КОМПОЗИЦИЯ С ДЕЗАМИНО-АРГИНИН-ВАЗОТОЦИНОМ ДЛЯ ПАРЕНТЕРАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ И СПОСОБ ЕЁ ПОЛУЧЕНИЯ
COMPOSITION WITH DESAMINO-ARGININE VASOTOCIN FOR PARENTERAL INTRODUCTION AND METHOD FOR ITS PRODUCTION

Изобретение относится к области фармации и касается технологии приготовления фармацевтического средства в форме раствора для инъекций на основе дезамино-аргинин-вазотоцина (дАВТ), предназначенного для профилактики и лечения гипернатриемии. Композиция для парентерального применения обладает стабильностью, удобна для применения, безопасна для клинического применения. Композиция имеет преимущества простой технологии получения, простого и удобного контроля качества и более низкой стоимости производства по сравнению с твердыми дозированными формами. Таким образом, средство является выгодным с экономической точки зрения для промышленного производства.
th
В клинической практике, связанной с решением проблем лечения отеков и гипернатриемии, вопрос о поддержании баланса натрия являлся и остается одним из наиболее актуальных и дискуссионных [Ellison D.H. Physiology and pathophysiology of diuretic action // Seldin and Geibisch’s The Kidney. Physiology and Pathophysiology; eds. R.J. Alpern [et al.]. - 5 Edition. - New York: Elsevier, 2013. - Vol. 1. - P. 1353-1404]. Активная терапевтическая тактика необходима при быстром повышении концентрации натрия в крови у пациента или при наличии клинических проявлений гипернатриемии. В отличие от опасности быстрого восстановления нормальной концентрации натрия в крови после гипонатриемии, осложнений коррекции гипернатриемии у взрослых (при ее длительности от нескольких минут до 2 суток) практически неописано [Bataille S. et al. Undercorrection of hypernatremia is frequent and associated with mortality // BMC Nephrol. - 2014. - Vol. 15. - P. 37]. При хронической гипернатриемии (более 2-х суток) рекомендуемая скорость снижения уровня натрия в крови составляет 0.5 мМ в час для уменьшения риска отека головного мозга и судорог [Sterns, R.H. Disorders of plasma sodium - causes, consequences, and correction // N. Engl. J. Med. - 2015. - Vol. 372. P. 55-65].
При увеличении концентрации натрия в плазме крови восстановление нормальной осмоляльности требует усиления экскреции ионов натрия почкой и одновременного увеличения реабсорбции осмотически свободной воды в кровь. В настоящее время в клинической практике для коррекции дисэлектролитных расстройств используются, главным образом, петлевые диуретики [Wargo К.A., Banta W.M. A comprehensive review of the loop diuretics: should furosemide be first line? // Ann. Pharmacother. - 2009. - Vol. 43. - P. 1836-1847] и введение гипотонических растворов. Однако их эффект может быть разным и, в зависимости от волемического статуса, приводить как к гипо-, так и гипернатриемии [Katzung B.G. Basic and clinical Pharmacology. - NY: McGraw-Hill, 2004]. Дегидратационная терапия мочегонными средствами у больных с нарушением сознания (при инсультах, черепно-мозговых травмах и т.д.) сопровождается высоким риском развития гипернатриемии из-за отсутствия чувства жажды и неадекватного потребления воды. В итоге возможен летальный исход из-за гиперосмолярной комы. Необходим поиск лекарственных средств для уменьшения объема внеклеточной жидкости, усиления выведения ионов натрия почками при увеличении обратного всасывания осмотически свободной воды в почечных канальцах.
Таким образом, разработка лекарственных средств для уменьшения объема внеклеточной жидкости, усиления выведения ионов натрия почками, но при увеличении обратного всасывания осмотически свободной воды в почечных канальцах является весьма актуальной задачей.
В арсенале современной медицины имеется ряд эффективных средств для нормализации водно-солевого баланса. Но, несмотря на это, проблема коррекции гипернатриемии сохраняет свою актуальность, так как применяющиеся диуретические средства одновременно усиливают выведение солей и воды почкой.
2
Известно, что deamino-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH(дезамино-аргинин-вазотоцин, дАВТ) способен угнетать канальцевую реабсорбцию ионов натрия и увеличивать их экскрецию почкой, что по силе эффекта сопоставимо с действием петлевых диуретиков [Патент RU 2342949, опубликовано 10.01.2009]. При этом дАВТ является аналогом вазопрессина - антидиуретического гормона. За счет влияния на рецепторы вазопрессина препарат повышает обратное всасывание воды в почке, что наряду с экскрецией натрия способствует более быстрой нормализации уровня натрия в крови.
Известны производные вазотоцина, которые отличаются от природного гормона структурой вазотоцина, имеющей модификации в положении 1, 4, 8 и необязательно 2. Новые производные вазотоцина вазоактивны более всего из-за специфичности повышать кровяное давление и в некоторых случаях имеют значительный пролонгированный эффект. Антидиуретический эффект (понижение выделения мочи) обусловлен удалением источника молекулы [Патент RU 2067586, опубликовано 10.10.1996].
Известные производные вазотоцина вызывают усиление экскреции калия почкой, однако при этом усиливается и экскреция почкой ионов натрия и воды, причем повышение экскреции натрия и воды в несколько раз превышает увеличение экскреции калия.
Известен способ поддержания и коррекции водно-электролитного баланса у млекопитающих, основанный на введении синтетического аналога аргенин-вазотоцина. Основной задачей способа была разработка метода поддержания и коррекции водно-электролитного баланса у млекопитающих, позволяющего увеличить реабсорбцию осмотически свободной воды при сохранении баланса калия и натрия и не вызывающего изменений деятельности сердечно-сосудистой системы [Патент RU 2342100, опубликовано 27.12.2008].
В данном патенте рассматривается только способ применения различных аналогов вазотоцина и не раскрывается информация о технологии получении этих аналогов.
Известен способ поддержания и коррекции водно-электролитического баланса у приматов, также основанный на введении синтетического аналога аргенин-вазотоцина [Патент RU 2342101, опубликовано 27.12.2008].
В данном патенте рассматривается только способ применения различных аналогов вазотоцина и не раскрывается информация о технологии получении этих аналогов.
Известно применение калийуретического пептида: 1-дезамино-4-аргинин-8-аргинин-вазотоцин (1-d-Arg-AVT) в качестве терапевтически активного химического соединения, влияющего на мочеобразующую деятельность почек, вызывающего селективное увеличение выделения ионов калия почкой [Патент RU 2454426, опубликовано 27.06.2012]. Данное изобретение относится к области получения пептидов, вызывающих селективное увеличение выделения ионов калия почкой, полезных для лечения гиперкалиемии, и не позволяет максимально вывести из организма соли натрия, например, при гипернатриемии, что важно для обеспечения оптимальной осмоляльности крови.
Известно применение новых аналогов эксенатида общей формулы HisGlyGluGlyThrPheThrSerAspLeuSerLysGlnNleGluGluGluAlaValArgLeuPheIleGluTrp-LeuLysAsnGlyGlyProSerSerGlyXProProProSer-ol, где X выбирают из L-Ala или D-Ala, которые могут быть использованы для лечения сахарного диабета, а также для лечения и профилактики диабетической нефропатии и сердечной недостаточности. Полученные аналоги более стабильны, чем эксенатид, обладают высокой инсулинотропной активностью, а также имеют высокую активность в отношении выделения почкой ионов натрия без потери ионов калия, усиливают выделение ионов кальция и магния, выделение осмотически свободной воды. Эти свойства могут быть полезны для восстановления водно-солевого обмена наряду с нормализацией гликемии [Патент RU 2422461, опубликовано 27.06.2011].
Представленный эксенатид относится к полипептидам, содержащим более 20 аминокислот. Синтез данного соединения сложен и многостадиен, что влечет за собой огромные экономические издержки на его производство и не позволит применить его в практике в качестве доступного средства для коррекции гипернатриемии.
Известна фармацевтическая композиция, содержащая окситоцин или его аналоги, фармацевтически приемлемые соли и, по меньшей мере, один неионный эфир целлюлозы [Заявка на патент RU 2013147739, опубликовано 20.05.2015].
В данной заявке на патент не рассматривается возможность использования производных окситоцина для коррекции гипернатриемии.
Таким образом, прямых аналогов, т.е. готовых лекарственных средств на основе deamino-вазотоцина для увеличения выведения почкой солей натрия и усиления обратного избирательного всасывания из почечных канальцев в кровь воды, не обнаружено.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является применение [дезамино-1, изолейцин-3, аргинин-8]-вазопрессина в качестве средства для увеличения выведения почкой солей натрия и усиления обратного избирательного всасывания из почечных канальцев в кровь воды-растворителя [Патент 2342949, опубликовано 10.01.2009]. Недостатком данного изобретения является отсутствие описания композиции для парентерального введения и дальнейшего применения в клинике.
В основу изобретения положена задача создания фармацевтического препарата в форме водного раствора для внутривенного и внутримышечного введения, который содержит необходимое и достаточное количество дезамино-аргинин-вазотоцина и обладает стабильностью при хранении.
Задача решена тем, что заявляемый состав для парентерального введения в форме водного раствора для лечения гипернатриемии согласно изобретению содержит терапевтически эффективное количество дезамино-аргинин-вазотоцин и ацетатный буферный раствор, обеспечивающий рН раствора от 5 до 6.
Заявляемый состав дополнительно может содержать 10,00-25,00 г натрия уксуснокислого 3-водного и 0,200-3,000 г кислоты уксусной в 1000 мл раствора.
Предпочтительно эффективное количество дезамино-аргинин-вазотоцина составляет 0,005-0,500 г/1000 мл.
Предпочтительный вариант заявляемого состава содержит 0,012 г дезамино-аргинин-вазотоцина, 19,5 г натрия уксуснокислого 3-водного, 0,315 г кислоты уксусной и достаточное количество буфера для обеспечения рН 5,5 в объеме 1000 мл.
Для получения лекарственной формы в реактор заливали воду, добавляли расчетное количество натрия уксуснокислого 3-водного, перемешивали до растворения, доводили до рН 5,0-6,0 уксусной кислотой, к полученному раствору добавляли дезамино-аргинин-вазотоцин, перемешивали, полученный раствор подвергали стерилизующей фильтрации через мембранные фильтры с диаметром пор предпочтительно не более 0,30 мкм, наиболее предпочтительно через фильтр с размером пор 0,22 мкм, и разливали по 1 мл в ампулы темного стекла.
Все стадии технологического процесса проводились при комнатной температуре и относительной влажности 30-50%.
При изучении свойств полученных растворов также установлено, что при охлаждении, замораживании и размораживании растворов в течение суток свойства препарата не изменяются.
При изучении стабильности при повышенной температуре (60±0,2°C) для контроля препарата были выбраны следующие показатели: описание, подлинность, прозрачность, цветность, рН, механические включения, посторонние примеси, количественное определение, бактериальные эндотоксины. Установлено, что за весь срок хранения раствора для инъекционного введения дезамино-аргинин-вазотоцина оставался стабильным по всем показателям.
Применение заявляемого изобретения на практике для регулирования процесса мочеобразования (для увеличения общего количества выделяемых с мочой ионов натрия и усиления обратного избирательного всасывания из почечных канальцев в кровь воды) обеспечивает ему критерий «промышленная применимость».
Настоящее изобретение поясняется следующими примерами приготовления композиции и ее применения в качестве натрийуретического средства, которую можно вводить с помощью инъекции.
Пример 1. Приготовление раствора для инъекций средства на основе дАВТ.
В установку для получения ацетатного буферного раствора загружают 1000 мл воды для инъекций, прибавляют 19,7947 г натрия уксуснокислого 3-водного, перемешивают до полного растворения с помощью перемешивающего устройства типа ПЭ-8100. Далее прибавляют 0,3 мл уксусной кислоты ледяной, перемешивают и измеряют рН полученного буферного раствора. рН полученного раствора должен быть 5,0-6,0. Затем прибавляют 12,2 мг дАВТ, перемешивают.
Полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации (фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм) в токе азота, затем в асептических условиях разливают в ампулы коричневого стекла. Получают 1000 ампул по 1 мл.
Пример 2. Оценка стабильности средства на основе дАВТ.
Изучение стабильности средства по примеру 1 проводили методом «ускоренного старения» в условиях повышенной температуры (60,0±0,2°C) для контроля качества препарата были выбраны следующие показатели: описание, подлинность, прозрачность, цветность, рН, механические включения, посторонние примеси, количественное определение, бактериальные эндотоксины.
Было установлено, что разработанное средство дАВТ для парентерального введения стабильно при хранении. Не происходит изменение цветности раствора, появления каких-либо включений. Также не наблюдается значимого изменения содержания концентрации действующего вещества и появления примесей. Полученные данные свидетельствуют, что предложенное средство соответствует требованиям Государственной Фармакопеи РФ XIII, том II, предъявляемым к растворам для инъекций (ОФС.1.4.1.0007.15).
Было установлено, что все показатели остаются в пределах нормы.
Технический результат изобретения заключается в возможности получения стабильного при хранении и нетоксичного при применении водного раствора дАВТ для парентерального введения с рН 5-6, получаемого без применения токсичных органических растворителей и высоких температур.
Пример 3. Оценка натрийуретической активности.
Эксперименты выполнены на ненаркотизированных аутбредных крысах-самках. Сбор мочи осуществлялся в течение 4 ч после введения препаратов и контрольного вещества (физиологический раствор).
Введение крысам средства по примеру 1 в дозах 0.1-1.5 мкг/кг привело к росту экскреции осмотически активных веществ почками (таблица 1). Наиболее выраженный эффект выявлен при действии дозы 1.0 мкг/кг (рисунок 1).
Петлевой диуретик фуросемид вызвал более выраженный рост диуреза, но равное со средством на основе дАВТ увеличение экскреции осмотически активных веществ у крыс. Фуросемид в отличие от дАВТ не оказал влияния на клиренс осмотически свободной воды и снизил скорость клубочковой фильтрации (таблица 1).
Диуретическая активность средства составила 59±6% от диуретической активности фуросемида. Меньшая диуретическая активность при большей натрийуретической активности средства объясняется противоположным действием фуросемида и средства на транспорт воды в почке. Данные клиренса осмотически свободной воды (таблица 1) указывают на то, что в отличие от фуросемида, который препятствовал концентрированию мочи, средство резко усиливало обратное всасывание осмотически свободной воды в почке.
Параллельно с ростом выведения осмотически активных веществ увеличилось обратное всасывание воды в почке, о чем свидетельствует уменьшение клиренса осмотически свободной воды (таблица 1, рисунок 1). Мочеотделение достоверно увеличилось при введении средства в дозах 0.25-1.5 мкг/кг (таблица 1), максимальный диурез наблюдался после инъекции средства в дозе 1.0 мкг/кг (рисунок 1). Средняя скорость клубочковой фильтрации, оцененная по клиренсу эндогенного креатинина, не менялась. Таким образом, средство на основе дАВТ у крыс действовала как салуретик, увеличивая мочеотделение за счет экскреции осмотически активных веществ.
Проведен анализ выведения почкой ионов натрия. Средство на основе дАВТ вызывало рост экскреции натрия при введении в дозах 0.1-1.5 мкг/кг (таблица 2). По экскреции ионов натрия и калия эффекты средства на основе дАВТ в дозе 1 мкг/кг и фуросемида в дозе 10 мг/кг не отличались друг от друга. Экскреция ионов магния и особенно ионов кальция росла в значительно большей степени после введения фуросемида.
Натрийурез возрастал с увеличением дозы препарата, максимальный эффект наблюдался после введения 1.0 мкг/кг дАВТ (рисунок 2). Натрийуретическое действие препарата длилось более 4 часов с момента введения, натрийурез достиг пика в интервале 30-60 мин и по величине более чем в 35-40 раз превысил базальное значение (рисунок 2). Таким образом, средство на основе дАВТ оказало выраженное натрийуретическое действие.
Для анализа селективности действия препарата на транспорт натрия в почке проанализирована экскреция других катионов - калия, магния и кальция. Выявлен рост экскреции калия при действии средства на основе дАВТ в дозах 0.05-1.5 мкг/кг (таблица 3). Выведение калия увеличилось в меньшей степени, чем выведение натрия. Калийуретический эффект нонапептида длился более 4 часов, экскреция калия существенно превышала базальный уровень на протяжении всего времени эксперимента. Экскреция кальция достоверно возросла при действии средства на основе дАВТ в дозах 0.25-1.5 мкг/кг (таблица 3). Наиболее выраженное действие на экскрецию кальция препарат оказывал в течение первого часа после инъекции средства на основе дАВТ и через 1.5 ч показатель вернулся к базальному уровню (Рисунок 2). Суммарная экскреция ионов магния за 2 часа действия препарата не изменилась (таблица 2). Анализ динамики экскреции ионов магния при действии средства на основе дАВТ в дозе 1.0 мкг/кг показал, что в первые 30 мин эксперимента у крыс происходил рост магнийуреза, затем этот показатель снизился до исходного уровня (через 1.5 ч), а в последующем выведение магния стало ниже, чем в контроле (рисунок 2).
Таким образом, средство на основе дАВТ оказала натрийуретическое действие и повлияла на выведение ионов калия, магния и кальция.
Пример 4. Исследование диуретической активности.
Оценку диуретической активности препарата проводили по методике Kau et al. (1984) в модификации Lahlou et al. (2007) с предварительным пероральным введением животным 0.9% раствора NaCl в объеме 5% от массы тела (50 мл/кг) через зонд в желудок для нормализации водно-солевого баланса. Средство по примеру 1 разводили физиологическим раствором и вводили в дозе 1.0 мкг/кг. Референтный препарат, обладающий диуретической активностью (фуросемид (Санофи Индия Лимитед, Индия) 10 мг/кг) и физиологический раствор инъецировали крысам внутримышечно.
Показатели функций почек (диурез, клиренс осмотически активных веществ и осмотически свободной воды, экскреция осмотически активных веществ, ионов натрия, калия, магния, кальция, скорость клубочковой фильтрации) рассчитаны по стандартным формулам и нормализованы на кг массы тела.
В таблице 3 представлены показатели функций почек у крыс при стандартизации условий водно-солевого обмена пероральным введением физиологического раствора (50 мл/кг 0.9% NaCl) через зонд в желудок.
При введении на этом фоне средство на основе дАВТ или петлевого диуретика фуросемида у крыс наблюдался рост мочеотделения, экскреции осмотически активных веществ, ионов натрия и калия (таблица 3). Экскреция ионов натрия и калия при действии средства по примеру 1 была достоверно выше, чем при действии референтного препарата фуросемида. Натрийуретическая и калийуретическая активность средства по примеру 1 составила 126±7% и 130±7% от соответствующих активностей фуросемида.
Диуретическая активность средства по примеру 1 составила 61±5% от диуретической активности фуросемида. Меньшая диуретическая активность при большей натрийуретической активности средства по примеру 1 объясняется противоположным действием фуросемида и средством на основе дАВТ на транспорт воды в почке. Данные клиренса осмотически свободной воды (таблица 3) указывают на то, что в отличие от фуросемида, который препятствовал концентрированию мочи, средство на основе дАВТ резко усиливало обратное всасывание осмотически свободной воды в почке.
Пример 5. Влияние средства на основе дАВТ на уровень натрия в сыворотке крови у животных с гипернатриемией.
Эксперименты выполнены на аутбредных крысах-самках. Для моделирования гипернатриемии в эксперименте животным вводили 2.5% раствор NaCl в объеме 18 мл на кг массы тела. Контрольное вещество, тестируемый и референтный препараты вводили внутримышечно. Через 55 мин эксперимента крыс наркотизировали золетилом (Вирбак, Франция; 50 мг/кг внутримышечно). Через 60 мин эксперимента у крыс забирали кровь из сосудов шеи, после чего животных подвергали эвтаназии путем декапитации.
В контрольных условиях введение крысам средства на основе дАВТ в натрийуретической дозе 1 мкг/кг привело к снижению концентрации натрия и осмоляльности крови (таблица 4). Данные показатели при этом оставались в пределах нормальных значений. Инъекция референтного препарата фуросемида привела к росту уровня натрия в крови (таблица 4). Как при действии средства на основе дАВТ, так и при действии референтного препарата фуросемида происходило снижение концентрации калия в сыворотке крови (таблица 4).
Показано, что внутрибрюшинное введение гипертонического (2.5%) раствора NaCl крысам привело к развитию острой гипернатриемии (концентрация натрия в крови в течение часа превышала 150 мМ) и повышению осмоляльности сыворотки крови.
Введение одновременно с гипертоническим раствором NaCl средства на основе дАВТ предотвращало значительное повышение уровня натрия и осмоляльности крови. Введение петлевого диуретика фуросемида, напротив, усугубило гиперосмию и гипернатриемию (таблица 4).
Таким образом, средство на основе дАВТ в дозе 1 мкг/кг эффективно снижает уровень натрия в крови у крыс с острой гипернатриемией, вызванной введением гипертонического раствора NaCl.