MoAb1 по настоящему изобретению, и набор может включать устройство для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (или устройство для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы), второе антитело, которое реагирует с MoAb (или MoAb1) по настоящему изобретению, реагент для обнаружения антитела и т.п. Кроме того, для удобства проведения анализа, набор для диагностики может дополнительно содержать подходящий раствор для реакции, раствор для разбавления, промывочный раствор, раствор для остановки реакции, реагент для измерения меченой активности и т.п.
(VI) Анализ стерилизованного образца
Способ обнаружения кислотоустойчивых бацилл или туберкулезной бациллы по настоящему изобретению, описанный выше в (III) может применяться в качестве аналитического теста, не представляющего биологическую опасность. Конкретно, аналитический тест, не представляющий биологическую опасность, по настоящему изобретению может быть проведен посредством следующих стадий.
(1) стерилизация тестируемого образца кипячением, предпочтительно, стерилизации паром высокого давления;
(2) стадия приведения MoAb, предпочтительно, MoAb1 по настоящему изобретению в контакт со стерилизованным тестируемым образцом; и
(3) стадия проведения анализа на ЛАМ туберкулезной бациллы в тестируемом образце с использованием в качестве показателя реакции связывания между MoAb, предпочтительно, MoAb1 по настоящему изобретению и ЛАМ туберкулезной бациллы; и
(4) стадия определения того, что тестируемый образец инфицирован туберкулезной бациллой, когда ЛАМ туберкулезной бациллы был обнаружен в тестируемом образце.
(VII) Способ определения лечебного эффекта противотуберкулезного лекарственного средства в отношении туберкулеза
Способ обнаружения кислотоустойчивых бацилл, в частности, туберкулезной бациллы по настоящему изобретению, описанный выше в (III) может применяться для определения лечебного эффекта противотуберкулезного лекарственного средства в отношении туберкулеза.
Конкретно, способ определения лечебного эффекта противотуберкулезного лекарственного средства в отношении туберкулеза по настоящему изобретению может осуществляться посредством следующих стадий.
(1) стадия приведения MoAb, предпочтительно, MoAb1 по настоящему изобретению в контакт с обоими тестируемыми образцами до и после введения противотуберкулезного лекарственного средства;
(2) стадия проведения анализа на ЛАМ туберкулезной бациллы в тестируемых образцах до и после введения противотуберкулезного лекарственного средства с использованием, в качестве показателя, реакции связывания между MoAb, предпочтительно, MoAb1 по настоящему изобретению, и ЛАМ туберкулезной бациллы; и
(3) стадия определения того, что противотуберкулезное лекарственное средство имеет лечебный эффект в отношении туберкулеза, когда ЛАМ туберкулезной бациллы обнаруживается в тестируемом образце перед введением противотуберкулезного лекарственного средства и, когда ЛАМ туберкулезной бациллы не обнаруживается в тестируемом образце после введения противотуберкулезного лекарственного средства.
Эти стадии (1) и (2) представляют собой стадии, соответствующие соответственно стадиям (1) и (2), приведенным в “(III) Способ обнаружения микобактерий, конкретно туберкулезной бациллы”, описанном выше, и способ, описанный в (III) выше, может быть осуществлен аналогично, за исключением того, что тестируемый образец представляет собой тестируемый образец пациента с туберкулезом, который заразился туберкулезом (инфицирован туберкулезной бациллой), и того, что тестируемые образцы, подвергнутые воздействию способа, представляют собой тестируемый образец перед введением противотуберкулезного лекарственного средства (перед лечением туберкулеза) и тестируемый образец после введения противотуберкулезного лекарственного средства (после лечения туберкулеза). Дополнительно, анализ на ЛАМ туберкулезной бациллы, проведенный на (2), может быть аналогично проведен с использованием устройства для обнаружения туберкулезной бациллы, приведенного в “(III) Способ обнаружения кислотоустойчивых бацилл, в частности, туберкулезной бациллы”, описанном выше (следует отметить, что в данном случае, воможно перефразировать его как “устройство для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы”).
В качестве противотуберкулезного лекарственного средства, описанного в настоящем описании, могут применяться лекарственные средства, которые известны в данной области до настоящего времени, такие как рифампицин, изониазид (гидразид изоникотиновой кислоты), пиразинамид, стрептомицин и его соль, и этамбутол и его соль. Однако, противотуберкулезное лекарственное средство не ограничено лишь ими, и включает разрешенные или еще не разрешенные к применению лекарственные средства, которые проявляют бактерицидное действие (противотуберкулезную активность) против туберкулезных бацилл.
В результате стадии (2), описанной выше, когда ЛАМ туберкулезной бациллы, другими словами туберкулезная бацилла, обнаруживается в тестируемом образце перед введением противотуберкулезного лекарственного средства, и, когда ЛАМ туберкулезной бациллы (туберкулезная бацилла) не обнаруживается в тестируемом образце после введения противотуберкулезного лекарственного средства; может быть определена эффективность противотуберкулезного лекарственного средства, поскольку противотуберкулезное лекарственное средство имело лечебный эффект в отношении туберкулеза на индивиде-пациенте с туберкулезом.
С другой стороны, в результате стадии (2), описанной выше, когда ЛАМ туберкулезной бациллы, другими словами туберкулезная бацилла, обнаруживается в тестируемом образце перед введением противотуберкулезного лекарственного средства, и, когда ЛАМ туберкулезной бациллы (туберкулезная бацилла) также обнаруживается в тестируемом образце после введения противотуберкулезного лекарственного средства, количество туберкулезной бациллы, обнаруженной перед введением и после введения противотуберкулезного лекарственного средства может сравниваться. В настоящем описании, когда наблюдают снижение количества туберкулезной бациллы перед введением и после введения противотуберкулезного лекарственного средства, предполагают возможный лечебный эффект в отношении туберкулеза от противотуберкулезного лекарственного средства на индивида-пациента с туберкулезом, и терапевтический выбор к продолжению применения противотуберкулезного лекарственного средства может быть предоставлен для медицинского работника. С другой стороны, когда не наблюдают снижения количества туберкулезной бациллы перед введением и после введения противотуберкулезного лекарственного средства, это указывает на то, что противотуберкулезное лекарственное средство не обладает лечебным эффектом в отношении туберкулеза на индивида-пациента с туберкулезом. Следовательно, терапевтический выбор остановки применения противотуберкулезного лекарственного средства и переключения на еще одну другую терапию может быть предоставлен для медицинского работника.
В способе, описанном выше, MoAb, в частности, MoAb1 по настоящему изобретению, является применимым в качестве реагента для определения лечебного эффекта в отношении туберкулеза, и настоящее изобретение относится к средству для определения лечебного эффекта в отношении туберкулеза, содержащему MoAb, в частности, MoAb1 по настоящему изобретению, в качестве реагента для определения лечебного эффекта в отношении туберкулеза. MoAb, в частности, MoAb1 по настоящему изобретению может разъединяемым образом или неразъединяемым образом иммобилизовано на любом твердом носителе или может быть мечено любым метящим веществом.
Кроме того, когда способ определения по настоящему изобретению, описанный выше, подлежит осуществлению, способ может быть проведен просто посредством применения набора для определения лечебного эффекта в отношении туберкулеза, включающего в качестве реагента для определения лечебного эффекта в отношении туберкулеза противотуберкулезного лекарственного средства MoAb, предпочтительно, MoAb1 по настоящему изобретению. Следовательно, настоящее изобретение относится к набору для определения лечебного эффекта в отношении туберкулеза для осуществления способа определения лечебного эффекта в отношении туберкулеза для противотуберкулезного лекарственного средства. Набор для определения лечебного эффекта в отношении туберкулеза представляет собой набор реагентов для определения терапевтического эффекта противотуберкулезного средства у пациента с туберкулезом, посредством анализа на обнаружение ЛАМ туберкулезной бациллы, существующей в тестируемых образцах до и после терапии с использованием реакции антиген-антитело. Является достаточным, когда набор включает MoAb, предпочтительно, MoAb1 по настоящему изобретению; и набор может включать устройство для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, описанное выше, второе антитело, которое реагирует с MoAb по настоящему изобретению, реагент для обнаружения антитела и т.п. Кроме того, для удобства проведения анализа, набор для диагностики может дополнительно включать подходящий реакционный раствор, раствор для разбавления, промывочный раствор, раствор для остановки реакции, реагент для измерения меченой активности и т.п.
Терапию активной формы туберкулеза, как правило, проводят посредством введения четырех или более типов терапевтических средств в течение шести месяцев. Когда существует подозрение на туберкулезную инфекцию, сначала проводят тест мазка с использованием окрашивания Циля-Нильсена или флуоресцентное окрашивание. Если бактерии существуют в количестве 10000 или более в 1 мл образца мокроты, он считается “положительным мазком”. Пациент с положительным результатом теста мазка мокроты является особенно важным в качестве источника инфекции, клинически и с точки зрения общественного здоровья. Следовательно, пациент с положительным результатом теста мазка требует больничного лечения в туберкулезном отделении. Одним показателем переключения на амбулаторное лечение является получение отрицательных результатов теста мазка в течение трех последовательных дней. Способ обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы по настоящему изобретению может количественно оценить концентрацию ЛАМ в биологическом образце, таком как мокрота, слюна и кровь. Следовательно, посредством аналитического теста на ЛАМ в биологическом образце, таком как мокрота, слюна и кровь, является возможным проводить мониторинг эффективности терапевтического средства, и настоящее изобретение является также применимым для определения инфекционно-отрицательного состояния по бактериям для выписки пациента.
Примеры
Настоящее изобретение и его эффекты описаны ниже со ссылкой на “Примеры”. Однако, объем притязаний изобретения не ограничивается данными Примерами.
Примеры 1-4
1. Подготовка материалов
(1-1) Подготовка олиго-ЛАМ и получение иммуногена
ЛАМ туберкулезной бациллы человека M. tuberculosis (3 мг) (полученный из штамма Aoyama B, Nacalai Tesque) диализовали против 50 мМ ацетатного буфера (рН 4,5) и доводили до концентрации 1 мг/мл. Последовательно, к нему добавляли 150 мкл 200 мМ водного раствора перйодной кислоты, и смесь перемешивали при 4°С в течение 7 минут, при обеспечении защиты от света. После перемешивания, к нему добавляли 35 мкл этиленгликоля, и смесь подвергали гель-фильтрации (0,1 М бикарбоната натрия, рН 8,3), используя небольшую колонку PD-10 (производимую компанией GE), и фракционировали на части по 1 мл. Фракционированные образцы тестировали на сахар методом фенол-серной кислоты; и фракции, в которых был обнаружен сахар диализовали против чистой воды и затем лиофилизировали.
Лиофилизированный олиго-ЛАМ (3 мг) растворяли в 0,5 мл чистой воды. После добавления к нему 12 мкл 100 мг/мл тетрафторбората 1-циано-4-диметиламинопиридина, растворенного в ацетонитриле и перемешивания смеси в течение приблизительно 1 минуты, к смеси добавляли 12 мкл 0,2 М триэтиламина, и смесь перемешивали в течение 2 минут. Затем к смеси добавляли 0,53 мл 0,6 М дигидразида адипиновой кислоты, растворенного в 0,5 М натрийбикарбонатного буфера (рН 8,5), и смесь перемешивали при 4°С в течение 10 часов, и затем диализовали против чистой воды в течение около 1 часа.
К раствору, полученному после диализа, добавляли 300 мкг гемоцианина устья моллюска (KLH), 30 мкл 200 мМ фосфатного буфера (рН 5,0) и 45 мкл 100 мМ N-гидроксисульфосукцинимида натрия. Последовательно, к смеси дополнительно добавляли 65 мкл 1 М дихлорида этилена, и смесь перемешивали при 4°С в течение 3 часов или более. Окончательно, полученную в результате смесь диализовали против фосфатного буфера с получением олиго-ЛАМ-KLH для иммуногена. Олиго-ЛАМ-KLH смешивали с адъювантом (Полный или Неполный адъювант Фрейнда, производимый Difco) при соотношении 1:1 (олиго-ЛАМ-KLH:адъювант (массовое отношение)), и использовали в качестве иммуногена.
(1-2) Подготовка вакцины БЦЖ и иммуногена
В качестве БЦЖ-вакцины, применяли лиофилизированную вакцину БЦЖ (номер авторизации: 20300AMZ00767000), производимую Japan BCG Laboratory. Для иммунизации, применяли смесь из 100 мг (влажной массы) лиофилизированной вакцины БЦЖ и 1 мл физиологического раствора.
(1-3) Получение убитых бактериальных клеток H37Ra и иммуногена
В качестве убитых бактериальных клеток H37Ra, использовали M. tuberculosis H37Ra (лиофилизированный продукт), производимый Difco. Для иммунизации использовали смесь из 100 мг (влажной массы) лиофилизированных убитых бактериальных клеток H37Ra и 1 мл физиологического раствора.
(1-4) Получение праймеров для получения фрагментов scFv
В Таблице 1 показаны наименования, последовательности оснований и применение праймеров, используемых для получений одноцепочечных антител (scFv). Были синтезированы следующие праймеры: четыре смысловых праймера и один антисмысловой праймер в качестве праймеров для амплификации области VH, четыре смысловых праймера и четыре антисмысловых праймера в качестве праймеров для амплификации области VL, один смысловой праймер и один антисмысловой праймер в качестве праймеров для амплификации линкера (GS-линкера), который объединяет фрагмент вариабельной области тяжелой цепи и фрагмент вариабельной области легкой цепи, и два праймера для амплификации областей распознавания рестрикционного фермента (SfiI, NotI). Аминокислотные последовательности SEQ ID NO:13-29 списка последовательностей, соответствуют аминокислотным последовательностям праймеров, перечисленных в Таблице 1, в порядке сверху-вниз.
Таблица 1
Наименование
Последовательность
Применение
SEQ ID NO
RabVH-F1
5′-gccggccgcccagtcggtggaggagtccRgg-3′
Смысловой праймер области VH
SEQ ID NO:13
RabVH-F2
5′-gccggccgcccagtcggtgaaggagtccgag-3′
Смысловой праймер области VH
SEQ ID NO:14
RabVH-F3
5′-gccggccgcccagtcgYtggaggagtccggg-3′
Смысловой праймер области VH
SEQ ID NO:15
RabVH-F4
5′-gccggccgcccagSagcagctgRtggagtccgg-3′
Смысловой праймер области VH
SEQ ID NO:16
RabVH-R
5′-cctccacctgaggatgaRgagaYggtgaccagggtgcc-3′
Антисмысловой праймер области VH
SEQ ID NO:17
RabVκ-F1
5′-gcggatcggagctcgtgMtgacccagactcca-3′
Смысловой праймер области VL
SEQ ID NO:18
RabVκ-F2
5′-gcggatcggagctcgatMtgacccagactcca-3′
Смысловой праймер области VL
SEQ ID NO:19
RabVκ-F3
5′-gcggatcggagctcgtgatgacccagactgaa-3′
Смысловой праймер области VL
SEQ ID NO:20
RabVκ-R1
5′-acctgcggccgcttaggatctccagctcggtccc-3′
Антисмысловой праймер области VL
SEQ ID NO:21
RabVκ-R2
5′-acctgcggccgcttttgatttccacattggtgcc-3′
Антисмысловой праймер области VL
SEQ ID NO:22
RabVκ-R3
5′-acctgcggccgcttttgacSaccacctcggtccc-3′
Антисмысловой праймер области VL
SEQ ID NO:23
RabVλ-F
5′-gcggatcggagctcgtgctgactcagtcgccctc-3′
Смысловой праймер области VL
SEQ ID NO:24
RabVλ-R
5′-acctgcggccgcgcctgtgacggtcagctgggtccc-3′
Антисмысловой праймер области VL
SEQ ID NO:25
RS1
5′-tcatcctcaggtggaggcggttcaggcggaggtggct ctggcggtggcggatcggagctcg-3′
Смысловой праймер GS-линкера
SEQ ID NO:26
RS2
5′-cgagctccgatccgccaccgccagagccacctccgcct gaaccgcctccacctgaggatga-3′
Антисмысловой праймер GS-линкера
SEQ ID NO:27
RS-Sfi
5′-agcggcccag ccggccgccc ag-3′
Праймер сайта Sfi-I
SEQ ID NO:28
RS-Not
5′-acctgcggccgc-3′
Праймер сайта Not-I
SEQ ID NO:29
(1-5) Получение библиотеки фагов scFv
Кролика иммунизировали, используя вакцину БЦЖ или убитые бактериальные клетки H37Ra в качестве иммуногена (см. (1-2) и (1-3) выше и Ссылочный Пример 1 (2)). После завершения иммунизации, отбирали селезенку кролика, ткань растворяли в среде RPMI (бессывороточной), общую РНК экстрагировали, и кДНК синтезировали из полученной общей РНК. Общую РНК экстрагировали с использованием набора для экстракции (Qiagen) в соответствии с инструкцией по эксплуатации. кДНК синтезировали из общей РНК, используя набор для синтеза кДНК в соответствии с инструкцией по эксплуатации.
Синтезированную кДНК использовали в качестве матрицы, и амплификацию фрагмента гена VH и амплификацию фрагмента гена VL осуществляли, используя специфичные праймеры, описанные в Таблице 1 выше. Конкретно, амплификацию фрагмента гена VH проводили, используя четыре набора праймеров: RabVH-F1 и RabVH-R, RabVH-F2 и RabVH-R, RabVH-F3 и RabVH-R, RabVH-F4 и RabVH-R. Амплификацию фрагмента гена VL проводили, используя 10 наборов праймеров: RabVk-F1 и RabVκ-R1, RabVκ-F1 и RabVκ-R2, RabVκ-F1 и RabVκ-R3, RabVκ-F2 и RabVκ-R1, RabVκ-F2 и RabVκ-R2, RabVκ-F2 и RabVκ-R3, RabVκ-F3 и RabVκ-R1, RabVκ-F3 и RabVκ-R2, RabVκ-F3 и RabVκ-R3, RabVλ-F и RabVλ-R. Полученные продукты генной амплификации разделяли посредством электрофореза на 1,5% агарозном геле. Продукты генной амплификации желательной молекулярной массы экстрагировали из геля и очищали.
Очищенный продукт амплификации гена VH и продукт амплификации гена VL объединяли, используя GS-линкер (GGGGSGGGGSGGGGS: SEQ ID NO:11). RS1, имеющий последовательность, гомологичную 3′-концу продукта амплификации гена VH, смешивали с геном VH, и ПЦР осуществляли в течение 5 циклов для добавления GS-линкера к 3′-концу продукта амплификации гена VH. Аналогично, RS2, имеющий последовательность, гомологичную 5′-концу продукта амплификации гена VL, смешивали с геном VL, и ПЦР осуществляли в течение 5 циклов для добавления GS-линкера к 5′-концу продукта амплификации гена VL. Продукт амплификации гена VH с добавленным GS-линкером и продукт амплификации гена VL с добавленным линкером смешивали, и ПЦР осуществляли в течение 10 циклов для получения гена scFv (ген VH/GS-линкер/ген VL), в котором ген VH и ген VL были объединены через GS-линкер. Полученный таким образом ген scFv использовали в качестве матрицы, амплифицированной посредством осуществления ПЦР в течение 30 циклов с использованием праймеров, в которые добавляют последовательность фермента рестрикции (см. “RS-Sfi” и “RS-Not” в Таблице 1), и окончательно расщепляют с помощью ферментов рестрикции SfiI и NotI.
Ген scFv, обработанный рестрикционными ферментами, затем вводили в сайты SfiI и NotI фагемидного вектора отображения антитела pCANTAB5E (прооизводимого GE) и трансформировали в JM109 E. coli посредством электропорации. Последовательно, трансформант культивировали в течение ночи при 37°C в среде на агаре LB-Amp/Glu (среда LB, содержащая 150 мкг/мл ампициллина, 1% глюкозы и 1,5% агара), и все полученные в результате колонии собирали.
600
12
После доведения трансформированной E. coli в среде LB до значения поглощения при длине волны 600 нм (OD), равного 0,2, трансформант смешивали с хелперным фагом М13К07 (производимым Invitrogen) (10 кое), затем статически культивировали в течение 30 минут при 37°C; и дополнительно культивировали при 37°C в 1 л жидкой среды на агаре LB-Amp/Kan (среда LB, содержащая 150 мкг/мл ампициллина и 100 мкг/мл канамицина) с получением библиотеки фагового дисплея scFv.
12
Окончательно, библиотеку фагового дисплея scFv концентрировали в растворе ПЭГ/NaCl и доводили с помощью PBS до концентрации, приблизительно равной 1×10 кое/мл, и полученную в результате библиотеку применяли для биопэннинга.
(1-6) Получение растворимого scFv (одноцепочечные антитела)
Растворимое scFv получали, используя вектор экспрессии pET22b(+) E. coli (производимый Novagen). Ген-мишень scFv амплифицировали с использованием смысловых и антисмысловых праймеров, посредством этого добавляя последовательность рестрикционного фермента NotI к 5′-концу и последовательность рестрикционного фермента NcoI к 3′-концу.
Ген scFv, обработанный NotI и NcoI вводили в вектор экспрессии pET22b(+) E. coli и затем трансформировали в хозяйскую E. coli Rosetta (Novagen). Трансформированную E. coli культивировали в течение ночи при 37°C в среде на агаре LB-Amp/Kan, и колонии культивировали в течение 8 часов при 25°C в 2 мл жидкой среды LB-Amp. Культуру (2 мл) добавляли к 200 мл жидкой среды LB-Amp, и культивировали в течение 16 часов при 30°C для секреции растворимого scFv (одноцепочечные антитела) в супернатант культуры.
Очистку растворимого scFv из супернатанта культуры осуществляли посредством аффинной очистки с использованием колонки, заполненной Ni-Сефарозой (Ni-колонки) (производимой GE). Трехкратное количество 100 мМ фосфатного буфера добавляют к супернатанту культуры, и смесь добавляют к Ni-колонке для обеспечения связывания растворимого scFv. Колонку промывают 100 мМ фосфатным буфером, содержащим 10 мМ имидазола, и затем растворимое scFv элюируют 100 мМ фосфатным буфером, содержащим 500 мМ имидазола.
Элюат последовательно диализуют против фосфатного буфера в течение ночи для удаления имидазола, и получают растворимое scFv (одноцепочечное антитело).
(1-7) Мечение антител биотином
Мечение биотином поликлонального (PoAb), и полученное выше одноцепочечное антитело scFv осуществляли с использованием набора для мечения Sulfo-NHS-LC-Biotin от Pierce, в соответствии с рекомендованной методикой эксплуатации набора.
2. Анализ
(2-1) Измерение титра антител в крови (ELISA)
С использованием сыворотки, собранной от кроликов и мышей, иммунизированных каждым антигеном, титр антител в крови подтверждали посредством ELISA, описанного ниже.
Очищенный ЛАМ туберкулезной бациллы человека M. tuberculosis (полученный из штамма Aoyama B, Nacalai Tesque) и очищенный ЛАМ нетуберкулезной кислотоустойчивой бациллы M. avium (полученный из штамма серотипа В, Nacalai Tesque) индивидуально доводили с помощью PBS до концентрации 100 мкл/мл. Каждый из растворов ЛАМ индивидуально добавляли в каждую лунку раздельных 96-луночных микропланшетов в количестве, равном 100 мкл/лунку и давали возможность реагировать в течение ночи при 4°С, и затем проводили блокирование в фосфатном буфере, содержащем 1% снятого молока для получения антигенных планшетов.
Первичную реакцию осуществляли посредством добавления 100 мкл сыворотки кролика или мыши, разбавленной реакционным буфером (Трис-буфер с рН 7,8, содержащим 1% БСА (зародышевый бычий альбумин), 1% снятого молока, 0,14 М NaCl и 0,1% Твин 20) в каждую лунку указанных выше антигенных планшетов, и посредством осуществления протекания реакции при 25°С в течение 1 часа. Непрореагировавшие антитела затем удаляли промывкой 3 раза. Вторичную реакцию осуществляли добавлением 100 мкл HRP-меченых против-кроличьих IgG (произведенных Epitomics) или HRP меченых против-мышиных IgG (произведенных Zymed), разбавленных 5000-кратно реакционным буфером, к указанному выше первичному раствору реакции, и обеспечивая протекание реакции при 25°С в течение 1 часа. Непрореагировавшие антитела затем удаляли промывкой 3 раза.
450-650 нм
Реакцию проявления цвета осуществляли добавлением 100 мкл раствора TMB (3,3′,5,5′-тетраметилбензидина) к продукту вторичной реакции, и оставляя смесь отстаиваться при комнатной температуре в течение 10 минут. После проявления цвета, реакцию останавливали добавлением 100 мкл раствора 1 н серной кислоты. Обнаружение осуществляли посредством измерения поглощения при длинах волн 450-650 нм (OD).
(2-2) Биопэннинг
Биопэннинг осуществляли в четыре стадии, состоящие из стадий 1-4.
11
12
12
600 нм
На стадиях 1-3, клоны фага, связанные с иммуногеном (БЦЖ-вакцина или убитые бактериальные клетки H37Ra) концентрировали. Библиотеку фагового дисплея scFv (см. (1-5) “1. Получение материалов)” доведенную до концентрации 1×10 кое/500 мкл реакционным буфером (Трис-буфер с рН 7,8, содержащий 1% БСА, 1% снятого молока, 0,14 М NaCl и 0,1% Твин 20), смешивали с 1 мг БЦЖ-вакцины или убитых бактериальных клеток H37Ra и обеспечивали реакцию при 25°С в течение 2 часов. После реакции, клетки собирали центрифугированием (при 10000 об/мин в течение 10 минут), и супернатант культуры удаляли. После добавления PBS к собранным клеткам и смешивания, клетки собирали повторно центрифугированием для промывки клеток. Операцию промывки проводили 5 раз. Фаги, связанные с клетками, элюировали 500 мкл элюента (раствор 0,1 н HCl, содержащий 0,1% БСА, и доведенный до рН 2,2 раствором 1М глицина), и нейтрализовали добавлением 500 мкл нейтрализационной жидкости (1М Трис-буфер, рН 9,1). Нейтрализованный пул фага инфицировали E. coli JM109, и культивировали при 37°C в среде на агаре LB-Amp/Glu в течение ночи; и колонии собирали. Далее трансформированная E. coli, доведенная в среде LB, чтобы иметь OD=0,2, и хелперный фаг М13К07 (производство Invitrogen) (10 кое) статически культивировали при 37°C в течение 30 минут, добавляли 100 мл жидкой среды LB-Amp/Kan, и клетки культивировали в течение ночи при 37°C. Культуру фага концентрировали в растворе ПЭГ/NaCl и доводили до концентрации приблизительно 1×10 кое/мл фосфатным буфером. Биопэннинг на клетках проводили 3 раза.
На стадии 4, биопэннинг осуществляли, используя антигенный планшет, на котором был иммобилизован ЛАМ M. tuberculosis или очищенный ЛАМ M. avium (микротитровальный планшет с иммобилизованным очищенным ЛАМ). Конкретно, пул фага, связанный с клетками, полученный на стадии 3, добавляли в микротитровальный планшет с иммобилизованным очищенным ЛАМ, и обеспечивали протекание реакции при 25°С в течение 2 часов. Последовательно, непрореагировавшие фаги удаляли промывкой реакционным буфером 10 раз. Фаги, связанные с ЛАМ, элюировали 100 мкл элюента и затем нейтрализовали добавлением 100 мкл жидкости для нейтрализации (1М Трис-буфер, рН 9,1). Нейтрализованный пул фага инфицировали E. coli JM109, и культивировали при 37°С в среде на агаре LB-Amp/Glu в течение ночи.
Ссылочный Пример 1. Получение антисыворотки против ЛАМ
(1) Для получения поликлонального антитела (PoAb) против ЛАМ кроликов иммунизировали с использованием олиго-ЛАМ. В качестве олиго-ЛАМ, использовали, конкретно, олиго-ЛАМ-KLH, полученный как иммуноген способом, описанным в упомянутом выше (1-1) из “1. Получение материалов”. Олиго-ЛАМ-KLH смешивали с адъювантом (неполным адъювантом Фрейнда), при соотношении 1:1 (олиго-ЛАМ-KLH:адъювант (массовое отношение), и 100 мкг смеси подкожно вводили кроликам (два кролика: Rab-1 и 2). Далее иммунизацию осуществляли 4 раза с 14-дневными интервалами. После завершения пятой иммунизации, проводили забор крови, и титры антител в крови против ЛАМ туберкулезной бациллы человека (M. tuberculosis) и ЛАМ нетуберкулезной кислотоустойчивой бациллы (M. Avium) измеряли в соответствии с методом ELISA, описанном в указанном выше (2-1) из “2. Анализ”.
В результате оценки с использованием антигенного планшета, на котором был иммобилизован ЛАМ M. tuberculosis достаточное увеличение титров антител было подтверждено в сыворотках, разбавленных 384000-кратно у двух подкожно иммунизированных кроликов (Rab-1 и 2). Антисыворотки этих кроликов (Rab-1 и 2) также проявляли реактивность связывания с антигенным планшетом на котором был иммобилизован ЛАМ M. Avium, и проявляли сходную реактивность как к ЛАМ M. tuberculosis, так и ЛАМ M. Avium. Конкретно, антисыворотки кролика (поликлональное антитело), полученное с использованием олиго-ЛАМ (олиго-ЛАМ-KLH) в качестве иммуногена, имели реактивность к ЛАМ кислотоустойчивых бацилл в целом, и никакой специфичности по отношению к ЛАМ туберкулезной бациллы не наблюдали.
(2) Далее, кролика иммунизировали, используя БЦЖ-вакцину в качестве иммуногена, и кролика иммунизировали, используя убитые бактериальные клетки H37Ra в качестве иммуногена. Каждого кролика подкожно иммунизировали 4 раза при 14-дневных интервалах таким же образом, что и выше. Конкретно, каждого кролика подкожно иммунизировали, с использованием, в целом, на иммунизацию 1 мл физиологического раствора, содержащего 100 мг БЦЖ-вакцины или убитых бактериальных клеток H37Ra, полученных способом, описанным в указанном выше (1-2) или (1-3) из “1. Получение материалов”.
Титр антител в крови каждого кролика после второй иммунизации измеряли таки же образом, что и выше, посредством метода ELISA, описанного в указанном выше (2-1) из “2. Анализ”. Конкретно, титры антител сывороток, полученных из кролика, иммунизированного БЦЖ-вакциной, и кролика, иммунизированного убитыми бактериальными клетками H37Ra, оценивали, используя антигенный планшет, на котором был иммобилизован очищенный ЛАМ M. tuberculosis, и антигенный планшет, на котором был иммобилизован очищенный ЛАМ M. avium. Фиг. 3 (А) показывает результаты, когда в качестве иммуногена использовали БЦЖ-вакцину, а фиг. 3 (В) показывает результаты, когда использовали убитые бактериальные клетки H37Ra. На чертежах “--” указывает на реактивность к ЛАМ M. tuberculosis, а “-●-” указывает на реактивность к ЛАМ M. avium.
Как показано на фиг. 3, как в случае использования БЦЖ-вакцины, так и в случае использования убитых бактериальных клеток H37Ra, было подтверждено, что титры антител к ЛАМ значительно возрастали концентрационно-зависимым образом. Далее, сходная реактивность проявлялась как к ЛАМ M. tuberculosis, так и ЛАМ M. avium.
Как описано выше, когда олиго-ЛАМ, БЦЖ-вакцина и убитые бактериальные клетки H37Ra индивидуально применялись в качестве иммуногенов, все антисыворотки (поликлональные антитела) против этих антигенов имели реактивность к ЛАМ кислотоустойчивых бацилл в целом, и никакой специфичности к ЛАМ туберкулезной бациллы не наблюдали.
Пример 1. Получение одноцепочечных антител (scFv) против ЛАМ
(1) Получение scFv против ЛАМ
Одноцепочечные антитела scFv выделяли из клеток селезенки кроликов, иммунизированных с использованием олиго-ЛАМ, БЦЖ-вакцины и убитых бактериальных клеток H37Ra в Ссылочном Примере 1.
Конкретно, в соответствии со способом, описанным в (1-5) из “1. Получение материалов”, общую РНК получали из селезенки каждого кролика, и ПЦР осуществляли, используя кДНК, синтезированную из общей РНК в качестве матрицы, и используя разнообразные праймеры, описанные в Таблице 1 для получения продуктов амплификации генов VH и VL.
6
6
Последовательно, получали гены scFv, каждый имеющий ген VH и ген VL, объединенные через GS-линкер (GGGGSGGGGSGGGGS: SEQ ID NO:11) (ген VH/GS-линкер/ген VL), и затем из них получали библиотеки фагового дисплея scFv, в соответствии со способом, описанном в (1-5) из “1. Получение материалов”. Титр каждой библиотеки составлял приблизительно 10 кое, и, таким образом, предполагали, что каждая библиотека имела диверсифицирование, равное 10.
Для библиотеки фагового дисплея scFv, полученной из клеток селезенки кролика, иммунизированного БЦЖ-вакциной, биопэннинг с использованием в качестве антигена БЦЖ-вакцины (см.(2-2) из “2. Анализ”) осуществляли 3 раза, и затем четвертый биопэннинг осуществляли, используя микропланшет, на котором был иммобилизован ЛАМ M. tuberculosis.
Аналогично, для библиотеки фагового дисплея scFv, полученной из клеток селезенки кролика, иммунизированного убитыми бактериальными клетками H37Ra, биопэннинг с использованием в качестве антигена убитые бактериальные клетки H37Ra осуществляли 3 раза, и затем четвертый биопэннинг осуществляли, используя микропланшет, на котором был иммобилизован ЛАМ M. tuberculosis.
В конечном счете, 200 клонов были статистически выбраны из полученного пэннинга, и клоны, реактивные к ЛАМ были подвергнуты скринингу. В результате, приблизительно 10 ЛАМ-реактивных клонов были получены из каждой библиотеки.
В результате анализа последовательности оснований, было подтверждено, что последовательности оснований клонов, полученных из каждой библиотеки, были почти идентичными.
Посредством указанных выше операций, одиночный клон scFv (одноцепочечные антитела) был успешно выделен из каждой библиотеки фагового дисплея scFv, полученной из клеток селезенки кролика, иммунизированного с использованием БЦЖ-вакцины, библиотеки фагового дисплея scFv, полученной из клеток селезенки кролика, иммунизированного с использованием убитых бактериальных клеток H37Ra.
Фиг. 4 показывает аминокислотную последовательность одноцепочечного антитела scFv (Myco-scFv), полученного из клеток селезенки кролика, иммунизированного с использованием убитых бактериальных клеток H37Ra (SEQ ID NO:30) и аминокислотную последовательность одноцепочечного антитела scFv (ТВ-scFv), полученного из клеток селезенки кролика, иммунизированного с использованием БЦЖ-вакцины (SEQ ID NO:12) вместе с положениями областей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи; GS-линкера; и областей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи.
(2) Реактивность scFv к ЛАМ
Реактивность к ЛАМ оценивали у одноцепочечного антитела scFv (ТВ-scFv), полученного из библиотеки фагового дисплея scFv, полученной из клеток селезенки кролика, иммунизированного с использованием БЦЖ-вакцины, и у одноцепочечного антитела scFv (Myco-scFv), полученного из библиотеки фагового дисплея scFv, полученной из клеток селезенки кролика, иммунизированного с использованием убитых бактериальных клеток H37Ra.
Конкретно, каждое из одноцепочечных антител (ТВ-scFv и Myco-scFv) солюбилизировали в соответствии со способом, описанным в (1-6) из “1. Получение материалов” для получения растворимого scFv. Растворимое scFv затем метили биотином в соответствии со способом, описанным в (1-7) из того же раздела; и реактивность к антигенным планшетам (микротитровальным планшетам с иммобилизованным очищенным ЛАМ), т.е. планшету, на котором был иммобилизован очищенный ЛАМ M. tuberculosis, и планшету, на котором был иммобилизован очищенный ЛАМ M. avium, оценивали методом ELISA, описанным в (2-1) из “2. Анализ”.
Фиг. 5 показывает реактивность одноцепочечного антитела ТВ-scFv к ЛАМ M. tuberculosis “--” и к ЛАМ M. avium “-●-”. Как показано на Фиг. 5, результаты, полученные посредством реакции ТВ-scFv при концентрациях, равных 1000 нг/мл, 500 нг/мл, 250 нг/мл, 125 нг/мл, 62,5 нг/мл, 31,25 нг/мл, 15,625 нг/мл и 7,8125 нг/мл с ЛАМ M. tuberculosis и ЛАМ M. avium в антигенных планшетах с иммобилизованным ЛАМ, подтверждали, что реактивность ТВ-scFv к ЛАМ M. tuberculosis “--” достигала максимального значения при концентрации 250 нг/мл со значением OD (450 нм) большим, чем 3, в то время как реактивность ТВ-scFv к ЛАМ M. avium “-●-” не достигала максимального значения даже при концентрации, равной 1000 нг/мл со значением OD (450 нм), равным приблизительно 2. Несмотря на то что результаты не показаны, Myco-scFv проявляло почти такую же реактивность как к ЛАМ M. tuberculosis, так и к ЛАМ M. avium.
Приведенные выше результаты подтверждали, что одноцепочечное антитело ТВ-scFv, полученное посредством использования БЦЖ-вакцины в качестве иммуногена, представляет собой специфичное антитело, имеющее более сильную реактивность к ЛАМ туберкулезной бациллы человека M. tuberculosis, чем к ЛАМ нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл M. avium.
Пример 2
Конструкция обнаружения ЛАМ посредством ELISA
Характеристики трех типов антител, полученных в Ссылочном Примере 1 и Примере 1 (поликлональное антитело от кролика, иммунизированного олиго-ЛАМ (далее в настоящем описании именуемое как “Myco-Poly”) (Ссылочный Пример 1) и моноклональное антитело от кролика, иммунизированного убитыми бактериальными клетками H37Ra (Myco-scFv) и моноклональное антитело от кролика, иммунизированного БЦЖ-вакциной (ТВ-scFv) (Пример 1)) были обобщены в Таблице 2.
На основании реакционной специфичности этих антител, антитела были объединены для конструирования двух типов ELISA:
ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы.
(1) Подготовка ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл
Для конструкции ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл Myco-Poly иммобилизовывали в качестве иммобилизованного антитела на планшете, а Myco-scFv метили биотином и применяли как антитело для обнаружения.
Myco-Poly доводили до концентрации 10 мкг/мл фосфатным буфером. Myco-Poly добавляли к 96-луночный микропланшет в количестве 100 мкл/лунку и обеспечивали протекание реакции в течение ночи при 4°С; затем блокирование проводили в фосфатном буфере, содержащем 1% снятого молока для получения планшета с антителом.
Первичную реакцию осуществляли следующим образом. Применяли тестируемый образец, который может содержать кислотоустойчивые бациллы, и 100 мкл тестируемого образца, разбавленного реакционным буфером (Трис-буфер с рН 7,8, содержащий 1% БСА, 1% снятого молока, 0,14 М NaCl и 0,1% Твин 20) добавляли в каждую лунку указанного выше планшета с антителом. Обеспечивали протекание реакции при 25°С в течение 1 часа, и планшет затем промывали 3 раза. Вторичную реакцию осуществляли добавлением 100 мкл биотин-меченых-против Myco-scFv, разбавленных 5000-кратно реакционным буфером, в каждую лунку планшета с антителом, обеспечивая протекание реакции при 25°С в течение 1 часа и удаляя непрореагировавшие антитела посредством промывки 3 раза. Третичную реакцию осуществляли добавлением к смеси 100 мкл авидин-меченых HRP (произведенных Millipore), разбавленных 10000-кратно реакционным буфером, обеспечивая протекание реакции при 25°С в течение 1 часа, и затем удаляя непрореагировавшие авидин-меченые HRP посредством промывки 3 раза.
Реакцию проявления цвета осуществляли добавлением 100 мкл раствора TMB в каждую лунку, и оставляя смесь отстаиваться при комнатной температуре в течение 10 минут. После проявления цвета, реакцию останавливали добавлением 100 мкл раствора 1 н серной кислоты. Интенсивность проявления цвета обнаруживали посредством измерения поглощения при длинах волн 450-650 нм.
(2) Подготовка ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы
ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы был построен с использованием ТВ-scFv как в качестве иммобилизованного антитела, так и антитела для обнаружения. ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы был подготовлен таким же образом, что описан выше в (1), за исключением того, что ТВ-scFv использовали как в качестве иммобилизованного антитела, так и антитела для обнаружения.
(3) Оценка обнаружения каждого ЛАМ с помощью ELISA
ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, подготовленные в (1) и (2), соответственно, оценивали на реактивность к ЛАМ, используя очищенный ЛАМ туберкулезной бациллы человека (M. Tuberculosis), и очищенный ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (M. Avium).
Фиг. 6 показывает результаты. На чертеже ● указывает на реактивность к ЛАМ M. tuberculosis при ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл,  указывает на реактивность к M. avium при ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, ○ указывает на реактивность к ЛАМ M. tuberculosis при ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы,  указывает на реактивность к ЛАМ M. avium при ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы.
Как становится ясно из фиг. 6, было возможно обнаружить ЛАМ M. tuberculosis (--) и ЛАМ M. avium (-●-) эквивалентно при проведении ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл. С другой стороны, при проведении ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, было потверждено, что реактивность к ЛАМ туберкулезной бациллы M. tuberculosis почти достигала максимального значения при концентрации 100 нг/мл со значением OD 450 нм, равным 3 или более, в то время как почти никакой реактивности к ЛАМ кислотоустойчивых бацилл M. avium не проявлялось даже при концентрации 100 нг/мл.
Пример 3
Оценка реактивности антитела к ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и ЛАМ туберкулезной бациллы при проведении ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы (использование клинических изолятов кислотоустойчивых бацилл)
Применяли ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, сконструированные в Примере 2, и реактивность антитела к ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и ЛАМ туберкулезной бациллы оценивали, используя клинические изоляты разнообразных кислотоустойчивых бацилл, показана на фиг. 7.
Конкретно, в качестве клинических изолятов кислотоустойчивых бацилл использовали культуры 38 штаммов M. tuberculosis (см. Таблицы А и В, фиг. 7), культуры 23 штаммов M. avium и культуры 6 штаммов M. intracellulare (см. Таблицы C и D, фиг. 7). Штаммы M. avium и штаммы M. intracellulare представляют собой патогенные бактерии заболевания MAC. Каждый клинический изолят кислотоустойчивых бацилл культивировали до слияния при 37°С в жидкой среде (бульон 7Н9, производимый BD, содержащий обогащение 10% ADC, производимое BD), и культуру консервировали замораживанием при -80°С.
Культуру, консервированную замораживанием оттаивали и затем смешивали с эквивалентным количеством Y-PER (реагентом для экстракции белка, производимым Thermo), и смесь последовательно нагревали в течение 10 минут при 95°С. После сбора клеток посредством центрифугирования (10000 об/мин, 10 минут), отбирали супернатант. К отобранному супернатанту добавляли 4-кратное количество реакционного буфера (фосфатный буфер, содержащий 1% снятого молока, 0,5% БСА, 0,05% Твин 20 и 0,1% XL-II), 100 мкл смеси подвергали ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, сконструированные в Примере 2, и измеряли реактивность антитела к ЛАМ.
Результаты измерений, полученные посредством каждого из ELISA, оценивали посредством сравнения с реактивностью антитела к очищенному ЛАМ M. tuberculosis, используемому в качестве стандарта. На фиг. 7 показаны результаты.
Как показано на фиг. 7, при проведении ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (см. столбец “myco” в каждой таблице фиг. 7), реактивность проявлялась ко всем из 38 штаммов M. tuberculosis, 23 штаммов M. avium и 6 штаммов M. intracellulare. С другой стороны, при проведении ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы (см. столбцы “TB” в каждой таблице фиг. 7), реактивность к 34 из 38 штаммов M. tuberculosis проявлялась в высокой степени, но никакой реактивности к 23 штаммам M. avium и 6 штаммам M. intracellulare не было проявлено.
Как показано выше, было продемонстрировано, что ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, сконструированный в Примере 2, имел высокую реактивность к ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, и обладал способностью к широкому обнаружению ЛАМ кислотоустойчивых бацилл. С другой стороны, при ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, сконструированном в Примере 2, существовало различие в реактивности среди штаммов, и реакция была специфичной по сравнению с ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл. Конкретно, ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, сконструированный в Примере 2, специфически обнаруживал ЛАМ туберкулезной бациллы и проявлял хорошие результаты с чувствительностью 90% и специфичностью 100%.
Исходя из приведенных выше результатов, было подтверждено, что ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, сконструированный в Примере 2 (иммобилизованное антитело: Myco-Poly и антитело для обнаружения: Myco-scFv), может широко обнаруживать ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, а ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, сконструированный в Примере 2 (иммобилизованное антитело: TB-scFv и антитело для обнаружения: TB-scFv), может специфически обнаруживать ЛАМ туберкулезной бациллы с четким отличием от ЛАМ нетуберкулезных бацилл.
Пример 4. Конструкция иммунохроматографических методов обнаружения ЛАМ
Иммунохроматографические тесты для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы были сконструированы с использованием пар антител, подвергнутых оценке посредством ELISA.
(1) Иммунохроматографический метод для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл
Для конструирования иммунохроматографического теста на обнаружение ЛАМ кислотоустойчивых бацилл Myco-Poly, иммобилизованное на нитроцеллюлозной мембране использовали в качестве иммобилизованного антитела, а Myco-scFv, меченый коллоидом золота, использовали в качестве антитела для обнаружения.
Myco-Poly (иммобилизованное антитело) наносили на нитроцеллюлозную мембрану (производимую Millipore, время капиллярного протока: 240) до концентрации 3,0 мг/мл (фосфатный буфер) и высушивали при 50°С в течение 20 часов. Получали иммунохроматографическую полоску, содержащую нитроцеллюлозный субстрат и поглощающую подложку, наклеенную на него. К ним присоединяли ламинатный герметик, и полученную в результате полоску нарезали на полоски шириной 4 мм, которые использовали для одного теста.
Для получения меченого коллоидным золотом Myco-scFv применяли коллоид золота с размером 40 нм. Myco-scFv добавляли к коллоидному золоту (OD=1) до концентрации 2,0 мкг/мл и обеспечивали реакцию при комнатной температуре в течение 20 минут. В качестве буфера для связывания антитела применяли 2 мМ TES (N-Трис(гидроксиметил)метил-2-аминоэтансульфоновую кислоту) (рН 7,5). После мечения коллоидным золотом блокировку осуществляли посредством обеспечения протекания реакции в буфере, содержащем 2 мМ Боракс (декагидрат тетрабората натрия) и 1,5 БСА (рн 9,0) при 300 об/мин при комнатной температуре в течение 5 минут. После блокировки, проводили центрифугирование при 4620×g в течение 20 минут при 4°С, и супернатант культуры удаляли. Полученный в результате осадок суспендировали в растворе для разбавления антитела, меченого коллоидным золотом (10 мМ Боракс, 5% сахарозы и 1% БСА (рН 9,0)), и затем отфильтровывали через 0,1 мкм фильтр.
Анализ проводили следующим образом. После разбавления тестируемого образца, который мог содержать кислотоустойчивые бациллы, экстракционным буфером (72 мМ дигидрата дигидрофосфата натрия, 4,5% бычьего сывороточного альбумина, 0,9% казеина, 0,09% Тритона-Х305, 0,1% азида натрия, 10,0% Y-PER и подходящее количество хлористоводородной кислоты, рН 7,0) добавляли подходящее количество раствора антитела, меченого коллоидным золотом. Полоску, полученную выше, погружали в эту жидкость для проявления тестируемого образца. Через семь минут после начала проявления, полоску удаляли и промывали фосфатным буфером, содержащим поверхностно-активное вещество (0,1% Твин 20) в течение 8 минут, после чего оценку осуществляли невооруженным глазом для определения того, был ли образец положительным или отрицательным.
(2) Иммунохроматографический метод обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы
Иммунохроматографический тест для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы был сконструирован образом, аналогичным методу построения и методу анализа, описанным выше в (1), за исключением того, что TB-scFv использовали в качестве как иммобилизованного антитела, так и антитела для обнаружения.
(3) Оценка каждого иммунохроматографического метода обнаружения ЛАМ
Реактивность против ЛАМ в иммунохроматографических тестах для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, сконструированных в (1) и (2), оценивали, используя очищенный ЛАМ M. tuberculosis и ЛАМ M. avium.
На фиг. 8 показаны результаты.
ЛАМ M. tuberculosis измеряли посредством иммунохроматографических методов обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы. Линию подтверждали невооруженным глазом в обоих иммунохроматографических тестах (myco: для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл; и ТВ: для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы (Фиг. 8А и 8В). Аналогично, ЛАМ M. avium измеряли, используя обе аналитические системы. Как показано на Фиг. 8С и 8D, в иммунохроматографическом тесте для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, линию, сравнимую с линией, наблюдаемой в анализе ЛАМ M. tuberculosis, подтверждали невооруженным глазом. Напротив, никакую линию не обнаруживали, даже при такой высокой концентрации как 1000 нг/мл, в иммунохроматографическом тесте для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы (ТВ) (Фиг. 8D).
Приведенные выше результаты указывают на то, что одноцепочечное антитело TB-scFv, полученное с использованием БЦЖ-вакцины в качестве иммуногена может специфически обнаруживать туберкулезную бациллу человека (M. Tuberculosis) в иммунохроматографических тестах.
Как показано в Примерах 1-4, авторы настоящего изобретения успешно выделили одноцепочечное антитело (scFv (TB-scFv)), которое специфически реагирует с ЛАМ туберкулезной бациллы, и установили систему иммунологического анализа, которая может специфически обнаруживать ЛАМ туберкулезной бациллы посредством измерения ЛАМ с помощью TB-scFv. Аналитическая система с использованием TB-scFv является применимой для ELISA и иммунохроматографических тестов и обеспечивает быструю и простую диагностику туберкулезной инфекции.
Примеры 5-12
3. Получение материалов
(3-1) Получение БЦЖ-вакцины и иммуногена
В качестве БЦЖ-вакцины, применяли лиофилизированную вакцину БЦЖ (номер авторизации: 20300AMZ00767000), производимую Japan BCG Laboratory. Для иммунизации, использовали смесь из 100 мг (влажной массы) лиофилизированной вакцины БЦЖ и 1 мл физиологического раствора.
(3-2) Получение библиотеки фагов scFv курицы
Цыпленка иммунизировали, используя вакцину БЦЖ в качестве иммуногена (см. (3-1) выше и Пример 6). После завершения иммунизации, селезенку иссекали из цыпленка и ткань растворяли в среде RPMI (бессывороточной). Общую РНК экстрагировали, с использованием набора для экстракции РНК (производимого Qiagen) в соответствии с инструкцией по эксплуатации. кДНК синтезировали из общей РНК, используя набор для синтеза кДНК (производимый Invitrogen) в соответствии с инструкцией по эксплуатации.
Фрагмента гена VH и гена VL амплифицировали, используя синтезированную кДНК в качестве матрицы, и с использованием праймеров, перечисленных в Таблице 3. Конкретно, амплификацию фрагмента гена VH проводили, используя набор праймеров из Sfi1-CκVH F и GSL-CκVH R, в то время как фрагмент гена VL амплифицировали с использованием набора праймеров GSL-CκVL F и Not1-CκVL R.
Таблица 3
Наименование
Последовательность
Применение
SEQ ID NO.
Sfi1-CκVH F
5′-ctatgcggcccagccggccgccgtgacgttggacgag-3′
Смысловой праймер области VH с сайтом SfiI (подчеркнут)
SEQ ID NO:41
GSL-CκVH R
5′-cctccaccggaggagacgatgacttcggtcc-3′
Антисмысловой приаймер области VH
SEQ ID NO:42
GSL-CκVL F
5′-gcggatcggccctgactcagccgtcctcggtgtc-3′
Смысловой праймер области VL
SEQ ID NO:43
Not1-CkVL R
5′-acctgcggccgctaggacggtcagg-3′
Антисмысловой праймер области VL с сайтом Not I (подчеркнут)
SEQ ID NO:44
CkVH-GSL- VLF
5′-tcctccggtggaggcggttcaggcggagatggctctgg cggtggcggatcggccctg-3′
Смысловой праймер GS-линкера
SEQ ID NO:45
CkVL-GSL- VHR
5′-cagggccgatccgccaccgccagagccatctccgcct gaaccgcctccaccggagg-3′
Антисмысловой праймер GS-линкера
SEQ ID NO:46
Полученные продукты генной амплификации разделяли посредством электрофореза на 1,5% агарозном геле. Продукты генной амплификации желательной молекулярной массы экстрагировали из геля и очищали.
Очищенный продукт гена VH и очищенный продукт гена VL объединяли, используя GS-линкер (SEQ ID NO:40). CκVL-GSL-VH R (SEQ ID NO:46), имеющий последовательность, гомологичную 3′-концу продукта гена VH, смешивали с геном VH, и ПЦР осуществляли в течение 5 циклов для добавления GS-линкера к 3′-концу гена VH. Аналогично, CκVH-GSL-VL F (SEQ ID NO:45), имеющий последовательность, гомологичную 5′-концу продукта гена VL, смешивали с геном VL, и ПЦР осуществляли в течение 5 циклов для добавления GS-линкера к 5′-концу гена VL. Ген VH с добавленным GS-линкером и ген VL с добавленным GS-линкером смешивали, и ПЦР осуществляли в течение 10 циклов для получения гена scFv (ген scFv курицы), имеющего ген VH, ген GS-линкера и ген VL, соединенные вместе. Окончательно, ген scFv расщепляли с помощью ферментов рестрикции SfiI и NotI.
Последовательно, ген scFv, обработанный рестрикционными ферментами, вводили в сайты SfiI и NotI фагемидного вектора отображения антитела pCANTAB5E и трансформировали в JM109 E. coli посредством электропорации. Трансформант культивировали в течение ночи при 37°C в среде на агаре LB-Amp/Glu (среда LB, содержащая 150 мкг/мл ампициллина, 1% глюкозы и 1,5% агара), и все генерированные колонии собирали.
600 нм
12
После доведения трансформированной E. coli в среде LB до значения поглощения при 600 нм (OD), равного 0,2, трансформант смешивали с хелперным фагом М13К07 (10 кое), затем статически культивировали при 37°C в течение 30 минут; и дополнительно культивировали в течение ночи при 37°C в 1 л жидкой среды на агаре LB-Amp/Kan (среда LB, содержащая 150 мкг/мл ампициллина и 100 мкг/л канамицина) с получением библиотеки фагового дисплея scFv курицы.
12
Окончательно библиотеку фагового дисплея scFv концентрировали в растворе ПЭГ/NaCl и доводили с помощью PBS до концентрации, приблизительно равной 1×10 кое/мл, и полученную в результате библиотеку применяли для биопэннинга.
(3-3) Антигенный биопэннинг с использованием библиотеки scFv курицы
Антигенный биопэннинг осуществляли в четыре стадии, состоящих из стадий 1-4.
11
12
12
600 нм
На стадиях 1-3, клоны фага, связанные с иммуногеном (БЦЖ-вакцина) концентрировали. Библиотеку фагового дисплея scFv курицы, доведенную до концентрации 1×10 кое/500 мкл реакционным буфером (Трис-буфер с рН 7,8, содержащий 1% БСА, 1% снятого молока, 0,14 М NaCl и 0,1% Твин 20) (см. (3-2) из “3. Получение материалов”), смешивали с 1 мг БЦЖ-вакцины и обеспечивали реакцию при 25°С в течение 2 часов. После реакции, клетки собирали центрифугированием (при 10000 об/мин в течение 10 минут), и супернатант культуры удаляли. После добавления PBS к собранным клетках и смешивания, клетки собирали повторно центрифугированием для промывки клеток. Операцию промывки проводили 5 раз. Фаги, связанные с клетками, элюировали 500 мкл элюента (раствор 0,1 N HCl, содержащий 0,1% БСА, и доведенный до рН 2,2 раствором 1М глицина), и нейтрализовали добавлением 500 мкл нейтрализационной жидкости (1М Трис-буфер, рН 9,1). Нейтрализованный пул фага инфицировали E. coli JM109, и культивировали при 37°С в среде на агаре LB-Amp/Glu в течение ночи; и колонии собирали. После того, как трансформированную E. coli, полученную в среде LB, с OD = 0,2, и хелперный фаг М13К07 (10 кое) статически культивировали в течение 30 минут, добавляли 100 мл жидкой среды LB-Amp/Kan, и клетки культивировали при 37°С в течение ночи. Культуру фага концентрировали в растворе ПЭГ/NaCl и доводили до концентрации приблизительно 1×10 кое/мл фосфатным буфером. Биопэннинг на клетках проводили 3 раза.
На стадии 4 очищенный ЛАМ M. tuberculosis реагировал с иммобилизованным на планшете ТВ-scFv и биопэннинг осуществляли, используя комплекс ТВ-scFv и ЛАМ. Конкретно, 10 мкг очищенного ЛАМ M. tuberculosis добавляли в микротитровальный планшет с иммобилизованным на нем ТВ-scFv при концентрации 5 мкг/мл, и обеспечивали протекание реакции при 25°С в течение 1 часа. После промывки, добавляли пул фага, связанный с клетками, полученными на стадии 3, и обеспечивали протекание реакции при 25°С в течение 2 часов. Последовательно, непрореагировавшие фаги удаляли промывкой реакционным буфером 10 раз. Фаг, связанный с комплесом ТВ-scFv и ЛАМ, элюировали 100 мкл элюента и затем нейтрализовали добавлением 100 мкл жидкости для нейтрализации (1М Трис-буфер, рН 9,1). Нейтрализованный пул фага инфицировали E. coli JM109, и культивировали при 37°С в среде на агаре LB-Amp/Glu в течение ночи.
(3-4) Селекция ЛАМ-связывающего клона scFv курицы
12
Для ЛАМ-связывающего scFv клоны фага, которые специфически реагировали с ЛАМ, были подвергнуты селекции с использованием ELISA фагов. Пул фага, полученный на стадии 4 антигенного биопэннинга с использованием библиотеки scFv курицы, объясненный в (3-3), культивировали в виде одиночной колонии, и полученную одиночную колонию культивировали в 50 мкл среды LB-Amp при 37°С в течение 8 часов. После инфицирования клеток 50 мкл раствора хелперного фага M13K07 (10 кое/мл), добавляли 400 мкл жидкой среды LB-Amp/Kan и культивировали при 37°С в течение ночи для получения культуры клонов одиночного фага.
450-650 нм
ELISA фага осуществляли добавлением 10 мкл очищенного ЛАМ M. tuberculosis в микротитровальный планшет с иммобилизованным на нем ТВ-scFv при концентрации 5 мкг/мл, обеспечивая протекание реакции при 25°С в течение 1 часа для получения комплекса ТВ-scFv и ЛАМ, и проводя скрининг клонов, способных реагировать с комплексом. Первичную реакцию осуществляли посредством добавления 90 мкл реакционного буфера (фосфатный буфер, содержащий 1% БСА, 1% снятого молока, и 0,05% Твина 20) и 10 мкл культуры фагового дисплея scFv в планшет с иммобилизованным ЛАМ, и обеспечения протекания реакции при 25°С в течение 1 часа. Последовательно, непрореагировавшие фаги удаляли промывкой 3 раза. Вторичную реакцию осуществляли добавлением к раствору первичной реакции 100 мкл HRP-меченого антитела против-белка р8 фага М13, разбавленного 5000-кратно таким же реакционным буфером, как и выше, и обеспечивая протекание реакции при 25°С в течение 1 часа. Последовательно, непрореагировавшие антитела удаляли промывкой 3 раза. Реакцию проявления цвета осуществляли добавлением 100 мкл раствора TMB к продукту вторичной реакции, и обеспечивая протекание реакции при комнатной температуре в течение 10 минут. После проявления цвета, к ней добавляли 100 мкл раствора 1 н серной кислоты для остановки реакции. Обнаружение осуществляли посредством измерения поглощения (OD) при длинах волн 450-650 нм.
Клон, реактивный к ЛАМ подвергали ПЦР для амплификации гена scFv, и последовательность гена определяли методом прямого секвенирования.
(3-5) Образцы, используемые для оценки ELISA с использованием бивалентного антитела
ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы с использованием бивалентных антител оценивали, используя клинические изоляты кислотоустойчивых бацилл (38 штаммов M. tuberculosis, 23 штамма M. avium и 6 штаммов M. intracellulare), БЦЖ, шесть типов бактерий полости рта (N. asteroides, N. farcinica, S. globisporus, C. albicans, A. israelii и T. paurometabolum) и образцы мокроты (54 образца). Все экстракции ЛАМ из культиврованных бактериальных клеток и из образцов мокроты осуществляли при одинаковых условиях. После добавления NaOH к каждому образцу до конечной концентрации, равной 0,4 М и смешивания, смесь кипятили в течение 30 минут. После кипячения, смесь нейтрализовали добавлением фосфатного буфера.
4. Анализ
(4-1) Получение бивалентного антитела
Одноцепочечное антитело scFvA было модифицировано в бивалентное антитело посредством общепринятого метода. Гены областей VH и VL были клонированы из Myco-scFv (SEQ ID NO:30), TB-scFv (SEQ ID NO:12) и G3-scFv (SEQ ID NO:39) в векторы экспрессии клеток млекопитающих, имеющие константную кроличью область (торговые наименования pFUSEss-CHIg-rG*03 и pFUSE2ss-CLIg-rk1, производимые InvivoGen) для получения векторов экспрессии VH и VL. Экспрессионные векторы VH и VL смешивали и трансфицировали в клетки СНО. После культивирования вектор-трансфицированных клеток в течение 4 дней, бивалентные антитела (бивалентное Myco-scFv, бивалентное TB-scFv и бивалентное G3-scFv) были выделены и очищены от супернатантов с использованием белка А (производимого Bio-Rad).
(4-2) Мечение бивалентного антитела биотином
Мечение биотином каждого бивалентного антитела осуществляли с использованием набора для мечения Sulfo-NHS-LC-Biotin от Pierce, в соответствии с инструкцией по эксплуатации, приложенной к набору. Биотин-меченое антитело использовали для конструирования системы ELISA.
(4-3) Конструкция ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл с использованием бивалентного антитела
ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл с использованием бивалентных антител был сконструирован с применением, бивалентного TB-scFv, бивалентного G3-scFv и бивалентного Myco-scFv (см. (4-1) “Получение бивалентного антитела”).
Бивалентное TB-scFv и бивалентное G3-scFv смешивали в равных количествах и доводили до концентрации 5 мкг/мл фосфатным буфером. Полученную в результате смесь добавляли в 96-луночный микропланшет при пропорции, равной 100 мкл/лунку, и обеспечивали протекание реакции при 4°С в течение ночи, после чего проводили блокирование в фосфатном буфере, содержащем 1% снятого молока, таким образом, получая планшет с иммобилизованными на нем антителами.
450-650 нм
Первичную реакцию осуществляли посредством добавления 100 мкл образца, разбавленного реакционным буфером (Трис-буфер, содержащий 1% БСА, 1% снятого молока, 0,14 М NaCl и 0,1% Твин 20) в лунки указанного выше планшета с антителами, и обеспечения протекания реакции при 25°С в течение 1 часа и 30 минут. Далее, планшет промывали 3 раза. Вторичную реакцию осуществляли добавлением к раствору первичной реакции 100 мкл биотин-меченого бивалентного Myco-scFv, разбавленного 5000-кратно тем же реакционным буфером, что и выше, и обеспечивая протекание реакции при 25°С в течение 1 часа и 30 минут. Последовательно, непрореагировавшие антитела удаляли промывкой 3 раза. Третичную реакцию осуществляли, добавляя к раствору вторичной реакции 100 мкл авидин-меченого HRP, разбавленного 10000-кратно тем же реакционным буфером, что и выше, и обеспечивая протекание реакции при 25°С в течение 1 часа и 30 минут. Последовательно, непрореагировавшее авидин-меченое HRP удаляли промывкой 3 раза. Реакцию проявления цвета осуществляли добавлением 100 мкл раствора TMB к раствору третичной реакции, и обеспечивая протекание реакции при комнатной температуре в течение 10 минут. После проявления цвета, добавляли 100 мкл раствора 1N серной кислоты для остановки реакции. Обнаружение проводили посредством измерения поглощения (OD) при длинах волн 450-650 нм.
(4-4) Конструкция ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы с использованием бивалентного антитела
ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы с использованием бивалентных антител был сконструирован таким же образом, как и ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, описанный в (4-3) выше, за исключением того, что бивалентное TB-scFv использовали в качестве иммобилизованного антитела, а биотин-меченое бивалентное Myco-scFv применяли в качестве антитела для обнаружения.
Пример 5. Иммунизация цыплят и оценка титра антител куриной антисыворотки против ЛАМ
Иммунизацию цыплят проводили через подкожную иммунизацию полного количества БЦЖ-вакцины (100 мг чистой массы/1 мл физиологического раствора), полученной посредством способа, описанного в (3-1) из “3. Подготовка материалов”. Иммунизацию проводили 4 раза с 14-дневными интервалами, и титр антител в крови цыплят оценивали посредством ELISA.
Очищенный ЛАМ туберкулезной бациллы человека M. tuberculosis (полученный из штамма Aoyama B, Nacalai Tesque) или очищенный ЛАМ нетуберкулезной кислотоустойчивой бациллы M. avium (полученный из штамма серотипа В, Nacalai Tesque) доводили с помощью PBS до концентрации 100 мкл/мл. Раствор ЛАМ добавляли в 96-луночный микропланшет в количестве, равном 100 мкл/лунку и давали возможность реагировать в течение ночи при 4°С, и проводили блокирование в фосфатном буфере, содержащем 1% снятого молока, для получения антигенного планшета.
450-650 нм
Первичную реакцию осуществляли посредством добавления 100 мкл куриной сыворотки, разбавленной реакционным буфером (Трис-буфер с рН 7,8, содержащим 1% БСА, 1% снятого молока, 0,14 М NaCl и 0,1% Твин 20) в каждую лунку антигенного планшета, и обеспечивая протекание реакции при 25°С в течение 1 часа. Последовательно, непрореагировавшие антитела удаляли промывкой 3 раза. Вторичную реакцию осуществляли добавлением к раствору первичной реакции, 100 мкл HRP-меченого против-куриного IgY, разбавленного 5000-кратно тем же самым реакционным буфером, и обеспечивая протекание реакции при 25°С в течение 1 часа. Последовательно, непрореагировавшие антитела удаляли промывкой 3 раза. Реакцию проявления цвета осуществляли добавлением 100 мкл раствора TMB к продукту вторичной реакции, и обеспечивая протекание реакции при комнатной температуре в течение 10 минут. После проявления цвета, реакцию останавливали добавлением 100 мкл раствора 1N серной кислоты. Обнаружение осуществляли посредством измерения поглощения при длинах волн 450-650 нм (OD).
Результаты показаны на Фиг. 9. На чертеже “--” представляет реактивность куриной антисыворотки к очищенному ЛАМ M. tuberculosis, а “-●-” представляет реактивность куриной антисыворотки к очищенному ЛАМ M. avium. Как показано на Фиг. 9, было подтверждено, что иммунизация цыплят БЦЖ-вакциной в достаточной степени увеличивала титр антител против ЛАМ. В дополнение, аналогичную реактивность наблюдали как к ЛАМ туберкулезной бациллы, так и ЛАМ кислотоустойчивых бацилл.
Пример 6. Получение куриного scFv (одноцепочечные антитела) против ЛАМ
(1) Получение куриного scFv (одноцепочечные антитела) против ЛАМ
6
6
Одноцепочечные антитело scFv было выделено из клеток селезенки цыплят, иммунизированных с использованием БЦЖ-вакцины. Конкретно, в соответствии с методом, описанным в (3-2) из “3. Подготовка материалов”, общую РНК получали из селезенки цыплят, и ПЦР осуществляли, используя кДНК, синтезированную из общей РНК в качестве матрицы и разнообразные праймеры, описанные в Таблице 3, для получения продуктов амплификации гена VH и продуктов амплификации гена VL. Далее, получали одноцепочечные антитела курицы (ген VH/GS-линкер/ген VL), каждое имеющее ген VH и ген VL, объединенные вместе через GS-линкер (SEQ ID NO:40), и из них получали библиотеки фагового дисплея scFv. Поскольку титр каждой библиотеки составлял приблизительно 10 кое, предполагали, что каждая библиотека имела диверсифицирование, равное 10.
Используя полученные библиотеки фагового дисплея scFv, биопэннинг проводили 3 раза с БЦЖ-вакциной. С целью выделения одноцепочечные антитела scFv, которое распознает эпитоп, который отличается от эпитопа TB-scFv, для четвертого биопэннинга применяли комплекс, образованный посредством реакции ЛАМ M. tuberculosis (полученной из штамма Аояма В) с TB-scFv, которое было иммобилизовано на микропланшете. Обеспечивали реакцию раствора ЛАМ M. tuberculosis на микропланшете, имеющем иммобилизованное на нем TB-scFv, микропланшет промывали 3 раза, к нему добавляли пул фагов пэннинга БЦЖ, и обеспечивали протекание реакции при 25°С в течение 2 часов. После реакции, микропланшет промывали 3 раза, и ЛАМ-связывающие фаги элюировали. В конечном счете, 200 клонов были статистически выбраны из пула пэннинга, и был проведен скрининг клонов, реактивных к ЛАМ, с использованием комплекса TB-scFv и ЛАМ. Приблизительно 10 ЛАМ-реактивных клонов были получены из каждой библиотеки. В результате анализа последовательности оснований, было подтверждено, что последовательности клонов, полученных из каждой библиотеки, были почти идентичными.
В результате, одиночный клон scFv одноцепочечного антитела (G3-scFv) был успешно выделен из библиотеки фагового дисплея scFv, полученной из клеток селезенки цыплят, иммунизированных с использованием БЦЖ-вакцины. Фиг. 10 показывает аминокислотную последовательность (SEQ ID NO:39) одноцепочечного антитела G3-scFv, выделенного из библиотеки клеток селезенки цыплят, вместе с положениями областей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи; GS-линкера; и областей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи.
(2) Реактивность куриного scFv (одноцепочечные антитела) к ЛАМ
Реактивность полученного G3-scFv, как описано выше, к ЛАМ оценивали, используя планшет, на котором был иммобилизован очищенный ЛАМ M. tuberculosis, и планшет, на котором был иммобилизован очищенный ЛАМ M.avium. Конкретно, G3-scFv солюбилизировали в соответствии со способом, описанным в (1-6) из “1. Получение материалов” для получения солюбилизированного G3-scFv. Затем мечение биотином проводили в соответствии со способом, описанным в (1-7) из того же раздела; и реактивность к антигенным планшетам (микротитровальным планшетам с иммобилизованным очищенным ЛАМ), т.е. планшету, на котором был иммобилизован очищенный ЛАМ M. tuberculosis, и планшету, на котором был иммобилизован очищенный ЛАМ M. avium, оценивали посредством анализа методом ELISA.
В результате, G3-scFv проявлял аналогичную реактивность как к ЛАМ туберкулезной бациллы, так и ЛАМ кислотоустойчивых бацилл. Исходя из данного результата, был сделан вывод, что одноцепочечное антитело G3-scFv курицы является антителом, имеющим реактивность против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл в целом, включая ЛАМ туберкулезной бациллы.
Пример 7. Конструкция ELISA для обнаружения ЛАМ с использованием бивалентных антител
Имея намерение довести настоящее изобретение до практического применения, три типа одноцепочечных антител scFv (Myco-scFv, TB-scFv и G3-scFv), полученные в Примерах 1 и 6, модифицировали в бивалентные антитела в соответствии с методом, описанным в (4-1) из “Получение бивалентного антитела”, и два типа ELISA, ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бактерий и ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, были сконструированы на основании реакционной специфичности бивалентных антител. Конкретно, в случае ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бактерий, бивалентное TB-scFv и бивалентное G3-scFv смешивали и иммобилизовывали на планшете в качестве иммобилизованных антител, а бивалентное Myco-scFv, которое было мечено биотином, использовали в качестве антитела для обнаружения. В случае ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, бивалентное TB-scFv было иммобилизовано на планшете в качестве иммобилизованного антитела, а бивалентное Myco-scFv, которое было мечено биотином, использовали в качестве антитела для обнаружения. Подробности иммобилизации описаны в (4-3) и (4-4) из “4. Анализ”.
Оценку сконструированных ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бактерий и ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы проводили посредством анализа ЛАМ, экстрагированного из культивированных бактериальных клеток БЦЖ (Фиг. 11). В результате, как показано на Фиг. 11, как при проведении ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бактерий (--), так и ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы (-●-), было возможно обнаружить ЛАМ БЦЖ с эквивалентной чувствительностью.
Пример 8. Оценка чувствительности обнаружения при обнаружении ЛАМ методом ELISA с использованием бивалентных антител
6
Чтобы провести оценку чувствительности ELISA с использованием бивалентных антител, культивированные бактериальные клетки БЦЖ разбавляли в ряде от 10 кое/мл до 61 кое/мл, и часть каждого из растворов разбавления применяли для экстракции геномной ДНК для осуществления теста с амплификацией нуклеиновой кислоты (NAAT), а еще одну их часть применяли для экстракции ЛАМ для осуществления ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бактерий.
Результат ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бактерий показан на фиг. 12. Как видно из таблицы на Фиг. 12, чувствительность обнаружения теста с амплификацией нуклеиновой кислоты (NAAT) составляла приблизительно 500 кое/мл, в то время как чувствительность обнаружения ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бактерий составляла приблизительно 250 кое/мл. Повторяющаяся последовательность, которая является мишенью теста с амплификацией нуклеиновой кислоты, является различной, в зависимости от бактериального штамма с точки зрения числа повторов, и утверждают, что чувствительность обнаружения может быть различной в зависимости от бактериального штамма. Несмотря на то что чувствительность генетического тестирования была низкой, поскольку повторяющаяся последовательность в БЦЖ является небольшой, утверждают, что бактериальный штамм, имеющий большую повторяющуюся последовательность, как правило, приводит в результате к чувствительности обнаружения, равной 100 кое/мл.
Имея результат, описанный выше, было доказано, что ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бактерий с использованием бивалентных антител по настоящему изобретению является очень высокочувствительным методом иммунологического анализа с чувствительностью обнаружения, которая является эквивалентной или более высокой, чем чувствительность обнаружения теста с амплификацией нуклеиновой кислоты.
Пример 9. Тест на перекрестную реактивность при обнаружении ЛАМ методом ELISA с использованием бивалентных антител
У бактерий полости рта, существуют виды, которые имеют мембранный антиген со структурой, сходной с компонентом ЛАМ. Когда нужно обнаружить ЛАМ кислотоустойчивых бактерий и ЛАМ туберкулезной бациллы в образце мокроты, перекрестная реактивность с этими бактериями полости рта становится очень проблематичной, и это является одним из препятствий для установления иммунологического анализа для обнаружения кислотоустойчивых бактерий и туберкулезной бациллы с использованием мокроты.
6
8
7
В настоящем описании, для исследования перекрестной реактивности к бактериям полости рта при обнаружении ЛАМ методом ELISA, получали жидкие культуры каждого из N. asteroides (сокращаемого как “Na”), N. farcinica (сокращаемого как “Nf”), S. globisporus (сокращаемого как “Sg”), C. albicans (сокращаемого как “Ca”), A. israelii (сокращаемого как “Ai”) и T. paurometabolum (сокращаемого как “Tp”). Жидкие культуры доводили до 10 кое/мл и 10 кое/мл (10 кое/мл только для Ca), и из них экстрагировали ЛАМ, как из культивируемых бактериальных клеток БЦЖ для анализа обнаружения ЛАМ методом ELISA.
5
8
Как может быть понятно из Фиг. 13, хотя реактивность БЦЖ, используемой в качестве контроля, достигала максимального значения при концентрации 10 кое/мл, каждая из бактерий полости рта совсем не проявляла реактивности при высоких уровнях концентрации, равных 10 кое/мл. Полностью такой же результат наблюдали при обнаружении методом ELISA ЛАМ туберкулезной бациллы.
Описанные выше результаты доказали, что одноцепочечные антитела, scFv (Myco-scFv, TB-scFv и G3-scFv), полученные авторами изобретения, имеют высокое сродство к ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и ЛАМ туберкулезной бациллы, и то, что возможно обнаруживать кислотоустойчивые бациллы (включая туберкулезную бациллу) при чувствительности, настолько же высокой, как чувствительность теста с амплификацией нуклеиновой кислоты, посредством комбинирования этих антител в виде бивалентного антитела, и то, что предоставлены анализ и антитела, которые являются очень селективными и специфичными при полном отсутствии перекрестной реактивности с бактериями полости рта.
Пример 10. Оценка обнаружения ЛАМ методом ELISA с использованием бивалентных антител с клиническими изолятами
С применением клинических изолятов кислотоустойчивых бацилл, оценивали ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы с использованием бивалентных антител.
В качестве клинических изолятов использовали 38 штаммов M. tuberculosis, 23 штамма M. avium и 6 штаммов M. intracellulare. Штаммы M. avium и штаммы M. intracellulare представляют собой патогенные бактерии заболевания MAC. ЛАМ экстрагировали из культивируемых бактериальных клеток этих штаммов, и осуществляли ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы с использованием бивалентных антител. Результаты показаны на фиг. 14.
На фиг. 14 “A” показывает результаты ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (черный столбец) и ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы (белый столбец), осуществляемых на 38 штаммах клинических изолятов туберкулезной бациллы (M. tuberculosis). “B” показывает результаты ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (черный столбец) и ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы (белый столбец), осуществляемых на 29 штаммах нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл (23 штамма M. avium и 6 штаммов M. intracellulare).
Как при ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, так и при ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, наблюдали реактивность у всех из 38 штаммов M. tuberculosis, 23 штаммов M. avium и 6 штаммов M. intracellulare. Несмотря на то что метод ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл проявлял эквивалентную реакцию для туберкулезных бацилл и нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл, ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы проявлял низкую реактивность к нетуберкулезным кислотоустойчивым бациллам.
С целью дифференциации туберкулезных бацилл от нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл исключительно по результату обнаружения ЛАМ методом ELISA, рассчитывали отношение (значение от ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл/значение от ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы) значения от ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл к значению от ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы (фиг. 15). В результате, в случае туберкулезной бациллы, из 38 штаммов, был только 1 штамм, который имел отношение двух значений измерения, превышающее 3. С другой стороны, в случае нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл, 23 штамма из 29 штаммов имели отношение 3 или более.
Результат, описанный выше, указывает на то, что метод обнаружения ЛАМ посредством ELISA может обнаруживать ЛАМ почти без влияния от различий между штаммами. Дополнительно, было доказано, что посредством расчета отношения (значение от ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл/значение от ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы) от обеих аналитических систем, возможно дифференцировать (различать) туберкулезные бациллы от нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл с превосходной оценкой, составляющей 97% чувствительности и 80% специфичности, и то, что способ по настоящему изобретению представляет собой первую в мире иммуноаналитическую систему в качестве обнаружения ЛАМ посредством ELISA “способную к обнаружению кислотоустойчивых бацилл в целом, а также различению туберкулезных бацилл от нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл”.
Пример 11. Оценка обнаружения ЛАМ методом ELISA с использованием бивалентных антител с клиническими образцами мокроты
Чтобы оценить способность обнаружения ЛАМ методом ELISA с использованием бивалентных антител, сконструированных в Примере 7, проводили оценку с использованием клинических образцов мокроты от 54 медицинских случаев. Оценку проводили посредством как прямого теста мазка (Мазок), так и теста с амплификацией нуклеиновой кислоты (NAAT). Результаты прямого теста мазка и теста с амплификацией нуклеиновой кислоты обобщены в Таблице 4.
Таблица 4
Мазок
NAAT
Число образцов
3+
+
11
2+
+
4
1+
+
18
Недостаточно
+
9
Недостаточно
-
1
-
+
3
-
-
8
По результатам прямого теста мазка, имели место 43 положительных случая (3+, 2+, 1+, Недостаточно); а теста с амплификацией нуклеиновой кислоты, 45 положительных случаев (+). Из этих случаев, 42 были положительными в обоих тестах, 8 случаев были отрицательными и 3 теста были положительными только в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты.
ЛАМы экстрагировали из клинических образцов мокроты и анализировали с использованием метода ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, и результаты каждого из них показаны в Таблице 5 и на Фиг. 16. В Таблице 5 показаны вместе показатели обнаружения метода ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы.
Как показано в Таблице 5, результаты метода ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы были почти идентичными. В группах, с подтвержденной балльной оценкой 1+ или выше, с точки зрения числа бактериальных клеток в тесте мазка, реактивность ELISA достигала максимального значения у большинства образцов. Даже с оценкой “Недостаточно”, в которых число бактериальных клеток было малым, реактивность ELISA достигала максимального значения у 50% образцов. Кроме того, даже в 3 случаях, которые имели очень малое число бактериальных клеток и были определены как положительные только в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты, более высокие значения получали во всех из них, в отличие от образцов, которые были определены как отрицательные в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты. В методе ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, хотя ЛАМ был обнаружен во всех образцах, которые были определены как положительные в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты, ЛАМ не смогли обнаружить даже в единичном случае в образцах, которые были определены как отрицательные в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты. Таким образом, чувствительность и специфичность ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл совпадали на 100% при сравнении с тестом с амплификацией нуклеиновой кислоты. Во всех случаях совпадение чувствительности и специфичности в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты также имело место с тестом ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, за исключением того что в одном случае, определенном как положительный в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты и как “недостаточно” в тесте мазка, не было совпадения с результатом теста с амплификацией нуклеиновой кислоты. Кроме того, один случай, в котором не было совпадения, находился только незначительно ниже критического значения.
Описанные выше результаты указывают на то, что ELISA для обнаружения ЛАМ по настоящему изобретению представляет собой тест, способный производить скрининг и отбор пациентов, инфицированных кислотоустойчивыми бациллами, с чувствительностью и специфичностью, эквивалентными этим показателям для теста с амплификацией нуклеиновой кислоты.
Далее, чтобы подтвердить существование корреляции между значением в ELISA для обнаружения ЛАМ и количеством бактерий, проводили измерение разбавлений.
Экстракционные растворы из образцов мокроты разбавляли 5-кратно, 25-кратно 125-кратно, и разбавленные растворы анализировали вместе с очищенным ЛАМ, который применяли в качестве стандартного препарата, и концентрации ЛАМ в них были рассчитаны. Результат показан на фиг. 17.
Образцы были разделены на группы (I: отрицательные как в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты и тесте мазка, II: положительные в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты и отрицательные в тесте мазка, III: положительные в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты и “недостаточно” в тесте мазка, IV: 1+ в тесте мазка, V: 2+ в тесте мазка; VI: 3+ в тесте мазка) с использованием теста с амплификацией нуклеиновой кислоты и количества бактерий на основании теста мазка, в сравнении с концентрацией ЛАМ (пг/мл). В результате, как показано на Фиг. 17, поскольку среднее значение концентрации ЛАМ возрастает от группы с небольшим количеством бактерий к группе с большим количеством бактерий (I к VI), это показывает, что существует положительная корреляция между количеством бактерий и концентрацией ЛАМ. Из результата, описанного выше, было показано, что количество бактерий может быть предсказано посредством количественного определения концентрации ЛАМ.
Эти результаты показали, что способ по настоящему изобретению имеет чувствительность и специфичность, эквивалентную чувствительности и специфичности в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты, и представляет собой тест, способный к дополнительному определению количества бактерий, и способ оказался применимым для терапевтического мониторинга и т.д. туберкулеза.
Пример 12. Оценка стабильности ЛАМ
При транспортировке образцов мокроты, необходимо транспортировать образцы под жестким контролем вследствие проблемы инфекционности. В таком случае, стоимость становится высокой, и доступные области становятся ограниченными. Если образец мокроты стерилизован после сбора, его обычная транспортировка становится возможной. Чтобы полностью стерилизовать кислотоустойчивые бациллы, обработки, такие как кипячение в течение 30 минут или дольше, и стерилизация паром под давлением (автоклав и т.д.) являются необходимыми. Когда осуществляют такие обработки, можно предсказать, что структура ЛАМ становится измененной. Авторы изобретения исследовали, является или нет сконструированный метод ELISA для определения ЛАМ, описанный выше, резистентным к жесткой стерилизационной обработке и может ли точно обнаруживать ЛАМ.
Каждый из ЛАМ экстрагировали из бактериальных клеток (автоклавированных бактерий), полученных автоклавированием (121°С, 20 минут) культивированных бактериальных клеток БЦЖ, бактериальных клеток, которые кипятили в течение 30 минут при 100°С (обработанных кипячением бактерий), и необработанных бактерий, и с ними осуществляли анализ, применяя ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл. Результаты показаны на Фиг. 18. Когда сравнивают необработанные бактерии (белый столбец), обработанные кипячением бактерии (черный столбец) и автоклавированные бактерии (серый столбец), значения были полностью идентичными для всех них, указывая на то, что возможно также анализировать ЛАМ у бактериальных клеток, подвергнутых жестким обработкам, таким как кипячение и автоклавирование, аналогично необработанным бактериям.
В дополнение, оценку стабильности при хранении проводили, используя бактериальные клетки, которые были автоклавированы (121°С, 20 минут), что является наиболее жесткой обработкой. После оставления автоклавированных бактериальных клеток БЦЖ при 25°С на 7 дней, ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл осуществляли на ЛАМ, экстрагированных из них. Фиг. 19 показывает результаты (черный столбец), и результаты (белый столбец) ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, осуществляемого на ЛАМ, экстрагированном из бактериальных клеток БЦЖ немедленно после автоклавирования. Как может быть понято из Фиг. 19, не было почти никакого различия между ними двумя, и результат, аналогичный результату для бактериальной клетки немедленно после обработки, был получен для бактериальных клеток, оставленных на 7 дней после автоклавирования. Этот факт указывает на то, анализ возможен в течение по меньшей мере одной недели после стерилизационной обработки.
Исходя из результатов, полученных выше, было подтверждено, что с аналитической системой по настоящему изобретению, анализ возможен даже тогда, когда целевыми клетками являются бактериальные клетки, с которые претерпели жесткие обработки, такие как стерилизация паром под давлением (автоклавирование), и анализ может осуществляться стабильно в течение по меньшей мере одной недели после обработки.
Следовательно, даже в области, в которой отсутствует специальная транспортная система образцов, доставка образца возможна с использованием обычных транспортных систем, таких как почта и т.п. Кроме того, с точки зрения времени, поскольку существует период отсрочки, равный приблизительно одной неделе, возможно, что задержка при транспорте образца не будет являться проблемой.
Свободный текст
SEQ ID NO:9 и 10 показывают единичные аминокислотные последовательности последовательностей GS-линкера, а SEQ ID NO:11 и 40 показывают аминокислотные последовательности линкерных последовательностей, применяемых в настоящем изобретении. SEQ ID NO:13-16 показывают аминокислотные последовательности смысловых праймеров вариабельной области тяжелой цепи антитела; SEQ ID NO:17 показывает аминокислотную последовательность антисмыслового праймера вариабельной области тяжелой цепи антитела; SEQ ID NO:18-20 и 24 показывают аминокислотные последовательности смысловых праймеров вариабельной области легкой цепи антитела; SEQ ID NO:21-23 и 25 показывают аминокислотные последовательности антисмысловых праймеров вариабельной области легкой цепи антитела; SEQ ID NO:26 показывает аминокислотную последовательность смыслового праймера GS-линкера; SEQ ID NO:27 показывает аминокислотную последовательность антисмыслового праймера GS-линкера; SEQ ID NO:28 показывает аминокислотную последовательность праймера сайта рестрикционного фермента (SfiI); и SEQ ID NO:29 показывает аминокислотную последовательность праймера сайта рестрикционного фермента (NotI) (см. Таблицу 1).
SEQ ID NO:41 показывает аминокислотную последовательность смыслового праймера вариабельной области тяжелой цепи антитела; SEQ ID NO:42 показывает аминокислотную последовательность антисмыслового праймера вариабельной области тяжелой цепи антитела; SEQ ID NO:43 показывает аминокислотную последовательность смыслового праймера вариабельной области легкой цепи антитела; SEQ ID NO:44 показывает аминокислотную последовательность антисмыслового праймера вариабельной области легкой цепи антитела; SEQ ID NO:45 показывает аминокислотную последовательность смыслового праймера GS-линкера; и SEQ ID NO:46 показывает аминокислотную последовательность антисмыслового праймера GS-линкера (см. Таблицу 3).