КОМБИНИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ РЕСПИРАТОРНО-СИНЦИТИАЛЬНЫХ ВИРУСНЫХ (RSV) ИНФЕКЦИЙ ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ИНДУЦИРОВАНИЯ ИММУННОГО ОТВЕТА С ЕЕ ПОМОЩЬЮ
COMBINED VACCINE AGAINST HUMAN RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRAL (RSV) INFECTIONS AND METHOD FOR INDUCING IMMUNE RESPONSE WITH ITS HELP

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ(И)
[0001] Настоящая заявка испрашивает преимущество и приоритет на основании китайской патентной заявки №202010863764.9, поданной в Национальное управление интеллектуальной собственности Китая 25 августа 2020 г. и озаглавленной «КОМБИНИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ РЕСПИРАТОРНО-СИНЦИТИАЛЬНЫХ ВИРУСНЫХ (RSV) ИНФЕКЦИЙ И СПОСОБ ИНДУЦИРОВАНИЯ ИММУННОГО ОТВЕТА С ЕЕ ПОМОЩЬЮ», которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0002] Настоящее изобретение относится к области техники биоинженерии, в частности, к комбинированной вакцине против инфекции респираторно-синцитиального вируса человека (RSV) и способу индуцирования иммунного ответа с ее помощью.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] Респираторно-синцитиальный вирус человека (RSV) широко распространен во всем мире, и восприимчивыми к нему популяциями являются в основном дети, пожилые люди и пациенты с ослабленным иммунитетом. 70% младенцев и детей младшего возраста могут быть инфицированы RSV в возрасте до 1 года, и почти все дети грудного и раннего возраста могут быть инфицированы RSV в возрасте до 2 лет. RSV является наиболее важным патогеном, вызывающим пневмонию у детей в возрасте до 5 лет, и является важным патогеном, приводящим к госпитализации и смерти пожилых людей и пациентов с ослабленным иммунитетом. Около 33,1 миллиона детей во всем мире заражаются RSV ежегодно, при этом 99% умерших детей приходится на развивающиеся страны. Видно, что RSV несет тяжелое экономическое и социальное бремя для стран по всему миру, особенно для развивающихся стран. Однако в настоящее время нет доступной коммерческой вакцины против RSV для детей.
[0004] Аденовирусные векторы широко используются в качестве вакцинных векторов благодаря их высокому титру репликации, желаемой безопасности и высокоэффективной экспрессии трансгена. Подобно живым аттенуированным вакцинам, аденовирусные векторные вакцины могут индуцировать слизистый и клеточный иммунитет; между тем, аденовирусные векторы также обладают адъювантным эффектом, вызывая более сильный иммунный ответ против белка, кодируемого трансгеном, в организме. Однако люди широко инфицированы аденовирусом 5 типа (Ad5), и ранее существовавший иммунитет к Ad5 может ограничивать эффективность рекомбинантных аденовирусных вакцин 5 типа (rAd5). Уровни ранее существовавших антител против аденовируса человека 26 типа (Ad26) и аденовируса шимпанзе 63 типа (ChAd63), соответственно, ниже, чем у Ad5, что позволяет избежать плохой эффективности при использовании Ad5. Более того, как рекомбинантный Ad26 (rAd26), так и рекомбинантный ChAd63 (rChAd63) можно выращивать до высоких титров на клеточных линиях, подходящих для производства вакцин клинического класса.
[0005] Когда для иммунизации используют аденовирусную векторную вакцину, она может индуцировать у вакцинируемого иммунный ответ против самого аденовирусного вектора, что будет мешать эффективности бустерной иммунизации, если один и тот же вектор используется дважды. Таким образом, гетерологичная «прайм-буст» иммунизация с использованием двух видов различных аденовирусных векторов является предпочтительной для предотвращения ингибирующего действия индуцированных аденовирусных антител посредством первичной иммунизации гомологичным бустером.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0006] Ввиду этого, чтобы преодолеть недостатки известного уровня техники, целью настоящего изобретения является обеспечение комбинированной вакцины против RSV-инфекций и способа индуцирования иммунного ответа с ее помощью.
[0007] Для достижения вышеуказанной цели настоящее раскрытие предлагает следующее техническое решение.
[0008] Комбинированная вакцина против RSV-инфекций, включающая: первую композицию и вторую композицию; в которой
[0009] первая композиция включает иммунологически эффективную дозу дефектного по репликации аденовирусного вектора человека 26 типа и фармацевтически приемлемого вектора, причем дефектный по репликации аденовирусный вектор человека 26 типа включает нуклеотид, кодирующий антигенный белок RSV;
[0010] вторая композиция включает иммунологически эффективную дозу дефектного по репликации аденовирусного вектора шимпанзе 63 типа и фармацевтически приемлемого вектора, причем дефектный по репликации аденовирусный вектор шимпанзе 63 типа включает нуклеотид, кодирующий антигенный белок RSV;
[0011] где первая композиция представляет собой композицию для первичной иммунизации, а вторая композиция представляет собой композицию для бустерной иммунизации; альтернативно, первая композиция представляет собой композицию для бустерной иммунизации, а вторая композиция представляет собой композицию для первичной иммунизации.
[0012] Предпочтительно, в первой композиции дефектный по репликации аденовирусный вектор человека 26 типа включает нуклеотид, кодирующий гликопротеин слияния preF «до слияния», и/или нуклеотид, кодирующий а.к. 130-230 гликопротеина адгезии RSV.
[0013] Предпочтительно во второй композиции дефектный по репликации аденовирусный вектор шимпанзе 63 типа включает нуклеотид, кодирующий preF, и/или нуклеотид, кодирующий G 130-230.
[0014] Предпочтительно, в первой композиции дефектный по репликации аденовирусный вектор человека 26 типа включает нуклеотид, кодирующий preF, нуклеотидная последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 1.
[0015] Предпочтительно, в первой композиции дефектный по репликации аденовирусный вектор человека 26 типа включает нуклеотид, кодирующий G 130-230, нуклеотидная последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 2.
[0016] Предпочтительно, в первой композиции дефектный по репликации аденовирусный вектор человека 26 типа включает нуклеотид, кодирующий как preF, так и G 130-230, нуклеотидная последовательность которых представлена в SEQ ID NO: 3.
[0017] Предпочтительно во второй композиции дефектный по репликации аденовирусный вектор шимпанзе 63 типа включает нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один из трех антигенных белков RSV.
[0018] Предпочтительно во второй композиции дефектный по репликации аденовирусный вектор шимпанзе 63 типа включает нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один из трех антигенных белков RSV, где нуклеиновая кислота содержит нуклеотидные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3.
[0019] Предпочтительно, в первой композиции дефектный по репликации аденовирусный вектор человека 26 типа представляет собой rAd26; и во второй композиции дефектный по репликации аденовирусный вектор шимпанзе 63 типа представляет собой rChAd63.
[0020] Предпочтительно комбинированную вакцину используют для выработки защитного иммунитета против инфекций RSV; при этом первый иммунизатор используют для вызова иммунного ответа, а вторую композицию используют для усиления иммунного ответа; альтернативно, второй иммунизатор используют для вызова иммунного ответа, а первую композицию используют для усиления иммунного ответа.
[0021] Из технических решений, представленных в примерах настоящего раскрытия, видно, что для индуцирования защитного иммунитета против RSV-инфекций применяют комбинированную вакцину против RSV-инфекции, а также композицию, вакцину и способ обеспечения защитного иммунитета против RSV-инфекций.
[0022] Дополнительные аспекты и преимущества настоящего раскрытия будут частично приведены в последующем описании и станут ясными в последующем описании, или будут изучены на практике настоящего раскрытия.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0023] Для более ясного описания технических решений примеров в настоящем раскрытии краткое представление чертежей для описания примеров выглядит следующим образом. По-видимому, чертежи в последующем описании являются лишь некоторыми примерами настоящего раскрытия, и для специалистов в данной области техники другие чертежи также могут быть получены из этих чертежей без творческих усилий.
[0024] На Фиг. 1 показан специфичный в отношении preF IgG, продуцируемый мышами BALB/c, иммунизированными рекомбинантный аденовирусом, представленным в примерах настоящего изобретения;
[0025] На Фиг. 2 показан специфичный в отношении postF IgG, продуцируемый мышами BALB/c, иммунизированными рекомбинантный аденовирусом, представленным в примерах настоящего изобретения;
[0026] На Фиг. 3 показано сывороточное нейтрализующее антитело, продуцируемое мышами BALB/c, иммунизированными рекомбинантным аденовирусом, представленным в примерах настоящего изобретения;
[0027] На Фиг. 4 показан иммунный ответ CD8+ Т-клеток, специфичный к RSV F, продуцируемый мышами BALB/c, иммунизированными рекомбинантный аденовирусом, представленным в примерах настоящего изобретения;
[0028] На Фиг. 5 показан специфичный в отношении preF IgG, продуцируемый мышами BALB/c, иммунизированными рекомбинантный аденовирусом, представленным в примерах настоящего изобретения;
[0029] На Фиг. 6 показан специфичный в отношении postF IgG, продуцируемый мышами BALB/c, иммунизированными рекомбинантный аденовирусом, представленным в примерах настоящего изобретения;
[0030] На Фиг. 7 показан специфичный в отношении G IgG, продуцируемый мышами BALB/c, иммунизированными рекомбинантный аденовирусом, представленным в примерах настоящего изобретения;
[0031] На Фиг. 8 показано сывороточное нейтрализующее антитело, продуцируемое мышами BALB/c, иммунизированными рекомбинантным аденовирусом, представленным в примерах настоящего изобретения; и
[0032] На Фиг. 9 показан иммунный ответ CD8+ Т-клеток, специфичный к RSV F, продуцируемый мышами BALB/c, иммунизированными рекомбинантным аденовирусом, представленным в примерах настоящего изобретения.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
[0033] Варианты осуществления настоящего раскрытия подробно описаны ниже. Примеры вариантов осуществления показаны на чертежах. Одни и те же или подобные цифровые обозначения представляют одинаковые или подобные элементы или элементы, имеющие одинаковые или подобные функции во всем раскрытии. Варианты осуществления, описанные ниже со ссылкой на чертежи, являются примерами и используются только для пояснения настоящего раскрытия, но не должны рассматриваться как ограничение.
[0034] Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что, если не указано иное, единственное число определенной и неопределенной формы, используемое здесь, может также включать формы множественного числа. Далее следует понимать, что слово «содержащий» или «включающий», используемое в описании настоящего раскрытия, относится к наличию описанных признаков, целых чисел, стадий, операций, элементов и/или компонентов, но не исключает наличия или добавления одного или нескольких других признаков, целых чисел, стадий, операций, элементов, компонентов и/или их групп. Следует понимать, что когда элемент «соединен» или «связан» с другим элементом, он может быть соединен или связан с другим элементом напрямую или через промежуточный элемент. Кроме того, термины «соединенный» или «связанный», используемые в настоящем документе, могут включать в себя беспроводное соединение или связь. Используемый в настоящем документе термин «и/или» включает любую единицу и все комбинации одного или нескольких связанных перечисленных элементов.
[0035] Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что, если не указано иное, все термины (включая технические термины и научные термины), используемые в настоящем документе, имеют те же значения, которые обычно понимаются специалистами в данной области техники. Также следует понимать, что такие термины, как те, которые определены в общих словарях, следует понимать как имеющие значения, согласующиеся со значениями в контексте известного уровня техники, и, если в настоящем документе не определено иное, их не следует объяснять в идеальных или чрезмерно формальных значениях.
[0036] Для простоты понимания приведенных в настоящем документе примеров дальнейшее пояснение и описание приведено с использованием нескольких конкретных примеров в качестве примеров в сочетании с чертежами, и каждый пример не является ограничением приведенных в настоящем документе примеров.
[0037] Настоящее раскрытие направлено на изучение защитного иммунитета против RSV-инфекций с помощью стратегии «прайм-буст» иммунизации, в частности композиции, вакцины и способа для защитного иммунитета против RSV-инфекций.
[0038] Обнаружено, что «прайм-буст» комбинация вакцины дефектного по репликации аденовирусного вектора обеспечивает эффективную иммунную защиту против RSV. Таким образом, примеры согласно настоящему изобретению обеспечивают комбинированную вакцину против RSV-инфекций, включающую: первую композицию и вторую композицию; в которой
[0039] первая композиция включает иммунологически эффективную дозу дефектного по репликации аденовирусного вектора человека 26 типа и фармацевтически приемлемого вектора, причем дефектный по репликации аденовирусный вектор человека 26 типа включает нуклеотид, кодирующий антигенный белок RSV;
[0040] вторая композиция включает иммунологически эффективную дозу дефектного по репликации аденовирусного вектора шимпанзе 63 типа и фармацевтически приемлемого вектора, причем дефектный по репликации аденовирусный вектор шимпанзе 63 типа включает нуклеотид, кодирующий антигенный белок RSV.
[0041] В одном варианте осуществления настоящего раскрытия первая композиция представляет собой композицию для первичной иммунизации, а вторая композиция представляет собой композицию для бустерной иммунизации; альтернативно, первая композиция представляет собой композицию для бустерной иммунизации, а вторая композиция представляет собой композицию для первичной иммунизации.
[0042] В одном из примеров настоящего раскрытия в первой композиции дефектный по репликации аденовирусный вектор человека 26 типа включает: нуклеотид, кодирующий гликопротеин слияния (preF) «до слияния», и/или нуклеотид, кодирующий а.к. 130-230 гликопротеина прикрепления (G 130-230) RSV; где нуклеотид, кодирующий а.к. 130-230 гликопротеина прикрепления RSV, обозначается аббревиатурой preF2A3G.
[0043] Во второй композиции дефектный по репликации аденовирусный вектор шимпанзе 63 типа включает нуклеотид, кодирующий preF, и/или нуклеотид, кодирующий G 130-230.
[0044] В одном примере настоящего раскрытия, в первой композиции дефектный по репликации аденовирусный вектор человека 26 типа включает нуклеотид, кодирующий preF, нуклеотидная последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 1; или нуклеотид, кодирующий G 130-230, нуклеотидная последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 2; или нуклеотид, кодирующий как preF, так и G 130-230, нуклеотидная последовательность которых представлена в SEQ ID NO: 3.
[0045] В одном примере настоящего раскрытия, во второй композиции дефектный по репликации аденовирусный вектор шимпанзе 63 типа включает нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один из трех антигенных белков RSV. В частности, нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один из трех антигенных белков RSV, где нуклеиновая кислота содержит нуклеотидные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3.
[0046] В одном примере настоящего раскрытия, в первой композиции дефектный по репликации аденовирусный вектор человека 26 типа представляет собой rAd26; и во второй композиции дефектный по репликации аденовирусный вектор шимпанзе 63 типа представляет собой rChAd63.
[0047] Примеры по настоящему раскрытию дополнительно обеспечивают способ индуцирования иммунного ответа против RSV у вакцинированного, включающий следующие стадии:
[0048] А. введение субъекту первой композиции, включающей иммунологически эффективное количество аденовирусного вектора, где аденовирусный вектор включает нуклеотид, кодирующий антигенный белок RSV; и
[0049] В. введение субъекту второй композиции, включающей иммунологически эффективное количество аденовирусного вектора, где аденовирусный вектор включает нуклеотид, кодирующий антигенный белок RSV; при этом
[0050] стадию (А) и стадию (В) проводят в любом порядке.
[0051] Пример 1
[0052] Прайм-буст иммунизация рекомбинантным аденовирусом, кодирующим гликопротеин слияния (preF) RSV «до слияния».
[0053] I. Иммунитет животных
6
[0054] Самок мышей BALB/c в возрасте 6-8 недель разделили на 6 групп; в день 0 собирали исходную сыворотку; в 1 день проводили первую иммунизацию внутримышечно. На 21 день после иммунизации отбирали кровь после первой иммунизации. На 28 день проводили повторную иммунизацию внутримышечно. На 49 день отбирали кровь после второй иммунизации. На 56 день проводили эксперимент с заражением интраназальным путем, и доза заражения составляла 1×10 БОЕ/50 мкл wtRSV.
[0055] Группирование и обработка представляли собой следующие:
10
10
[0056] первая группа (группа G1): вторичную иммунизацию проводили внутримышечной инъекцией; где первичный иммунизатор представлял собой раствор rChAd63/пустой вирус (с вирусной нагрузкой 1×10 в.ч.), а вторичный иммунизатор представлял собой раствор rChAd63/пустой вирус (с вирусной нагрузкой 1×10 в.ч.);
10
10
[0057] вторая группа (группа G2): вторичную иммунизацию проводили внутримышечной инъекцией; где первичный иммунизатор представлял собой раствор rAd26/пустой вирус (с вирусной нагрузкой 1×10 в.ч.), а вторичный иммунизатор представлял собой раствор rAd63/пустой вирус (с вирусной нагрузкой 1×10 в.ч.);
10
10
[0058] третья группа (группа G3): вторичную иммунизацию проводили внутримышечной инъекцией; где первичный иммунизатор представлял собой раствор rAd26/пустой вирус (с вирусной нагрузкой 1×10 в.ч.), а вторичный иммунизатор представлял собой раствор rChAd26/пустой вирус (с вирусной нагрузкой 1×10 в.ч.);
10
10
[0059] четвертая группа (группа G4): вторичную иммунизацию проводили внутримышечной инъекцией; где первичный иммунизатор представлял собой раствор rChAd63/preF вируса (с вирусной нагрузкой 1×10 в.ч.), а вторичный иммунизатор представлял собой раствор rChAd63/preF вируса (с вирусной нагрузкой 1×10 в.ч.);
10
10
[0060] пятая группа (группа G5): вторичную иммунизацию проводили внутримышечной инъекцией; где первичный иммунизатор представлял собой раствор rAd26/preF вируса (с вирусной нагрузкой 1×10 в.ч.), а вторичный иммунизатор представлял собой раствор rAd63/preF вируса (с вирусной нагрузкой 1×10 в.ч.); и
10
10
[0061] шестая группа (группа G6): вторичную иммунизацию проводили внутримышечной инъекцией; где первичный иммунизатор представлял собой раствор rAd26/preF вируса (с вирусной нагрузкой 1×10 в.ч.), а вторичный иммунизатор представлял собой раствор rChAd26/preF вируса (с вирусной нагрузкой 1×10 в.ч.).
[0062] II. Обнаружение IgG в сыворотке мышей после иммунизации
[0063] Тестируемый раствор представлял собой: сыворотку, выделенную и полученную из венозной крови мышей, собранную на 49-й день после иммунизации на стадии I.
[0064] Титр сывороточных антител определяли у мышей с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Очищенный RSV наносили на планшет для микротитрования в концентрации 2500 БОЕ/лунку, белок F «до слияния» (preF) наносили на планшет для микротитрования в концентрации 450 нг/лунку, а белок F «после слияния» (postF) наносили на планшет для микротитрования в концентрации 1200 нг/лунку, и сывороточные антитела IgG у мышей обнаруживали с помощью ELISA.
[0065] III. Сывороточные нейтрализующие антитела иммунизированных мышей
4
[0066] 1. Клетки НЕр-2 инокулировали на 96-луночный планшет при плотности 2,0×10 клеток/лунку и культивировали в течение 24 часов.
[0067] 2. Сыворотку иммунизированных мышей инактивировали при 56°С в течение 30 мин и дважды разбавляли средой Игла, модифицированной по способу Дульбекко (DMEM), содержащей 2% фетальной бычьей сыворотки. К сывороткам разных разведений добавляли RSV-mGFP с конечной концентрацией до 1000 БОЕ/100 мкл, сыворотки перемешивали и инкубировали при 37°С в течение 1 ч.
[0068] 3. Среду удаляли из 96-луночного планшета, планшет 1-2 раза промывали PBS, и 100 мкл смеси (содержащей 1000 БОЕ RSV-mGFP) добавляли в 96-луночный планшет, покрытый монослоем клеток НЕр-2, с последующей инкубацией при 37°С в течение 48 часов. В то же время были созданы группа холостого контроля (без вируса, без сыворотки или антитела), группа отрицательного контроля (с RSV-mGFP, без сыворотки) и группа положительного контроля (альтернативная сыворотка с поликлональными антителами RSV), и культивированы в течение 2 дней.
[0069] 4. После завершения стадии 3 интенсивность флуоресценции зеленых флуоресцентных белков в каждой лунке определяли с использованием многофункционального считывающего устройства для микропланшетов SpectraMax М5е при длине волны возбуждения 479 нм и длине волны испускания 517 нм в течение 10 с.
50
[0070] 5. Данные группы холостого контроля вычитали из данных экспериментальной группы, группы отрицательного контроля и группы положительного контроля, соответственно, и уравнение линейной регрессии экспериментальной группы было установлено с помощью SPSS; титр антител с 50% снижением интенсивности флуоресценции (IC) рассчитывали по уравнению линейной регрессии.
[0071] IV. Анализ клеточного иммунного эффекта иммунизированных мышей
[0072] Исследуемые клетки представляли собой: клетки селезенки мышей на 49 день
после иммунизации на стадии I.
[0073] 1. Мышей через 49 дней после иммунизации умерщвляли путем смещения шейных позвонков, и клетки селезенки собирали в асептических условиях на сверхчистом столе.
[0074] 2. Эффект клеточного иммунитета анализировали с помощью метода твердофазного иммуносорбента (ELISPOT), и подсчитывали количество лимфоцитов селезенки, секретирующих IFN-γ, после стимуляции Н-2K d-рестриктированным CTL-эпитопом F-белка RSV.
[0075] 3. На сверхчистом столе в каждую лунку добавляли 200 мкл среды 1640, и после выдерживания при комнатной температуре в течение 5-10 минут среду 1640 удаляли.
5
[0076] 4. В каждую экспериментальную лунку добавляли клеточную суспензию в количестве 100 мкл/лунка. 2×10 клеток/лунку добавляли в лунки положительного контроля, лунки отрицательного контроля и экспериментальные лунки, в то время как в лунки фонового контроля клетки не добавляли.
5
2
[0077] 5. Объем стимула, добавляемого в каждую лунку, составлял 10 мкл/лунку; в лунки положительного контроля добавляли рабочий раствор положительного стимула; бессывороточную среду 1640 добавляли в лунки отрицательного контроля и лунки холостого контроля; в экспериментальные лунки добавляли d-рестриктированные CTL-эпитопы белка F RSV Н-2K (KYKNAVTEL и TYMLTNSELL, чистота ≥95%) (по 0,5 мкг каждого из KYKNAVTEL и TYMLTNSELL добавляли к 2×10 клеток); инкубацию проводили в инкубаторе при 37°С, с 5% CO в течение 24-48 часов.
[0078] 6. После завершения стадии 5 клетки и среду в лунке сливали и добавляли ледяную деионизированную воду по 200 мкл/лунка; клетки помещали в холодильник при 4°С на 10 мин для проведения гипотонического лизиса клеток.
[0079] 7. Жидкость в лунке выливали, затем 5-7 раз промывали 1 x промывочным буфером по 200 мкл/лунка, каждый раз в течение 30-60 с, и сушили на впитывающей бумаге.
[0080] 8. В каждую экспериментальную лунку добавляли разбавленный и меченный биотином рабочий раствор антитела в количестве 100 мкл/лунка с последующей инкубацией при 37°С в течение 1 часа.
[0081] 9. После завершения стадии 8 жидкость в лунке выливали, затем 5-7 раз промывали 1 x промывочным буфером по 200 мкл/лунка, каждый раз в течение 30-60 с, и сушили на впитывающей бумаге.
[0082] 10. В каждую экспериментальную лунку добавляли разбавленный и меченный ферментом авидином рабочий раствор антитела в количестве 100 мкл/лунка с последующей инкубацией при 37°С в течение 1 часа.
[0083] 11. Жидкость в лунке выливали, затем 5-7 раз промывали 1 x промывочным буфером по 200 мкл/лунка, каждый раз в течение 30-60 с, и сушили на впитывающей бумаге.
[0084] 12. В каждую экспериментальную лунку добавляли свежеприготовленный рабочий раствор цветного проявителя АЕС в количестве 100 мкл/лунка и оставляли стоять при комнатной температуре на 15-45 мин.
[0085] 13. После того, как пятна выросли до подходящего размера, жидкость в лунке сливали, основание планшета открывали и промывали деионизированной водой 3-5 раз для прекращения развития окраски; планшет помещали в прохладное место при комнатной температуре для естественного высыхания до полного высыхания; 96-луночный планшет визуализировали с помощью считывающего устройства ELISPOT, а ряд пятен считывали и анализировали с помощью программного обеспечения для анализа изображений ImmunoSpot v4.0.
[0086] Пример 2
[0087] Прайм-буст иммунизация рекомбинантным аденовирусом, коэкспрессирующим гликопротеин слияния «до слияния» (preF) и гликопротеин прикрепления RSV.
[0088] I. Иммунитет животных
6
[0089] Самок мышей BALB/c в возрасте 6-8 недель разделили на 6 групп; в день 0 собирали исходную сыворотку; в 1 день проводили первую иммунизацию внутримышечно. На 21 день после иммунизации отбирали кровь после первой иммунизации. На 28 день проводили повторную иммунизацию внутримышечно. На 49-й день забор крови проводили непрерывно после второй иммунизации. На 56 день проводили эксперимент с заражением интраназальным путем, при этом доза заражения составляла 1×10 БОЕ/50 мкл wtRSV.
[0090] Группирование и обработка представляли собой следующие:
10
10
[0091] первая группа (группа G1): вторичную иммунизацию проводили внутримышечной инъекцией; где первичный иммунизатор представлял собой раствор rChAd63/пустой вирус (с вирусной нагрузкой 1×10 в.ч.), а вторичный иммунизатор представлял собой раствор rChAd63/пустой вирус (с вирусной нагрузкой 1×10 в.ч.);
10
10
[0092] вторая группа (группа G2): вторичную иммунизацию проводили внутримышечной инъекцией; где первичный иммунизатор представлял собой раствор rAd26/пустой вирус (с вирусной нагрузкой 1×10 в.ч.), а вторичный иммунизатор представлял собой раствор rAd63/пустой вирус (с вирусной нагрузкой 1×10 в.ч.);
10
10
[0093] третья группа (группа G3): вторичную иммунизацию проводили внутримышечной инъекцией; где первичный иммунизатор представлял собой раствор rAd26/пустой вирус (с вирусной нагрузкой 1×10 в.ч.), а вторичный иммунизатор представлял собой раствор rChAd26/пустой вирус (с вирусной нагрузкой 1×10 в.ч.);
10
10
[0094] четвертая группа (группа G4): вторичную иммунизацию проводили внутримышечной инъекцией; где первичный иммунизатор представлял собой раствор rChAd63/preF2A3G вируса (с вирусной нагрузкой 1×10 в.ч.), а вторичный иммунизатор представлял собой раствор rChAd63/preF2A3G вируса (с вирусной нагрузкой 1×10 в.ч.);
10
10
[0095] пятая группа (группа G5): вторичную иммунизацию проводили внутримышечной инъекцией; где первичный иммунизатор представлял собой раствор rAd26/preF2A3G вируса (с вирусной нагрузкой 1×10 в.ч.), а вторичный иммунизатор представлял собой раствор rAd63/preF2A3G вируса (с вирусной нагрузкой 1×10 в.ч.); и
10
10
[0096] шестая группа (группа G6): вторичную иммунизацию проводили внутримышечной инъекцией; где первичный иммунизатор представлял собой раствор rAd26/preF2A3G вируса (с вирусной нагрузкой 1×10 в.ч.), а вторичный иммунизатор представлял собой раствор rChAd26/preF2A3G вируса (с вирусной нагрузкой 1×10 в.ч.).
[0097] II. Обнаружение IgG в сыворотке мышей после иммунизации
[0098] Тестируемый раствор представлял собой: сыворотку, выделенную и полученную из венозной крови мышей, собранную на 49-й день после иммунизации на стадии I.
[0099] Титр сывороточных антител определяли у мышей с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Очищенный RSV наносили на планшет для микротитрования в концентрации 2500 БОЕ/лунку, белок F «до слияния» (preF) наносили на планшет для микротитрования в концентрации 450 нг/лунку, белок F «после слияния» (postF) наносили на планшет для микротитрования в концентрации 1200 нг/лунку, ии G-белок наносили на планшет для микротитрования в концентрации 1600 нг/лунку, и сывороточные антитела IgG у мышей определяли с помощью ELISA.
[0100] III. Сывороточные нейтрализующие антитела иммунизированных мышей
4
[0101] 1. Клетки НЕр-2 инокулировали на 96-луночный планшет при плотности 2,0×10 клеток/лунку и культивировали в течение 24 часов.
[0102] 2. Сыворотку иммунизированных мышей инактивировали при 56°С в течение 30 мин и дважды разбавляли средой Игла, модифицированной по способу Дульбекко (DMEM), содержащей 2% фетальной бычьей сыворотки. К сывороткам разных разведений добавляли RSV-mGFP с конечной концентрацией до 1000 БОЕ/100 мкл, сыворотки перемешивали и инкубировали при 37°С в течение 1 ч.
[0103] 3. Среду удаляли из 96-луночного планшета, планшет 1-2 раза промывали PBS, 100 мкл смеси (содержащей 1000 БОЕ RSV-mGFP) добавляли в 96-луночный планшет, покрытый монослоем клеток НЕр-2, с последующей инкубацией при 37°С в течение 48 часов. В то же время были созданы группа холостого контроля (без вируса, без сыворотки или антитела), группа отрицательного контроля (с RSV-mGFP, без сыворотки) и группа положительного контроля (альтернативная сыворотка с поликлональными антителами RSV), и культивированы в течение 2 дней.
[0104] 4. После завершения стадии 3 интенсивность флуоресценции зеленых флуоресцентных белков в каждой лунке определяли с использованием многофункционального считывающего устройства для микропланшетов SpectraMax М5е при длине волны возбуждения 479 нм и длине волны испускания 517 нм в течение 10 с.
50
[0105] 5. Данные группы холостого контроля вычитали из данных экспериментальной группы, группы отрицательного контроля и группы положительного контроля, соответственно, и уравнение линейной регрессии экспериментальной группы было установлено с помощью SPSS; титр антител с 50% снижением интенсивности флуоресценции (IC) рассчитывали по уравнению линейной регрессии.
[0106] IV. Анализ клеточного иммунного эффекта иммунизированных мышей
[0107] Исследуемые клетки представляли собой: клетки селезенки мышей на 49 день после иммунизации на стадии I.
[0108] 1. Мышей через 49 дней после иммунизации умерщвляли путем смещения шейных позвонков, и клетки селезенки собирали в асептических условиях на сверхчистом столе.
[0109] 2. Эффект клеточного иммунитета анализировали с помощью метода твердофазного иммуносорбента (ELISPOT), и подсчитывали количество лимфоцитов селезенки, секретирующих IFN-γ, после стимуляции Н-2K d-рестриктированным CTL-эпитопом F-белка RSV.
[0110] 3. На сверхчистом столе в каждую лунку добавляли 200 мкл среды 1640, и после выдерживания при комнатной температуре в течение 5-10 минут среду 1640 удаляли.
5
[0111] 4. В каждую экспериментальную лунку добавляли клеточную суспензию в количестве 100 мкл/лунка. 2×10 клеток/лунку добавляли в лунки положительного контроля, лунки отрицательного контроля и экспериментальные лунки, в то время как в лунки фонового контроля клетки не добавляли.
5
2
[0112] 5. Объем стимула, добавляемого в каждую лунку, составлял 10 мкл/лунку; в лунки положительного контроля добавляли рабочий раствор положительного стимула; бессывороточную среду 1640 добавляли в лунки отрицательного контроля и лунки холостого контроля; и в экспериментальные лунки добавляли d-рестриктированные CTL-эпитопы белка F RSV Н-2K (KYKNAVTEL и TYMLTNSELL, чистота ≥95%) (по 0,5 мкг каждого из KYKNAVTEL и TYMLTNSELL добавляли к 2×10 клеток); инкубацию проводили в инкубаторе при 37°С, с 5% CO в течение 24-48 часов.
[0113] 6. После завершения стадии 5 клетки и среду в лунке сливали и добавляли ледяную деионизированную воду по 200 мкл/лунка; клетки помещали в холодильник при 4°С на 10 мин для проведения гипотонического лизиса клеток.
[0114] 7. Жидкость в лунке выливали, затем 5-7 раз промывали 1 x промывочным буфером по 200 мкл/лунка, каждый раз в течение 30-60 с, и сушили на впитывающей бумаге.
[0115] 8. В каждую экспериментальную лунку добавляли разбавленный и меченный биотином рабочий раствор антитела в количестве 100 мкл/лунка с последующей инкубацией при 37°С в течение 1 часа.
[0116] 9. После завершения стадии 8 жидкость в лунке выливали, затем 5-7 раз промывали 1 x промывочным буфером по 200 мкл/лунка, каждый раз в течение 30-60 с, и сушили на впитывающей бумаге.
[0117] 10. В каждую экспериментальную лунку добавляли разбавленный и меченный ферментом авидином рабочий раствор антитела в количестве 100 мкл/лунка с последующей инкубацией при 37°С в течение 1 часа.
[0118] 11. Жидкость в лунке выливали, затем 5-7 раз промывали 1 x промывочным буфером по 200 мкл/лунка, каждый раз в течение 30-60 с, и сушили на впитывающей бумаге.
[0119] 12. В каждую экспериментальную лунку добавляли свежеприготовленный рабочий раствор цветного проявителя АЕС в количестве 100 мкл/лунка и оставляли стоять при комнатной температуре на 15-45 мин.
[0120] 13. После того, как пятна выросли до подходящего размера, жидкость в лунке сливали, основание планшета открывали и промывали деионизированной водой 3-5 раз для прекращения развития окраски; планшет помещали в прохладное место при комнатной температуре для естественного высыхания до полного высыхания; 96-луночный планшет визуализировали с помощью считывающего устройства ELISPOT, а ряд пятен считывали и анализировали с помощью программного обеспечения для анализа изображений ImmunoSpot v4.0.
[0121] Вышеописанное является просто конкретными вариантами осуществления настоящего раскрытия, и объем защиты в настоящем документе не ограничивается ими. Любая модификация или замена, легко предполагаемая специалистами в данной области техники в рамках технического объема настоящего изобретения, должна подпадать под заявленный в настоящем документе объем. Следовательно, заявленный объем настоящего изобретения должен соответствовать заявленному объему формулы изобретения.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Beijing Jiaotong University
Beijing Zhifei lvzhu Biopharmaceutical Co.,Ltd.
<120>  КОМБИНИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ РЕСПИРАТОРНО-СИНЦИТИАЛЬНЫХ ВИРУСНЫХ
(RSV) ИНФЕКЦИЙ ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ИНДУЦИРОВАНИЯ ИММУННОГО ОТВЕТА С
ЕЕ ПОМОЩЬЮ
<130>  GWPCTP2021121119
<150>  202010863764.9
<151>  2020-08-25
<160>  3
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  1659
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Нуклеотидная последовательность гликопротеина слияния "до слияния"
<400>  1
atggaactgc tgatcctgaa ggccaacgcc atcaccacca tcctgaccgc tgtgaccttc       60
tgcttcgcca gcggccagaa catcaccgag gaattctacc agagcacctg tagcgccgtg      120
tccaagggct acctgagcgc cctgcggacc ggctggtaca ccagcgtgat caccatcgag      180
ctgagcaaca tcaagaaaat caagtgcaac ggcaccgacg ccaagatcaa gctgatcaag      240
caggaactgg acaagtacaa gaacgccgtg accgagctgc agctgctgat gcagagcacc      300
cccgccacca acaaccaggc tagaggcagc ggaagcggac ggtccctggg cttcctgctg      360
ggcgtgggca gcgccattgc tagcggagtg gccgtgtcaa aggtgctgca cctggaaggc      420
gaagtgaaca agatcaagtc cgccctgctg agcaccaaca aggccgtggt gtccctgagc      480
aacggcgtgt ccgtgctgac cagcaaggtg ctggatctga agaactacat cgacaagcag      540
ctgctgccca tcgtgaacaa gcagagctgc agcatcccca acatcgagac agtgatcgag      600
ttccagcaga agaacaaccg gctgctggaa atcacccgcg agttcagcgt gaacgccggc      660
gtgaccaccc ccgtgtccac ctacatgctg accaacagcg agctgctgag cctgatcaac      720
gacatgccca tcaccaacga ccagaaaaag ctgatgagca acaacgtgca gatcgtgcgg      780
cagcagagct actccatcat gagcatcatc aaagaagagg tgctggccta cgtggtgcag      840
ctgcccctgt acggcgtgat cgacaccccc tgctggaagc tgcacaccag ccccctgtgc      900
accaccaaca ccaaagaggg cagcaacatc tgcctgaccc ggaccgaccg gggctggtac      960
tgcgataatg ccggcagcgt gtcattcttt ccacaagccg agacatgcaa ggtgcagagc     1020
aaccgggtgt tctgcgacac catgaacagc ctgaccctgc cctccgaagt gaacctgtgc     1080
aacgtggaca tcttcaaccc taagtacgac tgcaagatca tgacctccaa gaccgacgtg     1140
tccagctccg tgatcacctc cctgggcgcc atcgtgtcct gctacggcaa gaccaagtgc     1200
accgccagca acaagaaccg gggcatcatc aagaccttca gcaacggctg cgactacgtg     1260
tccaacaagg gggtggacac cgtgtccgtg ggcaacaccc tgtactacgt gaacaaacag     1320
gaaggcaaga gcctgtacgt gaagggcgag cccatcatca acttctacga ccccctggtg     1380
ttccccagcg accagttcga cgccagcatc agccaggtca acgagaagat caaccagagc     1440
ctggccttca tcagaaagag cgacgagctg ctgcacaatg tgaatgccgt gaagtccacc     1500
accaatatca tgatcaccac aatcatcatc gtgatcatcg tcatcctgct gtccctgatc     1560
gccgtgggcc tgctgctgta ctgcaaggcc cggtccaccc ctgtgaccct gtccaaggac     1620
cagctgagcg gcatcaacaa tatcgccttc tccaactga                            1659
<210>  2
<211>  1014
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Нуклеотидная последовательность 130-230aa гликопротеина прикрепления
<400>  2
atggacgcca tgaagagggg cctgtgctgc gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg       60
agccccagca ccgtgaaaac aaagaacacc accaccaccc agacccagcc cagcaagccc      120
accaccaagc agcggcagaa caagcccccc aacaagccca acaacgactt ccacttcgag      180
gtgttcaact tcgtgccctg cagcatctgc agcaacaacc ctacctgctg ggccatctgc      240
aagcggaagc ctaacaagaa gcccggcaag aaaaccacca caaagcccac caagaagcct      300
accttcaaga ccacaaagaa ggacctgaag ccccagacca ccaagcccaa agaggtgccc      360
accactaagc ccggaggcgg cggatccaca gtgaaaacta agaataccac aacaacacag      420
acacagcctt ccaagcctac aacaaaacag aggcagaaca aacctcctaa caaacctaac      480
aatgattttc actttgaagt gttcaatttt gtgccttgct ccatctgctc caacaatcca      540
acatgttggg ctatctgtaa acgcaaaccc aacaagaaac ctgggaaaaa gaccaccacc      600
aaacctacaa agaaacccac ctttaaaacc accaagaaag atctgaaacc tcagacaaca      660
aaacctaaag aagtgcctac taccaagccc ggaggcggcg gatccaccgt gaaaacaaaa      720
aacacaacaa caactcagac tcagccctct aaacccacaa ctaagcagag acagaacaag      780
cctccaaaca agccaaacaa tgatttccat ttcgaagtgt ttaactttgt gccatgttct      840
atctgttcta acaatcccac ttgttgggcc atctgcaaaa gaaagccaaa caaaaaaccc      900
ggcaaaaaga caacaactaa gcctaccaaa aagcccacat tcaaaactac caaaaaggat      960
ctgaagccac agacaactaa gccaaaagaa gtgcccacaa caaaaccctg ataa           1014
<210>  3
<211>  2736
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Нуклеотидная последовательность гликопротеина слияния "до слияния" и
гликопротеина прикрепления 130-230aa
<400>  3
atggaactgc tgatcctgaa ggccaacgcc atcaccacca tcctgaccgc tgtgaccttc       60
tgcttcgcca gcggccagaa catcaccgag gaattctacc agagcacctg tagcgccgtg      120
tccaagggct acctgagcgc cctgcggacc ggctggtaca ccagcgtgat caccatcgag      180
ctgagcaaca tcaagaaaat caagtgcaac ggcaccgacg ccaagatcaa gctgatcaag      240
caggaactgg acaagtacaa gaacgccgtg accgagctgc agctgctgat gcagagcacc      300
cccgccacca acaaccaggc tagaggcagc ggaagcggac ggtccctggg cttcctgctg      360
ggcgtgggca gcgccattgc tagcggagtg gccgtgtcaa aggtgctgca cctggaaggc      420
gaagtgaaca agatcaagtc cgccctgctg agcaccaaca aggccgtggt gtccctgagc      480
aacggcgtgt ccgtgctgac cagcaaggtg ctggatctga agaactacat cgacaagcag      540
ctgctgccca tcgtgaacaa gcagagctgc agcatcccca acatcgagac agtgatcgag      600
ttccagcaga agaacaaccg gctgctggaa atcacccgcg agttcagcgt gaacgccggc      660
gtgaccaccc ccgtgtccac ctacatgctg accaacagcg agctgctgag cctgatcaac      720
gacatgccca tcaccaacga ccagaaaaag ctgatgagca acaacgtgca gatcgtgcgg      780
cagcagagct actccatcat gagcatcatc aaagaagagg tgctggccta cgtggtgcag      840
ctgcccctgt acggcgtgat cgacaccccc tgctggaagc tgcacaccag ccccctgtgc      900
accaccaaca ccaaagaggg cagcaacatc tgcctgaccc ggaccgaccg gggctggtac      960
tgcgataatg ccggcagcgt gtcattcttt ccacaagccg agacatgcaa ggtgcagagc     1020
aaccgggtgt tctgcgacac catgaacagc ctgaccctgc cctccgaagt gaacctgtgc     1080
aacgtggaca tcttcaaccc taagtacgac tgcaagatca tgacctccaa gaccgacgtg     1140
tccagctccg tgatcacctc cctgggcgcc atcgtgtcct gctacggcaa gaccaagtgc     1200
accgccagca acaagaaccg gggcatcatc aagaccttca gcaacggctg cgactacgtg     1260
tccaacaagg gggtggacac cgtgtccgtg ggcaacaccc tgtactacgt gaacaaacag     1320
gaaggcaaga gcctgtacgt gaagggcgag cccatcatca acttctacga ccccctggtg     1380
ttccccagcg accagttcga cgccagcatc agccaggtca acgagaagat caaccagagc     1440
ctggccttca tcagaaagag cgacgagctg ctgcacaatg tgaatgccgt gaagtccacc     1500
accaatatca tgatcaccac aatcatcatc gtgatcatcg tcatcctgct gtccctgatc     1560
gccgtgggcc tgctgctgta ctgcaaggcc cggtccaccc ctgtgaccct gtccaaggac     1620
cagctgagcg gcatcaacaa tatcgccttc tccaacgagg gccgcggcag cctgctgacc     1680
tgcggcgacg tggaggagaa ccccggcccc ggtaccgcca ccatggacgc catgaagagg     1740
ggcctgtgct gcgtgctgct gctgtgcggc gccgtgttcg tgagccccag caccgtgaaa     1800
acaaagaaca ccaccaccac ccagacccag cccagcaagc ccaccaccaa gcagcggcag     1860
aacaagcccc ccaacaagcc caacaacgac ttccacttcg aggtgttcaa cttcgtgccc     1920
tgcagcatct gcagcaacaa ccctacctgc tgggccatct gcaagcggaa gcctaacaag     1980
aagcccggca agaaaaccac cacaaagccc accaagaagc ctaccttcaa gaccacaaag     2040
aaggacctga agccccagac caccaagccc aaagaggtgc ccaccactaa gcccggaggc     2100
ggcggatcca cagtgaaaac taagaatacc acaacaacac agacacagcc ttccaagcct     2160
acaacaaaac agaggcagaa caaacctcct aacaaaccta acaatgattt tcactttgaa     2220
gtgttcaatt ttgtgccttg ctccatctgc tccaacaatc caacatgttg ggctatctgt     2280
aaacgcaaac ccaacaagaa acctgggaaa aagaccacca ccaaacctac aaagaaaccc     2340
acctttaaaa ccaccaagaa agatctgaaa cctcagacaa caaaacctaa agaagtgcct     2400
actaccaagc ccggaggcgg cggatccacc gtgaaaacaa aaaacacaac aacaactcag     2460
actcagccct ctaaacccac aactaagcag agacagaaca agcctccaaa caagccaaac     2520
aatgatttcc atttcgaagt gtttaacttt gtgccatgtt ctatctgttc taacaatccc     2580
acttgttggg ccatctgcaa aagaaagcca aacaaaaaac ccggcaaaaa gacaacaact     2640
aagcctacca aaaagcccac attcaaaact accaaaaagg atctgaagcc acagacaact     2700
aagccaaaag aagtgcccac aacaaaaccc tgataa                               2736
<---