СРЕДСТВА И СПОСОБЫ ПРЕДСКАЗАНИЯ ОТВЕТА НА ЛЕЧЕНИЕ ГЕПАТИТА B
MEANS AND METHODS OF PREDICTING RESPONSE TO TREATMENT OF HEPATITIS B

Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение имеет отношение к области биологии, вирусологии и медицины. В частности, данное изобретение имеет отношение к лечению гепатита В.
Уровень техники
Гепатит В представляет собой инфекционное воспалительное заболевание печени, вызываемое вирусом гепатита В (HBV). В основном, передача вируса происходит в результате контакта с биологическими жидкостями, полового контакта, при переливании крови, гемодиализе, использовании наркозависимыми общих шприцов, в результате перинатальной инфекции и т.д.
HBV является членом семейства Hepadnavirus. Вирус является одним из самых маленьких вирусов с оболочкой, его диаметр составляет приблизительно 42 нм. Вирусная частица (вирион) состоит из внешней липидной оболочки (содержащей, главным образом, поверхностный антиген вируса гепатита В, HBsAg) и икосаэдрического нуклеокапсидного ядра (core), состоящего из корового антигена вируса гепатита В (HBcAg). В нуклеокапсид заключены вирусная ДНК и ДНК-полимераза, которая обладает активностью обратной транскриптазы. Внешняя оболочка содержит «встроенные» в нее белки, которые участвуют в связывании вируса с чувствительной клеткой и проникновении в нее.
Острая HBV-инфекция характеризуется воспалением печени, рвотой и желтухой. Как правило, симптомы продолжаются в течение нескольких недель и затем постепенно ослабевают, по мере того, как иммунная система устраняет инфекцию. Вероятность полного выздоровления и формирования защитного иммунитета увеличивается с возрастом: тогда как только 5% взрослых страдают от хронической инфекции, длящейся более шести месяцев, т.е. хронической инфекции HBV, этот показатель возрастает до 70% среди детей младшего возраста и до 95% среди новорожденных, инфицированных перинатально.
Длительное воспаление печени, обусловленное инфицированием HBV, может приводить к хроническому гепатиту В (СНВ) с прогрессированием до фиброза печени, цирроза и, в конечном итоге, гепатоклеточной карциномы (НСС) и смерти. По этой причине HBV классифицируется Международным агентством по изучению рака (МАИР) ВОЗ как канцерогенный фактор класса I, т.е. агент, канцерогенный для человека. Таким образом, действующие директивы рекомендуют проводить лечение пациентов с СHВ с активным воспалительным процессом в печени, например, руководства Американской ассоциации по изучению заболеваний печени (AASLD), рекомендуют проводить лечение пациентов, у которых наблюдаются уровни ДНК HBV в сыворотке более 2000 IU/мл и/или повышенный уровень аланинаминотрансферазы (ALT) (>2 раз относительно верхнего предела нормы).
СНВ можно разделить на четыре фазы. У лиц, зараженных перинатально, наиболее часто наблюдается фаза иммунной толерантности. Эта фаза характеризуется обнаружением "е антигена" гепатита В (HBeAg). В течение этой фазы Анти-НВе антитела не обнаруживаются. Плазматические уровни ДНК HBV превышают 20000 IU/мл и часто являются еще более высокими.
Вторая фаза представляет собой фазу активности иммунной системы. В продолжение этой фазы повышаются показатели ALT, у некоторых пациентов может наблюдаться исчезновение HBeAg и переход к анти-НВе антителам. После HBeAg/антиНВе сероконверсии количество ДНК HBV в плазме, как правило, снижается до уровня ниже 20000 IU/мл. Эта фаза носит название фазы HBeAg-отрицательного хронического неактивного гепатита В. Впоследствии может развиться фаза HBeAg-отрицательного хронического активного гепатита В, вследствие появления HBV-мутантов с мутациями в pre-соrе области; при этом уровни ДНК HBV в плазме снова превышают 20000 IU/мл, и возрастают показатели ALT (R.B. Takkenberg, thesis University of Amsterdam (2011), The Netherlands, chapter 2, ISBN 9789090263045).
По всему миру насчитывается около 400 миллионов больных хроническим гепатитом В, приблизительно 650000 человек ежегодно умирает от связанных с HBV осложнений. Хронический гепатит В (СНВ) представляет собой динамический процесс и, как описано выше, может находиться в активной и неактивной фазах. Стандартные схемы лечения включают интерферон альфа или аналоги нуклеотидов/нуклеозидов, ингибирующие вирусную ДНК-полимеразу. В исследованиях использовалась комбинированная терапия аналогами нуклеотидов/нуклеозидов и интерфероном альфа. Важным усовершенствованием стало введение в терапию пегилированного интерферона (например, Pegasys), обеспечивающего пролонгированный период полувыведения интерферона. Обзор по эпидемиологии и лечению HBV-инфекции см. в J.L. Dienstag N Engl J Med 2008, 359; 1486-1500.
По-прежнему, несмотря на улучшенную терапию, лишь очень небольшой доле пациентов удается избавиться от инфекции (исчезновение HBsAg и ДНК HBV с или без образования анти-HBs антител) при проведении лечения, тогда как большинству других - нет. Таким образом, было бы желательно иметь возможность предсказания ответа пациента на HBV терапию, для того, чтобы правильно скорректировать стратегию лечения с самого начала.
Как было показано в многочисленных исследованиях, невозможность достижения элиминации вируса под действием иммунной системы при постоянных высоких уровнях вирусемии HBV связана с плохими клиническими результатами, включая цирроз печени и гепатоклеточную карциному. Результаты показывают, что индивидуумы, у которых происходит устранение инфекции HBV, имеют низкий риск такого неблагоприятного исхода. Однако значительное количество пациентов не достигает устранения вируса после терапии, кроме того, обычным явлением являются выраженные побочные действия интерферона. Было описано несколько подходящих маркеров элиминации вируса при СНВ (например, вирусные генотипы А и В, ранняя сероконверсия HBeAg, низкий исходный уровень HBsAg). Однако, принимая во внимание недостаточную эффективность доступных видов лечения, огромное практическое значение имеет установление большего количества (и предпочтительно более надежных) прогностических факторов ответа (или отсутствия ответа) до начала противовирусной терапии.
Раскрытие изобретения
Целью настоящего изобретения является предоставление дополнительных маркеров положительного или отрицательного результата лечения HBV.
Настоящее изобретение дает возможность понять, что результат лечения гепатита В коррелирует с полиморфизмами нуклеотидов, как в геноме инфицированного индивидуума, так и в геноме HBV, а также с уровнем экспрессии карнитина и производных карнитина у указанного индивидуума. Однонуклеотидные полиморфизмы (SNPs) генома человека, имеющие отношение к результату лечения HBV, представлены на фиг. 1, a SNPs HBV-генома, имеющие отношения к результату лечения HBV, представлены на фиг. 2. Была использована номенклатура положений нуклеотидов, соответствующая Galibert et al. (Galibert F, et al. Nature. 1979 Oct 25; 281(5733): 646-50). До настоящего изобретения не было известно, что существуют корреляции между геномными + HBV нуклеотидными полиморфизмами и результатом лечения HBV. Также не было известно, что уровни экспрессии карнитина и производных карнитина служат прогностическим признаком результата лечения HBV. Теперь, когда настоящее изобретение дает возможность понять, что нуклеотидные полиморфизмы ассоциируются с результатом лечения, стало возможным типировать содержащий нуклеиновую кислоту образец индивидуума путем определения по меньшей мере одного из полиморфизмов, изображенных на фиг. 1 и/или 2. Один аспект изобретения, таким образом, предоставляет способ типирования содержащего нуклеиновую кислоту образца пациента с гепатитом В, включающий определение SNP, как показано на фиг. 1 и/или фиг. 2, в нуклеиновой кислоте указанного образца. Способы обнаружения нуклеиновокислотных полиморфизмов известны в данной области техники и, например, включают выделение нуклеиновой кислоты, амплификацию и обнаружение, например, с использованием стандартных способов, таких как ПЦР, мультиплексная амплификация лигированных зондов (MLPA), секвенирование и т.д. Такие хорошо известные методы не нуждаются в дополнительном объяснении.
Кроме того, стало возможным типировать образец пациента с гепатитом В путем определения уровня экспрессии карнитина и/или производного карнитина в указанном образце. В соответствии с настоящим изобретением относительно низкий уровень карнитина и/или производного карнитина является прогностическим признаком положительного результата лечения гепатита В, как более подробно указано ниже в этом описании. Один аспект изобретения, таким образом, предоставляет способ типирования образца пациента с гепатитом В, включающий определение уровня экспрессии карнитина и/или производного карнитина в указанном образце. Предпочтительно способ включает определение уровня карнитина и/или производного карнитина в указанном образце.
Карнитин представляет собой четвертичное аммонийное соединение, биосинтез которого происходит из аминокислот лизина и метионина. Карнитин вовлечен в метаболизм жирных кислот, поскольку он осуществляет транспорт длинноцепочечных ацильных групп жирных кислот в матрикс митохондрий. Производное карнитина определяется в этом описании как соединение на основе карнитина, отличное от собственно карнитина, которое содержит фрагмент карнитина, необязательно с модификациями, замещениями, введенными группами и/или делениями, который все еще обладает по меньшей мере одним свойством карнитина - участием в метаболизме жирных кислот. Предпочтительные производные карнитина представляют собой ацетил-L-карнитин и пропионил-L-карнитин. При использовании в этом описании термин «карнитин» включает L-карнитин и D-карнитин. L-карнитин, однако, является предпочтительным.
Способы согласно изобретению, в частности, пригодны для определения, является ли пациент с гепатитом В чувствительным к лечению гепатита В. При использовании в этом описании, пациент с гепатитом В является «чувствительным к лечению гепатита В» в том случае, если у пациента имеется повышенная вероятность положительного результата лечения гепатита В по сравнению средним значением в популяции пациентов с гепатитом В. Пациент с положительным результатом лечения называется пациентом, ответившим на лечение. С другой стороны, в случае если у пациента не наблюдается положительный результат лечения, такой пациент называется пациентом, не ответившим на лечение. Способы согласно изобретению позволяют определить, будет ли данный пациент с HBV отвечать на HBV-терапию, до начала такой терапии. Это обеспечивает преимущество, заключающееся в том, что пациенты, которые, не будут отвечать на лечение, могут быть отстранены от лечения, что позволит избежать излишних расходов, тяжести лечения и побочных эффектов. С другой стороны, это обеспечит более легкое включение в терапию пациентов с высокой вероятностью положительного результата лечения HBV, даже в том случае, когда состояние пациента не является оптимальным для осуществления такой терапии, поскольку известно, что для такого пациента вероятность положительного результата лечения значительно выше, чем средняя вероятность.
Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что вышеуказанные способы идентификации не претендуют на то, чтобы быть корректными для 100% подлежащих анализу субъектов. Тем не менее, оценка будет являться достоверной для статистически значимой доли подлежащих анализу субъектов. Является ли доля статистически значимой, специалист в данной области техники может определить с помощью различных хорошо известных методов статистической оценки, например, определения доверительных интервалов, определения р-значения, критерия Стьюдента, критерия Манна-Уитни и т.д. Подробную информацию можно найти в Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983. Предпочтительные доверительные интервалы составляют по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%. р-значения составляют предпочтительно 0,1; 0,05; 0,01; 0,005 или 0,0001. Предпочтительно предусматриваемая настоящим изобретением вероятность обеспечит правильное установление различий по меньшей мере для 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере для 90% субъектов данной когорты или популяции.
На фиг. 1 и 2 изображены SNPs геномов человека и HBV, связанные с результатом лечения HBV. Аллели, ассоциированные с положительным результатом лечения, изображены в шестом столбце фиг. 1а и lb и в четвертом столбце фиг. 2а. Таким образом, один аспект изобретения предоставляет способ определения, имеется ли у пациента с гепатитом В повышенная вероятность получения положительного результата лечения гепатита В, по сравнению со средним значением в популяции пациентов с гепатитом В, включающий определение, содержит ли содержащий нуклеиновую кислоту образец указанного пациента с гепатитом В по меньшей мере один ассоциированный с положительным результатом лечения аллель SNP, изображенный на фиг. 1 или 2. Пациент с гепатитом В определяется как имеющий повышенную вероятность получения положительного результата лечения гепатита В, исходя из наличия такого ассоциированного с положительным результатом лечения аллеля. Отсутствие одного или более ассоциированного с положительным результатом лечения аллеля(ей) SNP, как изображено на фиг. 1 или 2, указывает на более низкую вероятность получения положительного результата лечения гепатита В.
Термин «содержащий нуклеиновую кислоту образец» относится к образцу индивидуума, который содержит или нуклеиновую кислоту указанного индивидуума и/или нуклеиновую кислоту HBV. Термин нуклеиновая кислота охватывает соединения, содержащие цепь нуклеотидов, более предпочтительно ДНК и/или РНК. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный содержащий нуклеиновую кислоту образец представляет собой образец, содержащий ДНК. Мазок слюны или образец крови являются особенно предпочтительными, поскольку такой образец может быть взят без причинения большого дискомфорта пациенту или регулярно берется для других целей. В одном варианте осуществления используется образец сыворотки. Преимуществом образца сыворотки является тот факт, что, как показывает опыт, такой образец более часто хранят.
Настоящее изобретение дополнительно способствует пониманию того, что уровни (экспрессии) карнитина и производных карнитина у пациентов с гепатитом В, подвергающихся лечению от гепатита В, значительно ниже, чем уровни (экспрессии) карнитина и производных карнитина у пациентов с гепатитом В, не подвергающихся лечению гепатита В (см., например, фиг. 12 и 13). Теперь, когда это понимание существует, стало возможным определить, имеет ли конкретный пациент с гепатитом В повышенную вероятность положительного результата лечения гепатита В по сравнению со средним значением в популяции пациентов с гепатитом В. Например, уровень экспрессии карнитина или производного карнитина, такого как ацетил-L-карнитин и проопинил-L-карнитин, у данного пациента определяют с использованием любого подходящего метода, известного в данной области техники. Затем предпочтительно полученное значение сравнивают с эталонным. На основе указанного сравнения протестированного пациента относят к пациентом, которые будут отвечать на лечение, или к пациентам, которые не будут отвечать на лечение. В одном варианте осуществления полученное значение от протестированного пациента сравнивают с эталонным значением группы пациентов, отвечающих на лечение. Если полученное значение соответствует/ равно этому эталонному значению или является более низким, тестируемого пациента относят к «отвечающим на лечение». Если, однако, полученное значение значительно выше, тестируемого пациента относят к «не отвечающим на лечение». Альтернативно или дополнительно, полученное от тестируемого пациента значение сравнивают с эталонным значением группы пациентов, не отвечающих на лечение. В случае если полученное значение соответствует/равно этому эталонному значению или превышает его, тестируемого пациента относят к «не отвечающим на лечение». Если, однако, полученное значение значительно ниже, тестируемого пациента относят к «отвечающим на лечение».
В основном, любой образец, содержащий продукты экспрессии карнитина и/или производных карнитина является пригодным для осуществления способа в соответствии с данным изобретением. В предпочтительном варианте осуществления используется образец плазмы или крови, поскольку такой образец может быть взят без причинения большого дискомфорта пациенту или регулярно берется для других целей. В одном варианте осуществления используется образец сыворотки. Преимуществом образца сыворотки является тот факт, что такой образец, как показывает опыт, более часто хранят.
Предпочтительно «уровень экспрессии» карнитина и/или производного карнитина относится к уровню собственно карнитина или собственно производного карнитина в образце.
При использовании образца плазмы, как правило, пациента с гепатитом В, имеющего уровень экспрессии карнитина, равный или меньший чем 34 микромоль/л, предпочтительно равный или меньший чем 33,3 микромоль/л, относят к «отвечающим на лечение», тогда как пациента с гепатитом В, имеющего уровень экспрессии карнитина более 34 микромоль/л, предпочтительно более 33,3 микромоль/л, относят к «не отвечающим на лечение». Пациента, имеющего уровень экспрессии ацетил-L-карнитина равный или меньший чем 3,89 микромоль/л, относят к «отвечающим на лечение», тогда как пациента, имеющего уровень экспрессии ацетил-L-карнитина более 3,89 микромоль/л, относят к «не отвечающим на лечение». В одном варианте осуществления пациента, имеющего уровень экспрессии ацетил-L-карнитина, равный или меньший чем 3,0 микромоль/л, относят к «отвечающим на лечение», тогда как пациента, имеющего уровень экспрессии ацетил-L-карнитина более 3,0 микромоль/л, относят к «не отвечающим на лечение». Дополнительно, пациента, имеющего уровень экспрессии пропионил-L-карнитина, равный или меньший чем 0,4 микромоль/л, предпочтительно равный или меньший чем 0,43 микромоль/л, как правило, относят к «отвечающим на лечение», тогда как пациента, имеющего уровень экспрессии пропионил-L-карнитина более 0,4 микромоль/л, предпочтительно более 0,43 микромоль/л, относят к «не отвечающим на лечение».
В одном предпочтительном варианте осуществления значение, полученное от тестируемого пациента, сравнивают с эталонным значением группы, отвечающей на лечение, и с эталонным значением группы, не отвечающей на лечение, и определяют, какое эталонное значение является наиболее близким к полученному исследуемому значению. Затем тестируемого пациента относят к той группе, эталонное значение которой является наиболее близким к полученному исследуемому значению.
Таким образом, один аспект изобретения предоставляет способ определения, имеется ли у пациента с гепатитом В повышенная вероятность получения положительного результата лечения гепатита В по сравнению со средним значением в популяции пациентов с гепатитом В, включающий определение, содержит ли образец указанного пациента с гепатитом В уровень экспрессии карнитина или производного карнитина, который ассоциирован с положительным результатом лечения гепатита В. Предпочтительно определяют, содержит ли образец указанного пациента с гепатитом В уровень карнитина или производного карнитина, который ассоциирован с положительным результатом лечения гепатита В. В одном варианте осуществления указанное производное карнитина содержит ацетил-L-карнитин и/или пропионил-L-карнитин. Предпочтительно количество карнитина или производного карнитина сравнивают по меньшей мере с одним эталонным значением, как объясняется выше. В одном варианте осуществления определяют, является ли уровень экспрессии карнитина в образце плазмы равным или меньшим чем 34 микромоль/л («пациент, отвечающий на лечение»), или большим чем 34 микромоль/л («пациент, не отвечающий на лечение»). Предпочтительно определяют, является ли уровень экспрессии карнитина в образце плазмы равным или меньшим чем 33,3 микромоль/л («пациент, отвечающий на лечение») или большим чем 33,3 микромоль/л («пациент, не отвечающий на лечение»). В одном варианте осуществления, определяют, является ли уровень экспрессии ацетил-L-карнитина в образце плазмы равным или меньшим чем 3,0 микромоль/л («пациент, отвечающий на лечение») или большим чем 3,0 микромоль/л («пациент, не отвечающий на лечение»). Предпочтительно определяют, является ли уровень экспрессии ацетил-L-карнитина в образце плазмы равным или меньшим чем 3,89 микромоль/л («пациент, отвечающий на лечение») или большим чем 3,89 микромоль/л («пациент, не отвечающий на лечение»). В одном варианте осуществления определяют, является ли уровень экспрессии пропионил-L-карнитина в образце плазмы равным или меньшим чем 0,4 микромоль/л («пациент, отвечающий на лечение») или большим чем 0,4 микромоль/л («пациент, не отвечающий на лечение»). Предпочтительно определяют, является ли уровень экспрессии пропионил-L-карнитина в образце плазмы равным или меньшим чем 0,43 микромоль/л («пациент, отвечающий на лечение») или большим чем 0,43 микромоль/л («пациент, не отвечающий на лечение»). В дополнительном предпочтительном варианте осуществления определяют, является ли уровень экспрессии карнитина в образце плазмы равным или меньшим чем 29 микромоль/л («пациент, отвечающий на лечение») или большим чем 29 микромоль/л («пациент, не отвечающий на лечение»). Пациент с гепатитом В, имеющий уровень экспрессии карнитина в плазме, равный 29 микромоль/л или меньше обладает даже более высокой вероятностью получения положительного результата лечения гепатита В.
Пациент с хроническим гепатитом В определяется в качестве индивидуума, который будет диагностирован как имеющий инфекцию гепатита В (или HBV инфекцию) через более чем 7 месяцев.
Как правило, наличие HBV диагностируют путем обнаружения по меньшей мере одного вирусного полипептида в образце, взятом у субъекта, более предпочтительно обнаруживается по меньшей мере один из вирусных антигенов HBs (HBsAg, Genbank Асc. No.: AAL66340.1 GI:18252577, SEQ ID NO: 1), HBc (HBcAg, Genbank Acc. No.: CAA51257.1 GI:288930, SEQ ID NO: 2) и HBe (HBeAg, Genbank Acc. No.: AAM96930.1 GI:22530876, SEQ ID NO: 3). Специалисту ясно, что полипептиды HBV упоминаются в качестве биомаркеров, а не как специфические полипептиды, и что термин HBV охватывает различные штаммы HBV, которые могут содержать варианты последовательностей вышеуказанных полипептидов HBV. Соответственно, следует понимать, что вышеуказанные полипептиды, имеющие специфические последовательности, депонированные под учетными номерами в Genbank, являются иллюстративными последовательностями, представляя биомаркер. Поэтому, также возможно обнаружить «вариантные» (другие) полипептиды, измененные в результате добавления, замены, делеции и/или модификации по меньшей мере одной аминокислоты в упомянутых выше HBV полипептидах, при условии, что они также являются пригодными в качестве биомаркеров для HBV-инфекции, как обсуждалось выше. Предпочтительно «вариантные» полипептиды являются по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичными вышеуказанным специфическим полипептидам.
Термин «идентичный" при использовании в этом описании относится к идентичности последовательности, характеризующейся определением количества идентичных нуклеотидов или аминокислот между двумя последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислот, соответственно, при этом последовательности выровнены так, что получено соответствие самого высокого порядка. Он может быть вычислено с помощью опубликованных методов или способов, имеющих вид компьютерных программ, таких как, например, BLASTP, BLASTN или FASTA (Altschul 1990, J Mol Biol 215, 403). Процент идентичности, в одном аспекте, вычисляется относительно полной последовательности нуклеиновой кислоты или последовательности аминокислоты. Для сравнения различных последовательностей специалистами в данной области доступна серия программ на основе целого ряда алгоритмов. В этом контексте, в частности, дают надежные результаты алгоритмы Needleman и Wunsch или Smith и Waterman. Для проведения выравнивания последовательностей можно использовать программу PileUp (Higgins 1989, CABIOS 5,151) или программы Gap и BestFit (Needleman 1970, J Mol Biol 48; 443; Smith 1981, Adv Appl Math 2, 482), которые являются частью пакета программ GCG (Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711). Значения идентичности последовательностей, в данном описании выраженные в процентах (%), в другом аспекте изобретения, определяют с помощью программы GAP относительно участка полной последовательности при использовании следующих параметров: Штраф за открытие гэпа: 50, штраф за продолжение гэпа: 3, Average Match: 10000 и Average Mismatch: 0000, которые, если не указано иное, всегда используются в качестве стандартных параметров при выравнивании последовательностей.
Кроме того, предпочтительно наличие HBV устанавливается путем обнаружения по меньшей мере одного вирусного полинуклеотида, предпочтительно вирусной ДНК, в образце, полученном от пациента. Последовательности нуклеотидов вирусных полинуклеотидов или полного HBV-генома хорошо известны в данной области техники. Предпочтительно последовательности нуклеотидов HBV размещены для хранения в Genbank под учетным номером NC 003977.1. Специалисту ясно, что HBV полинуклеотиды упоминаются в качестве биомаркеров, а не как специфические полинуклеотиды, и что термин HBV охватывает различные штаммы HBV, содержащие варианты нуклеотидных последовательностей. Соответственно, следует понимать, что вышеуказанные полинуклеотиды, имеющие специфические последовательности, депонированные под учетными номерами в Genbank, являются иллюстративными последовательностями, представляя биомаркер. Поэтому, также возможно обнаружить «вариантные» (другие) полинуклеотиды, измененные в результате добавления, замены, делении и/или модификации по меньшей мере одного нуклеотида в упомянутых выше HBV-полинуклеотидах, при условии, что они также являются пригодными в качестве биомаркеров для HBV-инфекции, как обсуждалось выше. Предпочтительно «вариантные» полинуклеотиды являются по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичными упомянутым выше специфическим полинуклеотидам. Идентичность может быть вычислена, как изложено выше.
Предпочтительно термин HBV-инфекция относится к хронической HBV-инфекции. Хроническая HBV-инфекция предпочтительно отличается обнаружимым наличием HBV у субъекта в течение периода более шести месяцев. Более предпочтительно упоминаемая в описании хроническая HBV-инфекция соответствует определению, опубликованному Центром по контролю заболеваемости (CDC), согласно которому хроническая HBV-инфекция характеризуется следующими лабораторными параметрами: IgM антитела к коровому антигену вируса гепатита В (IgM анти-НВс), отрицательным AND и положительным результатом на один из следующих тестов: поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg), е-антиген вируса гепатита В (HBeAg) или ДНК OR вируса гепатита В (HBV), положительный HBsAg или HBV ДНК положительный по меньшей мере при проведении два раза с интервалом 6 месяцев (допускается любая комбинация этих тестов, осуществленная с интервалом 6 месяцев).
Следовательно, один предпочтительный вариант осуществления предоставляет способ согласно изобретению, в котором указанный пациент с гепатитом В страдает от хронического гепатита В.
Последовательность нуклеиновой кислоты, в которой в популяции возможна более чем одна последовательность, называется в описании "полиморфным сайтом". Полиморфные сайты могут приводить к различиям последовательностей в результате замен, вставок или делеций. Такие замены, вставки или делеции могут приводить в результате к сдвигу рамки, образованию преждевременных стоп-кодонов, делеции или добавлению одной или более аминокислот, кодируемых полинуклеотидом, изменению сайтов сплайсинга и могут также влиять на стабильность или транспорт мРНК. В том случае, когда полиморфный сайт представляет собой один нуклеотид в длину, такой сайт называется однонуклеотидным полиморфизмом ("SNP").
Термин "SNP" относится к однонуклеотидному полиморфизму в конкретном положении в геноме млекопитающего, который варьирует в популяции индивидуумов. При использовании в данном описании SNP может отождествляться по его названию или расположению в конкретной последовательности. SNPs, представленные на фиг. 1b, показаны скобками. Например, SNP "[A/G]" в последовательности rs12356193 на фиг. 1b указывает, что нуклеиновое основание (или аллель) в этом положении в последовательности может быть или аденином или гуанином. Аллель, ассоциированный с положительным результатом лечения гепатита В (например, гуанин в rs12356193), указан в столбце шесть на фиг. 1а и 1b или столбце четыре на фиг. 2а. Нуклеотиды, фланкирующие SNPs на фиг. 1b, являются фланкирующими последовательностями, которые используются для идентификации положения SNP в геноме. При использовании в описании, нуклеотидные последовательности, упоминаемые в настоящей заявке, включают комплементарные цепи указанных нуклеотидных последовательностей. В дополнение к этому, при использовании в описании термин "SNP" рассматривает любой аллель из числа набора аллелей.
Термин "аллель" относится к специфическому нуклеотиду из числа «ассортимента» нуклеотидов, определяющих SNP.
Термин "ассоциированный с положительным результатом аллель" или "аллель положительного результата" имеет отношение к аллелю, связанному с положительным результатом лечения гепатита В. Предпочтительные виды лечения гепатита В и предпочтительные способы лечения для получения положительного результата перечисляются в описании далее. Шестые столбцы на фиг. 1а и 1b и четвертый столбец на фиг. 2а показывают ассоциированные с положительным результатом аллели согласно настоящему определению.
Термин "гаплотип" относится к комбинации определенных аллелей из двух или более SNPs.
Термин "гаплотип положительного результата" относится к гаплотипу, связанному с положительным результатом лечения гепатита В.
Термин "полинуклеотид" имеет отношение к полимерным формам нуклеотидов любой длины. Полинуклеотиды могут содержать дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды и/или их аналоги. Полинуклеотиды могут иметь любую трехмерную структуру, включая одноцепочечную, двухцепочечную и тройную спиральную структуру молекулы, и могут осуществлять любую функцию, известную и неизвестную. Неограничивающими примерами полинуклеотидов являются следующие: ген или фрагмент гена, экзоны, интроны, мРНК, тРНК, рРНК, короткие интерферирующие молекулы нуклеиновых кислот (siNA), рибозимы, сДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, изолированные ДНК любой последовательности, изолированные РНК любой последовательности, зонды нуклеиновых кислот и праймеры. Полинуклеотид также может содержать модифицированные молекулы нуклеиновых кислот, такие как метилированные молекулы нуклеиновых кислот и аналоги молекул нуклеиновых кислот.
"Практически изолированный" или "изолированный" полинуклеотид - это полинуклеотид, практически свободный от последовательностей, с которыми он связан в природе. «Практически свободный» означает, что по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90% не содержит веществ, с которыми он связан в природе. "Изолированный полинуклеотид" также включает рекомбинантные полинуклеотиды, которые вследствие происхождения или манипуляции: (1) являются не связанными с полным или частью полинуклеотида, с которым они связаны в природе, или (2) являются связанными с полинуклеотидом, отличным от полинуклеотида, с которым они связаны в природе, или (3) не встречаются в природе.
Термин "вектор" имеет отношение к молекуле ДНК, которая несет ДНК, предназначенную для вставки и навсегда сохраняющуюся в клетке-хозяине. Векторы также известны как клонирующие векторы, клонирующие носители или носители. Термин "вектор" включает векторы, которые используются главным образом для вставки молекулы нуклеиновой кислоты в клетку, векторы репликации, которые используются главным образом для репликации нуклеиновых кислот, и векторы экспрессии, которые используются для транскрипции и/или трансляции ДНК или РНК. Также включаются векторы, обеспечивающие более чем одну из вышеупомянутых функций.
При помощи способа настоящего изобретения можно определить, имеется ли у пациента с гепатитом В повышенная вероятность получения положительного результата при лечении гепатита В. При использовании в описании термин «положительный результат» может иметь несколько клинических проявлений. В одном варианте осуществления положительный результат определяется как уменьшение HBsAg более чем на 1,5 log в крови указанного пациента. Предпочтительно указанное уменьшение HBsAg наблюдается на или до 24 недели лечения. Это означает, что количество обнаружимого HBsAg уменьшается быстрее, чем среднее значение HBsAg, наблюдаемое в популяции с гепатитом В, получающей тот же самый вид лечения. Быстрое уменьшение служит признаком более высокой вероятности подавления или излечения гепатита В, включая более высокую вероятность сероконверсии HBsAg, несмотря на то, что это происходит не всегда. Сероконверсия HBsAg определяется как отсутствие обнаружимого HBsAg в крови пациента и появление анти-HBs антител в крови. Таким образом, один вариант осуществления предоставляет способ определения, имеет ли пациент с гепатитом В повышенную вероятность уменьшения HBsAg более чем на 1,5 log, в его/ее крови на или до 24 недели лечения HBV, по сравнению со средним значением в популяции пациентов с гепатитом В, включающий установление, содержит ли содержащий нуклеиновую кислоту образец указанного пациента с гепатитом В по меньшей мере один аллель SNP, ассоциированный с положительным результатом, как показано на фиг. 1 и/или на фиг. 2, и/или установление, содержит ли образец указанного пациента с гепатитом уровень (экспрессии) карнитина или производного карнитина (предпочтительно ацетил-L-карнитина и/или проприонил-L-карнитина), который связывается с положительным результатом лечения гепатита В.
В предпочтительном варианте осуществления положительный результат лечения гепатита В определяется как устойчивый вирусологический ответ. Это означает, что получены уровни ДНК HBV равные или ниже чем 2000 IU/мл крови, а уровни аланин аминотрансферазы нормализуются в течение 2 лет дальнейшего наблюдения. Поэтому дополнительно предоставляется способ определения, имеется ли у пациента с гепатитом В повышенная вероятность устойчивого вирусологического ответа после лечения HBV по сравнению со средним значением в популяции пациентов с гепатитом В, включающий установление, содержит ли содержащий нуклеиновую кислоту образец указанного пациента с гепатитом В по меньшей мере один аллель SNP, ассоциированный с положительным результатом, как показано на фиг. 1 и/или на фиг. 2, и/или установление, содержит ли образец указанного пациента с гепатитом уровень (экспрессии) карнитина или производного карнитина (предпочтительно ацетил-L-карнитина и/или проприонил-L-карнитина), который ассоциируется с положительным результатом лечения гепатита В.
В отдельном предпочтительном варианте осуществления положительный результат лечения гепатита В определяется как отсутствие HBsAg. Это означает, что HBsAg исчезает из крови. Клиренс HBsAg является ближайшей к клиническому выздоровлению точкой и связан с увеличенной выживаемостью и более низким риском развития цирроза печени и гепатоклеточной карциномы. Как показано в примерах, настоящим изобретением предоставляются SNPs, которые сопряжены с этим наиболее благоприятным результатом. Кроме того, уровни карнитина и производных карнитина по-видимому коррелируют с этим наиболее благоприятным результатом. Поэтому дополнительно предоставляется способ определения, имеется ли у пациента с гепатитом В повышенная вероятность отсутствия HBsAg после лечения HBV по сравнению со средним значением в популяции пациентов с гепатитом В, включающий установление, содержит ли содержащий нуклеиновую кислоту образец указанного пациента с гепатитом В по меньшей мере один аллель SNP, ассоциированный с положительным результатом, как показано на фиг. 1 и/или на фиг. 2, и/или установление, содержит ли образец указанного пациента с гепатитом уровень (экспресмии) карнитина или производного карнитина (предпочтительно ацетил-L-карнитина и/или проприонил-L-карнитина), который ассоциируется с положительным результатом лечения гепатита В. Предпочтительно указанный пациент с гепатитом В имеет повышенную вероятность исчезновения HBsAg в сочетании с сероконверсией анти-НВ (что означает, что анти-HBs антитела обнаруживаются в крови индивидуума после лечения).
Таким образом, предпочтительный вариант осуществления предоставляет способ определения согласно изобретению, имеется ли у пациента с гепатитом повышенная вероятность положительного результата лечения гепатита В, при этом указанный положительный результат выбирают из группы, состоящей из отсутствия HBsAg, отсутствия HBsAg вместе с анти-HBs сероконверсией, устойчивого вирусологического ответа и уменьшение HBsAg более чем на 1,5 log в крови указанного пациента на или до 24 недели лечения. Предпочтительно любой из означенных способов осуществляется до начала указанного лечения гепатита В, для того чтобы предсказать результат лечения.
В одном предпочтительном варианте осуществления чувствительность пациента с гепатитом В для обеспечения положительного результата лечения гепатита В определяется с использованием способа в соответствии с изобретением, при этом указанное лечение гепатита В включает введение интерферона. Предпочтительно согласно изложенному в этом контексте, интерферон является интерфероном, ковалентно связанным с полиэтиленгликолем (PEG-интерферон). Более предпочтительно термин интерферон включает интерферон 2 альфа, наиболее предпочтительно интерферон 2 альфа, ковалентно связанный с полиэтиленгликолем (PEG-интерферон 2 альфа, коммерчески доступный как Pegasys). Другими предпочтительными неограничивающими примерами известных сегодня терапевтических соединений интерферона являются PEG-интерферон альфа 2b (Peg-Intron), пег-интерферон лямбда, Locteron (который представляет собой интерферон альфа2b, присутствующий в биосферах), Консенсус интерферон (который является генно-инженерным интерфероном, на 88% гомологичным с IFN-альфа и на 30% Fс IN-бета) и IFN-гамма.
Лечение пациентов с гепатитом В интерфероном или другими иммуномодуляторами, например, такими как агонисты toll-подобных рецепторов, предпочтительно комбинируют с ингибитором вирусной ДНК-полимеразы с целью улучшения ответа на лечение. Предпочтительно ингибитором вирусной ДНК-полимеразы является аналог нуклеотида или аналог нуклеозида. Таким образом, предпочтительный способ согласно изобретению определяет, имеется ли у пациента с гепатитом В повышенная вероятность положительного результата лечения интерфероном в комбинации с аналогом нуклеотида или аналогом нуклеозида. Более предпочтительно указанное лечение включает лечение интерфероном 2 альфа в комбинации с аналогом нуклеотида или аналогом нуклеозида и даже более предпочтительно указанное лечение включает лечение PEG-интерфероном или PEG-интерфероном 2 альфа (например, pegasys) или другими иммуномодуляторами в комбинации с аналогом нуклеотида или аналогом нуклеозида. Несколько аналогов нуклеотидов или нуклеозидов известно в данной области техники. Предпочтительными неограничивающими примерами являются ламивудин, адефовир, адефовир дипивоксил, энтекавир, тенофовир, тенофовир дизопроксил фумарат и телбивудин. Эти аналоги нуклеотидов/нуклеозидов хорошо известны в данной области техники. Кратко, ламивудин является аналогом цитидина. Он может ингибировать обратную транскриптазу гепатита В. Он фосфорилируется до активных метаболитов, которые конкурируют за включение в вирусную ДНК.
Адефовир является нециклическим фосфонатным аналогом нуклеотида, предназначенным для перорального приема, ингибирующим HBV-полимеразу терминацией цепи. Основное преимущество адефовира по сравнению с ламивудином (первый нуклеотидный ингибитор обратной транскриптазы (NRTI) разрешенный для лечения гепатита В) заключается в том, что до развития устойчивости вируса к адефовиру проходит более длительный период времени. Адефовир дипивоксил содержит две единицы пивалоилоксиметила, что делает его пролекарственной формой адефовира.
Энтекавир является циклопентильным аналогом гуанозина, предназначенным для перорального приема, ингибирующим ДНК-прайминг HBV. Транскрипция отрицательно-спирализованной HBV ДНК и синтез положительно-спириалзованной HBV ДНК является обратным.
Тенофовир является аналогом нуклеотида, блокирующим обратную транскриптазу. Тенофовир дизопроксил фумарат является пролекарственной формой тенофовира.
Телбивудин является L-изомером тимидина и вызывает терминацию цепи ДНК HBV.
Таким образом, отдельный предпочтительный вариант осуществления предоставляет способ установления, имеет ли пациент с гепатитом В повышенную вероятность положительного результата лечения гепатита В по сравнению со средним значением в популяции пациентов с гепатитом В, включающий определение, содержит ли содержащий нуклеиновую кислоту образец указанного пациента с гепатитом В по меньшей мере один аллель SNP, ассоциированный с положительным результатом, как показано на фиг. 1 и/или на фиг. 2, и/или установление, содержит ли образец указанного пациента с гепатитом уровень (экспрессии) карнитина или производного карнитина, ассоциированный с положительным результатом лечения гепатита В, при этом указанное лечение гепатита В включает введение интерферона (предпочтительно интерферона 2 альфа или пегилированного интерферона, более предпочтительно PEG-интерферона 2 альфа в комбинации с аналогом нуклеотида или нуклеозида, выбранным из группы, состоящей из ламивудина, адефовира, адефовир дипивоксила, энтекавира, тенофовира, тенофовир дизопроксил фумарата и телбивудина.
В отдельном предпочтительном варианте осуществления чувствительность пациента с гепатитом В для обеспечения положительного результата лечения гепатита В определяется способом согласно изобретению, при этом указанное лечение гепатита В включает введение интерферона (предпочтительно интерферона 2 альфа или пегилированного интерферона, более предпочтительно PEG-интерферона 2 альфа) в комбинации с адефовиром или тенофовиром. Наиболее предпочтительно указанное лечение включает лечение PEG-интерфероном 2 альфа, например, PEGasys, в комбинации с адефовиром или тенофовиром, предпочтительно адефовиром. Как правило, лечение PEGasys осуществляется путем подкожного введения (еженедельная подкожная инъекция) на протяжении 48 недель, тогда как ингибиторы вирусной ДНК-полимеразы (аналоги нуклеозидов/нуклеотидов) вводятся перорально в течение более длительного времени, т.е. на протяжении более чем одного года у 80% пациентов. Однако, в современных режимах комбинированной терапии лечение ингибиторами вирусной ДНК-полимеразы прекращают вместе с PEG-интерфероном после 48 недель. Подробности можно найти в работе J.L. Dienstag N Engl J Med 2008, 359; 1486-1500.
Фиг. 1 показывает несколько SNPs генома человека, которые связаны с результатом лечения HBV. В частности, одним предпочтительным ассоциированным с положительным результатом аллелем является G аллель SNP rs12356193. Как показано в примерах этот аллель rs12356193 был в значительной степени связан с исчезновением HBsAg по истечении последующего лечения HBV, с р-значением 2,61Е-09 и общей частотой минорного аллеля 0,11. В частности, поэтому предпочтительный вариант осуществления предоставляет способ установления согласно изобретению, имеется ли у пациента с гепатитом В повышенная вероятность положительного результата лечения гепатита В по сравнению с средним значением в популяции пациентов с гепатитом В, включающий определение, содержит ли содержащий нуклеиновую кислоту образец указанного пациента с гепатитом В по меньшей мере G аллель SNP rs12356193.
Другим предпочтительным ассоциированным с положительным результатом аллелем является T784G в геноме HBV, это означает, что в положении 784 HBV присутствует гуанидин вместо тимина. При использовании в описании положения нуклеотидов HBV определяются как положения в специфических для генотипа эталонных последовательностях adw2 (Х02763), aad (D00330), (АВ033556), ayw (Х02496) и (Х75657) для генотипов А, В, С, D и Е, соответственно, или положения, соответствующие им в других HBV штаммах. Для каждого отдельного штамма HBV специалист способен определить положения нуклеотидов, соответствующие положениям указанных выше эталонных штаммов, например, путем выравнивания с использованием программного обеспечения для анализа последовательностей ClustalW Multiple Alignment in BioEdit (Hall, T.A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor и analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp.Ser. 41:95-98). В Примерах показано, что аллель T784G в значительной степени ассоциирован с исчезновением HBsAg на неделе 96 после проведения поправки Бонферрони для множественных сравнений. Этот аллель встречается у 4 из 9 пациентов, у которых достигается исчезновение HBsAg на неделе 96, и не встречается ни у одного из пациентов, которые не достигли исчезновения HBsAg. Поэтому предпочтительный вариант осуществления предоставляет способ установления согласно изобретению, имеется ли у пациента с гепатитом В повышенная вероятность положительного результата лечения гепатита В по сравнению с средним значением в популяции пациентов с гепатитом В, включающий определение, содержит ли содержащий нуклеиновую кислоту образец указанного пациента с гепатитом В по меньшей мере аллель HBV T784G.
Для того чтобы увеличить прогностическое значение результата лечения HBV, полезно установить, присутствует ли более чем один ассоциированный с положительным результатом SNP аллель, показанный на фиг. 1 и/или фиг. 2, в образце, содержащем нуклеиновую кислоту. Поэтому согласно изобретению предоставляется способ, включающий установление, присутствует ли в данном образце по меньшей мере 2, предпочтительно по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 ассоциированных с положительным результатом SNP аллелей, как показано на фиг. 1 и/или фиг. 2. Пациент с HBV, у которого содержится по меньшей мере два ассоциированных с положительным результатом SNP аллеля, как показано на фиг. 1 и/или фиг. 2, имеет так называемый "гаплотип положительного результата". Предпочтительно по меньшей мере один из упомянутых выше SNP аллелей подвергается проверке, так как эти аллели в значительной степени ассоциированы с результатом лечения HBV. Поэтому способ согласно изобретению, включающий обнаружение SNP rs12356193 и/или HBV SNP в положении 784, является предпочтительным. В одном предпочтительном варианте осуществления определяют и SNP rs12356193 и HBV SNP в положении 784. Предпочтительно определяют, присутствует ли G аллель SNP rs12356193 и/или HBV T784G аллель в содержащем нуклеиновую кислоту образце, предпочтительно в сочетании по меньшей мере с одним другим ассоциированным с положительным результатом аллелем SNP, как показано на фиг. 1 и/или фиг. 2. Наиболее предпочтительно определяют, присутствует ли G аллель SNP rs12356193 и HBV T784G аллель в содержащем нуклеиновую кислоту образце, необязательно в сочетании по меньшей мере с одним другим ассоциированным с положительным результатом аллелем SNP, как показано на фиг. 1 и/или фиг. 2.
Один вариант осуществления включает выявление полиморфизмов HBV нуклеотидов в положениях 784 и 1888 (или положениях соответствующих им в HBV штаммах, отличных от упомянутых выше консенсусных штаммов). Аллель G1888W также ассоциируется с отсутствием HBsAg на неделе 96 после начала лечения HBV, как показано в примерах. В связи с этим, проверка наличия полиморфизмов HBV нуклеотидов в положениях HBV 784 и 1888 (или положениях соответствующих им в HBV штаммах, отличных от упомянутых выше консенсусных штаммов) увеличивает прогностическое значение в отношении результата лечения HBV. Следует отметить, наличие SNP в генотипе HBV зависит от генотипа HBV, при использовании в качестве эталона специфического для генотипа эталонного штамма. Поэтому, например, аллель А1135Н был отмечен в генотипе А, и аллель C1135Н в генотипах В, С, D и Е.
В другом предпочтительном варианте осуществления исследуются HBV SNPs в положениях 784, 1888 и/или 97 (или положениях соответствующих им в HBV штаммах, отличных от упомянутых выше консенсусных штаммов). В примерах показано, что аллель G97A также ассоциируется с отсутствием HBsAg на неделе 96 после начала лечения HBV. В связи с этим, проверка наличия полиморфизмов нуклеотидов HBV в положениях 784 и 1888 или положениях 784 и 97 дополнительно увеличивает прогностическое значение в отношении результата лечения HBV.
Любой из вышеупомянутых аллелей HBV предпочтительно исследуется в сочетании по меньшей мере с SNP rs12356193, необязательно дополнительно в сочетании по меньшей мере с другим SNP, показанным на фиг. 1, для того, чтобы дополнительно увеличить прогностическое значение в отношении результата лечения HBV.
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение также предоставляет интерферон или другой иммуномодулятор необязательно в комбинации с ингибитором вирусной ДНК-полимеразы (предпочтительно аналога нуклеозида или аналога нуклеотида) для использования при лечении гепатита В, при этом лечению подвергается пациент с гепатитом В, который при тестировании был определен, как позитивный в отношении по меньшей мере одного ассоциированного с положительным результатом SNP аллеля, как показано на фиг. 1 и/или фиг. 2, и/или который при проверке был определен как позитивный в отношении ассоциированного с положительным результатом уровня карнитина или производного карнитина.
Как объяснялось ранее, наличие такого ассоциированного с положительным результатом SNP аллеля и/или наличие такого ассоциированного с положительным результатом уровня карнитина или производного карнитина в образце данного пациента с HBV служит признаком наличия повышенной вероятности у указанного индивидуума оказаться пациентом, ответившим на лечение, по сравнению со средним значением в популяции с хроническим гепатитом В, в результате чего будет наблюдаться отсутствие HBsAg, устойчивый вирусологический ответ и/или уменьшение HBsAg более чем на 1,5 log в крови указанного пациента на или до 24 недели лечения. Соответственно, такому пациенту с HBV будет легко назначать лечение от HBV, несмотря на то, что состояние пациента может не быть оптимальным. С другой стороны, если у данного пациента при тестировании не обнаружен SNP аллель или гаплотип, ассоциированный с положительным результатом лечения, и/или не обнаружен уровень карнитина или производного карнитина, ассоциированный с положительным результатом, такое лечение может быть исключено для данного пациента, что дает возможность избежать липших расходов, тяжести лечения и побочных эффектов.
Предпочтительно HBV-терапию получает пациент с гепатитом В, при тестировании установленный как позитивный в отношении по меньшей мере аллеля G SNP rs12356193 и/или аллеля T784G генома HBV, необязательно в сочетании по меньшей мере с одним другим, связанным с положительным результатом SNP аллелем, как показано на фиг. 1 и/или фиг. 2, таким как например, HBV А/С1135Н аллель и/или HBV G1888W аллель.
В другом предпочтительном варианте осуществления HBV-терапию получает пациент с гепатитом В, у которого был исследован уровень карнитина в плазме, при этом установленный уровень карнитина был равен или составлял меньше чем 33,3 микромоль/литр, предпочтительно был равен или меньше чем 29 микромоль/литр.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления HBV-терапию получает пациент с гепатитом В, у которого был исследован уровень ацетил-L-карнитина в плазме, при этом установленный уровень ацетил-L-карнитина был равен или меньше чем 3,89 микромоль/литр.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления HBV-терапию получает пациент с гепатитом В, у которого был исследован уровень проприонил-L-карнитина в плазме, при этом установленный уровень проприонил-L-карнитина был равен или меньше чем 0,43 микромоль/литр.
Согласно описанию выше, указанное лечение HBV предпочтительно включает введение интерферона, предпочтительно интерферона 2 альфа или пегилированного интерферона, более предпочтительно PEG-интерферона 2 альфа. Другими предпочтительными неограничивающими примерами известных в настоящее время терапевтических соединений интерферона являются PEG-интерферон альфа 2b (ПегИнтрон), пег-интерферон лямбда, локтерон, Консенсус интерферон и IFN-гамма.
Указанное лечение интерфероном предпочтительно комбинируют с ингибитором вирусной ДНК-полимеразы, таким как аналог нуклеозида или нуклеотида. Такой аналог нуклеозида или нуклеотида наиболее предпочтительно выбирают из группы, состоящей из ламивудина, адефовира, адефовир дипивоксила, энтекавира, тенофовира, тенофовир дизопроксил фумарата и телбивудина.
Теперь, когда настоящее изобретение предоставляет понимание того, что результат лечения гепатита В ассоциируется с некоторыми SNP в геноме инфицированного индивидуума и в геноме HBV, становится возможным получение коллекции молекул нуклеиновых кислот, содержащих последовательности HBV, ассоциированные с результатом лечения. В частности, такая коллекция пригодна для тестирования HBV пациента в отношении результата лечения HBV. Соответственно, такая коллекция называется "коллекцией, предназначенной для предсказания результата лечения HBV" или "HBV-специализированной коллекцией". Разумеется, другие последовательности нуклеиновых кислот могут присутствовать в такой HBV-специализированной коллекции, такие как, например, эталонные нуклеиновые кислоты и калибровочные стандарты, при условии, что по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95% полинуклеотидов HBV-специализированной коллекции содержат SNP, ассоциированный с результатом лечения HBV, предпочтительно выбранный из SNP, как показано на фиг. 1 и/или фиг. 2. HBV-специализированная коллекция может иметь, например, форму состоящего из частей набора или панели или микропанели или вектора.
Соответственно, дополнительно предоставляется состоящий из частей набор или панель или микропанель или вектор, состоящий по меньшей мере из двух полинуклеотидов, содержащих SNP, как показано на фиг. 1 и/или фиг. 2, и необязательно один или более эталонных полинуклеотидов, при этом по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95% полинуклеотидов указанного состоящего из частей набора или панели или микропанели или вектора содержат SNP, как показано на фиг. 1 и/или фиг. 2.
В частности, такая специально сформированная коллекция HBV пригодна для тестирования содержащего нуклеиновую кислоту образца пациента с HBV с целью оценки, является ли указанный пациент восприимчивым к лечению гепатита В. Следовательно, также предоставляется применение состоящего из частей набора или панели или микропанели или вектора согласно изобретению для типирования содержащего нуклеиновую кислоту образца пациента с гепатитом В, а также применение состоящего из частей набора или панели или микропанели или вектора согласно изобретению для установления, имеется ли у пациента с гепатитом В повышенная вероятность положительного результата лечения гепатита В по сравнению со средним значением в популяции пациентов с гепатитом В. Как сказано ранее, указанный пациент с гепатитом В предпочтительно является пациентом с хроническим гепатитом В.
Состоящий из частей набор или панель или микропанель или вектор согласно изобретению предпочтительно содержит набор праймеров или зондов, каждый из указанных праймеров или зондов имеет в длину, независимо друг от друга, примерно от 8 до 50 нуклеотидов, предпочтительно от 8 до 30 нуклеотидов, более предпочтительно от 8 до нуклеотидов, и отличаются тем, что указанные праймеры или зонды являются комплементарными к последовательности, содержащей SNP, как показано на фиг. 1 или фиг. 2. В частности, такие праймеры и зонды пригодны для обнаружения и/или амплификации полиморфизмов нуклеотидов генома человека и/или HBV, ассоциированных с результатом лечения HBV, обеспечивая таким образом возможность типирования содержащего нуклеиновую кислоту образца пациента с гепатитом В. Следовательно, дополнительно предоставляется применение по меньшей мере одного изолированного полинуклеотида, содержащего SNP, как показано на фиг. 1 и/или фиг. 2, для типирования содержащего нуклеиновую кислоту образца пациента с гепатитом В. Длина такого изолированного полинуклеотида составляет предпочтительно в пределах от 8 до 50 нуклеотидов, более предпочтительно в пределах от 8 и 30 нуклеотидов, более предпочтительно в пределах от 8 до 25 нуклеотидов. Предпочтительно по меньшей мере один указанный полинуклеотид является по меньшей мере на 80% комплементарным с участком, по меньшей мере из 8, предпочтительно по меньшей мере 10, более предпочтительно по меньшей мере 12, более предпочтительно по меньшей мере из 15 нуклеотидов любой одной из последовательностей, представленных на фиг. 1 или 2. Разумеется, должно быть точно установлено для какой аллели указанный полинуклеотид является специфическим. Следовательно, нуклеотид, определяющий аллель SNP, не должен изменяться. Однако, фланкирующие последовательности указанных SNP могут изменяться до некоторой степени по сравнению с природными фланкирующими последовательностями. Более предпочтительно по меньшей мере используется полинуклеотид, комплементарный к G аллелю SNP rs12356193 и/или T784G аллелю HBV, поскольку эти аллели в значительной степени связаны с положительным результатом лечения НВV.
Изобретение дополнительно предоставляет способ анализа на наличие в образце нуклеиновой кислоты, содержащей ассоциированный с положительным результатом SNP аллель, как показано на фиг. 1 и/или фиг. 2, включающий контактирование указанного образца по меньшей мере с одним полинуклеотидом, содержащим SNP, как показано на фиг. 1 и/или фиг. 2, и установление, гибридизируется ли указанный полинуклеотид с нуклеиновой кислотой в образце. Указанный способ анализа предпочтительно включает анализ на основе ПЦР или анализ на основе мультиплексной амплификации лигированных зондов (MLPA). Предпочтительно определяют, гибридизируется ли указанный полинуклеотид с нуклеиновой кислотой в образце в строгих условиях. Термин "гибридизируется в строгих условиях" предназначается для описания условий гибридизации и отмывки, при которых нуклеотидные последовательности по меньшей мере на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 98% тождественные друг другу, как правило, остаются гибридизированными друг с другом. Подобные строгие условия известны специалистам в данной области техники, кроме того их можно найти в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y (1989), 6.3.1-6.3.6. Неограничивающими примерами строгих условий гибридизации являются гибридизация в 6х хлорид натрия/цитрат натрия (SSC) примерно при 45°С, с последующими одной или более промывками в 0,2 х SSC, 0,1% SDS при 50-65°С. И в этом случае определяющий SNP аллель нуклеотид должен быть строго установлен. Фланкирующие последовательности SNP по меньшей мере одного указанного полинуклеотида предпочтительно являются комплементарными по меньшей мере на 80% с любой одной из последовательностей, показанных на фиг. 1 или 2. Более предпочтительно используется полинуклеотид, у которого фланкирующие последовательности SNP по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно полностью комплементарны любой одной из последовательностей, показанных на фиг. 1 или 2. В отдельном предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере используется полинуклеотид, комплементарный к G аллелем SNP rs12356193 и/или T784G аллелем HBV.
Кроме того, изобретением предусматривается состоящий из частей набор или панель или микропанель или вектор или применение согласно изобретению, в котором, указанный по меньшей мере один полинуклеотид способен амплифицировать нуклеиновокислотную последовательность, длиной от 50 до 600 нуклеотидов, предпочтительно от 100 до 400 нуклеотидов, более предпочтительно 150-250 нуклеотидов, при этом указанная последовательность содержит SNP, как показано на фиг. 1 и/или фиг. 2.
Изобретение дополнительно предоставляет применение способов установления уровня экспрессии карнитина и/или производного карнитина (предпочтительно ацетил-L-карнитина и/или проприонил-L-карнитина) для типирования образца, полученного от пациента с гепатитом В.
В некоторых вариантах осуществления изобретение также предоставляет способ установления, имеет ли индивидуум генетическую предрасположенность к повышенной вероятности получения положительного результата лечения гепатита В по сравнению со средним значением в популяции пациентов с гепатитом В, включающий определение, содержит ли геномная нуклеиновая кислота указанного индивидуума по меньшей мере один связанный с положительным результатом SNP аллель, как показано на фиг. 1, предпочтительно по меньшей мере, G аллель SNP rs12356193, и/или определение, имеется ли в образце указанного индивидуума уровень (экспрессии) карнитина и/или производного карнитина, который ассоциируется с положительным результатом лечения гепатита В.
Другим применением текущего изобретения является специфическая идентификация гена, ассоциированного с повышенной вероятностью для пациента с гепатитом В положительного результата лечения гепатита В по сравнению со средним значением в популяции пациентов с гепатитом В. Это делается путем идентификации генов, связанных с SNP, в соответствии с изобретением. После того, как такой ген идентифицирован, предпочтительно сравнивают белковые последовательности и/или уровни экспрессии белков между пациентами с ответом на лечение и пациентами без ответа на лечение, например, для понимания молекулярных путей, связанных с повышенной вероятностью положительного результата лечения HBV. Соответственно, в одном варианте осуществления данное изобретение имеет отношение к способу идентификации гена, ассоциированного с повышенной вероятностью положительного результата лечения гепатита В у пациента с гепатитом В по сравнению со средним значением в популяции пациентов с гепатитом В, включающий:
- идентификацию гена, содержащего SNP, как показано на фиг. 1, и
- сравнение экспрессии указанного гена у индивидуума, имеющего ассоциированный с положительным результатом аллель SNP, как показано на фиг. 1, с экспрессией указанного гена у индивидуума, не имеющего ассоциированного с положительным результатом аллеля, на наличие различий, указывающих, что указанный ген связан с повышенной вероятностью положительного результата лечения гепатита В.
В еще одном варианте осуществления предоставляется способ согласно изобретению, с помощью которого также определяют, имеется ли у указанного индивидуума исходное содержание HBsAg в сыворотке менее чем 387 IU/мл, до начала лечения гепатита В. Исходное содержание HBsAg в сыворотке менее чем 387 IU/мл, может использоваться в качестве другого параметра, предсказывающего положительный результат лечения гепатита В (R.B. Takkenberg, thesis University of Amsterdam (2011), The Netherlands, chapter 2, ISBN 9789090263045). Следовательно, сочетание способа согласно изобретению и установления исходного содержания HBsAg имеет даже повышенное прогностическое значение в отношении результата лечения гепатита В.
Термины "индивидуум", "пациент", "хозяин" и "субъект" используются в описании взаимозаменяемым образом и относятся к позвоночному животному, предпочтительно млекопитающему, более предпочтительно человеку.
Настоящее изобретение использует, если не указано иное, общепринятые методы молекулярной биологии (включая рекомбинантные методы), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые являются частью данной области техники.
При использовании в описании единственное число любого термина может также охватывать множественное число и наоборот.
При использовании в описании производное карнитина предпочтительно включает ацетил-L-карнитин и/или проприонил-L-карнитин.
Все приведенные в описании публикации и ссылки полностью включаются в данное описание путем отсылки с любой целью.
Данное изобретение дополнительно иллюстрируется следующими примерами. Эти примеры не ограничивают изобретение каким бы то ни было образом, а служат только для пояснения изобретения.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1: SNP, ассоциированные с результатом лечения HBV. Каждая соответствующая последовательность может быть найдена в dbSNP с помощью своего учетного номера RefSNP accession ID (rs номер). Например, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp?term=rs12356193. Аллель каждого SNP, который ассоциируется с соответствующим результатом лечения HBV, показан в отдельной колонке (колонка 6).
Фиг. 2: Ассоциированные с положительным результатом лечения аллели HBV. Аллель каждого SNP, который ассоциируется с соответствующим результатом лечения HBV, показан в отдельной колонке (колонка 4) фиг. 2а.
Фиг. 3: График GWA-анализа исчезновения HBsAg на неделе 96 (ось у: -log 10 р-значения с использованием теста тренда Кохрана-Армитажа, ось х: положение в геноме), rs12356193 изображен в круге.
Фиг. 4: Q-Q график исчезновения HBsAg на неделе 96.
Фиг. 5: Исчезновение HBsAg в процентах в разных rs12356193 генотипах.
Фиг. 6: rs12356193 распределение аллелей у пациентов с или без исчезновения HBsAg.
Фиг. 7: а). Распределение rs12356193 генотипов среди пациентов с вирусным генотипом A, D и Е.
b). Исчезновение HBsAg в процентах в разных rs12356193 генотипах у пациентов с вирусным генотипом A, D и Е.
Фиг. 8: Схематическое изображение места расположения SNP rs12356193 на хромосоме 10.
Фиг. 9: Последовательности ПЦР гибридных праймеров.
Фиг. 10: Комбинации праймеров и полученная длина репликона.
Фиг. 11: Схема процесса секвенирования.
Фиг. 12: Средние уровни DL-карнитина (С0), ацетил-L-карнитина (С2) и пропионил-L-карнитина (С3) для разных rs12356193 генотипов.
Фиг. 13: Средние уровни DL-карнитина (С0), ацетил-L-карнитина (С2) и пропионил-L-карнитина (С3) у пациентов с исчезновением HBsAg в течение 2-летнего периода наблюдения без лечения и у пациентов с персистенцией HBsAg в течение 2-летнего периода наблюдения без лечения.
Фиг. 14: Уровни DL-карнитина (С0) в плазме согласно rs12356193 генотипу у всех 84 пациентов (а); уровни DL-карнитина (С0) в плазме у пациентов с или без потери HBsAg на неделе 96 (b) и на неделе 144 (с).
Фиг. 15: ROC-кривая исходных уровней DL-карнитина (С0) в связи с исчезновением HBsAg на неделе 96 у всех пациентов.
Фиг. 16: Уровни DL-карнитина (С0) в плазме у пациентов в соответствии с этнической группой и полом.
Фиг. 17: а) Уровни DL-карнитина (С0) в плазме в соответствии с rs12356193 генотипом у пациентов-мужчин, не являющихся азиатами; b) Уровни DL-карнитина (С0) в плазме у пациентов-мужчин, не являющихся азиатами, с и без исчезновения HBsAg на неделе 96.
Фиг. 18: ROC-кривая исходных уровней DL-карнитина (С0) в связи с исчезновением cHBsAg на неделе 96 у пациентов-мужчин, не являющихся азиатами.
Фиг. 19: Уровни ацетил-L-карнитина (С2) и пропионил-L-карнитина (С3) в плазме в соответствии с rs12356193 генотипом у всех 84 пациентов.
Фиг. 20: Уровни ацетил-L-карнитина (С2) в плазме у пациентов с и без исчезновения HBsAg на неделе 96 и на неделе 144.
Фиг. 21: Уровни пропионил-L-карнитина (С3) в плазме у пациентов с и без исчезновения HBsAg на неделе 96 и на неделе 144.
Фиг. 22: ROC-кривая исходных уровней ацетил-L-карнитина (С2) и пропионил-L-карнитина (С3 в связи с исчезновением HBsAg на неделе 96 у всех пациентов.
Фиг. 23: (а) Уровни ацетил-L-карнитина (С2) в плазме в соответствии с rs12356193 генотипом, у пациентов-мужчин, не являющихся азиатами; (b) Уровни ацетил-L-карнитина (С2) в плазме у пациентов-мужчин, не являющихся азиатами, с и без исчезновения HBsAg на неделе 96.
Фиг. 24: (а) Уровни пропионил-L-карнитина (С3) в плазме в соответствии с rs12356193 генотипом у пациентов-мужчин, не являющихся азиатами; (b) Уровни пропионил-L-карнитина (С3) в плазме у пациентов-мужчин, не являющихся азиатами, с и без исчезновения HBsAg на неделе 96.
Примеры
Пример 1
Мы анализировали результаты полногеномного исследования ассоциаций у 84 пациентов с активным хроническим гепатитом В, которых лечили пегинтерфероном и адефовиром, с целью установления связей между однонуклеотидными полиморфизмами (SNP) и результатом лечения.
Пациенты-Методы
1. PEG/ADV метод исследования
4
В недавно проведенном клиническом испытании при АМС [(R.B. Takkenberg, thesis University of Amsterdam (2011), The Netherlands, chapter 2, ISBN 9789090263045)] 84 пациента с хроническим гепатитом В (40 HBeAg положительных; 44 HBeAg отрицательных) с содержанием HBV ДНК≥2×10 IU/мл получали лечение Peg INF альфа-2а (Pegasys) и ADV-дипивоксилом (Hepsera) в течение 48 недель, с последующим наблюдением в течение 24-недель (и вплоть до 5 лет) без лечения.
Критериями ответа были HBeAg сероконверсия (исчезновение HBeAg с появлением анти- НВе антител), SVR (уровни HBV ДНК≤2000 IU/мл и нормализация ALT), и HBsAg сероконверсия (исчезновение HBsAg с появлением анти-HBs антител) в течение последующего наблюдения.
2. Основные характеристики пациентов
Исследуемая популяция отличалась значительной гетерогенностью по происхождению, что было отражено в распределении генотипов А (26), В (14), С (12), D (23) и Е (9). Устойчивый вирусологический ответ (SVR) был достигнут у 32 пациентов. HBeAg сероконверсия наблюдалась в течение лечения у 14 HBeAg-положительных пациентов. Исчезновение в сыворотке поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg), определенное как HBsAg уровни на более низком пределе чувствительности при количественном определении (0,05 IU/мл) с использованием Abbot Architect, было достигнуто у 9 пациентов в конце периода наблюдения (11%).
Статистически значимых различий основных характеристик не было обнаружено при сравнении всех пациентов. Однако, у HbeAg-позитивных участников пожилого возраста наблюдалась положительная связь с HBsAg сероконверсией (OR увеличение 1,16 в 1 год при исходном [95% CI, 1,008-1,337] р=0,039). У HBeAg-негативных участников и низкий исходный HBsAg (OR 16,96 на Hog10 IU/мл уменьшение [95% CI, 2,85-101] р=0,002) и HBV ДНК (OR 2,36 на 1log10 IU/мл уменьшение [95% CI, 1,02-5,45] р=0,044) были связаны с повышенной вероятностью HBsAg сероконверсии. При многофакторном анализе HBsAg был только независимым предсказывающим показателем HBsAg сероконверсии (OR 17,00 на 1log10 IU/мл уменьшение [95% CI 2,27-127, р=0,006). [Как описано в (R.B. Takkenberg, thesis University of Amsterdam (2011), The Netherlands, chapter 2, ISBN 9789090263045)].
3. Генотипирование
Приготовление образца ДНК (введение ДНК 200 нг)
Генотипирование 84 индивидуумов проводили по Roche (Nutley) при использовании Illumina Human Omnil-Quad BeadChip (Illumina, Inc. San Diego, США).
Результаты измерения интенсивности зерен (гранул) были обработаны и нормализованы в BeadStudio (Illumina); результаты успешно генотипированных образцов извлекали и генотипам давали название в пределах коллекций, используя Illuminus.
4. Исследование, ассоциированное с изучением всего генома (GWAS) и статистика
Полногеномное исследование GWA было проведено с помощью пакета GenABEL* в R Statistical Software (программное обеспечения для статистики).
* Aulchenko YS, Ripke S, Isaacs A, van Duijn CM. GenABEL: an R library for genome-wide association analysis. Bioinformatics (2007) 23 (10): 1294-1296.
Всего 999,091 различных SNP было генотипировано у 84 человек. После проверки качества 204862 (20,5%) SNP были исключены, как имеющие низкую (<5%) частоту минорного аллеля, 86 (0,009%) SNPs вследствие низкого call rate (>5% недостающие данные) и 31 (0,003%) SNP, потому что они не подчинялись закону Харди-Вейнберга (Р<1е-10). Ни один пациент не был исключен из-за низкого (<95%) call rate, чрезмерной аутосомной гетерозиготности (FDR<1%) или слишком высокой IBS (>=0,95). Всего 794130 (79,5%) SNP и 84 (100%) человека были удовлетворительными по всем критериям и были использованы для дальнейшего исследования.
Был проведен ассоциативный анализ исчезновения HBsAg в течение одного года наблюдения после лечения (неделя 96) у всей исследуемой популяции. В дополнение к этому, ассоциативные анализы были проведены при получении других результатов лечения (HBeAg сероконверсия, SVR и HBsAg уменьшение на неделе 24) у всех пациентов в совокупности и у пациентов, сгруппированных по происхождению или вирусному генотипу отдельно.
Имело место некоторое чрезмерное увеличение сводной статистики, что могло быть признаком стратификации популяции (см. график Q-Q исчезновение HBsAg на неделе 96). Лямбда λ значения находились в пределах от 0,97 до 1,07, свидетельствуя о возможном влиянии на положительные ассоциации вследствие стратификации популяции.
Статистическую значимость связи с каждым SNP оценивали с использованием теста для тренда Кохрана-Армитажа с 1 степенью свободы (1-d.f.). Мы использовали консервативную поправку Бонферрони для контроля величины ошибки ложного обнаружения, происходящей в результате множественных сравнений, и поэтому рассматривали полногеномные ассоциации при значении Р<6,3×10Е-8 (=0,05/794,161) для достоверности по всему геному. Вероятность успешного исхода и доверительные интервалы вычисляли, используя основной аллель в качестве эталонного. HWE р-значения вычисляли в GenABEL.
Результаты
10
Фиг. 3 представляет график -log Р значений. Р значения вычисляли с использованием теста для тренда Кохрана-Армитажа с 1 степенью свободы (1-d.f.) Большая отмеченная кругом точка на хромосоме 10 показывает полногеномную значимую ассоциацию SNP rs12356193 при исчезновении HBsAg в течение одного года наблюдения после лечения (неделя 96).
Фиг. 4 показывает Q-Q график исчезновения HBsAg на неделе 96.
Фиг. 5 показывает исчезновение HBsAg в процентах в разных rs12356193 генотипах.
Фиг. 6 показывает rs12356193 аллельное распределение у пациентов с и без исчезновения HBsAg.
Фиг. 7 показывает распределение rs12356193 генотипов среди пациентов с вирусным генотипом A, D и Е и процент исчезновения HBsAg в разных rs12356193 генотипах у пациентов с вирусным генотипом A, D и Е.
Фиг. 8 показывает схематическое изображение расположения SNP rs12356193 на хромосоме 10.
Обсуждение
Минорный аллель одного SNP, rs12356193, был значимо ассоциирован с исчезновением HBsAg в первый год наблюдения (Фиг.) при р-значении 2.61Е-09 и общей частоте минорного аллеля 0,12. Этот SNP располагается на хромосоме 10 в гене SLC16A9.
Фиг. 1 также показывает другие SNP, ассоциированные с результатом лечения гепатита В, которые являются подходящими для увеличения прогностического значения. Аллели, ассоциированные с положительными результатами, показаны в колонке шесть.
Эти открытия имеют двойное клиническое значение;
1. Во-первых, выделение групп риска среди пациентов посредством SNP генотипирования помогает выбрать метод лечения. Выбор метода лечения с наибольшей вероятностью положительного результата, такого как исчезновение HBsAg, уменьшение SVR или HBsAg более чем на 1,5 log на неделе 24, будет способствовать решению - начинать или нет лечение на основе пегинтерферона.
2. Во-вторых, новая связь SLC16A9 локусов с хроническим гепатитом В говорит о важной роли этого гена в ответе на лечение HBV пегинтерфероном и адефовиром. Эта связь обеспечивает новый взгляд на иммунный ответ хозяина на инфекцию вирусом гепатита В и предоставляет новые возможные мишени для терапевтических препаратов.
Пример 2
Мы анализировали данные о последовательностях HBV у 84 пациентов с хроническим гепатитом В, которых лечили пегинтерфероном и адефовиром, чтобы установить связи между однонуклеотидными полиморфизмами (SNP) и результатом лечения.
Пациенты-Методы
1. PEG/ADF метод исследования
В недавно проведенном клиническом исследовании при АМС [В. Takkenberg et al. (R.B. Takkenberg, thesis University of Amsterdam (2011), The Netherlands, chapter 2, ISBN 9789090263045)] 84 пациента с активным хроническим гепатитом В (40 HBeAg положительных; 44 HBeAg отрицательных) получали лечение Peg INF альфа-2а (Pegasys) и ADF-дипивоксилом (Hepsera) в течение 48 недель, с последующим 24-недельным периодом наблюдения (и вплоть до 5 лет) без лечения.
2. Исходные характеристики пациентов
Исследуемая популяция отличалась заметной гетерогенностью по происхождению, что было отражено в распределении генотипов А (26), В (14), С (12), D (23) и Е (9). Устойчивый вирусологический ответ (SVR) был достигнут у 32 пациентов. HBeAg сероконверсия наблюдалась в течение лечения у 14 HBeAg-положительных пациентов. Исчезновение в сыворотке поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg), определенное как HBsAg уровни на более низком пределе чувствительности при количественном определении (0,05 IU/мл) с использованием Abbot Architect, было достигнуто у 9 пациентов в конце периода наблюдения (11%).
3. Приготовление образца
Было создано несколько наборов гибридных ПЦР-праймеров, чтобы амплифицировать 13 ампликонов и охватить HBV-геном. Были созданы праймеры со специфическими последовательностями с вырожденными основаниями в положениях, чтобы компенсировать изменения в HBV эталонных последовательностях для генотипов А, В, С, D и Е (Entrez identifiers Х02763, D00330, AY123041, J02203, Х75657 соответственно). Полученные ПЦР-фрагменты были иммобилизованы на ДНК-«захватывающих зернах» через уникальный однонитевой участок, чтобы обеспечить присоединение фрагментов к зернам в соотношении 1:1; т.е. каждый фрагмент был присоединен к отдельному зерну.
4. Эмульсионная ПЦР-амплификация и секвенирование
Связанную с зернами библиотеку эмульгировали с реактивами для амплификации в смеси вода-в-масле, получая в результате микрореакторы (microreactors), содержащие на одном зерне один уникальный образец-фрагмент библиотеки. Каждый уникальный образец-фрагмент библиотеки был амплифицирован параллельно в его собственном микрореакторе, исключая конкуренцию или загрязнение последовательностей. Несущие ДНК «захватывающие зерна» были загружены в устройство PicoTiterPlate для секвенирования каждого зерна в лунке.
После загрузки устройства PicoTiterPlate в прибор 454 Genome Sequencer FLX Instrument, отдельные нуклеотиды «протекали» в установленном порядке через открытые ячейки (open wells) и ДНК «захватывающие зерна». Добавление одного (или более) нуклеотида(ов) комплементарного к матричной цепи вызывало хемилюминесцентный сигнал, регистрируемый CCD камерой прибора Genome Sequencer FLX Instrument. Полный рабочий цикл ПЦР и секвенирование проводили с помощью 454 Life Sciences, Branford СТ.
Фиг. 9, 10 и 11 показывают праймеры, ампликоны и схематический план протокола секвенирования.
5. Выравнивание и статистика
Специфические HBV последовательности пациентов выравнивали с помощью ClustalW Multiple Alignment и программного обеспечения BioEdit для анализа последовательностей*.
* Hall, Т.А. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor и analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41:95-98.
Нуклеотиды в каждом положении у каждого пациента сравнивали с genotype specific reference sequence. В качестве эталонных последовательностей использовали А adw2 (X02763), Ba ad (D00330), С (AB033556), D ayw (X02496) и E (X75657) для генотипов А, В, С, D и E соответственно. Положения, в которых по меньшей мере три или более мутаций присутствовали у всех пациентов, были использованы для дальнейшего исследования. Всего было проанализировано 503 положения с использованием таблиц сопряженности частот (frequency cross tables) и критерия хи-квадрат для пропорций.
Мы использовали консервативную поправку Бонферрони для контроля величины ошибки ложного обнаружения, происходящей в результате множественных сравнений, и поэтому рассматривали ассоциации при значении Р<9,9×10Е-5 (=0,05/503) как статистически значимые.
Был проведен ассоциативный анализ исчезновения HBsAg в течение одного года наблюдения после лечения (неделя 96) у всей исследуемой популяции. В дополнение к этому, ассоциативные анализы были проведены при получении других результатов лечения (HBeAg сероконверсия, SVR и HBsAg уменьшение на неделе 24) у всех пациентов в совокупности и у пациентов, сгруппированных по происхождению или вирусному генотипу отдельно.
Результаты
Было обнаружено, что одна мутация HBV в значительной степени связана с исчезновением HBsAg на неделе 96 после применения поправки Бонферрони для множественных сравнений (фиг. 2). Эта мутация была обнаружена у 4 из 9 пациентов, у которых было достигнуто исчезновение HBsAg на неделе 96, и не была обнаружена ни у одного пациента без исчезновения HBsAg. Фиг. 2 показывает также другие мутации HBV, ассоциированные с результатом лечения гепатита В, которые являются подходящими для увеличения прогностического значения. Например, анализ наличия или T784G или G1888W мутации в сочетании намного улучшал связь (фиг. 2).
Обсуждение
Нуклеотид в положении 784 располагается на S и Открытой рамке считывания (ORF) гена полимеразы. В S ORF мутация в этом положении вызывает замену аминокислоты серина (S) на аргинин (R) (фиг. 2). Следовательно, эта мутация в вирусном геноме является маркером ответа на лечение.
Пример 3
В примере 1 мы установили сильную связь между минорным аллелем (G) однонуклеотидного полиморфизма (SNP) и исчезновением HBsAg в первый год наблюдения без лечения у этих пациентов. Этот SNP, rs12356193, располагается на хромосоме 10 в интронном участке SLC16A9 гена. Интересно, что наличие этого SNP, как было описано, является строго связанным с уровнями L-карнитина в других GWA-исследованиях (Kolz et al. 2009). Однако, не сообщалось об исследовании эффекта уровней L-карнитина на исчезновение HBsAg у пациентов с хроническим гепатитом В, которых лечили пегинтерфероном и/или адефовиром.
Поэтому мы хотели определить уровни L-карнитина у пациентов СНВ, которых лечили пегинтерфероном и адефовиром, и найти связи между rs12356193 генотипом и исчезновением HBsAg.
Пациенты
Был отобран 21 пациент для измерения DL-карнитина (С0), ацетил-L-карнитина (С2) и пропионил-L-карнитина (С3) (см. раздел методы).
Основные характеристики пациентов, включенных в это исследование, показаны в таблице 1. В общем, 2 пациента имели GG генотип с SNP rs12356193, 10 пациентов с генотипом AG и 9 пациентов с генотипом АА. Существенных различий в исходных характеристиках между пациентами с генотипом AG или GG и пациентами с генотипом АА не наблюдалось.
Методы
Уровни L-карнитина и производного карнитина в исходных образцах плазмы были измерены в отделении Генетических метаболических нарушений (GMZ) при АМС с помощью тандемной масс-спектрометрии согласно стандартному протоколу.
Исчезновение HBsAg в этой выборке пациентов было определено как необнаружимые уровни HBsAg при использовании Abbott AxSYM (HBsAg<0,05 IU/мл). Уровни L-карнитина и производного карнитина показаны в микромолях на мл при этом различия между средними были проверены с помощью критерия Стьюдента для одной выборки. Значения Р ниже 0,05 считались статистически значимыми.
Результаты
Средние уровни DL-карнитина (С0), ацетил-L-карнитина (С2) и пропионил-L-карнитина (С3) для разных rs12356193 генотипов показаны на фиг. 12 и в таблице 2. У пациентов с rs12356193 генотипом AG или GG наблюдались значимо более низкие уровни С0, С2 и С3, чем у пациентов с генотипом АА.
Средние уровни DL-карнитина (С0), ацетил-L-карнитина (С2) и пропионил-L-карнитина (С3) у пациентов с исчезновением HBsAg в течение двух лет наблюдения после лечения и у пациентов с персистенцией HBsAg в течение двух лет наблюдения после лечения показаны на фиг. 13 и в таблице 2. У пациентов с исчезновением HBsAg наблюдались значимо более низкие уровни С0, С2 и С3, чем у пациентов с персистенцией HBsAg.
Заключение
В исследовании GWAS, когда 84 СНВ пациента получали лечение пегинтерфероном и адефовиром, мы установили строгую связь между минорным аллелем (G) SNP (rs12356193) и исчезновением HBsAg. Мы подтвердили, что уровни DL-карнитина (С0), ацетил-L-карнитина (С2) и пропионил-L-карнитина (С3) были в значительной степени связаны с разными rs12356193 генотипами. Кроме того, мы показали, что у пациентов с исчезновением HBsAg наблюдались значимо более низкие уровни С0, С2 и С3, чем у пациентов с персистенцией HBsAg.
Пример 4
В примере 3, мы подтвердили, что уровни DL-карнитина (С0), ацетил-L-карнитина (C2) и пропионил-L-карнитина (C3) были в значительной степени связаны с разными rs12356193 генотипами и что у пациентов с исчезновением HBsAg наблюдались значимо более низкие уровни С0, С2 и С3, чем у пациентов с персистенцией HBsAg.
В этом примере, мы расширили исследуемую популяцию до 84 пациентов и кроме того, оценили уровни DL-карнитина (С0), ацетил-L-карнитина (С2) и пропионил-L-карнитина (С3) в плазме как предсказывающих факторов исчезновения HBsAg и связи уровней С0, С2 и С3 с исчезновением HBsAg в субпополяции мужчин неазиатского происхождения..
Методы (измерение карнитин с помощью MS-MS)
Для оценки концентрации карнитина и производных карнитина в плазме использовали тройной квадрупольный масс-спектрометр Quattro II (Micromass, Manchester, UK) в режиме отрицательной ионизации электрораспылением (ESI) и систему сбора и обработки данных micromass MassLynx с использованием вводимого объема 50 микролитров в лаборатории Genetic Metabolic Disorders (АМС, Амстердам, Нидерланды), следуя описанному ранее методу (Chase et al. 1997).
Пациенты
Исходные характеристики пациента показаны в таблице 3.
Результаты
1. Связь уровней DL-карнитина (С0) в плазме с SNP rs12356193 и исчезновением HBsAg
-26
SNP rs12356193 располагается на хромосоме 10 в интронной области SLC16A9 гена. Сообщалось, что этот SNP строго связан с уровнями DL-карнитина (С0) в плазме в других GWAS исследованиях (Kolz et al. 2009) (β-3,58, р=4,0×10). Эта связь была подтверждена в нашей полной исследуемой когорте (n=84), так как средние уровни DL-карнитина (С0) в плазме значительно различались у пациентов с GG, AG и АА генотипом (26,3 vs 33,7 vs 37,7 мкмоль/л соответственно, р=0,02, фиг. 14а и таблица 3). Уровни DL-карнитина (С0) в плазме также были более низкими у пациентов с исчезновением HBsAg на неделе 96, чем у пациентов с персистенцией HBsAg (31,1 vs 37,3 мкмоль/л, р=0,02, фиг. 14b). Предоставляются данные о результатах лечения всех пациентов, участвующих в нашем исследовании вплоть до 2 лет после завершения лечения (неделя 144). Уровни DL-карнитина (С0) в плазме были также более низкими у пациентов с исчезновением HBsAg на неделе 144, чем у пациентов с персистенцией (32,2 vs 37,4 мкмоль/л, р=0,02, фиг. 14 с).
2. Уровни DL-карнитина (С0) в плазме как прогностический фактор исчезновения HBsAg на неделе 96
Дискриминацию переменных, определенную как способность различать пациентов, которые достигли исчезновения HBsAg на неделе 96, от пациентов, которые не достигли исчезновения, оценивали с помощью площади (AUC) под Roc-кривой.
Фиг. 15 показывает AUC для прогнозирования исчезновения HBsAg на неделе 96, которая составляла 0,75 (95% CI, 0,54-0,96; р=0,01). При использовании исходных уровней DL-карнитина (С0)≤33.31 мкмоль/л в качестве предельных значений, положительная прогностическая значимость (PPV) составляла 24% и отрицательная прогностическая значимость (NPV) составляла 96%, при этом чувствительность составляла 78% и специфичность 71%.
3. Субанализ уровней DL-карнитина (С0) в плазме у мужчин неазиатского происхождения
Известно, что различные факторы влияют на уровень DL-Карнитина (С0) в плазме, например, пищевой рацион, пол, возраст и заболевание (Cederblad et al. 1976; Cederblad et al 1987; Flanagan 2010). В нашей когорте уровень DL-карнитина (С0) значительно варьировал у пациентов различного пола и этнической принадлежности (фиг. 16).
Поскольку происхождение и пол, по-видимому, являются вмешивающимися факторами для уровней DL-карнитина (С0) в нашем исследовании, в дополнение к обнаружению очень низкого распространения благоприятного SNP у уроженцев Азии, мы решили дополнительно оценить связь уровней DL-карнитина (С0) и исчезновения HBsAg в субпопуляции мужчин неазиатского происхождения (n=44).
4. Связь уровней DL-карнитина (С0) в плазме с SNP rs12356193 и исчезновением HBsAg у мужчин неазиатского происхождения
В целом, средний исходный уровень DL-карнитина (С0) у пациентов мужского пола неазиатского происхождения составлял 36,5 мкмоль/л (SD 7,0). У мужчин неазиатского происхождения средние уровни DL-карнитина (С0) в плазме достоверно различались у пациентов с GG, AG и АА генотипом (26,3 vs 33,7 vs 38,5 мкмоль/л, соответственно, р=0,01, фиг. 17а).
В дополнение к этому, уровни DL-карнитина (С0) в плазме были более низкими у мужчин неазиатского происхождения с исчезновением HBsAg на неделе 96, чем с персистенцией HBsAg (28,4 vs 38,3 мкмоль/л, соответственно, р<0,001, фиг. 17b). Следует отметить, что все пациенты неазиатского происхождения с исчезновением HBsAg были мужского пола (n=8), вследствие чего субанализ связи уровней DL-карнитина (СО) и исчезновения HBsAg у женщин неазиатского происхождения был невозможен.
5. Уровни DL-карнитина (С0) в плазме как прогностический фактор исчезновения HBsAg на неделе 96 у мужчин неазиатского происхождения
Фиг. 18 показывает AUC для прогнозирования исчезновения HBsAg, которое составляло 0,75 (95% CI, 0,54-0,96; р=0,01). При использовании исходных уровней DL-карнитина (С0)≤33,31 мкмоль/л в качестве предельных значений, положительная прогностическая значимость (PPV) составляла 50% и отрицательная прогностическая значимость (NPV) составляла 97%, при этом чувствительность составляла 88% и специфичность 81%.
6. Связь уровней ацетил-L-карнитина (С2) и пропионил-L-карнитина (С3) в плазме с SNP rs12356193 и отсутствием HBsAg
Ацетил-L-карнитин (С2) и пропионил-L-карнитин (С3) представляют собой два сложных эфира DL-карнитина (С0) и также измеряются методом тандемной масс-спектроскопии. Для этих двух сложных эфиров были обнаружены подобные связи с SNP rs12345193 и исчезновением HBsAg, как у DL-карнитина (С0).
Средние уровни ацетил-L-карнитина в плазме достоверно различались у пациентов с генотипом GG, AG и АА (2,49 vs 3,51 vs 4,10 мкмоль/л, соответственно, р=0,03, фиг. 19а), однако, эта связь не была значимой в отношении уровня пропионил-L-карнитина (0,30 vs 0,42 vs 0,44 мкмоль/л соответственно, р=0,50, фиг. 19b).
Уровни в плазме ацетил-L-карнитина также были более низкими у пациентов с исчезновением HBsAg на неделе 96, чем у пациентов с персистенцией HBsAg (2,95 vs 4,08 мкмоль/л, р=0,004, фиг. 20а и таблица 3). Такая же связь была обнаружена для уровня пропионил-L-карнитина в плазме (0,30 vs 0,45 мкмоль/л, р=0,02, фиг. 21а и таблица 3). У пациентов с исчезновением HBsAg на неделе 144 также наблюдались значимо более низкие уровни и ацетил-L-карнитина (С2) (3,22 vs 4,09 мкмоль/л, р=0,009, фиг. 20b), и пропионил-L-карнитина (С3) (0,32 vs 0,46 мкмоль/л, р=0,009, фиг. 2lb).
7. Уровни ацетил-L-карнитина (С2) и пропионил-L-карнитина (С3) в плазме как s прогностический фактор исчезновения HBsAg на неделе 96
Фиг. 22а показывает AUC для предсказания исчезновения HBsAg на неделе 96 при использовании ацетил-L-карнитина (С2), которое составляло 0,80 (95% CI, 0,65-0,94; р=0,003). При использовании исходных уровней ацетил-L-карнитина (С2)≤3,89 мкмоль/л в качестве предельных значений, положительная прогностическая значимость (PPV) составляла 19% и отрицательная прогностическая значимость (NPV) составляла 98%, при этом чувствительность составляла 89% и специфичность 53%.
Фиг. 22b показывает AUC для предсказания исчезновения HBsAg на неделе 96 при использовании пропионил-L-карнитина (С3), которое составляло 0,78 (95% CI, 0,64-0,92; р=0,006). При использовании исходных уровней пропионил-L-карнитина (С3)≤0.43 мкмоль/л в качестве предельных значений, положительная прогностическая значимость (PPV) составляла 18% и отрицательная прогностическая значимость (NPV) составляла 100%, при этом чувствительность составляла 100% и специфичность 47%.
8. Суб-анализ уровней ацетил-L-карнитина (С2) и пропионил-L-карнитина (С3) в плазме у мужчин неазиатского происхождения
Суб-анализ мужчин неазиатского происхождения не повлиял на значение нашего открытия в отношении ацетил-L-карнитина (С2) и пропионил-L-карнитина (С3), как показано на фиг. 23 и 24.
Список литературы
Altschul 1990, J Mol Biol 215, 403.
Aulchenko YS, Ripke S, Isaacs A, van Duijn CM. GenABEL: an R library for genome-wide association analysis. Bioinformatics (2007) 23 (10): 1294-1296.
Cederblad G. Plasma DL-carnitine (C0) и body composition. Clin Chim Acta. 1976 Mar 1; 67(2): 207-12.
Cederblad G. Effect of diet on plasma DL-carnitine (C0) levels и urinary DL-carnitine (C0) excretion in humans. Am J Clin Nutr. 1987 Apr; 45(4): 725-9.
Chace DH et al. Rapid diagnosis of MCAD deficiency: quantitative analysis of octanoylcarnitine и other acylcarnitines in newborn blood spots by tandem mass spectrometry. ClinChem. 1997 Nov; 43(11): 2106-13.
Dienstag J.L. N Engl J Med 2008, 359; 1486-1500.
Dowdy и Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983.
Flanagan JL et al. Role of DL-Carnitine (C0) in disease. Nutr Metab (Lond). 2010 Apr 16; 7:30. doi: 10.1186/1743-7075-7-30.
Galibert F et al. Nature. 1979 Oct 25; 281(5733): 646-50).
Hall, T.A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor и analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41:95-98.
Kolz M et al. Meta-analysis of 28,141 individuals identifies common variants within five new loci that influence uric acid concentrations. PLoS Genet. 2009 Jun; 5(6):el000504.
Needleman 1970, J Mol Biol 48; 443; Smith 1981, Adv Appl Math 2,482.
Takkenberg, R.B.. Thesis University of Amsterdam (2011) The Netherlands. Chapter 2, ISBN 9789090263045.
Wiley, John & Sons, Current Protocols in Molecular Biology N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.