СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РЕЦЕПТИВНОСТИ ЭНДОМЕТРИЯ В ЦИКЛАХ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ
METHOD FOR PREDICTION OF ENDOMETRIAL RECEPTIVITY IN IN VITRO FERTILISATION CYCLES

Изобретение относится к медицине, а именно к области репродукции, и может быть использовано для прогнозирования рецептивности эндометрия в циклах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).
Известен способ прогнозирования рецептивности эндометрия в циклах ЭКО, включающий допплерометрическое исследование кровотока в сосудах матки (Wang L., Qiao J., Li R., Zhen X., Liu Z. Role of endometrial blood flow assessment with color Doppler energy in predicting pregnancy outcome of IVF-ET cycles. ReprodBiolEndocrinol. 2010; 18(8): 122). Wang и соавт. выявили, что систолодиастолическое отношение спиральных артерий (S/D) и индекс резистентности спиральных артерий (IR) в день введения триггера овуляции в группе женщин с клинически диагностированной беременностью значительно меньше, чем в группах женщин с не наступившей беременностью в результате ЭКО (P<0.001).
Недостатком способа является отсутствие комплексного исследования, позволяющего более точно определить рецептивность эндометрия в циклах ЭКО.
Известен способ прогнозирования наступления беременности при планировании экстракорпорального оплодотворения, включающий иммуногистохимическое исследование (ИГХ) для определения оптической плотности экспрессии лейкемия ингибирующего фактора (LIF) в поверхностном и железистом эпителии эндометрия в период окна имплантации в цикле, предшествующем проведению ЭКО (Serafini P.C., Rocha A.M., Osório С.Т., da Silva I., Motta E.L., Baracat E.C. Endometrial leukemia inhibitory factor as a marker of pregnancy after in vitro fertilization. IntJGynaecolObstet. 2008; 102(1): 23-7.). Авторы способа считают, что высокая оптическая плотность экспрессии LIF является маркером рецептивности эндометрия и может предсказать наступление беременности в результате цикла ЭКО. Этот способ принят за прототип.
Недостатком прототипа является отсутствие комплексного исследования, позволяющего более точно прогнозировать рецептивность эндометрия в циклах ЭКО.
Техническим результатом изобретения является возможность прогнозирования рецептивности эндометрия и наступления беременности при планировании ЭКО путем комплексного анализа наиболее информативных показателей, полученных с помощью построения математической модели.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе прогнозирования рецептивности эндометрия в циклах ЭКО, включающем определение оптической плотности экспрессии LIF в поверхностном и железистом эпителии эндометрия в период окна имплантации в цикле, предшествующем проведению ЭКО, согласно изобретению, дополнительно определяют содержание сосудистого эндотелиального фактора роста в цервикальной слизи (ЦС) в день трансвагинальной пункции (ТВП) фолликулов, систолодиастолическое отношение и индекс резистентности спиральных артерий в день введения триггера овуляции, а затем рассчитывают значение регрессионной функции по следующей формуле:
Ζ=LIF×44,832+VEGF×0,006+S/D×40,379-IR×152,351-15,799,
где
LIF - оптическая плотность экспрессии лейкемия ингибирующего фактора в поверхностном и железистом эпителии эндометрия в период окна имплантации в цикле, предшествующем проведению ЭКО (у.е.);
VEGF - содержание сосудистого эндотелиального фактора роста в цервикальной слизи в день трансвагинальной пункции фолликулов (пг/мг);
S/D - систолодиастолическое отношение спиральных артерий в день введения триггера овуляции;
IR - индекс резистентности спиральных артерий в день введения триггера овуляции;
и при Ζ>0 прогнозируют, что эндометрий рецептивен, а при Ζ<0 - эндометрий не рецептивен.
В исследование было включено 97 женщин с бесплодием в возрасте от 21 до 35 лет, которым было выполнено ЭКО или ЭКО/ИКСИ (экстракорпоральное оплодотворение с интрацитоплазматической инъекцией сперматозоидов) с последующим переносом только морфологически качественных эмбрионов в полость матки. В зависимости от исхода лечения ретроспективно были сформированы 2 группы. В I группу вошли 50 (51,55%) женщин с эхографически подтвержденной беременностью, II группа состояла из 47 (48,45%) женщин, у которых беременность не наступила в результате ЭКО.
В исследовании была проведена стандартизация исходных условий: все пациентки были раннего репродуктивного возраста, всем проводилось лечение бесплодия с применением одинаковых протоколов стимуляции суперовуляции, проводили перенос только морфологически качественных эмбрионов. Для проведения ИГХ полученные биоптаты эндометрия в период предполагаемого "окна имплантации" были ранней и средней стадии фазы секреции. Методики получения и обработки материала при выполнении ИГХ, исследования факторов роста в ЦС и оценка допплерометрических параметров сопротивления сосудов матки были одинаковые для всех женщин. Оценка полученных данных проводилась стандартным методом с использованием одной компьютерной системы подсчета данных для каждого из применяемых нами методов. Стандартизация исходных условий и комплексная оценка рецептивности эндометрия, с применением трех разных методов исследования, привели к более углубленным и точным результатам.
Оценка рецептивности эндометрия включала три метода исследования.
Первый метод заключался в получении биопсии эндометрия в период предполагаемого окна имплантации на 20-23 д.м.ц в цикле, предшествующем циклу ЭКО, с помощью аспирационной кюретки Pipellede Cornier ("Jiangs u Suyun Medical Materials Co., Ltd., КНР). Овуляция подтверждалась ультразвуковым методом и путем определения пика лютеинизирующего гормона в моче. Полученные образцы эндометрия обрабатывали по стандартной методике с получением парафиновых блоков. ИГХ проводилось на депарафинизированных и дегидратированных срезах толщиной 4-6 мкм с использованием авидин-биотиновогоиммунопероксидазного метода. Уровень экспрессии LIF в эндометрии определяли с использованием Abeam", RabbitpolyclonalAnti-LIF antibody (ab135629) разведение 1:100, уровень экспрессии полиморфизма гена VEGF-A определяли с использованием Abeam", MonoclonalMouseAnti-VEGF-A antibody (ab28775) разведение 1:50, для определения трансформирующего фактора роста фибробластов TGF-β1 использовались «Novocastra» MonoclonalMouseAnti-TransformingGrowthFactorBeta в разведении 1:40.
Исследование проводили с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений Морфология 5.2. В каждом случае анализировали 5 полей зрения при увеличении 400+. Относительную площадь экспрессии в каждом случае рассчитывали как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения и выражали в процентах. Оптическую плотность экспрессии выявленных продуктов измеряли в условных единицах (у.е.). Указанные параметры отражают интенсивность синтеза или накопления исследуемых молекул.
Второй метод исследования включал двукратное определение содержания сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF, фактора, стимулирующего колонии макрофагов - гранулоцитов GM-CSF и фактора роста TGF-β1 в цервикальной слизи в течение цикла ЭКО методом мультиплексного анализа с использованием стандартизованных коммерческих наборов "Flexset" (BD Bioscience). Забор цервикальной слизи с использованием флоковых тампонов фирмы "Copan" (Италия) осуществлялся в день трансвагинальной пункции (ТВП) фолликулов и в день переноса эмбрионов в полость матки. Полученные образцы с примесью крови были исключены из исследования. Полученные результаты обрабатывали с помощью компьютерной программы "CBA Array" (BD Bioscience). Для нормирования содержания исследуемых факторов в полученном материале количество белка в анализируемой жидкости определяли фотометрически ("NanoDrop 1000 Spectrophotometer"). Учитывая разные объемы полученной ЦС, содержание фактора роста VEGF в образце вычислялось с применением следующей формулы:
Содержание фактора роста VEGF в ЦС (пг/мг) = Количество фактора в образце (пг/мл) / Общее количество белка в образце (мг/мл).
Третий метод исследования рецептивности эндометрия заключался в выполнении оценки допплерометрических индексов сопротивления спиральных артерий кровотока сосудов матки: систолодиастолического отношения (S/D), индекса резистентности (IR), пульсационный индекса (PI)) в маточных (Ma), аркуатных (Аа) и радиальных (Ра) артериях на 2-3 д.м.ц. Повторные исследования указанных показателей проводились в день введения триггера овуляции и за 1-2 часа до переноса эмбрионов в полость матки и были дополнены допплерометрическими показателями параметрами сопротивления в базальных (Ба) и спиральных (Са) артериях.
Исследование кровотока в сосудах матки проводилось с помощью ультразвукового сканера Samsung Medison Sono Ace X6 (Республика Корея) с использованием трансвагинального датчика с частотой 4-9 МГц. Исследование выполнялось при опорожненном мочевом пузыре в утреннее время суток (с 09:00 до 12:00) с целью максимального исключения влияния суточных изменений показателей кровотока (циркадный ритм). Расчет качественных кривых скоростей кровотока производился в автоматическом режиме с помощью установленной программы обеспечения.
Статистическую обработку полученных данных проводили на персональном компьютере с использованием стандартного пакета «Microsoft Excel» и пакета прикладных программ «Statisticafor Windows» версия 6.0, StatSoftInc. (США) и SPSS-19 с использованием методов параметрической и непараметрической статистики.
В результате проведенного логистического регрессионного анализа, в список потенциальных предикторов которого вошли все переменные, имеющие уровень значимости p<0,05, была построена математическая модель, имеющая достаточно высокий коэффициент Нейджелкерка 0,74 (оптимальное его значение 0,5-0,9), оценивающий качества модели.
Всего было исследовано более 70 переменных, которые вошли в логистический регрессионный анализ: относительная площадь экспрессии LIF в поверхностном и железистом эпителии эндометрия и в строме эндометрия, оптическая плотность экспрессии LIF в поверхностном и железистом эпителии эндометрия и в строме эндометрия, относительная площадь экспрессии трансформирующего фактора роста фибробластов TGFβ1 в поверхностном и железистом эпителии эндометрия и в строме эндометрия, относительная и оптическая плотности экспрессии VEGF-A в строме эндометрия, содержание GM-CSF в цервикальной слизи в день ТВП и в день переноса эмбрионов, содержание TGFβ1 в цервикальной слизи в день ТВП и в день переноса эмбрионов, содержание VEGF в цервикальной слизи в день ТВП и в день переноса эмбрионов, S/D правой и левой маточных артерий на 2-3 день менструального цикла, IR правой и левой маточных артерии на 2-3 день менструального цикла, PI правой и левой маточных артерии на 2-3 день менструального цикла, S/D аркуатных артерий, IR аркуатных артерий, PI аркуатных артерий, S/D радиальных артерий, IR радиальных артерий, PI радиальных артерий на 2-3 день менструального цикла, S/D правой маточной артерии, IR правой маточной артерии, PI правой маточной артерии, S/D левой маточной артерии, IR левой маточной артерии, PI левой маточной артерии, S/D аркуатных артерий, IR аркуатных артерий, PI аркуатных артерий, S/D радиальных артерий, IR радиальных артерий, PI радиальных артерий, S/D базальных артерий, IR и PI базальных артерий, S/D, IR и PI спиральных артерий в день введения триггера овуляции, S/D, IR и PI правой и левой маточной артерии в день переноса эмбрионов, S/D, IR и PI аркуатных, радиальных и базальных артерий в день переноса эмбрионов, S/D, IR и PI спиральных артерий в день переноса эмбрионов, толщина эндометрия на 2-3 день менструального цикла, толщина эндометрия в день введения триггера овуляции, толщина эндометрия в день переноса эмбрионов в полость матки.
В результате логистического регрессионного анализа была получена регрессионная функция Z, которая включала 4 наиболее значимые переменные (по уровню значимости): оптическая плотность экспрессии LIF в поверхностном и железистом эпителии эндометрия в период окна имплантации в цикле, предшествующем проведению ЭКО, содержание VEGF в ЦС в день ТВП, S/D и IR спиральных артерий в день введения триггера овуляции и одну константу (-15,799).
В исследовании также был использован ROC-анализ. Для установленной математической модели частота истинно положительного результата (чувствительность) составила 82% (у 41 из 50 женщин беременность наступила после ЭКО, у остальных 9 был получен ложноположительный результат). Таким образом, ложноположительный результат был получен в 18% случаев.
Частота истинно отрицательного результата (специфичность) составила 89,4% (у 42 из 47 женщин беременность не наступила после ЭКО, у остальных 5 был получен ложноотрицательный результат). Таким образом, ложноотрицательный результат был получен в 10,6% случаев. Вышеуказанные значения не превышают допустимого уровня ложных значений для биомедицинских показателей в 20%.
Таким образом, чувствительность способа составляет 82%. Специфичность - 89,4%. Предсказательная ценность положительного результата - 89,1%, предсказательная ценность отрицательного результата - 82,3%, общая точность предсказания - 85,6%.
В связи с этим, если при использовании предложенной модели значение Ζ будет больше 0, то эндометрий рецептивен и беременность наступит в результате цикла ЭКО с вероятностью 82%. Если же значение Ζ будет меньше 0, то эндометрий не рецептивен и беременность не наступит в результате цикла ЭКО с вероятностью 89,4%.
Способ осуществляют, например, следующим образом.
Проводят биопсию эндометрия в период предполагаемого окна имплантации (на 20-23 д.м.ц) в цикле, предшествующем проведению ЭКО, с помощью аспирационной кюретки. Полученные образцы эндометрия обрабатывают по стандартной методике с получением парафиновых блоков. ИГХ проводят на депарафинизированных и дегидратированных срезах толщиной 4-6 мкм с использованием авидин-биотиновогоиммунопероксидазного метода. Уровень экспрессии LIF в эндометрии определяют с использованием Abeam", RabbitpolyclonalAnti-LIF antibody (ab135629) разведение 1:100. Исследование проводят с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений Морфология 5.2. Анализируют 5 полей зрения при увеличении 400+. Оптическую плотность экспрессии выявленных продуктов измеряли в у.е.
В день ТВП фолликулов проводят забор ЦС с использованием флоковых тампонов фирмы "Copan" (Италия). Определяют содержание VEGF методом мультиплексного анализа с использованием стандартизованных коммерческих наборов "Flexset" (BD Bioscience).
Полученные результаты обрабатывают с помощью компьютерной программы "CBA Array" (BD Bioscience). Для нормирования содержания VEGF в полученном материале количество белка в анализируемой жидкости определяют фотометрически ("NanoDrop 1000 Spectrophotometer"). Учитывая разные объемы полученной ЦС, содержание фактора роста VEGF в образце вычисляют с применением следующей формулы:
Содержание VEGF в ЦС (пг/мг) = Количество VEGF в образце (пг/мл) / Общее количество белка в образце (мг/мл).
В день введения триггера овуляции проводят оценку систолодиастолического отношения S/D и индекса резистентности IR спиральных артерияй (Са) с помощью ультразвукового сканера с использованием трансвагинального датчика с частотой 4-9 МГц. Исследование выполняют при опорожненном мочевом пузыре в утреннее время суток (с 09:00 до 12:00) с целью максимального исключения влияния суточных изменений показателей кровотока (циркадный ритм). Расчет S/D и IR производят в автоматическом режиме с помощью установленной программы обеспечения.
Способ подтверждается следующими клиническими примерами.
Пример 1. Пациентка Б., 27 лет. Беременность наступила в результате ЭКО.
Проведено исследование по предлагаемому способу.
Оптическая плотность экспрессии LIF в поверхностном и железистом эпителии эндометрия = 0,3182857;
содержание VEGF в ЦС в день ТВП=21,287554;
S/D спиральных артерий в день введения триггера овуляции = 2,15;
IR спиральных артерий в день введения триггера овуляции = 0,53
Ζ=(0,3182857*44,832)+(21,287554*0,006)+(2,15*40,379)-(0,53*152,351)-15,799=14,2693845024+0,127725324+86,81485-80,74603-15,799=4,6669298264
Ζ=4,6669298264>0.
Таким образом, прогнозируют, что эндометрий рецептивен и вероятность того, что беременность наступит в результате ЭКО составляет 82%. В данном случае беременность наступила.
Пример 2. Пациентка Α., 27 лет. Беременность не наступила в результате ЭКО.
Проведено исследование по предлагаемому способу.
Оптическая плотность экспрессии LIF в поверхностном и железистом эпителии эндометрия = 0,2194;
содержание VEGF в ЦС в день ТВП=27,964286;
S/D спиральных артерий в день введения триггера овуляции = 2,2;
IR спиральных артерий в день введения триггера овуляции = 0,55
Ζ=(0,2194*44,832)+(27,964286*0,006)+(2,2*40,379)-(0,55*152,351)-15,799=9,8361408+0,167785716+88,8338-83,79305-15,799=-0,75432348399999
Ζ=-0,75432348399999<0.
Таким образом, прогнозируют, что эндометрий не рецептивен и вероятность того, что беременность не наступит в результате ЭКО составляет 89,4%. В данном случае беременность не наступила.
При использовании данной модели можно было предсказать, что беременность не наступит в результате цикла ЭКО с вероятностью 89,4% и отказаться от переноса эмбрионов в полость матки. Таким образом, эмбрионы пациентки были бы криоконсервированы и перенесены в другом цикле после проведения соответствующей подготовки эндометрия.
Способ позволяет прогнозировать рецептивность эндометрия и наступление беременности в результате цикла ЭКО путем анализа наиболее информативных показателей, способствовать оптимизации времени переноса эмбрионов в полость матки и, тем самым, позволит увеличить результативность проведения программ ЭКО.