Адаптация полимеразной цепной реакции для диагностики лептоспироза и эпидемиологического надзора за лептоспирозной инфекцией

42

ЗНиСО ЯНВАРЬ №1

АДАПТАЦИЯ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЛЕПТОСПИРОЗА И ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА ЗА ЛЕПТОСПИРОЗНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ

А.Н. Ваганова, Н.А. Стоянов, Н.К. Токаревич

ADAPTATION OF PCR FOR LEPTOSPIROSIS DIAGNOSIS AND EPIDEMIOLOGICAL MONITORING OF LEPTOSPIROSIS INFECTION

A.N. Vaganova, N.A. Stoyanova, N.K.Tokarevich

Федеральное бюджетное учреждение науки Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера

ПЦР позволяет исследовать на присутствие патогенных лептоспир биологический материал от человека и различных животных, в том числе мочу, сыворотку и биоптаты органов. В ходе данного исследования ПЦР с праймерами к гену colA, присутствующему в геноме патогенных лептоспир, но не найденному у сапрофитных представителей рода, была адаптирована для выявления патогенных лептоспир в клиническом и полевом материале. Система показала высокий уровень чувствительности и специфичности при исследовании образцов мочи и сыворотки. Ключевые слова: Leptospira, лептоспироз, диагностика, ПЦР.

PCR allows examining material from human and different animals, including serum and urine, for presence of pathogenic leptospires. In this study, PCR with primers to the gene colA, that present only in pathogenic, but not in saprophytic leptospires, was adopted for pathogenic Leprospira detection in clinical and field specimens. This system showed a high level of sensitivity and specificity in urine and serum examination. Keywords: Leptospira, leptospirosis, diagnostic, PCR.

Лептоспироз — инфекционное заболевание, тяжело протекающее у человека и поражающее ряд млекопитающих, в том числе домашних и сельскохозяйственных животных, для которых часто характерно бессимптомное течение. Лептоспироз-ная инфекция характеризуется разнообразными клиническими проявлениями, в связи с чем необходимо лабораторное подтверждение диагноза. Актуальной проблемой является также разработка доступных методов для скрининговых исследований на носительство лептоспир у животных.

«Золотым стандартом» диагностики лепто-спироза является реакция микроагглютинации (РМА), требующая наличия живых культур лептоспир, с чем связана её трудоёмкость. Результаты РМА, свидетельствующие о лептоспирозной инфекции, могут быть получены, как правило, на второй неделе заболевания и, в ряде случаев, диагноз может быть поставлен только на основании повторного исследования сыворотки с интервалом в несколько дней. Антитела к леп-тоспирам, выявляемые в РМА, могут длительно сохраняться после перенесённого заболевания и вакцинации, что усложняет интерпретацию результата.

Доказательством лептоспирозной этиологии заболевания является обнаружение возбудителя в организме хозяина. Применяемые для этих целей классические микробиологические методы исследования обладают рядом недостатков, таких как низкая чувствительность микроскопии (1) и длительность проведения бактериологического исследования, связанная с тем, что лептоспиры относятся к микроорганизмам, медленно растущим на питательных средах. Указанные ограничения лабораторной диагностики лептоспироза могут быть преодолены при внедрении молекулярно-биологических методов, характеризующихся более высокой чувствительностью по сравнению с

микроскопией, и позволяющих быстро (в течение нескольких часов) получить ответ.

Метод ПЦР позволяет исследовать на присутствие лептоспир сыворотку, мочу, ликвор, (3) внутриглазную жидкость (4) и биоптаты различных органов (2). В настоящее время большая часть тест-систем для детекции лептоспир методом ПЦР рассчитана на выявление возбудителей в сыворотке. Однако немаловажное значение имеет выявление лептоспир в моче, необходимое как для адекватной диагностики, так и для контроля лечения лептоспироза у людей и животных, поскольку к концу первой недели заболевания происходит резкое снижение содержания возбудителя в крови, что связано с выработкой специфических антител в организме хозяина. Персистенция лептоспир в почках, как при острой, так и хронической инфекции сопровождается выделением лептоспир с мочой (1). Важна также адаптация метода для выявления лептоспир в полевом материале, поскольку обнаружение лептоспир в органах животных, отловленных в местах их обитания, необходимо для контроля распространения лептоспирозной инфекции.

Целью данного исследования является разработка тест-системы для детекции лептоспир в биологическом материале и оценка её чувствительности и специфичности.

В качестве генетической мишени был выбран ген colA, продуктом которого является микробная коллагеназа. Анализ структуры данного гена с использованием алгоритма BLAST показал, что наиболее близкие по структуре коллагеназы характерны для представителей рода Bacillus, однако в этом случае сходство не превышает 47 %. Сходство последовательности между видами патогенных лептоспир составляет 88 %, в то время как у сапрофитных лептоспир данный ген не найден. Праймеры были подобраны к консерва-

ЯНВАРЬ №1

43

тивным, специфическим для лептоспир участкам данного гена. Длина амплифицируемого участка составляет 447 п.н. Сравнение структуры праймеров с коллекцией последовательностей GeneBank показало, что полностью комплементарны оба праймера только последовательности гена colA, характерной для патогенных лепто-спир, что теоретически исключало неспецифический результат при ПЦР с препаратами ДНК из образцов различной природы.

Разработанная система была оптимизирована для проведения реакции в режиме стандартной ПЦР с последующей визуализацией полученных ампликонов методом электрофореза в агарозном геле. Для подтверждения специфичности данных праймеров было проведено исследование их взаимодействия с препаратами ДНК патогенных лептоспир различных видов (L. interrogans, L. kirschneri, L. borgpetersenii и L. noguchii). При проведении реакции с ДНК всех положительных образцов происходило образование специфического ампликона. В отрицательных контрольных образцах накопления продуктов реакции не наблюдалось. Также не было отмечено взаимодействия с ДНК сапрофитных лептоспир.

Чувствительность ПЦР с использованием разработанных праймеров оценивалась путём проведения реакции на препаратах ДНК, выделенных из образцов мочи и сыворотки людей, не больных лептоспирозом, контаминирован-ных лептоспирами в лабораторных условиях. Были протестированы разведения, содержащие 105—50 клеток лептоспир на мл. Выделение ДНК проводилось из объёма 1 мл мочи и 0,1 мл сыворотки. Установлено, что чувствительность данных праймеров составляет 2 геномных эквивалента на аликвоту ДНК препарата (50 клеток на мл). В то же время не было отмечено образование неспецифических продуктов реакции.

Специфичность праймеров была оценена при исследовании десяти образцов мочи людей, не болевших лептоспирозом, и пяти образцов мочи собак, перенесших лептоспироз и получивших антибиотикотерапию, приведшую к элиминации патогенна. Во всех случаях не наблюдалось неспецифическое взаимодействие праймеров с ДНК, выделенной из анализируемого материала.

Для подтверждения того, что в реакции происходит амплификация специфического фрагмента генома лептоспир, было проведено секве-нирование ампликонов, полученных в реакции ПЦР с разработанными праймерами на матрице ДНК штамма Перепелицин — эталонного штамма серогруппы Tarassovi, принадлежащего к виду L. borgpetersenii. При анализе полученной последовательности с использованием алгоритма BLAST было установлено, что она соответствует участку генома, являющегося мишенью разрабатываемой тест-системы. Структура амплико-нов штамма Перепелицин имеет более высокий уровень сходства с аналогичной последователь-

ностью в геноме лептоспир вида L. borgpetersenii (сходство последовательностей 95 %), к которому принадлежит данный штамм, чем со сходной последовательностью в геноме лептоспир вида L. interrogans (сходство последовательностей 24 %).

Исследование мочи пяти собак, больных лептоспирозом, до начала антибиотикотера-пии, показало наличие лептоспир в образцах. Лептоспирозная этиология инфекции была подтверждена положительными результатами РМА, однако в трёх случаях титр антител не превышал 1 : 200, то есть был сопоставим с титром, который может наблюдаться после вакцинации.

Для оценки возможности применения разработанной системы в эпидемиологическом надзоре за очагами лептоспирозной инфекции было проведено исследование полевого материала. Всего было исследовано 89 особей грызунов и насекомоядных различных видов, пойманных на территории г. Санкт-Петербурга, в том числе Apodemus agrarius — 56 особей, Apodemus uralensis — 7, Microtus arvalis — 6, Sorex araneus — 20. Для исследования отбирались печень и почки. ДНК патогенных лептоспир обнаружена у 4,5 % исследованных животных (M. arvalis — 2 особи, A. uralensis — 1 особь, S. araneus — 1 особь).

Таким образом, разработанная тест-система обладает достаточным уровнем чувствительности, позволяет в короткие сроки проводить исследование биологического материала различной природы на наличие патогенных лептоспир. Данная диагностическая система может быть использована для диагностики лептоспироза у людей и животных, выявления лептоспироноси-тельства у животных и контроля эффективности лечения, а также получения данных о наличии патогенных лептоспир в полевом биологическом материале.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Bal A.E., Gravekamp C., Hartskeerl R.A. et al. Detection of leptospires in urine by PCR for early diagnosis of leptospirosis // J Clin Microbiol, 1994. V.32. N.8. P. 1894—1898.

2. Manu V., Roy S., DuttaRoy A.R. et al. PCR on formalin-fixed necropsy tissues to diagnose leptospirosis // Indian J Med Res. 2009. V. 129. N. 1. P. 105—107.

3. Merien F., Amouriaux P., Perolat P et al. Polymerase chain reaction for detection of Leptospira spp. in clinical samples // Clin Microbiol. 1992. V. 30. N. 9. P. 2219—2224.

4. Merien F., Perolat P., Mancel E. et al. Detection of Leptospira DNA by polymerase chain reaction in aqueous humor of a patient with unilateral uveitis //J Infect Dis. 1993. P. 623—646.

Контактная информация:

Ваганова Анастасия Николаевна, тел.: 232-21-36 Contact information:

Vaganova Anastasiha, phone: тел.: 232-21-36