ПРОТИВОАЛЛЕРГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО
ANTIALLERGIC AGENT

Область техники
Настоящее изобретение относится к противоаллергическому средству
Уровень техники
Bifidobacterium
В отношении микроорганизма, принадлежащего к роду  (в дальнейшем также обозначаемому как «бифидобактерия»), одного из преобладающих бактерий в кишечнике, было сделано множество сообщений о воздействиях такого микроорганизма на кишечную регуляцию и иммунорегуляцию.
О некоторых бифидобактериях сообщили как о внеклеточно продуцирующих полисахариды. Множество сообщений имеет отношение к характеристикам составляющих компонентов и структур полисахаридов. О полисахаридах, продуцируемых бифидобактериями, сообщили в отношении их иммуностимулирующей функции (патентные документы 1 и 2).
Lactobacillus
Lactobacillus fermentum
natto Bacillus subtilis,
Существуют некоторые сообщения о противоаллергических воздействиях полисахаридов, продуцируемых не относящимися к бифидобактериям микроорганизмами. В патентном документе 3 описано противовоспалительное лекарственное средство, которое содержит в качестве активного ингредиента полисахарид, полученный из культурального бульона бактерии , и впатентном документе 4 описано, что иммуномодулятор, который содержит полисахарид, продуцируемый , в качестве активного ингредиента, обладает противовоспалительным эффектом, противоаллергическим эффектом и ингибирующим воздействием на пролиферацию опухоли. В патентном документе 5 описана подавляющая аллергическую реакцию композиция, которая содержит полисахарид леван, продуцируемый вариантом  в качестве активного ингредиента.
natto Bacillus subtilis
Вариант не является микроорганизмом, живущим в кишечнике в качестве местной бактерии. В здоровом кишечнике бифидобактерии в подавляющем большинстве случаев преобладают над молочнокислыми бактериями. Еще не появлялось никакого сообщения о противоаллергическом воздействии бифидобактерий, которые продуцируют внеклеточный полисахарид, среди бифидобактерий, которые являются преобладающими бактериями в кишечнике.
Документы предшествующего уровня техники
Патентные документы
Патентный документ 1: WO 07/007562
Патентный документ 2: японская выложенная патентная публикация № 58-203913
Патентный документ 3: японская выложенная патентная публикация № 7-70209
Патентный документ 4: японская выложенная патентная публикация № 2008-245576
Патентный документ 5: японская выложенная патентная публикация № 2006-1922
Сущность изобретения
Проблемы, которые будут решаться при помощи изобретения
Цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить противоаллергическое средство без риска возникновения какого-либо побочного действия.
Способы решения проблем
Настоящее изобретение относится к противоаллергическому средству, включающему в себя полисахарид, включающий в себя галактозу, глюкозу и рамнозу в качестве составляющих компонентов.
В варианте осуществления полисахарид включает в себя галактозу, глюкозу и рамнозу в молярном соотношении 3-5:1-3:1.
В варианте осуществления полисахарид включает в себя следующую ниже структуру:
Формула 1
Bifidobacterium.
В варианте осуществления полисахарид получают из микроорганизма, принадлежащего роду
Bifidobacterium
Bifidobacterium longum.
В дополнительном варианте осуществления микроорганизм, принадлежащий к роду , представляет собой
Bifidobacterium longum
Bifidobacterium longum
В еще одном дополнительном варианте осуществления представляет собой штаммJBL05 (NITE BP-82).
Bifidobacterium
Настоящее изобретение также относится к противоаллергическому средству, включающему в себя микроорганизм, причем микроорганизм принадлежит к роду  и продуцирует внеклеточный полисахарид, как указано выше.
Bifidobacterium longum
В варианте осуществления бифидобактерия, которая продуцирует внеклеточный полисахарид, как указано выше, представляет собой штамм JBL05(NITE BP-82).
Настоящее изобретение также относится к композиции для перорального введения, включающей в себя противоаллергическое средство. Данное противоаллергическое средство представляет собой противоаллергическое средство, включающее в себя продуцируемый бифидобактерией полисахарид, указанный выше, или противоаллергическое средство, включающее в себя продуцирующую экзополисахарид бифидобактерию, указанную выше.
Настоящее изобретение также относится к композиции для наружного применения, включающей в себя противоаллергическое средство. Данное противоаллергическое средство представляет собой противоаллергическое средство, включающее в себя продуцируемый бифидобактерией полисахарид, указанный выше.
В варианте осуществления композиция для перорального введения или композиция для наружного применения предназначена для подавления атопического дерматита или контактного дерматита.
Эффекты изобретения
Настоящее изобретение относится к противоаллергическому средству, проявляющему лечебное подавляющее аллергическую реакцию воздействие без риска возникновения какого-либо побочного действия.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 показаны графики, демонстрирующие продукцию интерферона-γ (IFN-γ) (А), продукцию интерлейкина-4 (IL-4) (B) и соотношение между IFN-γ и IL-4 (С), продуцируемыми в ответ на стимуляцию спленоцитов продуцируемым бифидобактерией полисахаридом in vitro.
На фиг.2 показан график, демонстрирующий изменение с течением времени средней величины утолщения ушной раковины у мышей, получавших при пероральном введении продуцируемый бифидобактерией полисахарид, после начала сенсибилизации.
На фиг.3 показаны микрофотографии окрашенных H&E срезов ушных раковин подвергшихся воздействию мышей, включающих в себя мышей, получающих при пероральном введении продуцируемый бифидобактерий полисахарид на 20 день после начала сенсибилизации.
На фиг.4 показан график, демонстрирующий изменение с течением времени средней величины утолщения ушной раковины у мышей, получающих при пероральном введении продуцирующую экзополисахарид бифидобактерию, после начала сенсибилизации.
На фиг.5 показаны микрофотографии окрашенного H&E среза ушных раковин подвергшихся воздействию мышей, включающих в себя мышей, получающих при пероральном введении продуцирующую экзополисахарид бифидобактерию на 20 день после начала сенсибилизации.
На фиг.6 показан график, демонстрирующий изменение с течением времени средней величины утолщения ушной раковины у мышей, получающих при наружном применении продуцируемый бифидобактерией полисахарид после начала сенсибилизации.
Способ осуществления изобретения
Продуцируемый бифидобактерией полисахарид и продуцирующая экзополисахарид бифидобактерия
В настоящем изобретении применяют полисахарид, содержащий галактозу, глюкозу и рамнозу в качестве составляющих компонентов. Полисахарид может содержать галактозу:глюкозу:рамнозу в молярном соотношении 3-5:1-3:1. Полисахарид, в котором молярное соотношение галактозы:глюкозы:рамнозы составляет, например, 4:2:1, может содержать повторяющуюся структуру, представленную следующей ниже формулой (I)
Формула 2
Bifidobacterium
Bifidobacterium longum
Bifidobacterium longum
В формуле (I) Galp представляет собой галактопиранозу, Glcp представляет собой глюкопиранозу и Rhap представляет собой рамнопиранозу, означая, что галактоза, глюкоза и рамноза обладают пиранозной структурой. Указанный выше полисахарид может дополнительно содержать пировиноградную кислоту, и пировиноградная кислота может входить в состав полисахарида в количестве вплоть до 10% масс. Идентификация составляющих компонентов полисахарида, определение количеств или долей составляющих компонентов в полисахариде и структурный анализ полисахарида будет описан в подробностях ниже. Полисахарид, обладающий данной структурой, можно получить при помощи микроорганизма, принадлежащего роду или, в частности, , например,штамма JBL05( NITE BP-82), который выделяют из кишечника человека. Поэтому данный полисахарид для удобства в настоящем документе также обозначают как «продуцируемый бифидобактерией полисахарид», но данная фраза не предназначена для ограничения микроорганизмов, которые продуцируют полисахарид.
Bifidobacterium
В настоящем изобретении также применяют микроорганизм, принадлежащий роду и продуцирующий внеклеточный полисахарид, как указано выше. Фраза «продуцирующий внеклеточный полисахарид» означает, что микроорганизм продуцирует капсулоподобный полисахарид вокруг себя. Данный микроорганизм для удобства в настоящем документе также обозначают как «продуцирующая экзополисахарид бифидобактерия».
Bifidobacterium longum
Bifidobacterium longum
В настоящем изобретении штамм JBL05 (NITE BP-82) приводят в качестве примера как микроорганизм, применяемый для получения продуцируемого бифидобактерией полисахарида, или как продуцирующую экзополисахарид бифидобактерию. Бактериологические свойства штамма JBL05 (NITE BP-82) показаны в таблице 1 ниже.
Таблица 1
А. Морфологические свойства
(1) Форма
от 0,6 до 0,8 × от 1,0 до 4,0 мкм, булавовидная, Y-образная и спиралевидная грамположительная бацилла
(2) Подвижность
-
(3) Спора
-
В. Свойства культуры<sup>*1</sup>
(1) Форма
Шарообразная сфера, гладкая как на поверхности, так и по окружности
(2) Размер
Диаметр от 0,5 до 2,5 мм
(3) Выбухание
Выбухает в форме полусферы
(4) Цвет
Желтовато-коричневый или молочно-белый
(5) Характеристики
Слегка вязкая
<sup>*1</sup>Свойства колонии, получаемой при нанесении на агаровую среду BL (NISSUI PHARMACEUTICAL CO., LTD.), после чего следовало культивирование в течение 48 часов при 37°С в анаэробных условиях в закрытом контейнере, содержащем AnaeroPack (MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC.)
C. Физиологические свойства
(1) Восстановление нитрата
-
(2) Выработка индола
-
(3) Каталаза
-
(4) Оптимальная температура роста
37°C
(5) Оптимальный уровень pH
Величина pH от 6,5 до 7,0
(6) Степень анаэробности
Облигатно-анаэробный
(7) Газообразование
-
(8) Ассимиляция сахаров
Арабиноза
+
Ксилоза
+
Рибоза
+
Глюкоза
+
Галактоза
+
Манноза
+
Фруктоза
+
Сахароза
+
Мальтоза
+
Целлобиоза
-
Лактоза
+
Трегалоза
-
Мелибиоза
+
Раффиноза
+
Мелезитоза
+
Крахмал
±
Глицерин
-
Маннит
-
Сорбит
-
Инозит
-
(+: положительный, -: отрицательный, ±: слегка положительный)
Bifidobacterium longum
На основе таксономических характеристик фенотипа штамм JBL05 идентифицировали как  согласно руководству Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Vol. 2 (1984), и его депонировали в Incorporated Administrative Agency, National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganisms Depositary (NPMD) (адрес: 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken 292-0818, Japan) 3 марта 2005 года (первичная дата депонирования) и приняли как NITE BP-82.
Bifidobacterium longum
Для того, чтобы получить полисахарид, штамм JBL05 (NITE BP-82) можно культивировать в подходящей среде для культивирования. Процедура культивирования будет проиллюстрирована ниже, но не ограничивается этим.
Примером среды для культивирования является среда для культивирования, которая содержит источник углерода и источник азота, который может использоваться микроорганизмами, принадлежащими к роду Bifidobacterium, и, необязательно, содержит гидрохлорид цистеина, аскорбат натрия и следовое количество неорганических солей. В частности, среда для культивирования, содержащая обезжиренное молоко или компонент молока, является предпочтительной для получения большого количества полисахарида, и можно предпочтительно использовать среду для культивирования, которая содержит ферментативно расщепленное обезжиренное молоко, культиватор (рыбный экстракт, производимый Yaizu Suisankagaku Industry Co., Ltd.), лактозу и аскорбат натрия, где ферментативно расщепленное обезжиренное молоко получают расщеплением обезжиренного молока ферментом, таким как протеаза.
Bifidobacterium longum
Когда штамм JBL05  (NITE BP-82) анаэробно культивируют в данной среде при перемешивании или в покое при температуре культивирования от 20 до 45°C в течение от 12 до 60 часов, предпочтительно от 15 до 50 часов, в то время как рН доводят до величины от 4 до 7, предпочтительно от 5 до 6, можно получить вязкое вещество (полисахарид) в культуральном бульоне.
Полисахарид можно собирать из полученного культурального бульона, применяя способы, обычно используемые специалистами в данной области для сбора интересующего вещества из культурального бульона, включая нагревание, обработку ферментом, центрифугирование, фильтрацию, способ с использованием мембраны и процеживание. Например, культуральный бульон, который содержит вязкое вещество (полисахарид) и клетки микроорганизма, центрифугируют для того, чтобы удалить клетки. Когда вязкость культурального бульона высока, культуральный бульон можно разбавить водой, и затем центрифугировать, чтобы удалить клетки, например. Впоследствии полученную надосадочную жидкость обрабатывают соответствующим органическим растворителем, чтобы осадить белки, и осадок удаляют центрифугированием или тому подобным. Дополнительно надосадочную жидкость обрабатывают органическим растворителем для того, чтобы осадить полисахарид, и полисахарид собирают центрифугированием или тому подобным. Более подробно, к надосадочной жидкости, из которой были удалены клетки, добавляют этанол до конечной концентрации 20% объема и затем центрифугируют для того, чтобы удалить содержащий белок осадок, и к полученной надосадочной жидкости добавляют этанол до конечной концентрации 50% объема, и затем центрифугируют и собирают осадок, таким образом получая неочищенный полисахарид.
Альтернативно, также можно применять способы для сбора полисахарида при комбинировании органического растворителя и катиона(ов). Например, можно применять способы для сбора с использованием одновалентного катиона(ов) и органического растворителя, для сбора с использованием двухвалентного катиона(ов) и органического растворителя (японская выложенная патентная публикация № 58-5301) и для сбора с использованием трехвалентного катиона(ов) и органического растворителя (японская выложенная патентная публикация № 59-196099) и подобным способом. Такой катион(ы) предпочтительно применяют для улучшения степени сбора полисахарида. Примеры одновалентного катиона(ов) включают в себя ионы натрия, калия и тому подобные ионы; примеры двухвалентного катиона(ов) включают в себя ионы магния, кальция и тому подобные ионы; и примеры трехвалентного катиона(ов) включают в себя ионы алюминия и тому подобные ионы. Такие катионы можно добавлять к вязкому раствору, который содержит полисахарид, совместно с органическим растворителем, таким как этанол, чтобы собирать полисахарид в большом количестве. Для того чтобы улучшить степень сбора полисахаридов, можно использовать двухвалентный или трехвалентный катион(ы), чем одновалентный катион(ы).
Полисахарид можно очищать из неочищенного полисахарида, применяя способы, широко используемые специалистами в данной области, например, фракционирование с использованием ионообменной смолы или фракционирование гель-фильтрацией само по себе или в комбинации. Не существует каких-либо определенных ограничений для способа с использованием ионообменной смолы. Например, полисахарид адсорбируют на анионообменной смоле (например, название продукта: DEAE Sephadex A-50 (Pharmacia Corporation) или тому подобное) и затем элюируют в градиенте натрия хлорида. Примеры способа посредством гель-фильтрации включают в себя способы с использованием продукта под названием TOYOPEARLHW65S (Tosoh Corporation) и тому подобное.
Структуру полисахарида можно определить способом, указанным ниже. Очищенный полисахарид подвергают кислотному гидролизу с использованием кислоты, такой как муравьиная кислота, разведенная соляная кислота или трифторуксусная кислота, и гидролизат затем подвергают ВЭЖХ, чтобы определить сахариды (моносахариды), составляющие полисахарид. Затем продукт кислотного гидролиза обычным способом ацетилируют и затем подвергают газовой хроматографии (ГХ) для того, чтобы определить композицию составляющих сахаридов (соотношение между составляющими сахаридами). Более того, очищенный полисахарид обычным способом метилируют и затем подвергают кислотному гидролизу, и гидролизат восстанавливают и затем ацетилируют, и полученный продукт подвергают ГХ-МС (газовой хроматографии/масс-спектрометрии), чтобы определить тип гликозидной связи для составляющих компонентов полисахарида. Кроме того, полисахарид анализируют ЯМР для того, чтобы выявить гликозидные связи моносахаридов друг с другом. Пировиноградную кислоту, связанную с полисахаридом, можно качественно и количественно определить, измеряя восстановление пировиноградной кислоты до молочной кислоты с использованием лактатдегидрогеназы в присутствии NADH.
Bifidobacterium longum
Штамм JBL05 (NITE BP-82) может продуцировать полисахарид, обладающий следующими ниже характеристиками:
(1) полисахарид содержит галактозу, глюкозу и рамнозу в качестве составляющих компонентов;
(2) полисахарид обладает молярным соотношением галактозы:глюкозы:рамнозы 3-5:1-3:1;
(3) полисахарид может содержать пировиноградную кислоту в количестве вплоть до 10% масс.;
(4) полисахарид имеет молекулярный вес в диапазоне приблизительно от 50000 до 10000000, предпочтительно приблизительно от 200000 до 2500000 (как определено гель-проникающей хроматографией/детекцией многоуглового лазерного светорассеивания (GPS-MALLS)); и
(5) полисахарид, возможно, обладает повторяющейся структурой представленной ниже формулы (I), где полисахарид обладает молярным соотношением галактозы:глюкозы:рамнозы, например, 4:2:1.
Формула 3
Полисахарид, обладающий указанными выше характеристиками, можно получить в очищенной фракции полисахарида, получаемой после процедуры, описанной в примере 1 ниже.
Молекулярный вес полисахарида меняется в зависимости от условий культивирования и условий сбора/очистки. Также молекулярный вес можно регулировать, выбирая подходящие условия культивирования и тому подобное.
Bifidobacterium longum
Полисахарид, обладающий данной структурой, может продуцироваться штаммом JBL05 (NITE BP-82), выделенным из кишечника человека, хотя можно применять другие микроорганизмы для получения полисахарида. Такие микроорганизмы можно определить, например, выделяя кишечные бактерии и анализируя полисахариды, происходящие из штаммов, которые, как определили, продуцируют капсулоподобные полисахариды вокруг бактерий, и сбор и очистку полисахарида можно проводить согласно описанному выше.
Bifidobacterium longum
Штамм JBL05(NITE BP-82) приводят в качестве примера как продуцирующую экзополисахарид бифидобактерию, хотя другие бифидобактерии, внеклеточно продуцирующие получаемый из бифидобактерий полисахарид, также можно применять в настоящем изобретении.
Продуцирующая экзополисахарид бифидобактерия для применения в настоящем изобретении может представлять собой бифидобактерию, которая содержится в бактериальных клетках, получаемых из культурального бульона после того, как бифидобактерию культивируют для получения полисахарида. В качестве продуцирующей экзополисахарид бифидобактерии можно применять непосредственно культуральный бульон бифидобактерии после культивирования или с применением центрифугирования, способа с использованием мембраны, фильтрации и тому подобного для получения содержащего клетки культурального бульона. Такой культуральный бульон можно также применять в концентрированном, высушенном или измельченном виде или тому подобном. Совместно с бактериальными клетками, измельчающие средства и тому подобное может входить в состав продуцирующей экзополисахарид бифидобактерии. Бифидобактерию можно получать в виде жизнеспособной бактерии согласно широко используемой методике. Культуральный бульон, непосредственно содержащий бактериальные клетки или концентрированную или высушенную форму или тому подобное, можно подвергнуть стерилизации, такой как стерилизация нагреванием и облучением, после чего необязательно следует гомогенизация, для получения мертвых бактерий, которые также можно применять в настоящем изобретении. Методики, применяемые для получения таких бактериальных клеток, соответствуют методике, обычно применяемой специалистами в данной области.
Противоаллергическое средство
Продуцируемый бифидобактерией полисахарид и продуцирующая экзополисахарид бифидобактерия проявляют противоаллергическое действие. Противоаллергическое действие включает в себя в качестве неограничивающих примеров эффект улучшения соотношения Th1/Th2, модулирующий эффект в отношении Th16, подавляющее воспаление воздействие, эффект, ингибирующий продукцию IgE, эффект, ингибирующий высвобождение химического медиатора (такого как гистамин) и активирующее лимфоциты воздействие. Следовательно, по настоящему изобретению продуцируемый бифидобактерией полисахарид или продуцирующую экзополисахарид бифидобактерию можно применять в качестве противоаллергического средства, и предлагается противоаллергическое средство, содержащее продуцируемый бифидобактерией полисахарид или продуцирующую экзополисахарид бифидобактерию.
Продуцируемый бифидобактерией полисахарид или продуцирующая экзополисахарид бифидобактерия может входить в состав в качестве противоаллергического средства любой композиции. Действия противоаллергического средства включают в себя в качестве неограничивающих примеров подавление аллергических реакций I типа, аллергических реакций IV типа, атопического дерматита, аллергических конъюнктивитов и бронхиальной астмы. Такие композиции применимы для предотвращения развития или лечения аллергических симптомов. Предпочтительно они могут подавлять атопический дерматит и контактный дерматит.
Такие композиции можно применять для пищевых продуктов, фармацевтических продуктов и косметических средств. Композиции можно приготавливать и применять, в частности, но не ограничиваясь этим, в виде, например, порошков, гранул, таблеток, капсул, паст, кремов, гелей и жидкостей. Композиции можно применять после смешивания с неорганическими или органическими веществами, такими как наполнители, связующие вещества, разрыхлители, корригирующие средства, солюбилизаторы, суспендирующие вещества и покрывающие средства при необходимости. Композиции можно получать, применяя способы, хорошо известные специалистам в данной области, для промышленного производства пищевых продуктов, фармацевтических продуктов и косметических средств.
Составленное для рецептуры количество продуцируемого бифидобактерией полисахарида можно подходящим образом определять в зависимости от цели, предполагаемого использования, вида, лекарственной формы, симптома, массы тела и тому подобного, и для перорального применения или введения композиции предпочтительно приготавливают так, чтобы можно было принимать от 1 мг до 10 г, более предпочтительно от 10 мг до 2 г продуцируемого бифидобактерией полисахарида в день. Для введения посредством нанесения на кожу или слизистую составленное для рецептуры количество продуцируемого бифидобактерией полисахарида предпочтительно составляет от 0,001 до 10% масс., более предпочтительно от 0,01 до 1% масс. от общей массы продукта.
6
12
8
11
Составленное для рецептуры количество продуцирующей экзополисахарид бифидобактерии можно также подходящим образом определять в зависимости от цели, предполагаемого использования, вида, лекарственной формы, симптома, массы тела и тому подобного, и бифидобактерия содержится в таком количестве, что можно принимать предпочтительно от 10 до 10, более предпочтительно, от 10 до 10 клеток в день.
Композиции, содержащие продуцируемый бифидобактерией полисахарид или продуцирующую экзополисахарид бифидобактерию, можно применять в качестве композиций для перорального применения. Например, композиции для перорального применения можно применять в виде пищевых композиций или фармацевтических композиций из-за их противоаллергического эффекта путем перорального приема внутрь и можно добавлять к фармацевтическим продуктам для перорального введения, жидкой пище, продуктам лечебного питания, продуктам детского питания, продуктам питания с требованием действия питательных веществ, продуктам питания с определенными оздоравливающими назначениями и тому подобному. Композиции, содержащие продуцируемый бифидобактерией полисахарид или продуцирующую экзополисахарид бифидобактерию, можно приготовить в обычных пищевых и питьевых продуктах, например, включающих в себя в качестве неограничивающих примеров различные напитки, такие как молоко, безалкогольные напитки и кисель, различные кондитерские изделия, такие как конфеты, липкие конфеты, шоколадки, печенье и крекеры, и различные продукты питания, такие как рис, хлеб, лапша «Удон» и соусы. Композиции, содержащие жизнеспособные клетки продуцирующей экзополисахарид бифидобактерии, можно применять для сбраживания молока и так далее в йогурт и кисломолочный продукт, который можно принимать.
Композиции, содержащие продуцируемый бифидобактерией полисахарид, можно использовать в качестве композиций для наружного применения. Например, композиции для наружного применения можно использовать в качестве косметических композиций или фармацевтических композиций из-за их противоаллергического эффекта при применении или нанесении на кожу или слизистую. Косметические средства, в которые можно сформулировать композиции, включают в качестве неограничивающих примеров, например, очищающие средства для лица, лосьоны для кожи, сыворотку, лосьоны-молочко, спреи, материалы для маски, кремы, мази, добавки для ванн и тому подобное. Косметические композиции могут также включать в себя композиции, получаемые и продаваемые в качестве лечебно-профилактической косметики. Фармацевтические продукты, в которые можно приготовить композиции, включают в себя в качестве неограничивающих примеров композиции для применения на слизистой носа (например, капли в нос и спреи), композиции для применения на слизистой глаза (например, капли для глаз и глазные примочки), композиции для применения на слизистой горла (например, лекарственные средства для полоскания, ополаскиватели для рта, спреи и пастилки) и тому подобное. Такие фармацевтические продукты также включают в себя средства гигиены, такие как пластыри, перевязочные средства и лейкопластыри.
Настоящее изобретение будет описано ниже более подробно в примерах, но настоящее изобретение ими не ограничивается.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Культивирование продуцирующей экзополисахарид бифидобактерии и получение продуцируемого бифидобактерией полисахарида
Bifidobacterium longum
Культивирование штамма JBL05 (NITE BP-82) и очистку полисахарида, продуцируемого микроорганизмом, осуществляли, как описано в патентном документе 1, который подробно описывается ниже.
К раствору 9% масс. обезжиренного молока добавляли панкреатин (Amano Enzyme Inc.) и силикон до конечных концентраций 0,36% масс. и 0,01% масс. соответственно, и при помощи 10н NaOH доводили величину pH продукта реакции до 8 и позволяли пройти реакции при 55°C в течение четырех часов, тем самым получая ферментативно-расщепленное обезжиренное молоко. К ферментативно-расщепленному обезжиренному молоку добавляли культиватор (рыбный экстракт, производимый Yaizu Suisankagaku Industry Co., Ltd.), лактозу и аскорбат натрия до конечных концентраций 3,0% масс., 2,5% масс. и 0,2% масс. соответственно, и затем стерилизовали в автоклаве при 121°C в течение 15 минут. Продукт реакции применяли в качестве жидкой среды для культивирования.
Bifidobacterium longum
Штамм JBL05 (NITE BP-82) предварительно культивировали в жидкой среде, полученной, как указано выше, и затем инокулировали в 5 л той же самой жидкой среды до концентрации 1% (об./об.) и анаэробно культивировали в покое при 37°C в течение 40 часов для получения вязкого вещества. Культуральный бульон центрифугировали для того, чтобы удалить бактериальные клетки. Впоследствии к надосадочной жидкости добавляли этанол до конечной концентрации 20%, и продукт реакции отстаивали при 4°C в течение ночи и затем центрифугировали для того, чтобы удалить содержащий белок осадок. Дополнительно к надосадочной жидкости добавляли этанол до конечной концентрации 50%, и продукт реакции отстаивали при 4°C в течение ночи и затем центрифугировали и осадок собирали, таким образом, получая неочищенную фракцию полисахарида. Фракцию лиофилизировали и хранили.
Неочищенную фракцию полисахарида дополнительно фракционировали с использованием колонки, заполненной DEAE Sephadex A-50, и элюировали с использованием от 0,07M до 0,5M NaCl. Полученную фракцию лиофилизировали, чтобы получить очищенную фракцию полисахарида.
Пример 2: Структурный анализ продуцируемого бифидобактерией полисахарида
Очищенную фракцию полисахарида, полученную в примере 1, подвергали гель-фильтрации на колонке, заполненной TOYOPEARL HW65S, и затем проверяли в отношении молекулярного веса посредством GPC-MALLS, и полисахарид, как было обнаружено, имел молекулярный вес приблизительно 540000.
Далее фракцию после гель-фильтрации (полисахарид) гидролизовали муравьиной кислотой и гидролизат высушивали при пониженном давлении. Затем полученный продукт гидролизовали трифторуксусной кислотой, чтобы получить продукт гидролиза. Продукт гидролиза подвергали ВЭЖХ с использованием колонки ION-300 (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd). Вследствие этого полисахарид, как было обнаружено, состоял из галактозы, глюкозы и рамнозы.
Продукт гидролиза обычным образом восстанавливали при помощи борогидрида натрия и затем ацетилировали с использованием уксусного ангидрида и пиридина. Продукт реакции подвергали ГХ на колонке R-225 (J&W Scientific). Вследствие этого полисахарид, как было обнаружено, состоял из галактозы, глюкозы и рамнозы при молярном соотношении 4:2:1.
Когда продукт гидролиза обрабатывали лактатдегидрогеназой в присутствии NADH, образовывалась молочная кислота, тем самым выявляя присутствие в полисахаридной фракции пировиноградной кислоты, а также содержание пировиноградной кислоты в полисахариде 5% масс.
Для того чтобы определить тип гликозидной связи составляющих компонентов полисахарида, проводили анализ полисахарида метилированием. Фракцию после гель-фильтрации (полисахарид) обычным способом метилировали и затем гидролизовали при помощи муравьиной кислоты, и гидролизат восстанавливали и затем ацетилировали. Полученный продукт подвергали ГХ-МС (масс-спектрометрией). Вследствие этого получили метилированные сахариды, как показано ниже: 1,5-ди-O-ацетил-2,3,4,6-тетра-О-метилглюцитол,
1,5-ди-O-ацетил-2,3,4,6-тетра-O-метилгалактитол,
1,3,4,5-тетра-O-ацетил-2,6-ди-O-метилрамнитол,
1,3,5-три-O-ацетил-2,4,6-три-O-метилгалактитол,
1,4,5-три-O-ацетил-2,3,6-три-O-метилглюцитол,
1,4,5-три-O-ацетил-2,3,6-три-O-метилгалактитол и
1,4,5,6-тетра-O-ацетил-2,3-ди-O-метилгалактитол.
Кроме того, гликозидную связь компонентов проверяли при помощи ЯМР. Было обнаружено из этих данных, что полисахарид обладал следующей ниже структурой I (повторяющейся структурой)
Формула 4
Пример 3: Улучшающий соотношение Th1/Th2 эффект продуцируемого бифидобактерией полисахарида
2
Спленоциты, полученные от мышей C3H/HeJ (в возрасте 8 недель, самцы, CLEA Japan, Inc.), культивировали при 37°C в течение 72 часов в атмосфере 5% СО в среде RPMI-1640, содержащей фетальную бычью сыворотку и антибиотики (раствор смеси антибиотики-противогрибковое средство, Nacalai Tesque, Inc.), дополненной очищенной фракцией полисахарида, полученной в примере 1, которую растворяли в воде до конечной концентрации 20 мкг/мл или 200 мкг/мл. Культуральную надосадочную жидкость извлекали и измеряли концентрации интерферона-γ (IFN-γ), который представляет собой цитокин Th1, и интерлейкина-4 (IL-4), который представляет собой цитокин Th2, с использованием ELISA (BIOSOURCE, Invitrogen). Контрольную культуру подготавливали с использованием той же процедуры, описанной выше, за исключением того, что такое же количество воды добавляли вместо очищенной фракции полисахарида.
Результаты показаны на фиг.1 с (А) по (С). Фиг. 1(А) представляет собой график, демонстрирующий количество IFN-γ, продуцируемое в ответ на стимуляцию спленоцитов продуцируемым бифидобактерией полисахаридом in vitro. По вертикальной оси представлено количество продуцируемого IFN-γ (пг/мл), и на горизонтальной оси показаны экспериментальные группы. Фиг.1(В) представляет собой график, демонстрирующий количество IL-4, продуцируемое в ответ на стимуляцию спленоцитов продуцируемым бифидобактерией полисахаридом in vitro. По вертикальной оси представлено количество продуцируемого IL-4 (пг/мл), и на горизонтальной оси показаны экспериментальные группы. Фиг.1(С) представляет собой график, демонстрирующий соотношение между IFN-γ и IL-4, продуцируемыми в ответ на стимуляцию спленоцитов продуцируемым бифидобактерией полисахаридом in vitro. По вертикальной оси представлено соотношение IFN-γ к IL-4 (IFN-γ/IL-4), и на горизонтальной оси показаны экспериментальные группы.
Данные результаты демонстрируют, что добавление очищенной фракции полисахарида (продуцируемого бифидобактерией полисахарида) увеличивает количество продуцируемого IFN-γ и снижает количество продуцируемого IL-4 зависимым от концентрации образом по сравнению с контрольной культурой с таким же количеством воды, добавленным вместо очищенной фракции полисахарида.
Следовательно, было показано, что добавление продуцируемого бифидобактерией полисахарида увеличивает содержание цитокина Th1 и, таким образом, Th1 становится преобладающим в соотношении между Th1/Th2, а именно, обеспечивая противоаллергическое действие.
Пример 4: Противоаллергическое действие продуцируемого бифидобактерией полисахарида
Очищенную фракцию полисахарида, полученную в примере 1, растворяли в фосфатном буфере (PBS) и перорально вводили по отдельности пяти мышам BALB/c (в возрасте 8 недель, самцы, Kiwa Laboratory Animals Co., Ltd.) при помощи питательного зонда каждый день (20 мг/кг массы тела/день). Для контрольной группы перорально вводили один только PBS пяти мышам каждый день. Для группы положительного контроля перорально вводили преднизолон (Sigma) пяти мышам каждый день (3 мг/кг массы тела/день). На 4 день после начала введения 10 мкл 0,3% 2,4,6-тринитро-1-хлорбензола (TNCB) (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd), растворенного в ацетоне (Nacalai Tesque, Inc.), наносили (сенсибилизация) на их правые ушки и такое же количество одного только ацетона наносили на их левые ушки, что повторяли каждый следующий день с 4 дня по 19 день после начала применения TNCB (сенсибилизации). Пероральное введение, как описано выше, также продолжали после начала сенсибилизации. Толщину ушных раковин измеряли, применяя для каждого нанесения TNCB с первого дня сенсибилизации. Измерения проводил каждый день тот же самый исследователь при тех же самых условиях, и рассчитывали средние величины (пять мышей на группу). Через 20 дней после начала сенсибилизации ушные раковины исследовали гистологически. Для гистологического исследования срезы готовили после диссекции из ушных раковин, фиксированных в 10% содержащем нейтральный буфер формалине (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), и затем окрашивали гематоксилином-эозином (H&E) (заказанным Applied Medical Research Laboratory) и исследовали под микроскопом.
Фиг.2 представляет собой график, демонстрирующий изменение с течением времени толщины ушных раковин у мышей, получавших при пероральном введении продуцируемый бифидобактерией полисахарид после начала сенсибилизации (пять мышей на группу). По вертикальной оси представлена толщина ушных раковин (мм) и по горизонтальной оси представлены дни после начала сенсибилизации (дни). Закрашенный кружок представляет контрольную группу (только PBS), незакрашенный кружок представляет группу положительного контроля (преднизолон), закрашенный треугольник представляет группу, получавшую при пероральном введении продуцируемый бифидобактерией полисахарид.
На фиг.3 показаны микрофотографии окрашенных H&E срезов ушных раковин подвергшихся воздействию мышей, включающих в себя мышей, получающих при пероральном введении продуцируемый бифидобактерией полисахарид на 20 день после начала сенсибилизации. Микрофотографии представляют собой, начиная сверху, изображения для контрольной группы (только PBS), для группы положительного контроля (преднизолон) и группы, получавшей при введении продуцируемый бифидобактерией полисахарид.
Пероральное введение очищенной фракции полисахарида (продуцируемого бифидобактерией полисахарида) значительно ингибирует увеличение толщины ушных раковин, как и в случае с положительным контролем, получавшим при пероральном введении преднизолон, по сравнению с контролем, получавшим при пероральном введении один только PBS (фиг.2). Результаты гистологического исследования ушных раковин также показали, что пероральное введение очищенной фракции полисахарида (продуцируемого бифидобактерией полисахарида) подавляет воспаление, индуцированное в ушных раковинах, и ингибирует увеличение толщины ушных раковин, как и в случае с положительным контролем, получавшим при пероральном введении преднизолон (фиг.3). Таким образом, очищенная фракция полисахарида проявляла противоаллергическое действие.
Пример 5: Противоаллергическое действие продуцирующей экзополисахарид бифидобактерии
Bifidobacterium longum
Воздействие штамма JBL05 (NITE BP-82) проверяли, используя тот же самый способ, как и в примере 4.
Bifidobacterium longum
8
Клетки JBL05 , продуцирующей экзополисахарид бифидобактерии, суспендировали в PBS и затем перорально вводили пяти мышам BALB/c (в возрасте 8 недель, самцы, Kiwa Laboratory Animals Co., Ltd.) при помощи питательного зонда каждый день (10 жизнеспособных бактериальных клеток/мышь/день). Для контрольной группы перорально вводили один только PBS пяти мышам каждый день. Для группы положительного контроля перорально вводили преднизолон (Sigma) пяти мышам каждый день (3 мг/кг массы тела/день). На 4 день после начала введения 10 мкл 0,3% 2,4,6-тринитро-1-хлорбензола (TNCB) (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd), растворенного в ацетоне (Nacalai Tesque, Inc.), наносили (сенсибилизация) на их правые ушки и такое же количество одного только ацетона наносили на их левые ушки, что повторяли каждый следующий день с 4 дня по 19 день после начала применения TNCB (сенсибилизации). Пероральное введение, как описано выше, также продолжали после начала сенсибилизации. Толщину ушной раковины измеряли, применяя для каждого нанесения TNCB, с первого дня сенсибилизации. Измерения проводил каждый день тот же самый исследователь при тех же самых условиях, и рассчитывали средние значения (пять мышей на группу). На 20 день после начала сенсибилизации ушные раковины исследовали гистологически. Для гистологического исследования после диссекции срезы готовили из ушных раковин, фиксированных в 10% содержащем нейтральный буфер формалине (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), и затем окрашивали гематоксилином-эозином (H&E) (заказанным в Applied Medical Research Laboratory) и исследовали под микроскопом.
Фиг.4 представляет собой график, демонстрирующий изменение с течением времени толщины ушной раковины у мышей, получавших при пероральном введении продуцирующую экзополисахарид бифидобактерию после начала сенсибилизации (пять мышей на группу). По вертикальной оси представлена толщина ушной раковины (мм), и по горизонтальной оси представлены дни после начала сенсибилизации (дни). Закрашенный кружок представляет контрольную группу (только PBS), незакрашенный кружок представляет группу положительного контроля (преднизолон), закрашенный треугольник представляет группу, получавшую при пероральном введении продуцирующую экзополисахарид бифидобактерию.
На фиг.5 показаны микрофотографии окрашенных H&E срезов ушных раковин подвергшихся воздействию мышей, включающих в себя мышей, получающих при пероральном введении продуцирующую экзополисахарид бифидобактерию на 20 день после начала сенсибилизации. Микрофотографии, начиная сверху, представляют собой изображения для контрольной группы (только PBS), для группы положительного контроля (преднизолон) и группы, получавшей при введении продуцирующую экзополисахарид бифидобактерию.
Bifidobacterium longum
Bifidobacterium longum
Bifidobacterium longum
Пероральное введение жизнеспособных клетокштаммаJBL05 (продуцирующей экзополисахарид бифидобактерии) значительно ингибирует увеличение толщины ушной раковины по сравнению с контрольной группой, получавшей при пероральном введении один только PBS (фиг.4). Результаты гистологического исследования ушных раковин также показали, что пероральное введение жизнеспособных клетокштаммаJBL05 (продуцирующей экзополисахарид бифидобактерии) подавляет воспаление, индуцированное в ушной раковине, и ингибирует увеличение толщины ушной раковины (фиг.5). Таким образом, жизнеспособные клеткиштаммаJBL05 проявляли противоаллергическое действие.
Пример 6: Противоаллергическое действие при наружном применении продуцируемого бифидобактерией полисахарида
Девяти мышам NC/Nga (в возрасте 7 недель, самцы, Japan SLC, Inc.) наносили 10 мкл 0,5% 2,4,6-тринитро-1-хлорбензола (TNCB) (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd), растворенного в ацетоне (Nacalai Tesque, Inc.), на их правые ушки (сенсибилизация) и такое же количество одного только ацетона наносили на их левые ушки, что повторяли дважды каждый следующий день, начиная с 4 дня после начала применения TNCB (сенсибилизации). Мышей делили на три группы так, чтобы толщина кожи ушной раковины была единообразной (три мыши на группу). 20 мкл очищенной фракции полисахарида, полученной в примере 1, растворенной в воде (1 мг/мл), наносили на переднюю и заднюю поверхности ушной раковины каждой из трех мышей каждый день, начиная с 9 дня после начала сенсибилизации. Схожим образом наносили воду в качестве контроля другим трем мышам и преднизолон в воде (25 мг/мл) в качестве положительного контроля наносили другим мышам. TNCB наносили мышам за более чем 30 минут до наружного применения продуцируемого бифидобактерией полисахарида, воды или преднизолона каждый второй день. Толщину ушной раковины измеряли, применяя, для каждого нанесения TNCB с первого дня сенсибилизации. Измерения проводил каждый день тот же самый исследователь при тех же самых условиях, и рассчитывали средние значения (три мыши на группу).
Фиг.6 представляет собой график, демонстрирующий изменение с течением времени толщины ушных раковин у мышей, получавших при наружном применении продуцируемый бифидобактерией полисахарид после начала сенсибилизации (три мыши на группу). По вертикальной оси представлена толщина ушных раковин (мм), и по горизонтальной оси представлены дни после начала сенсибилизации (дни). Закрашенные кружки представляют контрольную группу нанесения (только вода), незакрашенные кружки представляют группу нанесения положительного контроля (преднизолон), закрашенные треугольники представляют группу, получавшую при наружном применении продуцируемый бифидобактерией полисахарид.
Наружное применение очищенной фракции полисахарида (продуцируемого бифидобактерией полисахарида) ингибирует увеличение толщины ушных раковин, как и в случае с преднизолоном (положительный контроль), по сравнению с группой, получавшей при нанесении только воду (контроль) (фиг.6). Таким образом, продуцируемый бифидобактерией полисахарид также проявлял противоаллергическое действие при наружном применении.
Промышленная применимость
Настоящее изобретение предоставило возможность обеспечить противоаллергическое действие, применяя бифидобактерию, которая может преимущественно заселять кишечник человека. Продуцируемый бифидобактерией полисахарид или продуцирующую экзополисахарид бифидобактерию можно приготовить в виде пищевых продуктов, косметических средств, фармацевтических продуктов и тому подобного, чтобы воспользоваться их противоаллергическим воздействием.