СЫВОРОТОЧНАЯ ФРАКЦИЯ ОБОГАЩЕННОГО ТРОМБОЦИТАМИ ФИБРИНА
SERUM FRACTION OF THROMBOCYTE-ENRICHED FIBRIN

Область техники
Изобретение относится к способу получения выделенной фракции сыворотки из обогащенного тромбоцитами фибрина и ее медицинскому применению.
Предшествующий уровень техники
Кровяные пластинки или тромбоциты млекопитающих представляют собой небольшие, неправильной формы, похожие на клетки безъядерные тельца в крови, которые являются производными от своих предшественников мегакариоцитов. Тромбоциты играют фундаментальную роль в гемостазе. Тромбоциты, выделенные из периферической крови, являются источником аутологичных факторов роста. Различные концентраты тромбоцитов применялись в данной области техники для ускорения заживления мягких и твердых тканей.
Концентраты тромбоцитов представляют собой полученные из крови продукты, традиционно использующиеся, например, для лечения последствий тромбопении. Давно признано, что некоторые компоненты крови являются частью естественного процесса заживления и могут ускорить заживление при нанесении на области хирургического вмешательства.
Фибриновый клей образуется путем полимеризации фибриногена при помощи тромбина и кальция. Первоначально его готовили с использованием донорской плазмы; однако, из-за низкой концентрации фибриногена в плазме стабильность и качество фибринового клея были низкими.
Обогащенная тромбоцитами плазма (ОТП) в некотором смысле является аутологичной модификацией фибринового клея, который описан и используется в различных случаях с очевидным благоприятным клиническим исходом. ОТП, полученная из аутологичной крови, применяется для того, чтобы доставить факторы роста в высокой концентрации в место дефекта кости или область, требующую аугментации. Обогащенная тромбоцитами плазма (ОТП) является легко доступным источником факторов роста для поддержания заживления костей и мягких тканей. Ее производят с помощью способов, которые концентрируют аутологичные тромбоциты, и наносят на хирургические раны или трансплантаты и другие повреждения, которые нуждаются в поддержке или ускорении заживления. Сгусток крови является центральным явлением при инициации любого заживления мягких тканей и регенерации костной ткани. Во всех природных ранах образуется сгусток крови и с него начинается процесс заживления. ОТП представляет собой простую стратегию концентрирования тромбоцитов или обогащения ими природного сгустка крови, который образуется в нормальных хирургических ранах, с целью инициировать более быстрый и полный процесс заживления. Естественный сгусток крови содержит 95% красных кровяных клеток, 5% тромбоцитов, менее 1% белых кровяных клеток и большое количество нитей фибрина. ОТП сгусток крови содержит 4% красных кровяных клеток, 95% тромбоцитов и 1% белых кровяных клеток.
Поскольку использование ОТП для заживления кости действительно имеет под собой прочную научную основу, его применение является полезным только при использовании в сочетании с остеокондуктивным каркасом. Слишком активные методы обработки и очень высокие концентрации ОТП не могут улучшить исход заживления. Кроме того, существуют многие другие параметры в приготовлении и применении ОТП, которые влияют на ее эффективность; действие этих параметров следует понимать при рассмотрении ОТП в качестве терапевтической меры.
Обогащенный тромбоцитами фибрин (ОТФ) принадлежит к новому поколению концентратов тромбоцитов, позволяющему более простую обработку и уход. Медленно полимеризующийся слой ОТФ особенно благоприятен для поддержания процесса заживления, однако, биология действия ОТФ все еще в значительной степени неизвестна, и имеется лишь предположение, что действие происходит благодаря определенным растворимым молекулам, которые, скорее всего, попадают в фибриновую сеть ОТФ. ОТФ также используют в сочетании с лиофилизированным костным аллотрансплантатом для усиления регенерации кости при синус-лифтинге.
Имеется несколько методов для концентратов тромбоцитов и их применение может привести к путанице, поскольку каждый метод приводит к иному продукту с другой биологией и потенциальным применением.
Патент WO 2010/089379 A1 описывает комбинацию антикоагулированной (растворимой) обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП) с фактором свертывания для активации ОТП при введении этой комбинации в организм пациента.
Патент US 2009/0047242 A1 описывает кондиционированную композицию крови, которую получают путем инкубации крови в сосуде, имеющем такую удельную площадь поверхности, которая индуцирует факторы и цитокины, такие как интерлейкин-6.
Патент WO 2010/02047 А1 описывает продукт крови, включающий фибрин, тромбоциты и лейкоциты, который получают при помощи активации свертывания крови на поверхности.
Патент WO 2007/127834 А2 описывает композицию тромбина, полученную при помощи контакта цельной крови, ее компонента или ее фракции с активирующим агентом; такая композиция тромбина содержит стабилизирующий агент, например, этанол.
Терминология таких концентратов тромбоцитов, включая ОТП, ОТФ, тромбоцитарный гель, фибриновый клей, а также плазму, обедненную тромбоцитами (ПОТ) остается неясной, и их действие, несмотря на ряд положительных результатов, полученных в некоторых ситуациях, является спорным. Общая классификация этих продуктов предложена Dohan et al (Curr Pharm Biotechnol. 2012 Jun; 13(7): 1131-7).
Ишемия кости или ишемический некроз кости (асептический некроз, некроз кости, инфаркт кости, асептический некроз) является заболеванием, при котором происходит клеточная смерть (некроз) компонентов костей из-за прерывания кровоснабжения костной ткани. В результате этого костная ткань погибает; причем такой некроз клеток касается в первую очередь кроветворных клеток. Если болезнь поражает кости сустава, то она, чаще всего, приводит к разрушению соприкасающихся суставных поверхностей. Ишемический некроз кости может быть вызван, например, травматическим повреждением, переломом или вывихом костей, вывихом бедра или чрезмерным потреблением алкоголя или применением стероидов.
При реперфузии происходит восстановление ишемизированной кости. Сначала мезенхимальные клетки и макрофаги, мигрировавшие из живой костной ткани, растут в зонах погибшего костного мозга, а затем эти мезенхимальные клетки дифференцируются в остеобласты и фибробласты.
Возможное лечение включает замену мертвых тканей и/или применение соединений, которые могут уменьшить скорость распада кости. Однако все еще существует потребность в материалах, которые облегчают регенерацию костной ткани после ишемии.
Последние достижения в области регенеративной медицины проливают свет на потенциальные возможности различных факторов роста, которые обладают замечательным действием в качестве индукторов образования костной ткани. Кроме костных морфогенетических белков (BMP; от англ. bone morphogenetic protein) положительное воздействие на регенерацию костной ткани также оказывают тромбоцитарный фактор роста (PDGF от англ. platelet-derived growth factor), трансформирующий фактор роста бета (TGF-β от англ. transforming growth factor beta), инсулиноподобный фактор роста (IGF, от англ. insulin-like growth factor) и эпидермальный фактор роста (EGF, от англ. epidermal growth factor). Для монотерапии факторами в продаже имеются рекомбинантные продукты, в настоящее время разрешение на продажу имеют ВМР-2, ВМР-7 и PDGF или натуральные экстракты, как правило, выделенные из венозной крови.
Широко используется положительное действие ОТП при восстановлении зубной ткани и в других случаях челюстно-лицевой патологии. ОТП также применяется для лечения других патологий, таких как остеоартрит, тендинит и повреждения нерва и укрепляет свои позиции в качестве «средства от всех болезней» при многих заболеваниях опорно-двигательного аппарата. Тем не менее, точный механизм ее действия неизвестен и общее понимание ОТП сводится к тому, что как протоколы ее применения, так и результаты весьма разнообразны.
Краткое описание изобретения
Задачей настоящего изобретения является обеспечение улучшенной обработки крови, в частности, для поддержки восстановления ишемизированных костей.
Эту задачу решает предмет изобретения, раскрытый в настоящем описании.
Согласно изобретению, предложен способ получения выделенной фракции сыворотки из обогащенного тромбоцитами фибрина, содержащий стадии
а) обеспечения обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП) без добавления антикоагулянта;
б) коагуляции ОТП с целью получения коагеля ОТФ; и
в) разделения коагеля для того, чтобы выделить фракцию сыворотки, которая содержит реализат активированных тромбоцитов.
Характерно, что стадии способа а) и б) могут быть осуществлены в одностадийной процедуре, в частности, когда ОТП получают из образца крови путем фракционирования, в течение которого образуется коагель, например, при помощи интенсивной активации или самоактивации коагуляции. Более конкретно, стадии способа а), б) и в) могут быть осуществлены в одностадийной процедуре, например, в замкнутой системе.
В частности, ОТП приготовляют путем отделения фракции красных кровяных клеток из образца венозной крови, предпочтительно, когда ОТП свертывается во время ее приготовления.
Существенно, что ОТП применяют без экзогенных антикоагулянтов, которые обычно используются при получении ОТП, тем самым эффективной активации тромбоцитов и содержания реализата активированных тромбоцитов в выделенной фракции сыворотки достигают в соответствии с изобретением.
В частности, ОТП свертывается спонтанно во время ее получения путем центрифугирования образца крови, которое предпочтительно ускоряется путем контакта с отрицательно заряженными поверхностями и без добавления экзогенных активаторов коагуляции.
На предшествующем уровне техники ОТП обычно получали путем антикоагуляционной подготовки, например, из крови или ОТП, собранной с антикоагулянтами, такими как гепарин, цитрат, кислая цитратдекстроза (КЦД) и цитрат-теофиллин-аденозин-дипиридамол (ЦТАД). Как известно, такие антикоагулянты сохраняют тромбоциты, поддерживая целостность структур этих тромбоцитов. В противоположность этому, настоящее изобретение основано на активации обогащенной тромбоцитами плазмы, причем ОТП не содержит таких антикоагулянтов, вследствие чего поддерживается эффективная продукция очень ценных факторов роста и цитокинов, которые высвобождаются тромбоцитами, активированными в соответствии со способом по настоящему изобретению.
В частности, коагель разделяют путем прессования, отжимания, фильтрации и/или центрифугирования этого коагеля для того, чтобы выделить фракцию сыворотки, содержащую жидкую фракцию ОТФ.
Фракция сыворотки по настоящему изобретению, ниже также упоминаемая как сыворотка из ОТФ (СОТФ), может включать супернатант коагеля, например, получаемого центрифугированием, и/или жидкую фракцию, полученную из коагеля, например, такую СОТФ, которая в основном состоит из жидкой фракции. Например, фракцию сыворотки, состоящую в основном из жидкой фракции ОТФ, получают путем фракционирования ОТФ для того, чтобы выделить жидкую фракцию из ОТФ, например, путем отделения твердого коагеля, состоящего в основном из фибринового геля и тромбоцитов. В частности, для того, чтобы выделить жидкую фракцию ОТФ, бесклеточный или прозрачный супернатант из ОТФ может быть выделен при свертывании ОТП и образовании ОТФ, или он может быть удален перед фракционированием ОТФ. Такая жидкая фракция ОТФ, как оказалось, содержит высокую концентрацию реализата активированных тромбоцитов и содержащихся в нем факторов роста.
Существенно, что ОТП может быть получена из образца крови от одного донора, или из образов крови от нескольких доноров, смешанных вместе с получением одного образца крови. В соответствии с конкретным аспектом настоящего изобретения, ОТП получают из венозной крови, собранной от одного донора.
Кроме того, образец крови может быть получен от того же индивида, который будет получать фракцию сыворотки. Таким образом, кровь и фракция сыворотки могут быть аутологичными реципиенту. В частности, могут применяться аутологичная венозная кровь или аутологичная ОТП.
Образец крови может быть также получен от неаутологичного индивидуума, или донора, или нескольких доноров. Кроме того, образец крови может быть получен от гетерологичного индивидуума, или донора, или нескольких доноров. Таким образом, образец крови может быть получен от одного или нескольких индивидуумов. Фракция сыворотки по настоящему изобретению, являющаяся гетерологичной, может быть специально обработана с помощью обычных способов инактивации или удаления вирусов, включая обработку растворителем и детергентом, низкий рН и/или нанофильтрацию для того, чтобы инактивировать или удалить возможно присутствующие в ней вирусы, передающиеся через кровь. В качестве варианта и/или дополнительно, вирусная безопасность может быть обеспечена путем выбора подходящих доноров, которые, как было определено, не заражены патогенами, передающимися через кровь.
Как правило, объем такой пробы крови находится в диапазоне от 1 мл до 100 мл, предпочтительно от 10 мл до 40 мл, более предпочтительно от 15 до 35 мл.
В соответствии с конкретным аспектом изобретения образец крови собирают в устройство для отделения плазмы, например, пробирку для отделения плазмы или шприц для отделения плазмы, необязательно такое, в котором ОТП приготовили и позволили свернуться с получением коагеля, то есть, в активирующие образование сгустка пробирку или шприц, которые обычно снабжены соответствующими инициаторами коагуляции или ускорителями, называемыми в настоящем изобретении «активаторами коагуляции». Например, в типичных пробирках для отделения плазмы могут быть предусмотрены отрицательно заряженные поверхности контакта, в частности, стекло, которое может ускорить самопроизвольное свертывание ОТП во время отделения фракции красных кровяных клеток.
Устройство может быть использовано не только для сбора крови, но также и для получения ОТП, например, путем центрифугирования образца крови в одной или нескольких последовательных стадиях.
Кроме физико-химического разделения устройство также может быть пригодно для разделения специфических продуктов крови, например, путем фильтрования или размещения специфических выделенных фракций крови в другой камере или цилиндрической детали устройства. ОТП необязательно приготавливают и подвергают свертыванию в таком устройстве, в котором получают коагель, или с помощью такого устройства.
Наиболее предпочтительными контактными активаторами являются неорганические, физические и/или биологические контактные активаторы. В соответствии с конкретным аспектом настоящего изобретения, коагуляция ускоряется или активируется через путь контактной активации, в частности, при контакте с отрицательно заряженными поверхностями, предпочтительно стеклом, например, силикатом, боросиликатом; каломелем, кизельгуром, полимерами с полярной структурой, например, акрилатами, карбонатами, или полиакриламидами, в частности, такими, которые являются физическими контактными активаторами.
2
2
Другими возможными активаторами могут быть биологические или химические вещества, такие как коллаген, CaCl, кальция глюконат, MgCl, тромбоксан А2, АДФ, тромбин, D-глюкоза, декстран, глицерин.
Эти активаторы могут присутствовать в виде покрытия, гранул или пористой губки. Активатор может также представлять собой фермент или аминокислоту, такие как тромбин, тромбопластин или факторы свертывания, например, FIIa, FXa, FVIIa, FIXa, FXIa. FXIIa, FXIVa.
В соответствии с конкретной формой осуществления настоящего изобретения, предпочтительно, чтобы фракцию сыворотки приготавливали путем эндогенного свертывания ОТП, то есть, путем физического контакта только с подходящими поверхностями, тем самым избегая экзогенных добавок, которые возможно контаминировали бы приготовление сыворотки. Такое эндогенное свертывание обеспечивает получение эндогенно активированных тромбоцитов, позволяя сбор и выделение жидкой фракции ОТФ или фракции сыворотки по изобретению, содержащей реализат активированных тромбоцитов, полученный из таких активированных тромбоцитов без экзогенных загрязнений. Существенно, что в такой форме осуществления изобретения избегают добавления экзогенного тромбина или других факторов свертывания.
В соответствии с конкретным аспектом изобретения, фракция сыворотки является свежеприготовленной без добавления консервантов, таких как этанол, и, например, приготавливается без промежуточной стадии хранения или замораживания/оттаивания. Как правило, способ приготовления осуществляется в течение короткого периода времени для того, чтобы получить свежеприготовленную фракцию сыворотки, например, в течение периода до 10 часов; конкретно, меньше, чем 6 часов.
Такую фракцию сыворотки получают, например, как готовую к применению с целью лечения пациента без использования консервантов. Следовательно, избегают стабилизирующих агентов, таких как высокие концентрации спирта или дополнительные консерванты. Тем не менее, свежеприготовленная фракция сыворотки стабильно храниться при более низких температурах и может сохраняться при температурах холодильника или замороженной в течение более длительного периода времени, например, при температуре от 2°С до 12°С вплоть до 1-24 месяцев, или при температуре от -80°С до -25°С вплоть до 0-5 лет.
Например, фракция сыворотки по изобретению, в частности, аутологичный препарат, может быть свежеприготовленным с использованием способов сбора крови отдельных пациентов «у постели больного», с последующим концентрированием и активацией тромбоцитов путем активации коагуляции.
Согласно конкретному примеру, активация свертывания или коагуляции в настоящем изобретении, также называемая «активацией ОТП», осуществляется на стадии инкубации, в течение которой образуется коагель, например, когда ОТП оставляют стоять при комнатной температуре до 37С, предпочтительно примерно 18-25°С, в течение примерно 1-8 ч, предпочтительно в течение примерно 2-6 ч.
В соответствии с конкретным аспектом настоящего изобретения фракция сыворотки содержит реализат активированных тромбоцитов, высвободившийся из активированных тромбоцитов.
В соответствии с конкретным аспектом настоящего изобретения реализат тромбоцитов обогащен по сравнению с ОТП тромбоцитарными факторами, высвобожденными из активированных тромбоцитов. Тромбоцитарные факторы включают, в частности, ряд факторов роста, цитокинов, хемокинов, интерлейкинов и белков, родственных факторам ангиогенеза или факторам роста.
Предпочтительно, чтобы фракция сыворотки содержала специфические факторы, и, как правило, характеризовалась специфическим профилем таких факторов, среди которых факторы роста и цитокины. Например, фракция сыворотки содержит, по меньшей мере, один из белков ангиогенеза или факторов роста, выбранный из группы, состоящей из активина-А, ADAMTS-1, ангиогенина, CXCL16, DPPIV, эндоглина, эндостатина/коллагена XVII, FGF-4, GM-CSF, HB-EGF, HGF, IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IL-1. IL-8, LAP (TGF-1), лептина, МСР-1, ММР-8, ММР-9, NRG1-1, пентраксина-3, PD-ECGF, PDGF-AB/PDGF-BB, PIGF, пролактина, TIMP-4, тромбоспондина-1, uРА, например, на том же уровне (например, отличающемся менее, чем на 10%, 15%, или 20%) или на другом уровне (например, отличающемся, по меньшей мере, на 20%) по сравнению с ОТП или цельной кровью, например, измеренных при помощи анализа протеомного профиля, энзим связанного иммуносорбентного метода исследования (ELISA) или аналогичных анализов. В частности, присутствуют, по меньшей мере, 2 из этих факторов или, по меньшей мере, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, или даже больше, по меньшей мере, 15, 20, 25 или вплоть до того, что присутствуют все эти факторы.
В частности, фракция сыворотки по изобретению обогащена одним или более этих факторов. Обогащение конкретными факторами, как правило, определяется, если их концентрация увеличивается, по меньшей мере, на 20%, 30%, 40% или 50% или даже, по меньшей мере, на 100%, или, по меньшей мере, в 2 раза, по меньшей мере, в 3 раза, или по меньшей мере, в 4 раза по сравнению с ОТП или цельной кровью.
В частности, фракция сыворотки обогащена по сравнению с ОТП или цельной кровью, по меньшей мере, одним из белков, родственных факторам ангиогенеза или факторам роста, выбранным из группы, состоящей из тромбоцитарного фактора 4, серпина Е1 или TIMP-1, что измеряли, например, при помощи анализа протеомного профиля, (ELISA) или аналогичных анализов. В частности, фракция сыворотки обогащена одним, двумя или всеми тремя этими выбранными факторами.
В соответствии с другой конкретной формой осуществления изобретения фракция сыворотки, в частности, характеризуется повышенной концентрацией тромбоцитарного фактора 4 по сравнению с ОТП или цельной кровью, например, обогащена, по меньшей мере, в 2 раза, предпочтительно по меньшей мере, в 3 раза, по меньшей мере, в 4 раза или в 5 раз, что измеряли при помощи анализа протеомного профиля, ELISA или аналогичных анализов.
В конкретном случае, фракция сыворотки по изобретению обеднена одним или несколькими из этих факторов, т.е. содержание или концентрация их снижены. В частности, фракция сыворотки обеднена по сравнению с ОТП или цельной кровью, по меньшей мере, одним из белков, родственным факторам ангиогенеза или факторам роста, выбранным из группы, состоящей из SDF-1, ангиопоэтина-1, EGF, PDGF, VEGF что измерено, например, при помощи анализа протеомного профиля, ELISA или аналогичных анализов.
В соответствии с конкретной формой осуществления настоящего изобретения фракция сыворотки характеризуется снижением концентрации стромально клеточного фактора 1 (SDF-1, от англ. stromal cell-derived factor-1 или CXCL12, от англ. chemokine (С-Х-С motif) ligand 12) по сравнению с ОТП или цельной кровью. В частности, измеренная концентрация SDF-1 составляет менее 350 пг/мл, предпочтительно менее чем 275 пг/мл, что измерено с помощью ELISA.
В соответствии с другой конкретной формой осуществления настоящего изобретения фракция сыворотки характеризуется снижением концентрации ангиопоэтина 1 по сравнению с ОТП или цельной кровью.
В соответствии с еще одной конкретной формой осуществления настоящего изобретения фракция сыворотки характеризуется снижением концентрации эпидермального фактора роста (EGF) по сравнению с ОТП или цельной кровью.
В соответствии с еще одной конкретной формой осуществления настоящего изобретения фракция сыворотки характеризуется снижением концентрации тромбоцитарного фактора роста (PDGF) по сравнению с ОТП или цельной кровью.
В соответствии с еще одной конкретной формой осуществления настоящего изобретения фракция сыворотки характеризуется снижением концентрации фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) по сравнению с ОТП или цельной кровью.
В частности, фракция сыворотки характеризуется истощением или снижением содержания двух, трех, четырех или всех пяти истощенных факторов, где один из них, например, по меньшей мере SDF-1 или цельная кровь.
Истощение, то есть, снижение или уменьшение содержания специфических факторов, как правило, определяется, если это содержание или концентрация составляет менее 50 масс. %, или менее, чем 40 масс. %, или менее, чем 30 масс. %, или менее, чем 20 масс. %, или менее 10 масс. %, или менее, чем 5% от концентрации или содержания по сравнению с ОТП или цельной кровью, что измерено, например, при помощи анализа протеомного профиля, ELISA или аналогичных анализов.
В частности, фракция сыворотки обеднена красными кровяными клетками или не содержит их, например, в ней по существу отсутствует более, чем 75% красных кровяных клеток, предпочтительно более чем 95% их удалены по сравнению с цельной кровью.
9
9
В соответствии с конкретной формой осуществления настоящего изобретения фракция сыворотки характеризуется снижением содержания тромбоцитов по сравнению с цельной кровью, например, в 10 раз, предпочтительно в 20 раз. После отделения коагеля, фракция сыворотки, как правило, содержит менее, чем 50×10 на литр тромбоцитов, предпочтительно менее, чем 10×10 на литр.
В соответствии с конкретной формой осуществления настоящего изобретения фракция сыворотки дополнительно характеризуется снижением содержания фибриногена (например, определяемым содержанием фибриногена плюс содержание фибрина), по сравнению с цельной кровью, например, меньше, чем 20 масс. %, или менее 10 масс. %, или менее чем 5 масс. %. После отделения коагеля, фракция сыворотки обычно содержит менее чем 1,5 г/л фибриногена + фибрина, предпочтительно менее 0,5 г/л. Как правило, фракция сыворотки представляет собой прозрачный или непрозрачный раствор без массы твердых веществ, например, без фибринового сгустка, видимого невооруженным глазом.
В соответствии с конкретным аспектом настоящего изобретения, фракция сыворотки является свежеприготовленной и готовой к применению, при этом необязательно, чтобы фракция сыворотки поставлялась в устройстве для нанесения, в частности, в шприце. Конкретные формы осуществления изобретения относятся к аутологичной фракции сыворотки, то есть, к фракции сыворотки, полученной из крови или ОТП одного единственного донора, которая является готовой для применения с целью введения этому же индивидууму. Фракция сыворотки может быть в целях удобства приготовлена в соответствующем устройстве для препарата, пригодном для асептического сбора крови, приготовления ОТП, свертывания ОТП (например, путем активной стимуляции коагуляции или путем самоактивации), отделения коагеля и, необязательно, дальнейшего отделения твердого ОТФ для того, чтобы выделить фракцию сыворотки с добавлением или без добавления жидкой фракции ОТФ или для того, чтобы выделить фракцию сыворотки из ОТФ коагеля. В частности, устройство для препарата является пригодным для асептического сбора крови, и приготовления ОТП путем самоактивации во время образования коагеля, и дальнейшего разделения ОТФ коагеля и получения супернатанта коагеля вместе с жидкой фракцией ОТФ.
Выделенная фракция сыворотки может быть асептически получена в устройстве и может быть непосредственно и немедленно введена больному удобным путем, например, при помощи аппликатора, асептически соединенного с устройством для препарата, либо при помощи отдельного устройства для нанесения или набора, который позволяет асептический перенос приготовленной фракции сыворотки в устройство для нанесения и/или введение препарата больному.
В соответствии с изобретением, фракция сыворотки специально предназначена для применения в производстве лекарственного препарата или лечебного средства. Такой продукт может быть в форме фармацевтического препарата или препарата для медицинского устройства.
В конкретном случае, фракция сыворотки предназначена для лечения донора этой фракции сыворотки. Более конкретно, аутологичное применение фракции сыворотки является предпочтительным.
Существенно, что изобретение относится к медицинскому применению, например, для медицинского применения с целью пластики, реконструкции и регенерации, например, для использования в ортопедическом, хирургическом и/или косметологическом лечении.
В частности, фракция сыворотки применяется для лечения пациента, страдающего остеонекрозом, например головки бедренной кости, болезнью Келера I и II, болезнью Пертеса, болезнью Осгуда-Шлаттера или болезнью Шейерманна, остеоартритом, остеоартрозом, некрозом кости, тендинозом, например синдромом «теннисного локтя», подошвенным фасциитом или синдромом «колена прыгуна», критической ишемией конечностей, болезнью Бюргера, синдромом соударения, например, плеча или бедра, или применяется у пациента, подвергающегося лечению с целью дермонаполнения, омоложения носогубной гребня или каких-либо других мимических морщин, костной трансплантации или имплантации.
Фракция сыворотки по настоящему изобретению должна специфически индуцировать пролиферацию после ишемии в эксплантатах человеческого остеонекротического материала. В частности, когда фракцию сыворотки смешивают с костными трансплантатами in vitro или in situ, может быть определена регенерация костного материала.
В конкретном случае, настоящее изобретение относится к использованию аутологичной фракции сыворотки, например, к сбору пробы крови у пациента, страдающего или перенесшего состояние нарушения или заболевание, и введению этого препарата этому же пациенту.
В общих чертах, изобретение специально обеспечивает фракцию сыворотки по изобретению для медицинского применения. В соответствии с этим, изобретение, кроме того, относится к способу лечения пациента, нуждающегося в этом, эффективным количеством фракции сыворотки. Такое эффективное количество, как правило, представляет собой количество, достаточное для лечения, восстановления или аугментации клеток или ткани, например, для местного или накожного лечения в участке-мишени, нуждающемся в пролиферации клеток или регенерации, таком как кожа, рана, травма, разрез или место хирургического вмешательства.
В частности, фракция сыворотки предназначена для использования в лечении пациента, страдающего ишемией кости или перенесшего ишемию кости или родственные ей заболевания костей, в том числе некроз кости, остеоартроз или остеоартрит или другие дегенеративные заболевания костей. В частности, фракция сыворотки предназначена для использования в облегчении или ускорения пролиферации клеток костной ткани и, тем самым, регенерации костной ткани после ишемии кости, или для использования в лечении ишемии кости или любого родственного ей заболевания или заболевания, которое является следствием ишемии кости или заболевания, опосредованного ишемией кости.
Таким образом, изобретение также относится к способу лечения пациента, перенесшего или больного остеоартритом, остеоартрозом, некрозом кости, ишемией кости или какой-либо болезнью, определенной в настоящем изобретении, включающему стадии введения пациенту фракции сыворотки по изобретению.
В частности, изобретение относится к способу для облегчения или стимуляции пролиферации клеток костной ткани и, тем самым, регенерации костной ткани, включающему стадии введения фракции сыворотки по настоящему изобретению в находящуюся в условиях ишемии кости или подвергавшуюся ишемии кости костную ткань пациента, необязательно страдающего остеоартритом, остеоартрозом, некрозом кости или ишемией кости, или перенесшего эти болезни.
В соответствии с изобретением, дополнительно обеспечивается способ стимуляции пролиферации клеток in vitro путем контакта фракции сыворотки по изобретению с этими клетками и инкубации этих клеток в течение периода времени достаточного для того, чтобы способствовать росту клеток или регенерации, в частности, если эти клетки представляют собой эпителиальные клетки, стволовые клетки или клетки кости, например, остеоциты, остеокласты, остеобласты, или клетки, полученные из костного мозга, такие как мезенхимальные стволовые клетки и полученные из них клетки-предшественники. Такая обработка in vitro особенно пригодна для получения аутотогенного костного материала или аллотрансплантатов.
В частности, фракция сыворотки предназначается для использования in vitro в качестве добавки к клеточной культуре или для обработки костей или имплантатов, например, металлических имплантатов, в частности путем обработки поверхности или нанесения покрытия. Например, фракцию сыворотки применяют в подготовке костных трансплантатов для восстановления с их помощью зубной кости.
Конкретные методы обработки в соответствии с изобретением - либо in vitro, либо in vivo - относятся к восстановлению способности пост-ишемизированной кости к пролиферации, эффективной стимуляции васкуляризации и/или ангиогенеза в регенерирующей ткани или способствуют миграции и/или инфильтрации таких эндогенных ранозаживляющих компонентов, которые содержаться в периостеогенных клетках, клетках кровеносных сосудов, стромальных клетках, мезенхимальных клетках, остеопрогениторных клетках, остеобластах, остеокластах или тромбоцитах. Конкретные методы обработки относятся к кости, надкостнице, сухожилиям, мышцам, фасциям, нервной ткани, сосудистой ткани и их комбинациям.
В соответствии с изобретением дополнительно предусмотрен фармацевтический препарат, содержащий фракцию сыворотки и приемлемый с фармацевтической точки зрения носитель.
Существенно, что фармацевтический препарат дополнительно содержит активное вещество и/или устройство для стимулирования заживления ран, клеточной пролиферации или регенерации.
Более конкретно, дополнительное активное вещество представляет собой гидрогель, тканевый герметик или их активный компонент, например, гелеобразующий агент, который образует гидрогель при контакте с фракцией сыворотки по изобретению, компонент тканевого герметика, содержащий фибриноген и/или коллаген, и/или компонент тканевого герметика, содержащий тромбин или протромбин в комбинации с активатором протромбина для образования тромбина. Более конкретно, устройство представляет собой твердый, или полутвердый, или гелеобразный биоматериал, пригодный для использования в организме человека (рассасывающийся или нерассасывающийся), например, материал костного трансплантата, в частности, включающий аутогенный костный материал, аллотрансплантаты, такие как деминерализованный лиофилизированный костный материал, или аллопластические материалы, такие как гидроксиапатит и трикальцийфосфат синтетического или природного происхождения.
Фармацевтический препарат поставляется по существу, как готовый к применению, например, содержится в устройстве для нанесения, в частности, в шприце.
В соответствии с изобретением, дополнительно предусмотрен набор для применения, включающий такие компоненты:
а. фракцию сыворотки по настоящему изобретению; и
б. устройство для ее нанесения, например, шприц.
Более конкретно, набор может включать дополнительные компоненты или их комбинации, например, в качестве дополнительного компонента
г. материал костного трансплантата, гелеобразующий агент, тканевый герметик или их активный компонент; и
д. необязательно, устройство для смешивания компонентов а) и в) с получением смеси готовой к применению.
Краткое описание графических материалов
Фигура 1. Протокол моделируемой ишемии и реперфузии в эксплантатах кости человека. Кусочки костной ткани выделяли в 0-й день процедуры полного замещения тазобедренного сустава и поддерживали в культуре в течение 3 дней. На 3-й день клетки подвергали повреждению путем кислородо-глюкозной депривации (КГД) в течение 7 часов, с последующей заменой нормальной среды культивирования для стволовых клеток и возвращением уровня кислорода в нормальное состояние. Фракции сыворотки добавляли к эксплантированным культурам непосредственно перед КГД и заменяли при необходимости во время смены сред вплоть до конца эксперимента. Жизнеспособность клеток измеряли или на 6-й, или 9-й дни путем переноса тканей в новую лунку и, таким образом, проводя измерения только в клетках на костном матриксе.
Фигура 2. Влияние обработки ОТП на эксплантаты кости после КГД. Диаграммы А и В показывают, что ни ОТП, ни гепаринизированная ОТП не оказывает никакого влияния на жизнеспособность клеток после 3-го или 6-го дней реперфузии (n=24 на группу). Диаграмма С показывает, что увеличение концентрации ОТП до технически осуществимого максимального уровня, не повреждающее нативный препарат, все еще не оказывает никакого воздействия на пролиферацию. ОТП, активированная различными способами, такими как добавление кальция, «кальций + тромбин», или проведение обработки путем 3 циклов замораживания и оттаивания, также не оказывает воздействия (диаграмма D). Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (СОС).
Фигура 3. Воздействие СОТФ на эксплантаты кости после КГД. Диаграмма А показывает, что непосредственно после 7 часов КГД не отмечается никакого воздействия (n=18-24 на группу), но после 6 дней клетки начали размножаться значительно лучше. Диаграмма В показывает воздействие от предварительной обработки СОТФ, при которой фракция сыворотки присутствовала в среде с 0-го дня (n=24 на группу). Данные представлены как среднее значение ± СОС ** представляет р<0,01, *** представляет р<0,001.
Фигура 4. Компоненты фракций сыворотки, измеренные при помощи анализа протеомного профиля. Уровни белка измеряли по интенсивности пятен в произвольных единицах, сравнивая СОТФ и ОТП. Данные разделены между диаграммами А и В для удобочитаемости. Данные представлены как среднее значение ± СОС, n=3 объекта, для каждого пятна сделаны повторные измерения.
Подробное описание изобретения
Термин «свертывание», используемый в настоящем изобретении по отношению к свертыванию крови следует понимать следующим образом. Активация тромбоцитов и последующая дегрануляция и агрегация играют ключевую роль в процессе свертывания крови. Коагуляция может быть активирована посредством внутреннего или «контактного пути активации», который начинается с того, что фактор свертывания крови XII вступает в контакт с отрицательно заряженными поверхностями в процессе реакции, включающей кининоген с высокой молекулярной массой и плазматический калликреин. FXII может быть активирован так называемыми «контактными активаторами», например, биологическими макромолекулярными компонентами субэндотелиального матрикса, такими как гликозаминогликаны и коллагены, сульфатиды, нуклеотиды и другие растворимые полианионы или нефизиологические материалы, такие как стекло, полимеры или, например, искусственные отрицательно заряженные поверхности, такие как стеклянные гранулы. Кроме того, каскад свертывания поддерживает процесс свертывания крови. Каскад свертывания включает в себя ряд, т.е. каскад реакций, в котором происходит активация зимогена, например, ферментами, поддерживаемыми кофакторами, при этом зимоген становится активным ферментом, а затем катализирует следующую реакцию реакционного каскада, что в конечном счете, приводит к образованию фибринового сгустка, который повышает прочность агрегата тромбоцитов. Зимогены также известны как факторы коагуляции или факторы свертывания крови.
В результате активации свертывания образуется сгусток крови, который в настоящем изобретении называют «коагель». Под коагелем в данном случае понимают свернувшуюся фазу крови, то есть мягкую, слипающуюся, желеобразную массу, образовавшуюся при преобразовании фибриногена в фибрин, состоящую преимущественно из фибриновых волокон, связанную с образованием фибринового геля или сгустка. Коагель, как описано в настоящем изобретении, главным образом, улавливает тромбоциты и другие компоненты коагулировавшей плазмы.
Коагель, выделившийся из ОТП, в данном случае понимают, как обогащенный тромбоцитами фибрин (ОТФ), который по существу может включать агрегированный фибрин и клетки крови, такие как тромбоциты, лейкоциты и/или эритроциты.
Коагель ОТФ, в понимании, используемом в настоящем изобретении, состоит из двух фракций, жидкой фракции и твердой фракции, которые могут быть физически разделены для того, чтобы выделить жидкую фазу и отбросить твердую массу.
Коагуляцию специфически активируют в подходящем контейнере, например, таком как контейнер для отделения плазмы или контейнер для активации свертывания, в частности, пробирка. Контейнер обычно представляет собой стеклянный или пластиковый контейнер, снабженный или не снабженный дополнительными средствами для того, чтобы инициировать или ускорить свертывание, например, пробирки для сбора крови, обычно использующиеся в медицинской практике.
В частности, контейнер для отделения плазмы не содержит антикоагулянтов и применяется без добавления антикоагулянтов, так, чтобы поддержать свертываемость in situ. В соответствии с конкретной формой осуществления настоящего изобретения контейнер для отделения плазмы соответствующим оснащен контактными активирующими поверхностями для того, чтобы активировать внутренний путь активации свертывания крови.
Термин «обогащенная тромбоцитами плазма» или ОТП понимается в настоящем изобретении как объем плазмы, который имеет концентрацию тромбоцитов выше базового уровня. Нормальное содержание тромбоцитов в крови находится диапазоне между 150000 на мкл и 350000 на мкл. Концентрацию тромбоцитов специально увеличивают путем центрифугирования и/или другого способа фракционирования или разделения фракции красных кровяных клеток, например, путем центрифугирования цельной крови сначала при мягком режиме вращения, таком как 8 мин при 460 g, а лейкоцитарную пленку используют или дополнительно подвергают осаждению при жестком режиме вращения на более высоких значениях g. ОТП обычно содержит повышенную концентрацию тромбоцитов, которая является увеличенной примерно в 1,5-20 раз по сравнению с концентрацией тромбоцитов в венозной крови.
Такое центрифугирование и/или фракционирование будет отделять эритроциты от крови, а затем отделит фракцию, обогащенную тромбоцитами (ОТП), включающую тромбоциты с белыми кровяными клетками или не содержащую их, вместе с некоторым количеством эритроцитов от плазмы, обедненной тромбоцитами. ОТП может быть дополнительно сконцентрирована путем ультрафильтрации, при которой содержание белка в обогащенной тромбоцитами плазме увеличивается от примерно 5% до примерно 20%.
ОТП может быть активирована с помощью способа, описанного в настоящем изобретении, в частности, путем свертывания, которое специфически активирует содержащиеся в ОТП тромбоциты в отсутствие экзогенных антикоагулянтных добавок. Настоящее изобретение предусматривает главным образом активацию ОТП, например, так, чтобы большинство тромбоцитов являлось активированным. Следовательно, по меньшей мере, 50% тромбоцитов в ОТП активируются при помощи активации свертывания.
Термин «введение», в значении, использующемся в настоящем изобретении, включает способы введения или нанесения активированного препарата, такого как фракция сыворотки по изобретению, нуждающемуся в этом больному с целью выполнения предназначенной ему функции.
Предпочтительными способами введения являются местные, включая нанесение на кожу или слизистую оболочку или нанесения на участок раны или место (хирургического) вмешательства, такие как использование жидкости, спрея, гидрогеля, крема или мази, либо любой другой удобный способ, включая системное введение, например, инъекции, такие как подкожные или внутрисуставные инъекции, инъекции в слои кожи, под кожу в эпидермис, в жировые подушки мышц различных мягких тканей, в губчатое вещество кости и костный мозг, нанесение спрея на поверхности тканей, смешивание с жидкостями организма, и т.д.
Могут быть применены различные известные системы доставки, в том числе шприцы, иглы, трубки, мешки и т.д. Специфические системы доставки используют пластыри для местного нанесения, или имплантаты. В частности, предпочтительными являются препараты с медленным высвобождением, например, в виде гидрогеля, полутвердого или твердого геля, или составы и системы доставки для обеспечения длительного действия лечения.
Фракция сыворотки может быть введена отдельно, либо в комбинации или соединении с любым другим препаратом или любым другим терапевтическим лечением, применяемым в назначении, например, используемым для лечения пациентов, страдающих остеоартритом, остеоартрозом, некрозом кости или ишемией кости. Фракцию сыворотки можно вводить до введения другого препарата, одновременно с этим препаратом, или после введения этого препарата.
Другая возможная система доставки обеспечивает фракцию сыворотки, ассоциированную или связанную с материалом-носителем, например, гелем или имплантатом.
Термин «выделенный», в значении, использующемся в настоящем изобретении, в применении к фракции сыворотки относятся к такой фракции крови, плазмы или сыворотки, которая была в достаточной степени отделена от других фракций крови или компонентов, с которыми она была бы связана в естественном состоянии. В частности, фракцию сыворотки по изобретению выделяют таким образом, чтобы отделить ее от коагеля ОТФ и/или от твердой фракции коагеля ОТФ. «Выделенный» не обязательно означает исключение искусственных или синтетических смесей с другими фракциями, соединениями или материалами, или наличие примесей, которые не мешают основной функции. В частности, активные вещества и хирургические материалы могут быть комбинированы с выделенной фракцией сыворотки по изобретению.
Термин «приемлемый с фармацевтической точки зрения носитель», в значении, использующемся в настоящем изобретении, должен относиться по существу к любым и всем подходящим растворителям, дисперсионным средам, покрытиям, антибактериальным и противогрибковым веществам, изотоническим и задерживающим всасывание веществам и т.п., которые являются физиологически совместимыми с фракцией сыворотки, обеспечиваемой изобретением. Дополнительные примеры приемлемых с фармацевтической точки зрения носителей включают стерильную воду, физиологический раствор, забуференный фосфатом физиологический раствор, декстрозу, глицерин, этанол и т.п., а также комбинации любых из перечисленных носителей. В одном таком аспекте изобретения, фракция сыворотки может быть комбинирована с одним или более носителями, соответствующими требуемому пути введения. Такие носители и способы введения хорошо известны в фармацевтической области. Носитель может включать в себя гель или гидрогель, или гелеобразный агент или гелеобразующий агент, материал с контролируемым высвобождением или материал с замедленным высвобождением или другие материалы, хорошо известные в данной области.
Дополнительные приемлемые с фармацевтической точки зрения носители хорошо известны в данной области техники и описаны, например, в руководстве REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES. Жидкие препараты могут представлять собой растворы, эмульсии или суспензии и могут содержать наполнители, такие как суспендирующие агенты, солюбилизаторы, поверхностно-активные вещества, консерванты, гелеобразующие и хелатирующие агенты. Могут быть предусмотрены примерные составы, например, такие как гидрогель, включающий более 50% воды по массе.
В одной форме осуществления настоящего изобретения фракция сыворотки по настоящему изобретению является единственным терапевтически активным агентом, вводимым больному, например, как препарат, модифицирующий течение болезни или с целью предотвращения монотерапии.
В другой форме осуществления настоящего изобретения фракция сыворотки по настоящему изобретению комбинирована с дополнительными активными агентами или материалами, например, скомбинирована в смесь или в набор компонентов.
Фракция сыворотки по настоящему изобретению может быть введена в комбинации с одним или несколькими другими терапевтическими или профилактическими активными агентами или схемами лечения, включая стандартную терапию, но не ограничиваясь ею, например, антибиотики, стероидные и нестероидные ингибиторы воспаления, противовоспалительные агенты, витамины, или минералы.
Термины «больной» или «индивидуум», в значении, использующемся в настоящем изобретении, относятся к теплокровным млекопитающим, в частности, к человеку. В частности, медицинское применение по изобретению или соответствующий способ лечения относится к больному, нуждающемуся в профилактике или лечении состояния нарушения или заболевания, например, связанного с повреждением ткани, раной, травмой, ожогом, разрезом или случаем ишемии, таким как остеоартрит, остеоартроз, некроз кости или ишемия кости, или к больному, страдающему таким болезненным состоянием. Термин «пациент» включает человека и других млекопитающих, которые получают либо профилактическое, либо терапевтическое лечение. Термин «лечение», таким образом, подразумевает включение как профилактического, так и терапевтического лечения, в частности, для того, чтобы лечить, восстанавливать или проводить аугментацию ткани на целевом участке.
Биологические свойства фракции сыворотки или соответствующих фармацевтических препаратов по настоящему изобретению могут быть охарактеризованы ex vivo в экспериментах на клетке, ткани и целом организме. Как известно в данной области, препараты часто испытывали in vivo на животных, включая, без ограничений, мышей, крыс, кроликов, собак, кошек, свиней и обезьян, для того, чтобы определить эффективность лекарственного средства для лечения болезни или модели болезни, или для того, чтобы определить фармакокинетику, фармакодинамику, токсичность и другие свойства препарата.
Животные могут упоминаться как модели заболеваний. Фракция сыворотки и соответствующие фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть дополнительно проверены на людях для того, чтобы определить их терапевтическую или профилактическую эффективность, токсичность, иммуногенность, фармакокинетику и/или другие клинические свойства.
Предусмотрены другие ex vivo или in vivo способы обработки клеток, которые включают культуру клеток и стадию инкубации, например, в растворе или на твердой подложке, в частности, в материале имплантата или костного трансплантата. Такую культуру клеток или обработку по существу выполняют следующим образом: клетки культивируют в обычных условиях культивирования клеток и добавляют к среде фракцию сыворотки по настоящему изобретению. Добавление фракции сыворотки специфически индуцирует пролиферацию клеток, предотвращает гибель клеток или повреждение их и может индуцировать дифференцировку в специфические типы клеток. Пролиферация клеток обычно измеряется путем подсчета клеток или способами с применением косвенных показателей.
Неожиданно было обнаружено, что некоторые препараты крови, ускоряют и улучшают клеточную пролиферацию, восстановление и заживление тканей, в частности, в остеоартритном материале или в костной ткани после ишемического повреждения кости.
3
Клетки крови при активации посредством повреждения выделяют множество факторов пролиферации в сыворотку крови. Это увеличивает возможность использования продуктов сыворотки для терапевтических мишеней, отличных от острого повреждения, и, следовательно, применения более физиологических смесей факторов роста, чем монотерапия рекомбинантными белками. Были проведены исследования ОТП и родственных фракций сыворотки в ex vivo модели ишемии кости. Маленькие фрагменты кости размером 10 мм были выделены из головок бедренных костей, удаленных во время операций замещения тазобедренного сустава. Эксплантаты выращивали в культуре в течение 3 дней, затем подвергали временной кислородо-глюкозной депривации (КГД) для имитации ишемии. Большинство клеток в костных эксплантатах погибали, а выжившие клетки не пролиферировали. Добавление ОТП, которая является либо нативной, либо антикоагулированной (гепаринизированной) или активированной химическими или физическими средствами, не оказывало никакого действия на пост-ишемические клетки. Тем не менее, фракция сыворотки по изобретению, в частности, содержащая жидкую фракцию коагеля ОТФ, в частности, сыворотку, полученную прессованием обогащенного тромбоцитами фибрина (СОТФ), индуцировала клеточную пролиферацию пост-ишемических остеобластов. Анализ протеомного профиля показал, что ОТП и СОТФ имеют отличные профили факторов роста, в которых тромбоцитарный фактор 4, являющийся ключевым, имеет более высокую концентрацию в СОТФ по сравнению с ОТП. Еще одним существенным отличием является отсутствие фибрина или фибриногена в СОТФ, поскольку свертывание ее спонтанно, а ОТП активирована сразу же после забора крови. Сделан вывод, что фракция сыворотки по изобретению, в частности, СОТФ, является производным крови, которое может восстановить потенциал пролиферации клеток, например, в пост-ишемической кости и, следовательно, может быть новым терапевтическим средством со специфическим использованием для лечения дегенеративных заболеваний костей.
Фракция сыворотки по настоящему изобретению специально предусмотрена для лечения остеоартрита, остеоартроза, некроза кости или ишемии кости, для применения с имплантатами или аутологичными трансплантатами костей с целью предотвращения или лечения ишемии после имплантации, или для увеличения пролиферации клеток после ишемического эпизода.
Ишемия кости или аваскулярный некроз (АВН), например, головки бедренной кости все еще представляет собой проблему для хирургов-ортопедов, главным образом, ввиду прогрессирующего характера заболевания и относительно молодого возраста пациентов. Имеющимися в настоящее время специфическими и эффективными процедурами являются:
- декомпрессия головки бедренной кости
- аутологичный костный материал
- деминерализованный костный матрикс
- BMP (костные морфогенетические белки)
- остеотомия
- применение перспективных агентов человеческой крови, например, ОТП
- любые комбинации вышеизложенного.
Была разработана человеческая модель in vitro и исследовано действие полученных препаратов плазмы крови на патомеханизм ишемии кости.
Были проведены эксперименты с различными фракциями плазмы, в которых неожиданно было обнаружено, что могут быть получены препараты, эффективные для ускорения и облегчения регенерации кости после ишемии кости.
Результаты ex vivo показали, что препарат сыворотки, полученный по настоящему изобретению, непосредственно индуцирует пролиферацию костных клеток даже после тяжелой ишемии. Пролиферация клеток, как было установлено, значительно улучшается с помощью любой жидкой фракции ОТФ, которая содержит жидкое содержимое ОТФ или состоит из него, но не с помощью ОТП согласно предшествующему уровню техники.
Экспериментальные результаты оказались неожиданными в свете предшествующего уровня техники. В частности, было удивительно, что исходный материал, который представлял собой ОТП без добавления антикоагулянтов, и свертывание в соответствии с изобретением влияет на конечный результат. В частности, свежеприготовленная фракция сыворотки может предоставляться в качестве улучшенного материала для медицинского применения.
Активированный фибрин имеет сильное провоспалительное действие, которое полезно в случае острых травм, но может быть вредным при хронических случаях, когда персистирующее воспаление угнетает регенерацию тканей. Таким образом, необходимо соответствие между правильной формой смеси факторов пролиферации и определенной патологией для того, чтобы разработать надежный клинический протокол. В настоящем исследовании была использована новая ex vivo модель человеческой ишемии кости, которая очень похожа на состояние ткани пересаженной кости или ткани, поврежденной в терминальной стадии дегенеративных заболеваний. С целью подтверждения положительного действия фракции сыворотки по изобретению анализировали компоненты различных обогащенных тромбоцитами фракций сыворотки и исследовали их действие, как действие факторов пролиферации на пост-ишемические человеческие эксплантаты костей.
Не будучи связанными какой-либо теорией, авторы предполагают возможный механизм, лежащий в основе клинических наблюдений, который состоит в том, что дополненные ОТП костные трансплантаты имеют существенно лучшие результаты в течение 6 лет, чем декомпрессионная терапия некроза головки бедренной кости.
Конкретные стадии способа по настоящему изобретению являются следующими:
1. Получение венозной крови. Не требуется никаких добавок, например, антикоагулянтов.
2. Удаление красных кровяных клеток.
3. Получение обогащенного тромбоцитами фибрина (сгусток желтоватого цвета, всплывающий на поверхность фракции красных кровяных клеток).
4. Разделение ОТФ на жидкую фракцию и матрикс (твердую фракцию). Это может быть сделано путем прессования (отжатия) ОТФ или центрифугирования при соответствующей повышенной скорости.
В предпочтительной форме осуществления настоящего изобретения вращение осуществляется в течение 20 минут, предпочтительно в течение 15, 10, 5 минут, или в течение более короткого периода от момента получения венозной крови.
Центрифугирование предпочтительно проводят на скорости от 1000 до 5000 g, предпочтительно от 2000 до 4000 g, более предпочтительно на скорости примерно 3000 g. Центрифугирование предпочтительно проводят в течение от 2 до 20 минут, предпочтительно в течение от 4 до 15 минут, наиболее предпочтительно примерно в течение 10 минут (+/- 2 минуты).
Полученный сгусток (т.е. коагель) может быть удален с помощью любого подходящего способа, например, путем фильтрации или других физических средств. В предпочтительной форме осуществления настоящего изобретения применяют непрерывное центрифугирование и сгусток удаляют после открытия центрифуги со стенок сосудов для центрифугирования.
Жидкая фракция может быть удалена из сгустка путем отжимания, прессования, фильтрации вакуумной фильтрации или любым другим подходящим способом.
Изобретение является особенно пригодным для того, чтобы помочь, облегчить или дать возможность регенерации костной ткани больного. Костная ткань может иметь острое повреждение, например, в случае травмы или хирургического вмешательства, или может быть нарушена хронически, например, в случае дегенеративных заболеваний костей, таких как остеоартроз, некроз кости, или ишемия кости. В качестве примера, ишемия может отмечаться при трансплантации костной ткани или органов, содержащих кости, таких как костно-хрящевые цилиндры. Конкретными способами, которые могут быть улучшены с помощью фракции сыворотки по настоящему изобретению, являются, например, способы, применяющие препараты плазмы в хирургии, такие, как описано в следующих ниже публикациях.
Jun Araki et al: Optimized Preparation Method of Platelet-Concentrated Plasma and Noncoagulating Platelet- Derived Factor Concentrates: Maximization of Platelet Concentration and Removal of Fibrinogen (Tissue Eng Part С Methods. 2012 Mar; 18(3): 176-85).
Dohan D.M.E et al.: Platelet-rich fibrin (PRF): A second-generation platelet concentrate. Part 1: Technological concepts and evolution. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral RadioiEndod 2006; 101: E37-44.
Приведенное выше описание будет более понятно при ссылке на следующие ниже примеры. Такие примеры являются, однако, всего лишь примерами способов одной или нескольких форм осуществления настоящего изобретения на практике и не должны расцениваться, как ограничивающие объем настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1: Обогащенная тромбоцитами плазма как адъювантная терапия при асептическом некрозе головки бедренной кости
В ретроспективном клиническом исследовании по данным наблюдений сравнивали два вида хирургического лечения асептического некроза головки бедренной кости. Пациентов контрольной группы (n=13) лечили только путем декомпрессии головки бедренной кости, в группе с ОТП (n=19) декомпрессию головки бедренной кости дополняли внесением аутологичной костной стружки, смешанной с аутологичной ОТП. В клиническом исследовании по данным наблюдений на протяжении шести лет после операции в группе с ОТП была значительно ниже частота неудач (21% по сравнению с 67%, р<0,05), определяемая по случаям имплантации протеза.
Тем не менее, точная роль и клеточные механизмы способа неизвестны и необходимы дополнительные данные для того, чтобы доказать его действие.
Пример 2: Получение композиции СОТФ, которая является примером фракции сыворотки по настоящему изобретению
Получали препарат, который был свободен от тромбоцитов, однако, богат тромбоцитарными факторами.
Описание применяющейся процедуры заключается в следующем:
1. Производили забор венозной крови в стандартную, обычную пробирку без каких-либо добавок.
2. Центрифугировали ее немедленно, предпочтительно в течение 3 минут, в центрифуге при 1600-1700 g, в течение 5-10 минут.
3. Красные кровяные клетки собирались в нижней части пробирок, а на поверхности фракции красных кровяных клеток в чистой плазме плавал желтоватого цвета коагулят. Этот сгусток (коагулят или коагель) удаляли пинцетом и помещали на чистую чашку Петри.
4. Сгусток осторожно отжимали для того, чтобы получить из него жидкость: Жидкость, полученная из сгустка, по существу, представляет собой окончательную композицию СОТФ. По оценкам, 0,4 мл конечного продукта можно получить из 6 мл крови.
В порядке ускорения механизм свертывания для забора крови может применяться пробирка, покрытая диоксидом кремния или также стеклянная пробирка.
Пример 3: Костные эксплантаты и кислородо-глюкозная депривация (КГД) В этом исследовании in vitro костные образцы получали из головки бедренной кости, удаленной во время операций полного замещения тазобедренного сустава при первичном остеоартрите. Головки бедренных костей получали от пациентов, больных коксартрозом и подвергнутых хирургическому замещению тазобедренного сустава, в ходе которой головку бедренной кости полностью удаляют и отбрасывают как хирургические отходы.
- Эксплантаты со средней массой 0,004 г (n=40 штук на 1 пациента) были собраны из головок бедренной кости.
- Эксплантаты переносили в условия клеточной культуры при 37°С в среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко, содержащей 1 г/л глюкозы, 5% пенициллин-3D-стрептомицина и 10% фетальной бычьей сыворотки (среда для стволовых клеток).
2
2
После инкубации головок бедренных костей в течение 3 дней применяли кислородо-глюкозную депривацию (КГД) для моделирования плохого кровообращения головки бедренной кости. На тканевом уровне КГД моделирует повреждение клеток и нарушение регенерации, которые характерны для дегенеративных заболеваний костей, таких как асептический некроз, остеохондроз, остеоартроз и др. Головки бедренных костей были помещены в среду, свободную от глюкозы и аминокислот, с уровнем кислорода О<0,5 мм рт.ст. (заменен на газообразный N). Испытания повторяли на 1, 2, 5, 3, 5, 4, 5, и 7 ч, после чего восстанавливали нормальные условия культивирования клеток.
Для качественного анализа жизнеспособности клеток живые и мертвые клетки метили флуоресцентными красителями кальцеином AM (488 нм) и этидия гомодимером-2 (546 нм), а затем оценивали ее при помощи конфокальной микроскопии (конфокальный микроскоп Zeiss LSM, 20×).
Для количественного анализа жизнеспособности клеток применяли метилтиазол тетразолий (МТТ) со следующими параметрами: инкубация в течение 1 ч в растворе МТТ, солюбилизация в течение 1 ч в изопропаноле, измерение оптической плотности при 570 нм и 690 нм, с поправкой на сухую массу костей. Анализ проводили при 37°С. В предварительных экспериментах инкубацию исследовали во временных точках 10 минут, 1, 2, 5 часов, а солюбилизацию в изопропаноле исследовали во временных точках 10 минут, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 20 часов.
Пример 4: Получение примера фракции сыворотки по изобретению (СОТФ) и его характеристика
Обогащенную тромбоцитами плазму выделяли по протоколу двойного центрифугирования. Кровь от здоровых взрослых доноров собирали в пробирки с ЭДТА (BD Vacutainer, K2E ЭДТА) и центрифугировали при 1300 оборотах в минуту (320 g) в течение 12 минут. Супернатант отбирали и центрифугировали при 3000 оборотах в минуту (1710 g) в течение 10 минут. Осадок ресуспендировали в среде культивирования стволовых клеток в соотношении 1:4 в течение терапии КГД и после нее. Гепаринизированную ОТП получали путем добавления 100 мкл фракционированного гепарина (Clexane 4000 МЕ/0,4 мл) к 1200 мкл ОТП после выделения. Обогащенный тромбоцитами фибрин получали центрифугированием без антикоагулянтов в течение 5 минут при 3000 оборотах в минуту (1710 g). Фибринозный гель удаляли из пробирки и жидкость осторожно отжимали из геля для того, чтобы получить выделенную СОТФ, которую добавляли к среде культивирования стволовых клеток в соотношении 1:4. Концентрация сыворотки в случае ОТП составляла примерно 1:500 (500 мкл конечного продукта из 6 мл крови) и около 1:600 в случае СОТФ (600-800 мкл конечного продукта из 6 мл крови).
Пример 5: Воздействие фракций сыворотки на костные эксплантаты после кислородо-глюкозной депривации
3
2
2
Костные эксплантаты собирали из удаленных головок бедренных костей пациентов, подвергнутых замещению тазобедренного сустава. Костные трансплантаты около 10 мм собирали и немедленно переносили в среду Игла, модифицированную по способу Дульбекко, содержащую 1 г/л глюкозы, 1% пенициллин-стрептомицина и 10% фетальной бычьей сыворотки. Эксплантаты культивировали в этой среде при стандартных условиях культивирования клеток в 24-луночных планшетах. Кислородо-глюкозную депривацию (КГД) проводили в инкубационной системе Pecon (Erbach-Bach, Germany) на третий день после культивирования ткани вне организма. Костные образцы переносили в среду культивирования стволовых клеток, лишенную глюкозы и аминокислот, а кислород продували азотом в течение 7 часов до уровня 0,5% O. После завершения КГД среду заменяли и эксплантаты культивировали в 20% кислорода и 5% CO. Фракции крови добавляли в среду в соотношении 1:4 непосредственно перед КГД и обновляли при заменах среды. Как ОТП, так и СОТФ брали свежеприготовленными непосредственно перед применением, а не после хранения или замороживания.
В трансплантаты инкубировали в разбавленной до 1:9 смеси 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолия бромида (МТТ, #М5655, Sigma) и среды культивирования стволовых клеток при 37°С в течение 60 мин, а затем разбавляли изопропанолом. Оптическую плотность раствора измеряли с помощью спектрофотометра PowerWaveTM XS при 570 нм и фильтрацию шума проводили путем измерения оптической плотности при 690 нм. МТТ-анализ проводили на третий и шестой день после КГД.
2
В день операции на костной стружке было очень мало живых клеток и эти клетки были повреждены. Образцы были получены от разных пациентов. Для того, чтобы получить разнообразную костную стружку в одинаковом состоянии, ее инкубировали в среде культивирования стволовых клеток при температуре 37°С и при 5% CO в течение 3 дней. Достаточное количество клеток обнаружили на 3-й день, поэтому начали КГД для моделирования ишемического состояния. На основании данных от четырех пациентов с помощью t-критерия были показаны существенные различия между жизнеспособностью клеток костной стружки в день операции и спустя 3 дня после инкубации (81,75±47,72 по сравнению с 106,28±55,24).
Для достижения ишемического состояния КГД применяли в течение различных интервалов. Костные образцы наблюдали во временных точках равных один, два с половиной, три с половиной, пять и семь часов КГД. После КГД обработки продолжительностью 5 часов определяли жизнеспособность клеток при помощи МТТ-анализа в группе клеток, подвергнутых КГД и в необработанной группе, и было обнаружено, что 5 часов обработки недостаточно для того, чтобы повредить клетки (n=12 эксплантатов на группу, контроль: 50,36±6,66 по сравнению с группой КГД: 36,97±3,00, t-критерий, различия статистически не значимы). До КГД можно увидеть окрашенные в зеленый цвет здоровые прилипающие клетки, а с увеличением времени КГД до 7 часов эти клетки теряли свои отростки, изменяли свою форму, становились поврежденными или погибали, а их цвет становился красным. Проведенные авторами количественные измерения показали значимые различия между контрольной группой и группой клеток, подвергнутых КГД.
Во время обработки эксплантатов ОТП группа, подвергающаяся обработке, получала смесь ОТП и среды культивирования стволовых клеток в соотношении 1:4.
2
2
ОТП не может улучшить жизнеспособности клеток после ишемического состояния (Фиг. 2). После того, как ОТП помещали в среду культивирования для стволовых клеток, красные кровяные клетки в ОТП коагулировали, и консистенция раствора становилась желеобразной. Для того, чтобы избежать этой последовательности в раствор ОТП вводили гепарин, и исследовали жизнеспособность клеток на основе протокола, описанного ранее. Тенденцию к росту наблюдали на 6-й день после КГД сравнению с необработанной группой, но она не была статистически значимой. Значимые различия не наблюдались после исследования ОТП в более высоких и более низких концентрациях (Фиг. 2). Для активации тромбоцитов опробовали три способа: замораживание и оттаивание, добавление CaCl или добавление CaCl и тромбина, но ни один из них не изменил полученные ранее результаты (Фиг. 2).
Исследовали воздействие СОТФ в течение КГД. Обработанные эксплантаты инкубировали в среде культивирования для стволовых клеток, содержащей СОТФ в соотношении 1: 4 в течение 7 часов. На основании результата МТТ-анализа, делали заключение, что группа, получавшая СОТФ, не имеет более высокой жизнеспособности клеток по сравнению с необработанной группой. СОТФ не может защитить от непосредственного острого воздействия КГД (данные по 2 пациентам, контрольная группа: 70,18±6,64, группа с КГД: 24,85±2,49, СОТФ группа: 26,78±3,49, различия статистически не значимы).
После этого исследовали долгосрочное действие СОТФ. Эксплантаты обрабатывали во время КГД и непрерывно в течение 6 дней после КГД. На 3-й день среду заменяли анализ и делали жизнеспособности клеток, и группа, обработанная СОТФ, показывала тенденцию к росту. Спустя еще 3 дня инкубации после КГД разница была статистически значимой (Фиг. 3).
В предварительно обработанных группах эксплантаты получали СОТФ со дня операции. В этих случаях можно признать положительное воздействие СОТФ, поскольку были зафиксированы значимые различия между группой, получавшей обработку, и необработанной группой уже после 3 дней КГД (4 пациента, n=24 эксплантата на группу, **: р<0,01), причем, эти различия были более выражены на 6-й день после КГД (4 пациента, n=24 эксплантата на группу, ***: р<0,0001) (Фиг. 3).
В исследовании авторы сравнивали две довольно похожих фракции крови в модели ишемии кости. Неожиданно обнаружили, что положительное действие ОТП не могло быть обнаружено даже при высоких концентрациях, в то время как СОТФ значительно улучшала способность к пролиферации поврежденных ишемией остеобластов. Следует также отметить, что пролиферативное воздействие было аддитивным по отношению к действию фетальной бычьей сыворотки (ФБС), нормального компонента среды культивирования стволовых клеток, и наблюдалось только при пост-ишемическом состоянии.
Пример 6: Анализ состава фракций сыворотки
Для определения белков, родственных факторам ангиогенеза или факторам роста в СОТФ и ОТП применяли набор Proteome Profiler Human Angiogenesis Array Kit (R&D System, #ARY 007), а для количественной оценки экспрессии белка использовали программу Adobe Photoshop. Для количественного определения тромбоцитов и ионов в СОТФ применяли гематологический анализатор Sysmex XT 4000i и биохимический анализатор Beckman Coulter AU5800. Результаты представляли как среднее значение ± СОС. Статистическую значимость определяли при помощи t-критерия или однофакторного дисперсионного анализа с поведением апостериорных тестов Тьюки, совместимых с программным обеспечением GraphPad Prism. Значимым считали уровень статистической значимости р<0,05.
Существует несколько ключевых различий между ОТП и СОТФ, измеренных при помощи набора Proteome Profiler assay (Фиг. 4). Различия между двумя фракциями ограничены малым количеством белков, и это дает простое объяснение, что те факторы, которые имеют более высокие уровни во фракции СОТФ, являются ответственными за воздействие. Следует отметить, что только что составлен полный протеомный анализ реализата тромбоцитов и он содержит 3500 белков, то есть, значительно больше, чем измерено с помощью набора Proteome Profiler assay.
Тем не менее, в этих анализах часто упускают из виду два важных белка: альбумин и фибрин (Таблица 1). Оба белка находятся в большом количестве в сыворотке и обладают достаточно хорошо описанным воздействием на пролиферацию клеток. Ранее описано, что кость in vitro и in vivo индуцирует действие сывороточного альбумина, который увеличивает возможность того, что альбумин сам по себе является активным фактором в ОТП и СОТФ. Однако, поскольку альбумин в сопоставимых уровнях присутствует как в ОТП, так и в СОТФ, кроме того его также добавляют в культуральную среду в виде ФБС, авторы пришли к выводу, что он не отвечает за воздействие СОТФ, наблюдаемое в настоящем исследовании.
Четким различием между препаратами ОТП и СОТФ является наличие фибрина (Таблица 1). Фибрин или инактивированная форма фибриногена является вторым наиболее распространенным белком в сыворотке и присутствует как в нативной, так и в гепаринизированной ОТП, тогда как в СОТФ он отсутствует. Некоторые исследования описывали, что фибрин имеет очень сильное провоспалительное действие за счет специфически активированных макрофагов. Фибрин также известен как ключевой фактор в процессе заживления кости после перелома, как первая стадия энхондрального образования кости. Хотя ясны не все детали клеточных взаимосвязей фибрина, разумно предположить, что он, по меньшей мере, частично ответственен за различия в пролиферативном действии СОТФ по сравнению с ОТП. Важно также, что модель, используемая в настоящем исследовании, предназначена для имитации не заживления костей в нормальных условиях, а потенциала регенерации поврежденной ткани. Несмотря на то, что воспалительный ответ при острой травме сломанной здоровой кости может быть полезным, он имеет противоположное действие в дегенеративных ткани, где емкость ремоделирования клеток ослаблена. Считают, что настоящая модель напоминает эту последнюю ситуацию, имитируя период ишемии. То наблюдение, что фракции сыворотки не оказывали никакого воздействия на «здоровое» состояние костных эксплантатов, но оказывали его в постишемический период, также поддерживает идею о том, что нынешняя модель, с ее ограничениями как системы ex vivo, более напоминает дегенеративные костные ткани. Кроме того, настоящие результаты следует интерпретировать в данном контексте, поскольку костной тканью была головки бедренных костей, извлеченных из организма и культивированных, в процессе процедуры полного замещения тазобедренного сустава в терминальной стадии остеоартроза.
Авторы пришли к выводу, что выделенная из обогащенного тромбоцитами фибрина сыворотка обладает уникальными регенеративными свойствами по отношению к поврежденным костным тканям. Выделение СОТФ представляет собой простую процедуру, которая может быть выполнена у постели больного, обеспечив аутологичную смесь факторов роста, которые могут быть использованы также при дегенеративных заболеваниях костей. Тот факт, что СОТФ лишена фибрина и имеет, как правило, меньше компонентов, чем ОТП, но оказывает лучшее воздействие, является в данном конкретном случае еще одним шагом в процессе стандартизации продуктов сыворотки.
Основываясь на текущем ex vivo исследовании человеческой костной ткани, положено начало переносу в клинику применения СОТФ при дегенеративных и ишемических заболеваниях костей.
Безопасность ОТП при краткосрочном применении хорошо установлена многочисленными клиническими исследованиями, однако, возникли опасения относительно ее эффективности. Попытки составления мета-анализа сталкиваются с проблемой нестандартной номенклатуры, различных протоколов выделения и схем лечения. Даже хорошо продуманные исследования сосредоточены в нише определения способов борьбы с очень высокими различиями уровней факторов роста в ОТП. Поскольку ОТП является по существу смесью известных и еще неизвестных активных агентов, не очевидно, что она может быть использована в качестве эталонного соединения для дозирования. Поэтому в настоящее время лучшим способом стандартизации является определение продукта в соответствии с протоколом выделения, а не по его компонентам.
Пример 7: Определение SDF-1 в СОТФ
Стромально клеточный фактор 1 (SDF-1), также известный как фактор роста предшественников В-лимфоцитов (PBSF, от англ. pre-B-cell growth-stimulating factor), является недавно обнаруженным белком, относящимся к альфа-хемокинам (СХС) семейства цитокинов. SDF-1α и SDF-1β представляли собой первые цитокины, которые были исходно определены путем стратегии клонирования с использованием сигнальной последовательности в качестве ловушки в линии человеческих стромальных клеток костного мозга. SDF-1 обладает хемотаксической активностью по отношению к покоящимся Т-лимфоцитам и моноцитам. Наборы SDF-1 ELISA (от англ. enzyme-linked immunoelectrodiffusion essay - энзим связанный иммуносорбентный метод исследования) [Sigma-Adrich, RAB0123, Human SDF 1 alpha ELISA Kit и RAB0124 SIGMA Human SDF-1 beta ELISA Kit] являются энзим связанными иммуносорбентными методами исследования in vitro для количественного определения человеческого SDF-1 в плазме (образцы сыворотки не рекомендуется применять в данном анализе, поскольку концентрация человеческого SDF-1 в нормальной плазме является низкой, он не может быть обнаружен в этом анализе), супернатантах клеточных культур и моче. В этом анализ применяется специфичное к человеческому SDF-1 антитело, нанесенное на 96-луночный планшет. Стандарты и образцы отмеривали пипеткой в лунки и присутствующий в образце SDF-1 связывался с иммобилизованным на лунках антителом. Лунки промывали и добавляли биотинилированные антитела против человеческого SDF-1. После вымывания несвязанного биотинилированного антитела, в лунки отмеривали пипеткой стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена. Лунки снова промывали, добавляли в лунки раствор тетраметилбензидинового (ТМБ) субстрата и в них появлялось окрашивание в соответствии с количеством связанного SDF-1. Стоп-реагент меняет цвет с синего на желтый, а интенсивность цвета измеряется при 450 нм. Стандартную кривую разбавления получали с использованием следующих концентраций SDF-1 (пг в мл): 6000; 3000; 1500; 750; 375; 187,5; 93,75.