ГУМАНИЗИРОВАННОЕ ТАУ-АНТИТЕЛО
HUMANIZED TAU-ANTIBODY

Настоящее изобретение относится к способам и композициям для терапевтического и диагностического применения в лечении заболеваний и расстройств, которые вызваны нейрофибриллярными клубками или связаны с ними. В частности, настоящее изобретение относится к гуманизированным антителам, которые специфически распознают и связываются с фосфорилированными патологическими конформерами белка тау, а также к способам и композициям, содержащим указанные антитела, для терапевтического и диагностического применения в лечении таупатий, в том числе болезни Альцгеймера (AD).
Нейрофибриллярные клубки и нейропильные нити (NT) являются основными нейропатологическими признаками болезни Альцгеймера (AD). Они состоят из ассоциированного с микротрубочками белка тау, который претерпел посттрансляционные модификации, в том числе фосфорилирование, дезамидирование и изомеризацию аспарагинильных или аспартильных остатков. Они образуются посредством агрегации гиперфосфорилированного белка тау и его конформеров. Данная патология AD является общей для многих нейродегенеративных таупатий, в частности, для указанных типов лобно-височной деменции (FTD).
Белок тау представляет собой легкорастворимый, "нативно несвернутый" белок, который сильно связывается с микротрубочками (MT) с целью улучшения их сборки и стабильности. MT имеют большое значение для целостности цитоскелета нейронов и, тем самым - для надлежащего формирования и функционирования нейронных цепей, а значит и для обучения и памяти. Связывание тау с MT контролируют динамическим фосфорилированием и дефосфорилированием, что продемонстрировано в основном in vitro и в не-нейрональных клетках. В связи с большим количеством возможных участков фосфорилирования (>80) точный вклад каждого и идентичность ответственных киназ остаются в значительной степени неопределенными in vivo.
В головном мозге больных AD тау-патология развивается позже и, следовательно, возможно, в ответ на амилоидную патологию, которая определяет суть амилоидной каскадной гипотезы. Она основана на и определена посредством исследований пациентов с AD и синдромом Дауна, а также подтверждена посредством исследований на трансгенных мышах с комбинированной амилоидной и тау-патологией (Lewis с соавторами, 2001; Oddo с соавторами, 2004; Ribe с соавторами, 2005; Muyllaert с соавторами, 2006; 2008; Terwel с соавторами, 2008).
Точный временной паттерн обеих патологий у пациентов-людей с AD, а также механизмы, которые связывают амилоидную патологию с тау-патологией, остаются в значительной степени неизвестными, но предложены к включению активации нейрональных сигнальных путей, которые действуют на GSK3 и cdk5 или с помощью них в качестве основных "тау-киназ" (рассмотрены в публикации Muyllaert с соавторами, 2006, 2008).
Гипотеза о том, что таупатия является не безвредным побочным эффектом, а основным патологическим исполнителем в случае AD, основана на серьезных генетических, патологических и экспериментальных наблюдениях, которые полностью подтверждают друг друга:
- в семейных случаях AD с ранним началом, которые вызваны мутациями белка-предшественника амилоида (АРР) или пресенилина, обязательной патогенной причиной является накопление амилоида, но в любом случае данная патология включает коллатеральную таупатию, идентичную той, которая наблюдается в спорадических случаях AD с поздним началом;
- тяжесть когнитивной дисфункции и деменции коррелирует с таупатией, а не с амилоидной патологией, наиболее недавними примерами которой являются несколько фаз 1 и 2 клинических исследований, которые включают PIB-PET визуализацию амилоида и определяют многие "ложные результаты": когнитивно нормальные индивидуумы с высокой мозговой амилоидной нагрузкой;
- при семейной FTD таупатия провоцируется мутантным тау и непосредственно вызывает нейродегенерацию, без амилоидной патологии;
- в экспериментальных моделях мыши когнитивные расстройства, вызванные амилоидной патологией, почти полностью устранены в связи с отсутствием белка тау (Roberson с соавторами, 2007).
Совокупные аргументы поддерживают гипотезу о том, что белок тау является основным игроком в когнитивной смерти в случае AD и связанных с ней нейродегенеративных таупатий.
Значимое новое лечение AD представляет собой пассивную иммунотерапию с применением определенных mAb, чтобы очистить амилоидные пептиды и их агрегаты, которые считаются нейротоксичными или синаптотоксичными.
Предполагается, что направленная на тау-патологию иммунотерапия, как предложено в данном описании, противодействует патологическим конформерам белка тау, которые, как известно, вызывают или гипотетически вызывают синаптическую дисфункцию и нейродегенерацию. Предположительно обусловленные амилоидной патологией и внутринейрональные агрегаты гиперфосфорилированного белка тау действуют синергетически в когнитивном и дегенеративном каскаде патологических событий, которые ведут от умеренного когнитивного нарушения (MCI) к тяжелой деменции AD. В связи с этим комбинация направленного на тау лекарственного средства с направленным на амилоид (или любой другой) лекарственным средством будет представлять собой предпочтительное и, по сути, более эффективное лечение AD, в отличие от текущей монотерапии.
Другие терапевтические подходы, которые направлены на белок тау, являются немногочисленными и в основном включают:
- ингибиторы киназ, которые якобы увеличивают фосфорилирование тау до патологических уровней
- соединения, которые блокируют цитоплазматическую агрегацию гиперфосфорилированного белка тау.
Эти подходы имеют различные недостатки в специфичности и эффективности, эта проблема является общей для попыток модифицировать метаболизм АРР и амилоида, при этом подчеркивая важность постоянного поиска дополнительных вариантов лечения, в том числе иммунотерапии, направленной против тау.
Практически никаких усилий не было затрачено для того, чтобы определить - не говоря уже о направленности - патологические конформеры белка тау in vivo. Оказалось, что на фазе II клинического испытания Аβ42 патология клубков не была ни хорошо рассмотрена, ни тщательно проанализирована (Nicoll с соавторами, 2003; Masliah с соавторами, 2005). С другой стороны экспериментальная направленная на амилоид иммунотерапия в доклинической модели мыши с комбинированной AD-подобной патологией также продемонстрировала воздействие на тау-патологию, несмотря на то, что агрегаты тау сохранились (Oddo с соавторами, 2004).
Некоторые сомнения были отброшены в вопросе о целесообразности подхода к внутриклеточному белку тау посредством иммунотерапии. Им противопоставили самое последнее экспериментальное исследование в модели таупатий мыши (Asuni с соавторами, 2007). Они продемонстрировали снижение в патологии клубков и функциональные улучшения посредством вакцинации фосфопептидом, полученным из белка тау. Эти данные подтверждают предыдущие отчеты иммунотерапии, направленной на α-синуклеин, в моделях болезни Паркинсона (PD) и болезни телец Леви (Masliah с соавторами, 2005, 2011) и супероксиддисмутазы в модели бокового амиотрофического склероза (ALS) (Urushitiani с соавторами, 2007). Данные заболевания представляют собой примеры, в которых внутриклеточные белки приводят к синаптическим дефектам и нейродегенерации за счет механизмов, которые еще не полностью поняты. С другой стороны оказывается, что полноразмерный рекомбинантный белок тау, полученный в бактерии и выделенный из нее, не подходит в качестве вакцины, несмотря на то, что используемые адъюванты, то есть полный адъювант Фрейнда и коклюшный токсин, могут внести свой вклад в отрицательный результат данного исследования (Rosenmann с соавторами, 2006).
Эпитоп тау, который требует фосфорилирования Ser-409 (pS409), был использован в качестве маркера для участка фосфорилирования тау, который появляется на начальной стадии AD (Jicha с соавторами, 1999). Данное фосфорилирование является зависимым от протеинкиназы А (РКА) и предшествует или совпадает с начальными стадиями формирования парного спирального филамента (PHF), и с последующим распространением нейрофибриллярной патологии в пораженных нейронах в случаях AD на начальной стадии. В исследованиях механизма действия было также продемонстрировано, что pS409 является непосредственной детерминантой для олигомеризации тау, процесса, участвующего в сборке PHF и нейрофибриллярных клубков (Vanhelmont с соавторами, 2010; Alonso с соавторами, 2008). Кроме того, pS409 снизило способность тау связываться с микротрубочками (МТ), даже если он не является частью МТ-связывающего домена тау, демонстрируя, что фосфорилирование S409 также негативно влияет на взаимодействие микротрубочек с тау (Vandebroek с соавторами, 2006). Было продемонстрировано, что липосомальная вакцина, содержащая антигенный пептид тау 401-418 [pS404/pS409], индуцирует специфические антитела IgG у мышей C57BL/6 дикого типа и у тау-дефицитных мышей (Международная патентная заявка WO 2010/115843).
Длительная терапия у людей антителами грызунов приведет к антиглобулиновому иммунному ответу, который может быть детектирован почти на 8-12 день после введения и достигает пика почти на 20-30 день. Если такой антиглобулиновый ответ встречается, лечение должно быть прекращено после не более, чем около 10 дней, и повторная итерация лечения в более поздние сроки, как правило, исключается, потому что это приведет к новому и более быстрому началу вторичного антиглобулинового ответа. Несмотря на то, что антитела грызунов обладают общей значительной степенью консервативности последовательности с антителами человека, существует много различий в последовательности между антителами грызуна и человека, которые являются достаточными для того, чтобы антитела грызуна были иммуногенными для людей.
Данная проблема может быть решена посредством получения антител непосредственно в организме людей или посредством создания "человеческих", "гуманизированных" (также известных как "реконструированные" антитела) антител или антител "humaneered". Гуманизированные антитела обладают аминокислотными последовательностями вариабельной области, которая содержит CDR грызуна, сращенные с человеческими или человекоподобными каркасными последовательностями. Так как специфичность гуманизированного антитела обеспечивается за счет CDR, полученных из грызуна, их остатки должны быть использованы, по сути, без изменений, с допущением лишь незначительных модификаций, которые существенно не мешают аффинности и специфичности антитела для его целевого антигена. Каркасные остатки могут быть получены из любого примата или, в частности, из любой вариабельной области человека, или могут представлять собой их комбинацию, а полученная в результате сконструированная вариабельная область будет считаться реконструированной.
Чтобы максимизировать вероятность того, что аффинность будет сохранена в реконструированном антителе, важно сделать правильный выбор каркасной области. Известно, что каркасные последовательности служат для сохранения правильной ориентации CDR в пространстве для взаимодействия с антигеном, и что каркасные остатки даже иногда могут принимать участие в связывании антигена. Для того, чтобы сохранить аффинность антитела относительно его антигена, целесообразно выбирать каркасные последовательности человека, которые являются наиболее схожими с последовательностями каркасов грызуна. К тому же все еще может быть необходимо заменить одну или более аминокислот в каркасной последовательности человека соответствующим остатком в каркасе грызуна, чтобы избежать потерь в аффинности. Такой замене может помочь компьютерное моделирование.
Существует давно сложившаяся неудовлетворенная потребность в пассивных и/или активных иммунотерапиях у пациентов-людей, которые направлены на противодействие патологическим конформерам белков, которые, как известно, вызывают или предположительно вызывают нейродегенеративные расстройства, таким как амилоидные пептиды и их агрегаты в случае AD, а также внутринейрональные агрегаты гиперфосфорилированного белка тау, которые так же характерны для AD, как и амилоид.
Эта неудовлетворенная потребность была удовлетворена в пределах объема настоящего изобретения, которое обеспечивает новые способы и композиции, содержащие высоко специфические и высоко эффективные антитела, в частности, химерные антитела, в том числе их фрагменты, в частности, частично или полностью гуманизированные антитела, в том числе их фрагменты, обладающие способностью специфически распознавать и связываться с конкретными основными патологическими фосфоэпитопами белка тау. В частности, настоящее изобретение относится к специфическим антителам к линейным и конформационным, простым и сложным фосфоэпитопам на поверхности белка тау, в частности, на поверхности агрегированного белка тау, которые, как полагают, отвечают за синапто- и нейротоксичность в таупатиях, в том числе AD.
В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к антителу, в частности, к моноклональному антителу, в частности, к химерному антителу или его фрагменту, или к гуманизированному антителу или его фрагменту, которое распознает и связывается по меньшей мере с одним отдельным участком связывания на поверхности белка тау.
Данное антитело, в частности, моноклональное антитело, в частности, химерные или гуманизированные антитела, в соответствии с настоящим изобретением, как описано в различных вариантах реализации настоящего изобретения, распознает и специфически связывается с фосфоэпитопом на поверхности белка тау или на поверхности его фрагмента у млекопитающего, в частности, у человека, в частности, с фосфоэпитопом на поверхности агрегированного белка тау, в частности, с патологическим конформером белка тау, но не связывается с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или неродственными эпитопами, причем указанное антитело обладает высокой аффинностью связывания с растворимым и нерастворимым белком тау, и модулирует уровни растворимого и нерастворимого тау, в частности, в головном мозге, в частности, с
(a) константой диссоциации, равной по меньшей мере 100 нМ, в частности, по меньшей мере 80 нМ, в частности, по меньшей мере 70 нМ, в частности, по меньшей мере 50 нМ, в частности, по меньшей мере 10 нМ, в частности, по меньшей мере 8 нМ, в частности, по меньшей мере 5 нМ, в частности, по меньшей мере 2 нМ, в частности, по меньшей мере 1 нМ, в частности, по меньшей мере 500 пМ, в частности, по меньшей мере 400 пМ, в частности, по меньшей мере 300 пМ, в частности, по меньшей мере 200 пМ, в частности, по меньшей мере 100 пМ, в частности, по меньшей мере 50 пМ и/или
4
-1
-1
4
-1
-1
5
-1
-1
5
-1
-1
6
-1
-1
6
-1
-1
7
-1
-1
(b) константой скорости ассоциации, равной 10 MV или более, в частности, от 3-5×10 Мс или более, в частности, 10 Мс или более; в частности, 0,5-9×10 Mc или более; в частности, 10 Мс или более, в частности, 1-4×10Мс или более, в частности, 10 Mc или более.
5
-1
-1
5
-1
-1
5
-1
-1
5
-1
-1
5
-1
-1
6
-1
-1
В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к антителу, в частности, к моноклональному антителу, в частности, к химерному или гуманизированному антителу, в соответствии с настоящим изобретением, как описано в различных вариантах реализации настоящего изобретения, в которых антитело распознает и специфически связывается с фосфоэпитопом на поверхности белка тау или на поверхности его фрагмента у млекопитающего, в частности, у человека, в частности, с патологическим конформером белка тау, но в одном варианте реализации настоящего изобретения не связывается с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или неродственными эпитопами, причем указанное антитело обладает высокой аффинностью связывания с константой диссоциации, равной по меньшей мере 100 нМ и константой скорости ассоциации, равной 10 Мс или более, в частности, с константой диссоциации, равной по меньшей мере 80 нМ и константой скорости ассоциации, равной 10 Мс или более, в частности, с константой диссоциации, равной по меньшей мере 70 нМ и константой скорости ассоциации, равной 10 Mc или более, в частности, с константой диссоциации, равной по меньшей мере 10 нМ и константой скорости ассоциации, равной 10 Мс или более, в частности, с константой диссоциации, равной по меньшей мере 200 пМ и константой скорости ассоциации, равной 10 Мс или более, в частности, с константой диссоциации, равной по меньшей мере 100 пМ и константой скорости ассоциации, равной 10 Мс или более.
В различных вариантах реализации настоящего изобретения данное антитело, в частности, моноклональное антитело, в частности, химерное или гуманизированное антитело, в соответствии с настоящим изобретением, как описано в различных вариантах реализации настоящего изобретения, специфически распознает и связывается с фосфоэпитопом на поверхности белка тау у млекопитающего, в частности, у человека, в частности, ассоциированного с микротрубочками белка тау, в частности, агрегированного ассоциированного с микротрубочками и гиперфосфорилированного белка тау, такого, который присутствует в парных спиральных филаментах (PHF), которые являются преобладающими структурами в нейрофибриллярных клубках, нейропильных нитях и дистрофических нейритах, но в одном варианте реализации настоящего изобретения не связывается с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или неродственными эпитопами.
В конкретном варианте реализации настоящего изобретения белок тау человека представляет собой белок тау человека, как показано в SEQ ID NO: 19.
В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к антителу, в частности, к моноклональному антителу, в частности, к химерному антителу или его функциональному фрагменту, или к гуманизированному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к гуманизированному моноклональному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к антителу в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации настоящего изобретения, в котором антитело распознает и специфически связывается с фосфоэпитопом на поверхности белка тау у млекопитающего, в частности, у человека, как показано в SEQ ID NO: 19, или на поверхности его фрагмента, в частности, с патологическим конформером белка тау, но в одном варианте реализации настоящего изобретения не связывается с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или неродственными эпитопами, причем указанный эпитоп содержит аминокислотные остатки аа 404-411 белка тау человека, как показано в SEQ ID NO: 19, с необходимым фосфорилированным Серином в положении 409 (pS409).
В конкретном варианте реализации настоящее изобретение относится к антителу, в частности, к моноклональному антителу, в частности, к химерному антителу или его функциональному фрагменту, или к гуманизированному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к гуманизированному моноклональному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к антителу в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации настоящего изобретения, в котором антитело преимущественно распознает и связывается с некоторыми или всеми аминокислотными остатками тау, выбранными из группы, состоящей из Н407, pS409, N410 и V411, но, в частности, с pS409.
В другом конкретном варианте реализации настоящего изобретения указанное антитело или его фрагмент также распознает и связывается с остатком pS404, хотя и в меньшей степени. В частности, связывание с остатком pS404 составляет около 10%, в частности, около 20%, в частности, около 30% связывания с остатком pS409.
В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к антителу, в частности, к моноклональному антителу, в частности, к химерному антителу или его функциональному фрагменту, или к гуманизированному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к гуманизированному моноклональному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к антителу в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации настоящего изобретения, в котором антитело распознает и специфически связывается с фосфоэпитопом на поверхности белка тау у млекопитающего, в частности, у человека, как показано в SEQ ID NO: 19, или на поверхности его фрагмента, в частности, с патологическим конформером белка тау, но в одном варианте реализации настоящего изобретения не связывается с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или неродственными эпитопами, причем указанный эпитоп содержит аминокислотные остатки аа 405-411 белка тау человека, как показано в SEQ ID NO: 19, содержащей фосфорилированный Серии (Ser) в положении 409 (pS409) и, причем указанное антитело или его функциональный фрагмент предпочтительно распознает и связывается с некоторыми или всеми аминокислотными остатками тау, выбранными из группы, состоящей из Н407, pS409, N410 и V411, но, в частности, с pS409.
В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к химерному антителу или его функциональному фрагменту, или к гуманизированному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к гуманизированному моноклональному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к гуманизированному антителу в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации настоящего изобретения, в котором антитело распознает и специфически связывается с фосфоэпитопом на поверхности белка тау или на поверхности его фрагмента у млекопитающего, в частности, у человека, в частности, с патологическим конформером белка тау, но в одном варианте реализации настоящего изобретения не связывается с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или неродственными эпитопами, причем указанное связывающее антитело содержит первый домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Тяжелой Цепи (HCVR), который содержит интегрированные последовательно в каркасные области, полученные у человека или приматов, CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 1, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 2, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 3, или с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, в частности, по меньшей мере на 85%, в частности, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, в частности, по меньшей мере на 95%, в частности, по меньшей мере на 96%, в частности, по меньшей мере на 97%, в частности, по меньшей мере на 98%, в частности, по меньшей мере на 99% или 100% идентичной указанным, и/или второй домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Легкой Цепи (LCVR), который содержит интегрированные последовательно в каркасные области, полученные у человека или приматов, CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 10, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 5, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 6, или с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, в частности, по меньшей мере на 85%, в частности, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, в частности, по меньшей мере на 95%, в частности, по меньшей мере на 96%, в частности, по меньшей мере на 97%, в частности, по меньшей мере на 98%, в частности, по меньшей мере на 99% или 100% идентичной указанным.
Один вариант реализации настоящего изобретения относится к химерному антителу или его функциональному фрагменту, или к гуманизированному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к гуманизированному моноклональному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к гуманизированному антителу в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации настоящего изобретения, в котором антитело распознает и специфически связывается с фосфоэпитопом на поверхности белка тау или на поверхности его фрагмента у млекопитающего, в частности, у человека, в частности, с патологическим конформером белка тау, но в одном варианте реализации настоящего изобретения не связывается с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или неродственными эпитопами, причем указанное связывающее антитело содержит первый домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Тяжелой Цепи (HCVR), который содержит интегрированные последовательно в каркасные области, полученные у человека или приматов, CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 1, или с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, в частности, по меньшей мере на 85%, в частности, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, в частности, по меньшей мере на 95%, в частности, по меньшей мере на 96%, в частности, по меньшей мере на 97%, в частности, по меньшей мере на 98%, в частности, по меньшей мере на 99% или 100% идентичной указанной, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 2, или с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, в частности, по меньшей мере на 85%, в частности, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, в частности, по меньшей мере на 95%, в частности, по меньшей мере на 96%, в частности, по меньшей мере на 97%, в частности, по меньшей мере на 98%, в частности, по меньшей мере на 99% или 100% идентичной указанной, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 3, или с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, в частности, по меньшей мере на 85%, в частности, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, в частности, по меньшей мере на 95%, в частности, по меньшей мере на 96%, в частности, по меньшей мере на 97%, в частности, по меньшей мере на 98%, в частности, по меньшей мере на 99% или 100% идентичной указанной, и/или второй домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Легкой Цепи (LCVR), который содержит интегрированные последовательно в каркасные области, полученные у человека или приматов, CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 10, или с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, в частности, по меньшей мере на 85%, в частности, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, в частности, по меньшей мере на 95%, в частности, по меньшей мере на 96%, в частности, по меньшей мере на 97%, в частности, по меньшей мере на 98%, в частности, по меньшей мере на 99% или 100% идентичной указанным, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 5, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 6, или с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, в частности, по меньшей мере на 85%, в частности, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, в частности, по меньшей мере на 95%, в частности, по меньшей мере на 96%, в частности, по меньшей мере на 97%, в частности, по меньшей мере на 98%, в частности, по меньшей мере на 99% или 100% идентичной указанным.
В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к химерному антителу или его функциональному фрагменту, или к гуманизированному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к гуманизированному моноклональному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к гуманизированному антителу в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации настоящего изобретения, в котором антитело распознает и специфически связывается с фосфоэпитопом на поверхности белка тау или на поверхности его фрагмента у млекопитающего, в частности, у человека, в частности, с патологическим конформером белка тау, но в одном варианте реализации настоящего изобретения не связывается с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или неродственными эпитопами, причем указанное связывающее антитело содержит первый домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Тяжелой Цепи (HCVR), который содержит интегрированные последовательно в каркасные области, полученные у человека или приматов, CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 1, или с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 81%, в частности, по меньшей мере на 85%, в частности, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, в частности, по меньшей мере на 95%, в частности, по меньшей мере на 96%, в частности, по меньшей мере на 97%, в частности, по меньшей мере на 98%, в частности, по меньшей мере на 99% или 100% идентичной указанной, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 2, или с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 8%, в частности, по меньшей мере на 85%, в частности, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, в частности, по меньшей мере на 95%, в частности, по меньшей мере на 96%, в частности, по меньшей мере на 97%, в частности, по меньшей мере на 98%, в частности, по меньшей мере на 99% или 100% идентичной указанной, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 3, или с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, в частности, по меньшей мере на 85%, в частности, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, в частности, по меньшей мере на 95%, в частности, по меньшей мере на 96%, в частности, по меньшей мере на 97%, в частности, по меньшей мере на 98%, в частности, по меньшей мере на 99% или 100% идентичной указанной, и/или второй домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Легкой Цепи (LCVR), который содержит интегрированные последовательно в каркасные области, полученные у человека или приматов, CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 10, или с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 82%, в частности, по меньшей мере на 85%, в частности, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, в частности, по меньшей мере на 95%, в частности, по меньшей мере на 96%, в частности, по меньшей мере на 97%, в частности, по меньшей мере на 98%, в частности, по меньшей мере на 99% или 100% идентичной указанным, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 5, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 6, или с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 68%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, в частности, по меньшей мере на 85%, в частности, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, в частности, по меньшей мере на 95%, в частности, по меньшей мере на 96%, в частности, по меньшей мере на 97%, в частности, по меньшей мере на 98%, в частности, по меньшей мере на 99% или 100% идентичной указанным.
В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к химерному антителу или его функциональному фрагменту, или к гуманизированному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к гуманизированному моноклональному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к гуманизированному антителу в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации настоящего изобретения, в котором антитело распознает и специфически связывается с фосфоэпитопом на поверхности белка тау или на поверхности его фрагмента у млекопитающего, в частности, у человека, в частности, с патологическим конформером белка тау, но в одном варианте реализации настоящего изобретения не связывается с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или неродственными эпитопами, причем указанное связывающее антитело содержит первый домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Тяжелой Цепи (HCVR), который содержит интегрированные последовательно в каркасные области, полученные у человека или приматов, CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 1, или с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 85% идентичной указанной, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 2, или с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 75% идентичной указанной, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 3 или с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 20% идентичной указанной, и/или второй домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Легкой Цепи (LCVR), который содержит интегрированные последовательно в каркасные области, полученные у человека или приматов, CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 10, или с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 85% идентичной указанным, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 5, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 6, или с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 70% идентичной указанным.
В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к химерному антителу или его функциональному фрагменту, или к гуманизированному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к гуманизированному моноклональному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к гуманизированному антителу в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации настоящего изобретения, в котором антитело распознает и специфически связывается с фосфоэпитопом на поверхности белка тау или на поверхности его фрагмента у млекопитающего, в частности, у человека, в частности, с патологическим конформером белка тау, но в одном варианте реализации настоящего изобретения не связывается с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или неродственными эпитопами, причем указанное связывающее антитело содержит первый домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Тяжелой Цепи (HCVR), который содержит интегрированные последовательно в каркасные области, полученные у человека или приматов, CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 1, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 2, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 3, или с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 90% идентичной указанным, и/или второй домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Легкой Цепи (LCVR), который содержит интегрированные последовательно в каркасные области, полученные у человека или приматов, CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 10, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 5, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 6, или с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 90% идентичной указанным.
В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к химерному антителу или его функциональному фрагменту, или к гуманизированному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к гуманизированному моноклональному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к гуманизированному антителу в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации настоящего изобретения, в котором антитело распознает и специфически связывается с фосфоэпитопом на поверхности белка тау или на поверхности его фрагмента у млекопитающего, в частности, у человека, в частности, с патологическим конформером белка тау, но в одном варианте реализации настоящего изобретения не связывается с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или неродственными эпитопами, причем указанное связывающее антитело содержит первый домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Тяжелой Цепи (HCVR), который содержит интегрированные последовательно в каркасные области, полученные у человека или приматов, CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 1, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 2, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 3, или с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 95% идентичной указанным, и/или второй домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Легкой Цепи (LCVR), который содержит интегрированные последовательно в каркасные области, полученные у человека или приматов, CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 10, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 5, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 6, или с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 95% идентичной указанным.
В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к химерному антителу или его функциональному фрагменту, или к гуманизированному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к гуманизированному моноклональному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к гуманизированному антителу в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации настоящего изобретения, в котором антитело распознает и специфически связывается с фосфоэпитопом на поверхности белка тау или на поверхности его фрагмента у млекопитающего, в частности, у человека, в частности, с патологическим конформером белка тау, но в одном варианте реализации настоящего изобретения не связывается с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или неродственными эпитопами, причем указанное связывающее антитело содержит первый домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Тяжелой Цепи (HCVR), который содержит интегрированные последовательно в каркасные области, полученные у человека или приматов, CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 1, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 2, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 3, или с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 98% идентичной указанным, и/или второй домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Легкой Цепи (LCVR), который содержит интегрированные последовательно в каркасные области, полученные у человека или приматов, CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 10, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 5, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 6, или с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 98% идентичной указанным.
В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к химерному антителу или его функциональному фрагменту, или к гуманизированному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к гуманизированному моноклональному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к гуманизированному антителу в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации настоящего изобретения, в котором антитело распознает и специфически связывается с фосфоэпитопом на поверхности белка тау или на поверхности его фрагмента у млекопитающего, в частности, у человека, в частности, с патологическим конформером белка тау, но в одном варианте реализации настоящего изобретения не связывается с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или неродственными эпитопами, причем указанное связывающее антитело содержит первый домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Тяжелой Цепи (HCVR), который содержит интегрированные последовательно в каркасные области, полученные у человека или приматов, CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 1, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 2, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 3, и/или второй домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Легкой Цепи (LCVR), который содержит интегрированные последовательно в каркасные области, полученные у человека или приматов, CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 4, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 5, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 6.
В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к химерному антителу или его функциональному фрагменту, или к гуманизированному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к гуманизированному моноклональному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к гуманизированному антителу в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации настоящего изобретения, в котором антитело распознает и специфически связывается с фосфоэпитопом на поверхности белка тау или на поверхности его фрагмента у млекопитающего, в частности, у человека, в частности, с патологическим конформером белка тау, но в одном варианте реализации настоящего изобретения не связывается с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или неродственными эпитопами, причем указанное связывающее антитело содержит первый домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Тяжелой Цепи (HCVR), который содержит интегрированные последовательно в каркасные области, полученные у человека или приматов, CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 1, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 2, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 3, и/или второй домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Легкой Цепи (LCVR), который содержит интегрированные последовательно в каркасные области, полученные у человека или приматов, CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 10, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 5, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 6. Настоящее изобретение дополнительно относится к химерному антителу или его функциональному фрагменту, или к гуманизированному антителу или его фрагменту, которое содержит интегрированные в каркасные области, полученные у человека или приматов, по меньшей мере два пептида, в частности, по меньшей мере три пептида, в частности, по меньшей мере четыре пептида, в частности, по меньшей мере пять пептидов, в частности, шесть пептидов, пептиды которого являются разными и представляют аминокислотную последовательность, выбранную из группы последовательностей, состоящей из SEQ ID NO: 1, представляющей CDR1, SEQ ID NO: 2, представляющей CDR2, и SEQ ID NO: 3, представляющей GDR3 Вариабельной Области Тяжелой Цепи (HCVR), и SEQ ID NO: 4, представляющей CDR1, SEQ ID NO: 5, представляющей CDR2, и SEQ ID NO: 6, представляющей CDR3 Вариабельной Области Легкой Цепи (LCVR), причем один и тот же CDR не может присутствовать в антителе дважды.
Настоящее изобретение дополнительно относится к химерному антителу или его функциональному фрагменту, или к гуманизированному антителу или его фрагменту, которое содержит интегрированные в каркасные области, полученные у человека или приматов, по меньшей мере два пептида, в частности, по меньшей мере три пептида, в частности, по меньшей мере четыре пептида, в частности, по меньшей мере пять пептидов, в частности, шесть пептидов, пептиды которого являются разными и представляют аминокислотную последовательность, выбранную из группы последовательностей, состоящей из SEQ ID NO: 1, представляющей CDR1, SEQ ID NO: 2, представляющей CDR2, и SEQ ID NO: 3, представляющей CDR3 Вариабельной Области Тяжелой Цепи (HCVR), и SEQ ID NO: 10, представляющей CDR1, SEQ ID NO: 5, представляющей CDR2, и SEQ ID NO: 6, представляющей CDR3 Вариабельной Области Легкой Цепи (LCVR), причем один и тот же CDR не может присутствовать в антителе дважды.
В конкретном варианте реализации настоящее изобретение относится к химерному антителу или его функциональному фрагменту, или к гуманизированному антителу или его фрагменту, которое содержит интегрированные в каркасные области, полученные у человека или приматов, пептиды с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, представляющей CDRI, SEQ ID NO: 2, представляющей CDR2, и SEQ ID NO: 3, представляющей CDR3 Вариабельной Области Тяжелой Цепи (HCVR), и SEQ ID NO: 4, представляющей CDR1, SEQ ID NO: 5, представляющей CDR2, и SEQ ID NO: 6, представляющей CDR3 Вариабельной Области Легкой Цепи (LCVR).
В конкретном варианте реализации настоящее изобретение относится к химерному антителу или его функциональному фрагменту, или к гуманизированному антителу или его фрагменту, которое содержит интегрированные в каркасные области, полученные у человека или приматов, пептиды с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, представляющей CDR1, SEQ ID NO: 2, представляющей CDR2, и SEQ ID NO: 3, представляющей CDR3 Вариабельной Области Тяжелой Цепи (HCVR), и SEQ ID NO: 10, представляющей CDR1, SEQ ID NO: 5, представляющей CDR2, и SEQ ID NO: 6, представляющей CDR3 Вариабельной Области Легкой Цепи (LCVR). В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к гуманизированному моноклональному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к гуманизированному антителу в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации настоящего изобретения, в котором антитело распознает и специфически связывается с фосфоэпитопом на поверхности белка тау или на поверхности его фрагмента у млекопитающего, в частности, у человека, в частности, с патологическим конформером белка тау, но в одном варианте реализации настоящего изобретения не связывается с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или неродственными эпитопами, причем указанное антитело или фрагмент антитела содержит
а. первый домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Тяжелой Цепи (HCVR), который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере с 84%, в частности, по меньшей мере с 85%, по меньшей мере с 86%, по меньшей мере с 87%, по меньшей мере с 88%, по меньшей мере с 89%, в частности, по меньшей мере с 90%, по меньшей мере с 91%, по меньшей мере с 92%, по меньшей мере с 93%, по меньшей мере с 94%, в частности, по меньшей мере с 95%, в частности, по меньшей мере с 96%, в частности, по меньшей мере с 97%, в частности, по меньшей мере с 98%, в частности, по меньшей мере с 99% или 100% идентичностью по отношению к последовательности, показанной в SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21, и/или второй домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Легкой Цепи (LCVR), который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере с 89%, в частности, по меньшей мере с 90%, в частности, по меньшей мере с 91%, по меньшей мере с 92%, по меньшей мере с 93%, по меньшей мере с 94%, в частности, по меньшей мере с 95%, в частности, по меньшей мере с 96%, в частности, по меньшей мере с 97%, в частности, по меньшей мере с 98%, в частности, по меньшей мере с 99% или 100% идентичностью по отношению к последовательности, показанной в SEQ ID NO: 8; или
b. первый домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Тяжелой Цепи (HCVR), который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере с 84%, в частности, по меньшей мере с 85%, по меньшей мере с 86%, по меньшей мере с 87%, по меньшей мере с 88%, по меньшей мере с 89%, в частности, по меньшей мере с 90%, по меньшей мере с 91%, по меньшей мере с 92%, по меньшей мере с 93%, по меньшей мере с 94%, в частности, по меньшей мере с 95%, в частности, по меньшей мере с 96%, в частности, по меньшей мере с 97%, в частности, по меньшей мере с 98%, в частности, по меньшей мере с 99% или 100% идентичностью по отношению к последовательности, показанной в SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21, и/или второй домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Легкой Цепи (LCVR), который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере с 90%, по меньшей мере с 91%, по меньшей мере с 92%, по меньшей мере с 93%, по меньшей мере с 94%, в частности, по меньшей мере с 95%, в частности, по меньшей мере с 96%, в частности, по меньшей мере с 97%, в частности, по меньшей мере с 98%, в частности, по меньшей мере с 99% или 100% идентичностью по отношению к последовательности, показанной в SEQ ID NO: 9.
В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к гуманизированному моноклональному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к гуманизированному антителу в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации настоящего изобретения, в котором антитело распознает и специфически связывается с фосфоэпитопом на поверхности белка тау или на поверхности его фрагмента у млекопитающего, в частности, у человека, в частности, с патологическим конформером белка тау, но в одном варианте реализации настоящего изобретения не связывается с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или неродственными эпитопами, причем связывающее антитело содержит
a. первый домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Тяжелой Цепи (HCVR), который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере с 84% идентичностью по отношению к последовательности, показанной в SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21, и/или второй домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Легкой Цепи (LCVR), который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере с 89% идентичностью по отношению к последовательности, показанной в SEQ ID NO: 8; или
b. первый домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Тяжелой Цепи (HCVR), который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере с 84% идентичностью по отношению к последовательности, показанной в SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21, и/или второй домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Легкой Цепи (LCVR), который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере с 90% идентичностью по отношению к последовательности, показанной в SEQ ID NO: 9.
В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к гуманизированному моноклональному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к гуманизированному антителу в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации настоящего изобретения, в котором антитело распознает и специфически связывается с фосфоэпитопом на поверхности белка тау или на поверхности его фрагмента у млекопитающего, в частности, у человека, в частности, с патологическим конформером белка тау, но в одном варианте реализации настоящего изобретения не связывается с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или неродственными эпитопами, причем связывающее антитело содержит
а. первый домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Тяжелой Цепи (HCVR), который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере с 90% идентичностью по отношению к последовательности, показанной в SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21, и/или второй домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Легкой Цепи (LCVR), который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере с 90% идентичностью по отношению к последовательности, показанной в SEQ ID NO: 8; или
b. первый домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Тяжелой Цепи (HCVR), который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере с 90% идентичностью по отношению к последовательности, показанной в SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21, и/или второй домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Легкой Цепи (LCVR), который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере с 90% идентичностью по отношению к последовательности, показанной в SEQ ID NO: 9.
В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к гуманизированному моноклональному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к гуманизированному антителу в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации настоящего изобретения, в котором антитело распознает и специфически связывается с фосфоэпитопом на поверхности белка тау или на поверхности его фрагмента у млекопитающего, в частности, у человека, в частности, с патологическим конформером белка тау, но в одном варианте реализации настоящего изобретения не связывается с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или неродственными эпитопами, причем связывающее антитело содержит
a. первый домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Тяжелой Цепи (HCVR), который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере с 95% идентичностью по отношению к последовательности, показанной в SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21, и/или второй домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Легкой Цепи (LCVR), который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере с 95% идентичностью по отношению к последовательности, показанной в SEQ ID NO: 8; или
b. первый домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Тяжелой Цепи (HCVR), который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере с 95% идентичностью по отношению к последовательности, показанной в SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21, и/или второй домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Легкой Цепи (LCVR), который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере с 95% идентичностью по отношению к последовательности, показанной в SEQ ID NO: 9.
В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к гуманизированному моноклональному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к гуманизированному антителу в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации настоящего изобретения, в котором антитело распознает и специфически связывается с фосфоэпитопом на поверхности белка тау или на поверхности его фрагмента у млекопитающего, в частности, у человека, в частности, с патологическим конформером белка тау, но в одном варианте реализации настоящего изобретения не связывается с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или неродственными эпитопами, причем связывающее антитело содержит
a. первый домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Тяжелой Цепи (HCVR), который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21, и/или второй домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Легкой Цепи (LCVR), который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 8; или
b. первый домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Тяжелой Цепи (HCVR), который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21, и/или второй домен связывания, в частности, домен связывания Вариабельной Области Легкой Цепи (LCVR), который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 9.
В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к гуманизированному моноклональному антителу или его функциональному фрагменту, в частности, к гуманизированному антителу в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации настоящего изобретения, в котором антитело распознает и специфически связывается с фосфоэпитопом на поверхности белка тау или на поверхности его фрагмента у млекопитающего, в частности, у человека, в частности, с патологическим конформером белка тау, но в одном варианте реализации настоящего изобретения не связывается с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или неродственными эпитопами, в котором антитело дополнительно содержит константную область тяжелой цепи и константную область легкой цепи, в частности, константную область тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 14-17, и константную область легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 18.
В одном варианте реализации изобретения указанное гуманизированное антитело или его функциональный фрагмент в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения содержит константную область тяжелой цепи с мутацией в шарнирном участке, в частности, с мутацией в шарнирном участке, который предотвращает обмен фрагментами Fab и, таким образом, получение биспецифических антител. В конкретном варианте реализации изобретения шарнирный участок тяжелой цепи содержит замену Ser на Pro в положении 228 (S228P).
В одном варианте реализации изобретения указанное гуманизированное антитело или его функциональный фрагмент в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения содержит константную область тяжелой цепи с модификацией (например, делецией или мутацией) на С-конце. В конкретном варианте реализации изобретения тяжелая цепь содержит делецию С-концевого лизина (des-K). Данный С-концевой лизин (остаток 447 в соответствии с системой нумерации EU) Fc области константной области может быть удален, например, во время очистки антитела или посредством рекомбинантного конструирования нуклеиновой кислоты, кодирующей данное антитело. Такая мутация предотвращает случайное ферментативное расщепление С-концевого лизина антителообразующими клетками, такими как, например, клетки СНО.
В другом варианте реализации изобретения указанное гуманизированное антитело или его функциональный фрагмент в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения содержит константную область тяжелой цепи без модификации (например, делеции или мутации) на С-конце. В конкретном варианте реализации изобретения константная область тяжелой цепи содержит С-концевой лизин (лизин, находящийся на С-конце константной области тяжелой цепи). Таким образом, антитело в соответствии с настоящим изобретением может включать антитело с удаленным К447, со всеми удаленными К447, или смесь антител с остатком К447 и без него.
В одном варианте реализации настоящего изобретения связывающий пептид в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения представляет собой антитело, в частности, антитело изотипа IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, в частности, поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или полностью человеческое антитело. В одном варианте реализации настоящего изобретения связывающий пептид в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения представляет собой антитело, в частности, антитело изотипа IgG1 N297G с заменой аспарагина на глицин в положении 297 (система нумерации EU) в Fc области антитела, в частности, поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или полностью человеческое антитело.
Один вариант реализации изобретения относится к полинуклеотиду, кодирующему связывающий пептид в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения.
В одном варианте реализации изобретения указанный полинуклеотид содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область антитела, содержащую SEQ ID NO: 1-3, представляющие определяющие комплементарность области (CDR) 1, 2 и 3 Вариабельной Области Тяжелой Цепи (HCVR).
В другом варианте реализации изобретения указанный полинуклеотид содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область антитела, содержащую SEQ ID NO: 4-6, представляющие определяющие комплементарность области (CDR) 1, 2 и 3 Вариабельной Области Легкой Цепи (LCVR).
В другом варианте реализации изобретения указанный полинуклеотид содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область антитела, содержащую SEQ ID NO: 10, 5 и 6, представляющие определяющие комплементарность области (CDR) 1, 2 и 3 Вариабельной Области Легкой Цепи (LCVR).
В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из
a. молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, как показано в SEQ ID NO: 11, и/или нуклеотидную последовательность, как показано в SEQ ID NO: 12; или
b. молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность по меньшей мере с 85% идентичностью последовательности по отношению к последовательности, показанной в SEQ ID NO: 11, и/или нуклеотидную последовательность по меньшей мере с 85% идентичностью последовательности по отношению к последовательности, показанной в SEQ ID NO: 12; или
c. молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность по меньшей мере с 90% идентичностью последовательности по отношению к последовательности, показанной в SEQ ID NO: 11, и/или нуклеотидную последовательность по меньшей мере с 90% идентичностью последовательности по отношению к последовательности, показанной в SEQ ID NO: 12; или
d. молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность по меньшей мере с 95% идентичностью последовательности по отношению к последовательности, показанной в SEQ ID NO: 11, и/или нуклеотидную последовательность по меньшей мере с 95% идентичностью последовательности по отношению к последовательности, показанной в SEQ ID NO: 12; или
e. молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность по меньшей мере с 98% идентичностью последовательности по отношению к последовательности, показанной в SEQ ID NO: 11, и/или нуклеотидную последовательность по меньшей мере с 98% идентичностью последовательности по отношению к последовательности, показанной в SEQ ID NO: 12; или
f. молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, комплементарная цепь которой гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты в соответствии с любым из а)-е);
g. молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, которая отклоняется от нуклеотидной последовательности, определенной в любом из а)-f) в силу вырожденности генетического кода.
В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из
a. молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, как показано в SEQ ID NO: 11, и/или нуклеотидную последовательность, как показано в SEQ ID NO: 13; или
b. молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность по меньшей мере с 85% идентичностью последовательности по отношению к последовательности, показанной в SEQ ID NO: 11, и/или нуклеотидную последовательность по меньшей мере с 85% идентичностью последовательности по отношению к последовательности, показанной в SEQ ID NO: 13; или
c. молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность по меньшей мере с 90% идентичностью последовательности по отношению к последовательности, показанной в SEQ ID NO: 11, и/или нуклеотидную последовательность по меньшей мере с 90% идентичностью последовательности по отношению к последовательности, показанной в SEQ ID NO: 13; или
d. молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность по меньшей мере с 95% идентичностью последовательности по отношению к последовательности, показанной в SEQ ID NO: 11, и/или нуклеотидную последовательность по меньшей мере с 95% идентичностью последовательности по отношению к последовательности, показанной в SEQ ID NO: 13; или
e. молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность по меньшей мере с 98% идентичностью последовательности по отношению к последовательности, показанной в SEQ ID NO: 11, и/или нуклеотидную последовательность по меньшей мере с 98% идентичностью последовательности по отношению к последовательности, показанной в SEQ ID NO: 13; или
f. молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, комплементарная цепь которой гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты в соответствии с любым из а)-е);
g. молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, которая отклоняется от нуклеотидной последовательности, определенной в любом из а)-f) в силу вырожденности генетического кода.
В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, как показано в SEQ ID NO: 11, и/или нуклеотидную последовательность, как показано в SEQ ID NO: 12.
В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, как показано в SEQ ID NO: 11, и/или нуклеотидную последовательность, как показано в SEQ ID NO: 13.
Настоящее изобретение дополнительно относится к гуманизированному антителу или его фрагменту, который содержит Вариабельную Область Тяжелой Цепи (HCVR) SEQ ID NO: 7 и константную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 14-17.
Настоящее изобретение дополнительно относится к гуманизированному антителу или его фрагменту, который содержит Вариабельную Область Тяжелой Цепи (HCVR) SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21.
Настоящее изобретение дополнительно относится к гуманизированному антителу или его фрагменту, который содержит Вариабельную Область Тяжелой Цепи (HCVR) SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21 и константную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 14-17.
Настоящее изобретение дополнительно относится к гуманизированному антителу или его фрагменту, который содержит Тяжелую Цепь SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 или SEQ ID NO: 31.
Настоящее изобретение дополнительно относится к гуманизированному антителу или его фрагменту, который содержит Вариабельную Область Легкой Цепи (LCVR) SEQ ID NO: 8 и константную область легкой цепи SEQ ID NO: 18.
Настоящее изобретение дополнительно относится к гуманизированному антителу или его фрагменту, который содержит Вариабельную Область Легкой Цепи (LCVR) SEQ ID NO: 9 и константную область легкой цепи SEQ ID NO: 18.
Настоящее изобретение дополнительно относится к гуманизированному антителу или его фрагменту, который содержит Легкую Цепь SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 23.
Настоящее изобретение дополнительно относится к гуманизированному антителу или его фрагменту, который содержит Тяжелую Цепь SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 или SEQ ID NO: 31 и Легкую Цепь SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 23.
Настоящее изобретение дополнительно относится к гуманизированному антителу или его фрагменту, который содержит Вариабельную Область Тяжелой Цепи (HCVR) SEQ ID NO: 7 и константную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 14-17, и Вариабельную Область Легкой Цепи (LCVR) SEQ ID NO: 8, и константную область легкой цепи SEQ ID NO: 18.
Настоящее изобретение дополнительно относится к гуманизированному антителу или его фрагменту, который содержит Вариабельную Область Тяжелой Цепи (HCVR) SEQ ID NO: 7 и константную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 14-17, и Вариабельную Область Легкой Цепи (LCVR) SEQ ID NO: 9, и константную область легкой цепи SEQ ID NO: 18.
Настоящее изобретение дополнительно относится к гуманизированному антителу или его фрагменту, который содержит Вариабельную Область Тяжелой Цепи (HCVR) SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21 и константную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 14-17, и Вариабельную Область Легкой Цепи (LCVR) SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9, и константную область легкой цепи SEQ ID NO: 18.
В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему гуманизированные антитела в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения.
Химерные или гуманизированные антитела в соответствии с настоящим изобретением, как описано в различных вариантах реализации настоящего изобретения, распознают и специфически связываются с фосфоэпитопом на поверхности белка тау или на поверхности его фрагмента у млекопитающего, в частности, у человека, в частности, с фосфоэпитопом на поверхности агрегированного белка тау, в частности, с патологическим конформером белка тау, но не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или неродственными эпитопами, причем указанные антитела обладают высокой аффинностью связывания с растворимым и нерастворимым белком тау, и модулируют уровни растворимого и нерастворимого тау, в частности, в головном мозге, в частности, с
(c) константой диссоциации, равной по меньшей мере 100 нМ, в частности, по меньшей мере 80 нМ, в частности, по меньшей мере 70 нМ, в частности, по меньшей мере 50 нМ, в частности, по меньшей мере 10 нМ, в частности, по меньшей мере 8 нМ, в частности, по меньшей мере 5 нМ, в частности, по меньшей мере 2 нМ, в частности, по меньшей мере 1 нМ, в частности, по меньшей мере 500 пМ, в частности, по меньшей мере 400 пМ, в частности, по меньшей мере 300 пМ, в частности, по меньшей мере 200 пМ, в частности, по меньшей мере 100 пМ, в частности, по меньшей мере 50 пМ и/или
4
-1
-1
4
-1
-1
5
-1
-1
5
-1
-1
6
-1
-1
6
-1
-1
7
-1
-1
(d) константой скорости ассоциации, равной 10 Mc или более, в частности, от 3-5×10 Mc или более, в частности, 10 Мс или более; в частности, 0,5-9×10 Mc или более; в частности, 10 Мс или более, в частности, 1-4×10Mc или более, в частности, 10 Мс или более.
5
-1
-1
5
-1
-1
5
-1
-1
5
-1
-1
5
-1
-1
6
-1
-1
В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к химерному или гуманизированному антителу в соответствии с настоящим изобретением, как описано в различных вариантах реализации настоящего изобретения, в которых антитела распознают и специфически связываются с фосфоэпитопом на поверхности белка тау или на поверхности его фрагмента у млекопитающего, в частности, у человека, в частности, с патологическим конформером белка тау, но в одном варианте реализации настоящего изобретения не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или неродственными эпитопами, причем указанные антитела обладают высокой аффинностью связывания с константой диссоциации, равной по меньшей мере 100 нМ и константой скорости ассоциации, равной 10 Мс или более, в частности, с константой диссоциации, равной по меньшей мере 80 нМ и константой скорости ассоциации, равной 10 Mc или более, в частности, с константой диссоциации, равной по меньшей мере 70 нМ и константой скорости ассоциации, равной 10 Mc или более, в частности, с константой диссоциации, равной по меньшей мере 10 нМ и константой скорости ассоциации, равной 10 Mc или более, в частности, с константой диссоциации, равной по меньшей мере 200 пМ и константой скорости ассоциации, равной 10 Мс или более, в частности, с константой диссоциации, равной по меньшей мере 100 пМ и константой скорости ассоциации, равной 10 Мс или более.
В различных вариантах реализации настоящего изобретения химерные или гуманизированные антитела в соответствии с настоящим изобретением, как описано в различных вариантах реализации настоящего изобретения, специфически распознают и связываются с фосфоэпитопом на поверхности белка тау у млекопитающего, в частности, у человека, в частности, ассоциированного с микротрубочками белка тау, в частности, агрегированного ассоциированного с микротрубочками и гиперфосфорилированного белка тау, такого, который присутствует в парных спиральных филаментах (PHF). которые являются преобладающими структурами в нейрофибриллярных клубках, нейропильных нитях и дистрофических нейритах, но в одном варианте реализации настоящего изобретения не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или неродственными эпитопами.
В конкретном варианте реализации настоящего изобретения белок тау человека представляет собой белок тау человека, как показано в SEQ ID NO: 19.
Химерные или гуманизированные антитела в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, таким образом, могут быть использованы для снижения уровня общего растворимого белка тау, в частности, растворимого фосфорилированного белка тау в головном мозге, в частности, в коре головного мозга и/или гиппокампе млекопитающего или человека с повышенным уровнем растворимого белка тау и/или растворимого фосфорилированного белка тау.
Химерные или гуманизированные антитела в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения также могут быть использованы для снижения уровня парных спиральных филаментов, содержащих гиперфосфорилированный белок тау (фТау PHF) в головном мозге, в частности в коре головного мозга и/или гиппокампе млекопитающего или человека с повышенным уровнем указанных парных спиральных филаментов фТау (фТау PHF).
Снижение уровня общего растворимого белка тау и/или растворимого фосфорилированного белка тау, и/или парных спиральных филаментов фТау (фТау PHF) в головном мозге, в частности, в коре головного мозга и/или гиппокампе млекопитающего или человека с повышенным уровнем указанных вариантов белка тау, которые способствуют ассоциированным с белком тау заболеваниям, расстройствам или состояниям у указанного млекопитающего или человека, может привести к улучшению и/или облегчению симптомов, связанных с такими ассоциированными с белком тау заболеваниями, расстройствами или состояниями.
Химерные или гуманизированные антитела в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения могут, в силу этих обстоятельств, быть использованы в терапии, в частности, в терапии человека, для замедления или прекращения прогрессирования ассоциированного с белком тау заболевания, расстройства или состояния.
Химерные или гуманизированные антитела в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения дополнительно могут быть использованы в терапии, в частности, в терапии человека, для улучшения или облегчения симптомов, связанных с ассоциированными с белком тау заболеваниями, расстройствами или состояниями, такими как, например, нарушение или потеря когнитивных функций, в том числе рассуждения, ситуативного суждения, возможности памяти, обучения, специального ориентирования и т.д.
В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к химерным или гуманизированным антителам в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения для применения в терапии, в частности, для применения в профилактике или лечении таупатий, группы ассоциированных с белком тау заболеваний и расстройств, или для облегчения симптомов, связанных с таупатиями.
В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к химерным или гуманизированным антителам в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения для сохранения или увеличения возможности когнитивной памяти у млекопитающего, страдающего от таупатий.
Связывание пептидов или антител в соответствии с предыдущими вариантами реализации изобретения с клубками тау и фТау на поверхности головного мозга может быть определено с помощью анализа иммунологической реактивности белков выбранных срезов головного мозга и с помощью Вестерн-блоттинга гомогенатов головного мозга, соответственно, как описано в Примерах.
В другом варианте реализации настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей химерное или гуманизированное антитело или его функциональный фрагмент, или полинуклеотид в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, или их комбинации в терапевтически эффективном количестве, при необходимости вместе с фармацевтически приемлемым носителем.
В одном варианте реализации изобретения химерное или гуманизированное антитело или его функциональный фрагмент, или полинуклеотид, или фармацевтическую композицию в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, или их комбинации используют в терапии, в частности, в терапии человека для лечения или облегчения симптомов ассоциированных с белком тау заболеваний или расстройств, в том числе нейродегенеративных заболеваний, таких как таупатий.
Химерные или гуманизированные антитела и/или фармацевтические композиции в соответствии с любым из предыдущих вариантов реализации изобретения могут, таким образом, быть использованы для замедления или прекращения прогрессирования ассоциированного с белком тау заболевания, расстройства или состояния при введении указанных антител и/или фармацевтических композиций животному, в частности, млекопитающему, в частности, человеку, страдающему от такого заболевания или состояния.
Химерные или гуманизированные антитела и/или фармацевтические композиции в соответствии с любым из предыдущих вариантов реализации изобретения дополнительно могут быть использованы для улучшения или облегчения симптомов, связанных с ассоциированными с белком тау заболеваниями, расстройствами или состояниями, такими как, например, нарушение или потеря когнитивных функций, в том числе рассуждения, ситуативного суждения, возможности памяти, обучения, специального ориентирования и т.д., после введения указанных антител и/или фармацевтических композиций животному, в частности, млекопитающему, в частности, человеку, страдающему от такого заболевания или состояния.
В одном варианте реализации изобретения химерное или гуманизированное антитело, или его функциональный фрагмент, или полинуклеотид, или фармацевтическую композицию в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, или их комбинацию используют для профилактики или лечения заболеваний и расстройств, которые вызваны или связаны с формированием нейрофибриллярных поражений, с преобладающей патологией головного мозга в таупатий, включающей гетерогенную группу нейродегенеративных заболеваний или расстройств, в том числе заболевания или расстройства, которые демонстрируют сосуществование тау и амилоидных патологий, в том числе, без ограничения указанными, болезнь Альцгеймера, болезнь Крейцфельда-Якоба, деменция боксеров, синдром Дауна, болезнь Герстманна-Штреусслера-Шейнкера, миозит с включенными тельцами и прион-протеинцеребральная амилоидная ангиопатия, черепно-мозговая травма и дополнительные заболевания или расстройства, которые не демонстрируют явной амилоидной патологии, в том числе, без ограничения указанными, боковой амиотрофический склероз/сочетание паркинсонизма и деменции (комплекс Гуама), негуамская болезнь двигательного нейрона с нейрофибриллярными клубками, деменция аргирофильных зерен, кортикобазальная дегенерация, диффузные нейрофибриллярные клубки с кальцификацией, лобно-височная деменция с паркинсонизмом, связанная с мутацией на 17-й хромосоме, болезнь Галлервордена-Шпатца, множественная системная атрофия, болезнь Ниманна-Пика, тип С, паллидо-понто-нигральная дегенерация, болезнь Пика, прогрессивный субкортикальный глиоз, прогрессирующий надъядерный паралич, подострый склерозирующий панэнцефалит, деменция с преобладанием нейрофибриллярных клубков, постэнцефалитический паркинсонизм, миотоническая дистрофия.
В одном варианте реализации изобретения химерное или гуманизированное антитело или его функциональный фрагмент, или полинуклеотид, или фармацевтическую композицию в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, или их комбинации используют в лечении болезни Альцгеймера.
В одном варианте реализации настоящего изобретения предлагается способ для модуляции уровней растворимого и/или нерастворимого тау, в частности, в головном мозге, в частности, в коре головного мозга и/или гиппокампе животного, в частности, млекопитающего или человека, включающий введение указанному животному, в частности, указанному млекопитающему или человеку, химерного или гуманизированного антитела или его функционального фрагмента, или полинуклеотида, или фармацевтической композиции в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, или их комбинации.
В одном аспекте модуляция относится к снижению уровня растворимого белка тау, в частности, растворимого фосфорилированного белка тау в головном мозге, в частности, в коре головного мозга и/или гиппокампе животного, в частности, млекопитающего или человека с повышенным уровнем растворимого белка тау и/или растворимого фосфорилированного белка тау.
В одном варианте реализации настоящего изобретения предлагается способ для снижения уровня нерастворимого белка тау, в частности, парных спиральных филаментов, содержащих гиперфосфорилированный белок тау (фТау PHF) в головном мозге, в частности, в коре головного мозга и/или гиппокампе животного, в частности, млекопитающего или человека с повышенным уровнем нерастворимого белка тау, в частности, парных спиральных филаментов фТау (фТау PHF), включающий введение указанному животному, в частности, указанному млекопитающему или человеку, химерного или гуманизированного антитела или его функционального фрагмента, или полинуклеотида, или фармацевтической композиции в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, или их комбинации.
В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к способу для замедления или прекращения прогрессирования ассоциированного с белком тау заболевания, расстройства или состояния у животного, в частности, у млекопитающего или человека, включающему введение указанному животному, в частности, указанному млекопитающему или человеку, страдающему от такого заболевания или состояния, химерного или гуманизированного антитела или его функционального фрагмента, или полинуклеотида, или фармацевтической композиции в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, или их комбинации.
В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к способу для улучшения или облегчения симптомов, связанных с ассоциированными с белком тау заболеваниями, расстройствами или состояниями, такими как, например, нарушение или потеря когнитивных функций, в том числе рассуждения, ситуативного суждения, возможности памяти, обучения, специального ориентирования и т.д. у животного, в частности, у млекопитающего или человека, включающему введение указанному животному, в частности, указанному млекопитающему или человеку, страдающему от такого заболевания или состояния, химерного или гуманизированного антитела или его функционального фрагмента, или полинуклеотида, или фармацевтической композиции в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, или их комбинации.
В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к способу для сохранения или увеличения возможности когнитивной памяти у млекопитающего, страдающего от таупатии.
В еще одном варианте реализации настоящего изобретения предлагается способ для лечения ассоциированного с белком тау заболевания или расстройства, в том числе нейродегенеративного заболевания или расстройства, такого как таупатия, включающий введение животному, в частности, млекопитающему, но особенно человеку, страдающему от такого заболевания или расстройства, химерного или гуманизированного антитела или его функционального фрагмента, или полинуклеотида, или фармацевтической композиции в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, или их комбинации.
В одном варианте реализации настоящего изобретения предлагается способ для лечения заболеваний и расстройств, которые вызваны или связаны с формированием нейрофибриллярных поражений, с преобладающей патологией головного мозга в таупатии, включающей гетерогенную группу нейродегенеративных заболеваний или расстройств, в том числе заболевания или расстройства, которые демонстрируют сосуществование тау и амилоидных патологий, в том числе, без ограничения указанными, болезнь Альцгеймера, болезнь Крейцфельда-Якоба, деменция боксеров, синдром Дауна, болезнь Герстманна-Штреусслера-Шейнкера, миозит с включенными тельцами и прион-протеинцеребральная амилоидная ангиопатия, черепно-мозговая травма и дополнительные заболевания или расстройства, которые не демонстрируют явной амилоидной патологии, в том числе, без ограничения указанными, боковой амиотрофический склероз/сочетание паркинсонизма и деменции (комплекс Гуама), негуамская болезнь двигательного нейрона с нейрофибриллярными клубками, деменция аргирофильных зерен, кортикобазальная дегенерация, диффузные нейрофибриллярные клубки с кальцификацией, лобно-височная деменция с паркинсонизмом, связанная с мутацией на 17-й хромосоме, болезнь Галлервордена-Шпатца, множественная системная атрофия, болезнь Ниманна-Пика, тип С, паллидо-понто-нигральная дегенерация, болезнь Пика, прогрессивный субкортикальный глиоз, прогрессирующий надъядерный паралич, подострый склерозирующий панэнцефалит, деменция с преобладанием нейрофибриллярных клубков, постэнцефалитический паркинсонизм, миотоническая дистрофия, который включает введение животному, в частности, млекопитающему, но особенно человеку, страдающему от такого заболевания или расстройства, химерного или гуманизированного антитела или его функционального фрагмента, или полинуклеотида, фармацевтической композиции в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, или их комбинации.
В другом варианте реализации настоящего изобретения предлагается способ для индуцирования пассивного иммунного ответа у животного, в частности, у млекопитающего или человека, страдающего от нейродегенеративного расстройства, такого как таупатия, посредством введения указанному животного или человеку химерного или гуманизированного антитела, или функционального фрагмента, или полинуклеотида, или фармацевтической композиции в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, или их комбинации.
В еще одном варианте реализации настоящего изобретения предлагается способ диагностики ассоциированного с белком тау заболевания, расстройства или состояния у пациента, включающий детектирование иммуноспецифического связывания химерного или гуманизированного антитела, или его функционального фрагмента в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения с эпитопом белка тау в образце или in situ, который включает следующие этапы, в которых
a. приводят в контакт образец или определенную часть тела, или участок тела, который предположительно содержит белок тау, с химерным или гуманизированным антителом, или его функциональным фрагментом в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, причем указанное антитело или его фрагмент связывает эпитоп белка тау;
b. дают возможность указанному антителу или его функциональному фрагменту связываться с белком тау с образованием иммунологического комплекса;
c. детектируют образование иммунологического комплекса; и
d. устанавливают корреляцию между присутствием или отсутствием иммунологического комплекса и присутствием или отсутствием белка тау в образце или определенной части тела или участке.
В еще одном варианте реализации настоящего изобретения предлагается способ диагностики предрасположенности к ассоциированному с белком тау заболеванию, расстройству или состоянию у пациента, включающий детектирование иммуноспецифического связывания химерного или гуманизированного антитела, или его функционального фрагмента в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения с эпитопом белка тау в образце или in situ, который включает следующие этапы, в которых
а. приводят в контакт образец или определенную часть тела, или участок тела, который предположительно содержит тау-антиген, с химерным или гуманизированным антителом, или его функциональным фрагментом в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, причем антитело или его фрагмент связывает эпитоп белка тау;
b. дают возможность указанному антителу или его функциональному фрагменту связываться с тау-антигеном с образованием иммунологического комплекса;
c. детектируют образование иммунологического комплекса; и
d. устанавливают корреляцию между присутствием или отсутствием иммунологического комплекса и присутствием или отсутствием тау-антигена в образце или определенной части тела или участке;
e. сравнивают количество указанного иммунологического комплекса с нормальным контрольным значением;
причем увеличение количества указанного агрегата по сравнению с нормальным контрольным значением свидетельствует о том, что указанный пациент страдает от ассоциированного с белком тау заболевания или состояния или подвержен риску его развития.
В одном варианте реализации настоящего изобретения предлагается способ для мониторинга минимальной остаточной болезни у пациента после лечения химерным или гуманизированным антителом, или его функциональным фрагментом в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, причем указанный способ включает этапы, в которых:
a. приводят в контакт образец или определенную часть тела, или участок тела, который предположительно содержит тау-антиген, с химерным или гуманизированным антителом, или его функциональным фрагментом в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, причем антитело или его фрагмент связывает эпитоп белка тау;
b. дают возможность указанному антителу или его функциональному фрагменту связываться с тау-антигеном с образованием иммунологического комплекса;
c. детектируют образование иммунологического комплекса; и
d. устанавливают корреляцию между присутствием или отсутствием иммунологического комплекса и присутствием или отсутствием тау-антигена в образце или определенной части тела или участке,
е. сравнивают количество указанного иммунологического комплекса с нормальным контрольным значением,
причем увеличение количества указанного агрегата по сравнению с нормальным контрольным значением свидетельствует о том, что указанный пациент все еще страдает от минимальной остаточной болезни.
В одном варианте реализации изобретения предлагается способ для прогнозирования реактивности пациента, который получает лечение химерным или гуманизированным антителом, или его функциональным фрагментом в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, при котором
a. приводят в контакт образец или определенную часть тела, или участок тела, который предположительно содержит тау-антиген, с химерным или гуманизированным антителом, или его функциональным фрагментом в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, причем антитело или его фрагмент связывает эпитоп белка тау;
b. дают возможность указанному антителу или его функциональному фрагменту связываться с тау-антигеном с образованием иммунологического комплекса;
c. детектируют образование иммунологического комплекса; и
d. устанавливают корреляцию между присутствием или отсутствием иммунологического комплекса и присутствием или отсутствием тау-антигена в образце или определенной части тела или участке,
e. сравнивают количество указанного иммунологического комплекса до и после начала лечения,
причем уменьшение количества указанного агрегата свидетельствует о том, что указанный пациент обладает высоким потенциалом реагировать на лечение.
В другом варианте реализации настоящее изобретение относится к тест-набору для детектирования и диагностики ассоциированных с белком тау заболеваний, расстройств или состояний, содержащей химерное или гуманизированное антитело, или его функциональный фрагмент в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения.
В одном варианте реализации изобретения указанный тест-набор содержит контейнер, содержащий одно или более химерных или гуманизированных антител, или их функциональный фрагмент в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, а также инструкции по использованию данных антител с целью связывания с тау-антигеном с образованием иммунологического комплекса и с целью детектирования образования иммунологического комплекса таким образом, чтобы присутствие или отсутствие иммунологического комплекса коррелировало с присутствием или отсутствием тау-антигена.
В другом варианте реализации настоящее изобретение относится к клеточной линии, в частности, к бактериальной клеточной линии, в частности, к клеточной линии Е. coli, продуцирующей химерное или гуманизированное антитело, или его функциональный фрагмент в соответствии с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения.
В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к клеточной линии, которая представляет собой Escherichia coli 2В6А10С11-Н, которая депонирована 6 марта 2012 года под номером DSM 25743.
В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к клеточной линии, которая представляет собой Escherichia coli 2B6A10C11-L, которая депонирована 6 марта 2012 года под номером DSM 25744.
В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к клеточной линии, которая представляет собой Escherichia coli 3A8A12G7-H, которая депонирована 6 марта 2012 года под номером DSM 25745.
В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к клеточной линии, которая представляет собой Escherichia coli 3A8A12G7-L, которая депонирована 6 марта 2012 года под номером DSM 25746.
Краткое Описание Графических Материалов и Последовательностей
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигура 1 иллюстрирует связывание гуманизированных анти-фТау антител hACI-36-2B6-Ab1 и hACI-36-3A8-Ab1 с фТау пептидной вакциной (Т4.5), без связывания с нефосфорилированной версией того же пептида (Т4.6).
Фигура 2 иллюстрирует клубки тау в головном мозге 20-месячных тау-трансгенных (biGT) мышей, окрашенных гуманизированным анти-фТау антителом hACI-36-2В6-Аb1. Окрашивание проиллюстрировано для клубков тау в коре головного мозга (А) и гиппокампе (В), с окрашиванием нейропильных нитей, видимых в гиппокампе (В).
Фигура 3 иллюстрирует клубки тау в головном мозге 20-месячных тау-трансгенных (biGT) мышей, окрашенных гуманизированным анти-фТау антителом hACI-36-3A8-Ab1. Окрашивание проиллюстрировано для клубков тау в коре головного мозга (А) и гиппокампе (В), с окрашиванием нейропильных нитей, видимых в гиппокампе (В).
Фигура 4 иллюстрирует Легкую цепь bАСI-36-2В6-Аb1
Фигура 5 иллюстрирует Легкую цепь hACI-36-3A8-Ab1
Фигура 6 иллюстрирует Тяжелую цепь hACI-36-2B6-Ab1 и hАСI-36-3А8-Аb1
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
SEQ ID NO: 1 иллюстрирует аминокислотную последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR) гуманизированного антитела hACI-36-3А8-Аb1 и hАСI-36-2В6-Аb1, продуцируемого Escherichia coli 3A8A12G7-H, которая депонирована 6 марта 2012 года под номером DSM 25745, и Escherichia coli 2В6А10С11-Н, которая депонирована 6 марта 2012 года под номером DSM 25743, соответственно.
SEQ ID NO: 2 иллюстрирует аминокислотную последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR) гуманизированного антитела hACI-36-3А8-Аh1 и hACI-36-2B6-Ab1, продуцируемого Escherichia coli 3A8A12G7-H, которая депонирована 6 марта 2012 года под номером DSM 25745, и Escherichia coli 2В6А10С11-Н, которая депонирована 6 марта 2012 года под номером DSM 25743, соответственно.
SEQ ID NO: 3 иллюстрирует аминокислотную последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR) гуманизированного антитела hACI-36-3А8-Аb1 и hACI-36-2B6-Ab1, продуцируемого Escherichia coli 3A8A12G7-H, которая депонирована 6 марта 2012 года под номером DSM 25745, и Escherichia coli 2В6А10С11-Н, которая депонирована 6 марта 2012 года под номером DSM 25743, соответственно.
SEQ ID NO: 4 иллюстрирует аминокислотную последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи (LCVR) гуманизированного антитела hACI-36-3A8-Ab1, продуцируемого Escherichia coli 3A8A12G7-L, которая депонирована 6 марта 2012 года
SEQ ID NO: 5 иллюстрирует аминокислотную последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи (LCVR) гуманизированного антитела hACI-36-3A8-Аb1 и hACI-36-2B6-Ab1, продуцируемого Escherichia coli 3A8A12G7-L, которая депонирована 6 марта 2012 года под номером DSM 25746, и Escherichia coli 2B6A10C11-L, которая депонирована 6 марта 2012 года под номером DSM 25744, соответственно.
SEQ ID NO: 6 иллюстрирует аминокислотную последовательность CDR3 вариабельной области легкой цепи (LCVR) гуманизированного антитела hACI-36-3A8-Ab1 и hACI-36-2B6-Ab1, продуцируемого Escherichia coli 3A8A12G7-L, которая депонирована 6 марта 2012 года под номером DSM 25746, и Escherichia coli 2B6A10C11-L, которая депонирована 6 марта 2012 года под номером DSM 25744, соответственно.
SEQ ID NO: 7 иллюстрирует аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (HCVR) гуманизированного антитела hACI-36-3А8-Аb1 и hACI-36-2B6-Ab1, продуцируемого Escherichia coli 3A8A12G7-H, которая депонирована 6 марта 2012 года под номером DSM 25745, и Escherichia coli 2В6А10С11-Н, которая депонирована 6 марта 2012 года под номером DSM 25743, соответственно.
SEQ ID NO: 8 иллюстрирует аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (LCVR) гуманизированного антитела hACI-36-3A8-Ab1, продуцируемого Escherichia coli 3A8A12G7-L, которая депонирована 6 марта 2012 года под номером DSM 25746.
SEQ ID NO: 9 иллюстрирует аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (LCVR) гуманизированного антитела hACI-36-2B6-Аb1, продуцируемого Escherichia coli 2B6A10C11-L, которая депонирована 6 марта 2012 года под номером DSM 25744.
SEQ ID NO: 10 иллюстрирует аминокислотную последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи (LCVR) гуманизированного антитела hACI-36-2B6-Аb1, продуцируемого Escherichia coli 2B6A10C11-L, которая депонирована 6 марта 2012 года под номером DSM 25744.
SEQ ID NO: 11 иллюстрирует нуклеотидную последовательность тяжелой цепи (Н) гуманизированного антитела hАСI-36-3А8-Аb1, продуцируемого Escherichia coli 3A8A12G7-H, которая депонирована 6 марта 2012 года под номером DSM 25745, и тяжелой цепи (Н) гуманизированного антитела hАСI-36-2В6-Аb1, продуцируемого Escherichia coli 2В6А10С11-Н, которая депонирована 6 марта 2012 года под номером DSM 25743.
SEQ ID NO: 12 иллюстрирует нуклеотидную последовательность легкой цепи (L) гуманизированного антитела hACI-36-3A8-Ab1, продуцируемого Escherichia coli 3A8A12G7-L, которая депонирована 6 марта 2012 года под номером DSM 25746.
SEQ ID NO: 13 иллюстрирует нуклеотидную последовательность легкой цепи (L) гуманизированного антитела hACI-36-2B6-Ab1, продуцируемого Escherichia coli 2В6А10С11-L, которая депонирована 6 марта 2012 года под номером DSM 25744.
SEQ ID NO: 14 иллюстрирует аминокислотную последовательность СН1 константной области тяжелой цепи (НС) тяжелой цепи гуманизированного антитела hACI-36-3A8-Ab1, продуцируемого Escherichia coli 3A8A12G7-H, которая депонирована 6 марта 2012 года под номером DSM 25745, и тяжелой цепи гуманизированного антитела hАСI-36-2В6-Аb1, продуцируемого Escherichia coli 2В6А10С11-Н, которая депонирована 6 марта 2012 года под номером DSM 25743.
SEQ ID NO: 15 иллюстрирует аминокислотную последовательность шарнирного участка константной области тяжелой цепи (НС) тяжелой цепи гуманизированного антитела hACI-36-3A8-Ab1, продуцируемого Escherichia coli 3A8A12G7-H, которая депонирована 6 марта 2012 года под номером DSM 25745, и тяжелой цепи гуманизированного антитела hACI-36-2B6-Ab1, продуцируемого Escherichia coli 2В6А10С11-Н, которая депонирована 6 марта 2012 года под номером DSM 25743.
SEQ ID NO: 16 иллюстрирует аминокислотную последовательность СН2 константной области тяжелой цепи (НС) тяжелой цепи гуманизированного антитела hACI-36-3A8-Ab1, продуцируемого Escherichia coli 3A8A12G7-H, которая депонирована 6 марта 2012 года под номером DSM 25745, и тяжелой цепи гуманизированного антитела hACI-36-2B6-Ab1, продуцируемого Escherichia coli 2В6А10С11-Н, которая депонирована 6 марта 2012 года под номером DSM 25743. Аминокислотная последовательность СН2 константной области тяжелой цепи (НС) тяжелой цепи гуманизированного антитела hАСI-36-3А8-Аb1 также проиллюстрирована на Фигуре 6С.
SEQ ID NO: 17 иллюстрирует аминокислотную последовательность СН3 константной области тяжелой цепи (НС) тяжелой цепи гуманизированного антитела hACI-36-3A8-Ab1, продуцируемого Escherichia coli 3A8A12G7-H, которая депонирована 6 марта 2012 года под номером DSM 25745, и тяжелой цепи гуманизированного антитела hACI-36-2B6-Ab1, продуцируемого Escherichia coli 2В6А10С11-Н, которая депонирована 6 марта 2012 года под номером DSM 25743. SEQ ID NO: 17 иллюстрирует аминокислотную последовательность СН3 константной области тяжелой цепи (НС) тяжелой цепи гуманизированного антитела hACI-36-3A8-Аb1, которое содержит делецию С-концевого лизина (des-K).
SEQ ID NO: 18 иллюстрирует аминокислотную последовательность константной области легкой цепи (LC) гуманизированного антитела hACI-36-3A8-Ab1, продуцируемого Escherichia coli 3A8A12G7-H, которая депонирована 6 марта 2012 года под номером DSM 25745, и константной области легкой цепи (LC) гуманизированного антитела hACI-36-2B6-Ab1, продуцируемого Escherichia coli 2В6А10С11-Н, которая депонирована 6 марта 2012 года под номером DSM 25743. Аминокислотная последовательность константной области легкой цепи (LC) гуманизированного антитела hACI-36-3A8-Ab1 также проиллюстрирована на Фигурах 4В и 5В.
SEQ ID NO: 19 иллюстрирует самую длинную изоформу белка тау человека (441аа), также называемую тау40.
SEQ ID NO: 20 иллюстрирует аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (HCVR) гуманизированного антитела hACl-36-3A8-Ab1.v2.
SEQ ID NO: 21 иллюстрирует аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (HCVR) гуманизированного антитела hACl-36-2B6-Ab1.v2.
SEQ ID NO: 22 иллюстрирует аминокислотную последовательность легкой цепи (L) следующих гуманизированных антител: hACl-36-3A8-Ab1 (IgG4), hACl-36-3A8-Ab1.v2 (IgG4), hACl-36-3A8-Ab1.v3 (IgGl) и hACl-36-3A8-Ab1.v4 (IgGl N297G). Аминокислотная последовательность легкой цепи (L) hACl-36-3A8-Ab1 (IgG4), hACl-36-3A8-Ab1.v2 (IgG4), hACl-36-3A8-Ab1.v3 (IgGl) и hACl-36-3A8-Ab1.v4 (IgGl N297G) также проиллюстрирована на Фигуре 5.
SEQ ID NO: 23 иллюстрирует аминокислотную последовательность легкой цепи (L) следующих гуманизированных антител: hACl-36-2B6-Ab1 (IgG4), hACl-36-2B6-Ab1.v2 (IgG4), hACl-36-2B6-Ab1.v3 (IgGl) и hACl-36-2B6-Ab1.v4 (IgGl N297G). Аминокислотная последовательность легкой цепи (L) hACl-36-2B6-Ab1 (IgG4), hACl-36-2B6-Ab1.v2 (IgG4), hACl-36-2B6-Ab1.v3 (IgGl) и hACl-36-2B6-Abl.v4 (IgGl N297G) также проиллюстрирована на Фигуре 4.
SEQ ID NO: 24 иллюстрирует аминокислотную последовательность тяжелой цепи (Н) гуманизированного антитела hACl-36-3A8-Ab1 (IgG4). Аминокислотная последовательность тяжелой цепи (Н) гуманизированного антитела hACl-36-3A8-Ab1 (IgG4) также проиллюстрирована на Фигуре 6.
SEQ ID NO: 25 иллюстрирует аминокислотную последовательность тяжелой цепи (Н) гуманизированного антитела hACl-36-2B6-Ab1 (IgG4). Примечание: SEQ ID NO: 25 представляет собой такую же последовательность, как и SEQ ID NO: 24, и также проиллюстрирована на Фигуре 6.
SEQ ID NO: 26 иллюстрирует аминокислотную последовательность тяжелой цепи (Н) гуманизированного антитела hACl-36-3A8-Ab1.v2 (IgG4).
SEQ ID NO: 27 иллюстрирует аминокислотную последовательность тяжелой цепи (Н) гуманизированного антитела hACl-36-3A8-Ab1.v3 (IgG1).
SEQ ID NO: 28 иллюстрирует аминокислотную последовательность тяжелой цепи (Н) гуманизированного антитела hACl-36-3A8-Ab1.v4 (IgG1 N297G).
SEQ ID NO: 29 иллюстрирует аминокислотную последовательность тяжелой цепи (Н) гуманизированного антитела hACl-36-2B6-Ab1.v2 (IgG4).
SEQ ID NO: 30 иллюстрирует аминокислотную последовательность тяжелой цепи (Н) гуманизированного антитела hACl-36-2B6-Ab1.v3 (IgG1).
SEQ ID NO: 31 иллюстрирует аминокислотную последовательность тяжелой цепи (Н) гуманизированного антитела hACl-36-2B6-Ab1.v4 (IgG1 N297G).
Определение Терминов
В контексте данного описания термины "полипептид", "пептид" и "белок" являются взаимозаменяемыми и понимаются как означающие биомолекулы, состоящие из аминокислот, соединенных пептидной связью.
В контексте данного описания формы единственного числа (которые в языке оригинала передаются с помощью артиклей "a", "an" и "the") понимают как означающие "один или более" и включают в себя множественное число, если из контекста явно не следует иное.
Термины "пептиды" или "связывающий пептид" используют в данном описании взаимозаменяемо и относятся к цепям аминокислот (как правило, L-аминокислот), альфа-углеродные атомы которых связаны между собой пептидными связями, образованными реакцией конденсации между карбоксильной группой альфа-углеродного атома одной аминокислоты и аминогруппой альфа-углеродного атома другой аминокислоты. Концевая аминокислота на одном конце цепи (то есть, амино-конец) обладает свободной аминогруппой, в то время как концевая аминокислота на другом конце цепи (то есть, карбоксильный конец) обладает свободной карбоксильной группой. Таким образом, термин "амино-конец" (сокращенно N-конец) относится к свободной альфа-аминогруппе в аминокислоте на амино-конце пептида или к альфа-аминогруппе (иминогруппа, участвующая в образовании пептидной связи) аминокислоты в любом другом месте в пределах пептида. Аналогично, термин "карбоксильный конец" (сокращенно С-конец) относится к свободной карбоксильной группе в аминокислоте на карбоксильном конце пептида или к карбоксильной группе аминокислоты в любом другом месте в пределах пептида. Связывающий пептид может представлять собой антитела, такие как поликлональные или моноклональные антитела, человеческие или гуманизированные антитела, диатела, антитела верблюдовых и т.д., или их функциональные части, как определено в данном описании.
В контексте данного описания термины "функциональный фрагмент" или "фрагмент" относятся к функциональному пептидному фрагменту, то есть к части или участку антитела, или к цепи антитела, содержащей меньшее количество аминокислотных остатков, чем интактное или полное антитело, или цепь антитела, но обладает, по сути, такой же (биологической) активностью, что и антитело, из которого он получен, то есть указанные фрагменты все еще способны вызывать высоко специфичный, в частности, конформационно специфичный иммунный ответ в организме, но, в частности, в организме животного, в частности, млекопитающего или человека, который является высокоэффективным и способным к профилактике или облегчению таупатий или симптомов, связанных с таупатиями. В частности, указанные фрагменты все еще содержат специфичный патологический фосфоэпитоп или фосфоэпитопы пептида тау, как применяют и определяют в данном описании. Фрагменты могут быть получены посредством химической или ферментативной обработки интактного или полного антитела, или цепи антитела. Фрагменты также могут быть получены рекомбинантными способами. Иллюстративные фрагменты включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2, Fabc и/или Fv. Термин "антигенсвязывающий фрагмент" относится к полипептидному фрагменту иммуноглобулина или антитела, который связывает антиген или конкурирует с интактным антителом (то есть, с интактным антителом, из которого они были получены) за связывание антигена (то есть специфичное связывание).
2
Связывающие фрагменты получают методами рекомбинантной ДНК или посредством ферментативного или химического расщепления интактных иммуноглобулинов. Связывающие фрагменты включают Fab, Fab', F(ab'), Fabc, Fv, одиночные цепи и одноцепочечные антитела.
Термин "фрагмент" также относится к пептиду или полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, которая состоит по меньшей мере из 5 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 10 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 15 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 20 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 25 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 40 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 50 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 60 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 70 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 80 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 90 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 100 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 125 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 150 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 175 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 200 смежных аминокислотных остатков или по меньшей мере из 250 смежных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности другого полипептида. В конкретном варианте реализации изобретения фрагмент полипептида сохраняет по меньшей мере одну функцию полипептида.
Как правило, аминокислоты, образующие пептид, нумеруются по порядку, начиная с амино-конца и увеличиваясь по направлению к карбоксильному концу пептида. Таким образом, когда говорят, что одна аминокислота "следует" за другой, данная аминокислота расположена ближе к карбоксильному концу пептида, чем предыдущая аминокислота.
Термин "остаток" используют в данном описании как относящийся к аминокислоте, которая включена в пептид посредством амидной связи. Таким образом, аминокислота может представлять собой аминокислоту природного происхождения или, если не ограничено иное, может охватывать известные аналоги природных аминокислот, которые функционируют аналогично аминокислотам природного происхождения (то есть, аминокислотным миметикам). Более того, миметик амидной связи содержит модификации пептидного остова, хорошо известные специалистам в данной области техники.
Фразу "состоящий, по сути, из" используют в данном описании для исключения любых элементов, которые, по сути, меняли бы существенные свойства пептидов, к которым данная фраза относится. Таким образом, описание пептида "состоящего, по сути, из …" исключает любые аминокислотные замены, добавления или делеции, которые бы существенно изменяли биологическую активность данного пептида.
Кроме того, специалисту в данной области техники будет понятно, что, как упоминалось выше, отдельные замены, делеции или добавления, которые заменяют, добавляют или удаляют одну аминокислоту или небольшой процент аминокислот (как правило, менее 5%, как правило, менее 1%) в кодированной последовательности, представляют собой консервативно модифицированные варианты, в которых изменения приводят к замене аминокислоты химически аналогичной аминокислотой. Таблицы консервативных замен, предлагающие функционально аналогичные аминокислоты, хорошо известны в данной области техники. Каждая из следующих шести групп содержит аминокислоты, которые представляют собой консервативные замены друг для друга:
1) Алании (А), Серии (S), Треонин (Т);
2) Аспарагиновая кислота (D), Глутаминовая кислота (Е);
3) Аспарагин (N), Глутамин (Q);
4) Аргинин (R), Лизин (К);
5) Изолейцин (I), Лейцин (L), Метионин (М), Валин (V); и
6) Фенилаланин (F), Тирозин (Y), Триптофан (W).
Фразы "выделенный" или "биологически чистый" относятся к материалу, который, по сути, или практически не содержит компонентов, которые, как обнаружено, обычно сопровождают его в его естественном состоянии. Таким образом, пептиды, описанные в данном документе, не содержат материалов, которые обычно связаны с их окружающей средой in situ. Как правило, выделенные, иммуногенные пептиды, описанные в данном документе, являются чистыми по меньшей мере на около 80%, как правило, по меньшей мере на около 90%, а предпочтительно - по меньшей мере на около 95%, как измерено с помощью интенсивности полосы при окрашивании гелей серебром.
Чистота белка или гомогенность может быть указана с помощью ряда способов, хорошо известных в данной области техники, таких как электрофорез образца белка в полиакриламидном геле с последующей визуализацией при окрашивании. Для некоторых целей будут необходимы высокое разрешение и применение высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖК) или аналогичных способов для очистки.
Когда иммуногенные пептиды являются относительно короткими по длине (то есть, менее чем около 50 аминокислот), их часто синтезируют с использованием стандартных методов химического пептидного синтеза.
Твердофазный синтез, в котором С-концевая аминокислота последовательности присоединена к нерастворимой подложке с последующим последовательным добавлением остальных аминокислот в последовательности, является предпочтительным способом для химического синтеза иммуногенных пептидов, описанных в данном документе. Методы твердофазного синтеза известны специалистам в данной области техники.
В альтернативном варианте иммуногенные пептиды, описанные в данном документе, синтезируют с использованием метода рекомбинантных нуклеиновых кислот. Как правило, он включает создание последовательности нуклеиновых кислот, которая кодирует пептид, помещение нуклеиновой кислоты в кассету экспрессии под контролем определенного промотора, экспрессию пептида в организме хозяина, выделение экспрессированного пептида или полипептида и, при необходимости, ренатурацию пептида. В литературе можно найти методы, достаточные в качестве руководства по данным способам для специалиста в данной области техники.
После экспрессии рекомбинантные пептиды могут быть очищены в соответствии со стандартными методиками, включая осаждение сульфатом аммония, колонки для аффинной хроматографии, хроматографию на колонках, электрофорез в геле и тому подобное. Предпочтительными являются, по сути, чистые композиции с гомогенностью от около 50% до 95% и наиболее предпочтительной для использования в качестве терапевтических агентов является гомогенность от 80% до 95% или более.
Специалисту в данной области будет понятно, что после химического синтеза, биологической экспрессии или очистки иммуногенные пептиды могут обладать конформацией, по сути, отличной от нативных конформаций составляющих пептидов. В данном случае зачастую необходимо денатурировать и восстановить антипролиферативный пептид, а затем заставить пептид повторно свернуться в предпочтительной конформаций. Способы восстановления и денатурирования белков, а также индуцирования повторного сворачивания хорошо известны специалистам в данной области техники.
Антигенность очищенного белка можно подтвердить, например, посредством демонстрации реакции с иммунной сывороткой или с антисывороткой, полученной к белку как таковому.
В контексте данного описания термины "детектирование" или "детектированный" означают применение известных методик для детектирования биологических молекул, таких как иммунохимические или гистологические методы, и относятся к качественному или количественному определению присутствия или концентрации исследуемой биомолекулы.
Под термином "выделенный" подразумевают биологическую молекулу, которая не содержит по меньшей мере некоторых компонентов, с которыми она встречается в естественных условиях.
В контексте данного описания термины "антитело" или "антитела" представляют собой термины, принятые в данной области техники и понимаются, как относящиеся к молекулам или активным фрагментам молекул, которые связываются с известными антигенами, в частности, с молекулами иммуноглобулинов и с иммунологически активными фрагментами молекул иммуноглобулинов, то есть с молекулами, которые содержат участок связывания, который специфически связывается с антигеном. Иммуноглобулин представляет собой белок, содержащий один или более полипептидов, по сути, кодируемых генами каппа- и лямбда-, альфа-, гамма-, дельта-, эпсилон- и мю-цепи константной области иммуноглобулина, а также множеством генов вариабельных областей иммуноглобулина. Легкие цепи классифицируются либо как каппа-, либо как лямбда-цепи. Тяжелые цепи классифицируются как гамма-, мю-, альфа-, дельта- или эпсилон-цепи, которые в свою очередь определяют классы иммуноглобулинов, IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно. Также известны подклассы тяжелых цепей. Например, тяжелые цепи IgG человека могут относиться к любому из подклассов IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Иммуноглобулины в соответствии с настоящим изобретением могут относиться к любому классу (IgG, IgM, IgD, IgE, IgA и IgY) или подклассу (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) молекулы иммуноглобулина. В одном варианте реализации изобретения тяжелая цепь IgG представляет собой IgG1 N297G, содержащий замену аспарагина на глицин в положении 297 Fc области.
Антитела со сниженной эффекторной функцией включают антитела с заменой одного или более 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 остатков Fc области (патент США №6,737,056) в соответствии с системой нумерации EU. Такие мутанты Fc включают мутантов Fc с заменами в двух или более аминокислотных положениях 265, 269, 270, 297 и 327, в том числе так называемые мутанты Fc "DANA" с заменой остатков 265 и 297 на аланин (патент США 7,332,581).
Описаны некоторые варианты антител с улучшенным или ухудшенным связыванием с FcRs. (Смотри, например, патент США №6,737,056; Международную патентную заявку WO 2004/056312 и публикацию Shields с соавторами, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604(2001)).
В некоторых вариантах реализации изобретения вариант антитела содержит Fc область с одной или более аминокислотными заменами, которые улучшают ADCC (антителозависимую клеточно-обусловленную цитотоксичность), например, с заменами в положениях 298, 333 и/или 334 Fc области (EU нумерация остатков).
В некоторых вариантах реализации изобретения изменения сделаны в Fc области, что привело к изменению (то есть либо к улучшению, либо к ухудшению) связывания С1 q и/или комплементзависимой цитотоксичности (CDC), например, как описано в патенте США №6,194,551, Международной патентной заявке WO 99/51642 и публикации Idusogie с соавторами, J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
Антитела с увеличенным периодом полураспада и улучшенным связыванием с неонатальным Fc рецептором (FcRn), который отвечает за перенос материнских IgG плоду (публикации Guyer с соавторами, J. Immunol. 117:587 (1976) и Kim с соавторами, J. Immunol. 24:249 (1994)), описаны в US2005/0014934A1 (публикация Hinton с соавторами). Данные антитела содержат Fc область с одной или более заменами в них, которые улучшают связывание Fc области с FcRn. Такие варианты Fc включают варианты с заменами в одном или более остатках Fc области: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 или 434, например, с заменой остатка 434 Fc области (патент США №7,371,826).
Смотри также публикацию Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); патент США №5,648,260; патент США №5,624,821; и Международную патентную заявку WO 94/29351 в отношении других примеров вариантов Fc области.
В контексте данного описания термин "специфически связывает (связывается)" в отношении антитела означает, что антитело связывается с его целевым антигеном с более высокой аффинностью, чем при связывании с другим в структурном отношении антигеном (антигенами).
L
H
Известно, что типичная структурная единица иммуноглобулина содержит тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, каждая пара обладает одной "легкой" (около 25 кДа) и одной "тяжелой" цепью (около 50-70 кДа). N-конец каждой цепи определяет вариабельную область, состоящую из около 100-110 или более аминокислот, которые в первую очередь отвечают за распознавание антигена. Термины вариабельная легкая цепь (V) и вариабельная тяжелая цепь (V) относятся к этим легким и тяжелым цепям соответственно.
2
H
1
2
2
Антитела существуют в виде полноразмерных интактных антител или в виде множества хорошо охарактеризованных фрагментов, полученных в результате расщепления различными пептидазами или химическими веществами. Так, например, пепсин расщепляет антитело ниже дисульфидных связей в шарнирном участке с образованием F(ab'), димера Fab, который сам по себе представляет собой легкую цепь, соединенную с V-CH дисульфидной связью. F(ab') может быть восстановлен в мягких условиях с разрушением дисульфидной связи в шарнирном участке, вследствие чего происходит превращение димера F(ab') в мономер Fab'. Мономер Fab', по сути, представляет собой фрагмент Fab с частью шарнирного участка (смотри, Fundamental Immunology, W. Е. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993), где более подробно описаны другие фрагменты антител). Несмотря на то, что различные фрагменты антител описывают с позиций расщепления интактного антитела, специалисту в данной области техники должно быть очевидно, что любой из множества фрагментов антител можно вновь синтезировать либо химически, либо с использованием метода рекомбинантных ДНК. Таким образом, термин антитело в контексте данного описания также включает фрагменты антител, полученные либо посредством модификации полных антител, либо вновь синтезированных, либо антител и фрагментов, полученных с использованием метода рекомбинантных ДНК.
2
В пределах настоящего изобретения "антитела" предназначены включать моноклональные антитела, поликлональные, химерные, одноцепочечные, биспецифические, симианизированные, человеческие и гуманизированные антитела, антитела верблюдовых, диатела, а также их функциональные части или активные фрагменты. Примеры активных фрагментов молекул, которые связываются с известными антигенами, включают разделенные легкие и тяжелые цепи, фрагменты Fab, Fab/c, Fv, Fab' и F(ab'), в том числе продукты экспрессионной библиотеки фрагментов Fab иммуноглобулинов и связывающиеся с эпитопом фрагменты любых антител и их указанных выше фрагментов.
Данные активные фрагменты могут быть получены из антитела, предлагаемого в настоящем изобретении, с помощью многочисленных методик. Например, очищенные моноклональные антитела можно расщеплять ферментом, таким как пепсин, и подвергать ВЭЖК-гель-фильтрации. Затем соответствующую фракцию, содержащую фрагменты Fab, можно собирать и концентрировать с помощью фильтрации через мембрану и тому подобного. Для дополнительного описания общих методик для выделения активных фрагментов антител смотри, например, публикации Khaw, В. А. с соавторами, J. Nucl. Med. 23:1011-1019 (1982); Rousseaux с соавторами, Methods Enzymology, 121:663-69, Academic Press, (1986).
Рекомбинантные антитела могут представлять собой обычные полноразмерные антитела, активные фрагменты антител, известные при протеолитическом расщеплении, одиночные активные фрагменты антител, такие как Fv или одноцепочечные Fv (scFv), антитела с удаленными доменом и тому подобное. Размер антитела Fv составляет около 50 кДа и данное антитело содержит вариабельные области легкой и тяжелой цепи. Полипептид одноцепочечного Fv ("scFv") представляет собой ковалентно связанный гетеродимер VH::VL, который может экспрессироваться нуклеиновой кислотой, содержащей кодирующие VH- и VL-последовательности, соединенные либо непосредственно, либо соединенные с помощью кодирующего пептид линкера. Смотри публикацию Huston, с соавторами (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883. Известен ряд структур для превращения встречающихся в естественных условиях агрегированных, но химически разделенных легких и тяжелых полипептидных цепей из V области антитела в молекулы scFv, которые складываются в трехмерную структуру, по сути, аналогичную структуре антигенсвязывающего участка. Смотри, например, патенты США №№5,091,513, 5,132,405 и 4,956,778.
Антигенсвязывающий активный центр антитела относится к части молекулы антитела, которая участвует в связывании антигена. Антигенсвязывающий участок образуется аминокислотными остатками N-концевых вариабельных ("V") областей тяжелой ("Н") и легкой ("L") цепей. Вариабельные области антитела содержат три высоко неоднородных участка, которые называют "гипервариабельными областями" или "определяющими комплементарность областями" (CDR), которые расположены между более консервативными фланкирующими участками, которые известны как "каркасные области" (FR). В молекуле антитела три гипервариабельные области легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3) и три гипервариабельные области тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2 и HCDR3) расположены относительно друг друга в трехмерном пространстве, образуя антигенсвязывающую поверхность или "карман". Таким образом, антигенсвязывающий активный центр антитела представляет аминокислоты, которые образуют CDR антитела, и любые каркасные остатки, которые образуют "карман" участка связывания.
Идентичность аминокислотных остатков в конкретном антителе, которые образуют антигенсвязывающий активный центр антитела, можно определить с помощью способов, хорошо известных в данной области техники. Например, CDR антитела можно определить как гипервариабельные области, определение которым первоначально дал Kabat с соавторами (смотри, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," E. Kabat с соавторами, U.S. Department of Health and Human Services; Johnson, G и Wu, TT (2001) Kabat Database and its applications: future directions. Nucleic Acids Research, 29: 205-206; http://immuno.bme.nwa.edu). Положения CDR можно также определить как структурные петлеобразные структуры, первоначально описанные у Chothia и других (смотри публикацию Chothia и Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901 (1987), Chothia с соавторами, Nature 342, 877 (1989) и Tramontanoc соавторами, J. Mol. Biol. 215, 175 (1990)). Другие способы включают "определение АbМ", которое представляет собой компромисс между HVR Kabat и петлеобразными структурами Chothia, и получено с использованием Оксфордской программы молекулярного моделирования АbМ антител (Oxford Molecular's АbМ antibody modelling) (в настоящее время принадлежит компании Accelrys), или "определение контакта" CDR, выполненное Macallum с соавторами, ("Antibody-antigen interactions: contact analysis and binding site topography," J Mol Biol. 1996 Oct 11; 262(5): 732-45). Ниже представлены схемы идентификации CDR на основе различных известных определений.
Петля
Kabat
AbM
Chothia
Контакт
L1
L24--L34
L24--L34
L24--L34
L30--L36
L2
L50--L56
L50--L56
L50--L56
L46--L55
L3
L89--L97
L89--L97
L89--L97
L89--L96
H1
Н31--Н35В
Н26--Н35В
H26--H32..34
H30--H35B
(Нумерация Kabat)
H1
H31--H35
H26--H35
H26--H32
H30--H35
(Нумерация Chothia)
H2
H50--H65
H50--H58
H52--H56
H47--H58
H3
H95--H102
H95--H102
H95--H102
H93--H101
Ниже приведены общие руководства, с помощью которых можно определить CDR в антителе только на основе информации о последовательности:
LCDR1:
Начало - Приблизительно на остатке 24.
Остаток, расположенный перед участком, всегда представляет собой Cys.
Остаток, расположенный после участка, всегда представляет собой Тrp. Как правило, за TRP располагаются TYR-GLN, но также могут располагаться LEU-GLN, PHE-GLN или TYR-LEU.
Длина участка составляет 10-17 остатков.
LCDR2:
Начало - через 16 остатков после конца L1.
Расположенная перед участком последовательность, как правило, представляет собой ILE-TYR, но она может также представлять собой VAL-TYR, ILE-LYS или ILE-РНЕ.
Длина участка, как правило, составляет 7 остатков.
LCDR3:
Начало - как правило, через 33 остатка после конца L2.
Остаток, расположенный перед участком, представляет собой Cys.
Расположенная за участком последовательность представляет собой РНЕ-GLY-X-GLY.
Длина участка составляет 7-11 остатков.
HCDR1:
Начало - приблизительно на остатке 26 (через четыре остатка после CYS) [Определение Chothia/AbM] согласно определению Kabat начало находится на 5 остатков дальше.
Расположенная перед участком последовательность представляет собой CYS-Х-Х-Х.
Последующие остатки представляют собой TRP, за которым, как правило, расположен VAL, но также может располагаться ILE или ALA.
Длина участка составляет 10-12 остатков согласно определению АbМ, в то время как определение Chothia исключает 4 последних остатка.
HCDR2:
Начало - через 15 остатков после конца CDR-H1 согласно определению Kabat/AbM.
Расположенная перед участком последовательность, как правило, представляет собой LEU-GLU-TRP-ILE-GLY (SEQ ID NO: 1), но возможен ряд вариантов.
Расположенная за участком последовательность представляет собой LYS/ARG-LEU/ILE/VAL/PHE/THR/ALA-THR/SER/ILE/ALA.
Длина участка составляет 16-19 остатков согласно определению Kabat (согласно определению АbМ участок заканчивается на 7 остатков раньше).
HCDR3:
Начало - через 33 остатка после конца CDR-H2 (через два остатка после CYS).
Расположенная перед участком последовательность представляет собой CYS-Х-Х (как правило, CYS-ALA-ARG).
Расположенная за участком последовательность представляет собой TRP-GLY-X-GLY.
Длина участка составляет 3-25 остатков.
Идентичность аминокислотных остатков конкретного антитела, которые расположены вне CDR, но тем не менее образуют часть антигенсвязывающего активного центра антитела благодаря боковой цепи, которая является частью линейной структуры антигенсвязывающего центра (то есть доступна для связывания через антигенсвязывающий центр), можно определять с помощью способов, хорошо известных в данной области техники, таких как молекулярное моделирование и рентгеновская кристаллография. Смотри, например, Riechmann с соавторами, (1988) Nature, 332:; 323-327.
Химерные антитела представляют собой антитела, в которых одна или несколько областей антитела получены из одних видов животных и одна или несколько областей антитела получены из других видов животных. Предпочтительное химерное антитело представляет собой антитело, которое включает области из иммуноглобулина приматов. Считается, что химерное антитело, которое можно применять для лечения человека, как правило, обладает вариабельными областями из антитела животного нечеловеческого происхождения, например, грызуна, и константными областями из иммуноглобулина человека. В противоположность этому, гуманизированное антитело использует CDR из антитела нечеловеческого происхождения, в которых большинство вариабельных каркасных областей или все из них получают из константных областей иммуноглобулина человека. Считается, что химерное антитело человека, как правило, обладает вариабельными областями из иммуноглобулина грызунов. Типичное химерное антитело человека обладает константными областями тяжелых цепей человека и константными областями легких цепей человека и вариабельными областями как тяжелых, так и легких цепей из антитела грызунов. Химерное антитело может содержать некоторые изменения в нативной аминокислотной последовательности константных областей человека и нативной последовательности вариабельной области грызунов. Химерные и гуманизированные антитела можно получать с помощью способов, хорошо известных в данной области техники, в том числе подходов, основанных на трансплантации CDR (смотри, например, патенты США №№5,843,708; 6,180,370; 5,693,762; 5,585,089; 5,530,101), стратегии, основанные на перестановке цепи (смотри, например, патент США №5,565,332; публикацию Rader с соавторами, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 95:8910-8915), стратегии молекулярного моделирования (патент США №5,639,641) и тому подобных.
Термин "гуманизированное антитело" в контексте настоящего описания в случае двухцепочечного антитела представляет собой антитело, в котором по меньшей мере одна цепь является гуманизированной. Цепь гуманизированного антитела обладает вариабельной областью, в которой одна или более каркасных областей являются человеческими. Гуманизированное антитело, которое является одноцепочечным, представляет собой антитело, цепь которого обладает вариабельной областью, в которой одна или более каркасных областей являются человеческими. Нечеловеческие участки вариабельной области цепи гуманизированного антитела или его фрагмента получают из источника, не относящегося к человеку, в частности, нечеловеческого антитела, как правило, из антитела грызунов. Вклад нечеловеческого антитела в гуманизированное антитело, как правило, представляет собой по меньшей мере один CDR участок, который находится между каркасными областями, полученными из одного (или более) иммуноглобулина (иммуноглобулинов) человека. Помимо этого, можно изменять поддерживающие каркасные остатки для сохранения аффинности связывания. Гуманизированное антитело может дополнительно содержать константные области (например, по меньшей мере одну константную область или ее часть в случае легкой цепи, и предпочтительно три константные области в случае тяжелой цепи). Константные области гуманизированного антитела, если они присутствуют, как правило, являются человеческими.
Гуманизированное антитело может дополнительно содержать константные области (например, по меньшей мере одну константную область или ее часть в случае легкой цепи, и предпочтительно три константные области в случае тяжелой цепи). Константные области гуманизированного антитела, если они присутствуют, как правило, являются человеческими.
Гуманизированное антитело может дополнительно относиться к антителам с вариабельной областью, в которой одна или более его каркасных областей содержат аминокислоты человека или приматов. Помимо этого, можно изменять поддерживающие каркасные остатки для сохранения аффинности связывания. Способы получения "гуманизированных антител" хорошо известны специалистам в данной области техники (смотри, например, публикации Queen с соавторами, Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson с соавторами, Bio/Technoloy, 9:421 (1991)).
"Гуманизированное антитело" также может быть получено с помощью нового подхода генной инженерии, который позволяет получать человекоподобные поликлональные антитела с созревшей аффинностью у крупных животных, например, таких как кролики (http://www.rctech.com/bioventures/therapeutic.php).
Термин "полностью человеческое антитело" или "человеческое" антитело предназначен для обозначения антитела, полученного из трансгенных мышей, несущих гены антитела человека или из клеток человека. Тем не менее, для иммунной системы человека разница между "полностью человеческим", "человеческим" и "гуманизированным" антителами может быть незначительной или ее вовсе может не быть и, таким образом, все три из них могут быть одинаково эффективными и безопасными.
Термин константная область (CR) в контексте настоящего описания относится к генам константной области иммуноглобулина. Гены константной области кодируют часть молекулы антитела, которая придает эффекторные функции. В химерных антителах человека и гуманизированных антителах, как правило, нечеловеческого происхождения (например, мышиных), константные области замещены константными областями человека. Константные области подвергаемых воздействию химерных или гуманизированных антител, как правило, получают из иммуноглобулинов человека. Константная область тяжелой цепи может быть выбрана из любого из пяти изотипов: альфа, дельта, эпсилон, гамма или мю. Дополнительно тяжелые цепи различных подклассов (таких как подклассы IgG тяжелых цепей) отвечают за различные эффекторные функции и, таким образом, посредством выбора желаемой константной области тяжелой цепи могут быть получены антитела с желаемой эффекторной функцией. Константные области, которые могут быть использованы в пределах настоящего изобретения, представляют собой гамма 1 (IgG1), в частности, Fc область изотипа гамма 1 (IgG1), гамма 1 N297G (IgG1 N297G), гамма 3 (IgG3) и особенно гамма 4 (IgG4). Тип константной области легкой цепи может быть каппа или лямбда, предпочтительно - каппа. В одном варианте реализаций изобретения константная область легкой цепи представляет собой константную цепь каппа человека (публикация Heiter с соавторами (1980) Cell 22:197-207), а тяжелая константная цепь представляет собой константную цепь IgG4 человека.
Термин "моноклональное антитело" также является хорошо известным в данной области техники и относится к антителу, которое массово производится в лаборатории из одного клона, и которое распознает только один антиген. Моноклональные антитела, как правило, создают путем слияния антителопродуцирующей В-клетки, как правило, с коротким временем жизни, с быстро растущей клеткой, такой как раковая клетка (иногда ее называют "иммортализованной" клеткой). Образовавшаяся в результате гибридная клетка или гибридома быстро размножается, создавая клон, который продуцирует большие количества антител. Для целей настоящего изобретения под "моноклональным антителом" также понимают антитела, полученные с помощью материнского клона, который еще не достиг полной моноклональности.
В контексте настоящего описания термин "гибридизировать" относится к общепринятым условиям гибридизации, предпочтительно - к условиям гибридизации, при которых в качестве раствора применяют 5xSSPE, 1% ДСН (додецилсульфат натрия), 1-кратный (1х) раствор Денхардта и/или температура гибридизации составляет от 35°C до 70°C, предпочтительно - при 65°C. После гибридизации промывку предпочтительно сначала выполняют с применением 2×SSC, 1% ДСН, а затем 0,2×SSC при температуре от 35°C до 70°C, предпочтительно - при 65°C (для определения SSPE, ДСН и раствора Денхардта смотри публикацию Sambrook с соавторами, в цитированном месте). Строгие условия гибридизации, например, которые описаны в публикации Sambrook с соавторами, см. выше, являются наиболее предпочтительными. Особенно предпочтительными строгими условиями гибридизации являются, например, условия, при которых гибридизацию и промывку выполняют при 65°C, как указано выше. Менее предпочтительными являются нестрогие условия гибридизации, например, при которых гибридизацию и промывку выполняют при 45°C, и еще менее предпочтительно - когда их выполняют при 35°C.
"Гомологию" между двумя последовательностями определяют по идентичности последовательностей. Если две последовательности, которые требуется сравнить друг с другом, имеют различную длину, то идентичность последовательностей предпочтительно относится к проценту нуклеотидных остатков более короткой последовательности, которые идентичны нуклеотидным остаткам более длинной последовательности. Обычно идентичность последовательностей можно определять с помощью компьютерных программ, таких как программа Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, версия 8 для Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive Madison, WI 53711). Программа Bestfit использует локальный алгоритм гомологии Смита и Ватермана (Smith и Waterman), Advances in Applied Mathematics 2 (1981), 482-489, для поиска сегмента с самой высокой идентичностью последовательности между двумя последовательностями. При использовании Bestfit или другой программы выравнивания последовательностей с целью определения того, идентична ли конкретная последовательность, например, на 95% эталонной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, параметры предпочтительно регулируют таким образом, чтобы процент идентичности рассчитывался для всей длины эталонной последовательности, и при этом, чтобы допускались гэпы в гомологии вплоть до 5% от общего количества нуклеотидов в эталонной последовательности. При использовании программы Bestfit так называемые необязательные параметры предпочтительно оставляют такими, значения которых были установлены предварительно ("по умолчанию"). Отклонения, появляющиеся при сравнении данной последовательности и описанных выше последовательностей, предлагаемых в настоящем изобретении, могут быть вызваны, например, добавлением, делецией, заменой, инсерцией или рекомбинацией. Такое сравнение последовательностей можно предпочтительно выполнять с помощью программы "fasta20u66" (версия 2.0u66, сентябрь 1998 года, разработана William R. Pearson и Университетом Вирджинии; смотри также публикацию W.R. Pearson (1990), Methods in Enzymology 183, 63-98, прилагаемые примеры и http://workbench.sdsc.edu/). Для этой цели можно использовать установку значений параметров "по умолчанию".
Антитело в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой иммуноглобулин или антитело, для которого установлено, что каждый из его участков связывания является идентичным (в случае поливалентного антитела) или, в альтернативном варианте, оно может представлять собой "биспецифическое" или "бифункциональное антитело".
"Биспецифическое" или "бифункциональное антитело" представляет собой искусственное гибридное антитело с двумя различными парами тяжелых/легких цепей и двумя различными участками связывания. Биспецифические антитела можно получать различными способами, в том числе посредством слияния гибридом или связывания фрагментов Fab'. Смотри, например, публикации Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny с соавторами, J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).
Термин "антиген" относится к объекту или его фрагменту, который может индуцировать иммунный ответ в организме, в частности, животного, в частности, млекопитающего, в том числе человека. Данный термин включает иммуногены и области, ответственные за антигенность или антигенные детерминанты.
В контексте настоящего описания термин "растворимый" означает частично или полностью растворенный в водном растворе.
Также в контексте настоящего описания термин "иммуногенный" относится к веществам, которые вызывают или усиливают выработку антител, Т-клеток и других реактивных иммунных клеток, направленных против иммуногенного агента, и влияют на иммунный ответ у человека или животных.
Иммунный ответ возникает, когда индивидуум продуцирует достаточное количество антител, Т-клеток и других реактивных иммунных клеток против вводимых иммуногенных композиций по настоящему изобретению с целью смягчить или облегчить заболевание, подлежащее лечению.
Термин иммуногенность в контексте настоящего описания относится к мере способности антигена вызывать иммунный ответ (гуморальный или клеточный) при введении реципиенту. Настоящее изобретение относится к подходам, которые снижают иммуногенность подвергаемых воздействию химерных человеческих или гуманизированных антител.
Гуманизированное антитело со сниженной иммуногенностью относится к гуманизированному антителу, обладающему сниженной иммуногенностью относительно исходного антитела, например, мышиного антитела.
Гуманизированное антитело, по сути, сохраняющее связывающие свойства исходного антитела относится к гуманизированному антителу, которое сохраняет способность специфически связывать антиген, распознаваемый исходным антителом, используемым для получения такого гуманизированного антитела. Предпочтительно гуманизированное антитело будет обладать такой же или практически такой же антигенсвязывающей аффинностью и авидностью, что и исходное антитело. В идеале аффинность антитела будет не менее, чем 10% аффинности исходного антитела, более предпочтительно - не менее, чем около 30%, и наиболее предпочтительно - аффинность будет не менее, чем 50% аффинности исходного антитела. Способы анализа антигенсвязывающей аффинности хорошо известны в данной области техники и включают анализы полумаксимального связывания, конкурентные анализы и анализ Скэтчарда. В данной заявке описаны подходящие антигенсвязывающие анализы.
"Обратная мутация" представляет собой мутацию, введенную в нуклеотидную последовательность, которая кодирует гуманизированное антитело, данная мутация приводит к получению аминокислот, соответствующих аминокислотам в исходном антителе (например, донорское антитело, например, мышиное антитело). Определенные каркасные остатки из исходного антитела могут быть сохранены в процессе гуманизации антител, предлагаемых в настоящем изобретении, для того, чтобы, по сути, сохранить способность к связыванию исходного антитела, при этом минимизируя потенциальную иммуногенность получаемого в результате антитела. В одном варианте реализации настоящего изобретения исходное антитело имеет мышиное происхождение. Например, обратная мутация приводит к заменам каркасного остатка человека на исходный мышиный остаток. Примерами каркасных остатков, которые можно подвергать обратной мутации, являются, без ограничения указанными, канонические остатки, упаковывающие остатки поверхности раздела, необычные исходные остатки, которые примыкают к участку связывания, остатки в "зоне Вернье" (которая образует платформу, на которой располагаются CDR) (публикация Foote и Winter, 1992, J. Mol. Biol. 224, 487-499) и остатки, примыкающие к CDR Н3.
В контексте настоящего описания термин "консервативная замена" относится к изменениям, которые, по сути, являются нейтральными с позиций конформаций или антигенности, приводя к минимальным изменениям в третичной структуре мутантных полипептидов или приводя к минимальным изменениям в антигенных детерминантах мутантных полипептидов, соответственно, по сравнению с нативным белком. Что касается антител и фрагментов антител, предлагаемых в настоящем изобретении, консервативная замена означает аминокислотную замену, которая не приводит к отсутствию способности антитела к связыванию с рецептором-мишенью. Специалисты в данной области техники могут предсказывать, какие аминокислотные замены могут быть выполнены, при этом сохраняя высокую вероятность того, что они будут нейтральными с позиций конформаций или антигенности. Подобное руководство представлено, например в публикациях Berzofsky, (1985) Science 229:932-940 и Bowie с соавторами (1990) Science 247:1306-1310. Факторы, которые, как считается, влияют на вероятность сохранения конформационной и антигенной нейтральности включают, без ограничения указанными: (а) малую вероятность того, что замена гидрофобных аминокислот может повлиять на антигенность, так как более вероятно, что гидрофобные остатки локализованы внутри белка; (b) малую вероятность того, что замена сходных по физико-химическим характеристикам аминокислот может повлиять на конформацию, так как замещенная аминокислота структурно имитирует нативную аминокислоту; и (с) вероятность того, что изменение эволюционно консервативных последовательностей может оказать негативное воздействие на конформацию, так как считается, что такая консервативность предполагает, что аминокислотные последовательности могут иметь функциональное значение. Специалист в данной области техники может оценить конформационные изменения белка с помощью хорошо известных анализов, таких как, без ограничения указанными, методы фиксации микрокомплемента (публикации Wasserman с соавторами (1961) J. Immunol. 87:290-295; Levine с соавторами (1967) Meth. Enzymol. 11:928-936) и исследования связывания с использованием зависящих от конформаций моноклональных антител (Lewis с соавторами (1983) Biochem. 22:948-954).
Термин "гибридома" является признанным в данной области техники и специалистам в данной области понятно, что он относится к клетке, полученной посредством слияния антителообразующей клетки и иммортализованной клетки, например, клетки множественной миеломы. Данная гибридная клетка способна производить постоянный источник антитела. Смотри приведенное выше определение "моноклонального антитела" и приведенные ниже Примеры для более. подробного описания метода слияния.
Термин "носитель" в контексте настоящего описания означает структуру, в которую может быть включен антигенный пептид или надмолекулярная конструкция, или структуру, которая может быть связана с ними, тем самым представляя или подвергая антигенные пептиды или часть пептида воздействию иммунной системы человека или животного. Любая частица, которая может быть соответствующим образом использована в терапии животного или человека, такая как, например, пузырек, частица или микрочастица тела, может быть использована в качестве носителя в контексте настоящего изобретения.
Термин "носитель" дополнительно включает способы доставки, при которых надмолекулярные антигенные конструкционные композиции, содержащие антигенный пептид, можно перенести к желаемым участкам с помощью механизмов доставки. Один из примеров такой системы доставки использует коллоидные металлы, такие как коллоидное золото.
Белки-носители, которые могут быть использованы в надмолекулярных антигенных конструкционных композициях, предлагаемых в настоящем изобретении, включают, без ограничения указанными, связывающий мальтозу пептид "МВР"; бычий сывороточный альбумин "BSA"; гемоцианин лимфы улитки "KLH"; овальбумин; флагеллин; тироглобулин; сывороточный альбумин любых видов; гамма-глобулин любых видов; сингенные клетки; сингенные клетки, несущие Ia-антигены; и полимеры D- и/или L-аминокислот.
Кроме того термин "терапевтически эффективное количество" или "фармацевтически эффективное количество" относится к количеству связывающего пептида, которое при введении человеку или животному, является достаточным, чтобы привести к терапевтическому эффекту у указанного человека или животного. Специалист в данной области техники легко определит эффективное количество, следуя обычным процедурам.
Термины "фТау PHF", "PHF" и "парные спиральные филаменты" в настоящем описании используют как синонимы, и они относятся к парам филаментов, свитым в спирали с видимой при электронной микроскопии периодичностью, равной 160 нм. Ширина варьируется в диапазоне 10-22 нм. PHF представляют собой преобладающие структуры в нейрофибриллярных клубках болезни Альцгеймера (AD) и нейропильных нитях. PHF также можно увидеть в некоторых, но не всех дистрофических нейритах, связанных с нейритическими бляшками. Основным компонентом PHF является гиперфосфорилированная форма ассоциированного с микротрубочками белка тау. PHF может частично состоять из антипараллельных гиперфосфорилированных белков тау с дисульфидной связью. PHF тау могут быть укорочены на 20 С-концевых аминокислотных остатков. Механизмы, лежащие в основе строения PHF, являются неопределенными, но гиперфосфорилирование тау может отделить их от микротрубочек, увеличивая растворимый пул тау, из которого внутри нейронов могут образовываться PHF.
В рамках настоящего изобретения было продемонстрировано, что антителозависимый ответ на антигенную композицию в соответствии с настоящим изобретением в значительной степени является независимым от Т-клеток. Для этого использовали модель голой мыши, голых мышей вакцинировали, и ответы антител измеряли, чтобы оценить ответ Аβ-пептид-специфических антител под воздействием антигенной композиции в соответствии с настоящим изобретением у голых иммунизированных мышей. Голые мыши несут мутацию Foxnlnu и, как следствие, обладают сниженной функцией Т-клеток в связи с отсутствием должного тимуса.
Термин "фармацевтически эффективное количество" в контексте настоящего описания относится к дозе действующего вещества в фармацевтической композиции, достаточной для лечения или по меньшей мере частичной остановки симптомов заболевания, расстройства или состояния, подлежащего лечению, или любых осложнений, связанных с ними.
Настоящее изобретение относится к связывающим пептидам, распознающим и связывающимся с основными патологическими фосфоэпитопами белка тау. В частности, настоящее изобретение относится к специфическим антителам к линейным и конформационным, простым и сложным фосфоэпитопам на поверхности белка тау, которые, как полагают, отвечают за синапто- и нейротоксичность в таупатиях, в том числе AD.
Таким образом, в одном варианте реализации настоящее изобретение относится к химерному или гуманизированному антителу или его функциональному фрагменту, который распознает и специфически связывается с фосфоэпитопом на поверхности белка тау или на поверхности его фрагмента у млекопитающего, в частности, у человека, в частности, с патологическим конформером белка тау, но в одном варианте реализации настоящего изобретения не связывается с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или неродственными эпитопами, причем указанный связывающий пептид или антитело обладает высокой аффинностью связывания с константой диссоциации, равной по меньшей мере 10 нМ, в частности, по меньшей мере 8 нм, в частности, по меньшей мере 5 нМ, в частности, по меньшей мере 2 нМ, в частности, по меньшей мере 1 нМ, в частности, по меньшей мере 500 пМ, в частности, по меньшей мере 400 пМ, в частности, по меньшей мере 300 пМ, в частности, по меньшей мере 200 пМ, в частности, по меньшей мере 100 пМ, в частности, по меньшей мере 50 пМ.
Термин "растворимый тау" белок в контексте настоящего описания относится к белкам, состоящим из обоих полностью растворенных мономеров белков/пептидов тау или тауподобных пептидов/белков, или модифицированных или укороченных пептидов/белков тау или других производных мономеров белков/пептидов тау, и олигомеров белка тау. "Растворимый тау " исключает, в частности, нейрофибриллярные клубки (NFT).
Термин "нерастворимый тау" в контексте настоящего описания относится к множеству агрегированных мономеров пептидов или белков тау, или тауподобных пептидов/белков, или модифицированных или укороченных пептидов/белков тау, или других производных пептидов/белков тау, образующих олигомерные или полимерные структуры, которые являются нерастворимыми как in vitro в водной среде, так и in vivo в организме млекопитающего или человека, особенно - в головном мозге, но, в частности, относится к множеству агрегированных мономеров тау или модифицированных, или укороченных пептидов/белков тау или их производных, которые являются нерастворимыми в организме млекопитающего или человека, особенно - в головном мозге, соответственно. "Нерастворимый тау" включает, в частности, нейрофибриллярные клубки (NFT).
Термин "мономерный тау" или "мономер тау" в контексте настоящего описания относится к полностью солюбилизированным белкам тау без агрегированных комплексов в водной среде.
Термины "агрегированный тау", "олигомерный тау" и "олигомер тау" относятся к множеству агрегированных мономеров пептидов или белков тау, или тауподобных пептидов/белков, или модифицированных, или укороченных пептидов/белков тау, или других производных пептидов/белков тау, образующих олигомерные или полимерные структуры, которые являются нерастворимыми или растворимыми как in vitro в водной среде, так и in vivo в организме млекопитающего или человека, особенно - в головном мозге, но, в частности, относятся к множеству агрегированных мономеров тау или модифицированных, или укороченных пептидов/белков тау, или их производных, которые являются нерастворимыми или растворимыми в организме млекопитающего или человека, особенно - головном мозге, соответственно.
Термин "модулирующее антитело" относится к антителу или его функциональному фрагменту, как описано в данном документе в различных вариантах реализации, который может либо повышающе регулировать (например, активировать или стимулировать), понижающе регулировать (например, ингибировать или подавлять), либо иным образом изменять функциональное свойство, биологическую активность или уровень растворимого и/или нерастворимого белка тау, в частности, растворимого фосфорилированного белка тау в головном мозге, в частности, в коре головного мозга и/или гиппокампе животного, в частности, млекопитающего или человека с повышенным уровнем растворимого белка тау и/или растворимого фосфорилированного белка тау. Модулирующее антитело или его функциональный фрагмент может действовать таким образом, чтобы модулировать белок тау или полипептид, кодирующий указанный белок тау, либо прямо, либо косвенно. В некоторых вариантах реализации изобретения модулирующее антитело или его функциональный фрагмент снижает уровень растворимого и нерастворимого белка тау, в частности, растворимого фосфорилированного белка тау в головном мозге, в частности, в коре головного мозга и/или гиппокампе животного, в частности, млекопитающего или человека с повышенным уровнем растворимого белка тау и/или растворимого фосфорилированного белка тау.
В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей химерное антитело или гуманизированное антитело, или полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный связывающий пептид или антитело в соответствии с любым из вариантов реализации изобретения, описанным и заявленным в данном документе, или их комбинацию в терапевтически эффективном количестве вместе с фармацевтически приемлемым носителем.
Подходящие фармацевтические носители, разбавители и/или вспомогательные вещества хорошо известны в данной области техники и включают, например, фосфатно-солевые буферные растворы, воду, эмульсии, такие как масляные/водные эмульсии, различные типы увлажняющих компонентов, стерильные растворы и т.д.
В контексте настоящего описания термины "лечить", "предотвращать", "предотвращение" и "профилактика" относятся к профилактике рецидива или появления одного или более симптомов расстройства у субъекта в результате введения профилактического или терапевтического агента.
Конструирование Гуманизированных Антител
Настоящее изобретение может стать более понятным после ознакомления со следующим ниже подробным описанием конкретных вариантов реализации, включенным в данный документ. Несмотря на то, что настоящее изобретение было описано со ссылкой на конкретные детали некоторых вариантов его реализации, не следует рассматривать такие детали как ограничивающие объем настоящего изобретения.
Различные области HCVR и LCVR могут быть разработаны таким образом, чтобы содержать CDR нечеловеческого происхождения, полученные из донорского антитела, например, мышиного антитела, встроенного в нативные или модифицированные каркасные области, полученные у человека или приматов. В частности, модификация может касаться замены одного или более аминокислотных остатков в пределах каркасной области на остатки нечеловеческого происхождения, в частности, на мышиные остатки, наиболее часто встречающиеся в этом положении в соответствующих подгруппах, или на остатки, обладающие схожими свойствами с остатками, которые наиболее часто встречаются в этом положении в соответствующих подгруппах.
Модификация каркасной области каркасных последовательностей служит для сохранения правильной ориентации CDR в пространстве для взаимодействия с антигеном, и эти каркасные остатки даже иногда могут принимать участие в связывании антигена. В одном варианте реализации настоящего изобретения принимают меры для дальнейшей адаптации выбранных каркасных последовательностей человека, чтобы сделать их наиболее схожими с последовательностями каркасов грызунов, чтобы максимизировать вероятность того, что аффинность будет сохранена в реконструированном антителе.
Соответственно, мышиные остатки в каркасной области человека могут быть замещены. В частности, мышиные остатки могут быть замещены в человеческой каркасной области Вариабельной Области Тяжелой Цепи (HCVR) в положениях 47 или 94, или обоих, и в человеческой каркасной области Вариабельной Области Легкой Цепи (LCVR) в положениях 45 и/или 87, и/или 50, и/или 53, соответственно.
В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей химерное антитело или гуманизированное антитело, или полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный связывающий пептид или антитело в соответствии с любым из вариантов реализации изобретения, описанным и заявленным в данном документе, или их комбинацию в терапевтически эффективном количестве вместе с фармацевтически приемлемым носителем.
Подходящие фармацевтические носители, разбавители и/или вспомогательные вещества хорошо известны в данной области техники и включают, например, фосфатно-солевые буферные растворы, воду, эмульсии, такие как масляные/водные эмульсии, различные типы увлажняющих компонентов, стерильные растворы и т.д.
С использованием известных методик химерное антитело или гуманизированное антитело в соответствии с настоящим изобретением и их активные фрагменты могут быть получены в физиологически приемлемой композиции, и могут содержать фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и/или вспомогательное вещество. Например, антитела в соответствии с настоящим изобретением и как описано в данном документе объединяют с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем и/или вспомогательным веществом с образованием терапевтической композиции. Подходящие фармацевтические носители, разбавители и/или вспомогательные вещества хорошо известны в данной области техники и включают, например, фосфатно-солевые буферные растворы, воду, эмульсии, такие как масляные/водные эмульсии, различные типы увлажняющих компонентов, стерильные растворы и т.д.
Разработка фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением может быть выполнена в соответствии со стандартной методологией, известной специалистам в данной области техники.
Композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, могут быть введены субъекту в виде твердого вещества, жидкости или аэрозоля в подходящей фармацевтически эффективной дозе. Примеры твердых композиций включают таблетки, кремы и имплантируемые единицы дозирования. Таблетки могут быть введены перорально. Терапевтические кремы можно применять местно. Имплантируемые единицы дозирования могут быть введены локально, например, в месте опухоли, или могут быть имплантированы с целью систематического высвобождения терапевтической композиции, например, подкожно. Примеры жидких композиций включают препараты, адаптированные для введения внутримышечно, подкожно, внутривенно, внутриартериально, а также композиции для местного и внутриглазного введения. Примеры аэрозольных композиций включают ингаляционные композиции для введения в легкие.
Композиции могут быть введены с помощью стандартных способов введения. В целом, композиция может быть введена путем местного, перорального, ректального, назального, внутрикожного, внутрибрюшинного или парентерального (например, внутривенного, подкожного или внутримышечного) способа введения.
Помимо этого, композиция может быть включена в матрицы с замедленным высвобождением, такие как биоразлагаемые полимеры, полимеры, имплантированные в непосредственной близости от места желаемой доставки, например, в месте опухоли. Данный способ включает введение одной дозы, введение многократных доз с заданными интервалами времени и длительное введение в течение заданного периода времени.
В контексте настоящего описания матрица с замедленным высвобождением представляет собой матрицу, выполненную из материалов, как правило, полимеров, которые разлагаются посредством ферментативного или кислотного/щелочного гидролиза, или посредством растворения. После введения в организм матрица подвергается воздействию ферментов и биологических жидкостей. Матрицу с замедленным высвобождением предпочтительно выбирают из биосовместимых материалов, таких как липосомы, полилактиды (полилактидная кислота), полигликолид (полимер гликолевой кислоты), сополимер полилактида и гликолида (сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты), полиангидриды, сложные поли(орто)эфиры, полипептиды, гиалуроновая кислота, коллаген, хондроитинсульфат, карбоновые кислоты, жирные кислоты, фосфолипиды, полисахариды, нуклеиновые кислоты, полиаминокислоты, аминокислоты, такие фенилаланин, тирозин, изолейцин, полинуклеотиды, поливинилпропилен, поливинилпирролидон и силикон. Предпочтительная биоразлагаемая матрица представляет собой матрицу из любого следующего материала: полилактид, полигликолид или сополимер полилактида и гликолида (сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты).
Специалистам в данной области техники хорошо известно, что доза композиции будет зависеть от различных факторов, таких, например, как состояние, подлежащее лечению, конкретная применяемая композиция и другие клинические факторы, такие как вес, размер, пол и общее состояние здоровья пациента, площадь поверхности организма, конкретное соединение или композиция, подлежащая введению, другие совместно применяемые лекарственные средства и способ введения.
Композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть введена в комбинации с другими композициями, содержащими биологически активное вещество или соединение, такое как, например, известное соединение, используемое в медикаментозном лечении таупатий и/или амилоидозов, группы заболеваний и расстройств, связанных с амилоидом или амилоидоподобным белком, таким как β-амилоидный белок, участвующий в болезни Альцгеймера.
Другое биологически активное вещество или соединение может оказывать свой биологический эффект за счет такого же или сходного механизма действия, что и терапевтическая вакцина в соответствии с настоящим изобретением, или за счет несвязанного механизма действия, или за счет множества связанных и/или несвязанных механизмов действия.
Как правило, другое биологически активное соединение может представлять собой усилители переноса нейтронов, психотерапевтические лекарственные средства, ингибиторы ацетилхолинэстеразы, блокаторы кальциевых каналов, биогенные амины, транквилизаторы на основе бензодиазепинов, усилители синтеза, накопления или высвобождения ацетилхолина, агонисты постсинаптического рецептора ацетилхолина, ингибиторы моноаминоксидазы-А или -В, антагонисты рецептора N-метил-D-аспартатглутамата, нестероидные противовоспалительные лекарственные средства, антиоксиданты и антагонисты серотонергического рецептора.
В частности, биологически активное вещество или соединение может содержать по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из соединений против окислительного стресса, антиапоптозных соединений, хелаторов металлов, ингибиторов репарации ДНК, таких как пирензепин и метаболиты, 3-амино-1-пропансульфоновая кислота (3APS), 1,3-пропандисульфонат (1,3PDS), активаторы секретаз, ингибиторы [бета]- и γ-секретаз, белки тау, нейромедиатор, разрушители β-складчатой структуры, противовоспалительные молекулы, атипичные нейролептические средства, таких как, например, клозапин, зипрасидон, рисперидон, арипипразол или оланзапин, или ингибиторы холинэстеразы (ChEIs), таких как такрин, ривастигмин, донепезил и/или галантамин, и другие лекарственные средства и питательные добавки, таких как, например, витамин В 12, цистеин, предшественник ацетилхолина, лецитин, холин, гинкго билоба, ацетил-L-карнитин, идебенон, пропентофиллин или производное ксантина, совместно со связывающим пептидом в соответствии с настоящим изобретением, в том числе с антителами, в частности, с моноклональными антителами и их активными фрагментами, и, необязательно, с фармацевтически приемлемыми носителями и/или разбавителями, и/или вспомогательными веществами, а также инструкциями для лечения заболеваний.
В дополнительном варианте реализации композиция в соответствии с настоящим изобретением может содержать ниацин или мемантин совместно с химерным антителом или гуманизированным антителом в соответствии с настоящим изобретением, в том числе с антителами, в частности, с моноклональными антителами и их активными фрагментами, и, необязательно, с фармацевтически приемлемыми носителями и/или разбавителями, и/или вспомогательными веществами.
В еще одном варианте реализации настоящего изобретения предлагаемые композиции включают "атипичные нейролептические средства", такие как, например, клозапин, зипрасидон, рисперидон, арипипразол или оланзапин для лечения позитивных и негативных психотических симптомов, в том числе галлюцинаций, бреда, нарушения мышления (проявляющегося в выраженной непоследовательности действий, психическом расстройстве, тангенциальности мышления), и эксцентричного или неорганизованного поведения, а также ангедонии, притупленного аффекта, апатии и социального отчуждения, совместно с химерным антителом или гуманизированным антителом в соответствии с настоящим изобретением или его активными фрагментами, и, необязательно, с фармацевтически приемлемым носителем и/или разбавителем, и/или вспомогательным веществом.
Другими соединениями, которые можно надлежащим образом применять в композициях в дополнение к антителу или гуманизированному антителу в соответствии с настоящим изобретением, являются соединения, которые описаны, например, в Международной патентной заявке WO 2004/058258 (смотри, прежде всего, страницы 16 и 17), в том числе мишени терапевтических лекарственных средств (страницы 36-39), алкансульфоновые кислоты и алкансерные кислоты (страницы 39-51), ингибиторы холинэстеразы (страницы 51-56), антагонисты рецептора NMDA (страницы 56-58), эстрогены (страницы 58-59), нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (страницы 60-61), антиоксиданты (страницы 61-62), агонисты рецепторов, активируемых пероксисомальными пролифераторами (PPAR) (страницы 63-67), агенты, понижающие уровень холестерина (страницы 68-75); ингибиторы амилоида (страницы 75-77), ингибиторы образования амилоида (страницы 77-78), хелаторы металлов (страницы 78-79), антипсихотические средства и антидепрессанты (страницы 80-82), питательные добавки (страницы 83-89) и соединения, повышающие доступность биологически активных веществ в головном мозге (смотри страницы 89-93) и пролекарственные препараты (страницы 93 и 94); документ, который включен в настоящее описание в виде ссылки, но особенно соединения, упомянутые на страницах, указанных выше.
Белковое фармацевтически активное вещество может присутствовать в количествах от 1 нг до 30 мг на дозу. Как правило, схема приема может предусматривать введение от 0,1 мкг до 10 мг антитела в соответствии с настоящим изобретением, в частности, от 1,0 мкг до 1,0 мг и, в частности, от 1,0 мкг до 100 мкг, при этом все индивидуальные количества, входящие в указанный диапазон, также подпадают под объем настоящего изобретения. Если введение осуществляют путем непрерывной инфузии, то более приемлемая доза может составлять от 0,01 мкг до 10 мг на килограмм веса тела в час, при этом все индивидуальные количества, входящие в указанный диапазон, также подпадают под объем настоящего изобретения.
Введение, как правило, будет парентеральным, например, внутривенным или подкожным. Препараты для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. К неводным растворителям относятся, без ограничения указанными, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные растворители могут быть выбраны из группы, состоящей из воды, спиртовых/водных растворов, эмульсий или суспензий, в том числе физиологического раствора и буферной среды. Парентеральные наполнители включают раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, лактированный раствор Рингера или нелетучие масла. Наполнители для внутривенного введения представляют собой растворы для восполнения дефицита жидкости или питательных веществ, электролитные растворы (например, растворы на основе декстрозы Рингера) и другие вещества. Также могут присутствовать и консерванты, такие как, например, антимикробные средства, антиоксиданты, хелатирующие агенты, инертные газы и т.д.
Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать белковые носители, такие как, например, сывороточный альбумин или иммуноглобулин, в частности, человеческого происхождения. В зависимости от предполагаемого использования в фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением могут дополнительно присутствовать биологически активные вещества.
Если мишень для связывания локализована в головном мозге, конкретные варианты реализации настоящего изобретения предлагают химерное антитело или гуманизированное антитело в соответствии с настоящим изобретением, в том числе их активные фрагменты, для преодоления гематоэнцефалического барьера. Некоторые нейродегенеративные заболевания связаны с повышением проницаемости гематоэнцефалического барьера, так что связывающий пептид в соответствии с настоящим изобретением, в том числе антитела или их активные фрагменты, могут быть легко интродуцированы в головной мозг. Если гематоэнцефалический барьер остается интактным, существует несколько известных в данной области техники подходов для переноса молекул через него, в том числе, без ограничения указанными, физические методы, методы, основанные на применении липидов, а также методы, основанные на применении рецепторов и каналов.
Физические методы переноса химерного антитела или гуманизированного антитела в соответствии с настоящим изобретением, или их активных фрагментов, через гематоэнцефалический барьер включают, без ограничения указанными, полный обход гематоэнцефалического барьера или создание отверстий в гематоэнцефалическом барьере. Методы обхода включают, без ограничения указанными, непосредственное введение в головной мозг (смотри, например, публикацию Papanastassiou с соавторами, Gene Therapy 9: 398-406 (2002)) и имплантацию устройства для доставки в головной мозг (смотри, например, публикации Gill с соавторами, Nature Med. 9: 589-595 (2003); и Gliadel Wafers (ТМ), Guildford Pharmaceutical). Методы создания отверстий в барьере включают, без ограничения указанными, ультразвук (смотри, например, публикацию патента США №2002/0038086), осмотическое давление (например, посредством введения гипертонического раствора маннитола (публикация Neuwelt, Е. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N. Y. (1989)), пермеабилизацию с помощью, например, брадикинина или агента А-7, увеличивающего проницаемость (смотри, например, патенты США №№5,112,596, 5,268,164, 5,506,206 и 5,686,416), и трансфекцию нейронов, которые расположены в гематоэнцефалическом барьере, векторами, содержащими гены, кодирующие связывающий пептид или антигенсвязывающий фрагмент (смотри, например, публикацию патента США №2003/0083299).
:
Основанные на применении липидов методы переноса химерного антитела или гуманизированного антитела в соответствии с настоящим изобретением, в том числе антител, в частности, моноклональных антител или их активных фрагментов, через гематоэнцефалический барьер включают, без ограничения указанными, инкапсуляцию химерного антитела или гуманизированного антитела в соответствии с настоящим изобретением, или их активных фрагментов в липосомы, которые сшиты с их активными фрагментами, которые связываются с рецепторами на поверхности эндотелия сосудов гематоэнцефалического барьера (смотри, например, публикацию патентной заявки США №20020025313), и покрытие связывающего пептида в соответствии с настоящим изобретением, в том числе антител, в частности, моноклональных антител или их активных фрагментов, частицами липопротеинов низкой плотности (смотри, например, публикацию патентной заявки США №20040204354) или аполипопротеинов Е (смотри, например, публикацию патентной заявки США №20040131692).
Основанные на применении рецепторов и каналов методы переноса химерного антитела или гуманизированного антитела в соответствии с настоящим изобретением, или их активных фрагментов, через гематоэнцефалический барьер, включают, без ограничения указанными, применение глюкокортикоидных блокаторов для повышения проницаемости гематоэнцефалического барьера (смотри, например, публикации патентной заявки США №№2002/0065259, 2003/0162695 и 2005/0124533); активацию калиевых каналов (смотри, например, публикацию патентной заявки США №2005/0089473), ингибирование транспортеров лекарственных средств ABC (смотри, например, публикацию патентной заявки США №2003/0073713); покрытие антител трансферрином и модуляцию активности одного или более рецепторов трансферрина (смотри, например, публикацию патентной заявки США №2003/0129186), и катионизацию антител (смотри, например, патент США №5,004,697).
Кроме того, антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, могут быть сконструированы таким образом, чтобы воспользоваться преимуществом опосредованного рецептором переноса (RMT) через гематоэнцефалический барьер (ВВВ) с помощью различных использующих ВВВ рецепторов (то есть трансферринового рецептора, инсулинового рецептора, белка 8, связанного с рецептором липопротеинов низкой плотности, переносчика глюкозы 1 (Glut 1) и тому подобного) (смотри, например, Международную патентную заявку WO 9502421). Например, антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, можно сделать мультиспецифическими к целевому тау и рецептору ВВВ. Неограничивающий пример мультиспецифического антитела включает биспецифическое антитело, в котором одно плечо антитела представляет собой фрагмент антитела, предлагаемого в настоящем изобретении, а другое плечо антитела направлено на рецептор ВВВ, который опосредует перенос через ВВВ. Рецептор ВВВ, например, может включать трансферриновый рецептор (TfR), инсулиновый рецептор, инсулиноподобный фактор роста (рецептор IGF), белок 8, связанный с рецептором липопротеинов низкой плотности (LRP8), белок 1, связанный с рецептором липопротеинов низкой плотности (LRP1), переносчик глюкозы 1 (Glutl) и гепарин-связывающий фактор роста, подобный эпидермальному фактору роста (HB-EGF).
Одно или повторные введения химерного антитела или гуманизированного антитела в соответствии с настоящим изобретением, или их активного фрагмента, или фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением могут предоставляться субъекту в течение длительного периода времени. Продолжительность введения может составлять от 1 недели и до 12 месяцев или более. За это время связывающий пептид, антитело или фармацевтическую композицию можно вводить раз в неделю, раз в две недели, раз в три недели, раз в четыре недели и т.д. или с более высокой или более низкой частотой в зависимости от необходимости субъекта, подлежащего лечению.
В дополнительном варианте реализации настоящее изобретение относится к способам и наборам для детектирования и диагностики ассоциированных с белком тау заболеваний, расстройств или состояний, в том числе нейродегенеративных заболеваний или расстройств, таких как таупатии с гетерогенной группой нейродегенеративных заболеваний или расстройств, в том числе заболеваний или расстройств, которые демонстрируют сосуществование тау и амилоидных патологий, в том числе, без ограничения указанными, болезни Альцгеймера, болезни Крейцфельда-Якоба, деменции боксеров, синдрома Дауна, болезни Герстманна-Штреусслера-Шейнкера, миозита с включенными тельцами и прион-протеинцеребральной амилоидной ангиопатии, черепно-мозговой травмы и дополнительных заболеваний или нарушений, которые не демонстрируют четкой амилоидной патологии, в том числе, без ограничения указанными, бокового амиотрофического склероза/сочетания паркинсонизма и деменции (комплекс Гуама), негуамской болезни двигательного нейрона с нейрофибриллярными клубками, деменции аргирофильных зерен, кортикобазальной дегенерации, диффузных нейрофибриллярных клубков с кальцификацией, лобно-височной деменции с паркинсонизмом, связанной с мутацией на 17-й хромосоме, болезни Галлервордена-Шпатца, множественной системной атрофии, болезни Ниманна-Пика, тип С, паллидо-понто-нигральной дегенерации, болезни Пика, прогрессивного субкортикального глиоза, прогрессирующего надъядерного паралича, подострого склерозирующего панэнцефалита, деменции с преобладанием нейрофибриллярных клубков, постэнцефалитического паркинсонизма, миотонической дистрофии. Патологические расстройства могут быть вызваны или связаны с формированием нейрофибриллярных поражений, преобладающей патологии головного мозга при таупатий.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способам и наборам для диагностики предрасположенности к ассоциированным с белком тау заболеваниям, расстройствам или состояниям, в том числе к нейродегенеративным заболеваниям или расстройствам, таким как таупатий с гетерогенной группой нейродегенеративных заболеваний или расстройств, в том числе к заболеваниям или расстройствам, которые демонстрируют сосуществование тау и амилоидных патологий, или для мониторинга минимальной остаточной болезни у пациента или для прогнозирования реактивности пациента на лечение химерным антителом или гуманизированным антителом в соответствии с настоящим изобретением, или композицией в соответствии с настоящим изобретением, и как описано в данном документе. Данные методы включают известные иммунологические методы, обычно используемые для детектирования или количественного определения веществ в биологических образцах или в условиях in situ.
Диагностика ассоциированного с белком тау заболевания или состояния, или предрасположенности к ассоциированному с белком тау заболеванию или состоянию у субъекта, нуждающегося в этом, в частности, у млекопитающего, в частности, у человека, в том числе к нейродегенеративным заболеваниям или расстройствам, таким как таупатий с гетерогенной группой нейродегенеративных заболеваний или расстройств, в том числе к заболеваниям или расстройствам, которые демонстрируют сосуществование тау и амилоидных патологий, может быть достигнута посредством детектирования иммуноспецифического связывания связывающего пептида в соответствии с настоящим изобретением, в частности, антитела, в частности, моноклонального антитела или его активного фрагмента, с эпитопом белка тау в образце или in situ, которое включает приведение образца или определенной части тела, или участка тела, который предположительно содержит белок тау, в контакт с антителом, которое связывается с эпитопом белка тау, разрешения антителу связываться с белком тау с образованием иммунологического комплекса, детектирования образования иммунологического комплекса и установления корреляции между присутствием или отсутствием иммунологического комплекса и присутствием или отсутствием белка тау в образце или определенной части тела, или участке, при необходимости, сравнения количества иммунологического комплекса с нормальным контрольным значением, причем повышение количества иммунологического комплекса по сравнению с нормальным контрольным значением свидетельствует о том, что субъект страдает от ассоциированного с белком тау заболевания или состояния или подвержен риску его развития.
Мониторинг минимальной остаточной болезни у субъекта, в частности, у млекопитающего, в частности, у человека, после лечения связывающим пептидом в соответствии с настоящим изобретением, в том числе антителами, в частности, моноклональными антителами и их активными фрагментами, или композицией в соответствии с настоящим изобретением, можно достичь посредством детектирования иммуноспецифического связывания связывающего пептида в соответствии с настоящим изобретением, в частности, антитела, в частности, моноклонального антитела или его активного фрагмента, с эпитопом белка тау в образце или in situ, которое включает приведение образца или определенной части тела, или участка тела, который предположительно содержит белок тау, в контакт со связывающим пептидом в соответствии с настоящим изобретением, в том числе с антителами, в частности, моноклональными антителами и их активными фрагментами, которые связываются с эпитопом белка тау, посредством разрешения связывающему пептиду в соответствии с настоящим изобретением, в том числе антителам, в частности, моноклональным антителам и их активным фрагментам, связываться с белком тау с образованием иммунологического комплекса, детектирования образования иммунологического комплекса и установления корреляции между присутствием или отсутствием иммунологического комплекса и присутствием или отсутствием белка тау в образце или определенной части тела, или участке, при необходимости, сравнения количества указанного иммунологического комплекса с нормальным контрольным значением, причем повышение количества указанного иммунологического комплекса по сравнению с нормальным контрольным значением свидетельствует о том, что субъект может все еще страдать от минимальной остаточной болезни.
Прогнозирования реактивности субъекта, в частности, млекопитающего, в частности человека, на лечение химерным антителом или гуманизированным антителом в соответствии с настоящим изобретением, или композицией в соответствии с настоящим изобретением, можно достичь посредством детектирования иммуноспецифического связывания связывающего пептида, в частности, моноклонального антитела или его активного фрагмента, с эпитопом белка тау в образце или in situ, которое включает приведение образца или определенной части тела, или участка тела, который предположительно содержит белок тау, в контакт со связывающим пептидом в соответствии с настоящим изобретением, в том числе с антителами, в частности, моноклональными антителами и их активными фрагментами, которые связываются с эпитопом белка тау, посредством разрешения химерному антителу или гуманизированному антителу в соответствии с настоящим изобретением, или их активным фрагментам, связываться с белком тау с образованием иммунологического комплекса, детектирования образования иммунологического комплекса и установления корреляции между присутствием или отсутствием иммунологического комплекса и присутствием или отсутствием белка тау в образце или определенной части тела, или участке, при необходимости, сравнения количества указанного иммунологического комплекса до и после начала лечения, причем снижение количества указанного иммунологического комплекса свидетельствует о том, что указанный пациент обладает высоким потенциалом реактивности на лечение.
Биологические образцы, которые могут быть использованы для диагностики ассоциированного с белком тау заболевания или состояния, для диагностики предрасположенности к ассоциированному с белком тау заболеванию или состоянию, в том числе к нейродегенеративным заболеваниям или расстройствам, к таким как таупатий с гетерогенной группой нейродегенеративных заболеваний или расстройств, в том числе к заболеваниям или расстройствам, которые демонстрируют сосуществование тау и амилоидных патологий, или для мониторинга минимальной остаточной болезни у пациента, или для прогнозирования реактивности пациента на лечение химерным антителом или гуманизированным антителом в соответствии с настоящим изобретением, или их активными фрагментами, или композициями в соответствии с настоящим изобретением, и, как описано в данном документе, представляют собой, например, жидкости, такие как сыворотка, плазма, слюна, желудочные секреции, слизь, цереброспинальная жидкость, лимфатическая жидкость и тому подобное, или ткани, или образцы клеток, полученные из организма, такие как нервные, мозговые, сердечные или сосудистые ткани. Для определения присутствия или отсутствия белка тау в образце могут быть применены любые методы иммунологического анализа, известные специалистам в данной области техники, такие как, например, анализы, которые используют методы косвенного детектирования с использованием вторичных реагентов для детектирования, анализы ELISA (ферментсвязывающий иммуносорбентный анализ) и иммунопреципитации, и агглютинации. Подробное описание этих анализов приведено, например, в публикации Harlow и Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1988 555-612), Международных патентных заявках WO 96/13590 на имя Maertens и Stuyver, Zrein с соавторами (1998) и WO 96/29605.
Для диагностики in situ химерное антитело или гуманизированное антитело в соответствии с настоящим изобретением, в том числе антитела, или их активные фрагменты, могут быть введены в организм, подлежащий диагностике, с применением методов, известных в данной области техники, таких как, например, внутривенная, подкожная, интраназальная, внутрибрюшинная, внутримозговая, внутриартериальная инъекция, таким образом, чтобы могло произойти специфическое связывание между антителом в соответствии с настоящим изобретением и эпитопной областью на амилоидном белке. Комплекс "связывающий пептид/антиген" может быть легко детектирован посредством метки, прикрепленной к химерному антителу или гуманизированному антителу в соответствии с настоящим изобретением, или их функциональному фрагменту, или с применением любого другого способа детектирования, известного в данной области техники.
Иммунологические анализы, используемые для диагностики или для диагностики предрасположенности к ассоциированному с белком тау заболеванию или состоянию, в том числе к нейродегенеративным заболеваниям или расстройствам, к таким как таупатий с гетерогенной группой нейродегенеративных заболеваний или расстройств, в том числе к заболеваниям или расстройствам, которые демонстрируют сосуществование тау и амилоидных патологий, или для мониторинга минимальной остаточной болезни у пациента, или для прогнозирования реактивности пациента на лечение химерным антителом или гуманизированным антителом в соответствии с настоящим изобретением, в том числе антителами, или их активными фрагментами, или композицией в соответствии с настоящим изобретением, и, как описано в данном документе, как правило, основаны на использовании меченых антигенов, связывающих пептидов или вторичных реагентов, предназначенных для детектирования. Данные белки или реагенты можно метить соединениями, как правило, известными специалистам в данной области техники, в том числе ферментами, радиоизотопами и флуоресцентными, люминесцентными и хромогенными веществами, в том числе, без ограничения указанными, окрашенными частицами, такими как коллоидное золото и латексные гранулы. Из указанных методов радиоактивную маркировку можно применять практически во всех типах анализов и с наибольшим количеством вариаций. В частности, ферментные метки применяют, если требуется избежать радиоактивности или если необходимо быстро получить результаты. Несмотря на то, что для применения флуорохромов требуется дорогостоящее оборудование, они обеспечивают очень чувствительный метод детектирования. Связывающие пептиды, применяемые в данных анализах, представляют собой связывающие пептиды, которые раскрыты и заявлены в данном описании, в том числе моноклональные антитела, поликлональные антитела и аффинно очищенные поликлональные антитела.
В альтернативном варианте, химерное антитело или гуманизированное антитело в соответствии с настоящим изобретением, или их активные фрагменты, можно метить косвенно посредством взаимодействия с мечеными веществами, которые обладают аффинностью к иммуноглобулину, такими как белок А или G, или вторичные антитела. Химерное антитело или гуманизированное антитело в соответствии с настоящим изобретением, или их активные фрагменты, могут быть конъюгированы с вторичным веществом и детектированы с помощью меченого третьего вещества, обладающего аффинностью ко второму веществу, конъюгированному с антителом. Например, химерное антитело или гуманизированное антитело в соответствии с настоящим изобретением, или их активные фрагменты, можно конъюгировать с биотином и детектировать конъюгат "связывающий пептид/биотин" с применением меченого авидина или стрептавидина. Аналогичным образом, связывающий пептид можно конъюгировать с гаптеном и детектировать конъюгат "связывающий пептид/гаптен" с применением меченого связывающего пептида к гаптену.
Специалистам в данной области техники должно быть известно об этих и других подходящих метках, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением. Связывание этих меток со связывающими пептидами или их фрагментами можно выполнить с применением стандартных методик, как правило, известных специалистам в данной области техники. Типовые методики описаны в публикациях Kennedy, J. Н., с соавторами, 1976 (Clin. Chim. Acta 70:1-31) и Schurs, А. Н. W. М., с соавторами, 1977 (Clin. Chim Acta 57:1-40). Упомянутые в последней ссылке методы связывания представляют собой метод на основе глутарового альдегида, метод на основе перйодата, метод на основе дималеимида и другие, все из которых включены в настоящее описание в виде ссылки.
Современные иммунологические анализы используют метод двойных антител для детектирования присутствия анализируемого вещества, при котором антитело метят косвенно посредством реактивности со вторым антителом, которое предварительно метят детектируемой меткой. Второе антитело предпочтительно представляет собой антитело, которое связывается с антителами животного, из которого получено моноклональное антитело. Другими словами, если моноклональное антитело представляет собой антитело мыши, то меченое второе антитело представляет собой антимышиное антитело. Для антитела, предназначенного для применения в анализе, который описан ниже, эта метка предпочтительно представляет собой сенсибилизированную антителами гранулу, в частности, магнитную гранулу. Для антитела, предназначенного для применения в иммунологическом анализе, описанном в данном документе, метка предпочтительно представляет собой детектируемую молекулу, такую как радиоактивное, флуоресцентное или электрохемилюминисцентное вещество.
В пределах объема настоящего изобретения можно применять также альтернативную систему, основанную на использовании двойных антител, которую зачастую называют системами быстрого формата, так как они адаптированы к быстрому детектированию присутствия анализируемого вещества. Для этой системы требуется высокая аффинность между антителом и анализируемым веществом. В соответствии с одним из вариантов реализации настоящего изобретения присутствие белка тау детектируют с применением пары антител, каждое из которых является специфичным для амилоидного белка. В контексте настоящего описания одно из указанной пары антител называют "детекторное антитело", а другое из указанной пары антител в контексте настоящего описания называют "иммобилизованное антитело". Моноклональное антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, можно применять как в качестве иммобилизованного антитела, так и в качестве детекторного антитела. Моноклональное антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, также можно применять как в качестве иммобилизованного, так и детекторного антитела в одном анализе. Таким образом, в одном из вариантов реализации настоящего изобретения применяют сэндвич-метод с использованием двойных антител для детектирования белка тау в образце биологической жидкости. В этом методе анализируемое вещество (белок тау) находится посередине между детекторным антителом и иммобилизованным антителом, которое необратимо иммобилизовано на твердой подложке. Детекторное антитело должно содержать детектируемую метку, предназначенную для идентификации присутствия сэндвича "антитело-анализируемое вещество" и, как следствие, присутствия анализируемого вещества.
Иллюстративные твердофазные вещества включают, без ограничения указанными, микротитрационные планшеты, лабораторные пробирки из полистирола, магнитные, пластиковые или стеклянные гранулы, а также предметные стекла, которые хорошо известны в области радиоиммунологического анализа и иммунноферментного анализа. Способы связывания антител с твердыми фазами хорошо известны специалистам в данной области техники. В последнее время в качестве твердых подложек начали применять целый ряд пористых материалов, таких как нейлон, нитроцеллюлоза, ацетат целлюлозы, стекловолокно и другие пористые полимеры.
Настоящее изобретение также относится к набору для диагностики, предназначенному для детектирования белка тау в биологическом образце, который содержит указанную выше композицию. Более того, настоящее изобретение относится к указанному набору для диагностики, который в дополнение к указанной выше композиции также содержит реагент для детектирования, указанный выше. Термин "набор для диагностики" в целом относится к любому набору для диагностики, известному в данной области техники. В частности, данный термин относится к набору для диагностики, который описан у Zrein с соавторами (1998).
Еще одним объектом настоящего изобретения являются новые иммунозонды и тест-наборы, предназначенные для детектирования и диагностики ассоциированных с белком тау заболеваний и состояний, которые содержат связывающие пептиды в соответствии с настоящим изобретением. Для применения иммунозондов связывающие пептиды прямо или косвенно присоединяют к подходящей репортерной молекуле, например, к ферменту или радионуклиду. Тест-набор включает контейнер, который содержит один или более связывающих пептидов в соответствии с настоящим изобретением, и инструкции по применению связывающих пептидов с целью связывания с тау-антигеном с образованием иммунологического комплекса и детектирования образования иммунологического комплекса таким образом, чтобы присутствие или отсутствие иммунологического комплекса коррелировало с присутствием или отсутствием белка тау.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Связывание hACI-36-2B6-Ab1 и hACI-36-3A8-Ab1 с пептидами Т4 с помощью ELISA
1.1. Способ
1.1.1 Анализ связывания фосфо-тау
Чтобы испытать связывание антитела с фТау, использовали анализ ELISA. 96-луночные планшеты Nunc MaxiSorp (Nunc, Дания) покрывали 10 мкг/мл тау-пептида тау401-418, фосфорилированного (Т4.5) или нет (Т4.6) по серину 409. Покрытие выполняли в течение ночи в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS, Sigma-Aldrich, Швейцария) при температуре 4°C. Планшеты тщательно промывали 0,05% Tween 20/PBS, а затем блокировали 1% бычьим сывороточным альбумином (BSA, Sigma-Aldrich) в 0,05% Tween 20/PBS в течение 1 ч при температуре 37°C. Затем супернатант, содержащий предназначенное для испытания антитело, добавляли в 8 двукратных разведений, начиная с 0,5 мкг/мл, и инкубировали в течение 2 ч при температуре 37°C. Затем планшеты промывали, как описано выше, и добавляли козьи антитела к IgG человека, конъюгированные с щелочной фосфатазой (АР) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Англия), при разведении 1/2'000 в 0,05% Tween 20/PBS в течение 2 ч при температуре 37°C. После промывки планшеты инкубировали с субстратным раствором щелочной фосфатазы с гексагидратом n-нитрофенилфосфата динатрия (pNPP; Sigma-Aldrich, Швейцария) и после 1 ч инкубации считывали при 405 нм с использованием считывающего устройства для микропланшетов (Tecan, Швейцария). Результаты выражали в единицах оптической плотности (O.D.).
1.2. Результаты
Связывание гуманизированных антител hACI-36-2B6-Ab1 и hACI-36-3A8-Ab1 с целевым фТау испытывали с применением прямых ELISA на пептидах Т4.5 и Т4.6. Оба антитела продемонстрировали высокое связывание с мишенью (Фигура 1). Связывание с соответствующим нефосфорилированным пептидом тау (Т4.6) не наблюдалось. Это демонстрирует высокое связывание антител hACI-36-2B6-Ab1 и hACI-36-3A8-Ab1 с мишенью.
Пример 2. Окрашивание фТау в головном мозге 20-месячных трансгенных мышей с таупатией (biGT) с помощью TAUPIR с применением hACI-36-2B6-Ab1 и hACI-36-3A8-Ab1.
2.1. Способ
2.1.1 Связывание анти-тау антитела с клубками тау на срезах головного мозга тау-трансгенного животного (TAUPIR)
2
2
2
2
Использовали срезы головного мозга старых (>18 месяцев) дважды трансгенных biGT (GSK-3β трансгенных мышей, скрещенных с мышами TPLH, содержащих самую длинную изоформу (441аа) белка тау человека с мутацией P301L) мышей с таупатией. Срезы головного мозга промывали в течение 5 мин в PBS, затем инкубировали в течение 15 мин при температуре среды в 1,5% НО в PBS: МеОН (1:1), чтобы блокировать активность эндогенной пероксидазы. После трехкратной промывки срезов в PBST (PBS/0,1% TritonX100) их инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в блокирующем растворе PBST+10% FCS (фетальной телячьей сыворотки). Затем срезы инкубировали с неразбавленным супернатантом, содержащим предназначенное для испытания антитело, в течение ночи при температуре 4°C. Затем выполняли трехкратную промывку срезов в PBST прежде, чем выполнить инкубацию с вторичным антителом к IgG4 человека (Invitrogen), конъюгированным с пероксидазой хрена, в PBST/10% FCS в течение 1 ч при комнатной температуре. Перед детектированием выполняли трехкратную промывку срезов в PBST и инкубировали в 50 мМ Tris/HCl, pH 7,6 в течение 5 мин. Детектирование выполняли посредством инкубации срезов в течение 3 мин в диаминобензидине (DAB: 1 таблетка в 10 мл 50 мМ Tris.HCl + 3 мкл НO 30%, MP Biomedicals, США). Реакцию останавливали посредством трехкратной промывки срезов в PBST. Затем срезы переносили на силанизированные стеклянные планшеты и сушили воздухом на теплом планшете при температуре 50°C в течение 2 часов. Контрастное окрашивание выполняли с использованием инкубации с гематоксилином Майера (Fluka Chemie, Швейцария) в течение 1 мин, после чего выполняли этап промывки в течение 4 мин в проточной водопроводной воде. Срезы дегидрировали посредством пропускания через ванну с 50%, 70%, 90% этанолом и двукратного пропускания через ванну со 100% этанолом, а затем двукратного пропускания через ксилол в течение 1 мин. Наконец, заключение под стеклянные покровные стекла выполняли с использованием DePeX (BDH Chemicals Ltd., Англия).
2.2. Результаты
Связывание гуманизированных антител hACI-36-2B6-Ab1 и hACI-36-3A8-Ab1 фТау в головном мозге трансгенных (biGT) мышей с таупатией оценивали посредством окрашивания TAUPIR. Антитела hACI-36-2B6-Ab1 (Фигура 2А и 2В) и hACI-36-3A8-Аb1 (Фигура 3А и 3В) продемонстрировали связывание с клубками тау и нейропильными нитями, присутствующими в головном мозге мышей с таупатией.
Пример 3. Исследования Связывания II: Аффинность антител с использованием Biacore/SPR
3.1 Способы
3.1.1 Анализ связывания с помощью SPR (поверхностного плазменного резонанса)
Для того, чтобы оценить связывающее взаимодействие между hACI-36-2B6-Аb1 и пептидом Т4.5, антитело hАСI-36-2В6-Аb1 иммобилизовали на сенсорном чипе, а затем вводили Т4.5 в качестве анализируемого вещества.
Опыты SPR выполняли с применением прибора Biacore ТЮО (GE Healthcare). Реагенты для иммобилизации (EDC, NHS и этаноламин) и сенсорный чип СМ7 (карбоксиметил декстрана) были приобретены у компании GE Healthcare. В качестве подвижного буфера использовали PBS (PBS Дульбекко, Sigma). Для правильной ориентации антитела для связывания с пептидом Т4.5 антитело связывали с сенсорной поверхностью с помощью Белка G. С этой целью рекомбинантный Белок G (Sigma) разводили из исходного раствора в воде (2 мг/мл) с 10 мМ ацетата натрия pH 4,0 (GE Healthcare) до 50 мкг/мл. Затем этот белковый раствор соединяли с проточной кюветой (fc) 2 сенсорного чипа СМ7, который был предварительно активирован с использованием EDC/NHS. После связывания этаноламин распространяли по поверхности чипа с достижением окончательного уровня иммобилизации, равного 9860 RU (единиц отклика) на fc1 и 9492 RU на fc2. Затем hACI-36-2B6-Ab1 разбавляли до 100 мкг/мл с использованием 10 мМ фосфатного буфера, pH 7,4 и вводили при 2 мкл/мин в течение 85 сек с достижением уровня иммобилизации, равного 8340 RU. Для того, чтобы обеспечить получение ровной базы до введения пептида Т4.5, PBS оставляли на сенсорной поверхности в течение почти 2 ч, а затем систему дважды грунтовали с использованием PBS. Пять концентраций пептида Т4.5 (50→800 нМ) анализировали с помощью 2-кратных серийных разведений с использованием проточного буфера. Инъекции выполняли, начиная с самой низкой концентрации, и проводили как для fc 1, так и для fc 2 при скорости потока, равной 50 мкл/мин, с использованием однотактного метода кинетики. Время как ассоциации, так и диссоциации составляло 90 сек для каждой концентрации пептида. Отклики от fc 1 вычитали из fc 2 для регулировки аппаратурного шума, рефракционных изменений массы и неспецифического связывания с поверхностью карбоксиметил декстрана. Кинетический анализ выполняли с использованием алгоритмов для численного интегрирования и общего анализа с помощью Biacore Т100, программного обеспечения для оценки. Для подгонки кривой все данные одновременно подстраивали под 1:1 гомогенную модель (Ленгмюра).
Используемый пептид
3.2 Результаты
а
d
D
5
-1
-1
-4
-1
Мониторинг связывания пептида тау с гуманизированным антителом hACI-36-2В6-Аb1 выполняли в режиме реального времени с использованием SPR. Анализы фаз ассоциации и диссоциации связывания антител можно использовать для определения константы скорости ассоциации (k), константы скорости диссоциации (k), а также константы диссоциации K. Выполняли кинетические анализы на связывание пептида Т4.5 с иммобилизованным антителом hACI-36-2B6-Ab1, которое продемонстрировало большую константу скорости ассоциации, равную 0,54×10 Мс, и константу скорости диссоциации, равную 36,0×10 с (Таблица ниже).
Пример 4. Картирование эпитопов
4.1 Способы
4.1.1 Анализ картирования эпитопов
Картирование эпитопов гуманизированных моноклональных антител к фосфорилированному тау выполняли посредством ELISA с использованием различных фосфо- и нефосфопептидных библиотек. Аминокислотные последовательности сканирования библиотек пептидов, предполагаемого эпитопа приведены в Таблице 5А. Кроме того, библиотека пептидов была сгенерирована с заменой каждого остатка пептидной последовательности, который связывается с антителом аланином (Ala), как показано в Таблице 5 В. Каждая библиотека состояла из коротких биотинилированных пептидов, охватывающих фосфо- и нефосфопоследовательности, присутствующие в вакцине пептида. Библиотеки пептидов были приобретены у ANAWA Trading SA. Картирование эпитопов выполняли в соответствии с инструкциями изготовителя (Mimotopes). Коротко, покрытые стрептавидином планшеты (NUNC) блокировали 0,1% BSA в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) в течение ночи при температуре 4°C. После промывки PBS-0,05% Tween 20 планшеты покрывали в течение 1 ч при комнатной температуре с разными пептидами из каждой библиотеки, растворенными в 0,1% BSA, 0,1% азида натрия в PBS до достижения конечной концентрации, равной 10 мкМ. После промывки планшеты инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с антителом, чтобы испытать при различных разведениях в 2% BSA и 0,1% азида натрия в PBS. Планшеты снова промывали и инкубировали с козьими антителами к IgG человека, конъюгированными с щелочной фосфатазой (АР) (Jackson Cat. 109-055-098, Серия 95531) при разведении 1/2000 в течение от 30 мин до 1 ч при комнатной температуре. После последней промывки планшеты инкубировали с субстратным раствором щелочной фосфатазы с гексагидратом n-нитрофенилфосфата динатрия (pNPP; Sigma-Aldrich, Букс, Швейцария) и после 2 ч инкубации считывали при 405 нм с использованием считывающего устройства для микропланшетов ELISA. Связывание считали положительным, если оптическая плотность (O.D.) была по меньшей мере в 2 раза выше O.D. фона.
4.2 Результаты
Эпитоп hACI-36-2B6-Ab1 определяли с использованием ELISA для связывания с пептидами, приведенными в Таблице 5А и 5В. Эпитоп антитела hACI-36-2B6-Ab1 картировали на области, содержащей аминокислотные остатки 404-411 самой длинной изоформы тау человека (тау441), с фосфорилированным S409 (pS409), и предпочтительным связыванием с аминокислотными остатками тау, Н407, pS409, N410h V411.
Депонирование:
Следующие плазмиды в бактериях (трансформированные E.coli) были депонированы по поручению AC Immune SA, PSE-EPFL Building В, 1015 Лозанна, Швейцария, в "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH" (Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур) (DSMZ) в Брауншвейге (Inhoffenstrasse 7 В, 38124 Braunschweig), в соответствии с положениями Будапештского договора (Будапештский договор о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры):
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ УКАЗАТЕЛЬ ССЫЛОЧНЫХ МАТЕРИАЛОВ
Alonso A.D., с соавторами (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94. 298-303
Alonso АС с соавторами (2008), Curr Alzheimer Res 5:375-384.
Alving с соавторами, (1992) Infect. Immun. 60:2438-2444
Asuni с соавторами, (2007) J Neurosc. 27 (34), 9115-29
Braak H., с соавторами (1993). Eur.Neurol., 33, 403-408
Gill с соавторами, Nature Med. 9: 589-595 (2003)
Greenberg S.G., с соавторами (1992), J Biol. Chem., 267, 564-569.
Harlow и Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1988 555-612
Hodgson с соавторами, (1991) Bio/Technoloy, 9:421
Hoffmann R., с соавторами (1997), Biochemistry, 36, 8114-8124.
Jicha GA, Weaver с соавторами (1999), J Neurosci 19:7486-7494.
Kabat EA, Wu TT, Perry HM, Gottesman KS, Foeller C. Sequences of proteins of
Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, 1991
Kennedy, J. H., с соавторами, 1976 (Clin. Chim. Acta 70:1-31)
Khaw, В. А. с соавторами (1982) J. Nucl. Med. 23:1011-1019
Lewis с соавторами, (2000) Nature Genetics, 25:402-405
Masliah с соавторами, (2005) Neuron, 46(6), 857-68
Masliah с соавторами, (2011) PLoS ONE, Volume 6(4), e19338, pp - 1-17
Muhs с соавторами, (2007) Proc Natl Acad Sci USA, 104(23), 9810-5
Muyllaert с соавторами, (2006) Rev Neurol, 162(10), 903-907
Muyllaert с соавторами, (2008) Genes Brain Behav., Suppl. 1, 57-66
Neuwelt. E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2,
Plenum Press, N. Y. (1989))
Nicolau с соавторами (2002) Proc Natl. Acad. Sci USA 99, 2332-2337
Nicoll с соавторами, (2003) Nature Med, 9, 448-452
Oddo с соавторами, (2004) Neuron, 43, 321-332
Queen с соавторами, (1989) Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032
Papanastassiou с соавторами, Gene Therapy 9: 398-406 (2002)
Reig S., с соавторами (1995), Acta Neuropathol., 90, 441-447
Ribe с соавторами, (2005) Neurobiol Dis, 20(3), 814-22
Roberson с соавторами, (2007) Science, 316 (5825), 750-4
Rosenmann с соавторами, (2006) Arch Neurol, 63(10), 1459-67
Rousseaux с соавторами Methods Enzymology, (1986), Academic Press 121:663-69
Schurs, A. H. W. M., с соавторами 1977 (Clin. Chim Acta 57:1-40
Terwel с соавторами, (2006) J Biol Chem, 280, 3963-3973
Terwel с соавторами, (2008) Am J pathol., 172(3), 786-98
Urushitiani с соавторами, (2007) Proc. Natl Acad Sci USA, 104(79, 2495-500
Vandebroek Т, с соавторами, "Phosphorylation and Aggregation of Protein Tau in Humanized Yeast Cells and in Transgenic Mouse Brain"; 7th International Conference on
Alzheimer's and Parkinson's Disease, Sorrento, Italy, March 9-13, 2005, pp 15-19
Vandebroek T, с соавторами (2006), J Biol Chem 281:25388-25397
Vanhelmont T, с соавторами (2010, FEMS Yeast Res 10:992-1005
Wagner с соавторами (2002) Journal of Liposome Research Vol 12(3), pp 259-270
WO 2010/115843
WO 2004/058258
WO 96/13590
WO 96/29605
Публикация патента США №2002/0038086
Публикация патента США №2003/0083299
Публикация патента США №2002/0025313
Публикация патента США №2004/0204354
Публикация патента США №2004/0131692
Публикация патента США №2002/0065259
Публикация патента США №2003/0162695
Публикация патента США №2005/0124533
Публикация патента США №2005/0089473
Публикация патента США №2003/0073713
Публикация патента США №2003/0129186
Патент США №5,112,596
Патент США №5,268,164
Патент США №5,506,206
Патент США №5,686,416
Патент США №5,004,697.