Ассоциация полиморфных маркеров, локализованных в 5’-нетранслируемой области гена Defb 1 , с гипертрофией аденоидных вегетаций

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ

Ассоциация полиморфных маркеров, локализованных в 5'-нетранслируемой области гена р-дефенсина DEFB1,

w w

с гипертрофией аденоидных вегетаций

О.А.Свитич1'2, Л.В.Ганковская1, И.В.Рахманова1, И.А.Зайцева1, В.А.Ганковский1

Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова, Москва

Цель данного исследования — выявить ассоциацию полиморфных маркеров (-22G/A, -44C/G, -52G/A), локализованных в 5'-нетранслируемой области гена противомикробного пептида р-дефенсина DEFB1, с гипертрофией аденоидных вегетаций у детей. Включенные в исследование дети в возрасте от 3 до 7 лет были разделены на группы: пациенты с аденоидами, с аденоидами и аллергическими заболеваниями, пациенты с рецидивирующими аденоидными вегетациями и дети без инфекционно-воспалительных и аллергических патологий. Исследовали соскобы слизистой оболочки полости носа. Методом ПЦР-РВ в присутствии TaqMan зондов определяли полиморфные аллели в позициях -20G/A, -44C/G, -52G/A в гене DEFB1. Обработку результатов проводили методами статистики с помощью критерия Фишера и х2. Показано, что генотип GG в положении (-20) и (-44) в нетранслируемой области 5'-UTR гена DEFB1 достоверно ассоциирован с гипертрофией аденоидных вегетаций. Таким образом, изменения в структуре гена DEFB1 могут быть причиной нарушения экспрессии противомикробного пептида, что, в свою очередь, снижает противомикробную защиту слизистых оболочек. Ключевые слова: р-дефенсин 1, 5'-нетранслируемая область, полиморфный маркер, гипертрофия аденоидных вегетаций

The association of polymorphic markers

in the 5'-untranslated region of the DEFB1 gene

with adenoid hypertrophy vegetations

O.A.Svitich1'2, L.V.Gankovskaya1, I.V.Rakhmanova1, I.A.Zaytseva1, V.A.Gankovskiy1

1The Russian National Research Medical University named after N.I.Pirogov, Moscow

The aim of this investigation was to examine the association of polymorphous markers (-22G/A, -44C/G, -52G/A) localized in the 5'-UTR untranslated region in the DEFB1 gene with recurrent adenoid hypertrophy vegetations in children. There was an investigation among groups of children (from 3 to 7 years old): patients with adenoids, with adenoids and allergic diseases and a group of children without infection-inflammatory and allergic pathologies. There were studied scrapings of nasal mucosa. By RT-PCR method in the presence of TaqMan probes there were determined polymorphic alleles at positions -22G/A, -44C/G, -52G/A in the DEFB1 gene. Processing of the results was performed using the statistical methods by Fisher's criterion and х2. It was shown that the GG genotype at positions (-20) and (-44) in the untranslated region of 5'-UTR significantly associate with hypertrophy of adenoid vegetations. Thus, changes in the structure of the DEFB1 gene can cause violations of the expressions of antimictobial peptides, which in turn reduces the antimicrobial protection of mucous membranes.

Key words: fi-defensin 1, 5'-untranslated region, a polymorphic marker, adenoid hypertrophy vegetations

Для корреспонденции:

Свитич Оксана Анатольевна, доктор медицинских наук, заведующая лабораторией молекулярной иммунологии НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН, ведущий научный сотрудник Центра персонализированной медицины Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И.Пирогова Адрес: 105064, Москва, Малый Казенный пер., 5а Телефон: (495) 674-5501 E-mail: svitichoa@yandex.ru

Статья поступила 15.02.2012 г., принята к печати 17.04.2012 г.

В последнее время большое внимание уделяется изучению факторов врожденного иммунитета, в частности противомикробным пептидам, к которым относятся дефенсины. р-Дефенсины обладают широким спектром противобактериальной, противовирусной и противогрибковой активности, участвуют в хемотаксисе, в индукции адаптивного иммунитета, в созревании дендритных клеток и пр. На данный момент наиболее изученным является р-дефенсин 1,

который экспрессируется эпителиальными клетками слизистых оболочек респираторного, урогенитально-го и пищеварительного трактов [1, 2]. ß-Дефенсин 1 кодируется геном DEFB1, который локализуется на коротком плече хромосомы 8 в локусе 8p22-23 в кластере ß-дефенсинов. Полиморфизм гена DEFB1 может быть ассоциирован с выраженностью продукции ß-дефенсина 1 на уровне слизистых оболочек, поэтому данным полиморфизмом можно объяснить различную восприимчивость к заболеваниям инфекционного генеза [3].

Для данного исследования интерес представляли три полиморфных маркера (SNP — Single nucleotide polymorphism), локализованных в 5'-нетранслируе-мой области гена DEFB1: -20G/A, -44C/G и -52G/A. Установлено, что выбранные маркеры ассоциированы с широким спектром заболеваний (ВИЧ-1-инфекцией, сепсисом, инфекцией, вызванной C. albicans, P. aeruginosa и др.) [4, 5]. Таким образом, можно сделать предположение, что дефекты на уровне генов могут снижать экспрессию дефенсинов и тем самым приводить к уменьшению защиты на уровне слизистых оболочек и развитию патологии ЛОР-органов.

На протяжении последних лет педиатры уделяют особое внимание проблеме гипертрофии аденоидных вегетаций, патологическому увеличению носоглоточных миндалин, вызывающих затруднение дыхания, снижение слуха. Гипертрофия аденоидных вегетаций встречается более чем у 50% детей в возрасте от 3 до 7 лет. Если вовремя не начать лечить гипертрофию аденоидных вегетаций, у детей могут развиться такие серьезные осложнения, как аденоидный тип лица, нарушение формирования лицевых костей, снижение слуха, следствием чего может быть инвалидизация детей [6].

Целью данного исследования было выявление ассоциаций полиморфных маркеров (-20G/A, -44C/G, -52G/A), локализованных в 5'-нетранслируемой области гена DEFB1, с гипертрофией аденоидных вегетаций у детей.

Пациенты и методы

В исследовании принимали участие 244 пациента Морозовской детской клинической больницы в возрасте от 3 до 7 лет. Все пациенты были разделены на группы: пациенты с гипертрофией аденоидных вегетаций с аллергической патологией (n = 41) и без нее (n = 86), пациенты с рецидивирующими аденоидными вегетациями (n = 53). В группе сравнения были дети без аденоидных вегетаций и без инфекционно-воспа-лительных и аллергических заболеваний (n = 64) — здоровые дети. В качестве материала служили эпителиальные клетки слизистой оболочки носоглотки. Для исследования полиморфизмов из клинического материала выделяли ДНК (набор «К-сорб», Синтол, РФ), проводили ПЦР-РВ в присутствии TaqMan-зондов («Набор реагентов для проведения ПЦР-РВ» (R-412), Синтол, РФ). Последовательности праймеров и зондов представлены в табл. 1.

Для изучения экспрессии гена р-дефенсина 1 выделяли РНК (набор «RNeasy Mini Kit», QIAGEN), далее проводили реакцию обратной транскрипции («Набор реагентов для проведения реакции обратной транскрипции» (ОТ-1), Синтол, РФ) и полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени («Набор реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBR-Green1» (R-402), Синтол, РФ). Уровень экспрессии гена р-дефенсина 1 исследован относительно экспрессии гена р-актина [7].

Результаты были обработаны с помощью статистических критериев Фишера и х2 [8].

Результаты исследования и их обсуждение

Анализ полученных данных показал, что только генотипы GG(-20) и GG(-44) в 5'-нетранслируемой области гена DEFB1 ассоциированы с риском развития гипертрофии аденоидных вегетаций, как осложненных аллергическими заболевания, так и рециди-

Таблица 1. Последовательности праймеров и зондов для определения полиморфных маркеров (С(-20)Д, 0(-44)С, в(-52)Д) в гене йЕГБ1

Ген полиморфный маркер Название праймера/ зонда Последовательность праймера/зонда 5'-нетранслируемой области

DEFB1 G(-20)A HBD-1_-20_f gac-gag-gtt-gtg-caa-tcc-acc-a

HBD-1_-20_r gca-gaa-ggt-agg-aag-ttc-tca-t

HBD-1_-20_z1 FAM-tgg-cag-gca-aca-ctc-agg-att-tc-RTQ1

HBD-1_-20_z2 ROX-tgg-cag-gca-aca-ccc-agg-at-RTQ2

C(-44)G HBD-1_-44_z1 R6G-agc-cag-cct-ctc-ccc-agt-tcc-RTQ1

HBD-1_-44_z2 Cy5-agc-cag-cgt-ctc-ccc-agt-tcc-BHQ3

G(-52)A HBD-1_-44_f gac-gag-gtt-gtg-caa-tcc-acc-ag

HBD-1_-44_r gca-gaa-ggt-agg-aag-ttc-tca-tgg-cg

HBD-1_-52_z1 R6G-ctc-agc-ctc-caa-agg-agc-cag-RTQ1

HBD-1_-52_z2 Cy5-ctc-agc-ctc-caa-aga-agc-cag-BHQ3

Ассоциация полиморфных маркеров, локализованных в 5'-нетранслируемой области гена ß-дефенсина DEFB1,

с гипертрофией аденоидных вегетаций

0,8 0,7 -0,6 -

0,5 -

I АА

GG  GA

0,4 - а

ш

If

Рецидивы Аденоиды Аденоидные Здоровые

Д :l.'..'li™.'.l h  И ,1.'-|| !..'. 1Ч.Ч:. 1.1 l,i.' дети

вегетаций заболевания

Рецидивы

g ,11.. '11И.1.1 h .

вегетаций

Аденоиды и аллергические заболевания

Здоровые дети

Рис. 1. Распределение частот генотипов полиморфных маркеров в(-20)А (А) и С(-44)в (Б) в гене йЕГБ1 у детей с аденоидными вегетациями. По оси ординат — частота встречаемости генотипа. * — значение достоверно отличается от значения в группе сравнения (здоровые дети), р < 0,05.

вирующих (рис. 1). В свою очередь, аллель G(-52) и генотип GG(-52) ассоциированы с рецидивами гипер-трофий аденоидных заболеваний (рис. 2 А и 2 Б соответственно). Можно заключить, что аллель G(-52) является маркером рецидивирования аденоидных вегетаций.

Однонуклеотидная замена в промоторной последовательности может изменить эффективность транскрипции гена и привести к изменению количества синтезируемого белка. Для анализа данного предположения нами были исследованы полиморфные маркеры G(-20)A, C(-44)G и G(-52)A гена DEFB1, расположенные в 5'-нетранслируемой области. Пред-

положительно данные полиморфные маркеры могут влиять на уровень экспрессии гена дефенсина.

Пациенты были разделены на группы в соответствии с показателями уровня экспрессии гена р-дефенсина 1: с низкими (показатель был более чем в 1000 раз ниже показателя экспрессии гена р-актина), со средними и с высокими показателями уровня экспрессии исследуемого гена (показатель отличался в 10 раз и менее от показателя экспрессии гена р-актина).

Было установлено, что аллель А(-20) ассоциирован с увеличением уровня экспрессии р-дефенсина 1

0,9

0,8 -

0,7 -

0,6 -

I I .

0,3 -

0,2 -

0,1 -

0 -

Рецидивы

Аденоиды

Аденоидные

Здоровые

аденоидных и аллергические вегетации

вегетации

заболевания

GG  АА  AG

Рецидивы Аденоиды Аденоидные

аденоидных и аллергические вегетации вегетаций заболевания

Здоровые

Рис. 2. Распределение частот аллелей (А) и генотипов (Б) полиморфного маркера С(-52)в в гене йЕРБ1 у детей с аденоидными вегетациями. По оси ординат — частота встречаемости. * — значение достоверно отличается от значения в группе сравнения (здоровые дети), р < 0,05.

в эпителиальных клетках. Так, частоты аллеля А(-20) в группе пациентов с повышенным уровнем экспрессии дефенсина и с низким составляли 0,58 и 0,22 соответственно. Генотип GА(-52) был ассоциирован с пониженной экспрессией гена дефенсина. Другие аллели и генотипы (полиморфных маркеров G(-20)A, ^-44^, G(-52)A) не были ассоциированы с изменениями уровня экспрессии дефенсина в исследуемой нами группе.

Дефенсин Р1 человека является важным противо-микробным пептидом, индукция которого чаще всего не связана с инфекционным процессом, вследствие чего возникает вопрос о системе регуляции экспрессии этого пептида. Предполагается, что с-Мус может регулировать экспрессию гена НВЭ-1 через сигнальный путь, который не связан с воспалительными реакциями. Было показано, что ингибиторы с-Мус приводят к сниженной экспрессии гена НВЭ-1 [9]. Пять участков связывания ЫР-карраВ1 (ЫРВБб) были идентифицированы в некодирующих областях, которые охватывают 5'-нетранслируемую область и интрон 1 гена ЭЕРВ1. Поскольку вышеперечисленные полиморфизмы изменяют предполагаемую структуру мРНК, была выдвинута гипотеза, что эти полиморфные маркеры могут быть ассоциированы с изменением экспрессии гена [10].

Заключение

Исследуемые полиморфные маркеры могут быть причиной нарушения экспрессии гена ИВЭ-1 в естественных условиях. Была выдвинута гипотеза, что эти же полиморфные маркеры могут быть связаны со сниженными (неполноценными) реакциями врожденного иммунитета. Наши исследования и результаты зарубежных авторов указывают на значительную роль полиморфизма гена ЭЕРВ1 в восприимчивости хозяина к инфекциям. Идентификация аллельных вариантов в гене ЭЕРВ1 может способствовать лучшему пониманию патогенеза заболеваний на уровне слизистых оболочек (на примере пациентов с гипертрофией аденоидных вегетаций) и определению подгрупп пациентов, которые нуждаются в ином терапевтическом подходе.

Исследование выполнено в рамках приоритетного направления развития «Персонализированная медицина» Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И.Пирогова.

Литература

1. Кокряков В.Н. Очерки о врожденном иммунитете. СПб.: Наука, 2006. 261 с.

2. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Мешкова Р.Я. Клиническая иммунология и аллергология с основами общей иммунологии. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. С.148-165.

3. Semple C.A., Maxwell A., Gautier P. et al. The complexity of selection at the major primate beta-defensin locus // BMC Evol. Biol. 2005. V.5 (1). P.32.

4. Milanese M., Segat L., Pontillo A. et al. DEFB1 gene polymorphisms and increased risk of HIV-1 infection in Brazilian children // AIDS. 2006. V.20 (12). P.1673-1675.

5. Ганковская О.А., Бахарева И.В., Ганковская Л.В. и др. Ассоциация полиморфных маркеров G(-20)A, C(-44)G и G(-52)A гена DEFB1 с развитием преждевременных родов и внутриутробным инфицированием плода // Рос. иммунол. журн. 2011. № 1. С.26-33.

6. Богомильский М.Р. Детская оториноларингология. М.: Медицина, 2005. С.98-119.

7. Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., Ганковская О.А. и др. Роль Toll-подобных рецепторов и дефенсинов в противомикробной защите урогенитального тракта женщин // ЖМЭИ. 2008. №1. С.46-50.

8. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1999. 459 с.

9. Sherman H., Froy O. Expression of human beta-defensin 1 is regulated via c-Myc and the biological clock // Mol. Immunol. 2008. V.45 (11). P.3163-3167.

10. Prado-Montes de Oca E., Velarde-Félix J.S., Ríos-Tostado J.J. et al. SNP 668C (-44) alters a NF-kappaB1 putative binding site in non-coding strand of human beta-defensin 1 (DEFB1) and is associated with lepromatous leprosy // Infect. Genet. Evol. 2009. V.9 (4). P.617-625.

Информация об авторах:

Ганковская Людмила Викторовна, доктор медицинских наук, профессор, руководитель нКц персонализированной медицины, профессор кафедры иммунологии медико-биологического факультета Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И.Пирогова Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1 Телефон: (495) 434-9000 E-mail: lvgan@yandex.ru

Рахманова Ирина Викторовна, доктор медицинских наук, заведующая НИЛ клинической и экспериментальной детской оториноларингологии Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И.Пирогова

Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1

Телефон: (499) 236-4538

E-mail: irenalor@gmail.com

Зайцева Ирина Александровна, студенка V курса медико-биологического факультета Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И.Пирогова

Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1

Телефон: (495) 434-5467

E-mail: lira29@list.ru

Ганковский Виктор Анатольевич, аспирант кафедры оториноларингологии педиатрического факультета Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И.Пирогова

Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1 Телефон: (495) 434-5467 E-mail: pumeria@yandex.ru