СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА У ДЕТСКОГО НАСЕЛЕНИЯ В УСЛОВИЯХ ВНЕШНЕСРЕДОВОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НИКЕЛЯ
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR OXIDATIVE STRESS IN CHILDREN EXPOSED TO NICKEL FROM EXTERNAL ENVIRONMENT

Изобретение относится к области медицины, в частности к способам лабораторной диагностики токсического действия никеля, в виде проявления окислительного стресса у детей, проживающих в условиях техногенной нагрузки среды обитания, и может быть использовано для раннего выявления нарушений здоровья, а также - при формировании санитарно-гигиенических мероприятий по предупреждению и устранению воздействия вредных химических веществ, в частности, никеля, обуславливающих формирование экологически обусловленной патологии.
Среда обитания промышленных городов характеризуется многосредовым загрязнением химическими веществами. Одним из загрязнителей из ряда тяжелых металлов является никель, накопление которого в организме выше определенной нормы оказывает токсический эффект. Воздействие никеля на организм на клеточном и субклеточном уровне реализуется в виде индукции свободно-радикального процесса, что подавляет стабильность синтеза и активирует окислительное повреждение дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) клетки.
Следует отметить, что небольшие количества никеля находятся в ДНК и РНК (рибонуклеиновая кислота), в химическом составе каждой клетки организма. Никель играет важную роль в циркуляции некоторых белков и может внести вклад в выработку гормонов и липидов, в образование клеточных мембран. Никель используется также в организме при превращении глюкозы в энергию, необходимую для функционирования клеток. Его небольшое количество необходимо для синтеза ферментов, которые ускоряют химические реакции в организме и участвуют в синтезе нуклеиновых кислот и ДНК. Однако слишком много никеля считается весьма токсичным и может иметь негативные последствия для здоровья.
Поэтому решение задачи по выявлению наличия окислительного стресса в организме человека от воздействия никеля является актуальной, что позволит своевременно провести адекватные мероприятия по его устранению, назначив необходимые препараты с антиоксидантными свойствами в соответствующих дозировках.
Из уровня техники известны способы, обеспечивающие выявление токсического действия тяжелых металлов на здоровье человека. Так, например, известен Способ определения чувствительности мембран эритроцитов к воздействию тяжелых металлов, в частности, никеля (Патент РФ №2332668), Способ определения токсичности действия тяжелых металлов на организм (Патент РФ №2138816). Недостатком данных известных способов является их недостаточная информативность в отношении возникновения окислительного стресса у населения, поскольку предлагаемые лабораторные показатели не отражают все стороны свободно-радикальных процессов в организме.
Также из уровня техники был выявлен ряд технических решений, касающихся диагностики окислительного стресса у населения, например: «Способ диагностики нарушений метаболизма в организме, вызванных окислительным стрессом» по патенту РФ №2436101; «Способ диагностики окислительного стресса организма у человека» по патенту РФ №2236008.
В первом способе определяют активность супероксиддисмутазы (СОДi) и каталазы (KATi) в гемолизате, оценивают изменение этих показателей относительно нормы. При значении соотношения этих показателей, равном 1,000±0,002, определяют отсутствие дисбаланса функционирования ферментов антирадикальной защиты, а при других значениях дополнительно определяют степень выраженности окислительного стресса по максимуму и площади вспышки хемилюминесценции. Далее оценивают дисбаланс функционирования ферментов антирадикальной защиты, вычисляя показатель ИПФФАР31, по формуле. При значении ИПФФАР31 ниже 70,0 ед. определяют недостаточность каталазы, а при значении ИПФФАР31 выше 130,0 ед. определяют недостаточность супероксиддисмутазы. Использование известного способа дает возможность оценить функционирование исследуемых ферментов, что позволяет проводить диагностику заболеваний, сопровождающихся окислительным стрессом. Однако его недостатком является то, что активность ферментов определяется только в эритроцитах, использование отношения активностей каталазы/супероксиддисмутазы без учета содержания субстратов, катализируемых ими реакций и содержания продуктов этих реакций, приводит к снижению его достоверности при оценке степени выраженности окислительного стресса.
2+
Согласно способу по патенту РФ №2236008, в гемолизате определяют уровень тиоловых групп. По разнице между показателями среднего количества тиоловых групп гемолизата практически здоровых людей и количеством тиоловых групп гемолизата обследуемого человека определяют количество дисульфидных групп. При значении этой разницы, равной 0,000±0,008 оптических единиц, определяют отсутствие окислительного стресса. При положительном значении этой разницы дополнительно определяют количество промежуточных и минорных продуктов окислительной модификации биомолекул: белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой. Дополнительно определяют количество продуктов модификации биомолекул после предварительной химической индукции Fe процессов перекисного окисления. Определяют коэффициент окислительной модификации биомолекул эритротроцитов по расчетной формуле, и чем выше положительное значение этого коэффициента, тем выше уровень окислительного стресса организма. Но и этот известный способ не лишен недостатков, а именно: диагностика окислительного стресса проводится только в эритроцитах и базируется на определении только продуктов деградации биомолекул, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, таких как производные тиобарбитуровой кислоты, что не в полной мере отражает начальные и конечные этапы развития окислительных реакций (производные тиобарбитуровой кислоты являются, как правило, конечными продуктами окислительных реакций) и не позволяет с высокой достоверностью оценить степень выраженности окислительного стресса.
При этом из уровня техники не были выявлены известные способы определения окислительного стресса у детского населения при воздействии никеля, поэтому сделать выбор ближайшего аналога к заявляемому объекту не представляется возможным.
Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в обеспечении высокой точности диагностики окислительного стресса населения на ранней стадии в условиях внешнесредового воздействия никеля, за счет комплексного использования при интерпретации результатов наряду с лабораторными показателями, характеризующими окислительное повреждение ДНК и мембраны клетки и показателей содержания химического контаминанта - никеля в крови.
3
Указанный технический результат достигается предлагаемым способом диагностики окислительного стресса у детского населения в условиях внешнесредового воздействия никеля, заключающимся в том, что осуществляют определение содержания никеля в пробе крови и определение лабораторных показателей: в сыворотке крови - содержание гидроперекиси липидов, а в моче - содержание 8-гидрокси-2-деоксигуанозина, далее проводят корреляционный анализ между указанными лабораторными показателями и уровнем никеля в крови, и при одновременном установлении достоверных зависимостей: повышенное содержание в крови ребенка никеля более 0,083 мг/дм и повышенное, по сравнению с референтным уровнем, содержание гидроперекиси липидов в сыворотке крови и повышенное, по сравнению с референтным уровнем, содержание 8-гидрокси-2-деоксигуанозина в моче, диагностируют наличие окислительного стресса в организме на уровне ДНК клетки и мембраны клетки.
Поставленный технический результат достигается за счет следующего.
-
-
3
Следует пояснить, что никель обладает прямым цитотоксическим действием на мембрану клетки. Взаимодействуя с билипидным слоем клеточной мембраны, никель осуществляет окисление липопротеидов низкой плотности, в результате образуются свободные радикалы (ОН, О  и др.), а также гидроперекиси липидов (первичный продукт перекисного окисления липидов). Свободные радикалы и гидроперекиси липидов в свою очередь вновь взаимодействуют с билипидным слоем клеточной мембраны с образованием активных форм кислорода, т.е. запускается свободно-радикальный процесс. Окислительный стресс приводит к разрывам ДНК, изменяет химический состав РНК и нуклеопротеидов и активирует процесс клеточной гибели (апоптоз) и как следствие повышение уровня модифицированного нуклеозида 8-гидрокси-2-деоксигуанозин (далее 8-OHdG), являющегося продуктом повреждения ДНК. Окислительный стресс и активация апоптоза являются пусковым звеном в механизме развития многих патологических процессов и заболеваний.
3
Благодаря тому, что в предлагаемом способе в качестве лабораторных показателей используют совокупные показатели: гидроперекиси липидов в крови и 8-OHdG в моче, характеризующие окислительное повреждение ДНК и мембраны клетки, с использованием корреляционного анализа, обеспечивается дополнительная информационная связь не только указанных лабораторных показателей с определенным содержанием (более 0,083 мг/дм) никеля в крови и одновременно информационная связь между самими указанными лабораторными показателями, что делает способ точным и достоверным.
Кроме того, число максимально недействующего уровня никеля в крови для развития окислительного стресса было установлено экспериментальным путем. Иллюстрация этому приведена на Рис.1 и Рис.2. На Рис.1 показана связь повышения содержания гидроперекиси липидов в сыворотке крови, по сравнению с референтным уровнем, при увеличении в крови концентрации никеля. На Рис.2 - связь повышения содержания 8-OHdG в моче, по сравнению с референтным уровнем, при увеличении в крови концентрации никеля.
3
Данные, приведенные на Рис.1 и Рис.2, показывают, что достоверная корреляция между указанными лабораторными показателями и концентрацией никеля достигается только в диапазоне концентрации никеля более 0,083 мг/дм. При более низкой концентрации никеля в пробе крови достоверная связь между этой концентрацией и лабораторными показателями: содержанием гидроперекиси липидов в сыворотке крови и содержания 8-OHdG в моче, не выявлена. Данные о концентрации никеля и указанной достоверной связи были подтверждены и нижеприведенными исследованиями, характеризующими пример реализации предлагаемого способа.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет на ранней стадии, еще до проявления клинических признаков, прогнозировать вероятность окислительного стресса у детского населения, обусловленного мембранотоксическими эффектами воздействия никеля.
Все это повысит эффективность планирования санитарно-гигиенических мероприятий по предупреждению и устранению воздействия вредных химических веществ, в частности, никеля, обуславливающих экологически обусловленную патологию у детского населения.
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом, реализуя его на конкретном примере:
- выбирают экологически неблагополучную территорию по высокой нагрузке химических факторов среды обитания. В качестве такой территории был выбран г.Чусовой Пермского края, характеризующийся наличием хронического аэрогенного воздействия на население компонентов выбросов Чусовского металлургического завода («ЧМЗ»). В частности, никель является одним из приоритетных компонентов выбросов в атмосферный воздух данного промышленного предприятия;
- отбирают случайным образом группу детей, проживающих на этой территории в зоне воздействия выбросов «ЧМЗ». Данный контингент выбран как наиболее чувствительная субпопуляция к внешнесредовой экспозиции химических факторов, что обусловливается возрастными анатомо-физиологическими особенностями органов и систем, вентиляции легких, проницаемости барьерных структур, несовершенством процессов нейроэндокринной регуляции. В результате было отобрано 83 ребенка из организованного детского дошкольного учреждения, проживающих в зоне влияния компонентов выбросов «ЧМЗ», в том числе, 32 мальчика (38% от числа обследованных детей), 51 девочка (62% от числа обследованных детей) - группа наблюдения. Возраст обследованных детей составил 4-7 лет. В обследовании принимали участие дети, прошедшие утренний фильтр, следовательно, без клинических проявлений заболеваний. Лабораторное диагностическое обследование выполняется в соответствии с обязательным соблюдением этических норм, изложенных в Хельсинкской декларации 1975 года с дополнениями 1983 года;
- у детей проводят отбор проб мочи, а также - венозной цельной крови в две пробирки;
3
- в цельной крови из первой пробирки определяют уровень содержания никеля в соответствии с действующими методическими указаниями в Российской Федерации - МУК 4.1.777-99 (Определение содержания цинка, никеля, меди и хрома в крови методом атомной абсорбции). Оценка установленных уровней содержания в крови никеля осуществляется на основании сравнительного анализа с референтным уровнем полученных результатов у детей. В качестве референтного содержания никеля в крови используется величина - 0,015 мг/дм (Клиническая оценка лабораторных тестов / Под ред. Н.У. Тица. М.: Медицина, 1986. 472 с.);
3
- в сыворотке крови, полученной из второй пробирки, определяют содержание гидроперекиси липидов. Оценка установленных уровней содержания в крови гидроперекиси липидов осуществляется на основании сравнительного анализа полученных результатов у детей с диапазоном нормальных значений (референтного уровня), установленных производителем набора - 0-350 мкмоль/дм (Оху Stat, кат. № BI-5007, Biomedica, Австрия). Исследование выполнено на иммуноферментном анализаторе «Infinite F50 Тесаn» (Австрия);
3
- в пробе мочи определяют уровень 8-OHdG. Оценка установленных уровней содержания 8-OHdG в моче проводится на основании сравнительного анализа полученных результатов у детей с диапазоном референтных значений - 87,4-281,6 нг/см. Референтный диапазон установлен на основании данных собственных исследований (выборка из 100 практически здоровых детей, проживающих на территории санитарно-гигиенического благополучия), выполненных с использованием набора Assay Designs DNA Damage ELISA (USA) на иммуноферментном анализаторе «Infinite F50 Тесаn» (Австрия);
- далее проводят расчет вероятности изменения исследуемых показателей, включая линейный корреляционный анализ (зависимости показателей детей из Чусового: повышенный уровень никеля в крови - повышенный уровень гидроперекиси липидов в сыворотке крови; повышенный уровень никеля в крови - повышенный уровень 8-OHdG в моче). Проверка статистических гипотез относительно полученных корреляционных зависимостей проводится с использованием критерия Стьюдента. Различия считают статистически значимыми при вероятности p≤0,05.
На конкретном примере, анализ результатов обследования 83 детей, проживающих на промышленно развитой территории Чусового и подвергающихся внешнесредовому воздействию никеля, позволил установить достоверные различия изучаемых показателей с референтными уровнями (таблица 1).
Таблица 1
Результаты исследования детей группы наблюдения
Показатель
Группа наблюдения (М±m)
Референтный уровень (RL)
Доли RL
Достоверность различий с референтным уровнем (p≤0,05)
Никель в крови, мг/дм<sup>3</sup>
0,15±0,022
0,015
10,0
0,002
8-OHdG в моче, нг/см<sup>3</sup>
356,4±29,4
87,4-281,6
1,3
0,05
Гидроперекиси липидов в сыворотке крови, мкмоль/дм<sup>3</sup>
535,61±63,06
0-350
1,5
0,000
3
3
3
3
Средняя концентрация никеля в крови детей группы наблюдения превысила референтный уровень в 10,0 раз (р=0,002). Статистически достоверное повышенное содержание никеля в крови обнаружено у 73% обследованных детей. Средний уровень 8-OHdG в моче в группе наблюдения (356,4±29,4 нг/см) в 1,3 раза превысил верхнюю границу референтного уровня (281,6 нг/см, р=0,05), уровень гидроперекисей липидов в сыворотке крови (535,61±63,06 мкмоль/дм) в 1,5 раза превысил верхний предел референтного значения (350,0 мкмоль/дм, р=0,000). Достоверное повышение (p≤0,05) относительно референтных значений уровня гидроперекиси липидов в сыворотке крови выявлено в 68,9% случаев от числа обследованных детей и уровня 8-OHdG моче в 63,5%;
3
3
- затем сопоставляют уровень никеля в цельной крови с уровнем гидроперекиси липидов в сыворотке крови и уровнем 8-OHdG в моче. При значении уровня гидроперекиси липидов в сыворотке крови выше нормы (референтный уровень равен 0-350 мкмоль/дм) в сочетании с повышением уровнем содержания 8-OHdG в моче (референтный диапазон равен 87,4-281,6 нг/см) на фоне повышенного уровня никеля в цельной крови, при установлении достоверных зависимостей: повышенный уровень никеля в крови - повышенный уровень гидроперекиси липидов в сыворотке крови; повышенный уровень никеля в крови - повышенный уровень 8-OHdG в моче, действие никеля определяют как токсическое (а именно, мембранотоксичное).
Оценка результатов математического моделирования причинно-следственных связей позволила установить зависимость повышения уровня гидроперекиси липидов в сыворотке крови и уровня 8-OHdG в моче от повышения концентрации в крови никеля. Данные представлены в таблице 2.
Таблица 2
Параметры моделей зависимости вероятности отклонения лабораторных показателей от концентрации никеля в крови детей (p≤0,05)
Вид ответа
Параметры модели
Критерий Фишера (F)
Коэффициент корреляции (r)
Концентрация никеля, мг/дм<sup>3</sup>
Доверительные границы, мг/дм<sup>3</sup>
b<sub>0</sub>
b<sub>1</sub>
верхняя
нижняя
Гидроперекись липидов в сыворотке крови
-2,76
7,73
17,57
0,46
0,092
0,083
0,101
8-OHdG в моче
-1,47
19,81
98,18
0,83
0,114
0,107
0,121
Из полученных концентраций никеля в крови наименьшей концентрацией для вероятного проявления окислительного стресса у детского населения является 0,083 мг/дм (лимитирующий показатель - вероятность повышения гидроперекиси липидов в сыворотке крови). Установленная экспериментальным путем данная концентрация никеля рекомендована в качестве максимально недействующей концентрации никеля в крови для условий хронического аэрогенного воздействия никеля при диагностике окислительного стресса у детского населения.
После обследования детей предлагаемым способом было установлено, что у 52 из 83 детей, проживающих на промышленно развитой территории Чусового, имеется окислительный стресс на уровне ДНК и мембраны клетки, обусловленный токсическим действием никеля на организм.
Для доказательства такого вывода всем детям группы наблюдения (всем 83 детям) был выполнен цитогенетический анализ - микроядерный тест буккальных эпителиоцитов для выявления нарушений на уровне ДНК клетки. Анализ полученных результатов выявил, что максимальная частота ядерных аномалий (микроядра, протрузии и насечки ядра, многоядерные клетки) регистрируется у 52 детей с выявленными одновременно достоверными зависимостями (повышенный более 0,083 мг/дм уровень никеля в крови - повышенный уровень гидроперекиси липидов в сыворотке крови, повышенный более 0,083 мг/дм уровень никеля в крови - повышенный уровень 8-OHdG в моче). Данные цитогенетические нарушения свидетельствуют о повышенной генетической нестабильности, зафиксированной в эксфолиативных клетках буккального эпителия у вышеназванных 52 детей. Кратность превышения частоты регистрации ядерных аномалий у этих детей с указанными достоверными зависимостями до 3,5 раз статистически значимо превысила (p≤0,05) аналогичные показатели детей с отсутствием достоверных зависимостей.
Для доказательства развития окислительного стресса на уровне мембраны клетки всем детям группы наблюдения (83 человека) через 6 месяцев был проведен анализ заболеваемости. Из 52 детей с выявленными достоверными зависимостями у 12 была выявлена бронхиальная астма, у 11 - энцефалопатия, у остальных - частые манифестации ОРВИ в сочетании с хронической ЛОР патологией. Согласно токсикологическим свойствам никеля, все указанные болезни обусловлены воздействием именно повышенного содержания никеля в организме.
У 31 ребенка без корреляционной зависимости между уровнем содержания никеля в цельной крови и изучаемыми лабораторными показателями окислительного стресса анализ заболеваемости показал, что у 3 детей выявлена патология миндалин и аденоидов, установлен 1 случай бронхиальной астмы, у 2 зарегистрировано более 2 случаев ОРВИ за этот период, у 11 детей по одному эпизоду ОРВИ, у 14 детей клинической манифестации заболеваний не установлено. То есть заболеваемость на порядок ниже, чем у вышеназванных 52 детей.
Вышеуказанные данные являются доказательством того, что только при наличии предложенной взаимосвязи содержания никеля в крови более 0,083 мг/дм и уровня заявленных лабораторных показателей обеспечивается точность и информативность предлагаемого способа, посредством которого можно диагностировать окислительный стресс на уровне ДНК клетки и мембраны клетки у детского населения.
Таким образом, использование предлагаемого способа при обследовании детей, проживающих в экологически неблагополучных условиях внешнесредового воздействия никеля, позволяет:
- обеспечить возможность выявления с высокой точностью на ранней стадии развития окислительного стресса, как результата мембранотоксического действия никеля;
- обеспечить прогноз возникновения и характер течения заболевания различных нозологий (бронхиальная астма, болезни миндалин и аденоидов, энцефалопатия, развитие цитогенетических нарушений);
- обосновать необходимость углубленного клинического обследования ребенка именно в отношении заболеваний, характерных для развития окислительного стресса при повышенном содержании никеля в организме;
- своевременно выявлять группы риска и осуществлять профилактику окислительного стресса как первичной меры профилактики ряда заболеваний различной нозологии.