ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКОЕ ТИТРОВАНИЕ β-ЛАКТОГЛОБУЛИНА МОЛОЧНОЙ СЫВОРОТКИ

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН __________________2011, том 54, №2_____________

Институт химии им. В.И.Никитина АН Республики Таджикистан

С использованием метода потенциометрического титрования проведено сравнительное изучение ионного равновесия лактоглобулина и концентрата лактоглобулина молочной сыворотки в растворе в присутствии низкомолекулярного электролита. Найдены значения характеристической рК0 ионогенных групп для изученных биополимеров.

Ключевые слова: потенциометрическое титрование - полиэлектролиты - ионное равновесие - лактоглобулин.

Структурная организация полимерных цепей полиэлектролитов и энергия внутримолекулярных взаимодействий непосредственно связаны с электростатической энергией, вызванной диссоциацией ионогенных групп макромолекул. Количественной мерой этой энергии является значение рКа, где Ка -кажущаяся константа ионизации функциональных групп полимера [1,2].

Величина pKa, при моделировании полимерных цепей в виде стержня непосредственно связана с эффективной плотностью локального заряда X = ae2/DbkT [3] и с электростатическим потенциалом его поверхности у^):

где a - степень диссоциации или ионизации.

Целью настоящей работы явилось изучение ионного равновесия в растворах Р-лактоглобулинов (P-Lg) молочной сыворотки (МС) методом потенциометрического титрования.

Потенциометрическое титрование проводилось с использованием лабораторного pH-метра (Metrohm 827 model,Germany).

На рис.1 представлены кривые потенциометрического титрования карбоксильных групп P-Lg стандартного образца (Sigma), P-Lg, выделенного из МС [4] и сама МС. Как видно из рис. 1, для всех исследованных объектов в точке перехода потенциометрического титрования происходит излом кривой зависимости рН от величины объема добавленной щелочи.

Адрес для корреспонденции: Мухидинов Зайниддин Камарович. 734063, Республика Таджикистан, г. Душанбе, ул. Айни, 299/2, Институт химии АН РТ. E-mail: zainy@mail.ru

kT

a

Рис.1. Кривые потенциометрического титрования карбоксильных групп P-Lg стандартного, выделенного из МС

и белков молочной сыворотки.

Середина кривой появляется при одном и том же значении pH (5.2), а точки излома отличаются количеством титранта, пошедшего на ионизацию свободных карбоксильных групп. Кривые титрования карбоксильных групп образцов P-Lg стандартного и выделенного из МС немного отличались (рис 1.) из-за возможной примеси во втором образце. В то же время кривые титрования имида-зольной группы у них схожи для обоих образцов (рис.2).

Рис.2. Кривые потенциометрического титрования P-Lg соответственно для: имидазольных групп стандартного и выделенного из МС P-Lg, а также имидазольных групп P-Lg в присутствии 0.1 №С1.

Среди множеств функциональных групп у белков только те функциональные группы ионизируются, которые находятся на поверхности, то есть боковые карбоксильные и аминогруппы, играющие важную роль в установлении нативной структуры и их поведении в растворе [5]. Известно, что Р-^ имеет 48 карбоксильных групп, находящихся в боковых частях, и две концевые группы [6], которые ионизируются при различных значениях рН раствора. В кислотной среде из-за протонирования имидо-зольных групп макромолекула Р-^ в целом принимает положительный заряд. По эксперименальным

данным, представленным на рис. 1 и 2, вычислены кажущиеся константы диссоциации (pKa) как функции степени диссоциации (а), согласно уравнению:

pKa = pH + log (l-а )/ а.

С другой стороны, согласно теории Лифсон-Качальского:

pKa = pKo + ApK(a),

где К0 - константа ионизации функциональных групп полимера, а ApK(a) представляет вклад электростатических взаимодействий функциональных групп и определяется путем интегрирования площади под кривой рКа - f(a).

7.00 6 00 5 00 4 00

а*

“ 3 00 200

1.00 0 00

000 020 040 060 080 1 00

a

Рис.3. Зависимость рКа от степени диссоциации а имидазольных и карбоксильных групп в P-Lg: линии 1- и 1*-соответствуют имидазольным группам в присутствии и отсутствии NaCI; 2- и 2*- линии относятся к карбоксильным группам в присутствии и отсутствии NaCl. C(P-Lg) - 2.1мг/мл.

Таким способом значения рК0 найдены для всех изучаемых образцов лактоглобулинов и приводятся в таблице. Из данных потенциометрического титрования также можно определить величину плотности заряда, безразмерной величины Qr, относительно недиссоциированных карбоксильных групп P-Lg, используя уравнение [7]:

Qr = C^m/M^g),

где m - масса полимера (гр), M(Lg) - молекулярная масса P-Lg (г/моль), C - концентрация титранта (моль/л) и V3ra - объем титранта в точке эквивалентности (мл).

Значения рК0 для основных и концевых кабоксильных и имидазольных групп гистидинового остатка стандартного образца хорошо согласуются с известными данными [5].

Следует также отметить, что ионизация функциональных групп приводит к изменению пространственной структуры P-Lg из складчатой к развернутой, причем влияние карбоксильной группы больше, чем имидазольных. К такому заключению приводят численные значения АрК0, которые для -СООН групп в два раза выше имидазольных (таблица). Известно, что каждое уменьшение значения

рКа ионогенной группы в развернутом состоянии на единицу соответствует изменению свободной энергии нативной формы протеина на 1.4 ккал/моль [4].

Таблица

Величины УЭКв, Ог, рКо, ДрКо для Р^

Функциональная группа протеина Растворитель Vэкв*, мл Qr рКс ДрКс

P-Lg-имидазол H2O - 25.7 6.07 0.15

P-Lg-имидазол 0.1NaCl - 25.7 5.92

Р^ -СООН боковые H2O 0.72 12.34 4.45 0.35

Р^-СООН боковые 0.1NaCl 2.85 48.86 4.10

P-Lg -СООН концевые H2O 6.03 0.34

P-Lg-COOH концевые 0.1NaCl 6.37

P-Lg-имидазол конц. H2O - 25.7 7.47

Р^-СООН конц. H2O 0.44 7.54 3.27

* Количество 0.01н NaOH, пошедшего на нейтрализацию карбоксильных групп.

В результате добавления хлорида натрия к растворам P-Lg происходит уменьшение значения pK0 как для -COOH, так и для имидазольных групп, что является следствием электростатического взаимодействия фонового электролита (рис.3, табл.). Согласно данным ЯМР-спектроскопии [8], влияние фонового электролита на значение рКа гистидинового остатка His-121 белка чрезвычайно велико, что является следствием усиления репульсионного (отталкивающего) кулоновского взаимодействия с другими основными группами. Однако гистидиновый остаток, который подвергается ионизации, находится на 156 месте [9] и, согласно нашим данным, влияние использованного фонового электролита на His-156 незначительно и, следовательно, имидазольная группа у P-Lg является малодоступной к ионизации.

Таким образом, представленные в настоящей статье экспериментальные данные свидетельствует о том, что ионизация кислых групп в P-Lg вносит больший вклад в устойчивость пространственной структуры, чем ионизация основных групп.

Поступило 05.01.2011 г.

ЛИТЕРАТУРА

4. Levitt М. - J. Mol. Biol., 1976, v. 103, р. 227.

5. Malovikova A., Milas M., Rinaudo M., Borsali R. - “Macroions Characterization from dilute solution to complex fluids”, ACS Symposium series 548, Edit. K.S.Schmitz. - 1994, p.297.

6. Lifson S., Katchalsky A. - J.Polym.Sci., 1954, v.13, рp.43-55.

7. Мухидинов З.К., Джонмуродов А.С., Тешаев Х.И. и др. - Здравоохранение Таджикистана, 2009, №5, с.44-49

8. Creighton T.E. 1993. Proteins: Structures und molecular properties. 2nd ed. New York: W.H. Freeman & Co.

9. Basch J.J., Timasheff S.N. - Archives of Biochemistry and Biophysics Volume, 1967, v. 118, Issue 1, pp. 37-47.

10. Mattison K.W., Dubin P.L.,Brittian I.J. - Journal of Pysical Chemistry B.- 1998, v.102, pp. 38303836.

11. Anderson D.E., Becktel W.J., Dahlquist F.W. - Biochemisty, 1990, v. 29, pp. 2403-2408.

12. Lee K.K., Fitch C.A., Lecomte J.T.J., Garcia-Moreno E.B. - Biochemistry, 2002, v.41, p.5656.

З.К.Мухидинов, С.Р.Усмонова, Х.И.Тешаев, З.Б.Шарифова, Ф.Н.Чураева, Ч.Х.Холиков ТИТРОНИДАНИ ПОТЕНСИОМЕТРИИ р-ЛАКТОГЛОБУЛИНИ ЗАРДОБИ

ШИР

Институти химияи ба номи В.И.Никитини Академияи илмх;ои Тоцикистон

Истифодаи усули титронидани потенсиометрй дар омузиши мувозинати ионии сафедахои зардоби шир дар махлулхои бо ионхои мук;обил ва бе онхо гузаронида шудааст. Ин тарзи тач^из имконияти фахмиши модели биополимерхоро дар махлул фарохам меоварад. Дар натича pKo барои хардуи гуруххои ионизацияшавандаи биополимерхо муайян карда шудааст. Калимщои калиди: титронидани потенсиометрй - полиэлектролит - мувозинати ионї - лактоглобулин.

Z.K.Muhidinov, S.R.Usmanov, Kh. I. Teshaev, Z.B.Sharifova, F.N.Juraeva, D.Kh.Khalikov POTENTIOMETRIC TITRATION OF WHEY p-LACTOGLOBULIN

V.I.Nikitin Institute of Chemistry, Academy of Sciences of the Republic of Tajikistan Using the method of potentiometric titration carried out a comparative study of ionic equilibrium and complex formation of whey proteins in free and counterion solutions. This makes it possible to understand the polyion model in solution. The intrinsic pK0 for both ionogenic group in lactoglobulines were calculated. Key words: potentiometric titration - polyelectrolytes - ionic equilibrium - pectin - lactoglobulin.