СПОСОБ БИОВОССТАНОВЛЕНИЯ ВОДЫ, ЗАГРЯЗНЕННОЙ УГЛЕВОДОРОДАМИ
METHOD FOR BIOREMEDIATION OF WATER CONTAMINATED WITH HYDROCARBONS

Настоящее изобретение относится к способу биовосстановления воды, загрязненной углеводородами, который включает использование композиции на основе биоразрушаемого полимера.
Известно, что многие микроорганизмы, в частности бактерии, способны метаболизировать большое число загрязняющих веществ, которые могут присутствовать в водном пространстве из-за сброса химических веществ различных типов, в частности углеводородных веществ, происходящих из нефти. Эти микроорганизмы разрушают эти вещества через метаболические процессы окислительного типа до образования воды и диоксида углерода. Процессы восстановления загрязненных вод, известные как биовосстановление, основаны на этом природном эффекте.
Однако часто биовосстановление совсем не эффективно, преимущественно из-за низкого количества микроорганизмов, присутствующих в окружающей среде, которые способны вызывать разрушение за приемлемое время или в условиях окружающей среды в месте, подлежащем восстановлению, которые не оптимальны для бактериального роста.
Следовательно, в некоторых случаях благоприятно вызывать так называемую биостимуляцию места, подлежащего восстановлению, которая включает применение приемов стимуляции скорости роста природных микробных сообществ, обладающих способностью к биоразрушению посредством добавления питательных веществ в органической и/или неорганической форме.
В морской окружающей среде бактериальный рост в целом ограничен низкой концентрацией питательных веществ, обычно представленных соединениями азота и фосфора. Морские экосистемы фактически, по биотическим и абиотическим причинам, обычно не содержат эти вещества, которые могут подвергаться интенсивному «захвату» частью микроорганизмов, которые не разрушают сырую нефть (также включая фитопланктон).
3
3
4
3
2
4
4
4
Для того чтобы поддерживать рост автохтонных популяций бактерий, способных разрушать углеводороды, одним из приемов, наиболее широко принятых в процессах биовосстановления, состоит в использовании удобрений в качестве источника питательных веществ, например, растворимых азотных удобрений, удобрений с медленным высвобождением (SFR) или олеофильных удобрений. Другой источник питательных веществ можно предоставлять посредством введения водорастворимых питательных веществ, таких как минеральные соли (например KNO, NaNO, NHNO, KHPO, MgNHPO) и коммерческие неорганические удобрения.
По сравнению с другими питательными веществами (например, олеофильными питательными веществами), водорастворимые питательные вещества более легко доступны для микробного метаболизма. Однако из-за их растворимой природы, они имеют основной недостаток, поскольку более легко растворимы и диспергируемы под действием волн и течений.
Для того чтобы усиливать процесс биовосстановления, также возможно вызывать так называемую биоаугментацию, которая состоит в добавлении в систему, подлежащую восстановлению, больших плотностей бактериальных популяций (отдельных бактерий или микробных консорциумов) с конкретными катаболическими возможностями, для интеграции местной популяции для того, чтобы ускорять или активировать разрушение загрязняющих веществ. В соответствии с некоторыми исследованиями, биоаугментация показала чрезвычайную эффективность восстановления полициклических ароматических углеводородов (IPA) в осадках с небольшим или нулевым потенциалом к внутреннему разрушению, тогда как другие исследования показали, что этот прием не значительно усовершенствует, что может быть природным ослаблением.
Проблема, наблюдаемая в применении биоаугментации, состоит в обеспечении выживаемости и активности организмов, вводимых в окружающую среду. Кроме того, биоаугментацию могут ингибировать различные факторы, среди которых pH и присутствие продуктов с высоким окислительно-восстановительным потенциалом и токсичных загрязнителей, концентрация и биодоступность загрязнителей или отсутствие специфичных субстратов. Однако ключевым фактором для того, чтобы этот прием можно было считать успешным, определенно является выбор штамма и/или бактериального консорциума, при котором следует учитывать тип сообщества, присутствующего в рассматриваемой окружающей среде.
Стратегии биоаугментации могут доказывать эффективность относительно всех при восстановлении от загрязнителей антропного происхождения, где специализированные бактерии с подходящими катаболическими путями могут не присутствовать в загрязненной окружающей среде. Выбор биоаугментации в качестве стратегии восстановления становится важным, если лимитирующим фактором процессов природного биоразрушения является отсутствие конкретных катаболических генов в местном микробном сообществе. Следовательно, этот недостаток генетической информации будет восполнен вводимым штаммом.
2
2
В отношении микроорганизмов, присутствующих в окружающей среде, которые способны разрушать углеводороды, обычно они представляют собой бактерии, которые известны в качестве углеводород-разрушающих бактерий или нефтеядных бактерий (BIC). A Один бактериальный вид способен разрушать только ограниченное число нефтяных соединений, тогда как консорциум, состоящий из различных бактериальных видов (с различными ферментативными признаками) может развивать метаболическую синтропию, которая может вести к полной минерализации углеводородов вплоть до образования CO и HO. Способность к разрушению нефтяных углеводородов не ограничена несколькими микроорганизмами: идентифицировано более 30 видов морских бактерий have been, которые относятся к различным (под)типам (α-, β-, γ-Proteobacteria; грамположительные; Flexibacter-Cytophaga-Bacteroides). Среди наиболее важных типов (на основе частоты выделения) можно отметить следующие: Pseudomonas, Achromobacter, Nocardia, Micrococcus, Vibrio, Acinetobacter, Brevibacter, Flavobacterium.
В дополнение к этим гетеротрофным бактериям (т. е. способным использовать альтернативные источники углерода в дополнение к углеводородным источникам), через различные способы культивирования, включающие углеводороды в качестве единственного источника углерода, и последующий таксономический и физиологический анализ, выделен новый ряд углеводород-разрушающих морских бактерий, отличающихся медленным ростом при олиготрофных условиях, для которых доказана способность использовать исключительно нефтяные углеводороды с единственным источником углерода и энергии.
Анализ последовательности гена 16S рРНК показывает, что эти BIC часто подтверждают корреляцию с Marinomonas vaga, Oceanospirillum linum и Halomonas elongate, которые относятся к группе γ-Proteobacteria.
В отношении их метаболических свойств, их можно подразделять на две группы, ту, которая разрушает алифатические углеводороды, и ту, которая разрушает ароматические углеводороды. Alcanivorax borkumensis (выделено из Северного моря), Alcanivorax sp. ST1 (Японское море), Marinobacter hydrocarbonoclasticus (Средиземное море) и Marinobacter sp. CAB (Средиземное море) разрушают линейные или разветвленные алифатические цепи, тогда как бактерии, такие как Cycloclasticus oligotrophus, C. pugetii и Psychroserpens burtonensis, используют ароматические углеводороды, такие как толуол, нафталин, фенантрен и антрацен, в качестве единственного источника углерода.
BIC занимают уникальную пищевую нишу среди гетеротрофных бактерий, которые участвуют в глобальном углеродном цикле, поскольку они предпочтительно потребляют алифатические и ароматические углеводороды, которые относительно сложно использовать для нормальной аутотрофной и гетеротрофной микробной флоры, присутствующей в окружающей среде. Поскольку эти бактерии имеют необычные физиологические признаки, они также имеют несколько рРНК оперонов (1 или 2), несколько цитоплазматических белков (не больше чем 300) и небольшой геном (3-4 млн п. о.). Кроме того, число мембранных белков в 1,5-2 раза ниже, чем у других гетеротрофных бактерий, таких как E. coli или Pseudomonas, и это can вероятно можно объяснять за счет того факта, что клетки могут использовать только некоторые субстраты.
Заявитель рассмотрел проблему увеличения эффективности процессов биовосстановления через подачу веществ, которые могут некоторым образом содействовать развитию аэробных микроорганизмов, способных метаболизировать углеводороды, без подачи не биоразрушаемых материалов, которые следует удалять после обработки, которая делает процесс сложным, дорогостоящим и не лишенным рисков с экологической точки зрения.
Эта проблема и другие, описанные более подробно далее, решены посредством приведения воды, загрязненной углеводородами, в контакт с полигидроксиалканоатом (PHA), интенсивно биоразрушаемым полимерным материалом, который заявитель к удивлению верифицировал в качестве способного стимулировать отдельно, без добавления других веществ, метаболическую активность аэробных микроорганизмов, способных метаболизировать углеводороды. Позволяя этим микроорганизмам воздействовать на углеводороды при аэробных условиях, получают значимое снижение загрязнения окружающей среды за относительно короткое время, без введения посторонних не биоразрушаемых материалов в окружающую среду.
Кроме того, заявитель обнаружил, что дополнительное увеличение активность биовосстановления можно получать посредством добавления к PHA, по меньшей мере одного питательного вещества для микроорганизмов и/или по меньшей мере одного микроорганизма, способного метаболизировать углеводороды, благодаря тому факту, что PHA выполняет функцию носителя для указанных веществ и/или микроорганизмов с тем, чтобы обеспечивать их постоянное присутствие в экологической нише, где присутствуют углеводородные сбросы.
В соответствии с первым аспектом, настоящее изобретение, следовательно, относится к способу биовосстановления воды, загрязненной углеводородами, который включает:
- приведение указанных загрязненных вод в контакт с по меньшей мере одним полигидроксиалканоатом (PHA);
- предоставление возможности микроорганизмам, присутствующим в указанных загрязненных водах и способным метаболизировать углеводороды, развиваться и разрушать углеводороды в аэробных условиях.
Указанный PHA предпочтительно диспергируют в загрязненных водах в форме частиц, в частности, в форме порошка или микрогранул.
Указанный PHA также предпочтительно содержит по меньшей мере одно питательное вещество, подходящее для содействия развитию микроорганизмов.
Указанный PHA также предпочтительно содержит по меньшей мере один микроорганизм, способный метаболизировать углеводороды. Такая метаболическая способность может быть полной, т.е. с полным разрушением углеводородов, или частичной.
Не желая ограничиваться интерпретационной теорией для настоящего изобретения, тот факт, что PHA к удивлению способен стимулировать отдельно, без добавления других веществ, метаболическую активность микроорганизмов, способных метаболизировать углеводороды, может быть обусловлен интенсивно биоразрушаемой природой самого PHA, который получают посредством процесса ферментации органических субстратов и, таким образом, близок к микроорганизмам в целом, в частности к углеводород-разрушающим бактериям и/или нефтеядным бактериям (BIC).
Кроме того, использование PHA в качестве носителя для бактерий и/или их питательных веществ, в частности, позволяет продлевать эффект биовосстановления в экологической нише, в которой произошел углеводородный сброс. PHA фактически является биоразрушаемым материалом, нерастворимым в воде, который имеет высокое сродство к углеводородам, следовательно, он локализуется в контакте с загрязняющими веществами и избегает быстрого диспергирования микроорганизмов и/или питательных веществ в окружающей среде, без способности проявлять свою функцию, например, из-за движения волн и потоков, присутствующих в водных пространствах, таких как моря (прибрежные и/или пелагические), озера или реки.
Полигидроксиалканоаты (PHA) представляют собой полимеры, продуцируемые микроорганизмами, выделенными из природной окружающей среды, или также генетически модифицированными микроорганизмами, которые действуют как запасы углерода и энергии и которые накапливаются бактериями различных видов при неблагоприятных условиях роста и в присутствии избыточного источника углерода. PHA синтезируют и накапливают приблизительно 300 различных видов микробов, входящих в больше чем 90 типов грамположительных и грамотрицательных бактерий, таких как, например, Bacillus, Rhodococcus, Rhodospirillum, Pseudomonas, Alcaligenes, Azotobacter, Rhizobium. В клетках PHA накапливаются в форме микрогранул, размер и число которых на клетку варьирует у различных бактериальных видов.
В целом, PHA представляют собой полимеры, содержащие повторяющиеся звенья, имеющие формулу
1
2
n
-O-CHR-(CH)-CO- (I)
в которой:
1
1
12
4
16
2
12
1
4
R выбирают из: -H, C-C алкилов, C-C циклоалкилов, C-C алкенилов, возможно замещенных по меньшей мере одной группой, выбранной из: галогена (F, Cl, Br), -CN, -OH, -COOH, -OR, -COOR (R=C-C алкил, бензил);
n представляет собой 0 или целое в диапазоне от 1 до 6 и предпочтительно представляет собой 1 или 2.
1
Предпочтительно R представляет собой метил или этил и n представляет собой 1 или 2.
PHA могут представлять собой гомополимеры или сополимеры или терполимеры. В случае сополимеров или терполимеров, они могут состоять из различных повторяющихся звеньев, имеющих формулу (I), или по меньшей мере одного повторяющегося звена, имеющего формулу (I), в комбинации с по меньшей мере одним повторяющимся звеном, происходящим из сомономеров, способным к сополимеризации с гидроксиалканоатами, например, лактонами или лактамами. В последнем случае, повторяющиеся звенья, имеющие формулу (I), присутствуют в количестве, равном по меньшей мере 10% по молям в отношении общего числа молей повторяющихся звеньев.
Особенно предпочтительными повторяющимися звеньями, имеющими формулу (I), являются те, которые представляют собой производные: 3-гидроксибутирата, 3-гидроксивалерата, 3-гидроксигексаноата, 3-гидроксиоктаноата, 3-гидроксиундец-10-еноата, 4-гидроксивалерата.
PHA можно делить на три группы, в отношении числа атомов углерода, образующих мономерное звено: PHA с цепью малой длины состоят из мономерных звеньев, имеющих от 3 до 5 атомов углерода, PHA с цепью средней длины состоят из мономерных звеньев, имеющих от 6 до 15 атомов углерода, тогда как PHA с цепью большой длины состоят из мономерных звеньев, имеющих больше чем 15 атомов углерода. PHA с цепью малой длины имеют высокую степень кристалличности, тогда как PHA с цепью средней длины и PHA с цепью большой длины представляют собой эластомеры с низкой кристалличностью и имеют низкую температуру плавления.
Особенно предпочтительные PHA представляют собой: поли-3-гидроксибутират (PHB), поли-3-гидроксивалерат (PHV), поли-3-гидроксигексаноат (PHH), поли-3-гидроксиоктаноат (PHO), поли(3-гидроксибутират-со-3-гидроксивалерат) (PHBV), поли(3-гидроксибутират-со-3-гидроксигексаноат) (PHBH), поли(3-гидроксибутират-со-4-гидроксибутират), поли(3-гидроксиоктаноат-со-3-гидроксиундецен-10-еноат) (PHOU), поли(3-гидроксибутират-со-3-гидроксивалерат-со-4-гидроксивалерат (PHBVV) или их смеси.
w
PHA предпочтительно имеют средневзвешенную молекулярную массу (M) в диапазоне от 5000 до 1500000 Да, более предпочтительно от 100000 до 1000000 Да. Средневзвешенную молекулярную массу можно определять в соответствии с известными приемами, в частности посредством анализа GPC (гельпроникающей хроматографии).
Пока это касается получения PHA, предпочтительно его получают посредством микробной ферментации органического субстрата (например, углеводы или другие сбраживаемые субстраты, такие как глицерин), с помощью штаммов микроорганизмов, которые способны продуцировать PHA, и последующего извлечения PHA из клеточной массы. За дополнительными подробностями можно обратиться, например, к патентным заявкам WO 99/23146, WO 2011/045625 и WO 2015/015315. Субстраты, подходящие для получения PHA через ферментацию, можно получать в частности из переработки овощей, например, соков, мелассы, пульпы из переработки сахарной свеклы, сахарного тростника. Эти субстраты обычно содержат, в дополнение к сахарозе и другим углеводам, органические факторы роста, азот, фосфор и/или другие минералы, которые можно использовать в качестве питательных веществ для клеточного роста. Альтернатива состоит из глицерина, дешевого органического источника углерода, поскольку он является побочным продуктом при производстве биодизеля (см., например, патент US 8 956 835 B2).
Для реализации настоящего изобретения, PHA благоприятно используют в форме частиц с тем, чтобы увеличивать поверхность обмена с окружающей средой и, следовательно, эффект биовосстановления. Частицы предпочтительно имеют усредненный размер в диапазоне от 0,1 мкм до 1000 мкм, более предпочтительно от 1 мкм до 500 мкм. Эти размеры можно определять в соответствии с приемами, хорошо известными в данной области, такими как системы обнаружения размеров частиц в суспензии с использованием лазерных детекторов, известные как приемы динамического рассеяния света (DLS) (см. стандарт ISO 13320-2009). В качестве альтернативы, можно использовать электронно-микроскопические изображения (SEM), которые обрабатывают посредством цифрового анализа.
Альтернативно, PHA можно использовать в других формах, например, элементов, имеющих формы, которые могут увеличивать поверхность обмена с окружающей средой и способствовать плавучести или контакту с углеводородами, диспергированными в воде, например, перфорированные панели, пустотелые плитки и т.п. Эти элементы можно получать посредством формования, экструзии или других способов, хорошо известных для обработки и формования пластмассовых материалов.
3
10
5
8
Если микроорганизмы, способные метаболизировать углеводороды, включают в PHA, их можно включать в полимер в таком количестве, чтобы достигать концентрации жизнеспособных клеточных единиц (колониеобразующих единиц, КОЕ) предпочтительно от 10 до 10 на грамм PHA, более предпочтительно от 10 до 10 на грамм PHA.
Существует множество видов микроорганизмов, способных метаболизировать углеводороды, которые в целом являются бактериями, а также грибами или дрожжами. Их стимулируют посредством присутствия PHA в аэробных условиях, которые обеспечены кислородом, естественно растворенным в воде.
В частности, аэробные бактерии можно делить на:
(a) нефтеядные бактерии (BIC), которые способны полностью метаболизировать углеводороды до получения воды и диоксида углерода; и
(b) углеводород-разрушающие бактерии, которые способны только разрушать углеводороды, имеющие меньшие молекулы, не доходя до образования воды и диоксида углерода.
Нефтеядные бактерии могут относиться, например, к следующим видам:
Alcanivorax
Cycloclasticus
Oleiphilus
Oleispira
Thalassolituus
Углеводород-разрушающие бактерии могут относиться, например, к следующим видам:
Acinetobacter (GammaProteobacteria)
Aeromonas (GammaProteobacteria)
Alcaligenes (BetaProteobacteria)
Alteromonas (GammaProteobacteria)
Arthrobacter (группа с высоким содержанием GC)
Bacillus (Firmicutes)
Flavobacterium (группа CFB)
Georgfuchsia (BetaProteobacteria)
Halomonas (GammaProteobacteria)
Idiomarina (GammaProteobacteria)
Klebsiella (GammaProteobacteria)
Labrenzia (AlphaProteobacteria)
Marinobacter (GammaProteobacteria)
Marinomonas (GammaProteobacteria)
Maritimibacter (AlphaProteobacteria)
Methylophaga (GammaProteobacteria)
Muricauda (бактерии группы CFB)
Neptunomonas (GammaProteobacteria
Novosphingobium (AlphaProteobacteria)
Nocardia (группа с высоким содержанием GC)
Oleibacter (GammaProteobacteria)
Paracoccus (AlphaProteobacteria)
Pelagibacter (AlphaProteobacteria)
Porticoccus (GammaProteobacteria)
Pseudoalteromonas (GammaProteobacteria)
Pseudomonas (GammaProteobacteria)
Psycroserpens (GammaProteobacteria)
Rheinheimera (GammaProteobacteria)
Rhodobacter (AlphaProteobacteria)
Rhodococcus (группа с высоким содержанием GC)
Roseobacter (AlphaProteobacteria)
Roseovarius (AlphaProteobacteria)
Сарцинa (Firmicutes)
Shewanella (GammaProteobacteria)
Sphingomonas (AlphaProteobacteria)
Sulfitobacter (AlphaProteobacteria)
Thalassospira (AlphaProteobacteria)
Vibrio (GammaProteobacteria).
Особенно предпочтительные микроорганизмы для метаболической атаки и разрушения углеводородов представляют собой:
Alcaniviorax spp (грамотрицательные, не спорообразующие)
Bacillus spp (грамположительные, не спорообразующие)
Marinobacter spp (грамотрицательные, не спорообразующие)
Neptunomonax spp (грамотрицательные, не спорообразующие)
Pseudomonas spp. (грамотрицательные, не спорообразующие)
Rhodococcus spp (грамположительные, не спорообразующие).
Микроорганизмы можно использовать в виде отдельных штаммов или, предпочтительно, в виде смесей различных штаммов (консорциумов), чтобы увеличивать эффективность разрушения углеводородов в широком диапазоне различных условий окружающей среды.
Если питательные вещества включают в PHA, возможно в комбинации с микроорганизмами, способными метаболизировать углеводороды, их вводят в количествах обычно в диапазоне от 0,01 г до 2 г, более предпочтительно от 0,05 г до 1 г, на грамм PHA.
Питательные вещества, подходящие для этой цели, можно выбирать в широком диапазоне органических или неорганических продуктов, среди которых:
3
3
6
8
7
3
4
3
3
4
3
4
2
3
3
4
3
4
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
7
4
2
4
2
4
2
4
4
2
4
3
4
3
4
3
4
4
3
4
2
4
4
2
4
4
2
4
2
4
4
2
2
4
2
4
4
3
3
3
3
3
2
3
2
3
3
3
2
3
3
2
4
2
2
2
4
2
2
4
2
3
4
4
4
4
2
2
8
4
2
4
4
2
2
2
4
2
4
2
4
3
4
4
4
2
4
4
2
3
3
4
2
2
2
3
2
4
2
борная кислота (HBO), лимонная кислота (CHO), фумаровая кислота, ацетат аммония (CHCOONH), ацетат натрия (CHCOONa), ацетат калия (CHCOOK), бикарбонат аммония (NHHCO), бромид аммония (NHBr), бромид натрия (NaBr), карбонат натрия (NaCO), карбонат кальция (CaCO), хлорат аммония (NHClO), хлорид аммония (NHCl), хлорид кадмия (CdCl) хлорид железа(II) (FeCl), хлорид железа(III) (FeCl), тетрагидрат хлорида железа(II) (FeCl⋅4HO), тетрагидрат хлорида марганца (II) (MnCl⋅4HO), гексагидрат хлорида магния (MgCl⋅6HO), дигидрат хлорида меди(II) (CuCl⋅2HO), хлорид стронция (SrCl), хлорид цинка (ZnCl), дихромат калия (KCrO), дигидрофосфат аммония (NHHPO), дигидрофосфат калия (KHPO), дигидрофосфат натрия (NaHPO), фторид аммония (NHF), фторид кальция (CaF), фторид натрия (NaF), фосфат аммония (NH)PO, фосфат калия (KPO), фосфат натрия (NaPO), фосфат железа(II) (FePO), фосфат железа(III) [Fe(PO)], гидрогенизированный фосфат аммония натрия (NH⋅NaHPO⋅4HO], гидрофосфат аммония натрия [NaNHHPO⋅4HO], гидрофосфат диаммония [(NH)HPO], гидрофосфат магния (MgHPO⋅3HO), гидрофосфат калия (KHPO), гидрофосфат натрия (NaHPO), йодид аммония (NHI), йодид калия (KI), нитрат алюминия [Al(NO)], нитрат аммония (NHNO), нитрат кальция ([Ca(NO)], нитрат свинца [Pb(NO)], нитрат калия (KNO), нитрат натрия (NaNO), нитрат стронция [Sr(NO)], нитрат талия (TlNO), нитрат цинка [Zn(NO)], нитрит аммония (NHNO), нитрит калия (KNO), нитрит натрия (NaNO), оксалат диаммония [(NH)CO], оксид железа(III) (FeO), перхлорат аммония (NHClO), перманганат калия (KMnO), пероксидисульфат аммония [(NH)SO], сульфат аммония [(NH)SO], додекагидрат сульфата калия хрома [CrK(SO)⋅12HO], сульфат калия (KSO), сульфат натрия (NaSO), сульфат железа(III) [Fe(SO)], сульфат железа(II) (FeSO), сульфат магния (MgSO), пентагидрат сульфата меди (II) (CuSO⋅5HO), сульфат цинка (ZnSO), сульфит аммония [(NH)SO], сульфит цинка (ZnSO), сульфид аммония [(NH)S], сульфид калия (KS), сульфид железа(III) (FeS), сульфид железа(II) (FeS), сульфид натрия (NaS), мочевина (CHNO) или их смеси.
Питательные вещества, очевидно, можно включать индивидуально или, предпочтительно, смешанными друг с другом, чтобы получать композицию, более подходящую для содействия росту микроорганизмов.
Среди питательных веществ следующие особенно предпочтительны для содействия росту микроорганизмов, способных метаболически атаковать углеводороды:
4
3
3
4
2
4
2
4
2
2
4
2
хлорид аммония (NHCl), нитрат натрия (NaNO), фосфат калия (KPO), дигидрофосфат калия (KHPO), первичный кислый фосфат натрия (NaHPO), тетрагидрат хлорида железа(II) (FeCl⋅4HO), мочевина (CHNO) или их смеси.
Количество питательных веществ, добавляемых в воду, подлежащую биовосстановлению, является таким, чтобы достигать концентрации предпочтительно в диапазоне от 0,01 г до 100 г, более предпочтительно от 0,5 г до 50 г, на литр загрязненной воды или почвы.
PHA предпочтительно также содержит по меньшей мере одно поверхностно-активное средство. Добавление поверхностно-активного средства имеет основной целью содействие дисперсии углеводородов в форме микрокапелек, таким образом содействуя атаке микроорганизмов благодаря усовершенствованному соотношению поверхность/объем. Поверхностно-активное средство можно выбирать в широком диапазоне продуктов, в частности, из наиболее безопасных продуктов с экологической точки зрения, и которые способны содействовать росту микроорганизмов. Среди них: гликолипиды (в частности, рамнолипиды, софоролипиды, треалолипиды), липопротеины и липопептиды, жирные кислоты, возможно этоксилированные, фосфолипиды, особенно предпочтительны.
Указанное по меньшей мере одно поверхностно-активное средство предпочтительно присутствует в композиции в количестве в целом в диапазоне от 0,01 г до 2 г, более предпочтительно от 0,05 г до 1 г, на грамм PHA.
Количество поверхностно-активного средства, добавляемого в воду, подлежащую биовосстановлению, является таким, чтобы достигать концентрации предпочтительно в диапазоне от 0,01 г до 100 г, более предпочтительно от 0,5 г до 50 г, на литр загрязненной воды или почвы.
Получение композиции в соответствии с настоящим изобретением можно выполнять в соответствии с известными приемами, например, с помощью закрытых или открытых смешивателей, работающих порциями или непрерывно, без использования любых конкретных предосторожностей, при условии, что используют температуры процесса, которые не вызывают даже частичного разрушения используемых материалов. В частности, когда питательные вещества включают в композицию на основе PHA, температуру процесса поддерживают на значении, равном или ниже чем 120°C, тогда как если микроорганизмы заключают в PHA, температура процесса предпочтительно равна или ниже чем 60°C, поскольку более высокие температуры могут вызывать значительное снижение жизнеспособности самих микроорганизмов.
Для получения композиции в соответствии с настоящим изобретением, благоприятно использовать водную суспензию PHA, получаемую непосредственно из процесса бактериальной ферментации, в котором образуется сам PHA, без необходимости его осаждения и сушки. Водная суспензия, получаемая непосредственно из процесса получения, имеет оптимальные характеристики в отношении однородности, дисперсии и размера частиц PHA. Водную суспензию PHA, получаемую из процесса ферментации, в любом случае предпочтительно предварительно подвергают стадии очистки и осветления для того, чтобы устранять остатки и вещества, присутствующие в ферментативном бульоне.
Пока это касается количества PHA, подлежащего добавлению и диспергированию в загрязненной воде, оно преимущественно является предварительно определяемым по отношению к типу и сущности загрязнения, подлежащего обработке, и, следовательно, может варьировать в широких пределах. Количество PHA, добавляемого в воду, подлежащую биовосстановлению, в целом является таким, чтобы достигать концентрации предпочтительно в диапазоне от 0,01 г до 1000 г, более предпочтительно от 0,5 г до 200 г на литр загрязненной воды.
Следующие примеры вариантов осуществления приведены лишь с целью проиллюстрировать настоящее изобретение, и их не следует рассматривать в качестве ограничения объема защиты, определяемого приложенной формулой изобретения.
ПРИМЕР 1
Суспензию полигидроксибутирата (PHB) в воде брали непосредственно из процесса очистки культурального бульона, в котором полимер получали посредством бактериальной ферментации на мелассе сахарной свеклы. Средневзвешенная молекулярная масса PHB (определяли через GPC) составляла приблизительно 950 кДа. Суспензия содержала 190 г PHB на литр суспензии.
Суспензию PHA подвергали процессу сушки посредством распылительной сушки при температуре 230°C.
Конечный продукт представлял собой порошок PHB с кажущейся плотностью 0,35÷0,45 кг/л и усредненным размером частицы, равным 20-30 мкм. Влагосодержание составляло ниже 1%. Продукт был готов к расфасовке и непосредственному использованию.
ПРИМЕР 2
Суспензию полигидроксибутирата (PHB) в воде брали непосредственно из процесса очистки культурального бульона, в котором получали полимер посредством бактериальной ферментации на мелассе сахарной свеклы. Средневзвешенная молекулярная масса PHB (определяли через GPC) составляла приблизительно 800 кДа. Суспензия содержала 120 г PHB на литр суспензии.
В суспензию PHA добавляли смесь питательных веществ, состоящую из водного раствора минеральных солей с таким составом:
4
2
4
3
хлорид аммония (NHCl) 80 г/л, дигидрофосфат калия (KHPO) 8 г/л, нитрат натрия (NaNO) 20 г/л.
Суспензию PHA, содержащую вышеуказанную смесь, подвергали процессу сушки посредством распылительной сушки при температуре 220°C.
Конечный продукт представлял собой порошок, содержащий PHB и минеральные соли, с кажущейся плотностью 0,25÷0,35 кг/л и усредненным размером частиц, равным 20-30 мкм. Влагосодержание составляло ниже 1%. Продукт был готов к расфасовке и непосредственному использованию.
ПРИМЕР 3
Получали суспензию поли-(3-гидроксибутират-со-3-гидроксивалерат-со-4-гидроксивалерата (PHBVV) в воде, начиная с полимера в порошкообразной форме, имеющего средневзвешенную молекулярную массу (определяемую посредством GPC) приблизительно 500 кДа. Суспензия содержала 90 г PHBVV на литр суспензии.
6
Смесь бактерий, состоящую из Alcanivorax sp., Marinobacter sp., Sphingongomonas sp., Rhodococcus sp., Bacillus sp., добавляли в суспензию PHBVV. Различные бактериальные виды, в споровой, вегетативной и/или покоящейся форме, вводили в концентрации приблизительно 10 перикарионов на грамм PHBVV, присутствующего в суспензии.
Суспензию PHBVV, содержащую вышеуказанную смесь, подвергали процессу ортогонального фильтрования, получая осадок на фильтре, имеющий 35% влаги. Полученный таким образом осадок на фильтре подвергали процессу сушки с использованием сушилки слоя при температуре 60°C.
Полученный таким образом продукт, содержащий PHBVV и бактериальную смесь, был в порошкообразной форме с кажущейся плотностью 0,55÷0,65 кг/л. Влагосодержание составляло ниже 0,8%. Продукт был готов к расфасовке и последующему непосредственному использованию.
ПРИМЕР 4
Для того чтобы верифицировать эффективность материалов, полученных в соответствии с примерами 1 и 2, в процессе биовосстановления, микромасштабный эксперимент осуществляли в объеме морской воды, в который добавляли определенный объем нефти, как описано далее.
Следующие продукты вводили в резервуар, имеющий размеры 78 см × 33 см × 42 см (общая объемная вместимость составляет 108 л):
a) 90 л прибрежной морской воды; для того чтобы содействовать элиминации возможно присутствующих животных, частиц и/или дебриса, воду, перед подачей в резервуар, фильтровали на фильтре, имеющем пористость, равную 300 мкм:
b) 45 мл нефти Dansk Blend Crude Oil (плотность в API: 33,50).
Содержимое резервуара поддерживали в движении с помощью внутреннего насоса, с рециркуляцией, равной 5 л/ч, которая допускала поддержание нетурбулентного перемешивания. Система также содержала систему «перелива» и непрерывно загружала морскую воду (1 л/ч) для того, чтобы обеспечивать непрерывную замену и имитировать условия, присутствующие в морской окружающей среде.
Обработка с использованием только PHB (OIL-PHA)
После введения нефти, 51 г PHB, полученного в соответствии с примером 1, диспергировали в резервуаре. Порошок распределяли гомогенно на поверхности в соответствии с и на нефтяном пятне. Порошок PHB показывал заметную склонность к прилипанию к нефти, образуя комки, которые частично демонстрировали тенденцию к осаждению. Однако рециркуляционная система позволяла комкам PHB оставаться в суспензии.
Репрезентативный образец брали через регулярные временные интервалы и измеряли следующие параметры:
- измерение общего относительного содержания бактерий (подсчет DAPI): прямой подсчет клеток осуществляли с использованием эпифлуоресцентного микроскопа после окрашивания специальным флуорохромом, в соответствии со стандартным способом, описанным в публикации APAT и IRSA-CNR «Analytical methods for water» 29/2003, глава 9040 (стр. 1149-1153); значения представлены в виде логарифма числа клеток на мл образца;
- измерение количества остаточных углеводородов относительно начального количества (% масс.), которое измеряли посредством газовой хроматографии с ионизацией в пламени (GC-FID).
Результаты приведены на графиках на фиг. 1 и 2. На фиг. 1 также показано значение относительного содержания микробов, присутствующих в морской воде как таковой (NSW, природная морская вода).
Как можно видеть на этих графиках, относительно нулевого момента времени в эксперименте, начиная с четвертых суток, наблюдали увеличение количественных значений (относительного содержания) природной микробной популяции, предположительно из-за присутствия PHB. Одновременно наблюдали значимое снижение количества углеводородов, коррелирующее с началом процессов биоразрушения, приписываемых метаболической активности углеводород-разрушающей бактериальной флоры. Эта активность продолжалась до конца экспериментального периода (30 суток), когда подтверждали, что полная борьба с загрязнением составляла приблизительно 60%, тогда как пик разрушения (приблизительно 65%) наблюдали на 20-е сутки эксперимента (фиг. 2).
Обработка с использованием PHB и питательных веществ (нефть-PHA-смесь 1).
Эксперимент осуществляли в соответствии с теми же оперативными процедурами, которые описаны выше, используя, вместо одного PHB, как в примере 1, композицию, содержащую PHB и питательные вещества, полученную в соответствии с примером 2, которую добавляли в количестве 100 г.
Результаты представлены на фиг. 1 и 2, на которых можно наблюдать тенденцию в подсчете DAPI и борьбе с загрязнением углеводородам по существу аналогичную случаю OIL-PHA, при слегка улучшенных значениях (борьба с загрязнением углеводородами равна приблизительно 70% уже после 14 суток).
Для целей сравнения тот же эксперимент осуществляли без добавления PHB и/или питательных веществ, т. е. выливая в резервуар только нефть. Результаты также приведены на фиг. 1 и 2, из которых очевидно усовершенствование в отношении борьбы с загрязнением углеводородами из-за добавления PHB или PHB и питательных веществ.