Генетические маркеры резистентности к антибиотикам у биоплёнкоформирующих штаммов возбудителей анаэробной инфекции

cells transfected with BDV gene expression vectors. Over-expression of miR-122 and specific blocking experiments demonstrated that miR-122 was able to specifically inhibit BDV protein synthesis, viral gene replication and transcription, and induce the secretion/synthesis of interferon (IFN) in OL and OL/BDV cells. The abolishment of

miR-122 by AMO-122 inhibited endogenous IFN induction by IFN-beta. These results indicate that miR-122 can exert direct antiviral function by inhibiting BDV translation and replication on one hand, while acting indirect lythrough IFN to increase the host innate immunity to modulate the virus-host interactions on the other hand.

Keyword: complementary sequence, viral genome, transmission and replication.

УДК 578.52 ГРНТИ 34.25.37

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К АНТИБИОТИКАМ У БИОПЛЁНКОФОРМИРУЮЩИХ ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ АНАЭРОБНОЙ ИНФЕКЦИИ

В.Н. Царёв, Е.В. Ипполитов, Е.Н. Николаева

Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова Министерства здравоохранения РФ Россия, 127473, г. Москва, ул. Делегатская, д.20, стр.1

Установлено, что исследуемые штаммы резидентный и патогенной микробиоты имеют гены, кодирующие устойчивость к бета-лактамным антибиотикам, карбапенемам, макролидам, тетрациклинам. В результате ПЦР у штаммов выявлены генетические маркеры устойчивости к бета-лактамным антибиотикам (STX-M и MECA-цефалоспорины), включая карбапенемы (VIM и NDM, но не Окса-48), гликопептидам (Van А и Van B), макролидам (ERM), тетрациклину (Tet) и плазмидам QNR (A, B) - к фторхинолонам. Очевидно, что наиболее часто используемые в стоматологической практике препараты метронидазол и линкомицин (за последние 20-30 лет) показали наибольшее число резистентных штаммов - 52,3 и 22,7 % соответственно. Частота выявления генетических маркеров резистентности к другим изученных препаратам не превышала 2,5-11,4 %. Минимальное количество резистентных штаммов анаэробных бактерий выявлено к карбапенемам и фторхинолонам.

Ключевые слова: генетические маркеры, резистентность к антибиотикам, анаэробные бактерии, биоплёнки, ПЦР, сканирующая электронная микроскопия.

GENETIC MARKERS OF ANTIBIOTIC RESISTENCE BY BIOFILM-FORMING STRAINS OF ANAEROBIC INFECTIONS GERM

V.N. Tsaryov, E. V. Ippolitov, E.N. Nikolaeva

Evdokomov Moscow State University of Medicine and Denistry of the Russian Ministry of Health

Russia, 127473, Moscow, ul. Delegatskaya, d. 20, str. 1

© В.Н. Царёв, Е.В. Ипполитов, Е.Н. Николаева, 2016

The research identified the analyzing strains of resident and pathogenic microbiota have genes encoding resistance to beta-lactam antibiotics, carbapenems, macrolides and tetracycline. As PCR result, the molecular genetic resistance markers for beta-lactam antibiotics (STX-M and MecA cephalosporins) were found in the strains, including carbapenems (VIM and NDM, but not OXA-48), glycopeptides (VanA and VanB), macrolides (Erm), tetracyclines (Tet) and plasmid QNR (A, B) - fluoroquinolones. Obviously, the most commonly used medications (metronidazole and lin-comycin) in the dental practice (in the last 20-30 years) had the highest number of resistant strains - 52,3 and 22,7 %, respectively. The detection rate of the resistance genetic markers to other studied drugs did not exceed 2,5-11,4 %. The authors identified resistant strain minimum of anaerobic bacteria to carbapenems and fluoroquinolones.

Keywords: genetic markers, antibiotic resistance, anaerobic bacteria, biofilms, PCR, scanning electron microscopy.

Если десять-пятнадцать лет назад считалось, что анаэробная флора обладает высокой чувствительностью к производным имидазола и линкосамидам, то сегодня резистентные штаммы из группы бактероидов, фузобакте-рий, пептострептококков, клостридий выявляются достаточно часто [2, 3, 6]. По данным ряда отечественных и зарубежных исследователей, значительный вклад в формирование резистентности к антибактериальным препаратам вносят адаптационные механизмы микробных популяций, связанные с их персистен-цией и формированием микробных биопленок, однако данный вопрос находится в начальной фазе исследований [1, 4, 5].

Цель исследования - провести сравнительный анализ частоты выявления генетических маркеров резистентности к антибиотикам, формирующейся у анаэробных бактерий, в условиях смешанных биопленок в клинических условиях и сравнить данные фенотипических и генотипических методов исследования.

Материалы и методы исследования. У больных хроническим генерализованным пародонтитом выделены штаммы факультативно- и облигатно-анаэробных бактерий (свыше 600). Общее количество штаммов, формирующих биопленку in vitro и подвергнутых молекулярно-биологическому исследованию, - 66. В их числе оказалось 30 штаммов резидентной микрофлоры и 36 -анаэробных пародонто-патогенных видов 1 и 2-го порядка.

Моделирование биопленки in vitro проводили на твердой подложке из акриловой пластмассы в прогрессивно истощающейся среде в нашей модификации, разработанной совместно с Л.В. Диденко (2015) [1] для контроля с помощью сканирующей электронной микроскопии. Образцы полимеров (пластины размером 1x1 см) помещали в питательный LB бульон Luria-Bertani broth, в который предварительно засевали культуру бактерий в кон-

центрации 106 клеток/мл. Инкубацию образцов проводили при температуре 37 °С в течение 1, 2, 7 и 14 суток, а также в более отдаленные сроки. Сканирующая электронная микроскопия образцов биопленки на полиакрилатах проводилась с использованием сканирующего электронного двулучевого микроскопа Quanta 200 3D (FEI Company, USA) в режиме высокого вакуума в установке SPI-Module Sputter/Carbon Coater System (SPI Inc. USA).

Для генетического подтверждения паро-донтопатогенов 1-го порядка с помощью мультиплексной ПЦР использовали набор МультиДент-5 (НПФ ГенЛаб, Россия). Содержание пародонтопатогенов 2-го порядка определяли c помощью обратной гибридизации ДНК и набора Micro-IDentp/M5 (Hain Lifescience, Германия).

Определение генетических маркеров резистентности к антибиотикам с помощью мультиплексной ПЦР. В образцах из пародон-тальных карманов проводили идентификацию генов Мес, VanA, VanB, Clx-m, Erm, Tet, и плазмид Qnr А и B с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя мульти-праймерные наборы реагентов ООО «НПФ "Генлаб"» и OOO «Литех», соответственно для хромосомных участков и плазмидных (Москва). Выявление устойчивости микробов к антибиотикам проводили с помощью наборов реактивов в комплентации OneStep (НПФ «Литех», РФ) для обнаружения генетически обусловленной устойчивости микроорганизмов к антибиотикам методом ПЦР. Результаты исследования обработаны статистически по методу Манна-Уитни.

Результаты и обсуждение. Проведенные нами исследования позволили сформировать группу штаммов - клинических изолятов, у которых проведено исследование фенотипи-ческих и генотипических признаков устойчивости к антибактериальным препаратам. Способность к формированию биопленки данными штаммами была проверена с помощью

сканирующей электронной микроскопии [1, 2]. В эту группу были включены штаммы биопленкопродуцирующих представителей микрофлоры пародонтального кармана -

Streptococcus sanguinis, Streptococcus salivarius, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, а также анаэробных внутриклеточных патогенов -пародонтопатогенных видов 1-го порядка: Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia и 2-го порядка - Parvinonas micra, Prevotella intermedia.

В результате молекулярной детекции с помощью ПЦР у перечисленных штаммов были выявлены генетические маркеры резистентности к беталактамным антибиотикам (CTX-M и MecA к цефалоспо-ринам), включая карбапенемы (VIM и NDM, но не OXA-48), а также к гликопептидам (VanA и VanB), макролидам (Erm), тетрациклинам (Tet) и плазмидам Qnr (A, B) -к фторхинолонам.

Наиболее часто у представителей резидентной микрофлоры полости рта выявляли ген CTX-M-2, ответственный за резистентность к цефалоспоринам-1 (1-го типа).

Он выявлен у S. sanguis (2 штамма), S. salivarius (1 штамм), Staphylococcus spp. (2 штамма), E. faecalis (1 штамм), K. pneumoniae (1 штамм), V. parvula (1 штамм), то есть у 8 из 30 исследованных штаммов, что составило 26,6 %. Среди пародонтопатогенных видов ген CTX-M-2 выявлен у Т. forsythia (1 штамм), P. gingivalis (1 штамм), P. intermedia (1 штамм), P. micra (1 штамм), S. intermedius (2 штамма), то есть в 6 из 36 исследованных штаммов, что составило 16,7 %. Различия в 1,6 раза были статистически достоверны (р = 0,026).

Другой ген, контролирующий резистентность к цефалоспоринам, Mec-1 выявляли реже - у S. sanguis (2 штамма) и S. aureus (1 штамм), то есть у 3 из 30 штаммов (частота - 10 %), а у пародонтопатогенных видов -Т. forsythia (1 штамм), P. gingivalis (1 штамм), то есть у 2 из 36 (частота - 5,5 %). Различия почти в два раза также были статистически достоверны (р = 0,031).

Как известно, более высокий уровень устойчивости возбудителей связан с генами резистентности к карбапенемам, которые можно разделить на несколько групп. Так, ген VIM был выявлен у одного штамма Pseudo-

monas aeruginosa (частота для резидентной флоры - 3,3 %) и одного штамма P. micra (частота для пародонтопатогенной флоры -2,8 %).

Другой ген, кодирующий резистентность к карбапенемам 2-го типа - NDM выявлен у 1 штамма K. pneumonia (частота для резидентной флоры - 3,3 %) и ни в одном случае - у пародонтопатогенных бактерий.

И, наконец, третий ген этой группы -OXA-48 не выявлен ни в одном случае. Таким образом, обсуждая устойчивость к карбапе-немам, можно сделать заключение о единичных находках генов резистентности.

Резистентность к гликопептидным антибиотикам (ванкомицину, тейкопланину) кодируется генами VanA и VanB. Среди резидентной флоры выявлен один штамм E. fae-calis с геном VanB, кодирующим устойчивость энтерококков к ванкомицину (частота 3,3 %). Среди пародонтопатогенных видов данный ген не обнаружен, но выявлен один штамм P. intermedia с геном VanA, кодирующим расширенный спектр как против ван-комицина, так и против гликопептидного препарата нового поколения - тейкопланина (частота 3,3 %).

Таким образом, обсуждая устойчивость к гликопептидам, можно сделать заключение о единичных находках генов резистентности.

Ген Erm, кодирующий резистентность к макролидам, был выявлен у пяти штаммов резидентной флоры из 30: у S. sanguis (1 штамм), S. salivarius (1 штамм), S. aureus (1 штамм), E. faecalis (1 штамм), K. pneumonia (1 штамм), то есть с частотой 16,6 %. У пародонтопатоге-нов несколько реже - P. gingivalis (1 штамм), P. micra (1 штамм), S. intermedius (2 штамма), то есть с частотой 11,1 %. Различия в 1,5 раза были статистически достоверны (p = 0,05).

Ген Tet, кодирующий резистентность к тетрациклинам, был выявлен у семи штаммов резидентной флоры из 30: у S. sanguis (1 штамм), S. epidermidis (1 штамм), S. aureus (1 штамм), K. pneumonia (1 штамм), P. aeru-ginosa (1 штамм) V. parvula (2 штамма), то есть с частотой 23,3 %. У пародонтопатогенов несколько реже - у четырех штаммов: T. forsythia (1 штамм), P. gingivalis (1 штамм), P. micra (1 штамм), S. intermedius (1 штамм), то есть с частотой 11,1 %. Различия в 2 раза были статистически достоверны (p = 0,025).

Плазмидная резистентность к

фторхинолонам QnrB (но не Qn^, QnrS) выявлена у четырех штаммов резидентных бактерий: у S. sanguis (2 штамма), K. pneumonia (1 штамм), V. parvula (1 штамм), то есть с частотой 13,3 %, в то время как среди паро-донтопатогенных видов - только в двух случаях: P. gingivalis (1 штамм), S. intermedius (1 штамм), то есть с частотой 5,5 %. Различия более чем в два раза, были статистически достоверны (p=0,025).

Следует отметить, что среди выделенных нами культур были штаммы с множественной резистентностью к антибиотикам: K. pneumonia - к пяти, S. aureus, S. sanguinis, P. gingivalis — к четырем, E. faecalis, S. intermedius — к трем препаратам. Причем частота выявления штаммов с множественной устойчивостью среди резидентных видов составила 13,3 % (4 штамма), а пародонтопатогенных -5,5 % (2 штамма). Различия почти в 2,5 раза были статистически достоверны (p = 0,025).

Основное содержание дальнейшего исследования в этом направлении состояло в сравнении результатов фенотипического определения резистентности к антибактериальным препаратам диско-диффузионным методом и детекции соответствующих генов резистентности с помощью ПЦР, что позволило проследить связь между частотой встречаемости отдельных генетических марке-

ров резистентности и результатами стандартного метода определения чувствительности у микроорганизмов, формирующх биопленки десен (пародонтальных карманов) при воспалительных заболеваниях пародонта.

Для этого использовали следующие диски: метронидазол, линкомицин, метициллин (ампициллин), амоксициллин+клавуланат натрия, спирамицин, ванкомицин, тетрациклин (доксициклин), имепенем, ципро- и моксифло-ксацин (табл.).

Очевидно, что наиболее часто применяемые (за последние 20-30 лет) в стоматологической практике препараты -метронидазол и линкомицин продемонстрировали самое высокое число устойчивых штаммов - 52,3 и 22,7 % соответственно, причем чувствительных к метронидазолу штаммов было в 3,9 раза меньше, чем устойчивых, а для линкомицина это соотношение приближалось к 1:1.

Количество метициллин-резистентных штаммов составило 11,4 %, что коррелировало с выявлением генов резистентности CTX-M-2 у 16,7 % штаммов (г = 0,789; р = 0,032). При использовании беталактамазо-защищенных препаратов (амоксиклав) показатель резистентных штаммов снижался до 2,3 %, что коррелировало с выявлением гена резистентности Mec-1 у 5,5 % штаммов (г = 0,648; р = 0,022).

Частота выделения штаммов неклостридиальных анаэробных бактерий резистентных и чувствительных к антибиотикам

Таблица

Диски с Частота резистентных штаммов- Частота чувствительных штаммов- C00TH0-

препаратами R (кол-во / %) S (кол-во / %) шениеИ/S

Метронидазол 23 52,3 6 13,6 3 9**

Линкомицин 10 22,7 12 27,3 0,8

Метициллин 5 11,4 27 61,4 0,2*

Амоксиклав 1 2,3 40 90,9 0,03*

Спирамицин 6 13,6 24 54,5 0,3*

Ванкомицин 10 22,7 28 63,6 0,4*

Доксициклин 2 4,6 37 81,8 0,06*

Имепенем 2 2,3 41 95,5 0,02*

Ципрофлоксацин 6 13,6 28 63,6 0,2*

Моксифлоксацин 2 4,6 30 68,2 0,07*

Примечание: ** показатель резистентных штаммов достоверно выше, чем чувствительных; * показатель резистентных штаммов достоверно ниже, чем чувствительных.

Резистентность к карбопенемам (имепенем) выявлена только у 2,3 % штаммов, а ген VIM у 2,8 %, то есть показана высокая прямая корреляционная зависимость (г = 0,799; р = 0,01).

Резистентность к макролидам (спира-мицин) выявлена у 13,6 % штаммов, а ген Erm выявлен у 11,1 % штаммов, то есть также показана высокая прямая корреляционная зависимость (г = 0,764; р = 0,01).

Резистентность к тетрациклинам (доксициклин) выявлена только у 4,6 % штаммов, а ген Tet - у 11,1 % штаммов, то есть статистически достоверная корреляционная зависимость не выявлена (г = 0,234; р = 0,052).

Резистентность к гликопептидам (ванкомицин) выявлена у 13,6 % штаммов, а гены VanA и VanB выявлены у 3,3 % штаммов, то есть корреляционная зависимость также не выявлена (г = 0,242; р = 0,056).

Резистентность к фторхинолонам разных поколений - ципрофлоксацину (2-е поколение) и моксифлоксацину (4-е поколение) выявлена у 13,6 и 4,6 % штаммов соответственно, а плазмиды QnrB — у 5,5 % штаммов, при этом установлена прямая высокая корреляционная зависимость для мокси-флоксацина (г = 0,785; р = 0,01).

Заключение. Таким образом, для большинства изученных антибактериальных препаратов (беталактамы, карбапенемы, макролиды, фторхинолоны) установлена достоверная взаимосвязь между наличием генов, кодирующих резистентность, и результатами фенотипиче-ского метода определения чувствительности. Случаи ее отсутствия (тетрациклины, глико-пептиды) могут быть объяснены наличием дополнительных генетических маркеров резистентности, которые не учитывались в нашем исследовании, так как помимо генов Tet, VanA и VanB, отвечающих за устойчивость к данным антибиотикам, возможно, ее кодирование другими хромосомными генами и плазмидами.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1.Диденко Л.В. Формирование биопленок на стоматологических полимерных материалах как основа персистенции микроорганизмов при патологии зубов и пародонта / Диденко Л.В., Автандилов Г.А., Ипполитов Е.В., Царева Е.В., Смирнова Т.А., Шевля-гина Н.В., Царев В.Н. Эндодонтия Today. 2015. № 4. С. 13-17.

2.Ипполитов Е.В. Мониторинг формирования микробной биоплёнки и оптимизация диагностики воспалительных заболеваний пародонта: автореф. дис. ... д-ра мед. наук. М., 2016. 48 с.

3.Царёв В.Н. Лабораторная диагностика анаэробной (неклостридиальной) инфекции // Руководство по медицинской микробиологии / под ред. А.С. Лабинской, Н.Н. Костюковой. М.: Бином. 2013. Кн. 3. Т.1. С. 439-454.

4.Чеботарь И.В., Маянский А.Н., Кончакова Е.Д. Нейтрофилы и бактериальные биоплёнки: диалектика // ЖМЭИ. 2013. № 6. С. 105-112.

Полученные данные позволяют сделать заключение о предпочтительном использовании ряда препаратов в комплексном лечении заболеваний пародонта как варианта анаэробной неклостридиальной инфекции. На наш взгляд, к ним могут быть отнесены те антибиотики внутриклеточного действия, к которым определена минимальная частота выявления генетических механизмов резистентности: макролиды, тетрациклины и фторхинолоны. Применение препаратов этих групп показано не только в качестве терапии в острой фазе заболевания, но и в фазе ремиссии, в качестве профилактических курсов.

Что касается других групп антибактериальных препаратов с низкой частотой выявления генов резистентности (бета-лакамазо-защищенные препараты, карбапенемы, ванко-мицин), то их целесообразно применять исключительно в период обострения пародонти-та, так как они не обладают способностью проникать внутриклеточно. Применение таких препаратов желательно проводить в виде ступенчатой терапии, причем второй ступенью назначать пациенту антибактериальный препарат внутриклеточного действия.

Предложенное обоснование, на наш взгляд, позволит оптимизировать существующие схемы применения антибактериальных препаратов в комплексном лечении воспалительных заболеваний пародонта, которое в настоящее время, к сожалению, проводится эмпирически и потому дает кратковременный эффект.

REFERENCES

1. Didenko L.V. Formirovanie bioplenok na stomatologicheskih polimernyh materialah kak osnova persistentsii mikroorganizmov pri patologii zubov i parodonta / Didenko L.V., Avtandilov G.A., Ippolitov E.V., Careva E.V., Smirnova T.A., Shevlyagina N.V., Tsarev V.N. Endodontiya Today. 2015. № 4. S. 13-17.

2. Ippolitov E.V. Monitoring formirovaniya mikrobnoy bioplyonki i optimizatsiya diagnostiki vospalitel'nyh zabolevaniy parodonta: avtoref. dis. ... dra med. nauk. M., 2016. 48 s.

3. Tsaryov V.N. Laboratornaya diagnostika an-aerobnoy (neklostridial'noy) infektsii // Rukovodstvo po medicinskoy mikrobiologii / pod red. A.S. Labinskoy, N.N. Kostyukovoy. M.: Binom. 2013. Kn. 3. T.1. S. 439-454.

4. Chebotar' I.V., Mayanskiy A.N., Konchakova E.D. Neytrofily i bakterial'nye bioplyonki: dialektika // ZhMEI. 2013. № 6. S. 105-112.

5.LeBlanc D.J. Антибиотики и лечение инфекционных заболеваний / LeBlanc, D.J., Flynn T.R., Simos C., Lantz M.S. // Микробиология и иммунология для стоматологов / под ред. Р. Дж. Ламант, М.С. Лантц, Р.А. Берне, Д.Дж. Лебланк. М.: Практическая медицина. 2010. C. 427-470.

6.Lebeaux D., Chauhan A. O., Rendueles C. Beloin From in vitro to in vivo Models of Bacterial Bio-film-Related Infections Pathogens. 2013. № 2. P. 288-356.

7.Meier-Davis S. Host response to biofilms / Eds.: J.L. Pace, M.E. Rupp, R.G. Finch // Taylor & Francis. Biofilms, infection, and antimicrobial therapy. 2006. P. 305-320.

5. LeBlanc D.J. Antibiotiki i lechenie in-fektsionnyh zabolevaniy / LeBlanc, D.J., Flynn T.R., Simos C., Lantz M.S. // Mikrobiologiya i immunologiya dlya stomatologov / pod red. R. Dzh. Lamant, M.S. Lants, R.A. Berne, D.Dzh. Leblank. M.: Prakticheskaya meditsina. 2010. C. 427-470.

6. Lebeaux D., Chauhan A.O., Rendueles C. Beloin From in vitro to in vivo Models of Bacterial Bio-film-Related Infections Pathogens. 2013. N 2. P. 288-356.

7. Meier-Davis S. Host response to biofilms / Eds.: J.L. Pace, M.E. Rupp, R.G. Finch // Taylor & Francis. Biofilms, infection, and antimicrobial therapy. 2006. P. 305-320.

УДК 615.281 ГРНТИ 34.15.63

СИНЕРГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ БАЙКАЛЕИНА С ЦЕФОТАКСИМОМ В ОТНОШЕНИИ KLEBSIELLA PNEUMONIA, ОПОСРЕДОВАННЫЕ ИНЦИГИБИРОВАНИЕМ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА CTX-M-1

Wenhui Caia'b, Yingmei Fu a'c, Wenli Zhang a'c, Xiaobei Chena'c, Jizi Zhaoa'c, Wuqi Songa'c, Yujun Li a'c, Ying Huang a'c, Zheng Wua'c, Rui Sun a'c, Chunping Dong a'c, Fengmin Zhang a'c a Институт им. Ву Лейн-Тех, кафедра микробиологии, Медицинский университет Харбина, Харбин, Китайская народная республика

b Кафедра микробиологии и иммунологии, колледж базовых медицинских наук, Хэйлунцзян-ский университет китайской медицины, Харбин, Китайская народная республика c Китайско-российский институт инфекционных болезней и иммунитета, Медицинский университет Харбина, Харбин, Китайская народная республика

Генерация бета-лактамаз расширенного спектра является одним из ведущих механизмов развития резистентности к антибактериальным препаратам у Klebsiella pneumonia. Комбинированные антибактериальные препараты показали себя как сравнительно эффективный метод контроля таких резистентных штаммов. Некоторые из китайских растительных ингредиентов известны своими синергиче-скими антибактериальными эффектами. Целью настоящего исследования было изучение си-нергических эффектов китайских растительных ингредиентов с цефотаксимом в отношении

штаммов Klebsiella pneumonia, вырабатывающих бета-лактамазы расширенного спектра, а также анализ механизма синергетического действия, и экспериментальное обоснование клинического применения антимикробных препаратов. В отношении шестнадцати штаммов resistant K. pneumoniae, из которых 15 были резистентны к цефотаксиму и один вырабатывал бета-лактамазы расширенного спектра, выраженность синергического действия цефо-таксима с байкалеином, матрином и клавулоно-вой килотой составили 56,3, 0, и 100 % соответственно. Франкциональний индекс ингиби-

© Wenhui Cai, Yingmei Fu, Wenli Zhang, Xiaobei Chen, Jizi Zhao, Wuqi Son, Yujun Li, Ying Huang, Zheng Wu, Rui Sun, Chunping Dong, Fengmin Zhang, 2016