Устройство для окрашивания крахмалосодержащего образца для микроскопического исследования

Полезная модель относится к средствам для исследования крахмалосодержащих объектов и может быть использована для получения окрашенных образцов для микроскопического исследования распределения крахмальных зерен в тканях растительного и иного происхождения.
Содержание крахмала, его состав и характер распределения крахмальных зерен в растительных тканях зависят от вида и сорта растения, условий и агротехники выращивания, зрелости, сроков и условий хранения. Выведение и отбор для культивирования новых сортов крахмалосодержащих культур, оптимизация условий выращивания, хранения и переработки урожая, разработка рецептур продуктов питания требуют информации о содержании и распределении крахмала в тканях этих растений.
Известны различные способы определения содержания крахмала в крахмалосодержащих продуктах: колориметрический [Arie Gur, Aharon Cohen, and Ben-Ami Bravdo, "Colorimetric method for starch determination" J. Agric. Food Chem., 1969, 17 (2), p.p. 347-351; Magel E. "Qualitative and Quantitative Determination of Starch by a Colorimetric Method", Starchhtlrke 1991, 43, 10, S. 384-387], поляриметрический [«Способ определения содержания крахмала в клубнях или зерне поляриметрическим методом», BY 15229, С1, опубл. 30.12.2011], спектрофотометрический ["A method and system for determination of starch in a sample", С A 3018449 A1, опубл. 05.10.2017]. Они позволяют определить интегральные значения содержания крахмала в исследуемом продукте, но не дают информации о распределении крахмальных зерен в тканях крахмалосодержащих растений, что необходимо для решения многих практических задач.
В работе [Sjoo М.Е, Elisson А.-С, Autio K. "Comparison of different microscope methods for the study of starch and other components within potato cells", Food, (Special Issue 1), 2008, p.p. 39-44] дан обзор гистологических методов и устройств для фиксации и сравнительного микроскопического исследования распределения гранул крахмала в тканях разных сортов картофеля до и после термической обработки. Описано применение флуоресцентной микроскопии, конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, сканирующей электронной микроскопии, трансмиссионной электронной микроскопии. Все эти методы позволяют получать детальную информацию о распределении белков и углеводов в тканях крахмалосодержащих продуктов, однако ограниченно применимы для проведения массовых рутинных исследований, т.к. требуют длительного времени и дорогостоящего оборудования.
Использование доступного, пригодного для рутинного применения, способа исследования распределения крахмальных гранул в растительных тканях с помощью светлопольной микроскопии требует приготовления окрашенных образцов, для чего, как правило, используют хорошо известную реакцию крахмала с йодом, при которой образуются так называемые соединения включения характерного сине-фиолетового цвета. Реакция, открытая в начале XIX века, и поныне используется для обнаружения крахмала в крахмалосодержащих продуктах [ГОСТ 7698-93 Крахмал. Правила приемки и методы анализа]. В публикации «Количественное цитохимическое определение крахмала» [http://vinograd.info/knigi/metodiki-po-fiziologo-biohimicheskim-issledovaniyam/kolichestvennoe-citohimicheskoe-opredelenie-krahmala.html] описано применение йодокрахмальной реакции для цитохимического определения крахмала в многолетних частях кустов винограда. В качестве реактива применяют 0,2%-ный водный раствор йода с йодистым калием.
Обработанные соляной кислотой срезы помещают на часовые стекла или в неглубокие стаканчики и покрывают несколькими каплями йодсодержащего раствора. Для массовой работы авторы рекомендуют использовать многогнездовые кюветы, которые можно изготовить из чашек Петри. После того, как крахмальные зерна приобретают сине-фиолетовую окраску, срезы переносят на предметное стекло в каплю глицерина, покрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом. Следует, однако, отметить, что реализация метода требует выполнения последовательности ряда ручных операций, а также применения соляной кислоты, агрессивные пары которой весьма неблагоприятно влияют как на здоровье исследователей, так и на состояние не защищенного от коррозии оптико-механического оборудования.
Техническая проблема, решаемая предлагаемой полезной моделью, состоит в создании устройства для окрашивания образцов крахмалосодержащих тканей для микроскопического исследования, позволяющего упростить процесс подготовки образца, исключив ручные манипуляции и применение агрессивных реагентов при проведении йодокрахмальной реакции.
Предлагаемое устройство содержит генератор воздушного потока, соединенный через регулятор потока с проточной закрытой емкостью, содержащей источник паров йода, соединенной, в свою очередь, через воздуховодную линию с устанавливаемой на столике микроскопа прозрачной проточной кюветой, содержащей исследуемый образец.
На Фиг. 1 показана схема устройства.
На Фиг. 2 представлены фотографии, показывающие динамику развития окрашивания среза клубня картофеля во времени при проведении йодокрахмальной реакции в заявляемом устройстве. Время экспозиции в парах йода: 1-10 с; 2-30 с; 3-60 с. Толщина коричневой линии внизу справа - 50 мкм.
Устройство, схема которого показана на Фиг. 1, представляет собой проточную систему, включающую генератор 1 воздушного потока, присоединенный через регулятор 2 потока к проточной емкости 3, предназначенной для насыщения воздушного потока парами йода, которая, в свою очередь, через воздуховодную линию 4 соединена с размещаемой на столике 5 микроскопа проточной кюветой 6, в которой размещен исследуемый образец.
В качестве генератора 1 воздушного потока, обеспечивающего движение потока воздуха через систему, могут быть использованы микрокомпрессор или шприцевое устройство. В качестве регулятора 2 потока может быть использован трехходовой кран, с помощью которого регулируют скорость воздушного потока, подаваемого в систему. Проточная емкость 3, выполненная в виде плотно закрывающегося контейнера, имеющего входное и выходное отверстия, содержит источник паров йода - кристаллический йод, или раствор йода в спирте или водном растворе йодистого калия. Проточная кювета 6, в которой находится исследуемый образец, выполнена из прозрачного материала, накрыта покровным стеклом и имеет геометрические размеры, позволяющие размещать ее на предметном столике микроскопа.
Функционирование устройства проиллюстрировано приведенным ниже примером приготовления окрашенного образца среза картофеля для микроскопического исследования распределения крахмальных зерен, однако аналогичным образом оно может быть использовано для получения окрашенных образцов любых крахмалосодержащих тканей.
Исследуемый образец представляет собой тонкий (~0,7 мм) срез ткани клубня картофеля. Образец размещают в проточной кювете 6 так, чтобы он равномерно омывался со всех сторон потоком воздуха, содержащим пары йода, например, на закрепленной внутри кюветы сетке. Кювету накрывают покровным стеклом и размещают на предметном столике 5 микроскопа. В плотно закрывающуюся проточную емкость 3 помещают кристаллы йода или раствор йода, образующие пары йода, которые с потоком воздуха через воздуховод 4 поступают в установленную на столик 5 микроскопа проточную кювету 6. Скорость воздушного потока, регулируемую с помощью трехходового крана 2, подбирают эмпирически так, чтобы обеспечить захват паров йода из проточной емкости 3 в объеме, достаточном для окрашивания исследуемого образца в течение 10-60 секунд. Образец, содержащий крахмал, омывается воздушным потоком, содержащим молекулы йода, при этом развивается характерное сине-фиолетовое окрашивание. Динамика нарастания окрашивания образца в течение 60 секунд показана на Фиг. 2.
Применение полезной модели для обработки срезов крахмалосодержащих тканей парами йода обеспечивает визуализацию крахмальных зерен, позволяющую исследовать и фиксировать их распределение в образце с помощью микроскопа. Обработка полученных изображений может быть проведена известными методами - вручную или с помощью специальных программных средств.
Устройство удобно для выполнения серийных рутинных исследований, т.к. позволяет исключить ручные операции перемещения и предварительной обработки образцов в ходе их подготовки для анализа, исключает применение агрессивных реагентов и позволяет проводить микроскопическое исследование непосредственно в кювете, в которой происходит проявление крахмальных зерен парами йода.
Таким образом, совокупность отличительных признаков полезной модели обеспечивает решение технической проблемы - создание устройства для окрашивания образцов крахмалосодержащих тканей для микроскопического исследования, позволяющего упростить процесс подготовки образца, исключив ручные манипуляции и применение агрессивных реагентов при проведении йодокрахмальной реакции.