Способ увеличения миграции плазмоцитоидных дендритных клеток к тимоцитам мышей in vitro
METHOD FOR INCREASING THE MIGRATION OF PLASMOCYTOID DENDRITIC CELLS TO MOUSE THYMOCYTES IN VITRO

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, а именно к способу усиления миграции плазмоцитоидных дендритных клеток мышей к тимическим клеткам млекопитающих in vitro.
Плазмоцитоидные дендритные клетки (далее пДК) являются одним из подклассов дендритных клеток (далее ДК), которые являются основными антиген-презентирующими клетками, и их способность к миграции является ключевой для индукции иммунного ответа или иммунологической толерантности. В различных условиях в пДК формируется экспрессия различного набора хемокиновых рецепторов, что играет решающее значение для выбора направления их миграции и далее выполняемой ими функции. После выхода из костного мозга, циркулирующие пДК мигрируют из компартмента крови в селезенку, где через венулы высокого эндотелия, попадают в лимфатические узлы с дальнейшим участием в реакциях гомеостаза или воспаления (Plasmacytoid dendritic cell biology and its role in immune-mediated diseases. Ye Y. et all. Clinical & Translational immunology 2020; 9: e1139.). Например, пДК запускают внутренние программы, вследствие которых изменяется экспрессия поверхностных С-С хемокиновых рецепторов CCR7 или CCR9, которые направляют миграцию пДК в лимфоузлы или тимус, соответственно. В случае экспрессии в пДК CCR7, после захвата определенного антигена, они мигрируют в лимфатические узлы, где участвуют в инициации защитных провоспалительных иммунных механизмов. В случае экспрессии в пДК CCR9, после захвата определенного антигена, они мигрируют в тимус, где участвуют в индукции иммунологической толерантности (неотвечаемости иммунной системы на собственные антигены) [Dendritic cell migration in health and disease. Worbs T. et all. Nat Rev Immunol. 2017; 1:30-48.; Mechanisms of Tolerance Induction by Dendritic Cells In Vivo. Hasegawa H. and Matsumoto T. Front Immunol. 2018; 9: 350.; Dendritic cell migration to peripheral lymph nodes. A. Martin-Fontecha, etal. Handb. Exp.Pharmacol. 2009 188, 31-49.].
Мышинные пДК определяются как B220+CD11c+ клетки, непрерывно продуцируются в костном мозге и становятся зрелыми на периферии, где они имеют относительно короткую продолжительность жизни. Плазмоцитоидные ДК строго зависят в своем развитии от Fms-подобного лиганда тирозинкиназы 3 (Flt3-L), который стимулирует цитокиновый рецептор Flt3 (CD135) и запускает пролиферацию пДК [Reizis, В. Plasmacytoid dendritic cells: development, regulation, and function. Reizis В., Immunity. 2019 50: 37-50.]. Молекулы хемокинового рецептора CCR9 экспрессируют в основном пДК находящиеся на периферии, в костном мозге этот маркер идентифицирует подгруппы пДК, которые различаются по степени созревания и их способности продуцировать интерферон 1 типа или провоспалительные цитокины. Клетки, неэкспрессирующие CCR9 (CCR9-), являются пДК-подобными общими предшественниками ДК, тогда как CCR9-экспрессирующие (CCR9+) клетки являются полностью дифференцированными пДК [Swiecki, М. &Colonna, М. The multifaceted biology of plasmacytoid dendritic cells. Nat. Rev. Immunol. 2015 15: 471-485.]. CCR9+ пДК составляют значительную часть компартмента пДК в покоящихся вторичных лимфоидных тканях; кроме того, они значительно более эффективны, чем CCR9- пДК, в индукции регуляторных Т-клеток и ингибируют антиген-специфические иммунные ответы как in vitro, так и in vivo. Известно, что CCR9+ пДК эффективно предотвращают острую реакцию трансплантат против хозяина (РТПХ), обеспечивая долгосрочное подавление РТПХ в модели аллогенного переноса Т-клеток [Graft-versus-host disease prevents the maturation of plasmacytoid dendritic cells. Banovic T. et all, J Immunol. 2009. 182(2):912-20. CCR9 expression defines tolerogenic plasmacytoid dendritic cells able to suppress acute graft-versus-host disease. Hadeiba H. et all, Nat. Immunol. 2008. 9:1253-60.].
В работе Hadeiba H. и др. «CCR9 экспрессия определяет толерогенные плазмоцитоидные дендритные клетки способные подавлять острую реакцию трансплантат против хозяина» показано, что пДК участвуют в поддержании центральной толерантности, за счет миграции в тимус с помощью оси хемотаксиса CCR9/CCL25 и последующего представления собственных антигенов при делеции аутоспецифичных тимоцитов [CCR9 expression defines tolerogenic plasmacytoid dendritic cells able to suppress acute graft-versus-host disease. Hadeiba H. et all, Nat. Immunol. 2008. 9:1253-60.].
Таким образом показано, что индукция центральной толерантности, напрямую зависит от экспрессии CCR9 на пДК, т.к. они являются главными клетками лимфоидного происхождения, которые транспортирует аутоантигены в тимус, для непосредственного участия в механизме негативной селекции аутоспецифичных тимоцитов.
Ряд способов усиления миграции ДК описан в зарубежных патентах и статьях.
Известно изобретение, основанное на том, что пДК следуют уникальным маршрутам миграции для доставки антигенов в лимфатические узлы и, что эти маршруты доставки можно модулировать комбинацией специфических хемокинов. Например, с помощью введения агонистов рецепторов хемотаксиса СХС или С-С класса (CXCR3, CXCR4, CCR6, CCR10), представляющие из себя природные лиганды для модулирования миграции пДК из костного мозга в лимфатические узлы. (US 2010086560, 2010-04-08, C12N 5/06).
Недостатком способа является, описанная самими авторами, способность природных (физиологических) антагонистов блокировать связывание введенного лиганда (агониста) с рецептором в определенных местах, что способствует снижению миграции пДК в нужную область, а также, сложность определения количества агонистов, необходимых для увеличения миграции (количества могут варьировать в диапазоне от 1 до 1000 нг/мл).
Известен способ увеличения миграции дендритных клеток в лимфатические узлы, за счет увеличения экспрессии рецептора CCR7, включающий in vivo получение пДК в лимфатических узлах с помощью введения организму Flt3-L, выделенного из клеток меланомы мышей линии В6 и последующую стимуляцию ДК лигандами рецептора CCR7 - CCL19 и CCL21 (WO 0009151, 2000-02-24, C07K 14/52).
Недостатком способа является in vivo получение ДК из лимфатических узлов, среди которых лишь малое количество ДК (около 16% от выделенных клеток) мигрируют к CCL19 и CCL21. Также, в патенте отмечается неоднородность экспрессии CCR7 на полученных ДК, что приводит к погрешностям в анализе их миграции к CCL19 и CCL21.
Следует отметить, что в обоих описанных патентах описаны способы стимулирования миграции ДК в лимфатические узлы для увеличения их способности индуцировать провоспалительный защитный иммунный ответ, при этом в патентах не предлагается стимулирование миграции ДК в тимус для индукции иммунологической толерантности, т.е. подавления нежелательных иммунных реакций.
Для подавления нежелательных иммунных реакций известен способ оценки наличия плазмоцитоидных ДК кишечника млекопитающих в модели in vitro для лечения воспалительных процессов кишечника, включающий наработку пДК в селезенке с помощью введения Flt3-L-продуцирующей клеточной линии, их выделение и оценку миграции к CCL25 и ткани кишечника in vitro, а также оценку экспрессии CCR9 на выделенных пДК с помощью проточной цитометрии (Wendland, М., etall. CCR9 is a homing receptor for plasmacytoid dendritic cells to the small intestine. Proc. NatlAcad. Sci. USA 104, 6347-6352 (2007)). Указанный способ относится к способам привлечения пДК (CD11 с+В220+Ly6C+) в кишечник для презентации антигенов Т-клеткам кишечника и подавления местной воспалительной без индукции центральной иммунологической толерантности.
Недостатком способа является in vivo получение пДК в селезенке мышей с помощью введения Flt3-L-секретирующей опухолевой линии B16-FL, что занимает 14 суток и позволяет получить 15% пДК из всех лейкоцитов селезенки, При этом, культивирование клеток костного мозга in vitro с Flt3-L в течении 7 дней приводит к содержанию 40% пДК в культуре.
Наиболее близким к заявляемому - прототипом - является способ получения плазмоцитоидных дендритных клеток для миграции к тимоцитам мышей in vitro и in vivo, включающий in vitro получение B220+CD11c+ плазмоцитоидных дендритных клеток из клеток костного мозга путем культивирования с Flt3-L. В описанном способе CCR9+B220+CD11c+ пДК выделяют из костного мозга мышей и далее размножают их in vitro с помощью Flt3-L Затем полученные плазмоцитоидные дендритные клетки, нагружают антигеном и оценивают миграцию пДК к CCL25 in vitro и в тимус in vivo (US 2010080816, 2010-04-01, C12N 5/10).
Недостатком способа является, отсутствие анализа экспрессии CCR9 на пДК, полученных после культивирования с Flt3-L, поэтому неизвестно какое количество пДК в полученных культурах способно к миграции с помощью рецептора хемотаксиса CCR9.
Задачей изобретения является повышение эффективности миграции плазмоцитоидных дендритных клеток к тимоцитам мышей за счет увеличения экспрессии рецептора хемотаксиса CCR9 на плазмоцитоидных дендритных клетках.
Поставленная задача решается тем, что способ увеличения миграции плазмоцитоидных дендритных клеток к тимоцитам мышей in vitro, включающий получение B220+CD11c+ плазмоцитоидных дендритных клеток из клеток костного мозга с помощью их культивирования с Flt3-L, в котором после культивирования осуществляют трансфекцию плазмоцитоидных дендритных клеток ДНК-конструкцией, кодирующей мышиный белок CCR9, после чего наблюдают повышенную миграцию полученных клеток in vitro.
Трансфекцию, осуществляют с помощью метода электропорации.
Наличие CCR9 на трансфицированных плазмоцитиодных дендритных клетках анализируют с помощью проточной цитофлуориметрии.
Анализ экспрессии генов CCR9 в трансфицированных плазмоцитоидных дендритных клетках, осуществляют с помощью qRT-PCR.
Повышенную миграцию наблюдают в течение 24 часов через каждые 4 часа в системе TransWell in vitro с помощью флюоресцентной микроскопии.
Изобретение, на наш взгляд, является новым.
Увеличение миграции плазмоцитоидных дендритных клеток к тимоцитам in vitro в заявленном способе обеспечивается искусственным увеличением экспрессии CCR9 в пДК, что достигается трансфекцией плазмоцитоидных дендритных клеток ДНК-плазмидой, которая кодирует мышиный белок CCR9, что обеспечивает повышение миграции пДК in vitro, за счет увеличения количества поверхностного хемокинового рецептора CCR9. Способ трансфекции плазмоцитоидных дендритных клеток ДНК-конструкцией, который кодирует мышиный белок CCR9, для повышения миграции клеток, в известных источниках информации не обнаружен.
Изобретение осуществляется следующим образом.
Дендритные клетки получают из костного мозга мышей. Суспензию клеток костного мозга отмывают в центрифуге при добавлении PBS. Удаляют супернатант, после чего добавляют среду RPMI-1640. Далее клетки костного мозга высаживают во флакон при концентрации 1 млн клеток на 1 мл среды для культивирования, содержащей RPMI-1640, с добавлением 10% FCS, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES буфера, 5*10-4М 2-меркаптоэтанола, 80 мкг/мл гентамицина, 100 мкг/мл бензилпенициллина. Для дифференцирования клеток в плазмоцитиодные дендритные клетки в среду добавляют 20 нг/мл Flt3-L. Клетки культивируются 7 дней. Половину среды и Flt3-L заменяют каждые 2-3 дня. После 7 дней культивирования, CD11C+B220+ плазмоцитоидные дендритные клетки собирают скребком и трансфицируют с помощью метода электропорации ДНК-конструкцией, кодирующей мышиный белок CCR9. Электропорация осуществляется в холодной среде OptiMEM, содержащей 10 млн плазмоцитоидных дендритных клеток на электропораторе (например, ВТХ 830 square-wave) при следующих параметрах: сила импульса 200 вольт, длительность импульса 40 миллисекунд, 100 мкл среды OptiMEM и концентрация мышиной плазмидной ДНК 1000 мкг/мл. После этапа электропорации, трансфицированным плазмоцитоидным дендритным клеткам дается отдых 10 минут, после чего трансфицированные плазмоцитоидные дендритные клетки высаживают во флакон со средой, которая состоит из половины среды для культивирования и половины кондиционной среды. Через 24 часа, трансфицированные клетки используются в тестах миграции к тимическим клеткам млекопитающих in vitro. Увеличение экспрессии CCR9 после трансфекции выявляют с помощью проточной цитофлуорометрии и qRT-PCR. Увеличение миграции плазмоцитоидных дендритных клеток к CCL25 и тимоцитам наблюдают in vitro в TransWell системах.
Пример. 1 Определение с помощью метода проточной цитофлуорометрии, наличия B220+CD11c+CCR9+ после, трансфекции 7 дневной культуры in vitro.
Примеры проиллюстрированы рисунками. На рисунках 1А, 1В, 1С, 1D, 2А, 2В и на рис. 3 использованы следующие обозначения: культура пДК без элетропорации - nonEP; культура пДК с элетропорацией без каких-либо ДНК-конструкций - MockEP; культура пДК с электропорацией ДНК-конструкцией, кодирующей CCR9 - ЕР CCR9.
5
Для проточной цитометрии, 5×10 клеток собирают и инкубируют в темноте при комнатной температуре с подобранной комбинацией флуоресцентных моноклональных антител в буффере, например, PBS с азидом, на 20 минут. Для окрашивания ДК, были использованы антитела, а именно: anti-CD11c-РЕ/Су7 (N418), anti-B220-Bv510 (RA3-6B2), anti-SIRPα-PerCP/Cy5.5(P84), и anti-CCR9-PE (9 В1) (BioLegend, USA) антитела, так же, использовался DAPI для окрашивания мертвых клеток. Для внутриклеточного окрашивания CCR9, использовался набор для фиксации и пермеабилизации True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (Biolegend, США) в соответствии с инструкцией производителя.
На рисунке 1, показана поверхностная (1А, 1В) и внутриклеточная (1С, 1D) экспрессия CCR9 на пДК в культурах. На рисунках 1А и 1С, показано относительное количество CCR9+ пДК в культурах, а на рисунках 1В и 1D показана средняя геометрическая интенсивности флюоресценции CCR9+ на пДК. Анализ данных проточной цитофлуорометрии показал, что в культуре пДК без электропорации (nonEP), наблюдалось относительно небольшое количество пДК, экспрессирующих относительно небольшое количество поверхностного CCR9 (рис. 1А, 1В). Количество пДК, несущих CCR9 на поверхности, было достоверно выше в культуре пДК, подвергнутой электропорации ДНК-конструкциями, кодирующими CCR9, по сравнению с культурой пДК без электропорации пДК (рис. 1А). Согласно средней геометрической интенсивности флуоресценции CCR9, пДК в культурах, подвергнутых электропорации ДНК-конструкциями, кодирующими CCR9, имели значительно более высокие уровни экспрессии поверхностного CCR9 по сравнению с культурами пДК без электропорации и с электропорацией без каких-либо ДНК конструкций (рис. 1В).
Полученные результаты показали, что предлагаемый способ увеличения миграции пДК с помощью трансфекции пДК ДНК-конструкциями, которые кодируют мышиный белок CCR9, увеличивает количество пДК, несущих CCR9 поверхностно, и увеличивает среднее количество CCR9 на пДК.
Пример 2. Анализ экспрессии генов CCR9 в культурах пДК без электропорации, электропорации без каких-либо ДНК-конструкций и электропорации с ДНК-конструкциями, кодирующими CCR9, с помощью метода qRT-PCR.
Для анализа уровня экспрессии генов CCR9 в культурах пДК, общую РНК выделяли с использованием Тризола в соответствии с инструкцией производителя (Invitrogen, Carlsbad, США).
Определение концентраций РНК проводились путем измерения оптической плотности при 260 нм с использованием спектрометра Nanodrop 2000 с (Wilmington, Германия, США). Обратная транскрипция РНК в комплементарную ДНК (далее кДНК) проводили с помощью набора MMLV кДНК Synthesis Kit (Евроген, Россия).
Далее использовали технологию SYBR Green для количественного определения общей мРНК, кодирующей CCR9, с помощью количественной ПЦР (далее кПЦР) в термоциклере CFX96 С1000 (Bio-Rad). Реакции кПЦР проводили при 95°С в течение 4 минут, затем 40 циклов при 95°С в течение 10 с, 65°С в течение 15 секунд и 72°С в течение 30 секунд. Все наборы праймеров получены от компании Биосан (Россия). В таблице показаны последовательности праймеров для ПЦР в реальном времени.
Количественная ПЦР выполнялась в 3-х повторах и полученные уровни мРНК нормализировали до уровня контрольного гена фосфоглицераткиназы 1. Для подтверждения специфичности амплифицированного продукта реакции, анализировали с помощью кривой плавления. Обработку и анализ данных использовался метод ΔΔCt.
В культурах электропорации ДНК-конструкциями, кодирующими CCR9 был отмечен в 94,4 раза больший уровень общей РНК, кодирующей CCR9 по сравнению с культурами без электропорации. (медианы 2 ^ -ΔΔCt 119,46 и 1,27 соответственно, N=4).
Полученные результаты показали, что предлагаемый способ увеличения миграции пДК с помощью трансфекции пДК ДНК-конструкциями, кодирующими мышиный белок CCR9, увеличивает количество общей РНК, кодирующей CCR9 в культурах.
Пример 3. Оценка способности миграции трансфицированных пДК с помощью анализа in vitro миграции в системе TransWell.
6
5
Анализ in vitro миграции проводи с использованием поликарбонатных мембран TransWell с размером пор 5,0 мкм (Corning, США), установленных в 24х луночном планшете. На дно лунок добавляли по 600 мкл культуральной среды, 600 мкл культуральной среды с 500 нг CCL25 (R&D Systems, США) и 600 мкл культуральной среды с 1×10 клеток тимуса от мышей линии C57BL/6. Затем, сверху TransWell мембран наносили 2×10 жизнеспособных ДК от мышей UBC-GFP (экспрессирующих в своих клетках зеленый флюоресцентный белок), из групп, которые не подвергались электропорации, подвергались электропорации без каких-либо ДНК-конструкций и группы подвергнутой электропорации ДНК-конструкцией, кодирующей CCR9. In vitro миграцию оценивали с помощью флуоресцентной микроскопии дна лунок с использованием In Cell Analyzer 6000 (GE Healthcare, США). Изображения снимали в каналах проходящего света и FITC (GFP) каждые 4 часа до 24 часов после посева клеток. Для каждой лунки анализировали 25 полей зрения в проекции TransWell мембраны. Подсчет мигрировавших пДК, экспрессирующих GFP, производился с помощью программы In Cell Developer Toolbox 1.9.3 (GE Healthcare, США). Индекс миграции клеток для каждой группы рассчитывали, как (количество клеток, которые мигрировали к CCL25 или тимическим клеткам) / (количество клеток, которые мигрировали в культуральной среде).
Согласно расчету индекса миграции, культуры ДК, электропорированные ДНК-конструкциями, кодирующими CCR9, через 24 часа значимо активнее мигрировали к CCL25 и к тимическим клеткам по сравнению с неэлектропорированными ДК и ДК, электропорированными без ДНК-конструкций. (Рис. 2А, 2В).
На рисунке 3, показано что относительное количество пДК, смигрировавших к CCL25 и тимоцитам, в группе электропорации ДНК-конструкциями, кодирующими CCR9, оказалось значимо больше по сравнению с аналогичными количествами пДК в группах без электропорации и электропорации без ДНК-конструкций.
Полученные результаты говорят о том, что предлагаемый способ увеличения миграции пДК с помощью трансфекции ДНК-конструкцией, кодирующей CCR9, приводит к увеличению миграции пДК к CCL25 и тимоцитам in vitro.
Предложенный способ является универсальным, поскольку может быть использован в трансфекции отличных от CCR9 рецепторов хемотаксиса с целью увеличения миграции пДК в лимфатические узлы для участия в механизме иммунного ответа. Предложенный же способ трансфекции пДК ДНК-конструкциями, кодирующими CCR9, предназначен для увеличения миграции пДК в тимус для участия в механизме индукции иммунологической толерантности.
Также, предложенный способ не требует дополнительных мер биологической безопасности, поскольку трансфекция пДК осуществляется методом электропорации с помощью невирусных кольцевых ДНК-плазмид, что, к тому же, не приводит к изменению собственного генома дендритных клеток.