Современная тактика преодоления мужского бесплодия: селекция сперматозоидов по их способности к связыванию с гиалуроновой кислотой

Современная тактика преодоления мужского бесплодия: селекция сперматозоидов по их способности к связыванию с гиалуроновой кислотой

А.В. Зобова, А.Х. Дударова, Г.К. Сахарова, В.Ю. Смольникова, Н.П. Макарова

Отделение вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГБУ«Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России; Россия, 117997, Москва, ул. Академика Опарина, 4

Контакты: Анастасия Валерьевна Зобова zoana2011@gmail.com

Интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида в ооцит широко применяется во всем мире в программах вспомогательных репродуктивных технологий при наличии мужского фактора бесплодия. Однако данный подход может допустить отбор единичного сперматозоида, несущего разные виды патологий. Сведение к минимуму любых потенциальных рисков, влекущих за собой возникновение нарушений в развитии эмбрионов (апоптоз, фрагментация эмбрионов, нарушение экспрессии генов, анеуплоидии), является крайне важным условием для уменьшения возможных отрицательных последствий, возникающих в результате манипуляций с половыми клетками. Процессы, на которые способен оказать влияние эмбриолог, должны быть выполнены как можно более безопасным и физиологичным способом. Данные постоянно увеличивающегося количества публикаций, сообщающих о положительном эффекте использования техники селекции сперматозоидов по связыванию с гиалуроновой кислотой, позволяют сделать вывод о высокой перспективности этого подхода при лечении мужского бесплодия методами экстракорпорального оплодотворения. Отбор сперматозоидов с улучшенными характеристиками, определяющими зрелость и генетическую целостность, предоставляет возможность улучшения параметров преимплантационного эмбриогенеза, оказывая, таким образом, положительное влияние на клинические исходы программ вспомогательных репродуктивных технологий.

Ключевые слова: экстракорпоральное оплодотворение, мужское бесплодие, гиалуроновая кислота, селекция сперматозоидов, интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида, физиологическая интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида, вспомогательные репродуктивные технологии

DOI: 10.17650/2070-9781-2015-16-4-10-17

Current approach to male infertility treatment: sperm selection procedure based on hyaluronic acid binding ability

A. V. Zobova, A.Kh. Dudarova, G.K. Sakharova, V.Yu. Smol'nikova, N.P. Makarova

Department of Assistive Reproductive Technology in the Treatment of Infertility, Akad. V.I. Kulakov Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Ministry of Health of Russia; 4 Akademika Oparina St., Moscow, 117997, Russia

Intracytoplasmic sperm injection into an oocyte is widely used throughout the world in assisted reproductive technologies programs in the presence of male infertility factor. However, this approach can allow selection of a single sperm, which is carrying different types of pathologies. Minimizing of any potential risks, entailing the occurrence of abnormalities in the embryos development (apoptosis, fragmentation of embryos, alterations in gene expression, aneuploidies) is a very important condition for reducing the potential negative consequences resulting the manipulation with gametes. Processes that could be influenced by the embryologist must be fulfilled in safe and physiological way j as much as it is possible. Data of numerous publications reporting about the positive effects of using the technology of sperm selection by hy-g aluronic acid binding, let make a conclusion about the high prospects of this approach in the treatment of male infertility by methods of in vi-w tro fertilization. The selection of sperm with improved characteristics, which determine the maturity and genetic integrity, provides an op-g portunity to improve the parameters of pre-implantation embryogenesis, having thus a positive effect on clinical outcomes of assisted u reproductive technologies programs.

u Key words: in vitro fertilization, male infertility, hyaluronic acid, sperm selection, intracytoplasmic sperm injection, physiological intracyto-3 plasmic sperm injection, assisted reproductive technologies

Введение мире при лечении мужского фактора бесплодия. Пря-

Интрацитоплазматическая инъекция сперматозо- мая инъекция сперматозоида в ооплазму позволяет ида в ооцит (ИКСИ) широко применяется во всем клиническим эмбриологам преодолевать такие обсто-

ятельства, как низкая подвижность и малое количество сперматозоидов, плохое связывание сперматозоидов с блестящей оболочкой ооцита (zona pellucida), а также нарушение акросомальной реакции. Несмотря на успешное применение ИКСИ в мировой практике [1], на сегодняшний день недостаточно данных о долгосрочных последствиях этой процедуры. В связи с тем, что при проведении процедуры ИКСИ минуются некоторые этапы отбора сперматозоидов, осуществляемые in vivo, а некоторые шаги существенно отличаются от физиологического процесса, возникают сомнения в безопасности этого метода [2]. Многие исследователи убеждены, что ИКСИ может увеличить риск оплодотворения ооцита сперматозоидом с генетическими или функциональными аномалиями, поскольку отбор сперматозоидов при ИКСИ основан исключительно на микроскопической оценке их подвижности и морфологии и во многом зависит от опыта эмбриолога [3—7]. При этом оценка целостности генетического материала сперматозоида, так же как и выявление хромосомных аберраций, не представляется возможной [8]. Зачастую возникновение генетических аномалий эмбрионов, полученных c помощью ИКСИ, как и невынашивание беременности после проведения данной процедуры, обусловлены наличием повреждений в генетическом материале сперматозоида, использованного для оплодотворения [4, 9, 10]. Данные сведения ставят под сомнение целесообразность отбора сперматозоидов для ИКСИ лишь по таким параметрам, как их морфология и подвижность.

Существенно снизить количество аномальных сперматозоидов, в том числе с дефектами ДНК, при подготовке спермы к оплодотворению in vitro позволяют разнообразные методики ее обработки, широко применяющиеся в рутинной практике. Большинство этих методик дают возможность выделить сперматозоиды, которые обладают не только такими характеристиками, как жизнеспособность, подвижность и нормальная морфология, но также являются зрелыми и содержат неповрежденный генетический материал [11]. Так, количество сперматозоидов с дефектами ДНК может быть значительно снижено путем центрифугирования спермы в градиенте плотности [3, 12]. Однако, несмотря на то, что обработка спермы позволяет уменьшить количество сперматозоидов с низкой подвижностью, аномальной морфологией, а также количество апоптотических сперматозоидов с нарушениями генома, угроза использования сперматозоида с нарушениями в структуре ДНК для ИКСИ все же сохраняется [8, 13]. In vivo, прежде чем произойдет оплодотворение ооцита, сперматозоиды преодолевают несколько барьеров и анатомических структур, включающих церви-кальную слизь, матку, маточные трубы, кумулюсные клетки и блестящую оболочку ооцита [14]. Жесткий отбор функциональных сперматозоидов на этих участ-

ках совершается благодаря разнообразным механическим, биохимическим и биофизическим механизмам. На данный момент полное воспроизведение процесса естественного отбора сперматозоидов, осуществляемого на разных уровнях женского репродуктивного тракта, не представляется возможным в условиях in vitro. В связи с этим возникает необходимость в разработке новых подходов, имитирующих процесс оплодотворения и позволяющих минимизировать риски, связанные с выбором единичного зрелого сперматозоида без потери его жизнеспособности для процедуры ИКСИ [13].

Механизм связывания сперматозоидов с гиалуроновой кислотой

Одним из важнейших этапов селекции сперматозоидов в женской репродуктивной системе является связывание сперматозоидов с гиалуроновой кислотой (ГК) и ее расщепление. Данное вещество является одним из основных компонентов лучистого венца, окружающего ооциты человека и состоящего из кумулюс-ных клеток и белков кумулюсного комплекса [15, 16]. Лишь зрелые сперматозоиды, характеризующиеся наличием специфических рецепторов связывания с ГК, способны достигнуть яйцеклетки и оплодотворить ее

[17].

В процессе сперматогенеза, происходящего в яичке человека, элонгированные сперматиды сбрасывают цитоплазматическую каплю, а их плазматическая мембрана претерпевает молекулярные перестроения, определяющие формирование в ней участков связывания с ГК и блестящей оболочкой ооцита [18]. В конце сперматогенеза со степенью зрелости сперматозоидов, целостностью ДНК, частотой возникновения хромосомных анеуплоидий и оплодотворяющей способностью оказываются связанными различные уровни экспрессии 2 специфических белков. Этими белками являются HSPA2 (heat shock protein A2 — белок теплового шока A2) с молекулярной массой 70 кДа, относящийся к классу шаперонов и участвующий в процессе мейоза, и креатинкиназа (КК) — фермент, участвующий в энергетическом обмене сперматозоидов [16, 19]. Для зрелых сперматозоидов характерны повышенная концентрация HSPA2 и низкий уровень содержания КК [16, 20]. В случае же задержки в созревании в цитоплазме сперматозоидов наблюдается пониженный уровень экспрессии HSPA2, что способно приводить к нарушениям в мейозе и, возможно, к хромосомным аномалиям. Установлено, что частота анеу-плоидий в зрелых сперматозоидах по сравнению с незрелыми ниже более чем в 5 раз [21]. Высокий уровень КК в незрелых сперматозоидах объясняется нарушением, возникающим в конечной стадии сперматогенеза, когда при нормальном развитии происходит удаление излишка цитоплазмы с шейки будущего

Е га Е

Е га Е

сперматозоида в виде «остаточного тельца» [16]. При задержке или остановке созревания в сперматозоидах остается большее количество цитоплазмы с КК и другими цитоплазматическими белками, определяется повышенный уровень перекисного окисления липидов и, как следствие, уровень фрагментации ДНК, а также наблюдаются морфологические нарушения. В связи с тем, что мембрана этих сперматозоидов не претерпевает молекулярных перестроений, они остаются незрелыми. Такие сперматозоиды не в состоянии взаимодействовать с блестящей оболочкой ооцита и участками связывания ГК и поэтому не способны оплодотворить ооцит [16]. Те же сперматозоиды, у которых произошло удаление излишка цитоплазмы, закончилось созревание ядра, а в плазматической мембране завершились молекулярные перестроения, способны к связыванию с ГК не только in vivo, но и in vitro [16, 17, 22].

Структуры сперматозоида, связывающиеся с zona pellucida ооцита, включают несколько молекул распознавания, которые скоординированными действиями складываются в единый функциональный комплекс во время посттестикулярного созревания сперматозоидов и капацитации [23—25]. Одним из таких комплексов является HSPA2/SPAM1/ARSA (SPAM1 - sperm adhesion molecule 1 — молекула адгезии спермы 1; ARSA — arylsulfatase А — арилсульфатаза А) [26].

Комплекс белков HSPA2/SPAM1/ARSA локализуется в плазматической мембране сперматозоида, внутренней и наружной акросомальных мембранах. При этом белок HSPA2 находится в интрацеллюлярной области и не экспрессируется на поверхность сперматозоида [26, 27]. Белки SPAM1 и ARSA, в свою очередь, экспрессируются на внешнюю поверхность мембран. Также имеются сведения о том, что HSPA2 экспрессируется в области хвоста сперматозоида, в цитоплазме и в различных отделах головки сперматозоида [18, 28].

Экспрессия SPAM1 и ARSA на поверхности мембраны капацитировавших и не вступивших в капаци-тацию сперматозоидов различна. На поверхности более чем 85 % некапацитировавших сперматозоидов отмечена экспрессия SPAM1, в то время как поверхностная экспрессия ARSA составляет до начала капа-цитации около 5 %, а у капацитировавших сперматозоидов достигает 75 % [26, 27]. При этом в незрелых сперматозоидах SPAM1 локализован преимущественно на задней части головки, тогда как в зрелых данный белок распределен по всей головке [29, 30].

Регуляторным звеном в этом комплексе является белок HSPA2. Он обеспечивает изменение конфигурации и экспрессии молекул SPAM1 и ARSA в процессе капацитации [31—34]. При этом SPAM1 преимущественно участвует в расщеплении кумулюсного матрикса, а ARSA опосредует взаимодействие сперматозоида с блестящей оболочкой [35—38]. HSPA2 регу-

лирует экспрессию SPAM1 и ARSA на поверхности сперматозоида таким образом, что при проникновении через кумулюсный матрикс экспрессия SPAM1 максимальна, а в последующем периоде взаимодействия с блестящей оболочкой экспрессируется ARSA [37—39]. Во время процесса капацитации происходит изменение насыщенности мембраны холестеролом, в результате чего увеличение текучести мембраны приводит к переориентации комплекса HSPA2/SPAM1/ ARSA и активации тирозинового фосфорилирования белков, значимых для процесса капацитации [40]. Ин-гибирование фосфотирозинкиназ, таких как протеин-киназа А, приводит к блокированию переориентации комплекса HSPA2/SPAM1/ARSA в плазматической мембране, поэтому, возможно, тирозиновое фосфори-лирование HSPA2 является критичным для изменений, происходящих на поверхности мембраны сперматозоида в процессе капацитации [26, 27, 31].

При прохождении сперматозоида сквозь кумулюс-ный матрикс экспрессируемый на поверхности головки сперматозоида белок SPAM1 проявляет гиалуронидаз-ную активность, что приводит к разрыхлению куму-люсного матрикса и облегчает проникновение сперматозоида к zona pellucida [41]. По мере продвижения к zona pellucida в сперматозоиде возрастает уровень внутриклеточного Ca2+. Это провоцирует развитие акро-сомальной реакции [42—45]. Однако до ее развития происходит контакт поверхностных структур сперматозоида с гликопротеинами zona pellucida ZP-1, ZP-3 и ZP-4 (первичное связывание), в результате чего также повышается уровень внутриклеточного Ca2+ [46]. При развитии акросомальной реакции содержимое акросомы вместе со свободными частицами ARSA взаимодействует с zona pellucida [47], а белок ARSA в комплексе HSPA2/SPAM1/ARSA, находящемся на внутренней акросомальной мембране, участвует во вторичном связывании [27].

ARSA обладает сульфатазной активностью преимущественно в отношении гликопротеинов блестящей оболочки ZP-2 и ZP-3, облегчая проникновение сперматозоида в перивителлиновое пространство [48]. По некоторым данным, ARSA участвует в расщеплении кумулюсного матрикса [49].

SPAM1 — это одноцепочечный гликопротеин с гли-козилфосфатидилинозитольной областью, благодаря которой этот белок крепится в районе плазматической мембраны сперматозоида. Помимо якорной области, в SPAM1 имеются функциональные домены. Нейтральный каталитический домен осуществляет гиалу-ронидазную активность в отношении кумулюсного матрикса при нейтральном значении pH [47, 50, 51]. В условиях акросомальной реакции активируется кислотный каталитический домен, обеспечивающий гиалу-ронидазную активность в zona pellucida и перивител-линовом пространстве, облегчая пенетрацию [52—54].

По некоторым данным, SPAM1 также обладает доменом, связывающим zonapellucida, опосредующим вторичное связывание внутренней акросомальной мембраны с блестящей оболочкой ооцита [41, 55—57].

Применение гиалуроновой кислоты для селекции сперматозоидов in vitro

Показано, что гиалуронат-связанные сперматозоиды обладают лучшей морфологией и характеризуются меньшей частотой анеуплоидий или разрывов ДНК [13, 21, 58]. Использование ГК в качестве «физиологического селектора» применимо на практике.

Улучшение качественных характеристик сперматозоидов, способных связываться с ГК, подтверждено рядом исследований. Так, продемонстрировано отсутствие фрагментации ДНК в ядрах сперматозоидов, связавшихся с ГК [59]. Кроме того, доказана эффективность селекции сперматозоидов, связывающихся с ГК, в устранении анеуплоидий как при олигозоо-спермии, так и при нормальной концентрации половых клеток. При этом наблюдается существенное уменьшение частоты дисомий и диплоидий хромосом, что обеспечивает значительное улучшение качества популяции сперматозоидов [21].

На способности связываться с ГК отражается и морфологическая целостность ядра сперматозоида. С помощью микроскопии высокого увеличения было обнаружено, что количество гамет с нормальным ядром

согласно критериям MSOME (motile sperm organelle morphology examination — морфологический анализ органелл подвижного сперматозоида) среди сперматозоидов, связавшихся с ГК, существенно выше, чем среди сперматозоидов, погруженных в поливинилпир-ролидон, предназначенный для замедления сперматозоидов во время процедуры ИКСИ (14,5 и 11,0 % соответственно) [13, 60]. Кроме того, для ускорения процедуры интрацитоплазматической инъекции морфологически нормального сперматозоида (IMSI — intracytoplasmic morphologically normal sperm injection) авторы рекомендуют выполнять ее совместно с селекцией сперматозоидов с помощью ГК [13].

В таблице представлены результаты некоторых исследований, описывающих корреляцию способности сперматозоидов связываться с ГК с их ядерными, мембранными, цитоплазматическими и морфологическими характеристиками.

На основании результатов исследований, описывающих прямую корреляцию качества сперматозоидов с их способностью связываться с ГК, был разработан новый подход к выполнению процедуры ИКСИ, заключающийся в использовании ГК для селекции сперматозоидов перед их введением в ооциты. Данный подход, воспроизводящий важный этап селекции мужских половых клеток, осуществляемый in vivo, был определен как физиологическая ИКСИ, или ПИКСИ (PICSI -physiological intracytoplasmic sperm injection) [13, 22].

Качественные характеристики сперматозоидов, способных к связыванию с ГК

Источник Метод исследования Характеристики сперматозоидов, связавшихся с ГК

G. Huszar et al., 2003 [17] Окрашивание анилиновым синим Завершенный процесс молекулярной реорганизации плазматической мембраны, экструзия цитоплазмы и замена ядерных гистонов на протамины, а также целостность акросомы

S. Cayli et al., 2004 [61] Иммуноцитохимическое окрашивание Нормальный объем цитоплазмы, отсутствие апоптотиче-ских маркеров

A. Jakab et al., 2005 [21] Флуоресцентная гибридизация in situ Существенное снижение частоты анеуплоидий

P. Prinosilova et al., 2009 [58] 1. Оценка морфологии по строгим критериям Тигерберга. 2. Спектрофотометрическое определение ферментативной активности. 3. Флуориметрическое определение концентрации белков 1. Увеличение количества сперматозоидов с нормальной морфологией. 2. Снижение активности КК. 3. Увеличение концентрации белка ЖРА2

N. Tarozzi et al, 2009 [62] Терминальное дезоксиуридиновое мечение концов Существенное снижение уровня фрагментации ДНК

A. Yagci et al., 2010 [59] Окрашивание акридиновым оранжевым

L. Parmegiani et al., 2010 [13] 1. Тест на дисперсию хроматина сперматозоидов. 2. Оценка морфологии по критериям MSOME 1. Существенное снижение уровня фрагментации ДНК. 2. Значительное улучшение морфологии ядра

S.H. Razavi et al., 2010 [63] 1. Окрашивание хроматина хромомицином A3. 2. Тест на дисперсию хроматина сперматозоидов. 3. Окрашивание по Папаниколау Правильная морфология и нормальное содержание про-таминов в ядре

Е га Е

Е га Е

Клиническая эффективность физиологической интрацитоплазматической инъекции сперматозоида

Эффективность селекции сперматозоидов с использованием ГК в циклах ИКСИ подтверждена клинически. Доказано статистически значимое снижение частоты самопроизвольных абортов после ИКСИ связанными с ГК сперматозоидами в сравнении с теми, что были отобраны лишь посредством визуальной оценки [64]. Данные клинические результаты подтверждают выводы, полученные в проведенных ранее исследованиях биохимических и молекулярных маркеров функциональной зрелости сперматозоидов человека [17, 61, 65]. Кроме того, использование для ИКСИ сперматозоидов, отобранных с помощью ГК, увеличивает показатель частоты имплантаций [13]. Данные всех этих исследований свидетельствуют об отсутствии негативных влияний на ооциты-реципиенты и пре-имплантационный эмбриогенез при использовании ГК для селекции сперматозоидов в циклах ИКСИ.

В дополнительных исследованиях было продемонстрировано наличие обратной корреляции между индексом фрагментации ДНК в сперматозоидах и исходами программ вспомогательных репродуктивных технологий. Данный индекс связан с «отцовскими» эффектами, приводящими к ухудшению качества бла-стоцист и снижению частоты имплантаций [66—68]. В систематическом обзоре 11 исследований, включающих 1549 циклов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и ИКСИ, было показано, что повреждение спермальной ДНК обладает статистически достоверной прямой корреляцией с частотой самопроизвольных абортов [69]. Кроме того, снижение активности шаперона ЖРА2, присущее незрелым сперматозоидам, связано с нарушением транспорта ферментов репарации ДНК и, таким образом, с увеличением количества разрывов и уровня фрагментации ДНК, что снижает частоту наступления беременности [18, 70—72].

Использование феномена связывания сперматозоидов с ГК способствует селекции единичного зрелого, функционально компетентного сперматозоида с целостной ДНК, снижая таким образом потенциальные риски возникновения побочных эффектов, обусловленных вкладом отцовского генома в развитие эмбриона [73]. Показано, что при индексе связывания сперматозоидов с ГК <65 % селекция сперматозоидов с использованием гиалуроната приводит к статистически значимому снижению частоты спонтанных абортов [64]. Ранее эти же авторы привели убедительное доказательство того, что отбор сперматозоидов с нормальным ядром и интактной ДНК значительно улучшает качество эмбрионов, существенно уменьшает степень фрагментации эмбрионов 3-го дня, а также способствует формированию бластоцист хорошего качества, увеличивая частоту имплантации и наступления клинической беременности [13, 74, 75]. Сущест-

венно возрастает и скорость развития эмбрионов [13]. Сообщается также о положительной тенденции в частоте оплодотворения после введения в ооциты сперматозоидов, связавшихся с ГК [76].

В ряде публикаций приводятся сведения об отсутствии различий в частоте оплодотворения и наступления беременности после введения гиалуронат-свя-занных сперматозоидов [77, 78]. Однако отсутствие клинически значимых показателей после введения сперматозоидов, связавшихся с ГК, в ооцит может быть обусловлено малыми выборками пациентов (44 и 18 соответственно), участвовавших в данных исследованиях [75]. В одной из этих публикаций докладывается об отсутствии различий в выходе зигот после оплодотворения 407 ооцитов как связавшимися, так и не связавшимися с ГК сперматозоидами [77]. Однако из-за высокого риска передачи хромосомных аномалий этический аспект данного исследования был поставлен под сомнение другими авторами [79].

Заключение

Сведение к минимуму любых потенциальных рисков, влекущих за собой возникновение нарушений в развитии эмбрионов (таких как апоптоз, фрагментация эмбрионов, нарушение экспрессии генов, анеупло-идии), является крайне важным условием для уменьшения возможных отрицательных последствий, возникающих в результате манипуляций с половыми клетками in vitro. По крайней мере, те процессы, на которые способен оказать влияние клинический эмбриолог, должны быть выполнены как можно более безопасным и физиологичным способом.

В большинстве исследований, посвященных ПИКСИ с использованием ГК, продемонстрировано улучшение клинического исхода данной процедуры по сравнению с процедурой ИКСИ, широко применяемой в рутинной практике эмбриологических лабораторий. Важно обратить внимание на отсутствие в литературе данных, сообщающих о пагубном влиянии ПИКСИ на результаты лечения бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий. Это означает, что ГК может применяться как минимум в качестве физиологической альтернативы синтетическому поли-винилпирролидону, который обычно используется для замедления сперматозоидов во время процедуры ИКСИ в большинстве клиник ЭКО.

ПИКСИ можно рекомендовать пациентам, которым показана стандартная процедура ИКСИ, не только для того, чтобы улучшить клинические результаты, но, главным образом, для того, чтобы воссоздать некоторые природные этапы селекции сперматозоидов, обходимые стороной при выполнении традиционной ИКСИ. Эффективная селекция сперматозоидов с помощью ГК представляется особенно важным аспектом при следующих показаниях:

• низкая частота оплодотворения в предыдущих циклах ИКСИ;

• неудовлетворительное качество эмбрионов в предыдущих циклах ИКСИ;

• самопроизвольное прерывание беременностей в анамнезе;

• бесплодие неясного генеза;

• отклонение основных показателей спермограм-мы (концентрация, подвижность и количество морфологически нормальных сперматозоидов) от нормативных критериев Всемирной организации здравоохранения, особенно при абсолютной тератозооспермии;

• использование сперматозоидов, полученных путем биопсии яичка или его придатка;

• малое количество ооцитов.

Несомненно, для окончательного подтверждения положительного влияния использования ГК на исход

процедуры ЭКО необходимо проведение дальнейших крупномасштабных исследований, которые включали бы выборки еще большего объема. Однако уже сейчас, опираясь на данные постоянно увеличивающегося количества публикаций, сообщающих о положительном эффекте использования техники селекции сперматозоидов по связыванию с ГК, можно сделать вывод о высокой перспективности данного подхода для внедрения в рутинную практику всех лабораторий ЭКО. Благодаря полному отсутствию токсичности ГК, а также возможности снижать частоту возникновения генетических осложнений путем использования данного вещества для селекции сперматозоидов, применение методики ПИКСИ в качестве альтернативы традиционной ИКСИ позволит существенно улучшить характеристики преимплантаци-онного эмбриогенеза и, в конечном счете, увеличить количество благоприятных клинических исходов.

ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES

1. Van Steirteghem A.C., Nagy Z., Joris H. et al. High fertilization and implantation rates after intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod 1993;8(7):1061—6.

2. Oehninger S. Clinical management

of male infertility in assisted reproduction: ICSI and beyond. Int J Androl 2011; 34(5 Pt 2):e319-29.

3. Sakkas D., Manicardi G., Bizarro D., Bianchi P.G. Possible consequences

of performing intracytoplasmic sperm injection (ICSI) with sperm possessing nuclear DNA damage. Hum Fertil (Camb) 2000;3(1):26-30.

4. Bonduelle M., van Assche E., Joris H. et al. Prenatal testing in ICSI pregnancies: incidence of chromosomal anomalies in 1586 karyotypes and relation to sperm parameters. Hum Reprod 2002;17(10):2600-14.

5. Heytens E., Parrington J., Coward K. et al. Reduced amounts and abnormal forms

of phospholipase C zeta (PLCzeta) in spermatozoa from infertile men. Hum Reprod 2009;24(10):2417-28.

6. Navarro-Costa P., Nogueira P., Carvalho M. et al. Incorrect DNA methylation of the DAZL promoter CpG island associates with defective human sperm. Hum Reprod 2010;25(10):2647-54.

7. Palermo G., Joris H., Devroey P., van Steirteghem A.C. Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte. Lancet 1992;340(8810):17-8.

8. Celik-Ozenci C., Jakab A., Kovacs T. et al. Sperm selection for ICSI: shape properties do not predict the absence or presence

of numerical chromosomal aberrations. Hum Reprod 2004;19(9):2052-9.

9. Zini A., Finelli A., Phang D., Jarvi K. Influence of semen processing technique on human sperm DNA integrity. Urology 2000;56(6):1081-4.

10. Lucas H., Lammers J., Pfeffer J. et al. Conventional IVF versus ICSI in sibling oocytes: A French experience analysis for BLEFCO. Gynecol Obstet Fertil 2010;38(9):515-20.

11. Henkel R.R., Schill W.B. Sperm preparation for ART. Reprod Biol Endocrinol 2003;1:108.

12. A practical guide to select gametes and embryos. Ed.M. Montag. CRC Press, Taylor & Francis Group, 2014.

13. Parmegiani L., Cognigni G.E., Bernardi S. et al. "Physiologic ICSI": hyaluronic acid (HA) favors selection

of spermatozoa without DNA fragmentation and with normal nucleus, resulting in improvement of embryo quality. Fertil Steril 2010;93(2):598-604.

14. Suarez S.S., Pacey A.A. Sperm transport in the female reproductive tract. Hum Reprod Update 2006;12(1):23-37.

15. Aitken R., Bowie H., Buckingham D. et al. Sperm penetration into a hyaluronic acid polymer as a means of monitoring functional competence. J Androl 1992;13(1):44-54.

16. Cayli S., Jakab A., Ovari L. et al. Biochemical markers of sperm function: male fertility and sperm selection for ICSI. Reprod Biomed Online 2003;7(4):462-8.

17. Huszar G., Ozenci C.C., Cayli S. et al. Hyaluronic acid binding by human sperm indicates cellular maturity, viability, and unreacted acrosomal status. Fertil Steril 2003;79 Suppl 3:1616-24.

18. Huszar G., Stone K., Dix D., Vigue L. Putative creatine kinase M-isoform in human sperm is identified as the 70-kilodalton heat shock protein HspA2. Biol Reprod 2000;63(3):925-32.

19. Yeung C.H., Majumder G.C., Rolf C. et al. The role of phosphocreatine kinase in the motility of human spermatozoa supported by different metabolic substrates. Mol Hum Reprod 1996;2(8):591-6.

20. Huszar G., Celik-Ozenci C., Cayli S. et al. Semen characteristics after overnight shipping: preservation of sperm concentrations, HspA2 ratios, CK activity, cytoplasmic retention, chromatin maturity, DNA integrity, and sperm shape. J Androl 2004;25(4):593-604.

21. Jakab A., Sakkas D., Delpiano E. et al. Intracytoplasmic sperm injection: a novel selection method for sperm with normal frequency of chromosomal aneuploidies. Fertil Steril 2005;84(6):1665-73.

22. Huszar G., Jakab A., Sakkas D. et al. Fertility testing and ICSI sperm selection by hyaluronic acid binding: clinical and genetic aspects. Reprod Biomed Online 2007;14(5):650-63.

23. Nixon B., Aitken R.J. The biological significance of detergent-resistant membranes in spermatozoa. J Reprod Immunol 2009;83(1-2):8-13.

24. Gadella B.M. The assembly of a zona pellucida binding protein complex in sperm. Reprod Domest Anim 2008;43 Suppl 5:12-9.

25. Tanphaichitr N., Carmona E., Bou Khalil M. et al. New insights into sperm-zona pellucida interaction: involvement of sperm lipid rafts. Front Biosci 2007;12:1748-66.

E

W

E

Е га Е

26. Redgrove K.A., Anderson A.L., McLaughlin E. A. et al. Investigation

of the mechanisms by which the molecular chaperone HSPA2 regulates the expression of sperm surface receptors involved in human sperm-oocyte recognition. Mol Hum Reprod 2013;19(3):120-35.

27. Redgrove K.A., Nixon B., Baker M.A. et al. The molecular chaperone HSPA2 plays a key role in regulating the expression

of sperm surface receptors that mediate sperm-egg recognition. PLoS One 2012;7(11):e50851.

28. Motiei M., Tavalaee M., Rabiei F. et al. Evaluation of HSPA2 in fertile and infertile individuals. Andrologia 2013;45(1):66-72.

29. Evans E.A., Zhang H., Martin-DeLeon P.A. SPAM1(PH-20) protein and mRNA expression

in the epididymides of humans and macaques: utilizing laser microdissection/ RT-PCR. Reprod Biol Endocrinol 2003;1:54.

30. Sabeur K., Cherr G.N., Yudin A.I. et al. The PH-20 protein in human spermatozoa. J Androl 1997;18(2):151-8.

31. Asquith K.L., Baleato R.M., McLaughlin E.A. et al. Tyrosine phospho-rylation activates surface chaperones facilitating sperm-zona recognition. J Cell Sci 2004;117(Pt 16):3645-57.

32. Nixon B., Mitchell L.A., Anderson A.L. et al. Proteomic and functional analysis

of human sperm detergent resistant membranes. J Cell Physiol 2011;226(10):2651-65.

33. Redgrove K.A., Anderson A.L.,

Dun M.D. et al. Involvement of multimeric protein complexes in mediating the capacitation-dependent binding of human spermatozoa to homologous zonae pellucidae. Dev Biol 2011;356(2):460-74.

34. Dun M.D., Smith N.D., Baker M.A. et al. The chaperonin containing TCP1 complex (CCT/TRiC) is involved

in mediating sperm-oocyte interaction. J Biol Chem 2011;286(42):36875-87.

35. Kimura M., Kim E., Kang W. et al. Functional roles of mouse sperm hyalu-ronidases, HYAL5 and SPAM1, in fertilization. Biol Reprod 2009;81(5):939-47.

36. Lathrop W.F., Carmichael E.P., Myles D.G., Primakoff P. cDNA cloning reveals the molecular structure of a sperm surface protein, PH-20, involved in sperm-egg adhesion and the wide distribution of its gene among mammals. J Cell Biol 1990;111(6 Pt 2):2939-49.

37. Carmona E., Weerachatyanukul W., Soboloff T. et al. Arylsulfatase A is present on the pig sperm surface and is involved in sperm-zona pellucida binding. Dev Biol 2002;247(1):182-96.

38. Tantibhedhyangkul J., W;erachatyanukul W, Carmona E. et al. Role of sperm surface arylsulfatase A in mouse sperm — zona

pellucida binding. Biol Reprod 2002;67(1):212-9.

39. Dix D.J., Allen J.W., Collins B.W. et al. HSP70-2 is required for desynapsis

of synaptonemal complexes during meiotic prophase in juvenile and adult mouse spermatocytes. Development 1997;124(22):4595-603.

40. Osheroff J.E., Visconti P.E., Valenzuela J.P. et al. Regulation of human sperm capacitation by a cholesterol efflux-stimulated signal transduction pathway leading to protein kinase A-mediated up-regulation of protein tyrosine phosphorylation. Mol Hum Reprod 1999;5(11):1017-26.

41. Cherr G.N., Yudin A.I., Overstreet J.W. The dual functions of GPI-anchored PH-20: hyaluronidase and intracellular signaling. Matrix Biol 2001;20(8):515-25.

42. Vandevoort C.A., Cherr G.N., Overstreet J.W. Hyaluronic acid enhances the zona pellucida-induced acrosome reaction of macaque sperm. J Androl 1997;18(1):1-5.

43. Sabeur K., Cherr G.N., Yudin A.I., Overstreet J.W. Hyaluronic acid enhances induction of the acrosome reaction of human sperm through interaction with the PH-20 protein. Zygote 1998;6(2):103-11.

44. Cherr G.N., Yudin A.I., Li M.W. et al. Hyaluronic acid and the cumulus extracellular matrix induce increases

in intracellular calcium in macaque sperm via the plasma membrane protein PH-20. Zygote 1999;7(3):211-22.

45. Morales C.R., Badran H., El-Alfy M. et al. Cytoplasmic localization during testicular biogenesis of the murine mRNA for Spam1(PH-20), a protein involved

in acrosomal exocytosis. Mol Reprod Dev 2004;69(4):475-82.

46. Ganguly A., Bansal P., Gupta T. et al. "ZP domain" of human zona pellucida glycoprotein-1 binds to human spermatozoa and induces acrosomal exocytosis. Reprod Biol Endocrinol 2010;8:110.

47. Hunnicutt G.R., Mahan K., Lathrop W.F. et al. Structural relationship of sperm soluble hyaluronidase to the sperm membrane protein PH-20. Biol Reprod 1996;54(6):1343-9.

48. Xu H., Liu F., Srakaew N. et al. Sperm arylsulfatase A binds to mZP2 and mZP3 glycoproteins in a nonenzymatic manner. Reproduction 2012;144(2): 209-19.

49. Reitinger S., Laschober G.T., Fehrer C. et al. Mouse testicular hyaluronidase-like proteins SPAM1 and HYAL5 but not HYALP1 degrade hyaluronan. Biochem J 2007;401(1):79-85.

50. Lin Y., Mahan K., Lathrop W. F. et al.

A hyaluronidase activity of the sperm plasma membrane protein PH-20 enables sperm to penetrate the cumulus cell layer

surrounding the egg. J Cell Biol 1994;125(5):1157-63.

51. Meyers S.A., Yudin A.I., Cherr G.N. et al. Hyaluronidase activity of macaque sperm assessed by an in vitro cumulus penetration assay. Mol Reprod Dev 1997;46(3):392-400.

52. Talbot P. Hyaluronidase dissolves

a component in the hamster zona pellucida. J Exp Zool 1984;229(2):309-16.

53. Dandekar P., Talbot P. Perivitelline space of mammalian oocytes: extracellular matrix of unfertilized oocytes and formation

of a cortical granule envelope following fertilization. Mol Reprod Dev 1992;31(2):135-43.

54. Yudin A.I., Li M.W., Robertson K.R. et al. Characterization of the active site of monkey sperm hyaluronidase. Reproduction 2001;121(5):735-43.

55. Hunnicutt G.R., Primakoff P., Myles D.G. Sperm surface protein PH-20

is bifunctional: one activity is a hyaluronidase and a second, distinct activity is required in secondary sperm-zona binding. Biol Reprod 1996;55(1):80-6.

56. Myles D.G., Primakoff P. Why did the sperm cross the cumulus? To get

to the oocyte. Functions of the sperm surface proteins PH-20 and fertilin in arriving at, and fusing with, the egg. Biol Reprod 1997;56(2):320-7.

57. Morin G., Sullivan R., Laflamme I. et al. SPAM1 isoforms from two tissue origins are differentially localized within ejaculated bull sperm membranes and have different roles during fertilization. Biol Reprod 2010;82(2):271-81.

58. Prinosilova P., Kruger T., Sati L. et al. Selectivity of hyaluronic acid binding for spermatozoa with normal Tygerberg strict morphology. Reprod Biomed Online 2009;18(2):177-83.

59. Yagci A., Murk W., Stronk J.,

Huszar G. Spermatozoa bound to solid state hyaluronic acid show chromatin structure with high DNA chain integrity: an acridine orange fluorescence study. J Androl 2010;31(6):566-72.

60. Bartoov B., Berkovitz A., Eltes F. et al. Real-time fine morphology of motile human sperm cells is associated with IVF-ICSI outcome. J Androl 2002;23(1):1-8.

61. Cayli S., Sakkas D., Vigue L. et al. Cellular maturity and apoptosis in human sperm: creatine kinase, caspase-3 and Bcl-XL levels in mature and diminished maturity sperm. Mol Hum Reprod 2004;10(5):365-72.

62. Tarozzi N., Nadalini M., Bizzaro D. et al. Sperm-hyaluronan-binding assay: clinical value in conventional IVF under Italian law. Reprod Biomed Online 2009;19 Suppl 3:35-43.

63. Razavi S.H., Nasr-Esfahani M.H., Deemeh M.R. et al. Evaluation of zeta and HA-binding methods for selection

of spermatozoa with normal morphology,

protamine content and DNA integrity. Andrologia 2010;42(1):13-9.

64. Worrilow K.C., Eid S., Woodhouse D. et al. Use of hyaluronan in the selection

of sperm for intracytoplasmic sperm injection (ICSI): significant improvement in clinical outcomes — multicenter, double-blinded and randomized controlled trial. Hum Reprod 2013;28(2):306—14.

65. Huszar G., Vigue L., Morshedi M. Sperm creatine phosphokinase M-isoform ratios and fertilizing potential of men: a blinded study of 84 couples treated with in vitro fertilization. Fertil Steril 1992;57(4):882—8.

66. Benchaib M., Braun V., Lornage J. et al. Sperm DNA fragmentation decreases

the pregnancy rate in an assisted reproductive technique. Hum Reprod 2003;18(5):1023—8.

67. Virro M.R., Larson-Cook K.L., Evenson D.P. Sperm chromatin structure assay(SCSA) parameters are related

to fertilization, blastocyst development, and ongoing pregnancy in in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection cycles. Fertil Steril 2004;81(5):1289—95.

68. Seli E., Sakkas D. Spermatozoal nuclear determinants of reproductive outcome:

implications for ART. Hum Reprod Update 2005;11(4):337-49.

69. Zini A., Borman J.M., Belzile E., Ciampi A. Sperm DNA damage is associated with an increased risk of pregnancy loss after IVF and ICSI: Systematic review

and meta-analysis. Hum Reprod 2008;23(12):2663-8.

70. Allen J.W., Dix D.J., Collins B.W. et al.

Hsp70-2 is part of the synaptonemal complex in mouse and hamster spermatocytes. Chromosoma 1996;104(6):414—21.

71. Dix D.J., Allen J.W., Collins B.W. et al. Targeted gene disruption of Hsp70—2 results in failed meiosis, germ cell apoptosis, and male infertility. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93(8):3264-8.

72. Eddy E.M. Role of heat shock protein Hsp70—2 in spermatogenesis. Rev Reprod 1999;4(1):23-30.

73. Parmegiani L., Cognigni G.E., Filicori M. Sperm selection: effect on sperm DNA quality. Adv Exp Med Biol 2014;791:151-72.

74. Worrilow K.C., Eid S., Matthews J. et al. Multi-site clinical trial evaluating PICSI,

a method for selection of hyaluronan bound sperm (HBS) for use in ICSI: improved

clinical outcomes. Hum Reprod 2010;25(Suppl 1):i7.

75. Parmegiani L., Cognigni G.E., Ciampaglia W. et al. Efficiency of hyaluronic acid(HA) sperm selection. J Assist Reprod Genet 2010;27(1):13—6.

76. Nasr-Esfahani M.H., Razavi S., Vahdati A.A. et al. Evaluation of sperm selection procedure based

on hyaluronic acid binding ability on ICSI outcome. J Assist Reprod Genet 2008;25(5):197—203.

77. Van Den Bergh M., Fahy-Deshe M., Hohl M.K. Pronuclear zygote score following intracytoplasmic injection

of hyaluronan-bound spermatozoa: a prospective randomized study. Reprod Biomed Online 2009;19(6): 796—801.

78. Sanchez M., Aran B., Blanco J. et al. Preliminary clinical and FISH results on hyaluronic acid sperm selection

to improve ICSI. Hum Reprod 2005;20(Suppl 1):i200.

79. Parmegiani L., Cognigni G.E., Filicori M. Risks in injecting hyaluronic acid non-bound spermatozoa. Reprod Biomed Online 2010;20(3):437—8.

E

W

E