Применение фрагментов гормона роста
APPLICATION OF GROWTH HORMONE FRAGMENTS

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к применению пептидных фрагментов гормона роста для лечения состояний, которые можно лечить гормоном роста без ассоциированных с применением гормона роста побочных эффектов.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Все ссылки, включая любые патенты или заявки на патент, приведенные в настоящем описании, включены в данный документ посредством ссылки для обеспечения полного понимания настоящего изобретения. Тем не менее, такие ссылки не следует понимать как признание того, что любой из этих документов образует часть известного уровня техники, в Австралии или в любой другой стране. При обсуждении приведенной по ссылкам информации указано то, что заявляют их авторы, и заявители оставляют за собой право оспорить точность и релевантность цитируемых документов.
Соматотропин или гормон роста (GH) является мощным анаболическим гормоном, продуцируемым гипофизом в суточных дозах от 0,5 до 0,8 мг у детей и молодых людей. Его продукция быстро снижается с возрастом.
Человеческий гормон роста (hGH) характеризуется рядом метаболических эффектов, наиболее известным из которых является его анаболический эффект. HGH увеличивает приток аминокислот в клетку и уменьшает их отток. Пролиферация клеток усиливается, также как и общий синтез белка и рост новых тканей. HGH также стимулирует продуцирование печенью инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1), и анаболизм, наблюдающийся для hGH, является результатом действия IGF-1. Кроме того, известно, что hGH, в связи с активностью IGF-1, ускоряет трансляцию и транскрипцию нуклеиновых кислот, увеличивает задержку азота, повышает синтез белка, снижает активность рецепторов кортизола, увеличивает гидролиз жиров в жирные кислоты, повышает окисление жиров с выделением калорий, тем самым уменьшая запасы жира, повышает скорость обмена веществ, вызывает задержку исходной жидкости, вызывает резистентность к инсулину, что часто приводит к гипергликемии и увеличению потребности в инсулине.
Преобладающей формой hGH является глобулярный белок с молекулярной массой 22 кДа, состоящий из 191 аминокислотного остатка в одной цепи, свернутый за счет двух дисульфидных связей с малой петлей на карбоксильном конце между остатками 182 и 189. Кристаллографические исследования показывают, что hGH содержит четыре антипараллельные α-спирали, которые расположены в левозакрученной, плотно упакованной спиральной связке. Общепринятой является идея о том, что существуют дискретные функциональные домены внутри молекулы hGH, отвечающие за конкретные метаболические эффекты гормона. Аминотерминальный конец был определен в качестве функционального домена, отвечающего за секрецию IGF-1 и, следовательно, инсулиноподобные действия hGH (Ng (1990) New Antidiabetic Drugs, pp. 197-205). Карбокситерминальный конец был определен как липолитический домен hGH (Ng FM et al. (2000). J. Mol. Endocrin. 25, 287-298).
HGH служит в качестве важного гормона в регуляции роста клеток и органов и в физиологической функции на различных стадиях старения. Например, избыточное продуцирование hGH приводит к развитию гигантизма у детей и акромегалии у взрослых, в то время как недостаточное продуцирование приводит к карликовости у детей и хронической почечной недостаточности. У взрослых дефицит hGH может влиять на метаболизм белков, углеводов, липидов, минералов и соединительной ткани и может приводить к мышечной, кожной или костной атрофии. Другие нарушения, связанные с дефицитом hGH, которые характеризуются недостаточностью роста, включают синдром Прадера-Вилли, задержку внутриутробного развития плода и катаболическое состояние, например, при прохождении химиотерапевтического лечения и при лечении СПИДа.
Многие научные исследования подтверждают, что лечение гормоном роста у взрослых улучшает состав тканей организма (увеличивая мышечную массу и снижая содержание жиров), плотность костной ткани, мышечную силу, сердечно-сосудистые параметры (т.е. снижение уровня холестерина LDL) и качество жизни. Прогрессирующий синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) часто сопровождается потерей мышечной массы ("ассоциированная со СПИДом мышечная атрофия"), и было показано, что hGH улучшает это состояние. HGH применяют для ускорения заживления больших ожогов за счет уменьшения объема распада белков в течение раннего посттравматического периода. HGH применяют в качестве добавки при ограничении калорий при ожирении, так как hGH способствует расщеплению жиров и уменьшает протеолиз. Несколько исследований показали улучшения в способности переносить нагрузки и улучшения сердечной функции у пациентов с дефицитом hGH, которые получали заместительную терапию hGH. Такие пациенты демонстрируют повышенные поглощение кислорода и выходную мощность во время велоэргометрии, ассоциированные с повышением скелетной мышечной массы и улучшением сердечной функции.
Общепризнано, что анаболические эффекты hGH опосредованы секрецией IGF-1. Повышенные уровни IGF-1 могут приводить к снижению чувствительности к инсулину, повышению частоты гипергликемических эпизодов, задержке жидкости, развитию сахарного диабета, акромегалии и некоторых видов рака. Соответственно, клинические применения hGH в настоящее время ограничены.
Целью варианта осуществления настоящего изобретения является обеспечение вариантов лечения состояний, которые можно лечить с помощью гормона роста, без повышения IGF-1.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ
Первый аспект представляет способ:
(a) лечения состояния, при котором введение гормона роста является полезным,
(b) лечения остеоартрита,
(c) повышения продукции, или качества, или восстановления хондроцитов, протеогликана или коллагена или стимулирования формирования или восстановления хрящевой ткани,
(d) стимулирования или улучшения восстановления, формирования или функции мышечной массы, связок или сухожилий или
(e) лечения воспалительных заболеваний, травм или генетических заболеваний мышечной или соединительной ткани,
включающий введение субъекту эффективного количества пептида, содержащего карбокситерминальную последовательность из гормона роста и не содержащего домен гормона роста, ответственный за продукцию IGF-1.
Альтернативная форма первого аспекта представляет композицию для лечения состояния, при котором введение гормона роста является полезным, для лечения остеоартрита, для повышения продукции, или качества, или восстановления хондроцитов, протеогликана или коллагена или стимулирования формирования или восстановления хрящевой ткани, для стимулирования или улучшения восстановления, формирования или функционирования мышечной массы, связок или сухожилий или для лечения воспалительных заболеваний, травм или генетических заболеваний мышечной или соединительной ткани, при этом композиция содержит пептид, содержащий карбокситерминальную последовательность из гормона роста и не содержащий домен гормона роста, ответственный за продукцию IGF-1.
Дополнительная альтернативная форма первого аспекта представляет применение пептида, содержащего карбокситерминальную последовательность из гормона роста и не содержащего домен гормона роста, ответственный за продукцию IGF-1, в производстве лекарственного препарата для лечения состояния, при котором введение гормона роста является полезным, для лечения остеоартрита, для повышения продукции, или качества, или восстановления хондроцитов, протеогликана или коллагена или стимулирования формирования или восстановления хрящевой ткани, для стимулирования или улучшения восстановления, формирования или функции мышечной массы, связок или сухожилий или для лечения воспалительных заболеваний, травм или генетических заболеваний мышечной или соединительной ткани.
В варианте осуществления первого аспекта состоянием не является ожирение или болезнь костей.
В варианте осуществления первого аспекта пептид способен повышать дифференцировку клеток в миобласты.
Второй аспект представляет способ лечения состояния, связанного с недостаточностью функции хондроцитов или недостаточностью функции хрящевой ткани, при этом способ включает введение субъекту, нуждающемуся в таком введении, пептида, содержащего карбокситерминальную последовательность из гормона роста и не содержащего домен гормона роста, ответственный за продукцию IGF-1.
Альтернативная форма второго аспекта представляет композицию для лечения состояния, связанного с недостаточностью функции хондроцитов или недостаточностью функции хрящевой ткани, при этом композиция содержит эффективное количество пептида, содержащего карбокситерминальную последовательность из гормона роста и не содержащего домен гормона роста, ответственный за продукцию IGF-1.
Дополнительная альтернативная форма второго аспекта представляет применение пептида, содержащего карбокситерминальную последовательность из гормона роста и не содержащего домен гормона роста, ответственный за продукцию IGF-1, в производстве лекарственного препарата для лечения состояния, связанного с недостаточностью функции хондроцитов или недостаточностью функции хрящевой ткани.
В варианте осуществления второго аспекта состоянием является остеоартрит.
В варианте осуществления первого и второго аспектов пептид содержит карбокситерминальную последовательность из человеческого гормона роста или карбокситерминальную последовательность из гормона роста животного, отличного от человека.
В варианте осуществления первого и второго аспектов пептид способен стимулировать продукцию или регенерацию хондроцитов. В варианте осуществления первого и второго аспектов пептид способен стимулировать продукцию или регенерацию хрящевой ткани. В варианте осуществления первого и второго аспектов пептид способен повышать дифференцировку мезенхимальных клеток в хондроциты или хрящевую ткань. Способы позволяют получить повышенную продукцию или восстановление хондроцитов. Они также повышают продукцию или восстановление хрящевой ткани.
В варианте осуществления первого и второго аспектов пептид способен стимулировать продукцию протеогликана. В варианте осуществления первого и второго аспектов пептид способен стимулировать продукцию коллагена. В варианте осуществления первого и второго аспектов способы стимулируют продукцию хрящевой ткани, хондроцитов и/или протеогликанов в поврежденном хряще.
В варианте осуществления первого и второго аспектов, пептид вводят на или в средстве, имплантате, устройстве медицинского назначения, протезе или каркасе для клеток.
В варианте осуществления первого и второго аспектов состояние является таким, при котором полезным является анаболический эффект белка, включая регенерацию после травмы, для лечения ожогов или стимулирования роста, восстановления, силы, формирования или функционирования мышечной ткани, сухожилий и связок.
В варианте осуществления первого и второго аспектов пептид содержит AOD9604(SEQ ID NO:1).
В варианте осуществления первого и второго аспектов пептид фактически состоит из AOD9604 (SEQ ID NO:1).
В варианте осуществления первого и второго аспектов введение пептида или лекарственного препарата не приводит к увеличению IGF-1 в сыворотке и, следовательно, лечение обеспечивает терапевтический эффект в отсутствие побочных эффектов, связанных с увеличенным уровнем IGF-1 в сыворотке.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фигуре 1 показано содержание ДНК для культуры хондроцитов в течение 3 недель на фильтре при обработке AOD (SEQ ID NO:1), из которого видно, что обработка не оказывает токсического воздействия на клетки.
На фигуре 2 показано содержание протеогликана для культуры хондроцитов в течение 3 недель на фильтре при обработке AOD (SEQ ID NO:1).
На фигуре 3 показано содержание коллагена для культуры хондроцитов в течение 3 недель на фильтре при обработке AOD (SEQ ID NO:1).
На фигуре 4 показано, что AOD (SEQ ID NO:1) не оказывает никакого влияния на содержание ДНК в нативном хряще.
На фигурах 5 и 7 показано, что AOD (SEQ ID NO:1) не влияет на содержание протеогликана в нативном хряще.
На фигурах 6 и 8 показано, что AOD (SEQ ID NO:1) не влияет на содержание коллагена в нативном хряще.
На фигуре 9 показано, что AOD (SEQ ID NO:1) индуцирует дифференцировку клеток С2С12 в миобласты после 24 часов обработки.
На фигуре 10 показано, что AOD (SEQ ID NO:1) индуцирует дифференцировку клеток С2С12 в миобласты после 3 дней обработки.
На фигурах 11 и 12 показано, что обработка AOD (SEQ ID NO:1) не повышает формирование мышечных трубочек или не изменяет пролиферацию клеток.
На фигуре 13 показан гистологический анализ латеральных и медиальных мыщелков правого коленного сустава модели остеоартрита кроликов, получавших лечение Группы 1 (4 еженедельных инъекции наполнителя).
На фигуре 14 показан гистологический анализ латеральных и медиальных мыщелков правого коленного сустава модели остеоартрита кроликов, получавших лечение Группы 2 (4 еженедельных инъекции по 6 мг НА-гиуран-плюс).
На фигуре 15 показан гистологический анализ латеральных и медиальных мыщелков правого коленного сустава модели остеоартрита кроликов, получавших лечение Группы 3 (4 еженедельных инъекции по 0,25 мг AOD9604).
На фигуре 16 показан гистологический анализ латеральных и медиальных мыщелков правого коленного сустава модели остеоартрита кроликов, получавших лечение Группы 4 (4 еженедельных инъекции как НА, так и AOD9604).
ОПИСАНИЕ
Ng, FM et al., (1990) supra, определяет аминотерминальный конец человеческого гормона роста как функциональный домен, который отвечает за секрецию IGF-1 и, следовательно, за инсулиноподобные действия hGH.
В патенте Австралии №693478, от Университета Монаша, описано применение пептида, полученного из карбокситерминальной последовательности человеческого гормона роста, или соответствующего участка из гормона роста других видов млекопитающих для контроля ожирения. Этот участок гормона роста обладает способностью модулировать метаболизм липидов. В частности, было обнаружено, что синтетический пептид, соответствующий аминокислотным остаткам 177-191 последовательности человеческого гормона роста (далее в настоящем документе называемого hGH 177-191) снижал набор массы тела и массы жировой ткани в модельной системе для изучения ожирения, мыши линии C57BI/6J (Ob/Ob). Последующая заявка, PCT/AU98/00724, от Metabolic Pharmaceuticals Ltd, раскрывает аналоги пептида hGH177-191, которые обладают такой же активностью. PCT/AU00/01362 (WO01/33977), также от Metabolic Pharmaceuticals Limited, раскрывает неожиданную активность таких пептидов при пероральном приеме.
Клинические испытания конкретного аналога hGH 177-191, который обозначается как AOD9604 и имеет последовательность, представленную как SEQ ID NO:1 ниже, показали, что эффективная доза пептида не повышала уровень IGF-1 в плазме. Следовательно, было показано, что AOD9604 и другие С-терминальные фрагменты гормона роста на метаболизм липидов оказывают влияние, отличное от какого-либо влияния на секрецию IGF-1. Это было особенно удивительно, так как в данной области техники уже давно считалось, что влияния hGH модулируются секрецией IGF-1.
SEQ ID NO:1 Tyr-Leu-Arg-lle-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe (AOD9604 или Tyr-hGH 177-191)
Дополнительная работа по AOD9604 и другим С-терминальным фрагментам гормона роста показала влияние на метаболизм костной ткани, в частности, повышенное формирование остеобластов или отсутствие увеличения формирования остеокластов. Это было тем более неожиданно, поскольку в данной области техники давно считалось, что влияние полной формы человеческого гормона роста на метаболизм костной ткани осуществлялся за счет увеличенной секреции IGF-1, что не происходит при введении AOD9604. Это изобретение описано в PCT/AU05/00638 от Metabolic Pharmaceuticals Ltd.
Полные раскрытия AUG693478, PCT/AU98/00724, PCT/AU00/01362 и PCT/AU05/00638 включены в настоящий документ путем данной ссылки.
Авторы настоящего изобретения сейчас определили, что, к удивлению, применяемые C-терминальные фрагменты гормона роста, в частности AOD9604 (SEQ ID NO:1) оказывают анаболический эффект на хондроциты и мышечную ткань. Ранее считалось, что анаболический эффект hGH на хондроциты и мышечную ткань регулировался секрецией IGF-1 под действием человеческого гормона роста и что поскольку IGF-домен не присутствует в C-терминальных фрагментах гормона роста, то C-терминальные пептиды гормона роста не будут оказывать анаболический эффект, поскольку у них отсутствует функциональный домен hGH. Авторы настоящего изобретения показали, что это не так, что, таким образом, сделало возможным осуществление вариантов лечения с помощью C-терминального пептида гормона роста без повышенной секреции IGF-1 и связанных с его применением побочных эффектов.
Например, авторы настоящего изобретения теперь определили, что C-терминальные фрагменты гормона роста, в частности AOD9604 (SEQ ID NO:1), способны увеличивать число хондроцитов, уровень протеогликана, коллагена и их продукцию или качество, восстановление или регенерацию и, соответственно, могут повышать продукцию или качество хрящевой ткани. Несмотря на то, что ранее было известно, что человеческий гормон роста стимулирует пролиферацию хондроцитов, полагали, что данные виды лечения приводят к повышенной секреции IGF-1. Кроме того, авторы настоящего изобретения теперь показали, что C-терминальные фрагменты гормона роста могут индуцировать дифференцировку в миобласты что, следовательно, указывает на возможность применения фрагментов при состояниях, требующих роста мышечной ткани. Авторы настоящего изобретения ранее показали, что применяемый ими C-терминальный фрагмент гормона роста не вызывает повышения уровней IGF в плазме. Новые результаты предоставляют осуществления видов терапии без повышенной секреции IGF-1 и связанных с его применением побочных эффектов.
Побочные эффекты, которых следует избегать, включают по меньшей мере один из следующих: повышенная резистентность к инсулину, повышенная потребность в инсулине, задержка жидкости, гиперкальциемия и акромегалия.
ВИДЫ ЛЕЧЕНИЯ
Настоящее изобретение в одном аспекте касается лечения состояний. Термины "осуществление лечения" и "лечение", используемые в настоящем документе, касаются уменьшения тяжести и/или частоты симптомов, устранения симптомов и/или вызвавшей их причины, предупреждения возникновения симптомов (профилактики) и/или вызвавшей их причины, и уменьшения повреждения или восстановления после повреждения. Таким образом, например, настоящий способ "осуществления лечения" состояния охватывает как предупреждения состояния у предрасположенного к этому субъекта, так и лечение состояния у субъекта с клинической симптоматикой и лечение здорового индивидуума для получения полезного эффекта.
Используемый в настоящем документе термин "осуществление лечения" охватывает любое лечение, восстановление после состояния или предупреждение состояния у позвоночных животных, млекопитающих, в частности человека или домашних, племенных, сельскохозяйственных животных или животных из зоопарка, и включает подавление состояния, т.е. остановку его развития; или устранения или облегчения эффектов состояния, т.е. вызывает регрессию эффектов состояния и получение полезного эффекта.
Используемый в настоящем документе термин "профилактика" или "профилактическая" или "предупредительная" терапия включает предупреждение состояния или облегчение последующего прогрессирования состояния у субъекта, который может быть предрасположен к такому состоянию, но у которого оно еще не было диагностировано.
Используемый в настоящем документе термин "состояние" относится к любому отклонению от нормального здорового состояния и включает заболевание, нарушение, дефект или повреждение, такое как повреждение, вызванное травмой, и ухудшение здоровья в связи с возрастом, воспалительным, инфекционным или генетическим нарушением или в связи с воздействием окружающей среды.
Состояния, при которых полезным является введение фактора роста, раскрыты в предшествующем уровне техники, например в US 2011/0112021 и WO 2011/038205. Из них состояния, которые можно лечить в соответствии с настоящим изобретением, в целом, можно разделить на категории состояний, при которых желательно повышенное формирование или функция хондроцитов, коллагена, протеогликана, хрящевой или мышечной массы. Состояния, которые можно лечить с помощью настоящего изобретения, включают остеоартрит; ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит; ВИЧ-инфекцию у детей, получающих лечение с использованием HAART (дети с ВИЧ/HALS); дисплазию скелета; гипохондроплазию; ахондроплазию; лечение пациентов после хирургической операции на сухожилиях или связках руки, колена или плеча; дистракционный остеогенез; нарушения, являющиеся результатом замены тазобедренного сустава или диска, восстановления мениска, спондилодеза или фиксации протеза, например, в колене, бедре, плече, локте, запястье или челюсти; нарушения, являющиеся результатом фиксации материала для остеосинтеза, такого как гвозди, винты и пластинки; не сращение или неправильное сращение переломов; нарушения, являющиеся результатом остеотомии, например голени или первого пальца стопы; нарушения, являющиеся результатом пересадки трансплантата; дегенерацию суставной хрящевой ткани в коленном суставе, вызванную травмой или артритом; хронический диализ у взрослых пациентов (APCD); связанное с недостаточным питанием сердечно-сосудистое заболевание у пациентов с APCD; реверсию кахексии у пациентов с APCD; хроническую обструктивную болезнь легких у пациентов с APCD; ВИЧ у пациентов с APCD; пожилых людей с APCD; хроническое заболевание печени у пациентов с APCD, синдром усталости у пациентов с APCD; нарушение функции печени; мужчин с ВИЧ-инфекций; ВИЧ-ассоциированный синдром липодистрофии (HALS); мужское бесплодие; лечение пациентов после обширной плановой операции, алкогольную/лекарственную детоксикацию или неврологическую травму; старение; ослабленных пожилых лиц; травматические повреждения хрящевой ткани; фибромиалгию; нарушения памяти; травматические повреждения головного мозга; субарахноидальное кровоизлияние; очень низкий вес при рождении; фиброз миокарда; идиопатическую дилатационную кардиомиопатию; неврологическое заболевание или расстройство; нейродегенерацию; задержку или нарушение роста; сердечно-сосудистое заболевание или нарушение; вирусный синдром (например, СПИД); сахарный диабет; осложнения диабета (например, ретинопатию); анорексию; булимию; раковую кахексию; СПИД; ассоциированную со СПИДом потерю массы; кахексию; потерю массы; заболевания почек или нарушения функции почек; воспалительное заболевание или расстройство; воспаление; синдром Прадера-Вилли (PWS); хроническую почечную недостаточность (CRI); старение; терминальную стадию почечной недостаточности; терминальную стадию болезни почек (ESRD); муковисцидоз; эректильную дисфункцию; ВИЧ-ассоциированную липодистрофию; скелетную дисплазию; синдром Нунана; вызванную глюкокортикоидами миопатию; инфекции; сахарный диабет; гипертонию; рассеянный склероз; сердечную недостаточность; гематому, язвенный колит и ожоги.
Используемый в данном документе термин "неврологическое заболевание или расстройство" относится к любому заболеванию или расстройству нервной системы и/или зрительной системы, за исключением депрессии. "Неврологическое заболевание или расстройство" включает заболевание или расстройства, которые затрагивают центральную нервную систему (головной мозг, мозговой ствол и мозжечок), периферическую нервную систему (включая черепно-мозговые нервы) и вегетативную нервную систему (части которой расположены как в центральной, так и в периферической нервной системе). Примеры неврологического расстройства включают, но без ограничений, головную боль, ступор и кому, деменцию, пароксизм, нарушения сна, травмы, инфекции, новообразования, нейро-офтальмологические нарушения, нарушения движения, демиелинизирующие заболевания, нарушения со стороны спинного мозга и нарушения периферических нервов, мышечной ткани и нервно-мышечных синапсов. Ниже приведен список некоторых неврологических нарушений, симптомов, признаков и синдромов, которые можно лечить в соответствии с настоящим изобретением: приобретенная эпилептиформная афазия; острый рассеянный энцефаломиелит; адренолейкодистрофия; возрастная макулярная дегенерация; агенезия мозолистого тела; агнозия; синдром Айкарди; болезнь Александера; болезнь Альперса; альтернирующая гемиплегия; сосудистая деменция; латеральный амиотрофический склероз; анэнцефалия; синдром Ангельмана; ангиоматоз; кислородное голодание; афазия; апраксия; киста паутинной оболочки; арахноидит; мальформация Арнольда-Киари; артериовенозная мальформация; синдром Аспергера; атаксия-телеангиэктазия; синдром дефицита внимания и гиперактивности, аутизм; вегетативная дисфункция; боли в спине; болезнь Баттена; болезнь Бехчета; паралич Белла; доброкачественный эссенциальный блефароспазм; доброкачественная очаговая амиотрофия; доброкачественная внутричерепная гипертензия; болезнь Бинсвангера; блефароспазм; синдром Блоха-Сульцбергера; повреждение плечевого сплетения; абсцесс головного мозга; повреждение головного мозга; опухоли головного мозга (включая мультиформную глиобластому); опухолей спинного мозга; синдром Броун-Секара; болезнь Канавана; синдром запястного канала; каузалгия; центральный болевой синдром; центральный понтинный миелинолиз; цефалгическое расстройство; церебральная аневризма; церебральный атеросклероз; церебральная атрофия; церебральный гигантизм; церебральный паралич; болезнь Шарко-Мари-Тута; индуцированная химиотерапией нейропатия и невропатическая боль; хорея; хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия; хроническая боль; хронический региональный болевой синдром; синдром Коффина-Лоури; кома, включая персистирующее вегетативное состояние; врожденная диплегия лицевых нервов; кортикобазальная дегенерация; краниальный артериит; краниосиностоз; синдром Крейтцфельда-Якоба; кумулятивные травматические нарушения; синдром Кушинга; инклюзионная цитомегалия; цитомегаловирусная инфекция; синдром пляшущих глаз-пляшущих ног; синдром Денди-Уокера; энцефалит Доусона; синдром де Морсье; паралич Дежерин-Клюмпке; деменция; дерматомиозит; диабетическая нейропатия; диффузный склероз; вегетативная дисфункция; дисграфия; дислексия; дистония; ранняя детская эпилептическая энцефалопатия; синдром пустого турецкого седла; энцефалит; энцефалоцеле; энцефалотригеминальный ангиоматоз; эпилепсия; паралич Эрба; эссенциальный тремор; болезнь Фабри; синдром Фара; обмороки; семейный спастический паралич; фебрильные судороги; синдром Фишера; атаксия Фридрейха; деменция лобно-височного типа и другие "таупатии"; болезнь Гоше; синдром Герстманна; гигантоклеточный артериит; цитомегаловирусная инфекция; лейкодистрофия глобоидных клеток; синдром Гийена-Барре; HTLV-1-ассоциированная миелопатия; болезнь Галлервордена-Шпатца; черепно-мозговая травма; головная боль; гемифациальный спазм; наследственная спастическая параплегия; синдром Рефсума; синдром коленчатого узла; опоясывающий лишай; синдром Хираяма; ВИЧ-ассоциированная деменция и нейропатия; аринэнцефалия; болезнь Хантингтона и другие заболевания, связаные с полиглутаминовыми повторами; гидроанэнцефалия; гидроцефалия; гиперкортицизм; гипоксия; иммуноопосредованный энцефаломиелит; миозит с включенными тельцами; инфантильный пигментный дерматоз; болезнь накопления фитановой кислоты; болезнь Рефсума; инфантильные спазмы; воспалительные миопатии; внутричерепная киста; внутричерепная гипертензия; синдром Жубера; синдром Кернса-Сейра; болезнь Кеннеди; синдром Кинсбурна; синдром Клиппеля-Фейля; болезнь Краббе; болезнь Кугельберга-Веландера; куру; болезнь Лафора; миастенический синдром Ламберта-Итона; синдромом Ландау-Клеффнера; латеральный медуллярный синдром (синдром Валленберга);        нарушение обучаемости; болезнь Лея; синдром Леннокса-Гасто; синдром Леша-Нихена; лейкодистрофия; деменция с тельцами Леви; лиссэнцефалия; синдром "запертого человека"; болезнь Лу Герига (т.е. заболевания двигательных нейронов или амиотрофический латеральный склероз); заболевание межпозвоночных дисков; болезнь Лайма - неврологические последствия; болезнь Мачадо-Джозефа; макроэнцефалия; мегаэнцефалия; синдром Мелькерсона-Розенталя; болезнь Меньера; менингит; болезнь Менкеса; метахроматическая лейкодистрофия; микроцефалия; мигрень; синдром Миллера-Фишера; микроинсульты; митохондриальные миопатии; синдром Мебиуса; мономелическая амиотрофия; заболевание двигательных нейронов; болезнь Моямоя; мукополисахаридоз; деменция, связанная с множественными инфарктами; мультифокальная двигательная нейропатия; рассеянный склероз и другие демиелинизирующие расстройства; мультисистемная атрофия с ортостатической гипотензией; мышечная дистрофия; миастения; миелокластический диффузный склероз; миоклоническая энцефалопатия новорожденных; миоклонус; миопатия; врожденная миотония; нарколепсия; нейрофиброматоз; злокачественный нейролептический синдром; неврологические проявления СПИДа; неврологические осложнения волчанки; нейромиотония; нейронный цероидный липофусциноз; нарушения нейрональной миграции; болезнь Ниман-Пикка; синдром О'Салливан-Маклеода; невралгия затылочного нерва; скрытая дизрафия спинного мозга; синдром Отахара; оливопонтоцеребеллярная атрофия; опсо-миоклональный синдром; неврит зрительного нерва; ортостатическая гипотензия; травма от постоянного напряжения; парестезии; нейродегенеративное заболевание или расстройство (болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, болезнь Альцгеймера, латеральный амиотрофический склероз (ALS), деменция, рассеянный склероз и другие заболевания и нарушения, связанные с гибелью нейронов); врожденная парамиотония; паранеопластические заболевания; пароксизмальные приступы; болезнь Парри-Ромберга; болезнь Пелицеуса-Мерцбахера; периодические параличи; периферическая нейропатия; болезненная нейропатия и нейропатические боли; персистирующее вегетативное состояние; распространенные нарушения развития; световой чихательный рефлекс; болезнь накопления фитановой кислоты; болезнь Пика; защемление нерва; опухоли гипофиза; полимиозит; порэнцефалия; постполиомиелитный синдром; постгерпетическая невралгия; постинфекционный энцефаломиелит; постуральная гипотензия; синдром Прадера-Вилли; первичный латеральный склероз; прионные заболевания; прогрессирующая гемифациальная атрофия; прогрессирующая мультифокальная лейкоэнцефалопатия; прогрессирующая склерозирующая полиодистрофия; прогрессирующий супрануклеарный парез взора; доброкачественная внутричерепная гипертензия; синдром Рамсей-Ханта (типы I и II); энцефалит Расмуссена; синдром рефлекторной симпатической дистрофии; болезнь Рефсума; повторяющиеся нарушения движения; повторяющиеся индуцированные стрессом травмы; синдром беспокойных ног; ретровирус-ассоциированная миелопатия; синдром Ретта; синдром Рея; хорея; болезнь Сандхоффа; болезнь Шильдера; шизэнцефалия; септо-оптическая дисплазия; синдром детского сотрясения; опоясывающий лишай; синдром Шая-Дреджера; синдром Шегрена; апноэ во сне; синдром Сото; спастичность; расщепление позвоночника; повреждение спинного мозга; опухоли спинного мозга; спинальная мышечная атрофия; синдром мышечной скованности; инсульт; синдром Стерджа-Вебера; под острый склерозирующий панэнцефалит; подкорковая артериосклеротическая энцефалопатия; хорея Сиденгама; обмороки; сирингомиелия; поздняя дискинезия; болезнь Тея-Сакса; височный артериит; скрытая дизрафия спинного мозга; болезнь Томсена; синдром грудного выхода; невралгия тройничного нерва; паралич Тодда; синдром Туретта; транзиторная ишемическая атака; передающиеся губчатые энцефалопатии; поперечный миелит; травматическое повреждение головного мозга; тремор; невралгия тройничного нерва; тропический спастический парапарез; туберозный склероз; сосудистая деменция (мультиинфарктная деменция); васкулит, включая височный артериит; болезнь Гиппеля-Линдау; синдром Валленберга; Болезнь Верднига-Хоффмана, синдром Веста; травма от внезапного резкого движения головы; синдром Уильямса; болезнь Вильсона и синдром Зеллвегера.
Используемый в данном документе термин "воспаление" относится к системным воспалительным состояниям и состояниям, локально ассоциированным с миграцией и привлечением моноцитов, лейкоцитов и/или нейтрофилов. Примеры воспалений включают, но без ограничений, воспаление, являющееся результатом инфицирования патогенными организмами (включая грамположительные бактерии, грамотрицательные бактерии, вирусы, грибы и паразиты, такие как простейшие и гельминты), отторжение трансплантата (включая отторжение паренхиматозных органов, таких как почки, печень, сердце, легкие или роговица, а также отторжение трансплантатов костного мозга, включая реакцию "трансплантат против хозяина" (GVHD)), или являющиеся результатом локализованного хронического или острого аутоиммунного заболевания или аллергических реакций.
Аутоиммунные заболевания включают острый гломерулонефрит; ревматоидный или реактивный артрит; хронический гломерулонефрит; воспалительные заболевания кишечника, такие как болезнь Крона, неспецифический язвенный колит и некротический энтероколит; гепатит; сепсис; алкогольная болезнь печени; неалкогольный стеатоз; синдромы, ассоциированные с переливанием гранулоцитов; воспалительные дерматозы, такие как контактный дерматит, атопический дерматит, псориаз; системная красная волчанка (SLE), аутоиммунный тиреоидит, рассеянный склероз и некоторые формы диабета или любое другое аутоиммунное состояние, при котором атака собственной иммунной системы субъекта приводит к разрушению патологической ткани.
Аллергические реакции включают аллергическую астму, хронический бронхит, реакции гиперчувствительности немедленного типа и реакции гиперчувствительности замедленного типа.
Системные воспалительные болезненные состояния включают воспаление, ассоциированное с травмой, ожогами, реперфузией после ишемических явлений (например, тромбообразования в сердце, головном мозге, кишечнике или периферических сосудах, включая инфаркт миокарда и инсульт), сепсис, ARDS или синдром полиорганной недостаточности. Вовлечение воспалительных клеток также происходит в атеросклеротических бляшках.
Воспаление включает, но без ограничений, неходжкинскую лимфому, гранулематоз Вегенера, тиреоидит Хашимото, гепатоцеллюлярную карциному, атрофию вилочковой железы, хронический панкреатит, ревматоидный артрит, реактивную лимфоидную гиперплазию, остеоартрит, язвенный колит, папиллярную карциному, болезнь Крона, язвенный колит, острый холецистит, хронический холецистит, цирроз, хронический сиаладенит, перитонит, острый панкреатит, хронический панкреатит, хронический гастрит, аденомиоз, эндометриоз, острый цервицит, хронический цервицит, лимфоидную гиперплазию, рассеянный склероз, гипертрофию на фоне идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, первичную lgA-нефропатию, системную красную волчанку, псориаз, эмфизему легких, хронический пиелонефрит и хронический цистит. Сердечно-сосудистое заболевание или расстройство включает те нарушения, которые могут или быть причиной ишемии, или вызваны реперфузией сердца. Примеры таких заболеваний или расстройств включают, но без ограничений, атеросклероз, ишемическую болезнь сердца, гранулематозный миокардит, хронический миокардит (не гранулематозный), первичную гипертрофическую кардиомиопатию, заболевание периферических артерий (PAD), заболевание периферических сосудов, венозную тромбоэмболию, тромбоэмболию легочной артерии, инсульт, стенокардию, инфаркт миокарда, сердечно-сосудистые повреждения тканей, вызванные остановкой сердца, сердечнососудистые повреждения тканей, вызванные шунтированием сердца, кардиогенный шок и сопутствующие состояния, которые известны средним специалистам в данной области техники, или которые включают дисфункцию или повреждение тканей сердца или сосудов, особенно, но без ограничений, повреждение тканей, связанное с активацией GH.
Сердечно-сосудистые заболевания включают, но без ограничений, атеросклероз, гранулематозный миокардит, инфаркт миокарда, фиброз миокарда на фоне порока клапана сердца, фиброз миокарда без инфаркта миокарда, первичную гипертрофическую кардиомиопатию и хронический миокардит (негранулематозный).
Другие виды лечения, предложенные для гормона роста и, таким образом, для настоящего изобретения, включают восстановление нервной ткани, купирование боли, репарацию нервной ткани и рост нервных волокон. Известный уровень техники также предполагает, что гормон роста можно применять для усиления роста ногтей и волос и, таким образом, представлять собой лечение облысения и аллопеции.
Специалистам в данной области техники будет понятно, что лица, страдающие одним или несколькими состояниями, описанными выше, могут проходить лечение hGH в соответствии с методиками известного уровня техники, но что такое лечение сопровождалось бы нежелательными побочными эффектами, вызванными повышенным уровнем IGF-1. Авторы настоящего изобретения, соответственно, предлагают лечить такие состояния С-терминальным фрагментом гормона роста, описываемым в данном документе, без повышения уровня IGF-1 и побочных эффектов, которые он вызывает.
Кроме того, авторы настоящего изобретения показали особые варианты применения С-терминального фрагмента гормона роста, которые могли или не могли представляться для полной формы гормона роста.
Хондроциты являются единственными клетками, обнаруживаемыми в хряще. Они производят и поддерживают хрящевую матрицу, состоящую главным образом из коллагена II типа, протеогликанов и эластина.
Хрящ представляет собой гибкую соединительную ткань, обнаруживаемую во многих участках организмов человека и животных, включая суставы между костями, грудную клетку, ухо, нос, локоть, колено, лодыжку, бронхиолы и межпозвоночные диски. В отличие от других соединительных тканей, хрящ не содержит кровеносных сосудов и таким образом обладает ограниченными возможностями восстановления. Поскольку хондроциты располагаются в связанном состоянии в лакунах, они не могут мигрировать в поврежденные участки. Следовательно, если хрящ повреждается, его заживление является трудным и медленным.
Для целей настоящего раскрытия состояния, которые могут подвергать лечению, включают состояния, связанные с хондроцитами, для которых полезный эффект оказывают восстановление или новый рост хрящевой ткани или хондроцитов. Данные состояния, однако, не являются исключительными и используются описательно для подчеркивания преимущества раскрываемых в настоящее время способов.
Состояния, связанные с хондроцитами, включают поражения суставов, при которых повреждается хрящ, и включают повреждения хряща, вызванные декомпрессией верхней суставной поверхности большеберцовой кости.
Остеоартрит является многофакторным заболеванием и его развитие зависит от особенностей телосложения, генетики и гормонального статуса.
При остеоартрите хрящ, покрывающий кости (суставной хрящ - разновидность гиалинового хряща) истончается, в конце концов, полностью изнашиваясь, приводя к формированию сустава, в котором соприкасаются две кости, что сопровождается снижением подвижности и болью. Существующие в настоящее время терапевтические методы направлены на уменьшение боли и увеличение функциональной возможности сустава. Неинвазивные вмешательства, такие как физические упражнения и потеря веса, относятся к терапии первой линии с последующим приемом противовоспалительных препаратов. Последние облегчают симптомы, но не подавляют процессы, которые приводят к характерным для этого заболевания изменениям и могут фактически ускорить разрушение сустава. Неэффективность данных видов лечения, как правило, завершается хирургическим вмешательством (артропластика). Замена сустава является чрезвычайно успешной в отношении восстановления подвижности пациента и уменьшения болевых ощущений. Тем не менее, неудачная имплантация в результате остеолиза и асептическое расшатывание протеза из-за воздействий продуктов износа или утрата костной ткани в связи с биомеханическими процессами, ограничивают срок службы этих имплантатов, делая необходимым проведение ассоциированной с более высоким риском ревизионной хирургической операции, ценой повышенной смертности пациентов и более высокого риска неудач. Настоящее изобретение предлагает лечение остеоартрита.
При травматическом разрыве или отрыве хрящ в колене часто повреждается и может быть частично восстановлен путем терапии, направленной на замену хряща колена.
При ахондроплазии сниженная пролиферация хондроцитов в эпифизарной пластинке длинных костей в младенчестве и детстве приводит к карликовости.
Реберный хондрит представляет собой воспаление хрящей ткани в ребрах, приводящее к боли в груди.
При грыже межпозвонкового диска асимметричное сжатие межпозвонкового диска приводит к разрыву фиброзного кольца с формированием мешковидного выпячивания. Грыжа часто сжимает прилегающие нервы и вызывает боль в спине.
При рецидивирующем полихондрите, разрушение, вероятно, аутоиммунное, хряща, особенно носа и ушей, вызывает деформацию. Смерть наступает от удушья, так как гортань теряет свою жесткость и спадается.
Могут развиваться опухоли, состоящие из хрящевой ткани, как доброкачественные, так и злокачественные.
Настоящее изобретение предлагает лечение каждого из вышеописанных состояний. Любое из этих состояний можно лечить за счет восстановления или роста нового хряща или хондроцитов, согласно способам, раскрытым в данном документе, используя пептид, содержащий С-терминальный фрагмент гормона роста, или содержащую его композицию.
Другие состояния, которые могут быть подвергнуты лечению в соответствии с настоящим изобретением, включают следующие: хондромаляция надколенника; хондромаляция; хондросаркома - головы и шеи; хондросаркома; реберный хондрит; энхондрома; деформирующий артроз I плюсне-фалангового сустава стопы; разрыв вертлужной губы тазобедренного сустава; рассекающий остеохондрит (OCD); остеохондродисплазии; перихондрит; полихондрит или разрыв мениска.
Настоящее изобретение предлагает средства для улучшения функции существующих хондроцитов и хряща в поддержании хрящевой матрицы. Оно также предлагает средства для стимулирования роста хондроцитов и хряща и формирования хрящевой матрицы, с имплантатом или протезом или без него. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предлагает средства для стимулирования формирования или восстановления хряща в каркасе для клеток или в методиках инженерии тканей, например, для создания или восстановления хряща, с формированием нового хряща в тканях, включая нос, перегородки, ухо, локоть, колено, голеностоп и межпозвоночные диски.
В одном аспекте пептид вводят с имплантатом или подобным для получения или восстановления хондроцитов или хрящевой ткани, которые могут взаимодействовать с имплантатом, для лечения состояний, раскрытых в данном документе. Используемый в данном документе термин "взаимодействовать" относится к эффекту от сочетания компонентов, позволяющего достичь желаемого биологического результата.
Не желая быть связанными теорией, если имплантат "взаимодействует" с хондроцитами, то эффект имплантата в лечении состояния является более сильным, чем эффект при применении только одного имплантата, и может быть синергетическим.
В одном аспекте пептид вводят в комбинации с видами терапии мезенхимальными стволовыми клетками для повышения эффективности восстановления. Эффект лечения пептидом и стволовыми клетками может быть большим, чем аддитивный эффект отдельных видов лечения и может быть синергетическим.
В данном варианте осуществления "желаемым биологическим результатом", который обеспечивается данным изобретением, предпочтительно является восстановление хряща и рост хряща, более предпочтительно устранение симптомов остеоартрита и наиболее предпочтительно лечение и предупреждение остеоартрита.
В другом примере авторы настоящего изобретения демонстрируют, что С-терминальный фрагмент гормона роста, в частности, AOD9604 (SEQ ID NO:1) может быть использован для стимуляции роста мышечной ткани, улучшения восстановления мышечной ткани в результате повреждений, травмы или нагрузки, увеличения силы мышечной ткани, улучшения толерантности к физической нагрузке, увеличения доли мышечной ткани, увеличения мышечной массы, снижения потери мышечной массы, улучшения восстановления мышечной ткани или может быть полезен для лечения поражений мышц, включая нарушения, приводящие к потере массы, такие как кахексия и гормональная недостаточность, анорексия, синдром истощения, ассоциированный со СПИДом, саркопения, мышечные дистрофии, нервно-мышечные заболевания, заболевания двигательных нейронов, заболевания нервно-мышечных соединений и воспалительные миопатии у субъекта, нуждающегося в таком лечении.
Настоящее изобретение распространяется также на лечение нарушений мышц и заболеваний, ассоциированных с характеристиками мышечной дегенерации. Неограничивающие примеры таких нарушений включают различные нервно-мышечные заболевания, сердечную недостаточность, слабость отдельных мышц, таких как, например, констриктора или мочевого пузыря, гипо- или гипертонию, вызванные проблемами с сократительной функцией гладко-мышечных клеток сосудистой стенки, импотенцию/эректильную дисфункцию, недержание, мышечную слабость, ассоциированную со СПИДом, и общую и связанную с возрастом амиотрофию.
Нарушения мышц, которые описываются в данном документе, в частности, включают состояния потери мышечной массы или нарушения, при которых мышечная атрофия является одним из основных симптомов.
"Мышечная атрофия" относится к прогрессирующей потере мышечной массы и/или к прогрессирующему ослаблению и дегенерации мышечных тканей, включая скелетные или произвольно сокращающиеся мышцы, которые контролируют движение, сердечные мышцы, которые контролируют сердце, и гладкие мышцы. В одном варианте осуществления состояние мышечной атрофии или нарушение является состоянием или нарушением, связанным с хронической мышечной атрофией. "Хроническая мышечная атрофия" определяется в данном документе как хроническая (т.е. сохраняющаяся в течение длительного периода времени) прогрессирующая потеря мышечной массы и/или хроническое прогрессирующее ослабление и вырождение мышечной ткани. Хроническая мышечная атрофия может проявляться как часть процесса старения.
Потеря мышечной массы, которая имеет место при мышечной атрофии, может характеризоваться распадом или деградацией белков мышц, за счет катаболизма белков мышц. Катаболизм белков происходит из-за необычно высокой скорости деградации белков, необычно низкого уровня синтеза белка, или сочетания и того, и другого. Истощение запасов или катаболизм белков, вызванный высокой степенью деградации белков или низкой степенью синтеза белков, приводит к уменьшению мышечной массы и мышечной атрофии. Термин "катаболизм" имеет свой широко известный смысл в данной области техники, в частности, обозначая форму метаболизма, связанную со сжиганием энергии.
Мышечная атрофия может развиваться в результате старения, патологии, заболевания, состояния или нарушения. В одном варианте осуществления патология, болезнь, заболевание или состояние является хроническим. В другом варианте осуществления патология, болезнь, заболевание или состояние является генетическим. В другом варианте осуществления патология, болезнь, заболевание или состояние является неврологическим. В другом варианте осуществления патология, болезнь, заболевание или состояние является инфекционным. Описываемые в данном документе патологии, заболевания, состояния или нарушения прямо или опосредованно вызывают атрофию (т.е. потерю) мышечной массы, то есть нарушение, вызывающее мышечную атрофию.
Также рассматривается лечение нервно-мышечных заболеваний, которые приведены в соответствие с деформациями суставов или скелета. В одном варианте осуществления мышечная атрофия у субъекта является результатом наличия у субъекта мышечной дистрофии; атрофии мышечной ткани или Х-сцепленной спинобульбарной мышечной атрофии (SBMA).
Мышечные дистрофии представляют собой генетические заболевани, которые характеризуются прогрессирующей слабостью и дегенерацией скелетных или произвольно сокращающихся мышц, которые контролируют движения. Мышцы сердца и некоторые другие непроизвольно сокращающиеся мышцы также поражаются при некоторых формах мышечной дистрофии. Основными формами мышечной дистрофии (MD) являются: мышечная дистрофия Дюшенна, миотоническая дистрофия, мышечная дистрофия Беккера, конечностно-поясная дистрофия, плече-лопаточно-лицевая мышечная дистрофия, врожденная мышечная дистрофия, окулофарингеальная мышечная дистрофия, дистальная мышечная дистрофия и мышечная дистрофия Эмери-Дрейфуса.
Мышечная дистрофия может развиваться у людей всех возрастов. Хотя некоторые формы впервые проявляются в младенчестве или детстве, другие могут не проявляться до среднего или более позднего возраста. Мышечная дистрофия Дюшенна является наиболее распространенной формой, как правило, затрагивающей детей. Миотоническая дистрофия является наиболее распространенным из данных заболеваний у взрослых.
Атрофия мышечной ткани (MA) характеризуется атрофией мышц или уменьшением мышечной ткани и уменьшением мышечной массы. Например, постполиомиелитная MA представляет собой мышечную атрофию, которая развивается как часть постполиомиелитного синдрома (PPS). Атрофия включает слабость, мышечное утомление и боль.
Другим типом атрофии мышечной ткани является Х-сцепленная спинобульбарная мышечная атрофия (SBMA - также известна как заболевание Кеннеди). Это заболевание возникает в результате дефекта в гене рецептора андрогенов на Х-хромосоме, затрагивает только мужчин, и его начало приходится на зрелый возраст.
Саркопения представляет собой изнуряющее заболевание, которое поражает пожилых и хронически больных пациентов, и характеризуется потерей мышечной массы и функции. Дополнительно, увеличение безжировой массы тела ассоциируется со снижением заболеваемости и смертности при некоторых нарушениях, вызванных мышечной атрофией. Кроме того, существует связь с другими обстоятельствами и состояниями, которые могут привести к мышечным атрофическим нарушениями. Например, исследования показали, что при тяжелых случаях хронических болей в пояснице, имеет место параспинальная мышечная атрофия.
Мышечная атрофия и атрофия других тканей также ассоциируются с преклонным возрастом. Считается, что общая слабость в пожилом возрасте обусловлена мышечной атрофией. По мере старения организма все большая доля скелетных мышц замещается фиброзной тканью. Результатом этого является значительное уменьшение силы, производительности и выносливости мышц.
Длительная госпитализация в связи с болезнью или травмой, или детренированность в связи с бездействием, что происходит, например, когда конечность обездвижена, также может привести к мышечной атрофии или атрофии другой ткани. Исследования показали, что у пациентов, имеющих повреждения, хронические заболевания, ожоги, травмы или рак, которых госпитализируют на длительные периоды времени, наблюдается продолжительная односторонняя мышечная атрофия и снижение массы тела.
Повреждения или поражения центральной нервной системы (ЦНС) также ассоциируются с мышечной атрофией и другими атрофическими нарушениями. Повреждения или поражения ЦНС могут быть вызваны, например, заболеваниями, травмами или химическими веществами. Примерами являются повреждение или поражение центральных нервов, повреждение или поражение периферических нервов и повреждение или поражение спинного мозга. В одном варианте осуществления повреждение или поражение ЦНС включает заболевания Альцгеймера (AD); инсульт, гнев (настроение); анорексию, нервную анорексию, анорексию, ассоциированную со старением, и/или ассертивность (настроение).
В другом варианте осуществления мышечная атрофия или атрофия других тканей (например, суставов или связок) может быть результатом алкоголизма.
В одном варианте осуществления заболевание, нарушение или состояние мышечной атрофии, подвергаемое лечению, ассоциируется с хронической болезнью.
Данный вариант осуществления направлен на лечение, в некоторых вариантах осуществления, любого мышечного атрофического нарушения, которое может отражаться в мышечной атрофии, потере массы, недоедании, голодании или любой атрофии или потере функции, связанной с потерей массы ткани.
В некоторых вариантах осуществления заболевания или нарушения, вызывающие истощение, такие как кахексия, включая кахексию, вызванную недоеданием, туберкулезом, проказой, сахарным диабетом, почечными заболеваниями, хроническим обструктивным заболеванием легких (COPD), раком, терминальной стадией почечной недостаточности, эмфиземой, остеомаляцией или кардиомиопатией можно лечить с применением способов по данному изобретению
В некоторых вариантах осуществления мышечная атрофия вследствие заражения энтеровирусами, вирусом Эпштейна-Барр, опоясывающим лишаем, ВИЧ, трипаносомами, гриппом, вирусом коксаки, риккетсиями, трихинеллами, шистосомами или микобактериями.
Кахексия характеризуется слабостью и потерей веса, вызванными заболеванием или являющимися побочным эффектом заболевания. Сердечная кахексия, то есть истощение мышечного белка как в сердечной, так и в скелетной мускулатуре, является характерной особенностью застойной сердечной недостаточности. Раковая кахексия является синдромом, который встречается у пациентов с солидными опухолями и гематологическими злокачественными образованиями, и проявляется потерей веса с массовым истощением как жировой ткани, так и сухой мышечной массы.
Кахексия также наблюдается при COPD, синдроме приобретенного иммунодефицита (СПИД), ассоциированной с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) миопатией и/или мышечной слабостью/мышечной атрофией, которая является относительно распространенным клиническим проявлением СПИДа. Лица с ВИЧ-ассоциированной миопатией, или мышечной слабостью, или мышечной атрофией обычно испытывают значительную потерю веса, общую или проксимальную мышечную слабость, болезненность и атрофию мышечной ткани.
В отсутствие лечения мышечные атрофические нарушения могут иметь серьезные последствия для здоровья. Изменения, которые происходят при мышечной атрофии, могут привести к ослаблению физического состояния, приводящему в результате к нарушению функционирования организма и вредному влиянию на здоровье.
Таким образом, атрофия мышечной ткани может серьезно ограничить реабилитацию пациентов после иммобилизации. Мышечная атрофия, связанная с хроническим заболеванием, может привести к преждевременной потере подвижности и увеличить риск связанной с заболеванием смертности. Мышечная атрофия из-за бездействия органа является особенно серьезной проблемой у пожилых людей, которые, возможно, уже страдают возрастного дефицита функции и массы мышечной ткани, что приводит к постоянной инвалидизации и преждевременной смерти, а также повышает частоту переломов костей. Несмотря на клиническое значение состояния, существует несколько видов лечения, которые способны предотвратить или способствовать регрессии состояния. Авторы настоящего изобретения предполагают, что пептид может быть использован для предотвращения, восстановления и лечения потери мышечной массы или мышечной атрофии, ассоциированной с любым из состояний, указанных выше.
В предпочтительном варианте осуществления пептид используется для лечения ожогов и сепсиса. Было показано, что человеческий гормон роста проявляет полезные анаболические эффекты при лечении пациентов после серьезной операции, травмы, сепсиса и ожогов.
Ramirez (1998) Ann Surg; 228, No. 4: 439-448, сообщает об исследовании безопасности и эффективности hGH в лечении детей с тяжелыми ожогами. Эффект hGH проявлялся через повышение уровня IGF-1, что вызвало снижение потребления глюкозы, ингибирование окисления глюкозы и дефицит транспорта глюкозы, приводя к повышению уровня глюкозы в сыворотке крови. Хотя для такого состояния можно использовать лечение инсулином, оно не приводит к желаемому результату. Авторы настоящего изобретения предполагают, что способы настоящего изобретения позволяют проводить лечение ожогов без побочных эффектов, ассоциированных с повышенным уровнем IGF-1, так как C-терминальный фрагмент гормона роста проявляет анаболические эффекты человеческого гормона роста в отношении мышечной массы и не содержит домен, отвечающий за продукцию IGF-1, таким образом, не оказывая измеримого эффекта на уровень IGF-1.
Настоящее изобретение в других аспектах также предусматривает применение здоровым лицам с целью повышения мышечной массы, силы, улучшения функции или общего телосложения. Было сделано предположение, что полная форма гормона роста стимулирует восстановление мышц после повреждения или травмы, или поражения, или чрезмерной нагрузки в результате тренировок и, следовательно, повышения толерантности к физическим нагрузкам. Авторы настоящего изобретения предполагают, что C-терминальные фрагменты гормона роста могут оказывать тот же эффект, но без побочных эффектов, связанных с повышенным IGF-1.
Термин "увеличение мышечной массы" относится к наличию большего количества мышечной ткани после лечения по сравнению с количеством мышечной массы, которое имелось до лечения.
Термин "увеличение мышечной силы" относится к наличию мышечной ткани с возможностью генерировать большую силу после лечения по сравнению с соответствующей возможностью до лечения.
Термин "улучшение функциональных возможностей мышц" относится к наличию мышечной ткани с большим разнообразием функций после лечения по сравнению с таким показателем до лечения.
Термин "увеличение толерантности к физической нагрузке" относится к возможности выполнять упражнения с меньшим периодом отдыха между упражнениями после лечения по сравнению с таким показателем до лечения.
Мышца представляет собой ткань организма, которая в первую очередь функционирует как источник силы. В организме есть три типа мышц: а) скелетная мышца - поперечнополосатая мышца, отвечающая за генерацию силы, передающейся на скелет для обеспечения возможности движения, поддержания позы и дыхания; b) миокард - сердечная мышца; и c) гладкая мышца - мышца, которая расположена в стенках артерий и кишечника. Способы настоящего изобретения, в частности, применимы к скелетной мышце, но они могут оказывать некоторый эффект на сердечную и/или гладкую мышцы. Ссылка в данном документе на скелетные мышцы также включает взаимодействия между костью, мышцей и сухожилиями и включает мышечные волокна и суставы.
ПЕПТИДЫ
В настоящем изобретении используется пептид, содержащий карбокситерминальный фрагмент гормона роста.
Термины карбокситерминальный и C-терминальный могут использоваться взаимозаменяемо.
В одном варианте осуществления в настоящем изобретении используется пептид, содержащий карбокситерминальный фрагмент человеческого гормона роста.
В одном варианте осуществления в настоящем изобретении используется пептид, содержащий карбокситерминальный фрагмент гормона роста, отличного от человеческого.
Опубликованные соответствующие последовательности C-терминального участка гормона роста отдельных млекопитающих приведены в таблице ниже, с использованием стандартных однобуквенных обозначений. Для специалистов в данной области техники будет очевидно, что имеются аминокислотные последовательности гормонов роста других животных, и они также могут использоваться для конструирования пептида для применения в соответствии с настоящим изобретением.
Настоящее изобретение также распространяется на применение пептидов, которые являются функциональными гомологами или вариантами нативных карбокситерминальных последовательностей человеческого гормона роста или гормона роста других видов животных.
Эти функциональные гомологи или варианты могут быть получены путем вставки, делеции или замещения аминокислот в карбокситерминальной последовательности, или химической модификации нативной карбокситерминальной последовательности. Варианты вставок аминокислот включают амино- и/или карбокситерминальные слияния, а также вставки внутри последовательности одной или нескольких аминокислот. Варианты вставки аминокислотной последовательности представляют собой такие, в которых один или несколько аминокислотных остатков вводят в заранее определенный сайт в белке, хотя также возможна случайная вставка при использовании подходящего скрининга полученного продукта. Варианты делеций характеризуются удалением одной или нескольких аминокислот из последовательности. Варианты аминоксилотной замены представляют собой такие, в которых по крайней мере один аминокислотный остаток в последовательности замещен другим остатком из двадцати первичных белковых аминокислот или небелковой аминокислотой. В одном варианте осуществления замены осуществляются консервативными аминокислотами. Химические модификации нативной карбокситерминальной последовательности включают ацетилирование аминотерминального конца, и/или амидирование карбокситерминального конца, и/или циклизации боковой цепи нативной карбокситерминальной последовательности.
В одном варианте осуществления варианты могут включать одну, две, три, четыре или пять вставок, делеций или замен по сравнению с природной C-терминальной последовательностью гормона роста при условии, что функции нативной C-терминальной последовательность сохраняются.
В одном варианте осуществления варианты включают дисульфидную связь, которая придает пептиду циклическую конфигурацию. В частности, следует понимать, что применение всех активных пептидов, которые раскрываются в АН 693478 и РСТ/А1198/00724, входит в объем данного изобретения, например:
где сокращения, используемые для обозначения аминокислотных остатков, соответствуют стандартной номенклатуре для пептидов:
Gly = глицин; Ile = изолейцин; Glu = глутаминовая кислота; Phe = фенилаланин; Cys = цистеин; Arg = аргинин; Gln = глютамин; Leu = лейцин; Ser = серии; Val = валин; Lys = лизин; Ala = аланин; Asp = аспарагиновая кислота; His = гистидин; Orn = орнитин; Tyr = тирозин; Pen = пеницилламин (п,п'-диметил-цистеин).
В одном варианте осуществления аминокислоты, за исключением глицина, имеют L-абсолютную конфигурацию. Также могут быть использованы аминокислоты с D-конфигурацией. Пептид может иметь циклическую дисульфидную связь между Cys(182) и Cys(189) или Pen(182) и Pen(189), если это необходимо.
Специалистам в данной области техники будет понятно, что используемый пептид может быть модифицирован для улучшения стабильности при хранении, биологической активности, периода полувыведения из крови или для любой другой цели, используя способы, доступные в данной области техники, например, гликозилирование, конъюгация с полимером для увеличения периода полувыведения из циркуляторного русла, пегилирование или другая химическая модификация.
Например, может быть желательным введение модификации для повышения стабильности при хранении или улучшение биологической доступности.
В одном варианте осуществления пептид содержит аминокислоты 182-189 (hGH 182-189), аминокислоты 181-189, 180-189, 179-189, 178-189, 177-189, 176-189, 175-189, 175-190, 176-190, 177-190, 178-190, 179-190, 180-190, 181-190, 182-190, 182-191, 181-191, 180-191, 179-191, 178-191, 177-191, 176-191 или 175-191 человеческого гормона роста или соответствующие пептиды из гормона роста животных, отличных от человека, например из SEQ ID NO:2-20.
В одном варианте осуществления пептид содержит вариант С-терминального фрагмента hGH, содержащий аминокислоты 182-189 или, в частности, 177-191. В предпочтительном варианте осуществления пептидом является AOD9604 (Tyr-hGH 177-191) SEQ ID NO:1.
Используемый в данном документе термин "пептид" означает любую аминокислотную цепь длиной от 8 до 50 аминокислотных остатков, предпочтительно от 8 до 40, от 8 до 30, от 8 до 25 или от 8 до 20, или более предпочтительно приблизительно 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18 или 19 аминокислотных остатков длиной.
Любой пептид для применения в соответствии с настоящим изобретением не может иметь полную последовательность гормона роста. Полная форма гормона роста является эффективной для предложенных видов лечения, но также повышает секрецию IGF-1. Соответственно, полная форма гормона роста не относится к пептидам для применения в соответствии с настоящим изобретением.
Любой пептид для применения в соответствии с настоящим изобретением не может иметь полную последовательность гормона роста, так как пептид для применения в настоящем изобретении не может содержать домен гормона роста, который отвечает за продукцию IGF-1. В рамках настоящего документа домен гормона роста, который отвечает за продукцию IGF-1, представляет собой аминокислотные остатки 6-14 человеческого гормона роста.
Пептид для применения в соответствии с настоящим изобретением может быть получен из природных источников, получен с помощью технологии рекомбинантной ДНК или синтезирован с использованием обычных способов синтеза пептидов.
Пептид может быть конъюгирован с молекулой для слияния, чтобы облегчить биосинтез и/или доставку. Он может быть включен в обычную фармацевтическую композицию или может присутствовать в генетически модифицированных продуктах питания, таких как раскрыты в WO 01/33997.
ВВЕДЕНИЕ
Пептид может быть введен в фармацевтическую композицию вместе с фармацевтически приемлемым носителем для введения.
Пептид может быть введен любым подходящим способом, и специалист в данной области техники легко сможет определить путь введения и дозу, наиболее подходящие для состояния, подлежащего лечению, и субъекта. Пептид можно вводить перорально, сублингвально, буккально, интраназально, путем ингаляции, чрескожно, местно, внутрисуставно или парентерально в виде составов единиц дозирования, содержащих общепринятые нетоксичные фармацевтически приемлемые носители, вспомогательные средства и наполнители. Используемый в данном документе термин "парентеральный" включает подкожные, внутривенные, внутримышечные, интратекальные, внутричерепные, инъекционные или инфузионные способы.
В одном варианте осуществления пептид можно вводить вместе с или в имплантате, устройстве медицинского назначения или протезе. Имплантатом может быть биоразлагаемый имплантат или депо с медленным высвобождением или другой имплантат, известный специалистам в данной области техники. Такой вариант осуществления в частности подходит для улучшения роста и силы мышечной ткани после травмы или повреждения мышц.
При использовании для лечения ожогов пептид можно вводить перорально, местно или парентерально.
Композиции, содержащие пептид, должны вводиться в терапевтически эффективном количестве. Используемый в данном документе термин "эффективное количество" относится к дозе, которая является достаточной для достижения желаемого биологического результата. Желаемым биологическим результатом может быть любой терапевтический эффект, включая увеличение мышечной массы, увеличение мышечной силы, рост мышечной ткани или лечение ожогов или ран. Такие улучшения можно измерять с помощью различных способов, включая те, которые измеряют сухую и жировую массу тела (например, с использованием двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии), мышечную силу или формирование клеток мышечной ткани.
Обычная суточная доза может варьировать от приблизительно 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более, в зависимости от способа доставки.
Уровни доз фрагмента гормона роста могут составлять от порядка приблизительно 0,1 мг в сутки до приблизительно 50 мг в сутки, или, как правило, от приблизительно 0,25 мг до приблизительно 1 мг в сутки. Количество активного ингредиента, которое может сочетаться с материалами-носителями для получения однократной дозы, будет меняться, в зависимости от организма, подлежащего лечению, и конкретного способа введения. Например, состав, предназначенный для перорального введения человеку, может содержать приблизительно от 1 мг до 1 г активного соединения с соответствующим и подходящим количеством материала-носителя, которое может варьировать от приблизительно 5 до 95 процентов от общей композиции. Стандартные лекарственные формы будут в целом содержать от приблизительно 0,1 мг до 50 мг активного ингредиента.
Однако следует понимать, что конкретный уровень дозы для любого конкретного субъекта будет зависеть от целого ряда факторов, включая активность конкретного применяемого соединения, возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола, диеты, времени введения, способа введения, скорости экскреции, комбинации лекарственных средств и тяжести конкретного заболевания, в отношении которого проводят терапию.
Схема дозирования может быть скорректирована в зависимости от периода полувыведения пептида или тяжести состояния субъекта.
В целом, композиции вводят в болюсной дозе для увеличения циркулирующих уровней пептида в течение наиболее длительного периода времени после введения дозы. Непрерывную инфузию также может применять после болюсной дозы.
СУБЪЕКТ
Виды лечения по настоящему изобретению подходят для субъектов, нуждающихся в таком лечении. Используемый в данном документе термин "субъект" относится к человеку и животным, отличным от человека.
Термин "животные, отличные от человека" включает всех позвоночных, например, млекопитающих, таких как приматы, отличные от человека (в частности, высшие приматы), овцы, лошади, собаки, грызуны (например, мыши или крысы), морские свинки, козы, свиньи, кошки, кролики, коровы, и не являющихся млекопитающими, таких как куры, амфибии, рептилии и т.д. В одном варианте осуществления субъектом является экспериментальное животное, животное, подходящее в качестве модели заболевания, или животное из животноводческой отрасли (использование животных как источник пищи), где способы повышения сухой мышечной массы принесут существенную пользу отрасли. Кроме того, способ первого аспекта особенно важен для скаковых лошадей.
В одном варианте осуществления лечение применяют к человеку, в частности к взрослым, детям в возрасте от 11 до 16 лет, в возрасте от 4 до 10 лет, детям грудного возраста от 18 месяцев до 4 лет, младенцам младше 18 месяцев. Лечение также можно применять у пожилых лиц или лиц с ограниченными физическими возможностями.
В одном варианте осуществления субъект страдает от заболевания, например остеоартрита, сахарного диабета, ВИЧ или иммуносупрессии. Субъект может иметь маркеры предиабетического состояния или страдать от заболевания, осложнением которого является сахарный диабет. В другом варианте осуществления субъект желает улучшить свое состояние здоровья или внешний вид, например замедлить старение или улучшить телосложение. Следовательно, субъекты включают спортсменов, как профессиональных, так и любителей, лиц, культуристов, лиц, желающих улучшить свое телосложение, военнослужащих и работников физического труда.
В одном варианте осуществления виды лечения по настоящему изобретению используют для дополнения альтернативных видов лечения того же состояния. Например, C-терминальный фрагмент гормона роста можно использовать для дополнения видов терапии стволовыми клетками для восстановления суставов и мышц.
В одном варианте осуществления субъекту противопоказана терапия гормоном роста.
В рамках всего настоящего описания изобретения и формулы изобретения, которая следует далее, если контекст не требует иного, слово "включает" или его варианты, такие как "содержит" или "содержащий", будут понимать как включение указанного целого или группы целых, но не исключать любое другое целое или группу целых.
Следует также отметить, что, как используется в описании объекта, формы единственного числа включают аспекты множественного числа, если из контекста явно не следует иное.
Специалисту в данной области техники будет очевидно, что, хотя настоящее изобретение было описано в некоторых деталях в целях ясности и понимания, можно производить различные модификации и изменения вариантов осуществления и способов, описываемых в данном документе, не отклоняясь от объема концепции изобретения, раскрываемой в данном описании.
Далее настоящее изобретение будет описано посредством ссылки только на следующие неограничивающие примеры.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Определение влияния AOD на восстановление хряща путем оценки формирования ткани
Способы
Культура клеток и обработка
Хондроциты выделяли из суставных хрящей, полученных асептическим способом из карпо-метакарпальных суставов теленка, и высевали на покрытые коллагеном II типа мембранные вставки (Millipore™) (1,5х106 клеток/мембрану диаметром 12 мм). Хондроциты выращивали в среде Ham's F-12, обогащенную 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS), в стандартных культуральных условиях. Через 5 дней содержание сыворотки повышали до 20%. Хондроциты затем выращивали в присутствии и в отсутствии AOD9604 (SEQ ID NO:1) (10 или 100 мкг/мл) в течение 2 недель (общее время культивирования 3 недели). Свежий AOD добавляли при каждой замене среды.
Оценка ткани
Ткань собирали и расщепляли папаином (Sigma, 40 мкг/мл) в течение 48 ч при 65°C. Содержание ДНК определяли с использованием анализа связывания красителя Hoechst 33258 (Polysciences) и флюорометрии (длина волны возбуждения 365 нм, длина волны излучения 458 нм). Содержание протеогликана определяли путем измерения количества сульфатированных гликозаминогликанов с использованием анализа связывания красителя диметилметиленового синего и спектрофотометрии (525 нм). Содержание коллагена определяли путем измерения содержания оксипролина в аликвоте папаинового гидролизата, который гидролизировали в 6N HCl в течение 18 часов при 110°C. Содержание оксипролина определяли с использованием анализа с хлорамином-Т/реактивом Эрлиха и спектрофотометрии (560 нм). Насыщенность клетками определяли путем измерения содержания ДНК с использованием анализа связывания с красителем Hoescht 33258 (Polysciences) и флюорометрии (длина волны возбуждения 365 нм, длина волны излучения 458 нм).
Статистический анализ
Все эксперименты повторяли трижды, и каждое состояние изучали в трех повторениях. Данные выражали как среднее ±SD. Статистическую значимость определяли с использованием двухфакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Тьюки, когда оценивали несколько групп. Т-тест использовали в тех случаях, когда сравнивали 2 группы. Статистическую значимость присваивали при значениях p<0,05.
Результаты
Обработка AOD9604 не была токсичной для клеток, как было определено по количественному содержанию ДНК после 2 недель обработки (фигура 1 ).
AOD9604 (100мкг/мл) повышал восстановление хряща за счет увеличения содержания протеогликана и коллагена в ткани, как было определено через 3 недели культивирования (фигура 2 и фигура 3).
На фигурах AOD9604 обозначен как AOD.
Пример 2. Влияние AOD на нативный хрящ
Способы
Эксплантаты хрящей получали из карпо-метакарпальных суставов теленка и помещали в культуру со средой Ham's F-12, обогащенную 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS), в присутствии или отсутствии AOD9604 (SEQ ID NO:1) (10 или 100 мкг/мл) на 1 неделю или (100 или 500 мкг/мл) на 2 недели.
Оценка ткани
Ткань собирали и измеряли содержание воды и сухой вес. Затем ткань расщепляли папаином (Sigma, 40 мкг/мл) в течение 48 ч при 65°C. Содержание ДНК определяли с использованием анализа связывания красителя Hoechst 33258 (Polysciences) и флюорометрии (длина волны возбуждения 365 нм, длина волны излучения 458 нм). Содержание протеогликана определяли путем измерения количества сульфатированных гликозаминогликанов с применением анализа связывания красителя диметилметиленового синего и спектрофотометрии (525 нм). Содержание коллагена определяли путем измерения содержания оксипролина в аликвоте папаинового гидролизата, который гидролизировали в 6N HCl в течение 18 часов при 110°C. Содержание оксипролина определяли путем анализа с хлорамином-Т/реактивом Эрлиха и спектрофотометрии (560 нм). Насыщенность клетками определяли путем измерения содержания ДНК с использованием анализа связывания красителя Hoescht 33258 (Polysciences) и флюорометрии (длина волны возбуждения 365 нм, длина волны излучения 458 нм.
Статистический анализ
Все эксперименты повторяли трижды и каждое состояние изучали в трех повторениях. Данные выражали как среднее ±SD. Статистическую значимость определяли с применением двухфакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Тьюки, когда оценивали несколько групп. Т-тест использовали в тех случаях, когда сравнивали 2 группы. Статистическую значимость присваивали при значениях p<0,05.
Результаты
AOD не являлся токсичным для клеток в концентрациях до 500мкг/мл в течение 2 недель обработки, поскольку не наблюдали значимого изменения в содержании ДНК в течение данного периода времени (фигура 4).
AOD9604 не оказывал никакого влияния на нативный хрящ в концентрациях AOD 500 мкг/мл (фигуры 5-8).
На фигурах AOD9604 обозначен как AOD.
ВЫВОДЫ
AOD9604 оказывал положительное (анаболическое) влияние на формирование хрящевой ткани, что указывало на то, что AOD мог бы быть подходящим для применения с целью стимулирования восстановления хряща.
AOD9604 не оказывал никакого влияния на интактный хрящ.
Пример 3. Влияние пептида AOD9604 на дифференцировку миобластов в клетки мышечной ткани in vitro
Способы
Культура клеток и обработка
2
С2С12 выращивали в монослойной культуре в среде DMEM (с повышенным содержанием глюкозы), обогащенную 10% фетальной бычьей сыворотки в стандартных условиях культивирования клеток. Клетки пассировали при конфлюентности монослоя 60-70%. Влияние AOD9604 (SEQ ID NO:1) на пролиферацию клеток определяли путем выращивания клеток (3000 клеток/см) в отсутствие или присутствие AOD9604 (10 и 100мкг/мл) в течение 3 дней. Содержание ДНК затем определяли количественно. Клетки расщепляли папаином и определяли содержание ДНК путем анализа связывания красителя Hoechst (Polysciences) и флюорометрии (длина волны возбуждения 365 нм, длина волны излучения 458 нм).
Оценка дифференцировки клеток
3
2
Клетки С2С12 (2×10 клеток/см) выращивали в DMEM и 10% FBS. Дифференцировку индуцировали путем замены ростовых сред на среды для дифференцировки, которые состояли из DMEM, обогащенной 2% лошадиной сыворотки. Клетки выращивали в отсутствие или присутствие AOD9604 (10 или 100 мкг/мл). Клетки фиксировали в 4% параформальдегиде и совместно окрашивали на миогенин (специфический маркер мышечной ткани (транскрипционный фактор), 1/250 в буфере Трис-Тритон X) и окрашивали Bodipy (цитоплазматический краситель, Invitrogen, 1/1000 PBS). Количество клеток, окрашенных для оценки миогенина, подсчитывали в 4 случайных полях (до 100 клеток/поле) (n=4). Подсчитывали процент клеток с положительной окраской на миогенин.
Для количественной оценки мышечных трубочек клетки окрашивали Bodipy (Invitrogen, 1/1000 PBS) согласно инструкциям производителя. Количество мышечных трубочек, которые сформировались в течение 72 часов, определяли и выражали как процент от общего количества клеток в культуре (n=3,100 клеток в культуре).
Статистический анализ
Данные выражали как среднее ±SD. Статистическую значимость определяли с использованием двухфакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Тьюки, когда оценивали несколько групп. Т-тест использовали в тех случаях, когда сравнивали 2 группы. Статистическую значимость присваивали при значениях p<0,05.
Результаты
AOD9604 повышал дифференцировку клеток С2С12 в миобласты через 72 часа уже в таких низких дозах как 10 мкг/мл (фигуры 9 и 10). AOD9604 не оказывал влияния на формирование мышечных трубочек (фигура 11). AOD9604 не влиял на пролиферацию клеток (фигура 12). На фигурах AOD9604 обозначен как AOD.
Вывод
AOD9604 повышал дифференцировку в миобласты и может быть подходящим для применения для стимулирования формирования мышечной ткани.
Пример 4. Влияние внутрисуставного введения AOD9604 на модели коллагеназа-индуцированного остеоартрита кролика при монотерапии и в комбинации с НА
План исследования
Исследование проводили согласно протоколам, описанным Kim et al., (2010) J Korean Med Sci 25:776-780, который показал терапевтический эффект от внутрисуставного введения гиалуроновой кислоты (НА) в присутствие или в отсутствие AOD9604 (SEQ ID NO:1). AOD9604 (SEQ ID NO:1) был предоставлен Metabolic Pharmaceutical Pty Ltd.
Вид: Новозеландский белый кролик. Пол: самец. Возраст: 12 недель. Число кроликов: 32.
Группы лечения: каждому из 32 кроликов инъецировали 2 мг коллагеназы в правый коленный сустав, с проведением второй инъекции через три дня для индуцирования остеоартрита. Через 4 недели кроликов разделяли на 4 группы по 8 животных в каждой для последующего лечения.
Группа 1 получала 4 еженедельных инъекции наполнителя (контрольная группа заболевания).
Группа 2 получала 4 еженедельных инъекции по 6 мг НА-гиуран-плюс (группа положительного контроля, получавшая НА).
Группа 3 получала 4 еженедельных инъекции по 0,25 мг AOD9604 (группа, получавшая только AOD).
Группа 4 получала 4 еженедельных инъекции и НА, и AOD9604 (группа комбинированной терапии).
Клинические наблюдения проводили путем прямого наблюдения ежедневно для оценки хромоты (как описано в Kim et al., (2010) supra). Через 9 недель после первой инъекции коллагеназы животных подвергали эвтаназии.
Полное наблюдение правого и левого коленных суставов проводили после вскрытия, при этом оценивали степень поражения в баллах (как описано в Kim et al., (2010) supra). Проводили гистологический анализ латеральных и медиальных мыщелков каждого сустава с оценкой в баллах.
Проводили статистический анализ данных, результаты которого показаны на фигурах 13 (Группа 1), 14 (Группа 2), 15 (Группа 3) и 16 (Группа 4). Результаты показали, что AOD9604 (SEQ ID NO:1) стимулирует регенерацию по сравнению с контролем, и что НА и AOD9694 (SEQ ID NO:1) обеспечивают сходную степень улучшения в этот момент времени.
Пример 5. Анализ клинического случая - инфекция
Субъектом был мужчина в возрасте 46 лет. Прокол левой ступни гвоздем. У субъекта отмечали очень опухшую ступню с высокой степенью покраснения диаметром два сантиметра вокруг участка прокола. Также имела место высокая степень болезненности. Отек определялся по правой стороне левой стопы и проходил через фаланги четвертого и пятого пальцев. Некоторая отечность отмечалась в голеностопном суставе. Симптомы указывали на инфекцию Clostridium tetani.
Дозировка:
три дозы по 360 мкг AOD9604 (SEQ ID NO:1) подкожно вокруг инфицированной области в сутки. Каждая индивидуальная доза представляет получение 0,3 мл с дозировкой 1200 мкг в 1 мл на дозу. 4 дня.
Основные наблюдения:
к пятому дню субъект был очень доволен как состоянием болевых ощущений, так и функциональностью в пораженной области. Он был в состоянии полностью надеть на ногу обувь и мог возобновить общие нагрузки на ногу. Субъект возобновил полную двигательную активность и подъем умеренного веса на восьмой день. Субъект также отмечал, что болевые ощущения значительно уменьшились приблизительно после трех инъекций. Большей частью уменьшение этих болевых ощущений было связано с уменьшением отека, являвшегося результатом инфицирования. Дискомфорт в тканях из-за разрыва был ликвидирован примерно на пятые сутки. Субъект почувствовал, что все симптомы и любой другой ассоциированный незначительный дискомфорт в полной мере были устранены примерно на восьмые сутки. Никакие другие химиотерапевтические вмешательства или антимикробные средства в лечении не использовали.
Пример 6. Анализ клинического случая - икроножная мышца
Субъектом был 24-летний профессиональный футболист. Спортсмен получил разрыв камбаловидной мышцы длиной 1,5 см возле прилегающего апоневроза икроножной мышцы. МРТ показала некоторое ассоциированное кровотечение и ушиб. Разрыв длиной 1,5 см считается умеренно большим разрывом для данного участка. МРТ показала, что скопление крови и отек локализовались рядом с местом прикрепления переднего апоневроза на медианной перегородке. Разрывы волокна были расположены по направлению ориентации волокон. Длина разрыва составляла 1,5 см.
Дозировка:
субъект получал AOD9604 (SEQ ID NO:1) в концентрации 600 мкг на дозу. Он наносил один мл два раза в сутки. Трансдермальное нанесение проводили при концентрации 600 мкг на 1 мл. Общий наносимый объем составлял 20 мл.
Основные наблюдения:
заживление повреждения у спортсмена произошло через две недели. Это являлось значительным сокращением продолжительности заживления, учитывая первоначальный характер повреждения. МРТ подтвердила, что участок повреждения вернулся в полностью целостное состояние. На повторных МРТ не было выявлено ни кровотечения, ни отека. Кроме того, к этому моменту времени спортсмен вернулся к выполнению полной мышечной нагрузки. Спортсмен сообщил об отсутствии каких-либо остаточных болей или дискомфорта, связанных с первоначальным повреждением. При возвращении к выполнению упражнений поврежденная область не ощущалась. После полного возобновления весовых нагрузок на ногу отсутствовали внезапная боль или дискомфорт. Спортсмен также отмечал, что боль, связанная с повреждением, начинала уменьшаться достаточно быстро после трансдермального нанесения средства на область повреждения. Он отметил отсутствие возобновления какой-либо патологии и болевых ощущений или воспаления после возвращения к активности. Он был доволен механическими возможностями во время бега и отмечал, что не ощущал никакого дискомфорта. Спортсмен считал, что поврежденная область полностью вернулась к функциональному состоянию.
Пример 7. Анализ клинического случая - задние мышцы бедра
Субъектом был 22-летний профессиональный футболист. Спортсмен получил разрыв длиной 2,0 см длинной головки бицепса бедра. МРТ показала, что масса крови и отек наблюдались вблизи верхней трети длинной головки мышечного брюшка. Некоторое нарушения волокна отмечали ниже сухожильного соединения, выходящего из места прикрепления мышцы. Длина разрыва составляла 1,5 см. Участок веретеновидного брюшка мышцы вокруг повреждения был сильно воспален.
Дозировка:
субъект получал AOD9604 (SEQ ID NO:1) в концентрации 600 мкг на дозу. Он наносил один мл два раза в сутки. Трансдермальное нанесение проводили при концентрации 600 мкг на 1 мл. Общий наносимый объем составлял 40 мл.
Основные наблюдения:
заживление повреждения у спортсмена произошло через три недели. Это являлось значительным сокращением продолжительности заживления, по сравнению с ожидаемым, учитывая первоначальный характер повреждения. МРТ подтвердила, что длинная головка бицепса бедра вернулась в полностью целостное состояние. На повторной МРТ не было выявлено ни кровотечения, ни отека. Спортсмен возобновил полную весовую нагрузку по окончании трехнедельного трансдермального нанесения. Это считали опережением графика. Спортсмен отмечал отсутствие какой-либо остаточной боли или дискомфорта, связанных с первоначальным повреждением, после возвращения к полной весовой нагрузке. При возвращении к выполнению упражнений поврежденная область не ощущалась. После полного возобновления весовых нагрузок отсутствовали внезапная боль или дискомфорт. Спортсмен ощущал, что боль, связанная с повреждением, начала уменьшаться в течение первой недели после трансдермального нанесения. Он показал отсутствие возобновления патологии и отсутствие боли или воспаления. Он был доволен механическими возможностями во время бега и отмечал, что не ощущал никакого дискомфорта во время или после тренировок. В течение первой недели после возвращения к полной весовой нагрузке спортсмен не испытывал никаких ограничений способности переносить весовую нагрузку и считал, что имеет место полное восстановление функциональности.
Пример 8. Анализ клинического случая - плечевое сухожилие
Субъектом был 23-летний профессиональный футболист. Спортсмен получил разрыв волокон в стыке места прикрепления сухожилия надостной мышцы. МРТ показала площадь 1,0 см в области патологии разрыва. МРТ показала, что разрыв подошел к верхней фасетке большого бугорка плечевой кости. Большая часть пострадавшего участка относилась к мышечной части сустава. МРТ показала площадь 1,0 см в области патологии разрыва. Спортсмен сообщил, что боль, связанная с данной областью, ощущалась в течение приблизительно 5 недель, что указывало на некоторую степень хронического состояния повреждения. Спортсмен был ограничен как в диапазоне движений, которые он мог применять к пострадавшему участку, так и в количестве весовой нагрузки, которую он мог выполнять с вовлечением этой области. Он находил трудным отведение руки в плечевом суставе. Ему было трудно сопротивляться силам гравитации в области плечевого сустава, и он наблюдал ухудшение состояние при любом натяжении верхней конечности вниз под действием массы.
Дозировка:
субъект получал AOD9604 (SEQ ID NO:1) в концентрации 600 мкг на дозу. Он наносил один мл два раза в сутки. Трансдермальное нанесение проводилось в концентрации 600 мкг на 1 мл. Общий наносимый объем составлял 30 мл.
Основные наблюдения:
восстановление повреждения у спортсмена произошло в течение трех недель. Проведенная после этого МРТ подтвердила возвращение области сустава в полностью целостное состояние. Спортсмен также возобновил полную весовую нагрузку и вращательные движения в области сустава. Спортсмен ощущал отсутствие остаточной боли или дискомфорта, связанных либо с движением, либо с выполнением постоянной работы с вовлечением данного участка. При возвращении к выполнению упражнений с вращением или весовой нагрузкой поврежденная область не ощущалась. Спортсмен подтвердил отсутствие внезапной боли или дискомфорта после полного возобновления способности выполнять весовые нагрузки, и отсутствие боли, воспаления или ощущения повреждения после тренировки. Ни на каком этапе не отмечалось повторного ухудшения состояния повреждения. Спортсмен также отмечал, что боль, ассоциированная с повреждением начала уменьшаться к концу первой недели трансдермального нанесения.
Пример 9. Анализ клинического случая - ушиб квадрицепса - гематома
Субъектом был 24-летний профессиональный футболист. Спортсмен перенес ушиб прямой мышцы бедра, прилегающей к центральному сухожилию. МРТ показала площадь области ушиба 2,0 см. МРТ показала наличие нарушения волокон в средней части прямой мышцы бедра, непосредственно прилегающей к участку центрального сухожилия. МРТ показала, что площадь нарушения составляла 2,0 см. Имела место незначительная степень связанного с патологией отека. МРТ подтвердила, что имело место нарушение волокон, но не истинный разрыв. Центральное сухожилие осталось неповрежденным. Повреждение было острым. Спортсмен обнаруживал дискомфорт при движении с весовой нагрузкой, и образование было легко пальпируемым. Любое сгибание ноги в тазобедренном суставе могло вызвать дискомфорт и ощущение повреждения. Хотя данная мышца не считается доминирующей мышцей в разгибательном движении коленного сустава, пораженный участок был болезненным и вызывал дискомфорт при выполнении такой работы.
Дозировка:
субъект получал AOD9604 (SEQ ID NO:1) в концентрации 600 мкг на дозу. Он наносил один мл два раза в сутки. Трансдермальное нанесение проводилось при концентрации 600 мкг на 1 мл. Общий наносимый объем составлял 20 мл.
Основные наблюдения:
заживление повреждения у спортсмена произошло через две недели. На последующей МРТ отмечалось отсутствие в области ушиба кровотечений или отека. МРТ подтвердила восстановление полной анатомической целостности травмированной области. Спортсмен вернулся к выполнению деятельности с полной весовой нагрузкой, не испытывая никаких проблем с механической нагрузкой или двигательной механикой. Не отмечалось никаких проблем с возобновлением контакта. Спортсмен подтвердил отсутствие внезапной боли или дискомфорта после полного возобновления способности выполнять весовые нагрузки. Спортсмен не ощущал какой-либо боли, воспаления или области повреждения после тренировки. Не отмечалось повторного обострения повреждения ни на какой стадии при беге, весовой нагрузке или контакте. Спортсмен отмечал, что боль, ассоциированная с повреждением, начала уменьшаться к концу первой недели трансдермального нанесения, хотя некоторое образование все еще пальпировалось в травмированной области.