Новые направления в исследовании и ранней диагностике рака с применением детекционных систем на основе флуоресцентных нанокристаллов

This review summarizes recent advances in the development and applications of detection systems based on fluorescent nanocrystals and the prospects of the application of these systems to early multiplexed diagnostics of cancer in the near future.

Keywords: tumor markers, antigens, autoantibodies, semiconductor nanocrystals, quantum dots, beads, flow cytometry; Förster resonance energy transfer; multiphoton excitation.

Введение

Своевременная высокоточная диагностика онкологических заболеваний и разработка эффективных методов лечения являются наиболее актуальными задачами современной медицины. Для разработки эффективных методов диагностики и терапии онкологического заболевания необходимо понимать основные механизмы и принципы развития рака.

Злокачественная трансформация включает в себя изменения в экспрессии белков с последующей клональной пролиферацией измененных клеток. Аномальная экспрессия генов в опухолевых клетках обуславливает синтез эмбриональных, плацентарных и эктопических белков, ферментов, антигенов и гормонов [25].

Эти изменения можно контролировать на уровне опухолевых маркеров (биомаркеров) и качественно, и количественно. Опухолевые маркеры (биомаркеры) являются важным информативным показателем наличия опухолевого процесса и представляют мощный инструмент для мониторинга и оценки эффективности проводимой терапии злокачественных новообразований. Они могут иметь огромное значение в клинической онкологии, если их концентрация в сыворотке крови коррелирует с наличием и ростом злокачественной опухоли до появления клинических симптомов.

Поиск, идентификация и качественный анализ специфических биомаркеров в биологических жидкостях и разработка высокоточных многопараметрических систем их детекции по-прежнему остаются наиболее актуальными задачами ранней диагностики и прогнозирования онкологических заболеваний. Существуют разнообразные геномные и протеомные технологии для мониторинга много -численных изменений и процессов, протекающих в организме на молекулярном уровне: степень опухолеспецифичного метилирования ДНК [8; 46], модификация профилей мРНК [58], изменение уровня экспрессии и степени гликозилирования белков [34], появление антиген-специфических аутоантител [1; 4; 14; 23] и циркулирующих раковых клеток [21; 54] и т.д.

Тем не менее, несмотря на большое количество проводимых научных исследований, подавляющее большинство потенциальных онкомаркеров нового поколения не выдерживают полноценные клинические испытания для успешного применения их в клинической диагностике и практике [20]. Причины такого критического отбора заключаются в естественных различиях протеомных профилей индивидов, тонких вариациях методик отбора и обработки биологических проб, что может приводить к серьезным систематическим ошибкам, ограниченности технологических ресурсов для тестирования и методов ранней диагностики развития заболевания.

Несмотря на все эти ограничения, идеальный белковый онкомаркер должен отражать истинную биологическую гетерогенность в уровне экспрессии опухолевых белков в зависимости от стадии и типа заболевания, а идеальная диагностическая

система должна быть многопараметрической, высокоточной, а также несложной для использования в рутинной клинической практике.

1. Опухолевые маркеры

1.1. Ассоциированные

с опухолью антигены

- классические онкомаркеры

С точки зрения диагностической ценности опухолевый антиген должен продуцироваться опухолевой клеткой в количествах, достаточных для обнаружения с помощью современных методов анализа. Кроме того, он не должен выявляться (или его уровень должен быть значительно меньше) в крови у здоровых людей или при доброкачественных опухолях.

Известно более 200 антигенных онкомаркеров, однако в клинической практике высокоспециализированных онкологических учреждений выявление опухолевых антигенов подтвердило их эффективность при раке предстательной железы (ПСА), герминогенных опухолях (АФП, ХГЧ), раке яичников (СА 125), раке шейки матки (8СС), тро-фобластических опухолях (ХГЧ), раке молочной железы (РЭА; СА 15.3), раке легкого (РЭА; СУБЯЛ 21.1; НСЕ), раке толстой кишки (РЭА; Са 19.9), раке поджелудочной железы (СА 19.9), раке желудка (РЭА; СА 19.9; СА 72.4), первичном раке печени (АФП; СА 19.9), раке мочевого пузыря (СУБЯЛ 21.1; иВС), меланоме (8 100). В применяемых и разрабатываемых диагностических системах пока используются известные опухолевые антигенные маркеры с ограниченной диагностической специфичностью и чувствительностью.

Несмотря на эти недостатки, единичная детекция опухолевых антигенов широко применяется в клинической практике, и вся история использования онкомаркеров в клинической диагностике - это постоянный поиск опухолеспецифичных тестов, способных выявить злокачественную опухоль, установить ее тип и локализовать на возможно более ранних этапах формирования. Традиционные им-мунохимические методы позволяют определять концентрацию только одного опухолевого антигена в одном образце сыворотки крови, поэтому в настоящее время в области ранней диагностики большие надежды связывают с комплексными системами, которые позволяют проводить одновременный количественный многопараметрический анализ [40].

1.2. Циркулирующие аутоантитела против ассоциированных

с опухолью антигенов

- ранние чувствительные индикаторы развития рака

Многочисленные исследования причин и механизмов возникновения и развития злокачественных раковых клеток показывают, что опухолевые антигены обладают иммуногенными свойствами и способны индуцировать продукцию специфических антител.

Причины и механизмы приобретения нормальными антигенами иммуногенных свойств до

сих пор не до конца установлены и изучены [82]. Однако очевидно, что структурные перестройки молекул или изменение профиля экспрессии клеточных белков во время трансформации опухолевых клеток приводят к активации иммунного ответа и продукции аутоантител [27; 68]. Собственные белки клетки могут в избытке экспрессироваться, подвергаться мутациям и нарушением структуры, деградации, посттрансляционным модификациям, что в свою очередь приводит к активации аутореактивного иммунного ответа у онкологических пациентов [11] (рис. 1). Продукция аутоантител к опухолевому антигену может позволить детектировать появление малого количества антигена, ассоциированного с опухолью, еще на самых ранних стадиях опухолевого роста [15; 37; 66].

Циркулирующие аутоантитела в сыворотке крови онкологических пациентов используют для идентификации новых панелей антигенов, ассоциированных с опухолью, как потенциальных прогностических/диагностических маркеров и терапевтических мишеней [13]. Применение белковых чипов позволяет анализировать специфику гуморального иммунного ответа при развитии рака в отношении тысяч различных белковых мишеней [24; 69], выявляя новые панели антигенов, ассоциированных с опухолью и обладающих высокой имму-ногенностью.

В настоящее время специфические аутоантитела к опухолевым антигенам признаны наиболее многообещающими диагностическими маркерами для ранней детекции патологии и контроля эффективности лечения. Идентификация профиля раковых аутоантел в сыворотке крови онкологических пациентов может способствовать выявлению комплексных признаков определенной стадии или типа заболевания, облегчить разработку и испытание противораковых вакцин. Кроме того, аутоантитела, выявление которых ассоциировано с улучшением прогностических показателей заболевания, могут представлять новый класс потенциально эффективных иммунотерапевтических молекул.

Существует несколько протеомных технологий для детекции аутоантител и опухолевых антигенов, выявления корреляции между профилем экспрессии маркеров и развитием онкологического заболевания, изучения механизмов их функционирования. Однако после идентификации потенциальных опухолевых антигенов необходимо установить и подтвердить их функциональность как опухолевых биомаркеров для клинической диагностики заболевания.

С этой целью выполняют хорошо воспроизводимые и недорогие аналитические исследования и тесты с использованием большого количества сывороток. Но основные аналитические подходы для детекции онкомаркеров обладают характерными недостатками и ограничениями, такими как низкая скорость и недостаточные точность, чувствительность, эффективность анализа.

В настоящее время по-прежнему существует необходимость разработки высокоточных и сверхчувствительных методов многопараметрического анализа для детекции даже небольших количеств онкомаркеров в сыворотке крови. В этой связи, нанотехнологические подходы к детекции онкомаркеров и создание принципиально нового поколения систем для клинической диагностики рака на основе полупроводниковых флуоресцентных нанокристаллов являются многообещающими направлениями наномедицины.

2. Характеристика

и свойства флуоресцентных полупроводниковых нанокристаллов

Флуоресцентные маркеры используются в качестве основного инструмента для визуализации многих процессов в биологических системах in vivo и in vitro [50; 72; 81]. Благодаря достижениям в области нанотехнологии был получен новый класс усовершенствованных флуорофоров - полупроводниковых нанокристаллов размером 2-6 нм (КТ). КТ обладают рядом уникальных свойств, которые делают их идеальными флуоресцентными маркерами и дают им неоспоримое преимущество перед классическими органическими флуорофорами для различных биологических приложений [49; 51; 57; 81].

Для КТ характерны уширенные области поглощения и возбуждения и, в то же время, узкие и симметричные спектры флуоресценции. При этом положение максимума флуоресценции определяется размером ядра нанокристалла. КТ разных размеров могут возбуждаться единым источником излучения и испускать флуоресценцию разных цветов, что практически невыполнимо в случае органических красителей. Для КТ также характерны высокие коэффициенты экстинкции, а следовательно, и усиленная яркость излучения. Более того, по сравнению с органическими флуорофорами КТ обладают высокой фотостабильностью и устойчивостью к выцветанию. Другим уникальными преимуществами КТ является возможность двухфотонного возбуждения, что позволяет значительно усовершенствовать качество детекции и визуализации различных биологических процессов. Также КТ могут выступать в роли эффективных доноров в процессах Ферстеровского резонансного переноса энергии.

Свойства КТ зависят от химического состава, размера частиц, химии поверхности. Как правило, КТ, используемые для биологических приложений, состоят из фотолюминесцентного полупроводникового ядра селенида кадмия (CdSe), дополнительно ядро может быть покрыто оболочкой сульфида цинка (ZnS). Для большинства биологических приложений необходима адаптация КТ к водной среде. Получение водорастворимых частиц предусматривает дополнительную модификацию поверхности КТ с помощью тиол-содержащих молекул с экспонированными карбоксильными, гидроксильными или амино-группами. Это дополнительно защищает поверхность КТ от ферментативного и химического воздействия биологических жидкостей и предоставляет возможность для конъюгации с биомолекулами [49; 73]. При поглощении света КТ происходит перенос возбужденных электронов из зоны валентности в зону проводимости, при этом валентный уровень остается свободным (рис. 2). Ввиду малых размеров ядра полупроводникового нанокристалла эк-ситонный переход возможен на короткие дискретные расстояния - ширину запрещенной зоны. В процессе обратного переноса экситона на валентный уровень происходит испускание энергии и излучение флуоресценции. Ширина запрещенной зоны перехода возбужденного экситона определяется размером ядра нанокристалла. Благодаря этому при возвращении электрона в состояние покоя излучается свет разных длин волн [51].

Кроме того, КТ обладают высокой эффективностью двухфотонного поперечного поглощения. При интенсивном облучении нанокристалла длиной волны в красной области спектра возможно поглощение двух фотонов с меньшей энергией и возбуждение электрона.

14 Щ ОБЗОРЫ ЛИТЕРАТУРЫ НОВЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ В ИССЛЕДОВАНИИ...

д НК клетка/ М в клетка моноцит у^ктиваци я ^ ШАутоантитело Система комплемента  «гаи*. ' Раковая В клетка Т клетка ^||Аутоа нтител о Раковая^атетка г-. * презентирующая Воспаление ^ клет7а Рис. 1. Предположительные механизмы развития противоопухолевого иммунного ответа, индуцированного аутоантителами: Л - Механизм взаимодействия аутоантитела с поверхностным опухолеспецифичным антигеном. Индукция клеточной цитотоксичности и системы комплемента. Б - Механизм взаимодействия аутоантитела с внутриклеточным опухолеспецифичным антигеном. Комплекс ауто-антитело-опухолевый антиген связывается с Боу-рецептором антиген-презентирующей клетки. Опухолеспецифичный антиген внутриклеточно расщепляется до пептидов и в составе МНС II (главного комплекса гистосовместимости) презентируется цитотоксическим клеткам.

В результате также происходит испускание энергии и флуоресценция при переходе возбужденного электрона на базовый валентный уровень (рис. 2). Поскольку вероятность одновременного поглощения фотонов низка, для двухфотонного возбуждения флуоресценции нанокристалла необходим постоянный поток фотонов, обеспечиваемый фокусируемым импульсным (фемтосекундным) инфракрасным лазером [83]. Свойство двухфотонного возбуждения нанокристаллов активно используется в двухфотонной спектроскопии и проточной флуо-риметрии для прижизненной визуализации клеток и тканей, мониторинга минорных популяций циркулирующих раковых клеток [42; 45; 70].

Было также показано, что флуоресцентные нанокристаллы могут выступать в роли эффективных доноров в Ферстеровском резонансном переносе энергии.

Во-первых, контролируя размер наночастицы можно регулировать смещение максимума и общий спектр флуоресценции кристалла. Это необходимо для коррекции перекрывания спектра флуоресценции донора (КТ) и спектра поглощения акцептора в паре.

Во-вторых, несколько разных акцепторов органического происхождения могут взаимодействовать с единственным донором КТ. Это позволяет усовершенствовать эффективность переноса энергии [35].

Возможность участия флуоресцентных нанокристаллов в Ферстеровском резонансном переносе энергии активно используется в различных высокочувствительных схемах для мониторинга внутриклеточных процессов и взаимодействий [41; 48; 60].

3. Области применения квантовых точек и перспективы использования в клинической диагностике рака

3.1. Иммуногистохимическое

окрашивание клеток и тканей с помощью КТ:

детекция клеточных маркеров и рецепторов

С успешным развитием эпохи нанотехнологии, флуоресцентные нанокристаллы привлекают все больший научный интерес в области биологических исследований. КТ активно адаптируют для флуоресцентной визуализации биомолекул и маркеров (рецепторы клеточной поверхности, компоненты цитоскелета, ядерные и цитоплазматические антигены). Разработаны эффективные технологии целевой доставки КТ в разные компартменты клетки (цитоплазматическая мембрана, цитоплазма, ядро) в различных типах образцов (культуры клеток, фиксированные образцы клеток, срезы тканей), как то: эндо-цитоз, прямая микроинъекция, электропорация, опосредованное поглощение, целевая доставка, избирательная специфичная маркировка белков клеточной поверхности [22]. В настоящее время опубликовано достаточно много интересных работ в области индивидуальной и многопараметрической иммуногисто-химической детекции различных клеточных мишеней с использованием КТ [67; 76].

Возможность использования флуоресцентных нанокристаллов для детекции антигена в фиксированных образцах клеток была впервые описана ВтсИе7 с соавт. в 1998 году [9]. Вскоре после этого, с помощью зеленых и красных КТ удалось одновременно маркировать ядерные антигены и Б-ак-тиновые

филаменты в культуре фиксированных фибробластов мыши. Детализированная трехмерная структура цитоскелета была реконструирована с помощью конфокальной микроскопии. Качество изображений, параметры разрешения и правильность графического воссоздания молекулярных структур с использованием КТ оптимизированы и сопоставимы с данными по классической детекции со стандартными красителями Alexa [76]. Другой группе ученых в своих исследованиях удалось одновременно комбинировать для детекции три вида КТ (КТ 655; 705 и 800), классические флуорохромы DAPI и Alexa 555 и зеленый флуоресцентный белок GFP [43]. Ness с соавт. разработали комплексную процедуру иммуногистохимического окрашивания для высокочувствительной детекции внутриклеточных антигенов в тканях мозга грызунов. Предложенная схема сочетает в себе принципы маркировки с помощью биоконъюгатов КТ и ферментативного усиления сигнала [52].

Основные иммуногистохимические исследования с использованием КТ были выполнены на клеточных линиях или свежеизолированных образцах тканей. Однако, большинство получаемых клинических образцов тканей пациентов, как правило, фиксированы в формалине или заключены в парафин (FFPE) и должны храниться в течение нескольких лет. Процедуры маркировки с помощью КТ также удалось успешно адаптировать для детекции до четырех различных биомолекул в фиксированных образцах тканей пациентов [7; 77].

Помимо этого, КТ были адаптированы для маркировки и визуализации в многопараметрическом анализе на тканевых микрочипах. Так называемые тканевые микрочипы позволяют исследовать большое количество образцов тканей одновременно с помощью иммуногистохимического окрашивания. Caldwell с коллегами использовали два вида КТ (КТ 605 и 705) для количественной детекции белковых мишеней MDM-2 and Р-актина одновременно в 25 образцах ткани почечной карциномы [10]. Преимущества использования КТ для иммуногистохимического окрашивания тканевых микрочипов также были продемонстрированы на модели рака легкого. Анализируя уровень кавеоли-на-1 и PCNA в качестве модельных антигенов, исследователи пришли к выводу, что детекция с помощью КТ превосходит классические методы окрашивания [19]. Эта же группа ученых использовала конъюгаты стрептавидина с КТ 605 и 545 для оценки статуса HER 2 при раке молочной железы. Аналогичным образом исследователи показали, что такой подход к окрашиванию образцов характеризуется большей чувствительностью и точностью по сравнению с использованием органических флуо-рофоров. Это оказалось особенно критично для идентификации низкого уровня экспрессии HER2 и его предшественника ER белка [18].

3.2. Многоцветная

проточная цитофлуориметрия: иммунофенотипирование клеточных субпопуляций с помощью КТ

Аналитический метод проточной цитометрии является основным инструментом для идентификации клеточных популяций, принимающих участие в процессах нормального функционирования организма и развития различных патологий. В практических приложениях эта задача осложнена тем фактом, что любая клетка может экспрессировать широкий профиль белков и рецепторов.

16 ОБЗОРЫ ЛИТЕРАТУРЫ НОВЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ В ИССЛЕДОВАНИИ...

Рис. 2. Схематическая диаграмма процессов однофотонного и двухфотонного поглощения и испускания энергии:

При облучении флуоресцентной частицы светом происходит индуцированный переход электронов между различными энергетическими уровнями. Часть полученной системой энергии испускается в результате релаксации электрона с возбужденного на базовый энергетический уровень. Разница энергии между энергетическими уровнями и частота колебаний поглощенного света определяют спектр флуоресценции. В случае однофотонного возбуждения частица поглощает один фотон с более короткой длинной волны, чем у излучаемого фотона. При двухфотонном возбуждении половина энергии эффективно поглощается и испускается при релаксации электрона на базовый уровень, оставшаяся энергия рассеивается. Вероятность поглощения одной молекулой двух возбуждающих фотонов очень мала. Поэтому необходим интенсивный поток возбуждающих фотонов, который можно получить при помощи фокусированного фемтосекундного лазера, испускающего фотоны с большой частотой следования импульсов.

Зачастую неизвестно или строго не определено, какие качественные и количественные комбинации и сочетания белков являются уникальными для определенного типа клеток. Таким образом, количественное определение целого профиля белков является важной задачей для характеризации того или иного процесса и популяции клеток, принимающих в нем участие. В случае, если количество образца ограничено или важна точная оценка соотношения и взаимодействия белков, возникает острая необходимость в многопараметрической детекции. Эту задачу успешно помогают решать проточная цитометрия с применением КТ.

Серьезное научное достижение в области применения КТ для многопараметрического анализа фенотипа индивидуальных Т-клеточных популяций методом проточной цитометрии продемонстрировали Chattopadhyay и соавт. [16; 17; 56]. В этой работе авторы изучали механизмы адаптивного иммунитета и идентифицировали EBV, CMV, HIV Nef, and HIV Gag -специфические CD8 + Т-клеточные популяции в образцах крови ВИЧ-инфицированных пациентов.

Благодаря уникальным спектральным свойствам КТ, исследователи создали панель из 17 различных флуорофоров, включающую семь типов КТ и десять органических красителей [17; 56]. КТ были конъюгированы с антителами против CD4, CD45RA и ОТ57-рецепторов, а также специфическими мультимерами пептидов MHC класса I (pMHCI) для детекции EBV-, CMV-, HIV-специфичных цитотоксических лимфоцитов [2; 17] (рис. 3).

Chattopadhyay и соавт. разработали особую конфигурацию проточного цитометра, оснащенного несколькими фильтрами, детекторами и лазера-

ми. Это позволило максимально увеличить количество флуорофоров, которые могут быть идентифицированы при возбуждении одним источником излучения. Благодаря такой конструкции флуоресценция всех типов КТ индуцировалась с помощью одного ультрафиолетового лазера 408 нм, это также помогло снизить интенсивность автофлуоресценции клеток [17; 56].

В этом исследовании наглядно продемонстрированы потенциал КТ для разработки новых многопараметрических подходов анализа. Существование нескольких фенотипически отличающихся субпопуляций в составе каждой антиген-специфической популяции Т-клеток дает представление о сложности механизмов развития Т-клеточного иммунитета. Разработка принципов применения суспензионных систем на основе КТ для определения фенотипа индивидуальных клеточных популяций может оказаться важным шагом в создании качественной и высокочувствительной многопараметрической диагностики в онкологии.

3.3. Мониторинг

внутриклеточных процессов и взаимодействий с помощью квантовых точек

Широко известно, что механизм FRET активно используется для визуализации и контроля внутриклеточных взаимодействий и процессов. Благодаря успешному внедрению флуоресцентных наноматериалов в практику биологических исследований стало очевидно, что КТ могут быть гораздо более эффективными донорами в этом процессе, чем классические флуорофоры [35; 48]. Различные высокочувствительные схемы мониторинга внутриклеточных процессов были разработаны на основе КТ в качестве FRET доноров.

Рис. 3. Применение квантовых точек для иммунофенотипирования клеточных популяций цитотоксических лимфоцитов (CTL):

Схематическое изображение связывания конъюгата флуоресцентного нанокристалла с пептид-MHC I комплексом на мембране CD8 + Т-клеток. Мультивалентные взаимодействия между мембранным СБ8-корецептором и петидом MHC I-комплекса определяют стабильность TCR/pMHC-I/CD8 комплексов и усиливают CD8 + Т-клеточный ответ.

Наиболее распространенный пример определения активного аналита на основе механизма FRET заключается в вытеснении и замещении связанного тушителя флуоресценции. Показано, что в присутствии мальтозы происходит диссоциация комплекса циклодекстрина, меченого QSY-9, с MBP, конъюгированным с КТ, и восстановление флуоресценции КТ [48].

Чувствительные зонды на основе пептидов, конъюгированных с парами донор-акцептор, могут служить для определения специфической активности ряда протеолитических ферментов. Shi с соавт. создали зонд для реализации механизма FRET и измерения ферментативной активности трипсина, состоящий из пептида, конъюгированного с КТ в качестве донора и родамином в качестве акцептора. При направленном облучении и возбуждении КТ индуцируется эффективный перенос энергии на близкорасположенный флуорофор родамин. При расщеплении пептида трипсином процесс переноса энергии нарушается, сигнал флуоресценции КТ в образце возрастает до 60 %, а флуоресценция родамина, соответственно, исчезает [60].

Относительно недавно была продемонстрирована возможность использования КТ в качестве акцепторов в процессах BRET [61]. Эффект индукции флуоресценции КТ был показан в системе с

Luc8, вариантом люциферазы R. reniformis, конъюгированной с КТ. После добавления люминесцентного субстрата коэлентеразина индуцировалась флуоресценция с максимумами на 480 нм (коэлен-теразин) и 655 нм (КТ). Эта схема также применима для высокочувствительной детекции активности протеаз [80].

В дополнение к схемам FRET and BRET, эффекты тушения переноса электронов могут быть использованы как альтернативный способ изучения механизмов биокаталитических процессов. Активность различных ферментов исследовали в схемах электронного тушения КТ. С помощью такого подхода можно оценить тирозиназную активность в присутствии КТ, покрытых монослоем метилового эфира тирозина. Индуцированное окисление тирозина и каталитическое превращение в субъединицы гасителя флуоресценции допахинона приводит к тушению флуоресценции КТ. Активность тирози-назы оценивается по степени угасания флуоресценции КТ при взаимодействии с различными концентрациями тирозиназы и различном времени каталитической реакции [30]. Помимо наглядной демонстрации мониторинга биокаталитических процессов анализ тирозиназной активности с использованием КТ имеет важное практические значение. Повышенный уровень тирозиназы обнаружен в рако-

вых клетках меланомы, поэтому такой способ быстрой оптической детекции этого биомаркера с помощью КТ может быть полезным диагностическим приложением.

Таким образом, конъюгаты КТ с различными активными целевыми молекулами (белки, фрагменты антител, аптамеры ДНК) могут служить эффективными донорами FRET для детекции небольших моле-кул-аналитов в клинической диагностике [31; 48].

Кроме того, применение флуоресцентных нанокристаллов помогло решить технологические проблемы, связанные с прижизненной маркировкой и визуализацией структур in vivo [3; 42; 43], в том числе - с использованием метода двухфотонной спектроскопии. Последний считается одним из наиболее перспективных подходов для изучения структуры плотных образцов и живых тканей [44; 45]. Принцип двухфотонной микроскопии основан на нелинейном двухфотонном возбуждении флуоресцентных частиц фокусируемым импульсным (фемтосекундным) инфракрасным лазером (7001000 нм) и регистрации флуоресценции в видимой области спектра. Облучение светом инфракрасного диапазона характеризуется гораздо большей проникающей и индуцирующей способностью, чем облучение светом видимой области спектра. Благодаря этому появляется возможность визуализировать структуры живых тканей в функционирующем организме in vivo [45].

С помощью КТ с максимумами флуоресценции в ближнем ИК диапазоне (840-860 нм) ученые визуализировали и картировали лимфатические узлы, первично подверженные метастазам, для направленных хирургических вмешательств у животных. Инъекция 400 пмоль КТ ближнего ИК-диапазона позволила идентифицировать метастази-рованные лимфоузлы в подкожном слое у свиней [42]. Таким образом, интраоперационная флуоресцентная микроскопия позволяет визуально идентифицировать лимфатический ток и первично мета-стазированные лимфоузлы без использования радиоактивных индикаторов или органических флуо-рофоров. Благодаря такой возможности может осуществляться направленное местное хирургическое вмешательство без повреждения здоровых тканей и структур.

В аналогичных исследованиях с помощью КТ были обнаружены желудочно-кишечные и легочные лимфатические узлы, подверженные раннему первичному метастазированию [55; 62]. Эти данные также предоставляют важную информацию для клинического картирования зон риска метаста-зирования опухоли в лимфатической системе и диагностирования рака.

4. Многопараметрические суспензионные системы на основе микросфер, кодированных флуорофорами

Благодаря своим уникальным оптическим свойствам и характеристикам, полупроводниковые нанокристаллы являются идеальными флуоресцентными метками для клинической лабораторной диагностики [16; 42; 71]. Современные методы маркировки, визуализации и оптического кодирования анализируемых молекул с помощью КТ позволяют получать весьма информативные данные и знания о многих биологических процессах. Кроме того, с помощью оптического кодирования полимерных микросфер флуоресцентными нанокристаллами могут быть созданы многопараметриче-

ские системы анализа [64; 65; 75], необходимые для быстрого скрининга большого количества биомолекул одновременно [32; 75].

Оптически кодированные микросферы, оптимально подходят для анализа биологических образцов с помощью методов классической проточной цитометрии, высокочувствительной лазерной сканирующей цитометрии, а также СЬ8М. Большинство описанных оптически кодированных суспензионных систем состоят из полистирольных микросфер, в структуру которых включены несколько флуоресцентных красителей в разных количественных соотношениях.

При включении в состав микросфер различных концентраций флуоресцентных красителей с разными спектрами излучения удается получить набор микросфер с уникальными спектральными кодами (рис. 4). Теоретически возможное число кодов определяется количеством красителей и количеством уровней интенсивности их излучения и рассчитывается в соответствии с уравнением:

С = Ыт — 1, где С (величина) определяет теоретически возможное число спектральных кодов,

N - число уровней интенсивности, а т - количество цветов (флуорофоров).

Фактическое число кодов, однако, оказывается ниже в связи с перекрыванием спектров, разницей в интенсивности флуоресценции красителей и требованиями к соотношению сигналов флуоресценции и фона [32].

В настоящее время существует 2 разные стратегии многоцветного оптического кодирования микросфер для биологических исследований: использование классических органических флуоро-форов и включение в микросферы полупроводниковых нанокристаллов различных цветов [32; 65].

Последние успешные достижения в области многопараметрической детекции заключаются в разработке компанией Ьыттвх суспензионной системы кодированных микросфер для анализа биологических образцов методом проточной цитометрии (ЫЕСА) [28; 65]. Технология Ьыттвх подразумевает включение трех видов органических красителей в 10 различных концентрационных соотношениях в состав полистирольных микросфер размером 5,6 мкм. Далее, кодированные сферы конъюгируют с индивидуальными молекулярными зондами, которые распознают и связывают анализируемые молекулы в биологическом образце. Вариации количественных соотношений трех органических красителей позволяют получить до 500 спектральных кодов микросфер, конъюгированных с различными биологическими зондами. Количественная оценка сигнала флуоресценции микросфер и интенсивности флуоресцентного сигнала референсной метки осуществляется с помощью классической проточной цитометрии. Поскольку каждый отдельный тип микросфер может быть идентифицирован с помощью проточной цитометрии, большое число различных молекул может быть детектировано одновременно [65]. Такая возможность предоставляет свободу для многопараметрического определения большого числа анализируемых параметров в 1 образце. Суспензионная система оптически кодированных микросфер, разработанная компанией Ьыminвx, успешно используется для широкого спектра анализов, в том числе - для детекции цито-кинов [39] и ряда других белков и ферментов, ви-

русов иммунодефицита человека и гепатита В [47], SNP [33], определения уровня тиреоидного гормона [5], скрининга аллергических реакций [74], диагностики инфекционных заболеваний [79] и проч.

Относительно недавно была разработана альтернативная стратегия многоцветного кодирования микросфер флуоресцентными полупроводниковыми нанокристалами, обладающими уникальными оптическими свойствами и характеристиками [29; 64].

Существует несколько альтернативных способов включения КТ в состав микросферы. Кодирование может быть реализовано путем частичного разрушения полистирольных сфер в органических растворителях с последующей загрузкой флуоресцентных нанокристаллов [32; 63], непосредственного включения метки во время синтеза микросферы [38; 59] и формирования многослойной полимерной оболочки на поверхности сферы с включением между слоями КТ [12; 75].

Принципы кодирования (рис. 4) и спецификации микросфер с помощью молекулярных зондов и многопараметрическая детекция с использованием такой суспензионной системы во многом аналогичны технологии, разработанной Ьыminвx.

Однако стоит отметить, что система кодированных микросфер, разработанная Ьыminвx, обладает серьезными недостатками и ограничениями в использовании по сравнению с суспензией микросфер, кодированных КТ [32; 64].

Прежде всего, увеличение числа органических красителей в составе кодированных микросфер и детекторных меток требует оснащения цитометра несколькими лазерами возбуждающего света. Это значительно увеличивает стоимость декодирующего прибора. В тоже время флуоресценция различных популяций КТ эффективно индуцируется светом одной длины волны благодаря тому, что для всех нанокристаллов характерны широкие спектры поглощения. Во-вторых, органические красители, входящие в состав микросфер Ьыminвx, обладают низким порогом фотообесцвечивания и широкими спектрами флуоресценции, что повышает вероятность перекрывания спектров поглощения и испускания разных красителей и снижения точности детекции. Напротив, КТ обладают узкими спектрами излучения и хорошей устойчивостью к фотообесцвечиванию, характеризуются широким набором непере-крывающихся спектральных кодов и высокой чувствительностью многопараметрической детекции. Таким образом, благодаря своим уникальным оптическим характеристикам КТ являются более подходящими флуоресцентными метками для оптического кодирования микросфер [29; 64].

Первые функциональные системы на основе кодированных нанокристаллами микросфер были успешно разработаны для поиска нуклеотидных полиморфизмов и генотипирования. С помощью микросфер, кодированных нанокристаллами, удалось с высокой точностью детектировать 10 разных типов нуклеотидных полиморфизмов в составе амплифициро-ванной геномной ДНК [78]. ЕаБ1тап и соавт. использовали микросферы, кодированые четырьмя типами КТ в 12 разных концентрационных соотношениях, для анализа экспрессии генов [26]. Точность и чувствительность такого метода детекции были сопоставимы с параметрами анализа на микрочипах. Была продемонстрирована эффективность применения КТ-кодированных микросфер для многопараметрического генетического типирования без предварительной амплификации геномной ДНК в образце [29].

Относительно недавно были продемонстрированы перспективы приложения суспензионных систем на основе микросфер, кодированных флуоресцентными нанокристаллами, в клинической протеомике. А.В. Суханова и И.Р. Набиев с коллегами разработали эффективные суспензионные диагностические системы для определения специфичных аутоантител, ассоциированных с развитием аутоиммунных заболеваний [64] (рис. 5). Были также продемонстрированы преимущества использования принципа FRET в суспензионной системе микросфер, кодированных КТ, для достижения высокой чувствительности и точности детекции.

Полная схема определения профиля аутоантител, сопряженных с аутоимунными заболеваниями, включает несколько основных этапов. Оптически кодированные микросферы конъюгируют с зондом-антигеном, инкубируют с аналитом, содержащим специфические аутоантитела, а визуализация и детекция специфического сигнала осуществляется с помощью вторичных антител, меченых референсной флуоресцентной меткой [64]. В описанной работе в качестве модельного аутоиммунного заболевания была выбрана системная склеродермия, прогрессирующее системное заболевание, в основе которого лежит воспалительное поражение мелких сосудов всего организма, с последующими фиброзно-склеротическими изменениями кожи, опорно-двигательного аппарата и внутренних органов. Развитие этого аутоиммунного заболевания ассоциировано с появлением антител против компонентов клеточного ядра, таких как anti-Scl-70, nRNP, anti Smith antigen) и некоторых других аутоантител. В качестве антигенов использовали рекомбинантный фрагмент человеческой ДНК топоизомеразы I (Scl-70), нуклеарный рибонуклео-протеин (nRNP) или Sm-антиген. Такая схема может быть реализована в двух разных форматах оптического декодирования. В одном случае спектральный код микросфер, созданный сочетанием нанокристаллов, и референсный флуоресцентный сигнал детекторных антител фиксируются одновременно, индивидуально и независимо друг от друга (рис. 5).

Другой более чувствительный формат детекции анализируемых молекул (аутоантител) предполагает резонансный перенос энергии при возбуждении КТ на референсный краситель, конъюгированный с вторичным детекторным антителом. Преимущество такой схемы переноса энергии заключается в оптимизации индукции флуоресценции нанокристаллов с помощью света одной длины волны и улавливании даже низкого сигнала детекции анализируемых молекул. В составе указанной системы детекции спектры излучения КТ и поглощения ре-ференсного красителя AlexaFluor633 в значительной степени перекрываются.

Благодаря этому свойству при облучении нанокристаллов происходит эффективный перенос энергии их возбуждения на близко расположенные флуоресцентные референсные метки, конъюгированные с вторичными антителами. Значительная удаленность максимумов флуоресценции КТ и органического красителя позволяет дифференцировать два пика излучения энергии, что предоставляет возможности для высокочувствительной детекции [64] (рис. 5). Авторы продемонстрировали, что при селективном возбуждении КТ в составе микросферы одновременно индуцируется флуоресценция оранжевого спектра от нанокристаллов и красного спектра от AlexaFluor633.

А- -СП

в- g

с-jC>

°-х>

Рис. 4. Принципы оптического кодирования, основанные на спектральных свойствах (длине волны поглощения и флуоресценции) и интенсивности флуоресценции нанокристалла:

Крупные сферы представляют собой полимерные микрошарики, в которые в определенном соотношении, количестве и цветовой комбинации включены разноцветные квантовые частицы (маленькие сферы). Поверхность оптически кодированных полимерных микросфер модифицирована биологическим пробами (А-D) для молекулярного распознавания и связывания с мишенью. Количество цветных сфер отражает уровень интенсивности флуоресценции, а не количество отдельных КТ. Принцип кодирования микросфер определяется и абсолютными значениями интенсивности излучения и отличимыми спектрами флуоресценции разных нанокристаллов. Таким образом, количественные соотношения квантовых точек в составе полимерной микросферы (например, соотношения (2 : 2 : 2) and (4 : 0 : 4)) определяют различия цветового кода микросферы.

Рис. 5. Суспензионные аналитические системы на основе микросфер, кодированных флуоресцентными нанокристаллами. Принцип иммунодетекции аутоантител методом проточной цитометрии:

Оптически кодированные с помощью квантовых точек микросферы конъюгированы с антигеном топоизомераза I, инкубируются с моноклональными антителами к антигену или образцами сыворотки и дополнительно окрашиваются вторичными антителами, мечеными органическим красителями.

А - Вторичные антитела конъюгированы с ПТС. Возбуждение и флуоресценция квантовых точек и органического красителя одновременно обеспечивается аргоновым лазером с длиной волны облучения 488 нм.

Б - Вторичные антитела конъюгированы с А1ехаИиог633. Возбуждение квантовых точек обеспечивается светом в диапазоне длин волн 450-500 нм, при близком пространственном расположении покрытых антигеном микросфер и вторичных антител происходит резонансный перенос энергии от квантовых точек и возбуждение флуоресценции органического флуорофора А1ехаИиог633.

При этом не связанные в растворе детекторные антитела, меченые Л1ехаР1иог633, не выявляют сигнала флуоресценции, поскольку длина волны облучения не попадет в спектральный диапазон возбуждения данного референсного красителя. Таким образом, в составе такой системы КТ поверхностного слоя микросфер могут выступать в качестве эффективных доноров для резонансного переноса энергии и возбуждения красителя Л1ехаР1иог633 на специфически связанных детекторных антителах [64].

5. Преимущества использования суспензионных систем на основе квантовых точек по сравнению со стандартными диагностическими системами

Качественное выявление опухолевых маркеров уже на ранних стадиях развития заболевания имеет большое значение для выбора эффективных методов лечения и своевременного предотвращения развития онкологии. В настоящее время принципы клинической диагностики рака в основном базируются на двух базовых стратегиях детекции опухолевых маркеров, таких как ИФА и МБСЛ-технология, разработанная компанией Luminex. Однако перечисленные методы обладают серьезными недостатками и ограничениями по сравнению с возможностями многопараметрических суспензионных систем на основе микросфер, кодированных КТ. С помощью ИФА можно единовременно детектировать только один маркер в образце, что делает этот способ анализа профиля онкомаркеров дорогим и затратным по времени. К другим недостаткам технологии анализа с помощью ИФА относятся:

необходимость в получении больших объемов образцов,

узкий динамический диапазон,

сложные стадийные процедуры исполнения [6; 36].

Для МБСЛ-технологии характерны более широкие диапазоны измерения и детекции анализируемых молекул, гораздо более простая и быстрая техническая подготовка по сравнению с классическим методом ИФА[53]. Тем не менее, разработанная Ьиттех суспензионная система полимерных микросфер, оптически кодированных органическими красителями, требует наличия сложного специального оборудования и насчитывает ограниченное число уникальных спектральных кодов. В то же время, использование флуоресцентных нанокристаллов для кодирования микросфер может значительно усовершенствовать многопараметрические возможности, а также фотостабильность и чувствительность системы [64; 65].

Таким образом, разработка принципов применения в клинической диагностике суспензионных систем на основе микросфер, кодированных нанокристаллами, имеет важное медицинское значение. Возможность многопараметрического анализа профиля онкомаркеров в биологических жидкостях пациентов может значительно способствовать своевременной ранней диагностике и выбору грамотного терапевтического лечения, и как следствие предотвращению развития, метастазирования опухоли, а также развитию новых принципов иммунотерапии.

Заключение

Разработка и успешная интеграция в клинико-диагностическую практику технологий применения квантовых точек и микросфер, кодированных флуоресцентными нанокристаллами, находится на этапе интенсивного исследования и развития. Получены первые интересные результаты применения таких систем для идентификации аутоантител в сыворотке крови пациентов [64+ и фенотипирова-ния опухолеспецифических CD8 Т-клеток [16; 17]. Эти исследования открывают хорошие перспективы применения разработанных диагностических систем для многопараметрической детекции различных биологических маркеров с очень высокой точностью и чувствительностью. Возможность реализации системы детекции в формате резонансного переноса энергии от возбужденных КТ на специфически связанную референсную метку позволяет в значительной степени нивелировать сигнал неспецифического связывания и повысить чувствительность анализа. С помощью диагностической суспензионной системы микросфер, кодированных КТ, появится возможность детектировать даже малые количества антигенов и специфических аутоантител в крови пациентов.

Это может иметь очень большое значение для своевременной диагностики онкологических заболеваний еще на ранних этапах их развития и применения адекватных эффективных методов терапии рака. Кроме того, идентификация и анализ антиген-специфических CD8+ T-клеточных популяций с помощью проточной цитометрии может способствовать пониманию механизмов адаптивного иммунного ответа и разработать подходы для эффективного предотвращения метастазирования опухоли. Детекция редких популяций циркулирующих опухолевых клеток с помощью двухфотонной проточной цитометрии может быть информативной для мониторинга эффективности терапии и прогнозирования метастазирования.

Развитие современных диагностических технологий применения КТ и микросфер, кодированных флуоресцентными нанокристаллами, предоставит новый способ сверхчувствительной ранней диагностики онкологических заболеваний для повышения эффективности противоопухолевой терапии.

Благодарности

Данная работа частично финансировалась Министерством образования и науки Российской Федерации в рамках программы привлечения ведущих ученых в российские образовательных учреждениях высшего профессионального образования (проф. Игорь Набиев, грант № 11.G34.31.0050, www.lnbe.mephi.ru), а также Европейской Комиссией, через проект Седьмой рамочной программы научного сотрудничества «Нанотехнологические системы для много-модальной диагностики заболеваний и контроля эффективности лечения: Nanotechnological toolkits for multi-modal disease diagnostics and treatment monitoring » (проф. Игорь Р. Набиев и Д-р Алена В. Суханова, грант № FP7-NMP-2009-LARGE-3 - 246479 NAMDIATREAM).

Литература

1. Anderson K.S., Sibani S., Wallstrom G. et al. Protein microarray signature of autoantibody biomarkers for the early detection of breast cancer // J Proteome Res. - 2011. - 10. P. 85-96.

2. Anikeeva N., Lebedeva T., Clapp A.R. et al. Quantum dot/peptide-MHC biosensors reveal strong CD8-dependent cooperation between self and viral antigens that augment the T cell response // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2006. -103. - P. 16846-51.

3. Ballou B., Ernst L.A., Andreko S. et al. Sentinel lymph node imaging using quantum dots in mouse tumor models // Bioconjug Chem. - 2007. - 18. -P. 389-96.

4. Bei R., Masuelli L., Palumbo C. et al. A common repertoire of autoantibodies is shared by cancer and autoimmune disease patients: Inflammation in their induction and impact on tumor growth // Cancer Lett. - 2009. - 281. - P. 823.

5. Bellisario R., Colinas R.J., Pass K.A. Simultaneous measurement of thyroxine and thyrotropin from newborn dried blood-spot specimens using a multiplexed fluorescent microsphere immunoassay // Clin Chem. - 2000. - 46. - P. 1422-4.

6. Biagini R.E., Sammons D.L., Smith J.P. et al. Comparison of a multiplexed fluorescent covalent microsphere immunoassay and an enzyme-linked immunosorbent assay for measurement of human immunoglobulin G antibodies to anthrax toxins // Clin Diagn Lab Immunol. - 2004. - 11. - P. 50-5.

7. Bodo J., Durkin L., Hsi E.D. Quantitative in situ detection of phosphoproteins in fixed tissues using quantum dot technology // J Histochem Cytochem. - 2009. - 57. - P. 701-8.

8. Brena R.M., Huang T.H., Plass C. Quantitative assessment of DNA methylation: Potential applications for disease diagnosis, classification, and prognosis in clinical settings // J Mol Med (Berl). - 2006. - 84. - P. 365-77.

9. BruchezM. Jr., Moronne M., Gin P. et al. Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels // Science. -1998. - 281. - P. 2013-6.

10. Caldwell M.L., Moffitt R.A., Liu J. et al. Simple quantification of multiplexed quantum dot staining in clinical tissue samples // Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. - 2008. - P. 1907-10.

11. Caron M., Choquet-Kastylevsky G., Joubert-Caron R. Cancer immunomics using autoantibody signatures for biomarker discovery // Mol Cell Proteomics. - 2007. - 6. - P. 1115-22.

12. Caruso F. Nanoengineering of Particle Surfaces // Adv Mater. - 2001. - 13. - P. 11-22.

13. Casal J.I., Barderas R. Identification of cancer autoantigens in serum: toward diagnostic/prognostic testing?// Mol Diagn Ther. - 2010. - 14. - P. 149-54.

14. Chapman C., Murray A., Chakrabarti J. et al. Autoantibodies in breast cancer: their use as an aid to early diagnosis // Ann Oncol. - 2007. - 18. - P. 868-73.

15. Chapman C.J., Thorpe A.J., Murray A. et al. Immunobiomarkers in small cell lung cancer: potential early cancer signals // Clin Cancer Res. - 2011. - 17. - P. 1474-80.

16. 16. Chattopadhyay P.K., Perfetto S.P., Yu J. et al. The use of quantum dot nanocrystals in multicolor flow cytometry // Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. - 2010. - 2. - P. 334-48.

17. Chattopadhyay P.K., Price D.A., Harper T.F. et al. Quantum dot semiconductor nanocrystals for

immunophenotyping by polychromatic flow cytometry // Nat Med. - 2006. - 12. - P. 972-7.

18. Chen C., Peng J., Xia H.S. et al. Quantum dots-based immunofluorescence technology for the quantitative determination of HER2 expression in breast cancer // Biomaterials. - 2009. - 30. - P. 2912-8.

19. Chen H., Xue J., Zhang Y. et al. Comparison of quantum dots immunofluorescence histochemistry and conventional immunohistochemistry for the detection of caveolin-1 and PCNA in the lung cancer tissue microarray // J Mol Histol. - 2009. - 40. - P. 261-8.

20. Cramer D.W., Bast R.C., Jr., Berg C.D. et al. Ovarian cancer biomarker performance in prostate, lung, colorectal, and ovarian cancer screening trial specimens // Cancer Prev Res (Phila). - 2011. - 4. - P. 365-74.

21. Cristofanilli M., Budd G.T., EllisM.J. et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer // N Engl J Med. - 2004. - 351. - P. 781-91.

22. Delehanty J.B., Mattoussi H., Medintz I.L. Delivering quantum dots into cells: strategies, progress and remaining

issues // Anal Bioanal Chem. - 2009. - 393. - P. 1091-105.

23. Desmetz C., Cortijo C., Mange A. et al. Humoral response to cancer as a tool for biomarker discovery // J

Proteomics. - 2009. - 72.- P. 982-8.

24. Desmetz C., Maudelonde T., Mange A. et al. Identifying autoantibody signatures in cancer: a promising challenge // Expert Rev Proteomics. - 2009. - 6. - P. 377-86.

25. Diamandis E.P., Fritsche H.A., Chan D. W. In: Tumor markers: Physiology, Pathobiology, Technology and Clinical Applications. AACC Press Inc, USA, 2002.

26. Eastman P.S., Ruan W., Doctolero M. et al. Qdot nanobarcodes for multiplexed gene expression analysis // Nano Lett. - 2006. - 6. - P. 1059-64.

27. Finn O.J. Immune response as a biomarker for cancer detection and a lot more // N Engl J Med. - 2005. - 353. - P. 1288-90.

28. Fulton R.J., McDade R.L., Smith P.L. et al. Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system // Clin Chem. - 1997. - 43. - P. 1749-56.

29. Gao Y., Stanford W.L., Chan W.C. Quantum-dot-encoded microbeads for multiplexed genetic detection of nonamplified DNA samples // Small. - 2011. - 7. - P. 137-46.

30. Gill R., Freeman R., Xu J.P. et al. Probing biocatalytic transformations with CdSe-ZnS QDs // J Am Chem Soc. -2006. - 128. - P. 15376-7.

31. Goldman E.R., Medintz I.L., Whitley J.L. et al. A hybrid quantum dot-antibody fragment fluorescence resonance energy transfer-based TNT sensor // J Am Chem Soc. - 2005. - 127. - P. 6744-51.

32. Han M., Gao X., Su J.Z. et al. Quantum-dot-tagged microbeads for multiplexed optical coding of biomolecules // Nat Biotechnol. - 2001. - 19. - P. 631-5.

33. Hurley J.D., Engle L.J., Davis J.T. et al. A simple, bead-based approach for multi-SNP molecular haplotyping // Nucleic Acids Res. - 2004. - 32. - P. e186.

34. Jacob F., Goldstein D.R., Bovin N.V. et al. Serum antiglycan antibody detection of nonmucinous ovarian cancers by using a printed glycan array // Int J Cancer. - 2012. - 130. - P. 138-46.

35. Jares-Erijman E.A., Jovin T.M. FRET imaging // Nat Biotechnol. - 2003. - 21. - P. 1387-95.

36. Jia X.C., Raya R., Zhang L. et al. A novel method of Multiplexed Competitive Antibody Binning for the characterization of monoclonal antibodies // J Immunol Methods. - 2004. - 288. - P. 91-8.

37. Jimenez L.G., Aguilar M.C., Monroy O.L. et al. Detection of autoantibodies to survivin in cervical mucus from patients with human papillomavirus-associated cervical cancer and precursor lesions // Autoimmunity. - 2007. -40. - P. 66-72.

38. Joumaa N., LansalotM., Theretz A. et al. Synthesis of quantum dot-tagged submicrometer polystyrene particles by miniemulsion polymerization // Langmuir. - 2006. - 22. - P. 1810-6.

39. Kellar K.L., Douglass J.P. Multiplexed microsphere-based flow cytometric immunoassays for human cytokines // J Immunol Methods. - 2003. - 279. - P. 277-85.

40. Kellar K.L., Iannone M.A. Multiplexed microsphere-based flow cytometric assays // Exp Hematol. - 2002. - 30. -P. 1227-37.

41. Kim G.B., Kim Y.P. Analysis of protease activity using quantum dots and resonance energy transfer // Theranostics.

- 2012. - 2. - P. 127-38.

42. Kim S., Lim Y.T., Soltesz E.G. et al. Near-infrared fluorescent type II quantum dots for sentinel lymph node mapping // Nat Biotechnol. - 2004. - 22. - P. 93-7.

43. Kingeter L.M., Schaefer B.C. Expanding the multicolor capabilities of basic confocal microscopes by employing red and near-infrared quantum dot conjugates // BMC Biotechnol. - 2009. - 9. - P. 49.

44. Konig K. Multiphoton microscopy in life sciences // J Microsc. - 2000. - 200. - P. 83-104.

45. Larson D.R., Zipfel W.R., Williams R.M. et al. Water-soluble quantum dots for multiphoton fluorescence imaging in vivo // Science. - 2003. - 300. - P. 1434-6.

46. Lee J.S., Lo P.K., Fackler M.J. et al. A comparative study of Korean with Caucasian breast cancer reveals frequency of methylation in multiple genes correlates with breast cancer in young, ER, PR-negative breast cancer in Korean women // Cancer Biol Ther. - 2007. - 6. - P. 1114-20.

47. Lukacs Z., Dietrich A., Ganschow R. et al. Simultaneous determination of HIV antibodies, hepatitis C antibodies, and hepatitis B antigens in dried blood spots a feasibility study using a multi-analyte immunoassay // Clin Chem Lab Med. - 2005. - 43 - P. 141-5.

48. Medintz I.L., Clapp A.R., Mattoussi H. et al. Self-assembled nanoscale biosensors based on quantum dot FRET donors // Nat Mater. - 2003. - 2. - P. 630-8.

49. MedintzI.L., Uyeda H.T., Goldman E.R. et al. Quantum dot bioconjugates for imaging, labelling and sensing // Nat Mater. - 2005. - 4. - P. 435-46.

50. Michalet X., Pinaud F.F., Bentolila L.A. et al. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics // Science. - 2005. - 307.- P. 538-44.

51. Murphy C.J. Optical sensing with quantum dots // Anal Chem. - 2002. - 74. - P. 520A-526A.

52. Ness J.M., Akhtar R.S., Latham C.B. et al. Combined tyramide signal amplification and quantum dots for sensitive and photostable immunofluorescence detection // J Histochem Cytochem. - 2003. - 51. - P. 981-7.

53. Nolan J.P., Sklar L.A. Suspension array technology: evolution of the flat-array paradigm // Trends Biotechnol. -2002. - 20. - P. 9-12.

54. Pantel K., Alix-Panabieres C. Circulating tumour cells in cancer patients: challenges and perspectives // Trends Mol Med. - 2010. - 16. - P. 398-406.

55. Parungo C.P., Ohnishi S., Kim S.W. et al. Intraoperative identification of esophageal sentinel lymph nodes with near-infrared fluorescence imaging // J Thorac Cardiovasc Surg. - 2005. - 129. - P. 844-50.

56. Perfetto S.P., Chattopadhyay P.K., Roederer M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system // Nat Rev Immunol. - 2004. - 4. - P. 648-55.

57. Resch-Genger U., Grabolle M., Cavaliere-Jaricot S. et al. Quantum dots versus organic dyes as fluorescent labels // Nat Methods. - 2008. - 5. - P. 763-75.

58. Resnick K.E., Alder H., Hagan J.P. et al. The detection of differentially expressed microRNAs from the serum of

ovarian cancer patients using a novel real-time PCR platform // Gynecol Oncol. - 2009. - 112. - P. 55-9.

59. Sheng W., Kim S., Lee J. et al. In-situ encapsulation of quantum dots into polymer microspheres // Langmuir. -2006. - 22. - P. 3782-90.

60. Shi L., Rosenzweig N., Rosenzweig Z. Luminescent quantum dots fluorescence resonance energy transfer-based probes for enzymatic activity and enzyme inhibitors // Anal Chem. - 2007. - 79. - P. 208-14.

61. So M.K., Xu C., Loening A.M. et al. Self-illuminating quantum dot conjugates for in vivo imaging // Nat

Biotechnol. - 2006. - 24. - P. 339-43.

62. Soltesz E.G., Kim S., Laurence R.G. et al. Intraoperative sentinel lymph node mapping of the lung using near-infrared fluorescent quantum dots // Ann Thorac Surg. - 2005. - 79. - P. 269-77.

63. Stsiapura V., Sukhanova A., Artemyev M. et al. Functionalized nanocrystal-tagged fluorescent polymer beads: synthesis, physicochemical characterization, and immunolabeling application // Anal Biochem. - 2004. - 334. - P. 257-65.

64. Sukhanova A., Susha A.S., Bek A. et al. Nanocrystal-encoded fluorescent microbeads for proteomics: antibody profiling and diagnostics of autoimmune diseases // Nano Lett. - 2007. - 7. - P. 2322-7.

65. Sun K., Wang Q., Huang X.H. et al. Establishment of multiplexed, microsphere-based flow cytometric assay for multiple human tumor markers // Acta Pharmacol Sin. - 2007. - 28. - P. 2011-8.

66. Suzuki H., Graziano D.F., McKolanis J. et al. T cell-dependent antibody responses against aberrantly expressed cyclin B1 protein in patients with cancer and premalignant disease // Clin Cancer Res. - 2005. - 11. - P. 1521-6.

67. Sweeney E., Ward T.H., Gray N. et al. Quantitative multiplexed quantum dot immunohistochemistry // Biochem Biophys Res Commun. - 2008. - 374. - P. 181-6.

68. Tan E.M. Autoantibodies as reporters identifying aberrant cellular mechanisms in tumorigenesis // J Clin Invest. -2001. - 108. - P. 1411-5.

69. Tan H.T., Low J., Lim S.G. et al. Serum autoantibodies as biomarkers for early cancer detection // FEBS J. - 2009.

- 276. - P. 6880-904.

70. Tkaczyk E.R., Zhong C.F., Ye J.Y. et al. In Vivo Monitoring of Multiple Circulating Cell Populations Using Two-photon Flow Cytometry // Opt Commun. - 2008. - 281. - P. 888-94.

71. Voura E.B., Jaiswal J.K., Mattoussi H. et al. Tracking metastatic tumor cell extravasation with quantum dot nanocrystals and fluorescence emission-scanning microscopy // Nat Med. - 2004. - 10. - P. 993-8.

72. Waggoner A. Fluorescent labels for proteomics and genomics // Curr Opin Chem Biol. - 2006. - 10. - P. 62-6.

73. Walling M.A., Novak J.A., Shepard J.R. Quantum dots for live cell and in vivo imaging // Int J Mol Sci. - 2009. -

10. - P. 441-91.

74. Whitehead G.S., Walker J.K., Berman K.G. et al. Allergen-induced airway disease is mouse strain dependent // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. - 2003. - 285. - P. L32-42.

75. Wilson R., Spiller D.G., Prior I.A. et al. A simple method for preparing spectrally encoded magnetic beads for multiplexed detection // ACS Nano. - 2007. - 1. - P. 487-93.

76. Wu X., Liu H., Liu J. et al. Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots // Nat Biotechnol. - 2003. - 21. - P. 41-6.

77. Xing Y., Smith A.M., Agrawal A. et al. Molecular profiling of single cancer cells and clinical tissue specimens with semiconductor quantum dots // Int J Nanomedicine. - 2006. - 1. - P. 473-81.

78. Xu H., Sha M.Y., Wong E.Y. et al. Multiplexed SNP genotyping using the Qbead system: a quantum dot-encoded microsphere-based assay // Nucleic Acids Res. - 2003. - 31. - P. e43.

79. Yan X., Zhong W., Tang A. et al. Multiplexed flow cytometric immunoassay for influenza virus detection and differentiation // Anal Chem. - 2005. - 77. - P. 7673-8.

80. Yao H., Zhang Y., Xiao F. et al. Quantum dot/bioluminescence resonance energy transfer based highly sensitive detection of proteases // Angew Chem Int Ed Engl. - 2007. - 46. - P. 4346-9.

81. Zhang J., Campbell R.E., Ting A.Y. et al. Creating new fluorescent probes for cell biology // Nat Rev Mol Cell Biol. - 2002. - 3. - P. 906-18.

82. ZinkernagelR.M. What is missing in immunology to understand immunity? // Nat Immunol. - 2000. - 1. - P. 181-5.

83. Zipfel W.R., Williams R.M., Webb W.W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences // Nat Biotechnol. - 2003. - 21. - P. 1369-77.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИИ

anti-Scl-70 - анти-топоизомераза

anti Smith antigen - анти^т-антиген

BRET

CMV

CLSM

EBV

FRET

FFPE

PCNA

SNP

nRNP

MBP

HIV Nef HIV Gag

биолюминисцентно резонансный перенос энергии Cytomegalovirus

конфокальная лазерная сканирующая микроскопия Epstein-Barr virus

Forster resonance energy transfer (Ферстеровский резонансный перенос энергии) formalin fixed, paraffin wax embedded Proliferating Cell Nuclear Antigen

Single nucleotide polymorphism (одиночные нуклеотидные полиморфизмы) Human Immunodeficiency Virus Negative regulatory factor Human Immunodeficiency Virus Group-specific antigen анти-нуклеарный рибонуклеопротеин мальтоза-связывающий белок

НАУЧНЫЕ ЖУРНАЛЫ РОНЦ ИМ. Н.Н. БЛОХИНА РАМН

г