Карнозин восстанавливает активацию сигнальных каскадов и соотношение белковрегуляторов апоптоза в приочаговой зоне при необратимой фокальной ишемии мозга у крыс

Карнозин восстанавливает активацию сигнальных каскадов и соотношение белков-регуляторов апоптоза в приочаговой зоне при необратимой фокальной ишемии мозга у крыс

о.м. лопачева1, А.в. лопачев1, к.н. куличенкова1, А.А. девятов1, д.с. Бережной1, с.л. стволинский1, о.и. куликова1, с.А. Гаврилова2, м.П. морозова2, т.н. Федорова1

ФГБНУ «Научный центр неврологии», Москва, Россия; 2ФГОУ ВПО ««Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», Москва, Россия

Введение. Ишемический инсульт - одно из самых распространенных и социально значимых заболеваний, в патогенезе которого важная роль отводится окислительному стрессу. Изучение механизмов нейропротекторного действия природного антиоксиданта карнозина представляется перспективным для разработки лекарственных препаратов на его основе.

Цель исследования. Изучение влияния карнозина на уровень белков-регуляторов апоптоза семейства Bcl-2 и уровень активации протеинкиназы B (Akt) и MAP киназ ERK1/2, p38 и JNK в мозге крыс, перенесших 24-часовую необратимую фокальную ишемию мозга.

Материалы и методы. В модели необратимой фокальной ишемии головного мозга, вызванной окклюзией средней мозговой артерии, у крыс линии Wistar методом вестерн-блоттинга оценивали уровень экспрессии белков семейства Bcl-2 и фосфорилирования киназ Akt, ERK1/2, p38 и JNK в приочаговой зоне коры ишемизированного полушария и симметричного участка контрлатерального полушария, а также аналогичных участков мозга интактных животных. Карнозин вводили животным внутрибрюшинно в дозах 50 мг/кг и 500мг/кг массы тела в постишемическом периоде. Результаты. При необратимой фокальной ишемии головного мозга у крыс в приочаговой зоне повышалось количество Bax и, в меньшей степени, Bcl-2, смещая соотношение Bcl-2/Bax в сторону проапоптотического сигнала, а также наблюдалось снижение активации Akt и рост активации ERK1/2. Введение карнозина восстанавливало уровень активации Akt и соотношение Bcl-2/Bax, однако не влияло на повышенную активацию ERK1/2. Существенных изменений уровня белков Bak, Bcl-xL и Bcl-w и активации киназ p38 и JNK в приочаговой зоне не было обнаружено. Заключение. Нейропротекторное действие карнозина в условиях необратимой фокальной ишемии головного мозга у крыс сопровождается восстановлением активации Akt и соотношения Bcl-2/Bax в приочаговой зоне до уровня, наблюдаемого у интактных животных, что препятствует развитию апоптоза.

ключевые слова: карнозин, необратимая фокальная ишемия головного мозга, приочаговая зона, семейство Bcl-2, Akt, MAP киназы.

для цитирования: Лопачева О.М., Лопачев А.В., Куличенкова К.Н. и др. Карнозин восстанавливает активацию сигнальных каскадов и соотношение белков-регуляторов апоптоза в приочаговой зоне при необратимой фокальной ишемии мозга у крыс. Анналы клинической и экспериментальной неврологии. 2018; 12(1): 38-49.

DOI: 10.25692/ACEN.2018.1.6

Carnosine restores the activation of signaling cascades

and the ratio of apoptosis-regulating proteins in the penumbra zone after a permanent focal cerebral

ischemia in rats

olga M. Lopacheva1, Alexander v. Lopachev1, Kseniya N. Kulichenkova1, Alexander A. Devyatov1, Daniil s. Berezhnoy1, sergey L. stvolinsky1, olga I. Kulikova1, svetlana a. Gavrilova2, Mariya p. Morozova2, Tatiana п. Fedorova1

Research Center of Neurology, Moscow, Russia; 2Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia

Introduction. Ischemic stroke is one of the most common and socially significant diseases, and its pathogenesis is associated with oxidative stress. The study of mechanisms of the neuroprotective action of the natural antioxidant carnosine is promising in the context of carnosine-based drug development. Objective. To study the effect of carnosine on the level of apoptosis-regulating proteins of the Bcl-2 family and the level of activation ofprotein kinase B (Akt) and MAP kinases ERK1/2, p38 and JNK in the rat brain after a 24-hour permanent focal cerebral ischemia.

Карнозин при ишемии мозга у крыс

Materials and methods. In the model of permanent focal cerebral ischemia caused by the occlusion of the middle cerebral artery in Wistar rats, we assessed, using Western blotting, the level of expression of Bcl-2 family proteins and the phosphorylation of Akt, ERK1/2, p38 and JNK in the penumbra zone of the cortex in the ischemic hemisphere and in the symmetrical region of the contralateral hemisphere, as well as in similar areas of the brain of intact animals. Carnosine was administered to animals intraperitoneally at doses of 50 mg/kg and 500 mg/kg of body weight in the postischemic period.

Results. In permanent focal cerebral ischemia in rats, the amount of Bax and, to a lesser extent, of Bcl-2 increased in the penumbra zone shifting the Bcl-2/Bax ratio towards the pro-apoptotic signal; a decreased Akt activation and an increased ERK1/2 activation was observed. The administration of carnosine rescued the activation of Akt and the Bcl-2/Bax ratio but did not affect an increased activation of ERK1/2. No significant changes in the level of Bak, Bcl-xL and Bcl-w, and no activation of p38 and JNK were observed in the penumbra zone.

Conclusion. The neuroprotective effect of carnosine in permanent focal cerebral ischemia in rats is accompanied by the restoration of Akt activation and the Bcl-2/Bax ratio in the penumbra zone to the levels observed in intact animals, and this effect prevents the development of apoptosis.

Keywords: carnosine, permanent focal cerebral ischemia, ischemic penumbra, Bcl-2 family, Akt, MAP kinases.

For citation: Lopacheva O.M., Lopachev A.V., Kulichenkova K.N. et al. [Carnosine restores the activation of signaling cascades and the ratio of apoptosis-regulating proteins in the penumbra zone after a permanent focal cerebral ischemia in rats]. Annals of clinical and experimental neurology. 2018; 12

DOI: 10.25692/ACEN.2018.1.6

введение

Ишемический инсульт - одно из самых распространенных и социально значимых заболеваний, в молекулярных механизмах которого важная роль отводится окислительному стрессу (ОС) [1-3]. Недостаток кислорода в мозге вызывает повышение содержания эксайтотоксических аминокислот во внеклеточном пространстве, гиперактивацию внесинап-тических NMDA-рецепторов, следствием чего является нарушение мембранного потенциала и чрезмерное увеличение концентрации Са2+ в цитоплазме нейронов. Это в свою очередь приводит к ОС, дальнейшее развитие которого может индуцировать митохондриальную дисфункцию и связанный с ней апоптоз [4-7]. В стрессовых условиях, когда активность эндогенной антиоксидантной системы клетки снижается, целесообразно применение препаратов, способных препятствовать чрезмерному повышению уровня активных форм кислорода (АФК) внутри клеток и дальнейшему развитию ОС [8]. Однако, несмотря на успешность экспериментальных исследований, антиоксидантная терапия ишеми-ческого инсульта не показала клинической эффективности.

Перспективным природным антиоксидантом является дипептид карнозин (¡З-аланин^-гистидин), характеризующийся широким спектром биологического действия [9, 10]. Карнозин рассматривают как модулятор активности эндогенной антиоксидантной системы [9]. Его нейропро-текторная эффективность была выявлена на различных экспериментальных моделях заболеваний ЦНС, в том числе глобальной и фокальной ишемии мозга грызунов, преимущественно при его профилактическом применении в высоких дозах (до 2 г/кг массы тела) [11-14]. В недавно проведенном в нашей лаборатории исследовании было впервые показано, что низкие суточные дозы карнозина при его введении в постишемическом периоде также способны оказывать нейропротекторное действие. При введении животным карнозина в суточной дозе 50 или 500 мг/кг массы тела в условиях постоянной 72 ч фокальной ишемии площадь очага ишемического повреждения уменьшалась на 27% и 39% соответственно [15]. Нейропротекторный эффект карнозина в мозге экспериментальных животных обеспечивается его способностью проходить через гемато-энцефалический барьер [16] и проникать внутрь нейронов за счет наличия в них трансмембранного переносчика коротких пептидов РЕРТ2 [17]. Однако молекулярные механизмы действия карнозина в условиях фокальной ишемии мозга остаются недостаточно изученными.

Важными участниками ишемического повреждения мозга и эксайтотоксической гибели нейронов являются проапоп-тотические белки семейства Bcl-2 [18]. Данные белки образуют поры во внешней мембране митохондрий, что приводит к выходу в цитоплазму цитохрома C и связыванию с белком Apaf-1, который активирует каспазу 9, запускающую апоптоз через эффекторные каспазы 3/7 [19]. Основными проапоптотическими белками семейства Bcl-2, активирующимися при ишемии мозга, являются Bax [20] и Bak [21]. Одновременно снижается количество ингибирующих их активность антиапоптотических белков Bcl-2, Bcl-xL и Bcl-w [18, 20]. Основными регуляторами баланса про- и антиапоптотических белков при ишемии мозга являются киназы Akt (протеинкиназа B, PKB) [18, 22] и MAP киназы (MAPK) ERK1/2, p38 и JNK [23]. Известно, что при фокальной ишемии снижается активность Akt [23], в то время как эффективные нейропротекторы или ишемическое прекондиционирование за счет повышения активации Akt предотвращают эксайтотоксическую гибель нейронов [24]. Три МАР киназы - ERK1/2, p38 и JNK - активируются при ишемии головного мозга. JNK работает как проапоптоти-ческая киназа. p38 имеет двоякое действие: с одной стороны, запускает выделение провоспалительных цитокинов, с другой - активирует транскрипционный фактор CREB, который в свою очередь активирует антиапоптотические белки Bcl-2 и Bcl-xL. ERK1/2 также активирует CREB, и, кроме того, фосфорилирует p90PSK, который фосфорили-рует и блокирует проапоптотический белок Bad [23, 25, 26].

Для разработки лекарственных препаратов на основе кар-нозина важное значение имеет исследование его влияния на работу перечисленных белков, связанных с регуляцией апоптоза при ишемии мозга. Поэтому целью данной работы стала оценка влияния карнозина на уровень белков-регуляторов митохондриального пути апоптоза семейства Bcl-2 (Bax, Bak, Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w) и активацию сигнальных каскадов Akt и MAPK.

материалы и методы_

Экспериментальные животные. Все исследования на животных выполнялись согласно «Руководству по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских технологиях» [27]. Эксперименты были выполнены на 48 самцах крыс линии "^аг весом 300-350 г. Животных содержали на стандартном гранулированном корме в вентилируемом виварии с режимом освещения

12 час день/12 час ночь при температуре 25±2°C и свободном доступе к воде и пище.

Моделирование необратимой фокальной ишемии головного мозга у крыс. Перед операцией животных наркотизировали хлоралгидратом (400 мг/кг массы тела, внутри-брюшинно). Необратимую фокальную ишемию мозга продолжительностью 24 час моделировали с помощью электрокоагуляции левой ветви средней мозговой артерии (проксимальнее места ее бифуркации на фронтальную и париетальную ветви), а также прилежащей к ней вены с одновременной перевязкой ипсилатеральной сонной артерии. Начало ишемии регистрировали визуально по прекращению кровотока в ветвях среднемозговой артерии дистальнее места коагуляции. Животных, у которых регистрировалась геморрагия или у которых не удавалось прервать кровоток, выводили из эксперимента. Оперированных животных помещали на подогреваемый столик до выхода из наркоза [28, 29].

Крысы были разделены на 4 группы по 12 животных: 1 группа - интактные крысы; 2 группа - крысы, перенесшие окклюзию средней мозговой артерии (ОСМА), с последующим внутрибрюшинным (в/б) введением физиологического раствора (контроль); 3 группа - крысы, перенесшие ОСМА, с последующим в/б введением карнозина в дозе 50 мг/кг массы тела; 4 группа - крысы, перенесшие ОСМА, с последующим в/б введением карнозина в дозе 500 мг/кг массы тела.

Карнозин вводили по следующей схеме: через 15 мин после операции животные получали 50% дозы карнозина, затем через 2 час 15 мин вводили еще половину дозы. Контрольным животным по аналогичной схеме вводили физиологический раствор. Через 24 час после операции животных декапитиро-вали, извлекали мозг и при 0°C выделяли прилегающую к очагу ишемического повреждения зону коры ишемизированного полушария и симметричный участок контрлатерального полушария мозга (рис. 1). У интактных животных выделяли аналогичные по расположению участки коры больших полушарий. Образцы ткани замораживали в жидком азоте, хранили при -80°C и затем использовали для оценки уровня экспрессии про- и антиапоптотических белков и фосфорилирования исследуемых киназ методом вестерн-блоттинга.

Вестерн-блоттинг. Полученные образцы ткани мозга лизировали в RIPA буфере (Sigma, США), содержащем коктейли ингибиторов протеаз и фосфатаз (Sigma). Ли-зат центрифугировали при 12000g в течение 10 мин, затем отбирали супернатант. Концентрацию белка в пробах измеряли с помощью набора реактивов DC Protein Assay Kit (Bio-Rad, США). Белки разделяли при помощи электрофореза в полиакриламидном геле по Лэммли, переносили на PVDF-мембрану Westran Clear Signal (Whatman, Великобритания) и проводили окрашивание антителами в соответствии с рекомендациями производителей. Были использованы первичные антитела к Bax, Bak, Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Akt, p-Akt, p38 (Cell Signaling Technology, США), p-p38, ERK1/2, p-ERK1/2, JNK, p-JNK и ß-актину (Santa Cruz Biotechnology, США), а также вторичные антитела anti-goat, anti-rabbit (Santa Cruz Biotechnology) и anti-mouse (Cell Signaling Technology), конъюгированные с пероксидазой хрена. Мембраны проявляли при помощи хемилюминесцентного субстрата Super Signal West Femto Maximum Sensitivity Substrate или Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific, США).

Очаг

Ischemic core

рис. 1. схема отбора образцов ткани мозга:

1 - приочаговая зона; 2 - симметричная зона контрлатерального полушария

Fig. 1. scheme for obtaining brain tissue samples:

1 - ischemic penumbra zone; 2 - the symmetric zone of the contralateral hemisphere

Люминесценцию полос детектировали при помощи системы гель-документирования ChemiDoc XRS+ (BioRad), интенсивность обсчитывали при помощи программы Image Lab 3.0 (Bio-Rad). Уровень экспрессии белков семейства Bcl-2 оценивали по отношению интенсивности полос исследуемого белка к интенсивности полос ß-актина. Активацию киназ оценивали по уровню фосфорилирования, т.е. отношению интенсивности полос фосфорилированной формы киназы к интенсивности ее общей формы.

Статистический анализ. Статистическую обработку проводили с использованием программы Statistica 10.0. Для определения достоверности различий использовали U-критерий Манна-Уитни. Различия считались достоверными при значении p<0,05. Результаты представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего (M±m).

результаты_

Влияние карнозина на уровень белков-регуляторов апоптоза семейства Bcl-2. Исходя из того, что карнозин уменьшает площадь очага ишемического повреждения ткани мозга, мы предположили, что его эффект может выражаться через ингибирование митохондриального пути апоптоза в нейронах, который запускается в приочаговой зоне [30, 31] про-апоптотическими белками семейства Bcl-2: Bax, Bak [20, 21] на фоне уменьшения уровня блокаторов их активности -антиапоптотических белков семейства Bcl-2: Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w [19, 32]. В зоне, прилегающей к ишемическому очагу, и в соответствующей зоне контралатерального полушария при помощи вестерн-блоттинга было проведено сравнение количества проапоптотических белков Bax и Bak, а также антиапоптотических белков Bcl-2, Bcl-xL и Bcl-w между группами животных с фокальной ишемией без введения карнозина и с введением карнозина в дозах 50 мг/кг и 500 мг/кг массы тела, а также в соответствующих участках мозга интактных животных.

Как видно из рис. 2A, B, при фокальной ишемии в исследованных участках коры головного мозга увеличивается

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ. Экспериментальная неврология Карнозин при ишемии мозга у крыс

ишемическое полушарие

ischemic hemisphere

inlact

ischemia карнозин карнозин

ischemia + ischemia +

carnosine carnosine

(50 mg/kg) (500 mg/kg}

23 кДа | 23 kDa 42 кДа | 42 kDa

контралатеральное полушарие

contralateral hemisphere

к § 2

Is

t о

I с

* E i- P о

200

150

и

7

CO. .

"— X X ГО

re to CD

MHTaifTHbie ишемия ишемия + ишемия +

htacl ischeTiia карнозин карнозин

{50 мг/кг)

ischemia + ischemia +

carnosine carnosine

23 кДа | 23 kDa 42 «Да I 42 kDa

A

B

ишемическое полушарие

ischemic hemisphere

карнозин

ischemia + carnosine

25 кДа | 25 kDa 42 кДа | 42 kDa

контрапатеральное полушарие

contralateral hemisphere

§ О 200n

0

а- с

i- о

1 у

P с

150-

c с

о re

J is

,3 CQ CD

100

интактные

intact

Bak p-actin

ишемия

ischeTiia

• Г

карнозин карнозин

(50 мг/кг) (500 мг/кг}

ischemia + ischemia *

carnosine carnosine

25 кДа | 25 kDa

42 кДа | 42 kDa

C

D

рис. 2. влияние карнозина на уровень проапоптотических белков в модели необратимой фокальной ишемии головного мозга у крыс

A - Bax, ишемическое полушарие; B - Bax, контралатеральное полушарие; C - Bak, ишемическое полушарие; D - Bak, контралатеральное полушарие

1 - интактные животные; 2 - ишемия; 3 - ишемия + карнозин (50 мг/кг); 4 - ишемия + карнозин (500 мг/кг); * - p<0,05 по сравнению с интактной группой

Fig. 2. Effect of carnosine on the level of proapoptotic proteins in the model of irreversible focal brain ischemia in rats

A - Bax, the ischemic hemisphere; B - Bax, the contralateral hemisphere; C - Bak, the ischemic hemisphere; D - Bak, the contralateral hemisphere 1 - intact animals; 2 - ischemia; 3 - ischemia + carnosine (50 mg/kg); 4 - ischemia + carnosine (500 mg/kg); * - p<0.05 compared to the intact group

ишемическое полушарие

ischemic hemisphere

X

т

ишемия +

карнозин

ischemia + carnosine

ишемия t

карнозин

ischemia + catnosire

контрапатеральное полушарие

contralateral hemisphere

Bcl-2 p-actin

26 кДа | 26 kDa 42 кДа I 42 kDa

Bcl-2 p-actin

26 кДа j 23 kDa 42 кДа | 42 kDa

A

B

ишемическое полушарие

ischemic hemisphere

ишемия

ischemia

ишемия + карнозин

ischemia г carnosine

ишемия + карнозин

ischemia + carnosine

К

e; о a н x о ¥

контрапатеральное полушарие

contralateral hemisphere

с! 150

100

с .E

5 " m ¥

_l x

¥ —

J. <J

U CD CQ

ишемия + карнозин {50 мг/кг)

ischemia + carnosine (50 mg/kg}

ишемия + карнозин

ischemia t carnosine

Bcl-xL

p-actin

30 кДа I 30 kDa 42 кДа | 42 kDa

Bcl-xL p-actin

30 кДа I 30 kDa

42 кДа | 42 kDa

C

D

Карнозин при ишемии мозга у крыс

Е

К

Ц, О о W 200-1

о. с

н о

X о

о а: Е 150-

Н о

о

чв

е-4 о 100-

с с

V» о

и СП

7 1 50-

5 1

15 О-

о СО

m

ишемическое полушарие

ischemic hemisphere

Т

ингаетные

ir lad

I. Т

ишемия

ischemia

-г-

ишемия + карнознн

isctiemia f carnosirie

ишемия + карнознн (500 мг/кг}

ischemia + carnosine

К

Ii

11 * E

н 2

о ч-

150

100

ti u

У го Ч "

cd,

if

о О СО ffl

50

контралатеральное полушарие

contralateral hemisphere

т

интактные

inlact

ишемия

ischemia

-г-

ишемия * карнозин

ischemia + car no sm=

—г-

ишемия *

карнознн

ischemia + cam os he

F

Bcl-w p-actin

18 кДа I 18 kDa 42 кДа j 42 kDa

Bcl-w ß -actin

18 «Да | 18 kDa 42 кДа | 42 kDa

Рис. 3. Влияние карнозина на уровень антиапоптотических белков в модели необратимой фокальной ишемии головного мозга у крыс

A - Bcl-2, ишемическое полушарие; B - Bcl-2, контрлатеральное полушарие; C - Bcl-xL, ишемическое полушарие; D - Bcl-xL, контрлатеральное полушарие; E - Bcl-w, ишемическое полушарие; Т - Bcl-w, контрлатеральное полушарие

1 - интактные животные; 2 - ишемия; 3 - ишемия + карнозин (50 мг/кг); 4 - ишемия + карнозин (500 мг/кг); * - p<0,05 по сравнению с интактной группой

Fig. 3. Effect of carnosine on the level of antiapoptotic proteins in the model of irreversible focal brain ischemia in rats

A - Bcl-2, the ischemic hemisphere; B - Bcl-2, the contralateral hemisphere; C - Bcl-xL, the ischemic hemisphere; D - Bcl-xL, the contralateral hemisphere; E - Bcl-w, the ischemic hemisphere; F - Bcl-w, the contralateral hemisphere

1 - intact animals; 2 - ischemia; 3 - ischemia + carnosine (50 mg/kg); 4 - ischemia + carnosine (500 mg/kg); * - p<0.05 compared to the intact group

количество проапоптотического белка Bax на 230% в ише-мическом полушарии и на 56% в контрлатеральном полушарии. Карнозин в исследованных дозах препятствует росту количества Bax как в ишемическом, так и в контрлатеральном полушариях (рис. 2A, B), снижая его до уровня в соответствующем участке мозга интактных животных. При этом значительных изменений количества белка Bak не наблюдается ни в одной из экспериментальных групп (рис. 2C, D).

Также мы оценили изменение относительного количества антиапоптотических белков семейства Bcl-2: Bcl-2, Bcl-xL и Bcl-w в зоне, прилегающей к ишемическому очагу и соответствующей зоне контрлатерального полушария, а также в соответствующих зонах мозга интактных животных. Относительное количество антиапоптотического белка Bcl-2 как в ишемизированном, так и в контралатеральном полушариях повышалось на 120% в группе животных с ишемией относительно интактной группы, в то время как у крыс, получавших карнозин в дозах 50 мг/кг и 500 мг/кг массы тела, относительное количество Bcl-2 не отличалось от его содержания у интактных животных (рис. 3A, B). Относительное количество Bcl-xL и Bcl-w достоверно не изменялось в ипсилатеральном и контрлатеральном полушариях ни в группе ишемизированных животных без введения карнозина, ни в группах с его введением (рис. 3C-F).

Влияние карнозина на активацию киназы Akt. Поскольку важную роль в ингибировании митохондриального пути апоптоза играет киназа Akt [22, 24], мы исследовали уро-

вень ее активации в зоне, прилежащей к ишемическому очагу, и в контрлатеральном полушарии животных через 24 час после операции, а также в соответствующих зонах мозга интактных животных. Фокальная ишемия приводила к снижению уровня активации Akt на 60% в зоне, прилежащей к ишемическому очагу, относительно интактной группы (рис. 4A), в то время как в соответствующей зоне контрлатерального полушария не происходило значительного изменения активации Akt (рис. 4B). Карнозин в дозах 50 мг/кг и 500 мг/кг восстанавливал уровень активации Akt до контрольного в зоне, прилежащей к ишемическому очагу.

Влияние карнозина на активацию MAP киназ. Поскольку карнозин восстанавливал соотношение проапоптотиче-ских и антиапоптотических белков семейства Bcl-2 в зоне, прилежащей к ишемическому очагу, было целесообразно оценить его влияние на сигнальные механизмы, регулирующие количество проапоптотических и антиапоптотиче-ских белков семейства Bcl-2. Мы исследовали уровень активации MAP-киназных сигнальных путей (ERK1/2, p38, JNK) в зоне, прилежащей к ишемическому очагу, в контра-латеральном полушарии животных через 24 час после операции, а также в соответствующих зонах мозга интактных животных. Как видно из рис. 5A, фокальная ишемия приводила к увеличению активации киназы ERK1/2 на 280% по сравнению с интактной группой в зоне, прилежащей к ишемическому очагу, и на 150% - в симметричной зоне контрлатерального полушария (рис. 5B). При этом кар-нозин в дозах 50 мг/мг и 500 мг/кг массы тела не оказывал

рис. 4. влияние карнозина на уровень фосфорилирования киназы Akt в модели необратимой фокальной ишемии головного мозга у крыс

A - ишемическое полушарие; B - контрлатеральное полушарие

1 - интактные животные; 2 - ишемия; 3 - ишемия + карнозин (50 мг/кг); 4 - ишемия + карнозин (500 мг/кг); * - p<0,05 по сравнению с интактной группой; # - p<0,05 по сравнению с группой ишемии

Fig. 4. Effect of carnosine on the level of akt phosphorylation in the model of irreversible focal brain ischemia in rats

A - the ischemic hemisphere; B - the contralateral hemisphere

1 - intact animals; 2 - ischemia; 3 - ischemia + carnosine (50 mg/kg); 4 - ischemia + carnosine (500 mg/kg); * - p<0.05 compared to the intact group; # - p<0.05 compared to the ischemia group

A

B

A

B

Карнозин при ишемии мозга у крыс

ишемическое полушарие

ischemic hemisphere

<50 мг/кг}

ischemia + carnosine

ишемия+ карнозин

ischemia + carnosine

контрапатеральное полушарие

contralaterai hemisphere

1500 мг/кг)

ischemia + carnosine (500 mg/kg}

p-p38

40 кДа I 40 kDa

p-p38

40 кДа I 40 kDa

p38

40 кДа I 40 kDa

p38

40 кДа I 40 kDa

контрапатеральное полушарие

contralateral hemisphere

контрапатеральное полушарие

contralateral hemisphere

JNK

ишемия + карнозин

ischemia + carnosine

54 кДа I 54 kDa 46 кДа I 46 kDa

54 кДа I 54 kDa

46 кДа I 46 kDa

интактные

intact

pJNK

JNK

ишемия +

карнозин I SO 0 мг/кг)

ischemia + carnosine

54 кДа I 54 kDa 46 кДа I 46 kDa

54 кДа I 54 kDa 46 кДа I 46 kDa

Рис. 5. Влияние карнозина на уровень фосфорилирования MAP киназ в модели необратимой фокальной ишемии головного мозга у крыс

A - ERK1/2, ишемическое полушарие; B - ERK1/2, контрлатеральное полушарие; C - p38, ишемическое полушарие; D - p38, контрлатеральное полушарие; E - JNK, ишемическое полушарие; F - JNK, контрлатеральное полушарие

1 - интактные животные; 2 - ишемия; 3 - ишемия + карнозин (50 мг/кг); 4 - ишемия + карнозин (500 мг/кг); * - p<0,05 по сравнению с интактной группой; ** - p<0,01 по сравнению с интактной группой.

Fig. 5. Effect of carnosine on the level of MAP kinase phosphorylation in the model of irreversible focal brain ischemia in rats

A - ERK1/2, the ischemic hemisphere; B - ERK1/2, the contralateral hemisphere; C - p38, the ischemic hemisphere; D - p38, the contralateral hemisphere; E - JNK, the ischemic hemisphere; F - JNK, the contralateral hemisphere

1 - intact animals; 2 - ischemia; 3 - ischemia + carnosine (50 mg/kg); 4 - ischemia + carnosine (500 mg/kg); * - p<0.05 compared to the intact group; ** - p<0.01 compared to the intact group

C

D

E

F

влияния на уровень активации ERK1/2 у ишемизирован-ных животных (рис. 5A, B). В зоне, прилежащей к ишемическому очагу, и в соответствующей зоне контрлатерального полушария животных, перенесших фокальную ишемию, через 24 час не наблюдалось изменений активации p38 и JNK по сравнению с соответствующими участками мозга интактных животных (рис. 5C—F).

Обсуждение_

Ранее в наших исследованиях было показано, что при моделировании постоянной фокальной ишемии в бассейне средней мозговой артерии у крыс введение карнозина в суточной дозе 50 мг/кг и 500 мг/кг оказывало нейропротекторное действие, обеспечивая значительное снижение площади очага ишемического повреждения, формирующегося в течение 72 час после операции [15]. Поскольку задачей данного исследования было выяснение механизмов нейропротектор-ного действия карнозина, мы выбрали время 24 час после операции, когда очаг вторичного повреждения еще не сформирован полностью. Ранее нами было показано, что через 24 час после операции карнозин в дозе 50 мг/кг и 500 мг/кг оказывает существенное влияние на состояние окислительного статуса в приочаговой зоне коры головного мозга крыс, снижая уровень образующихся липидных гидроперекисей и увеличивая общую антиоксидантную активность ткани мозга (в печати). В настоящем исследовании мы выявили внутриклеточные сигнальные каскады, сопровождающие нейропро-текторный эффект карнозина в данной модели. Мы показали, что через 24 час после ОСМА карнозин восстанавливает соотношение проапоптотического белка Вах и антиапоптоти-ческого белка Вс1-2, регулирующих митохондриальный путь апоптоза при ишемии мозга [18, 20, 33]. В ипсилатеральном полушарии при ишемии увеличивалось относительное количество как Вах (на 230%), так и Вс1-2 (на 120%), при этом соотношение этих белков смещалось в сторону проапопто-тического сигнала. В контрлатеральном полушарии также наблюдался рост относительного количества как Вах, так и Вс1-2, но при этом соотношение Вс1-2/Вах измененялось в пользу антиапоптотического сигнала. Увеличение количества Вс1-2 вслед за Вах, согласно литературе, является адаптивным механизмом защиты нейронов после ишемии [34], однако то, запустится ли механизм апоптоза, зависит от изменения соотношения количества данных белков [35]. В использованной модели карнозин в дозах 50 мг/кг и 500 мг/кг массы тела восстанавливал в приочаговой зоне соотношение данных белков, препятствующее развитию апоптоза.

В нашем исследовании при ишемии не было обнаружено значительных изменений количества проапоптотического белка Вак и антиапоптотических белков Bd-xL и Вс1^ ни в ипсилатеральном, ни в контрлатеральном полушариях. В литературе есть сведения, что при ишемии головного мозга увеличивается экспрессия как Bcl-xL, так и Вак [18, 20, 21]. В других исследованиях было показано, что при фокальной ишемии увеличивается относительное количество Вак [21] и уменьшается Bcl-xL [18]. Однако в данных работах результаты были получены на модели кратковременной ишемии [36]. В использованной нами модели введение карно-зина в постишемическом периоде не повлияло на уровень Вак, Bcl-xL и Вс1^ в приочаговой зоне и в симметричном участке коры контралатерального полушария.

Активность и экспрессия проапоптотических и антиапоптотических белков семейства Вс1-2 регулируется внутри-

клеточными сигнальными каскадами [19]. В использованной нами модели при ишемии происходило существенное уменьшение активации Akt-киназы, связанной с поддержанием жизнеспособности нейронов [22, 24], что согласуется с результатами других исследований в моделях фокальной ишемии на животных [37]. Введение карнозина приводило к восстановлению активации Akt до уровня, наблюдаемого у интактных животных. В другом исследовании ишемиче-ское посткондиционирование в моделях ишемии головного мозга также было связано с сохранением активации Akt [37].

Наконец, мы исследовали влияние карнозина на активацию MAP киназ ERK1/2, p38 и JNK - участников быстрого ответа на стресс, вызываемый ишемией в нейронах [23]. ERK1/2 может активироваться в нейронах в ответ на стрессовые состояния [38, 39] и деполяризацию [40], в том числе эксайтотоксический стресс [41]. В целом активация ERK1/2 способна оказывать антиапоптотическое действие в нейронах [42]. Однако при продолжительной активации ее роль в регуляции жизнеспособности нейронов неоднозначна [41, 43]. В нашем исследовании нейропротекторное действие карнозина в условиях 24 час ишемии оказалось не связано напрямую с активацией ERK1/2. Повышенная активация ERK1/2 как в ипсилатеральном, так и в контрлатеральном полушариях мозга может быть связана с общим стрессовым воздействием перенесенной фокальной ишемии на мозг животных. То, что в нашем исследовании ни ишемия, ни карнозин не оказывали влияния на активацию p38 и JNK, может быть связано с тем, что мы исследовали механизмы ответа данных сигнальных каскадов через 24 час после ОСМА, в то время как рост активации p38 и JNK связан с гибелью нейронов при меньших временах после ишемии [44].

Из данного исследования можно заключить, что нейро-протекторная эффективность карнозина при фокальной ишемии мозга связана с его способностью препятствовать изменению соотношения про- и антиапоптотических белков семейства Bcl-2, в особенности Bax и Bcl-2, а также уменьшению активации киназы Akt, регулирующей соотношение и активность данных белков.

При прохождении в мозг через гематоэнцефалический барьер карнозин может непосредственно участвовать в предотвращении развития ОС как во внеклеточном пространстве, так и благодаря активности белка-транспортера PEPT2 внутри клеток, где продукция АФК запускает ки-назные каскады, влияющие на баланс про- и антиапопто-тических белков. Можно полагать, что антиоксидантный механизм нейропротекторного действия карнозина в условиях фокальной ишемии мозга является одним из ведущих факторов регуляции баланса про- и антиапоптотических белков.

Таким образом, впервые на экспериментальной модели необратимой фокальной ишемии мозга у крыс охарактеризованы ключевые молекулярные механизмы действия карнозина при введении в постишемическом периоде, что представляется перспективным для разработки нейропро-текторных лекарственных средств с использованием кар-нозина в качестве активного вещества.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. The authors declare there is no conflict of interest.

Карнозин при ишемии мозга у крыс

Список литературы

1. Пирадов М.А., Танашян М.М., Домашенко М.А. и др. Нейропротекция при цереброваскулярных заболеваниях: поиск жизни на Марсе или перспективное направление лечения? Часть 1. Острые нарушения мозгового кровообращения. Анналы клин. и эксперим. неврологии 2015; 9(1): 41-50.

2. Green D.R., Reed J.C. Mitochondria and apoptosis. Science 1998; 281(5381): 1309-1312. PMID: 9721092.

3. Niizuma K., Endo H., Chan P.H. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction as determinants of ischemic neuronal death and survival. J Neurochem 2009; 109 Suppl 1: 133-138. DOI: 10.1111/j.1471-4159.2009.05897.x. PMID: 19393019.

4. Atlante A., Calissano P., Bobba A. et al. Glutamate neurotoxicity, oxidative stress and mitochondria. FEBS Lett 2001; 497(1): 1-5. PMID: 11376653.

5. Babot Z., Cristofol R., Sunol C. Excitotoxic death induced by released glutamate in depolarized primary cultures of mouse cerebellar granule cells is dependent on GABAA receptors and niflumic acid-sensitive chloride channels. Eur J Neurosci 2005; 21(1): 103-112. DOI: 10.1111/j.1460-9568.2004.03848.x. PMID: 15654847.

6. Lu Y.M., Yin H.Z., Chiang J., Weiss J.H. Ca(2+)-permeable AMPA/kainate and NMDA channels: high rate of Ca2+ influx underlies potent induction of injury. J Neurosci 1996; 16(17): 5457-5465. PMID: 8757258.

7. Parsons M.P., Raymond L.A. Extrasynaptic NMDA receptor involvement in central nervous system disorders. Neuron 2014; 82(2): 279-293. DOI: 10.1016/j. neuron.2014.03.030. PMID: 24742457.

8. Rajendran P., Nandakumar N., Rengarajan T. et al. Antioxidants and human diseases. Clin Chim Acta 2014; 436: 332-347. DOI: 10.1016/j.cca.2014.06.004. PMID: 24933428.

9. Болдырев, А.А. Карнозин: новые концепции для функций давно известной молекулы. Биохимия 2012; 77(4): 403-418. PMID: 22809149.

10. Boldyrev A.A., Aldini G., Derave W. Physiology and pathophysiology of carnosine. Physiol Rev 2013; 93(4): 1803-1845. DOI: 10.1152/physrev.00039.2012. PMID: 24137022.

11. Dobrota D., Fedorova T., Stvolinsky S. et al. Carnosine protects the brain of rats and Mongolian gerbils against ischemic injury: after-stroke-effect. Neurochem Res 2005; 30(10): 1283-1288. DOI: 10.1007/s11064-005-8799-7. PMID: 16341589.

12. Boldyrev A.A., Stvolinsky S.L., Fedorova T.N., Suslina Z.A. Carnosine as a natural antioxidant and geroprotector: from molecular mechanisms to clinical trials. Rejuvenation Res 2010; 13(2-3): 156-158. DOI: 10.1089/rej.2009.0923. PMID: 20017611.

13. Park H.S., Han K.H., Shin J.A. et al. The neuroprotective effects of carnosine in early stage of focal ischemia rodent model. J Korean Neurosurg Soc 2014; 55(3): 125-130. DOI: 10.3340/jkns.2014.55.3.125. PMID: 24851146.

14. Bae O.N., Serfozo K., Baek S.H. et al. Safety and efficacy evaluation of carnosine, an endogenous neuroprotective agent for ischemic stroke. Stroke 2013; 44(1): 205-212. DOI: 10.1161/STROKEAHA.112.673954. PMID: 23250994.

15. Федорова Т.Н., Гаврилова С.А., Морозова М.П. и др. Нейропротек-торное действие карнозина в условиях фокальной ишемии мозга. Вопр. биол., мед. и фармацевт. химии 2017; 20(4): 25-31.

16. Абаимов Д.А., Сариев А.К., Танкевич М.В. и др. Исследование базовых фармакокинетических характеристик и эффективности проникновения в ткань мозга дипептида карнозина в эксперименте. Эксп. клин. фармакол. 2015; 78(3): 30-5. PMID: 26036009.

17. Лопачев А.В., Лопачева О.М, Абаимов Д.А. и др. Нейропротекторное действие карнозина на первичную культуру клеток мозжечка крысы в условиях окислительного стресса. Биохимия 2016; 81(5): 678-689. PMID: 27297901.

18. Graham S.H., Chen J., Clark R.S. Bcl-2 family gene products in cerebral ischemia and traumatic brain injury. J Neurotrauma 2000; 17(10): 831-841. DOI: 10.1089/neu.2000.17.831. PMID: 11063051.

19. Broughton B.R., Reutens D.C., Sobey C.G. Apoptotic mechanisms after cerebral ischemia. Stroke 2009; 40(5): e331-339. DOI: 10.1161/STROKEA-HA.108.531632. PMID: 19182083.

20. Ferrer I., Planas A.M. Signaling of cell death and cell survival following focal cerebral ischemia: life and death struggle in the penumbra. J Neuropathol Exp Neurol 2003; 62(4): 329-339. PMID: 12722825.

21. Zhang L.M., Zhao X.C., Sun WB. et al. Sevoflurane post-conditioning protects primary rat cortical neurons against oxygen-glucose deprivation/resuscitation via down-regulation in mitochondrial apoptosis axis of Bid, Bim, Pu-ma-Bax and Bak mediated by Erk1/2. J Neurol Sci 2015; 357(1-2): 80-87. DOI: 10.1016/j.jns.2015.06.070. PMID: 26152828.

22. Lu Q., Wang J., Jiang J. et al. rLj-RGD3, a Novel Recombinant Toxin Protein from Lampetra japonica, Protects against Cerebral Reperfusion Injury Following Middle Cerebral Artery Occlusion Involving the Integrin-PI3K/Akt Pathway in Rats. PLoS One 2016; 11(10): e0165093. DOI: 10.1371/journal.pone.0165093. PMID: 27768719.

23. Cheng C.Y., Tang N.Y., Kao S.T., Hsieh C.L. Ferulic Acid Administered at Various Time Points Protects against Cerebral Infarction by Activating p38 MAPK/p90RSK/CREB/Bcl-2 Anti-Apoptotic Signaling in the Subacute Phase of Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury in Rats. PLoS One 2016; 11(5): e0155748. DOI: 10.1371/journal.pone.0155748. PMID: 27187745.

References

1. Piradov M.A., Tanashyan M.M., Domashenko M.A. et al. [Neuroprotection in cerebrovascular diseases: is it the search for life on Mars or a promising trend of treatment? Part 1. Acute stroke]. Annals of clinical and experimental neurology 2015; 9

2. Green D.R., Reed J.C. Mitochondria and apoptosis. Science 1998; 281(5381): 1309-1312. PMID: 9721092.

3. Niizuma K., Endo H., Chan P.H. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction as determinants of ischemic neuronal death and survival. J Neurochem 2009; 109 Suppl 1: 133-138. DOI: 10.1111/j.1471-4159.2009.05897.x. PMID: 19393019.

4. Atlante A., Calissano P., Bobba A. et al. Glutamate neurotoxicity, oxidative stress and mitochondria. FEBS Lett 2001; 497(1): 1-5. PMID: 11376653.

5. Babot Z., Cristofol R., Sunol C. Excitotoxic death induced by released glutamate in depolarized primary cultures of mouse cerebellar granule cells is dependent on GABAA receptors and niflumic acid-sensitive chloride channels. Eur J Neurosci 2005; 21(1): 103-112. DOI: 10.1111/j.1460-9568.2004.03848.x. PMID: 15654847.

6. Lu Y.M., Yin H.Z., Chiang J., Weiss J.H. Ca(2+)-permeable AMPA/kainate and NMDA channels: high rate of Ca2+ influx underlies potent induction of injury. J Neurosci 1996; 16(17): 5457-5465. PMID: 8757258.

7. Parsons M.P., Raymond L.A. Extrasynaptic NMDA receptor involvement in central nervous system disorders. Neuron 2014; 82(2): 279-293. DOI: 10.1016/j. neuron.2014.03.030. PMID: 24742457.

8. Rajendran P., Nandakumar N., Rengarajan T. et al. Antioxidants and human diseases. Clin Chim Acta 2014; 436: 332-347. DOI: 10.1016/j.cca.2014.06.004. PMID: 24933428.

9. Boldyrev A.A. Carnosine: new concept for the function of an old molecule. Biochemistry (Mosc) 2012; 77(4): 313-326. DOI: 10.1134/S0006297912040013. PMID: 22809149.

10. Boldyrev A.A., Aldini G., Derave W Physiology and pathophysiology of carnosine. Physiol Rev 2013; 93(4): 1803-1845. DOI: 10.1152/physrev.00039.2012. PMID: 24137022.

11. Dobrota D., Fedorova T., Stvolinsky S. et al. Carnosine protects the brain of rats and Mongolian gerbils against ischemic injury: after-stroke-effect. Neuro-chem Res 2005; 30(10): 1283-1288. DOI: 10.1007/s11064-005-8799-7. PMID: 16341589.

12. Boldyrev A.A., Stvolinsky S.L., Fedorova T.N., Suslina Z.A. Carnosine as a natural antioxidant and geroprotector: from molecular mechanisms to clinical trials. Rejuvenation Res 2010; 13(2-3): 156-158. DOI: 10.1089/rej.2009.0923. PMID: 20017611.

13. Park H.S., Han K.H., Shin J.A. et al. The neuroprotective effects of carnosine in early stage of focal ischemia rodent model. J Korean Neurosurg Soc 2014; 55(3): 125-130. DOI: 10.3340/jkns.2014.55.3.125. PMID: 24851146.

14. Bae O.N., Serfozo K., Baek S.H. et al. Safety and efficacy evaluation of carnosine, an endogenous neuroprotective agent for ischemic stroke. Stroke 2013; 44(1): 205-212. DOI: 10.1161/STROKEAHA.112.673954. PMID: 23250994.

15. Fedorova T.N., Gavrilova S.A., Morozova M.P. et al. [The neuroprotective effect of the carnosine in a focal cerebral ischemia]. Voprosy biologicheskoj, medicinskoj i farmacevticheskoj himii 2017; 20

16. Sariev A.K., Abaimov D.A., Tankevich M.V. et al. [Experimental study of the basic pharmacokinetic characteristics of dipeptide carnosine and its efficiency of penetration into brain tissues]. Eksp Klin Farmakol 2015; 78

17. Lopachev A.V., Lopacheva O.M., Abaimov D.A. et al. Neuroprotective Effect of Carnosine on Primary Culture of Rat Cerebellar Cells under Oxidative Stress. Biochemistry (Mosc) 2016; 81(5): 511-520. DOI: 10.1134/S0006297916050084. PMID: 27297901.

18. Graham S.H., Chen J., Clark R.S. Bcl-2 family gene products in cerebral ischemia and traumatic brain injury. J Neurotrauma 2000; 17(10): 831-841. DOI: 10.1089/neu.2000.17.831. PMID: 11063051.

19. Broughton B.R., Reutens D.C., Sobey C.G. Apoptotic mechanisms after cerebral ischemia. Stroke 2009; 40(5): e331-339. DOI: 10.1161/STROKEA-HA.108.531632. PMID: 19182083.

20. Ferrer I., Planas A.M. Signaling of cell death and cell survival following focal cerebral ischemia: life and death struggle in the penumbra. J Neuropathol Exp Neurol 2003; 62(4): 329-339. PMID: 12722825.

21. Zhang L.M., Zhao X.C., Sun W.B. et al. Sevoflurane post-conditioning protects primary rat cortical neurons against oxygen-glucose deprivation/resuscitation via down-regulation in mitochondrial apoptosis axis of Bid, Bim, Pu-ma-Bax and Bak mediated by Erk1/2. J Neurol Sci 2015; 357(1-2): 80-87. DOI: 10.1016/j.jns.2015.06.070. PMID: 26152828.

22. Lu Q., Wang J., Jiang J. et al. rLj-RGD3, a Novel Recombinant Toxin Protein from Lampetra japonica, Protects against Cerebral Reperfusion Injury Following Middle Cerebral Artery Occlusion Involving the Integrin-PI3K/Akt Pathway in Rats. PLoS One 2016; 11(10): e0165093. DOI: 10.1371/joumal.pone.0165093. PMID: 27768719.

23. Cheng C.Y., Tang N.Y., Kao S.T., Hsieh C.L. Ferulic Acid Administered at Various Time Points Protects against Cerebral Infarction by Activating p38 MAPK/p90RSK/CREB/Bcl-2 Anti-Apoptotic Signaling in the Subacute Phase of Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury in Rats. PLoS One 2016; 11(5): e0155748. DOI: 10.1371/joumal.pone.0155748. PMID: 27187745.

24. Bright R., Raval A.P., Dembner J.M. et al. Protein kinase C delta mediates cerebral reperfusion injury in vivo. J Neurosci 2004; 24(31): 6880-6888. DOI: 10.1523/JNEUR0SCI.4474-03.2004. PMID: 15295022.

25. Niizuma K., Yoshioka H., Chen H. et al. Mitochondrial and apoptotic neuronal death signaling pathways in cerebral ischemia. Biochim Biophys Acta 2010; 1802(1): 92-99. DOI: 10.1016/j.bbadis.2009.09.002. PMID: 19751828.

26. Chen H., Yoshioka H., Kim G.S. et al. Oxidative stress in ischemic brain damage: mechanisms of cell death and potential molecular targets for neuroprotection. Antioxid Redox Signal 2011; 14(8): 1505-1517. DOI: 10.1089/ ars.2010.3576. PMID: 20812869.

27. Каркищенко Н.Н., Грачев С.В. (ред.). Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских технологиях. М.: Профиль, 2010.

28. Chen S.T., Hsu C.Y., Hogan E.L. et al. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke 1986; 17(4): 738-743. PMID: 2943059.

29. Гаврилова С.А., Самойленкова Н.С., Пирогов Ю.А. и др. Нейропро-текторный эффект гипоксического прекондиционирования при фокальной ишемии мозга крыс. Патогенез 2008; 6(3): 13-17.

30. Wang J.P., Yang Z.T., Liu C. et al. L-carnosine inhibits neuronal cell apop-tosis through signal transducer and activator of transcription 3 signaling pathway after acute focal cerebral ischemia. Brain Res 2013; 1507: 125-133. DOI: 10.1016/j.brainres.2013.02.032. PMID: 23454231.

31. Cheng J., Wang F., Yu D.F. et al. The cytotoxic mechanism of malondial-dehyde and protective effect of carnosine via protein cross-linking/mitochon-drial dysfunction/reactive oxygen species/MAPK pathway in neurons. Eur J Pharmacol 2011; 650(1): 184-194. DOI: 10.1016/j.ejphar.2010.09.033. PMID: 20868662.

32. Minami M., Jin K.L., Li W et al. Bcl-w expression is increased in brain regions affected by focal cerebral ischemia in the rat. Neurosci Lett 2000; 279(3): 193-195. PMID: 10688062.

33. Ouyang Y.B., Giffard R.G. Cellular neuroprotective mechanisms in cerebral ischemia: Bcl-2 family proteins and protection of mitochondrial function. Cell Calcium 2004; 36(3-4): 303-311. DOI: 10.1016/j.ceca.2004.02.015. PMID: 15261486.

34. Mattson M.P., Culmsee C., Yu Z.F. Apoptotic and antiapoptotic mechanisms in stroke. Cell Tissue Res 2000; 301(1): 173-187. PMID: 10928290.

35. Yaidikar L., Thakur S. Punicalagin attenuated cerebral ischemia-reperfu-sion insult via inhibition of proinflammatory cytokines, up-regulation of Bcl-2, down-regulation of Bax, and caspase-3. Mol Cell Biochem 2015; 402(1-2): 141-148. DOI: 10.1007/s11010-014-2321-y. PMID: 25555468.

36. Moore J.G., Hibbard L.T., Growdon WA., Schifrin B.S. Urinary tract endo-metriosis: enigmas in diagnosis and management. Trans Pac Coast Obstet Gyne-col Soc 1979; 46: 61-71. PMID: 542976.

37. Xie R., Wang P., Ji X., Zhao H. Ischemic post-conditioning facilitates brain recovery after stroke by promoting Akt/mTOR activity in nude rats. J Neuro-chem 2013; 127(5): 723-732. DOI: 10.1111/jnc.12342. PMID: 23777415.

38. Zhu X., Castellani R.J., Takeda A. et al. Differential activation of neuronal ERK, JNK/SAPK and p38 in Alzheimer disease: the 'two hit' hypothesis. Mech Ageing Dev 2001; 123(1): 39-46. PMID: 11640950.

39. Zamora-Martinez E.R., Edwards S. Neuronal extracellular signal-regulated kinase (ERK) activity as marker and mediator of alcohol and opioid dependence. Front Integr Neurosci 2014; 8: 24. DOI: 10.3389/fnint.2014.00024. PMID: 24653683.

40. Ha S., Redmond L. ERK mediates activity dependent neuronal complexity via sustained activity and CREB-mediated signaling. Dev Neurobiol 2008; 68(14): 1565-1579. DOI: 10.1002/dneu.20682. PMID: 18837011.

41. Luo T., Wu WH., Chen B.S. NMDA receptor signaling: death or survival? Front Biol (Beijing) 2011; 6(6): 468-476. DOI: 10.1007/s11515-011-1187-6. PMID: 23144645.

42. Morrison R.S., Kinoshita Y., Johnson M.D. et al. Neuronal survival and cell death signaling pathways. Adv Exp Med Biol 2002; 513: 41-86. PMID: 12575817.

43. Cheung E.C., Slack R.S. Emerging role for ERK as a key regulator of neuronal apoptosis. Sci STKE 2004; 2004(251): PE45. DOI: 10.1126/stke.2512004pe45. PMID: 15383672.

44. Okami N., Narasimhan P., Yoshioka H. et al. Prevention of JNK phosphor-ylation as a mechanism for rosiglitazone in neuroprotection after transient cerebral ischemia: activation of dual specificity phosphatase. J Cereb Blood Flow Metab 2013; 33(1): 106-114. DOI: 10.1038/jcbfm.2012.138. PMID: 23032483.

24. Bright R., Raval A.P., Dembner J.M. et al. Protein kinase C delta mediates cerebral reperfusion injury in vivo. J Neurosci 2004; 24(31): 6880-6888. DOI: 10.1523/JNEUROSCI.4474-03.2004. PMID: 15295022.

25. Niizuma K., Yoshioka H., Chen H. et al. Mitochondrial and apoptotic neuronal death signaling pathways in cerebral ischemia. Biochim Biophys Acta 2010; 1802(1): 92-99. DOI: 10.1016/j.bbadis.2009.09.002. PMID: 19751828.

26. Chen H., Yoshioka H., Kim G.S. et al. Oxidative stress in ischemic brain damage: mechanisms of cell death and potential molecular targets for neuroprotection. Antioxid Redox Signal 2011; 14(8): 1505-1517. DOI: 10.1089/ ars.2010.3576. PMID: 20812869.

27. Karkishchenko N.N., Grachev S.V.

28. Chen S.T., Hsu C.Y., Hogan E.L. et al. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke 1986; 17(4): 738-743. PMID: 2943059.

29. Gavrilova S.A., Samoylenkova N.S., Pirogov Yu.A. et al. [Neuroprotective effect of hypoxic preconditioning in focal ischemia of rat brain]. Patogenez 2008; 6

30. Wang J.P., Yang Z.T., Liu C. et al. L-carnosine inhibits neuronal cell apoptosis through signal transducer and activator of transcription 3 signaling pathway after acute focal cerebral ischemia. Brain Res 2013; 1507: 125-133. DOI: 10.1016/j.brainres.2013.02.032. PMID: 23454231.

31. Cheng J., Wing F., Yu D.F. et al. The cytotoxic mechanism of malondialdehyde and protective effect of carnosine via protein cross-linking/mitochondrial dysfunction/reactive oxygen species/MAPK pathway in neurons. Eur J Pharmacol 2011; 650(1): 184-194. DOI: 10.1016/j.ejphar.2010.09.033. PMID: 20868662.

32. Minami M., Jin K.L., Li W. et al. Bcl-w expression is increased in brain regions affected by focal cerebral ischemia in the rat. Neurosci Lett 2000; 279(3): 193-195. PMID: 10688062.

33. Ouyang Y.B., Giffard R.G. Cellular neuroprotective mechanisms in cerebral ischemia: Bcl-2 family proteins and protection of mitochondrial function. Cell Calcium 2004; 36(3-4): 303-311. DOI: 10.1016/j.ceca.2004.02.015. PMID: 15261486.

34. Mattson M.P., Culmsee C., Yu Z.F. Apoptotic and antiapoptotic mechanisms in stroke. Cell Tissue Res 2000; 301(1): 173-187. PMID: 10928290.

35. Yaidikar L., Thakur S. Punicalagin attenuated cerebral ischemia-reperfu-sion insult via inhibition of proinflammatory cytokines, up-regulation of Bcl-2, down-regulation of Bax, and caspase-3. Mol Cell Biochem 2015; 402(1-2): 141-148. DOI: 10.1007/s11010-014-2321-y. PMID: 25555468.

36. Moore J.G., Hibbard L.T., Growdon W.A., Schifrin B.S. Urinary tract endo-metriosis: enigmas in diagnosis and management. Trans Pac Coast Obstet Gyne-col Soc 1979; 46: 61-71. PMID: 542976.

37. Xie R., Wang P., Ji X., Zhao H. Ischemic post-conditioning facilitates brain recovery after stroke by promoting Akt/mTOR activity in nude rats. J Neuro-chem 2013; 127(5): 723-732. DOI: 10.1111/jnc.12342. PMID: 23777415.

38. Zhu X., Castellani R.J., Takeda A. et al. Differential activation of neuronal ERK, JNK/SAPK and p38 in Alzheimer disease: the 'two hit' hypothesis. Mech Ageing Dev 2001; 123(1): 39-46. PMID: 11640950.

39. Zamora-Martinez E.R., Edwards S. Neuronal extracellular signal-regulated kinase (ERK) activity as marker and mediator of alcohol and opioid dependence. Front Integr Neurosci 2014; 8: 24. DOI: 10.3389/fnint.2014.00024. PMID: 24653683.

40. Ha S., Redmond L. ERK mediates activity dependent neuronal complexity via sustained activity and CREB-mediated signaling. Dev Neurobiol 2008; 68(14): 1565-1579. DOI: 10.1002/dneu.20682. PMID: 18837011.

41. Luo T., Wu W.H., Chen B.S. NMDA receptor signaling: death or survival? Front Biol (Beijing) 2011; 6(6): 468-476. DOI: 10.1007/s11515-011-1187-6. PMID: 23144645.

42. Morrison R.S., Kinoshita Y., Johnson M.D. et al. Neuronal survival and cell death signaling pathways. Adv Exp Med Biol 2002; 513: 41-86. PMID: 12575817.

43. Cheung E.C., Slack R.S. Emerging role for ERK as a key regulator ofneuronal apoptosis. Sci STKE 2004; 2004(251): PE45. DOI: 10.1126/stke.2512004pe45. PMID: 15383672.

44. Okami N., Narasimhan P., Yoshioka H. et al. Prevention of JNK phosphor-ylation as a mechanism for rosiglitazone in neuroprotection after transient cerebral ischemia: activation of dual specificity phosphatase. J Cereb Blood Flow Metab 2013; 33(1): 106-114. DOI: 10.1038/jcbfm.2012.138. PMID: 23032483.

Карнозин при ишемии мозга у крыс

Информация об авторах: Лопачева Ольга Михайловна - лаборант-исследователь лаб. клинической и экспериментальной ней-рохимии ФГБНУ НЦН. 125367, Россия, Москва, Волоколамское ш., д.80. E-mail: olga3511@yandex.ru; Лопачев А.В. - м.н.с., лаб. клинической и экспериментальной нейрохимии ФГБНУ НЦН, Москва, Россия; Куличенкова К.Н. - асп. лаб. клинической и экспериментальной нейрохимии ФГБНУ НЦН, Москва, Россия; Девятов А.А. - лаборант-исследователь лаб. клинической и экспериментальной нейрохимии ФГБНУ НЦН, Москва, Россия; Бережной Д.С. - к.б.н., н.с., лаб. клинической и экспериментальной нейрохимии ФГБНУ НЦН, Москва, Россия; Стволинский С.Л. - д.б.н.; в.н.с., лаб. клинической и экспериментальной нейрохимии ФГБНУ НЦН, Москва, Россия; Куликова О.И. - м.н.с., лаб. клинической и экспериментальной нейрохимии ФГБНУ НЦН, Москва, Россия; Гаврилова С.А. - к.б.н., доцент каф. физиологии и общей патологии факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия;

Морозова М.П. - к.б.н., ассистент каф. физиологии и общей патологии, ФФМ МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия; Федорова Т.Н. - д.б.н., зав. лаб. клинической и экспериментальной нейрохимии ФГБНУ НЦН, Москва, Россия

Information about the authors: Olga M. Lopacheva, technician, Laboratory of Clinical and Experimental Neurochemistry, Research Center of Neurology. 125367, Moscow, Russia, Volokolamskoe shosse, 80. E-mail: olga3511@yandex.ru;

Alexander V. Lopachev, junior researcher, Laboratory of Clinical and Experimental Neurochemistry, Research Center of Neurology, Moscow, Russia;

Kseniya N. Kulichenkova, PhD-student, Laboratory of Clinical and Experimental Neurochemistry, Research Center of Neurology, Moscow, Russia

Alexander A. Devyatov, technician, Laboratory of Clinical and Experimental Neurochemistry, Research Center of Neurology, Moscow, Russia

Daniil S. Berezhnoy, PhD, researcher, Laboratory of Clinical and Experimental Neurochemistry, Research Center of Neurology, Moscow, Russia

Sergey L. Stvolinsky, Dr. Sci. (Biol.), leading researcher of the Laboratory of Clinical and Experimental Neurochemistry, Research Center of Neurology, Moscow, Russia

Olga I. Kulikova, technician, Laboratory of Clinical and Experimental Neurochemistry, Research Center of Neurology, Moscow, Russia Svetlana A. Gavrilova, PhD, associate professor of the Department of Physiology and General Pathology, Faculty of Fundamental Medicine, Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia

Mariya P. Morozova, PhD, teaching assistant of the Department of Physiology and General Pathology, Faculty of Fundamental Medicine, Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia

Tatiana N. Fedorova, Dr. Sci. (Biol.), Head of the Laboratory of Clinical and Experimental Neurochemistry, Research Center of Neurology, Moscow, Russia