СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ АГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ
METHOD OF STUDYING THROMBOCYTE AGGREGATION

Предлагаемое изобретение относится к медицине, в частности к способам исследования агрегации тромбоцитов, и может быть использовано для диагностики риска тромбоза.
В основе первичного звена системы гемостаза лежит агрегация тромбоцитов, которая инициирует гемостатический процесс и определяет как нормальный гемостаз, так и патологическое тромбообразование. Нарушения свойств тромбоцитов, связанные с угнетением или прекращением агрегации, вызывают тяжелые геморрагии. Усиление проагрегатных свойств тромбоцитов влечет за собой высокий риск внутрисосудистого тромбообразования, что наблюдается при ряде патологий и острых состояний (ишемической болезни сердца, ревматизме, атеросклерозе, нарушении мозгового кровообращения, инфаркте миокарда и пр.). В связи с этим для прогнозирования течения подобных заболеваний и проведения адекватного лечения необходим точный анализ агрегационных свойств тромбоцитов.
В качестве прототипа выбран способ исследования агрегации тромбоцитов, включающий забор крови, ее стабилизацию, получение из нее центрифугированием обогащенной тромбоцитами плазмы, помещение плазмы в камеру реоскопа, перемешивание и измерение изменения ее оптической плотности (Born C.V.R. Aggregation of Blood Platelets by Adenosine Diphosphate and its Reversal // Nature. - 1962. - Vol.194, №4832. - P.927-929).
Однако известный способ имеет ряд недостатков: исследование агрегации тромбоцитов происходит косвенным путем, так как оценивается светопропускание плазмы, обогащенной тромбоцитами, которое зависит не только от агрегации тромбоцитов, но и от поглощения света самой плазмой, цвета плазмы, формы тромбоцитов и т.д. Кроме того, способ недостаточно точный, так как светопропускание в некоторых случаях неоднозначно характеризует выраженность агрегации, например, когда два образца различаются количеством вошедших в агрегаты тромбоцитов и размером образующихся агрегатов, но при этом обладают одинаковой оптической плотностью.
Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является объективизация и повышение точности исследования процесса агрегации тромбоцитов.
Поставленная задача решается за счет того, что в способе, включающем забор крови, ее стабилизацию, получение из нее обогащенной тромбоцитами плазмы, помещение плазмы в камеру реоскопа, перемешивание и измерение изменения ее оптических характеристик, измеряют интегральную оптическую плотность всех агрегатов, образовавшихся в результате взаимодействия клеток, а по окончании процесса агрегации измеряют дополнительно интегральную оптическую плотность каждого агрегата и рассчитывают индекс R агрегатообразования по формуле:
R=K/N×100%,
где К - количество крупных агрегатов с интегральной оптической плотностью больше 151 усл.ед.;
N - общее количество агрегатов с интегральной оптической плотностью больше 10 усл.ед.;
100% - коэффициент, определяющий процентное выражение отношения К/N.
Способ исследования агрегации тромбоцитов осуществляют следующим образом.
Для определения нормы была исследована группа здоровых доноров (n=20). Значения нормы приведены:
степень агрегации 466,86±67,95 усл.ед.
скорость агрегации 107,28±26,94 усл.ед.
индекс агрегатообразования от 0 до 8%.
-1
Забирают кровь из вены, стабилизируют ее цитратом натрия 3,8% в соотношении 9:1, получают из нее плазму, обогащенную тромбоцитами, путем центрифугирования в режиме 1000 об/мин в течение 10 минут. Обогащенную тромбоцитами плазму помещают в камеру реоскопа, задают скорость сдвига 20 с и регистрируют на ПК изменение ее оптических характеристик в динамике путем измерения интегральной оптической плотности всех агрегатов. По окончании процесса рассчитывают интегральную оптическую плотность каждого образовавшегося агрегата. На основании этих результатов получают данные о степени и скорости процесса агрегации, а также о размерах и количестве тромбоцитарных агрегатов, рассчитывают индекс R агрегатообразования и сравнивают с нормой.
Оценку процесса агрегации тромбоцитов и прогнозирования риска тромбоза проводят по следующим показателям:
1. Степень агрегации - суммарная максимальная интегральная оптическая плотность тромбоцитарных агрегатов (усл.ед.).
2. Скорость агрегации - суммарная интегральная оптическая плотность тромбоцитарных агрегатов через 180 с после начала процесса агрегации (усл.ед.).
3. Индекс R агрегатообразования, который рассчитывают по формуле:
R=K/N×100%,
где К - количество крупных агрегатов с интегральной оптической плотностью больше 151 усл.ед. образовавшихся по окончании процесса;
N - общее количество агрегатов образовавшихся по окончании процесса с интегральной оптической плотностью больше 10 усл.ед.;
100% - коэффициент, определяющий процентное выражение отношения К/N.
В серии исследований in vitro было показано, что данный способ исследования агрегации тромбоцитов позволяет дать более объективную и точную оценку процесса, а также повысить его информативность. В подтверждение вышесказанного приведены результаты нескольких исследований.
Клинический пример 1.
Пациентка Щ. 86 лет (история болезни №226235), ожог 30-39% поверхности тела.
Результаты исследования агрегации тромбоцитов предложенным способом:
степень агрегации 1059,80 усл.ед.
скорость агрегации 373,17 усл.ед.
К=2
N=13
R
=2/13×100%=15%.
У данной больной выявлено значительное повышение степени и скорости агрегации тромбоцитов, что свидетельствует о риске тромбообразования. Это подтверждает и оценка индекса агрегатообразования.
Клинический пример 2.
Пациент К. 44 года (история болезни №226325), ожог 31% поверхности тела.
Результаты исследования агрегации тромбоцитов предложенным способом: степень агрегации 906,34 усл.ед.,
скорость агрегации 410,46 усл.ед.
К=2
N=16
=2/16×100%=12%.
Пациент Т. 26 лет (история болезни №226640), ожог 35% поверхности тела.
Результаты исследования агрегации тромбоцитов предложенным способом: степень агрегации 940,80 усл.ед.
скорость агрегации  587,14 усл.ед.
К=2
N=8
=2/8×100%=25%.
По результатам исследования, если оценивать только стандартные показатели агрегации (скорость и степень), которые значительно превышают норму у обоих пациентов, можно предположить у них равновеликий риск тромбообразования. Однако, если сравнить индексы агрегатообразования, то видно, что у пациента Т. индекс R выше в 2 раза, по сравнению с таковым у пациента К. Это свидетельствует о более высоком риске тромбоза у пациента Т., что следует учитывать при проведении антикоагулянтной и дезагрегационной терапии.
Так же было проведено исследование in vitro с целью оценки эффективности снижения агрегации тромбоцитов фармакологическим препаратом, который содержит антитела к рецепторам GP IIb-IIIa тромбоцитов. Именно к ним наиболее высокой аффинностью связывания обладает фибриноген. Для этого к обогащенной тромбоцитами плазме ожогового больного С., 31 год (история болезни №241272; ожог 30% поверхности тела), добавляли диагностируемый препарат в концентрации 0,025 мг/мл, а затем исследовали агрегацию тромбоцитов предлагаемым способом.
Результаты исследования предлагаемым способом показали, что диагностируемый препарат полностью не подавил агрегацию тромбоцитов, хотя наблюдалось ее значительное снижение.
Агрегация тромбоцитов без блокатора рецепторов GP IIb-IIIa:
степень агрегации 1762,53 усл.ед.
скорость агрегации 1635,19 усл.ед.
К=1
N=5
=1/5×100%=20%.
Агрегация тромбоцитов после добавления блокатора рецепторов GP IIb-IIIa:
степень агрегации 629,13 усл.ед.
скорость агрегации 611,79 усл.ед.
К=0
N=1
=0/1×l00%=0%.
Из приведенных результатов видно, что фармакологический препарат резко снизил агрегацию тромбоцитов, хотя ее скорость и степень оставались выше нормы. Более важным явилось изменение характера агрегации тромбоцитов под воздействием антител к GP IIb-IIIa, о чем свидетельствовал индекс R агрегатообразования: крупные агрегаты не образовывались, хотя сформировалось большое количество малых агрегатов. Изменение характера агрегации при блокаде рецепторов GP IIb-IIIa тромбоцитов показано на микрофотоснимках 1 и 2.
Исходя из вышесказанного, можно сделать два вывода:
1. Исследованный фармакологический препарат высокоэффективен с целью снижения риска тромбозов у данной пациентки.
2. В агрегации тромбоцитов, вызванной фибриногеном, принимают участие не только GP IIb-IIIa, но и другие рецепторы мембраны тромбоцитов.
Из представленного примера видно, что предлагаемый способ может быть использован для тестирования фармакологических препаратов.
Предлагаемый способ позволяет более объективно и точно оценить процесс агрегации тромбоцитов. Это имеет большое значение в прогнозировании течения заболеваний, в патогенезе которых возможен риск тромбоза, и оценке проводимой антитромботической терапии, в научных и фармакологических исследованиях, связанных с изучением системы гемостаза.