Мониторинг трансплантации клеток кардиосфер в фибриновом геле в зону ишемического повреждения миокарда с использованием люциферазной репортерной системы

оригинальные исследования

b9

DOI: 10.23868/201707032

Мониторинг трансплантации клеток кардиосфер в фибриновом геле в зону ишемического повреждения миокарда с использованием люциферазной репортерной системы

C.В. Павлова 1 223, Е.А. Леонова 2, Е.В. Чепелева 2, А.А. Докучаева 2, Д.С. Сергеевичев 2, Е.А. Покушалов 2

1 Федеральный исследовательский центр институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, Россия

2 Национальный медицинский исследовательский центр им. акад. Е.Н. Мешалкина, Новосибирск, Россия.

3 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, Россия

Bioluminescent monitoring of rat сardiosphere-derived cells in platelet gel engraftment in ischemic heart

S.V. Pavlova 13, EA. Leonova 2, E.V. Chepeleva 2, A.A. Dokuchaeva 2,

D.S. Sergeevichev 2, EA. Pokushalov2

11nstitute of Cytology and Genetics of Siberian Branch of the RAS, Novosibirsk, Russia

2 E.N. Meshalkin National Medical Research Center, Novosibirsk, Russia

3 Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of the RAS, Novosibirsk, Russia

Успех клеточной терапии зависит от эффективного способа доставки и выживания целевых клеток. Использование трансгенных клеток, несущих репортерную систему на основе гена люциферазы, позволяет проводить в динамике количественную оценку эффективности трансплантации биохимическими методами. Цель работы — провести мониторинг персистенции клеток кардиосфер (Cardiosphere-Derived Cells, CDC) крысы после введения в периин-фарктную зону на модели острого инфаркта миокарда. Трансплантацию проводили методом интрамиокардиальных инъекций суспензии клеток, находящихся в культуральной среде или в плазме крови, богатой тромбоцитами и фибриногеном (Platelet Rich Plasma, PRP). При инъекции клеток в PRP в миокарде формируется фибриновый гель, который служит матриксом для трансплантированных клеток. Клетки были модифицированы геном фермента люциферазы с помощью трансдукции лентивирусами (CDC-Luc). Динамику выживания CDC-Luc в ишемизированном миокарде оценивали по интенсивности люминесценции в белковых экстрактах миокарда в нескольких временных точках после трансплантации (0—14 сут.). Было показано, что CDC-Luc успешно трансплантировались и персистировали в пери-инфарктной зоне в первые 48 ч., однако интеграция их в миокард не происходила. CDC-Luc, инъецированные в культуральной среде, сохранялись в миокарде в течение 5 сут., а в PRP — 10 сут. после трансплантации. Было показано положительное влияние PRP геля на адаптацию клеток после трансплантации, что, вероятно, способствовало пролонгированию периода персистенции CDC-Luc в ткани.

Использование PRP при трансплантации может быть полезным для долгоживущих клеток, таких как кардиоми-оциты, в частности, для повышения эффективности трансплантации тканеинженерного биологического водителя ритма. Репортерная система, экспрессирующая люциферазу, может быть эффективна для in vitro и in vivo мониторинга судьбы клеток как на биотехнологических этапах культивирования и сборки тканеинженерного биопейсмейкера, так и после трансплантации в сердце. В дальнейшем разработанный методический подход будет использован нами при in vivo исследовании функционирования тканеинженерных биопейсмейкеров у экспериментальных животных.

Ключевые слова: клеточная трансплантология; клетки, полученные из кардиосфер, плазма крови, богатая тромбоцитами и фибриногеном, фибриновый гель, люци-фераза.

e-mail: sonpavlova@gmail.com

The success of cell therapy depends on an effective method of cell delivery and engraftment. The use of transgenic cells carrying a reporter system based on the luciferase gene allows to perform the quantitative evaluation of the transplantation efficiency in dynamics using biochemical methods. The purpose of this work was to monitor the persistence of rat cardiosphere-derived cells (CDC) after allogeneic transplantation into the peri-infarction zone. Transplantation was performed by intramyocar-dial injection of a cell suspension in a culture medium or in platelet rich plasma (PRP). When injected into the myocardium PRP forms fibrin clots which serves as a matrix for the transplanted cells. The cells were modified by the luciferase enzyme gene by transduction with lentiviruses (CDC-Luc). The activity of lucif-erase was determined in protein extracts of the myocardium at different time points after the transplantation. It was shown that in the first hour after injections, CDC-Luc is quantitatively detected in the peri-infarction zone irrespective of the use of platelet gel or medium, and their amount does not decrease within 48 hours. During this period, we found a positive effect of the fibrin matrix on the cells — the luminescence of CDC-Luc protein extracts in the platelet gel composition was significantly higher. We suggested that the platelet gel promotes a more favorable microenvironment for CDC-Luc and facilitates the adaptation of cells after transplantation, what reflected in the recovery of the level of luciferase production in cells. Further, we found negative dynamics: CDC-Luc injected in the culture medium is retained in the myocardium for 5 days and on the seventh day their presence is not determined, CDC-Luc in the fibrin matrix is retained in the myocardium for 10 days after transplantation. Thus, despite the successful transplantation of CDC, the integration of cells into the myocardium does not occur. Nevertheless, the use of platelet gel prolongates the time of CDC persistence in the tissue and enhances of their paracrine effect.

The use of fibrin matrix can be useful for long-lived cells, such as cardiomyocytes, in particular, to improve the efficiency of transplantation of the tissue engineering biological pacemaker. A luciferase reportering system can be effective for in vitro and in vivo monitoring of cell fate, both in biotechnological stages of cultivation and assembly of the tissue engineering biopee maker, and after myocardial transplantation. In the future, the developed methodological approach will be used to study of tissue-engineering biopacemakers in experimental animals.

Keywords: intramyocardial transplantation, Cardio-sphere-Derived Cells, platelet rich plasma (PRP), platelet gel, luciferase assay.

Введение

Разработка эффективных методов лечения сердечно-сосудистых заболеваний является актуальной задачей современной медицины. Большие перспективы в восстановлении функции утраченной ткани миокарда открывают методы клеточной терапии. В качестве источников клеток для клеточной терапии выступают мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга [1], сердечные стромальные клетки [2], c-kit-позитивные клетки сердца [3], клетки кардиосфер (Cardiosphere-Derived Cells, CDC) [4, 5], кардиоваскулярные про-гениторные клетки и кардиомиоциты, полученные из плюрипотентных стволовых клеток [6, 7].

Для замещения функции проводящей системы используют пейсмейкерные кардиомиоциты, дифференцированные из эмбриональных или индуцированных плюрипотентных клеток, или генетически модифицированные рабочие кардиомиоциты, сверх-экспрессирующие транскрипционные факторы TBX3, TBX18, Shox2 и ионные каналы (HCN4) [8]. Ранее мы изучали влияние аллогенной интрамиокардиаль-ной трансплантации клеток, выделенных методом получения кардиосфер (CDC), у крыс линии WAG с экспериментальным ишемическим повреждением на восстановление миокарда в области постинфарктного кардиосклероза [9]. Клеточная терапия привела к незначительному снижению объема рубцовой ткани и усилению ангиогенеза в очаге поражения. Недостаточная эффективность клеточной терапии могла быть связана как с источником клеток, так и с неоптимальной процедурой трансплантации клеток.

Успех клеточной терапии напрямую зависит от эффективного способа доставки и выживания клеток. Использование трансгенных клеток, несущих репор-терную систему на основе гена люциферазы, позволяет проводить в динамике количественную оценку эффективности трансплантации как биохимическими методами, так и с помощью прижизненных методов детекции биолюминесценции на грызунах [10].

Плазма крови, богатая тромбоцитами и фибриногеном (Platelet Rich Plasma, PRP) часто используется во многих областях медицины. В тромбоцитах в большом количестве содержатся факторы роста и цитокины, играющие роль в регенерации тканей. Способность PRP образовывать фибриновый гель (PRP гель), также широко применяется в трансплантологии [11]. Учитывая перечисленные свойства PRP, мы использовали ее при инъекциях CDC, чтобы локализовать клетки в миокарде и увеличить период их присутствия в нем, что должно способствовать лучшему выживанию клеток после трансплантации.

Цель данной работы — проведение оценки перси-стенции клеток кардиосфер с помощью люцифераз-ной репортерной системы при интрамиокардиальном введении в периинфарктную область и подбор оптимальных условий трансплантации с применением фибринового геля.

Материал и методы

Получение и культивирование клеток кардиосфер из миокарда крысы. Эксперименты проводили на лабораторных животных в соответствии с «Правилами работ с использованием экспериментальных живот-

ных» (приказ Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 № 755 и приложение к приказу МЗ СССР № 565 от 04.10.1977) и принципами Хельсинкской декларации, разработанной Всемирной медицинской ассоциацией (2000). Животные содержались на стандартной диете и имели свободный доступ к воде.

Клетки кардиосфер получали от 20-дневных крыс линии WAG по стандартному протоколу с модификациями. Миокард предсердий и желудочков сердца измельчали механически и проводили ферментативный гидролиз в растворе 0,1% коллагеназы NB4 (Serva, Германия). Полученные клетки и фрагменты ткани высаживали на пластик, обработанный желатином, в ростовой среде СЕМ: IMDM (Gibco, Германия), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, HyClone, США), 100 ед/мл пенициллина (Gibco, Германия), 100 ед/мл стрептомицина (Gibco, Германия), 2 ммоль/л L-глютамина (Invitrogen, Германия). Для получения кардиосфер клетки первичной культуры снимали с пластика, обработанного желатином реактивом TrypLE (Gibco, Германия), высаживали на пластик, обработанный поли-Д-лизином (BD, Германия) с плотностью 30х103 кл/ см2 и культивировали в среде CGM (35% среды IMDM/65% среды DMEM/F-12 фирмы Gibco, Германия), с 2% B27 (Gibco, Германия), 10 нг/мл EGF (RnD Systems, США), 10 нг/мл bFGF (PeproTech, Германия), 100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина, 2 ммоль/л L-глютамина. Через 3 сут. собирали кардиосферы из суспензии, переносили в новые культуральные флаконы со средой СЕМ, где они распластывались, и культивировали в течение 3-5 пассажей [12-14].

Модификация кардиальных клеток кардиосфер крысы экзогенной экспрессией люциферазы (CDC-Luc). С помощью лентивирусной трансдукции pLenti PGK V5-Luc Neo (Addgen, #21471, США) и селекции на устойчивость к генетицину (G418, 400мг/мл) (Sigma, США) были получены клетки, экспрессиру-ющие люциферазу (CDC-Luc). Лентивирусы получали путем котрансфекции в клетки линии 293FT указанной плазмиды с плазмидами pxPAX2 (Addgene, #12260, США) и pMD2.G (Addgene, #12259, США), которые кодируют белки, необходимые для упаковки вирусных частиц. Трансфекцию проводили кальций-фосфатным методом [15]. Культуральные среды с вирусными частицами, собранные через 48, 72 и 96 ч. после трансфекции, очищали от примеси клеток с помощью фильтра с диаметром пор 0,45 мкм (Millipore, США) и концентрировали на ультрацентрифуге Optima XE-90 (Beckman Coulter, Германия) в течение 90 мин. при 70000 g. Осадок вирусных частиц растворяли в 200 мкл среды DMEM/F12 и хранили в аликвотах при -70°С [16]. Для трансдукции лентивирусами использовали CDC 4 пассажа.

Получение плазмы крови, богатой тромбоцитами и фибриногеном (PRP). Цельную кровь крыс центрифугировали при 400 g в течение 10 мин. в присутствии 0,2% цитрата натрия и отбирали плазму, содержащую фибриноген и тромбоциты. Полученную плазму (PRP) делили на аликвоты и замораживали при -70°С. Образование PRP геля активировалось добавлением ионов Са2+ в составе среды DMEM (Gibco, Германия) в течение 2-4 мин. Подобранное время позволяет проводить инъекции суспензии клеток в PRP так, чтобы фибриновый гель с клетками формировался непосредственно в миокарде

оригинальные исследования

71

и служил матриксом для трансплантированных клеток [17, 18].

Определение активности люциферазы в белковых лизатах клеток. Активность люциферазы определяли в белковых лизатах клеток: CDC-Luc, культивировавшихся in vitro; CDC-Luc, культивировавшихся in vitro и заключенных в фибриновый гель; CDC-Luc, инъецированных в миокард ex vivo в среде DMEM или DMEM/PRP в соотношении 1:1. Для определения значения люминесценции белковых лизатов строили калибровочную кривую в интервале концентрации CDC-Luc 1,0х103-3,0-104 кл./мл. Для построения графика зависимости люминесценции лизата CDC-Luc от количества клеток в образце применяли метод регрессионного анализа.

Получение клеточного лизата и детекцию активности люциферазы для клеток in vitro проводили согласно рекомендациям производителя набора Luciferase Assay Reporter System (Promega, США). Для получения белкового лизата миокарда использовали модификацию протокола. Ткань сердца измельчали в пудру в небольшом количестве жидкого азота, растворяли в равном объеме двукратного ли-зирующего буфера (25 мМ Трис рН 7,8; 2 мМ ЭДТА; 2 мМ ДТТ; 10% глицерол; 1% Тритон Х-100) с добавлением ингибиторов протеаз Complete Mini EDTA-Free (Roche, Германия) и инкубировали в течение 15 мин. Полученный лизат однократно замораживали-размораживали в жидком азоте, центрифугировали 5 мин. при 10 000 g и собирали супернатант. К осадку добавляли 0,5 мл однократного лизирую-щего буфера, процедуру лизиса клеток повторяли. Второй супернатант смешивали с первым и хранили при температуре -70°С до определения активности люциферазы [17, 19, 20]. Люминесценцию регистрировали на приборе Wallac 1420 Multilabel Counter Victor-3 (Perkin Elmer).

Трансплантация CDC-Luc в миокард крыс линии WAG. Крыс наркотизировали смесью золетила-100 (30 мг/кг; Virbac Sante Animale, Франция) и Роме-тара (5 мг/кг; Bioveta, Чехия), интраперитонеально, за 15 мин. до наркоза вводили 0,1 мг/кг атропина сульфата подкожно. Крыс интубировали, проводили искусственную вентиляцию легких 100% кислородом при помощи аппарата Rodent Ventilator № 683 (Harvard Apparatus, США). Доступ к сердцу осуществляли латерально слева через III межребе-рье. Инфаркт миокарда моделировали лигировани-ем передней нисходящей ветви левой коронарной артерии в области между ушком левого предсердия и пульмональным конусом полипропиленовой нитью размером 6/0. Наступление инфаркта диагностировали по показателям ЭКГ (элевация сегмента ST) и визуально по появлению бледности миокарда ниже места окклюзии.

Суспензию клеток CDC-Luc в количестве 106 в 100 мкл среды DMEM или в 100 мкл DMEM/PRP в соотношении 1:1 вводили инсулиновым шприцем Microfine со встроенной иглой 30G (BD, Германия), контрольную аликвоту, содержащую 105 клеток, замораживали и хранили при -70°С. Для каждого опыта рассчитывали значение люминесценции одной клетки в контроле и по значению люминесценции опытного образца определяли абсолютное количество клеток, которое нормировалось на количество введенных клеток.

Для детекции клеток CDC-Luc в миокарде использовали реактив MitoTracker Deep Red FM (Invitrogen, Германия) согласно рекомендациям производителя. После эвтаназии выделяли зону миокарда с введенными клетками на приборе Kodak In-Vivo Imaging System по свечению MitoTracker Deep Red FM. Образцы ткани быстро замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -70°С до момента проведения последующего анализа.

Динамику выживания CDC-Luc в ишемизирован-ном миокарде оценивали по интенсивности люминесценции в белковых экстрактах миокарда в нескольких временных точках (от 0 до 14 сут. после трансплантации, табл.). «Нулевая точка» (0) — инъекции CDC-Luc ex vivo в среде DMEM или DMEM/PRP).

Формирование исследуемых групп животных. Эксперимент выполняли на 5-6-мес. крысах-самцах линии WAG массой 250—300 г (n = 80), которым трансплантировали клетки CDC-Luc в культуральной среде или в PRP. Животные были разделены на 16 групп в зависимости от состава суспензии трансплантируемых клеток, наличия/отсутствия острого инфаркта миокарда (ОИМ) и длительности срока наблюдения (табл.).

Статистический анализ. Статистическую обработку полученных данных проводили в программе «Statistica 6.0» и программном пакете R. Для определения достоверных различий между группами применяли критерий Уилкоксона с поправкой Бон-феррони. Различия между группами считали достоверными при p<0,05. Данные представляли в виде среднее значение ± стандартное отклонение.

Результаты

Оценка люминесценции в белковых экстрактах CDC-Luc. Определение значений люминесценции в белковых экстрактах всех вариантов CDC-Luc (CDC-Luc, культивировавшихся in vitro; CDC-Luc, культивировавшихся in vitro и заключенных в фи-бриновый гель; CDC-Luc, инъецированных в миокард ex vivo в среде DMEM или DMEM/PRP) методом регрессионного анализа выявило линейную зависимость между количеством CDC-Luc и регистрируемым свечением (рис. 1).

таблица. Распределение животных по исследуемым группам

Нулевая точка 60 мин. 48 ч. 72 ч. 5 сут. 8 сут. 10 сут. 14 сут.

PRP + - + + - + - + - + - + +

ОИМ - - + - + - + + + + + +

Количество Б Б Б Б Б Б в в в в З З З З З З

животных

Номер группы 1 2 З 4 Б б l в g 10 11 12 1З 14 1Б 16

5х104

4х104

3х104

2х104

1х104

R2 f

R2 f

• у/

0 о R2 f

•__ —1

0 •

0.5х104

1х104

1.5х104

2х104

5.5х104

3х104

Количество клеток в 10 мкл белкового экстрата

Рис. 1.

Зависимость люминесценции лизата CDC-Luc от количества клеток в образце: в среде DMEM

0

Однако следует отметить, что значение люминесценции для одинакового количества клеток в разных белковых экстрактах различалось и, очевидно, было связано с потерями при лизисе клеток. Значение люминесценции в лизатах миокарда с введенными ex vivo CDC-Luc, не зависело от наличия фибрино-вого геля и составило примерно 43,50±4,45% от люминесценции клеток in vitro.

Влияние перфузии миокарда на задержку клеток CDC-Luc в миокарде после их трансплантации в DMEM/PRP или в среде DMEM. В эксперименте определяли значение люминесценции белкового экстракта миокарда крыс через 60 мин. после трансплантации CDC-Luc в периинфарктную зону после моделирования ОИМ (10 крыс) и после ложной операции (10 крыс). Было обнаружено, что в «нулевой точке» при инъекциях клеток в миокард ex vivo независимо от наличия фибринового геля, интенсивность люминесценции соответствует в среднем люминесценции 43,50±4,45% введенных клеток.

В неишемизированном миокарде у ложно оперированных крыс через 60 мин. после трансплантации клеток в культуральной среде обнаружили достоверно меньшее количество CDC-Luc (28,48±4,42%) по сравнению с CDC-Luc, введенных в DMEM/PRP (42,52±4,38%). Вероятно, в перфузируемом миокарде происходит вымывание клеток, трансплантированных в DMEM, тогда как клетки, введенные в фибриновом геле, остаются в месте трансплантации. В ишемизирован-ном миокарде через 60 мин. после ОИМ и трансплантации клеток в периинфарктную зону разницы между группами обнаружено не было: выявлялось 42,9±4,63% CDC-Luc, введенных в DMEM/PRP, и 38,31±4,16% CDC-Luc, введенных в культуральной среде (рис. 2). Снижение объемной перфузии зоны введения клеток после окклюзии коронарной артерии приводило к уменьшению количества клеток, вымываемых в системный кровоток.

Таким образом, при трансплантации клеток в периинфарктную зону после ишемического поражения миокарда через 60 мин. в обеих группах была обнаружена максимальная степень задержки CDC-Luc в ткани сердца, а значит трансплантация CDC-Luc в периинфарктную зону миокарда происходила успешно, все клетки задерживались в месте инъекций.

Динамика выживания CDC-Luc в ишемизирован-ном миокарде. Через 48 ч. после трансплантации в группе, где использовали РПР, было зарегистрировано достоверное увеличение значения люминесценции белковых экстрактов почти в 1,5 раза: от 42,9±4,63% (1 ч.) до 72,07±6,21% (48 ч.) от расчетного значения (рис. 3).

%

50

40

30

20

10

Ex vivo

60 мин. после ложной операции

60 мин. после окклюзии ПНВ

CDC-Luc + DMEM

CDC-Luc + DMEM/PRP

Рис. 2. Доля CDC-Luc (от числа введенных), обнаруженных в миокарде ex vivo и через 60 мин. после трансплантации при ОИМ и ложной операции

*

3 80

3 70

о 60

50

40

3 30

20

10

0

на

60°

40h

72h

120h

8d

10d

Рис. 3.

Доля СйС-1_ис (от числа введенных), обнаруженных в миокарде через разные промежутки времени после ОИМ

Время

Далее в обеих группах происходило снижение значений люминесценции: на 3 сут. оно равнялось 60,48±5,98% и 16,34±7,57%; на 5 сут. -37,60±5,30% и 2,42±0,46% соответственно; на 8 сут. клетки, вводимые в суспензии йМЕМ, не определялись, а количество детектируемых СйС-1_ис, введенных в йМЕМ/РПР составило 7,62±3,21% от числа клеток в контрольной аликвоте; на 10 сут. оно снизилось до 1,63±0,68%. На 14 сут. люминесцентный сигнал зарегистрировать не удалось (рис. 3).

Таким образом, достоверно показано, что СйС-1_ис, трансплантируемые интрамиокардиально, сохраняют жизнеспособность в столь неблагоприятной зоне, окружающей инфаркт миокарда. Клетки, введенные в смеси йМЕМ/РПР могут быть обнаружены в течение как минимум 10 сут. после трансплантации, что особенно важно, так как этот период соответствует острой стадии инфаркта миокарда, и любые действия, направленные на минимизацию последствий ишемии, имеют первостепенное значение для дальнейшего прогноза заболевания.

обсуждение

Нами была создана и охарактеризована система мониторинга трансплантированных клеток. С помощью этой системы проведена оценка количества СйС-1_ис в периинфарктной зоне на основании определения показателей люминесценции белкового экстракта миокарда через разные временные промежутки после трансплантации клеток.

Фибриновый гель является аутогенным биоматериалом, характеризующимся низкой стоимостью, простотой получения и высоким содержанием разнообразных ростовых факторов. В настоящем исследовании было показано положительное влияние РПР геля на задержку и персистенцию клеток в миокарде. Была обнаружена пролонгация с 5 до 10 сут. периода присутствия трансплантированных клеток в ишимизированном миокарде в экспериментах, где был применен фибриновый гель по сравнению с экспериментами, где клетки инъецировали в йМЕМ. Также было обнаружено, что в первые двое сут. после трансплантации с использованием РПР

геля наблюдается достоверное повышение значения люминесценции клеток. Можно предположить, что усиление продукции люциферазы связано с адаптацией клеток после процедуры трансплантации или увеличением их количества в результате деления. PRP гель не только обеспечивает задержку (хоу-минг) трансплантированных клеток, но и создает трансплантированным клеткам комфортное микроокружение в ишемизированном миокарде. Тем не менее, через 72 ч. после трансплантации количество CDC-Luc в миокарде начинает снижаться и на 14 сут. ни в одной из групп клетки не обнаруживаются. Вероятно, элиминация клеток после трансплантации связана с их природой. Как ранее было показано нами и другими авторами, кардиальные клетки, полученные из кардиосфер (CDC), позитивны на ме-зенхимальные маркеры CD105, CD73, CD29, CD44, CD13, CD166 и негативны на маркеры CD45, CD14 и HLA-DR. В популяции CDC маркер CD90 выявляется у 60—80% клеток. Также около 80% клеток имеют маркер перицитов NG2 [2, 21—23]. На ранних пассажах в популяции CDC можно обнаружить до 3—7% клеток, позитивных на CD31 и CD34. Культивирование в средах для эндотелиальных клеток способствует сохранению и пролиферации CD31 и CD34 позитивных клеток в популяции, при использовании стандартных сред для культивирования CDC эндотелиальные клетки из популяции элиминируются [24, 25]. Многими авторами отмечается способность CDC формировать капилляроподобные структуры в тесте на матригеле [14, 21, 26, 27]. Количество CD117 (c-kit) позитивных CDC варьирует в разных исследованиях от 16% [28] до 0% [21, 22]. Однако, сколько бы c-kit позитивных CDC на самом деле не присутствовало в кардиосферах, они в любом случае не будут вносить вклад в регенерацию кардиомиоцитов, так как современные данные свидетельствуют, что c-kit позитивные клетки сердца не являются предшественниками кардиомио-цитов [29]. При изучении судьбы c-kit позитивных клеток сердца в процессе эмбриогенеза и у взрослых особей, было показано, что потомками этих клеток являются только эндотелиоциты и фибро-бласты [29—31]. Артефакты, которые принимались за доказательства кардиальной дифференцировки,

*

*

возникали из-за способности мультипотентных ме-зенхимальных стромальных клеток (в том числе и CDC) сливаться с кардиомиоцитами и формировать гибридные клетки, содержащие сократительные ми-офибриллы [32].

На основании иммунофенотипа CDC некоторые авторы выделяют их в класс региональных мезенхи-мальных стромальных клеток (cardiac stromal cells, CStC) [2]. Кардиальные стромальные клетки плохо дифференцируются в адипоциты и остеоциты (по сравнению с МСК костного мозга), зато в них более эффективно экспрессируются кардиоваскулярные гены и микроРНК (например, miR-126 и miR-146a). Показано, что CStC секретируют матриксные проте-иназы, в том числе MMP-1, которые способствуют ремоделированию фиброзных образований и ангио-генезу, продуцируют IL-6 и LIF, чем обеспечивают тканеспецифическую пластичность и терапевтический потенциал [2]. Также известно, что кардиаль-ные стромальные клетки продуцируют ростовые факторы, такие как VEGF165, SDF-1a и HGF, которые способствуют пролиферации и выживаемости клеток [25].

Поскольку доказано, что c-kit позитивные клетки в составе CDC не способны дифференцироваться в кардиомиоциты, при трансплантации клеток в миокард основной терапевтический эффект происходит за счет паракринного воздействия CDC, которые имеют т.н. «мезенхимальный фенотип». Полученные

нами данные о том, что CDC не обладают способностью к длительной персистенции в миокарде, согласуются с наблюдениями других авторов, исследовавших c-kit кардиальнные клетки, CDC [10, 22, 33, 34], а также стромальные кардиальные клетки [2].

Таким образом, нами был разработан методический подход для интрамиокардиальной трансплантации биоматериалов на примере кардиальных мезенхимальных клеток с применением PRP геля, который может быть в дальнейшем полезен для повышения эффективности трансплантации тканеин-женерного биологического водителя ритма. Очень важно использовать матрикс природного или искусственного происхождения для трансплантации в пер-фузируемый миокард кардиомиоцитов, способных к спонтанному формированию импульса и точной локализации биопейсмейкера. Фибриновый гель, как было показано в данной работе, является идеальным кандидатом на эту роль, а репортерная система, экс-прессирующая люциферазу, может быть эффективна для in vitro и in vivo мониторинга судьбы клеток как на биотехнологических этапах культивирования и сборки тканеинженерного биопейсмейкера, так и после трансплантации в сердце.

Благодарности

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ № 16-15-10322.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Gyongyosi M., Wojakowski W., Lemarchand P. et al. Meta-Analysis of Cell-based CaRdiac stUdiEs (ACCRUE) in Patients With Acute Myocardial Infarction Based on Individual Patient Data. Circ. Res. 2015; 116(8): 1346-60.

2. Rossini A., Frati C., Lagrasta C. et al. Human cardiac and bone marrow stromal cells exhibit distinctive properties related to their origin. Cardiovasc. Res. 2011; 89(3): 650-60.

3. Bolli R., Chugh A.R., D'Amario D. et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet 2011; 378(9806): 1847-57.

4. Makkar R.R., Smith R.R., Cheng K. et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet 2012; 379(9819): 895-904.

5. Malliaras K., Makkar R.R., Smith R.R. et al. Intracoronary Cardiosphere-Derived Cells After Myocardial Infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 2014; 63(2): 110-22.

6. Birket M.J., Ribeiro M.C., Verkerk A.O. et al. Expansion and patterning of cardiovascular progenitors derived from human pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 2015; 33(9): 970-9.

7. Chong J.H., Yang X., Don C.W. et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature 2014; 510(7504): 273-7.

8. Husse B., Franz W.M. Generation of cardiac pacemaker cells by programming and differentiation. Biochim. Biophys. Acta — Mol. Cell Res. 2016; 1863(7): 1948-52.

9. Chepeleva E.V., Pavlova S.V., Malakhova A.A. et al. Therapy of Chronic Cardiosclerosis in WAG Rats Using Cultures of Cardiovascular Cells Enriched with Cardiac Stem Cells. Bull. Exp. Biol. Med. 2015; 160(1): 165-73.

10. Terrovitis J.V., Smith R.R., Marban E. Assessment and Optimization of Cell Engraftment After Transplantation Into the Heart. Circ. Res. 2010; 106(3): 479-94.

11. Cheng K., Malliaras K., Shen D. et al. Intramyocardial injection of platelet gel promotes endogenous repair and augments cardiac function in rats with myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 2012; 59(3): 256-64.

12. Smith A.J., Lewis F.C., Aquila I. et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nat. Protoc. 2014; 9(7): 1662-81.

13. Messina E., De Angelis L., Frati G. et al. Isolation and Expansion of Adult Cardiac Stem Cells From Human and Murine Heart. Circ. Res. 2004; 95(9): 911-21.

14. Pavlova S.V., Perovskii P.P., Chepeleva E.V. et al. Characteristics of cardiac cell cultures derived from human myocardial explants. Bull. Exp. Biol. Med. 2013; 156(1): 127-35.

15. Kingston R.E., Chen C.A., Rose J.K. Calcium Phosphate Transfection. In: Hoboken N.J., editor. Current Protocols in Molecular Biology. USA: John Wiley & Sons Inc.; 2003. р. 9.1.1-11.

16. Григорьева Е.В., Шевченко А.И., Медведев С.П. и соавт. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки гибридов полёвок Microtus levis х Microtus arvalis : условия, необходимые для получения и поддержания. Acta Naturae 2015; 4(27): 64-78.

17. Милевская Е.А., Немудрый А.А., Чепелева Е.В. и соавт. Оптимизация протокола интрамиокардиальной трансплантации с использованием люминесценции кардиальных мезенхимальных клеток, маркированных экспрессией люциферазы. Патология кровообращения и кардиохирургия 2015; 19(4-2): 69-76.

18. Cheng K., Shen D., Smith J. et al. Transplantation of platelet gel spiked with cardiosphere-derived cells boosts structural and functional benefits relative to gel transplantation alone in rats with myocardial infarction. Biomaterials 2012; 33(10): 2872-9.

19. Chang C., Chan A., Lin X. et al. Cellular bioenergetics is an important determinant of the molecular imaging signal derived from luciferase and the sodium-iodide symporter. Circ. Res. 2013; 112(3): 441-50.

20. Manthorpe M., Cornefert-Jensen F., Hartikka J. et al. Gene Therapy by Intramuscular Injection of Plasmid DNA: Studies on Firefly Luciferase Gene Expression in Mice. Hum. Gene Ther. 1993; 4(4): 419-31.

21. Koninckx R., Daniäls A., Windmolders S. et al. Mesenchymal stem cells or cardiac progenitors for cardiac repair? A comparative study. Cell. Mol. Life Sci. 2011; 68(12): 2141-56.

22. Kasai-Brunswick T.H., Costa A.R., Barbosa R.A. et al. Cardiosphere-derived cells do not improve cardiac function in rats with cardiac failure. Stem Cell Res. Ther. 2017; 8(1): 36.

23. Павлова С.В., Сергеевичев Д.С., Чепелева Е.В. и др. Сравнение мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и региональных стволовых клеток сердца и фибробластов кожи человека. Патология кровообращения и кардиохирургия 2015; 19(4-2): 12-9.

24. Захарова И.С., Живень М.К., Саая Ш.Б. и соавт. Разработка клеточных технологий для создания клеточно-наполненных сосудистых трансплантатов. Патология кровообращения и кардиохирургия 2015; 19(4-2): 43-54.

25. Zakharova I.S., Zhiven' M.K., Saaya S.B. et al. Endothelial and smooth muscle cells derived from human cardiac explants demonstrate angiogenic potential and suitable for design of cell-containing vascular grafts. J. Transl. Med. 2017; 15(1): 54.

26. Andersen D.C., Andersen P., Schneider M. et al. Murine "Cardiospheres" Are Not a Source of Stem Cells with Cardiomyogenic Potential. Stem Cells 2009; 27(7): 1571-81.

27. Павлова С.В., Розанова И.А., Чепелева Е.В. и др. Анги-огенный потенциал кардиальных стволовых и мезенхимальных стромальных клеток костного мозга крысы. Патология кровообращения и кардиохирургия 2015; 19(4-2): 77-84.

28. Li T.S., Cheng K., Lee S.T. et al. Cardiospheres Recapitulate a Niche-Like Microenvironment Rich in Stemness and Cell-Matrix Interactions, Rationalizing Their Enhanced Functional Potency for Myocardial Repair. Stem Cells 2010; 28(11): 2088-98.

29. Keith M.C., Bolli R. "String Theory" of c-kit pos Cardiac Cells. Circ. Res. 2015; 116(7): 1216-30.

30. van Berlo J.H., Kanisicak O., Maillet M. et al. C-Kit+ Cells Minimally Contribute Cardiomyocytes To the Heart. Nature 2014; 509(7500): 337-41.

31. Sultana N., Zhang L., Yan J. et al. Resident c-kit(+) cells in the heart are not cardiac stem cells. Nat. Commun. 2015; 6: 8701.

32. Laflamme M.A., Murry C.E. Regenerating the heart. Nat. Biotechnol. 2005; 23(7): 845-56.

33. Hong K.U., Guo Y., Li Q.H. et al. c-kit+ Cardiac Stem Cells Alleviate Post-Myocardial Infarction Left Ventricular Dysfunction Despite Poor Engraftment and Negligible Retention in the Recipient Heart. PLoS One 2014; 9(5): e96725.

34. Johnston P.V., Sasano T., Mills K. et al. Engraftment, differentiation, and functional benefits of autologous cardiosphere-derived cells in porcine ischemic cardiomyopathy. Circulation 2009; 120(12): 1075-83.

Поступила: 13.09.2017