СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЕЙ
METHOD OF PREPARING ORGANIC SOLVENTS

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения органических растворителей - бутанола, ацетона и этанола путем биосинтеза углеводсодержащих материалов.
Микробиологическим путем указанные растворители начали производить в 10-х годах XX века с использованием бактерии вида Clostridium acetobutylicum в основном из пищевого сырья (глюкозы сахарного тростника, свеклы, кукурузы, пшеницы, маниоки).
При сбраживании глюкозы бактерии этого рода синтезируют одновременно бутанол, ацетон и этанол, с процентным соотношением примерно 60:30:10 (соответственно). Это соотношение не является строго постоянным и может незначительно изменяться в сторону увеличения выхода того или иного продукта брожения.
Представляется интересным иметь возможность влиять на соотношение растворителей для целей преимущественного получения того или иного из них, в частности бутанола или ацетона. Доля этанола в процессе незначительна, тем более что существуют иные способы его получения.
При этом известно, что на соотношение целевых продуктов оказывают влияние различные факторы. В значительной степени на соотношение растворителей влияет состав исходного сырья, используемого для брожения. Так, при культивировании на мучных средах различные штаммы Clostridium acetobutylicum синтезируют бутанол, ацетон, этанол в соотношении 63:26:11 соответственно. (Корнеева О.С., Жеребцов Н.А. и др. Роль амилолитических ферментов Clostridium acetobutylicum в биосинтезе растворителей. Биотехнология, 1986 г., №3, стр.133-136).
Известно также, что снижение температуры брожения с 30°С до 24°С в течение 16 часов приводит к следующему соотношению растворителей: бутанол 77,6%, ацетон 19,1% и этанол 3,3% (US 2198104). Однако указанное снижение температуры значительно замедляет скорость реакции брожения, приводит к образованию побочных продуктов и уменьшает общий выход растворителей.
Описан (CN 101250496, 27.08.2008) штамм Clostridium acetobutylicum SB-1 CGMCC No. 2287, полученный методами генной инженерии, при использовании которого соотношение органических растворителей в процессе биосинтеза может смещаться в сторону увеличения содержание бутанола до 68-75%. Однако известно, что относительный недостаток генетических инструментов для манипуляций с метаболизмом Clostridium acetobutylicum и ее медленный рост не позволяют добиться ощутимых результатов при практическом использовании. (Eric J. Steen, et al. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the production of n-butanol. Microbial Cell Factories, 7:36, 03.12.2008).
Таким образом, авторами не были обнаружены технические решения, позволяющие в значительной степени регулировать соотношение растворителей в процессе биосинтеза углеводсодержащих материалов, тем более изменять его во время самого процесса.
Технической задачей настоящего изобретения является создание способа, который позволил бы изменять соотношение органических растворителей - бутанола, ацетона и этанола в процессе биосинтеза углеводсодержащих материалов для преимущественного получения того или иного органического растворителя.
Для решения этой задачи предложен способ получения органических растворителей, предусматривающий биосинтез углеводсодержащего сырья с помощью бактерий вида Clostridium acetobutylicum, в котором осуществляют изменение соотношения получаемых органических растворителей путем воздействия на продуцирующую культуру понижением давления.
При этом предпочтительно указанное воздействие осуществлять на всю культуру в ферментере в процессе биосинтеза углеводсодержащего сырья, но возможно воздействие осуществлять на часть культуры вне процесса биосинтеза углеводсодержащего сырья, отводя часть культуральной жидкости в отдельную емкость, с последующим возвращением ее в процесс.
Предпочтительно понижать давление в ферментере периодически.
Оптимальным является в процессе понижения давления осуществлять отгонку образующихся растворителей, при этом, что понижение давления и отгонку начинают при достижении уровня концентрации растворителей в культуральной среде, приближающейся к ингибирующей для продуцирующей культуры, оптимально - по достижению уровня концентрации растворителей в культуральной среде - 0,6-1,2%, и продолжают до достижения уровня концентрации растворителей в культуральной среде - 0,5-0,2%.
Во время экспериментальных исследований авторами неожиданно было обнаружено, что при создании отрицательного (относительно атмосферного) давления над поверхностью культуральной среды в ферментере классическое соотношение растворителей 60:30:10 (бутанол, ацетон, этанол) изменяется. Возможным объяснением этого является действие переменного давления на биологические системы, что влечет за собой изменение микроокружения клеточных мембран, приводящее к нарушению процессов переноса веществ через мембраны, изменению скоростей ферментативных процессов в клетке, возникновению и развитию репаративных реакций, сопровождаемых новыми синтезами (Акопян В.Б., Коржевенко Г.Н., Шангин-Березовский Г.Н. Скрытый резерв роста и развития живых систем. Вестник сельскохозяйственной науки, 1988, №4, (380), с.96-105).
С практической точки зрения предлагаемый способ позволяет вести процесс биосинтеза с преимущественным синтезом бутанола, как наиболее ценного из органических растворителей, а при необходимости решить задачу получения ацетона для нужд собственного производства. Важным является тот факт, что соотношение растворителей возможно изменять в процессе сбраживания.
Важно также отметить, что, как показали исследования авторов, соотношение образующихся растворителей, зафиксированное во время понижения давления, сохраняется таковым примерно и в течение последующих 20 часов после предыдущего понижения давления.
В данной связи возможным становится вариант осуществления изобретения, при котором воздействие понижением давления осуществляют на часть культуры вне процесса биосинтеза углеводсодержащего сырья с возвращением ее в процесс, что значительно упрощает процесс и его конструктивное оформление.
В этом случае часть культуральной жидкости из ферментера направляют в отдельную емкость, где осуществляют понижение давления, затем культуральную жидкость возвращают обратно в ферментер, при этом в ферментере вся культура будет продуцировать растворители с соотношением, зафиксированным в отдельной емкости во время понижения давления.
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.
9
В ферментер вносят подготовленную стандартным способом углеводо-минеральную смесь (раствор минеральных солей, необходимый набор витаминов и один из возможных источников углерода: глюкозу, маннозу, ксилозу, ферментолизат не пищевых полисахаридов растений в концентрации 2-4%; затем вносят инокулят бактерий Clostridium acetobutylicum, например, с плотностью клеток 1-2 млрд/мл. Через 30 мин после засева начинается интенсивное выделение газов брожения, через 5-6 часов - синтез органических кислот и на 10-12 часах - интенсивный синтез органических растворителей, скорость которого достигает максимума к 28-36 часу. На тот момент концентрация клеток бактерий в ферментере также максимальна - 3·10 клеток/мл суспензии.
2
2
При концентрации органических растворителей в среде 0,6-1,2% снижают давление в ферментере на 0,3-1,0 часа до 0,80-0,95 кг/см, что приводит к изменению соотношения растворителей 60:30:10 на соотношение 70:21:9. Через 6-8 часов осуществляют повторное понижение давления на 0,3-1,0 часа до 0,80-0,95 кг/см, что приводит к дальнейшему изменению соотношения растворителей до 90:9:1.
После удаления образующихся газов вводят в ферментер питательную среду, с содержанием 50 г глюкозы. Раз в три дня в питательную среду добавляют 28 г дрожжевого автолизата.
Изобретение поясняется примерами, которые не носят ограничивающего характера.
Пример 1. В предварительно стерилизованный ферментер с рабочим объемом 3 л вводят 2,5 л 4%-ного раствора глюкозы, 120 г муки, 300 мл инокулята, состоящего из муки (40 г/л), воды и бактерий Clostridium acetobutylicum CK 425, регистрационный номер ВКПМ В-4786 с плотностью 1-2 млрд/мл. Осуществляют ацетон-бутанол-этаноловое брожение при температуре 37°С. Ферментацию продолжают в течение 72 часов. После 72 часов процесс ферментации прекращают и конденсацией отогнанных паров получают в среднем 250 мл раствора (органические растворители 17,5 мл), содержащего 5% бутанола, 1,5% ацетона и 0,5% этанола с соотношением растворителей 60:30:10.
После удаления бутанола и сопутствующих газов вводят в ферментер питательную среду, с содержанием 50 г глюкозы. Раз в три дня в питательную среду добавляют 28 г дрожжевого автолизата.
Пример 2. 120 г предварительно измельченного зерна (обойная мука) смешивают с 2,4 л воды, стерилизуют и вносят в предварительно стерилизованный ферментер с рабочим объемом 3 л. Туда же вносят 300 мл инокулята, содержащего бактерии Clostridium acetobutylicum BKM B-2531D с плотностью 1-2 млрд/мл. Осуществляют ацетон-бутанол-этаноловое брожение при температуре 37°С.
2
2
При концентрации органических растворителей в среде 0,6% снижают давление в ферментере на 0,5 часа до -0,94 кг/см, что приводит к изменению классического соотношения бутанол-ацетон-этанол 60:30:10 (соотношение растворителей 80:15:5). Как только концентрация бутанола в среде достигает 0,5%, давление в ферментере повышают до атмосферного. Через 8 часов осуществляют повторное понижение давления на 0,5 часа до -0,94 кг/см, что приводит к изменению соотношения бутанол-ацетон-этанол 90:9:1.
Конденсацией отогнанных паров во время всей ферментации получают в среднем 250 мл раствора (органические растворители 19,9 мл), содержащего 6,5% бутанола, 1,2% ацетона и 0,25% этанола (соотношение растворителей 81:16:3).
После удаления бутанола и сопутствующих газов вводят в ферментер питательную среду, с содержанием 50 г глюкозы. Раз в три дня в питательную среду добавляют 28 г дрожжевого автолизата.
Пример 3. В предварительно стерилизованный ферментер с рабочим объемом 3 л вводят 2,5 л 4%-ного раствора сахаров древесины и 300 мл инокулята, состоящего из муки (40 г/л), воды и бактерий Clostridium acetobutylicum BKM B-2531D с плотностью 1-2 млрд/мл. Осуществляют непрерывное ацетон-бутанол-этаноловое брожение при температуре 37°С.
2
При концентрации бутанола в среде 1,0% снижают давление в ферментере на 1,0 час до -0,90 кг/см, что приводит к изменению соотношения ацетон-бутанол-этанол
2
30:60:10 на соотношение растворителей 70:21:9. Как только концентрация бутанола в среде достигает 0,4%, давление в ферментере повышают до атмосферного. Через 6 часов осуществляют повторное понижение давления на 1,0 часа до -0,92 кг/см, что приводит к повторному изменению соотношения ацетон-бутанол-этанол. Конденсацией отогнанных паров во время всей ферментации получают в среднем 250 мл раствора (органические растворители 19,9 мл), содержащего 7,5% бутанола, 0,7% ацетона и 0,25% этанола (соотношение растворителей 89:8:3).
После удаления бутанола и сопутствующих газов вводят в ферментер питательную среду, с содержанием 50 г глюкозы. Раз в три дня в питательную среду добавляют 28 г дрожжевого автолизата.
Пример 4
2
2
В предварительно стерилизованный ферментер с рабочим объемом 3 л вводят 2,5 л 4%-ного раствора глюкозы, добавляют 120 г муки, 300 мл инокулята, состоящего из муки (40 г/л), воды и бактерий Clostridium acetobutylicum BKM B-2531D с плотностью 1-2 млрд/мл. Осуществляют ацетон-бутанол-этаноловое брожение при температуре 37°С. При концентрации бутанола в среде 0,9% осуществляют отвод 0,5 литра культуральной жидкости в отдельную емкость. Давление в отдельной емкости снижают до 0,94 кг/см. Конденсацией отогнанных паров получают 50 мл раствора (органические растворители 4,2 мл), который содержит 3,75 мл бутанола, 0,35 мл ацетона и 0,125 мл этанола, соотношение растворителей бутанол:ацетон:этанол равно 89:8:3. Обедненную культуральную жидкость из отдельной емкости (концентрация бутанола 0,2%) возвращают обратно в ферментер. В ферментер вводят питательную среду, содержащую 50 г глюкозы, процесс брожения продолжается. При концентрации бутанола в среде 1,0% вновь осуществляют отвод 0,5 литра культуральной жидкости в отдельную емкость. Давление в отдельной емкости снижают до 0,92 кг/см. Конденсацией отогнанных паров получают 60 мл раствора (органические растворители 5,1 мл), который содержит 4,62 мл бутанола, 0,42 мл ацетона и 0,15 мл этанола, соотношение растворителей бутанол:ацетон:этанол равно 91:6:3. Обедненную культуральную жидкость из отдельной емкости возвращают обратно в ферментер. Затем цикл повторяют вновь. Конденсацией отогнанных паров во время всей ферментации получают в среднем 250 мл раствора (органические растворители 19,9 мл), содержащего 6,5% бутанола, 1,2% ацетона и 0,25% этанола (соотношение растворителей 81:16:3).
Преимущества предложенного способа состоят в возможности целенаправленного изменения соотношения органических растворителей, получаемых биосинтезом углеводсодержащего сырья, непосредственно в процессе сбраживания. Способ позволяет увеличить долевой выход определенного растворителя в зависимости от текущих потребностей в том или ином растворителе в данный момент.