Роль регуляторных Т-лимфоцитов и Т-хелперов при невынашивании в ранние сроки беременности

РОЛЬ РЕГУЛЯТОРНЫХ Т-ЛИМФОЦИТОВ И Т-ХЕЛПЕРОВ ПРИ НЕВЫНАШИВАНИИ В РАННИЕ СРОКИ БЕРЕМЕННОСТИ

Н.Ю. Сотникова, Л.В. Посисеева, Н.В. Крошкина, И.А. Панова, А.В. Кудряшова, Е.Л. Бойко, С.И. Чухина

ФГУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова Росмедтехнологий» ул. Победы, 20, Иваново, Россия, 153731

Целью исследования было изучить особенности содержания в периферической крови Т-хел-перов, параметров их активации, а также уровня регуляторных Т-лимфоцитов в I триместре беременности с угрозой невынашивания. Установлено, что невынашивание в ранние сроки беременности ассоциируется с преобладанием активности пула ТЫ и снижением уровня естественных и индуцированных ^eg в периферической крови беременных женщин, что может способствовать развитию неконтролируемого цитотоксического ответа.

Длительное время в иммунологии репродукции господствовала теория Th1/Th2 шифта, авторы и приверженцы которой однозначно полагают, что физиологическое течение беременности определяется преобладающим влиянием пула Th2 клеток и продуцируемых им IL-4 и IL-6 [8, 22, 29], в то время как угроза невынашивания беременности возникает при усилении влияния пула Th1 и продуцируемых им IL-2 и IFNy [8, 11, 29]. Однако, как показывают различные исследователи, эта теория не в полной мере отражает механизмы участия Т-лимфоцитов в регуляции гестационного процесса [5, 7, 11, 22]. В последнее время все больше внимания уделяется другой популяции лимфоцитов — регуляторным Т-клеткам (Treg). Treg — гетерогенная Т-клеточная популяция, которая предотвращает развитие потенциально опасного иммунного ответа на антигены собственного организма [21, 27]. В зависимости от цитокинового профиля регуляторных Т-лимфоци-тов и их способности супрессировать иммунный ответ через непосредственный контакт по типу клетка-клетка или через секрецию иммуносупрессорных цитоки-нов принято выделять естественные CD25+CD4+ Treg [13, 27] и 1 тип или индуцированные регуляторные T клетки (Tr1), продуцирующие преимущественно IL-10 [28]. Предполагают, что Treg ограничивают развитие патологического иммунного ответа во время беременности. Известно, что Treg подавляют иммунный ответ как наивных клеток, так и клеток памяти [16]. Данная клеточная популяция обеспечивает иммунологическую толерантность и препятствует отторжению трансплантата [19], контролирует активность аутореактивных Т-клеток и предотвращает развитие аутоиммунных заболеваний [19, 24].

Представляется наиболее вероятным, что при физиологическом течении беременности существует тонкий баланс в соотношении популяций, способных стимулировать развитие реакций как клеточного, так и гуморального иммунного ответа, а нарушение функции Treg может способствовать сдвигу дифференцировки Т-хелперов и развитию акушерской патологии.

В связи с этим целью проведенного исследования было изучить особенности содержания в периферической крови различных пулов Т-хелперов, параметров их активации, а также уровня регуляторных Т-лимфоцитов в I триместре беременности при различном характере последующего гестационного процесса.

Материалы и методы. Всего были обследованы 72 женщины в I триместре беременности. У 29 женщин на момент обследования отмечались клинические проявления угрозы невынашивания: боли внизу живота, гипертонус матки по данным УЗи, в отдельных случаях мажущие кровянистые выделения из половых путей (группа УН на момент обследования). У 43 женщин беременность на момент обследования протекала без осложнений, однако впоследствии у 25 из них в I триместре беременности развилась угроза невынашивания (группа с развившейся УН), и лишь у 18 женщин беременность протекала без осложнений на всем протяжении гестационного периода (группа — ФБ).

Для исследований методом проточной цитометрии кровь забирали в центрифужные пробирки, содержащие 2,7% раствор ЭДТА из расчета 3 мл крови на 1 мл раствора ЭДТА. Выделение клеток из периферической крови осуществляли традиционным методом скоростного центрифугирования при 1500 об/мин в градиенте плотности фиколл-урографина (d-1,078). Методом проточной цитофлюори-метрии исследовали общее содержание CD4+ клеток, уровень их активации (CD4+HLA-DR+), содержание естественных Treg (CD4+CD25+, CD4+CD152+), Treg1 (CD4+IL-10+), а также Th1 (CD4+IFNy+) и Th2 (CD4+IL-4+) лимфоцитов.

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программы Microsoft Excel из комплекта Microsoft Office 2000 и программы STUD BAT из комплекта «Statistica». Достоверность различий сравниваемых показателей определялась по t-критерию Стьюдента.

Результаты. Проведенное исследование показало, что в группе женщин с признаками угрозы невынашивания на момент обследования отмечалось достоверное уменьшение относительного содержания общей популяции CD4+ лимфоцитов (41,91 ± 1,66% и 36,12 ± 1,97%, p < 0,05) и активированных CD4+HLA-DR+ клеток (2,66 ± 0,25 и 0,94 ± 0,17, p < 0,05) по сравнению с показателями группы женщин с неосложненной беременностью на всем ее протяжении.

Анализ данных о содержании двух популяций Т-хелперов в группе женщин с УН на момент обследования свидетельствовал об усилении влияния Th1 клеток. Так, по нашим данным в периферической крови женщин с угрозой невынашивания отмечалось достоверно повышенное содержание CD4+IFNy+ лимфоцитов (6,21 ± 0,81% и 13,14 ± 2,89%, p < 0,05) при неизмененных, по сравнению с показателями группы ФБ, параметрах CD4+IL-4+ клеток (12,73 ± 1,52% и 12,46 ± ± 2,57%, p > 0,05). Это определяло равное соотношение двух пулов периферических Th1/Th2 при угрозе невынашивания (1,06 ± 0,19). В группе с физиологическим течением беременности преобладала популяция CD4+IL-4+ лимфоцитов, при этом соотношение Th1/Th2 клеток составило 0,49 ± 0,15.

Наибольшие различия между группами с угрозой невынашивания при обследовании и с физиологической беременностью были выявлены при исследо-

вании показателей, характеризующих Treg. В группе женщин с угрозой невынашивания на момент обследования уровень естественных Treg CD4+CD25+ (5,99 ± 0,36% и 3,87 ± 0,20, p < 0,01), CD4+CD152+ (6,64 ± 0,45% и 3,56 ± 0,24%, p < 0,01) и Тге§1 CD4+IL-10+ (8,51 ± 0,42% и 4,37 ± 0,49%, p < 0,001) был достоверно ниже, чем в группе женщин с неосложненным течением гестационного процесса.

В периферической крови женщин с неосложненным течением беременности на момент обследования, но имевших впоследствии угрозу невынашивания, большинство показателей состояния CD4+ лимфоцитов не имели достоверных различий по сравнению с аналогичными показателями женщин с неосложнен-ным течением всего гестационного процесса. Однако для данной группы женщин были характерны тенденции к изменению ряда показателей, которые в группе с угрозой невынашивания на момент обследования приобретали достоверный характер. Так, в периферической крови женщин с впоследствии развившейся угрозой невынашивания мы отмечали тенденцию к снижению содержания общей популяции CD4+ клеток (41,91 ± 1,66% и 39,83 ± 0,96%, p > 0,05), активированных CD4+HLA-DR+ (2,66 ± 0,25% и 1,88 ± 0,38%, p > 0,05), CD4+IL-10+ лимфоцитов (8,51 ± 0,42% и 7,40 ± 0,54%, p > 0,05) и к повышению содержания CD4+IFNy+ ТЫ (6,21 ± 0,81% и 8,34 ± 0,66%, p > 0,05). Уровень естественных Treg был сопоставим с таковым в группе с неосложненным течением гестации (5,99 ± 0,36% и 5,80 ± 0,32%, p > 0,05).

Обсуждение. Полученные нами данные свидетельствуют, что в ранние сроки гестации важную роль в регуляции иммунологических реакций беременных женщин играют как популяция Т-хелперов, так и регуляторных Т-клеток.

Изменение баланса в соотношении ТЫ/^2 клеток в сторону преобладания Ш^-продуцирующих лимфоцитов, отмеченное нами еще до появления выраженной клиники угрозы невынашивания, подтверждает мнение большинства авторов о значимости цитотоксических реакций в развитии данной патологии беременности [29]. Кроме того, следует отметить, что усиление выработки ТЫ цитокинов на системном уровне при невынашивании беременности отмечалось различными авторами [8, 29]. В эксперименте было показано, что введение ТЫ цитокинов приводит к прерыванию беременности, а введение антител против этих цитокинов предотвращает его [8]. Известно, что 1ЕЫу способен подавлять рост и дифференцировку клеток трофобласта [3]. Нарушение процессов синтеза 1КЫу может приводить к активации ^§12 протромбиназы в клетках децидуаль-ной оболочки плаценты [6], которая стимулирует отложение фибрина, ограничивающего проникновение ворсин трофобласта в миометрий [15]. Наряду с этим данный цитокин обладает выраженным прямым эмбриотоксическим действием [12], а также может оказывать эмбриотоксический эффект опосредовано за счет стимуляции апоптоза клеток трофобласта [17].

В периферической крови женщин с угрозой невынашивания нами было отмечено снижение содержания как естественных, так и индуцированных Тге§. Причем по нашим данным в первую очередь изменения затрагивают пул CD4+IL-10+ Тге§1, так как тенденция к снижению содержания этой клеточной популяции проявляется еще до клинических проявлений угрозы невынашивания. Таким об-

разом, при развитии угрозы невынашивания беременности в первую очередь отмечается нарушение дифференцировки индуцированных Tregl из периферических CD4+CD25- клеток, возможно, в результате недостаточной продукции IL-10 — критического фактора дифференцировки данной популяции [9]. При выраженной клинической картине угрозы невынашивания изменения затрагивают и пул естественных Treg, формирующихся в процессе нормальной дифференцировки в тимусе [1]. Наши данные позволяют предположить, что изменению уровня иммунного ответа матери при угрозе невынашивания могла способствовать и недостаточная активация пула регуляторных Т-лимфоцитов. Возможно, отмеченное нами при угрозе невынашивания снижение уровня CD4+HLA-DR+ клеток отражает именно этот процесс.

Необходимость усиления функциональной активности Treg в ранние сроки физиологически протекающей беременности для регуляции материнского иммунного ответа отмечалась в работах ряда авторов [10, 25]. По данным литературы, Treg подавляют активность NKT и NK клеток в интерфазе мать—плод [20], угнетают пролиферацию клеток и синтез IFNy в ответ на специфические отцовские антигены [2], адоптивный перенос Treg предотвращает отторжение плода [2]. Однако значимость данного фактора в формировании иммунных реакций, приводящих к развитию акушерской патологии, остается мало изученной. Имеются лишь отдельные данные о снижении уровня Treg при спонтанных абортах [24]. Известно, что популяция CD4+CD25+ способна ингибировать продукцию IL-2 и угнетать клеточный цикл CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов [1]. Следовательно, недостаточная дифференцировка данной популяции может лежать в основе развития материнского цитотоксического ответа. В основе супрессорного действия Treg1 лежит способность продуцировать высокий уровень IL-10 и TGFß [28]. Кроме того, данные цитокины способны оказывать непосредственное влияние на развитие плаценты и эмбриона. Известно, что введение экзогенного TGFß in vitro усиливает пролиферацию клеток бластоцисты [14], а сверхэкспрессия антагониста TGFß ассоциируется с уменьшением числа имплантационных зон и бесплодием [26]. Экспериментальные исследования на мышах показывают, что дефицит IL-10 определяет задержку роста плода [18, 23].

Таким образом, результаты нашего исследования показали, что развитие угрозы невынашивания беременности в ранние сроки гестации ассоциируется с угнетением дифференцировки регуляторных Т-клеток. Это может способствовать нарушению контроля иммунного ответа матери, развитию Th1 опосредованных реакций, а также недостаточной выработке цитокинов определяющих формирование фетоплацентарного комплекса.

ЛИТЕРАТУРА

[1] Ярилин А.А. Естественные регуляторные клетки и фактор FOXP3 [Текст] / А.А. Яри-лин, А.Д. Донецкова // Иммунология. — 2006. — № 3. — С. 176—188.

[2] Abnormal T-cell reactivity against paternal antigens in spontaneous abortion: adoptive transfer of pregnancy-induced CD4+CD25+ T regulatory cells prevents fetal rejection in a murine abortion model [Text] / A.C. Zenclussen et al. // Am. J. Pathol. — 2005. — Vol. 166. — P. 811—822.

[3] Aboagye-Mathiesen G. Functional characteristics of human trophoblast interferons [Text] / G. Aboagye-Mathiesen, F.D. Toth, M. Zdravkovic, P. Ebbesen // Am. J. Reprod. Immunol. — 1996. — Vol. 35. — P. 309—317.

[4] CD4+ CD25+ suppressor T cells: more questions than answers [Text] / E.M. Shevach // Nat. Rev. Immunol. — 2002. — Vol. 2(6). — P. 389—400.

[5] Chaouat G. TH1/TH2 paradigm in pregnancy: paradigm lost? Cytokines in pregnancy/early abortion: reexamining the TH1/TH2 paradigm [Text] / G. Chaouat et al. // Int. Arch. Allergy. Immunol. — 2004. — Vol. 134. — P. 93—119.

[6] Clark D.A. The cutting edge: cytokine-dependent abortion in CBAxDBA/2 mice is mediated by the procoagulant fg12 prothrombinase [Text] / D.A. Clark et al. // J. Immunul. — 1998. — Vol. 160. — P. 545—549.

[7] Croy B.A. Update on pathways regulating the activation of uterine Natural Killer cells, their interactions with decidual spiral arteries and homing of their precursors to the uterus [Text] / B.A. Croy // J. Reprod. Immunol. — 2003. — Vol. 59. — P. 175—191.

[8] IL-10 prevents naturally occurring fetal loss in the CBAxDBA/1 mating combination and local defect IL-10 production in this abortion-prone combination is corrected by in vivo injection of IFNt [Text] / Chaouat G. et al. // J. Immunol. — 1995. — Vol. 154. — P. 4261—4268.

[9] Groux H. Interleukin-10 induces a long-term antigen-specific anergic state in human CD4+ T cells [Text] / H. Groux, M. Bigler, J.E. de Vries, M.G. Roncarolo // J. Exp. Med. — 1996. — Vol. 184(1). — P. 19—29.

[10] Heikkinen J. Phenotypic characterization of regulatory T cells in the human deciduas [Text] / J. Heikkinen, M. Mottonen, A. Alanen, O. Lassila // Clin. Exp. Immunol. — 2004. — Vol. 136. — P. 373—378.

[11] Hill J.A. Immunodystrophism: evidence for a novel alloimmune hypothesis for recurrent pregnancy loss involving Th1-type immunity to trophoblast [Text] / J.A. Hill, B.C. Choi // Semin. Reprod. Med. — 2000. — Vol. 18. — P. 401—405.

[12] Hill J.A. T-helper 1-type immunity to trophoblast in women with recurrent spontaneous abortion [Text] / J.A. Hill, K. Polgar, D.J. Anderson // JAMA. — 1995. — Vol. 24. — P. 1933—1936.

[13] Immunologic tolerance maintained by CD25+ CD4+ regulatory T cells: their common role in controlling autoimmunity, tumor immunity, and transplantation tolerance [Text] / S. Sakagu-chi et al. // Immunol. Rev. — 2001. — Vol. 182. — P. 18—32.

[14] Jones R.L. TGF-beta superfamily expression and actions in the endometrium and placenta [Text] / R.L. Jones, C. Stoikos, J.K. Findlay, L.A. Salamonsen // Reproduction. — 2006. — Vol. 132(2). — P. 217—232.

[15] Knackstedt M. Activation of the novel prothrombinase, fg12, as a basis for the pregnancy complications spontaneous abortion and pre-eclampsia [Text] / M. Knackstedt et al. // Am J. Reprod. Immunol. — 2001. — Vol. 46(3). — P. 196—210.

[16] Levings M.K. Human CD25+CD4+ T regulatory cells suppress naive and memory T-cell proliferation and can be expanded in vitro without loss of function [Text] / M.K. Levings, R. Sangregorio, M.G. Roncarolo // J. Exp. Med. — 2001. — Vol. 193. — P. 1295—1302.

[17] Liu Z. The effect on MHC class II expression and apoptosis in placenta by IFN gamma administration [Text] / Z. Liu, Y. Chen, Y. Yang, J.P. Peng // Contraception. — 2002. — Vol. 65. — P. 177—184.

[18] Lohler K.R. Interleukin-10 deficient mice develop chronic enterocolitis [Text] / K.R. Lohler, D. Rennick, K. Rajewsky, W. Muller // Cell. — 1993. — Vol. 75. — P. 263—274.

[19] Maloy K.J. Regulatory T cells in the control of immune pathology [Text] / K.J. Maloy, F. Powrie // Nat. Immunol. — 2001. — Vol. 2(9). — P. 816—22.

[20] Nishikawa H. Accelerated chemically induced tumor development mediated by CD4+CD25+ regulatory T cells in wild-type hosts [Text] / H. Nishikawa et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2005. — Vol. 102(26). — P. 9253—9257.

BecTHHK Py^H, cepua Медицина, 2009, № 6

[21] Park H.B. Acquisition of anergic and suppressive activities in transforming growth factor-beta-costimulated CD4+CD25- T cells [Text] / H.B. Park et al. // Int. Immunol. — 2004. — Vol. 16(8). — P. 1203—1213.

[22] Pregnancy-dependent expression of leukaemia inhibitory factor (LIF), LIF receptor-beta and interleukin-6 (IL-6) messenger ribonucleic acids in the porcine female reproductive tract [Text] / T. Modric et al. // Placenta. — 2000. — Vol. 21. — P. 345—353.

[23] Rijhhsinghani A.G. Inhibition of interleukin-10 during pregnancy results in neonatal growth retardation [Text] / A.G. Rijhhsinghani, K. Thompson, L. Tygrette, S.K. Bhatia // Am. J. Re-prod. Immun. — 1997. — Vol. 37. — P. 232—235.

[24] Sasaki Y. Decidual and peripheral blood CD4+CD25+ regulatory T cells in early pregnancy subjects and spontaneous abortion cases [Text] / Y. Sasaki et al. // Mol. Hum. Reprod. — 2004. — Vol. 10. — P. 347—353.

[25] Somerset D.A. Normal human pregnancy is associated with an elevation in the immune suppressive CD4+CD25+ regulatory T-cell subset [Text] / D.A. Somerset et al. // Immunol. — 2004. — Vol. 112. — P. 38—43.

[26] Tang M. Decidual differentiation of stromal cells promotes Proprotein Convertase 5/6 expression and lefty processing [Text] / M. Tang et al. // Endocrinology. — 2005. — Vol. 146(12). — P. 5313—5320.

[27] The phenotypic characterization of naturally occurring regulatory CD4+CD25+ T cells [Text] / H. Yi et al. // Cell. Mol. Immunol. — 2006. — Vol. 3. — P. 189—195.

[28] Type 1 T regulatory cells [Text] / M.G. Roncarolo et al. // Immunol. Rev. — 2001. — Vol. 182. — P. 68—79.

[29] Wegmann T.G. Bidirectional cytokine interactions in the maternal-fetal relationship: is successful pregnancy a Th2 phenomenon? [Text] / T.G. Wegmann, H. Lin, L. Guilbert, T.R. Mosmann // Immunol. Today. — 1993. — Vol. 14. — P. 353—356.

THE ROLE OF REGULATORY T CELLS AND T-HELPERS DURING THREATENED ABORTION IN EARLY PREGNANCY

N.Yu. Sotnikova, L.V. Posiseeva, N.V. Kroshkina, I.A. Panova, A.V. Kudryashova, E.L. Boiko, S.I. Chuhina

Federal State «Ivanovo Research Institute of Maternity and Childhood by V.N. Gorodkov of Rusmedtechnologies» Pobedi str., 20, Ivanovo, Russia, 153731

The aim of the study was to investigate the character of the content and activation pattern of T-helpers, as well as the level of regulatory T cells in peripheral blood of 1-st trimester women with threatened abortion. It was found that threatened abortion at early stages of pregnancy was associated with the dominance of Th1 activity and decrease of the amount of regulatory T cells in the peripheral blood of pregnant women. This phenomenon might induce the development of uncontrollable cytotoxic response.