Исследование влияния дифторида ксенона XeF2 в дозе12,5 мг/кг на развитие рака молочной железы мышей

Биомедицина • № 2. 2010. С. 38 — 45

Исследование влияния дифторида ксенона XeF2 в дозе 12,5 мг/кг на развитие рака молочной железы мышей

Х. Х.Семенов, Н. Н. Каркищенко, Г. Д. Капанадзе, А. А. Артюхов,

А. А. Артюхов, Т. Б. Бескова, Е. Л. Матвеенко, А. О. Ревякин

Научный центр биомедицинских технологий РАМН,Московская обл.

РНЦ Курчатовский институт

Контактная информация: matveyenkoel@mail.ru

Исследовано влияние дифторида ксенона в дозе 12,5 мг/кг на продолжительность жизни мышей, больных раком молочной железы I и II стадии опухолевого роста. Животные поступили из популяции Ку:8НК, разводимой в филиале «Андреевка» НЦБМТ РАМН. Согласно результатам исследования, препарат не оказал значимого влияния на срок жизни мышей-носителей опухолей молочной железы. Все 80 голов в опыте и 40 - в контроле пали в течение 4-х месяцев. Дифторид ксенона на проявил также мутагенного эффекта ни на половых клетках самцов (метод доминантных леталей), ни на клетках костного мозга (цитогенетический анализ).

Ключевые слова: молочная железа, рак, дифторид ксенона ХеБ2, цитогенетический анализ, аберрации хромосом.

Интерес к проблеме опухолевого роста обусловлен ее разносторонним значением не только для медицины, но и для биологической науки в целом. Необходимость понимания эволюционной сущности неопластического процесса и выяснение наиболее общих причин, лежащих в его основе, привели к созданию направления, цель которого - поиск и установление общих закономерностей возникновения и развития новообразований. Накопление огромного фактического материала (и не только в рамках онкологии, но и в смежных областях таких биологических дисциплин, как экология, генетика, синтетическая теория эволюции, сравнительная физиология и биохимия и т.д.) поставило перед исследователями новые вопросы, решение которых может иметь существенное теоретическое и практическое значение для проблем рака в целом.

Один из таких вопросов можно сформулировать следующим образом: су-

ществует ли филогенетический порог в возникновении опухолей и чувствительности к опухолеродным воздействиям? Большинство исследователей признают, что опухоль - это относительно автономное патологическое разрастание тканей, характеризующееся рядом особенностей и вызванное конкретными нарушениями в системах, обеспечивающих внутритканевой и межклеточный гомеостаз. Живые организмы способны отвечать на воздействия бластомоген-ных факторов образованием опухолей лишь на определенной ступени филогенеза. Этот порог лежит на уровне кишечнополостных животных, так как начиная именно с кишечнополостных имеется «субстрат» (ткань; наличие экто- и эндодермы) для возникновения опухолей и зачатки нервной и гуморальной регуляции [5, 6].

Еще один вопрос, логично связанный с предыдущим. Существуют ли сре-

ди Eumetasoa виды, свободные от опухолей или виды, нечувствительные к канцерогенным воздействиям? До сих пор поиски видов, свободных от опухолей, безуспешны. В ходе эволюции, приобретая определенные преимущества для выживания, организмы усложняются и совершенствуются. Вместе с усложнением тканей и систем регуляции возрастает и потенциальная возможность поломки в них, что может проявиться и в неопластическом росте. Это положение подтверждается хорошо известными фактами увеличения числа опухолей от низших форм к высшим. У низших беспозвоночных новообразования не только малочисленны, но и чрезвычайно однообразны; у более организованных объектов возрастает как частота неоплазм вообще, так и частота опухолей отдельных локализаций. Эта тенденция прослеживается не только в таких крупных таксонах, как тип, но и в классах, и объясняется как приобретением в фело-генезе новых органов (а значит, и «мишеней»), так и все возрастающими и усложняющимися связями организма с внешней средой.

Однако при анализе распространенности новообразований среди мелких таксономических групп (начиная с семейств) бросается в глаза крайне неравномерное их распределение. Например, среди рыб в отряде карпозубообразных подавляющее большинство опухолей обнаружено у карпозубых, в других семействах наблюдаются единичные случаи опухолей; среди грызунов - чаще у крыс и мышей, и исключительно редко -у кроликов и морских свинок [5].

У человека как вида частота различных опухолей существенно отличается от таковой у любого другого млекопитающего, что связано в значительной сте-

пени с диетой, вредными привычками, профессией и условиями внешней среды

[7].

Основным методом борьбы с опухолями многих локализаций является химиотерапия. Химиотерапия злокачественных новообразований, введенная в клиническую практику в 40-х гг. прошлого века, развилась к настоящему времени в самостоятельную область биомедицинской науки. Изучение молекулярных и клеточных механизмов действия противоопухолевых препаратов, привлечение иммунологических подходов к объяснению некоторых феноменов химиотерапии позволяют проводить направленный поиск активных агентов, разрабатывать принципиально новые подходы к лечению опухолей.

Однако остается малоизученным парадоксальный аспект химиотерапии, который привлекает к себе внимание исследователей и который можно определить, как феномен усиления агрессивности поведения опухолевых клеток под воздействием химиотерапии [2].

В настоящее время хорошо известен, но трудно объясним тот факт, что при достаточно высокой первоначальной чувствительности к химиотерапии последняя дает лишь незначительный эффект в лечении больных.

Одним из важнейших биологических свойств опухоли является опухолевая прогрессия, выражающаяся в усилении признаков злокачественности по мере роста опухоли, в основе которого лежит нестабильность генотипа [10]. Эта нестабильность, по-видимому, может быть причиной того, что неопластические клетки более склонны к мутациям, чем их нормальные аналоги [13]. Найдено, что в опухолях с более злокачественным фенотипом накапливается больше

генетических изменений, чем в менее анаплазированных неоплазмах [16]. А поскольку большинство противоопухолевых препаратов являются мутагенами, следовательно, мутагенный эффект химиотерапии может способствовать появлению более злокачественных мутантов опухолевых клеток. Об усилении опухолевой прогрессии после химиотерапии свидетельствуют данные анализа клеточных линий, полученных от больных нейробластомой до и после химиотерапии. Во втором случае клетки имели значительное укорочение времени удвоения, большую эффективность посева, содержали повышенное число минихромосом [14].

При обсуждении механизмов повышения агрессивности поведения опухолевых клеток при химиотерапии рассматриваются, как правило, два аспекта этого процесса: действие препаратов на опухолевую клетку и влияние на организм опухоленосителя. Генетическая нестабильность, свойственная неопластическим клеткам, способствует генерации мутантов с повышенной способностью к выживанию, что может проявляться в более агрессивном поведении. Известно, что метастатический потенциал коррелирует с увеличением спонтанных мутаций [5].

Большинство химиотерапевтических режимов иммуносупрессивны. У больных отмечается лимфопения, снижение бласттрансформации лимфоцитов крови и концентрации сывороточных иммуноглобулинов [14]. Эти свойства противоопухолевых цитостатиков, как известно, используются в трансплантологии, что, по мнению Ь. Ьаигаеп [10], является одним из величайших парадоксов медицины. Одни и те же препараты при-

меняются с прямо противоположными целями. Больным с пересаженными органами цитокинетические препараты вводят для предотвращения отторжения гомографта, а онкологическим больным - для того, чтобы вызвать отторжение аутографта [10]. Таким образом, накоплено достаточно экспериментальных фактов, свидетельствующих о том, что в определенных условиях химиотерапевтические воздействия могут усиливать злокачественность опухоли. Анализ этих данных диктует необходимость учитывать все большее число факторов, влияющих на выбор режимов лечения, соответствующих доз.

Возможно, что определение оптимальной иммуномодулирующей дозы цитостатика, использование модификаторов биологических реакций, своевременная соответствующая коррекция режимов химиотерапии позволят снизить до минимума ее нежелательные последствия.

Цель настоящей работы - исследование влияния дифторида ксенона на рак молочной железы мышей.

Материалы и методы

Исследование проводилось на мышах стока Ку:8НК филиала «Андреев-ка», которые характеризуются высокой частотой рака молочной железы. Из популяции мышей 8ИК на эксперимент были отобраны 120 самок, больных раком молочной железы. Самки были разбиты на две группы: опытную - 80 голов и контрольную - 40. Самки отбирались с учетом стадии опухолевого роста пропорционально количеству животных в группах. На эксперимент были взяты самки только с I и II стадией опухолевого роста. Животные содержались в конвенциональных условиях по 5 голов

в клетке размером 20x15x13 см фирмы ВЕЛАЗБ, в качестве подстилочного материала применялись древесные опилки. Мыши получали гранулированный комбикорм производства ООО «Лаборатор-корм». Самкам опытной группы инъецировали раствор дифторида ксенона в дозе 12,5 мг/кг живого веса внутри-брюшинно. Дозу устанавливали путем предварительного исследования токсичности препарата. На втором этапе, как правило, рекомендуется использовать 3-4 дозы. Для лекарственных препаратов рекомендуется использовать терапевтическую дозу и дозы, превышающие ее в 5 и 15 раз, а также 0,5 ЛД50 [8]. Мы использовали максимальную дозу 0,5 ЛД50, которая составила 12,5 мг/кг. Инъекцию проводили по 2 раза в неделю с интервалом в 3-4 дня за весь период наблюдения. Эффект дифторида ксенона оценивали по разнице в сроках выживания самок опытной и контрольной групп.

Поскольку большинство противоопухолевых препаратов являются высокоактивными мутагенами, мы сочли необходимым исследовать дифторид ксенона на возможный мутагенный эффект. Оценку мутагенной активности дифторида ксенона проводили двумя методами. Методом доминантных леталей (ДЛ) - в половых клетках самцов мышей и методом цитогенетического анализа в клетках костного мозга. В обоих случаях исследования были использованы мыши линии С57БЬ/6У, поддерживаемые в НЦБМТ РАМН, которые являются одной из наиболее чувствительных к мутагенам линий. При исследовании мутагенного эффекта дифторида ксенона с целью максимального избегания влияния генотипа самцов в опыте и контроле были использованы одни и те же животные. Для этого каждому из 15 самцов подса-

живали по 3 виргинных самки ICR, которые также поддерживаются в НЦБМТ РАМН. Через неделю самок отсаживали, а самцам вводили внутрибрюшинно дифторид ксенона в дозе 12,5 мг/кг и тут же подсаживали по 3 виргинных самки, которых через неделю меняли также на 3 виргинных самок. Первая группа самок (45 гол.), отсаженная от необработанных самцов, служила контрольной группой, последняя группа, подсаженная на второй неделе после инъекции препарата, - опытной. Самок как опытной, так и контрольной групп вскрывали на 1517-й день беременности для анализа эмбриональной смертности и определения частоты индуцированных доминантных леталей. Более подробно метод изложен в наших рекомендациях [4]. Расчет частоты ДЛ производили по формуле, предложенной Эллингом [9].

Термином ДЛ обозначают наследственные изменения в половых клетках родительских особей, которые вызывают смерть потомков первого поколения, в основном, во время эмбрионального развития. Большая часть или почти все доминантные летали представляют собой количественные и структурные аберрации хромосом, приводящие к утратам генетического материала во время деления клеток эмбриона. Доминантные летали приводят к увеличению эмбриональной смертности и, соответственно, снижению выживаемости эмбрионов и плодовитости самок. Доминантные летали могут быть индуцированы как в мужских, так и в женских половых клетках, но обычно воздействию мутагена подвергают только самцов, которых затем спаривают с интактными виргинными самками. Если яйцеклетка оплодотворена сперматозоидом, несущим доминантные летали, то смерть развивающегося

эмбриона может произойти как до, так и после имплантации. Вещества, способные индуцировать структурные аберрации хромосом, являются мутагенами.

Цитогенетический анализ клеток костного мозга осуществляли на мышах той же линии, что и для учета частоты доминантных леталей, а именно, на линии С57БЬ/6У. Опытная группа состояла из 5 самок, контрольная - из 10. Разница по количеству животных была связана с соответствующими рекомендациями Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ). В целях получения надежной и полной информации в спонтанном мутационном процессе ВОЗ рекомендовала использовать в контроле 10 животных

[8]. Определение мутагенной активности дифторида ксенона по тесту цитогенетического анализа клеток костного мозга проводили с той же дозой, что для ДЛ - 12,5 мг/кг. Раствор препарата вводили самкам внутрибрюшинно. Для фиксации максимального количества метафаз за 2 часа до приготовления препаратов мышам вводили 0,025% раствор колхицина внутрибрюшинно по 0,01 мл на 1 г веса. Для выявления мутагенного эффекта следует учитывать ахроматические повреждения хромосом (пробелы) и структурные аберрации - фрагменты хромосом и обмены.

Следует отметить, что анэуплодия очень слабо возрастает даже после сильных мутагенов, высока вероятность артефактов, обусловленных обработкой клеток при приготовлении препаратов, поэтому этот показатель использовать нецелесообразно. Подробное описание метода дается в методических рекомендациях [4].

Результаты исследований

Результаты экспериментального исследования влияния химического соеди-

нения - дифторид ксенона ХеБ2 на рак молочной железы у самок мышей представлены в табл. 1. Проведенная экспе-

Таблица 1

Результаты исследований влияния дифторида ксенона на продолжительность жизни мышей с раком молочной железы

Срок жизни, мес. Количество павших животных

Опыт Контроль

голов % голов %

1 5 6,25 2 5,0

2 18 22,50 10 25,0

3 26 32,50 12 30,0

4 31 38,75 16 40,0

риментальная работа показала, что дифторид ксенона ХеБ2 в дозе 12,5 мг/кг не произвел видимых изменений на темп роста новообразований у мышей опытной группы за весь период исследования. Значительных различий по этому показателю между опытной и контрольной группой животных не наблюдалось. Смерть самок по месяцам, выраженная в процентах, - наглядное тому свидетельство. Имеющие место небольшие колебания между группами по месяцам (22,5-25,0; 32,75-40,0) были статистически недостоверны. Все животные как в опыте, так и в контроле пали в течение четырех месяцев.

Таким образом, результаты проведенных исследований служат основанием для утверждения, что дифторид ксенона ХеБ2 не оказывает значимого влияния на рост опухоли молочной железы у мышей, следовательно, и на жизнеспособность их носителей. Несмотря на развитие новых методов исследования мутагенных факторов, значение метода доминантных леталей (ДЛ) не снижается, напротив, он остается основным ме-

Таблица 3

Результаты анализа кластогенного эффекта в клетках костного мозга дифторида ксенона, введенного в дозе 12,5 мг/кг мышам линии C57BL/6Y

Показатель Опыт Контроль

Количество клеток в анализе 500 1000

Число аберраций

ГЭПы 3 5

Хроматидные разрывы (одиночные фрагменты) 1 6

Изохроматидные разрывы (пары фрагментов) 2 2

Частота поврежденных клеток, %

Только с ГЭПами 0,6 0,5

Со структурными повреждениями 0,6 0,8

Всего поврежденных клеток 1,2±0,49 1,3±0,36

тодом оценки мутагенного эффекта в половых клетках млекопитающих. Это обусловлено тем, что половые клетки наиболее чувствительны к мутагенному действию химических агентов.

Данные, полученные в результате исследования плодовитости и эмбриональной смертности у мышей после воздействия дифторидом ксенона в дозе 12,5 мг/кг на поздние сперматозоиды самцов мышей инбредной линии С57БЬ/6У, представлены в табл. 2.

Вскрытие самок опытной и контрольной групп показало, что плодовитость была практически одинаковой, независимо от того, с какими самцами они были спарены. Наблюдаемые небольшие колебания числа живых эмбрионов на самку (8,38 и 8,11) статистически недостоверны. Смертность эмбрионов после имплантации практически была одинаковой в опыте и контроле. Частота доминантных лета-

Таблица 2

Результаты вскрытия беременных самок, скрещенных с самцами, обработанными дифторидом ксенона в дозе 12,5 мг/кг

Показатель Опыт Контроль

Число:

самок 36 31

живых эмбрионов 292 258

мертвых эмбрионов 38 37

Смертность после имплантации 0,115 0,125

Живых эмбрионов на 1 самку 8,11 8,32

Частота ДЛ, % 2,6

лей, рассчитанная по формуле Эллинга, составила лишь 2,6%. Таким образом, полученные данные свидетельствуют об отсутствии мутагенного эффекта дифторида ксенона на поздних сперматидах (2-я неделя) самцов мышей С57БЬ/6У.

Данные цитогенетического анализа клеток костного мозга мышей линии С57БЬ/6У после воздействия дифторидом ксеноном в дозе 12,5 мг/кг представлены в табл. 3. Уровень «индуцированных» дифторидом ксенона хромосомных нарушений в клетках костного мозга мышей опытной группы был ниже спонтанных нарушений хромосом мышей контрольной группы. Основным типом структурных повреждений хромосом в клетках костного мозга мышей как опытной, так и контрольной групп были фрагменты. Результаты цитогенетического тестирования дифторида ксенона свидетельствуют, что он не обладает мутагенной активностью. Таким образом, результаты цитогенетического анализа полностью согласуются с таковыми, полученными методом доминантных лета-

лей. Это означает, что дифторид ксенона не является мутагеном.

Выводы

Результаты проведенных исследований дают основание заключить, что дифторид ксенона в дозе 12,5 мг/кг не тормозит рост опухоли у мышей, больных раком молочной железы. Следовательно, он не в состоянии значимо увеличить продолжительность жизни экспериментальных животных в сравнении с их аналогами в контроле. Мыши опытной и контрольной групп пали в течение четырех месяцев.

Дифторид ксенона в дозе 12,5 мг/кг исследован на мутагенную активность методом воздействия на поздние сперматозоиды самцов (ДЛ) и методом цитогенетического анализа клеток костного мозга. В результате проведенных исследований установлено, что дифторид ксенона в дозе 12,5 мг/кг не оказал значимого влияния как на уровень эмбриональной смертности после имплантации, так и на мутационный процесс в клетках костного мозга у мышей опытных групп. Следовательно, он не обладает мутагенной активностью.

Список литературы

1. Бриан П. Бластогенез и гематогенез. Л.: Медицина, 1968.

2. Коновалова Н.П. Парадоксы химио-терапии//Вопросы онкологии. 1992. № 10. С. 1155-1163.

3. Макрушин А.В., Худолей В.В. Опухоль как атавистическая адаптивная реакция на условия окружающей среды//Общая биология. 1991. Т. 52, № 52. С. 717-721.

4. Малашенко А.М., Суркова Н.И., Семенов Х.Х., бескова Т.Б. Определение мутагенной активности химических соединений с использованием лабораторных мышей. Методические рекомендации. М., 1985.

5. Худолей В.В. Сравнительный анализ опухолевого роста//Общая биология. 1976. Т. 39, № 2 С. 242-254.

6. Худолей В.В. Филогенез и онтогенез// Природа. 1978. № 5. С. 114-120.

7. Худолей В.В. Экологическая онкология //Природа. 1992. № 26. С. 311-344.

8. Методические рекомендации по проверке мутагенных свойств у новых лекарственных препаратов. М.: Минздрав СССР, 1981.

9. Ehling U.H. Comparison of radiation and chemically induced dominant lethal mutations in male mice//Mutant. res. 1971. Vol.11, №1. P. 35.

10. Foulds L. Neoplastic development. London-New York. Acad. Press, 1969.

11. Laursen L. Chemotherapy of malignant tumors a self-defeating form of immunotherapy //Medical Hypotheses. 1989. Vol.29. P. 9-15.

12. Manzo G. Phylogenesis - ontogenesis -oncogenesis//Medical Hypotheses. 1989. Vol. 30, №4. P. 259-263.

13. Nowell P. The clonal evolution of tumor cells populations//Science. 1986. Vol.76. P. 375383.

14. Reynold C.P. Characterization of human neuroblastoma cell lines established before and after therapy//J. Nat. Cancer Inst. 1986. Vol.76. P. 375-383.

15. Sasaki M., Makino S. The meiotic chromosomes of man//Chromosoma. 1965. Vol.16. P. 637.

16. Sato T., Akiyama F., Sakamoto G. et al. Accumulation of genetic alterations and progression of primary breast cancer//Cancer Res. 1991. Vol.51. P. 5794-5799.

Study of xenon difluoride influence on mammarian cancer growth in mice

H. H. Semenov, N. N. Karkischenko, G. D. Kapanadze, A. A. Artuhov,

A. A. Artuhov, T. B. Beskova, E. L. Matveenko, A. O. Revyakin

Influence of xenon difluoride on survival time of mice with I and II tumor stage breast cancer was studied. Xenon difluoride was injected in dosage 12,5mg/kg. The mice were taken from a population Kv:SHK, which is bred in a branch «Andreevka» of the Scientific Center of Biomedical technologies of RAMS. According to the research results, medicine had no significant influence on survival time of mice with breast cancer. All 80 mice in a study group and 40 mice in a control group died during 4 months. Xenon difluoride had no mutagenic effect on male germ sells (DL method) and on bone marrow cells (cytogenetic analysis).

Key words: breast, cancer, xenon difluoride XeF2, cytogenetic analysis, chromosome aberration.