Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток
METHOD FOR CRYOPRESERVATION OF HAEMOPOIETIC STEM CELLS

Изобретение относится к медицине, а именно к технологии криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) человека, и может быть использовано в гематологических, онкологических, хирургических и других центрах для лечения больных с депрессией кроветворения различного происхождения. Принцип изобретения заключается в следующем: проводят смешивание криозащитного 10% раствора ДМСО с концентратом ядросодержащих клеток в эластичной упаковке, холодовую адаптацию при температуре +4±1°С в течение 10 мин, замораживание клеточной взвеси от +4±1°С до -80÷-196°С в режиме быстрой двухступенчатой программы, при которой на первом этапе замораживания осуществляют холодовую адаптацию при температуре -26÷-30°С с продолжительностью выдерживания 25 мин, при втором этапе биообъект быстро переносят в хранилище с температурой -80÷-196°С, при этом хладагентом на этапах смешивания клеточной взвеси с криоконсервантом и холодовой адаптации гемопоэтических стволовых клеток является гранулированный теплоноситель из сухих обеззараженных термогранул Lab Armor с заданной температурой +4±1°С и -28±2°С соответственно.
Изобретение позволяет повысить технологичность способа криоконсервирования клеток, его безопасность для здоровья персонала, приготовить гарантированно максимальное количество стерильных и полноценных криоконсервированных ядросодержащих клеток с ГСК за счет замены токсичного жидкого хладагента в виде раствора этилового спирта 42-45 об.% на нетоксичный сухой теплоноситель в виде обеззараженных термогранул Lab Armor с заданной температурой +4±1°С или -28±2°С.
В технологии консервирования ГСК известны способы их криоконсервирования, например, см. пат. РФ №2569834, A01N 1/02, «Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток», опубл. 27.11.2015 г., Бюл. №33 и пат. РФ №2195111, A01N 1/02, «Способ криоконсервирования клеточных суспензий», опубл. 27.12.2002 г., Бюл. №36, который взят за прототип, предусматривает смешивание криозащитного 10% раствора ДМСО с концентратом ядросодержащих клеток в эластичной упаковке, поэтапное замораживание до -80°С с выдерживанием в морозильной камере в хладагенте в виде раствора этилового спирта 42-45 об.% с фиксированной температурой холодовой адаптации от -26 до -30°С в течение 25 мин, перемещение для замораживания в хранилище и последующее размораживание в водяной бане при 38-42°С до температуры клеточной взвеси 2-4°С.
Недостатками такого способа криоконервирования ГСК являются: использование раствора этилового спирта 42÷45 об.% в качестве хладагента консервируемых клеток нежелательно из-за высокого токсического воздействия на клетки и организм человека в целом, а также профессиональная и бытовая вредность химического соединения.
Цель изобретения: заменить раствор этилового спирта 42÷45 об.% на нетоксичный, сухой и стерильный хладагент, а также стандартизировать условия криоконсервирования ГСК человека.
Техническим результатом предложенного решения является повышение технологичности и эффективности криоконсервирования клеточной взвеси с использованием современных технических средств.
Этот результат достигается за счет смешивания криозащитного 10% раствора ДМСО с концентратом ядросодержащих клеток в эластичной упаковке и холодовой адаптации в течение 10 мин при температуре +4±1°С, последующего замораживания клеточной взвеси в режиме быстрой двухступенчатой программы, при которой на первом этапе замораживания осуществляют холодовую адаптацию при температуре -26÷-30°С с продолжительностью выдерживания 25 мин, при втором этапе биообъект быстро переносят в хранилище с температурой -80÷-196°С, при этом хладагентом на этапах смешивания клеточной взвеси с криоконсервантом и холодовой адаптации гемопоэтических стволовых клеток является гранулированный теплоноситель из сухих обеззараженных термогранул Lab Armor с заданной температурой +4±1°С и -28±2°С соответственно.
После отогревания в водяной бане все пробы консервированных ядросодержащих клеток были стерильны, количество морфологически сохранных ядерных клеток при этих условиях составляло 87,3±11,2%, устойчивостью к витальному красителю обладали 83,1±10,3 ядерных клеток крови.
Сущность изобретения заключается в совокупности существенных признаков, достаточной для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата.
Существенными признаками предложенного способа, совпадающего с известными признаками, являются: А - приготовление взвеси ядросодержащих клеток с ГСК в эластичной упаковке; Б - поэтапное замораживание приготовленной взвеси в морозильной камере с выдерживанием упаковок в хладагенте при -26÷-30°С - фиксированной температуре холодовой адаптации продолжительностью 25 мин; В - замораживание и консервирование биообъекта в хранилище при температуре -80÷-196°C; Г - отогревание ГСК при +38-42°С.
Существенными отличительными признаками способа криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток являются: Д - использование для холодовой адаптации взвеси ядросодержащих клеток с ГСК в качестве хладагента гранулированного теплоносителя сухих обеззараженных термогранул Lab Armor с заданной температурой +4±1°С и -28±2°С; Е - подготовка гранулированного теплоносителя Lab Armor к работе включает сборку устройства для холодовой адаптации ГСК, состоящего из «Термоконтейнера ТМ-20», хладоэлементов МХД-2 с охлажденным раствором антифриза, обеспечивающих температуру +4°С или -28±2°С термогранулам Lab Armor массой 4 кг и консервируемым клеткам.
Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток крови заключается в следующем (пример выполнения):
- производят заготовку концентратов ядросодержащих клеток периферической крови с ГСК. Концентраты ядросодержащих клеток крови с ГСК получают методом сепарации на аппарате Amicus в объеме от 38,0 до 81,0 (56,3±7,3) мл в стандартную эластичную полимерную упаковку, откуда закрытым способом переводят в пластиковые криопакеты и герметизируют, после чего помещают в устройство для холодовой адаптации клеточной взвеси. Для холодовой адаптации ГСК поэтапно используют электрический морозильник на +4±1°С и «Термоконтейнер ТМ-20», выложенный изнутри в виде прямоугольной ячейки хладоэлементами МХД-2 с раствором антифриза, гарантированно обеспечивающих температуру +4±1°С и -28±2°С вложенным в нее теплоносителю в виде сухих обеззараженных термогранул Lab Armor и консервируемому биообъекту;
- производят сборку устройства для холодовой адаптации клеточной взвеси. Для этого используют «Термоконтейнер ТМ-20» для временного хранения и транспортирования термонеустойчивых медицинских и других препаратов, который выкладывают изнутри в виде прямоугольной ячейки хладоэлементами МХД-2 с раствором антифриза, предварительно охлажденных в электроморозильнике до +4±1°С или -28±2°С и гарантированно обеспечивающих заданную температуру в течение всего цикла холодовой адаптации биообъектов. Техническим носителем указанных температурных режимов являются сухие обеззараженные термогранулы Lab Armor массой до 4 кг, которые помещают в ячейку устройства и покрывают эластичную упаковку с консервируемыми клетками слоем охлажденного теплоносителя толщиной от 3 до 5 см;
- готовят 10% раствор ДМСО и помещают его для охлаждения в бытовой электрический холодильник до температуры +4±1°С;
- производят подготовку полученной клеточной взвеси к замораживанию. Для этого клеточную взвесь в эластичном пластиковом криопакете погружают в слой теплоносителя толщиной от 3 до 5 см с заданной температурой +4±1°С, затем к ней порционно добавляют охлажденный до +4±1°С 10% раствор ДМСО, криопакет герметизируют, после чего клеточную взвесь подвергают холодовой адаптации при +4±1°С в течение 10 мин.
Далее взвесь ядросодержащих клеток с ГСК замораживают в режиме быстрой двухступенчатой программы. На первом этапе клеточную взвесь в эластичном пакете погружают в слой теплоносителя толщиной от 3 до 5 см с заданной температурой -28±2°С и выдерживают при ней в течение 25 мин. На втором этапе биообъект быстро переносят в хранилище с температурой -80÷-196°С и в последующем взвесь клеток отогревают при +38-42°С до 2-4°С.
После отогревания в водяной бане все пробы суспензии ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками были стерильными, количество морфологически сохранных ядерных клеток при этих условиях составляло 87,3±11,2%, устойчивостью к витальному красителю обладали 83,1±10,3% ядерных клеток крови.
Сравнительный анализ используемых критериев при оценке заявляемого и известного способов криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток крови представлен в таблице 1.
Таблица 1 - Сравнительный анализ способов криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток крови
Предлагаемый «Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток» крови по сравнению с прототипом:
а) обладает повышенной технологичностью;
б) обеспечивает стерильность криоконсервированной клеточной суспензии;
в) обеспечивает морфологическую сохранность большего количества ядерных клеток;
г) обеспечивает гарантированно высокую устойчивость к витальному красителю мембран большего количества криоконсервированных ядерных клеток.
При использовании фондов научно-технической литературы эквивалентных решений не обнаружено, что подтверждает новизну предлагаемого способа криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток крови.
Использование простых приемов и доступного оборудования подтверждает промышленную применимость.
Неочевидность и оригинальный подход к решению проблемы подтверждает изобретательский уровень.
Исследования выполнены на базе лаборатории консервирования крови и тканей, ФГБУН «Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России».