СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАЧЕСТВА ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ МЕТОДОМ ЭПР-СПЕКТРОСКОПИИ ЛИШАЙНИКОВ
METHOD FOR DETERMINING ENVIRONMENT QUALITY BY EPR-SPECTROSCOPY OF LICHENS

Изобретение относится к экологии и может найти применение при оценке экологического состояния любого участка территории по биофизическим характеристикам растительности на примере лишайников.
Поиск критериев оценки качества окружающей среды выходит на передний план современной науки, и поэтому поиски методов контроля состояния окружающей среды расширяются и дополняются новыми способами измерения. Перспективным направлением является применение биологических методов, основанных на использовании показателей чувствительных биоиндикаторов к состоянию окружающей среды. Актуальность использования биоиндикационных методов при экологическом мониторинге загрязнения среды сегодня не вызывает сомнения. Они дают полную информацию о состоянии природных систем в дополнение к физико-химическим методам. Стресс любого живого организма в результате воздействия поллютантов является предпосылкой изменения в самом организме, который при усилении отражается уже на структурах природных популяций. В этой связи большим потенциалом обладает оценка состояния отдельных видов на организменном уровне, что позволяет приблизиться к одной из основных целей биологического мониторинга - определения чрезвычайного состояния окружающей природной среды на ранних стадиях.
На сегодняшний день лихеноиндикация является одним из перспективных и наиболее разработанных методов экологического мониторинга, который позволяет достоверно и без больших затрат определять степень загрязнения воздуха, почвы и оценивать воздействие предприятий на окружающую среду. Основаниями для лихеноиндикации служат низкая способность лишайников к авторегуляции и высокая степень их зависимости от физико-химических параметров среды.
В настоящее время методы лихеноиндикации основываются, как правило, на показателях биоразнообразия (количество видов, проективное покрытие, видовой состав лихеносообществ, полеотолерантные лихенологические индексы), но которые сложно интерпретировать для урбанизированных территорий. Лишайники, произрастающие в условиях города, подвержены влиянию комплекса как экологических показателей, так и воздействий поллютантов. Если экологические показатели характеризуют условия местообитаний видов (pH коры дерева, водный режим лишайников, интенсивность освещения, размеры окружности стволов деревьев, отклонение от поверхности стволов и др.), то возникает ряд вопросов в разграничении между фактами неоднородности экологических показателей и уровнем загрязнения. В этой связи особое значение приобретают исследования, направленные на изучение механизма ответной реакции биосенсоров на негативное воздействие и экологической приуроченности объекта.
3
3
У лишайников нет восковой кутикулы или другого внешнего слоя для защиты от влияния окружающей среды или снижения водных потерь, нет у них и отверстий, через которые проходят газы. Вся их поверхность в течение суток открыта для диффузии химического вещества, находящегося в воздухе. В итоге любое химическое вещество, к которому клетки лишайника не могут адаптироваться, представляют опасность, если концентрация достигает высокого уровня. Из всех ингредиентов загрязненного воздуха самое отрицательное воздействие на лишайники оказывает двуокись серы. Наиболее мощные источники двуокиси серы - ТЭЦ, плавильные заводы, электростанции - наносят серьезный ущерб численности и видовому составу лишайников. Экспериментально установлено, что сернистый газ даже в небольшой концентрации 0,08-0,1 мг/м воздуха начинает губительно воздействовать на многие лишайники. Концентрация двуокиси серы, равная 0,5-0,1 мг/м, смертельна для всех лишайников.
2
2
Атмосферные выбросы от предприятий и автотранспорта оказывают негативное воздействие на талломы лишайников, а именно на лихенизированные водоросли, представляющие автотрофный компонент, в которых снижается содержание хлорофилла и каротиноидов, вызывая сдвиги в структуре мембран хлоропластов, что отрицательно сказывается на интенсивности фотосинтеза. Исследование воздействия SO на лишайники показывают: с увлечением концентрации сернистого ангидрида в воздухе увеличивается проницаемость мембран. Диоксид серы, действуя как акцептор или донор электронов, препятствует транспорту метаболитов и разрушает мембрану клеток. Внутри клетки SO разрушает молекулы ферментов, ассоциированных на мембране. Большинство важных ферментов содержат в своем составе ионы металлов, ферментативная активность которых часто сопровождается изменением валентности этих металлов. Поскольку такие изменения валентности часто связаны с возникновением неспаренного электрона в электронном окружении самого металла, то их можно обнаружить методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР-спектроскопии), который является универсальным для понимания причин изменения гомеостаза внутренней среды биосенсоров. Метод ЭПР-спектроскопии служит для изучения парамагнитных центров (неспаренных электронов) в веществах и в их окружениях. Его применение связано с изучением органических свободных радикалов, комплексных ионов парамагнитных металлов и фотовозбужденных триплетных состояний молекул.
Одними из первых шагом в области изучения воздействия внешней среды на биологические организмы методом ЭПР-спектроскопии были работы Л.А. Блюменфельда и др., в которых были получены спектры электронного парамагнитного резонанса свободных радикалов белковых препаратов. Количество свободных радикалов увеличивалось в результате прямого воздействия гамма-излучения на аминокислоты и пептиды, что отражалось в изменении ЭПР-спектров белковых препаратов. Метод ЭПР применяется для изучения всех процессов, которые протекают с участием парамагнитных частиц, например свободных радикалов, как в интактных биологических образцах, так и в клеточных фрагментах и в модельных системах. Количество свободных радикалов в тканях коррелирует с их метаболической активностью. Концентрация свободных радикалов изменяется при возникновении патологических процессов. С помощью метода ЭПР-спектоскопии был получен массив данных при исследовании действия излучений как на биологически значимые макромолекулы, так и на ткани животных, семена и др. биологические объекты.
ЭПР-спектроскопия широко применяется в исследованиях фотосинтеза, где с помощью этого метода изучаются первичные стадии фотохимических реакций переноса электрона от хлорофилла к первичным акцепторам электрона и дальнейший перенос электрона по электрон-транспортной цепи хлоропластов. Примерами парамагнитных частиц служат свободные радикалы, возникающие как в результате повреждающего действия радиации на биологические структуры, так и при фотохимическом окислении хлорофилла. Ионы парамагнитных металлов Fe, Co, Ni, Cu, Mn являются распространенными в биологических системах парамагнитными частицами, входящими в состав энзимов. Парамагнетизм этих ионов обусловлен особенностями заполнения электронных оболочек, в результате чего энергетически выгодным оказывается наличие неспаренных электронов на некоторых внутренних орбиталях. Метод ЭПР позволяет наблюдать окислительно-восстановительные превращения этих металлов и судить, таким образом, об их функционировании.
Измерения ЭПР-спектра основных представителей биоты (представители растительного и животного царства, грибов и лишайников) показали, что как водоросли, так и грибы, так и высшие растения имеют спектры, схожие со спектрами лишайников. Однако значение амплитуды широкого пика спектра ЭПР как у низших растений (водоросли, дрожжи, мхи), так и у высших растений (можжевельник) меньше, чем у лишайников. К примеру, характеристики широкого пика ЭПР-спектра имеют максимальную концентрацию спинов у лишайника Xanthoria parietina, а минимальную концентрацию спинов имеют дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Узкий пик ЭПР-спектра изучаемых образцов тоже определяет характерные различия между разными представителями биоты. Максимальную концентрацию спинов имеет можжевельник обыкновенный Juniperus communis (голосеменное растение), а минимальную концентрацию спинов имеют дрожжи Saccharomyces cerevisiae.
Таким образом, концентрация спинов широкого и узкого пиков природных стабильных радикалов в исследуемых образцах модельных организмов биоты является достоверной характеристикой состояния организма, которая может определять условия среды, но из основных таксонов биоты именно исследование талломов лишайников методом ЭПР является более информативным [1].
Известен способ оценки экологического состояния территории методом лихеноиндикации, при котором в качестве биоиндикатора используют значение фрактальной размерности поверхности талломов лишайников с последующим использованием компьютерной техники, на которой определяют размерность талломов лишайников и по изменению их структуры судят о загрязнении территории [2].
Недостатком способа является то, что обязательным условием является наличие целостности внешнего вида талломов эпифитных лишайников, которые при высоких уровнях антропогенных загрязнений могут не иметь требуемого стандарта внешнего вида.
Известен способ биоиндикации загрязнения воздуха методом лихеноиндикации, который основан на геоботаническом исследовании для определения пробных площадок для сбора лишайников и изготовлением особых палеток для наложения на исследуемые поверхности [3]. Метод также требует сложных процедур измерений и затрат на изготовление специальных палеток. Выбор точки наложения палеток определяется визуально, т.е. степень субъективности исследователя высокая, что негативно влияет на достоверность результата.
Наиболее близким к заявляемому патенту является способ определения экотоксикантов в атмосфере промышленных зон с помощью применения биоиндикатора - эпифитного лишайника HYPOGYMNIA PHYSODES (L.) NYL и определение его физико-химического состояния методом инфракрасной спектроскопии (ИК-спектроскопия) [4]. Возможность идентификации химического состава соединений с помощью ИК-спектроскопии определяет интерес к использованию этого метода в лихеноиндикации.
Недостатками этого способа являются узкий спектр определения химических экотоксикантов и трудоемкий процесс моделирования воздействия на лишайник концентрированными растворами кислот.
Технической задачей в способе определения качества окружающей среды методом ЭПР-спектроскопии лишайников является оперативность, повышение точности и достоверности результатов с применением известных математических методов вычисляется концентрация парамагнитных центров в талломах лишайников по ЭПР-спектрам, значения которых определяют интенсивность антропогенного воздействия в образцах собранных видов лишайников.
Технический результат данного изобретения - усовершенствование способа лихеноиндикации, повышение качества оценки исследуемых объектов, получение объективного результата, независимого от субъективной оценки исследователя на основе биофизических характеристик лишайников.
Сущность изобретения.
Способ определения качества окружающей среды методом ЭПР-спектроскопии лишайников, включающий сбор образцов талломов лишайников со стволов деревьев, произрастающих в индустриальной и фоновой зоне, не загрязненной антропогенными выбросами в окружающую среду, очистку, сушку, измельчение, согласно изобретению, сушку проводят при температуре 85-95°C до постоянного веса и измельчают, снимают ЭПР-спектры, по которым определяют концентрацию парамагнитных центров, при превышении концентрации парамагнитных центров в образцах лишайников, собранных в индустриальной зоне, над концентрацией парамагнитных центров образцов лишайников из фоновой зоны судят о низком качестве окружающей среды в индустриальной зоне, а при равенстве концентраций парамагнитных центров - о допустимом качестве окружающей среды, причем в исследованиях используют образцы одного и того же вида лишайника.
Изобретение основано на дополнении известного метода ЭПР-спектроскопии лишайников новыми условиями подготовки образцов лишайников к измерениям с последующим сравнением с концентрацией ПМЦ фоновой зоны. При этом температурная обработка образцов до постоянного веса положительно влияет на качество получаемого ЭПР-спектра.
Это позволило получить новую взаимосвязь известных и отличительных признаков, в результате чего достигнут новый технический результат - повышение достоверности оценки качества окружающей среды на основе биофизических характеристик лишайников независимо от субъективной оценки исследователя.
Способ поясняется следующими графическими изображениями.
1
2
1
Фиг. 1. ЭПР-спектр лишайника X.PARIETINA: g=2,1-2,2; g=2,0025-2,0034; ΔΗ=400±23 Гс.
Фиг. 2. Значения концентрации парамагнитных центров ЭПР-спектров лишайника X.PARIETINA в местах, различающихся по уровню загрязнения окружающей среды (точка 1 - фоновая зона, точка 2 - зона с антропогенной нагрузкой).
Фиг. 3. Значения концентрации парамагнитных центров ЭПР-спектров лишайника Н. PHYSODES в местах, различающихся по уровню загрязнения окружающей среды (точка 1 - фоновая зона, точка 2 - зона с антропогенной нагрузкой).
Способ осуществляется следующим образом.
1
1
2
Исследование талломов лишайников показывают, что все образцы имеют характерный ЭПР-спектр [4]. Регистрируемый широкий сигнал ЭПР с g=2,1-2,2 и ΔΗ=400±23 Гс, который характеризует парамагнитные свойства как органической, так и неорганической компоненты, кроме того, во всех анализируемых спектрах присутствует узкий сигнал ЭПР с g=2,0025-2,0034 (фиг. 1).
Способ включает следующие этапы.
2
а) Сбор образцов лишайников проводится общепринятыми геоботаническими и лихенологическими методами. Закладываются пробные участки размером 25×25 м. Лишайники осторожно собираются с помощью острого скальпеля. Лишайники, собранные с одного дерева (с одной экспозиции), помещаются в пронумерованный бумажный пакет. Данные на пакете заносятся в таблицу полевого дневника, где указываются следующие данные: дата сбора, порода дерева, экспозиция, наклон ствола, общая площадь покрытия лишайников и доля покрытия каждого вида отдельно. Таким образом, на каждом пробном участке исследуют 5-10 деревьев одного вида со сходным диаметром ствола и сбор производят на высоте от 50 до 200 см от комля ствола. При выборе стволов деревьев необходимо соблюдать расстояние между ними (не менее 10 м).
б) Подготовка образцов к измерению. Из собранных образцов, при помощи пинцета, удаляют макроскопический инородный материал (мхи, частицы грунта, щебень). Образцы промывают три раза по пять минут в дистиллированной воде, а затем кладут на фильтровальную бумагу для удаления лишней влаги; образцы сушат в сушильном шкафу при температуре 85-95°C в течении трех часов; в аналитической мельнице марки ″ΙΚΑ А11″ сухой образец предварительно размалывают, а затем для тонкого измельчения используют фарфоровую ступку с пестиком. Образец получают помещением тонко измельченного лишайника в пробирку диаметром 5 мм и толщиной стенки 0,1 мм так, чтобы масса образца составляла 50,0±0,5 мг.
в) Подготовка к снятию ЭПР-спектра. Выполняют проверку пробирок на отсутствие в них фоновых сигналов ЭПР. Проверка проводится при максимальном усилении ЭПР-спектрометра с выбранными оптимальными режимами измерения. Пробирка не должна иметь собственных сигналов ЭПР, в противном случае ее не используют при проведении экспериментов. Подготовку спектрометра ЭПР к работе выполняют в соответствии с руководством по эксплуатации прибора. Амплитуда модуляции магнитного поля составляет не более 0,2 мТл, скорость развертки магнитного поля - не более 0,1 мТл/с, постоянная времени - не более 2 с, ширина развертки поля - 51,2 мТл и 3,2 мТл, уровень СВЧ-мощности - не более 12 мВт.
Работы на ЭПР-спектрометре проводятся при температуре окружающего воздуха 17-35°C, атмосферном давлении 630-800 мм рт. ст. и влажности окружающего воздуха 45-80%. Для снятия ЭПР-спектра лишайника в резонаторе закрепляется кристалл рубин так, чтобы спектр кристалла не накладывался на спектр исследуемых образцов. Характеристики ЭПР-спектра кристалла рубин определяют по спектру одного миллиграмма стабильного радикала 2,2-дифинил-1-пикрил-гидразила (ДФПГ). Для этого необходимо записать спектр ДФПГ совместно со спектром ″закрепленного″ кристалла рубин. Спектр ЭПР ДФПГ представляет собой симметричный синглет, g-фактор равен 2,0036, а ширина линии - 0,01 мТл. Спектр ЭПР кристалла рубин дает анизотропные спектры. Пробирку с образцом помещают в резонатор спектрометра ЭПР на фиксированную глубину, соответствующую центру резонатора. Спектр ЭПР образца снимают совместно со спектром кристалла рубин. В процессе длительных измерений периодически проводят контроль над стабильностью работы ЭПР в соответствии с руководством по эксплуатации.
x
г) Расчет концентрации парамагнитных центров. Снятыми ЭПР характеристиками были g-фактор; ширина линии ΔΗ (Тл); интенсивность сигнала J′. Концентрацию ПМЦ (парамагнитных центров) N определяют при помощи построения линейных анаморфоз по экспериментальным данным. Двумя крайними случаями спектра ЭПР являются линии, описываемые уравнением Гаусса и Лоренца (Приложение 1). Для определения N пользуются сравнением спектров от исследуемого образца и эталона (рубин), содержащего известное количество неспаренных электронов, причем спектры должны быть измерены в идентичных условиях, обеспечивающих одинаковое значение параметра а. Если линии образца и эталона имеют одинаковую форму, то количество Nнеспаренных электронов в образце определяется по формуле (Приложение 1)
д) Определение качества окружающей среды. Сравнивают значения концентрации парамагнитных центров в образцах лишайников одного вида, собранных в индустриальной зоне, с концентрацией парамагнитных центров образцов лишайников того же вида из фоновой зоны, и по полученной разнице значений концентрации парамагнитных центров между образцами одного и того же вида лишайника определяют уровень качества окружающей среды исследуемой зоны. Увеличение разницы значений концентрации парамагнитных центров свидетельствует о возрастании антропогенной нагрузки на окружающую среду, а при равенстве их величин следует вывод о допустимом качестве окружающей среды.
Примеры конкретного выполнения способа.
Пример 1.
В примере 1 использовались образцы эпифитных видов лишайника, собранных в зонах интенсивной антропогенной деятельности и в ненарушенных местах обитаний. Образцы собраны и определены по стандартам полевых методов исследований. С каждой точки исследований было собранно не менее пяти талломов лишайника. Отобраны образцы распространенного эпифитного вида лишайника: XANTHOMA PARIETINA (L.) ΤΗ. FR. (Фиг. 2). Образцы собраны 14.09.2011 года в местах с разной антропогенной нагрузкой: точка №1 - пос. Пестово Московской области (55° 44′ 41″ с. ш., 38° 3′ 9″ в. д.); точка 2 - г. Долгопрудный Московской области (55° 56′ 34″ с. ш., 37° 30′ 31″ в. д.).
14
-4
Измерения проводили на ЭПР-спектрометре ″СПЕКТР-001″, страна-производитель - Российская Федерация, который имеет следующие характеристики: рабочий диапазон частот 9,8±0,3 ГГц; чувствительность не менее 2×10 спин/Тл; диапазон регулирования мощностей СВЧ-генератора от 10 до 50 мВт; добротность СВЧ - резонатора не менее 6000; амплитуда модуляции индукции магнитного поля на частоте 100 кГц (1-4)×10 Тл; диапазон развертки индукции магнитного поля не менее 0,37 Тл; диапазон значений постоянной времени накопления сигнала ЭПР от 0,1 до 10 с (сертификат о калибровке №910-13-01 от 09.07.2013 г. выдан ВНИИФТРИ).
Во всех образцах были сняты сигналы ЭПР с двумя пиками. Первый пик имеет g-фактор, равный 2.0029±0.0005, и ширину пика ΔΗ=5.3±0.4 Гс (g-фактор и ширина этого пика на всех образцах оставались неизменными). Другой пик - ширина около 400 Гс и g-фактор от 2,126 до 2,196.
17
Таким образом, концентрация ПМЦ в широком пике ЭПР-спектра образца различалась для лишайника X. PARIETINA в фоновой зоне (точка 1) и г. Долгопрудном (точка 2) на 3,9×10 спин/мг (Таблица 1), т.е. точка 2 находится на территории с антропогенной нагрузкой, что обусловлено расположением точки 2 рядом с дорогой с интенсивным движением автотранспорта.
Пример 2.
В примере 2 вид HYPOGYMNIA PHYSODES (L.) NYL был собран в городском сквере (г.Долгопрудный, 55° 93′ 20″ с. ш. 37° 51′ 45″ в. д.) со стволов деревьев (точка 2), фоновой зоной служила ненарушенная территория поселка Банино (точка 1) (56° 26′ 56″ с. ш. 37° 19′ 48″ в. д.). Отбор проб осуществлялся 9.06.2012 года (фиг. 3) и проводился по аналогии с первым примером.
17
Таким образом, изменение концентрации ПМЦ в широком пике ЭПР-спектра образца для лишайника Н. PHYSODES с разной антропогенной нагрузкой составило 1,2 x 10 спин/мг (Таблица 2), т.е. точка 2 находится на территории с антропогенной нагрузкой.
Выводы.
Промышленная применимость данного способа лихеноиндикации на основе новых подходов и биофизического метода даст возможность создать первые лихеноиндикационные карты Подмосковья на примере г. Долгопрудного и дополнит разрабатываемые экологические карты для других регионов России. Результаты исследований могут быть использованы для оценки степени устойчивости лишайников к отрицательному воздействию различных предприятий на растительные объекты при проведении экологического мониторинга окружающей природной среды. Создание базы данных по биофизическим характеристикам распространенных лишайников позволит выявить динамику загрязнения окружающей среды, что, в свою очередь, позволит картировать и ранжировать территории по степени загрязнения окружающей среды. Созданные коллекции лишайников и базы данных по лихенологическим показателям разных урбанотерриторий России, а также новый разработанный способ может служить основой при разработке программ долговременного мониторинга качества окружающей среды. В итоге ботанический узкоспециализированный метод определения зон загрязнения среды по наличию и обилию проективного покрытия индикаторных видов лишайников получит дополнительное и достоверное биофизическое обоснование, осуществленное методом ЭПР-спектроскопии.
Список используемых источников литературы
1. Журавлева, С.Е., Бондаренко П.В., Трухан Э.М. Биомониторинг индикаторных видов лишайников методом ЭПР-спектроскопии. Биофизика, 2013. Т. 58. Вып. 2. С. 329-333.
2. RU 2260934 С1, 27.09.2005.
3. RU 2459202 С1, 23.03.2011.
4. RU 2430357 С2, 27.12.2010.