Длительно действующий рекомбинантный свиной гибридный белок FSH, способ его приготовления и его применение
LONG-ACTING RECOMBINANT PORCINE FSH FUSION PROTEIN, METHOD FOR ITS PREPARATION AND ITS USE

Область техники
Настоящее изобретение относится к области биомедицины и технологии разведения животных, в частности к длительно действующему рекомбинантному гибридному белку ФСГ свиного (FSH) и способу его приготовления и его применению.
Уровень техники
Свиной фолликул о стимулирующий гормон (pFSH) - гонадотропин, секретируемый свиным аденогипофизом, который сформирован α-субъединицей и β-субъединицей, связанными нековалентной связью, где α-субъединица является высококонсервативной и идентична α-субъединице свиного лютеинизирующего гормона (pLH) и свиного тироидстимулирующего гормона (pTSH); а β-субъединица не идентична, что в основном определяет функциональную специфичность ФСГ. pFSH может стимулировать рост и созревание эндометрия, яичника и фолликулов свиноматки; стимулировать синтез и секрецию эстрогена; и вызывать развитие семенных канальцев хряка и поддерживать сперматогенез. pFSH обычно используют в области разведения животных для синхронизации эструса, суперовуляции, трансплантации эмбрионов и лечения заболеваний яичников у самок. Исследования показывают, что влияние свиного ФСГ на суперовуляцию крупного рогатого скота и овец лучше, чем такое влияние ФСГ крупного рогатого скота и овец, и, таким образом, pFSH имеет большое значение в производстве животноводческой продукции и промышленном разведении животных.
В настоящее время в родственных патентах и статьях сообщается об экспрессии гибридных белков ФСГ, но большинство из них относится к рекомбинантной экспрессии и применению человеческого ФСГ. Применение человеческого ФСГ в области разведения животных также достигло некоторого успеха. Однако, хотя люди и домашние животные относятся к млекопитающим, есть большие видовые различия в белковых последовательностях (человеческий ФСГ и свиной ФСГ имеют гомологию 73% в отношении аминокислотной последовательности α-субъединицы, гомологию 93% в отношении β-субъединицы, и гомологию 73% в отношении Fc-фрагмента). Если человеческий рекомбинантный ФСГ используют у животных в течение долгого времени, иммунная система животного будет распознавать человеческий рекомбинантный ФСГ и вызывать образование антител (включая нейтрализующие антитела), которые специфично связываются со связывающим сайтом рецептора ФСГ животного, тем самым блокируя биологическую активность лекарственного средства и приводя к все более низкой биодоступности человеческого ФСГ у животных, что ограничивает применение человеческого ФСГ у животных, в частности у промышленных животных, таких как свиньи, крупный рогатый скот и овцы, которые нуждаются в применении ФСГ в течение долгого времени. Это одна из причин того, почему имеющийся в настоящее время в продаже человеческий рекомбинантный ФСГ не применяют в области разведения животных.
В настоящее время коммерческие продукты ФСГ, имеющиеся в продаже, преимущественно включают ФСГ, выделенный из свиного аденогипофиза, и гонадотропин из сыворотки беременных кобыл (PMSG). ФСГ из свиного аденогипофиза, такой как фоллтропин-V (Канада), имеет короткий период полувыведения (5 часов) и требует частого введения, что приводит к высокой стоимости кормления и ухода для конечных потребителей. Кроме того, при очистке из ткани свиного аденогипофиза свиной ФСГ сложно отделить от LH, и сложная очистка и низкая продуктивность существенно ограничивают практическое применение свиного ФСГ. PMSG - гликопротеиновый гормон, секретируемый клетками хориоаллантоисной мембраны плаценты животного из рода Equus, имеющий как ФСГ (высокую) так и LH (низкую) активности, и оказывающий влияние на стимулирование репродуктивной функции яичников и семенников животных. В области разведения животных PMSG часто используют для того чтобы индуцировать синхронизацию эструса и суперовуляцию у самок, и для лечения репродуктивных заболеваний и недостаточности яичников у самок; стимулированию развития семенных канальцев и сперматогенеза у самцов. Однако, поскольку молекулы PMSG содержат сравнительно высокое количество гексозы и сиаловой кислоты и имеют долгий период полувыведения у животных (120 ч), при использовании у животных для суперовуляции легко вызвать у маток различные побочные эффекты, такие как цисты яичников, раннюю деградацию эмбриона в начале беременности. Кроме того, коммерческий PMSG выделяют и очищают из сыворотки беременных лошадей; при использовании у других животных будут вырабатываться антитела, и PMSG обладает определенной иммуногенностью, и его нельзя использовать в течение долгого времени. В добавление, PMSG изготавливают, собирая сыворотку от беременных лошадей, что часто вызывает выкидыш у беременных лошадей и смерть плода из-за обширного забора крови, что не соответствует этике обращения с животными.
Следовательно, на основе того, что человеческий ФСГ не подходит для животных, ФСГ из свиного аденогипофиза требует частого введения, a PMSG часто вызывает нежелательные явления, есть потребность в длительно действующем ФСГ из животного источника в области разведения животных, в частности в промышленном разведении животных.
Сущность изобретения
Цель настоящего изобретения - обеспечить новый длительно действующий рекомбинантный гибридный белок свиного ФСГ и способ его приготовления и применения.
Концепция настоящего изобретения состоит в следующем: технология гибридного белка Fc - одна из наиболее широко используемых и стабильных технологий в разработке длительно действующих белковых лекарственных средств, и ФСГ гибридизирован с Fc посредством технологии генетической инженерии для получения нового рекомбинантного белка ФСГ-Fc. Можно не только достичь высокой биологической активности ФСГ, но также получить более длительный период полу вы ведения. В то же время полученный рекомбинантный белок имеет высокую чистоту, сравнительно однородное качество, отсутствие LH и высокий фактор безопасности. Использование экспрессионной системы млекопитающих, в частности клеток яичника китайского хомячка (СНО) для экспрессии рекомбинантных белков обеспечивает белковые молекулы, которые являются наиболее близкими к природным молекулам в отношении молекулярной структуры, физико-химических свойств и биологических функций.
Для целей настоящего изобретения длительно действующие рекомбинантные гибридные белки свиного ФСГ согласно настоящему изобретению содержат гибридные белки pFSH-Fc-1 и pFSH-Fc-2, где α-субъединица pFSH-Fc-1 гибридного белка свиного ФСГ прямо или непрямо гибридизирована с Fc-фрагментом посредством связывающего компонента, а β-субъединица pFSH-Fc-1 гибридного белка свиного ФСГ связана с α-субъединицей посредством ван-дер-ваальсовой силы или связывающего компонента; а β-субъединица pFSH-Fc-2 гибридного белка свиного ФСГ прямо или непрямо гибридизирована с Fc-фрагментом посредством связывающего компонента, а α-субъединица pFSH-Fc-2 гибридного белка свиного ФСГ связана с β-субъединицей посредством ван-дер-ваальсовой силы или связывающего компонента.
2
2
Гибридный белок свиного ФСГ содержит две пептидные цепи, соответствующие следующей формуле: (pFSHβ:pFSHα-L-Fc) или (pFSHα:pFSHβ-L-Fc), где pFSHβ относится к β-субъединице свиного ФСГ с удаленным сигнальным пептидом; двоеточие представляет связь, которой β-субъединица и α-субъединица свиного ФСГ связаны посредством ван-дер-ваальсовой связи; pFSHα относится к α-субъединице свиного ФСГ с удаленным сигнальным пептидом; L обозначает линкерную связь между pFSHα- или pFSHβ-субъединицей и Fc-фрагментом; Fc относится к Fc-фрагменту иммуноглобулина, или к его мутанту; индекс 2 за скобками означает, что гибридный белок свиного ФСГ представляет собой дивалентный гомодимер.
Аминокислотная последовательность pFSHα представлена SEQ ID NO: 1, или pFSHα составлена из аминокислотной последовательности, имеющей гомологию 90% или более с SEQ ID NO: 1 и активность, эквивалентную активности SEQ ID NO: 1.
Аминокислотная последовательность pFSHβ представлена SEQ ID NO: 3, или pFSHβ составлена из аминокислотной последовательности, имеющей гомологию 90% или более с SEQ ID NO: 3 и активность, эквивалентную активности SEQ ID NO: 3.
Fc содержит шарнирный участок, а также участки СН2 и СН3 иммуноглобулина.
Иммуноглобулин получен из человека, свиньи, крупного рогатого скота, овцы, лошади или собаки. Иммуноглобулины классифицируют на IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, и каждый тип иммуноглобулинов включает различные подтипы, такие как IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.
Мутант Fc относится к варианту Fc, содержащему аминокислотную мутацию в одном или более сайтах Fc-фрагмента, и включает вариант Fc человеческого IgG2, содержащий шарнирный участок человеческого IgG2, участок СН2 и участок СН3, с мутацией Pro331Ser.
Предпочтительно Fc получен из свиного иммуноглобулина, т.е. pFc, и содержит шарнирный участок, участки СН2 и СН3 свиного иммуноглобулина. Аминокислотная последовательность pFc представлена SEQ ID NO: 5, или pFc составлен из аминокислотной последовательности, имеющей гомологию 80% или более с SEQ ID NO: 5 и активность, эквивалентную активности SEQ ID NO: 5.
Субъединица pFSHα или pFSHβ связана с Fc прямо или линкером, предпочтительно линкером.
При этом линкер представляет собой лабильный полипептид, состоящий из от 2 до 20 лабильных аминокислот, выбранных из по меньшей мере одного из Gly, Ser, Ala и Thr;
n
предпочтительно линкер представляет собой (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser), где n является целочисленной переменной от 2 до 5, более предпочтительно n составляет 3.
Предпочтительно pFSHα-L-Fc представляет собой: i) белок, составленный аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID No. 6; или
ii) белок, полученный из i), который состоит из аминокислотной последовательности, имеющей функцию, эквивалентную функции SEQ ID No. 6 и полученной из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID No. 6, путем замены, делеции и/или добавления одной или более аминокислот; или
iii) белок, составленный аминокислотной последовательностью, имеющей гомологию 90% или более с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID No. 6 и имеющей функцию, эквивалентную SEQ ID No. 6.
Предпочтительно pFSHβ-L-Fc представляет собой: iv) белок, составленный аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID No. 8; или
v) белок, полученный из iv), который состоит из аминокислотной последовательности, имеющей функцию, эквивалентную функции SEQ ID No. 8 и полученной из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID No. 8, путем замены, делеции и/или добавления одной или более аминокислот; или
vi) белок, составленный аминокислотной последовательностью, имеющей гомологию 90% или более с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID No. 8 и имеющей функцию, эквивалентную SEQ ID No. 8.
Настоящее изобретение также обеспечивает экспрессионную кассету, экспрессионный вектор, клонирующий вектор, инженерные бактерии или трансгенную клеточную линию, содержащую (содержащий) нуклеиновую кислоту, кодирующую гибридный белок, описанный выше.
Длительно действующий рекомбинантный гибридный белок свиного ФСГ согласно настоящему изобретению может быть приготовлен следующим образом: искусственный синтез генов, кодирующих pFSHα, pFSHβ, pFSHα-L-Fc и pFSHβ-L-Fc, проведение оптимизации кодонов и клонирование оптимизированных генов в эукариотные экспрессионные векторы, соответственно; одновременная трансформация рекомбинантного вектора pFSHα и рекомбинантного вектора pFSHβ-L-Fc в эукариотные клетки, и экспрессия в эукариотных клетках и выделение и очистка целевого белка; одновременная трансформация рекомбинантного вектора pFSHβ и рекомбинантного вектора pFSHα-L-Fc в эукариотные клетки, и экспрессия в эукариотных клетках и выделение и очистка целевого белка.
Эукариотный экспрессионный вектор включает, но не ограничиваясь тем самым, pcDNA3.1, и эукариотные клетки включают, но не ограничиваясь тем самым, клетки 293 и СНО.
Настоящее изобретение также обеспечивает применение вышеупомянутого длительно действующего рекомбинантного свиного гибридного белка для приготовления лекарственного средства для стимуляции разведения животных (включая синхронизацию эструса, суперовуляцию и тому подобное) и для лечения связанного с репродуктивной функцией заболевания у животных. При этом животное включает, но не ограничиваясь тем самым, свинью, крупный рогатый скот, лошадь или собаку; предпочтительно свинью.
Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает лекарственное средство для стимулирования разведения животных (включая синхронизацию эструса, суперовуляцию и тому подобное) и для лечения связанного с репродуктивной функцией заболевания у животных, приготовленное из вышеупомянутого длительно действующего рекомбинантного гибридного белка свиного ФСГ.
Изобретение также обеспечивает применение вышеупомянутого длительно действующего рекомбинантного гибридного белка свиного ФСГ в области разведения животных.
В объем настоящего изобретения входят все модифицированные белки, включая два гибридных белка pFSH-Fc-1, pFSH-Fc-2 или свиной ФСГ, который гликозилирован, пегилирован, ацетилирован или связан с BSA, и тому подобные.
Сконструированные белки, включая два гибридных белка pFSH-Fc-1, pFSH-Fc-2 или гибридные белки, которые составлены гибридным белком свиного ФСГ со свиным Fc или другими белками, без изменений в активности белка свиного ФСГ, все входят в объем настоящего изобретения.
В сравнении с предыдущим уровнем техники, настоящее изобретение имеет следующие преимущества:
(I) Длительно действующий рекомбинантный гибридный белок свиного ФСГ и/или свиной белок ФСГ и полученные из них белки или модифицированные из них белки, обеспеченные согласно настоящему изобретению, имеют период полувыведения около 60 ч, который выше, чем у ФСГ из свиного аденогипофиза, но ниже, чем у ФСГ из PMSG. Они не требуют постоянных инъекций и не вызывают нежелательные реакции, поскольку период полувыведения у домашнего скота увеличен; и они не иммуногенны для свиноматок и не вызывают образования антител с лекарственной устойчивостью.
(II) Длительно действующий рекомбинантный гибридный белок свиного ФСГ и/или свиной белок ФСГ, и полученные из него или модифицированные из него белки, обеспеченные согласно настоящему изобретению, имеют степень эффективности стимулирования эструса свиноматок 90% или более и степень эффективности лечения анэструса свиноматок 85% и более, и достижение среднего размера овуляции около 27 на свинью, и среднего размера помета около 13 на свинью, и оказывают лучший эффект на эструс и суперовуляцию, чем PMSG, hFSH-hFc и pFSH-hFc.
(III) Длительно действующий рекомбинантный гибридный белок свиного ФСГ и/или белок свиного ФСГ, и полученные из него или модифицированные из него белки, обеспеченные согласно настоящему изобретению, могут также улучшать частоту эструса у крупного рогатого скота и овец и стимулировать эффект суперовуляции: количество эструсов на корову составляет около 8,0, а количество доступных эмбрионов на корову составляет около 6,1, что соответственно выше, чем при воздействии PMSG, hFSH-hFc и pFSH-hFc; и имеют степень эффективности стимулирования эструса овцематок 90%, что также лучше, чем при воздействии PMSG, hFSH-hFc и pFSH-hFc.
(IV) Длительно действующий рекомбинантный гибридный белок свиного ФСГ и/или белок свиного ФСГ, и полученные из него или модифицированные из него белки, обеспеченные согласно настоящему изобретению, могут эффективно обеспечить безопасное и эффективное лекарственное средство для усиления коэффициента воспроизводства у животных, в частности при промышленном разведении животных.
(V) При применении в области разведения животных, длительно действующий рекомбинантный гибридный белок свиного ФСГ и/или белок свиного ФСГ, и полученные из него или модифицированные из него белки имеют пониженную иммуногенность и повышенную биологическую активность по сравнению с человеческим ФСГ, имеют более высокую чистоту и более продолжительный период полувыведения по сравнению с природным ФСГ из свиного аденогипофиза, и вызывают меньше нежелательных побочных явлений и имеют пониженную иммуногенность по сравнению с PMSG.
(VI) Длительно действующий рекомбинантный гибридный белок свиного ФСГ, обеспеченный согласно настоящему изобретению, может эффективно пролонгировать период полувыведения свиного ФСГ, снизить количество введений, снизить иммуногенность и повысить частоту эструса и количество овуляций у свиней, крупного рогатого скота, овец и тому подобного, и не вызывает нежелательных реакций у животных, и может заменить ФСГ из свиного аденогипофиза и PMSG в области разведения животных.
Краткое описание чертежей
2
2
На Фигуре 1 представлена диаграмма, показывающая ДСН-ПААГ электрофорез pFSH-Fc-1 и pFSH-Fc-2 в Примере 1 настоящего изобретения. При этом А и С - денатурированные электрофореграммы pFSH-Fc-1 и pFSH-Fc-2, соответственно; В и D - не денатурированные электрофореграммы pFSH-Fc-1 и pFSH-Fc-2, соответственно. МК: Белковый маркер; 1: Очищенный ферментационный бульон; 2: проточный раствор из хроматографии Белка А; 3: раствор, собранный при хроматографии Белка А; 4: раствор, собранный при хроматографии Capto S; и 5: раствор, собранный при хроматографии Capto Q. Структурная формула pFSH-Fc-1 - (pFSHβ:pFSHα-L-Fc), а структурная формула pFSH-Fc-2 - (pFSHα:pFSHβ-L-Fc).
На Фигуре 2 представлена диаграмма, показывающая яичник крысы в группах pFSH-Fc-1, pFSH-Fc-2 и PMSG в Примере 2 настоящего изобретения. При этом 10 ME, 20 ME и 40 ME показывают, что крысам в группах pFSH-Fc-1, pFSH-Fc-2 и PMSG сделали инъекцию соответствующих лекарственных средств в количествах 10 ME, 20 ME и 40 ME, соответственно.
На Фигуре 3 представлена диаграмма, показывающая яичник суперовулированных первородящих овцематок No. 1 в группах pFSH-Fc-1, pFSH-Fc-2, PMSG, hFSH-hFc и pFSH-hFc в Примере 4 настоящего изобретения.
Конкретные способы осуществления вариантов реализации
Следующие примеры предназначены для иллюстрации настоящего изобретения, но не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. Если не указано иное, Примеры основаны на стандартных экспериментальных условиях, таких как Sambrook J & Russell DW, молекулярное клонирование: лабораторное руководство, 2001, или в соответствии с условиями, предполагаемыми в инструкциях производителя.
hFSH-hFc и pFSH-hFc, описанные в следующих примерах, получены путем связывания β-субъединиц с hFc, и способ конструирования такой же, как в pFSH-Fc-2, и включает: генетические последовательности человеческого ФСГα, человеческого ФСГβ и человеческого Fc были найдены после поиска, после оптимизации кодонов, гены hFSHα, hFSHβ-L-hFc, pFSHα и pFSHβ-L-hFc были синтезированы искусственно, и рекомбинантные плазмиды hFSHα и hFSHβ-L-hFc, pFSHα и pFSHβ-L-hFc были перенесены в клетки 293 путем транзиентной трансфекции для экспрессии, и очистка была проведена для получения hFSH-hFc и pFSH-hFc.
Пример 1: Приготовление белков pFSH-Fc-1 и pFSH-Fc-2
В базе данных GeneBank проводили поиск последовательностей генов свиного ФСГα (GenBank NM-214446.1), свиного ФСГβ (GenBank NM-213875.1) и свиного Fc (GenBank ВАЕ20056). Проводили оптимизацию кодонов. Нуклеотидная последовательность pFSHα представлена SEQ ID NO: 2; нуклеотидная последовательность pFSHβ представлена SEQ ID NO: 4; последовательность pFSHα-L-pFc представлена SEQ ID NO: 7; нуклеотидная последовательность pFSHβ-L-pFc представлена SEQ ID NO: 9.
Искусственно синтезированные гены pFSHα, pFSHβ, pFSHα-L-pFc и pFSHβ-L-pFc клонировали в вектор pcDNA3.1, соответственно. Рекомбинантные векторы pFSHβ и pFSHα-L-pFc, pFSHα и pFSHβ-L-pFc соответственно электрофоретически переносили в клетки 293 для экспрессии pFSH-Fc-1 и pFSH-Fc-2, а белки, полученные путем транзиентной трансфекции и экспрессии, очищали и проверяли на активность. После подтверждения активности рекомбинантные векторы pFSHβ и pFSHα-L-pFc, pFSHα и pFSHβ-L-pFc линеаризовали и электрофоретически перенесли в клетки СНО для получения стабильных клеточных линий pFSH-Fc-1 и pFSH-Fc-2.
Стабильные клетки pFSH-Fc-1 и pFSH-Fc-2 подвергали ферментативному культивированию в ферментере, ферментативный бульон подвергали фильтрации для удаления клеток и клеточного дебриса с использованием двухступенчатого толстослойного комплекта фильтрующих мембран, а затем отфильтрован через фильтрующую мембрану с размером пор 0,22 мкм для получения осветленного ферментативного бульона. Ферментативный бульон первоначально очищали методом афинной хроматографии на основе связывания с белком A (MabSelect SuReTM, GE Healthcare): сначала уравновешивали до базовой линии уравновешивающим раствором (50 мМ глицина, 0,15 М NaCl, рН 7,2), а затем элюировали элюентом (50 мМ глицина, рН 3,0) и собирали элюат. Раствор, собранный после хроматографии на основе связывания с белком А, очищали далее методом хроматографии на колонке с катионообменной средой Capto S (GE Healthcare): уровень рН собранного раствора доводили до 6,5 при помощи 1 М NaOH, проводимость вышеуказанного раствора доводили до 4,5-5,0 мСм/см при помощи воды, собранный раствор уравновешивали уравновешивающим раствором (50 мМ глицина, рН 6,5), загружали и собирали проточный элюат. Раствор, собранной после хроматографии на колонке с катионообменной средой Capto S, подвергали итоговой очистке на колонке с анионообменной средой Capto Q (GE Healthcare): рН собранного раствора доводили до 8 при помощи 1 М NaOH, уравновешивали до базовой линии уравновешивающим раствором (50 мМ глицина, рН 8,0) с последующим элюированием элюентом (50 mM глицина, 1 М KCl, рН 8,0) и собирали очищенный белок. Изучаемый очищенный белок исследовали методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ) (Фиг. 1).
Пример 2: Анализ активности белков pFSH-Fc-1 и pFSH-Fc-2
Активность белков pFSH-Fc-1 и pFSH-Fc-2 измеряли с помощью теста на увеличение веса яичников у крыс (тест Стилмана-Поли). Продукт по настоящему изобретению предназначен для применения в области разведения животных вместо PMSG. Таким образом, активность образца определяли согласно "Serum Gonadotropin Bioassay" в Pharmacopoeia of China, издание 2015 г., используя PMSG в качестве стандарта. В частности, тест осуществлялся следующим образом: из pFSH-Fc-1 (с расчетным значением специфической активности 10000 ед./мг), pFSH-Fc-2 (с расчетным значением специфической активности 10000 ед./мг) и PMSG готовили составы в трех дозах: 40 ME (высокая концентрация), 20 ME (средняя концентрация) и 10 ME (низкая концентрация) соответственно. Самки крыс линии Спрег-Доули (SD) в возрасте 21-23 дня и весом 40-55 г в произвольном порядке делили на 9 групп, по 6 особей в каждой группе. Каждой крысе вводили по 0,5 мл соответствующего препарата подкожно. По прошествии 6 дней крыс умерщвляли, взвешивали и иссекали, яичники удаляли и взвешивали, полученные значения веса яичников переводили в вес яичников на 100 г веса тела (Фиг. 2). Значение специфической активности pFSH-Fc-1 согласно расчетам с применением программного обеспечения "Pharmacopoeia Bioassay Statistics BS2000" Национальных институтов по контролю качества пищевых продуктов и медикаментов (National Institutes for Food and Drug Control) приблизительно составило 9600 ед./мг, a значение специфической активности pFSH-Fc-2 составило около 10700 ед./мг.
Пример 3: Исследование фармакокинетических свойств белков pFSH-Fc-1 и pFSH-Fc-2
Десять самок крыс линии SD весом примерно 40 г в произвольном порядке делили на две группы: группу pFSH-Fc-1 и группу pFSH-Fc-2. Соответствующий лекарственный препарат вводили подкожно в дозе 20 МЕ/кг веса тела, отбирали по 100 мкл крови в контрольных точках 0, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120 и 144 часа после введения, соответственно, центрифугировали при 3000 об./мин, отбирали сыворотку и хранили при -80°C для целей криоконсервации. Содержание pFSH-Fc-1 и pFSH-Fc-2 в сыворотке измеряли при помощи набора ИФА для определения ФСГ, и каждый образец крови анализировали в трех повторностях. В соответствии с расчетами с применением программного обеспечения PKSolver период полувыведения pFSH-Fc-1 составил 57,2 часа, а период полувыведения pFSH-Fc-2 составил 63,4 часа, оба из которых были выше, чем период полувыведения натурального свиного ФСГ и были ниже, чем период полувыведения PMSG.
Пример 4: Применение белков pFSH-Fc-1 и pFSH-Fc-2 для стимулирования синхронизации эструса и суперовуляции у первородящих и повторнородящих свиноматок
Отобрали 100 первородящих свиноматок йоркширской породы и повторнородящих свиноматок йоркширской породы с отсутствием эструса через 2 недели после отъема, весом 85-100 кг, одинакового экстерьера и со схожими признаками, соответственно. Животных делили на 5 групп в произвольном порядке: группы pFSH-Fc-1, pFSH-Fc-2, PMSG, hFSH-hFc и pFSH-hFc; далее каждую из групп делили на группу первородящих и группу повторнородящих свиноматок. По 1000 ME соответствующих препаратов вводили в виде инъекции в мышцы шеи, позади уха свиней-доноров каждой из групп, а через 72 часа вводили еще по 500 ME HCG в виде инъекции. Эструс в каждой группе свиноматок наблюдали спустя 5 дней. За исключением того, что свиноматку йоркширской породы №1 в эструсе из группы первородящих свиноматок забивали и изымали яичник для фотосъемки, свиноматок в эструсе из других групп случали с хряками такого же экстерьера 3 раза с интервалами в 12 часов каждый раз. Через 36 часов после первой случки у свиней-доноров хирургическим путем извлекали яйцеклетки и подсчитывали количество овулировавших яйцеклеток (Фиг. 3).
Полученные результаты приведены в Таблице 1. У свиней-доноров в каждой из групп был хороший эструс, показатели эструса у первородящих и у повторнородящих свиноматок в группе pFSH-Fc-1 составили 90% и 95%, соответственно, что было выше, чем показатели эструса в группе PMSG (60% и 65%), в группе hFSH-hFc (65% и 70%) и в группе pFSH-hFc (80% и 85%), и существенно отличались от показателей эструса в группе PMSG и в группе hFSH-hFc (Р<0,05). Показатели эструса первородящих и повторнородящих свиноматок в группе pFSH-Fc-2 составили 100% и существенно отличались от показателей эструса в группе PMSG и в группе hFSH-hFc (Р<0,01).
Число овулировавших яйцеклеток в каждой группе свиноматок было выше, чем у здоровых свиноматок в естественном эструсе (от 8 до 14 на свинью), а среднее число овулировавших яйцеклеток на свинью у первородящих и повторнородящих животных в группе pFSH-Fc-1 составило 27,7 и 27,5, соответственно, что было выше, чем в группе PMSG (19,8 и 20,2), в группе hFSH-hFc (22,1 и 21,6) и в группе pFSH-hFc (25,7 и 26,2) и существенно отличалось от аналогичных показателей в группе PMSG и группе hFSH-hFc (Р<0,05). Среднее число овулировавших яйцеклеток на свинью у первородящих и повторнородящих животных в группе pFSH-Fc-2 составило 29,9 и 29,1, соответственно, что было выше, чем в группе PMSG, в группе hFSH-hFc и в группе pFSH-hFc и существенно отличалось от аналогичных показателей в группе PMSG и в группе hFSH-hFc (Р<0,05).
Пример 5: Применение белков pFSH-Fc-1 и pFSH-Fc-2 для увеличения размера помета у свиноматок
Отобрали 50 первородящих свиноматок йоркширской породы одинакового экстерьера и со схожими признаками. Их разделили на 5 групп: группы pFSH-Fc-1, pFSH-Fc-2, PMSG, hFSH-hFc и pFSH-hFc, каждой группе свиноматок вводили в виде инъекции препараты согласно способу, описанному в Примере 4. Во время эструса свиноматок в эструсе случали с хряками такого же экстерьера 3 раза с интервалами в 12 часов каждый раз. Размер помета в каждой группе свиноматок подробно фиксировали.
Полученные результаты показаны в Таблице 2, суммарный размер помета свиноматок в группах pFSH-Fc-1 и pFSH-Fc-2 (123 и 125) было выше, чем в группе PMSG (65), группе hFSH-hFc (68) и группе pFSH-hFc (99) и существенно отличалось от аналогичных показателей в группах PMSG и hFSH-hFc (Р<0,05). Средний размер помета на один опорос в группах pFSH-Fc-1 и pFSH-Fc-2 (13,7 и 13,9) также был выше, чем в группе PMSG (10,1), группе hFSH-hFc (10,5) и группе pFSH-hFc (12,4).
Пример 6: Применение белков pFSH-Fc-1 и pFSH-Fc-2 в лечении свиноматок с анэструсом
100 свиноматок йоркширской породы без эструса на протяжении более 21 дня после отъема произвольно разделили на 5 групп: группы pFSH-Fc-1, pFSH-Fc-2, PMSG, hFSH-hFc и pFSH-hFc. По 1000 ME соответствующих препаратов вводили в виде инъекции соответственно в мышцы шеи, позади уха свиней-доноров каждой из групп, а через 72 часа вводили еще по 500 ME HCG в виде инъекции. Наблюдали характеристики эструса у свиноматок: такие как покраснение и слизь в вульве; и рефлекс неподвижности при нажатии на спину. Свиноматок в эструсе случали с хряками согласно Примерам 4 и 5, и фиксировали условия оплодотворения.
Полученные результаты приведены в Таблице 3. Свиноматки в анэструсе были чувствительны к реакциям препарата, показатели эструса у свиноматок в группах pFSH-Fc-1 и pFSH-Fc-2 (85% и 90%) были выше, чем в группе PMSG (55%), группе hFSH-hFc (65%) и группе pFSH-hFc (75%) и существенно отличались от показателя в группе PMSG (Р<0,05). Показатели супоросности свиноматок в группах pFSH-Fc-1 и pFSH-Fc-2 (88,2% и 88,9%) также были выше, чем в группе PMSG (63,6%), группе hFSH-hFc (61,5%) и группе pFSH-hFc (73,3%), и разница была несущественной (Р>0,05).
Пример 7: Применение белков pFSH-Fc-1 и pFSH-Fc-2 в стимуляции суперовуляции у коров
50 коров голштинской породы в возрасте 3-6 лет, здоровых, без заболеваний произвольным образом разделили на группы pFSH-Fc-1, pFSH-Fc-2, PMSG, hFSH-hFc и pFSH-hFc. Каждая группа коров получала по 1 кг комбикорма на основе оригинального рациона, одновременно коровам внутримышечно вводили VA, VD и VE. Каждой корове-донору имплантировали интравагинально вкладыш CIDR с препаратом прогестерона (содержащий прогестерон в концентрации 1,56 г/интравагинальный вкладыш). День введения вкладыша регистрировали как День 0, коровам-донорам в каждой группе внутримышечно вводили инъекции по 1000 ME соответствующего препарата (День 5) и по 0,5 мг клопростенола (ПГ), затем вкладыш извлекали (День 10) и наблюдали эструс, приоритетным показателем считали садку быка, принимаемую коровой-донором. Первое осеменение проводили через 12 часов активной течки, второе осеменение проводили через 24 часа активной течки. Зародышей собирали на День 16 путем нехирургической промывки и подсчитывали количество зародышей.
Полученные результаты приведены в Таблице 4, эффекты, оказываемые на суперовуляцию коров-доноров в каждой группе введения были значительными (в естественных условиях от одной коровы получают только один эмбрион), а среднее количество эмбрионов на одну корову в группах pFSH-Fc-1 и pFSH-Fc-2 (7,9 и 8,7) было выше, чем в группе PMSG (5,7), группе hFSH-hFc (6,1) и группе pFSH-hFc (7,3) и существенно отличалось от аналогичного показателя в группе PMSG и в группе hFSH-hFc (Р<0,05). Среднее количество пригодных для дальнейшего развития эмбрионов на одну корову в группах pFSH-Fc-1 и pFSH-Fc-2 (6,1 и 7,4) было выше, чем в группе PMSG (3,5), группе hFSH-hFc (3,9), а также в группе pFSH-hFc (5,7) и существенно отличалось от показателя в группе PMSG и в группе hFSH-hFc (Р<0,05). Среднее количество непригодных для дальнейшего развития эмбрионов на одну корову в группах pFSH-Fc-1 и pFSH-Fc-2 (1,8 и 1,3) было ниже, чем в группе PMSG (2,2) и группе hFSH-hFc (2,2), и показатель в группе pFSH-Fc-2 был меньше, чем в группе pFSH-hFc (1,6), и разница между группой pFSH-Fc-2 и группой PMFG, а также hFSH-hFc была значительной (Р<0,05).
Пример 8 Применение белков pFSH-Fc-1 и pFSH-Fc-2 в стимуляции синхронизации эструса у самок коз
75 коз в возрасте 1,5-3 года, весом 30-45 кг, здоровых, без заболеваний произвольным образом разделили на группы pFSH-Fc-1, pFSH-Fc-2, PMSG, hFSH-hFc и pFSH-hFc. Каждой козе-донору имплантировали интравагинально вкладыш с препаратом прогестерона в любой день цикла эструса, и такой день регистрировали как День 0. Каждой козе-донору внутримышечно вводили по 300 ME соответствующего препарата (День 10), затем вкладыш извлекали (День 12). Наблюдали характеристики эструса у самок коз, для определения прихода самок коз в эструс использовали козла-пробника. Ситуации, в которых имело место покраснение и слизь в вульве у самок коз, а также принятие садки считали эструсом, и рассчитывали показатель эструса.
Полученные результаты приведены в Таблице 5, эструс у самок коз в каждой группе был очевидным, оба показателя эструса самок коз в группах pFSH-Fc-1 и pFSH-Fc-2 составили 93,3%, чтобы было выше показателей в группе PMSG (60%), группе hFSH-hFc (73,3%) и группе pFSH-hFc (80,0%) и существенно отличались от показателя в группе PMSG (Р<0,05).
Пример 9: Детекция антигенного иммунитета белков pFSH-Fc-1 и pFSH-Fc-2
490 нм
Антигенный иммунитет белков pFSH-Fc-1 и pFSH-Fc-2 детектировали посредством детекции антител к лекарственному препарату (ADA) в сыворотке образца с помощью мостикового ИФА. Отобрали 40 йоркширских первородящих свиноматок и разделили их на 4 группы: группа pFSH-Fc-1, группа pFSH-Fc-2, группа hFSH-hFc и группа pFSH-hFc. По 1000 ME препаратов вводили в виде инъекции в мышцы шеи, позади уха каждой свиньи-донора, и вводили один раз каждые три дня на протяжении в общей сложности 5 недель (13 раз введения), и день первого введения регистрировали как День 0. Образцы крови отбирали в следующих точках: перед первым введением (День-2), перед третьим введением (День 6), перед пятым введением (День 12) и перед шестым введением до последнего введения (День 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33 и 36), и на третий день после последнего введения (День 39). Кровь центрифугировали, собирали сыворотку, детектировали при OD значение ADA в сыворотке на планшете для ИФА, покрытом pFSH-Fc-1, pFSH-Fc-2, hFSH-hFc или pFSH-hFc, соответственно. Готовили образцы для положительного контроля с кроличьим моноклональным антителом против pFSH-Fc-1, против pFSH-Fc-2, против hFSH-hFc или против pFSH-hFc, разведенным с 100% смешанной свиной сывороткой, соответственно; и готовили образцы отрицательного контроля (N) с сывороткой первородящей свиноматки йоркширской породы, инъецированной с таким же количеством буфера PBS. Пороговое значение (SCP) использовали в качестве критерия оценки для разграничения испытуемых образцов на положительные и отрицательные. В соответствии с расчетами с применением программного обеспечения JMP для статистического анализа значение SCP составило 1,15, то есть, при значении SCP≥1,15 образец считали положительным и содержащим ADA; в противном случае образец считали отрицательным и не содержащим ADA.
Результаты приведены в Таблице 6, все значения SCP для образцов, полученных от свиней-доноров в группах pFSH-Fc-1 и pFSH-Fc-2, были ниже, чем 1,15, и ADA не детектировали, что свидетельствовало об отсутствии образования антител к лекарственному препарату у свиноматок йоркширской породы, инъецированных 1000 ME pFSH-Fc-1 или pFSH-Fc-2. В группе hFSH-hFc значения SCP в образцах сыворотки свиноматок №№1, 2, 4, 7 и 9 были больше, чем 1,15 в День 27 и после Дня 27 (первое обнаружение в День 27, последнее обнаружение в День 39), а значения SCP в образцах сыворотки других свиноматок были больше, чем 1,15 в День 30 и после Дня 30 (первое обнаружение в День 30, последнее обнаружение в День 39), что свидетельствует о том, что ADA детектировали у всех свиноматок в группе hFSH-hFc, т.е. показатель позитивности составил 100%. В группе pFSH-hFc значения SCP в образцах сыворотки свиноматок №№2, 3, 6, 7 и 9 были больше, чем 1,15 в День 30 и после Дня 30 (первое обнаружение в День 30, последнее обнаружение в День 39), значения SCP в образцах сыворотки свиноматок №№1, 5 и 8 были больше, чем 1,15 в День 36 и после Дня 36 (первое обнаружение в День 36, последнее обнаружение в День 39), и значения SCP во всех образцах сыворотки свиноматок №№4 и 10 были меньше, чем 1,15, что свидетельствует о том, что ADA детектировали у 8 свиноматок в группе pFSH-hFc, т.е. показатель позитивности составил 80%. Приведенные выше результаты свидетельствуют о том, что у свиноматок йоркширской породы, инъецированных 1000 ME hFSH-hFc или pFSH-hFc, вырабатываются антитела к лекарственному препарату.
Хотя настоящее изобретение подробно описано выше при помощи общего описания и конкретных вариантов осуществления, возможность внесения некоторых модификаций или улучшений на основе настоящего изобретения будет очевидной для специалиста в данной области техники. Следовательно, все такие модификации и улучшения, внесенные без отклонения от сути настоящего изобретения, подпадают под объем защиты настоящего изобретения.
Промышленная применимость
В настоящем изобретении предложены два длительно действующих рекомбинантных гибридных белка свиного ФСГ (follicle-stimulating hormone - фолликулостимулирующего гормона), содержащих pFSH-Fc-1 и pFSH-Fc-2. α-субъединица/β-субъединица прямо или непрямо гибридизирована с Fc-фрагментом посредством связывающего компонента; β-субъединица/α-субъединица связана с α-субъединицей/β-субъединицей посредством ван-дер-ваальсовой силы или связывающего компонента. Гибридные белки свиного ФСГ можно приготовить, используя эукариотическую систему экспрессии на основе технологии генной инженерии. Два гибридных белка свиного ФСГ, предложенных в настоящем изобретении, обладают хорошим лечебным эффектом и более длительным периодом полувыведения по сравнению с периодом полувыведения у натурального свиного ФСГ; не вызывают нежелательных эффектов у животных, не приводят к иммуногенности у свиноматок, не вызывают выработку антител к препарату и могут заменить гонадотропин из сыворотки беременных кобыл (PMSG), применяемый в разведении животных, могут эффективно стимулировать коэффициент воспроизводства животных, в особенности сельскохозяйственных животных, а также имеют хорошие экономическую ценность и перспективы применения.
--->
Перечень последовательностей
<110> BEIJING VJT BIO CO., LTD.
<120> Long-acting Recombinant Porcine FSH Fusion Protein and  Preparation
Method and Application Thereof
<130> KHP193910062.1
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 96
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 1
Phe Pro Asp Gly Glu Phe Thr Met Gln Gly Cys Pro Glu Cys Lys Leu
1        5          10         15
Lys Glu Asn Lys Tyr Phe Ser Lys Leu Gly Ala Pro Ile Tyr Gln Cys
20         25         30
Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Ala Arg Ser Lys
35         40         45
Lys Thr Met Leu Val Pro Lys Asn Ile Thr Ser Glu Ala Thr Cys Cys
50         55         60
Val Ala Lys Ala Phe Thr Lys Ala Thr Val Met Gly Asn Ala Arg Val
65         70         75         80
Glu Asn His Thr Glu Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser
85         90         95
<210> 2
<211> 288
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 2
ttccctgacg gcgagttcac catgcagggc tgccccgagt gcaagctgaa ggagaacaag    60
tacttctcca agctgggcgc ccccatctac cagtgcatgg gctgctgctt ctcccgggct    120
taccctaccc ctgcccggtc caagaagacc atgctggtgc ccaagaacat cacctccgag    180
gccacctgtt gcgtggccaa ggccttcacc aaggccaccg tgatgggcaa cgccagggtg    240
gagaaccaca ccgagtgcca ctgcagcacc tgctactacc acaagtcc          288
<210> 3
<211> 109
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 3
Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Thr Val Glu Lys Glu Glu Cys Asn
1        5          10         15
Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys Tyr Thr
20         25         30
Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Asn Ile Gln Lys Thr
35         40         45
Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Lys Val Pro Gly Cys
50         55         60
Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr Glu Cys
65         70         75         80
His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val Arg Gly
85         90         95
Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Ser Glu Met Lys Glu
100         105
<210> 4
<211> 327
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 4
tgcgaactca caaacatcac catcaccgtg gaaaaggagg agtgcaactt ctgcatcagc    60
atcaacacca cctggtgcgc cggctattgc tatacaaggg atctggtcta caaggacccc    120
gccaggccca acatccagaa gacatgcacc ttcaaggagc tggtgtatga aaccgtgaag    180
gtccccggat gcgcccatca cgccgattcc ctgtacacct accccgtggc taccgagtgc    240
cattgcggca agtgcgactc cgactccacc gattgtacag tgaggggcct cggaccctcc    300
tactgctcct ttagcgagat gaaggag                      327
<210> 5
<211> 221
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 5
Ile Cys Pro Ala Cys Glu Ser Pro Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
1        5          10         15
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Gln Val Thr
20         25         30
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asn Pro Glu Val Gln Phe Ser
35         40         45
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Arg Pro Lys
50         55         60
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile
65         70         75         80
Gln His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn
85         90         95
Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Thr Arg Ile Ile Ser Lys Ala Lys
100         105         110
Gly Gln Thr Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro His Ala Glu
115         120         125
Glu Leu Ser Arg Ser Lys Val Ser Ile Thr Cys Leu Val Ile Gly Phe
130         135         140
Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu
145         150         155         160
Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly
165         170         175
Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Phe Ser Val Asp Lys Ala Ser Trp Gln
180         185         190
Gly Gly Gly Ile Phe Gln Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn
195         200         205
His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Thr Pro Gly Lys
210         215         220
<210> 6
<211> 332
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>(: Laboratory synthesis;)
<400> 6
Phe Pro Asp Gly Glu Phe Thr Met Gln Gly Cys Pro Glu Cys Lys Leu
1        5          10         15
Lys Glu Asn Lys Tyr Phe Ser Lys Leu Gly Ala Pro Ile Tyr Gln Cys
20         25         30
Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Ala Arg Ser Lys
35         40         45
Lys Thr Met Leu Val Pro Lys Asn Ile Thr Ser Glu Ala Thr Cys Cys
50         55         60
Val Ala Lys Ala Phe Thr Lys Ala Thr Val Met Gly Asn Ala Arg Val
65         70         75         80
Glu Asn His Thr Glu Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser
85         90         95
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile
100         105         110
Cys Pro Ala Cys Glu Ser Pro Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
115         120         125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Gln Val Thr Cys
130         135         140
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asn Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp
145         150         155         160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Arg Pro Lys Glu
165         170         175
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln
180         185         190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
195         200         205
Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Thr Arg Ile Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210         215         220
Gln Thr Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro His Ala Glu Glu
225         230         235         240
Leu Ser Arg Ser Lys Val Ser Ile Thr Cys Leu Val Ile Gly Phe Tyr
245         250         255
Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Pro
260         265         270
Glu Gly Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr
275         280         285
Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Phe Ser Val Asp Lys Ala Ser Trp Gln Gly
290         295         300
Gly Gly Ile Phe Gln Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
305         310         315         320
Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Thr Pro Gly Lys
325         330
<210> 7
<211> 996
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> (: Laboratory synthesis; )
<400> 7
ttccctgacg gcgagttcac catgcagggc tgccccgagt gcaagctgaa ggagaacaag    60
tacttctcca agctgggcgc ccccatctac cagtgcatgg gctgctgctt ctcccgggct    120
taccctaccc ctgcccggtc caagaagacc atgctggtgc ccaagaacat cacctccgag    180
gccacctgtt gcgtggccaa ggccttcacc aaggccaccg tgatgggcaa cgccagggtg    240
gagaaccaca ccgagtgcca ctgcagcacc tgctactacc acaagtccgg aggaggagga    300
tccggaggag gcggctccgg cggcggaggc agcatctgtc ctgcttgtga gagccccggc    360
cctagcgtgt ttatcttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatctc caggaccccc    420
caggtcacct gtgtcgtggt ggacgtgagc caggagaacc ctgaggtcca gttttcctgg    480
tacgtggatg gcgtggaggt gcacaccgcc cagaccaggc ccaaggagga acagttcaat    540
tccacctacc gggtggtgag cgtgctgcct atccagcatc aggactggct gaacggaaag    600
gagtttaagt gcaaggtcaa caacaaggac ctgcccgccc ccatcaccag gatcatcagc    660
aaagctaaag gccagacccg ggaaccccag gtgtacaccc tgcctcccca cgctgaggag    720
ctgtccagga gcaaggtgag catcacatgc ctggtcattg gcttctaccc tcccgacatc    780
gacgtcgaat ggcagaggaa tggccagccc gaacccgagg gaaactacag gaccacccct    840
ccccagcagg acgtggatgg aacctatttt ctgtactcca agttctccgt ggacaaggcc    900
tcctggcagg gcggcggaat ttttcagtgc gccgtgatgc acgaggctct ccacaaccat    960
tacacccaga agtccatctc caagaccccc ggcaaa                 996
<210> 8
<211> 345
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> (:Laboratory synthesis; )
<400> 8
Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Thr Val Glu Lys Glu Glu Cys Asn
1        5          10         15
Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys Tyr Thr
20         25         30
Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Asn Ile Gln Lys Thr
35         40         45
Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Lys Val Pro Gly Cys
50         55         60
Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr Glu Cys
65         70         75         80
His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val Arg Gly
85         90         95
Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Ser Glu Met Lys Glu Gly Gly Gly
100         105         110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Cys Pro Ala
115         120         125
Cys Glu Ser Pro Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys
130         135         140
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Gln Val Thr Cys Val Val Val
145         150         155         160
Asp Val Ser Gln Glu Asn Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp
165         170         175
Gly Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe
180         185         190
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp
195         200         205
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu
210         215         220
Pro Ala Pro Ile Thr Arg Ile Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Thr Arg
225         230         235         240
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro His Ala Glu Glu Leu Ser Arg
245         250         255
Ser Lys Val Ser Ile Thr Cys Leu Val Ile Gly Phe Tyr Pro Pro Asp
260         265         270
Ile Asp Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn
275         280         285
Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Tyr Phe Leu
290         295         300
Tyr Ser Lys Phe Ser Val Asp Lys Ala Ser Trp Gln Gly Gly Gly Ile
305         310         315         320
Phe Gln Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
325         330         335
Lys Ser Ile Ser Lys Thr Pro Gly Lys
340         345
<210> 9
<211> 1035
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> (:Laboratory synthesis；)
<400> 9
tgcgaactca caaacatcac catcaccgtg gaaaaggagg agtgcaactt ctgcatcagc    60
atcaacacca cctggtgcgc cggctattgc tatacaaggg atctggtcta caaggacccc    120
gccaggccca acatccagaa gacatgcacc ttcaaggagc tggtgtatga aaccgtgaag    180
gtccccggat gcgcccatca cgccgattcc ctgtacacct accccgtggc taccgagtgc    240
cattgcggca agtgcgactc cgactccacc gattgtacag tgaggggcct cggaccctcc    300
tactgctcct ttagcgagat gaaggaggga ggaggaggat ccggaggagg cggctccggc    360
ggcggaggca gcatctgtcc tgcttgtgag agccccggcc ctagcgtgtt tatcttcccc    420
cccaagccca aggacaccct gatgatctcc aggacccccc aggtcacctg tgtcgtggtg    480
gacgtgagcc aggagaaccc tgaggtccag ttttcctggt acgtggatgg cgtggaggtg    540
cacaccgccc agaccaggcc caaggaggaa cagttcaatt ccacctaccg ggtggtgagc    600
gtgctgccta tccagcatca ggactggctg aacggaaagg agtttaagtg caaggtcaac    660
aacaaggacc tgcccgcccc catcaccagg atcatcagca aagctaaagg ccagacccgg    720
gaaccccagg tgtacaccct gcctccccac gctgaggagc tgtccaggag caaggtgagc    780
atcacatgcc tggtcattgg cttctaccct cccgacatcg acgtcgaatg gcagaggaat    840
ggccagcccg aacccgaggg aaactacagg accacccctc cccagcagga cgtggatgga    900
acctattttc tgtactccaa gttctccgtg gacaaggcct cctggcaggg cggcggaatt    960
tttcagtgcg ccgtgatgca cgaggctctc cacaaccatt acacccagaa gtccatctcc   1020
aagacccccg gcaaa                                                    1035
<---