ТРАНСФОРМАЦИЯ ГАПЛОИДНОЙ КУКУРУЗЫ

1. Способ модификации генома кукурузы, где указанный способ включает:
(а) получение компетентной по трансформации гаплоидной ткани кукурузы, происходящей от микроспор и содержащей геном гаплоидной ткани;
(b) доставку полинуклеотида, кодирующего сайт-специфическую нуклеазу, в компетентную по трансформации гаплоидную ткань; и
(c) подтверждение модификации генома гаплоидной ткани кодируемой сайт-специфической нуклеазой.
2. Способ по п.1, где компетентной по трансформации гаплоидной тканью является ткань эмбриона или каллуса.
3. Способ по п.1 или 2, где указанный способ включает доставку полинуклеотида, кодирующего сайт-специфическую нуклеазу, в компетентную по трансформации гаплоидную ткань методом трансформации растений, выбранным из группы, состоящей из метода трансформации посредством бомбардировки микрочастицами; метода трансформации Agrobacterium; метода трансформации фосфатом кальция; метода трансформации полибреном; метода трансформации посредством электропорации; метода ультразвуковой трансформации; метода липосомной трансформации; метода трансформации посредством микроинжекции; метода трансформации «оголенной» ДНК; метода трансформации плазмидным вектором; метода трансформации вирусным вектором; метода трансформации, оспосредуемой карбидом кремния; метода трансформации посредством распыления аэрозоля и метода ПЭГ-трансформации.
4. Способ по любому из пп.1-2, где полинуклеотид сайт-специфической нуклеазы кодирует нуклеазу, выбранную из группы, состоящей из нуклеазы «цинковый палец», нуклеазы TALEN, мегануклеазы и нуклеазы CRISPR.
5. Способ по любому из пп.1-2, где указанный способ также включает:
(b) доставку донорного полинуклеотида и стабильную интеграцию донорного полинуклеотида в модифицированный геном гаплоидной ткани.
6. Способ по п.5, где каждый донорный полинуклеотид содержит один или два домена, которые по меньшей мере на 85% идентичны последовательности геномной области ДНК-мишени генома гаплоидной ткани.
7. Способ по любому из пп.1-2, 6, где компетентная по трансформации ткань, происходящая от микроспор, представляет собой ткань кукурузы, имеющей свойства элитных сортов.
8. Способ по п.7, где компетентная по трансформации ткань, происходящая от микроспор, представляет собой ткань гибридной кукурузы, полученной в результате скрещивания линий кукурузы элитных сортов с другой линией кукурузы, обладающей высокой восприимчивостью к культивированию с микроспорами.
9. Способ по любому из пп.1-2, 6, где указанный способ включает подтверждение модификации генома гаплоидной ткани с помощью ПЦР-анализа, Саузерн-блот-анализа, Нозерн-блот-анализа, анализа на экспрессию белка, вестерн-блот-анализа, ELISA-анализа или анализа на секвенирование новой генерации.
10. Способ по любому из пп.1-2, где указанный способ также включает:
(d) обработку гаплоидной ткани, содержащей модифицированные геном гаплоидной ткани, агентом для удвоения хромосом;
(e) продуцирование дигаплоидной ткани кукурузы, содержащей модифицированный геном дигаплоидной кукурузы; и
(f) регенерацию дигаплоидной ткани кукурузы с получением дигаплоидного растения кукурузы, содержащего гомозиготный модифицированный дигаплоидный геном кукурузы.
11. Способ по любому из пп.1-2, 6, где указанную компетентную по трансформации гаплоидную ткань, происходящую от микроспор кукурузы получают способом, включающим:
(i) сбор метелок кукурузы, содержащих микроспоры;
(ii) инкубирование метелок при температуре приблизительно 4-12°C;
(iii) выделение пыльника, содержащего микроспоры, из этих метелок;
(iv) культивирование пыльников в среде для культивирования пыльников с получением эмбрионов микроспор; и
(v) культивирование эмбрионов микроспор в среде для культивирования каллуса с получением компетентной по трансформации гаплоидной ткани, происходящей от микроспоры.
12. Способ по любому из пп.1-2, 6, где указанный способ включает:
(bʹ) доставку донорного полинуклеотида и стабильную интеграцию одного или более донорных полинуклеотидов в модифицированный геном гаплоидной ткани;
(bʹʹ) стабильную интеграцию донорного полинуклеотида в область-мишень генома гаплоидной ткани; и
(c) подтверждение интеграции донорного полинуклеотида в область-мишень генома гаплоидной ткани.
13. Способ по любому из пп.1-2, 6, где интегрированный донорный полинуклеотид экспрессируется в гаплоидной ткани кукурузы.
14. Способ по любому из пп.1-2, 6, где интегрированный донорный полинуклеотид сообщает нужный агрономический признак.
15. Способ по любому из пп.1-2, 6, где указанный способ также включает:
(b) экспрессию сайт-специфической нуклеазы и введение мутации в гаплоидный геном кукурузы; и
(c) подтверждение присутствия мутации в гаплоидном геноме кукурузы.
16. Растение кукурузы, регенерированное из ткани, содержащей модифицированный гаплоидный геном ткани по любому из пп.1-15.
17. Растение кукурузы, регенерированное из модифицированного дигаплоидного генома ткани по любому из пп.1-16, где регенерированное растение имеет геномную модификацию, введенную посредством кодируемой сайт-специфической нуклеазы.
18. Дигаплоидное растение кукурузы, регенерированное из модифицированного дигаплоидного генома ткани по п.10, где регенерированное растение имеет модификацию, введенную посредством кодируемой сайт-специфической нуклеазы.
19. Способ получения потомства растения кукурузы, имеющего модификацию, введенную посредством кодируемой сайт-специфической нуклеазы, где указанный способ включает:
(а) скрещивание растения кукурузы по п.17 с растениями другой родительской линии кукурузы с получением потомства F1 растений;
(b) отбор одного или более потомств F1 растений, имеющих геномную модификацию, введенную посредством кодируемой сайт-специфической нуклеазы, с получением одного или более потомств растения кукурузы, имеющих модификацию, введенную посредством кодируемой сайт-специфической нуклеазы; и
(c) необязательно, (i) возвратное скрещивание потомства F1 растения кукурузы с растением кукурузы по п.18 или с другой родительской линией кукурузы с получением потомства «бэксроссов» растения кукурузы, (ii) отбор «бэксроссов» потомства растений, имеющих геномную модификацию, введенную посредством кодируемой сайт-специфической нуклеазы, и (iii) необязательное повторение стадий (i) и (ii) с получением одного или более потомств растения кукурузы, имеющих геномную модификацию, введенную посредством кодируемой сайт-специфической нуклеазы.
20. Способ получения потомства растения кукурузы, имеющего модификацию, введенную посредством кодируемой сайт-специфической нуклеазы, где указанный способ включает:
(а) скрещивание растения кукурузы по п.18 с растениями другой родительской линии кукурузы с получением потомства F1 растений;
(b) отбор одного или более потомств F1 растений, имеющих геномную модификацию, введенную посредством кодируемой сайт-специфической нуклеазы, с получением одного или более потомств растения кукурузы, имеющих модификацию, введенную посредством кодируемой сайт-специфической нуклеазы; и
(c) необязательно, (i) возвратное скрещивание потомства F1 растения кукурузы с растением кукурузы по п.18 или с другой родительской линией кукурузы с получением потомства «бэксроссов» растения кукурузы, (ii) отбор «бэксроссов» потомства растений, имеющих геномную модификацию, введенную посредством кодируемой сайт-специфической нуклеазы, и (iii) необязательное повторение стадий (i) и (ii) с получением одного или более потомств растения кукурузы, имеющих геномную модификацию, введенную посредством кодируемой сайт-специфической нуклеазы.
21. Зерно потомства растения кукурузы, содержащее модификацию, введенную посредством кодируемой сайт-специфической нуклеазы, полученной способом по п.19.
22. Зерно потомства растения кукурузы, содержащее модификацию, введенную посредством кодируемой сайт-специфической нуклеазы, полученной способом по п.20.