МЕТОД ПОЛУЧЕНИЯ МЕЖМОЛЕКУЛЯРНЫХ КОНЪЮГАТОВ ДЛЯ ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЕЛНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ
METHOD OF OBTAINING INTERMOLECULAR CONJUGATE FOR IMMUNOCHROMATOGRAPHIC DETERMINATION OF SPECIFIC ANTIBODIES

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии и представляет собой метод получения межмолекулярных конъюгатов, которые используются в качестве маркера при иммунохроматографическом определении антител, специфичных к определенному антигену или группе антигенов (серодиагностике). Применительно к серодиагностике общая схема иммунохроматографии заключается в следующем: проба, потенциально содержащая специфические антитела, под действием капиллярных сил перемещается вдоль тест-полоски. При этом она вначале взаимодействует с окрашенными частицами (коллоидное золото или иная метка), на поверхности которых адсорбирован компонент, предназначенный для связывания с антителами. Обычно в качестве такого компонента используют антивидовые антитела (иммуноглобулины, выделенные из сыворотки животного, иммунизированного препаратом иммуноглобулинов организма, для которого проводится серодиагностика), белок A из Staphylococcus aureus, белок G из Streptococcus spp. или иной реагент для связывания антител - далее обозначаемый как ССвАт (соединение, связывающее антитела). Затем фронт жидкости преодолевает аналитическую (тестовую) зону, которая представляет собой участок мембраны с иммобилизованным антигеном (нативным или специально модифицированным для эффективной сорбции). Степень связывания маркера с иммобилизованным антигеном и, соответственно, интенсивность окрашивания мембраны определяются концентрацией специфических антител в пробе. Для проверки качества реагентов и сохранения функциональности тест-системы используется расположенная далее контрольная зона, в которой компонент, сорбированный на окрашенной частице (ССвАт), связывается с соответствующим иммобилизованным на мембране реагентом (Рис.1).
Количество ССвАт, связанного с поверхностью метки, лимитировано сорбционной емкостью поверхности метки. В качестве метки наиболее часто используется коллоидное золото, а в качестве метода иммобилизации - простая физическая адсорбция белка на поверхности с последующим отделением неадсорбированных молекул с помощью осаждения частиц коллоидного золота центрифугированием. В этом случае концентрация ССвАт в конечном объеме реакционной среды в порах мембран иммунохроматографического теста не превышает 0,1 мг/мл. Концентрация антител в сыворотке крови чаще всего превышает 5 мг/мл. При таком избытке антител концентрация свободного ССвАт быстро уменьшается при контакте с пробой, поэтому интенсивность окраски контрольной зоны значительно снижается, а в некоторых случаях исчезает полностью (Рис.2), вследствие чего можно сделать неверный вывод о непригодности теста. Некоторые производители по этой причине используют в тест-системах смесь из двух конъюгатов, один из которых (конъюгированный с ССвАт) предназначен для связывания в аналитической зоне и не взаимодействует с контрольной зоной, а второй взаимодействует только с контрольной зоной. Например, такой подход использован иммунохроматографических системах серодиагностики Salmonella typhi «Enterocheck-WB» фирмы "Zephyr Biomedicals" (Индия).
(http://www.tulipgroup.com/Zephyr_New/html/pack_inserts/Enterochek%20WB.pdf).
Однако в этом случае в контрольной и аналитической зоне связываются разные реагенты, и наличие или отсутствие окраски контрольной зоны не свидетельствует о потере или сохранении активности ССвАт. Нами предлагается иной подход, основанный на добавлении в конъюгат, полученный после адсорбции ССвАт на частицы коллоидного золота и отделения неадсорбированных молекул с помощью осаждения частиц коллоидного золота центрифугированием, антивидовых антител против антител, сорбированных в контрольной зоне теста. Антивидовые антитела добавляются в концентрациях, существенно ниже связывающей способности конъюгата, поэтому данная добавка не приводит к существенному уменьшению чувствительности тест-системы, а контрольная зона образуется только при сохранении функциональной активности ССвАт, что повышает достоверность анализа.
Предложенный подход был реализован заявителями на примере серодиагностики бруцеллеза коров с использованием в качестве антигена липополисахарида (ЛПС) Brucella abortus, в качестве ССвАт - рекомбинантного белка G, к которому добавляли козьи антитела против антител мыши, а в контрольной зоне сорбированы моноклональные мышиные антитела. Рекомбинантный белок G был использован нами, т.к. он обладает наибольшим сродством к иммуноглобулинам крупного рогатого скота, однако для серодиагностики можно также использовать белок А, антивидовые антитела и другие реагенты для связывания антител. Ниже представлено описание способа получения тест-полосок и проведения иммунохроматографического анализа, а также полученные результаты.
Пример
Для изготовления иммунохроматографических тест-систем использовали набор mdi Easypack («Advanced Microdevices», Индия), включающий рабочие мембраны CNPH90 с размером пор 15 мкм, подложку под конъюгат PT-R5, мембрану для нанесения образца FR1(0.6), конечную адсорбирующую мембрану АР045 и ламинирующую защитную пленку на клейкой основе МТ-1.
520
2
3
Иммобилизация белка G на частицах коллоидного золота. Белок G диализовали против 1,000-кратного объема 10 мМ карбонатного буфера, рН 9.0. К коллоидному золоту (D=1,0) добавляли 0,1 М KCO до достижения pH 9, а затем - белок G в концентрации 8 мкг/мл. Смесь инкубировали 10 мин при комнатной температуре и перемешивании, после чего добавляли 10%-ный водный раствор БСА до конечной концентрации 0,25%.
Частицы коллоидного золота отделяли от неиммобилизовавшегося белка 30-минутным центрифугированием при 6.000 g, ресуспендируя осадок в 50 мМ K-фосфатном буфере, pH 7,4, с 0,1 М NaCl (PBS), содержащем 0,25% БСА.
520
Нанесение реагентов на иммунохроматографические мембраны. Конъюгат коллоидного золота с белком G наносили на стекловолоконную мембрану (PT-R5, «Advanced Microdevices», Индия) в разведении, соответствующем D=10,0, в объеме 11 мкл на 1 см полосы с помощью диспенсера IsoFlow фирмы «Imagene Technology» (США). В первом случае (немодифицированная методика) на мембрану наносился только конъюгат с белком G, во втором случае (модифицированная методика) конъюгат с белком G предварительно смешивался с козьими антителами против иммуноглобулинов мыши («Arista Biologicals Inc.» (США)) в концентрации 10 мкг/мл.
Для формирования аналитической зоны использовали препарат ЛПС, выделенный из бактерий Brucella abortus (Национальный центр биотехнологии, Астана, Казахстан). На 1 см полосы наносили 2 мкл препарата ЛПС (1,0 мг/мл в дистиллированной воде).
Для формирования контрольной зоны в первом случае использовали кроличьи антитела против иммуноглобулинов крупного рогатого скота производства фирмы «Имтек» (Россия), на 1 см полосы наносили 2 мкл антител (0, 5 мг/мл в PBS); во втором случае - мышиные моноклональные антитела (Центр молекулярной диагностики и терапии, Москва (Россия)).
Иммунохроматографический анализ (ИХА) проводили при комнатной температуре. Тест-полоску в вертикальном положении погружали на 5 мин в анализируемую сыворотку крови, затем извлекали, помещали на горизонтальную поверхность и через 5 мин визуально контролировали результат иммунохроматографического анализа.
Как видно из рис.3, предложенная схема позволяет увеличить интенсивность контрольной зоны тест-системы. При этом, так как добавленная к коллоидному конъюгату концентрация антивидовых антител значительно ниже концентрации белка G в конъюгате, потери интенсивности окраски аналитической зоны иммунохроматографического теста не наблюдается.
Рис.1. Принцип иммунохроматографического определения специфических антител.
Рис.2. Связывание конъюгата коллоидного золота и белка G в контрольной зоне тест-полоски А. в буферном растворе, не содержащем антител, и Б. в сыворотке крови.
Рис.3. Тестирование иммунохроматографических систем, изготовленных А. по традиционной методике и Б. по методике, предложенной заявителями (с использованием конъюгата коллоидного золота с рекомбинантным белком G и антивидовыми антителами) на сыворотке коровы, больной бруцеллезом.