Соединения, обладающие антиишемическими, антиангинальными, цитопротективными свойствами, способ их получения и их применение, способ лечения нейродегенеративного заболевания, способ лечения психического расстройства
COMPOUNDS HAVING ANTI-ISCHEMIC, ANTIANGINAL, CYTOPROTECTIVE PROPERTIES, A METHOD FOR PRODUCTION THEREOF AND USE THEREOF, A METHOD OF TREATING A NEURODEGENERATIVE DISEASE, A METHOD OF TREATING A PSYCHIC DISORDER

Область техники, к которой относится настоящее изобретение
Настоящее изобретение относится к солям 3-(2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)пропан-1-сульфоновой кислоты, обладающим антиишемическими, антиангинальными, цитопротективными свойствами, ноотропной активностью и тормозящим развитие нейродегенеративного заболевания, к способу их получения, а также к способу лечения нейродегенеративных заболеваний и психических расстройств с их применением.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
В настоящее время ведется активный поиск соединений, обладающих ноотропным действием. Все большую актуальность приобретают ноотропы, т.е. нейрометаболические стимуляторы, которые используют для улучшения когнитивных навыков, функциональности и самочувствия пациентов во многих областях медицины. К нарушениям когнитивных способностей относятся психиатрические расстройства, такие как синдром дефицита внимания и гиперактивности, шизофрения и депрессия. Когнитивные проблемы в психиатрических расстройствах включают нарушение внимания, памяти и недостаток когнитивного контроля префронтальной коры головного мозга. Ноотропы назначают также при когнитивных нейродегенеративных нарушениях, например, при болезни Альцгеймера, Паркинсона и Хантингтона.
Одним из наиболее известных и применимых препаратов данной группы является пирацетам. Пирацетам был синтезирован в 1964 г. (Dr. Corneliu Е. Giurgea, The Father of Nootropics) и остается основным представителем данной группы препаратов (М.Д. Машковский. Лекарственные средства. Часть 1, с. 117 М.: Медицина, 1965 г.). Химически пирацетам представляет собой производное пирролидона и является родоначальником семейства так называемых «рацетамов» (S. Shorvon. Pyrrolidone derivatives // The Lancet, 2001, V. 358, P. 1885-1892). В большинстве стран мира, включая США и страны Западной Европы, пирацетам и другие ноотропы не зарегистрированы в качестве лекарственных препаратов, так как их эффективность при лечении деменции и нейродегенеративных заболеваний не была доказана в контролируемых исследованиях (Flicker L., Grimley Evans J. Piracetam for dementia or cognitive impairment). Несмотря на это, в России и некоторых других странах пирацетам широко применяется в клинической практике для лечения множества неврологических, психиатрических и других заболеваний. Однако пирацетам также не лишен побочных эффектов: диспептических проявлений, нарушений сна, тремора, нервозности, раздражительности. Кроме того, препарат противопоказан пациентам с коронарной недостаточностью, повышенной судорожной активностью, острой почечной недостаточностью, что ограничивает его применение.
Особый интерес вызывают фенильные производные пирацетама с фрагментами известных ноотропных средств, в частности, раскрытые в ряде патентов СССР: №937450 (выданном в 1982 г.), касающемся 2-(2-оксо-4-фенил-1-пирролидиноацетамидо)ацетамида; №805945 (выданном в 1981 г.), касающемся способа получения 2-(2-оксо-4-фенил-1-пирролидиноацетамидо)ацетамида; №1746665 (выданном в 1990 г.), в котором раскрыты N-ацильные производные 4-фенилпирролидин-2-онов. Также указанные производные раскрыты в патентах Российской Федерации, например, №2440981 (выданном в 2012 г.), №2050851 (выданном в 1995 г.), №2329804 (выданном в 2007 г.), №2291860 (выданном в 2007 г.), и в евразийском патенте №2380 (выданном в 2002 г.).
Наиболее близким аналогом настоящего изобретения являются раскрытые в патенте Российской Федерации №2611623, выданном в 2017 г., соединение N-[(4-фенил-2-пирролидон-1-ил)ацетил]таурат калия, содержащая его композиция и способ лечения нарушений нервной системы с применением указанной композиции. Однако в доклинических испытаниях предложенная композиция показывала некоторое (хотя и слабое) токсическое действие на животной модели.
Поэтому несмотря на наличие довольно большого количества ноотропных лекарственных средств, в медицине сохраняется потребность в расширении спектра безопасных и эффективных препаратов для лечения когнитивных и нейродегенеративных нарушений и психических расстройств.
Раскрытие настоящего изобретения
Таким образом, задача настоящего изобретения заключается в получении безопасного и эффективного антиишемического, антиангинального, цитопротективного и тормозящего развитие нейродегенеративных заболеваний, в том числе болезни Альцгеймера, лекарственного средства, в разработке способа его получения, а также способа лечения нейродегенеративных заболеваний и психических расстройств с его применением.
Для решения этой задачи предлагаются соединения, представляющие собой соли 3-(2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)пропан-1-сульфоновой кислоты, характеризующиеся следующей формулой:
в которой X представляет собой катион металла, выбранного из группы щелочного или щелочноземельного металла.
Авторами настоящего изобретения разработан и осуществлен способ получения соединений по настоящему изобретению, который предусматривает следующие стадии.
1) Получение 3-(2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)пропан-1-сульфоновой кислоты
Указанная стадия иллюстрируется схемой 1.
На данной стадии осуществляют реагирование 1,3-пропансульфона (1) с 1-(триметилсилил)-4-фенилпирролидоном при добавлении толуола с получением сульфоната (3). Затем к сульфонату (3) добавляют ацетонитрил и этанол и получают 3-(2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)пропан-1-сульфоновую кислоту (4).
2) Получение соли 3-(2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)пропан-1-сульфоновой кислоты Указанная стадия иллюстрируется схемой 2.
В воду добавляют полученное на стадии 1 соединение (4) и оксид металла, реакционную смесь нагревают, а затем упаривают. При этом оксидом металла может быть оксид любого металла, выбранного из групп щелочных и щелочноземельных металлов. К остатку добавляют этиловый спирт, при этом выпадают кристаллы, которые отфильтровывают с получением соединения (5), которое является солью 3-(2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)пропан-1-сульфоновой кислоты.
Один из вариантов осуществления способа получения соединений по настоящему изобретению подробно описывается в разделе Примеры.
С целью прогнозирования биологической активности соединений по настоящему изобретению авторы настоящего изобретения использовали компьютерную программу PASS, доступную на веб-ресурсе PASS Online (http://www.way2drug.com/passonline), которая позволяет по структурной формуле «лекарственно-подобного» органического соединения оценить вероятный профиль его активности. При этом прогноз осуществляется на основе анализа связей структура - активность в обучающей выборке, содержащей информацию о структуре и биологической активности более 300 тысяч органических соединений. Результаты прогнозирования представлены в таблице 1.
Как видно из результатов прогнозирования соединения, полученные в соответствии с настоящим изобретением, с большой степенью вероятности обладают антиангинальной, антиишемической, спазмолитической, нейропротективной, противовоспалительной активностью и могут быть использованы для лечения ишемических, цереброваскулярных заболеваний, а также когнитивных и нейродегенеративных расстройств.
С целью исследования следующего аспекта соединений по настоящему изобретению, а именно, для прогнозирования биологической активности используют веб-ресурс SwissTargetPrediction, который осуществляет анализ структурного сходства. Результаты этого анализа представлены на фиг. 9. Из фиг. 9 видно, соединения по настоящему изобретению действуют на мускариновые рецепторы и глутамиламинопетидазу.
С целью исследования следующего аспекта соединений по настоящему изобретению, а именно, для прогнозирования токсичности и проникновения соединений по настоящему изобретению через гематоэнцефалический барьер с помощью программы «Lazar: a modular predictive toxicology framework». Полученные данные из таблицы 2 демонстрируют, что предложенные соединения проходят гематоэнцефалический барьер и не являются онкогенными.
Таким образом, компьютерное моделирование и прогнозирование позволило выяснить, что соединения по настоящему изобретению обладают антиишемической, антиангинальной, цитопротективной активностью и влияют на развитие болезни Альцгеймера, предположительно действуют на мускариновые рецепторы, глутамиламинопетидазу, с большой вероятностью проходят через гематоэнцефалический барьер, а также не обладают онкогенным действием.
На основании прогнозирования и анализа биологической активности in silico можно сделать вывод о целесообразности дальнейшего исследования соединений по настоящему изобретению на биологических объектах. Следовательно, для подтверждения биологической активности полученных в соответствии с настоящим изобретением соединений авторами настоящего изобретения проведен ряд экспериментов на животных моделях, описания и результаты которых представлены в разделе Примеры.
Таким образом, настоящее изобретение относится к соли 3-(2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)пропан-1-сульфоновой кислоты формулы
где X представляет собой катион металла,
обладающей антиишемическими, антиангинальными, цитопротективными свойствами, ноотропной активностью и тормозящей развитие нейродегенеративного заболевания.
В соответствии с одним из вариантов осуществления катион металла является катионом металла, выбранного из щелочных и щелочно-земельных металлов.
В соответствии с одним из предпочтительных вариантов осуществления катион металла является катионом кальция.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения указанной выше соли 3-(2-оксо-4-фенил пирролидин-1-ил)пропан-1-сульфоновой кислоты,
предусматривающему следующие стадии:
1) получение 3-(2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)пропан-1-сульфоновой кислоты, при котором осуществляют реагирование 1,3-пропансульфона с 1-(триметилсилил)-4-фенилпирролидоном при добавлении толуола с получением сульфоната, к которому затем добавляют ацетонитрил и этанол с получением 3-(2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)пропан-1-сульфоновой кислоты;
2) добавление в воду полученной на стадии 1) 3-(2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)пропан-1-сульфоновой кислоты и оксида металла при нагревании.
Кроме того, настоящее изобретение относится к применению указанной выше соли 3-(2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)пропан-1-сульфоновой кислоты в качестве антиишемического, антиангинального, цитопротективного и тормозящего развитие нейродегенеративных заболеваний средства, а также ноотропного средства.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения нейродегенеративного заболевания или нарушения, предусматривающему введение пациенту терапевтически эффективного количества указанной выше соли.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения психического расстройства (в том числе расстройства настроения), предусматривающему введение пациенту терапевтически эффективного количества указанной выше соли.
Примеры
Пример 1
Способ получения 3-(2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)пропан-1-сульфоната кальция
Стадия 1. Получение 3-(2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)пропан-1-сульфоновой кислоты
На данной стадии 1 осуществляли реагирование 1,3-пропансульфона (1) с 1-(триметилсилил)-4-фенилпирролидоном (2). Для этого смесь 6,1 г (0,05 моль) 1,3-пропансульфона, 12,8 г (0,055 моль) 1-(триметилсилил)-4-фенилпирролидона-2 в 12 мл абс. толуола кипятили 3 часа. Фракционированием реакционной смеси получали 8,6 г (49%) триметилсилил-3-(2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)пропан-1-сульфоната (3) с температурой кипения 285-286°С (10 мм рт. ст.).
-1
2
ИК-спектр (тонкий слой, ν, см): 1680 с (C=О), 1257 с, 1161 сл, 1057 ср (SO).
3
Затем к раствору 8,6 г (0,024 моль) триметилсилил-3-(2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)пропан-1-сульфоната (3) в 10 мл ацетонитрила добавляли 3 мл этанола, образовавшиеся кристаллы отфильтровывали. Получали 6,05 г (43%) 3-(2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)пропан-1-сульфоновой кислоты (4) с температурой плавления 146-148°С (CHCN).
13
17
4
2
Найдено (%): С, 51.35; Н, 6.29; N, 4.55; S, 10.36. CHNOS⋅HO. Вычислено (%): С, 51.81; Н, 6.35; N, 4.64; S, 10.63.
-1
2
ИК-спектр (тв. тело, ν, см): 1604 ш (С=O), 1225 ср, 1028 с (SO).
1
6
2
2
3
2
2
2
цикл
Спектр ЯМР Н (DMSO-d, δ, м.д., J/Гц): 1.74-1.87 (кв, 2Н, С-СН-С, J=7.5), 2.31-2.72 (м, 4Н, CHSO и СНСО), 3.32-3.36 (м, 2Н, N-CH), 3.48-3.61 (кв, 2Н, N-CH, J=8.1), 3.72 (т, 1Н, СН-Ph, J=8.7), 7.18-7.37 (м, 5Н, Ph).
13
6
2
2
3
2
2
3
2
C
Спектр ЯМР С (DMSO-d, δ, м.д.): 23.99 (H-CHSO), 37.25 (CH-Ph и СНСО), 41.41, 49.39 (CHSO), 53.85 (N-CH), 127.04 (Ph), 127.28, 128.99, 143.23, 173.21 (С=O).
Стадия 2. Получение 3-(2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)пропан-1-сульфоната кальция
На данной стадии к 4 мл воды, нагретой до 70°С, при перемешивании добавляли 2,83 г (0,01 моль) полученной на стадии 1 3-(2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)пропан-1-сульфоновой кислоты (4) и 0,28 г (0,005 моль) оксида кальция. После 4-х часового нагревания реакционную массу упаривали. К остатку приливали 10 мл этилового спирта, выпавшие кристаллы отфильтровывали с получением 2,1 г (69%) 3-(2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)пропан-1-сульфоната кальция (5) с температурой плавления >300°С.
26
32
2
8
2
Найдено (%):С, 51.33; Н, 5.47; N, 4.73; S, 10.33. CHNOSCa. Вычислено (%): С, 51.64; H,5.33;N, 4.63; S, 10.60.
-1
2
ИК-спектр (тв. тело, v, см): 1678 сл, 1656 с (С=O), 1206 с, 1171 ср, 1054 с (SO).
1
2
2
2
3
2
2
2
цикл
2
цикл
ЯМР Н (DO, δ, м.д., J/Гц): 1.76-1.89 (кв, 2Н, С-СН-С, J=7.5), 2.28-2.40 и 2.56-2.66 (м, 2Н, CHSO), 2.66-2.79 (м, 2Н, СНСО), 3.12-3.33 (м, 2Н, N-CH и 1 N-CH), 3.63 (д+д, 1Н, 1 N-CH, J=9.8, 8.6), 3.63 (кв, CH-Ph, J=7.9), 7.04-7.31 (м, 5Н, Ph).
13
6
2
2
3
2
2
3
2
цикл
C
C
ЯМР С (ДМСО-d, δ, м.д.): 22.01 (СН-CHSO), 36.48 (PhH-HCO), 38.51, 48.35 (CHSO), 54.8 (N-СН), 126.76 (Ph), 128.95, 142.30, 176.80 (С=O).
Пример 2
Изучение биологической активности солей 3-(2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)пропан-1-сульфоновой кислоты
Использовали крыс линии Wistar весом 180-320 г. Крыс получали из питомника лабораторных животных «Столбовая» (Московская область, Чеховский район, пос. Столбовая, ул. Мира, д. 1а). Животных содержали в пластиковых клетках размером 460×300×160 мм, с решетчатой металлической крышкой по 5 особей, в виварии при температуре 22-24°С, относительной влажности воздуха 60%, с циклом свет/темнота 12/12 часов и со свободным доступом к воде и пище.
Все эксперименты проводили согласно «Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (Миронов А.Н. и др., 2012 г.), в соответствии с ГОСТ 33216-2014 («Правила работы с лабораторными грызунами и кроликами») и положениям международной конвенции о «Правилах работы с экспериментальными животными» (Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD №420).
Перед началом исследования животных разделяли на идентичные по активности группы с использованием теста «норковая камера» (см. пример 2): 1 группа (n=5) - контрольная, получала 0,9% NaCl - растворителя для соединения по настоящему изобретению;
3
3
3
4
2 группа (n=5) получала 200 мг/кг тестируемого соединения - 3-(2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)пропан-1-сульфонат кальция по настоящему изобретению. Вещества вводили животным внутрибрюшинно объемом 0,6 мл в течение 5 дней. Затем крыс декапитировали, головной мозг извлекали на льду и выделяли фронтальную кору. Выделенные структуры размельчали в гомогенизаторе «стекло-тефлон» в CHCN и центрифугировали. Проводили измерения концентраций серотонина и дофамина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометром на приборе Shimadzu со следующими параметрами: аналитическая колонка С-18 TRACER EXCEL ODS-A 4,6 мм × 150 мм, 5 мкм; фаза А - CHCN, Б - 0,005 М раствор CHCOONH в воде, рН 5,5; градиент 0,0-0,5 минуты (5% А, 95% Б), 0,5-2,5 минуты (линейный градиент до 20% А), 2,5-4,0 минуты (20% А, 80% Б), 4,0-4,5 минуты (линейный градиент до 95% А) и 4,5-5,0 минуты (95% А, 5% Б); скорость потока элюента 0,8 мл/минута.
Результаты измерений дофамина и серотонина представлены соответственно на фигурах 1А и 1В (хроматограммы дофамина и серотонина) и в таблице 3.
Из таблицы 3 видно, что 3-(2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)пропан-1-сульфонат кальция увеличивает концентрацию дофамина и уменьшает концентрацию серотонина в коре голоного мозга крыс. Следовательно, можно сделать вывод о том, что соединения по настоящему изобретению обладают биологической активностью в отношении головного мозга.
Пример 3
Изучение специфической активности солей 3-(2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)пропан-1-сульфоновой кислоты
В данном исследовании специфической активности солей 3-(2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)пропан-1-сульфоновой кислоты выполняли 3 серии экспериментов (см. таблицу 4). В первой серии исследовали поведение животных под воздействием одной дозы вещества относительно контроля и препарата сравнения в тест-системах, во второй серии производили выработку условного пищедобывательного рефлекса. При этом животным в течение пяти дней внутрибрюшинно один раз в сутки (во второй половине дня) вводили следующие препараты объемом 0,3 мл:
1. контрольная группа: физиологический раствор - 0,9% NaCl;
2. опытная группа: тестируемое соединение - 3-(2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)пропан-1-сульфонат кальция дозой 200 мг/кг;
3. группа, получающая препарат сравнения пирацетам дозой 300 мг/кг.
В третьей серии экспериментов тестировали меньшие дозы исследуемого соединения для того, чтобы выбрать терапевтическую дозу и доказать дозозависимый эффект. При этом применяли следующие дозы:
a) 5-18 50 мг/кг:
b) 5-18 100 мг/кг.
Объем введения составлял 0,3 мл.
Методика эксперимента
Всех животных перед началом экспериментов тестировали в норковой камере, определяя уровень двигательной активности животных и исследуя их ориентировочно-исследовательское поведение, с целью формирования идентичных по поведению групп. После тестирования и формирования групп животным проводили 5-дневный курс введения препаратов. Затем препараты вводили за 1 час до начала эксперимента. На 6-й день животных тестировали в открытом поле. На 7, 8-й день животных тестировали на уровень тревожности в тесте светло-темного выбора и в приподнятом крестообразном лабиринте. На 9-й день повторно тестировали в норковой камере. На 10-й день в тесте вынужденного плавания по Порсолту. В третьей серии экспериментов на 12-13 день проводили тест экстраполяционного избавления.
После первой серии экспериментов животные находились в покое 1 неделю, после чего повторяли 5-дневное введение препаратов. На 6-й день животных знакомили с установкой Т-образного лабиринта. С 7-го по 10-й день производили выработку условного рефлекса (для второй серии) и выработку УРПИ на 6-й день, тестирование на 7-й день и 14-й день после введения препаратов.
Для изучения ориентировочно-исследовательского поведения, двигательной активности и тревоги выполняли тест «норковая камера». При этом всех животных тестировали в «норковой камере» за сутки до введения препаратов. Установка представляла собой квадратную камеру размером 50×50×40 см, пол которой был рассечен на 5 секторов (1 - центральный и 4 - периферические). На равном расстоянии друг от друга в полу находись отверстия диаметром 3 см. Освещение производили лампой 60 Вт, расположенной на высоте 100 см над центром. За поведением животного наблюдали в течение 3 минут, после чего крысу возвращали в клетку. Пол арены тщательно протирали после каждого теста. В протоколе фиксировали количество пересеченных секторов (периферических и центрального), количество вертикальных стоек, норковых реакций, количество и время актов замирания и груминга.
Затем всех животных тестировали в тесте «открытое поле» через 5 суток введения препаратов. Тест проводили в круглой арене диаметром 97 см, рассеченной тремя концентрическими окружностями, находящимися на равных расстояниях друг от друга. Каждая зона была рассечена на равные по площади сектора. Высота стенок арены составляла 42 см. В полу арены находились отверстия диаметром 2 см. Освещение производили лампой 60 Вт, расположенной на высоте 150 см над центром поля. За поведением животного наблюдали в течение 5 минут, после чего крысу возвращали в клетку. Пол арены тщательно протирали после каждого животного (F.J. Martin-Arenas, et al., 2014). В протоколе фиксировали количество пересеченных секторов (периферических и центрального), количество вертикальных стоек и норковых реакций, количество и продолжительность замираний животного, количество и длительности актов полного и неполного груминга, количество болюсов-дефекаций.
Также выполняли тест «приподнятый крестообразный лабиринт». Тест считается одной из наиболее адекватных и специфичных моделей тревожности, поскольку он основан на тех же природных стимулах, которые могут вызвать тревожность у людей. Считается, что в приподнятом крестообразном лабиринте используется баланс естественного страха животного (перед новизной - неофобия; открытым пространством и, возможно, высотой) и характерного для грызунов стремлением исследовать эти незнакомые пространства.
При этом лабиринт был приподнят над уровнем пола на высоту 50 см, два из четырех рукавов которого по периметру имели стенки высотой 30 см («закрытые рукава»), а другие два были открыты (размер одного рукава 50×14 см). Лабиринт был выполнен из серого пластика. Освещение светлых рукавов производилось лампой 40 Вт. Для анализа поведения в установке выделяли три зоны: открытая - два открытых рукава, закрытая - два закрытых рукава и центральная - площадка пересечения рукавов. Каждый рукав условно делили на два равных сектора, центральную площадку считали центральным сектором. Животных помещали на центральную площадку лабиринта носом к открытому рукаву и в течение 5 минут наблюдали поведение животного, регистрируя число заходов в открытые и закрытые рукава, длительность нахождение в рукавах, число выглядываний из закрытых рукавов, число стоек, количество и длительность актов груминга и периодов неподвижности, количество болюсов-дефекаций.
Тест «светло-темного выбора» проводили в установке размерами 30×30×30 см, разделенной перегородкой на 2 равных отсека. Стенки и пол камеры были выполнены из поливинилхлорида белого цвета. Темный отсек был покрыт изнутри матовой пленкой черного цвета. Освещение производили лампой 60 Вт, расположенной на высоте 50 см над центром светлой части камеры. Животных помещали в центр освещенного отсека спиной к темному (стартовое положение) и в течение 3 минут наблюдали поведение животного, регистрируя латентный период захода в темный отсек, длительность пребывания в светлом отсеке, число выглядываний из темного отсека, количество пересеченных отсеков, число стоек, количество болюсов-дефекаций.
Тест Порсолта (тест отчаяния) проводили в стеклянном цилиндре диаметром 20 см и высотой 40 см, на 1/3 заполненном водой с температурой +27±1°С. При этом животных помещали в цилиндр и наблюдали за их животного в течение 5 минут, после чего крысу возвращали в клетку. В протоколе фиксировали время и количество эпизодов активного плавания и иммобильности, количество прыжков и заныриваний. При этом увеличение активного плавания и уменьшение времени иммобилизации рассматривали как антидепрессивный эффект.
Далее выполняли тест «экстраполяционное избавление». При этом установка состояла из 2 цилиндров - большого внешнего диаметром 31 см и внутреннего диаметром 7,3 см, который был прикреплен к внешнему 3 втулками. Высота внутреннего цилиндра составляла 23 см, внешнего - 50 см. Установку заполняли водой (температурой 22°С) таким образом, чтобы внутренний цилиндр был погружен на 2,5 см, и погружали животное во внутренний цилиндр. Регистрировали время начала аверсивных реакций, число прыжков и латентный период подныривания. Время теста составляло 3 минуты. При этом тест проводили дважды, второй раз через 3 суток. Тест «экстраполяционного избавления» используется в психофармакологии как чувствительный метод для выявления соединений с анксиолитической и нейролептической активностью, а также для изучения когнитивных функций в условиях острой стрессорной ситуации (Бондаренко Н.А., 2012).
Также проводили эксперимент по выработке пищедобывательного условного рефлекса (ПУР). Перед этим животных подвергали 24-часовой пищевой депривации. Выработку условного пищедобывательного рефлекса проводили по методике Deacon R.M.J. (2006). Для выработки рефлекса использовали установку из неламинированного поливинилхлорида, представляющую собой лабиринт со стенками высотой 30 см, разделенный на 3 отсека - стартовый размером 50×16 см и два боковых размером 50×10 см, разделенных между собой поднимающимися задвижками. Освещенность лабиринта осуществляли лампой мощностью 60 Вт, установленной на высоте 40 см над стартовым отсеком.
В начале эксперимента каждую крысу индивидуально помещали в Т-образный лабиринт на 5 минут для адаптации к условиям опыта. Сеанс обучения состоял в том, что животное помещали в стартовый отсек лабиринта. После условного сигнала (щелчка при открывании дверцы) крысе предоставляли возможность выхода из стартового отсека и регистрировали время нахождения животным корма, который располагался в одном из рукавов Т-образного лабиринта. Регистрировали время захождения в рукава, при захождении в рукав с пищей животному давали время поесть (5 секунд) и вынимали животное из лабиринта; при захождении в неправильный рукав отмечали поведение животного и по истечении 3-х минут животное так же извлекали из лабиринта. Ежедневный сеанс обучения состоял из 5 пробежек. Рефлекс считали сформированным при достижении крысами корма с латентным временем не более 15 секунд в последней попытке или трехкратный заход только в верный рукав.
Установка «Т-образный лабиринт» позволяла исследовать рабочую память грызунов, лежащую в основе поведения чередования рукавов (спонтанного или подкрепленного) и чувствительную к дисфункции септо-гиппокампальной системы. Согласно руководству по доклиническому изучению новых фармакологических веществ оценка обучения крыс и мышей (с положительным пищевым или питьевым подкреплением) в Т-образном лабиринте входит перечень методических указаний по изучению ноотропной активности фармакологических веществ.
После выполнения животными всех поведенческих тестов у крыс вырабатывали условный рефлекс пассивного избегания (УРПИ), который считается базисной моделью для оценки влияния веществ на формирование и воспроизведение памятного следа в норме и при амнезии. Для его формирования использовали камеру 90×30×30 см с электрифицированным полом из стальных прутьев диаметром 0,6 мм, расстояние между которыми составляло 10 мм. Камера состояла из двух равных отсеков - светлого и темного, закрытых крышкой. В перегородке между отсеками имелось отверстие 10×10 см. Освещенность светлого отсека осуществляли лампой мощностью 100 Вт, установленной на высоте 40 см над центром.
Латентный период (ЛП) захода в темную камеру (время между помещением животного в установку и его переходом в темную камеру) измеряли с помощью секундомера. Критерием выработки УРПИ являлось увеличение ЛП.
При обучении животное помещали в освещенную камеру спиной к темному отсеку (стартовое положение). Крышку камеры закрывали. Через некоторое время (ЛП) крыса находила вход в темную камеру и входила в нее. В темном отсеке крыса получала удар током (0,8 мА) через электрифицированный пол до момента перехода в светлый отсек, но не более 5 секунд. После обучения животное переводили в жилую клетку. Через 24 часа животное вновь помещали в светлый отсек в стартовом положении и регистрировали ЛП входа в темный отсек. Тест заканчивали или когда животное входило в темный отсек, или через 3 минуты, если животное в него не входило. Тест повторяли через неделю после обучения, для изучения отдаленных эффектов препаратов. Результаты обобщены на фигуре 8.
Статистическая обработка
Статистическую обработку полученных данных проводили с применением программы STATISTICA 10.0 (Statsoft, США), используя непараметрический критерий Манна-Уитни (поведенческие тесты), t критерий для независимых выборок (поведенческие тесты), а также с использованием кси-квадрат критерий Пирсона (обучение). Статистическую обработку результатов исследования проводили методом вариационной статистики с определением средней арифметической (М), стандартного отклонения (δ), стандартной ошибки средней (m).
Результаты исследования
Тест «открытое поле» продемонстрировал статистически значимые различия в показателях времени короткого груминга по сравнению с контрольной группой. Результаты теста представлены в таблицах 5 и 6.
В трех сериях экспериментов не выявляли различия в поведении животных с разными дозами тестируемого соединения.
В тесте «норковая камера» наблюдали значимые различия между контрольной группой животных, получавших инъекцию пирацетама, и опытной группой. Различия проявлялись в количестве и времени короткого груминга. Результаты теста представлены в таблице 7.
Тест Порсолта показал статистически значимые различия в показателях времени замирания и в количестве актов выныриваний по сравнению с контрольной группой. Результаты теста представлены в таблице 8 и на фигуре 2 в виде графика средних значений количества выныриваний и времени замираний у животных в тесте Порсолта 1 серии эксперимента.
В 3 серии эксперимента в тесте вынужденного плавания по Порсолту были получены статистически значимые различия между двумя дозами исследуемого соединения. Так у животных, получавших дозу 100 мг/кг, сокращалось время замираний и увеличивалась двигательная активность. Результаты теста представлены в таблице 9 и на фигуре 3 в виде графика средних значений количества выныриваний и времени замираний у животных в тесте Порсолта 3 серии эксперимента.
В тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» выявляли статистически значимые различия между животными, получавшими инъекции тестируемого соединения и препарата сравнения, и контрольными животными в продолжительности и количестве актов короткого груминга, а также различия между временем длительного груминга и выглядываний между опытной группой и группой, получавшей пирацетам. Результаты теста представлены в таблице 10 и на фигуре 4 в виде графика средних значений времени нахождения в светлом рукаве лабиринта и количества выполненных стоек у животных в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт».
*р<0,05 относительно животных контрольной группы и группы, получающей препарат сравнения.
**р<0,05 относительно животных группы, получающей препарат сравнения.
В 3 серии экспериментов не выявляли статистически значимые различия между 2 дозами, но прослеживали тенденцию к увеличению выраженности анксиолитического эффекта при дозе 50 мг/кг. Результаты представлены в таблице 11 и на фигуре 5 в виде графика средних значений времени нахождения в светлом рукаве лабиринта и количества выполненных стоек у животных в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт», 3 серия.
При проведении теста «Т-образный лабиринт» статистически значимых различий в проценте обучившихся животных не выявили. Но животные, получавшие тестируемое соединение, демонстрировали тенденцию к лучшему обучению. Результаты представлены в таблице 12 и на фигуре 6 в виде графика процентов обучившихся животных в тесте «Т-образный лабиринт».
В тесте «темно-светлая камера» не выявляли статистически значимых отличий между группами. Наблюдали тенденцию к увеличению исследовательского поведения под воздействием тестируемого соединения. Результаты представлены в таблице 13.
Статистически значимых различий между 2 дозами не выявляли, но наблюдали тенденцию (p<0,07) к увеличению выраженности анксиолитического эффекта при дозе 50 мг/кг, а также к увеличению двигательной активности при дозе 100 мг/кг. Результаты представлены в таблице 14 и на фигуре 7 в виде графика средних значений времени нахождения в светлом отсеке камеры и количества выполненных стоек у животных в тесте «темно-светлая камера» 3 серии экспериментов.
В 3 серии экспериментов в тесте «экстраполяционное избавление» не наблюдали значимых различий между группами, получавшими двумя дозами исследуемого вещества. Результаты представлены в таблице 15.
Таким образом, эксперименты на животных in vivo показали, что соли 3-(2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)пропан-1-сульфоновой кислоты увеличивают концентрацию дофамина и уменьшают концентрацию серотонина в коре головного мозга крыс.
В отношении специфической активности соли 3-(2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)пропан-1-сульфоновой кислоты демонстрируют дозозависмый эффект. При этом доза 200 мг/кг у интактных животных снижает тревожность. Доза 100 мг/кг оказывает антидепрессивное действие, повышает ориентировочно-исследовательскую активность, улучшает обучение. Доза 50 мг/кг показывает анкисиолитическую активность, но снижает возможность обучения и двигательную активность.
Как видно из приведенных выше примеров, соли 3-(2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)пропан-1-сульфоновой кислоты обладают ноотропной активностью и, следовательно, могут быть применимы в качестве ноотропного лекарственного средства, а также средства, тормозящего развитие нейродегенеративных заболеваний, в том числе болезни Альцгеймера.