Неспецифическая регуляция гормоном активности рецепторного аппарата клетки

УДК [612.018:612.017.1]

НЕСПЕЦИФИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ГОРМОНОМ АКТИВНОСТИ РЕЦЕПТОРНОГО АППАРАТА КЛЕТКИ

© 2010 г. А. В. Полетаева

Институт физиологии природных адаптаций УрО РАН, г. Архангельск

В работе приводятся новые сведения о неспецифической ингибиции рецепторной активности кластеров дифференциации лимфоцитов высокими концентрациями кортизола, тироксина, прогестерона, эстра-диола, тестостерона и окситоцина в условиях in vitro. Выявленная неспецифическая ингибиция активности кластеров дифференциации Т- и В-лимфоцитов объясняет формирование региональных особенностей гормонального профиля человека, проживающего в дискомфортных климатических условиях Севера. Ключевые слова: иммунная системы, фенотипы лимфоцитов, кортизол, тироксин, прогестерон, эстрадиол, тестостерон, окситоцин.

Эндокринная система и система иммунной защиты настолько тесно функционально связаны друг с другом, что представляются во многих отношениях единым комплексом, обеспечивающим защиту организма от чрезвычайных воздействий [1, 9—11]. Комплекс климатических неблагоприятных факторов Севера оказывает влияние на гормональный профиль жителей высоких широт, и этим проблемам посвящен целый номер журнала «Экология человека» (№7, 2009). Выброс гормонов в плазму регулируется по типу обратной связи концентрацией гормона в крови, которая, в свою очередь, зависит от интенсивности использования гормонов клетками. Эволюция рецепторов клетки к гормону идет по пути конкретизации специфичности, хотя целые группы гормонов пользуются одним и тем же внеклеточным рецептором [3, 4, 8]. Увеличение содержания гормона может приводить к снижению специфичности, когда гормон связывается не только со своим специфическим рецептором, но и с рецептором, близким по структуре [2, 4, 16]. Естественно, при этом рецепторная активность клетки может претерпевать значительные изменения. Для выявления возможных механизмов регуляции гормонального профиля человека на Севере путем изучения влияния гормонов на рецепторное взаимодействие кластера дифференциации (CD) и моноклональных антител в реакции идентификации фенотипа лимфоцитов in vitro использовали концентрации гормонов, соответствующих верхним границам их уровней в организме человека.

Цель работы — установить влияние кортизола, тироксина, прогестерона, эстрадиола, тестостерона и окситоцина in vitro на рецепторную активность лимфоцитов периферической крови у практически здоровых людей, проживающих на Европейском Севере Российской Федерации.

Методы

Исследована иммунологическая реактивность 300 человек (177 женщин и 123 мужчины) в возрасте от 40 до 57 лет, проживающих на территории Европейского Севера страны и практически здоровых на момент обследования.

Иммунологические методы исследования включали определение содержания в периферической крови лимфоцитов фенотипов CD3+, CD4+, CD8+, CD10+, CD16+, CD22+, CD23+, CD25+, CD71+, CD95+, HLA-DR+ с помощью непрямой иммунопероксидазной реакции с использованием препаратов лимфоцитов типа «высушенная капля» (реактивы НПЦ «МедБиоСпектр» г. Москва). Были изучены лейко-грамма, фагоцитарное число и фагоцитарный показатель. В процессе фенотипирования лимфоцитов параллельно с обычной схемой постановки иммунопероксидазной реакции проводили реакцию с предварительной обработкой клеточной смеси гормоном. Использовали две схе-

мы контроля: 1) с добавлением гормона в реактивную клеточную смесь после моноклональных антител и индикаторной ферментной системы и 2) в условиях реакции без моноклональных антител, но в присутствии индикаторной смеси. В дальнейшем реакцию продолжали и оценивали стандартным способом.

Длительность контакта моноклональных антител с лимфоцитами и продолжительность иммуноперокси-дазной реакции были одинаковыми при фенотипирова-нии лимфоцитов в обычных условиях и при контакте с гормонами. В работе использованы гормоны эстрадиол (DRG Эстрадиол EIA-2693), тестостерон (Testosterone EIA-1559), прогестерон (DRG Прогестерон EIA-1561), окситоцин (Correlate-EIA. Кат. № 900-153), тироксин (T4, свободный EIA-2386), кортизол (DRG Кортизол EIA-1887). Гормоны вводили в клеточную смесь в объеме 0,02 мл, в дозах, предусмотренных условиями опыта (кортизол — 996,14, L-тироксин —

0,09268, прогестерон — 127,2, окситоцин — 0,9929, тестостерон — 55,48, эстрадиол — 7,342 нмоль/л).

В большинстве выборок выявлено нормальное распределение. В связи с этим статистическая обработка проводилась параметрическими методами. Для оценки полученных данных манипулировали методами описательной статистики с определением средней арифметической величины, величины средней ошибки, минимальных и максимальных значений изучаемых сигнальных молекул, а также стандартного отклонения. Проверка нулевой гипотезы о равенстве всех средних в исследуемых группах осуществлялась с использованием однофакторного дисперсионного анализа. Критический уровень значимости (p) при проверке статистических гипотез принимался за 0,05. Для проверки статистической гипотезы разности средних значений использовали t-критерий для независимых выборок. Корреляционный анализ параметров сделан с учетом коэффициента корреляции Пирсона.

Результаты

Полученные данные свидетельствуют о том, что кроме специфического влияния гормон в состоянии модулировать число рецепторов, в том числе CD, на мембране клетки. Введение в реактивную смесь любого из испытуемых гормонов приводит к снижению эффективности взаимодействия CD с моноклональным антителом в среднем на (46,69 ± 2,13) % с колебаниями от (42,11 ± 2,54) % при идентификации HLA-DR II до (55,88 ± 3,23) % в случаях выявления Т-лимфоцитов с рецептором к трансферину (CD71+). При добавлении в реактивную смесь прогестерона и эстрадиола уровень снижения составил соответственно (46,11 ± 2,78) и (44,90 ± 1,35) %, тестостерон и кортизол снижали активность рецепторов на (41,39 ± 1,98) и (46,62 ± 3,50) %, а тироксин и окситоцин — на (46,53 ± 3,99) и (49,37 ± 3,05) %. Максимальный уровень ингибиции наблюдается под действием окситоцина (р < 0,01), минимальный — в присутствии тестостерона (р < 0,01). Статистически значимые различия установлены также относительно действия тестостерона (р < 0,01), окситоцина (р < 0,01) и эстрадиола (р < 0,05). Можно предполагать, что указанные различия обусловлены различиями молекулярной массы испытуе-

мых гормонов; действительно, окситоцин, дающий наиболее значимое снижение рецепторной активности, имеет молекулярную массу, превышающую массу остальных гормонов в 3 раза.

Установлено, что уровень такой неспецифической ингибиции активности рецепторов (снижение содержания рецепторов или снижение их активности) прямо зависит от исходного содержания фенотипируемых лимфоцитов, что подтверждается при действии окситоцина (51,22 ± 2,25) и (47,33 ± 2,94) %; р < 0,05, прогестерона (47,24 ± 1,79) и (44,22 ± 1,34) %; р < 0,01, и тироксина (47,71 ± 1,52) и (45,88 ± 1,28) %; р < 0,01. В среднем, вне зависимости от гормона, более высокий уровень неспецифического ингибирования при высоких концентрациях фенотипируемых лимфоцитов также статистически достоверны (р < 0,01). Наиболее резко указанные различия проявляются относительно ингибиции взаимодействия рецепторов антителообразующих В-лимфоцитов (р < 0,001).

Обсуждение результатов

Известно, что в основе взаимодействия антиген — антитело лежат те же законы термодинамики, что и в основе любой обратимой биомолекулярной реакции связывания. В заданных условиях отношение концентрации комплекса к концентрациям реагентов в состоянии равновесия будет всегда постоянным. При изменении концентрации одного из реагентов (антитело, лиганд и т. д.) будет соответственно меняться концентрация комплекса при условии, что ни один из реагентов не лимитирован, т. е. их концентрация не достигла ещё насыщения и имеется достаточно времени для достижения равновесия. Поскольку в закон действующих масс входят концентрации, а не количество каждого из реагентов, то при переносе реагентов в меньший объем количество комплекса увеличивается пропорционально кратности уменьшения, а при увеличении объема происходит соответствующее снижение количества комплекса [13].

В наших исследованиях дополнительный объем гормонов составил 0,02 мкл, т. е. был увеличен фактически в 2 раза. Казалось бы, это соответствует уровню ингибиции рецепторной активности, однако данные исследования с введением в реактивную смесь физиологического раствора того же объема опровергают высказанное предположение. В этих условиях постановки реакции уровень ингибиции рецепторной активности составил всего лишь (0,18 ± 0,02) %. Итак, снижение концентрации реагирующих компонентов в рассматриваемых условиях опыта не оказывают существенного влияния на ингибицию активности рецепторов и не может объяснить выявленную способность больших доз гормонов неспецифически подавлять рецепторную способность CD. Предположение о влиянии гормонов на индикаторную реакцию между ферментом и субстратом (т. е. на активность пероксидазы хрена во взаимодействии с диамино-бензидином) также не оправдалось. При добавлении гормонов в объеме 0,02 мкл после введения в реак-

тивную смесь моноклональных антител, т. е. перед индикаторной реакцией, снижение уровня чувствительности реакции составило всего (0,05 ± 0,01) %.

Кроме снижения концентрации реагирующих компонентов известны еще несколько возможных причин (условий) торможения реакции. Торможение может быть конкурентным, когда два различных антигена могут связываться с одним и тем же паратопом [14, 15].

Неспецифическое подавление реакции может быть также стерическим за счет реагирования антител с целой мозаикой рецепторов, располагающихся на поверхности клетки. При этом ингибитор мешает образованию комплекса антиген — антитело, оказываясь на пути их взаимодействия [ 15]. Однако подобный вариант ингибирования характерен только для случаев влияния путем разведения концентрации ингредиентов реакции дополнительным объемом, что было опровергнуто многочисленными исследованиями по введению в реактивную смесь физиологического раствора.

Полученные данные свидетельствуют о том, что гормон сам по себе в состоянии модулировать число рецепторов, в том числе CD, на мембране клетки. Как это происходит, пока трудно сказать; возможно, путем кэппинга. Известно, что кэппинг возникает сразу после взаимодействия лиганда с рецептором. Так, в условиях инкубации В-клеток с конъюгатами антитело-метка микроворсинки клеток через 2 мин начинают мигрировать к одному из полюсов клетки, образуя шапочку (сар), тогда как на другом полюсе образуются удлиненные микроворсинки и пластинки. В процессе кэппинга субъединицы мембраны, собираясь в шапочку на полюсе клетки, отделяются и уходят в окружающую среду либо поглощаются клеточными пластинками [12].

Итак, гормоны кортизол, тироксин, прогестерон, ок-ситоцин и тестостерон в дозе, соответствующей верхней границе их содержания в организме человека, in vitro подавляют рецепторную активность СD лимфоцитов на (46,69 ± 2,13) %. Выявленная неспецифическая инги-биция активности СD не обусловлена дополнительным разведением концентрации составляющих реакционной взвеси и специфической конкуренцией; получены предварительные сведения о прямой зависимости неспецифической ингибиции рецепторной активности от молекулярной массы гормона, выявлена тенденция более выраженного влияния на активность кластеров дифференциации В-лимфоцитов. Известно, что эндокринный профиль людей, проживающих на Севере, отличается более широкими пределами колебания содержания гормонов в крови [5—7]. Вполне реально, что одним из механизмов формирования экологически зависимых вторичных иммунодефицитов на Севере может быть неспецифическое ингибиторное влияние высоких концентраций некоторых гормонов на рецепторную активность кластеров дифференциации иммунокомпетентных клеток.

Список литературы

1. АлехинЕ. К. Иммунотропные свойства лекарственных средств / Е. К. Алехин, Д. Н. Лазарева, С. В. Сибиряк. — Уфа, 1993. — 208 с.

2. Калинина Н. М. Заболевания иммунной системы. Диагностика и фармакотерапия / Н. М. Калинина, С. А. Кетлинский, С. В. Оковитый, С. Н. Шуленин. — М., 2008. — 496 с.

3. Козлов И. Г. Рецепторы контактного взаимодействия / И. Г. Козлов, Н. К. Горлина, А. Н. Чередеев // Иммунология. — 1995. — № 4. — С. 14—24.

4. Корнеева Е. А. Гормоны и иммунная система / Е. А. Корнеева, Э. К. Шхинек. — Л., 1988. — 250 с.

5. Нормативы содержания гормонов в сыворотке крови жителей Севера Европейской территории СССР / под ред. Л. К. Добродеевой [и др.]. — Архангельск, 1991. — 12 с.

6. Типисова Е. В. Пределы содержания гормонов в сыворотке крови у мужчин / Е. В. Типисова, А. В. Ткачев, Л. В. Поскотинова и др. // Пределы физиологического колебания в периферической крови метаболитов, гормонов, лимфоцитов, цитокинов и иммуноглобулинов у жителей Архангельской области / под ред. Л. К. Добродеевой [и др.].

— Архангельск, 2005. — С. 19—24.

7. Ткачев А. В. Проблемы здоровья человека на Севере / А. В. Ткачев, Л. К. Добродеева. — СПб., 2002. — С. 53—111.

8. Чередеев А. Н. Клеточные и молекулярные аспекты иммунных процессов / А. Н. Чередеев, Л. В. Ковальчук // Итоги науки и техники. Сер. Иммунология. — М., 1989. — Т. 19. - С. 84-122.

9. Abbas A. Cellular fined molecular immunology / A. Abbas, A. Lichtman. — Philadelphia, 2003. — 562 p.

10. Bhala A. K. // Ann. Rheum Dis. — 1989. — Vol. 48, N 1. — P. 16.

11. Comsa J., Leonhardt H., Wekerle H. // Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. — 1982. — N 92. — P. 115—191.

12. Kay M. M. // Nature. — 1975. — Vol. 254. — P 424—426.

13. Kochler G, Milstein C. // Natur. — 1975. — P. 495—497.

14. Munson P. G., RodbardD. // Anal. Biochem. — 1980.

— N 107. — P. 220—239.

15. Thakur A. K., Munson P. G., Hungston D. L., RobardD. // Anal. Biochem. — 1980. — N 103. — P. 240—254.

NONSPECIFIC REGULATION BY THE HORMONE OF ACTIVITY OF RECEPTOR THE CAGE DEVISE

A. V. Poletaeva

Institute of Environmental Physiology, Ural Branch RAS, Arkhangelsk

In work new data about nonspecific inhibition of receptor activity of cluster differentiations by high concentration of a cortisol, thyroxin, progesterone, estradiol, testosterone and oxytocin in conditions in vitro are resulted. Revealed nonspecific inhibition to activity of cluster differentiations T- and B-lymphocytes are explained by formation of regional features of a hormonal profile of the person living in discomfort able environmental conditions of the north.

Key words: immune system, lymphocyte of phenotype, cortisol, thyroxin, progesterone, estradiol, testosterone, oxytocin.

Контактная информация:

Полетаева Анна Васильевна — младший научный сотрудник лаборатории экологической иммунологии Института физиологии природных адаптаций УрО РАН

Адрес: 163000, г. Архангельск, пр. Ломоносова, д. 249 E-mail: annapoletaeva2008@yandex.ru

Статья поступила 10.09.2010 г.