ПРИМЕНЕНИЕ БЕТА-ЦЕОЛИТА В КАЧЕСТВЕ ВЕЩЕСТВА, СВЯЗЫВАЮЩЕГО МУЛЬТИТОКСИНЫ В КОРМЕ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ
APPLICATION OF BETA-ZEOLITE AS A MULTITOXIN BINDER IN ANIMAL FEED

По настоящей патентной заявке испрашивается приоритет индийской патентной заявки серийный номер 544/DEL/2014, поданной 26 февраля 2014, и патентной заявки Соединенных Штатов серийный номер No. 61/978,457, поданной 11 апреля 2014, каждая из которых включена посредством ссылки в полном объеме.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к веществам, связывающим токсины, для применения в кормах для животных и, в частности, к применению нового микропористого цеолита в качестве вещества, связывающего мультитоксины в корме для животных.
th
Микотоксины невидимы, не имеют запаха и не могут быть определены на запах или вкус, но могут привести к значительным экономическим потерям на всех уровнях производства сельскохозяйственных кормов и, в частности, в животноводстве. Микотоксины представляют вторичные метаболиты, продуцируемые нитчатыми грибами, таким как Fusarium, Aspergillus и Penicillium, перед и во время сбора урожая, или во время (не соответствующего) хранения. Их токсическое воздействие очень различно в зависимости от микотоксинов (Akande, K. E., Abubakar, M. M., Adegbola, T. A., and Bogoro, S. E. 2006. Nutritional and Health Implications of Mycotoxins in Animal Feeds: A Review. Pakistan Journal of Nutrition, 5: 398-403). У сельскохозяйственных животных микотоксины оказывают негативное воздействие на потребление корма, показатели продуктивности и физиологического состояния животных, уровень воспроизведения, способность к росту и иммунологическую защиту наряду с канцерогенностью, мутагенностью, тератогенностью, причиной треморов или повреждений центральной нервной системы, гемморагичностью, наряду с повреждением печени и почек. Микотоксины метаболизируются в печени и почках, а также микроорганизмами в пищеварительном тракте. Следовательно, часто химическая структура и токсичность, обусловленная выделяемыми животными или обнаруживаемыми в их тканях остатками митотоксинов, отличается от исходной молекулы (Ratcliff, J. Aug. 16, 2002. The Role of Mycotoxins in Food and Feed Safety. Presented at Animal Feed Manufacturers Association. Presented at Animal Feed Manufacturers Association). В зависимости от условий окружающей среды и субстрата могут иметь место одновременно различные микотоксины (Sohn, H. В., Seo, J. A., and Lee, Y. W. 1999. Co-occurrence of Fusarium Mycotoxins in Mouldy and Healthy Corn from Korea. Food Additives and Contaminants. 16: 153-158). Принимая во внимание этот синергетический эффект, весьма вероятно, что животные подвергаются воздействию смесей, а не отдельных соединений. Полевые исследования показали, что более тяжелые токсикозы у животных могут быть результатом дополнительных и синергетических эффектов различных микотоксинов (Ratcliff J., 2002. The role of mycotoxins in food and feed safety. Presented at AFMA (Animal Feed Manufacturers Association) on 16 August 2002).Проблема микотоксинов не только не заканчивается на корме для животных или не только снижает показатели продуктивности и физиологического состояния животных; многие из них концентрируются в мясе, яйцах и молоке животного и могут представлять угрозу для здоровья человека. Продолжает расти беспокойство по поводу уровней микотоксинов в пищевых продуктах для людей, как растительного, так и животного происхождения.
Однако в мире существуют географические и климатические различия в продуцировании и возникновении микотоксинов, воздействующих на эти вещества. По оценкам микотоксины оказывают влияние на целых 25 процентов мирового урожая каждый год (Akande K.E., Abubakar M.M., Adegbola T.A. and Bogoro S.E. 2006. Nutritional and Health Implications of Mycotoxins in Animal Feeds: A Review. Pakistan Journal of Nutrition. 5 (5): 398-403). В большинстве стран существуют строгие правила по уровням микотоксинов в корме, и основной целью сельскохозяйственной индустрии и пищевой индустрии является предотвращение инфицирования микотоксинами в поле. Управленческая практика максимизации продуктивности растений и снижения стресса растений может существенно снизить инфицирование микотоксинами. Это включает выращивание адаптированных сортов, правильное внесение удобрений, борьбу с сорняками, необходимую ирригацию и правильный севоооборот (Edwards, S. G. 2004. Influence of Agricultural Practices on Fusarium Infection of Cereals and Subsequent Contamination of Grain by Tricothecenes Mycotoxins. Toxicology Letters, 153: 29-35). Но даже самые лучшие стратегии управления не позволяют избежать инфицирования микотоксином в годы, благоприятные для развития заболевания. Среди различных микотоксинов выявлены оказывающие особое влияние на индустрию сельского хозяйства и пищевой промышленности, некоторые проявляются в значительной степени в естественным образом инфицированных пищевых и кормовых продуктах. Включая афлатоксин Bl (afla Bl), охратоксин A (OTA), зеараленон (zea), микофеноловую кислоту (MPA), циклопиазоноваяую кислоту (CPA), фумозин Bl (fum Bl), трихотхецины (T-2), деоксиниваленол (DON) и патулин (pat).
Afla В1 – метаболит грибка Aspergillus flavus и Aspergillus parasiticus, является в высочайшей степени гепатотоксичным соединением, которое часто на низком уровне инфицирует кормовые продукты для птицы (Ramos A.J., Hernandez E. 1996. In vitro aflatoxin adsorption by means of a montmorillonite silicate. A study of adsorption isotherm. Animal Feed Technology. 62: 263-269).
Другое семейство микотоксинов, продуцируемое Penicillium и Aspergillus genera, представляет OTA, являющийся очень сильным токсином, оказывающим негативное воздействие на параметры продуктивности и здоровье птицы. Этот микотоксин известен, как нефротоксическое, иммунотоксическое, канцерогенное и тератогенное вещество для различных видов животных.
Поглощение OTA приводит к повреждению желудочно-кишечного тракта, включая воспаление и диарею (Maresca M., Mahfoud R., Pfohl-Leszkowicz A and Fantini J. 2001. The mycotoxin ochratoxin A alters intestinal barrier and absorption functions but has no effect on chloride secretion. Toxicology and Applied Pharmacology. 176: 54-63).
Сообщалось, что виды Fusarium, которые продуцируют микоэстраген zea, активируют рецепторы эстрагена, что в результате приводит к функциональному изменению в репродуктивных органах. Отек отверстия и увеличение размера яйцевода может быть связано с высокими уровнями zea (Fink-Gremmels J, Malekinejad H. 2007. Clinical effects and biochemical mechanisms associated with exposure to the mycoestrogen zearalenone. Animal Feed Science and Technology. 137:326-341.)
Penicillium roqueforti является одним из значительных источников MPA и он главным образом присутствует в кукурузе (Mansfield M.A., Jones A.D. and Kuldau G.A. 2008. Contamination of fresh and ensiled maize by multiple Penicillium mycotoxins. Department of Plant Pathology, the Pennsylvania State University, University Park 16802, USA. Phytopathology. 98: 330-6) и силосе (Scheis I., Meyer K., Hormansdorfer S. and Bauer J. 2000. Mycophenolic Acid in Silage. Appl Environ Microbiol. 66: 3639-3641). Penicillium roqueforti, Penicillium rubrum и Penicillium brevicompactum ассоциируются с продуцированием MPA и обнаруживаются, как в кормах для крупного рогатого скота, так и в кормах для птицы (Koteswara Rao V., Shilpa P., Girisham S. and Reddy S. M. 2011. Incidence of mycotoxigenic Penicillia in feeds of Andhra Pradesh, India. International Journal for Biotechnology and Molecular Biology Research. 2: 46-50). Микотоксин MPA имеет сильное иммуносупрессивное воздействие, которое выражается в блокировании перехода инозин-5-фосфата в гуанозин-5-фосфат (Allison A.C. and Eugui E.M. 2000. Mycophenolate mofetil and its Mechanism of action. Immunopharmacology. 47: 85-118).
Микотоксин CPA также продуцируется грибками, принадлежащими к родам Aspergillus и Penicillium. Совместное появление CPA с afla В1 главным образом имеет место из-за роста Aspergillus flavus, которая продуцирует оба этих токсина (Dilek H., SukraS., Funda K H and Nesirin M. 2012. Natural contamination of Cyclopiazonic acid in dried figs and co-occurrence of aflatoxin Food control. 23: 82-86). Токсичность CPA у птиц также приводит к патологическим эффектам, таким как гиперемия и изъязвление железистого желудка, фокальный некроз печени и селезенки, истощение лимфоидной ткани фабрициевой сумки, потеря массы и изменения в относительной массе органа (Gentles A., Smith E.E., Kubena L.F., Duffus E., Johnson Paul., Thompson J., Harvey R.B and Edrington T.S. 1999. Toxicological evaluations of Cyclopiazonic acid and Ochratoxin A in broilers. Poultry science. 78: 1380-1384).
Fum В1 - токсическое соединение, по сообщениям продуцируемое Fusarium moniliforme (Gelderblom, W. C. A., Jeskiewicz, K., Marasas, W. F. O., Thiel,P. G., Horak, R. M.m Vleggaar, R., and Kriek, N. P. J. 1988. Fumonisins-novel, mycotoxins with cancer promoting activity produced by Fusarium moniliforme. Appl. Environ. Microbiol. 54: 1806-1811). Воздействие этого токсина включает рахиты и иммуносупрессию у птицы (Norred, W. P. 1993. Fumonisins mycotoxins produced by Fusarium moniliforme. /. Toxicol. Environ. Health. 38:309-328). Однако пагубное воздействие этого токсина также отмечалось у других видов животных. Также сообщалось, что fum В1 проявляется совместно с afla В1 в индийской кукурузе и кормовых продуктах для птицы (Prathapkumar H. Shetty and Ramesh V. Bhat. 1997. Natural Occurrence of Fumonisin Bl and Its Co-occurrence with Aflatoxin Bl in Indian Sorghum, Maize, and Poultry Feeds. /. Agric. FoodChem. 45: 2170-2173).
Токсин T-2, продуцируемый грибком Fusarium, также оказывает токсическое воздействие на птицу. Его пагубное воздействие включает низкую продуктивность у птицы, такую как снижение прироста массы, яйценоскость и выводимость из яиц. Дополнительно к этому также сообщалось об ингибировании синтеза белка, ДНК и РНК, цитотоксичности, иммуномодуляции, повреждении клеток пищеварительного тракта, органов и кожи, нарушении в нервной системе (Sokolovi M, et al. T-2 toxin incidence and toxicity in poultry. 2008. Arh Hig Rada Toksikol 59:43-52).
Сообщалось, что патулин выделен из грибков, включая Penicillium и Aspergillus. Воздействие патулина связано с изменением почечной функции и ингибированием кишечной и почечной ATPаз (Puel O, Galtier P and Oswald LP. 2010. Biosynthesis and Toxicological Effects of Patulin. Toxin. 2: 613-631).
Токсичность и клинические признаки наблюдаются у животных в случае, когда в корме присутствует более чем один микотоксин, последние представляют комплекс и отличаются. Микотоксины, как правило, сопровождаются другими неизвестными метаболитами, которые оказывают синергетические или дополнительные воздействия. По-прежнему предстоит изучить способность связующих веществ смягчать негативное воздействие некоторых комбинаций микотоксинов, естественным образом присутствующих в корме, на продуктивность и биохимические и гематологические параметры сыворотки.
В настоящее время недоступны практические методы детоксикации инфицированного микотоксинами зерна в промышленном масштабе экономически эффективным способом. В настоящее время одним из наиболее перспективных и практичных подходов является использование адсорбентов. Однако было установлено, что некоторые адсорбенты оказывают воздействие на использование питательных веществ (Kubena, L. F., Harvey R. В., Phillips T. D., Corrier D. E., and Huff W. E.. 1990 Diminution of aflatoxicosis in growing chickens by the dietary addition of hydrated sodium calcium aluminosilicate. Poult. Sci. 69:727-735) and mineral adsorption (Chestnut, А. В., Anderson P. D., Cochran M. A., Fribourg H. A., and Twinn K. D. 1992. Effects of hydrated sodium calcium aluminosilicate on fescue toxicosis and mineral absorption. /. Anim. Sci. 70:2838-2846) и отсутствие практического связывающего воздействия с несколькими микотоксинами (Edrington, T. S.; Sarr, А. В.; Kubena, L. F.; Harvey, R. В.; Phillips, T. D. 1996. Hydrated sodium calcium aluminosilicate (HSCAS), acidic HSCAS, and activated charcoal reduce urinary excretion of aflatoxin Ml in turkey poults. Lack of effect by activated charcoal on aflatoxicosis. Toxicology letter, 89: 115-122). Применение ингибиторов плесени или консервация при использовании кислоты позволяет только снизить количество плесени, но не оказывает влияние на содержание микотоксинов, генерированных перед обработкой. В случае, когда микотоксины были продуцированы ранее, никакая форма ингибиторов плесени или смеси кислот не могут оказать на них влияние, поскольку они являются очень стабильными соединениями. Следовательно, эти токсичные соединения остаются в инфицированном ранее продукте даже, если позже не будет обнаружено или определено присутствие плесень. Самой часто используемой стратегией снижения воздействия микотоксинов является снижение их биодоступности за счет включения различных связывающих микотоксины агентов или адсорбентов, что приводит к снижению поглощения микотоксинов и попадания в кровь и органы-мишени. Основные преимущества адсорбентов включают стоимость, безопасность и простоту добавления в кормовые продукты для животных. Для использования в этих целях были протестированы различные группы веществ с силикатами алюминия, в частности глина и традиционные цеолиты, поскольку они являются самыми применяемыми группами.
Глины традиционно добавляют в рационы для животных в качестве веществ, связывающих мультитоксины. Однако была обнаружена низкая степень связывания токсинов с высоким показателем LogP, таких как охратоксин A (OTA), микофеноловая кислота и зеараленон, возможно из-за заряда и гидрофобности микотоксинов с высоким показателем LogP. Следовательно, с недавнего времени более пристально фокусируется внимание на применении альтернативных материалов, таких как цеолиты (Dakovic, A., Tomasevic-Canovic, M., Dondur, V., Rottinghaus, G. E., Medakovic, V., and Zaric, S. (2005) Adsorption of mycotoxins by organozeolites. Colloids Surfaces B: Biointerfaces 46: 20-25), продукты стенок дрожжевых клеток (Joannis-Cassan C, Tozlovanu M, Hadjeba-Medjdoub K, Ballet N, Pfohl-Leszkowicz A., (2011). Binding of zearalenone, aflatoxin Bl, and ochratoxin A by yeast-based products: a method for quantification of adsorption performance. J Food Prot. 74:1175-85.), молекулярно-импринтированные полимеры (Yiannikouris A, Kwiatkowski A, Kudupoje M S and Matney C. Synthetic mycotoxin adsorbents and methods of making and utilizing the same. US 8,426,541 B2) и функционализированные материалы (Dakovic, A., Tomasevic-Canovic, M., Dondur, V., Rottinghaus, G. E., Medakovic, V., and Zaric, S. (2005) Adsorption of mycotoxins by organozeolites. Colloids Surfaces B: Biointerfaces 46: 20-25) в качестве веществ, связывающих токсины.
4+
Цеолиты, которые содержат кислотные центры на поверхности, с высокой удельной поверхностью могут связывать органические молекулы, включая токсины в широких пределах полярности. Сосуществуют, обе формы, и форма H+, и форма NH бета-цеолита, которые содержат упорядоченный и неупорядоченный каркас, и существуют три взаимопересекающихся канала. Каркасная структура имеет два типа 12 членных кольцевых пор. Канальная система бета-цеолита имеет диаметр пор 5,6×5,6 A и 7,7×6,6 A (Barcia, P. S., Silva, J. A. C, Rodrigues, A. E.,(2005) Adsorption Equilibrium and Kinetics of Branched Hexane Isomers in Pellets of Beta Zeolite. Microporous and Mesoporous Materials. 79: 145-163.). Настоящее изобретение относится к оценке связывающей способности H бета-цеолита (HBZ) с микотоксинами.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к веществу, связывающему токсин, содержащему бета-цеолиты. Приведенный в описании настоящей патентной заявки бета-цеолит обладает потенциалом связывания микотоксинов, и не ограничивается афлатоксином В1, охратоксином A, зеараленоном, микофеноловой кислотой, циклопиазоновой кислотой, Фумозином В1, T-2 и патулином, а распространяется также на все другие грибковые вторичные метаболиты, присутствующие в корме для животных.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигура 1 - схематическое изображение линейного графика изотерм HBZ.
Фигура 2 - схематическое изображение данных анализа радиуса пор HBZ при использовании способа BJH.
Фигура 3 - схематическое изображение данных анализа HBZ, проведенного при использовании порошковой рентгено-дифрактометрии (pXRD).
Фигура 4 - схематическое изображение данных эффективности связывания HBZ при трех различных концентрациях связывающего вещества; каждая точка, представляющая экспериментальные данные, является средним суммы связывания/среднее связывания в чистом виде (среднее +/- стандартное отклонение (n=3)). Значительные различия между концентрациями HBZ были отмечены различными буквами в верхнем индексе (ANOVA, p<0,05).
Фигура 5 - схематическое изображение воздействие кислого и близкого к нейтральному pH на связывание HBZ с OTA. Данные каждого эксперимента приведены, как среднее +/- стандартная ошибка, n=3. Значительные различия между концентрациями HBZ были отмечены различными буквами в верхнем индексе (ANOVA, p<0,5).
Фигура 6 - схематическое изображение воздействия различных pH на адсорбированный OTA в HBZ. Данные каждого эксперимента приведены, как среднее +/- стандартная ошибка n=3. Значительные различия между концентрациями HBZ были отмечены различными буквами в верхнем индексе (ANOVA, p<0,05).
Фигура 7 - схематическое изображение влияния метанола на адсорбированный OTA в HBZ. Данные каждого эксперимента приведены, как среднее +/- стандартная ошибка n=3.
Фигура 8 - схематическое изображение воздействия времени контактирования на скорость адсорбции OTA при использовании HBZ. Данные каждого эксперимента приведены, как среднее, n=3.
Фигура 9 - схематическое изображение оценки in vivo OTA связывания HBZ. Данные каждого эксперимента приведены, как среднее +/- стандартная ошибка (n=6 повторов, 2 птиц/повтор). Значительные различия между концентрациями HBZ были отмечены различными буквами (p<0,05).
Фигура 10 - схематическое изображение in vitro сумма/в чистом виде эффективность связывания HBZ с микотоксинами. Данные каждого эксперимента приведены, как среднее +/- стандартная ошибка (n=3).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
4+
+
Приведенное в описании настоящей патентной заявки вещество, связывающее токсин, содержит материалы микропористого цеолита, имеющие 12 членные кольцевые системы. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения приведенное в описании настоящей патентной заявки вещество, связывающее токсин, содержит или NH, или H из бета-цеолита. Согласно другим вариантам осуществления настоящего изобретения приведенные в описании настоящей патентной заявки бета-цеолиты имеют размер пор в пределах от около 1 до около 15 Å, а предпочтительно около 5 Å. Согласно другим вариантам осуществления настоящего изобретения приведенные в описании настоящей патентной заявки бета-цеолиты имеют соотношение Si/Al в пределах от около 10 до около 50, предпочтительно около 25. Согласно другим вариантам осуществления настоящего изобретения приведенные в описании настоящей патентной заявки бета-цеолиты имеют кислотные центры Льюиса и Бренстеда на поверхности наряду с таковыми внутри пор. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения приведенное в описании настоящей патентной заявки вещество, связывающее токсин, адаптировано для применения в качестве вещества, связывающего мультитоксины, в добавках к кормовому продукту для животных. В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения приведенное в описании настоящей патентной заявки вещество, связывающее токсин, адаптировано для связывания микотоксина, где микотоксин выбирают из группы, состоящей из афлатоксина В1, охратоксина A, зеараленона, микофеноловой кислоты, циклопиазоновой кислоты, фумозина В1, T-2 и патулина и также распространяется на вторичные токсичные метаболиты, продуцируемые грибками, бактериальные экзотоксины, алкалоид спорыньи и пестициды.
Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «токсин» относится к любому веществу, включая метаболиты, продуцируемые микробами, которые являются токсичными по своей природе (например, микотоксины, бактериальные эндотоксины, алкалоиды спорыньи).
Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «пестициды» относится к веществам, присутствующим в корме для животных, способным оказывать фунгицидное воздействие на домашних животных.
Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «связывающие вещества» относится к не абсорбируемому материалу, который способен связать целевые молекулы (например, микотоксины, бактериальные эндотоксины, алкалоиды спорыньи).
Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «пористые материалы» относится к материалам, имеющим поры в своем каркасе.
Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «микропористые материалы» относится к материалам, имеющим размер пор менее чем около 20 Å.
Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «размер пор» относится к измерению внутреннего диаметра каналов, присутствующих в цеолитах.
Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «вещество, связывающее мультитоксины» относится к связывающему веществу, способному связать более чем один токсин.
3+
Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «кислотные центры Льюиса» относится к присутствию положительного иона Al в материалах, которые имеют тенденцию к приему электронов.
4+
Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «кислотные центры Бренстеда» относится к присутствию положительного иона NH в материалах, которые имеют тенденцию к отдаче электронов.
ПРИМЕР 1
МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ
18
18
Анализ микотоксинов в настоящей патентной заявки провели при использовании высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Использованные микотоксины были получены от Sigma-Aldrich, India. Разделение провели при использовании аналитической колонки с обращенной фазой С, Phenomenex, Luna С (250 мм×4,6 мм внутренний диаметр, размер частиц 5 μм) при скорости потока 1 мл/минуту. Используемые для количественной оценке композиции мобильной фазы и длина волны детектирования приведены в Таблице 1. Хроматографическая система состояла из Shimadzu LC-20AD, снабженного флуорисцентным детектором и диодно-матричным детектором, соединенным с компьютером с программным обеспечением для обработки данных ЖХ (version 1.25).
<b>ТАБЛИЦА 1</b>
Используемые для количественной оценки токсинов композиции мобильной фазы и длина волны детектирования
Серийный номер
Название микотоксина
Композиция мобильной фазы
Детектор/длина волны
1
Afla В1
Вода: Ацетонитрил=70: 30
Флуоресцентный/Длина волны возбуждения: 365 Длина волны излучения: 440 нм
2
OTA
2% Водный раствор ледяной уксусной кислоты: Ацетонитрил=40: 60
Флуоресцентный/Длина волны возбуждения:333 Длина волны излучения: 443 nm
3
Zea
2% Водный раствор ледяной уксусной кислоты: Ацетонитрил=40: 60
Флуоресцентный/Длина волны возбуждения: 274 нмДлина волны излучения: 450 нм
4
MPA
Ацетонитрил: Вода, отрегулированная до pH 3,0 ортофосфорной кислотой=60: 40
UV/284 нм
5
CPA
Вода: Метанол в соотношение 30: 70 объем/объем, содержащий 300 мг/л сульфата цинка
UV/284 нм
6
PAT
Вода: Ацетонитрил=90: 10
UV/284 нм
7
Fum Bl
0.1 M фосфатный буфер с pH, отрегулированным до 3,35 ортофосфорной кислотой: метанолом=30: 70
Длина волны возбуждения: 335 нмДлина волны излучения: 440 нм
Статистический анализ. Все анализы проводили с множеством повторов. Статистический анализ провели при использовании ANOVA со STATGRAPHICS plus 5.1. Различия при p<0,05 обозначены различными верхними индексами и считаются значимыми.
Способ связывания In vitro. Бифазный способ связывания in vitro включал адсорбцию при pH 3,2 (0,1 M цитратный буфер) с последующей десорбцией при pH 6,8 (0,1 M фосфатный буфер). Взяли известное количество связывающего вещества (10 мг) и суспендировали в 1 мл раствора микотоксина, полученного в 0,1 M цитратном буфере при pH 3,2. Суспензию перемешали на вортексе в течение 1 минуты и выдержали на встряхивающей водяной бане с температурой 40°C в течение 45 минут. После выдержки смесь центрифугировали (Eppendorf, 581 OR) при 10000 оборотов в минуту в течение 10 минут при комнатной температуре. Супернатант удалили и переместили в микроцентрифужные пробирки. Осадок суспендировали 1 мл 0,1 M фосфатного буфера при pH 6,8 и перемешивали на вортексе в течение 1 минуты. Смесь выдерживали на встряхивающей водяной бане с температурой 40°C в течение 45 минут. После выдержки смесь центрифугировали при 10000 оборотов в минуту в течение 10 минут при комнатной температуре. Супернатант удалили и переместили в микроцентрифужные пробирки. Супернатанты анализировали при использовании ВЭЖХ согласно способу, описанному выше, и рассчитали процент связывания в чистом виде (связывание в чистом виде = процент адсорбционного связывания – процент десорбционного связывания).
ПРИМЕР 2
2
2
3
2
+
Бета-цеолит с молярной композицией 30 TEAOH (гидроксид тетраметиламмония)-50SiO-AlO-75OHO и соотношением Si/Al 25 синтезировали при использовании гидротермального метода. Материал синтезировали на основе описанной в литературе процедуры (Ding L, Zheng Y, Zhang Z, Ring Z, Chen J. 2006. Effect of agitation on the synthesis of zeolite beta and its synthesis mechanism in the absence of alkali. Microporous and Mesoporous Materials. 94 1-8) синтез пористого материала, который широко используют в качестве катализатора в нефте-химической промышленности. Синтезированный материал подвергли ионообмену при использовании 0,1M нитрата аммония в течение 24 часов (NH4 форма). После этого продукт обмена аммония фильтровали и прокаливали при температуре 550°C в течение 12 часов (H+ форма). Полученный таким образом конечный продукт назвали H бета-цеолит (HBZ), который далее использовали для последующих исследований в настоящем изобретении.
ПРИМЕР 3
Для получения характеристик HBZ провели анализы. Получили такие характеристики HBZ, как удельная поверхность BET, размер пор BJH, при использовании анализатора сорбции N2 (Quantachrome Autosorb) и порошковой рентгено-дифрактометрии (pXRD, дифрактометр Rigaku при использовании излучения Cu-Ka (k=0,154 нм)).
На Фигурах 1 и 2 приведены изотермы адсорбции-десорбции и распределение размера пор BJH HBZ, а результаты анализа удельной поверхности при использовании BET способа приведены в Таблице 2. Установленный радиус пор (Фигура 2) составил 5,5 Å. Эти данные позволяют предположить, что меньший радиус пор HBZ играет роль в улавливании более мелких молекул, таких как микотоксины, что могло бы привести к возникновению эффекта удержания (Li, C. 2004. Chiral synthesis on catalysts immobilized in microporous and mesoporous materials. Catal. Rev. 46: 419-492).
У изотермы наблюдается узкая петля типа II, что подтверждает образование упорядоченной микропористой структуры с однородным распределением размера пор. Значительное снижение количества адсорбированного азота в случае HBZ в обоих, и в монослойной, и в мультислойной области подтверждает образование пор малого размера. Также данные, полученные при наблюдении на стадии капиллярной конденсации, которая дает прямое измерение диаметра пор материалов, сдвинуты в сторону низкого относительного давления для HBZ, обнаруживая снижение диаметра пор HBZ.
<b>ТАБЛИЦА 2</b>
Анализ удельной поверхности BET H-бета цеолита (HBZ)
Материалы
Удельная поверхность (м<sup>2</sup>/г)
HBZ
333
Дополнительно, характеристики материала получают при использовании pXRD и отражения приведены на Фигуре 3. Отражение HBZ при более высоких 29 показателях от 21° до 23° подтверждает образование бета-цеолита (Kang, Z., Zhang, X., Liu, H., Qiu, J., and Yeung, K. L. 2013. A rapid synthesis route for Sn-Beta Zeolite s by steam-assisted conversion and their catalytic performance in Baeyer-Villiger oxidation. Chem. Eng. J. 218: 425-432).
ПРИМЕР 4
Провели оценку In vitro связывания OTA для HBZ при использовании бифазного исследования связывания для обнаружения наименьших концентраций, необходимых для адсорбции/связывания всего OTA, используемого в эксперименте. Процедура включает суспензию из HBZ: 0,75% (0,75 мг) в растворе OTA (1 μг/мл, полученного в цитратном буфере при pH 3,2) в течение 1 часа при температуре 40°C на встряхивающей водяной бане. Далее рассчитали связывание OTA в чистом виде по Примеру 1. Аналогично провели оценку при 0,25% и 0,5%. На Фигуре 4 показано влияние различных концентраций HBZ на связывание с OTA. Высокое связывание наблюдали при 0,5% и 0,75% HBZ. Наблюдалось дозозависимое увеличение связывания при 0,25% и 0,5%, которое является статистически значимым (p<0,05, n=3). Это указывает на то, что 0,5% концентрация адсорбента является достаточной для связывания концентрации OTA, использованной в эксперименте.
ПРИМЕР 5
Провели эксперимент для оценки влияния pH на связывание OTA с HBZ. Адсорбцию OTA оценили по отдельности при pH 3,2 и pH 6,8 по Примеру 1 с 1 μг/мл OTA, результаты приведены на Фигуре 5. HBZ продемонстрировал максимальное связывание при показателе pH 3,2 наряду с pH 6,8. Не наблюдалось статистических различий эффективности связывания для HBZ при pH 6,8 по сравнению с pH 3,2 (p>0,05, n=3). В большей части процесса адсорбции эффект связывания микотоксинов из водной среды в очень высокой степени зависит от pH, поскольку pH оказывает влияние на поверхностный заряд адсорбентов, наряду со степенью ионизации токсинов. Это подтверждает способность HBZ связываться с OTA независимо от состояния ионизации (либо ионизированное, либо не ионизированное).
В процессе переваривания у моногастричных животных показатель pH пищевого комка изменяется в значительной степени в зависимости от отделов желудочно-кишечного тракта (GI), то есть от pH 6,5 (желудок) до pH 3,0 (мускульный желудок) и затем до pH 7,5 (дистальная часть кишечного тракта, Fengying, G., Jie, G., Hui, R., and Guoqing, H. (2011) In Vitro Evaluating the Activities and Stabilities of the Multihydratases Produced by Aspergillus Niger Zju-Yl in Simulated Poultry Digestive Tract pH Levels. Procedia Eng. 18, 405). Следовательно, провели оценку влияния pH, симулирующего pH ЖК тракта. Сначала OTA адсорбировали на адсорбенты (HBZ) при pH 6,8 по Примеру 1 и провели последовательную оценку осадка на десорбцию с 1 мл pH 3,0, 5,0, 6,8 и 7,5 и анализировали супернатанты на каждой стадии на содержание OTA. Рассчитали остаточное содержание OTA, результаты приведены на Фигуре 6. Минимальные данные по десорбции HBZ (<5%) наблюдались при pH (3,2, 5, 6,8), и десорбция 16% наблюдалась при pH 7,5 (Фигура 6). Это исследование свидетельствует о том, что связанный OTA в HBZ остается практически интактным при прохождении его через ЖК тракт. Эти результаты и полученные данные указывают на то, что HBZ с адсорбированным OTA практически стабилен во всех пределах pH, относящихся к ЖК тракту моногастричных.
ПРИМЕР 6
initial
bound
unbound
Хемосорбционный индекс (CI), интенсивность адсорбции OTA в HBZ определили при использовании описанного ранее способа с некоторыми модификациями (Dwyer M. R., Kubena L., Harvey R. В., Mayura K., Sarr А. В., Buckley S., Bailey R. H. and Phillips T. D. 1997. Effects of Inorganic Adsorbents and Cyclopiazonic Acid in Broiler Chickens. Poultry Science. 76: 1141-1149). Кратко, 10 мг адсорбентов добавили в 1 мл воды, содержащей 1 μг/мл OTA (С) и выдерживали при температуре 40°C в течение 1 часа. Через 1 час пробирки центрифугировали и супернатанты анализировали на OTA, и провели оценку количества связанного OTA (C). В осадок добавили 1 мл 20% метанола и выдержали в течение 1 часа на встряхивающей водяной бане, центрифугировали и провели анализ супернатнтов на OTA (C). Процент OTA, связанного с HBZ, на каждой стадии приведен на Фигуре 7. Показатель CI рассчитали при использовании следующего уравнения 1,
bound
unbound
initial
CI - (C - C)/C*
Уравнение 1. Хемосорбционный индекс.
Полученный в результате показатель CI приведен в Таблице 3. CI HBZ составил 0,78. Результаты свидетельствуют о том, что HBZ имеет самую высокую склонность и самую высокую связываемость для HBZ при анализируемой концентрации метанола.
<b>ТАБЛИЦА 3</b>
Определение хемосорбционного индекса (CI)H-бета цеолита (HBZ)
Адсорбенты
CI
20% метанол
HBZ
0,78%
ПРИМЕР 7
Дополнительно провели эксперименты для определения взаимодействий, связанных с HBZ и OTA. Взаимодействия, связанные с HBZ и OTA, определили проведением термодинамических исследований (Avantaggiato, G., Greco, D., Damascelli, A., Solfrizzo, M., and Visconti, A. (2014) Assessment of Multi-микотоксин Adsorption Efficacy of Grape Pomace. /. Agric. Food Chem. 62, 497-507; Ringot, D., Lerzy, В., Bonhoure, J. P., Auclair, E., Oriol, E., and Larondelle, Y. (2005) Effect of temperature on in vitro ochratoxin A biosorption onto yeast cell wall derivatives. Process. Biochem.: 3008-3016). Полученные при проведении термодинамических исследований параметры представляли следующие: изменение свободной энергии Гиббса, AG° (кДж/моль) является фундаментальным критерием самопроизвольности и получено при использовании уравнения Гиббса-Гельмгольца (Ур.2),
0
AG°=-RT In K
Уравнение 2. Уравнение Гиббса-Гельмгольца.
0
где K – константа равновесия, R – универсальная газовая константа и T – абсолютная температура (K).
0
eq
eq
Константу равновесия K для реакции адсорбции определяли при использовании Уравнения 3, где Q (моль/кг) – молярную концентрацию OTA в адсорбированной фазе и C – остаточная концентрация OTA в равновесии (моль/л).
0
eq
eq
K=Q/C
Уравнение 3. Константа равновесия.
0
0
Константа равновесия (K) выражена через изменения энтальпии и энтропии, полученные при использовании уравнения Вант-Гоффа (Ур. 4), где R – универсальная газовая константа и T – абсолютная температура (K), ΔH° - изменение энтальпии (кДж/моль) и S° - изменение энтропии (кДж/моль.K). Кривизна графика и отсекаемые участки графика 1/T относительно In K использовали для расчета показателей AH° и AS°.
0
Ln K=(-ΔH7RT)+(ΔS7R) Уравнение 4. Уравнение Вант-Гоффа.
0
2
Термодинамические параметры (ΔG°, ΔH° и ΔS°) для OTA с HBZ рассчитали при различных температурах (278 K, 288 K, 298 K, 308 K и 318 K), результаты приведены в Таблице 4. Наблюдались отрицательные показатели ΔG° (Таблица 4) с HBZ, что указывает на стихийный процесс адсорбции. Кривизну графика и отсекаемые участки графика 1/T относительно In K использовали для расчета термодинамических параметров (ΔH° и ΔS°) согласно уравнению Вант-Гоффа (Таблица 4). Графики, полученные для OTA при экспериментальных температурах, дали корреляцию R=0,9612 для HBZ (данные не показаны). Показатели AH° (стандартная энтальпия) и ΔS° (стандартная энтропия) приведены в Таблице 4. Отрицательный показатель ΔH° для OTA подтверждает экзотермическую природу феномена.
Было установлено, что энтальпия составила менее чем 20 кДж/моль, указывая на физическую сорбцию, позволяя быстро достигать равновесие. Магнитуда показателей ΔS° также указывает на природу взаимодействий между адсорбатом и адсорбентом. HBZ продемонстрировал положительный показатель ΔS°, предполагая главным образом гидрофобное взаимодействие между адсорбентом и адсорбатом. Как правило, расход энтальпии ассоциируются с гидрофобными взаимодействиями, но обратное наблюдается с HBZ, что позволяет предположить, что связывание также включает полярные не ковалентные взаимодействия. Отрицательный показатель энтальпии и положительный показатель энтропии также наблюдались с другими сорбентами (Lin, F.-Y., and Chen, W.Y. (2001) Microcalorimetric Studies on the Interaction Mechanism between Proteins and Hydrophobic Solid Surfaces in Hydrophobic Interaction Chromatography: Effects of Salts, Hydrophobicity of the Sorbent, and Structure of the Protein. Anal. Chem. 73: 3875-3883. Ringot, D., Lerzy, В., Bonhoure, J. P., Auclair, E., Oriol, E., and Larondelle, Y. (2005) Effect of temperature on in vitro ohratoxin A biosorption onto yeast cell wall derivatives. Process. Biochem. 40: 3008-3016).
<b>ТАБЛИЦА 4</b>
Термодинамические параметры для адсорбции OTA H-бета-цеолита (HBZ)
Материал
Температура (K)
K<sub>0</sub>
In K<sub>0</sub>
ΔG(кДж/моль)
ΔH° (кДж/моль)
ΔS°(кДж/моль-K)
HBZ
278
7592,30
8,93
-20,65
288
5424,86
8,59
-20,58
298
4754,36
8,46
-20,97
-14,22
22,76
308
4305,28
8,36
-21,42
318
3244,48
8,08
-21,37
ПРИМЕР 8
Оценивали скорость адсорбции OTA HBZ при различных временных интервалах при pH 6,8 и pH 3,2 по отдельности при дозировке 1% масса/объем (10 мг/мл) наряду с 0,2% (2 мг/мл) (трехкратные независимые эксперименты) при 1 μг/мл OTA (Avantaggiato, G., Greco, D., Damascelli, A., Solfrizzo, M., and Visconti, A. (2014) Assessment of Multi-mycotoxin Adsorption Efficacy of Grape Pomace. /. Agric. Food Chem. 62: 497-507). Отбор образцов проводили через определенные временные промежутки (1-60 минут). Порции жидкого супернатанта анализировали на остаточное содержание OTA и рассчитали процент связывания по Примеру 1. Результаты приведены на Фигуре 8.
Наблюдалась очень быстрая адсорбция OTA на HBZ, и равновесие устанавливалось за короткий период времени. Воздействие времени контакта является очень важным для снижения микотоксинов за счет адсорбции, поскольку большая часть токсинов очень быстро адсорбируется в ЖК тракте (Avantaggiato, G., Greco, D., Damascelli, A., Solfrizzo, M., and Visconti, A. (2014) Assessment of Multi- mycotoxin Adsorption Efficacy of Grape Pomace. /. Agric. Food Chem. 62: 497-507). OTA is reported to absorb rapidly from the GI tract by passive absorption (Ringot, D., Lerzy, В., Bonhoure, J. P., Auclair, E., Oriol, E., and Larondelle, Y. (2005) Effect of temperature on in vitro ochratoxin A biosorption onto yeast cell wall derivatives. Process. Biochem. 40: 3008-3016). Максимальная адсорбция >80% для HBZ достигалась через 5 минут. Не наблюдалось быстрого изменения в проценте адсорбции HBZ через 5 минут. Это указывает на установление равновесия с HBZ за более короткое время. Такое быстрое поглощение токсинов и установление равновесия HBZ в короткий период времени указывает на более высокую эффективность материала.
ПРИМЕР 9
Одним из подходов для оценки in vivo потенциала связывания адсорбентов является анализ содержания микотоксинов в выделениях организма, получавших адсорбенты, и сравнения с выделениями организма контрольной группы, не получавшей адсорбенты. In vivo потенциал связывания материала оценивали при участии цыплят бройлеров.
In vivo исследование выделений организма провели при участии шести недельных птиц породы Vencobb-400. Каждая из исследуемых групп имела шесть повторов с двумя птицами на повтор. Птиц адаптировали в течение пяти дней с доступом к корму без ограничений (мешанка на основе кукурузы и сои) и воде. Птиц держали голодными в течение 24 часов для опорожнения содержимого желудка. После периода голодания каждую птицу кормили 50 г кормового продукта (зараженного 200 частей на миллиард OTA) соответствующего исследуемой группе, как показано в Таблице 5. Воду давали без ограничения в течение всего периода исследования. Образцы выделений организма собирали в течение 72 часов. Собранные образцы выделений организма сушили при температуре 50°C в течение 48 часов. OTA из образцов выделений организма выделяли, как следующее: 5г сухих образцов выделений организма экстрагировали 20 мл растворителя (ацетонитрил и 10% ледяная уксусная кислота=1:1) при использовании встряхивателя-инкубатора (Orbitrek, LT) в течение 60 минут при 250 оборотах в минуту (овм). После перемешивания встряхиванием смесь профильтровали. Фильтрат переместили в разделительную воронку и добавили 20 мл гексана, перемешали энергичным встряхиванием в течение 10 минут и оставили на 10 минут для разделения слоев. Верхний гексановый слой выгрузили для удаления жиров и масла. Ту же процедуру повторили дважды. Нижний слой дополнительно экстрагировали 50 мл хлороформа трижды. Все слои хлороформа объединили вместе и пропустили через слой сульфата натрия, расположенный на воронке. Хлороформ удалили при использовании ротационного испарителя (Heidolph, Hei-VAP advantage), остаток восстановили 5 мл 50% водного раствора ацетонитрила. Восстановленный слой центрифугировали при 10000 оборотов в минуту в течение 10 минут (Eppendorf, 5810R), супернатанты подвергли количественной оценке при использовании ВЭЖХ на OTA по Примеру 1.
<b>ТАБЛИЦА 5</b>
Исследуемые группы, участвующие в исследовании in vivo выделения OTA. Все исследуемые группы получали кормовой продукт, зараженный OTA#.
Группа
Число повторов*
Доза HBZ (на тонну кормового продукта)
Контроль
6
-
Исследование 1 (Tl)
6
Исследование 2 (T2)
6
1кг
*-2 птицы/повтор; #-200 частей на миллиард мешанки с добавлением OTA; HBZ- H-бета цеолит.
Результаты представлены на Фигуре 9. Все исследуемые группы показали значительно более высокое количество OTA в выделениях организма по сравнению с контролем. В этом исследовании куры, откармливаемые кормовым продуктом с добавлением OTA, показали значительно более высокий выделенный OTA во всех исследуемых группах по сравнению с контролем (p<0,05, Фигура 9), что подтверждает in vivo потенциал связывания обогащенного материала.
ПРИМЕР 10
Далее провели оценку HBZ на его способность связывания множества микотоксинов. Получили концентрированные растворы микотоксинов в ацетонитриле и хранили при температуре 4°C. Получили рабочие концентрированные растворы (afla Bl (0,5 μг/мл), OTA (1 μг/мл), fum Bl (2 μг/мл), MPA (5 μг/мл), CPA (5 μг/мл), zea (1 μг/мл), PAT (5 μг/мл) и T-2 (2 μг/мл) отдельных микотоксинов в 0,1 M цитратном буфере с pH 3,2 по Примеру 1. Провели бифазное in vitro исследование всех указанных токсинов по отдельности согласно процедуре, указанной в Примере 1, и рассчитали связывание в чистом виде. На Фигуре 10 приведены результаты чистого связывания токсина HBZ, и эти результаты показали, что HBZ обладает способностью связывать мультитоксин.
Приведенное выше описание патентной заявки и чертежи содержат иллюстрирующие варианты осуществления настоящего изобретения. Приведенные варианты и способы осуществления настоящего изобретения могут варьировать на основе квалификации, опыта и предпочтений специалиста в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Простое перечисление стадий способа в определенном порядке не ограничивает любой другой порядок стадий способа. Приведенное выше описание патентной заявки и чертежи просто разъясняют и иллюстрируют настоящее изобретение, настоящее изобретение ими не ограничивается, за исключением случаев, когда ограничение накладывается самой формулой изобретения. Специалист в области техники, к которой относится настоящее изобретение, может сделать модификации и вариации, не выходящие за рамки настоящего изобретения.