УСТАНОВКА ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ ФОСФОЛИПИДОВ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ ОРГАНИЗМА

Полезная модель относится к области медицины, в частности для исследования количества фосфолипидов в желчи и сыворотке крови и влияния на их обмен в организме новых лекарственных средств при проведении научно-исследовательских экспериментов, в частности у животных.
Общим свойством всех фосфолипидов является их нерастворимость в воде и наличие молекулы фосфорной кислоты. Поэтому все методы количественного определения фосфолипидов сводятся к определению содержания липидного фосфора. Существует множество установок для количественного определения фосфолипидов, использующих спектрофотометрические и денситометрические методы измерения.
Спектрофотометры для оценки уровня содержания фосфолипидов используются:
1) после экстракции их из биологических жидкостей (крови, желчи) и тканей организма, или 2) разделвяия фосфолипидов желчи методом тонкослойной хроматографии. Так, липиды экстрагируют из желчи смесью равных частей этанола и диэтилового эфира. После выпаривания экстракта фосфолипиды минерализуют, и содержание фосфора определяют по методу Фиске-Суббароу [Fiske C.H., Subbarow Y. // J. Biol. Chem. - 1925. - Vol.66. - Р.375] или по методу Ганиткевич. Метод Фиске-Суббароу основан на присоединении фосфора в кислой среде к молибдату аммония с образованием комплексной фосфорно-молибденовой кислоты, после восстановления, которой получаются продукты, окрашенные в синий цвет (молибденовая синь). Количественную оценку фосфора по второму методу производят по реакции комплексообразования с малахитовым зеленым и фосфоромолибдатом аммония. Интенсивность окраски в обоих случаях определяют колориметрически при 656 и 623 нм, соответственно. Калибровочный график строят в пределах концентрации фосфора 2,5-
20,0 мкг в 10 мл пробы (конечный объем пробы перед фотометрированием). Хроматогра-фическое разделение фосфолипидов желчи проводится на хроматограмме, в которой связывающим силикагель веществом является химически чистый гипс [Ганиткевич Я.В., Карбач Я.И. Исследование желчи. Биохимические и биофизические методы. - Киев: Вища шк. Головное изд-во, 1985. - 136 с]. При этом пробы желчи наносятся на пластину и разделяется смесь фосфолипидов в стеклянной камере с подвижной фазой. Затем проводят идентификацию пятен фосфора фосфолипидов по цветным реакциям и последующее количественное определение фосфора фосфолипидов путем соскабливания в пробирку силикагеля с пятнами фосфолипидов. К остатку после сжигания прибавляют растворы молибдата аммония и аскорбиновой кислоты и спектрофотометрирование по сравнению с контролем проводят при 656 нм. Расчет проводят по калибровочному графику [Ганиткевич Я.В., Карбач Я.И. Исследование желчи. Биохимические и биофизические методы. - Киев: Вища шк. Головное изд-во, 1985. - 136 с].
Недостатком известных спектрометрических способов являются длительность процесса исследования фосфолипидов и необходимость построения калибровочного графика.
Среди денситометрических устройств для определения подклассов фосфолипидов в липидных экстрактах можно назвать денситометр БИАН-170. Вначале экстрагируют липиды из различных биологических субстратов (кровь, желчь, содержимого желудочно-кишечного тракта и лимфы) по методу Фолча [Folch Y., Lees M., Steans-Stanley C.H. // Simple method for isolation and purification of general lipids from tissue ofanimals. - 1957. - Vol.226. -P.497-509], затем их разделяют тонкослойной хроматографией. Для хроматографии можно использовать хроматограммы промышленного производства или приготовленные из силикагеля, где связывающим веществом является силикатный клей. Применение реагента Васьковского чувствительного к липидному фосфору позволяет определить процентное отношение и количество отдельных подклассов фосфолипидов без калибровки
[Джавадов А.К. Определение фосфолипидов методом тонкослойной хроматографии с последующей денситометрией//Лабораторное дело, 1989. - №2. - С.28-29]. Затем проводят денситометрию хроматограммы на денситометре БИАН-170. Площадь пиков (S) подсчитывают, умножая их высоту (h) на ширину (d), взятую на половине высоты пика после достраивания треугольника [Литвинов Л.Д., Руденко Б.А. Газовая хроматография в биологии и медицине. - М., 1971. - 170 с]: S=d×h. Для проверки точности метода процентное отношение подклассов фосфолипидов определяли также по количеству фосфора в каждом из пятен после соскабливания по известному способу [Fiske C.H., Subbarow Y. // J. Biol. Chem. - 1925. - Vol.66. - Р.375].
Недостатком данного устройства является невозможность исследовать количество фосфолипидов с помощью хроматограммы, в которой связующим веществом силикагеля используется химически чистый гипс.
Наиболее близким техническим решением к полезной модели является прибор микрофотометр МФ-4, смонтированный на массивной плите и установленный на амортизаторах. Предметный столик с пластинкой перемещают вручную микровинтом или автоматически специальным электрическим двигателем. При этом, специальным мотором с редуктором устанавливается нужная скорость перемещения пластинки со спектром на столике. Работа с прибором основана на сравнении фототоков, возникающих в фотоэлементе при последовательном освещении его светом, прошедшим через не засвеченный и фотометрируемый участок спектрограммы. Движение предметного столика со спектрограммой связано с помощью стеклянного рычага с движением верхней каретки, в которой закреплена кассета с неэкспонированной фотографической пластинкой. Узкий световой пучок - зайчик - отражается от зеркальца гальванометра и проектируется на эту фотографическую пластинку. В зависимости от почернения спектральной линии или полосы меняется угол отклонения зайчика зеркальцем гальванометра, и он перемещается поперек фотографической пластинки. Свечение лампы микрофотометра достаточно стабильно,
поэтому на каждой фотографической пластинке можно только один раз определить интенсивность света, прошедшего через прозрачное место. В этом случае показание гальванометра будет зависеть только от почернения измеряемой линии, так как интенсивность падающего света постоянна. Это позволяет заранее рассчитать шкалу, на которой сразу указано почернение, и отпадает необходимость переходить каждый раз от показания шкалы прибора к почернению линии по формуле:
Поэтому в микрофотометре МФ-4, кроме линейной шкалы, которая имеет деления от 0 до 1000, есть еще две шкалы - шкала почернений S и шкала преобразованных почернений Р [Инструкция по использованию микрофотометра МФ-4 - Москва, 1971. - 23 с.].
Однако данное устройство дает только возможность измерять плотности почернения линий на спектрограммах, и предназначено для проведения точного количественного спектрального анализа. Микрофотометр МФ-4 не способен дать количественную оценку фосфолипидов в желчи после тонкослойной хроматографии на хроматограммах, в которых связывающим силикагель веществом используется химически чистый гипс. Кроме того, устройство МФ-4 имеет регистрирующий блок (верхнюю каретку), у которого требуется постоянно менять кассету после экспонирования фотографической пластинки. Следовательно, процесс спектрометрии, и возможно денситометрии, становиться сложным и длительным.
Таким образом, технической задачей предлагаемой полезной модели является создание такого устройства, которое позволило бы исследовать количественный уровень фосфолипидов в желчи, крови, проводить научно-исследовательские эксперименты и лабораторные работы по денситометрическим измерениям и применять полученные данные в исследовательских целях.
Технический результат полезной модели заключается в относительно быстром и точном получении данных о количестве фосфолипидов в желчи и крови в норме и при
заболеваниях печени, а также влияния на эти биологически активные вещества новых лекарств, с возможностью автоматической регистрации результатов и количественной оценки фосфолипидов желчи и крови.
Указанный технический результат полезной модели достигается тем, что установка для количественного определения индивидуальных фосфолипидов биологических жидкостей организма, содержащая фотоприемное устройство, предметный столик, фотопластинку, согласно полезной модели, в качестве фотопластинки применена хроматограмма, у которой в качестве связывающего силикагель вещества использованы химически чистый гипс или силикатный клей, а фотоприемное устройство снабжено фотоэлементом и фотоэлектронным умножителем, попеременно переключаемых в зависимости от вида измерения фосфолипидов и от связывающего силикагель вещества, причем фотоэлемент и фотоэлектронный умножитель для передачи сигнала последовательно соединены с самопишущим и регистрирующим аппаратом, в котором экспериментальные данные автоматически регистрируются в виде кривых графиков с последующим анализом полученных результатов и количественной оценки фосфолипидов.
Технический результат достигается также благодаря тому, что при связывающем силикагель веществе химически чистом гипсе используется фотоэлектронный умножитель, а при силикатном клее - фотоэлемент.
Новыми отличительными признаками предлагаемой полезной модели-установки для количественного определения фосфолипидов биологических жидкостей организма являются:
- применение хроматограмм для количественного анализа фосфолипидов желчи и крови, в которых связывающим силикагель веществом являются химически чистый гипс, или силикатный клей, позволит одновременно получать информацию о метаболизме фосфолипидов в пробах желчи и крови с последующим ее поступлением на самопишущий и регистрирующий аппарат;
- использование в фотометрической части оптической схемы фотоприемного устройства: фотоэлектронного умножителя и фотоэлемента, попеременно переключаемых в зависимости от вида измерения фосфолипидов и связывающего силикагель вещества - химически чистого гипса или силикатного клея, обеспечивает наиболее эффективную и рациональную оценку количества фосфолипидов при денситометрии;
- последовательное соединение фотоэлемента и фотоэлектронного умножителя фотоприемного устройства с самопишущим и регистрирующим аппаратом, в котором экспериментальные данные автоматически регистрируются в виде кривых графиков, позволяет относительно быстро и точно оценить их количество в норме и при патологии печени, а также изучить влияние на эти процессы новых лекарств с возможностью автоматической регистрации и анализа результатов для количественной оценки фосфолипидов.
В известных устройствах - аналогах денситометрия фосфолипидов осуществляется на тонкослойных хроматограммах, приготовленных на водном растворе силикагеля из расчета 0,6 г на одну пластинку, без связывающего силикагель вещества [Джавадов А.К. Определение фосфолипдов методом тонкослойной хроматографии с последующей денситометрией // Лабораторное дело, 1989. - №2. - С.28-29]. При использовании пластинок с силикагелем и гипсом происходит незначительное смещение пера регистрирующего прибора на бумажной ленте. А микрофотометрическая установка МФ-4 не снабжена приставкой для автоматической регистрации поступающей информации. На ней используется для этого процесс отражения светового пучка - зайчика - от зеркальца гальванометра, который проектируется на неэкспонированную фотографическую пластинку в кассете верхней каретки [Инструкция по использованию микрофотометра МФ-4 - Москва, 1971. - 23 с.].
В Предлагаемой установке для количественного определения фосфолипидов в желчи и крови, содержащей предметный столик, на котором закреплена хроматограмма, а связывающим силикагель веществом у последней является силикатный клей, или химически чистый гипс, причем фотоприемное устройство, снабженное фотоэлектронным
умножителем, фотоэлементом, последовательно через редуктор соединенныис регистрирующим и самопишущим аппаратом, позволяет одновременно оценить количество фосфолипидов в желчи и крови, автоматически регистрировать полученные экспериментальные данные с последующим анализом результатов для количественной оценки фосфолипидов.
Сравнение предлагаемого устройства с другими известными техническими решениями из уровня техники по патентной и научной документации позволило установить, что авторами не выявлены решения, включающие совокупность признаков, сходных и эквивалентных заявленным. Это позволяет сделать вывод о соответствии предложения критериям охраноспособности полезных моделей.
Сущность предлагаемой полезной модели поясняется чертежом, где изображена установка для количественного определения индивидуальных фосфолипидов биологических жидкостей организма в научно-исследовательских, лабораторных экспериментах, в частности у животных.
Предлагаемая установка для количественного определения индивидуальных фосфолипидов в желчи и крови содержит предметный столик денситометра 1 для закрепления на нем хроматограммы 2 с индивидуальными фосфолипидами, на которой связывающим веществом при изготовлении пластин применяют химически чистый гипс или силикатный клей. В зависимости от характера связывающего силикагель вещества приготовленной пластины переключается фотоприемное устройство 3: при связывающем силикагель веществе химически чистом гипсе используется фотоэлектронный умножитель 4 - ФЭУ-16, при - силикатном клее - применяется фотоэлемент 5 - ФЭС. Фотоприемное устройство 3, содержащее фотоэлектронный умножитель 4 и фотоэлемент 5 - ФЭС, последовательно соединены с самопишущим и регистрирующим аппаратом 6 - КСП-4. Фотоэлектронный умножитель 4 ФЭУ-16 получает ток от выпрямителя постоянного тока 7. В фонаре лампы 8 осветителя фотоприемного устройства 3, лампа 8 получает питание от универсального источника питания 9 - УИП-1 напряжением 12В. Сигнал с фотоэлектронного умножителя
4 (ФЭУ-16) на самопишущий и регистрирующий аппарат 6 (КСП-4) поступает через редуктор 10, выполненный в виде высокоомного резистора. Полученная информация на фотоприемном устройстве 3 автоматически регистрируется на бумажной ленте самопишущего и регистрирующего аппарата 6 (КСП-4), в виде кривых, по площади которых можно оценить количество фосфолипидов в биологических жидкостях.
Предлагаемая установка для количественного определения индивидуальных фосфолипидов в биологических жидкостях работает следующим образом.
При денситометрии фосфолипидов из сыворотки крови применятся хроматограммы 2, где связывающим силикагель веществом является силикатный клей, а фотоприемным устройством - фотоэлемент 5 - ФЭС. При определении количества фосфолипидов из желчи используется хроматограмма 2 со связывающим силикагель веществом химически чистым гипсом, а фотоприемным устройством является фотоэлектронный умножитель 4 - ФЭУ-16. Для изготовления хроматограммы 2 для количественного определения индивидуальных фосфолипидов из крови и желчи на тонкие пластинки наносится раствор сили-кагеля из расчета 0,6 г на одну пластинку. Раствор силикагеля приготавливают сразу на 4 пластинки, используя в качестве связывающего вещества силикатный клей в соотношении с раствором силикагеля 1:1, и наносят с помощью пипетки. После высушивания пластинок при комнатной температуре их активизируют в сушильном шкафу при 100°С в течение 1 часа [Хотимченко С.В. Липиды морских макрофитов. - Дисс. На соискание ученой степени канд. хим. наук. - Владивосток, 1985. - 141 с.]. Для второго вида хроматограммы 2 используется порошок силикагеля (КСК), полученный после размола на шаровой мельнице. В качестве связывающего силикагель вещества при изготовлении хроматограмм применяют химически чистый гипс, предварительно подсушенный при температуре 100°С. Хроматограммы 6-8 ч сушат на воздухе, затем активируют в сушильном шкафу при 110°С в течение 30 мин.
Кровь у белых крыс собирают из бедренной вены. Липиды экстрагируют по методу Фольч. Разделение фосфолипидов на подклассы проводят на хроматограмме 2, со связывающим силикагель веществом в виде силикатного клея, в системе хлороформ - метанол - вода (65:25:4) в течение 30-40 мин. После высушивания хроматограммы опрыскивают реагентом Васьковского. Через 2-3 мин на белом фоне появляются голубые пятна отдельных подклассов фосфолипидов. Затем проводят денситометрию хроматограммы 2 с помощью фотоэлемента 5 - ФЭС фотоприемного устройства 3. При этом, освещенный лампой 8, участок хроматограммы 2 на предметном столике 1 проектируется на специальный экран фотоприемного устройства и через щель равномерно распределяется по поверхности фотоэлемента 5 - ФЭС. Сигнал с фотоэлемента 5 (ФЭС) поступает и регистрируется автоматически в виде кривого графика на самопишущем и регистрирующем аппарате 6 (КСП-4).
Желчь собирается у наркотизированных тиопентал-натрием (0,1 мл 50% водного раствора) интактных белых крыс линии Wistar обоего пола массой 180-200 г по общепринятому методу. Липиды экстрагируют из желчи смесью равных частей этанола и диэтилового эфира. После выпаривания экстракта фосфолипиды минерализуют и содержание фосфора определяют по методу Фиске-Суббароу. Экстракт выпаривают досуха и сухой остаток растворяют в 0,1-0,2 мл хлороформа. Полученный раствор порциями по 0,02 мл наносят на выбранную точку хроматограммы 2, где связующим силикагель веществом является химически чистый гипс. После нанесения липидов хроматограмму 2 помещают в стеклянную камеру с подвижной фазой хлороформ: метанол: вода=76:25:4 (по объему). После хроматографии пластины сушат на воздухе и опрыскивают 10 н (нормальным) раствором серной кислоты и помещают в сушильный шкаф при температуре 120°С до обугливания пятен индивидуальных фосфолипидов.
Затем проводят денситометрию хроматограммы 2 с помощью фотоэлектронного умножителя 4 - ФЭУ-16 фотоприемного устройства 3. При этом, освещенный участок
хроматограммы 2 на предметном столике 1 проектируется на специальный экран фотоприемного устройства и через щель равномерно распределяется по торцевой поверхности фотоэлектронного умножителя 4 - ФЭУ-16. Сигнал с фотоэлектронного умножителя 4 -ФЭУ-16 поступает и регистрируется автоматически в виде графика на самопишущем и регистрирующем аппарате 6 - КСП-4.
В результате полученных данных строится график зависимости удельной электропроводности от разбавления желчи, на котором на оси абсцисс откладывается концентрация, а на оси ординат - удельная электропроводность.
Далее в обоих случаях площадь пиков (S) подсчитывают, умножая их высоту (h) на ширину (d), взятую на половине высоты пика после достраивания треугольника: S=dh. По данным графиков можно судить о количестве индивидуальных фосфолипидов в желчи и крови минуя процесс биохимического анализа и построения калибровочного графика.
При денситометрии индивидуальных фосфолипидов из желчи и крови можно отметить, что коэффициент корреляции составляет 0,97 [Танганов Б.Б. Математические методы в курсе аналитической химии. Учебное пособие / ВСГТУ. - Улан-Удэ, 1999.-104 с.].
Предлагаемая установка для количественного определения фосфолипидов в биологических жидкостях организма по сравнению с прототипом позволяет проводить определение количества индивидуальных фосфолипидов с автоматическим графическим регистрированием данных на самопишущем регистрирующем устройстве КСП-4 с последующим анализом уровня содержания различных фосфолипидов в крови и желчи.