МНОГОКАНАЛЬНЫЙ КОНФОКАЛЬНЫЙ СПЕКТРОАНАЛИЗАТОР ИЗОБРАЖЕНИЙ
MULTICHANNEL CONFOCAL IMAGE SPECTRUM ANALYZER

Изобретение относится к устройствам регистрации спектров поверхностей методом фотолюминесценции или рассеяния при лазерном возбуждении. Данные сканирования поверхности могут быть представлены в виде ряда изображений в разных диапазонах спектра, интервалы по длинам волн которых задаются системой управления и обработки данных.
Изобретение может быть использовано для физических исследований и в медицинских целях для спектральной диагностики поверхностных областей различных биологических сред, включая флуоресцентный анализ трехмерной динамики переменных структур среды.
В конфокальной микроскопии при исследовании динамических объектов трехмерное изображение создается реконструкцией последовательно сканируемых точек оптической системой с точечной конфокальной диафрагмой. Скорость реконструкции - решающий фактор, определяющий возможность регистрации быстро меняющихся процессов. Одно из направления решения этой задачи - создание многоканального сканирующего устройства и распараллеливание процесса обработки данных.
Известен «Многоканальный конфокальный микроскоп» (Патент RU 2574863 от 10.12.2016), содержащий источник излучения, фокусирующую оптику, дисперсионный акустооптический элемент, направляющий лучи на матрицу конфокальных диафрагм и, через светоделитель, модуль сканирования, на объект. Отраженные от объекта лучи возвращаются в обратном направлении, через светоделитель попадают в регистрирующий блок на матрицу фотодетекторов через дополнительную матрицу конфокальных диафрагм, модуль сканирования и фокусирующую оптику.
Недостатки устройства, прежде всего, в сложности - наличии нескольких механических систем, требующих взаимной синхронизации с оптической точностью: двухкоординатных дефлекторов, установленных на ортогональных осях роторов системы сканирования. При этом движение пластин дефлекторов синхронизировано с движением пластин аналогичного модуля сканирования регистрирующего блока. Все это привело к ограничению потенциально достижимой разрешающей способности микроскопа. По данным авторов, для количества лазерных лучей 25×25 расстояние между соседними пятнами лучей в плоскости объекта - 5 мкм. Следует отметить, что для современных конфокальных микроскопов достижимое разрешение находится в субмикронной области.
Распараллеливание на аппаратном уровне, применяя матрицу точечных конфокальных диафрагм, в данном случае не является эффективным. В теории пространственных методов обработки оптической информации рассмотрен иной метод построения многоканального устройства для обработки сигналов [Л.М. Сороко Основы голографии и когерентной оптики, «Наука», М., 1971]. В предлагаемом изобретении данный метод применен в устройстве для построения многоканальной системы обработки двухмерных оптических сигналов.
Наиболее близким по совокупности признаков является «Конфокальный спектроанализатор изображений» (Патент RU 2579640 от 10.04.2016, Бюл. №10), содержащий лазерный источник излучения, устройство пространственного сканирования, объектив, линейную конфокальную диафрагму, содержащий также линзовую оптику, фильтры селекции лазерного освещения, дифракционную решетку и монохромную камеру, регистрирующую спектральное разложение на двухмерной матрице, содержащий также цифровую систему, управляющую процессом формирования данных видеокамеры и осуществляющую синтез изображений объекта в выбранных спектральных интервалах на основе видеоряда спектров линейных участков объекта.
Достижимый технический эффект устройства по патенту RU 2579640 основан на компьютерной реконструкции изображения, сформированного из видеоряда покадровой съемки линейных освещенных областей в процессе сканирования поверхности объекта через объектив, в сопряженной плоскости которого расположена конфокальная диафрагма в виде щели. Щель является также элементом спектроанализатора при разложении изображения линейной области в спектр. Распределение по интенсивности этой области, регистрируемое монохромной двухмерной матрицей, представлено в координатах пикселей строки. Фазовая дифракционная решетка формирует разложение множества точек линии в спектр по длинам волн в ортогональном измерении кадра. Сканирование спектроанализатора вдоль плоскости объекта, ограниченной предметным стеклом, осуществляется ортогонально линии лазерного освещения и синхронизировано с видеозаписью. Изображения всей поверхности объекта в выбранных диапазонах спектра реконструируются из соответствующих спектральных интервалов видеоряда кадров зарегистрированных спектров.
Недостатки устройства в следующем. Линейное лазерное освещение формируется оптической системой, не связанной с объективом, регистрирующим флуоресцентный спектр. Это требует точной взаимной юстировки осветителя и линейной конфокальной диафрагмы, что усложняет устройство и работу с ним. Сканирование осуществляется смещением объекта. Для систем высокого разрешения это является ограничивающим точность фактором.
Заявляемое изобретение предназначено, прежде всего, для получения флуоресцентных изображений при анализе биологических структур и для создания экспертных систем постановки диагноза в медицинских приложениях.
Применяя заявленное изобретение, можно существенно увеличить информативность регистрируемого изображения, упростить конструкцию, увеличить скорость достижения конечного результата.
Технический результат заключается в существенном увеличении информативности регистрируемого изображения, упрощении конструкции, увеличении скорости сканирования объекта за счет распараллеливания обработки информации по многим точкам (каналам), формирующим линию. Множество линий объединяются в спектральное изображение.
Технический результат в заявленном изобретении достигается тем, что в многоканальном конфокальном спектроанализаторе изображений содержащем лазерный источник излучения, устройство пространственного сканирования, объектив, линейную конфокальную диафрагму, содержащем также линзовую оптику, фильтры селекции лазерного освещения, дифракционную решетку и монохромную камеру, регистрирующую спектральное разложение на двухмерной матрице, содержащем также цифровую систему, управляющую процессом формирования данных видеокамеры и осуществляющую синтез изображений объекта в выбранных спектральных интервалах на основе видеоряда спектров линейных участков объекта, согласно изобретению, содержится диодный лазер с протяженной излучающей областью, первая цилиндрическая линза, образующая которой ортогональна плоскости быстрой оси лазера, формирующая коллимированный пучок излучения, рассеиваемый дифракционной решеткой на пропускание, содержится также вторая цилиндрическая линза, локализующая интерференционные порядки спектрального разложения в фокальной плоскости этой линзы, в которой расположена щелевая диафрагма, пропускающая нулевой порядок дифракции, и расположена предметная плоскость объектива, формирующего в сопряженной плоскости, совпадающей с объектом, сфокусированное лазерное излучение в виде линии в заданном масштабе, а флуоресцентное или рассеянное объектом излучение возвращается через объектив в пределах его числовой апертуры, проходит через щель конфокальной диафрагмы, преобразуется второй линзой в коллимированный пучок, разлагается в спектр дифракционной решеткой, и первый порядок дифракции, под углом блеска дифракционной решетки, камерным объективом локализуется на двухмерной матрице видеокамеры, а результаты пошагового сканирования объективом освещения объекта ортогонально лазерной линии регистрируются видеокамерой в виде видеоряда спектральных изображений каждой линии в координатах: линейное положение точки линии изображения - развертка спектра точек по длине волны, из которых синтезируется изображение поверхности объекта в каждом из заданных спектральных интервалов; в плоскости медленной оси диодного лазера содержится третья цилиндрическая линза, образующая которой ортогональна плоскости медленной оси, расположенная таким образом, чтобы излучающая площадка лазера и щель конфокальной диафрагмы находились в сопряженных плоскостях этой линзы, обеспечивая необходимый масштаб изображений в координатах длины линии.
Технический эффект, достижимый при использовании данного изобретения, в сравнении с известным техническим решением, основан на использовании диодных лазеров повышенной мощности, имеющих протяженную излучающую площадку с отношением сторон, достигающим двух порядков. Возникают ограничения при их использовании в лазерном конфокальном сканирующем микроскопе с точечной конфокальной диафрагмой (КД) и сферической оптикой. В данном случае применение цилиндрической оптики, линейной КД и наличие протяженной излучающей области диодного лазера представляют собой оптимальное сочетание для выполнения независимых преобразований двухмерных сигналов на плоскости. Возникает возможность разделения координат по х и у. Сигнал ƒ(x) в плоскости изображений превращается с помощью цилиндрической линзы в фурье-образ F(ω) в плоскости пространственных частот в многоканальное устройство [Л.М. Сороко Основы голографии и когерентной оптики, «Наука», М., 1971, с. 503-504]:
y
у
где F(x, ω) преобразование Фурье, преобразующее цилиндрической линзой функцию ƒ(x, у) плоскости изображений по координате у в плоскость пространственных частот F(x, ω) по данной координате. Здесь параметр х служит индексом (номером) данного канала. По координате у все каналы могут быть обработаны одновременно. Изображение линии по х может быть преобразовано по другому алгоритму.
Элементом большинства известных флуоресцентных конфокальных микроскопов является светоделитель, выполняющий функцию 3-х портового Y-циркулятора, основанного на известном принципе спектрального разделения световых пучков дихроичным зеркалом или акустооптическим дефлектором. Т.е. излучение лазерного источника (порт 1) отражается от дихроичного зеркала и направляется на объект (порт 2), а излучение объекта из порта 2 с другой длинной волны проходит через дихроичное зеркало в фотоприемник (порт 3). Альтернативой спектральному разделению является пространственное разделение оптических пучков [Э.К. Алгазинов, В.А. Шульгин, И.А. Лавриненко, А.А. Сирота Анализатор спектра флуоресценции на основе оптоволоконного Y-циркулятора, Письма в ЖТФ, 2018, том 44, вып. 14, с. 50-57]. В данном изобретении предлагается функцию Y-циркулятора выполнить с использованием новой пространственной структуры - комбинации дифракционной решетки на пропускание и линейной КД. Коллимированное излучение диодного лазера с протяженной излучающей областью (порт 1) разлагается дифракционной решеткой на пропускание на дифракционные порядки и цилиндрической линзой собирается в фокальной плоскости этой линзы, совпадающей с плоскостью линейной КД. Линейная КД пропускает нулевой порядок лазерного излучения, направляемого на объект (порт 2). Остальные порядки блокируются данным пространственным фильтром. Флуоресцентное или рассеянное излучение объекта с измененным спектром из порта 2 возвращается обратно через диафрагму и разлагается дифракционной решеткой. Первый порядок разложения, под углом блеска решетки, отклоняется и фокусируется камерным объективом на видеосенсоре (порт 3). В данном случае линейная КД является излучателем и приемником излучения, блокирующим внефокусные лучи. Такая конструкция исключает процесс динамической юстировки взаимного положения сфокусированного на объекте излучения и КД в процессе сканирования. При сканировании объективом всегда выполняется взаимное их соответствие в пространстве.
Второе назначение КД - выполнение функции пространственного фильтра, блокирующего внефокусные лучи, излучаемые освещенной областью. Точечная диафрагма конфокального микроскопа, блокирующая внефокусные лучи, ничем не отличается от линейной конфокальной диафрагмы. Для первой внефокусные лучи пропускаются лишь окрестностью точки (диска Эйри) и в пределе блокируются полностью. Окрестности точки и линии, пропускающие внефокусные лучи, в пределе стремятся к нулю, то есть КД в виде точки или линия эквивалентны, так как нульмерный и одномерный объекты не имеют площади.
На Фиг. 1 изображена схема многоканального конфокального спектроанализатора изображений с диодным лазером 1', имеющим протяженную излучающую площадку. Рисунок изображен в плоскости быстрой оси лазера, в которой размер излучателя минимален.
3
Пучок излучения лазера с расходимостью, соответствующей дифракции на апертуре, цилиндрической линзой 2', расположенной на расстоянии фокуса от источника, преобразуется в коллимированное излучение в плоскости быстрой оси. Далее расположены bay-pass фильтр 3' и дифракционная решетка 4'. Разложение в плоскости быстрой оси излучения лазера по порядкам дифракции второй цилиндрической линзой 5' собирается в фокальной плоскости этой линзы. В этой плоскости расположена КД 6', щель которой ортогональна плоскости быстрой оси лазера, которая выделяет нулевой порядок дифракции. Далее это излучение объективом 7' фокусируется на объекте 8' в виде линии, длина которой вдоль медленной оси лазера формируется третьей цилиндрической линзой 9 (показана на фиг. 2). Образующая третьей линзы 9 параллельна плоскости быстрой оси, а в ее сопряженных плоскостях расположены излучающая площадка лазера 1' и плоскость КД 6'. Изображение, излучающей области диодного лазера 1', сформированное в щели КД 6', объективом масштабируется в сопряженную плоскость на объекте 8'. Сканирование этого изображения может осуществляться перемещением объектива 7'. При этом рассеянный или флуоресцентный сигнал области фокусировки 8' лазерного излучения в силу «взаимности» объектива 7', будут возвращаться, и формировать соответствующее изображение в плоскости щели КД 6'. Второй линзой 5' из излучения возвратного сигнала будет сформирован коллимированный пучок, рассеиваемый дифракционной решеткой 4'. В первом порядке интерференции, под углом блеска ϕ' решетки 4', будет сформировано разложение в угловой спектр по длинам волн, которое long-pass фильтром 10' будет преобразовано к соответствующему виду и камерным объективом 11' зафиксировано на двухмерном видеосенсоре 12'. Изображение кадра будет построено в координатах линии фокусировки освещенной области объекта и развертки спектра по длинам волн каждой из точек этой линии.
1
На Фиг. 2 изображена трехмерная схема многоканального конфокального спектроанализатора изображений. Работа конфокального спектроанализатора изображений осуществляется следующим образом. В плоскости «быстрой оси» диодного лазера 1, источник можно считать точечным (~1 мкм в направлении у). Излучение, соответственно, имеет большую угловую расходимость из-за дифракции на апертуре (угол ϕ). В этой плоскости выполняется коллимирование пучка линзой 2, фильтрация лазерного источника фильтром 3 и дисперсионное рассеяние излучения дифракционной решеткой на пропускание 4. Далее, цилиндрическая линза 5 в фокальной плоскости локализует изображение порядков дифракции. В этой плоскости расположена линейная по х КД 6, пропускающая только нулевой порядок дифракции. Линия изображения источника, выделенная щелью диафрагмы, объективом 7 преобразуется в сопряженную плоскость 8 объектива в соответствующем масштабе. Сканирование линии освещения 8 на объекте может осуществляется смещением объектива в плоскости х, у и по оси z.
2
1
2
Излучающая площадка в плоскости «медленной оси» x диодного лазера имеет линейную геометрию и меньший угол ϕ дифракционной расходимости излучения. Формирование изображения линейного источника в плоскости щелевой диафрагмы осуществляется линзой 9. Апертура линии источника а и требуемая апертура А изображения в сопряженной плоскости, совпадающей с плоскостью линейной КД задают увеличение этого оптического каскада. По формуле линзы для фокусного расстояния ƒ при А>а рассчитываются соответствующие расстояния L и L до сопряженных плоскостей линзы 9:
3
Изображение, излучающей области диодного лазера, сформированное в щели линейной КД, объективом масштабируется в сопряженную плоскость на объекте. При этом рассеянный или флуоресцентный сигнал области фокусировки лазерного излучения в пределах числовой апертуры объектива 7, будут возвращаться в обратном направлении, и формировать соответствующее изображение в плоскости щели линейной КД 6. Линзой 5 из излучения возвращаемого сигнала будет сформирован коллимированный пучок, рассеиваемый дифракционной решеткой. В первом порядке интерференции, под углом блеска решетки ϕ, будет сформировано разложение в угловой спектр по длинам волн, которое long-pass фильтром 10 будет преобразовано к соответствующему виду и камерным объективом 11 зафиксировано на двухмерном видеосенсоре 12. Изображение кадра будет построено в координатах линии фокусировки освещенной области объекта и развертки спектра по длинам волн каждой из выбранных точек этой линии.
Число независимых каналов многоканального конфокального спектроанализатора изображений будет соответствовать числу разрешаемых на видеоматрице 12 камеры точек по координате x, каждая из которых имеет спектральное разложение по координате у.