ПЕПТИДЫ ТЕМ8 И СОДЕРЖАЩИЕ ИХ ВАКЦИНЫ
TEM8 PEPTIDES AND VACCINES CONTAINING THEM

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США № 60/911194, поданной 11 апреля 2007 года, полное описание которой, таким образом, приведено в настоящем документе в качестве ссылки для всех целей.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к биологии, более конкретно, к области злокачественных новообразований. В частности, настоящее изобретение относится к пептидам TEM8, которые невероятно эффективны в качестве противораковых вакцин, а также к лекарственным средствам для лечения и профилактики опухолевых заболеваний.
Предшествующий уровень техники
Было показано, что CD8-позитивные цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) распознают эпитопы пептидов опухоле-ассоциированных антигенов (ОАА), представленные на молекуле главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I, после чего уничтожают опухолевые клетки. С момента открытия семейства меланомных антигенов (MAGE) в качестве первого примера ОАА, при помощи различных иммунологических подходов было идентифицировано большое число других ОАА (Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80; Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9), и некоторые из этих ОАА в настоящее время проходят клинические исследования в качестве мишеней для иммунотерапевтических препаратов.
Идентификация новых ОАА, индуцирующих мощный специфический противоопухолевый иммунный ответ, обеспечивает возможность дальнейшего клинического использования различных стратегий пептидной вакцинации в различных типах злокачественных новообразований (Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55; Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42; Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9; van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14; Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8; Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72; Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66; Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94). На сегодняшний день было опубликовано несколько клинических исследований с использованием этих пептидов опухоле-ассоциированных антигенов. К сожалению, до настоящего момента, наблюдаемый в исследованиях этих противораковых вакцин уровень объективных клинических ответов был низким (Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80; Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42; Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15).
Одной из возможных причин подобного отсутствия эффективности может быть потеря или ингибирование уровня экспрессии антигена лейкоцитов человека (HLA) класса I опухолевыми клетками, что часто происходит в солидных опухолях и значительно снижает эффективность Т-клеточного противоопухолевого ответа (Cormier JN et al., Int J Cancer 1998 Feb 9, 75(4): 517-24; Hicklin DJ et al., Mol Med Today 1999 Apr, 5(4): 178-86; Paschen A et al., Int J Cancer 2003 Mar 1, 103(6): 759-67). Даже в том случае, если противораковая вакцина на основе опухоле-ассоциированных антигенов индуцирует эффективные цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), то такие CTL неспособны распознать клетки-мишени, поскольку последние не экспрессируют молекулы HLA класса I на достаточном уровне.
Опухолевый ангиогенез является важным фактором, связанным с прогрессией опухолей. Ранее уже была показана возможность разработки эффективной вакцины, направленной на опухолевый ангиогенез, при помощи подхода, основанного на использовании эндотелиальных клеток, при котором в качестве мишеней используются рецепторы васкулярно-эндотелиального фактора роста (VEGFR) 1 и 2, как молекулы HLA класса I, которые не ингибируются на эндотелиальных клетках (Wada S et al., Cancer Res 2005 Jun 1, 65(11): 4939-46; Ishizaki H et al., Clin Cancer Res 2006 Oct 1, 12(19): 5841-9). Более того, так как эти терапевтические мишени являются независимыми от опухоли, то уничтожение эндотелиальных клеток сосудов микроокружения опухоли может оказаться эффективным для широкого спектра злокачественных новообразований. Более того, эндотелиальные клетки опухоли являются легкодоступными для лимфоцитов, находящихся в кровотоке, и CTL могут непосредственно повреждать эндотелиальные клетки, не проникая в ткани каких-либо других типов. Помимо этого, лизис даже небольшого количества эндотелиальных клеток сосудистой сети опухоли приводит к нарушению целостности сосудов, что в свою очередь ведет к ингибированию роста большого числа опухолевых клеток (Folkman J, Nat Med 1995 Jan, 1(1): 27-31). Таким образом, эндотелиальные клетки опухоли представляют собой отличную мишень для противораковой иммунотерапии. Для подавления опухолевого ангиогенеза при помощи специфического и эффективного CTL-ответа, среди молекул, вовлеченных в процесс ангиогенеза, следует выбрать подходящую мишень.
Было обнаружено, что экспрессия эндотелиальных маркеров опухоли (TEM), в том числе TEM8, специфически повышена в опухоле-ассоциированном эндотелии по сравнению с нормальной тканью (St Croix B et al., Science 2000 Aug 18, 289(5482): 1197-202). Транскрипт TEM8 экспрессируется в опухолях легких и головного мозга, а также в метастатических опухолях печени. Терапия, направленная на TEM, может использоваться в отношении широкого спектра опухолей. Например, в патентной заявке WO2005/048943 предлагается использовать вакцины, содержащие вектор, кодирующий внеклеточный домен TEM8, в сочетании с вектором, кодирующим опухоле-ассоциированный антиген. Однако в вышеупомянутом документе не приводится никаких доказательств того, что введение в состав вакцины вектора, экспрессирующего TEM8, приводит к индукции CTL против опухоле-ассоциированного эндотелия и никакой информации о локализации эпитопов в пределах TEM8.
Раскрытие изобретения
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Улучшение показателей клинической эффективности противораковой терапии, направленной на разрушение опухолевого микроокружения, и в частности, терапии, направленной на подавление опухолевого ангиогенеза, является важной задачей. В фокусе настоящего изобретения находятся кровеносные сосуды опухоли в качестве мишени для противоопухолевой иммунотерапии. В частности, настоящее изобретение относится к использованию маркера опухолевого эндотелия 8 (TEM8) (№ NP_115584 по базе данных GenBank (SEQ ID NO:76), кодируемого геном № NM_032208 по базе данных GenBank (SEQ ID NO:75)), поскольку считается, что TEM8 экспрессируется сосудами широкого спектра опухолей. Настоящее изобретение относится к белковым продуктам гена TEM8, содержащим эпитопы пептидов, вызывающие специфический CTL-ответ на соответствующие молекулы. Периферические мононуклеарные клетки (PBMC), полученные из крови здорового донора, были простимулированы кандидатными в отношении связывания с молекулами HLA-A*2402 или HLA-A*0201 пептидами, полученными из TEM8. Настоящее изобретении, кроме того, относится к стабильным линиям CTL, специфически распознающим HLA-A24 или HLA-A02 - позитивные клетки-мишени, нагруженные соответствующими кандидатными пептидами, а также HLA-A24 или HLA-A02 - рестрицированным эпитопам пептидов, способным индуцировать мощный и специфический иммунный ответ на экспрессируемый в кровеносных сосудах опухоли TEM8. Приведенные результаты демонстрируют высокую иммуногенность TEM8, и соответствующие эпитопы представляют собой эффективные мишени для противоопухолевой иммунотерапии.
Таким образом, настоящее изобретение относится к выделенному нона- или декапептиду, способному к индукции цитотоксических Т-клеток, где указанный нонапептид или декапептид, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:76. В частности, настоящее изобретение относится к пептидам, содержащим аминокислотную последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 3, 4, 9, 23, 25, 30, 60, 63 и 68, способным к индукции CTL. Пептиды по настоящему изобретению включают пептиды, в которых замещены или добавлены одна, две или более аминокислот, при условии, что эти модифицированные пептиды сохраняют изначальную способность исходного пептида индуцировать CTL.
При введении индивиду, пептиды по настоящему изобретению презентируются на поверхности антиген-экспрессирующих клеток, после чего индуцируют CTL, специфически распознающие соответствующие пептиды. Таким образом, настоящее изобретение, в соответствии с одним из его аспектов, также относится к антиген-презентирующим клеткам и экзосомам, презентирующим любой из пептидов по настоящему изобретению, а также к способам индукции антиген-презентирующих клеток.
Противоопухолевый иммунный ответ индуцируется путем введения полипептидов ТЕМ8 по настоящему изобретению или кодирующих эти полипептиды полинуклеотидов, а также экзосом и антиген-презентирующих клеток, презентирующих полипептиды TEM8. Таким образом, настоящее изобретение относится к фармацевтическим средствам, содержащим в качестве активных ингредиентов полипептиды по настоящему изобретению или кодирующие их полинуклеотиды, а также экзосомы и антиген-презентирующие клетки. Фармацевтические средства по настоящему изобретению могут использоваться в качестве вакцин.
Далее, настоящее изобретение относится к способам лечения и/или профилактики (т.е. предотвращения) злокачественных новообразований (опухолей) и/или профилактики послеоперационного рецидивирования этих опухолей, а также к способам индукции CTL, способам индукции иммунного ответа против опухоле-ассоциированного эндотелия и противоопухолевого иммунитета, включающим введение полипептидов TEM8, полинуклеотидов, кодирующих полипептиды TEM8, экзосом или антиген-презентирующих клеток, презентирующих полипептиды ТЕМ8 или фармацевтических средств по настоящему изобретению.
Помимо этого, CTL, специфически распознающие полипептиды TEM по настоящему изобретению, усиливают иммунный ответ против опухоле-ассоциированного эндотелия. В связи с этим, настоящее изобретение также относится к CTL, специфически распознающим полипептиды TEM по настоящему изобретению. CTL по настоящему изобретению также могут использоваться в качестве противораковых вакцин.
Нижеследующее краткое описание и подробное описания изобретения приведены лишь на примерах отдельных вариантов осуществления и не ограничивают объем изобретения и не исключают наличия альтернативных вариантов.
Краткое описание графического материала
На фигуре 1 изображены фотографии, демонстрирующие результаты IFN-γ ELISPOT-анализа CTL, индуцированных пептидами TEM8. CTL в лунках #5 и #6 на панели «а», стимулированные TEM8-A24-9-39 (SEQ ID NO:3); в лунке #6 на панели «b», стимулированные TEM8-A24-9-277 (SEQ ID NO:4); в лунке #3 на панели «с», стимулированные TEM8-A24- 10-277 (SEQ ID NO:9); в лунке #3 на панели «d», стимулированные TEM8-A02-9-337 (SEQ ID NO:23); в лунке #6 на панели «е», стимулированные TEM8-A02-9-338 (SEQ ID NO:25); в лунке #3 на панели «f», стимулированные TEM8-A02-9-278 (SEQ ID NO:30); в лунке #2 на панели «g», стимулированные TEM8-A02-10-338 (SEQ ID NO:60); в лунке #5 на панели «h», стимулированные TEM8-A02-10-265 (SEQ ID NO:63); и в лунке #4 на панели «i», стимулированные TEM8-A02-10-333 (SEQ ID NO:68), демонстрировали высокую продукцию IFN-γ по сравнению с контролем. Напротив, специфической продукции IFN-γ не было обнаружено в типичном случае отсутствия индукции CTL при стимуляции последних клетками-мишенями, нагруженными пептидом TEM8-A02-9-207 (SEQ ID NO:46) (j). Большая часть прогнозированных пептидов не демонстрировала индукции CTL, поэтому в фокусе настоящего изобретения находятся лишь положительные результаты (наличие индукции CTL). Рамки на вышеописанных рисунках указывают на лунки, содержавшие клетки, в дальнейшем выведенные в стабильные линии CTL. Знак «+» относится к продукции IFN-γ, стимулированными клетками-мишенями, нагруженными подходящим пептидом, знак «-» - к продукции IFN-γ, стимулированными клетками-мишенями, не нагруженными никакими пептидами.
На фигуре 2 приведены линейные диаграммы, демонстрирующие результаты выведения линий CTL, стимулированных пептидами TEM8-A24-9-39 (SEQ ID NO:3) (a), TEM8-A24-9-277 (SEQ ID NO:4) (b), TEM8-A24-10-277 (SEQ ID NO:9) (c), TEM8-A02-9-337 (SEQ ID NO:23) (d), TEM8-A02-9-338 (SEQ ID NO:25) (e), TEM8-A02-9-278 (SEQ ID NO:30) (f), TEM8-A02-10-338 (SEQ ID NO:60) (g), TEM8-A02-10-265 (SEQ ID NO:63) (h) и TEM8-A02-10-333 (SEQ ID NO:68) (i) (данные IFN-γ ELISA-анализа). Данный анализ продемонстрировал, что клеточные линии CTL, выведенные путем стимуляции CTL каждым из вышеуказанных пептидов, демонстрируют высокую продукцию IFN-γ по сравнению с контролем. Напротив, специфической продукции IFN-γ не было обнаружено в типичном случае «негативной» клеточной линии, выведенной путем стимуляции CTL клетками-мишенями, нагруженными пептидом TEM8-A02-9-207 (SEQ ID NO:46) (j). Знак «+» относится к продукции IFN-γ CTL, стимулированными клетками-мишенями, нагруженными подходящим пептидом, знак «-» - к продукции IFN-γ CTL, стимулированными клетками-мишенями, не нагруженными никакими пептидами.
На фигуре 3 приведены линейные диаграммы, демонстрирующие результаты выведения клонов CTL, стимулированных пептидами TEM8-A24-9-277 (SEQ ID NO:4) (a) TEM8-A24-10-277 (SEQ ID NO:9) (b), TEM8-A02-9-337 (SEQ ID NO:23) (c), TEM8-A02-9-338 (SEQ ID NO:25) (d) и TEM8-A02-10-265 (SEQ ID NO:63) (e). Клоны CTL, выведенные путем стимуляции CTL каждым из вышеуказанных пептидов, демонстрируют высокую продукцию IFN-γ при стимуляции клетками-мишенями, нагруженными соответствующими пептидами. Напротив, в случае стимуляции CTL клетками-мишенями, не нагруженными никакими пептидами, продукции IFN-γ не наблюдалось. Знак «+» относится к продукции IFN-γ CTL, стимулированными клетками-мишенями, нагруженными подходящим пептидом, знак «-» - к продукции IFN-γ CTL, стимулированными клетками-мишенями, не нагруженными никакими пептидами.
На фигуре 4 приведены линейные диаграммы, демонстрирующие специфическую CTL-активность против клеток-мишеней, эндогенно экспрессирующих TEM8 и HLA-A*2402 или HLA-A*0201. В качестве контролей использовались клетки COS7, трансфецированные полноразмерным геном TEM8, либо трансфецированные соответствующим геном HLA и нагруженные нерелевантным пепидом TEM8. (a) Клон CTL, полученный путем стимуляции пептидом TEM8-A24-9-277 (SEQ ID NO:4) демонстрирует высокую и специфичную CTL-активность в отношении клеток COS7, трансфецированных TEM8 и HLA-A24 (закрашенные ромбами). Напротив, в отношении клеток-мишеней, экспрессирующих HLA-A*2402 (незакрашенные треугольники) или TEM8 (незакрашенные круги) по отдельности, не было обнаружено сколь-нибудь значимой CTL-активности. (b) Клон CTL, полученный путем стимуляции пептидом TEM8-A02-10-265 (SEQ ID NO:63) демонстрирует высокую и специфичную CTL-активность в отношении клеток COS7, трансфецированных TEM8 и HLA-A24 (закрашенные ромбами). Напротив, в отношении клеток-мишеней, экспрессирующих HLA-A*0201 (незакрашенные треугольники) или TEM8 (незакрашенные круги) по отдельности, не было обнаружено сколь-нибудь значимой CTL-активности
4
На фигуре 5 приведены данные по in vivo иммуногенности и противоопухолевым эффектам вакцинации с использованием пептида TEM8-A24-9-277. (a) In vivo иммуногенность эпитопа пептида TEM8 была исследована по протоколу, описанному в разделе «Материалы и методы». Мышам линии BALB/c путем инъекции вводили пептид TEM8-A24-9-277 (SEQ ID NO:4) (M1-M5) в неполном адъюванте Фрейнда (IFA), либо только IFA (N1 и N2). Знак «+» относится к продукции IFN-γ CTL, стимулированными клетками-мишенями, нагруженными подходящим пептидом (черные столбцы), знак «-» - к продукции IFN-γ CTL, стимулированными клетками-мишенями, не нагруженными никакими пептидами (белые столбцы). Спленоциты вакцинированных мышей продуцировали IFN-γ при стимуляции клетками RLmale1, нагруженными пептидами TEM8-A24-9-277 (SEQ ID NO:4) и не продуцировали IFN-γ при стимуляции клетками-мишенями, не нагруженными никакими пептидами. Аббревиатура SFC относится к числу спот-образующих клеток. (b) Противоопухолевые эффекты вакцинации эпитопом пептидов TEM8 были исследованы в режиме профилактики. TEM8-A24-9-277 (SEQ ID NO:4) (закрашенные треугольники) в IFA либо не содержащую пептидов композицию (незакрашенные ромбы) вводили путем инъекции в дни -7 и 0 мышам линии BALB/c. В день 0 мышам подкожно вводили клетки линии CT26 (мышиный колоректальный рак) в количестве 5×10 клеток/мышь. Приведенные значения размеров опухолей представляют собой среднее в выборке из 5 мышей. В группе мышей, вакцинированных эпитопом пептидов, наблюдали статистически значимое подавление роста опухоли (*; p<0,05).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
I. Определения
Используемые в настоящей заявке взаимозаменяемые термины «полипептид», «пептид» и «белок» относятся к полимеру, состоящему из аминокислотных остатков. Эти термины также относятся к полимерам, в которых один или несколько аминокислотных остатков представляют собой модифицированный или неприродный остаток, такой как искусственный химический миметик соответствующей природной аминокислоты, а также к природным полимерам аминокислот.
Используемый в настоящей заявке термин «аминокислота» относится к природным и синтетическим аминокислотам, а также к аминокислотным аналогам и миметикам, являющихся функционально близкими к природным аминокислотам. Природными являются аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, а также аминокислоты, подвергающиеся после трансляции внутриклеточным модификациям (например, гидроксипролин, γ-карбоксиглутаминовая кислота и O-фосфосерин). Фраза «аминокислотный аналог» относится к соединениям, имеющим такую же общую химическую структуру (α-атом углерода, связанный с атомом водорода, карбокси-группу, аминогруппу и R-группу), как и природная аминокислота, но содержащим модифицированную R-группу или полипептидный остов (например, гомосерин, норлейцин, метионин, сульфоксид, метионин-метилсульфоний). Фраза «аминокислотный миметик» относится к химическим соединениям, имеющим отличные от природных аминокислот химические структуры, однако функционально с ними сходные.
Аминокислоты могут быть обозначены в соответствии с общепринятыми трехбуквенным или однобуквенным кодами, рекомендованными номенклатурной комиссией по биохимии IUPAC-IUB.
Использование взаимозаменяемых терминов «ген», «полинуклеотиды», «нуклеотиды» и «нуклеиновые кислоты», если не указано иного, аналогично таковому для аминокислот в соответствии с общепринятым однобуквенным кодом.
Если не указано иного, все используемые в настоящей заявке технические и научные термины имеют свои обычные значения, общепринятые в кругу специалистов в той области техники, к которой относится настоящее изобретение.
II. Пептиды
Для того, чтобы показать, что пептиды TEM8 действуют как антигены, распознаваемые цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL), было исследовано, являются ли пептиды TEM8 (№ NP_115584 по базе данных GenBank (SEQ ID NO: 76)) антигенными эпитопами, рестрицированными часто встречающимися HLA-аллелями HLA-A24 или HLA-A02 (Date Y et al., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996; Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995; Kubo RT et al., J Immunol 152: 3913-24, 1994). Идентификация кандидатных в отношении связывания с HLA-A24 и HLA-A02 пептидов проводили на основании информации об аффинности их связывания с HLA-A24 и HLA-A02. Стабильные линии CTL были получены в результате in vitro стимуляции Т-клеток дендритными клетками (ДК), нагруженных каждым из нижеследующих пептидов:
TEM8-A24-9-39 (SEQ ID NO:3),
TEM8-A24-9-277 (SEQ ID NO:4),
TEM8-A24-10-277 (SEQ ID NO:9),
TEM8-A02-9-337 (SEQ ID NO:23),
TEM8-A02-9-338 (SEQ ID NO:25),
TEM8-A02-9-278 (SEQ ID NO:30),
TEM8-A02-10-338 (SEQ ID NO:60),
TEM8-A02-10-265 (SEQ ID NO:63) и
TEM8-A02-10-333 (SEQ ID NO:68).
Эти стабильные линии CTL демонстрировали мощную специфическую CTL-активность по отношению к клеткам-мишеням, нагруженным соответствующими пептидами. Эти результаты демонстрируют, что TEM8 представляет собой антиген, распознаваемый CTL, а нижеследующие пептиды являются эпитопами пептидов ТЕМ8, рестрицированными HLA-A24 или HLA-A02:
TEM8-A24-9-39 (SEQ ID NO:3),
TEM8-A24-9-277 (SEQ ID NO:4),
TEM8-A24-10-277 (SEQ ID NO:9),
TEM8-A02-9-337 (SEQ ID NO:23),
TEM8-A02-9-338 (SEQ ID NO:25),
TEM8-A02-9-278 (SEQ ID NO:30),
TEM8-A02-10-338 (SEQ ID NO:60),
TEM8-A02-10-265 (SEQ ID NO:63) и
TEM8-A02-10-333 (SEQ ID NO:68).
Поскольку у большинства больных злокачественными опухолями ген TEM8 сверхэкспрессирован, то он представляет хорошую мишень для иммунотерапии с повышенной клинической эффективностью. Таким образом, настоящее изобретение относится к нонапептидам (пептиды, состоящие из девяти аминокислотных остатков) и декапептидам (пептиды, состоящие из десяти аминокислотных остатков) эпитопов ТЕМ8, распознаваемых CTL. Согласно настоящему изобретению, аминокислотные последовательности нонапептидов или декапептидов могут быть выбраны из последовательности SEQ ID NO:76. Таким образом, настоящее изобретение относится к выделенным пептидам, способным индуцировать цитотоксические Т-клетки, состоящим из девяти или десяти аминокислот, непрерывная последовательность которых может быть выбрана из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:76. В частности, в некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к пептидам, которые содержат аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 4, 9, 23, 25, 30, 60, 63 и 68.
В настоящее время доступное в сети Интернет программное обеспечение, такое как, например, описанное в работе Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75, может быть использовано для расчета аффинности связывания различных пептидов с антигенами HLA in silico. Аффинность связывания с антигенами HLA может быть определена согласно описанному, например, в работах Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75; и Kuzushima K et al., Blood 2001, 98(6): 1872-81. Способы определения аффинности связывания приведены, например, в Journal of Immunological Methods, 1995, 185: 181-190.; Protein Science, 2000, 9: 1838-1846. Таким образом, настоящее изобретение включает в себя пептиды TEM8, в отношении которых связывание с антигенами HLA прогнозировано при помощи известных программ.
Кроме того, эти пептиды по настоящему изобретению могут быть фланкированы дополнительными аминокислотными остатками, при условии что полученный пептид сохраняет способность индуцировать CTL. Длина подобных пептидов, способных к индукции CTL, составляет, например, менее 40 аминокислот, часто менее 20 аминокислот, обычно менее 15 аминокислот. Аминокислотные последовательности, фланкирующие пептиды, которые содержат аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 4, 9, 23, 25, 30, 60, 63 и 68, не ограничены и могут состоять из аминокислот любого типа при условии, что добавление этих последовательностей не снижает способности исходных пептидов индуцировать CTL. Таким образом, настоящее изобретение относится к пептидам, способным индуцировать CTL, которые содержат аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 4, 9, 23, 25, 30, 60, 63 и 68.
В общем случае известно, что модификации одной или более аминокислот в белке не оказывают влияния на его функцию, а в некоторых случаях даже повышают желаемую функцию исходного белка. Действительно, известно, что модифицированные пептиды (т.е. пептиды, аминокислотная последовательность которых модифицирована путем введения одного, двух или нескольких аминокислотных остатков в исходную аминокислотную последовательность), могут сохранять биологическую активность исходного пептида (Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6; Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500; Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13). Таким образом, в соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, аминокислотная последовательность пептида по настоящему изобретению, способного индуцировать CTL, может представлять собой последовательность SEQ ID NO: 3, 4, 9, 23, 25, 30, 60, 63 или 68, в которой одна, две или более аминокислот добавлены и/или замещены на другие.
Специалистам в данной области техники будет понятно, что индивидуальные добавления или замещения одной или небольшой части аминокислот в аминокислотной последовательности сохраняют свойства боковых цепей исходных аминокислот; подобный тип модификаций, при которых полученный модифицированный белок обладает свойствами, близкими к исходному, называется «консервативной заменой» или «консервативной модификацией». Таблицы консервативных замен функционально сходных аминокислот хорошо известны в данной области техники. Примеры аминокислот, сгруппированных по свойствам их боковых цепей, включают в себя гидрофобные аминокислоты (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), гидрофильные аминокислоты (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), а также аминокислоты с нижеследующими боковыми цепями, содержащими общие функциональные группы или характеристики: алифатические боковые цепи (G, A, V, L, I, P); боковые цепи, содержащие гидроксильную группу (S, T, Y); боковые цепи, содержащие атом серы (C, M); боковые цепи, содержащие карбокси- или амидные группы (D, N, E, Q); основные боковые цепи (R, K, H); и боковые цепи, содержащие ароматические кольца (H, F, Y, W). Помимо этого, консервативными являются замены одной аминокислоты на другую в пределах каждой из нижеследующих восьми групп:
(1) аланин (A), глицин (G);
(2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (E);
(3) аспарагин (N), глутамин (Q);
(4) аргинин (R), лизин (K);
(5) изолейцин (I), лейцин (L), метионин (M), валин (V);
(6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W);
(7) серин (S), треонин (T); и
(8) цистеин (C), метионин (M) (см., например, Creighton, Proteins 1984).
Подобные консервативно модифицированные пептиды также рассматриваются как пептиды по настоящему изобретению. Однако пептиды по настоящему изобретению не ограничиваются подобными модификациями и также включают в себя пептиды с неконсервативными модификациями при условии, что полученный пептид сохраняет способность к индукции CTL. Помимо этого, модифицированные пептиды по настоящему изобретению не исключают из своего множества способные к индукции CTL пептиды, являющиеся продуктами полиморфных и аллельных вариантов, а также межвидовых гомологов TEM8.
Для сохранения требуемой способности индуцировать CTL можно модифицировать (добавить или заменить) небольшое число (например, 1, 2 или несколько) или небольшой процент аминокислот. В данном контексте термин «несколько» означает 5 или менее аминокислот, например, 3 или менее. Процент аминокислот, подлежащих замене, может составлять 20% или менее, например, 15% или менее, например, 10% или от 1 до 5%.
Анализ гомологии представленного пептида TEM8-A24-9-39 (SEQ ID NO:3), TEM8-A24-9-277 (SEQ ID NO:4), TEM8-A24-10-277 (SEQ ID NO:9), TEM8-A02-9-337 (SEQ ID NO:23), TEM8-A02-9-338 (SEQ ID NO:25), TEM8-A02-9-278 (SEQ ID NO:30), TEM8-A02-10-338 (SEQ ID NO:60), TEM8-A02-10-265 (SEQ ID NO:63) и TEM8-A02-10-333 (SEQ ID NO:68) продемонстрировал отсутствие значимой гомологии с любыми другими пептидами каких бы то ни было белковых продуктов других человеческих генов. Этот факт снижает вероятность развития неизвестных или нежелательных иммунных реакций при использовании этих пептидов в иммунотерапии. Таким образом, в контексте данного аспекта, эти пептиды могут быть использованы для индукции иммунного ответа против TEM8 в опухоле-ассоциированном эндотелии у пациентов с опухолями.
При использовании в иммунотерапии, пептиды по настоящему изобретению презентируются на поверхности клетки или экзосомы в виде комплекса с антигеном HLA. Таким образом, можно выбрать пептиды, которые в дополнение к способности индуцировать CTL обладают высокой аффинностью связывания с антигеном HLA. Более того, подобные пептиды могут быть модифицированы путем замены, добавления и т.д. аминокислотных остатков для повышения аффинности связывания. Поскольку закономерности пептидных последовательностей, представляемых в ходе связывания с антигенами HLA, в настоящее время известны (J Immunol 1994, 152: 3913; Immunogenetics 1995, 41: 178; J Immunol 1994, 155: 4307), на основании этих закономерностей и в дополнение к естественно представляемым пептидам, в иммуногенные пептиды по настоящему изобретению могут быть введены определенные модификации. Например, пептиды, в которых вторая с N-конца аминокислота замещена на фенилаланин, тирозин, метионин или триптофан, демонстрируют высокую аффинность связывания с HLA-A24; пептиды, в которых С-концевая аминокислота замещена на фенилаланин, лейцин, изолейцин, триптофан или метионин, также могут быть успешно использованы. Таким образом, пептиды с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 3, 4 или 9, в которых вторая с N-конца аминокислота замещена на фенилаланин, тирозин, метионин или триптофан, и/или в которых С-концевая аминокислота замещена на фенилаланин, лейцин, изолейцин, триптофан или метионин, также включены в объем настоящего изобретения.
(264-272)
(369-377)
(209-217)
С другой стороны, пептиды, в которых вторая с N-конца аминокислота замещена на лейцин или метионин, а С-концевая аминокислота замещена на валин или лейцин, могут быть использованы как пептиды с высокой аффинностью связывания с HLA-02. Таким образом, пептиды, соответствующие любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 23, 25, 30, 60, 63 и 68, в которых вторая с N-конца аминокислота замещена на лейцин или метионин, и/или в которых С-концевая аминокислота замещена на валин или лейцин, также включены в объем настоящего изобретения. Замены могут быть введены не только в концевых позициях, но также в положениях, соответствующих месту потенциального распознавания Т-клеточным рецептором (ТКР). В нескольких исследованиях было продемонстрировано, что аминокислотные замены в пептиде могут быть нейтральными или улучшать исходный пептид, как в случаях, например, CAP1, p53, Her-2/neu или gp100  (Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Feb 1; 168(3): 1338-47., S. O. Dionne et al. Cancer Immunol Immunother. (2003) 52: 199-206 and S. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314).
Кроме того, с N- или C-конца пептида могут быть добавлены одна или две аминокислоты. Подобные модифицированные пептиды с высокой аффинностью связывания с антигенами HLA и сохранением способности к индукции CTL, также включены в объем настоящего изобретения.
Однако в том случае, если последовательность пептида идентична фрагменту аминокислотной последовательности эндогенного или экзогенного белка с функцией, отличной от исходного белка, из которого получен пептид, могут проявиться побочные эффекты, такие как аутоиммунные расстройства или аллергические реакции против определенных веществ. Поэтому можно провести поиск гомологов по доступным базам данных для исключения ситуаций, в которых пептид будет соответствовать аминокислотной последовательности другого белка. В том случае, если из подобного поиска становится ясно, что не существует ни одного пептида, отличающегося от исходного на 1 или 2 аминокислоты, исходный пептид может быть далее модифицирован для повышения аффинности связывания с антигенами HLA и/или повышения способности пептида к индукции CTL без какой-либо опасности возникновения побочных эффектов.
Хотя ожидается, что пептиды с высокой аффинностью связывания с антигенами HLA (предсказанной согласно вышеописанному) будут высокоэффективными, кандидатные пептиды, выбранные на основании высокой аффинности связывания как индикаторного свойства, далее тестируются на способность к индукции CTL. В данном контексте, фраза «способность к индукции CTL» относится к способности презентированного на антиген-презентирующих клетках пептида индуцировать CTL. Также, фраза «способность к индукции CTL» относится к способности пептида индуцировать активацию CTL, пролиферацию CTL, а также активировать CTL к лизису клеток-мишеней и повышению продукции IFN-γ.
51
Подтверждение способности к индукции CTL проводится при помощи индукции антиген-презентирующих клеток, несущих антигены MHC человека (например, B-лимфоциты, макрофаги и дендритные клетки (ДК)), в частности - ДК, полученных из мононуклеарных лейкоцитов периферической крови, и дальнейшей стимуляции пептидами с последующим смешиванием с CD8-позитивными клетками и измерением уровня продукции IFN-γ, секретируемого CTL в ответ на стимуляцию клетками-мишенями. В качестве экспериментальной системы также могут быть использованы трансгенные животные, экспрессирующие антиген HLA человека (описанные, например, в работе BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8): 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DRl transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) response). Например, клетки-мишени могут быть помечены радиоактивным изотопом Cr и т.д., и цитотоксическая активность может быть вычислена по количеству высвобожденной радиоактивной метки из клетки-мишени. Помимо этого, цитотоксическая активность может быть определена по количеству IFN-γ, продуцируемого и высвобождаемого CTL в присутствии несущих иммобилизованный пептид антиген-презентирующих клеток, с последующей визуализацией зон ингибирования при помощи моноклональных анти-IFN-γ антител.
По результатам вышеописанного анализа на способность пептидов к индукции CTL, пептиды с высокой аффинностью связывания с антигеном HLA не обязательно демонстрируют высокую способность к индукции CTL. Нонапептиды или декапептиды, выбранные из группы пептидов, аминокислотные последовательности которых соответствуют последовательностям SEQ ID NO: 3, 4, 9, 23, 25, 30, 60, 63 и 68, демонстрировали особо высокую способность к индукции CTL, равно как и высокие показатели аффинности связывания с антигеном HLA. Таким образом, эти пептиды представляют собой примеры вариантов настоящего изобретения.
Помимо вышеописанных модификаций пептидов, пептиды по настоящему изобретению могут быть далее дополнительно связаны с другими веществами, при условии, что полученный продукт сохраняет способность к индукции CTL. Примеры подобных веществ включают в себя: пептиды, липиды, сахара и сахаридные цепи, ацетильные группы, природные и синтетические полимеры и т.д. Эти пептиды могут быть подвергнуты различным модификациям, таким как гликозилирование, окисление боковых цепей или фосфорилирование, при условии что подобные модификации не снижают вышеописанной биологической активности исходных пептидов. Подобные типы модификаций могут быть применены для придания полипептиду дополнительных функций (например, способности к таргеттированию или доставке) либо для его стабилизации. Например, известным в данной области техники способом повышения стабильности полипептида in vivo является введение в его состав D-аминокислот, аминокислотных миметиков либо искусственных аминокислот; данный подход также может быть адаптирован для целей настоящего изобретения. Стабильность полипептида может быть проанализирована множеством способов. Например, для анализа стабильности могут быть использованы пептидазы и различные биологические среды, такие как человеческая плазма и сыворотка (см., например, Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302).
В данном тексте, пептиды по настоящему изобретению также могут быть названы как «пептид(ы) TEM8» или «полипептид(ы) TEM8».
III. Получение пептидов TEM8
Пептиды по настоящему изобретению могут быть получены при помощи широко известных методов. Например, данные пептиды могут быть получены синтетически, при помощи технологии рекомбинантной ДНК или путем химического синтеза. Пептиды по настоящему изобретению могут быть получены в индивидуальном виде или в виде более длинного полипептида, состоящего из двух или более пептидов. Данные пептиды могут быть выделены, т.е. очищены или выделены в виде препаратов, практически свободных от других белков клеток-хозяев и их фрагментов, а также от любых других химических соединений.
Пептиды по настоящему изобретению могут быть получены путем химического синтеза на основании выбранной аминокислотной последовательности. Например, общепринятые способы пептидного синтеза, которые могут быть адаптированы для целей настоящего изобретения, включают в себя способы, изложенные в следующих руководствах и работах:
(i) Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966;
(ii) The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976;
(iii) Peptide Synthesis (in Japanese), Maruzen Co., 1975;
(iv) Basics and Experiment of Peptide Synthesis (in Japanese), Maruzen Co., 1985;
(v) Development of Pharmaceuticals (second volume) (in Japanese), Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa, 1991;
(vi) WO99/67288; и
(vii) Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, New York, 1980, 100-118.
Помимо этого, пептиды по настоящему изобретению могут быть получены при помощи адапатации любых известных генноинженерных способов получения пептидов (см., например, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62). Например, на первой стадии получают подходящий вектор, несущий кодирующий целевой пептид полинуклеотид в экспрессируемой форме (например, расположенный с 3'-конца от регуляторной последовательности, соответствующей последовательности промотора), которым далее трансформируют подходящие клетки-хозяева. Полученные клетки-хозяева далее культивируются для продукции целевого пептида. Пептид также может быть получен in vitro при помощи адаптации систем in vitro трансляции.
IV. Полинуклеотиды
Настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим любой из вышеупомянутых пептидов по настоящему изобретению. Эти полинуклеотиды включают в себя полинуклеотиды, полученные из природного гена TEM8 (№ NM_032208 по базе данных GenBank (SEQ ID NO:75)), а также нуклеотидные последовательности, представляющие собой их консервативно модифицированные аналоги. Термин «консервативно модифицированные аналоги» относится к последовательностям, кодирующим идентичные либо почти идентичные аминокислотные последовательности. В силу вырожденности генетического кода, один белок может кодироваться множеством функционально идентичных нуклеиновых кислот. Например, кодоны GCA, GCC, GCG и GCU все кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в каждом положении, в котором аланин кодируется тем или иным кодоном, данный кодон может быть замещен на любой из вышеуказанных кодонов без изменения последовательности кодируемого полипептида. Подобные варианты нуклеиновых кислот называются «молчащими заменами» и представляют собой одну из разновидностей консервативно модифицированных вариантов. Каждая описанная в настоящей заявке нуклеотидная последовательность, кодирующая тот или иной пептид, также относится и ко всем возможным вариантам соответствующей нуклеиновой кислоты, содержащей любые молчащие замены. Специалистам в данной области техники будет понятно, что любой кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением AUG, обычно представляющего собой уникальный кодон для метионина, и TGG, обычно представляющего собой уникальный кодон для триптофана) может быть замещен таким образом, что полученная молекула будет функционально идентична исходной. В соответствии с этим, к каждой раскрытой последовательности косвенным образом относятся также все содержащие любые молчащие замены варианты этой последовательности, кодирующие тот или иной пептид.
Полинуклеотид по настоящему изобретению может состоять из ДНК, РНК или их производных. ДНК состоит из оснований, таких как А, Т, С и G, в то время как в РНК Т заменяется на U.
Полинуклеотид по настоящему изобретению может кодировать несколько пептидов по настоящему изобретению, разделенных друг с другом промежуточными последовательностями или расположенных «стык в стык». Например, промежуточная последовательность может содержать сайт расщепления (например, сайт распознавания фермента) полинуклеотида или транслированных пептидов. Далее, полинуклеотид может включать в себя любые дополнительные последовательности помимо последовательности, кодирующей пептид по настоящему изобретению. Например, полинуклеотид может представлять собой рекомбинантный полинуклеотид, содержащий регуляторные последовательности, необходимые для экспрессии целевого пептида, либо может представлять собой экспрессионный вектор (плазмиду) с маркерными генами и т.д. В общем случае, подобные рекомбинантные полинуклеотиды могут быть получены путем определенных манипуляций из других полинуклетидов при помощи общепринятых в технологии рекомбинантной ДНК способов с использованием, например, полимераз и эндонуклеаз.
Полинуклеотиды по настоящему изобретению могут быть получены как при помощи технологии рекомбинантной ДНК, так и путем химического синтеза. Например, полинуклеотид может быть получен при помощи вставки в подходящий вектор, который может быть далее экспрессирован после трансфекции в компетентые клетки. Помимо этого, полинуклеотид может быть амплифицирован с использованием методов, основанных на ПЦР, либо при помощи экспрессии в подходящих клетках-хозяевах (см., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989). Помимо этого, полинуклеотид может быть получен при помощи твердофазного синтеза, согласно описанному в работах Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5.
V. Экзосомы
Настоящее изобретение далее относится к внутриклеточным везикулам, называемым экзосомами, презентирующим на своей поверхности комплексы между пептидами по настоящему изобретению и антигенами HLA. Экзосомы могут быть получены, например, при помощи способов, описанных в патентных заявках Японии №№ Hei 11-510507 и WO99/03499, а также с использованием АПК, полученных у пациентов, которым планируется проводить лечение и/или профилактику. Экзосомы по настоящему изобретению могут быть введены индивиду как вакцины, аналогично пептидам по настоящему изобретению.
Типы антигенов HLA, входящих в состав комплексов с пептидами, должны совпадать с таковыми у пациентов, которым планируется проводить лечение и/или профилактику. Например, для японцев, подходящими антигенами HLA часто являются антигены HLA-A24, в частности - HLA-A2402. Для получения хороших результатов предпочтительным является использование антигенов A-24 или A-02, экспрессируемых на высоком уровне среди японцев и у индивидов европеоидной расы, в частности, могут быть использованы подтипы этих антигенов, такие как A-2402 и A-0201. В клинических условиях HLA-типирование пациента, нуждающегося в лечении, проводится заранее, что позволяет выбрать подходящий пептид, характеризующийся высокой аффинностью связывания с идентифицированным антигеном HLA, либо высокой способностью к индукции CTL в ходе презентации антигена. Далее, для получения пептидов, обладающих высокой аффинностью связывания и высокой способностью к индукции CTL, в природной аминокислотной последовательности пептидного фрагмента TEM8 могут быть добавлены или замещены 1, 2 или несколько аминокислот.
При использовании экзосом по настоящему изобретению, в случае применения HLA-A24 могут быть использованы пептиды с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 3, 4 или 9, в то время как в случае применения HLA-A02 могут быть использованы пептиды с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 23, 25, 30, 60, 63 или 68.
VI. Антиген-презентирующие клетки (АПК)
Настоящее изобретение также относится к антиген-презентирующим клеткам (АПК), презентирующим на своей поверхности комплексы между пептидами по настоящему изобретению и антигенами HLA. АПК, которые могут быть получены путем нагрузки пептидами по настоящему изобретению либо путем введения кодирующих эти пептиды полинуклеотидов по настоящему изобретению, первоначально могут быть выделены у пациентов, которым планируется проводить лечение и/или профилактику, и могут быть введены в виде вакцин сами по себе либо в комбинации с другими медицинскими средствами, в том числе пептидами по настоящему изобретению, экзосомами или цитотоксическими Т-клетками. Помимо этого, настоящее изобретение также относится к АПК, презентирующим пептиды по настоящему изобретению в контексте антигенов HLA, индукция которых выполняется при помощи:
(а) нагрузки АПК пептидами по настоящему изобретению, или
(b) введения в АПК полинуклеотида, кодирующего эти пептиды.
АПК не ограничены по своей природе какими-либо частными типами клеток и включают в себя ДК, клетки Лангерганса, макрофаги, B-клетки и активированные Т-клетки, которые презентируют на своей поверхности белковые антигены, далее распознаваемые другими лимфоцитами. Поскольку ДК являются типичными АПК с наиболее высокой среди всех АПК CTL-индуцирующей активностью, именно ДК могут быть использованы в качестве предпочтительных АПК по настоящему изобретению.
Например, АПК могут быть получены путем преобразования (индукции) ДК из моноцитов периферической крови с последующей нагрузкой (стимуляцией) полученных ДК пептидами по настоящему изобретению in vitro, ex vivo или in vivo. При введении пептидов по настоящему изобретению индивиду, АПК, презентирующие эти пептиды, индуцируются в организме этого индивида. Термин «индукция АПК» относится к нагрузке (стимуляции) клеток пептидами по настоящему изобретению, либо нуклеотидами, кодирующими пептиды по настоящему изобретению, в результате чего комплексы последних с антигенами HLA презентируются на клеточной поверхности. Также, после нагрузки АПК пептидами по настоящему изобретению для обеспечения им возможности презентировать эти антигены, полученные АПК могут быть введены индивиду в виде вакцины. Например, ex vivo подход к введению препарата может включать в себя следующие этапы:
а: забор АПК у первого индивида
b: контактирование полученных на этапе «а» АПК с пептидами по настоящему изобретению, и
c: введение нагруженных пептидами АПК второму индивиду.
Первый и второй индивиды могут быть как одним индивидом, так и двумя разными индивидами. Помимо этого, настоящее изобретение также относится к использованию пептидов по настоящему изобретению для производства фармацевтической композиции, индуцирующей АПК. Далее, настоящее изобретение относится к использованию пептидов по настоящему изобретению для индукции антиген-презентирующих клеток. АПК, полученные по п.b, могут быть введены индивиду в качестве вакцины.
В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения, данные АПК обладают высокой способностью к индукции CTL. Фраза «высокая способность к индукции CTL» относится к уровню индукции CTL по отношению к таковому в отсутствие стимуляции АПК, либо при стимуляции АПК пептидами, не вызывающими индукции CTL. Подобные АПК с высокой способностью к индукции CTL могут быть получены при помощи способа, включающего в себя этап переноса генов, содержащих нуклеотиды, кодирующие пептиды по настоящему изобретению, в АПК in vitro. Данные гены могут быть введены в форме ДНК или РНК. Примеры способов подобного введения включают в себя без особого ограничения различные общепринятые в данной области техники способы, такие как липофекция, электропорация и кальций-фосфатная трансфекция. Более конкретно, это может быть выполнено в соответствии с описанным в работах Cancer Res 1996, 56: 5672-7; J Immunol 1998, 161: 5607-13; J Exp Med 1996, 184: 465-72; а также в опубликованном японском переводе международной публикации № 2000-509281. После переноса гена в АПК, введенный ген транскрибируется, транслируется и т.д. внутри клетки, и полученный белок далее процессируется при участии молекул MHC I и II классов и вовлекается в процесс презентации антигена, конечным результатом которого является презентация пептидных фрагментов.
VII. Цитотоксические Т-клетки
Индуцированные цитотоксические Т-клетки, специфичные к любому из пептидов по настоящему изобретению, усиливают иммунный ответ против опухоле-ассоциированного эндотелия in vivo, и таким образом, подобно пептидам, могут быть использованы в качестве вакцин. Таким образом, настоящее изобретение относится к очищенным цитотоксическим Т-клеткам, которые специфически индуцируются или активируются одним из пептидов по настоящему изобретению. Предпочтительно, настоящее изобретение относится к очищенным цитотоксическим Т-клеткам, которые:
+
(а) индуцируются путем приведения CD8 Т-клеток во взаимодействие с АПК, презентирующими пептиды по настоящему изобретению в комплексе с антигенами HLA, либо
(b) трансдуцируются нуклеиновыми кислотами, кодирующими полипептидные субъединицы ТКР, способные связываться с пептидами по настоящему изобретению, представленными в контексте HLA-A24 или HLA-A2.
Подобные цитотоксические Т-клетки могут быть получены путем (1) введения пациенту пептидов по настоящему изобретению, либо (2) приведением (стимуляцией) полученных от индивида АПК и CD8-позитивных клеток, либо мононуклеарных лейкоцитов периферической крови in vitro во взаимодействие с пептидами по настоящему изобретению.
Цитотоксические Т-клетки, индуцированные при помощи стимуляции антиген-презентирующими клетками, презентирующими пептиды по настоящему изобретению, могут быть получены от индивидов, которым планируется проводить лечение и/или профилактику, и могут быть далее введены сами по себе или в комбинации с другими лекарственными средствами, включающими пептиды по настоящему изобретению или экзосомами с целью осуществления регуляторных эффектов. Полученные цитотоксические Т-клетки действуют специфически против клеток-мишеней, презентирующих пептиды по настоящему изобретению, или, например, тот же пептид, что использовался для индукции. Клетки-мишени могут представлять собой клетки, эндогенно экспрессирующие TEM8, либо клетки, трансфецированные геном TEM8; клетки, презентирующие пептиды по настоящему изобретению на поверхности клетки в результате стимуляции этими пептидами, также могут быть мишенями атаки активированных CTL.
VIII. Т-клеточный рецептор (ТКР)
Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, способные формировать субъединицы Т-клеточного рецептора (ТКР), а также к способам их использования. Субъединицы Т-клеточного рецептора способны формировать ТКР, обуславливающий специфичность Т-лимфоцитов в отношении опухолевых клеток, презентирующих TEM8. Нуклеиновые кислоты, кодирующие альфа- и бета-цепи (т.е. две субъединицы ТКР) CTL, индуцированных одним или несколькими пептидами по настоящему изобретению, могут быть идентифицированы при помощи известных в данной области техники способов (WO2007/032255 и Morgan et al., J Immunol, 171, 3288 (2003)). Подобные производные TCR могут с высокой авидностью связываться с клетками-мишенями, экспонирующими пептиды TEM8, и (не обязательно) опосредовать эффективное уничтожение клеток-мишеней, презентирующих пептиды TEM8 in vivo и in vitro.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие субъединицы ТКР, могут быть включены в состав подходящих векторов, например, ретровирусных векторов. Подобные векторы хорошо известны в данной области техники. Нуклеиновые кислоты или содержащие их векторы могут быть эффективно перенесены в Т-клетки, полученные, например, от пациента. Предпочтительно, настоящее изобретение относится к готовым к использованию композициям, позволяющим выполнять быстрые модификации Т-клеток пациента (или другого млекопитающего) для быстрого и легкого получения Т-клеток, обладающих превосходной способностью уничтожать опухолевые клетки.
Настоящее изобретение также относится к CTL, полученным путем переноса нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды субъединиц ТКР, способных связываться с пептидами TEM8, например, с пептидами SEQ ID NO: 3, 4, 9, 23, 25, 30, 60, 63 и 68 в контексте HLA-A24 или HLA-A2. Трансдуцированные CTL способны к миграции в очаг раковых клеток in vivo, и могут быть размножены при помощи хорошо известных культуральных способов in vitro (см., например, Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461 (1989)). Т-клетки по настоящему изобретению могут быть использованы в виде иммуногенной композиции, пригодной для лечения или профилактики злокачественных опухолей у пациентов, нуждающихся в подобном лечении или профилактике (WO2006/031221).
Термин «профилактика» относится к любым действиям, направленным на снижение заболеваемости или смертности от того или иного заболевания. Профилактика может быть «первичной», «вторичной» или «третичной». В то время как целью первичной профилактики является предотвращение развития заболевания, вторичная и третичная профилактики включают в себя действия, направленные на предотвращение прогрессии заболевания и возникновения симптомов, требующих неотложного медицинского вмешательства, а также на уменьшение негативных воздействий уже развившегося заболевания путем восстановления различных функций и сокращения осложнений заболевания. Также профилактика включает в себя множество способов профилактической терапии, направленной на облегчение тяжести того или иного заболевания, например, на уменьшение пролиферации опухоли и метастатической нагрузки, а также на подавление ангиогенеза.
Лечение и/или профилактика злокачественных опухолей и/или профилактика послеоперационного рецидивирования включает в себя любой из нижеприведенных способов, таких как хирургическое удаление раковых клеток, ингибирование роста раковых клеток, инволюция или регрессия опухоли, индукция ремиссии и предотвращение возникновения злокачественной опухоли, регрессия опухоли и уменьшение объема или замедление роста метастазов. Эффективное лечение и/или профилактика рака снижает смертность и улучшает прогноз пациентов, страдающих злокачественными опухолями, снижает уровень опухолевых маркеров в крови и облегчает определяемые симптомы, сопутствующие развитию злокачественной опухоли. Например, эффективное лечение и/или профилактика приводят к снижению выраженности или улучшению симптомов на 10%, 20% или 30%, либо к стабилизации заболевания.
IX. Фармацевтические средства
Поскольку экспрессия TEM8 специфически повышена в опухоле-ассоциированном эндотелии по сравнению с нормальной тканью (St Croix B et al., Science 2000 Aug 18, 289(5482): 1197-202), пептиды по настоящему изобретению или полинуклеотиды, кодирующие эти пептиды, могут быть использованы для лечения и/или профилактики злокачественных опухолей и/или профилактики их послеоперационного рецидивирования. Таким образом, настоящее изобретение относится к фармацевтическому средству, предназначенному для лечения и/или профилактики злокачественных опухолей и/или профилактики их послеоперационного рецидивирования, содержащему в качестве активных ингредиентов один или более пептидов по настоящему изобретению или полинуклеотиды, кодирующие эти пептиды. Также пептиды по настоящему изобретению могут быть экспрессированы на поверхности любых вышеупомянутых экзосом или клеток, таких как АПК, с целью использования в качестве фармацевтических средств. Кроме того, вышеуказанные цитотоксические Т-клетки, направленные на любой из пептидов по изобретению, могут использоваться в качестве активного ингредиента в фармацевтических средствах по настоящему изобретению.
Фармацевтические средства по настоящему изобретению могут быть использованы в качестве вакцины. В контексте настоящего изобретения термин «вакцина» (также называемая «иммуногенной композицией») относится к некоторому веществу, способному после инокуляции в организм животного индуцировать противоопухолевый иммунитет.
Фармацевтические средства по настоящему изобретению могут быть использованы для лечения и/или профилактики злокачественных опухолей и/или профилактики их послеоперационного рецидивирования у индивидов или пациентов, включая людей и любых других млекопитающих, включая без ограничения мышей, крыс, морских свинок, кроликов, кошек, собак, овец, козлов, свиней, крупный рогатый скот, лошадей, обезьян, павианов и шимпанзе, в особенности коммерчески важных и домашних животных.
Согласно настоящему изобретению, было продемонстрировано, что полипептиды с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 3, 4 или 9 представляют собой рестрицированные HLA-A24 эпитопы пептидов, способные индуцировать мощный и специфический иммунный ответ против опухоле-ассоциированного эндотелия. Следовательно, особенно эффективными для введения индивиду являются фармацевтические средства по настоящему изобретению, содержащие любой полипептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, 4 и 9, у которых антиген HLA представляет собой HLA-A24. С другой стороны, было продемонстрировано, что полипептиды с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 23, 25, 30, 60, 63 и 68 представляют собой рестрицированные HLA-A02 эпитопы пептидов, способные индуцировать мощный и специфический иммунный ответ против опухоле-ассоциированного эндотелия. Таким образом, фармацевтические средства, содержащие любые из полипептидов, содержащих полипептиды с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 23, 25, 30, 60, 63 и 68, являются в особенности подходящими для введения индивидам с HLA-антигеном HLA-A02. Это же относится к фармацевтическим средствам, содержащим полинуклеотиды, кодирующие любые из этих полипептидов.
Злокачественные опухоли, для лечения которых могут быть использованы фармацевтические средства по настоящему изобретению, не ограничены и включают в себя все виды злокачественных опухолей, в развитие которых вовлечен TEM8, включая, например, рак мочевого пузыря, злокачественные опухоли мозга, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярный рак, рак эндометрия, рак пищевода, рак желудка, рак печени, рак легких, нейробластома, остеосаркома, рак яичников, меланома, рак поджелудочной железы, рак простаты, опухоли яичек и колоректальный рак (см. фигуру 5).
Помимо вышеупомянутых активных ингредиентов, фармацевтические средства по настоящему изобретению могут также содержать другие пептиды, обладающие способностью к индукции CTL против раковых клеток, другие полинуклеотиды, кодирующие другие пептиды, другие клетки, которые презентируют другие пептиды, или тому подобное. В контексте настоящего изобретения, примерами других пептидов, обладающих способностью к индукции CTL против раковых клеток, служат без ограничения раково-специфичные антигены (например, идентифицированные ОАА).
При необходимости фармацевтические средства по настоящему изобретению могут (не обязательно) включать в себя в качестве активного ингридиента другие вещества при условии, что они не снижают противоопухолевого эффекта активного ингредиента на опухолевый эндотелий, например, любой из пептидов по настоящему изобретению. Например, композиции могут включать в себя противовоспалительные средства, болеутоляющие средства, химиотерапевтические средства и т.д. Помимо введения в их состав других терапевтических веществ, медикаменты по настоящему изобретению также могут быть введены последовательно или одновременно с другими фармакологическими средствами. Количества медикамента и фармакологического средства зависят, например, от типа используемого(ых) фармакологического(их) средства(в), от заболевания, которое планируется лечить, а также от режима и способа введения.
Должно быть понятно, что помимо ингредиентов, особо оговоренных в тексте настоящей заявки, фармацевтические средства по настоящему изобретению могут включать в себя другие общеиспользуемые в данной области техники средства с учетом типа рассматриваемой композиции.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, фармацевтические средства по настоящему изобретению могут быть включены в изделия и наборы, содержащие материалы, пригодные для использования при лечении патологических состояний, ассоциированных с рассматриваемым заболеванием (например, раком). Изделие может включать в себя снабженную этикеткой емкость с любым из фармацевтических средств по настоящему изобретению. Подходящие емкости включают в себя флаконы, ампулы и пробирки. Емкость может быть выполнена из различных материалов, таких как стекло или пластик. Этикетка на емкости должна содержать информацию о средстве, используемом для лечения или предотвращения одного или более ассоциированных с заболеванием состояний. Этикетка также может содержать инструкции по введению и т.д.
Помимо вышеописанных емкостей, набор, включающий в себя фармацевтическое средство по настоящему изобретению, далее может (не обязательно) содержать вторую емкость, содержащую фармацевтически приемлемый разбавитель. Набор также может включать в себя другие материалы, включение которых является желательным с коммерческой или пользовательской точек зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы, различные вкладыши в упаковку и инструкции по применению.
При желании фармацевтические композиции могут быть помещены в упаковки или дозировочные устройства, которые могут содержать одну или более стандартных лекарственных форм, содержащих активный ингредиент. Упаковка может, например, включать в себя металлическую или пластиковую фольгу, например, в виде блистерной упаковки. Упаковки или дозировочные устройства могут сопровождаться инструкциями по применению.
(1) Фармацевтические средства, содержащие в качестве активных ингредиентов пептиды
Пептиды по настоящему изобретению могут быть введены в качестве фармацевтических средств напрямую, либо, при необходимости, включены в состав фармацевтической композиции при помощи общепринятых технологий приготовления лекарственных средств. В этом случае, при необходимости, помимо пептидов по настоящему изобретению, в композицию могут быть без особых ограничений включены обычно используемые для приготовления лекарственных средств носители, наполнители и т.д. Примеры подобных носителей включают в себя стерилизованную воду, физиологический раствор, фосфатный буфер, культуральную жидкость и т.д. Более того, фармацевтические средства могут содержать, если необходимо, стабилизаторы, суспендирующие агенты, консерванты, и тому подобное. Фармацевтические средства по настоящему изобретению могут быть использованы в качестве противораковых препаратов.
Для индукции CTL in vivo пептиды по настоящему изобретению могут использоваться в виде комбинации, сочетающей в себе два или более пептидов по настоящему изобретению. Пептиды могут быть использованы в виде смеси или конъюгированы друг с другом при помощи стандартных способов. Например, пептиды могут быть конъюгированы друг с другом химически, либо могут быть изначально экспрессированы в виде единой гибридной (слитой) полипептидной последовательности. Пептиды в подобной комбинации могут быть одними и теми же, либо различными. В результате введения пептидов по настоящему изобретению, они с высокой плотностью презентируются антигенами HLA на поверхности АПК, после чего CTL специфически реагируют с комплексами между экспонированным пептидом и антигеном HLA, что приводит к их индукции. Альтернативный подход заключает в получении АПК, презентирующих любой из пептидов по настоящему изобретению на своей поверхности, путем забора АПК (например, ДК) у индивида с последующей стимуляцией полученных АПК пептидами по настоящему изобретению, и дальнейшей индукцией CTL в организме индивида в результате обратного введения ему полученных АПК (например, ДК); в результате, агрессивность атаки против опухоле-ассоциированного эндотелия может быть повышена.
Фармацевтические средства, предназначенные для лечения и/или профилактики злокачественных опухолей, содержащих в качестве активного ингредиента пептиды по настоящему изобретению, могут также содержать адъювант для эффективного развития клеточного иммунного ответа, или же они могут быть введены вместе с другими активными ингредиентами; также эти средства могут быть заключены в гранулы. Под адъювантом следует понимать некоторое вещество или состав, которое(ый) при одновременном (или последовательном) введении с иммунологически активным белком усиливает иммунный ответ на последний. Адъюванты, которые могут быть использованы в контексте настоящего изобретения, включают в себя таковые, описанные в литературе (Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89). Примеры адъювантов включают в себя без ограничения фосфат алюминия, гидроксид алюминия, алюм, холерный токсин, токсин сальмонеллы и т.д.
Далее, удобным может быть использование липосомальных композиций, композиций на основе гранул, в которых пептиды связаны с шариками диаметром в несколько микрометров, а также композиции, в которых пептиды связаны с липидами.
В некоторых воплощениях, фармацевтические средства по настоящему изобретению содержат компоненты, осуществляющие праймирование CTL. Было показано, что липиды представляют собой средства, пригодные для праймирования CTL вирусными антигенами in vivo. Например, остатки пальмитиновой кислоты могут быть конъюгированы с эпсилон- и альфа-аминогруппами остатков лизина, таким образом связываясь с пептидами по настоящему изобретению. Полученный липопептид может быть далее введен напрямую в виде мицеллы или частицы, включен в состав липосомы или эмульгирован в адъюванте. Другим примером липидного праймирования CTL являются липопротеины E. coli, такие как трипальмитоил-S-глицерилцистеинилсерил-серин (P3CSS), который, будучи ковалентно связан с подходящим пептидом, может быть использован для праймирования CTL (см., например, Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4).
Введение может осуществляться перорально, внутрикожно, чрезкожно, подкожно, путем внутривенной инъекции и т.д.; введение может быть системным или локальным, осуществляемым вблизи сайтов-мишеней. Введение может осуществляться однократно, либо в усиленном режиме путем нескольких введений. Дозировка пептидов по настоящему изобретению может быть подобрана в соответствии с заболеванием, которое планируется лечить, возрастом пациента, его весом, способом введения и т.д. и обычно составляет от 0,001 мг до 1000 мг, например от 0,001 мг до 1000 мг, например, от 0,1 мг до 10 мг; введение может осуществляться с частотой от одного раза в несколько дней до одного раза в несколько месяцев. Специалист в данной области техники способен должным образом подобрать подходящую дозу.
(2) Фармацевтические средства, содержащие в качестве активных ингредиентов полинуклеотиды
Фармацевтические средства по настоящему изобретению также могут содержать нуклеиновые кислоты, кодирующие раскрытые в настоящей заявке пептиды, в экспрессируемой форме. В данном тексте фраза «в экспрессируемой форме» означает, что введенный в клетку полинуклеотид будет in vivo экспрессировать полипептид, индуцирующий противоопухолевый иммунный ответ. В одном из воплощений настоящего изобретения, последовательность нуклеиновых кислот полинуклеотида включает в себя регуляторные элементы, необходимые для его экспрессии. Полинуклеотид может содержать элементы, необходимые для стабильной интеграции в геном клетки-мишени (см., например, Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12 для ознакомления с кассетными векторами для гомологичной рекомбинации). См., например, Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8; патенты США №№ 5580859; 5589466; 5804566; 5739118; 5736524; 5679647; и WO 98/04720. Примеры ДНК-опосредованных технологий доставки включают в себе «голую ДНК», облегченную доставку (бупивакаин, полимеры, пептид-опосредованная), комплексы с катионными липидами, а также доставка при помощи микрочастиц («генная пушка»), либо доставка при помощи давления (см., например, патент США № 5922687).
Пептиды по настоящему изобретению также могут быть экспрессированы при помощи вирусных или бактериальных векторов. Примеры экспрессионных векторов включают в себя ослабленные штаммы вирусов, таких как вирусы коровьей и птичьей оспы. Данный подход включает в себя использование вируса коровьей оспы, например, как вектор для экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей тот или иной пептид. После введения в хозяина, рекомбинантный вирус осповакцины экспрессирует иммуногенный пептид, тем самым вызывая иммунный ответ. Вирус осповакцины и способы, применимые для протоколов иммунизации, описаны, например, в патенте США № 4722848. Другим вектором является БЦЖ (бацилла Кальметта-Герена). Векторы на основе БЦЖ описаны в работе Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60. Также для терапевтического введения или иммунизации может быть использован широкий спектр других векторов, например, векторы на основе адено- и аденоассоциированных вирусов, ретровирусные векторы, векторы на основе Salmonella typhi, векторы на основе детоксифицированного токсина сибирской язвы и т.д. См., например, Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71; Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806; Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85.
Доставка полинуклеотида в организм пациента может осуществляться напрямую - в этом случае пациенту напрямую вводят вектор, несущий необходимый полинуклеотид, либо непрямо - при этом подходе на первом этапе клетки трансформируют целевым полинуклеотидом in vitro, после чего трансформированные клетки переносят в организм пациента. Вышеописанные подходы известны как генная терапия in vivo и ex vivo, соответственно.
Для получения общего обзора способов генной терапии, см. Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505; Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96; Mulligan, Science 1993, 260: 926-32; Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217; Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215). Общеизвестные в области технологии рекомбинантной ДНК способы, которые также могут быть использованы в контексте настоящего изобретения, описаны в руководствах Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993; and Krieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990.
Введение может осуществляться перорально, внутрикожно, подкожно, путем внутривенной инъекции и т.д.; введение может быть системным или локальным, осуществляемым вблизи сайтов-мишеней. Введение может осуществляться однократно, либо в усиленном режиме путем нескольких введений. Дозировка полинуклеотидов в подходящем носителе, либо клеток, трансформированных полинуклеотидом, кодирующим пептиды по настоящему изобретению, может быть подобрана в соответствии с заболеванием, которое планируется лечить, возрастом пациента, его весом, способом введения и т.д. и обычно составляет от 0,001 мг до 1000 мг, например от 0,001 мг до 1000 мг, например, от 0,1 мг до 10 мг; введение может осуществляться с частотой от одного раза в несколько дней до одного раза в несколько месяцев. Специалист в данной области техники способен должным образом подобрать подходящую дозу.
X. Способы использования пептидов, экзосом, АПК и CTL
Пептиды по настоящему изобретению и полинуклеотиды, кодирующие эти пептиды, могут быть использованы для индукции АПК и CTL. Экзосомы и АПК по настоящему изобретению также могут быть использованы для индукции CTL. Пептиды, полинуклеотиды, экзосомы и АПК могут быть использованы в комбинации с другими соединениями при условии, что они не ингибируют их способность к индукции CTL. Таким образом, любой из вышеупомянутых фармацевтических средств по настоящему изобретению может быть использован для индукции CTL; помимо этого, подобные средства, содержащие пептиды и полинуклеотиды, также могут быть использованы для индукции АПК согласно описанному ниже.
(1) Способ индукции антиген-презентирующих клеток (АПК)
Настоящее изобретение относится к способам индукции АПК с использованием пептидов по настоящему изобретению или полинуклеотидов, кодирующих эти пептиды. Индукция АПК может быть проведена в соответствии с описанным выше в разделе «VI. Антиген-презентирующие клетки». Настоящее изобретение также относится к способу индукции АПК с высокой способностью к индукции CTL, которая также была упомянута в разделе «VI. Антиген-презентирующие клетки», см. выше. Предпочтительно, настоящее изобретение относится к способу, включающему в себя нагрузку АПК пептидами по настоящему изобретению или введение в АПК полинуклеотидов, кодирующих эти пептиды, с получением АПК, презентирующих пептиды по настоящему изобретению в контексте антигенов HLA.
(2) Способ индукции CTL
8+
Далее, настоящее изобретение относится к способам индукции CTL с использованием пептидов по настоящему изобретению, полинуклеотидов, кодирующих эти пептиды, либо экзосом или АПК, презентирующих эти пептиды. В предпочтительном воплощении, способ включает в себя этап приведения CD Т-клеток во взаимодействие с:
(а) АПК, презентирующих пептиды по настоящему изобретению в контексте антигенов HLA, или
(b) АПК, индуцированных путем введения гена, содержащего полинуклеотид, кодирующий пептиды по настоящему изобретению, в антиген-презентирующую клетку. При введении пептидов по настоящему изобретению индивиду, CTL индуцируются в организме пациента, и сила иммунного ответа против опухоле-ассоциированного эндотелия повышается. Помимо этого, пептиды и полинуклеотиды, кодирующие эти пептиды, могут быть использованы в соответствии с ex vivo терапевтическим способом, в котором полученные от индивида АПК и CD8-позитивные клетки, либо мононуклеарные лейкоциты периферической крови приводятся во взаимодействие (стимулируются) с пептидами по настоящему изобретению in vitro, и после индукции CTL активированные цитотоксические Т-лимфоциты возвращают в организм индивида. Например, данный способ может включать в себя этапы:
(а) забора АПК у индивида;
(b) приведения АПК, полученных на этапе «а», во взаимодействие с пептидом;
+
(с) смешивания АПК, полученных на этапе «b» с CD8 Т-клетками и их совместного культвирования для индукции CTL; и
+
(d) выделения CD8 Т-клеток из смешанной культуры, полученной на этапе «с».
Помимо этого, настоящее изобретение относится к использованию пептидов по настоящему изобретению для производства фармацевтической композиции, способной к индукции CTL. Далее, настоящее изобретение также относится к использованию пептидов по настоящему изобретению для индукции CTL.
+
+
Обладающие цитотоксической активностью CD8 Т-клетки, полученные на этапе «d», могут быть введены индивиду в качестве вакцины. АПК, которые планируется смешивать с CD8 Т-клетками на вышеприведенном этапе «с» также могут быть получены путем переноса в АПК генов, кодирующих пептиды по настоящему изобретению, в соответствии с описанным в разделе «VI. Антиген-презентирующие клетки»; однако АПК, которые могут быть использованы в данных процедурах, не ограничены вышеописанными, и любые АПК или экзосомы, эффективно презентирующие пептиды по настоящему изобретению на Т-клетках, могут быть использованы в контексте данного способа.
В данном тексте описаны подходящие способы и материалы, хотя иные способы и материалы, схожие или эквивалентные описанным, также могут быть использованы в практическом воплощении или испытании настоящего изобретения. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие упомянутые литературные источники полностью включены в настоящую заявку посредством ссылок. В случае возникновения конфликтных ситуаций, предпочтение следует отдавать настоящему описанию, включая определения. Также, все материалы, способы, методы и примеры являются иллюстративными и не ограничивающими объем настоящего изобретения.
Нижеследующие примеры призваны проиллюстрировать настоящее изобретение и помочь специалисту в данной области техники в практической реализации и использовании оного. Данные примеры ни коим образом не ограничивают объем настоящего изобретения.
ПРИМЕРЫ
Материалы и методы
Клеточные линии
Лимфобластоидная клеточная линия А24 (A24LCL) была получена из трансформированного вирусом Эпштейна-Барра HLA-A24 - позитивного B-лимфоцита человека. B-лимфобластоидные клеточные линии человека Т2 (HLA-A2), и линии мышиного колоректального рака, COS7 и CT26, были приобретены из АТСС. Линия мышиной лимфомы, RLmale1, была приобретена от Cell Resource center for biomedical research, tohoku University.
Выбор кандидатных пептидов TEM8
9- и 10-мерные пептиды TEM8, связывающиеся с молекулами HLA-A*2402 и HLA-A*0201 были предсказаны при помощи программного обеспечения для предсказания связывания «BIMAS» (http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind), алгоритмы которого были описаны в работах Parker KC et al. (J Immunol 1994, 152(1): 163-75) и Kuzushima K et al. (Blood 2001, 98(6): 1872-81). Предсказанные пептиды были синтезированы в компании Sigma (Саппоро, Япония) в соответствии со стандартными методами твердофазного синтеза, очищены при помощи обратно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Чистота (>90%) и идентичность полученных пептидов предсказанным были доказаны при помощи аналитической ВЭЖХ и масс-спектрального анализа, соответственно. Пептиды растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) в концентрации 20 мг/мл и хранили при -80°C.
Индукция CTL in vitro
4
5
Для индукции цитотоксического Т-лимфоцитарного (CTL) ответа на пептиды, презентированные на молекулах лейкоцитарного антигена человека (HLA), использовали полученные из моноцитов дендритные клетки (ДК). ДК были получены in vitro согласно описанному в других источниках (Nakahara S et al., Cancer Res 2003 JuI 15, 63(14): 4112-8). Более конкретно, мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), выделенные из крови здорового донора (HLA-A*2402 или HLA-A*0201 позитивные) при помощи раствора Фиколл-пак (Pharmacia), отделяли при помощи адгезии в пластиковой чашке для тканевых культур (Becton Dickinson) с целью обогащения популяции моноцитарной фракцией. Популяцию, обогащенную моноцитами, культивировали в присутствии 1000 Ед/мл гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) (R&D System) и 1000 Ед/мл интерлейкина (IL)-4 (R&D System) в среде AIM-V (Invitrogen), содержащей 2% инактивированной прогреванием аутологичной сыворотки (AS). После 7 дней культивирования, индуцированные цитокинами ДК нагружали каждым из синтезированных пептидов в концентрации 20 мкг/мл в присутствии 3 мкг/мл β2-микроглобулина на протяжении 3 часов при 37°С в среде AIM-V. Полученные клетки экспрессировали на поверхности молекулы, ассоциированные с фенотипом ДК, такие CD80, CD83, CD86 и молекулы HLA класса II (данные не продемонстрированы). Эти нагруженные пептидами ДК далее инактивировали митомицином С (MMC) (30 мкг/мл на протяжении 30 мин) и смешивали с аутологичными CD8+ T-клетками в соотношении 1:20, полученными в ходе позитивной селекции при помощи набора для выделения CD8-позитивных CD8 Positive Isolation Kit (Dynal). Полученные культуры рассевали в 48-луночные планшеты (Corning); в каждой лунке содержалось 1,5 × 10 ДК, нагруженных пептидом, 3 × 10 CD8+ T-клеток и 10 нг/мл IL-7 (R&D System) в 0,5 мл среды AIM-V/2% AS. Три дня спустя в полученные культуры добавляли IL-2 (CHIRON) до конечной концентрации 20 МЕд/мл. В дни 7 и 14 Т-клетки дополнительно стимулировали аутологичными нагруженными соответствующим пептидом ДК. ДК для этого каждый раз получали заново в соответствии с вышеприведенным протоколом. CTL тестировали на нагруженных пептидами клетках линии A24LCL после третьего цикла стимуляции пептидами в день 21 (Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).
Процедура размножения CTL
4
CTL были размножены в культуре при помощи метода, аналогичного описанному в работе Riddell et al. (Walter EA et al., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): 1038-44; Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23). CTL в количестве 5 × 10 клеток суспендировали в 25 мл среды AIM-V/5% AS вместе с 2 типами инактивированных ММС человеческих B-лимфобластоидных клеточных линий в присутствии 40 нг/мл моноклональных анти-CD3 - антител (Pharmingen). Через день после начала культивирования к культурам добавляли 120 МЕд/мл IL-2. В дни 5, 8 и 11 культуры снабжали свежей средой AIM-V/5% AS, содержащей 30 МЕд/мл IL-2 (Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).
Выведение клонов CTL
4
Были приготовлены такие разведения CTL, что при последующем высевании на 96-луночные титрационные микропланшеты (Nalge Nunc International) со скругленным дном содержание CTL в лунках составляло 0,3, 1 и 3 CTL/лунку. CTL культивировали вместе с 2 типами инактивированных ММС человеческих B-лимфобластоидных клеточных линий в количестве 1 × 10 клеток/лунку в присутствии 30 нг/мл анти-CD3 антител и 125 Ед/мл IL-2 в среде AIM-V, содержащей 5% AS в общем объеме 150 мкл/лунку IL-2. Спустя 10 дней в среду добавляли 50 мкл/лунку раствора IL-2 до конечной концентрации 125 Ед/мл. CTL-активность определяли на 14-ый день, и далее клоны CTL размножали, используя способы, описанные выше (Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).
Специфическая CTL-активность
4
Для тестирования специфической CTL-активности использовали иммуноспот-анализ с ферментной меткой (ELISPOT) на интерферон-гамма (IFN-γ) и ELISA-анализ со связанным IFN-γ ферментом. Более конкретно, в качестве клеток-стимуляторов использовали нагруженные пептидами клетки A24LCL (1 × 10/лунку). В качестве клеток-респондеров использовали культивируемые в 48-луночных планшетах клетки или клоны CTL после серийных разведений. IFN-γ-ELISPOT- и IFN-γ-ELISA-тесты были выполнены в соответствии с инструкциями производителей.
Иммуногенность эпитопных пептидов в мышах линии BALB/c
Для праймерования пептид-специфических CTL животных иммунизировали 100 мкл вакцинирующей смеси, содержащей 50 мкл HLA-A24-рестрицированного пептида и 50 мкл IFA на мышь. Первую иммунизацию проводили в день 0 путем подкожной инъекции в область правого бока, вторую иммунизацию проводили в день 7 путем подкожной инъекцию в область левого бока. В день 14 выполняли ELISPOT-тест на IFN-γ, в качестве клеток-респондеров использовали спленоциты вакцинированных мышей, в качестве клеток-стимуляторов использовали ненагруженные либо нагруженные пептидами клетки линии RLmale1.
Противоопухолевые эффекты in vivo
4
2
Вакцинацию мышей проводили в дни -7 и 0 с использованием пептида, конъюгированного с IFA. В день 0 мышам линии BALB/C путем подкожной инъекции в область правого бока вводили клетки линии CT26 в количестве 5×10 клеток/мышь. Опухолевый рост оценивали исходя из двух перпендикулярных диаметров опухоли (мм).
Результаты
Прогнозирование HLA-A24 - связывающих пептидов TEM8
В таблице 1 приведены HLA-A*2402 и HLA-A*0201 - связывающие пептиды TEM8 в порядке убывания аффинности. Всего было выбрано и протестировано для идентификации эпитопных пептидов: 21 пептид, потенциально обладающий способностью связывать HLA-A24 (таблица 1а) и 53 пептида, потенциально обладающих способностью связывать HLA-A2 (таблицы 1b и 1c). Большая часть пептидов не демонстрировала индукции CTL. Поэтому в фокусе настоящего изобретения находятся пептиды, демонстрирующие индукцию CTL.
Индукция CTL прогнозированными пептидами TEM8, рестрицированными HLA-A*2402 или HLA-A*0201 и выведение линий CTL, стимулированных пептидами TEM8
CTL, специфичные к пептидам TEM8 были получены в соответствии с протоколами, приведенными в разделе «Материалы и методы». Пептид-специфическую активность CTL определяли при помощи ELISPOT-тест на IFN-γ (фиг.1а-i). Данный анализ показал, что пептиды TEM8-A24-9-39 (SEQ ID NO:3), TEM8-A24-9-277 (SEQ ID NO:4), TEM8-A24-10-277 (SEQ ID NO:9), TEM8-A02-9-337 (SEQ ID NO:23), TEM8-A02-9-338 (SEQ ID NO:25), TEM8-A02-9-278 (SEQ ID NO:30), TEM8-A02-10-338 (SEQ ID NO:60), TEM8-A02-10-265 (SEQ ID NO:63) и TEM8-A02-10-333 (SEQ ID NO:68) демонстрируют мощную продукцию IFN-γ по сравнению с контрольными лунками. Более того, клетки в позитивных лунках: #5, стимулированные SEQ ID NO:3, #6, стимулированные SEQ ID NO:4, #3, стимулированные SEQ ID NO:9, #3, стимулированные SEQ ID NO:23, #6, стимулированные SEQ ID NO:25, #3, стимулированные SEQ ID NO:30, #2, стимулированные SEQ ID NO:60, #5, стимулированные SEQ ID NO:63 и #4, стимулированные SEQ ID NO:68, были размножены и выведены в стабильные линии CTL. CTL-активность полученных линий CTL определяли при помощи ELISA-теста на IFN-γ (фигура 2a-i). Данный анализ показал, что все линии CTL демонстрируют мощную продукцию IFN-γ в ответ на стимуляцию клетками-мишенями, нагруженными соответствующими пептидами, по сравнению с клетками-мишенями, не нагруженными никакими пептидами. С другой стороны, в результате стимуляции другими пептидами, приведенными в таблице 1, не удалось получить ни одной линии CTL, несмотря на наличие у этих пептидов потенциальной HLA-A*2402 или HLA-A*0201 - связывающей активности. Например, типичные отрицательные в отношении CTL-ответа результаты, полученные при стимуляции TEM8-A02-9-207 (SEQ ID NO:46) приведена на фигурах 1j и 2j. Это означает, что в результате подобного скрининга было идентифицировано девять пептидов TEM8, способных индуцировать стойкие клеточные линии.
Выведение клонов CTL, против TEM8-специфичных пептидов
Далее, из каждой линии CTL при помощи серийных разведений были выведены клоны CTL в соответствии с описанным в разделе «Материалы и методы», и продукция IFN-γ этими клонами при стимуляции нагруженными пептидами клетками-мишенями была измерена при помощи ELISA-теста на IFN-γ. Мощная продукция IFN-γ была продемонстрирована клонами CTL, стимулированными SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 и SEQ ID NO:63 (фигура 3).
Специфическая CTL-активность против клеток-мишеней, эндогенно экспрессирующих TEM8 и HLA-A*2402 или HLA-A*0201
Стабильные линии CTL или клоны, полученные при стимуляции этими пептидами, были протестированы на способность распознавать клетки-мишени, эндогенно экспрессирующие TEM8 и молекулы HLA- A*2402. Специфическая CTL-активность против клеток линии COS7, одновременно трансфецированных полноразмерными генами TEM8 и HLA-A*2402 (специфическая модель клеток-мишеней, эндогенно экспрессирующих гены TEM8 и HLA-A*2402), была проанализирована с использований линий CTL или клонов, полученных при стимуляции соответствующим пептидом, в качестве эффекторных клеток. Клетки COS7, трансфецированные полноразмерными генами TEM8 или HLA-A* 2402 по отдельности, были получены для использования в качестве контролей. CTL демонстрировали мощную CTL-активность против клеток COS7, одновременно трансфецированных генами TEM8 и HLA-A24 (фигура 4а). С другой стороны, в отношении контролей не было детектировано сколь-либо значимой CTL-активности. Далее, стабильные линии CTL или клоны, полученные при стимуляции HLA-A2-рестрицированными пептидами, также были протестированы на способность распознавать клетки-мишени, эндогенно экспрессирующие TEM8 и молекулы HLA-A*0201. Была проанализирована специфическая CTL-активность против клеток линии COS7, одновременно трансфецированных полноразмерными генами TEM8 и HLA-A*0201. В качестве эффекторных клеток использовались линии CTL или клоны, полученные в ходе индукции соответствующим HLA-A2 - рестрицированным пептидом. Клетки COS7, трансфецированные полноразмерными генами TEM8 или HLA-A*0201 по отдельности, были получены для использования в качестве контролей. CTL демонстрировали мощную CTL-активность против клеток COS7, одновременно трансфецированных генами TEM8 и HLA-A2 (фигура 4b). С другой стороны, в отношении контролей не было детектировано сколь-либо значимой CTL-активности. Таким образом, приведенные данные четко демонстрируют, что SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:63 являются естественно экспрессируемыми на поверхности клеток-мишеней в контексте молекул HLA-A*2402 или HLA-A*0201 и распознаваемыми CTL. Более того, это указывает на то, что эти два пептида TEM8 являются эпитопами пептидов, способными индуцировать CTL, и введение противораковых вакцин пациентам, несущим TEM8-экспрессирующиие клетки, может оказаться полезным.
Иммуногенность эпитопных пептидов в мышах линии BALB/c
Для изучения иммуногенности эпитопных пептидов TEM8 была выполнена иммунизация мышей линии BALB/C пептидом SEQ ID NO:4. После второй инъекции пептида в IFA, пептид-специфическую CTL-активность определяли в ELISPOT-анализе на IFN-γ. При использовании полученных из вакцинированных мышей спленоцитов в качестве клеток-респондеров, была продемонстрирована мощная продукция IFN-γ. Согласно продемонстрированному на фигуре 5а, специфичную в отношении SEQ ID NO:4 продукцию IFN-γ демонстрировали спленоциты четырех из пяти мышей (M1, M3, M4 и M5), но не спленоциты контрольных мышей (N1 и N2). Приведенные данные демонстрируют, что SEQ ID NO:4 индуцирует специфические CTL против нагруженных пептидами клеток-мишеней in vivo.
Противоопухолевые эффекты вакцинации эпитопным пептидом TEM8
Для тестирования противоопухолевых эффектов с использованием данного пептида была применена in vivo модель противоопухолевого лечения с использованием опухолевой клеточной линии CT26. Введение пептида SEQ ID NO:4 осуществляли мышам линии BALB/C в дни -7 и 0, а клетки колоректального рака CT26 вводили подкожно этим же животным в день 0. У мышей, вакцинированных SEQ ID NO:4, опухолевый рост значительно снижался по сравнению с контрольными мышами (фигура 5b). Данная разница оказалась статистически значимой; мыши, вакцинированные SEQ ID NO:4, демонстрировали подавление опухолевого роста (P<0,05).
Анализ гомологии антигенных пептидов
Было показано, что CTL, стимулированные нижеследующими пептидами, демонстрируют значительную и специфическую CTL-активность:
TEM8-A24-9-39 (SEQ ID NO:3),
TEM8-A24-9-277 (SEQ ID NO:4),
TEM8-A24-10-277 (SEQ ID NO:9),
TEM8-A02-9-337 (SEQ ID NO:23),
TEM8-A02-9-338 (SEQ ID NO:25),
TEM8-A02-9-278 (SEQ ID NO:30),
TEM8-A02-10-338 (SEQ ID NO:60),
TEM8-A02-10-265 (SEQ ID NO:63) и
TEM8-A02-10-333 (SEQ ID NO:68).
Данный результат может быть объяснен тем, что последовательности этих пептидов гомологичны другим молекулам, способным сенсибилизировать иммунную систему человека. Для исключения этой возможности для этих пептидных последовательностей был проведен анализ гомологии с использованием алгоритма BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi), продемонстрировавший отсутствие каких-либо последовательностей со значимой гомологией. Результаты анализа гомологии демонстрируют, что последовательности
TEM8-A24-9-39 (SEQ ID NO:3),
TEM8-A24-9-277 (SEQ ID NO:4),
TEM8-A24-10-277 (SEQ ID NO:9),
TEM8-A02-9-337 (SEQ ID NO:23),
TEM8-A02-9-338 (SEQ ID NO:25),
TEM8-A02-9-278 (SEQ ID NO:30),
TEM8-A02-10-338 (SEQ ID NO:60),
TEM8-A02-10-265 (SEQ ID NO:63) и
TEM8-A02-10-333 (SEQ ID NO:68), являются уникальными и, таким образом, насколько нам известно, вероятность того, что эти молекулы могут вызвать «незапланированный» иммунный ответ на какие-либо неродственные молекулы, мала.
Таким образом, были идентифицированы новые HLA-A*2402 или A*0201 - рестрицированные эпитопы пептидов TEM8. Также было продемонстрировано, что эпитопные пептиды TEM8 применимы для иммунотерапии злокачественных опухолей.
Промышленная применимость
Настоящее изобретение относится к новым пептидам, индуцирующим CTL против эндотелиальных клеток, образующихся в ходе широкого спектра заболеваний, ассоциированных с ангиогенезом, и эти пептиды являются крайне эффективными при использовании в качестве вакцин. Настоящее изобретение также относится к лекарственным препаратам, предназначенным для лечения и профилактики ассоциированных с ангиогенезом заболеваний, таких как опухоли, и содержащим в качестве активных ингредиентов любой из этих пептидов. Согласно настоящему изобретению, размер пептида, необходимый для индукции иммунного ответа, крайне мал (например, 9 или 10 аминокислотных остатков). Таким образом, настоящее изобретение является в особенности полезным с учетом того, что синтез и очистка подобных пептидов могут быть выполнены очень легко.
Все процитированные в настоящем тексте публикации, патенты и патентные заявки, включены в настоящую заявку посредством ссылок.