СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК TORQUE TENO MINI VIRUS РОДА BETATORQUEVIRUS СЕМЕЙСТВА ANELLOVIRIDAE В КРОВИ И ДРУГИХ БИОМАТЕРИАЛАХ МЕТОДОМ ПЦР-РВ
METHOD FOR DETECTING DNA OF TORQUE TENO MINI VIRUS OF THE GENUS BETATORQUEVIRUS FAMILY ANELLOVIRIDAE IN BLOOD AND OTHER BIOMATERIALS BY PCR-RT

Область техники, к которой относится изобретение:
Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии, молекулярной биологии и клинико-лабораторной диагностики вирусов человека. Раскрыты синтетические олигонуклеотиды для выявления ДНК вируса Torque teno mini virus рода Betatorquevirus семейства Anelloviridae. Праймеры объединены в наборы для выявления ДНК в крови и других биоматериалах вируса Torque teno mini virus рода Betatorquevirus семейства Anelloviridae методом полимеразной цепной реакции. Изобретение позволяет достоверно проводить обнаружение указанного вируса в биологическом материале. Использование данного метода обеспечивает также высокочувствительную и объективную количественную оценку вируса Torque teno mini virus.
Уровень техники:
Torque teno virus (TTV) впервые был обнаружен в 1997 году у пациента с посттрансфузионным гепатитом неизвестной этиологии [Nishizawa Т. et al., 1997]. Первоначально он был так назван по инициалам пациента, позже, не меняя аббревиатуры его стали называть Torque teno virus (в виде «тонкого ожерелья», лат.) и Transfusion transmitted virus (вирус, передающийся при переливании крови). TTV, раннее отнесенный к семейству Circoviridae, роду Anellovirus [Fauquet С.М. et al., 2005], в настоящее время состоит в недавно открытом семействе Anelloviridae с длиной генома 3.6-3.9 kb, варьирующейся в зависимости от изолятов [King А.М.Q. et al., 2012]. Вирус TTV представляет собой небольшой, без оболочки вирус с одноцепочечной кольцевой ДНК с отрицательной полярностью. Существуют две основные области генома TTV, а именно кодирующая белок область (~ 2,6 т.п.н.) и нетранслируемая область (UTR) (~ 1,2 т.п.н.). Возникновение расхождения последовательности TTV неравномерно распределено по всему геному; однако UTR высоко консервативен по сравнению с областью, кодирующей белок. Кодирующая белок область состоит из нескольких открытых рамок считывания (ORF), области N22 - ORF1, гипервариабельной области (HVR) и N-концевого богатого аргинином мотива [Okamoto et al., 1998; Muljono et al., 2001; Hussain et al., 2012; Hsiao et al., 2016]. Было показано, что TTV продуцирует до четырех мессенджерных РНК (мРНК), и экспрессия белка приводит к двум основным ORF, которые представляют собой ORF 1 и ORF 2 с несколькими более короткими ORF. Сайт сплайсинга соединяет отдаленные ORF и создает новые ORF, такие как ORF 3 и ORF 4 [Muljono et al., 2001; Qiu et al., 2005; Kakkola et al., 2008; Mueller et al., 2008].
Известно, что изоляты TTV демонстрируют «высокий уровень гетерогенности» - наличие у него более 40 генотипов, классифицированных в 5 различных филогенетических групп [Haramoto Е. et. al., 2008; Hussain et al., 2012; Mi Z. et al., 2014], однако, недавно было сообщено о дополнительных двух группах, которые объединяют варианты TTV в семь групп [Hsiao et al., 2016]. Кроме того, усовершенствование методов детекции ДНК TTV в последние годы, а также более глубокий анализ его биологии и строения, привело к открытию в рамках изучения TTV, таких самостоятельных вирусов как torque teno midi virus (TTMDV) и torque teno mini virus (TTMV). В 2000 г. был обнаружен небольшой ДНК-вирус, названный мини-вирусом Torque teno (TTMV), отдаленно похожий на TTV [Takahashi K. et al., 2000]. Позже, в 2007 году было зарегистрировано третье дополнение к роду анелловирусов; новый вирус имел геном 3,2 т.п.н. (TTV и TTMV были около 3,8 и 2,8 т.п.н., соответственно), отсюда и обозначение вируса Torque teno midi (TTMDV) [Ninomiya M. et al., 2007]. Хотя ПИР является быстрым и недорогим методом, в случае TTV, выбор геномной области TTV, нацеленной на амплификацию, является наиболее важной частью из-за его гетерогенности последовательности среди вариантов TTV. Обнаружение всего спектра генотипа TTV невозможно с использованием только одного набора праймеров. Так, группой японских ученых [Itoh K. et. al. 1999] были разработаны различные наборы праймеров на разные области генома TTV, чтобы оценить их способность к обнаружению ДНК TTV с помощью ПНР. Кроме того, нуклеотидные последовательности продуктов амплификации определяли и сравнивали среди изолятов TTV разных генотипов. Полученные результаты выявили глубокое влияние праймеров, используемых для ПЦР, на обнаружение ДНК TTV, обусловленное чрезвычайно широким диапазоном различий последовательностей среди TTV различных генотипов. Их результаты [Itoh K. et. al.,1999], а также данные недавних исследований других ученых свидетельствуют о том, что амплификация 5' или 3' UTR (UTR PCR) увеличивала частоту обнаружения TTV по сравнению с амплификацией области N22 - ORF 1 [Koohi А.K. et al., 2012; Peng J. et al., 2015]. До настоящего времени известны данные о распространенности и генетической гетерогенности TTV как у здоровых людей, так и при различных патологиях. Так, например, существует ряд исследований, которые изучают его распространение в сочетании с исследованиями его ассоциации с заболеваниями печени [Hsieh S.-Y. et al., 1999; Hafez M.M. et al., 2007], раком [Yoshida H. et al., 2000; de Villiers E.-M. et al., 2002; Jelcic I. et al., 2004], талассемией [Kondili L.A. et al., 2001; Abdalla N.M. et al., 2006; El-Maghraby D. et al., 2010; Hassuna N.A. et al., 2017], немалярийными лихорадочными заболеваниями [Hsu J. et al., 2018] и респираторными заболеваниями [Maggi F. et al., 2003 (a); Maggi F. et al., 2003(b); Jones M.S. et al., 2005]. Повышенные уровни виремии TTV были обнаружены у людей с ВИЧ-инфекцией [Shibayama Т. et al., 2001; Thorn К. et al., 2007; Fogli M. et al., 2012; Li L. et al., 2015], раком [Zhong S. et al., 2002; de Villiers E.-M. et al., 2002; Jelcic I. et al., 2004; de Villiers E. -M. et al., 2007], у детей с воспалительными заболеваниями органов дыхательной системы [Maggi F. et al., 2004; Pifferi M. et al., 2006], а также у людей с подавленным иммунитетом, при трансплантации стволовых клеток и трансплантации твердых органов [Blasek A. et al., 2008; Maggi F. et al., 2008; Gorzer I. et al., 2015; Abbas A.A. et al., 2016; Albert E. et al., 2017]. TTV устанавливает стойкие инфекции у человека, демонстрируя повышенную виремию у пациентов с ослабленным иммунитетом, так наблюдались максимумы репликации TTV во время сепсиса [Davila S. et al., 2018]. Хоть Pifferi М.С коллегами [Pifferi М. et al., 2005] при исследовании нагрузки TTV в носовой жидкости у здоровых детей и детей с астмой не обнаружили корреляции между показателями TTV и самим заболеванием, однако, выявили зависимость между назальной нагрузкой TTV и спирометрическими показателями, а также уровнем эозинофильного катионного белка в мокроте. Вирусная нагрузка TTV может снижаться у пациентов с отторжением трансплантата или хроническим гепатитом, поскольку печень является одним из мест репликации TTV. Beland K с коллегами обнаружили более низкую вирусную нагрузку у пациентов с хроническим гепатитом после ортотопической трансплантации печени, чем у пациентов с нормальной гистологией [Beland K. et al., 2014].
Среди множества исследований по вирусной нагрузке TTV, встречаются разные уровни TTV у людей. Более ранние сообщения о TTV выявляли низкую представленность этого вируса у здоровых людей и у пациентов с различными заболеваниями, частота обнаружения не достигала 90-100% [Charlton М. et al., 1998; Irshad М. et al, 2008], что, вероятно, связано с изменчивостью генотипов TTV и применением недостаточно универсальных ПЦР-праймеров. Отмеченная изменчивость распространенности TTV среди популяции людей в различных континентах по мнению Jarkasi N.S. [Jarkasi N.S. et al, 2018] также может быть связана с различными областями генома TTV, на которые нацелена амплификация, поскольку UTR-специфический праймер может приводить к более высокой частоте обнаружения по сравнению с ORF-специфическим праймером. Согласно исследованиям, проведенным в 2009 году [Vasilyev Е. V. et al., 2009], около 94% здоровых людей в российском населении имеют более 1000 копий генома TTV на 1 мл крови. Российскими учеными проведено исследование, в ходе которого были изучены особенности ПЦР-диагностики вирусов TTV и их распространенность среди пациентов с хроническими заболеваниями печени и у здоровых людей. По результатам этого исследования показано доминирование смешанной инфекции: ДНК TTV, TTMDV и TTMV выявлена у 67 и 72% пациентов из основной и контрольной групп соответственно. Сочетание вирусов TTV+TTMV выявлено у 15,6% пациентов из основной и у 12% из контрольной группы. Другие сочетания, а также моноинфекция TTMDV и TTMV встречались значительно реже и были представлены единичными случаями. При этом авторы утверждают, что отсутствие вирусов TTV, TTMV, TTMDV или их комбинации в организме человека встречается редко, частота выявления ДНК хотя бы одного из указанных вирусов в основной и контрольной группах составляет 95,3 и 89,6% соответственно, также не обнаружено статистически значимых отличий между контрольной группой и группой больных [Осипкина О.В. и др., 2018].
Во многих работах были исследованы возможные пути передачи TTV, так, например, известно, что TTV обнаруживается не только в мононуклеарных клетках печени и крови [Okamoto Н.. et al., 1998; Lopez-Alcorocho J.M. et. al., 2000], но и в грудном молоке [Yokozaki S. et al., 1999; Toyoda H. et al., 1999; Goto K. et al., 2000; Iso K. et al., 2001; E1-Esnawy N.A. et al, 2007], в амниотической жидкости [Matsubara H. et al., 2001], в сперме [Matsubara H. et al., 2000; Inami T. et al., 2000], в цервикальных мазках [Calcaterra S. et al., 2001; Fornai C. et al., 2001], в носовой жидкости и слезах [Calcaterra S. et al., 2001; Maggi F. et al., 2003 (а)], в фекалиях [Okamoto H. et al., 1998; Ross R.S. et al, 1999; Pinho-Nascimento C.A. et al., 2011], желчных соках [Itoh M. et al., 2001], в слюне [Ishikawa Т. et al., 1999; Gallian P. et al., 2000; Deng Xetal, 2000].
Кроме того, вирусный титр в пробах слюны был в 100-1000 раз выше, чем у соответствующей сыворотки [Gallian P. et al., 2000]. Gallian P. утверждает, что помимо возможной передачи TTV родительскими и перорально-фекальными путями, высокий титр ДНК TTV, наблюдаемый в слюне, поднимает гипотезу о передаче вируса капельками слюны. Этот путь передачи может объяснить высокую степень заражения вирусной инфекцией, наблюдаемой у населения в целом [Gallian P. et al., 2000].
Также показано, что TTV, встречающийся практически у 100% населения и обнаруженный почти в каждой ткани или жидкости организма человека, вызывает пожизненную виремию у большинства людей независимо от возраста и других параметров. Так, несмотря на то, что вертикальная передача TTV до настоящего времени однозначно не подтверждена [Mutlu D. et. al., 2007; Tyschik E.A. et. al., 2017] известно, что TTV обнаруживается также у детей первого года жизни независимо от их клинических данных [Yokozaki S. et al., 1999; Saback F. L. et al., 1999; Gemer P. et al., 2000; Bagaglio S. et al., 2002; Komatsu H. et al., 2004; Xin X. et al., 2004; Indolfi G. et al., 2007; Tyschik E. A. et al., 2018]. Kondili L. А. утверждает, что наличие TTV, по-видимому, не имеет клинического значения [Kondili L. A. et al., 2001]. TTV инфекция довольно распространена среди здоровых детей дошкольного и школьного возраста [Toyoda Н. et al., 1999]. Убедительных доказательств, подтверждающих ее патогенное участие у детей, не было найдено, так, например, TTV был обнаружен у детей с талассемией и здоровых детей в Египте [Abdalla N.M.et al., 2006, El-Maghraby D. et al., 2010; Hassuna N.A. et al, 2017]. Как показали данные выборки исследователей [Учайкин В.Ф. и др., 2010], прямой связи между обнаружением TTV с поражением печени не прослеживается. Частота идентификации трех представителей TTV оказалась практически одинаковой у здоровых детей, у детей больных острым гепатитом неустановленной этиологии и больных HVB или FFVC.
В литературе встречаются данные о комменсальной природе TTV [Simmonds P. et al, 1999; Griffiths P., 1999; Mushahwar I.K., 2000; Bendinelli M. et al., 2001; Griffin J.S. et al., 2008], поскольку он вызывает пожизненную виремию у большинства людей независимо от возраста, состояния здоровья и других параметров [Abe K. et al., 1999; AbuOdeh R. et al., 2015]. Мнения ученых о том, что репликация TTV отражает нарушение иммунной системы привело к тому, что группу этих вирусов считают маркером иммунодефицита [Focosi D. et al., 2014; Wohlfarth P. et al., 2018; Norden R. et al., 2018]. Тем не менее, вездесущность TTV инфекций, как было описано выше, затрудняет интерпретацию этих данных в ключе возможной патогенности этой группы вирусов и не позволяет связывать эти наблюдения с развитием какого-либо заболевания. Кроме того, автор [Mushahwar I.K., 2000] призывает не ссылаться на эти вирусы как на новые или потенциальные вирусы гепатита, поскольку они не соответствуют критериям, которые необходимо классифицировать как таковые. Эти критерии включают репликацию в гепатоцитах и последующее повреждение печени инфицированных хозяев, одновременное повышение уровня аланинаминотрансферазы (ALT) в сыворотке и аномальную патологию печени, а также доказательство развития острого и/или хронического гепатита.
Таким образом, многие аспекты TTV все еще противоречивы, это объясняется тем, что распространенность TTV является географически изменчивой, быстрый рост вариантов TTV с течением времени представляет собой проблему в оценке глобальной распространенности TTV, поскольку ни один из протоколов ПНР не способен обнаруживать весь спектр вариантов TTV. К тому же в настоящее время роль TTV в патогенезе заболевания до сих пор неизвестна, и заражение этим вирусом не дает никаких признаков и симптомов. Изучение распространенности TTV среди более уязвимых групп, таких как беременные женщины и новорожденные дети может дать оценку распространенности TTV в ходе беременности и в постнатальном периоде, однако для количественной оценки этого вируса необходимы новые подходы, например, выявления ДНК вирусов TTV, TTMDV, TTMV и их различных комбинаций, поэтому обоснованность в новых тест-системах для TTV очевидна.
Существует ряд недавних исследований, в которых используемые методы ПНР не были достаточно эффективными и не могли идентифицировать типы TTV в крови [Izadi S. et. al., 2016; Mohamed A. et. al., 2017].
В последние годы разрабатываются различные методы молекулярно-генетической диагностики вирусов, а также оценки их вирусной нагрузки. Данные методы позволяют выявлять специфические последовательности ДНК, уникальные для определенного вируса. Таким образом, соответствующий вирус обнаруживается в биоматериале, и делается вывод о наличии инфицирования. Из уровня техники известны следующие аналоги данного изобретения:
2.1 Патент № JP 2000175700 A «Определение вируса TTV с использованием метода ПНР в реальном времени с использованием праймера и пробы» [Kakinuma K. et. al., 2000].
Предметом данного изобретения является создание новых олигонуклеотидных праймеров, прямого и обратного, используемых для определения вируса TTV с помощью метода ПНР в реальном времени.
2.2 Патент № WO 2001085771 A1 «Новый TTV-родственный вирус s-TTV» [Abe K., 2001].
С точки зрения того, что новый вирус s-TTV, родственный вирусу TTV, может оказывать влияние на возникновение такого заболевания, как хронический гепатит, предусмотрены средства обнаружения нового вируса, связанного с TTV. Исходя из этого, была клонирована ДНК вируса s-TTV, что сделало возможным анализировать s-TTV ДНК, s-TTV антиген и s-TTV-антитело. В результате стало возможным диагностировать s-TTV инфекцию или отслеживать процесс заражения. Таким образом, может быть изучена связь между s-TTV и человеческими заболеваниями, а методика, подтверждающая эту связь, может быть отработана на животных.
2.3 Патент № US 2001041331 A1 «Методы определения вируса TTV» [LearyT. et. al., 2001]
Настоящее изобретение направлено на получение праймеров или проб, применяемых для определения вируса TTV в биологических образцах. Изобретение распространяется на методы, позволяющие использовать данные праймеры и пробы, а также на получение набора реагентов, содержащего эти олигомеры. Кроме того, данное изобретение направлено на использование нуклеотидных последовательностей вируса TTV в качестве векторов и в качестве маркеров для определения факта передачи вируса между организмами, а также путей передачи. Кроме того, данное изобретение направлено на методы определения инфекции TTV перед ксенотрансплантацией органов или тканей.
2.4 Патент № WO 2008138619 A2 «Определение новой последовательности олигонуклеотидов TTV для предупреждения, диагностики и лечения детской лейкемии» [De Villiers E.-M. et. al., 2008]
Настоящее изобретение описывает специфичную перестройку нуклеиновой кислоты вируса TTV, а также последовательности праймеров и проб, с помощью которых можно амплифицировать и детектировать данную нуклеиновую кислоту. Кроме того, настоящее изобретение описывает полипептиды, закодированные нуклеиновой кислотой, а также описывает антитела, связывающие данные полипептиды. В конечном итоге, данное изобретение описывает методы применения полученной нуклеиновой кислоты для диагностики развития детской лейкемии, для диагностики других злокачественных новообразований, для диагностики аутоиммунных заболеваний, также для производства вакцины для предупреждения и лечения данных заболеваний.
2.5 Патент № RU 2422536 C1 «Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления днк в крови и других биоматериалах возбудителя латентной вирусной инфекции - вируса Torque teno virus семейства Circoviridae методом полимеразной цепной реакции» [Трофимов Д.Ю. и др., 2011]
Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Раскрыты синтетические олигонуклеотиды для выявления ДНК вируса Torque teno virus всех известных генотипов. Праймеры объединены в набор для выявления ДНК в крови и других биоматериалах возбудителя латентной вирусной инфекции - вируса Torque teno virus семейства Circoviridae методом полимеразной цепной реакции. Изобретение позволяет достоверно проводить обнаружение указанного вируса в биологическом материале.
2.6 Патент № AU 2013204978 А1 «Изоляты и композиции вируса Torque Teno (TTV)» [Ankenbauer R.G. et. al., 2013]
Настоящее изобретение относится к новым нуклеотидным и аминокислотным последовательностям вируса Torque teno («TTV»), включая их новые генотипы, все из которых полезны для приготовления вакцин для лечения и профилактики заболеваний у свиней и других животных. Вакцины, предоставленные в соответствии с практикой изобретения, эффективны против множественных генотипов и изолятов TTV свиней. Диагностические и терапевтические поликлональные и моноклональные антитела также являются особенностью настоящего изобретения, как и инфекционные клоны, полезные для размножения вируса и для приготовления вакцин. Особенно важные аспекты изобретения включают вакцины, которые предусматривают белок TTV ORF1 или его пептидные фрагменты в качестве антигена.
2.7 Патент № US 9249192B2 «Клон инфекционной геномной ДНК и серологический профиль вируса Torque teno sus 1 и 2» [Meng X.-J., Huang Y., 2016]
Настоящее изобретение также относится к клонам инфекционной ДНК, биологически функциональной плазмиде или вирусному вектору, содержащему молекулу генома инфекционной нуклеиновой кислоты вируса Torque teno sus (TTsuV). Настоящее изобретение также относится к способам диагностики инфекции TTsuV с помощью иммунологических методов, например, иммуноферментного анализа (ELISA) и вестерн-блоттинга с использованием PTTV-специфических антигенов для выявления сывороточных PTTV-специфических антител, которые указывают на инфекции TTsuV1, TTsuV2 и отдельные генотипы TTsuV1.
2.8 Патент № US 9624511 B2 «Специфические последовательности вируса ТТ и молекулы ДНК клетки-хозяина химерного вируса ТТ для использования в диагностике, профилактике и лечении рака и аутоиммунитета» [Zur Hausen Н., de Villiers E.-M., 2017]
В настоящем изобретении описаны новые одноцепочечные последовательности вирусов ТТ, перестроенные последовательности ТТВ и гибридные молекулы определенной последовательности вируса ТТ и ДНК клеток-хозяев, которые способны автономно реплицироваться для использования в диагностике, профилактике и лечении заболеваний, таких как рак и аутоиммунитет. Кроме того, это относится к использованию таких молекул, как генные векторы и искусственные хромосомы.
2.9 Патент № US 9676828 B2 «Перегруппированные молекулы вируса ТТ для использования в диагностике, профилактике и лечении рака и аутоиммунитета» [De Villiers E.-M., zur Hausen H., 2017]
Настоящее изобретение относится к перегруппированным молекулам (а) специфической последовательности вируса ТТ и (б) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, проявляющий гомологию с белками млекопитающих, ассоциированными с раком и аутоиммунными заболеваниями, которые способны автономно реплицироваться для использования в диагностике, профилактике и лечении таких заболеваний, как рак и аутоиммунитет.
2.10 Патент № ЕР 3008185 В1 «Последовательности miRNA TTV как ранний маркер будущего развития рака и как мишень для лечения и профилактики рака» [Zur Hausen Н., de Villiers E.-M. et. al., 2018]
Настоящее изобретение относится к miRNA TTV, а также к зондам и праймерам, составляющим часть указанной полинуклеиновой кислоты miRNA TTV. Наконец, настоящее изобретение относится к применению указанных соединений в качестве раннего маркера для будущего развития рака.
Таким образом, в настоящее время в РФ нет действующих аналогов заявляемого изобретения.
Описание (раскрытие) изобретения:
Предложен способ определения вируса Torque teno mini virus рода Betatorquevirus семейства Anelloviridae в крови и других биологических жидкостях человека.
Наиболее перспективным является использование в этих целях метода полимеразной цепной реакции (ПНР) - это высокоспецифичный и высокочувствительный метод выявления вирусной ДНК. Принцип ПЦР заключается в многократном копировании (амплификации) определенного фрагмента ДНК, являющегося маркерным для данного вируса. Реакция ПНР осуществляется ферментом Taq-полимеразой, которая умеет удлинять олигонуклеотидные затравки (праймеры) до целого специфического продукта.
Основным достоинством метода ПНР как молекулярно-биологического исследования является его чрезвычайно высокая чувствительность. Используемые в медицинской практике тест-системы, основанные на принципе амплификации ДНК, позволяют обнаруживать патогенные для человека микроорганизмы даже в тех случаях, когда другими способами (иммунологическим, бактериологическим) их выявление невозможно. Система детекции результатов ПЦР в режиме «реального времени», наряду с ответом на вопрос о наличии или отсутствии в исследуемом образце ДНК инфекционного возбудителя, позволяет оценить его количество, что в ряде случаев позволяет уточнить диагноз и выбрать более адекватный метод лечения.
Работа над созданием олигонуклеотидов, которые используются в подобных наборах, строится обычно следующим образом.
1) С помощью открытых и коммерческих баз данных нуклеотидных последовательностей геномов вирусов либо в результате самостоятельного определения нуклеотидной последовательности изучаемого вируса выбирается участок генома, уникальный для данного вируса (или группы видов).
2) На основании выбранного участка генома с помощью специального программного обеспечения подбирается последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПНР-реакции (как правило, это 2 праймера и проба). На данном этапе работа заключается в создании выравнивания многих геномных последовательностей и выборе участка последовательности, где число мутаций соответствует требуемому расположению праймеров.
Выравнивание геномных последовательностей означает сравнение последовательностей геномов многих организмов друг с другом, поиск уникальных для интересующего вируса участков генома, не имеющих аналогов у других вирусов.
Поиск соответствия между числом мутаций и расположением праймеров означает, что известные на данный момент мутации, возможные у данного вируса, не должны затрагивать выбранный для праймеров участок генома, так как замены в геномной последовательности (мутации) могут негативно сказаться на работе праймеров.
3) Изготовление праймеров заказывается в специальном сервисном центре.
4) С помощью практических экспериментов доказывается пригодность подобранных последовательностей для конкретных целей (например, для определения наличия/отсутствия данного вируса в биоматериале; подсчета количества ДНК данного вируса в биоматериале - вирусной нагрузки).
Предлагаемое изобретение позволяет обнаруживать ДНК вируса Torque teno virus, вызывающего латентную вирусную инфекцию. Аналогичные наборы, а также реакционные смеси, праймеры и способы обнаружения ДНК этого вируса неизвестны.
Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является достоверное обнаружение указанного вируса в биологическом материале (цельная кровь, плазма крови, образцы тканей).
Указанный результат достигается путем использования при постановке ПЦР набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК вируса Torque teno mini virus рода Betatorquevirus семейства Anelloviridae, вызывающего латентную вирусную инфекцию, включающего в себя праймеры пробы соответственно:
где BHQ1 означает присоединенный к 3'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FAM - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду G на 5'-конце пробы.
Указанный набор синтетических олигонуклеотидов является составной частью набора следующих веществ:
4
2
4
2
1) Пробирки с реакционной смесью, запаянной парафином. В данную смесь входят указанные праймеры и проба, специфичные к участку ДНК Torque teno mini virus - так называемому консервативному домену, последовательность нуклеотидов которого среди разных генотипов TTV одинакова, смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов, реакционный буфер (80 мМ Tris-HCl (рН 8.6 при 25°С), 20 мМ (NH)SO, 3 мМ MgCl).
И праймеры, и проба представляют собой синтетические олигонуклеотиды. Праймеры, специфичные к маркерному участку генома вируса, вводятся в реакцию непосредственно для амплификации (наработки) продукта. Проба (тоже специфичная к данному участку ДНК) имеет в своем составе флуоресцентную метку, интенсивность флуоресценции которой свидетельствует о количестве образующегося продукта, что, в свою очередь, зависит от эффективности работы праймеров, количества стартового материала и других параметров реакции. Праймеры в реакции выступают в качестве компонентов, обеспечивающих прохождение реакции, а проба - в качестве компонента, обеспечивающего наблюдение за ходом реакции.
2) Раствор фермента Taq-полимеразы.
3) Положительный контрольный образец (ПК) - ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом консервативного участка генома TTV. Положительный контрольный образец вносится в отдельную пробирку с реакционной смесью. Результат амплификации ПК демонстрирует эталонное положительное прохождение реакции, с которым сравниваются результаты амплификации исследуемых образцов.
4) Отрицательный контрольный образец - образец, который вводится в эксперимент для контроля возможного загрязнения реактивов продуктами ранее проведенных реакций. Положительный результат в этом образце свидетельствует о необходимости заменить реагенты и переставить эксперимент.
Осуществление (реализация) изобретения:
1) Биологический материал (цельная кровь, плазма крови, образцы тканей) перед проведением ПНР с помощью предлагаемого набора реагентов проводится через процедуру пробоподготовки с использованием другого набора (набор реагентов для пробоподготовки не является предметом данного патента); в ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую, в свою очередь, используют для ПНР;
2) Необходимое количество пробирок с подготовленной реакционной смесью, содержащей специфические синтетические олигонуклеотидные праймеры и пробу, маркируется согласно количеству анализируемых образцов;
3) Во все промаркированные пробирки, не повреждая слой парафина, добавляется раствор Taq-полимеразы;
4) Во все промаркированные пробирки (кроме пробирок Неотрицательный контрольный образец), К+(положительный контрольный образец)) вносится выделенная согласно п. 1) ДНК;
5) В пробирку, маркированную К-, вносится отрицательный контрольный образец;
6) В пробирку, маркированную К+, вносится положительный контрольный образец;
7) Все пробирки устанавливаются в блок термоциклера, амплификация проводится согласно режимам, прописанным в инструкции к набору. Детекция результатов осуществляется детектирующим термоциклером автоматически во время амплификации (устройства: детектирующие термоциклеры ДТ-322, ДТ-96 (ЗАО "НПФ ДНК-Технология").
Анализ результатов проводится в соответствии с инструкцией к прибору.
В случае образования специфического продукта ДНК проба разрушается, что ведет к возрастанию уровня флуоресценции, который фиксируется специальными приборами - детектирующими термоциклерами.
Пробирки (приготовленные как описано выше) устанавливали в детектирующий амплификатор ДТ-прайм (ООО «НПО ДНК-Технология», Москва) и проводили реакцию со следующими параметрами циклирования:
Настройки анализа, устанавливаемые на приборе:
Метод - Геометрический (Ср) (BF), cr=9, vt=10, tp=0, tv=0
На основании экспериментальных данных при сравнении образцов крови методом ПЦР-РВ «в реальном времени» были получены и проанализированы результаты определения количества вируса на ПНР и определения количества вируса в 1 мл крови относительно образцов крови с единичными молекулами вируса Torque teno virus в виде кривой на определенном геометрическом цикле ПНР (в нашем случае СрО=46).
Количество вируса на ПНР определяют по формуле:
Ср0 - значение геометрического цикла в образце с единичными молекулами вируса, определяемое детектирующим амплификатором автоматически.
Cp1 - значение порогового цикла в целевом образце, определяемое детектирующим амплификатором автоматически.
Количество вируса в 1 мл крови определяют по формуле:
где 166,67 мл - чувствительность метода.
Список использованных источников
1. Abbas A.A., Diamond J.М., Chehoud С, Chang В., Kotzin J.J., Young J.C. et al. The perioperative lung transplant virome: torque teno viruses are elevated in donor lungs and show divergent dynamics in primary graft dysfunction. // Am. J. Transplant - 2017. - Vol 17, №5. - P. 1313-1324, doi: 10.1111/ajt.14076
2. Abdalla N.M, Galal A., Fatouh A. A., Eid K., Salama E.E.E., Gomma H.E. Transfusion transmitted virus (TTV) infection in polytransfused egyptian thalassemic children. // J. Med. Sci. - 2006. - Vol 6, №5. - P. 833-837, doi:10.3923/jms.2006.833.837
3. Abe K. et al. TT virus infection is widespread in the general populations from different geographic regions. // J Clin Microbiol. - 1999. - Vol 37, №8. - P. 2703-2705.
4. Abe K. Patent № WO 2001085771 A1. Novel ttv-related virus s-ttv. Application filed by 11.05.2001. Publication of 15.11.2001.
5. AbuOdeh R. et al. Detection and genotyping of torque teno virus (TTV) in healthy blood donors and patients infected with HBV or HCV in Qatar. // J. Med. Virol. - 2015. - Vol 87, №7. - P. 1184-1191, doi: 10.1002/jmv.24146.
6. Albert E., Solano C,  E., Focosi D.,  A., Macera L. et al. The kinetics of torque teno virus plasma DNA load shortly after engraftment predicts the risk of high-level CMV DNAemia in allogeneic hematopoietic stem cell transplant recipients. // Bone Marrow Transplantation. - 2017. - Vol 53, №2. - P. 180-187, doi: 10.1038/bmt.2017.235.
7. Ankenbauer R.G., Calvert J.G., Dunyak D.S. et. al. Patent № AU 2013204978 A1. Torque teno virus (TTV) isolates and compositions. Application filed by 12.04.2013. Publication of 16.05.2013.
8. Bagaglio S., Sitia G., Prati D., Cella D., Hasson H., Novati R., Lazzarin A., Morsica G. Mother-to-child transmission of TT virus: sequence analysis of the non-coding region of TT virus in infected mother-infant pairs. // Arch Virol. - 2002. - Vol 147, №4. - P. 803-812.
9. Bendinelli M., Pistello M., Maggi F. et al. Molecular properties, biology, and clinical implications of TT virus, a recently identified widespread infectious agent of humans. // Clin Microbiol Rev. - 2001. - Vol 14, №1. - p. 98-113, doi: 10.1128/CMR. 14.1.98-113.2001
10. Blasek A., Sillo P., Ishii N., Gergely P., Poor G., Preisz K., Hashimoto Т., Medvecz M., Karpati S. Searching for foreign antigens as possible triggering factors of autoimmunity: Torque Teno virus DNA prevalence is elevated in sera of patients with bullous pemphigoid. // Experimental Dermatology. - 2008. - Vol 17, №5. - P. 446-454, doi: 10.1111/j.1600-0625.2007.00663.x.
11. Beland K., Dore-Nguyen M., Gagne M.J. et al. Torque teno virus in children who underwent orthotopic liver transplantation: new insights about a common pathogen. // J Infect Dis. - 2014. - Vol. 209, №2. - P. 247-254, doi: 10.1093/infdis/jit423.
12. Calcaterra S., Zaniratti M.S., Serraino D., Peroni M., Abbate I. et al. Cervicovaginal shedding of TT virus in HIV-infected women. // J Hum Virol. - 2001. - Vol. 4, №6. - P. 343-345.
13. Charlton M. et al. TT-virus infection in north american blood donors, patients with fulminant hepatic failure, and cryptogenic cirrhosis. // Hepatology. - 1998. - Vol 28, №3. - P. 839-842.
14. Davila S., Halstead E.S., Hall M.W. et al. A viral DNAemia and immune suppression in pediatric sepsis. // Pediatric critical care medicine. - 2018. - Vol 19, №1. - P. 14-22, doi: 10.1097/PCC.0000000000001376.
15. De Villiers E.-M., Bulajic M., Nitsch C. et al. TTV infection in colorectal cancer tissues and normal mucosa. // Int. J. Cancer. - 2007. - Vol 121, P. 2109-2112.
16. De Villiers E.-M., Schmidt R., Delius H., zur Hausen H. Heterogeneity of TT virus related sequences isolated from human tumour biopsy specimens. // J. Mol. Med. - 2002. - Vol 80, P. 44-50, doi: 10.1007/s001090100281.
17. De Villiers E.-M., zur Hausen H. Patent № US 9676828 B2. Rearranged TT virus molecules for use in diagnosis, prevention and treatment of cancer and autoimmunity. Application filed by 19.12.2012. Publication of 13.06.2017.
18. De Villiers E.-M., zur Hausen H., Gunst K., Lehtinen M. Patent № WO 2008138619 A2. New ttv sequences for diagnosis, prevention and treatment of childhood leukaemia. Application filed by 15.05.2008. Publication of 20.11.2008.
19. Deng X., Terunuma H., Handema R., Sakamoto M., Kitamura T. et al. Higher prevalence and viral load of TT virus in saliva than in the corresponding serum: another possible transmission route and replication site of TT virus. // J Med Virol. - 2000. - Vol 62, №4. - P. 531-537.
20. El-Esnawy N. A., Bacheer H. H., Ezzat E., Mostafa A., Ashour E. et al. TT virus in infants sera and mother breast milks. // JGEB. - 2007. - Vol 5, P. 19 - 26.
21. El-Maghraby D., EL-Shafie A., El-Sayed S., Alkady M. Detection of TT virus among thalassaemic children with chronic viral hepatitis В and С receiving irradiated and non irradiated RBC. // J Radiat Res. - 2010. - Vol 3, №1. - P. 165-182.
22. Fauquet С.M. et. al. Virus taxonomy: Classification and nomenclature of viruses. // Eighth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. - 2005. - 1259 pp.
23. Focosi D., Macera L. et. al. Torque teno virus viremia correlates with intensity of maintenance immunosuppression in adult orthotopic liver transplant. // J Infect Dis. - 2014. - Vol 210, №4. - P. 667-668, doi: 10.1093/infdis/jiu209.
24. Fogli M., Torti C, Malacarne F., Fiorentini S., Albani M., Izzo I. et al. Emergence of exhausted В cells in asymptomatic HIV-1-infected patients naive for HAART is related to reduced immune surveillance. // Clin Dev Immunol. - 2012. - Vol 2012, P. 1-10, doi: 10.1155/2012/829584.
25. Fornai C, Maggi F., Vatteroni M.L., Pistello M., Bendinelli M. High prevalence of TT virus (TTV) and TTV-like minivirus in cervical swabs. // J Clin Microbiol. - 2001. - Vol 39, №5.-P. 2022-2024.
26. Gallian P., Biagini P., Zhong S. et al. TT virus: a study of molecular epidemiology and transmission of genotypes 1, 2 and 3. // J Clin Virol. - 2000. - Vol 17, №1. - P. 43-49.
27. Gerner P., Oettinger R., Gerner W., Falbrede J., Wirth S. Mother-to-infant transmission of TT virus: prevalence, extent, and mechanism of vertical transmission. // Pediatr Infect Dis J. - 2000. - Vol 19, №11. - P. 1074-1078.
28. Gorzer I., Jaksch P., Kundi M., Seitz Т., Klepetko W., Puchhammer-Stockl E. Pretransplant plasma torque teno virus load and increase dynamics after lung transplantation. // PLoS One. - 2015. - Vol 10, №3, doi: 10.1371/journal.pone.0122975.
29. Goto K., Sugiyama K., Ando Т., Mizutani F., Terabe K., Tanaka K., Nishiyama M., Wada Y. Detection rates of TT virus DNA in serum of umbilical cord blood, breast milk and saliva. // Tohoku J Exp Med. - 2000. - Vol 191, №4. - P. 203-207.
30. Griffin J. S., Plummer J. D., Long S. C. Torque teno virus: an improved indicator for viral pathogens in drinking waters. // Virol. J. - 2008. - Vol 5, P. 112, doi: 10.1186/1743-422X-5-112.
31. Griffiths P. Time to consider the concept of a commensal virus? // Rev. Med. Virol. - 1999. - Vol 9, №2. - P. 73-74.
32. Hafez M.M. et al. Prevalence of transfusion transmitted virus (TTV) genotypes among HCC patients in Qaluobia governorate. // Virol. J. - 2007. - Vol 4, №1, doi: 10.1186/1743-422X-4-135
33. Haramoto E., Katayama H., Ohgaki S. Quantification and genotyping of torque teno virus at a wastewater treatment plant in Japan. // Appl. Environ. Microbiol. - 2008. - Vol 74, №23. - P. 7434-7436, doi: 10.1128/AEM.01605-08.
34. Hassuna N.A., Naguib E., Abdel-Fatah M., Mousa S.M.O. Phylogenetic analysis of torque teno virus in thalassemic children in Egypt. // Intervirology. - 2017. - Vol 60, №3. - P. 102-108, doi: 10.1159/000480507.
35. Hsiao K.-L., Wang L.-Y., Lin C.-L., Liu H.-F. New Phylogenetic Groups of Torque Teno Virus Identified in Eastern Taiwan Indigenes. // PloS one. - 2016. - Vol 11, №2, doi: 10.1371 /journal.pone.0149901
36. Hsieh S.-Y. et al. High prevalence of TT virus infection in healthy children and adults and in patients with liver disease in Taiwan. // Am Soc Microbiol. - 1999. - Vol 37, №6. - P. 1829-1831.
37. Hsu J., Rosenthal P., Ruel Т., Kyohere M. et al. Etiology of non-malarial febrile illnesses in Ugandan children. // Pediatrics. - 2018. - Vol 141, №1. - P. 463-463.
38. Hussain Т., Manzoor S., Waheed Y., Tariq H., Hanif K. Phylogenetic analysis of torque teno virus genome from Pakistani isolate and incidence of co-infection among HBV/HCV infected patients. // Virology journal. - 2012. - Vol 9, №1. - P. 1.
39. Inami Т., Konomi N., Arakawa Y., Abe K. High prevalence of TT virus DNA in human saliva and semen. // J. Clin. Microbiol. - 2000. - Vol. 38, №6. - P. 2407-2408.
40. Indolfi G., Moriondo M., Galli L., Azzari C, Poggi G. M. et al. Mother-to-infant transmission of multiple blood-borne viral infections from multi-infected mothers // Journal of medical virology. - 2007. - Vol 79, №6. - P. 743-747, doi: 10.1002/jmv.20885.
41. Irshad M., Singh S., Irshad K., Agarwal S. K., Joshi Y. K. Torque teno virus: Its prevalence and isotypes in North India. // World J. Gastroenterol. - 2008. - Vol 14, №39. - P. 6044-6051, doi: 10.3748/wjg.14.6044.
42. Ishikawa Т., Hamano Y., Okamoto H. Frequent detection of TT virus in throat swabs of pediatric patients. // Infection. - 1999. - Vol 27, №4-5. - P. 298.
43. Iso K., Suzuki Y., Takayama M. Mother-to-infant transmission of TT virus in Japan. // International Journal of Gynecology and Obstetrics. - 2001. - Vol 75, №1. - P. 11-19, doi: 10.1016/S0020-7292(01)00450-7.
44. Itoh K., Takahashi M., Ukita M., Nishizawa Т., Okamoto H. Influence of primers on the detection of TT virus DNA by polymerase chain reaction. // The Journal of Infectious Diseases. - 1999. - Vol 180, №5. - P. 1750-1751, doi: 10.1086/315107
45. Itoh M., Shimomura H., Fujioka S.-1., Miyake M. et. al. High Prevalence of TT virus in human bile juice samples. // Dig Dis Sci. - 2001. - Vol 46, №3. - P. 457 - 462.
46. Izadi S., Samarbafzadeh A., Makvandi M., Neisi N. The association of prevalence and genotypes of torque teno virus (TTV) among chronic hepatitis В and С patients in Ahvaz, 2012. // Jentashapir J Health Res. - 2016 - Vol 7, №3, doi: 10.17795/jjhr-28407.
47. Jarkasi N.S., Sekawi Z., Kqueen C.Y., Othman Z. A. Review on The Global Widespread of TTV Infection Among Humans Population. // PJSRR. - 2018. - Vol 4, №1. - P. 10-24.
48. Jelcic I., Hotz-Wagenblatt A. et al. Isolation of multiple TT virus genotypes from spleen biopsy tissue from a Hodgkin's disease patient: genome reorganization and diversity in the hypervariable region. // J. Virol. - 2004. - Vol 78, №14. - P. 7498-7507.
49. Jones M. S. et al. New DNA viruses identified in patients with acute viral infection syndrome. // J. Virol. - 2005. - Vol 79, №13. - P. 8230-8236.
50. Kakinuma K., Kawamata O. et. al. Patent № JP 2000175700 A. Measuring of tt virus gene by real-time detection per method and primer and probe used therefor. Application filed by 18.12.1998. Publication of 27.06.2000.
51. Kakkola L.,  H., Hedman L., Kivi N., Moisala S. et. al. Expression of all six human Torque teno virus (TTV) proteins in bacteria and in insect cells, and analysis of their IgG responses. // Virology. - 2008. - Vol 382, №2. - P. 182-189, doi: 10.1016/j.virol.2008.09.012.
52. King A.M.Q., Adams M.J., Carstens E.В., Lefkowitz E.J. Virus Taxonomy: Classification and Nomenclature of Viruses. // Ninth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. - 2012. - 1327 pp.
53. Komatsu H., Inui A., Sogo Т., Kuroda K., Tanaka Т., Fujisawa T. TTV infection in children born to mothers infected with TTV but not with HBV, HCV, or HIV. // J Med Virol. - 2004. - Vol 74, №3. - P. 499-506, doi: 10.1002/jmv.20204.
54. Kondili L.A. et al. Prevalence of TT virus in healthy children and thalassemic pediatric and young adult patients. // JPGN. - 2001. - Vol 33, №5. - P. 629-632.
55. Koohi A. K., Ravanshad M., Rasouli M., Falahi S., Baghban A. Phylogenetic analysis of torque teno virus in hepatitis С virus infected patients in shiraz. // Hepatitis monthly. - 2012. - Vol 12, №7. - P. 437-441, doi: 10.5812/hepatmon.6133
56. Leary Т., Erker J., Chalmers M. et. al. Patent № US 2001041331 A1. Methods of utilizing the TT virus. Application filed by 23.03.2001. Publication of 15.11.2001.
57. Li L., Deng X., Da Costa A. C, Bruhn R., Deeks S. G., Delwart E. Virome analysis of antiretroviral treated HIV patients shows no correlation between T-cell activation and anelloviruses levels. // J Clin Virol. - 2015. - Vol 72, P. 106 -113, doi: 10.1016/j.jcv.2015.09.004.
58. Lopez-Alcorocho J. M., Mariscal L. F., de Lucas S. et. al. Presence of TTV DNA in serum, liver and peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic hepatitis // J Viral Hepat. - 2000. - Vol 7, №6. - P. 440-447.
59. Maggi F., Focosi D., Ricci V., Paumgardhen E., Ghimenti M., Bendinelli M. et. al. Changes in 8 CD8+57+ T lymphocyte expansions after autologous hematopoietic stem cell transplantation 9 correlate with changes in torquetenovirus viremia. // Transplantation. - 2008 - Vol 85, №12. - P. 1867-1868.
60. Maggi F., Pifferi M., Fornai C, Andreoli E., Tempestini E. et al. TT virus in the nasal secretions of children with acute respiratory diseases: relations to viremia and disease severity. // J Virol. - 2003 (a). - Vol 77, №4. - P. 2418-2425.
61. Maggi F., Pifferi M., Tempestini E. et al. TT virus loads and lymphocyte subpopulations in children with acute respiratory diseases. // J Virol. -2003 (b). - Vol 77, №16. -P. 9081 -9083, doi: 10.1128/JVI.77.16.9081-9083.2003.
62. Maggi F., Pifferi M., Tempestini E., Lanini L., de Marco E., Fornai C. et al. Correlation between Torque tenovirus infection and serum levels of eosinophil cationic protein in children hospitalized for acute respiratory diseases. // J. Infect. Dis. - 2004. - Vol 190, №5. - P. 971-974, doi: 10.1086/423143.
63. Matsubara H., Michitaka K., Horiike N., Kihana Т., Yano M., Mori Т., Onji M. Existence of TT virus DNA and TTV-like mini virus DNA in infant cord blood: mother-to-neonatal transmission. // Hepatol Res. - 2001 - Vol 21, №3 - P. 280-287.
64. Matsubara H., Michitaka K., Horiike N., Yano M., Akbar S. M., Torisu M., Onji M. Existence of TT virus DNA in extracellular body fluids from normal healthy Japanese subjects. // Intervirology. - 2000. - Vol 43, №1. - P. 16-19
65. Meng X.-J., Huang Y. Patent № US 9249192 B2. Infectious genomic DNA clone and serological profile of Torque teno sus virus 1 and 2. Application filed by 15.03.2013. Publication of 02.02.2016.
66. Mi Z., Yuan X., Pei G., Wang W., An X., Zhang Z. et. al. High-throughput sequencing exclusively identified a novel Torque teno virus genotype in serum of a patient with fatal fever. // Virologica Sinica. - 2014. - Vol 29, №2. - P. 112-118, doi: 10.1007/s12250-014-3424-z.
67. Mohamed A., Rahim El Hussein A., Elkhidir I., Enan K. Molecular detection of Torque Teno Virus (TTV) in plasma of people in contact with domestic village chickens using polymerase chain reaction (PCR). // IJSRSET. - 2017. - Vol 3, №8. - P. 250-254.
68. Mueller В., Maerz, A., Doberstein K., Finsterbusch Т., Mankertz A. Gene expression of the human Torque Teno Virus isolate P/1C1. // Virology. - 2008. - Vol 381, №1. - P. 36-45, doi: 10.1016/j.virol.2008.08.017.
69. Muljono D., Nishizawa Т., Tsuda F., Takahashi M., Okamoto H. Molecular epidemiology of TT virus (TTV) and characterization of two novel TTV genotypes in Indonesia. // Archives of virology. - 2001. - Vol 146, №7. - P. 1249-1266.
70. Mushahwar I.K. Recently discovered blood-borne viruses: are they hepatitis viruses or merely endosymbionts? // J Med Virol. - 2000. - Vol 62, №4. - P. 399-404.
71. Mutlu D., Abacioglu H., Altunyurt S. Investigation of transplacental transmission of TT virus in mother - newborn pairs // Mikrobiyol Bui. - 2007. - Vol. 41, №1. - P. 71-77.
72. Ninomiya M., Nishizawa Т., Takahashi M., Lorenzo F. R., Shimosegawa Т., Okamoto H. Identification and genomic characterization of a novel human torque teno virus of 3.2 kb. // J Gen Virol. - 2007. - Vol 88. - P. 1939 - 1944.
73. Nishizawa Т., Okamoto H., Konishi K., Yoshizawa H., Miyakawa Y., Mayumi M. A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1997. - Vol 241, №1. - P. 92-97.
74. Norden R., Magnusson, J. et. al. Quantification of torque teno virus and epstein-barr virus is of limited value for predicting the net state of immunosuppression after lung transplantation. // Open Forum Infect Dis. - 2018. - Vol 5, №4, doi: 10.1093/ofid/ofy050.
75. Okamoto H., Nishizawa Т., Kato N., Ukita M., Ikeda H., Iizuka H., Mayumi M. Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus (TTV) associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology. // Hepatology research. - 1998. - Vol 10, №1. -P. 1-16.
76. Peng J., Fang Y., Zhao X., Peng Y. New prevalence estimate of Torque Teno virus (TTV) infection in healthy population and patients with chronic viral hepatitis in Jiujiang, China // Virologica sinica. - 2015. - Vol 30, №3. - P. 218-220, doi: 10.1007/s12250-014-3531-x.
77. Pifferi M., Maggi F., Andreoli E., Lanini L., Marco E.D., Fornai C. et al. Associations between nasal torquetenovirus load and spirometric indices in children with asthma. // J. Infect. Dis. -2005. - Vol 192, №7. - P. 1141-1148,doi: 10.1086/444389.
78. Pifferi M., Maggi F., Caramella D., de Marco E., Andreoli E., Meschi S. et al. High torquetenovirus loads are correlated with bronchiectasis and peripheral airflow limitation in children. // Pediatr. Infect. Dis. J. - 2006. - Vol 25, №9. - P. 804-808, doi: 10.1097/01.inf.0000232723.58355.f4
79. Pinho-Nascimento C.A., Leite J.P., Niel C, Diniz-Mendes L. Torque teno virus in fecal samples of patients with gastroenteritis: prevalence, genogroups distribution, and viral load. // J Med Virol. - 2011. - Vol 83, №6. - P. 1107-1111, doi: 10.1002/jmv.22024.
80. Qiu J., Kakkola L., Cheng F., Ye C, Soderlund-Venermo M., Hedman K., Pintel D.J. Human circoviras TT virus genotype 6 expresses six proteins following transfection of a full-length clone. // Journal of Virology. - 2005. - Vol 79, №10. - P. 6505-6510, doi: 10.1128/JVI.79.10.6505-6510.2005.
81. Ross R.S., Viazov S., Runde V., Schaefer U.W., Roggendorf M. Detection of TT virus DNA in specimens other than blood. // J Clin Virol. - 1999. - Vol 13, №3. - P. 181-184, doi: 10.1016/S 1386-6532(99)00015-3.
82. Saback F.L., Gomes S.A., de Paula V.S., da Silva R.R., Lewis-Ximenez L L., Niel C. Age-specific prevalence and transmission of TT virus. // J Med Virol. - 1999. - Vol 59, №3. -P. 318-322.
83. Shibayama Т., Masuda G., Ajisawa A., Takahashi M., Nishizawa Т., Tsuda F., Okamoto H. Inverse relationship between the titre of TT virus DNA and the CD4 cell count in patients infected with HIV. // AIDS. - 2001. - Vol 15, №5. - P. 563-570
84. Simmonds P., Prescott L.E., Logue C, Davidson F., Thomas A.E., Ludlam C.A. TT virus-part of the normal human flora? III. Infect. Dis. - 1999. - Vol 180, №5. - P. 1748-1749, doi: 10.1086/315105.
85. Takahashi K., Iwasa Y., Hijikata M., Mishiro S. Identification of a new human DNA virus (TTV-like mini virus, TLMV) intermediately related to TT virus and chicken anemia virus. // Arch Virol. - 2000. - Vol 145, №5. - P. 979-993.
86. Thorn K., Petrik J. Progression towards AIDS leads to increased torque teno virus and torque teno minivirus titers in tissues of HIV infected individuals. // J Med Virol. - 2007. - Vol 79, №1. - P. 1-7.
87. Toyoda H., Naruse M., Yokozaki S., Morita K., Nakano I., Itakura A., Okamura M., Fukuda Y., Hayakawa T. Prevalence of infection with TT virus (TTV), a novel DNA virus, in healthy Japanese subjects, newborn infants, cord blood and breast milk. // J Infect. - 1999. - Vol 38, №3. - P. 198- 199.
88. Tyschik E.A., Rasskazova A.S., Degtyareva A.V., Rebrikov D.V., Sukhikh G.T. Torque teno virus dynamics during the first year of life. // Virol. J. - 2018. - Vol 15, №1. - P. 96-99, doi: 10.1186/s12985-018-1007-6.
89. Tyschik E.A., Sherbakova S.M., Ibragimov R.R., Rebrikov D.V. Transplacental transmission of torque teno virus. // Virol. J. - 2017. - Vol 14, №1. - P. 92-94, doi: 10.1186/s 12985-017-0762-0.
90. Vasilyev E.V., Trofimov D.Y., Tonevitsky A.G., Ilinsky V.V., Korostin D.O., Rebrikov D.V. Torque Teno Virus (TTV) distribution in healthy Russian population. // Virol. J. - 2009. - Vol 6, №1. - P. - 134-137, doi: 10.1186/1743-422X-6-134.
91. Wohlfarth P., Leiner M., Schoergenhofer C., Hopfinger G., Goerzer I., Puchhammer-Stoeckl E., Rabitsch W. Torquetenovirus dynamics and immune marker properties in patients following allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: a prospective longitudinal study. // Biol Blood Marrow Transplant. - 2018. - Vol 24, №1. - P. 194-199, doi: 10.1016/j.bbmt.2017.09.020.
92. Xin X., Xiaoguang Z., Ninghu Z., Youtong L., Liumei X., Boping Z. Mother-to-infant vertical transmission of the transfusion-transmitted virus in South China. // J Perinat Med. - 2004. - Vol 32, №5. - P. 404-406, doi: 10.1515/JPM.2004.136.
93. Yokozaki S., Fukuda Y., Nakano I. et al. TT virus: a mother to child transmitted rather than blood borne virus. // Blood. - 1999. - Vol 93, №10. - P. 3569-3570.
94. Yoshida H., Kato N., Shiratori Y. et al. Poor association of TT virus viremia with hepatocellular carcinoma. // Liver Int. - 2000. - Vol 20, №3. - P. 247-252, doi: 10.1034/j.1600-0676.2000.020003247.x.
95. Zhong S., Yeo W., Tang M., Liu C, Lin X.-R., Ho W. M., Hui P., Johnson P. J. Frequent detection of the replicative form of TT virus DNA in peripheral blood mononuclear cells and bone marrow cells in cancer patients. // J Med Virol. - 2002. - Vol 66, №3. - P. 428-434, doi: 10.1002/jmv.2163.
96. Zur Hausen H., de Villiers E.-M. et. al. Patent № EP 3008185 B1. TTV miRNA sequences as an early marker for the future development of cancer and as a target for cancer treatment and prevention. Application filed by 12.06.2014. Publication of 31.10.2018.
97. Zur Hausen H., de Villiers E.-M. Patent №US9624511B2. Specific TT virus sequences and chimeric TT virus host cell DNA molecules for use in diagnosis, prevention and treatment of cancer and autoimmunity. Application filed by 08.09.2014. Publication of 18.04.2017.
98. Осипкина О.В., Воропаев Е.В., Мицура В.М., Зятьков А.А., Терешков Д.В., Переволоцкая Т.В., Переволоцкий А.Н. Torque Teno Virus: распространенность и особенности ПЦР-диагностики // Проблемы здоровья и экологии. - 2018. Т. 57, №3. - С. 85-90.
99. Трофимов Д.Ю., Ребриков Д.В., Коростин Д.О. Патент № RU 2422536 C1. Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления днк в крови и других биоматериалах возбудителя латентной вирусной инфекции - вируса Torque teno virus семейства Circoviridae методом полимеразной цепной реакции. Заявка от 19.10.2009. Опубл. 27.06.2011.
100. Учайкин В.Ф., Чередниченко Т.В., Самохвалов Е.И., Филипова Е.В., Чаплыгина Г.В., Ковалев О.Б., Конев В.А. Современные представления о ТТ-вирусной инфекции у детей. // Детские инфекции. - 2010. - Т. 9, №4. - С. 15-18.