КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ МОДИФИКАЦИИ ЗАДАННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ-МИШЕНИ

1. Нуклеопротеиновая композиция для модификации заданного сайта-мишени в последовательности нуклеиновой кислоты-мишени в клетке-мишени, содержащая:
(а) молекулу полинуклеотида, кодирующую химерный полипептид, при этом указанный полипептид содержит:
(i) функциональный домен, способный к модифицированию указанного сайта-мишени, при этом функциональный домен лишен сайта специфического связывания нуклеиновой кислоты; и
(ii) связующий домен, способный к взаимодействию с придающей специфичность нуклеиновой кислотой, при этом связующий домен лишен сайта специфического связывания нуклеиновой кислоты-мишени; и
(b) придающую специфичность нуклеиновую кислоту (SCNA), содержащую:
(i) нуклеотидную последовательность, комплементарную участку нуклеиновой кислоты-мишени, фланкирующему сайт-мишень; и
(ii) участок распознавания, способный к специфическому присоединению к связующему домену полипептида;
в соответствии с чем в результате сборки полипептида и SCNA внутри клетки-мишени образуется функциональный нуклеопротеиновый комплекс, способный к специфической модификации указанной нуклеиновой кислоты-мишени в сайте-мишени.
2. Композиция по п. 1, в которой указанный функциональный домен содержит каталитический домен.
3. Композиция по п. 1, в которой указанную модификацию нуклеиновой кислоты-мишени выбирают из мутации, делеции,
вставки, замены, связывания, расщепления, создания двухцепочечного разрыва, одноцепочечного разрыва, метилирования, ацетилирования, лигирования, рекомбинации, раскручивания спирали, химической модификации, мечения, активации и инактивации.
4. Композиция по п. 1, в которой указанный химерный полипептид, кроме того, содержит домен субклеточной локализации.
5. Композиция по п. 1, в которой SCNA включает нуклеиновую кислоту, выбираемую из группы, состоящей из одноцепочечной ДНК, одноцепочечной РНК, двухцепочечной РНК, модифицированной ДНК, модифицированной РНК, закрытой нуклеиновой кислоты (LNA) и пептидо-нуклеиновой кислоты (PNA), или их комбинации.
6. Композиция по п. 1, в которой указанной нуклеиновой кислотой-мишенью является ДНК.
7. Композиция по п. 1, в которой участок распознавания в SCNA содержит химическую модификацию, выбираемую из группы, состоящей из 5'-концевой модификации, 3'-концевой модификации и внутренней модификации.
8. Композиция по п. 7, в которой указанную химическую модификацию выбирают из группы, состоящей из модификации нуклеотида и добавления ненуклеотидного компонента.
9. Композиция по п. 8, в которой ненуклеотидный компонент выбирают из биотина, флуоресцеина, аминолинкеров, олигопептидов, аминоаллила, молекулы красителя, флуорофоров, дигоксигенина, акридита, аденилирования, азида, NHS-эфира, холестерил-TEG, алкинов, фоторазрушаемого биотина, тиола, дитиола.
10. Композиция по п. 8, в которой модификацию нуклеотида
выбирают из группы, состоящей из фосфата, 2-аминопурина, Тримера-20, 2,6-диаминопурина, 5-бромдезоксиуридина, дезоксиуридина, инвертированного dT, дидезоксинуклеотидов, 5-метилдезоксицитидина, дезоксиинозина, 5-нитроиндола, 2-О-метил-РНК-оснований, изо-dC, изо-dG, фтор-модифицированных оснований и фосфоротиоатных связей.
11. Композиция по п. 1, в которой присоединение указанной модификации к указанному связующему домену является таковым пары партнеров по связыванию, выбираемой из белок-белок, VirD2 Agrobacterium - связывающийся с VirD2 белок; антитело-антиген; одноцепочечное антитело-антиген; одноцепочечный Fv-фрагмент антитела против флуоресцеина (анти-FAM ScFv) - флуоресцеин; одноцепочечный Fv-фрагмент иммуноглобулина (scFv) против DIG (анти-DIG-ScFv) - дигоксигенин (DIG) и IgG-белок A.
12. Композиция по п. 1, в которой указанный участок распознавания в SCNA содержит нуклеотидный мотив, способный к специфического присоединению связующего домена химерного белка.
13. Композиция по п. 12, в которой присоединение нуклеотидного мотива к связующему домену выбирают из взаимодействия спираль-петля-спираль с доменом E-боксом; взаимодействия одноцепочечной ДНК с VirE2; StickyC с дцДНК; белка оболочки вируса с нуклеиновой кислотой; взаимодействия основного связывающего домен Tat бычьего вируса иммунодефицита (BIV) с петлевым участком 1 последовательности трансдействующего отвечающего элемента (TAR) BIV; взаимодействия N-белка фага λ, ϕ21 со "шпильками" петли бокса-B в сайте N-использования (nut); и взаимодействия белка rev ВИЧ с "Ножкой" IIB отвечающего на rev элемента (RRE) ВИЧ.
14. Композиция по п. 12, в которой связующий домен содержит полипептид, выбираемый из группы, состоящей из белка VirD2 Agrobacterium, VPg пикорнавирусов, топоизомеразы, белка А фага ϕX174, белка A* ϕX и любых их вариантов.
15. Способ модифицирования заданного сайта-мишени в последовательности нуклеиновой кислоты-мишени с помощью программируемого нуклеопротеинового молекулярного комплекса, который включает стадии:
a. доставки последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей программируемый химерный полипептид, в клетку-хозяина, при этом указанный химерный полипептид содержит:
(i) функциональный домен, способный к модифицированию указанного сайта-мишени, при этом функциональный домен лишен сайта специфического связывания нуклеиновой кислоты; и
(ii) связующий домен, способный к взаимодействию с придающей специфичность нуклеиновой кислотой, при этом связующий домен лишен сайта специфического связывания нуклеиновой кислоты-мишени;
b. доставки молекулы придающей специфичность нуклеиновой кислоты (SCNA) или нуклеиновой кислоты, кодирующей SCNA, в указанную клетку-хозяина, при этом указанная молекула SCNA содержит:
(i) нуклеотидную последовательность, комплементарную участку нуклеиновой кислоты-мишени, фланкирующему сайт-мишень; и
(ii) участок распознавания, способный к специфическому присоединению к связующему домену полипептида с высоким
сродством связывания;
причем экспрессия полипептида в клетке, содержащей SCNA, создает возможность для присоединения указанного химерного полипептида к SCNA, образуя активный запрограммированный нуклеопротеиновый комплекс, в силу чего химерный белок нацеливается на заданную последовательность нуклеиновой кислоты-мишень в клетке-хозяине, допускается модификация заданного сайта-мишени последовательности нуклеиновой кислоты-мишени с помощью указанного активного запрограммированного нуклеопротеинового молекулярного комплекса.
16. Способ по п. 15, в котором указанной нуклеиновой кислотой-мишенью является ДНК.
17. Способ по п. 16, в котором указанной ДНК-мишенью является геномная ДНК.
18. Способ по п. 17, в котором указанная геномная ДНК-мишень эукариотического происхождения.
19. Способ по п. 15, в котором указанной последовательностью нуклеиновой кислоты-мишенью является последовательность экстрахромосомной нуклеиновой кислоты, выбираемая из группы, состоящей из таковых митохондрии, хлоропласта, амилопласта и хромопласта.
20. Способ по п. 15, в котором указанную последовательность нуклеиновой кислоты-мишень выбирают из последовательности вирусной нуклеиновой кислоты, последовательности прокариотической нуклеиновой кислоты и синтетической последовательности нуклеиновой кислоты.
21. Способ по п. 15, в котором указанную модификацию выбирают
из группы, состоящей из мутации, делеции, вставки, замены, связывания, расщепления, создания двухцепочечного разрыва, одноцепочечного разрыва, метилирования, ацетилирования, лигирования, рекомбинации, раскручивания спирали, химической модификации, мечения, активации и инактивации.
22. Способ по п. 15, в котором химерный белок содержит белковый компонент с функциональным модификатором нуклеиновой кислоты, причем функциональную модификацию выбирают из группы, состоящей из активации транскрипции, инактивации транскрипции, сайленсинга РНК-транскрипта, альтернативного сплайсинга РНК, реконфигурации структуры хроматина, инактивации внутриклеточного паразита и вируса и изменения клеточной локализации или компартментализации указанной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени.
23. Способ по п. 15, в котором указанная SCNA включает молекулу нуклеиновой кислоты, выбираемую из группы, состоящей из одноцепочечной ДНК, одноцепочечной РНК, двухцепочечной РНК, модифицированной ДНК, модифицированной РНК, закрытой нуклеиновой кислоты (LNA) и пептидо-нуклеиновой кислоты (PNA), или их комбинаций.
24. Способ по п. 15, в котором взаимодействие между SCNA и нуклеиновой кислотой-мишенью осуществляется через спаривание оснований, выбираемое из группы, состоящей из спаривания оснований с образованием полной двойной спирали, спаривания оснований с образованием частичной двойной спирали, спаривания оснований с образованием полной тройной спирали, спаривания оснований с образованием частичной тройной спирали и D-петель
или разветвленных форм, образуемых в результате указанного спаривания.
25. Способ по п. 15, в котором участок распознавания в SCNA включает модификацию, выбираемую из группы, состоящей из 5'-концевой модификации, 3'-концевой модификации и внутренней модификации.
26. Способ по п. 25, в котором указанную модификацию выбирают из группы, состоящей из модификации нуклеотида, биотина, флуоресцеина, аминолинкеров, олигопептидов, аминоаллила, молекулы красителя, флуорофоров, дигоксигенина, акридита, аденилирования, азида, NHS-эфира, холестерил-TEG, алкинов, фоторазрушаемого биотина, тиола, дитиола, модифицированных оснований, фосфата, 2-аминопурина, Тримера-20, 2,6-диаминопурина, 5-бромдезоксиуридина, дезоксиуридина, инвертированного dT, дидезоксинуклеотидов, 5-метилдезоксицитидина, дезоксиинозина, 5-нитроиндола, 2-О-метил-РНК-оснований, изо-dC, изо-dG, фтор-модифицированных оснований и фосфоротиоатных связей.
27. Способ по п. 25, в котором ассоциацией между модификацией и указанным связующим доменом является взаимодействие пары партнеров по связыванию, выбираемой из белок-белок, VirD2 Agrobacterium - связывающийся с VirD2 белок; антитело-антиген; одноцепочечное антитело-антиген; одноцепочечный Fv-фрагмент антитела против флуоресцеина (анти-FAM ScFv) - флуоресцеин; одноцепочечный Fv-фрагмент иммуноглобулина (scFv) против DIG (анти-DIG-ScFv) - дигоксигенин (DIG) и IgG-белок A.
28. Способ по п. 15, в котором участок распознавания в SCNA
содержит нуклеотидный мотив, способный к взаимодействию со связующим доменом химерного белка.
29. Способ по п. 28, в котором взаимодействие между нуклеотидным мотивом и связующим доменом выбирают из взаимодействия спираль-петля-спираль с доменом E-боксом; взаимодействия одноцепочечной ДНК с VirE2; StickyC с дцДНК; белка оболочки вируса с нуклеиновой кислотой; взаимодействия основного связывающего домена Tat бычьего вируса иммунодефицита (BIV) с петлевым участком 1 последовательности трансдействующего отвечающего элемента (TAR) BIV; взаимодействия N-белка фага λ, ϕ21 со "шпильками" петли бокса-B в сайте N-использования (nut); взаимодействия белка rev ВИЧ с "Ножкой" IIB отвечающего на rev элемента (RRE) ВИЧ и взаимодействия VirD2 Agrobacterium с последовательностью правого края.
30. Способ по п. 28, в котором связующий домен содержит полипептид, выбираемый из группы, состоящей из белка VirD2 Agrobacterium, VPg пикорнавирусов, топоизомеразы, белка А фага ϕX174, белка A* ϕX и их вариантов.
31. Нуклеопротеиновый комплекс, созданный с помощью способа по п. 15, где в результате физической связи между связующим доменом белкового компонента и участком распознавания в относящемся к придающей специфичность нуклеиновой кислоте компоненте образуется запрограммированный функциональный комплекс в клетке-мишени.
32. Нуклеопротеиновый комплекс по п. 31, где физической связью между связующим доменом белкового компонента и
относящимся к придающей специфичность нуклеиновой кислоте компонентом является аффинное взаимодействие, выбираемое из группы, состоящей из взаимодействия лиганд-рецептор, лиганд-субстрат, водородных связей, сил Ван-дер-Ваальса, ионных связей и гидрофобного взаимодействия.
33. Клетка-хозяин с заданной генетической модификацией в заданном сайте-мишени, созданной с помощью способа по п. 15.
34. Клетка-хозяин по п. 33, которую выбирают из группы, состоящей из клетки позвоночного животного, клетки млекопитающего, клетки человека, клетки животного, клетки растения, клетки беспозвоночного, клетки круглого червя, клетки насекомого и стволовой клетки.
35. Трансгенный организм или нокаутный организм, с заданной генетической модификацией, созданной с помощью способа по п. 15.
36. Способ лечения генетического заболевания организма, включающий экспрессию в клетке организма нуклеопротеинового программируемого молекулярного комплекса по п. 1.
37. Клетка-хозяин, содержащая:
a) полипептид, содержащий:
(i) функциональный домен, способный к модифицированию сайта-мишени в последовательности нуклеиновой кислоты-мишени в клетке, при этом функциональный домен лишен сайта специфического связывания нуклеиновой кислоты; и
(ii) связующий домен, который способен к взаимодействию с придающей специфичность нуклеиновой кислотой и лишен сайта специфического связывания нуклеиновой кислоты-мишени; и
b) придающую специфичность нуклеиновую кислоту (SCNA),
содержащую:
(i) нуклеотидную последовательность, комплементарную участку нуклеиновой кислоты-мишени, фланкирующему сайт-мишень; и
(ii) участок распознавания, способный к специфическому присоединению к связующему домену полипептида;
в соответствии с чем в результате сборки полипептида и SCNA в клетке-хозяине образуется функциональный нуклеопротеиновый комплекс, способный к специфическому модифицированию нуклеиновой кислоты-мишени в сайте-мишени.
38. Клетка-хозяин по п. 37, которую выбирают из группы, состоящей из клетки позвоночного животного, клетки млекопитающего, клетки человека, клетки животного, клетки растения, клетки беспозвоночного, клетки круглого червя, клетки насекомого и стволовой клетки.