ОБНАРУЖЕНИЕ КЛЕТОК, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ ТКАНИ ПУПОВИНЫ ЧЕЛОВЕКА
DETECTION OF CELLS OBTAINED FROM UMBILICAL CORD TISSUE

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Данная заявка истребует приоритет, предоставляемый в связи с подачей Предварительной заявки на патент США № 61/579710, поданной 23 декабря 2011 года, которая в полном объеме содержится в настоящий документ посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способам обнаружения аллогенных клеток для терапевтических целей, таких как, например, клетки, полученные из ткани пуповины человека, в образце биологической жидкости пациента, который проходил клеточную терапию.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Терапия аллогенными клетками является многообещающей новой технологией для лечения множества нереализованных потребностей медицины. Однако клетки для клеточной терапии являются уникальными продуктами, процесс разработки которых связан с некоторыми проблемами. Одним из конкретных примеров данной технологии является развитие клеток, полученных из ткани пуповины человека («hUTC»), которые используются по различным клиническим показаниям. Последующее введение пациентам hUTC и определение наличия и/или количества клеток, обнаруженных в крови пациента, позволяют получить необходимую информацию, которая связана с фармакокинетикой hUTC с точки зрения продукта для клеточной терапии. Тем не менее, это представляет собой проблему, поскольку hUTC может иметь характеристики, которые аналогичны таковым для клеток, которые были получены из крови пациента. Таким образом, необходимо отличать hUTC от других клеток.
Клинические исследования во время разработки содержат исследования фармакокинетики для определения параметров абсорбции, распределения, метаболизирования и экскреции лекарственного препарата in vivo. Важным элементом исследований фармакокинетики является определение уровня воздействия лекарственного препарата на пациентов. Обычно это производится при помощи анализа концентрации лекарственного препарата в образцах крови; уровни воздействия оцениваются в связи с эффективностью и безопасностью препарата. В случае продукта для клеточной терапии, такого как hUTC, исследование биораспределения или фармакокинетики hUTC в рамках клинических исследований представляет собой проблему, поскольку не существует общепринятого способа различения hUTC (или других клеточных продуктов) и собственных клеток пациента. Таким образом, сложно определить биодоступность hUTC.
Принятый в настоящее время подход для определения наличия аллогенных клеток для терапевтических целей (например, hUTC) в кровотоке требует использования аллогенных клеток для терапевтических целей, например, hUTC), которые были получены у донора мужского пола и введены путем внутривенного переливания крови пациенткам женского пола. См., например, Bader P. et al., «How and when should we monitor chimerism after allogeneic stem cell transplantation?» Bone Marrow Transplantation, 2005; 35: 107-119; см. также Durnman, DM et al., «Analysis of the origin of marrow cells in bone marrow transplant recipients using a Y-chromosome-specific in situ hybridization assay,» Blood, 1989; 74: 2220-2226. ПЦР в режиме реального времени используется для обнаружения Y-хромосомы в образце крови пациента и получения результатов в виде количественного описания или двоичного сигнала для определения наличия или отсутствия аллогенных клеток для терапевтических целей (например, hUTC) в образце крови. См. Brader P. et al. Данный подход требует исключения использования клеток (например, hUTC) от доноров женского пола и пациентов мужского пола из анализов фармакокинетики hUTC в клинических исследованиях. Таким образом, сохраняется потребность в способе обнаружения аллогенных клеток, таких как, например, UTC, у пациентов после введения данных клеток.
ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение предусматривает обнаружение наличия аллогенных клеток для терапевтических целей в образце мононуклеарных клеток периферической крови человека. Изобретение обеспечивает обнаружение подобных клеток для терапевтических целей без ограничения по кариотипу клеток для терапевтических целей (XY против XX) и полу реципиента (пациента).
Один вариант осуществления настоящего изобретения является способом обнаружения аллогенных клеток для терапевтических целей в крови, содержащим: (a) проведение анализа аллогенных клеток для терапевтических целей и мононуклеарных клеток периферической крови человека для определения одного или более маркеров, характерных для аллогенных клеток для терапевтических целей, и одного или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови пациента; (b) получение образца крови у пациента, который прошел терапию аллогенными клетками; (c) анализ образца при помощи аналитической методики обнаружения одного или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови пациента, и одного или более маркеров, характерных для аллогенных клеток для терапевтических целей; и (d) различение мононуклеарных клеток периферической крови пациента и аллогенных клеток для терапевтических целей на основании обнаружения одного или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови пациента, и одного или более маркеров, характерных для аллогенных клеток для терапевтических целей. В одном варианте осуществления один или более маркер, характерный для мононуклеарных клеток периферической крови пациента, содержит CD45. В качестве альтернативы способ обнаружения аллогенных клеток для терапевтических целей содержит: (a) проведение анализа аллогенных клеток для терапевтических целей и мононуклеарных клеток периферической крови пациента для определения одного или более маркеров, характерных для аллогенных клеток для терапевтических целей, и одного или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови пациента; (b) сравнение одного или более маркеров, характерных для аллогенных клеток для терапевтических целей, и одного или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови пациента, для определения одного или более уникальных маркеров, которые отличают аллогенные клетки для терапевтических целей от мононуклеарных клеток периферической крови пациента; (c) получение образца крови у пациента, который прошел терапию аллогенными клетками; (d) анализ образца при помощи аналитической методики обнаружения одного или более уникальных маркеров, характерных для аллогенных клеток для терапевтических целей; и (e) различение мононуклеарных клеток периферической крови пациента и аллогенных клеток для терапевтических целей на основании обнаружения одного или более уникальных маркеров.
Способы могут подходить для обнаружения любых необходимых аллогенных клеток для терапевтических целей. Например, аллогенные клетки для терапевтических целей могут быть выбраны из группы, содержащей клетки, полученные из ткани пуповины человека, клетки, полученные из пуповинной крови человека, клетки, полученные из плаценты, клетки, полученные из мезенхимальных стволовых клеток, клетки печени, клетки островков Лангерганса, кардиомиоциты и клетки нерастворимого коллагенового костного матрикса. Данные способы могут также использоваться для обнаружения двух или более различных типов аллогенных клеток для терапевтических целей в образце крови.
В этих способах может использоваться множество различных аналитических методик, таких как, например, проточная цитометрия, твердофазный иммуноферментный анализ, иммуногистохимический анализ, обнаружение нуклеиновых кислот, ПЦР и их комбинации. Кроме того, способы могут содержать стадию обогащения между стадиями (a) и (b). Стадия обогащения может содержать методику магнитной сепарации. Стадия различения содержит установления различия между аллогенными клетками для терапевтических целей, которые были введены пациенту, и мононуклеарными клетками периферической крови пациента, которые были получены у пациента. Пациентом является человек, низший примат, мышь, крыса, хомяк, морская свинка, собака или свинья.
Настоящее изобретение также предусматривает наборы, которые могут использоваться в способах обнаружения аллогенных клеток для терапевтических целей в образце крови. Наборы могут содержать маркерный профиль, содержащий один или более маркеров, характерных для аллогенных клеток для терапевтических целей, и один или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови пациента.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ обнаружения в крови клеток, полученных из ткани пуповины человека, который состоит из следующего: (a) проведение анализа клеток, полученных из ткани пуповины человека, и мононуклеарных клеток периферической крови пациента для определения одного или более маркеров, характерных для клеток, полученных из ткани пуповины человека, и одного или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови человека; (b) получение образца крови у пациента, которому были введены клетки, полученные из ткани пуповины человека; (c) анализ образца при помощи аналитической методики обнаружения одного или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови пациента, и одного или более маркеров, характерных для клеток, полученные из ткани пуповины человека; и (d) различение мононуклеарных клеток периферической крови пациента и клеток, полученных из ткани пуповины человека, на основании обнаружения одного или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови пациента, и одного или более маркеров, характерных для клеток, полученных из ткани пуповины человека. В качестве альтернативы способ обнаружения клеток, полученных из ткани пуповины человека, содержит: (a) проведение анализа клеток, полученных из ткани пуповины человека, и мононуклеарных клеток периферической крови человека для определения одного или более маркеров, характерных для клеток, полученных из ткани пуповины человека, и одного или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови пациента; (b) сравнение одного или более маркеров, характерных для клеток, полученных из ткани пуповины человека, и одного или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови человека, для определения одного или более уникальных маркеров, которые отличают клетки, полученные из ткани пуповины человека, от мононуклеарных клеток периферической крови пациента; (c) получение образца крови у пациента, которому были введены клетки, полученные из ткани пуповины человека; (d) анализ образца при помощи аналитической методики обнаружения одного или более уникальных маркеров, характерных для клеток, полученных из ткани пуповины человека; и (e) различение мононуклеарных клеток периферической крови пациента и клеток, полученных из ткани пуповины человека, на основании обнаружения одного или более уникальных маркеров. Пациентом является человек, низший примат, мышь, крыса, хомяк, морская свинка, собака или свинья.
В одном варианте осуществления маркер, характерный для мононуклеарных клеток периферической крови пациента, содержит CD45, и маркер, характерный для клеток, полученных из ткани пуповины человека, содержит CD10. В другом варианте осуществления маркеры для мононуклеарных клеток периферической крови пациента и клеток, полученных из ткани пуповины человека, содержат один или более из CD10, CD13, NRP1, CD45, LAMP1, DKK3, NRP1 или LAMB1. В способе может использоваться множество аналитических методик, включая проточную цитометрию, твердофазный иммуноферментный анализ, иммуногистохимический анализ, обнаружение нуклеиновых кислот, ПЦР и их комбинации. Одним или более уникальными маркерами, характерными для клеток, полученных из ткани пуповины человека, могут быть один или более из CD10, CD13, NRP1, LAMP1, DKK3, NRP1, LAMB1 и их комбинаций.
Способ может дополнительно содержать стадию обогащения между стадиями (a) и (b). На стадии обогащения может использоваться методика магнитной сепарации. Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой набор, который может использоваться в способах обнаружения в крови клеток, полученных из ткани пуповины человека, и содержать маркерный профиль, содержащий один или более маркеров, характерных для клеток, полученных из ткани пуповины человека, и один или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови человека. Настоящее изобретение также предусматривает системы для использования со способами настоящего изобретения.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения является способом обнаружения в крови клеток, полученных из ткани пуповины человека, содержащим стадии: проведения анализа клеток, полученных из ткани пуповины человека, и мононуклеарных клеток периферической крови человека для определения одного или более маркеров, характерных для клеток, полученных из ткани пуповины человека, и одного или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови человека; получения образца крови, в котором содержатся клетки, полученные из ткани пуповины человека; выделения из образца крови фракции клеток, полученных из ткани пуповины человека/мононуклеарных клеток периферической крови; анализа фракции клеток, полученных из ткани пуповины человека/мононуклеарных клеток периферической крови при помощи проточной цитометрии для обнаружения маркера CD45, характерного для мононуклеарных клеток периферической крови человека, и маркеров CD10 или CD13, характерных для клеток, полученных из ткани пуповины человека, а также мононуклеарных клеток периферической крови человека и клеток, полученных из ткани пуповины человека, на основании обнаружения маркера CD45, характерного для мононуклеарных клеток периферической крови человека, и маркеров CD10 или CD13, характерных для клеток, полученных из ткани пуповины человека.
Стадия анализа может содержать анализ фракции клеток, полученных из ткани пуповины человека/мононуклеарных клеток периферической крови при помощи проточной цитометрии для обнаружения маркера CD45, характерного для мононуклеарных клеток периферической крови, и маркера CD13, характерного для клеток, полученных из ткани пуповины человека. В качестве альтернативы стадия анализа может содержать анализ фракции клеток, полученных из ткани пуповины человека/мононуклеарных клеток периферической крови при помощи проточной цитометрии для обнаружения маркера CD45, характерного для мононуклеарных клеток периферической крови, и маркера CD10, характерного для клеток, полученных из ткани пуповины человека. Способ может также дополнительно содержать стадию обогащения, на которой используется, например, методика магнитной сепарации, до анализа фракции клеток, полученных из ткани пуповины человека/мононуклеарных клеток периферической крови.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения является способом обнаружения в крови клеток, полученных из ткани пуповины человека, который содержит стадии: получения образца крови, в котором содержатся клетки, полученные из ткани пуповины человека; выделения из образца крови фракции клеток, полученных из ткани пуповины человека/мононуклеарных клеток периферической крови; удаления всей плазмы крови; анализа фракции клеток, полученных из ткани пуповины человека/мононуклеарных клеток периферической крови при помощи проточной цитометрии для обнаружения маркера CD45, характерного для мононуклеарных клеток периферической крови, и маркера CD13, характерного для клеток, полученных из ткани пуповины человека, а также мононуклеарных клеток периферической крови человека и клеток, полученных из ткани пуповины человека, на основании обнаружения маркера CD45, характерного для мононуклеарных клеток периферической крови человека, и маркера CD13, характерного для клеток, полученных из ткани пуповины человека. Способ может также дополнительно содержать стадию обогащения, на которой используется, например, методика магнитной сепарации, до анализа фракции клеток, полученных из ткани пуповины человека/мононуклеарных клеток периферической крови. Способ может также содержать обнаружение маркера CD10, характерного для клеток, полученных из ткани пуповины человека.
Клетки, полученные из ткани пуповины человека, выделены из ткани пуповины человека по существу свободными от крови, способными к самообновлению и размножению в культуре, а также обладающими потенциалом к дифференцированию. В одном варианте осуществления клетки, полученные из ткани пуповины человека, выделены из ткани пуповины человека по существу свободными от крови, способными к самообновлению и размножению в культуре, обладающими потенциалом к дифференцированию и имеющими следующие характеристики: (1) экспрессия CD10, CD13, CD44, CD90 и HLA-ABC; (2) отсутствие экспрессии CD31, CD34, CD45, HLA-DR и CD117, а также (3) отсутствие экспрессии hTERT или теломеразы. В качестве альтернативы клетки, полученные из ткани пуповины человека, могут быть выделены из ткани пуповины человека по существу свободными от крови, способными к самообновлению и размножению в культуре, обладающими потенциалом к дифференцированию и имеющими следующие характеристики: (1) экспрессия CD10, CD13, CD44, CD90 и HLA-ABC; (2) отсутствие экспрессии CD31, CD34, CD45, HLA-DR и CD117; (3) отсутствие экспрессии hTERT или теломеразы; (4) экспрессия рецептора окисленных липопротеинов низкой плотности 1, ретикулона, лиганда хемокинового рецептора 3 и/или гранулоцитарного хемотаксического белка; и (4) экспрессия, по отношению к фибробластам, мезенхимальным стволовым клеткам или клеткам костного мозга гребня подвздошной кости человека, повышенных уровней интерлейкина-8 или ретикулона 1.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения является способом обнаружения в крови клеток, полученных из ткани пуповины человека, содержащим следующие стадии: (a) получения образца крови у пациента, которому были введены клетки, полученные из ткани пуповины человека; (b) анализа образца при помощи способа обнаружения одного или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови человека, и одного или более маркеров, характерных для клеток, полученных из ткани пуповины человека; и (c) различения мононуклеарных клеток периферической крови человека и одного или более маркеров, характерных для клеток, полученных из ткани пуповины человека. В одном варианте осуществления маркером, характерным для мононуклеарных клеток периферической крови человека, является CD45, а маркером, характерным для клеток, полученных из ткани пуповины человека, является CD10. На стадии анализа могут использоваться проточная цитометрия, твердофазный иммуноферментный анализ, иммуногистохимический анализ, обнаружение нуклеиновых кислот и/или ПЦР. Способ может дополнительно содержать стадию обогащения между стадиями (a) и (h). На стадии обогащения может использоваться методика магнитной сепарации.
Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является способ обнаружения в крови клеток, полученных из ткани пуповины человека, содержащий следующие стадии: (a) получения образца крови, содержащего клетки, полученные из ткани пуповины человека; (b) выделения из образца крови фракции клеток, полученных из ткани пуповины человека/ мононуклеарных клеток периферической крови; и (c) анализа фракции клеток, полученных из ткани пуповины человека/мононуклеарных клеток периферической крови при помощи проточной цитометрии для обнаружения маркера CD45, характерного для мононуклеарных клеток периферической крови, и маркера CD10, характерного для клеток, полученных из ткани пуповины человека.
Альтернативным вариантом осуществления настоящего изобретения является способ обнаружения в крови клеток, полученных из ткани пуповины человека, содержащий стадии: получения образца крови, в котором содержатся клетки, полученные из ткани пуповины человека; выделения из образца крови фракции клеток, полученных из ткани пуповины человека/мононуклеарных клеток периферической крови; удаления всей плазмы крови; и анализа фракции клеток, полученных из ткани пуповины человека/мононуклеарных клеток периферической крови при помощи проточной цитометрии для обнаружения маркера CD45, характерного для мононуклеарных клеток периферической крови, и маркера CD13, характерного для клеток, полученных из ткани пуповины человека.
Другие характеристики и преимущества настоящего изобретения станут понятны после изучения следующего подробного описания и примеров.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Приведенное выше краткое описание, а также приведенное ниже подробное описание настоящего изобретения, будут более понятны при изучении вместе приложенными фигурами. Для целей иллюстрирования настоящего изобретения на фигурах представлены варианты осуществления настоящего изобретения. Однако следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается только приведенными точными конструкциями, примерами и устройствами.
На Фиг. 1 перечислены 24 образца и возраст клеточной культуры каждого образца, использованного в Исследовании 1 в Примере 1. В частности, в Таблице на Фиг. 1A перечислены 24 образца, которые были использованы в микроматричном анализе, а на схеме на Фиг. 1B показан возраст клеточной культуры для каждого из этих 24 образцов.
На Фиг. 2A показана сравнительная экспрессия гена PTPRC (CD45) в клетках, полученных из ткани пуповины человека (hUTC), и различных видах клеток крови, которые входят в состав мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) человека.
На Фиг. 2B показана сравнительная экспрессия гена MME (CD10) в hUTC и различных видах клеток крови, которые входят в состав мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) человека.
На Фиг. 2C показана сравнительная экспрессия гена ANPEP (CD13) в hUTC и различных видах клеток крови, которые входят в состав МКПК человека.
На Фиг.3 показан анализ ПЦР в реальном времени для отбора генов, экспрессия которых в hUTC превышает таковую в МКПК человека.
На Фиг. 4A показаны результаты анализа проточной цитометрии для обнаружения маркеров на поверхности клеток hUTC. В соответствии с Фиг. 4A на панелях A1, B1, C1, D1 и E1 изображены неокрашенные контрольные препараты. Панель A2 изображает CD13 и 7AAD. Панель B2 изображает CD10 и 7AAD. Панель C2 изображает NRP1 и 7AAD. Панель D2 изображает CD45 и 7AAD. Панель E2 изображает LAMP1 и 7AAD.
На Фиг. 4B показаны результаты анализа проточной цитометрии для обнаружения маркеров на клеточной поверхности МКПК человека. В соответствии с Фиг. 4B на панелях A1, B1, C1, D1 и E1 изображены неокрашенные контрольные препараты. Панель A2 изображает CD13 и 7AAD. Панель B2 изображает CD10 и 7AAD. Панель C2 изображает NRP1 и 7AAD. Панель D2 изображает CD45 и 7AAD. Панель E2 изображает LAMP1 и 7AAD.
На Фиг. 4C показаны результаты анализа проточной цитометрии для обнаружения внутренних маркеров DKK3 и LAMP1 в МКПК и hUTC.
На Фиг. 5A показано обнаружение hUTC в смеси, содержащей hUTC (в диапазоне 1500-1700 клеток/мл) и МКПК человека (1 миллион клеток/мл), в присутствии 1 мл человеческой сыворотки при помощи проточной цитометрии.
На Фиг. 5B показано обнаружение hUTC в смеси, содержащей hUTC (в диапазоне от 1700 до 110000 клеток/мл) и МКПК человека (1 миллион клеток/мл), в присутствии 1 мл человеческой сыворотки при помощи проточной цитометрии.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Данная заявка посвящена способам обнаружения аллогенных клеток для терапевтических целей, таких как клетки-предшественники, которые циркулируют в крови пациента (например, человека). Клетки-предшественники или другие генно-инженерные клетки, которые являются компонентами продукта для клеточной терапии, разрабатываются для множества клинических показаний. Подобные клетки, такие как, например, hUTC, вводятся пациенту, например, внутривенным путем. Распределение этих клеток в кровотоке необходимо определять для проведения фармакокинетического анализа подобных клеток в качестве продукта для клеточной терапии, а также более точного определения благоприятных исходов данной терапии. Однако человеческая кровь содержит множество видов клеток крови, один или более виды которых экспрессируют одинаковые белки, которые также могут экспрессироваться клетками-предшественниками или генно-инженерными клетками. Более того, сложно разработать достаточно чувствительную аналитическую методику, которая бы позволила обнаружить малое количество этих клеток (таких как, например, hUTC) при значительном избытке клеток в крови реципиента. Поэтому обнаружение этих клеток в присутствии крови человека представляет собой проблему, для решения которой требуется достижение достаточной чувствительности и специфичности методики. Таким образом, существует потребность в аналитической методике, при помощи которой можно определить и отличить клетки-предшественники или генно-инженерные клетки от клеток крови человека.
I. Определения
Используемый в настоящем документе термин «образец» относится к любому веществу, которое содержит необходимый аналит. Образец может быть биологической жидкостью, такой как цельная кровь или компоненты цельной крови, включая эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, сыворотку и плазму, асцитическая жидкость, моча, спинно-мозговая жидкость и другие компоненты организма.
Клетки, которые могут быть определены в образце крови, содержащем мононуклеарные клетки периферической крови, при помощи способов настоящего изобретения, обычно относятся к постнатальным клеткам или клеткам, полученным после родов (PPDC). Более конкретно, данные клетки являются «клетками, полученными из пупка», «клетками, полученными из пуповины» (UDC), «клетками, полученными из ткани пуповины» (UTC) или «клетками, полученными из ткани пуповины человека» (hUTC). Кроме того, клетки могут быть описаны как являющиеся стволовыми клетками или клетками-предшественниками, причем последний термин используется в широком смысле. Термин «полученный из» используется для указания того, что клетки были получены из их биологического источника и были выращены или иным образом обработаны in vitro (например, культивированы в ростовой среде для размножения популяции и/или получения клеточной линии). Манипуляции in vitro над пуповинными стволовыми клетками и уникальные характеристики клеток, полученных из пуповины, которые составляют предмет настоящего изобретения, более подробно описаны ниже.
Стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, определяющиеся по способности на уровне единичной клетки как самообновляться, так и дифференцироваться для получения клеток-потомков, включая самообновляющиеся клетки-предшественники, необновляющиеся клетки-предшественники и окончательно дифференцированные клетки. Стволовые клетки также характеризуются своей способностью дифференцирования in vitro в функциональные клетки различных клеточных линий дифференцировки из множества зародышевых листков (энтодермы, мезодермы и эктодермы), а также после трансплантации давать начало тканям, происходящим от множества зародышевых листков, и способствовать образованию по существу большинства, если не всех, тканей после инъекции в бластоцисты.
По своему потенциалу развития стволовые клетки разделяются на: (1) тотипотентные; (2) плюрипотентные; (3) мультипотентные; (4) олигопотентные; и (5) унипотентные. Тотипотентные клетки способны преобразовываться во все виды эмбриональных и внеэмбриональных клеток. Плюрипотентные клетки способны преобразовываться во все виды эмбриональных клеток. Мультипотентные клетки содержат клетки, способные преобразовываться в подмножество клеточных линий дифференцировки, но только в пределах конкретной ткани, органа или физиологической системы. Например, гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) могут порождать потомство, которое содержит ГСК (самообновление), рестриктированные олигопотентные клетки-предшественники клеток крови и все виды и элементы клеток (например, тромбоциты), представляющие собой стандартные компоненты крови. Клетки, которые являются олигопотентными, способны преобразовываться в более ограниченное подмножество клеточных линий дифференцировки, чем мультипотентные стволовые клетки. Клетки, которые являются унипотентными, способны преобразовываться в единственную клеточную линию дифференцировки (например, сперматогенные стволовые клетки).
Стволовые клетки также классифицируются на основании источника их получения. Взрослая стволовая клетка по существу представляет собой мультипотентную недифференцированную клетку, присутствующую в ткани, содержащей множество дифференцированных видов клеток. Взрослая стволовая клетка способна к самообновлению. В нормальных условиях они также могут дифференцироваться для получения специализированных типов клеток той ткани, в которой они находятся, а также, возможно, тканей других типов. Эмбриональная стволовая клетка представляет собой плюрипотентную клетку из внутренней клеточной массы эмбриона на стадии бластоцисты. Фетальная стволовая клетка представляет собой клетку, происходящую из тканей или мембран плода. Постнатальная стволовая клетка является мультипотентной или плюрипотентной клеткой, которая по существу происходит из внеэмбриональной ткани, доступной после родов, а именно - из пуповины. Известно, что данные клетки обладают признаками, характерными для плюрипотентных стволовых клеток, включая быструю пролиферацию и потенциал дифференцирования в клетки многих клеточных линий дифференцировки. Постнатальные стволовые клетки можно получить из крови (например, клетки, полученные из пуповинной крови) или не из крови (например, из отличных от крови тканей пуповины).
Для описания клеток в культуре используются различные термины. «Культура клеток» по существу обозначает клетки, взятые из живого организма и выращенные в контролируемых условиях («в культуре» или «культивированные»). «Первичная культура клеток» обозначает культуру клеток, тканей или органов, взятых непосредственно из организма(ов) до первого пересева. Клетки «размножают» в культуре, когда их помещают в ростовую среду в условиях, облегчающих рост и/или деление клеток, что приводит к большей популяции клеток. При размножении клеток в культуре скорость пролиферации клеток иногда измеряют по количеству времени, которое необходимо клеткам для удвоения численности. Данное время называют «временем удвоения».
Термин «клеточная линия» по существу относится к популяции клеток, полученной в результате одного или более пересевов первичной клеточной культуры. Каждый цикл пересева называют пассажем. Клетки, которые пересеивают, называются клетками, которые «пассированы». Конкретная популяция клеток или клеточная линия иногда описывается или характеризуется числом выполненных с ней пассажей. Например, пассированная 10 раз культивируемая популяция клеток может описываться как культура десятого пассажа, или культура P10. Первичная культура, т.е. первая культура после выделения клеток из ткани, обозначается P0. После первого пересева клетки описываются как вторичная культура (P1, или культура первого пассажа). После второго пересева клетки превращаются в третичную культуру (P2, или культура второго пассажа) и т.п. Специалистам в данной области будет понятно, что за период пассирования популяция клеток может многократно удваиваться; следовательно, количество удвоений популяции в культуре больше номера пассажа. Степень размножения клеток (то есть число удваиваний популяции) за промежуток времени между последовательными пассированиями зависит от многих факторов, включая, помимо прочего, плотность посева, тип подложки, тип среды, условия роста и продолжительность времени между пересевами.
«Дифференцировка» представляет собой процесс, при помощи которого неспециализированная («некоммитированная») или малоспециализированная клетка приобретает свойства специализированной клетки, например, нервной или мышечной. Дифференцированная клетка представляет собой клетку, занявшую более специализированную («коммитированную») позицию в пределах клеточной линии дифференцировки. Термин «коммитированная» применительно к процессу дифференцировки обозначает клетку, дошедшую в ходе процесса дифференцировки до стадии, от которой в нормальных условиях она продолжит дифференцироваться до определенного вида клеток или набора видов клеток и не сможет в нормальных условиях дифференцироваться в иной вид клеток или вернуться обратно к менее дифференцированному виду. Термин «дедифференцировка» относится к процессу, в ходе которого клетка возвращается к менее специализированному (или коммитированному) положению в клеточной линии дифференцировки. Используемый в настоящем документе термин «клеточная линия дифференцировки» определяет наследственность клетки, т.е. определяет, из какой клетки произошла данная клетка и каким клеткам она может дать начало. В клеточной линии дифференцировки клетка помещается в наследственную схему развития и дифференцировки.
В широком смысле, «клетка-предшественник» представляет собой клетку, которая обладает возможностью давать начало потомству, которое более дифференцировано, чем она сама, а также сохраняет возможность пополнения пула клеток-предшественников. По данному определению, сами стволовые клетки также являются прогениторными клетками, поскольку являются ближайшими предшественниками окончательно дифференцированных клеток. В отношении клеток из настоящего изобретения, которые более подробно описываются ниже, может использоваться такое широкое значение клеток-предшественников. В более узком смысле клетку-предшественника часто определяют как клетку, которая является промежуточным предшественником в процессе дифференцирования, т.е. она происходит из стволовой клетки и является промежуточным звеном в получении зрелого вида клеток или подмножества видов клеток. Клетки-предшественники данного типа по существу не способны к самообновлению. Таким образом, при отсылке к клетке этого типа в настоящем документе она будет называться «необновляющейся клеткой-предшественником» или «промежуточной клеткой-предшественником».
В целом, «трофический фактор» определяют как вещество, способствующее выживанию, росту, пролиферации, и/или созреванию клетки, или стимулирующее повышенную активность клетки.
Используемый в настоящем документе термин «стандартные условия роста» относится к культивированию клеток при 37°C в стандартной атмосфере, содержащей 5% CO2, и поддержании относительной влажности около 100%. Хотя описанные выше условия можно использовать при культивировании клеток, следует понимать, что специалист в данной области, принимая во внимание возможности культивирования клеток, известные в данной области, вполне может варьировать такие условия.
Используемый в настоящем документе термин «выделенная» по существу относится к клетке, которая была отделена от ее естественной среды. Данный термин содержит грубое физическое отделение от естественной среды, например, путем удаления у животного-донора. В предпочтительных вариантах осуществления выделенная клетка не находится в ткани, т.е. клетка отделена или разобщена с соседними клетками, с которыми она контактирует в нормальных условиях. Предпочтительно, чтобы клетки вводились в виде клеточной суспензии. Используемый в настоящем документе термин «клеточная суспензия» содержит клетки, которые контактируют со средой и были разобщены, например, путем осторожного измельчения фрагмента ткани.
Используемый в настоящем документе термин мононуклеарная клетка периферической крови («МКПК») относится к любой клетке крови, которая имеет круглое ядро. Примерные мононуклеарные клетки периферической крови неограниченно содержат лимфоциты, моноциты и макрофаги.
II. Способы обнаружения аллогенных клеток для терапевтических целей в образце крови пациента
Данная заявка предусматривает способы обнаружения аллогенных клеток для терапевтических целей в образце крови пациента после введения этих клеток пациенту. Способы содержат стадии (a) получения образца крови у пациента, который прошел терапию аллогенными клетками; (b) анализа образца при помощи аналитической методики обнаружения одного или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови пациента («МКПК») (например, любой клетки крови, имеющей круглое ядро), и одного или более маркеров, характерных для клеток для терапевтических целей; и (c) различения мононуклеарных клеток периферической крови человека и одного или более маркеров, характерных для аллогенных клеток для терапевтических целей и не экспрессируемых мононуклеарными клетками периферической крови. Для различения маркеров мононуклеарных клеток периферической крови пациента и одного или более маркеров, характерных для аллогенных клеток для терапевтических целей и не экспрессируемых мононуклеарными клетками периферической крови, также необходимо сначала определить эти маркеры. Таким образом, способы могут дополнительно содержать стадию анализа данных маркеров. Способы настоящего изобретения обеспечивают обнаружение подобных клеток без ограничения по кариотипу аллогенных клеток для терапевтических целей (т.е. XX против XY) и полу пациента. Таким образом, способы не ограничиваются полом пациента, как они не ограничиваются определением только мужских аллогенных клеток для терапевтических целей (XX) у пациенток женского пола.
В одном варианте осуществления изобретение предусматривает способы обнаружения или определения в образце крови клеток, полученных из ткани пуповины человека. Способы содержат стадии: (a) получения образца крови у пациента, которому были введены клетки, полученные из ткани пуповины человека; (b) анализа образца при помощи способа обнаружения одного или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови человека, и одного или более маркеров, характерных для клеток, полученных из ткани пуповины человека; и (c) различения мононуклеарных клеток периферической крови человека и клеток, полученных из ткани пуповины человека. Для различения также необходимо провести анализ уникального маркерного профиля для обеспечения выбора уникального маркерного профиля для различения. Также может быть использована дополнительная стадия количественного определения hUTC. В одном варианте осуществления могут использоваться маркеры, показанные в Примере 3.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение описывает способы отличения и/или определения продукта для клеточной терапии на основе hUTC после его внутривенного введения человеку. Данные способы используются для определения молекулярных маркеров, которые экспрессируются по существу на более высоком уровне в hUTC в сравнении с клетками, которые обычно находятся в крови, т.е. мононуклеарными клетками периферической крови («МКПК»). Поскольку данные способы для определения hUTC основываются на уникальном маркерном профиле, они позволяют обнаруживать подобные клетки без ограничений по кариотипу hUTC (XX против XY) и полу пациента. Они не ограничены по полу или только мужскими hUTC. Таким образом, подобные способы обеспечивают проведение анализов мужских и женских клеток hUTC у пациентов мужского и женского пола в любых сочетаниях.
Способы настоящего изобретения подходят для различения аллогенных клеток для терапевтических целей в крови пациента из различных источников. В частности, способы настоящего изобретения подходят для обнаружения небольшого количества hUTC в присутствии значительного избытка крови реципиента. Данный способ применим к любым животным из класса млекопитающих и не ограничен клетками, получаемыми у людей. Например, способы настоящего изобретения могут использоваться для различения аллогенных клеток для терапевтических целей, таких как, например, hUTC, и МКПК человека. В качестве альтернативы способы могут использоваться для различения аллогенных клеток для терапевтических целей, таких как, например, hUTC и МКПК низшего примата, мыши, крысы, хомяка, морской свинки, собаки или свиньи.
Такие способы помогают отличить hUTC и другие аллогенные клетки для терапевтических целей от МКПК, а также наблюдать за фармакокинетикой у пациентов, которые получают продукт для клеточной терапии.
Способы настоящего изобретения подходят для обнаружения аллогенных клеток для терапевтических целей (таких как, например, hUTC) в образцах крови пациентов, которые прошли терапию данными клетками. Таким образом, способы настоящего изобретения подходят для обнаружения введенных ранее аллогенных клеток для терапевтических целей (таких как, например, hUTC). Способы настоящего изобретения могут подходить для обнаружения любой клетки, которая представляет терапевтический интерес, такой как, например, клетки, полученные из пуповинной крови человека, клетки, полученные из плаценты, мезенхимальные стволовые клетки и клетки, полученные из мезенхимальных стволовых клеток, hUTC, кардиомиоциты и т.д., или любые целевые клетки, экспрессирующие определенный белок или белки, которые представляют интерес. Другие подходящие клетки для использования с данными способами содержат клетки печени, клетки островков Лангерганса, фибробласты и клетки нерастворимого коллагенового костного матрикса (ICBM).
Данные способы также могут подходить для обнаружения двух или более видов аллогенных клеток для терапевтических целей (таких как, например, hUTC) в образцах крови пациентов, которые прошли терапию этими клетками. Например, данные способы могут использоваться для обнаружения в образце крови клеток, полученных из ткани пуповины человека, и клеток, полученных из плаценты. В качестве альтернативы способы могут использоваться для обнаружения в образце крови клеток, полученных из ткани пуповины человека, и фибробластов дермы. Данные способы могут также использоваться для обнаружения в образце крови клеток, полученных из ткани пуповины человека, клеток, полученных из плаценты, и фибробластов дермы.
a. Определение уникального маркерного профиля для различения
Способы настоящего изобретения содержат стадию определения уникального маркерного профиля для различения на основании наличия клеток для терапевтических целей (таких как, например, клетки, полученные из ткани пуповины человека), в образце крови пациента, который содержит МКПК.
Для получения такого уникального маркерного профиля необходимо сравнить экспрессию генов и наличие поверхностных маркеров данных клеток например, клеток, полученных из ткани пуповины человека) и МКПК. Для обнаружения в крови hUTC может использоваться множество методик, включая методики на основе белков, такие как твердофазный иммуноферментный анализ и иммуногистохимический анализ, или методики на основе нуклеиновых кислот, такие как гибридизация in situ. В качестве альтернативы может использоваться метод ПЦР. Как указано в приведенных ниже примерах, уровень экспрессии различных генов в МКПК и/или аллогенных клетках для терапевтических целей также может быть получен из общедоступных источников.
На основании уровня экспрессии подобного множества генов могут быть определены некоторые уникальные маркерные гены. В одном варианте осуществления, особенно подходящем для быстрого скрининга, маркер является поверхностным маркером.
Как показано в приведенных ниже примерах, молекулярные маркеры hUTC могут быть определены путем сравнения профилей экспрессии данных клеток с профилем экспрессии мононуклеарных клеток периферической крови человека (МКПК). При помощи сравнения профилей экспрессии маркеров hUTC и МКПК, которые экспрессируются по существу на более высоком уровне в hUTC в сравнении с клетками, в норме присутствующими в кровотоке, и наоборот, возможно определить их для каждого пациента. Определяемые маркеры содержат CD45, CD13 и CD10. Поскольку уровни экспрессии в hUTC и клеток в кровотоке могут изменяться, способ основывается на определении нескольких маркеров, что позволяет отличить hUTC от клеток в кровотоке пациента.
Уникальный маркерный профиль может содержать один или более маркеров, характерных для аллогенных клеток, для определения наличия которых и проводится анализ, и один или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови. Таким образом, при анализе клеток, полученных из ткани пуповины человека, маркерный профиль может содержать один или более маркеры, характерные для hUTC, один или более маркеры, характерные для мононуклеарных клеток периферической крови. В качестве альтернативы аллогенные клетки, для определения наличия которых и проводится анализ, могут быть определены при помощи только одного или большего количества уникальных маркеров аллогенных клеток, если этого достаточно для различения этих клеток и мононуклеарных клеток периферической крови.
В одном варианте осуществления, особенно полезном для определения hUTC среди МКПК, уникальный маркерный профиль содержит один или более из CD10, CD13, NRP1, CD45, LAMP1, DKK3, NRP1 или LAMB1. В одном варианте осуществления уникальный маркерный профиль содержит по меньшей мере один или более маркеров, характерных (например, присущий) для hUTC, и по меньшей мере один маркер, характерный (например, присущий) для МКПК (такой как, например, CD45).
В другом варианте осуществления, также особенно полезном для определения hUTC среди МКПК, уникальный маркерный профиль содержит один или более уникальных маркеров, которые характерны для hUTC, если их наличия достаточно для различения hUTC и мононуклеарных клеток периферической крови. Такие один или более из уникальных маркеров могут содержать один или более из CD10, CD13, NRP1, LAMP1, DKK3, NRP1 или LAMB1.

Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что выбор используемого маркера может изменяться в зависимости от используемой методики. Например, при использовании микроматричного анализа (такого как, например, матрица Ayffmetrix GeneChip HT HG-U133+ PM), маркеров ANPEP (CD13), LAMP1 и LAMB1 может быть недостаточно для различения, в то время как для различения может быть достаточно одного или более других маркеров. Аналогичным образом, при использовании ПЦР в реальном времени маркер LAMP1 может не подходить для включения в уникальный маркерный профиль, который позволил бы отличить hUTC от МКПК, в то время как для различения может быть достаточно одного или более других маркеров. В одном варианте осуществления уникальный маркерный профиль, используемый для скрининга hUTC при помощи проточной цитометрии для обнаружения поверхностных маркеров, не содержит DKK3 и LAMB1. В другом варианте осуществления уникальный маркерный профиль, используемый в проточной цитометрии для обнаружения внутриклеточных маркеров, содержит LAMP1 и DKK3.
Примерные подходящие маркеры для определения в образце hUTC среди МКПК при использовании избранных методик, которые приведены ниже.
Методика
Маркеры, характерные только для hUTC, при использовании методики
Маркеры, характерные только для МКПК, при использовании методики
Микроматричный анализ
MME (CD10), NRP1, DKK3
PTPRC (CD45)
ПЦР в реальном времени
MME (CD10), NRP1, DKK3, LAMB1
PTPRC (CD45)
Проточная цитометрия (поверхностные маркеры)
MME (CD10), ANPEP (CD13)
PTPRC (CD45)
Проточная цитометрия (внутриклеточные маркеры)
LAMP1
Таким образом, в одном варианте осуществления уникальный маркерный профиль содержит CD10 в качестве одного или более маркеров, характерных для hUTC, и CD45 в качестве одного или более маркеров, характерных для МКПК. В другом варианте осуществления уникальный маркерный профиль содержит CD10 и/или CD13 в качестве одного или более маркеров, характерных для hUTC, и CD45 в качестве одного или более маркеров, характерных для МКПК.
В другом варианте осуществления, в котором в качестве аналитической методики используется проточная цитометрия, уникальный маркерный профиль для определения hUTC среди МКПК содержит CD45 в качестве одного или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови, и CD10 в качестве одного или более маркеров, характерных для клеток, полученных из ткани пуповины человека.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения маркерный профиль для различения hUTC и МКПК содержит маркеры CD45, CD10 и CD13 при использовании проточной цитометрии, причем CD10 и CD13 являются одними или более маркерами, характерными для hUTC, а маркер CD45 является одним или более маркеров, характерных для МКПК.
Ниже приведены примерные подходящие маркеры для определения выбранных клеток для терапевтических целей в образце с МКПК:
Вид клетки
Маркер данного вида клетки
Маркер МКПК в организме хозяина
Клетка, полученная из пуповинной крови человека
CD10, CD13, CD107a
CD45
Клетка, полученная из плаценты
Ренин
Белок теплового шока 27 кДа
Клетка, полученная из мезенхимальной стволовой клетки
1L26, a-глюкозидаза
CD45
Печень
FOXa2, HNFal
CD45
Клетки островков Лангерганса
G6PC2, инсулин
CD45
Вид клетки
Маркер данного вида клетки
Маркер МКПК в организме хозяина
Фибробласты
SDF-1, GCP-2
CD45
Клетки, полученные из пуповинной крови, клетки, полученные из плаценты, и фибробласты дермы
IL8, GCP-2
CD45
Клетки, полученные из пуповинной крови, клетки, полученные из плаценты
IL6, MCP-1
CD45
Клетки нерастворимого коллагенового костного матрикса (ICBM)
Интегрин a-10; белок повтора сердечного анкирина
CD45
Кардиомиоцит
FoxA2,GATA4, MIR20
CD45
Уникальный маркерный профиль можно получить при помощи следующих операций, а также способов, описанных в примерах. Описанные выше операции могут содержать получение уникального маркерного профиля и подтверждение его точности. Поскольку стадия подтверждения может содержать анализ образца, данная стадия может быть необходима для определения точности и установления ограничений определенной операции, в ходе которой может быть обнаружен уникальный маркерный ген или белок. В данном варианте осуществления для определения маркеров может быть использована проточная цитометрия.
Получение уникального маркерного профиля. Профиль экспрессии генов hUTC, полученных из различных источников, был получен при помощи матрицы Affymetrix GeneChip HT HG-U133+ PM. Профили экспрессии генов МКПК человека и крысы, а также других видов клеток крови, были получены из общедоступных баз данных. По результатам получения профилей экспрессии генов может быть определен набор маркеров, которые в большом количестве экспрессируются в hUTC, и набор маркеров, которые в большом количестве экспрессируются в МКПК человека. Таким образом, был определен шестьдесят один (61) ген, подмножество которых было изучено подробнее. Для списка из 61 гена было определено, что маркер CD45 характерен для МКПК человека, а маркеры CD10 и CD13 являются двумя маркерами, характерными для hUTC.
Проверка способа определения маркерного профиля. Поскольку предполагается, что количество hUTC в образце крови пациента будет небольшим, было определено, возможно ли обнаружить и количественно оценить при помощи определенных выше маркеров небольшое количество hUTC в присутствии значительного избытка МКПК человека. Для этой цели известные количества hUTC были добавлены приблизительно в один миллион МКПК в 1 мл человеческой сыворотки. После этого аликвота каждого образца была проанализирована путем проточной цитометрии для выявления маркера CD45, характерного для МКПК человека, и маркеров CD10 или CD13, характерных для hUTC. Клетки были собраны при помощи центрифугирования, однократно промыты в фосфатном буферном растворе (ФСБ), а затем фиксированы и пермеабилизированы. Затем аликвоты клеток были инкубированы с: (1) анти-CD45, меченными флуоресцеин изотиоцианатом (Abeam, номер в каталоге 27287); (2) мышиными моноклональными антителами к CD 10 (Abeam, номер в каталоге 34175), после которых используются козьи антимышиные антитела, меченные флуоресцеин изотиоцианатом (Abeam, номер в каталоге 6785); и (3) мышиными моноклональными антителами к CD13 (Abeam, номер в каталоге 7417), после которых используются козьи антимышиные антитела, меченные флуоресцеин изотиоцианатом (Abeam, номер в каталоге 6785). В каждый образец был введен йодид пропидия (PI) для отслеживания жизнеспособности клеток, поскольку для дальнейшего анализа отбирались только живые клетки. При помощи этой операции было подтверждено, что определение маркерного профиля, содержащего CD10, CD13 и CD45, при помощи проточной цитометрии может успешно использоваться для обнаружения hUTC и МКПК.
В одном варианте осуществления уникальный маркерный профиль может быть представлен частью набора, содержащего материалы для определения уникального маркерного профиля.
Стадия определения уникального маркерного профиля также может содержать стадию проверки его правильности и возможного подтверждения уникального маркерного профиля в соответствии с имеющимися правилами.
B. Получение образца
Стадия получения образца содержит стадию забора образца крови у пациента. Как упоминалось выше, в одном варианте осуществления пациентом является человек, низший примат, мышь, крыса, хомяк, морская свинка, собака или свинья. Образец крови может быть дополнительно очищен или концентрирован для выделения клеток. Например, в одном варианте осуществления из крови может быть удалена плазма. Плазма может быть удалена при помощи стандартных методик, известных в данной области техники, включая центрифугирование.
Используемый для дальнейшего анализа образец (например, фракция крови) содержит необходимые клетки для терапевтических целей и мононуклеарные клетки периферической крови пациента. В одном варианте осуществления образец содержит фракцию клеток, полученных из ткани пуповины человека/мононуклеарных клеток периферической крови.
В одном варианте осуществления стадия получения образца дополнительно содержит выделение из образца крови фракции клеток, полученных из ткани пуповины человека/мононуклеарных клеток периферической крови. Данный вариант осуществления может дополнительно содержать стадию удаления плазмы крови.
В альтернативном варианте осуществления стадия получения образца содержит использование при фракционировании фиколла.
C. Анализ образца
В целом, стадия анализа содержит забор у пациента образца крови и его исследование на наличие уникального маркерного профиля для различения аллогенных клеток для терапевтических целей (например, hUTC). Стадия анализа также может содержать определение наличия МКПК на основании установленного выше уникального маркерного профиля. Например, стадия анализа образца содержит использование аналитической методики для определения одного или более маркеров, характерных для аллогенных клеток для терапевтических целей, и одного или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови. Таким образом, стадия анализа содержит обнаружение клеток на основании определенного выше уникального маркерного профиля. В качестве альтернативы стадия анализа образца содержит использование аналитической методики для определения одного или более уникальных маркеров, характерных для аллогенных клеток для терапевтических целей, чего достаточно для различения этих клеток и мононуклеарных клеток периферической крови.
В одном варианте осуществления стадия анализа содержит обнаружение в образце крови пациента одного или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови, и одного или более маркеров, характерных для клеток, полученных из ткани пуповины человека. В другом варианте осуществления стадия анализа содержит обнаружение одного или более уникальных маркеров, характерных для hUTC, чего достаточно для различения этих клеток и МКПК в образце крови пациента. Образец крови пациента может быть фракцией клеток, полученных из ткани пуповины человека/мононуклеарных клеток периферической крови.
Стадия анализа может проводиться при помощи множества стандартных лабораторных методик. В одном варианте осуществления на стадии анализа могут использоваться проточная цитометрия, твердофазный иммуноферментный анализ, иммуногистохимический анализ, обнаружение нуклеиновых кислот, ПЦР и их комбинации.
Для обнаружения в крови hUTC может использоваться множество методик, включая методики на основе белков, такие как твердофазный иммуноферментный анализ и иммуногистохимический анализ, или методики на основе нуклеиновых кислот, такие как гибридизация in situ. В качестве альтернативы для ускорения сравнительного подсчета hUTC в образце крови может использоваться метод ПЦР.
В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения способы изобретения используются для различения hUTC человека от МКПК человека. В одном варианте осуществления уникальный маркерный профиль содержит один или более из маркеров CD10, CD13, NRP1, CD45, LAMP1, DKK3, NRP1 или LAMB1, а на стадии анализа могут применяться проточная цитометрия, твердофазный иммуноферментный анализ, иммуногистохимический анализ, обнаружение нуклеиновых кислот, ПЦР и их комбинации. В другом варианте осуществления на стадии анализа применяется проточная цитометрия для определения маркеров CD10 и/или CD13, характерных для клеток, полученных из ткани пуповины человека, и маркера CD45, характерного для мононуклеарных клеток периферической крови. В другом варианте осуществления способы изобретения используются для различения hUTC и МКПК человека на основании наличия одного или более уникальных характерных маркеров (таких как, например, CD10, CD13, NRP1, LAMP1, DKK3, NRP1 или LAMB1), достаточных для различения этих клеток и МКПК.
D. Дополнительные стадии обогащения
Способы настоящего изобретения могут дополнительно содержать одну или более стадий обогащения. Используемый в настоящем документе термин «обогащение» относится к процессу, который по существу увеличивает отношение целевых биологических частиц (например, аллогенных клеток для терапевтических целей (таких как, например, hUTC)) к нецелевым биологическим материалам (например, МКПК) в обрабатываемом аналитическом образце в сравнении с отношением в исходном биологическом образце.
В частности, если для обнаружения аллогенных клеток для терапевтических целей (например, hUTC) необходима большая чувствительность, до проведения анализа образца может потребоваться стадия обогащения. Например, стадия обогащения может требоваться в том случае, если количество имеющихся аллогенных клеток для терапевтических целей (например, hUTC) слишком мало относительно количества клеток крови, или количество аллогенных клеток для терапевтических целей падает ниже пределов обнаружения лабораторной методики. При проведении стадии обогащения способы настоящего изобретения обеспечивают определение и подсчет аллогенных клеток для терапевтических целей, даже если они присутствуют в очень низкой концентрации в крови пациента, а также предусматривают механизм облегчения подсчета клеток, содержащихся в любом имеющемся образце.
Для проведения одной или более стадий обогащения может использоваться множество стандартных методик. Подобные стадии неограниченно содержат использование селективной среды для обогащения и элиминации определенных видов клеток, способ избирательной адгезии, физические и биологические способы разделения клеток, электрофорез с градиентом плотности, центрифугирование и т.д. Примерные методики обогащения содержат использование иммуноаффинной колонки, иммуноаффинных микроносителей, центрифугирование в градиенте сукрозы или фиколла.
Таким образом, в зависимости от количества hUTC на мл крови и количества hUTC на миллион МКПК может возникнуть потребность в выделении и обогащении фракции hUTC до проведения анализа. Для этих целей могут использоваться анти-CD45 антитела, конъюгированные с магнитным микроносителем (см. обсуждение ниже).
Клеточная сепарация с магнитными микроносителями
Стадия обогащения может содержать клеточную сепарацию с магнитными частицами/микроносителями. Магнитные частицы хорошо известны в данной области техники в связи с их использованием в иммунологических и других биоспецифических аффинных реакциях. В целом, для этих целей могут использоваться любые материалы, которые облегчают магнитную или гравитационную сепарацию. Примерные методики обогащения с использованием магнитных микроносителей описаны в патенте США № 7863012 и опубликованной заявке на патент США № 2011/0147180, которые включены в настоящий документ путем ссылки.
Магнитные частицы могут классифицироваться по размеру: крупные (от 1,5 до около 50 микрон); мелкие (около 0,7-1,5 микрон); или коллоидные (<200 нм), которые также называются наночастицами. Третий тип частиц, также известных как ферромагнитные растворы или вещества, похожие на ферромагнитные растворы и обладающие множеством свойств классических ферромагнитных жидкостей, в настоящем документе иногда называются коллоидными суперпарамагнитными частицами.
Мелкие магнитные частицы описанного выше типа крайне полезны при проведении анализов, включающих биоспецифические аффинные реакции, поскольку в целях удобства они покрываются биофункциональными полимерами (например, белками), тем самым обеспечивая получение очень большой площади реакционной поверхности и правдоподобной реакционной кинетикой. Магнитные частицы с размером в диапазоне около 0,7-1,5 микрон описывались в патентной литературе, включая, например, патенты США № 3970518; 4018886; 4230685; 4267234; 4452773; 4554088; и 4659678. Некоторые из описанных частиц могут использоваться в качестве твердых носителей для иммунологических реагентов.
Эффективность, с которой может проводиться магнитная сепарация, как и выделение и чистота магнитно-меченых клеток, зависит от многих факторов. Они содержат: количество отсепарированных клеток, плотность рецепторов или эпитопов на подобных клетках, магнитной нагрузки на клетку, неспецифического связывания (НСС) магнитного вещества, перенос захваченных нецелевых клеток, использованную методику, тип сосуда, тип поверхности сосуда, вязкость среды и использованное устройство для магнитной сепарации. Если уровень неспецифического связывания в системе по существу постоянный, как это обычно бывает, то по мере уменьшения целевой популяции будет увеличиваться ее чистота.
6
Например, в системе, где НСС равно 0,8%, происходит выделение 80% популяции, которая составляет 0,25% от исходной смеси, чистота будет равняться 25%. Таким образом, если исходная популяция составила 0,01% (одна целевая клетка на 10 фоновых клеток), а НСС было равно 0,001%, то чистота составит 8%. Следовательно, большая чистота целевого вещества в образце клинического материала приводит к более специфичному и эффективному выделению целевого вещества. Крайне низкое неспецифическое связывание необходимо или полезно для облегчения обнаружения или проведения анализа редких клеток, таких как находящиеся в кровотоке эпителиальные опухолевые клетки.
Чем меньше популяция целевых клеток (таких как, например, hUTC), тем сложнее будет их магнитная метка и выделение. Более того, метка и выделение будут явно зависеть от свойств используемой магнитной частицы. Например, если клетки инкубировались с крупными магнитными частицами, такими как магнитные микроносители Dynal (Invitrogen), клетки метились при столкновениях с частицами, вызванных перемешиванием системы, поскольку микроносители слишком велики для эффективной диффузии. Таким образом, если клетки присутствуют в популяции в количестве 1 клетки на мл крови или менее, то вероятность метки целевых клеток будет зависеть от количества добавленных в систему магнитных частиц и продолжительности времени смешивания. Поскольку смешивание клеток с подобными частицами в течение значительных периодов времени может оказывать пагубное воздействие, появляется необходимость в как можно большем повышении концентрации частиц. Тем не менее, существует предел количества добавляемых магнитных частиц, поскольку при магнитной сепарации таким образом можно заменить смесь редких клеток с другими клетками крови смесью редких клеток с большим количеством магнитных частиц. Последнее условие незначительно улучшает возможность подсчета необходимых клеток или их исследования.
В одном варианте осуществления используемые при переносе магнитные частицы на стадии обогащения ведут себя как коллоиды. Подобные частицы характеризуются субмикронным размером частиц, который обычно менее приблизительно 200 нм (0,20 микрон), и их устойчивостью к гравитационной сепарации из раствора в течение длительных периодов времени. В дополнение ко многим другим преимуществам данный диапазон размеров делает их по существу необнаружимыми для аналитических методик, которые обычно применяются для анализа клеток. Для использования в настоящем изобретении рассматриваются частицы с размером в диапазоне около 90-150 нм и магнитной массой около 70-90%. Подходящие магнитные частицы состоят из кристаллического ядра из суперпарамагнитного материала, окруженного молекулами, которые связаны, например, физически абсорбированы, или ковалентно связаны с магнитным ядром, а также предают им свойства, стабилизирующие коллоидный раствор. Предпочтительно, чтобы материал покрытия наносился в количестве, обеспечивающем эффективное предотвращение неспецифических взаимодействий между биологическими макромолекулами, находящимися в образце и магнитных ядрах. Подобные биологические макромолекулы могут содержать углеводы, такие как остатки сиаловой кислоты, на поверхности нецелевых клеток, лектины, гликопротеины и другие компоненты мембран. Кроме того, материал должен иметь как можно большую магнитную массу в пересчете на наночастицы. Размер содержащих ядро магнитных кристаллов достаточно мал, вследствие чего они имеют неполный магнитный домен. Размер наночастиц достаточно мал, благодаря чему энергия их броуновского движения превышает магнитный момент. Следовательно, расположение северного магнитного полюса, южного магнитного полюса, по-видимому, не способствует последующему притяжению/отталкиванию подобных коллоидных магнитных частиц даже при воздействии магнитных полей умеренной силы, что способствует стабильности этих частиц в растворе. В итоге магнитные частицы должны сепарироваться магнитным сепаратором с высоким градиентом приложенного магнитного поля. Такая характеристика облегчает работу с образцом и обеспечивает экономические преимущества в сравнении с более сложными колонками с внутренним градиентом, заполненными ферромагнитными микроносителями или стальной стружкой. Магнитные частицы с описанными выше свойствами могут быть получены путем модификации исходных материалов, описанных в патентах США № 4795698; 5597531 и 5698271, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки.
Поскольку мелкие наночастицы (30-70 нм) будут диффундировать быстрее, они будут преимущественным образом маркировать клетки в сравнении с более крупными аналогами. При использовании очень высоких градиентов, которые применяются в колонках с внутренним градиентом, производительность подобных материалов мало отличается вне зависимости от их размера. С другой стороны, при использовании внешних градиентов или градиентов с меньшей величиной, чем создаваемая микроносителями или колонками со стальной стружкой, расположение мелких наночастиц на клетках производить существенный эффект. Это было убедительно показано в отношении фракционирования наночастиц в постоянном токе и изучения их влияния на выделение. На основании данных исследований и других экспериментов для оптимизации были установлены средства для фракционирования наночастиц при помощи магнитного поля или колонок, для которых магнитные частицы с основным покрытием могут быть подготовлены таким образом, чтобы среди них не было слишком мелких или слишком крупных наночастиц. Например, могут быть изготовлены частицы с основным покрытием и средним диаметром 100 нм, которые содержат в лучшем случае следовые количества материала, меньшего чем 80 нм или большего чем 130 нм. Аналогичным образом, материал размером около 120 нм может быть изготовлен без существенного количества материала, меньшего чем 90-95 нм и большего чем 160 нм. Подобные материалы оптимально подходят для выделения и могут быть неоптимальными за счет включения наночастиц размером 60-70 нм. Одним предпочтительным диапазоном размеров частиц для использования в практическом осуществлении данного изобретения является 90-150 нм для магнитных частиц с основным покрытием, например, частиц магнетита, покрытых бычьим сывороточным альбумином.
На основании вышеизложенного используемые устройством для магнитной сепарации с высоким градиентом приложенного магнитного поля коллоидные магнитные частицы с сильными магнитными свойствами и слабым неспецифическим связыванием являются способом выбора для сепарации необходимого подмножества клеток из смешанной популяции эукариотических клеток (таких как, например, аллогенные клетки для терапевтических целей (например, hUTC) среди мононуклеарных клеток периферической крови), в особенности, если необходимое подмножество составляет небольшую фракцию от всей популяции. В связи с их диффузионными свойствами подобные материалы быстро находят и придают магнитные свойства редким явлениям, таким как опухолевые клетки в крови. В одном варианте осуществления для успешного проведения анализа аллогенных клеток для терапевтических целей (например, hUTC) при магнитной сепарации магнитные частицы должны быть специфичны к эпитопам, которые не представлены на аллогенных клетках для терапевтических целей (например, hUTC).
Стадия обогащения при помощи магнитных микроносителей содержит применение магнитных наночастиц (таких как описанные выше частицы), которые мечены моноклональными антителами. Подобные моноклональные антитела могут быть антителами для определения мононуклеарных клеток периферической крови, но не аллогенных клеток для терапевтических целей. Соединенное с наночастицами моноклональное антитело связывается с мононуклеарными клетками периферической крови, которые затем могут быть отделены при помощи магнитных средств. Обычно такая сепарация производится при помощи магнитных сепараторов с высоким градиентом приложенного магнитного поля. Примерная подходящая методика сепарации при помощи магнитных средств описана в патенте США № 6365362, раскрытие сути которого включено в настоящий документ. В одном варианте осуществления используется анти-CD45 антитело, конъюгированное с магнитной частицей. В качестве альтернативы стадия обогащения содержит использование анти-CD4 и анти-CD8 антител для удаления T-клеток.
В другом варианте осуществления стадия обогащения содержит использование моноклональных антител для определения аллогенных клеток для терапевтических целей. В дополнительном варианте осуществления аллогенные клетки для терапевтических целей являются клетками hUTC, а антитела содержат одно или более из анти-CD10 или анти-CD13 антител.
В одном варианте осуществления способы настоящего изобретения содержат использование системы Cell Search (Veridex, LLC (Раритан, штат Нью-Джерси)), которая была оптимизирована для обнаружения hUTC и МКПК.
Если примерное количество аллогенных клеток для терапевтических целей (таких как, например, hUTC) в образце неизвестно, способы настоящего изобретения также могут содержать стадию консервации достаточного объема образца для проведения дополнительных анализов. Это может быть особенно полезно, если исходный анализ не способен обнаружить аллогенные клетки для терапевтических целей (такие как, например, hUTC), поскольку аллогенные клетки для терапевтических целей присутствуют в количестве ниже предела обнаружения использованной аналитической методики. Таким образом, в одном варианте осуществления способ дополнительно содержит дополнительный анализ образца, если изначально не было обнаружено аллогенных клеток для терапевтических целей (таких как, например, hUTC). Дополнительные анализы также содержат один или более стадий обогащения, аналогичные описанным выше.
E. Обнаружение аллогенных клеток для терапевтических целей и мононуклеарных клеток периферической крови в образце крови
Способы настоящего изобретения дополнительно содержат обнаружение аллогенных клеток для терапевтических целей в образце мононуклеарных клеток периферической крови. Стадия обнаружения упомянутых клеток содержит сравнение результатов анализа образца с уникальными маркерами, которые анализировались выше, причем наличие уникальных маркеров аллогенных клеток для терапевтических целей указывает на присутствие в образце аллогенных клеток для терапевтических целей. Стадия обнаружения также может содержать сравнение результата с определенным выше уникальным маркером МКПК. Таким образом, стадия обнаружения содержит сравнение результатов для одного или более маркеров, характерных для аллогенной клетки для терапевтических целей (например, hUTC), и одного или более маркеров, не характерных для МКПК, с приведенным выше маркерным профилем.
В другом варианте осуществления способ настоящего изобретения содержит обнаружение клеток, полученных из ткани пуповины человека, в образце мононуклеарных клеток периферической крови (такой как, например, кровь человека или грызуна). Стадия обнаружения содержит сравнение результатов анализа образца с уникальным маркером, который анализировался выше, причем наличие уникальных маркеров аллогенных клеток для терапевтических целей указывает на присутствие в образце клеток hUTC. Стадия обнаружения также может содержать сравнение результата с уникальным маркером МКПК указанным выше способом. Стадия обнаружения может содержать обнаружение одного или более маркеров, характерных для hUTC, и одного или более маркеров, характерных для МКПК, описанным выше способом.
Стадия обнаружения также содержит различение мононуклеарных клеток периферической крови человека и клеток, полученных из ткани пуповины человека, на основании определения одного или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови человека, и одного или более маркеров, характерных для клеток, полученных из ткани пуповины человека. Стадия обнаружения также может содержать различение введенных пациенту клеток, полученных из ткани пуповины человека, и человеческих мононуклеарных клеток периферической крови пациента.
Стадия обнаружения клеток может также содержать подсчет клеток. В одном варианте осуществления стадия обнаружения hUTC содержит подсчет количества hUTC в образце.
Стадия обнаружения может дополнительно содержать выбор одной или более клеток, полученных из ткани пуповины человека, на основании наличия уникального маркерного профиля (такого как, например, один или более маркеры, характерные для hUTC).
Стадия обнаружения может также содержать обнаружение мононуклеарных клеток периферической крови человека и клеток, полученных из ткани пуповины человека, на основании определения маркера CD45, характерного для мононуклеарных клеток периферической крови человека, и маркера CD10 или CD13, характерного для клеток, полученных из ткани пуповины человека.
В альтернативных вариантах осуществления способы, описанные в настоящем документе, могут подходить для различения аллогенных клеток для терапевтических целей и МКПК крысы, которые могут быть особенно полезны для наблюдения в моделях заболеваний у крыс.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения описывается способ определения hUTC в крови. Способ содержит следующие стадии: (a) получения образца крови у пациента, которому были введены клетки, полученные из ткани пуповины человека; (b) анализа образца при помощи способа обнаружения одного или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови человека, и одного или более маркеров, характерных для клеток, полученных из ткани пуповины человека; и (c) различения мононуклеарных клеток периферической крови человека и одного или более маркеров, характерных для клеток, полученных из ткани пуповины человека. Также может использоваться дополнительная стадия количественного определения hUTC. В одном варианте осуществления используются один или более маркеры, показанные в Примере 3.
В другом варианте осуществления способы настоящего изобретения подходят для определения около 1700 или более hUTC/мл в присутствии 1 миллиона МКПК человека путем проточной цитометрии вне зависимости от стадии обогащения.
III. Наборы и системы для исследования аллогенных клеток для терапевтических целей в образце крови
Другой вариант осуществления настоящего изобретения является набором для обнаружения аллогенных клеток для терапевтических целей, таких как hUTC, в образце крови при помощи способов настоящего изобретения.
Наборы могут содержать уникальный маркерный профиль для различения и подходящие компоненты для определения уникального маркерного профиля для различения в соответствии с одной или более аналитическими методиками. Например, набор, подходящий для различения уникального маркерного профиля при помощи ПЦР в реальном времени, будет содержать праймеры для ПЦР, подходящие для амплификации генов уникального маркерного профиля. Аналогичным образом, набор, подходящий для различения уникального маркерного профиля при помощи иммуноферментного анализа будет содержать антитела, которые связываются с маркерами.
В одном варианте осуществления набор разработан для обнаружения hUTC в популяции МКПК. В другом варианте осуществления набор содержит уникальный маркуерный профиль CD10, CD13 и CD45 и другие подходящие компоненты для определения CD10, CD13 и CD45 при помощи одной или более методики из проточной цитометрии, твердофазного иммуноферментного анализа, иммуногистохимического анализа, обнаружения нуклеиновых кислот, ПЦР или их комбинаций.
Еще одним вариантом осуществления является система для обнаружения аллогенных клеток для терапевтических целей (таких как, например, hUTC) в популяции МКПК. Система содержит необходимые материалы для выполнения способов настоящего изобретения.
IV. Клетки, полученные из ткани пуповины человека
Хотя предполагается, что способы настоящего изобретения могут применяться для различения клеток для терапевтических целей (например, клеток-предшественников/стволовых клеток) и клеток организма хозяина, в предпочтительном варианте осуществления клетки могут быть клетками, полученными из ткани пуповины человека («hUTC» или «UTC»). Пригодные клетки, полученные из ткани пуповины человека, выделены из ткани пуповины человека и по существу свободны от крови, способны к самообновлению и размножению в культуре, а также обладают потенциалом к дифференцированию. Популяции UTC и UTC могут обнаруживаться в рамках способов настоящего изобретения, которые подробно описаны как в настоящем документе, так и в патентах США № 7510873; 7524489; и заявке на патент США № 2005/005863.
A. Выделение и рост клеток, полученных из ткани пуповины человека
В соответствии со способами, описанными в настоящем документе, пуповину млекопитающего получают по завершении доношенной или недоношенной беременности, например, после отделения последа, или вскоре после этого. Ткань неонатального материала можно транспортировать с места родов в лабораторию в стерильном контейнере, таком как колба, лабораторный стакан, чашка для культивирования или пакет. Контейнер может содержать раствор или среду, включая, без ограничений, солевой раствор, такой как, например, модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM) (также известная как минимальная питательная среда Дульбекко) или фосфатно-солевой буфер (ФСБ), либо любой раствор, применяемый для транспортировки органов, используемых для трансплантации, такой как раствор, разработанный в Университете штата Висконсин, или перфторированный раствор. В среду или буферный раствор можно добавить один или более антибиотиков и/или антимикотиков, включая, без ограничений, пенициллин, стрептомицин, амфотерицин B, гентамицин и нистатин. Ткань неонатального материала можно промыть в растворе антикоагулянта, таком как гепаринсодержащий раствор. До экстрагирования UTC ткань предпочтительно поддерживать при температуре приблизительно 4–10°. Еще более предпочтительно не замораживать ткань до извлечения клеток UTC.
Выделение UTC предпочтительно проводить в асептических условиях. Пуповину можно отделить от плаценты с использованием средств, известных специалистам в данной области. Перед выделением UTC из ткани неонатального материала предпочтительно удалить кровь и продукты распада клеток. Например, ткань неонатального материала можно промыть в буферном растворе, неограниченно включая фосфатно-буферный раствор. Промывочный буфер может также содержать один или более антимикотиков и/или антибиотиков, включая, без ограничений, пенициллин, стрептомицин, амфотерицин B, гентамицин и нистатин.
Ткань неонатального материала, представляющую собой цельную пуповину или ее фрагмент или часть, механически измельчают (используя разрезающее или сдвиговое усилие). В предпочтительном в настоящее время варианте осуществления в процедуре выделения клеток также используют способ ферментативного расщепления. Специалистам в данной области известно множество ферментов, которые можно использовать для выделения отдельных клеток из сложных тканевых матриц для облегчения их выращивания в культуре. Свойства расщепляющих ферментов варьируются от слабой расщепляющей способности (например, у дезоксирибонуклеаз и нейтральной протеазы, диспазы) до сильной расщепляющей способности (например, у папаина и трипсина), причем эти ферменты доступны в продаже. Неограничивающий перечень ферментов, совместимых с целями настоящего изобретения, содержит ферменты с муколитической активностью, металлопротеазы, нейтральные протеазы, серинпротеазы (такие как трипсин, химотрипсин или эластаза) и дезоксирибонуклеазы. В настоящее время предпочтительными являются ферменты с активностью, выбранные из металлопротеаз, нейтральных протеаз и ферментов с муколитической активностью. Например, известно использование коллагеназ для выделения различных клеток из тканей. Дезоксирибонуклеазы могут расщеплять одноцепочечные ДНК и позволяют свести к минимуму агглютинацию клеток в процессе выделения. Предпочтительные способы содержат ферментативную обработку, например, с использованием коллагеназы и диспазы, либо коллагеназы, диспазы и гиалуронидазы. В определенных вариантах осуществления на стадии диссоциации используют смесь коллагеназы и нейтральной протеазы (диспазы). В более конкретных вариантах осуществления применяют расщепление в присутствии по меньшей мере одной коллагеназы из Clostridium histolyticum и одного из ферментов с протеазной активностью, диспазы или термолизина. В других вариантах осуществления используют расщепление с использованием ферментов как с коллагеназной, так и диспазной активностью. Также используют способы, которые содержат себя расщепление ферментом с гиалуронидазной активностью помимо ферментов с коллагеназной и диспазной активностью. Специалист в данной области определит, что известно множество способов таких ферментативных обработок для выделения клеток из различных тканей-источников. Например, в способах, составляющих предмет настоящего изобретения, можно применять ферментативные смеси для диссоциации тканей, доступные в продаже под торговым наименованием LIBERASE (Roche, Индианаполис, штат Индиана). Известны и другие источники ферментов, и специалист в данной области также может выделить такие ферменты непосредственно из их природных источников. Специалист в данной области также может оценивать возможности новых или дополнительных ферментов или комбинаций ферментов для выделения клеток, составляющих предмет настоящего изобретения. Предпочтительная продолжительность ферментативной обработки составляет 0,5, 1, 1,5 или 2 часа или более. В других предпочтительных вариантах осуществления ткань инкубируют при температуре 37°C в процессе ферментативной обработки на стадии диссоциации.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ткань неонатального материала разделяют на части, содержащие различные аспекты ткани, такие как, например, неонатальный, неонатальный/материнский и материнский аспекты плаценты. Разделенные части затем диссоциируют с использованием механической и/или ферментативной диссоциации в соответствии со способами, описанными в настоящем документе. Клетки неонатальных или материнских линий можно определить любыми средствами, известными специалистам в данной области техники, например, с использованием анализа кариотипа или гибридизации in situ на Y-хромосому.

Выделенные клетки или ткань пуповины, из которой получают UTC, можно использовать для инициирования, или посева, клеточных культур. Выделенные клетки переносят в стерильные сосуды для культивирования ткани без покрытия или с покрытием внеклеточным матриксом или лигандами, такими как ламинин, коллаген (нативный, денатурированный или сшитый), желатин, фибронектин и другие белки внеклеточного матрикса. UTC культивируют в любой культуральной среде, которая описана в настоящем документе и способна поддерживать рост клеток, такой как, без ограничений, среда DMEM (с высоким или низким содержанием глюкозы), улучшенная среда DMEM, среда DMEM/MCDB 201, основная среда Игла, среда Хэма F10 (F10), среда Хэма F12 (F12), модифицированная по способу Искова среда Дульбекко, ростовая среда для мезенхимальных стволовых клеток (MSCGM), среда DMEM/F12, среда RPMI 1640 и среда, не содержащая сыворотку/субстрат, доступная в продаже под торговым наименованием CELL-GRO-FREE (Mediatech, Inc., Херндон, штат Вирджиния). В культуральную среду можно дополнительно ввести один или более компонентов, включая, например, фетальную бычью сыворотку (FBS), предпочтительно в количестве приблизительно 2–15% (об/об); сыворотку лошади (ES); сыворотку человека (HS); бета-меркаптоэтанол (BME или 2-ME), предпочтительно в количестве приблизительно 0,001% (об/об); один или более факторов роста, например, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов (FGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-1), фактор ингибирования лейкоцитов (LIF) и эритропоэтин (EPO); аминокислоты, включая L-валин; и один или более антибиотиков и/или антимикотиков для борьбы с микробактериальным заражением, таких как пенициллин G, сульфат стрептомицина, амфотерицин B, гентамицин и нистатин, либо индивидуально, либо в комбинации. Культуральная среда может содержать ростовую среду, которая описана в приведенных ниже примерах.
2
2
2
-
Клетки высевают в сосуды для культивирования с плотностью, позволяющей клеткам расти. В предпочтительном варианте осуществления клетки культивировались в атмосфере, содержащей в воздухе от 0 до около 5% CO по объему. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления клетки культивировались в атмосфере, содержащей в воздухе от около 2 до около 25% O, предпочтительно от около 5 до около 20% O в воздухе. Предпочтительно, чтобы клетки культивировались при температуре от около 25 до около 40°C, предпочтительнее, чтобы они культивировались при 37°C. Предпочтительно, чтобы клетки культивировались в термостате. Среда в сосуде для культивирования может быть неподвижной или перемешиваемой, например, при помощи биореактора. Клетки UTC предпочтительно выращивают в условиях низкого окислительного стресса (например, с добавлением глутатиона, витамина C, каталазы, витамина E, N-ацетилцистеина). Термин «условия низкого окислительного стресса» обозначает условия отсутствия или минимального свободнорадикального повреждения культивируемых клеток.
Способы выбора наиболее предпочтительной культуральной среды, подготовки среды и методик культивирования клеток хорошо известны в данной области и описаны в ряде источников, включая руководства Doyle et al., (под ред.), 1995 г., Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley & Sons, Чичестер; и Ho и Wang (ред.), 1991 г., Animal Cell Bioreactors, Butterworth-Heinemann, Boston, которые включены в настоящий документ путем ссылки.
После культивирования выделенных клеток или фрагментов ткани в течение достаточного периода времени клетки UTC прорастают в результате миграции из ткани неонатального материала или деления клеток, либо по обеим причинам. В некоторых вариантах осуществления UTC пассируют или переносят в отдельный сосуд для культивирования, содержащий свежую среду того же типа или другого типа по сравнению с первоначально использованной, в которой популяцию клеток можно митотически размножить. Клетки, составляющие предмет настоящего изобретения, можно применять на любой стадии от пассажа 0 до старения. Клетки предпочтительно пассируют от приблизительно 3 до приблизительно 25 раз, более предпочтительно пассируют от приблизительно 4 до приблизительно 12 раз и предпочтительно пассируют 10 или 11 раз. Для подтверждения выделения клональной популяции клеток можно провести клонирование и/или субклонирование.
В некоторых вариантах осуществления различные виды клеток, находящиеся в неонатальном материале, фракционируются в субпопуляции, из которых могут быть выделены клетки UTC. Фракционирования или отбора можно достигнуть с использованием стандартных методик разделения клеток, включая, без ограничений, ферментативную обработку для диссоциации ткани неонатального материала на составляющие ее клетки с последующим клонированием и отбором определенных видов клеток, включая, без ограничений, отбор на основе морфологических и/или биохимических маркеров; выборочный рост необходимых клеток (положительный отбор), выборочное разрушение нежелательных клеток (отрицательный отбор); разделение на основе различной способности клеток в смешанной популяции к агглютинации, например, с соевым агглютинином; процедуры заморозки-разморозки; различие адгезионных характеристик клеток в смешанной популяции; фильтрование; стандартное и зональное центрифугирование; элютриационное центрифугирование (противоточное центрифугирование); разделение при нормальном поле тяжести; противоточное распределение; элекрофорез; и сортировку флуоресцентноактивированных клеток (FACS). Обзор методик клонального отбора и разделения клеток можно найти в руководстве Freshney, 1994 г., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques, 3-е изд., Wiley-Liss, Inc., Нью-Йорк, которое включено в настоящий документ путем ссылки.
Культуральную среду меняют по необходимости, например, путем осторожной аспирации среды из чашки, например, с помощью пипетки и добавления требуемого количества свежей среды. Инкубацию продолжают до накопления в чашке достаточного количества или плотности клеток. Исходные эксплантированные части ткани можно удалить и трипсинизировать оставшиеся клетки с помощью стандартных методик или с использованием скребка. После трипсинизации клетки собирают, переносят в свежую среду и инкубируют описанным выше способом. В некоторых вариантах осуществления среду заменяют по меньшей мере один раз приблизительно через 24 часа после трипсинизации для удаления плавающих клеток. Оставшиеся в культуре клетки считают клетками UTC.
Клетки UTC могут криоконсервироваться. Соответственно, клетки UTC для аутогенного переноса (либо для матери, либо для ребенка) можно получить из соответствующих послеродовых тканей после рождения ребенка, а затем криоконсервировать их таким образом, чтобы после этого они были доступны в случае возникновения необходимости в трансплантации.
B. Характеристики клеток, полученных из ткани пуповины
Поскольку hUTC можно отличить от МКПК на основании наличия, например, CD45, CD13, CD10 и других маркеров, которые обсуждались выше и в примерах ниже, hUTC обладает множеством других уникальных характеристик.
Клетки UTC могут быть охарактеризованы, например, по ростовым характеристикам (например, способности к удвоению популяции, времени удвоения, количеству пассажей до старения), анализу кариотипа (например, нормальный кариотип; материнская или неонатальная линия), проточной цитометрией (например, анализ FACS), иммуногистохимически и/или иммуноцитохимически (например, на обнаружение эпитопов), по профилю экспрессии генов (например, с использованием генных чипов; полимеразной цепной реакции (например, ПЦР с обратной транскриптазой, ПЦР в реальном времени и стандартной ПЦР)), по белковым чипам, по секреции белков (например, по анализу коагулирующей активности плазмы или анализу среды кондиционированной плазмацитоидными дендритными клетками (ПДК), например, с использованием твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА)), реакции смешанной культуры лимфоцитов (например, как меры стимуляции мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК)) и/или другими способами, известными в данной области техники.
Примеры клеток, полученных из ткани пуповины, хранятся в Американской коллекции клеточных культур (ATCC, 10801 Университетский бульвар, Манассас, штат Вирджиния) с 10 июня 2004 г. под следующими номерами доступа ATCC: (1) штамму UMB 022803 (P7) присвоен № доступа PTA-6067; и (2) штамму UMB 022803 (P17) присвоен № доступа PTA-6068.
В различных вариантах осуществления клетки UTC обладают одной из более из следующих характеристик роста: (1) для роста в культуре им требуется L-валин; (2) они способны к росту в атмосферах, содержащих от около 5% до по меньшей мере около 20% кислорода; (3) они имеют потенциал по меньшей мере для приблизительно 40 удвоений в культуре до старения; и (4) клетки закрепляются и размножаются на поверхности сосуда для культивирования с покрытием или без покрытия, причем сосуд для культивирования с покрытием содержит покрытие из желатина, ламинина, коллагена, полиорнитина, витронектина или фибронектина.
В некоторых вариантах осуществления клетки UTC имеют нормальный кариотип, который сохраняется в процессе пассирования клеток во время культивирования. Способы кариотипирования доступны и известны специалистам в данной области.
В других вариантах осуществления клетки UTC можно охарактеризовать по выработке некоторых белков, включая: (1) выработку по меньшей мере одного из тканевого фактора, виментина и альфа-актина гладких мышц; и (2) выработку по меньшей мере одного из CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-альфа, PD-L2 и маркеров клеточной поверхности HLA-A,B,C по результатам анализа с использованием проточной цитометрии. В других вариантах осуществления клетки UTC можно охарактеризовать по отсутствию выработки по меньшей мере одного из маркеров клеточной поверхности CD31, CD34, CD45, CD80, CD86, CD117, CD141, CD178, B7-H2, HLA-G и HLA-DR,DP,DQ по результатам анализа с использованием проточной цитометрии. Особенно предпочтительны клетки, которые вырабатывают по меньшей мере два из тканевого фактора, виментина и альфа-актина гладких мышц. Также предпочтительно, чтобы эти клетки вырабатывали все три белка из тканевого фактора, виментина и альфа-актина гладких мышц.
В других вариантах осуществления клетки UTC можно охарактеризовать по экспрессии гена, которая, по сравнению с клеткой человека, представляющей собой фибробласт, мезенхимальную стволовую клетку или клетку костного мозга гребня подвздошной кости, повышена для гена, кодирующего по меньшей мере один из: интерлейкина-8; ретикулона 1; CXCL1 (хемокиновый (мотив C-X-C) лиганд 1/стимулятор активности роста меланомы, альфа); CXCL6 (хемокиновый (мотив C-X-C) лиганд 6/белок хемотаксиса гранулоцитов 2); CXCL3 (хемокиновый (мотив C-X-C) лиганд 3); и TNFAIP3 (индуцируемый фактором некроза альфа белок 3).
В других вариантах осуществления клетки UTC можно охарактеризовать по экспрессии гена, которая, по сравнению с клеткой человека, представляющей собой фибробласт, мезенхимальную стволовую клетку или клетку костного мозга гребня подвздошной кости, понижена для гена, кодирующего по меньшей мере один из: SHOX2 (содержащий гомеобокс ген низкорослости 2); HSPB2 (27 кДа белок теплового шока 2); CXCL12 (хемокиновый (мотив C-X-C) лиганд 12/стромальный фактор 1); эластина (надклапанный аортальный стеноз, синдром Вильямса-Бойрена); мРНК Homo sapiens; кДНК DKFZp586M2022 (из клона DKFZp586M2022); Meox2 (содержащий мезенхимальный гомеобокс гена 2, содержащий гомеобокс блокировки роста ген); SIX1 (гомолог содержащего гомеобокс гена sine oculis 1) (Drosophila); кристаллин, альфа B; DAAM2 (ассоциированный с белком Disheveled активатор морфогенеза 2); белка DKFZP586B2420; аналога нейтралина 1; тетранектина (связывающийся с плазминогеном белок); STAC (ген, содержащий домен src-гомологии 3 (SH3) и богатый цистеином домен); холестерин-25-гидроксилазы; RUNX3 (связанный с карликовостью фактор транскрипции 3); рецептора интерлейкина-11, альфа; PCOLCE (усилитель проколлаген-C-эндопептидазы); FZD7 (гомолог frizzled 7) (Drosophila); гипотетического гена BC008967; коллагена, тип VIII, альфа 1; TNC (тенасцин C, гексабрахион); IRX5 (содержащий гомеобокс IRX белок 5); гефестина; интегрина, бета 8; SV2A (гликопротеин синаптического пузырька 2); NBL1 (нейробластома, ген подавления онкогенности 1); IGFBP2 (связывающийся с инсулиноподобным фактором роста белок 2), 36 кДа; кДНК Homo sapiens FLJ12280 fis, клон MAMMA1001744; CRLF1 (подобный цитокиновому рецептору фактор 1); KCNN4 (активируемый кальцием калиевый канал средней/низкой проводимости, подсемейство N, член 4); интегрина, бета 7; транскрипционного коактиватора с мотивом связывания с PDZ (TAZ); SIX2 (гомолог содержащего гомеобокс гена sine oculis 2) (Drosophila); белок KIAA1034; VAMP5 (везикуло-ассоциированный мембранный белок 5/миобревин); EFEMP1 (содержащий EGF фибулинподобный белок внеклеточного матрикса 1); EGR3 (белок раннего ростового ответа 3); DLX5 (содержащий гомеобокс distal-less гена 5); гипотетического белка FLJ20373; AKR1C3 (альдокеторедуктаза семейства 1, член C3/3-альфа-гидроксистероиддегидрогеназа, тип II); бигликана; транскрипционного коактиватора с мотивом связывания с PDZ (TAZ); фибронектина 1; проэнкефалина; интегрина, бета-подобного 1 (с доменами EGF-подобных повторов); мРНК Homo sapiens, полноразмерная вставка кДНК, клон EUROIMAGE 1968422; EphA3 (эфриновый рецептор 3 типа А); белка KIAA0367; NPR3 (рецептор натрийуретического пептида C/гуанилатциклаза C/рецептор атрионатрийуретического пептида C); гипотетического белка FLJ14054; мРНК Homo sapiens; кДНК DKFZp564B222 (из клона DKFZp564B222); геном белка, подобного белку 3, взаимодействующему с BCL2/белком аденовируса E1B 19 кДа; AE-связывающий белок 1; и COX7A1 (полипептид 1 субъединицы VIIa цитохром c оксидазы) (мышечный).
В других вариантах осуществления во время культивирования клетки UTC можно охарактеризовать по секреции по меньшей мере одного из MCP-1, IL-6, IL-8, GCP-2, HGF, KGF, FGF, HB-EGF, BDNF, TPO, MIP1b, 1309, MDC RANTES и TIMPL. Кроме того, во время культивирования клетки UTC можно охарактеризовать по отсутствию секреции по меньшей мере одного из TGF-бета-2, ANG2, PDGFbb, MIP1A и VEGF.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления клетки получают из ткани пуповины по существу без крови, клетки способны к самообновлению и размножению в культуре, требуют для роста L-валин, могут расти в атмосфере с содержанием кислорода по меньшей мере приблизительно 5% и обладают по меньшей мере одной из следующих характеристик: потенциал к по меньшей мере приблизительно 40 удвоениям в культуре; закрепление и размножение на поверхности сосуда для культивирования с покрытием или без покрытия, который содержит покрытие из желатина, ламинина, коллагена, полиорнитина, витронектина или фибронектина; выработка виментина и альфа-актина гладких мышц; выработка CD10, CD13, CD44, CD73 и CD90; и экспрессия гена, которая, по сравнению с клеткой человека, представляющей собой фибробласт, мезенхимальную стволовую клетку или клетку костного мозга гребня подвздошной кости, повышена для гена, кодирующего интерлейкин-8 и ретикулон 1. В некоторых вариантах осуществления подобные клетки UTC не вырабатывают CD45 и CD117.
В предпочтительных вариантах осуществления клетка обладает двумя или более из перечисленных выше характеристик роста, выработки белков/маркеров клеточной поверхности, экспрессии генов или характеристик секреции веществ. Более предпочтительна клетка, обладающая тремя, четырьмя, пятью или более характеристиками. Еще более предпочтительна клетка UTC обладающая шестью, семью, восьмью или более характеристиками. Более предпочтительна клетка, обладающая всеми из перечисленных выше характеристик.
Среди клеток, которые в настоящее время предпочтительны для использования в целях настоящего изобретения в некоторых его аспектах, имеются постнатальные клетки, обладающие описанными выше характеристиками, и, в частности, те из них, которые имеют нормальные кариотипы и поддерживают нормальные кариотипы при пассировании, и дополнительно те из них, которые экспрессируют каждый из маркеров CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-альфа и HLA-A,B,C, причем клетки вырабатывают иммунологически детектируемые белки, соответствующие перечисленным маркерам. Более предпочтительными являются клетки, которые, в дополнение к вышесказанному, не вырабатывают белки, соответствующие любому из маркеров CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 или HLA-DR,DP,DQ, по результатам анализа с использованием проточной цитометрии.
В одном варианте осуществления клетки UTC выделены из ткани пуповины человека по существу свободными от крови, способными к самообновлению и размножению в культуре, обладающими потенциалом к дифференцированию, не вырабатывающими CD117 или CD45, экспрессирующими CD10 и CD13 и не экспрессирующими hTERT или теломеразу. Подобные клетки UTC необязательно экспрессируют рецептор окисленных липопротеинов низкой плотности 1, ретикулон, лиганд хемокинового рецептора 3 и/или гранулоцитарный хемотаксический белок; и/или не экспрессируют CD31 или CD34; и/или экспрессируют, по отношению к фибробластам, мезенхимальным стволовым клеткам или клеткам костного мозга гребня подвздошной кости человека, повышенные уровни интерлейкина-8 или ретикулона 1; и/или экспрессируют CD44, CD73 и CD90.
В другом варианте осуществления клетки UTC выделены из ткани пуповины человека по существу свободными от крови, способными к самообновлению и размножению в культуре, обладающими потенциалом к дифференцированию, экспрессирующими CD10, CD13, CD90 и HLA-ABC, а также не экспрессирующими CD34, CD45, CD117 и HLA-DR. В необязательном порядке подобные клетки также не экспрессируют hTERT или теломеразу. В одном варианте осуществления клетки также экспрессируют CD44 и CD43. В еще одном варианте осуществления клетки также не экспрессируют CD31. Подобные клетки UTC необязательно: (i) экспрессируют рецептор окисленных липопротеинов низкой плотности 1, ретикулон, лиганд хемокинового рецептора 3 и/или гранулоцитарный хемотаксический белок; и/или (ii) экспрессируют, по отношению к фибробластам, мезенхимальным стволовым клеткам или клеткам костного мозга гребня подвздошной кости человека, повышенные уровни интерлейкина-8 или ретикулона 1.
В альтернативном варианте осуществления клетки UTC выделены из ткани пуповины человека по существу свободными от крови, способными к самообновлению и размножению в культуре, обладающими потенциалом к дифференцированию и следующими характеристиками: (1) экспрессия CD10, CD13, CD44, CD90 и HLA-ABC; (2) отсутствие экспрессии CD31, CD34, CD45, HLA-DR и CD117, а также (3) отсутствие экспрессии hTERT или теломеразы. В другом варианте осуществления клетки UTC выделены из ткани пуповины человека по существу свободными от крови, способными к самообновлению и размножению в культуре, обладающими потенциалом к дифференцированию и следующими характеристиками: (1) экспрессия CD10, CD13, CD44, CD90 и HLA-ABC; (2) отсутствие экспрессии CD31, CD34, CD45, HLA-DR и CD117; (3) отсутствие экспрессии hTERT или теломеразы; (4) экспрессия рецептора окисленных липопротеинов низкой плотности 1, ретикулона, лиганда хемокинового рецептора 3 и/или гранулоцитарного хемотаксического белка; и (5) экспрессия, по отношению к фибробластам, мезенхимальным стволовым клеткам или клеткам костного мозга гребня подвздошной кости человека, повышенных уровней интерлейкина-8 или ретикулона 1.
В одном варианте осуществления клетки hUTC представлены популяцией клеток, которые могут быть однородными. В некоторых вариантах осуществления клеточная популяция может быть неоднородной. Неоднородная популяция клеток, составляющая предмет настоящего изобретения, может содержать по меньшей мере приблизительно 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% клеток UTC, составляющих предмет настоящего изобретения. Неоднородная популяция клеток, составляющая предмет настоящего изобретения, может дополнительно содержать стволовые клетки или другие клетки-предшественники, такие как миобласты или другие мышечные клетки-предшественники, а также гемангиобласты, или клетки-предшественники кровеносных сосудов; или она может дополнительно содержать полностью дифференцированные клетки скелетных мышц, клетки гладких мышц, перициты или эндотелиальные клетки кровеносных сосудов. В некоторых вариантах осуществления популяция по существу
Кроме того, в соответствии со следующими примерами и какими-либо частями описания изобретения, клетки hUTC, которые могут быть определены при помощи способов скрининга, можно выделить и охарактеризовать в соответствии с раскрытием сути патентов США № 7510873; 7524489; и опубликованной заявки на патент США № 2005/005863, которые включены в настоящий документ во всей полноте путем ссылки, поскольку они имеют отношение к описанию, выделению и характеристике hUTC. Более того, методики обогащения при помощи магнитных микроносителей описаны в патенте США № 7863012 и опубликованной заявке на патент США № 2011/0147180, которые были включены в настоящий документ во всей полноте путем ссылки, поскольку они имеют отношение к методикам обогащения и магнитным микроносителям.
Без более подробного описания предполагается, что любой специалист в данной области может, используя предыдущее описание и следующие иллюстративные примеры, реализовать и использовать настоящее изобретение и применять на практике заявленные способы. Следующие рабочие примеры, в связи с этим, специально указывают на предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, и не должны быть истолкованы как ограничивающие каким-либо образом остальную часть раскрытия.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Выделение, поддержание стабильности и размножение hUTC
Клетки, полученные из ткани пуповины человека, были выделены у четырех доноров и размножены в питательной среде с добавлением 15% фетальной бычьей сыворотки, что было описано в патентах США № 7510873; 7524489; опубликованной заявке на патент США № 2005/005863 и приведенных ниже Примерах. Культуры, подвергнутые раннему пассажу, были криоконсервированы для создания размножаемого и основного банков клеток, называемых РБК и ОБК соответственно. Стабильность живых культур hUTC поддерживалась при помощи одного из двух следующих способов: 1) адгезивных культур в колбах с тканевыми культурами; и 2) суспензионных культур в колбах с перемешиванием и биореакторах с механическим перемешиванием. В рамках последнего способа клетки сначала были посеяны на микроносители.
Три набора образцов были подвергнуты микроматричному анализу следующим образом: (1) Исследование 1 (Микроматричных анализ донорских клеток); (2) Исследование 2 (Исследование колебания температуры); и (3) Исследование 3 (Исследование биомаркеров).
Исследование 1 (Микроматричных анализ донорских клеток)
5
6
В данном наборе образцов клетки культивировались в колбах с перемешиванием, начиная от УУП (уровня удвоения популяции) 5 клеточной линии, подвергнутой раннему пассажу, до УУП 44. Типичная культура была инициирована путем посева на свежую питательную среду с содержанием инокулята около 5×10 клеток/мл и инкубирована в течение 4 дней, в это время была достигнута максимальная плотность жизнеспособных клеток (ПЖК около 3-4×10клеток/мл). Из всех из тридцати двух (32) образцов периодически отбирались аликвоты культур. В приведенной ниже Таблице 1-1 перечислены образцы для исследования.
Таблица 1-1
Перечень образцов, включенных в Исследование 1(Микроматричный анализ донорских клеток)
Этикетка
Название
Номер донора
R52550
Донор 1; УУП = 11,30
Umb 041505
R52551
Донор 1; УУП = 20,26
Umb 041505
R52552
Донор 1; УУП = 30,06
Umb 041505
R52553
Донор 1; УУП = 33,58
Umb 041505
R52554
Донор 1; УУП = 36,78
Umb 041505
R52555
Донор 1; УУП = 40,03
Umb 041505
R52556
Донор 1; УУП = 43,00
Umb 041505
R52557
Донор 1; УУП = 44,98
Umb 041505
R52559
Донор 2; УУП = 11,30
Umb 072304A
R52560
Донор 2; УУП = 20,92
Umb 072304A
R52561
Донор 2; УУП = 30,29
Umb 072304A
R52562
Донор 2; УУП = 31,13
Umb 072304A
R52563
Донор 2; УУП = 32,66
Umb 072304A
R52564
Донор 2; УУП = 33,01
Umb 072304A
R52565
Донор 2; УУП = 33,81
Umb 072304A
R52558
Донор 2; УУП = 5,00
Umb 072304A
R52567
Донор 3; УУП = 10,79
Umb 083105
R52568
Донор 3; УУП = 20,12
Umb 083105
R52569
Донор 3; УУП = 30,03
Umb 083105
R52570
Донор 3; УУП = 30,45
Umb 083105
R52571
Донор 3; УУП = 31,16
Umb 083105
R52572
Донор 3; УУП = 31,47
Umb 083105
R52573
Донор 3; УУП = 31,69
Umb 083105
Сбор клеток проводился в любой из четырех дней роста, что показано на Фиг.1 (правая сторона). Из списка из 32 образцов для проведения микроматричного анализа были выбраны 24 образца. На Фиг. 1 изображен уровень удвоения популяции (УУП) и участок кривой роста, когда был собран каждый из образцов.
Исследование 2 (Исследование колебания температуры)
В данном наборе образцов перед сбором клетки выдерживались при диапазоне температур от 25°C до 42°C в течение 18 часов. Использованные в данном исследовании образцы показаны в приведенной ниже Таблице 1-2.
Таблица 1-2
Перечень образцов, включенных в Исследование 2(Исследование колебания температуры)
Этикетка
Название
Донор
R52550
Донор 1; УУП = 11,30
Umb 041505
R52551
Донор 1; УУП = 20,26
Umb 041505
R52552
Донор 1; УУП = 30,06
Umb 041505
R52553
Донор 1; УУП = 33,58
Umb 041505
R52554
Донор 1; УУП = 36,78
Umb 041505
R52555
Донор 1; УУП = 40,03
Umb 041505
R52556
Донор 1; УУП = 43,00
Umb 041505
R52557
Донор 1; УУП = 44,98
Umb 01505
R52559
Донор 2; УУП = 11,30
Umb 072304A
R52560
Донор 2; УУП = 20,92
Umb 072304A
R52561
Донор 2; УУП = 30,29
Umb 072304A
R52562
Донор 2; УУП = 31,13
Umb 072304A
R52563
Донор 2; УУП = 32,66
Umb 072304A
R52564
Донор 2; УУП = 33,01
Umb 072304A
R52565
Донор 2; УУП = 33,81
Umb 072304A
R52558
Донор 2; УУП = 5,00
Umb 072304A
R52567
Донор 3; УУП = 10,79
Umb 083105
R52568
Донор 3; УУП = 20,12
Umb 083105
R52569
Донор 3; УУП = 30,03
Umb 083105
R52570
Донор 3; УУП = 30,45
Umb 083105
R52571
Донор 3; УУП = 31,16
Umb 083105
R52572
Донор 3; УУП = 31,47
Umb 083105
R52573
Донор 3; УУП = 31,69
Umb 083105
R52566
Донор 3; УУП = 5,00
Umb 0105
R52575
Донор 4; УУП = 10,71
Umb 090304A
R52576
Донор 4; УУП = 14,66
Umb 090304A
R52577
Донор 4; УУП = 19,55
Umb 090304A
R52578
Донор 4; УУП = 25,06
Umb 090304A
R52579
Донор 4; УУП = 27,25
Umb 090304A
R52580
Донор 4; УУП = 23,60
Umb 090304A
R52581
Донор 4; УУП = 30,15
Umb 090304A
R52574
Донор 4; УУП = 5,00
Umb 090304A
Исследование 3 (Исследование биомаркеров)
В данном исследовании использовался набор из восьми (8) образцов. Клетки были размножены в биореакторе с механическим перемешиванием и собраны при УУП 30. Использованные в данном исследовании образцы показаны в приведенной ниже Таблице 1-3.
Таблица 1-3
Перечень образцов, включенных в Исследование 3(Исследование биомаркеров)
Идентификационный номер эксп.
Название эксп.
E55465
Донор1_РБК_Ранний пассаж УУП 12Набор1
E55466
Донор1_РБК_Ранний пассаж УУП 12_Набор2
E55467
Донор 1_РБК_Поздний пассаж УУП 40_Набор1
E55468
Донор 1_РБК_Поздний пассаж УУП 40Набор2
E55469
Донор 1_РБК_Ранний пассаж УУП 16_Набор1
E55470
Донор 1_РБК_Ранний пассаж УУП 16_Набор2
E55471
Донор 1_РБК_Поздний пассаж УУП 36_Набор1
E55472
Донор 1_РБК_Поздний пассаж УУП 36_Набор2
Анализ данных
Для получения данных микроматричного анализа использовалась матрица Affymetrix GeneChip HT HG-U133+ PM. Данные анализировались в две стадии. На первой стадии данные, полученные в ходе микроматричного анализа в рамках исследования колебания температуры (Исследование 2, Таблица 1-2), использовались для сравнения профиля экспрессии hUTC с профилем экспрессии МКПК человека. Уровень экспрессии различных генов в МКПК был получен из общедоступных источников, включая базу данных Национального центра биотехнологии (NCBI), которая находится в ведении Национальных институтов здравоохранения. На второй стадии использовались данные, полученные в ходе микроматричного анализа в рамках Исследования 1, и архивные данные восьми (8) образцов, которые были получены в Исследовании 3 (см. Таблицы 1-1 и 1-3). Профиль экспрессии hUTC сравнивался с профилем экспрессии (1) МКПК человека (2) МКПК крысы. Профиль экспрессии МКПК человека был получен у здоровых испытуемых людей (исследование в базе данных GSE14642), в то время как профиль экспрессии МКПК крысы был получен в исследованиях GSE11083 и GSE19537 из базы данных NCBI. Профили экспрессии подтипов клеток крови человека (B-клеток, NK-клеток, дендритных клеток, лимфоидных T-клеток, моноцитов и нейтрофилов костного мозга) также были получены из баз данных NCBI (исследование GSE22886 и исследование GSE3982). Кроме того, сбор сведений из баз данных «Генная онтология» (GO) и «Entrez» позволил определить 3976 генов белков плазмы крови человека (GO:0005886), 355 генов белков клеточной поверхности (GO:0009986) и 349 генов антигенов CD. В данное исследование было включено подмножество из 2614 генов цитоплазматической мембраны человека и крысы и 288 генов белков клеточной поверхности было сравнено с генами человека и крысы на микроматрицах, а 315 генов антигенов CD было сравнено с генами человека на микроматрицах.
На основании динамики сигнала экспрессии, т.е. log2 (интенсивности), большего или равного десяти, который является порогом для сигналов высокой экспресии для всех наборов данных, был определен перечень из 314 наборов зондов из более чем 200 генов, которые усиленно экспрессируются в обоих типах образцов. В обоих случаях были выбраны и упорядочены гены, экспрессия которых в hUTC сильно отличается от таковой в МКПК человека. В Таблице 1-4 показан перечень генов, полученных в Исследовании 2, уровень экспрессии которых существенно отличается в hUTC и МКПК человека. Они содержат как белки клеточной поверхности и цитоплазматической мембраны, так и внутриклеточные белки.
В Таблице 1-4 выделены гены, которые были определены во всех трех наборах образцов. Жирным шрифтом выделены гены, которые были исследованы более подробно (они содержат DKK3, LAMB1, ANPEP (CD13), LAMP1 (CD107a), PTPRC (CD45), MME (CD10) и NRP1).
Таблица 1-4
Перечень генов, экспрессия которых существенно отличаласьв hUTC и МКПК человека в Исследовании 2
Обозначение гена
Ген в базе данных Entrez
Название гена
KRT19
3880
Кератин 19
DKK3
27122
Гомолог Диккопф 3 (Xenopus laevis)
GJA1
2697
Белок межклеточных щелевых контактов, альфа-1, 43 кДа
LOX
4015
Лизилоксидаза
FBN1
2200
Фибриллин 1
COL3A1
1281
Коллаген, тип III, альфа-1
TPM2
7169
Тропомиозин 2 (бета)
COL1A1
1277
Коллаген, тип I, альфа-1
CYR61
3491
Индуктор ангиогенеза, богатый цистеином, 61
DKK1
22943
Гомолог Диккопф 1 (Xenopus laevis)
CTGF
1490
Фактор роста соединительной ткани
DCBLD2
131566
Дискоидин, содержащий домены CUB и LCCL
ITGB5
3693
Интегрин, бета-5
COL5A1
1289
Коллаген, тип V, альфа-1
THY1
7070
Антиген клеточной поверхности Thy-1
FTL
2512
Ферритин, легкий полипептид
NNMT
4837
Никотинамида N-метилтрансфераза
TMEM47
83604
Трансмембранный белок 47
CDH11
1009
Кадгерин 11, типа 2, ОБ-кадгерин (остеобласта)
SPTBN1
6711
Спектрин, бета, неэритроцитарный 1
RPS19
6223
Рибосомальный белок S19
DCN
1634
Декорин
RPS20
6224
Рибосомальный белок S20
LAMB1
3912
Ламинин, бета-1
COL5A2
1290
Коллаген, тип V, альфа-2
SERP INE2
5270
Ингибитор серпин пептидазы, клада E (нексин)
TPBG
7162
Гликопротеин трофобласта
CLMP
79827
CXADR-подобный белок мембраны
MAP1B
4131
MAP1A (белок, ассоциированный с микротрубочками, 1B)
SLIT2
9353
Гомолог белка Slit 2 (Drosophila)
FRMD6
122786
Белок 6, кодирующийся доменом FERM
CSPG4
1464
Протеогликан 4 хондроитин сульфата
PLOD2
5352
Проколлаген-лизин, 2-оксоглутарат 5-диоксиеназа 2
CDH2
1000
Кадгерин 2, тип 1, N-кадгерин (нейрональный)
COL1A2
1278
Коллаген, тип I, альфа-2
FAT1
2195
Гомолог 1 опухолевого супрессора FAT (Drosophila)
Таблица 1-4
Перечень генов, уровень экспрессии которых существенно отличался в образцах hUTC и МКПК человека в Исследовании 2
Обозначение гена
Ген в базе данных Entrez
Название гена
GNG12
55970
Гуаниннуклеотид-связывающий белок (G-белок), гамма-12
FGG
2266
Гамма-цепь фибриногена
SULF1
23213
Сульфатаза 1
ANTXR 1
84168
Рецептор сибиреязвенного токсина 1
PAPPA
5069
PAPPA-антисмысловая РНК (не кодирующая белок)
MFAP5
8076
Белок, связанный с микротрубочками, 5
SSTR1
6751
Соматостатиновый рецептор 1
CAP2
10486
CAP-белок, белок связанный с аденилатциклазой
EDIL3
10085
Повторы в EGF-подобном домене и I-подобные домены дискоидина
TEK
7010
TEK, эндотелиальная тирозинкиназа
YAP1
10413
Yes-связанный белок 1
PTRF
284119
Полимераза 1 и фактор освобождения транскрипта
LUM
4060
Люмикан
WWTR1
25937
Домен WW, содержащий регулятор транскрипции
NR2F2
7026
Член подсемейства ядерных рецепторов 2, группа F
ANPEP (CD13)
290
Аланинаминопептидаза (мембранная)
LAMP1 (CD107a)
3916
Мембранный белок, связанный с лизосомами, 1
PTPRC (CD45)
5788
Протеинтирозинфосфатаза рецепторного типа, C
MME (CD10)
4311
Матричная металлопротеиназа
NRP1
8829
Нейропилин 1
В Таблице 1-5 показан перечень генов (полученных в Исследовании 1 и Исследовании 2), уровни экспрессии которых существенно отличаются в hUTC и ИКПК человека. В Таблице 1-5 подчеркиванием выделены гены, которые были определены во всех трех наборах образцов, т.е. в рамках Исследований 1, 2 и 3 (они содержат LAMB1, DKK3 и CAP2). Жирным шрифтом выделены гены, которые были исследованы более подробно (они содержат ANPEP (CD13), LAMP1 (CD107a), PTPRC (CD45), MME (CD10) и NRP 1).
Таблица 1-5
Перечень генов, уровни экспрессии которых существенно отличаются в образцах hUTC и МКПК человека, которые были получены для Исследований 2 и 3
Обозначение гена
Ген в базе данных Entrez
Название гена
LAMB 1
3912
Ламинин, бета-1
LUM
4060
Люмикан
WWTRI
25937
Домен WW, содержащий регулятор транскрипции
DKK3
27122
Гомолог Диккопф 3 (Xenopus laevis)
NR2F2
7026
Член подсемейства ядерных рецепторов 2, группа F
CAP2
10486
CAP-белок, белок связанный с аденилатциклазой, 2
ANPEP (CD13)
290
Аланинаминопептидаза (мембранная)
LAMP1 (CD107a)
3916
Мембранный белок, связанный с лизосомами, 1
PTPRC (CD45)
5788
Протеинтирозинфосфатаза рецепторного типа, C
MME (CD10)
4311
Матричная металлопротеиназа
NRP1
8829
Нейропилин 1
Как показано в Таблице 1-5, в ходе анализа набора образцов из Исследований 2 и 3 было определено одиннадцать генов, включая три гена, которые были определены во всех трех наборах образцов. Из этих одиннадцати генов более подробно были исследованы семь генов (NRP1, DKK3, LAMP1, LAMB1, MME (CD10), PTPRC (CD45) и ANPEP (CD13)).
Из этих семи генов гены NRP1, DKK3, LAMP1, LAMB1 и MME (CD10) являются маркерами клеточной поверхности, в то время как экспрессируемые белки PTPRC (CD45) и ANPEP (CD13) расположены внутриклеточно. Были сравнены уровни экспрессии трех генов, а именно PTPRC (CD45) (идентификационный номер гена: 207238), MME (CD10) (идентификационный номер гена: 203434) и ANPEP (CD13) (идентификационный номер гена: 202888), в hUTC и различных видах клеток крови человека, которые относятся к МКПК. Данное сравнение экспрессии генов белков клеточной поверхности (PTPRC (CD45), MME (CD10) и ANPEP (CD13)) в hUTC и различных видах клеток крови человека, которые относятся к МКПК, показано на Фиг. 2A, B и C соответственно.
Пример 2
Подтверждение наличия определенных маркеров при помощи ПЦР в реальном времени
Затем при помощи ПЦР в реальном времени было проведено подтверждение уровней транскрипции выбранных генов, которые были определены в Примере 1. На Фиг. 3 показаны результаты анализа ПЦР в реальном времени для выбранных генов, экспрессия которых в hUTC сравнивалась с экспрессией в МКПК человека.
Для получения подобных результатов из каждого препарата hUTC была выделена вся РНК, по которой затем была получена кДНК. Затем для проведения ПЦР в реальном времени с кДНК в качестве матрицы были использованы флуоресцентные зонды, специфичные к каждому гену.
На Фиг. 3 показаны результаты ПЦР в реальном времени для MME (CD10), ANPEP (CD13), PTPRC (CD45), DKK3, LAMB1, NRP1, GAPPD и HPRT1 в hUTC и МКПК. За исключением конститутивных генов (GAPDH и HPRT), в hUTC наблюдалась большая концентрация всех исследованных генов в сравнении с МКПК человека. Менее выраженной в hUTC была только экспрессия гена PTPRC (CD45), который использовался в качестве отрицательного контроля, поскольку известно, что этот ген в большом количестве экспрессируется в МКПК человека. В соответствии с Фиг. 3, большее значение конечной точки (КТ) указывает на меньшее количество транскрипта.
Поскольку МКПК содержит различные виды клеток крови, профили экспрессии отобранных генов, которые экспрессируются в каждом из этих видов клеток, сравнивались с профилями экспрессии генов в hUTC. Как показано на Фиг. 2B, хотя относительная экспрессия MME (CD10) в МКПК мала в сравнении с экспрессией в hUTC, в нейтрофилах относительная экспрессия этого гена высока. Аналогичным образом, хотя экспрессия ANPEP (CD13) в hUTC сравнима с экспрессией этого гена в МКПК человека (см. Фиг. 2C), его относительная экспрессия в T-клетках и макрофагах выше, чем в hUTC.
Пример 3
Обнаружение hUTC среди МКПК при помощи проточной цитометрии
Из перечня генов, для которых была показана различная экспрессия в hUTC и МКПК человека (см. Таблицы 1-4 и 1-5), было выбрано подмножество из пяти генов, которые экспрессируют генный продукт, находящийся на поверхности клетки и/или в цитоплазматической мембране. Кроме того, были выбраны два гена, которые экспрессируют соответствующие белковые продукты внутри клетки. Подобные маркеры включали NRP1, DKK3, LAMB, LAMP1, MME (CD10), PTPRC (CD45) и ANPEP (CD13).
Для проведения анализа методом проточной цитометрии клетки были собраны во время фазы экспоненциального роста, после чего они были фиксированы и пермеабилизованы при помощи набора, приобретенного у компании BD Bioscience. Затем аликвота данного препарата была инкубирована с антителами против выбранных маркеров, которые должны находиться на поверхности hUTC, а именно CD10, CD13, CD45, NRP1 и LAMP 1. После удаления излишка антител клетки были инкубированы с флуоресцентно меченым вторичным антителом. Затем клетки подверглись анализу с использованием проточного цитометра.
На Фиг. 4A-4C показаны результаты анализа методом проточной цитометрии для обнаружения маркеров клеточной поверхности, цитоплазматической мембраны и внутриклеточной среды. На Фиг. 4A показаны маркеры клеточной поверхности, которые были определены при помощи hUTC с верхней панелью в качестве контроля. На Фиг. 4B показаны маркеры клеточной поверхности, которые были определены при помощи МКПК с верхней панелью в качестве контроля. На Фиг. 4C показаны результаты анализа проточной цитометрии для обнаружения внутренних маркеров DKK3 и LAMP1 в МКПК и hUTC.
+
4
+
В соответствии с Фиг. 4A, 90% клеток из популяции hUTC были CD13-положительными (CD13), 75% клеток из популяции hUTC были CD10-положительными (CD10), а 17 % клеток из популяции hUTC были NRP1-положительными (NRP1). Ни одна клетка из популяции hUTC не была CD45-положительной или LAMP1-положительной.
+
+
+
+
В соответствии с Фиг. 4B, 6% клеток из популяции МКПК были CD13-положительными (CD13), 2% клеток из популяции МКПК были CD10-положительными (CD10), 4% клеток из популяции МКПК были NRP1-положительными (NRP1), а 72% клеток из популяции МКПК были CD45-положительными (CD45). Ни одна клетка из популяции МКПК не была LAMP1-положительной.
В соответствии с Фиг. 4C, показаны данные анализа методом проточной цитометрии для внутриклеточных маркеров DKK3 и LAMP1. 52% клеток из популяции hUTC были DKK3-положительными. 23% клеток из популяции МКПК были DKK3-положительными. Фиг. 4C указывает на то, что LAMP 1 является хорошим внутренним маркером для hUTC.
За исключением NRP1, маркерные гены белков клеточной поверхности могут использоваться для обнаружения интактных живых клеток hUTC в смешанных образцах, в сыворотке которых содержатся МКПК (см. Фиг. 4A и 4B). Хотя NRP1 в большем количестве транскрибируется в hUTC в сравнении с МКПК человека (Фиг. 3), NRP1 не может быть обнаружен в hUTC при помощи проточной цитометрии (см. Фиг. 4A). В отношении CD45, как и ожидалось, только на поверхности живых МКПК человека наблюдался высокий уровень экспрессии CD45 (см. Фиг. 4B). Кроме того, также исследовались два внутриклеточных маркера LAMP1 и DKK3 (из перечня генов с отличающейся экспрессией, Таблица 1-4), экспрессия которых была выше в hUTC в сравнении с МКПК человека (см. Фиг. 4C). Подобные маркеры могут использоваться в качестве дополнительного подтверждения подлинности hUTC.
В приведенной ниже Таблице 3-1 показаны различия между hUTC и МКПК человека, полученные в ходе анализа методом проточной цитометрии.
Таблица 3-1
Разница между hUTC и МКПК в отношении процента положительных клеток, который был получен при помощи проточной цитометрии
Популяция
% CD13
% CD10
% NRP1
% CD45
% LAMP1
% DKK3
% LAMB
Клетки hUTC
90
70-90
17
0
92
52
н/о
МКПК
6
2
4
45
32
23
н/о
В приведенной ниже Таблице 3-2 обобщены различия между hUTC и МКПК, которые были установлены при помощи ПЦР в реальном времени в приведенном выше Примере 2 и проточной цитометрии в Настоящем примере. В Таблице 3-2 «н/о» означает «не определено».
Таблица 3-2
Краткое изложение результатов анализов методом ПЦР в реальном времени и проточной цитометрии
Микроматричный анализ
ПЦР в реальном времени
Проточный анализ поверхностный маркер
Проточный анализ внутриклеточный маркер
Клетки hUTC
МКПК
Клетки hUTC
МКПК
Клетки hUTC
МКПК
Клетки hUTC
МКПК
MME (CD10)
+
-
+
-
+
-
н/о
н/о
ANPEP (CD13)
+
+
+
+
+
-
н/о
н/о
PTPRC (CD45)
-
+
-
+
-
+
н/о
н/о
LAMP1
+
+
+
+
-
-
+
-
NRP1
+
-
+
-
-
н/о
н/о
Таблица 3-2
Краткое изложение результатов анализов методом ПЦРв реальном времени и проточной цитометрии
Микроматричный анализ
ПЦР в реальном времени
Проточный анализ (поверхностный маркер)
Проточный анализ (внутриклеточный маркер)
Клетки hUTC
МКПК
Клетки hUTC
МКПК
Клетки hUTC
МКПК
Клетки hUTC
МКПК
DKK3
+
-
+
-
н/о
н/о
++
+
LAMB1
+
+
+
-
н/о
н/о
н/о
н/о
Пример 4
Обнаружение hUTC в смеси hUTC и МКПК человека
Для демонстрации обнаружения hUTC в крови различные концентрации hUTC были смешаны с 1 миллионом МКПК человека. Затем смесь подверглась анализу методом проточной цитометрии при помощи CD45 (положительного маркера для МКПК), CD10 и CD13 (положительного маркера для hUTC). В частности, обнаружение hUTC в смеси, содержащей hUTC (в диапазоне от 1500 клеток/мл до 110000 клеток/мл) и МКПК человека (1 миллион клеток/мл), показано на Фиг. 5A и 5B.
В 1 мл сыворотки человека при комнатной температуре было смешано два вида клеток. Непосредственно после этого аликвоты смеси подверглись анализу методом проточной цитометрии при помощи CD10 в качестве маркера hUTC и CD45 в качестве маркера МКПК. На Фиг. 5A концентрация hUTC находится в диапазоне от 1500 до 1700 клеток/мл, а концентрация МКПК человека составляет 1 миллион клеток/мл. На Фиг. 5B концентрация hUTC находится в диапазоне от 1700 до 110000 клеток/мл, а концентрация МКПК человека составляет 1 миллион клеток/мл.
2
2
Как видно на Фиг. 5A, если образец содержит 1700 или более hUTC/мл в присутствии 1 миллиона МКПК человека, то точность определения при помощи проточной цитометрии высока (R=0,94). Если образец содержит от 1500 до 1700 hUTC/мл в присутствии 1 миллиона МКПК человека (Фиг. 5B), то точность определения при помощи проточной цитометрии ниже (R=0,51).
Пример 5
Выделение hUTC
Выделение клеток пуповины. Пуповины получили в Национальном центре по обмену материалами для исследования заболеваний (National Disease Research Interchange/NDRI, г. Филадельфия, штат Пенсильвания). Ткани были получены после нормально прошедших родов. Протоколы выделения клеток проводили в асептических условиях в ламинарном боксе. Для удаления крови и продуктов распада клеток пуповина промывалась в фосфатном буферном растворе (ФСБ; Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния) в присутствии пенициллина в дозе 100 Ед/мл, стрептомицина в дозе 100 мг/мл и амфотерицина B в дозе 0,25 мкг/мл (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния).
2
Затем ткани механически диссоциировали в планшетах для культивирования тканей площадью 150 см в присутствии 50 мл среды (среды DMEM с низким содержанием глюкозы или среды DMEM с высоким содержанием глюкозы; Invitrogen) до измельчения ткани в мелкую пульпу. Размельченные ткани перенесли в конические пробирки объемом 50 мл (приблизительно по 5 г ткани на пробирку).
Затем ткань была расщеплена в среде DMEM с низким содержанием глюкозы или среде DMEM с высоким содержанием глюкозы, каждая из которых содержала пенициллин в дозе 100 Ед/мл, стрептомицин в дозе 100 мг/мл, амфотерицин B в дозе 0,25 мкг/мл и расщепляющие ферменты. В некоторых вариантах осуществления использовалась смесь ферментов из коллагеназы и диспазы («C:D») (коллагеназа (Sigma, Сент-Луис, штат Миссури), 500 Ед/мл; и диспаза (Invitrogen), 50 Ед/мл, в среде DMEM с низким содержанием глюкозы). В других экспериментах использовали смесь коллагеназы, диспазы и гиалуронидазы («C:D:H») (C:D:H = коллагеназа, 500 Ед/мл; диспаза, 50 Ед/мл; и гиалуронидаза (Sigma), 5 Ед/мл, в среде DMEM с низким содержанием глюкозы). Конические пробирки, содержащие ткань, среду и расщепляющие ферменты, инкубировали при температуре 37°C на орбитальном шейкере (Environ, Бруклин, Нью-Йорк) при скорости 225 об/мин в течение 2 ч.
После расщепления ткани центрифугировали при 150×g в течение 5 минут и аспирировали супернатант. Клеточный осадок ресуспендировали и высевали в ростовой среде объемом 20 мл (среда DMEM с низким содержанием глюкозы (Invitrogen), 15% (об/об) фетальной бычьей сыворотки (ФБС; фетальная бычья сыворотка определенного состава; партия № AND18475; Hyclone, Логан, штат Юта), 0,001% (об/об) 2-меркаптоэтанола (Sigma), пенициллин в дозе 100 Ед/мл, стрептомицин в дозе 100 мкг/мл и амфотерицин B в дозе 0,25 мкг/мл (каждый из реагентов приобретен у компании Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния)). Клеточную суспензию фильтровали через нейлоновый клеточный фильтр BD FALCON с размером поры 70 мкм (BD Biosciences, Сан-Хосе, штат Калифорния). Фильтр дополнительно промыли 5 мл ростовой среды. Затем клеточную суспензию пропустили через нейлоновый клеточный фильтр с размером пор 40 мкм (BD Biosciences, Сан-Хосе, штат Калифорния), после чего фильтр дополнительно промыли 5 мл ростовой среды.
Фильтрат ресуспендировали в ростовой среде (до общего объема 50 мл) и центрифугировали при 150×g в течение 5 минут. Супернатант аспирировали, а клетки ресуспендировали в 50 мл свежей ростовой среды. Описанную процедуру повторили еще дважды.
После последнего центрифугирования супернатант аспирировали, а клеточный сгусток ресуспендировали в 5 мл свежей ростовой среды. Количество жизнеспособных клеток определили окрашиванием трипановым синим. Затем клетки культивировали в стандартных условиях.
2
2
Клетки, полученные из ткани пуповины, высевали с плотностью 5000 клеток/смна покрытые желатином колбы T-75 (Corning Inc., Корнинг, штат Нью-Йорк) в ростовой среде. Через два дня из колб аспирировали использованную среду и неприкрепившиеся клетки. Закрепившиеся клетки трижды промывали ФБР для удаления продуктов распада клеток и клеток крови. Затем клетки снова заливали ростовой средой и давали культуре расти до конфлюентности (приблизительно 10 суток от пассажа 0 до пассажа 1). При последующих пассированиях (от пассажа 1 до пассажа 2 и т.д.) клетки достигали субконфлюентности (75–85% конфлюентности) за 4–5 суток. Для данных последующих пассирований клетки высевали с плотностью 5000 клеток/см. Клетки выращивались во влажной камере с 5% углекислого газа при 37°C.
В некоторых вариантах осуществления клетки выделялись из тканей неонатального материала в среду DMEM с низким содержанием глюкозы после расщепления с использованием LIBERASE (2,5 мг/мл, Blendzyme 3; Roche Applied Sciences, Индианаполис, штат Индиана) и гиалуронидазы (5 Ед/мл, Sigma). Расщепление ткани и выделение клеток проводили описаным выше способом для расщепления с использованием других протеаз, используя смесь LIBERASE/гиалуронидазы вместо ферментативной смеси C:D или C:D:H. Расщепление ткани с использованием LIBERASE позволило выделить из тканей неонатального материала популяции клеток, которые легко размножались.
Сравнили между собой процедуры выделения клеток из пуповины с использованием разных комбинаций ферментов. Ферменты, которые сравнивали на расщепление, включали в себя: i) коллагеназу; ii) диспазу; iii) гиалуронидазу; iv) смесь коллагеназа: диспаза (C:D); v) смесь коллагеназа:гиалуронидаза (C:H); vi) смесь диспаза:гиалуронидаза (D:H); и vii) смесь коллагеназа:диспаза:гиалуронидаза (C:D:H). При выделении клеток с использованием данных разных условий ферментативного расщепления наблюдали различия, представленные в Таблице 5-1.
Предприняли другие попытки выделения пулов клеток из пуповины различными способами. В одном случае пуповину нарезали и промывали ростовой средой для отделения сгустков крови и студенистого материала. Смесь крови, студенистого материала и ростовой среды собрали и центрифугировали при 150×g. Клеточный осадок ресуспендировали и высевали в ростовой среде на покрытые желатином колбы. Данные эксперименты позволили выделить популяцию клеток, которые легко размножались.
Клетки также выделили из образцов пуповинной крови, полученных из NDRI. В соответствии с использованным протоколом выделения, совпадающим с международной заявкой на патент PCT/US2002/029971 Ho et al., образцы (50 мл и 10,5 мл соответственно) пуповинной крови (NDRI, Филадельфия, штат Пенсильвания) смешивали с лизирующим буфером (стерилизованным посредством фильтрации 155 мМ хлоридом аммония, 10 мМ бикарбонатом калия, 0,1 мМ буферным ЭДТА с pH 7,2 (все компоненты были приобретены у компании Sigma, Сент-Луис, штат Миссури)). Клетки лизировали при соотношении пуповинной крови к лизирующему буферу 1:20. Полученную суспензию клеток в течение 5 секунд перемешивали на вортексе и затем инкубировали в течение 2 минут при температуре окружающей среды. Лизат центрифугировали (10 минут при 200×g). Клеточный осадок ресуспендировали в полноценной минимальной питательной среде (Gibco, Карлсбад, штат Калифорния), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (Hyclone, Логан, штат Юта), 4 мМ глутамина (Mediatech, Херндон, штат Виргиния), пенициллин в дозе 100 Ед/мл и стрептомицин в дозе 100 мкг/мл (Gibco, Карлсбад, штат Калифорния). Повторно суспендированные клетки центрифугировали (10 минут при 200×g), супернатант отсасывали и клеточный осадок промывали в полной среде. Клетки высевали непосредственно либо в колбы T75 (г. Корнинг, штат Нью-Йорк) либо в покрытые ламинином колбы T75, либо в покрытые фибронектином колбы T175 (все колбы производства Becton Dickinson, г. Бедфорд, штат Массачусетс).
Чтобы определить возможность выделения популяций клеток в разных условиях и их размножения в различных условиях сразу после выделения клетки расщепляли в ростовой среде с добавлением или без добавления 0,001% (об/об) 2-меркаптоэтанола (Sigma, Сент-Луис, штат Миссури) с использованием комбинации ферментов C:D:H в соответствии с описанными выше процедурами. Все клетки выращивались в присутствии пенициллина в дозе 100 Ед/мл и стрептомицина в дозе 100 мкг/мл. Клетки закреплялись и хорошо размножались между пассажами 0 и 1 при всех исследуемых условиях. Для клеток при условиях 5–8 и 13–16 наблюдали хорошую пролиферацию вплоть до 4 пассажей после посева, после чего их криоконсервировали.
Комбинация ферментов C:D:H обеспечила наилучший выход клеток после выделения и дала клетки, которые размножались в культуре в течение большего количества поколений, чем при использовании других условий (Таблица 5-1). При использовании только коллагеназы или только гиалуронидазы не удалось получить способную к размножению популяцию клеток. Попыток проверить, специфичен ли этот результат к конкретной исследуемой коллагеназе, не предпринималось.
Таблица 5-1
Выделение клеток из ткани пуповины с использованием различных комбинаций ферментов
Расщепляющая ферментативная смесь
Выделенные клетки
Размножение клеток
Коллагеназа
x
x
Диспаза
+ (>10 ч)
+
Гиалуронидаза
x
x
Коллагеназа:Диспаза
++ (<3 ч)
++
Коллагеназа:гиалуронидаза
++ (<3 ч)
+
:Гиалуронидаза
+ (>10 ч)
+
Коллагеназа:Диспаза:Гиалуронидаза
+++ (< 3 ч)
+++
Обозначения: += хорошее, ++ = очень хорошее, +++ = отличное,X = успех не достигнут
Клетки закреплялись и хорошо размножались между пассажами 0 и 1 при всех исследуемых условиях по ферментативному расщеплению и условиям роста (Таблица 5-2). Для клеток при экспериментальных условиях 5–8 и 13–16 наблюдали хорошую пролиферацию вплоть до четырех пассажей после посева, после чего их криоконсервировали. Все клетки криоконсервировали для проведения дальнейшего анализа.
Таблица 5-2
Выделение и размножение в культуре клеток неонатального материала при различных условиях
Режим
среда
15% FBS
BME
Желатин
20% 0<sub>2</sub>
Факторы роста
1
DMEM-Lg
Y
Y
Y
Y
Кол-во
2
DMEM-Lg
Y
Y
Y
Нет (5%)
Кол-во
3
DMEM-Lg
Y
Y
Количество
Y
Кол-во
4
DMEM-Lg
Y
Y
Количество
Нет (5%)
Кол-во
5
DMEM-Lg
Нет (2%)
Y
Нет (ламинин)
Y
EGF/FGF (20 нг/мл)
6
DMEM-Lg
Нет (2%)
Y
Нет (ламинин)
Нет (5%)
EGF/FGF (20 нг/мл)
7
DMEM-Lg
Нет (2%)
Y
Количество(фибронектин)
Y
PDGF/VEGF
8
DMEM-Lg
Нет (2%)
Y
Количество(фибронектин)
Нет (5%)
PDGF/VEGF
9
DMEM-Lg
Y
Кол-во
Y
Y
Кол-во
10
DMEM-Lg
Y
Кол-во
Y
Нет (5%)
Кол-во
11
DMEM-Lg
Y
Кол-во
Количество
Y
Кол-во
12
DMEM-Lg
Y
Кол-во
Количество
Нет (5%)
Кол-во
13
DMEM-Lg
Нет (2%)
Кол-во
Нет (ламинин)
Y
EGF/FGF (20 нг/мл)
14
DMEM-Lg
Нет (2%)
Кол-во
Нет (ламинин)
Нет (5%)
EGF/FGF (20 нг/мл)
15
DMEM-Lg
Нет (2%)
Кол-во
Количество(фибронектин)
Y
PDGF/VEGF
16
DMEM-Lg
Нет (2%)
Кол-во
Количество(фибронектин)
Нет (5%)
PDGF/VEGF
Ядросодержащие клетки быстро закреплялись и росли. Данные клетки анализировали методом проточной цитометрии, и они оказались аналогичны клеткам, полученным методом ферментативного расщепления.
Препараты содержали эритроциты и тромбоциты. Ядросодержащие клетки не закреплялись и не делились в течение первых 3 недель. Среду заменили через 3 недели после посева, не наблюдали никакого закрепления и роста клеток.
Популяции клеток можно успешно выделять из ткани пуповины при помощи комбинации ферментов, содержащей в себя коллагеназу (металлопротеиназа), диспазу (нейтральная протеаза) и гиалуронидазу (фермент с муколитической активностью, который разрушает гиалуроновую кислоту). Также может использоваться смесь LIBERASE, которая представляет собой смесь коллагеназы и нейтральной протеазы. Вместе с гиалуронидазой для выделения клеток также использовали смесь Blendzyme 3, которая представляет собой смесь коллагеназы (4 единицы Вунша/г) и термолизина (1714 единиц казеина/г). Данные клетки легко размножались на протяжении многих пассирований при культивировании в ростовой среде на покрытом желатином пластике.
Клетки также выделили из остаточной крови в пуповинах, но не из пуповинной крови. Присутствие клеток в сгустках крови, смытых с ткани, которые закрепляются и растут в используемых условиях, может быть обусловлено клетками, высвобожденными в процессе рассечения.
Пример 6
Анализ кариотипа клеток
Используемые в клеточной терапии клеточные линии предпочтительно должны быть однородными и свободными от любых примесей клеток других типов. Клетки человека, которые используются в терапевтических целях, должны иметь нормальное количество (46) хромосом с нормальной структурой. Анализ кариотипов образцов клеток был проведен для определения клеточных линий клеток, полученных из пуповины, а также однородных и свободных от клеток, происхождение которых отличается от такового клеток тканей неонатального материала.
Клетки UTC, полученные из тканей неонатального материала новорожденного мальчика, культивировали в ростовой среде. Ткань неонатального материала новорожденного мальчика (X,Y) выбрали для возможности различения неонатальных клеток и материнских клеток (X,X). Клетки высевали с плотностью 5000 клеток на кв. сантиметр в ростовой среде в колбе T25 (Corning, г. Корнинг, штат Нью-Йорк) и размножали до степени конфлюентности 80%. Затем содержащую клетки колбу T25 заполнили по горлышко ростовой средой. Образцы доставили курьером в лабораторию клинической цитогенетики (оцениваемое время транспортировки из лаборатории в лабораторию составляет один час). Хромосомный анализ проводился Центром молекулярной генетики человека & при медицинской школе Нью-Джерси, Ньюарк, штат Нью-Джерси. Клетки анализировали во время метафазы, когда хромосомы видны лучше всего. Из двадцати подсчитанных в метафазе клеток пять проанализировали на количество кариотипов для нормальной однородной популяции клеток (два). Образец клеток охарактеризовали как однородный при наблюдении двух кариотипов. Образец клеток охарактеризовали как неоднородный при наблюдении более двух кариотипов. При определении количества кариотипов (четыре), характерного для неоднородной популяции клеток, подсчитывали и анализировали дополнительные клетки в метафазе.
Все образцы клеток, которые были отправлены для проведения хромосомного анализа, были интерпретированы персоналом цитогенетической лаборатории как нормальные. Три из шестнадцати проанализированных клеточных линий продемонстрировали неоднородный фенотип (XX и XY), указывающий на присутствие клеток как неонатального, так и материнского происхождения (Таблица 6-1). Каждый из образцов клеток был охарактеризован как однородный. (Таблица 6-1).
Таблица 6-1
Результаты кариотипирования клеток hUTC
Ткань
Пассаж
Подсчитано метафазных клеток
Проанализировано метафазных клеток
Количество кариотипов
Кариотип ISCN
Пуповина
23
20
5
2
46, XX
Пуповина
6
20
5
2
46, XY
Пуповина
3
20
5
2
46, XX
В результате хромосомного анализа идентифицированы клетки UTC, полученные из пуповины, кариотипы которых были интерпретированы в лаборатории клинической цитогенетики как нормальные. В результате кариотипического анализа также идентифицированы клеточные линии, свободные от материнских клеток, как было определено по однородному кариотипу.
Пример 7
Определение количества маркеров клеточной поверхности методом проточной цитометрии
Характеризацию белков, или «маркеров», клеточной поверхности методом проточной цитометрии можно применять для определения отличительных признаков клеточной линии. Стабильность экспрессии можно определить по множеству доноров и в клетках, культивировавшихся и обрабатывавшихся в разных условиях. Линии клеток неонатального материала, выделенных из пуповины, охарактеризовали методом проточной цитометрии, получив профиль экспрессии для установления отличительных признаков данных клеточных линий.
Клетки культивировали в ростовой среде в обработанных плазмой колбах для культивирования тканей T75, T150 и T225 (Corning, Корнинг, штат Нью-Йорк) до конфлюентности. Ростовые поверхности колб покрывали желатином инкубацией с 2% (в/об) раствором желатина (Sigma, г. Сент-Луис, штат Миссури) в течение 20 минут при комнатной температуре.
7
Закрепившиеся клетки в колбах промывали фосфатным буферным раствором (ФБР); (Gibco, Карлсбад, штат Миссури) и отделяли трипсином/ЭДТА (Gibco). Клетки собирали, центрифугировали и ресуспендировали в 3% (об/об) ФБС в ФБР при концентрации 1×10/мл. В соответствии с инструкциями производителя добавляли антитело на рассматриваемый маркер клеточной поверхности (см. ниже) к 100 мкл клеточной суспензии и инкубировали смесь в темноте в течение 30 минут при температуре 4°C. После инкубации клетки промывали ФСБ и центрифугировали для удаления несвязавшихся антител. Клетки повторно суспендировали в 500 мкл ФБР и анализировали с использованием проточной цитометрии. Анализ методом проточной цитометрии проводили на анализаторе FACS calibur (Becton Dickinson, Сан-Хосе, штат Калифорния).
Применяли следующие антитела на маркеры клеточной поверхности.
Таблица 7-1
Антитела, использованные в характеризации маркеров клеточной поверхности UDC
Антитело
Производитель
Номер по каталогу
CD10
BD Pharmingen (Сан-Диего, штат Калифорния)
555375
CD13
BD Pharmingen
555394
CD31
BD Pharmingen
555446
CD34
BD Pharmingen
555821
CD44
BD Pharmingen
555478
CD45RA
BD Pharmingen
555489
CD73
BD Pharmingen
550257
CD90
BD Pharmingen
555596
CD117
BD Pharmingen
340529
CD141
BD Pharmingen
559781
PDGFr-альфа
BD Pharmingen
556002
HLA-A, B, C
BD Pharmingen
555553
HLA-DR, DP, DQ
BD Pharmingen
555558
IgG-FITC
Sigma (Сент-Луис, штат Миссури)
F-6522
IgG- PE
SiGMA
P.4685
Клетки, полученные из пуповины, анализировали на пассажах 8, 15 и 20.
Для сравнения различий доноров друг с другом сравнивались клетки, полученные из ткани пуповины, от различных доноров. Клетки, полученные из пуповины, культивировавшиеся на покрытых желатином колбах, также сравнили с клетками, полученными из пуповины, культивировавшимися на непокрытых колбах.
Сравнили результаты четырех процедур для выделения и подготовки клеток. Клетки были получены из ткани неонатального материала путем обработки: 1) коллагеназой; 2) коллагеназой/диспазой; 3) коллагеназой/гиалуронидазой; и 4) коллагеназой/гиалуронидазой/диспазой.
Все проанализированные методом проточной цитометрии клетки, полученные из пуповины, на пассажах 8, 15 и 20 экспрессировали CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-альфа и HLA-A, B, C, на что указывают повышенные значения флуоресценции по сравнению с используемым в качестве контроля IgG. Данные клетки были отрицательными в отношении CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 и HLA-DR, DP, DQ, на что указывают значения флуоресценции, согласующиеся с используемым в качестве контроля IgG.
Все проанализированные методом проточной цитометрии клетки, полученные из пуповины и выделенные у разных доноров, показали положительную выработку CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-альфа и HLA-A, B, C, на что указывают повышенные значения флуоресценции по сравнению с используемым в качестве контроля IgG. Данные клетки были отрицательными в отношении выработки CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 и HLA-DR, DP, DQ, на что указывают значения интенсивности флуоресценции, согласующиеся с величинами для используемого в качестве контроля IgG.
Все проанализированные методом проточной цитометрии клетки, полученные из пуповины и размноженные на покрытых желатином и непокрытых колбах, показали положительную выработку CD10, CD13,
CD73, CD 90, PDGFr-альфа и HLA-A, B, C, на что указывают повышенные значения флуоресценции по сравнению с используемым в качестве контроля IgG. Данные клетки были отрицательными в отношении выработки CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 и HLA-DR, DP, DQ, на что указывают значения интенсивности флуоресценции, согласующиеся с величинами для используемого в качестве контроля IgG.
Анализ клеток, полученных из пуповины, методом проточной цитометрии позволил установить отличительные особенности данных клеточных линий. Подобные клетки, полученные из пуповины, положительны в отношении CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-альфа и HLA-A,B,C; и отрицательны в отношении CD31, CD34, CD117, CD141 и HLA-DR, DP, DQ. Данные отличительные признаки стабильны при изменении различных переменных, включая донора, номер пассажа, покрытие поверхности сосуда для культивирования, расщепляющие ферменты и плацентарный слой. Наблюдаются некоторые вариации в средних значениях и диапазонах изменения кривых гистограмм значений флуоресценции, но все положительные кривые при всех исследуемых условиях имели нормальный вид и значения интенсивности флуоресценции, превышающие значения для используемого в качестве контроля IgG, тем самым подтверждая, что клетки представляют собой однородную популяцию с положительной экспрессией маркеров.
ПРИМЕР 8
Анализ клеток при помощи олигонуклеотидных чипов
Для сравнения профилей экспрессии генов клеток, полученных из пуповины и плаценты, с профилями экспрессии для фибробластов, мезенхимальных стволовых клеток человека и другой клеточной линии, полученной из костного мозга человека, использовали олигонуклеотидные чипы. Данный анализ позволил охарактеризовать полученные из послеродового материала клетки и идентифицировать уникальные молекулярные маркеры данных клеток.
2
Клетки, полученные из ткани неонатального материала. Пуповины и плаценту человека получили в Национальном центре по обмену материалами для исследования заболеваний (NDRI, Филадельфия, штат Пенсильвания) после нормально прошедших родов при доношенной беременности с согласия пациента. Ткани были получены, а клетки выделили способом, описанным в Примере 5, после расщепления смесью C:D:H. Клетки культивировали в ростовой среде на покрытых желатином пластиковых колбах для культивирования тканей. Культуры инкубировали при 37°C в атмосфере с 5% CO.
Фибробласты. Фибробласты дермы человека приобретались у компании Cambrex Incorporated (Уолкерсвилл, штат Мэриленд; партия № 9F0844) и ATCC CRL-1501 (CCD39SK). Обе линии культивировали в среде DMEM/F12 (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния) с добавлением 10% (об/об) фетальной бычьей сыворотки (Hyclone) и пенициллина/стрептомицина (Invitrogen). Клетки выращивались на стандартном культивированной тканью пластике.
2
Мезенхимальные стволовые клетки человека (hMSC). Клетки hMSC приобрели у компании Cambrex Incorporated (Уолкерсвилл, штат Мэриленд; партии № 2F1655, 2F1656 и 2F1657) и культивировали в соответствии с техническими требованиями производителя в среде MSCGM (Cambrex). Клетки растили на стандартном культивированном тканью пластике при температуре 37°C в атмосфере с 5% CO.
4
3
2
2
2
4
2
Клетки костного мозга гребня подвздошной кости человека (ICBM). Костный мозг гребня подвздошной кости человека получили из NDRI с согласия пациента. Костный мозг обрабатывали в соответствии со способом, изложенным Ho, et al. (заявка на международный патент № WO03/025149). Костный мозг смешивали с лизирующим буфером (155 мМ NHCl, 10 мМ KHCO и 0,1 мМ ЭДТА, pH 7,2) в соотношении 1 часть костного мозга к 20 частям лизирующего буфера. Суспензию клеток перемешали на вортексе, инкубировали в течение 2 минут при температуре окружающей среды и центрифугировали в течение 10 минут при 500×g. Супернатант удалили, а клеточный осадок повторно растворили в минимальной поддерживающей среде-альфа (Invitrogen) с добавлением 10% (об/об) фетальной бычьей сыворотки и 4 мМ глутамина. Клетки еще раз центрифугировали и клеточный осадок повторно растворили в свежей среде. Количество жизнеспособных мононуклеарных клеток определили тестом на вытеснение трипанового синего (Sigma, Сент-Луис, штат Миссури). Мононуклеарные клетки высевали в пластиковые колбы для культивирования тканей в количестве 5×10 клеток/см. Клетки инкубировали при температуре 37°C в атмосфере с 5% CO и стандартным содержанием O или 5% O. Клетки культивировали в течение 5 суток без замены среды. Среду и незакрепившиеся клетки удаляли после 5 дней культивирования. Закрепившиеся клетки поддерживали в культуре.
Активно растущие культуры клеток удаляли из колб при помощи скребка для клеток в холодный фосфатный буферный раствор (ФБР). Клетки центрифугировали в течение 5 минут при 300×g. Супернатант удаляли, клетки повторно суспендировали в свежем ФСБ и центрифугировали еще раз. Супернатант удаляли, а клеточный осадок немедленно замораживали и хранили при -80°C. Клеточную мРНК экстрагировали и транскрибировали в кДНК. Затем кДНК транскрибировали в кРНК и пометили биотином. Меченую биотином кРНК гибридизировали с олигонуклеотидным чипом Affymetrix GENECHIP HG-U133A (Affymetrix, Санта-Клара, штат Калифорния). Гибридизации и сбор данных проводились в соответствии с техническими требованиями производителя. Анализ данных проводили при помощи программного обеспечения версии 1.21 «Достоверность микроматричных анализов» (SAM) (Tusher, V.G. et al., 2001 г., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 5116-5121). Лицензии для аналитического программного обеспечения можно приобрести в Управлении лицензирования технологий Стэнфордского университета, а более подробную информацию можно получить во всемирной сети на веб-сайте профессора Тибширани с кафедры статистики Стэндфордского университета.
В рамках данного исследования анализу подверглись четырнадцать различных популяций клеток. В Таблице 8-1 перечислены клетки, информация о их пассировании, субстрат для культивирования и питательная среда для культивирования. Клеточные линии перечислены вместе со своими идентификационными номерами, сведениями о пассировании на момент анализа, субстратом для роста клеток и ростовой средой.
Таблица 8-1
Клетки, проанализированные на микрочипах
Клеточная популяция
Пассаж
Субстрат
Среды
Клетки пуповины (022803)
2
Желатин
DMEM, 15% ФБР, 2-BME
Клетки пуповины (042103)
3
Желатин
DMEM, 15% ФБР, 2-BME
Клетки пуповины (071003)
4
Желатин
DMEM, 15% ФБР, 2-BME
Клетки плаценты (042203)
12
Желатин
DMEM, 15% ФБР, 2-BME
Клетки плаценты (042903)
4
Желатин
DMEM, 15% ФБР, 2-BME
Таблица 8-1
Клетки, проанализированные на микрочипах
Клеточная популяция
Пассаж
Субстрат
Среды
Клетки плаценты (071003)
3
Желатин
DMEM, 15% ФБР, 2-BME
Клетки ICBM (070203) (5% O<sub>2</sub>)
3
Пластик
DMEM, 10% ФБР
Клетки ICBM (062703) (станд. O<sub>2</sub>)
5
Пластик
DMEM, 10% ФБР
ICBM (062703 )(5% O<sub>2</sub>)
5
Пластик
DMEM, 10% ФБР
Клетки hMSC (партия 2F1655)
3
Пластик
MSCGM
Клетки hMSC (партия 2F1656)
3
Пластик
MSCGM
Клетки hMSC (партия 2F1657)
3
Пластик
MSCGM
Фибробласты человека (9F0844)
9
Пластик
DMEM-F12, 10% FBS
Фибробласты человека (CCD39SK)
4
Пластик
DMEM-F12, 10% FBS
Данные были оценены при помощи анализа главных компонентов с использованием программного обеспечения SAM описанным выше способом. В ходе анализа были выявлены 290 генов, которые экспрессировались в исследуемых клетках в различных сравнительных количествах. Данный анализ позволил провести сравнительное сопоставление популяций друг с другом.
В Таблице 8-2 представлены евклидовы расстояния, рассчитанные для сравнения клеточных пар. Евклидовы расстояния были основаны на сравнении клеток на основе 290 генов, которые дифференциально экспрессировались в клетках разных типов. Евклидово расстояние обратно пропорционально схожести в экспрессии 290 генов. Евклидово расстояние рассчитывали для видов клеток при помощи 290 генов, которые по-разному экспрессируются в этих видах клеток. Схожесть клеток обратно пропорциональна евклидовому расстоянию.
Таблица 8-2
Евклидовы расстояния для клеточных пар
Клеточная пара
Евклидово расстояние
ICBM-hMSC
24,71
Плацента-пуповина
25,52
ICBM-фибробласт
36,44
ICBM-плацента
37,09
Фибробласт-MSC
39,63
ICBM-пуповина
40,15
Фибробласт-пуповина
41,59
MSC-плацента
42,84
MSC-пуповина
46,86
ICBM-плацента
48,41
В Таблицах 8-3, 8-4 и 8-5 показана экспрессия генов, повышенная в клетках, полученных из плаценты (Таблица 8-3), повышенная в клетках, полученных из пуповины (таблица 8-4) и пониженная в клетках, полученных из пуповины и плаценты (Таблица 8-5).
Таблица 8-3
Гены со специфически повышенной экспрессией в клетках, полученных из плаценты, по сравнению с другими проанализированными клеточными линиями
ИД набора зондов
Название гена
Номер доступа NCBI
209732_at
CLEC2B (C-типа (кальцийзависимый, домен распознавания углеводов) лектин, член 2 суперсемейства (индуцируемый активацией))
AF070642
206067_s_at
WT1 (белок опухоли Вильмса 1)
NM_024426
207016_s_at
ALDH1A2 (белок 1 семейства альдегиддегидрогеназ, член A2)
AB015228
206367_at
Ренин
NM_000537
210004_at
OLR1 (рецептор 1 окисленных ЛПНП (лектинподобных)
AF035776
214993_at
Homo sapiens, клон IMAGE:4179671, мРНК, частичная кодовая последовательность
AF070642
202178_at
PRKCZ (протеинкиназа C, дзета)
NM_002744
209780_at
гипотетический белок DKFZp564F013
AL136883
204135_at
DOC1 (понижаемый при раке яичника белок 1)
NM_014890
213542_at
мРНК Homo sapiens; кДНК DKFZp547K1113 (из клона DKFZp547K1113)
A1246730
Таблица 8-4
Гены, экспрессия которых специфически повышена в клетках, полученных из пуповины, в сравнении с другими исследованными линиями клеток
ИД набора зондов
Название гена
Номер доступа NCBI
202859_x_at
Интерлейкин 8
NM_000584
211506_s_at
Интерлейкин 8
AF043337
210222_sat
Ретикулон 1
BC000314
204470_at
CXCL1 (хемокиновый (мотив C-X-C) лиганд 1 (стимулятор активности роста меланомы))
NM001511
206336_at
CXCL6 (хемокиновый (мотив C-X-C) лиганд 6 (белок хемотаксиса гранулоцитов 2))
NM_002993
207850_at
CXCL3 (хемокиновый (мотив C-X-C) лиганд 3)
NM_002090
203485_at
Ретикулон 1
NM 021136
202644_s_at
TNFAIP3 (индуцируемый фактором некроза опухоли альфа белок 3)
NM_006290
Таблица 8-5
Гены, экспрессия которых специфически снижена в клетках, полученных из пуповины и плаценты, в сравнении с другими исследованными линиями клеток
ИД набора зондов
Название гена
№ доступа в базе данных NCBI
210135_s_at
SHOX2 (содержащий гомеобокс ген низкорослости 2)
AF022654.1
205824_at
HSPB2 (27 кДа белок теплового шока 2)
NM_001541.1
209687_at
CXCL12 (хемокиновый (мотив C-X-C) лиганд 12/стромальный фактор 1)
U19495.1
203666_at
CXCL12 (хемокиновый (мотив C-X-C) лиганд 12/стромальный фактор 1)
NM_000609.1
212670_at
эластин (надклапанный аортальный стеноз, синдром Вильямса-Бойрена)
AA479278
213381_at
мРНК Homo sapiens; кДНК DKFZp586M2022 (из клона DKFZp586M2022)
N91149
206201_s_at
мезенхимальный гомеобокс 2 (гомеобокс блокировки роста)
NM_005924.1
205817_at
SIX1 (гомолог содержащего гомеобокс гена Sine oculis 1) (Drosophila)
NM_005982.1
209283_at
Кристаллин, альфа B
AF007162.1
212793_at
DAAM2 (ассоциированный с белком Disheveled активатор морфогенеза 2)
BF513244
213488_at
Белок DKFZP586B2420
AL050143.1
209763_at
Аналог нейтралина 1
AL049176
205200_at
Тетранектин (связывающийся с плазминогеном белок)
NM_003278.1
205743_at
STAC (ген, содержащий домен src-гомологии 3 (SH3) и богатый цистеином домен)
NM 003149.1
Таблица 8-5
Гены, экспрессия которых специфически снижена в клетках, полученных из пуповины и плаценты, в сравнении с другими исследованными линиями клеток
ИД набора зондов
Название гена
№ доступа в базе данных NCBI
20092l_s_at
BTG1 (ген транслокации B-клеток 1, антипролиферативный)
NM_001731.1
206932_at
Холестерин-25-гидроксилаза
NM_003956.1
204198_s_at
RUNX3 (связанный с карликовостью фактор транскрипции 3)
AA541630
219747_at
Гипотетический белок FLJ23191
NM_024574.1
204773_at
Рецептор интерлейкина-11, альфа
NM_004512.1
202465_at
PCOLCE (усилитель проколлаген-C-эндопептидазы)
NM_002593.2
203706_s_at
FZD7 (гомолог Frizzled 7) (Drosophila)
NM_003507.1
212736_at
Гипотетический ген BC008967
BE299456
214587_at
Коллаген, тип VIII, альфа-1
BE877796
201645_at
TNC (тенасцин C, гексабрахион)
NM_002160.1
210239_at
IRX5 (содержащий гомеобокс IRX белок 5)
U90304.1
203903_s_at
Гефестин
NM_014799.1
205816_at
Интегрин, бета-8
NM_002214.1
203069_at
SV2A (гликопротеин синаптического пузырька 2)
NM_014849.1
213909_at
Homo sapiens кДНК FLJ12280 fis, клон MAMMA1001744
AU147799
206315_at
CRLF1 (подобный цитокиновому рецептору фактор 1)
NM 004750.1
204401_at
KCNN4 (активируемый кальцием калиевый канал средней/низкой проводимости, подсемейство N, член 4)
NM 002250.1_
216331_at
Интегрин, альфа 7
AK022548.1
209663_s_at
Интегрин, альфа 7
AF072132.1
213125_at
Белок DKFZP586L151
AW007573
202133_at
Транскрипционный коактиватор с мотивом связывания с PDZ (TAZ)
AA081084
206511_s_at
SIX1 (гомолог содержащего гомеобокс гена Sine oculis 2) (Drosophila)
NM_016932.1
213435_at
Белок KIAA1034
AB028957.1
206115_at
EGR3 (белок раннего ростового ответа 3)
NM_004430.1
213707_s_at
Гомеобокс distal-less 5
NM 005221.3
21818l_s_at
Гипотетический белок FLJ20373
NM 017792.1
209160_at
AKR1C3 (альдокеторедуктаза, семейства 1, член C3/3-альфа-гидроксистероиддегидрогеназа, тип II)
AB018580.1
213905_x_at
Бигликан
AA845258
201261_x_at
Бигликан
BC002416.1
202132_at
Транскрипционный коактиватор с мотивом связывания с PDZ (TAZ)
AA081084
214701_s_at
Фибронектин 1
AJ276395.1
213791_at
Проэнкефалин
NM_006211.1
205422_s_at
Интегрин, бета-подобный 1 (с доменами EGF-подобных повторов)
NM_004791.1
214927_at
мРНК Homo sapiens, полноразмерная вставка кДНК, клон EUROIMAGE 1968422
AL359052.1
206070_s_at
EphA3
AF213459.1
212805_at
Белок KIAA0367
AB002365.1
219789_at
NPR3 (рецептор натрийуретического пептида C/гуанилатциклаза C/рецептор атрионатрийуретического пептида C)
AI628360
219054_at
Гипотетический белок FLJ14054
NM_024563.1
213429_at
мРНК Homo sapiens; кДНК DKFZp564B222 (из клона DKFZp564B222)
AW025579
204929_s_at
VAMP5 (везикуло-ассоциированный мембранный белок 5/миобревин)
NM_006634.1
201843_s_at
EFEMP1 (содержащий EGF фибулинподобный белок внеклеточного матрикса 1)
NM_004105.2
Таблица 8-5
Гены, экспрессия которых специфически снижена в клетках, полученных из пуповины и плаценты, в сравнении с другими исследованными линиями клеток
ИД набора зондов
Название гена
№ доступа в базе данных NCBI
221478_at
BNIP3L (ген белка, подобного белку 3, взаимодействующему с BCL2/белком аденовируса E1B 191 кДа)
AL132665.1
201792_at
AE-связывающий белок 1
NM_001129.2
204570_at
полипептид 1 субъединицы Vila цитохром c оксидазы) (мышечный)
NM_001864.1
201621_at
NBL1 (нейробластома, ген подавления онкогенности 1)
NM_005380.1
202718_at
IGFBP2 (связывающийся с инсулиноподобным фактором роста белок 2, 36 кДа)
NM_000597.1
В Таблицах 8-6, 8-7 и 8-8 показаны гены, экспрессия которых повышена в фибробластах человека (Таблица 8-6), клетках ICBM (Таблица 8-7) и клетках MSC (Таблица 8-8).
Таблица 8-6
Гены, экспрессия которых повышена в фибробластах человекав сравнении с другими исследованными линиями клеток
DUSP2 (фосфатаза двойной специфичности 2)
Белок KIAA0527
Homo sapiens, кДНК: FLJ23224 fis, клон ADSU02206
динеин, цитоплазматический, промежуточный полипептид 1
ANK3 (анкирин 3, перехват Ранвье (анкирин G))
INHBA (ингибин, бета A (активин A, активин AB-альфа-полипептид))
ENPP4 (эндонуклеотид-пирофосфатаза/фосфодиэстераза 4 (предполагаемая функция))
белок KIAA1053
MAP1A (белок, ассоциированный с микротрубочками 1A)
ZNF41 (цинк-пальцевый белок 41)
белок HSPC019
Homo sapiens, кДНК: FLJ23564 fis, клон LNG10773
мРНК Homo sapiens; кДНК DKFZp564A072 (из клона DICFZp564A072)
LIM-белок (аналогичный связывающемуся с протеинкиназой C крысы, класс enigma)
IKBKAP (ингибитор усилителя гена легкого полипептида каппа в B-клетках, ассоциированный с киназным комплексом белок)
гипотетический белок FLJ22004
Человеческая (клон CTG-A4) последовательность мРНК
ESTs, умеренно сходный с CRLF2 (подобный цитокиновому рецептору фактор 2); предшественник цитокинового рецептора CRL2 [Homo sapiens]
TGF-бета2 (трансформирующий фактор роста бета-2)
гипотетический белок MGC29643
антиген, идентифицируемый моноклональным антителом MRC OX-2
предполагаемый белок, связанный с X-хромосомой ретинопатией
Таблица 8-7
Гены, экспрессия которых повышена в клетках ICBM в сравнении с другими исследованными линиями клеток
Белок повтора сердечного анкирина
MHC, класс I, участок ORF
Интегрин, альфа 10
Гипотетический белок FLJ22362
UDP-N-ацетил-альфа-D-галактозамин:полипептид N-ацетилгалактозаминилтрансфераза 3 (GalNAc-T3)
Индуцируемый интерфероном белок 44
SRY (определяющий пол участок Y)-бокс 9 (кампомелическая дисплазия, аутосомная реверсия пола)
Ассоциированный с кератином белок 1-1
Подобный гиппокальцину 1
AG1 (jagged 1 (синдром Алажиля))
Протеогликан 1, секреторная гранула
Таблица 8-8
Гены, экспрессия которых повышена в клетках MSC в сравнении с другими исследованными линиями клеток
Интерлейкин 26
Мальтаза-глюкоамилаза (альфа-глюкозидаза)
Ядерный рецептор, подсемейство 4, группа A, член 2
v-fos FBJ гомолог вирусного онкогена мышиной остеосаркомы
Гипотетический белок DC42
Ядерный рецептор, подсемейство 4, группа A, член 2
FBJ гомолог вирусного онкогена мышиной остеосаркомы B
WISP1 (индуцируемый WNT1 белок сигнального пути 1)
Трансформирующая последовательность MCF.2, полученная из клеточной линии
KCNK15 (калиевый канал, подсемейство K, член 15)
CART1 (хрящевой гомеобелок 1)
Homo sapiens кДНК FLJ12232 fis, клон MAMMA1001206
Homo sapiens кДНК FLJ34668 fis, клон LIVER2000775
JUNB (прото-онкоген jun B)
BCL6 (B-клеточный CLL/лимфома 6 (цинк-пальцевый белок 51))
ZFP36 (цинк-пальцевый белок 36, тип C3H, гомолог (мышиный))
Настоящее примерное исследование провели для получения молекулярной характеризации клеток, полученных из пуповины и плаценты. Анализ включал клетки, полученные из трех различных пуповин и трех различных плацент. Исследование также включало две различные линии фибробластов дермы, три линии мезенхимальных стволовых клеток и три линии клеток костного мозга гребня подвздошной кости. Экспрессируемая данными клетками мРНК подверглась анализу с использованием олигонуклеотидного чипа GENECHIP, который содержал олигонуклеотидные зонды для 22000 генов.
Анализ позволил обнаружить транскрипты 290 генов, которые присутствуют в различных количествах в пяти различных видах клеток. Данные гены содержат десять генов, экспрессия которых специфически повышается в клетках, полученных из плаценты, и семь генов, экспрессия которых специфически повышается в клетках, полученных из пуповины. Было обнаружено пятьдесят четыре гена со специфически сниженными уровнями экспрессии в клетках, полученных из плаценты, и клетках, полученных из ткани пуповины.
Пример 9
Иммуногистохимическая характеризация клеточных фенотипов
Провели иммуногистохимический анализ фенотипов клеток, присутствующих в ткани пуповины человека.
Ткань пуповины человека собрали и фиксировали погружением в 4% (в/об) раствор параформальдегида в течение ночи при температуре 4°C. Иммуногистохимический анализ проводился с использованием антител к следующим эпитопам (см. Таблицу 8-1): Виментин (1:500; Sigma, Сент-Луис, штат Миссури), дезмин (1:150, выработанные на кролика; Sigma; или 1:300, выработанные на мышь; Chemicon, Темекула, штат Калифорния), альфа-актин гладких мышц (SMA; 1:400; Sigma), цитокератин 18 (CK18; 1:400; Sigma), фактор фон Виллебранда (vWF; 1:200; Sigma) и CD34 (CD34 человека, класс III; 1:100; DAKOCytomation, Карпинтерия, штат Калифорния). Кроме того, тестировали следующие маркеры: античеловеческий GRO-альфа – PE (1:100; Becton Dickinson, Франклин Лейкс, штат Нью-Джерси), античеловеческий GCP-2 (1:100; Santa Cruz Biotech, Санта-Крус, штат Калифорния), рецептор 1 окисленных ЛПНП против человека (ox-LDL R1; 1:100; Santa Cruz Biotech) и анти-человеческий NOGO-A (1:100; Santa Cruz Biotech). Фиксированный препарат иссекали скальпелем и поместили в герметизирующий реактив OCT (Tissue-Tek OCT; Sakura, Торранс, штат Калифорния) на бане из сухого льда с этанолом. Затем замороженные блоки нарезали на части толщиной 10 мкм с использованием стандартного криостата (Leica Microsystems) и установили на предметные стекла для окрашивания.
Иммуногистохимический анализ провели аналогично предыдущим исследованиям. (E.g., Messina et al., Exper. Neural., 2003; 184: 816-829). Части тканей промывали фосфатным буферным раствором (ФБР) и обрабатывали белковым блокирующим раствором, содержащим ФБР, 4% (об/об) козьей сыворотки (Chemicon, Темекула, штат Калифорния) и 0,3% (об/об) Тритона (Triton X-100; Sigma), в течение 1 часа для доступа к внутриклеточным антигенам. Когда рассматриваемый эпитоп находился на клеточной поверхности (CD34, ox-LDL R1), Тритон исключали на всех стадиях процедуры, чтобы не допустить потери эпитопа. Кроме того, когда первичное антитело было выработано на козу (GCP-2, ox-LDL R1, NOGO-A), в течение всей процедуры вместо козьей сыворотки использовали 3% (об/об) ослиную сыворотку. Затем части обрабатывали в течение 4 часов при комнатной температуре первичными антителами, разбавленными в блокирующем растворе. Растворы первичных антител удаляли, а культуры промывали культуры ФБР перед добавлением растворов вторичных антител (1 час при комнатной температуре), содержащих блокирующий раствор вместе с конъюгатом козьего антимышиного IgG – Texas Red (1:250; Molecular Probes, Юджин, штат Орегон) и/или конъюгатом козьего антикроличьего IgG – Alexa 488 (1:250; Molecular Probes), либо конъюгатом ослиного антикозьего IgG, меченого флуоресцеинизотиоцианатом (1:150; Santa Cruz Biotech). Культуры промывали и обрабатывали 10-микромолярным раствором DAPI (Molecular Probes) в течение 10 минут для визуализации клеточных ядер.
После иммунного окрашивания получали флуоресцентные изображения с использованием соответствующего фильтра для флуоресценции на инвертированном эпи-флуоресцентном микроскопе (Olympus, Мелвилл, штат Нью-Йорк). Положительное окрашивание представляло собой флуоресцентный сигнал выше сигнала окрашивания контроля. Показательные изображения получали с использованием цветной цифровой видеокамеры и программного пакета ImagePro (Media Cybernetics, Карлсбад, штат Калифорния). Для образцов с тройным окрашиванием каждое изображение получали с использованием только одного фильтра на эмиссию. Затем получили послойные монтажи с использованием программного обеспечения Adobe Photoshop (Adobe, г. Сан-Хосе, штат Калифорния).
Таблица 9-1
Обзор использованных первичных антител
Антитело
Концентрация
Производитель
Виментин
1:500
Sigma, Сент-Луис, штат Миссури
Дезмин (rb)
1:150
SiGMA
Дезмин (m)
1:300
Chemicon, Темекула, штат Калифорния
Альфа-актин гладких мышц (SMA)
1:400
SiGMA
Цитокератин 18 (CK18)
1:400
SiGMA
Фактор Виллебранда (vWF)
1:200
SiGMA
CD34 III
1:100
DakoCytomation, Карпинтерия, штат Калифорния
GRO-альфа-PE
1:100
BD, Франклин Лейкс, штат Нью-Джерси
GCP-2
1:100
Santa Cruz Biotech
Ox-LDL R1
1:100
Santa Cruz Biotech
NOGG-A
1:100
Santa Cruz Biotech
+
Маркеры виментин, дезмин, SMA, CK18, vWF и CD34 экспрессировались подмножеством клеток, присутствующих в пуповине (данные не приведены). В частности, экспрессия vWF и CD34 ограничивалась кровеносными сосудами, находящимися внутри пуповины. CD34-положительные (CD34) клетки находились в самом внутреннем слое (обращенном в просвет). Эспрессию виментина обнаружили по всему матриксу и кровеносным сосудам пуповины. Экспрессия SMA ограничивалась матриксом и внешними стенками артерии и вены, но не проходила внутри самих сосудов. CK18 и дезмин наблюдали только внутри сосудов, причем экспрессия дезмина ограничивалась только средним и внешними слоями.
Ни один из данных маркеров не обнаружили в ткани пуповины (данные не приведены).
Маркеры виментин, дезмин, альфа-актин гладких мышц, цитокератин 18, фактор Виллебранда и CD 34 экспрессируются в клетках пуповины человека. На основании исследований, посвященных характеризации in vitro, было показано, что экспрессируются только виментин и альфа-актин гладких мышц, причем данные свидетельствуют о том, что текущий процесс выделения субпопуляции клеток, полученных из пуповины, приводит к изменению экспрессии маркеров, вследствие чего в клетках начинают экспрессироваться виментин и альфа-актин гладких мышц.
Пример 10
Секреция трофических факторов
Измерялась секреция выбранных трофических факторов в клетках UTC. Факторы были выбраны исходя из их ангиогенной активности, например, фактор роста гепатоцитов (HGF) (Rosen et al., Ciba Found. Symp., 1997; 212:215-26); моноцитарный хемотактический белок 1 (MCP-1) (Salcedo et al., Blood, 2000; 96;34-40); интерлейкин-8 (IL-8) (Li et al., J. Immunol., 2003; 170:3369-76); фактор роста кератиноцитов (KGF); основной фактор роста фибробластов (bFGF); фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) (Hughes et al., Ann. Thorac. Surg. 2004; 77:812-8); тканевый ингибитор матриксной металлопротеиназы 1 (TIMP1); ангиопоэтин 2 (ANG2); тромбоцитарный фактор роста (PDGFbb); тромбопоэтин (TPO); связывающийся с гепарином эпидермальный фактор роста (HB-EGF); стромальный фактор роста-1-альфа (SDF-1-альфа); нейтротрофической/нейропротекторной активности (нейротрофический фактор из тканей головного мозга (BDNF) (Cheng et al., Dev. Biol., 2003; 258; 319-33); интерлейкин-6 (IL-6); гранулоцитарный хемотактический белок-2 (GCP-2); трансформирующий фактор роста бета-2 (TGF-бета-2)); или хемокиновой активности (макрофагальный белок воспаления-1-альфа (MlP-1-альфа); макрофагальный белок воспаления-1-бета (MIP-1-бета); хемоаттрактант-1 моноцитов (MCP-1); Rantes (хемокин, экспрессируемый и выделяемый нормальными T-клетками при активации); 1309; хемокин тимуса, регулируемый активацией (TARC); Эотаксин; хемокин макрофагов (MDC); и (IL-8).
2
Клетки, полученные из ткани пуповины, а также фибробласты человека, полученные из неонатальной крайней плоти человека, культивировали в ростовой среде в покрытых желатином колбах T75. На пассаже 11 клетки криоконсервировали и замораживали в жидком азоте. После размораживания в клетки добавляли ростовую среду, переносили их в пробирку для центрифугирования объемом 15 мл и центрифугировали при 150×g в течение 5 минут. Клеточный осадок ресуспендировали в 4 миллилитрах ростовой среды, после чего клетки подсчитывали. Клетки высевали в количестве 5000 клеток/см в колбы T75, каждая из которых содержала 15 мл ростовой среды, и культивировали в течение 24 часов. Среду меняли на бессывороточную среду (DMEM с низким содержанием глюкозы (Gibco), 0,1% (масса/об) альбумин бычьей сыворотки (Sigma), пенициллин (50 Ед/мл) и стрептомицин (50 мкг/мл) (Gibco)) и культивировали в течение 8 часов. В конце инкубации кондиционированную бессывороточную среду собрали центрифугированием при 14000×g в течение 5 минут и хранили при температуре -20°C.
Для определения количества клеток в каждой колбе клетки были промыты в фосфатном буферном растворе (ФБР) и отделены при помощи 2 мл трипсина/ЭДТА (Gibco). Активность трипсина ингибировали добавлением 8 миллилитров ростовой среды. Клетки центрифугировали при 150×g в течение 5 минут. Супернатант удалили, а клетки ресуспендировали в 1 миллилитре ростовой среды. Количество клеток устанавливали при помощи гемоцитометра.
2
Клетки выращивали при температуре 37°C в присутствии 5% CO и атмосферной концентрации кислорода. Количество MCP-1, IL-6, VEGF, SDF-1-альфа, GCP-2, IL-8 и TGF-бета-2, вырабатываемое каждым образцом клеток, определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) (R&D Systems, Миннеаполис, штат Миннесота). Все анализы проводили в соответствии с инструкциями производителей. Представленные значения выражены в пикограммах на мл на миллион клеток (n=2, сканирующая электронная микроскопия).
Хемокины (MIP1a, MIP1b, MCP-1, Rantes, I309, TARC, эотаксин, MDC, IL8), BDNF и ангиогенные факторы (HGF, KGF, bFGF, VEGF, TIMP1, ANG2, PDGF-bb, TPO, HB-EGF) определяли с использованием протеомных массивов SearchLight (Pierce Biotechnology Inc.). Протеомные массивы представляют собой мультиплексные твердофазные иммуноферментные сэндвич-системы для количественного определения от 2 до 16 белков на лунку. Массивы получают, нанося матрицу 2×2, 3×3 или 4×4 разные антитела захвата в каждую лунку 96-луночного планшета. После проведения процедуры сэндвич-ИФА снимают изображение всего планшета для получения сигнала хемилюминесценции, генерируемого в каждой точке матрицы в каждой лунке планшета. Сигнал, генерируемый в каждой точке матрицы, пропорционален количеству целевого белка в исходном стандартном или анализируемом образце.
MCP-1 и IL-6 секретировались клетками PPDC, полученными из ткани пуповины, и фибробластами дермы (Таблица 10-1). SDF-1-альфа и GCP-2 секретировались фибробластами. GCP-2 и IL-8 секретировались клетками PPDC, полученными из ткани пуповины. При использовании твердофазного иммуноферментного анализа во всех видах клеток не был обнаружен TGF-бета-2.
Таблица 10-1
Результаты твердофазного иммуноферментного анализа:Обнаружение трофических факторов
MCP-1
IL-6
VEGF
SDF-lα
GCP-2
IL-8
TGF-бета-2
Фибробласты
17±1
61±3
29±2
19±1
21±1
н/о
н/о
Клетки пуповины (022803)
1150±74
4234±289
н/о
н/о
160±11
2058±145
н/о
Клетки пуповины(071003)
2794±84
1356±43
н/о
н/о
2184±98
2369±23
н/о
Обозначения: н/о: не обнаружено, =/- сканирующая электронная микроскопия
Мультиплексный твердофазный ИФА SearchlightTM. TIMP1, TPO, KGF, HGF, FGF, HBEGF, BDNF, M1P 1 beta, MCP1, RANTES, 1309, TARC, MDC и IL-8 секретировались клетками PPDC, полученными из пуповины (Таблицы 10-2 и 10-3). Ang2, VEGF или PDGFbb не были обнаружены.
Таблица 10-2
Результаты мультиплексного твердофазного ИФА SearchlightTM
TIMP1
ANG2
PDGFbb
TPO
KGF
HGF
FGF
VEGF
HBEGF
BDNF
hF B
19306,3
н/о
н/о
230,5
5,0
н/о
н/о
27,9
1,3
н/о
U1
57718,4
н/о
н/о
1240,0
5,8
559,3
148,7
н/о
9,3
165,7
U3
21850,0
н/о
н/о
1134,5
9,0
195,6
30,8
н/о
5,4
388,6
Обозначения: hFB (фибробласты человека), U1 (клетки PPDC, полученные из пуповины (022803)), U3 (клетки PPDC, полученные из пуповины (071003)),н/о: не обнаружено.
Таблица 10-3
Результаты мультиплексного твердофазного ИФА SearchlightTM
Mff'la
Mffilb
MCP1
RANTES
1309
TARC
Эотаксин
MDC
IL8
Hfb
н/о
н/о
39,6
н/о
н/о
0,1
н/о
н/о
204,9
U1
н/о
8,0
1694,2
н/о
22,4
37,6
н/о
18,9
51930,1
U3
н/о
5,2
2018,7
41,5
11,6
21,4
н/о
4,8
10515,9
Обозначения: hFB (фибробласты человека), U1 (клетки PPDC, полученные из пуповины (022803)), U3 (клетки PPDC, полученные из пуповины (071003)),н/о: не обнаружено
Клетки, полученные из пуповины, секретируют множество трофических факторов. Некоторые из данных трофических факторов, такие как HGF, bFGF, MCP-1 и IL-8, играют важные роли в ангиогенезе. Другие трофические факторы, такие как BDNF и IL-6, играют важные роли в регенерации или защите нервной ткани.
Пример 11
Анализ теломеразной активности
Функция теломеразы состоит в синтезе теломерных повторов, которые защищают целостность хромосом и продлевают репликативно-активную жизнь клеток (Liu, K, et al., PNAS, 1999 г.; 96:5147-5152). Теломераза состоит из двух компонентов - теломеразного РНК-шаблона (hTER) и теломеразной обратной транскриптазы (hTERT). Регулирование теломеразы определяется транскрипцией hTERT, но не hTER. Таким образом, полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени для мРНК hTERT является общепринятым способом определения теломеразной активности клеток.
Выделение клеток
Для определения выработки теломеразы в клетках, полученных из ткани пуповины человека, провели эксперименты по ПЦР в реальном времени. Клетки, полученные из ткани пуповины человека, были подготовлены в соответствии с приведенными выше Примерами и примерами, изложенными в патенте США № 7510873. По существу пуповины, полученные в Национальном центре по обмену материалами для исследования заболеваний (NDRI, г. Филадельфия, штат Пенсильвания) после нормально прошедших родов, промывали для удаления крови и продуктов распада клеток и механически диссоциировали. Затем ткань инкубировали с расщепляющими ферментами, включая коллагеназу, диспазу и гиалуронидазу, в культуральной среде при 37°C. Клетки, полученные из ткани пуповины человека, культивировались в соответствии со способами, изложенными в примерах заявки ʹ012. Мезенхимальные стволовые клетки и нормальные фибробласты дермы кожи (cc-2509 партия № 9F0844) получили от компании Cambrex, г. Уолкерсвилл, штат Мэриленд. Клеточная линия плюрипотентных клеток тестикулярной эмбиональной карциномы (тератокарциномы) человека nTera-2 cells (NTERA-2 cl.D1) (See, Plaia et al., Stem Cells, 2006; 24(3):531-546) была приобретена в Американской коллекции клеточных культур (Манассас, штат Вирджиния) и культивировалась в соответствии со способами, изложенными в патенте США № 7510873.
Выделение всей РНК
РНК экстрагировали из клеток с использованием набора RNeasy (Qiagen, г. Валенсия, штат Калифорния). РНК элюировали 50 микролитрами обработанной DEPC воды и хранили при температуре -80°C. Обратную транскрипцию РНК проводили с использованием случайных гексамеров, применяя реагенты для обратной транскрипции TaqMan (Applied Biosystems, Фостер Сити, штат Калифорния) при температуре 25°C в течение 10 минут, температуре 37°C в течение 60 минут и температуре 95°C в течение 10 минут. Пробы хранили при температуре -20°C.
ПЦР в реальном времени
ПЦР проводили на образцах кДНК с использованием продуктов для экспрессии генов Assays-on-Demand™ компании Applied Biosystems (также известные как наборы для определения экспрессии генов TaqMan Gene Expression Assays) в соответствии с инструкциями производителя. Данный доступный в продаже набор широко используют для анализа клеток человека на теломеразу. Вкратце, hTert (ген теломеразы человека) (Hs00162669) и GAPDH человека (внутренний контроль) смешивали с кДНК и универсальным мастер-миксом для ПЦР TaqMan, при этом использовали секвенатор 7000 с программным обеспечением ABI Prism 7000 SDS (Applied Biosystems). Использовали следующие условия термоциклирования: сначала 50°C в течение 2 минут и 95°C в течение 10 минут, затем 40 циклов по 95°C в течение 15 секунд и 60°C в течение 1 минуты. Данные ПЦР анализировали в соответствии с рекомендациями производителя.
Клетки, полученные из ткани пуповины человека (номер доступа ATCC PTA-6067), фибробласты и мезенхимальные стволовые клетки анализировали на hTert и 18S РНК. Как показано в Таблице 11-1, hTert и, следовательно, теломеразу не обнаружили в клетках, полученных из ткани пуповины человека.
Таблица 11-1
hTERT
18S РНК
Клетки пуповины (022803)
н/о
+
Фибробласты
н/о
+
н/о: не обнаружено; + сигнал обнаружен
Проанализировали клетки, полученные из ткани пуповины человека (изолят 022803, номер доступа ATCC PTA-6067), и клетки nTera-2, и результаты показали отсутствие экспрессии теломеразы в двух партиях клеток, полученных из ткани пуповины человека, тогда как клеточная линия тератокарциномы экспрессировала теломеразу на высоком уровне (Таблица 11-2).
Таблица 11-2
Тип клеток
hTERT
GAPDH
hTERT норм.
Exp. 1
Exp. 2
Exp. 1
Exp. 2
nTera2
25,85
27,31
16,41
16,31
0,61
022803
-
-
22,97
22,79
-
Следовательно, можно сделать вывод, что клетки, полученные из ткани пуповины человека, которые описываются в настоящем документе, не экспрессируют теломеразу.
Хотя изобретение было описано и проиллюстрировано ссылками на различные конкретные материалы, процедуры и примеры, следует понимать, что изобретение не ограничивается конкретными комбинациями материалов и процедур, выбранными для этой цели. Многочисленные изменения, касающиеся таких деталей изобретения, будут очевидными для специалистов в данной области техники. Подразумевается, что все описания и примеры представлены только в качестве иллюстрации и находятся в пределах сущности и объема настоящего изобретения, что отражено в нижеприведенной формуле изобретения. Все ссылки, патенты и заявки на патенты, приведенные в этой заявке, полностью включены в этот документ путем отсылки.