Производные слитого с Fc белка с высокой двойной активностью: противовирусной активностью в отношении ВИЧ и иммуномодулирующей активностью
DERIVATIVES OF PROTEIN FUSED WITH Fc WITH HIGH DOUBLE ACTIVITY: ANTIVIRAL ACTIVITY RELATIVELY TO HIV AND IMMUNOMODULATING ACTIVITY

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к производным слитого с Fc белка, направленным против ВИЧ, с улучшенным выходом при продуцировании в клетках млекопитающих, пролонгированными противовирусной и иммуномодулирующей активностями. Производные слитого с Fc белка по настоящему изобретению характеризуются тем, что: (1) блокируют проникновение вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) в клетки-хозяева, (2) индуцируют селективные эффекторные функции благодаря активации естественных киллерных (NK) и других клеток иммунной системы, (3) продуцируются в клетках млекопитающих с высоким выходом и (4) обладают пролонгированной активностью in vivo. Изложены различные формы этих полипептидов и приведены их примеры. В объем настоящего изобретения также входят выделенные нуклеиновые кислоты, векторы и клетки-хозяева, экспрессирующие указанные полипептиды, а также их применение в здравоохранении в терапевтических и диагностических целях.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
ВИЧ-инфекция представляет собой одну из главных угроз для общественного здоровья, имеющих международное значение. Согласно оценкам, более 78 миллионов людей во всем мире были инфицированы вирусом иммунодефицита человека, начиная с 1981 г. За это время почти половина этих инфицированных индивидуумов скончались вследствие синдрома приобретенного иммунодефицита человека (СПИД). См. UNAIDS, http://www.unaids.org/, октябрь 2015.
Создание защитных антител является основным механизмом для разработки вакцин против патогенов человека. Однако до сих пор не удавалось создать иммуногены, способные вызывать выработку таких антител против ВИЧ. Конструирование таких иммуногенов требует, во-первых, идентификации консервативных эпитопов для обеспечения продолжительного и стабильного ответа и, во-вторых, изобретения новых и более эффективных иммуногенов, которые надлежащим образом презентируют эти эпитопы. См. Haynes В, Curr Opin Immunol. 2015; 35:39-47. В отличие от указанных скромных достижений в разработке иммуногенов, за последнее время было идентифицировано большое количество новых эффективных антител широкого спектра (т.е. нейтрализующих антител широкого спектра действия, bNAbs) против гликопротеина оболочки ВИЧ, выделенных у ВИЧ-инфицированных индивидуумов. См. Mascola J, et al., Immunol Rev. 2013; 254:225-244. Кроме того, в качестве новых терапевтических агентов также были предложены синтетические молекулы на основе структуры антител. См. Gardner М, et al., Nature 2015; 519:87-91. Действительно, высокоэффективные антитела могут защищать неинфицированных индивидуумов от заражения ВИЧ или могут применяться в стратегиях эрадикации у ВИЧ-инфицированных пациентов. См. Mascola, 2013, выше. Применение нейтрализующих антител против гликопротеина оболочки и его субъединиц также было предложено для предупреждения репликации ВИЧ in vivo. См. Yang X, et al., J. Virol. 2005; 79:3500-3508.
С терапевтической точки зрения антитела имеют особо важное значение благодаря выполнению ими двойной функции: противовирусных агентов, способных блокировать репликацию ВИЧ за счет связывания с гликопротеином оболочки ВИЧ, и активаторов NK-клеток за счет взаимодействия константных областей цепей антител (Fc) с Fc-рецептором CD16, экспрессируемым на поверхности NK-клеток и других клеток. Такое взаимодействие позволяет CD16+ иммунным клеткам убивать инфицированные клетки за счет механизма, известного как антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC). См. Milligan С, et al., Cell Host Microbe. 2015; 17:500-506. Поскольку для защиты неинфицированных субъектов, как полагают, необходимы оба вида активности, прилагали значительные усилия для разработки нейтрализующих антител с повышенной противовирусной активностью и ADCC-активностью. Описано несколько производных IgG, которые повышают аффинность человеческих IgG1 к CD16 человека, таким образом, увеличивая их ADCC-активность. См. Saxena A, et al., Frontiers Immunol 2016; 7(580):1-11. Однако на клиническое применение таких модифицированных слитых с Fc белков может повлиять то, что они продуцируются в клетках млекопитающих с низким выходом или то, что происходят изменения их эффекторных функций. Таким образом, в области техники существует потребность в нейтрализующих антителах с улучшенной ADCC-активностью, обладающих селективностью в отношении рецепторов, и продуцируемых с высоким выходом.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В первом аспекте данная заявка относится к модифицированным производным слитого с Fc белка по изобретению, содержащим в направлении от N- к С-концу:
(а) внеклеточные домены D1 и D2 человеческого рецептора CD4,
(б) Fc-участок человеческого IgG1, содержащий по меньшей мере одну из точечных мутаций M428L или N434S,
(в) группировку, выбранную из группы, состоящей из:
n
(1) линкерного полипептида с последовательностью (GGGGS) где 1≤n≤10,
(2) SEQ ID NO: 5-9 и
(3) их комбинации, и
(г) полипептид, являющийся производным gp41.
Производные слитого с Fc белка по изобретению обладают противовирусной активностью и ADCC-активностью, превышающей таковую любых сопоставимых антител, известных в области техники. См. Gardner, 2015, выше. Экспрессия и продолжительность действия производных слитого с Fc белка по изобретению также выше, чем у других сопоставимых антител против ВИЧ.
В дополнительном аспекте изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим производные слитого с Fc белка по изобретению, к векторам, содержащим указанные нуклеиновые кислоты, и клеткам-хозяевам, содержащим нуклеиновые кислоты и векторы, указанные выше.
В следующем аспекте изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим производные слитого с Fc белка, нуклеиновые кислоты, векторы и клетки-хозяева по изобретению или их смеси.
В другом аспекте изобретение относится к комбинации, содержащей производные слитого с Fc белка, нуклеиновые кислоты, векторы, клетки-хозяева и фармацевтические композиции по изобретению и по меньшей мере один терапевтический агент.
В еще одном аспекте изобретение относится к применению производных слитого с Fc белка, нуклеиновых кислот, векторов, клеток-хозяев, фармацевтических композиций и комбинаций по изобретению или их смесей в качестве лекарственного средства. В следующем варианте данного аспекта изобретение относится к применению производных слитого с Fc белка, нуклеиновых кислот, векторов, клеток-хозяев, фармацевтических композиций и комбинаций по изобретению или их смесей в лечении или предупреждении ВИЧ-инфекции или СПИДа. В альтернативной форме указанного аспекта изобретение относится к способу лечения или предупреждения ВИЧ-инфекции или СПИДа у субъекта, включающему введение субъекту терапевтически эффективного количества производных слитого с Fc белка, нуклеиновых кислот, векторов, клеток-хозяев, фармацевтических композиций и комбинаций по изобретению или их смесей. В другой альтернативной форме данного аспекта изобретение относится к применению производных слитого с Fc белка, нуклеиновых кислот, векторов, клеток-хозяев, фармацевтических композиций и комбинаций по изобретению или их смесей в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения ВИЧ-инфекции или СПИДа.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения производных слитого с Fc белка по изобретению, включающему стадии (а) культивирования клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту по изобретению, (б) экспрессии нуклеотидной последовательности и (в) выделения производного слитого с Fc белка из культуры клетки-хозяина.
В другом аспекте изобретение относится к способу инактивации ВИЧ, включающему приведение вируса в контакт с производным слитого с Fc белка по изобретению.
В дополнительном аспекте изобретение относится к способу индукции экспрессии gp120 в ВИЧ-инфицированной клетке, включающему стадию приведения инфицированной клетки в контакт с производными слитого с Fc белка, нуклеиновыми кислотами, векторами, клетками-хозяевами, фармацевтическими композициями и комбинациями по изобретению или их смесью.
В следующем аспекте изобретение относится к способу определения ВИЧ в образце, включающему стадии (а) приведения образца в контакт с производным слитого с Fc белка по изобретению и (б) определения, происходит ли специфическое связывание производного слитого с Fc белка с молекулой из образца.
В еще одном аспекте изобретение относится к набору, включающему производные слитого с Fc белка, нуклеиновые кислоты, векторы, клетки-хозяева и фармацевтические композиции по изобретению, или их смеси.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг. 1 Схематическое изображение общей структуры производных слитого с Fc белка по изобретению. В направлении от N- к С-концу молекулы содержат домены D1 и D2 человеческого CD4, константную область человеческого IgG1 (например, дикого типа, мутированную), возможно, пептид CCR5 человека, гибкий линкер и пептид gp41 ВИЧ (например, Т-20, С34 или ЕНО).
Фиг. 2 Схематическое изображение процедур скрининга, осуществляемых для улучшения активности и выхода слитого с Fc белка. Провели скрининг различных наборов мутаций в последовательности человеческого IgG1 для улучшения продукции и эффекторных функций. См. Таблицу 1. Затем провели скрининг различных линкеров и полипептидов Т20, С34 и ЕНО, являющихся производными gp41.
Фиг. 3 Кинетика продукции различных производных слитого с Fc белка по изобретению. Все мутации IgG1 внедряли в молекулу М7 IgG1 wt С34.
50
50
Фиг. 4 Нейтрализующая активность нескольких производных слитого с Fc белка по изобретению. Все мутации внедряли в молекулу М7 IgG1 wt С34. А) Показаны значения IC для следующих изолятов ВИЧ: NL4.3, BaL, АС10 и SVPB16. Показаны среднегеометрические значения IC для каждого производного слитого с Fc белка. Б) Показано влияние мутаций LL на нейтрализующую активность в отношении изолята BaL. В) Показано влияние различных комбинаций мутаций на нейтрализующую активность в отношении изолята BaL.
Фиг. 5 ADCC-активность различных мутированных слитых с IgG белков по изобретению. Значения ЕС50 для ADCC нормализовали к референтной молекуле M1. Более низкие значения указывают на более высокую активность. А) ADCC-активность серий А12-А141. Б) Показано влияние мутаций LL на ADCC-активность. В) Показано влияние различных комбинаций мутаций на ADCC-активность.
Фиг. 6 Связывание с CD32a, CD32bc, Cd16a, CD16aVF, CD64 и C1q различных мутированных слитых с IgG белков по изобретению. Кратность изменений сигналов, регистрируемых при связывании в ИФА (иммуноферментный анализ), рассчитывали для каждого соединения с применением молекулы IgG1 дикого типа М7АС34 (данные не приведены). Кратность изменений подвергали логарифмическому преобразованию Log2 и разбивали на кластеры.
Фиг. 7 Аффинность связывания нескольких производных слитого с Fc белка по изобретению, обладающих пролонгированной активностью в отношении рекомбинантного человеческого неонатального Fc рецептора (FcRn). Проводили ИФА при рН 6,0 (верхняя панель) и рН 7,2 (нижняя панель).
Фиг. 8 Влияние различных линкеров на продуцирование, нейтрализацию и ADCC-активность слитых белков по изобретению. А) Оценивали продуцирование в клетках 293Т вплоть до 7 суток после трансфекции. Б) Оценивали нейтрализующую активность в отношении изолятов ВИЧ-1 BaL и АС10. В) ADCC-активность показана как на Фиг. 5.
Фиг. 9. Влияние различных пептидов gp41 на продуцирование, нейтрализацию и ADCC-активность слитых белков по изобретению. А) Оценивали продуцирование в клетках 293Т вплоть до 7 суток после трансфекции. Б) Оценивали нейтрализующую активность в отношении изолята ВИЧ-1 BaL. В) ADCC-активность представлена первичными данными о зависимости доза-эффект (в качестве отрицательного контроля использовали молекулу М7ВС34, производное IgG2).
Фиг. 10. Влияние слитых белков по изобретению in vivo. А) Схематическое изображение экспериментов in vivo. Б) Анализ инфицированных клеток (HIV GAG+ клетки) через две недели после инфицирования в селезенке необработанных животных (CTROL) и животных, обработанных (M20A16_4LLC34 и M21A16_4LLC34).
Фиг. 11. Диаграмма экспрессирующей плазмиды рМ5А16Т20. Показаны основные характеристики плазмиды, такие как селектируемый маркер и открытые рамки считывания.
Фиг. 12. Диаграмма экспрессирующей плазмиды pM7A16LLC34. Показаны основные характеристики плазмиды, такие как селектируемый маркер и открытые рамки считывания.
ДЕПОНИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ
Плазмиды рМ5А16Т20 и pM7A16LLC34 депонировали 20 апреля 2017 г. под регистрационными номерами DSM 32496 и DSM 32497, соответственно, в DSMZ - Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen),  7 B, D-38124 Braunschweig, ФРГ.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Нуклеотидные и аминокислотные последовательности, приведенные в прилагаемом перечне последовательностей, показаны с использованием стандартных буквенных аббревиатур и кодов, обычно используемых в области техники. Показана только одна цепь каждой нуклеотидной последовательности, однако очевидно, что комплементарная цепь также включена благодаря ссылке на приведенную цепь. В прилагаемом перечне последовательностей:
SEQ ID NO: 1 представляет собой аминокислотную последовательность домена D1 человеческого рецептора CD4.
SEQ ID NO: 2 представляет собой аминокислотную последовательность домена D2 человеческого рецептора CD4.
SEQ ID NO: 3 представляет собой аминокислотную последовательность Fc-участка человеческого IgG1.
SEQ ID NO: 4 представляет собой аминокислотную последовательность линкерного полипептида GGGGS.
SEQ ID NO: 5 представляет собой аминокислотную последовательность N-концевой области человеческого рецептора CCR5.
SEQ ID NO: 6 представляет собой аминокислотную последовательность линкерного пептида M19.
SEQ ID NO: 7 представляет собой аминокислотную последовательность линкерного пептида М20.
SEQ ID NO: 8 представляет собой аминокислотную последовательность линкерного пептида М21.
SEQ ID NO: 9 представляет собой аминокислотную последовательность линкерного пептида М22.
SEQ ID NO: 10 представляет собой аминокислотную последовательность полипептида Т-20.
SEQ ID NO: 11 представляет собой аминокислотную последовательность полипептида С34.
SEQ ID NO: 12 представляет собой аминокислотную последовательность полипептида ЕНО.
SEQ ID NO: 13 представляет собой аминокислотную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего набор мутаций AM (т.е. точечные мутации G236A, S239D, A330L и I332E).
SEQ ID NO: 14 представляет собой аминокислотную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего набор мутаций А12 (т.е. точечные мутации F243L, R292P и Y300L).
SEQ ID NO: 15 представляет собой аминокислотную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего набор мутаций А14 (т.е. точечные мутации F243L, R292P и P396L).
SEQ ID NO: 16 представляет собой аминокислотную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего набор мутаций А16 (т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L и P396L).
SEQ ID NO: 17 представляет собой аминокислотную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего набор мутаций А18 (т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L, P396L и V305I).
SEQ ID NO: 18 представляет собой аминокислотную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего набор мутаций А41 (т.е. точечные мутации S298A, Е333А и K334A).
SEQ ID NO: 19 представляет собой аминокислотную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего набор мутаций LL (т.е. точечные мутации M428L и N434S).
SEQ ID NO: 20 представляет собой аминокислотную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего набор мутаций AM+LL (т.е. точечные мутации G236A, S239D, A330L, I332E, M428L и N434S).
SEQ ID NO: 21 представляет собой аминокислотную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего набор мутаций A12+LL (т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L, M428L и N434S).
SEQ ID NO: 22 представляет собой аминокислотную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего набор мутаций A14+LL (т.е. точечные мутации F243L, R292P, P396L, M428L и N434S).
SEQ ID NO: 23 представляет собой аминокислотную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего набор мутаций A16+LL (т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L, P396L, M428L и N434S).
SEQ ID NO: 24 представляет собой аминокислотную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего набор мутаций A18+LL (т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L, P396L, V305I, M428L и N434S).
SEQ ID NO: 25 представляет собой аминокислотную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего набор мутаций A41+LL (т.е. точечные мутации S298A, Е333А, K334A, M428L и N434S).
SEQ ID NO: 26 представляет собой аминокислотную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего наборы мутаций А16_1 и LL (т.е. точечные мутации S239D, F243L, R292P, Y300L, P396L, M428L и N434S).
SEQ ID NO: 27 представляет собой аминокислотную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего наборы мутаций А16_2 и LL (т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L, K322A, P396L, M428L и N434S).
SEQ ID NO: 28 представляет собой аминокислотную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего наборы мутаций А16_3 и LL (т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L, I332E, P396L, M428L и N434S).
SEQ ID NO: 29 представляет собой аминокислотную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего наборы мутаций А16_4 и LL (т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L, K322A, I332E, P396L, M428L и N434S).
SEQ ID NO: 30 представляет собой аминокислотную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего наборы мутаций А16_5 и LL (т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L, Е333А, K334A, P396L, M428L и N434S).
SEQ ID NO: 31 представляет собой аминокислотную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего наборы мутаций А16_6 и LL (т.е. точечные мутации S239D, F243L, R292P, Y300L, K322A, I332E, K334A, P396L, M428L и N434S).
SEQ ID NO: 32 представляет собой аминокислотную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего наборы мутаций А41_1 и LL (т.е. точечные мутации S239D, F243L, R292P, S298A, Е333А, K334A, M428L и N434S).
SEQ ID NO: 33 представляет собой аминокислотную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего наборы мутаций А41, А16 и LL (т.е. точечные мутации F243L, R292P, S298A, Е333А, K334A, M428L и N434S).
SEQ ID NO: 34 представляет собой нуклеотидную последовательность домена D1 человеческого рецептора CD4.
SEQ ID NO: 35 представляет собой нуклеотидную последовательность домена D2 человеческого рецептора CD4.
SEQ ID NO: 36 представляет собой нуклеотидную последовательность Fc-участка человеческого IgG1.
SEQ ID NO: 37 представляет собой нуклеотидную последовательность линкерного полипептида.
SEQ ID NO: 38 представляет собой нуклеотидную последовательность 5' концевой области человеческого рецептора CCR5.
SEQ ID NO: 39 представляет собой нуклеотидную последовательность линкерного пептида M19.
SEQ ID NO: 40 представляет собой нуклеотидную последовательность линкерного пептида М20.
SEQ ID NO: 41 представляет собой нуклеотидную последовательность линкерного пептида М21.
SEQ ID NO: 42 представляет собой нуклеотидную последовательность линкерного пептида М22.
SEQ ID NO: 43 представляет собой нуклеотидную последовательность полипептида Т-20.
SEQ ID NO: 44 представляет собой нуклеотидную последовательность полипептида С34.
SEQ ID NO: 45 представляет собой нуклеотидную последовательность полипептида ЕНО.
SEQ ID NO: 46 представляет собой нуклеотидную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего набор мутаций AM (т.е. точечные мутации G236A, S239D, A330L и I332E).
SEQ ID NO: 47 представляет собой нуклеотидную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего набор мутаций А12 (т.е. точечные мутации F243L, R292P и Y300L).
SEQ ID NO: 48 представляет собой нуклеотидную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего набор мутаций А14 (т.е. точечные мутации F243L, R292P и P396L).
SEQ ID NO: 49 представляет собой нуклеотидную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего набор мутаций А16 (т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L и P396L).
SEQ ID NO: 50 представляет собой нуклеотидную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего набор мутаций А18 (т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L, P396L и V305I).
SEQ ID NO: 51 представляет собой нуклеотидную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего набор мутаций А41 (т.е. точечные мутации S298A, Е333А и K334A).
SEQ ID NO: 52 представляет собой нуклеотидную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего набор мутаций LL (т.е. точечные мутации M428L и N434S).
SEQ ID NO: 53 представляет собой нуклеотидную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего набор мутаций AM+LL (т.е. точечные мутации G236A, S239D, A330L, I332E, M428L и N434S).
SEQ ID NO: 54 представляет собой нуклеотидную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего набор мутаций A12+LL (т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L, M428L и N434S).
SEQ ID NO: 55 представляет собой нуклеотидную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего набор мутаций A14+LL (т.е. точечные мутации F243L, R292P, P396L, M428L и N434S).
SEQ ID NO: 56 представляет собой нуклеотидную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего набор мутаций A16+LL (т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L, P396L, M428L и N434S).
SEQ ID NO: 57 представляет собой нуклеотидную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего набор мутаций A18+LL (т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L, P396L, V305I, M428L и N434S).
SEQ ID NO: 58 представляет собой нуклеотидную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего набор мутаций A41+LL (т.е. точечные мутации S298A, Е333А, K334A, M428L и N434S).
SEQ ID NO: 59 представляет собой нуклеотидную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего наборы мутаций А16_1 и LL (т.е. точечные мутации S239D, F243L, R292P, Y300L, P396L, M428L и N434S).
SEQ ID NO: 60 представляет собой нуклеотидную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего наборы мутаций А16_2 и LL (т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L, K322A, P396L, M428L и N434S).
SEQ ID NO: 61 представляет собой нуклеотидную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего наборы мутаций А16_3 и LL (т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L, I332E, P396L, M428L и N434S).
SEQ ID NO: 62 представляет собой нуклеотидную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего наборы мутаций А16_4 и LL (т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L, K322A, I332E, P396L, M428L и N434S).
SEQ ID NO: 63 представляет собой нуклеотидную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего наборы мутаций А16_5 и LL (т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L, Е333А, K334A, P396L, M428L и N434S).
SEQ ID NO: 64 представляет собой нуклеотидную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего наборы мутаций А16_6 и LL (т.е. точечные мутации S239D, F243L, R292P, Y300L, K322A, I332E, K334A, P396L, M428L и N434S).
SEQ ID NO: 65 представляет собой нуклеотидную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего наборы мутаций А41_1 и LL (т.е. точечные мутации S239D, F243L, R292P, S298A, Е333А, K334A, M428L и N434S).
SEQ ID NO: 66 представляет собой нуклеотидную последовательность Fc-участка человеческого IgG1, несущего наборы мутаций А41, А16 и LL (т.е. точечные мутации F243L, R292P, S298A, Е333А, K334A, M428L и N434S).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к производным слитого с Fc белка, направленным против ВИЧ, с улучшенной двойной противовирусной и иммуномодулирующей активностью. Производные слитого с Fc белка по настоящему изобретению характеризуются повышенной способностью: (1) блокировать проникновение вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) в клетки-хозяева и (2) индуцировать эффекторные функции благодаря активации естественных киллерных (NK) клеток. Производные слитого с Fc белка по настоящему изобретению также характеризуются (3) высокой продукцией в клетках млекопитающих и (4) пролонгированной активностью in vivo.
1. Определения основных терминов и выражений
Термин «АС10», используемый в данном документе, относится к первичному изоляту ВИЧ, отличающемуся своей устойчивостью к антителам против сайта связывания CD4. АС10 относится к изолятам с чувствительностью 2 уровня (умеренной) к нейтрализующим антителам. См. Seaman М, et al., J. Virol. 2010; 84:1439-1452.
Термин «адено-ассоциированный вирус» или «AAV», используемый в данном описании, относится к представителю семейства вирусов Parvoviridae, который содержит линейный одноцепочечный ДНК-геном приблизительно из 5000 нуклеотидов. В области техники известно по меньшей мере 11 распознаваемых серотипов AAV (AAV1-11).
Термин «AAV вектор», используемый в данном описании, относится к нуклеиновой кислоте, имеющей последовательность 5'-концевого инвертированного концевого повтора (ITR) AAV и 3'-концевого ITR AAV, фланкирующих последовательность, кодирующую полипептид, функционально связанную с элементами регуляции транскрипции (например, промоторами, энхансерами) и последовательностью полиаденилирования. AAV вектор может включать, возможно, один или более интронов, расположенных между экзонами последовательности, кодирующей полипептид. См. Samulski J, et al., Annu. Rev. Virol. 2014; 1:427-451.
Термин «СПИД», используемый в данном документе, относится к симптоматической фазе ВИЧ-инфекции и включает как синдром приобретенного иммунодефицита (известный как СПИД), так и «ARC», или СПИД-ассоциированный комплекс. См. Adler М, et al., Brit. Med. J. 1987; 294: 1145-1147. Иммунологические и клинические проявления СПИДа хорошо известны в области техники и включают, например, оппортунистические инфекции и злокачественные новообразования, возникающие вследствие иммунодефицита.
Термин «аминокислота», используемый в данном документе, относится к аминокислотам естественного происхождения и синтетическим аминокислотам, а также к аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, функция которых аналогична аминокислотам естественного происхождения. Аминокислоты в данном описании могут обозначаться либо их общеизвестными трехбуквенными символами, либо однобуквенными символами, рекомендованными комиссией по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB. Аналогично, нуклеотиды могут обозначаться их общепринятыми однобуквенными кодами.
Термин «конъюгат лекарственное средство-антитело» или «ADC», используемый в данном документе, относится к антителу, антигенсвязывающему фрагменту антитела, производному слитого с Fc белка, комплексу с антителом или слитому с антителом белку, которые конъюгированы с терапевтическим агентом. Конъюгация может быть ковалентной или нековалентной. Предпочтительно, конъюгация является ковалентной.
Термин «антиретровирусная терапия» или «АТ», используемый в данном документе, относится к введению одного или более антиретровирусных лекарственных средств (т.е. антиретровирусных агентов для лечения ВИЧ) для ингибирования репликации ВИЧ. Как правило, AT включает введение по меньшей мере одного антиретровирусного агента (или, обычно, коктейля антиретровирусных агентов), таких как нуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы (например, зидовудин (AZT), ламивудин (3ТС) и абакавир), ненуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы (например, невирапин и эфавиренз) и ингибитор протеаз (например, индинавир, ритонавир и лопинавир). Термин высокоактивная антиретровирусная терапия (ВААРТ) относится к режимам лечения, разработанным для агрессивного подавления репликации ВИЧ и прогрессирования заболевания. ВААРТ обычно включает три или более различных лекарственных средств, таких как, например, два нуклеозидных ингибитора обратной транскриптазы и ингибитор протеазы.
-6
-7
-8
Термин «эффективность связывания», используемый в данном описании, относится к аффинности молекулы к рецептору CD4 и, предпочтительно, D1 и D2 доменам указанного рецептора. В контексте изобретения «аффинность» означает силу, с которой производное слитого с Fc белка связывается, например, с сайтом связывания CD4 на gp120. В данном документе термин «связывание» или «специфично связывается» относится к взаимодействию между связывающимися парами (например, двумя белками или соединениями, предпочтительно, между (1) сайтом связывания CD4 на gp120 и (2) рецептором CD4 или D1 и D2 доменами рецептора CD4. В некоторых воплощениях взаимодействие характеризуется константой аффинности самое большее 10 моль/л, самое большее 10 моль/л или самое большее 10 моль/л. В целом, выражение «связывание» или «специфично связывается» относится специфическому связыванию одного соединения с другим, где уровень связывания, измеряемый с помощью любого стандартного исследования, статистически значимо выше, чем фоновый контроль в исследовании.
Термин «С34», используемый в данном документе, относится к полипептиду, являющемуся производным gp41, с последовательностью SEQ ID NO: 11, включающему часть HR2 области gp41. См. Eggink D, et al., J. Virol. 2008; 82(13):6678-6688.
Термин «CCR5», используемый в данном документе, относится к человеческому рецептору С-С хемокинов 5 типа, также известному как CD195, рецептору, имеющему 7 трансмембранных доменов, связанному с G-белками. CCR5 связывается с различными хемокинами и действует как корецептор для Env ВИЧ в процессе проникновения ВИЧ в клетки-мишени. В выполнении функции корецептора ВИЧ задействованы различные области CCR5; однако, первое взаимодействие происходит между N-концевой внеклеточной областью CCR5 и сайтом связывания корецептора Env ВИЧ, расположенным на субъединице gp120. См. Lagenaur L, et al., Retrovirology 2010; 7:11. Полная последовательность белка человеческого CCR5 имеет регистрационный номер UniProt Р51681 (18 августа 2015).
Термин «CD4» или «рецептор CD4», используемый в данном документе, относится к кластеру дифференцировки 4, гликопротеину, экспрессируемому на поверхности Т-хелперных клеток, моноцитов, макрофагов и дендритных клеток. CD4 помогает Т-клеточному рецептору (TCR) присоединяться к антиген-презентирующим клеткам. Используя ту часть, которая располагается внутри Т клетки, CD4 усиливает сигнал, генерируемый TCR, рекрутируя фермент, известный как тирозин-киназа lck, который является существенным для активации многих молекул, задействованных в сигнальном каскаде активированной Т клетки. Полная последовательность белка человеческого CD4 имеет регистрационный номер UniProt Р01730 (18 июня 2012).
Термин «кодон-оптимизированный», используемый в данном документе, относится к изменению кодонов нуклеиновых кислот, отражающему типичное использование кодонов организмом-хозяином для улучшения экспрессии референтного полипептида без изменения его аминокислотной последовательности. Существует несколько способов и программ, известных в области техники, для оптимизации кодонов. См. Narum D, et al., Infect. Immun. 2001; 69(12):7250-7253), Outchkourov N, et al., Protein Expr. Purif. 2002; 24(1):18-24, Feng L, et al., Biochemistry 2000; 39(50):15399-15409 and Humphreys D, et al., Protein Expr. Purif. 2000; 20(2):252-264.
Термин «комплемент», используемый в данном документе, относится к части системы врожденного иммунитета, которая усиливает (комплементирует) способность антител и фагоцитирующих клеток удалять микробы и поврежденные клетки из организма, способствует воспалению и атакует плазматическую мембрану патогенов. См. Janeway С, et al., "The complement system and innate immunity", Immunobiology: The Immune System in Health and Disease (Garland Science, New York, US, 2001).
Термин «содержащий» или «содержит», используемый в данном документе, также охватывает «состоящий из», в соответствии с общепринятой патентной практикой.
Термин «ЕНО», используемый в данном документе, относится к пептиду С34ЕНО, последовательности фрагмента HR2 трансмембранной субъединицы изолята ЕНО ВИЧ-2 с последовательностью SEQ ID NO: 12.
Термин «Env» или «gp160», используемый в данном документе, относится к гликопротеину, обладающему либо антигенной специфичностью, либо биологической функцией белка внешней оболочки (Env) ВИЧ и включающему две субъединицы, гликопротеины gp120 и gp41. Примеры последовательностей полипептидов дикого типа (wt) gp160 доступны. См. регистрационные номера GenBank ААВ05604 и AAD12142.
Термин «кристаллизующийся фрагмент иммуноглобулина», или «Fc область», используемый в данном документе, относится к хвостовой области антитела, которая взаимодействует с рецепторами клеточной поверхности, обозначаемыми Fc рецепторами и некоторыми белками системы комплемента.
Выражение «функционально эквивалентный вариант», используемое в данном документе, относится к: (1) полипептиду, образующемуся в результате модификации, делеции или вставки одной или нескольких аминокислот, и по существу сохраняющему активность своего референтного полипептида, и (2) полинуклеотиду, образующемуся в результате модификации, делеции или вставки одного или нескольких оснований, и по существу сохраняющему активность полипептида, экспрессируемого референтной нуклеиновой кислотой. Функционально эквивалентные варианты, рассматриваемые в контексте данного изобретения, охватывают полипептиды, демонстрирующие по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% сходства или идентичности с последовательностями SEQ ID NO: 1-33, или полинуклеотиды, демонстрирующие по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% сходства или идентичности с последовательностями SEQ ID NO: 34-66. Степень идентичности или сходства между двумя полипептидами или двумя полинуклеотидами определяют с использованием компьютерных алгоритмов и способов, хорошо известных в области техники. Идентичность и сходство между двумя последовательностями аминокислот предпочтительно определяют с помощью алгоритма BLASTP. См. Altschul S, et al., "BLAST Manual" (NCBI NLM NIH, Bethesda, MD, USA, 2001).
Термин «слитый белок», используемый в данном документе, относится к белкам, созданным при помощи генетической инженерии, состоящим из двух или нескольких функциональных доменов, происходящих из различных белков. Слитый белок может быть получен стандартными способами (например, посредством экспрессии гена нуклеотидной последовательности, кодирующей указанный слитый белок в подходящей клетке).
Термин «gp41», используемый в данном документе, относится к гликопротеину gp41 оболочки вируса иммунодефицита человека 1 типа. Gp41 представляет собой субъединицу, которая вместе с gp120 образует гликопротеин Env ВИЧ-1. Env представляет собой тример, состоящий из трех внешних субъединиц (gp120) и трех трансмембранных субъединиц (gp41). Внеклеточная группировка белка gp41 содержит три основных функциональных области: пептид слияния (FP), N-концевой гептадный повтор (HR1) и С-концевой гептадный повтор (HR2). Области HR1 и HR2 содержат ряд мотивов, подобных лейциновой «застежке-молнии», которые склонны образовывать спиральные структуры. См. Peisajovich S, Shai Y, Biochem. Biophys. Acta 2003; 1614:122-129;  T, et al., FEBS Lett. 2000; 477:145-149; Chan D, et al., Cell 1997; 89:263-273. В данном описании «gp41» также относится к трансмембранному гликопротеину оболочки других типов ВИЧ (например, ВИЧ-2, ВИОЧ, ВИО), помимо ВИЧ-1. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности gp-41 многих ВИЧ находятся в публичном доступе. См. базу данных последовательностей ВИЧ http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/mainpage.html, апрель 2017.
Термин «ингибиторы gp41», используемый в данном документе, включает ряд полипептидов различной длины, которые включают HR2 область gp41. Эти ингибиторы включают без ограничения полипептиды Т-20, С34, Т-1249, Т-2635 и ЕНО, являющиеся производными gp41.
Выражение «полипептид, являющийся производным gp41», используемое в данном документе, относится к полипептиду, имеющему происхождение от мотивов гептадного повтора 1 (HR1) или гептадного повтора 2 (HR2) gp41. Последовательности HR1 и HR2 gp41 хорошо известны в области техники. См. Lupas A, Trends Biochem. Sci. 1996; 21:375-382 and Chambers P, et al., J. Gen. Virol. 1990; 71:3075-3080. Предпочтительно, полипептид, являющийся производным gp41, имеет происхождение от HR2. Полипептиды, являющиеся производными gp41, могут содержать дополнительные экзогенные аминокислоты, расположенные на их N- или С-концах. Предпочтительно, экзогенных аминокислот меньше 10, более предпочтительно, меньше 5, и наиболее предпочтительно, меньше 3.
Термин «gp120», используемый в данном документе, относится к гликопротеину, обладающему либо антигенной специфичностью, либо биологической функцией белка внешней оболочки (env) ВИЧ. «Белок gp120» представляет собой молекулу, имеющую происхождение от области gp120 полипептида Env. Аминокислотная последовательность gp120 составляет приблизительно 511 аминокислот. Gp120 представляет собой сильно N-гликозилированный белок со средней молекулярной массой 120 кДа. Gp120 содержит пять относительно консервативных доменов (С1-С5), чередующихся с пятью вариабельными доменами (V1-V5). Вариабельные домены содержат значительные аминокислотные замены, вставки и делеции. «Полипептид gp120» включает как одиночные субъединицы, так и мультимеры. Gp41 часть заякорена в мембранном бислое вириона (и является трансмембранной), тогда как сегмент gp120 выдается в окружающее пространство. Рецептор-связывающий домен gp120 локализован в N-концевой половине белка. За ним расположена богатая пролином область (PRR), которая ведет себя как шарнир или триггер, сообщая аппарату слияния о связывании с рецептором. С-конец gp120 высоко консервативен и взаимодействует с gp41. См. регистрационные номера GenBank ААВ05604 и AAD12142.
Термин «ВИЧ», используемый в данном документе, охватывает ВИЧ-1 и ВИЧ-2, вирус иммунодефицита обезьян и человека (ВИОЧ) и вирус иммунодефицита обезьян (ВИО). «ВИЧ-1» означает вирус иммунодефицита человека 1 типа. ВИЧ-1 охватывает внеклеточные вирусные частицы и формы ВИЧ-1, ассоциированные с ВИЧ-1-инфицированными клетками, но не ограничивается ими. Вирус ВИЧ-1 может представлять собой любой из известных основных подтипов (классы А, В, С, D Е, F, G и Н) или обособленный подтип (группа О), включая лабораторные штаммы и первичные изоляты. «ВИЧ-2» означает вирус иммунодефицита человека 2 типа. ВИЧ-2 охватывает внеклеточные вирусные частицы и формы ВИЧ-2, ассоциированные с ВИЧ-2-инфицированными клетками, но не ограничивается ими. Термин «ВИО» относится к вирусу иммунодефицита обезьян, который представляет собой ВИЧ-подобный вирус, который инфицирует обезьян, шимпанзе и других приматов, не являющихся человеком. ВИО охватывает внеклеточные вирусные частицы и формы ВИО, ассоциированные с ВИО-инфицированными клетками, но не ограничивается ими.
Термин «воздействие ВИЧ», используемый в данном документе, относится к контакту неинфицированного субъекта с субъектом, имеющим ВИЧ-инфекцию или СПИД, или к контакту с жидкостями организма ВИЧ-инфицированного субъекта, при котором указанные жидкости от инфицированного субъекта контактируют со слизистой оболочкой, порезом или царапиной в ткани (например, при уколе иглой, незащищенном половом акте) или другой поверхностью неинфицированного субъекта таким образом, что вирус может передаваться от инфицированного субъекта или жидкостей организма инфицированного субъекта к неинфицированному субъекту.
Термин «ВИЧ-инфекция», используемый в данном описании, относится к свидетельствам наличия вируса ВИЧ у индивидуума, включая бессимптомную серопозитивность, СПИД-ассоциированный комплекс (ARC) и синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД).
50
Термин «IC», используемый в данном описании, относится к количеству конкретного активного агента, необходимому для 50% ингибирования заданного биологического процесса или компонента биологического процесса (т.е. фермента, клетки, клеточного рецептора или микроорганизма).
Термины «идентичный» или процент «идентичности» в контексте двух или более нуклеиновых кислот или полипептидов относится к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или обладают определенным процентным содержанием нуклеотидов или аминокислотных остатков, которые являются одинаковыми при сравнении и выравнивании (с введением «гэпов» при необходимости) для максимального соответствия, не считая какие-либо консервативные замены аминокислот частью идентичной последовательности. Процент идентичности можно определить с помощью программы или алгоритма сравнения последовательностей или при визуальном изучении. В области техники известны различные алгоритмы и программы, которые можно применять для выравнивания аминокислотных или нуклеотидных последовательностей. Примеры алгоритмов, подходящих для определения сходства последовательностей, включают без ограничения алгоритмы BLAST, Gapped BLAST, и BLAST 2.0, WU-BLAST-2, ALIGN и ALIGN-2. См. Altschul S, et al., Nuc. Acids Res. 1977; 25:3389-3402, Altschul S, et al., J. Mol. Biol. 1990; 215:403-410, Altschul S, et al., Meth. Enzymol. 1996; 266:460-480, Karlin S, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990; 87:2264-2268, Karlin S, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90:5873-5877, Genentech Corp, South San Francisco, CA, US, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, апрель 2017. Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в области техники. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно выполнять, например, согласно алгоритму поиска локальной гомологии Смита-Ватермана, алгоритма выравнивания областей гомологии Нидлмана-Вунша, способу поиска сходства Пирсона-Липмана, при помощи компьютеризированного исполнения указанных алгоритмов или при помощи ручного выравнивания и визуального изучения. См. Smith Т, et al., Adv. Appl. Math. 1981; 2:482-489, Needleman S, et al., J. Mol. Biol. 1970; 48:443-453, Pearson W, et al., Lipman D, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988; 85:2444-2448, программы GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, WI, USA; Ausubel F, et al., Eds., "Short Protocols in Molecular Biology", 5th Ed. (John Wiley and Sons, Inc., New York, NY, USA, 2002).
Термин «набор», используемый в данном описании, относится к продукту, содержащему различные реагенты, необходимые для осуществления применений и способов по изобретению, которые упакованы таким образом, чтобы их можно было транспортировать и хранить. Материалы, подходящие для упаковки компонентов набора, включают стекло, пластик (например, полиэтилен, полипропилен, поликарбонат), бутыли, флаконы, бумагу или конверты.
Термин «нейтрализующее антитело», используемый в данном документе, представляет собой любое антитело, антигенсвязывающий фрагмент или производное слитого с Fc белка, которое связывается с внеклеточной молекулой (например, белком или белковым доменом на поверхности патогенного вируса) и препятствует способности внеклеточной молекулы инфицировать клетку или модулировать ее активность. Как правило, производные слитого с Fc белка по изобретению могут связываться с поверхностью внеклеточной молекулы и способны ингибировать ее связывание с клеткой по меньшей мере на 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 60%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% или 10% относительно присоединения внеклеточной молекулы к клетке в отсутствие указанных производных слитого с Fc белка или в присутствии отрицательного контроля. В области техники описаны способы для подтверждения, является ли производное слитого с Fc белка нейтрализующим. См. Li М, et al., J. Virol. 2005; 79:10108-10125, Wei X, et al., Nature 2003; 422:307-312, and Montefiori D, Curr. Protoc. Immunol. 2005; Jan, Chapter 12:Unit 12.11. В контексте изобретения патоген предпочтительно представляет собой ВИЧ, и более конкретно, белок gp120 вирусной оболочки ВИЧ. В частности, термин «нейтрализующее ВИЧ антитело» относится к производному слитого с Fc белка с аффинностью к сайту связывания CD4 у gp120, такому как IgGb12. Термин «нейтрализующие антитела» охватывает подкласс bnAbs. В данном описании «нейтрализующие антитела широкого спектра», или «bnAb» понимают как антитело, полученное любым способом, которое при введении в эффективной дозе может применяться в качестве терапевтического агента для предупреждения или лечения ВИЧ-инфекции или СПИДа в отношении более чем 7 штаммов ВИЧ, предпочтительно, более чем 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более штаммов ВИЧ.
Термин «NK-клетка», используемый в данном документе, относится к «естественной киллерной клетке», типу цитотоксического лимфоцита крайне важного для системы врожденного иммунитета. NK-клетки обеспечивают быстрые ответы на инфицированные вирусом клетки и отвечают на образование опухоли, действуя на протяжении приблизительно 3 дней после инфицирования. Как правило, иммунные клетки распознают HLA (антиген лейкоцитов человека), презентированные на поверхности инфицированных клеток, запуская высвобождение цитокинов, вызывающее лизис или апоптоз. NK-клетки являются уникальными, при этом они обладают способностью распознавать клетки в состоянии стресса в отсутствие антител и HLA, обеспечивая гораздо более быструю иммунную реакцию. NK-клетки определяют как крупные гранулярные лимфоциты, и они составляют третий тип клеток, дифференцированных из общего лимфоидного предшественника, из которого образуются В и Т лимфоциты. Известно, что NK-клетки дифференцируются и созревают в костном мозге, лимфоузле, селезенке, миндалинах и тимусе, откуда они попадают в циркуляцию. У человека NK-клетки обычно экспрессируют поверхностные маркеры CD16 (FcγRIII) и CD56.
Термины «NL4-3» и «BaL», используемые в данном описании, относятся к двум различным изолятам ВИЧ, обычно используемым в лаборатории. Изолят NL4-3 был клонирован из провирусов NY5 и LAV. См. Adachi A, et al., J. Virol. 1986; 59:284-291. Изолят BaL был получен из первичной культуры адгезивных клеток, выращенных из эксплантата ткани легкого. См. Gartner S, et al., Science 1986; 233:215-219.
Термины «нуклеиновая кислота», «полинуклеотид» и «нуклеотидная последовательность» в данном документе используются взаимозаменяемо, относятся к любой полимерной форме нуклеотидов любой длины и состоящих из рибонуклеотидов или дезоксирибонуклеотидов. Термины охватывают как одноцепочечные, так и двуцепочечные полинуклеотиды, а также модифицированные полинуклеотиды (например, метилированные, защищенные). Как правило, нуклеиновая кислота представляет собой «кодирующую последовательность», которая в данном документе относится к последовательности ДНК, которая транскрибируется и транслируется в полипептид в клетке-хозяине, будучи помещенной под контроль подходящих регуляторных последовательностей. Границы кодирующей последовательности определяются инициирующим кодоном на 5' (амино) конце и кодоном терминации трансляции на 3' (карбокси) конце. Кодирующая последовательность может включать прокариотические последовательности, кДНК с мРНК эукариот, последовательности геномной ДНК эукариот (например, млекопитающих) и даже последовательности синтетической ДНК, но не ограничивается ими. Последовательность терминации трансляции обычно располагается в 3' направлении относительно кодирующей последовательности.
Термин «функционально связанный», используемый в данном документе, означает, что нуклеотидная последовательность, представляющая интерес, связана с регуляторной последовательностью (последовательностями) таким образом, что обеспечивает экспрессию нуклеотидной последовательности (например, в системе транскрипции/трансляции in vitro или в клетке-хозяине при внедрении вектора в клетку-хозяина). См. Auer Н, Nature Biotechnol. 2006; 24: 41-43.
Выражение «панель изолятов ВИЧ», используемое в данном описании, относится к коллекции референтных изолятов ВИЧ, предназначенных для применения в качестве Env-псевдотипированных вирусов для облегчения стандартизованной оценки 2/3 уровня ответов нейтрализующих антител. См. Mascola R, et al., J. Virol. 2005; 79(16):10103. Псевдовирусы демонстрируют нейтрализующий фенотип, характерный для большинства первичных изолятов ВИЧ-1. Гены gp160 клонировали из приобретенных половым путем острых/ранних инфекций, и они включают широкий спектр генетического, антигенного и географического разнообразия внутри подтипа В. Эти клоны используют CCR5 в качестве ко-рецептора. См. Li, et al., J. Virol. 2005; 79(16):10108-10125.
Выражение «парентеральное введение» и «вводили парентерально», используемые в данном документе, означают способы введения, отличные от энтерального и местного введения, обычно посредством инъекции, и включают без ограничения внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, интракапсулярную, интраорбитальную, внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, эпидуральную и внутригрудинную инъекцию и инфузию.
Выражение «фармацевтически приемлемый носитель», используемое в данном документе, охватывает любые всевозможные растворители, диспергирующие среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие абсорбцию агенты, физиологически совместимые с производными слитого с Fc белка, нуклеиновыми кислотами, векторами и клетками-хозяевами по изобретению.
Термины «полипептид», «пептид» и «белок» в данном документе используют взаимозаменяемо для обозначения полимера из аминокислотных остатков. Термины применяют к полимерам аминокислот, в которых один или более чем один аминокислотный остаток представляет собой искусственный химический миметик соответствующей аминокислоты естественного происхождения, а также к полимерам аминокислот естественного происхождения и полимерам аминокислот искусственного происхождения.
Термины «предупреждать», «предупреждающий» и «предупреждение», используемые в данном документе, относятся к ингибированию начала или снижению частоты заболеваемости у субъекта. Предупреждение может быть полным (например, полное отсутствие патологических клеток у субъекта). Предупреждение также может быть частичным, например, таким как уменьшение проявления патологических клеток у субъекта. Предупреждение также относится к сниженной восприимчивости клиническому состоянию. В контексте данного изобретения термины «предупреждать», «предупреждающий» и «предупреждение» в частности относятся к предотвращению или снижению вероятности ВИЧ-инфекции у субъекта, оказавшегося в контакте с ВИЧ.
Термин «образец», используемый в данном документе, относится к любой биологической жидкости и, в частности, к крови, сыворотке, плазме, лимфе, слюне, сыворотке клеток периферической крови или клеток ткани, сперме, мокроте, цереброспинальной жидкости, слезам, слизи, поту, молоку или мозговым экстрактам, полученным у субъекта. Ткань организма может охватывать ткань тимуса, лимфоузла, селезенки, костного мозга или миндалины. Термин «образец» также относится к небиологическим образцам (например, полученным из воды, напитков).
Термин «субъект», используемый в данном документе, относится к индивидууму, растению или животному, такому как человек, не являющийся человеком примат (например, шимпанзе и другие виды человекообразных и нечеловекообразных обезьян); сельскохозяйственные животные, такие как птицы, рыбы, крупный рогатый скот, овцы, свиньи, козы и лошади; домашние млекопитающие, такие как собаки и кошки; лабораторные животные, включая грызунов, таких как мыши, крысы и морские свинки. Термин не обозначает конкретный возраст или пол. Термин «субъект» охватывает эмбрион и плод. В предпочтительном воплощении субъектом является человек.
Термин «Т-1249», используемый в данном документе, относится к полипептиду, являющемуся производным gp41, включающему часть HR2 области gp41. См. Eggink, 2008, выше.
Термин «Т-20», используемый в данном документе, относится к полипептиду, являющемуся производным gp41, с последовательностью SEQ ID NO: 10, включающему часть HR2 области gp41, также известному как энфувиртид. См. CAS [159519-65-0] и US 5464933. Данный полипептид обладает противовирусной активностью в наномолярном диапазоне и использовался в терапии против ВИЧ-инфекции. См. Zhang D, et al., Expert Opin Ther Pat. 2015; 25:159-173 и Eggink, 2008, выше.
Термин «Т-2635», используемый в данном документе, относится к полипептиду, являющемуся производным gp41, охватывающему часть HR2 области gp41. См. Eggink, 2008, выше.
Термин «терапевтический агент», используемый в данном документе, относится к атому, молекуле или соединению, полезному в лечении или предупреждении заболевания. Примеры терапевтических агентов включают без ограничения антитела, фрагменты антител, антиретровирусные агенты для лечения ВИЧ, лекарственные средства, цитотоксические агенты, проапоптотические агенты, токсины, нуклеазы (например, ДНКазы и РНКазы), гормоны, иммуномодуляторы, хелаторы, соединения бора, фотоактивные агенты или красители, радионуклиды, олигонуклеотиды, интерферирующие РНК, миРНК, РНКи, антиангиогенные агенты, химиотерапевтические агенты, цитокины, хемокины, пролекарства, ферменты, связывающие белки, пептиды или их комбинации.
Термин «терапевтически эффективное количество», используемый в данном документе, относится к дозе или количеству производных слитого с Fc белка, нуклеиновых кислот, векторов, фармацевтических композиций по изобретению или их смесей, которые вызывают у субъекта терапевтический ответ или желаемый эффект.
Термины «терапия» или «терапевтический», используемые в данном документе, относятся к применению производных слитого с Fc белка, нуклеиновых кислот, векторов, фармацевтических композиций по изобретению или их смесей для лечения или предупреждения заболевания, включая ВИЧ и СПИД, но не ограничиваясь ими.
Термин «лечить» или «лечение», используемый в данном документе, относится к введению производного слитого с Fc белка, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина или фармацевтической композиции по изобретению для контроля прогрессирования заболевания после проявления его клинических признаков. Под контролем прогрессирования заболевания понимают полезные или желаемые клинические результаты, которые включают без ограничения уменьшение симптомов, уменьшение продолжительности заболевания, стабилизацию патологических состояний (особенно во избежание дополнительного ухудшения), задержку прогрессирования заболевания, улучшение патологического состояния и ремиссию (как частичную, так и полную). Контроль прогрессирования заболевания также включает увеличение выживаемости по сравнению с выживаемостью, ожидаемой в отсутствие применения лечения. В контексте данного изобретения термины «лечить» и «лечение» конкретно относятся к купированию или замедлению инфекции и разрушения здоровых CD4+ Т-клеток у ВИЧ-инфицированного субъекта. Это также относится к купированию и замедлению появления симптомов приобретенного иммунодефицитного заболевания, таких как крайне низкий уровень CD4+ Т-клеток и повторные инфекции, вызванные оппортунистическими патогенами. Полезные или желаемые клинические результаты включают без ограничения увеличение абсолютного количества наивных CD4+ Т-клеток (диапазон 10-3520), увеличение процентного содержания CD4+ Т-клеток по отношению к общему количеству циркулирующих иммунных клеток (диапазон 1-50%) или увеличение количества CD4+ Т-клеток в процентах от нормального количества CD4+ Т-клеток у неинфицированного субъекта (диапазон 1-161%). «Лечение» может также означать продление выживаемости инфицированного субъекта по сравнению с ожидаемой выживаемостью, если субъект не получает какого-либо целенаправленного лечения ВИЧ.
Термин «вектор», используемый в данном документе, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, линейной или кольцевой, которая содержит нуклеиновую кислоту по изобретению, функционально связанную с дополнительными сегментами, которые обеспечивают ее автономную репликацию в клетке-хозяине или в соответствии с экспрессионной кассетой молекулы нуклеиновой кислоты.
2. Производные слитого с Fc белка
Настоящее изобретение относится к производным слитого с Fc белка, содержащих в направлении от N- к С-концу:
(а) внеклеточные домены D1 и D2 человеческого рецептора CD4,
(б) Fc-участок IgG1 человека, содержащий по меньшей мере одну из точечных мутаций G236A, S239D, A330L, I332E, F243L, R292P, S298A, Y300L, V305I, K322A, Е333А, K334A, P396L, M428L или N434S,
n
(в) группировку, выбранную из группы, состоящей из (1) линкерного полипептида с последовательностью (GGGGS) где 1≤n≤10, (2) SEQ ID NO: 5-9 и (3) их комбинаций и
(г) полипептид, являющийся производным gp41.
1/2
Производные слитого с Fc белка по изобретению характеризуются повышенной противовирусной активностью и ADCC-активностью. Экспрессия и продолжительность действия (т.е. t) производных слитого с Fc белка по изобретению также выше, чем у других сопоставимых антител.
(а) внеклеточные домены D1 и D2 человеческого рецептора CD4
В одном воплощении домен D1 производных слитого с Fc белка по изобретению содержит аминокислоты 26-125 человеческого рецептора CD4 (т.е. регистрационный номер Р01730 базы данных UniProtKB) или его функционально эквивалентного варианта. В другом воплощении домен D2 производных слитого с Fc белка по изобретению содержит аминокислоты 126-203 человеческого рецептора CD4 или его функционально эквивалентного варианта. Предпочтительно, домены D1 и D2 содержат последовательности SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, соответственно, или их функционально эквивалентный вариант.
(б) Fc-участок IgG1 человека
В дополнительном воплощении Fc-участок IgG1 человека содержит наборы и подгруппы комбинаций мутаций, которые содержат по меньшей мере одну из точечных мутаций F243L, R292P, S298A, Y300L, V305I, K322A, Е333А, K334A, P396L, M428L или N434S, или их функционально эквивалентный вариант. В следующем воплощении Fc-участок IgG1 человека содержит (1) по меньшей мере одну из точечных мутаций G236A, S239D, A330L или I332E или их функционально эквивалентный вариант.
(1) Точечные мутации M428L и N434S (набор мутаций LL)
В дополнительном варианте данного воплощения Fc-участок IgG1 человека содержит по меньшей мере одну из точечных мутаций M428L или N434S или их функционально эквивалентный вариант. Предпочтительно, Fc-участок IgG1 человека содержит обе точечные мутации M428L или N434S или их функционально эквивалентный вариант. Fc-участок IgG1 человека, содержащий SEQ ID NO: 19 или ее функционально эквивалентный вариант является предпочтительной.
В дополнительной характеристике данного варианта Fc-участок IgG1 человека содержит (1) по меньшей мере одну из точечных мутаций G236A, S239D, A330L или I332E и (2) по меньшей мере одну из точечных мутаций M428L или N434S или их функционально эквивалентный вариант. В одной характеристике данного варианта Fc-участок IgG1 человека содержит (1) по меньшей мере одну из точечных мутаций G236A, S239D, A330L или I332E и точечную мутацию M428L или их функционально эквивалентный вариант. В другой характеристике данного варианта Fc-участок IgG1 человека содержит (1) по меньшей мере одну из точечных мутаций G236A, S239D, A330L или I332E и точечную мутацию N434S или их функционально эквивалентный вариант. Предпочтительно, Fc-участок IgG1 человека содержит точечные мутации G236A, S239D, A330L или I332E или их функционально эквивалентный вариант. Fc-участок IgG1 человека, содержащий SEQ ID NO: 19, или ее функционально эквивалентный вариант является предпочтительной.
В другой характеристике данного варианта Fc-участок IgG1 человека содержит по меньшей мере одну или более чем одну из точечных мутаций F243L или R292P или их функционально эквивалентный вариант. Предпочтительно, Fc-участок IgG1 человека содержит обе точечные мутации F243L и R292P или их функционально эквивалентный вариант. В дополнительной характеристике Fc-участок IgG1 человека содержит по меньшей мере одну из точечных мутаций Y300L, P396L, S298A, Е333А или K334A или их функционально эквивалентный вариант. Fc-участок IgG1 человека, содержащий SEQ ID NO: 21-25, или ее функционально эквивалентный вариант является предпочтительной.
В следующей характеристике данного варианта Fc-участок IgG1 человека содержит точечную мутацию K322A. Fc-участок IgG1 человека, содержащий SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 31, или ее функционально эквивалентный вариант является предпочтительной.
(2) F243L, R292P, Y300L, P396L, S298A, Е333А и K334A (наборы мутаций А12, А14, А16 и А41)
В другом варианте данного воплощения Fc-участок IgG1 человека содержит по меньшей мере одну или более чем одну из точечных мутаций F243L или R292P или их функционально эквивалентный вариант. Предпочтительно, Fc-участок IgG1 человека содержит обе точечные мутации F243L и R292P или их функционально эквивалентный вариант. В дополнительной характеристике данного варианта Fc-участок IgG1 человека содержит по меньшей мере одну из точечных мутаций Y300L, P396L, S298A, Е333А или K334A или их функционально эквивалентный вариант. Fc-участок IgG1 человека, содержащий SEQ ID NO: 14-18, или ее функционально эквивалентный вариант является предпочтительной.
В следующей характеристике данного варианта Fc-участок IgG1 человека содержит (1) по меньшей мере одну из точечных мутаций G236A, S239D, A330L или I332E или их функционально эквивалентный вариант. Предпочтительно, Fc-участок IgG1 человека содержит точечные мутации G236A, S239D, A330L и I332E или их функционально эквивалентный вариант. В следующей характеристике данного варианта Fc-участок IgG1 человека содержит точечную мутацию K322A.
(3) Точечная мутация K322A
В другом вараинте данного воплощения Fc-участок IgG1 человека содержит точечную мутацию K322A или ее функционально эквивалентный вариант.
В другой характеристике данного варианта Fc-участок IgG1 человека содержит (1) по меньшей мере одну из точечных мутаций G236A, S239D, A330L или I332E и точечную мутацию K322 или ее функционально эквивалентный вариант. Предпочтительно, Fc-участок IgG1 человека содержит точечные мутации G236A, S239D, A330L или I332E или их функционально эквивалентный вариант.
В дополнительном варианте данного воплощения Fc-участок IgG1 человека содержит по меньшей мере одну или более чем одну из точечных мутаций F243L или R292P или их функционально эквивалентный вариант. Предпочтительно, Fc-участок IgG1 человека содержит обе точечные мутации F243L и R292P или их функционально эквивалентный вариант. В следующей характеристике данного варианта Fc-участок IgG1 человека содержит по меньшей мере одну из точечных мутаций Y300L, P396L, S298A, Е333А или K334A или их функционально эквивалентный вариант.
(в) Группировка
n
n
n
n
n
n
В другом воплощении группировка производных слитого с Fc белка по изобретению выбрана из группы, состоящей из (1) линкерного полипептида с последовательностью (GGGGS) (SEQ ID NO: 4), где 1≤n≤10, (2) SEQ ID NO: 5-9, (3) комбинации (1) и (2) и функционально эквивалентного варианта (1), (2) и (3). В следующем варианте данного воплощения группировка производных слитого с Fc белка по изобретению выбрана из группы, состоящей из (1) линкерного полипептида с последовательностью (GGGGS) (SEQ ID NO: 4), где 1≤n≤10, (2) SEQ ID NO: 5, (3) комбинации (1) и (2) и функционально эквивалентного варианта (1), (2) и (3). В дополнительном варианте данного воплощения группировка производных слитого с Fc белка по изобретению выбрана из группы, состоящей из (1) линкерного полипептида с последовательностью (GGGGS) (SEQ ID NO: 4), где 1≤n≤10, (2) SEQ ID NO: 6, (3) комбинации (1) и (2) и функционально эквивалентного варианта (1), (2) и (3). В другом варианте данного воплощения группировка производных слитого с Fc белка по изобретению выбрана из группы, состоящей из (1) линкерного полипептида с последовательностью (GGGGS) (SEQ ID NO: 4), где 1≤n≤10, (2) SEQ ID NO: 7, (3) комбинации (1) и (2) и функционально эквивалентного варианта (1), (2) и (3). В следующем варианте данного воплощения группировка производных слитого с Fc белка по изобретению выбрана из группы, состоящей из (1) линкерного полипептида с последовательностью (GGGGS) (SEQ ID NO: 4), где 1≤n≤10, (2) SEQ ID NO: 8, (3) комбинации (1) и (2) и функционально эквивалентного варианта (1), (2) и (3). В другом варианте данного воплощения группировка производных слитого с Fc белка по изобретению выбрана из группы, состоящей из (1) линкерного полипептида с последовательностью (GGGGS) (SEQ ID NO: 4), где 1≤n≤10, (2) SEQ ID NO: 9, (3) комбинации (1) и (2) и функционально эквивалентного варианта (1), (2) и (3). В одном варианте данного воплощения группировка содержит только линкер или последовательность человеческого рецептора CCR5 или ее функционально эквивалентный вариант. В другом варианте данного воплощения группировка содержит комбинацию линкера и последовательности человеческого рецептора CCR5 или ее функционально эквивалентного варианта. Предпочтительно, линкер присоединен к С-концу последовательности человеческого рецептора CCR5, когда используется комбинация. Предпочтительно, группировка содержит только линкер или комбинацию линкера и последовательности человеческого рецептора CCR5 или ее функционально эквивалентного варианта. Предпочтительно, последовательность человеческого рецептора CCR5 содержит SEQ ID NO: 5 или ее функционально эквивалентный вариант. В одном варианте данного воплощения SEQ ID NO: 5-9 или их функционально эквивалентные варианты дополнительно модифицированы включением остатков аланина. Предпочтительно, линкер, модифицированный остатками аланина, представляет собой SEQ ID NO: 8 или ее функционально эквивалентный вариант.
(г) Полипептид gp41
В следующем воплощении полипептид, являющийся производным gp41, содержит полипептид Т-20, Т-4912, С34, Т-2635 и ЕНО, их комбинации или функционально эквивалентный вариант. Предпочтительно, полипептид, являющийся производным gp41, содержит полипептиды Т-20, С34 и ЕНО или их функционально эквивалентный вариант. Более предпочтительно, полипептиды Т-20, С34 и ЕНО содержат последовательности SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12, соответственно.
В дополнительном воплощении производные слитого с Fc белка по изобретению содержат последовательности SEQ ID NO: 13-33 или их функционально эквивалентный вариант. Предпочтительно, производные слитого с Fc белка по изобретению содержат последовательности SEQ ID NO: 19-33 или их функционально эквивалентный вариант. Более предпочтительно, производные слитого с Fc белка по изобретению содержат последовательность SEQ ID NO: 20 или ее функционально эквивалентный вариант.
Предпочтительно, производные слитого с Fc белка по изобретению содержат:
n
(1) (а) внеклеточные домены D1 и D2 человеческого рецептора CD4, (б) Fc-участок IgG1 человека, содержащий точечные мутации G236A, S239D, A330L, I332E и M428L, (в) группировку, выбранную из группы, состоящей из (1) линкерного полипептида с последовательностью (GGGGS) где 1≤n≤10, (2) SEQ ID NO: 5 и (3) их комбинации и (г) полипептид Т-20. Fc-участок IgG1 человека может дополнительно содержать по меньшей мере одну из точечных мутаций F243L, R292P, Y300L, P396L, S298A, Е333А или K334A.
n
(2) (а) внеклеточные домены D1 и D2 человеческого рецептора CD4, (б) Fc-участок IgG1 человека, содержащий точечные мутации G236A, S239D, A330L, I332E и M428L, (в) группировку, выбранную из группы, состоящей из (1) линкерного полипептида с последовательностью (GGGGS) где 1≤n≤10, (2) SEQ ID NO: 5 и (3) их комбинации и (г) полипептид С34. Fc-участок IgG1 человека может дополнительно содержать по меньшей мере одну из точечных мутаций F243L, R292P, Y300L, P396L, S298A, Е333А или K334A.
n
(3) (а) внеклеточные домены D1 и D2 человеческого рецептора CD4, (б) Fc-участок IgG1 человека, содержащий точечные мутации G236A, S239D, A330L, I332E и N434S, (в) группировку, выбранную из группы, состоящей из (1) линкерного полипептида с последовательностью (GGGGS) где 1≤n≤10, (2) SEQ ID NO: 5 и (3) их комбинации и (г) полипептид Т-20. Fc-участок IgG1 человека может дополнительно содержать по меньшей мере одну из точечных мутаций F243L, R292P, Y300L, P396L, S298A, Е333А или K334A.
n
(4) (а) внеклеточные домены D1 и D2 человеческого рецептора CD4, (б) Fc-участок IgG1 человека, содержащий точечные мутации G236A, S239D, A330L, I332E и N434S, (в) группировку, выбранную из группы, состоящей из (1) линкерного полипептида с последовательностью (GGGGS) где 1≤n≤10, (2) SEQ ID NO: 5 и (3) их комбинации и (г) полипептид С34. Fc-участок IgG1 человека может дополнительно содержать по меньшей мере одну из точечных мутаций F243L, R292P, Y300L, P396L, S298A, Е333А или K334A.
n
(5) (а) внеклеточные домены D1 и D2 человеческого рецептора CD4, (б) Fc-участок IgG1 человека, содержащий точечные мутации G236A, S239D, A330L, I332E, M428L и N434S, (в) группировку, выбранную из группы, состоящей из (1) линкерного полипептида с последовательностью (GGGGS) где 1≤n≤10, (2) SEQ ID NO: 5 и (3) их комбинации и (г) полипептид Т-20. Fc-участок IgG1 человека может дополнительно содержать по меньшей мере одну из точечных мутаций F243L, R292P, Y300L, P396L, S298A, Е333А или K334A.
n
(6) (а) внеклеточные домены D1 и D2 человеческого рецептора CD4, (б) Fc-участок IgG1 человека, содержащий точечные мутации G236A, S239D, A330L, I332E, M428L и N434S, (в) группировку, выбранную из группы, состоящей из (1) линкерного полипептида с последовательностью (GGGGS) где 1≤n≤10, (2) SEQ ID NO: 5 и (3) их комбинации и (г) полипептид С34. Fc-участок IgG1 человека может дополнительно содержать по меньшей мере одну из точечных мутаций F243L, R292P, Y300L, P396L, S298A, Е333А или K334A.
n
(7) (а) внеклеточные домены D1 и D2 человеческого рецептора CD4, (б) Fc-участок IgG1 человека, содержащий точечные мутации F243L, R292P, Y300L, K322A, I332E, P396L, M428L и N434S, (в) группировку, выбранную из группы, состоящей из (1) линкерного полипептида с последовательностью (GGGGS) где 1≤n≤10, (2) SEQ ID NO: 5-9 и (3) их комбинации и (г) полипептид С34. Fc-участок IgG1 человека может дополнительно содержать по меньшей мере одну из точечных мутаций S298A, Е333А или K334A. В другом варианте данного воплощения группировка дополнительно включает остатки аланина, как в SEQ ID NO: 8.
n
(8) (а) внеклеточные домены D1 и D2 человеческого рецептора CD4, (б) Fc-участок IgG1 человека, содержащий точечные мутации F243L, R292P, Y300L, K322A, I332E, P396L, M428L и N434S, (в) группировку, выбранную из группы, состоящей из (1) линкерного полипептида с последовательностью (GGGGS) где 1≤n≤10, (2) SEQ ID NO: 5-9 и (3) их комбинации и (г) полипептид ЕНО. Fc-участок IgG1 человека может дополнительно содержать по меньшей мере одну из точечных мутаций S298A, Е333А или K334A. В другом варианте данного воплощения группировка дополнительно включает остатки аланина, как в SEQ ID NO: 8.
n
(9) (а) внеклеточные домены D1 и D2 человеческого рецептора CD4, (б) Fc-участок IgG1 человека, содержащий точечные мутации G236A, S239D, A330L, I332E и N434S, (в) группировку, выбранную из группы, состоящей из (1) линкерного полипептида с последовательностью (GGGGS) где 1≤n≤10, (2) SEQ ID NO: 5-9 и (3) их комбинации и (г) полипептид Т-20. Fc-участок IgG1 человека может дополнительно содержать по меньшей мере одну из точечных мутаций F243L, R292P, Y300L, P396L, S298A, Е333А или K334A.
n
(10) (а) внеклеточные домены D1 и D2 человеческого рецептора CD4, (б) Fc-участок IgG1 человека, содержащий точечные мутации G236A, S239D, A330L, I332E и N434S, (в) группировку, выбранную из группы, состоящей из (1) линкерного полипептида с последовательностью (GGGGS) где 1≤n≤10, (2) SEQ ID NO: 5-9 и (3) их комбинации и (г) полипептид С34. Fc-участок IgG1 человека может дополнительно содержать по меньшей мере одну из точечных мутаций F243L, R292P, Y300L, P396L, S298A, Е333А или K334A.
n
(11) (а) внеклеточные домены D1 и D2 человеческого рецептора CD4, (б) Fc-участок IgG1 человека, содержащий точечные мутации G236A, S239D, A330L, I332E, M428L и N434S, (в) группировку, выбранную из группы, состоящей из (1) линкерного полипептида с последовательностью (GGGGS) где 1≤n≤10, (2) SEQ ID NO: 5-9 и (3) их комбинации и (г) полипептид Т-20. Fc-участок IgG1 человека может дополнительно содержать по меньшей мере одну из точечных мутаций F243L, R292P, Y300L, P396L, S298A, Е333А или K334A.
n
(12) (а) внеклеточные домены D1 и D2 человеческого рецептора CD4, (б) Fc-участок IgG1 человека, содержащий точечные мутации G236A, S239D, A330L, I332E, M428L и N434S, (в) группировку, выбранную из группы, состоящей из (1) линкерного полипептида с последовательностью (GGGGS) где 1≤n≤10, (2) SEQ ID NO: 5-9 и (3) их комбинации и (г) полипептид С34. Fc-участок IgG1 человека может дополнительно содержать по меньшей мере одну из точечных мутаций F243L, R292P, Y300L, P396L, S298A, Е333А или K334A.
50
50
Производные слитого с Fc белка по изобретению применяют для предупреждения (т.е. нейтрализации) присоединения молекул (например, ВИЧ) к человеческому рецептору CD4 в клетках, экспрессирующих указанный кластер на своей поверхности (например, Т-хелперных клетках, моноцитах, макрофагах, дендритных клетках). Предпочтительно, производные слитого с Fc белка по изобретению применяют для предупреждения присоединения белков gp160, расположенных в вирусной оболочке ВИЧ, к человеческим рецепторам CD4, обнаруживаемым в Т-хелперных клетках. Нейтрализующая способность производных слитого с Fc белка по изобретению может характеризоваться IC 10 нг/мл или ниже и предпочтительно, IC менее 5 нг/мл, менее 2,5 нг/мл, менее 1,25 нг/мл, менее 0,625 нг/мл, менее 0,312 мкг/мл, менее 0,156 нг/мл, менее 0,07 нг/мл или менее 0,035 нг/мл.
2
2
n
В дополнительном воплощении производные слитого с Fc белка по изобретению могут быть химически модифицированы посредством ковалентной конъюгации с полимером, например, для увеличения их времени полужизни в кровотоке. Способы присоединения полипептидов к полимерам известны в области техники. См. US 4766106, US 4179337, US 4495285 и US 4609546. Предпочтительно, полимеры представляют собой полиоксиэтилированные полиолы и полиэтиленгликоль (ПЭГ). ПЭГ представляет собой водорастворимый полимер, который имеет общую формулу: R(O-СН-СН)O-R, где R может быть водородом или защитной группой, такой как алкильная или алканольная группа. Предпочтительно, защитная группа имеет от 1 до 8 атомов углерода, более предпочтительно, она представляет собой метил. Предпочтительно, n представляет собой целое число от 1 до 1000, и более предпочтительно, от 2 до 500. ПЭГ имеет предпочтительную среднюю молекулярную массу от 1000 до 40000, более предпочтительно от 2000 до 20000 и наиболее предпочтительно от 3000 до 12000.
В следующем воплощении производные слитого с Fc белка по изобретению присоединены к терапевтическому агенту с образованием конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC). Например, терапевтические агенты, используемые для лечения оппортунистических заболеваний и состояний, вызванных возникновением СПИДа или появлению которых способствует возникновение СПИДа, например, таких как саркома Капоши, можно лечить при помощи ADC, образованных производным слитого с Fc белка по изобретению и интерфероном альфа, липосомальным антрациклином (например, доксилом) или паклитакселом. Дополнительные ADC, эффективные для лечения других оппортунистических заболеваний, таких как вирусные и бактериальные инфекции (например, опоясывающий лишай, пневмония, туберкулез), кожные заболевания и другие виды злокачественных новообразований (например, лимфома), связанные со СПИДом, также могут быть сконструированы путем объединения производного слитого с Fc белка по изобретению и соответствующего терапевтического агента.
3. Нуклеиновые кислоты, векторы и клетки-хозяева
В другом аспекте настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим производное слитого с Fc белка по изобретению, и к экспрессионным кассетам и векторам, содержащим указанные нуклеиновые кислоты.
Предпочтительно, нуклеиновые кислоты представляют собой полинуклеотиды, включая без ограничения дезоксирибонуклеотиды (ДНК) и рибонуклеотиды (РНК), связанные межнуклеотидными фосфодиэфирными связями. В предпочтительном воплощении нуклеиновые кислоты по изобретению содержат полинуклеотиды, кодирующие внеклеточные домены D1 и D2 человеческого рецептора CD4 (SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35), Fc-участок IgG1 человека, содержащую точечные мутации G236A, S239D, A330L, I332E, M428L и N434S (SEQ ID NO: 53), линкерный полипептид (SEQ ID NO: 37), человеческий рецептор CCR5 (SEQ ID NO: 38) и полипептид Т-20 (SEQ ID NO: 43), полипептид С34 (SEQ ID NO: 44) или полипептид ЕНО (SEQ ID NO: 45) или их функционально эквивалентные варианты. Предпочтительно, нуклеиновые кислоты по изобретению кодируют производные слитого с Fc белка, содержащие последовательности SEQ ID NO: 13-25 или их функционально эквивалентный вариант.
Функционально эквивалентные варианты нуклеиновых кислот по изобретению могут быть получены посредством вставки, делеции или замены одного или нескольких нуклеотидов относительно их референтных последовательностей. Предпочтительно, полинуклеотиды, кодирующие функционально эквивалентные варианты нуклеиновых кислот по изобретению, представляют собой полинуклеотиды, последовательности которых позволяют им гибридизоваться в условиях высокой жесткости со своими референтными нуклеиновыми кислотами. Типичные жесткие условия гибридизации включают инкубацию в 6 X SSC (1 X SSC: 0,15 M NaCl, 0,015 М цитрат натрия) и 40% формамиде при 42°С в течение 14 часов с последующим одним или несколькими циклами отмывки с применением 0,5 X SSC, 0,1% SDS при 60°С. В альтернативном варианте условия высокой жесткости включают гибридизацию при температуре приблизительно 50-55°С в 6 X SSC и финальную отмывку при температуре 68°С в 1-3 X SSC. Условия умеренной жесткости включают гибридизацию при температуре от приблизительно 50°С до приблизительно 65°С в 0,2 или 0,3 М NaCl, с последующей отмывкой при температуре от приблизительно 50°С до приблизительно 55°С в 0,2 X SSC, 0,1% SDS (додецилсульфат натрия). В следующем воплощении нуклеиновые кислоты по изобретению являются кодон-оптимизированными.
В другом воплощении применяют вариант нуклеиновой кислоты, обладающий сходством по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 99% со своей референтной нуклеиновой кислотой, где указанный вариант кодирует производное слитого с Fc белка по изобретению или его функционально эквивалентный вариант.
Нуклеиновые кислоты по изобретению могут требовать обработки рестриктазами для их лигирования в подходящий вектор (например, 1, 2 или 3 концевых нуклеотида могут быть удалены). В дополнительном воплощении изобретение относится к указанным нуклеиновым кислотам, которые были разрезаны на каждом конце рестриктазой.
В другом воплощении настоящее изобретение относится к экспрессионной кассете, содержащей нуклеиновую кислоту по изобретению, последовательность промотора и 3'-UTR (нетранслируемая область) и, возможно, селективный маркер.
В другом воплощении настоящее изобретение относится к вектору, содержащему нуклеиновую кислоту по изобретению. В дополнительном аспекте данного воплощения нуклеиновая кислота по изобретению содержится в экспрессионной кассете, содержащейся в указанном векторе. Подходящие векторы по настоящему изобретению включают без ограничения прокариотические векторы, такие как плазмиды pUC18, pUC19 и Bluescript и их производные, такие как плазмиды mp18, mp19, pBR322, рМВ9, ColE1, pCR1 и RP4; фаговые и челночные векторы, такие как векторы pSA3 и рАТ28; векторы экспрессии в дрожжах, такие как 2-микронные векторы плазмидного типа; интегрирующие плазмиды; векторы YEP; центромерные плазмиды и аналоги; векторы экспрессии в клетках насекомых, такие как векторы серии рАС и серии pVL; векторы экспрессии в растениях, такие как векторы серий pIBI, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, pORE и аналоги; и векторы экспрессии в высших эукариотических клетках, либо на основе вирусных векторов (например, аденовирусов, аденоассоциированных вирусов, ретровирусов, лентивирусов), а также невирусные векторы, такие как pSilencer 4.1-CMV (Ambion, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA, US), pcDNA3, pcDNA 3.1, pcDNA3.1/hyg, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl, pZeoSV2, pCI, pSVL и pKSV-10, pBPV-1, pML2d и pTDTl. Предпочтительно, вектор представляет собой вектор pcDNA3.1. Более предпочтительно, вектор представляет собой рАВТ-5, рАВТ-7 и рАВТ-8.
В дополнительном воплощении вектор на основе вируса представляет собой вектор AAV. Векторы AAV, кодирующие производные слитого с Fc белка по изобретению, могут быть сконструированы в соответствии с методами молекулярной биологии, хорошо известными в области техники. См. Brown Т, "Gene Cloning" (Chapman & Hall, London, GB, 1995); Watson R, et al., "Recombinant DNA", 2nd Ed. (Scientific American Books, New York, N.Y., US, 1992); Alberts B, et al., "Molecular Biology of the Cell" (Garland Publishing Inc., New York, N.Y., US, 2008); Innis M, et al., Eds., "PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications" (Academic Press Inc., San Diego, Calif., US, 1990); Erlich H, Ed., "PCR Technology. Principles and Applications for DNA Amplification" (Stockton Press, New York, N.Y., US, 1989); Sambrook J, et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., US, 1989); Bishop T, et al., "Nucleic Acid and Protein Sequence. A Practical Approach" (IRL Press, Oxford, GB, 1987); Reznikoff W, Ed., "Maximizing Gene Expression" (Butterworths Publishers, Stoneham, Mass., US, 1987); Davis L, et al., "Basic Methods in Molecular Biology" (Elsevier Science Publishing Co., New York, N.Y., US, 1986), Schleef M, Ed., "Plasmid for Therapy and Vaccination" (Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, Del., 2001).
Например, можно использовать клетки HEK-293 (экспрессирующие гены Е1), хелперную плазмиду, несущую функции аденовируса, хелперную плазмиду, обеспечивающую гены rep из серотипа 2 и гены cap из желаемого серотипа AAV (например, AAV8) и, наконец, плазмиду-остов с ITR (инвертированный концевой повтор) и конструкцию, представляющую интерес. Для создания вектора AAV, экспрессирующего производное слитого с Fc белка по изобретению, кДНК производного слитого с Fc белка можно клонировать в плазмиду с остовом AAV под контролем универсального (например, CAG) или клеточно-специфического промотора.
Векторы AAV (частицы вирусного вектора) могут быть получены путем трансфекции клеток HEK293 без вируса-хелпера с применением трех плазмид с модификациями. См. Matsushita Т, et al., Gene Ther. 1998; 5:938-945 и Wright J, et al., Mol. Ther. 2005; 12:171-178. Клетки можно культивировать до 70% конфлюентности во вращающихся флаконах (Corning Inc., Coining, NY, USA) в DMEM (среда Игла в модификации Дульбекко) с добавлением 10% BFS (эмбриональной телячьей сыворотки) и затем совместно трансфицировать: 1) плазмидой, несущей экспрессионную кассету, фланкированную вирусными ITR (описанными выше); 2) хелперной плазмидой, несущей rep2 AAV и соответствующие гены cap (cap1 и сар9), и 3) плазмидой, обеспечивающей хелперные функции аденовируса. Затем векторы могут быть очищены двумя последовательными градиентами хлорида цезия с использованием стандартного протокола или оптимизированного протокола, как описано ранее. См. Ayuso Е, et al., Gene Ther. 2010; 17:503-510. Векторы можно дополнительно диализовать против PBS (фосфатно-солевой буферный раствор), отфильтровать, определить количество с помощью qPCR (количественной полимеразной цепной реакции) и хранить при -80°С до применения.
В другом воплощении настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей нуклеиновую кислоту, экспрессионную кассету или вектор по изобретению. Клетка-хозяин для применения по настоящему изобретению может быть клеткой любого типа, включая как эукариотические клетки, так и прокариотические клетки. Предпочтительно клетки включают прокариотические клетки, клетки дрожжей или клетки млекопитающих. Более предпочтительно, клетки-хозяева представляют собой клетки HEK-293 и СНО.
4. Фармацевтические композиции
nd
В следующем аспекте данное изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим по меньшей мере одно из: производных слитого с Fc белка, нуклеиновых кислот, векторов или клеткок-хозяев по изобретению (далее по-отдельности или совместно обозначаемые «активным(и) агентом(ами) по изобретению») или их смеси, объединенные с фармацевтически приемлемым носителем. Указанные фармацевтические композиции применяют для лечения ВИЧ или СПИДа у субъекта или для предупреждения ВИЧ-инфекции у неинфицированного субъекта. В одном воплощении композиция включает смесь множества (например, двух или более) производных слитого с Fc белка, нуклеиновых кислот, векторов или клеток-хозяев по изобретению. В одном воплощении изобретения композиция включает производное слитого с Fc белка, содержащее по меньшей мере одну из последовательностей SEQ ID NO: 13-25 или нуклеиновые кислоты, векторы или клетки-хозяева, экспрессирующие указанные производные слитого с Fc белка, или их смесь. Предпочтительно, композиция включает производное слитого с Fc белка, содержащее по меньшей мере одну из последовательностей SEQ ID NO: 19-25 или нуклеиновые кислоты, векторы или клетки-хозяева, экспрессирующие указанные производные слитого с Fc белка, или их смесь. Более предпочтительно, композиция включает производное слитого с Fc белка, содержащее по меньшей мере одну из последовательностей SEQ ID NO: 20 или нуклеиновые кислоты, векторы или клетки-хозяева, экспрессирующие указанное производное слитого с Fc белка, или их смесь. Получение фармацевтических композиций, содержащих производные слитого с Fc белка по изобретению, известно в области техники. См. McNally Е, et al., Eds., "Protein Formulation and Delivery" (Marcel Dekker, Inc., New York, NY, USA, 2000), Hovgaard L, et al., Eds., "Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins", 2 Ed. (CRC Press, Boca Raton, FL, USA, 2012) and Akers M, et al., Pharm Biotechnol. 2002; 14:47-127.
Предпочтительно, носитель подходит для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, посредством инъекции или инфузии). В зависимости от способа введения активный агент по изобретению может быть покрыт материалом для защиты агента от воздействия условий, которые могут привести к инактивации агента.
В следующем воплощении настоящего изобретения предложены фармацевтические композиции, специально подходящие для генной терапии («пассивная иммунизация»). Указанные фармацевтические композиции включают, по меньшей мере, одну из нуклеиновых кислот или векторов по изобретению или их смесь, и их получают в соответствии со способами, известными в области техники. См.  S, et al., J. Virol. 1998, 72:1497-1503; Mulligan M, Webber J, AIDS 1999; 13 (Suppl A):S105-S112; O'Hagan D, et al., J. Virol. 2001; 75:9037-9043 and Rainczuk A, et al., Infect. Immun. 2004; 72:5565-5573. Конкретный остов вектора, в который встроены нуклеиновые кислоты по изобретению, не важен, если указанная нуклеиновая кислота экспрессируется у субъекта надлежащим образом. Примеры подходящих векторов включают вирусы и плазмиды, но не ограничиваются ими. Предпочтительно, когда используется вирусный вектор, используют вектор AAV. Предпочтительно, когда используется плазмидный вектор, используют pcDNA3.1 и pVAX1 (Invitrogen, Carlsbad, СА, USA); последовательности ДНК доступны на сайте Invitrogen http://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/invitrogen.html, октябрь 2015); pNGVL (National Gene Vector Laboratory, University of Michigan, MI, USA); и p414cyc (регистрационный номер АТСС 87380) и p414GALS (регистрационный номер АТСС 87344). Более предпочтительно, в качестве плазмидного вектора используют плазмиду pcDNA3.1. Наиболее предпочтительно, плазмидный вектор представляет собой РМ5А16Т20 и pM7A16LLC34.
Схемы и применение пассивной иммунизации известны в области техники. См. Donnelly J, et al., Annu. Rev. Immunol. 1997; 15:617-648; Robinson H, Pertmer T, Adv. Virus Res. 2000; 55:1-74; Gurunathan S, et al., Annu. Rev. Immunol. 2000; 18:927-974 (2000) and Ulmer J, Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 2001; 4:192-197. Вкратце, пассивная иммунизация в контексте настоящего изобретения настроена направить экспрессию производного слитого с Fc белка у субъекта in vivo. См. Ulmer J, et al., Science 1993; 259:1745-1749. Как правило, нуклеиновую кислоту клонируют в бактериальную плазмиду, которая оптимизирована для экспрессии у эукариот и состоит из следующего: (1) точка начала репликации для размножения в бактериях, обычно происходящая из E.coli, такая как ColE1, (2) ген устойчивости к антибиотику, обычно канамицину, для отбора бактерий, интегрировавших плазмиду, (3) сильный промотор для оптимальной экспрессии в клетках млекопитающих, такой как промотор цитомегаловируса (CMV) или вируса обезьян 40 (SV40), (4) участок множественного клонирования в 3' направлении от промотора для вставки представляющего интерес гена и (5) сигнал полиаденилирования SV40 или бычьего гормона роста (BGH) для стабилизации мРНК.
Еще одним объектом настоящего изобретения является доставка векторов с применением непатогенных или аттенуированных бактериальных штаммов, несущих плазмиды, способные экспрессировать производные слитого с Fc белка по изобретению, таких как Escherichia spp., Salmonella spp., Shigella spp., Mycobacterium spp. и Listeria spp., не ограничиваясь перечисленными.
Использование конкретного штамма Escherichia не имеет принципиального значения для настоящего изобретения. Примеры штаммов Escherichia, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают штаммы Escherichia coli DH5a, НВ 101, HS-4, 4608-58, 1184-68, 53638-С-17, 13-80 и 6-81, энтеропатогенные Е. coli, энтеропатогенные Е. coli и энтерогеморрагические Е. coli. См. Sambrook, 1989, supra; Sansonetti Р, et al., Ann. Microbiol. 1982; 132A:351-355); Evans D, et al., Infect. Immun. 1975; 12:656-667; Donnenberg S, et al., J. Infect. Dis. 1994; 169:831-838 and McKee M, O'Brien A, Infect. Immun. 1995; 63:2070-2074.
Использование конкретного штамма Salmonella не имеет принципиального значения для настоящего изобретения. Примеры штаммов Salmonella, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают S. typhi (регистрационный номер АТСС 7251), S. typhimurium (регистрационный номер АТСС 13311), S. galinarum (регистрационный номер АТСС 9184), S. enteriditis (регистрационный номер АТСС 4931), S. typhimurium (регистрационный номер АТСС 6994), двойной мутант S. typhi aroC, aroD (Hone D, et al., Vaccine 1991; 9:810-816) и мутант S. typhimurium aroA (Mastroeni D, et al., Micro. Pathol. 1992; 13:477-491).
Использование конкретного штамма Shigella не имеет принципиального значения для настоящего изобретения. Примеры штаммов Shigella, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают S. flexneri (регистрационный номер АТСС 29903), S. flexneri CVD1203 (регистрационный номер АТСС 55556), S. flexneri 15D (Sizemore D, et al., Vaccine 1997; 15:804-807; Sizemore D, et al., Science 1995, 270:299-302), S. sonnei (регистрационный номер АТСС 29930) и S. dysenteriae (регистрационный номер АТСС 13313).
Использование конкретного штамма Mycobacterium не имеет принципиального значения для настоящего изобретения. Примеры штаммов Mycobacterium, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают штамм М. tuberculosis CDC1551 (Griffith Т, et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1995; 152:808-811), штамм M. tuberculosis Beijing (van Soolingen D, et al., J. Clin. Microbiol. 1995; 33:3234-3238), штамм M. tuberculosis H37Rv (регистрационный номер АТСС 25618), штамм-ауксотроф по пантотенату М. tuberculosis (Sambandamurthy V, Nat. Med. 2002; 8:1171-1174, мутантный штамм М. tuberculosis rpoV (Collins D, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1995; 92: 8036, штамм-ауксотроф по лейцину M. tuberculosis (Hondalus M, et al., Infect. Immun. 2000; 68(5):2888-2898), штамм BCG Danish (регистрационный номер АТСС 35733), штамм BCG Japanese (регистрационный номер АТСС 35737), штамм BCG Chicago (регистрационный номер АТСС 27289), штамм BCG Copenhagen (АТСС No. 27290), штамм BCG Pasteur (регистрационный номер АТСС 35734), штамм BCG Glaxo (регистрационный номер АТСС 35741), штамм BCG Connaught (регистрационный номер АТСС 35745) и BCG Montreal (регистрационный номер АТСС 35746).
Использование конкретного штамма Listeria не имеет принципиального значения для настоящего изобретения. Примеры штаммов Listeria monocytogenes, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают без ограничения штамм L. monocytogenes 10403S (Stevens R, et al., J. Virol. 2004; 78:8210-8218), штаммы L. ivanovii и L. seeligeri (Haas A, et al., Biochim. Biophys. Acta. 1992; 1130:81-84) или мутантные штаммы L. monocytogenes, такие как (1) двойной мутант actA plcB (Peters С, et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2003; 35:243-253 и Angelakopoulos H, et al., Infect. Immun. 2002; 70:3592-3601) или (2) двойной мутант dal dat по гену аланин-рацемазы и гену аминотрансеразы D-аминокислот (Thompson R, et al., Infect. Immun. 1998; 66:3552-3561).
Способы доставки векторов с применением бактериальных носителей хорошо известны в области техники. См. US 6500419, US 5877159 and US 5824538; Shata M, et al., Mol. Med. Today 2000; 6:66-71; Hone D, Shata M, J. Virol. 2001; 75:9665-9670; Shata M, et al., Vaccine 2001; 20:623-629; Rapp U and Kaufmann S, Int. Immunol. 2004, 16:597-605; Dietrich G, et al., Curr. Opin. Mol. Ther. 2003; 5:10-19 и Gentschev I, et al., J. Biotechnol. 2000; 83:19-26. Тип плазмид, доставляемых указанными бактериальными носителями для экспрессии производных слитого с Fc белка по изобретению, не имеет принципиального значения.
В дополнительном воплощении также предложено применение вектора AAV для доставки нуклеиновых кислот по изобретению.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить различными способами, известными в области техники. Как будет понятно специалисту в данной области, путь или способ введения будут варьироваться в зависимости от желаемых результатов. Активные агенты по изобретению могут быть получены с носителями, которые будут защищать агент от быстрого высвобождения, такими как состав с контролируемым высвобождением, включая имплантаты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Могут быть использованы биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие способы получения таких составов широко известны в данной области. См. Robinson J, et al., Eds., "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems" (Marcel Dekker, Inc., New York, NY, USA, 1978).
Для введения активного агента по изобретению посредством некоторых путей введения, может потребоваться покрытие агента материалом или введение агента совместно с материалом, предотвращающим его инактивацию или обеспечивающим его надлежащее распределение in vivo. Например, агент можно вводить субъекту в подходящем носителе (например, липосоме) или разбавителе. Фармацевтически приемлемые разбавители включают физиологический раствор и водные буферные растворы, но не ограничиваются ими. Липосомы включают эмульсии CGF вода-в-масле-в-воде, а также обычные липосомы. См. Strejan G, et al., J. Neuroimmunol. 1984; 7:27-41. В области техники известны многие способы производства липосом. См. US 4522811, US 5374548 и US 5399331. Липосомы могут содержать одну или несколько группировок, которые избирательно транспортируются в конкретные клетки или органы и, таким образом, улучшают адресную доставку лекарств. Типичные группировки, обеспечивающие адресную доставку, включают фолат или биотин, маннозиды и рецептор сурфактантного белка А. В одном воплощении изобретения активные агенты по изобретению заключены в липосомы; в более предпочтительном воплощении липосомы имеют группировку, обеспечивающую адресную доставку. В наиболее предпочтительном воплощении активные агенты в липосомах доставляются посредством болюсной инъекции.
Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для немедленного приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий. Использование таких сред в приготовлении фармацевтических композиций по изобретению рассматривается в данной заявке, поскольку их использование не является несовместимым с активными агентами по изобретению. Дополнительные активные соединения также могут быть включены в фармацевтические композиции.
Фармацевтические композиции обычно являются стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиция может быть предствлена в виде раствора, микроэмульсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для концентрации активного агента. Носитель может представлять собой растворитель или диспергирующую среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль) или их подходящие смеси. Для поддержания надлежащей текучести можно, например, применять покрытия, такие как лецитин, уменьшать отклонения в размере частиц, а также применять поверхностно-активные вещества. Во многих случаях в композицию предпочтительно включать изотонические агенты, такие как, например, сахара, полиатомные спирты (например, маннит, сорбит) или хлорид натрия. Пролонгированная абсорбция инъекционных композиций может быть достигнута включением в композицию соединений, которые замедляют абсорбцию (например, моностеаратных солей, желатина).
Стерильные растворы для инъекций могут быть приготовлены путем включения активного агента по изобретению в требуемом количестве в подходящий растворитель с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, по необходимости, с последующей стерилизацией путем микрофильтрации. Как правило, дисперсии готовят путем включения активного агента в стерильный носитель, который содержит основную диспергирующую среду и требуемые другие ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций предпочтительными способами приготовления являются вакуумная сушка и высушивание из замороженного состояния (то есть лиофилизация), которые позволяют получить порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный желаемый ингредиент из их раствора, предварительно простерилизованного фильтрованием.
Схемы введения подбирают так, чтобы обеспечить оптимальный желаемый ответ (например, ответ на лечение). Например, можно вводить один болюс, можно вводить несколько раздельных доз в течение времени, или дозу можно пропорционально уменьшать или увеличивать, в зависимости от терапевтической ситуации. Например, производные слитого с Fc белка по изобретению можно вводить один или два раза в неделю посредством подкожной инъекции или один или два раза в месяц посредством подкожной инъекции.
Для удобства введения и единообразия введения наиболее целесообразно составлять парентеральные композиции в виде дозированной лекарственной формы. Дозированная лекарственная форма в данном описании относится к физически дискретным единицам, представленным в виде единых доз для субъектов, которым предстоит лечение, каждая единица содержит заданное количество активного агента, рассчитанное для обеспечения желаемого терапевтического эффекта, в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем. Спецификация дозированных лекарственных форм по изобретению продиктована и напрямую зависит от уникальных характеристик активного агента и конкретного терапевтического эффекта, который должен быть достигнут.
Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают без ограничения водорастворимые антиоксиданты (например, аскорбиновую кислоту, гидрохлорид цистеина, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия), маслорастворимые антиоксиданты (например, аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропилгаллат, альфа-токоферол) и хелатирующие металлы агенты (например, лимонную кислоту, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), сорбит, винную кислоту, фосфорную кислоту). Составы фармацевтических композиций по изобретению включают те, которые подходят для перорального, назального, местного (например, трансбуккального и сублингвального), ректального, вагинального или парентерального введения. В целях удобства составы могут быть представлены в виде дозированной лекарственной формы и могут быть получены любыми способами, известными в области техники. Количество активного агента, которое можно комбинировать с материалом-носителем для получения однодозовой лекарственной формы будет варьироваться в зависимости от субъекта, которого лечат, и конкретного способа введения. Количество активного агента, которое можно комбинировать с материалом-носителем для получения однодозовой лекарственной формы, как правило, будет таким количеством композиции, которое оказывает терапевтический эффект. Как правило, это количество будет находиться в диапазоне от приблизительно 0,001% до приблизительно 90% активного агента, предпочтительно от приблизительно 0,005% до приблизительно 70% и, наиболее предпочтительно, от приблизительно 0,01% до приблизительно 30%.
Составы по настоящему изобретению, которые подходят для вагинального введения, также включают пессарии, тампоны, кремы, гели, пасты, пены или аэрозольные композиции, содержащие такие носители, которые известны в данной области техники как подходящие. Лекарственные формы для местного или трансдермального введения композиций по настоящему изобретению включают порошки, аэрозоли, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, пластыри и ингалянты. Активный агент по изобретению может быть смешан в стерильных условиях с фармацевтически приемлемым носителем и с любыми консервантами, буферами или пропеллентами, которые могут потребоваться.
Фармацевтические композиции по изобретению могут также содержать адъюванты, такие как консерванты, смачивающие вещества, эмульгирующие вещества и диспергирующие вещества. Предотвращение присутствия микроорганизмов может быть обеспечено как процедурами стерилизации, так и включением различных антибактериальных и противогрибковых средств (например, парабена, хлорбутанола, фенолсорбиновой кислоты). Также может быть желательным включение в композиции изотонических агентов (например, Сахаров, хлорида натрия).
Фактические уровни дозировки активных агентов в фармацевтических композициях по настоящему изобретению могут варьироваться для достижения у субъекта желаемого терапевтического ответа. Выбранный уровень дозировки будет зависеть от множества фармакокинетических факторов, включая активность конкретного используемого агента по изобретению, его количество, путь введения, время введения, скорость экскреции или экспрессию конкретного используемого активного агента, продолжительность лечения, другие лекарства, соединения или материалы, используемые в сочетании с конкретными используемыми фармацевтическими композициями, возраст, пол, вес, состояние, общее состояние здоровья и анамнез субъекта, которого лечат, и другие подобные факторы, известные в области медицины. Врач или ветеринар, имеющий обычные навыки в данной области, может легко определить и назначить терапевтически эффективное количество требуемого(ых) активного(ых) агента(ов). Например, врач или ветеринар может начинать с более низких доз активных агентов по изобретению, используемых в фармацевтической композиции, чем те, которые требуются для достижения желаемого терапевтического эффекта, и постепенно увеличивать дозу до тех пор, пока не будет достигнут желаемый эффект. Как правило, подходящая суточная доза композиции по изобретению будет представлять собой такое количество активного агента, которое является самой низкой дозой, эффективной для получения терапевтического эффекта. Такая эффективная доза будет в целом зависеть от факторов, описанных выше. Предпочтительно, чтобы введение было парентеральным, более предпочтительно внутривенным, внутримышечным, внутрибрюшинным или подкожным. При желании эффективную суточную дозу фармацевтической композиции можно вводить в виде двух, трех, четырех, пяти, шести или более субдоз, применяемых раздельно с соответствующими интервалами в течение дня, возможно, в виде дозированных лекарственных форм. Хотя активный агент по изобретению можно вводить отдельно, предпочтительно вводить указанный агент в составе фармацевтической композиции.
Фармацевтические композиции по изобретению можно вводить с помощью медицинских устройств, известных в области техники. Например, в предпочтительном воплощении фармацевтическую композицию по изобретению можно вводить с помощью безыгольного устройства для подкожных инъекций. См. US 5399163, US 5383851, US 5312335, US 5064413, US 4941880, US 4790824 или US 4596556. Примеры хорошо известных имплантатов и модулей, которые могут найти применение в настоящем изобретении, включают без ограничения инфузионные насосы для дозирования лекарственных средств с различными скоростями (например, US 4447233 (не имплантируемые, с контролируемой скоростью), US 4447224 (имплантируемые, с переменной скоростью), US 4487603 (имплантируемые, с контролируемой скоростью)), устройства для введения лекарственных средств через кожу (например, US 4486194) и осмотические системы доставки лекарственных средств (например, US 4439196 и US 4475196). Многие другие такие имплантаты, системы доставки и модули известны специалистам в данной области.
Фармацевтические композиции по изобретению должны быть стерильными и жидкими до такой степени, чтобы доставку композиции можно было осуществить при помощи шприца. Помимо воды, носитель может представлять собой изотонический забуференный солевой раствор, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль) и их подходящие смеси. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем использования поверхностно-активных веществ. Во многих случаях предпочтительно включать в композицию изотонические агенты, например, сахара, полиатомные спирты (например, маннит, сорбит) и хлорид натрия. Долгосрочная абсорбция инъекционных композиций может быть достигнута благодаря включению в композицию агента, замедляющего абсорбцию (например, моностеарата алюминия и желатина).
5. Способы лечения и профилактики
В другом аспекте изобретение относится к способу лечения или предупреждения ВИЧ-инфекции или СПИДа у субъекта, включающему введение указанному субъекту по меньшей мере одного из производных слитого с Fc белка, нуклеиновых кислот, векторов, клеток-хозяев или фармацевтических композиций по изобретению, или их смеси. Благоприятные лечебные или профилактические эффекты активных агентов и фармацевтических композиций по изобретению в отношении симптомов ВИЧ-инфекции или СПИДа включают, например, предотвращение или задержку начальной инфекции субъекта, находившегося в контакте с ВИЧ, снижение вирусной нагрузки у субъекта, инфицированного ВИЧ, продление бессимптомной фазы ВИЧ-инфекции, поддержание низких вирусных нагрузок у ВИЧ-инфицированных субъектов, чьи уровни вируса были снижены посредством антиретровирусной терапии (AT), увеличение уровней CD4 Т-клеток или уменьшение снижения CD4 Т-клеток, как ВИЧ-1 специфических, так и неспецифических, у субъектов, не получавших лекарств, и у субъектов, получавших AT, улучшение общего состояния здоровья или качества жизни у субъекта со СПИДом и увеличение ожидаемой продолжительности жизни субъекта со СПИДом. Врач или ветеринар может сравнить влияние лечения с состоянием субъекта до лечения или с ожидаемым состоянием нелеченого субъекта, чтобы определить, является ли лечение эффективным в подавлении СПИДа. В предпочтительном воплощении активные агенты и фармацевтические композиции по изобретению применяют для профилактики ВИЧ-инфекции или СПИДа. В другом предпочтительном воплощении активные агенты и фармацевтические композиции по изобретению применяют для лечения ВИЧ-инфекции или СПИДа.
Активные агенты и фармацевтические композиции по изобретению могут найти применение в лечении ВИЧ-инфекции или СПИДа. При том, что таким образом можно лечить всех субъектов, которые могут быть поражены ВИЧ или его эквивалентами, (например, шимпанзе, макак, бабуинов или людей), активные агенты и фармацевтические композиции по изобретению предназначены, в частности, для их терапевтического применения у людей. Часто для достижения желаемого терапевтического эффекта может потребоваться более одного введения; точный протокол (дозировка и частота введения) может быть установлен согласно стандартным клиническим процедурам.
Настоящее изобретение также относится к уменьшению или устранению симптомов, связанных с ВИЧ-инфекцией или СПИДом. К ним относятся симптомы, связанные с незначительной симптоматической фазой ВИЧ-инфекции, включая, например, опоясывающий лишай, кожную сыпь и инфекции ногтей, язвы во рту, рецидивирующую инфекцию носа и горла и потерю веса. Кроме того, другие симптомы, связанные с основной симптоматической фазой ВИЧ-инфекции, включают, например, кандидоз полости рта и вагинальный кандидоз (Candida), постоянную диарею, потерю веса, постоянный кашель и реактивированный туберкулез или рецидивирующие герпетические инфекции, такие как простой герпес (herpes simplex). Другие симптомы развившегося СПИДа, которые можно лечить в соответствии с настоящим изобретением, включают, например, диарею, тошноту и рвоту, стоматит и язвы полости рта, постоянные, рецидивирующие вагинальные инфекции и рак шейки матки, персистирующую генерализованную лимфаденопатию (PGL), тяжелые кожные инфекции, бородавки и стригущий лишай, респираторные инфекции, пневмонию, особенно пневмонию, вызванную Pneumocystis carinii (РСР), herpes zoster (или опоясывающий лишай), проблемы с нервной системой, такие как боли, онемение или «покалывание» в руках и ногах, неврологические нарушения, саркому Капоши, лимфому, туберкулез или другие подобные оппортунистические инфекции.
В другом предпочтительном воплощении активные агенты или фармацевтические композиции по изобретению вводят ВИЧ-инфицированному субъекту или субъекту, находившемуся в контакте с ВИЧ, в комбинации по меньшей мере с одним терапевтическим агентом. Предпочтительно, терапевтический агент показан для профилактики или лечения ВИЧ или СПИДа. Подходящие терапевтические агенты включают без ограничения лекарственные средства, входящие в современные протоколы антиретровирусной терапии (AT) и высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ), такие как ненуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы (например, эфавиренз, невирапин, делавирдин, этравирин, рилпивирин), нуклеозидные аналоги - ингибиторы обратной транскриптазы (например, зидовудин, тенофовир, ламивудин, эмтрицитабин) и ингибиторы протеазы (например, саквинавир, ритонавир, индинавир, нелфинавир, ампренавир), именуемые здесь и далее независимо или совместно как «антиретровирусный(ые) агент(ы) для лечения ВИЧ». В одном варианте данного воплощения, по меньшей мере один активный агент или фармацевтическую композицию по изобретению и по меньшей мере один антиретровирусный агент против ВИЧ вводят субъекту совместно в одно и то же время. В другом варианте по меньшей мере один активный агент или фармацевтическую композицию по изобретению вводят субъекту до введения какого-либо антиретровирусного агента для лечения ВИЧ. В еще одном варианте по меньшей мере один активный агент или фармацевтическую композицию по изобретению вводят после того, как субъекту введут антиретровирусный агент против ВИЧ, например, как после прерывания протокола AT или ВААРТ.
Кроме того, производные слитого с Fc белка по изобретению также можно вводить с терапевтическими агентами, которые могут индуцировать экспрессию gp120 ВИЧ на поверхности латентно инфицированных клеток, что позволяет NK-клеткам быстро их удалять. См. Siliciano J, et al, J Allergy Clin Immunol. 2014; 134(1):12-19.
6. Нейтрализация и способы определения
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу инактивации ВИЧ, который включает стадию приведения вируса в контакт с по меньшей мере одним производным слитого с Fc белка по изобретению. Предпочтительно, способ осуществляют на образце, содержащем ВИЧ или подозреваемом на наличие ВИЧ. Способ можно осуществлять в условиях, которые способствуют связыванию производного слитого с Fc белка и ВИЧ, как описано в области техники. См. Lu L, et al., Retrovirology 2012; 9(104), 1-14.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу обнаружения молекулы или ее фрагмента (например, ВИЧ, gp120), который присоединяется к доменам D1 и D2 человеческого рецептора CD4 в образце, включающему стадии (а) приведения образца в контакт с производным слитого с Fc белка по изобретению и (б) определения, происходит ли специфическое связывание производного слитого с Fc белка с молекулой в образце. Образец может представлять собой биологический образец, включая без ограничения кровь, сыворотку, мочу, ткань или другой биологический материал от неинфицированных, инфицированных или потенциально инфицированных субъектов (например, субъектов, подвергающихся периодическому или эпизодическому воздействию ВИЧ). Образец также может быть небиологическим (например, полученным из воды, напитков). Предпочтительно, молекула представляет собой ВИЧ и, более предпочтительно, белок gp120 вирусной оболочки ВИЧ.
В предпочтительном воплощении данного аспекта настоящее изобретение относится к способу определения ВИЧ в образце, включающему стадии (а) приведения образца в контакт с производным слитого с Fc белка по изобретению и (б) определения, происходит ли специфическое связывание производного слитого с Fc белка с молекулой ВИЧ в образце. Предпочтительно, образец представляет собой образец плазмы или образец сыворотки.
Вначале можно осуществить манипуляции с образцом, чтобы сделать его более подходящим для способа определения. В предпочтительном воплощении контакт между образцом и производным слитого с Fc белка является пролонгированным (то есть осуществляют инкубацию в условиях, подходящих для стабильности образца и производного слитого с Fc белка). Условия на стадии приведения в контакт могут быть определены специалистом в области техники рутинным образом. Подходящие буферы, которые можно использовать на стадии приведения в контакт, включают физиологические буферы, не мешающие выполнению анализа, который должен быть проведен. Например, можно использовать Трис или триэтаноламиновый (TEA) буфер. Значение рН буфера (и получаемого лизирующего реагента, включающего в себя буферный раствор) может варьироваться в диапазоне от приблизительно 2,0 до приблизительно 10,0, возможно, от приблизительно 4,0 до приблизительно 9,0, предпочтительно от приблизительно 7,0 до приблизительно 8,5, и еще более предпочтительно от приблизительно 7,5 до приблизительно 8,0 или составлять приблизительно 7,0, приблизительно 7,5, приблизительно 8,0 или приблизительно 8,5. Типичные условия «приведения в контакт» могут включать инкубацию в течение от 15 минут до 4 часов (например, 1 час при 4°С, 37°С или при комнатной температуре). Однако они могут варьировать при необходимости, например, в соответствии с природой взаимодействующих партнеров по связыванию. Как вариант, образец может быть подвергнут мягкому покачиванию, перемешиванию или вращению. Кроме того, могут быть добавлены другие подходящие реагенты, такие как блокирующие агенты для снижения неспецифического связывания. Например, можно использовать 1-4% BSA (бычий сывороточный альбумин) или другой подходящий блокирующий агент (например, молоко). Условия приведения в контакт можно варьировать и адаптировать в зависимости от цели способа обнаружения. Например, если температура инкубации составляет, например, комнатную температуру или 37°С, это может увеличить возможность идентификации связующих, которые стабильны в этих условиях (например, стабильны в условиях, обнаруживаемых в организме человека).
Предпочтительно, приводят производные слитого с Fc белка по изобретению в контакт с образцом в условиях, которые обеспечивают образование комплекса между производным слитого с Fc белка и молекулой или ее фрагментом, присутствующими в образце. Затем определяют и измеряют подходящими средствами образование комплекса, указывающее, например, на наличие ВИЧ в образце. Эти средства определения и измерения зависят от природы партнеров по связыванию и включают без ограничения гомогенные и гетерогенные анализы связывания, например, такие как радиоиммунологические анализы (RIA), ИФА (иммуноферментный анализ), иммунофлуоресцентный, иммуногистохимический анализ, проточную цитометрию (например, FACS), BIACORE и вестерн-блоттинг. Предпочтительными методами анализа, особенно для крупномасштабного анализа сывороток субъекта и крови, а также полученных из крови продуктов, являются методы проточной цитометрии, ИФА и вестерн-блоттинга.
В предпочтительном воплощении измерение осуществляют методом проточной цитометрии (например, FACS). Используемый в данном документе термин «проточная цитометрия» относится к анализу, в котором определяют долю материала в образце путем мечения материала (например, путем связывания меченого антитела с материалом), заставляя поток жидкости, содержащий материал, пройти через луч света, разделяя свет, испускаемый образцом, на составляющие волны определенной длины с помощью ряда фильтров и зеркал и детектируя свет. Проточная цитометрия обеспечивает чувствительное обнаружение и быстрое количественное определение некоторых характеристик отдельных клеток, таких как вариабельность относительного размера и эндогенная флуоресценция, а также количественный анализ любого клеточного соединения, которое может быть помечено флуорохромом. См. Melamed М, et al., "Flow Cytometry and Cell Sorting", 2nd Ed. (Wiley-Liss, New York, NY, USA, 1990). Одним из основных преимуществ проточной цитометрии является быстрое количественное определение аналитов на большом количестве частиц или клеток. Как правило, флуорохромы, выбранные для использования в качестве детектируемых маркеров, выбирают на основе их способности флуоресцировать при возбуждении светом с длиной волны, используемой лазером. Когда флуорохром возбуждают лазерным лучом, он испускает свет, который затем оценивается фотоэлектронными умножителями проточного цитометра. Этот метод способен анализировать 10000 клеток/частиц в течение 1-2 минут. Проточные цитометры имеют фильтры для обнаружения излучательной способности от различных флуорохромов, которые флуоресцируют на разных длинах волн, и позволяют использовать четыре или более разных флуорохрома в качестве детектируемых маркеров, что означает, что в настоящее время одновременно можно детектировать по меньшей мере 4 различных молекулы. Эти способы и устройства для анализа образца доступны для приобретения и хорошо известны в данной области (например, проточный цитометр FACSCalibur; BD Biosciences Corp., Franklin Lakes, NJ, USA).
В предпочтительном воплощении указанное измерение включает анализ образца, предпочтительно с помощью проточной цитометрии, с использованием репортера, способного связываться с производным слитого с Fc белка, предпочтительно, с Fc-областью указанного производного слитого с Fc белка. Предпочтительно, репортер содержит детектируемую группировку и, более предпочтительно, он представляет собой вторичное антитело, специфичное в отношении Fc, связанное с детектируемой группировкой.
Детектируемые группировки, которые могут применяться, включают флуорофоры. Под «флуорофором» (или «флуорохромом» или «хромофором») понимают флуоресцентное соединение, которое может переизлучать свет при возбуждении светом. Флуорофоры, которые можно применять, включают биологические (например, белки) и химические флуорофоры. Примеры биологических флуорофоров включают T-sapphire, Cerulean, mCFPm, CyPet, EGFP, PA-EGFP, Emerald, EYFP, Venus, mCitrine, mKO, mOrange, DSRed, JRed, mStrawberry, mCherry, PA-mCherry, mRubl, Tomato, mPuby, mPub mKate, mKatushka, Kaede, Halotag и суперэклиптический фтор. Примеры химических флуорофоров включают Alexafluor, родамин, BODIPY, тетраметилродамин, цианиновые красители, флуоресцеин, квантовые точки, ИК-красители, FM-красители, АТТО-краситель. Вторичное антитело также может быть мечено ферментами, которые могут найти применение для детекции, такими как, например, пероксидаза хрена, β-галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза или глюкозооксидаза. Когда антитело мечено детектируемым ферментом, его можно обнаружить добавлением дополнительных реагентов, которые фермент использует для катализа реакции, продукт которой можно различить. Например, когда присутствует агент пероксидаза хрена, добавление перекиси водорода и диаминобензидина приводит к окрашенному продукту реакции, который обнаруживается визуально. Антитело также может быть мечено биотином и обнаружено посредством косвенного измерения связывания авидина или стрептавидина. Следует отметить, что сам авидин может быть мечен ферментом или флуоресцентной меткой.
Предпочтительно, используемое вторичное антитело к Fc специфично в отношении видов, от которых получено первичное антитело (например, человека). В одном воплощении указанное специфичное в отношении Fc вторичное антитело выбрано из группы, состоящей из IgA (например, IgA1, IgA2), IgD, IgE, IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) и IgM. Предпочтительно, вторичное антитело представляет собой IgG и, более предпочтительно, IgG1. Указанное специфичное в отношении Fc вторичное антитело может представлять собой любое антитело позвоночного, предпочтительно, любое антитело млекопитающего и, более предпочтительно, любое антитело, не являющееся человеческим (например, антитело кролика, мыши, крысы, козы, лошади, овцы или осла).
Для применения в качестве реагентов в вышеупомянутых анализах может быть удобно, чтобы производные слитого с Fc белка по изобретению были связаны с внутренней поверхностью лунок планшета для микротитрования. Производные слитого с Fc белка по изобретению могут быть непосредственно связаны с лункой планшета для микротитрования. Однако максимальное связывание производных слитого с Fc белка с лунками может быть достигнуто путем предварительной обработки лунок полилизином перед добавлением производных слитого с Fc белка. Кроме того, производные антител по изобретению могут быть ковалентно присоединены к лункам способами, известными в области техники. Как правило, производные слитого с Fc белка по изобретению используют для иммобилизации на лунках в диапазоне концентраций от 0,01 до 100 мкг/мл, хотя их также можно использовать как в большем, так и в меньшем количестве. Затем в лунки, покрытые производным слитого с Fc белка по изобретению, вносят образцы.
7. Наборы
В следующем аспекте данное изобретение относится к наборам, содержащим по меньшей мере одно из: производных антитела, нуклеиновых кислот, векторов, клеток-хозяев, фармацевтических композиций или комбинаций по изобретению или их смесей. Возможно, компоненты наборов по изобретению могут быть упакованы в подходящие контейнеры и помечены для обнаружения, инактивации, диагностики, профилактики или лечения ВИЧ или СПИДа или связанных с ними состояний. Компоненты наборов можно хранить в однодозовых или многодозовых контейнерах в виде водного, предпочтительно стерильного, раствора или в виде лиофилизированной, предпочтительно стерильной, композиции для разведения. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик, и могут иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может представлять собой пакет для внутривенного раствора или флакон с пробкой, прокалываемой иглой для подкожных инъекций). Наборы могут дополнительно содержать больше контейнеров, содержащих фармацевтически приемлемый носитель. Они могут дополнительно включать другие материалы, привлекательные с коммерческой и пользовательской точки зрения, включая без ограничения буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы, культуральную среду для одной или нескольких подходящих клеток-хозяев или другие активные агенты. Наборы могут содержать инструкции, обычно включаемые в коммерческие упаковки диагностических и терапевтических продуктов, которые содержат информацию, например, о показаниях, применении, дозировке, изготовлении, введении, противопоказаниях или предупреждениях, касающихся применения таких диагностических и терапевтических продуктов.
Все процитированные в данном документе публикации включены во всей полноте путем ссылки. Лучше понять изобретение, описанное выше в общих чертах, позволят следующие примеры, которые приведены в качестве иллюстрации и не предназначены для ограничения настоящего изобретения, если не указано иное.
Общие методики
1. Конструирование производных слитого с Fc белка
Два внеклеточных домена молекулы человеческого CD4 (D1 и D2) присоединяли к Fc-участку человеческого IgG1, содержащему точечные мутации G236A, S239D, A330L и I332E, включающему шарнирный участок, домены СН2 и СН3, с получением модифицированной молекулы CD4-IgG1. На основе модифицированного каркаса CD4-IgG1 создавали производные слитого с Fc белка, обладающие следующими характеристиками:
(а) в цепи Fc были сделаны точечные мутации M428L и N434S для пролонгирования активности производных слитого с Fc белка.
(б) точечная мутация K322A была сделана для модулирования активации комплемента.
(в) точечные мутации F243L и R292P в цепи Fc были сделаны для улучшения продукции производных слитого с Fc белка.
(г) по меньшей мере одна или несколько точечных мутаций Y300L, P396L, S298A, Е333А или K334A в цепи Fc были сделаны для дальнейшего улучшения продукции производных слитого с Fc белка.
(д) добавление N-концевой внеклеточной последовательности человеческого CCR5 (SEQ ID NO: 5) на С-конце цепи Fc.
(е) добавление последовательности Т-20 (SEQ ID NO: 10), С34 (SEQ ID NO: 11) или ЕНО (SEQ ID NO: 12) на С-конце цепи Fc.
(ж) последовательное добавление (1) последовательности CCR5 (SEQ ID NO: 5), (2) последовательности Т-20 (SEQ ID NO: 10), С34 (SEQ ID NO: 11) или ЕНО (SEQ ID NO: 12) и (3) варьирующего числа гибких звеньев (GGGGS) (SEQ ID NO: 4) и/или SEQ ID NO: 6-9 на С-конце цепи Fc.
Все полинуклеотиды, экспрессирующие производные слитого с Fc белка по изобретению, синтезировали с использованием процесса GeneArt и экспрессионных плазмид pcDNA3.1 и pcDNA3.4.
Плазмиды растворяли в 10 мМ Трис-буфере, рН 8, до концентрации 0,5 мкг/мкл. Химически компетентные E.coli One Shot ТОР10 (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA, США) трансформировали с использованием 1 мкл плазмиды, следуя инструкции изготовителя. Вкратце, 1 мкл плазмиды добавляли во флакон с бактериями и инкубировали на льду в течение 15 минут. После этого пробирку инкубировали при 42°С в течение 30 секунд и сразу помещали на лед на две минуты. Бактерии ресуспендировали в 250 мкл среды SOC (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA, США) и инкубировали в течение 1 часа при 37°С и перемешивании при 225 об/мин в шейкер-инкубаторе Innova 4000 (New Brunswick Scientific Co., Inc., Enfield, CT, USA). После этого 100 мкл культуры клеток в разведении 1/100 распределяли на чашках с LB-агаром, содержащим ампициллин для отбора (100 мкг/мл). Чашки инкубировали при 37°С в течение 16-24 часов в инкубаторе Heraeus (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Выделяли одну колонию и инокулировали в 5 мл среды LB, содержащей ампициллин для отбора (100 мкг/мл), и инкубировали в течение 8 часов при 37°С и перемешивании 225 об/мин в шейкер-инкубаторе Innova 4000 (New Brunswick Scientific Co., Inc., Enfield, CT, США). После этого 500 мл среды LB, содержащей ампициллин для отбора (100 мкг/мл), инокулировали 500 мкл культуры, описанной выше, и инкубировали при 37°С и перемешивании при 225 об/мин в течение 16 часов, как описано ранее. Бактерии собирали центрифугированием при 3000 g в течение 45 минут при комнатной температуре в центрифуге Eppendorf 5810R (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) и выделяли плазмиды с использованием набора Qiagen Plasmid Maxi (Qiagen NV, Venlo, NL) согласно инструкциям производителя. Проводили количественный спектрофотометрический анализ очищенных плазмид с использованием прибора nanodrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).
2. Получение белка, количественное определение и очистка
Клетки HEK-293 трансфицировали плазмидами, кодирующими различные производные слитого с Fc белка по изобретению, используя набор для трансфекции Calphos (Clontech, Takara Bio Inc., Otsu, JP), следуя инструкциям производителя. Через 48 часов собирали надосадочную жидкость, очищали фильтрованием через 0,45 мкм фильтр (EMD Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, DE) и хранили при -20°С до использования.
2
4
Проводили количественный анализ производных слитого с Fc белка методом ИФА. Вкратце, планшеты Maxisorp 96-F (Nunc, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) инкубировали в течение ночи при 4°С со 100 мкл/лунку F(ab)2 антитела козы к IgG человека (специфичного в отношении Fc) (Jackson ImmunoResearch Labs, Inc., West Grove, PA, USA) в концентрации 1 мкг/мл в PBS. После блокирования PBS / 10% FBS / 0,05% tween20 и промывания в планшет добавляли серийные разведения культуральной надосадочной жидкости (содержащей рекомбинантный белок) в блокирующем буфере (100 мкл/лунку) и инкубировали в течение ночи при 4°С.Планшеты снова промывали и добавляли вторичное HRP-F(ab)2 антитело козы к IgG человека (специфичное в отношении Fc) (Jackson ImmunoResearch Labs, Inc., West Grove, PA, USA) в разведении 1/10000 в блокирующем буфере (100 мкл/лунку) и инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа. Планшеты промывали и детектировали связанные антитела с использованием субстрата OPD (о-фениледиамин дигидрохлорид), реакцию останавливали добавлением 4н. HSO. Продукт измеряли при 492 нм при помощи считывающего устройства для планшетов ИФА.
2
Белки очищали с использованием колонки с сефарозой с белком A (GE Healthcare, Inc., Stamford, CT, USA). Белки получали при помощи транзиторной трансфекции с использованием бессывороточной среды, как указано выше. Собирали надосадочные жидкости, центрифугировали при 3000 g в течение 10 минут и фильтровали через фильтр с порами 0,45 мкм для удаления клеточного дебриса. Очищенный супернатант добавляли к предварительно отмытым гранулам сефарозы с белком А и инкубировали в течение ночи при 4°С в режиме вращения «с донышка на крышку». Белок А промывали трис-буферным солевым раствором (TBS) и связанный белок элюировали 4М MgCl. В альтернативном варианте белки очищали с использованием колонок CaptureSelect FcXL Affinity Matrix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) и элюировали глициновым буфером с рН 3,5. Очищенные белки подвергали диализу против PBS, концентрировали ультрафильтрацией, проводили количественный анализ методом ИФА или спектрофотометрии и хранили при -80°С до использования.
3. Исследования нейтрализации
50
2
Изоляты ВИЧ NL4-3, BaL, АС10, SVBP6, SVBP8, SVBP11, SVBP12, SVBP14, SVBP15, SVBP17, SVBP18 и SVBP19 создавали как псевдовирусы с применением плазмид, экспрессирующих Env, и вектора pSG3. См.  S, et al., Vaccine 2011; 29:5250-5259. Бесклеточную нейтрализацию вируса производными слитого с Fc белка исследовали в стандартном анализе на основе TZM-bl. См. Li, 2005, выше. Вкратце, в 96-луночном культуральном планшете 100 мкл предварительно разведенных производных слитого с Fc белка предварительно инкубировали с 50 мкл псевдовируссодержащего материала, используя 200 TCID (инфекционные дозы для тканевой культуры) при 37°С в течение одного часа. Затем в каждую лунку добавляли по 10000 клеток-мишеней TZM-bl с люциферазным репортером в объеме 100 мкл. Планшеты культивировали при 37°С и 5% СО в течение 48 часов. Исследовали серийные разведения производных слитого с Fc белка от 1000 до 0,1 нг/мл. Репортерные клетки TZM-bl обрабатывали декстраном (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) для усиления инфекционности. Для считывания использовали субстрат люциферазы Britelite Plus (PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA). Для аппроксимации данных нейтрализации нелинейной функцией в расчетах использовали нормализованные значения, которые аппроксимировали кривой ингибирования одного сайта с переменным угловым коэффициентом Хилла. Весь статистический анализ и аппроксимацию нелинейной функцией выполняли с использованием программного обеспечения GraphPad Prism v5.0.
4. Исследования ADCC
4
5
Для оценки способности различных производных слитого с Fc белка активировать опосредованную NK-клетками деструкцию ВИЧ-инфицированных клеток NK-клетками, выполняли исследование ADCC согласно Alpert М, et al., J. Virol. 2012, 86:12039-12052. Вкратце, использовали NK-клетки линии KHYG-1 CD16+ в качестве источника эффекторных клеток и клеточную линию CEM.NKR.CCR5+ Luc в качестве источника клеток-мишеней. За пять дней до исследования клетки-мишени инфицировали материалом, содержащим высокоинфекционный изолят BaL, и культивировали в среде R10 (RPMI с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки) при 37°С. Для проведения анализа 10 клеток-мишеней (более 40% из них продуктивно инфицированы) культивировали с 10 эффекторных клеток в среде R10 с добавлением 10 ед/мл рекомбинантного IL-2 (интерлейкин-2) в присутствии различных концентраций производных слитого с Fc белка или молекул на основе антител в общем объеме 200 мкл в круглодонных 96-луночных планшетах. После 8 часов инкубации при 37°С клетки ресуспендировали и 150 мкл суспензии клеток смешивали с 50 мкл субстрата люциферазы, Britelite Plus (PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA). Единицы люциферазы были использованы для считывания. Поскольку клетки-мишени экспрессируют люциферазу при ВИЧ-инфекции, снижение активности люциферазы является непосредственным показателем антитело- и NK-опосредованного уничтожения клеток.
5. Связывание с Fc-рецепторами (исследование при помощи ИФА)
2
4
Для оценки аффинности связывания производных слитого с Fc белка с человеческими Fc-рецепторами проводили различные исследования при помощи ИФА с использованием рекомбинантных растворимых белков CD64, CD32, CD16 и FcRn человека (R&D Systems, Bio-Techne Ltd, Abingdon, GB). Вкратце, планшеты Maxisorp 96-F (Nunc, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) инкубировали в течение ночи при 4°С со 100 мкл/лунку клона HIS.H8 мышиного анти-6xHis антитела (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) в концентрации 1 мкг/мл в PBS. После блокирования PBS / 1% BSA / 0,05% tween20 и промывания в планшет добавляли серийные разведения иммунных комплексов слитого с Fc белка, растворенных в блокирующем буфере (100 мкл/лунку) и инкубировали в течение ночи при 4°С. Иммунные комплексы получали путем инкубации слитых с Fc белков (1 мкг), конъюгированного с биотином мышиного антитела к человеческому CD4 (1,4 мкг) (клон SK3, Biolegend) и стрептавидина (0,125 мкг) (Jackson ImmunoResearch Labs, Inc., West Grove, PA, USA) в течение двух часов при комнатной температуре. Планшеты снова промывали и добавляли вторичное HRP-F(ab)2 антитело козы к IgG человека (специфичное в отношении Fc) (Jackson ImmunoResearch Labs, Inc., West Grove, PA, USA) в разведении 1/10000 в блокирующем буфере (100 мкл/лунку) и инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа. Планшеты промывали и детектировали связанные антитела с использованием субстрата OPD, реакцию останавливали добавлением 4н. HSO. Продукт измеряли при 492 нм при помощи считывающего устройства для планшетов ИФА.
6. Связывание с C1q (исследование при помощи ИФА)
2
4
Для оценки аффинности связывания производных слитого с Fc белка с C1q человека проводили исследования при помощи ИФА с использованием растворимого C1q человека (Bio-Rad Labs, Inc., Hercules, CA, USA). Вкратце, планшеты Maxisorp 96-F (Nunc, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) инкубировали в течение ночи при 4°С со 100 мкл/лунку человеческого C1q (1 мкг/мл в PBS). После блокирования PBS / 1% BSA / 0,05% tween20 и промывания добавляли серийные разведения слитого с Fc белка и инкубировали в течение ночи при 4°С. Планшеты снова промывали и добавляли вторичное HRP-F(ab)2 антитело козы к IgG человека (специфичное в отношении Fc) (Jackson ImmunoResearch Labs, Inc., West Grove, PA, USA) в разведении 1/10000 в блокирующем буфере (100 мкл/лунку) и инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа. Планшеты промывали и детектировали связанные антитела с использованием субстрата OPD, реакцию останавливали добавлением 4н. HSO. Продукт измеряли при 492 нм при помощи считывающего устройства для планшетов ИФА.
Пример 1
Конструирование производных слитого с Fc белка
Слитый белок человеческий CD4-IgG1 мыши получали, как описано ранее. Этот слитый белок использовали в прошлом для идентификации антител к сайту связывания CD4. См. Carrillo J, et al., PLOS One 2015; 10(3):0120648; Фиг. 1. Однако, поскольку известно, что молекулы CD4-IgG1 обладают ограниченным терапевтическим потенциалом, в последовательность белка CD4-IgG1 были внесены некоторые изменения для усиления его противовирусной активности и ADCC-активности. См. Jacobson J, et al., Antimicrob Agents Chemother. 2004; 48(2):423-429.
Сначала в Fc-область человеческого IgG1 вводили мутации в положениях G236A, S239D, A330L и I332E (т.е. набор мутаций AM), как описано в области техники, для усиления ADCC-опосредованных ответов. См. Bournazos, 2014, выше. Дальнейшие модификации, направленные на усиление взаимодействия с Env ВИЧ, включали добавление последовательности из 29 аминокислот, соответствующей N-концевой внеклеточной области CCR5 (SEQ ID NO: 5), и добавление последовательности Т-20 (SEQ ID NO: 10) на С-конце цепи Fc с гибким оптимальным линкером. Таким образом, сконструировали производное слитого с Fc белка (М5), содержащее последовательности CCR5 и Т-20. См. Фиг. 1 и 2. Также, сконструировали молекулы, лишенные последовательности CCR5 и имеющие удлиненный линкер (М7).
Во-вторых, в последовательность IgG1 внедрили несколько наборов мутаций для улучшения активности молекул М5 и М7. Наборы протестированных мутаций были следующими: (1) А12 (т.е. F243L, R292P и Y300L; SEQ ID NO: 14), (2) А14 (т.е. F243L, R292P и P396L; SEQ ID NO: 15), (3) А16 (т.е. F243L, R292P, Y300L и P396L; SEQ ID NO: 16), (4) А18 (т.е. F243L, R292P, Y300L, P396L и V305I; SEQ ID NO: 17), (5) А41 (т.е. S298A, Е333А и K334A; SEQ ID NO: 18), (6) LL (M428L и N434S; SEQ ID NO: 19) и их комбинации (например, SEQ ID NO: 20-33). См. Фиг. 1 и 2., Табл. 1.
Для целей сравнения также подготовили слитый белок eCD4-IgG1 (M1), как описано ранее. В настоящее время слитый белок eCD4-IgG1 является одним из наиболее эффективных генно-инженерных антител против ВИЧ, известных в области техники. См. Gardner, 2015, supra. Чтобы обеспечить лучшую основу для сравнения, в цепь слитого с Fc белка CD4-IgG1 дополнительно ввели мутации в положениях G236A, S239D, A330L и I332E с образованием молекулы М6. Дополнительную контрольную молекулу получали путем замены последовательности IgG1 молекулы M7IgG1C34 на последовательность человеческого IgG2. См. Фиг. 2. У IgG2 отсутствует способность опосредовать ADCC, и поэтому его использовали в качестве отрицательного контроля при исследовании ADCC.
Пример 2
Получение производных слитого с Fc белка
Для оценки выхода различных молекул в клетках млекопитающих (например, клеточной линии HEK293) проводили стандартный анализ трансфекции. Уровень слитых с Fc белков, высвобождаемых в культуральную надосадочную жидкость, анализировали методом ИФА, как описано выше, и определяли динамику продуцирования в течение 6 суток после трансфекции. Чтобы оценить влияние мутаций в последовательности IgG1, проанализировали ряд молекул на основе производного M7IgG1C34. Молекулы включали IgG1 дикого типа и несколько различных наборов мутаций. См. Таблицу 1. В то время как производное IgG1 дикого типа было получено с высоким выходом, вариант AM продемонстрировал отчетливое снижение выхода (то есть снижение примерно на 90%). Напротив, все мутанты, содержащие точечные мутации F243L и R292P (т.е. А12, А14, А16 и А18) и мутанты серии А41 продемонстрировали продуцировались с выходом, сопоставимым с молекулой IgG1 дикого типа. См. Фиг. 3А. Введение мутаций LL существенно не изменяло выход молекул. См. Фиг. 3В. Напротив, комбинация мутаций сильно влияла на выход. Действительно, добавление мутаций S239D и I332E (содержащихся в серии AM) к фоновому генотипу А16 оказывало негативное влияние на продуцирование. См. Фиг. 3С.
Пример 3
Нейтрализующая способность производных слитого с Fc белка
Для оценки влияния наборов мутаций А12, А14, А16, А18 и А41 на нейтрализующую способность производных слитого с Fc белка по изобретению проводили стандартный анализ нейтрализации. Для анализа использовали четыре различных вируса: (1) штамм ВИЧ-1 NL4-3, (2) Х4-монотропный лабораторный изолят, (3) штамм BaL ВИЧ-1, R5-монотропный лабораторный изолят и (4) два первичных изолята ВИЧ-1 (т.е. АС10 и SVPB16), оба относятся к вирусам 2 типа уровня чувствительности, особенно трудно поддающимся нейтрализации.
50
2
50
Вкратце, в 96-луночном культуральном планшете 100 мкл предварительно разведенных образцов плазмы предварительно инкубировали с 50 мкл псевдовируссодержащего материала, используя 200 TCID при 37°С в течение одного часа. Затем в каждую лунку добавляли по 10000 клеток-мишеней TZM-bl с люциферазным репортером в объеме 100 мкл. Планшеты культивировали при 37°С и 5% СО в течение 48 часов. Исследовали серийные разведения производных слитого с Fc белка от 1000 до 0,1 нг/мл. Репортерные клетки TZM-bl обрабатывали декстраном (Sigma-Aldrich, Saint Louis, МО, USA) для усиления инфекционности. Для считывания использовали субстрат люциферазы Britelite Plus (PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA). Для аппроксимации данных нейтрализации нелинейной функцией в расчетах использовали нормализованные значения, которые аппроксимировали кривой ингибирования одного сайта с переменным угловым коэффициентом Хилла, и получали для каждой молекулы значения IC против каждого вируса. Весь статистический анализ и аппроксимацию нелинейной функцией выполняли с использованием программного обеспечения GraphPad Prism v5.0.
50
Все протестированные молекулы, включая IgG1 дикого типа и производные слитого с Fc белка, содержащие наборы мутаций AM, А12, А14, А16, А18 и А41, показали сходную эффективность при блокировании инфекционности ВИЧ. Существенных различий в среднегеометрических значения IC не наблюдалось. См. Фиг. 4А. Введение мутаций LL и комбинации различных мутаций существенно не модифицировали нейтрализующую активность молекул против изолята ВИЧ-1 BaL. См. Фиг. 4В и 4С.
Пример 4
Антитело-зависимая клеточная цитотоксическая (ADCC) активность производных слитого с Fc белка
Одним из наиболее важных признаков производных слитых с Fc белков по изобретению является их способность активировать NK-клетки и опосредовать ADCC. Этот механизм важен для эффективного и быстрого удаления ВИЧ-инфицированных клеток и способствует защите неинфицированных людей от воздействия ВИЧ и заражения. См. Euler Z, et al., AIDS Res Hum Retroviruses 2015; 31(1):13-24.
50
50
50
ADCC-активность производных слитого с Fc белка по изобретению оценивали при помощи теста, описанного ранее в области техники. См. Alpert М, et al., J. Virol. 2012, 86:12039-12052. В этом анализе способность NK-клеток к уничтожению измеряют по уменьшению экспрессии люциферазы в линии репортерных клеток, инфицированных ВИЧ. Анализ кривых доза-ответ против клеток, инфицированных изолятом ВИЧ BaL, проводили путем нормализации значений IC относительно M1. Молекулы, несущие набор мутаций AM (например, М6 и М7АМС34), разрушали ВИЧ-инфицированные клетки с самыми низкими значениями IC, что согласовывалось с данными связывания, полученными в исследованиях ИФА. См. Фиг. 5А. С другой стороны, молекулы, несущие наборы мутаций А16 и А18, показывали схожие значения IC, в то время как в молекулах, несущих набор мутаций А41, и молекулах IgG1 дикого типа (например, М7А41С34 и M1) наблюдалась более низкая активность. См. Фиг. 5А. Внедрение мутаций LL существенно не изменяло ADCC активность молекул. См. Фиг. 5В. Напротив, комбинация мутаций в некоторых случаях улучшала ADCC активность. Действительно, комбинации A16_4LL и А6_6LL показали самую высокую активность, которая была сопоставима с референтной молекулой М6. См. Фиг. 5С.
Пример 5
Аффинность связывания производных слитого с Fc белка с человеческими Fc-рецепторами и C1q
Исследовали аффинности связывания производных слитого с Fc белка по изобретению с различными Fc-рецепторами. Эти молекулы были сконструированы с конкретной целью увеличения их аффинности связывания с CD16 человека. Однако введенные наборы мутаций могли также влиять на аффинности связывания производных слитого с Fc белка по изобретению с другими Fc-рецепторами и вызывать нежелательные побочные эффекты. Среди человеческих Fc-рецепторов CD64, CD32 и CD16 являются наиболее значимыми для опосредования эффекторных функций антител и слитых с Fc белков. См. Vogelpoel L, et al., Front. Immunol. 2015; 6(79):1-11. Таким образом, исследовали аффинности связывания нескольких производных слитого с Fc белка по изобретению с рекомбинантными человеческими CD64, CD32a, CD32b/c и CD16 (обе изоформы V и F) при помощи ИФА.
Аффинности связывания производных слитого с Fc белка по изобретению с C1q исследовали для оценки возможной активации комплемента. Таким образом, исследовали аффинности связывания нескольких производных слитого с Fc белка по изобретению с рекомбинантными человеческим компонентом комплемента C1q при помощи ИФА.
Все данные ИФА нормализовали к молекуле дикого типа М7АС34, содержащей немутированный человеческий IgG1. Соотношения сигналов подвергали логарифмическому преобразованию Log2. После нормализации данных молекулы и рецепторы разбивали на кластеры, используя в качестве критерия сходства (подобия) евклидово расстояние. См. Фиг. 6. Этот глобальный анализ выявил минимальные и гомогенные изменения аффинности различных молекул к CD64. Что касается CD32a и CD32b/c, имели место минимальные изменения, за исключением молекул А16_1, которые демонстрировали наиболее высокую аффинность. Напротив, некоторые молекулы демонстрировали низкую или нулевую аффинность к C1q (молекулы А16_4 и AM, соответственно). См. Фиг. 6. Все молекулы увеличивали аффинность к CD16 в разной степени, наиболее мощные производные группировались в кластер, включающий молекулы A16_1, А16_3, Am, А16_6 и А16_4.
Пример 6
Сочетание мутаций, усиливающих ADCC и пролонгирующих активность
Fc-участок молекул, содержащий последовательность IgG1 дикого типа и наборы мутаций AM и А16, дополнительно модифицировали, чтобы включить набор мутаций LL (т.е. M428L и N434S). Набор мутаций LL был связан с пролонгированной активностью рекомбинантных антител в плазме человека. См. Roopenian D, et al., Nature Reviews Immunology. 2007; 7:715-725.
Во-первых, различные комбинации мутаций протестировали в анализах трансфекции, чтобы оценить их потенциальное влияние на выход продукции. Добавление мутаций M428L и N434S к молекуле IgG1 дикого типа М7АС34 или к молекулам М7АМС34 и М7А16С34 не влияло на выход их продукции, нейтрализующую активность и ADCC-активность. См. Фиг. 3-5.
Приведенные выше результаты позволяют предположить, что внедренный набор мутаций LL не оказывал отрицательного влияния на противовирусную активность в отношении ВИЧ и ADCC-активность производных слитого с Fc белка по изобретению.
Пример 7
Влияние набора мутаций LL на аффинность связывания производных слитого с Fc белка с человеческими неонатальными Fc рецепторами (FcRn)
Для анализа изменений аффинности к рецепторам FcRn, индуцированных набором мутаций LL в производных слитого с Fc белка по изобретению, проводили исследования при помощи ИФА. Исследования проводили с использованием двух разных условий рН: рН 6,0 и рН 7,2. Все молекулы, несущие набор мутаций LL (M7ALLC34, M7A16LLC34 и M7A41LLC34) показали значительно более высокую аффинность к рецепторам FcRn, чем их немутантные аналоги (М7АС34, М7А16С34 и М7А41С34) при рН 6,0 (среднее увеличение в 10 раз), в то время как при рН 7,2 эффект был значительно ниже. См. Фиг. 7. Таким образом, эти данные позволяют предположить, что набор мутаций LL поддерживает как нейтрализующую, так и ADCC-активность производных слитого с Fc белка по изобретению, в то же время пролонгируя их активность.
Пример 8
Анализ влияния линкерных последовательностей на продукцию и активность белка
Хотя молекула M7A16_4LLC34 продемонстрировала приемлемый профиль продукции, нейтрализующей и ADCC-активности, производные слитого с Fc белка дополнительно модифицировали, чтобы включить последовательность CCR5 (SEQ ID NO: 5) и различных линкеров с различной гибкостью. Для этого на основе молекулы M7A16_4LLT20 сконструировали молекулу М7А16Т20, включающую последовательность Т20 (SEQ ID NO: 10) или последовательность С34 (SEQ ID NO: 11). Аналогично, также были протестированы линкерные пептиды М19, М20, М21 и М22 (SEQ ID NO: 6-9) с образованием молекул M19A16_4LLT20, M20A16_4LLT20, M21A16_4LLT20 и M22A16_4LLT20 и их соответствующих С34-производных.
С точки зрения продукции, все Т20-производные показали худший выход, чем С34-аналоги. Различные линкеры также влияли на продукцию, так как молекулы, несущие линкеры М21 и М22, показали самый высокий выход. См. Фиг. 8А. Кроме того, хотя нейтрализующая способность была примерно одинаковой для всех молекул, М22-производные были стабильно менее действенными при нейтрализации изолятов ВИЧ-1 BaL или АС10. См. Фиг. 8В.
В отношении ADCC-активности наблюдалось сходное ранжирование, где производное М22 было менее мощным, чем его аналоги М19-М21. Производные М19, М20 и М21 неожиданно показали более высокую активность, чем референтная молекула М6. См. Фиг. 8С.
Пример 9
Анализ влияния последовательностей gp41 на продукцию и активность белка
Для улучшения выхода и профиля активности производные слитого с Fc белка дополнительно модифицировали, чтобы включить ЕНО пептид ВИЧ-2 (SEQ ID NO: 12) в С-конец. Сконструировали производные M19A16_4LLEHO, M20A16_4LLEHO и M21A16_4LLEHO и сравнили с их С34-аналогами.
С точки зрения продукции, молекулы, несущие пептид ЕНО, показали наиболее высокий выход, достигались темпы продуцирования, сопоставимые с таковыми молекулы дикого типа М7АС34. См. Фиг. 9А. Примечательно, что это улучшение выхода сопровождалось высокой нейтрализующей активностью и ADCC-активностью. См. Фиг. 9В и 9С.
Пример 10
Инактивирующая вирус активность производных слитого с Fc белка
50
Для оценки необратимой инактивации ВИЧ, индуцированной производными слитого с Fc белка по изобретению, высокоинфекционный вируссодержащий материал BaL ВИЧ инкубировали в культуральной среде DMEM с серийными разведениями (диапазон концентраций: от 0,7 мкг/мл до 0,7 пг/мл) производных слитого с Fc белка по изобретению (диапазон концентраций: от 1 мкг/мл до 1 пг/мл). После 1 часа инкубации при 37°С образцы разводили DMEM, а вирусы и растворимые белки разделяли добавлением реагента LentiX Concentrator (Takara / Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA). Смесь инкубировали в течение 30 минут при 4°С и затем центрифугировали при 1500 g в течение 45 минут при 4°С. Надосадочные жидкости удаляли и осадки вируса ресуспендировали в DMEM. Инфекционность обработанных вирусов анализировали титрованием в клетках TZM-bl. См. Li М, et al., J. Virol. 2005; 79:10108-10125. Для каждого препарата рассчитывали значение TCID для оценки остаточной инфекционности обработанных вирусов.
Пример 11
Опосредованная AAV экспрессия производных слитого с Fc белка in vivo
Мышей NSG (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA) содержали в условиях скрещивания между сибсами и отсутствия специфических патогенов (SPF).
11
50
Чтобы индуцировать стабильную экспрессию производных слитого с Fc белка у этих животных, их последовательности клонировали в плазмиды, экспрессирующие AAV8 (CBATEG, Universitat Autonoma de Barcelona, Barcelona, ES). 1×10 вирусных частиц разводили в 40 мкл буфера, содержащего 100 мМ цитрата натрия, 10 мМ трис, рН 8, и вводили путем инъекции в икроножную мышцу мышей в возрасте восьми недель. В то же время мышей гуманизировали посредством внутрибрюшинной инъекции 10 миллионов мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), выделенных от здоровых людей. Через две недели мышей инфицировали путем внутрибрюшинной инъекции 10000 TCDI изолята ВИЧ NL4-3. Образцы крови собирали еженедельно и анализировали количество CD4+ и CD8+ Т-клеток при помощи проточной цитометрии с использованием частиц Perfect Count (Cytognos SL, Salamanca ES) в сочетании со следующими антителами к антигенам человека: CD45-V450, CD3-APC/Cy7, CD4-APC, CD8-V500, CD14-PerCP/Cy5.5, CD56-PE, CD16-Fitc и антителом к антигену мыши CD45-PE/Cy7. Образцы анализировали с использованием проточного цитометра LSR II (BD Biosciences Corp., Franklin Lakes, NJ, USA). В образцах также исследовали уровни производных слитого с Fc белка, используя описанный выше подход с применением ИФА. Через 3 недели после заражения мышей умерщвляли и брали образцы крови и ткани. Образцы анализировали при помощи проточной цитометрии и вирусную нагрузку и общую ДНК ВИЧ определяли с помощью qPCR.
Пример 12
Протокол пассивной иммунизации плазмидными векторами
Мышей NSG (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA) содержали в условиях скрещивания между сибсами и отсутствия специфических патогенов (SPF).
Плазмиды рМ5А16Т20 и pM7A16LLC34 получали в условиях отсутствия эндотоксинов с использованием наборов EndoFree Plasmid (Qiagen NV, Venlo, NL). Для транзиторной экспрессии производных слитого с Fc белка in vivo плазмиды вводили мышам NGS посредством внутримышечных или внутривенных инъекций. После введения плазмиды еженедельно собирали образцы крови и исследовали уровни производных слитого с Fc белка, используя описанный выше подход с применением ИФА. Через 4 недели после введения плазмиды мышей умерщвляли и брали образцы крови и ткани и анализировали уровни производных слитого с Fc белка и анти-идиотипические антитела.
Пример 13
Активность in vivo
Производные слитого с Fc белка получали в большом объеме культуры клеток HEK-293Т путем транзиторной трансфекции. Рекомбинантный белок очищали после загрузки надосадочных жидкостей в колонки CaptureSelect FcXL Affinity Matrix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) и элюирования связанного белка глициновым буфером с рН 3,5. После нейтрализации рН, диализа и концентрирования получали материал высокой чистоты с концентрацией 5 мг/мл.
50
Мышей NSG с иммунодефицитом гуманизировали посредством внутрибрюшинной инъекции 10 миллионов РВМС, выделенных от здоровых людей. Через две недели мышей инфицировали посредством внутрибрюшинной инъекции 100 TCID изолята ВИЧ NL4-3. За 24 часа до заражения мышам вводили 1 мг очищенного производного слитого с Fc белка в 200 мкл или такой же объем PBS посредством внутрибрюшинной инъекции. Образцы крови собирали на первой и второй неделе после заражения пункцией верхнечелюстной вены и обрабатывали для получения образцов плазмы. См. Фиг. 10А. В образцах плазмы исследовали уровни виремии с использованием Abbott Real Time HIV-1 (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA), в то время как продуктивное заражение клеток крови и спленоцитов анализировали, оценивая процентное содержание клеток GAG+ ВИЧ-1. Молекулы M20A16_4LLC34 и M21A16_4LLC34 поддерживали процентное содержание инфицированных клеток ниже предела обнаружения спустя две недели после заражения. Напротив, в контрольной группе медианное значение GAG-положительных клеток составляло 3,3%.
Пример 14
Выявление гликопротеинов Env ВИЧ
Чтобы оценить способность производных слитого с Fc белка по изобретению идентифицировать белки ВИЧ в образце, клетки MOLT, хронически инфицированные изолятами ВИЧ NL4-3 или BaL, инкубировали с увеличивающимися количествами производных слитого с Fc белка. Молекулы, связанные с этими клетками, выявляли с помощью мышиного антитела к IgG человека, связанного с флуорохромом фикоэритрином (PE/Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA), и анализировали с помощью проточной цитометрии на проточном цитометре LSRII BD Biosciences Corp., Franklin Lakes, NJ, USA).
--->
SEQUENCE LISTING
<110>  AlbaJuna Therapeutics, S.L.
Carrillo Molina, Jorge
Clotet Sala, Bonaventura
Blanco Arbues, Julian M.
<120>  Fc-fusion protein derivatives with high dual HIV antiviral and
immunomodulatory activity
<130>  P1607WO
<150>  US62/504411
<151>  2017-05-10
<160>  66
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  100
<212>  PRT
<213>  Human CD4 receptor
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(100)
<223>  домен D1 человеческого рецептора CD4
<400>  1
Lys Lys Val Val Leu Gly Lys Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys
1               5                   10                  15
Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser Ile Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn
20                  25                  30
Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro
35                  40                  45
Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln
50                  55                  60
Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp
65                  70                  75                  80
Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu
85                  90                  95
Val Phe Gly Leu
100
<210>  2
<211>  78
<212>  PRT
<213>  Human CD4 receptor
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(78)
<223>  домен D2 человеческого рецептора CD4
<400>  2
Thr Ala Asn Ser Asp Thr His Leu Leu Gln Gly Gln Ser Leu Thr Leu
1               5                   10                  15
Thr Leu Glu Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val Gln Cys Arg Ser
20                  25                  30
Pro Arg Gly Lys Asn Ile Gln Gly Gly Lys Thr Leu Ser Val Ser Gln
35                  40                  45
Leu Glu Leu Gln Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr Val Leu Gln Asn
50                  55                  60
Gln Lys Lys Val Glu Phe Lys Ile Asp Ile Val Val Leu Ala
65                  70                  75
<210>  3
<211>  232
<212>  PRT
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(232)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1
<400>  3
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210>  4
<211>  5
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Последовательность гибкого линкера
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(5)
<223>  Гибкий линкер
<400>  4
Gly Gly Gly Gly Ser
1               5
<210>  5
<211>  29
<212>  PRT
<213>  Human CCR5 receptor
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(29)
<223>  N-концевая область человеческого рецептора CCR5
<400>  5
Met Asp Tyr Gln Val Ser Ser Pro Ile Tyr Asp Ile Asn Tyr Tyr Thr
1               5                   10                  15
Ser Glu Pro Cys Gln Lys Ile Asn Val Lys Gln Ile Ala
20                  25
<210>  6
<211>  42
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Линкерный пептид M19
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(42)
<223>  Линкерный пептид M19
<400>  6
Gly Gly Gly Gly Thr Ala Glu Ala Trp Tyr Asn Leu Gly Asn Ala Tyr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Gln Gly Asp Tyr Gln Lys Ala Ile Glu Tyr Tyr Gln Lys Ala
20                  25                  30
Leu Glu Leu Asp Pro Asn Asn Ala Glu Ala
35                  40
<210>  7
<211>  37
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Линкерный пептид M20
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(37)
<223>  Линкерный пептид M20
<400>  7
Gly Gly Gly Gly Thr Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1               5                   10                  15
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu
20                  25                  30
Ala Ala Ala Lys Ala
35
<210>  8
<211>  50
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Линкерный пептид M21
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(50)
<223>  Линкерный пептид M21
<400>  8
Gly Gly Gly Gly Thr Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ser
1               5                   10                  15
Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala
20                  25                  30
Gly Ser Gly Ala Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Ala Ala
35                  40                  45
Gly Ser
50
<210>  9
<211>  61
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Линкерный пептид M22
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(61)
<223>  Линкерный пептид M22
<400>  9
Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Met Phe Gly
1               5                   10                  15
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Thr Gly Pro Gly Tyr Ser
20                  25                  30
Phe Pro His Tyr Gly Phe Pro Thr Tyr Gly Gly Ile Thr Phe His Pro
35                  40                  45
Gly Thr Thr Lys Ser Asn Ala Gly Met Lys His Gly Ser
50                  55                  60
<210>  10
<211>  36
<212>  PRT
<213>  Human immunodeficiency virus type 1
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(36)
<223>  Полипептид T-20
<400>  10
Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln
1               5                   10                  15
Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu
20                  25                  30
Trp Asn Trp Phe
35
<210>  11
<211>  34
<212>  PRT
<213>  Human immunodeficiency virus type 1
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(34)
<223>  Полипептид C34
<400>  11
Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His
1               5                   10                  15
Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu
20                  25                  30
Leu Leu
<210>  12
<211>  34
<212>  PRT
<213>  Human immunodeficiency virus type 2
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(34)
<223>  Полипептид EHO
<400>  12
Trp Gln Gln Trp Glu Arg Gln Val Arg Phe Leu Asp Ala Asn Ile Thr
1               5                   10                  15
Lys Leu Leu Glu Glu Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Met Tyr Glu
20                  25                  30
Leu Gln
<210>  13
<211>  232
<212>  PRT
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(232)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций AM
(т.е. точечные мутации G236A, S239D, A330L и I332E)
<400>  13
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Ala Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100                 105                 110
Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210>  14
<211>  232
<212>  PRT
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(232)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A12
(т.е. точечные мутации F243L, R292P и Y300L)
<400>  14
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210>  15
<211>  232
<212>  PRT
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(232)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A14
(т.е. точечные мутации F243L, R292P и P396L)
<400>  15
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Leu Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210>  16
<211>  232
<212>  PRT
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(232)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A16
(т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L и P396L)
<400>  16
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Leu Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210>  17
<211>  232
<212>  PRT
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(232)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A18
(т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L, P396L и V305I)
<400>  17
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ile Leu Thr Val Leu His Gln
85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Leu Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210>  18
<211>  232
<212>  PRT
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(232)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A41
(т.е. точечные мутации S298A, E333A и K334A)
<400>  18
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210>  19
<211>  232
<212>  PRT
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(232)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций LL
(т.е. точечные мутации M428L и N434S)
<400>  19
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys
210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210>  20
<211>  232
<212>  PRT
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(232)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций AM+LL
(т.е. точечные мутации G236A, S239D, A330L, I332E, M428L и N434S)
<400>  20
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Ala Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100                 105                 110
Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys
210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210>  21
<211>  232
<212>  PRT
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(232)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A12+LL
(т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L, M428L и N434S)
<400>  21
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys
210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210>  22
<211>  232
<212>  PRT
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(232)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A14+LL
(т.е. точечные мутации F243L, R292P, P396L, M428L и N434S)
<400>  22
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Leu Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys
210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210>  23
<211>  232
<212>  PRT
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(232)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A16+LL
(т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L, P396L, M428L и N434S)
<400>  23
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Leu Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys
210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210>  24
<211>  232
<212>  PRT
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(232)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A18+LL
(т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L, P396L, V305I, M428L
и N434S)
<400>  24
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ile Leu Thr Val Leu His Gln
85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Leu Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys
210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210>  25
<211>  232
<212>  PRT
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(232)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A41+LL
(т.е. точечные мутации S298A, E333A, K334A, M428L и N434S)
<400>  25
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys
210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210>  26
<211>  232
<212>  PRT
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(232)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A16_1 и LL
(т.е. точечные мутации S239D, F243L, R292P, Y300L, P396L, M428L
и N434S)
<400>  26
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Leu Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys
210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210>  27
<211>  232
<212>  PRT
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(232)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A16_2 и LL
(т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L, K322A, P396L, M428L
и N434S)
<400>  27
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala
100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Leu Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys
210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210>  28
<211>  232
<212>  PRT
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(232)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A16_3 и LL
(т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L, I332E, P396L, M428L
и N434S)
<400>  28
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Leu Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys
210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210>  29
<211>  232
<212>  PRT
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(232)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A16_4 и LL
(т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L, K322A, I332E, P396L,
M428L и N434S)
<400>  29
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala
100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Leu Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys
210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210>  30
<211>  232
<212>  PRT
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(232)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A16_5 и LL
(т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L, E333A, K334A, P396L,
M428L и N434S)
<400>  30
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Leu Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys
210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210>  31
<211>  232
<212>  PRT
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(232)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A16_6 и LL
(т.е. точечные мутации S239D, F243L, R292P, Y300L, K322A, I332E,
P396L, M428L и N434S)
<400>  31
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala
100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Glu Glu Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Leu Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys
210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210>  32
<211>  232
<212>  PRT
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(232)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A41_1 и LL
(т.е. точечные мутации S239D, F243L, R292P, S298A, E333A, K334A,
M428L и N434S)
<400>  32
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys
210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210>  33
<211>  232
<212>  PRT
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(232)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A41, A16 и LL
(т.е. точечные мутации F243L, R292P, S298A, E333A, K334A, M428L и
N434S)
<400>  33
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys
210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210>  34
<211>  300
<212>  DNA
<213>  Human CD4 receptor
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(300)
<223>  Домен D1 человеческого рецептора CD4
<400>  34
aagaaagtgg tgctgggcaa gaaaggcgac accgtggaac tgacctgcac cgccagccag       60
aagaagtcca tccagttcca ctggaagaac agcaaccaga tcaagatcct gggcaaccag      120
ggcagcttcc tgaccaaggg ccccagcaag ctgaacgaca gagccgactc tcggcggagc      180
ctgtgggacc agggcaattt cccactgatc atcaagaacc tgaagatcga ggacagcgac      240
acctacatct gcgaggtgga agatcagaaa gaagaggtgc agctgctggt gttcggcctg      300
<210>  35
<211>  234
<212>  DNA
<213>  Human CD4 receptor
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(234)
<223>  Домен D2 человеческого рецептора CD4
<400>  35
accgccaact ccgacaccca tctgctgcag ggccagagcc tgaccctgac actggaaagc       60
cctccaggca gcagccccag cgtgcagtgt agaagcccca gaggcaagaa catccagggc      120
ggcaagaccc tgagcgtgtc ccagctggaa ctgcaggata gcggcacctg gacctgtacc      180
gtgctgcaga accagaaaaa ggtggaattc aagatcgaca tcgtggtgct agcc            234
<210>  36
<211>  696
<212>  DNA
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(696)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1
<400>  36
gagcccaaga gctgcgacaa gacccacacc tgtccccctt gtcctgcccc tgaactgctg       60
ggcggaccta gcgtgttcct gttcccccca aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg      120
acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc      180
aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagcccag agaggaacag      240
tacaacagca cctaccgggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac      300
ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ctgcccccat cgagaaaacc      360
atcagcaagg ccaagggcca gccccgcgaa ccccaggtgt acacactgcc ccctagcagg      420
gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctcg tgaagggctt ctacccctcc      480
gatatcgccg tggaatggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc      540
cctgtgctgg acagcgacgg ctcattcttc ctgtacagca agctgacagt ggacaagagc      600
cggtggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac      660
tacacccaga agtccctgag cctgagccct ggaaaa                                696
<210>  37
<211>  15
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  гибкий линкер GGGGS
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(15)
<223>  гибкий линкер GGGGS
<400>  37
ggggggggag gctcc                                                        15
<210>  38
<211>  87
<212>  DNA
<213>  Human CCR5 receptor
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(87)
<223>  N-концевая область человеческого рецептора CCR5
<400>  38
accgattatc aggtgtccag ccccatctac gacatcaact actacaccag cgagccctgc       60
cagaaaatca acgtgaagca gatcgcc                                           87
<210>  39
<211>  126
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  линкерный пептид M19
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(126)
<223>  линкерный пептид M19
<400>  39
ggtggcggag gtaccgctga ggcctggtac aatctgggca acgcctacta caagcagggc       60
gactaccaga aggccatcga gtattatcag aaggcccttg agctggaccc caacaatgct      120
gaagct                                                                 126
<210>  40
<211>  111
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  линкерный пептид M20
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(111)
<223>  линкерный пептид M20
<400>  40
ggtggcggag gtaccgctga agccgccgct aaagaagccg ctgcaaaaga ggctgccgcc       60
aaagaggcag ctgctaaaga agcagcagcc aaagaagccg ccgcaaaggc t               111
<210>  41
<211>  150
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  линкерный пептид M21
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(150)
<223>  линкерный пептид M21
<400>  41
ggcggcggag gtaccgctgg atctgctgct ggaagcggag caggctctgc aggttctgca       60
gcaggatctg gtgcaggttc cgctggtagt gcagctggtt ctggcgctgg ctctgctggt      120
agcgctgcag gcagcggagc tgctggatcc                                       150
<210>  42
<211>  183
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  линкерный пептид M22
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(183)
<223>  линкерный пептид M22
<400>  42
ggcggcggag gtaccggagc tggtgctggt ggcggaggaa tgtttggatc tggcggcgga       60
ggtggcggca caggatctac aggacctggc tacagcttcc ctcactacgg ctttccaacc      120
tacggcggca tcacatttca ccccggcacc accaagtcta acgccggcat gaagcacgga      180
tcc                                                                    183
<210>  43
<211>  108
<212>  DNA
<213>  Human immunodeficiency virus type 1
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(108)
<223>  Полипептид T-20
<400>  43
tacacaagcc tgatccacag cctgatcgag gaaagccaga accagcagga aaagaacgag       60
caggaactgc tggaactgga caagtgggcc atcctgtgga attggttt                   108
<210>  44
<211>  102
<212>  DNA
<213>  Human immunodeficiency virus type 1
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(102)
<223>  Полипептид C34
<400>  44
tggatggaaa tggacagaga gatcaacaat tacaccagcc tgatccactc cctgatcgag       60
gaaagccaga accagcagga aaagaacgag caggaactgc tg                         102
<210>  45
<211>  102
<212>  DNA
<213>  Human immunodeficiency virus type 2
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(102)
<223>  Полипептид EHO
<400>  45
tggcagcagt gggaaagaca agtgcggttc ctggacgcca acatcaccaa gctgctggaa       60
gaggcccaga tccagcaaga gaagaatatg tacgagctgc ag                         102
<210>  46
<211>  696
<212>  DNA
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(696)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций AM
(т.е. точечные мутации G236A, S239D, A330L и I332E)
<400>  46
gagcccaaga gctgcgacaa gacccacacc tgtccccctt gtcctgcccc tgaactgctg       60
gccggacccg acgtgttcct gttcccccca aagcccaagg acaccctgat gatctcccgg      120
acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc      180
aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagcccag agaggaacag      240
tacaacagca cctaccgggt ggtgtccgtg ctgacagtgc tgcaccagga ctggctgaac      300
ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ctctgcccga ggaaaagacc      360
atcagcaagg ccaagggcca gcccagggaa ccccaggtgt acacactgcc ccccagcaga      420
gatgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctcg tgaagggctt ttacccctcc      480
gatatcgccg tggaatggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc      540
cctgtgctgg actccgacgg ctcattcttc ctgtactcca agctgaccgt ggacaagagc      600
agatggcagc agggcaacgt gttcagctgc tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac      660
tacacccaga agtccctgag cctgagccca ggcaaa                                696
<210>  47
<211>  696
<212>  DNA
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(696)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A12
(т.е. точечные мутации F243L, R292P и Y300L)
<400>  47
gagcccaaga gctgcgacaa gacccacacc tgtccccctt gtcctgcccc tgaactgctg       60
ggcggaccta gcgtgttcct gctgccccca aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg      120
acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc      180
aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagccccc tgaggaacag      240
tacaacagca ccctgcgggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac      300
ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ctgcccccat cgagaaaacc      360
atcagcaagg ccaagggcca gccccgcgaa ccccaggtgt acacactgcc ccctagcagg      420
gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctcg tgaagggctt ctacccctcc      480
gatatcgccg tggaatggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc      540
cctgtgctgg acagcgacgg ctcattcttc ctgtacagca agctgacagt ggacaagagc      600
cggtggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac      660
tacacccaga agtccctgag cctgagccct ggaaaa                                696
<210>  48
<211>  696
<212>  DNA
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(696)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A14
(т.е. точечные мутации F243L, R292P и P396L)
<400>  48
gagcccaaga gctgcgacaa gacccacacc tgtccccctt gtcctgcccc tgaactgctg       60
gccggacccg acgtgttcct gttcccccca aagcccaagg acaccctgat gatctcccgg      120
acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc      180
aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagcccag agaggaacag      240
tacaacagca cctaccgggt ggtgtccgtg ctgacagtgc tgcaccagga ctggctgaac      300
ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ctctgcccga ggaaaagacc      360
atctccaagg ccaagggcca gcccagggaa ccccaggtgt acacactgcc ccccagcaga      420
gatgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctcg tgaagggctt ttacccctcc      480
gatatcgccg tggaatggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc      540
cctgtgctgg actccgacgg ctcattcttc ctgtactcca agctgaccgt ggacaagagc      600
cggtggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac      660
tacacccaga agtccctgag cctgagccca ggcaaa                                696
<210>  49
<211>  696
<212>  DNA
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(696)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A16
(т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L и P396L)
<400>  49
gagcccaaga gctgcgacaa gacccacacc tgtccccctt gtcctgcccc tgaactgctg       60
ggcggaccta gcgtgttcct gctgccccca aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg      120
acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc      180
aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagccccc tgaggaacag      240
tacaacagca ccctgcgggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac      300
ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ctgcccccat cgagaaaacc      360
atcagcaagg ccaagggcca gccccgcgaa ccccaggtgt acacactgcc ccctagcagg      420
gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctcg tgaagggctt ctacccctcc      480
gatatcgccg tggaatggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc      540
ctggtgctgg acagcgacgg ctcattcttc ctgtacagca agctgacagt ggacaagagc      600
cggtggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac      660
tacacccaga agtccctgag cctgagccct ggaaaa                                696
<210>  50
<211>  696
<212>  DNA
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(696)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A18
(т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L, P396L и V305I)
<400>  50
gagcccaaga gctgcgacaa gacccacacc tgtccccctt gtcctgcccc tgaactgctg       60
ggcggaccta gcgtgttcct gctgccccca aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg      120
acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc      180
aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagccccc tgaggaacag      240
tacaacagca ccctgcgggt ggtgtccatc ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac      300
ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ctgcccccat cgagaaaacc      360
atcagcaagg ccaagggcca gccccgcgaa ccccaggtgt acacactgcc ccctagcagg      420
gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctcg tgaagggctt ctacccctcc      480
gatatcgccg tggaatggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc      540
ctggtgctgg acagcgacgg ctcattcttc ctgtacagca agctgacagt ggacaagagc      600
cggtggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac      660
tacacccaga agtccctgag cctgagccct ggaaaa                                696
<210>  51
<211>  696
<212>  DNA
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(696)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A41
(т.е. точечные мутации S298A, E333A и K334A)
<400>  51
gagcccaaga gctgcgacaa gacccacacc tgtccccctt gtcctgcccc tgaactgctg       60
ggcggaccta gcgtgttcct gttcccccca aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg      120
acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc      180
aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagcccag agaggaacag      240
tacaacgcca cctaccgggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac      300
ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ctgcccccat cgccgccacc      360
atcagcaagg ccaagggcca gccccgcgaa ccccaggtgt acacactgcc ccctagcagg      420
gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctcg tgaagggctt ctacccctcc      480
gatatcgccg tggaatggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc      540
cctgtgctgg acagcgacgg ctcattcttc ctgtacagca agctgacagt ggacaagagc      600
cggtggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac      660
tacacccaga agtccctgag cctgagccct ggaaaa                                696
<210>  52
<211>  696
<212>  DNA
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(696)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций LL
(т.е. точечные мутации M428L и N434S)
<400>  52
gagcccaaga gctgcgacaa gacccacacc tgtccccctt gtcctgcccc tgaactgctg       60
ggcggaccta gcgtgttcct gttcccccca aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg      120
acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc      180
aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagcccag agaggaacag      240
tacaacagca cctaccgggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac      300
ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ctgcccccat cgagaaaacc      360
atcagcaagg ccaagggcca gccccgcgaa ccccaggtgt acacactgcc ccctagcagg      420
gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctcg tgaagggctt ctacccctcc      480
gatatcgccg tggaatggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc      540
cctgtgctgg acagcgacgg ctcattcttc ctgtacagca agctgacagt ggacaagagc      600
cggtggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgctgc acgaggccct gcactcccac      660
tacacccaga agtccctgag cctgagccca ggcaaa                                696
<210>  53
<211>  696
<212>  DNA
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(696)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций AM+LL
(т.е. точечные мутации G236A, S239D, A330L, I332E, M428L и N434S)
<400>  53
gagcccaaga gctgcgacaa gacccacacc tgtccccctt gtcctgcccc tgaactgctg       60
gccggacccg acgtgttcct gttcccccca aagcccaagg acaccctgat gatctcccgg      120
acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc      180
aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagcccag agaggaacag      240
tacaacagca cctaccgggt ggtgtccgtg ctgacagtgc tgcaccagga ctggctgaac      300
ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ctctgcccga ggaaaagacc      360
atctccaagg ccaagggcca gcccagggaa ccccaggtgt acacactgcc ccccagcaga      420
gatgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctcg tgaagggctt ttacccctcc      480
gatatcgccg tggaatggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc      540
cctgtgctgg actccgacgg ctcattcttc ctgtactcca agctgaccgt ggacaagagc      600
cggtggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgctgc acgaggccct gcactcccac      660
tacacccaga agtccctgag cctgagccca ggcaaa                                696
<210>  54
<211>  696
<212>  DNA
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(696)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A12+LL
(т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L, M428L и N434S)
<400>  54
gagcccaaga gctgcgacaa gacccacacc tgtccccctt gtcctgcccc tgaactgctg       60
ggcggaccta gcgtgttcct gctgccccca aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg      120
acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc      180
aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagccccc tgaggaacag      240
tacaacagca ccctgcgggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac      300
ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ctgcccccat cgagaaaacc      360
atcagcaagg ccaagggcca gccccgcgaa ccccaggtgt acacactgcc ccctagcagg      420
gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctcg tgaagggctt ctacccctcc      480
gatatcgccg tggaatggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc      540
cctgtgctgg acagcgacgg ctcattcttc ctgtacagca agctgacagt ggacaagagc      600
cggtggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgctgc acgaggccct gcactcccac      660
tacacccaga agtccctgag cctgagccca ggcaaa                                696
<210>  55
<211>  696
<212>  DNA
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(696)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A14+LL
(т.е. точечные мутации F243L, R292P, P396L, M428L и N434S)
<400>  55
gagcccaaga gctgcgacaa gacccacacc tgtccccctt gtcctgcccc tgaactgctg       60
gccggacccg acgtgttcct gttcccccca aagcccaagg acaccctgat gatctcccgg      120
acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc      180
aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagcccag agaggaacag      240
tacaacagca cctaccgggt ggtgtccgtg ctgacagtgc tgcaccagga ctggctgaac      300
ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ctctgcccga ggaaaagacc      360
atctccaagg ccaagggcca gcccagggaa ccccaggtgt acacactgcc ccccagcaga      420
gatgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctcg tgaagggctt ttacccctcc      480
gatatcgccg tggaatggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc      540
cctgtgctgg actccgacgg ctcattcttc ctgtactcca agctgaccgt ggacaagagc      600
cggtggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgctgc acgaggccct gcactcccac      660
tacacccaga agtccctgag cctgagccca ggcaaa                                696
<210>  56
<211>  696
<212>  DNA
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(696)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A16+LL
(т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L, P396L, M428L и N434S)
<400>  56
gagcccaaga gctgcgacaa gacccacacc tgtccccctt gtcctgcccc tgaactgctg       60
ggcggaccta gcgtgttcct gctgccccca aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg      120
acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc      180
aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagccccc tgaggaacag      240
tacaacagca ccctgcgggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac      300
ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ctgcccccat cgagaaaacc      360
atcagcaagg ccaagggcca gccccgcgaa ccccaggtgt acacactgcc ccctagcagg      420
gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctcg tgaagggctt ctacccctcc      480
gatatcgccg tggaatggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc      540
ctggtgctgg acagcgacgg ctcattcttc ctgtacagca agctgacagt ggacaagagc      600
cggtggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgctgc acgaggccct gcactcccac      660
tacacccaga agtccctgag cctgagccca ggcaaa                                696
<210>  57
<211>  696
<212>  DNA
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(696)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A18+LL
(т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L, P396L, V305I,
M428L и N434S)
<400>  57
gagcccaaga gctgcgacaa gacccacacc tgtccccctt gtcctgcccc tgaactgctg       60
ggcggaccta gcgtgttcct gctgccccca aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg      120
acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc      180
aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagccccc tgaggaacag      240
tacaacagca ccctgcgggt ggtgtccatc ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac      300
ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ctgcccccat cgagaaaacc      360
atcagcaagg ccaagggcca gccccgcgaa ccccaggtgt acacactgcc ccctagcagg      420
gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctcg tgaagggctt ctacccctcc      480
gatatcgccg tggaatggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc      540
ctggtgctgg acagcgacgg ctcattcttc ctgtacagca agctgacagt ggacaagagc      600
cggtggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgctgc acgaggccct gcactcccac      660
tacacccaga agtccctgag cctgagccca ggcaaa                                696
<210>  58
<211>  696
<212>  DNA
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(696)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A41+LL
(т.е. точечные мутации S298A, E333A, K334A, M428L и N434S)
<400>  58
gagcccaaga gctgcgacaa gacccacacc tgtccccctt gtcctgcccc tgaactgctg       60
ggcggaccta gcgtgttcct gttcccccca aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg      120
acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc      180
aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagcccag agaggaacag      240
tacaacgcca cctaccgggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac      300
ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ctgcccccat cgccgccacc      360
atcagcaagg ccaagggcca gccccgcgaa ccccaggtgt acacactgcc ccctagcagg      420
gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctcg tgaagggctt ctacccctcc      480
gatatcgccg tggaatggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc      540
cctgtgctgg acagcgacgg ctcattcttc ctgtacagca agctgacagt ggacaagagc      600
cggtggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgctgc acgaggccct gcactcccac      660
tacacccaga agtccctgag cctgagccca ggcaaa                                696
<210>  59
<211>  696
<212>  DNA
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(696)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A16_1 и LL
(т.е. точечные мутации S239D, F243L, R292P, Y300L, P396L, M428L
и N434S)
<400>  59
gagcccaaga gctgcgacaa gacccacacc tgtccccctt gtcctgcccc tgaactgctg       60
ggcggacctg acgtgttcct gctgccccca aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg      120
acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc      180
aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagccccc tgaggaacag      240
tacaacagca ccctgcgggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac      300
ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ctgcccccat cgagaaaacc      360
atcagcaagg ccaagggcca gccccgcgaa ccccaggtgt acacactgcc ccctagcagg      420
gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctcg tgaagggctt ctacccctcc      480
gatatcgccg tggaatggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc      540
ctggtgctgg acagcgacgg ctcattcttc ctgtacagca agctgacagt ggacaagagc      600
cggtggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgctgc acgaggccct gcactcccac      660
tacacccaga agtccctgag cctgagccca ggcaaa                                696
<210>  60
<211>  696
<212>  DNA
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(696)
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(696)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A16_2 и LL
(т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L, K322A, P396L, M428L
и N434S)
<400>  60
gagcccaaga gctgcgacaa gacccacacc tgtccccctt gtcctgcccc tgaactgctg       60
ggcggaccta gcgtgttcct gctgccccca aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg      120
acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc      180
aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagccccc tgaggaacag      240
tacaacagca ccctgcgggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac      300
ggcaaagagt acaagtgcgc agtgtccaac aaggccctgc ctgcccccat cgagaaaacc      360
atcagcaagg ccaagggcca gccccgcgaa ccccaggtgt acacactgcc ccctagcagg      420
gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctcg tgaagggctt ctacccctcc      480
gatatcgccg tggaatggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc      540
ctggtgctgg acagcgacgg ctcattcttc ctgtacagca agctgacagt ggacaagagc      600
cggtggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgctgc acgaggccct gcactcccac      660
tacacccaga agtccctgag cctgagccca ggcaaa                                696
<210>  61
<211>  696
<212>  DNA
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(696)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A16_3 и LL
(т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L, I332E, P396L, M428L и
N434S)
<400>  61
gagcccaaga gctgcgacaa gacccacacc tgtccccctt gtcctgcccc tgaactgctg       60
ggcggaccta gcgtgttcct gctgccccca aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg      120
acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc      180
aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagccccc tgaggaacag      240
tacaacagca ccctgcgggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac      300
ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ctgcccccga ggagaaaacc      360
atcagcaagg ccaagggcca gccccgcgaa ccccaggtgt acacactgcc ccctagcagg      420
gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctcg tgaagggctt ctacccctcc      480
gatatcgccg tggaatggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc      540
ctggtgctgg acagcgacgg ctcattcttc ctgtacagca agctgacagt ggacaagagc      600
cggtggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgctgc acgaggccct gcactcccac      660
tacacccaga agtccctgag cctgagccca ggcaaa                                696
<210>  62
<211>  696
<212>  DNA
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(696)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A16_4 и LL
(т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L, K322A, I332E, P396L,
M428L и N434S)
<400>  62
gagcctaaga gctgcgacaa gacccacacc tgtcctccat gtcctgctcc agaactgctc       60
ggcggacctt ccgtttttct gctgcctcct aagcctaagg acaccctgat gatctccaga      120
acacccgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aagatcctga agtgaagttc      180
aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga caaagcctcc tgaggaacag      240
tacaacagca ccctgagagt ggtgtccgtg ctgacagtgc tgcaccagga ttggctgaac      300
ggcaaagagt acaagtgcgc cgtgtccaac aaggccctgc cagctccaga ggaaaagacc      360
atctccaagg ccaagggcca gcctagagaa ccccaggtgt acacactgcc tccaagcaga      420
gatgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctgg tcaagggctt ctacccctcc      480
gatatcgccg tggaatggga gagcaatgga cagcccgaga acaactacaa gacaacccct      540
ctggtgctgg actccgacgg ctcattcttc ctgtactcca agctgaccgt ggacaagagc      600
agatggcagc agggcaacgt gttcagctgc tctgtgctgc acgaagccct gcacagccac      660
tacacccaga agtccctgtc tctgagccct ggaaaa                                696
<210>  63
<211>  696
<212>  DNA
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(696)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A16_5 и LL
(т.е. точечные мутации F243L, R292P, Y300L, E333A, K334A, P396L,
M428L и N434S)
<400>  63
gagcccaaga gctgcgacaa gacccacacc tgtccccctt gtcctgcccc tgaactgctg       60
ggcggaccta gcgtgttcct gctgccccca aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg      120
acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc      180
aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagccccc tgaggaacag      240
tacaacagca ccctgcgggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac      300
ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ctgcccccat cgccgccacc      360
atcagcaagg ccaagggcca gccccgcgaa ccccaggtgt acacactgcc ccctagcagg      420
gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctcg tgaagggctt ctacccctcc      480
gatatcgccg tggaatggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc      540
ctggtgctgg acagcgacgg ctcattcttc ctgtacagca agctgacagt ggacaagagc      600
cggtggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgctgc acgaggccct gcactcccac      660
tacacccaga agtccctgag cctgagccca ggcaaa                                696
<210>  64
<211>  696
<212>  DNA
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(696)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A16_6 и LL
(т.е. точечные мутации S239D, F243L, R292P, Y300L, K322A, I332E,
P396L, M428L и N434S)
<400>  64
gagcccaaga gctgcgacaa gacccacacc tgtccccctt gtcctgcccc tgaactgctg       60
ggcggacctg acgtgttcct gctgccccca aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg      120
acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc      180
aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagccccc tgaggaacag      240
tacaacagca ccctgcgggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac      300
ggcaaagagt acaagtgcgc agtgtccaac aaggccctgc ctgcccccga ggagaaaacc      360
atcagcaagg ccaagggcca gccccgcgaa ccccaggtgt acacactgcc ccctagcagg      420
gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctcg tgaagggctt ctacccctcc      480
gatatcgccg tggaatggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc      540
ctggtgctgg acagcgacgg ctcattcttc ctgtacagca agctgacagt ggacaagagc      600
cggtggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgctgc acgaggccct gcactcccac      660
tacacccaga agtccctgag cctgagccct ggaaaa                                696
<210>  65
<211>  696
<212>  DNA
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(696)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A41_1 и LL
(т.е. точечные мутации S239D, F243L, R292P, S298A, E333A, K334A,
M428L и N434S)
<400>  65
gagcccaaga gctgcgacaa gacccacacc tgtccccctt gtcctgcccc tgaactgctg       60
ggcggaccta gcgtgttcct gctgccccca aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg      120
acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc      180
aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagccccc tgaggaacag      240
tacaacgcca cctaccgggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac      300
ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ctgcccccat cgccgccacc      360
atcagcaagg ccaagggcca gccccgcgaa ccccaggtgt acacactgcc ccctagcagg      420
gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctcg tgaagggctt ctacccctcc      480
gatatcgccg tggaatggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc      540
cctgtgctgg acagcgacgg ctcattcttc ctgtacagca agctgacagt ggacaagagc      600
cggtggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgctgc acgaggccct gcactcccac      660
tacacccaga agtccctgag cctgagccct ggaaaa                                696
<210>  66
<211>  696
<212>  DNA
<213>  Human IgG1
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(696)
<223>  Fc-участок человеческого IgG1, несущий набор мутаций A41, A16 и LL
(т.е. точечные мутации F243L, R292P, S298A, E333A, K334A, M428L
и N434S)
<400>  66
gagcccaaga gctgcgacaa gacccacacc tgtccccctt gtcctgcccc tgaactgctg       60
ggcggaccta gcgtgttcct gctgccccca aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg      120
acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc      180
aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagccccc tgaggaacag      240
tacaacgcca cctaccgggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac      300
ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ctgcccccat cgccgccacc      360
atcagcaagg ccaagggcca gccccgcgaa ccccaggtgt acacactgcc ccctagcagg      420
gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctcg tgaagggctt ctacccctcc      480
gatatcgccg tggaatggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc      540
cctgtgctgg acagcgacgg ctcattcttc ctgtacagca agctgacagt ggacaagagc      600
cggtggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgctgc acgaggccct gcactcccac      660
tacacccaga agtccctgag cctgagccct ggaaaa                                696
<---