Суспензионный штамм культивируемых клеток растения якорцы стелющиеся (Tribulus terrestris L.) под обозначением Tter8 N81 в условиях in vitro - продуцент стероидных гликозидов
SUSPENSION STRAIN OF CULTURED CELLS OF TRIBULUS TERRESTRIS LINNAEUS PLANT UNDER DESIGNATION TTER8 №81 IN VITRO - PRODUCER OF STEROID GLYCOSIDES

Область применения
Изобретение относится к биотехнологии, в частности культивированию клеток растения якорцев стелющихся, и может быть использовано для получения ценных биологически активных соединений - стероидных гликозидов, которые широко используются в фармацевтической промышленности.
Уровень техники
Биологическая активность якорцев стелющихся обусловлена в основном за счет содержания стероидных гликозидов. На основе гликозидов якорцев стелющихся созданы многие медицинские препараты "Tribestane" и "Vitanone", которые используют для лечения импотенции, а также "Tribusaponins" и "Xin-CAK Shutong" - для лечения сердечнососудистых заболеваний. Показано, что экстракты растения якорцы стелющиеся являются безопасным и эффективным средством при лечении женской сексуальной дисфункции (Gama C.R., Lasmar R., Gama G.F., Abreu C.S., Nunes C.P., Geller M., Oliveira L., Santos A. Clinical Assessment of Tribulns terrestris Extract in the Treatment of Female Sexual Dysfunction / Clinical Medicine Insights: Women's Health. - 2014. - № 7. - P. 45-50). Также экстракт используется в качестве афродизйака для мужчин (Singh S. Nair V., Gupta Y.K. Evaluation of the aphrodisiac activity of Tribulus terrestris Linn, in sexually sluggish male albino rats / S. Singh, // Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. - 2013. - V. 3. - P. 43-47). Водный экстракт якорцев Tribulus terrestris L. при наружном применении обладает ранозаживляющими свойствами (Wesley J. J., Christina M., Chidambaranathan N., Ravikumar K. Wound healing activity of the leaves of Tribulus terrestris (Linn) aqueous extract in rats // Journal of Pharmacy Research. - 2009. - V.2. - № 5. - P. 841-843). Во многих работах сказано о противоопухолевой активности компонентов якорцев стелющихся - в частности, водный экстракт растения блокирует пролиферацию и индуцирует апоптоз раковых клеток печени человека через ингибирование передачи сигналов NF-kB.
Растение якорцы стелющиеся распространены в умеренном климате в сухих степях и полупустынях Средней Азии, в Южной Европе и северной Австралии.
Растение якорцы стелющиеся содержит большой спектр стероидных гликозидов - протодиосцин, прототрибестин, диосцин, трибестин, трибулозин, неопротодиосцин, и каждый год выдяляются все новые стероидные гликозиды из якорцев. Наибольшее содержание стероидных гликозидов обнаружено в семенах якорцев. Широкий спектр синтезируемых гликозидов делает это растение перспективным для биотехнологического производства.
Однако авторы не обнаружили в литературе данных о получении суспензионной культуры клеток in vitro якорцев стелющихся.
Задача изобретения
Задача изобретения - получение суспензионного штамма якорцев стелющихся (Tribulus terrestris L.) продуцента стероидных гликозидов со стабильными ростовыми параметрами, синтезом стероидных гликозидов и отсутствием сезонной зависимости их получения.
Решение задачи
Эта задача была решена получением суспензионного штамма культивируемых клеток растения якорцев стелющихся (Tribulus terrestris L.) в условиях in vitro, депонированного в Российскую Коллекцию Культивируемых Клеток Высших Растений при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук под обозначением Tter8 №81 - продуцент стероидных гликозидов.
Новизна изобретения
Новизной настоящего изобретения является то, что впервые был получен штамм суспензионной культуры клеток растения якорцев стелющихся - продуцент стероидных гликозидов.
Сущность изобретения
По мнению авторов, предлагаемое изобретение состоит в том, что за основу взят штамм каллусной культуры клеток растения якорцев стелющихся, которые помещают в жидкую питательную среду в качестве экспланта. В результате был получен суспензионный штамм - продуцент стероидных гликозидов.
Реализация изобретения
2
Культуру клеток якорцев стелющихся (Tribulus terrestris L.) получили путем перевода каллусной культуры в жидкую питательную среду. Для получения каллусной культуры в качестве эксплантов используют зрелые семена якорцев. Семена промывают детергентом и стерилизуют 0,1% водным раствором сулемы (HgCl) в течение 5 мин. После стерилизации материал ополаскивают, а затем 3-кратно отмывают в течение 20 мин в дистиллированной стерильной воде. Стерильные семена помещают на твердую питательную среду.
Для экспериментов используют твердую питательную среду следующего состава:
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>
1650,000±2,0000 мг
KNO<sub>3</sub>
1900,000±2,0000 мг
MgSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
370,000±1,0000 мг
КН<sub>2</sub>РO<sub>4</sub>
170,000±0,1000 мг
СаС1<sub>2</sub>×2Н<sub>2</sub>O
440,000±0,5000 мг
Н<sub>3</sub>ВО<sub>3</sub>
6,200±0,0100 мг
MnSO<sub>4</sub>×4H<sub>2</sub>O
22,300±0,0200 мг
ZnSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
8,600±0,0100 мг
KI
0,830±0,0010 мг
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>×2H<sub>2</sub>O
0,250±0,0010 мг
CuSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
0,025±0,0001 мг
СоС1<sub>2</sub>×6Н<sub>2</sub>O
0,025±0,0001 мг
FeS0<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
2,785±0,001 мг
Na-ЭДТА
3,725±0,001 мг
Гидролизат казеина
500,000±0,1000 мг
Мезо-инозит
100,000±0,0500 мг
Тиамин
0,100±0,0010 мг
Пиридоксин
0,100±0,0010 мг
Никотиновая кислота
0,500±0,0010 мг
6-бензиламинопурин
1,000±0,0010 мг
2,4-дихлорфеноскиуксусная
2,000±0,0010 мг
кислота
Сахароза
30000,000±100,0000 мг
Вода
1000 мл
Агар
5000 мг
Полученную в результате каллусную культуру помещают в жидкую питательную среду аналогичного состава, но без добавления агара.
Культивирование проводят в темноте, при 26±1°С, влажности помещения 70±5%, на качалке (100±10 об/мин), в колбах объемом 250 мл (30-40 мл суспензии в колбе). Цикл субкультивирования составляет 2 недели. При пересеве на 1 объем инокулюма вносят 6 частей свежей среды.
Полученные суспензионные культуры клеток выращивают в течение более тридцати циклов. В процессе культивирования определяют ростовые и биосинтетические характеристики.
Штамм якорцев стелющихся Tter8 №81 обладает следующими признаками: Культуральные признаки: биомасса клеток гомогенная, светло-желтой окраски, культуральная жидкость прозрачная.
Описание визуальных и цитологических наблюдений: культура представлена меристемоподобными клетками, собранными в компактные агрегаты, одиночными паренхимоподобными и удлиненными клетками.
Индекс роста (кратность прироста биомассы за одно субкультивирование) определяют по числу клеток, по сырому и сухому весу биомассы. Число клеток подсчитывают в камере Фукса-Розенталя после мацерации суспензии в 20% растворе хромовой кислоты при 60°±1С в течение 15-20 минут, в зависимости от возраста суспензии. Для определения веса сырой биомассы клетки отделяют от среды культивирования на бумажных фильтрах на вакуумном насосе, промывают водой и взвешивают. Сухую биомассу клеток получают после лиофильной сушки.
Жизнеспособность оценивают по проценту неокрашенных клеток в 0,1% растворе феносафранина.
В результате постоянного мониторинга состояния культур установлено, что жизнеспособность суспензионных культур стабильно держится на 90-100%. Ростовые характеристики культуры клеток якорцев стелющихся представлены на фиг.1.
При анализе представленных кривых роста следует отметить отсутствие лаг-фазы, при начальной плотности культуры клеток 1,5 г/л по сухому весу. Замедление роста на 14 сутки культивирования позволяет использовать 2-недельный цикл выращивания. Ростовые параметры (кроме индекса роста) рассчитывали по сухому весу биомассы. Результаты представлены в табл.1.
Для высокоэффективного жидкостного хроматографического (ВЭЖХ) анализа 100 мг лиофильно высушенной биомассы культур клеток трижды экстрагируют 70% этиловым спиртом (соотношение биомасса/растворитель 1/40 масса/объем) на ультразвуке (3 раза по 30 минут при комнатной температуре). Объединенный спиртовой экстракт упаривают досуха под вакуумом (при 55°С) и растворяют в воде. Затем последовательно чистят через обратнофазные силикогелевые трубки Supelclean™ ENVI™-18 SPE (Германия). Полученный спиртовой экстракт упаривают досуха и растворяют в этаноле. Осадок растворяют в смеси ацетонитрил:вода (24:76, по объему) и фильтруют через нейлоновой фильтр с порами 0,2 мкм (Acrodisc, Германия).
ВЭЖХ проводят на приборе Agilent 1200 Series. Пробу в объеме 20 мкл наносят на колонку Pecosphere 3CR С18 (83×4,6 мм, 3 мкм). Скорость подвижной фазы: 0-1 минута 0,6 мл/мин, 1-25 мин - 0,4 мл/мин. Детекция по поглощению при 203 нм. В качестве компонентов подвижной фазы используют ацетонитрил и воду. Элюирование осуществляют в изократическом режиме при соотношении ацетонитрил: вода (24:76, по объему). Количественное содержание фуростанолового гликозида определяют по стандарту R-протодиосцина чистотой 98%.
Перечень иллюстративных материалов
Фигура 1. Ростовые характеристики культуры клеток якорцев стелющихся.
Таблица 1. Ростовые параметры культуры клеток якорцев стелющихся.
Результаты изобретения
Как видно из таблицы 1, штамм обладает высокой жизнеспособностью - около 95% при стабильных ростовых характеристиках. В штамме Tter8 №81 культуры клеток якорцев стелющихся был обнаружен фуростаноловый гликозид - протодиосцин.
В результате изобретения был показан способ получения суспензионной культуры клеток из семян через каллусные культуры клеток. Таким образом была получена суспензионная культура клеток якорцев стелющихся (Tribulus terrestris L.) со стабильными ростовыми параметрами и синтезирующая протодиосцин. Удобство такого способа получения этого соединений состоит в отсутствии сезонной зависимости их производства.