БИОРЕАКТОР ДЛЯ АДГЕЗИОННОЙ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ, УСТРОЙСТВО ДЛЯ АСЕПТИЧЕСКОГО ПОЛУЧЕНИЯ ПРОБЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОДУКТА КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ (ВАРИАНТЫ)
BIOREACTOR FOR ADHESIVE CELL CULTURE, DEVICE FOR ASEPTIC SAMPLING AND METHOD FOR OBTAINING CELL CULTURE PRODUCT (OPTIONS)

Уровень техники
Как известно, при крупномасштабном культивировании клеточных культур используют либо суспензионную клеточную культуру, либо адгезионную клеточную культуру, см. Merten, Otto-Wilhelm et al., Manufacturing Of Viral Vectors For Gene Therapy: Part I. Upstream Processing («Производство вирусных векторов для генной терапии: Часть I. Предварительная обработка»). – Pharmaceutical Bioprocessing, 2014, рр.183–203. Суспензионная клеточная культура подразумевает культивирование клеток, свободно плавающих в жидкой среде, предназначенной для выращивания клеточной культуры. В качестве альтернативы, возможно культивировать клетки, прикрепленные к микрогранулам, которые, в свою очередь, свободно плавают в среде. В описании этого изобретения термин «суспензионная» клеточная культура охватывает оба этих подхода к культивированию клеточных культур.
В качестве альтернативы возможно культивировать клетки, прикрепленные к твердому субстрату, который является настолько объемным или плотным, что не может свободно суспендироваться в культуральной среде. Такими субстратами являются, например, упорядоченные синтетические волокна. В качестве альтернативы, могут быть использованы листы из волокон, подобные бумаге, которые могут быть разрезаны на меньшие части.
Промышленно освоенная клеточная культура нередко нуждается в периодическом отборе проб клеточной культуры для анализа. Отбор проб суспензионной клеточной культуры является относительно простой операцией. Поскольку клетки (либо сами по себе, либо на микрогранулах) суспендированы в жидкой культуральной среде, достаточно взять пробу культуральной среды с суспендированными в ней клетками. Это может быть сделано с помощью пипетки через порт биореактора, предназначенный для отбора проб.
Когда же клетки культивируют прикрепленными к субстрату, не подлежащему суспендированию, то с помощью пипетки получают пробу жидкой культуральной среды, а не субстрата, к которому прикреплены клетки. Это позволяет оценивать культуральную среду по метаболитам клеточной культуры, но не дает возможности непосредственно исследовать культивируемые клетки.
Известен способ отбора проб адгезионных клеток путем добавления протеазы в культуральную среду. Он обеспечивает отделение адгезионных клетки от субстрата, позволяя клеткам свободно плавать в жидкой среде. Таким образом, для отбора проб культуральной среды и получения пробы клеток можно использовать пипетку. Тем не менее, протеаза влияет на клеточную культуру. Кроме того, высвобожденные протеазой клетки не позволяют получить некоторые важные данные, например, выяснить степень конфлюэнтности клеток, прикрепленных к твердому субстрату. Таким образом, протеаза обеспечивает эффективное высвобождение адгезионных клеток по завершении их культивирования, но применение протеазы недопустимо для отбора проб адгезионных клеток в процессе их культивирования.
Следовательно, в данной области техники существует потребность в способе отбора проб клеток, прикрепленных к несуспендируемому субстрату, в системе адгезионной клеточной культуры, который позволял бы отбирать пробы клеток без существенного воздействия на оставшиеся (после отбора пробы) клетки и без их изменения.
Автором найдено простое и технологичное решение этой проблемы. При этом оно позволяет сохранить асептическую среду даже в крупных промышленных биореакторах для адгезионных клеток. В этом документе термин «асептический» использован в значении «не содержащий нежелательных микроорганизмов».
Для этой заявки испрашивается приоритет по предварительной патентной заявке США № 62/419613, поданной 09 ноября 2016 г., содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.
Раскрытие изобретения
Устройство содержит асептический контейнер или корпус для отбора проб, такой как стерильная трубка для отбора проб, асептически присоединяемый к порту на биореакторном сосуде для клеточной культуры. Сосуд содержит культуральную среду и твердый субстрат для адгезионной клеточной культуры. В асептическом корпусе находится устройство для получения пробы субстрата для клеточной культуры с прикрепленными к нему адгезионными клетками. После отбора пробы асептический корпус герметизируют и отсоединяют от сосуда для клеточной культуры, так что сосуд после отсоединения асептического корпуса остается в асептическом состоянии. Затем проба субстрата клеточной культуры, содержащаяся в асептическом корпусе, может быть подвергнута анализу.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 изображен вариант осуществления устройства для отбора проб, а именно, пинцет, в асептических условиях помещенный в трубку для отбора проб из биореактора, и проиллюстрирован способ его использования.
На фиг. 2 изображен другой вариант осуществления устройства для отбора проб, а именно, щипцы, в асептических условиях помещенные в стерильный пакет для проб.
На фиг. 3 приведена фотография примера осуществления, в котором пинцет помещен в трубку для отбора проб, как показано на фиг. 1.
На фиг. 4 приведена фотография пинцета, погруженного в биореакторный сосуд для доступа к твердому субстрату для клеточной культуры и извлечения этого субстрата.
На фиг. 5 приведена фотография использования оператором пинцета, помещенного в трубку для отбора проб.
На фиг. 6 приведена фотография пинцета, которым извлекают из биореактора фрагмент субстрата для клеточной культуры.
Осуществление изобретения
В данном описании биореакторами называются не только биологические реакторы как таковые, но также ферментеры и контейнеры для культивирования тканей. Биореакторы обеспечивают подходящие условия роста для различных культивируемых микроорганизмов, называемых здесь клетками. В большинстве случаев желательно, чтобы в биореакторе обеспечивался рост только определенных видов клеток, а рост каких-либо других клеток, например, бактерий, крайне нежелателен. Поэтому для защиты биореакторов и всех используемых растворов от загрязнения клетками из окружающей среды применяются довольно сложные меры.
Биореакторный сосуд для культивирования адгезионной клеточной культуры содержит жидкую культуральную среду, в которой расположен твердый субстрат, образующий поверхность, к которой культивируемые клетки могут прикрепляться и расти. Таким образом, создается закрытая асептическая среда для адгезионной клеточной культуры.
Известно множество различных подходящих твердых субстратов, способных обеспечивать твердую подложку, к которой могут прикрепляться культивируемые клетки. Обычно субстрат представляет собой волокно, поскольку волокна являются недорогими однородными материалами и обеспечивают высокое соотношение площади поверхности и объема. В данной области техники волокно может представлять собой полимерное волокно, например полиэфирное или полипропиленовое волокно. Можно использовать и другие волокна, например, силикатные или лактатные электроспряденные нановолокна.
Субстрат можно использовать в виде упорядоченных или свободных волокон. Субстрат также может иметь форму листа. Листовой субстрат может быть монолитным. Листы могут быть изготовлены из волокон подобно тому, как лист бумаги изготовлен из целлюлозных волокон. В данной области техники известно множество субстратов и носителей, создающих «неподвижный слой» для культивирования адгезионной клеточной культуры. В настоящем изобретении все они являются в значительной степени взаимозаменяемыми эквивалентами.
Отбор проб из биореакторов для подсчета количества клеток и их анализа имеет первостепенное значение в биотехнологии. Как известно, асептический отбор клеток (или носителей, на которых растут клетки) из биореакторов с неподвижным слоем затруднен или невозможен, см. приведенную выше ссылку: Merten et al. (2014). Поэтому за ростом клеток следят и оценивают его, используя пробу биомассы либо измеряя скорость потребления питательных веществ или скорость образования продуктов метаболизма, растворенных в жидкой культуральной среде. Тем не менее, распределение клеток по субстрату-носителю при этом остается неизвестным. Таким образом, определять конфлюэнтность клеток и анализировать сами адгезионные клетки не представляется возможным.
Это создает серьезную проблему для некоторых видов клеточных культур. Например, при трансфицировании плазмид основным фактором, определяющим эффективность и результативность трансфекции, является локальная плотность или конфлюэнтность клеток. Вместо фактических наблюдений конфлюэнтности в данной области техники используют расчетное среднее число клеток. Тем не менее, среднее число клеток может не отражать фактическую картину роста клеток. Клетки вместо равномерного распределения могут расти плотными скоплениями в одной области, но полностью отсутствовать в другой области.
Таким образом, в данной области техники существует потребность в отборе проб твердого субстрата-носителя, к которому прикреплены клетки. Это позволило бы более успешно оптимизировать процесс. В частности, это позволило бы проводить точный анализ эффективности трансфекции, показывая, где и насколько успешно трансфекционная смесь была интернализирована клетками. Кроме того, это позволило бы применять ряд клеточных анализов, таких как протеомный анализ и анализ экспрессии генов. Таким образом, отсутствие вариантов отбора проб из биореакторов с неподвижным слоем является существенным недостатком промышленной биотехнологии.
Было найдено простое, экономически выгодное решение, обеспечивающее при этом высокую точность. Сущность изобретения далее поясняется со ссылкой на фиг. 1.
На фиг. 1 показана структура и поэтапная работа одного из примеров реализации изобретения. На фиг. 1 изображен биореакторный сосуд (1) для культивирования адгезионной культуры, заполненный жидкой культуральной средой. В этой жидкой среде находится твердый субстрат (2) для клеточной культуры (на фиг. 1 показаны небольшие полосы волокнистого материала). Биореакторный сосуд (1) содержит один или несколько асептических портов (3). Коммерчески доступные биореакторы обычно имеют несколько портов, предназначенных, например, для ввода свежей среды, вывода использованной среды, подачи свежего кислорода или другого газа и т.п.
К по меньшей мере одному порту асептически присоединен корпус (4) для устройства для отбора проб. Как показано на фиг. 1, корпус для устройства для отбора проб представляет собой гибкую трубку. Можно также использовать стерильный пакет, как показано на фиг. 2, с герметизируемым отверстием на конце (8), через который можно загрузить в пакет устройство (5) для отбора проб, например щипцы, а затем асептически герметизировать пакет (4). В качестве альтернативы можно использовать, например, жесткую пластиковую или стеклянную трубку.
Корпус (4) для устройства для отбора проб содержит устройство (5) для отбора проб твердого субстрата, позволяющее получать пробу твердого субстрата (2) для адгезионной клеточной культуры. Например, на фиг. 1 устройство для отбора проб представляет собой пинцет. На фиг. 2 это устройство представляет собой щипцы. Также можно использовать стержень с крючком на конце, подобным рыболовному крючку. Также можно использовать всасывающее устройство, позволяющее получать пробу твердого субстрата для адгезионной клеточной культуры.
При использовании пинцетов или щипцов желательно, чтобы корпус (4) был достаточно гибким и позволял оператору вручную манипулировать пинцетом или щипцами путем манипулирования этим корпусом. Если устройство (5) для отбора проб изготовлено из черного металла, то для перемещения устройства (5) для отбора проб внутри корпуса (4) можно использовать магнит (7).
Корпус (4) может быть герметизирован и затем отсоединен от биореактора. В этом случае желательно, чтобы уплотнение на том конце корпуса, который соединен с биореактором, легко открывалось, позволяя оператору выдвигать пинцет через образующееся отверстие. В случае необходимости корпус (4) может содержать пакет, предоставляющий больше пространства для работы с крупными инструментами, такими как щипцы-кусачки (фиг. 2).
Чтобы подготовить устройство к работе, следует собрать корпус (4), поместить в него устройство (5) для отбора проб, герметизировать сборку, а затем стерилизовать сборку, например, путем автоклавирования или облучения. После этого стерилизованный герметично закрытый корпус (4) с устройством (5) для отбора проб следует асептически присоединить к порту (3) биореактора. Этот порт может представлять собой обычный порт, предусмотренный на обычном коммерчески доступном биореакторе. В качестве альтернативы, можно снабдить биореактор новым портом, предназначенным для отбора проб субстрата, или несколькими такими портами. Это позволяет оператору продолжать использовать имеющиеся обычные порты по их назначению, например, для ввода и вывода культуральной среды, для подачи газа и т.п. Желательно снабдить биореактор несколькими портами, чтобы можно было наглухо закрывать порты после их использования и тем самым сводить к минимуму риск загрязнения. В качестве альтернативы, можно несколько раз использовать один и тот же порт (3).
На фиг. 1 также проиллюстрирован способ отбора пробы твердого субстрата. Для получения пробы субстрата сначала присоединяют корпус (4) к порту (A). Затем открывают порт (Б) (при необходимости) и вводят устройство для отбора проб через открытый порт (Б) внутрь биореактора, содержащего твердый субстрат (2) для клеточной культуры. Эту процедуру можно выполнять с помощью магнита (7). Затем получают пробу твердого субстрата (2) для клеточной культуры с помощью устройства (5) для отбора проб; если при этом используют пинцет в гибкой трубке, то можно отобрать пробу, просто сдавливая гибкую трубку с целью манипулирования пинцетом. После этого устройство (5) для отбора проб с удерживаемой пробой твердого субстрата (2) для клеточной культуры возвращают в корпус через открытый порт (В), например, с помощью магнита или путем манипулирования корпусом. Затем корпус изолируют (6) от биореактора. После этого устройство (5) для отбора проб можно извлечь из корпуса (4), не загрязняя биореактор (1).
Биологическая безопасность является важным аспектом изобретения. После изоляции (6) корпуса (4) от биореактора (1), ту часть корпуса (4), в которой находится устройство (5) для отбора проб и проба (2), можно отсоединить от порта (3), поместить в вытяжной бокс с ламинарным потоком и вскрыть в нем, обеспечивая асептическое 5 извлечение пробы (2). Благодаря этому отобранный материал не подвергается открытой обработке в лаборатории. Это позволяет исключить риск загрязнения, сопутствующий открытой обработке отобранного материала. Кроме того, открытая обработка проб не допускается, если материал в биореакторе представляет опасность для здоровья операторов.
В производственном цикле для клинических целей, когда биореактор производит биологический продукт, предназначенный для использования человеком, в культуральной среде нельзя использовать антибиотики, корпус биореактора не должен иметь люка и нормативные требования запрещают открывать биореактор. Предпосылкой этого изобретения послужило то, что автор столкнулся с этими ограничениями при попытке выяснить, что происходит с адгезионной клеточной культурой в биореакторе, и был вынужден искать решение при запрете открывать биореактор или использовать в его среде антибиотики для предотвращения случайного загрязнения. Автор начал работать над этой идеей, намереваясь использовать для стерильного отбора проб субстрата из реактора порты, имеющиеся в корпусе коммерчески доступного биореактора. Тем не менее, эти принципы применимы и к биореактору, изготовленному на заказ, с дополнительным портом, специально предназначенным для отбора проб субстрата, или с несколькими такими портами. Основная идея изобретения заключается в создании механизма для асептического отбора проб твердого субстрата для клеточной культуры, не влияющего на жизнеспособность всей клеточной культуры.
С учетом предлагаемой основной идеи можно легко создать и другие эквивалентные варианты реализации изобретения. Например, вместо пинцета можно использовать зазубренный металлический стержень, где зазубрины позволяют зацеплять и удерживать пробу волокнистого субстрата. Такой зазубренный инструмент можно поднимать и опускать с помощью внешнего магнита. В качестве альтернативы, корпус может представлять собой гибкую пластиковую пленку или пакет, при этом оператор может рукой держать стержень за дистальный конец через пластиковую пленку, по необходимости манипулируя стержнем.
В некоторых биореакторах носитель заключен внутри корзины кольцевой формы. Сверху слой носителя накрыт сеткой и верхней решеткой, удерживающей массу носителя внутри корзины. Тем не менее, между стенкой корзины и верхней решеткой имеется просвет, через который можно брать пробы из слоя носителя с помощью пинцета или крючка, описанного выше. Если такой просвет отсутствует, можно использовать щипцы-кусачки, чтобы создать отверстие для отбора проб носителя. В этой заявке наиболее практично использовать корпус для устройства для отбора проб, представляющий собой комплект, состоящий из трубки и пакета, как показано на фиг. 2.
Пример 1
Тестирование устройства проводили на обычном биореакторе iCELLis™ 500 одноразового использования. На фиг. 3–6 представлены фотографии, сделанные на разных стадиях тестирования. Во время подготовки к тестированию устройство для отбора проб (в этом примере пинцет) вставляли наконечниками вперед через первый конец корпуса для устройства для отбора проб, диаметр которого соответствовал диаметру биореакторного порта, как показано на фиг. 3. Использовали трубку на ¾ дюйма, чтобы она подходила для газоотводного порта на ¾ дюйма. В этом примере на первом конце трубки использовали переходник MPX. Второй конец трубки может быть герметизирован или снабжен переходником. Затем устройство для отбора проб подвергали автоклавированию, снабдив переходники подходящими колпачками (в данном случае колпачками MPX для переходников MPX). После автоклавирования устройства колпачки MPX использовали для асептического закрывания корпуса в вытяжном боксе с ламинарным потоком.
Во время тестирования прекращали подачу газа в реакторы на время отбора проб. Второй конец корпуса для устройства для отбора проб приварили к газоотводному порту. Затем устройство для отбора проб вводили по трубке в порт, как показано на фиг. 4. В биореакторе iCELLis™ 500 устройство для отбора проб можно направлять через просвет между корзиной с неподвижным слоем и верхней решеткой биореактора и захватывать им один или несколько носителей из неподвижного слоя. Чтобы облегчить процедуру захвата носителя, можно использовать сильный магнит. Для снижения трения можно впрыснуть в контейнер для носителя смазку или этанол, если они не являются вредными для процесса. Использование контейнера для устройства для отбора проб, изготовленного из тонкого и гибкого материала, позволяет оператору вручную перемещать пинцет внутри контейнера, как показано на фиг. 5. Успешный захват фрагмента субстрата для адгезионной клеточной культуры показан на фиг. 6.
Затем устройство для отбора проб вместе с захваченным носителем или субстратом перемещали из биореактора в корпус. В этом примере использовался корпус из достаточно длинной трубки, чтобы обеспечить возможность повторного приваривания газоотводной трубки. В общем случае, предпочтительно втянуть устройство для отбора проб внутрь корпуса, в котором он прежде находился. Затем трубку герметизировали и/или вваривали новую трубку в газоотводную линию.
Таким образом, пинцет и пробы носителя можно асептически изолировать или герметизировать в трубке-держателе устройства для отбора проб. Конструкция устройства позволяет делать это без риска для биологической безопасности оператора и без риска загрязнения реактора.
Затем трубку корпуса для устройства для отбора проб можно перенести в вытяжной бокс с ламинарным потоком и там открыть для подготовки пробы носителя и его анализа.