Способ для диагностирования рака молочной железы на основе набора генов длинных некодирующих РНК
METHOD FOR DIAGNOSING BREAST CANCER BASED ON A SET OF LONG NON-CODING RNA GENES

Настоящее изобретение относится к области фундаментальной медицины и касается способа для диагностирования рака молочной железы (РМЖ) путем оценки статуса метилирования набора генов длинных некодирующих РНК (нкРНК): HAND2-AS1, KCNK15-AS1 и PLUT. Заявленный способ основан на анализе метилирования набора из трех генов днРНК и позволяет диагностировать РМЖ со 100%-ой специфичностью, 82%-ой чувствительностью и высокой достоверностью (AUC=0.978). Выявление метилирования двух любых генов данного набора в ДНК из ткани молочной железы позволяет диагностировать РМЖ у данной пациентки с указанной точностью. Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее распространенным раком среди женщин. Так, по оценкам экспертов, в 2020 году, зарегистрировано около 2,3 миллиона новых случаев РМЖ, что составляет 11,7% от общего числа случаев рака. Данный вид онкологии занимает 1-е место по заболеваемости в большинстве стран мира (159 из 185) и по смертности в 110 странах, в том числе и в России. Сложность задействованных молекулярных путей затрудняет решение этой проблемы, но также предоставляет возможности для открытия новых маркеров и терапевтических мишеней. Появление геномики и технологий секвенирования нового поколения позволило по-новому взглянуть на участие нкРНК, включая микроРНК и длинные нкРНК, а также на роль метилирования их генов в регуляции опухоль ассоциированных белок-кодирующих генов и оценить их клинический потенциал.
Нами ВПЕРВЫЕ в образцах ДНК опухолей больных РМЖ обнаружен статистически значимо повышенный уровень метилирования 5 генов длинных нкРНК (HAND2-AS1, KCNK15-AS1, PLUT, SEMA3B-AS1, SSTR5-AS1) относительно ДНК парных гистологически нормальных тканей молочной железы тех же пациенток и относительно ДНК образцов тканей молочной железы «доноров» (людей, умерших не от онкологических заболеваний). На основе трех из этих 5 генов (HAND2-AS1, KCNK15-AS1, PLUT) составлен НОВЫЙ набор маркеров и разработан способ для диагностирования РМЖ со 100% специфичностью и высокой чувствительностью в биопсиях или резекционном материале пациенток.
Ранее имелись единичные сообщения о метилировании указанных генов при некоторых других видах рака, а именно: гена HAND2-AS1 при раке матки [1], гена KCNKI5-ASI -при раке желудка [21 и гена PLUT - в аденокарциноме легкого [3]. Однако не обнаружено сообщений о выявлении метилирования ни одного из указанных генов в опухолях больных РМЖ (на 30.06.2022).
По данным мировой литературы ранее имелись публикации по разработке способов диагностирования РМЖ. Так, в работе [4] проведен отбор дифференциально экспрессируемых длинных нкРНК и выявлено четыре транскрипта (ENST00000425820.1, ENST00000448208.5, ENST00000521666.1 и ENST00000650510.1) с наивысшей диагностической значимостью для наиболее злокачественного подтипа РМЖ, а именно трижды негативного РМЖ.
Описаны также наборы маркеров для диагностики РМЖ на основе метилирования циркулирующей в крови ДНК [5]. 26 маркеров показали чувствительность 89,37% и специфичность 100% для дифференциации РМЖ от тканей молочной железы здоровых женщин или доброкачественных изменений в молочной железе. При этом наилучший маркер cg23035715 показал чувствительность 84.90% и специфичность 93.88%. Ранее в патенте США US 11072830B2 (2021) для оценки риска развития РМЖ предложен набор однонуклеотидных полиморфизмов: rs2981582, rs3803662, rs889312, rs13387042, rs13281615, rs4415084, rs3817198, rs4973768, rs6504950, rs11249433 [6]. В патенте WO 2021/170777 A1 (2021) авторы изучили возможности применения межгенной длинной нкРНК LINC01087 как для диагностики, так и для прогноза и лечения РМЖ [7]. В отношении диагностики РМЖ данные таковы: уровень экспрессии LINC01087 повышается прибл. в 1.5 раза при люминальном РМЖ, и резко снижается при трижды-негативном РМЖ. Таким образом, этот подход может быть использован для диагностики трижды-негативного РМЖ, но не подходит для выявления РМЖ любого подтипа. В качестве ближайшего аналога рассмотрим патент ЕР 3268494 В1/ ES 2882104 Т3 (2021), в котором дан способ определения риска развития или наличия РМЖ у субъекта, основанный на определении уровня экспрессии наборов микроРНК в образцах биологической жидкости организма по сравнению с контролем [8]. Проведена оценка точности метода по величине AUC. Для отдельных микроРНК, как miR-409-3р, miR-25-3р, miR-186-3р, miR-324-5p величина AUC составила 0.81-0.86, а их комбинация позволила поднять эту величину до AUC ≥ 0.9. Однако данные по чувствительности и специфичности метода не представлены и не указана наиболее оптимальная комбинация маркеров.
Задача заявляемого изобретения - расширить арсенал способов диагностирования РМЖ за счет применения новых маркеров на основе группы генов длинных нкРНК.
Задача решена путем:
- разработки заявляемого способа диагностирования РМЖ на основе анализа уровня метилирования набора из трех генов длинных нкРНК (HAND2-AS1, KCNK15-AS1 и PLUT), позволяющего диагностировать РМЖ с высокой точностью путем выявления метилирования у любых двух генов из этого набора
Диагностику РМЖ осуществляют по методу:
Берут образцы ткани молочной железы у лиц, обследуемых для выявления онкологического заболевания. Выделение и очистку ДНК из образцов ткани молочной железы проводят методом фенол-хлороформенной экстракции. Качество и точную концентрацию ДНК определяют спектрофотометрически по соотношению оптической плотности при длинах волн 260 и 280 нм. Анализ уровня метилирования генов длинных нкРНК проводят с применением бисульфитной конверсии ДНК и количественной метил-специфичной ПЦР (qMSP) с детекцией в реальном времени, как описано в работе [9]. Для оценки значимости различий применяют непараметрический критерий Манна-Уитни. Различия считают значимыми при p<0.05. Расчеты проводят в системе для статистического анализа данных IBM SPSS Statistics 22. Далее проводят оценку порогового уровня на основании данных по уровню метилирования каждого гена в нормальных тканях молочной железы «доноров» [10]; значения порогового уровня для каждого гена учитывают затем для выявления его гиперметилирования в образцах доноров и в образцах опухолей РМЖ. Для набора генов длинных нкРНК рассчитывают специфичность и чувствительность набора маркеров методом ROC-анализа.
Пример 1. Анализ уровня метилирования трех генов длинных нкРНК HAND2-ASI, KCNK15-AS1 и PLUT, используемых в заявляемом способе для диагностики РМЖ.
Для анализа метилирования каждого гена используют две пары праймеров, специфичных как к метилированному, так и к неметилированному аллелю (Таблица 1). Используют набор реактивов «qPCRmix-HS SYBR» по протоколу фирмы Евроген. Амплификацию проводят в системе Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR Detection System (США) в соответствии с прилагаемым к прибору протоколом. Полноту конверсии ДНК определяют с помощью контрольного локуса АСТВ с использованием олигонуклеотидов специфичных к неконвертированной матрице [9]. Для сравнительного анализа эффективности амплификации также применяют локус АСТВ с использованием олигонуклеотидов, специфичных к конвертированной матрице. В качестве контролей для неметилированных аллелей используют коммерческий препарат ДНК #G1471 (Promega, США). В качестве позитивного контроля 100%-ого метилирования используют коммерческий препарат ДНК #SD1131 (Thermo Scientific, США). Соотношение уровней метилирования и их значимость оценивают с применением непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия считают значимыми при /К0.05. Уровень метилирования трех генов днРНК HAND2-AS1, KCNK15-AS1 и PL UT определен в 79 образцах РМЖ (Таблица 2) и в 17 образцах нормальных тканей молочной железы от «доноров», т.е. людей, умерших не от онкологических заболеваний (Таблица 3).
Пример 2. Оценка статуса метилирования трех генов длинных нкРНК HAND2-AS1, KCNK15-AS1 и PLUT с учетом порогового уровня.
Для выявления факта гиперметилирования исследуемых генов длинных нкРНК HAND2-AS1, KCNK15-AS1 и PLUT в опухолях был выбран пороговый уровень, который рассчитывался для каждого гена на основании данных, полученных для «доноров» (табл.2). Пороговый уровень равен N(mean) + 2SD, где N(mean) - средний уровень метилирования в норме («доноры»), SD - стандартное отклонение [10]. Примеры оценки статуса метилирования генов в клинических образцах РМЖ и в 17 образцах «доноров» даны в Таблице 4.
Пример 3. Оценка чувствительности и специфичности заявляемого способа для диагностирования РМЖ на основе набора маркеров (HAND2-AS1, KCNK15-AS1 и PLUT) с применением ROC-анализа.
Важным свойством заявляемого способа для диагностирования РМЖ и набора маркеров является высокая специфичность относительно ложно-положительных случаев и высокая чувствительность. С учетом данных по статусу метилирования трех генов (HAND2-AS1, KCNK15-AS1 и PLUT) в образцах 17 «доноров» и в 79 клинических образцах (табл.4) проведен анализ характеристик набора маркеров методом ROC-анализа, как показано на Рисунке. Согласно результатам ROC-анализа, чувствительность и специфичность заявляемого способа и набора маркеров для диагностирования РМЖ, составили 82.3% и 100%, соответственно, а величина AUC (Area Under the ROC Curve) составила 0,978, что близко к единице и существенно выше 0.9, что считается показателем высокой точности для набора маркеров. Таким образом, заявляемый способ позволяет диагностировать РМЖ с 82%-ой чувствительностью и со 100%-ой специфичностью, то есть строго специфично - у пациенток истинно больных РМЖ. Согласно параметрам, оценивающим набор маркеров (в частности, критерий >0,3333), необходимо и достаточно выявления метилирования двух любых маркерных генов из трех маркеров данного набора для диагностирования РМЖ у пациентки с указанной точностью.
Заявляемый способ для диагностирования РМЖ характеризуются тем, что
- Позволяет диагностировать РМЖ с высокой чувствительностью, 82,3%, и 100%-ой специфичностью при величине AUC близкой к единице (AUC = 0.978). Рассмотренный ближайший аналог (ЕР 3 268 494 В1/ ES 2 882 104 ТЗ, 2021) [8] позволяет диагностировать РМЖ при величине AUC ≥ 0.9, но данные по чувствительности и специфичности метода не представлены, а также не указана наиболее оптимальная комбинация маркеров.
Заявленное изобретение поясняется фигурой 1, на которой представлена характеристика методом ROC-анализа набора из трех маркеров (HAND2-AS1, KCNK15-AS1 и PLUT) для диагностирования РМЖ. Примечание: уровень значимости р<0,0001.
Цитированные источники научно-технической информации:
1. Yang X, Wang СС, Lee WYW, Trovik J, Chung TKH, Kwong J. Long non-coding RNA HAND2-AS1 inhibits invasion and metastasis in endometrioid endometrial carcinoma through inactivating neuromedin U. Cancer Lett. 2018 Jan 28;413:23-34. doi: 10.1016/j.canlet.2017.10.028. Epub 2017 Oct 26. PMID:29107108
2. Zhang H, Zhang Z, Wang D. Epigenetic regulation of IncRNA KCNKI5-ASI in gastric cancer. Cancer Manag Res. 2019 Sep 20; 11:8589-86()2. doi: 10.2147/CMAR.S 186002. PMID: 31572012
3. Kim-Wanner SZ, Assenov Y, Nair MB, Weichenhan D, Benner A, Becker N, Landwehr K, Kuner R, Siiltmann H, Esteller M, Koch I, Lindner M, Meister M. Thomas M, Bieg M, Klingmiiller U, Schlesner M, Warth A, Brors B, Seifried E, Bonig H, Plass C, Risch A, Muley T. Genome-Wide DNA Methylation Profiling in Early Stage I Lung Adenocarcinoma Reveals Predictive Aberrant Methylation in the Promoter Region of the Long Noncoding RNA PLUT: An Exploratory Study. J Thorac Oncol. 2020 Aug; 15(8): 1338-1350. doi: 10.1016/j.jtho.2020.03.023. Epub 2020 Apr 7. PMID: 32272161.
4. Shaath H, Elango R, Alajez NM. Molecular Classification of Breast Cancer Utilizing Long Non-Coding RNA (IncRNA) Transcriptotnes Identifies Novel Diagnostic IncRNA Panel for Triple-Negative Breast Cancer. Cancers (Basel). 2021 Oct 26;13(21):5350. doi: 10.3390/cancersl3215350. PMID: 34771513. S.Zhang X, Zhao D, Yin Y, Yang T, You Z, Li D, Chen Y, Jiang Y, Xu S, Ceng J, Zhao Y, Wang J, Li H, Tao j, Lei S, Jiang Z, Chen Z, Yu S, Fan JB. Pang D. Circulating cell-free DNA-based methylation patterns for breast cancer diagnosis. NPJ Breast Cancer. 2021 Aug 16:7(1): 106. doi: 10.103 8/s41523-021-00316-7. PMID: 34400642.
6. US 11072830 B2 (2021) David A. Hinds, Bryan Walser. Methods for breast cancer risk assessment.
7. WO 2021/170777 A1 (2021) Chiara Maiuri et al. Methods for diagnosing, prognosing and managing treatment of breast cancer.
8. EP 3268494 В1/ ES 2882104 T3 (2021). Heng-Phon Too et al. METHOD OF DETERMINING THE RISK OF DEVELOPING BREAST CANCER BY DETECTING THE EXPRESSION LEVELS OF MICRORNAS (MIRNAS)
9. Hattermann K., Mehdorn H.M., Mentlein R., Schultka S., Held-Feindt J. A methylation-specific and SYBR-green-based quantitative polymerase chain reaction technique for Об-methylguanine DNA methyltransferase promoter methylation analysis. Analytical Biochemistry. 2008. Vol.377, N 1, 62-71. doi 10.1016/j.ab.2008.03.014.
10. Lehmann U, Berg-Ribbe I, Wingen LU, Brakensiek K, Becker T, Klempnauer J, Schlegelberger B, Kreipe H, Flemming P. Distinct methylation patterns of benign and malignant liver tumors revealed by quantitative methylation profiling. Clin Cancer Res. 2005 May 15;11(10):3654-60. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-04-2462