Ассоциация полиморфизмов -238A/G TNF и Ile655Val Her2 влияет на риск и молекулярные особенности рака молочной железы

enhancer: a pan-active control element in transgenic mice. Mol. Cell Biol. 1990; 10:4406—11.

14. Kashkin K., Chernov I., Stukacheva E., Monastyrskaya G., Uspenskaya N., Kopantzev E. et al. Cancer specificity of promoters of the genes controlling cell proliferation. J. Cell Biochem. 2015; 116: 299—309.

15. Zhang Y., Luoh S.M., Hon L.S., Baertsch R., Wood W.I., Zhang Z. GeneHub-GEPIS: digital expression profiling for normal and cancer tissues based on an integrated gene database. Nucleic Acids Res. 2007; 35: W152—8.

16. Naryzhny S.N., Lee H. Proliferating cell nuclear antigen in the cytoplasm interacts with components of glycolysis and cancer. FEBS Lett. 2010; 584: 4292—8.

17. Ramakers C., Ruijter J.M., Deprez R.H., Moorman A.F. Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data. Neurosci Lett. 2003; 339: 62—6.

18. Messeguer X., Escudero R., Farre D., Nunez O., Martinez J., Alba M.M. PRoMo: detection of known transcription regulatory elements using species-tailored searches. Bioinformatics. 2002; 18: 333—4.

19. Farre D., Roset R., Huerta M., Adsuara J.E., Rosello L., Alba M.M. et al. Identification of patterns in biological sequences at the ALGGEN server: PROMO and MALGEN. Nucleic Acids Res. 2003; 31: 3651—3.

20. Nemtzova E.R., YakubovskayaR.I., VinogradovaT.V. et al. Universal Promoter for Expression of TherapeuticalGgenes in Mammalian Cells. Patent RF, N 2551784; 2015

Kondratyeva L.G., Kashkin K.N., Chernov IP, Stukacheva EA, Dydich DA., Kopantzev EP, Sverdlov E.D.

PCNA: CONSTITUTIVE HUMAN PROMOTER FOR EXPRESSION OF GENES FOR THEIR FUNCTIONAL AND THERAPEUTIC USE

Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of RAS, 117997 Russian Federation, Moscow, Mikluho-Maklay street,

16/10.

We cloned the promoter of the human PCNA gene that codes for a proliferating cell nuclear antigen. Two promoter DNA fragments were cloned — of 1416 and 389 bp in length. The expression of the luc and PDX1 genes under the control of the PCNA promoter was demonstrated in transient and stable transfection of various human and mouse cells. We have shown that the PCNA promoter within genetically-engineered vectors is able to provide efficient expression of heterologous genes at the level comparable to the widely used CMV promoter. The PCNA promoter was suggested to be used as a universal one for designing of gene therapeutic constructs. A comparative analysis of the master gene of pancreas PDX1 expression in cells of pancreatic cancer was also carried out in this work. Keywords: promoter; PCNA; gene therapy; therapeutic gene; PDXl; cancer; pancreas.

For citation: Kondratyeva L.G., Kashkin K.N., Chernov I.P., Stukacheva E.A., Dydich D.A., Kopantzev E.P., Sverdlov E.D. PCNA: constitutive human promoter for expression of genes for their functional and therapeutic use. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologi-ya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology) 2017; 35(3): 89-92 (Russian). DOI 10.18821/0208-0613-2017-35-389-92.

For correspondence: Liya G. Kondratyeva, PhD student of the laboratory of human genes and function "Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of RAN", E-mail: liakondratyeva@ yandex.ru

Acknowledgments. This work was supported by the Russian Science Foundation (Project No. 14-50-00131).

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Received 28.02.17 Accepted 27.05.17

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 618.19-006.04-092:577.24.08

Маливанова Т.Ф.1, Осташкин А.С.2, МазуренкоН.Н.1

АССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФИзМОВ -238A/G TNF И ILE655VAL HER2 ВЛИЯЕТ НА РИСК И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ РАКА МОЛОЧНОЙ жЕЛЕзЫ

'ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н.Блохина» Минздрава России, 115211, Москва, Россия; 2ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр имени

А.И. Бурназяна» ФМБА России, 123182, Москва, Россия

В развитии рака молочной железы (РМЖ) важную роль играют воспаление, гормональные и ростовые факторы. Гены TNF, ESR1 и HER2 имеют полиморфизмы, влияющие на уровень транскрипции или активность их белковых продуктов. Целью работы было оценить влияние функциональных полиморфизмов этих генов на клинические и молекулярные особенности РМЖ. В исследование включено 140 первичных больных РМЖ без отдаленных метастазов. Для 111 больных РМЖ определяли концентрацию сывороточного sTNF. Дополнительно использовали архивные образцы ДНК с известным генотипом -238A/G TNF от больных РМЖ и женщин контрольной группы. Полиморфизмы -238G/A TNF, -308G/A TNF, -397C/TESR1 и Ile655Val HER2 определяли методом ПЦР. Анализ полученных данных выявил ассоциацию генотипа AG -238TNF с люминальным A молекулярным подтипом опухоли. Отмечено синхронное снижение показателей индекса пролиферации Ki67 и сывороточного уровня sTNF для генотипов AG -238TNF и IleVal HER2. В то же время носители AG -238TNF чаще имели генотип IleVal HER2 по сравнению с носителями GG -238TNF (70% и 32%, соответственно;

Для корреспонденции: Маливанова Татьяна Федоровна, канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаб. онкогеномики НИИ канцерогенеза ФГБУ «НМИЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, E-mail: tmali-vanova@yandex.ru

p = 0,032). В целом, распределение генотипов HER2 для носителей AG -238TNF больных РМЖ достоверно отличалось от GG -238TNF больных РМЖ и обоих генотипов (AG и GG -238TNF) контрольной группы. Выявленная зависимость подтверждена на архивных образцах ДНК больных РМЖ с генотипом AG -238TNF. Не обнаружено ассоциации полиморфизма 397C/T ESR1 с РЭ статусом опухоли и Ile655Val HER2 с гиперэкспрессией и/или амплификацией клеточного рецептора Her2. Таким образом, полиморфизм -238G/A TNF ассоциирован с Ile655Val HER2 и влияет на молекулярные особенности РМЖ. Предполагается, что Val HER2 может быть фактором риска РМЖ для носителей генотипа AG -238TNF.

Ключевые слова: рак молочной железы; TNF; HER2; ESR1; полиморфизм.

Для цитирования: Маливанова Т. Ф., Осташкин А.С., Мазуренко Н.Н. Ассоциация полиморфизмов -238A/G TNF и Ile655Val HER2 влияет на риск и молекулярные особенности рака молочной железы. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 2017;35(3):92-97. DOI 10.18821/0208-0613-2017-35-3-92-97.

Введение

Рак молочной железы (РМЖ) представляет собой наиболее частое онкологическое заболевание среди

женщин. Его распространенность в России за последние 10 лет увеличилась в 1,4 раза и, по официальным статистическим данным на 2015 г., достигла 426,4 больных на 100 тыс. населения [1]. РМЖ — это многофакторное заболевание, в развитии которого важную роль играют воспаление, гормональные и ростовые факторы. Фактор некроза опухоли (TNF), воспалительный медиатор иммунного ответа, в зависимости от физиологического контекста способен индуцировать как апоптоз, так и пролиферацию опухолевых клеток [2]. К факторам, вызывающим пролиферацию, также относятся рецепторы эстрогенов (РЭ), прогестерона (РП) и эпидермального фактора роста Her2, экспрессионный профиль которых лежит в основе современной молекулярной классификации рака молочной железы [3]. В экспериментах in vivo и in vitro было показано, что протуморогенные и про-метастатические функции TNF в значительной степени усиливаются при кооперации с эстрогеном и эпидер-мальным фактором роста [4].

Гены TNF, ESR1 и HER2 имеют ряд функциональных полиморфизмов, когда замена одного нуклеотида в определённом сайте приводит к изменению уровня транскрипции или активности их белковых продуктов. В регуляторной области гена TNF, расположенного на коротком плече 6-й хромосомы (6p21.3), находятся полиморфизмы -238G/A (rs361525) и -308G/A (rs1800629), которые, соответственно, снижают [5] и повышают [6] уровень транскрипции в экспериментах in vitro. Ген ESR1 локализован на длинном плече 6-й хромосомы (6q25.1), и замена 397C/T в 1 интроне (rs2234693) повышает уровень транскрипции этого гена [7]. Ген HER2 локализован на 17-й хромосоме (17q12), и полиморфизм в кодоне Ile655Val (rs1136201) трансмембранного домена увеличивает эффективность димеризации и тирозин-киназной активности Her2, приводящей к клеточной трансформации [8].

Гены TNF, ESR1 и HER2 являются низкопенетрант-ными, и современные мета-анализы опубликованных данных демонстрируют влияние их полиморфизмов на предрасположенность к РМЖ, которое, однако, лишь в некоторой степени, на 5—15%, повышает или снижает риск заболевания [9—12]. В то же время, как индивидуальное, так и интегративное действие этих полиморфизмов может вносить свой вклад в патогенез и обеспечивать гетерогенность таких заболеваний, как РМЖ. Поэтому целью нашей работы было оценить влияние функциональных полиморфизмов генов TNF, HER2 и ESR1 на клинические и молекулярные характеристики РМЖ.

Материал и методы

В исследование включено 140 первичных больных с подтверждённым патологическим диагнозом «инвазив-ный РМЖ без отдалённых метастазов», госпитализированных в течение 2014 г. в хирургическое отделение опухолей молочной железы РОНЦ им. Н.Н. Блохина. Средний возраст женщин составил 54,5 [30; 76] лет. Образцы венозной крови получали в дооперационном периоде и до проведения терапии для выделения плазмы крови и геномной ДНК из лейкоцитов. Дополнительно использовали архивные образцы ДНК с известным генотипом -238A/G TNF: 23 образца от больных РМЖ из ранее описанной выборки [13], средний возраст 56,6 [33; 73], и 54 образца от женщин контрольной группы без онкологических и аутоиммунных заболеваний, средний возраст 53,9 [27; 75] лет.

Методом ПЦР-ПДРФ с использованием соответствующих эндонуклеаз рестрикции

определяли полиморфизмы -238G/A TNF (F238: 5'-AAA CAg ACC ACA gAC CTg gTC-3'; R238: 5'-CTC ACA CTC CCC ATC CTC CCg gAT C-3'; BamHI), 397C/T ESR1 (F397: 5'-Agg CTg ggC TCA AAC TAC Ag-3'; R397: 5'-TCC TTg gCA gAT TCC ATA gC-3'; PvuII) и Ile655Val HER2 (F655: 5'-AgA gCg CCA gCC CTC TgA CgT CCA T-3'; R655: 5'-TCC gTT TCC TgC AgC AgT CTC CgC A-3'; BstMAI). При определении полиморфизма -308G/A TNF использовали ПЦР с аллель-специфическими прай-мерами (AF-308: 5'-AAT Agg TTT TgA ggg gCA TgA-3'; gF-308: 5'-ATA ggT TTT gAg ggg CAT gg-3'; R-308: 5'-TCT Cgg TTT CTT CTC CAT Cg-3').

При анализе полученных данных, группы сравнения формировали в соответствии со стандартными клиническими данными о стадии заболевания, степени злокачественности опухоли и ИГХ-маркёрах РМЖ (РЭ, РП, Her2, Ki67). Молекулярный подтип РМЖ определяли по формальным признакам: люминальный A — РЭ+, РП+, Her2-, Ki67 низкий < 20%; люминальный B (Her2-) — РЭ+, Her2-, Ki67 высокий > 20%; Люминальный B (Her2+) — РЭ+, Her2+; Her2 положительный (не Люминальный) — Her2+, РЭ—, РП-; Трижды негативный — РЭ-, РП-, Her2-. Для 111 больных РМЖ была определена концентрация sTNF в сыворотке венозной крови (набор альфа-ФНО-ИФА-Бест, Вектор-Бест, Россия). Значения в диапазоне 0—5 пг/мл, в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя, считали нормальными.

Распределение генотипов в выборке получали прямым вычислением и сравнивали с теоретическим распределением по Hardy—Weinberg критерием Пирсона. Частоты в выделенных группах сравнивали критерием Фишера или Пирсона. Абсолютные значения индекса пролиферации Ki67 (% положительных клеток) и концентрации sTNF (пг/мл) использовали для вычисления коэффициента корреляция критерием Спирмена, результаты которого представляли как r [95% CI]. Медианы значений и интерквартильный размах представляли как Median [25%; 75%]. Медианы сравнивали с помощью критерия Манна—Уитни. Для оценки риска заболевания рассчитывали отношение шансов и представляли как OR [95% CI]. Для всех критериев использовали двустороннюю оценку, при p < 0,05 различия считали достоверными.

Результаты и обсуждение

Аллель -238A TNF обнаружен у 7,1% больных РМЖ только в качестве гетерозиготы. Аллель -308A TNF найден у 22,1% больных РМЖ как гетерозигота, у 2,9% — в качестве гомозиготы, и в дальнейшем эти больные были объединены в группу носителей AG+AA генотипа. Активирующий аллель 655Val HER2 выявлен у 34,3% больных как гетерозигота и у 7,1% в качестве гомозиготы. Как гомозигота C аллель полиморфизма 397C/T гена ESR1 обнаружен у 19,3%, аллель T — у 23,6%, остальные 57,1% случаев представляют собой гетерозиготы. Распределения генотипов по всем сайтам соответствовали теоретическому распределению по Харди—Вайнбергу (Р > 0,05).

Анализ клинических и молекулярных характеристик РМЖ показал, что у носителей AG генотипа -238TNF по сравнению с GG в 3 раза чаще встречались опухоли с низким индексом пролиферации (20% и 60%, соответственно; p = 0,019) (табл. 1). При сравнении абсолютных значений индекса пролиферации оказалось, что медиана Ki67 для носителей AG генотипа -238TNF была достоверно ниже, чем для носителей GG (15 [13; 24,5] и 25 [16; 60]; p = 0,034), как и для носителей генотипа IleVal

гена HER2 по сравнению с Ilelle (18 [13; 39] и 30 [16; 60]; p = 0,037). Кроме того, у носителей AG генотипа по сравнению с GG -238TNF в 2 раза чаще встречались опухоли с люминальным A молекулярным подтипом (70% и 37%, соответственно; p = 0,042). Для другого полиморфизма гена TNF, носители распространённого генотипа GG —308TNF более чем в 3 раза чаще имели опухоли 3-й степени злокачественности, по сравнению с носителями аллеля A -308TNF (20% и 6% соответственно), однако различия не достигали статистически значимого уровня. Среди гомозигот ValVal HER2 опухоли с гиперэкспрес-

сией и/или амплификацией клеточного рецептора Нег2 встречались в 33% случаев, что несколько чаще (однако статистически недостоверно), чем у больных с другими генотипами. Не обнаружено ассоциации полиморфизма 397С/Т ESR1 с РЭ или РП статусом опухоли.

Дополнительно была изучена зависимость уровня sTNF от всех изученных полиморфизмов в сыворотках крови больных РМЖ (см. табл. 1). Все значения концентраций sTNF находились в рамках от 0 до 9,89 пг/мл (медиана и интерквартильный размах 4,9 [3,7; 6,1]), а единственный образец с концентрацией 71,57 пг/мл в анализ

Таблица 1

Клинические и молекулярные характеристики РМЖ в зависимости от полиморфизмов -238G/A TNF, -308G/A TNF, 397C/TESR1 и

Ile655Val HER2

Генотипы Все -238G/A TNF -308G/A TNF Ile655Val HER2 397C/T ESR1

GG AG GG AG+AA IleIle IleVal ValVal CC CT TT

I стадия 29% 29% 30% 30% 29% 30% 29% 20% 37% 26% 30%

II стадия 48% 47% 60% 48% 49% 44% 52% 60% 44% 55% 33%

III стадия 23% 24% 10% 23% 23% 26% 19% 20% 19% 19% 36%

Всего N 140 130 10 105 35 82 48 10 27 80 33

1—2 степень злока- 83% 83% 89% 80% 94% 85% 81% 78% 83% 82% 88%

чественности

3 степень злокаче- 17% 17% 11% 20% 6% 15% 19% 22% 17% 18% 13%

ственности

ВсегоN (н.д. 13) 127 118 9 95 32 75 43 9 24 71 32

РЭ положительные 77% 76% 90% 77% 79% 76% 80% 80% 77% 76% 81%

РЭ отрицательные 23% 24% 10% 23% 21% 24% 20% 20% 23% 24% 19%

Всего N (н.д. 7) 133 123 10 99 34 79 44 10 26 76 31

РП положительные 77% 75% 90% 76% 79% 75% 80% 78% 69% 77% 81%

РП отрицательные 23% 25% 10% 24% 21% 25% 20% 22% 31% 23% 19%

Всего N (н.д. 8) 132 122 10 98 34 79 44 9 26 75 31

Her2 положительные 19% 18% 20% 20% 15% 20% 14% 33% 17% 19% 19%

Her2 отрицательные 81% 82% 80% 80% 85% 80% 86% 67% 83% 81% 81%

Всего N (н.д. 11) 129 119 10 95 34 76 44 9 24 74 31

Люминальный A 39% 37% 70%f 40% 33% 34% 49% 22% 43% 40% 30%

Люминальный B (Her2-) 27% 30% 0% 25% 36% 32% 21% 33% 26% 25% 37%

Люминальный B (Her2+) 14% 13% 20% 14% 12% 14% 12% 22% 13% 13% 17%

Her2 положитель- 5% 5% 0% 5% 3% 7% 0% 11% 4% 6% 3%

ный

Трижды негативный 15% 16% 10% 15% 15% 14% 19% 11% 13% 17% 13%

Всего N (н.д. 15) 125 115 10 92 33 73 43 9 23 72 30

Ki67 высокий 58% 60% 20%ff 57% 62% 63% 48% 60% 50% 57% 68%

Ki67 низкий 42% 40% 80% 43% 38% 37% 52% 40% 50% 43% 32%

Ki67, Median [25%;75%] 23 [15;52,5] 25 [16;60] 15* [13;24,5] 25 [15;55] 23 [15,5;55] 30 [16;60] 18** [13;39] 36 [16;63] 19 [13;45] 23,5 [13,5;50] 30 [16;70]

Всего N (н.д. 7) 133 123 10 99 34 79 44 10 26 76 31

sTNF < 5 pg/ml 55% 51% 89%fff 51% 66% 50% 63% 2 из 5 50% 59% 48%

sTNF > 5 pg/ml 45% 49% 11% 49% 34% 50% 37% 3 из 5 50% 41% 52%

sTNF (pg/ml), Median [25%;75%] 4,9 [3,7;6,1] 5,0 [3,8;6,1] 3,7J [3,4;4,2] 5,0 [3,7;6,5] 4,7 [3,5;5,2] 5,1 [4,4;6,4] 4,4JJ [3,5;5,8] 6,0 [3,8;7,7] 4,7 [3,3;6,5] 4,8 [3,8;6,2] 5,0 [3,8;5,6]

Всего N (н.д. 30) 110 101 9 81 29 64 41 5 22 63 25

Fisher test (AG га GG): f p = 0,042; ff p = 0,019; fff p = 0,038

Mann-Whitney test: * p(AG vs GG) = 0,034; ** p(IleVal vs Ilelle) = 0,037; J p(AG vs GG) = 0,027; JJ p(IleVal vs Ilelle) = 0,051

включён не был. Медиана концентраций sTNF оказалась достоверно ниже у носителей AG, по сравнению с GG генотипом -238TNF (3,7 [3,4; 4,2] и 5,0 [3,8; 6,1] пг/мл; p = 0,027). Такая же тенденция отмечена и для носителей IleVal генотипа HER2 (4,4 [3,5; 5,8], по сравнению с 5,1 [4,4; 6,4] пг/мл для Ilelle; p = 0,051). Для полиморфизмов -308TNF и 397C/T ESR1 достоверных отличий не обнаружено.

Таким образом, было отмечено синхронное снижение показателей Ki67 и сывороточного уровня sTNF для генотипов AG -238TNF и IleVal HER2 (см. табл. 1), при этом в общей группе корреляции между абсолютными значениями Ki67 и sTNF не выявлено (r = 0,14 [-0,05; 0,33]; p = 0,13). В то же время, генотип IleVal HER2 в 2 раза чаще имели носители AG —238TNF по сравнению с GG -238TNF (70% и 32% соответственно; p = 0,032) (табл. 2). Распределение всех генотипов Ile655Val HER2 также достоверно отличалось для больных РМЖ носителей GG —238TNF по сравнению с носителями AG -238TNF (p = 0,032). Эта зависимость была подтверждена (p = 0,019) на дополнительно исследованных 23 архивных образцах ДНК от больных РМЖ с генотипом AG -238TNF (см. табл. 2).

Дополнительно были исследованы архивные образцы ДНК 19 носителей AG генотипа и 35 носителей GG генотипа —238TNF от женщин без онкологических заболеваний. Распределения генотипов HER2 в этих двух контрольных группах (с GG и AG генотипом) статистически достоверно отличались от обеих групп носителей AG -238TNF больных РМЖ, как экспериментальной, так и архивной (p < 0,05) (см. табл. 2). Вычисление отношения шансов показало, что полиморфизм HER2 не влияет на риск заболевания РМЖ для носителей GG генотипа -238TNF (OR = 1,36 [0,61; 3,04]). Для носителей AG генотипа присутствие аллеля Val существенно увеличивает риск РМЖ (oR = 11,2 [1,62; 77,66] для экспериментальной группы; OR = 5,25 [1,33; 20,13] для архивной группы; OR = 6,44 [1,77; 23,45] для объединенной группы больных РМЖ). Для других полиморфизмов достоверного влияния на риск заболевания в представленном исследовании не выявлено.

Оценка клинического и биологического разнообразия РМЖ стала одним из наиболее изучаемых направлений в онкологии. В настоящее время биология РМЖ довольно подробно исследована, что нашло применение в терапии опухолей, и активно изучается влияние генетического фона на возникновение опухоли и ответ на проводимую терапию. Для анализа мы выбрали функциональные полиморфизмы генов, кодирующих классические маркёры молекулярно направленной терапии РМЖ — РЭ и Her2. Особое внимание было уделено полиморфизму гена TNF, который, на наш взгляд, может стать новым дополнительным маркёром РМЖ.

TNF через свои рецепторы способен активировать сигнальные каскады, вызывая различные эффекты: выживание и пролиферацию, транскрипцию провоспалительных генов, гибель опухолевых клеток. Кроме того, TNF способствует канцерогенезу и прогрессии опухоли через воспалительный иммунный ответ, модулируя активность T и B лимфоцитов, опухоль-ассоциированных макрофагов, вызывая продукцию VEGF [2]. TNF-индуцированная активация MAP3K каскадов приводит к фосфорилирова-нию IKK комплекса, активации NF-kB и транскрипции как провоспалительных генов, так и генов связанных с выживаемостью клеток; JNK

и p38 MAPK активируют транскрипционный фактор AP-1; ras—raf—MEK1 —ERK1,2 и PI3K-Akt также способствуют выживанию и пролиферации клетки. Гибель клеток через апоптоз и некроптоз вызывается активацией каспазного каскада [2]. Для HER2 и РЭ актуальны те же, что и для TNF, сигнальные пути, вызывающие пролиферацию [14].

Функциональные полиморфизмы, влияющие на уровень экспрессии или активность белковых молекул, могут создавать индивидуальный генетический фон, склоняя физиологический баланс сигнальных каскадов в сторону канцерогенеза. Одной из задач нашего исследования было определить, каким образом влияют полиморфизмы генов TNF, HER2 и ESR1 на уровень сывороточного sTNF. Ранее сообщалось о повышенном уровне белкового продукта гена TNF в сыворотках крови больных РМЖ носителей аллеля Val655 HER2 [15]. В другом сообщении уровень сывороточного sTNF был достоверно выше у носителей CC генотипа 397C/T ESR1 при системной красной волчанке [16] и ниже у носителей TT генотипа при диабете 1-го типа [17]. В нашем исследовании уровни sTNF для всей выборки оказались невысокими (до 10 пг/мл), что можно объяснить тем, что сыворотки крови для исследования были получены от больных РМЖ, госпитализированных для проведения операции, соответственно, больные не должны были иметь выраженных признаков воспаления. Возможно, поэтому нам не удалось подтвердить данные об ассоциации 397C/T ESRl с уровнем sTNF и обнаружить зависимости для полиморфизма -308G/A TNF, хотя именно его влияние на уровень экспрессии TNF при различных заболеваниях наиболее часто рассматривалось исследователями [18—20].

Тем не менее, для генотипов AG -238TNF и IleVal в 655 кодоне HER2 была обнаружена ассоциация с пониженным уровнем sTNF, и, таким образом, наши данные находятся в противоречии с публикацией, упомянутой выше [15]. В то же время мы обнаружили, что 65—80% носителей AG -238TNF больных РМЖ имеют аллель Val655 HER2 (см. табл. 2), в отличие от 40% носителей GG генотипа -238TNF. Таким образом, пониженный уровень сывороточного sTNF у носителей генотипа IleVal связан скорее с влиянием полиморфизма -238G/A TNF, описанным ранее [5, 21] и подтверждённым в нашем исследовании (см. табл. 1). С другой

Таблица 2

Распределение генотипов Ile655Val HER2 в зависимости от полиморфизма -238TNF среди больных РМЖ (экспериментальная и архивная группы) и в контрольной группе

Группы сравнения Больные РМЖ Больные РМЖ

Генотип GG AG AG GG AG

-238

Генотип

Ile655Val HER2

ValVal 7% 10% 22% 6% 0%

IleVal 32% 70% 43% 27% 26%

IleIle 62% 20% 35% 67% 74%

xi2; df = 2 6,8649 0 1,9825 7,6803 8,3439

p 0,032 1 0,37 0,021 0,015

xi2; df = 2 7,9564 1,9825 0 7,1622 7,9946

p 0,019 0,37 1 0,028 0,018

95

стороны, это объясняет полученные нами ранее данные о снижении общей выживаемости больных РМЖ с РЭ-положительными опухолями носителей AG —238TNF [13]. Так как эти больные имеют активирующий аллель Val655 HER2, резистентность к проводимой гормонотерапии может возникать за счет PI3K-Akt-mTOR сигналинга [22]. Ранее было продемонстрировано, что полиморфизм Ile655Val HER2 влияет на функцию гена только при Her2-положительных (с гиперэкспрессией или амплификацией) РМЖ, причём опухоли при наличии аллеля Val имеют более агрессивный фенотип, но лучше отвечают на анти-Her2 терапию трастузумабом [23]. В нашем исследовании AG -238TNF генотип ассоциировался с люминальным A, т. е. Her2 отрицательным (с отсутствием или низким уровнем Her2), типом опухоли (см. табл. 1). Если иметь в виду обнаруженную нами ассоциацию AG -238TNF генотипа с IleVal HER2, возможно, использование терапии, направленной на сигнальные каскады Her2, будет эффективно для этой группы больных с Люминальным A РМЖ.

Следует отметить, что подтип Люминальных A РМЖ мы выделяли на основании иммуногистохимических данных о Ki67 — ядерном антигене, ассоциированным с пролиферацией клеток и экспрессирующимся во всех, кроме G0, фазах клеточного цикла [24]. В нашем исследовании опухоли 80% носителей AG -238TNF генотипа имели низкий Ki67, что косвенно подтверждает ассоциацию этого полиморфизма с низким уровнем экспрессии TNF, так как есть данные, что обработка TNF in vitro повышает число Ki67 положительных клеток при нейродегенеративных процессах [25]. При местном использовании антител против TNF у больных псориазом было показано снижение уровня экспрессии Ki67 [26]. Однако в тканях опухолей молочной железы корреляции между экспрессией TNF и Ki67 обнаружено не было [27]. Таким образом, для носителей AG -238TNF особенностью является низкий уровень sTNF, низкий индекс пролиферации Ki67 и Люминальный A молекулярный подтип опухоли.

Наиболее интересным результатом исследования является обнаружение кооперативного влияния полиморфизмов -238G/A TNF и Ile655Val HER2 на риск развития РМЖ. Мы впервые обнаружили, что аллель Val более чем в 5 раз повышает риск заболевания РМЖ только для носителей AG, но не GG генотипа -238TNF. Определённой сложностью изучения полиморфизма -238G/A TNF является низкая частота его редкого аллеля A (7,1% в нашем исследовании, 6,7—13,0% по данным других авторов [9, 28]). Хотя группы сравнения были невелики (см. табл. 2), мы получили статистически значимые результаты для двух независимых выборок больных РМЖ (экспериментальной и архивной), что в определённой степени повышает достоверность полученных данных. Однако, поскольку для этих двух групп РМЖ отношения шансов отличались почти в 2 раза (OR = 11,2 и OR = 5,25 соответственно), необходимы дальнейшие, возможно многоцентровые, исследования для подтверждения и уточнения полученных данных.

Заключение

Таким образом, мы обнаружили генетически детерминированную группу носителей AG —238TNF, для которых наличие аллеля Val655 HER2 в несколько раз повышает риск заболевания РМЖ. Для больных РМЖ генотип AG —238TNF ассоциируется с низким уровнем sTNF, низким уровнем Ki67 и Люминальным A молекулярным подтипом опухоли. Ассоциация генотипа AG -238TNF с активирующим аллелем Val655 HER2 по-

зволяет предположить возможность использования терапии, направленной на сигнальные каскады Her2, для этой группы больных РМЖ.

Благодарности. Авторы выражают глубокую благодарность канд. мед. наук Родионовой М.В. за помощь в подборе клинической группы.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ЛИТЕ РАТ У РА / REFERENCES

1. Kaprin A.D., Starinskiy V.V., Petrova G.V., eds. Status of cancer care the population of Russia in 2015. Moscow: MNIOI by P. A. Gertsen; 2016. (in Russian). Available at: http://www.oncology.ru/service/sta-tistics/condition/ (accessed 1 March 2017). Russian (Каприн А.Д., Старинский В.В., Петрова Г.В., ред. Состояние онкологической помощи населению России в 2015 году. М.: МНИОИ им. П.А. Герцена филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России; 2016. 236 с. Available at: http://www.oncology.ru/service/statistics/condition/ (accessed 1 March 2017)).

2. Waters J.P., Pober J.S., Bradley J.R. Tumour necrosis factor and cancer. J. Pathol. 2013; 230: 241—48. DOI: 10.1002/path.4188

3. Sonnenblick A., Fumagalli D., Sotiriou Ch., Piccart M. Is the differentiation into molecular subtypes of breast cancer important for staging, local and systemic therapy, and follow up? Cancer Treatment Reviews. 2014; 40: 1089—95. DOI: 10.1016/j. ctrv.2014.07.005

4. Weitzenfeld P., Meron N., Leibovich-Rivkin T., Meshel T., Ben-Baruch A. Progression of Luminal Breast Tumors Is Promoted by Ménage à Trois between the Inflammatory Cytokine TNFa and the Hormonal and Growth-Supporting Arms of the Tumor Microenvironment. HPC Mediators Inflamm. 2013; 2013: 720536. DOI: 10.1155/2013/720536

5. Simpson P.D., Moysi E., Wicks K., Sudan K., Rowland-Jones S.L., McMichael A.J. et al. Functional Differences Exist between TNFa Promoters Encoding the Common -237G SNP and the Rarer HLA-B*5701-Linked A Variant. PLoS One. 2012; 7(7): e40100. DOI: 10.1371/journal.pone.0040100

6. Karimi M., Goldie L.C., Cruickshank M.N., Moses E.K., Abraham L.J. A critical assessment of the factors affecting reporter gene assays for promoter SNP function: a reassessment of -308 TNF polymorphism function using a novel integrated reporter system. European Journal of Human Genetics 2009; 17: 1454 —62. DOI: 10.1038/ejhg.2009.80

7. Weickert C.S., Miranda-Angulo A.L., Wong J., Perlman W.R., Ward S.E., Radhakrishna V. et al. Variants in the estrogen receptor alpha gene and its mRNA contribute to risk for schizophrenia. Human Molecular Genetics. 2008; 17(15): 2293—09. DOI: 10.1093/hmg/ddn130

8. Fleishman S.J., Schlessinger J., Ben-Tal N. A putative molecular-activation switch in the transmembrane domain of erbB2. PNAS. 2002; 99(25): 15937—40. DOI: 10.1073/pnas.252640799

9. Guo J., Meng H., Pei J., Zhu M. Association between the TNF-a-238G>A and TGF-b1 L10P Polymorphisms and Breast Cancer Risk: A Meta-Analysis. Breast Care. 2011; 6: 126—9. DOI: 10.1159/000327515

10. Fang F., Yao L., Yu X.J., Yu L., Wu Q., Yu L. TNFa 2308 G/A polymorphism is associated with breast cancer risk: a meta-analysis involving 10,184 cases and 12,911 controls. Breast Cancer Res. Treat. 2010;122(1): 267—71. DOI: 10.1007/s10549-009-0698-1

11. Chen W., Yang H., Tang W.-R., Feng Sh.-J., Wei Y.-L. Updated Metaanalysis on HER2 Polymorphisms and Risk ofBreast Cancer: Evidence from 32 Studies. Asian Pac. J. Cancer Prev. 2014; 15(22):9643—7. DOI: http://dx.doi.org/10.7314/APJCP.2014.15.22.9643

12. Zhang Y., Zhang M., Yuan X., Zhang Z., Zhang P., Chao H. et al. Association Between ESR1 PvuII, XbaI, and P325P Polymorphisms and Breast Cancer Susceptibility: A Meta-Analysis. Med. Sci. Monit. 2015; 21: 2986—96. DOI: 10.12659/MSM.894010

13. Маливанова Т.Ф., Скоромыслова Е.В., Юрченко В.А., Кононен-ко И.Б., Манзюк Л.В., Мазуренко Н.Н. Анализ полиморфизма -238

14. Taneja P., Maglic D., Kai F., Zhu S., Kendig R.D., Fry E.A., Inoue K. Classical and Novel Prognostic Markers for Breast Cancer and their Clinical Significance. Clin. Med. Insights Oncol..2010; 4: 15—34. DOI: 10.4137/CMO .S4773

15. Papadopoulou E., Tripsianis G., Anagnostopoulos K., Tentes I., Kakolyris S., Galazios G. et al. Significance of serum tumor necrosis factor-alpha and its combination with HER-2 codon 655 polymorphism in the diagnosis and prognosis of breast cancer. Int. J. Biol. Markers. 2010; 25

16. Rupasree Y., Naushad S.M., Rajasekhar L., Uma A., Kutala V.K. Association of estrogen receptor 1

17. Ryba-Stanislawowska M., Rybarczyk-Kapturska K., Brandt A., Mysliwiec M., Mysliwska J. IVS1 -397T>C estrogen receptor a polymorphism is associated with low-grade systemic inflammatory response in type 1 diabetic girls. Mediators Inflamm. 2014; 2014:839585. DOI: 10.1155/2014/839585

18. Kroeger K.M., Steer J.H., Joyce D.A., Abraham L.J. Effects of stimulus and cell type on the expression of the -308 tumour necrosis factor promoter polymorphism. Cytokine. 2000; 12(2): 110—9. DOI: 10.1006/cyto.1999.0529

19. Gupta R., Kapuria V., Das S.N. Single nucleotide polymorphisms in TNF-alpha, TNFR2 gene and TNF-alpha production in Asian Indians. Immunol. Invest. 2009; 38(3—4): 240—54. DOI: 10.1080/08820130902766563

20. Mekinian A., Tamouza R., Pavy S., Gestermann N., Ittah M., Mariette X., Miceli-Richard C. Functional study of TNF-a promoter polymorphisms: literature review and meta-analysis. Eur. Cytokine Netw. 2011; 22(2): 88—102. DOI: 10.1684/ecn.2011.0285

21. Kaluza W., Reuss E., Grossmann S., Hug R., Schopf R.E., Galle P.R. et al. Different transcriptional activity and in vitro TNF-alpha production in psoriasis patients carrying the TNF-alpha 238A promoter polymorphism. J. Invest. Dermatol. 2000; 114(6): 1180—3. DOI: 10.1046/j.1523-1747.2000.00001.x

22. Hasson S.P., Rubinek T., Ryvo L., Wolf I. Endocrine resistance in breast cancer: focus on the phosphatidylinositol 3-kinase/akt/mam-malian target of rapamycin signaling pathway. Breast Care (Basel). 2013; 8(4): 248—55. DOI: 10.1159/000354757

23. Han X., Diao L., Xu Y., Xue W., Ouyang T., Li J. et al. Association between the HER2 Ile655Val polymorphism and response to trastu-zumab in women with operable primary breast cancer. Ann. Oncol. 2014; 25(6): 1158—64. DOI: 10.1093/annonc/mdu111

24. Bustreo S., Osella-Abate S., Cassoni P., Donadio M., Airoldi M., Pedani F. et al. Optimal Ki67 cut-off for luminal breast cancer prognostic evaluation: a large case series study with a long-term follow-up. Breast Cancer Res. Treat. 2016; 157(2): 363—71. DOI: 10.1007/ s10549-016-3817-9

25. Wang X.H., Hong X., Zhu L., Wang Y.T., Bao J.P., Liu L. et al. Tumor necrosis factor alpha promotes the proliferation of human nucleus pulposus cells via nuclear factor-KB, c-Jun N-terminal kinase, and p38 mitogen-activated protein kinase. Exp. Biol. Med. (Maywood). 2015; 240(4): 411—7. DOI: 10.1177/1535370214554533

26. Tsianakas A., Brunner P.M., Ghoreschi K., Berger C., Loser K., Röcken M. et al. The single-chain anti-TNF-a antibody DLX105 induces clinical and biomarker responses upon local administration in patients with chronic plaque-type psoriasis. Exp. Dermatol. 2016; 25(6): 428—33. DOI: 10.1111/exd.12927

27. Erdem H., Gundogdu B., Ankarali H., Yasar M., Sener E., Oktay M. et al. Correlation of astrocyte elevated gene-1, basic-fibroblast growth factor, beta-catenin, Ki-67, tumor necrosis factor-alfa with prognostic parameters in ductal carcinomas and ductal intraepithelial neoplasms. Niger J. Clin. Pract. 2015;18(5): 638—43. DOI: 10.4103/1119-3077.158961

28. Pooja S., Francis A., Bid H.K., Kumar S., Rajender S., Ramalingam K. et al. Role of ethnic variations in TNF-a and TNF-ß polymor-

phisms and risk of breast cancer in India. Breast Cancer Res. Treat.

2011; 126(3): 739—47. DOI: 10.1007/s10549-010-1175-6

Malivanova T.F.1, Ostashkin AS.2, Mazurenko NN.1

ASSOCIATION OF POLYMORPHISMS -238A/G

TNFAND ILE655VAL HER2 INFLUENCES THE RISK AND MOLECULAR FEATURES OF BREAST CANCER

1FSBI «N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology» of the Ministry of Health of the Russian Federation, 115211, Moscow, Russia; 2State Research Centre — Burnasyan Federal Medical Biophysical Centre of Federal Medical Biological Agency, 123182, Moscow, Russia

Inflammation, hormonal and growth factors play an important role in the development of breast cancer (BC). Genes TNF, ESR1 and HER2 have polymorphisms that affect the level of transcription or activity of their protein products.The objective was to evaluate the effect of functional polymorphisms of these genes on the clinical and molecular features of BC. The study included 140 patients with primary BC without distant metastases. For 111 BC patients the concentrations of serum sTNF were determined. Additionally archival DNA samples with known genotype -238A/G TNF from BC patients and the control group women were used. Polymorphisms -238G/A TNF, -308G/A TNF, 397C/T ESR1 and Ile655Val HER2 were determined by PCR. The analysis of the data revealed the association of AG -238TNF genotype with the Luminal A molecular subtype of tumor. Synchronous decrease of the index of proliferation Ki67 and serum level of sTNF was noted for AG -238TNF and IleVal HER2 genotypes. At the same time, carriers of the AG -238TNF more often had IleVal HER2 genotype then carriers of GG -238TNF (70% and 32%, respectively; p = 0,032). In general, the distribution of HER2 genotypes in carriers of the AG -238TNF BC patients differed from the GG -238TNF BC patients and from the both genotypes (AG and GG -238TNF) of the control group. The dependence was confirmed on archived DNA samples from BC patients with AG -238TNF genotype. There were no association of polymorphism 397C/T ESR1 with ER status of the tumor and no association of polymorphism Ile655Val HER2 with over expression and/or amplification of the cell receptor Her2. Thus, the polymorphism -238G/A TNF is associated with Ile655Val HER2 and affects the molecular characteristics of BC. It is assumed that the Val HER2 may be a risk factor of BC for carriers of the AG -238TNF genotype.

Keywords: breast cancer; TNF; HER2; ESR1; polymorphism.

For citation: Malivanova T.F., Ostashkin A.S., Mazurenko N.N. Association of polymorphisms-238A/G TNF and Ile655Val HER2 influences the risk and molekular features of breast cancer. Molekul-yarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology) 2017; 35(3): 92-97 (Russian). DOI 10.18821/0208-0613-2017-35-3-92-97.

For correspondence: Tatyana F. Malivanova, MD PhD, Senior Researcher, Oncogenomics Laboratory, N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia, 115211, Moscow, Russia; e-mail: tmalivanova@yandex.ru

Acknowledgments. The study had no sponsorship. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Received 03.03.17 Accepted 27.05.17