Разработка комплекса ПЦР для выявления антибиотикоустойчивых штаммов Yersinia pestis и Escherichia coli

2012, Т. 2, № 1-2

Современное лабораторное обеспечение.

личения количества больных на поздних стадиях ВИЧ-инфекции, при которых ТБ развивается как вторичное заболевание, быстрое определение резистентности к противотуберкулезным препаратам (ПТП) влияет на положительный исход заболевания. Золотым стандартом среди быстрых тестов является метод прямого секвенирования.

Целью нашей работы явилось сравнение определения чувствительности МБТ к основному ПТП рифампицину с помощью культурального метода и секвенирования.

Материалом для исследования явилось 135 образцов мокроты от 128 больных легочным туберкулезом, у которых традиционными микробиологическими методами было определено бактериовыделение. При исследовании методом секвенирования с помощью набора реагентов «АмплиСенс МТС-Rif-seq» (производства ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) 33 образцов от 32 впервые выявленных больных ТБ без ВИЧ-коинфекции, в 37,5% случаев была выявлена устойчивость к рифампицину. В то время как при тестировании 12 образцов у аналогичной группы из 11 больных ВИЧ/ТБ, она была обнаружена в 45,5% случаев. Исследование 77 образцов мокроты у 72 больных хроническим ТБ, выявило наличие резистентного ТБ у 80,6% больных без ВИЧ-инфекции и у 84,6% из 13 больных на поздних стадиях ВИЧ-инфекции.

Метод секвенирования позволяет не только подтвердить наличие резистентности, но и определяет все возможные виды мутационных изменений в rpoB-гене. Кроме того, он позволяет выявить одновременное присутствие смеси штаммов МБТ в организме одного пациента. Среди всех проанализированных нами образцов в 99 были обнаружены мутации, при этом 8 образцов представляли собой смеси штаммов. Из 13 обнаруженных вариантов мутаций наиболее частой явилась 531 Leu, встретившаяся в нашей выборке в 69,4% случаев.

Время, требуемое для определения чувствительности МБТ методом секвенирования, составило 2— 4 дня, тогда как получение результатов с помощью культурального метода — 58,2+15,6 дней.

Таком образом, метод секвенирования позволяет в кратчайшие сроки получить более информативные, по сравнению с культуральным методом, данные о резистентности МБТ, необходимые для корректного лечения больных ТБ на фоне его распространения, в том числе у больных на поздних стадиях ВИЧ-инфекции.

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ПАТОГЕННОСТИ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ В ОЦЕНКЕ ИХ ЭТИОЛОГИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТИ ПРИ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЯХ У ДЕТЕЙ

Е.В. Анганова12, Е.Д. Савилов12, А.В. Духанина1, Н.Н. Чемезова1, Л.А. Распопина3

1ФГБУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» СО РАМН, г. Иркутск; 2ГБОУДПО «Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования», г. Иркутск; ЮГБУЗ «Иркутская областная инфекционная клиническая больница», г. Иркутск

Факт выделения условно-патогенных энтеро-бактерий (УПЭ) при острых кишечных инфекциях (ОКИ), как и их количественная оценка не всегда

определяют способность изолята вызывать заболевание (Бондаренко В.М., 2011). Для выявления этиологической значимости энтеробактерий при ОКИ необходимо заключение об их патогенном потенциале на молекулярно-генетическом уровне.

Клинические штаммы УПЭ (представители родов Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Kluyvera, Morganella, Pantoea, Serratia и Providencia), выделенные от детей с ОКИ, находящихся на лечении в Иркутской областной инфекционной клинической больнице, протестированы на наличие следующих генетических маркеров патогенности: sfaA, sfaG гены, ответственные за адгезию S типа, fimA ген — адгезия 1 типа, hlyA, hlyB — продукция гемолизинов, irp-2 — синтез железорегулируемо-го белка. Выявлена генотипическая гетерогенность энтеробактерий по оцениваемым признакам. Нуклеотидные последовательности генов, кодирующих указанные факторы патогенности, обнаружены у 23,4% штаммов. Наибольшая частота обнаружения была характерна для hlyA и hlyB генов (9,7% от всех протестированных штаммов и 60,9% от штаммов с наличием нуклеотидных последовательностей искомых генов). Среди генов, ассоциированных с адгезией, чаще обнаруживались маркеры sfaA и sfaG, а частота встречаемости генетических детерминант адгезинов 1 типа (fimA) оказалась значимо ниже (p < 0,05). Наибольшую долю среди штаммов с наличием генетических детерминант патогенности составили Klebsiella spp. и Citrobacter spp. (39,0 и 24,4% соответственно). Самый широкий набор маркеров патогенности отмечен у штаммов Klebsiella spp. (sfaA, sfaG, fimA, hlyB, hlyB, irp-2). Выявлена связь между наличием генетических детерминант патогенности у выделенных от больных детей штаммов энтеробак-терий и клиническими проявлениями вызываемых ими инфекций (продолжительность и уровень лихорадки, а также длительность диареи). Полученные данные свидетельствуют о целесообразности определения генетических маркеров патогенности условно-патогенных энтеробактерий для выявления их этиологической значимости.

РАЗРАБОТКА КОМПЛЕКСА ПЦР ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВЫХ ШТАММОВ YERSINIA PESTIS И ESCHERICHIA COLI

Л.В. Анисимова, К.А. Никифоров, Г.Н. Одиноков, Г.А. Ерошенко, В.В. Кутырев

ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», г. Саратов

Штаммы, циркулирующие в природных очагах чумы, как правило, чувствительны к действию различных антибиотиков, однако, в 1995 г. на о. Мадагаскар от больного чумой был выделен штамм Yersinia pestis c множественной лекарственной устойчивостью к стрептомицину, хлорамфениколу, тетрациклину, канамицину, ампициллину, спекти-номицину, сульфониламидам. Изучение резистентного штамма Y. pestis показало, что гены устойчивости к антибиотикам расположены на конъюгативной плазмиде pIP1202, которая могла с высокой частотой передаваться другим штаммам возбудителя чумы. В течение трех последующих лет на этой же территории было изолировано еще несколько антибио-тикоустойчивых штаммов Y. pestis. В 2002—2005 гг. у штаммов салмонелл и у других энтеробактериаль-

Материалы X съезда ВНПОЭМП, Москва, 12-13 апреля 2012 г.

Инфекция и иммунитет

ных патогенов, выделенных из различных продуктов в США, были выявлены плазмиды, практически идентичные плазмиде pIP1202. О возрастающем распространении антибиотикоустойчивых бактериальных штаммов свидетельствует также большая вспышка острой кишечной инфекции в Германии, вызванная энтерогеморрагической кишечной палочкой E. coli 0104:H4, с завозом инфекции в другие страны Европейского региона и США. Используемые в настоящее для определения антибиотикоустойчи-вости микробиологические методы занимают достаточно продолжительное время, что затрудняет своевременный выбор препарата для лечения больного человека. Большей эффективностью и быстротой получения результатов отличается метод ПЦР, предназначенный для детекции различных генов пато-генности.

Нами разработан комплекс ПЦР для выявления у штаммов Y. pestis и E. coli генов резистентности к различным антибиотикам. На основе нуклеотид-ных последовательностей плазмид антибиотикоре-зистентности Y. pestis, представленных в базе данных NCBI GenBank, а также данных литературы по анти-биотикоустойчивым патогенным штаммам E. coli нами сконструированы олигонуклеотидные прай-меры для детекции генов резистентности к стрептомицину, тетрациклину, хлорамфениколу, кана-мицину, полимиксину, ванкомицину, гентамицину. Подобраны оптимальные условия проведения ПЦР. Разрешающая способность сконструированных ПЦР исследована на коллекции антибиотикостойчивых штаммов Y. pestis и E. coli и показана их эффективность для выявления резистентных к лекарственным препаратам штаммов бактерий. Разработанный способ позволяет быстро и эффективно проводить детекцию генов антибиотикоустойчивости у штаммов Y. pestis и E. coli.

ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ЛЕКТИНСВЯЗЫВАЮЩЕГО КОМПОНЕНТА LACTOBACILLUS FERMENTUM 90 TS-4 (21) В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ЦЕНОЗАХ С ДРОЖЖЕПОДОБНЫМИ ГРИБАМИ И.В. Анохина, Э.Г. Кравцов, Я.А. Рыбас Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов», медицинский факультет, Москва

Было протестирванно 20 клинических изолятов дрожжеподобных грибов Candida albicans на предмет зависимости их адгезивной активности от динамики менструального цикла и возможности влиять на эту адгезию лектинсвязывающим компонентом, выделенным из культуральной жидкости молочнокислых бактерий [Lactobacillus fermentum 90 TS-4(21)].

Установленно, что для 75% изолятов дрожжеподобных грибов Candida albicans изменение гормонального фона организма женщины является существенным фактором в процессе адгезии к клеткам-мишеням (влагалищные эпителиоциты). Прослеживается значимое увеличение адгезии в период овуляции и резкое снижение последней в начале и в конце менструального цикла.

Если выделенные на 9 день менструального цикла клетки-мишени проинкубировать с лектинсвя-зывающим компонентом, то из 20 клинических изо-

лятов торможение адгезии проявится у 35% культур. При инкубации влагалищных эпителиоцитов с лек-тинсвязывающим компонентом в период овуляции торможение адгезии демонстрирует 90% дрожжеподобных грибов Candida albicans. Среди этих изолятов 12 культур претерпевают сдвиг адгезивной активности в сторону увеличения в контроле и уменьшения в опыте. Обработка клеток-мишеней лектинсвязыва-ющим компонентом в конце менструального цикла сокращает количество отвечающих на это действие культур до 45%.

Таким образом, среди 20 клинических изолятов дрожжеподобных грибов Candida albicans 75% культур представлены гормонзависимыми, 25% — гор-моннезависимыми микроорганизмами. Попытки модулировать адгезивную активность с помощью лектинсвязывающего компонента молочнокислых бактерий выявили, что наибольший ингибирую-щий эффект проявляется в отношении гормонза-висимых культур дрожжеподобных грибов Candida albicans и только в овуляционную фазу менструального цикла.

САЛЬМОНЕЛЛЕЗ, ВЫЗВАННЫЙ SALMONELLA ENTERICA СЕРОВАРА ORANIENBURG, СВЯЗАННЫЙ С УПОТРЕБЛЕНИЕМ СУХОЙ МОЛОЧНОЙ СМЕСИ ДЛЯ ДЕТЕЙ

М.В. Афанасьев1, М.В. Чеснокова1, Р.И. Пещерова1, Л.П. Нурсаянова2, Н.С. Казановская3, М.Ю. Шестопалов1, С.В. Балахонов1

ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, г. Иркутск; 2Управление Роспотребнадзора по Иркутской области, г. Иркутск; 3ФБУЗ Центр гигиены и эпидемиологии по Иркутской области, г. Иркутск

В этиологической структуре пищевых зоонозов сальмонеллез занимает лидирующие позиции, как в мире, так и в Российской Федерации. Среди сальмонелл, вызывающих заболевания людей, преобладают возбудители S. enterica сероваров Enteritidis и Typhimurium. В связи с этим, зарегистрированные случаи сальмонеллеза в г. Усолье-Сибирское Иркутской области с 2 ноября 2011 г. по 16 января 2012 г. среди детей, обусловленные редко встречающимся сероваром Oranienburg, и связанные с употреблением сухой адаптированной молочной смеси, представляются достаточно интересными. В процессе эпидемиологического расследования было изучено 13 штаммов S. enterica, выделенных от больных детей (n = 7; 53,8%; от 2 до 7 мес.), взрослых (n = 2; 15,4%; 24—27 лет) и образцов молочной смеси (n = 4; 30,8%). Изоляция штаммов, их микробиологическая и серологическая характеристика проводилась стандартными методами. В качестве дополнительного теста выполнялась ускоренная масс-спектрометрическая идентификация с применением MALDI-ToF масс-спектрометра Microflex и программного комплекса «Biotyper» (Bruker Daltonics, Германия). Расширенная генетическая характеристика штаммов включала ПЦР-детекцию гена инвазивности inv А, изучение плазмидного спектра и сравнительный анализ рестрикционных профилей, полученных с помощью эндонуклеаз рестрикции XbaI и SpeI методом электрофореза в переменном поле (PFGE-анализ). Все исследованные штаммы имели типичные для вида биохимические