СРАВНЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ РАЗЛИЧНЫХ ПРЕПАРАТОВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРОТЕАЗ ПРИ ГИДРОЛИЗЕ КОЛЛАГЕНА

Научная статья УДК 664.38

DOI 10.52653/PPI.2021.11.11.010

Сравнение эффективности различных препаратов бактериальных протеаз при гидролизе коллагена

Елена Викторовна Костылева1, Анна Сергеевна Середа2, Ирина Александровна Великорецкая3, Нина Васильевна Цурикова4

'' 2 3' 4ВНИИ пищевой биотехнологии - филиал ФИЦ питания, биотехнологии и безопасности пищи, Москва ekostyleva@list.ru

Аннотация. Гидролизаты коллагена широко используются в пищевой, фармацевтической и косметической промышленности. Для обработки коллагена используют различные протеолитические ферменты растительного, животного и микробного происхождения, из которых самыми перспективными являются бактериальные протеазы. Наиболее известные и часто используемые в пищевой отрасли коммерческие препараты бактериальных протеаз различаются по компонентному составу и могут содержать сериновые, металлопротеазы либо их смесь. С целью определения эффективности препаратов бактериальных протеаз с различным компонентным составом при получении гидролизатов коллагена мы провели ферментативную обработку говяжьего коллагена с использованием коммерческих препаратов Alcalase, Neutrase, Protamex и двух образцов ферментных препаратов, полученных в лабораторных условиях на основе новых отечественных штаммов Bacillus. Эффективность гидролиза оценивали по накоплению аминного азота, содержанию низкомолекулярного белка и по интенсивности белковых полос на электрофореграммах полученных продуктов. Все исследуемые препараты обеспечивали эффективный гидролиз коллагена. Наиболее интенсивно коллаген расщепляли препараты, содержащие только сериновые протеазы: Alcalase и ФП-145, полученный из культуральной жидкости штамма B. licheniformis-145. Высокую эффективность показали коммерческий препарат Protamex и ФП-96, полученный на основе мутантного варианта штамма B. subtilis-359 - продуцента субтилизина BPN' и бациллолизина. Наименьший выход аминного азота и низкомолекулярных белков наблюдался в варианте с препаратом Neutrase, протеолитическая активность которого полностью представлена действием нейтральной протеазы бациллолизина. Лабораторные образцы ферментных препаратов, полученные на основе новых отечественных продуцентов, не уступали зарубежным коммерческим аналогам, а ФП-96 обеспечил более высокий выход аминного азота и низкомолекулярных белков в сравнении с широко используемым в пищевой промышленности препаратом Protamex.

Ключевые слова: коллаген, гидролиз, протеазы, Bacillus

Для цитирования: Костылева Е. В., Середа А. С., Великорецкая И. А., Цурикова Н. В. Сравнение эффективности различных препаратов бактериальных протеаз при гидролизе коллагена // Пищевая промышленность. 2021. № 11. С. 67-69.

Original article

Comparison of effectiveness of various bacterial proteases preparations in collagen hydrolysis

Elena V. Kostyleva1, Anna S. Sereda2, Irina A. Velikoretskaya3, Nina V. Tsurikova4

2 1 4All-Russian Scientific Research Institute of Food Biotechnology - Branch of the Federal Research Center of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, Moscow

Abstract. Collagen hydrolysates are widely used in the food, pharmaceutical and cosmetic industries. For collagen hydrolysis, various proteolytic enzymes of plant, animal and microbial origin are used, of which the most promising are bacterial proteases. The most well-known and commonly used in the food industry commercial preparations of bacterial proteases differ in their component composition and may contain serine protease, metalloproteases, or their mixture. In order to determine the effectiveness of bacterial protease preparations with different component composition in obtaining collagen hydrolysates, we carried out hydrolysis of beef collagen using commercial preparations Alcalase, Neutrase, Protamex and two laboratory samples of enzyme preparations obtained from new domestic Bacillus strains. The efficiency of hydrolysis was assessed by amine nitrogen accumulation, low-molecular-weight protein content, and by the intensity of the protein bands on the electrophoregrams of the hydrolysates. All investigated preparations provided effective collagen hydrolysis. Collagen was hydrolyzed most intensively by preparations containing only serine proteases: Alcalase and FP-145, obtained from B. licheniformis-145 culture liquid. The commercial preparation Protamex and FP-96, obtained from a mutant variant of the B. subtilis-359 strain, a producer of subtilisin BPN' and bacillolysin, showed high efficiency. The lowest yield of amine nitrogen and low molecular weight proteins was observed when using Neutrase, which contains only the neutral protease bacillolysin. Laboratory samples of enzyme preparations obtained from the new domestic producers were not inferior to foreign commercial counterparts, and FP-96 provided a higher yield of amine nitrogen and low molecular weight proteins in comparison with Protamex, which is widely used in the food industry.

Keywords: collagen, hydrolysis, protease, Bacillus

For citation: Kostyleva E. V., Sereda A. S., Velikoretskaya I. A., Tsurikova N. V. Comparison of effectiveness of various bacterial proteases preparations in collagen hydrolysis // Food processing industry. 2021;(11):67-69 (In Russ.).

Благодарности. Научно-исследовательская работа по подготовке рукописи проведена за счет средств субсидии на выполнение государственного задания в рамках Программы фундаментальных научных исследований государственных академий наук на 20192021 гг.

Автор, ответственный за переписку: Елена Викторовна Костылева, ekostyleva@list.ru Corresponding author: Elena V. Kostyleva, ekostyleva@list.ru

© Костылева Е. В., Середа А. С., Великорецкая И. А., Цурикова Н. В., 2021

ISSN 0235-2486 ПИЩЕВАЯ ПРОМЫШЛЕННОСТЬ 11/2021 67

ПИЩЕВАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

Введение. Ценным источником белка для получения белковых гидролизатов являются коллагенсодержащие отходы птице-, мясо- и рыбоперерабатывающих предприятий. Коллаген составляет около 30 % всех животных белков и отличается высоким содержанием глицина, пролина и оксипролина. Гидролизаты коллагена широко используют в пищевой, фармацевтической и косметической промышленности благодаря их специфическим функциональным свойствам и низкой иммуногенности. Пептиды, полученные на основе коллагена, обладают криопро-текторным свойством, что позволяет применять их при приготовлении замороженных продуктов [1, 2]. На основе коллагена успешно получают биоактивные пептиды, обладающие антиокси-дантными и антимикробными свойствами. Специфический аминокислотный состав позволяет использовать гидро-лизаты коллагена при получении омолаживающих фармацевтических средств. Гидролизаты коллагена широко применяют в производстве мясных продуктов, супов, напитков и др. для улучшения органолептических, физико-химических свойств и текстуры [2].

Молекула коллагена характеризуется молекулярной массой (ММ) около 300 кДа и состоит из трех а-цепей с ММ около 100 кДа, формирующих жесткую вторичную, третичную и четвертичную структуры. ММ и функциональные свойства получаемых пептидов зависят от источника коллагена, специфичности используемых протеолитических ферментов и условий гидролиза. В среднем ММ пептидов в гидролизатах коллагена составляет 3-6 кДа [1-3].

Для гидролиза коллагена используют ферментные препараты протеолитиче-ского действия [4]. В исследованиях эффективности протеаз различного происхождения - животного (трипсин, пепсин, химотрипсин), растительного (папаин, бромелаин) и микробного (Алкалаза, Нейтраза, Флавозим и др.) - была показана перспективность использования для гидролиза коллагена ферментных препаратов (ФП), полученных на основе бактериальных продуцентов [3, 5-7]. Известно, что коллагенолитической активностью обладают некоторые бактериальные сериновые и металлопротеазы [8, 9].

Цель исследований - сравнение эффективности различных препаратов бактериальных протеаз при гидролизе говяжьего коллагена. Для эксперимента были выбраны наиболее широко используемые в пищевой промышленности коммерческие ФП: Alcalase (Novozymes A/S, Дания), основным компонентом которого является сериновая протеаза субтилизин Bacillus licheniformis; Protamex (Novozymes A/S, Дания), представляющий собой смесь субтилизина B. licheniformis и металлопротеазы бациллолизина Bacillus sp., и Neutrase (Novozymes A/S, Дания), содержащий бациллолизин B. amylolyquefaciens [10]. В эксперимент были включены лабораторные образцы концентрированных ФП, полученных в результате распылительной сушки супернатантов культу-ральной жидкости новых отечественных

штаммов: ФП-145, полученный на основе BacШus licheniformis-145 - продуцента сериновой протеазы типа субтилизина йУ [11], и ФП-96, полученный на основе му-тантного варианта штамма В. subtШs-359 -продуцента субтилизина ВР№ и бациллолизина [10].

Экспериментальная часть. В качестве субстрата использовали белок говяжий VT-PRO (коллаген фибриллярный / Россия) без предварительной обработки. Ферментативную обработку проводили в термостатированном шейкере с перемешиванием 110о об/мин в течение 2 ч при 50 °С при естественном рН 6,2, концентрации субстрата 100 г/л, дозировке ФП 2 ед/г субстрата. Инактивацию ферментов проводили инкубированием реакционной смеси при 90 °С в течение 10 мин. Гидролизаты центрифугировали при 13 000 об/мин в течение 5 мин.

Эффективность гидролиза коллагена оценивали по накоплению азота образующихся свободных аминогрупп и аминокислот (аминного азота), по содержанию низкомолекулярного белка (НМБ) с молекулярной массой <10 кДа, а также сравнивали полноту гидролиза основных белков коллагена с помощью ПААГ-электрофореза. Содержание аминного азота определяли методом формоль-ного титрования [12]. Для определения

влияет на эффективность препаратов при гидролизе коллагена. Наибольшим содержанием аминного азота и НМБ характеризовались гидролизаты, полученные с помощью А!са!аБе и ФП-145, содержащих только сериновые протеазы. высокий выход аминного азота и НМБ наблюдался также при использовании препаратов Protamex и ФП-96, в состав которых входят одновременно сериновые и металло-протеазы. По концентрации аминного азота в гидролизатах они лишь на 12 % и 7 % соответственно уступали ФП серино-вых протеаз, по выходу НМБ - на 19 % и 15 % соответственно. следует отметить, что лабораторный ФП-96 более эффективно гидролизовал коллаген, чем широко используемый в пищевой промышленности препарат Protamex.

ФП Neutrase, протеолитическая активность которого полностью представлена действием нейтральной протеазы бацил-лолизина, был наименее эффективен при обработке коллагена. По содержанию аминного азота он на 33 % уступал препаратам Alcalase и ФП-145, а по выходу НМБ -на 30 %. В то же время по отношению к контролю (без ФП) в варианте с Neutrase содержание аминного азота было увеличено почти в 4 раза, а НМБ - в 7,7 раз (рис. 1 а, б).

Данные электрофореза показывают (рис. 2), что все исследуемые препараты

1 2 3 4 5 6

Рис. 1. Содержание аминного азота (а) и низкомолекулярного белка с ММ <10 кДа (б) в гидролизатах говяжьего коллагена, полученных с использованием следующих ФП: 1 - контроль (без ФП), 2 - Alcalase, 3 - Protamex, 4 - Neutrase, 5 - ФП-145, 6 - ФП-96

содержания НМБ из супернатантов гидролизатов удаляли белковую фракцию с ММ выше 10 кДа, используя для этого 20 %-ный раствор трихлоруксусной кислоты, осадок отделяли центрифугированием и в полученном растворе определяли концентрацию белка по методу Лоури. Содержание НМБ выражали в процентах по отношению к концентрации общего белка в субстрате. Результаты получали не менее чем в трех повторностях.

Разделение белков в полученных гидролизатах проводили в 12 %-ном по-лиакриламидном геле (ПААГ) (25 мМ трис-глициновый буфер, pH 8,3, с ДДС-Na в концентрации 1 мг/мл) в ячейке для электрофореза Mini Protein Cell system (Bio-Rad, США). Гель окрашивали кумас-си бриллиантовым синим G-250 (Amresco, США).

Полученные результаты показали (рис. 1 а, б), что специфичность протеаз, входящих в состав ФП, существенно

M 1 2 3 4 5 6

Рис. 2. Электрофореграмма продуктов гидролиза говяжьего коллагена, где М - молекулярный маркер, 1 - контроль (коллаген без гидролиза), 2 - обработка ФП Alcalase, 3 - обработка ФП Protamex, 4 - обработка ФП Neutrase, 5 - обработка ФП-145, 6 - обработка ФП-96

68 11/2021 FOOD PROCESSING INDUSTRY ISSN 0235-2486

достаточно интенсивно гидролизовали коллаген. Полосы высокомолекулярного белка с ММ на уровне 100 и выше кДа отсутствуют во всех вариантах ферментативных гидролизатов. В продукте, полученном с помощью Neutrase, осталось небольшое количество промежуточных продуктов гидролиза с ММ между 20 и 40 кДа. В вариантах с Protamex и ФП-96 остаточные промежуточные продукты гидролиза обладают более низкой ММ по сравнению с вариантом с Neutrase, значительная их часть характеризуется ММ ниже 10 кДа. В вариантах с Alcalase и ФП-145 коллаген полностью расщеплен до низкомолекулярных пептидов.

Заключение. Проведенные исследования показали высокую эффективность исследуемых препаратов бактериальных протеаз. Наиболее интенсивно коллаген гидролизовали препараты, содержащие сериновые протеазы. Следует отметить, что лабораторные образцы ферментных препаратов, полученные на основе новых отечественных продуцентов, не уступали зарубежным коммерческим аналогам.

список источников

1. Liu D., Nikoo M., Boran G., Zhou P., Regenstein J. M. Collagen and gelatin // Annual Review of Food Science and Technology. 2015. No. 6. P. 527-557. DOI: 10.1146/annurev-food-031414-111800

2. León-López A., Morales-Peñaloza A., Martínez-Juárez V. M., Vargas-Torres A., Zeugolis D. I., Aguirre-Álvarez G. Hydrolyzed Collagen-Sources and Applications // Molecules. 2019. No. 24 (22). P. 4031. Doi:10.3390/molecules24224031

3. Nguyen B. C., Kha T. C., Nguyen K. H. N., Nguyen H. M. X. Optimization of enzymatic hydrolysis of collagen from yellowfin tuna skin (Thunnus albacares) by response surface methodology and properties of hydrolyzed collagen // Journal of Food Processing and Preservation. 2021. No. 45. P. e15319. DOI: 10.1111/jfpp.15319

4. Серба Е. М., Римарева Л. В., Соколова Е. Н., Борщева Ю. А., Курбатова Е. И., Волкова Г. С., Погоржельская Н. С., Мартыненко Н. Н. Биотехнологические основы направленной конверсии сельскохозяйственного сырья и вторичных биоресурсов для получения пищевых ингредиентов, функциональных продуктов питания и кормов. М.: Библио-Глобус, 2017. 180 с. Doi: 10.18334/9785604023716

5. Yang H., Xue Y., Liu J., Song Sh., Zhang L., Song Q., Tian L., He X., He Sh., Zhu H. Hydrolysis Process Optimization and Functional Characterization of Yak Skin Gelatin Hydrolysa-tes // Journal of Chemistry. 2019. Vol. 2019. https://doi.org/10.1155/2019/9105605

6. Ky P. X., Vy P. B., Ha D. V., Hy L., Hong N. T., Thiet D. T., Anh N. P. Investigation of protein patterns and antioxidant activity of collagen hydrolysates from skin of fan-bellied leatherjacket Monacanthus chinensis by various enzymes // Journal of Marine Science and Technology. 2018. Vol. 18. No. 4A. P. 141-150. DOI: 10.15625/1859-3097/18/4A/13642

7. Hong H., Fan H., Chalamaiah M., Wu. J. Preparation of low-molecular-weight, collagen hydrolysates (peptides): Current progress, challenges, and future perspectives // Food Chemistry. 2019. Vol. 301. P. 125222. Doi: 10.1016/j.foodchem.2019.125222.

8. Zhang Y.-Z., Ran L.-Y., Li C.-Y., Chen X.-L. Diversity, structures, and collagen-degrading mechanisms of bacterial collagenolytic proteases // Applied and Environmental Microbiology.

2015. No. 81. P. 6098 -6107. Doi:10.1128/ AEM.00883-15.

9. Ran L. Y., Su H. N., Zhao G. Y., Gao X., Zhou M. Y., Wang P., Zhao H. L., Xie B. B., Zhang X. Y., Chen X. L., Zhou B. C., Zhang Y. Z. Structural and mechanistic insights into collagen degradation by a bacterial collagenolytic serine protease in the subtilisin family // Molecular Microbiology. 2013. Vol. 90. No. 5. P. 997-1010. Doi: 10.1111/ mmi.12412

10. Костылева Е. В., Середа, А. С., Великорецкая И. А., Минеева Д. T., Цурикова H. В., Рубцова Е. А. Ферментные препараты бактериальных протеаз для получения белковых гидролизатов без горечи // Биотехнология. 2020. T. 36. № 4. С. 42-48. DOI: 10.37747/2312-640X-2020-18-407-409

11. Костылева Е. В., Середа А. С., Великорецкая И. А., Hефедова Л. И., Шариков А. Ю., Цурикова H. В., Лобанов H. С., Семенова М. В., Синицын А. П. Hовый мутантный штамм Bacillus licheniformis - продуцент сериновой протеазы, высокоэффективной при гидролизе белков соевого шрота // Микробиология.

2016. T. 85. № 4. С. 436-445. DOI 10.7868/ S0026365616040133.

12. оФС.1.2.3.0022.15 определение аминно-го азота методами формольного и йодометри-ческого титрования. М., 2015.

REFERENCES

1. Liu D., Liu D., Nikoo M., Boran G., Zhou P., Regenstein J. M. Collagen and gelatin. Annual Review of Food Science and Technology. 2015;6:527-557. DOI: 10.1146/annurev-food-031414-111800

2. León-López A., Morales-Peñaloza A., Martínez-Juárez V. M., Vargas-Torres A., Zeugolis D. I., Aguirre-Álvarez G. Hydrolyzed Collagen-Sources and Applications. Molecules. 2019;24(22):4031. Doi:10.3390/molecules24224031

3. Nguyen B. C., Kha T. C., Nguyen K. H. N., Nguyen H. M. X. Optimization of enzymatic hydrolysis of collagen from yellowfin tuna skin (Thunnus albacares) by response surface

methodology and properties of hydrolyzed collagen. Journal of Food Processing and Preservation. 2021;45:e15319. DOI: 10.1111/ jfpp.15319

4. Serba E. M., Rimareva L. V., Sokolova E. N., Borshcheva Yu. A., Kurbatova E. I., Volkova G. S., Pogorzhelskaya N. S., Martynenko N. N. Biotechnological bases of directed conversion of agricultural raw materials and secondary biological resources for obtaining food ingredients, functional food and feed. Moscow: Biblio-Globus, 2017. 180 p. (In Russ.) Doi: 10.18334/9785604023716

5. Yang H., Xue Y., Liu J., Song Sh., Zhang L., Song Q., Tian L., He X., He Sh., Zhu H. Hydrolysis Process Optimization and Functional Characterization of Yak Skin Gelatin Hydrolysates. Journal of Chemistry. 2019. https://doi. org/10.1155/2019/9105605

6. Ky P. X., Vy P. B., Ha D. V., Hy L., Hong N. T., Thiet D. T., Anh N. P. Investigation of protein patterns and antioxidant activity of collagen hydrolysates from skin of fan-bellied leatherjacket Monacanthus chinensis by various enzymes. Journal of Marine Science and Technology. 2018;18(4A):141-150. DOI: 10.15625/1859-3097/18/4A/13642

7. Hong H., Fan H., Chalamaiah M., Wu. J. Preparation of low-molecular-weight, collagen hydrolysates (peptides): Current progress, challenges, and future perspectives. Food Chemistry. 2019;301:125222. Doi: 10.1016/j. foodchem.2019.125222.

8. Zhang Y.-Z., Ran L.-Y., Li C.-Y., Chen X.-L. Diversity, structures, and collagen-degrading mechanisms of bacterial collagenolytic proteases. Applied and Environmental Microbiology. 2015;81:6098-6107. Doi:10.1128/AEM.00883-15.

9. Ran L. Y., Su H. N., Zhao G. Y., Gao X., Zhou M. Y., Wang P., Zhao H. L., Xie B. B., Zhang X. Y., Chen X. L., Zhou B. C., Zhang Y. Z. Structural and mechanistic insights into collagen degradation by a bacterial collagenolytic serine protease in the subtilisin family. Molecular Microbiology. 2013;90(5):997-1010. Doi: 10.1111/mmi.12412

10. Kostyleva E. V., Sereda A. S., Velikoretskaya I. A., Mineeva D. T., Tsurikova N. V., Rubtso-va E. A. Bacterial protease enzyme preparations for the production of non-bitter protein hydrolysates. Biotekhnologiya = Biotechnology. 2020;36(4):42-48 (In Russ.). DOI: 10.37747/2312-640X-2020-18-407-409

11. Kostyleva E. V., Sereda A. S., Velikoretskaya I. A., Nefedova L. I., Sharikov A. Yu., Tsurikova N. V., Lobanov N. S., Semenova M. V., Sinitsyn A. P. A new Bacillus licheniformis mutant strain producing serine protease efficient for hydrolysis of soy meal proteins. Mikrobiologiya = Microbiology. 2016;85(4):462-470 (In Russ.). DOI 10.1134/S0026261716040123.

12. OFS.1.2.3.0022.15. Determination of amine nitrogen by formol and iodometric titration methods. Moscow, 2015 (In Russ.).

Информация об авторах

Костылева Елена Викторовна, канд. техн. наук Середа Анна Сергеевна, канд. техн. наук Великорецкая Ирина Александровна, канд. техн. наук Цурикова Нина Васильевна, канд. техн. наук

ВНИИ пищевой биотехнологии - филиал ФИЦ питания, биотехнологии и безопасности пищи, 111033, Москва, ул. Самокатная, д. 4б, ekostyleva@list.ru, as.sereda@gmail.com, smirnova_i.a@mail.ru, nina.tsurikova@gmail.com

Information about the authors

Elena V. Kostyleva, Candidate of Technical Sciences, Anna S. Sereda, Candidate of Technical Sciences, Irina A. Velikoretskaya, Candidate of Technical Sciences, Nina V. Tsurikova, Candidate of Technical Sciences

All-Russian Scientific Research Institute of Food Biotechnology -Branch of the Federal Research Center of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, 4b, Samokatnaya str., Moscow, 111033, ekostyleva@list.ru, as.sereda@gmail.com, smirnova_i.a@mail.ru, nina.tsurikova@gmail.com

Статья поступила в редакцию 14.07.2021; принята к публикации 25.10.2021. The article was submitted 14.07.2021; accepted for publication 25.10.2021.

ISSN G235-2486 ПИЩЕВАЯ ПРОМЫШЛЕННОСТЬ 11/2021 69