СУХОЙ ПРОБИОТИЧЕСКИ АКТИВНЫЙ ПРЕПАРАТ "ВИТАФЛОР-П"
"VITAFLOR-P" DRY PROBIOTICALLY ACTIVE PREPARATION

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к составам для получения кисломолочного продукта, обладающего высоким пробиотическим потенциалом, в экстремальных условиях, в частности на борту космического корабля или станции, в условиях длительного автономного подводного плавания и т.д. Она также может быть использована в пищевой промышленности, медицине, ветеринарии и смежных отраслях.
Известны сухие биопрепараты на основе молочно-кислых микроорганизмов (ЕР 0097484, 1984: ЕР 0043962, 1980; US 4289888, 1979). Такие препараты содержат клетки бактерий, остатки культуральной жидкости (КЖ), жиры, белки, лактозу, камедь и другие добавки. Технология их получения включает в себя, как правило, подготовку раствора или взвеси биомассы микроорганизмов, введение в нее специальных добавок, сублимационное высушивание и получение готового сухого продукта (закваски), используемого в последующем в качестве посевного материала при получении кисломолочного продукта с помощью ферментеров или иного аналогичного оборудования.
Недостатком вышеуказанных технологий является относительно невысокая биологическая активность посевного материала, технологическая сложность, а также необходимость использования специального оборудования для приготовления напитка, что затруднительно в экстремальных условиях в связи с дефицитом свободных площадей и имеющимися ограничениями по весу оборудования.
Одним из наиболее перспективных пробиотических препаратов для использования в экстремальных условиях в связи с простотой получения и широким спектром позитивного воздействия на организм является препарат «ВИТАФЛОР» (RU 2160992, 2000). Полученный на его основе напиток зарекомендовал себя как эффективное антибактериальное средство для профилактики и лечения кишечных инфекций, некоторых онкологических заболеваний, а также как перспективный иммуностимулятор и адаптоген (RU 2269353, 2006; RU 2170023, 2001), что наряду с полной безопасностью - препарат разрешен для кормления детей старше 3 месяцев- делает его перспективным для использования в экстремальных условиях, когда человек лишен возможности пользоваться стационарным лечением. Способ получения напитка заключается в том, что лиофилизированная сухая закваска данного препарата, которая содержит 2-100 млрд жизнеспособных клеток 2-х штаммов Lactobacillus acidophilus Н-1 и Н-2, 0.5-2.5 масс.% желатина, 5-20 масс.% сахарозы, 3-5 масс.% обезжиренного молока, 2-8 масс.% воды и остатки культуральной жидкости помещается в молоко или молочную смесь и выдерживают при повышенной температуре в течение 16-18 ч.
К недостаткам данного препарата и технологии его получения можно отнести то, что для получения конечного кисломолочного продукта, обладающего требуемыми пробиотическими свойствами, необходимо наличие значительных количеств свежего молока, что трудно выполнимо в условиях длительного отрыва от источников снабжения. Вместе с тем использование стандартного сухого молока, полученного методом распылительного высушивания, не позволяет получить качественный препарат с высоким титром живых микроорганизмов
Известна технология получения закваски «Витафлора» в виде таблетки с помощью тритурационной технологии, сущность которой заключается в разливе посевного материала с питательной средой и формообразующими и вспомогательными добавками (альгинатом натрия, полиглюкином, соком свеклы и мегасвитом) по матричным стерильным алюминиевым формам диаметром 20 мм и высотой 7 мм, после чего формы охлаждали до -10°С и помещали в сублимационную камеру на 2.0-2.5 часа при -25-27°С, а затем температуру понижали до -47-50°С при одновременном снижении давления до 10-12 Па и выдерживали в течение 33-43 часов при постепенном подъеме температуры до -25-27°С и понижении давления до 5-6 Па. При достижении в камере указанных условий форму экспонировали 3 часа, после чего сбрасывали вакуум и осуществляли выгрузку таблеток из форм (RU 2169574, 2001).
Преимуществами пробиотического препарата, полученного подобным образом, является стабильность при хранении при положительных температурах. Недостатками препарата является плохая водорастворимость, а также введение в его композицию веществ, не показанных к применению в условиях невесомости, а также необходимость при получении кисломолочного продукта на его основе использовать значительные количества жидкой питательной среды сложного состава, что затруднительно в условиях ограничений по весу и габаритам используемых продуктов.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является разработанный ранее авторами препарат для использования в экстремальных условиях - «Витафлор-К» (RU 2425576, 2011), представляющий собой смесь лиофилизированных порошков закваски «Витафлора» и питательной среды-смеси сухого молока с 0,1-1,0% поверхностно-активного вещества (ПАВ), помещенные в герметически закупоренную емкость. Исходный продукт (смесь порошков питательной среды и посевного материала) для последующего получения на его основе кисломолочного напитка готовят путем смешивания в определенном соотношении сублимационно высушенной и измельченной закваски «Витафлор», ПАВ и сублимационно высушенного и измельченного молока. Для получения конечного кисломолочного продукта емкость вскрывают, препарат разводят водой в заданной концентрации (как правило, в соотношении примерно 1:10) и помещают на 18-20 часов в термостат при 37±2°С.
9
9
Недостатками возможность является возможность потери активности микробиологического препарата при транспортировке препарата на орбиту при температурах, достигающих значений 25-27°С и выше (например, в ходе доставки препарата на борт МКС, где предполагается использовать его в качестве закваски для получения кисломолочного продукта «Витафлор») и его последующем хранении. Такая деактивация препарата связана с тем, что при измельчении сухого биологического препарата, состоящего из клеток микроорганизмов наблюдается значительное увеличение его удельной поверхности и повышается доступность бактериальных клеток к постороннему воздействию со стороны как кислорода и воды, особенно проявляющиеся в ходе контакта с питательной средой, содержащей определенные количества связанной воды. В результате наблюдается значительное увлажнение сухого материала и, как следствие, неконтролируемое снижение биологической активности нарабатываемого продукта в процессе его последующего хранения, что может негативно отразиться на возможности последующего получения на их основе кисломолочного продукта и его качестве, так как транспортировка сухой смеси и ее хранение до момента использования зачастую осуществляются (как было показано в прямом эксперименте, при нахождении сухого продукта при температуре 37°С в течение 2-х недель (тест на «ускоренное хранение»), биологическая активность «Витафлора», входящего в состав сухой смеси, снижается с 2,1±0,2×10 КОЕ/г до 0,07±0,01×10 КОЕ/г, то есть более чем в 100 раз. Особенно заметно снижение активности бактерий при замене в данной композиции «Витафлора» на пробиотические препараты, содержащие иные микроорганизмы).
9
9
К недостаткам данного препарата можно отнести также то, что при измельчении сухого биологического препарата, состоящего из клеток микроорганизмов, в результате увеличения его удельной поверхности может наблюдаться значительное увлажнение сухого материала и, как следствие, неконтролируемое снижение биологической активности нарабатываемого продукта в процессе его последующего хранения в области положительных температур. Как было показано в прямом эксперименте, при нахождении сухого продукта при температуре 37°С в течение 2-х недель (тест на «ускоренное хранение»), биологическая активность измельченной закваски пробиотика «Витафлор», входящей в состав сухой смеси, снижается с 2,1±0,2×10 КОЕ/г до 0,07±0,01×10 КОЕ/г, то есть примерно в 30 раз.
Задачей, решаемой авторами, являлось создание технологии получения сухого препарата на основе закваски «Витафлор», более стабильного к воздействию внешних факторов и позволяющего при разбавлении сухого биопрепарата водой с последующим помещением его на 18 час. в термостат при 37°С гарантированно получать высококачественный кисломолочный напиток, обладающий пробиотическими свойствами и иммуномодулирующим действием.
Для решения данной задачи было предложено разработать технологию, позволяющую перевести содержащуюся в препарате закваску в более защищенную от воздействия внешней среды форму, в частности в форму таблетки. Вместе с тем таблеточная форма препарата должна была легко разрушаться при механическом воздействии и быстро растворяться в водной среде.
Технический результат был достигнут созданием композиции «Витафлор-П», которое наряду с сублимационно высушенным и измельченным молоком содержало сухую закваску «Витафлор» в виде таблетки имеющей внутренние поры, составляющие не менее 50% объема таблетки и полученной модифицированным тритурационным методом. Для этого в ходе формирования таблетки питательную среду, содержащую микроорганизмы разливали в алюминиевые формы объемом 2,0±0,05 мл слоем 6-7 мм, предварительно охлажденные до температуры минус 35-минус 45°С, выдерживали при температуре минус 30-35°С, а затем подвергали сублимационному высушиванию при температуре не выше минус 50°С и давлении 13-15 Па в течение 48-50 часов.
Было показано, что эффективность хранения препарата «Витафлор-П» дополнительно возрастает при введении в питательную среду перед обезвоживанием 5-10% аскорбиновой кислоты в расчете на конечный сухой продукт.
Отличием заявляемой технологии обработки закваски от ее технологии, описанной в ближайшем аналоге и от ранее описанной тритурационной технологии, является то, что в заявляемом случае композиция подвергается быстрому замораживанию по всему объему жидкости в результате воздействия низкой температуры на всю ее поверхность, в том числе боковую. Подобное воздействие приводит к быстрой кристаллизации замораживаемой жидкой среды и образованию большого количества вертикальных и горизонтальных каналов (см. фиг.3), общий объем которых в полученной таблетки составляет более 50% объема.
Наличие таких каналов с одной стороны позволяет использовать по сравнению с тритурационными методами более щадящий для микроорганизмов режим дегидратации, а с другой стороны обеспечивает быстрое растворение таблетки в воде и более быстрый контакт микроорганизмов с защитной казеиновой средой (казеином молока, образующим «защитные капсулы», вокруг колоний микроорганизмов), создавая оптимальные условия для их дальнейшего культивирования.
Тем самым, существенными отличиями от аналога - тритурационной технологии является отсутствие полиглюкина и иных формообразующих элементов, а также использование быстрого охлаждения до минус 30-минус 40°С по сравнению с предлагаемым в аналоге первичным охлаждением (до минус 10°С).
По сравнению с технологией получения закваски в препарате «Витафлор-К» существенными отличиями являются формирование целевого продукта объемным замораживанием небольших фрагментов жидкой среды с образованием таблетки и возможность применения более жесткого режима обезвоживания. Так, время сублимации закристаллизованной влаги составляет 20 ч при температуре материала на выше 30°С, а досушивание осуществляется в течение 8 ч при температуре 25°С.
Как указывалось выше, в ходе исследований было установлено, что при такой обработке происходит при наличии относительно небольшой внешней поверхности образование магистральных вертикальных и радиальных пор, которые составляют более 50% объема таблетки, что обеспечивает ее легкое размельчение при внешнем механическом воздействии и быстрое растворение (время полного растворения таблетки не превышает 30 с).
9
Полученная в результате композиция для получения молочнокислого напитка в экстремальных условиях представляла собой пакет, содержащий пористую таблетку закваски «Витафлор», весом 0,260±0,010 г (имеет диаметр 19,0±1,0 мм и высоту 6,5±0,5 мм) и порошок лиофилизированного молока в количестве 12,5±0,30 г. Как показало тестирование методом «ускоренного хранения», биологическая активность композиции, на основе таблеток, содержащих закваску, обработанную вышеуказанным образом, хранение «Витафлора-П» 2 недели при температуре 37°С не привело к заметной инактивации хранящегося биопрепарата. Так биологическая активность таблеток снизилась с 3,2±0,6×10 КОЕ/г до 1,1±0,25 КОЕ/г сухого препарата, что дает основания предполагать, что после транспортировки на орбиту препарат «Витафлор-П» полностью сохранит сквашивающую способность после его регидратации питьевой водой. Еще одним преимуществом заявляемой технологии является возможность применения данного способа для получения молочнокислых напитков с использованием других видов лактобацилл, использующих гомоферментативный тип брожения, например, Lactobacillus helveticus.
На фиг.1 приведен общий вид заявляемой упаковки «Витафлор-П»; на фиг.2 показан внешний вид таблеток полученных по технологии сублимационного формования; на фиг.3 - микрофотография поперечного разреза таблетки.
Сущность изобретения иллюстрируются следующими примерами.
Пример 1. Получение закваски. В ампулы с лиофилизованными эталонами производственных штаммов Lactobacillus acidophilus H-1 и Н-2 вносят по 1 мл дистиллированной воды, после чего тщательно перемешивают, вносят раздельно в пробирки с обезжиренным молоком, и выдерживают при 37°С в течение 16-20 часов. Посевной материал вводят в колбы, содержащие по 100 мл гидролизатно-молочной среды, содержащей в панкреатическом гидролизате молока 0.2 г пептона, 0.06 г хлористого натрия, 0.002 г цистеина и 0.1 г лактозы и выдерживают при 37°С в течение 16-20 часов. Готовый посевной материал получают смешением отдельно выращенных культур таким образом, чтобы соотношение клеток отдельных штаммов было близко к 1:1 по данным оптической плотности при длине волны 600 нм.
Выращивание нативной культуры производится на среде, содержащей в 1 л панкреатического гидролизата молока 2 г пептона, 0.6 г хлористого натрия, 0.02 г цистеина, 4 г углекислого кальция и 1 г лактозы при 37°С в течение 16-20 часов. К культуральной жидкости добавляют при необходимости аскорбиновую кислоту в расчете 5-10% масс. на конечный продукт.
Полученный продукт разливают по охлажденным до 30±5°С алюминиевым формам по 2,0±0,05 мл в каждый, что составляет толщину высушиваемого слоя в 6 мм, после чего помещают в камеру пилотной сублимационной установки Альфа 1-20 («Крист», Германия) при минус 30-35°С на 1-2 часа, а затем подвергают сублимационному высушиванию при температуре конденсатора-вымораживателя не выше минус 50°С и давлении в сублимационной камере - 13-15 Па. Время достижения рабочего вакуума составляет 20-30 мин, суммарная продолжительность процесса высушивания - 48-50 часов.
Продолжительность этапа сублимации закристаллизованной влаги составляет 20 ч при температуре материала на выше 30°С, досушивание осуществляется в течение 8 ч при температуре 25°С.
9
Полученный после высушивания препарат имеет вид однородной по цвету и высоте таблетки (диаметр 19,0±1,0 мм, высоту - 6,5±0,5 мм). Внешний вид таблеток полученных по технологии сублимационного формования показан на фиг.1. Биологическая активность таблеток составляет 5,6×10 КОЕ/таблетку.
Полученные по технологии сублимационного формования пористые таблетки хранятся в герметично закрытой таре при температуре 5 - 6°С, гарантийный срок хранения таблеток - 2 года.
9
Пример 2. В условиях примера 1 получают закваску при введении в питательную среду аскорбиновой кислоты в количестве 8% масс. в расчете на конечный продукт. Биологическая активность таблеток составляет 2,8±10 КОЕ/таблетку.
9
Пример 3. В условиях примера 1 получают закваску при введении в питательную среду аскорбиновой кислоты в количестве 5% масс. в расчете на конечный продукт. Биологическая активность таблеток составляет 2,0×10 КОЕ/таблетку.
9
Пример 4. В условиях примера 1 получают закваску без введения в питательную среду аскорбиновой кислоты. Биологическая активность таблеток составляет 0,6×10 КОЕ/таблетку.
Пример 5. Получение продукта «Витафлор-П». Питьевое молоко разливают в алюминиевые поддоны по 300 мл в каждый (толщина высушиваемого слоя составляет 3-4 мм) и подвергают замораживанию на полке сублимационной установки ТГ-5 (Германия) при температуре минус 25 - минус 30°С в течение 1,5-2,0 часов, а затем сублимационной сушке при температуре не выше минус 20°С и давлении 15-18 Па в течение, по крайней мере, 48 часов. По завершении процесса высушивания лиофилизированное молоко измельчается на шнековом измельчителе.
При приготовлении продукта «Витафлор-П» использовалось следующее соотношение компонентов: сублимационно высушенное измельченное молоко - 12.5 г; полученная по технологии сублимационного формования пористая таблетка пробиотика «Витафлор», содержащая 2 штамма лактобацилл, полученная в условиях примера 1-0,260 г. Полученные навески сухой питательной среды (сублимационно высушенное и измельченное питьевое молоко марки «Полная крынка» жирностью 1,5%) фасовались в герметичные емкости. Туда же помещались пористые таблетки «Витафлор» (по 1 таблетке в каждую), после чего емкости герметизировались.
Для получения кисломолочного напитка «Витафлор» в емкость с продуктом «Витафлор-П» добавляли 60 мл питьевой воды. Емкость с регидратированным материалом закрывали и помещали в термостат, нагретый до 37±2°С на 18 ч. По достижении вышеуказанной экспозиции полученный кисломолочный продукт извлекали из термостата и проверяли на наличие пробиотических свойств: биологическую активность, антибиотике устойчивость, антагонизм по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам и кислотообразование. Биологическая активность полученного кисломолочного продукта составила - 4×10 КОЕ/мл, рН полученного продукта равнялась 3,4. Антибиотике устойчивость и антагонизм - соответствовали норме, заявленной для пробиотика «Витафлор».
Пример 6. Композиция «Витафлор-П», полученная в условиях примера 4, подвергалась хранению при комнатной температуре в течении 1 месяца, после чего определялась биологическая активность сухой композиции. Затем сухая композиция регидратировалась путем добавления 60 мл питьевой воды и культивировали в термостате при 37°С в течение 18 ч. В заключение опыта определялась биологическая активность полученного кисломолочного продукта. Для сравнения в этих же температурных условиях хранились образцы (контроль), где в качестве посевного материала использовался измельченный препарат «Витафлор-К» и композиции, содержащие закваску, полученную по примерам 2 и 3. Процентное соотношение между компонентами: питательная среда / посевной материал у продукта «Витафлор-П» было аналогичным для контрольных и экспериментальных образцов. Результаты испытаний приведены в таблице 1.
Таблица 1.
Влияние формы закваски на биологическую активность регидратированного кисломолочного продукта (исходный состав: 0.26 г закваски пробиотика; 12,5 г питательной среды - измельченного лиофилизированного молока).
Форма закваски
Биологическая активность «Витафлор» после хранения 1 месяц при температуре 20°С (КОЕ/г)
Биологическая активность кисломолочного продукта (КОЕ/мл)
пористая таблетка по примеру 1
5,6±0,4×10<sup>9</sup>
7.2±0,3×10<sup>8</sup>
пористая таблетка по примеру 2
2,8±0,4×10<sup>9</sup>
5,8±0,3×10<sup>8</sup>
пористая таблетка по примеру 3
2,1±0,4×10<sup>9</sup>
5,0±0,3×10<sup>8</sup>
пористая таблетка по примеру 4
0,6±0,4×10<sup>9</sup>
4.2±0,3×10<sup>8</sup>
порошок
2,2±0,3×10<sup>9</sup>
1.4±0.1×10<sup>8</sup>
Пример 7. Композиция «Витафлор-П», полученная в условиях примера 1, подвергалась хранению при температуре 37°С в течение 2-недель, после чего определялась биологическая активность сухой композиции. Затем сухая композиция регидратировалась путем добавления 60 мл питьевой воды и культивировалась в термостате при 37°С в течение 18 часов. В заключение опыта определялась биологическая активность полученного кисломолочного продукта. Для сравнения в этих же температурных условиях хранились образцы, где в качестве посевного материала использовались таблетки закваски, полученные по технологии примеров 2 и 4, а также измельченный препарат «Витафлор» (контроль). Процентное соотношение между компонентами: питательная среда / посевной материал у продукта «Витафлор-П» было аналогичным для контрольных и экспериментальных образцов. Результаты испытаний приведены в таблице 2.
Таблица 2.
Влияние формы закваски после хранения в условиях на свойства кисломолочного продукта (исходный состав: 0.26 г закваски пробиотика; 12,5 г питательной среды - измельченного лиофилизированного молока).
Пробиотик «Витафлор» (закваска),
Биологическая активность «Витафлор-П» после хранения 2 недели при 37°С (КОЕ/г)
Биологическая активность кисломолочного продукта (КОЕ/мл)
пористая таблетка по примеру 1
3,1±0,3×10<sup>9</sup>
4,6±0,3×10<sup>8</sup>
пористая таблетка по примеру 2
2,2±0,3×10<sup>9</sup>
1,4±0,3×10<sup>8</sup>
пористая таблетка по примеру 4
1,1±0,3×10<sup>9</sup>
0,4±0,3×10<sup>8</sup>
порошок
0,01±0,002×10<sup>9</sup>
5,1±0,4×10<sup>4</sup>
Приведенные результаты показали, что заявляемая технология позволяет сохранять препарат в течение длительного времени и получить качественный кисломолочный продукт с требуемыми пробиотическими свойствами (биологической активностью) по относительно простой технологии, пригодной для использования ее в условиях повышенных положительных температур в процессе длительного космического полета или автономного подводного плавания.
Пример 8.
Получение закваски. В ампулу с лиофилизованным эталоном производственного штамма Lactobacillus helveticus вносят 1 мл дистиллированной воды, после чего тщательно перемешивают, вносят в пробирку с обезжиренным молоком и выдерживают при 37°С в течение 16-20 часов. Посевной материал вводят в колбу, содержащую 100 мл гидролизатно-молочной среды, содержащей в панкреатическом гидролизате молока 0.2 г пептона, 0.06 г хлористого натрия, 0.002 г цистеина и 0.3 г лактозы и выдерживают при 37°С в течение 18-20 часов Выращивание нативной культуры производится на среде, содержащей в 1 л панкреатического гидролизата молока 2 г пептона, 0.6 г хлористого натрия, 0.02 г цистеина, 4 г углекислого кальция и 3 г лактозы при 37°С в течение 18-20 часов. К культуральной жидкости добавляют 4х-компонентную защитную среду, состоящую из сахарозы, желатина, обезжиренного сухого молока (ОСМ) и аскорбиновой кислоты 10%: 2%: 4%: 5% (% масс.) в расчете на сухое вещество конечного продукта
Полученный продукт разливают по алюминиевым формам по 2,0±0,05 мл в каждый, что составляет толщину высушиваемого слоя в 6 мм и замораживают в камере пилотной сублимационной установки Альфа 1-20 («Крист», Германия) при минус 30-35°С в течение 1,5 часа, после чего подвергают сублимационному высушиванию по представленной на фиг.2 термограмме. Температура конденсатора-вымораживателя в течение всего процесса высушивания составляет минус 50°С-55°С и рабочее давление в сублимационной камере - 13-15 Па. Время достижения рабочего вакуума составляет 20-30 мин, суммарная продолжительность процесса высушивания - 48-50 часов.
Термограмма высушивания Lactobacillus helveticus в процессе получения пористых таблеток на их основе аналогична представленной на фиг.2.
8
Биологическая активность таблеток в случае использования Lactobacillus helveticus составляет не менее 6,2×10 КОЕ/таблетку.
При приготовлении сухого 2-х компонентного продукта использовалось следующее соотношение компонентов: сублимационно высушенное измельченное молоко - 12.5 г; полученная по технологии сублимационного формования пористая таблетка пробиотика на базе Lactobacillus helveticus - 0,260 г. Полученные навески сухой питательной среды (сублимационно высушенное и измельченное питьевое молоко марки «Полная крынка» жирностью 1,5%) фасовались в герметичные емкости. Туда же помещались пористые таблетки Lactobacillus helveticus (по 1 таблетке в каждую), после чего емкости герметизировались.
Для получения кисломолочного пробиотического напитка, содержащего L.helveticus в емкость с сухим продуктом добавляли 60 мл питьевой воды. Емкость с регидратированным материалом закрывали и помещали в термостат, нагретый до 37±2°С на 20 ч. По истечении вышеуказанной временной экспозиции, полученный кисломолочный продукт извлекали из термостата и проверяли на наличие пробиотических свойств: биологическую активность, антибиотике устойчивость, антагонизм по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам и кислотообразование.
8
Биологическая активность полученного кисломолочного продукта на базе L.helveticus составила - 5,2×10 КОЕ/мл, рН полученного продукта равнялась 4,4. Антибиотике устойчивость и антагонизм - соответствовали норме, заявленной для пробиотика «Витафлор».
Как следует из вышеприведенных примеров, полученные экспериментальные результаты показали, что заявляемая технология позволяет получить качественный кисломолочный продукт с требуемыми пробиотическими свойствами (биологической активностью) по более простой технологии изготовления, пригодной для использования ее в условиях повышенных положительных температур в процессе длительного космического полета и автономного подводного плавания.