ФЕРМЕНТАТИВНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ HBA1C

1. Способ определения количества гликозилированного гемоглобина (HbA1c) в пробе, в котором осуществляют следующие стадии:
a) гемолиз эритроцитов в пробе для высвобождения содержащегося в них HbA1c;
b) приведение в контакт HbA1c, высвобожденного на стадии a), с протеолитически действующим агентом для получения гликозилированных продуктов разложения гемоглобина;
c) определение количества HbA1c за счет количественного определения гликозилированных продуктов разложения гемоглобина, полученных на стадии b;
отличающийся тем, что протеолитический агент, применяемый на стадии b), образуется благодаря тому, что по меньшей мере два разных раствора приводят в контакт с HbA1c, высвобожденным на стадии a), причем один из растворов имеет значение pH в интервале от 1 до 8 и содержит:
i) металлопротеазу;
ii) соответственно от 0,1 до 2 ммоль/л агента, хелатирующего двухвалентные ионы металлов, на 1000 ед/мл металлопротеазы и
2+
2+
iii) от 0,5 до 10 ммоль/л Ca или 0,5 до 10 ммоль/л Mg;
2+
2+
2+
2+
2+
2+
причем молярное соотношение "хелатирующий агент: Ca" или "хелатирующий агент: Mg" находится в интервале от 1:2 до 1:20, а другой раствор содержит от 100 до 5000 мкмоль/л двухвалентного иона металла, выбранного из Fe, Mn, Co и Zn.
2+
2+
2+
2+
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что раствор, содержащий от 100 до 5000 мкмоль/л двухвалентного иона металла, выбранного из Fe, Mn, Co и Zn, представляет собой гемолизирующий раствор, который на стадии a) прибавляют к пробе, причем этот гемолизирующий раствор содержит гемолитически действующее поверхностно-активное вещество.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что гемолиз на стадии a) осуществляют прибавлением гемолизирующего раствора (H), причем гемолизирующий раствор содержит гемолитически действующее поверхностно-активное вещество и полимер 2-(метакрилоилоксиэтил)-2'-(триметиламмонийметил)фосфата, фосфатидилхолин или их смеси и имеет значение pH в интервале от 1 до 3.
4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что количественное определение гликозилированных продуктов разложения гемоглобина на стадии c) осуществляют путем их окисления посредством фруктозилпептидоксидазы или фруктозиламиноацилоксидазы с получением пероксида водорода и путем определения образующегося при этом количества пероксида водорода, причем количество пероксида водорода определяют благодаря цветной реакции красителя в лейкоформе в присутствии пероксидазы, а краситель в лейкоформе готовят в растворе, который для стабилизации красителя содержит соединение общей формулы (I):
,
1
2
3
1-
8
где P означает атом фосфора, а X, X и X независимо друг от друга выбраны из замещенных или незамещенных линейных или разветвленных CC-алкилов, замещенных или незамещенных циклогексилов и замещенных или незамещенных фенильных радикалов.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что раствор, содержащий краситель в лейкоформе, для стабилизации красителя содержит по меньшей мере одно тиосоединение.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что по меньшей мере одно тиосоединение выбрано из тиодигликоля, тиояблочной кислоты, тионикотинамида, тио-NAD и их смесей.
7. Способ по п.5 или 6, отличающийся тем, что до проведения определения количества HbA1c на стадии c) к реакционной смеси прибавляют агент, улавливающий SH-группы.
8. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что в ходе стадий a)-c) или между ними осуществляют определение концентрации общего гемоглобина.
2+
2+
2+
2+
2+
2+
2+
2+
9. Набор реагентов для применения в способе определения в пробе количества HbA1c, отличающийся тем, что набор реагентов содержит по меньшей мере два разных раствора в отдельных сосудах, причем один из растворов имеет значение pH в интервале от 1 до 8 и содержит металлопротеазу и от 0,1 до 2 ммоль/л агента, хелатирующего двухвалентные ионы металлов, на 1000 ед/мл металлопротеазы и от 0,5 до 10 ммоль/л Ca или от 0,5 до 10 ммоль/л Mg, причем молярное соотношение "хелатирующий агент: Ca" или "хелатирующий агент: Mg" находится в интервале от 1:2 до 1:20, а другой раствор содержит от 100 до 5000 мкмоль/л двухвалентного иона металла, выбранного из Fe, Mn, Co и Zn.
10. Набор реагентов по п.9, отличающийся тем, что он в отдельных сосудах содержит по меньшей мере следующие растворы:
2+
2+
2+
2+
гемолизирующий раствор (H), содержащий гемолитически действующее поверхностно-активное вещество и от 100 до 5000 мкмоль/л двухвалентного иона металла, выбранного из Fe, Mn, Co и Zn;
первый раствор реагентов (R1), содержащий фруктозилпептидоксидазу или фруктозиламиноацилоксидазу и пероксидазу, и
2+
2+
2+
2+
второй раствор реагентов (R2), дополнительно содержащий металлопротеазу и от 0,1 до 2 ммоль/л агента, хелатирующего двухвалентные ионы металлов, на 1000 ед/мл металлопротеазы и от 0,5 до 10 ммоль/л Ca или от 0,5 до 10 ммоль/л Mg, причем молярное соотношение "хелатирующий агент: Ca" или "хелатирующий агент: Mg" находится в интервале от 1:2 до 1:20, и краситель в лейкоформе.
11. Набор реагентов по п.9 или 10, отличающийся тем, что раствор (H) представляет собой гемолизирующий раствор, который содержит гемолитически действующее поверхностно-активное вещество и дополнительно полимер 2-(метакрилоилоксиэтил)-2'-(триметиламмонийметил)фосфата, фосфатидилхолин или их смеси и имеет значение pH в интервале от 1 до 3.
12. Набор реагентов по п.10 или 11, отличающийся тем, что раствор (R2) для стабилизации красителя в лейкоформе содержит по меньшей мере одно соединение общей формулы (I):
,
1
2
3
1-
8
где P означает атом фосфора, а X, X и X независимо друг от друга выбраны из замещенных или незамещенных линейных или разветвленных CC-алкилов, замещенных или незамещенных циклогексилов и замещенных или незамещенных фенильных радикалов.
13. Набор реагентов по любому из пп. 10-12, отличающийся тем, что раствор (R2) для стабилизации красителя в лейкоформе содержит по меньшей мере одно тиосоединение, причем по меньшей мере один тиоспирт предпочтительно выбран из тиодигликоля, тиояблочной кислоты, тионикотинамида, тио-NAD и их смесей.
14. Набор реагентов по любому из пп. 10-13, отличающийся тем, что раствор (R1) содержит агент, улавливающий SH-группы, причем агент, улавливающий SH-группы, предпочтительно представляет собой N-этилмалеинимид.
15. Набор реагентов по любому из пп. 10-14, отличающийся тем, что его используют в способе по любому из пп. 1-8.