СПОСОБ РЕГЕНЕРАЦИИ ТКАНИ
METHOD FOR NEOGENESIS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к способу индукции структурного роста ткани, более конкретно - при регенерации печени, и притязает на приоритеты Заявки на патент Германии №10361813.9-41 и европейской Заявки на патент №03029961.4, содержание которых включено в данную заявку посредством ссылки.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В онтогенезе экспрессируются факторы роста, которые могут запускать основополагающие структурные и, относительно числа клеток, количественные процессы синтеза тканей. Однако в растущем и зрелом организме способность образовывать или - в случае повреждений тканей - регенерировать структурно и функционально неповрежденные ткани в значительной степени утрачивается. Предполагается, что это снижение способности к регенерации обусловлено снижением экспрессии факторов роста, которые, в свою очередь, контролируют экспрессию белков, необходимых для синтеза тканей.
Тем не менее, по меньшей мере, относительно некоторых органов известно, что они даже во взрослом организме сохраняют способность к саморегенерации, которая может индуцироваться процессами повреждения. Так, например, регенерационная способность печени известна еще с древних времен. Почти все остальные органы не могут самостоятельно устранять структурные дефекты с восстановлением оригинальной ткани.
Печень во взрослом организме, как правило, находится в состоянии покоя, которое называется непролиферирующим состоянием и в котором орган должен выполнять сложное многообразие различных метаболических функций. Однако in vivo печень все же может снова получить стимулы к росту при потере клеточной массы, например, из-за повреждения клеток печени или из-за хирургического вмешательства.
Тем не менее, пролиферация ткани печени не восстанавливает функциональные и анатомические структуры органа желательным образом, а, как правило, приводит к увеличению и гипертрофии оставшейся ткани печени до тех пор, пока не будет восстановлена исходная масса клеток печени. Интенсивность реакции роста зависит от объема потери ткани. Ход регенерации печени во времени подчиняется обратно пропорциональной зависимости, то есть небольшие потери клеток печени восстанавливаются медленно, большие потери клеток печени - значительно быстрее.
Таким образом, само по себе восстановление массы органа за счет пролиферации клеток не обеспечивает достаточной базы для лечения пациентов со значительным повреждением органа. Поэтому известны различные подходы к индукции структурного роста - то есть формообразующего роста - тканей, но ни один из них еще не привел к удовлетворительному успеху. Однако такой структурный рост клеток имел бы большое значение, особенно для терапевтических или биотехнологических способов.
В прошлом были предприняты попытки индуцировать рост клеток посредством введения факторов роста, например, таких как «эпидермальный фактор роста» (EGF, ЭФР), «сосудисто-эндотелиальный фактор роста» (VEGF, СЭФР) или «фактор роста гепатоцитов» (HGF, ФРГ). Однако влияние этих факторов на размножение первичных клеток in vitro ограничено. Напротив, их применение in vivo не лишено проблем из-за возможных побочных эффектов, например активации онкогенов.
Другой подход базируется на применении комплексных гетерологичных экстрактов тканей, например экстрактов из гипофиза или гипоталамуса, для индукции размножения клеток, например гепатоцитов в культуре (см., например, патент US 6,008,047). Однако применение экстрактов из тканей животных или человека в лаборатории или в клинике проблематично из-за возможности передачи вирусных заболеваний, например, таких как BSE (губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота), вирусов свиней или овец, и подтверждает, скорее, недостаток знаний о процессах, которые участвуют в построении сложных структур органов, а также о действительно важных факторах и возможности их использования, и о механизме действия. Кроме того, трудно определить качество экстрактов, так как оно, среди прочего, зависит от источника и условий культивирования.
Тем не менее, даже небольшие сведения, полученные из классических применений первичных культур тканей, нельзя прямо применить к вопросам тканевого инжиниринга. Так, тканевый инжиниринг, как правило, начинается с пациент-специфических зрелых клеточных систем, которые уже дифференцированы в гораздо большей степени, чем фетальные или эмбриональные клетки. Кроме того, в случае тканевого инжиниринга, как in situ, так и in vitro, речь идет о ситуациях совместного культивирования, которые не рассматриваются в классическом применении. В самом деле, при культивировании паренхиматозных клеток печени, напротив, стараются избежать совместных культур эндотелиальных клеток, макрофагов и фибробластов, существующих в печени, так как они нежелательны.
В публикации международной заявки WO 02/092013 А2 описано введение пациенту терапевтически эффективного количества гормона роста (Growth Hormone, GH, ГР) для лечения повреждений печени с тем, чтобы стимулировать естественную способность печени к регенерации. Согласно этому документу ГР обладает способностью усиливать экспрессию фактора роста Fox M1B гепатоцитами, и за счет этого повторно инициировать рост печени.
Тем не менее, гормон роста оказывает очень широкое и поэтому неспецифическое действие на рост тканей. Поэтому в результате введения ГР возникают и нежелательные побочные действия или гиперреакции, например в форме так называемой акромегалии, то есть избыточной оссификации с патологическими состояниями костей. Кроме того, было установлено, что Fox1M активирован в базально-клеточных карциномах. Fox-протеины играют важную роль в регуляции генов роста при размножении, дифференцировке и трансформации, в том числе и при активации так называемых Sonic Hedgehog (Shh) сигнальных путей. Они, в свою очередь, участвуют в активации базально-клеточных карцином в коже человека. Так, Teh et al. показали (Cancer research 2002, 15 августа; 62 (16): 4773-80), что активация Fox1M в базально-клеточных карциномах является одним из основных механизмов инициации, посредством которого SONIC HEDGEHOG сигнальные пути оказывают митогенные воздействия на базальные кератиноциты, что приводит к развитию распространенной раковой язвы у человека. Этот опухолегенный потенциал агонистов Fox1 M и низкая специфичность и повсеместное присутствие во всех тканях препятствуют применению фактора роста (ГР) для стимуляции регенерации печени.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Поэтому задачей настоящего изобретения является обеспечение способа, которым можно было вызвать индукцию преимущественно структурного роста ткани. Этот рост предпочтительно должен приводить к восстановлению функциональных возможностей и структуры соответствующей ткани.
Эта задача была достигнута согласно настоящему изобретению посредством применения гематопоэтических цитокинов, их производных, аналогов или фрагментов для структурной и функциональной регенерации печени. В особо предпочтительной форме осуществления изобретения вводили эритропоэтин (ЭПО) или его производное, фрагменты или аналог. Однако воздействие согласно настоящему изобретению на соответствующую ткань может быть достигнуто и при введении тромбопоэтина (ТПО) или его фрагментов.
Неожиданно было показано, что при введении гематопоэтических факторов роста, таких как ЭПО и ТПО, происходит не только размножение клеток, но и структурный рост. Этот рост происходит, прежде всего, в предварительно травмированных тканях. Вызванный таким образом рост приводит in vivo к регенерации ткани в истинном смысле, то есть имеет место не только пролиферативный рост, но и направленный, дифференцированный рост, ведущий к образованию сложных структур.
В своей основе применение согласно настоящему изобретению гематопоэтических факторов для регенерации ткани, в основном, базируется на двух до сих пор неизвестных эффектах, вызываемых ЭПО, а именно: с одной стороны, на стимуляции структурного роста различных типов клеток в синхронной и координированной форме (например фибробластов, гладкомышечных клеток и эндотелиальных клеток в области сосудов совместно с новообразованием архитектуры законченного сосуда с учетом внеклеточного матрикса (коллагена, эластина, фибронектина, энтактина) и завершением истинной ассоциации паренхиматозной ткани. Это включает в себя, например, образование гепатоцитов со связанными с ними клетками Купфера, ямочными (Pit-клетками), стеллатными (Ito-клетками) и эндотелиальными клетками (так называемыми непаренхиматозными клетками печени). Кроме образования реального сосудистого дерева и его взаимосвязей, при этом согласно настоящему изобретению индуцируется регенерация тканей в смысле restitutio ad integrum (полного восстановления).
В печени это приводит к образованию смеси синусоидальных капилляров в области микроциркуляторного русла и подводящих и отводящих сосудов рядом с фактической паренхиматозной ассоциацией гепатоцитов в виде упорядоченной трехмерной структуры.
Как уже было указано, действие гематопоэтических факторов роста проявляется, прежде всего, в травмированных тканях и клетках. Термин «травма» в контексте настоящего изобретения является противоположным процессу гистогенеза (образования тканей). Соответственно, травма представляет собой процесс, который действует противоположно гистогенезу как процессу образования тканей в отдельном организме в тех положениях, о которых идет речь, или аннулирует результат гистогенеза. Травма как повреждение тканей может быть вызвана многочисленными событиями, например ранениями, воспалениями или аутоиммунными заболеваниями с саморазрушением. Эти повреждения или разрушения тканей, в свою очередь вызывают множество реакций, например активацию макрофагов, тучных клеток и иммунокомпетентных клеток, которые секретируют хемотактические, вазоактивные и способствующие заживлению ран факторы, и за счет этого регулируют системные и региоселективные механизмы.
Преимущества применения гематопоэтических факторов роста согласно настоящему изобретению, прежде всего - ЭПО, распространяются на регенерацию тканей всех четырех основных типов тканей, а именно - соединительной ткани, мышечной ткани, эпителиальной ткани и нервной ткани. Эти ткани в онтогенезе образуются из мезодермы (соединительная ткань, мышцы, эндотелий (как особая форма эпителия)), эндодермы (эпителий, выстилающий желудочно-кишечный тракт) или эктодермы (нервная ткань). Ранее было показано, что ЭПО-рецептор может экспрессироваться как на клетках мезодермального, так и на клетках эндодермального происхождения, а также на нейрональных клетках.
В этих тканях применение ЭПО или ТПО согласно настоящему изобретению приводит к местному рекрутингу (пополнению) специфичных для данной ткани популяций прогениторных клеток (стволовых клеток), миграции клеток и дифференцировке или трансдифференцировке клеток в паренхиматозные или структурные клетки. Во время этого образования ткани и перед ним клетки размножаются благодаря введению ЭПО.
При применении способа согласно настоящему изобретению, например для регенерации печени, может быть достигнуто восстановление ранее поврежденного органа с образованием законченной ассоциации паренхиматозной ткани, включая образование гепатоцитов с купферовскими клетками, Pit-клеток, Ito-клеток и эндотелиальных клеток. Совместно с продолжающимся формированием сосудистого дерева при этом возможна регенерация ткани согласно настоящему изобретению в соответствии с принципом restitutio ad integrum (полного восстановления).
Таким образом, особое преимущество способа согласно настоящему изобретению заключается в том, что стимулируется не только микрокапилляризация регенерирующей ткани за счет развития эндотелия, но и регенерация паренхимы и образование структур стенок печени. Только это приводит к получению желаемого результата координированного трехмерного роста для образования функционирующего органа.
Поэтому применение согласно настоящему изобретению основано на действии ЭПО, которое значительно шире ранее известного действия ЭПО как ангиогенетического фактора на размножение эндотелиальных клеток (Journal of Nephrology, 2002, 15, 97-103). Так как микроваскулярные структуры, такие как капилляры и синусоиды, состоят исключительно из эндотелиальной выстилки и не имеют собственных структур стенок, то до сих пор, исходя из ангиогенетического действия ЭПО можно было только рассуждать о том, может ли ЭПО иметь определенное значение при новообразовании сосудов и заживлении ран (Journal of Nephrology, 2002, 15, 97-103). Однако подтверждения этих предположений до сих пор не было.
Поэтому очень важно, что в данной работе было впервые получено доказательство влияния ЭПО на синхронизированный и координированный рост самих сосудов, включая образование структур стенок и регенерацию паренхимы.
Следующее преимущество способа согласно настоящему изобретению состоит в том, что структурный рост не обязательно требует в качестве исходной точки заранее заданной органической или неорганической трехмерной структуры, а создает структуру органа (фрагменты органа) заново. Поэтому применение гематопоэтических факторов роста может индуцировать заметно ускоренную саморегенерацию поврежденной ткани, что имеет большое значение для клинико-терапевтического применения изобретения.
В особо предпочтительной форме осуществления изобретения гематопоэтические факторы применяют для индуцирования регенерации ткани, в которой имеются травматически поврежденные области. В этих участках ткани может быть простимулировано не только закрытие раны за счет образования грануляционной ткани и начала ангиогенеза, но и новообразование специфической для данной ткани трехмерной структуры, состоящей из внеклеточного матрикса, например из коллагена, эластина, фибронектина и этнактина.
Согласно настоящему изобретению используют гематопоэтические факторы роста. При этом речь идет, прежде всего, о тробопоэтине, эритропоэтине и гормоне роста (ГР), а также об их функционально и структурно гомологичных аналогах, производных и/или фрагментах. Однако более конкретно применяются ЭПО или ТПО, или их фрагменты, производные или аналоги. Также применимы пептиды, имитирующие их действие, (так называемые пептиды-миметики) (см. ниже). Кроме того, гематопоэтические факторы роста включают в себя G-CSF (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор) и GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор).
Гематопоэтические факторы роста являются белками с архитектурой «левостороннего четырехспирального пучка» с ориентацией «вверх-вверх-вниз-вниз» с двумя перекрывающимися петлями, которые связывают между собой две первые и две последние спиральные структуры (Livnah О. et al., Science, 1999, 283 (5404): 987-90, и Ultsch M.H. et al., Blood, 1995, 86 (2): 540-7). Соответствующие RBD-домены (рецепторсвязывающие домены) обладают выраженной гомологией с ЭПО. Тромбопоэтин, эритропоэтин и гормон роста связываются с MPL-рецепторным комплексом. В публикации Youssoufianh et al. (Blood, 1993, 819, 2223-36, Structure, function and activation of the Erythropoietin receptor) описана продуктивная димеризация. Эритропоэтин и Тромбопоэтин, пептиды-миметики (ЕМР и DMP) и некоторые другие мелкие непептидные молекулы также являются функциональными, однако на более низкой молярной основе (публикации: Wrighton N.C. et al. Small peptides as mimetics of the protein hormone erythropoietin. Science, 1996, 273 (5274), 458-64, Cwirla S.E. et al. Peptide agonist of the thrombopoietin receptor as potent as the natural cytokine. Science, 1997, 27653191696-9, и Qureshi S.A. et al. Mimicry of Erythropoietin by non peptid molecules. Proceedings National Academy of Sciences PNAS USA, 1999, 9621: 12156-61). Связывание ЕМР-1 с рецептором происходит на сайтах связывания, которые гомологичны «горячим пятнам» соединений рецептора гормона роста. Структурные последовательности тромбопоэтина подробно описаны в патентном документе ЕР 1201246 А2. Структурные последовательности эритропоэтина подробно описаны в Заявке на Европейский Патент ЕР 84308654.7.
В особенно полезной форме осуществления изобретения используется ЭПО, который стимулирует in vivo образование эритроцитов, деление и дифференцировку клеток-предшественников эритроцитов. ЭПО можно выделить из мочи или получить рекомбинантными способами. Получение рекомбинантного ЭПО человека подробно описано в публикации международной заявки WO 86/03520. Кроме того, ЭПО описан в следующих патентных документах: ЕР 0148605, ЕР 0205564, ЕР 0209539, ЕР 0267678 и ЕР 0411678.
Тем не менее, можно также использовать производные нативного или рекомбинантного ЭПО. Так, например, известно производное ЭПО (ЕР 0640619 В1), которое содержит дополнительные сайты гликозилирования и поэтому имеет более высокое содержание углеводов с 22 остатками сиаловой кислоты. Преимуществом этой модификации является то, что с увеличением содержания сиаловой кислоты увеличивается период полужизни ЭПО в плазме, так как только не сиалированный ЭПО способен связываться с рецептом галактозы в печени, участвующим в разрушении ЭПО. Хотя это производное ЭПО - известное под аббревиатурой NESP (novel erythropoiesis stimulating protein or darbepoetin, новый белок, стимулирующий эритропоэз, или дарбопоэтин) - имеет последовательность аминокислот, модифицированную в пяти положениях по сравнению с рекомбинантным ЭПО, оно по своему действию в отношении стимуляции образования эритроцитов соответствует нативному или рекомбинантному ЭПО (Fisher, J.W.: Erythropoietin: Physiology and Pharmacology Update. Erythropoietin, 2003, 1-14). Содержание патентного документа ЕР 0640619 В1 в полном объеме включено в данную работу посредством ссылки в отношении структуры и получения NESP.
Полезно также химически конъюгировать NESP с полиэтиленгликолем (ПЭГ) для еще большего увеличения периода полужизни in vivo без изменения биологической активности. Модифицированный таким образом NESP известен из патентного документа WO 01/76640, который в полном объеме включен в данную работу посредством ссылки в отношении структуры и получения этого производного ЭПО.
Из публикаций международных заявок WO 02/49673 А2 и WO 01/02017 известны также пегилированные производные ЭПО, которые, кроме увеличенного периода полужизни в плазме, обнаруживают также повышенную клиническую эффективность. Для этого, например, посредством направленного мутагенеза в аминокислотную последовательность ЭПО вводят 1-6 дополнительных сайтов гликозилирования. Это производное также можно использовать согласно настоящему изобретению.
Наряду с ЭПО и производными ЭПО с соответствующей биологической функцией можно также использовать согласно настоящему изобретению другие гематопоэтические факторы роста, например ТПО или его фрагменты.
ТПО (также известный под названием c-Mpl-лиганда, mpi-лиганда, мегапоэтина или фактора роста и развития мегакариоцитов) - это гематопоэтический фактор роста с комплексным биологическим действием, который, среди прочего, регулирует развитие и пролиферацию мегакариоцитов и тромбоцитов. Зрелый ТПО состоит из последовательности, содержащей 332 аминокислоты, при этом N-терминальная область (RBD-домен), содержащая 154 аминокислоты, обнаруживает значительную гомологию последовательности и структуры по отношению к ЭПО (20%-ная идентичность и дополнительно 25%-ное сходство). Более конкретно, ТПО содержит два в высокой степени «консервированных» цистеиновых мостика, которые также обнаруживаются в положениях, гомологичных ЭПО.
Ранее было показано, что N-терминальная область ТПО ответственна за связывание рецептора цитокина и индуцируемый этим связыванием сигнальный каскад по JAK/STAT-пути (Geddis A.E., Linden H.M., Kaushansky К.: Thrombopoietin: a pan-hematopoietic cytokine. Cytokine & Growth Factor Reviews, 13 (2002), 61-73). Поэтому, также можно использовать согласно настоящему изобретению только фрагмент ТПО, более конкретно - N-терминальный фрагмент.
Получение и характеристики ТПО и его вариантов были описаны, например, в патентных документах ЕР 1201246, WO95/21919, WO95/21920 и WO95/26746. Эти документы в полном объеме включены в данную работу посредством ссылок с целью раскрытия содержания изобретения. Действие ТПО на фетальные гепатоциты известно из исследований Е.Шмельцера (Е.Schmelzer: Optimierung der Kultur und Charakterisierung primarer embryonaler Hepatozyten der Ratte; диссертация, Геттинген, 2002).
В качестве вариантов ТПО можно использовать, например, описанные в публикации международной заявки WO95/21919 производные ТПО, или описанные в публикации международной заявки WO95/21920 аллельные варианты или видовые гомологи, или описанные в патентных документах WO95/26746 и ЕР 1201246 пегилированные ТПО, но не ограничиваясь этими вариантами. В качестве пегилированного ТПО в контексте настоящего изобретения понимают производные ТПО, которые связаны с органическим полимером, например полиэтиленгликолем, полипропиленгликолем или полиоксиалкиленом. Под другими вариантами ТПО понимают также такие производные ТПО, которые обладают идентичностью последовательности менее 100%, но, несмотря на это, сохраняют активность ТПО, предпочтительно - описанные в патентном документе ЕР 1201246. Обычно производные ТПО имеют последовательность, идентичную ТПО человека, по меньшей мере, на 70%, предпочтительно - по меньшей мере, на 75%, более предпочтительно - по меньшей мере, на 80%, и наиболее предпочтительно - по меньшей мере, на 85%, включая фрагменты, обладающие ТПО-активностью. Особо предпочтительной для задач настоящего изобретения ТПО-активностью является ускорение ТПО или его вариантами пролиферации, дифференцировки и/или созревания мегакариоцитов или предшественников мегакариоцитов в тромбоцитпродуцирующих формах этих клеток.
Согласно настоящему изобретению могут быть применены ЭПО и ТПО человека и животных. Так, например, ТПО человека гомологичен ТПО свиньи или мыши более чем на 70%.
В альтернативной форме осуществления изобретения можно вводить пациенту не сами гематопоэтические факторы роста, а факторы, которые индуцируют экспрессию факторов роста в травмированных тканях.
Так, например, в работе Nughton B.A. et al. (Age-related variations in hepatic regeneration and erythropoietin production in the rat. Am. J. Anat, июль 1977 г., 149(3):431-8) описано, что эритропоэтин образуется преимущественно в печени и селезенке в течение неонатальных фаз, и что при нефрэктомии феномен образования ЭПО в печени может снова усиливаться после гепатэктомии. Эта способность снижается с возрастом. Позже было установлено (Hepatic regeneration and erythropoietin production in the rat. Naughton B.A., Kaplan S.M., Roy M., Burdowski A.J., Gordon A.S., Piliero S.J. Science, 1977, Apr. 15; 196 (4287):301-2), что регенерирующая печень продуцирует эритропоэтин в ответ на гипоксию. Было обнаружено, что продукция ЭПО зависит от стадии регенерации печени, причем наибольшие концентрации были обнаружены в фазе наиболее интенсивного роста печени.
Dornfest et al. в 1981 г.описали (Recovery of an erythropoietin inducing factor from the regenerating rat liver. Dornfest B.S., Naughton B.A., Kolks G.A., Liu P., Piliero s.J., Gordon A.S. Ann. Clin. Lab. Sci., 1981 Jan-Feb, 1191):37-46), что печень является основным источником образования ЭПО-индуцирующего фактора. В случае нефрэктомии образование этого фактора в печени усиливается. Таким образом, можно обеспечить действие ЭПО согласно настоящему изобретению также опосредованно путем введения фактора, индуцирующего экспрессию ЭПО.
Эндогенную экспрессию ЭПО можно также обеспечить, например, посредством стимуляции секреции ЭПО среднедлительным или длительным введением гормона роста (ГР) (Sohmiya, M., Y. Kato. Effect of long-term administration of recombinant human growth hormone (rhGH) on the plasma erythropoietin (THJ) and haemoglobin levels in anaemic patients with adult GH deficiency. Clinical Endocrinology (2001)55, 749-754).
Конкретные концентрации факторов роста в растворе могут быть равны от приблизительно 1 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл, предпочтительно от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 50 нг/мл, особо предпочтительно от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 20 нг/мл. Однако в случае локального нанесения (местного применения) концентрации факторов роста могут также быть в несколько раз выше.
Гематопоэтические факторы роста можно успешно применять для культивирования культур тканей in vitro. При этом клетки культивируют в устройствах, специально предназначенных для культивирования тканей, с применением соответствующих способов, например на сетке с размером ячеек, равным 500 меш, которая обеспечивает постоянное образование новых дочерних агрегатов гепатоцитов. Особо предпочтительными in vitro являются комбинации ЭПО и гормона роста.
Более конкретно, можно использовать бесконтактные, управляемые автоматически или вручную насосные системы, которые представляют собой, например, плунжерные насосы, или создавать направленные потоки за счет сжатия шлангов магнитным полем или сжатым воздухом. В присутствии эндотелиальных клеток напряжение сдвига в перфузируемом биореакторе может привести к спонтанному образованию скоплений эндотелиальных клеток на поверхностях агрегата, что может быть полезным для дальнейшего применения.
Для инкапсулирования подходят известные специалисту в данной области материалы, в которые, например, встроены структурированные формы или пространства, которые обеспечивают возможность структурного роста или увеличения in situ. Альтернативно, капсулы могут быть устранены, и эндотелизация, а за счет этого - оптимальная гемосовместимость, могут быть обеспечены, например, в присутствии эндотелиальных клеток.
Введение ЭПО или ТПО согласно настоящему изобретению приводит, либо отдельно, либо, при больших структурных дефектах, в сочетании с опорными материалами, к биологическому замещению ткани. Эти материалы-носители могут быть заселены клетками in vitro или экстракорпорально, могут быть биологически моделируемыми (биодеградиеруемыми), и, в идеальном случае, микро- и макроструктурно и биохимически они должны быть как можно более сходными с замещаемой структурой. Биохимическая близость или идентичность включает в себя реконструкцию in vivo состава с применением коллагенов и белков матрикса (эластина, фибронектина и всех компонентов матрикса организма в известной форме, специфической для данной ткани).
Стволовые клетки могут быть получены из различных источников, имеющихся в организме пациента: из костного мозга, периферической крови, жировой ткани, самой ткани, пуповинной крови или ткани. Соответственно, могут быть получены аллогенные стволовые клетки, но они обладают иммунологическими недостатками. Можно использовать эмбриональные клетки, но они также обладают соответствующими недостатками.
В особо предпочтительной форме осуществления изобретения процесс структурированного роста культивируемых клеток можно индуцировать с помощью матрикса, покрытого факторами роста согласно настоящему изобретению. Для этого матрикс можно последовательно обработать одним или несколькими вышеназванными факторами роста.
Если речь идет о биологическом матриксе, то он обычно является имплантатом (стентом, пластырем или катетером), трансплантатом (например трансплантатом кожи), материалом-носителем для роста клеток, например так называемым медленно растворяющимся материалом (например гидрогелем на основе фибрина, и/или полимеров, например таких, как полилактиды или полигидроксиалканоаты, и/или альгинаты), материалом, заменяющим кость (например, трикальцийфосфатом) аллогенной, аутологичной или ксеногенной лишенной клеток или не лишенной клеток тканью (например, сердечным клапаном, венозным клапаном, артериальным клапаном, кожей, сосудом, аортой, сухожилием, роговицей, хрящом, костью, трахеей, нервом, мениском, межпозвоночным диском, мочеточником, уретрой или мочевым пузырем (см., например, ЕР 0989867 или ЕР 1172120)), или матриксом (например, матриксом из ламинина, коллагена IV и/или матригеля), или, предпочтительно, подпитывающим слоем, например, таким как подпитывающий слой коллагена I, 3T3 и/или MRC-5, или коллагеновым флисом.
Биологический матрикс предпочтительно заранее заселяют специфичными для данной ткани клетками, клетками-предшественниками, клетками костного мозга, периферической крови, жировой ткани и/или фиброзной ткани, например зрелыми клетками-предшественниками из костного мозга взрослых людей. Предварительное заселение приводит к тому, что процесс регенерации начинается уже in vitro, a после имплантации матрикса в организм время регенерации in vivo сокращается.
Используемые матриксы можно также дополнительно активировать. Активацию биологического матрикса или структуры-носителя можно осуществить, например, посредством плазменной ионизации, например с помощью перекиси водорода, или посредством лазерной активации.
Альтернативно, можно нанести покрытие из слоя биодеградирующего (био)полимерного материала, который содержит один или несколько вышеуказанных факторов роста. Подходящими для этого являются, например, фибрин, плазма, кровь, коллаген и/или полилактиды.
Способ согласно настоящему изобретению особенно хорошо подходит для зрелых клеток, то есть первично дифференцированных клеток, которые больше не имеют эмбрионального или фетального фенотипа. Он особенно хорошо подходит для зрелых клеток человека, например для зрелых прогениторных клеток, тканеспецифических клеток, предпочтительно - остеобластов, фибробластов, гепатоцитов и/или гладкомышечных клеток.
Кроме прекращения или снижения добавления вышеописанных факторов роста к культуре, для завершения процесса роста согласно настоящему изобретению также пригодны соматостатин, и/или TGF-бета (трансформирующий фактор роста бета), и/или простагландины.
Особенным преимуществом является то, что способы согласно настоящему изобретению можно использовать местно in vivo. Для этого можно нанести факторы роста, например, на поверхность резекции органа (например, печени). Их можно нанести на поверхность или локально или системно с помощью катетера. В случае резекции печени их можно альтернативно или дополнительно ввести до, во время или после вмешательства. Также можно инъецировать факторы роста (например, для стимуляции регенерации хряща) непосредственно в пораженную ткань или сустав. При этом факторы роста через синовиальную жидкость могут непосредственно воздействовать на образование новой структуры хряща.
В конкретной форме осуществления изобретения дополнительно к гематопоэтическим факторам роста можно вводить один или более из следующих факторов роста: «трансформирующий фактор роста бета» (TGF-бета), простагландины, гранулоцитарный (макрофагальный) колониестимулирующий фактор (G(M)-CSF), «рилизинг-фактор гормона роста» (GHRH), «тиреотропин-рилизинг-гормон» (TRH), «гонадотропин-рилизинг-гормон» (GnRH), «кортикотропин-рилизинг-гормон» (CRH), допамин, «антидиуретический гормон» (ADH), окситоцин, пролактин, адренокортикотропин, тропин бета-клеток, лутротропин и/или вазопрессин, или дополнительно вводить один или несколько факторов регенерации нервов, предпочтительно - «фактор роста нервов» (NGF), и/или один или несколько факторов регенерации сосудов, предпочтительно - «фактор роста сосудистого эндотелия» (VEGF) и/или «тромбоцитарный фактор роста» (PDGF).
Гематопоэтические факторы роста вводят парентерально в виде инъецируемых микросфер, распадающихся частиц, полимерных соединений (с полипептидом, полигликолевой кислотой), липосом и мелких частиц. Также можно использовать инъецируемые или имплантируемые устройства для введения лекарственных средств. Вещества можно также ввести посредством ингаляции, подкожной и внутримышечной инъекции или - в случае местного применения - ввести с помощью накожного пластыря.
Кроме того, можно смешать с пластырями вещества, которые вызывают местную гиперемию и за счет этого повышают проницаемость кожи (например, пчелиный яд). Гиперионные структуры с прямым соединением с ЭПО или без него или с покрытием из солей могут лучше транспортироваться через кожные барьеры и могут связываться с преимущественно положительно ионизированными структурами. Возможна также отрицательная ионизация. Факторы можно применять совместно с миндальным маслом или маслом жожоба для улучшения транспорта через слизистые оболочки в области кишечника или через кожу.
Для преодоления барьеров для транспорта (слизистой ротовой полости, желудка, кишечника, других слизистых оболочек, роговицы) возможно также связывание с полиэтиленгликолем (ПЭГ).
Известно, что из белков можно приготовить смешанные препараты. Возможны суспензии, гелевые эмульсии, твердые соединения, дегидратированные или лиофилизированные порошки. Факторы роста можно абсорбировать на частицах или инкапсулировать.
Особенно полезным может быть применение для регенерации тканей стволовых клеток (клеток-предшественников, в прямом смысле этих слов) совместно с ЭПО/ТПО, чтобы заметно ускорить пополнение клеток из 4 основных типов тканей для процесса регенерации. ЭПО/ТПО и другие вышеуказанные факторы можно наносить в виде смеси со стволовыми клетками и, например, фибриновым клеем в виде опорного матрикса. При необходимости можно устранить опорный матрикс или заменить его более структурированным и оформленным матриксом. Факторы можно также вводить системно или местно без какого-либо биологического опорного матрикса, например в виде водной суспензии.
Введение ЭПО согласно настоящему изобретению улучшает регенерацию тканей за счет тканеспецифического формирования стволовых клеток и дифференцировки после их размножения и интеграции и координирует рост основных типов тканей.
СВЕДЕНИЯ. ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
I. Области применения
1. Плоский эпителий
ЭПО применяется согласно настоящему изобретению для поддержки образования базальных мембран (внеклеточного опорного слоя, находящегося под эпителием). ЭПО поддерживает образование краевых областей сосочков.
ЭПО применяется согласно настоящему изобретению для поддержки образования железистого эпителия. ЭПО приводит к регенерации плоского кубического или цилиндрического эпителия (плоский эпителий пищевода, высокоцилиндрический эпителий семенных протоков, переходный эпителий мочевого пузыря).
Благодаря ЭПО в процессе структурного роста происходит повторное формирование десмосом, то есть «соединительных мостиков» между клетками и прилежащими структурами. Также происходит образование на эпителии так называемых микровилл, например в тонком кишечнике (придатках яичек, трахее).
ЭПО оказывает прямое воздействие на регенерацию однослойного плоского эпителия, эндотелиальной выстилки сосудов сердца, кровеносных и лимфатических сосудов и высокопризматического эпителия (желудок, тонкий и толстый кишечник, желчный пузырь, яйцеводы, матка). ЭПО применяется согласно настоящему изобретению для образования двуслойного эпителия (слюнные железы ротовой полости, носослезный канал, проток придатка яичка, семенные протоки). Также ЭПО применяется согласно настоящему изобретению для образования высокопризматического эпителия (полость носа, носоглотка, гортань, трахеобронхиальное дерево, уретра, евстахиева труба) и для образования неороговевающего и ороговевающего плоского эпителия. Структурирующий аспект регенерации паренхимы под действием ЭПО способствует образованию экзокринных желез. Сюда относятся, среди прочего, поджелудочная железа, железы эпителия тонкого кишечника (бокаловидные клетки, подчелюстная слюнная железа, островковые клетки, продуцирующие инсулин). ЭПО способствует также регенерации эндокринных желез.
2. Соединительная ткань
ЭПО может восстанавливать основные компоненты соединительной ткани в координации с окружающими структурами паренхимальных желез. Компонентами, на которые оказывается влияние, являются основное вещество (глюкозаминогликаны), координация с так называемыми плазматическими клетками, жировыми клетками, кровеносными сосудами и окружающими их гладкомышечными клетками, а также с клетками соединительной ткани, фибробластами, тучными клетками, коллагеновыми и эластиновыми волокнами и расположенными между ними макрофагами (а также с купферовскими клетками, Pit- и lto-клетками в печени) и клетками эндотелия капилляров. Капилляры содержат только выстилку, состоящую из эндотелиальных клеток.
Однако ЭПО оказывает и более широкое координирующее влияние на описываемую микросреду. Она при травматических повреждениях переходит в инициаторное состояние. ЭПО согласно настоящему изобретению можно вводить с терапевтической целью, если необходимо активировать эти инициаторные каскады после травматических повреждений. При этом ЭПО, как катализатор и системный и местный стимулятор регенерации тканей, поддерживает согласно настоящему изобретению иммуномодулирующий эффект, вызванный местно макрофагами, который включает в себя иммунологическую модуляцию и выделение интерлейкинов и цитокинов макрофагами в комбинации с плазматическими клетками. За счет этой способности к взаимодействию согласно настоящему изобретению обеспечивается высокая региональная селективность терапевтического введения ЭПО/ТПО в том месте, где существует в них потребность (травма, воспаление, аутоиммунное заболевание).
При терапевтическом применении согласно настоящему изобретению ЭПО координирует эту региональную иммуностимуляцию с системной эндогенной реакцией. За счет этого в качестве терапевтического действия ЭПО стимулирует возникновение воспалительной реакции, а именно ускоряет каскадные реакции. Он увеличивает высвобождение эндогенных гормонов роста и при этом регулирует также потенциальную возможность их побочных эффектов. За счет этого устраняется необходимость системного введения гормонов роста и их неконтролируемое воздействие, связанное с потенциальной канцерогенностью в ходе физиологического действия.
Согласно настоящему изобретению могут быть восстановлены структуры соединительной ткани. Сюда относятся коллагеновые волокна, ретикулярные волокна, например лимфатические узлы, эластиновые волокна и образование основного вещества (протеогликанов, глюкозаминогликанов, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дерматансульфата, кератансульфата, гепарансульфата, гепарина). Модулируемыми клетками соединительной ткани являются фибробласты, ретикулярные клетки, особенно в лимфатических тканях и органах, мезенхимальные клетки, жировые клетки, моноциты и макрофаги. Известно, что моноциты могут дифференцироваться в макрофаги. ЭПО может усиливать макрофагальную защиту при воспалении и при воспалительных реакциях в отношении последующего и необходимого восстановления ткани и 3D-регенерации.
Также ЭПО координирует хемотактические функции макрофагов. Местные моноциты, находящиеся в соединительной ткани, благодаря ЭПО могут включаться в тканевое пополнение, что позволяет им оказывать прямое влияние на системные и местные клетки-предшественники и локальное восстановление ткани.
ЭПО координирует функцию ретикулоэндотелиальной системы (RES). Она представляет собой сеть ретикулярных волокон и включает в себя эндотелиальные клетки печени, селезенки и костного мозга. Кроме того, ЭПО координирует активность лимфоцитов, плазматических клеток, макрофагов и - посредством иммуномодуляции - активность тучных клеток.
После травматических процессов ЭПО объединяет по существу известные индивидуальные функции этих клеток с образованием структуры и региоселективной регенерацией тканей. Затем, за счет эффектов обратных связей, затухают воспалительные реакции и аутоиммунные процессы, которые также могут быть опосредованы через образование антител. При этом ЭПО используется согласно настоящему изобретению с терапевтической целью как лекарственный препарат.
В ходе регенерации тканей происходит образование структур соединительной ткани, и образуются рыхлые соединительнотканные структуры (в подкожной клетчатке кожи, в полых органах, в неспециализированной соединительной ткани). ЭПО приводит к образованию соединительной ткани (неупорядоченной и упорядоченной соединительной ткани, образованию связок, фасций, сухожилий) и к координации между упругими структурами и их объединению в трехмерную сеть, которая смешана тканеспецифическим образом или представлена желатинообразным веществом.
ЭПО способствует образованию ретикулярных клеток, которые, в частности, восстанавливают ретикулярную соединительную ткань. ЭПО поддерживает образование жировой ткани и относящихся к ней предшественников за счет пополнения и применения функций ЭПО, влияющих на размножение клеток.
Введение ЭПО согласно настоящему изобретению улучшает опорные функции и передачу сил через эти компоненты соединительной ткани. Происходит улучшение обмена веществ, так как соединительная ткань содержит кровеносные сосуды. Происходит улучшение накопительных функций структур соединительной ткани с накоплением липидов, глюкозаминогликанов. ЭПО оказывает лечебное действие, улучшая функцию водного и электролитного обмена.
Благодаря ЭПО происходит улучшение защитной функции, так как восстанавливаются механические барьеры для патогенных возбудителей болезней. После воспаления начинаются репаративные процессы, то есть восстанавливаются структуры тканей. Согласно настоящему изобретению ЭПО поддерживает регенерацию паренхимы и структурную регенерацию.
Это следует рассматривать как отличие от образования грануляционных тканей (которые характерны для так называемого заживления ран), которое, с точки зрения заживления ран, приводит только к появлению заместительных тканей и, за счет этого, только к заместительным функциям. Под этим понимают образование рубцовых тканей и рыхлых фиброзных тканей, которые могут обеспечить закрытие дефекта, но связаны с большими потерями функциональности. Согласно настоящему изобретению ЭПО в данном случае обеспечивает структурообразующий процесс восстановления исходной ткани. При особенно больших дефектах можно также поддержать и стимулировать (морфологически и функционально) структурообразующий процесс за счет комбинаций покровных материалов. Это имеет большое значение для тканевого инжиниринга, так как любые опорные материалы, примененные для интеграции (например, опорные материалы для сосудов, сердечные клапаны, трансплантаты) можно комбинировать с ЭПО. На постоянные имплантаты (не биоразлагаемые материалы) можно нанести покрытие для лучшей интеграции в ткань (например, в случае металлических и керамических протезов).
3. Кровеносные сосуды и система лимфообращения
ЭПО приводит к образованию новой системы кровеносных сосудов и к образованию крупных сосудов, а не только капилляров, как было известно ранее. К структурам крупных сосудов относятся также вены и артерии (большого и малого кругов кровообращения).
Кроме того, ЭПО облегчают регенеративные процессы в тканевых структурах, относящихся к системе лимфообращения, в самих лимфатических сосудах. Восстановление за счет ЭПО-интеграции относится не только к tunica intima (внутренней оболочке), эндотелию, но и, прежде всего, к tunica media (средней оболочке), которая состоит из соединительной ткани и мышечных клеток. А также к tunica externa (наружной оболочке), которая образует продольный слой соединительной ткани. При образовании сосудов важны различные типы артерий. Так, существуют артерии эластического мышечного типа строения и различные структуры соединительной ткани, образование которых индуцируется совместно в ходе регенеративных процессов, а именно - внутренней эластической мембраны (membrana elastica interna) и наружной эластической мембраны (membrana elastica externa), а также образование вазовазальных сосудов. При этом в слои стенок интегрируются жировые клетки. В случае артерий эластического типа строения ЭПО способствует регенерации внутренней эластической мембраны и наружной оболочки с вазовазальными сосудами. В случае артерий мышечного типа строения с поперечником от 0,1 до 7 мм ЭПО способствует быстрому образованию гладких мышц в средней оболочке (tunica media). Кроме того, ЭПО способствует образованию субэндотелиального слоя соединительной ткани. Происходит восстановление типичных форм строения, таких как внутренняя оболочка, известная до сих пор как компонент, состоящий из эндотелиальных клеток, и, прежде всего, внутренней эластической мембраны, мышечных клеток, средней оболочки, эластической мембраны и наружной оболочки. Также за счет терапевтического введения ЭПО обеспечиваются пространственные геометрические образования, например образование мышечных венул в области сопутствующих венул со специфическим геометрическим расположением соседних структур.
Речь идет не о двумерных процессах соединения со стимуляцией образования конгломерата, а о процессах образования специфических трехмерных структур. ЭПО и ТПО согласно настоящему изобретению не эквивалентны уже известным факторам пролиферации, то есть классическим факторам роста; они действуют скорее как «факторы трехмерной регенерации».
Аналогичные результаты обнаруживаются при стимуляции ЭПО образования вен с образованием внутренней оболочки, средней оболочки и адвентициальной оболочки (tunica adventitia). Кроме того, может быть регенерирована структура венозных клапанов с их геометрической формой, особенно - в комбинации с опорными материалами, или обеспечено закрытие повреждения, если оно возможно на значительной площади сосудов после травматических повреждений и дегенеративных процессов.
В случае дефектов относительно большого объема при определенных условиях могут быть также имплантированы материалы-носители, так что действие ЭПО фокусируется на процессах коррекции и интеграции в организм как в целое. При полных регенеративных процессах, прежде всего - в случае паренхиматозных структур, эти сосуды образуются одновременно.
Нет ограничения в отношении различных сосудистых структур, например артериовенозных анастомозов. В частности, в сочетании с терапевтическим введением ЭПО могут быть исправлены изменения сосудов, обусловленные старением, и дегенеративные структуры. В процессе старения образуются продольные гладкомышечные структуры. Дегенеративные процессы подразумевают активность в отношении образования новых структур в соответствии с принципом построения тканевых структур. Они могут встраиваться в тканевые структуры в качестве сосудов, образованных de novo, и не являются первично патологически измененными.
Посредством введения ЭПО согласно настоящему изобретению можно моделировать воспалительные реакции. При введении ЭПО возникают регенеративные процессы в области эндокарда и миокарда. Эпикард - это листок перикарда, который начинает регенерировать после введения ЭПО. Париетальный листок перикарда - это слизистая мембрана, которая состоит из слоя мезотелиальных клеток, расположенного на слое соединительной ткани. В области сердца регенерация клапанов сердца и сухожильных нитей сердца (chordae tendinae) происходит, прежде всего, в том случае, если вспомогательные структурные средства (носители) доставляются в комбинации с заселением стволовыми клетками и введением ЭПО. Может происходить восстановление системы проведения возбуждения после регионального повреждения. Сюда относятся также волокна Пуркинье (Purkinje fibres), а также атриовентрикулярные узлы, которые также могут быть восстановлены. Дополнительно могут быть скомбинированы между собой лимфатические сосуды, нервы, сердечные сплетения, структуры коронарных артерий.
Образование лимфатических сосудов и лимфатических капилляров осуществляется при введении ЭПО в соответствии с нормальной формой собирательных сосудов (внутренняя оболочка, средняя оболочка и адвентициальная оболочка). Регенеративные процессы могут затрагивать также область грудного протока (ductus thoraticus).
Клапаны и собирательные сосуды представляют собой складки, которые сходным образом интегрируются при процессах структурного роста. В случае системы кровеносных сосудов происходит активация ангиопластов, которые частично получаются из периферических, а частично - из региональных предшественников. Первоначально происходит закладка капилляров, которые состоят из эндотелиальных клеточных структур. Однако в области применения ЭПО важно, что может быть инициирован структурный рост, при котором впоследствии образуются мышечные структуры и структуры соединительной ткани.
Система проведения возбуждения играет большую роль в координации действия ЭПО, так как она обеспечивает взаимодействия с модулирующими клетками и узлами.
К клеткам иммунной системы относятся лимфоциты, макрофаги, плазматические клетки, стволовые клетки. Сетчатая структура ретикулярной соединительной ткани объединяет клетки иммунного аппарата в иммунную систему. Благодаря введению ЭПО происходит ускоренное восстановление ретикулярной соединительной ткани, ретикулярных клеток и ретикулярных волокон. Также могут восстанавливаться структуры тимуса. С гистологической точки зрения там могут восстанавливаться корковые и мозговые структуры. Введение ЭПО также приводит к гистологической регенерации лимфатических сосудов, которые, в свою очередь, способны формировать промежуточный синус, медуллярный синус, краевой синус, капсулярные и соединительнотканные перегородки, а также отводящие лимфатические сосуды, лимфатические узлы или мякотные шнуры.
После завершения процесса восстановления и координированного объединения гистологическая организация соответствует обычной структуре с капсулярными и соединительнотканными перегородками, корневой соединительной тканью, приносящими/отводящими лимфатическими сосудами, лимфатическими узлами, мякотными шнурами и отводящими лимфатическими сосудами.
Процессы регенерации могут также приводить к восстановлению нормальной капсулы, дольковой структуры и ворот селезенки. Кроме того, в млечных тяжах обнаруживаются мальпигиевы тельца синусных пластин селезенки для восстановления белой пульпы. Восстанавливается кровообращение селезенки, при этом артерии селезенки, вены синусов селезенки и вены пульпы соединяются между собой. Восстанавливаются белая пульпа и связи лимфатических слоев.
При введении ЭПО после повреждений происходит трехмерное взаимодействие базальных мембран, ретикулярных клеток, ретикулярных волокон и эритроцитов. Образуются открытые и закрытые системы циркуляции. При этом взаимодействие с макрофагами, которые могут образовываться из клеток костного мозга, имеет значение для инициации эндогенных каскадов внутри организма и опосредования медиаторами роста (гормонами роста).
4. Кожа/дерма
Репаративные процессы после ожогов, травм, ожогов кипящей жидкостью или паром, механических повреждений или воспалений в области кожи очень разнообразны. Благодаря введению ЭПО или ТПО можно добиться регенерации с образованием заместительных структур или без их образования.
Более конкретно, при хронических заболеваниях, нарушениях кровообращения, диабетических язвах и явлениях иммунологической природы ЭПО может оказать моделирующее действие. С гистологической точки зрения, происходит восстановление нормального эпидермиса, дермы и подкожной клетчатки, которая обеспечивает соответствующую васкуляризацию с образованием макроструктур. На ладонях рук и подошвах ног происходит образование базального слоя эпидермиса (stratum basale), зернистого слоя эпидермиса (stratum granulosum), блестящего слоя эпидермиса (stratum lucidum), наружного (рогового) слоя эпидермиса (stratum corneum). В дерме и на внешней поверхности происходит образование сосочков дермы. На эпидермисе (на внутренней поверхности) восстанавливаются соответствующие углубления эпидермиса. Кроме того, поддерживаются придатки кожи и их образование из клеток-предшественников. До сих пор при тканевом инжиниринге кожи существовала проблема соединения структурного восстановления с образованием придатков кожи.
При введении ЭПО могут быть обеспечены процессы взаимодействия в области меланоцитарной системы человека. Учитываются физиологические процессы обратной связи между глазами, корой мозга и образованием пигментации, так как в данном случае речь идет не об изолированных соединениях клеток, а о продуктах регенерации, типичных для органов.
Репаративные процессы дермальной части охватывают мышечные структуры (musculus erector pili), тактильные структуры, наружные влагалища корней волос, внутренние влагалища корней волос и структуры волосяных луковиц. При определенных обстоятельствах они проецируются в жировую ткань. В случае волос и волосяных фолликулов происходит образование соединительнотканных влагалищ корней волос, которые являются важными функциональными структурами для регенерации. Из них образуется стекловидная оболочка, наружное влагалище корня волоса, внутреннее влагалище корня волоса и, наконец, волос. Аналогичные процессы могут поддерживаться и изменяться в области регенерации ногтей. Внутри тканевых структур образуются также потовые железы. В структурах кожи заново образуются перифолликулярные сетчатые структуры, сети, субкапиллярные артериальные сети, терминальные венозные сети.
5. Пищеварительная система
Введение ЭПО способствует восстановлению самого внутреннего слоя слизистой оболочки (tunica mucosa) и соединительнотканного слоя, так называемой lamina propria (собственная пластинка слизистой оболочки). Самый глубокий слой образует слой гладких мышц - мышечная пластинка слизистой оболочки кишки (lamina muskularis mucosae). Структура слоев является следующей: серозные клетки, затем мышечный слой, подслизистая и слизистая оболочки. Через эти структуры проходят пищеварительные железы, а в слизистой оболочке находятся железы слизистой оболочки. Дополнительно регенерируют железы подслизистой оболочки, мышечно-кишечное нервное сплетение (сплетение Ауэрбаха) и подслизистое нервное сплетение (сплетение Мейсснера). В области языка регенерируют листовидные сосочки. В ротовой полости в области регенерации тканей также регенерируются вкусовые сосочки языка. Они состоят из базальных клеток типа 4, опорных клеток типа 1, рецепторных клеток типа 3, гликопротеинов и вкусовых пор. Серомукозная (щечная) слюнная железа состоит из исчерченного протока, вставочного протока, слизистого концевого отдела, базальной мембраны, миоэпителиальных корзинчатых клеток и серозного концевого отдела. Важные репаративные процессы могут происходить при пародонтозе в области зубов. Например, это относится к структурам периодонта, связанным с альвеолярной костью и каналом корня зуба с верхушкой корня зуба. Репаративные процессы могут быть вызваны посредством добавления заселенных стволовыми клетками кальцийфосфатных структур или других минеральных заместительных материалов с покрытием из ЭПО. Процесс регенерации, поддержанный ЭПО, происходит в области кист в гайморовых пазухах, нижнечелюстных структур, после удаления корней зубов и локального восстановления этих структур in vivo.
Соответствующие материалы и одонтобласты также могут быть получены in vitro при введении ЭПО.
Остеохондральные структуры, например такие как остеохондральный цилиндр, могут быть получены in vitro и имплантированы in vivo после стимуляции регенеративного роста введением ЭПО. Образованию структур каналов корней зубов с новой иннервацией способствуют вводимые направляющие структуры с покрытием из ЭПО. Здесь помогают молекулы внеклеточного матрикса, которые могут быть также применены в процессах нанесения покрытия в качестве белковых структур. Может быть поддержан процесс роста эмалевых структур совместно с одонтопластами пульпы (эмали-дентина-пульпы) после повреждений и травматических процессов. Репаративные и регенеративные процессы фокусируются на области окружающей соединительной ткани и на интеграции структуры зуба или имплантата в область челюсти. Соединительная ткань пульпы и образование кровеносных сосудов, которые входят и выходят через верхушку канала корня, играют большую роль в развитии иннервации. Так регенерирует периодонт (надкостница зуба). Шарпеевы волокна пронизывают надкостницу и крепятся в цементе или альвеолярной кости.
ЭПО приводит к регенеративным процессам в этой области после воспалений и травматических реакций. В области десен введение ЭПО при воспалении при пародонтозе приводит к улучшению репаративных процессов.
Глотка:
Регенеративные процессы после введения ЭПО могут также распространяться на область глотки посредством восстановления многослойного плазматического эпителия. И в этом случае могут координировано восстанавливаться мышечная оболочка (tunica muscularis) и адвентициальная оболочка (tunica adventitia}. В лимфоцитарных структурах в миндалинах восстанавливаются структуры крипт и структуры капсул. Регенеративные процессы могут также способствовать региоселективной регенерации воспаленных структур, например при тонзиллите.
Туловище/кишечник:
В области кишечника имеются эпителиальные компоненты с высокой способностью к регенерации, которые способны обновляться в течение 24-48 часов. При воспалительных реакциях эта репаративная активность нарушается, так что поддерживающее действие ЭПО/ТПО может в данном случае стимулировать компенсаторную реакцию организма. За счет этого происходит повторное образование эпителиальных структур, таких как собственная пластинка слизистой оболочки (lamina propria), слизистая оболочка (tunica mucosa), мышечная пластинка слизистой оболочки кишки (lamina muscularis mucosae), подслизистая оболочка (tunica submucosa), кольцевые мышцы, мышечная оболочка (tunica muscularis), продольные мышцы и адвентициальная оболочка (tunica adventitia), которое происходит во всей стенке кишечника в качестве репаративного процесса, так что стимулируется селективная поверхностная, интрамуральная и глубокая регенерация кишечной стенки. Эти принципы могут распространяться на всю область желудочно-кишечного тракта, начиная от глотки, рта и пищевода и заканчивая прямой кишкой. В пищеводе могут регенерировать мышечная пластинка слизистой оболочки кишки (lamina muscularis mucosae), собственная пластинка слизистой оболочки (lamina propria) и многослойный чешуйчатый эпителий. Серозные структуры интегрируются и восстанавливаются после введения ЭПО.
Возможна реконструкция стенки желудка, более конкретно - зоны желудочных полей (areae gastricae), с желудочными ямками, желудочными железами, мышечной пластинкой слизистой оболочки кишки, мезотелием на наружной стороне, субсерозной соединительной тканью, мышечной оболочки, подслизистой оболочки и слизистой оболочки. В структурах регенерируют париетальные клетки, желудочные железы, основные клетки, собственная пластинка слизистой оболочки, мышечная пластинка слизистой оболочки кишки и слизистая оболочка, а также поверхностный эпителий. Регенеративные процессы, включая в области клеток железистой зоны дна желудка, включают также повторное образование основных клеток. Обеспечивается связь с париетальными клетками. Стимуляция, обеспечиваемая ЭПО согласно настоящему изобретению, включает в себя также регенерацию клеток, выделяющих вазоактивные вещества, например полипептиды, и образование энтерохромаффинных клеток (ЭХК), которые выделяют серотонин. Могут регенерировать желудочные железы. Известно, что поверхностный эпителий желудка может обновляться за три дня. При сильных травматических и воспалительных повреждениях и нарушениях регенерации введение ЭПО помогает восстановить эту способность к регенерации. В области тонкого кишечника происходит восстановление собственной пластинки слизистой оболочки, мышечная пластинка слизистой оболочки кишки, солитарных лимфатических фолликулов, подслизистой оболочки, кольцевой мускулатуры, продольной мускулатуры, серозной оболочки (tunica serosa). В структурах снова образуются кишечные ворсинки, а также солитарные лимфатические узлы и складки Керкринга (Kerkring′s folds). Также восстанавливаются крипты. Крипты содержат так называемые клетки Панета (Paneth′s cells). Они могут образовывать секрет, который выделяется в основание желез. В собственной пластинке слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки расположены пейеровы бляшки (Peyer′s patches). В концевых отделах бруннеровских желез (Brunner′s glands) после вызванной ЭПО регенерации обнаруживаются характерные мукозные клетки со светлой цитоплазмой и плоским клеточным ядром, расположенным в основании клетки. Важную роль играет регенерация толстого кишечника после введения ЭПО, в частности - после хирургических резекций.
6. Скелет
ЭПО вызывает регенерацию тканей скелета, которые можно подразделить на плотную коллагеновую соединительную ткань, хрящевую ткань и костную ткань. В случае хондроцитов ЭПО стимулирует образование межклеточных веществ и вызывает функциональные улучшения структуры хондроцитов. ЭПО поддерживает образование зон роста и образование перикондиума (окружающей соединительнотканной структуры, за исключением суставов) после травматических воздействий. У взрослых, как известно, хондроциты больше не могут размножаться, так что способность перикондиума образовывать хрящи ограничена периодом роста, предшествующим взрослому возрасту. Посредством введения ЭПО можно оказывать терапевтическое влияние на эти регенеративные процессы и препятствовать образованию соединительнотканных клеток как материала, заполняющего дефекты, которое происходит в противном случае. В некоторых случаях при этом могут играть роль пластические процессы, то есть преобразование фибробластов и хондроцитов в ходе пополнения, вызванного введением ЭПО. С терапевтической целью ЭПО используют для регенерации хрящевых структур, например гиалиновых хрящей в области суставных поверхностей, гортани, трахеи, бронхов и фрагменты скелета носа. Согласно настоящему изобретению ЭПО стимулирует образование хрящевых капсул и образование протеогликана/коллагена. Согласно настоящему изобретению, возможна комбинация ЭПО со стволовыми клетками. Однако ЭПО используют и изолированно для регенерации эластического хряща, который локализован, например, в области надгортанного хряща. Сюда относятся также хрящи наружного уха и евстахиевой трубы. ЭПО используют согласно настоящему изобретению для восстановления волокнистого хряща в области соединений суставов. Сюда относятся регенеративные процессы в области межпозвоночных дисков, внутрисуставных отростков, дисков и менисков. В организме взрослого человека согласно настоящему изобретению можно восстановить регенеративные изменения в хрящах, которые к этому времени утрачены; могут снова начаться регенерация, реконструкция и синтез протеогликанов/коллагена в хондроцитах. Можно предотвратить кальцификацию хряща в нежелательных точках.
Согласно настоящему изобретению ЭПО в терапевтических областях приводит к координированной 3-мерной регенерации костной ткани как законченной структуры, включая регенерацию сосудов. При относительно больших дефектах можно ввести замещающие структуры, состоящие из неорганических или биологических опорных материалов. Можно использовать комбинацию фазово-чистого трикальцийфосфата и покрытия из ЭПО.
Альтернативно, можно использовать гидроксилапатиты или биологические кости алогенного или ксеногенного происхождения после соответствующей обработки. Согласно настоящему изобретению, введение ЭПО действует на надкостницу (периост) и внутреннюю надкостницу (эндост), и приводит к пополнению и размножению расположенных здесь предшественников. Затем происходит образование костных пластинок, остеоцитов и соответствующих лакун и канальцев. Согласно настоящему изобретению ЭПО используют для регенерации костей, и при этом происходи образование гаверсовых каналов, костных канальцев интерстициальных пластинок, лакун, концентрических пластинок, что способствует отграничению и соединению системы смежных костных пластинок. Неожиданно были обнаружены каналы Фолькмана (Volkmann′s canals) как костные пути для кровеносных сосудов. ЭПО стимулирует индукцию остеопредшественников, остеобластов, остеоцитов и остеокластов. В остеобластах ЭПО вызывает неосинтез и индукцию межклеточных веществ кости. Образование ткани включает в себя образование костно-специфических клеток. ЭПО стимулирует образование костных каналов и костных балок и интеграцию сосудистых соединительнотканных структур. После повреждений, например несчастных случаев, травм, а также воспалительных реакций, ЭПО может выполнять задачи, связанные с координацией восстановления тканевых структур, так что возникают зоны разрушения хрящей, зоны новообразования костей с зонами кальцификации хряща, зоны гипертрофии хондроцитов, зоны деления (столбики, хрящи и резервные зоны хряща (высокий хрящ)).
Согласно настоящему изобретению ЭПО стимулирует васкулогенез также и в области кости, более конкретно - образование питающих артерий, метафизарных сосудов и эпифизарных сосудов. Кроме того, в соответствии с местоположением интегрируются сосуды надкостницы.
ЭПО способствует образованию студенистого ядра (nucleus pulposus) и студенистого кольца (annulus pulposus), а также гиалинового хряща в области межпозвоночных дисков. В структурах суставов стимулируется образование наружных связок, внутренних связок и укрепляющих связок суставных капсул. Сюда входят также процессы восстановления синовиальной мембраны. Согласно настоящему изобретению после воспалительных реакций ЭПО стимулирует восстановление гладкой мускулатуры, поперечно-полосатой мускулатуры и миокардиальной ткани.
7. Гладкая мускулатура
ЭПО стимулирует гистогенез гладкой мускулатуры, а именно - образование и дифференциацию миобластов из мезенхимальных клеток. В скелетных мышцах ЭПО способствует образованию перемизия и эндомизия. ЭПО осуществляет интеграцию и координацию врастания двигательных нервных волокон и образование двигательных концевых пластинок. ЭПО стимулирует гистогенез сердечной мышцы. Сердечная мышца в норме не обладает способностью к регенерации или обладает очень малой способностью к регенерации. Согласно настоящему изобретению ЭПО используют для тканевой регенерации структур гладкомышечных клеток, скелетных мышц и ткани сердечной мышцы и для обеспечения иммуномодуляторного действия затухания за счет обратной связи. Это имеет значение для лечения воспалительных аутоиммунных заболеваний мышц.
8. Нервная ткань
В трехмерной регенерации тканей большую роль играет связь с нервными системами и инновационными процессами. Согласно настоящему изобретению ЭПО используют для координации васкулогенеза с нейрогенезом и для включения этих структур в обновление паренхимальных желез, тканей и органов. Это приводит к восстановлению синаптических контактов, образованию нейронов в виде поперечных и вертикальных единиц и к образованию нервных волокон и нервных путей. Образуются соединительные структуры в области ганглиозных сплетений. В процесс вовлекаются черепные и мозговые нервы, спинномозговые нервы регенерируются после рассечений, а двигательные (моторные) и афферентные (сенсорные) структуры снова соединяются. В качестве поддержки можно использовать направляющие для нервов, которые могут состоять из биополимеров (биодеградируемых или небиодеградируемых (силикон, полиуретан)) или могут иметь биологическое или синтетическое происхождение (например, коллаген, эластины, фибронектины, полилактиды, полигидроксибутираты, шелк), и которые могут быть применены в комбинации со стволовыми клетками. Стволовые клетки могут иметь мезенхимальное происхождение. Однако они могут также быть получены прямо из тканевых структур нейрональных структур, причем речь идет не о предотвращении апоптоза, а об инициации роста нервных волокон и размножении с образованием ориентированной трехмерной структуры.
Важным эффектом действия ЭПО является тканевая регенерация в области соединительнотканных структур центральной нервной системы, более конкретно - мозговых оболочек и сопровождающих их сосудов. Это действие является очень важным для регенерации ганглиев и органов чувств. Согласно настоящему изобретению обеспечивается возможность образования аксональных структур и образование аксонов. После образования поперечных связей восстанавливаются электрофизиологическая активность и аксональный транспорт. Эти процессы могут поддерживаться комбинированным введением вместе с витаминами, например с витамином С. Однако важным является действие согласно настоящему изобретению направленное на регенерацию тканей с взаимосвязью между активацией местных плазматических клеток, макрофагов, лимфоцитов, при определенных обстоятельствах - тучных клеток, которое приводит к пополнению клеток и репаративным процессам (после терапевтического введения ЭПО). В центральной нервной системе ЭПО также может быть применен согласно настоящему изобретению для регенерации в области дегенерированных структур. Сюда относятся болезнь Паркинсона и дегенерация в области полосатого тела, а также болезнь Альцгеймера и амиотрофический латеральный склероз, который также иррадиирует на периферию, рассеянный склероз и депрессии органической природы. При таких заболеваниях важно лечение стимуляторами воспаления, чтобы могли быть запущены активационные каскады, опосредуемые ЭПО. Терапевтический эффект стереотаксической имплантации мезенхимальных предшественников и клеток-предшественников нейронов и применения местных предшественников региональных и периферических моноцитов может быть усилен ЭПО и привести к регенерации. Целью является образование новых нейрональных клеток центральной нервной системы. Согласно настоящему изобретению затем клетки начинают функционировать с образованием нейроактивных пептидов и эндорфинов, а также, например, серотонина, допамина, норадреналина, ацетилхолина. Клетки снова соединяются за счет синаптических процессов. Сопутствующими функциями регенерации является вовлечение в этот процесс также ненейрональных клеток ЦНС, например протоплазматических астроцитов, фибриллярных астроцитов, олигодендроцитов, микроглии (глиобластов) и эпендимы. Нервная ткань образуется под влиянием ЭПО в ходе регенерации не только нейронов, но также и сопутствующей опорной клеточной структуры - так называемой нейроглии. Клетки нейроглии превышают по количеству нейрональные клетки примерно в 10 раз. Они образуют соединительнотканный каркас ЦНС и содержат кровеносные сосуды. Это является важным регенеративным компонентом реконструкции структуры. Под эпендимой понимают эпителиальную выстилку внутренних поверхностей желудочков ЦНС.
Согласно настоящему изобретению ЭПО приводит к регенерации оболочек аксонов, так называемых шванновских оболочек (Schwann′s sheath). ЭПО способствует образованию миелиновых оболочек (медуллярных оболочек). В ЦНС миелиновые оболочки образуют олигодендроциты. Это особенно важно при терапии нарушений образования миелиновых оболочек. В периферических нервах происходит стимуляция сопутствующих клеток к образованию оболочек ганглиев. В области процесса регенерации ЭПО также стимулирует шванновские клетки (Schwann′s cells), что приводит к образованию новых периферических нервов. При этом происходит образование перехватов между миелиновыми сегментами.
Согласно настоящему изобретению ЭПО способствует образованию серого и белого вещества и его тканеспецифической дифференциации в ЦНС. ЭПО поддерживает образование ганглиев (скоплений нервных клеток за пределами ЦНС). После травматических ситуаций происходит регенерация этих структур. Регенеративные процессы, происходящие в области регенерации, через модулирование ЭПО приводят к неоиннервации, причем неоиннервация происходит как репаративный процесс, начинающийся от слезной железы, подчелюстной слюнной железы, подъязычной слюнной железы и околоушной слюнной железы, сердца, гортани, трахеи, бронхов, легких, желудка, тонкого кишечника, кровеносных сосудов брюшной полости и других кровеносных сосудов, печени, желчного пузыря, желчных протоков, поджелудочной железы, мозгового вещества надпочечников, толстого кишечника, прямой кишки, почек, мочевого пузыря и гениталий. Репаративные процессы возникают в области симпатического ствола и симпатического ганглия (ramus communicans album и ramus communicans griseus, nervus splanchnicus, ganglium coeliacum и Ganglium mesentericum superius). В результате регенеративных процессов нервные окончания могут также встраиваться в структуры многослойного плоского эпителия.
Гистологически в чувствительных структурах восстанавливаются структуры колб Краузе, инкапсулированных нервных окончаний и так называемых телец Пачини (Pacini′s corpuscles). ЭПО поддерживает образование твердой мозговой оболочки, структура которой, в свою очередь, содержит направляющие соединительнотканные структуры для кровеносных сосудов чувствительных нервов. В результате этого происходит образование субдуральной полости (образование твердой оболочки спинного мозга) и эпидуральной полости. Твердая оболочка головного мозга прикрепляется к костям черепа и реконструируется при стимуляции ЭПО в ходе процесса регенерации. Паутинная оболочка продолжается в субарахноидальную полость. Регенеративные процессы, опосредованные ЭПО, также стимулируют восстановление субарахноидального пространства и лептоменинкса. При этом могут устанавливаться связи с периваскуляным пространством (пространством Вирхова, Virchow′s cavity). ЭПО приводит к восстановлению тонкого слоя соединительной ткани, которая покрывает поверхность головного и спинного мозга. Происходит регенерация венозных синусов в области вилл паутинной оболочки. Более конкретно, регенерируются Plexus chorioidius и желудочки мозга. При воспалительных процессах введение ЭПО согласно настоящему изобретению приводит к восстановлению гематоэнцефалического барьера за счет структурной регенерации тканей.
Функциональное значение этой регенерации, которая распространяется на всю ткань мозга, включая продолговатый мозг и исключая нейрогипофиз, имеет большое значение для гомеостаза в ЦНС. Барьер восстанавливается за счет астроцитов при введении ЭПО.
Гистогенез нервной системы под действием ЭПО
После травмы в области центральных нервов и дегенеративных процессов нарушаются взаимодействия между глиальными клетками, олигодендроцитами, нейронами субдуральным пространством и кровеносными сосудами. Эти пространственные связи и находящиеся здесь сопутствующие клетки принимают физиологическое участие в гистогенезе. Тем не менее, в случае травмы возникают проблемы с заживлением, поскольку нервная ткань взрослых людей не способна к регенерации в желательном объеме. Посредством введения ЭПО согласно настоящему изобретению можно ускорить этот процесс, идущий в направлении регенерации, и добиться восстановления структур за счет связи структурных компонентов с паренхимальными компонентами. В ходе эмбрионального развития эта стадия протекает в соответствии со строго определенным временным графиком. ЕПО в ЦНС является структурой-посредником в сочетании, например, с фактором роста нервов (NGF). Плохая способность ЦНС к регенерации у взрослого организма компенсируется при введении ЭПО за счет того, что может происходить пополнение местных клеток, иммуномодулирующих клеток, клеток-«мусорщиков» (макрофагов) и стволовых клеток. Стволовые клетки (например, аутологичные СD45-позитивные клетки периферической крови, мезенхимные стволовые клетки, клетки из жировой ткани, из пуповинной ткани) можно сочетать с другими стволовыми клетками. Применение аутологичной ткани предпочтительнее применения аллогенных клеток (например, эмбриональных клеток), действие которых следует отличать от действия ЭПО по иммунологическим причинам, но не следует исключать.
В сочетании со стереотаксическими операциями или инфузиями можно расположить клетки-предшественники в определенном месте. Разорванные или поврежденные периферические нервные волокна могут быть направлены в желаемую область посредством введения ЭПО в сочетании с направляющими структурами, направляющими проводниками или местными биологическими структурами (из непосредственного окружения), например в сочетании с фибриновыми структурами. Структуры фибробластов можно также включить в другие области с помощью стволовых клеток и ЭПО. Альтернативно, можно вводить также молекулы биологического матрикса на основе коллагенов или эластинов в рекомбинантной форме или состоящие из пептидных последовательностей в виде смесей, позволяющих получить растворы для инъекций, действие которых может быть опосредовано введением ЭПО. Параллельно регенерацию можно также поддерживать системно посредством введения ЭПО. Без введения ЭПО и поддержки стволовыми клетками возникает так называемая валлеровская дегенерация (Waller′s degeneration), которая известна с 1850 г. Процессы регенерации происходят вдоль так называемых бюнгнеровых лент (Büngner′s band). В ЦНС через 12-24 часов после поражения возникает феномен дегенерации терминалей. Тело клетки разрушается в результате хроматолиза. Регенеративные процессы, которые ускоряет ЭПО, приводят к образованию аксонов. Набухание тел клеток уменьшается по мере возникновения физиологического явления регенерации в периферических аксонах в течение первой недели после повреждения. Благодаря введению ЭПО согласно настоящему изобретению происходит ускорение регенерации, так что в течение одной недели уже возможны такие явления регенерации, как образование филоподий и протоплазматических узлов роста. Аксональным филоподиям обычно требуется две недели для врастания в полости дистального сегмента шванновских клеток. В случае полного разрыва эти структуры могут быть соединены биологическими структурами или коллагеном. Формой применения для шинирования нервов являются, например, коллагеновые трубочки с покрытием из ЭПО. Могут быть также применены другие опорные материалы, например полилактиды или полигидроксиалканоаты. Возможно также сочетание со стволовыми клетками и аутологичным или аллогенным фибрином в качестве направляющей структуры.
При полиомиелитных состояниях благодаря введению ЭПО обеспечивается неосинтез периневрия. Это способствует образованию коллатеральных отростков в ЦНС.
9. Печень
После вирусных инфекций печени (например, гепатитов А, В, С и D) могут возникать регенерационные дефекты печени. Цирроз печени представляет собой конечную стадию регенерационного дефекта печени, в ходе которой происходит замещение паренхиматозных клеток соединительной тканью, так как эндогенная регенерация не может совпадать по скорости с вызванными ядами повреждениями в ходе непрерывной регенерации.
После травмы и оперативных вмешательств, например после резекций опухолей печени, возникает острая потеря жизнеспособной ткани и деструкция ткани.
Согласно настоящему изобретению после введения ЭПО происходит ускоренная регенерация гепатоцитов и непаренхиматозных клеток печени, вплоть до полного восстановления. Характерным для этого является восстановление нормальной архитектуры долек печени, восстановление междольковой соединительной ткани, центральных вен и печеночных триад: наряду с клетками печени восстанавливаются желчные протоки, лимфатические сосуды, перипортальная соединительная ткань, артерии и междольковые вены.
Восстанавливается специфическое образование междолькового сплетения ретикулярных волокон и синусоид печени. Гистологическое строение после регенерации обнаруживает типичную балочную структуру. Окна в области эндотелиальных клеток имеют типичную для печени форму. Важными инициаторными клетками после травмы являются купферовские клетки, которые выделяют IL-6, IL-1, ТМР(фактор некроза опухолей)-альфа.
Введение ЭПО приводит к достоверному усилению регенеративных процессов, даже по сравнению с тканью онтогенетически более молодой печени. Происходит повышение in vitro-фактора в 10-30 раз.
10. Желчный пузырь
При воспалениях желчного пузыря, а также после механически вызванных травм желчного пузыря после терапевтического введения ЭПО происходит восстановление нормальной структуры стенки, имеющей следующее строение: соединительная ткань (капсула, срастающаяся с капсулой печени), мышечная оболочка, ходы Пушки (Luschka′s crypts), собственная пластинка слизистой оболочки (богато васкуляризованная) и слизистая оболочка (с однослойным цилиндрическим эпителием). Снова замыкаются лимфатические сосуды и нервы из зоны блуждающего нерва.
11. Регенерация поджелудочной железы
Введение ЭПО поддерживает регенерацию В-клеток, D-клеток и А-клеток поджелудочной железы. Регенерация начинается с небольших эпителиальных тяжей, которые отходят от секреторных протоков. Одновременно образуются вены и артерии поджелудочной железы.
Регенеративные процесс охватывают эндокринный и экзокринный компоненты после травмы, воспалительных заболеваний и иммунологических аутоиммунных процессов.
12. Носовая полость и параназальные синусы
Перегородка носа, преддверие носа, носовая полость, мышцы носа подвергаются регенеративным процессам после повреждений и введения ЭПО. Восстанавливается эпителий, а также собственная пластинка слизистой оболочки (плотная коллагеновая соединительная ткань с тубулоальвеолярными мукосерозными железами), сосуды с артериовенозными анастомозами и кавернозными телами, адренергические и холинергические нервы. В обонятельной области слизистой оболочки реконструируется очень высокий эпителий и серозные железы Боумена (Bowman′s glands).
13. Область гортани (larynx)
Многорядный призматический мерцательный эпителий, собственная пластинка слизистой оболочки, серозные железы и смешанные серомукозные железы восстанавливаются после введения ЭПО/ТПО в сочетании со стволовыми клетками или без стволовых клеток.
14. Трахея
Восстановление типичной структуры стенки с перихондрием, гиалиновым хрящом, перихондрием, собственной пластинки слизистой оболочки с серомукозными железами, подслизистой основой, собственной пластинкой слизистой оболочки и эпителием. На периферии регенерирует адвентиция, а хрящи трахеи соединяются гладкими мышцами. Эпителий содержит бокаловидные клетки, базальные клетки и реснитчатые клетки. Также присутствуют эндокринные (Ра-) клетки и щеточные клетки типа I и типа II.
15. Легкие
Согласно настоящему изобретению комплексная трехмерная архитектура и структура легких восстанавливается следующим образом. Бронхиальная артерия (Arteria bronchialis), железы, бронх, ветви легочной артерии (arteria pulmonalis), бронхиолы, гладкая мускулатура и ветви легочной вены (vena pulmonalis), альвеолярные каналы (ducti alveolaris), альвеолярные мешочки и плевральная оболочка совмещаются в виде трехмерной структуры. В бронхопульмонарном сегменте регенерируются межсегментарные септы, сегментарные вены и сегментарные артерии. В бронхах регенерируется эпителий, собственная пластинка слизистой оболочки, мышечная оболочка, железы и хрящи. В альвеолах восстанавливается функция барьера между кровью и воздухом. Регенерируются эластиновые структуры. Снова образуются клетки альвеолярного эпителия (типы I и II). Кровеносные сосуды, лимфатические сосуды и нервы (plexus pulmonalis) координируются в трех измерениях благодаря введению ЭПО и/или интеграции со стволовыми клетками.
16. Мочевая система
Регенеративные эффекты в области почек до сих пор остаются неизвестными, так как ЭПО использовался только в качестве заместительной терапии при дефиците ЭПО в случае хронической почечной недостаточности. При травматических повреждениях, воспалении и токсическом или аутоиммунном повреждении введение ЭПО совместно со стволовыми клетками/предшественниками или без них приводит согласно настоящему изобретению к регенерации урологических систем. В почке происходит регенерация корковой структуры, почечных чашечек, мозгового вещества, мозговых лучей, почечных пирамид и почечных столбов.
Происходит регенерация мезангиального матрикса, мезангиальных клеток, почечных клубочков (с lamina rara interna, lamina densa, lamina rara externa). Восстанавливаются структурные связи пучков коллагеновых волокон, мезангиальных клеток, подоцитов и эндотелиальных клеток. В корковом веществе почки регенерируются собирательная трубочка, главная трубочка, петля нефрона, клетки плотного пятна (macula densa), юкстагломерулярные клетки и приносящий почечный сосуд (vas afferens). В мозговом веществе почки происходит образование новых характерных интерстициальных клеток и сосочковых протоков.
Структура мочеточников регенерирует в виде адвентициальной оболочки, кольцевой и продольной мускулатуры мышечной оболочки, собственной пластинки слизистой оболочки и эпителия (tunica mucosa). В мочевом пузыре стимулируется восстановление эпителия, собственной пластинки слизистой оболочки (tunica mucosa), подслизистой оболочки (продольной и кольцевой мускулатуры) и наружной продольной мускулатуры.
В женской уретре с помощью ЭПО и/или стволовых клеток стимулируется регенерация мышечной оболочки, венозного сплетения, железистых лакун, собственной пластинки слизистой оболочки и преимущественно неороговевающего плоского эпителия. В мужской уретре регенерируются предстательная часть мочеиспускательного канала (pars prostatica), сфинктер мочеиспускательного канала (musculus sphincter urethrae) и мочеполовая диафрагма (diaphragma urogenitale), мужская простатическая маточка (utriculus prostaticus), перепончатая часть мочеиспускательного канала (pars membranaceae), губчатая часть мочеиспускательного канала (pars spongiosa) и ладьевидная ямка мочеиспускательного канала (fossa navicularis). За слизистой оболочкой губчатой части мочеиспускательного канала следует губчатое тело (corpus spongiosum). После травматических повреждений или хирургических вмешательств ЭПО в сочетании с фибриновым клеем и со стволовыми клетками или без них может быть инъецирован в качестве связующего средства в структурные дефекты или соответствующим образом применен местно.
17. Эндокринные железы
В области гипофиза, эпифиза, щитовидной железы, паращитовидной железы, поджелудочной железы (островки Лангерганса), надпочечников, яичников и семенников повреждения тканей могут возникать в результате травматических повреждений, операций (например, резекций опухолей). В этих случаях ЭПО может согласно настоящему изобретению привести к регенерации тканей или поддержать регенерацию тканей в сочетании со стволовыми клетками из аутологичного костного мозга, стволовыми летками пуповинной крови, клетками-предшественниками из периферической крови (моноцитами) или посредством пополнения местных предшественников. В аденогипофизе восстанавливаются базофильные клетки, верхняя и нижняя гипофизарные артерии, гомитоли и портальные сосуды. Регенерируется нейрогипофиз, состоящий из питуицитов и немиелинизированных нервных волокон нейросекреторных нейронов гипоталамуса. С этой целью согласно настоящему изобретению между различными областями в качестве направляющих структур прокладывают покрытые ЭПО фибриновые нити со стволовыми клетками. Как и в других структурах мозга, регенерируются структуры капсул. В эпифизе восстанавливаются хабенула, выступ шишковидного тела (recessus pinealis), дольковые структуры, «мозговой песок», соединительнотканные септы и мягкая оболочка (рiа mater (капсула)). Нервные волокна, пинеалоциты, астроциты объединяются с образованием специфических структур эпифиза.
Щитовидная железа часто подвергается хирургическим вмешательствам. Соответственно в ней регенерируются эпителиальные клетки фолликулов, С-клетки, соединительнотканные структуры.
После регенерации согласно настоящему изобретению надпочечники состоят из капсулы, сферических железистых комплексов (zona glomerulosa), среднего слоя (zona fasciculata), внутреннего слоя (zona reticularis). Спонгиоциты находятся в среднем слое.
18. Репродуктивная система
Процессы регенеративного восстановления могут согласно настоящему изобретению привести к восстановлению функциональной структуры посредством структурных процессов в яичниках. Сюда относятся, прежде всего, регенеративные процессы в строме яичника (stroma ovarii), белочной оболочке (tunica albuginea), гранулезных клетках, во внутреннем слое фиброзной соединительной ткани (theca folliculi interna) и наружном слое фиброзной соединительной ткани (theca folliculi externa). Мезотелиальная выстилка снова замыкается после повреждений. В фаллопиевых трубах восстанавливается структура стенки (эпителий, собственная пластинка слизистой оболочки (слизистая оболочка), кольцевые мышцы, продольные мышцы (мышечный слой), субсерозная соединительная ткань, мезотелий (серозная оболочка)).
В ампуле фаллопиевой трубы регенерируются железистые клетки, собственная пластинка слизистой оболочки и реснитчатые клетки. Тело матки регенерируется структурно с образованием эндометрия, миометрия и периметрия. Регенерируется слизистая оболочка (эпителий, собственная пластинка слизистой оболочки), мышечный слой (продольные мышцы, musculus bulbospongiosus) и адвентиция влагалища. Восстанавливаются лимфатические сосуды и нервные связи. Кроме всей зоны тканей женских половых органов, возможны также восстановительные процессы в мужских половых органах после травм и других повреждений. Так, среди прочего, могут координированно регенерироваться яички, придатки яичек, пенис (включая corpus cavernosum), семенная протока (ductus seminiferus), простата и их структурные связи с окружающими мягкими и твердыми тканями. Реинтегрируются также кровоснабжающие структуры, лимфатические сосуды и нервы.
19. Молочная железа
В ходе регенерации опять имеет место структурное образование долек, соединительной ткани, молочных синусов, секреторных протоков с гистологически детальной структурой, альвеол, внутри- и междольковой соединительной ткани, молочного протока, миоэпителиальных клеток. В частности, после резекций опухолей или пластических операций можно реконструировать ткань молочной железы в сочетании с биологически моделируемыми опорными материалами, ЭПО и стволовыми клетками.
20. Центральная нервная система
В области головного и спинного мозга клинически важную роль играют, например, механические и ишемические инсульты с последующей дегенерацией тканей или нарушениями структур. Серое и белое вещество, мозжечок, средний мозг и полушария головного мозга структурно объединяются и регенерируют.
К промежуточному мозгу относятся эпиталамус, дорсальный таламус, субталамус и гипоталамус. Область конечного мозга цитоархитектонически объединяет около 50 полей, которые можно структурно регенерировать. Основными областями являются лобные доли, височные доли, теменные доли и затылочные доли. Можно регенерировать области перегородки, обонятельную луковицу и области коры. Область регенерации базальных ганглиев включает полосатое тело с хвостатым ядром и скорлупой, вентральное полосатое тело, прилежащее ядро (nucleus accumbens) и базальное ядро (nucleus basalis). Регенеративные процессы позволяют исправить дефекты моторных зон с ассоциированными параличами и выпадениями сенсорных нейронов. Можно исправить повреждения в области моторной коры (например, из-за родовых травм или несчастных случаев) с результирующими спастическими параличами. В случае повреждения передних рогов спинного мозга с ассоциированными вялыми параличами также могут быть индуцированы регенеративные процессы. Нарушения функций гиппокампа вызывают тяжелые дефекты в области ориентации в пространстве и памяти (синдром Корсакова). В случае повреждения кортикальных нейронов можно снизить ассоциированный риск развития болезни Альцгеймера. В случае цереброваскулярной недостаточности или даже инфаркта мозга можно повлиять на репаративные процессы через регенерацию.
21. Глаз
Регенеративные процессы распространяются на роговицу, конъюнктиву, радужную оболочку, шлемов канал, цилиарную мышцу, хрусталик, зонулярные волокна, зубчатый край (ora serrate), внутреннюю прямую мышцу глазного яблока (musculus rectus medialis), стекловидное тело, сетчатку, сосуды, твердую мозговую оболочку, паутинную оболочку, зрительный нерв, центральную артерию и центральную вену сетчатки, сетчатую оболочку, сосудистую оболочку и склеру. Восстанавливается специфическая структура роговицы, состоящей из коллагеновой пластинки, фибробластов, эластиновых волокон, коллагеновой пластинки, боуменовой мембраны (Bowmann′s membrane), слоя эпителия. Регенерируется склера (белочная оболочка), состоящая из бурой пластинки (lamina fusca), эписклеральной пластинки (substantia propria) и эписклеры. Восстанавливаются эпителий хрусталика, веки с эпидермальным и дермальным компонентами, подкожная клетчатка, потовые железы, волосяные фолликулы, эпителий, собственная пластинка слизистой оболочки, хрящ века, железа Мельборна (Melborn′s gland), железа Моля (Moll′s gland), мышца, поднимающая верхнее веко (musculus levator palpebrae), круговая мышца глаза (musculus orbicularis oculi).
22. Ухо
Согласно настоящему изобретению в регенеративные процессы вовлекаются мышцы уха, среднее ухо, барабанная перепонка, барабанная полость, слуховые косточки, стременная мышца (musculus stapedius), мышца, натягивающая барабанную перепонку (musculus tensor tympani), сосцевидная пещера (antrum mastoideum), сосцевидные ячейки (cellulae mastoideae) и евстахиева труба, внутреннее ухо и костный лабиринт, улитка с относящимися к ней нервами, лабиринт и, соответственно, кортиев орган (Corti′s organ).
II. Описание примеров осуществления изобретения
1. Трансплантация клеток. Гепатоциты
Клетки печени выделяли стандартным способом из непригодных для трансплантации органов или резектатов печени посредством обработки коллагеназой. (Bader. A., Rinkes, I.H.B., Closs, I.E., Ryan, C.M., Toner, M., Cunningham, J.M., Tompkins, G.R., Yarmush, M.L. (1992). A stable long-term hepatocyte culture system for studies of physiologic processes: Cytokine stimulation of the acute phase response in rat and human hepatocytes. Biotechnol Prog. 8, 219-225).
Выделенные или предварительно культивированные клетки хранили в жидком азоте. После размораживания клеток в соответствии с известными протоколами (Karim, N., Allmeling, С., Hengstler, J.-G., Haverich, A., Bader, A. (2000). Diazepam metabolism and albumin secretion of porcine hepatocytes in collagen-sandwich after cryopreservation. Biotechnol. Letters 22:1647-1652) к гепатоцитам добавляли суспензии/культуры, содержавшие 100-150 МЕ/кг массы тела эпоэтина-альфа (в соответствии с реципиентом). С этой целью эпоэтин добавляли в виде стерильного раствора в объеме 1-1,5 мл к 10 мл суспензии гепатоцитов с концентрацией 2-10 миллионов клеток/мл.
Эту суспензию медленно (1 мл/минуту) инъецировали интрапортально. Для предотвращения свертывания можно было дополнительно добавить 1000 ME гепарина.
Альтернативно, смесь клеток/ЭПО можно также инъецировать под капсулу печени или непосредственно в паренхиму печени в несколько точек. Для этой цели рекомендуется увеличить концентрацию' гепатоцитов в 2-5 раз и соответственно уменьшить объем.
Каналы, образовавшиеся от проколов, заклеивали коммерчески доступным фибриновым клеем (Baxter Tissucol). Альтернативно, можно использовать тампонаду коллагеновой ватой. Раствор эпоэтина-альфа можно также добавить к тампону. Следует следить за тем, чтобы тампон на месте адгезии оставался сухим.
2+
Фибриновый клей представляет собой 2-компонентную смесь. Один компонент обычно представляет собой фибриноген, а второй - активирующий раствор, содержащий Са и ингибиторы протеиназы (например, апротинин). Эпоэтин-альфа можно добавить к активирующему раствору посредством смешивания до конечной концентрации, равной 100-150 МЕ/кг массы тела.
Аналогичным образом можно использовать стволовые клетки из костного мозга, жировой ткани, специфической паренхимы или крови (выделенные из светлого слоя кровяного сгустка СD34-позитивные клетки), стволовые клетки из пуповинной крови и мезенхимные клетки из пуповинной ткани.
Параллельно с трансплантацией клеток в ишемически, токсически, инфекционно или механически (травматически) поврежденные зоны клетки можно внедрить в фибриновый клей или аутологичную плазму и подвергнуть полимеризации с добавлением эопоэтина-альфа (100-150 МЕ/кг массы тела).
Параллельно можно начать введение ЭПО в дозе 10.000 ME подкожно, чтобы в течение недели было введено всего 40.000 ME.
Результатом является усиление регенерации ткани в 2-3 раза, приводящее к структурному восстановлению.
2. Послеоперационное введение
После обширных операций в области сосудов сердца и грудной клетки, висцеральной хирургии, пластической хирургии или после обширной травмы возникают дефекты тканей, которые могут привести к опасности для жизни пациентов.
Эпоэтин-альфа можно в этом случае вводить в концентрация 10-150 МЕ/кг массы тела.
Введение ЭПО приводит к эндогенному повышению концентрации гормона роста в 2 раза, в результате чего ускоряется регенерация тканей после операции. Полное восстановление происходит примерно на 1-2 недели раньше, чем у пациентов, получавших сравнимое лечение без введения ЭПО.
ЭПО можно также вводить для индукции регенерации печени после трансплантации части печени или трансплантации всей печени.
После трансплантации печени трансплантированная ткань или, в случае доноров печени, остаток ткани доступен в качестве активной ткани недостаточно быстро и в недостаточном количестве. В этом случае можно ввести 100-150 МЕ/кг массы тела эпоэтина-альфа за 24 часа до операции, во время операции и после операции с 24-часовыми интервалами. Это приводит к заметному ускорению регенерации печени, при помощи ультразвукового исследования можно диагностировать послеоперационное увеличение объема, более конкретно - на 4-5 день.
3. Введение после оперативной резекции печени в случае доброкачественных и злокачественных опухолей
При обширной резекции печени необходимо вызвать ускоренную регенерацию, так как для выживания пациентов важно наличие адекватной массы клеток. После хирургической резекции можно ввести 100-159 МЕ/кг массы тела эпоэтина-альфа в случае системного введения или соответствующее количество в случае местного введения (в фибриновом клее, плазме).
При подозрении на сохранение опухолевой инвазии или при наличии нерезецируемых метастазов можно вводить стандартные цитостатики в комбинации с ЭПО, как системно, так и местно, в зависимости от типа опухоли и прогноза.
После резекции и введения ЭПО у группы, получавшей лечение, ускоряется объемный рост на 30%, по сравнению с группой, не получавшей лечение. Прежде всего, в структурный рост усиленно вовлекаются гепатоциты с поверхностей резекции. Происходит полное формирование сосудистого дерева и окружающей ткани. Гепатоциты организуются типичным способом, соответствующим нормальному органу - в виде долек с сосудистым обеспечением, клеточных пластин с непаренхимальными клетками (купферовскими, Pit, Ito и эндотелиальными клетками).
Происходит системное увеличение размеров. Увеличение размеров заканчивается после достижения начального размера.
В группе пациентов с предоперационным введением ЭПО концентрация гемоглобина была примерно на 0,5 г/дл выше уже через 1-2 дня после операции. Это следует рассматривать как признак общеизвестного действия ЭПО. Однако параллельно происходит регенерация печени. При этом размножаются не только гепатоциты, но все типы клеток и, в частности, также соединительнотканные структуры, которые отображают архитектурное строение печени.
Экспериментальная процедура:
28 самок свиньи (вес 40,0-62,0 кг) случайным образом были разделены на три группы. С использованием техники эндоскопии брюшной полости было выполнено частичное удаления печени с левой стороны.
Контрольная группа (n=16) не получала ЭПО. Группа 2 (n=6) получила комбинацию 10.000 единиц ЭПО и фибринового клея (Quixil) местно на поверхность резекции печени. Группа 3 получила то же лечения; однако, свиньи дополнительно поучили 10.000 ЭПО системно в дни 0, 3, 7 и 11.
Пробы печени были взяты из удаленного куска печени в день 0, через 24 часа после резекции из области, расположенной на 1 см ниже поверхности резекции, и через 14 дней после резекции ниже поверхности резекции и из правой доли.
Для определения Ki-67 антигена, PCNA (ядерного антигена пролиферирующих клеток, ЯАПК = Ядерный Антиген Пролиферирующих Клеток) и апоптоза на зафиксированной в формалине и залитой в парафиновый блок ткани был проведен стрептавидин-биотин-иммунопероксидазный анализ.
Результаты
Группа 1 (контроль, n=16)
Группа 2(Фактор роста местно)
Группа 3Фактор роста местно и системно
Объем печени (мл)
892,071±130,56
894,02±104,705
1073,10±190,13*
Масса печени (г)
1001,55±155,76
1027,18±166,95
1249,42±222,51*
Гемоглобин (моль/л) (14-й день)
6,0077±9,65
6,550±0,89
6,58±0,5541
Масса свиней (кг)
48,37±5,25
52,67±6,76
50,54±9,801
Группа 1Контрольная группа
Группа 2Фактор роста местно
Группа 3Фактор роста местно и системно
Ki 67 на 14-й день (%)
1,85±2,01
14,01±12,11*
15,08±15,71*
ЯАПК (%)
25,33±9,82
29,87±7,18
37,16±14,32
Апоптоз(%)
0,56±0,429
0,267±0,103
0,56±0,30
Среднее арифметическое и стандартное отклонение * р<0,05
4. Оптимизированные эндопротезы и имплантаты
Имплантаты могут состоять из биологически разлагаемых или стойких материалов. Примером этого являются металлические эндопротезы, например в области бедра. После изготовления грубой металлической заготовки производится микроструктурирование посредством абразии, травления или лазерной обработки. Это позволяет получить пористость или шероховатость в диапазоне от 0,1 до 50-60 мкм.
Эти структуры впоследствии заполняют раствором фазовочистого бета-трикальцифосфата, так что на поверхности образуется гомогенное покрытие. После этого структуры в идеале подвергают процессу длительного спекания для отверждения бета-ТКФ-структур.
В минеральные структуры можно включить растворимые соли/сахара или вызвать газообразование, чтобы получить дополнительные взаимосвязанные поры. После этого производственного процесса структуры импрегнируют или покрывают фактором роста согласно настоящему изобретению или его производными, фрагментами или аналогами. Депо можно, соответственно, разместить на поверхностях посредством заполнения полостей ЭПО или использовать медленно выделяющиеся вещества. Альтернативно, на имплантат, без нарушения стерильности вынутый из упаковки, можно нанести покрытие из ЭПО или его аналогов непосредственно перед имплантацией.
За счет этого обеспечивается улучшенный процесс соединения ткани с имплантатом. Кость соединяется макроваскулярно, а имплантат быстрее и более прочно встраивается в кость.
Аналогично можно приготовить имплантаты для области рта, челюстей и лица (зубные имплантаты).
Возможна комбинация с колонизацией стволовыми клетками в биореакторах.
Также можно нанести покрытие из ЭПО, и/или ГР, и/или ТПО на биологические имплантаты (сосуды, сердечные клапаны, кожа и мембраны).
5. Лечение остеопороза
Гранулы трикальцийфосфата с покрытием из ЭПО вводят в дефицитные/разреженные тела позвонков в растворе аутологичной плазмы посредством игольной пункции. Гранулы затем ускоренно реконструируются в эндогенную кость, а процесс дегенерации трансформируется в анаболический эффект.
Эффект можно использовать также в случае межпозвоночных дисков, для которых существует высокий риск разрушения. Предпочтительно сочетание с процессом колонизации клетками, более предпочтительно - стволовыми клетками из аутологичного костного мозга или надкостницы и крови и/или жировой ткани.
6. Показание - регенерация хряща
Клетки хряща представляют собой в высокой степени брадитрофную ткань. При региональной травме и абразии возникают воспалительные процессы, которые могут привести к артриту. Введение ЭПО в суставную щель или системно и/или в комбинации с клеточными трансплантациями хондроцитов или остеохондральных цилиндров стимулирует регенерацию тканей и реконструкцию структуры. Возможно комбинированное системное или подкожное введение в дозе 10000 МЕ/день.
7. Показание - кожные болезни
На плохо заживающие раны согласно настоящему изобретению наносят ЭПО или ТПО (или их производные, аналоги, фрагменты) после подготовки раневого ложа. Для этого предпочтительно производят механическую обработку раны. 10000 ME ЭПО вводят в коагулят крови. Этот процесс можно повторять до тех пор, пока раневое ложе не очистится.
Структурный рост начинается через 2-3 дня и приводит к ускоренному формированию грануляционной ткани.
8. Показание - Воспалительные заболевания кишечника
При воспалительных феноменах кишечника с потерей массы тела и анемией было обнаружено, что анемия не является вторичным явлением, вызванным плохим всасыванием питательных веществ, но может быть сопутствующим явлением, связанным с исходным дефицитом ЭПО. Введение ЭПО в дозе 10000 МЕ/день приводит к улучшению восстановления/регенерации кишечника.
9. Показание - Регенерация нервов
После разрывов спинного мозга ЭПО приводит к структурному росту нейронов и к разрастанию аксонов. Введение витамина С оказывает поддерживающее действие.
ЭПО можно вводить местно в комбинации с фибриновым клеем/аутологичной плазмой и/или эндогенными стволовыми клетками (из костного мозга, СD34-клетки крови, из жировых клеток, надкостницы, пуповины).
10. Показание - Болезнь Паркинсона/пример хронического заболевания с убывающей воспалительной реакцией
Аутологичные макрофаги, простимулированные разлагаемыми частицами, вводили стереотаксически в дегенерированные области. Параллельно в эти области вводили ЭПО (10000 ME) в сочетании с аутологичными стволовыми клетками (0,3 мл). Параллельно в течение 2 недель также вводили ЭПО системно. Этот принцип стимуляции посредством индукции воспаления макрофагами можно использовать также при других хронических заболеваниях, при которых нет острой травмы или острой воспалительной реакции.
11. Заживление ран после ожогового повреждения
У 8 пациентов с ожеговыми повреждениями после введения ЭПО донорские участки, с которых были взяты трансплантаты кожи, зажили на 50% быстрее. Глубокие ожоговые раны второй степени (степень 2В) на лице заживали без образования рубцов, если пациенту назначали ЭПО. Без ЭПО раны такого типа заживали с образованием рубцов.