Фертильность сперматозоидов и состояние хроматина: методы контроля (обзор)

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2012, № 2

Обзоры, проблемы, итоги

УДК 636.018:591.463.1:57.086.8

ФЕРТИЛЬНОСТЬ СПЕРМАТОЗОИДОВ И СОСТОЯНИЕ ХРОМАТИНА:

МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ

В.А. БАГИРОВ1, В.П. КОНОНОВ1, Б.А. ИОЛЧИЕВ1, П.М. КЛЕНОВИЦКИЙ1,

Л.К. ЭРНСТ2

Повышение уровня воспроизведения в современном животноводстве составляет значительный резерв роста эффективности, а в молочном скотоводстве представляет собой задачу, от решения которой зависит существование самой подотрасли в ее интенсивной форме. Уровень воспроизведения обусловлен репродуктивным потенциалом как самок, так и самцов, однако если низкая воспроизводительная способность матки — это потери только от бесплодного осеменения ее самой, то ущерб от субфертильности производителя возрастает пропорционально числу самок, подвергшихся искусственному осеменению, то есть контроль биологической полноценности используемой спермы целесообразно отнести к числу приоритетов. Одной из причин субфертильности производителей может быть аномальное состояние хроматина в сперматозоидах. К наиболее частым из таких нарушений, снижающих оплодотворяемость и эмбриональную выживаемость, относятся фрагментация ДНК, недостаточная конденсация нуклеопротеидов и др. В обзоре обсуждаются различные тесты, применяемые для оценки состояния хроматина в сперматозоидах (и, как следствие, репродуктивного потенциала производителя): SCSA (sperm chromatin structure assay; определяет устойчивость хроматина к денатурации ДНК); TUNEL (terminal de-oxynucleotidyl transferase-mediated dUtp nick end labeling; осуществляет визуализацию фрагментации ДНК посредством мечения разрывов); Comet Assay (с использованием микроэлекрофореза выявляются фрагменты ДНК в сперматозоиде); соотношения —S—S— и —SH групп в хроматине сперматозоидов (определяет степень его конденсации) и т.д.

Уровень воспроизводства в животноводстве — доминирующий фактор эффективности и, более того, обязательное условие сохранения численности поголовья как основного средства производства. В настоящее время из-за недостаточного воспроизводства многие породы крупного рогатого скота (в первую очередь высокопродуктивные) находятся в критическом состоянии (1). К таковым, например, относится голштинский скот, обладающий самой высокой молочной продуктивностью. По данным

Н.И. Стрекозова и соавт. (2), в России 5,7 тыс. гол. этой породы имеют среднегодовую молочную продуктивность 6907 кг, пожизненный надой 14505 кг и дают в среднем 80 телят на 100 коров в год. Из этих данных следует, что продолжительность продуктивной жизни коровы равняется всего 14505: 6907 = 2,1 лактации, а доля ремонта в стаде с целью сохранения его продуктивности — 100 %: 2,1 = 48,6 %. Иными словами, ежегодно число ремонтных телок на каждые 100 коров должно составлять 48,6 гол. Однако, как уже отмечалось, 100 коров указанной породы дают за год всего 80 телят, то есть, соответственно, только 40 телочек. Следовательно, даже теоретически (при расчете, предусматривающем идеальную ситуацию) полученных телочек не хватает для ремонта голштинского стада. Вместе с тем фактически дефицит значительно увеличивается из-за неминуемого отхода (падежа) телят, браковки особей, непригодных для воспроизведения, и т.п. В других подотраслях (в овцеводстве, свиноводстве и др.) в связи с многоплодием подобная проблема стоит не столь остро, тем не менее в большинстве случаев низкий выход молодняка обусловливает удорожание продукции, снижает эффективность производства и часто приводит к банкротству.

Очевидно, что для решения проблемы необходимо радикально по-

высить уровень воспроизведения и сохранность молодняка.

В скотоводстве принято считать, что результаты осеменений определяются главным образом состоянием репродуктивной функции у коров, а в отношении всех быков допускается, что у них репродуктивный потенциал одинаково высокий, то есть негативные последствия при искусственном оплодотворении не связывают с воспроизводительной способностью у быков. Отсюда бытует мнение, что усилия в поиске приемов повышения эффективности воспроизведения следует направлять исключительно на повышение репродуктивной способности коров или на хозяйственные условия, действующие на воспроизводительную функцию маточного стада. Вместе с тем специальные исследования показали (3), что результаты осеменения не только варьируют по хозяйствам, но и неодинаковы у разных производителей, то есть в значительной мере зависят от репродуктивного потенциала быков. Эти данные нашли подтверждение в опытах других исследователей (4).

Таким образом, репродуктивный потенциал производителей — критический фактор в стадах вне зависимости от состояния этой функции у маток. Бесплодие отдельной матки — это бесплодие одного животного, тогда как бесплодие производителя, пока оно не выявлено, становится причиной безуспешного осеменение сотен и даже тысяч маток. Субфертильность и бесплодие производителей могут быть вызваны разными причинам, причем наиболее общие и частые из них связаны с состоянием воспроизводительной функции. Вне всякого сомнения, в целом воспроизведение в стадах определяется репродуктивным потенциалом самок, но самцы-производители в зависимости от биологической полноценности (или неполноценности) спермы могут либо способствовать, либо препятствовать реализации этого потенциала, соответственно повышая или снижая уровень воспроизводства в стаде.

Репродуктивную способность производителей оценивают, как правило, по количеству и качеству продуцируемого им семени. Вместе с тем существующие методы оценки семени не дают достаточно корректного прогноза результатов осеменения, а следовательно, репродуктивного потенциала того или иного производителя. Повсеместно в практике животноводства используется тест на подвижность сперматозоидов — он доступный, легко выполнимый, не требует сложного оборудования. Главная причина его популярности в том, что метод «гипнотизирует» кажущейся очевидностью биологической полноценности сперматозоидов и, соответственно, прогноза результатов осеменения — привычно видеть движение как показатель энергетического потенциала и жизнеспособности объекта. Однако высокая подвижность необходима, но недостаточна для осуществления таких сложных процессов, как оплодотворение и последующее развитие зародыша, зависящих от состояния многих морфофункциональных свойств сперматозоидов. Прямые опыты (В.П. Кононов, Н.А. Голышев) подтвердили это: достаточно высокая подвижность в замороженном-отта-янном семени хряка не всегда сопровождалась адекватно удовлетворительной оплодотворяющей способностью (5). Имеются даже курьезные данные, когда от быка, выбракованного на основании подвижности семени, были получены более высокие результаты осеменения, чем при использовании семени, признанного пригодным (6).

В обзоре, обобщающем почти все методы оценки качества семени на этапах доставки генетического материала к яйцеклетке и собственно оплодотворения, А. Вгаииёше1ег с соавт. (7) отмечают, что пока нет теста, достаточно точно прогнозирующего результаты осеменения. Обусловлено

это несколькими причинами. Во-первых, в оплодотворении участвует один сперматозоид, в то время как в используемых тестах можно оценить только их значительную по численности популяцию. Во-вторых, имеющиеся тесты позволяют определить какую-либо одну характеристику сперматозоидов, тогда как способность донести генетическую информацию до места оплодотворения, оплодотворить ооцит и обеспечить последующее эмбриональное развитие зародыша зависит от целостности многих его структур и состояния различных функций. В-третьих, сперматозоиды после введения в половые пути самки встречаются с чрезвычайно разными условиями, в том числе с ооцитами, имеющими неодинаковую биологическую полноценность. В этой связи все дефекты сперматозоидов авторы разделяют на компенсируемые и некомпенсируемые. К первым относятся те из них, которые можно нивелировать за счет численности сперматозоидов (например, низкая подвижность, наличие некоторых физиологических аномалий и др.). Некомпенсируемые дефекты представляют собой нарушения, которые распространяются на всю популяцию сперматозоидов, когда их негативное воздействие на результаты осеменения невозможно устранить увеличением числа половых клеток. В частности, подобные дефекты связаны с ядерным материалом, с повреждениями хроматина, что чаще всего становится причиной эмбриональной смертности. Среди факторов, наиболее сопряженных с результативностью осеменения, упоминаются так называемые молекулярные индикаторы оплодотворяющей способности — биохимические факторы семени, отражающие биологическую полноценность сперматозоидов (7).

Вместе с тем методы оценки качества семени, используемые на практике, хотя и не дают достаточно точного прогноза результатов осеменения, позволяют выявлять отдельные эякуляты, явно не пригодные для достижения зачатия, своевременно выбраковывать производителей, не способных дать потомство, контролировать точность технологического процесса обработки семени и обнаруживать допущенные при этом ошибки. Рассмотренные выше методы оценивают способность сперматозоида донести генетическую информацию до яйцеклетки и произвести оплодотворение. Однако они совершенно не учитывают, насколько донесенная генетическая информации полноценна и способна обеспечить нормальное развитие зародыша.

Такие повсеместно используемые критерии при оценке семени, как «оплодотворяемость», «оплодотворяющая способность», в прагматическом отношении лишены смысла. По неопровержимым данным ряда авторов, у многих видов, в частности у коров, оплодотворение наступает у 90-95 % осемененных особей. Однако при последующем развитии зародыша у крупного рогатого скота примерно половина, а обычно больше половины, погибают на разных стадиях эмбриогенеза. В практическом же аспекте важно не только оплодотворение, но и рождение полноценного потомства. Если считать завершающим этапом оплодотворения слияние материнского и отцовского пронуклеусов, то последующее развитие эмбриона в основном определяется состоянием заложенной в ядре зиготы генетической информации, полученной наполовину от материи, наполовину от отца. Иными словами, примерно на 50 % судьба зародыша зависит от состояния ДНК и хроматина сперматозоидов.

О ц е н к а с о с т о я н и я х р о м а т и н а в я д р а х с п е р-м а т о з о и д о в. Хроматин — доминирующая и имеющая исключительное значение структура. Он обеспечивает сохранение биологической полноценности сперматозоида, нативности содержащейся в нем ДНК, ее дос-

тавку непосредственно к месту оплодотворения и собственно осуществление оплодотворения. С состоянием хроматина связана регуляция функциональной активности генома и лежащих в ее основе механизмов.

Сформированные в результате сперматогенеза гаметы еще биологически незрелы и не способны к оплодотворению ооцитов. Их окончательное созревание происходит в процессе продвижении по каналу эпиди-димиса, при этом они приобретают способность к прямолинейно-поступательному движению и оплодотворению (8, 9).

Созревание сопряжено с изменением многих структур и функций сперматозоидов: плазматических мембран, протоплазмы и, главное, ядерного материала. Хроматин ядер в процессе созревания сперматозоидов конденсируется, в результате чего плотность его упаковки становится даже значительно больше, чем в метафазных хромосомах соматических клеток (10, 11). Конденсация хроматина начинается на стадии сперматид, и гаметы претерпевают изменения, названные ремоделингом (remodeling), которые способствуют уплотнению хроматина. Суть ремоделинга состоит в том, что на постмейотической стадии сперматогенеза гистоны как катионные положительно заряженные белки, соединенные с отрицательно заряженной ДНК, заменяются вначале промежуточными белками, а затем про-таминами, имеющими больший положительный заряд из-за увеличенного содержания положительно заряженной диаминомонокарбоновой кислоты аргинина. Усиление за счет этого связи белок—ДНК ведет к уплотнению (компактизации) хроматина.

Дальнейшее уплотнение происходит в эпидидимисе при формировании дисульфидных связей (-S—S-) между сопредельными белковыми молекулами хроматина вследствие окисления сульфгидрильных групп (-SH) серосодержащих аминокислот (12). В свою очередь, соотношение количества —SH групп, окисленных до —S—S— связей, обусловлено временем продвижения сперматозоидов по каналу эпидидимиса и условиями среды, в которой при этом находятся сперматозоиды (13).

О п р е д е л е н и е о б щ е г о к о л и ч е с т в а х р о м а т и н а (р е а к ц и я Ф е л ь г е н а). Применение реакция Фельгена, как известно, — классический стехиометрический прием выявления хроматина в ядрах клеток (рис. 1): при взаимодействии реактива Шиффа (комплекс основного фуксина с сернистой кислотой) с альдегидными группами дезок-сирибозы, которые становятся доступными после гидролиза соляной кислотой, комплекс ДНК—фуксин образует осадок пурпурного цвета (14). Цитофотометрирование оптической плотности окрашенного материала и умножение полученного значения на площадь ядра позволяет оценить общее содержание ДНК в сперматозоиде.

Кроме классического, известен флуоресцентный вариант, в котором в реагирующем с ДНК комплексе фуксина с сернистой кислотой фуксин заменен на флуорохром аурамин ОО (15) и содержание ДНК определяется по интенсивности флуоресценции Фельген-положительного комплекса ДНК—аурамин ОО.

Ранние попытки применить измерение общего содержания Фельген-положительного материала в сперматозоидах как тест на степень фертильности самцов дали противоречивые результаты (16-18). В одних случаях зависимость между фертильностью мужчин (или самцов млекопитающих) и общим содержанием ДНК в сперматозоидах отмечалась, в других — нет.

Однако, как оказалось, наблюдаемые противоречия обусловлены неодинаковыми методическими подходами, которые были использованы. Исследования выявили исключительную устойчивость к деградации и по-

тере хроматина у Фельген-положительного материала в сперматозоидах хряка: количество такого материала в гаметах из свежевзятого семени и в погибших сперматозоидах после 6-суточного хранения при комнатной температуре не различалось (19).

Рис. 1. Реакция Фельгена со сперматозоидами: А — свежевзятое семя, Б — семя, хранившееся 6 сут при комнатной температуре (подвижность 0 баллов); слева и справа — соответственно классический и флуоресцентный вариант.

Статистический анализ содержания хроматина в сперматозоидах из семени, хранившегося разное время (и, соответственно, характеризующегося неодинаковым соотношением живых и погибших сперматозоидов) приведен на рисунке 2.

После 1 сут хранения семени большинство клеток содержали столько же ДНК, сколько таковые из свежевзятого семени, хотя доля живых, то есть способных к оплодотворению, существенно сократилась. Даже после полной гибели всех сперматозоидов (6 сут хранения) примерно в половине из них содержание ДНК сохранялось на уровне показателя в клетках из свежевзятого семени. Только после 1-3 сут хранения мертвого семени наблюдалось преобладание числа сперматозоидов с пониженным содержанием ДНК (мода на кривой Гаусса смещается в сторону низких значений). Таким образом, в погибших сперматозоидах содержание хроматина уменьшается не сразу после их гибели.

Полученные результаты были подтверждены исследованиями, в которых перед проведением реакции Фельгена живые и мертвых сперматозоиды разделили фильтрацией через стеклянные шарики (20).

Эти и другие данные сделали нецелесообразным поиск связи общего содержания хроматина в сперматозоидах с их биологической полноценностью, вариабельность которой обусловлена почти исключительно степенью деградации погибших половых клеток. Стало ясно, что для нахождения зависимости между состоянием хроматина в сперматозоидах и репродуктивным потенциалом самцов необходимо не простое определение общего содержания Фельген-положительного материала, а более точные исследования нуклеопротеидов ядра.

О ц е н к а у с т о й ч и в о с т и х р о м а т и н а п р и д е н ат у р а ц и и ДНК (м е т о д SCSA — sperm chromatin structure assay). Первый подобный метод был предложен D.P. Evenson с соавт. (21). Суть его

заключалась в выявлении стабильности ДНК сперматозоидов в условиях тепловой денатурации. Изолированные ядра клеток нагревали в течение

Рис. 2. Распределение сперматозоидов по содержанию ДНК на разных сроках хранения семени (19): А, Б, В, Г, Д — соответственно свежевзятое семя, семя после хранения в течение 1 сут, семя после хранения в течение 6 сут (оценка подвижности — 0 баллов), хранение в течение 1 сут после полной гибели гамет, хранение в течение 3 сут после полной гибели гамет. Вертикальная линия соответствует моде.

5 мин при температуре 100 °С, обеспечивающей плавление ДНК. После окрашивания акридиновым оранжевым при облучении светом возбуждающей длины волны (с отсечением луча возбуждающего света от света флуоресценции) ядра, которые содержат двуспиральную ДНК, светятся зеленым светом (X = 540 нм), ядра с односпиральной денатурированной ДНК — красным (X = 600 нм). Селекция ядер по длине волны флуоресценции (540 и 600 нм) осуществляется на поточном микрофлуори-метре с программным управлением, который позволяет производить автоматический расчет соотношения числа ядер с денатурированной и не-

1. Связь между фертильностью сперматозоидов у мужчин и быков

Состояние репродуктивной функции Доля ядер с денатурированной ДНК (X = б00 нм) Соотношение числа ядер с денатурированной ДНК, прогретые/непрогретые

непрогретых | прогретых

М у ж ч и н ы

Проверяемые на фертильность 0,18±0,01 0,29±0,03 1,1б±0,11

С пониженной фертильностью 0,20+0,02 0,45±0,11 2,25±0,12

Б ы к и

Высокофертильные 0,10±0,04 0,1б±0,12 1,б

Низкофертильные 0,07±0,04 0,41±0,23 5,8

Эффективность БСБЛ для прогноза репродуктивного потенциала быков была подтверждена в последующих опытах (22). Методом БСБЛ исследовали структуру хроматина в сперматозоидах в связи с возрастом быков (половозрелые особи старше 3 лет и молодые 15-месячные) и полученные данные сопоставили с результатами осеменения (23). Авторы отмечали положительную корреляцию между наличием аномалий в структуре хроматина и числом перегулов у коров, осемененных семенем взрослых и молодых быков (соответственно г = 0,40 и г = 0,53).

Был предложен еще один вариант метода БСБЛ, в котором денатурацию ДНК осуществляли на цельных сперматозоидах без выделения из

них ядер (24). Мазки семени на предметных стеклах обрабатывали кислотой и окрашивали акридиновым оранжевым. Соотношение числа сперматозоидов с денатурированной и неденатурированной ДНК определяли подсчетом гамет, светящихся красным и зеленым светом под люминесцентным микроскопом, то есть без использования поточного микрофлуо-риметра. В некоторых случаях при этом ядра имели желтое свечение (нечто среднее между красным и зеленым). Преимущество анализа с использованием люминесцентного микроскопа в том, что не требуется дорогостоящего поточного микрофлуориметра, однако при этом возрастают затраты времени, прием более трудоемкий и объем тестируемой выборки сокращается в сотни раз, что снижает точность полученных данных.

Результаты анализа методом SCSA выражаются как доля (%) ядер сперматозоидов, светящихся красным светом, то есть высокочувствительных к денатурации, что прямо связано с числом разрывов в молекуле ДНК, и обозначается как индекс фрагментации ДНК (DFI — DNA fragmentation index, %) (25).

Кроме чувствительности ДНК сперматозоидов к денатурации, SCSA позволяет идентифицировать процент сперматозоидов с незрелым ядром, с недостаточно конденсированным хроматином. Незрелый хроматин слабее экранирует ДНК и обеспечивает ее меньшую защиту от интеркаляции акридинового оранжевого, вследствие чего интенсивность свечения незрелых ядер в 5 раз сильнее, чем зрелых (26). Этот показатель обозначается как HDS (high level of DNA satiability, %) (25).

М е ч е н и е р а з р ы в о в ДНК (м е т о д TUNEL). Повреждения ДНК в сперматозоидах могут носить характер разрывов (ников) отдельных хромосом, что связано с дефицитом протаминов в молекуле нук-леопротеида. Для выявления таких разрывов были успешно использованы хромомицин A3 (СМА3) и флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ) (27). Однако имеется и более надежный способ оценки — так называемый метод TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick and labeling), когда мечение разрывов в ДНК осуществляют с помощью фермента кольцевой нуклеотидилтрансферазы. Интенсивность люминесценции при этом пропорциональна числу встроенных флуоресцентных меток (dUTP) и, следовательно, числу разрывов в ДНК. В качестве флуорохрома обычно используется флуоресцеин, а показателем служит рассчитанный процент TUNEL-позитивных клеток (25, 28, 29).

А п о п т о з с п е р м а т о з о и д о в. Наличие разрывов в ДНК обычно служит ключевым индикатором апоптоза — запрограммированной клеточной гибели. Считается, что детектируемые на этапах репарации и ремоделинга разрывы ДНК могут быть не связаны с апоптозом. В то же время в ходе сперматогенеза элиминация половых клеток посредством апоптоза в норме происходит постоянно и обеспечивает удаление биологически неполноценных гамет (30, 31).

Сперматозоиды с развивающимся апоптозом распознают по наличию специфических маркеров. Для апоптотических маркеров в популяции сперматозоидов используют красители для дифференцировки живых и некротических клеток. Дегенерирующие сперматозоиды определяют с помощью йодистого пропидиума, который проникает только в погибшие клетки через поврежденную мембрану. Зная число окрашенных апоптотических и некротических клеток, можно рассчитать апоптотический индекс — соотношение апоптотических и живых сперматозоидов (32-34).

Наиболее распространенный апоптотический маркер, применяющийся для оценки состояния сперматозоидов, — аннексии. Этот белок

обладает высокой аффинностью к фосфатидилсерину, находящемуся на наружной поверхности плазматической мембраны у апоптозных сперматозоидов. Аннексии, связанный с каким-либо флуоресцентным красителем, позволяет детектировать перемещение фосфатидилсерина на внешнюю часть плазматической мембраны при апоптозе (32, 34, 35). Присутствие аннексина служит ранним признаком апоптоза. По оценкам, полученным на основе выявления аннексина, к апоптотическим можно отнести около 20 % эякуляторных сперматозоидов (36).

C o m e t A s s a y. При апоптозе соматических клеток ДНК подвергается эндонуклеазному расщеплению на фрагменты размером до 180200 п.н., что можно выявить электрофоретически в образцах выделенной из клеток ДНК с окрашиванием бромистым этидием. Характерный для большинства апоптотических клеток паттерн электрофоретических фрагментов ДНК («лестница») у сперматозоидов не выявляется, однако высокомолекулярные и низкомолекулярные фракции могут быть идентифицированы (25).

Электрофорез на единичных сперматозоидах, получивший название Comet Assay, позволяет определить содержание высоко- и низкомолекулярной ДНК. Низкомолекулярная ДНК на фореграммах, получаемых при мини-электрофорезе сперматозоидов в агарозном геле, формирует так называемый хвост кометы. Применяется специфическая обработка клеток с использованием протеиназы К. Показателем служит число сперматозоидов с хвостом кометы (comet) относительно их общего числа и длина кометного хвоста (28, 37). Специальные исследования показали, что результаты Comet-анализа коррелируют с данными, полученными методами TUNEL и SCSA (38-40).

О п р е д е л е н и е с о о т н о ш е н и я —S—S— и —SH г р у п п в х р о м а т и н е с п е р м а т о з о и д о в. Как указывалось выше, доля дисульфидных связей отражает степень компактности хроматина и связанную с этим зрелость и биологическую полноценность сперматозоидов. Показано, что стабильность дисульфидных связей может быть оценена посредством определения устойчивости хроматина к воздействию детергентов, например SDS (додецилсульфат натрия), или с применением веществ, выявляющих дисульфидные связи, таких как дитиотреитол (41, 42).

Таким образом, прогнозирование репродуктивного потенциала производителей может иметь большое значение для решения проблемы повышения воспроизводства в животноводстве. Однако до настоящего времени при оценке этого потенциала не учитывается состояние наследственного материала сперматозоидов — хроматина, несмотря на то, что известны методы исследования нарушений его структуры, влекущие за собой дефекты состояния ДНК. В этой связи важной задачей представляется разработка тестов, позволяющих оценить фертильность производителей на уровне молекулярной структуры хроматина в сперматозоидах, сохраняемых для использования в технологиях искусственного осеменения.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. Б а г и р о в В.А. Генетические ресурсы животноводства. Животноводство России, 2008, 2: 10-12.

2. С т р е к о з о в Н.И., А м е р х а н о в Х.А., П е р в о в Н.Г. и др. Молочное ското-

водство России. М., 2006.

3. К о н о н о в В.П., М а м б е т а л и е в М.С. Оценка потенциала воспроизводительной способности быков. Зоотехния, 1994, 7: 27-29.

4. Ч о м а е в А.М., Ч е р н ы ш ё в а М.Н., Д а р о в с к и х В.Е., А ф а н а с ь е в В.А.

Анализ оплодотворяющей способности семени быков-производителей. Вестник Российского университета дружбы народов, сер. сельскохозяйственные науки, животноводство, 2003, 10: 46-48.

5. К о н о н о в В.П., Г о л ы ш е в Н.А. Прогнозирование результатов осеменения свиноматок в зависимости от подвижности спермиев. Свиноводство, 1998, 3: 15-17.

6. N e g o i t a V., I l i n c a N., D r u m e C. et al. Cercefari privind posibilifatile de utilizare a spermei considerate improprie pentru congelare. Lucr. Sti. Inst cerc si prod. Crest. Bovin. Ba-lotesti, 1986, 11: 7-13.

7. B r a u n d m e i e r A., M i l l e r D.J. Invited review: The search is on: finding accurate molecular markers of male fertility. J. Dairy Sci., 2001, 84(9): 1915-1925.

8. O r g e b i n - C r i s t M.C. Studies on the function of the epididymis. Biol. Reprod., Suppl., 1969, 1: 155-175.

9. H i n r i c h s e n M.J., B l a q u i e r J.A. Evidence supporting existence of sperm maturation in the human epididymis, J. Reprod. Fert., 1980, 60(2): 291-294.

10. F u e n t e s - M a c o r r o G., S e r r a n o H., R o s a d o A. Sperm chromatin. Arch. Androl., 2000, 45(4): 215-225.

11. W y k e s S.M., K r a w e t z S.A. The structural organization of sperm chromatin. J. Biol. Chem., 2003, 278(32): 29471-29477.

12. C a l v i n H.I. Comparative analysis of the nuclear basic proteins in rat, human, guinea pig, mouse and rabbit spermatozoa. Biochem. Biophys. Acta, 1976, 434(4): 377-389.

13. C a l v i n H.I., B e d f o r d J.M. Formation disulphide bonds in the nucleus and accessory structures of mammalian spermatozoa during maturation in the epididymis. J. Reprod. Fert., Suppl., 1971, 13: 65-75.

14. H о в и к о в В. Гистохимические и цитохимические методы окраски. В кн.: Методы цитологического анализа. М., 1957: 58-108.

15. З е л е н и н А.В. Люминесцентная цитохимия нуклеиновых кислот. М., 1967.

16. S a l i s b u r y G.W., D e l a T o r r e L., B i r g e W.G., L o d g e L.R. Effect of 5 °С storage in yolk-citrate on Feulgen-positive material (DNA) of sperm heads. J. Dairy Sci., 1960, 43(4): 882-885.

17. A n a n d A.S., F i r s t N.L. Effect of aging of boar semen on DNA content of live and dead spermatozoa. Proc. VI Congr. de reproduction et insemination artificielle, Paris, 1968: 217 (resume).

18. G l e d h i l l B.L. Enigma of spermatozoa deoxyribonucleic acid and male infertility: a review. Am. J. Vet. Res., 1970, 31(3): 539-546.

19. К о н о н о в В.П. Динамика дезоксирибонуклеиновых кислот в живчиках хряка при различных условиях и сроках хранеия семени. Животноводство, 1967, 12: 66-69.

20. И в а н о в И.И., К о р б а н Н.В., Ш а р о б а й к о В.И. О содержании ДНК в ядрах сперматозоидов свежевзятой и сохранённой спермы в течение пяти суток. Докл. советских ученых к VI Межд. конгр. по размножению и искусственному осеменению животных. М., 1968: 14-17.

21. E v e n s o n D.P., D a r z y n k i e w i c z Z., M e l a m e d M.R. Relation of mammalian sperm chromatin heterogeneity to fertility. Science, 1980, 240: 1131-1133.

22. E v e n s o n D.P., B a l l a c h e y B.E. Sperm chromatin structure assay usefulness for the assessment of sperm quality and fertility potential. Congr. proc., 1988, 3: 241-241a (abstract).

23. B a l l a c h e y B.E., H o e n b o k e n W.D., E v e n s o n D.P. Heterogeneity of sperm nuclear chromatin structure and its relationship to bull fertility. Biol. Reprod., 1987, 36(4): 915-925.

24. T e j a d a R.I., M i t c h e l l J.C., N o r m a n A. et al. A test for the practical evaluation of male fertility by acridine orange (AO) fluorescence. Fertil. Steril., 1984, 42: 87-91.

25. S c h l e g e l P.N., P a d u c h D.A. Yet another test of sperm chromatin structure. Fertil. Steril., 2005, 84(4): 854-859.

26. E v e n s o n D.P., J o s t 1 L.K., M a r s h a l l D., Z i n a m a n M.J., C l e g g E.,

P u r v i s K., D e A n g e l i s P., C l a u s s e n O.P. Utility of the sperm chromatin

structure assay as a diagnostic and prognostic tool in the human fertility clinic. Hum. Reprod., 1999, 14(4): 1039-1049.

27. S a k k a s D., M a n i c a r d i G., B l a n h i P.C., В i z z a r o D., B i a n c h i U. Relationship between the presence of endogenous nicks and sperm chromatin packaging in maturing and fertilizing mouse spermatozoa. Biol. Reprod., 1995, 52(5): 1149-1155.

28. S i n g h N.P., M c C o y M.T., T i c e R.R., S c h n e i d e r E.L. A simple technique

for the quantification of low levels of DNA damage in individual cells. Exp. Cell Res., 1988, 15:

1338-1344.

29. G o r c z y c a W., G o n g J., D a r z y n k i e w i c z Z. Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays. Cancer Res., 1993, 53: 945-951.

30. O l d e r e i d N.B., A n g e l i s P.D., W i g e r R., C l a u s e n O.P. Expression of Bcl-2 family proteins and spontaneous apoptosis in normal human testis. Mol. Hum. Reprod., 2001, 7: 403-408.

31. S e l i E., S a k k a s D. Spermatozoal nuclear determinants of reproductive outcome: implications for ART. Hum. Reprod. Update, 2005, 11(4): 337-349.

32. B a r r o s o G., M o r s h e d i M., O e h n i n g e r S. Analysis of DNA fragmentation, plasma membrane translocation of phosphatidylserine and oxidative stress in human spermatozoa. Hum. Reprod., 2000, 15(6): 1338-1344.

33. R i c c i G., P e r t i c a r a r i S., F r a g o n a s E., G i o l o E., C a n o v a S.,

P o z z o b o n C., G u a s c h i n o S., P r e s a n i G. Apoptosis in human sperm: its

correlation with semen quality and the presence of leukocytes. Hum. Reprod., 2002, 17(10): 2665-2672.

34. L a c h a u d С., T e s a r i k J., C a с a d a s M.L., M e n d o z a C. Apoptosis and necrosis in human ejaculated spermatozoa. Hum. Reprod., 2004, 19(3): 607-610.

35. M a r t i n S.J., R e u t e l i n g s p e r g e r C.P., M c G a h o n A.J., R a d e r J.A.,

V a n S c h i e R.C., L a F a c e D.M., G r e e n D.R. Early redistribution of plasma

membrane phosphatidylserine is a general feature of apoptosis regardless of the initiating stimulus: inhibition by over expression of Bcl-2 and Abl. J. Exp. Med., 1995, 182(5): 1545-1556.

36. W a n g X., S h a r m a R.K., S i k k a S.C., T h o m a s A.J. Jr., F a l c o n e T., A g a r w a l A. Oxidative stress is associated with increased apoptosis leading to spermatozoa DNA damage in patients with male factor infertility. Fertil. Steril., 2003, 80(3): 531-535.

37. S i n g h N.P., D a n n e r D.B., T i c e R.R., M c C o y M.T., C o l l i n s G.T.,

S c h n e i d e r E.L. Abundant alkali-sensitive sites in DNA of human and mouse sperm. Exp.

Cell. Res., 1989, 184: 461-470.

38. M o r r i s I.D., I l o t t S., D i x o n L., B r i s o n D.R. The spectrum of DNA damage in human sperm assessed by single cell gel electrophoresis (Comet assay) and its relationship to fertilization and embryo development. Hum. Reprod., 2002, 17: 990-998.

39. T o m s u M., S h a r m a V., M i l l e r D. Embryo quality and IVF treatment outcomes may correlate with different sperm comet assay parameters. Hum. Reprod., 2002, 17(7): 1856-1862.

40. E r e n p r e i s s J., J e p s o n K., G i w e r c m a n A., T s a r e v I., E r e n p r e is a Je., S p a n o M. Toluidine blue cytometry test for sperm DNA conformation comparison

with the flow cytometric sperm chromatin structure and TUNEL assays. Hum. Reprod., 2004, 19: 2277-2282.

41. B a z a k W.F., O v e r s t r e e t J.W. Instability of nuclear chromatin in the ejaculated spermatozoa of fertile men. J. Reprod. Fert., 1982, 65(5): 331-339.

42. C a l v i n H.I., B e d f o r d J.M. Stimulation of actinomycin D-binding to eutherian sperm chromatin by reduction of disulphide bonds. J. Reprod. Fert., 1974, 36(2): 225-229.

1ГНУ Всероссийский НИИ животноводства Поступила в редакцию

Россельхозакадемии, 14 ноября 2011 года

142132 Московская обл., Подольский р-н, пос. Дубровицы, e-mail: vugarbagirov@mail.ru;

2Российская академия сельскохозяйственньх наук,

117218 г. Москва, ГСП-7, ул. Кржижановского, 15, корп. 2

CHROMATIN STATUS AS THE INDEX OF SPERMATOZOA VALUABLE: THE TESTS FOR ESTIMATION

V.A. Bagirov1, V.P. Kononov1, B.A. Iolchiev1, P.M. Klenovitskii1,

L.K. Ernst2

S u m m a r y

Improvement of reproduction level in the modern animal husbandry is a reserve of a considerable rise of its effectiveness. That is the extreme necessity in a dairy farming as low calf income can produce the depression of this intensive subindustry. Basically reproduction level is determined by reproductive potential of female and male equally. However in case of a female the infertility causes loss only from one itself but the subfertility of a male determines the loss that multiplied by number of females inseminated without success. Therefore, the priority of the problem decision should prefer the work with the sires. The last studies shown a sire subfertility can be caused by pathological state of spermatozoa chromatin as a genetic information carrier that determines the fertilization and the embryo development. Frequent a spermatozoa anomalies are the chromatin fragmentation, insufficient condensation and other violations that can decrease fertilization and embryo

survival. For assessment of spermatozoa chromatin and accordingly sires reproductive potential the tests were developed. In particular, SCSA (Sperm Chromatin Structure Assay) reveals stability of chromatin to denaturation, TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUtp Nick End Labeling) realizes visualization of DNA fragmentation by marking nicks, Comet Assay method reveals fragments by microelectrophoresis of separate spermatozoa, content ratio —S—S— h —SH groups and other.

Новые книги

С е л ь ц о в В.И., С е р м я г и н А.А., С и в-к и н Н.В. Совершенствование племенной работы и генеалогической структуры симментальской породы отечественной и импортной селекции. Дубровицы: ВИЖ, 2011, 72 с.

Методическое пособие представляет собой научно-аналитический труд, в котором изучено состояние племенной базы симментальской породы отечественной селекции за последние 10 лет, дана характеристика импортных животных симментальской породы зарубежной селекции по основным племенным и продуктивным качествам, проведен анализ генеалогических связей и структуры симментальской породы отечественной и зарубежной селекции по принадлежности к линиям для выделения современных и перспективных линий, уточнены целевые установки по разведению и параметрам продуктивности племенных групп животных, разработана единая генеалогическая структура линий симментальской породы в России с включением в нее племенного поголовья скота родственных пород зарубежной селекции. Приведены подробные генеалогические схемы линий. Реализация положений методического пособия способствует совершенствованию селекционной и племенной работы с симментальской породой и позволяет внести уточнения в кодификатор линий породы с целью присвоения уникальных кодов линиям родственных пород зарубежной селекции. Предназначено для селекционеров племенных хозяйств, специалистов региональных племенных служб и научных сотрудников.

Н и к и ф о р о в М.Е. Формирование и структура орнитофауны Беларуси. Минск: изд-во «Беларуская навука», 2008, 297 с.

В монографии излагаются подходы и результаты реконструкции истории формирования орнитофауны центральной части Европы, включая территорию Беларуси, в процессе завершения и после окончания эпохи плейстоценовых оледенений. Исследования осуществлялись с применением комплексного историко-биогеографического метода с привлечением данных по палеофаунистике, палеоботанике, палеофлористике и палеоклиматологии. На основе анализа ареалов моно-типических видов, а также подвидов полити-пических видов птиц центральной Европы проведены их типизация и выделение орни-тофаунистических голоценовых комплексов, определение закономерностей и моделей расселения таксономически дифференцированных популяций в позднем плейстоцене и го-

лоцене. Дана характеристика орнитогеографи-ческой структуры фауны птиц на территории Беларуси и ее фауногенетическая интерпретация. Обоснована система и локализация рефу-гиумов и рефугиальных зон Европы, давших начало расселению географически разделенных популяций птиц, а также перигляциальных плейстоценовых ареалов криофильных видов птиц. Проведены орнитофаунистические реконструкции суббореала голоцена и сравнительный анализ структуры фауны водноболотных птиц Беларуси на основе палеорни-тологических данных. Оценена динамика орнитофауны Беларуси в XX столетии и влияние на нее глобальных климатических изменений. Предназначена для специалистов в области зоологии, биогеографии, преподавателей, студентов и аспирантов биологической и географической специальностей, широкого круга читателей.

Р у п п е р т Э., Ф о к с Р., Б а р н с Р. Зоология беспозвоночных: Функциональные и эволюционные аспекты. В 4 томах. М.: изд-во «Академия», 2008, 496 с.

В четырех томах учебника рассматриваются группы животных от простейших до хордовых включительно. Помимо морфологических характеристик приводятся сведения о физиологии и биология беспозвоночных животных. Описание строения организмов сопровождается подробным анализом особенностей их функционирования. Третий том учебника посвящен членистоногим животным и родственным группам, объединяемым в таксон Рапат1Игороёа. В книге даны характеристики онихофор, тихоходок, трилобитов, хелицеровых, ракообразных, многоножек и шестиногих. Наиболее подробно рассмотрен комплекс адаптаций, обусловивший успешное освоение членистоногими суши. Для студентов высших учебных заведений. Может заинтересовать широкий круг специалистов-биологов.

Б о р и с е н к о Е.Г., В а н ь к о в а А.А., В о й н о Л.И., С и д о р е н к о О.Д. Микробиология. М.: изд-во «Инфра-М», 2010, 287 с.

Учебник представляет современные данные по обшей микробиологии, биотехнологии и биоконверсии возобновляемых ресурсов. Впервые отходы сельского хозяйства рассматриваются как исходное сырье для получения полезных продуктов: органических удобрений, кормовых добавок, лечебных препаратов и др. Учебник предназначен для студентов высших учебных заведений.