БИОГИБРИДНЫЕ МАТЕРИАЛЫ НА ОСНОВЕ ОРГАНО-НЕОРГАНИЧЕСКИХ МАТРИЦ И КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ (МИНИ-ОБЗОР)

УДК 54.057; 579.6 DOI: 10.24412/2071-6176-2023-4-76-91

БИОГИБРИДНЫЕ МАТЕРИАЛЫ НА ОСНОВЕ ОРГАНО-НЕОРГАНИЧЕСКИХ МАТРИЦ И КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ

Е.С. Филиппова, Д.Г. Лаврова

Рассматриваются методы изучения структуры и свойств биогибридных материалов на основе клеток микроорганизмов, инкапсулированных в органо-неорганические матрицы в условиях золь-гель синтеза. Такие системы можно применять в микробиологических процессах брожения и ферментации, при очистке сточных вод, при разработке систем адресной доставки лекарственных препаратов. Особое внимание уделяется особенностям получения матриц из различных прекурсоров.

Ключевые слова: иммобилизация, инкапсулированные микроорганизмы, клетка в оболочке, органо-неорганические матрицы, биогибридные материалы, золь-гель синтез.

Биотехнологии на основе ннкапсулированных живых клеток в инертную, биологически совместимую матрицу имеют ряд преимуществ перед биотехнологиями с прмменением свободных клеток или иммобилизованных адгезией микроорганизмов на на двумерной поверхности носителей. В качестве матрицы для инкапсуляция клеток используют природные и синтетические полимеры, способные формировать SD-гидрогели с определенными характеристиками. В зависимости от будущего применения 3D-гидрогелей с инкапсулированными клетками используют разные типы полимеров или соединений, образующих сетчатые структуры. В медицинских целях такие биоматериалы могут использоваться для разработки биодеградируемых покрытий, способных контролировать развитие инфекции и помогать в лечении ран; для разработки систем адресной доставки целевого соединения; для создания биосовместимых каркасов при получении искусственных органов и тканей. В биотехнологических процессах иммобилизованные микроорганизмы применяют для обеспечения стабильности и повышения эффективности брожения и ферментации (в производстве пищевых продуктов и напитков), для получения биологически активных веществ, для очистки сточных вод от определенных загрязнителей-токсикантов.

В отличии от систем на основе отдельных ферментов, инкапсулированные целые клетки содержат весь ферментативный комплекс, белки, кофакторы и транспортные механизмы для проведения биохимических реакций, которые трудно и/или дорого воспроизвести in vitro. Инкапсуляция предотвращает потерю продуцирующих клеток,

которые могут представлять собой сконструированный мутантный штамм, имеющий большую ценность и/или экологический интерес. Поскольку рост инкапсулированных клеток физически ограничен, энергия, обычно направленная на поддержание роста клеток, вместо этого может быть направлена на производство желаемых вторичных метаболитов, что увеличивает выход целевого продукта. В то же время, живые клетки могут выполнять поддерживающие и самовосстановительные процессы, что может продлевать их метаболическую активность. Однако для комфортного окружения живых клеток микроорганизмов необходимо тщательно выбирать матрицу, в которую их инкапсулируют. Традиционно для ферментов используют органические матрицы на основе альгината кальция, хитозана [1], каррагенана [2], имеющие ряд преимуществ (прочность, меньшая деградационная способность). В природе микроорганизмы иммобилизованы и инкапсулированы в неорганические матрицы, в частности в кремнезем - инертный и широко распространенный в окружающей среде минерал, поэтому в природной экосистеме у диатомовых водорослей в процессе эволюции даже возникли механизмы формирования на их поверхности сложных экзоскелетов из аморфного кремнезема, которые обеспечивают им механическую прочность, химическую инертность, термическую стабильность, а также устойчивость к воздействию других биологических факторов, и замедления диффузии питательных веществ и отходов [3]. Примечательно, что процесс образования оболочки происходит при температуре и давлении окружающей среды и нейтральном рН в водной среде [4, 5]. Такие кремнеземные архитектуры диатомовых водорослей, а также условия их мягкого биосинтеза послужили стимулом для развития биомиметических искусственных систем на основе живых клеток [6, 7]. Дополнительным стимулом для получения матрицы на основе оксида кремния являются его преимущества перед органическими гидрогелями, которые наиболее часто используют для инкапсулирования живых клеток, так как они способны удерживать воду без значительного набухания, химически и биологически инертны, механически прочны и обеспечивают жизнеспособность клеток в течение длительного времени. Существуют различные способы инкапсулирования живых клеток микроорганизмов на основе соединений кремнезема и информация о них суммирована в обзорах [8-10]. Для получения таких систем широко используют методы золь-гель синтеза, которые реализуются в мягких условиях, являются экономичными и экологически чистыми.Введение различных органических функциональных групп, таких как амино-, эпокси-, гидроксил- в алкоксидные мономеры приводит к получению органически модифицированных золь-гель стекол (ORMOSIL). Использование золь-гель технологий позволяет получать органо-неорганические композиты с непрерывно настраиваеваемыми химичес-

кими и физическими свойствами путем простого изменения используемых прекурсоров, их молярного соотношения или и того и другого.

Процессы золь-гель синтеза высокомолекулярных соединений кремниевой кислоты и кремнийорганических композитовна ее основе

Для золь-гель реакций чаще всего в качестве прекурсоровиспользуют алкоксиды соответствующих элементов [М(ОЯ)п], где М — сетеобразующий элемент [11]. Например, в качестве исходных веществ часто применяюттетраметоксисилана (ТМОС) или тетраэтоксисилана (ТЭОС), гидролиз (с образованием свободных силанольных групп ^-ОН)) и поликонденсация ^-О^) которых при комнатной температуре приводит к формированию трехмерной решетки 8Ю2 (рис. 1).

.р / .он но, РН Щ

»о _ ¿'^он НО^Л но^ ? ^о^ ? .он

Гидролиз > но_8|->* «Ч^-ОН ^¡^

\ _// \ / / \

____' ___*

он но

Предшественник он Монокремниевая кислота Дикрем

—о о \ рн н<э.

ноч ^ oJ \ \ ОН но^ ? ^о,

но он

ниевая кислота

Конденсация

'.о

а' О-Э; ¿1 рн НО.

—'&ч1-о-а-о'Ь1ч -- о о 8181

/ ? ъ \ / / \

о ^ о' 3, НО он

/°о'и°Н нс/^ХгЧн

о2 / он но

' Олигокремниевая кислота

ни

Рис. 1. Схема золь-гель синтеза

С использованием реакций золь-гель синтеза разрабатываются технологии получения наночастиц, нанопористых материалов с регулируемым размером пор, тонкие наноразмерные пленки,различные композиты, размер фаз которых находится в нанодиапазоне [12].Однако традиционный золь-гель синтез приводят к образованию плотных и жестких структур неорганической матрицы на поверхности живых клеток, что оказывает на них неблагоприятное действие и уменьшает жизнеспособность. Поэтому в настоящее время основное внимание в исследованиях уделяется развитиюстратегий, направленных на формирование органо-неорганических гидрогелей из частиц кремнезема при участии структурообразующих компонентов (биоорганические молекулы с активными группами,природные и синтетические гидрофильные полимеры, поверхностно-активные вещества и т.д.), способных образовывать пространственные структуры (рис. 2). Разлагаемые синтетические полимеры или природные биополимеры,

включая поливиниловый спирт (ПВС) [13], хитозан [14], желатин [15], полиэтиленгликоль (ПЭГ) [16], поли(е-капролактон) (PLC) [17], широко применяются в медицине и биотехнологии. Однако хитозан токсичен для целых клеток микроорганизмов поскольку обладает антимикробными свойствами [18].

но

/

он

Поливиниловый спирт

НО' . НО-

он ОН он

МН2 NH£ МНг

Хитозан

Поли

Рис. 2. Структурообразующие агенты

В ряде исследований, в том числе и проведенных нами [19, 20], показано, что дополнительное введение структуроуправляющих агентов при синтезе кремнеземной матрицы из ТМОС и ТЭОС позволяет значительно повысить долговременную жизнеспособность иммобилизованных клеток. Эти агенты экранируют контакт клеток с полярными силанольными группами и силоксанами, которые повреждают мембраны, приводя к лизису [21-23]. Кроме того, они создаютвокруг клеток интегрированный слой воды, связанный водородными связями, что приводит к его сохранению после высушивания биогибридов, что повышает жизнеспособность иммобилизованных клеток [24, 25].

Ранее мы исследовали возможности инкапсулирования микроорганизмов в гидрогели из ТЭОС и гидрофобной добавки метилтриэтоксисилана (МТЭС) в присутствии ПЭГ и ПВС путем одностадийного золь-гель синтеза в условиях основного катализа. В качестве биологической составляющей использовали метилотрофные дрожжи, обладающие эффективной системой окисления низкомолекулярных спиртов. В этих условиях при определенном соотношении силановых прекурсоров клетки дрожжей являются центрами формирования архитектуры «клетка в оболочке» [19, 20, 26, 27]. Такая оболочка защищает микроорганизмы от влияния стрессовых факторов окружающей среды (ионы тяжелых металлов, УФ-излучение, экстремальные значения рН) [27]. Однако разработанный ранее метод индивидуального инкапсулирования ограничен в использовании различных микроорганизмов, ввиду образования в ходе золь-гель синтеза токсичных для клеток спиртов.

В формировании органо-неорганических гидрогелей способны участвовать не только соединения кремния. Интересными свойствами обладают материалы на основе диоксида титана, которые тоже могут быть синтезированы золь-гель методов в мягких условиях из различных титановых прекурсоров, в том числе с использованием методологии экологического синтеза [28]. Несмотря на то, что гидрогели с диоксидом титана, полученные золь-гель методом, редко используется для иммобилизации живых клеток микроорганизмов из-за его выраженных антимикробных свойств [29], тем не менее их часто используют для получения биоматериалов и биокомпозитов на основе природных полимеров, в том числе с иммобилизованными ферментами. В работе [30] описано включение бактериальных клеток в гидрогели титана, полученные в водной фазе из алкоксидов титана. Исследование полученных структур методами оптической микроскопии показало, что микроорганизмы покрыты оболочкой из гидратированного оксида и включены в кусочки гидрогеля, размером от 0,1 мкм до 1 мм. Дополнительные исследования позволили предположить, что полученная оболочка непрерывная, плотная и непроницаемая для относительно небольших органических молекул.

Добавление при синтезе золь-гель матриц структуроуправляющих агентов позволяет снизить жесткоть формируемой матрицы, однако это не решает проблему выделения побочных продуктов гидролиза и конденсации, что приводит к повреждению целых клеток и лизису клеточных мембран и ограничивает применение золь-гель технологии для разработки эффективных оболочек вокруг целых клеток.

Полиолатные соединения кремния и титана как биосовместимые прекурсоры в золь-гель синтезе

Альтернативный способ улучшения биосовместимости золь-гель матриц заключается в использовании полиолатных соединений кремния и титана, не содержащих цитотоксичных побочных продуктов гидролиза и конденсации [24, 31-33]. Например, в 1998 году Гилл и др. сообщили о новом классе предшественников кремнезема - полиолсиликатах и полиолсилоксанах [24, 31, 33, 34]. Использование полиглицерилсиликата в процессах золь-гель синтеза имеет ряд преимуществ:

- высокая растворимость в воде, что позволяет отказаться от использования органического растворителя;

- катализ реакций гидролиза и конденсации инициируется водой, что позволяет отказаться от использования кислотных и щелочных катализаторов;

- биосовместимый продукт гидролиза - глицерин, который позволяет воспроизводимо и эффективно удерживать клетки в 3D-матрицах способом, аналогичным традиционной схеме золь-гель синтеза [32].

Анализ литературных данных показал, что это направление золь-гель химии в области получения биогибридных материалов представляет большой интерес, поскольку позволяет синтезировать материалы с огромным разнообразием структур. Полиэтиленгликоляты кремния и титана являются многообещающими прекурсорами в золь-гель синтезе гидрогелей для медицинских применений. Шадрина и др. (Институт органического синтеза им. И.Я. Постовского Уральского отделения РАН) на основе гидрогелей вышеупомянутых предшественников разработали различные фармацевтические препараты с активными лекарственными добавками для лечения кожи, мягких тканей и слизистые оболочки [35]. Чрескожная и трансмукозальная активность гидрогелей полиэтилен -гликоля позволяет использовать минимальные количества лекарственных добавок при сохранении их эффективности, а соответствующая структура геля позволяет пролонгировать их высвобождение [36]. Введение биомолекул в подобные материалы позволит расширить спектр практического применения в медицинской и экологической биотехнологии.

Алкоксильные производные титана более реакционно способны по отношению к воде, чем алкоксисиланы, что приводит, чаще всего, к осаждению диоксида титана (ТЮ2), а не к гелеобразованию [37]. При анализи литературы удалось найти несколько работ [38-40], в которых авторы указывают на специфические особенности золь—гель процесса для предшественников полиолатов по сравнению с алкоксильными производными, в то время как механизм процесса детально не был изучен. В отличие от алкоксидов, полиолаты кремния хорошо растворимы в воде и, следовательно, скорость гидролиза в нейтральной среде высока. Глицеролаты титана в избытке глицеринаболее устойчивы к гидролизу, чем алкоксиды, что приводит кобразованию гидрогелей вместо осаждения оксида. Кроме того, гидрогели, полученные из глицеролатов кремния и глицеролатов титана в избытке глицерина менее склоннык синерезису [41]. В работе [42] для получения полиолатов кремния и титана проводили алкоголиз диметилдиэтоксисалана (ДМДЭС) или тетраэтоксисилана (ТЭОС) и тетрабутоксисилана (ТБС) избытком полиола, например глицерина или полиэтиленгликоля. Выделившиеся спирты (этанол и бутанол) удаляли. Для формирования гидрогеля проводили реакцию кислотного гидролиза: взаимодействие полученных растворов полиолов кремния и титана с водным раствором соляной кислоты.

Морфологические свойства таких материалов зависят от соотношения неорганической и органической фаз в системе. Так, тетраглицерат кремния в избытке глицерина (молярное соотношение Si(CзH7Oз)4 : С3Н8О3 = 1 : 3) представляет собой прозрачный бесцветный вязкий раствор. Тетраглицерат титана в избытке глицерина (мольное

соотношение Т^С3Н7О3)4 : С3Н8О3 = 1 : 10) представляет собой вязкий коллоидный раствор белого цвета [43].

Полиэтиленгликолят и глицеролат кремния использовали в процессе биомиметической минерализации полисахаридов, белков и синтетических биополимеров. Однако нам не удалось найти информацию об использовании этих предшественников для инкапсулирования целых живых клеток.

Научной группой ТулГУ проведены исследования по инкапсулированию микроорганизмов в полиолатные соединения кремния. Впервые были получены структуры метилотрофных дрожжей Ogataea ро1ушогрка в органосиликатной оболочке из тетраполиэтиленгликолятов кремния. Используемые соединения были синтезированы в Институте органического синтеза им. И.Я. Постовского Уральского отделения РАН [44]. Микроорганизмы, инкапсулированные в органосиликатные оболочки, защищены от УФ-излучения и токсического действия ионов тяжелых металлов и могут быть успешно использованы в качестве материалов для загрузки биофильтров в системах очистки сточных вод (окислительная мощность 270 гО2/(м3хцикл). Однако иммобилизовали только один штамм дрожжей [45].

Использование полиолатных соединений кремния и титана в формировании матриц для инкапсулирования целых клеток микроорганизмов позволит существенно расширить спектр применения таких биомиметических систем в различных областях человеческой жизнедеятельности. Хотя этот подход кажется многообещающим, существует ряд фундаментальных пробелов, требующих исследования для реализации экономически обоснованных биотехнологий, а именно, лучшего понимания:

- стрессовых процессов, вызванные инкапсуляцией, и метаболические реакции на них;

- определяющих факторов, которые способствуют старению клеток после инкапсуляции;

- взаимодействий поверхности клеток и компонентов органосиликатной матрицы, способствующих активности и долговременной стабильности инкапсулированных клеток.

Характеристика органо-неорганических матриц

Удельная площадь поверхности. Выделяют расчетные и экспериментальные методы. Для расчетного метода необходимо исходить из геометрических представлений о форме и размере частиц исследуемого вещества. Экспериментальные методы отличаются друг от друга подходами, которые лежат в основе измерения площади исследуемой поверхности. Например, адсорбционные методы основаны на определении адсорбционной емкости поверхности образца по отношению к зондовым

молекулам. Наиболее распространенный метод определения удельной площади поверхности — низкотемпературная адсорбция азота по методу Брунауэра-Эмметта-Теллера (БЭТ). Его основу составляет теория полимолекулярной адсорбции газа на поверхности твердого тела.

Суть этого метода заключается в анализе адсорбции азота твердым телом при постоянной криогенной температуре 77 К путем постепенного повышения давления. Зная количество газа, сорбируемого образцом, площадь поперечного сечения молекул и массу образца, можно определить значение площади поверхности образца. По мере увеличения давления газа поверхность образца покрывается адсорбированными молекулами, а поры постепенно заполняются конденсированным газом. При низком давлении сначала заполняются самые мелкие поры, а по мере роста давления — более крупные. Когда давление становится равным давлению насыщения азота, все поры образца заполняются. Зависимость между объемом адсорбированного газа и давлением может быть использована для определения распределения пор по размерам в исследуемом образце [46].

Структура матриц. Для стекол, полученных с использованием процессов золь-гель технологии, основными факторами, определяющими связанность сети, текстурные свойства и конформационную структуру полученных материалов, являются температура стабилизации, химический состав. Рамановская и инфракрасная спектрокопия — чувствительные методы для определения локальной структуры стекол и пленок, полученных золь-гель методом, и изменения в колебательных связях М-О-М (М= Тшли Si).

Инфракрасная спектроскопия. Метод может быть использован для определения состава и структуры полимеров,мониторинга процессов полимеризации, исследования поверхности полимеров и процессов деградации полимеров [47]. ИК-спектроскопия позволяет идентифицировать полосы колебаний гидроксильных групп, связанных с различной конфигурацией терминальных силанольных связей на поврехности стекла и свободной молекулярной воды в матрице стекла. Данный метод позволяет качественно оценить усложение трехмерной структуры за счет образования новых связей M-O-M (М = Тшли Si) по интенсивности и высоте пика, соотвествующего данным колебаниям (1090 см-1 для связи Si-O-Siи 1450 см-1 для связи Ti-O-Ti) [48].

Одной методик пробоподготовки образца для последующего проведения инфракрасных измерений с преобразованием Фурье (ИК-Фурье) золь-гелевые пленки (либо стекла) измельчают пестиком в агатовой ступке. После измельченный материал смешивают в бромидом калия в соотношении 1:100 и высушивают при 40 °С. Смесь спрессовывают в полупрозрачный диск под давлением 10 т в течение 5 минут. ИК-спектры регистрируют с использованием ИК-Фурье спектрометра [49].

Спектроскопия комбинационного рассеяния (Рамановская спектроскопия). По сравнению с другими оптическими методами рамановская спектроскопия обладает превосходными возможностями. Она может быть использована in situ в физиологических экспериментальных условиях, а при использовании резонансного рамановского рассеяния она является чрезвычайно селективным методом. Соединив конфокальный оптический микроскоп с обычным рамановским спектрометром, рамановская спектроскопия становится микрозондом с пространственным разрешением менее 1 мкм [50]. Рамановский анализ позволяет количественно оценить степень связанности пространственной сетки матрицы и спрогнозировать текстурные свойства стекол и пленок. Пробоподготовку можно проводить по одной из методик, описанной ниже.

Кремниевые пластины и кварцевая подложка тщательно очищаются, нагреваются до 200 °С в течение 20 мин и охлаждаются до комнатной температуры. Для нанесения пленок используют аппарат для нанесения покрытий методом погружений, при этом толщина пленки регулируется скоростью отбора. После нанесения каждого покрытия пленки подвергают предварительной обработке при 80 °С в течение 1 ч, а затем проводят термообработку в муфельной печи. Для быстрого термического отжига (БТО) образцы нагревают в быстром термопро-цессоре в течение 20 с с в диапазоне температур 300-800 °С. Раствор также высушивают при 80 °С для получения порошка, а затем нагревают в муфельной печи [51].

Характеристика иммобилизованных микроорганизмов

Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) предоставляет информацию о размере и морфологии. СЭМ основан на сфокусированном луче электронов, который сканирует образец и взаимодействует с атомами в образце, создавая трехмерную топографию поверхности. Однако обычный СЭМ выполняется в высоком вакууме и требует сложной и обширной обработки образца, включая обезвоживание, фиксацию и металлизацию [52].

Для проведения сканирующей электронной микроскопии требуется провести пробоподготовку [53]: культуральную жидкость центрифугируют, осадок промывают фосфатным буферным раствором 3 раза, добавляют 0,25 % глютеральдегида (в фосфате натрия с рН=7,2), инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут, затем инкубируют в течение ночи. После инкубации снова промывают 3 раза фосфатным буфером и собирают осадок центрифугированием. Затем пробы обезвоживают различными объемами этанола (30, 50, 70, 80, 90 и 100 %) и для каждого объема этанола производят инкубацию в течение 10 минут. Затем проводят инкубацию в течение 1 часа в 100 % этаноле. После подготовленные клетки наносят на клейкую ленту.

Также пробоподготовку можно проводить другим способом: бактериальная культура находится в культуральной жидкости, затем эта жидкость наносится на мембрану фильтра (например, поликарбонатные «нуклепоровые» фильтры, 0,45 микрона или 0,2 микрона; воздух сухой), после проводится фиксация в 2,5 % глутаральдегиде в буфере PBS (фосфатно-буферный физиологический раствор) в течение 45 минут и 1 часа, затем 15 минутное суспензирование в PBS, повторная фиксация в 1 % OsO4 в буфере PBS в течение 1 часа, серийное обезвоживание этанолом, суспензированиев течение 10 мин (30, 50, 70, 80 и 100 % этанол). Затем образцы оставляют в абсолютном этаноле (примерно на 15 минут), достигается сухая критическая точка, после которой бактериальная биомасса прикрепляется к заглушке, на которую напыляют золото. После тщательной пробоподготовки по одному из описанных протоколов проводят анализ СЭМ.

Амперометрический метод определения жизнеспособных клеток. Принцип определения количества клеток основан на определении дыхания микроорганизмов. Система состоит из кислородного электрода и пористого ацетилцеллюлозного мембранного фильтра для улавливания микроорганизмов. Данный метод можно использовать для определения небольшого количества жизнеспособных клеток [54].

Для проведения измерений клетки разбавляют буферным раствором, выдерживают при 0 °С в течение 0,5-1,0 ч. Суспензию, содержащую клетки, наносят на мембранный фильтр легким присасыванием. Микроорганизмы удерживаются на поверхности мембранного фильтра, который прикрепляют к поверхности тефлоновой мембраны кислородного электрода с использованием держателя. Сформированный электрод помещают в 50 мл фосфатного буферного раствора (рН =7,0), содержащего 500 мг/л глюкозы, после раствор насыщают кислородом при перемешивании и фиксируют изменение тока [54, 55].

Биолюминисцентный метод определения внутриклеточного АТФ [56]. Этот метод относится к методам «быстрой микробиологии», которые позволяют в течение нескольких минут (или часов) определять численность микроорганизмов в различных объектах через оценку энергетического ста АТФ — соединение, которое присутвует только в живых клетках, в случае возникновения неблагоприятных условий существования происходить затрата внутренних энергетических ресурсов на реализацию биохимических процессов, направленных на выживание клетки. Это сопровождается снижением внутриклеточной концентрации АТФ. Для определение концентрации внутриклеточного АТФ используют биолюминисцентный метод, который основан на АТФ-зависимой реакции окисления люциферина люциферазой светлячков (рис. 3).

Рис. 3. Реакции, лежащие в основе биолюминисцентного метода определения концентрации АТФ, где Е -люцифераза,ФФЬ -пирофосфат неорганический, АМФ - аденозинмонофосфат

Сначала происходит связывание фермента с субстратами (люциферином и АТФ), после тройной комплекс ковалентно взаимодейтсвует с АТФ с образованием смешанного ангидрида карбоновой и фосфорной кислот, люцифериладенилата и пирофосфата. Конечным продуктом реакции является оксилюциферин, а индикаторной реакцией — желто-зеленое свечение при длине волны 550-570 нм.

Заключение

В обзоре рассмотрен важный класс функциональных материалов -биогибридные материалы на основе иммобилизованным микроорганизмов в органо-силикатные и органо-титанатные композиты, полученные путем гидролиза и конденсации биосовместимых прекурсоров. Они сочетают в себе преимущества органических материалов, таких как гибкость и биосовместимость, с прочностью и функциональностью неорганических материалов. Использование клеток микроорганизмов в качестве активных компонентов позволяет создавать материалы с биологической активностью и специфичными функциями. Эти материалы имеют широкий спектр потенциальных применений, включая области медицины, биотехнологии и экологии. Представленный в обзоре анализ свидетельствует о перспективах биогибридных материалов, и указывает на направления исследований для развития современных технологий и научных открытий.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования РФ в рамках государственного задания № ГЕЖ0-2021-0013 (Биокаталитические платформы на основе клеток микроорганизмов, субклеточных структур и ферментов в сочетании с наноматериалами).

Список литературы

1. Enzyme activity and stability of lactase immobilized on two different supports: Calcium alginate and magnetic chitosan / F.S. Zawawi, K. Latiffah, O. Sitiradhiah [et al.] // Mal. J. Fund. Appl. Sci. 2020. V. 16. № 4. P. 413-417.

2. к-Carrageenan Hydrogel as a Matrix for Therapeutic Enzyme Immobilization / O.N. Makshakova, L.R. Bogdanova, A.O. Makarova [et al.] // Polymers. 2022. V. 14. № 19. P. 4071.

3. Nassif N., Livage J. From diatoms to silica-based biohybrids // Chem. Soc. Rev. 2011. V. 40. № 2. P. 849-859.

4. All New Faces of Diatoms: Potential Source of Nanomaterials and Beyond / M. Mishra, A. Arukha, T. Bashir [et al.] // Front. Microbiol. 2017. V. 8. P. 1239.

5. Hildebrand M., Lerch S.J.L., Shrestha R.P. Understanding Diatom Cell Wall Silicification—Moving Forward // Front. Mar. Sci. 2018. V. 5. P. 125.

6. Sol-Gel-Based Advanced Porous Silica Materials for Biomedical Applications / Q. Lei, J. Guo, A. Noureddine [et al.] // Adv Funct Materials. 2020. V. 30. № 41. P. 1909539.

7. Strategic Advances in Formation of Cell-in-Shell Structures: From Syntheses to Applications / B.J. Kim, H. Cho, J.H. Park [et al.] // Advanced Materials. 2018. V. 30. № 14. P. 1706063.

8. Bioinspired Cell Silicification: From Extracellular to Intracellular / Q. Lei, J. Guo, F. Kong [et al.] // J. Am. Chem. Soc. 2021. V. 143. № 17. P. 63056322.

9. Sol-gel silica platforms for microalgae-based optical biosensors / M. Perullini, Y. Ferro, C. Durrieu [et al.] // Journal of Biotechnology. 2014. V. 179. P. 65-70.

10. Dickson D.J., Ely R.L. Silica sol-gel encapsulation of cyanobacteria: lessons for academic and applied research // Appl Microbiol Biotechnol. 2013. V. 97. № 5. P. 1809-1819.

11. Preparation of Hybrid Sol-Gel Materials Based on Living Cells of Microorganisms and Their Application in Nanotechnology / O.A. Kamanina, E.A Saverina, P.V. Rybochkin [et al.] // Nanomaterials. 2022. V. 12. № 7. P. 1086.

12. Nanomaterial by sol-gel method: synthesis and application / D. Bokov, A.T. Jalil, S. Chupradit [et al.] //Advances in Materials Science and Engineering. 2021. P. 1-21.

13. Organic-inorganic hybrid material for the cells immobilization: Long-term viability mechanism and application in BOD sensors / L. Liu, L. Shang, S. Guo [et al.] // Biosensors and Bioelectronics. 2009. V. 25. № 2. P. 523-526.

14. Use of biocompatible redox-active polymers based on carbon nanotubes and modified organic matrices for development of a highly sensitive

BOD biosensor / V.A. Arlyapov, A.S. Kharkova, S.K. Kurbanaliyeva [et al.] // Enzyme and Microbial Technology. 2021. V. 143. P. 109706.

15. Bioactive and degradable hybridized nanofibers of gelatin-siloxane for bone regeneration / J.H. Song, B.H. Yoon, H.E. Kim [et al.] // J. Biomed. Mater. Res. 2008. V. 84A. № 4. P. 875-884.

16. Influence of the polymer amount on bioactivity and biocompatibility of SiO2/PEG hybrid materials synthesized by sol-gel technique / M. Catauro, F. Bollino, F. Papale [et al.] // Materials Science and Engineering: C. 2015. V. 48. P. 548-555.

17. Effect of Washing Treatment on the Textural Properties and Bioactivity of Silica/Chitosan/TCP Xerogels for Bone Regeneration / A. Pérez-Moreno, M.V. Reyes-Peces, J.I. Vilches-Pérez [et al.] // IJMS. 2021. V. 22. № 15. P. 8321.

18. Antimicrobial properties of chitosan and mode of action: A state of the art review / M. Kong, X.G. Chen, K. Xing [et al.] // International Journal of Food Microbiology. 2010. V. 144. № 1. P. 51-63.

19. Impact of hydrophilic polymers in organosilica matrices on structure, stability, and biocatalytic activity of immobilized methylotrophic yeast used as biofilter bed / D.G. Lavrova, O.A. Kamanina, V.A. Alferov [et al.] // Enzyme and Microbial Technology. 2021. V. 150. P. 109879.

20. Effect of polyethylene glycol additives on structure, stability, and biocatalytic activity of ormosil sol-gel encapsulated yeast cells / D.G. Lavrova,

0.A. Kamanina, A.V.Machulin [et al.] // J Sol-Gel Sci Technol. 2018. V. 88. №

1. P. 1-5.

21. SiO2 Entrapment of Animal Cells: Liver-Specific Metabolic Activities in Silica-Overlaid Hepatocytes / M. Muraca, M.T. Vilei, G.E.Zanusso [et al.] // Artificial Organs. 2002. V. 26. № 8. P. 664-669.

22. Cells in Sol-Gels I: A Cytocompatible Route for the Production of Macroporous Silica Gels / J.F. Conroy, M.E. Power, J. Martin [et al.] // Journal of Sol-Gel Science and Technology. 2000. V. 18. № 3. P. 269-283.

23. A sol-gel matrix to preserve the viability of encapsulated bacteria / N. Nassif, C. Roux, T. Coradin [et al.] // J. Mater. Chem. 2003. V. 13. № 2. P. 203-208.

24. Influence of Silica Matrix Composition and Functional Component Additives on the Bioactivity and Viability of Encapsulated Living Cells / T.J. Savage, D.R. Dunphy, S. Harbaugh [et al.] // ACS Biomater. Sci. Eng. 2015. V. 1. № 12. P. 1231-1238.

25. Three-Dimensional Encapsulation of Saccharomyces cerevisiae in Silicate Matrices Creates Distinct Metabolic States as Revealed by Gene Chip Analysis / Z. Fazal, J. Pelowitz, P.E. Johnson [et al.] // ACS Nano. 2017. V. 11. № 4. P. 3560-3575.

26. Yeast-based self-organized hybrid bio-silica sol-gels for the design of biosensors / O.N. Ponamoreva, O.A. Kamanina, V.A. Alferov [et al.] // Biosensors and Bioelectronics. 2015. V. 67. P. 321-326.

27. Yeast Debaryomyces hansenii within ORMOSIL Shells as a Heterogeneous Biocatalyst / O.N. Ponamoreva, E.L. Afonina, O.A. Kamanina [et al.] // Appl Biochem Microbiol. 2018. V. 54. № 7. P. 736-742.

28. Siwinska-Stefanska K., Jesionowski T. Advanced Hybrid Materials Based on Titanium Dioxide for Environmental and Electrochemical Applications // Titanium Dioxide / ed. Janus M. InTech, 2017.

29. Kambala V.S.R., Naidu R. Disinfection Studies on TiO2 Thin Films Prepared bya Sol-Gel Method // Journal of Biomedical Nanotechnology. 2009. V. 5. № 1. P. 121-129.

30. Chemically Triggered Biodelivery Using Metal-Organic Sol-Gel Synthesis / V.G. Kessler, G.A. Seisenbaeva, M. Unell [et al.] // Angewandte Chemie. 2008. V. 120. № 44. P. 8634-8637.

31. Sol-gel encapsulation of bacteria: a comparison between alkoxide and aqueous routes/ A. Coiffier, T. Coradin, C. Roux [et al.] // J. Mater. Chem. 2001. V. 11. № 8. P. 2039-2044.

32. Encapsulation of S. cerevisiae in Poly(glycerol) Silicate Derived Matrices: Effect of Matrix Additives and Cell Metabolic Phase on Long-Term Viability and Rate of Gene Expression / J.C. Harper, D.M. Lopez, E.C. Larkin [et al.] // Chem. Mater. 2011. V. 23. № 10. P. 2555-2564.

33. Aqueous sol-gel encapsulation of genetically engineered Moraxella spp. cells for the detection of organophosphates/ D. Yu, J. Volponi, S. Chhabra [et al.] // Biosensors and Bioelectronics. 2005. V. 20. № 7. P. 1433-1437.

34. Gill I., Ballesteros A. Encapsulation of Biologicals within Silicate, Siloxane, and Hybrid Sol-Gel Polymers: An Efficient and Generic Approach // J. Am. Chem. Soc. 1998. V. 120. № 34. P. 8587-8598.

35. Formation and pharmacological activity of silicon—chitosan-containing glycerohydrogels obtained by biomimetic mineralization / E.V. Shadrina, O.N. Malinkina, T.G. Khonina [et al.] // Russ Chem Bull. 2015. V. 64. № 7. P. 1633-1639.

36. Features of silicon- and titanium-polyethylene glycol precursors in sol-gel synthesis of new hydrogels / T.G. Khonina, A.P. Safronov, M.V. Ivanenko [et al.] // J. Mater. Chem. B. 2015. V. 3. № 27. P. 5490-5500.

37. Brinker C.J., Scherer G.W. Sol-gel science: the physics and chemistry of sol-gel processing. Boston: Academic Press, 2013. 908 p.

38. Glycol-Modified Silanes in the Synthesis of Mesoscopically Organized Silica Monoliths with Hierarchical Porosity / D. Brandhuber, V. Torma, C. Raab [et al.] // Chem. Mater. 2005. V. 17. № 16. P. 4262-4271.

39. Shchipunov Y., Postnova I. One-pot biomimetic synthesis of monolithic titania through mineralization of polysaccharide // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2009. V. 74. № 1. P. 172-177.

40. Sugar-modified silanes: precursors for silica monoliths / M.A. Brook, Y. Chen, K. Guo [et al.] // J. Mater. Chem. 2004. V. 14. № 9. P. 14691479.

41. Synthesis of pharmacologically active hydrogels based on combined silicon and titanium polyolates / M.V. Ivanenko, T.G. Khonina, O.N. Chupakhin [et al.] // RussChemBull. 2012. V. 61. № 11. P. 2163-2171.

42. Иваненко М.В., Хонина Т.Г., Чупахин О.Н. Фармакологически активные кремнийтитан содержащие матрицы // XIV молодежная конференция по органической химии. Екатеринбург, 2011.

43. Synthesis and antimicrobial activity of silicon—titanium—zinc- and silicon—titanium—boron-containing glycerohydrogels / T.G. Khonina, E.Y. Nikitina, E.V. Shadrina [et al.] // Russ Chem Bull. 2021. V. 70. № 5. P. 967974.

44. Features of formation and structure of silicon-polysaccharide-containing polyolate hydrogels obtained by the method of biomimetic mineralization / M.V. Ivanenko, E.Y. Nikitina, T.G. Khonina [et al.] // J Sol-Gel Sci Technol. 2019. V. 92. № 2. P. 376-385.

45. Biocompatible Silica-Polyethylene Glycol-Based Composites for Immobilization of Microbial Cells by Sol-Gel Synthesis / D.G. Lavrova, A.V. Zvonarev, V.A. Alferov [et al.] // Polymers. 2023. V. 15. № 2. P. 458.

46. Пьянова Л.Г., Седанова А.В., Корниенко Н.В. Использование низкотемпературнго метода адсорбции азота при синтезе модифицированных углеродных сорбентов медицинского и ветеринарного назначения // Химия под знаком СИГМА: исследования, инновации, технологии. 2014. С. 268-269.

47. Stuart B. Infrared Spectroscopy // Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology. 1st ed. / ed. Kirk-Othmer. Wiley, 2015. P. 1-18.

48. Structural study of sol-gel silicate glasses by IR and Raman spectroscopies / H. Aguiar, J. Serra, P. Gonzalez [et al.] // Journal of Non-Crystalline Solids. 2009. V. 355. № 8. P. 475-480.

49. Kalampounias A.G. IR and Raman spectroscopic studies of sol-gel derived alkaline-earth silicate glasses // Bull Mater Sci. 2011. V. 34. № 2. P. 299-303.

50. Nabiev I., Chourpa I., Manfait M. Applications of Raman and surface-enhanced Raman scattering spectroscopy in medicine // J Raman Spectroscopy. 1994. V. 25. № 1. P. 13-23.

51. Wang X., Shen J., Pan Q. Raman spectroscopy of sol-gel derived titanium oxide thin films // J Raman Spectroscopy. 2011. V. 42. № 7. P. 15781582.

52. Advances in exosome analysis / A. Pallares-Rusinol, M. Bernuz, S.L. Moura [et al.] // Advances in Clinical Chemistry. Elsevier, 2023. V. 112. P. 69117.

53. Ammar O.F. Preparation of bacteria for Scanning Electron Microscope and common reagents preparation protocols. Unpublished, 2017.

54. Amperometric determination of viable cell numbers based on sensing microbial respiration / T. Matsunaga, I. Karube, T. Nakahara [et al.] // European J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1981. V. 12. № 2. P. 97-101.

55. Chotinantakul K., Suginta W., Schulte A. Advanced Amperometric Respiration Assay for Antimicrobial Susceptibility Testing // Anal. Chem. 2014. V. 86. № 20. P. 10315-10322.

56. Sakakibara T., Murakami S., Imai K. Enumeration of bacterial cell numbers by amplified firefly bioluminescence without cultivation // Analytical Biochemistry. 2003. V. 312. № 1. P. 48-56.

Филиппова Екатерина Сергеевна, магистрант,

katya.filippova010197@gmail.com, Россия, Тула, Тульский государственный университет,

Лаврова Дарья Геннадьевна, канд. хим. наук, ст. науч. сотр. лаборатории экологической и медицинской биотехнологии, d.g.fedoseeva@gmail.com, Россия, Тула, Тульский государственный университет

BIOHYBRID MATERIALS BASED ON ORGANIC-INORGANIC MATRICES AND MICROORGANISM CELLS

E.S. Filippova, D.G. Lavrova

The review is dedicated to studying the methods of analyzing the structure andprop-erties of biohybrid materials, which are based on microorganism cells that are enclosed in organic-inorganic matrices under sol-gel synthesis circumstances. Such systems can be employed in microbiological processes of fermentation and fermentation, in wastewater treatment, and in the creation of targeted drug delivery systems. Specific emphasis is placed on the idiosyncrasies of matrix preparation using various precursors.

Keywords: immobilization, encapsulated microorganisms, encapsulated cell, or-gano-inorganic matrices, sol-gel synthesis, biohybrid materials

Filippova Ekaterina Sergeevn, master's student, katya.filippova0l0l97agmail.com, Russia, Tula, Tula State University,

Lavrova Daria Gennadyevna, candidate of ^emical science, docent,senior research laboratory of Environmental and Medical Biotechnology, d. g. fedoseevaagmail. com, Russia, Tula, Tula State University