Влияние блокаторов медленных кальциевых каналов верапамила и дилтеазема на интенсивность процессов пролиферации и апоптоза фибробластов в условиях гиперплазии соединительной ткани при спайкообразовании

3. Zhivotova E.Yu., Lebedko O.A., Fleishman M.Yu., et. al. Regulatory peptides participation in regulation of gastric mucous tissue homeostasis // Far Eastern Medical Journal. - 2013. - № 1. - P. 101-105.

4. Zhivotova E.Yu., Maslennikova N.V, Fleishman M. Yu., et. al. NOS-NO system as a universal link providing gastroprotective effects of opioid peptides // Far Eastern Medical Journal. - 2011. - № 4. - P. 83-86.

5. Merchiyeva S.A. The effect of short glyprolines with N- or C- end attached aminoacid residues of argi-nine or leucine on the resistance of gastric mucosa to the effect of stress // Proceedings of the «Lomonosov-2010» International Youth Forum / managing editors: Alesh-kovsky I.A., Kostylev P.N., Andreyev A.I., Andriya-nov A.V [URL] - M.: MAX Press, 2010. - P. 279280. - Access mode: http://lomonosov-msu.ru/archive/ Lomonosov_2010/02.pdf.

6. Samonina G.E., Kopylova G.N., Umarova B.A., et al. Some mechanisms of antiulcerative effects of glypro-lines // Problems of Biological, Medical and Pharmaceutical Chemistry. - 2011. - Vol. 9, № 4. - P. 58-64.

7. Sangadzhieva A.D., Bakayeva Z.V, Samonina G.E., et al. The change of cytokine profile of rats in protective antiulcerative effects of glyprolines. Impact of glyprolines (PGP u N-Acetyl-PGP) on cytokines gene expression in ethanol-induced erosion of the stomach // Moscow University Biological Sciences Bulletin. - Series 16. - 2013. -№ 2. - P. 7-11.

8. Trukhan D.I. The choice of a non-steroidal antiinflammatory drug from the perspective of prevention

NSAID-gastropathy and drug safety // Consilium Medi-cum. - 2014. - Vol. 16, № 8. - P. 34-39.

9. Falaleyeva T.M., Samonina G.E., Beregovaya T.V, et al. The effect of PGP, GP, PG glyprolines on homeosta-sis of gastric mucosa in rats with ethanol-induced gastric ulcers // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. -2010. - Vol. 149, № 6. - P. 637-639.

10. Fleishman M.Yu., Tolstenok I.V, Lebedko O.A., et al. Effects of glyprolines on DNA synthesis and free radical oxidation in mouse gastric mucosa under physiological conditions and during therapy with non-steroidal anti-inflammatory drugs // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2015. - Vol. 159, № 4. - P. 500-503.

11. Khotimchenko M.Yu., Razina T.G., Shilova N.V., et al. Prophylactic effect of calcium alginate in case of indomethacin-induced injuries of rats' stomach mucous membrane // Pacific Medical Journal - 2007. - № 4. -P. 42-44.

12. Laine L., Kivitz A.J., Bello A.E. Double-blind randomized trials of single-tablet ibuprofen/high-dose fa-motidine vs. ibuprofen alone for reduction of gastric and duodenal ulcers // American Journal of Gastroenterol-ogy. - 2012. - Vol. 107, № 3. - P. 379-386.

13. Svintsitskyi A. NSAID-gastropathy: current state of the problem // Crimean therapeutic journal. - 2010. -Vol. 2, № 2 (15). - P. 280-286.

14. Thomas D.D., Ridnour L.A., Isenberg J.S., et al. The chemical biology of nitric oxide: implications in cellular signaling // Free Radical Biology and Medicine. -2008. - Vol. 45, № 1. - P. 18-31.

Координаты для связи с авторами: Толстенок Иван Владимирович - соискатель ЦНИЛ ДВГМУ, тел. 8-(4212)-32-99-64, e-mail: toiv@bk.ru; Брагина Валентина Владимировна - научный сотрудник ЦНИЛ ДВГМУ, тел. 8-(4212)-32-99-64, e-mail: valent.bragina@ya.ru; Флейшман Марина Юрьевна - д-р мед. наук,

доцент, зав. ЦНИЛ ДВГМУ, тел. 8-(4212)-32-99-64, e-mail: marfl@yandex.ru.

УДК 615.22:616-007.274-085:611.018.2 С.В. Скальский, Т.Ф. Соколова

ВЛИЯНИЕ БЛОКАТОРОВ МЕДЛЕННЫХ КАЛЬЦИЕВЫХ КАНАЛОВ ВЕРАПАМИЛА И ДИЛТЕАЗЕМА НА ИНТЕНСИВНОСТЬ ПРОЦЕССОВ ПРОЛИФЕРАЦИИ И АПОПТОЗА ФИБРОБЛАСТОВ В УСЛОВИЯХ ГИПЕРПЛАЗИИ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ ПРИ СПАЙКООБРАЗОВАНИИ

Омский государственный медицинский университет, 644099, ул. Ленина, 12, e-mail: pharm@omsk-osma.ru, г. Омск

Резюме

Изучено влияние блокаторов медленных кальциевых каналов верапамила и дилтиазема на интенсивность процессов пролиферации и апоптоза фибробластов в условиях гиперплазии соединительной ткани при спайкообразо-вании. Исследования проведены в первичной культуре перитонеальных фибробластов крыс с гемоперитонеумом. Установлено, что при индукции спаечного процесса в брюшной полости крыс происходит усиление процессов пролиферации фибробластов, сопровождающееся активацией фактора транскрипции NF-kB, приводящей к блоки-

рованию процессов апоптоза. Интенсификация процессов пролиферации и ингибиции апоптоза реализовалась 5,3-кратным увеличением митотической активности фибробластов, 8-кратным увеличением уровня ядерной формы ОТ-кВ. БМКК верапамил (0,0001 мл-1) и дилтиазем (0,0001 мл-1) оказывали выраженный фармакологический эффект в отношении избыточной активности перитонеальных фибробластов, снижая уровень пролиферации клеток и активность ядерного фактора транскрипции ОТ-кВ. Наиболее выраженным (в среднем в 2 раза) модулирующим эффектом обладал верапамил.

Ключевые слова: спайкообразование, верапамил, дилтиазем, пролиферация, ядерный фактор транскрипции ОТ-кВ.

S.V. Skalsky, T.F. Sokolova

EFFECT OF VERAPAMIL AND DILTIAZEMUM CALCIUM CHANNEL BLOCKING AGENTS ON PROLIFERATION INTENSITY AND APOPTOSIS OF FIBROBLASTS IN HYPERPLASIA OF CONNECTIVE

TISSUES IN ADHESIONS

Omsk State Medical University, Omsk Summary

The authors studied the effect of verapamil and diltiazemum calcium channel blockers on proliferation intensity and apoptosis of fibroblasts in hyperplasia of connective tissues in adhesions. The studies were conducted in the primary cultures of peritoneal fibroblasts from rats with hemoperitoneum. It was detected that in adhesion process, induction in the abdominal cavity of rats proliferation of fibroblasts was reinforced, accompanied by transcription factor NF-kB activation leading to apoptosis blocking.

Proliferation intensity and apoptosis inhibition were carried out by 5,3-fold increase of fibroblast mitotic activity, and 8-fold increase of nuclear factor NF-kB. Verapamil CCBA (0.0001 ml-1) and diltiazemum (0.0001 ml-1) provided a pronounced pharmacological effect on extra activity of peritoneal fibroblasts, reducing a level of cell proliferation and activity of nuclear transcription factor NF-kB. Verapamil demonstrated the most pronounced (on an average in 2 times) modulating effect.

Key words: adhesions, verapamil, diltiazemum, proliferation, nuclear transcription factor NF-kB.

Одной из основных проблем современной хирургии и гинекологии остается спаечная болезнь [1, 2]. Несмотря на современные достижения в настоящее время не существует надежных средств ее предотвращения [3, 4]. В последнее время особое внимание уделяется влиянию антагонистов кальция на процессы фиброгенеза при избыточном росте соединительной ткани. Значимыми являются данные литературы о положительном эффекте блокаторов медленных кальциевых каналов (БМКК) в качестве средства для профилактики и лечения спайкообразования. Известно, что применение БМКК в эксперименте уменьшает обра-

Материалы

Основу работы составили результаты исследований, выполненных в первичной культуре перитонеальных фибробластов крыс, которым для индукции фибропла-стических процессов в брюшной полости моделировался гемоперитонеум путем введения аутокрови [5]. Эксперименты выполнены на 54 лабораторных белых крысах-самцах массой 200-240 граммов. Животные содержались в обычных условиях вивария, регламентируемых приказом МЗ СССР № 1179 от 10.10.1983 г. Опыты проводили в соответствии с приказами МЗ СССР № 755 от 12.08.77 и № 701 от 27.07.78 об обеспечении принципов гуманного обращения с экспериментальными животными. На 10 сутки гемоперитонеума, при развитии спаечного процесса в брюшной полости, сразу после эвтаназии животного, брюшную полость промывали 10 мл среды RPMI-1640 с антибиотиками и 10 % раствором гепарина через прокол в каудальной трети белой линии живота. Клетки из перитонеальных смывов трижды отмывали ростовой средой: RPMI-1640 («Sigma») с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки, 2 % глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 ЕД/мл стрептомицина и доводили концентрацию до 2х106/мл. Суспензию клеток делили на одинаковые

зование послеоперационных спаек путем ингибирова-ния пролиферации фибробластов [8, 13, 14]. Доказано действие БМКК на ядерный фактор транскрипции NF-kB, блокирующий апоптоз [7, 10, 11, 12]. Однако, данные о влияние различных препаратов БМКК на процессы фиброгенеза немногочисленны, противоречивы и требуют дальнейших исследований [6, 7, 11].

Целью настоящей работы явилось изучение влияния БМКК верапамила и дилтеазема на интенсивность процессов пролиферации и апоптоза фибробластов в условиях гиперплазии соединительной ткани при спайкообразовании.

и методы

пулы и помещали в чашки Петри диаметром 40 мм половина которых, для подсчета пролиферативной активности фибробластов, была со стеклами, покрытыми синтетическим аналогом внеклеточного матрикса поли-D-лизином. В 1-й группе опытов активированные in vivo фибробласты крыс с гемоперитонеумом культивировались в ростовой среде без добавления лекарственных средств. Во 2-й группе к суспензии активированных клеток добавляли 0,1 мг/мл верапамила производства ОАО «Биосинтез», г Пенза, Россия. В 3-й группе активированные клетки культивировали с дилтиаземом (0,1 мг/мл). Контролем служил пул неактивированных клеток, полученный от интактных крыс. Клетки инкубировали 24 часа (37 °С, 5 % СО2). Покровные стекла окрашивали по Романовскому-Гимза. Микроскопию мазков проводили с помощью бинокулярного светового микроскопа «Zeiss,» (Германия) при иммерсионном увеличении х1000. Пролиферативную активность фибробластов оценивали по количеству клеток с морфологическими признаками митозов. Оценку мито-тической активности фибробластов проводили путем определения митотического индекса (МИ) по формуле: n/Nx 100 %, где n - число клеток, вступивших в митоз,

N - общее количество клеток. Для приготовления ядерных экстрактов и определения содержания в них NF-kB (р50/р65) клетки собирали и промывали холодным PBS, концентрировали центрифугированием. Полученный осадок ресуспензировали в гипотоническом буфере, инкубировали на льду 15 минут, затем добавляли детергент NP40 и центрифугировали при 4 °С (3 000 об. мин, 10 минут). Осадок суспензировали в 50 мкл экстракционного буфера в присутствии ингибиторов протеиназ (30 мин) и центрифугировали при 4 °С (13 000 об./мин.,

Результаты

Данные, характеризующие средние величины исследованных показателей пролиферативной активности перитонеальных фибробластов крыс с гемоперитонеу-мом и регуляции апоптоза в клеточных культурах, представлены в таблице. Пролиферативная активность пери-тонеальных фибробластов крыс с гемоперитонеумом в 1-й группе активированных фибробластов через 1 сутки культивирования была высокой, митотический индекс превышал аналогичные показатели в группе контроля (не активированные фибробласты) в 5,3 раза. Введение верапамила в культуру клеток (2-я группа) предотвращало чрезмерную активацию фибробластов: митотиче-ская активность клеток снизилась на 58,5 % от уровня митотического индекса в культуре активированных фи-бробластов без добавления лекарственных средств (1-я группа). Внесение дилтиазема в ростовую среду клеток 3-й группы вызывало менее значимое, в сравнении с верапамилом, уменьшение пролиферативного ответа активированных фибробластов. Митотический индекс в 3-й группе с дилтиаземом был ниже значений 1-й группы (без лекарственных средств) на 23,6 %. Сравнительный анализ пролиферативной активности фибро-бластов во 2-й и 3-й группах выявил достоверное различие показателей. Нормализующий эффект дилтиазема был менее выражен: значения митотического индекса фибробластов при действии дилтиазема были почти в 2 раза ниже, чем при действии верапамила.

Таблица

Морфофункциональные показатели перитонеальных фибробластов ^±m)

Показатели Группы

контроль 1-я 2-я 3-я

Митотический индекс (МИ) 2,3±0,2 12,3±0,4# 5,1±0,1* 9,4±0,3*Л

% снижения МИ от уровня 1-й группы 58,5% 23,6%

ОТ-кВ (пг/мл) 84,2±27,6 671,7±21,3# 482,4±26,5* 570,5±21,8*Л

% снижения ОТ-кВ от уровня 1-й группы 28,3% 15,1%

Примечание. # - достоверность различий показателей группы 1 и контроля, * - группы 1 и 2, * - группы 1 и 3, Л - группы 2 и 3, р<0,05.

Согласно представленным в таблице данным по экспрессии транскрипционного фактора NF-kB

30 мин.). Супернатант (ядерная фракция) хранили до измерения при -80 °С. Определение NF- kB проводили методом иммуноферментного анализа, используя наборы реагентов BCM Diagnostics (США). Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Statistica 6,0 с анализом характера распределения полученных данных по критерию Шапиро - Уилка и использованием t-критерия Стьюдента. Различия величин показателей считали достоверными при р<0,05.

и обсуждение

(р50/р65) в первичной культуры перитонеальных фи-бробластов крыс с гемоперитонеумом и фибробластов интактных животных (контроль), а также влиянию классических БМКК верапамила и дилтиазема на его активность, количество ядерного фактора транскрипции NF-kB в образцах лизата ядер клеток контрольных культур не превышало минимальной, определяемой параметрами тест-системы концентрации (150 пг/мл). В ядерных лизатах культур активированных клеток, содержание NF-kB было выше, чем в контроле в 8 раз. Активность NF-kB (р50/р65) в культурах активированных фибробластов (1-я группа) без добавления БМКК в инкубационную среду, а также при добавлении в культуры клеток раствора верапамила (2-я группа) и дилтиазема (3-я группа) была различной. Введение верапамила (2-я группа) предотвращало чрезмерную активацию ядерного фактора транскрипции фибробла-стов: уровень NF-kB в ядерных лизатах культур снизился на 28,3 %. Добавление дилтиазема (3-я группа) в культуру клеток вызывало статистически значимое, но менее выраженное в сравнении с верапамилом, уменьшение активированного NF-kB. Его уровень в 3-й группе был ниже значений 1-ой группы на 15,1 %. Сравнительный анализ уровней активированного NF-kB во 2-й и 3-й группах также выявил достоверное различие показателей.

Таким образом, результаты исследований in vitro позволяют утверждать, что при индукции спаечного процесса в брюшной полости крыс путем моделирования гемоперитонеума наблюдалось усиление процессов пролиферации фибробластов, сопровождающееся активацией фактора транскрипции NF-kB, приводящей к блокированию процессов апоптоза. Интенсификация процессов пролиферации реализовалась 5,3-кратным увеличением митотической активности фибробластов, активация фактора транскрипции NF-kB - 8-кратным увеличением уровня ядерной формы NF-kB. Исследование не описанного ранее фармакологического действия БМКК на клетки соединительной ткани показало, что верапамил (0,0001 мл-1) и дилтиазем (0,0001 мл-1) оказывали нормализирующее влияние на чрезмерную пролиферативную активность фибробластов и ядерного фактора NF-kB при индукции спаечного процесса. Наиболее выраженным (в среднем в 2 раза) модулирующим эффектом обладал верапамил.

Выводы

1. Моделирование гемоперитонеума на этапе об- приводящего к ингибированию процессов апоптоза. разования спаек сопровождается повышением (в 2. Верапамил (0,0001 мл-1) тормозит чрезмерную среднем 6,6-кратное) пролиферации фибробластов и митотическую и антиапоптическую активность пери-активности ядерного фактора транскрипции NF-kB, тонеальных фибробластов.

3. Дилтиазем (0,0001 мл-1) оказывает менее значимый (в среднем в 2 раза), чем верапамил в той же дозе,

нормализующий эффект на функциональные показатели фибробластов.

Литература

1. Бойко В.В., Тарабан И.А., Евтушенко Д.А. и др. Современное состояние вопроса острой спаечной кишечной непроходимости // Харьювскька xiрургiчна школа. - 2014. - № 1 (64) . - С. 87-90.

2. Дронов А.И. , Задорожная К.О., Дронова В.Л., Насташенко М.И. Патогенез, осложнения и контроль перитонеального спаечного процесса в гинекологии и хирургии // Хирургия. Восточная Европа. - 2015. -№ 2 (14). - С. 124-129.

3. Лаврешин П.М., Гобеджишвили В.В., Кела-сов И.Г. Прогнозирование и профилактика развития внутрибрюшных спаек. - Saarbrucken, 2012. - 148 с.

4. Ляхова А.В. Пути профилактики послеоперационного спайкообразования брюшной полости // Вестник экспериментальной и клинической хирургии. -2010. - Т. 3, № 1. - С. 72-81.

5. Скальский С.В., Шамрай Г.А. Способ моделирования внутрибрюшинных спаек // Патент России № 2260854, 2005, Бюл. № 26.

6. Ishii N., et al. Anti-atherosclerotic potential of di-hydropyridine calcium channel blockers // Journal of atherosclerosis and thrombosis. - 2012. - Vol. 19, № 8. -P. 693-704.

7. Kawamura A., et al. Azelnidipine, Not Amlodipine, Induces Secretion of Vascular Endothelial Growth Factor From Smooth Muscle Cells and Promotes Endothelial Tube Formation // Cardiology Research. - 2014. - Vol. 5, № 5. - P. 145-150.

Литература

8. Li Y., Ma X., Yu P., et al. Intra-articular adhesion reduction after knee surgery in rabbits by calcium channel blockers // Med Sci Monit. - 2014. - № 20. -P. 2466-2471.

9. Li Y., et al. BK Channels Regulate Myometrial Contraction by Modulating Nuclear Translocation of NF-kB // Endocrinology. - 2014. - Vol. 155, № 8. -P. 3112-3122.

10. Liang S.J., et al. Inhibition of Orai1 Store-Operated Calcium Channel Prevents Foam Cell Formation and Atherosclerosis // Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. - 2016. - Vol. 36, № 4. - P. 618-628.

11. Ohya S., et al. Recent advances in therapeutic strategies that focus on the regulation of ion channel expression // Pharmacology & therapeutics. - 2016. - Vol. 160. -P. 11-43.

12. Suzuki Y., Inoue T., Ra C. Calcium signaling in mast cells: Focusing on L-type calcium channels // Calcium Signaling. - Springer Netherlands, 2012. -P. 955-970.

13. Wang R., Mao Y., Zhang Z., et al. Role of vera-pamil in preventing and treating hypertrophic scars and keloids // Int Wound J. - 2015. - doi: 10.1111/iwj.12455.

14. Wang Z., Wang Y., Xie P., et al. Calcium channel blockers in reduction of epidural fibrosis and dural adhesions in laminectomy rats // Eur J Orthop Surg Trauma-tol. - 2014. - Vol. 24, № 1. - P. 293-298.

1. Boyko V.V, Taraban I.A., Yevtushenko D.A., et al. The present state of acute adhesive intestinal obstruction // Kharkov Surgical School - 2014. - № 1 (64). - P. 87-90.

2. Dronov A.I., Zadorozhnaya K.O., Dronova VL., Nastashenko M.I. Pathogenesis, consequences and control of peritoneal adhesions in gynecologic surgery // «Surgery. East Europe». - 2015. - № 2 (14). - P. 124-129.

3. Lavreshin P.M., Gobedzhishvili VV, Kelasov I.G. Prognosis and prevention of the development of intraperi-toneal adhesions. - Saarbrucken, 2012. - 148 p.

4. Lyakhova A.V Methods of prevention of postoperative peritoneal adhesions formation // Bulletin of Experimental and Clinical Surgery. - 2010. - Vol. 3, № 1. -P. 72-81.

5. Skalsky S.V., Shamrai G.A. A method of intraperitoneal adhesions modelling // Patent of Russia № 2260854. -2005, Bul. № 26.

6. Ishii N., et al. Anti-atherosclerotic potential of di-hydropyridine calcium channel blockers // Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. - 2012. - Vol. 19, № 8. -P. 693-704.

7. Kawamura A., et al. Azelnidipine, Not Amlodipine, Induces Secretion of Vascular Endothelial Growth Factor From Smooth Muscle Cells and Promotes Endothelial Tube Formation // Cardiology Research. - 2014. - Vol. 5, № 5. - P. 145-150.

8. Li Y., Ma X., Yu P., et al. Intra-articular adhesion reduction after knee surgery in rabbits by calcium channel blockers // Med Sci Monit. - 2014. - № 20. -P. 2466-2471.

9. Li Y., et al. BK Channels Regulate Myometrial Contraction by Modulating Nuclear Translocation of NF-kB // Endocrinology. - 2014. - Vol. 155, № 8. - P. 3112-3122.

10. Liang S.J., et al. Inhibition of orai1 store-operated calcium channel prevents foam cell formation and atherosclerosis // arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. - 2016. - Vol. 36, № 4. - P. 618-628.

11. Ohya S., et al. Recent advances in therapeutic strategies that focus on the regulation of ion channel expression // Pharmacology & therapeutics. - 2016. - Vol. 160. -P. 11-43.

12. Suzuki Y., Inoue T., Ra C. Calcium signaling in mast cells: Focusing on L-type calcium channels // Calcium Signaling. - Springer Netherlands, 2012. - P. 955-970.

13. Wang R., Mao Y., Zhang Z., et al. Role of vera-pamil in preventing and treating hypertrophic scars and keloids // Int Wound J. - 2015. - doi: 10.1111/iwj.12455.

14. Wang Z., Wang Y., Xie P., et al. Calcium channel blockers in reduction of epidural fibrosis and dural adhesions in laminectomy rats // Eur J Orthop Surg Trauma-tol. - 2014. - Vol. 24, № 1. - P. 293-298.

Координаты для связи с авторами: Скальский Сергей Викторович - канд. мед. наук, зав. кафедрой фармакологии с курсом клинической фармакологии, e-mail: sergscalskiy@mail.ru, тел.: сот. +7-913-601-22-11, раб. 8-(3812)-24-79-27; Соколова Татьяна Федоровна - д-р мед. наук, ассистент кафедры фармакологии с курсом клинической фармакологии, e-mail: pharm@omsk-osma.ru, тел. 8-(3812)-24-79-27.