СПОСОБ ОТБОРА ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ ДЛЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ С ВЫРАЖЕННЫМ ДЕЙСТВИЕМ НА СОСУДИСТУЮ СИСТЕМУ
METHOD FOR SELECTING PHOTOSENSITISERS FOR PHOTODYNAMIC THERAPY WITH PRONOUNCED EFFECT ON VASCULAR SYSTEM

Изобретение относится к области фотобиологии и медицины, а более конкретно - способам отбора фотосенсибилизаторов (ФС) - препаратов с определенным направленным действием, используемых для фотодинамической терапии (ФДТ).
Актуальность проблемы обусловлена увеличением числа методов ФДТ и диагностики, основанных на использовании порфириновых ФС. Повышенное внимание к таким вопросам обусловлено поиском ФС, обладающих высокой эффективностью при терапии онкологических заболеваний, а также болезней сетчатки, самыми распространенными из которых являются экссудативная форма возрастной макулярной дегенерации и пролиферативная диабетическая ретинопатия.
Фотодинамическая терапия представляет собой метод лечения, состоящий из последовательного системного или местного введения ФС, который избирательно накапливается в патологически измененной ткани, и воздействия на данную биологическую мишень излучения с длиной волны, соответствующей одному из максимумов поглощения ФС. При этом образуются активные формы кислорода, оказывающие цитотоксическое воздействие на клетки-мишени [1].
Васкулярная система в опухолях и патологически измененных тканях при других заболеваниях является важным объектом при проведении ФДТ. Разрушение сосудистой системы в результате фотодинамического воздействия регистрируется при фототерапии солидных опухолей, подавлении роста неокапилляров при возрастной дистрофии сетчатки и во многих других случаях [2, 3].
Механизмы, лежащие в основе васкулярных эффектов ФДТ, многообразны: индуцированные активными формами кислорода (преимущественно синглетным кислородом) окислительные процессы сопровождаются сокращением кровеносных сосудов, увеличением проницаемости их стенок, повышением степени адгезии лейкоцитов, образованием тромбов. Так как основной действующий в ходе проведения ФДТ агент, синглетный кислород, обладает очень малым временем жизни, основные мишени повреждения и, соответственно, механизмы развития реакции сосудистой системы существенно зависят от характеристик распределения ФС.
Разработка метода ФДТ с высокой степенью поражения васкулярной системы патологически измененных тканей связана с поиском ФС с повышенным сродством к клеткам и тканям сосудов. Нами заявляется способ отбора ФС, проявляющих повышенную фотодинамическую активность в отношении сосудистой системы.
Известен способ определения фотодинамической активности in vitro, при котором в оптически прозрачный сосуд для фотобиологических исследований помещают биологическую культуральную среду, содержащую культуру опухолевых клеток, вводят ФС, инкубируют культуру клеток с ФС, затем культуру клеток отмывают от фотосенсибилизированной культуральной среды, добавляют чистую культуральную среду, затем этот сосуд облучается светом соответствующей длины волны. В результате фотодинамического воздействия часть клеток гибнет, и по соотношению погибших и выживших клеток определяют фотодинамическую активность фотосенсибилизатора [4]. Недостатком известного способа является его сложность, неоперативность, необходимость использования сложных микроскопических, радиоактивных или флуоресцентных методов для контроля соотношения погибших и выживших клеток.
Известен также способ лечения злокачественных опухолей методом ФДТ, заключающийся в том, что осуществляют фотодинамическую терапию сочетанным воздействием фотосенсибилизаторов, разрушающих питающие опухоль сосуды (ФССД), и фотосенсибилизаторов, преимущественно накапливающихся в отдаленных от сосудов клеточных структурах (ФСКД). Введение ФССД и соответствующее облучение проводят по крайней мере не ранее введения ФСКД и соответствующего облучения. Способ позволяет более полноценно разрушить опухоль. Однако в способе отсутствует метод отбора ФССД [5].
Известен способ прижизненного исследования фотосенсибилизаторов [6]. Способ позволяет прижизненно и неинвазивно исследовать на мелких лабораторных животных селективность накопления фотосенсибилизаторов разной химической природы в опухолевой ткани и получать сведения об их диагностических и фармакокинетических характеристиках на основе анализа флюоресценции всей опухоли. Проводят исследование фотосенсибилизаторов путем моделирования у экспериментального животного опухоли, введения фотосенсибилизатора, исследование накопления его в опухоли с помощью флюоресценции. При этом в качестве модели опухоли используют рак шейки матки или карциному легких Льюис. Регистрацию флюоресценции проводят методом диффузионной флюоресцентной томографии. Недостатками данного способа является его трудоемкость, большая протяженность во времени, а также невозможность определения преимущественной направленности ФС («сосудистого» или «клеточного» действия).
Наиболее близким по сущности к предлагаемому является способ определения фотодинамической активности in vitro [7], заключающийся в следующем. В оптически прозрачный сосуд для фотобиологических исследований помещают биологическую культуральную среду, содержащую культуру опухолевых клеток, вводят ФС, инкубируют культуру клеток с ФС, отмывают культуру клеток от фотосенсибилизированной культуральной среды, добавляют чистую культуральную среду, дополнительно в культуральную среду непосредственно перед облучением вводят эритроциты. Далее проводится облучение и в автоматическом режиме мониторинга регистрируются спектры поглощения или рассеяния, производится расчет соотношения окси- и дезоксигемоглобина, по динамике изменения которого оценивается скорость изменения оксигенации среды, по которой и определяют фотодинамическую активность ФС.
Однако способ-прототип является сложным, требующим множества манипуляций, снижающих точность метода. При этом определяется общая фотодинамическая активность ФС, но не оценивается направленность его действия.
Заявляемый способ позволяет производить быстрый отбор ФС, характеризующихся избирательностью действия на васкулярную систему. На основании скрининга ряда порфириновых ФС данным способом можно определить наиболее эффективные сенсибилизаторы для фотодинамической терапии патологий сосудистой системы.
Задачей предлагаемого изобретения является создание способа, позволяющего проводить отбор фотосенсибилизаторов с выраженным действием на сосудистую систему для увеличения эффективности фотодинамической терапии опухолей и повышения избирательности действия в случае сосудистых патологий.
Поставленная задача достигается тем, что в способе отбора фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии с выраженным действием на сосудистую систему, заключающимся в разделении образца крови на плазму и клетки путем центрифугирования, отборе плазмы, введении в каждый образец плазмы крови фотосенсибилизатора в таком количестве, чтобы конечная концентрация фотосенсибилизатора в плазме составляла 1-10 микромоль/литр, инкубировании образца в течение 40-60 минут в темноте при температуре 37°С, добавлении образца окрашенной фотосенсибилизатором плазмы, к клеточному осадку, инкубировании полученной смеси в течение 40-60 минут в темноте при температуре 37°С, повторном разделении центрифугированием клеток и плазмы, определении спектрофлуориметрическим методом относительного количества связанного с клетками фотосенсибилизатора по убыли его концентрации в плазме крови, а также в выборе в качестве ФС сосудистого действия фотосенсибилизаторов, более 40% которых связываются с клетками крови.
6
6
6
6
6
6
6
6
Сущность изобретения заключается в том, что установлена возможность использования ряда биофизических параметров распределения порфириновых ФС в крови для прогнозирования их фармакокинетического поведения в организме при проведении фотодинамической терапии. Ряд исследованных ФС включал хлорин e (Хл е), его производные, отличающиеся от Хл е составом боковых групп: γ-монометиловый эфир хлорина е (ММЭ); 6, γ-Диметиловый эфир хлорина е (ДМЭ); триметиловый эфир хлорина е (ТМЭ); а также гематопорфирин (ГП), тетракарбоксифенилпорфин (ТКФП). Все производные Хл е в мономерном состоянии обладают сходными спектрально-флуоресцентными свойствами [8]. Модификация боковых заместителей значительно изменяет полярные свойства молекулы ФС. Так, коэффициент распределения октанол/вода изменяется от 1 для наиболее полярного среди хлоринов пигмента Хл e, до 54 для липофильного ТМЭ (табл.1). Полярность ГП близка полярности ММЭ. Коэффициент распределения октанол/вода для ТКФП меньше 0,1; ТМЕ практически нерастворим в воде [8].
6
Было показано ранее, что все выбранные ФС характеризуются высоким сродством к белкам сыворотки крови. При этом при введении в сыворотку крови различия в химической структуре ФС проявляются не в изменении относительной концентрации несвязанного ФС, а в характере распределения его молекул между различными типами белков. Так, Хл е, ММЭ, ГП, ТКФП образуют в составе плазмы комплексы преимущественно с альбумином, тогда как ДМЭ, ТМЭ связываются, главным образом, липопротеинами низкой и высокой плотности. Смешивание окрашенного ФС образца сыворотки крови с клетками приводит к нарушению равновесия в процессах комплексообразования ФС с белками и, как следствие, к перераспределению ФС с белков сыворотки на клетки крови. Результаты анализа распределения ФС между клетками крови и сывороточными белками представлены в таблице 1.
Таблица 1
Распределение ФС между клетками крови и сывороточными белками
Фотосенсибили-затор
ТКФП
ГП
Хлеб
ММЭ
ДМЭ
ТМЭ
N, %
0
8,7
2,5
5,7
43,0
10,0
N - относительное количество ФС, связанного в образце крови с клетками крови через 1 час после введения.
6
6
Как видно из представленных данных, эффективность связывания ФС с клеточными компонентами крови сильно различается. Умеренно полярные ФС Хл e, ММЭ, ГП проявляют определенное сродство к клеткам, однако относительное количество этих ФС, связанных с клетками, невелико. Более 90% введенного количества умеренно полярных ФС остается связанными с белками сыворотки крови. Величина фракции ФС, регистрируемая в составе клеточного осадка, остается практически неизменной при варьировании длительности темновой инкубации исследуемого образца в интервале 0,1-24 часа. В случае диметилового эфира Хл e наблюдается совершенно иной характер распределения в составе крови: более 40% ДМЭ, введенного в плазму, перераспределяются и связываются с клетками крови. Равновесный уровень их окрашивания достигается в течение 1 часа, при дальнейшем инкубировании относительное количество ДМЭ в составе клеток крови практически не изменяется.
Сравнение эффективности связывания клетками различных порфириновых ФС показывает, что данный параметр определенным образом коррелирует с уровнем полярности молекулы ФС. Независимо от особенностей химической структуры уменьшение степени полярности ФС сопровождается ростом относительного сродства ФС к клеточным компонентам крови. Данная закономерность нарушается лишь при исследовании наименее полярных ФС. Как видно из таблицы 1, только 10% ТМЭ спустя 1 час после введения связывается в составе клеток. Низкая эффективность связывания неполярных ФС клетками отражает особенности поведения этих ФС в водной среде, а также низкую скорость перераспределения неполярных ФС между белковыми носителями и плазматической мембраной клеток крови [8].
6
6
Проведено сравнение взаимосвязи характеристик распределения порфириновых ФС между плазмой и форменными элементами крови и эффективностью сенсибилизации ими фотоповреждений кровеносных сосудов. Установлено, что физико-химические характеристики ФС, влияющие на процессы его распределения в крови, играют основную роль в определении результативности фотосенсибилизированного воздействия на сосудистую систему тканей. Так, методом флуоресцентной конфокальной микроскопии на изолированной стенке артерии кролика, было показано, что основное количество исследуемых ФС сосредоточено в монослое эндотелиальных клеток, при этом умеренно гидрофобные ФС накапливаются в эндотелиальных клетках в значительно больших количествах по сравнению с полярными и гидрофобными ФС [9]. Эти данные согласуются с полученными ранее результатами сравнения связывания Хл e и ДМЭ exvivo [9], согласно которым при однократном пропускании образцов сыворотки, окрашенной ФС, значительно большее количество ДМЭ в сравнении с Хл е связывается в стенке изолированной артерии.
Для оценки активности ФС мы исследовали динамику фотоповреждения васкулярной системы musculus cremaster. Фотоповреждение васкулярной системы мышцы musculus cremaster, сенсибилизируемое различными ФС, представлено в таблице 2.
Таблица 2
Фотоповреждение васкулярной системы мыщцы musculus cremaster, сенсибилизируемое различными ФС
Фотосенсибилизатор
Реакция сосудистой системы на фотовоздействие
Полный гемостаз
Время после облучения, мин
Хл e<sub>6</sub>
30,2±8,7
90,4±15,5
ММЭ
32,4±6,6
85,2±15,2
ГП
48,2±9,6
120±26,8
ДМЭ
10,2±3,1
21,3±4,2
ТМЭ
32,2±9,1
92,2±16,7
Доза препарата - 1 мг/кг внутривенно. Облучение полупроводниковыми лазерами (для хлоринов λ=660 нм, для ГП λ=630 нм), мощность - 50 мВт/см<sup>2</sup>, время световой экспозиции - 1 минута
*представлены результаты пяти повторных экспериментов (М±m)
6
Данные, представленные в таблице 2, поясним на примере сравнения фотосенсибилизирующей активности Хл е и ДМЭ с использованием фиг.1-фиг.3. На фиг.1-фиг.3 показана динамика фотоповреждения васкулярной системы musculus cremaster крысы, сенсибилизированного ДМЭ до облучения и при различных временах облучения: фиг.1 - сосудистая система мышцы крысы до облучения; фиг.2 - сосудистая система мышцы крысы через 10 минут после облучения; фиг.3 - сосудистая система мышцы крысы через 20 минут после облучения. Уже спустя 3-5 минут после начала облучения наблюдается сужение кровеносных сосудов, движение крови в них замедляется, по-видимому, вследствие запуска первичного тромбообразования. В дальнейшем, после образования более крупных тромбов, кровоток на отдельных участках сосудов прекращается, возникают видимые зоны запустевания в мелких сосудах. Затем в них, в области фотовоздействия, появляются отдельные участки, заполненные тромбированной клеточной массой, а часть сосудов полностью запустевает. Дальнейшее облучение усиливает реакцию васкулярной системы на фотосенсибилизированное воздействие: через 20-25 минут после начала облучения в образцах, обработанных ДМЭ, происходит полное прекращение циркуляции крови по сосудам исследуемой ткани.
6
При сенсибилизации musculus cremaster Хл е, ГП, ММЭ, ТМЭ наблюдается аналогичная динамика развития фотоповреждения васкулярной системы, однако для достижения окклюзии сосуда требуется в 3-5 раз большее время.
Представленные данные показывают, что физико-химические характеристики ФС, влияющие на процессы его распределения в крови, параметры связывания ФС со стенками кровеносных сосудов, играют основную роль в определении результативности фотосенсибилизированного воздействия на сосудистую систему тканей.
Предлагаемый нами способ отбора ФС с выраженным действием на сосудистую систему заключается в оценке распределения ФС в между белковыми и клеточными компонентами крови и отбора ФС, который преимущественно связывается с клетками крови.
6
6
6
6
тритона
6
-4
-6
Способ осуществляется следующим образом. Из образца крови (с гематокритом от 40% до 54%) готовятся 2 пробы объемом 2 мл, к каждой из которых добавляют 2 мл фосфатно-солевого раствора (буфер Дюльбекко). Пробы центрифугируют 10 минут при 1500 об/мин и, таким образом, разделяют клетки крови и плазму. Надосадочную жидкость каждой пробы осторожно отбирают, переносят в чистые пробирки, измеряют объем. Исходные растворы Хл e и ДМЭ с концентрацией 6,5·10 моль/л добавляют к соответствующим образцам отобранной плазмы из расчета по 7,7 мкл на 1 мл плазмы. Таким образом, концентрация Хл e и ДМЭ в плазме будет составлять 5·10 моль/л. Окрашенные хлоринами образцы плазмы инкубируют 40-60 минут в темноте в термостате при температуре 37°С. Затем в пробы с клеточным осадком добавляют плазму, окрашенную Хл e и ДМЭ. После инкубирования полученной смеси в течение 40-60 минут в темноте при температуре 37°С клетки и плазму повторно разделяют центрифугированием (10 минут при 1500 об/мин). Относительное количество связанного с клетками ФС определяют по убыли его концентрации в плазме крови. Для измерения концентрации ФС образцы плазмы крови с Хл e и ДМЭ разбавляют в 100 раз раствором детергента тритона Х-100 (Сх100=10%). Концентрации хлоринов в образцах определяли флуориметрически с использованием спектрофлуориметра SFL1211 фирмы Солар (Минск). Значения интенсивности флуоресценции определяли в максимумах спектра испускания 672-680 нм для Хл е и ДМЭ при возбуждении с λ=405 нм.
6
Полученные значения корректируют с целью учета ФС, связанного с сывороточными белками, находящимися в фазе клеточного осадка. Для этого клеточный осадок помещают в 10 мл буферного раствора и после центрифугирования определяют отношение концентраций белка в надосадочной жидкости и в исходной окрашенной плазме. В данном эксперименте с клетками связалось 2, 5% Хл e, тогда как 43,0% ДМЭ оказалось связанным с клеточной фракцией (см. табл.1). Из полученных данных следует, что ДМЭ является фотосенсибилизатором сосудистого действия.
Таким образом, предлагаемый способ оценки фотосенсибилизирующей активности порфириновых ФС является более простым, доступным, оперативным и достоверным. Предлагаемый способ позволяет проводить отбор ФС с высокой фотодинамической активностью и выраженным действием в отношении сосудистой системы, что позволяет корректировать выбор необходимого фотосенсибилизатора для избирательного повреждения васкулярной стстемы при различных патологиях.
Источники информации
1. Konan Y.N., Gurny R., Alleman E. State of the art in the delivery of photosensitizers for photodynamic therapy // J. Photochem. Photobiol. B: Biology. 2002. - V.66. - P.89-106.
2. Коган Е.А., Невольских А.А., Жаркова Н.Н., Лощенов В.Б. Морфо- и патогенез повреждений злокачественных опухолей при фотодинамической терапии. Арх.пат., №6, с.73-76.
3. Белый Ю.А., Терещенко А.В., Каплан М.А., Пупкова Т.Н. Фотодинамическая терапия при неоваскуляризации роговицы с фотосенсибилизатором Фотолон. Обзор // Рефракционная хирургия и офтальмология. - 2009. - Т.9, №1. - С.4-15.
4. Якубовская Р.И. и др. Скрининг и медико-биологическое изучение отечественных фотосенсибилизаторов. Российский химический журнал, том XLII, с.17-23.
5. Патент РФ №2113254/06, A61N 5/06, опубл. 20.06.1998 г.
6. Патент РФ №2373973, A61N 5/00, опубл. 27.11.2009 г.
7. Патент РФ №2185103, А61В 10/00, G01N 33/48, опубл. 20.07.2002 (прототип).
8. Зорин В.П., Хлудеев И.И., Зорина Т.Е. Распределение порфириновых сенсибилизаторов между белковыми и клеточными элементами крови // Биофизика. - 2000. - Т.45, вып.2. - С.313-319.
6
9. Зорин В.П., Хлудеев И.И., Кравченко И.Е., Портянко А.С. Васкулярные механизмы сенсибилизированного производными хлорина е фотоповреждения тканей // Веснiк Гродзенскага дзярж. Ўнiверсiтэта iнкi Яню Купалы. - .Сер.2. - Матэматыка. Фiзiка, Iнфарматыка, вылiчальная тэхнiка, кiраванне. Бiялогiя: - 2008. - №1(64). - С.25-29.