СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ДЕЗИНФИЦИРУЮЩИХ СРЕДСТВ, ПРИМЕНЯЕМЫХ В ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫХ УЧРЕЖДЕНИЯХ
METHOD FOR DETERMINATION OF EFFICIENCY OF DISINFECTANTS USED IN TB FACILITIES

Изобретение относится к медицине, в частности к области микробиологии и санитарной гигиены, и направлено на улучшение и ускорение контроля качества работы средств дезинфекции в противотуберкулезных диспансерах и лечебных заведениях противотуберкулезного профиля.
Известно, что в настоящее время туберкулоцидная эффективность дезинфицирующих средств оценивается: в России согласно руководству «Методы испытаний дезинфекционных средств для оценки их безопасности и эффективности», М.: Минздрав РФ 1998 г., 72 с., в Европе - согласно Европейскому стандарту. Проект pr EN 14348, октябрь 2002.
Согласно руководству «Методы испытаний дезинфекционных средств для оценки их безопасности и эффективности» в качестве тест-микроорганизма для оценки туберкулоцидной эффективности дезинфицирующих средств при проведении ими дезинфекции различных объектов применяется сапрофитный штамм Mycobacterium B-5.
Для получения культуры микобактерий штамма B-5 и бактериологического контроля проб после воздействия дезсредства рекомендуются такие питательные среды, как: картофельно-глицериновый бульон, среда Петраньяни, 2% глицериновый агар.
6
Европейский стандарт Проект pr EN 14348 для определения туберкулоцидной и микобактерицидной активности дезинфицирующих средств предусматривает и регламентирует использование суспензионного метода. В качестве тест-микроорганизмов для оценки туберкулоцидной и микобактерицидной активности дезсредств применяют культуры Mycobacterium avium ATCC 15769 и Mycobacterium terrae ATCC 15755. Суть метода заключается в том, что в пробирку с 1 мл суспензии культуры тест-микроорганизмов (10 м.т./мл) вносят 8 мл раствора тестируемого дезинфектанта, после окончания времени экспозиции 1 мл смеси переносят в пробирку с 8 мл раствора нейтрализатора и по 1 мл полученной смеси рассевают на 2 чашки Петри с питательной средой Миддлбрука 7Н10. Посевы инкубируют в термостате при 37°С в течение 21 дня.
Результаты проведенных исследований по сравнительной оценке чувствительности вирулентных (музейных и клинических) и непатогенных штаммов микобактерий к различным по составу действующих веществ дезсредствам убедительно показали, что тест-микобактерии сапрофитного штамма В-5 менее устойчивы (и в ряде случаев значительно) к воздействию дезсредств, чем музейные и клинические штаммы микобактерий. Наиболее адекватными в этом плане тест-микробами являются, как показали результаты этих исследований, микобактерии штаммов М.terrae и М.avium.
Однако утвержденные туберкулоцидные режимы всех зарегистрированных к применению в России дезсредств были разработаны с использованием в качестве тест-микроба микобактерий штамма В-5. В связи с этим имеется реальная угроза неэффективного проведения дезинфекции объектов и распространения возбудителя туберкулеза и микобактериозов как в противотуберкулезных стационарах, где сконцентрированы наиболее активные бактериовыделители, так и в медицинских учреждениях общей лечебной сети (ЛПУ), куда обращаются пациенты с неустановленным диагнозом. В ЛПУ, как правило, следуют методическим указаниям фирм-производителей в выборе туберкулоцидных режимов для проведения текущей дезинфекции, которые в силу вышеуказанной причины, могут не обеспечить надежного обеззараживания объектов окружающей среды, загрязненных возбудителем туберкулеза. Кроме того, в ЛПУ могут иметь место случаи появления клинических штаммов микобактерий с более высокой устойчивостью к дезагентам, чем музейные штаммы микобактерий туберкулеза. Но, поскольку в ЛПУ нормативными документами не предусмотрено проведение целенаправленного контроля обсемененности объектов микобактериями и изучение устойчивости последних к дезсредствам, то госпитальные эпидемиологи, как правило, информации о появлении более резистентных штаммов не имеют и не могут адекватно реагировать на это.
Задачей изобретения является разработка способа определения в лабораторных условиях эффективности дезинфицирующих средств в противотуберкулезных учреждениях (ПТУ), позволяющего наиболее достоверно и точно с минимальными затратами времени и средств проводить оценку качества действия дезсредств для условий повышенной микробной нагрузки противотуберкулезных учреждений, при использовании известных и доступных препаратов, питательных сред, технической аппаратуры и приборов.
Задача решается тем, что оценку качества туберкулоцидной и микобактерицидной эффективности дезинфицирующих средств, применяемых в противотуберкулезных учреждениях, и тестирование дезсредств в бактериологических лабораториях противотуберкулезных учреждений проводят на наличие туберкулоцидной активности в отношении культур микобактерий, выделенных от больных, проходящих лечение в этих учреждениях, или в отношении тест-штаммов М.terrae и/или М.avium, являющихся адекватной по устойчивости к дезинфектантам моделью клиническим штаммам микобактерий. При этом определение проводят путем использования метода погружения в дезинфектант бязевых тест-объектов размером 1×1 см, контамированных тест-микроорганизмами с применением бульона по «Ди-Ингли» в качестве универсального нейтрализатора, при культивировании на плотной питательной среде «Новая» в количестве по 4,5-5 мл в пробирках со скошенным срезом длиной 8-10 см с размещением в одной пробирке до 3-х тест-объектов. Предлагаемый для использования в ЛПУ фтизиатрического профиля способ определения туберкулоцидной и микобактерицидной эффективности дезсредств предусматривает последовательное осуществление операций подготовительного этапа, выполнение самого эксперимента, проведение учета и анализа его результатов.
На подготовительном этапе проводят приготовление качественной суспензии культуры тест-микобактерий, которая будет использоваться при оценке туберкулоцидной (микобактерицидной) эффективности применяемого или планируемого к применению в противотуберкулезном учреждении дезинфицирующего средства.
В качестве тест-микобактерий при отработке способа могут быть использованы следующие штаммы:
1) М.tuberculosis (особенно штаммов с множественной лекарственной устойчивостью МЛУ), выделенные от больных непосредственно в данном учреждении;
∗)
2) M.terrae ATCC 15755;
3) М.avium ATCC 15769.
Учитывая, что в последнее время на рынке появляются специальные нейтрализующие бульоны с оптимальным составом нейтрализующих ингредиентов, которые легко готовятся и предназначены непосредственно для использования в опытах по оценке дезинфектантов, в предложенном способе использован нейтрализующий бульон по «Ди-Ингли» (фирма-производитель «HIMEDIA»). В его состав входят такие ингредиенты, как: гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, глюкоза, натрия тиосульфат, натрия тиогликолят, натрия бисульфит, лецитин, Твин-80 и др. Готовую жидкую питательную среду «Ди-Ингли» следует, как показали специальные эксперименты, выполненные в Уральском НИИ фтизиопульмунологии, применять в качестве универсального нейтрализатора для дезсредств на основе четвертичноаммонийных соединений (ЧАС), перекиси водорода и альдегидов.
Используемая в способе среда «Новая» - это плотная яичная среда - оригинальная, малоизвестная ранее, не применяемая для оценки качества дезсредств и используемая в способе в количество по 5 мл в пробирке со скошенной средой длиной 8-10 см для размещения до 3-х тест-объектов в пробирке.
В рецептуру питательной среды «Новая» входят (в вес.%):
Калий фосфорнокислый одноосновной
0,05
Натрий лимоннокислый
0,05
Магний сернокислый
0,05
Натрий пировинограднокислый (гликокол)
0,2
Глицерин
3,6
Малахитовая зелень
0,036
Желтки
50,0
Дистиллированная вода
до 100,0
(см. Приготовление и использование новой питательной среды для выращивания микобактерий туберкулеза. Методические указания. М.: Минздрав РСФСР 1972).
В качестве контрольной питательной среды для тест-микроорганизмов использована среда Левенштейна-Йенсена - это международная среда, которая в качестве стандартной среды используется для первичного выделения возбудителя туберкулеза и определения его лекарственной чувствительности. Эта среда рекомендуется для использования во всех микробиологических лабораториях противотуберкулезной службы РФ для получения сравнимых результатов (см. Инструкция по унифицированным методам микробиологических исследований при выявлении, диагностике и лечении туберкулеза. Приложение к приказу Минздрава России от 21.03.2003 №109).
Для чистоты эксперимента используют готовую питательную среду в стандартных пробирках с завинчивающимися крышками.
При невозможности приобретения готовой среды ее можно приготовить самостоятельно.
Способ обеззараживания тест-объектов испытываемого дезсредства и контроль эффективности обеззараживания предусматривает последовательное проведение контаминации микобактериями бязевых тест-объектов, обработку их в испытываемом дезрастворе, нейтрализацию на них дезинфектанта после заданной экспозиции воздействия дезинфектанта на контаминированные микобактериями тест-объекты, инкубирование нейтрализованных тестов на плотной питательной среде.
Приготовление бязевых тест-объектов проводится, руководствуясь «Инструкцией по определению бактерицидных свойств новых дезинфицирующих средств» от 06 мая 1968 г. №739-68, заменяя дорогой батист, отсутствующий в ЛПУ, на более технологичную бязь. Лоскут бязи погружают на 24 часа в холодную водопроводную воду для удаления крахмала, тщательно стирают с мылом, кипятят, сушат и отутюживают. Из приготовленной ткани с помощью иглы выдергивают нитки в продольном направлении на расстоянии 10 мм друг от друга и в поперечном на расстоянии 10 мм. По приготовленным линиям ткань разрезают ножницами на тест-объекты размером 1×1 см и по 50 штук раскладывают в чашки Петри.
Чашки Петри с тест-объектами стерилизуют в автоклаве 30 минут при 126°С.
9
При контаминации бязевых тест-объектов стерильные бязевые тест-объекты размером 1×1 см (в количестве 50-100 штук) в чашке Петри заливают 10-20 мл суспензии тест-микобактерий, содержащей 10 КОЕ/мл, и равномерно, смачивая, оставляют тест-объекты в суспензии в закрытой чашке Петри. Через 30 минут бязевые тест-объекты, контаминированные бактериальной суспензией, стерильным пинцетом переносят в чашку Петри на поверхность двухслойной стерильной фильтровальной бумаги, покрывают их сверху стерильной бумагой и закрывают чашку. Оставляют на 10 минут с целью удаления избытка жидкости. Для фиксации микроорганизмов на бязевых тест-объектах последние переносят на поверхность сухой стерильной фильтровальной бумаги в чашке Петри и сверху прикрывают стерильным листом фильтровальной бумаги, подсушивают в термостате при 37°С в течение 20 минут.
Хранение контаминированных тест-штаммами тест-объектов возможно при температуре +4°С в течение суток.
5
6
Для контроля количества жизнеспособных бактериальных клеток на контаминированном тест-объекте тест-объект погружают в колбу со 100 мл стерильной дистиллированной воды. Колбу устанавливают на шейкер и встряхивают в течение 30 минут для отмывания бактериальных клеток с бязевого тест-объекта. Из полученной суспензии производят посев по 0,1 мл на 5 пробирок (5 повторностей) со средой Левенштейна-Йенсена или «Новая», инкубируют в термостате при 37°С в течение 5-7 суток. Выросшие колонии на поверхности питательной среды подсчитывают, определяют среднее значение, производят пересчет с учетом разведения. Количество жизнеспособных бактериальных клеток в приготовленной суспензии на тест-объекте должно соответствовать 10-10 микробных тел в 1 мл (если рост микобактерий отсутствует, при посеве суспензии объемом 0,1 мл можно увеличить объем до 0,2-0,3 мл и соответственно учесть его при расчете бактериальной концентрации на тест-объекте).
Далее контаминированные тест-штаммом бязевые тест-объекты стерильным пинцетом погружают в пробирки с раствором дезинфектанта (объем дезсредства в пробирке должен рассчитываться с учетом соотношения 1,0 мл раствора на 1 тест-объект, т.е., например, для 9 тест-объектов необходимо 9,0 мл раствора дезинфектанта), на указанное в инструкции по применению дезинфектанта время, соответствующее испытываемой концентрации, и фиксируют время начала опыта.
По истечении времени экспозиции стерильным пинцетом извлекают тест-объект из раствора дезинфектанта и погружают его на 1-2 с поочередно в 2 пробирки со стерильным бульоном нейтрализатора (бульон по «Ди-Ингли»).
После нейтрализации при помощи пинцета размещают тест-объект на скошенную поверхность длиной 8-10 см питательной среды «Новая» и контрольной среды Левенштейна-Йенсена (на скошенную площадку питательной среды в пробирке можно разместить до 3 тест-объектов, что позволяет увеличить без дополнительных затрат количество проб, а значит, и достоверность результатов оценки эффективности средства).
Засеянные пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками, помещают в термостат в наклонном положении под углом 30° таким образом, чтобы посевной материал равномерно распределился по всей поверхности питательной среды, и инкубируют при 37°С в течение 5-7 дней с ежедневным просмотром.
Учет результатов посевов проводят визуально путем подсчета выросших колоний на самом тест-объекте и на поверхности питательной среды. Колонии М.tuberculosis на контрольной среде Левенштейна-Йенсена и «Новая» имеют вид влажных или иногда - сухих и шероховатых выпуклых образований с желтоватым оттенком, приобретающих при разрастании вид розетки. Колонии М. avium на среде Левенштейна-Йенсена и «Новая» представляют собой гладкие, блестящие, влажные, выпуклые округлые образования с молочным, кремовым или желтоватым оттенком. Колонии М.terrae на среде Левенштейна-Йенсена и «Новая» представляют собой гладкие и блестящие или шершавые и матовые выпуклые округлые образования с молочным или желтоватым оттенком.
Наличие роста колоний тест-микобактерий на тест-объекте и на поверхности питательной среды показывает, что тестируемое дезсредство в данном режиме применения (концентрация раствора и экспозиция времени воздействия) не обеспечивает надежного туберкулоцидного (микобактерицидного) эффекта. Поэтому от использования в данном ЛПУ такого средства либо целесообразно отказаться либо провести аналогичное тестирование в более жестком режиме (большая концентрация рабочего раствора и время воздействия), если таковой имеется в инструкции по применению средства. По результатам его и с учетом экономических и других эксплуатационных показателей принять решение об использовании данного средства.
5
-2
Отсутствие роста колоний тест-микобактерий на тест-объекте и на поверхности питательной среды свидетельствует о наличии у средства туберкулоцидной и микобактерицидной эффективности, отвечающей предъявляемым к дезинфектантам для практического их использования требованиям (обеспечение снижения уровня обсемененности объекта на 10 КОЕ·см). С учетом экономических и других эксплуатационных показателей (токсичность, коррозионные свойства, хранение и др.) такое средство может либо широко, либо с ограничениями использоваться для проведения дезинфекционных мероприятий в данном ЛПУ.
Новым для отечественной практики в способе является экспериментально обоснованное последовательное использование нейтрализующего бульона по «Ди-Ингли» в качестве универсального нейтрализатора для многих дезсредств на основе ЧАС, альдегидов, а также плотной питательной среды «Новая» в пробирках с объемом питательной среды 5 мл и косым срезом 8-10 см при использовании в качестве тест-микроба M.avium и M.terrae на бязевых тест-объектах размером 1×1 см с размещением в одной пробирке до 3-х тест-объектов. Использование этой питательной среды (в отличие от применяемого в зарубежной практике при испытании дезинфектантов питательного агара Миддлбрука 7Н10 в чашках Петри) позволяет в комплексе с предложенными операциями и параметрами сократить сроки получения результатов в 2,5-3 раза (т.е. свести их с 21 суток до 7-10 суток), существенно снизить расход питательной среды и свести к минимуму загрязнение посевов посторонней микрофлорой.
Использование данного способа в практике противотуберкулезных учреждений позволит главным врачам и госпитальным эпидемиологам, как ответственным за организацию и обеспечение эффективного противоэпидемического режима работы ЛПУ, объективно, целенаправленно, с минимальными затратами времени и средств осуществлять выбор дезсредств в соответствии с эпидемиологической обстановкой в ЛПУ, которые обеспечивали бы эффективное обеззараживание различных объектов в отношении возбудителей туберкулеза и микобактериозов.
Результаты исследований по предложенному способу показали, что музейные тест-штаммы микобактерий M.avium и M.terrae, используемые в зарубежной практике в качестве тест-штаммов, более адекватны возбудителям туберкулеза и микобактериозов по устойчивости к дезинфектантам. Эти данные подтверждают целесообразность использования при разработке туберкулоцидных режимов применения дезсредств этих тест-штаммов (как предусматривает Европейский стандарт), а не микобактерий штамма В-5.
Полученные данные свидетельствуют о необходимости проведения тестирования дезинфицирующих средств в противотуберкулезных учреждениях с использованием реальных микобактерий туберкулеза, выделяемых от больных в этих ЛПУ, или тест-штаммов M.terrae и M.avium.
5
6
При проведении исследований по оценке эффективности дезсредств с использованием предложенного способа было проведено сравнительное определение скорости роста патогенных и непатогенных микобактерий (микробная нагрузка соответствовала 10-10 микробных тел в 1 мл) на питательных средах «Новая», Левенштейна-Йенсена и Миддлбрука 7Н10 с ростовой добавкой 10% OADC (контроль) после обработки дезинфектантом с нейтрализацией бульоном по «Ди-Ингли» и без воздействия дезинфектанта с нейтрализацией. Данные по срокам роста различных штаммов представлены в таблице 1 и 2.
Таблица 1.
Скорость роста тест-штаммов микобактерий на различных питательных средах
Питательные среды
Сроки появления роста колоний микобактерий (сутки)
В-5
М.terrae
M.avium
H<sub>37</sub>Rv
«Новая»
2-3
3-4
4-5
7-8
Левенштейна-Йенсена
3-4
3-5
6-7
10-12
Миддлбрука 7Н10 с 10% OADC
Нет роста
8-10
14-16
21-23
37
37
37
Из таблицы 1 видно, что рост микобактерий на среде «Новая» без воздействия дезсредств тест-штамма В-5 появлялся на 2-3 сутки; рост M.terrae - на 3-4 сутки; рост M.avium - на 4-5 сутки; рост M.tuberculosis HRv - на 7-8 сутки. Рост микобактерий на среде Левенштейна-Йенсена без воздействия дезсредств тест-штамма В-5 появлялся на 3-4 сутки; рост M.terrae - на 3-5 сутки; рост M.avium - на 6-7 сутки; рост М. tuberculosis HRv - на 10-12 сутки. На среде Миддлбрука 7Н10 с 10% OADC без воздействия дезсредств рост микобактерий тест-штамма В-5 отсутствовал; рост микобактерий M. terrae появлялся на 8-10 сутки; рост M.avium - на 14-16 сутки; рост M.tuberculosis HRv - на 21-23 сутки.
Таблица 2.
Скорость роста тест-штаммов микобактерий на различных питательных средах при обработке дезсредствами
Питательные среды
Сроки появления роста колоний микобактерий (сутки)
В-5
M.terrae
M.avium
Н<sub>37</sub>Rv
«Новая»
3-5
7-10
8-10
12-14
Левенштейна-Йенсена
5-7
10-12
12-14
14-16
Миддлбрука 7Н10 с10% OADC
Нет роста
21-23
21-23
23-25
37
37
37
Из таблицы 2 видно что, рост микобактерий тест-штамма В-5 на среде «Новая» после воздействия дезсредств и нейтрализации бульоном по «Ди-Ингли» появлялся на 3-5 сутки; рост M.terrae - на 7-10 сутки; рост M.avium - на 8-10 сутки; рост М.tuberculosis HRv - на 12-14 сутки. Рост микобактерий на среде Левенштейна-Йенсена после воздействия дезсредств и нейтрализации тест-штамма В-5 появлялся на 5-7 сутки; рост M.terrae - на 10-12 сутки; рост M.avium - на 12-14 сутки; рост М. tuberculosis HRv - на 14-16 сутки. На среде Миддлбрука 7Н10 с 10% OADC после воздействия дезсредств и нейтрализации рост микобактерий тест-штамма В-5 отсутствовал; рост микобактерий M.terrae и M.avium появился на 21-23 сутки; рост М. tuberculosis HRv - на 23-25 сутки.
Таким образом, таблицы показывают, что по технологии предложенного способа скорость роста микобактерий на среде «Новая», без воздействия и после воздействии дезинфектантов с нейтрализацией, в 2 раза выше, чем на среде Миддлбрука 7Н10 с ростовой добавкой 10% OADC, а для рекомендуемых в качестве тест-микроорганизмов М.terrae и M.avium - почти в 3 раза.
Скорость роста микобактерий на среде Левенштейна-Иенсена без воздействия и после воздействии дезинфектантов с нейтрализацией уступает скорости роста микобактерий на среде «Новая» в среднем на 2-4 суток и превышает скорость роста микобактерий на среде Миддлбрука 7Н10 с ростовой добавкой 10% OADC почти в 2 раза.
Использование предлагаемого способа позволило установить, что тест-штамм В-5, являясь менее устойчивым по сравнению с тест-штаммами M. terrae и M.avium к воздействию химических дезсредств, не может использоваться в качестве тест-микроорганизма для разработки туберкулоцидных режимов применения дезинфектантов в противотуберкулезных учреждениях.
Использование в предложенном способе тест-микобактерий штаммов М. tuberculosis (выделенных от больных) или M.terrae и M.avium для оценки туберкулоцидной и микобактерицидной эффективности дезсредств, применяемых в противотуберкулезных ЛПУ, с использованием нейтрализующего бульона по «Ди-Ингли» и более богатой яичной питательной среды «Новая» в пробирках при тест-контроле на скошенной среде на длине 8-10 см с размещением в пробирке до 3-х тест-объектов для контроля жизнеспособности микобактерий позволяет:
- обеспечить соответствие туберкулоцидных режимов применения дезсредств устойчивости к ним реальных возбудителей туберкулеза;
- повысить объективность, достоверность и воспроизводимость результатов исследований путем проведения расширенного контроля полноты нейтрализации остаточного действия испытуемого дезсредства, контроля реального количества жизнеспособных бактериальных клеток в суспензии тест-штаммов микобактерий и на тест-объекте с использованием питательной среды, которая по составу доступна для любой баклаборатории ЛПУ и более эффективна в выявлении жизнеспособных микобактерий;
- проводить учет результатов в более короткие сроки (на 5-7 сутки);
- обеспечить удобство работы и безопасность сотрудников при проведении экспериментов на питательной среде в пробирках;
- свести к минимуму загрязнение посевов посторонней микрофлорой.
Неочевидным эффектом предложенного способа определения эффективности дезинфицирующих средств, применяемых в противотуберкулезных учреждениях, является то, что, комплексно используя по новому назначению известные препараты и носители (тест-микобактерии на бязевых тест-объектах размером 1×1 см, бульон по «Ди-Ингли» для нейтрализации контамированных тест-объектов, плотную питательную среду «Новая» в пробирках со скосом длиной 8-10 см, с размещением в пробирке до 3-х тест-объектов), в конечном результате резко (в 1,5-2 раза) сокращают время определения эффективности дезинфицирующих средств, что может дать большой экономический и социальный эффект при сокращении площадей под размещение термостатов (пробирки вместо чашек Петри) и при повышенной защите персонала от внутрибольничной инфекции с улучшением условий их труда, не требуя больших вложений средств и сил.
Применение способа позволяет достоверно и быстро дать объективную оценку активности используемых в противотуберкулезных учреждениях дезсредств в отношении вирулентных клинических штаммов микобактерий, обеспечить оптимальный выбор дезинфектантов, повысить эффективность дезинфекционных мероприятий и снизить риск нозокоминального распространения туберкулеза.
Способ разработан и апробирован в условиях противотуберкулезного учреждения и может быть рекомендован для практического применения оценки дезсредств.
Проведение тестирования дезсредств, применяемых в ЛПУ, или планируемых к применению, с использованием представленного способа осуществляется при обнаружении в пробах-смывах, целенаправленно отбираемых в ЛПУ с обеззараженных раствором дезсредства различных объектов, жизнеспособных возбудителей туберкулеза или микобактериозов. Кроме того, показанием к проведению такого тестирования является переход на другое дезинфицирующее средство, осуществляемый в плане обеспечения ротации дезсредств с целью предотвращения «привыкания» микобактерий к дезинфектанту.
Противопоказаний к применению способа не выявлено.