СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛУТАТИОНА В БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВКАХ МЕТОДОМ КАТОДНОЙ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ
METHOD OF DETERMINING GLUTATHIONE IN BIOLOGICALLY ACTIVE ADDITIVES USING CATHODE VOLTAMMETRY TECHNIQUE

Способ относится к области фармацевтической химии и касается способов количественного определения веществ с антиоксидантными свойствами в биологически активных добавках к пище, в частности глутатиона. Метод определения - катодная вольтамперометрия.
Важную роль в антиоксидантной защите организма человека играют легкоокисляющиеся биологически активные серосодержащие соединения, одним из которых является глутатион. Ведущая роль в антиоксидантном действии глутатиона заключается в защите клеток организма от действия активных кислородных форм, в большей степени от OH-радикала. Структурная формула глутатиона представлена на фиг.1.
2+
2+
2+
Помимо выше указанных свойств, глутатион эффективно взаимодействует с ионами металлов переменной валентности, защищая клетки от токсичного действия ионов тяжелых металлов (Cd, Hg, Zn). Защитные и регуляторные эффекты эндогенного глутатиона могут быть усилены экзогенным глутатионом. Так, на основе глутатиона создан целый ряд синтетических антиоксидантов для защиты клеток от окислительного стресса в виде биологически активных добавок к пище (БАД); радиопротекторов; лекарственных препаратов, применяемых при терапии атеросклероза, ишемической болезни сердца, интоксикации организма человека.
Для обеспечения контроля качества БАД, содержащих глутатион, необходимо разработать методику количественного определения глутатиона в БАД.
В настоящее время из методик количественного определения глутатиона в разных объектах используются методы спектрофотометрии и хроматографии.
Спектрофотометрический метод количественного определения глутатиона основан на способности реактива Элмана или 5,5-дитиобис(2-нитробензойной) кислоты (ДТНБ) образовывать окрашенное соединение с SH-группами глутатиона. Образующийся 5-тио-2-нитробензойный анион имеет интенсивную окраску желтого цвета, спектр поглощения которого определяют при λ=412 нм (G.L.Ellman. Tissue sulfhydryl groups // Arch. Biochem. Biophys, 1959, Vol.82, P.70-81).
Недостатком метода является то, что данный способ не позволяет проводить количественное определение глутатиона с необходимой чувствительностью.
Самыми чувствительными методами для определения тиоловых соединений являются методы ВЭЖХ с разными способами детектирования. Преимущества методов ВЭЖХ связано с одновременным разделением и определением глутатиона в разных объектах при низких концентрациях.
Известна работа по определению глутатиона в клетках печени животных (K.Murayama, T.Kinoshita, Determination of glutathione on HPLC using N-chlorodanasyl-amide (NCDA) // Anal. Lett., 1981, Vol.14B, P.379-384.), основанная на использовании хромато-масс-спектрометрического детектирования глутатиона.
Несмотря на хорошую чувствительность и селективность определения глутатиона в объектах, хроматографические методы имеют ряд недостатков: оборудование и растворители для метода ВЭЖХ имеют высокую стоимость, для проведения специальной пробоподготовки требуются дорогостоящие реактивы.
Перспективно использование вольтамперометрии для количественного определения глутатиона в БАД - простого, чувствительного и экспрессного метода.
Наиболее близким к теме изобретения является вольтамперометрическое определение глутатиона в модельных растворах на платиновом электроде.
2
4
Сущность методики состоит в электроокислении глутатиона на фоне 0.05 M HSO с использованием платинового электрода при потенциале, равном 1.1 В, при скорости развертки потенциала 0.02 В/с (Г.К.Будников, Г.К.Зиятдинова, Я.Р.Валитова. Электрохимическое определение глутатиона // Журнал аналитической химии, 2004, Т.59, №6, с.645-648).
Использование условий в способе-прототипе не обеспечивает чувствительности определения глутатиона в реальных объектах БАД, что связано с внесением погрешности в суммарный сигнал определения глутатиона через влияние сопутствующих компонентов БАД.
Новая техническая задача - увеличение чувствительности и экспрессности способа определения глутатиона в таблетированной форме БАД методом катодной вольтамперометрии.
-5
-4
Поставленная задача достигается тем, что глутатион переводят из таблетированной формы в раствор и проводят вольтамперометрическое определение, используют катодную вольтамперометрию. Для разработки методики определения глутатиона использован аналитический сигнал глутатиона при E - 0.237 B в боратном буферном растворе pH 9.18 (фиг.2б), где зависимость прироста предельного тока восстановления GSH от увеличения его концентрации в модельном растворе линейна. Эта область находится между концентрациями от 6.42·10 до 6.16·10 M. Скорость развертки потенциала составила 0.05 В/с.
-5
-4
Фиг.2а. Градуировочная зависимость тока восстановления глутатиона от его концентрации в ячейке в области от 6.42·10 до 6.16·10 на ртутно-пленочном электроде.
Фиг.2б. Вольтамперограммы тока восстановления глутатиона на ртутно-пленочном электроде при различных его концентрациях в растворе.
-5
Предел обнаружения глутатиона 6.3·10 моль/л достаточен для применения ее в оценке количественного содержания в БАД.
Правильность методики количественного химического определения  глутатиона в модельных растворах проверялась методом «введено-найдено» по критерию Стьюдента (табл.1)
Таблица 1
Результаты количественного определения глутатиона в модельных растворах (n 5, P 0.95)
Введено, C·10<sup>-5</sup>, моль/л
Найдено, C·10<sup>-5</sup>, моль/л
, %
6.43
7.15±0,93
12
12.70
12.51±0,77
6
19.10
19.60±0,979
8
25.30
27.42±0,65
7
31.00
33.30±0,32
7
37.50
37.90±0,32
2
43.60
44.50±0,64
3
49.60
48.44±0,54
2
55.00
56.60±0,57
3
61.60
63.20±0,30
2
Для рассматриваемого диапазона концентрации глутатиона принято решение приписать наибольшую погрешность (12%) для всей области концентраций линейного участка градуировочной характеристики.
Пример 1. Определение глутатиона в таблетках БАД «Глутатион комплекс»
Одну таблетку растирают в ступке до получения порошка. Порошок взвешивают и переносят в колбу 50 мл, добавляют 10-15 боратного буферного раствора pH 9.18 и нагревают на водяной бане при температуре 45-50°C в течение 10 минут. После этого раствор фильтруют через бумажный фильтр, который промывают буфером два раза по 5 мл. Затем в кварцевый стаканчик вместимостью 20 мл вносят 10.0 мл раствора фонового электролита боратного буферного раствора pH 9.18, помещают в электрохимическую ячейку вольтамперометрического анализатора (ТА-2, г.Томск). Опускают в раствор электроды: индикаторный - ртутно-пленочный электрод, вспомогательный и электрод сравнения - насыщенные хлорид-серебряные. Регистрацию фоновой линии проводят в постояннотоковом режиме съемки при линейной скорости развертки потенциала 50 мВ/с после удаления кислорода из электрохимичекой ячейки инертным азотом в течение 15 минут, в интервале потенциалов от 0 до -0.8 B. Отсутствие пиков на вольтамперограмме и воспроизводимые кривые свидетельствовали о чистоте фона. После получения удовлетворительных кривых фона, вносят аликвоту фильтрата глутатиона объемом 0,1 мл. Перемешивают раствор 10 с газом азотом, успокаивают 20 с и снимают вольтамперограмму в тех же условиях. Катодный пик регистрируют в диапазоне потенциалов от -0.15 B до -0.3 B. Концентрацию глутатиона оценивали по высоте катодного пика методом добавок аттестованных смесей глутатиона по общепринятой методике.
Предложенный способ количественного определения глутатиона отличается простотой, не требует больших трудозатрат, значительного количества реактивов и отличается высокой, экспрессностью и чувствительностью.
Предложенный способ может быть использован для количественного определения глутатиона в БАД и лекарственных формах.