СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДНОЙ СУСПЕНЗИИ БИОСОВМЕСТИМЫХ ПОРИСТЫХ КРЕМНИЕВЫХ НАНОЧАСТИЦ
METHOD FOR PREPARING WATER SUSPENSION OF BIOCOMPATIBLE POROUS SILICON PARTICLE

Область техники
Изобретение относится к области неорганических наноматериалов, которые могут быть использованы в биомедицинских применениях. Более конкретно настоящее изобретение относится к кремниевым наночастицам для биомедицинских применений, а также к методу получения таких наночастиц.
Уровень техники
Из современного уровня развития биологии и медицины хорошо известны технические решения, основанные на применении различных видов наночастиц.
Кремний является одним из наиболее распространенных элементов на Земле, и интерес к его роли в человеческой физиологии и метаболизме неуклонно растет после новаторских работ Е.М. Карлисле (Carlisle Е.М. "Silicon: an essential element for the chick" // Science 1972. V.178. PP.619-62; Carlisle E.M. "The nutritional essentiality of silicon" // Nutr. Rev. 1982. V.40. PP.193-1988) и последующих затем исследований (Dobbie J.W, Smith M.J.B. "Silicon: its role in medicine and biology" // Scott. Med. 1982. V.27; Seaborn C. "Silicon: a nutritional beneficence for bones, brain and blood vessels" // Nutr. Today. 1993. V.28. PP.13-18; Van Dyck K. "Indication of silicon essentiality in humans: serum concentrations in Belgian children and adults, including pregnant women" // Biol. Trace Elem. 2000. V.77. PP.25-32; Bisse E. "Reference values for serum silicon in adults" // Anal. Biochem. 2005. V.337. PP.130-135). Установлено, что ортокремниевая кислота является наиболее быстро усваиваемой и выделяемой формой кремния и силикатов у людей (Jugdaosingh R. "Dietary silicon intake and absorption" // Am. J. Clin. Nutr. 2002. V.75. PP.887-993).
Общее содержание кремния в теле здорового взрослого человека весом 70 кг в норме составляет 0,5-1,0 г., что делает кремний третьим наиболее распространенным микроэлементом в организме человека после железа и цинка (Jugdaosingh R. "Dietary silicon intake and absorption" // Am. J. Clin. Nutr. 2002. V.75. PP.887-93).
Коммерчески доступные кремниевые добавки базируются на кремнеземе или силикатах вместо использования кремния в его чистой полупроводниковой форме, и биологическая усвояемость таких форм кремния переменна и низка (Jugdaosingh R. "Dietary silicon intake and absorption" // Am. J. Clin. Nutr. 2002. V.75. PP.887-93).
Интерес к наночастицам кремния на начальном этапе изучения был вызван возможностями их применения в оптоэлектронике и работами Л. Кэнама (Canham L.T. "Nanoscale semiconducting silicon as a nutritional food additive" // Nanotechnology. 2007. V.18. P.185704), который продемонстрировал интенсивную красную фотолюминесценцию данного материала. Однако еще более удивительным было обнаруженное свойство биосовместимости и биодеградации нанокремния (Seaborn С."Silicon: a nutritional beneficence for bones, brain and blood vessels" // Nutr. Today. 1993. V.28 PP.13-18; Van Dyck K. "Indication of silicon essentiality in humans: serum concentrations in Belgian children and adults, including pregnant women" // Biol. Trace Elem. Res. 2000. V.77. PP.25-32). Материал ведет себя настолько дружественно к живой ткани, что способствует росту живых клеток на своей поверхности (нейронов, костной ткани и т.д.). Это открытие ознаменовало собой прорыв в биомедицинских применениях нанокремния, позволяя предложить инновационные методы и материалы для доставки лекарств, способные рассасываться ортопедические материалы, биосовместимые ткани и т.д. В работе Е. Биссе (Bisse Е. "Reference values for serum silicon in adults" // Anal. Biochem. 2005. V.337. PP.130-135.) установлено, что нанокремний может стать важнейшим биоматериалом, и предполагает, что на его основе может в дальнейшем развиваться биомедицинская инженерия и биосенсорная технология. Биоматериал - это неживой материал, который используют в биомедицине для взаимодействия с биологическими системами. Биоматериалы могут быть "биоинертными", "биоактивными" и "биорастворимыми". Биоактивные - это такие материалы, при попадании которых в живой объект (in-vivo) образуются связи между данным материалом и живой тканью (Bisse Е. "Reference values for serum silicon in adults" // Anal. Biochem. 2005. V.337. PP.130-135).
2
2
5
Одним из первых методов получения кремниевых наночастиц явился метод электрохимического формирования так называемого пористого кремния (ПК) при его электрохимическом травлении монокристаллического кремния (c-Si), предложенный еще в 1956 г.группой ученых под руководством А. Улира (A. Uhlir), и затем изучалось многими исследователями. Обзор таких работ имеется, например, в работе Р.Югдаосайна (Jugdaosingh R. "Dietary silicon intake and absorption" // Am. J. Clin. Nutr. 2002. V.75. PP.887-93). В качестве электролитов обычно используют концентрированную плавиковую кислоту (HF) или ее водно-спиртовые смеси HF:HO:CHOH в различных пропорциях, в зависимости от условий эксперимента. Данный способ получения пленок ПК, состоящего из нанокристаллических кремниевых частиц, до сих пор остается одним из наиболее практичных и доступных.
2
3
Известны также многочисленные методы получения ПК с использованием не электрохимического, а чисто химического травления кремния. Для этого в состав раствора наряду с HF вводится сильный окислитель, например, KNO, HNO и т.п.(Jugdaosingh R. "Dietary silicon intake and absorption" // Am. J. Clin. Nutr. 2002. V. 75. PP. 887-93). Такой пористый кремний по сравнению со сформированным электрохимическим способом имеет ограниченную толщину слоя (от 100 нм до единиц мкм). Известен также способ создания кремниевых наночастиц с помощью измельчения (помола) кремниевых порошков в планетарных мельницах (Seaborn С."Silicon: a nutritional beneficence for bones, brain and blood vessels" // Nutr. Today 1993.V. 28. PP. 13-18., Canham L.T. "Nanoscale semiconducting silicon as a nutritional food additive"// Nanotechnology. 2007. V.18. P. 185704.). Для получения нанопорошков кремния также используют лазерную абляцию из кремниевых мишеней (Canham L.T., Reeves C.L., King D.O., Branfield P.J., Crabb J., Ward M.C.L. // Adv Mater. 1996. V.8. P. 850; Canham L.T. // Adv Mater. 1995. V.7. No 12. P.1033).
Все вышесказанное свидетельствует о том, что проблема получения нанопорошков кремния все еще находится в процессе обсуждения, а соответствующие теории получения наночастиц кремния сложны, и в ряде случаев противоречивы. Очевидно также, что понимание механизмов образования наночастиц кремния, а также результирующей биосовместимости и биоактивности кремниевых наночастиц, невозможно без учета конкретных химических свойств кремния.
Известен патент 1999 г.US 5,914,183, в котором описаны слои пористого кремния и раскрыт способ их изготовления с помощью жидкостного электрохимического травления. Известен также патент US 6,666,214, а также патенты US 7,186,267 и US 7,332,339, где показано, что некоторые виды кремниевых наноструктур и наночастиц являются биосовместимыми и биоактивными.
В заявках на изобретения US 2011204489 и US 2011215441 описываются сходные методы создания легко отделяемых от кремниевой подложки кремниевых наноструктур с помощью химического осаждения ионов металла на окисленную поверхность кремния. Ионы металла создают на поверхности наноструктуры, которые служат маской при травлении кремния. После химического травления и удаления металла остаются ансамбли кремниевых наноструктур. В заявке на изобретение US 2007104888 раскрыт метод создания центров нуклеации и последующего роста на них наноструктур. Для создания центров нуклеации подложка облучается пучком ионов кремния. В международной заявке WO/2011/073666 раскрыт метод создания наноструктур на поверхности кремния (то есть пористого кремния) с помощью химического травления в присутствии ионов металлов.
Известны методы измельчения твердых веществ. Так в патентах US 6,537,672 и US 6,500,534 в частности раскрывается метод измельчения суспензии неорганических частиц, например, бемита до размеров частиц от 1 до 100 нм с помощью ультразвукового воздействия. В международной заявке WO/2003/099262 раскрывается метод создания биодеградируемых полимерных наночастиц в водно-масляной эмульсии с применением ультразвука. В международной заявке публикации WO/2001/003670 описано приготовление суспензий из готовых (заранее созданных) наночастиц с помощью ультразвука. Патент US 7,671,113 описывает метод приготовления наноэмульсии эластичного материала, например стирен-бутадиеновой резины с узким распределением частиц по размерам. Для этого жидкость с частицами эластичного материала размером от 600 до 1000 нм пропускают через кавитационное устройство. Кавитацию вызывают пропусканием через жидкость ультразвука частотой от 16 до 100 кГц.
2
2
Наиболее близким аналогом к данному изобретению является патент US 6,585,947 "Method for producing silicon nanoparticles", в котором раскрыт метод получения нанокристаллов кремния размером 1 нм с очень узким распределением частиц по размерам. Наночастицы кремния получают в процессе электрохимического травления кремниевой подложки в растворе HF и НО. После чего посредством ультразвуковой обработки в ацетоне, этаноле или метаноле отделяют наночастицы от кремниевой подложки после травления. Полученные наночастицы предлагается использовать для последующей обработки или создания нанокомпозитов, в том числе, получения водных суспензий для биомедицинских применений.
Сущность изобретения
Главными проблемами при разработке методов создания суспензий кремниевых наночастиц для биомедицинских применений являются: 1) создание наночастиц с необходимыми размерами (10 до 500 нм), сохраняющих кристаллическую структуру, которые могли бы образовывать устойчивые суспензии; 2) получение суспензий таких частиц концентрацией 1 г/л или более, так чтобы они могли бы быть использованы в биомедицинских применениях. Существующие в настоящее время методы получения кремниевых наночастиц не дают возможности получать их устойчивые водные суспензии. Имеющиеся методы позволяют изготавливать наночастицы либо с большим числом дефектов, либо недостаточного размера. Водные суспензии таких наночастиц слишком быстро деградируют для того, чтобы их можно было использовать в биомедицинских применениях. Кроме того, химический состав поверхности таких частиц может быть недостаточно хорошо контролируем для того, чтобы они были биосовместимыми.
Задачей изобретения является создание способа получения биосовместимых водных суспензий наночастиц кремния преимущественно для использования в биомедицинских целях, включая диагностику и терапию различных заболеваний.
Технический результат изобретения заключается в получении биосовместимой суспензии наночастиц кремния при помощи измельчения пленок пористого кремния в воде ультразвуковым излучением определенной интенсивности с сохранением пористой и нанокристаллической структуры наночастиц с размерами от 10 до 500 нм. При измельчении пленок пористого кремния массой 1 г в объеме воды 1 л получается суспензия наночастиц кремния с концентрацией 1 г/л. Полученные наночастицы проникают в живые клетки, сохраняя свои полезные биологические свойства и люминесценцию.
Оригинальность используемого метода заключается в выборе в качестве исходного материала пленок пористого кремния определенной пористости, определяющей биосовместимость и биодеградируемость материала, и последующего их измельчения ультразвуком определенной интенсивности, что обеспечивало получение водной суспензии пористых наночастиц кремния, сохраняющих свои полезные свойства биосовместимости и биодеградируемости, а также способных проникать в живые клетки.
2
2
Поставленная задача решается тем, что способ получения водных суспензий кремниевых нанокристаллических частиц для биомедицинских применений включает формирование на поверхности кремниевых пластин пленки пористого кремния (толщиной от 1 до 100 мкм и пористостью от 50 до 80%) методом электрохимического травления в растворе, содержащем плавиковую кислоту (водный раствор с концентрацией кислоты от 40 до 50% по объему) и этиловый, метиловый, пропиловый, изопропиловый спирт или другие подобные спирты в соотношении от 1:1 до 1:5, в течение промежутка времени от 10 до 60 минут с плотностью тока от 20 до 60 мА/см, после чего полученные пластины кремния, покрытые слоем пористого кремния, промывают в дистиллированной воде, высушивают, затем помещают в емкость с дистиллированной водой и в течение промежутка времени не менее 10 минут подвергают обработке ультразвуком с интенсивностью воздействия на пластины кремния в воде 10-100 Вт/см с частотой 23 кГц или больше с получением в дистиллированной воде устойчивой суспензии из наночастиц с поперечными размерами от 10 до 500 нм.
Изобретение поясняется чертежами, где на фиг.1 представлен общий вид пленки пористого кремния в сканирующем электронном микроскопе, фиг.2, - изображение полученных наночастиц кремния в просвечивающем электронном микроскопе, фиг.3 - картина электронной дифракции от полученных наночастиц кремния, которая демонстрирует их нанокристаллическое строение, фиг.4 - результаты проведенного эксперимента по использованию полученных водных суспензий наночастиц кремния в качестве люминесцентных меток для окрашивания клеток млекопитающих, на которой представлены фотографии клеток тимоцита собаки CF2Th, сделанные через красный фильтр, на которых яркие белые точки соответствуют наночастицам кремния, проникшим в клетку.
В настоящем изобретении предлагается использовать двухстадийный метод производства водных суспензий нанокристаллических кремниевых частиц для биомедицинских применений.
2
На первой стадии процесса на поверхности кремниевых пластин формируют пленки пористого кремния методом электрохимического травления в растворе, содержащем плавиковую кислоту (водный раствор с концентрацией кислоты от 40 до 50% по объему) и этиловый, метиловый, пропиловый, изопропиловый спирт или другой подобный спирт в соотношении от 1:1 до 1:5, в течение промежутка времени от 10 до 60 минут с плотностью тока от 20 до 60 мА/см. В результате данного процесса на поверхности кремниевых пластин формируются слои пористого кремния толщиной от 1 до 100 мкм и пористостью от 50 до 80%. Полученные пластины кремния, покрытые слоем пористого кремния, тщательно промывают в дистиллированной воде и высушивают, что обеспечивает контролируемый химический состав их поверхностного покрытия.
2
На второй стадии процесса пластины кремния, покрытые слоем пористого кремния, помещают в емкость с дистиллированной водой и в течение не менее 10 минут подвергают обработке ультразвуком высокой интенсивности воздействия на пластины кремния в воде от 10 до 100 Вт/см с частотой около 23 кГц или больше. В результате ультразвуковой обработки слои пористого кремния отделяются от кремниевых пластин и разрушаются на отдельные наночастицы с размерами от 10 до 500 нм. При этом разрушение происходит в области максимально напряженного и дефектного материала. В результате, получаемые наночастицы остаются кристаллическими и малодефектными. Эти наночастицы образуют в дистиллированной воде суспензию, которую можно вводить в живой организм.
Новизна заявляемого способа формирования суспензий наночастиц кремния для биомедицинских применений заключается в использовании в качестве исходного материала пленок кремния с высокой пористостью не менее 50%, которые можно измельчать в воде при помощи ультразвука относительно низкой интенсивности, что сохраняло одновременно нанокристаллическую структуру наночастиц и их пористость. Такие наночастицы существуют в виде водных суспензий, которые являются биосовместимыми и допускают введение в живые системы и последующее использование в диагностике и терапии.
Предлагаемый метод изготовления наночастиц кремния позволяет получать водные суспензии с известными размерами наночастиц от 10 до 500 нм и высокой концентрации до 10 г/л. Указанные суспензии могут храниться в темноте при комнатной температуре в течение не менее одного месяца. При этом размеры наночастиц существенно не изменяются. Наночастицы в виде суспензий могут быть введены в культуры клеток и биологические системы, а именно в кровь, соединительные и мышечные ткани для использования их в качестве диагностического и терапевтического средства.
Данные суспензии могут вводиться в биологические системы, а именно, культуры клеток и ткани, для последующей активации с помощью света, ультразвука и других физических воздействий для достижения необходимого диагностического или терапевтического эффекта.
Исследованиям токсикологической безопасности наночастиц в биомедицинских исследованиях уделяется повышенное внимание (Garnett М.С., Kallinteri P. "Nanomedicines and nanotoxicology. some physiological principles"// Occup.Med. 2006. V.56, PP.307-311; Дурнев А.Д., Соломина А.С. и др. "Исследование генотоксической и тератогенной активности нанокристаллов кремния" // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2010. Т.148. №4. С.429-433).
В работе (Дурнев А.Д., Соломина А.С. и др. "Исследование генотоксической и тератогенной активности нанокристаллов кремния" // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2010. Т.148. №4. С.429-433), описано, что при попадании наночастиц в кровоток, возможен их транспорт через все тело и накопление в конкретных органах. Здесь же отмечено, что если в организм попадает биорастворимый кремний, то он легко выводится в виде ортокремниевой кислоты.
Пример получения суспензии
2
5
2
2
Наноструктурированные кремниевые поверхности были получены стандартным методом электрохимического травления пластин кристаллического кремния (c-Si) р-типа проводимости с ориентацией поверхности (100) и удельным сопротивлением 10 Ом-см в растворе плавиковой кислоты и этилового спирта (HF(50%):CHOH) при плотности тока травления от 50 мА/см в течение 60 минут. Это позволяло сформировать на подложке с-Si слои так называемого пористого кремния с пористостью 50%. Толщина слоя пористого кремния составила около 100 мкм (большее время травления обеспечивало большую толщину слоя). Как показали исследования в атомно-силовом микроскопе, на поверхности слоя присутствовали наноструктуры в виде выступов и впадин высотой 10-100 нм (Фиг.1). После получения пористого слоя, кремниевые пластины подвергались тщательной промывке и сушке, что обеспечивало контролируемый состав поверхностного покрытия наночастиц кремния. Для получения водных суспензий кремниевых наночастиц осуществлялась обработка кремниевых пластин с пористой пленкой или отслоенных пленок пористого кремния ультразвуковыми колебаниями с частотой 23 кГц, интенсивностью 60 Вт/см в дистиллированной воде в течение 15 мин. При этом пленка пористого кремния разрушалась с образованием водной суспензии кремниевых наночастиц размером 200-400 нанометров, сохраняющих пористое строение (Фиг.2). Концентрация получаемых суспензий составляла 1 г/л, что определялось долевым соотношением массы используемых пленок пористого кремния (1 г) и воды (1 л). Нанокристаллическая структура получаемых наночастиц подтверждалась данными электронной дифракции (Фиг.3).
Биосовместимость полученных водных суспензий проверяли в экспериментах на животных, в ходе которых полученную суспензию вводили внутрибрюшинно крысам в дозах 5, 25 и 50 мг/кг. Исследуемый материал не показал цитогенетической активности в клетках костного мозга испытуемых животных после 24-х часовой, 7 и 14 дневной экспозиции при однократного введения.
Таким образом, в проведенном исследовании не выявлено цитогенетических эффектов водной суспензии наночастиц кремния in vivo, показана их незначительная генотоксическая активность в клетках костного и головного мозга. Представленные результаты характеризуют полученные водные суспензии наночастиц кремния как биосовместимый наноматериал.