СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К АНТИГЕНАМ ВИРУСОВ ГЕПАТИТОВ
WAY OF REVEALING ANTIBODIES TO ANTIGENS OF HEPATITIS VIRUSES

Изобретение относится к области медицины, в частности к диагностике инфекционных заболеваний. Способ обеспечивает дифференциальную скрининговую экпресс-диагностику гепатитов А, В и С. Для этой цели проводят дифференциальное выявление антител к антигену гепатитов, при этом антигены гепатитов А, В и С наносят раздельно, формируя диагностический участок для каждого антигена в пределах одного имунохроматографического стрипа. В процессе иммунохроматографии комплекс антител к соответствующим антигенам из исследуемых сывороток и конъюгатов наноколлоидных частиц с антителами против иммуноглобулинов человека, предварительно иммобилизованных в инертном несорбирующем носителе в зоне нанесения образца, мигрируют и связываются в зоне нанесения соответствующего антигена, визуализируя наличие антител к антигенам вирусов гепатитов А, В и С, что позволяет одновременно выявить наличие таких антител и определить, к какому из вирусов они специфичны.
Описание изобретения
Изобретение относится к медицине, в частности к прикладной иммунологии и диагностике инфекционных заболеваний.
Известен иммуноферментный метод обнаружения в нарастающем титре антител к вирусу гепатита А в продромальном периоде заболевания и начальной фазе периода разгара (Е.П.Шувалова. Инфекционные болезни. М., 1990, с.154). Недостатком данного способа является его длительность и выявление антител только к вирусу гепатита А.
Известен способ диагностики гепатита А с помощью иммуноферментной диагностической тест-системы для выявления вируса гепатита с помощью магносорбентов (патент RU 2065164). Недостатком данного метода является низкая диагностическая ценность в связи с незначительным количеством антигена в биологических жидкостях. Кроме того, данный способ позволяет диагностировать только гепатит А.
Известен способ иммуноферментного определения гепатита С путем выявления антител к пептидной композиции, моделирующей антигенный состав вируса гепатита С (патент RU 2071350). Недостатком данного способа является длительность анализа и то, что способ позволяет определять только вирус гепатита С.
Известна нанодиагностическая тест-система для выявления вируса гепатитов, включающая использование двухканального биосенсора "резонансное зеркало" с биочипом, состоящим из биосенсорной кюветы, в основании которой расположена призма с сопряженным с нею волноводом, образованным из слоя среды с высоким показателем преломления - "nel" и слоя кварца с низким показателем преломления "ncl" толщинами порядка нескольких сотен нанометров в зависимости от материала слоя, к чувствительной поверхности которого, являющейся одновременно поверхностью дна кюветы, иммобилизуются молекулы-зондов, образующие в биологической жидкости специфичные комплексы с макромолекулярными маркерами заболеваний в поверхностном к волноводу слое размером нескольких сотен нанометров, путем взаимодействия молекул антител (анти-HBs) и HBsAg (антигена вируса гепатита В), и/или взаимодействия поверхностного нуклеокапсидного антигена гепатита С и антитела к нему, и/или гибридизацией олигонуклеотидов с комплементарными участками к ДНК вируса гепатита В, и/или гибридизацией олигонуклеотидов с комплементарными участками к РНК вируса гепатита С, с последующим определением изменения коэффициента преломления света в поверхностном слое на границе волновода (Заявка на изобретение RU 2004134192/15). Недостатком данной системы является необходимость наличия специальных приборов для детекции и интерпретации полученных результатов.
Известны иммунохроматографические стрипы для выявления антител к антигенам вируса гепатита С производства фирмы VedaLab (Франция). Недостатком этих тестов является то, что они не позволяют диагностировать другие виды гепатитов. Таким образом универсального экспресс теста, позволяющего дифференциально диагностировать наличие AT классов IgG и IgM к гепатитам А, В и С в настоящее время не предложено.
Известны иммунохроматографические стрипы для выявления HBs-антигена производства фирмы Syntron (США) (наиболее близкий аналог), однако эти тесты позволяют диагностировать только больных гепатитом В.
Задачей, стоящей перед авторами, являлось создание экспресс-системы для комплексной дифференциальной диагностики гепатитов А, В и С путем одновременного определения антител классов G (IgG) и М (IgM) к антигенам этих гепатитов в сыворотке крови пациентов. Для этой цели была предложена конструкция стрипа для непрямого иммунохроматографического анализа, включающая следующие элементы (чертеж):
1) пластиковую подложку (1), покрытую адгезивным слоем (12) с низкой проникающей способностью;
2) смонтированную на ней микропористую нитратцеллюлозную мембрану (2) с напыленной на прилежащую к подложке сторону защитной полимерной основой, причем на мембрану с незащищенной стороны наносили перпендикулярно длинной стороне стрипа смеси антигенов вирусов гепатита А (АГВГА) (3), гепатита В (АГВГВ) (4), гепатита С (АГВГС) (5) таким образом, что полосы были параллельны друг другу;
3) стекловолоконную несорбирующую матрицу - ПЭД (6), на которой были нанесены и иммобилизованы с помощью высушивания полосы, содержащие конъюгаты окрашенных наноколлоидных частиц с моноклональными антителами к иммуноглобулинам G-IgG (7) и М-IgM (8) человека, причем антитела были нанесены перпендикулярно длинной стороне стрипа, при этом полосы были параллельны друг другу;
4) целлюлозный фильтр-отсос (9);
5) нижняя защитная лавсановая маска (10);
6) верхняя защитная лавсановая маска (11).
В процессе иммунохроматографии ПЭД стрипа смачивали исследуемой сывороткой (разведенной или цельной), предположительно содержащей антитела к антигенам одного из вирусов гепатита. В процессе латерального движения образец растворял конъюгаты, находящиеся в ПЭДе, образовывая в случае наличия исследуемых антигенов комплекс конъюгат против IgG (кг α IgG) или конъюгат против IgM (кг α IgM) с антителами (AT) вирусов гепатита А (АТВГА), гепатита В (АТВГВ) и С (АТВГС), которые, в свою очередь, в процессе дальнейшего латерального движения через тест-зоны 3, 4 и 5 связывались с соответствующими антигенами, образуя комплексы кг α IgA-АТВГА-АГВГА, кг α IgB-АТВГВ-АГВГВ, кг α IgC-АТВГС-АГВГС. Такие комплексы, иммобилизуясь в соответствующих тест-зонах, визуализировали наличие соответствующих антител, образуя окрашенные полосы. При отсутствии AT к данным АГ ни одна из полос не окрашивалась, что свидетельствовало об отсутствии контакта пациента с исследуемыми вирусами. Таким образом с помощью одного стрипа удавалось определить антитела классов IgG и IgM человека к АГ вирусов гепатита А, В и С по появлению окрашенных полос в тест-зоне стрипа, причем тип вируса дифференцировался с помощью местоположения окрашенной полосы.
Концентрация смеси антигенов в опытных полосах при нанесении варьировала от 0,1 до 1 мг/мл. В качестве позитивного и негативного контроля реакции использовали сыворотки производства ГИСК им. Тарасевича. Было исследовано по десять сывороток, содержащих каждое из исследованных AT, и десять сывороток доноров, не содержащих таких антител. Эти же сыворотки исследовали с помощью иммуноферментных тест-систем производства ЗАО «Вектор-Бест», Совпадение данных иммуноферментного анализа и иммунохроматографического анализа составили 100%.
Пример 1. На блок, состоящий из пластиковой подложки (1), покрытой адгезивным слоем (12), и смонтированной на нем нитроцеллюлозной мембраной с диаметром пор 10 мкм производства фирмы MDI (Индия), монтировали отсос (9) таким образом, что он на 1 мм перекрывал мембрану, но при этом не выходил за границу подложки (1). На мембрану (2) наносили в концентрации 0,1 мг/мл полосами шириной 1 мм смеси геноинженерных АГ фирмы ООО НПО. Диагностические системы (Россия) в следующем порядке - АГВГС (5) в 1,5 см от края отсоса, АГВГВ (4) - в 2 см, АГВГА (3) - в 2,5 см и высушивали в ламинарном потоке воздуха при 37°С в течение 30 минут. Смеси АГ имели следующий состав:
причем в каждой смеси входящие в нее АГ брали в равных весовых частях.
Конъюгаты наноколлоидных частиц получали путем сорбции моноклональных антител против IgG и IgM на коллоидное золото с диаметром частиц 30 нм фирмы «ImmunoGold» (Великобритания) согласно прилагавшейся к коллоидному золоту прописи. После сорбции конъюгат центрифугировали при десяти тысячах оборотах в минуту и температуре 4°С в течение 30 минут и стабилизировали добавлением к осадку равного объема тридцатитрехпроцентного раствора бычьего сывороточного альбумина (SIGMA, США). Конъюгаты наносили на ПЭД полосой толщиной 2-4 мм и высушивали двумя полосами кг IgG (7) и кг IgM (8) при 37°С. После высушивания ПЭД монтировали на адгезивную поверхность (12) подложки (1), противоположную той, на которой монтировали отсос (9) таким образом, что край ПЭДа на 1 мм выступал над краем мембраны, а противоположный край ПЭДа совпадал с краем блока. Затем поверх ПЭДа монтировали маску таким образом, что она на 1 мм выступала за край ПЭДа на нитроцеллюлозу, а ее противоположный край совпадал с краем блока. Прилежащая к ПЭДу сторона маски была покрыта адгезивным слоем и фиксировалась на ПЭДе и нитроцеллюлозе. Свободная сторона маски была окрашена таким образом, чтобы отличаться от маски, покрывающей отсос. На нее были нанесены стрелки, указывающие на противоположный краю нитроцеллюлозы край ПЭДа. Этот край входит в контакт с образцом в процессе постановки реакции, поэтому стрелки на маске необходимы для исключения неверной ориентации стрипа в ходе анализа. Сверху отсоса монтировали маску таким образом, чтобы она на 1 мм выступала над краем отсоса на нитроцеллюлозу. Ее противоположный край совпадал с краем блока. Адгезивный слой внутренней части маски приклеивал маску к отсосу и нитроцеллюлозе. После окончания монтажа блока его нарезали на стрипы шириной 5 мм и хранили в герметичных пакетах из аллюминизированного ламината с осушителем при температуре 4-25°С.
Испытания полученных стрипов проводили следующим образом. Разведенный в соответствии с инструкцией исследуемые сыворотки помещали в лунки 96-луночной плашки (350 мкл/лунку). В эти же лунки помещали край стрипов, помеченный стрелками. Реакцию учитывали через 10 минут после начала постановки. Было использовано по 10 опытных сывороток, содержащих антитела к ВГА, ВГВ, ВГС, и 10 контрольных сывороток. Совпадение результатов иммунохроматографии с данными ГИСК им. Тарасевича о данных сыворотках оказалось 100%.
Пример 2. Стрипы приготовили аналогично Примеру №1. В тест-зоны 3, 4 и 5 наносили соответственно АГ в концентрации 1 мг/мл - АГВГА (3) - в 2,5 см от края отсоса, АГВГВ (4) - в 2 см, АГВГС (5) в 1,5 см. Было использовано по 10 опытных сывороток, содержащих антитела к ВГА, ВГВ, ВГС, и 10 контрольных сывороток. Совпадение результатов иммунохроматографии с данными ГИСК им.Тарасевича о данных сыворотках оказалось 100%.