СИСТЕМА, СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ БИОПЕРЕРАБОТКИ
SYSTEM, METHODS AND COMPOSITIONS FOR BIOPROCESSING

ЗАЯВЛЕНИЕ В ОТНОШЕНИИ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Перечень последовательностей, относящийся к настоящей заявке, приведен в формате текстового файла вместо бумажной копии, и тем самым включен в описание изобретения посредством ссылки. Название текстового файла, содержащего перечень последовательностей - 200206_404_SEQUENCE_LISTING.txt. Указанный текстовый файл имеет размер 146 Кбайт, создан 12 июля 2013 года и подан в электронном виде через EFS-Web.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Область техники
1
1
Настоящее изобретение относится к биотехнологическим способам получения биотоплива, и в частности к применению реакторной системы на основе метаболизирующего C микроорганизма для превращения C субстратов, таких как метан или метанол, в биомассу и затем в биотопливо, биопластики или т.п.
Уровень техники
Учитывая постоянно растущее истощение месторождений ископаемого топлива, увеличение выбросов парниковых газов и недавнюю озабоченность в отношении изменения климата, усилия в промышленности направлены на замену ископаемых топлив на биотоплива (например, этанол, биодизельное топливо). Однако получаемые в настоящее время виды биотоплива характеризуются своими трудностями и проблемами. Биотопливо первого поколения получают из растений (например, крахмала, тростникового сахара и кукурузного, рапсового, соевого, пальмового и других растительных масел), но такие топливные зерновые культуры конкурируют с зерновыми культурами, выращиваемыми для потребления человеком и животными. Количество имеющихся сельскохозяйственных земель недостаточно для удовлетворения глобальных потребностей одновременно как в продовольствии, так и в топливе. Поэтому биотопливо второго поколения получают, например, из целлюлозы или водорослей. Тем не менее, в связи с наличием технических трудностей при производстве, а также с высокой стоимостью производства, биотопливо второго поколения не стало более экономически эффективным или доступным.
3
3
2
Таким образом, существует потребность в биотопливе третьего или следующего поколения, которое можно было бы получать из альтернативного сырья (т.е., без применения сахара, кукурузы, водорослей). В этом отношении, метан представляет собой один из наиболее распространенных отечественных видов углеродного сырья, источником которого является главным образом природный газ. Недавний рост внутреннего производства метана (от 48 млрд. фут/день (1359 млрд. л) в 2006 году до 65 млрд. фут/день (1841 млрд. л) в 2012 году) довел стоимость природного газа до рекордно низкого уровня (от примерно $14,00/млн. БТЕ в 2006 году до примерно $2,50/млн. БТЕ в 2012 году). Природный газ внутри страны в основном получают путем гидроразрыва пласта («фрэкинга»), но метан можно также получить из других источников, таких как мусорные свалки и сточные воды. Кроме того, освоение метановых источников принесет значительную пользу для окружающей среды, поскольку парниковый эффект метана в 23 раза больше по сравнению с CO.
Однако летучесть метана делает его транспортировку и непосредственное применение в качестве топлива проблематичными. По этой причине имеется сильный стимул для превращения газа в жидкую форму, что позволит облегчить транспортировку к месту применения. В настоящее время используют два подхода: сжижение, приводящее к получению сжиженного природного газа (СПГ), и химическое превращение с конвертированием газа в жидкость (ГВЖ) (Patel, 7th World Congress of Chemical Engineering, Глазго, Шотландия, Соединенное Королевство, 2005). Метод Фишера-Тропша (Ф-Т) является в настоящее время наиболее распространенным ГВЖ-способом для превращения метана из природного газа в углеводороды более высокого порядка (Patel, 2005). Следует отметить, что в методе Ф-Т в качестве сырья используют синтез-газ, который получают из природного газа путем парового риформинга (источником синтез-газа также может быть газификация угля, при высокотемпературной реакции с водой и кислородом). В процессе Ф-Т получают нефтепродукты, которые соответствуют сегодняшним требованиям к поставке топлива, однако указанный способ имеет ряд недостатков, в том числе низкие выходы, плохую селективность (что делает сложной утилизацию при переработке), и требует значительных капитальных затрат и больших масштабов для обеспечения экономически выгодного производства (Spath и Dayton, December 2003 NREL/TP-510-34929). Большой масштаб, необходимый для функционирования установки Ф-Т (для типичной установки капитальные затраты составляют более $2 миллиардов $ [Patel, 2005]) также приводит к значительному ограничению вследствие большого количества исходного метана, требующегося для непрерывной работы такой установки. Так как во многих случаях стоимость транспортировки метана чрезвычайно высокая, указанную установку следует размещать вблизи или большого газового источника, или трубопровода. Дополнительные затраты и коэффициент масштабирования определяют собой экономику технологий мокрой очистки газа (Spath и Dayton, 2003), так как Ф-Т катализаторы проявляют высокую чувствительность к обычным загрязняющим веществам в природном газе, которые успешно выдерживают процесс превращения синтез-газа.
Установки Ф-Т работают в полунепрерывном режиме с 1938. В настоящее время несколько компаний изучают возможность введения новых установок с учетом текущей доступности и цены метана, приведенной выше. Однако, несмотря на значительное количество научных исследований и разработок, сделанных за последние 70 с лишним лет, недостатки технологии Ф-Т препятствуют широкому внедрению промышленных способов ГВЖ. Требование свободного доступа к большим объемам чистого газа в сочетании с внушительными капитальными вложениями ограничивают в настоящее время применение установок Ф-Т на основе природного газа их успешным функционированием только в нескольких местах по всему миру (Spath и Dayton, 2003). Строгое требование к минимальной обработке для установки ГВЖ или СПГ в сочетании с высокой стоимостью транспортировки приводят к применению более маленьких источников метана, именуемых «труднодоступным» газом (например, природного газа, добываемого на нефтяных скважинах в открытом море, или метана, выделяющегося из мусорных свалок). При текущем отсутствии эффективных маломасштабных технологий превращения такие источники труднодоступного газа, как правило, выбрасываются в атмосферу или сжигаются на факелах, так как накопление метана несет значительную угрозу безопасности.
В связи с ограничениями, связанными с производством биотоплива первого, второго и следующего поколений, в данной области техники имеется явная потребность в новых способах эффективного и рентабельного получения альтернативных видов топлива без воздействия на окружающую среду или без конкуренции с производством продуктов питания. Настоящее изобретение решает эту проблему путем обеспечения эффективных и рентабельных способов получения биотоплива и других продуктов с применением биоинженерии.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
1
1
1
13
Согласно одному из аспектов, в настоящем изобретении предложен способ получения топлива путем переработки масляной композиции, полученной из метаболизирующего C нефотосинтезирующего микроорганизма (например, в устройстве переработки), с получением топлива. Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ получения топлива путем превращения биомассы из культуры, в основном содержащей метаболизирующий C нефотосинтезирующий микроорганизм, в масляную композицию и переработки масляной композиции с получением топлива. Согласно еще одному аспекту, в настоящем изобретении предложена установка для биопереработки, содержащая блок обработки, в котором масляную композицию получают из метаболизирующего C нефотосинтезирующего микроорганизма; и устройство переработки для переработки масляной композиции с получением топлива. Согласно другому аспекту, в настоящем изобретении предложена масляная композиция или биотопливная композиция, содержащая молекулы, содержащие атомы водорода и углерода, составляющие по меньшей мере от примерно 50% до примерно 99% относительно массы композиции, при этом δC композиции составляет от примерно - 35‰ до примерно - 50‰, от -45‰ до примерно - 35‰, или от примерно - 50‰ до примерно - 40‰, или от примерно - 45‰ до примерно - 65‰, или примерно - 60‰ до примерно - 70‰, или от примерно - 30‰ до примерно - 70‰.
1
1
Согласно некоторым вариантам реализации, в настоящем изобретении предложены метаболизирующие C микроорганизмы, которые представляют собой прокариоты или бактерии, такие как Methylomonas, Methylobacter, Methylococcus, Methylosinus, Methylocystis, Methylomicrobium, Methanomonas, Methylophilus, Methylobacillus, Methylobacterium, Hyphomicrobium, Xanthobacter, Bacillus, Paracoccus, Nocardia, Arthrobacter, Rhodopseudomonas или Pseudomonas. Согласно другим вариантам реализации изобретения, метаболизирующие C бактерии представляют собой метанотроф или метилотроф. Типичные метанотрофы включают Methylomonas, Methylobacter, Methylococcus, Methylosinus, Methylocystis, Methylomicrobium, Methanomonas или их комбинацию.
Типичные виды метанотрофов включают Methylomonas sp. 16a (ATCC РТА 2402), Methylosinus trichosporium OB3b (NRRL В-11, 196), Methylosinus sporium (NRRL В-11, 197), Methylocystis parvus (NRRL В-11, 198), Methylomonas methanica (NRRL В-11, 199), Methylomonas albus (NRRL В-11, 200), Methylococcus capsulatus Bath (NCIMB 11132), Methylobacter capsulatus Y (NRRL B-11, 201), Methylobacterium organophilum (ATCC 27, 886), Methylomonas sp. AJ-3670 (FERM P-2400), Methylomicrobium alcaliphilum, Methylocella silvestris, Methylacidiphilum infernorum, Methylibium petroleiphilum, Methylococcus capsulatus (Bath) или их быстрорастущие варианты.
Типичные виды метилотрофов включают Methylobacterium extorquens, Methylobacterium radiotolerans, Methylobacterium populi, Methylobacterium chloromethanicum, Methylobacterium nodulans или их комбинацию.
1
Согласно другим вариантам реализации в настоящем изобретении предложены метаболизирующие C микроорганизмы, которые представляют собой бактерии, метаболизирующие синтез-газ, такие как Clostridium, Moorella, Pyrococcus, Eubacterium, Desulfobacterium, Carboxydothermus, Acetogenium, Acetobacterium, Acetoanaerobium, Butyribaceterium, Peptostreptococcus или любую их комбинацию. Типичные бактерии, метаболизирующие синтез-газ, включают Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahli, Clostridium ragsdalei, Clostridium carboxydivorans, Butyribacterium methylotrophicum, Clostridium woodii, Clostridium neopropanologen или любую их комбинацию.
1
Согласно некоторым другим вариантам реализации изобретения, метаболизирующие C микроорганизмы представляют собой эукариоты, такие как дрожжи, в том числе Candida, Yarrowia, Hansenula, Pichia, Torulopsis или Rhodotorula.
1
1
Согласно другим вариантам реализации изобретения, метаболизирующий C нефотосинтезирующий микроорганизм представляет собой рекомбинантный микроорганизм, содержащий гетерологичный полинуклеотид, кодирующий фермент синтеза жирных кислот, фермент ассимиляции формальдегида или их комбинацию. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, гетерологичный полинуклеотид кодирует тиоэстеразу, малонил-КоА: ацилпереносящий белок-трансацилазу, ацетил-КоА-карбоксилазу или любую их комбинацию. Например, тиоэстераза может представлять собой кодон-оптимизированный tesA E. coli, в котором отсутствует последовательность нацеливания на периплазму; малонил-КоА: ацилпереносящий белок-трансацилаза может представлять собой кодон-оптимизированный fabD E. coli; и ацетил-КоА-карбоксилаза может представлять собой кодон-оптимизированный ассА, ассВ, ассС, accD E. Coli, или любую их комбинацию. Согласно некоторым другим вариантам реализации изобретения, метаболизирующий C микроорганизм дополнительно содержит мутацию, которая минимизирует или устраняет активность жирная кислота: КоА-лигазы.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
1
На фиг. 1 показана типичная концептуальная модель реакторной системы на основе метаболизирующего C микроорганизма, предназначенная для улавливания метана и превращения его в алкановое топливо согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения.
1
На фиг. 2 показана типичная концептуальная модель реакторной системы на основе метаболизирующего C микроорганизма, предназначенная для улавливания метана и превращения его в биодизельное топливо согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения.
На фиг. 3A и 3B показано, что рекомбинантный Methylobacter capsulatus, экспрессирующий TesA' (ген TesA из Е. coli с удаленной последовательностью нацеливания на периплазму) приводит (A) к увеличению продуцирования свободных жирных кислот, и (B) указанное увеличение основном обусловлено повышенными уровнями C16:0 и C18:0 липидов.
На фиг. 4A и 4B показаны ГХ/МС-хроматограммы масляной композиции, экстрагированной из М. Trichosporium, до (A) и после (B) гидролиза и переэтерификации с применением KOH в смеси толуол : метанол.
На фиг. 5A и 5B показаны ГХ/МС-хроматограммы масляной композиции, экстрагированной из M. Capsulatus, до (A) и после (B) гидролиза и переэтерификации с применением KOH в смеси толуол : метанол.
На фиг. 6A и 6B показаны ГХ/МС-хроматограммы масляной композиции, экстрагированной из Methylomonas sp. 16a, до (A) и после (B) гидролиза и переэтерификации с применением KOH в смеси толуол : метанол.
13
На фиг. 7 показана схема распределения δC в разных источниках углерода.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
1
В настоящем изобретении предложены композиции, способы и системы для получения биотоплив и биопластика, в которых культивируют метаболизирующие C микроорганизмы с получением биомассы, характеризующейся максимальным накоплением биомасла. Например, предложен способ ферментации, включающий превращение метана в биотопливо и представляющий собой масштабируемый промышленный процесс. Такой новый подход позволяет использовать, например, метилотрофные или метанотрофные бактерии в качестве новой системы-хозяина для продуцирования биомассы с получением биотоплива в форме, например, эстерифицированного биодизельного топлива или алканового топлива для гидрообработки или для биопластика в форме полигидроалканоатов (ПГА). Кроме того, представляющую интерес масляную композицию можно получить из метилотрофных или метанотрофных бактерий, поскольку указанные организмы могут аккумулировать значительные количества мембранных липидов в условиях, описанных в настоящей заявке и, более того, указанные микроорганизмы продуцируют высокое содержание мембран.
В качестве справочной информации, метан из различных источников, в том числе природного газа, представляет собой имеющийся в изобилии отечественный ресурс. Химические подходы, направленные на разработку технологии превращения газа в жидкости (ГВЖ) для улучшения использования метана в качестве топлива имеют на сегодняшний день только ограниченный успех, несмотря на значительные капиталовложения. Напротив, на развитие современных биотехнологических подходов в отношении разработки способов ГВЖ были потрачены небольшие усилия. Некоторые ограничения, в первую очередь, стоимость сахарного сырья, препятствовали экономически выгодному производству биотоплива с применением микробных систем. Эксплуатация дешевого, имеющегося в изобилии внутри страны углеродного сырья, такого как метан, является экономически рациональной альтернативой производства биотоплива. С помощью новых биотехнологических инструментов и методов были разработаны новые промышленные микроорганизмы, которые обеспечивают биопроцесс ГВЖ в промышленном масштабе, как описано в настоящей заявке. Кроме того, характеристики топлива после переработки и повышения качества экстрагированных липидов демонстрируют падающий потенциал для таких применений, как дизельное топливо, газолин, топливо для реактивных двигателей или олефины.
1
1
1
Согласно одному из аспектов, в настоящем изобретении предложен способ получения топлива в устройстве переработки путем переработки масляной композиции, полученной из метаболизирующего C нефотосинтезирующего микроорганизма, с получением топлива. Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ получения топлива путем превращения биомассы из культуры, в основном содержащей метаболизирующий C нефотосинтезирующий микроорганизм, в масляную композицию и обработку масляной композиции с получением топлива. В другом аспекте, в настоящем изобретении предложена установка для биопереработки, содержащая блок обработки, в котором масляную композицию получают из метаболизирующего C нефотосинтезирующего микроорганизма; и устройство переработки для переработки масляной композиции с получением топлива.
13
13
Согласно другому аспекту, в настоящем изобретении предложена масляная композиция или полученная из нее биотопливная композиция, содержащая молекулы, содержащие атомы водорода и углерода, составляющие по меньшей мере от примерно 50% до примерно 99% относительно массы композиции, при этом δC композиции составляет менее - 30‰ или составляет от примерно - 70‰ до примерно - 35‰, или, при смешивании с компонентом топлива с получением топливного продукта, составляет от примерно - 37‰ до примерно - 10‰. В соответствующем аспекте, в настоящем изобретении предложена биомасса, δC которой составляет менее - 30‰ или находится в диапазоне от примерно - 35‰ до примерно - 50‰, от - 45‰ до примерно - 35‰, или от примерно - 50‰ до примерно - 40‰, или от примерно - 45‰ до примерно - 65‰, или от примерно - 60‰ до примерно - 70‰, или от примерно - 30‰ до примерно - 70‰.
Перед более подробным изложением настоящего изобретения, может быть полезным для его понимания дать определения некоторым терминам, применяемым настоящей заявке. Дополнительные определения приведены по всему тексту настоящего описания.
В настоящем описании подразумевают, что любой диапазон концентраций, диапазон процентных отношений, диапазон соотношений или диапазон целочисленных значений включает величину любого целочисленного значения в пределах приведенного диапазона и, когда это целесообразно, его доли (такие как одна десятая и одна сотая целого числа), если не указано иное. Кроме того, подразумевают, что любой диапазон чисел, приведенный в настоящей заявке в отношении любого физического свойства, такого как элементарные звенья полимера, размер или толщина, включает любой целочисленное значение в пределах приведенного диапазона, если не указано иное. В настоящей заявке, термин «примерно» означает ±20% от указанного диапазона, значения или структуры, если не указано иное. Термин «состоящий в основном из» ограничивает объем формулы изобретения конкретными материалами или стадиями или теми материалами или стадиями, которые по существу не влияют на основные и новые характеристики заявленного изобретения. Следует иметь в виду, что в настоящей заявке термины в единственном числе относятся к «одному или более» перечисленных компонентов. Следует понимать, что применение альтернативного варианта (например, «или») означает любой один, оба или любая комбинация альтернативных вариантов. В настоящей заявке, термины «включают», «имеют» и «содержат» применяют синонимично, что предполагает толкование указанных терминов и их вариантов как неограничивающих.
1
1
1
В настоящей заявке, «C субстрат» или «C соединение» относится к любой углеродсодержащей молекуле или композиции, у которой отсутствует связь углерод-углерод. Типичные C субстраты включают природный газ, нетрадиционный природный газ, синтез-газ, метан, метанол, формальдегид, муравьиную кислоту или ее соль, моноксид углерода, диоксид углерода, метилированные амины (например, метиламин, диметиламин, триметиламин, и т.п.), метилированные тиолы, метилгалогены (например, бромметан, хлорметан, иодметан, дихлорметан, и т.п.), цианид или любую их комбинацию.
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
В настоящей заявке, «метаболизирующий C микроорганизм» или «метаболизирующий C нефотосинтезирующий микроорганизм» относится к любому микроорганизму, обладающему способностью использовать C субстрат в качестве источника энергии или в качестве своего основного источника энергии и биомассы, и который может использовать или не использовать другие углеродные субстраты (такие как сахара и сложные углеводы) для энергии и биомассы. Например, метаболизирующий C микроорганизм может окислять C субстрат, такой как метан или метанол. Метаболизирующие C микроорганизмы включают бактерии (такие как метанотрофы и метилотрофы) и дрожжи. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, метаболизирующий C микроорганизм не включает фотосинтезирующий микроорганизм, такой как водоросль. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, метаболизирующий C микроорганизм будет представлять собой «облигатный метаболизирующий C микроорганизм», что означает, что его единственным источником энергии являются C субстраты. Согласно другим вариантам реализации изобретения, метаболизирующий C микроорганизм (например, метанотроф) будет расти в культурной среде в присутствии сырья, представляющего собой C субстрат (т.е., при применении C субстрата в качестве источника энергии).
1
1
В настоящей заявке, термин «метилотрофные бактерии» относится к любым бактериям, способным окислять любое соединение в любой форме (например, твердое вещество, жидкость, газ), которое содержит по меньшей мере один углерод и которое не содержит связи углерод-углерод. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, метилотрофная бактерия может представлять собой метанотроф. Например, «метанотрофные бактерии» относятся к любым метилотрофным бактериям, которые обладают способностью окислять метан в качестве источника углерода и энергии, который может представлять собой основной источник углерода и энергии. Типичные метанотрофные бактерии включают Methylomonas, Methylobacter, Methylococcus, Methylosinus, Methylocystis, Methylomicrobium или Methanomonas. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, метилотрофная бактерия представляет собой «облигатную метилотрофную бактерию», относящуюся к бактериям, которые ограничены применением C субстратов для выработки энергии. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, метилотрофные бактерии представляют собой «факультативные метанотрофные бактерии», которые наряду с C субстратами по природе способны использовать субстраты, содержащие несколько атомов углерода, такие как ацетат, пируват, сукцинат, малат или этанол, в качестве их источника углерода и энергии. Факультативные метанотрофы включают некоторые виды Methylocella, Methylocystis, Methylocapsa (например, Methylocella silvestris, Methylocella palustris, Methylocella tundrae, Methylocystis daltona SB2, Methylocystis bryophila, и Methylocapsa aurea KYG), и Methylobacterium organophilum (ATCC 27, 886).
В настоящей заявке, термин «утилизирующая CO бактерия» относится к бактерии, которая по природе обладает способностью окислять моноксид углерода (CO) в качестве источника углерода и энергии. Можно использовать моноксид углерода из «синтез-газа» или «синтез-газа», смеси моноксида углерода и водорода, образующейся при газификации любого органического сырья, такого как уголь, угольная нефть, природный газ, биомасса или органические отходы. Утилизирующие CO бактерии не включают бактерии, которые должны быть генетически модифицированы для выращивания на CO в качестве источника углерода.
2
2
2
В настоящей заявке, «синтез-газ» относится к смеси, содержащей моноксид углерода (CO) и водород (H). Синтез-газ может также включать CO, метан, и другие газы в меньших количествах относительно CO и H.
«Рост» определяют как увеличение клеточной массы. Такое увеличение может происходить путем деления клеток (репликации) и образования новых клеток при «сбалансированном росте» или при «несбалансированном росте», когда клеточная масса увеличивается вследствие аккумулирования конкретного соединения или полимера, такого как некоторые липиды. В последнем случае рост может проявляться в виде увеличения размера клеток вследствие аккумулирования биополимера внутри клетки.
Во время «сбалансированного клеточного роста» все сырье (электронные доноры и акцепторы электронов) и все питательные вещества присутствуют в соотношениях, необходимых для создания всех макромолекулярных компонентов клетки. То есть, сырье или питательное вещество не ограничивает синтез белков, сложных углеводных полимеров, жиров или нуклеиновых кислот. Напротив, во время «несбалансированного клеточного роста» сырье или питательное вещество, необходимое для построения одной или более макромолекул клетки, не присутствует в количестве или соотношении, требуемом для сбалансированного роста. Соответственно, такое сырье или питательное вещество становится ограничивающим фактором и называется «ограничивающим питательным веществом».
Некоторые клетки могут все еще обеспечивать чистый рост при несбалансированных условиях, но такой рост является несбалансированным, и полимеры, которые могут синтезироваться в отсутствии ограничивающего сырья или питательного вещества, будут аккумулироваться. Указанные полимеры включают липиды или продукты, хранящиеся внутри клеток, такие как полигидроксиалканоаты (ПГА), в том числе полигидроксибутират (ПГБ), полигидроксивалерат (ПНВ), и полигидроксигексаноат (ПГГ)-гликоген, или секретируемые материалы, такие как внутриклеточный полисахарид. Указанные масляные композиции можно применять при производстве биопластика.
Типичные сбалансированные и несбалансированные условия роста могут различаться по содержанию азота в средах. Например, азот составляет примерно 12% относительно сухой массы клеток, что означает, что для выращивания 100 мг/л сухой массы клеток необходимо обеспечить 12 мг/л азота (например, в форме нитрата или соли аммония вместе с сырьем и другими питательными веществами в требуемых стехиометрических соотношениях). Не желая быть связанными теорией, предполагают, что фиксация атмосферного азота с образованием аммиака (т.е. посредством фиксации азота) не является важным источником азота для биосинтетических промежуточных соединений или клеточных компонентов. Если другое сырье и питательные вещества доступны в количествах, необходимых для получения 100 мг/л сухой массы клеток, но поступает меньше 12 мг/л азота, то может происходить несбалансированный клеточный рост с аккумулированием полимеров, не содержащих азот. Если впоследствии подают азот, накопленный полимер может служить в качестве сырья для клетки, обеспечивая сбалансированный рост с репликацией и образованием новых клеток.
В настоящей заявке термин «ростовой цикл», применимый к клетке или микроорганизму, относится к метаболическому циклу, посредством которого клетка или микроорганизм развивается в условиях культивирования. Например, цикл может включать различные стадии, такие как лаг-фаза, экспоненциальная фаза, конец экспоненциальной фазы и стационарная фаза.
Термин «экспоненциальный рост», «экспоненциальная фаза роста», «логарифмическая фаза» или «логарифмическая фаза роста» относятся к скорости, с которой микроорганизмы растут и делятся. Например, во время логарифмической фазы, микроорганизмы растут с их максимальной скоростью с учетом их генетического потенциала, природы среды и условий, при которых их выращивают. Скорость роста микроорганизма является постоянной во время экспоненциальной фазы, и микроорганизм делится и его количество удваивается через равные промежутки времени. Клетки, которые являются «активно растущими», представляют собой клетки, которые растут в логарифмической фазе. Напротив, «стационарная фаза» относится к точке в цикле роста, во время которой рост культуры клеток замедляется или даже прекращается. Термин «окружающая среда, изменяющая рост» относится к энергии, химическим веществам или живым существам, обладающим способностью подавлять клеточный рост или уничтожать клетки. Ингибиторы могут включать мутагены, лекарственные препараты, антибиотики, УФ свет, экстремальную температуру, pH, метаболические побочные продукты, органические химические вещества, неорганические химические вещества, бактерии, вирусы или т.п.
1
1
В настоящей заявке, «быстрорастущий вариант» относится к организму, микроорганизму, бактерии, дрожжам или клетке, способной расти с помощью C субстрата, такого как метан или метанол, в качестве единственного или основного источника углерода и энергии и которая характеризуется скоростью роста в экспоненциальной фазе, более быстрой, чем в случае родительского, эталонного или дикого типа организма, микроорганизма, бактерии, дрожжей или клетки - то есть, быстрорастущий вариант имеет более быстрое время удвоения и, следовательно, высокую скорость роста и высокий выход клеточной массы на грамм метаболизируемого C субстрата по сравнению с родительской клеткой (см., например, патент США №6689601).
В настоящей заявке, «биотопливо» относится к топливу, по меньшей мере частично полученному из «биомассы».
1
1
1
1
1
1
В настоящей заявке «биомасса» или «биологический материал» относится к органическому материалу биологического происхождения, который может включать одну или более цельных клеток, лизированных клеток, внутриклеточный материал или т.п. Например, материал, собранный из культивируемого микроорганизма (например, бактериальной или дрожжевой культуры) считается биомассой, которая может включать клетки, клеточные мембраны, клеточную цитоплазму, тельца включений, продукты, секретируемые или экскретируемые в культуральную среду, или любую их комбинацию. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, биомасса содержит метаболизирующие C микроорганизмы согласно настоящему изобретению вместе с культивирующими средами, в которых выращивали метаболизирующие C микроорганизмы согласно настоящему изобретению. Согласно другим вариантам реализации изобретения, биомасса содержит метаболизирующие C микроорганизмы (цельные или лизированные или и то, и другое) согласно настоящему изобретению, извлеченные из культуры, растущей на C субстрате (например, природном газе, метане). Согласно другим вариантам реализации изобретения, биомасса содержит супернатант отработавшей среды из культуральной жидкости метаболизирующего C микроорганизма, культивируемого на C субстрате. Такую культуру можно рассматривать как возобновляемый ресурс.
В настоящей заявке, «масляная композиция» относится к липидному содержанию биомассы (например, бактериальной культуры), в том числе к содержанию жирных кислот, сложных эфиров жирных кислот, триглицеридов, фосфолипидов, полигидроксиалканоатов, изопренов, терпенов или т.п. Масляную композицию биомассы можно экстрагировать из остатка материала биомассы с помощью способов, описанных в настоящей заявке, таких экстракция гексаном или хлороформом. Кроме того «масляную композицию» можно обнаружить в любой одной или более участках культуры, включая клеточную мембрану, клеточную цитоплазму, тельца включений, секретируемые или экскретируемые в культуральную среду, или любую их комбинацию. Масляная композиция не является ни природным газом, ни сырой нефтью.
В настоящей заявке, термин «хозяин» относится к клетке или микроорганизму (например, метанотрофу), который можно генетически модифицировать с помощью молекулы экзогенной нуклеиновой кислоты с образованием представляющего интерес полипептида (например, тиоэстеразы [tesA], ацетил-КоА-карбоксилазы [accABCD], малонил-КоА: АСР-трансацилазы [fabD]). Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, клетка-хозяин может уже обладать другими генетическими модификациями или быть модифицирована таким образом, чтобы включать другие генетические модификации, которые придают требуемые свойства, связанные или несвязанные с биосинтезом липидов (например, клетка может быть модифицирована путем исключения, изменения или процессирования длинноцепочечной жирной кислоты КоА-лигазы [fadD]). Например, клетка-хозяин может обладать генетическими модификациями, которые минимизируют или уменьшают расщепление жирных кислот, минимизируют или уменьшают продуцирование ингибиторов роста клетки-хозяина, обеспечивают быстрый рост, устойчивость к загрязняющим веществам или конкретным условиям культивирования (например, кислотоустойчивость, устойчивость к биоцидам), способность метаболизировать дополнительные углеродные субстраты или способность синтезировать дополнительные необходимые продукты или промежуточные вещества.
В настоящей заявке, «рекомбинантный» или «искусственный» относится к организму, микроорганизму, клетке, молекуле нуклеиновой кислоты или вектору, который имеет по меньшей мере одно генетическое изменение или был модифицирован путем введения молекулы гетерологичной нуклеиновой кислоты, или относится к клетке, которая была изменена таким образом, чтобы можно было регулировать экспрессию молекулы эндогенной нуклеиновой кислоты или гена. Рекомбинантный также относится к клетке, которую получают из клетки или которая является потомком клетки, содержащей одну или более таких модификаций. Генетические изменения включают, например, модификации, вносящие способные к экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие белки или ферменты, или другие присоединения, делеции, замещения молекул нуклеиновой кислоты или другое функциональное изменение генетического материала клетки. Например, рекомбинантные клетки могут экспрессировать гены или другие молекулы нуклеиновой кислоты, которые не встречаются в идентичной форме в нативной клетке (т.е., немодифицированной клетке или клетке дикого типа), или могут обеспечить измененный профиль экспрессии эндогенных генов, таких генов, которые можно иным образом сверхэкспрессировать, недостаточно экспрессировать, минимально экспрессировать или не экспрессировать совсем.
Рекомбинантные способы экспрессии экзогенных или гетерологичных нуклеиновых кислот в микробных организмах хорошо известны в данной области техники. Описание таких способов можно найти, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley и Sons, Baltimore, MD (1999). Типичные экзогенные белки или ферменты, подлежащие экспрессии, включают тиоэстеразу, одну или более ацетил-КоА-карбоксилаз, малонил-КоА: ACP-трансацилазу или любую их комбинацию. Генетические модификации молекул нуклеиновых кислот, кодирующих ферменты или их функциональные фрагменты, могут придавать биохимическую или метаболическую способность рекомбинантной клетке, которая изменена по сравнению с ее естественным состоянием.
В настоящей заявке, термин «эндогенный» или «нативный» относится к гену, белку, соединению или активности, которая обычно присутствует в клетке-хозяине. Термин «гомологичный» или «гомолог» относится к молекуле или активности, относящейся к экзогенному (ненативному) источнику, который представляет собой такую же или похожую молекулу или активность, обнаруживаемую в клетке, виде или штамме хозяина или получаемую из такой клетки, вида или штамма.
В настоящей заявке, молекула, конструкт или последовательность «гетерологичной» нуклеиновой кислоты относится к молекуле нуклеиновой кислоты или части последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, которая не является нативной по отношению к клетке, в которой ее экспрессируют, к молекуле нуклеиновой кислоты или части молекулы нуклеиновой кислоты, нативной по отношению к клетке-хозяину, которая была изменена или подверглась мутации, или к молекуле нуклеиновой кислоты с измененной экспрессией по сравнению с уровнями нативной экспрессии в похожих условиях. Например, гетерологичную управляющую последовательность (например, промотор, энхансер) можно использовать для регулирования экспрессии гена или молекулы нуклеиновой кислоты, которая в какой-то мере отличается от гена или молекулы нуклеиновой кислоты, обычно экспрессируемой в природе или культуре. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, молекула гетерологичной нуклеиновой кислоты может быть гомологичной относительно гена нативной клетки-хозяина, но может иметь измененный уровень экспрессии или содержать другую последовательность или и то, и другое. Согласно другим вариантам реализации изобретения, молекулы гетерологичной или экзогенной нуклеиновой кислоты могут быть не эндогенными относительно клетки-хозяина или генома хозяина, но в качестве альтернативы их можно было внести в клетку-хозяина путем конъюгации, трансформации, трансфекции, электропорации или т.п., при этом внесенная молекула может встраиваться в геном хозяина или может существовать в виде экстрахромосомного генетического материала (например, плазмиды или другого самореплицирующегося вектора).
1
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, более чем одна молекула гетерологичной или экзогенной нуклеиновой кислоты может быть введена в клетку-хозяина в виде отдельных молекул нуклеиновой кислоты, в виде полицистронной молекулы нуклеиновой кислоты, в виде одной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей гибридный белок, или любой их комбинации, и все еще может рассматриваться как более чем одна гетерологичная или экзогенная нуклеиновая кислота. Например, метаболизирующий C микроорганизм можно модифицировать таким образом, чтобы он экспрессировал две или более молекулы гетерологичной или экзогенной нуклеиновой кислоты, которые могут быть одинаковыми или разными, которые кодируют одну или более тиоэстераз, как описано в настоящей заявке. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, многократные копии полинуклеотидной молекулы кодирующей тиоэстеразу (ТЕ), вводят в клетку-хозяина, которая может представлять собой две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более копий полинуклеотидов, кодирующих одну и ту же ТЕ или другую ТЕ.
1
Когда две или более молекул экзогенной нуклеиновой кислоты вводят в метаболизирующий C микроорганизм хозяина, понятно, что еще две молекулы экзогенной нуклеиновой кислоты можно ввести в виде одной молекулы нуклеиновой кислоты (например, на один вектор), на отдельные вектора, встроенные в хромосому хозяина на одном сайте или нескольких сайтах, и каждый из указанных вариантов реализации изобретения все еще следует рассматривать как две или более молекулы экзогенной нуклеиновой кислоты. Таким образом, количество упомянутых молекул гетерологичной нуклеиновой кислоты или активность белка относится к количеству кодирующих молекул нуклеиновой кислоты или показателю активности белка, не к количеству отдельных молекул нуклеиновой кислоты, введенных в клетку-хозяина.
«Идентичность, выраженная в процентах» двух или более последовательностей нуклеиновых кислот представляет собой функцию количества идентичных позиций, совместно используемых последовательностями (т.е., идентичность, % = количество идентичных позиций / общее количество позиций × 100), с учетом количества разрывов и длины каждого разрыва, который необходимо внести, чтобы оптимизировать выравнивание двух или более последовательностей. Сравнение последовательностей и установление идентичности в процентах двух или более последовательностей можно выполнить, используя математический алгоритм, такой как программы BLAST и Gapped BLAST при их параметрах, используемых по умолчанию (например, Altschul et al., J. Mol. Biol. 275:403, 1990; см. также BLASTN на сайте www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
nd
В данной области техники «консервативным замещением» считается замещение одной аминокислоты на другую аминокислоту, имеющую похожие свойства. Типичные консервативные замещения хорошо известны в данной области техники (см., например, WO 97/09433, р. 10; Lehninger, Biochemistry, 2 Edition; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), pp. 71-77; Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY и Cell Press, Cambridge, MA (1990), p. 8).
В настоящей заявке «сверхэкспрессируемый» в отношении гена или белка означает увеличение экспрессии или активности гена или белка. Повышенная экспрессия или активность включает экспрессию или активность гена или белка, повышенную относительно уровня контрольного микроорганизма дикого типа (не созданного методами генетической инженерии) или эталонного микроорганизма. Ген или белок сверхэкспрессируется, если экспрессия или активность имеет место в микроорганизме, где он обычно не экспрессируется или не активен. Ген или белок сверхэкспрессируется, если экспрессия или активность расширена или протекает дольше в рекомбинантном микроорганизме, чем в контрольном микроорганизме дикого типа или эталонном микроорганизме.
В настоящей заявке «ингибирование» или «ингибированный» относится, непосредственно или косвенно, к изменению, уменьшению, угнетающей регуляции, устранению или делеции при экспрессии гена-мишени или активности молекулы-мишени (например, длинноцепочечная жирная кислота: КоА-лигазы) по сравнению с контрольной, эндогенной или эталонной молекулой, при этом изменение, уменьшение, угнетающая регуляция или устранение является статистически, биологически, промышленно или клинически значимым.
В настоящей заявке, «установка для биопереработки» относится к средствам производства, которые объединяют оборудование и способы превращения биомассы для получения топлива из биомассы.
В настоящей заявке «установка по переработке» относится к нефтеперерабатывающему заводу или его аспектам, в котором можно обрабатывать масляные композиции (например, биомассу, биотопливо или ископаемые топлива, такие как сырая нефть, уголь или природный газ). Типичные процессы, выполняемые на нефтеперерабатывающих заводах, включают крекинг, переэтерификацию, риформинг, дистилляцию, гидроочистку, изомеризацию или любую их комбинацию.
Системы для производства биотоплива
1
Системы для получения биотоплива согласно настоящему изобретению могут включать отдельные блоки (например, близко расположенные или прилегающие друг к другу или не прилегающие), комплексные блоки или сама система может быть объединенной и частично или полностью комплексной. В системах согласно настоящему изобретению можно использовать биомассу микроорганизма, выращенного в комплексной установке для биопереработки с получением топливных композиций и топливных продуктов, в частности биотоплива. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, в установке для биопереработки в качестве биомассы используют одну биомассу или смешанную биомассу с получением топлива (например, дизельного топлива, топлива для реактивных двигателей, газолина), такую как метаболизирующий C микроорганизм (например, метанотроф, такой как Methylosinus trichosporium OB3b, Methylococcus capsulatus Bath, Methylomonas sp. 16a, Methylomonas methanica, Methylomicrobium alcaliphilum или их быстрорастущие варианты).
Типичная система биопереработки проиллюстрирована на фиг. 1. В такой системе можно выполнить одну или более из следующих стадий: культивирование представляющего интерес штамма микроорганизма (например, метанотрофа, метилотрофа или дрожжей), которые могут иметь одно или более улучшенных свойств (например, быть рекомбинантными, иметь более быструю скорость роста, способность расти при высоком pH, проявлять улучшенную усвояемость питательных веществ, термоустойчивость, повышенный выход биомассы), выделение из микроорганизма продукта, такого как масляная композиция (например, жирные кислоты, триглицериды, фосфолипиды, изопрены, терпены, РНА или любая их комбинация), и обработку масляной композиции с получением предшественников пластмассы или одного или более видов топлива, таких как топливо для реактивных двигателей, дизельное топливо, газолин или их комбинация. С помощью указанной системы можно одновременно или последовательно получить различные биотопливные композиции и продукты. Например, система может включать установку или блок гидрообработки, в которой можно превратить масляную композицию в топливо для реактивных двигателей и дизельное топливо. Система может также включать установку по переработке нефти, в которой можно превратить сырую нефть и продукты, получаемые на установке гидрообработки, в газолин. Например, при производстве топлива для реактивных двигателей и дизельного топлива можно получить дополнительные продукты, такие как нафта и легкие углеводороды, в том числе, пропан, которые затем используют для получения газолина. Типичные легкие углеводороды включают метан, этан, пропан, бутан, пентан, бутанол и изобутанол. В другом примере при производстве газолина можно получить дополнительные продукты, такие как дизельное топливо, которые можно использовать для получения топлива для реактивных двигателей.
Альтернативная типичная система биопереработки показана на фиг. 2. В такой системе можно выполнить одну или более из следующих стадий: культивирование представляющего интерес штамма микроорганизма (например, метанотрофа, метилотрофа или дрожжей), которые могут иметь одно или более улучшенных свойств (например, быть рекомбинантными, иметь более быструю скорость роста, способность расти при высоком pH, проявлять улучшенную усвояемость питательных веществ, термоустойчивость, повышенный выход биомассы), выделение из микроорганизма продукта, такого как масляная композиция (например, жирных кислот, сложных эфиров жирных кислот, триглицеридов, фосфолипидов, изопренов, терпенов, РНА или любой их комбинации), и модифицирование масляной композиции с получением биодизельной топливной композиции. Например, система может включать установку или блок эстерификации, в котором можно превратить масляную композицию в биодизельной топливо посредством реакции со спиртом. Типичные спирты включают метанол, этанол, пропанол, бутанол или жирные спирты с более длиной цепью.
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, в системах, описанных в настоящей заявке, в качестве микроорганизма используют бактерии, такие как метилотрофы или метанотрофы или дрожжи. Бактерии или дрожжи можно собрать и отделить от культуральных сред (если их не выращивают, например, в виде биопленки), получив в результате бактериальную или дрожжевую пасту. Перед получением масляной композиции из биомассы бактериальную или дрожжевую биомассу можно высушить. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, бактериальная или дрожжевая биомасса остается до некоторой степени влажной и ее не нужно полностью высушивать перед получением, отделением или экстрагированием масляной композиции. Бактериальные или дрожжевые масляные композиции можно экстрагировать из биомассы и отделить от бактериальной или дрожжевой твердой фазы или шлама.
Экстракцию масляной композиции можно выполнить с применением других различных способов или растворителей (например, полярного растворителя, неполярного растворителя, нейтрального растворителя, кислого растворителя, щелочного растворителя, гексана или их комбинации), таких как гексан или кислый метанол или смесь хлороформ/метанол, в способах, таких как способы, более подробно описанные в настоящей заявке, или с применением других способов экстракции, известных в данной области техники.
1
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, масляную композицию метаболизирующего C микроорганизма (например, метанотрофа), содержащуюся в собранной биомассе, отделяют от биомассы путем приведения в контакт с большими сдвиговыми усилиями с органическим растворителем (например, гексаном) и облагораживающим реагентом. В качестве справочной информации, масло растворяется в гексане или других похожих растворителях, образуя раствор мисцеллы, тогда как вода и твердое клеточное вещество не растворяются и могут быть отделены от мисцеллы. Несмешиваемость воды и гексана используют для достижения требуемого отделения. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, после смешивания с большими сдвиговыми усилиями, смесь масляной композиции/гексана/воды направляют в декантатор, где ее разделяют на две различные жидкости: фазу (мисцеллу), содержащую более легкие гексан и масляную композицию, и фазу, содержащую более тяжелые воду и отработавшее твердое вещество. Согласно другим вариантам реализации изобретения, мисцеллу из декантатора направляют в процесс дистилляции, в котором масляную композицию отделяют от растворителя, что позволяет извлекать и повторно использовать растворитель и очищает масло до той степени, при которой оно готово для последующей обработки. При дистилляции, например, используют преимущество, состоящее в разнице между точками кипения растворителя и масла, для разделения указанных двух компонентов.
2
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, масляную композицию, предложенную в настоящем изобретении, подвергают переработке. Переработка может включать крекинг, переэтерификацию, риформинг, дистилляцию, гидроочистку, изомеризацию или их комбинацию. При необходимости, переработка может включать удаление загрязняющих веществ. Например, гетероатомы и металлы можно удалить путем гидрообработки (например, гидродеазотирования (HDN), гидродеоксигенирования (HDO), гидродесульфирования (HDS), гидродеметаллизации (HDM)). Гидрообработка также может включать насыщение олефинов, гидрообработку дистиллятов, гидрообработку вакуумного газойля, гидрообработку остатка в неподвижном слое или их комбинацию. При гидрообработке масляной композиции можно получить топливо для реактивных двигателей или дизельное топливо. Масляную композицию можно также очистить с помощью крекинга, такого как каталитический крекинг, с получением газолина. Типичные способы крекинга могут включать каталитический крекинг, флюид-каталитический крекинг, паровой крекинг, гидрокрекинг, термический крекинг, термический каталитический крекинг или их комбинацию. Переработку путем гидрообработки и крекинга можно осуществлять одновременно (протекают оба процесса) или альтернативно (протекает один или другой процесс). Процессы переработки также можно осуществлять последовательно один за другим, например, продукты, полученные при гидрообработке, затем можно обработать посредством крекинга. Продукты, полученные с применением одного способа переработки (например, H), можно также в дальнейшем использовать в другом способе переработки. Процессы переработки можно выполнять в отдельных блоках системы или в одном и том же блоке. Более того, бактериальное или дрожжевое твердое вещество или шлам можно использовать для получения топлива, корма для животных или энергии, такого как метан, выделяющийся при разложении твердого вещества или шлама.
1
1
1
Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложена установка для биопереработки, содержащая: (а) блок обработки, в котором масляную композицию получают из метаболизирующего C нефотосинтезирующего микроорганизма; и (b) устройство переработки для переработки масляной композиции с получением топлива. Согласно другим вариантам реализации изобретения, установка для биопереработки может дополнительно содержать блок регулируемого культивирования для выращивания метаболизирующего C нефотосинтезирующего микроорганизма в присутствии сырья, содержащего C субстрат, при этом культивируемые бактерии продуцируют масляную композицию.
Типичные блоки регулируемого культивирования включают ферментатор, биореактор, половолоконную ячейку, биореактор с фильтрующим наполнителем или т.п. Согласно другим вариантам реализации изобретения, культуру можно выращивать в форме жидкофазной ферментации или твердофазной ферментации. Например, бактерии, такие как метилотрофы или метанотрофы, можно культивировать в биореакторе, содержащим сбалансированные среды или несбалансированные среды, которые содержат ограничивающие количества фосфора, азота, микроэлементов, кислорода или любой их комбинации, так что некоторые липиды или другие представляющие интерес полимеры (например, ПГА) аккумулируются в клетках.
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, культуры включают бактериальное сообщество, в том числе, различные метилотрофы или метанотрофы, которые продуцируют самые высокие уровни представляющей интерес масляной композиции (т.е., с высоким соотношением, масс./масс., липидов к биомассе). Можно использовать целый ряд конфигураций биореактора, в том числе мембранные биореакторы для секвенирования и конфигурацию для непрерывного многостадийного роста в суспензии. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, биореактор функционирует таким образом, что в нем происходит отбор бактерий, эффективно продуцирующих представляющую интерес масляную композицию из метана, например, условия в биореакторе позволяют отсеять те бактерии, которые или не продуцируют представляющую интерес масляную композицию из метана или продуцируют такую композицию неэффективно.
1
1
Согласно другим вариантам реализации в настоящем изобретении предложен блок регулируемого культивирования, в котором при ферментации в твердой фазе C субстрат (например, метан или синтез-газ) доставляют в газовой фазе к микробным биопленкам. Согласно другим вариантам реализации изобретения, при ферментации в твердой фазе устанавливают сбалансированные или несбалансированные условия роста. Согласно другим вариантам реализации изобретения, метилотрофы или метанотрофы выращивают при сбалансированных условиях роста, собирают и отделяют от жидкой фазы и переносят в камеру для проведения ферментации в твердой фазе, куда C субстрат поставляют при несбалансированных условиях (например, не включают азот), при этом бактерии потребляют субстрат и вырабатывают представляющую интерес масляную композицию.
1
1
1
1
Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложена установка для биопереработки, содержащая (а) блок регулируемого культивирования для выращивания метаболизирующего C нефотосинтезирующего микроорганизма в присутствии сырья, содержащего C субстрат, при этом культивируемые бактерии продуцируют масляную композицию; (b) блок обработки, в котором масляную композицию получают или экстрагируют из метаболизирующего C нефотосинтезирующего микроорганизма; и (с) устройство переработки для переработки масляной композиции с получением топлива. Согласно другим вариантам реализации изобретения, сырьевой C субстрат, применяемый в установке для биопереработки, представляет собой метан, метанол, формальдегид, муравьиную кислоту или ее соль, моноксид углерода, диоксид углерода, синтез-газ, метиламин, метилтиол или метилгалоген.
1
1
1
1
Согласно другим вариантам реализации установки для биопереработки метаболизирующий C нефотосинтезирующий микроорганизм представляет собой метанотроф или метилотроф, сырьевой C субстрат представляет собой природный газ или метан, и бактерии культивируют в аэробных условиях. Согласно другим вариантам реализации изобретения, метанотроф представляет собой Methylosinus trichosporium OB3b, Methylococcus capsulatus Bath, Methylomonas sp. 16a, Methylomonas methanica, Methylomicrobium alcaliphilum, любую их комбинацию или их быстрорастущий вариант, и метилотроф представляет собой Methylobacterium extorquens, Methylobacterium radiotolerans, Methylobacterium populi, Methylobacterium chloromethanicum, Methylobacterium nodulans, любую их комбинацию или их быстрорастущий вариант. Согласно некоторым другим вариантам реализации изобретения, метаболизирующий C нефотосинтезирующий микроорганизм представляет собой облигатный метаболизирующий C нефотосинтезирующий микроорганизм, такой как облигатный метанотроф или метилотроф.
1
1
Согласно другим вариантам реализации изобретения, метаболизирующий C нефотосинтезирующий микроорганизм представляет собой рекомбинантный микроорганизм, содержащий гетерологичный полинуклеотид, кодирующий фермент синтеза жирных кислот, фермент ассимиляции формальдегида или их комбинацию. Например, биосинтез свободных жирных кислот (СЖК), которые можно использовать в качестве предшественников для получения топлива или других ценных химических веществ, можно усилить путем введения гена тиоэстеразы (ТЕ) в метаболизирующий C нефотосинтезирующий микроорганизм согласно настоящему изобретению (например, Methylosinus trichosporium OB3b, Methylococcus capsulatus Bath, Methylomonas sp. 16a, Methylomonas methanica). Биосинтез СЖК также можно усилить путем введения более чем одного гена ТЕ, гена малонил-КоА: ацилпереносящий белок-трансацилазы (FabD, также называемого МСТ), одного или более генов оперона ацетил-КоА-карбоксилазы (AccABCD) или любой их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, продуцирование СЖК можно улучшить путем сверхэкспрессии малонил-КоА: ацилпереносящий белок-трансацилазы (FabD, также называемого МСТ), поскольку первой обязательной стадией биосинтеза жирных кислот является превращение ацетил-КоА в малонил-КоА под действием аденозинтрифосфат (АТФ)-зависимой ацетил-КоА-карбоксилазы с последующим превращением малонил-КоА в малонил-АСР посредством FabD фермента.
1
1
Согласно другим вариантам реализации изобретения, метаболизирующий C нефотосинтезирующий микроорганизм представляет собой рекомбинантный микроорганизм, содержащий генетическую модификацию, которая минимизирует или уменьшает расщепление жирных кислот. Например, метаболизирующий C нефотосинтезирующий микроорганизм представляет собой рекомбинантный микроорганизм, содержащий одну или более мутаций, которые процессируют или нокаутируют активность длинноцепочечная жирная кислота: КоА-лигазы, кодированную одним или более эндогенными генами fadD.
1
Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие белки FadD дикого типа, представляют собой эталонную исходную точку для конструирования мутантных генов fadD. Например, последовательность белка FadD дикого типа, кодированная М. trichosporium OB3b, М. capsulatus Bath, M. methanica, M. extorquens и С. ljungdahlii, находится в банке данных GenBank Accession №№ EFH00931.1, YP_114021.1, YP_004512148.1, YP_002964871.1 и YP_003782065.1, соответственно. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, молекулу нуклеиновой кислоты гена fadD, кодирующего любой из перечисленных выше белков, отдельно модифицируют, чтобы подвергнуть мутации fadD. В примере 2, описанном в настоящей заявке, ген fadD из разного метаболизирующего C микроорганизма синтезировали для внедрения нескольких мутаций остановки и сдвигов рамки в 5'-область гена M. trichosporium OB3b (SEQ ID №: 1), M. methanica (SEQ ID №: 35), M. extorquens (SEQ ID №: 52) и С. ljungdahlii (SEQ ID №: 85). Для гена fadD M. capsulatus, синтезировали молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую внутриклональную делецию, чтобы оставшиеся 5' и 3' концы гена могли соединиться с сохранением первоначальной рамки считывания (SEQ ID №: 18).
1
Для некоторых метаболизирующих C микроорганизмов, в которых последовательность гена fadD не известна (например, Clostridium autoethanogenum), геном можно секвенировать и fadD, гомологичный Е. coli, идентифицируют путем поиска с применением TBLASTN (поиск транслированных нуклеотидных последовательностей гена с последовательностью белка FadD Е. coli). Например, синтезируют молекулу нуклеиновой кислоты гена fadD С. autoethanogenum для введения нескольких мутаций остановки и сдвигов рамки в 5'-область гена.
1
1
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, молекулу нуклеиновой кислоты мутантного fadD клонируют в плазмидном экспрессионном векторе (и, возможно, не имеющем точки начала репликации метаболизирующего C микроорганизма и кодирующем устойчивость к антибиотику) для конъюгации, электропорации или трансформации в метаболизирующем C микроорганизме с применение способов, описанных в настоящей заявке. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, мутант fadD встраивается в геном клетки-хозяина путем гомологической рекомбинации и образует рекомбинантные клетки, в которых отсутствует или которые проявляют минимальную активность длинноцепочечная жирная кислота: КоА-лигазы.
1
1
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, любой или все гены ТЕ, МСТ и Acc, введенные в метаболизирующие C микроорганизмы согласно настоящему изобретению, могут быть сверхэкспрессированы, при этом метаболизирующие C микроорганизмы могут содержать мутацию, которая минимизирует или устраняет активность жирная кислота: КоА-лигазы (например, нокаут fadD).
1
1
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, в блоке обработки для биопереработки можно получить масляную композицию с помощью влажной экстракции, сверхкритической флюидной экстракции, сухой экстракции, термической экстракции (например, посредством отгонки водяным паром, гидротермического сжижения, варки под давлением), ферментативного гидролиза (например, клеточной стенки), экстракции в импульсном электрическом поле, микропузырьков, экстракции в полых волокнах или т.п. Согласно другим вариантам реализации изобретения, влажная экстракция включает применение полярного растворителя, неполярного растворителя, нейтрального растворителя, кислого растворителя, основного растворителя, гексана или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, масляную композицию получают или экстрагируют из клеточной мембраны метаболизирующего C нефотосинтезирующего микроорганизма или указанную композицию можно извлечь из супернатанта культуры при секретировании или экскретировании, или с применением их комбинации. Согласно другим вариантам реализации изобретения, установка для биопереработки дополнительно содержит второй блок обработки, представляющий собой блок обработки отходов, в котором перерабатывают остаток от очищенной масляной композиции и которое включает установку для анаэробного разложения, установку для аэробного разложения или и то, и другое. Согласно другим вариантам реализации изобретения, установка для биопереработки дополнительно содержит трубопровод для подачи по меньшей мере одного продукта из блока обработки отходов для применения при культивировании или поддержании метаболизирующего C нефотосинтезирующего микроорганизма.
2
2
Согласно другим вариантам реализации изобретения, блок обработки для биопереработки дополнительно содержит блок регулируемого культивирования, представляющий собой блок для ферментации в твердой фазе, в котором может происходить культивирование и обработка (например, экстракция) в одном и том же блоке или даже в одной и той же камере. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, установка для биопереработки, объединяющая устройство для культивирования/обработки, включает сверхкритическую флюидную экстракцию, например, посредством сверхкритической жидкости, содержащей CO, метанол или HO.
В некоторых аспектах, любые из описанных выше установок для биопереработки являются комплексными.
1
Метаболизирующие C микроорганизмы
1
1
1
Метаболизирующие C микроорганизмы согласно настоящему изобретению могут быть природными, представлять собой адаптированный штамм (например, проводит ферментацию для выбора штаммов с улучшенными скоростями роста и повышенным общим выходом биомассы по сравнению с родительским штаммом) или могут быть рекомбинантно модифицированными таким образом, чтобы продуцировать представляющие интерес липиды (например, генетически измененными таким образом, чтобы экспрессировать фермент синтеза жирных кислот, фермент ассимиляции формальдегида или их комбинацию) или иметь повышенные скорости роста или и то, и другое. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, метаболизирующие C микроорганизмы не представляют собой такие метаболизирующие C нефотосинтезирующие микроорганизмы, как водоросли или растения.
1
Согласно некоторым вариантам реализации, в настоящем изобретении предложены метаболизирующие C микроорганизмы, которые представляют собой прокариоты или бактерии, такие как Methylomonas, Methylobacter, Methylococcus, Methylosinus, Methylocystis, Methylomicrobium, Methanomonas, Methylophilus, Methylobacillus, Methylobacterium, Hyphomicrobium, Xanthobacter, Bacillus, Paracoccus, Nocardia, Arthrobacter, Rhodopseudomonas или Pseudomonas.
1
Согласно другим вариантам реализации изобретения, метаболизирующие C бактерии представляют собой метанотроф или метилотроф. Типичные метанотрофы включают Methylomonas, Methylobacter, Methylococcus, Methylosinus, Methylocystis, Methylomicrobium, Methanomonas, Methylocella или их комбинацию. Типичные метилотрофы включают Methylobacterium extorquens, Methylobacterium radiotolerans, Methylobacterium populi, Methylobacterium chloromethanicum, Methylobacterium nodulans или их комбинацию.
1
1
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, метанотрофные бактерии созданы методами генетической инженерии со способностью превращать сырье, представляющее собой C субстрат, в масляную композицию. Метанотрофные бактерии обладают способностью окислять метан как источник углерода и энергии. Метанотрофные бактерии классифицируют на три группы на основе их путей ассимиляции углерода и структуры внутренней мембраны: I тип (гамма протеобактерии), II тип (альфа протеобактерии) и Х тип (гамма протеобактерии). Для ассимиляции углерода метанотрофы I типа используют рибулозомонофосфатный (РМФ) путь, тогда как метанотрофы II типа используют сериновый путь. Метанотрофы Х типа используют РМФ путь, но также экспрессируют низкие уровни ферментов серинового пути. Метанотрофные бактерии включают облигатные метанотрофы, которые могут только утилизировать C субстраты как источники углерода и энергии, и факультативные метанотрофы, которые по природе обладают способностью утилизировать некоторые субстраты, содержащие более одного атома углерода, в качестве источника углерода и энергии.
Типичные факультативные метанотрофы включают некоторые виды Methylocella, Methylocystis и Methylocapsa (например, Methylocella silvestris, Methylocella palustris, Methylocella tundrae, Methylocystis daltona штамм SB2, Methylocystis bryophila u Methylocapsa aurea KYG), Methylobacterium organophilum (ATCC 27, 886), Methylibium petroleiphilum или их быстрорастущие варианты. Типичные облигатные метанотрофные бактерии включают Methylococcus capsulatus Bath (NCIMB 11132), Methylomonas sp. 16a (ATCC РТА 2402), Methylosinus trichosporium OB3b (NRRL B-11, 196), Methylosinus sporium (NRRL B-11, 197), Methylocystis parvus (NRRL B-11, 198), Methylomonas methanica (NRRL B-11, 199), Methylomonas albus (NRRL B-11, 200), Methylobacter capsulatus Y (NRRL B-11, 201), Methylomonas flagellata sp. AJ-3670 (FERM P-2400), Methylacidiphilum infernorum и Methylomicrobium alcaliphilum или их быстрорастущие варианты.
1
Согласно другим вариантам реализации в настоящем изобретении предложены метаболизирующие C микроорганизмы, которые представляют собой бактерии, метаболизирующие синтез-газ, такие как Clostridium, Moorella, Pyrococcus, Eubacterium, Desulfobacterium, Carboxydothermus, Acetogenium, Acetobacterium, Acetoanaerobium, Butyribaceterium, Peptostreptococcus или любая их комбинация. Типичные бактерии, метаболизирующие синтез-газ, включают Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahli, Clostridium ragsdalei, Clostridium carboxydivorans, Butyribacterium methylotrophicum, Clostridium woodii, Clostridium neopropanologen или любую их комбинацию.
1
Согласно некоторым другим вариантам реализации изобретения, метаболизирующие C микроорганизмы представляют собой эукариоты, такие как дрожжи, в том числе Candida, Yarrowia, Hansenula, Pichia, Torulopsis или Rhodotorula.
1
1
1
1
1
Согласно некоторым другим вариантам реализации изобретения, метаболизирующий C нефотосинтезирующий микроорганизм представляет собой облигатный метаболизирующий C нефотосинтезирующий микроорганизм, такой как облигатный метанотроф или метилотроф. Согласно другим вариантам реализации изобретения, метаболизирующий C нефотосинтезирующий микроорганизм представляет собой рекомбинантный микроорганизм, содержащий гетерологичный полинуклеотид, кодирующий фермент синтеза жирных кислот, фермент ассимиляции формальдегида или их комбинацию. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, любой или все гены ТЕ, МСТ и Acc, введенные в метаболизирующий C микроорганизм согласно настоящему изобретению, могут быть сверхэкспрессированы и метаболизирующие C микроорганизмы могут иметь мутацию, которая минимизирует или устраняет активность жирная кислота: КоА-лигазы (например, нокаут fadD).
1
1
Каждый из микроорганизмов согласно настоящему изобретению можно выращивать как изолированную культуру, вместе с гетерологичным организмом, который может содействовать росту, или одну или более из указанных бактерий можно объединять с получением смешанной культуры. Согласно другим вариантам реализации изобретения, метаболизирующие C нефотосинтезирующие микроорганизмы согласно настоящему изобретению представляют собой облигатные метаболизирующие C нефотосинтезирующие микроорганизмы.
1
1
Любой из перечисленных выше метаболизирующих C микроорганизмов можно использовать в качестве родительской или эталонной клетки-хозяина для создания рекомбинантных метаболизирующих C микроорганизмов согласно настоящему изобретению.
Оптимизация кодонов
Экспрессия рекомбинантных белков может быть трудной за пределами их первоначального хозяина. Например, изменчивость в отклонении частоты использования кодона наблюдалась во всех различных видах бактерий (Sharp et al., Nucl. Acids. Res. 33:1141, 2005). Сверхэкспрессия рекомбинантных белков даже внутри их нативного хозяина также может быть трудной. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, молекулы нуклеиновых кислот (например, нуклеиновых кислот, кодирующих тиоэстеразу, fabD, accABCD), которые должны быть введены в хозяина, как описано в настоящей заявке, можно подвергнуть оптимизации кодонов перед введением в хозяина для обеспечения эффективной или усиленной экспрессии белка. Оптимизация кодонов относится к изменению кодонов в генах или кодирующих областях нуклеиновых кислот перед трансформацией для отражения типичной частоты использования кодона хозяина без изменения полипептида, кодированного искусственной молекулой ДНК. Способы оптимизации кодонов для достижения оптимальной экспрессии генов в гетерологичных хозяевах были описаны ранее (см., например, Welch et al., PLoS One 4:е7002, 2009; Gustafsson et al., Trends Biotechnol. 22:346, 2004; Wu et al., Nucl. Acids Res. 35:D76, 2007; Villalobos et al., BMC Bioinformatics 7:285, 2006; публикации патентов США №№2011/0111413 и 2008/0292918; описание предложенных в указанных ссылках способов в полном объеме включено в настоящую заявку посредством ссылки).
Подобным образом, можно сконструировать молекулы экзогенных нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению, кодирующие варианты полипептида, используя филогенетические способы, описанные в ссылках, приведенных выше (патент США №8005620; Gustafsson et al.; Welch et al.; Villalobos et al.; Minshull et al.). Каждый вариантный полипептид, получаемый с помощью указанных способов, будет сохранять По меньшей мере 50% активность (предпочтительно 100% или более активность) и содержать последовательность полипептидов, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% идентична или на 100% идентична эталонной или родительской полипептидной последовательности дикого типа. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, вариантные полипептиды будут включать по меньшей мере одну аминокислотную замену (например, 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более или до 20, 25 или 30 замен) в заранее определенном положении относительно эталонного или родительского фермента дикого типа, при условии, что вариант сохраняет представляющую интерес активность (например, активность тиоэстеразы или продуцирование жирных кислот).
1
1
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, тиоэстераза Е. coli, Cinnamomum camphorum, Umbellularia californica, Streptoccus pyogenes, Ricinius communis или Jatropha curcus является кодон-оптимизированной для экспрессии в метаболизирующем C микроорганизме согласно настоящему изобретению (например, метанотрофе, метилотрофе, клостридии). Согласно другим вариантам реализации изобретения, любую одну или более из последовательностей кодон-оптимизированной тиоэстеразы вводят (например, путем трансформации, конъюгации, электропорации) в метаболизирующий C микроорганизм согласно настоящему изобретению. Типичные последовательности кодон-оптимизированной тиоэстеразы приведены в (1) SEQ ID №№: 3-13 для М. trichosporium OB3b; (2) SEQ ID №№: 20-30 для М. capsulatus Bath; (3) SEQ ID №№: 37-47 для М. methanica; (4) SEQ ID №№: 54-64 for М. extorquens; (5) SEQ ID №№: 70-80 для С. autoethanogenum; и (6) SEQ ID №№: 87-97 для С. ljungdahlii.
1
1
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, последовательность малонил-КоА: ацилпереносящий белок-трансацилазы (fabD) в Е. coli является кодон-оптимизированной для экспрессии в метаболизирующем C микроорганизме согласно настоящему изобретению (например, метанотрофе, метилотрофе, клостридии). Согласно другим вариантам реализации изобретения, любую одну или более из последовательностей кодон-оптимизированного fabD вводят (например, путем трансформации, конъюгации, электропорации) в метаболизирующий C микроорганизм согласно настоящему изобретению. Типичные последовательности кодон-оптимизированного fabD приведены в (1) SEQ ID №: 2 для М. trichosporium OB3b; (2) SEQ ID №: 19 для М. capsulatus Bath; (3) SEQ ID №: 36 для М. methanica; (4) SEQ ID №: 53 для М. extorquens; (5) SEQ ID №: 69 для С. autoethanogenum; и (6) SEQ ID №: 86 для С. ljungdahlii.
1
1
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, одна или более последовательностей ацетил-КоА-карбоксилазы (например, ассА, ассВ, ассС и accD из Е. coli) являются кодон-оптимизированными для экспрессии в метаболизирующем C микроорганизме согласно настоящему изобретению (например, метанотрофе, метилотрофе, клостридии). Согласно другим вариантам реализации изобретения, любую одну или более из последовательностей кодон-оптимизированного Acc вводят (например, путем трансформации, конъюгации, электропорации) в метаболизирующий C микроорганизм согласно настоящему изобретению. Согласно другим вариантам реализации изобретения, вводят кодон-оптимизированный ассА или вводят кодон-оптимизированный accABCD. Типичные последовательности кодон-оптимизированных ассА, ассВ, ассС и accD приведены, соответственно, в (1) SEQ ID №№: 14-17 для М. trichosporium OB3b; (2) SEQ ID №№: 31-34 для М. capsulatus Bath; (3) SEQ ID №№: 48-51 для М methanica; (4) SEQ ID №№: 65-68 для М. extorquens; (5) SEQ ID №№: 81-84 для С. autoethanogenum; и (6) SEQ ID №№: 98-101 для С. ljungdahlii.
Способы трансформации
1
Любые из рекомбинантных метаболизирующих C микроорганизмов или метанотрофных бактерий, описанных в настоящей заявке, можно трансформировать таким образом, чтобы они содержали по меньшей мере одну экзогенную нуклеиновую кислоту для придания хозяину новой или усиленной активности (например, ферментативной активности), или можно генетически модифицировать для удаления или по существу понижения функции эндогенного гена с применением любых различных способов, известных в данной области техники.
Трансформация относится к введению молекулы нуклеиновой кислоты (например, молекулы экзогенной или гетерологичной нуклеиновой кислоты) в клетку-хозяина. Трансформированная клетка-хозяин может нести молекулу экзогенной или гетерологичной нуклеиновой кислоты, экстрахромосомную или встроенную в хромосому. Интеграция в геном клетки-хозяина и самореплицирующиеся векторы в целом приводит к генетически стабильному наследованию трансформированной молекулы нуклеиновой кислоты. Клетки-хозяина, содержащие трансформированные молекулы нуклеиновых кислот, называют «искусственными» или «созданными методами генетической инженерии» или «рекомбинантными» или «трансформированными» или «трансгенными» клетками (например, бактериями).
1
Известны экспрессионные системы и экспрессионные векторы, применимые для экспрессии гетерологичных нуклеиновых кислот в метаболизирующих C микроорганизмах (например, метанотрофных бактериях).
1
Электропорация метаболизирующих C бактерий описана в настоящей заявке и было ранее описана, например, в Toyama et al., FEMS Microbiol. Lett. 166:1, 1998; Kim и Wood, Appl. Microbiol. Biotechnol. 48:105, 1997; Yoshida et. al., Biotechnol. Lett. 23:787, 2001 и в патенте США Appl. Pub. №2008/0026005.
1
1
Бактериальную конъюгацию, которая относится к конкретному типу трансформации, включающему непосредственный контакт клеток донора и реципиента, более часто используют для переноса молекул нуклеиновых кислот в метаболизирующие C бактерии. Бактериальная конъюгация включает смешивание клеток «донора» и «реципиента» в тесном контакте друг с другом. Конъюгация происходит при образовании цитоплазматических связей между бактериями донора и реципиента, при однонаправленном переносе вновь синтезированных молекул-доноров нуклеиновых кислот в клетки реципиента. Реципиент в реакции конъюгации представляет собой любую клетку, которая может принять нуклеиновые кислоты посредством горизонтального переноса из бактерии-донора. Донор в реакции конъюгации представляет собой бактерию, которая содержит конъюгативную плазмиду, конъюгативный транспозон или мобилизованную плазмиду. Физический перенос плазмиды-донора может произойти посредством самотрансмиссивной плазмиды или с помощью плазмиды «помощника». Конъюгации, включающие метаболизирующие C бактерии, описаны в настоящей заявке и были ранее описаны в Stolyar et al., Mikrobiologiya 64-686, 1995; Motoyama et al., Appl. Micro. Biotech. 42:67, 1994; Lloyd et al., Arch. Microbiol. 171:364, 1999; публикации РСТ № WO 02/18617; и Ali et al., Microbiol. 152:2931, 2006.
1
Экспрессия гетерологичных нуклеиновых кислот в метаболизирующих C бактериях известна в данной области техники (см., например, патент США №6818424; публикацию заявки на патент США №2003/0003528). Была описана основанная на мю-транспозоне трансформация метилотрофных бактерий (Akhverdyan et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 91:857, 2011). Была описана система мини-Tn7 транспозона для одной и мультикопийной экспрессии гетерологичных генов без инсерционной инактивации генов хозяина в Methylobacterium (публикация заявки на патент США №2008/0026005).
1
1
Можно использовать различные способы инактивации, нокаута или делеции функции эндогенного гена в метаболизирующих C бактериях. Аллельный обмен с помощью суицидных векторов с созданием мутантов с делецией/вставкой при медленной росте метаболизирующих C бактерий был также описан в настоящей заявке и, например, в Toyama и Lidstrom, Microbiol. 144:183, 1998; Stolyar et al., Microbiol. 145-1235, 1999; Ali et al., Microbiol. 152:2931, 2006; Van Dien et al., Microbiol. 149:601, 2003.
1
Для сильной экспрессии молекул экзогенных нуклеиновых кислот можно использовать подходящие гомологичные или гетерологичные промоторы. Например, в патенте США №7098005 описано применение промоторов, которые сильно экспрессируются в присутствии метана или метанола, для экспрессии гетерологичных генов в метаболизирующих C бактериях. Дополнительные промоторы, которые можно использовать, включают промотор оперона деокси-ксилулоза-фосфат-синтаза метанол-дегидрогеназы (Springer et al., FEMS Microbiol. Lett. 160:119, 1998); промотор для синтеза PHA (Foellner et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 40-284, 1993); промотор пируватдекарбоксилаза (Tokuhiro et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 131:795, 2006); или промоторы, идентифицированные по нативной плазмиде в метилотрофах (ЕР 296484). Ненативные промоторы включают промотор lac-оперон-Plac (Toyama et al., Microbiol. 143:595, 1997) или гибридный промотор, такой как Ptrc (Brosius et al., Gene 27:161, 1984).
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, промоторы или оптимизацию кодонов применяют для сильной конститутивной экспрессии экзогенных полинуклеотидов, кодирующих один или более ферментов, продуцирующих лактат, в метанотрофных бактериях-хозяевах. Можно также использовать регулируемую экспрессию экзогенной нуклеиновой кислоты в метанотрофной бактерии-хозяине. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, для оптимизации продуцирования липидов искусственными метанотрофными бактериями может быть необходима регулируемая экспрессия экзогенных нуклеиновых кислот, кодирующих один или более ферментов тиоэстеразы, ацетил-КоА-карбоксилазы или малонил-КоА: АСР-трансацилазы. Например, можно использовать индуцируемую/регулируемую систему экспрессии рекомбинантных белков в метилотрофных и метанотрофных бактериях, как описано, например, в заявке на патент США №2010/0221813.
1
Рекомбинантные метаболизирующие C микроорганизмы
1
1
1
1
1
Как указано в настоящей заявке, для создания рекомбинантных метаболизирующих C микроорганизмов в качестве родительской или эталонной клетки-хозяина можно использовать любой из рекомбинантных метаболизирующих C микроорганизмов (например, метанотрофные бактерии), описанных в настоящей заявке. Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен рекомбинантный метаболизирующий C нефотосинтезирующий микроорганизм, содержащий последовательность гетерологичных нуклеиновых кислот, связанную с биосинтезом жирных кислот, причем экспрессия последовательности гетерологичных нуклеиновых кислот приводит к аккумулированию повышенного уровня жирных кислот или сверхэкспрессии жирных кислот в рекомбинантном метаболизирующем C микроорганизме по сравнению с родительским или эталонным метаболизирующим C нефотосинтезирующим микроорганизмом.
1
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, рекомбинантный метаболизирующий C нефотосинтезирующий микроорганизм содержит гетерологичный полинуклеотид, кодирующий фермент синтеза жирных кислот, фермент ассимиляции формальдегида или любую их комбинацию. Согласно другим вариантам реализации изобретения, гетерологичный полинуклеотид кодирует тиоэстеразу, малонил-КоА: ацилпереносящий белок-трансацилазу, ацетил-КоА-карбоксилазу или любую их комбинацию. Например, тиоэстераза может представлять собой тиоэстеразу Е. coli, Cinnamomum camphorum, Umbellularia californica, Streptoccus pyogenes, Ricinius communis или Jatropha curcus. Типичные гены fabD, accA, accB, accC и accD могут быть из Е. coli или любого другого выбранного организма.
1
1
1
Согласно другим вариантам реализации изобретения, рекомбинантный метаболизирующий C нефотосинтезирующий микроорганизм содержит последовательность гетерологичных нуклеиновых кислот, кодон-оптимизированную для эффективной экспрессии в метаболизирующем C нефотосинтезирующем микроорганизме. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, любую одну или более из тиоэстеразы, fabD, accA, accB, accC и accD подвергают оптимизации кодонов для метаболизирующего C нефотосинтезирующего микроорганизма. Согласно одному из вариантов реализации изобретения кодон-оптимизированная тиоэстераза представляет собой tesA Е. coli, в которой отсутствует последовательность нацеливания на периплазму.
1
Согласно другим вариантам реализации изобретения, любой из описанных выше рекомбинантных метаболизирующих C нефотосинтезирующих микроорганизмов дополнительно содержит мутацию, которая минимизирует или устраняет активность жирная кислота: КоА-лигазы.
1
1
1
Типичные организмы, применяемые при конструировании рекомбинантных метаболизирующих C нефотосинтезирующих микроорганизмов согласно настоящему изобретению, включают бактерии или дрожжи. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, родительская или эталонная метаболизирующая C бактерия, применяемая для создания рекомбинантной метаболизирующей C бактерии согласно настоящему изобретению, представляет собой метанотроф или метилотроф, такой как Methylomonas sp. 16а (АТСС РТА 2402), Methylosinus trichosporium OB3b (NRRL В-11, 196), Methylosinus sporium (NRRL В-11, 197), Methylocystis parvus (NRRL В-11, 198), Methylomonas methanica (NRRL В-11, 199), Methylomonas albus (NRRL В-11, 200), Methylobacter capsulatus Y (NRRL B-11, 201), Methylococcus capsulatus Bath (NCIMB 11132), Methylobacterium organophilum (АТСС 27, 886), Methylomonas sp. AJ-3670 (FERM P-2400), Methylomicrobium alcaliphilum, Methylocella silvestris, Methylacidiphilum infernorum, Methylibium petroleiphilum, Methylobacterium extorquens, Methylobacterium radiotolerans, Methylobacterium populi, Methylobacterium chloromethanicum, Methylobacterium nodulans или любую их комбинацию.
1
1
Согласно другим вариантам реализации изобретения, родительская или эталонная метаболизирующая C бактерия, применяемая для создания рекомбинантной метаболизирующей C бактерии согласно настоящему изобретению, представляет собой бактерию, метаболизирующую синтез-газ, такую как Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahli, Clostridium ragsdalei, Clostridium carboxydivorans, Butyribacterium methylotrophicum, Clostridium woodii, Clostridium neopropanologen или их комбинацию.
Способы культивирования и способы получения масляных композиций
1
Для выращивания микроорганизмов, бактерий и дрожжей, описанных в настоящей заявке, можно использовать различные методологии культивирования. Например, метаболизирующие C микроорганизмы (такие как метанотрофные или метилотрофные бактерии) можно выращивать с применением методик периодического культивирования или непрерывного культивирования. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, указанные культуры выращивают в блоке регулируемого культивирования, таком как ферментатор, биореактор, половолоконная ячейка или т.п. В целом в некоторых системах клетки в логарифмической фазе часто обеспечивают массовое продуцирование продукта или представляющего интерес промежуточного вещества, тогда как в других системах можно осуществить продуцирование в стационарной или пост-экспоненциальной фазе.
Классический способ периодического культивирования представляет собой закрытую систему, в которой задают состав среды в начале культивирования и не меняют его в процессе культивирования. То есть, в начале процесса культивирования среду инокулируют одним или более выбранными микроорганизмами и затем оставляют расти без добавления в систему каких-либо компонентов. В настоящей заявке, термин «периодическое» культивирование используют со ссылкой на неизменность количества конкретного источника углерода, добавленного в начале, при этом в процессе культивирования можно контролировать и изменять такие факторы, как pH и концентрация кислорода. В системах периодического действия, составы метаболитов и биомассы в системе изменяются постоянно до времени завершения культивирования. В периодических культурах, клетки (например, бактерии, такие как метилотрофы) будут в целом перемещаться со статической лаг-фазы на логарифмическую фазу быстрого роста и на стационарную фазу, на которой скорость роста уменьшается или рост прекращается (что, в конце концов, приведет к некрозу клеток, если условия не изменятся).
nd
Система периодического действия с подпиткой представляет собой вариацию стандартной системы периодического действия, в которую по мере развития культуры добавляют в возрастающих количествах представляющий интерес углеродный субстрат. Систему периодического действия с подпиткой можно использовать, когда метаболизм клеток, вероятно, может быть ингибирован посредством катаболитной репрессии и когда желательно иметь ограниченные количества субстрата в среде. Поскольку в системе периодического действия с подпиткой трудно измерить фактическую концентрацию субстрата, оценку делают на основе изменений измеримых факторов, таких как pH, растворенный кислород и парциальное давление отходящих газов. Способы периодического культивирования и периодического культивирования с подпиткой являются общепринятыми и известны в данной области техники (см., например, Thomas D. Brock, Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, 2 Ed. (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA; Deshpande, Appl. Biochem. Biotechnol. 36:227, 1992).
Непрерывные культуры представляют собой «открытые» системы в том смысле, что определенную культуральную среду непрерывно добавляют в биореактор, при этом равное количество используемой («кондиционированной») среды одновременно удаляют для обработки. В целом в непрерывных культурах клетки поддерживаются при постоянной высокой плотности жидкой фазы, при этом клетки в основном находятся в фазе логарифмического роста. Согласно альтернативному варианту реализации изобретения непрерывное культивирование можно осуществить на практике с помощью иммобилизованных клеток (например, биопленки), при этом непрерывно добавляют углерод и питательные вещества, а ценные продукты, побочные продукты и отходы непрерывно удаляют из клеточной массы. Иммобилизацию клеток можно осуществить с помощью широкого ряда твердых подложек, состоящих из природных материалов, синтетических материалов или их комбинации.
Непрерывное или полунепрерывное культивирование позволяет модулировать один или более факторов, которые влияют на клеточный рост или концентрацию конечного продукта. Например, один из способов позволяет поддерживать лимитирующее питательное вещество при фиксированной скорости (например, источник углерода, азот) и позволяет изменять со временем все другие параметры. Согласно другим вариантам реализации изобретения, несколько факторов, влияющих на рост, можно непрерывно изменять, тогда как концентрацию клеток, измеряемую посредством измерения мутности среды, поддерживают постоянной. Цель системы непрерывного культивирования состоит в поддержании условий роста, обеспечивающих стационарную фазу, при уравновешивании потери клеток вследствие удаления среды относительно скорости клеточного роста. Способы модулирования питательных веществ и факторов роста для процессов и технологий непрерывного культивирования для максимизирования скорости получения продукта хорошо известны в данной области техники (см. Brock, 1992).
1
1
1
1
1
1
1
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, культуральная среда включает углеродный субстрат в качестве источника энергии для метаболизирующего C микроорганизма. Подходящие субстраты включают C субстраты, такие как метан, метанол, формальдегид, муравьиная кислота (формиат), моноксид углерода, диоксид углерода, метилированные амины (метиламин, диметиламин, триметиламин и т.п.), метилированные тиолы или метилгалогены (бромметан, хлорметан иодметан, дихлорметан и т.п.). Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, культуральные среды могут содержать один C субстрат в качестве единственного источника углерода для метаболизирующего C микроорганизма или могут содержать смеси из двух или более C субстратов (композицию смешанных C субстратов) в качестве нескольких источников углерода для метаболизирующего C микроорганизма.
1
1
2
3
4
1
1
Кроме того, как известно, некоторые C метаболизирующие организмы для обеспечения метаболической активности утилизируют вещества, не относящиеся к C субстратам, такие как сахар, глюкозамин или различные аминокислоты. Например, некоторые виды Candida могут метаболизировать аланин или олеиновую кислоту (Sulter et al., Arch. Microbiol. 753:485, 1990). Methylobacterium extorquens AM1 способна расти на ограниченном количестве C, C и C субстратов (Van Dien et al., Microbiol. 149:601, 2003). Согласно альтернативному варианту реализации изобретения метаболизирующий C микроорганизм может представлять собой рекомбинантный вариант, обладающий способностью утилизировать альтернативные углеродные субстраты. Поэтому, предполагают, что источник углерода в культуральной среде может содержать смесь углеродных субстратов, с соединениями, содержащими один и несколько атомов углерода, в зависимости от выбранного метаболизирующего C микроорганизма.
1
1
1
1
1
1
1
Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен способ получения топлива, включающий превращение биомассы из культуры, в основном содержащей метаболизирующий C нефотосинтезирующий микроорганизм, в масляную композицию и обработку масляной композиции с получением топлива. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, метаболизирующий C нефотосинтезирующий микроорганизм представляет собой облигатный метаболизирующий C нефотосинтезирующий микроорганизм, такой как облигатный метанотроф или метилотроф. Согласно другим вариантам реализации изобретения, метаболизирующий C нефотосинтезирующий микроорганизм представляет собой рекомбинантный микроорганизм, содержащий гетерологичный полинуклеотид, кодирующий фермент синтеза жирных кислот, фермент ассимиляции формальдегида или их комбинацию. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, любой или все гены ТЕ, МСТ и Acc, введенные в метаболизирующие C микроорганизмы согласно настоящему изобретению, можно сверхэкспрессировать, при этом метаболизирующие C микроорганизмы могут содержать мутацию, которая минимизирует или устраняет активность жирная кислота: КоА-лигазы (например, нокаут fadD). Согласно другим вариантам реализации изобретения, масляную композицию получают или экстрагируют из клеточной мембраны метаболизирующего C нефотосинтезирующего микроорганизма (например, метилотрофа, метанотрофа, дрожжей) или ее можно извлечь из супернатанта культуры при секретировании или экскретировании, или с применением их комбинации.
Согласно другим вариантам реализации изобретения, стадия превращения биомассы в масляную композицию включает экстрагирование масляной композиции, например, с применением влажной экстракции, сверхкритической флюидной экстракции, сухой экстракции, термической экстракции (например, отгонки водяным паром, гидротермического сжижения, варки под давлением), ферментативного гидролиза (например, клеточной стенки), экстракции в импульсном электрическом поле, микропузырьков, экстракции в полых волокнах или т.п. Типичные способы экстракции известны в данной области техники, такие как способ Фолча с применением смеси хлороформ : метанол (2:1 об./об.) (раствор ХМ) (см. Folch et al., J. Biol. Chem. 226:497, 1957) или его модифицированный способ (см. пример 3); способ экстракции Hara и Radin с применением смеси гексан : изопропанол (ГИП) (см. Hara and Radin, Anal. Biochem. 90:420, 1978); способ Bligh и Dyer с применением смеси хлороформ : метанол : вода (см. Bligh and Dyer, Canadian J. Biochem. Physiol. 37:911, 1959); или т.п. Другие типичные способы экстракции включают способы с применением колонки для твердофазной экстракции (Pinkart et al., J. Microbiol. Meth. 34:9, 1998), одностадийную реактивную экстракцию (Nelson, All Graduate Theses and Dissertations. Paper 642, digitalcommons.usu.edu/etd/642), экстракцию α-гидроксисульфоновой кислотой (публикация патента США №2013/0144078), экстракцию при высоких температуре и давлении (публикация патента США №2012/0110898) или ускоренную экстракцию растворителем (ASE), экстракцию в аппарате Сокслета, ультразвуковую экстракцию и осциллирующую экстракцию (см. Liu et al., J. Earth Sci. 27:300, 2010). Каждый из указанных способов экстракции в полном объеме включен в настоящую заявку посредством ссылки и может быть использован в любом из упомянутых выше способов или систем биопереработки, описанных в настоящей заявке.
1
1
1
1
1
Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен способ получения топлива путем переработки масляной композиции (например, в устройстве переработки) с получением топлива, при этом масляную композицию получают из метаболизирующего C нефотосинтезирующего микроорганизма, такого как метилотроф или метанотроф. Согласно другим вариантам реализации изобретения, указанный способ дополнительно включает экстрагирование масляной композиции или применение блока обработки для экстрагирования масляной композиции из метаболизирующего C нефотосинтезирующего микроорганизма. Согласно другим вариантам реализации изобретения, указанный способ включает: (а) культивирование метаболизирующих C бактерий в присутствии сырья, содержащего C субстрат, в блоке регулируемого культивирования, при этом культивируемые бактерии продуцируют масляную композицию; (b) экстрагирование масляной композиции из культивируемых бактерий или экстрагирование масляной композиции в блоке обработки; и (с) обработку экстрагированной масляной композиции или обработку масляной композиции в устройстве переработки с получением топлива. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, исходный C субстрат представляет собой метан, метанол, формальдегид, муравьиную кислоту, моноксид углерода, диоксид углерода, метиламин, метилтиол или метилгалоген.
1
1
1
1
В любом из описанных выше способов получения топлива или биотоплива метаболизирующий C нефотосинтезирующий микроорганизм представляет собой метанотроф, метилотроф или клостридий, исходный C субстрат представляет собой природный газ, синтез-газ или метан и бактерии культивируют в аэробных или анаэробных условиях. Согласно другим вариантам реализации изобретения, метанотроф представляет собой Methylosinus trichosporium OB3b, Methylococcus capsulatus Bath, Methylomonas sp. 16a, Methylomonas methanica, Methylomicrobium alcaliphilum, любую их комбинацию или их быстрорастущий вариант; метилотроф представляет собой Methylobacterium extorquens, Methylobacterium radiotolerans, Methylobacterium populi, Methylobacterium chloromethanicum, Methylobacterium nodulans, любую их комбинацию или их быстрорастущий вариант; и клостридий представляет собой Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahli, Clostridium ragsdalei, Clostridium carboxydivorans, Clostridium woodii, Clostridium neopropanologen или любую их комбинацию или их быстрорастущий вариант. Согласно некоторым другим вариантам реализации изобретения, метаболизирующий C нефотосинтезирующий микроорганизм представляет собой облигатный метаболизирующий C нефотосинтезирующий микроорганизм, такой как облигатный метанотроф, метилотроф или клостридий.
1
1
1
1
В любом из описанных выше способов получения топлива или биотоплива метаболизирующий C нефотосинтезирующий микроорганизм представляет собой метанотроф, исходный C субстрат представляет собой природный газ или метан и бактерии культивируют в аэробных условиях. Согласно другим вариантам реализации изобретения, метаболизирующий C нефотосинтезирующий микроорганизм представляет собой метанотроф, C субстрат представляет собой природный газ или метан и бактерии культивируют с применением ограничивающих количеств фосфора, азота, микроэлементов, кислорода или любой их комбинации.
Топливные композиции и топливные продукты
13
13
12
13
2
4
4
2
1
В качестве справочной информации, для оценки глобальных источников и стоков метана широко используют измерения устойчивых изотопов и подходы, основанные на балансе масс (см. Whiticar и Faber, Org. Geochem. 10:759, 1986; Whiticar, Org. Geochem. 16:531, 1990). Для использования значений δC остаточного метана для определения количества окисленного метана необходимо знать степень фракционирования изотопов, вызванную микробным окислением метана. Например, аэробные метанотрофы могут метаболизировать метан с помощью конкретного фермента, метанмонооксигеназы (ММО). Метанотрофы превращают метан в метанол и затем в формальдегид. Далее формальдегид можно окислить до CO, что обеспечивает клетке энергию в форме восстанавливающих эквивалентов (NADH), или ввести в биомассу посредством или РМФ, или серинового циклов (Hanson и Hanson, Microbiol. Rev. 60:439, 1996), которые прямо аналогичны путям ассимиляции углерода в фотосинтезирующих организмах. Более конкретно, метанотроф I типа использует РМФ путь для синтеза биомассы и генерирует биомассу полностью из CH, тогда как метанотроф II типа использует сериновый путь, который ассимилирует 50-70% клеточного углерода из CH и 30-50% из CO (Hanson и Hanson, 1996). Способы измерения изотопных составов углерода приведены, например, Templeton et al. (Geochim. Cosmochim. Acta 70:1739, 2006), при этом указанные способы тем самым в полном объеме включены посредством ссылки. Устойчивое отношение углерода C/C в масляной композиции, полученной из биомассы (обозначаемое как значение «дельта» ‰, δC), может меняться в зависимости от источника и чистоты применяемого C субстрата (см., например, фиг. 7).
1
13
Масляные композиции, полученные при использовании метаболизирующих C нефотосинтезирующих микроорганизмов и способов, описанных в настоящей заявке, а также полученные из них биотопливные композиции, могут отличаться с точки зрения «отпечатков пальцев» углерода от масла и топлив, полученных из нефтепродуктов или из фотосинтезирующих микроорганизмов или растений. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, δC биомассы, масляной композиции или биотоплива, полученного из биомассы или масляной композиции, составляет менее - 30‰, менее - 31‰, менее - 32‰, менее - 33‰, менее - 34‰, менее - 35‰, менее - 36‰, менее - 37‰, менее - 38‰, менее - 39‰, менее - 40‰, менее - 41‰, менее - 42‰, менее - 43‰, менее - 44‰, менее - 45‰, менее - 46‰, менее - 47‰, менее - 48‰, менее - 49‰, менее - 50‰, менее - 51‰, менее - 52‰, менее - 53‰, менее - 54‰, менее - 55‰, менее - 56‰, менее - 57‰, менее - 58‰, менее - 59‰, менее - 60‰, менее - 61‰, менее - 62‰, менее - 63‰, менее - 64‰, менее - 65‰, менее - 66‰, менее - 67‰, менее - 68‰, менее - 69‰ или менее - 70‰.
1
13
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, биомасса метаболизирующего C микроорганизма содержит масляную композицию, при этом δC биомассы составляет от примерно - 35‰ до примерно - 50‰, от - 45‰ до примерно - 35‰, или от примерно - 50‰ до примерно - 40‰, или от примерно - 45‰ до примерно - 65‰, или от примерно - 60‰ до примерно - 70‰, или от примерно - 30‰ до примерно - 70‰. Согласно другим вариантам реализации изобретения, масляная композиция биомассы содержит по меньшей мере 50% жирных кислот или содержит по меньшей мере 50% свободных жирных кислот. Согласно другим вариантам реализации изобретения, масляная композиция биомассы содержит смесь диацилглицеридов и триацилглицеридов. Согласно другим вариантам реализации изобретения, большая часть (более 50% масс./масс.) жирных кислот в масляной композиции биомассы содержит углеродную цепь длиной от C14 до C18 или от C16 до C18, или большая часть жирных кислот содержит углеродную цепь длиной менее C16. Согласно другим вариантам реализации изобретения, масляная композиция биомассы содержит более 50% масс./масс. терпеноидных или изопреноидных соединений, при этом терпеноид может представлять собой фарнезен или лимонен.
1
1
1
1
1
13
13
Согласно другим вариантам реализации изобретения, биомасса метаболизирующего C нефотосинтезирующего микроорганизма имеет δC, составляющую менее примерно - 30‰ или от примерно - 40‰ до примерно - 60‰. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, биомасса содержит рекомбинантный метаболизирующий C нефотосинтезирующий микроорганизм вместе с отработавшей средой или биомасса содержит композицию супернатанта отработавшей среды из культуральной жидкости рекомбинантного метаболизирующего C нефотосинтезирующего микроорганизма, при этом δC биомассы составляет менее примерно - 30‰. Согласно некоторым другим вариантам реализации изобретения, масляную композицию экстрагируют или концентрируют из биомассы, которая может содержать рекомбинантные метаболизирующие C нефотосинтезирующие микроорганизмы вместе с отработавшей средой из культуральной жидкости или композицией супернатанта отработавшей среды из культуральной жидкости рекомбинантного метаболизирующего C нефотосинтезирующего микроорганизма.
1
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, биомасса рекомбинантного метаболизирующего C нефотосинтезирующего микроорганизма содержит гетерологичный полинуклеотид, кодирующий фермент синтеза жирных кислот, фермент ассимиляции формальдегида или любую их комбинацию. Согласно другим вариантам реализации изобретения, гетерологичный полинуклеотид кодирует тиоэстеразу, малонил-КоА: ацилпереносящий белок-трансацилазу, ацетил-КоА-карбоксилазу или любую их комбинацию. Например, тиоэстераза может представлять собой тиоэстеразу Е. coli, Cinnamomum camphorum, Umbellularia californica, Streptoccus pyogenes, Ricinius communis или Jatropha curcus. Типичные гены fabD, accA, accB, accC и accD могут быть из Е. coli или любого другого выбранного организма.
1
1
1
Согласно другим вариантам реализации изобретения, биомасса состоит из рекомбинантного метаболизирующего C нефотосинтезирующего микроорганизма, содержащего последовательность гетерологичных нуклеиновых кислот, кодон-оптимизированную для эффективной экспрессии в метаболизирующем C нефотосинтезирующем микроорганизме. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, любой один или более из генов, выбранных из тиоэстеразы, fabD, accA, accB, ассС и accD, подвергают оптимизации кодонов для метаболизирующего C нефотосинтезирующего микроорганизма. Согласно одному из вариантов реализации изобретения кодон-оптимизированная тиоэстераза представляет собой tesA Е. coli, в которой отсутствует последовательность нацеливания на периплазму.
1
Согласно другим вариантам реализации изобретения, любая из описанной выше биомассы рекомбинантного метаболизирующего C нефотосинтезирующего микроорганизма дополнительно содержит мутацию, которая минимизирует или устраняет активность жирная кислота: КоА-лигазы.
1
1
Типичные организмы, применяемые для получения биомассы рекомбинантных метаболизирующих C нефотосинтезирующих микроорганизмов согласно настоящему изобретению включают бактерии или дрожжи. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, биомасса представляет собой биомассу метаболизирующих C бактерий, выбранных из метанотрофа или метилотрофа, таких как Methylomonas sp. 16a (АТСС РТА 2402), Methylosinus trichosporium OB3b (NRRL В-11, 196), Methylosinus sporium (NRRL В-11, 197), Methylocystis parvus (NRRL В-11, 198), Methylomonas methanica (NRRL B-11, 199), Methylomonas albus (NRRL B-11, 200), Methylobacter capsulatus Y (NRRL B-11, 201), Methylococcus capsulatus Bath (NCIMB 11132), Methylobacterium organophilum (ATCC 27, 886), Methylomonas sp. AJ-3670 (FERM P-2400), Methylomicrobium alcaliphilum, Methylocella silvestris, Methylacidiphilum infernorum, Methylibium petroleiphilum, Methylobacterium extorquens, Methylobacterium radiotolerans, Methylobacterium populi, Methylobacterium chloromethanicum, Methylobacterium nodulans или любая их комбинация.
1
1
Согласно другим вариантам реализации изобретения, биомасса метаболизирующих C бактерий из рекомбинантных метаболизирующих C бактерий согласно настоящему изобретению представляет собой бактерию, метаболизирующую синтез-газ, такую как Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahli, Clostridium ragsdalei, Clostridium carboxydivorans, Butyribacterium methylotrophicum, Clostridium woodii, Clostridium neopropanologen или их комбинацию.
13
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, δC масляной композиции составляет от примерно - 35‰ до примерно - 50‰, от - 45‰ до примерно - 35‰, или от примерно - 50‰ до примерно - 40‰, или от примерно - 45‰ до примерно - 65‰, или от примерно - 60‰ до примерно - 70‰, или от примерно - 30‰ до примерно - 70‰. Согласно другим вариантам реализации изобретения, масляная композиция содержит по меньшей мере 50% масс./масс. жирных кислот или содержит по меньшей мере 50% масс./масс. свободных жирных кислот. Согласно другим вариантам реализации изобретения, масляная композиция содержит смесь диацилглицеридов и триацилглицеридов. Согласно другим вариантам реализации изобретения, масляная композиция содержит жирные кислоты, большая часть которых имеет углеродную цепь длиной от C14 до C18 или от C16 до C18, или жирные кислоты, большая часть которых имеет углеродную цепь длиной менее C16. Согласно другим вариантам реализации изобретения, масляная композиция содержит более 50% масс./масс. терпеноидных или изопреноидных соединений, при этом терпеноидные соединения могут представлять собой фарнезен, лимонен или и то, и другое.
13
13
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, биотопливо, полученное из биомассы или масляной композиции, имеет δC, составляющее от примерно - 35‰ до примерно - 50‰, от - 45‰ до примерно - 35‰, или от примерно - 50‰ до примерно - 40‰, или от примерно - 45‰ до примерно - 65‰, или от примерно - 60‰ до примерно - 70‰, или от примерно - 30‰ до примерно - 70‰. Согласно некоторым другим вариантам реализации изобретения, δC биотоплива, полученного из масляной композиции, составляет от примерно - 35‰ до примерно - 50‰, от - 45‰ до примерно - 35‰, или от примерно - 50‰ до примерно - 40‰, или от примерно - 45‰ до примерно - 65‰, или от примерно - 60‰ до примерно - 70‰, или от примерно - 30‰ до примерно - 70‰.
Согласно другим вариантам реализации изобретения, биотопливо содержит по меньшей мере 50% масс./масс. сложных метиловых эфиров жирных кислот (СМЭЖК). Согласно связанным вариантам реализации изобретения, биотопливо содержит по меньшей мере 50% СМЭЖК, при этом большая часть СМЭЖК имеет углеродные цепи длиной C14-C18, C16-C18 или менее C16. Согласно другим вариантам реализации изобретения, биотопливо содержит по меньшей мере 50% масс./масс. сложных этиловых эфиров жирных кислот (СЭЭЖК). Согласно связанным вариантам реализации изобретения, биотопливо содержит по меньшей мере 50% СЭЭЖК, при этом большая часть СЭЭЖК имеет углеродные цепи длиной C14-C18, C16-C18 или менее C16. Согласно другим вариантам реализации изобретения, биотопливо содержит по меньшей мере 50% масс./масс. гидрогенизованных терпеноидов, таких как фарнезан или лимонан. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, большинство гидрогенизованных терпеноидов состоят из фарнезана, лимонана или и того и другого. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, биотопливо содержит гидрогенизованную биомассу. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, большая часть гидрогенизованной биомассы содержит смесь линейных и разветвленных алканов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, биотопливо содержит жирные кислоты, большая часть которых имеет углеродную цепь длиной от C14 до C18 или от C16 до C18, или жирные кислоты, большая часть которых имеет углеродную цепь длиной менее C16. Согласно другим вариантам реализации изобретения, биотопливо содержит более 50% масс./масс. терпеноидных или изопреноидных соединений, при этом терпеноид может представлять собой фарнезен или лимонен.
1
1
2
13
13
13
13
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, масляная композиция метаболизирующего C микроорганизма (которая может представлять собой экстракт или изолят из биомассы метаболизирующего C микроорганизма) содержит атомы водорода и углерода, составляющие по меньшей мере от примерно 50% до примерно 80% относительно массы композиции, при этом δC композиции составляет менее примерно - 35‰, или менее примерно - 36‰, или менее примерно - 37‰, или менее примерно - 38‰, или менее примерно - 39‰, или менее примерно - 40‰. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, масло или полученная из него биотопливная композиция содержит молекулы, содержащие атомы водорода и углерода, составляющие по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75% или по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% относительно массы композиции, при этом δC композиции составляет от примерно - 30‰ до примерно - 70‰, или δC в биомассе уменьшается при увеличении плотности клеток на от примерно - 5‰ до примерно - 20‰, или δC биомассы было выше, чем в случае одновременного полученного CO в среднем на от 5‰ до 15‰ при культивировании в присутствии или при отсутствии меди.
1
1
13
Согласно другим вариантам реализации изобретения, масляная композиция метаболизирующего C микроорганизма согласно настоящему изобретению (которую можно экстрагировать или выделить из биомассы метаболизирующего C микроорганизма) содержит атомы водорода и углерода, составляющие примерно по меньшей мере 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% относительно массы композиции. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, масляная композиция или полученная из нее биотопливная композиция содержит молекулы, содержащие атомы водорода и углерода, составляющие по меньшей мере примерно 90% относительно массы композиции, и при этом δC композиции составляет от примерно - 40‰ до примерно - 55‰.
Компонент топлива, описанный в настоящей заявке и известный в данной области техники, может представлять собой ископаемое топливо или смешивающуюся смесь для получения топливного продукта. Например, смесь для получения топливной или биотопливной смеси может представлять собой углеводородную смесь, подходящую для смешивания с другой углеводородной смесью с получением топливного или биотопливного продукта. Например, смесь легких алканов может не иметь определенное октановое число, соответствующее данному типу топлива; однако, указанную смесь можно смешать со смесью с высоким содержанием октана с получением топливного продукта. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, биомасса, масляная композиция или полученное из нее биотопливо согласно настоящему изобретению представляет собой после переработки топливный или биотопливный компонент.
13
13
13
2
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, биотопливная композиция содержит молекулы, содержащие атомы водорода и углерода, составляющие по меньшей мере 80% относительно массы композиции, причем распределение δC композиции составляет от примерно - 37% до примерно - 10%, или распределение δC в биомассе увеличивается при увеличении плотности клеток от - 22% до - 9%, или δC композиции биомассы было выше, чем в случае одновременного полученного CO в среднем на от 5‰ до 15‰ при культивировании в присутствии или при отсутствии меди.
13
1
Биотопливный продукт, описанный в настоящей заявке, представляет собой продукт, полученный путем смешивания масляной композиции или полученной из нее биотопливной композиции согласно настоящему изобретению с топливным или биотопливным компонентом. В некоторых случаях, распределение δC биотопливного продукта составляет более - 60‰, или более - 50‰, или более - 40‰, или более - 30‰, при условии, что часть смеси, представляющая собой масляную композицию или полученную из нее биотопливную композицию, не получают из фотосинтезирующего микроорганизма или растения. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, компонент топлива, применяемый для смешивания, представляет собой композицию на основе нефти или присадку к топливу (например, оксигенаты, такие как метанол, этанол, изопропанол; простые эфиры, такие как метил-трет-бутиловый эфир, трет-амилметиловый эфир; противоокислители, такие как бутилированный гидрокситолуол, этилендиамин; антидетонаторы, такие как тетраэтилсвинец, ферроцен толуол; уловители свинца, такие как трикрезилфосфат; красители; или т.п.). Например, масляную композицию метаболизирующего C микроорганизма можно смешать с компонентом топлива перед переработкой (например, переэтерификацией; крекингом) с получением топливного продукта, описанного в настоящей заявке. Согласно другим вариантам реализации изобретения, масляная композиция представляет собой жидкость или твердое вещество и ее можно очистить с получением присадки к топливу, применяемой для получения биотопливного продукта. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, масляная композиция содержит терпен, терпеноид, изопрен или изопреноид. Согласно другим вариантам реализации изобретения, биотопливный продукт имеет октановое число, составляющее от 85 до 120, или октановое число больше 90.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1
1
УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И В БИОРЕАКТОРЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПИДОВ С ПОМОЩЬЮ МЕТАБОЛИЗИРУЮЩИХ C МИКРООРГАНИЗМОВ
1
Типичные метаболизирующие C микроорганизмы согласно настоящему изобретению (метанотрофы, метилотрофы, клостридии) культивировали в пробирках, во флаконах, в склянках, на планшетах или в биореакторе (ферментация). В настоящем примере описаны условия роста, среды и источник углерода для различных микроорганизмов.
Methylosinus trichosporium штамм OB3b (NCIMB 11131); Methylomonas sp. штамм 16a (ATCC PTA-2402); или Methylomonas methanica
Для приготовления флаконов с сывороткой указанные бактерии культивировали при 30°C в среде Хиггинза с минимальным содержанием нитратных солей (NSM; Cornish et al., J. Gen. Microbiol. 130:2565, 1984; Park et al., Biotechnol. Bioeng. 38:423, 1991) или в среде MM-W1. Состав газа в свободном пространстве регулировали до объемного соотношения метан : воздух 1:1. Флаконы встряхивали при скорости 200-250 об/мин. Согласно альтернативному варианту реализации изобретения культуры находились на планшетах со средой NSM, содержащих 1,5% масс./об агара, выращенного в газонепроницаемой камере, содержащей газовую смесь 1:1 (об./об.) метан : воздух, или в присутствии пара метанола (путем применения 0,5 мл метанола в крышечке запечатанных парафильмом планшетов) или на планшетах со средой NSM с добавкой 0,5% метанола. Планшеты инкубировали перевернутыми в увлажнительной камере при 30°C.
4
2
2
2
2
3
4
2
4
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
4
2
2
4
2
4
2
Состав применяемой среды NSM был следующим: 1,0 г MgSO×7HO, 0,20 г CaCl×6HO, 2,0 мл раствора хелатного железа (0,1 г цитрата аммония железа (III) или 0,5 г хлорида железа (III); 0,2 г ЭДТК, натриевой соли; 0,3 мл HCl, концентрированной; 100,0 мл дистиллированной деионизированной HO), 1,0 г KNO, 0,5 мл раствора микроэлементов (500,0 мг ЭДТК, 200,0 мг FeSO. 7HO, 10,0 мг ZnSO×7HO, 3,0 мг MnCl×4HO, 30,0 мг HBO, 20,0 мг CoCl×6HO, 1,0 мг CaCl×2HO, 2,0 мг NiCl×6HO, 3,0 мг NaMoO×2HO, 1,0 л дистиллированной воды), 0,272 г KHPO, 0,717 г NaHPO×12HO, возможно 12,5 г очищенного агара (например, агара Oxoid L28 или Bacto™; применяемого при изготовлении планшетов), 1,0 л дистиллированной деионизированной воды, устанавливали pH 6,8 и стерилизовали в автоклаве при 121°C в течение 15 минут.
4
2
3
2
3
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
2
2
2
2
2
2
3
3
III
III
Для проведения ферментации, 2-литровый биореактор, содержащий 1 л стерилизованной заданной среды MM-W1, инокулировали клетками из периодических культур, содержащихся во флаконах с сывороткой (10-20% об./об.), выращенных в среде MM-W1, в которую подавали смесь 1:1 (об./об.) метана и воздуха. Состав применяемой среды MM-W1 был следующим: 0,8 мМ MgSO×7HO, 10 мМ NaNO, 0,14 мМ CaCl, 1,2 мМ NaHCO, 2,35 мМ KHPO, 3,4 мМ KHPO, 20,7 мкМ NaMoO×2HO, 1 мкМ CuSO×5HO, 10 мкМ Fe-Na-ЭДТК, и 1 мл на литр раствора металлических микроэлементов (содержащего, на литр 500 мг FeSO×7HO, 400 мг ZnSO×7HO, 20 мг MnCl×7HO, 50 мг CoCl×6HO, 10 мг NiCl×6HO, 15 мг HBO, 250 мг ЭДТК). После автоклавирования и охлаждения среды добавляли фосфат, бикарбонат и Fe-Na-ЭДТК. При некоторых ферментациях добавляли бикарбонат до концентрации 0,1% (масс./об). Содержимое реактора перемешивали с помощью подвесной мешалки при постоянной скорости 750 об/мин. Культуры подкармливали при постоянном барботировании метана со скоростью от примерно 60 мл/мин до примерно 120 мл/мин, при этом подавали концентрированный кислород (по меньшей мере 85%) с переменной скоростью от примерно 10 до 100 мл/мин для поддержания уровня растворенного кислорода от примерно 40% до примерно 80% (относительно насыщения среды воздухом).
600
4
4
x
y
4
3
600
III
Температуру в биореакторе поддерживали при 30°C, а pH поддерживали при 7,1±0,1 путем автоматизированного добавления в культуру 0,5 М NaOH и 0,5 М HCl вместе с другими добавками примерно каждые от 4 часов до примерно 24 часов (что соответствовало увеличению OD на приблизительно 5 единиц оптической плотности (OD)). При добавлении других компонентов чередовали добавление металлов (конечные концентрации 10 мкМ CuSO, 5 мкМ FeSO, 5 мкМ Fe-Na-ЭДТК) и добавление питательных веществ (5,75 мМ KHPO, 10 мМ NaNO). При указанных условиях наблюдался по существу линейный рост, при этом эффективная скорость образования биомассы составляла от примерно 2,7 до примерно 3,3 граммов сухой массы клеток на литр в день при достижении OD более 20. Культивируемую биомассу собирали путем центрифугирования, промывали один раз в среде MM-W1, и извлеченную биомассу либо замораживали при -80°C, либо сразу же применяли для фракционирования клеточных компонентов (например, экстракции липидов).
Подход на основе полунепрерывной ферментации можно также применять для поддержания продуктивности биомассы и уменьшения времени, связанного с остановкой и запуском ферментации (т.е., времени оборота или времени производственного цикла).
Сбор бактериальной биомассы выполняли с промежутками приблизительно 12-24 часа, когда плотность культуры достигала стационарной фазы (но до ее наступления). Приблизительно половину объема биореактора удаляли путем переноса в отдельный контейнер с помощью центробежного насоса. Затем равный объем стерилизованной или повторно используемой среды возвращали в биореактор, так что оптическая плотность реактора составляла приблизительно половину от ее исходного значения. Ферментацию в биореакторе продолжали согласно приведенному выше протоколу таким образом, чтобы можно было выполнить несколько циклов выращивания и извлечения биомассы в течение одного цикла ферментации.
Methylococcus capsulatus Bath (NCIMB 11132)
Бактерии культивировали при 42°C во флаконах с сывороткой, содержащих среду Хиггинза с минимальным содержанием нитратных солей (NSM) или среду MM-W1. Состав газа в свободном пространстве регулировали до объемного соотношения метан : воздух 1:1. Флаконы встряхивали при скорости от 200 до 250 об/мин. Согласно альтернативному варианту реализации изобретения культуру содержали на планшетах со средой NSM, затвердевших под действием 1,5% масс./об агара, выращенного в газонепроницаемой камере, содержащей газовую смесь 1:1 (об./об.) метан : воздух. Планшеты инкубировали перевернутыми в камере при 42°C.
4
2
3
2
3
2
4
2
4
4
2
4
2
4
2
4
2
2
2
2
2
2
2
3
3
III
III
Для проведения ферментации 3-литровый биореактор, содержащий 1,25 л стерилизованной среды MMF1.1 инокулировали клетками из периодических культур, содержащихся во флаконах с сывороткой (10-20% об./об.), выращенных в одинаковой среде, в которую подавали смесь 1:1 (об./об.) метана и воздуха. Состав среды MMF1.1 был следующим: 0,8 мМ MgSO×7HO, 40 мМ NaNO, 0,14 мМ CaCl, 6 мМ NaHCO, 4,7 мМ KHPO, 6,8 мМ KHPO, 20,7 мкМ Na2MoO×2HO, 6 мкМ CuSO×5HO, 10 мкМ Fe-Na-ЭДТК и 1 мл на литр раствора металлических микроэлементов (содержащего на литр 500 мг FeSO×7HO, 400 мг ZnSO×7HO, 20 мг MnCl×7HO, 50 мг CoCl×6HO, 10 мг NiCl×6HO, 15 мг HBO, 250 мг ЭДТК). После автоклавирования и охлаждения среды добавляли фосфат, бикарбонат и Fe-Na-ЭДТК. Содержимое реактора перемешивали с помощью подвесной мешалки при постоянной скорости 750 об/мин. Культуры подкармливали при постоянном барботировании метана со скоростью от примерно 60 до примерно 200 мл/мин, при этом концентрированный кислород (>85%) подавали с переменной скоростью от 15 до 90 мл/мин, и уровень растворенного кислорода поддерживали ниже 10% (относительно насыщения среды воздухом).
4
600
600
III
Температуру в биореакторе поддерживали при 44°C, а pH поддерживали при 7,0±0,1 путем автоматизированного добавления в культуру 0,5 М NaOH и 0,5 М HCl вместе с добавлениями меди и железа (конечная концентрация 5 мкМ CuSO4, 5 мкМ FeSO, 10 мкМ Fe-Na-ЭДТК) каждые 3-6 часа (что соответствует увеличению OD на приблизительно 3-5 единиц оптической плотности после достижения значения 5 единиц оптической плотности). При указанных условиях по существу наблюдался линейный рост, при этом эффективная скорость образования биомассы составляла более 5 граммов сухой массы клеток на литр в день до достижения OD больше 10. Культивируемую биомассу собирали путем центрифугирования, клетки промывали один раз в среде MM-W1 и конгломераты клеток либо замораживали при -80°C, либо сразу же применяли для фракционирования клеточных компонентов.
600
Исчерпание питательных веществ было признано проблемой, которая могла ограничить выход биомассы в процессе ферментации. Чтобы избежать недостатка питательных веществ, главным образом, азота и фосфата, подачу питательных веществ, содержащих 2-кратно концентрированную MMF1.1, начинали после того, как OD культуры превышала 5. Подачу питательных веществ начинали при скоростях разбавления, соответствующих приблизительно половине скорости роста культуры, чтобы избежать вымывания и поддержать увеличение OD при расширении объема культуры. Ферментацию в биореакторе продолжали согласно приведенному выше протоколу таким образом, чтобы можно было выполнить несколько циклов выращивания и извлечения биомассы в течение одного цикла ферментации.
Methylobacterium extorquens или Methylosinus trichosporium штамм OB3b (NCIMB 11131)
Бактерии культивировали при 30°C в пробирках, содержащих среду Хиггинза с минимальным содержанием нитратных солей (NSM) с добавкой 0,5% метанола. Пробирки встряхивали при скорости от 200 до 250 об/мин. Согласно альтернативному варианту реализации изобретения культуры содержали на планшетах со средой NSM, содержащих 1,5% масс./об агара, выращенного в присутствии пара метанола (путем применения 0,5 мл метанола в крышечке запечатанных парафильмом планшетов) или с добавкой 0,5% метанола. Планшеты инкубировали перевернутыми в увлажнительной камере при нормальной атмосфере при 30°C.
Для проведения ферментации, 2-литровый биореактор, содержащий 1 л заданной среды MM-W1, инокулировали клетками из содержащейся в культуральной пробирке периодической культуры (10-20% об./об.). Использовали состав среды MM-W1, описанный выше. Содержимое реактора перемешивали с помощью подвесной мешалки при постоянной скорости 800 об/мин. Культуру подпитывали посредством начального болюса метанола до конечной концентрации 0,5% и переменной подачи метанола, при этом чистый кислород подавали с переменной скоростью от 30 до 100 мл/мин для поддержания уровня растворенного кислорода от 60 до 90% (относительно насыщения среды воздухом).
600
Температуру в биореакторе поддерживали при 30°C, а pH поддерживали при 7,1±0,1 путем автоматизированного добавления 0,5 М NaOH и 1 М HCl вместе с добавлениями металлов и питательных веществ, как описано выше. При указанных условиях наблюдался по существу линейный рост, при этом эффективная скорость образования биомассы составляла от 2,7 до 3,3 граммов сухой массы клеток на литр в день до достижения величины OD более 20. Культивируемую биомассу собирали путем центрифугирования, клетки промывали один раз в среде MM-W1 и конгломераты клеток либо замораживали при -80°C, либо сразу же применяли для фракционирования клеточных компонентов.
Подход на основе полунепрерывной ферментации можно также применять для поддержания продуктивности биомассы и уменьшения времени, связанного с остановкой и запуском ферментации (т.е., времени оборота или времени производственного цикла).
Сбор аккумулированной бактериальной биомассы выполняли с промежутками приблизительно 12-24 часа, когда плотность культуры достигала стационарной фазы (но до ее наступления). Приблизительно половину объема биореактора удаляли путем переноса в отдельный контейнер с помощью центробежного насоса. Затем равный объем свежей или повторно используемой среды возвращали в биореактор, так что оптическая плотность реактора составляла приблизительно половину от ее исходного значения. Ферментацию в биореакторе продолжали согласно приведенному выше протоколу таким образом, чтобы было выполнено несколько циклов роста и извлечения биомассы в течение одного цикла ферментации.
Clostridium autoethanogenum и Clostridium ljungdahlii
600
Бактерии рода клостридий культивировали в анаэробных условиях в 100 мл модифицированной среды РЕТС (среда АТСС 1754) при 37°C в покрытых пластмассой 500 мл флаконах Schott Duran GL45 с бутилрезиновыми пробками, содержащих отходящие газы сталелитейного завода при давлении 200 кПа. Рост контролировали путем измерения оптической плотности при 600 нм (OD).
4
4
2
2
4
2
2
3
2
2
2
2
Модифицированная среда РЕТС содержала (на литр) 1 г NHCl, 0,4 г KCl, 0,2 г MgSO×7HO, 0,8 г NaCl, 0,1 г KHPO, 20 мг CaCl×2HO, 10 мл раствора микроэлементов (см. ниже), 10 мл витаминного раствора Вольфа (см. ниже), 2 г NaHCO и 1 мг резазурина. После установления pH 5,6, среду кипятили, распределяли в анаэробных условиях и стерилизовали в автоклаве при 121°C в течение 15 мин. В качестве источника углерода применяли отходящие газы сталелитейного завода (состав: 44% CO, 32% N, 22% CO, 2% H) или эквивалентные синтетические смеси. Указанная среда имела конечное значение pH 5,9 и восстанавливалась посредством цистеина-HCl и NaS при концентрации 0,008% (масс./об).
4
4
2
4
2
2
2
2
4
2
2
2
2
2
2
4
2
2
4
2
4
Раствор микроэлементов содержал 2 г нитрилотриацетной кислоты (устанавливали pH 6 с помощью KOH перед добавлением оставшихся ингредиентов), 1 г MnSO, 0,8 г Fe(SO)(NH)×6HO, 0,2 г CoCl×6HO, 0,2 мг ZnSO×7HO, 20 мг CuCl×2HO, 20 мг NiCl×6HO, 20 мг NaMoO×2HO, 20 мг NaSeO и 20 мг NaWO на литр.
Витаминный раствор Вольфа (Wolin et al., J. Biol. Chem. 235:2882, 1963) содержал (на литр) 2 мг биотина, 2 мг фолиевой кислоты, 10 мг пиридоксина гидрохлорида, 5 мг тиамина-HCl, 5 мг рибофлавина, 5 мг никотиновой кислоты, 5 мг кальция D-(+)-пантотената, 0,1 мг витамина B12, 5 мг n-аминобензойной кислоты и 5 мг липоевой кислоты.
а. Ферментация Clostridium autoethanogenum
4
2
2
2
2
2
3
4
4
2
2
2
2
2
Ферментацию Clostridium autoethanogenum проводили с применением способов, аналогичных способам, описанным, например, в заявке на патент США №2011/0300593. Короче, 2-литровый биореактор, содержащий 1,3 л раствора А (3,083 г NHAc; 0,61 г MgCl×6HO; 0,294 г CaCl×2HO; 0,15 г KCl; 0,12 г NaCl (необязательно); доводили до 1 л дистиллированной водой) барботировали газообразным N. Добавляли 85% раствор HPO (2,025 мл, 30 мМ) и устанавливали pH 5,3, используя концентрированный водный NHOH. Затем добавляли 13,5 мл раствора В (20,0 мг биотина; 20,0 мг фолиевой кислоты; 10,0 мг пиридоксина HCl; 50,0 мг тиамина × HCl; 50,0 мг рибофлавина; 50,0 мг никотиновой кислоты; 50,0 мг кальция D-(*)-пантотената; 50,0 мг витамина B12; 50,0 мг n-аминобензойной кислоты; 50,0 мг липоевой кислоты; доводили до 1 л дистиллированной водой), и полученный раствор барботировали газообразным N. Добавляли хлорид хрома (II) до тех пор, пока окислительно-восстановительный потенциал (ORP) раствора не уменьшился до приблизительно - 200 мВ, затем добавляли резазурин (1,35 мл 2 г/л раствора). Добавляли полисульфид натрия (5,4 мл 3 М раствора, см. ниже), и полученный раствор барботировали N и затем газом, содержащим CO (1% H; 13% N; 71% CO; 15% CO). Добавляли раствор сульфида металла (150 мл, см. ниже), и полученный раствор барботировали в течение дополнительных 30 минут, перед инокуляцией посредством активно растущей культуры С. autoethanogenum при уровне приблизительно 5% (об./об.).
2
2
2
2
Готовили раствор полисульфида натрия в 500 мл колбе, в которую загружали NaS (93,7 г, 0,39 моль) и 200 мл HO. Раствор перемешивали до растворения соли и добавляли серу (25 г, 0,1 моль) при постоянном потоке N. После перемешивания при комнатной температуре в течение 2 часов раствор полисульфида натрия (примерно 4 М относительно Na и примерно 5 М относительно серы), теперь прозрачная красновато-коричневая жидкость, переносили в прошедшие продукву N флаконы с сывороткой и заворачивали в алюминиевую фольгу.
3
2
2
2
2
Готовили раствор хрома (II) в 1 л трехгорлой колбе, снабженной газонепроницаемыми входным и выходным отверстиями, что позволяло работать в атмосфере инертного газа и осуществить последующий перенос требуемого продукта в подходящую колбу для хранения. Колбу загружали CrCl×6HO (40 г, 0,15 моль), гранулами цинка [20 меш] (18,3 г, 0,28 моль), ртутью (13,55 г, 1 мл, 0,0676 моль) и 500 мл дистиллированной воды. После продукви N в течение одного часа, смесь нагревали до примерно 80°C, чтобы инициировать реакцию. После двух часов перемешивания при постоянном потоке N, смесь охлаждали до комнатной температуры и непрерывно перемешивали в течение еще 48 часов, за время которых реакционная смесь превращалась в темно-голубой раствор. Раствор переносили в прошедшие продукву N флаконы с сывороткой и хранили при 4°C для будущего применения.
2
3
4
4
2
3
2
2
3
3
2
4
2
2
4
2
2
3
2
Раствор сульфида металла готовили путем добавления примерно 950 мл раствора А в 1 л ферментатор и барботирования газообразным N. Добавляли 85% раствор HPO (1,5 мл, 30 мМ) и устанавливали pH 5,3, используя концентрированный водный NHOH. Добавляли раствор В (10 мл), и полученный раствор барботировали с помощью N. Добавляли хлорид хрома (II) до тех пор, пока окислительно-восстановительный потенциал (ORP) раствора не уменьшился до приблизительно - 200 мВ, затем добавляли резазурин (1 мл 2 г/л раствора). Добавляли раствор C (1/10; 10 мл FeCl; 5 мл CoCl; 5 мл NiCl; 1 мл HBO; 1 мл NaMoO; 1 мл MnCl; 1 мл NaWO; 1 мл ZnCl; 1 мл NaSeO; в 1 л среды), затем добавляли полисульфид натрия (2 мл 3 М раствора) и далее полученный раствор барботировали газообразным N.
Ферментация субстрата, содержащего CO, посредством С. autoethanogenum в статических условиях в присутствии полисульфида приводила к значительному увеличению скорости аккумулирования, при этом конечное аккумулирование биомассы составляло приблизительно 4 г/л на протяжении периода от 2 до 3 дней. Например, после короткой лаг-фазы, составляющей приблизительно 1 день, биомасса могла увеличиться от примерно 0,5 г/л до по меньшей мере 3,5 г/л в течение приблизительно 36 часов ферментации. Кроме того, ацетат не образовывался во время фазы роста в присутствии полисульфида (который обычно находят при периодической ферментации) и в некоторых случаях определенное количество ацетата потреблялось, так что имело место чистое уменьшение количества ацетата в ферментаторе. Культивируемую биомассу собирали путем центрифугирования, клетки промывали один раз в среде и конгломерат клеток либо замораживали при -80°C, либо сразу же применяли для фракционирования клеточных компонентов.
Подход на основе полунепрерывной ферментации можно также применять для поддержания продуктивности биомассы и уменьшения времени, связанного с остановкой и запуском ферментации (т.е., времени оборота или времени производственного цикла).
Сбор аккумулированной бактериальной биомассы выполняли с промежутками приблизительно 12-24 часа, когда плотность культуры достигала стационарной фазы (но до ее наступления). Приблизительно половину объема биореактора удаляли путем переноса в отдельный контейнер с помощью центробежного насоса. Затем равный объем свежей или повторно используемой среды возвращали в биореактор, так что оптическая плотность реактора составляла приблизительно половину от ее исходного значений Ферментацию в биореакторе продолжали согласно приведенному выше протоколу таким образом, чтобы было выполнено несколько циклов роста и извлечения биомассы, в течение одного цикла ферментации.
b. Ферментация Clostridium ljungdahlii
2
4
2
4
4
2
4
4
2
2
2
4
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
4
2
2
3
2
2
3
2
Ферментацию Clostridium ljungdahlii выполняли с применением способов, аналогичных способам, описанным, например, в патентах США №№5173429 и 5593886. Короче, периодические ферментации проводили с применением биологически чистой культуры С. ljungdahlii. Приготовление среды ((1) 80,0 мл соли, содержащей KHPO 3,00 г/л, KHPO 3,00 г/л, (NH)SO 6,00 г/л, NaCl 6,00 г/л, MgSO×2HO 1,25 г/л; (2) 1,0 г дрожжевого экстракта; (3) 1,0 г триптиказы; (4) 3,0 мл раствора металлических микроэлементов PFN (Pfenning), содержащего FeCl×4HO 1500 мг, ZnSO×7HO 100 мг, MnCl×4HO 30 мг, HBO 300 мг, CoCl×6HO 200 мг, CuCl×HO 10 мг, NiCl×6HO 20 мг, NaMoO×2HO 30 мг, NaSeO 10 мг и дистиллированную воду до 1 л; (5) 10,0 мл витаминов В, содержащих пиридоксаль HCl 10 мг, рибофлавин 50 мг, тиамин HCl 50 мг, никотиновую кислоту 50 мг, Ca-D-пантотенат 50 мг, липоевую кислоту 60 мг, n-аминобензойную кислоту 50 мг, фолиевую кислоту 20 мг, биотин 20 мг, цианокобаламин 50 мг и дистиллированную воду до 1 л; (6) 0,5 г цистеина HCl; (7) 0,06 г CaCl×2HO; (8) 2,0 г NaHCO; (9) 1,0 мл резазурина (0,01%); и (10) 920,0 мл дистиллированной воды) выполняли в анаэробных условиях в атмосфере 80% азота и 20% CO. В процессе ферментации регулировали показатель pH среды, который поддерживали равным 5,0 посредством HCl. При необходимости, регулировку pH осуществляли с помощью стерильного 10% NaOH или 1,0% раствора уксусной кислоты. Среду переносили в 157,5 мл флаконы с сывороткой и герметично закрывали с помощью бутилрезиновых пробок и алюминиевых прокладок. Затем флаконы стерилизовали в автоклаве при 121°C в течение 20 минут.
2
За приблизительно 48 часов до начала эксперимента готовили затравочную культуру из исходной культуры С. ljungdahlii во флаконе, аналогичном флаконам, описанным выше. Затравочную культуру выращивали в вибрационном инкубаторе при 37°C и встряхивали при 100 об/мин. Добавляли восстанавливающие растворы (2,0 мл NaS, 2,5% раствор и 2,0 мл цистеин-HCl, 3,5% раствор) к культуре, которую помещали в вибрационный инкубатор на приблизительно 15 минут для полного удаления кислорода и температурной акклиматизации. В отличие от процедуры, применяемой для выделения биологически чистой культуры организма, при периодической ферментации не требуется добавление ингибиторов метана.
Ферментацию с применением С. ljungdahlii выполняли в 2,5-литровом ферментаторе New Brunswick Scientific Bioflow IIc, содержащем питательную среду при 37°C, и поддерживали постоянный уровень жидкости 1,5 литров при перемешивании жидкости при переменных скоростях, составляющих до 1000 оборотов в минуту, с помощью газа, введенного со скоростью приблизительно 500 кубических сантиметров в минуту. Оптимальные времена удерживания газа находились в диапазоне трех минут. Подачу газа изменяли при поглощении его бактериями, которое в свою очередь являлось функцией плотности клеток.
Сбор аккумулированной бактериальной биомассы выполняли с промежутками приблизительно 12-24 часа, когда плотность культуры достигала стационарной фазы (но до ее наступления). Приблизительно половину объема биореактора удаляли путем переноса в отдельный контейнер с помощью центробежного насоса. Затем равный объем свежей или повторно используемой среды возвращали в биореактор, так что оптическая плотность реактора составляла приблизительно половину от ее исходного значения. Ферментацию в биореакторе продолжали согласно приведенному выше протоколу таким образом, чтобы было выполнено несколько циклов роста и извлечения биомассы в течение одного цикла ферментации.
ПРИМЕР 2
1
МЕТАБОЛИЗИРУЮЩИЕ C МИКРООРГАНИЗМЫ, СКОНСТРУИРОВАННЫЕ ДЛЯ УСИЛЕНИЯ ПРОДУЦИРОВАНИЯ ЛИПИДОВ
Клетки-хозяина были сконструированы таким образом, что они обладают генетическими модификациями, минимизирующими или уменьшающими расщепление жирных кислот - путем нокаута активности длинноцепочечная жирная кислота: КоА-лигазы, кодированной эндогенным геном fadD. Кроме того, биосинтез свободных жирных кислот (СЖК) был усилен путем введения гена тиоэстеразы (ТЕ) в метанотроф согласно настоящему изобретению (Methylococcus capsulatus). Такие рекомбинантные изменения дополнительно описаны в настоящем примере.
Молекулы рекомбинантных нуклеиновых кислот
Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие белки FadD дикого типа, представляли собой эталонную исходную точку для конструирования мутантных генов fadD. Например, последовательность белка FadD дикого типа, кодированная М. trichosporium OB3b, М. capsulatus Bath, М. methanica, М. extorquens и С. ljungdahlii, находится в банке данных GenBank Accession №№ EFH00931.1, YP_114021.1, YP_004512148.1, YP_002964871.1 и YP_003782065.1, соответственно. В результате, молекула нуклеиновой кислоты генов fadD, кодирующих указанные выше белки, была отдельно синтезирована таким образом, что содержит несколько мутаций остановки и сдвиги рамки в 5'-области гена из М. trichosporium OB3b (SEQ ID №: 1), М. methanica (SEQ ID №: 35), М. extorquens (SEQ ID №: 52) и С. ljungdahlii (SEQ ID №: 85). Для гена fadD М. capsulatus, была синтезирована молекула нуклеиновой кислоты, содержащая внутриклональную делецию, так что оставшиеся 5' и 3' концы гена могли соединиться с сохранением первоначальной рамки считывания (SEQ ID №: 18).
В случае С. autoethanogenum геном являлся секвенированным и fadD, гомологичный Е. coli, идентифицировали путем поиска с помощью TBLASTN (поиск транслированных нуклеотидных последовательностей генов с последовательностью белка FadD Е. coli). Молекулу нуклеиновой кислоты гена fadD С. autoethanogenum синтезировали для внедрения нескольких мутаций остановки и сдвигов рамки в 5'-область указанного гена.
1
1
1
Молекулы нуклеиновых кислот мутантного fadD по отдельности клонировали в плазмидном векторе (не имеющем точки начала репликации метанотрофа или клостридии и кодирующем устойчивость к канамицину) для конъюгации, электропорации или трансформации в метаболизирующий C микроорганизм с применением способов, описанных в настоящей заявке. Такой вектор (который не реплицирует в метаболизирующем C микроорганизме) гарантирует, что любой канамициноустойчивый метаболизирующий C микроорганизм будет иметь ген устойчивости, встроенный в клеточный геном хозяина в результате гомологической рекомбинации и замещения эндогенного гена fadD указанными выше мутантами fadD (так что рекомбинантные клетки будут отсутствовать или проявлять минимальную активность длинноцепочечная жирная кислота: КоА-лигазы).
1
1
Кроме того одна или более выбранных последовательностей тиоэстеразы, последовательность малонил-КоА: ацилпереносящий белок-трансацилазы (fabD) и последовательность ацетил-КоА-карбоксилазы (например, ассА, accB, ассС и accD из Е. coli) подвергали оптимизации кодонов и синтезировали с помощью подходящих промоторов. Затем один или более генов тиоэстеразы и ген ацетил-КоА-карбоксилазы (например, ассА или accABCD) клонировали в подходящем экспрессирующем векторе и конъюгировали, электропорировали или трансформировали в метаболизирующие C микроорганизмы дикого типа или метаболизирующие C микроорганизмы с нокаутированным fadD, описанные в настоящей заявке.
Кодон-оптимизированные последовательности тиоэстеразы приведены в (1) SEQ ID NOS.: 3-13 для М. trichosporium OB3b; (2) SEQ ID NOS.: 20-30 для М. capsulatus Bath; (3) SEQ ID NOS.: 37-47 для М. methanica; (4) SEQ ID NOS.: 54-64 для М. extorquens; (5) SEQ ID NOS.: 70-80 для С. autoethanogenum; и (6) SEQ ID NOS.: 87-97 для С. ljungdahlii. Кодон-оптимизированные последовательности fabD приведены в (1) SEQ ID №: 2 для М. trichosporium OB3b; (2) SEQ ID №: 19 для М capsulatus Bath; (3) SEQ ID №: 36 для М. methanica; (4) SEQ ID №: 53 для М. extorquens; (5) SEQ ID №: 69 для С. autoethanogenum; и (6) SEQ ID №: 86 для С. ljungdahlii. Кодон-оптимизированные последовательности ассА, ассВ, ассС и accD описаны, соответственно, в (1) SEQ ID NOS.: 14-17 для М. trichosporium OB3b; (2) SEQ ID NOS.: 31-34 для М. capsulatus Bath; (3) SEQ ID NOS.: 48-51 для М. methanica; (4) SEQ ID NOS.: 65-68 для М. extorquens; (5) SEQ ID NOS.: 81-84 for С autoethanogenum; и (6) SEQ ID NOS.: 98-101 для С. ljungdahlii.
Конъюгация
Процедура конъюгирования плазмид из Escherichia coli в М. trichosporium OB3b или М. methanica была основана на способе, разработанном Martin и Murrell (FEMS Microbiol. Lett. 727:243, 1995), тогда как процедура конъюгирования плазмид из Е. coli в M. capsulatus была основана на способе, описанном Ali и Murrell (Microbiology 755:761, 2009).
Короче, мобилизуемая плазмида, содержащая один или более представляющих интерес генов (например, мутантный fadD, МСТ, один или более ТЕ, один или более Acc) и кодирующая устойчивость к канамицину, была сначала трансформирована в S17-1 Е. coli с применением стандартных способов электропорации. Трансформация была подтверждена выбором устойчивых к канамицину колоний на LB-агаре, содержащем 30 мкг/мл канамицина. Трансформированные колонии инокулировали в среду LB, содержащую 30 мкг/мл канамицина, и встряхивали всю ночь при 37°C. Затем 10 мл аликвоту полученной за ночь культуры собирали на стерильный 47 мм нитроцеллюлозный фильтр (размер пор 0,2 мм). Донорные клетки Е. coli промывали на фильтре с помощью 50 мл стерильной среды NSM для удаления остаточной среды и антибиотика.
600
Параллельно, пробу штаммов-реципиентов M. trichosporium OB3b, M. methanica или M. capsulatus Bath по отдельности инокулировали в 100 мл флаконы с сывороткой, содержащие от 20 до 50 мл среды NSM. Затем свободное пространство во флаконах заполняли смесью 1:1 кислорода и метана и флаконы герметично закрывали бутилрезиновыми крышками и обжимали. Флаконы непрерывно встряхивали в инкубаторе при 30°C (M. trichosporium OB3b, M. methanica) или 45°C (M. capsulatus Bath) до достижения OD приблизительно 0,3. Далее клетки собирали на такой же фильтр, что и штамм-донор Е. coli. Фильтр снова промывали с помощью 50 мл стерильной среды NSM. Указанный фильтр помещали (клетками вверх) на планшет с агаровой средой NSM, содержащий 0,2% дрожжевого экстракта, и инкубировали в течение 24 ч при 30°C (M. trichosporium OB3b, M. methanica) или 37°C (M. capsulatus Bath) в присутствии смеси 1:1 метана и воздуха. Через 24 ч перед концентрированием путем центрифугирования клетки повторно суспендировали в 10 мл стерильной среды (NSM). Собранные клетки повторно суспендировали в 1 мл стерильной среды NSM и аликвоты (100 мкл) распределяли по планшету с агаровой средой NSM, содержащему 10 мкг/мл канамицина.
Планшеты инкубировали в герметичных камерах, содержащих смесь 1:1 метана и воздуха, и выдерживали при 30°C (M. trichosporium OB3b, M. methanica) или 45°C (M. capsulatus Bath). Газовую смесь пополняли каждые 2 дня до формирования колоний, как правило, через 7-14 дней. Колонии засеивали штрихом на планшетах с NSM, содержащих канамицин, для подтверждения устойчивости к канамицину, а также для дополнительного выделения трансформированных метанотрофных клеток из остаточных клеток-доноров Е. coli.
Электропорация - Methanobacterium
9
10
2
2
Процедура введения плазмид в М. extorquens была основана на процедуре, описанной Ueda et al., Appl. Environ. Microbiol. 57:924, 1991. Короче, М. extorquens дикого типа (wt) культивировали при 30°C в среде NSM с добавкой 0,5% метанола. Клетки NR-2 М. extorquens, выращенные до фазы середины логарифмического роста (1,4×10/мл), собирали путем центрифугирования при 6000 × г в течение 10 мин и промывали электропорационным буферным раствором (10 мМ Tris-HCl, 2 мМ MgCl, 6HO, 10% [масс./об.] сахарозы [pH 7,5]). Клетки повторно суспендировали в том же буферном растворе при концентрации клеток 7,0×10/мл. Клеточную суспензию и вектор (70 мкг/мл) смешивали при соотношении 9:1 (об./об.) в пробирке и затем 10 мкл переносили пространство между электродами камеры, где указанную суспензию приводили в равновесие в течение 3 минут. После воздействия 10 импульсами 10 кВ/см электрического поля в течение 300 мкс/импульс, 5 мкл аликвоту смеси переносили в чистую пробирку и добавляли 0,2 мл среды NSM. Затем клеточную суспензию инкубировали в течение 2 ч при 30°C для протекания экспрессии генов, устойчивых к антибиотикам, перед культивированием на планшетах со средой NSM, содержащих 0,5 метанола и 20 мкг/мл канамицина.
Указанные планшеты инкубировали при 30°C до образования колоний. Колонии засеивали штрихом на одинаковых планшетах для подтверждения устойчивости к канамицину, а также для дополнительного выделения трансформированных метанотрофных клеток из остаточных донорных клеток Е. coli.
Электропорация - Clostridium
600
600
2
Способы трансформации для С. autoethanogenum или С. ljungdahlii выполняли, как описано в публикации патента США №2011/0236941, или с применением модифицированного протокола для С. tyrobutyricum (Zhu et al., Biotechnol. Bioeng. 90:154, 2005). Короче, для получения компетентных клеток 50 мл культуры С. autoethanogenum пересеивали в свежую среду в течение 3 последовательных дней согласно условиям культивирования, описанным в настоящей заявке. Указанные клетки применяли для инокулирования 50 мл среды РЕТС, содержащей 40 мМ DL-треонина, при OD 0,05. Когда OD культуры достигла 0,4, клетки переносили в анаэробную камеру и собирали при 4700 × г и 4°C. Культуру дважды промывали ледяным электропорационным буферным раствором (270 мМ сахарозы, 1 мМ MgCl, 7 мМ фосфата натрия, pH 7,4) и в заключении суспендировали в свежем электропорационном буферном растворе объемом 600 мкл. Указанную смесь переносили в предварительно охлажденную кювету для электропорации с 0,4 см зазором между электродами, содержащую 1 мкг вектора (не имеющего точки начала репликации Clostridium и содержащего представляющую интерес молекулу нуклеиновой кислоты и кодирующего устойчивость к кларитромицин) и сразу же воздействовали импульсами, используя систему электропорации Gene pulser Xcell (Bio-Rad) при следующих установочных параметрах: 2,5 кВ, 600 мкл и 25 мкФ. Обеспечивали постоянные времени от 3,7 до 4,0 мс. Культуру переносили в 5 мл свежей среды. Регенерацию клеток контролировали при длине волны 600 нм, используя спектрофотометр Spectronic Helios Epsilon (Thermo), оборудованный держателем для пробирок. После начального уменьшения биомассы, клетки снова возобновили рост. После того, как количество биомассы удвоилось относительно указанной точки, клетки собирали, суспендировали в 200 мкл свежей среды и высеивали на планшетах с селективной средой РЕТС (содержащих 1,2% Bacto™ Agar (BD)) с 4 мкг/мкл кларитромицина. После 4-5 дней инкубирования с применением газа от сталелитейного завода при давлении 30 psi (207 кПа) при 37°C, колонии были ясно видны.
Согласно альтернативному варианту реализации изобретения после электропорационного импульса клетки переносили в 5 мл предварительно нагретой среды в пробирке Хангейта и инкубировал при 37°C до тех пор, пока рост не становился видимым (измерения проводили в пробирках Хангейта в фотометре). Аликвоты трансформантов инокулировали в 5 мл жидкой среды и распределяли по содержащим кларитромицин планшетам для выращивания мутантных колоний.
Выбранные рекомбинантные колонии применяли для инокулирования 2 мл среды РЕТС, содержащей 4 мкг/мкл кларитромицина. Когда происходил рост, объем культуры увеличивали в 5 мл и затем в 50 мл среды РЕТС, содержащей 4 мкг/мкл кларитромицина и газ от сталелитейного завода при давлении 30 psi (207 кПа) в качестве источника углерода.
1
Рекомбинантные метаболизирующие C бактерии
Трансформация была подтверждена устойчивостью клеток к выбранному антибиотику и экспрессия генов была подтверждена методами ПЦР (полимеразной цепной реакцией), нозерн-блоттинга, вестерн-блоттинга или ELISA. Например, для подтверждения переноса можно выделить плазмидную ДНК и подвергнуть ее ПЦР, используя гранулы illustra PuReTaq Ready-To-Go™ ПЦР Beads (GE Healthcare) и стандартные условия (95°C в течение 5 мин; 32 цикла при 95°C в течение 30 с, 50°C в течение 30 с и 72°C в течение 1 мин; 72°C в течение 10 мин). В качестве дополнительного контроля, 1 мкл каждой из изолированных плазмид повторно трансформировали в XL1-Blue MRF' Kan E. coli (Stratagene, Ла-Холья, Калифорния), откуда плазмиды можно аккуратно выделить и верифицировать с помощью рестриктазных фрагментов.
Способы идентификации актов гомологичной рекомбинации надежно отработаны в данной области техники, например, ПЦР и секвенирование с применением уникальных праймеров в геноме и векторе для подтверждения соответствующей вставки. Далее рекомбинантные бактерии, имеющие согласно идентификации соответствующую вставку, выращивали в отсутствии селективного давления (например, без канамицина или кларитромицина) в течение нескольких поколений и чувствительные к канамицину клоны идентифицировали методом отпечатков (или эквивалентным методом). Приблизительно 50% чувствительных к канамицину ревертантов должно обладать мутировавшей формой гена-мишени вместо дикого типа, что подтверждалось посредством ПЦР и секвенирования. Потерю экспрессии или функции fadD можно подтвердить с помощью одного или более методов, выбранных из (1) ПЦР и секвенирования, (2) Нозерн-блоттинга и (3) анализа на активность ацил-КоА синтетазы.
9
3
2
4
Для анализа активности ацил-КоА синтетазы можно использовать, например, способ Kameda et al. (J. Biol. Chem. 256:5702, 1981) путем выращивания клеток до фазы середины логарифмического роста в среде NSM с антибиотиками, при необходимости, сбора клеток путем центрифугирования, промывания дважды с помощью NSM, суспендирования клеток до плотности 1,2×10 клеток/мл в 10 мМ Tris-HCl, pH 7,5  и затем лизирования при трех циклах обработки ультразвуком на льду. Готовили реакционные смеси в общем объеме 0,5 мл, содержащие 200 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 2,5 мМ АТФ, 8 мМ MgCl, 2 мМ ЭДТК, 20 мМ NaF, 0,1% Triton X-100, 10 пМ [H]олеата, 0,5 мМ кофермента А и клеточный экстракт. Ферментативные реакции инициировали путем добавления кофермента А, инкубировали при 35°C в течение 10 минут и заканчивали путем добавления 2,5 мл изопропилового спирта : н-гептана : 1М HSO (40:10:1). Радиоактивную олеиновую кислоту удаляли путем органической экстракции с применением н-гептана, тогда как олеоил-КоА, образовавшийся во время реакции, оставался в водной фракции для количественного определения посредством сцинтилляционного счета. Концентрации белка в ферментных экстрактах определяли методом Бредфорда, используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта.
1
4
Получение жирных кислот из C субстратов (CH и CO)
Для метанотрофов применяли М. trichosporium OB3b, М. methanica, M. extorquens или М. capsulatus Bath, дикого типа или с нокаутированным fadD, трансформированные вектором, содержащим гены, кодирующие один или более генов тиоэстеразы или сверхэкспрессирующие гены ацетил-КоА-карбоксилазы, для инокулирования 100 мл флаконов с сывороткой или культуральных пробирок, содержащих от 20 до 50 мл среды NSM и 10 мкг/мл канамицина. Для М. extorquens в среду добавляли 0,5% метанола в качестве источника углерода, тогда как для М. trichosporium OB3b, М. methanica и М. capsulatus Bath свободное пространство во флаконе заполняли смесью 1:1 кислорода и метана в качестве источника углерода. Флаконы герметично закрывали бутилрезиновыми крышками и обжимали. Затем флаконы или пробирки непрерывно встряхивали при скорости 200-250 об/мин во время инкубирования при 30°C (М. trichosporium OB3b, М. methanica, М. extorquens) или 42-45°C (М. capsulatus Bath).
В случае клостридии применяли С. autoethanogenum или С. ljungdahlii дикого типа или с нокаутированным fadD, трансформированные вектором, содержащим гены, кодирующие один или более ферментов тиоэстеразы, и с содержанием или без генов ацетил-КоА-карбоксилазы, для инокулирования 2 мл среды РЕТС, содержащей 4 мкг/мкл кларитромицина. Когда происходил рост, объем культуры увеличивали в 5 мл и затем в 50 мл среды РЕТС, содержащей 4 мкг/мкл кларитромицина и газ от сталелитейного завода при давлении 30 psi (207 кПа) в качестве источника углерода. Затем флаконы непрерывно встряхивали при скорости от 200 до 250 об/мин во время инкубирования при 37°C.
1
Количественное определение жирных кислот, продуцируемых рекомбинантными метаболизирующими C бактериями, выполняли с применением газового хроматографа/масс-спектрометра (ГХ/МС). Жирные кислоты в клеточной культуре экстрагировали путем интенсивного перемешивания с бутилацетатом, содержащим ундекановую кислоту в качестве внутреннего стандарта для ГХ/МС анализа экстракта. После недолгого центрифугирования смеси небольшую часть органической фазы переносили в отдельный флакон, с последующим добавлением равного объема N,O-бис(триметилсилил)трифторацетамида. Пробу анализировали посредством ГХ с масс-спектрометрическим детектором (HP 5792), используя ГХ/МС колонку Agilent HP-5MS (толщина пленки 30,0 м × 250 мкм × 0,25 мкм). Для инжектора применяли отношение деления потока 20:1 при 250°C, и в качестве газа-носителя использовали гелий при скорости потока 1,2 мл/мин. Температуру термостата поддерживали при 60°C в течение 1 минуты, с последующим увеличением градиента температуры на 19°C/мин до достижения температуры 250°C. Концентрацию жирных кислот в клеточной культуре рассчитывали в режиме селективного детектирования ионов на основе калибровочных кривых стандартов жирных кислот. Поскольку метан был единственным источникам углерода, поставляемым в клетки, все продуцируемые жирные кислоты должны были быть получены из метана.
Результаты
600
Профиль жирных кислот М. capsulatus Bath изменяли посредством нокаута fadD и путем введения и экспрессии гена тиоэстеразы Е. coli. Сначала синтезировали ген тиоэстеразы Е. coli с удаленной последовательностью нацеливания на периплазму (TesA'), используя три различные композиции кодонов (TesA'-3, SEQ ID NO: 102; TesA'-37, SEQ ID NO: 103; и TesA'-20, SEQ ID NO: 104), сконструированные для получения вариантов с различными уровнями экспрессии. Варианты TesA' клонировали в плазмиду на основе IncP (содержащую Inc-P oriV и oriT) и функционально связывали с промотором, который функционировал в метанотрофах. Рекомбинантный экспрессирующий вектор, содержащий TesA', трансформировали в М. capsulatus, как описано в настоящей заявке. Культуры М. capsulatus выращивали в течение 5 дней в 5 мл объеме в 150 мл герметично закрытых флаконах с сывороткой с использованием 40 мл метана и 80 мл кислорода. После стадии роста 1 мл каждой культуры анализировали на концентрацию и состав жирных кислот, используя ГХ/МС, как описано в настоящей заявке. Измеренные концентрации свободных жирных кислот нормализировали до OD с помощью культуры. Отметим, что фракция C16:1 состояла из по меньшей мере трех различных изомеров, при этом наиболее распространенной была Δ9-цис-пальмитолеиновая кислота (данные не показаны).
Параллельно, гомолог ацилкофермент А (КоА)-синтетазы (fadD) Е. coli рекомбинантно нокаутировали SEQ ID NO: 18 в геноме М. capsulatus, как описано в настоящей заявке, и подтверждали с помощью анализа ПЦР. Было показано, что нокаутированный FadD в некоторых других микробных штаммах увеличивал уровни свободных жирных кислот (см., например, Lennen et al., Trends Biotechnol. 72:659, 2012). Нокаутированный мутант fadD М. capsulatus не проявлял значительного увеличения уровней свободных жирных кислот, что указывает на то, что один или более дополнительных гомологов FadD может присутствовать в геноме М. capsulatus, но липидный профиль был сдвинут, поскольку имело место увеличение содержания C18:0 липидов.
Пул свободных жирных кислот в трансформированных клетках резко увеличился (см. фиг. 3A), причем указанное увеличение в основном связано с повышенными уровнями С16:0 и С18:0 липидов (см. фиг. 3B).
ПРИМЕР 3
1
ЭКСТРАКЦИЯ ЛИПИДОВ ИЗ МЕТАБОЛИЗИРУЮЩИХ C МИКРООРГАНИЗМОВ
Масляную композицию, содержащуюся в собранной бактериальной биомассе, экстрагировали согласно модифицированной версии протокола экстракции Фолча (Folch et al., J. Biol. Chem. 226:497, 1957), выполняемого при 20°C (т.е., комнатной температуре) в экстрактном растворе, приготовленном из одного объема метанола в двух объемах хлороформа (раствор ХМ). Для экстракции использовали примерно 5 г влажной клеточной массы (ВКМ) из каждой свежей бактериальной биомассы (или бактериальной биомассы, которую хранили при -80°C и затем оттаивали). К клеточному материалу добавляли 100 мл раствора ХМ и смесь энергично экстрагировали в делительной воронке. Через по меньшей мере 10 минут три фазы растворялись. Органическая фаза, содержащая экстрагированные липиды, оседала в нижней части делительной воронки, которую сливали в чистый стеклянный флакон. Средний слой содержал в основном лизированный клеточный материал, который можно было отделить от легкой водной фазы, содержащей соли и другие растворимые клеточные компоненты.
При необходимости, твердые вещества в водной фазе можно сконцентрировать, используя центрифугу или другое механическое оборудование для концентрирования. Воду, удаленную из твердой фазы, можно повторно использовать, тогда как твердые вещества с некоторым количеством остаточной воды можно загрузить в устройство для обработки твердой фазы.
Для повышения эффективности экстракции липидов выполняли вторую стадию экстракции путем добавления дополнительных 100 мл свежего раствора ХМ непосредственно в делительную воронку, содержащую оставшуюся лизированную клеточную массу и остаточную воду. Смесь опять тщательно перемешивали, оставляли фазы разделяться и объединяли нижние органические фазы, полученные в результате двух экстракций. Затем объединенные органические фазы промывали в делительной воронке 100 мл деионизированной воды для удаления любого остаточного водорастворимого материала. Снова сливали отделенную органическую фракцию из нижней части делительной воронки и удаляли растворитель путем вращательного испарения при нагревании, предпочтительно, в отсутствии кислорода или путем испарения при 55°C в потоке азота.
1
Затвердевшие масляные композиции, экстрагированные из собранных культур М. trichosporium OB3b, Methylococcus capsulatus Bath и Methylomonas sp. 16a, взвешивали, и результаты взвешивания приведены в таблице 1 в виде массовой доли относительно первоначальной сухой массы клеток (СМК). Полученные данные показывают, что значительная часть СМК из указанных метаболизирующих C микроорганизмов состоит из липидов.
Масляную композицию из биомассы Methylomonas sp. 16a также экстрагировали способом экстракции Hara и Radin с применением смеси гексан : изопропанол (ГИП) (Anal. Biochem. 90:420, 1978). Анализ масляной композиции, экстрагированной способом с применением ГИП, показал, что указанная масляная композиция была по существу идентична масляной композиции, экстрагированной с применением модифицированного способа Фолча (данные не показаны).
ПРИМЕР 4
1
ПРЕВРАЩЕНИЕ ЛИПИДОВ ИЗ МЕТАБОЛИЗИРУЮЩИХ C МИКРООРГАНИЗМОВ В СЛОЖНЫЕ МЕТИЛОВЫЕ ЭФИРЫ ЖИРНЫХ КИСЛОТ
Липидные фракции, экстрагированные из культивируемой биомассы М. capsulatus Bath, М. trichosporium OB3b и Methylomonas sp. 16a в форме сухого твердого вещества, подвергали по отдельности гидролизу с применением гидроксида калия (KOH) и превращали в сложные метиловые эфиры жирных кислот (СМЭЖК) посредством реакции с метанолом в одну стадию. Примерно 5 г экстрагированных твердых липидов в 10 мл стеклянном флаконе растворяли в 5 мл 0,2 М KOH раствора толуола : метанола (1:1 об./об.). Флакон энергично встряхивали и затем перемешивали при 250 об/мин при 42°C в течение 60 минут, после чего раствор оставляли охлаждаться до температуры окружающей среды и переносили в делительную воронку. В делительную воронку добавляли приблизительно 5 мл дистиллированной воды и 5 мл раствора ХМ, перемешивали и затем оставляли фазы разделяться под действием силы тяжести или путем центрифугирования (3000 об/мин, 25°C) в течение 5 минут. Удаляли верхний водный слой, содержащий растворенные сложные эфиры глицеринфосфата, тогда как тяжелую масляную фазу (нижнюю) собирали и концентрировали до сухости путем вращательного испарения или с применением постоянного потока азота.
Анализ СЖК и СМЭЖК, обнаруженных в липидах из каждой метанотрофной культуры, выполняли с применением газового хроматографа/масс-спектрометра (ГХ/МС). Твердую фазу, собранную перед и после стадии гидролиза/переэтерификации растворяли в 300 мкл бутилацетата, содержащего ундекановую кислоту в качестве внутреннего стандарта для ГХ/МС анализов. Полученный раствор центрифугировали в течение 5 минут при 14000 об/мин для удаления нерастворимых остатков. К супернатанту, полученному на стадии центрифугирования, добавляли одинаковый объемный эквивалент N,O-бис(триметилсилил)трифторацетамида и быстро встряхивали. Пробы помещали в ГХ, оборудованный масс-спектрометрическим детектором (HP 5792), и применяли ГХ/МС колонку Agilent HP-5MS (толщина пленки 30,0 м × 250 мкм × 0,25 мкм) для разделения СЖК и СМЭЖК. Идентичность СЖК и СМЭЖК подтверждали на основе времени удерживания и масс-спектров электронной ионизации их стандартов. В ГХ/МС способе в качестве газа-носителя использовали гелий при скорости потока 1,2 мл/мин. Температуру в отверстии для ввода пробы поддерживали при 250°C при отношении деления потока 20:1. Температуру термостата поддерживали при 60°C в течение 1 минуты при последующем градиенте температуры, включающем увеличение на 8°C/мин до 300°C. Площадь в % каждой СЖК и СМЭЖК рассчитывали на основе общего количество ионов из показания масс-детектора.
Твердый остаток, собранный перед и после гидролиза/переэтерификации, анализировали на содержание СЖК и СМЭЖК с применением ГХ/МС (см. таблицу 2). Кроме того, хроматограммы, полученные при анализе ГХ/МС, приведены на фиг. 4-6.
1
Как видно из таблицы 2 и фиг. 4-6, экстрагированные масляные композиции перед гидролизом/переэтерификацией содержали в изобилии свободные жирные кислоты и дополнительные жирные кислоты, присутствующие в виде (наиболее вероятно) ди- и триацилглицеридов (которые не были обнаружены при следовом ГХ/МС анализе), но после гидролиза/переэтерификации СЖК превращались в сложные метиловые эфиры жирных кислот различной длины. Полученные данные указывают, что масляные композиции из метаболизирующих C микроорганизмов согласно настоящему изобретению можно очистить и применять для получения высокоценных молекул.
ПРИМЕР 5
1
ПОЛУЧЕНИЕ БИОТОПЛИВА С ПОМОЩЬЮ МАСЛЯНЫХ КОМПОЗИЦИЙ ИЗ МЕТАБОЛИЗИРУЮЩИХ C МИКРООРГАНИЗМОВ
1
Экстрагированные масляные композиции из метаболизирующих C микроорганизмов можно обработать на расположенной вблизи установке для переработки или транспортировать на удаленную установку для переработки. Установку для переработки применяли для превращения триглицеридов из биовозобновляемого сырья (такого как жиры, животные жиры и метанотрофные масла) в смесь жидких углеводородных топлив, в основном биодизельного топлива и биотоплива для реактивных двигателей, высококачественного синтетического парафинированного керосина (СПК). Указанный способ требует водорода, который можно получить на месте посредством риформинга метана или который обеспечивают с применением аппарата для ферментации, расположенного вблизи существующей установки для переработки.
Установка для переработки может работать в смешенном режиме, при этом выходной продукт представлял собой смесь биодизельного топлива и биотоплива для реактивных двигателей, или в режиме дизельного топлива, при этом выходной продукт представлял собой в основном биодизельное топливо.
15
18
Во время переработки жирные кислоты и глицериды превращали в СПК за три стадии. Сначала сырье обрабатывали для удаления загрязняющих веществ-катализаторов и воды, при необходимости. На второй стадии цепи жирных кислот трансформировали в н-парафины в гидроочистителе. Примером является превращение олеиновой кислоты в н-октадекан посредством реакций гидрирования и дезоксигенирования в гидроочистителе. Для большинства биомасел, жиров и животных жиров полученный в гидроочистителе жидкий продукт представлял собой, главным образом, композицию C-C н-парафинов. На третьей стадии способа указанные парафины с длинными прямыми цепями подвергали гидрокрекингу с получением более коротких разветвленных парафинов. Продукты гидрокрекинга главным образом соответствовали интервалу температур кипения керосина.
3
3
Полученный СПК предпочтительно соответствовал или превосходил все соответствующие целевому назначению спецификации топлива для реактивных двигателей, за исключением плотности. Высокое отношение H к C в СПК, придающее ему отличную термическую устойчивость и низкий показатель выбросов твердых частиц, означает углеводородную композицию с пониженной плотностью: 760-770 кг/м по сравнению с минимальным значением 775 кг/м, приведенным в спецификации ASTM (Американского общества по испытанию материалов)' Но такая пониженная плотность не является проблемой в случае смесей нефтяного топлива для реактивных двигателей: СПК (например, 50/50).
ПРИМЕР 6
1
РАСПРЕДЕЛЕНИЕ СТАБИЛЬНОГО ИЗОТОПА УГЛЕРОДА В ЛИПИДАХ ИЗ МЕТАБОЛИЗИРУЮЩИХ C МИКРООРГАНИЗМОВ
13
15
13
Сухие пробы биомассы М. trichosporium и липидных фракций анализировали на содержание углерода и азота (% сухой массы) и отношения стабильных изотопов углерода (C) и азота (N) с помощью элементного анализатора/масс-спектрометрии изотопных отношений при непрерывном потоке, используя элементный анализатор CHNOS (vario ISOTOPE cube, Elementar, Ханау, Германия), соединенный с IsoPrime100 IRMS (Isoprime, Чидл, Соединенное Королевство). Пробы метанотрофной биомассы, культивируемой в ферментаторах или флаконах с сывороткой, центрифугировали, ресуспендировали в деионизированной воде и объемы, соответствующие от 0,2 до 2 мг углерода (примерно от 0,5 до 5 мг сухой массы клеток), переносили в 5×9 мм оловянные капсулы (Costech Analytical Technologies, Inc., Валенсия, Калифорния) и высушивали при 80°C в течение 24 часов. Подобным образом, предварительно экстрагированные липидные фракции суспендировали в хлороформе и объемы, содержащие от 0,1 до 1,5 мг углерода, переносили в оловянные капсулы и испаряли до сухости при 80°C в течение 24 часов. Стандарты, содержащие 0,1 мг углерода, обеспечивали надежные значения δC.
13
15
Проба
Стандарт-1
Изотопное отношение выражали с помощью условного обозначения «дельта» (‰), при этом изотопный состав материала относительно состава стандартного образцам расчете на миллион отклонений обозначали как δC (или δN)=(R/R)×1000, где R представлял собой молекулярное отношение тяжелой формы изотопа к легкой форме. Стандартным образцом для углерода являлся венский белемнит Pee Dee (V-PDB), а для азота - воздух. В качестве калибровочного стандартного образца применяли предложенный NIST (Национальным институтом стандартов и технологии) SRM (стандартный эталонный материал) №1547, листья персика. Все изотопные анализы проводили в Центре биогеохимии стабильных изотопов при Калифорнийском университете, Беркли. Долгосрочная внешняя точность для анализов С и N изотопов составляла 0,10‰ и 0,15‰, соответственно.
13
Штамм М. trichosporium OB3b выращивали на метане в трех различных ферментируемых партиях, М. capsulatus Bath выращивали на метане в двух различных ферментируемых партиях и Methylomonas sp. 16a выращивали на метане в одной ферментируемой партии. Биомассу из каждой из указанных культур анализировали на распределение стабильного изотопа углерода (значения δC; см. таблицу 3).
Кроме того, выполняли анализ на стабильный изотоп углерода для биомассы и соответствующих липидных фракций (см. таблицу 4) из штаммов Methylosinus trichosporium OB3b (Mt OB3b), Methylococcus capsulatus Bath (Mc Bath) и Methylomonas sp. 16a (Mms 16a), выращенных на метане в биореакторах, как описано в примере 1.
13
Биомассу из штаммов Mt OB3b, Me Bath и Mms 16a собирали через 94 ч (3,14 г СМК/л), 26 ч (2,2 г СМК/л) и 39 ч (1,14 г СМК/л), соответственно. В таблице 4 значения δC для липидов представляют собой среднее значение повторных определений.
ПРИМЕР 7
ВЛИЯНИЕ ИСТОЧНИКА И ЧИСТОТЫ МЕТАНА НА РАСПРЕДЕЛЕНИЕ СТАБИЛЬНОГО ИЗОТОПА УГЛЕРОДА В ЛИПИДАХ
4
2
3
2
3
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
2
2
2
2
2
3
3
III
III
Для исследования роста метанотрофов на метане, содержащем компоненты природного газа, ряд 0,5-литровых флаконов с сывороткой, содержащих 100 мл заданной среды MMS 1.0, инокулировали Methylosinus trichosporium OB3b или Methylococcus capsulatus Bath из содержащейся во флаконе с сывороткой периодической культуры (5% об./об.), выращенной в такой же среде, снабжаемой смесью 1:1 (об./об.) метана и воздуха. Состав среды MMS1.0 был следующим: 0,8 мМ MgSO×7HO, 30 мМ NaNO, 0,14 мМ CaCl, 1,2 мМ NaHCO, 2,35 мМ KHPO, 3,4 мМ KHPO, 20,7 мкМ NaMoO×2HO, 6 мкМ CuSO×5HO, 10 мкМ Fe-Na-ЭДТК и 1 мл на литр раствора металлических микроэлементов (содержащего, на л: 500 мг FeSO×7HO, 400 мг ZnSO×7HO, 20 мг MnCl×7H2O, 50 мг CoCl×6HO, 10 мг NiCl×6HO, 15 мг HBO, 250 мг ЭДТК). Фосфат, бикарбонат и Fe-Na-ЭДТК добавляли после автоклавирования и охлаждения среды. Конечное значение pH среды составляло 7,0±0,1.
600
Инокулированные флаконы герметично закрывали резиновыми пустотелыми пробками и вводили 60 мл газообразного метана, который добавляли шприцом через стерильный 0,45 мкм фильтр с помощью стерильных игл 27G. В одинаковые культуры в каждую вводили 60 мл объемы (A) метана с чистотой 99% (марка 2,0, Praxair посредством Alliance Gas, Сан Карлос, Калифорния), (B) метана с чистотой 70%, представляющего собой стандартный природный газ (Sigma-Aldrich; также содержащий 9% этана, 6% пропана, 3% метилпропана, 3% бутана и другие второстепенные углеводородные компоненты), (С) метана с чистотой 85%, полученного в виде 1:1 смеси источников метана А и В; и (D)>93% метана (марка 1.3, Specialty Chemical Products, Южный Хьюстон, Техас; внутрипроизводственный анализ показал состав с >99% метана). Культуры инкубировали при 30°C (штамм М. trichosporium OB3b) или 42°C (M. capsulatus Bath) с применением вращательного встряхивания при 250 об/мин, и измеряли рост через приблизительно 12-часовые интервалы путем отбора 1 мл проб для определения OD. Через указанные временные интервалы из флаконов выпускали газ и свободное пространство заполняли 60 мл соответствующего источника метана (А, В, С или D) и 60 мл концентрированного кислорода (с чистотой по меньшей мере 85%). Через примерно 24-часовые интервалы 5 мл пробы удаляли, клетки извлекали путем центрифугирования (8000 об/мин, 10 минут) и затем хранили при -80°C до анализа.
13
15
Анализ на содержание углерода и азота (% сухой массы) и отношения стабильных изотопов углерода (C) и азота (N) выполняли для метанотрофной биомассы, полученной из штамма М. trichosporium OB3b и М. capsulatus Bath, как описано в примере 6. В таблице 5 показаны результаты анализа на стабильный изотоп углерода для проб биомассы из М. capsulatus Bath, выращенной на метане с различными уровнями чистоты и в различных партиях культур, содержащихся во флаконах.
13
13
13
13
13
12
13
Среднее значение δC для М. capsulatus Bath, выращенного на одном источнике метана (A, 99%) составляло -41,2±1,2, тогда как среднее значение δC для М. capsulatus Bath, выращенного на другом источнике метана (В, 70%), составляло -44,2±1,2, При смешивании источников метана А и В наблюдалось промежуточное среднее значение δC, составляющее -43,8±2,4. Указанные данные свидетельствуют, что δC клеточного материала, выращенного на источниках метана А и В, значительно отличаются друг от друга вследствие различия δC потребляемого метана. С другой стороны, клетки, выращенные на смеси двух газов, предпочтительно утилизировали C и, поэтому, как правило, демонстрировали более отрицательные значения δC.
13
Аналогичный эксперимент выполняли для исследования, проявляют ли два различных метанотрофа, Methylococcus capsulatus Bath и Methylosinus trichosporium OB3b, выращенные на различных источниках метана и в разных партиях культур из флаконов, разницу в распределении δC (см. таблицу 6).
13
13
13
13
13
13
13
Среднее значение δC для М. Capsulatus, выращенного на первом источнике метана (A), составляло -44,5±8,8, тогда как среднее значение δC для М. Trichosporium, выращенного на этом же источнике метана, составляло -47,8±2,0. Среднее значение δC для М. Capsulatus, выращенного на втором источнике метана (B), составляло -37.9±0,4, тогда как среднее значение δC для М. trichosporium составляло -39,8±4,5, Указанные данные показали, что δC клеточного материала, выращенного на одном источнике метана, очень похоже на δC клеточного материала из другого штамма, выращенного на таком же источнике метана. Таким образом, наблюдаемое значение δC клеточного материала, по-видимому, в основном зависит от состава потребляемого газа, а не от свойства конкретного изучаемого бактериального штамма.
Различные варианты реализации изобретения, описанные выше, можно объединять с получением других вариантов реализации изобретения. Все патенты США, публикации заявок на патент США, заявки на патент США, иностранные патенты, иностранные заявки на патенты и не относящиеся к патентам публикации, упоминаемые в описании настоящего изобретения и/или перечисленные в перечне прилагаемых данных, включающем, но не ограниченным ею, заявку на патент США №61/67152, в полном объеме включены в настоящую заявку посредством ссылки. Аспекты описанных вариантов реализации изобретения могут быть модифицированы, при необходимости, для применения идей различных патентов, заявок и публикаций для обеспечения других вариантов реализации изобретения.
В вариантах реализации изобретения могут быть сделаны указанные и другие изменения с учетом приведенного выше подробного описания. В общем, подразумевают, что в следующей формуле изобретения используемые термины не ограничивают изобретение конкретными вариантами реализации, приведенными в описании и формуле изобретения, а включают все возможные варианты вместе со всем объемом эквивалентов, к которьм относится указанная формула изобретения. Соответственно, формула изобретения не ограничена настоящим описанием.
--->
Перечень последовательностей
<110> Calysta Energy, LLC
Silverman, Joshua
Resnick, Sol M.
Mendez, Michael
Saville, Renee
Lee, Sungwon
Nguyen, Luan
<120> Система, способы и композиции для биопереработки
<130> 200206.404WO
<140> PCT
<141> 2013-07-12
<150> US 61/671,542
<151> 2012-07-13
<160> 104
<170> FastSEQ для Windows, версия 4.0
<210> 1
<211> 1731
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность мутированного fadD M. trichosporium
<400> 1
acccatgaca gacgcatgac tcgcgctcga cccttacgcc gcgcgtccct gactcgcctc      60
ttaaaccgcc gagcgtcgcg ccggacatcg atcccgccga gccgcgcact ctggtcgagg     120
tgtttcgtcg cagcgtcgcc gcgcattccg acaaaatcgc gctcgagagc ttcggcgcga     180
cgctgacctt cgcgcaattc gacggcgccg cgcgcgccat cgccgccttt ctgcaatcgc     240
agggcctgaa gaagggcgat cgcgtcgcga tcatgtcgcc caatgtgatg gcctatccgc     300
cgatcatctt cggcgtgctg ctcgccggcg gcgcggtggt caacgtcaat ccgctctaca     360
cgccgagcga gctctccttt cagatcaatg attccggcgc gcgcatcgtc ttcgtgctgg     420
agaatttcgc ccatacggtc gaagccgcat ggcccgacat gtcgatcgat ctcgcggtcg     480
tcgtcacgcc aggcgatctg ctcgggctca aaggcaagct cgtcgatttc gtctcgcgct     540
atgtgaaatg cgccgtgcgg ccctatcagc tgccgacgag catgcgcttt cgcgatatca     600
tgaagcaagg ctcggcgcgc tcgggcgcgc gacgtctaga tcgcaccgga cgatctcgct     660
tttctgcaat atacgggcgg cacgaccggc gtcgccaagg gagcgatgct gctccaccgc     720
aatgtcgcgg ccaatgtggc gcaagcgacc gcctggctgc atccgtttct gctggaggcg     780
tccgggcgcg agcggccgca gaagatggtg gcggcgctgc cgctctagca cattttcggc     840
ctcaccgcct gtctgctggt gctggtgcgc atcggcggct cctgcctgct catcgccaat     900
ccgcgcgaca tcgccggctt cgtgaagacg ctgcgcaagt cgcgcttctc gatgatctcc     960
ggcgtcaaca cgctctatgc ggcgctcgcc gatcatccgt aattcgcgca ggtcgacttc    1020
tctcgcctcg tcttctgcat cgccggcggc atggcgacgc aggacgtcgt cgcgcgcaaa    1080
tggagagcga tcaccggccg cccgatcatc gaaggctatg ggctctccga gacctcgccg    1140
gtcgtcgcct gcaacaggcc cgatctcgag taattctccg gctcgatcgg ctatccgcat    1200
ccctcgaccg ccgtgtcgat ccgcgcgccc tcgggcgagc cggttccgat cggcgagcgc    1260
ggggagctgt gcgtgaaggg tccgcaggtg atgccgggat attggaatcg ccccgcctag    1320
accgaggcgg cgttcacgcc ggacgggttt tttcgcaccg gcgatgtggc gatcatgctg    1380
ccggacggac aggtgaagct cgtcgatcgt ttgaagtaga tgattctcgt ctccggcttc    1440
aacgtctatc cgaacgaggt cgagaatgtg ctggtgcagc atcccaaggt gaaggaggcg    1500
gcggtgatcg gcgttcccga tccgcattcg ggctaggcgc cgctcgcctt catcgtgccg    1560
cgcgacgcca gcgtcaccgg ccaggagctg catgatttct gccgcaagac gctgacgcac    1620
tataaggcgc cgaagcattt ctaattccgc gacagcctgc cgaagagcaa tgtcggcaag    1680
gtgctgcggc gcgtgctgcg cgacgaggtg caagcgcgag ccgaatgagg a             1731
<210> 2
<211> 927
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность FabD E. coli
<400> 2
atgacgcaat tcgctttcgt tttcccggga caaggttcgc aaactgttgg aatgctcgct      60
gatatggccg cctcgtaccc gatcgtcgag gaaacgttcg ccgaggccag cgcggcgctg     120
gggtacgacc tgtgggccct cacccagcag ggcccggccg aggaactcaa caagacctgg     180
cagacgcagc ctgccctcct gaccgcctcg gtcgcgctct atcgtgtgtg gcagcagcag     240
ggcggcaagg cgcccgccat gatggccggc cacagcctgg gcgagtactc cgccctcgtg     300
tgcgcgggcg tgatcgactt cgcggacgcc gtccgcctgg tcgagatgcg cggcaagttc     360
atgcaggaag ccgtccccga gggcacgggc gctatggcgg cgatcatcgg cctcgacgat     420
gcctccatcg ccaaggcgtg cgaggaagcg gccgagggcc aggtcgtcag cccggtgaat     480
ttcaactcgc ccggtcaggt cgtcattgcc ggccataaag aggccgtcga gcgcgcgggc     540
gccgcgtgca aggccgccgg cgcgaagcgc gcgttgcccc tcccggtcag cgtcccgtcc     600
cattgcgcgc tgatgaagcc ggcggccgac aagctggccg tggagctcgc gaagatcacc     660
ttcaatgcgc cgaccgtccc ggtggtcaat aacgtcgacg tcaagtgcga aacgaacggc     720
gatgccatcc gcgacgcgct cgtccggcag ctgtataacc cggtgcagtg gacgaagtcc     780
gtcgagtata tggcggcgca gggcgtggag cacctctatg aagtgggccc cggcaaggtc     840
ctcaccggcc tcaccaagcg catcgtggac accctgacgg cctcggcgct gaatgagccc     900
tcggccatgg cggctgcgct ggagctg                                         927
<210> 3
<211> 549
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность TesA E. coli с
удаленной последовательностью нацеливания на периплазму
<400> 3
atggctgaca ccctcctgat tcttggcgat tccctctctg ctggttaccg tatgtccgcg      60
tccgctgcct ggcctgccct cctcaacgac aagtggcaga gcaagacgag cgtcgtcaat     120
gcgtcgatct cgggcgatac ctcgcaacag ggcctggcgc gcttgccggc cctgctcaag     180
cagcatcagc cgcgctgggt gctcgtcgag ctgggcggca acgatggact gcgcggcttc     240
cagccccagc agaccgagca gacgctccgc cagatcctcc aagacgtcaa ggccgccaat     300
gcggagccgc tgctgatgca gatccgcctc ccggcgaatt atggccgccg ctataacgaa     360
gcgttctcgg ccatctatcc gaagctggcg aaagagttcg acgtgcccct gctcccgttc     420
ttcatggaag aagtctacct gaagccgcag tggatgcaag acgatggcat ccatccgaac     480
cgggacgcgc agcccttcat cgccgactgg atggccaaac agctgcagcc cctcgtgaac     540
cacgactcg                                                             549
<210> 4
<211> 1146
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая тиоэстеразу Cinnamomum camphorum
<400> 4
atggccacaa cttcacttgc ctctgccttt tgttcgatga aagctgtcat gctcgcccgc      60
gatggacgtg gaatgaagcc gcgttcgtcg gacctccagc tccgagccgg caatgcgcag     120
acctccctga aaatgattaa cggcacgaag ttctcgtata ccgagtcgct gaagaagctc     180
ccggactgga gcatgctgtt cgcggtgatc accaccatct tctcggccgc tgagaagcaa     240
tggaccaatc tcgaatggaa gccgaagccg aatccgcccc agctgctgga cgaccacttc     300
ggcccccacg gcctcgtgtt ccgccgcacc ttcgccatcc gctcgtatga agtgggcccg     360
gaccgctcga ccagcatcgt cgccgtgatg aaccatttgc aggaagcggc gctcaatcat     420
gcgaagagtg tgggcatcct gggcgacggc ttcggtacga cgctggagat gagcaagcgc     480
gacctgatct gggtcgtcaa gcgcacgcac gtggcggtgg agcgttaccc cgcgtggggg     540
gacacggtcg aagtcgagtg ctgggtcggc gcctccggca acaatggccg ccggcacgac     600
ttcctcgtgc gcgattgcaa gaccggtgag attctcaccc gctgcacgtc gctgagcgtc     660
atgatgaata ctcgcacccg ccgcctctcg aagatccctg aggaagtgag gggcgagatc     720
ggcccggcgt tcatcgacaa cgtggccgtc aaagatgagg agatcaagaa gccccagaag     780
ctcaacgact cgaccgcgga ttacatccag ggcggactga cgccgcgttg gaacgatctg     840
gacatcaacc agcacgtcaa caacatcaag tatgtggact ggatcctcga aaccgtcccc     900
gactcgatct tcgagagcca tcatatctcg tccttcacca tcgagtaccg gcgcgagtgc     960
acgatggatt ccgtcctcca gtccctcacc acggttagcg gcggcagctc cgaggccggc    1020
ttggtctgcg agcatctgct gcagcttgag ggcggctccg aggtcctccg cgcgaaaacg    1080
gagtggcgcc ccaagctcac ggatagcttc cgcggcatct cggtgatccc ggcggagagc    1140
tcggtc                                                               1146
<210> 5
<211> 1146
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая тиоэстеразу Umbellularia californica
<400> 5
atggccacta cctcccttgc ttctgccttt tgctcaatga aagctgtgat gctcgcccgt      60
gacggacgcg gtatgaagcc gcgctcgtcc gacctccagc tccgggccgg caacgcgccg     120
acctcgctca agatgattaa tggcactaag ttctcctata ccgagtcgct caagcgcctg     180
ccggattggt cgatgctgtt cgcggtcatc accacaatct tctcggccgc tgagaagcag     240
tggaccaact tggagtggaa gccgaagccg aagctgcccc agctcctgga cgaccatttc     300
ggcctccatg gcctggtgtt ccgccggacg ttcgccatcc gttcgtacga agtcggcccc     360
gaccgctcga cctccatcct ggcggtgatg aatcacatgc aagaggcgac gctcaaccat     420
gccaagtccg tcggtatcct gggcgatggc ttcggcacca ccctggagat gagcaagcgc     480
gatctcatgt gggtcgtccg ccgcacgcat gttgccgtgg agcgctatcc cacgtggggc     540
gacacggtcg aggtcgagtg ctggatcggg gcgtcgggaa ataacggcat gcgccgcgac     600
ttcctcgtcc gtgactgcaa gaccggcgag atcctcacgc gctgcacgtc gctgtcggtg     660
ctgatgaata cccgcacccg tagactgtcc accatccccg atgaagtgcg cggcgaaatc     720
ggcccggcct tcatcgacaa tgtcgccgtc aaagacgatg agatcaagaa gctgcagaag     780
ttgaacgact cgaccgcgga ctatatccag ggcggcctga cgccccgctg gaatgacctc     840
gacgtcaacc agcatgtcaa caatctcaag tacgtggcgt gggtgttcga aacggtgccg     900
gacagtatct tcgagagcca ccacatttcc agcttcacgc tcgaatatcg tcgcgagtgc     960
acgcgcgact ccgtcctccg gtcgctgacc accgtgagcg gcggctcgtc ggaagcgggc    1020
ctggtctgcg atcacctcct gcagctggag ggcggctccg aggtcctccg cgcgaggacc    1080
gagtggcgtc cgaagctgac ggatagcttc cgcgggatca gcgtcatccc cgccgagccc    1140
cgcgtg                                                               1146
<210> 6
<211> 750
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая ацил: АЦП-тиоэстеразу Streptococcus pyogenes
<400> 6
atgggccttt cctatcaaga agaactcacc ctccccttcg agctctgcga cgtcaagtcc      60
gatatcaagc tgccgctgct gctcgactac tgcctgatgg tgagcggccg ccagtcggtc     120
cagctgggcc gttcgaacaa caatctgctg gttgactata agctcgtctg gatcgtgacc     180
gactatgaga tcaccatcca tcgcctcccg catttccagg aaacgattac catcgagaca     240
aaggccctct cgtacaacaa gttcttctgc taccgccagt tctatatcta tgaccaggag     300
ggctgcctgc tcgtcgatat cctcagctac ttcgcgctgc tgaatccgga tacgcgcaag     360
gtcgcgacca tccccgagga cctggtcgcg cccttcgaaa cggacttcgt caaaaagctc     420
caccgggtgc cgaagatgcc gctgttggag cagtcgatcg atcgcgacta ttatgtgcgc     480
tacttcgata tcgacatgaa tggtcacgtg aacaattcga agtatctcga ctggatgtac     540
gacgtcctgg gctgccagtt cctcaagacc catcagccgc tgaagatgac gctcaagtat     600
gtcaaagagg tcagccctgg cggacagatc acgtcctcgt accacctgga ccagctcacc     660
tcgtatcacc agatcatctc ggacggccag ctcaacgccc aggccatgat cgagtggcgc     720
gctattaagc agaccgagtc ggagactgat                                      750
<210> 7
<211> 1191
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая пальмитоил: ацилпереносящий белок-тиоэстеразу Ricinus communis
<400> 7
atgggaacat gctcgtatac catcaccctg ccgatccgct gcctgtctaa ttcgaacggc      60
catcacgacc cccataagca gaatctcaac aagatcaaga tcaacggcgc cagcacgagc     120
acgcgtccgc tgaagctcga tgcgccgtcg cagaccgtgg gcgtcgccac catttatctg     180
gcctccgtca gcgagaacct caccctcacc aaagaggtca tgcggcagaa catccccacg     240
aagaagcagt acatcgaccc gcaccgccag ggcctgatga tcgagggcgg cgtcggctat     300
cgccagacga tcgtcatccg ttcgtatgaa gtcggccctg ataagaccgc gacgctggag     360
agtatcctct atctcctgca ggaaacggcc ctgaatcacg tgtggctgtc gggcctgctc     420
tccaatggct tcggcgccac gcatggcatg gtgaagaata acctgatctg ggtggtgtcc     480
aagctccagg tccaggtcga ccattacccg atctggggcg aggtcgtcga gatcgatacc     540
tgggtccggg cgtccggcaa gaacggcatg aagcgtgact ggctgatccg ctcgcaggcc     600
acgggccatg ttttcgtccg cgcgacctcg acgtgggtca tgatgaacga gaaaactcgc     660
cgcctctcga agatgccgga agaagtgagg gccgagatct ccccgtggtt catcgagaag     720
caagcgatca aggaagaggt gccggataag atcgcgaagc tcgacgataa ggctcgctac     780
gtcatctcga atttgaagcc gaagcgctcg gatctcgaca tgaaccatca cgtgaataac     840
gtgaaatatg tccgctggat gctggagatc ctcccggacc acttcctgga gtcgcatcag     900
ctctcgggca tcaccatgga gtatcgccgc gagtgcgggt cggccgacat tgtccagtcc     960
ctctgcgagc ccgacggtga cgagatcctg tccaacgaca tccccgtgct taacggattc    1020
agcctcgcgt cggagcccct gatggaaggc aacggcttcc tcgtccccct ggacaaggtc    1080
ccgctgaagt acacccacct cctgctcacg aagggtgaga gccagaatga agagatcgtc    1140
cgcggcaaga ccatttggaa gaagaaactc tgcaccatgc ccttcagcac c             1191
<210> 8
<211> 1176
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая пальмитоил: ацилпереносящий белок-тиоэстеразу Ricinus communis
<400> 8
atggcttcga aaggttccat ccgcctctac ttcccctgcg acttccgcaa caccctccag      60
aagaagaaca tgaagatgga catggtcatg gcccgctcgg gcttctccta ctcgctcaac     120
ccgatcgcgc cgaagatccc ccgcttctac gtggtcgcca acgcgtcgaa ccctcagcgg     180
gtcgacacga tcaatggcaa aaaggtgaac ggcattcacg tcgcggagag ctcgaattcg     240
tatgccgacc agaataagat gaacgcgacc gctggcctcg tcctggacgg caatgtcgac     300
catcagccgc tccacaagtg gctgttgggc cgtttcgtgg acgagcgcct ggtctatagt     360
caaaccttca tcatccgcag ctacgagatc ggtcccgata agaccgcgac catggagact     420
ctcatgaatc tgctccagga aaccgcgctc aatcatgtga cctcttcggg cctggcgggc     480
gatgggttcg gcgcgacgcg ggagatgtcg ctccggaagc tgatctgggt cgtcacgcgc     540
atccatatcc aggtccagcg ctattcctgc tggggcgatg tcgtcgagat cgacacgtgg     600
gtcgatggag cgggcaagaa tggcatgcgc agggattgga tcatccggga ctacaacacg     660
aaggagatca ttacccgcgc cacctcgacc tgggtcatca tgaaccgcga gacacgtaag     720
ctgtcgaaga tgccggaaca ggtgcgccag gaactggtgc cgttctatac caaccgcatc     780
gcgatcgcca aggaaaacaa cgacgtggag aagattgaca agctgaccga cgaaaccgcc     840
gagcgcatcc gtagcggcct cgcgccgcgc tggagcgata tggacgccaa ccagcatgtg     900
aacaatgtta agtatatcgg ctggatcctt gagagcgtcc cgatcaatgt cctcgaagat     960
tacaatctga cgtccatgac cctggagtat cgccgcgagt gccgccagag caacctcctg    1020
gagtcgctca cgtcgaccac ggagcattcg aataacaact cgtgcaaccg caaggcccac    1080
ctggagtata cgcacctcct gcgtatgcag gccgacaagg ccgagatcgt gcgtgcccgc    1140
accgagtggc agtccaagtc gaatcgcaag acgatc                              1176
<210> 9
<211> 1257
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая пальмитоил: ацилпереносящий белок-тиоэстеразу Ricinus communis
<400> 9
atggtcgcca ccgccgccgc cgctacctcc tcgttcttcc ccgtgccgtc ccagtccgct      60
gacgccaatt tcgataaggc cccggcgagc ctgggcggca tcaagctgaa atcgacgtcg     120
tgcagccggg gcctccaggt gaaggccaat gcgcaggcgc cgccgaagat caacggctcg     180
tcggtcggct tcaccacctc ggtggagaca gtgaagaatg acggcgacat gccgctcccg     240
cctcccccca ggaccttcat taatcagctc ccggactgga gtatgctcct ggccgcgatc     300
accaccatct tcctggcggc ggagaagcag tggatgatgc tcgactggaa gccccgccgt     360
ccggatatgc tcattgaccc gttcggaatc ggccgcatcg tccaggacgg cctgatcttc     420
cgccagaact tcagcatccg ctcgtatgag atcggcgccg accgcaccgc cagcatcgaa     480
accctgatga atcatctcca ggaaaccgcg ctcaaccacg tgaaaactgc gggcctcctt     540
ggcgatggct tcggctcgac cccggagatg tcgaagcgca atctgatctg ggtggtcacg     600
cgcatgcaag tcctggtcga ccgctacccg acctggggcg acgtcgtcca ggtcgacacc     660
tgggtgtcca agtcgggcaa gaacggaatg cgccgggatt ggtgcgttcg cgacagccgc     720
acgggtgaaa ccctgacgcg tgcgagctcg gtctgggtca tgatgaacaa gctgacgcgc     780
cgcctgtcga agatccccga ggaggtgcgt ggcgagattg agccgtattt cctcaactcg     840
gacccgatcg tcgacgagga ctcgcgcaag ctccccaagc tggacgactc gaatgccgac     900
tatgtccgca agggcctcac gccgcgctgg tcggacctcg atatcaacca gcacgtcaac     960
aatgtgaagt atatcggctg gatcctggag agcgcgccac tgccgatcct cgaatcgcac    1020
gagctctcgg cgatcacgtt ggagtaccgt cgcgagtgcg gtcgtgatag cgtcctgcag    1080
tccctgacgg ccgtgtccgg caacggcatc ggcaatctcg ggaacgcggg cgacatcgag    1140
tgccagcatc tcctgcgcct ggaagatggc gcggagatcg tccggggacg cacggagtgg    1200
cgccctaagt actctagcaa cttcggcatc atgggccaga tccccgtgga gtcggcc       1257
<210> 10
<211> 1215
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая ацил: АЦП-тиоэстеразу Jatropha curcas
<400> 10
atggctgttt tcacctaccg catcgccatg ctcccgattc gctgctcctc ctccaatagt      60
accaactcgc attcgcacga cccgaaccag cagaatctcc ataagatcaa gatcaatggg     120
tcggcgtcgg ccatgatgcc cctcaaggtc gacctcccgt cgagcctcac gatcacgagc     180
gtcgcccccg tggtcgagaa tctcagcctg accaaggagc agacgcgcca gaacatcccc     240
accaagaagc agtatatcga tccgcaccgc cagggcctca tcgtcgagga gggcgtgggc     300
taccgccaga ccgtcgtgat ccgctcgtat gaggtcggcc ccgataagac cgccaccctg     360
gagatcatcc tctgcttgct gcaagagact gccctgaacc acgtctggct ctcgggcctg     420
ctcagcaacg gcttcggcgc gacgcatgga atggtgcgca ataatctcat ctgggtcgtg     480
tcgaagctcc aggtccaggt cgaccagtat cccatctggg gcgaggtcgt cgagatcgac     540
acgtgggtcg gcgcctccgg caagaacggt atgcgtcgcg actggctggt ccgctcgcag     600
gcgaccggtc aggtgttcgc gcgtgccacg tctacgtggg tgatgatgaa cgagaaaacg     660
cgccgtctgt cgaagatgcc cgaggaagtc cgggctgaga ttgcgccgtg gttcatcgag     720
aaacaggcga tcaaagaaga agtgcctgag aagatcgcga agctggacga caaggcccgc     780
tacgtcgtca ccaacctcaa gcccaagcgc tcggacctgg atatgaacca gcacgtgaac     840
aatgtcaagt atgtgcgctg gatgctcgaa accctgccgg atcaattctt cgagaaccat     900
cagcttagcg gcatcacgct ggagtacaag cgggagtgcg gctcctcgga tatcgtggag     960
tcgttgtgcg agccggacga ggaggagggc atcatcaata ccggcctgaa gcagaacaat    1020
gacaagtcgc tgttcaacgg cttcagcctc ccgtcggaga ttatggaagg caacggattc    1080
ctgtcgtcgc tggaaaagac cccgctgaag tatacccatc tcctcgttgc gaagggcaag    1140
acacagagcg aagagatcgt ccgcggcaag accatctgga agaagaagct gctcacgacc    1200
atgccgttct ccccg                                                     1215
<210> 11
<211> 1044
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая ацил: АЦП-тиоэстеразу Jatropha curcas
<400> 11
atggtgtcca cggccatctc gttctccctc ctccccatca agctcatcaa agaagaaacc      60
cgcatggctt ccgcggaccg ccgcaagaat tcgatcgtca aagaattcgg ccatttcacg     120
tgccggtgcg cggcgatcga gaagcgcatc cagaagctca acaacttcct catcgatggc     180
ggcttcggct cgctggagca gaacggcctg atctatcgcc agaatatctt cattcgctcg     240
ttcgagatcg gcttcgaccg caagttgtcg ctggctgccc tcaccaattt cctccaggac     300
accgccctca accatgtccg catgatcggg ctgctggcgg ccggattcgg ctcgaccccg     360
gagatgtcga aaaaggacct catctgggtc ctctgcaccc tccagatcct cgtcgatcgc     420
catccgtcgt ggctcgatgc ggtcgaggtc gacacctgga tgtacccctc cggccagaac     480
ggccagggcc gcgattggct cgtgcgggac gccaagacgg gcaagcccct tgcccaggcg     540
agcagcgtga tggtgctgct gaacaagaaa acccgcaagc tgagtaagtt cacggaagag     600
atccgtgacg agatcgcccc tcacatgatg atggactgca acccgatcat caatagccgc     660
aagatgctgc ccttcgacgt gaacaccgcc gactatgcgc gcacgggcct gaccccgggt     720
tggaacgatc tcgacctgaa tcagcatgtc aatcacgtcc aatatatcaa ttggattctc     780
cagaatgtcc tgcgctcgct catccagcac cacaagctga gcgacatcac gctggagtat     840
cgtaaggagt gcgatatcaa tagcatcctc cagttcctgt cgaagatcgt gaagaacggc     900
agcaaccatt cgaccgacac caacaacctc attgagctgg accactcgct gctgctggag     960
aatggctcgg agatcgcgag ggccaacacg atctggaagc cgcgtgaggt caataacttc    1020
aagaacgccg tttacactcc ggcg                                           1044
<210> 12
<211> 1071
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая ацил: АЦП-тиоэстеразу Jatropha curcas
<400> 12
atggcttcca ccgcgatctc gttcctctcc attcccatca agctgatcaa agaagaaatg      60
cgcatggcct cggcgggtcg tcggaagaat acgatcgcgg cggagttcgg ccatttcacc     120
ttcggctccg ccaccgtgga gaagaaggtc cagaagtcga acaacttcct catcgacggc     180
ggcttcggca gcctggagca gaacggactg atctaccgcc agaatatctt cgtccgctcg     240
ttcgagatcg gcttcgaccg caagctctcg ctggccgctc tgacgaattt cctgcaggac     300
accgcgctca accactgccg catgatcggc ctgctggccg agggcttcgg ctcgacgccg     360
gagatgatca agaaagacct gatttgggtg ctctgcaccc tccagatcct ggtcgacggc     420
taccccagct ggctcgacgt tgtcgaggtc gacacctgga tgtatccgag cggccagaac     480
ggcctcggcc gcggctggct ggtgcgtgat ggcaagaccg gtcgctcgtt ggcgcagagt     540
tcgtctgtca tggtgagctt caataagaaa actcgcaagc tgagcaagct cgccaaggaa     600
atccgcgacg agatcgcccc gcacatgatg gactgcgatc cgatcatgaa caagaactcg     660
cggaagatcc tcccgttcga tgtgaacacc gccgactatg cccgcaccgg cctgaccccc     720
ggatggaacg aactggatct caatcagcat gtcaaccacg tccagtatat caactggatc     780
ctccagaatg tccgtccgag cctggtccaa catcacaagc tctcggcgat cacgctggag     840
tatcgcaaag agtgcgatat gaactcgatc ctccagtccc tctcgcgcat tgtcaagaat     900
ggcgggaacg acagcacgga caagaataac gtgatcgagc tcgaccattt cctgctcctg     960
gagaatggct cggagatcgc gcgcgccaac acgatctgga agccccgcga ggtgaataac    1020
ttcaagaatg tcgtccattc ccctgcggaa gagaatatct cgtcgatgaa c             1071
<210> 13
<211> 396
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность FadM E. coli
<400> 13
atgcaaaccc agattaaggt ccgcggctac catctcgacg tctaccagca tgtgaataac      60
gcccgttatc tcgaattcct cgaagaagcg cgctgggacg gcctggagaa ctcggatagc     120
ttccagtgga tgaccgccca caatatcgcg ttcgtcgtgg tcaatatcaa catcaactat     180
cgccggccgg ctgtgctctc ggacctcctg accatcacct cgcagctcca gcagctgaac     240
ggcaagtcgg gaatcctgtc ccaggtgatc acgctggagc ccgagggcca ggtcgtcgcg     300
gatgccctga tcacgttcgt ttgcatcgac ctcaagacgc agaaagccct cgcgcttgag     360
ggcgagctgc gcgagaagct ggagcagatg gtcaag                               396
<210> 14
<211> 957
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность AccA E. coli
<400> 14
atgtccctga acttcttgga tttcgaacag cccatcgccg aactggaagc gaagatcgac      60
tctctgaccg ccgtgagccg ccaagatgag aagctcgaca tcaacatcga cgaagaagtc     120
caccgcctcc gcgagaaatc ggtcgagctt acccgcaaga ttttcgcgga tctgggcgcg     180
tggcagatcg cccagctcgc gcgtcatccg cagcgcccgt acacgctcga ctatgttcgt     240
ctggccttcg acgagttcga cgagctcgcc ggtgatcgcg cgtatgccga cgataaggcc     300
atcgtcggcg gcatcgccag gctggatgga cgcccggtga tgatcatcgg ccatcagaaa     360
ggccgcgaga ctaaggagaa gatccgtcgc aacttcggca tgcctgcgcc cgaggggtat     420
cgcaaggccc tgcgcctcat gcagatggct gagcgcttca agatgcccat catcacgttc     480
atcgacaccc cgggcgcgta tccgggcgtg ggcgccgagg aacgcggcca gagcgaggcc     540
atcgcgcgga atctccggga gatgtcgcgc ctcggagtcc cggtcgtgtg caccgtgatc     600
ggcgagggcg gctccggcgg cgcgctcgcg atcggcgtcg gcgacaaggt caacatgctg     660
cagtattcga cgtactccgt catcagcccc gagggctgcg cgtcgatcct ctggaagtcg     720
gccgacaagg cgcccctcgc cgctgaggcc atgggcatca ttgccccgcg cctgaaagag     780
ctcaagctga tcgactcgat cattccggag ccgctgggtg gcgcgcaccg caatcccgag     840
gcgatggcgg cgtcgctgaa ggcgcagctg ctcgccgatc tcgccgacct ggacgtcctc     900
tcgaccgagg acctcaagaa tcgccgctac cagcgtctga tgtcctacgg ctatgct        957
<210> 15
<211> 468
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность AccB E. coli
<400> 15
atggacattc gtaagatcaa aaagctcatc gaactcgtcg aggaaagcgg catctccgaa      60
ctggaaatct ctgagggcga agagtcggtg cgcatcagcc gcgcggcgcc tgccgcctcg     120
ttccccgtca tgcagcaggc ctacgcggcg cccatgatgc agcagccggc tcagtcgaac     180
gccgccgcgc cggccaccgt gccctcgatg gaagcgccgg ctgcggcgga gatcagcggc     240
catatcgtgc gctcgccgat ggtcggcacc ttctatcgca cgccctcccc ggatgccaag     300
gccttcatcg aggtcggcca aaaggtcaac gttggagaca ccctgtgcat cgtcgaggcg     360
atgaagatga tgaatcagat cgaggccgac aagtcgggta cggtcaaggc catcctcgtg     420
gagtcgggcc agccggtcga gttcgacgag ccgctggtcg tgatcgag                  468
<210> 16
<211> 1347
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность AccC E. coli
<400> 16
atgctggata agatcgttat agccaaccgt ggagaaatcg ccctgcgtat cctcagagcc      60
tgcaaagaac tcggtatcaa gaccgtcgcg gtgcatagct cggccgaccg cgacctcaag     120
cacgtgctgc tggccgacga aacggtctgc attggccccg ccccctcggt caagtcctat     180
ctcaatatcc cggcgatcat ctcggcggct gagatcaccg gggcggtcgc gatccacccc     240
ggctatggct tcctgtccga gaatgccaac ttcgcggagc aagtcgagcg ttcgggcttc     300
atcttcatcg gccccaaggc cgaaacgatc cgccttatgg gagacaaggt gtcggcgatc     360
gcggcgatga aaaaggctgg cgtgccgtgc gtgccgggct cggatggccc gctgggcgac     420
gacatggata agaaccgggc catcgcgaag cgtatcggct atccggtcat tatcaaggcc     480
tccggcggcg gcggcggccg cggcatgcgc gtcgtccgcg gtgacgccga gctggcgcag     540
tcgattagca tgactcgcgc cgaggcgaaa gcggcgttct cgaatgacat ggtgtatatg     600
gagaagtact tggagaaccc tcgccacgtc gagatccagg tgctcgcgga tggccagggc     660
aacgccatct atctcgcgga gcgcgattgc tcgatgcagc ggcgccacca gaaggtcgtc     720
gaggaagcgc ccgccccggg catcacgccg gagctgcgcc gctatatcgg tgagcgctgc     780
gccaaggcgt gcgtcgatat cggatatcgc ggcgccggaa ccttcgagtt cctcttcgag     840
aacggcgagt tctatttcat cgagatgaat acccgcatcc aggtcgagca tcccgttacc     900
gagatgatca ccggcgtcga tctgatcaaa gagcagctgc gcatcgccgc tggccagccg     960
ctgtcgatca agcaagaaga ggtccatgtg aggggccacg ccgtcgagtg ccgcatcaat    1020
gccgaggacc cgaacacgtt cctcccgtcc cccggcaaga ttacgcgctt ccatgcgccc    1080
ggcggcttcg gcgtccggtg ggagagccat atctacgcgg gctacaccgt gccgccgtac    1140
tacgacagca tgatcggcaa gctcatctgc tatggcgaga accgcgacgt cgcgatcgcc    1200
cgcatgaaga acgccctcca ggaactcatc atcgacggga tcaagacgaa tgtggacctc    1260
cagatccgca tcatgaacga cgagaacttc cagcatggcg gcaccaatat ccactacctg    1320
gaaaagaagc tgggcctgca ggaaaag                                        1347
<210> 17
<211> 912
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность AccD E. coli
<400> 17
atgagctgga ttgaacgcat caagagtaat atcaccccca cccgcaaggc ctctatccct      60
gaaggcgtct ggaccaagtg cgactcgtgc ggccaggtcc tctatcgcgc cgagctggag     120
cgcaacctcg aagtctgccc caagtgcgat catcacatgc gcatgacggc gaggaatcgg     180
ctccattcgc tgctggacga gggcagcctc gtcgagctcg gctcggagct ggagccgaag     240
gacgtcctca agttccggga ttcgaagaag tacaaggacc gcctggccag cgcccagaag     300
gaaacgggcg agaaagatgc cctcgtcgtt atgaagggca ccctgtacgg catgccggtg     360
gtggccgctg cgttcgagtt cgcgttcatg ggcggcagca tgggctcggt cgtcggtgcc     420
cgcttcgtcc gtgcggtgga gcaggcgctt gaggataatt gcccgctgat ctgcttctcc     480
gcgtcgggcg gtgcgcgcat gcaagaagcg ctgatgtcgc tgatgcagat ggcgaaaacg     540
tccgccgccc tggccaagat gcaggagcgc ggactgccgt atatctcggt cctgacggac     600
ccgaccatgg ggggagtctc cgcgtccttc gcgatgctcg gcgacctgaa catcgccgag     660
ccgaaggccc tcatcggctt cgcgggcccc cgtgtcatcg agcagaccgt gcgcgagaag     720
ctcccgccgg gcttccagcg cagcgagttc ctcatcgaaa agggcgcgat cgacatgatc     780
gtgcgtcgcc cggagatgcg cctcaagctc gcgtcgatct tggccaagct catgaacctc     840
ccggccccca accccgaggc gccccgcgag ggcgtcgtcg tgccgccggt gccggaccag     900
gagcccgagg ct                                                         912
<210> 18
<211> 2181
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность мутированного fadD Methylococcus capsulatus
<400> 18
gatcgtagtc gtcttcacag gtcatggctc gggtggcgga gttcatggga aggcggaggg      60
actgagtctt cgttcaaatc ggccgcactg ccggtggctg ggacgggaat gatagcgctg     120
ccatcccctc gcccgaaagg cggctagatc gtcttcttga gccggtcctc ctcccgttgg     180
ccaacggtcg ctcgagtcgc gcattcgctg ccgcctgctc cgcgtccaac gccccaggca     240
cggatcgctg acgatggcgc gcccgcccgc tgggaatcag cccggcgcca acccccgact     300
cccacgccac cgtcgccatg ggatgccacc caaagcatgc gtttgaccgg ctgttcctcg     360
aactccgccg tatatcgccg ccggctcggt ttctgtcggc cactcatcga ccaccccccc     420
caagggcttg acccgcataa atggggggct acgcaggcgt agcgagatca gcgccacgca     480
cgttcgattc cgcggacttg cagtcgatga aggccggcct gtccaccagc agcggtcgcg     540
tttccaggaa gccagccgtt tcgttcttgg tctaccccac gatgatccga ggctcggtgt     600
acctcggcat ctcctgcaga gcaatggtgg gccggacggt cagcgtagcg ggctcgtttg     660
cggccatggc cgctccaaaa gccgttgcaa gagtgtcgta tttcacgata ttcccggcgc     720
tcccaaggca gaacgaaccg gtgacgcatc accagcccgg cgctcagaga gcgtcgtaaa     780
gtttacgacc ggcccagttt gaccgcgact ggcagggttt gcggctctgg gagaaagtca     840
tcgaactgcc tcgggcgcac gcctcctcaa attccttcaa ggcagcaggc ggcgctgcaa     900
cgacgccccc gaccgcaggg acctggaccg cgacgggaat cacggaccgt tcccgcctgg     960
aaccgggggc atcggagatg cttcagagga tatcctgtca ggcatccacc ccgcgctcca    1020
cttcaccctg ccgccgcagc tgccgcttca ctattttgct tatacgtgtc gtaggtcggt    1080
ttccatccgg tataggtggc gcagcccgaa acggccacgg cggacatcag cagtatcggt    1140
acgcttttca acatggtcat gaactcctcg ctcgaaaatt ccgtccttac agcccccagc    1200
ccagatccgg ggacaggaag acgcagccac tatatcaaaa ccgggttcac gccgaacact    1260
tcgccgattc gggaatatcc ggtgcttctg ttatgatcgc atcctccgat gagcgcgatg    1320
gcccgccgcc ctcccccgaa cgaccgaatc cctgcgccga tcgacgtccc ggcacgcggt    1380
caccctcatc agacattttt cactctttga ctccccatcc tgatgcaatc gaccgaaact    1440
cccttttcct ttgccgatct ggcgatctct gcccccattc tccaggccat ccgcgaaatc    1500
ggctacgaga ctccctctcc catccaggcg gcgagcattc cccctctcct cgccggccat    1560
gatcttctgg gccaggcgca gaccggcacg ggcaaaaccg ccgctttcgc cctgccgatc    1620
ctgaacggta tcgacctcga gcgccgcgag ccgcaagcgc tggtgctggc tccgacccgc    1680
gaactcgccc tgcaagtggc cgaggccttc cagagctatg cccgccacct gcccgatttc    1740
catatcctgc cgatctatgg cggccagtcg atggatgcac agttgcgtca tctgcgccgg    1800
ggagtccacg tcatcgtcgg cacccccggc cgggtgattg accacctgcg ccgcaagagc    1860
ctcaatctgg atggcctgcg cacccttgtt ctggacgaag ccgacgagat gctgcgaatg    1920
ggcttcatcg aagacgtcga gtggatcctc gagcacactc cgcccgagcg ccagatcgca    1980
ctgttctccg ccaccatgcc ggaagcgatc cgcagggtcg ccaagcgcca cctccgccat    2040
cccaaggagg ccaagatcga ggccaagacc gccacggtcg aggcaatcac ccagcgctac    2100
tggctgggtt cgggcgcgca caaactggac gccctgaccc gcatcctcga ggtcgaggac    2160
ttcgacgcca tgatcatctt c                                              2181
<210> 19
<211> 927
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность FadD E. coli
<400> 19
atgactcagt tcgcgttcgt ctttccaggt caaggttcac aaacagtcgg tatgctcgca      60
gatatggccg cctcctaccc gatcgtcgaa gaaaccttcg cggaagcctc ggcggcactg     120
ggttacgacc tgtgggccct gacgcagcaa ggcccggccg aggaactgaa caagacctgg     180
cagacgcagc ccgctctgct gaccgcctct gtggccctgt atcgcgtttg gcagcaacag     240
ggcgggaaag ctcctgcgat gatggcgggc cacagcttgg gggagtatag tgcgctggtc     300
tgtgccgggg tgatcgattt cgccgacgcg gtccggctgg tcgagatgcg cggcaagttc     360
atgcaggaag ccgtaccgga aggcaccggc gccatggccg cgataatcgg cctggacgac     420
gcctcgatcg cgaaggcgtg cgaagaagcc gccgagggcc aggttgtcag ccccgtgaac     480
ttcaactccc ccggacaggt cgtcatcgcc ggacacaaag aagccgtgga gcgggccgga     540
gcggcctgca aggctgcagg cgccaagcgc gccttgccgc tcccggtgtc ggtccccagc     600
cattgcgcgc tcatgaagcc cgctgccgat aagctggcgg tggagcttgc gaaaatcacg     660
ttcaacgccc ccaccgtgcc ggtggtaaac aacgtggacg tgaagtgcga aaccaatggc     720
gacgcgattc gggacgccct cgtgcgtcag ctgtataacc cggtgcagtg gacgaaatcg     780
gtcgagtaca tggcagccca gggcgtcgag catctctacg aagtcggccc ggggaaggtc     840
ctcaccggcc tgaccaagcg catcgtggat accctgacgg cgagcgcctt gaatgagccg     900
tccgcgatgg cagccgccct ggagctc                                         927
<210> 20
<211> 549
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая последовательность TesA E. coli с удаленной последовательностью нацеливания на периплазму
<400> 20
atggcagata ccctccttat tcttggcgat tctctctcag ctggttaccg tatgtccgct      60
tccgccgcat ggcccgccct gctcaatgac aaatggcaaa gcaagacctc ggtcgtgaat     120
gcctcgatct cgggcgacac cagccaacag gggctggcca ggctgcctgc gttgctgaag     180
cagcatcagc cgcgctgggt gctcgtggag ctgggcggca acgatggact gcgcggcttc     240
cagccccagc agaccgagca gacgctgcgg cagatcctgc aagacgtgaa agcggccaat     300
gcggagccgc tgctcatgca gatccgcctc ccggccaact acggccggcg gtacaacgaa     360
gccttcagcg ccatctaccc aaagctggcg aaagaattcg acgttccgct gttgcccttc     420
ttcatggaag aagtctatct gaagccgcag tggatgcagg acgatggcat ccatcccaac     480
cgcgacgcgc agccgtttat cgccgactgg atggccaaac agctgcagcc gctggtcaac     540
cacgacagc                                                             549
<210> 21
<211> 1146
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая тиоэстеразу Cinnamomum camphorum
<400> 21
atggccacca ctagtcttgc ttcagccttt tgttctatga aagccgtaat gttagcccgc      60
gatggtagag gaatgaagcc gaggtcgtcg gacttgcagc tgcgagcggg caacgcccag     120
acctccctga agatgatcaa cggcaccaag ttcagctaca ccgagtcgtt gaaaaagctg     180
ccggactggt ccatgctgtt cgcggtcatc accaccatct tcagtgccgc ggagaagcag     240
tggaccaacc tggagtggaa gcccaagccg aatccgcctc agctgctgga cgaccacttc     300
ggcccacatg gcctcgtctt tcgccgcacg ttcgccatcc gcagctacga agtcggcccg     360
gatcggtcga cctccatcgt ggccgtgatg aaccatctgc aagaagcggc gctgaatcac     420
gccaagtccg tgggaatcct gggtgacggt ttcgggacga ccctggaaat gagcaagcgg     480
gatctcatct gggtggtgaa gcgcacccat gttgcggtcg aacggtaccc cgcgtggggg     540
gacaccgtcg aggtcgaatg ctgggtgggc gcctccggca ataacggacg ccgccacgat     600
ttcttggtgc gcgattgcaa aaccggcgaa attctgaccc ggtgcaccag cctgtcagtc     660
atgatgaaca cgcggacgcg ccgtctgagc aagatcccgg aagaagtcag gggcgagatc     720
ggtccggcat ttatcgataa tgtcgctgtt aaagatgaag agatcaagaa gccccagaag     780
ctcaacgact ccaccgccga ctacatccag ggcgggctga cgccccgttg gaacgaccta     840
gacatcaacc agcatgtgaa caacattaaa tatgtcgact ggatcctgga gactgtgccg     900
gatagcatat tcgaaagcca tcacatctcg tcgttcacga tcgaatatcg tcgggagtgc     960
acgatggaca gcgtcctgca gtcgttgacg accgtgagcg gcggttcctc cgaagcgggc    1020
ctcgtgtgcg aacacctcct ccagcttgag ggcgggtccg aggtcctgcg cgccaagacc    1080
gagtggcggc cgaaactgac agactcgttc cggggcatct ccgtgatccc cgcagagagc    1140
agcgtc                                                               1146
<210> 22
<211> 1146
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая тиоэстеразу Umbellularia californica
<400> 22
atggccacca cctctctagc ttcagccttt tgttcaatga aagccgttat gctcgcacgc      60
gatggacgcg gaatgaagcc ccgcagcagc gacttgcagc tccgcgccgg caatgcaccg     120
accagcttga aaatgatcaa cggaactaag ttctcgtaca cagagtccct gaagagactg     180
ccggactggt ccatgctgtt cgcggtcatc accaccatct tctcggccgc ggaaaagcag     240
tggacgaacc tcgaatggaa gccgaagccg aaactgcccc agctgctcga cgaccacttc     300
gggctgcacg gcctcgtgtt ccggcgaacc ttcgccattc ggtcgtacga agttggcccg     360
gatcggagta cctcgattct ggccgtcatg aaccacatgc aagaagccac cctgaaccac     420
gccaaaagtg tgggtatcct cggtgacggc ttcggcacga ccctggaaat gagcaagcgg     480
gacttgatgt gggtcgtgcg taggacccat gtcgcggtcg aacgttatcc tacctggggg     540
gatacggtcg aggtcgagtg ttggataggc gcgtccggca ataacggcat gcgccgcgac     600
ttcctggtgc gcgactgcaa gacgggcgag atcttgaccc gctgcacctc gctgtcggtg     660
ctgatgaaca cccggacgcg gcgcctgagc accatccctg acgaagtccg aggcgagatc     720
ggccccgcct tcatcgacaa cgtggccgta aaagacgacg agataaagaa gctgcagaag     780
ctcaacgact ccaccgccga ctacatccag ggcggcctga ccccccggtg gaacgacctg     840
gatgtgaacc agcacgtcaa taatctgaag tacgttgcgt gggtgtttga aacggtgccc     900
gatagcatct tcgagtccca tcacatcagc tcgttcaccc tggagtatcg ccgggaatgc     960
acacgcgata gcgtgttgcg gtcgcttacc actgtcagcg ggggttcgtc cgaggccgga    1020
ctggtctgcg accatctcct ccagcttgag ggcgggtcgg aagtcctgcg cgcccggacg    1080
gaatggcgtc cgaagttgac ggactccttc cgtgggatct ccgtgatccc agccgaaccg    1140
cgcgtg                                                               1146
<210> 23
<211> 750
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая ацил-АЦП-тиоэстеразу Streptococcus pyogenes
<400> 23
atgggcctgt cctaccaaga agaactgacc ctgccattcg aactctgcga cgtgaaatcc      60
gacatcaagc tgccgcttct tctggattat tgcctcatgg tgtctggccg gcagtccgtc     120
cagctgggcc gcagcaacaa caatctgctg gtcgactaca agctcgtctg gatagtcacg     180
gactacgaga tcactatcca taggttgccg cacttccagg aaacgatcac gatcgaaacc     240
aaggccctgt cgtataacaa attcttttgt taccgccagt tctacatcta cgaccaggaa     300
ggctgcctgc tcgtcgacat cctgtcgtac ttcgcgctgc tgaaccccga tacgcgcaag     360
gtcgcgacca tccctgagga tctggtggcc cccttcgaaa ccgacttcgt gaagaaactc     420
catcgggtgc cgaagatgcc gttgctggag cagagtatcg accgtgacta ctacgttcgc     480
tacttcgaca tcgacatgaa tggacacgta aacaactcaa agtatctgga ttggatgtat     540
gatgtgctgg gctgccaatt cctcaagacc catcagccct tgaagatgac cctgaaatat     600
gtgaaagaag tcagcccggg tggtcagatt accagctcgt atcacctcga ccaattgacc     660
agctaccacc agatcatctc ggacgggcag ctcaacgccc aggccatgat tgagtggcgg     720
gcaatcaagc agaccgagtc cgagacagat                                      750
<210> 24
<211> 1191
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая пальмитоил: ацилпереносящий белок-тиоэстеразу Ricinus communis
<400> 24
atgggcacat gttcttacac catcaccctc cccatccgct gcctcagtaa ctcgaacggc      60
caccatgatc cgcacaagca gaatctgaac aagatcaaga tcaatggcgc ctcgacctcc     120
acccggcctc tgaagcttga cgccccctcc cagacggtcg gcgtcgccac catatacttg     180
gcgagcgtgt ccgagaacct caccctgacc aaagaagtca tgcgccagaa catcccgacc     240
aagaaacagt acatcgatcc ccaccgccag ggcctgatga tcgagggtgg cgtgggctat     300
aggcagacta ttgtcatccg cagctacgaa gtgggacccg acaaaacggc cactctggag     360
agcatcctgt atctgctcca ggaaaccgcc ctcaaccatg tgtggctgtc cggtctgctg     420
tccaatgggt tcggcgcgac gcacggcatg gtcaaaaaca acctgatttg ggtggtgagc     480
aagctgcaag tccaggtcga tcattatccg atctgggggg aagtggtgga gatcgacacc     540
tgggtccgcg cctccggcaa gaatggaatg aagcgggact ggctcattcg tagccaggca     600
acggggcacg ttttcgtgcg cgcgacgtcg acctgggtga tgatgaacga aaagaccaga     660
cggctctcca aaatgccgga agaagtccga gcggagataa gcccatggtt catcgagaag     720
caagcgatca aagaagaagt acccgacaag atcgctaagt tggacgacaa ggcccggtac     780
gtaatctcaa acctgaaacc gaagcgctcc gacctcgata tgaaccacca tgttaacaat     840
gtcaaatacg tccggtggat gctggagatc ctgcccgacc actttctgga aagccatcag     900
ctatcgggga tcaccatgga gtatcggcgt gagtgcggct cggccgatat cgtgcagagc     960
ctgtgcgaac cggacgggga cgagatcctg tcgaatgaca tcccggtgct taacggcttc    1020
agtctggcca gcgagcctct gatggaaggt aatggattct tggtccccct ggataaggtc    1080
ccgctgaagt acacccactt gctgttgacg aagggcgagt cccagaacga agagatcgtg    1140
cgcggcaaga cgatctggaa gaaaaagctc tgcaccatgc cgttctcgac g             1191
<210> 25
<211> 1176
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая последовательность, кодирующая пальмитоил: ацилпереносящий белок-тиоэстеразу Ricinus communis
<400> 25
atggcatcta aaggctcgat caggttgtat ttcccctgtg actttcgtaa caccctgcag      60
aagaagaaca tgaagatgga tatggtcatg gcccgcagcg gattcagcta ttcgctcaac     120
ccgatcgcac caaaaatccc ccgcttctat gtcgtggcga acgccagcaa cccgcagcgg     180
gtggacacca tcaatggcaa aaaagtgaac ggtatccacg tggccgaatc ctccaactcg     240
tatgcggacc agaacaagat gaatgcgaca gccggcctcg tgctggacgg gaacgtcgac     300
catcagccgc tccacaagtg gctgctgggg cggttcgtcg atgaacgcct ggtctactcg     360
cagaccttca tcatccgctc ctatgagata ggccccgaca agaccgccac catggaaacc     420
ctgatgaatc tgctgcagga aaccgcgttg aaccacgtaa ccagtagcgg cctcgctggc     480
gacggattcg gtgcgacgcg tgagatgtcc ctgcggaaac tgatctgggt ggtgacgcgc     540
attcatatcc aagtacagcg ctacagctgc tggggggacg ttgtcgagat cgacacctgg     600
gtggatggtg ccggcaagaa tggcatgcgt cgggattgga tcatccgcga ttacaatacg     660
aaagaaatca tcactcgcgc gacctcaacc tgggtgatta tgaaccgcga aacccggaaa     720
ctgtccaaga tgccggaaca ggttcgacag gaactcgtgc ccttctacac caacaggatc     780
gcgattgcca aggaaaacaa cgacgtcgag aagatcgaca agctcacgga cgagactgcc     840
gagcgcatca gaagcggctt ggcccctcgg tggtcggata tggatgccaa tcaacacgtc     900
aacaacgtga agtacatcgg ctggatcctg gagtcggtcc cgatcaatgt ccttgaggac     960
tacaacctga cctcgatgac gctggagtac cgccgtgagt gccggcagtc caatctgttg    1020
gaatcgctga cgagcaccac cgaacattcc aacaacaata gctgcaaccg caaggcgcac    1080
ctggagtaca cgcatctcct gcggatgcag gctgacaagg ccgagatcgt ccgagcccgg    1140
accgaatggc agagtaagtc gaaccgcaag acgatc                              1176
<210> 26
<211> 1257
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая последовательность, кодирующая пальмитоил: ацилпереносящий белок-тиоэстеразу Ricinus communis
<400> 26
atggtcgcca cagccgccgc cgccacctcc tcattcttcc ccgttcctag ccaatccgca      60
gacgccaact tcgacaaagc gccagccagc ctggggggca tcaaactgaa atccacgtcc     120
tgcagtcgcg gcctccaggt caaggccaac gcccaggcac cgcccaagat caatggtagc     180
agcgtgggct tcaccacgag cgtggaaacc gtgaagaacg acggcgacat gcccctgcca     240
ccgcctccgc ggaccttcat caatcagttg cccgattggt ccatgctgct cgctgcgatt     300
acgacgatct tcctggcggc tgagaagcag tggatgatgc tggactggaa gccgcggcgc     360
cccgacatgc tcatcgaccc cttcggcatc ggccggatcg tccaggacgg gctcatcttc     420
cggcaaaact ttagcatccg gtcgtacgag atcggggcgg atcggaccgc gtcgatcgag     480
actctgatga accatttgca ggaaactgcc ctcaaccacg tgaaaaccgc cggtctgctg     540
ggggacggct tcggcagcac cccggaaatg agcaaaagga atctgatctg ggtcgtaacc     600
cggatgcaag ttctggtgga tcgctacccg acgtggggtg acgtcgtaca ggtcgatacg     660
tgggtgtcga agtcgggtaa gaacggcatg cgccgtgatt ggtgcgtgcg cgacagtcgc     720
acgggcgaaa ccttgacccg agccagctct gtctgggtca tgatgaacaa gctgacccgt     780
agactatcga agatccccga agaagtccga ggggaaatcg agccgtattt cctgaactcc     840
gaccccatag tggacgaaga ttcccgcaag ctcccgaagc tggacgacag caatgcggac     900
tacgtccgca agggactgac gccgcgttgg tcagatcttg acatcaacca gcacgtgaat     960
aacgtcaagt acatcggctg gattctggag agcgcgccgc tcccgatcct cgaatcccac    1020
gagctttcgg ccatcaccct cgaatatcgc cgggaatgtg gccgggattc cgtcttgcag    1080
tcgttgaccg cggtgtccgg caacgggatt ggcaacctgg gcaacgccgg cgacatcgag    1140
tgccagcatc tgctgcgcct ggaagatggc gccgagatcg tgaggggacg caccgagtgg    1200
cgcccgaaat acagctcgaa tttcggaatc atgggccaga tccccgtgga gtcggcg       1257
<210> 27
<211> 1071
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая ацил: АЦП-тиоэстеразу Jatropha curcas
<400> 27
atggctagca cggctatctc cttcctctct atcccgatca aactcatcaa agaagaaatg      60
cgcatggcgt ccgccggacg gcggaagaac accatcgcag cggagttcgg ccacttcaca     120
ttcggctcgg cgaccgttga gaagaaggtg cagaaaagca acaacttcct gatcgacggc     180
ggctttgggt cgctggagca gaacggtctt atctaccgtc aaaacatctt cgtccgcagc     240
ttcgaaatcg gtttcgatcg caagttgagc ctggcagccc tgaccaattt cttgcaggat     300
acggccctca accattgccg gatgattggc ctgttggccg aggggtttgg gtccaccccc     360
gaaatgatca agaaagacct gatctgggtc ctgtgtaccc tgcagattct cgtggacggc     420
tatccctcct ggctcgatgt ggtcgaagtc gatacgtgga tgtacccgtc gggacaaaac     480
ggcctggggc gcggctggct cgttcgcgac ggaaagactg gccggagcct ggcccagtcg     540
tccagcgtaa tggtgtcctt caacaaaaag acccgcaagc tgagtaagtt ggccaaagaa     600
attcgggacg agatagcgcc tcacatgatg gactgcgacc cgatcatgaa caagaactcc     660
cgtaagatcc tgccgttcga cgtcaatacg gcggactatg ccaggaccgg ccttaccccc     720
ggttggaatg aactggatct gaatcagcac gtcaaccatg tgcagtacat caactggatc     780
ctgcagaacg tgcgcccctc cctggtgcag caccataagc tctcagcgat caccctggag     840
taccgaaaag aatgcgacat gaacagcatc ctgcagtcgc tctcgcggat cgtgaagaat     900
ggcggcaacg actcgaccga caagaacaac gtgatcgaac tcgatcattt cctgctgctg     960
gagaacggca gtgagatcgc cagagccaat acgatctgga agccgcgcga ggtcaataac    1020
ttcaaaaatg tcgtccactc gccagccgaa gagaacatca gcagcatgaa c             1071
<210> 28
<211> 1215
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая Jatropha curcas ацил: АЦП-тиоэстеразу
<400> 28
atggccgtgt tcacctaccg tatcgcaatg ctcccaatcc ggtgttcctc ttccaattcg      60
accaactccc atagccacga tccgaatcag cagaacttgc acaaaatcaa gatcaacggc     120
tccgcctcgg cgatgatgcc gctgaaggtt gacctcccca gcagcctgac gatcaccagc     180
gtggcccctg tggtggagaa cctgtccctg accaaagagc agacgcggca gaacattccc     240
accaagaagc agtacattga cccgcatcgt caggggctga tcgtagaaga gggcgtgggt     300
taccggcaga cagttgtcat ccgctcctac gaggtcggtc cggataagac ggccaccttg     360
gagatcattc tctgcctgtt gcaagaaacc gccctgaacc acgtctggct gagcggcctg     420
ctgagcaatg gcttcggagc cactcatggc atggtgcgca acaacttgat ctgggtcgtc     480
agcaagctcc aggtccaagt cgatcagtat cccatctggg gcgaagtagt ggagatcgat     540
acgtgggtgg gagcgagtgg caagaatggg atgcgcagag actggctggt ccggtcgcag     600
gcgaccggtc aggtctttgc acgcgcgacc tcgacgtggg tgatgatgaa cgaaaagacg     660
cgacgcctgt cgaaaatgcc ggaagaagtg agggccgaaa tcgcgccgtg gttcatcgag     720
aaacaggcca tcaaagaaga ggtcccggag aaaatcgcga agcttgacga caaggcccgc     780
tatgtggtga ccaacctgaa gccgaagcgg tccgacctcg acatgaacca acatgtcaac     840
aatgtgaaat atgtccgctg gatgctagaa accctgcccg accagttttt cgaaaatcac     900
cagctcagcg gaatcaccct ggaatacaag cgcgagtgcg gctcctcgga catcgtcgag     960
tcgctgtgcg agccggacga agaagagggc atcatcaaca ccggcctcaa gcagaacaac    1020
gataagagtc tgttcaatgg gttcagcctc ccttcggaga tcatggaagg gaacggcttc    1080
ctgtccagcc tggaaaagac cccgctgaag tacacccacc tccttgtggc taaaggcaag    1140
acccagtcag aggaaatcgt ccggggcaag actatatgga agaaaaagct gctgacaacg    1200
atgcccttct cgccg                                                     1215
<210> 29
<211> 1044
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая Jatropha curcas ацил: АЦП-тиоэстеразу
<400> 29
atggtgtcaa ccgcgatctc ctttagcctc ctgcccatca aacttatcaa agaagaaacc      60
cgcatggcct ccgccgaccg gcgcaagaac agtatcgtca aagaattcgg ccatttcacc     120
tgtcgctgcg cagccatcga aaagcgaatc cagaagctga ataacttcct gatcgacggg     180
ggcttcggat ccctggagca aaatggcctg atctataggc aaaacatctt cattcggagc     240
tttgagatcg gtttcgaccg caagttgtcg ctggccgcgt tgaccaactt cctgcaggat     300
acagcgctca accatgtccg tatgataggc ctgctcgctg ccggcttcgg cagcaccccg     360
gagatgtcca agaaagacct gatctgggtg ctgtgcaccc tgcagatcct tgttgatcgg     420
cacccctctt ggctggatgc ggtcgaagtg gacacgtgga tgtaccctag cggccagaac     480
gggcagggca gagattggct cgtccgcgac gccaagacgg gcaagcccct cgcccaggcg     540
tcgagcgtga tggtcctgct caacaagaaa acccgcaagc tgagcaagtt caccgaagag     600
attcgcgacg agatcgcccc acacatgatg atggactgca atccgatcat caactcgcgg     660
aagatgctcc cgttcgacgt aaataccgcc gactacgccc gcaccgggct aacgccgggt     720
tggaacgatt tggatctcaa tcagcatgtg aatcacgtgc agtacatcaa ctggatcctg     780
cagaacgtgc tccggtccct gatccagcat cacaagctgt ccgacatcac tctggagtat     840
cgtaaggaat gcgacatcaa ctccatcttg cagttcctgt cgaagatcgt caagaacggc     900
agtaaccact cgaccgatac gaacaatttg attgagctcg accactcgct gctgctggag     960
aacggaagcg agatcgcgcg ggcgaacacg atctggaaac cccgggaagt caacaacttc    1020
aaaaacgccg tctacacccc ggca                                           1044
<210> 30
<211> 396
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность FadM E. coli
<400> 30
atgcagaccc agatcaaagt gcgcggctac cacctcgacg tctatcagca cgttaacaac      60
gctcgttacc tcgaatttct ggaagaagcc cggtgggacg gcctggagaa cagcgactcg     120
ttccagtgga tgaccgcgca taacatcgcg ttcgtggtcg tcaacatcaa tatcaactac     180
cggcgcccgg ccgtactgtc ggaccttctc accattacga gccagctgca gcagctgaat     240
ggaaagtccg ggatcctgtc ccaagtgatc accctggaac ccgagggtca agtggtggca     300
gatgcgctga tcacgttcgt ctgcatcgat ctcaagaccc agaaagccct ggccttggaa     360
ggcgagttgc gcgagaagct ggagcagatg gtcaag                               396
<210> 31
<211> 957
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность AccA E. coli
<400> 31
atgtccctga atttcctcga cttcgaacag cccatcgccg agcttgaagc caaaatcgac      60
agcctcaccg ccgtcagccg tcaagacgag aagctggaca ttaacatcga cgaagaggtt     120
catcggctcc gggagaagtc cgtcgaactg acccgcaaga tcttcgccga tctgggggcc     180
tggcagatcg cccagctagc tcggcacccg cagcgcccct acacgctgga ctatgtacgg     240
ctcgcattcg acgagtttga tgagctcgct ggcgaccgcg cctacgcgga cgataaggcc     300
atcgtcggcg gcatcgctcg gctggacggt cgtccggtca tgatcatcgg ccaccaaaag     360
ggcagagaaa ccaaagaaaa gatccgccgt aacttcggca tgccagcgcc cgagggatac     420
cggaaggccc tgcggttgat gcagatggcc gaacgcttca agatgcccat catcacgttc     480
atcgataccc cgggagccta tccgggcgtg ggtgccgagg aaaggggcca gtccgaagcg     540
attgcccgca acttgcgaga gatgtcgcgc ctgggcgtgc cggtcgtgtg caccgtgatc     600
ggcgagggtg gcagcggcgg agcgctcgcc atcggcgtcg gggataaagt caacatgctg     660
cagtattcca cttactcggt gatcagtccc gaaggctgcg cctctatcct gtggaaaagc     720
gccgacaagg caccgctggc ggcagaggcc atggggatca ttgcgcctcg cctgaaagaa     780
ctgaagctca tagactcgat catcccggag cccttgggcg gtgcgcatcg caacccggaa     840
gcgatggcgg cgagcctcaa ggcccagctg ttggcggacc tggccgacct tgatgtgctg     900
tcaaccgagg atctgaagaa tcggcgctac cagaggctga tgtcgtacgg gtacgcg        957
<210> 32
<211> 468
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность AccB E. coli
<400> 32
atggacatca ggaaaatcaa gaaactcatt gaattggtcg aggaaagtgg cattagcgaa      60
ctggaaatca gcgagggtga ggaatccgtt cgcatcagcc gtgcggcgcc cgccgcgtcc     120
ttcccggtca tgcaacaggc ctatgcagcc cccatgatgc agcagccagc ccagtcgaat     180
gccgcggccc ccgcgaccgt gccgagcatg gaagcaccgg ctgccgccga gatctccgga     240
cacatcgtgc ggtcccctat ggtgggcacc ttttaccgca cgccgtcgcc ggatgcgaag     300
gccttcatcg aagtcgggca gaaagtgaac gtcggcgata cgctgtgcat agtcgaggcg     360
atgaagatga tgaaccagat cgaggccgac aagtcgggca ccgtcaaggc catcctggta     420
gagtcgggcc agcccgtgga gttcgacgaa ccgctggtcg tgatcgag                  468
<210> 33
<211> 1347
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность AccC E. coli
<400> 33
atgcttgaca aaatagtaat tgcgaataga ggggaaatag cgttgaggat cttgagggcc      60
tgcaaagaat tgggcatcaa gaccgttgcc gtccatagca gcgccgatcg ggacctcaaa     120
cacgtgttgc tggccgacga aaccgtgtgc atcgggcctg caccttccgt caagtcgtat     180
ctcaacatcc cggccattat ctccgctgcg gaaatcaccg gagccgtggc gatccacccg     240
ggctacggct tcctgagcga gaatgccaac ttcgccgaac aggtcgagcg gtcggggttt     300
atctttattg gcccaaaggc cgaaaccatc cggctgatgg gcgacaaagt gtctgcgatc     360
gccgccatga agaaagcggg agtgccctgc gtcccgggca gtgacggccc tctgggcgac     420
gacatggaca agaaccgcgc gatcgcgaag cgcatcggct acccggtaat catcaaagcg     480
agcggtgggg gtggtggacg tggtatgcgt gtggtcaggg gcgatgcgga gctcgcccag     540
agcatctcca tgacccgcgc tgaggccaag gccgccttct ccaacgatat ggtgtacatg     600
gagaagtacc tggaaaatcc ccggcacgtg gaaatccagg tcctggcaga cgggcaaggc     660
aacgcgatct acctggccga gcgggattgc tcgatgcaac gccggcatca gaaagtcgtt     720
gaagaagcgc cggcacccgg catcaccccc gagctgcgcc gctacatcgg cgagcggtgt     780
gccaaggcct gcgtcgacat cggctatcgg ggagcgggca ccttcgagtt cctgttcgag     840
aatggcgaat tctatttcat cgagatgaac acacgcatcc aggtcgagca tccggtgacc     900
gaaatgatca ccggggtgga cctgattaag gaacagctgc gaatcgcagc cggccagccg     960
ctctcgatca agcaagaaga agtccacgtc cggggacacg ccgtggagtg ccgtatcaac    1020
gccgaggatc cgaacacgtt cctgccctcg cccggtaaga tcacgcgctt ccatgctccg    1080
ggtggattcg gcgtccgctg ggagtcacac atctatgccg gctacacggt cccgccctac    1140
tacgactcca tgatcggcaa gctgatctgt tatggcgaga accgcgatgt ggcgatcgcc    1200
cgcatgaaga acgcgctcca ggaactgatt atcgacggca tcaagactaa cgtggacctc    1260
cagatccgga tcatgaacga cgaaaacttc cagcacggcg gcacgaatat ccattacctg    1320
gagaagaaac tgggcctcca ggaaaag                                        1347
<210> 34
<211> 912
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность AccD E. coli
<400> 34
atgagctgga tcgaacgcat taagtcaaac ataaccccca ccagaaaggc gagcattccc      60
gagggcgtat ggaccaagtg cgacagctgc ggtcaagtcc tgtatcgggc tgagttggag     120
cgaaatctgg aagtgtgtcc gaagtgcgac catcacatgc ggatgactgc caggaaccgt     180
ctgcacagtc tcctggacga agggtcgctc gtcgaactgg gctccgagct ggagccgaaa     240
gacgtgctga agttccggga ctcgaagaag tataaagatc ggctggcgtc cgcccagaaa     300
gaaaccggcg agaaagatgc gttggtcgtg atgaagggga cgctgtacgg catgccggtc     360
gtggcggcag ccttcgagtt tgccttcatg ggcggctcta tgggcagcgt ggtgggagcg     420
cggttcgtcc gcgctgtgga acaggcgctc gaagataact gcccgctgat ctgcttctcg     480
gcgtcggggg gtgcgcgcat gcaagaagcc ctgatgtccc tgatgcagat ggcgaaaacg     540
tccgccgcac tcgccaagat gcaggaacgc ggcctcccct acatctcggt gctgaccgat     600
ccgacgatgg gcggtgttag cgcctccttc gccatgctcg gcgacctgaa catcgccgag     660
cccaaagccc tgatcggctt cgccggaccg cgggtcatcg aacagaccgt tcgcgagaag     720
ctccctccgg ggttccagcg ctcggagttc cttatcgaaa agggcgccat cgacatgatc     780
gtccgtcgcc ccgagatgcg gctgaagttg gccagcatcc tggccaagct gatgaatctt     840
cctgccccca accccgaggc accgcgcgag ggcgtcgtcg tgccgccagt gccggaccag     900
gaaccggaag cg                                                         912
<210> 35
<211> 1668
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность мутированного FadD Methylomonas methanica
<400> 35
atgatgggat tgggtaatgt cgacatattc tgctacgata gtttgcattg agcgtcccta      60
acaatttggt ttattttcca catggcaacc tgattacatc aattattatt cgataacctg     120
aatgctcgcg gcggattccg atgctattga gcataaggat agccgaatta gttttcgtca     180
actgagcgag ttagtagcac tccaggccaa agccctacaa agcctggatt tgaaacgcca     240
gcaacgtgtt gcaatttacc ttcctaaaca aatcgaaacc gtcagcagct tcctggccgt     300
ttccttggcc gggcggcgtg ttcgtgacgg taaatccggt actaaaggcg ccacaggtta     360
gccacatcct caacgactga aacgtcaaaa tactgatcac ctcaaaaagc cgcctgcata     420
gtttacagac agtactgcat gaatgaaccg atctacacac catcatcctg gttgatcatg     480
acgcgggcga cgttaaactc ccgtcgtggc aaattattga ctggcaaacc tacaaccgtt     540
tagccgactc ttatccacac catccggtta ccatgatcga caccgacatg gcggcgatct     600
tgtacacctc cggcagcacg ggcaaaccga aaggcgtggt gttatctcat cgcaatatcg     660
tggccggcgc ccaaagtgtg gctgaatacc tgcaaattca ggcagacgac cgattgctcg     720
ccgtactacc ctttagtttc gactacgggc tgaatcaact aacgaccagc ctgttgaagg     780
gtgcaagttg cgtgttattg gactatttac tgcccaagga tgtgattaac gccctaggca     840
aataccaaat cacaggtctg gccgccgtcc cgcctttatg ggctcaactg gcggatttaa     900
actggccgga atccatcgat caacacttgc gctatatgac caactcgggc ggaaaaatgc     960
ccaaaaccgt actacaaaaa ctgcgctcta aagcccccaa ttcaaagttt tttctgatgt    1020
atggcctgac ggaagccttc cgttcaacct atttaccacc cgagcaaatc gacattcgtc    1080
cggactccat gggtaaagcc atcccaaacg cggaaatcat ggtagtccgt gaggacggta    1140
gcctgtgcgc tccgcacgaa ccgggcgaac tggttcaccg cggctccctg gtcagtcttg    1200
gttattggaa cgaccccgcc aaaaccgcgg aacgctttaa acccgctccc ggccaactat    1260
ccggcttacc cctgaccgaa atagccgtct ggtccggcga taccgtcacg atggatgagg    1320
atggtttttt gtattttgtc ggccgtaaag acgatatgat caaaacgtcc ggctacagag    1380
tgagtccgag tgaaattgaa gaagtcattt acgcctccgg attggttaag gaggctgcgg    1440
cgattgggat cgaacaccca aacctgggcc aggcggttgt cgttgtcgtt agcccacaac    1500
ctgatatgca attcgatcca caacaattga ttgattgctg caaaacccaa ctgccaaatt    1560
tcatggtacc cgcgcgaatt gaagagctca gcagcttacc gcgtaacccc aacggcaaaa    1620
tagatcgtaa aatgcttagc caacagtttg cccatttgtt tcagctga                 1668
<210> 36
<211> 927
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность FabD E. coli
<400> 36
atgacgcagt tcgctttcgt tttccccgga caaggatccc agaccgttgg tatgctcgct      60
gatatggccg cttcgtatcc gatcgtcgag gagactttcg cggaagcctc cgcggccctg     120
ggctacgatc tctgggccct cacccagcaa ggtccggcgg aagagttgaa taagacctgg     180
cagacgcagc ccgcgctgct caccgcgtcc gtggcgctgt atcgcgtgtg gcagcagcag     240
ggcggcaagg cccctgccat gatggcgggc cactcgctcg gcgagtattc ggccctggtc     300
tgcgccggcg tcatcgactt cgccgacgcc gtccgcctgg tcgagatgcg cggcaagttc     360
atgcaggagg ccgtccccga gggcaccggc gctatggccg ccatcatcgg cctcgacgac     420
gcgtcgatcg cgaaggcgtg cgaagaagcc gccgagggcc aggtcgtgag cccggtcaat     480
ttcaactcgc cgggtcaggt cgtcatcgcg ggccataaag aagcggtcga gcgtgccgga     540
gcggcgtgca aggccgcggg ggcgaagcgc gcgctcccgc tgccggtgtc ggtccccagc     600
cattgcgccc tcatgaagcc ggccgccgat aagctggccg tcgagctggc caagatcacg     660
ttcaacgccc cgaccgtccc cgtggtgaac aatgtcgacg tgaagtgcga aacgaacggc     720
gacgccatcc gggacgcgct ggtgcgccag ctctataatc cggtccagtg gaccaagagc     780
gtggagtaca tggcggcgca gggcgtcgag cacctctacg aagtgggccc cggcaaggtc     840
ctcaccggcc tgaccaagcg cattgtcgac acgctgacgg cgtcggccct gaacgagccc     900
agcgcgatgg ccgcggcgct ggagctg                                         927
<210> 37
<211> 549
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность TesA E. coli с удаленной последовательностью нацеливания на периплазму
<400> 37
atggctgata ccctcctcat tctcggcgac tccctctctg ctggttatcg tatgtccgct      60
tccgctgcct ggcctgcgct gctcaacgac aagtggcagt cgaaaaccag cgtcgtcaac     120
gcctcgatca gcggagacac gtcgcagcag ggcctcgccc gcctgcccgc gctcctgaag     180
cagcaccagc cgcggtgggt cctggtggag ctgggcggca atgacggcct gcgtggcttc     240
cagccccagc agacggagca gaccctgcgc cagatcctgc aagacgtgaa ggccgccaac     300
gcggagccgc tcctcatgca gatccgcctg ccggcgaact acggccgccg ctataatgaa     360
gcgttctcgg cgatctaccc gaagctcgcg aaggaattcg acgtgccctt gctgccgttc     420
ttcatggagg aggtctatct caagccgcag tggatgcaag acgatggcat ccaccccaat     480
cgcgacgccc agccgttcat cgcggattgg atggccaagc agctccagcc gctggtcaac     540
catgattcg                                                             549
<210> 38
<211> 1146
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая тиоэстеразу Cinnamomum camphorum
<400> 38
atggccacta cctcccttgc ttctgccttt tgctctatga aagctgtgat gctcgcccgt      60
gatggacgcg gtatgaagcc gcggagctcg gatctccagc tgcgcgcggg caacgcgcag     120
acgtccctga agatgatcaa tgggaccaag ttctcctata cggagtcgct gaagaagctg     180
ccggactggt ccatgctgtt cgcggtgatc accaccatct tcagcgccgc cgagaagcag     240
tggaccaacc tcgaatggaa gcccaagccg aatcccccgc agctcctcga tgatcatttc     300
ggcccccatg gcctggtgtt ccgccgtacg ttcgcgatcc gctcgtatga ggtcggcccg     360
gaccgctcca cctcgatcgt cgccgtcatg aatcatctcc aagaagcggc cctgaaccat     420
gccaaaagcg tcggcatcct gggcgacggc ttcggcacca ccctggagat gtcgaagcgc     480
gacctgatct gggtcgtcaa acgcacccac gtcgccgtgg agcgctaccc ggcctggggc     540
gataccgtcg aggtcgagtg ctgggtgggc gcctcgggca acaacggccg tcgccacgac     600
ttcctggtcc gcgactgcaa aacgggagag atcctgaccc gctgcacaag cctgagcgtc     660
atgatgaata cccgcacgcg ccggctctcc aagatccccg aggaagtgcg cggtgagatc     720
ggacccgcgt tcatcgacaa cgtcgcggtc aaggacgaag agatcaagaa gccgcagaag     780
ctcaacgaca gtacggcgga ctatattcag ggcggcctga ccccccgctg gaatgacctg     840
gacatcaacc agcatgtgaa caatatcaag tacgttgact ggatcctgga gactgtgccg     900
gactcgatct tcgagtcgca tcacatttcg tcgttcacga tcgagtatcg ccgcgagtgc     960
accatggatt cggtcctcca gtccttgacc acggtcagcg gcggcagctc ggaagcgggc    1020
ctcgtctgcg agcacctcct ccagctcgaa ggcggctccg aggtcctccg ggccaagacc    1080
gagtggcgtc ctaagctcac cgactcgttc cgcggcatct cggtcatccc tgccgagtcg    1140
agcgtg                                                               1146
<210> 39
<211> 1146
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая тиоэстеразу Umbellularia californica
<400> 39
atggccacta cctcccttgc ttctgccttt tgctcgatga aagctgtgat gctcgcccgt      60
gatggacgag gaatgaagcc gcgctcgtct gacctccagc tgcgtgcggg caatgccccg     120
acctcgctca agatgatcaa cggcacgaag ttctcgtata ccgagtccct caagcgcctc     180
ccggactggt cgatgctgtt cgccgtcatc accacgatct tcagcgccgc ggaaaagcag     240
tggaccaacc tggagtggaa gccgaagccg aagctccccc agctgttgga tgatcacttc     300
ggcctgcacg gcctcgtgtt ccgccgcacc ttcgcgatcc gcagctacga ggtcggccct     360
gatcgcagca cctcgatcct ggcggtcatg aaccacatgc aagaagccac gctgaaccac     420
gccaagtccg tcggcatcct gggcgacggc ttcggcacca ccctcgaaat gagtaagcgc     480
gacctcatgt gggtcgtccg ccgcacccat gtcgccgtcg agcgttaccc gacctggggc     540
gacaccgtcg aggtcgagtg ctggattgga gcgtcgggca acaatggcat gcgtcgcgac     600
ttcctcgtgc gcgattgcaa gaccggcgag attctgacgc gctgcacctc gctctcggtg     660
ctgatgaaca cccgcacccg ccgcctctcg accatcccgg acgaggtcag gggcgaaatc     720
ggccccgcgt tcatcgacaa cgtcgcggtg aaggacgacg agatcaaaaa gctgcagaag     780
ctcaacgact ccacggcgga ctatatccag ggcggcctga cgccccgctg gaatgacctg     840
gacgtcaacc agcatgtcaa taatctgaaa tacgtcgcct gggtgttcga gacagtgccc     900
gatagcatct tcgagagcca tcacatctcg tcgttcaccc tggagtatcg ccgggagtgc     960
acgcgggaca gcgtgctgcg gtcgctcacg accgtcagcg ggggctccag cgaagccggc    1020
ctcgtctgcg accacctcct gcagcttgag ggtggcagcg aagtcctccg tgcgcgcacg    1080
gagtggcgcc ccaagctcac ggattcgttc cgcggcatct cggtgattcc cgcggagccg    1140
cgcgtc                                                               1146
<210> 40
<211> 750
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая ацил-АЦП-тиоэстеразу Streptococcus pyogenes
<400> 40
atgggactct cgtatcaaga agaactgacc ctgcctttcg agctttgcga cgtgaaatcg      60
gacatcaagc tgccgttgct gctcgattat tgcctgatgg tgtccggccg gcagtcggtc     120
cagctcggcc gcagcaacaa taatctcctc gtcgactaca agctcgtgtg gatcgtgacc     180
gattacgaga ttacgatcca tcgcctcccg cacttccagg aaaccatcac catcgagaca     240
aaggccctgt cgtataacaa gttcttctgc taccgccagt tctatatcta cgatcaggaa     300
ggctgcctgc tcgtcgacat cctgtcctat ttcgcgctcc tcaatccgga cacccgcaag     360
gtcgccacga tccccgagga cctggtcgct cccttcgaaa ccgacttcgt gaagaaactc     420
caccgtgtgc cgaagatgcc gctgctggag cagtccatcg accgcgacta ctatgtccgc     480
tatttcgaca tcgatatgaa cggtcatgtc aacaactcga agtacctcga ttggatgtat     540
gacgtcctcg gctgccagtt cctcaagacg catcagccgc tcaagatgac cctgaaatat     600
gttaaggaag tctcgcccgg cggccagatc acgtcgtcgt accatctgga tcagctgacg     660
tcgtatcacc agatcatcag cgacggccag ctgaacgcgc aggccatgat cgagtggcgc     720
gcgattaagc agaccgagag cgagactgac                                      750
<210> 41
<211> 1191
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая пальмитоил: ацилпереносящий белок-тиоэстеразу Ricinus communis
<400> 41
atgggcactt gctcctatac catcaccctc ccgatccgct gcctctcgaa ttccaacggc      60
caccatgacc cccacaagca gaacctcaat aagatcaaga ttaatggcgc gtcgaccagc     120
acgcgcccgc tcaagctcga cgccccctcg cagaccgtgg gcgtggcgac catctacctg     180
gccagcgtgt cggagaatct gaccctgacg aaagaggtca tgcgccagaa catccccacc     240
aagaagcagt atatcgatcc ccatcgccag ggcctcatga tcgagggcgg agtgggctat     300
cgccagacga tcgtcatccg ctcctacgaa gtgggccctg acaagacggc cacgcttgag     360
tcgatcctgt atctgctcca ggaaaccgcg ctcaaccacg tgtggctgtc cggcctgctc     420
tcgaacggtt tcggcgcgac gcacggaatg gtcaagaaca acctcatctg ggtcgtgtcc     480
aagctgcaag tccaggtcga ccattacccg atctggggcg aggtcgtcga gatcgacacg     540
tgggtccgcg ctagcgggaa gaacggcatg aagcgcgatt ggctgatccg cagccaggcc     600
accggccacg tgttcgtccg cgccacctcg acctgggtga tgatgaatga gaaaacacgc     660
cggctctcga agatgccgga agaagtccgt gccgagatca gcccctggtt catcgagaag     720
caggcgatca aagaagaggt ccccgacaag atcgcgaagc tggacgataa ggcgcgttat     780
gttatctcga atctgaagcc gaagcgctct gacctcgaca tgaaccacca tgtcaataat     840
gtcaagtacg tccgctggat gctggagatc ctgccggacc atttcctgga gtcgcatcag     900
ctctcgggca ttacgatgga gtatcgccgt gagtgcggca gtgcggacat cgtccagagc     960
ctgtgcgagc cggacggcga tgagatcctg tccaacgaca tcccggtgct caacggcttc    1020
tcgctggcct cggagccgct catggaaggt aatggcttcc tggtcccgct ggataaggtg    1080
ccgttgaagt acacccatct gctcctcacg aagggcgagt cccagaacga agagatcgtc    1140
cggggcaaga cgatttggaa gaaaaagctc tgcaccatgc ccttctcgac c             1191
<210> 42
<211> 1176
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая пальмитоил: ацилпереносящий белок-тиоэстеразу Ricinus communis
<400> 42
atggcgtcca agggctcgat ccggctgtat ttcccctgcg atttccgtaa caccctccag      60
aagaagaata tgaagatgga catggtcatg gcgcggtcgg gcttctccta ctcgctcaat     120
ccgatcgcgc ccaagattcc gcgcttctac gtggtcgcca atgccagcaa tccccagcgc     180
gtggatacga tcaacgggaa gaaagtgaac ggcatccatg tcgcggagtc gagcaatagt     240
tatgcggacc agaataagat gaacgctacg gccggactgg tcctcgacgg caatgtggat     300
caccagccgc tgcataagtg gctcctcggc cgcttcgtcg acgagcgcct cgtgtatagc     360
cagacgttca tcatccgttc gtatgagatc ggccctgaca agacggcgac catggaaacc     420
ctgatgaatc tcctgcagga aaccgcgctc aaccatgtca cctcgtcggg cctcgccggt     480
gacggcttcg gcgccacccg cgagatgtcg ctccgcaagc tgatctgggt ggttacccgc     540
atccacatcc aggtccagcg ttactcgtgc tggggcgatg tcgtcgagat cgacacgtgg     600
gtcgacggcg cgggcaagaa cggcatgcgt cgcgactgga tcatccgcga ttacaacacc     660
aaggaaatca tcacgcgcgc tacgtctacc tgggtgatca tgaaccgcga aacgcgcaag     720
ctgtccaaga tgccggagca agtccgccag gaactggtcc cgttctatac gaaccgcatc     780
gccatcgcga aagagaacaa cgacgtcgag aagattgaca agctgactga cgagacagcg     840
gagcgcatcc gctcgggcct ggcgccgcgc tggagcgaca tggacgccaa ccagcatgtg     900
aataatgtca agtatatcgg ctggatcctg gagtcggtcc ccatcaatgt ccttgaggat     960
tacaacctca cgagcatgac cctggagtat cgccgcgagt gcaggcagag caatttgctg    1020
gagtcgctca cctccaccac cgagcacagc aataacaact cgtgcaaccg caaggcccac    1080
ctggagtata cccacctcct ccgtatgcag gccgacaagg ccgagattgt gcgtgcccgg    1140
accgagtggc agtccaagtc gaaccgcaag accatc                              1176
<210> 43
<211> 1257
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая пальмитоил: ацилпереносящий белок-тиоэстеразу Ricinus communis
<400> 43
atggtcgcca ccgccgccgc cgctaccagc tcgttcttcc ccgtcccgtc ccagtctgcc      60
gacgccaatt ttgataaggc gccggcctcg ctggggggca tcaagctcaa gtccacgtcg     120
tgcagtcgtg gcctccaggt caaggcgaat gcgcaggcgc ctccgaagat caacggctcc     180
tcggtgggtt tcacgaccag cgtggagaca gtgaagaatg acggcgacat gccgctgccg     240
ccgcctcccc gcacgttcat caaccagctg cccgattggt ccatgctcct ggcggccatc     300
accaccatct tcctggctgc ggagaagcag tggatgatgc tggactggaa gccccggcgc     360
ccggacatgt tgatcgaccc gttcggcatc ggccggattg tccaggacgg cctcatcttc     420
cgccagaatt tctccatccg ttcctatgag atcggcgcgg atcgcacggc ctcgatcgag     480
actctcatga accatctcca ggaaacggcg ctcaaccatg tgaaaaccgc cggtctgctc     540
ggcgatggct tcggctcgac cccggagatg agcaagcgca atctcatttg ggtggtgacc     600
cgcatgcaag ttctggtcga ccgctacccg acctggggcg acgtcgtcca ggtcgacacg     660
tgggtcagca aatcgggcaa gaacggaatg cgtcgcgatt ggtgcgtgcg cgactcgcgc     720
accggcgaaa cgctgacgcg tgcgagctcg gtgtgggtca tgatgaacaa gctcacccgc     780
cgcctctcga agatccccga ggaagtccgc ggagagatcg agccgtactt cctcaatagc     840
gacccgatcg tcgacgaaga ttcgcgcaag ctgccgaagc tggacgactc gaacgccgac     900
tacgtccgca agggcctcac gccccgctgg tcggatctgg acatcaacca gcacgtcaat     960
aatgtcaagt atatcggctg gatcctggag tccgcgccgc ttcccatcct cgaatcgcat    1020
gagctgtcgg cgatcaccct ggagtatcgg cgtgagtgcg gcagggacag cgtcctgcag    1080
tcgctgaccg ccgtgtcggg caacggcatc ggcaacctcg gcaatgccgg cgacatcgag    1140
tgccagcacc tcctgcgcct cgaagatggc gcggagattg tgcgcggacg cacggagtgg    1200
cgccccaagt attcgtcgaa cttcggcatc atgggccaga tcccggtcga gagcgcg       1257
<210> 44
<211> 1215
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая ацил: АЦП-тиоэстеразу Jatropha curcas
<400> 44
atggccgttt tcacctaccg catcgctatg ctccccatcc gctgcagctc gtctaactcc      60
accaattccc atagccacga cccgaaccag cagaacctcc acaagatcaa gatcaatggc     120
tcggcgagcg cgatgatgcc gctgaaggtc gatctgccct cctcgctcac gatcacgtcg     180
gtcgcccccg tcgtggagaa cctctcgctg acgaaggaac aaactcggca gaatattccc     240
accaagaagc agtatatcga cccgcatcgc cagggcctga tcgtcgagga gggcgtgggc     300
taccgccaga cggtcgtgat ccggtcgtat gaggtcggac cggacaagac ggcgaccctg     360
gagatcattt tgtgcctcct gcaggaaacg gcgctgaacc atgtctggct gtccggtctg     420
ctctcgaatg gcttcggcgc cacccacggc atggtccgca acaatctcat ttgggtggtg     480
tcgaagctcc aggtccaggt cgatcagtat cccatctggg gcgaggtcgt ggagatcgac     540
acgtgggtcg gcgcctcggg taagaacgga atgcgtcgcg actggctcgt ccgcagccag     600
gcgacgggcc aggttttcgc ccgcgcgacc agtacgtggg tcatgatgaa tgagaaaaca     660
cgccgcctca gcaagatgcc ggaagaagtc cgcgcggaga tcgccccgtg gttcatcgag     720
aaacaggcca tcaaagagga agtgccggag aagatcgcga agctcgacga taaggcccgc     780
tatgtggtga cgaacctgaa gcccaagcgc tccgacctgg acatgaacca gcatgtcaat     840
aacgtcaagt acgtgcgctg gatgctggaa accctcccgg atcagttctt cgagaatcat     900
cagttgtcgg gcatcaccct ggagtacaag cgtgagtgcg gctcgtcgga catcgtcgag     960
agcctgtgcg agcccgatga agaggagggc atcatcaaca ccggcctcaa gcagaacaac    1020
gacaagtcgc tgttcaatgg cttcagcctc ccgtcggaga tcatggaggg caacgggttc    1080
ctgtcgtcgc tggaaaagac cccgctcaag tatacccacc ttctcgtcgc gaagggcaag    1140
acccagtccg aggagatcgt gcgtggcaag accatctgga agaaaaagct cctcaccacc    1200
atgcctttct cgccg                                                     1215
<210> 45
<211> 1044
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая ацил: АЦП-тиоэстеразу Jatropha curcas
<400> 45
atggtttcca ccgccatctc tttctcgctc ctgcccatca agctcatcaa agaagaaact      60
cgcatggcct ccgcggaccg ccgcaagaac agcatcgtga aggagttcgg ccacttcacg     120
tgccgctgcg ccgcgatcga gaagcgcatc cagaagctga acaatttcct gattgacggc     180
ggcttcggct cgcttgagca gaatggcctc atctaccgcc agaatatctt catccggtcc     240
ttcgagatcg gcttcgaccg taagctgagc ctcgccgccc tcacgaattt cctccaggac     300
acggcgctga accatgtccg tatgattgga ctgctcgcgg ctggcttcgg gtccaccccg     360
gagatgtcga agaaagacct gatctgggtg ctctgcaccc tgcagatcct ggtcgaccgc     420
catccctcgt ggctcgacgc ggtcgaggtc gatacctgga tgtacccctc cggccaaaac     480
ggccagggcc gtgactggct ggtgcgggat gccaagacgg gcaagccgct ggcccaggcg     540
tcgagcgtga tggtcttgct caataagaaa acccgcaagc tcagcaagtt caccgaagag     600
atccgcgatg agatcgctcc gcacatgatg atggactgca atcccatcat taactcgcgc     660
aagatgctgc cgttcgacgt caacaccgcg gactatgcgc gcacgggcct cacgccgggt     720
tggaacgacc tcgatctcaa tcagcatgtc aaccacgtgc agtatatcaa ctggatcctc     780
cagaatgtgc tccgctcgct catccagcac cataagctgt cggacatcac cctggagtac     840
cgcaaggaat gcgatatcaa ctcgatcctg cagttcctct cgaagatcgt caagaacggc     900
tcgaaccact cgaccgacac caataacctg atcgagctgg atcattcgct gctcctggag     960
aatggcagcg agatcgcgcg cgccaacacc atctggaagc cgcgcgaggt caataacttc    1020
aagaacgccg tctatacgcc tgcg                                           1044
<210> 46
<211> 1071
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая ацил: АЦП-тиоэстеразу Jatropha curcas
<400> 46
atggcctcga ctgcgatctc cttcctctct atccccatta agcttatcaa agaagaaatg      60
cgcatggcgt ccgcgggccg ccgcaagaac accatcgcgg ccgagttcgg ccatttcacg     120
ttcggatccg cgaccgtcga gaagaaggtc cagaagtcga ataacttcct catcgacggc     180
ggcttcggct ccctggagca gaacgggctc atctaccgcc agaacatctt cgtgcgctcg     240
ttcgagattg gcttcgatcg gaagctgagc ctggcggctc tgaccaactt cctccaggac     300
acggcgctca atcattgccg catgatcggc ctgctcgccg agggcttcgg ctcgacgccg     360
gagatgatta agaaagatct catctgggtt ctgtgcacgc tgcagatcct ggtggatggc     420
tatccgtcgt ggctcgacgt ggtcgaggtc gatacgtgga tgtacccgag cggtcagaat     480
ggcctcggcc gtggctggct ggtccgcgac ggcaagacgg gtcgcagcct ggcccagtcg     540
agcagtgtga tggtgtcgtt caacaaaaag acccggaagc tctcgaagct ggccaaggaa     600
atcagggacg agatcgcccc tcacatgatg gactgcgacc cgatcatgaa caagaactcg     660
cgcaagatct tgcccttcga cgtcaacacc gcggattatg cccgcaccgg cctcaccccc     720
ggatggaatg agctggacct gaatcagcat gtcaatcacg tgcagtacat caattggatc     780
ctccagaacg tccgcccgtc cctcgtccaa caccataagc tctcggcgat cacgctggag     840
tatcgcaaag agtgcgacat gaattcgatc ctccagtcgc tcagccgcat cgtcaagaac     900
ggcggcaacg atagcaccga caagaacaac gtcatcgagc tggaccactt cctgctcctg     960
gagaacggct cggagatcgc ccgtgccaat accatctgga agccgcgtga ggtgaacaac    1020
ttcaagaatg tcgtgcatag ccccgccgaa gagaatatct cctcgatgaa t             1071
<210> 47
<211> 396
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность FadM E. coli
<400> 47
atgcagaccc agatcaaagt gcgcggatat catctcgacg tttatcaaca tgtcaacaat      60
gctcgttacc tggagttctt ggaagaagcc cggtgggacg gcctggagaa ctcggactcg     120
ttccagtgga tgaccgcgca caacatcgcc ttcgtcgtcg tgaatatcaa catcaattac     180
cgccgcccgg cggtgctgtc ggatctgctc acgatcacgt cccagctcca gcagctcaac     240
ggcaagtcgg gcatcctcag ccaggtcatt acgctggagc ccgagggcca ggtcgtcgcg     300
gatgccctga tcaccttcgt ctgcatcgac ctcaagaccc agaaagccct cgcgctggaa     360
ggcgagctcc gcgagaagct ggagcagatg gtgaag                               396
<210> 48
<211> 957
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность AccA E. coli
<400> 48
atgtccctca atttcctcga cttcgaacaa cccatcgccg agctggaagc caagatcgat      60
tcgctcaccg ctgttagccg ccaggacgag aagctcgaca tcaacatcga cgaggaagtg     120
catcgcctcc gcgagaagtc cgtcgagctg acgcgcaaga tcttcgccga cctgggcgcc     180
tggcagatcg cccagctcgc gcgccacccg cagcgcccgt atacgctgga ttatgtgcgc     240
cttgccttcg acgagttcga cgagctggcc ggcgaccggg cgtatgcgga cgataaggcc     300
atcgtgggcg gcatcgcgag gctggacgga cgcccggtca tgatcatcgg ccatcagaaa     360
ggccgcgaaa cgaaggaaaa gattcgccgc aacttcggca tgccggcccc cgagggctac     420
cgcaaggccc tgcgcctcat gcagatggcg gagcgtttca agatgccgat cattaccttc     480
atcgacaccc ccggcgcgta tccgggggtg ggtgccgagg aacggggcca gagcgaggcg     540
atcgctcgca acctccgcga gatgtcccgt ctgggcgtgc cggtcgtctg cacggtcatc     600
ggcgagggcg gctcgggtgg cgccctcgcg atcggcgtcg gcgacaaggt caatatgctc     660
cagtactcga cctatagcgt catctcgccc gagggctgcg cctcgatcct gtggaagtcg     720
gcggacaagg ccccgttggc ggctgaggcg atgggcatca tcgcccctcg cctcaaagaa     780
ctgaagctga tcgactcgat catcccggag ccgctgggcg gagcgcaccg taaccccgag     840
gccatggcgg ccagcctgaa ggcgcagctc ctcgcggatc tcgccgatct ggacgtcctc     900
tcgaccgagg atctgaagaa tcgccggtac cagcgcctga tgtcctacgg ctatgcg        957
<210> 49
<211> 468
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность AccB E. coli
<400> 49
atggacattc ggaagatcaa gaaactcatc gaactcgtgg aagagagcgg aatctcggag      60
ctggaaatta gcgagggcga ggaatccgtc cgcatctccc gtgccgcccc cgcggcctcg     120
ttcccggtga tgcagcaagc ctacgcggct ccgatgatgc agcagccggc gcagtcgaac     180
gcggctgcgc cggcgacggt cccctcgatg gaagcccctg ccgcggcgga gatctcgggc     240
cacatcgtgc gctcccccat ggtcggcacc ttctatcgca cgccgtcgcc ggacgcgaag     300
gccttcatcg aggtcggtca gaaagtgaat gtcggcgata ccctctgcat cgtcgaggcc     360
atgaagatga tgaaccagat cgaggccgat aagagcggca ccgtcaaggc catcctggtc     420
gagtcgggcc agcccgtgga gttcgacgag ccgctggttg tcatcgag                  468
<210> 50
<211> 1347
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность AccC E. coli
<400> 50
atgcttgaca agatcgtgat cgccaatcgt ggagaaattg ctttgagaat cctgcgcgcc      60
tgcaaagaac tcggaatcaa gaccgtcgcg gtgcattcct cggccgaccg cgacctcaaa     120
cacgtcctgc tggcggatga aacggtctgc ataggccctg cgccgtcggt gaagtcgtac     180
ctcaacatcc cggccatcat ctctgccgcg gagatcaccg gcgccgtcgc catccacccc     240
ggctatggct tcctgtcgga gaatgcgaac ttcgcggaac aggttgagag gtcgggcttc     300
attttcatcg gccccaaggc cgaaaccatc cgcctgatgg gcgacaaggt gagcgcgatc     360
gcggcgatga agaaagcggg cgtgccctgc gtccccggca gcgacggccc tctcggcgac     420
gacatggata agaaccgcgc gattgcgaag cgcattggct atccggtgat catcaaggcc     480
tccggcggtg gtggcgggcg cggcatgcgg gtcgtgcgcg gcgacgcgga gctcgcccag     540
tcgatctcga tgactcgcgc cgaggccaag gctgccttct cgaacgatat ggtctatatg     600
gagaagtatc tggagaatcc gcggcacgtc gagatccagg tgctcgcgga cggccagggt     660
aatgccatct acctcgccga gcgcgattgc tccatgcagc gccgtcatca gaaggtcgtc     720
gaggaagcgc cggcccccgg catcaccccg gagctgcgtc gctatatcgg cgagcgctgc     780
gcgaaggcct gcgtggacat cggctatcgc ggcgccggca cgttcgagtt cctcttcgag     840
aacggggagt tctacttcat cgagatgaac acccgcatcc aggtcgagca tcccgtgacc     900
gagatgatca cgggcgtgga cctgatcaag gaacagctcc gcatcgcggc tggtcagccg     960
ctctcgatca agcaagagga ggtccacgtc cgtggccacg cggtcgagtg ccgcatcaac    1020
gccgaggatc cgaacacgtt cctgccgtcg ccgggaaaga tcacgcgctt ccatgccccc    1080
ggcggcttcg gcgtccgctg ggagagccat atctatgccg gatatacggt cccgccgtat    1140
tacgattcca tgatcggcaa gctgatctgc tatggcgaga atcgggacgt cgccatcgcg    1200
cgcatgaaga acgctctcca agagctcatc atcgacggca tcaagaccaa tgtcgatctg    1260
cagattcgca tcatgaacga cgagaacttc cagcacggcg gcaccaatat ccattacctg    1320
gagaagaagc tgggcctcca ggagaag                                        1347
<210> 51
<211> 912
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность AccD E. coli
<400> 51
atgtcgtgga tcgagcgtat caagagcaat attaccccca cacggaaggc gagcatcccg      60
gaaggcgtct ggactaagtg cgacagctgc ggccaggtcc tctatcgtgc cgagctggag     120
cgcaatctgg aagtgtgccc gaagtgcgac catcacatgc gcatgaccgc tcgcaaccgc     180
ctgcattccc tcctggatga aggctcgctc gtcgagctgg gctcggagct ggagcccaag     240
gacgtcctga agttccgcga ttccaagaag tataaggacc gcctggcgtc ggcgcagaaa     300
gaaaccggcg agaaagacgc cctcgtcgtc atgaagggca ccctgtatgg catgccggtc     360
gttgccgcgg cgttcgagtt cgcgttcatg ggcggctcga tggggtcggt ggtcggcgcc     420
cgcttcgtcc gggcggtgga gcaggcgctt gaggacaact gcccgctgat ctgcttctcg     480
gcgagcggtg gtgcgcgcat gcaagaagcg ctcatgtccc tcatgcagat ggccaagacg     540
agtgccgctt tggccaagat gcaggaacgt ggcctcccct acatctcggt cctcacggac     600
ccgacgatgg gcggagtgtc cgcgtcgttc gcgatgctcg gcgatctcaa catcgccgag     660
ccgaaggccc tgatcggctt cgccggcccg cgcgtgatcg agcagaccgt gcgcgagaag     720
ctcccgcccg gcttccagcg ctcggagttc ctcatcgaga aaggcgcgat cgacatgatc     780
gtccgccgcc cggagatgcg cctgaagctc gcctcgatcc tggccaagct catgaatctg     840
ccggctccga accccgaggc cccgcgcgag ggagtcgtgg tgcctccggt ccccgaccaa     900
gagcccgagg cg                                                         912
<210> 52
<211> 1749
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность мутированного FadD Methylobacterium extorquens
<400> 52
atggcgtagg accggagcgc ggagcgtcct tggctggccg cctatccccc cggcattccc      60
gccgatatcg acgtcgattc cgtcggcacg gtggtcgatc tgttcgaccg cagcgtgctg     120
cgcttcgcct agcgcccggc gatcacctgc ttcggcgcgc agcctgcgct accgcgaggt     180
cggcgccgcg gcgcaggcgg tggcggcgtg gctcgcccgc caacggctac ggcaaggccg     240
gcaagggaag tgagaacggc agcgagacgg gtgtggacgg catcggcgac cgcatcgcgg     300
tgatgatgcc caacgtcccg gcctgtcccg tctcgctgct cggcgtgctg gtggcgggct     360
gcaccgtcgt caacgtcaac ccgctctaca ccccgcgcga actcgccgcg cagatcaacg     420
attccggcgc ccgcgtcctc ttcgtgctgg agaacttctg ccacacggtc gcgcaggcgc     480
tgccgcagat gccgagcctg gagcggatcg tcgtggcagg ccccggcgac ctgctcgggc     540
tgaagggacg gatcgtcgat ctcgtctcgc ggcgggtgaa gcgggcggtg ccgccctaca     600
ccctgccggc cgggcggacc ctgcggttcg aggcggtggt gcgggcgggc cgcggcctca     660
agcgcccctc ggtcgcgatc gatcccggcg acgtcgcctt cctgcaatat accggcggca     720
ccaccggcat cgccaaggcg gcgatgctga cccaccgcaa catcatggcc aatgtcgagc     780
agagccgggc gtggttccgc ggcccggcgg gggaggggga cggacatgtg gcggtgacgg     840
cgctgccgct ctaccacatc ttcgcgctga cggcctgctt cctgttcttc ttccggctcg     900
gcggctgctg cctgctgatc ccgaacccgc gcgatctcga cggcttcgtg aagacgctca     960
gccgcacccg cttcaccaac ttcgccgggg tgaacacgct gttcaacgcg ctgaacaacc    1020
acccgaagat cggcacggtc gatttctcaa acgtggagta cgtggtcggc ggcggcatgg    1080
cggtgcagtc ggcggtggcc gcccgctgga aggcgatcac cggccagacc atcctcgaag    1140
gctacggcct gtcggagacc tcgccggtgg tgagcgtcaa cccgctcggg ctcgccaact    1200
ggaccgggac gattggttat ccgctgccct cgaccgaggt gacgatccgc gccgaggacg    1260
gcacggtgct gcccttcggc gtgcccggcg aactctgcgt gcgcgggccc caggtgatgg    1320
ccggctattg gaaccgcccg gaggagacgc gggcggcgat gaccgccgac ggcttcttcc    1380
gcaccggcga cgtggcggtg atgacgccgg acgggcagat ccgcatcgtc gaccggatga    1440
aggacatgat cctcgtctcc ggcttcaacg tctacccgaa cgaggtcgag gacgtgctcg    1500
ccacccatcc ggcggtggtc gaatgcgccg tggtcggcgc gccctgcggc gagagcggcg    1560
agatggtcgt cgcccatgtc gtcctgcgcg atccctctgt ggagccggac gcgctcaggg    1620
cgcatgcccg cgcgagcctc accggctaca aggtgccccg ccggatcgtg atccaggaca    1680
gcctgccgaa gaccaatgtc ggcaaggtgc tgcgccgggc cctgcgggac agcgggccgg    1740
cggcggtaa                                                            1749
<210> 53
<211> 927
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность FabD E. coli
<400> 53
atgactcaat tcgccttcgt tttccccgga caaggatcgc agaccgttgg aatgctcgct      60
gatatggccg cctcctatcc catcgtcgag gaaaccttcg ccgaggcgag cgcggctctc     120
ggctatgatc tctgggccct gacccagcaa ggcccggccg aagagttgaa caagacctgg     180
cagacccagc cggccctgct gaccgcctcg gtggccctct atcgcgtgtg gcagcagcag     240
ggcggcaagg cgccggcgat gatggccggc cacagcctcg gcgagtactc ggcgcttgtc     300
tgcgcgggcg tcatcgactt cgcggacgcc gtccgcctgg tggagatgcg cggcaagttc     360
atgcaggaag ccgtcccgga aggcacgggc gcgatggcgg cgatcattgg cctcgacgac     420
gcctcgatcg cgaaggcgtg cgaagaagcg gccgagggcc aggtcgtgtc cccggtcaac     480
ttcaactcgc cgggtcaggt cgtgatcgcc ggccataaag aagcggtcga gcgcgccggc     540
gctgcctgca aagccgccgg cgcgaagcgg gccctgcccc tgccggtgag cgtgccgtcc     600
cactgcgcgc tgatgaagcc cgcggcggat aagctggccg tggagctcgc taagatcacg     660
ttcaacgcgc ctacggtccc ggtcgtcaat aatgtcgacg tgaagtgcga aacgaatggt     720
gatgcgatcc gcgacgccct cgtgcgccag ctgtacaacc ccgtccagtg gaccaagtcc     780
gtggagtaca tggccgccca gggcgtcgag catctgtatg aggtcgggcc gggcaaggtc     840
ctcaccggcc tgaccaagcg tatcgtggac acgctcacgg cgtcggcgct caatgagccg     900
tcggccatgg cggcggccct ggagctg                                         927
<210> 54
<211> 549
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность TesA E. coli с удаленной последовательностью нацеливания на периплазму
<400> 54
atggctgata ccctcctgat ccttggcgac tccctctctg ctggttatcg tatgtccgcg      60
tccgctgcct ggcctgcgct gctcaacgat aagtggcaga gcaagacgag cgtcgtgaac     120
gcgagcatct cgggcgatac ctcgcagcag ggactggccc ggctccccgc cctcctcaag     180
cagcatcagc cccgctgggt gttggtcgag ctgggcggca acgacggcct gcgcggcttc     240
cagccgcagc agacggagca gaccctgcgc cagatcctcc aagacgtcaa ggccgccaat     300
gccgagccgc tgctgatgca gatccgcctg ccggcgaact acggccgccg ctataatgaa     360
gcgttctcgg ccatctatcc caagctcgcg aaagagttcg acgtccccct cctgccgttc     420
ttcatggaag aagtgtacct gaagccgcag tggatgcaag acgacggcat tcatcccaat     480
cgcgacgcgc agccgttcat cgccgattgg atggcgaaac agctccagcc gctcgtcaac     540
cacgactcg                                                             549
<210> 55
<211> 1146
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая тиоэстеразу Cinnamomum camphorum
<400> 55
atggccacaa cttcactcgc ttccgctttt tgttctatga aagccgttat gcttgcccga      60
gatggtagag gaatgaagcc gcgctccagc gatctccagc tgcgtgcggg caacgcgcag     120
acgtcgctga agatgattaa tggcacgaag ttctcgtaca ccgagtcgct caaaaagctc     180
ccggactggt cgatgctgtt cgccgtcatc accaccatct tctcggccgc ggagaagcag     240
tggaccaacc tggagtggaa gccgaagccg aatcccccgc agctcctcga cgatcacttc     300
ggcccgcatg gcctggtgtt ccgccgtact ttcgccatcc gctcgtatga agtgggcccc     360
gataggtcga cctcgatcgt cgcggtcatg aaccatctcc aagaagcggc gctgaaccac     420
gccaagtccg tgggcatact cggcgatgga ttcggaacca cgctggagat gtccaagcgc     480
gacctgatct gggtggtcaa gcggacccat gtcgccgtgg agcgctatcc cgcgtggggg     540
gacacggtcg aggtcgagtg ctgggtgggc gcgtcgggaa acaatggccg ccgccacgac     600
ttcctggttc gcgattgcaa gaccggcgag atcctgaccc gctgcacgtc gctgagtgtc     660
atgatgaata cgcgcacccg tcgcctcagc aagatccccg aagaggtccg gggcgagatc     720
ggcccggcgt tcatcgacaa tgtcgcggtc aaggacgaag agatcaaaaa gccgcagaag     780
ctcaatgaca gcaccgcgga ctatatccag ggtggcctca cgccccgttg gaacgacctg     840
gatatcaatc agcatgtcaa caacatcaag tatgtggatt ggatcctgga aaccgtcccg     900
gactcgatct tcgagagcca ccacatctcc tcgttcacca tcgagtaccg ccgcgaatgc     960
accatggaca gcgtcctcca gtccctgacc acggtgtcgg gcggcagcag cgaggccggc    1020
ttggtgtgcg agcatctcct gcagctggag ggcggctccg aggtcctccg cgccaagacg    1080
gagtggcgcc ctaagctgac cgactcgttc cgcggcatct cggtgattcc cgccgagtcg    1140
tcggtc                                                               1146
<210> 56
<211> 1146
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая тиоэстеразу Umbellularia californica
<400> 56
atggccacta ctagtctcgc ttcagccttt tgttctatga aagccgttat gctcgctcgc      60
gatggacgcg gaatgaagcc gcgttcctcc gatctgcagc tcagggccgg aaatgcgccg     120
acgtcgctca agatgatcaa cggcacgaag ttctcgtaca cggaaagcct gaagcggctc     180
cccgactggt cgatgctgtt cgccgtgatc acgaccatct tctcggccgc ggagaagcag     240
tggaccaatc tggagtggaa gccgaagccc aagctccccc agctcctcga cgaccacttc     300
ggcctgcatg gcctggtgtt ccgccgcacg ttcgcgatcc gctcctatga ggtcggcccg     360
gatcgctcga ccagcatcct ggcggtcatg aaccacatgc aggaagcgac cctgaaccat     420
gccaaaagcg ttggcatcct cggcgacggc ttcggcacca cgttggaaat gtcgaagcgc     480
gacctgatgt gggtcgtccg ccggacgcac gtcgcggtgg agcgttaccc gacctggggc     540
gacaccgtcg aggtcgagtg ctggatcggc gcgtcgggca ataacggcat gcgccgggac     600
ttcctcgtcc gggactgcaa gaccggcgag atcctcaccc gctgcacgag cctcagcgtc     660
ctgatgaata cccgcacgcg gcgcctgtcc accatcccgg acgaagtccg cggcgagatt     720
ggccccgcct tcatcgataa cgtcgctgtc aaagatgacg agatcaagaa gctccagaag     780
ctgaacgact cgaccgcgga ttatattcag ggtgggctga cccctcgctg gaacgatctc     840
gacgtcaacc agcatgtgaa caatctgaag tatgtcgcct gggtgttcga aacggtcccg     900
gattcgattt tcgagtcgca ccatatcagc tcgttcaccc tggagtatcg ccgcgagtgc     960
acgcgcgact cggtcctccg tagcctgacc accgtgagcg gcggttcgtc cgaagccggg    1020
ctggtctgcg atcacctcct ccagctggag ggcggctccg aggtgctgcg cgcgcgcacc    1080
gagtggcgcc ccaagctgac ggacagcttc cgtggcatct cggtgatccc cgccgagccg    1140
cgcgtg                                                               1146
<210> 57
<211> 750
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая ацил-АЦП-тиоэстеразу Streptococcus pyogenes
<400> 57
atgggcctct cgtaccaaga agaactcacc ctgcctttcg agctctgcga cgttaaatcg      60
gacatcaagc tgccgttgct gctggactac tgcctgatgg tgtcgggccg tcagtccgtc     120
cagctcggcc ggtcgaacaa caacctcctc gtggactaca agctcgtgtg gatcgtgacc     180
gattatgaga tcaccattca ccgcctgccc catttccagg aaacgatcac catcgaaacc     240
aaggctctct cgtacaataa gttcttctgc taccgccagt tctatatcta tgaccaggag     300
ggatgcctgc tcgtcgacat cctgagctat ttcgccctgc tcaatccgga cacccgcaag     360
gtcgcgacga tccccgagga tctcgtcgcg ccgttcgaga ctgatttcgt caaaaagctg     420
catcgcgtgc ccaagatgcc gctcctggag cagtcgatcg atcgcgacta ttatgtccgt     480
tatttcgaca tcgatatgaa tggccacgtc aacaactcga agtatctcga ctggatgtat     540
gacgtcctgg gctgccagtt cctcaagacg caccagccgc tgaagatgac gctgaagtac     600
gtgaaggaag tcagcccggg cggccagatc acctccagct atcatctgga ccagctcacg     660
tcgtatcatc agatcatctc cgatggtcag ctcaacgcgc aggccatgat cgagtggcgc     720
gccattaagc agaccgagtc ggagacagac                                      750
<210> 58
<211> 1191
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая пальмитоил: ацилпереносящий белок-тиоэстеразу Ricinus communis
<400> 58
atgggcactt gctcctatac catcaccctc cccatccgct gcctcagcaa cagtaacggc      60
caccacgacc cgcataagca gaacctgaat aagattaaga tcaatggggc ctcgacctcc     120
acccgccctc tcaagctgga tgccccgtcg cagaccgtcg gcgtcgcgac catctatctg     180
gcctcggttt cggagaatct gacgctcacg aaagaggtga tgcggcagaa catccccacg     240
aagaagcagt acatcgatcc gcatcgccag ggcctgatga tcgagggcgg agtgggctac     300
cgtcagacca tcgtgatccg cagctatgag gtcggaccgg acaagacggc gaccctggag     360
agcatcctgt atctcctcca ggaaacggcc ctgaaccatg tctggctttc gggcctcctc     420
tcgaacggct tcggcgcgac acatggcatg gtcaagaata atctgatctg ggtcgtgtcc     480
aagctccagg tccaggtcga ccattatccc atctggggcg aggtcgtcga gattgacacg     540
tgggtccgcg cgtcgggcaa gaacggcatg aagcgcgact ggctgattcg cagccaggcg     600
acgggccacg tgttcgtccg cgcgacctct acgtgggtca tgatgaacga aaagacccgc     660
cgcctctcga agatgcccga agaggtgcgc gctgagatct cgccgtggtt catcgagaag     720
caagccatca aggaagaggt gccggacaag atcgcgaagc tggatgataa ggcccgctat     780
gtcatcagca acctcaagcc gaagcgttcg gacctggata tgaaccacca tgtgaataac     840
gtgaaatatg tgcgctggat gctggagatc ctgccggacc acttcctgga gtcgcaccag     900
ctgtcgggca tcacgatgga gtaccgtcgg gagtgcggct cggcggacat cgtccagtcc     960
ctgtgcgagc ccgacggcga tgagatcttg tcgaatgaca tcccggtcct caatggtttc    1020
agcctcgcct cggagcccct gatggaaggc aacggcttcc tcgtcccgct cgacaaggtc    1080
cccctcaagt acacgcatct gctcctcacc aagggcgagt cccagaacga agagatcgtg    1140
cgcggtaaga ccatctggaa gaagaaactg tgcacgatgc cgttctccac c             1191
<210> 59
<211> 1176
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая пальмитоил: ацилпереносящий белок-тиоэстеразу Ricinus communis
<400> 59
atggcctcca aaggtagcat ccgcctctat ttcccctgcg atttccggaa caccctccag      60
aagaagaaca tgaagatgga catggtcatg gcccgcagcg gcttctcgta ttcgctcaat     120
ccgatcgccc cgaagatccc ccgcttctat gtcgtcgcca atgcgtcgaa cccgcagcgc     180
gtcgacacga tcaacggcaa gaaagtgaac ggaatccacg tggcggagag ctccaactcg     240
tacgccgacc agaacaagat gaatgccaca gcggggctgg tcctggacgg caacgtggat     300
caccagcccc tccataagtg gctcctcggc cgtttcgtgg acgagcgcct cgtctattcg     360
cagacgttca tcatccgctc ctatgagatc ggaccggata agaccgccac tatggaaacg     420
ctgatgaatc tcctgcagga aaccgcgctc aatcacgtga cgagctcggg cctcgcgggc     480
gatggcttcg gcgcgacccg cgagatgagc ctccgcaagc tcatctgggt cgtgacccgc     540
atccatattc aggttcagcg ctattcgtgc tggggcgacg tggtcgagat cgacacgtgg     600
gtggacggcg ctggcaagaa cggcatgcgt cgcgattgga ttatccgcga ctacaatacc     660
aaggagatca tcacccgtgc gacgtccacg tgggtcatca tgaacaggga aacccggaag     720
ctgtccaaga tgccggagca agtccgccag gaactggtcc ccttctacac caatcgcatc     780
gcgattgcga aagagaacaa cgacgtcgag aagatcgaca agctgaccga cgaaacggcg     840
gagcgcatcc gctcgggcct ggcccctcgc tggtcggata tggacgcgaa ccagcacgtg     900
aacaatgtca agtacatcgg ctggatcctg gagtcggtcc cgatcaacgt ccttgaggat     960
tacaatctca cgtcgatgac cctggagtac cgtcgtgagt gccgccagtc taacctgttg    1020
gagtcgctga cctcgaccac cgagcatagt aataacaatt cgtgcaaccg gaaggcccat    1080
ctggagtata cccatctgct ccgcatgcag gccgacaagg ccgagatcgt ccgcgctcgc    1140
acggagtggc agtccaagag caatcgcaag accatc                              1176
<210> 60
<211> 1257
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая пальмитоил: ацилпереносящий белок-тиоэстеразу Ricinus communis
<400> 60
atggtcgcta ccgccgccgc tgccacctcc tccttcttcc ccgtcccgtc ccagtcagcc      60
gatgcgaatt tcgataaggc gcctgcctcg ctcggcggca tcaagctcaa gtcgacgagc     120
tgctcgcgcg gcctccaggt caaggcgaac gcgcaggccc ctccgaagat caatggcagc     180
tcggtgggct tcacgactag cgtggaaacc gtcaagaatg atggcgacat gccgctgccg     240
ccgccgcccc gcacgttcat caaccagctg ccggactggt ccatgctcct cgccgcgatc     300
acgaccatct tccttgcggc ggagaagcag tggatgatgc tggactggaa gccgcgccgc     360
cccgacatgc tgatcgatcc cttcggcatc ggccgcatcg tgcaggacgg cctcattttc     420
cgccagaact tctcgatccg ctcctatgag attggcgcgg atcgcaccgc gtcgatcgag     480
acactcatga atcatctcca ggaaaccgcg ctcaaccatg tcaagacggc cggcctgctg     540
ggcgatggat tcggcagcac cccggagatg tcgaagcgga acctgatctg ggtcgtgacg     600
cgcatgcaag ttttggtcga ccgctacccc acctggggtg acgtcgtcca ggtcgacacc     660
tgggtgtcca agtccggcaa aaatggcatg cgccgcgact ggtgcgtccg cgactcgcgc     720
acgggagaaa cgctgacccg tgcgagctcg gtctgggtga tgatgaacaa gctcacccgg     780
cgtctgtcga agatcccgga agaggtcagg ggcgagatcg agccctactt cctcaactcg     840
gacccgatcg tggatgagga cagtcgtaag ctcccgaaac tggacgactc gaacgcggac     900
tatgtccgca agggcctcac gccgcgctgg tctgacctgg acatcaacca gcacgtgaac     960
aatgtcaagt acatcggctg gatcctggag tcggccccgc tccccatcct ggagtcgcac    1020
gagctgagcg ccattaccct ggagtatcgg cgcgagtgcg gccgcgacag cgtgctgcag    1080
tcgctgaccg ccgtcagcgg caacggcatc ggcaacctcg gcaatgcggg cgacatcgag    1140
tgccagcatc tcctccgtct ggaagatggg gccgagatcg tccgcggtcg taccgagtgg    1200
cgcccgaagt attcgtccaa cttcggcatc atggggcaga tcccggtcga gtcggcc       1257
<210> 61
<211> 1215
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая ацил: АЦП-тиоэстеразу Jatropha curcas
<400> 61
atggccgtgt tcacctatcg tatcgccatg ctccctatcc gctgctcctc ctcgaatagc      60
accaactcgc atagccacga tccgaaccag cagaatctcc acaagatcaa gattaacggc     120
tcggcgtccg ccatgatgcc gctcaaggtc gatctgccga gctcgctcac gatcacctcc     180
gtggcgcccg tggtggagaa tctcagcctc acgaaagagc agacccgcca gaacatcccg     240
acgaagaagc aatacatcga cccccatcgc cagggcctga tcgtcgagga gggcgtgggc     300
tatcggcaga ccgtcgtgat ccgctcgtat gaagtcggac cggataagac cgctaccctt     360
gagatcatcc tctgcctcct gcaggaaact gcgctcaacc atgtgtggct gtccggcctc     420
ctgtcgaatg gcttcggcgc cacccacggc atggtccgca acaacctcat ttgggtcgtc     480
agcaagctcc aggtccaggt cgatcagtat ccgatctggg gtgaggtcgt cgagatcgac     540
acgtgggtcg gcgcctcggg caagaacggc atgcgccgcg actggctggt ccgctcgcag     600
gccacgggcc aggtgttcgc gcgcgccacc tcgacctggg tcatgatgaa cgagaaaacc     660
cgtcggctga gcaagatgcc ggaagaagtc cgcgcggaga tcgcgccctg gttcatcgag     720
aagcaggcga tcaaagaaga ggtgcccgag aagatcgcca agctcgacga caaggcccgt     780
tacgtcgtca ccaatttgaa gccgaagcgc tccgacctgg acatgaacca gcacgtgaat     840
aacgtgaagt acgtccgctg gatgctggaa accctgccgg accagttctt cgagaatcac     900
cagctctcgg gaatcacgct ggagtacaag cgcgagtgcg gctcgtcgga catcgtcgag     960
tctctgtgcg agccggatga agaagagggc atcatcaata ccgggctcaa gcaaaacaac    1020
gacaagtcgc tgttcaatgg cttcagtctc ccctccgaga tcatggaagg caacggtttc    1080
ctgtcgtcgc tggagaaaac cccgctcaag tatacgcatc tgctcgttgc gaagggcaag    1140
acgcagtcgg aagagatcgt gcgcggcaag accatttgga agaaaaagct gctcacgacg    1200
atgccgttct cgccc                                                     1215
<210> 62
<211> 1044
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая ацил: АЦП-тиоэстеразу Jatropha curcas
<400> 62
atggtcagca ccgcgatctc cttctccctc ctcccgatca agctcattaa agaagaaacc      60
cgcatggcct cggcggaccg ccgcaagaac agtatcgtga aggaattcgg ccatttcacg     120
tgccgctgcg ctgccatcga gaagcggatc cagaagctca acaacttcct gatcgacggc     180
ggcttcggct ccctggagca gaacggcctg atctaccgtc agaatatctt cattcgctcg     240
ttcgagatcg gcttcgaccg caagctcagc ctggccgcgc tgacgaactt cctccaggat     300
accgcgctca atcatgtccg catgatcggc ctcctcgccg ctggcttcgg atcgaccccg     360
gagatgtcca agaaagacct catctgggtg ctctgcacgc tgcagatcct cgtcgatcgc     420
cacccgtcgt ggctggacgc cgtcgaggtc gacacctgga tgtaccccag cggccaaaat     480
ggccaggggc gtgactggct cgttcgcgat gccaagactg gcaagcccct ggcgcaggcg     540
tcgtcggtca tggtcctgct gaacaagaaa acgcgcaagc tctccaagtt caccgaagag     600
atccgcgacg agatcgcgcc gcacatgatg atggactgca atccgattat caactcgcgc     660
aagatgctgc ccttcgacgt caacaccgcg gattatgccc gtaccggcct gacccccggt     720
tggaacgacc tcgatctcaa tcagcacgtg aatcacgtcc agtatatcaa ctggatcctc     780
cagaatgtgc tgcggagctt gatccagcat cacaagctct cggatatcac cctggagtat     840
cgcaaggaat gcgacatcaa ttcgatcctg cagttcctgt cgaagatcgt caagaacggc     900
agcaatcatt cgacggacac caataacctg atcgagctcg accattcgct cctgctggag     960
aacggctcgg agatcgccag ggcgaacacg atctggaagc cgcgcgaggt gaacaacttc    1020
aagaacgccg tgtatacgcc tgcg                                           1044
<210> 63
<211> 1071
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая ацил: АЦП-тиоэстеразу Jatropha curcas
<400> 63
atggcctcga ccgcgatctc gttcctctcc atcccgatca agcttatcaa agaagaaatg      60
cgtatggcct ccgcgggccg ccgcaagaac accattgcgg cggagttcgg ccacttcacg     120
ttcggcagcg cgaccgtcga gaagaaagtc cagaagtcga ataacttcct catcgacggc     180
ggcttcggct cgctggagca gaacggactg atctaccggc agaacatctt cgtccgctcc     240
ttcgagatcg gcttcgatcg caagctgagc ctcgcggccc tgaccaattt cctgcaggac     300
accgcgctca accattgccg catgatcggg ctcctcgctg agggtttcgg ctccacgccg     360
gagatgatca aaaaggactt gatctgggtg ctgtgcacgc tccagatcct cgtcgacggc     420
tatccgagct ggctcgatgt ggtcgaggtc gacacctgga tgtatccctc gggccagaat     480
ggactgggcc gtggctggct cgtccgcgac ggtaagaccg gccgcagcct ggcccagtcg     540
tcatcggtca tggtgtcctt caataagaaa acccggaagc tgtcgaagct ggcgaaggaa     600
atccgcgacg agatcgcccc tcacatgatg gattgcgacc cgatcatgaa caagaactcg     660
cgcaagatcc tcccgttcga cgtgaatacg gcggactatg ctcgcacggg cctcacgccc     720
ggctggaatg aactggatct gaaccagcac gtgaaccatg tccagtacat caactggatc     780
ctccagaacg tgcgcccgtc gctcgtccag catcataagc tctcggccat tacgctggag     840
tatcgcaaag agtgcgacat gaactccatc ctgcaatcgc tctcgcgcat cgtgaagaac     900
ggcggcaacg acagcaccga taagaataac gtcatcgagc tcgaccactt cctcctgctg     960
gagaatggca gtgagattgc ccgtgccaat accatctgga agccccgcga ggtcaataac    1020
ttcaagaacg ttgtccattc gcccgccgaa gagaatatct ctagcatgaa c             1071
<210> 64
<211> 396
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность FadM E. coli
<400> 64
atgcaaaccc agatcaaggt ccgcggatac catctcgatg tctatcagca tgtcaataac      60
gcccgttatc tcgaattcct cgaagaggcg cggtgggacg gcctggagaa ctcggactcg     120
ttccagtgga tgacggccca caacattgcg ttcgtggtgg tcaatatcaa catcaattac     180
cgccgcccgg cggtcctgtc cgatctgctc acgatcacct cgcagctcca gcagctgaac     240
ggcaagtcgg gcatcctcag ccaggtcatc acgctggagc ccgagggcca ggtcgtggcc     300
gacgctctga tcaccttcgt gtgcatcgac ctcaagaccc agaaagcgct ggccctcgaa     360
ggcgagctgc gcgagaagtt ggagcagatg gttaag                               396
<210> 65
<211> 957
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность AccA E. coli
<400> 65
atgtcgctca acttcctgga cttcgaacaa cccatcgccg agctcgaagc gaagatcgat      60
tccctcaccg ccgtcagccg ccaggatgag aagctcgaca tcaatatcga cgaggaggtg     120
catcgcctgc gggagaagtc cgtcgagctc acccgcaaga tcttcgccga tctgggcgcg     180
tggcagatcg ctcagctcgc gcgtcatccg cagcgcccgt acacgctgga ctatgtgcgc     240
ctggcgttcg acgagttcga cgagctggcc ggtgatcgcg cctacgccga tgacaaggcc     300
atcgtcggcg gcatcgcgcg tctggacggc cgtccggtga tgatcatcgg ccaccagaaa     360
ggccgcgaaa ccaaagagaa gatccgccgc aacttcggca tgcctgcccc cgagggctat     420
cgcaaggccc tccgcctcat gcagatggcc gagcgcttca agatgccgat tatcaccttc     480
atcgatacgc cgggcgcgta tccgggcgtc ggagccgagg aacgcggcca gagcgaggcg     540
atcgcgcgca atctccgcga gatgtcgcgc ctgggcgtcc ccgttgtctg caccgtgatc     600
ggcgagggcg gctcgggcgg tgccttggcc atcggcgtcg gcgacaaggt caacatgctc     660
cagtattcca cgtacagcgt catcagcccc gaggggtgcg cgtcgattct ctggaagtcg     720
gcggacaagg ctccgctcgc ggctgaggcg atgggcatca ttgcgccgcg cctgaaagaa     780
ctgaagctca tcgactcgat catcccggag cccctgggcg gagcccaccg taaccccgag     840
gccatggcgg cgtcgctgaa ggcccagctg ctcgcggacc tggcggacct cgatgtgctc     900
tcgaccgagg acctgaagaa taggcgctat cagcggctga tgtcgtacgg ctatgcg        957
<210> 66
<211> 468
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность AccB E. coli
<400> 66
atggacattc gcaaaatcaa gaaactcatc gaactggtcg aggaaagcgg catttcggaa      60
ctggagatct cggaaggtga agagtcggtg cgtatctcgc gcgcggcccc tgcggcgtcg     120
ttccccgtca tgcagcaagc gtatgccgct ccgatgatgc agcagccggc gcagtccaat     180
gcggcggccc cggccaccgt cccgagcatg gaagcgccgg cggccgctga gatctcgggc     240
catatcgtgc gcagccccat ggtcggaacg ttctaccgca ccccgtcccc cgacgcgaag     300
gccttcatcg aagttggcca aaaggtcaac gtgggcgata cgctctgcat cgtcgaggcc     360
atgaagatga tgaaccagat cgaggccgat aagtccggca ccgtgaaggc catcctggtc     420
gagtcgggcc agcccgtcga gttcgacgag ccgctcgtcg tgatcgag                  468
<210> 67
<211> 1347
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность AccC E. coli
<400> 67
atgttggata agatcgtcat cgccaatcgc ggagaaatag ccctcaggat tctcagagct      60
tgcaaagaac tcggaatcaa gactgtcgcg gtccactcca gcgcggaccg cgatctcaag     120
catgtcctgc tggcggacga aacggtctgc atcggccccg ccccctcggt caagtcctat     180
ctgaacatcc ccgccatcat ctctgccgcg gagatcaccg gggcggtggc tatccacccc     240
ggctacggct tcctctcgga gaatgccaac ttcgcggaac aggtcgagcg ctcgggcttc     300
atcttcatcg gcccgaaggc cgagacaatt cgcctgatgg gcgacaaggt gtcggccatc     360
gcggccatga agaaagcggg cgtcccgtgc gtgccgggct cggacggccc tctcggcgac     420
gacatggata agaaccgcgc gatcgcgaag cgcatcggct acccggtcat catcaaggcc     480
agcggtggcg gcggcggccg tggcatgcgc gtcgtgcgcg gtgacgcgga gctcgcgcag     540
tcgatctcca tgacccgggc tgaggccaag gccgccttct cgaacgacat ggtgtatatg     600
gagaagtacc tcgaaaatcc gcggcacgtt gagattcagg tcctcgccga cgggcagggc     660
aatgcgatct atctggcgga gcgcgattgc tccatgcagc gtcgccatca gaaggtcgtc     720
gaggaagcgc cggctccggg tattaccccc gagcttcgcc gctatatcgg cgagcgctgc     780
gcgaaggcct gcgtggacat tggctatcgc ggcgcgggca cgttcgagtt cctgttcgag     840
aacggcgagt tctacttcat cgagatgaac acgcgcatcc aggtcgagca cccggtgacc     900
gagatgatca cgggcgtgga cctgatcaag gaacagctcc gcatcgccgc gggccagccc     960
ctgagcatca agcaagaaga ggtgcacgtc cggggccatg cggtggagtg ccgcatcaac    1020
gccgaggacc cgaatacctt cctcccgtcg ccgggcaaga tcacccgctt ccatgcccct    1080
ggcggcttcg gagtccgctg ggagtcccat atctacgccg gctataccgt cccgccctat    1140
tatgattcga tgatcggaaa gctcatctgc tacggcgaga accgtgacgt ggcgatcgcg    1200
cgtatgaaga acgccctgca ggaactgatc atcgacggca tcaagaccaa tgtcgacctc    1260
cagatccgca tcatgaacga cgagaatttc cagcatggcg gcaccaacat ccattacctg    1320
gagaagaaac tgggcctgca agagaag                                        1347
<210> 68
<211> 912
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность AccD E. coli
<400> 68
atgagctgga tcgaacgcat caaaagcaac attaccccta cccgcaaggc ttccatcccc      60
gagggcgtct ggacgaagtg cgactcgtgc ggccaggtcc tctaccgcgc ggagctggag     120
cgcaacctcg aagtctgccc caagtgcgac catcacatgc gcatgacggc gcgcaatcgc     180
ctgcacagcc tgctggacga gggttccctc gtggagctgg gatcggagtt ggagccgaag     240
gatgtcctca agttccgcga ctcgaagaag tataaggatc ggctggcgtc ggcccagaaa     300
gaaacgggcg agaaagacgc cctcgtggtc atgaagggca ccctctatgg catgccggtc     360
gtcgcggcgg cgttcgagtt cgccttcatg ggcggctcga tgggctcggt cgtcggcgct     420
cgcttcgtcc gggcggtgga gcaggccctg gaagataatt gcccgctgat ctgcttctcg     480
gcgagcggtg gcgctcgtat gcaagaagcc ctgatgtcgc tcatgcagat ggccaagacc     540
tccgccgccc tggcgaagat gcaggaacgc gggctcccgt acatctccgt gctcaccgac     600
ccgaccatgg gcggcgtgtc ggcgtcgttc gccatgctcg gcgacctgaa catcgccgag     660
ccgaaggccc tcatcggctt cgccggaccg cgcgtcatcg agcagacggt gcgcgagaag     720
ctgcccccgg gcttccagag gtcggagttc ctgatcgaga agggcgcgat cgacatgatc     780
gtgcgccgtc cggagatgcg cctcaagctg gcgtcgatcc tcgccaagct gatgaacctc     840
ccggccccga accccgaggc gccccgtgag ggcgtggtcg ttccgcccgt cccggaccag     900
gaacccgagg cg                                                         912
<210> 69
<211> 744
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность FabD E. coli
<400> 69
atgacacagt tcgcattcgt attcccagga caaggatcac agacagttgg aatgttagca      60
gatatggcag catcataccc aatagtagag gaaacatttg cagaggcatc agcagcatta     120
ggatacgact tatgggcact aacacaacag ggaccagcag aagagttaaa caagacatgg     180
cagacacagc cagcactatt aacagcatca gtagcattat acagggtatg gcagcaacag     240
ggtggaaagg caccagcaat gatggcagga cactcattag gagagtattc agcattagta     300
tgcgcaggag taatagactt cgcagacgca gtaaggttag tagagatgag gggaaagttt     360
atgcaggaag cagtaccaga gggaacagga gcaatggcag ctataatagg attagatgac     420
gcatcaatag caaaggcatg cgaggaggca gcagagggac aggtagtatc accagtaaac     480
ttcaactcac caggacaagt agtaatagca ggacacaaag aggcagtaga gagagctgga     540
gcagcatgta aggcagctgg agcaaaaagg gcattaccat taccagtatc agtaccatca     600
cattgcgcat taatgaagcc agcagcagac aagttagcag tagagttagc aaagataaca     660
ttcaacgcac caacagtacc agtagtaaac aatgtagatg taaagtgcga aacaaacggt     720
gacgcaataa gggacgcatt agta                                            744
<210> 70
<211> 549
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность TesA E. coli с удаленной последовательностью нацеливания на периплазму
<400> 70
atggcagaca cattattaat attaggagac tcattatcag ctggatacag aatgtcagca      60
tcagcagcat ggccagcatt attaaatgac aagtggcaga gtaagacatc agtagtaaac     120
gcatcaatat ctggagatac atcacagcaa ggattagcaa ggctaccagc attactaaag     180
cagcaccagc ctagatgggt attagtagag cttggaggaa atgatggatt aaggggattc     240
cagccacagc agacagagca gacattaagg cagatattac aagacgtaaa ggcagcaaac     300
gcagagccat tactaatgca gataaggtta ccagcaaact acggaagaag gtataacgaa     360
gcattctcag caatataccc aaagttagca aaagagtttg acgtaccact attaccattc     420
tttatggaag aagtatactt aaagccacag tggatgcaag atgacggaat acatccaaac     480
agggacgcac agccattcat agcagattgg atggcaaaac agttacagcc attagtaaac     540
cacgactca                                                             549
<210> 71
<211> 1146
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая тиоэстеразу Cinnamomum camphorum
<400> 71
atggcaacaa catcattagc atcagcattt tgcagtatga aagcagtaat gttagcaagg      60
gacggaaggg gaatgaagcc taggtcatca gatttacagt taagggcagg aaacgcacag     120
acatcattaa agatgataaa tggaacaaag ttctcataca cagagtcatt aaagaaatta     180
ccagactggt caatgttatt cgcagtaata acaacaatat tctcagcagc agagaagcag     240
tggacaaact tagagtggaa gccaaagcca aacccaccac agttattaga cgatcacttc     300
ggaccacacg gattagtatt taggagaaca ttcgcaataa gatcatacga ggtaggacca     360
gacaggtcta catcaatagt agctgtaatg aaccatttac aagaagcagc attaaaccac     420
gcaaagtcag ttggaatact aggtgacgga ttcggaacaa cattagagat gtcaaaaagg     480
gacctaatat gggtagtaaa gagaacacat gtagcagtag aaaggtaccc agcatgggga     540
gacacagtag aggtagagtg ctgggtagga gcatcaggaa ataacggaag gagacacgac     600
ttcttagtaa gggattgcaa gacaggtgag atactaacaa gatgcacatc attatcagta     660
atgatgaaca ctaggacaag gagactttca aagataccag aagaagtaag gggagagata     720
ggaccagcat tcatagacaa cgtagcagta aaagatgaag agataaagaa gccacaaaag     780
ttaaacgatt caacagcaga ctatatacag ggaggattaa caccaaggtg gaatgactta     840
gacataaacc agcacgtaaa caatataaaa tatgtagact ggatactaga gacagtacca     900
gattcaatat tcgagtcaca ccatatatca tcatttacaa ttgagtacag aagagagtgc     960
acaatggact cagtattaca gtcattaaca acagtatctg gaggatcatc agaggctgga    1020
ctagtatgtg agcacttatt acagttagag ggaggatcag aggtattaag ggcaaagaca    1080
gagtggaggc caaagttaac agatagtttt aggggaatat cagtaatacc agcagagtca    1140
tcagta                                                               1146
<210> 72
<211> 1146
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая тиоэстеразу Umbellularia californica
<400> 72
atggcaacaa caagtttagc atcagcattt tgcagtatga aggcagtaat gttagcaagg      60
gacggaaggg gaatgaagcc aaggtcatca gatttacagt taagggcagg aaacgcacca     120
acatcattaa agatgataaa cggaacaaag ttctcataca cagagtcact aaaaagatta     180
ccagactggt caatgctttt tgcagtaata acaacaatat tctcagcagc agagaagcaa     240
tggacaaact tagaatggaa gccaaagcca aagttaccac agttattaga cgatcacttt     300
ggattacacg gattagtatt cagaagaaca ttcgctataa ggtcttatga ggtaggacca     360
gacaggtcaa catcaatact agcagtaatg aaccacatgc aagaagcaac attaaaccac     420
gcaaagtcag ttggaatact aggagatgga ttcggaacaa cattagagat gtcaaaaagg     480
gacttaatgt gggtagtaag aagaacacac gtagcagtag aaaggtaccc aacatgggga     540
gacacagtag aggtagagtg ctggatagga gcatcaggta ataacggaat gagaagggac     600
ttcttagtaa gggactgcaa gacaggagag atactaacaa ggtgcacttc attatcagta     660
ctaatgaata caaggacaag aaggctatca acaataccag atgaagtaag gggagaaata     720
ggaccagcat tcatagacaa tgtagcagta aaagacgatg agataaagaa attacagaag     780
ttaaacgact caacagcaga ttacatacag ggaggattaa cacctaggtg gaacgactta     840
gacgtaaatc agcacgtaaa caacttaaag tacgtagcat gggtatttga gacagtacca     900
gactcaatat tcgagtcaca ccatatatca tcattcacat tagagtatag aagagagtgt     960
acaagggatt cagtattaag gtcattaaca acagtatctg gaggatcatc agaggctgga    1020
ttagtatgcg accatctatt acagttagag ggaggatcag aggtattaag ggcaaggaca    1080
gagtggaggc caaagttaac agactcattc aggggaatat cagtaatacc agcagagcca    1140
agggta                                                               1146
<210> 73
<211> 750
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая ацил-АЦП-тиоэстеразу Streptococcus pyogenes
<400> 73
atgggattat catatcaaga agagttaaca ttaccatttg agttatgcga cgtaaagtca      60
gacataaagt taccattact attagattat tgcttaatgg tatctggaag gcaatcagta     120
cagttaggaa gatcaaacaa caacttatta gtagactata agttagtatg gatagtaaca     180
gactacgaga taacaataca caggttacca cacttccaag agacaataac aatagagaca     240
aaggcattat catacaacaa gtttttctgt tacaggcagt tctacatata cgaccaagag     300
ggatgcttac tagtagacat actatcatac ttcgcattac taaacccaga tacaagaaag     360
gtagcaacaa taccagagga tttagtagca ccattcgaaa cagactttgt aaagaaatta     420
cacagggtac caaagatgcc attactagag cagtcaatag atagggacta ctatgtaagg     480
tacttcgaca tagacatgaa tggacatgta aacaactcaa agtacttaga ctggatgtac     540
gacgtattag gttgccagtt cttaaagaca caccagccat taaagatgac attaaaatac     600
gtaaaagaag tatcacctgg aggacagata acttcatcat atcatttaga tcagttaaca     660
tcataccacc agataatatc agatggacag ttaaatgcac aggcaatgat agagtggaga     720
gcaataaagc agacagagag tgagacagac                                      750
<210> 74
<211> 1191
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая пальмитоил: ацилпереносящий белок-тиоэстеразу Ricinus communis
<400> 74
atgggaacat gctcatacac aataacatta ccaataagat gcttatcaaa ctcaaacgga      60
caccacgacc cacataagca gaacttaaac aagataaaga taaatggagc atctacatca     120
acaaggccat taaagttaga cgcaccatca cagacagttg gagtagcaac aatatactta     180
gcatcagtat cagagaactt aactttaaca aaagaagtaa tgagacagaa tataccaaca     240
aagaagcagt acatagatcc acacaggcag ggattaatga tagagggtgg agtaggatat     300
aggcagacaa tagtaataag atcttacgag gtaggaccag acaagacagc aacattagag     360
tcaatactat acttattaca agagacagca ttaaaccacg tatggttatc aggactatta     420
tcaaacggat tcggagcaac acatggaatg gtaaagaata acctaatatg ggtagtatca     480
aagttacagg tacaggtaga ccactaccca atatggggag aggtagtaga gatagacaca     540
tgggtaaggg caagtggaaa gaacggaatg aaaagggact ggttaataag atcacaagca     600
acaggacatg tatttgtaag ggcaacatca acatgggtaa tgatgaatga gaaaactaga     660
aggctatcaa agatgccaga ggaagtaagg gcagagatat caccatggtt catagagaag     720
caagcaataa aagaagaagt acctgataag attgctaagt tagacgacaa ggcaaggtat     780
gtaatatcaa acttaaagcc aaaaagatca gacttagaca tgaaccatca cgtaaacaat     840
gtaaaatatg taaggtggat gttagagata ttaccagatc acttcttaga gtcacaccag     900
ttaagtggaa taacaatgga gtacaggaga gagtgtggat cagcagacat agtacagtca     960
ttatgcgagc cagacggaga tgagatacta tcaaacgata taccagtact aaatggattt    1020
tcattagcat cagagccatt aatggaagga aacggattct tagtaccatt agataaggta    1080
ccattaaagt acacacactt actattaaca aagggagagt cacagaacga agagatagta    1140
aggggaaaga caatatggaa gaaaaagtta tgcacaatgc cattctcaac a             1191
<210> 75
<211> 1176
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая пальмитоил: ацилпереносящий белок-тиоэстеразу Ricinus communis
<400> 75
atggcatcaa agggatcaat aaggctatac tttccatgcg acttcaggaa cacactacag      60
aagaagaata tgaagatgga catggtaatg gcaaggtcag gattttcata ctcattaaac     120
ccaatagcac caaagatacc aaggttctat gtagtagcaa atgcatcaaa tccacagagg     180
gtagatacaa taaacggaaa gaaagtaaac ggaatacacg tagcagagtc atcaaactca     240
tacgcagacc agaataagat gaacgcaaca gcaggattag tattagacgg aaacgtagat     300
catcagccat tacacaagtg gttattaggt aggttcgtag acgagaggtt agtatattca     360
cagacattca taataagatc atacgagata ggaccagaca agacagcaac aatggagaca     420
ttaatgaact tattacaaga gacagcatta aaccacgtaa catcaagtgg attagcagga     480
gatggattcg gagcaacaag agagatgtca ttaagaaagc taatatgggt agtaacaagg     540
atacacatac aggtacaaag gtactcatgc tggggagatg tagtagagat agatacatgg     600
gtagacggag ctggaaagaa cggaatgaga agggactgga taataaggga ttacaacaca     660
aaagaaataa taacaagggc aacatcaaca tgggtaataa tgaataggga aactagaaag     720
ttatcaaaga tgccagaaca ggtaaggcag gaattagtac cattctacac aaataggata     780
gcaatagcaa aagagaataa cgacgttgag aagatagata agttaacaga cgagacagca     840
gaaaggataa ggtctggatt agcaccaaga tggagtgaca tggacgcaaa ccagcacgta     900
aacaacgtaa agtacatagg atggatacta gagtcagtac caataaacgt attagaggac     960
tataacttaa cttcaatgac attagagtac agaagagagt gcaggcagtc aaacttatta    1020
gagtcattaa catcaacaac agagcattca aacaacaatt cttgtaacag gaaagcacac    1080
ttagagtata cacacttact aagaatgcaa gcagacaagg cagagatagt aagggcaagg    1140
acagagtggc agtcaaagtc aaacagaaag acaata                              1176
<210> 76
<211> 1257
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая пальмитоил: ацилпереносящий белок-тиоэстеразу Ricinus communis
<400> 76
atggtagcaa cagcagcagc agcaacatca tcattctttc cagtaccatc acagtcagca      60
gatgcaaact tcgataaggc accagcatca ttaggaggaa taaagttaaa gtcaacttca     120
tgctcaaggg gactacaggt taaggcaaac gcacaggcac caccaaagat aaacggatca     180
tctgtaggat ttacaacatc agtagagaca gtaaagaacg acggagacat gccattacca     240
ccaccaccaa gaacattcat aaaccagtta ccagattggt caatgttatt agcagcaata     300
acaacaatat tcttagcagc agagaagcaa tggatgatgt tagattggaa gccaagaagg     360
ccagacatgt taatagaccc atttggaata ggaaggatag tacaagacgg attaatattc     420
aggcagaatt tctcaataag atcatacgag ataggagcag acaggacagc atcaatagag     480
acattaatga atcacttaca ggaaacagca ttaaaccatg taaagacagc aggactatta     540
ggtgacggat tcggatcaac accagagatg tcaaaaagaa acctaatatg ggtagtaaca     600
agaatgcaag tattagtaga taggtatcca acatggggag atgtagtaca ggtagacaca     660
tgggtatcaa agagtggaaa gaacggaatg agaagggact ggtgcgtaag ggactcaagg     720
acaggagaga cactaacaag ggcatcatca gtatgggtaa tgatgaataa gttaacaaga     780
aggctatcaa agataccaga agaagtaagg ggagagatag agccatactt cttaaactca     840
gacccaatag tagacgaaga ttctaggaaa ttaccaaagt tagacgattc aaacgcagac     900
tacgtaagga aaggattaac acctaggtgg agtgatttag acataaatca gcacgtaaac     960
aatgtaaagt acataggatg gattttagag tcagcaccat taccaatact agagtcacac    1020
gagttatcag caataacatt agagtataga agagagtgcg gaagggactc agtattacag    1080
tcattaacag cagtatcagg aaacggaata ggaaacttag gaaacgctgg agacatagaa    1140
tgtcagcact tactaaggtt agaggacgga gcagagatag taaggggaag gacagagtgg    1200
aggccaaagt actcatcaaa ctttggaata atgggacaga taccagtaga gtctgca       1257
<210> 77
<211> 1215
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая ацил: АЦП-тиоэстеразу Jatropha curcas
<400> 77
atggcagtat ttacatacag aatagcaatg ttaccaataa gatgttcatc atcaaactca      60
acaaattcac actcacacga cccaaaccaa cagaatttac acaagataaa gataaacgga     120
tcagcttcag caatgatgcc attaaaggta gacttaccat catcattaac aataacatca     180
gtagcaccag tagtagagaa cttatcttta acaaaagagc agacaaggca gaacatacca     240
acaaagaagc agtatataga cccacatagg cagggactaa tagtagagga gggtgtagga     300
tacaggcaga cagtagtaat aagatcatac gaggtaggac cagacaagac agcaacatta     360
gagataatac tatgcttatt acaagagaca gcattaaacc acgtatggtt atcaggatta     420
ctatcaaacg gatttggagc aacacacgga atggtaagaa ataacctaat atgggtagta     480
tcaaagttac aggtacaggt agaccagtac ccaatatggg gagaggtagt agagatagac     540
acatgggtag gagcatctgg aaagaacgga atgagaaggg attggttagt aaggtcacag     600
gcaactggac aggttttcgc aagggcaaca agtacatggg taatgatgaa tgagaaaaca     660
agaaggctat caaagatgcc agaggaagta agggcagaga tagcaccatg gttcatagag     720
aagcaagcaa taaaagaaga agtaccagag aagatagcaa agttagacga taaggcaagg     780
tatgtagtaa caaacttaaa gcctaagagg tcagatttag acatgaatca acatgtaaac     840
aacgtaaaat acgtaaggtg gatgttagag acattaccag accagttctt cgagaaccac     900
cagttaagtg gaataacttt agagtataag agagagtgcg gatcatcaga tatagtagag     960
tcattatgcg agccagatga agaagaggga ataataaaca caggattaaa gcagaacaac    1020
gacaagtcat tattcaatgg attctcatta ccatcagaga taatggaagg aaacggattc    1080
ttatcatcat tagaaaagac accattaaag tacacacact tattagtagc aaagggaaag    1140
acacagtcag aggaaatagt aaggggaaag acaatatgga agaaaaagtt actaacaaca    1200
atgccatttt cacca                                                     1215
<210> 78
<211> 1044
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая ацил: АЦП-тиоэстеразу Jatropha curcas
<400> 78
atggtatcaa cagcaatatc attttcacta ttaccaataa agttaataaa agaagagaca      60
agaatggcat cagcagatag gagaaagaac tcaatagtaa aagaattcgg acacttcaca     120
tgcagatgtg cagcaataga gaagagaata caaaagttaa acaacttctt aatagacgga     180
ggattcggat cattagagca aaatggatta atatataggc agaacatatt cataaggtca     240
ttcgagatag gattcgacag aaagttatca ttagcagcat taactaattt cttacaggat     300
acagcattaa accacgtaag aatgatagga ttactagctg caggatttgg atcaacacca     360
gagatgtcaa agaaagactt aatatgggta ttatgcacat tacagatatt agtagacagg     420
cacccatctt ggttagacgc agtagaggta gacacatgga tgtacccatc aggacagaac     480
ggacagggaa gggactggtt agtaagggac gcaaagacag gaaagccatt agcacaggca     540
tcaagtgtaa tggtattatt aaacaaaaag acaaggaagc tatcaaagtt cacagaagag     600
ataagggacg agatagcacc acacatgatg atggactgca acccaataat aaattctagg     660
aagatgttac cattcgatgt aaatacagca gattacgcaa ggacaggatt aacaccaggt     720
tggaacgatt tagacttaaa tcagcatgta aaccatgtac agtacataaa ctggatatta     780
cagaacgtat taaggtcact aatacagcat cacaagttat cagatataac attagagtac     840
agaaaggaat gcgacataaa ctcaatacta cagtttctat caaagatagt taagaatgga     900
tcaaaccact caacagacac aaataactta atagagttag accactcatt actattagag     960
aacggatcag agatagcaag ggcaaacaca atatggaagc caagagaagt aaacaacttt    1020
aagaacgcag tatatacacc agca                                           1044
<210> 79
<211> 1071
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая ацил:АЦП-тиоэстеразу Jatropha curcas
<400> 79
atggcatcaa ctgcaatatc attcttaagt ataccaataa agttaataaa agaagagatg      60
agaatggcat ctgcaggaag gagaaagaac acaatagcag cagagttcgg acattttaca     120
ttcggatcag caacagtaga gaaaaaagta cagaagtcaa ataacttcct aatagacgga     180
ggatttggat cattagagca gaacggatta atatacaggc agaacatatt tgtaaggtca     240
tttgagatag gattcgatag aaagttatca ttagcagcat taacaaactt cttacaggac     300
acagcattaa accactgcag aatgatagga ttactagcag agggattcgg atcaacacca     360
gagatgataa agaaagattt aatatgggta ttatgtacat tacagatatt agtagacgga     420
tatccaagtt ggctagacgt agtagaggta gatacatgga tgtacccatc aggacaaaac     480
ggattaggta ggggatggtt agtaagggac ggaaagacag gaaggtcatt agcacagtca     540
tcatcagtaa tggtatcatt caataagaaa acaaggaaac tatcaaagtt agcaaaggag     600
ataagggacg agatagcacc acacatgatg gactgcgacc caataatgaa caagaactca     660
agaaagatat taccattcga cgtaaataca gctgattatg caaggacagg tttaacacca     720
ggatggaacg aattagactt aaaccaacac gtaaatcacg tacagtacat aaactggata     780
ttacagaatg taaggccatc attagttcag catcacaagt tatcagcaat tacattagag     840
tacagaaaag agtgcgacat gaattctata ctacagtcat tatcaaggat agtaaagaac     900
ggaggaaacg attcaacaga caagaacaac gtaatagagt tagaccactt cttactatta     960
gagaacggat cagagatagc aagggcaaac acaatatgga agccaagaga agtaaacaac    1020
tttaagaatg tagtacactc accagcagaa gagaacatat catcaatgaa t             1071
<210> 80
<211> 396
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность FadM E. coli
<400> 80
atgcagacac agataaaggt aaggggatat cacttagacg tataccaaca cgtaaacaac      60
gcaaggtact tagagttctt agaagaagca agatgggatg gattagagaa ctcagattca     120
ttccagtgga tgacagcaca taacatagca tttgttgtag taaacataaa tataaactac     180
agaaggccag cagtattatc agacctatta acaataacat cacagttaca gcagttaaat     240
ggaaagtcag gaatactatc acaggtaata acattagagc cagagggaca ggtagtagca     300
gacgcactaa taacattcgt atgcatagac ttaaagacac aaaaggcatt agcattagag     360
ggagagttaa gggagaaatt agagcagatg gtaaag                               396
<210> 81
<211> 957
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность AccA E. coli
<400> 81
atgtcattaa acttcttaga tttcgagcag ccaatagcag agttagaggc aaagatagac      60
tcattaacag cagtatcaag gcaagatgag aagttagaca taaacataga cgaagaagta     120
cataggttaa gggagaagtc agtagagtta acaagaaaga tattcgcaga cttaggagca     180
tggcagatag cacagctagc aaggcaccca cagaggccat acacattaga ctatgtaagg     240
ttagcattcg acgagttcga tgagcttgca ggagacaggg catacgcaga cgataaggca     300
atagtaggag gaatagcaag gttagacgga aggccagtaa tgataatagg acaccaaaag     360
ggaagggaga caaaagagaa gataagaaga aactttggaa tgcctgctcc agagggatac     420
agaaaggcat taaggttaat gcagatggca gaaaggttta agatgccaat aataacattc     480
atagacacac caggagcata cccaggagta ggagcagagg aaaggggaca gagtgaggca     540
atagcaagaa acttaaggga aatgtcaagg ttaggtgtac cagtagtatg cacagtaata     600
ggagagggag gatctggagg agcattagca ataggagtag gtgacaaggt aaacatgtta     660
cagtactcaa catattcagt aatatcacca gagggatgcg catcaatact atggaaatca     720
gcagataagg caccattagc tgcagaggca atgggaataa tagcaccaag gctaaaagaa     780
ctaaagttaa tagactcaat aataccagag ccattaggag gagcacacag aaatccagag     840
gcaatggcag catcattaaa ggcacagcta ttagcagatt tagcagactt agatgtatta     900
tcaacagagg acttaaagaa tagaagatac cagaggttaa tgtcatacgg atatgca        957
<210> 82
<211> 468
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность AccB E. coli
<400> 82
atggacataa gaaagataaa gaaattaata gagttagtag aagagtcagg aatatcagag      60
ttagaaatat cagagggaga ggaatcagta agaatatcaa gggcagctcc agcagcatca     120
ttcccagtaa tgcaacaggc atacgcagca ccaatgatgc agcagcctgc acagagtaac     180
gcagcagcac cagcaacagt accatcaatg gaagcaccag cagcagcaga gatatctgga     240
cacatagtaa ggtcaccaat ggtaggaaca ttctatagga caccatcacc agacgcaaag     300
gcattcatag aggtaggaca aaaggtaaac gttggagata cattatgcat agtagaggca     360
atgaagatga tgaatcagat agaggcagat aagtcaggaa cagtaaaggc aatactagta     420
gagtcaggac agccagtaga gtttgacgag ccattagtag taatagag                  468
<210> 83
<211> 1347
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность AccC E. coli
<400> 83
atgttagaca agatagtaat agcaaatagg ggagagatag cattaagaat actaagggca      60
tgcaaagagt taggaataaa gacagtagct gtacactcat cagcagacag ggacttaaaa     120
catgtattac tagcagatga gacagtttgt ataggaccag caccatcagt aaagtcatac     180
ttaaacatac cagcaataat atcagcagca gagataacag gagcagtagc aatacaccca     240
ggatacggat tcttatcaga aaacgcaaat ttcgcagagc aagtagagag atcaggattc     300
atattcatag gaccaaaggc agagacaata aggctaatgg gagacaaggt atcagcaata     360
gcagcaatga agaaagctgg agtaccatgc gtaccaggat cagacggacc attaggtgat     420
gacatggata agaatagggc aatagcaaaa aggataggat acccagtaat aataaaggca     480
agtggaggag gtggaggaag gggaatgaga gtagtaaggg gagatgcaga gttagcacag     540
tcaatatcaa tgacaagggc agaggcaaag gcagcattct caaatgacat ggtatacatg     600
gagaagtact tagagaaccc aaggcacgta gagatacagg tattagcaga cggacaggga     660
aacgcaatat acttagcaga gagggactgc tcaatgcaga gaaggcacca gaaagtagta     720
gaagaagcac cagctccagg aataacacca gagttaagaa gatacatagg agagaggtgc     780
gcaaaggcat gcgtagacat aggatatagg ggagcaggaa catttgagtt cttattcgag     840
aacggagagt tttacttcat agagatgaac acaaggatac aggtagagca cccagtaaca     900
gagatgataa caggagtaga cttaataaag gaacagttaa ggattgcagc aggacagcca     960
ttatctataa agcaagaaga agtacacgta aggggacatg cagtagagtg caggataaac    1020
gcagaggatc ctaacacatt tctaccatca ccaggaaaga taacaagatt ccatgcacca    1080
ggaggattcg gagtaaggtg ggagtcacac atatatgcag gatacacagt accaccatat    1140
tacgattcaa tgataggtaa gctaatatgc tacggagaga acagggacgt agcaatagca    1200
agaatgaaga acgcattaca ggaattaata atagacggaa taaagacaaa tgtagattta    1260
cagataagga taatgaacga cgagaacttt cagcacggag gaacaaacat acactattta    1320
gagaaaaagt taggattaca agagaag                                        1347
<210> 84
<211> 912
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность AccD E. coli
<400> 84
atgtcatgga tagagaggat aaagtcaaac ataacaccaa caagaaaggc atcaatacct      60
gagggagtat ggacaaagtg cgactcatgc ggacaggtac tatatagggc agaattagag     120
agaaacttag aggtatgccc aaagtgcgat catcacatga gaatgacagc aaggaatagg     180
ttacactcat tattagatga aggatcatta gtagagttag gatcagagtt agagccaaag     240
gacgtactaa agtttaggga cagtaagaag tacaaggaca ggttagcatc agcacagaaa     300
gagacaggag agaaagacgc attagtagta atgaagggaa cattatacgg aatgccagta     360
gtagcagcag catttgagtt cgcattcatg ggaggatcaa tgggatcagt agtaggagca     420
aggttcgtaa gggcagtaga gcaagcttta gaggacaact gcccattaat atgtttctca     480
gcatctggag gtgcaagaat gcaagaagca ttaatgtcat taatgcagat ggcaaagaca     540
tcagcagcat tagcaaaaat gcaggaaagg ggactaccat acatatcagt attaacagat     600
ccaacaatgg gaggagtatc agcatcattc gcaatgttag gagacttaaa catagctgag     660
ccaaaggcac taataggatt cgcaggacca agggtaatag agcagacagt aagggagaag     720
ttaccaccag gatttcagag gtcagagttc ttaatagaaa agggagcaat agacatgata     780
gttagaaggc cagagatgag attaaagtta gcatcaatac tagcaaagtt aatgaattta     840
ccagcaccaa acccagaggc accaagagag ggagtagtag taccaccagt accagatcag     900
gaaccagagg ca                                                         912
<210> 85
<211> 1716
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность мутированного FadD Clostridium ljungdahlii
<400> 85
atggatgaaa ttaaaataaa tgatagccaa aaaagatagt atgaaaaaat gggctattgg      60
ggtaaaaaaa cactctaaga ttactggcat acgtcggtaa aaaagtatag agataaggaa     120
tttgtagtag atgatagagg atatcgttac acctagggac aattggatga aaaagcaggt     180
attgttgctt cctattttct tagtattgga gtaaagcctc tagatgttat ttcttttcaa     240
ataccaatat ggagtgaatt tgtaattgtt agtattgcat gcatgaaggt ggggagctgt     300
tgttaaccca attggcatgt gctatagtgg tccgggaagt ttcatatctt ttgaatttat     360
gtaaaagtaa agtttttctc tgccctacat ggtacaataa gacaaattat gaaaaattga     420
ttctatcagt caaaaaggat gtaaaaagtt taaaacacat tgtattactt gacaatctta     480
aagaaaaaga aagtaacagt attactttaa aacatatatt atcatcatac ttttccttga     540
acataaaaga tgaggtaatg gttgacagta atgatgtagc agctatcctt tgcacatccg     600
gtactactgg atgtgcaaag ggagccatgc tgactcataa taacataata tttagtgaaa     660
aatactttaa taaggaactt ggcattacaa aagatgatat tatgtttatg ccggcacctt     720
taaatcatgc aactggcttt catcatggaa ttattgcacc tatgcttatt ggatcaaaag     780
tggttttaca gcagaagttt aaaagtaaaa aggcaataga acttatgaat agagaaaaat     840
gcacctggtc aatgggagct acaccattta tatatgatat tttgaaaaac attagagagg     900
atgaagttta ccttagttcg ttaaaatttt atctttgtgg tggagctgta gtaccagaag     960
aaatggtaag gcaagcctat gaatatggaa taaaattatg tgaagtttat ggatctacag    1020
aaagtgttcc acatgtattt gtaagaccag atgaaaatat tgagttaaca tttggcactg    1080
caggaagggc tatggaaggc gtagaagtta aaattgtaga tgaaaataga aaagagatac    1140
tacctggaaa tctaggggaa gaagtatcga gaggtccaaa tgtatttgta ggatatatag    1200
gtgataaatc agctacaaat aaggtactgg atgatgaagg atggttttat agtggcgatt    1260
tatgtgtaag tgatataagt ggcaatatta atatcattgg gagaaaaaaa gacataattg    1320
ttagaggcgg tgaaaatctc aactcgaatc atataagtca gtatatttca aaatttccac    1380
taattaaaga tgaggcagtt attggaatgc ctgataagcg tcttggtgaa cgaatttgtg    1440
cttatgtcgt attgaaaaaa gaagttaatt ctctgaaatt agaagaactt ttagagtaca    1500
tggaaaagga aaaaatccct aaaaggtatt ggccggaaca cctggagatt atagataaaa    1560
ttcccagaac tgacagtgga aaggtgaaaa aaaatttatt ggcaaaggat ttaaaagttc    1620
gaatgagtag acaggaggag tcaagttgga agggcgagaa ttcggtccaa gaagatcaag    1680
agaaacaaca aaaccaaggg ttgtgtgccc caataa                              1716
<210> 86
<211> 927
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность FabD E. coli
<400> 86
atgactcaat tcgcgttcgt ttttccaggg caaggttctc agaccgtagg tatgttagca      60
gatatggcag catcatatcc aattgtagag gaaacctttg cagaagcatc agcggcgtta     120
ggctatgact tatgggcgct tacccaacag ggcccagcag aggaacttaa taagacttgg     180
cagacccagc cagcgttact aaccgcatca gttgcgcttt atagagtttg gcagcaacag     240
ggcggcaagg cgccagcgat gatggcaggg cattcattag gtgagtattc agcgcttgtg     300
tgtgcgggcg tcattgactt cgcggacgcg gtgagactag ttgaaatgag aggtaagttc     360
atgcaagaag cagtaccaga gggtaccgga gcaatggcag ccattattgg gcttgacgat     420
gcgagtatag cgaaagcgtg tgaagaagcg gccgagggtc aggttgtgtc accagtcaat     480
ttcaattcac caggacaagt tgttattgcc ggtcataaag aagcggttga gagagctggc     540
gcagcatgta aagcagcggg agcaaagaga gcacttccat taccagtttc agttccttca     600
cattgtgcct taatgaagcc tgcggcggac aagttagcgg ttgagttagc gaagattacc     660
ttcaatgcgc caactgtacc agttgtcaat aatgttgacg ttaaatgtga aaccaatggc     720
gacgcgatta gagatgcact tgtgagacaa ctttataatc cagttcaatg gaccaaatca     780
gttgagtata tggcggcaca gggtgttgaa catctttatg aagtcggccc aggtaaagta     840
cttaccggcc ttaccaagag aattgtagac acccttactg cgtcagcgtt aaatgagcct     900
tcagcgatgg cggcagcgct tgagtta                                         927
<210> 87
<211> 549
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность TesA E. coli с удаленной последовательностью нацеливания на периплазму
<400> 87
atggcagata ccttacttat tcttggcgac agtttatcag cgggttatag aatgtcagca      60
tcagcagcgt ggcctgcgtt actaaatgac aaatggcaat caaagacctc agttgttaat     120
gcatcaatat ctggtgacac ttcacaacag ggattagcga gacttccagc gttacttaag     180
cagcatcagc caagatgggt attagttgag cttggtggga atgacggcct tagaggtttc     240
caaccacagc aaaccgagca aaccttaaga cagattcttc aagatgtgaa agcggcgaat     300
gcggagcctc ttcttatgca gattagactt cctgcgaatt atggcagaag atataatgaa     360
gcgttttcag ccatttatcc aaagttagca aaagaattcg acgttccatt acttccattt     420
ttcatggaag aagtctatct aaagccacag tggatgcaag atgacggcat tcatccaaat     480
agagatgcac aaccattcat tgcggactgg atggcaaaac agcttcagcc attagtaaat     540
catgactca                                                             549
<210> 88
<211> 1146
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая тиоэстеразу Cinnamomum camphorum
<400> 88
atggcaacca ccagtttagc gagtgcgttt tgttcaatga aagccgttat gttagcaaga      60
gatgggagag gaatgaaacc aagatcatca gaccttcaac ttagagcggg caatgcgcag     120
acctcattaa agatgattaa tggtaccaaa ttctcatata ccgaatcatt aaagaaactt     180
ccagactggt caatgctttt cgcagttatt accactattt tctcagccgc ggaaaagcaa     240
tggaccaatt tagagtggaa acctaagcca aatcctccac agttattaga tgaccatttc     300
ggtccacatg gtttagtatt cagaagaact tttgcgatta gatcttatga agttggccca     360
gacagatcaa cctcaatagt tgcggtcatg aatcatttac aagaagcagc gcttaatcat     420
gcgaaatcag ttggcattct aggcgacggt ttcggcacta cccttgaaat gtcaaagaga     480
gatcttattt gggttgtgaa gagaacccat gtagcagttg agagatatcc agcgtgggga     540
gataccgttg aagttgaatg ttgggttgga gcatcaggga ataatggtag acgacatgac     600
ttcttagtaa gagactgtaa aactggcgag attcttacca gatgtacttc actttcagta     660
atgatgaata ccagaaccag aagattatca aagattccag aagaagtgag aggtgagatt     720
ggtccagcgt ttattgataa tgttgcggtg aaagatgaag agattaagaa gccacaaaag     780
cttaatgatt caaccgcaga ctatattcag ggtggcctta cccctagatg gaatgactta     840
gacattaatc agcatgtcaa taatattaaa tatgtcgact ggattcttga aactgttcca     900
gactcaattt tcgagtcaca tcatatttca tcatttacca ttgaatatag aagagagtgt     960
accatggact cagtcctaca atcattaacc accgtttctg gcgggtcatc agaggcaggc    1020
cttgtgtgtg agcatcttct acagcttgag ggcggatcag aagttttaag agcgaaaacc    1080
gagtggaggc caaagcttac tgactcattc agaggtattt cagtaatacc agcggagtca    1140
tcagtt                                                               1146
<210> 89
<211> 1146
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая тиоэстеразу Umbellularia californica
<400> 89
atggcaacta cttcattagc gtcagcattt tgttcaatga aagccgtaat gttagcaaga      60
gatgggagag gaatgaagcc aagatcaagt gacttacagt taagagcggg taatgcgcca     120
acttcactta agatgataaa tggtaccaaa ttctcatata ccgaatcatt aaagagactt     180
ccagactggt caatgttatt cgcggtgatt accaccattt tctcagcggc cgagaaacaa     240
tggaccaatc tagagtggaa acctaagcca aaacttccac aactacttga cgaccatttt     300
ggcttacatg gtcttgtttt cagaagaacc tttgcgatta gatcttatga agttggccct     360
gacagatcaa cttctattct tgcggttatg aatcacatgc aagaagcaac tcttaatcat     420
gcaaagtcag ttggtattct tggtgacggt ttcgggacca ctcttgaaat gtcaaagaga     480
gacttaatgt gggtagtaag aagaactcat gtcgcggttg aaagatatcc aacctgggga     540
gacaccgttg aggttgaatg ttggattggt gcgtcaggca ataatggcat gagaagagac     600
tttcttgtga gagattgtaa gaccggagag attcttacca gatgtacctc actttcagtt     660
cttatgaata cccgtaccag aagattatca accatacctg acgaagtgag aggcgaaatt     720
gggccagcgt tcattgacaa tgttgcggtt aaagatgatg agattaaaaa gcttcaaaag     780
cttaatgact caaccgcaga ctatattcag ggcggcttaa ccccaagatg gaatgacctt     840
gacgttaatc agcatgtcaa taatctaaaa tatgtagcgt gggttttcga aaccgttcca     900
gactcaattt tcgaatcaca tcatatttca tcattcacct tagagtatag aagagaatgt     960
accagagatt cagttttaag gtcattaacc accgtaagtg gtggttcatc agaggcaggc    1020
cttgtctgtg atcatctttt acagttagag ggcggatcag aggtgcttag agcgagaacc    1080
gagtggcgac caaagttaac tgattcattc agaggcattt cagttattcc agcggagcca    1140
agagtt                                                               1146
<210> 90
<211> 750
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая ацил-АЦП-тиоэстеразу Streptococcus pyogenes
<400> 90
atgggcttat catatcaaga agagttaacc ttaccatttg aattatgtga tgttaagtca      60
gacattaaac ttccattact tttagactat tgtcttatgg tttcaggcag acagtcagtg     120
cagcttggta gatcaaataa taatctttta gtcgactata aacttgtatg gatagttact     180
gactatgaga ttaccattca tagattacca catttccaag aaaccattac cattgaaacc     240
aaagcgctaa gttataataa gttcttttgt tatagacaat tctatattta tgaccaagag     300
ggctgtcttt tagttgacat tctatcatat ttcgcgcttc ttaatccaga taccagaaag     360
gttgcaacta ttccagagga cttagtcgcc ccattcgaga ctgactttgt taagaaatta     420
catagagttc caaaaatgcc tttacttgag cagtcaattg acagagacta ttatgtaaga     480
tatttcgata ttgacatgaa tggacatgtt aataattcaa agtatcttga ctggatgtat     540
gatgttttag gctgtcaatt ccttaagacc catcagccac ttaagatgac ccttaaatat     600
gtgaaagaag tatcacctgg tggtcaaatt acctcatcat atcatcttga ccagttgacc     660
tcatatcatc agattatatc agatgggcag cttaatgcac aggcgatgat tgaatggaga     720
gcgattaagc aaaccgagtc tgaaaccgat                                      750
<210> 91
<211> 1191
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая пальмитоил: ацилпереносящий белок-тиоэстеразу Ricinus communis
<400> 91
atggggacct gttcatatac cattaccctt ccaattcgat gtttatcaaa ttcaaatggc      60
catcatgatc cacataagca gaatcttaat aagataaaga taaatggcgc gtcaactagt     120
accagaccac ttaagttaga cgcaccttca caaaccgttg gtgttgcgac catttatcta     180
gcatcagttt cagaaaatct tacccttacc aaagaagtca tgagacagaa tattccaacc     240
aagaaacagt atattgaccc acatagacaa gggttaatga ttgagggtgg agttggttat     300
agacaaacta ttgtcattag aagttatgaa gttggcccag acaaaaccgc gactttagag     360
tcaattcttt atcttttaca ggaaaccgcc ttaaatcatg tatggctttc aggtctactt     420
tcaaatggct tcggggcgac ccatggcatg gtaaagaata atttgatttg ggtagtgtct     480
aagcttcagg ttcaagtgga tcattatcca atttggggag aggttgtaga gattgacacc     540
tgggttagag catcaggtaa gaatggtatg aaaagagact ggcttattag atcacaagca     600
accggccatg tatttgttag agcgacctca acttgggtta tgatgaatga gaaaaccaga     660
agattatcaa agatgccaga agaagtcaga gcggagattt caccatggtt cattgaaaag     720
caagcgatta aagaagaagt gccagacaaa attgcaaagt tagacgacaa ggcgagatat     780
gttatttcaa atctaaaacc taaaagatca gaccttgata tgaatcatca tgtgaataat     840
gtcaaatatg ttagatggat gcttgagatt ttaccagatc atttcttaga gtctcatcag     900
ttatcaggca taactatgga gtatagaaga gaatgtggat cagcagatat tgttcaatca     960
ttatgtgagc ctgacggtga cgagattctt tcaaatgaca ttcctgttct taatggtttc    1020
tcacttgcgt cagaaccatt aatggaaggc aatggtttcc ttgtaccatt agataaggtt    1080
ccattaaagt atacccatct tttacttacc aaaggcgagt cacagaatga agagattgtt    1140
agaggaaaaa ccatttggaa gaagaaactt tgtactatgc cattttcaac c             1191
<210> 92
<211> 1176
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая пальмитоил: ацилпереносящий белок-тиоэстеразу Ricinus communis
<400> 92
atggcatcaa agggctcaat tagattatat tttccatgtg acttcagaaa tactttacag      60
aaaaagaata tgaaaatgga catggtaatg gcgagatcag gattctcata ttcacttaat     120
ccaattgcgc caaagattcc aagattctat gttgtcgcta atgcgtcaaa tccacagaga     180
gttgatacca ttaatggcaa aaaagttaat ggtatacatg ttgcagagtc atcaaattct     240
tatgcggatc agaataagat gaatgcaacc gcgggtttag tcttagacgg caatgtagat     300
catcagccac ttcataagtg gcttttaggt agattcgttg acgaaagact tgtttattca     360
caaaccttca ttattagaag ttatgagatt ggtccagata agaccgcgac tatggaaacc     420
ttaatgaatt tacttcaaga aaccgcactt aatcatgtta cctcatcagg ccttgcggga     480
gatggttttg gtgcgactag agagatgtca ctaagaaaac taatttgggt ggtaactaga     540
attcatattc aagtccagag gtattcatgt tggggggatg tggttgaaat agacacctgg     600
gttgacggcg caggcaagaa tggaatgaga agagactgga ttattagaga ctataatacc     660
aaagaaataa ttactagagc aacctcaacc tgggtcatta tgaatagaga aactagaaag     720
ctttcaaaga tgccagagca agttagacaa gagttagttc cattctatac caatagaatt     780
gcaattgcga aagagaataa tgacgttgag aaaattgaca agttaaccga cgaaaccgcg     840
gagagaattc gatcagggct tgcgcctaga tggtcagaca tggacgccaa tcaacatgtg     900
aataatgtta agtatattgg ctggattctt gaatcagtac ctattaatgt acttgaggac     960
tataatctta cctcaatgac ccttgagtat agaagagaat gtagacagtc aaatctttta    1020
gagtcattaa ccagtaccac cgaacattca aataataatt cttgtaatag aaaggcccat    1080
ttagaatata cccatttact tagaatgcaa gcggataaag cggaaattgt tagagcaaga    1140
actgagtggc agtcaaagtc aaatagaaaa accatt                              1176
<210> 93
<211> 1257
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая пальмитоил: ацилпереносящий белок-тиоэстеразу Ricinus communis
<400> 93
atggtggcga ccgcagcagc agcaacctca tcatttttcc cagtcccatc acaatcagcc      60
gacgcgaatt tcgacaaagc accagcgtca cttggcggca ttaaactaaa atcaacttca     120
tgttctagag gattacaggt taaagcaaat gcacaagcgc ctccaaagat aaatggatca     180
tcagttggtt tcaccacttc agtagaaacc gttaagaatg acggtgatat gcctttacct     240
ccaccaccaa gaaccttcat taatcagtta ccagactggt ctatgttact tgcggccatt     300
accaccattt tcttagcggc tgaaaagcag tggatgatgc ttgattggaa gccacgtaga     360
ccagacatgc ttattgatcc atttggcatt ggaagaattg tccaagacgg gttaatattt     420
agacagaatt tctcaattag aagttatgag attggtgcag acagaaccgc gtcaattgag     480
actttaatga atcatcttca agaaaccgcg ttaaatcatg ttaaaaccgc gggtctttta     540
ggtgacggtt tcggttcaac tccagaaatg agtaaaagaa atctaatttg ggttgtcacc     600
agaatgcaag ttttagtaga cagatatcca acctggggtg atgttgttca ggttgatact     660
tgggtttcaa aatctggtaa gaatggcatg agaagagact ggtgtgtgag agactcaaga     720
accggcgaaa cccttacccg agcgtcatca gtatgggtaa tgatgaataa gcttaccaga     780
agattatcaa agattccaga agaagtgaga ggcgaaattg agccatattt ccttaattca     840
gacccaattg tagacgaaga ttcaagaaag cttcctaaac ttgacgactc aaatgcggac     900
tatgttagaa aaggtttaac ccctagatgg tcagatcttg acataaatca acatgtgaat     960
aatgttaagt atattggttg gattcttgag tcagcgccat taccaattct agagtcacat    1020
gaactttcag cgattaccct tgagtataga agagaatgtg ggagagactc agttcttcag    1080
tcacttaccg cggtttcagg caatggcatt ggcaatcttg gcaatgcggg ggatattgag    1140
tgtcagcatt tacttagatt agaagatgga gcagagattg ttagaggtag aactgagtgg    1200
aggccaaagt attcatcaaa tttcggcatt atgggccaaa ttccagtcga gtcagcg       1257
<210> 94
<211> 1215
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая Jatropha curcas ацил: АЦП-тиоэстеразу
<400> 94
atggcagtat tcacctatag aattgcgatg ttaccaatta gatgttcatc atcaaattca      60
accaattcac attcacatga cccaaatcaa cagaatttac ataagattaa gattaatggc     120
tcagcgtcag cgatgatgcc tcttaaggtt gatttaccaa gttcattgac gattacctca     180
gttgcaccag ttgtagagaa tctttcatta actaaagaac aaaccagaca gaatattcca     240
accaagaagc agtatattga cccacataga caaggtctta ttgtcgaaga gggcgttggt     300
tatagacaga ccgtcgttat tagatcttat gaagttggcc ctgacaaaac cgcaaccctt     360
gagattatac tttgtctact tcaagagact gcgttaaatc atgtttggtt atcaggctta     420
ctttcaaatg gttttggggc gacccatgga atggtgagaa ataatcttat ttgggttgtt     480
tcaaaacttc aggtacaagt tgatcaatat ccaatttggg gcgaagttgt cgagattgac     540
acttgggttg gcgcgagtgg caagaatggt atgcgaagag actggcttgt tagatcacag     600
gcgaccggcc aggtatttgc aagggccacc tcaacctggg ttatgatgaa tgagaaaact     660
agaagattat caaaaatgcc agaagaagtg agagcggaaa ttgcgccatg gttcattgag     720
aagcaagcga ttaaagaaga agtgccagag aagattgcaa aactagacga taaggcgaga     780
tatgtagtta ccaatcttaa gcctaaaaga tcagaccttg acatgaatca gcatgtgaat     840
aatgtcaaat atgttagatg gatgcttgaa accttaccag atcaattctt cgagaatcat     900
cagttatcag gtattacttt agagtataag agagaatgtg gatcatcaga tatagtagag     960
tcattatgtg agccagacga agaggaaggg attataaata ccggacttaa gcagaataat    1020
gacaaatcac tattcaatgg tttctcactt ccatcagaga ttatggaagg taatggtttc    1080
ctttcatcat tagaaaagac ccctcttaag tatactcatc ttttagttgc aaaagggaaa    1140
acccaatctg aggaaattgt tagaggcaag accatttgga aaaagaaatt acttaccacc    1200
atgccatttt cacca                                                     1215
<210> 95
<211> 1044
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая Jatropha curcas ацил: АЦП-тиоэстеразу
<400> 95
atggtttcaa ccgcgatttc attttcactt ttaccaatta agttaattaa agaagaaact      60
agaatggcct cagcggacag aagaaagaat tcaattgtaa aagaattcgg tcatttcacc     120
tgtagatgtg cagcgattga aaagagaatt caaaaactta ataatttctt aatagacggc     180
ggcttcggct cattagagca aaatggtctt atatatagac agaatatttt cattagatca     240
ttcgagattg gattcgacag aaagctttca ttagcagcgt tgaccaattt ccttcaggac     300
accgcgctta atcatgttag aatgattggc ttacttgcag cgggtttcgg cagtactcca     360
gaaatgtcaa agaaagacct tatttgggtt ttatgtacct tacagattct tgttgacaga     420
catccttcat ggttagatgc agttgaggtc gacacctgga tgtatccatc aggccagaat     480
gggcaaggta gagactggct tgttagagat gcgaaaaccg gaaagccact tgcgcaggca     540
tcttcagtta tggttctatt aaataaaaag accagaaaac tttctaagtt taccgaagag     600
attagagatg aaattgcgcc acatatgatg atggactgta atccaattat taattcaaga     660
aaaatgctac catttgacgt gaatactgcg gattatgcaa gaaccggtct taccccaggt     720
tggaatgacc ttgaccttaa tcagcatgta aatcatgtcc aatatattaa ttggatttta     780
caaaatgttt taagatcact tattcaacat cataagttat cagatattac cttagagtat     840
agaaaagagt gtgacataaa ttcaattctt cagttccttt caaagattgt gaaaaatggg     900
tcaaatcatt caaccgatac caataatcta attgagttag accattcact tcttttagaa     960
aatggctcag agattgcgcg agcgaatact atttggaagc caagagaagt aaataatttt    1020
aagaatgcag tttatacccc tgcc                                           1044
<210> 96
<211> 1071
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая Jatropha curcas ацил: АЦП-тиоэстеразу
<400> 96
atggcatcaa ccgcgattag tttcctttca attccaatta agcttattaa agaagagatg      60
agaatggcgt cagcgggaag aagaaagaat actattgcag cagaattcgg ccatttcacc     120
ttcggctcag cgactgttga gaaaaaagtc caaaagtcaa ataatttctt aattgatggc     180
gggtttggct cattagaaca gaatgggtta atatatagac agaatatttt cgtgaggtca     240
ttcgagattg gttttgaccg aaagttatca ttagcagcgc ttaccaattt tctacaggac     300
actgcgctta atcattgtag aatgattggc ttattagccg agggtttcgg atcaacccca     360
gaaatgatta agaaagacct tatttgggtt ctttgtaccc ttcaaattct tgttgacgga     420
tatccatcat ggcttgacgt tgttgaggtc gacacctgga tgtatccttc aggtcaaaat     480
ggtcttggca gaggttggtt agtaagagat ggcaagactg gcagatcatt agcgcagtca     540
tcatcagtta tggtgtcatt caataagaaa accagaaaac tttctaagtt agcgaaagaa     600
attagagatg agattgcacc acacatgatg gattgtgacc caattatgaa taagaattca     660
agaaagatac ttccattcga tgtaaatacc gcagactatg cgagaaccgg ccttacccca     720
ggttggaatg aattagactt aaatcagcat gttaatcatg tccagtatat taattggatt     780
ttacaaaatg ttagaccttc acttgttcaa catcataagc tttcagcgat taccttagaa     840
tatagaaaag agtgtgacat gaattcaatt ctacaatcac tttcaagaat tgttaagaat     900
ggtgggaatg atagtaccga caagaataat gttattgagt tagaccattt tcttcttcta     960
gagaatggtt cagaaattgc gagagcgaat accatttgga aaccaagaga agtaaataat    1020
ttcaaaaatg tagtgcattc accagcagaa gagaatatat cttcaatgaa t             1071
<210> 97
<211> 396
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность FadM E. coli
<400> 97
atgcaaactc agattaaggt tagaggctat catctagacg tttatcaaca tgtgaataat      60
gcgagatatc ttgagttcct tgaagaagcc agatgggacg gtttagagaa ttcagattca     120
tttcagtgga tgaccgcaca taatattgca ttcgtagtgg tcaatattaa tataaattat     180
agacgaccag cggtcttatc agacctttta accattacct cacaacttca acagttaaat     240
ggaaagtcag ggattctttc acaggttatt acccttgaac cagagggtca ggttgtagca     300
gatgcgctta ttaccttcgt ttgtattgac cttaaaactc aaaaagcgtt agcgcttgaa     360
ggcgagttaa gagaaaagtt agagcagatg gttaaa                               396
<210> 98
<211> 957
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность AccA E. coli
<400> 98
atgtcattaa atttcttaga ctttgaacaa ccaatagcag aacttgaagc gaaaattgat      60
tcattaaccg cagtttcaag acaagatgaa aagttagaca ttaatataga cgaagaagtc     120
catagactta gagaaaaatc agttgagtta actagaaaga ttttcgcaga ccttggtgca     180
tggcagattg cgcaacttgc aagacatcca caaagaccat ataccttaga ctatgtaaga     240
ttagcatttg acgagttcga cgagcttgcg ggtgaccgag cgtatgcgga cgataaagca     300
attgttggtg gcattgccag attagacgga aggccagtta tgattattgg acatcagaaa     360
gggagagaga ctaaggaaaa gattagaaga aatttcggca tgccagcacc agagggctat     420
agaaaggcac ttagacttat gcagatggcg gaaagattca agatgccaat tataaccttc     480
attgataccc ctggagcgta tccaggcgtt ggcgccgaag agagaggcca atcagaggcg     540
attgcgagaa atcttagaga gatgtcaaga ctaggtgtgc ctgtagtatg taccgttatt     600
ggcgagggtg gaagtggcgg tgcccttgcg attggggttg gtgacaaagt gaatatgtta     660
cagtattcaa cctattcagt catttcacct gagggctgtg cgtcaattct ttggaaatca     720
gcggacaaag cgccattagc ggcagaggcg atggggatta ttgcaccaag acttaaagaa     780
ctaaagctta ttgattcaat tattccagag ccacttggtg gtgcgcatag aaatccagaa     840
gcgatggcag cgtcattaaa ggcgcagtta ttagcggatc tagcggactt agacgttctt     900
tcaaccgaag atcttaagaa tagaagatat cagagactta tgtcttatgg ttatgca        957
<210> 99
<211> 468
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность AccB E. coli
<400> 99
atggatatta gaaagataaa gaaactaatt gagttagtcg aagagagtgg tatatcagag      60
ttagaaattt cagagggtga agaatcagtt agaatttcaa gagcggcacc agcggcctct     120
ttcccagtca tgcagcaagc gtatgcggca ccaatgatgc agcaaccagc ccagtcaaat     180
gcggcagcgc cagcgaccgt accatcaatg gaagcgccag cagcagcgga gatttcaggc     240
catattgtta gatcacctat ggttggtacc ttctatagaa ccccttcacc agacgcgaaa     300
gcgtttattg aagtgggaca aaaggttaat gtaggcgata ccctttgtat tgttgaggca     360
atgaaaatga tgaatcagat tgaagcggac aaatcaggca ctgttaaggc aattcttgta     420
gagtcagggc aaccagttga gttcgacgaa ccacttgtgg ttattgaa                  468
<210> 100
<211> 1347
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность AccC E. coli
<400> 100
atgttagaca agattgttat tgcaaataga ggggaaattg cgcttagaat tcttagagcg      60
tgtaaagaat taggcattaa gactgttgca gttcattcat cagcagacag agatcttaaa     120
catgttttac ttgcggacga aaccgtttgt attggtccag caccatcagt aaagtcatat     180
cttaatattc cagccattat ttcagccgcg gagattaccg gagcggtagc gattcatcca     240
ggttatggct tcttatcaga gaatgcgaat ttcgcagaac aagttgagag atcaggattc     300
attttcattg gtccaaaggc agaaaccatt agattaatgg gcgacaaggt ttcagcgatt     360
gcggcgatga aaaaggcagg cgtcccatgt gttccaggct cagatggccc attaggtgac     420
gatatggaca agaatagagc catagcgaaa agaatagggt atccagtaat tataaaggcg     480
tctgggggtg gcggtggtag aggtatgaga gtagtcagag gcgacgcaga gctagcacaa     540
tcaatttcaa tgaccagagc ggaagcaaaa gcggcattct caaatgacat ggtgtatatg     600
gagaagtatt tagagaatcc aagacatgtg gagattcaag ttcttgcgga cggccagggt     660
aatgcgattt atcttgcgga aagagactgt agtatgcaga gaaggcatca gaaagttgtt     720
gaagaagcac cagcgccagg tattacccct gaacttagaa gatatatagg cgagagatgt     780
gcaaaggcgt gtgttgacat tggttataga ggggcaggga cctttgagtt tctttttgag     840
aatggagagt tctatttcat tgaaatgaat accagaattc aagttgaaca tcctgttacc     900
gagatgatta ccggcgtgga cttaattaaa gagcaattaa gaattgcagc gggccagcca     960
ctttcaatta agcaagaaga agtccatgtt agaggacatg cggtcgagtg tagaattaat    1020
gcggaagatc ctaatacttt cttaccatca ccaggcaaga ttaccagatt ccatgcacct    1080
ggtggtttcg gtgtaagatg ggaatcacat atttatgcgg gctatactgt tccaccatat    1140
tatgactcaa tgattggtaa acttatttgt tatggagaga atagagatgt agcgattgcg    1200
agaatgaaaa atgctttaca agaactaatt attgacggta ttaagaccaa tgtggatctt    1260
cagattcgaa ttatgaatga tgagaatttt cagcatggcg gcaccaatat acattatctt    1320
gagaagaaac ttggattaca ggaaaaa                                        1347
<210> 101
<211> 912
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность AccD E. coli
<400> 101
atgtcatgga tagaaagaat taagtcaaat attaccccaa ccagaaaggc gtcaattcca      60
gagggcgtat ggaccaagtg tgactcatgt ggtcaggttc tttatagagc cgaattagaa     120
agaaatcttg aggtttgtcc aaaatgtgac catcacatga gaatgaccgc aagaaataga     180
ttacattcac ttttagacga aggctcactt gtggaattag gctcagagct tgaaccaaaa     240
gacgttctta agttcagaga cagtaagaag tataaagata gattagcatc agcacagaaa     300
gagactgggg agaaagatgc gttagtggtc atgaaaggta ccttatatgg aatgcctgtc     360
gttgcagctg cgttcgaatt cgcgtttatg ggcggttcaa tgggttcagt tgtaggcgcg     420
agattcgtta gagcagttga acaggcgtta gaagataatt gtccactaat ttgtttttca     480
gcgtctggtg gtgcaagaat gcaagaagca ctaatgtcac ttatgcaaat ggcgaaaact     540
tcagcggcgc ttgcaaagat gcaagagaga gggttaccat atatttcagt tcttaccgac     600
ccaaccatgg ggggtgtctc agcgtcattc gcgatgttag gcgacttaaa tattgccgag     660
ccaaaagcac ttattggctt cgcgggacca agagtgattg aacagaccgt tagggaaaag     720
cttccacctg gatttcagag atcagagttc cttattgaaa aaggcgcgat tgatatgata     780
gttagacgac cagagatgag attaaagctt gcgtcaattc ttgcaaagtt aatgaatctt     840
ccagcgccta atccagaagc accaagagag ggtgttgtag tacctccagt tccagaccaa     900
gagccagagg cg                                                         912
<210> 102
<211> 568
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность TesA E. coli с удаленной последовательностью нацеливания на периплазму
<400> 102
ggtctctaat ggcagacaca cttttgatct tgggcgactc actttccgcg ggctatcgta      60
tgagtgcgtc cgcggcgtgg cccgcgctgc tgaacgacaa gtggcagagc aagacctccg     120
tcgtcaacgc gtccatctcg ggcgacacga gccagcaggg actggcccgc ctcccggcgc     180
tgctcaagca gcatcagcca cgctgggtgc tcgtcgagct gggtggcaac gacgggctcc     240
gcggcttcca accgcagcag accgaacaga ccctccggca aattctccaa gacgtcaaag     300
cggccaacgc ggagcccctg ctgatgcaga tccgcctgcc ggcgaactac ggtcggcgtt     360
ataatgaggc gttcagcgcc atctatccga agctggccaa ggaattcgac gtgcccctcc     420
tcccgttttt catggaagaa gtgtacctca agccccagtg gatgcaagac gacggcatcc     480
acccgaatcg cgacgcgcag ccgttcatcg cggactggat ggcgaagcag ctgcagccgc     540
tcgtaaacca cgactcgtaa aagagacc                                        568
<210> 103
<211> 568
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность TesA E. coli с удаленной последовательностью нацеливания на периплазму
<400> 103
ggtctctaat ggctgatacc ctcttgattc ttggtgattc ccttagcgcc ggctaccgca      60
tgtccgcgag cgccgcatgg ccggcgctgc tgaatgacaa gtggcagtcc aagacctcgg     120
tcgtcaatgc gagcatcagc ggcgacacct cgcagcaggg cctcgcgcgg ctgccggccc     180
tcctgaagca acatcagccg cgctgggtac tcgtggagct cggcggcaat gatgggctgc     240
gtggcttcca gccccaacag accgagcaga cgttgaggca gatcctccaa gacgtgaagg     300
cagcgaatgc ggagcctctc ctcatgcaga tccggctgcc cgcgaattat ggccgccgtt     360
acaacgaggc cttctcggcg atctatccga agctcgcgaa agagttcgac gtcccgctgc     420
tgcccttctt tatggaggag gtgtacctga agccgcaatg gatgcaggat gacggcatcc     480
acccgaaccg ggacgcgcag cccttcatcg ccgattggat ggcgaagcag ctgcagccgc     540
tggttaatca tgacagttaa aagagacc                                        568
<210> 104
<211> 568
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизированная последовательность TesA E. coli с удаленной последовательностью нацеливания на периплазму
<400> 104
ggtctctaat ggccgatacc ctgctgatcc tcggcgattc acttagcgct ggataccgca      60
tgagcgcctc ggctgcgtgg cctgcactcc tcaacgacaa gtggcagagc aagacctcgg     120
tggtcaacgc gtccatttcg ggcgacacca gtcagcaggg cctcgccagg ctgcctgccc     180
tgctgaagca acatcagccg cgctgggtcc tggtcgagct tggcggcaac gacggcctcc     240
gggggttcca gccgcaacag acggagcaga cgttgcggca gattctccag gatgtaaagg     300
cggcgaatgc cgagccgctc ctgatgcaga tcaggctccc ggccaactat ggtcgccgct     360
ataacgaggc gttctccgca atctacccca agctggcaaa agaattcgac gtgccgctgc     420
tgccattttt catggaagaa gtgtacctca agccgcagtg gatgcaagat gatggtatcc     480
accccaaccg ggacgcccaa cccttcatcg ccgactggat ggcgaagcag ctgcagcccc     540
ttgtcaatca cgactcctaa aagagacc                                        568
<---