Способ усиления гибели опухолевых клеток при комбинации ионизирующего излучения и ингибитора CDK
METHOD FOR ENHANCING TUMOR CELL DEATH IN COMBINATION OF IONIZING RADIATION AND CDK INHIBITOR

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу усиления гибели опухолевых клеток, включающему комбинированное использование терапевтических доз гамма-излучения и химического соединения - ингибитора циклинзависимых киназ CDK8/19 - сенексина Б (SnxB) - для индукции гибели опухолевых клеток. Настоящее изобретение обеспечивает эффективное лечение опухоли за счет препятствования формирования резистентности опухолевых тканей при действии ионизирующего излучения и противоопухолевых препаратов.
Предшествующий уровень техники, к которому относится изобретение
Целью лучевой терапии (гамма-фотоны) является индукция гибели опухолевых клеток. Первичной причиной остановки продвижения клеток по циклу (в том числе блокирование деления) считают нарушение структуры ДНК. Повреждение ДНК может быть обусловлено как ионизацией атомов и последующим разрушением молекулярных связей в ДНК, так и развиваться опосредованно через радиолиз воды. В этом случае ионизирующее излучение взаимодействует с молекулами воды, формируя свободные радикалы, воздействующие с ДНК или изменяющие профиль экспрессии генов в опухолевых клетках [Seidlitz A et al., 2016]. Из этого следует важный вывод: чем активнее делится клетка, тем более выражено повреждающее действие гамма-фотонов. Описанные механизмы обусловливают эффективность и избирательность лучевой терапии против активно пролиферирующих опухолевых клеток [Bernier J. et al., 2004].
Вместе с тем, опухолевые клетки способны защищаться и выживать, что служит причиной рецидива опухоли. Биологическая пластичность регуляторных механизмов выживания определяется, главным образом, способностью клетки перепрограммировать транскрипцию: активировать гены, продукты которых функционируют как анти-апоптотические. Поэтому правомерно предположить, что комбинирование облучения и фармакологических модуляторов генной транскрипции, к тому же прицельно воздействующих на конкретные гены, не позволит активировать гены защиты и усилит повреждающее действие гамма-фотонов.
Современные подходы к повышению радиочувствительности опухолей предусматривают использование наноструктурированных сенсибилизаторов, генерирующих активные формы кислорода [Kwatra D. et al., 2013]. Наряду с этим подходом используют низкомолекулярные химические соединения – мишень-направленные регуляторы сигнальных путей в опухолевых клетках [Hussain P.R. et al., 2018]. Наконец, воздействия на конкретные "белки выживания" в опухолевых клетках для снятия супрессорного влияния также применяются для преодоления радиорезистентности [Zhang L. et al., 2019; Morgan M.A. et al., 2010].
В каждом подходе важным является переносимость химического соединения. Учитывая, что курс лучевой терапии длителен (1-1.5 месяца) и может сопровождаться побочными эффектами (наряду с местными осложнениями, отмечается и общая астения), переносимость радиосенсибилизирующего агента особенно актуальна. Модуляторы же транскрипции, как правило, неселективны, вызывают многочисленные и разнонаправленные эффекты в разных областях генома и поэтому токсичны. Требуется прицельное воздействие на механизм транскрипции именно тех генов, значение которых в выживании клеток велико. Такой механизм - перепрограммирование транскрипции в ответ на стрессовые воздействия (в том числе ионизирующее излучение). На молекулярном уровне перепрограммирование транскрипции и выживание опухолевых клеток в стрессовых условиях обеспечивают циклин-зависимые киназы 8 и 19 (CDK8/19) [Roninson LB. et al., 2019]. Подавление активности этих киназ селективными ингибиторами направлено на предотвращение активации генов выживания и повышение гибели при лучевых воздействиях.
Раскрытие изобретения
Изобретение состоит в комбинировании терапевтических доз гамма-излучения и ингибировании циклинзависимых киназ CDK8/19 для усиления гибели опухолевых клеток.
Способ включает воздействие химическим соединением (ингибитор CDK8/19 Сенексин Б) за 1 ч до облучения (4 Гр однократно) клеток рака кишки человека (линия НСТ116)
Ранее сравнивали предлагаемую комбинацию с другим вариантом совместного действия ингибиторов циклинзависимых киназ - ССТ251545 и понатиниба - с облучением 4 Гр [Chen В et al., 2020]. Заявленный в публикации способ обеспечивает снижение выживаемости на 17% - с 85% при облучении 4 Гр до 68% при комбинации препарата с облучением. В то же время, при предложенной нами комбинации Сенексина Б с облучением в разовой дозе 4 Гр достигнуто снижение выживаемости популяции опухолевых клеток через 15 сут после воздействия с 67,7% при непосредственном облучении до 20,6% при совместном использовании облучения с ингибитором, т.е. наблюдалось подавление клеточного роста на ~47% (Рис. 2.).
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 - Пролиферация клеток линии НСТ116 в присутствии 1 мкМ Сенексина Б (SnxB).
На графике показаны средние величины трех независимых измерений и стандартные отклонения. Сенексин Б не влияет на прирост количества клеток в течение 14 суток непрерывного воздействия.
Фиг. 2 - Выживаемость клеток линии НСТ116 при комбинации Сенексина Б и облучения (4 Гр).
На рисунке показаны результаты МТТ-теста (средние величины и стандартные отклонения по данным трех измерений).
Сенексин Б малотоксичен, облучение (4 Гр) частично снижает выживаемости клеток. Комбинации Сенексина Б (0,5 мкМ в меньшей степени, 1 мкМ в большей степени) с облучением (4 Гр) резко снижает выживаемость.
Фиг. 3. Морфология клеток линии НСТ116 при облучении (4 Гр), действии Сенексина Б и комбинации облучения и Сенексина Б через 5, 10 и 15 дней после однократного облучения.
Верхний ряд «А» - интактные клетки. Средний ряд «Б» - облучение (4 Гр), нижний ряд «В» - Сенексин Б+4 Гр, x200. Сенексин Б без облучения не вызывал изменений формы клеток.
Интактные клетки образуют монослой, клетки распластаны, полигональны (верхняя панель А). Облучение 4 Гр: через 5-15 суток сохраняются распластанные клетки (средняя панель Б). Облучение 4 Гр + Сенексин Б: выраженное повреждение клеток через 5-10 сут - округлившиеся малочисленные клетки (нижняя панель В).
Примеры осуществления изобретения
1. Облучение клеток линии НСТ116
Для воздействия гамма-излучения клетки линии НСТ116 (аденокарцинома кишки человека) рассевали на 6-луночные планшеты (Eppendorf, США; 100 тыс. клеток на лунку) так, чтобы через 24 ч плотность составляла 60-70% монослоя. Источником гамма-фотонов служил радиотерапевтический аппарат РУМ-17 в Военно-Медицинской Академии им. СМ. Кирова. В экспериментах использованы дозы 1-6 Гр (однократное воздействие). Параметры облучения: напряжение на трубке 180 kV, ток 10 мА, фокусное расстояние 50 см, фильтр 1 мм А1, 0.5 мм Си; мощность дозы 0,32 Гр/мин. Для валидации значений использовался дозиметрический контроль: дозиметр ИД-11, показания доз с прибора ГО-32. Клетки облучали 12,06 минут для достижения поглощенной дозы 4 Гр.
2. Жизнеспособность клеток линии НСТ116 при сочетании гамма-излучения и Сенексина Б
В первой серии экспериментов сравнивали скорость удвоения клеток линии НСТ116 при постоянном присутствии 1 мкМ Сенексина Б в культуральной среде (модифицированная Дульбекко среда Игла с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) на протяжении 14 сут. Более высокую концентрацию Сенексина Б не исследовали, т.к. по данным авторов соединения (I.Roninson), селективность к мишени CDK8/19 достигается при 1 мкМ. На рис. 1 показано, что Сенексин Б не вызывал торможения пролиферации культуры по крайне мере в течение 2 недель. Это означает, что соединение нетоксично при относительно длительном применении, что важно для его использования не как самостоятельного противоопухолевого агента, а в комбинации с известным способом терапии.
Цитотоксическое действие гамма-излучения и комбинации с Сенексином Б исследовали в МТТ-тесте (по восстановлению желтой соли 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола в темно-синий кристаллический формазан митохондриями живых клеток). По результатам исследования цитотоксичности построены кривые выживаемости со стандартными отклонениями.
2
2
Облученные и интактные клетки высевали в лунки 96-луночного планшета (Eppendorf, США) (100 клеток в 180 мкл культуральной среды) и инкубировали 24 ч при 37°С, 5% СО в увлажненной атмосфере. Затем вносили по 20 мкл раствора Сенексина Б в культуральной среде до конечной концентрации 0,5 мкМ или 1 мкМ и инкубировали до 15 сут, заменяя среду (с и без Сенексина Б в соответствующих концентрациях) каждые 5 дней. Цитотоксичность облучения, Сенексина Б и комбинации исследовали по восстановлению желтой соли 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтетразолия (МТТ) в темно-синий кристаллический формазан редуктазами митохондрий - признак жизнеспособных клеток. В соответствующие дни в лунки вносили по 20 мкл раствора МТТ (конечная концентрация 0,5 мкг/мл, через 1,5 ч инкубации при 37°С, 5% СО культуральную среду отбирали, клетки ресуспендировали в 200 мкл диметилсульфоксида и измеряли оптическую плотность раствора на планшетном спектрофотометре Infinite F50 (Тесап, США) при длине волны 570 нм. Процент клеток, выживших при действии каждой дозы соединения, подсчитывали как частное от деления средней оптической плотности в лунках после инкубации с данной дозой к средней оптической плотности контрольных лунок (100% выживаемости). Результаты представлены на рис. 2.
Сравнение предложенной комбинации с другим вариантом совместного действия ингибиторов циклин-зависимых киназ - ССТ251545 и понатиниба - с гамма-излучением (4 Гр) [Chen В et al., 2020] показало, что при использовании указанных ингибиторов на клетках НСТ116 удалось добиться снижения выживаемости на 17% - с 85% при облучении 4 Гр до 68% при комбинации ингибиторов с облучением. В то же время, при комбинации Сенексина Б с облучением 4 Гр нами достигнуто снижение выживаемости опухолевых клеток с ~70% при облучении до ~20% при совместном использовании облучения с ингибитором перепрограммирования транскрипции на 15-е сут, т.е. наблюдалось подавление выживания клеток практически на 50% (рис. 2).
Микрофотографии клеток (интактных и облученных в присутствии и без Сенексина Б) приведены на фиг. 3. Клетки, получившие 4 Гр и ингибитор перепрограммирования транскрипции, повреждены значительно сильнее, чем клетки, получившие только лучевое воздействие. Эффект комбинации на морфологию клеток нарастает с 5-х сут к 15-м сут.
Таким образом, заявлен способ усиления гибели опухолевых клеток в результате комбинации конкретной дозы гамма-излучения и селективного ингибитора перепрограммирования транскрипции Сенексина Б. Нетоксичность последнего позволяет считать комбинацию безопасной для организма.
Работа поддержана грантом Минобрнауки Российской Федерации (соглашение №14.W03.31.0020 с Институтом биологии гена РАН).