Штамм Moraxella bovoculi «Сх-ч6 №-Деп» возбудителя инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота

PRODUCTION OF SPECIFIC COMPONENTS OF BACTERIA CLOSTRIDIUM PERFRINGENS FOR ELISA

Spiridonov A.G.

Summary

The article describes a new method to produce components specific to Clostridium perfringens and hyperimmune serum for ELISA test. The antigen was produced by ultrasonification of CL.perfringens bacterial suspension containing 5 billion of each A, B, C, D serotypes per 1 cm3. The ul-trasonication was performed using ultrasonic disintegrator at 20 mHz frequency during 10-15 min at 4 C. It was followed by endotoxin sedimentation with ammonium sulfate and dialysis against tap water. Positive serum was produced by young calves hyperimmunization with corpuscular antigen and anatoxin from Cl. perfringens A, B, C, D serotypes. The 4-fold hyperimmunization was performed with 14-days intervals. Simultaneously the animals were introduced corpuscular antigen subcutaneously and anatoxin intravenously. The basic conditions for ELISA test (determining optimal and antigen absorption time in polysterol plates, appropriate exposure time of tested sera) were standardized. The most appropriate titration in animal blood sera was determined at 1:2500 conjugate solution and 5-8 mkg/cm3 absorbed antigen concentration. The most efficient mode of antigen fixation was was 18hours at 4C. Interlaboratory commission trial showed that ll the components of the test-system were active and specific. Specific antigen does not respond to heterogenic hyperimmune sera (salmonella, escherichia) while with homogenic sera (hyperimmune and blood sera sampled from vaccinated and infected with anaerobic enterotoxemy) it responses at high titers - 1:3200-1:12800.

УДК 619:617.711/.713-002-022.6

ШТАММ MORAXELLA BOVOCULI «СХ-Ч6 № -ДЕП» ВОЗБУДИТЕЛЯ ИНФЕКЦИОННОГО КЕРАТОКОНЪЮНКТИВИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Спиридонов Г.Н. - д.б.н., Дуплева Л.Ш. - к.б.н., Спиридонов А.Г.- к.б.н., Зарипов А.С. - зав. отделом, Хусаинов И.Т. - м.н.с., Юсупова Ю.В - н.с.

ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»

Ключевые слова: крупный рогатый скот, инфекционный кератоконъюнктивит, возбудитель, Moraxella bovoculi, биологические свойства.

Key words: cattle, infectious keratoconjunctivitis, pathogen, Moraxella bovoculi, biological properties.

В последние годы установлено широкое распространение в некоторых регионах Российской Федерации инфекционного кера-токонъюнктивита крупного рогатого скота, вызываемого бактериям Moraxella bovis и Moraxella bovoculi. Заболевание характеризуется слезотечением, гиперемией сосудов конъюнктивы, светобоязнью, серозно-гнойным истечением, помутнением и изъязвлением роговицы, деформацией глазного яблока в виде кератоглобуса или кератоконуса, частичной или полной потерей зрения [4, 5].

Заболевание причиняет значительный экономический ущерб развитию скотоводства вследствие снижения удоев молока до 50%, прироста массы тела на 31-37%, гибели животных, а также затрат на проведение лечебно-профилактических мероприятий.

Согласно определителю бактерий

Берджи 1984 г. род Moraxelta, предложенный Lwoff (1939), относился к семейству Neisseriaceae [3]. Однако с современных позиций таксономии, на основе изучения 16S рРНК и анализа рРНК-ДНК гибридизации, в настоящее время род Moraxelta отнесён к семейству Moraxellaceae. До недавнего времени для ветеринарной медицины наиболее важным представителем этого рода считался Moraxella bovis, вызывающий инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота. В настоящее время установлено, что инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота может быть вызван и другими представителями рода Moraxella, в частности бактериями Moraxella bovoculi. Впервые эти бактерии были выделены при инфекционном кератоконъюнктивите у молочных коров калифорнийскими учеными Angelos J. A. и со-

авт. в 2005 году [6].

Цель исследований - выделение и изучение основных биологических свойств бактерий Moraxella bovoculi - возбудителя инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота.

Материалы и методы исследований. Выделение чистой культуры предполагаемого возбудителя осуществляли в лабораторных условиях путем первичного посева проб смывов из глаз больных телят, доставленных из стационарно неблагополучных по инфекционному кератоконъюнктивиту хозяйств, на кровяной МПА. Посевы инкубировали в термостате при температуре 370С в течение 24 ч. На 2-й день изучали характер выросших колоний: определяли величину, формы их очертаний, цвет, поверхность, наличие зоны ß-гемолиза. Затем выявляли под микроскопом структуру и края колоний. Из отдельных колоний готовили мазки и окрашивали по Граму. Идентификацию микроорганизмов проводили путем изучения их биохимических, морфологических, тинкто-риальных свойств в соответствии «Краткого определителя бактерий Bergeys» (1948) и «Определителя зоопатогенных микроорганизмов» [6].

Определение сахаролитических

свойств культур бактерий Moraxella bovoculi осуществляли путем их пересева в среды Гисса с 1% содержанием глюкозы, сахарозы, лактозы, сорбита и маннита. Посевы инкубировали при 370С в течение 5 суток, после чего проводили учет результатов.

О протеолитической активности культур бактерий судили по их способности разжижать желатин. Для этого производили посев культуры в столбик желатина, следя за тем, чтобы укол пришелся строго по оси пробирки. Посев оставляли при комнатной температуре на 48 часов.

Для установления оксидазной активности на поверхность 18-часовой агаровой культуры бактерий Moraxella bovoculi наносили каплю 1% раствора парааминодимети-ланилина гидрохлорида и каплю 1% спиртового раствора а-нафтола.

Тест на каталазную активность проводили на предметных стеклах, используя 24-часовую культуру бактерий, выращенную на триптон-соевом агаре. На каждую культуру штамма бактерий наносили по 1 капле 3% раствора перекиси водорода. Показания снимали сразу же и через 5 мин. О реакции судили по образованию пузырьков.

При определении образования индола

культурой бактерий Moraxella bovoculi использовали реакцию Эрлиха. По изменению цвета реактива судили о наличии индола в эфирной вытяжке среды.

Результаты исследований. В процессе изучения этиологии инфекционного кера-токонъюнктивита в 7 скотоводческих хозяйствах Республики Татарстан и в 2-х хозяйствах Челябинской области нами выделены 39 культур микроорганизмов, по морфологическим и культуральным свойствам сходных с возбудителями инфекционного керато-конъюнктивита крупного рогатого скота -бактериями Moraxella bovis и Moraxella bovoculi. Инфекционный кератоконъюнкти-вит крупного рогатого скота, вызванный бактериями Moraxella bovoculi, мы диагностировали в 4-х хозяйствах Республики Татарстан и в двух хозяйствах Челябинской области. Клинические признаки инфекционного кера-токонъюнктивита, вызванного бактериями Moraxella bovoculi, были схожи с таковыми при поражении с бактериями Moraxella bovis.

Проводили изучение биологических свойств культур бактерий Moraxella bovoculi, изолированных из патологического материала от больных инфекционным кратоконъ-юнктивитом животных. Установили, что на кровяном мясопептонном агаре при температуре 370С в аэробных условиях бактерии Moraxella bovoculi формируют рассеянные колонии небольших размеров (< 1 мм в диаметре) с зоной полного гемолиза (ß-гемолиз). Колонии не имеют склонности к слиянию, если только не были расположены близко друг к другу. Они были круглые, выпуклые, с ровными краями белого или серовато-белого цвета. Все изоляты имели узкую зону ß-гемолиза вокруг или под каждой колонией.

На жидких питательных средах - мясо-пептонном и триптозо-соевом бульонах в течение 48-часового культивирования при температуре 370С вызывают незначительное помутнение среды с осадком, который при взбалтывании образует хлопья.

В мазках, окрашенных по Граму, бактерий Moraxella bovoculi представляют собой грамотрицательные диплококки, с редко встречающимися кокками; диаметр клеток составляет 0.7-1.3 мкм, смежные стороны клеток уплощены.

При определении ферментативных и протеолитических свойств установили, что бактерии Moraxella bovoculi не ферментируют сахаров, не образуют индол; не разжижают желатину; дают положительную реакцию на оксидазу и отрицательную на пробу с

лакмусовым молоком. Штаммы характеризуются полным набором антигенов, типичных для бактерий рода Moraxella. Активно образуют эндотоксин, переходящий в анатоксин под действием тепла и формалина. Продуцируемый ими токсин обладает гемолитическим и некротическим действиями. LD50 для белых мышей составляет 5х108 микробных клеток. Телята 1 - 2- месячного возраста в полевых условиях сравнительно легко заражаются при введении им в конъ-юнктивальный мешок 24-часовой культуры Moraxella bovoculi в дозе 1,0 см3, содержащей не менее 1,0х109 микробных клеток, при наличии естественного или искусственного ультрафиолетового облучения.

Инактивированная формалином культура бактерий Moraxella bovoculi при подкожном введении индуцирует у телят образование специфических антител в сыворотке крови в титрах 1:1280 - 1:5120 в ИФА, а также формирование специфического иммунитета.

Проведена идентификация штамма бактерий Moraxella bovoculi «СХ-Ч6», выделенного от теленка 7-месячного возраста, больного с признаками острого кератоконъ-юнктивита, методом ПЦР и секвенирования ДНК в ФГБУ «ВГНКИ». В ходе исследований определена нуклеотидная последовательность фрагмента гена 16S pPHK штамма (с 246 по 1121 п.н. по полной нуклеотидной последовательности данного гена). При помощи программы Blast проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей исследуемого штамма с последовательностями микроорганизмов, представленных в базах данных нуклеотидных последовательностей GenBank. При этом установлена наибольшая гомология анализируемых последовательностей с геном 16S pPHK Moraxella bovoculi (100% гомология). Данный штамм прошел депонирование в лаборатории качества и стандартизации бактериальных средств для ветеринарного применения ФГБУ «ВГНКИ» под регистрационным названием «Moraxella bovoculi «СХ-Ч6 № -ДЕП» инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота». На штамм получен Патент РФ на изобретение №2521651, он признан производственным и предназначен для изготовления вакцин против инфекционного кратоконъюнктивита крупного рогатого скота и диагностикумов [1, 2].

Заключение. Изучена этиологическая структура инфекционного кератоконъ-юнктивита крупного рогатого скота в ското-

водческих хозяйствах Республики Татарстан и Челябинской области. Выделены возбудители болезни - бактерии Moraxella bovis и Moraxella bovoculi. Изучены иммунобиологические свойства изолятов бактерий Moraxella bovoculi, выделенных от больных инфекционным кератоконъюнктивитом телят, результаты которых позволили депонировать штамм «СХ-Ч6 № -ДЕП» в лаборатории качества и стандартизации бактериальных средств для ветеринарного применения ФГБУ «ВГНКИ» в качестве производственного для изготовления вакцин против инфекционного кератоконъюнктивита и диагности-кумов.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Патент Российской Федерации. Штамм бактерий Moraxella bovoculi «СХ-Ч6 № -ДЕП», используемый для изготовления диагностикумов и вакцин против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота / А.В. Иванов, Г.Н. Спиридонов, А.А. Иванов, Л.В. Валебная, Ю.В. Юсупова,

A.Г. Спиридонов, А.Р. Нургалиева, Х.Н. Ма-каев; заявитель ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности». - № 2521651; опубл. 10.07.2014, Бюл. № 19.

2. Патент Российской Федерации. Вакцина против инфекционного керато-конъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и Moraxella bovoculi / Г.Н. Спиридонов, А.В. Иванов, А.Н. Чернов, А.Г. Спиридонов, А.А. Иванов, Л.В. Валебная, Х.Н. Макаев, Р.Х. Юсупов, Л.Ш. Дуплева; заявитель и патентообладатель ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности». - №2589819; опубл. 10.07.2016, Бюл. № 19.

3. Сидоров, М.А. Определитель зоо-патогенных микроорганизмов: Справочник / М.А. Сидоров, Д.И. Скородумов,

B.Б.Федотов. - М.: Колос. - 1995. - С. 169176.

4. Спиридонов, Г.Н. Инфекционный кератоконьюнктивит крупного рогатого скота / Г.Н. Спиридонов // Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных. - Труды межд. научн.-производ. конф., посвященной 50-летию ВНИИВВиМ. - том 2. - Покров. - 2008. - С. 195-197.

5. Спиридонов, Г.Н. Методические рекомендации по диагностике, лечению и специфической профилактике инфекционно-

го кератоконъюнктивита крупного рогатого скота, вызванного бактериями Moraxella bovis и Moraxella bovoculi / Г.Н. Спиридонов, Х.З. Гаффаров, А.И. Никитин, К.Х. Папуни-ди, Л.В. Валебная, А.Н. Чернов, Л.Ш. Дупле-ва, А.Г. Спиридонов, Х.Н. Макаев // - М. -

2016. - 27 c.

6. Angelos, J.A. Moraxella bovoculi sp. nov., isolated from calves with infectious bovine keratoconjunctivitis / J.A. Angelos, P.Q. Spinks, L.M. Ball, L.W. George // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. - 2007. - V.57. - P. 789-795.

ШТАММ MORAXELLA BOVOCULI «СХ-Ч6 № -ДЕП» ВОЗБУДИТЕЛЯ ИНФЕКЦИОННОГО КЕРАТОКОНЪЮНКТИВИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Спиридонов Г.Н., Дуплева Л.Ш., Спиридонов А.Г., Зарипов А.С., Хусаинов ИТ., Юсупова Ю.В. Резюме

В статье приведены биологические свойства штамма бактерий Moraxella bovoculi «СХ-Ч6 № -ДЕП» - возбудителя инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота.

STRAIN MORAXELLA BOVOCULI «SX-CH6 № DEP» CAUSATIVE AGENT OF INFECTIOUS

KERATOCONJUNCTIVITIS OF CATTLE

Spiridonov G.N., Dupleva L.Sh., Spiridonov A.G., Saripov A.S., Khusainov I.T., Ysupova Y.V.

Summary

The biological properties of the strain of bacteria Moraxella bovoculi «SX-CH6 № DEP» of the causative agent of infectious keratoconjunctivitis of cattle are given in the article.

УДК 63:636.087.7/088.3:636.93

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРЕПАРАТА «ЦЕОСТИМУЛ» ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ СЕРЕБРИСТО-ЧЕРНЫХ ЛИСИЦ

Фролов Г. С. - аспирант, Якимов О. А. - д.б.н., профессор ФГБОУ ВО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»

Ключевые слова: серебристо-черные лисы, препарат «Цеостимул», живая масса, гематологические и биохимические показатели, шкурковая продукция, экономическая эффективность.

Key words: silver-black foxes, the drug "Zeostimul", body weight, hematological and biochemical parameters, the productivity of foxes, economic efficiency.

Одной из наиболее перспективных отраслей сельского хозяйства в нашей стране является клеточное пушное звероводство. Продуктивность сельскохозяйственных животных, в том числе и пушных зверей зависит от многих факторов - породных особенностей, условий содержания, их физиологического состояния. Но главное - это организация полноценного кормления, что является важнейшим фактором, оказывающим влияние на рост, развитие зверей, их воспроизводительные способности, формирование волосяного покрова и качество шкурок (4, 6, 7).

В современных социально-экономических условиях в Российской Федерации, в том числе и республики Татарстан, произошло значительное снижение количе-

ства поголовья зверей и их продуктивности, что связано с рядом объективных и субъективных факторов экономического характера. Из-за удорожания кормов животного происхождения и снижения улова непищевой рыбы в кормлении плотоядных увеличилось количество неполноценных кормов низкого качества, представляющих собой отходы переработки мясного сырья и т.д. Одновременно с этим отмечается сокращение производства комбикормов, витаминно-минеральных премиксов и других кормовых добавок (1, 2, 5, 7). Дефицит минеральных элементов, переваримого протеина и углеводов в рационах приводит к нарушению метаболизма, возникновению различных заболеваний, изменению структурно-функционального состоя-