Биорезорбируемая барьерная мембрана на основе полисахарида для направленной регенерации костной ткани
BIORESORBABLE BARRIER MEMBRANE BASED ON POLYSACCHARIDE FOR DIRECTED REGENERATION OF BONE TISSUE

Область техники
Изобретение относится к способу изготовления биорезорбируемой барьерной мембраны для направленной регенерации костной̆ ткани, при замещении костных дефектов в области ортопедии, стоматологии, травматологии, реконструктивно-восстановительной, челюстно-лицевой хирургии, нейрохирургии, онкологии.
Уровень техники
Фундаментальной проблемой современной клинической медицины и трансплантологии является повсеместная нехватка донорских органов, которая, согласно прогнозам на ближайшие годы, будет только увеличиваться. В последние годы при поиске альтернативных способов компенсации или замены поврежденных жизненно важных органов и тканей основной акцент в решении этих проблем делается на использование технологий регенеративной клеточной медицины.
Технологии регенеративной клеточной медицины можно разделить на три группы:
- клеточная терапия - использование стволовых клеток или сигнальных биомолекул для стимуляции процессов регенерации тканей;
- биостимуляция регенерации тканей пациента с помощью биоактивных биополимерных материалов;
- тканевая инженерия - тканеинженерные конструкции (ТИК) органов и тканей.
Трехмерные биорезорбируемые пористые матриксы являются сегодня базовыми элементами в заместительной и регенеративной медицине, обеспечивающие организацию и поддержание роста, пролиферацию и дифференцировку мультипотентных стромальных клеток в процессе формирования определенных типов живых тканей. Они способствуют локализации клеток в области имплантации, одновременно являясь их носителем и действуя как аналог естественного внеклеточного матрикса.
Барьерные мембраны играют важную роль для замещения и регенерации дефектов костной ткани. Барьерные мембраны устанавливаются поверх костнозамещающих материалов для предотвращения миграции материала в окружающие ткани и прорастания мягких тканей. Они выполняют сразу несколько функций, способствующих выздоровлению пациента. Во-первых, конструкция надежно фиксирует остеогенный материал в том месте и положении, куда он был установлен, без возможности мигрирования. Далее, мембраны не пропускают разрушающие кость клетки - остеокласты, которые в норме отвечают за баланс обменных процессов и контролируют количество костной ткани. Дополнительной функцией мембраны является защита от инфекции и сокращение риска проникновения патогенных агентов. Для направленной тканевой регенерации используются резорбируемые мембраны – самостоятельно резорбируют через определенное время, не требуют удаления, и нерезорбируемые мембраны – требуются повторное хирургическое вмешательство для удаления мембраны из оперативного поля.
Мембрана для костной пластики представляет собой очень тонкую и достаточно эластичную пластинку - пленку, которая устанавливается между костной тканью и мягкими тканями. Таким образом происходит отделение мягких тканей от костного материала в процессе формирования костной ткани. Присутствие защитной мембраны над дефектом на определенный промежуток времени, позволяет полностью завершить процесс остеогенеза и обеспечить нормальное созревание вновь сформированной костной ткани. Благодаря барьерной мембране приживление трансплантата ускоряется, как и общее лечение пациента.
Анализ уровня техники свидетельствует о том, что получение пористого материала для решения ряда задач регенеративной медицины со стабильной структурой в активных биологических средах и одновременно характеризующегося оптимальным комплексом свойств, в том числе оптимальным временем резорбции, является актуальной задачей получения материалов медицинского назначения, а также барьерных мембран для клеточных технологий.
Раскрытие изобретения
Задача, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, состоит в разработке нового способа получения барьерной мембраны (БМ) на основе альгината бария, позволяющего получить барьерную мембрану с заданными свойствами, в том числе с высоким регенеративным потенциалом для направленной̆ регенерации костной ткани, при замещении костных дефектов, пористостью, размером пор, значением рН, прочностью и оптимальным темпом биодеградации (резорбции).
Техническим результатом изобретения является разработка нового эффективного способа получения барьерной мембраны на основе альгината бария, характеризующейся оптимальным временем резорбции (повышенная стойкость к резорбции в биологических средах - от 6 до 12 месяцев), повышением механических свойств, равномерной пористостью (пористость до 98 %, размер пор от 100 до 500 мкм), значением рН 6,8-7,4, прочностью при растяжении 3-5 МПа. Барьерные мембраны, полученные способом по изобретению, позволяют избежать образования дефектной ткани в ходе направленной регенерации костной ткани. Все указанные свойства мембраны по изобретению обеспечивают эффективную регенерацию костной ткани и делают барьерные мембраны по изобретению перспективными для применения в клинической практике.
Указанный технический результат достигается посредством разработки способа получения биорезорбируемой барьерной мембраны на основе альгината бария для направленной регенерации костной ткани, в которой пористость составляет до 95-98%, размер пор от 100 до 500 мкм, рН 6,8-7,4, прочность при растяжении 3-5 МПа, фазовый состав - 100 масс. % альгинат бария,
включающий следующие этапы:
а) получение водного раствора альгината натрия;
а,
б) вспенивание раствора, полученного на стадии  вместе с водным раствором ПАВ;
б
в) получение стабильной вспененной суспензии посредством добавления водного раствора хлорида бария к раствору, полученному на стадии ;
в
г) фиксации структуры вспененной суспензии, полученной на стадии , посредством замораживания при -3-5°С;
г
д) сшивка мембраны, полученной на стадии , в водном растворе хлорида бария.
В частных вариантах воплощения изобретения фиксация структуры осуществляется в течение 4-6 часов.
В частных вариантах воплощения изобретения фиксация структуры осуществляется в течение 5 часов.
г
В частных вариантах воплощения изобретения после стадии  дополнительно проводят понижение температуры до -7°С.
В частных вариантах воплощения изобретения понижение температуры до -7°С проводят в течение 12 часов.
В частных вариантах воплощения изобретения после понижения температуры до -7°С проводят сублимационную сушку.
д
В частных вариантах воплощения изобретения сшивку мембраны на стадии  проводят при температуре 37±1°С.
д
В частных вариантах воплощения изобретения сшивка мембраны на стадии  осуществляется в течение 12-24 часов.
д
В частных вариантах воплощения изобретения сшивка мембраны на стадии  осуществляется в течение 24 часов.
б
В частных вариантах воплощения изобретения вспенивание раствора на стадии  осуществляется в течение 30±5 минут.
В частных вариантах воплощения изобретения ПАВ представляет собой анионные ПАВ, такие как карбоксиэтоксилаты, фосфаты, полифосфаты, сульфосукцинаты, алкилсульфаты и/или ликилэфиросульфаты. В наиболее предпочтительных вариантах воплощения изобретения ПАВ представляет собой лаурилсульфат натрия.
Настоящее изобретение также относится к барьерной мембране (БМ), полученной указанным способом по изобретению, с пористостью до 95-98 %, размером пор от 100 до 500 мкм, имеющий следующий фазовый состав:
- 100 масс. % альгинат бария.
В некоторых частных вариантах воплощения изобретения барьерная мембрана характеризуется значением рН 6,8-7,4.
В некоторых вариантах воплощения изобретения барьерная мембрана имеет прочность при растяжении 3-5 МПа.
Краткое описание чертежей
Фигура 1.
Микроструктура БМ без этапа повышения вязкости (а, б) и с повышением (в, г):
Фигура 2.
Микрофотография. Альгинатная мембрана (АМ) по изобретению через месяц эксперимента. * границы костного дефекта перекрываются АМ. Нижняя часть лежит на твердой мозговой оболочке - ТМО (стрелки углом). Мембрана инфильтрована небольшим количеством клеточных элементов типа макрофагов, фибробластов, красных кровяных телец. Наблюдается расслоение ее структуры. Окраска Г-Э. Х40.
Фигура 3.
Микрофотограмма АМ по изобретению через три месяца эксперимента. Резорбция и оссификация мембраны. Стрелки углом - ТМО. Окраска Г-Э. х40.
Фигура 4.
а
Микрофотограмма участка  на фигуре 3 при большем увеличении. Расслоение участков мембраны (одиночные стрелки) с последующей оссификацией, которая носит циклический характер, что подтверждается линиями склеивания (двойные стрелки). ТМО стрелки углом. Мелкие капилляры-стрелка с кружком. * границы дефекта. Окраска Г-Э. х100.
Фигура 5.
Микрофотограмма. Резорбция центральной части АМ через три месяца эксперимента и замещение ее грубо-волокнистой соединительной тканью (стрелки углом). По краям дефекта остатки оссифицированной мембраны (одиночные стрелки). * границы дефекта. Окраска Г-Э. х40.
Определения и термины
Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приведены некоторые термины, использованные в настоящем описании изобретения.
включает
включающий
В описании данного изобретения термины «» и «» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».
Альгинат бария это молекулярные цепочки гетерополимера, образованные двумя остатками полиуроновых кислот (D-маннуроновой и L-гулуроновой) сшитые между собой двухвалентными ионами бария.
В данном документе под поверхностно-активными веществами (ПАВ) понимают анионные ПАВ, такие как карбоксиэтоксилаты, фосфаты, полифосфаты, сульфосукцинаты, алкилсульфаты и/или ликилэфиросульфаты (например, лаурилсульфат натрия).
Подробное раскрытие изобретения
Возможность объективного достижения технического результата при осуществлении изобретения подтверждена достоверными данными, приведенными в примерах, содержащих сведения экспериментального характера. Следует понимать, что эти и все приведенные в материалах заявки примеры не являются ограничивающими и приведены только для иллюстрации настоящего изобретения.
Описание способа получения барьерной мембраны по изобретению
о
Для получения БМ по изобретению готовят 2-х-% водный раствор альгината натрия, при температуре 50С. Затем добавляют 2-х-% водный раствор лаурилсульфата натрия 0,5% (количество раствора ПАВ по отношению к раствору альгината натрия) и проводят активное вспенивание, в частности на верхне-приводной мешалке при 3000 об/мин в течение 30 минут. После чего добавляют 2% водный раствор хлорида бария 1 мл для увеличения вязкости системы, что позволяет избежать разделения (расслоения) образованных пузырьков воздуха (пор) и суспензии во время фиксации структуры. Полученную вспененную суспензию разливают по пластиковым формам, в частности размерами 30х40 мм, и замораживают при температуре -5°С в течение 5 часов с последующим понижением температуры до -7°С, после чего подвергают сублимационной сушке. При температурах выше -5°С не происходит фиксация структуры, а при температурах ниже -7°С при фиксации структуры образуются пластинчатая структура, которая отрицательно сказывается на механических характеристиках получаемой мембраны. Высушенные БМ подвергают сшивке в 10% водном растворе хлорида бария при 37°С в течении 12-24 часов при постоянном перемешивании. Затем полученные БМ отмывают от остатков хлорида бария в дистиллированной воде и подвергают сушке под давлением.
о
о
о
о
Пример.1 Готовят 100 мл 2%-го водного раствора альгината натрия и примешивают 1 час при температуре 50С. Затем добавляют 1 мл 2-х% водного раствора лаурилсульфата натрия и данную суспензию подвергают активному вспениванию на верхне-приводной мешалке при 3000 об/мин в течение 30 минут. После чего добавляют 1 мл 2-х% водного раствора хлорида бария для увеличения вязкости системы, чтобы не происходило разделения образованных пор и суспензии во время фиксации структуры. Полученную вспененную суспензию разливают по пластиковым формам, в частности размерами 30х40 мм, и замораживают при -5С в течение 5 часов с последующим понижением температуры до -7С и подвергают сублимационной сушке. Высушенные БМ подвергают сшивке в 10% водном растворе хлорида бария при 37С в течении 24 часов при постоянном перемешивании. Затем полученные БМ отмывают от остатков хлорида бария в дистиллированной воде и подвергают сушке под давлением.
Сравнительное исследования мембран по изобретению и барьерных мембран на основе альгината кальция
В соответствии с примерами были изготовлены образцы БМ, имеющие составы в пределах заявленных, и определены их свойства в сравнении с БМ на основе альгината кальция. Полученные результаты сведены в таблице 1.
Таблица 1. Сравнительная характеристика барьерных мембран по изобретению и мембран на основе альгината кальция.
№ образца
Фазовый состав, масс. %
Температура фиксации структуры, <sup>о</sup>С.
Толщина, мкм
Пористость,%
Прочность при растяжении, МPa.
Биологическая деградация (потеря массы), %
Примечание
1
100 масс % альгинат бария
-5 - -7
1500
95
5±0,5
25*
Структура материала однородная, с равномерным распределением округлых пор по всему объему материала
2
100 масс % альгинат бария
-10
1500
95
1±0,1
25
Нарушается структура, образуются пластинчатые поры, что может приводить  к потере прочности при растяжении до 70%.
3
100 масс % альгинат бария
-3
материал не сформировался
материал не сформировался
материал не сформировался
материал не сформировался
Не происходит фиксации структуры
4
100 масс % альгинат кальция
-5 - -7
95
0,56±0,5
100**
Полностью растворяется ко 2-м суткам
0
0
Биологическую деградацию определяют по потере массы при выдерживании БМ в буферном растворе при значении рН=5,5 согласно ГОСТ Р ИСО 10993-13. Образцы массой 0,5 г выдерживают в 50 мл дистиллированной воды при 37С в течение 60 суток, после чего их извлекают, сушат при 60С до полного высыхания, когда масса образцов становится неизменной. Расчет растворимости производят по формуле:
1
2
1
Р=(m-m) /m х100%,  (1)
1
где:  m-масса БМ до испытания на растворимость;
2
m- масса БМ после испытания на растворимость.
Таким образом, результаты, представленные в таблице 1, показывают, что материал, полученный способом по изобретению, (образец 1) при деградации в буферном растворе, моделирующем среду раны с значением рН 5,5, к 60 суткам теряет 25 масс.%. Следовательно, данный материал будет стабилен, по меньшей мере 2 месяца. Мембрана должна обеспечивать раздельное формирование тканей в течение 2-6 месяцев, поскольку при меньших сроках устойчивости мембраны, при ее растворении может наблюдаться образование дефектной ткани, за счет врастания в нее ткани другого типа. Поэтому, барьерные мембраны по изобретению позволяют избежать образование дефектной ткани.
При этом мембрана на основе альгината кальция, полученная аналогичным способом по изобретению, полностью растворяется ко 2-м суткам, таким образом уже ко 2-м суткам она перестанет выполнять барьерную функцию, что не позволяет использовать этот материал в клинической практике.
о
о
Кроме того, результаты данных исследований показывают, что именно при температуре фиксации -5-7 С можно получить материал с равномерной пористой структурой большой площадью, в то время как использование температуры фиксации равной -10 С приводит к получению менее прочного материала с пластинчатыми порами.
Если исключить стадию стабилизации пены, то наблюдается расслоение пор по размерам в объеме образца (фигура. 1 а, б). Размер изменяется с 1000 мкм в верхней части образца до 50-200 мкм в нижней части. Размер стенок доходит до 2 мкм. При стабилизации пены наблюдается гомогенное распределение взаимосвязанных пор, размером от 100 до 500 мкм (фигура.1 в, г). Структура альгината непрерывна. Толщина стенок достигает 2 мкм.
Исследование поведения мембраны по изобретению на критических дефектах черепа кости крыс линии Вистар
Поведение альгинатной мембраны по изобретению изучали на критических дефектах черепа кости крыс линии Вистар. Всего в эксперименте участвовало 6 животных со сроком наблюдения в 1 и 3 месяца. Под внутрибрюшинной анестезией раствором Золетил-50 0,2 мл, инфильтрационной анестезией Ubistesin 0,2 мл проводили угловой разрез от венечного шва и лобной кости. Бором диаметром 2,3 мм на малых оборотах с постоянной ирригацией NaCl 0,9% создавали критический костный дефект диаметром 9 мм. Особое внимание при препарировании уделялось сохранению твердой мозговой оболочки (ТМО - dura mater). Дефект закрывали альгинатной мембраной и производили послойное ушивание. Животных выводили из эксперимента передозировкой Золетилом-50. Выделяли нужный костный фрагмент, промывали, фиксировали в 10% формалине, декальцинировали в ЭДТА, заключали в парафин. Полученные срезы окрашивали гемотоксилин-эозином и изучали в преходящем свете на синхроскопе Motic Inc. (Италия).
Структура альгинатной мембраны (АМ) через 1 месяц эксперимента. После месяца наблюдений, при закрытии дефекта, часть АМ лежит на надкостнице внешнего слоя компактной кости черепа, сверху покрыта подкожной клетчаткой кожи головы. В некоторых пограничных участках фиброзная ткань надкостницы срастается с альгинатной мембраной. При прохождении внутрь дефекта края АМ уже располагаются на концевых участках кости, а середина на твердой мозговой оболочке, которая является надкостницей внутреннего слоя компактной кости черепа (фигура 2) и представляет собой фиброзную мембрану, состоящую из двух слоев, плотно прилегающих друг к другу.
Наружная часть твердой мозговой оболочки (ТМО) плотно связана с костями черепа, так как от нее вглубь кости врастают пучки коллагеновых волокон. Внутренняя поверхность ТМО со стороны субдурального пространства выстлана эндотелием. ТМО содержит наружную и внутреннюю капиллярную сеть. Наружная капиллярная сеть прилегает к надкостнице, а внутренняя находится под эндотелием. Так как получение критических дефектов связано с механическим воздействием, часть наружной поверхности ТМО может быть деформирована или отсутствовать. Наружную капиллярную сеть можно видеть в местах, не подвергшихся механическому воздействию. Стенки ячеек мембраны начинают расслаиваться на мелкие нитевидные фрагменты. АМ инфильтрирована небольшим количеством фибробластов, макрофагов, красных кровяных телец. Характерно отсутствие гигантских многоядерных клеток, которые появляются как реакция на инородное тело, что говорит о нейтральном состоянии мембраны по отношению к окружающим тканям.
Структура АМ через 3 месяца. Через 3 месяца структура мембраны меняется. Участки ее расслаиваются и подвергаются частичной минерализации, которая идет неравномерно (фигура 3). Там, где произошла оссификация, видны линии склеивания, что говорит о формировании подобия зрелой пластинчатой кости (фигура 4). Клеточные элементы типа фибробластов и макрофагов представлены незначительно. Важным моментом является отсутствие гигантских многоядерных клеток, возникающих как реакция на чужеродную ткань, что еще раз подтверждает нейтральный характер мембраны. Отмечается наличие мелких сосудов и красных кровяных телец. Не происходит врастания соединительной ткани под АМ. В некоторых участках можно наблюдать резорбцию центральной части АМ (фигура 3), замещение ее фиброзной тканью. По краям, около костных фрагментов, сохраняются участки оссифицированной мембраны (фигура 5).
Таким образом, исследования поведения альгинатной мембраны по изобретению в критическом костном дефекте показали высокую биосовместимость альгинатной мембраны.
Несмотря на то что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования способа согласно настоящему изобретению, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.