Антибактериальное средство на основе бактериофага
ANTIBACTERIAL AGENT BASED ON BACTERIOPHAGE

Изобретение относится к антибактериальному средству на основе бактериофага и может быть использовано в медицине, ветеринарии и биотехнологии.
Возросшее количество персистирующих антибиотикорезистентных патогенных и условно-патогенных штаммов бактерий, влияющих на клиническое течение заболеваний, появление хронических госпитальных инфекций из-за бесконтрольного использования антибиотиков при самолечении и профилактике инфекций в стационарах, а так же массовое применение консервантов и бактерицидных препаратов в пищевой промышленности и сельском хозяйстве, требует разработки новых эффективных препаратов. Среди возбудителей внутрибольничных инфекций следует отметить бактерии рода Staphylococcus aureus и S. epidermidis - резистентные к метициллину (оксациллину) и/или ванкомицину и/или ципрофлоксацину и/или β-лактамазопродуцирующие; 2) Enterococcus faecalis и Е. faecium - резистентные к ванкомицину; 3) Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Serratia marcescens - резистентные к цефтазидиму и/или цеф-триаксону и/или гентамицину; 4) Pseudomonas aeruginosae - резистентные к имипенему и/или цефтазидиму и/или ципрофлоксацину; 5) Streptococcus pneumoniae - резистентные к бета-лактамным антибиотикам. (Гудкова Е.И. и др. Микробиологический мониторинг госпитальных эковаров условно-патогенных бактерий - возбудителей внутрибольничных инфекций). (Медицинские новости 2003, №3).
Эпидемиологическая ситуация осложняется распространением клинических изолятов, полирезистентных к современным антибиотикам которые в последнее время представляют угрозу не только для госпитализированных пациентов, но и для населения за пределами стационаров. (Методические указания МУК 4.2-1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам»). Часто лечение хронических инфекций не дает должных результатов в связи с тем, что бактерии способны образовывать биопленки, которые не доступны антибиотикам, проявляют существенно увеличенную резистентность к лекарственным препаратам, дезинфектантам, иммунной защите организма. Поэтому большие надежды возлагаются именно на бактериофаги, которые работают в данной ситуации по принципу «троянского коня»: поражая одну бактериальную клетку, проникают вместе с ней под биопленку, и после гибели клетки-носителя в колонию выходит большое количество вновь синтезированных фагов, поражая остальные бактерии. Бактериофаги могут быть более эффективными, чем традиционные антибиотики для разрушения бактериальных биопленок.
Кроме того, бактериофаги стимулируют активизацию факторов специфического и неспецифического иммунитета, что усиливает их эффективность в терапии хронических инфекций. (Костюкевич О.И. Применение бактериофагов в клинической практике: эпоха Возрождения // РМЖ. 2015. №21. С. 1258-1262).
Альтернативу антибиотикам составляют препараты бактериофагов. Достоинство этих препаратов заключается в высокой специфичности фагов, в чувствительности патогенной микрофлоры к бактериофагам, эффективность в терапии хронических инфекций, особенно ассоциированных с образованием бактериальных биопленок в сочетаемости со всеми видами традиционной антибактериальной терапии, в отсутствии противопоказаний к фагопрофилактике и фаготерапии, в отсутствии аллергических реакций и низкой токсичности; в отсутствии влияния на нормальную бактериальную флору кишечника и препараты пробиотиков, что дает возможность для их совместного применения.
Бактериофаги назначают внутрь, а также используют для орошения ран, для введения в дренированные полости - брюшную, плевральную, полости пазух носа, среднего уха, абсцессов, ран, матки, мочевого пузыря. Используют бактериофаги для профилактики и лечения послеоперационных гнойно-воспалительных осложнений. При пероральном и аэрозольном применении, а также при нанесении на поверхность слизистых оболочек бактериофаги проникают в кровь и лимфу и выводятся через почки, санируя мочевыводящие пути.
Ограничения фаговой терапии - это высокая специфичность фагов в отношении бактерий-мишеней, что требует предварительных исследований для правильного выбора фага; появление фагорезистентных форм бактерий; тщательный отбор вирулентных («литический эффект») форм бактериофагов, обусловлен тем, что некоторые лизогенные формы могут переносить опасные бактериальные гены, кодирующие токсины и устойчивость к антибиотикам; побочные эффекты возникают от плохо очищенных терапевтических препаратов (наличие эндотоксинов и продуктов жизнедеятельности бактерий в процессе культивирования).
Кроме того, известно, что препараты серебра обладают антибактериальной и противовирусной активностью. Например, препарат «Витар» представляет собой кластеры высокодисперсного серебра, стабилизированные полимером, в состав препарата включены микроэлементы - медь, цинк. В 3-5 раз менее токсичен по сравнению с аналогами - протарголом (коллоидное серебро, стабилизированное гидролизатом казеина) и обладает антибактериальной активностью в отношении Е. coli, Salmonella tiphimurium, Shigella sonnei, Staphilococcus aureus, Bacillus subtilis.
Известно также водорастворимое средство, обладающее противовирусной активностью, на основе соединения серебра с цистином и способ его получения (патент РФ №2277908, МПК А61К 31/197, опубл. 20.06.2006 г.). Препарат имеет выраженные противовирусные свойства, снижающие инфекционную активность вируса ВД-БС КРС (диарея крупного рогатого скота) в сто раз.
Известен способ лечения инфицированных ран, включающий проведение электрофореза серебра, с предварительной санацией раны 2-5%-ным водным раствором арговита, с использованием в качестве анода полосок синтепона, модифицированного серебром, и после этого проводят перевязку 2-5%-ным аргогелем (патент РФ №2342120, МПК А61К 31/00, опубл. 27.12.2008 г.)
Недостатком выше указанных изобретений является то, что не все патогенные микроорганизмы высокочувствительны к действию соединений серебра, а в некоторых случаях требуется высокая концентрация препарата для достижения бактерицидного эффекта.
8
3
7
7
Известен препарат против сальмонеллеза голубей и способ лечения сальмонеллеза голубей с его использованием, содержащий суспензию бактериофагов, штаммы: Phagum Salmonella typhimurium №5 Т3-ДЕП с концентрацией 3,6×10 БОЕ/см и Phagum Salmonella typhimurium №8 ME-ДЕП с концентрацией 1,0×10 БОЕ/см в равных объемах в культуральной среде, консервированной хинозолом (патент РФ №2366456, МПК А61К 39/112, опубл. 10.09.2009 г.). В данном случае лечебный эффект достигается за счет сочетанного действия двух фагов разной специфичности.
Данный аналог имеет ограничения по применению, т.к. он не эффективен в отношении фагорезистентных штаммов и сопутствующей патогенной микрофлоры.
-5
Наиболее близким аналогом (прототипом) является антибактериальное средство избирательного действия на основе бактериофагов (патент РФ №2366436, МПК А61К 35/74, оубл. 10.09.2009 г.). Указанное средство включает концентрат бактериофагов с литической активностью на менее 10 по Аппельману, экстракт растений, стабилизирующую добавку, эфирное масло, консервант, воду, пребиотики (необходимые для развития нормофлоры) - аминокислоту и сахар, сорбент, антиоксидант и протеолитический фермент.
Недостатком прототипа является недостаточная стабильность препарата при хранении, а также наличие остаточной фагорезистентной и сопутствующей патогенной микрофлоры после применения указанного средства, что снижает эффективность лечения. Кроме того, в процессе лечения организма от бактериальных инфекций требуются высокие концентрации фагового препарата.
Техническим результатом изобретения является расширение спектра действия заявляемого средства за счет снижения остаточной фагорезистентной и сопутствующей патогенной микрофлоры в процессе лечения, а также снижение концентрации активных компонентов в средстве.
Указанный технический результат достигается тем, что антибактериальное средство, включающее суспензию частиц бактериофага, согласно изобретения, оно дополнительно содержит кластерное серебро и поливинилпирролидон при следующем количественном содержании компонентов:
кластерное серебро
0,25-15,0 мкг/мл
поливинилпирролидон
в конечной концентрации
0,4-0,8 мг/мл
суспензия частиц бактериофага
в концентрации
10<sup>5</sup>-10<sup>7</sup> бое/мл
В качестве бактериофага средство содержит штамм бактериофага С-47 Staphyloccocus aureus с регистрационным номером Ph-1346 при следующем количественном содержании компонентов:
суспензия частиц штамма бактериофага С-47
Staphyloccocus aureus в концентрации
3×10<sup>5</sup> бое/мл
кластерное серебро
7,0-14,0 мкг/мл
поливинилпирролидон
в конечной концентрации
0,4-0,8 мг/мл
В качестве бактериофага средство содержит штамм бактериофага DS-1 Salmonella enteritidis с регистрационным номером Ph-1343 при следующем количественном содержании компонентов:
суспензия частиц штамма бактериофага
DS-1 Salmonella enteritidis в концентрации
10<sup>6</sup>-10<sup>7</sup> бое/мл
кластерное серебро
0,26 мкг/мл
поливинилпирролидон
в конечной концентрации
0,4-0,8 мг/мл
В заявленном препарате литический бактериофаг разрушает специфические патогенные бактерии, а частицы кластерного серебра воздействуют на фагоустойчивые патогенные бактериальные клетки. Совместное применение данных компонентов позволяет снизить концентрацию патогенных микроорганизмов до минимального уровня. Кроме того, заявляемое средство позволяет снизить как концентрацию фага в препарате, так и количество кластерного серебра, в сравнении со средством-прототипом. Использование заявляемого препарата устраняет сопутствующие инфекции, что расширяет спектр действия препарата за счет неспецифического действия серебра.
Кластерное серебро - это разновидность коллоидного серебра, но с меньшим размером серебряных частиц. По данным физико-химических методов исследования (электронная микроскопия ЭМ, метод малоуглового рентгеновского рассеяния ММУРР, электронная спектроскопия в различных вариантах) средний размер первичных кластерных частиц серебра в препаратах составляет 15-2 нанометра, в то время как в классических препаратах коллоидного серебра (колларгол, протаргол) размер частиц от 10 до 300 нанометров и даже больше.
Нанокластеры серебра стабилизированы полимером медицинского назначения поливинилпирролидоном (низкомолекулярный медицинский поливинилпирролидон со средней молекулярной массой 12600±2700, Фармакопейная статья: ФСП 42-0345-4368-03).
Поливинилпирролидон (ПВП) легко растворим в воде, спирте, хлороформе, практически нерастворим в эфире. ПВП является основным действующим веществом таких препаратов, как кровезаменитель гемодез и пероральный энтеросорбент энтеродез, то есть, ПВП обладает антитоксическим действием.
В работе были использованы коллекционные штаммы бактерий Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, Shigella sonnei, Escherichia coli, Staphyloccocus aureus, штамм Salmonella sp, выделенный в ходе санитарных мероприятий на птицефабрике и бактериофаги, выделенные и задепонированные во ФБУН ГНЦВБ «Вектор». Бактериофаг DS-1 Salmonella enteritidis имеет регистрационный номер Ph-1343, а и бактериофаг С-47 Staphyloccocus aureus - регистрационный номер Ph-1346.
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами. На фиг. 1 представлена динамика роста Salmonella enteritidis в присутствии бактериофага DS-1 и препарата серебра. На фиг. 2. приведена динамика роста Staphyloccocus aureus в присутствии бактериофага С-47 и препарата серебра.
Ниже приведены примеры 1-3 состава заявляемого препарата.
Пример 1. Антибактериальное средство на основе штамма бактериофага С-47 Staphyloccocus aureus с регистрационным номером Ph-1346 суспензия частиц штамма бактериофага С-47
Staphyloccocus aureus с регистрационным
номером Ph-1346 в концентрации
3×10<sup>5</sup> бое/мл
кластерное серебро
7,0 мкг/мл
поливинилпирролидон
в конечной концентрации
0,4 мг/мл
Пример 2. Антибактериальное средство на основе штамма бактериофага С-47 Staphyloccocus aureus с регистрационным номером Ph-1346
суспензия частиц штамма бактериофага С-47
Staphyloccocus aureus с регистрационным
номером Ph-1346 в концентрации
10<sup>6</sup> бое/мл
кластерное серебро
14,0 мкг/мл
поливинилпирролидон
в конечной концентрации
0,6 мг/мл
Пример 3. Антибактериальное средство на основе штамма бактериофага DS-1 Salmonella enteritidis с регистрационным номером Ph-1343
суспензия частиц штамма бактериофага
DS-1 Salmonella enteritidis в концентрации
10<sup>7</sup> бое/мл
кластерное серебро
0,26 мкг/мл
поливинилпирролидон
в конечной концентрации
0,8 мг/мл
Технология приготовления заявляемого средства
Бактериофаги размножали путем инфицирования чувствительных бактерий (Salmonella enteritidis, Staphyloccocus aureus), находящихся в логарифмической фазе роста. Наиболее кратковременный латентный период и наибольший выход фага при лизисе бактерий наблюдался в том случае, когда бактерии находятся в логарифмической фазе роста в благоприятной питательной среде.
Для сальмонеллезного фага был определен спектр литического действия (табл. 1). Для определения чувствительности бактериальных культур к фаголизису на чашки Петри с газонами исследуемых бактерий наносят по 10 мкл разведений лизата бактериофага, чувствительность к бактериофагу проявляется после суточной инкубации при 37,0±1,0°С, в виде зон лизиса бактериальной культуры в местах контакта с бактериофагом или появлением отдельных негативных колоний. Количество различных бактериальных культур, которые лизируются испытуемым фагом, определяет широту спектра его литического действия.
6
8
Определение бактерицидного (антимикробного) действия серебра проводили на двух концентрациях бактерий - 10 и 10 кое/мл. Показано, что для достижения бактерицидного эффекта необходимо 0,8-1,2 мг/мл серебра для Salmonella enteritidis и не менее 10-12 мг/мл серебра для Staphyloccocus aureus (табл. 2).
6
9
6
9
Далее исследовали сохранность биологической активности сальмонеллезного и стафилококкового бактериофагов в присутствии серебра. Показано, что препараты бактериофагов с концентрацией 10-10 бое/мл сохраняют литическую активность в течение 6 месяцев (табл. 3). Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что кластерное серебро не снижает биологической активности сальмонеллезного и стафилококкового бактериофагов с концентрацией в препарате 10-10 бое/мл.
Определение концентрации бактериофагов проводилось по методу Грациа путем посева десятикратных разведений опытных образцов на чашки Петри с газонами чувствительных к фагу бактерий и учета количества негативных колоний бактериофага. Концентрацию бактерий определяли при высевах десятикратных разведений образцов на плотный питательный агар. Все результаты представлены как среднее трех повторов.
Приготовление заявляемого антибактериального средства проводили в асептических условиях в емкости с мешалкой куда вводили компоненты препарата в соответствии с примерами 1-3.
Результаты исследования антибактериальных свойств заявляемого средства.
При совместном культивировании бактерий Salmonella enteritidis и заявляемого препарата (пример 3) бактериофага DS-1 с кластерным серебром, показано направленное снижение количества бактерий. Полное отсутствие бактерий наблюдается к 20 часам культивирования, в отличие от применения только одного компонента препарата.
8
6
6
В случае использования одного бактериофага наблюдается развитие фагорезистентных форм бактерий, концентрация которых к 20 часам роста достигает 8,0⋅10 кое/мл, применение же кластерного серебра в таком количестве существенно не влияет на рост патогенной микрофлоры (табл .4, фиг. 1). Динамика роста Salmonella enteritidis в присутствии бактериофага DS-1 и препарата серебра представлена на фиг. 1. Образцы: 1 - контроль, 2 - 1,0⋅10 бое/мл; 3 - 1,0⋅10 бое/мл + 0,26 мкг/мл серебра.
При исследовании динамики роста бактерий Staphyloccocus aureus в присутствии бактериофага С-47, кластерного серебра и заявляемого препарата бактериофага С-47 с кластерным серебром (примеры 1-2) получили подобные результаты (табл. 5). Количество серебра от 1,4 до 14 мкг/мл не оказывает влияния на рост бактерий, но в сочетании с бактериофагом, этого количества серебра достаточно для снижения остаточной микрофлоры до полного удаления.
5
5
5
5
Динамика роста Staphyloccocus aureus в присутствии бактериофага С-47 и препарата серебра приведена также на фиг. 2. Образцы: 1 - контроль, 2 - 3,0⋅10 бое/мл; 3 - 3,0⋅10 бое/мл + 1,4 мкг/мл серебра; 4 - 3,0⋅10 бое/мл + 7 мкг/мл серебра; 5 - 3,0⋅10 бое/мл + 14 мкг/мл серебра.
Предлагаемым изобретением решается задача снижения концентрации компонентов (бактериофага и ионов кластерного серебра) без потери бактерицидной активности препарата.
Таким образом, заявляемый технический результат изобретения достигается тем, что препарат, содержащий бактериофаги и кластерное серебро со стабилизатором - поливинилпирролидоном, эффективно снижает концентрацию патогенных и условно-патогенных бактерий до минимального уровня, обладает бактерицидным и бактериостатическим свойствами и пролонгированным действием. Восстановление патогенной микрофлоры при использовании данного препарата затруднено.