СПОСОБ ОЦЕНКИ ПРИСУТСТВИЯ ФОСФАТИДИЛСЕРИНА НА ПОВЕРХНОСТИ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ
METHOD FOR DETECTING PHOSPHATIDYL SERINE ON ERYTHROCYTE MEMBRANE SURFACE

Предлагаемое изобретение относится к биологии и медицине, а именно к лабораторным методам исследования, и может использоваться для оценки присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов.
Известно, что в эритроцитах фосфолипиды расположены асимметрично. Фосфатидилхолин и сфингомиелин локализованы на внешней половине липидного бислоя, фосфатидилэтаноламин на внешней и внутренней половине мембраны. Отрицательно заряженный фосфолипид фосфатидилсерин локализован исключительно на внутренней стороне липидного бислоя (Zwaal R.F.A., Schroit A.J. Blood. 1997. Vol.89. P.1121-1132). Выход фосфатидилсерина на поверхность мембран клеток крови при многих патологических состояниях ускоряет свертывание крови, приводит к тромботическим состояниям (Zwaal R.F.A, Comfurius P., Bevers E.V. Cell.Mol.Life Sci. 2005. Vol.62. P.971-988).
Лантан, являясь трехвалентным катионом, имеет высокое сродство к фосфатидилсерину и в низких концентрациях избирательно взаимодействует с отрицательно заряженным фосфатидилсерином (Bentz J., Alford О., Cohen J., Duzgunes N. Biophys J. 1988. Vol.53. P.593-607).
Принцип предлагаемого способа оценки присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов основан на электростатическом взаимодействии положительно заряженного лантана с отрицательным фосфатидилсерином. В результате взаимодействия лантана с фосфатидилсерином происходит агрегация эритроцитов.
В качестве прототипа выбран способ оценки присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов, который включает добавление к эритроцитам флюоресцентного белка аннексина V и последующее измерение флюоресценции с помощью проточного цитофлюориметра (Kuypers F.A., Lewis R.A., Hua M. Et al. Blood. l996. Vol.87. P.1179-1183).
Однако для этого требуется дорогостоящее дефицитное оборудование (проточный цитофлюориметр) и дорогие дефицитные реактивы.
Задача предлагаемого изобретения - совершенствование способа.
Технический результат - упрощение способа оценки присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов.
Технический результат достигается за счет того, что в способе? включающем фиксацию эритроцитов с помощью глутарового альдегида, их отмывание, помещение на предметное стекло, обработанное хлористым лантаном, наблюдение за появлением агрегатов, по появлению агрегатов эритроцитов судят о присутствии фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов.
Способ осуществляется следующим образом. Эритроциты фиксируют в 1%-ном растворе глутарового альдегида, приготовленного на фосфатном буфере, в течение 60 мин при комнатной температуре. После фиксации эритроциты трижды отмывают дистиллированной водой с последующим центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 мин. Отмытые эритроциты переносят на предметное стекло, обработанное 0.5 мМ раствором хлористого лантана, перемешивают и наблюдают с помощью светового микроскопа за образованием агрегатов клеток. Появление агрегатов свидетельствует о присутствии фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов.
Известно, что эритроциты кренатной формы (эхиноциты) в отличие от эритроцитов нормальной формы (дискоциты) имеют на поверхности мембраны высокое содержание фосфатидилсерина (Wolfs J.L.N., Comfurius Р., Bevers E.M., Swaal R.F.A. Molecular Membrane Biology. 2003. Vol.20. P.83-91).
В качестве примеров использовали дискоциты и эхиноциты. Эхиноциты получали путем истощения; по АТФ (Feo С., Mohandas N. Nature. 1977. Vol.265. P. 166-168) и после обработки лизофосфатидной кислотой (Chung S.M., Bae O.N., Lim K.M. et al. Arterioscler.Thromb. Vasc.Biol. 2007. Vol.27. P.414-421).
Пример 1. Фиксированные дискоциты помещают на предметное стекло, обработанное лантаном, перемешивают и наблюдают с помощью светового микроскопа. Наблюдается отсутствие агрегатов эритроцитов. На поверхности мембран эритроцитов фосфатидилсерин отсутствует.
Пример 2. Фиксированные эхиноциты, полученные после истощения по АТФ, помещают на предметное стекло, обработанное лантаном, перемешивают и наблюдают с помощью световой микроскопии. Наблюдаются агрегаты эритроцитов. На поверхности мембран эритроцитов присутствует фосфатидилсерин.
Пример 3. Фиксированные эхиноциты, полученные после обработки лизофосфатидной кислотой, помещают на предметное стекло, обработанное лантаном, перемешивают и наблюдают с помощью световой микроскопии. Наблюдаются агрегаты эритроцитов. На поверхности мембран эритроцитов присутствует фосфатидилсерин.
Таким образом, предлагаемый способ оценки присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов не требует специального оборудования.
Преимуществом предлагаемого способа является простота, доступность, быстрота, отсутствие необходимости в сложном дорогостоящем оборудовании и дорогих дефицитных реактивов.