СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ ЛЕТАЛЬНОСТИ У БОЛЬНЫХ С ХРОНИЧЕСКОЙ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ ИШЕМИЧЕСКОЙ ЭТИОЛОГИИ, СОЧЕТАЮЩЕЙСЯ С САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 2 ТИПА
METHOD FOR PREDICTION OF RISK OF CARDIOVASCULAR MORTALITY IN PATIENTS SUFFERING FROM CHRONIC ISCHEMIC HEART FAILURE COMBINED WITH TYPE 2 DIABETES MELLITUS

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к медицине, а именно кардиологии, может быть использовано при определении риска сердечно-сосудистой летальности пациентов с хронической сердечной недостаточностью (ХСН) ишемической этиологии, сочетающейся с сахарным диабетом 2 типа, по определению количества прогениторных клеток иммунофенотипа CD34+, CD 133 dim, CD45- в периферической крови. Данный параметр может быть использован в качестве прогностического критерия для оценки вероятности неблагоприятного прогноза по сердечно-сосудистой летальности.
Уровень техники
Хроническая сердечная недостаточность (ХСН) широко распространена в популяции, что представляет собой важную медицинскую, социальную и экономическую проблему. ХСН - это комплексный синдром, представляющий собой исход многих сердечно-сосудистых заболеваний, таких как инфаркт миокарда, приводящий к потере части миокарда, который не восстанавливается за счет эндогенных репаративных процессов; артериальная гипертония, приводящая к развитию диффузного фиброза сердца; воспалительные и аутоиммунные, генетические заболевания миокарда, пороки сердца. Подавляющее число больных с ХСН представлены постинфарктной сердечной недостаточностью. Хотя за последние 20 лет был сделан существенный прогресс в лечении ХСН, прогноз ее остается фатальным, и все виды имеющейся терапии направлены только на ограничение ее прогрессирования. Во многом это обусловлено тем, что важнейшие подгруппы пациентов с ХСН достаточно не исследованы. Это особенно касается пациентов, у которых ХСН сочетается с метаболическими расстройствами, такими как метаболический синдром, сахарный диабет 2 типа (СД2) и ожирение. Известно, что пациенты с ХСН, сочетающейся с инсулинорезистентностью и СД2, характеризуются значительно более тяжелым течением и плохим прогнозом, что диктует необходимость более ранней диагностики такого сочетания и более агрессивного ведения таких больных. Качество и продолжительность жизни больного с ХСН во многом зависят от наличия, выраженности и сочетания так называемых факторов риска (ФР) неблагоприятного прогноза. Объективная риск-стратификация у больных ХСН с учетом независимых ФР не всегда возможна в связи с различной этиологией ХСН, индивидуальными особенностями ее течения, наличием сопутствующей патологии, влияющей на прогностическую ценность ФР. К ФР относят целый ряд показателей, таких как возраст, наличие ИБС, сахарного диабета, тяжесть ХСН, тахикардия, снижение массы тела, низкая фракция изгнания левого желудочка, снижение результатов теста 6-минутной ходьбы, повышение уровней мозгового натрийуретического пептида, мочевой кислоты, креатинина, тропонина, показатели «ремоделирования» камер сердца и пр. [Swedberg К. The task force for the diagnosis and treatment of chronic heart failure of the European Society of Cardiology. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic heart failure: executive summary (update 2005). Eur. Heart J. 2005; 26(22):1115-40].
В последние годы особое внимание привлечено к исследованию клеточных маркеров тяжести различных заболеваний, в том числе сердечно-сосудистых, что обусловлено большим количеством исследований состояния стволовых и прогениторных клеток при различных патологиях и обнаружением связей между количественными и качественными характеристиками различных типов этих клеток и клиническими характеристиками пациентов.
По современным представлениям ключевую роль в регенеративных процессах в организме играют стволовые клетки, способные к самовоспроизведению, дифференцировке и к воспроизведению различных клеток других видов, то есть к трансформации через этапы клеток-предшественников в высокодифференцированные органо-специфичные клетки, например, в клетки эндотелия сосудов, кардиомиоциты, клетки крови, гепатоциты и другие [Iwami Y., Masuda Н., Asahara Т. Endothelial progenitor cells: past, state of the art, and future. J Cell Mol Med 2004; 8:488-497]. Помимо этого важнейшим механизмом стимуляции процессов регенерации тканей стволовыми и прогениторными клетками является их способность продуцировать большое количество биологически активных молекул, стимулирующих восстановительные процессы в тканях.
Многие, если не все, заболевания сердечно-сосудистой системы связаны с дисфункцией эндотелия сосудов. Особая роль в процессе восстановления эндотелиального слоя и в поддержании его нормальной функции отводится циркулирующим в периферической крови предшественникам эндотелиальных клеток (ПЭК) [Wassmann S., Werner N., Czech Т., Nikening G. Improvement of endothelial function by systemic transfusion of vascular progenitor cells. Circ Res 2006; 99: Е74]. Впервые популяция ПЭК была изолирована из циркулирующей мононуклеарной фракции в 1997 г. Asahara с сотр. [Asahara Т., Murohara Т., Sullivan A. et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science 1997; 275:964-966]. Эти клетки были охарактеризованы авторами как клетки с низкой экспрессией или полным отсутствием на своей поверхности общего лейкоцитарного антигена CD45 и наличием специфичных для предшественников (CD34) и зрелого эндотелия (рецепторы 2 типа к VEGF (VEGF-R2)) клеточных маркеров. В последующем было продемонстрировано, что эти клетки представлены в циркуляции несколькими субпопуляциями, в частности субпопуляция, несущая маркер CD133+, представляет ранние предшественники эндотелиальных клеток, мобилизованные из костного мозга и в определенных условиях способные дифференцироваться в клетки с эндотелиальным фенотипом [Yang С, Zhang Z.H., Li Z.J. et al. Enhancement of neovascularization with cord blood CD133+ cell-derived endothelial progenitor cell transplantation. Thromb Haemost. 2004: 91(6):1202-1212].
Относительно недавно было показано, что увеличение количества циркулирующих предшественников эндотелиальных клеток (ПЭК) может отражать наличие васкулярной патологии, эндотелиальной дисфункции и служить биомаркером заболеваний сосудов, а уменьшение пула ПЭК может приводить к нарушениям адаптивного ангиогенеза. Показано, что метаболический синдром и СД2 могут существенно влиять на количество и функциональные характеристики ПЭК при данных патологиях [Vasa М., Fichtlscherer S., Aicher A. et al. Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease. Circ Res. 2001; 89:E1-E7].
У больных с сердечной недостаточностью часто имеется дисфункция эндотелия [Agnoletti L, Curello S, Bachetti T, Malacarne F, Gaia G, Comini L, Volterrani M, Bonetti P, Parrinello G, Cadei M, Grigolato PG, Ferrari R. Serum from patients with severe heart failure downregulates eNOS and is proapoptotic: role of tumor necrosis factor-alpha. Circulation. 1999 Nov 9;100(19):1983-91]. Однако работ, посвященных исследованию популяций циркулирующих клеток-предшественников при сердечной недостаточности крайне мало и результаты их противоречивы [Shantsila Е, Wrigley BJ, Shantsila А, Тарр LD, Gill PS, Lip GY. Monocyte-derived and CD34+/KDR+endothelial progenitor cells in heart failure. J Thromb Haemost. 2012 Jul; 10(7):1252-61]. Недавно показано, что сахарный диабет 2 типа обладает повреждающим действием на ПЭК и их мобилизацию из «костно-мозговой ниши», что может приводить к снижению количества этих клеток в циркуляции, нарушению их участия в репарации эндотелия сосудов и в ангиогенезе, а следовательно, и в восстановлении тканей после ишемического повреждения [Террег О.М., Galiano R.D., Capla J.M. et al. Human endothelial progenitor cells from type II diabetics exhibit impaired proliferation, adhesion, and incorporation into vascular structures. Circulation. 2002; 106:2781-2786]. Это может приводить к прогрессированию заболеваний ишемической природы и ухудшению их прогноза. Однако способов прогнозирования сердечно-сосудистой летальности у больных с ХСН, ассоциированной с сахарным диабетом, по количеству циркулирующих в крови стволовых и прогениторных клеток не описано.
Из уровня техники известен способ прогнозирования риска сердечно-сосудистой летальности у больных с различными формами хронической сердечной недостаточности по уровню мозгового натрийуретического пептида (NT-proBNP) и тканевого ингибитора матриксных металлопротеаз (TIMP-I) в периферической крови. Повышение уровня NT-proBNP≥1520fmol/ml и TIMP-I≥865ng/mL позволяет выделять среди пациентов с ХСН больных высокого риска, для которых необходимы интенсивное лечение как сердечной недостаточности, так и осложнений (Соломахина Н.И., Беленков Ю.Н. Прогностическое значение тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ-1 (TIMP-I) у больных ХСН // Сердечная недостаточность. - 2010. - №5. - С.281 - 284.; Соломахина Н.И. Уровни NT-proBNP и сердечно-сосудистая смертность у больных хронической сердечной недостаточностью пожилого и старческого возраста // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2009.- №8, S2. - С.303).
Однако представленный способ не учитывает, что сопутствующие метаболические расстройства, такие как метаболический синдром, ожирение и сахарный диабет 2 типа, могут влиять на прогностическую ценность уровня NT-proBNP (Taylor JA, Christenson RH, Rao K, Jorge M, Gottlieb SS. B-type natriuretic peptide and N-terminal pro B-type natriuretic peptide are depressed in obesity despite higher left ventricular end diastolic pressures. Am Heart J. 2006; 152:1071-1076.; Martin Andreas, Harald Zeisler, Ammon Handisurya, Maximilian В Franz, Michael Gottsauner-Wolf, Michael Wolzt, Alexandra Kautzky-Wilier. N-terminal-pro-brain natriuretic peptide is decreased in insulin dependent gestational diabetes mellitus: a prospective cohort trial. Cardiovasc Diabetol. 2011; 10:28; Susana Gonzalez, Eric S. Kilpatrick, Stephen L. Atkin. The Biological Variation of N-Terminal Pro-Brain Natriuretic Peptide in Postmenopausal Women with Type 2 Diabetes: A Case Control Study. PLoS One. 2012; 7(11):e47191; Henrik Reinhard, Niels Wiinberg, Peter R Hansen, Andreas Kjaer, Claus L Petersen, Kaj Winther, Hans-Henrik Parving, Peter Rossing, Peter К Jacobsen. NT-proBNP levels, atherosclerosis and vascular function in asymptomatic type 2 diabetic patients with microalbuminuria: peripheral reactive hyperaemia index but not NT-proBNP is an independent predictor of coronary atherosclerosis. Cardiovasc Diabetol. 2011; 10:71). Это диктует необходимость поиска новых предикторов неблагоприятного исхода для пациентов с ХСН, сочетающейся с метаболическими расстройствами, прежде всего сахарным диабетом. Помимо этого убедительно показано, что использование нескольких предикторов в дополнение к уровням натрийурептических пептидов позволяет значительно повышать прогнозирование исходов сердечно-сосудистых заболеваний (Zethelius В, Berglund L, Sundstrom J, Ingelsson E, Basu S, Larsson A, Venge P, Arnlov J. Use of multiple biomarkers to improve the prediction of death from cardiovascular causes. N Engl J Med 2008; 358:2107-2116), что делает актуальным разработку новых предикторов неблагоприятного прогноза хронической сердечной недостаточности, особенно при ее сочетании с метаболическими расстройствами, которые могут влиять на прогностическую ценность классических биомаркеров тяжести и прогноза хронической сердечной недостаточности.
Раскрытие изобретения
Задачей изобретения является создание нового способа прогнозирования сердечно-сосудистой летальности у больных с хронической сердечной недостаточностью, ассоциированной с сахарным диабетом 2 типа.
Техническим результатом, на достижение которого направлено заявленное изобретение, является разработка нового клеточного маркера сердечно-сосудистой летальности у больных с хронической сердечной недостаточностью ишемической этиологии, при ее сочетании с сахарным диабетом.
Прогнозирование сердечно-сосудистой летальности у больных с хронической сердечной недостаточностью, ассоциированной с сахарным диабетом 2 типа, основано на измерении, например, с помощью проточной цитофлуориметрии, количества циркулирующих в крови прогениторных клеток определенного иммунофенотипа, а именно - иммунофенотипа CD34+, CD133 dim, CD45- (клетки характеризуются наличием на их поверхности маркера CD34, слабым присутствием маркера CD133 и отсутствием маркера CD45). Снижение количества циркулирующих прогениторных клеток иммунофенотипа CD34+, CD 133 dim, CD45- менее 300 клеток на миллион лейкоцитов у больных с хронической сердечной недостаточностью ишемической этиологии, сочетающейся с сахарным диабетом 2 типа, негативно сказывается на течении хронической сердечной недостаточности и, прежде всего, на показателях выживаемости, и может служить очевидным предиктором сердечно-сосудистой летальности.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется чертежами, где на фиг.1 представлен пример детекции субпопуляций предшественников среди мононуклеаров периферической крови. При этом на фиг.1А показано выделение живых клеток на основании соотношения красной (Hoechst-Red) и голубой (Hoechst-Blue) флуоресценции Хехста 33342; на фиг.1Б -выделение мононуклеаров (лифоциты, НК-клетки, моноциты) на сновании светорассеяния, на фиг.1В Идентификация CD34+/CD45-Low предшественников; на фиг.1Г - определение базового уровня флюоресценции клеток в каналах РЕ и PerCP с помощью изотопических иммуноглобулинов; на фиг.1Д - детекция KDR-положительных (РЕ+) и С0133-положительных (PerCP+) клеток.
На фиг.2 представлена диаграмма, демонстрирующая показатели летальности, частоты нефатальных сердечно-сосудистых событий и несердечно-сосудистых событий у больных ХСН ишемического генеза в зависимости от исходного количества циркулирующих прогениторных клеток.
Осуществление изобретения
Учитывая, что и сахарный диабет, и сердечная недостаточность сопряжены с развитием дисфункции эндотелия и ишемии тканей, уровень циркулирующих прогениторных клеток, связанный с эндотелиальной дисфункцией и ишемией, может явиться важным биомаркером тяжести заболевания и прогноза у больных, имеющих сочетание этих патологий. Однако этот вопрос пока не был исследован при сердечной недостаточности, сочетающейся с сахарным диабетом 2 типа.
По результатам проведенных исследований был найден критерий, позволяющий с высокой степенью достоверности прогнозировать риск сердечно-сосудистой летальности у пациентов с хронической сердечной недостаточностью ишемической этиологии, сочетающейся с сахарным диабетом 2 типа. В качестве такого критеря выступает количественное содержание циркулирующих в периферической крови прогениторных клеток иммунофенотипа CD34+, CD133 dim, CD45-. При этом снижение количества циркулирующих прогениторных клеток ниже 300 клеток на миллион лейкоцитов принимают в качестве маркера неблагоприятного прогноза течения заболевания, проявляющегося в прогрессировании сердечной недостаточности и увеличении сердечно-сосудистой летальности.
Для измерения количественного содержания циркулирующих в периферической крови прогениторных клеток осуществляют забор периферической крови в пробирку с ЭДТА в качестве антикоагулянта, выделяют мононуклеарную фракцию с помощью раствора Hisopaque-1077 (Sigma-Aldrich, кат. №10771) в соответствии с инструкцией производителя, измеряют количество циркулирующих прогениторных клеток иммунофенотипа CD34+, CD 133 dim, CD45-, например, с помощью проточной цитофлуориметрии и соответствующих флуоресцентно меченных антител, и при обнаружении измеренного количества циркулирующих прогениторных клеток ниже 300 клеток на миллион лейкоцитов делают вывод о неблагоприятном прогнозе течения заболевания, проявляющегося в прогрессировании сердечной недостаточности и увеличении сердечно-сосудистой летальности.
Краткое описание проведенного исследования
В работу были включены 55 пациентов с хронической сердечной недостаточностью, развившейся после острого инфаркта миокарда (ИМ). Средний возраст составил 60,1±6,3 года (возрастной интервал от 40 до 73 лет), 47 мужчин и 8 женщин. У всех пациентов диагностирована сердечная недостаточность II-III функциональный класс (ФК) по классификации Нью-Йоркской Ассоциации Сердца (NYHA) (70% больных со II ФК и 30% - с III ФК по NYHA). У 25 больных из них ХСН сочеталась с сахарным диабетом 2 типа. Фракция выброса (ФВ) левого желудочка у всех больных на момент включения составляла менее 40%.
Для оценки структурно-функционального состояния сердца всем обследуемым проводилась трансторакальная ЭХО-КГ на ультразвуковом аппарате iE 33 фирмы «Philips». Для повышения точности измерений в каждом случае усредняли значения, полученные в 5 последовательных сердечных циклах. В ходе исследования определяли структурные и функциональные показатели сердца, допплеровские показатели диастолической функции ЛЖ.
Критерием исключения служило наличие инфаркта миокарда и инсульта давностью менее 12 месяцев, перикардита, ревматического порока сердца, инфекционного эндокардита, тяжелой сопутствующей патологии (злокачественных заболеваний, хронических заболеваний легких, почечной недостаточности, коллагенозов, заболеваний печени).
В качестве контрольной группы было обследовано 20 лиц сопоставимого возраста и пола без сердечно-сосудистых заболеваний.
Количество циркулирующих прогениторных клеток (ЦПК) оценивали с помощью цитофлуориметрии в потоке по представленной ниже методике.
Протокол анализа циркулирующих предшественников (маркеры CD45, c-Kit, CD34, KDR, CD133).
Взятие крови из кубитальной вены осуществлялось в утренние часы (между 9-10 ч), натощак, после 10-минутного отдыха и адаптации пациента/донора к окружающей обстановке, в положении сидя на стуле. 10 мл крови забирали в пробирку с ЭДТА в качестве антикоагулянта. Полученный образец крови при комнатной температуре доставляли в лабораторию для дальнейшего анализа. Оценку количества циркулирующих предшественников проводили с использованием метода проточной цитофлюориметрии. Из образцов крови выделяли мононуклеарную фракцию с помощью раствора Hisopaque-1077 (Sigma-Aldrich, кат. №10771) в соответствии с инструкцией производителя.
8
Полученные клетки ресуспендировали в 150 мкл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) с 2% бычьим сывороточным альбумином (конечная концентрация ~ 10/мл). Клеточную суспензию разделяли на 2 пробы:
1) пробу для выявления предшественников (100 мкл);
2) пробу с изотипическими контролями (50 мкл клеточной суспензии + 50 мкл ФСБ с 2% альбумином).
Добавляли по 20 мкл на пробу флуоресцентно-меченные антитела и инкубировали в темном месте при легком перемешивании при комнатной температуре в течение 2 ч. Использовали следующие комбинации антител:
1) CD45-FITC (Beckton Dickinson, BD, кат №555482), KDR-PE (R&D Systems, кат. №FAB357P), CD133-Biot (Miltenyi Biotec, кат №130-090-852), Str-PerCP (Jackson Immunoresearch, кат №016-120-084, добавляли после 1 ч инкубации), CD34-APC (BD, №555824),
2) CD45-FITC (BD, №555482), IgG-PE (BD, №555749), IgG-PerCP (R&D, №IC003C), Str-PerCP (Jackson Immunoresearch, кат №016-120-084, добавляли после 1 ч инкубации), CD34-APC (BD, №555824).
По истечении периода окраски антителами разбавляли каждую пробу ФБС до объема 1,5 мл и осаждали центрифугированием при ускорении 300g×10 мин, удаляли супернатант, ресуспендировали в 600 мкл ФСБ (300 мкл для изотипического контроля) и добавляли Хехст 33342 (Invitrogen кат №Н21492) до конечной концентрации 10 мкг/мл. Инкубировали 20-90 мин при комнатной температуре. Анализировали клетки на проточном цитофлюориметре с использованием возбуждения на длинах волн 355, 488 и 635 нм, например проточном цитофлюориметре/сортировщике MoFlo (Beckman Colter, США), или LSR Fortessa (BD). При этом накапливали не менее 2 млн Хехст-положительных событий для первой пробы и не менее 1 млн - для пробы с изотипическими контролями.
Анализ данных осуществлялся при помощи программного обеспечения цитометра, (Summit для Beckman Coulter и FACSDiva для BD), или специализированного программного обеспечения FlowJo (Treestar Inc, США) или Kaluza (Beckman Coulter). Анализ проводился по следующей схеме:
1. Выделение фракции живых мононуклеаров крови
a) На гистограмме Хехст красный (650-690 нм, линейная шкала), Хехст голубой (420-450 нм, линейная шкала) выделяли область живых клеток. Эти клетки характеризовались менее интенсивным окрашиванием и преобладанием голубой компоненты флюоресценции Хехста. Отображение этих клеток предсталено на гистограмме прямого/бокового светорассеяния (Фиг.1А).
b) На гистограмме (прямое, боковое светорассеяние) выделяли область лимфоцитов/НК-клеток/моноцитов (мононуклеаров) и отображали эти клетки на гистограмме [CD45, CD34] (Фиг.1Б).
2. Определение CD34+ предшественников и содержания среди них KDR+ и CD133+ клеток
a) На гистограмме [CD45, CD34] выделяли клетки с высокой экспрессией CD34 и пониженной экспрессией CD45 (CD34+/CD45-Low, Фиг.1В). Эти клетки представляют собой большинство циркулирующих предшественников. Рассчитывали число CD34+/CD45-Low клеток на 1 миллион мононуклеаров, выделенных в п.1b. Отображали эти клетки на гистограмме [KDR, CD133] или [IgG-PE, IgG-PerCP] для изотипического контроля.
b) С помощью пробы с изотипическим контролем определяли верхнюю границу базовой флюоресценции клеток в каналах РЕ и PerCP (Фиг.1Г). На гистограмме [KDR-PE, CD133-PerCP] выделяли клетки, интенсивность флюоресценции которых в каналах РЕ и PerCP превышала базовую флюоресценцию (Рис.1Д). Рассчитывли, какой % из CD34+ клеток экспрессирует KDR и CD133.
Воспроизводимость и контроли
CD34+ CD45-Low популяция практически всегда четко различима и обладает интенсивной окраской CD34. Среди 120 образцов мононуклеаров, проанализированных на Факультете фундаментальной медицины МГУ им. М.В.Ломоносова, в 98,3% из них удалось четко различить эту популяцию клеток. В случае, когда популяция неразличима, проверяли юстировку прибора и корректность регистрации в канале АРС. Если юстировка верна и параметры регистрации в канале АРС в норме, осуществляли замену антитела к CD34. Если даже с новыми антителами популяция CD34+ CD45-Low не регистрировалась или регистрировалась не четко, проверяли все реагенты, используемые в пробоподготовке, и при необходимости их заменяли.
Отрицательными контролями покраски на KDR, c-Kit, CD 133 служат клетки, окрашенные изотипическими антителами, конъюгированные с соответствующей специфическим антителам флюоресцентной меткой (Стерпавидин-РPerCP для CD133). Положительный контроль для CD34 не требуется т.к. присутствует практически в каждом образце. CD133 экспрессирован почти на всех CD34+ CD45-Low клетках, хотя и в меньшей степени. Сравнение уровня интенсивности свечения PerCP в изотипическом контроле и в пробе, окрашенной на CD133, позволяет понять, есть ли специфическое окрашивание CD133. Положительным контролем окрашивания на KDR являются CD45+ моноциты, т.к. они несут на поверхности все эти антигены, хотя и в умеренном количестве.
Надежность и достоверность подсчета популяций была оценена при помощи параллельной пробоподготовки, окраски и анализа двух проб из одного исходного образца крови. При этом различия по относительному содержанию CD34+ CD45-Low клеток составляли менее 10%.
Статистическую обработку всех результатов исследования осуществляли с помощью пакетов статистических программ Microsoft Excel 2003, STATISTICA 6.0, SPSS, реализованных на PC IBM Pentium IV. Для проведения сравнения при нормальном распределении переменных применяли параметрический метод (непарный t-тест), при отклонении от нормального - непараметрический (тест Манна-Уитни); величины выражали как среднее±стандартное отклонение. Кумулятивная выживаемость исследовалась методом Каплана-Мейера, различия между группами оценивали с учетом критерия Уилкоксона. Частоту неблагоприятных событий в группах сравнивали с помощью дисперсионного анализа (односторонний критерий Фишера).
Больных наблюдали в течение 3-х лет в НКО ФГБУ РКНПК МЗ РФ от начала и до конца испытания или до момента летального исхода каждого конкретного больного.
Все больные находились на многокомпанентной стандартной терапии по поводу ХСН и ИБС, больные с сахарным диабетом получали соответствующую антидиабетическую терапию.
В контрольной группе за период наблюдения не отмечено ни одного случая возникновения сердечно-сосудистого заболевания.
У больных ХСН летальных исходов было 3 - в результате сердечно-сосудистых причин, а именно - 2 случая внезапной смерти на фоне декомпенсации ХСН и один случай смерти в результате декомпенсации ХСН. Все летальные исходы за время наблюдения были у больных с ХСН, сочетающейся с сахарным диабетом 2 типа.
В 11 случаях были нелетальные сердечно-сосудистые события - повторные госпитализации, из них у 6 больных по поводу декомпенсации ХСН, у 5 больных по поводу прогрессирования ИБС (развитие острого коронарного синдрома, потребовавшего интраваскулярной реваскуляризации - стентирования). У 4 больных причиной госпитализации была декомпенсация сахарного диабета.
Трехлетняя выживаемость в общей группе ХСН составила 94% при 100% выживаемости в группе контроля. При этом в подгруппе ХСН с сопутствующим сахарным диабетом 2 типа трехлетняя выживаемость составила 88% при 100% выживаемости в группе ХСН без сахарного диабета.
Количество ЦПК у больных контрольной группы составило в среднем 649.9±276.8 клеток на миллион лейкоцитов, у всех больных с ХСН - 793.0±456.0 клеток на миллион лейкоцитов.
При разделении всех больных с ХСН на две группы - больных со стабильным течением без повторных госпитализаций и летальных исходов и больных с прогрессирующим течением и повторными госпитализациями и летальными исходами - обнаружено, что уровень ЦПК в первой группе составил 634.9±415.5 клеток на миллион лейкоцитов, а во второй - 460.8±411.3 клеток на миллион лейкоцитов, p>0,05, то есть была только тенденция к более большему количеству ЦПК у больных ХСН со стабильным течением.
У больных с летальными исходами количество ЦПК в начале исследования составило 149.3±92.7 клеток на миллион лейкоцитов, а у всех остальных больных, включая случаи всех госпитализаций и стабильное течение ХСН - 610.5±413.7 клеток на миллион лейкоцитов, то есть было более чем в 4 раза ниже (p<0,01). При этом уровень ЦПК у больных со всеми случаями госпитализаций по поводу сердечно-сосудистых событий и декомпенсации сахарного диабета составил в среднем 554.3±426.1 клеток на миллион лейкоцитов, что также было выше значения у больных с летальными исходами, но существенно не отличалось от больных со стабильным течением ХСН. У больных со стабильным течением количество ЦПК составило 634.9±415.5 клеток, что более чем в 4 раза выше, чем у больных с летальными исходами ХСН (p<0,05). Учитывая значительное снижение количества ЦПК у больных, у которых в течение трехлетнего наблюдения наблюдались летальные исходы ХСН, был проведен анализ всех исходов ХСН в зависимости от исходного уровня ЦПК.
Для этого все больные с ХСН были разделены на группы в зависимости от количества циркулирующих прогениторных клеток. В первую группу вошли пациенты с ХСН, у которых количество ЦПК было ниже максимального разброса этого показателя в группе контроля (относительно здоровые люди) - менее наименьшего показателя в группе контроля. Таких больных было 12. Количество ЦПК у них было менее 300 клеток на миллион лейкоцитов. 43 больных составили группу, у которой исходный уровень ЦПК был в пределах разброса в группе контроля и выше. Обе группы были сопоставимы по возрасту, полу, тяжести ХСН и др. показателям.
В первой группе больных с ХСН и исходно сниженным количеством ЦПК дожитие в течение 3 лет наблюдения с учетом сердечно-сосудистой смертности составило 75%, что достоверно ниже, чем в группе больных ХСН с исходно нормальным уровнем ЦПК (100%) (p<0,05). Среди остальных неблагоприятных событий в группе со сниженным исходно количеством ЦПК было три госпитализации в связи с декомпенсацией ХСН и одна - в связи с декомпенсацией сахарного диабета. Ни одной госпитализации в связи с прогрессированием ИБС (острым коронарным синдромом или повторным инфарктом миокарда не наблюдалось). В целом неблагоприятных событий в этой группе было 7, включая случаи смерти, что составило 58,3%, сердечно-сосудистых событий было 6, что составило 50%, 1 госпитализация было в связи с декомпенсацией сахарного диабета.
В группе больных с ХСН, у которых исходно уровень ЦПК был в пределах разброса в контрольной группе или превышал его, за 3 года наблюдения не отмечено ни одного летального исхода, 5 госпитализаций по поводу развития острого коронарного синдрома, 3 госпитализации по поводу декомпенсации ХСН и 3 по поводу декомпенсации сахарного диабета. Всего 11 неблагоприятных событий за 3 года наблюдения (25,6%), что было в два раза меньше, чем в группе со сниженным исходным количеством ЦПК (p<0,02). Полученные результаты показывают, что у больных ХСН с исходно сниженным количеством ЦПК (ниже 300 клеток на миллион лейкоцитов) с высокой достоверностью более часто наблюдаются летальные исходы, связанные с прогрессированием ХСН, чем у больных с исходно нормальным уровнем ЦПК. Снижение ЦПК ниже 300 клеток на миллион лейкоцитов было связано с возрастанием летальности от сердечно-сосудистых причин на 25% (выживаемость в группе с низким количеством ЦПК - 75%, у остальных больных, включая больных с прогрессирующим течением - 100% при 0% летальности за 3 года), различия достоверны, p<0,01 с учетом критерия Уилкоксона-Манна-Уитни и одностороннего теста Фишера.
При оценке данных по всем сердечно-сосудистым событиям (сердечно-сосудистая летальность, острый коронарный синдром, госпитализации по поводу декомпенсации ХСН), исключая госпитализации по поводу декомпенсации сахарного диабета, у больных с исходно низкими значениями ЦПК их было 50% при 18, 6% у больных с нормальными и повышенными значениями ЦПК (p<0,01). Причем следует подчеркнуть, что в группе с низкими значениями ЦПК не было ни одного случая острого коронарного синдрома, а все нелетальные сердечно-сосудистые события были представлены декомпенсацией ХСН. В то же время у больных с нормальным и повышенным уровнем ЦПК среди нелетальных сердечно-сосудистых событий более половины составило развитие острого коронарного синдрома, потребовавшего интраваскулярной реваскуляризации (стентирования).
ХСН, возникающая после перенесенного инфаркта миокарда, является результатом процесса постинфарктного ремоделирования сердца. Развитие некроза части миокарда и последующее формирование рубцовой ткани приводит к изменению формы, размеров и толщины стенок левого желудочка сердца - их истончению в зоне рубца и гипертрофии неповрежденного участка стенки миокарда в ответ на повышенную гемодинамическую нагрузку. Изменение формы левого желудочка приводит к снижению его насосной функции, что и ведет к развитию ХСН. Снижение показателя насосной функции - фракции выброса левого желудочка - всегда связано с ухудшением прогноза. С другой стороны на процесс ремоделирования сердца и его восстановления после инфаркта может оказывать влияние уровень адаптивного ангиогенеза и функция эндотелия, на которые, в частности, могут оказывать влияние циркулирующие прогениторные клетки, которые могут мобилизоваться из костного мозга в ответ на факторы роста и цитокины, секретируемые клетками поврежденного миокарда, выходить в кровоток и по механизму хоуминга приходить в поврежденный миокард, где они могут оказывать эффекты, способствующие регенерации/репарации миокарда: встраиваться в поврежденный эндотелий и улучшать его функцию, участвовать в ангио-васкулогенезе и улучшать кровоснабжение миокарда, а также, что немаловажно, секретировать широкий набор факторов роста и цитокинов, улучшающих функциональное состояние кардиомиоцитов и подавляющих их апоптоз, что способствует улучшению функции сердца и препятствует прогрессированию сердечной недостаточности. Поэтому снижение количества ЦПК, которое вероятнее всего происходит в результате нарушений их мобилизации из костного мозга под влиянием сопутствующего сахарного диабета, может вносить существенный вклад в прогноз больных с ХСН, особенно при ее сочетании с сахарным диабетом 2 типа.
Таким образом, снижение количества циркулирующих прогениторных клеток (иммунофенотипа CD34+, CD133 dim, CD45-) менее 300 клеток на миллион лейкоцитов у больных ХСН ишемической этиологии, сочетающейся с сахарным диабетом 2 типа, негативно сказывается на течении ХСН и прежде всего на показателях выживаемости и может служить очевидным предиктором сердечно-сосудистой летальности.
Способ прогнозирования сердечно-сосудистой летальности по уровню ЦПК апробирован в научно-консультативном отделе НИИ кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ. Он дал достоверно положительные результаты и найдет применение в медицинской практике.