МИНИ-АНТИТЕЛА J591 И ЦИС-ДИАТЕЛА ДЛЯ НАПРАВЛЕННОЙ ДОСТАВКИ ПРОСТАТА-СПЕЦИФИЧНОГО МЕМБРАННОГО АНТИГЕНА (PSMA) ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
J591 MINIBODIES AND CYS-DIABODIES FOR TARGETED DELIVERY OF HUMAN PROSTATE SPECIFIC MEMBRANE ANTIGEN (PSMA) AND METHODS FOR THEIR USE

ЗАЯВЛЕНИЕ ОБ ИССЛЕДОВАНИИ, ФИНАНСИРУЕМОМ ИЗ ФЕДЕРАЛЬНОГО БЮДЖЕТА
[0001] Настоящее изобретение было выполнено при поддержке государства в рамках Договора № HHSN261200900051C, заключенного с Национальным институтом рака (NCI). Государство обладает определенными правами на настоящее изобретение.
ПРИТЯЗАНИЕ НА ПРИОРИТЕТ
В настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке США №61/266134 от 2 декабря 2009 года, содержание которой полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
123
111
[0002] Прогресс в конструировании антител сделал возможной разработку различных фрагментов антител, обладающих разными свойствами в отношении фармакокинетики и связывания (Wu et al 2005, Wu et al 2008, Wu et al 2009). Мини-антитело представляет собой форму антитела, которая обладает более низкой молекулярной массой (~80 кДа), чем полноразмерное антитело, но при этом сохраняет способность двухвалентного связывания в отношении антигена (Hu et al 1996). Благодаря своему малому размеру, мини-антитело обладает способностью к более быстрому выведению из системы и повышенной способностью к проникновению при направленной доставке к ткани опухоли. Обладая сильной способностью к направленной доставке в сочетании с быстрым выведением, мини-антитело является оптимизированной формой антитела, которую можно применять для диагностической визуализации (Wu et al 2005). С момента открытия первого мини-антитела против ассоциированной с опухолью мишени РЭА (раковый эмбриональный антиген) было разработано много мини-антител против разных ассоциированных с раком мишеней для доклинической диагностической визуализации, включая рецептор эпидермального фактора роста-2 человека (HER2) при раке молочной железы, антиген В-лимфоцитов CD20 при не-Ходжскинской лимфоме и антиген стволовых клеток предстательной железы (PSCA) при раке предстательной железы (Hu et al 1996, Leyton et al 2008, Olafsen et al 2004, Olafsen et al 2009). Например, I-меченное мини-антитело на СЕА прошло оценку в клинике для визуализации пациентов с раком ободочной и прямой кишки методом однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ), и аналогичные исследования были проведены с In-DOTA-меченными мини-антителами (Wong et al 2004). Разработка новых радиофармацевтических препаратов играет важную роль в диагностике, лечении и борьбе со специфическими типами рака, которые сложно визуализировать при помощи современных технологий, такими как рак предстательной железы.
[0003] Существует потребность в разработке радиофармацевтических препаратов для всех типов рака, которые могли бы обеспечить возможность направленной доставки, определения стадии заболевания и мониторинга заболевания. Современные способы диагностической визуализации рака предстательной железы остаются относительно неточными. По оценкам за 2006 год было диагностировано 234460 новых случаев данного рака и 27350 летальных исходов, в свете чего возникает потребность в радиофармацевтическом препарате, позволяющем точно диагностировать, определять стадию заболевания и отслеживать течение рака предстательной железы (Olson et al 2007).
[0004] Простата-специфичный мембранный антиген (PSMA) - биомаркер на поверхности клеток, который ассоциирован с раком предстательной железы (Slovin 2005), представляет собой односпиральный трансмембранный белок типа II с активностью глутаматкарбоксипептидазы, хотя функциональная роль PSMA еще не вполне ясна (Olson et al 2007). Экспрессия PSMA относительно невелика в здоровых тканях за пределами предстательной железы, включая ткани головного мозга, тонкой кишки, печени, проксимальных канальцев почек и слюнных желез (Olson et al 2007).
[0005] Экспрессия PSMA в раковых опухолях предстательной железы увеличивается с повышением агрессивности опухоли и максимальна в опухолях высокой степени злокачественности, очагах метастазов и при андроген-независимом заболевании (Olson et al 2007). Следовательно, PSMA представляет собой биомаркер опухолевого роста, который является хорошим кандидатом для применения его при направленной доставки при помощи радиофармацевтического препарата. Также экспрессия PSMA увеличивается в новообразованных сосудах многих солидных опухолей, происходящих не из предстательной железы, включая карциномы легких, ободочной кишки, молочной железы, почек, печени и поджелудочной железы, а также саркомы и меланомы (Olson et al 2007).
[0006] Были разработаны полноразмерные антитела, которые направлены против PSMA, некоторые из которых находятся сейчас на разных стадиях доклинических и клинических исследований (Olson et al 2007). Изначально PSMA был охарактеризован при помощи антитела мыши (mAb), 7E11, которое распознавало внутриклеточный эпитоп PSMA (Olson et al 2007). На основе mAb 7E11 позже был разработан одобренный FDA (Управление по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными препаратами) радиофармацевтический препарат для ОФЭКТ под названием Простасцинт для выявления и визуализации рака, происходящего из предстательной железы, в мягких тканях (Olson et al 2007). Однако поскольку 7E11 распознает внутриклеточный эпитоп, Простасцинт является относительно плохим радиофармацевтическим препаратом, действие которого ограничивается выявлением некротической ткани опухоли (Olson et al 2007). Поскольку Простасцинт обладает фармакокинетическими свойствами полноразмерного антитела, между инъекцией и визуализации должен пройти большой период времени (Olson et al 2007). Кроме того, Простасцинт - это антитело мыши, которое провоцирует сильные иммунные реакции, что не позволяет многократно вводить указанный препарат (Olson et al 2007).
111
[0007] Было разработано и в дальнейшем подвергнуто деиммунизации другое полноразмерное антитело, направленное против PSMA, J591; деиммунизированная версия называется huJ591 (Liu et al 1997, Bander et al 2003). Деиммунизированное антитело huJ591 представляет собой антитело против PSMA человека, которое распознает и связывается с внеклеточным эпитопом PSMA (Bander et al 2003). Антитело huJ591 проходит испытания как потенциальный препарат для радиоиммунотерапии рака предстательной железы. В исследованиях I фазы конъюгированное с DOTA антитело huJ591, меченное гамма-излучающим изотопом индия 111 и лютеция 177, продемонстрировало превосходную направленную доставку в очаги метастазов, отсутствие иммуногенности, и переносимость многократных доз была хорошей (Bander et al 2003, Milowsky et al 2004, Bander et al 2005, Olson et al 2007). Помимо рака предстательной железы в исследованиях I фазы с In-DOTA huJ591 была продемонстрирована специфическая направленная доставка к новообразованным сосудам распространенных солидных опухолей (Milowsky et al 2007).
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ
[0008] Согласно одному варианту реализации предложено мини-антитело, которое связывается с PSMA. Согласно данному варианту реализации указанное мини-антитело кодируется последовательностью нуклеотидов и содержит, от N-конца к C-концу, последовательность scFv (одноцепочечного вариабельного фрагмента), которая может связываться с простата-специфичным мембранным антигеном (PSMA), искусственный шарнирный участок и последовательность СН3 IgG1 человека. Мономер указанного мини-антитела также может содержать N-концевую сигнальную последовательность, которая позволяет указанному мини-антителу секретироваться при его экспрессии в клетке.
[0009] scFv указанного мини-антитела, описываемый в настоящей заявке, содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) при помощи линкерной последовательности. Согласно одному аспекту указанный scFv находится в ориентации VHVL так, что VH расположен против направления транскрипции от VL. Мономер мини-антитела, содержащий такой scFv, может иметь последовательность нуклеотидов, включающую SEQ ID №:1 или SEQ ID №:2. Согласно другому аспекту scFv находится в ориентации VLVH так, что VL расположен против направления транскрипции от VH.
[0010] Мономер указанного мини-антитела может экспрессироваться клеткой. Согласно такому варианту реализации мономер CysDB, экспрессируемый клеткой, может содержать последовательность аминокислот SEQ ID №:10 или SEQ ID №:11.
[0011] Согласно еще одному варианту реализации предложено цис-диатело (CysDB), которое связывается с PSMA. Согласно данному варианту реализации мономер указанного CysDB кодируется последовательностью нуклеотидов и содержит, от N-конца к С-концу, последовательность scFv, которая может связываться с PSMA и цистеиновым «хвостом». Также CysDB может содержать N-концевую сигнальную последовательность, которая позволяет мини-антителу секретироваться при его экспрессии в клетке.
[0012] scFv указанного CysDB, описываемого в настоящей заявке, содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) при помощи линкерной последовательности. Согласно одному аспекту указанный scFv находится в ориентации VHVL так, что VH расположен против направления транскрипции от VL. Мономер CysDB, содержащий такой scFv, может иметь последовательность нуклеотидов, включающую SEQ ID №:6 или SEQ ID №:7. Согласно другому аспекту указанный scFv находится в ориентации VLVH так, что VL расположен против направления транскрипции от VH. Мономер CysDB, содержащий такой scFv, может иметь последовательность нуклеотидов, включающую SEQ ID №:8 или SEQ ID №:9.
[0013] Мономер указанного CysDB может экспрессироваться клеткой. Согласно некоторым вариантам реализации CysDB, экспрессируемое клеткой, может содержать последовательность аминокислот SEQ ID №:12, SEC ID №:13, SEQ ID №:14 или SEQ ID №:15.
[0014] Согласно еще одному варианту реализации предложен способ диагностики рака, ассоциированного с экспрессией PSMA у субъекта. Такой способ включает введение мини-антитела или цис-диатела против PSMA, конъюгированного с диагностическим препаратом, субъекту, у которого предполагают или установили наличие рака, ассоциированного с экспрессией PSMA; применение по отношению к указанному субъекту способа визуализации для обнаружения меченного мини-антитела или цис-диатела in vivo; и определение того, что указанный субъект страдает раком, ассоциированным с экспрессией PSMA в случае, если указанное меченное мини-антитело или цис-диатело локализовано в участке опухоли.
[0015] Согласно еще одному варианту реализации предложен способ лечения рака, ассоциированного с экспрессией PSMA, у субъекта. Такой способ включает введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции субъекту, причем указанная композиция содержит мини-антитело или цис-диатело против PSMA. Согласно одному аспекту указанное мини-антитело или цис-диатело против PSMA конъюгировано с терапевтическим агентом.
[0016] Рак, ассоциированный с экспрессией PSMA у субъекта, может включать рак легких, ободочной кишки, молочной железы, почек, печени, мочевого пузыря и поджелудочной железы или меланому.
[0017] Мини-антителом, которое можно применять в рамках способов, описываемых выше, может быть любое подходящее мини-антитело, описываемое в настоящей заявке, или оно может содержать последовательность SEQ ID №:10 или SEQ ID №:11. Цис-диатело, которое можно применять в рамках способов, описываемых выше, может представлять собой любое подходящее мини-антитело, описываемое в настоящей заявке, или оно может содержать последовательность SEQ ID №:12, SEQ ID №:13, SEQ ID №:14 или SEQ ID №:15.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ
[0018] На Фигуре 1А представлена схематическая диаграмма мини-антитела J591. На данной диаграмме изображено мини-антитело в ориентации VHVL, связывающееся с мишенью PSMA.
[0019] На Фигуре 1B представлена схематическая диаграмма конструкции для экспрессии мини-антитела J591 в ориентации VHVL. SP = сигнальный пептид, VH - вариабельный домен тяжелой цепи, VL - вариабельный домен легкой цепи, L - линкер из 18 аминокислот, Н./Е - искусственная шарнирная/удлиняющая область, СН3 из IgG1 человека.
[0020] На Фигуре 2 представлено сравнение последовательностей аминокислот V-области деиммунизированного антитела (строка 3; SEQ ID №:5; SEQ ID №:19), мышиного антитела (Line 2; SEQ ID №:4; SEQ ID №:18) и составного человеческого атитела J591. Выделение цветом остатков в строке НС (строка 1) показывает различия между V-областью НС и V-областью мыши. Выделение цветом остатков в строке деиммунизированного антитела (строка 3) показывает различия между V-областью деиммунизированного антитела и V-областью антитела мыши, возникшие в результате первоначального процесса деиммунизации. Две звездочки показывают два пролина, введенные при деиммунизации.
[0021] На Фигуре 3 представлена последовательность нуклеотидов составного VHVL мини-антитела человека J591 2Р (SEQ ID №:1) и соответствующая транслируемая последовательность аминокислот (SEQ ID №:10).
[0022] На Фигуре 4 представлена последовательность нуклеотидов VHVL мини-антитела J591 2Р (SEQ ID №:2) и соответствующая транслируемая последовательность аминокислот (SEQ ID №:11).
[0023] На Фигуре 5 представлена схематическая диаграмма цис-диатела (CysDB) (А), схематическая диаграмма конструкции для экспрессии CysDB в ориентации VLVH (В) и схематическая диаграмма конструкции для экспрессии CysDB в ориентации VHVL (С). SS = сигнальная последовательность, VH = вариабельный домен тяжелой цепи, VL = вариабельный домен легкой цепи, L = линкер (может быть 5 или 8 аминокислот), GGS = цистеиновый «хвост» (Gly-Gly-Cys).
[0024] На Фигуре 6 представлена последовательность нуклеотидов VH-5-VL цис-диатела (CysDB) J591 (SEQ ID №:6) и соответствующая транслируемая последовательность аминокислот (SEQ ID №:12).
[0025] На Фигуре 7 представлена последовательность нуклеотидов VH-8-VL цис-диатела (CysDB) J591 (SEQ ID №:7) и соответствующая транслируемая последовательность аминокислот (SEQ ID №:13).
[0026] На Фигуре 8 представлена последовательность нуклеотидов VL-5-VH цис-диатела (CysDB) J591 (SEQ ID №:8) и соответствующая транслируемая последовательность аминокислот (SEQ ID №:14).
[0027] На Фигуре 9 представлена последовательность нуклеотидов VL-8-VH цис-диатела (CysDB) J591 (SEQ ID №:9) и соответствующая транслируемая последовательность аминокислот (SEQ ID №:15).
[0028] На Фигуре 10 представлена карта вектора для pcDNA 3.1/myc-His (-) Версий А, В, С. Указанный вектор экспрессии, полученный от компании «Invitrogen Corp.», является характерным промотором CMV (цитомегаловируса) для экспрессии у млекопитающих и устойчив к неомицину при селекции.
[0029] На Фигуре 11 представлен репрезентативный результат вестерн-блоттинга, подтверждающий экспрессию мини-антитела J591 клетками СНО-K1. Дорожка 1 соответствует пробе с маркерами молекулярной массы, дорожка 2 соответствует пробе с пустым вектором, дорожка 3 соответствует пробе с мини-антителом - положительным контролем, дорожка 4 соответствует пробе с VLVH J591 НС, дорожка 5 соответствует пробе с VHVL J591 НС, дорожка 6 соответствует пробе с VLVH J591 2Р, и дорожка 7 соответствует пробе с VHVL J591 2Р.
[0030] На Фигуре 12A-D представлены графики, иллюстрирующие результаты проточной цитометрии мини-антител J591. На гистограммах отложено количество клеток в зависимости от сигнала РЕ (FL2-H). На Фигуре 12А показан график, отображающий результаты проточной цитометрии для VLVH мини-антитела J591 НС. На Фигуре 12B показан график, отображающий результаты проточной цитометрии для VHVL мини-антитела J591 НС, на Фигуре 12С показан график, отображающий результаты проточной цитометрии для VLVH мини-антитела J591 2Р, а на Фигуре 12D показан график, отображающий результаты проточной цитометрии для VHVL мини-антитела J591.
[0031] На Фигуре 13 представлен результат SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) очищенного мини-антитела J591. Белок указанного очищенного антитела J591 загружали на гель SDS-PAGE при невосстановительных условиях (дорожка 1) и восстановительных условиях (дорожка 2). Указанный гель окрашивали красителем GelCode Blue (Pierce, Thermo Scientific). Для загрузки на гель мини-антитело разводили в соотношении 1/5.
[0032] На Фигуре 13 представлен результат эксклюзионной хроматографии (ЭХ) очищенного мини-антитела J591. На графике построена зависимость поглощения УФ света на длине волны 220 нм (mAU) от времени (мин). 4 мкг мини-антитела J591 загружали на колонку TSK-GEL Super SW3000. Также для получения эталонных значений через колонку отдельно пропускали стандарт молекулярной массы белка. Процент агрегатов относительно всего белка мини-антитела (обозначаемого здесь как мономер) определяли путем расчета площади под кривой.
[0033] Фигура 15 иллюстрирует связывание белка мини-антитела J591 с PSMA, что показано методом ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ). В 96-луночные планшеты для ELISA наносили очищенный рекомбинантный белок PSMA в концентрации 1 мкг/мл. Очищенный белок мини-антитела J591 (1, •) вводили в начальной концентрации 2 мкг/мл и десять раз проводили серийные разведения в три раза. Аналогичное разведение проводили для мини-антитела отрицательного контроля (2, ). Пробы анализировали в трех экземплярах на каждое разведение, полосы погрешностей соответствуют стандартному отклонению. После первичной инкубации связанные мини-антитела определяли при помощи античеловеческого антитела овцы - IgG (Fc-специфичного), конъюгированного со щелочной фосфатазой, и образующегося в растворе pNPP. Поглощение определяли на 405 нм.
5
[0034] На Фигуре 16A-D представлены графики по результатам проточной цитометрии, иллюстрирующие, связывание мини-антитела J591 с PSMA+ линиями клеток. На всех гистограммах отложено количество клеток в зависимости от сигнала РЕ (FL2-H). Белок мини-антитела J591 и мини-антитело - отрицательный контроль (1), оба при концентрации 20 мкг/мл, тестировали на предмет связывания с PSMA+ линией клеток LNCaP (А и В) и CWR22rv1 (С и D). Впоследствии клетки окрашивали вторичным античеловеческим IgG (Fc-специфичным)-РЕ конъюгированным антителом в количестве 1×10 клеток/ячейку, и анализ проводили при 5000 событий/ячейку. (А) мини-антитело J591 (2), связывающееся с клетками LNCaP (В) мини-антитело J591-DOTA (2), связывающееся с клетками LNCaP (С) мини-антитело J591 (2), связывающееся с клетками CWR (D) J591-DOTA мини-антитело (2), связывающееся с клетками CWR.
[0035] На Фигуре 17 приведены репрезентативные изображения, которые показывают интернализацию мини-антитела J591 в клетках LNCaP. Клетки LNCaP помещали на покровные стекла, покрытые поли-d-лизином в планшеты на 12 лунок. После 2-дневного роста клетки подвергали предварительному охлаждению при 4С в течение 30 минут перед инкубацией с первичным антителом или мини-антителом в течение 30 минут при 4С. В указанные моменты времени после первичной инкубации клетки фиксировали, повышали у них проницаемость мембраны и окрашивали вторичным античеловеческим антителом IgG-Alexa 488. Указанные покровные стекла одновременно соединяли с покровными стеклами с лункой и докрашивали DAPI (4’, 6-диамидин-2-фенилиндол) в среде для заключения ткани. Покровные стекла с лункой просматривали на конфокальном микроскопе Leica SP2-1P-FCS с применением 63Х масляно-иммерсионной линзы.
[0036] На Фигуре 18 приведены репрезентативные изображения, которые показывают интернализацию мини-антитела J591 в клетках CWR22rv1. Клетки CWR22rv1 помещали на покровные стекла, покрытые поли-d-лизином в планшеты на 12 лунок. После 2-дневного роста клетки подвергали предварительному охлаждению при 4С в течение 30 минут перед инкубацией с первичным антителом или мини-антителом в течение 30 минут при 4С. В указанные моменты времени после первичной инкубации клетки фиксировали, повышали у них проницаемость мембраны и окрашивали вторичным античеловеческим антителом IgG-Alexa 488. Указанные покровные стекла одновременно соединяли с покровными стеклами с лункой и докрашивали DAPI в среде для заключения ткани. Покровные стекла с лункой просматривали на конфокальном микроскопе Leica SP2-1P-FCS с применением 63Х масляно-иммерсионной линзы.
131
111
5
131
111
[0037] На Фигуре 19 представлен график, иллюстрирующий захват и удерживание ассоциированной с клетками радиоактивности I-меченного и In-DOTA-меченного мини-антитела J591. Захват и удерживание ассоциированной с клетками радиоактивности показан во времени при связывании с клетками CWR22rv1. Фракции радиоактивности, связанные с мембранами клеток, лизатом клеток (интернализованная) и общей радиоактивности выражены как количество в минуту (cpm). Клетки засевали на 24-луночные планшеты с плотностью 5×10 клеток/лунку за один день до проведения эксперимента. Перед инкубацией с избытком I-меченного или In-DOTA-меченного мини-антитела J591 клетки подвергали предварительному охлаждению при 4С. В каждый момент времени отбирали надосадочную жидкость, содержащую мини-антитело с радиоактивной меткой, клетки отделяли от подложки при помощи кислого глицинового буфера и получали фракцию мембран, а клетки подвергали лизису. В каждый момент времени эксперимент проводили трижды. Полосы погрешностей по оси Y соответствуют стандартному отклонению.
131
111
131
111
[0038] На Фигуре 20 представлен график сравнительной ассоциированной с клетками радиоактивности I-меченного и In-DOTA-меченного мини-антитела J591. Полная ассоциированная с клетками радиоактивность (мембранная + интернализованная) выражена как процент от исходной ассоциированной с клетками радиоактивности; показан временной ход при связывании с клетками CWR22rv1. На данном графике показано как I-меченное (нижняя линия), так и In-DOTA-меченное (верхняя линия) мини-антитело J591.
64
[0039] На Фигуре 21 приведены репрезентативные серийные микроизображения, полученные при ПЭТ/КТ (позитронно-эмиссионной томографии/компьютерной томографии) у мыши с вживленными ксенотрансплантатами CWR22rv1 и РС3, инъецированной мини-антителом Cu-DOTA-J591. Репрезентативное животное подвергали серийному сканированию в разные моменты времени после инъекции. Опухоль CWR22rv1 обозначена как (+) опухоль, а опухоль РС3-как (-) опухоль. (А) КТ через 4 часа после инъекции. Показаны изображения во фронтальной и поперечной плоскостях. (В) Совмещено изображение ПЭТ/КТ через 4 часа после инъекции. Показаны изображения во фронтальной и поперечной плоскостях. (С) Фронтальные ПЭТ/КТ совмещают 3D-проекцию для репрезентативной мыши через 4 часа после инъекции. (D) Фронтальные ПЭТ/КТ совмещают 3D-проекцию для репрезентативной мыши через 43 часа после инъекции.
64
64
[0040] На Фигуре 22 представлен столбчатый график, иллюстрирующий биораспределение Cu-DOTA-меченного мини-антитела J591 через 19 и 43 часа после инъекции. На графике отложено биораспределение Cu-DOTA-меченного мини-антитела J591 в опухолях на основе ксенотрансплантата и избранных здоровых тканях, представляющих особый интерес. Биораспределение отложено в % от вводимой дозы, отнесенной к массе в граммах (%ID/г). Каждая точка на графике соответствует среднему %ID/г для группы мышей через 19 ч (n=8) и 43 ч после инъекции (n=4). Полосы погрешностей соответствуют стандартному отклонению.
124
[0041] На Фигуре 23 приведены репрезентативные серийные микроизображения, полученные при ПЭТ у мыши с вживленными ксенотрансплантатами CWR22rv1 и РС3, инъецированной мини-антителом I-J591. Репрезентативное животное подвергали серийному сканированию в разные моменты времени после инъекции. Опухоль CWR22rv1 обозначена как (+) опухоль, а опухоль РС3 - как (-) опухоль. (А) КТ через 4 часа после инъекции. (А) КТ через 4 часа после инъекции. Показаны изображения во фронтальной и поперечной плоскостях. (В) Совмещено изображение ПЭТ/КТ через 4 часа после инъекции. Показаны изображения во фронтальной и поперечной плоскостях. (С) Фронтальные совмещенные ПЭТ/КТ изображения через 4, 20 и 44 часа после инъекции.
124
124
[0042] На Фигуре 24 представлен столбчатый график, иллюстрирующий биораспределение I-меченного мини-антитела J591 через 19 и 44 часа после инъекции. На графике отложено биораспределение I-меченного мини-антитела J591 в опухолях на основе ксенотрансплантата и избранных здоровых тканях, представляющих особый интерес. Биораспределение отложено в % от вводимой дозы, отнесенной к массе в граммах (%ID/г). Каждая точка на графике соответствует среднему %ID/г для группы мышей через 19 ч и 44 ч после инъекции (n=4 через 19 часов, n=2 через 44 часа). Полосы погрешностей соответствуют стандартному отклонению.
[0043] На Фигуре 25 представлен столбчатый график, иллюстрирующий уровень экспрессии следующих вариантов мини-антитела во временно трансфецированных клетках СНО-K1: (1) мини-антитело J591 НС VLVH (J591 VLVH Mb), (2) мини-антитело J591 НС VHVL (J591 VHVL Mb), (3) мини-антитело J591 2Р VLVH (J591 VLVH** Mb) и (4) мини-антитело J591 2Р VHVL (J591 VHVL** Mb). Мини-антитело huJ591 НС VHVL проявляло наиболее высокий уровень экспрессии (6,7 мкг/мл) в результате временной трансфекции.
64
[0044] На Фигуре 26 представлен столбчатый график, отображающий соотношение биораспределения (т.е., между позитивной опухолью и здоровыми тканями) через 4 часа, 20 часов и 43 часа после введения Cu-DOTA-меченного мини-антитела J591. Соотношения биораспределения включали сравнение распределения для позитивной опухоли (Pos) и печени (Liv), почек (Kid) и мягких тканей (Soft). Полосы погрешностей соответствуют стандартной ошибке среднего (SEM).
124
[0045] На Фигуре 27 представлен столбчатый график, отображающий соотношение биораспределения (т.е., между позитивной опухолью и здоровыми тканями) через 4 часа, 20 часов и 43 часа после введения I-А-меченного мини-антитела J591. Соотношения биораспределения включали сравнение распределения для позитивной опухоли (Pos) и печени (Liv), почек (Kid) и мягких тканей (Soft). Полосы погрешностей соответствуют стандартной ошибке среднего (SEM).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0046] Настоящее описание посвящено антителу или функциональному фрагменту антитела, которые направлены против простата-специфичного мембранного антигена (PSMA). Антитело на PSMS или функциональный фрагмент указанного антитела может быть конъюгирован с таким веществом, как диагностический агент, терапевтический агент или наночастица, вместе с которыми они образуют анти-PSMA конъюгат. Также в настоящей заявке раскрываются способы применения анти-PSMA антитела, функционального фрагмента анти-PSMA антитела или анти-PSMA конъюгата для диагностики, визуализации, мониторинга или лечения раковых опухолей или других состояний, ассоциированных с гиперэкспрессией PSMA.
Антитела против PSMA и их функциональные фрагменты
2
[0047] В настоящей заявке передоложены антитела против PSMA или функциональные фрагменты антител против PSMA в соответствии с вариантами реализации, описываемыми в настоящей заявке. Антитело против PSMA или функциональный фрагмент указанного антитела представляет собой молекулу, которая включает одну или более частей иммуноглобулина или иммуноглобулин-подобной молекулы, специфически связывающуюся с PSMA или иммунологически реактивные в отношении PSMA. Термин «модифицированное антитело» включает сконструированные методами генной инженерии или другим способом модифицированные формы иммуноглобулинов, такие как интраантитела (intrabodies), химерные антитела, полностью человеческие антитела, гуманизированные антитела и антитела-гетероконъюгаты (например, биспецифические антитела, диатела, триотела и тетратела), но не ограничивается ими. Термин «функциональный фрагмент антитела» включает один или более антиген-связывающих фрагментов антител сами по себе или в сочетании с другими молекулами, включая фрагменты Fab’, F(ab’), Fab, Fv, rIgG, scFv, однодоменные фрагменты, пептидные антитела, мини-антитела и цис-диатела, но не ограничиваясь ими. Термин «scFv» относится к одноцепочечному антителу Fv, в котором вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи традиционного двухцепочечного антитела соединились, образовав одну цепь.
[0048] Согласно одному варианту реализации указанное модифицированное антитело или функциональный фрагмент антитела представляет собой анти-PSMA мини-антитело. Согласно одному варианту реализации указанное анти-PSMA антитело представляет собой мини-антитело J591. Анти-PSMA мини-антитело содержит фрагмент антитела против PSMA с оптимизированными фармакодинамическими свойствами для визуализации in vivo и биораспределением, как будет описано ниже. «Мини-антитело» - это гомодимер, в котором каждый мономер представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), связанный с доменом СН3 IgG1 человека линкером, таким как шарнирная последовательность ana. Согласно одному варианту реализации шарнирная последовательность представляет собой шарнирная последовательность IgG1 человека (EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP; SEQ ID №:16). Согласно еще одному варианту реализации шарнирная последовательность представляет собой искусственную шарнирную последовательность. Искусственная шарнирная последовательность может включать часть шарнирной области IgG1 человека и последовательность линкера GlySer. Согласно одному варианту реализации искусственная шарнирная последовательность включает первые приблизительно 14 или 15 остатков шарнирной области IgG1 человека, после которых идет последовательность линкера GlySer, длина которой составляет 8, 9 или 10 аминокислот. Согласно еще одному варианту реализации искусственная шарнирная последовательность включает первые приблизительно 15 остатков шарнирной области IgG1 человека, после которых идет последовательность линкера GlySer, длина которой составляет 10 аминокислот.
[0049] Указанный scFv может иметь ориентацию VHVL или VLVH, причем ориентация VHVL означает, что вариабельный домен тяжелой цепи (VH) scFv расположен против направления транскрипции по отношению к вариабельной области легкой цепи (VL), а ориентация VLVH означает, что VL scFv расположен против направления транскрипции от VH. Применяемый в настоящей заявке термин «против направления транскрипции от» означает «ближе к N-концу в последовательности аминокислот или ближе к 5’-концу в последовательности нуклеотидов». Указанные VH и VL соединены друг с другом линкерной последовательностью аминокислот. Аминокислотный линкер может иметь любую подходящую длину. Согласно одному варианту реализации указанный линкер богат остатками глицина и серина, и его длина составляет приблизительно 15-20 аминокислот. Согласно еще одному варианту реализации указанный линкер богат остатками глицина и серина, и его длина составляет 18 аминокислот.
[0050] Согласно вариантам реализации, описываемым в настоящей заявке, каждый мономер указанного мини-антитела против PSMA может кодироваться последовательностью нукпеотидов, которая включает следующие элементы, в направлении от N-конца к С-концу: (а) последовательность scFv, которая может связываться с PSMA, (b) искусственную шарнирная последовательность и (с) последовательность СН3 IgG человека. Указанные мини-антитела могут экспрессироваться клеткой, линией клеток или другими подходящими системами экспрессии, которые описаны в настоящей заявке. Так, сигнальную последовательность можно присоединить к N-концу scFv, чтобы сделать возможной секрецию мини-антитела, при его экспрессии в клетке или линии клеток. Согласно некоторым вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов представляет собой SEQ ID №:1 или SEQ ID №:2. Во время экспрессии в клетке или в линии клеток нуклеотид транскрибируется и транслируется в последовательность аминокислот. Согласно некоторым вариантам реализации экспрессируемая такая последовательность аминокислот соответствует SEQ ID №:10 или SEQ ID №:11.
[0051] Согласно еще одному варианту реализации предложено модифицированное антитело или функциональный фрагмент антитела, которое представляет собой цис-диателом против PSMA (CysDB). «Диатело» включает первую полипептидную цепь, содержащую вариабельный домен тяжелой цепи (VH), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в первой полипептидной цепи, соединенные пептидным линкером, который такой короткий, что не позволяет конъюгировать (объединиться) двум доменам в состава первой полипептидной цепи, и вторую полипептидную цепь, содержащую вариабельный домен легкой цепи (VL), соединенный с вариабельным доменом тяжелой цепи (VH) во второй полипептидной цепи (VL-VH), соединенные пептидным линкером, который настолько короткий, что не позволяет конъюгировать двум доменам в составе второй полипептидной цепи. Малая длина линкеров приводит к конъюгации комплементарных доменов, находящихся в составе первой и второй полипептидных цепей и способствует сборке димерной молекулы с двумя функциональными сайтами связывания антигенов. Следовательно, пептидный линкер может иметь любую подходящую длину, которая способствовала бы такой сборке, например, длину от 5 до 10 аминокислот. Как будет описано далее, некоторые цис-диатела могут включать пептидный линкер длиной 5 или 8 аминокислот. CysDB против PSMA (анти-PSMA CysDB) представляет собой антитело в форме гомодимера, образованного двумя идентичными мономерами, которые включают одноцепочечные фрагменты Fv (scFv) с молекулярной массой приблизительно 55 кДа. Согласно одному варианту реализации антитело против PSMA представляет собой CysDB J591. Подобно мини-антителам против PSMA, описанным выше, анти-PSMA CysDB, описываемые в настоящей заявке, содержат фрагмент анти-PSMA антитела с оптимизированными фармакодинамическими свойствами, которые можно применять при визуализации in vivo, и биораспределением.
[0052] Согласно вариантам реализации, описываемым в настоящей заявке, каждый мономер указанного CysDB может кодироваться последовательностью нуклеотидов, которая включает следующие элементы, в направлении от N-конца к С-концу: (а) последовательность scFv, которая может связываться с PSMA, и (b) цистеиновый «хвост». Указанные CysDB могут экспрессироваться клеткой или линией клеток, которые описаны в настоящей заявке. Так, сигнальную последовательность можно присоединить к N-концу scFv, чтобы сделать возможной секрецию указанного мини-антитела, когда оно экспрессируется в указанной клетке или линии клеток. Согласно некоторым вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов представляет собой SEQ ID №:6, SEQ ID №:7, SEQ ID №:8 или SEQ ID №:9. Во время экспрессии в клетке или в линии клеток указанный нуклеотид транскрибируется и транслируется в последовательность аминокислот. Согласно некоторым вариантам реализации экспрессируемая последовательность аминокислот соответствует SEQ ID №:12, SEQ ID №:13, SEQ ID №:14 или SEQ ID №:15.
[0053] Согласно некоторым вариантам реализации последовательность scFv CysDB аналогична последовательностям scFv мини-антител, описанных выше. Так, scFv может обладать ориентацией VHVL или VLVH, причем ориентация VHVL означает, что вариабельный домен тяжелой цепи (VH) scFv расположен против направления транскрипции по отношению к вариабельной области легкой цепи (VL), а ориентация VLVH означает, что VL scFv расположен против направления транскрипции от VH. Вариабельные области антитела соединены линкером GlySer, как описано выше. На С-конце добавляют цистеиновый «хвост» (Gly-Gly-Cys). Указанный цистеиновый «хвост» позволяет комплексу антитела образовывать ковалентные связи между цистеинами и создает возможность сайт-специфичной конъюгации доступных серосодержащих остатков в таких функциональных компонентах, как радиоактивные метки.
[0054] Было успешно разработано множество CysDB из разных исходных антител против разных мишеней, включая СЕА, Her2 (трастузумаб/Herceptin), PSCA и CD20 (ритуксимаб/Rituxan). Разные варианты форм CysDB прошли оценку в четырех конкретных версиях, и в отношении связывания и уровня экспрессии были получены наиболее многообещающие результаты. Для каждого индивидуального антитела вариабельные домены тяжелой и легкой цепей связаны разными способами. По этой причине применение линкеров разной длины создает возможность конформационной гибкости и широкого диапазона подвижности, обеспечивающая образование дисульфидных связей. Согласно некоторым вариантам реализации два варианта с разной длиной линкера содержат либо линкер длиной 5 аминокислот, либо линкер длиной 8 аминокислот. Каждый вариант со своей длиной линкера можно создавать на основе обеих ориентации (VL-линкер-VH-Cys-«хвост» и VH-линкер-VL-Cys-«хвост»), чтобы гарантировать надлежащую укладку и достичь стабильности. Согласно некоторым вариантам реализации были сконструированы четыре варианта CysDB, которые могут применяться при реализации способов, описываемых в настоящей заявке: VH5VL, VH8VL, VL5VH и VL8VH (см. Фигуры 6-9). Хотя каждый из указанных вариантов CysDB можно успешно экспрессировать, результаты могут варьировать в зависимости от применяемого исходного антитела. Получение и оценка экспрессии и связывания всех четырех вариантов гарантирует выявление формы, оптимальной для выработки белка для каждого нового CysDB. Оценка набора вариантов важна, чтобы гарантировать получение высококачественного стабильного белка, в котором возможно образование дисульфидных мостиков. Следовательно, конструирование CysDB действительно подразумевает применение двух линкеров разной длины, а не одного - как в случае мини-антитела, а также обеих ориентации вариабельных областей, VH/VL и VL/VH.
[0055] Согласно некоторым вариантам реализации в качестве системы экспрессии для получения мини-антител, цис-диател и других фрагментов антител, описываемых в настоящей заявке, можно применять линию клеток млекопитающего (например, линию клеток СНО-K1). Однако поскольку мини-антитела, цис-диатела и другие фрагменты антител, описываемых в настоящей заявке, не гликозилированы, линия клеток или система экспрессии млекопитающего не требуется, поскольку нет нужды в такой посттрансляционной модификации. По этой причине для получения фрагментов антител к PSMA (например, анти- PSMA мини-антител или цис-диател) согласно вариантам реализации настоящего изобретения можно применять широкий спектр систем экспрессии из млекопитающих и не млекопитающих, включая, но не ограничиваясь, системы экспрессии на основе клеток млекопитающих (например, клетки СНО-K1), системы экспрессии на основе бактерий (например, Е. Coli, В. subtilis), системы экспрессии на основе дрожжей (например, Pichia, S. cerevisiae) или любую другую известную систему экспрессии.
[0056] Как подробно описано ниже в разделе «Примеры», были созданы четыре варианта мини-антитела, различающиеся по области svFv, и были экспрессированы в клетках СНО-K1. Специфическое связывание с PSMA было продемонстрировано методами ELISA и проточной цитометрии. Один из вариантов с высоким уровнем экспрессии и связывания с PSMA (J591 НС VHVL) отобрали для получения белка, очистки и дельнейшей оценки. Получение белка мини-антитела J591 НС VHVL успешно перевели в более крупный масштаб для производства достаточного количества для интернализации и экспериментов с микро-ПЭТ визуализацией, описываемых ниже.
111
131
[0057] Исследования мини-антитела J591 на конфокальном микроскопе выявили увеличение внутриклеточного окрашивания в клетках CWR22rv1 и LNCaP со временем, аналогично действию интактного мини-антитела huJ591, что указывает на то, что мини-антитела J591 подвергаются быстрой интернализации. Для дальнейшей оценки интернализации мини-антитела J591 были применены две стратегии радиоактивного мечения: мечение радиоактивным йодом I-131 и конъюгация с DOTA в целях мечения радиометаллом In-111. Меченное In-DOTA мини-антитело J591 демонстрировало увеличение ассоциированной с клетками радиоактивности на 260% в течение 3-часового периода. Напротив, после начального связывания клетками I-меченного мини-антитела J591 наступало падение изначальной активности до 80%.
131
131
111
111
[0058] Мини-антитело J591 быстро интернализуется при связывании с PSMA+ линией клеток CWR22rv1 и LNCaP. В случае I-меченного мини-антитела J591 общая ассоциированная с клетками радиоактивность со временем падает, что указывает на потерю метки, вероятно, обусловленную дегалогенизацией, и/или быстрый метаболизм и выведение из клеток I-меченного мини-антитела J591. Напротив, общая ассоциированная с клетками радиоактивность при введении In-DOTA мини-антитела J591 со временем значительно увеличивается (~2,5 раза), что согласуется с тем, что отделенная от остатков метка захватывается лизосомами. На основании сохранения общей ассоциированной с клетками радиоактивности со временем стратегия разделительного радиоактивного мечения In-DOTA представляется приемлемым подходом к визуализации интернализующегося антигена PSMA in vivo.
Производные и конъюгаты анти-PSMA антител
[0059] Согласно некоторым вариантам реализации антитела или функциональные фрагменты антител против PSMA могут включать производные антител, которые модифицированы. Например, указанные производные антител включают антитела, которые были модифицированы путем гликозилирования, ацетилирования, пегилирования, фосфорилирования, образования амидной связи, получения производных путем присоединения известных защитных/блокирующих групп, протеолитического расщепления и соединения с лигандом клеток или другим белком, но не ограничиваясь ими. Любые из многочисленных химических модификаций можно произвести при помощи известных способов, включая специфическое расщепление, ацетилирование, формилирование и метаболический синтез туникамицина, но не ограничиваясь ими. Кроме того, указанные производные могут содержать одну или более неприродных аминокислот.
[0060] Согласно другому варианту реализации антитело или функциональный фрагмент против PSMA можно конъюгировать с другим веществом с образованием анти-PSMA конъюгата. Анти-PSMA конъюгаты, описываемые в настоящей заявке, можно получить известными способами связывания антител с липидами, углеводами, белками и или другими атомами и молекулами. Согласно одному аспекту анти-PSMA конъюгаты образуются при сайт-специфичной конъюгации с применением соответствующего соединения или связи. При сайт-специфичной конъюгации с большей вероятностью можно сохранить связывающую активность антитела или функционального фрагмента антитела. Указанное вещество можно конъюгировать или присоединить к шарнирной области сокращенного компонента антитела или фрагмента антитела посредством образования дисульфидной связи. Например, введение остатков цистеина в С-конец фрагмента scFv, которые, например, вводят в цис-диатела, описываемые выше, способствует сайт-специфичному присоединению широкого спектра агентов благодаря реакции тиолов в сайте, удаленном от сайта связывания антигена. В качестве альтернативы другие способы соединения или связи, применяемые для образования анти-PSMA конъюгата, могут включать ковалентную связь, нековалентную связь, сульфидную связь, гидразоновую связь, гидразиновую связь, эфирную связь, амидосвязь, аминосвязь, имино-связь, тиосемикарбазоновую связь и семикарбазоновую связь, оксимовую связь и углерод-углеродную связь, но не ограничиваются ими.
[0061] Согласно одному варианту реализации указанный анти-PSMA конъюгат может включать антитело против PSMA или функциональный фрагмент антитела против PSMA, конъюгированный с диагностическим агентом. Под «диагностическим агентом» понимают атом, молекулу или соединение, которое применимо при диагностике, выявлении или визуализации заболевания. Согласно вариантам реализации, описываемым в настоящей заявке, диагностические агенты могут включать радиоактивные вещества (например, радиоактивные изотопы, радиоактивные метки или радиоизотопные индикаторы), красители, контрастные вещества, флуоресцентные соединения или молекулы, биолюминесцентные соединения или молекулы, ферменты и усиливающие агенты (например, парамагнитные ионы), но не ограничиваются ими. Кроме того, следует отметить, что некоторые наночастицы, например, квантовые точки и наночастицы металлов (описываемые ниже), также можно применять в качестве агентов для детекции.
18
32
33
45
47
52
64
64
67
67
68
75
77
86
90
89
89
94
94
99m
99
105
105
111
111
123
124
125
131
142
143
149
153
154-1581
161
166
166
169
175
177
186
188
189
194
198
199
211
211
212
212
213
223
225
[0062] Радиоактивные вещества, которые можно применять в качестве диагностических агентов согласно вариантам реализации настоящего раскрытия, включают F, P, P, Ti, Sc, Fe, 59Fe, Cu, Cu, Cu, Ga, Ga, Sc, As, Y, Y. Sr, Zr, Tc, Tc, Tc, Mo, Pd, Rh, Ag, In, I, I, I, I, Pr, Pr, Pm, Sm, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Lu, Lu, Re, Re, Re, Ir, Au, Au, At, Pb, Bi, Pb, Bi, Ra и Ас, но не ограничиваются ими. Парамагнитные ионы, которые можно применять в качестве диагностических агентов согласно вариантам реализации настоящего раскрытия, включают ионы переходных металлов и лантаноидов (например, металлы, обладающие атомными числами 6-9, 21-29, 42, 43, 44 или 57-71), но не ограничиваясь ими. Указанные металлы включают ионы Cr, V, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, La, Се, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Но, Er, Tm, Yb и Lu.
223
18
[0063] Когда диагностическим агентом является радиоактивный металл или парамагнитный ион, указанный агент может вступать в реакцию с реагентом, обладающим длинным «хвостом» с одной или более хелатирующими группами, присоединенными к длинному «хвосту» для связывания указанных ионов. Указанный длинный «хвост» может быть образован полимером, таким как полилизин, полисахарид или другой производной цепью или цепью, из которой можно получить производное, содержащие боковые группы, к которым можно присоединить хелатирующую группу для связывания указанных ионов. Примеры хелатирующих групп, которые можно применять согласно настоящему раскрытию, включают этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA), диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA), DOTA, NOTA, NETA, порфирины, полиамины, краун-эфиры, бис-тиосемикарбазоны, полиоксимы и подобные группы, но не ограничиваются ими. В норме указанный хелат связывается с антителом против PSMA или функциональным фрагментом антитела против PSMA через группу, которая способствует образованию связи с молекулой с минимальной потерей иммунореактивности и минимальной агрегацией и/или внутренними перекрестными связями. Такие же хелаты, при образовании комплексов с нерадиоактивными металлами, такими как марганец, железо и гадолиний, применяют при МРТ, вместе с антителами и носителями, описываемыми в настоящем документе. Макроциклические хелаты, такие как NOTA, DOTA и ТЕТА, применяют с разными металлами и радиоактивными металлами, включая радионуклиды галлия, иттрия и меди, соответственно, но не ограничиваясь ими. Другие хелаторы циклического типа, такие как макроциклические полиэфиры, которые представляют интерес в связи со стабильным связыванием нуклидов, такие как Ra, можно применять для радиойодтерапии. Согласно конкретным вариантам реализации хелатирующие компоненты можно применять для присоединения к агентам для визуализации при ПЭТ, такие как комплекс Al-F, для направленной доставки молекулы при ПЭТ анализе.
[0064] Контрастные вещества, которые можно применять в качестве диагностических агентов согласно вариантам реализации настоящего раскрытия, включают барий, диатризоат, этиодизированное масло, цитрат галлия, йокармиковую кислоту, йоцетамовую кислоту, йодамид, йодипамид, йодоксамовую кислоту, иогуламид, иогексил, йопамидол, иопаноевую кислоту, ioprocemic acid, йозефамовую кислоту, йозериевую кислоту, йосуламид меглюмин, йоземетовую кислоту, йотасул, йотетровую кислоту, иоталамическую кислоту, йотроксовую кислоту, йоксагловую кислоту, йоксотризоевую кислоту, йопода, меглумин, метризамид, метризоат, пропилиодон, хлористый таллий или их комбинации, но не ограничиваясь ими.
[0065] Биолюминесцентные и флуоресцентные соединения или молекулы и красители, которые можно применять в качестве диагностических агентов согласно вариантам реализации настоящего раскрытия, включают флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат (FITC), Oregon Green™, родамин, техасский красный, тетрародамин изотиоцианат (TRITC), Cy3, Cy5 и др., флуоресцентные маркеры (например, зеленый флуоресцентный белок (GFP), пикоэритрин и др.), флуоресцентные вещества с автогашением, которые активируются ассоциированными с опухолями протеазами, ферменты (например, люцифераза, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и др.), наночастицы, биотин, дигоксигенин или их комбинации, но не ограничиваясь ими.
[0066] Ферменты, которые можно применять в качестве диагностических агентов согласно вариантам реализации настоящего раскрытия, включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, кислую фосфатазу, глюкооксидазу, β-галактозидазу, β-глюкуронидазу или β-лактамазу, но не ограничиваясь ими. Такие ферменты можно применять в сочетании с хромогеном, флюорогеном или люминогеном в целях генерации различимого сигнала.
[0067] Согласно другому варианту реализации, конъюгаты с антителами против PSMA могут включать антитела против PSMA или фрагменты антител против PSMA, конъюгированные с терапевтическим агентом. В настоящей заявке термин «терапевтический агент» относится к атому, молекуле или соединению, которые применимы при лечении рака или других патологических состояний, ассоциированных с PSMA. Примеры терапевтических агентов включают лекарственные препараты, химиотерапевтические агенты, терапевтические антитела, токсины, радиоизотопы, ферменты (например, ферменты для расщепления пролекарств с образованием цитотоксического агента в очаге опухоли), нуклеазы, гормоны, иммуномодуляторы, антисмысловые олигонуклеотиды, хелаторы, соединения бора, фотоактивные вещества и красители, но не ограничиваются ими.
[0068] Химиотерапевтические агенты часто по своей природе цитотоксичны или являются цитостатиками, и они могут включать алкилирующие агенты, антиметаболиты, противоопухолевые антибиотики, ингибиторы топоизомеразы, ингибиторы митоза, гормональные средства, направленные лекарственные вещества и иммунотерапевтические средства. Согласно некоторым вариантам реализации химиотерапевтические агенты, которые можно применять в качестве диагностических агентов в соответствии с вариантами реализации настоящего раскрытия, включают 13-цис-ретиноевую кислоту, 2-холрдезоксиаденозин, 5-азацитинид, 5-фторурацил, 6-мекраптопурин, 6-тиогуанин, актиномицин-D, адриамицин, альдеслейкин, алемтузумаб, алитретиноин, полностью-трансретиноевая кислота, альфа-интерферон, альтретамин, аметоптерин, амифостин, анаглелид, анастрозол, арабинозилцитозин, триоксид мышьяка, амсакрин, аминокамтотецин, аминоглютетимидин, аспарагиназа, азацитин, бацилла Кальмета-Герена (BCG), бендамустин, бевацизумаб, бексаротен, бикалумид, бортезомиб, блеомицин, бусульфан, лейковиорин кальция, цитроворум-фактор, капецитабин, канертиниб, карбоплатин, кармустин, цетуксимаб, хлорамбуцил, цисплатин, кладрибин, кортизон, циклофосфамид, цитарабин, дарбепоэтин альфа, дазатиниб, дауномицин, децитабин, денилейкин дифтитокс, дексаметазон, дексазон, декстразоксан, дактиомицин, даунорубицин, декарбазин, доцетаксел, доксорубицин, доксифлуридин, энилурацил, эпирубицин, эпоэтин альфа, эрлотиниб, эверолимус, экземестан, эстрамустин, этопозид, филграстим, флуоксиместерон, фулвестрант, флавопиридол, флоксуридин, флударабин, фторурацил, флутамид, гефитиниб, гемцитабин, гемтузумаб озогамицин, гозерелин, колониестимулирующий фактор гранулоцитов, колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов, гексаметилмеламин, гидрокортизон гидроксимочевина, ибритумомаб, интерферон альфа, интерлейкин-2, интерлейкин-11, изотретионин, ихабепилон, идарубицин, иматиниб мезилат, ифосфамид, иринотекан, лапатиниб, леналидомид, летрозол, лейковорин, лейпролид, липосомальный Ara-С, ломустин, мехлорэтамин, мегестрол, мелпалан, меркаптопурин, месна, метотрексат, метилпреднизолон, митомицин С, митотан, митоксантрон, неларабин, нилутамид, октретид, опрелвекин, оксалиплатин, паклитаксел, памидронат, пеметрексед, панитумумаб, интерферон ПЭГ, пегаспаргаза, пегфилграстим, ПЭГ-L-аспарагиназа, пентотсатин, пликамицин, преднизолон, преднизон, прокарбазин, ралоксифен, ритуксимаб, ромиплостим, ралитрексед, сапацитабин, сарграмостим, сатраплатин, сорафениб, сунитиниб, семустин, стрептозоцин, тамоксифен, тегафур, тегафур-урацил, темсиролимус, темозаламид, тенипозид, талидомид, тиогуанин, тиотепа, топотекан, торемифен, тозитомомаб, трастузумаб, третиноин, тримитрексат, алрубицин, винкристин, винбластин, виндестин, винорелбин, вориностат или золедроновая кислота, но не ограничиваясь ими.
[0069] Терапевтические антитела и их функциональные фрагменты, которые можно применять в качестве диагностических агентов в соответствии с вариантами реализации настоящего раскрытия, включают алемтузумаб, бевацизумаб, цетуксимаб, эдреколомаб, гемтузумаб, ибритумомаб, тиуксетан, панитумумаб, ритуксимаб, тозитумумаб и трастузамаб, но не ограничиваясь ими.
[0070] Токсины, которые можно применять в качестве диагностических агентов в соответствии с вариантами реализации настоящего раскрытия, включают рицин, абрин, рибонуклеазу (РНКаза), ДНКазу I, энтеротоксин стафилококка А, противовирусный белок фитолакки, гелонин, дифтерийный токсин, экзотоксин Pseudomonas и эндотоксин Pseudomonas, но не ограничиваясь ими.
32
89
90
99m
99
131
153
177
186
213
223
225
[0071] Радиоизотопы, которые можно применять в качестве диагностических агентов в соответствии с вариантами реализации настоящего раскрытия, включают P, Sr, Y. Tc, Mo, I, Sm, Lu, Re, Bi, Ra и Ас, но не ограничиваются ими.
[0072] Согласно другому варианту реализации, конъюгаты с антителами против PSMA могут включать антитела против PSMA или фрагменты антител против PSMA, конъюгированные с наночастицами. Термин «наночастицы» относится к микроскопической частице, размер которой измеряется нанометрами, например, частице, у которой наименьший размер менее чем приблизительно 100 нм. Наночастицы особенно применимы в качестве детектируемых частиц, поскольку они достаточно малы для рассеивания видимого света, а не его поглощения. Например, наночастицы золота обладают значительной экстинкцией в видимом свете и в растворе приобретают окрашивание от темно-красного до черного. В результате, композиции, содержащие PSMA-специфичное антитело или фрагменты, конъюгированные с наночастицами, можно применять для визуализации опухоли или раковых клеток у субъекта in vivo. На нижней границе размерного ряда наночастицы часто называют кластерами. Были созданы наночастицы из металлов, диэлектриков и полупроводников, а также гибридные структуры (например, наночастицы типа «ядро-оболочка»). Наносферы, наностержни и наночаши - вот несколько форм, которые были выращены. Примеры дополнительных типов наночастиц включают квантовые точки и нанокристаллы из полупроводников. Такие нанометровые частицы при их конъюгации с антителами к PSMA или функциональными фрагментами таких антител можно применять в качестве агентов для визуализации при in vivo детекции клеток опухоли, как описывалось выше. В качестве альтернативы наночастицы можно применять для терапевтических приложений в качестве транспортеров лекарственного препарата, которые, когда конъюгированы с антителами к PSMA или функциональными фрагментами таких антител согласно настоящему изобретению, доставляют химиотерапевтические агент, гормональные терапевтические агенты, радиотерапевтические агенты, токсины или любой другой цитотоксический или противоопухолевый агент, известный в данной области техники, к раковым клеткам, которые гиперэкспрессируют на поверхности клетки PSMA.
131
131
[0073] Любой из описанных выше конъюгатов с антителами против PSMA, можно дополнительно конъюгировать с одним или более дополнительными терапевтическими агентами, диагностическими агентами, наночастицами, транспортерами или их комбинацией. Например, антитело против PSMA или функциональный фрагмент антитела против PSMA можно метить радиоактивной меткой I и конъюгировать с липидом-переносчиком, так, что конъюгат анти-PSMA-липид образует мицеллу. Указанная мицелла может заключать в себя один или более терапевтических или диагностических агентов. В качестве альтернативы, помимо переносчика, антитело против PSMA или функциональный фрагмент антитела против PSMA можно конъюгировать с I (например, по остатку тирозина) и лекарственным препаратом (например, оп эпсилон-аминогруппе остатка лизина), и переносчик может включать дополнительный терапевтический или диагностический агент.
Способы диагностики, определения стадии и мониторинга рака
[0074] Указанное антитело против PSMA, функциональный фрагмент антитела против PSMA или анти-PSMA конъюгат можно применять для направленной доставки к PSMA-позитивным клеткам, таким как раковые клетки, экспрессирующие в избытке PSMA. Следовательно, способы диагностики, выявления, визуализации, мониторинга или лечения рака или других патологических состояний, ассоциированных с экспрессией PSMA, могут включать введение антитела против PSMA, функционального фрагмента антитела против PSMA или анти-PSMA конъюгата субъекту, у которого установлен или предполагается рак или другое патологическое состояние, ассоциированное с экспрессией PSMA. Применяемый в настоящей заявке термин «субъект» относится к любому животному (например, млекопитающему), включая человека, низших приматов, грызунов, собак, свиней и подобных, но ограничиваясь ими.
[0075] Типы рака, которые ассоциированы с экспрессией PSMA, могут включать типы рака, содержащие ткани раковой опухоли, в избытке экспрессирующие PSMA (например, рак предстательной железы) или содержащие новообразованные сосуды в солидной опухоли, избытке экспрессирующие PSMA (например, рак предстательной железы, рак легких, рак ободочной кишки (или ободочной и прямой кишки, рак молочной железы, рак почек, рак печени, рак мочевого пузыря и рак поджелудочной железы, а также саркомы и меланома). Большинство новообразованных сосудов в солидных опухолях экспрессируют PSMA, что делает PSMA маркером новообразования сосудов. Таким образом, помимо раковых клеток, которые экспрессируют PSMA, рак, который ассоциирован с экспрессией PSMA, может включать любой тип раковых тканей с новообразованными сосудами, включая карциномы, такие как рак предстательной железы, рак легких, рак ободочной кишки (или ободочной и прямой кишки, рак молочной железы, рак почек, рак печени, рак мочевого пузыря и рак поджелудочной железы, а также саркомы и меланому, но не ограничиваясь ими.
[0076] Согласно одному варианту реализации способ диагностики, выявления, визуализации или мониторинга рака или других патологических состояний, ассоциированного с экспрессией PSMA, включает введение диагностического анти-PSMA конъюгата субъекту, у которого установлен или предполагается рак. Диагностический анти-PSMA конъюгат включает антитело против PSMA или функциональный фрагмент антитела против PSMA, конъюгированный с одним или более диагностическими агентами, описанными выше. Согласно одному варианту реализации указанное антитело против PSMA или функциональный фрагмент антитела против PSMA представляет собой мини-антитело или CysDB, полученное из антитела J591, такого как мини-антитела J591 и CysDBs J591, описываемые в настоящей заявке. Указанный диагностический анти-PSMA конъюгат можно конъюгировать или связывать с одним или более дополнительными веществами, описываемыми в настоящей заявке, так, такими как терапевтический анти-PSMA конъюгат (как описано далее), неконъюгированные терапевтические агенты, контрастные растворы, липиды-переносчики или наночастицы.
[0077] Указанный диагностический анти-PSMA конъюгат, применяемый при реализации способа, описанного выше, применим для способов детекции или визуализации in vivo или in vitro. Согласно одному варианту реализации диагностическое или прогнозирующее исследование проводят в целях определения уровня экспрессии PSMA в образце ткани, взятом у субъекта с установленным или предполагаемым раком, ассоциированным с PSMA по сравнению с образцом нормальной (т.е., не раковой) или контрольной ткани (т.е., в образце ткани, в которой установлен рак, или которая является доброкачественной). Рассматривают разные типы исследований для определения такого уровня экспрессии и включают иммуногистохимию, флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH) и анализ антигенов культуральной жидкости, блоттинг по Саузерну или методы ПЦР.
[0078] Согласно другому варианту реализации указанный диагностический анти-PSMA конъюгат можно применять в качестве средства визуализации in vivo для визуализации клеток-мишеней в пределах топографии организма субъекта. В соответствии со способом, описываемом в настоящей заявке, определение наличия у субъекта рака, ассоциированного с экспрессией PSMA, проводят путем визуализации меченных мини-антител или CysDB, при которой визуализированные меченные мини-антитела или CysDB локализованы в очаге опухоли. Помимо диагностики рака, ассоциированного с экспрессией PSMA, указанное мини-антитело против PSMA можно применять для определения стадии и мониторинга прогрессии рака в соответствии со способом, который сходен с описанным выше.
[0079] Подходящие способы визуализации in vivo, которые можно применять в соответствии со способами, описываемыми в настоящей заявке, включают, ядерный магнитный резонанс (ЯМР), позитронно-эмиссионную томографию (ПЭТ) или микро-ПЭТ, компьютерную томографию (КТ), комбинированную визуализацию ПЭТ/КТ, охлажденную полупроводниковую светочувствительную матрицу (ПЗС),регистрацию оптических эффектов с помощью камеры, оптическую визуализацию (например, биолюминесцентная оптическая визуализация, флуоресцентная оптическая визуализация или поглощение либо отражение) и однофотонную эмиссионную компьютерную томографию (SPECT), но не ограничиваясь ими.
124
64
89
111
[0080] Как описано в примерах далее, мини-антитело или CysDB, описываемые в настоящей заявке, меченные соответствующим радиоизотопом (например, выделение аномальной части I, Cu-DOTA или Zr-DOTA) можно применять в качестве клинического визуализирующего агента, направленного на PSMA in vivo в соответствии со способами, описываемыми в настоящей заявке. Указанные мини-антитела и CysDB J591 также можно разработать в качестве потенциального визуализирующего агента для однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (SPECT) в соответствии с вариантами реализации, описываемыми в настоящей заявке. Указанное мини-антитело J591 можно применять в качестве визуализирующего агента для SPECT путем изменения радиоактивной метки, например, In-DOTA-J591.
1/2
1/2
[0081] Указанные мини-антитела J591, описываемые в настоящее заявке, прошли оценку в отношении направленной доставки к опухоли в ходе ПЭТ у мелких животных (микро-ПЭТ) и исследования биораспределения после радиоактивного мечения излучателями позитронов I-124 (t=4,2д) и Cu-64 (t=12,7ч) в целях сравнения ассоциированной с клетками радиоактивности in vivo.
124
64
64
124
64
124
64
124
64
124
[0082] И I и Cu-DOTA-меченные мини-антитела J591 быстро достигали опухоли CWR22rv1 с высоким уровнем захвата и с высокой специфичностью. Серийная визуализация мышей-носителей PSMA-позитивной опухоли CWR22rv1 и негативных ксенотрансплантатов РС-3 привела к получению высококонтрастных изображений и продемонстрировала превосходный захват опухолью антител с обеими метками. Через 19 часов после инъекции 8,2(±1,2) %ID/г и 8,8(±2,0) %ID/г достигались при введении Cu-DOTA- и I-меченных мини-антител J591, соответственно. Через 43 часа после инъекции (п.и.) захват опухолью увеличивался до 13,3(±8,3) %ID/г в случае Cu-DOTA-меченных мини-антител J591, и снижался до 3,25(±0,9) %ID/г в случае I-меченных мини-антител J591. Соотношение позитивной и негативной опухоли было 3,1 и 4,9 через 19 часов и 5,4 и 7,3 через 43 часа для Cu-DOTA- и I-меченных мини-антител J591, соответственно. Устойчиво высокий уровень захвата печенью [21,4(±3,1) %ID/г через 19 ч и 14,4(±2,1) %ID/г через 43 ч] наблюдался для мини-антител J591, меченных Cu-DOTA, а I-меченные мини-антитела J591 проявляли быстрое фоновое выведение, что приводило к получению более контрастных изображений. Неожиданным результатом оказалось то, что захват опухолями обеих меченных мини-антитела был близким через 19 часов, что могло бы указывать на более медленную интернализацию in vivo. Таким образом, мини-антитела J591, меченные радиоактивным I-124, являются эффективным индикаторным агентом для выявления PSMA-позитивных клеток.
Способы лечения рака
[0083] Согласно некоторым вариантам реализации предложены способы лечения рака или других патологических состояний, ассоциированных с гиперэкспрессией PSMA. Такие способы включают введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей антитело против PSMA, или функциональный фрагмент антитела против PSMA, как описано выше. Согласно одному варианту реализации антитело против PSMA или функциональный фрагмент антитела против PSMA представляет собой мини-антитело или CysDB, полученные из антитела J591, такие как мини-антитело J591 или CysDBs J591, описываемые в настоящей заявке.
[0084] Термин «лечение» или «борьба» с определенным патологическим состоянием относится к профилактике патологического состояния, замедлению начала патологического состояния, снижению риска развития патологического состояния, предотвращению или отсрочиванию развития симптомов, ассоциированных с патологическим состоянием, сокращению или прекращению симптомов, ассоциированных с патологическим состоянием, генерированию полной или частичной регрессии патологического состояния или какому-либо их сочетанию.
st
[0085] «Терапевтически эффективное количество» или «терапевтически эффективная доза» - это количество соединения, которое вызывает желаемое терапевтическое действие на субъекта, такое как профилактика или лечение целевого патологического состояния или облегчение симптомов, ассоциированных с указанным патологическим состоянием. Точное терапевтически эффективное количество представляет собой количество соединения, которое будет приводить к наиболее эффективным результатам с точки зрения эффективности лечения у данного субъекта. Указанное количество может варьировать в зависимости от множества факторов, включая характеристики терапевтического соединения (включая активность, фармакокинетику, фармакодинамику и биодоступность), физиологическое состояние указанного субъекта (включая возраст, пол, тип и стадию заболевания, общее физическое состояние, чувствительность к данной дозе и типу лекарственного препарата), природу фармацевтически приемлемой основы или основ в лекарственной форме, и путь введения, но ограничиваясь ими. Специалист в области клинической практики и фармакологии способен определить терапевтически эффективное количество на основании повседневного опыта, а именно на основании мониторинга реакции субъекта на введение соединения и соответствующей корректировки дозы. Дополнительные рекомендации можно найти в Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21Edition, Univ. of Sciences in Philadelphia (USIP), Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2005.
[0086] Согласно одному варианту реализации указная фармацевтическая композиция может включать терапевтический анти-PSMA конъюгат, причем указанный конъюгат включает антитело против PSMA или функциональный фрагмент антитела против PSMA с одним или более терапевтическими агентами, описанными выше. Согласно одному варианту реализации указанное антитело против PSMA или функциональный фрагмент антитела против PSMA представляет собой мини-антитело или CysDB, полученное из антитела J591, такие как мини-антитело J591 или CysDBs J591, описываемые в настоящей заявке. Например, мини-антитела или цис-диатела J591, описываемые в настоящей заявке, можно применять при способе радиоиммунотерапии, при котором одно или более мини-антител 3В J591 содержат бета-излучающую радиоактивную метку, такую как Иттрий 90. Мини-антитело или мини-антитела 3В J591 с радиоактивной меткой можно применять, чтобы добиться повреждения и гибели клеток в очаге раковой ткани, которая экспрессирует PSMA. Также применение мини-антител и цис-диател J591 с радиоактивной меткой должно, вероятно, характеризоваться улучшенным проникновением в опухоль по сравнению с радиоактивно меченным полноразмерным исходным антителом huJ591.
[0087] Указанный терапевтический анти-PSMA конъюгат можно конъюгировать или соединять с одним или более дополнительными веществами, описываемыми в настоящей заявке, такими как диагностические анти-PSMA конъюгаты (описаны выше), неконъюгированные диагностические агенты, контрастные растворы, липиды-переносчики или наночастицы.
[0088] Согласно некоторым вариантам реализации указанная фармацевтическая композиция также может включать фармацевтически приемлемую основу. Фармацевтически приемлемой основой может быть фармацевтически приемлемый материал, композиция или растворитель, которые участвуют в переносе или транспортировке рассматриваемого соединения из одной ткани, органа или части организма в другую ткань, орган или часть организма. Например, основой может быть жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, вспомогательное вещество, растворитель или инкапсулированный материал, или определенное их сочетание. Каждый компонент основы должен быть «фармацевтически приемлемым» в том смысле, что он должен быть совместим с другими ингредиентами лекарственной формы. Также он должен подходить для контакта с тканью, органом или частью организма, с которой он может контактировать, в том смысле, что он не должен представлять риска токсичности, раздражения, аллергической реакции, иммуногенности или других осложнений, которые бы значительно превышали его терапевтическую пользу.
[0089] Фармацевтические композиции, описываемые в настоящей заявке, можно вводить подходящим путем. Термин «путь введения» может относиться к любому способу введения, известному в технике, включая аэрозольный, энтеральный, назальный, глазной, офтальмологический, пероральный, парентеральный, ректальный, чрескожный (например, местный крем или мазь, пластырь) или вагинальный путь введения, но не ограничиваясь ими. «Чрескожного» введения можно достигнуть посредством применения местного крема или мази, или посредством трансдермального пластыря. «Парентеральный» означает путь введения, который обычно связан с инъекцией, включая подглазничные инъекции, инфузии, внутриартериальные, внутрикапсульные, внутрикожные, внутримышечные, внутрибрюшинные, внутрилегочные, внутриспинальные, интрастернальные, подоболочечные, внутриматочные, внутривенные, субарахноидальные, подкапсулярные, подкожные, чрезслизистые или транстрахеальные инъекции.
[0090] Следующие примеры приведены с целью иллюстрирования разных вариантов реализации настоящего изобретения. Сами по себе специфические обсуждаемые варианты реализации не должны ограничивать область изобретения. Для специалиста в данной области техники должно быть очевидно, что разные эквиваленты, замены и модификации можно выполнить, не выходя за рамки изобретения, и должно быть понятно, что такие эквивалентные варианты реализации должны быть включены в настоящую заявку. Также все справочные материалы, цитируемые в настоящем раскрытии, тем самым включены в своей полноте посредством ссылки, как если бы они были включены полностью.
Пример 1: Генерирование мини-антител J591
[0091] Конструкция мини-антитела J591. Третье поколение мини-антител J591 представляет собой сконструированные фрагменты антитела, которые включают в себя модифицированные вариабельные области полноразмерного исходного антитела huJ591. Формат мини-антитела представляет собой гомодимер, в котором каждый мономер представляет собой вариабельный фрагмент из одной цепи (scFv), связанный с доменом СН3 IgG1 человека (Фигура 1А). scFv может быть в VHVL или в VLVH ориентации. Как показано на Фигуре 1В, конструкция экспрессии мини-антитела J591 для scFv в ориентации VHVL, содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), который соединен с вариабельной областью легкой цепи (VL) через линкерную последовательность (L) из 18 аминокислот. В ориентации VLVH может быть переключение между VL и VH на Фигуре 1В, такое, что область VL оказывается против направления транскрипции от домена VH.
[0092] Для применения в исследованиях экспрессии были синтезированы четыре последовательности мини-антитела J591, которые описаны ниже:
Последовательности мини-антител было сконструированы следующим образом:
1) Составное человеческое антитело (НС) J591 с ориентацией VHVL (J591 НС VHVL; SEQ ID №:1);
2) Составное человеческое антитело (НС) J591 с ориентацией VLVH (J591 НС VLVH);
3) J591 с 2 заменами пролина (2Р) с ориентацией VHLV (J591 2Р VHVL; SEQ ID №:2); и
4) J591 с 2 заменами пролина (2Р) с ориентацией VLVH (J591 2Р VLVH).
[0093] На Фигуре 3 представлена последовательность СН VHVL мини-антитела J591 2Р (SEQ ID №:1), а на Фигуре 4 представлена последовательность VHVL мини-антитела J591 2Р (SEQ ID №:2). Линкер (L) из 18 аминокислот обладает специфической последовательностью, богатой остатками глицина и серина (см. Фигуру 1, последовательность на Фигуре 3 и 4). scFv связан с доменом СН3 IgG1 человека посредством искусственной шарнирной последовательности, в которой первые 15 остатков представляет собой остатки шарнирной области lgG1 человека, после которых идет линкерная GlySer последовательность из 10 аминокислот (см. Фигуру 1, последовательность на Фигуре 3 и 4). Данная специфическая шарнирная последовательность также была успешно включена в предыдущие мини-антитела. Указанное мини-антитело в ориентации либо VH-VL-CH3, либо VL-VH-CH3) существует в виде стабильного димера благодаря связи между доменами СНЗ, а также образованию дисульфидных связей в указанных шарнирных областях. Чтобы была возможна секреция указанного мини-антитела, конструкцию экспрессии и присоединенный на N-конце вариабельный домен тяжелой цепи направляет сигнальная последовательность легкой цепи каппа (см. Фигуру 1В, последовательность на Фигуре 3 и 4).
[0094] Набор мини-антител J591 конструировали путем проведения замен аминокислот в доменах легкой и тяжелой цепи в исходном huJ591. Анализ последовательности вариабельных областей полноразмерного исходного huJ591 позволил выявить необычно высокое количество конформационно ограниченных остатков пролина, которые, как известно, снижают гибкость структуры белка. Сравнение выравнивания последовательностей между деиммунизированным J591 (SEQ ID №:5; SEQ ID №:19) и исходным J591 мыши (SEQ ID №:4; SEQ ID №:18) показало, что процесс деиммунизации состоял во введении дополнительных остатков пролина (см. Фигуру 2). После анализа, основанного на моделировании последовательности и белка, в белок внесли два изменения с целью повышения гибкости и способности к скручиванию. Во-первых, два остатка пролина в вариабельном домене легкой цепи (P42Q и Р100А) заменили на остатки, обнаруживаемые в последовательности мыши (см. Фигуру 2, здесь обозначены как 2Р). Во-вторых, был выполнен расчет замен для обеих вариабельных областей с применением технологии составного человеческого (НС) антитела, которая позволяет деиммунизировать последовательность путем устранения потенциальных эпитопов вместо разрушения эпитопов (см. Фигуру 2, здесь обозначены как НС).
[0095] Экспрессия мини-антитела J591. Были сгенерированы векторы экспрессии для последовательностей каждого четырех мини-антител, описанных выше. Последовательность каждого четырех мини-антител клонировали в вектор для экспрессии у млекопитающих pcDNA3.1/myc-His (-) Версия А (Компания «Invitrogen, Inc.») в соответствующих сайтах XbaI/HindIII. Вектор экспрессии pcDNA3.1 отличается тем, что он содержит CMV промотор для экспрессии селектируемых маркеров как для млекопитающих (Неомицин), так и для бактерий (Ампициллин) (см. Фигуру 10). Вектора экспрессии четырех мини-антител J591 временно трансфецировали в клетки СНО-K1 для подтверждения экспрессии мини-антител J591. Трансфекцию проводили с применением реагента липофектамина в формате планшета на 6 лунок. Через 72 часа после трансфекции отбирали надосадочную жидкость и фильтровали ее для удаления любых клеток.
[0096] Для подтверждения экспрессии мини-антител J591 клетками СНО-K1 проводили вестерн-блоттинг с применением пробы надосадочной жидкости, отобранной после временной трансфекции. В качестве отрицательного контроля включали надосадочную жидкость из культуры клеток, трансфецированных пустым вектором, а в качестве положительного контроля применяли надосадочную жидкость из культуры клеток, трансфецированных другим мини-антителом. Надосадочную жидкость из культур клеток, подвергнутых трасфекции подвергали SDS-PAGE и переносили на мембрану из поливинилиденфторида (ПВДФ). Указанную мембрану анализировали с применением антитела против IgG1 человека (Fc-специфичного), конъюгированного со щелочной фосфатазой (ЩФ) и обрабатывали путем инкубации с субстратом ЩФ - BCIP/NBT. На фигуре 11 приведен репрезентативный результат блоттинга из нескольких экспериментов, которые подтвердили экспрессию мини-антитела J591. При невосстановительных условиях мини-антитела J591 демонстрировали ожидаемую молекулярную массу приблизительно 90 кДа (Фигура 11). Малая полоса, соответствующая мономерной форме, также определялась на молекулярной массе приблизительно 40 кДа.
[0097] В целях оценки экспрессии мини-антител J591 в культуре после временной трансфекции проводили количественный анализ ELISA. ELISA представляет собой сэндвич-анализ, который основан на применении антитела овцы против IgG человека (Fc-специфичные) в качестве иммобилизованного антитела и ЩФ-конъюгированное антитело овцы против IgG человека (Fc-специфичное) в качестве детекторного антитела. В качестве стандарта применяли очищенный белок для ранее выработанного мини-антитела. Надосадочную жидкость с мини-антителом J591 последовательно разводили, чтобы определить такие разведения, при которых стандартная кривая находится в линейном диапазоне. Для интерполяции концентрации неизвестных проб по стандартной кривой применяли программу SoftMax Pro.
[0098] Оценивали пробы надосадочной жидкости из культур после разных трансфекции, и средние значения приведены на Фигуре 25. Из трех генераций мини-антител максимальную экспрессию демонстрировало мини-антитело J591 НС VHVL (6,7 мкг/мл).
[0099] Связывающая способность мини-антител J591. Чтобы подтвердить связывающую способность мини-антител J591 в отношении связывания клеточного PSMA, надосадочную жидкость культур после трансфекции, описываемых выше, анализировали посредством проточной цитометрии. Как проиллюстрировано на Фигурах 12A-12D, надосадочная жидкость из культур после трансфекции для каждого из мини-антител J591 тестировали в отношении связывания клеток LNCaP, которые PSMA-позитивны (PSMA+)(2), и сравнивали с клетками - отрицательным контролем, которые PSMA-негативны. Значения для всех проб надосадочной жидкости нормировали на концентрацию мини-антитела J591 2,1 мкг/мл. Далее клетки окрашивали вторичными антителами против IgG человека (Fc-специфичным), конъюгированным со ЩФ. Клетки отрицательного контроля окрашивали только вторично (1), 1×105 клеток/точку и проводили анализ при 10000 событий/точку.
[00100] Каждая из популяций клеток, окрашенная по мини-антителам J591, демонстрировала значительное превышение сигнала по сравнению с клетками отрицательного контроля (см. Фигуру 12). Окрашивание надосадочной жидкости на мини-антитела J591 не давало значительного результата в отрицательном контроле клеток РС3 (PSMA-негативных) (данные не показаны). Все четыре мини-антитела проявляли сопоставимую связывающую активность в отношении связывания LNCaP-клеток (см. Фигуру 12).
Пример 2: Получение стабильной линии клеток
[00101] На основании данных об экспрессии и связывающей активности в качестве основного кандидата на перенос в более крупный масштаб получения белка (~ несколько миллиграмм) для последующих исследований визуализации in vivo, описываемых ниже, было отобрано человеческое составное VHVL (НС VHVL) мини-антитело J591. Хотя примеры, описываемые ниже, относятся специфически к мини-антителу J591 НС VHVL, следует отметить, что в ходе аналогичных исследований можно очищать любое из мини-антител или цис-диател J591.
[00102] Указанное мини-антитело J591 НС VHVL стабильно траснфецировалось в клетки СНО-K1 с применением неомицина в качестве селектируемого маркера. После селекции по отбору клонов с высоким уровнем селекции был выбран клон, экспрессирующий мини-антитело J591 в концентрации приблизительно 36 мг/л (в течение 4 дней культивирования).
[00103] Процесс получения белка. Для получения финального очищенного белка в количестве по меньшей мере 10 мг, стабильную линию клеток увеличили для производственного цикла в объеме 400 мл (в среде 2% ФСБ). Клетки засевали в восемь флаконов Т175, и производственный цикл длился 7 дней.
[00104] Очистка белка. В конце производственного цикла надосадочную жидкость отбирали, центрифугировали в целях удаления всех возможных клеток и фильтровали на фильтровальной установке с диаметром пор 0,2 мкм. Мини-антитело J591 выделяли в очищенном виде из надосадочной жидкости при помощи аффинной хроматографии с L-белком. После загрузки колонку промывали ФСБ (рН=7,2), и указанное мини-антитело элюировали при помощи элюирующего буфера для IgG (Pierce, Thermo Scientific). Элюируемые фракции сразу же нейтрализовывали с применением 1М трио-буфера (рН=8). Конечные элюируемые фракции концентрировали, и в конечной смеси заменяли буфер на ФСБ (рН=7,2).
[00105] Анализ очищенного белка. После очистки конечную концентрацию мини-антитела J591 рассчитывали на основании поглощения в УФ области при 280А. Коэффициент поглощения составил 1,76 (единиц поглощения при А280 на мг/мл). Конечная концентрация белка составила 1,06 мг/мл.
[00106] Для анализа чистоты мини-антитела J591 указанный белок подвергали процедуре SDS-PAGE при невосстановительных и восстановительных условиях. При невосстановительных условиях указанное мини-антитело определялось на молекулярной массе приблизительно 85 кДа (Фигура 13).
Относительно малое пятно присутствовало раньше полосы 85 кДа, что могло соответствовать мономеру мини-антитела. При восстановительных условиях указанное мини-антитело определялось в мономерной форме около 40 кДа (Фигура 13).
[00107] Для оценки чистоты объединенного комплекса мини-антитела указанный белок анализировали посредством эксклюзионной хроматографии. 4 микрограмма очищенного белка анализировали посредством ЭХ (Фигура 14). Основной пик, который элюировал в ранние моменты времени, соответствует более крупным агрегатам белка. Анализ площади пиков показал, что 85% белкового продукта существует в форме нужного гомодимера мини-антитела, а 15% - в форме агрегата.
Пример 3: Мини-антитела J591 связываются с клетками PSMA+ и нейтрализуются ими
[00108] Стабильные популяции клеток с высоким уровнем экспрессии были сгенерированы при помощи собственной технологии GPEx Каталента с применением трансдукции клеток CHO-S в бессывороточной среде лентивирусом. Посредством обменной хроматографии мини-антитело J591 очищали из надосадочной жидкости культуры клеток с достаточно высокой чистотой для последующих экспериментов. Такую высокую чистоту продукта подтверждали при помощи SDS-PAGE и ЭХ (чистота >85%). Очищенный белок не содержал никакой значительной микрофлоры (0 КОЕ/мл), и содержал относительно низкий уровень эндотоксинов (от 8 до 16 ЕД/мг). Общий выход указанного производственного цикла составлял 65 мг белка мини-антитела J 591.
[00109] Функциональный анализ ELISA. Для подтверждения способности мини-антитела J591 к связыванию очищенного PSMA, проводили непрямой ELISA с применением очищенного рекомбинантного PSMA. В эксперимент включали мини-антитело для отрицательного контроля. При начальной концентрации 2 мкг/мл мини-антитело J591 связывало рекомбинантный PSMA при насыщении (см. Фигуру 15). Последующие серийные разведения мини-антитела J591 показали, что существует зависимость связывания от концентрации (см. фигуру 15). Как и ожидалось, мини-антитело - отрицательный контроль не связывало PSMA (см. Фигуру 15).
[00110] Проточная цитометрия. После удачного связывания с рекомбинантным PSMA при анализе ELISA, белок мини-антитела J591 тестировали на способность связывать клетки PSMA+ посредством проточной цитометрии. В эксперимент включали полноразмерное антитело hJ591 в качестве положительного контроля (данные не показаны), и мини-антитело в качестве отрицательного контроля. В данном эксперименте в качестве клеток PSMA+ брали клетки LNCaP и CWR22rv1, а в качестве PSMA-клеток брали РС3. мини-антитело j591 явно связывало и клетки LNCaP (см. Фигуру 16А), и клетки CWR22rv1 (см. Фигуру 16С) в сравнении с эквивалентной концентрацией мини-антитела - отрицательного контроля. Известно, что клетки LNCaP обладают более высокой экспрессией PSMA, чем клетки CWR, что могло бы объяснить более сильный ПЭ сигнал указанной популяции клеток (см. Фигуру 16, сравнить верхний и нижний ряд). Как и ожидалось, мини-антитело J591 не связывало значительно клетки РС3 (данные не показаны).
[00111] Перед описанным анализом методом проточной цитометрии белок мини-антитела J591 конъюгировали с бифункциональным хелатором - 1,4,7,10-тетраазациклододекан-N,N’,N”,N”’-тетрауксусной кислотой (DOTA) в ходе подготовки к последующему мечению радиоактивными металлами. Конъюгацию проводили посредством способа с водорастворимым N-гидроксисукцинимидом (Lewis et al 2001). После конъюгации с DOTA конъюгат белка диализировали, чтобы заменить буфер и удалить избыток DOTA.
[00112] Чтобы проверить наличие связывающей активности после конъюгации мини-антитело J591-DOTA тестировали с оценкой связывания с PSMA методом проточной цитометрии. По сравнению с неконъюгированным мини-антителом J591, мини-антитело J591-DOTA демонстрировало небольшое снижение иммунореактивности, что выявлялось по небольшому сдвигу сигнала ПЭ популяции клеток (см. Фигуру 16В и 16D). Известно, что избыточная конъюгация бифункционального хелатора с мини-антителами вызывает снижение иммунореактивности (Kukis et al 1995). Условия конъюгации можно оптимизировать так, чтобы избежать избыточной конъюгации и дальнейшей потери связывания. Однако небольшой сдвиг связывания для мини-антитела J591-DOTA сочли приемлемым, и указанный белок отправили на присоединение радиоактивной метки.
[00113] Интернализация немеченого мини-антитела. Интернализацию мини-антитела j591 в клетки PSMA+ оценивали посредством иммунофлуоресцентной конфокальной микроскопии. Применяемые в данном эксперименте две линии клеток - LNCaP и CWR22rv1 - ранее применялись в исследованиях связывания с клетками, а также они служили для последующего исследования интернализации радиоактивной метки. В качестве отрицательного контроля PSMA- применяли клетки РС3. В качестве положительного контроля в эксперимент включали полноразмерное исходное антитело J591. Мини-антитело, служащее отрицательным контролем, также включали, чтобы в дальнейшем продемонстрировать специфичность захвата мини-антитела J591 клетками PSMA+.
[00114] Поскольку предыдущие исследование интернализации с исходным полноразмерным антителом J591 в клетках LNCaP продемонстрировали выраженную интернализацию через 180 минут (Liu et al 1998), для измерения интернализации клетки окрашивали в момент времени t=0 и t=180 минут после инкубации с первичным антителом. Локализацию антитела и мини-антитела определяли при помощи вторичного антитела против JgG человека, конъюгированного с флюорофором Alexa 488. Клетки докрашивали DAPI, чтобы окрасилось ядро.
[00115] Полноразмерное антитело J591 демонстрировало очень резкое и отчетливое окрашивание плазматической мембраны в момент времени t=0 (см. Фигуру 17). После инкубации в течение 180 минут при 37С полноразмерное антитело J591 интернализовалось в клетки LNCaP, на что указывала дисперсия окрашивания Alexa 488 по всей клетке. Мини-антитело J591 также демонстрировало отчетливое окрашивание плазматической мембраны в момент времени t=0 и сильную интернализацию в момент времени t=180 минут (Фигура 17). Окрашивание мини-антитела J591 в момент времени t=0 было значительно менее отчетливым, чем полноразмерного антитела J591, что вероятно, указывает на более быструю интернализацию в клетки LNCaP мини-антитела с меньшим размером. Антитело - отрицательный контроль не могло связаться с клетками LNCaP в момент времени t=0. Полноразмерное антитело J591 и мини-антитело J591 не могли связаться с клетками PSMA- РС3 (данные не показаны).
[00116] Интернализация полноразмерного антитела J591 в клетки CWR22rv1 приводило к характеру окрашивания, очень похожему на окрашивание для клеток LNCaP. Окрашивание было очень резким и отчетливым на плазматической мембране в момент времени t=0 и становилось очень размытым в момент времени t=180 минут (см. Фигуру 18). Мини-антитело J591 также интернализовалось в клетки CWR22rv1. В момент времени t=0 окрашивание отчетливо локализовалось на плазматической мембране и становилось более размытым к t=180 минут (Фигура 18). Как и ожидалось, мини-антитело-отрицательный контроль не связывалось с клетками CWR22rv1 (Фигура 18).
Пример 4: PSMA-специфичные мини-антитела с радиоактивной меткой
131
131
131
[00117] Мини-антитела с радиоактивной меткой йод-131. К очищенному белку мини-антитела J591 (50 мкг) присоединяли радиоактивную метку I с радиоактивностью приблизительно 50 мкКюри с применением метода йодирования от компании «Pierce Thermo Scientific» (как описано у Olafsen et al 2006). Указанный реагент способствует химической реакции окисления, при которой I присоединяется к доступным остаткам тирозина в мини-антителе J591. В Таблице 2 обобщены результаты присоединения радиоактивной метки к мини-антителу J591, включая эффективность радиоактивного мечения, процент связанной радиоактивности после очистки и специфическую активность. Эффективность радиоактивного мечения определяли при помощи моментальной тонкослойной хроматографии (МТСХ), позволяющей измерить процент радиоактивности, связанной с белком относительно несвязанной радиоактивности, и он составил приблизительно 51% (см. Таблицу 2 ниже). Специфическую активность определяли путем измерения общей активности радиоактивно меченного белка с помощью дозкалибратора и расчета специфической активности на основании эффективности мечения; специфическая активность составила 0,46 мкКюри/мкг (Таблица 2). В целях удаления несвязанного I радиоактивно меченный белок подвергали дальнейшей очистке с помощью центрифужных колонок. Процент радиоактивности, связанной с мини-антителом J591 после очистки, значительно снижался до приблизительно 96% после очистки (Таблица 2).
111
111
111
131
[00118] Конъювироеание с J591 DOTA и присоединение метки из радиоактивного металла Индия-111. К мини-антителу J591, предварительно конъюгированному с бифункциональным хелатором ионов металлов DOTA, присоединяли радиоактивную метку In. 100 мкг мини-антитела J591-DOTA инкубировали с 20 мкКюри In-хлорида в 0,1 М не содержащем металлов ацетате аммония (рН 6,0) при 43С в течение 50 минут. Указанную реакцию останавливали путем добавления 10 мМ DTPA до конечной концентрации 1 мМ. Определяемая эффективность радиоактивного мечения составила приблизительно 60%, а специфическая активность составила 1,1 мкКюри/мкг (см. Таблицу 2). Такой белок с радиоактивной меткой подвергали дополнительной очистке с целью удаления избытка несвязанного In при помощи центрифужных колонок. Аналогично мини-антителу I-J591 процент радиоактивности, связанной с мини-антителом J591 после очистки значительно снижался до приблизительно 94% (Таблица 2).
Таблица 2.
Присоединение радиоактивной метки с <sup>131</sup>I и <sup>111</sup>In к мини-антителу J591.
Эффективность радиоактивного мечения (%)
% связанной радиоактивности после очистки
Специфическая активность (мкКюри/мкг)
<sup>131</sup>I и
51%
96,2%
0,46
<sup>111</sup>In-DOTA
60%
94,2%
1,1
131
111
[00119] Интернализация и удерживание мини-антитела J591 с радиоактивной меткой. Мини-антитело J591, меченное I и In-DOTA тестировали, чтобы оценить захват и удерживание ассоциированной с клетками радиоактивности в PSMA+ клетках CWR22rv1. Клетки CWR22rv1 были выбраны как единственные PSMA+ клетки для данного типа экспериментов in vitro, поскольку их можно было применить для эксперимента с микроПЭТ визуализацией. На основании данных, найденных в литературе и экспериментального опыта коллег модель с ксенотрансплантатом CWR22rv1 демонстрирует более высокий процент образования опухолей, более быстрый рост опухоли in vitro, чем модель LNCaP.
131
131
131
[00120] При захвате и удерживании I-меченного мини-антитела J591 количество радиоактивности, ассоциированной с мембраной, быстро уменьшалось в первые 30 минут, а интернализованная радиоактивность быстро нарастала на данном отрезке времени (см. Фигуру 19А). В совокупности эти данные указывают на интернализацию I-меченного мини-антитела J591. Хотя количество интернализованного I J591 со временем увеличивается, полная ассоциированная с клетками радиоактивность в течение 180 минут существенно уменьшалась относительно начального значения ~2900 импульсов/минуту (см. Фигуру 19А).
111
131
[00121] Резкие отличия продемонстрировал захват и удержание In-DOTA-меченного мини-антитела: имело место относительно большое увеличение полной ассоциированной с клетками радиоактивности со временем (см. Фигуру 19В). Аналогично I-меченному мини-антителу J591 ассоциированная с мембраной радиоактивность существенно снижалась по мере того, как интернализованная радиоактивность увеличивалась, что указывает на активную интернализацию (см. Фигуру 19В). Обусловленная по большей части увеличением интернализованной радиоактивности со временем полная ассоциированная с клетками радиоактивность повышалась приблизительно до 20000 импульсов/минуту к 180 минуте с начального значения ~7500 импульсов/минуту (см. Фигуру 19В).
111
131
131
111
[00122] В целях сравнения двух радиоактивно меченных мини-антител J591 полную ассоциированную с клетками радиоактивность нормировали, выражая данные в процентах от начальной ассоциированной с клетками радиоактивности для каждой соответствующей радиоактивной метки в момент времени t=0 (см. Фигуру 20). В момент времени t=180 минут In-DOTA-меченное мини-антитело j591 демонстрировало увеличение ~250% по сравнению с начальной ассоциированной с клетками радиоактивностью, а I-меченное мини-антитело J591 демонстрировало снижение ~80% по сравнению с начальным значением (Фигура 20). Как показано другими группами в источниках литературы (Vaidyanathan et al 2009), не-разделяющая стратегия мечения I приводила к общему снижению ассоциированной с клетками радиоактивности со временем. Эти данные явно указывает на удерживание и аккумуляцию ассоциированной с клетками радиоактивности во времени для разделения радиоактивной метки In-DOTA.
[00123] Очищенное мини-антитело J591 НС VHVL (или любое из мини-антител, описываемых выше) можно использовать, чтобы продемонстрировать способность к направленной доставке к PSMA человека in vivo при визуализации методом микроПЭТ и в исследованиях биораспределения. Согласно одному варианту реализации очищенный белок мини-антитела J591 НС VHVL сначала можно подвергнуть повторной проверке, чтобы подтвердить способность к связыванию PSMA in vitro при подготовке визуализирующих исследований. В случае подтверждения связывания мини-антитело J591 НС VHVL можно затем конъюгировать с бифункциональным хелатором DOTA и радиоактивной меткой, содержащей соответствующий позитрон-излучающий металл для микроПЭТ, например, медь-64. Перед проведением визуализации методом микроПЭТ можно провести анализ мини-антитела с радиоактивной меткой, чтобы убедиться в высокой эффективности радиоактивного мечения и иммунореактивности.
[00124] Согласно некоторым вариантам реализации мини-антитело с радиоактивной меткой можно вводить внутривенно мышам с ксенотрансплантатом, которым имплантировали PSMA-позитивные или PSMA-негативные опухоли. В заранее определенные моменты времени после инъекции можно провести серийное сканирование каждого животного посредством ПЭТ. После конечного сканирования животных можно провести КТ для анатомического контроля. Изображения, полученные при ПЭТ и КТ для каждого животного можно затем анализировать, оценивая направленную доставку к опухоли и специфичность.
124
64
Пример 5: Связывание и биораспределение in vivo I-J591 and Cu-DOTA-конъюгированных мини-антител J59
124
124
124
124
124
[00125] Присоединение радиоактивной метки йода-124 к мини-антителу J591. К очищенному белку мини-антитела J591 (общее количество 300 мкг) присоединяли метку I с радиоактивностью приблизительно 1,3 мкКюри с применением метода йодирования от компании «Pierce Thermo Scientific» (как описано у Olafsen et al 2006). Указанный способ основан на химической реакции окисления, при которой I присоединяется к доступным остаткам тирозина в мини-антителе J591. В Таблице 3, ниже, обобщены результаты присоединения радиоактивной метки к мини-антителу J591, включая эффективность радиоактивного мечения, процент связанной радиоактивности после очистки, специфическую активность и иммунореактивность. После реакции присоединения метки эффективность радиоактивного мечения определяли при помощи моментальной тонкослойной хроматографии (МТСХ), позволяющей измерить процент радиоактивности, связанной с белком относительно несвязанной радиоактивности, и он составил приблизительно 51% (процент радиоактивности, связанной с белком относительно несвязанной радиоактивности) (см. Таблицу 3). Мини-антитело J591 с радиоактивной меткой подвергали частичной очистке на центрифужных колонках с сефадексом G-25 и проводили повторную оценку методом МТСХ, определяя процент связанной радиоактивности. Специфическая активность белка с радиоактивной меткой составила 2,6 мкКюри/мкг (Таблица 3), которая была определена путем измерения общей радиоактивности белка с применением дозкалибратора. В целях удаления несвязанного I радиоактивно меченный белок подвергали дальнейшей очистке с помощью центрифужных колонок. Процент радиоактивности, связанной с мини-антителом J591 после очистки, значительно снижался до приблизительно 98% после очистки (Таблица 3). Иммунореактивность мини-антитела I-J591 составила 48%, что было определено при оценке связывания с клетками CWR22rv1 в сравнении с РС3 (Таблица 3). Хотя указанная Иммунореактивность была ниже, чем ожидалось, было принято решение направить мини-антитело I-J591 на эксперименты с визуализацией и оценкой биораспределения на основании предшествующего поведения указанного мини-антитела в отношении связывания. Иммунореактивность можно было бы повысить путем дальнейшей оптимизации условий радиоактивного мечения (рН, время, температура и др.) и достижения более высокой чистоты белка.
Таблица 3.
Присоединение радиоактивной метки с <sup>124</sup>I и <sup>64</sup>Cu к мини-антителу J591.
Условия присоединения радиоактивной метки
Эффективность радиоактивного мечения (%)
% связанной радиоактивности после очистки
Специфическая активность (мкКюри/мкг)
Иммунореактивность (%)
<sup>124</sup>I
Белок в ФСБ
62%
98,0%
2,6
48%
<sup>64</sup>Cu-DOTA
Белок в ФСБ
40%
85%
1*
29%*
<sup>64</sup>Cu-DOTA
AmmOAc, повышенный Аммонийно-цитраный буфер
92%
85%
1*
29%*
* - фракции, полученные при обоих условиях радиоактивного мечения, были объединены
64
64
2-
[00126] Присоединение к мини-антителу DOTA-J591 метки из меди-64. К мини-антителу J591, предварительно конъюгированному с бифункциональным хелатором ионов металлов DOTA, присоединяли радиоактивную метку Cu. В качестве исходных условий присоединения радиоактивной метки 400 мкг мини-антитела J591-DOTA в ФСБ инкубировали приблизительно с 745 мкКюри CuCl в 0,1 М не содержащем металлов цитрате аммония (рН 5,2) при 43С в течение 60 минут. Указанную реакцию останавливали путем добавления 10 мМ EDTA до конечной концентрации 1 мМ. В случае применения указанных условий радиоактивного мечения определяемая эффективность радиоактивного мечения оказывалась ниже, чем ожидалось - приблизительно 40% (см. Таблицу 3).
64
2
[00127] В попытке повысить эффективность мечения мини-антитело DOTA-J591 сначала диализировали в буфер из 0,25 цитрата аммония [рН 7.2] до начала реакции присоединения радиоактивной метки. Еще 560 мкг мини-антитела в буфере на основе ацетата аммония метили приблизительно CuCl с радиоактивностью приблизительно 730 мкКюри. Еще одно изменение, направленное на повышение эффективности радиоактивного мечения, предусматривало повышение процента буфера на основе цитрата аммония, после внесения данных корректировок эффективность радиоактивного мечения существенно повысилась и составила приблизительно 92% (Таблица 3).
64
64
124
124
[00128] Все фракции Cu-DOTA-меченного мини-антитела, полученные при обоих вариантах условий, объединяли и подвергали дальнейшей очистке на центрифужных колонках с целью удаления избытка несвязанного Cu. Процент радиоактивности, присоединенной к мини-антителу J591, после очистки составил приблизительно 85%, а специфическая активность составила 1 мкКюри/мкг (Таблица 3). Иммунореактивность мини-антитела с радиоактивной меткой определяли способом, основанным на анализе клеток, описанным выше для I-меченного мини-антитела J591, и она составила 29% (Таблица 3). Хотя указанная Иммунореактивность была ниже, чем ожидалось, было принято решение направить мини-антитело I-J591 на эксперименты с микроПЭТ и оценкой биораспределения. Помимо чистоты белка и условий присоединения метки дальнейшие попытки оптимизации иммунореактивности могут включать оптимизирование реакции конъюгации с DOTA (например, отношение DOTA-молекула и др.).
Пример 6: Серийная визуализация микроПЭТ и исследование биораспределения мини-антитела J591 с радиоактивной меткой
64
64
64
[00129] Мини-антитело Cu-DOTA J591. Чтобы оценить направленную доставку к опухоли и специфичность связывания мини-антитела Cu-DOTA-J591, проводили визуализацию мирокПЭТ и анализ биораспределения у мышей, которым имплантировали ксенотрансплантаты CWR22rv1 (PSMA+) и РС3 (PSMA-). Перед началом экспериментов с визуализацией обе ксенотрансплантатные опухоли выращивали до размера 39-233 мг. КТ и ПЭТ/КТ снимки через 4 часа после инъекции показывали быструю локализацию в опухоли CWR22rv1 по сравнению с опухолью РС3 (На Фигурах 21А и 21В показано репрезентативное животное). Как и ожидалось для мини-антитела, меченного радиоактивным металлом, выраженная активность выявлялась в грудной клетке и частично локализовалась в печени. Локализация радиоактивных металлов, таких как Cu, была хорошо изучена, и данные есть в литературе (Yazaki et al 2001). За исключением печени фоновая активность была относительно низкой даже через 4 часа после инъекции, что способствовало значительной контрастности ПЭТ/Кт изображений (Фигуры 21В и 21С). Выраженная локализация опухоли сохранялась через 19 часов и даже через 43 часа после инъекции (Фигура 21D). общая фоновая активность немного снижалась со временем, но печень оставалась выраженным источником активности (Фигура 21D).
[00130] После последнего сканирования всех животных (n=8 через 19 часов и n=4 через 43 час после инъекции) подвергли эвтаназии, и извлекли все ткани, представляющие интерес (включая позитивные и негативные опухоли, кровь, печень, селезенку, легкие и почки), их взвешивали и проводили измерение радиоактивности счетчиком гамма-частиц. Биораспределение через 19 часов после инъекции, представленное на Фигуре 22, демонстрирует, что опухоль CWR22rv1 (опухоль+) достигала среднего захвата 8,23%ID/г, а опухоль РС3 (опухоль-) - захвата 2,69% ID/г. Локализация была значительно выше в опухоли CWR22rv1, чем в опухоли РС3 (p<0,05). Как удалось выявить при визуализации микроПЭТ захват в печени через 19 часов после инъекции был относительно высок 921,43%ID/г), а локализация во всех других анализируемых тканях была выражена значительно слабее (см. Фигуру 22).
[00131] Через 43 часа после инъекции анализ биораспределения выявил увеличение общего захвата в опухоли CWR22rv1 (Опухоль+; 13,25%ID/г) по сравнению с ситуацией через 19 часов после инъекции (Фигура 22). Фоновая активность относительно снижалась через 19 часов после инъекции, особенно значительно она снижалась в печени-до 14.37%ID/г (Фигура 22).
[00132] При общем снижении фоновой активности в сочетании с повышением аккумуляции в опухоли CWR22rv1, отношение активности в опухоли к фоновой активности существенно возрастало от 19 часов до 43 часов после инъекции (фигура 26).
124
64
124
[00133] Мини-антитело I J591. Как и в случае мини-антитела J591 Cu-DOTA, для I-меченного мини-антитела J591 проводили микроПЭТ и эксперименты по оценке биораспределения, чтобы оценить направленную доставку к опухоли. Перед началом визуализации обе ксенотрансплантатные опухоли выращивали до размера 36-192 мг. МикроПЭТ снимки через 4 часа после инъекции показывали быструю локализацию в опухоли CWR22rv1, но также выявлялась высокая циркулирующая активность в грудной, брюшной полости и мочевом пузыре (Фигура 23А и 23В). Фоновая активность в значительной степени вымывалась из системного кровотока до 20 часов после инъекции, и почти полностью отсутствовала через 44 часа после инъекции, хотя активность в позитивной опухоли сохранялась (фигура 23С).
[00134] Для анализа биорапределения всех животных в группе подвергли эвтаназии n=6 через 20 часов и n=2 через 44 часа после инъекции), и избранные ткани, представляющие интерес извлекали, взвешивали и измеряли в них радиоактивность счетчиком гамма-частиц. Биораспределение через 20 часов после инъекции у животного, данные для которого представлены на Фигуре 24, показало, что опухоль CWR22rv1 (опухоль+) достигала среднего захвата 8,75%ID/г, а опухоль РС3 (опухоль-) - захвата 1,8% ID/г. Локализация была значительно выше в опухоли CWR22rv1, чем в опухоли РС3 (p<0,05). Фоновая активность относительно через 20 часов после инъекции была относительно низкой (Фигура 24).
124
[00135] Через 44 часа после инъекции захват опухолью CWR22rv1 (Опухоль+;) существенно снижался до 3,25%DI/г (Фигура 24). В подтверждение предыдущих результатов, полученных при оценке интернализации и удерживанию in vitro, описанной выше, ассоциированная с клетками радиоактивность снижалась со временем вследствие дегалогенирования и/или метаболизма мини-антитела I-J591. Фоновая активность почти полностью вымывалась из системного кровотока к 44 часам после инъекции (Фигура 24).
[00136] Хотя захват радиоактивности в опухоли CWR22rv1 снижался со временем (Фигура 24), быстрое снижение фоновой активности способствовало сильной контрастности изображений. Отношение биораспределения отражает значительно увеличение отношения активности в опухоли и фоновой активности со временем (Фигура 27).
[00137] При успешной визуализации PSMA-позитивных опухолей при помощи мини-антитела J591, биораспределение указанного мини-антитела можно изучать в соответствии с вариантами реализации настоящего раскрытия. Такие исследования биораспределения позволяют изучать локализацию мини-антитела в очаге опухоли относительно других избранных тканей в зависимости от времени после инъекции. Такие исследования можно применять, чтобы продемонстрировать высокое отношение активности в опухоли к фоновой активности. Применение мини-антитела J591, вероятно, может давать высокое отношение активности в опухоли к фоновой активности, когда визуализируют опухоль с гиперэкспрессией PSMA, например, рак предстательной железы. Положительные результаты такой визуализации и экспериментов по оценке биораспределения могут стать основанием для токсикологических экспериментов при подготовке к клиническим исследованиям.
[00138] Также способность мини-антитела J591 к направленному связыванию с PSMA человека in vivo, показанную в исследованиях с ПЭТ визуализацией, можно продемонстрировать и в клинических исследованиях с участием пациентов с раком. Согласно одному варианту реализации клинические исследования можно проводить с участием пациентов с раком предстательной железы. Указанные клинические исследования с участием пациентов с раком можно проводить с применением тех же способов, которые описаны выше. Если кратко, мини-антитело с радиоактивной меткой можно вводить внутривенно пациентам, страдающим той формой рака, при которой показана гиперэкспрессия PSMA. Для каждого пациента можно проводить серийную ПЭТ через заранее определенные интервалы времени после инъекции. После последнего сканирования можно провести компьютерную томографию для анатомического контроля. Снимки ПЭТ и КТ для каждого пациента затем можно анализировать и оценивать направленную доставку и специфичность.
ССЫЛКИ
Ссылки, патенты и опубликованные заявки на патенты перечисленные ниже, и все источники, цитируемые в вышеизложенном описании включены в настоящий документ посредством ссылки на их полную версию, как если бы они вошли в данную заявку полностью.
Bander NH, Trabulsi EJ, Kostakoglu L, Yao D, Vallabhajosula S, Smith-Jones P, Joyce MA, Milowsky M, Nanus DM, Goldsmith SJ. Targeting metastatic prostate cancer with radiolabeled monoclonal antibody J591 to the extracellular domain of prostate specific membrane antigen. J Urol, 2003. 170(5):1717-1721.
Bander NH, Milowsky MI, Nanus DM, Kostakoglu L, Vallabhajosula S, Goldsmith SJ. Phase I trial of 177 Lutetium-labeled J591, a monoclonal antibody to prostate-specific membrane antigen, in patients with androgen-independent prostate cancer. J Clin Oncol, 2005. 23(21):4591-601.
Hu S, Shively L, Wu AM. Minibody: A novel engineered anti-carcinoembryonic antigen antibody fragment (single-chain Fv-CH3) which exhibits rapid, high-level targeting of xenografts. Cancer Res, 1996. 56(13):3055-61.
Kukis DL, Denardo GL, Denardo SJ, Mirick GR, Miers LA, Greiner DP, Meares CF. Effect of the Extent of Chelate Substitution on the Immunoreactivity and Biodistribution of 2IT-BAT-Lym-1 Immunoconjugates, 1995. 55, 878-884.
Lewis MR, Kao JY, Anderson AL, Shively JE, Raubitscheck A. An improved method for conjugating monoclonal antibodies with N-hydroxysulfosuccinimidyl DOTA. Bioconjug Chem, 2001. 12:320-324.
Leyton JV, Wu AM. Humanized radioiodinated minibody for imaging of prostate stem cell antigen-expressing tumors. Clin Cancer Res, 2008. 14(22):7488-96.
Liu H, Rajasekaran AK, Moy P, Xia Y, Kim S, Navarro V, Rahmati R, Bander NH. Constitutive and Antibody-induced Internalization of Prostate-specific Membrane Antigen. Cancer Res, 1998. 58:4055-4060.
Liu H, Moy P, Kim S, Xia Y, Rajasekaran A, Navarro V, Knudsen B, Bander NH. Monoclonal antibodies to the extracellular domain of prostate specific membrane antigen also react with tumor vasculature endothelium. Cancer Res, 1997. 57(17):3629-34.
Milowsky MI, Nanus DM, Kostakoglu L, Vallabhajosula S, Goldsmith SJ, Bander NH. Phase I trial of Yttrium-90-labeled anti-prostate specific membrane antigen monoclonal antibody J591 for androgen-independent prostate cancer. J Clin Oncol, 2004. 22(13):2522-2531.
Milowsky MI, Nanus DM, Kostakoglu L, Sheehan CE, Vallabhajosula S, Goldsmith SJ, Ross JS, Bander NH. Vascular targeted therapy with anti-prostate-specific membrane antigen monoclonal antibody J591 in advanced solid tumors. J Clin Oncol, 2007. 25(5):540-547.
Morris MJ, Divgi CR, Pandit-Taskar N, et al. Pilot trial of unlabeled and indium-111-labeled anti-prostate-specific membrane antigen antibody J591 for castrate metastatic prostate cancer. Clin Cancer Res, 2005. 11(20):7454-7461.
Olafsen T, Tan GJ, Cheung CW, Yazaki PJ, Park JM, Shively JE, Williams LE, Raubitschek AA, Press MF, Wu AM. Characterization of engineered anti-p185HER-2 (scFv-CH3)2 antibody fragments (minibodies) for tumor targeting. Protein Eng Des Sel, 2004. 17(4):315-23.
Olafsen T, Kenanova VE, Wu AM. Tunable pharmacokinetics: modifying the in vivo half-life of antibodies by directed mutagenesis of the Fc fragment. Nat Protoc, 2006. 1:2048-60.
Olafsen T, Betting D, Kenanova VE, Salazar FB, Clarke P, Said J, Raubitschek AA, Timmerman JM, Wu AM. Recombinant Anti-CD20 Antibody Fragments for Small-Animal PET Imaging of B-Cell Lymphomas. J Nuc Med, 2009. 50(9):1500-1508.
Olson WC, Heston WDW, Rajasekaran AK. Clinical Trials of Cancer Therapies Targeting Prostate Specific Membrane Antigen. Reviews on Recent Clinical Trials, 2007. 2:182-190.
Slovin SF. Targeting novel antigens for prostate cancer treatment: focus on prostate-specific membrane antigen. Expert Opin Ther Targets, 2005. 9(3):561-570.
Vaidynathan G, Jestin E, Olafsen T, Wu AM, Zalutsky MR. Evaluation of an anti-p185(HER2)(scFv-C(H)2-C(H)3)2 fragment following radioiodination using two different residualizing labels: SGMIB and IB-Mal-D-GEEEK. Nucl Med Biol, 2009. 36(6):671-80.
Wong JY, Chu DZ, Williams LE, Yamauchi DM, Ikle DN, Kwok CS, Liu A, Wilczynski S, Colcher D, Yazaki PJ, Shively JE, Wu AM, Raubitschek AA. Pilot trial evaluating an 123I-labeled 80-kilodalton engineered anticarcinoembryonic antigen antibody fragment (cT84.66 minibody) in patients with colorectal cancer. Clin Cancer Res, 2004. 10(15):5014-21.
Wu AM and Senter PD. Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates. Nat Biotechnol, 2005. 23(9):1137-46.
Wu AM and Olafsen T. Antibodies for molecular imaging of cancer. Cancer J, 2008. 14(3):191-7.
Wu AM. Antibodies and Antimatter: The resurgence of ImmunoPET. J Nucl Med, 2009. 50(1):2-5.
Yazaki PJ, Wu AM, Tsai SW, Williams LE, Ikle DN, Wong JYC, Shively JE, and Raubitschek AA. Tumor targeting of radiometal labeled anti-CEA recombinant T84.66 diabody and T84.66 minibody: Comparison to radioiodinated fragments. Bioconj Chem, 2001. 12, 220-228.
Патенты и опубликованные заявки на патенты:
Wu, Anna. Antibody Construct. Патент США5837821, зарегистрированный 06/24/94 и выданный 11/17/98.
Bander, Neil. Treatment and diagnosis of cancer. Патент США6649163, зарегистрированный 7/20/99 и выданный 11/18/03.
Bander, Neil. Treatment and diagnosis of cancer. Патент США6770450, зарегистрированный 7/20/99 и выданный 8/3/04.
Bander, Neil. Carr, Francis. Hamilton, Anita. Modified antibodies to prostate-specific membrane antigen and uses thereof. Патент США7045605, зарегистрированный 5/30/02 и выданный 5/16/06.
Bander, Neil. Treatment and diagnosis of prostate cancer. Патент США7112412, зарегистрированный 7/20/99 и выданный 9/26/06.
Bander, Neil. Treatment and diagnosis of cancer. Патент США7163680, зарегистрированный 8/13/2001 и выданный 1/16/07.
Bander, Neil. Treatment and diagnosis of cancer. Патент США6136311, зарегистрированный 7/17/97 и выданный 10/24/00.
Bander, Neil. Treatment and diagnosis of prostate cancer with antibodies to extracellular PSMA. Патент США6107090, зарегистрированный 4/9/97 и выданный 8/22/00.
Bander, Neil. Carr, Francis. Hamilton, Anita. Methods of treating prostate cancer with anti-prostate specific membrane antigen antibodies. Патент США7514078, зарегистрированный 05/30/03 и выданный 4/7/09.