Полиморфизм гена ангиотензинпревращающего фермента при сахарном диабете 1 типа у детей Сибири

у ..

Проблемы генетики и патогенеза

Полиморфизм гена ангиотензинпревращающего фермента при сахарном диабете 1 типа у детей Сибири

Е.И. Кондратьева, В.П. Пузырев, Е.Б. Кравец,

Т.В. Косянкова, Е.В. Вылегжанина,

М.Б. Фрейдин, А.П. Деменкова

Сибирский медицинский университет I (ректор — член-корр. РАМН, проф. В.В. Новицкий), Научно-исследовательский институт медицинской генетики I (дир. — член-корр. РАМН, проф. В. П. Пузырев) ТНЦ СО РАМН, Томск |

Эпидемиологические исследования при сахарном диабете 1 типа (СД 1) свидетельствуют об увеличении заболеваемости среди всех возрастных групп. Доля больных СД 1 составляет 715 % от всех больных диабетом, и смертность в этой группе превышает таковую у лиц с другими типами СД [2]. Специфические осложнения СД 1 зарегистрированы у 82,7 % больных, из них ретинопатия у

61.1 %, нейропатия — у 50,5 % и нефропатия — у

28.2 %. Диабетическая триопатия (ретинопатия, нейропатия, нефропатия) встречается у 8,2-19,2 % больных [2].

Клинические проявления и быстрое прогрессирование микроангиопатий при СД не всегда коррелируют с уровнем компенсации углеводного обмена, длительностью заболевания и лечением. Особый интерес представляет изучение генов-кандидатов, если продукт их экспрессии (фермент, гормон, рецептор) прямо или косвенно участвует в развитии патологического процесса при СД 1 [2, 4].

Ангиотензинпревращающий фермент (АПФ) играет важную роль в регуляции давления и электролитного баланса крови, он вызывает гидролиз ангиотензина I и его превращение в ангиотензин II (И). Ген АПФ заслуживает особого внимания не только в связи с его функцией в организме и ассоциацией его полиморфных маркеров с уровнем фермента, но и с растущей потребностью в использовании ингибиторов АПФ для реабилитации больных с диабетической нефропатией [1, 2, 8, 17-19].

Ген, кодирующий АПФ-АСЕ, локализован на хромосоме |15|, состоит из 26 экзонов общей длиной 4,3 т.п.о. и кодирует белок, состоящий из 1306 аминокислотных остатков, включая сигнальный пептид из 29 аминокислот. Среди различных полиморфных вариантов гена наиболее интенсивно изучается инсерци-онно-делеционный (1/0) полиморфизм, характеризующийся наличием или отсутствием фрагмента длиной 287 п.о. (копия А1и-по-втора) в 16-м интроне. Появляется все больше данных о том, что ¡/Б полиморфизм гена АСЕ связан с сердечно-сосудистыми нарушениями: атеросклерозом )6, 7], инфарктом миокарда [9], гипертрофией левого желудочка |6]. Во всех исследованиях, где ассоци-

ации были установлены, аллель О (генотип ОО) был связан с болезнью. Однако некоторые авторы [9, 12] ассоциаций генотипа ОО с сердечно-сосудистой патологией не выявили. В этиологии диабетической нефропатии среди генетических факторов риска обсуждается роль полиморфизма гена АСЕ. Первые сообщения об ассоциации двух полиморфных маркеров гена АСЕ с диабетической нефропатией были описаны в 1994 г. [11, 15].

Целью настоящей работы был поиск ассоциаций инсерционно-делеционного полиморфизма гена АСЕ с СД 1 типа, его клиническими особенностями и количественными показателями иммунитета и липидного обмена.

Объем и методы исследования

Обследованы 113 детей с СД 1 типа в возрасте 13,1 ±0,3 лет, (мальчиков 53,1 %, девочек 46,9 %). Дети находились под наблюдением в клинике НИИ медицинской генетики Томского научного центра РАМН и эндокринологическом отделении детской больницы № 1 Томска.

Больные находились в состоянии клинической компенсации заболевания и (или) компенсации (субкомпенсации) углеводного обмена. Средний уровень гликированного гемоглобина составил 11,2±0,4 %. Давность СД до 3 лет была у 41 ребенка (36,1 %), от 3 до 7 лет — у 39 больных (34,5 %), более 7 — лет у 33 (29,2 %). Все дети получали базисно-болюсную инсулинотерапию. Потребность в инсулине в среднем составила 0,6+0,02 ЕД на 1 кг массы тела (различий в потребности инсулина в зависимости от пола ребенка не выявлено). В зависимости от потребности в инсулине дети были разделены на группы. Потребность в инсулине до 0,5 ЕД на 1 кг массы тела имела место у 8,6 % детей, в дозе 0,5-0,7 ЕД на 1 кг массы — у 26,7 % больных; суточная доза инсулина более 0,7 ЕД на 1 кг массы тела была у 64,8 % пациентов.

Критерием диагностики диабетической нефропатии у детей служила классификация С.Мо§еп5еп с соавт. (1983). Стадию микроальбуминурии диагностировали при альбуминурии от 30 до 300 мг в сутки, стадию протеинурии — при альбуминурии более 300 мг в сутки. В группе обследуемых не было пациентов с нарушенной азотовыделительной функцией почек, отсутствовали пороки развития и воспалительные заболевания мочевыводящей системы.

Сахарный диабет

/

Проблемы генетики и патогенеза

Контрольную группу составляли 122 человека, принадлежащих к русскому населению Томска и не имеющих по данным клинического и инструментального обследования СД и признаков сердечно-сосудистых нарушений.

Гликированный гемоглобин определяли колориметрическим методом. Уровень микроальбуминурии определяли с помощью наборов фирмы "Rondox" (Англия) на лазерном нефелометре "Boehring” (Австрия).

Исследовали иммунный статус 1-го уровня с определением уровня IL-1, 1L-2, IL-4, IL-6, FNO-a с помощью иммунофермент-ного метода реактивами фирмы "ООО" Протеиновый контур", С.-Петербург.

С помощью наборов фирмы "Biocon" (Франция) исследовали содержание общего холестерина (ХС), холестерина липопротеидов высокой плотности (ХС ЛПВП) и триглицеридов (ТГ). Определение изучаемых показателей проводили на биохимическом автоанализаторе FP-900 (Labsystems, Финляндия). Содержание холестерина липопротеидов очень низкой плотности (ХС ЛПОНП); холестерина липопротеидов низкой плотности (ХС ЛПНП); коэффициента ате-рогенности (ИА) рассчитывали по общепринятой методике [3].

У всех пациентов определяли показатели перекисного окисления липидов (ПОЛ) по содержанию малонового диальдегида [5]; о состоянии антиоксидантной защиты судили по уровню каталазы [5]; активность 5'-нуклеотидазы оценивали по методу D.Lesso, Е.Marinetti.

ДНК выделяли из образцов цельной крови с помощью неэнзиматического метода с некоторыми модификациями [13]. Для гено-типирования I/D полиморфизма гена АСЕ ДНК амплифицирова-ли в соответствующем участке путем полимеразной цепной реакции с использованием структуры праймеров и параметров температуры циклов. Применяли следующую номенклатуру аллелей: аллель I соответствовал длине 490 п.н. — наличие (инсерция) А1и-по-втора, аллель D (190 п.н.) — его отсутствие. В работе были использованы реактивы фирм Медиген и СибЭнзим (Новосибирск).

Тестирование распределения генотипов на равновесие Харди-Вайнберга проводили с помощью критерия X2 с поправкой Йетса на непрерывность, а в случае малых объемов групп — с помощью теста Фишера [25]. Для оценки ассоциаций полиморфизма с патологическими фенотипами рассчитывали относительный риск (RR) по формуле: RR=ad/bc, где а — частота анализируемого аллеля у больных; b — частота анализируемого аллеля в контрольной выборке; end — суммарная частота альтернативного аллеля у больных и в контроле соответственно [7].

Для поиска ассоциации частоты патологии с генетическими маркерами был использован тест на неравновесие по сцеплению — Transmission/Diseqilibrum Test (TDT) [7] TDT=(b-c)2/(b+c), где b и с — наследуемые аллели от гетерозиготных родителей.

Все расчеты по приведенным формулам выполняли в компьютерных пакетах прикладных программ STAT1STICA 5.0, Microsoft Excel-97.

Результаты и их обсуждение

Проведен анализ особенностей клинического течения СД 1 типа у детей, проживающих в Сибирском регионе. Средний возраст больных во время

дебюта СД составил 9,1 ±0,3 г. Манифестация заболевания у 20,4 % пациентов наступила в возрасте до 7 лет, у 59,2 % - от 7 до 11 лет и у 20,4 % - в период пубертата. Инфекционный фактор был провоцирующим у 17,7 % больных, стресс — у 44,2 %, лекарственная терапия (лечение описторхоза) спровоцировала манифестацию заболевания у 1,8 % детей. Провоцирующий фактор отсутствовал в анамнезе у 31 % детей с диабетом. Стресс как провоцирующий фактор дебюта заболевания преобладал у мальчиков (53,3 % против 34 % у девочек).

В коматозном состоянии при манифестации заболевания поступили 22 (19,4 %) пациента. Ремиссия СД ("медовый месяц") отмечалась в анамнезе у 23 % больных, чаще регистрировалась у мальчиков (30 %), в 15,1 % у девочек. Ремиссия более 3 мес. зарегистрирована у 16 детей (10 мальчиков и 6 девочек). На 1-м году заболевания потребность в инсулине до 0,5 ЕД на 1 кг массы тела чаще отмечалась у мальчиков (у 9 мальчиков и 1 девочки).

Коматозные состояния в анамнезе отсутствовали у 69,9 % детей. Гипергликемическая кетоацидотиче-ская кома имела место у 25,7 % больных.

Диабетическая нефропатия зарегистрирована у 19,6 % больных, из них — у 16 девочек и 6 мальчиков. Стадия микроальбуминурии диагностирована у 13 детей, стадия протеинурии с сохранной азотовыделительной функцией почек — у 9. Таким образом, нефропатия чаще наблюдалась у девочек (30,2 % от общего количества девочек и 10,2 % от общего числа мальчиков).

Частоты аллелей, распределение генотипов гена АСЕ, а также оценка их соответствия равновесию Харди-Вайнберга в группе контроля и у больных СД представлены в табл. 1. Анализ распределения генотипов II, ID и DD I/D полиморфизма гена АСЕ в группе больных не выявил достоверного отклонения от равновесия Харди-Вайнберга (р<0,05). Гетерози-готность среди больных СД соответствовала ожидаемой (0,47 и 0,49 соответственно). Частоты аллелей

Таблица 1

Распределение генотипов и частот аллелей 1/0 полиморфизма гена АСЕ у больных СД 1типа и здоровых лиц

Группа Гено- n t H.o±s.e.

тип d.f. = 1 Y.e.±s.e.

Больные СД 1 II 27 0.2990 Н.о. = 0,4715±0,0450

п= 123 ID 58 р>0,05 Н.е. = 0,4960±0,0063

DD 38

Контроль II 24 0.000011 Н.о. = 0.4878±0.0451

п= 123 ID 60 р>0.05 Н.е. = 0,4926±0,0082

DD 39

Примечание: п - наблюдаемая численность генотипов; х2 - критерий использован для оценки соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому, исходя из равновесия Харди-Вайнберга;

И.о. и Н.е. - наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность с ошибкой ; с1.1 - число степеней свободы.

І

Сахарный диабет

Проблемы генетики и патогенеза

I и О соответственно составили 45,5 % и 54,5 %. Полученные данные согласуются с показателями распределения частот аллелей 1/0 полиморфизма гена АСЕ в других популяциях (табл. 2). Так, частота аллеля О в различных популяциях варьирует от 36 % (японская популяция) до 67 % (Московская популяция) [2, 22, 24]. Анализ материала методом "случай-контроль" (больные СД — здоровые лица) показал наличие ассоциации 1/0 полиморфизма гена АСЕ с заболеванием (1111=1,1), однако взаимосвязь не является достоверной (табл. 3).

Результаты теста на неравновесие по сцеплению показали ассоциацию аллеля Э с диабетической нефропатией (ТОТ=3,6, р<0,05). Таким образом, нами впервые с помощью анализа семейного материала была получена данная ассоциация. Наличие ассоциации 1/0 полиморфизма гена АСЕ с диабетической нефропатией не случайно. Оно основано на роли АПФ в регуляции тонуса сосудов, а в рассматриваемом случае — сосудов почек [1, 12].

Исследования роли аллеля О и ОО генотипа в развитии диабетической нефропатии строились на основании достоверности различий частот аллелей и генотипов полиморфных локусов в группах сравнения с последующим расчетом относительного риска [2, 4, 11, 15]. В популяциях ряда европейских стран было показано, что у больных с генотипом ОО быстро прогнессировали нарушения со стороны почек [21]. В Московской популяции наличие аллеля I препятствовало развитию нефропатии полиморфизма гена АСЕ с нефропатией, что связывается с неоднородностью сравниваемых групп, расовыми и этническими вариациями в распределении частот встречаемости генетического маркера, а также с распространенностью диабетической нефропатии и особенностями ее течения [4, 16, 20].

В настоящем исследовании обнаружена зависимость потребности в инсулине у больных СД 1 от 1Д) полиморфизма гена АСЕ. Дети со II генотипом имели более низкую потребность в инсулине (р<0,045) в отличие от больных с генотипом ОО (табл. 4). Ассоциации генотипов 1/0 полиморфизма гена АСЕ (ИМТ) не было.

Таблица 4

Анализ 1/0 полиморфизма гена АСЕ в зависимости от ИМТ и потребности в инсулине у больных СД

Генотип ИМТ Потребность в инсулине, ЕД на 1 кг массы тела

00

Ю

И

? 1.542 2.076

Р 0,218 0,130

р для парных исследований - 1-3:0,045

Примечание: р- 1 -3 - отличия для групп 00 и II.

Проведен анализ зависимости количественных показателей иммунного статуса и липидного обмена от генотипов изучаемого гена. Установлена ассоциация генотипа II у больных СД 1 с высоким содержанием ІЕ-6, который является защитным фактором эндотелия сосудов.

Уровень 1Ь-6 у детей с генотипом ОО составил 3,88+3,71 пг/мл, а с генотипом II — 14,90±6,09 пг/мл (р=0,029).

Установлена зависимость показателей липидного обмена от генотипов гена АСЕ у больных СД 1. Уровень ТГ и ХС ЛПОНП у детей с генотипом II достоверно превышал показатели у детей с генотипом ОО (табл. 5). Анализ показателей липидного

Таблица 5

Показатели липидного обмена и 1/0 полиморфизм гена АСЕ у детей и подростков с СД 1 типа

Гено- типы Груп- па ХС, ммоль/л ТГ, ммоль/л ХС ЛПВП, ммоль/л ХС ЛПНП, ммоль/л ИА ХС ЛПОНП, ммоль/ л

00 п=13 1-я 5,59 ±0,61 1,17±0,10 р|3<0,05 1,54 ±0,10 3,27±0,49 3,01 ±0,30 0,53±0,04 р, _2<0,01 рьз<0,01

Ю п=35 2-я 5,00±0,18 1,52±0,14 1,40±0,07 3,00±0,13 3,29±0,22 0,66±0,05

II п=13 3-я 5,49±0,41 1,86±0,26 1,28±0,08 3,36±0,40 3,85±0,43 0,91 ±0,12

Примечание: р,_2, Р,.3 - достоверность различий показателей между группами.

обмена у больных СД 1 показал достоверное повышение уровня ХС, ТГ, ХС ЛПНП и индекса атерогенности (ИА) у детей с диабетической нефропатией (табл. 6). Показатели липидов случайной выборки, использовавшейся в эпидемиологическом исследовании факторов риска развития ИБС

Таблица 2

Распределение маркерных аллелей I и 0 гена АСЕ среди больных СД 1 типа и здоровых лиц

Группа п Частота аллелей, % Ґ Р 171?

1 0

Больные СД 1 Контроль 123 122 46 44 54 56 0,299 0,786 Ы

Таблица 3

Распределение генотипов и частот аллелей 1/0 полиморфизма гена АСЕ в зависимости от наличия нефропатии у детей с СД

Диабетическая нефропатия II Ю 00 х2/р 1 0 х2/р

+ 5 9 8 0,299/ 43,2 56,8 0,041/

- 20 47 27 0,861 46,3 53,7 0,839

Сахарный диабет

Проблемы генетики и патогенеза

Таблица 6

Показатели липидного обмена в сыворотке крови детей с СД 1 типа и нефропатией

Показатель Нефропатия Контроль

без нефропатии п = 82 стадия микро альбуминурии п = 14 стадия протеинурии п= 14

XC, ммоль/л 4,76 ±0,13 Pl-2-C 0,01 Pi-3<0,0! 5,60 ± 0,26 р< 0,001 5,96 ± 0,58 р< 0,001 4,51 ±0,13

ХСЛПВП, ммоль/л 1,38 ±0,04 р< 0,001 1,44 ±0,11 р< 0,001 1,14 ± 0,13 р< 0,05 1,10 ± 0,03

ХСЛПНП, ммоль/л 2,97 ±0,13 р,.3<0,05 3,29 ±0,18 р< 0,01 3,70 ± 0,35 р< 0,01 2,78 ±0,11

ХСЛПОНП, ммоль/л 0,56 + 0,02 р, 2< 0,001 рьз< 0,001 0,85 ± 0,09 р< 0,01 0,80 ±0,12 0,61 ±0,05

тг, ммоль/л 1,21 ±0,05 р, 2< 0,001 Pl_3< °-001 1,86 ± 0,19 р< 0,01 1,75 ±0,26 1,37 ±0,10

ИА 2,61 ±0,12 р< 0,01 р13< 0,001 3,04 ±0,19 Р2-3<0'05 5,15 ±0,92 р< 0,01 3,24 ±0,20

Примечание: р - достоверность различий по сравнению с контролем;

р, _2 - достоверность различия показателей между группами больных без нефропатии и с нефропатией в стадии микроальбуминурии;

р1 з - достоверность различия показателей между группами больных без нефропатии и с нефропатией в стадии протеинурии;

р2_з - достоверность различия показателей между группами больных с нефропатией в стадии микроальбуминурии и протеинурии.

в Томске зависели от генотипов гена АСЕ: отмечено увеличение показателей обмена липидов у больных с аллелем I [6]. Полученные результаты могут служить объяснением отсутствия ассоциации диабетической нефропатии с I/D полиморфизмом гена АСЕ у больных СД 1 типа с помощью расчета критерия относительного риска в популяции. В целом полученые данные свидетельствуют о многообразии факторов, играющих роль в развитии диабетической нефропатии.

Выводы

1. В Сибирской популяции сахарный диабет 1 типа у большинства детей манифестируется в возрасте 7-11 лет, чаще встречается среди мальчиков, у которых имеет стабильное течение; чаще достигается ремиссия на первом году заболевания, ниже потребность в инсулине, реже развивается диабетическая нефропатия.

2. Результаты теста на неравновесие по сцеплению на семейном материале показали наличие взаимосвязи аллеля D с диабетической нефропатией.

3. Установлены ассоциации показателей липидного обмена, 1L-6 и потребности в экзогенном инсулине с генотипами I/D полиморфизма гена АСЕ.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке РГНФ (грант № 00-06-00162а) и РФФИ (№00-15-97876).

Литература МІМІ

1. Воронцов А.В., Шестакова М.В. //Проблемы эндокринологии. -1997. - № 4. - С. 37 - 42.

2. Дедов И.И. //Вестник РАМН. - 1 998. - № 7. - С. 24-29.

3. Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Липиды, липопротеды и атеросклероз.

- СПб: Питер Пресс, 1 995.

4. Кондратьев Я.(О., Чугунова Л.А., Шамхалова M.LU.., Шестакова М.В. с соавт. // Проблемы эндокрин. - 1 998. - Т. 44, № 4. - С. 12-15.

5. Королюк М.А., Иванова Л.И.//Лабораторное дело. - 1998. - № 1. -С. 45-52.

6. Степанов В.А., Пузырев В.П., Карпов Р.С.//Сибирский медицинский журнал. - 1999. - Том. 13, № 3. - 4. - С. 20-25.

7. Фогель Ф., Мотульски А. Генетика человека. В 3 т. Пер. с англ. - М. «Мир», 1 990. - 366 с.

8. Arbustini Е., Grasso М., Fasani R. // Brit. Heart J. - 1 995. - V. 74. - P. 584-591.

9. Bobn М., Berge K.E., Bakken A. et al.// Clin. Genet. - 1 993. - V. 44. -P. 292-297.

10. Cambien F., Piorier O., Lecerf L. et all.// Nature. - 1 992. - 359. - P. 641-644.

1 1. Doria A., Warram J.H., Krolewski A.S.// Diabetes. - 1 994. - V. 43. -P. 690-695.

12. Hilgers K.F., Norwood V.F., Gomez R.A. // Semin. Nephrol. - 1997. -Sep;17(5).-P. 492-501.

13. Lahiri D.K., Bye S., Nunberg J.l. et all. // J. of Biochemical and Biophisikal methods. - 1992. - Vol. 25. - P. 193-205.

1 4. Lesko D.N., Marinetti E.V. // Biochim. et Biophys. Acta. - 1972. - Vol. 266. - P. 51 1 -523.

15. Marre M., Bernadet P., Gallous Y. et al.// Diabetes. - 1 994. - V. 43. -P. 384-388.

1 6. Mattei M.G., Hubert C., Alhenc-Gelas F. et al. // Cytogenet. Cell. Genet.- 1989. - Vol. 51. - P. 1041-1045.

1 7. Panagiotopous S., Smith T.J., Aldred P. et al. // J. Diabet. Compl. -

1995. - V. 9. - P. 272-276.

1 8. Remuzzi G., Ruggenenti P. // Diabetes Res. Clin. Pract. - 1 998. - Apr; 39. - Suppl. - P. 49-53.

1 9. Rigat B., Hubert C., Albenc-Gelas F. et al. // J. Clin. Invest. - 1990. -Vol. 86. - P. 1343-1346.

20. Ruggenenti P., Remuzzi G. // Exp. Nephrol. - 1 996. - V. 4. - Suppl 1.

- P. 53-60.

21. Sbadrina M.I., Slominsky P.A., Perova N.V., Limborska S.A. // Am. J. Hum. Genet. - 1 996. - Suppl. - P. 376.

22. Stoneking M., Fontius J., Clifford S. et al. // Genom Research. - 1997. -Vol. 7.-P. 1061-1071.

23. Tarnov L., Gambien F., Rossing P., Nielsen F.S. et al. // Diabetes. -

1996. - V45. - N3. - P. 367-369.

24. Yu-Lin Ko., Yu-Shien Ko., Shu-Mei Wang X.L. et al. // Hum. Genet. -

1997. - Vol. 100. - P. 21 -214.

25. Zar J.H. Biostatistical Analysis. - New Jersey, Prentice Hall International, Inc., 1999. - P. 750.