Защитные эффекты арабиногалактана при экспериментальной гемолитической анемии

© ГАВРИЛОВА О.В., ВАСИЛЬЕВА Л.С., ЧЕТВЕРИКОВА Т.Д.

Сибирский медицинский журнал, 2007, № 6 2007

ЗАЩИТНЫЕ ЭФФЕКТЫ АРАБИНОГАЛАКТАНА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АНЕМИИ

О.В. Гаврилова, Л.С. Васильева, Т.Д. Четверикова

Резюме. Пятикратное введение арабиногалактана в условиях гемолитической фенилгидразиновой анемии препятствует снижению осмотической резистентности эритроцитов и их гемолизу, а также способности макрофагов селезенки к фагоцитозу и утилизации железа, что способствует активации эритропоэза, созреванию эритроцитов и восстановлению их числа в периферической крови.

Ключевые слова: гемолитическая анемия, фенилгидразин, эритропоэз, арабиногалактан.

Большое разнообразие причин гемолитических состояний и недостаточная эффективность традиционных методов лечения актуализируют необходимость поиска новых методов и средств терапии этих патологий. В последние годы все большее распространение и популярность приобретают препараты, изготовленные из растительного сырья. Приоритет этого направления обусловлен многими причинами, в том числе появлением заболеваний ятрогенного характера, вследствие непереносимости, несовместимости или неадекватного назначения препаратов. Совсем недавно предметом исследований стала биологическая активность природного полисахарида — арабиногалактана, получаемого из лиственницы сибирской. К настоящему времени известно, что арабиногалактан обладает рядом таких свойств как низкая токсичность, хорошая растворимость, гепа-тотропность, иммуномодулирующая и антиоксидантная активность [3]. Учитывая многогранность эффектов арабиногалактана, представляется целесообразным исследовать его защитные свойства в отношении клеток красной крови при гемолитических состояниях.

Целью работы явилось выявление защитных эффектов арабиногалактана на клетки эритрона при экспериментальной гемолитической анемии, вызванной фе-нилгидразином.

Материалы и методы

Опыты выполнены на 54 беспородных белых крысах-самцах массой 180-200 г. Шесть из них оставались интакт-ными, у остальных вызывали токсическую гемолитическую анемию путем введения солянокислого фенилгидразина (ФГ) в дозе 3 мг/100 г массы тела в/м в течение двух дней [2]. Половине из них, начиная с первого введения ФГ и затем ежедневно в течение четырех дней, инъецировался раствор арабиногалактана (АГ) в дозе 200 мг/кг массы. В момент наступления пика анемии, а также через 1, 3, 5, 15 суток после него исследовали периферическую кровь, красный костный мозг, селезенку. В периферической крови определяли количество эритроцитов в 1 л с использованием камеры с сеткой Горяева. Определяли осмотическую резистентность эритроцитов (ОРЭ) микроскопическим методом А.А. Яновского [4] и концентрацию гемоглобина унифицированным ге-миглобинцианидным методом на гемоглобинометрах ГФ-3 и ГФ-Ц-04 с использованием стандарта гемигло-бинцианида («Reanal», Hungary).

Мазки крови и красного костного мозга (ККМ) окрашивали по Паппенгейму. В мазках крови дифференцировали и подсчитывали процентное количество микроци-

тов, нормоцитов и макроцитов для вымвления анизоцито-за. В мазках костного мозга подсчитывали количество клеток эритроидного ростка из 1000 клеток. Высчитывали индексы пролиферации (ИП) и созревания (ИС) клеток эритрона по формулам:

ИП=[(ПроЭр*0+БН*1+ПН*2)/(ПроЭр+БН+ПН)]*Е, ИС= (ПН*0+0Н*1+Эр*2)/(ПН+0Н+Эр)]* Е, где ПроЭр — количество проэритробластов, БН — ба-зофильных нормобластов, ПН — полихроматофильных нормобластов, ОН — оксифильных нормобластов, Эр — зрелых эритроцитов, Е — сумма всех клеток эритроидного ряда [5]. В мазках крови, окрашенных азуром-11 по Г.А. Алексееву [4], подсчитывали ретикулоциты. Гистологические срезы селезенки толщиной 7 мкм окрашивали гематоксилин-эозином, выявляли активность кислой фосфа-тазы по Гомори (для регистрации активных макрофагов) и гемосидерин по Перлсу [7]. С помощью окулярной сетки [1] подсчитывали объемную долю красной пульпы, гемо-сидерина, эритроцитов, активных макрофагов.

Полученные данные имели нормальное распределение и были обработаны статистически с вычислением г-кри-терия Стьюдента [6]. Данные считались отличающимися при р<0,05.

Результаты и обсуждение

После введения ФГ пик анемии развивался на пятые сутки. При этом количество эритроцитов снизилось на 40% (р<0,001), ОРЭ — на 78% (р<0,01), концентрация гемоглобина — на 60% (р<0,001) от исходного уровня (табл. 1). Нарастает число микроцитов и макроцитов (р<0,05). В селезенке (табл. 1) увеличивается относительный объем красной пульпы с 77% до 93% (р<0,05) и концентрация депонированных в ней эритроцитов (на 15%; р<0,05). В ККМ численность клеток эритроидного ряда (рис. 1) в пик анемии уменьшается в 1,9 раз

т л Г, 1 ппп . .

Обозначения: ПроЭр — проэритробласты, БН — базофильные нормобласты, ПН — по-лихроматофильные нормобласты, ОН — ' " ~

эритроциты.

оксифильные нормобласты, Эр — зрелые

Рис. 1. Количественное соотношение клеток эритроидного ряда в красном костном мозге при интоксикации ФГ и пятикратном введении АТ.

(р<0,05) за счет уменьшения вдвое всех видов нормоб-ластов и депо зрелых эритроцитов. ИП снижается в 2,7 раза, а ИС — в 1,9 раза (р<0,05) (рис. 2).

В первые трое суток после наступления пика анемии со стороны красных клеток крови не наблюдалось положительной динамики. По-прежнему оставались низкими и количество эритроцитов, и их осмотическая устойчивость, которые составили соответственно

всего 46,3% и 19% от исходных значений (р<0,01). В селезенке объем красной пульпы уменьшается незначительно, а концентрация эритроцитов снижается до 36% (р<0,05). При этом, несмотря на активное разрушение эритроцитов, количество гемосидерина через 1 сутки после пика анемии очень низкое (30% от его количества у интактных крыс, р<0,05), что свидетельствует об уменьшении относительного содержания активных фагоцитов в селезенке. В ККМ состояние эритрона через 1 сутки после пика анемии характеризовалось нарастанием угнетения эрит-ропоэза (рис. 1) и очень низкими значениями ИП и ИС (рис. 2). Эти данные дают основание предположить, что низкая скорость созревания эритроцитов в ККМ может быть связана с недостатком железа, которое в виде гемосидерина фагоциты переносят в красный костный мозг.

На 3 сутки объемная доля гемо-сидерина и активных макрофагов в селезенке нормализуется (р<0,05). В ККМ возрастает на 23% ИС клеток эритропоэза (р<0,05), что приводит к увеличению на 25% (р<0,05) депо зрелых эритроцитов, хотя ИП остается низким.

Через 5 суток после пика анемии начинается восстановление количественных показателей красной крови, к 15 суткам нормализация числа эритроцитов в крови завершается, но выявляется умеренный ретикулоцитоз, а осмотическая резистентность остается низкой. Выявляются качественные изменения большей части эритроцитов в виде анизо- и пойкилоци-тоза, которые сохранялись в течение всего экспериментального периода. В селезенке объемная доля красной пульпы продолжает снижаться, а концентрация эритроцитов увеличивается. К концу эксперимента объемная доля красной пульпы меньше, чем у интактных крыс на 16% (р<0,05), а концентрация эритроцитов в ней выше на 10% (р<0,05). Количество активных макрофагов и концентрация гемосидерина в красной пульпе увеличиваются до конца наблюдения. Эти данные дают основание предполагать, что с 5 суток после пика анемии в организме активируются защитные механизмы, направленные на эффективную элиминацию продуктов распада эритроцитов.

В ККМ через 5 суток после пика анемии происхо-

(Я

£

л

&

= і

о 5

а

о

И

Объемная доля структур красной пульпы селезенки, % гемоси- дерин 5 0^' <Л, ,' +1 ГО * го ,' +1 <л, г^' * Г^, +1 ГО ', +1 г^, 5 ', г^' гч * ", +1 4!^ * 4^' 4Н * г^' гч * ,' +1 00 * 4^' ', гч +1 с^_ * 00 гч * 4Н ' гч *

-о ри кг аа 00 ©, +1 ио, гч ,' +1 ', гч * го ©, +1 г^, ГО * «л г^, +1 ', ', г^' ,' +1 * гч * 4^' * г^, +1 го * * гч * ", +1 00 * 00 00 *

-о р ты ти т ир и ъ а ©, +1 сл ГЧ НН ', 0^' Л * го г^' +1 00, 1/0 * ГО ,' ГО * ', го НН 1/0 * ГО ,' +1 1°, * ^ * гч ,' +1 * гч * гч ,' +1 гч * 00 ^ * го ,' +1 ," го * г^ ,' +1 ГО * |/^' гч *

я аа на ап сь ал кр уп ГЧ, НН ст, ЧО 5 гч, го * 00, о" +1 го о" * ', <л, 00 * Г^, г^' +1 го ,' 00 ', г^' +1 ', 40 * ", * гч 4Н ГО ,' 00 * ', г^' +1 ', 00 * * ', +1 ', гч 00 * г*^ +1 ', '

Гемоглобин, г/л г^, +1 ГО іл ', +1 1/0 ,' л * ст, 5 о го ,' +1 ', 1Л +1 г^, ', +1 <л, ГО Н^1 |/^' * го г*0 +1 ", 00 * ,' +1 ,' ' ,' +1 ГЧ 1 гч \ +1 го

% т 0. О ГО 5 40, 4^' <Л ГО г*^ +1 го гч +1 ', го 5 г^, ГО г^' +1 го г*^ гч * г<0 +1 ГО ,' ,' +1 ^ * л * го ,' +1 ОС * ,' +1 го г^' * 00 * го ,' +1 го ОС * го г*^ +1 * 4^' \ *

Ретикуло-циты, % ГО ©, гч, ©, ' ', +1 гч, ,' гч ', +1 г^ гч ,' 1/0 ', гч ,' ' о, ©, +1 го ,' ,' +1 ,' ' ', +1 4!^ * ', +1 1/0 * * ', +1 го * ©, * ' ', +1 40, # * ' ', +1 гч ',

Эритроциты периферической крови -% -о, ры кт аи мц 5 00 ,' ио, <л, г^, 5 ГО ГО ', +1 гч ,' гч, <л, ", +1 ', 1Л * г^' +1 го ", г^' го го ,' +1 го го 4Н го г^' г^, +1 го ,'

-% о, мы рт ои нц <л г^' +1 гч, 0^' гч, г^' го 1/0 * ГО 5 гч г^' ' 5 г^, г^ ст, +1 ГО г^ 4Н 1/0 гч +1 г- * 0^' 40 * г^' +1 го |/^' * * ,' +1 го ,' г^ г^' +1 го 00 ', '

-% о, & =2 мц НН ', гч, г^' +1 гч, гч * <Л, г^' +1 <л, гч * го НН гч г*^ г^, +1 гч ," ГО ,' +1 ГЧ ," ,' +1 го * 0^' ,' +1 го * гч ГО +1 г^, го 4Н го ,' ", +1 г^,

о о ю — * ', +1 г^, 4^' ,' +1 го ГО * ,' +1 <л, ГО * го ,' +1 ', Г^' * <л ,' +1 ', ^ * 1/^ ,' +1 гч 4^' го ,' +1 * ,' +1 * гч ,' +1 * * го ,' +1 г^, * го ,' +1 ',

І І&Е о б н кт р ба не ту е ы н т ка т н 5 и и м ик мен па — го 1/0 1/0 и и м ке ин па — го ' '

Груп- пы крыс Г © + ГГ в ^

Є

*

К

ей

К

о

О

н

я

к

X

а

о

ч

V

а

л

х

а

о

ч

<3^ У 1/0

Рис. 2. Индекс пролиферации (ИП) и индекс созревания (ИС) клеток эритроидного ростка при интоксикации ФГ и пятикратном введении АТ.

дит восстановление скорости созревания (ИС) клеток эритропоэза и увеличение их пролиферативной активности (ИП). Восстанавливается депо зрелых эритроцитов, что обеспечивает увеличение числа этих клеток в крови. Тем не менее, количество бластнык форм эрит-рона продолжает снижаться и к 15 суткам их становится меньше, чем у интактнык крыс, в 10 раз (р<0,05).

Таким образом, несмотря на относительно благополучную картину крови и состояние селезенки, к концу наблюдения в ККМ происходит истощение бластных форм эритроидных клеток.

При введении АГ пятикратно, начиная со 2-ой инъекции ФГ, количество эритроцитов в пик анемии уменьшилось в меньшей степени, чем без введения АГ, а ОРЭ осталось в норме (табл. 1). При этом количество рети-кулоцитов увеличилось в 2,3 раза (р<0,05) по сравнению с животными, не получавшими АГ. Эти данные свидетельствуют о том, что АГ, введенный вместе с ФГ, значительно повышает устойчивость эритроцитов к гемолитическому действию ФГ и стимулирует компенсаторный выброс из ККМ ретикулоцитов. Концентрация гемоглобина при введении АГ снизилась, но в меньшей степени, чем при ФГ-интоксикации без введения АГ. Количество микроцитов увеличилось в 1,5 раза меньше (р<0,05), чем при гемолитической анемии без введения АГ. В селезенке объемная доля красной пульпы под действием АГ не изменилась, однако концентрация эритроцитов в красной пульпе не увеличилась. Ак-тивнык макрофагов в селезенке при введении АГ выявлялось в 2,4 раза больше (р<0,05), чем при ФГ-ин-токсикации без введения АГ. При этом увеличилось и количество гемосидерина, которое в 5,3 раза (р<0,05) превышало этот показатель при гемолитической анемии без введения АГ. Таким образом, в пик гемолитической анемии, вызванной ФГ, проявляется достаточно выраженное защитное действие АГ, направленное на стабилизацию мембран эритроцитов и сохранение фагоцитарной активности макрофагов селезенки.

В ККМ при введении АГ в пик гемолитической анемии суммарное количество клеток эритроидного ростка в 1,3 раза (р<0,05) превышает этот показатель у животных, не получавших АГ (рис. 1). При этом количе-

ство базофильных нормоб-ластов не изменяется, а по-лихроматофильных нор-мобластов уменьшается в 2,6 раза (р<0,05). Величина ИС эритроцитов под действием АГ сохраняется в пределах нормы (рис. 2), что способствует увеличению резерва зрелых эритроцитов в 1,5 раза (р<0,05), несмотря на низкую пролиферативную активность бласт-ных форм эритропоэза.

В первые сутки после наступления пика анемии при введении АГ количество эритроцитов в периферической крови держится на прежнем уровне, а их ОРЭ увеличивается на 40% (р<0,05) и превышает нормальное значение в 1,4 раза. При этом нормализуется количество микроцитов. Концентрация гемоглобина снижается, а количество ретикулоцитов возрастает. В селезенке относительный объем красной пульпы не изменяется, но концентрация эритроцитов в ней в 1,8 раза меньше (р<0,05) по сравнению с животными, не получавшими АГ. В красной пульпе увеличивается количество активных макрофагов, которых становится в 2,7 раза (р<0,05) больше, чем у животных, не получавших АГ. В 1,3 раза (р<0,05) возрастает количество гемосиде-рина и становится в 9 раз больше (р<0,05), чем при ФГ -интоксикации без введения АГ. Таким образом, в первые сутки после пика анемии продолжает проявляться мембранопротекторное действие АГ.

В ККМ, по отношению к предыдущему сроку, уменьшается в 1,4 раза (р<0,05) количество базофиль-ных нормобластов, но увеличивается в 2 раза (р<0,05) количество оксифильных нормобластов и в 1,2 раза (р<0,05) депо зрелых эритроцитов. Индексы пролиферации и созревания, по сравнению с ФГ-интоксикацией без введения АГ, выше в 1,8 раза и в 1,4 раза, соответственно (р<0,05). Необходимо подчеркнуть, что уже через сутки после пика гемолитической анемии в условиях 5-кратного введения АГ в ККМ полностью восстанавливается резерв зрелых эритроцитов.

На 3 сутки в периферической крови количество эритроцитов и их ОРЭ сохраняются на прежнем уровне. Концентрация гемоглобина возрастает, увеличивается и количество ретикулоцитов (в 1,2 раза, р<0,05), которых становится в 3,2 раза больше (р<0,05), по сравнению с ФГ-интоксикацией без введения АГ. Анизо-цитоз не выявляется. В селезенке относительный объем красной пульпы нормализуется, а концентрация эритроцитов в ней незначительно превышает норму. Количество активных макрофагов в селезенке увеличивается в 2 раза (р<0,05), но при этом количество гемосиде-рина уменьшается в 1,3 раза (р<0,05), хотя остается выше, чем у интактных животных, в 2 раза (р<0,05).

В ККМ, по сравнению с ФГ-интоксикацией без введения АГ, количество проэритробластов в 1,4 раза меньше, а базофильных, полихроматофильных и оксифиль-

ных нормобластов больше (в 1,3 раза, в 2,9 и в 6 раз, соответственно, р<0,05, рис. 1). ИП в 2,4 раза более высок (р<0,05) и лишь на 31% ниже, чем у интактных животных. ИС выше в 1,5 раза, чем у животных с ФГ-интоксикацией, не получавших АГ (р<0,05). Депо зрелых эритроцитов увеличивается в 1,5 раза (р<0,05) и становится больше, чем у интактных животных. Таким образом, при 5-кратном введении АГ через 3 суток после пика гемолитической анемии эритроидный росток остается активным и пополняет резерв эритроцитов путем гомобластического эритропоэза.

К 5 суткам интоксикации в периферической крови количество эритроцитов увеличивается, концентрация гемоглобина приближается к нормальной, а количество ретикулоцитов и ОРЭ остаются высокими. В селезенке структура красной пульпы нормализуется, но активность макрофагов в ней остается высокой, а количество гемо-сидерина увеличивается в 1,7 раза (р<0,05). В ККМ вновь уменьшается количество бластных форм клеток, при этом значения индексов пролиферации и созревания остаются высокими. Депо зрелых эритроцитов в 1,3 раза превышает этот показатель у интактных животных (р<0,05).

Через 15 суток в периферической крови происходит полная нормализация концентрации гемоглобина, числа эритроцитов и ретикулоцитов при сохранении высоких значений ОРЭ. В красной пульпе селезенки уменьшается на 40% концентрация эритроцитов (р<0,05). Активность макрофагов и количество гемоси-дерина в них сохраняются высокими. В ККМ активность эритропоэза не снижается. Вероятно, поэтому уменьшается количество бластных форм эритрона, но резерв зрелых эритроцитов сохраняется высоким.

Таким образом, в условиях 5-кратного введения АГ при ФГ-интоксикации все проявления гемолитической анемии существенно уменьшаются. Пик анемии, наступающий через 5 суток после введения ФГ, был выражен значительно меньше, преимущественно, за счет выброса из красного костного мозга ретикулоцитов и сохранения в пределах нормы ОРЭ. По-видимому, АГ обладает способностью укреплять мембраны эритроцитов и повышать их осмотическую резистентность. Уже через сутки после пика анемии резерв зрелых эритроцитов в ККМ полностью восстанавливался, а через 3 суток происходила значительная активация эритропо-эза, который, тем не менее, имел характер гомобласти-ческого. Разрушение эритроцитов в селезенке было менее интенсивным, а макрофаги селезенки сохраняли высокую активность утилизации продуктов распада гемоглобина. Вероятно, сохраняя высокую функциональную активность, макрофаги в достаточном количестве поставляют железо в ККМ, что способствует активации эритропоэза. Таким образом, вторым защитным эффектом АГ можно считать его иммуномодулирующее действие, сохраняющее функциональную активность макрофагов на высоком уровне.

Таким образом, пятикратное введение арабинога-лактана в условиях гемолитической фенилгидразино-вой анемии препятствует снижению осмотической резистентности эритроцитов, оказывая мембранопротекторное действие. При этом макрофаги селезенки сохраняют высокую активность к фагоцитозу и утилизации железа, что способствует активации эритропоэза, созреванию эритроцитов и восстановлению их числа в периферической крови.

PROTECTIVE EFFECTS OF ARABINOGALACTAN IN EXPERIMENTAL HAEMOLYTIC

ANEMIA

O.V. Gavrilova, L.S. Vasiljeva, T.D. Chetverikova

Fivefold injection of arabinogalactan in experimental haemolytic anemia prevents decreasing erythrocytes osmotic resistency and their haemolysis, and also abilities of a spleen macrophages to phagocytosis and using of iron that promotes erythropoesis activation, erythrocytes maturing and restoration of their number in peripheral blood.

ным методам исследования. — М.: Медицина, 1975. — 382 с.

5. Макарова О.А. Стресс-индуцированные нарушения в системе крови и их коррекция медиаторами и метаболитами стресс-лимитирующих систем: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. — Иркутск, 2003. — 22 с.

6. Медик В.А., Токмачев М.С., Фишман Б.Б. Статистика в медицине и биологии: Руководство. В 2-х томах / Под ред. Ю.М. Комарова. Т. 1. Теоретическая статистика. — М.: Медицина, 2000. — 412 с.

7. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. — Л.: Медицина, 1969. — 424 с.

ЛИТЕРАТУРА

1. АвтандиловГ.Г. Медицинская морфометрия. — М.: Медицина, 1990. — 384 с.

2. Белокриницкая Т.Е., Кузник Б.И., Хавинсон В.Х. Влияние полипептидов эритроцитов на систему эритрона при экспериментальной анемии // Бюлл. эксп. биол. и

мед. — 1992. — Т. 114 № 8. — С.132-133.

3. Дубровина В.И., Медведева С.А. и др. Иммуномодулирующие свойства арабиногалактана лиственницы сибирской // Фармация. — 2001. — № 5. — С.26-27.

4. Кост Е.А. Справочник по клиническим и лаборатор-

© БАБИЧ М.В. - 2007

ФАРМАКОЭКОНОМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ЛЕЧЕНИЯ ВНЕБОЛЬНИЧНОЙ ПНЕВМОНИИ МЕТОДОМ СТУПЕНЧАТОЙ ТЕРАПИИ

М.В. Бабич

(Амурская государственная медицинская академия, ректор — д.м.н., проф. Дралюк, кафедра госпитальной терапии,

зав. — д.м.н., проф. Ю.С. Ландышев)

Резюме. Настоящая работа посвящена сравнительному фармакоэкономическому анализу применения левофлоксаци-