Способ прогнозирования рецидива ранней преэклампсии по маркерам эндотелиальной дисфункции
METHOD FOR PREDICTING THE RECURRENCE OF EARLY PREECLAMPSIA BY MARKERS OF ENDOTHELIAL DYSFUNCTION

Изобретение относится к медицине, в частности к акушерству, и может быть использовано для прогнозирования рецидива ранней преэклампсии по данным показателей биомаркеров системного эндотелиоза, а именно уровня эндотелина-1 и микровезикул эндотелиального происхождения в сроки гестации 11-13 недель.
Преэклампсия (ПЭ) является специфическим осложнением беременности, связанным с повышенным артериальным давлением, повышенным сопротивлением почечных сосудов и дисфункцией эндотелия. Определено, что ПЭ - одна из основных причин материнской и перинатальной заболеваемости и смертности, и до настоящего времени не разработано патогенетически обоснованных терапевтических вмешательств из-за неполного понимания механизмов, вовлеченных в патофизиологию ПЭ (Sava RI, March KL, Pepine CJ. Hypertension in pregnancy: Taking cues from pathophysiology for clinical practice. Clin Cardiol. 2018 Feb;41(2):220-227. doi: 10.1002/clc.22892.).
При этом исследования последних лет показывают, что первичным звеном в патогенезе ПЭ является материнская эндотелиальная дисфункция (Сидорова И.С., Никитина Н.А. Преэклампсия как гестационный иммунокомплексный комплементоопосредованный эндотелиоз. Российский вестник акушера-гинеколога. 2019; 19(1): 5-11. https://doi.org/10.17116/rosakush2019190115.), характеризующаяся дисфункцией нескольких сигнальных путей, включая систему эндотелина-1 и патологическую экспрессию экстраклеточных микровезикул эндотелиального происхождения (EVs). Метаанализ 16 опубликованных когортных исследований, включающих 1739 пациентов с реализованной гипертензией и 409 контрольных, показал, что концентрации эндотелина-1 в плазме повышены у беременных с гипертонией по сравнению с контрольной группой с нормальным артериальным давлением (Lu YP, Hasan АА, Zeng S, Hocher В. Plasma ET-1 Concentrations Are Elevated in Pregnant Women with Hypertension -Meta-Analysis of Clinical Studies. Kidney Blood Press Res. 2017;42(4):654-663. doi: 10.1159/000482004.). Наиболее вероятной причиной усиленного биосинтеза эндотелина-1 является ишемия плаценты, в следствии неадекватной инвазии ворсин синцитиотрофобласта (Bakrania ВА, Spradley FT, Satchell SC, Stec DE, Rimoldi JM, Gadepalli RSV, Granger JP. Heme oxygenase-1 is a potent inhibitor of placental ischemia-mediated endothelin-1 production in cultured human glomerular endothelial cells. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2018 Mar 1;314(3):R427-R432. doi: 10.1152/ajpregu.00370.2017).
EVs эндотелиального происхождения рассматриваются в качестве ключевых биологических маркеров дисфункции/деструкции эндотелия, выполняющие роль мессенджеров межклеточных коммуникаций в патогенезе развития системного эндотелиоза, клиническим примером которого является ранняя ПЭ (Brewster LM, Garcia VP, Levy MV, Stockelman KA, Goulding A, DeSouza NM, Greiner JJ, Hijmans JG, DeSouza CA. Endothelin-1-induced endothelial microvesicles impair endothelial cell function. J Appl Physiol (1985). 2020 Jun 1;128(6):1497-1505. doi: 10.1152/japplphysiol.00816.2019).
Несмотря на то, что пациентки с ранней ПЭ в личном анамнезе относятся к группе высокого риска рецидива, в которой осуществляется комплекс профилактических мероприятий и углубленное диспансерное наблюдение, рецидив заболевания достигает 10-25%, что предполагает поиск новых биомаркеров и мишеней терапевтических возможностей (Brouwers L, van der Meiden-van Roest AJ, Savelkoul C, Vogelvang ТЕ, Lely AT, Franx A, van Rijn BB. Recurrence of pre-eclampsia and the risk of future hypertension and cardiovascular disease: a systematic review and meta-analysis. BJOG. 2018 Dec;125(13):1642-1654. doi: 10.1111/1471-0528.15394).
Известен способ прогнозирования риска развития ПЭ у женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрально-Черноземного региона России, (патент РФ, 2016 год: RU 2642939) посредством анализа полиморфизма металлопротеиназы-1 (ММР-1) (rs 1799750) и оценки риска развития ПЭ по уравнениям линейной дискриминантной функции, включающим в себя такие переменные как индекс массы тела, наличие ПЭ в анамнезе, наличие гинекологической патологии, наличие инфекций, передающихся половым путем, систолическое артериальное давление (АД), диастолическое АД, генетический вариант по локусу ММР-1.
Развитие ПЭ прогнозируют по сумме баллов, полученных в формуле уравнений бинарной логистической регрессии. Недостатком способа является необходимость проведения сложных математических расчетов, составления уравнений линейной дискриминантной функции. Информативность предложенного способа доказана только для пациенток, являющихся уроженками Центрально-Черноземного региона России.
Известен способ прогнозирования ранней ПЭ на сроке беременности 11-13 недель (Патент РФ, 2018 год: RU 2732489) путем определения P1GF (плацентарный фактор роста) и sVEGF R1 (растворимый рецептор-1 васкулоэндотелиального фактора роста) в периферической крови женщин в сроке беременности 11-13 недель. При регистрации P1GF более 60 пг/мл в сочетании с sVEGF R1 более 2000 пг/мл прогнозируют увеличение риска развития ранней преэклампсии. Недостатком данного способа является дороговизна, а также специфичность вышеуказанных маркеров в отношении задержки роста плода (ЗРП), а также формирования плацентарной недостаточности, наличие которых может затруднять диагностику ПЭ.
Известен способ прогнозирования тяжелой ПЭ (патент РФ, 2020 год: RU 2739694), основанный на вычислении прогностического индекса развития ПЭ по формуле: РIПЭ= -2,42X1-3,17X2+1,48X3+0,1X4-0,1X5-7,35X6+1,93X7-32,3, где Р1ПЭ- прогностический индекс развития тяжелой преэклампсии; X1-наличие анемии (1 - у пациентки имеется анемия (гемоглобин в 1 триместре <110 г/л), 0 - нет анемии); Х2- наследственность, отягощенная по сердечнососудистой патологии (1 - отягощенная наследственность, 0 - неотягощенная наследственность); Х3- уровень АЧТВ в 1 триместре, с; Х4- уровень ACT в 1 триместре, Ед/л; Х5- уровень креатинина в 1 триместре, мкмоль/л; Х6- MHO в 1 триместре, усл. ед.; Х7- уровень РАРР-А в 11-13,6 недель, МоМ; Константа = - 32,3. При РIПЭ > 0 прогнозируют низкий риск развития тяжелой преэклампсии, а при РIПЭ ≤ 0 делают заключение о высоком риске развития тяжелой ПЭ. Недостатком заявленного способа является необходимость выполнения значительного количества лабораторных исследований, отсутствие ссылок на перечень сердечно-сосудистых заболеваний у беременной, что может снижать информативность метода, и необходимость проведения сложных математических расчетов.
Прототипом заявляемого способа выбран патент РФ RU 2693412 (2018) «Способ прогнозирования ранней и поздней преэклампсии», в котором авторы путем количественного определения в плазме крови концентрации фактора некроза опухоли альфа (ФНОα), фактора роста плаценты (ФРП) и плацентарного альфа-1 микроглобулина (ПАМГ), значения индекса инсулинорезистентности (HOMA-IR), уровней инсулина и лептина в сроки гестации 11-14 и 18-21 недель прогнозируют соответственно раннюю и позднюю ПЭ. При значении этих показателей в сроки 11-14 недель и 18-21 недель беременности соответственно: концентрации ФНОα (пкг/мл) - 44±5,1 и 91±8,7; концентрации ФРП (пкг/мл) - 84±11 и 263±22; концентрации ПАМГ (нг/мл) - 8,6±2,2 и 72,4±7,6; значении HOMA-IR - 1,52±0,13 и 3,64±0,36; уровня инсулина (пмоль/мл) - 59,7±5,6 и 152,3±7,8; уровня лептина (нг/мл) -34,1±3,3 и 48,3±4,4 прогнозируют рано проявляющуюся ПЭ; при значении этих показателей в указанные сроки беременности соответственно: концентрации ФНОа (пкг/мл) - 16±2,8 и 86±7,5; концентрации ФРП (пкг/мл) -114±12 и 272±26; концентрации ПАМГ (нг/мл) - 7,7±2,1 и 75,6±7,9; значении HOMA-IR - 0,93±0,08 и 3,58±0,33; уровня инсулина (пмоль/мл) - 33,7±3,4 и 144,6±7,4; уровня лептина (нг/мл) - 20,6±2,4 и 44,5±4,1 прогнозируют поздно проявляющуюся ПЭ.
Недостатком метода является необходимость проводить исследование дважды за беременность в 11-14 и 18-21 неделю. Кроме того, референсные значения для физиологического течения беременности, лежащие в основе изобретения, специфичны для набранной выборки и могут отличаться от таковых в популяции.
Авторы предлагают простой, доступный способ прогнозирования рецидива развития ранней ПЭ у пациенток группы риска, позволяющий своевременно стратифицировать беременных в группу для проведения дополнительных методов обследования и профилактических мероприятий.
Технический результат заявляемого способа достигается путем определения концентрации ЭТ-1 в плазме периферической крови и измерения количества CD144 позитивных (+) событий (EVs эндотелиального происхождения) в объеме безтромбоцитарной плазмы крови в сроки гестации 11-13 недель.
Способ осуществляют следующим образом.
Для определения концентрации ЭТ-1 кровь для исследования забирают утром, натощак, из локтевой вены в пробирки "VACUETTE" 3,0 мл, содержащие ЭДТА. Кровь должна быть обработана в течение 1 часа после сбора. Центрифугирование проводят при 1500g в течение 15 минут при комнатной температуре для получения бедной тромбоцитами плазмы (БТП). При необходимости образцы бедной тромбоцитами плазмы переносят в эппендорфы и замораживают с последующим хранением при -50°С до проведения анализа (но не более чем 6 месяцев). В день проведения анализа образцы плазмы размораживают (если они были заморожены) при +37°С на водяной бане.
Данный тест основан на методе количественного твердофазного иммуноферментного анализа типа «сэндвич». Лунки микропланшета покрыты специфическими моноклональными антителами к эндотелину-1. В ходе реакции в лунки микропланшета вносят стандарты и образцы, и эндотелии-1, присутствующий в образце, связывается с иммобилизованными антителами. После промывки несвязавшиеся компоненты удаляются, и в лунки вносят моноклональные антитела к эндотелину-1, конъюгированные с ферментом.
После второй промывки и удаления несвязавшегося конъюгата фермент-антитела добавляется субстратный раствор, который взаимодействует с ферментом с образованием цветного комплекса. Интенсивность окрашивания раствора прямо пропорциональна концентрации эндотелина-1, присутствующего в образце. Цветная реакция останавливается стопраствором и интенсивность окрашивания измеряется на микропланшетном фотометре.
Для измерения количества CD144 позитивных (+) событий (EVs эндотелиального происхождения) забор крови для исследования проводят утром, натощак, из локтевой вены в пробирки "VACUETTE" 4,5 мл, содержащие забуференный раствор цитрата натрия 3,2%, соотношение объемов крови и цитрата натрия - 9:1. Кровь должна быть обработана в течение 1 часа после сбора. Далее, последовательными центрифугированиями, получают свободную от тромбоцитов плазму (PFP или СТП), которая подвергается дальнейшему анализу. Сначала центрифугирование проводят при 2500 × g в течение 15 минут при комнатной температуре для получения бедной тромбоцитами плазмы (БТП). Верхний слой (3/4) БТП еще дважды центрифугируют при 2500 × g в течение 15 минут при комнатной температуре, отбирая на каждом этапе 3/4 верхнего слоя супернатанта для получения свободной от тромбоцитов плазмы (PFP или СТП), которая может быть тут же проанализирована.
При необходимости образцы безтромбоцитарной плазмы могут быть заморожены при температуре кипения жидкого азота (-196°С) с последующим хранением при -70°С до проведения анализа (но не более чем 6 месяцев). В день проведения анализа замороженные образцы плазмы размораживают при+37°С на водяной бане, переносят из криопробирок в микроцентрифужные пробирки и проводят дополнительное центрифугирование 3000xg 10 минут. После центрифугирования супернатант (3/4 верхнего слоя) используют для анализа.
Подготовка конъюгированных антител и настройка прибора.
Для окрашивания эндотелиальных внеклеточных везикул по данному изобретению предлагается использовать антитела против CD144 (VE-кадгерин, или кадгерин 5 2-го типа). Антитела против CD144 могут быть коньюгированны с любым коммерчески доступным флуорофором, позволяющим получить хороший сигнал для событий с низкой представленностью. Перед работой с антителами необходима их подготовка для устранения шума: антитела разводят в 20 раз фосфатно-солевым буфером и подвергают центрифугированию 20000 × g - 12 минут для удаления возможных конъюгатов.
Окрашивание проводят смешиванием 5 мкл коньюгированных антител с 50 мкл образца, перемешиванием и последующей экспозицией в темном месте в течение 20-30 минут. В качестве отрицательного контроля допустимо использование, как неокрашенного образца в том же разведении, что и окрашенный образец, так и соответствующего изотипического контроля. Непосредственное измерение событий может проводиться на любом проточном цитофлюориметре с пределом обнаружения событий не менее 200 нм. Например, CytoFlex (Beckman Coulter, США), который использует боковое светорассеяние на более короткой длине волны 405 нм (фиолетовый лазер) в качестве триггерного сигнала, что повышает чувствительность и разрешения исследуемых объектов, позволяя обнаруживать частицы с диаметром менее 500 нм (предел обнаружения на уровне 150-200 нм). Для отнесения CD144+ событий к внеклеточным везикулам используется параметр размера (0,1-1 мкм), гейт для которого формируются в ходе использования микрогранул фиксированного размера с пришитой флуоресцентной меткой (0,1 - 1,0 мкм). Например, Flow Cytometry Sub-micron Particle Size Reference Kit, Thermoflsher, США, с набором калибровочных шариков 0.1, 0.2, 0.5, и 1.0 мкм, по которым выставляется ориентировочный гейт в диапазоне от 0,1 до 1 мкм.
Обязательным в описываемом методе проведение проверки на возможный вклад в «шум» для фосфатно-солевого буфера, а также для антител, разведенных в фосфатно-солевом буфере в тех же пропорциях, что и окрашенные образцы. Только после этого можно переходить к измерению для неокрашенных проб, по которым выставляется граница для «CD144-» гейта. Соответственно все события, превышающие по величине сигнала отрицательный гейт, относят к положительным событиям.
Окрашенные пробы по истечении 20-30 минут инкубации повторно встряхивают и проводят измерение после разбавления пробы фосфатно-солевым буфером достаточным, чтобы избежать эффекта роя («swarm effect») или совпадения (coincidence). В каждом анализе проводится запись 1 млн всех событий на скорости 10 мкл/мин, предварительно убеждаясь, что в анализируемой области нет объектов более 1000 нм. После измерения окрашенной пробы выборочно может проводится тест с тритоном XI00 (детергент, разрушающий мембраны эукариотических клеток).
Для статистической обработки использовали параметр количества событий (внеклеточных событий) в 1 мкл.
Для подтверждения эффективности заявляемого способа проведено проспективное наблюдательное исследование, с включением 127 пациенток, с ранней тяжелой преэклампсией в анамнезе, которые по исходам наблюдаемой беременности были разделены на 2 группы: с благоприятным исходом данной беременности (группа сравнения n=59), и с рецидивом тяжелой ПЭ в настоящую беременность (основная группа n=38). Из группы наблюдения к моменту формирования групп сравнения по объективным причинам были исключены 30 пациенток (у 17 женщин зарегистрирована неразвивающаяся беременность, 9 - принимали низкомолекулярные гепарины со второго триместра беременности, у 3 пациенток произошла преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты, 1 женщина отказалась от участия в исследовании).
Критерии включения в исследование: одноплодная спонтанная беременность, возраст пациентки от 18 до 35 лет, ранняя тяжелая ПЭ в анамнезе.
Критерии исключения из исследования: беременность, наступившая в программах вспомогательных репродуктивных технологий, многоплодная беременность, семейный и личный отягощенный тромботический и геморрагический анамнез, соматическая патология (гипертоническая болезнь, сахарный диабет, ожирение, системная красная волчанка, антифосфолипидный синдром). Необходимо отметить, что все беременные женщины с 12 недель беременности получали ацетилсалициловую кислоту в суточной дозе 150 мг, согласно клиническим рекомендациям.
Сформированные по окончанию гестации группы сравнения были сопоставимы по клиническим характеристикам и социальному статусу. Медиана возраста пациенток группы контроля составила 31 [95% CI 29,0-34] год, основной - 28,4 [95% CI 25,6-33,4] лет.
Медиана (Me) уровня ЭТ-1 на при обследовании в сроке беременности 11-13 недель в группе контроля составила 0,42 пмоль/мл (95% CI:0,29-0,61), в основной 0,92 пмоль/мл (95% CI:0,81-1,11), разница показателей статистически достоверна (р=0,0003) (Фиг. 1). Для определения порогового значения ЕТ-1 в плазме крови и степени прогностической информативности теста проведен ROC-анализ. Установлено, что при значении уровня ЕТ-1 в плазме крови >0,497 пмоль/мл число верно классифицируемых положительных случаев составляет 100%, верно классифицируемых отрицательных случаев - 62,5% (Фиг. 2).
Медиана (Me) уровня EVs эндотелиального происхождения при обследовании в сроке беременности 11-13 недель в группе контроля составила 0,40 соб/мкл (95% CI:0,17-0,44), в основной 1,77 соб/мкл (95% CI:1,67-2,97), разница показателей статистически достоверна (р<0,0001) (Фиг. 3). Для определения порогового значения уровня EVs эндотелиального происхождения в плазме крови и степени прогностической информативности теста проведен ROC-анализ. Определено, что при значении уровня EVs в плазме крови >0,97 соб/мкл число верно классифицируемых положительных случаев составляет 100%, верно классифицируемых отрицательных случаев -100% (Фиг. 4).
Клиническое наблюдение 1
И.С.Н. - повторнобеременная, повторнородящая 30 лет. Менструальная функция не нарушена. В 2019 году преждевременные роды в сроке гестации 28 недель оперативным путем в связи с тяжелой преэклампсией (АД 210/120, белок в разовой порции мочи 6,0 граммов/литр). Родился живой плод мужского пола весом 720 грамм, умер на 3 сутки жизни. Данная (анализируемая) беременность вторая, спонтанная, желанная. Наступила на 2 месяце регулярной половой жизни без контрацепции после этапа прегравидарной подготовки. При взятии на диспансерный учет рост пациентки 155, вес 44 кг, ИМТ=18,3. Консультацию посещала регулярно. При обследовании в первом триместре отклонений в лабораторных показателях не зарегистрировано.
Первый ультразвуковой скрининг в сроке гестации 11,5 недели. Ультразвуковых маркеров хромосомной патологии не обнаружено. Ультразвуковая анатомия плода без патологии. Рассчитан риск развития акушерских осложнений в программе Astraia как высокий (риск ПЭ до 37 недель беременности - 1 из 67, риск по задержке роста плода до 37 недель беременности - 1 из 54). Уровень ЭТ-1 в 12 недель беременности - 0,98 пмоль/мл, уровень EVs эндотелиального происхождения 1,94 соб/мкл. При проведении второго ультразвукового скрининга в сроке гестации 19,5 недель: ультразвуковых маркеров хромосомной патологии не обнаружено. Ультразвуковая анатомия плода без патологии. Показатели фетометрии в пределах референсных значений. По данным доплерометрии патологические кровотоки в маточных артериях, сосудах пуповины не зарегистрированы.
В 29 недель на фоне полного благополучия появилась сильная головная боль, не купируемая приемом анальгетиков (принимала по совету родственников). При обращении в стационар АД 210/120; протеинурия в разовой порции мочи 7 граммов/литр. Переведена в отделение реанимации и интенсивной терапии (диагноз: беременность 29,1 неделя; тяжелая преэклампсия), при стабилизации состояния (через 4 часа) экстренно родоразрешена абдоминальным путем. Родился недоношенный мальчик, весом 1450. Кровопотеря в родах составила 650 мл. Стабилизация пациентки на 3 сутки после родоразрешения. Переведена с ребенком на второй этап выхаживания новорожденных. Клиническое наблюдение 2.
З.Т.Г. - повторнобеременная, повторнородящая, 35 лет. Менструальная функция не нарушена, гинекологические заболевания отсутствуют. В анамнезе преждевременные роды оперативным путем в сроке гестации 30 недель по поводу тяжелой преэклампсии. Родилась девочка, весом 1380 грамм. Соматические заболевания отрицает. Беременность желанная, запланированная, наступила сразу после отмены контрацепции. При взятии на диспансерный учет рост пациентки 161, вес 64 кг, ИМТ=24,69. Консультацию посещала регулярно. При обследовании в первом триместре отклонений в лабораторных показателях не зарегистрировано.
Первый ультразвуковой скрининг в сроке гестации 11,5 недели: КТР 50,2 мм, соответствует сроку 11,5 недели. Ультразвуковых маркеров хромосомной патологии не обнаружено. Ультразвуковая анатомия плода без патологии. Допплерометрические характеристики маточно-плацентарного кровотока в норме. Рассчитан риск развития акушерских осложнений в программе Astraia как высокий (риск ПЭ до 37 недель беременности - 1 из 82, риск по задержке роста плода до 37 недель беременности - 1 из 68). Уровень ЭТ-1 в 12 недель беременности - 0,47 пмоль/мл, уровень EVs эндотелиального происхождения 0,38 соб/мкл.
При проведении второго ультразвукового скрининга в сроке гестации 20,1 недель: фетометрически плод соответствует сроку 20,1 недель. Ультразвуковых маркеров хромосомной патологии не обнаружено. Ультразвуковая анатомия плода без патологии. Течение беременности благоприятное.
В 38 недель проведено плановое оперативное родоразрешение по причине наличия рубца на матке после кесарева сечения в анамнезе и отказа женщины от родов через естественные родовые пути. Родилась девочка, весом 3100 грамм 50 см. На 5-е сутки выписаны домой с ребенком из родильного дома.