Об L-трансформации бактерий аcidithiobacillus ferrooxidans in vitro и in vivo

УДК 579.23+616.157

В.М.Катола, Л.М.Павлова, А.И.Сорокина ОБ L-ТРАНСФОРМАЦИИ БАКТЕРИЙ АС1В1ТИ10БАС1ЬЬи8 FERROOXIDANS IN VITRO И IN VIVO

1 Институт геологии и природопользования ДВО РАН, Благовещенск

РЕЗЮМЕ

С помощью сканирующей электронной микроскопии установлено, что различные штаммы A. ferrooxidans в культурах, растущих без пересевов на среде 9К в течение 30 суток, и непосредственно в органах белых мышей, внутрибрюшинно инфицированных данными бактериями, частично подвергаются L-трансформации. Структурнофункциональная трансформация штаммов A. fer-rooxidans в условиях макроорганизма более стабильна, чем в опытах in vitro, кроме того, эти бактерии обладают инвазивностью, адгезией, колонизацией и бессимптомной персистенцией, что сближают их с патогенами. Однако вопрос о потенциальной патогенности A. ferrooxidans и их роли в развитии патологии у населения и животных, находящихся в местах горных разработок, нуждается в дополнительных доказательствах.

SUMMARY V.M.Katola, L.M.Pavlova, A.I.Sorokina

L-TRANSFORMATION OF BACTERIA АCIDITHI0BACILLUS FERROOXIDANS IN VITRO AND IN VIVO

Scanning electrone microscopy showed that various strains A. ferrooxidans growing in the cultures without subculturing on medium 9K within 30 day, and in bodies of white mice, abdominally infected by these bacteria, undergo partial L-transformations. Structural-functional transformation of strains A. ferrooxidans in a macroorganism is more stable, than in vitro experiences. Besides these bacteria are characterized by invasiveness, adhesion, colonization and asymptomatic persistence, which makes them similar to pathogens. However, the question of potential A. ferrooxidans pathogenicity and their role in development of population’s and animals’ pathology in mining areas remains to be elucidated.

Считается, что хемолитотрофные бактерии не только не патогенны для человека, но и не способны к L-трансформации [7]. Однако нами замечено, что при несвоевременных пересевах на свежую питательную среду Сильвермана и Люндгрена (9К) происходит L-трансформация клеток Aaidithiobacillus ferrooxidans ВКМ-В-458 [2]. В природных условиях представители этого вида бактерий обитают преимущественно в тех местах, где повышена концентрация Cu, Zn, Pb, W, Mo, Be и других переменновалентных металлов, играют ведущую роль в химических преобразованиях этих элементов, используются в биогидрометаллургии цветных и драгоценных

металлов. Не исключено, что во время эксплуатации сульфидных месторождений либо технологической переработки рудного сырья клетки А. ferrooxidans с аэрозолями фиброгенного действия могут попадать в организм человека. Теоретически для жизнедеятельности этих бактерий в живом организме имеются источник энергии и донор электронов Fe2+ (появляется при ежедневном распаде старых эритроцитов), а для синтеза углеродсодержащих веществ - С02.

Причиной для детального изучения взаимоотношений А . ferrooxidans с организмом человека и высших животных послужил и тот факт, что отходы горнодобывающих и горно-перерабатывающих производств, будучи признанными загрязнителями окружающей среды токсическими элементами, индуцируют переход патогенных и условно-патогенных бактерий в L-формы [4, 5], что может представлять эпидемиологическую угрозу населению, домашним и диким животным. Возможно, существует взаимосвязь между вспышками пылевой патологии легких (бронхита, пневмосиликоза), туберкулеза и других заболеваний и распространением L-форм бактерий в окружающей среде.

С учетом изложенного целью настоящей работы явилось исследование изменений, которым подвергаются различные штаммы A. ferrooxidans как in vitro, так и в организме экспериментальных животных.

Методы исследований

Исследования проведены с тремя штаммами хе-молитотрофных бактерий A. ferrooxidans: коллекционный штамм ВКМ-В-458; штамм АМТ, выделенный из мышьяковистых золотосодержащих концентратов; штамм SHT-II, выделенный из донных отложений горной реки Алла (Бурятия). Все штаммы культивировали в колбах Эрленмейера со средой 9К, основными ингредиентами которой являются FeS04x7H20 (концентрация 44,2 г/л) и незначительные количества неорганических соединений Mg, К, Р и Са.

В первом варианте опытов культуры A . ferrooxi-dans выращивали в течение 30 суток в условиях стационарного культивирования. В этих условиях кинетика роста культур менялась в зависимости от лимитирующих субстратов, обеспечивающих основу метаболизма. Центрифугат, приготовленный из непере-севаемых культур A. ferrooxidans, наносили непосредственно на объектный столик электронного микроскопа.

Во втором варианте опытов культуральные растворы с накопленной биомассой штаммов (ВКМ-В-458 или АМТ) центрифугировали, осадки трижды отмывали в стерильном физиологическом растворе, затем 0,1 мл бактериальной взвеси, содержащей 50 млн. м. т., вводили внутрибрюшинно двум группам

белых беспородных мышей. Спустя 30 суток всех животных декапитировали и из крови, лимфатических узлов, легких, печени, селезенки и почек мышей готовили препараты-отпечатки. Одновременно бактериальные взвеси непересеваемых культур, кровь и эмульгированные органы высевали в отдельные пробирки со средой 9К.

Приготовленные препараты просушивали, напыляли в вакуумной установке ВУП-4 углеродом и исследовали в сканирующем электронном микроскопе JEOL JSM-35C (Япония). В итоге была получена цельная картина изменения морфологии клеток A. ferrooxidans в различных условиях роста, по которой можно судить и о степени их стабильности.

Результаты исследований и их обсуждение

Бактерии A . ferrooxidans, развивающиеся в периодическом режиме, подвижны, спор не образуют, гра-мотрицательны, при просмотре в сканирующем электронном микроскопе представляют собою полиморфные палочки размером 1,29*0,43-1,46*0,42 мкм

с закругленными концами (рис. 1 а). Но на 30-е сутки в клеточном составе непересеваемых культур обнаруживаются выраженные изменения: резкое уменьшение численности исходных (родительских) клеток, доминирование над ними конгломератов из слившихся клеток, формирование гигантских бесформенных масс (тел) и многочисленных субмикроскопиче-ских (менее 1мкм) структур (рис. 1 б, в, г). Субмик-ронные структуры представлены шаровидными клетками, скопления которых образовывают крупные конгломераты, элементарными тельцами (гранулами) и тонкими нанопалочками. Обращает на себя внимание множественное деление шаровидных клеток. Кроме того, у бесформенных масс, конгломератов и шаровидных клеток довольно хорошо прослеживается один из способов образования элементарных телец, а именно, почкование на поверхности, чего не отмечалось у нанопалочек. Отпочковавшись от исходной формы, гранулы превращаются в самостоятельные элементы популяции. Согласно данным ли-

Рис. 1. Сканирующая электронная микроскопия А. ferrooxidans: а - исходные клетки культуры ВКМ-В-458. Увеличение х 4000; б - L-трансформация непересеваемой культуры. ВКМ-В-458. Увеличение х 5000; в - L-трансформация непересеваемой культуры SHT-II. Увеличение х 4000; г - L-трансформация непересеваемой культуры АМТ, адаптированной к мышьяку. Увеличение х 4000.

45

тературы [8, 9] элементарные тельца могут возникать, помимо почкования, и другим путем, в том числе внутри клеток. Нами был зафиксирован выход элементарных телец на поверхность бактериальной нити через клеточную стенку непосредственно в организме человека [3]. Уже сам факт присутствия элементарных телец в бактериальных культурах свидетельствует о том, что определенная часть клеточной популяции переходила в L-формы и становилась смешанной.

Несмотря на грубые и однотипные нарушения морфогенеза у всех трех штаммов A. ferrooxidans, растущих в необновляемой среде 9К, можно было заметить и некоторые отличительные детали. Например, в непересеваемой культуре ВКМ-В-458 содержались огромные, неопределенной формы тела с множеством шаровидных или овальных клеток на поверхности (рис. 1 б). Рядом с телами изолировано располагались элементарные тельца и отдельные шаровидные клетки, отпочковывающие гранулы; гораздо реже встречались родительские клетки, их нераз-делившиеся пары, а также нанопалочки. В культуре АМТ (рис. 1 в) в основном преобладали исходные бактериальные клетки, причем, часть из них находилась на стадии деления без расхождения дочерних особей. В итоге из таких пар формировались различной величины и формы структуры с неровной поверхностью. Среди них в большом количестве встречались слившиеся в конгломераты либо отдельно расположенные шаровидные клетки, на которых почковались элементарные тельца. Культура SNT-11 (рис. 1 г) в меньшем количестве, чем культура АМТ, содержала неразделившиеся клетки, но они были значительно крупнее клеток контрольных (исходных) культур, контактировали друг с другом и, слипаясь, создавали конгломераты и огромные тела. В ряде случаев у некоторых клеток можно было наблюдать вспучивание поверхности и появление на ней элементарных телец; нанопалочки попадались крайне редко.

При сравнительном анализе клеточного состава непересеваемых культур A. ferrooxidans мы не обнаружили разбухшие клетки, нитевидные либо вакуо-лизированные структуры и клетки сферопластного типа. Не отмечена и полная трансформация каждой популяции.

Наличие в длительно непересеваемых культурах A. ferrooxidans огромных бесформенных масс, конгломератов, шаровидных палочек и особенно элементарных телец мы склонны рассматривать как результат образования различных вариантов L-форм. Интенсивность перехода значительной части популяции A. ferrooxidans в L-формы in vitro обусловлена многими причинами: особенностями изучаемого вида бактерий, увеличением концентрации метаболитов в питательной среде, возрастающим дефицитом элементов питания, в первую очередь лимитирующим субстратом FeS04*7H20, накоплением Fe3+ и совокупным влиянием этих факторов на клеточную стенку наиболее чувствительных клеток. Из всех компонентов клеточной стенки самым восприимчивым к действию вредных факторов считается пептидогли-

кан [1, 6, 7]. Поэтому, чтобы обеспечить себе жизнестойкость в неблагоприятных условиях, бактериальная клетка вынуждена избавляться от него и превращаться в L-форму. Тем не менее, конкретный механизм действия измененной среды 9К на клеточную стенку A . ferrooxidans пока неясен. Скорее всего, изменения в клеточной стенке носят временный характер, поскольку при пересеве на свежую среду 9К спустя 7-14 дней L-трансформированная культура полностью реверсирует в исходную бактериальную форму.

Способность популяции хемолитотрофа A. fer-rooxidans частично переходить в L-формы подтверждена и в опытах на белых мышах. Уже на 30 сутки с момента его внутрибрюшинной инокуляции многочисленные варианты L-форм электронномикроскопически визуализировались в крови, лимфатических узлах, легких, печени, селезенке и почках (рис. 2). При этом каких-либо внешних признаков заболевания животных не отмечено, отсутствовали также и макроскопические изменения со стороны внутренних органов. В крови (рис. 2 а) циркулировали огромные L-тела, на поверхности которых формировались элементарные тельца, мелкие (5-10 мкм), слабой интенсивности скопления из шаровидных клеток, незначительное количество очень тонких нанопалочек и множество свободных элементарных телец. Иногда встречались исходные клетки A. ferrooxidans и, что интересно, распадающиеся бактериальные нити, не регистрировавшиеся у культур A. ferrooxidans в опытах in vitro. По сравнению с кровью в лимфатических узлах было больше исходных клеток, а в печени мелких L-конгломератов (размером до 5 мкм). Самые крупные (30*15 мкм) L-конгломераты обнаруживались в селезенке (рис. 2 в), несколько меньшего размера в почках (15 мкм). Из всех органов более разнообразная картина отмечена в легких (рис. 2 б): на разных участках располагались группы исходных клеток, в том числе на начальных этапах преобразований, L-конгломераты величиною до 5 мкм, множество свободных элементарных телец, нанопалочек и шаровидные клетки диаметром 0,5-0,7 мкм, которые образовывали неразделившиеся пары и скопления пар.

Если in vitro L-формы A. ferrooxidans образуются под влиянием факторов питательной среды 9К, то в организме здоровых мышей их индукторами могли быть лишь факторы неспецифической и иммунной защиты. Индукция L-форм Salmonella typhimurium, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae и Escherichia coli в организме белых мышей была установлена еще в 50-е годы ХХ века [9]. Особенностью же L-трансформации в организме мышей хемолитотрор-фов A. ferrooxidans является то, что смесь, состоящая из исходных клеток, L-трансформантов крови и эмульгированных органов, не произрастала при высеве на среду 9К. То есть, возникающие в макроорганизме структурно-функциональные изменения A. ferrooxidans более стабилизированы, чем это наблюдалось в опытах in vitro.

Таким образом, обобщенные результаты наших опытов доказывают, что автотрофные бактерии A.

X4006 003 Э 1 -0U

в

Рис. 2. Сканирующая электронная микроскопия вариантов Ь-форм А. /вггоох1ёат в организме мышей: а - Ь-конгломераты и элементарные тельца в крови. Увеличение х 1200; б - шаровидные клетки и элементарные тельца в легочной ткани. Увеличение х 12000; в - крупный Ь-конгломерат, отпочковывающий элементарные тельца, в селезенке. Увеличение х 4000.

ferrooxidans способны существовать in vitro и in vivo в виде L-форм. В организме инфицированных белых мышей различные варианты L-форм этих бактерий обнаружены во всех органах; а распространение их по всему организму происходит, по-видимому, лимфогематогенным путем. Это свидетельствует о том, что штаммы A. ferrooxidans обладают инвазивностью (преодолевают защитные механизмы макроорганизма, приживляются в нем и размножаются), адгезией, колонизацией и бессимптомной персистенцией. Все перечисленные признаки как бы сближают их с патогенными бактериями, персистенция которых даже без заметных клинических и патоморфологических изменений (так называемое «здоровое» бактерионосительство) считается формой инфекционного процесса [1, 6, 7]. Но на настоящий момент у нас нет достаточных оснований утверждать о наличии патогенных потенций у A. ferrooxidans. Во-первых, при-

сутствие этого вида бактерий в организме мышей после искусственного инфицирования еще не означает инфекционного заболевания; во-вторых, чтобы доказать, что А. ferrooxidans способен вызвать заболевание, необходимо провести опыты в разных условиях, при различных дозировках микроба и на различных животных, так как мыши могут обладать к нему естественной резистентностью. Актуальность подобных исследований не вызывает сомнения. Для большей убедительности напомним, что бактерии рода Зегга^а, вызывающие отиты, менингиты, поражение кожи, желчного пузыря, мочеполовой и нервной систем, долгое время, как сейчас А. ferrooxidans, считались сапрофитными, а вид & та^е^тет даже именовался «чудесной палочкой».

Выводы

1. Проведенные исследования показали, что раз-

ные штаммы A. ferrooxidans в опытах in vitro и in vivo склонны к L-трансформация.

2. Непосредственно в организме внутрибрюшинно инфицированных белых беспородных мышей L-формы

A. ferrooxidans (шаровидные клетки, образованные ими гигантские бесформенные массы и конгломераты, а также элементарные тельца) обнаруживаются в крови, почках, селезенке, легких прямой сканирующей электронной микроскопией. Наряду с L-формами в различных количествах в органах циркулируют исходные родительские клетки, бактериальные нити и отдельные субмикроскопические палочки - нанопалочки.

3. В условиях макроорганизма структурнофункциональные изменения клеток A. ferrooxidans более стабильны, чем в опытах in vitro.

ЛИТЕРАТУРА

1. Персистенция бактериальных патогенов как результат отношений в системе паразит-хозяин [Текст]/О.В.Бухарин//Микробиол., эпидемиол. и им-мунол.-1997.-№4.-С.3-9.

2. L-трансформация литоавтотрофа ACIDITHIOBACILLUS FERROOXIDANS [Текст]/

B.М.Катола, Л.М.Павлова, Т.Б.Макеева//Современные технологии освоения минеральных ресурсов: сб. науч. тр./ГАЦМиЗ.-Красноярск, 2004. С.365-366.

3. Техника взятия материала из небольших по площади или труднодоступных участков тела чело-

века для изучения микроорганизмов [Текст]/А.М.Катола, Э.В.Хмелькова,

Т.Б.Макеева//Бюл. физиол. и патол. дыхания.-2004.-Вып.18.-С.64-68.

4. Индукция L-форм микобактерий туберкулеза и их электронномикроскопическая визуализация in vitro и in v^ [Текст]/В.М.Катола [и др.]// Бюл. физиол. и патол. дыхания.-2005.-Вып.21.-С.75-77.

5. Электронно-микроскопический анализ морфофизиологического состояния бактерий в местах колонизации [Текст]/В.М.Катола [и др.]//Бюл. физиол. и патол. дыхания.-2005.-Вып.21.-С.79-83.

6. Медицинская микробиология, иммунология

и вирусология [Текст]/А.И.Коротяев,

С.А.Бабичев.-СПб.: Спец. литература, 1998.-580 с.

7. Микробиологические факторы, определяющие носительство при капельных инфекциях [Текст]/Н.Н.Кострюкова//Микробиол., эпидемиол. и иммунол.-1997.-№4.-С.10-15.

8. L-формы бактерий (механизм образования,

структура, роль в патологии)

[Текст]/С.В.Прозоровский, Л.Н.Кац, Г.Я.Каган.-М.: Медицина, 1981.-236 с.

9. L-формы бактерий и семейство Mycoplas-mataceae в патологии [Текст]/В.Д.Тимаков, Г.Я.Каган.-М.: Медицина, 1973.-391 с.

п

УДК 616.233-002+616.248:616.24-008.8-076.5

С.В.Зиновьев

МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ БРОНХИАЛЬНОГО ЭПИТЕЛИЯ, СОДЕРЖАЩЕГОСЯ В БРОНХОАЛЬВЕОЛЯРНОМ ЛАВАЖЕ У БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ

ГОУ ВПО Амурская государственная медицинская академия, Благовещенск

РЕЗЮМЕ

Изучены морфометрические характеристики бронхиального эпителия, содержащихся в бронхоальвеолярном лаваже людей больных бронхиальной астмой. Проведен корреляционный анализ морфометрических параметров клеток бронхоальвеолярного лаважа.

SUMMARY

S.V.Zinoviev

MORPHOMETRICAL FEATURES OF THE BRONCHIAL EPITHELIUM CONTAINED IN THE BRONCHOALVEOLAR LAVAGE

The study morphometrical characteristics of the bronchial epithelium contained in the bron-choalveolar lavage in patients with bronchial asthma. Is carried out correlation analyses morphometrical cells parameters contained in the bronchoalveolar lavage.

Морфометрия основное направление количественной морфологии с помощью, которого можно применять системный подход к изучению динамики биологических структур. По этому, цитометрия клеток представляет значительный интерес для объекти-

визации цитологического исследования. Морфомет-рия информативна в случае изучения строения клеток бронхоальвеолярного лаважа [1, 2, 5]. Тем не менее морфометрические характеристики клеток, содержащегося в бронхоальвеолярном лаваже остаются недостаточно изученными. Остается не ясной биологическая целесообразность результатов цитометриче-ского исследования бронхолаважной жидкости.

В связи с этим, целью настоящего исследования явилось изучение морфометрии бронхиального эпителия, содержащегося в бронхолаважной жидкости у больных с бронхиальной астмой.

Материалы и методы

Изучены мазки клеток бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ). Изученный нами материал извлекался по оригинальной эндоскопической методике

С.И.Ткачевой и Г.Ф.Паламарчук [6]. Мы исследовали бронхолаважную жидкость у 300 больных с бронхиальной астмой.

Результаты цитологического исследования заносились в электронные таблицы автоматизированной базы данных. Основным методом статистической оценки различия между двумя группами исследования и принятия решения о принадлежности этих групп к одной генеральной совокупности служили: критерий