Изучение характера взаимоотношений некоторых видов растений с бактериями видов listeria monocytogenes и Yersinia pseudotuberculosis

14. Урусов, В.М. Смена растительного покрова юга Дальнего Востока в связи с проблемами географического районирования и рационального природопользования / В.М. Урусов, О.А. Смирнова, М.Н. Чипизубо-ва; Тихоокеанский ин-т географии ДВНЦ АН СССР. - Владивосток, 1985. - 49 с.

15. Урусов, В.М. О высотных поясах растительности и формационных реликтах в Приморье в связи с изменением климата и морской трансгрессией / В.М. Урусов, Л.С. Лауве // Бот. журн. - 1980. - Т. 65. -№2. - С. 185-197. |

16. Короткий, А.М. Палеогеографические рубежи плейстоцена: принципы выделения, обоснования возраста и корреляция / А.М. Короткий // Развитие природной среды в плейстоцене. - Владивосток: ДВНЦ АН СССР, 1981. - С. 5-28.

17. Кормилицин, А.М. Ботанико-географические закономерности в интродукции деревьев на юге СССР / А.М. Кормилицин // Науч. тр. гос. Никит. ботан. сада. - Ялта, 1964. - Т. 37. - С. 37-56.

18. Культиасов, М.В. Эколого-исторический метод в интродукции растений М.В. Культиасов // Бюл. ГВС. -Вып. 15. - 1953. - С. 24-39.

19. Тахтаджян, А.Л. Флористические области Земли / А.Л. Тахтаджян. - Л.: Наука, 1978. - 247 с.

20. Зайцев, Г.Н. Оптимум и норма в интродукции растений / Г.Н. Зайцев. - М.: Наука, 1983. - 269 с.

21. Петухова, И.П. Эколого-физиологические основы интродукции древесных растений / И.П. Петухова. - М.: Наука, 1981. - 124 с.

22. Петровская-Баранова, Т.П. Физиология адаптации и интродукция растений / Т.П. Петровская-Баранова. -М.: Наука, 1983. - 151 с.

---------♦------------

УДК 631.95 (579.63 9) М.Л. Сидоренко, Л.С. Бузолева

ИЗУЧЕНИЕ ХАРАКТЕРА ВЗАИМООТНОШЕНИЙ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ С БАКТЕРИЯМИ ВИДОВ LISTERIA MONOCYTOGENES И YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS

Исследовали взаимодействие бактерий Listeria monocytogenes и Yersinia pseudotuberculosis с растениями (капуста, кукуруза, морковь, салат), являющимися наиболее предпочтительными для размножения этих бактерий. Показано, что летучие метаболиты прорастающих семян могут являться для листерий и иерсиний единственным источником углерода и энергии; основным летучим веществом, влияющим на рост и размножение изучаемых бактерий, является метанол.

Введение. Listeria monocytogenes и Yersinia pseudotuberculosis, принадлежащие к группе факультативных психрофилов, обладают способностью размножаться в субстрате в условиях низких положительных температур (4-60С) и широком диапазоне рН среды. Сведения о длительном существовании и размножении листерий и иерсиний в различных условиях окружающей среды довольно обширны [4,5,9]. Однако обитание их в растительных сообществах исследовано недостаточно.

Возможно, к факторам, влияющим на колонизацию растений листериями и иерсиниями, можно отнести летучие метаболиты этих растений, так как известно, что летучие органические выделения прорастающих семян, благодаря высокой проникающей способности в почве, доступности для усвоения, могут быть источником углерода и энергии для почвенных микроорганизмов [2]. В настоящее время доказано, что ряд бактерий и грибов при обитании в почве могут потреблять летучие метаболиты прорастающих семян в качестве единственного источника углерода [12, 13].

Целью настоящей работы явилось изучение взаимодействия бактерий видов Listeria monocytogenes и Yersinia pseudotuberculosis и прорастающих семян растений посредством летучих метаболитов.

Объекты и методы исследования. В качестве объектов исследования использовали следующие штаммы бактерий из музея НИИ ЭМ СО РАМН: грамположительные Listeria monocytogenes (штамм 2L, 1/2а серовар) и грамотрицательные Yersinia pseudotuberculosis (штамм 512, 1b серовар). В опыте также исполь-

зовали пророщенные семена растений, являющихся наиболее предпочтительными для иерсиний - капуста (Brassica oleacia), морковь (Daukus carota) и листерий - салат (lactuca sativa), кукуруза (Zea mays L.) [5,8]. Изучение влияния летучих метаболитов прорастающих семян на размножение бактерий проводили с помощью специально сконструированной установки по схеме Шенк и Стоцкого в нашей модификации (рис. 1).

Рис. 1. Схема установки для изучения использования патогенными бактериями летучих метаболитов прорастающих семян: 1 - колба с КОН; 2 - ватные фильтры; 3 - сосуд с почвой и прорастающими семенами; 4 - колба с жидкой средой, инокулированной патогенными бактериями;

5 - перистальтический насос

В качестве источника летучих метаболитов использовали смесь из семян растений (салат, кукуруза, капуста, морковь), а также выращивали отдельно - иерсинии на метаболитах капусты или моркови, а листе-рии - на метаболитах кукурузы или салата.

Проращиваемые семена стерилизовали в слабом растворе марганцовокислого калия и промывали стерильной водой. Стерильные семена помещали в сосуд со стерильной почвой 3, который плотно закупоривали, чтобы в него не поступал воздух из вне. Через сосуд при помощи насоса прокачивали стерильный и очищенный от СО2 воздух. Стерилизацию воздуха осуществляли ватными фильтрами 2, а очистку воздуха от СО2 проводили в ловушке 1, заполненной 30% раствором КОН. Воздух, проходящий через сосуд с почвой и семенами, увлекал летучие метаболиты и поступал в колбу с жидкой минеральной средой 4, инокулиро-ванной культурой исследуемого микроорганизма.

Внутренние поверхности стеклянных частей установки тщательно стерилизовали 70% раствором этилового спирта. Остальные детали стерилизовали автоклавированием. Проращиваемые семена стерилизовали в слабом растворе марганцовокислого калия и промывали стерильной водой. Почву обрабатывали текучим паром трижды по 30 мин. В сосуд с почвой помещали 20-40 штук семян, в зависимости от вида растения. Всю систему помещали в комнате при температуре 20-220С.

Культивирование микроорганизмов проводили на жидкой минеральной среде без источника углерода, содержащей (%): NH4NO3 - 0,3, KH2PO4 - 0,1, MgSO4 7H2O - 0,05, KCl - 0,025, pH= 6,8-7,0.

Инокуляцию 100 мл минеральной среды осуществляли суточными культурами изучаемых бактерий, выращенных на агаризованной среде. Заражающая доза составила 102 колониеобразующих единиц (КОЕ) в

0,1 мл-1. Через определенные промежутки времени отбирали пробы для подсчета количества колоний. Для этого по 0,1 мл инокулированной жидкости с учетом необходимых разведений высевали на плотные среды (для индикации иерсиний использовали среду Серова, для листерий - казеиново-дрожжевой агар с глюкозой). Количество подсчитанных колоний (КОЕ/ 0,1 мл) выражали в lg. В качестве контроля использовали сосуд с почвой без семян.

Определение летучих выделений прорастающих семян осуществляли методом газожидкостной хроматографии. Для хроматографического анализа семена проращивали в плотно закрытых сосудах. Через 24, 48, и 72 ч воздух из сосудов отбирали через резиновые колпачки при помощи 1 мл шприца и вводили его в дозатор хроматографа.

Газожидкостный хроматографический анализ (ГЖХ) летучих метаболитов прорастающих семян проводили на газовом хроматографе «Shimadzu-16A» газ-носитель гелий, температура колонки - 350С, температура испарителя - 1000С, температура детектора (пламенно-ионизационный) - 1000С, давление водорода

и воздуха на детекторе - 0,5 кг/см2. Расчет и обработку хроматограмм проводили на специализированном компьютере «Shimadzu-cR-4A». Определение качественного состава летучих органических веществ производилось путем сравнения полученных хроматографических пиков с пиками, полученными при хроматографическом анализе чистых летучих органических веществ (эталонов) без каких-либо примесей.

Повторность опытов трехкратная, результаты обрабатывались статистически в компьютерной программе электронных таблиц Excel 7 с использованием критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение. На первом этапе исследований изучали влияние летучих метаболитов смеси семян растений (салат, кукуруза, морковь, капуста) на размножение L.monocytogenes и Y.pseudotuberculosis. В результате эксперимента было установлено, что летучие метаболиты взятых в опыт прорастающих семян стимулировали размножение исследуемых бактерий в 10-100 раз в среде, лимитированной по источнику углерода, по сравнению с контролем (рис. 2). Анализ полученных данных позволил сделать заключение, что интенсивность размножения листерий и иерсиний на летучих метаболитах смеси растений зависела от вида бактерий. Так, количество бактерий Y.pseudotuberculosis в минеральной среде по сравнению с листериями увеличилось в 2 раза на 7-е сутки опыта. Полученные результаты подтверждаются данными литературы, где имеются указания на то, что не все бактерии способны усваивать летучие метаболиты прорастающих семян [2]. Следует отметить также, что иерсинии размножались на летучих метаболитах на протяжении всего срока наблюдения (8 суток), а у листерий на 6-е сутки интенсивность размножения значительно снизилась (рис. 2).

Известно, что специфичность действия летучих органических соединений зависит от вида бактерий и проращиваемых семян [2]. В связи с этим нами был изучен рост листерий и иерсиний на метаболитах растений в зависимости от вида проращиваемых семян. Для этого исследуемые бактерии отдельно культивировали на летучих метаболитах прорастающих семян растений, являющихся для них предпочтительными: листерии - на кукурузе и салате, а иерсинии - на метаболитах моркови и капусты.

При сопоставлении данных, полученных при культивировании микроорганизмов на летучих веществах смеси семян и отдельно взятых растениях, наблюдали избирательный рост бактерий в голодной среде с метаболитами прорастающих семян в зависимости от вида растений (рис. 2). Так, иерсинии практически одинаково размножались как на летучих метаболитах моркови, так и на летучих метаболитах капусты, достигая максимальной концентрации 5,6 lg, при заражающей дозе 2,1 lg, что несколько ниже (на 0,4 lg), чем в опыте с использованием смеси семян всех растений. Листерии предпочтительно размножались на летучих метаболитах кукурузы, достигая при этом значений 5,4 lg при заражающей дозе 2,1 lg, что на 2 lg выше по сравнению с ростом на летучих метаболитах смеси растений. При этом регистрировали увеличение численности листерий и иерсиний на протяжении всего срока наблюдения (8 суток). Тогда как в опыте с одновременным использованием семян всех растений увеличение численности листерий не было отмечено, а в контроле интенсивность размножения этих бактерий падала до нуля.

По данным О. А. Берестецкого с сотрудниками (1981), качественный состав летучих выделений может положительно либо отрицательно влиять на процесс потребления органических соединений бактериями. Ряд авторов [7,10] отмечают, что основными компонентами, играющими роль источника углерода и энергии в выделениях прорастающих семян, являются этанол и ацетальдегид. Другие авторы указывают на то, что летучие метаболиты прорастающих семян содержат метанол, пропанол, муравьиный и пропионовый альдегиды, ацетон, этилен [1, 6, 12]. Эти вещества являются энергетически ценными, поэтому могут оказывать физиологическое действие на растущие микроорганизмы, стимулировать или ингибировать потребление основного субстрата [11].

Для выяснения зависимости между ростом численности бактерий и качественным составом летучих метаболитов прорастающих семян был проведен газохроматографический анализ летучих веществ. Из данных хроматографического анализа прорастающих семян кукурузы, моркови, салата, капусты, представленных на рисунке 3, видно, что летучие вещества всех вышеперечисленных растений содержали в достаточно высоких концентрациях ацетальдегид, метанол, этанол. При этом наибольшее количество метанола выделялось проростками кукурузы, гораздо меньше его содержали летучие выделения проростков моркови, капусты и салата. Поскольку в присутствии прорастающих семян кукурузы наблюдалось более интенсивное размножение L. monocytogenes, чем в опытах с салатом и смесью семян, можно предположить, что одним из основных веществ, влияющих на размножение листерий, являлся метанол.

А

6 -

5 -

ч 5! 4 -

S3 О 3 -

2 1

і 4

Сутки

4

2

0

1

3

5

7

8

Б

ад

W

О

2 5

Сутки

2

7 8

зар. доза

1

1

6

Рис. 2. Размножение Y. pseudotuberculosis шт. 512 (А) и L. monocytogenes шт. 10CN (Б) на летучих выделениях прорастающих семян: 1 - смесь семян; 2 - контроль; 3 - морковь;

4 - капуста; 5 - салат; 6 - кукуруза

По данным хроматографических исследований летучие выделения капусты и моркови содержали метанола меньше, чем ацетальдегида (рис. 3). Кроме того, они выделяли меньшее количество метанола, чем кукуруза. Было показано, что при культивировании У. pseudotuberculosís отдельно на летучих метаболитах прорастающих семян моркови и капусты бактерии размножались хуже, чем на летучих метаболитах смеси семян, в состав которых входила кукуруза. Полученные данные позволяют предположить, что в условиях лимитирования источника углерода, иерсинии, так же, как и листерии, используют для питания метанол. В ранее опубликованных нами исследованиях было показано, что метанол в 0,1% концентрации стимулирует размножение иерсиний и листерий в физиологическом растворе и фосфатно-солевом буфере [3].

А

1.58

1

2.40

V

В

Рис. 3. Данные хроматографических исследований летучих метаболитов прорастающих семян:

А - ацетальдегид (контроль); Б - метанол (контроль); В - этанол (контроль); Г - морковь;

Д - кукуруза; Е - капуста; Ж - салат

Таким образом, установлено, что летучие метаболиты прорастающих семян могут являться для лис-терий и иерсиний единственным источником углерода и энергии. При этом обнаружена специфичность действия летучих органических соединений растений на размножение бактерий, которая зависела как от свойств самих бактерий, так и от вида растений. Показано, что основным летучим веществом, влияющим на рост и размножение изучаемых бактерий, является метанол.

Литература

1. Берестецкий, О. А., Кравченко Л.В. // Бюл. ВНИИСХМ. - 1976. - Т.18. - №3. - С. 38.

2. Берестецкий, О.А., КравченкоЛ.В., Азарова Т.С. // Журн. микробиол. - 1981. - Т. 50. - № 5. - С. 898-902.

3. Бузолева, Л.С., Сомов Г.П. // Биохимия. - 1999. - Т.64. - №.10. - 0.1357-1361.

4. Гершун, В.И. // Изв. АН Казахской ССР. Серия биологическая. - Алма-Ата, 1980. - № 6. - 0. 42-44.

5. Гершун, В.И. Экология возбудителей сапронозов / В.И. Гершун. - М., 1988. - С. 80-85.

6. Дадыкин, В.П. Физиолого-биохимические основы взаимодействия растений в фитоценозах / В.П. Дады-кин, Л.Н. Степанов, В.Е. Рыжова. - Киев: Наук. думка, 1970. - С. 118.

7. Кравченко, Л.В. // Микробиологические процессы в почвах и урожайность сельскохозяйственных культур

/ Л.В. Кравченко, А.П. Фомичева. - Вильнюс: Изд-во АН Лит. ССР - 1978. - С. 171.

8. Рожкова, Л.П. Дальневосточная скарлатиноподобная лихорадка (псевдотуберкулез человека) / Л.П. Рожкова. - Владивосток, 1974. - С. 35-38.

9. Сомов, Г.П. Сапрофитизм и паразитизм патогенных бактерий: экологические аспекты / Г.П. Сомов,

В.Ю. Литвин. - Новосибирск: Наука, Сиб. отд-ние, 1988. - 208 с.

10. Griebel, G. E., Owens L. D. // Soil Biol. Biochem. - 1972. - V. 4. - P.1.

11. Rasmussen, R.A., Hutton R. S. // Chemosphere. - 1972. - V. 1. - P. 47.

12. Stotzky, G., Schenk S. // CRC Crit. Revs. Microbiol. - 1976. - V. 4. - P. 333.

13. Weiss, J., Seeliger H. // Appl. Microbiol. - 1975. - V. 30. - № 1. - P. 29-32.

----------♦------------

УДК 630.271 Р.И. Лоскутов

РОСТ И РАЗВИТИЕ ДРЕВЕСНЫХ РАСТЕНИЙ ДЕНДРОФЛОРЫ ЕВРОПЕЙСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ В ДЕНДРАРИИ ИНСТИТУТА ЛЕСА им. В.Н. СУКАЧЕВА СО РАН

Изложены результаты двадцативосьмилетних наблюдений за ростом и развитием некоторых видов древесных растений дендрофлоры европейской части России. Представлены характеристика декоративных свойств растений, особенности фенологии, таксационные данные. Предложены рекомендации по способам размножения и типам посадок.

В связи с ограниченным ассортиментом декоративных деревьев и кустарников, используемых в практике зеленого строительства в крупных промышленных центрах и других населенных пунктах юга Средней Сибири возникла необходимость интродукции древесных растений как из состава местной арборифлоры, так и других ботанико-географических областей. С 1977 года в дендрарии Института леса (г. Красноярск, Академгородок) создается коллекция декоративных древесных растений из различных ботаникогеографических областей бывшего Советского Союза и зарубежных стран. На базе этой коллекции ведутся исследования по интродукции и акклиматизации растений, изучается их рост и развитие в новых условиях, выделяются виды, перспективные для выращивания в южной части Средней Сибири [1]. В настоящем сообщении приводятся результаты исследований по росту и развитию некоторых видов растений дендрофлоры европейской части России в условиях г. Красноярска.

Характеристика условий дендрария

Дендрарий расположен на высокой (250-260 м над у.м.) террасе левого берега Енисея. Его площадь составляет 15,15 га, в том числе дендрария - 8,5, интродукционного питомника - 6,5 и холодных рассадников - 0,15 га. Климат резко континентальный - с холодной зимой и коротким жарким летом. Дата перехода среднесуточной температуры через 0° отмечена весной 11.04 и осенью - 21.10. Вегетационный период начинается с 30.04, заканчивается - 02.10. Продолжительность его 154 дня. Средняя годовая температура воздуха 0,5° С. Абсолютный минимум минус 53° С, абсолютный максимум +38° С. Первый осенний заморозок отмечен в среднем 20.09, последний весенний - 22.05. Среднее количество осадков - 485 мм. Почва в дендрарии дерново-карбонатная, характеризующаяся слабо щелочной (близкой к нейтральной по pH солевому) реакцией среды (7,01 ±0,08), невысоким содержанием гумуса (2,55-0,13%). Органическое вещество минерализовано. В составе поглощающего комплекса преобладает кальций (20,1±0,58 мг-зкв/100 г), содержание магния в слое 0-20 см - 7,13±0,51 мг-зкв/100 г, фосфора - 58±4,93 и калия - 319±8,04 мг на 1 кг почвы. Анализируя состояние азотного питания дерново-карбонтной почвы, следует отметить низкую степень подвижности азота (% легкогидролизуемой фракции от общего содержания азота).