К вопросу о повышении эффективности антимикробной фотодинамической терапии

BISSA 2017 Vol. 6 № 1

ORIGINAL ARTICLES

УДК 615.28

К ВОПРОСУ О ПОВЫШЕНИИ ЭФФЕКТИВНОСТИ АНТИМИКРОБНОЙ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ

Баженов Л.Г., Садыков Р.А., Косникова И.В., Садыков P.P., Касымова К.Р.

Республиканский специализированный центр хирургии им. ак. В.Вахидова, Ташкентская медицинская академия, Ташкент, Республика Узбекистан

ON QUESTION OF THE INCREASE IN EFFECTIVENESS OF THE

ANTIMICROBIAL PHOTODYNAMIC THERAPY

Bajenov L.G., Sadykov R.A., Kosnikova I.V., Sadykov R.R., Kasymova K.R.

Republican Specialised Centre of Surgery named after Academician V. Vahidov, Tashkent Medical Academy, Tashkent, Republic of Uzbekistan

Аннотация

Целью работы явилось сравнительное изучение антимикробного действия приме-нямых в фотодинамической терапии (ФДТ) растворов метиленового синего (MC) в зависимости от их pH. Максимальный антибактериальный эффект ФДТ в отношении Klebsiella pneumoniae достигался при использовании 0,05% буферного раствора MC с pH 8,0 стенденцией к его усилению при pH 9,0. Возрастание pH растворов MC наряду с усилением воздействия на мембрану гра-мотрицательных микроорганизмов приводило к сдвигу спектра поглощения излучения в длинноволновую сторону.

Ключевые слова: антимикробная фотодинамическая терапия, эффективность, фотосенсибилизаторы, метиленовый синий, рН-растворов

Abstract

The aim of the work was the comparative study of antibacterial activity of methylene blue solutions, applied in photodynamic therapy (PDT) depending on their pH-level. The maximal PTD antibacterial activity was observed in relation to Klebsiella pneumoniae using 0,05% methylene blue buffer solution with pH 8,0; with tendency to its intensification with pH 9,0. The rise of pH-level of methylene blue solutions alongside with growing effect on membrane of gram negative microorganisms led to the shift of absorption spectrum of radiation to long-wavelength part.

Keywords: antimicrobial photodynamic therapy, effectiveness, photosensitizers, methylene blue, pH-level of solutions.

Антибактериальная фотодинамическая терапия (ФДТ) является альтернативой ан-тибиотикотерапии и заключается в избирательной окислительной деструкции патогенных микроорганизмов при комбинированном воздействии фотосенсибилизатора (ФС) и светового излучения с определенными параметрами [5].

Метиленовый синий (МС) из группы фе-нотиазинов известен как ФС, применяемый для антимикробной ФДТ, не обладающий токсичностью и относительно инертный к живым организмам [5,7]. МС - окислительно-восстановительный индикатор, восстановленная форма его бесцветна, окис-

ленная - синего цвета, окислительно-восстановительный потенциал при рН 7+0,011 В, при рН 0 +0,53 В. Хорошо известно его антисептическое действие, в некоторых клинических случаях она вводится внутривенно, в частности при лечении токсической метгемоглобинемии. МС для инъекционных 1% растворов должен иметь рН не ниже 3,9. Применение его в качестве антидота при отравлениях основано на роли акцептора и донатора ионов водорода в организме [2].

Механизмы антимикробного эффекта сенсибилизированной МС фототерапии находятся в стадии исследования. Некоторые авторы связывают их с тем, что внутриклеточное воздействие света реализуется

ORIGINAL ARTICLES

BISSA 2017 Vol. 6 № 1

через химические (фотоокисление, фотовосстановление, фотодиссоциация и др.) и физические процессы превращения энергии [3]. Одним из механизмов может быть прямой фотохимический процесс, связанный с активным поглощением света молекулярным кислородом на длинах волн 638 и 762 нм [2] и усилением свободнорадикаль-ных процессов [1].

Целью работы явилось сравнительное изучение антимикробной активности применяемых в ФДТ растворов МС в зависимости от уровня их рН.

Материалы и методы

В работе использовали полирезистентный госпитальный штамм Klebsiella pneumoniae 360. Его суточную культуру высевали газоном на чашки Петри с агаром Мюллера-Хинтона. Затем на чашку пастеровской пипеткой наносили 2 капли раствора МС и после 10 минутной экспозиции проводили световое воздействие аппаратом ФДУ-1 с диной волны 630 нм на расстоянии 2 см от чашки в течение 1, 5 и 10 минут. Суммарная мощность лазерного излучения не превышала 5 Вт, применяли непрерывный режим излучения с плотностью мощности в фокусе до 200 мВт/см2. Результаты регистрировали через 24 часа. В работе использовали 0,01% и 0,05% растворы МС, приготовленные на дистиллированной воде и на 0,06 М фосфатном буфере с различным рН. Спектры поглощения МС исследовали на спектрофотометре Acta-C-lll фирмы «Весктап» (США).

Результаты и обсуждение

Для выбора оптимальной концентрации МС предварительно исследовали 0,01%, 0,05%, 0,1% и 0,5% водные растворы МС. Было установлено, что рН водных растворов МС находится в обратно пропорциональной зависимости от их концентрации: более концентрированные растворы имеют более низкий уровень рН. Отмечалось, что рН водных растворов МС нестабилен, при их хранении наблюдается тенденция к его сдвигу в щелочную сторону, более концентрированные растворы, имеющие более низкое значение рН, менее стабильны. рН водных растворов возрастает с повышением ихтемпературы, в более концентрированных растворах эта зависимость сильнее. Также изучали изменения рН водных растворов после лазерного облучения. В фото-сенсибилизированных водных растворах МС отмечена тенденция к сдвигу рН в ще-

лочную сторону, при более высокой концентрации она менее выражена. В то же время растворы красителя, приготовленные на фосфатном буфере, оказались более стабильными, их рН после фотосенсибилизации лазерным излучением не изменялся. Выбранные, как наиболее оптимальные, 0,01% и 0,05% растворы МС, приготовленные на фосфатном буфере, были использованы для работы с культурой микроорганизмов.

Бактерицидное действие водного 0,01% раствора МС отмечалось только после 10 минутного облучения. При использовании буферного раствора с рН 7,0 и 8,0 оно проявлялось уже через 5 минут облучения с увеличением эффекта при возрастании рН и продолжительности облучения.

Значительно большей эффективностью обладали 0,05% растворы МС. Установлено, что при облучении лазером в течение 1 и 5 минут эффективнее были буферные 0,05% растворы с более высоким рН, чем водные. Чем выше был рН раствора, тем наблюдался менее интенсивный рост. При использовании растворов с рН 8,0 и 9,0 зоны отсутствия микробного роста, возрастая после первых минут облучения, после 10-минутного облучения оставались такими же, как и после 5-минутного облучения.

Отдельно взятые в качестве контроля буферные растворы, как с низким, так и высоким рН не проявляли бактерицидных свойств.

Известно, что эффективность ФДТ зависит от совпадения пика поглощения ФС с пиком излучения светового потока. Разработанная нами установка ФДУ-1 имеет пик излучения в спектре 630±10 нм, а пик поглощения МС соответствует 620 нм. Нашими исследованиями установлено, что изменение рН МС в щелочную сторону приводит к возрастанию пика поглощения излучения до 630 нм. Тем самым происходит практически полное соответствие оптических параметров ФС и светоизлучающей установки.

Клебсиеллы — грамотрицательные эллипсоидные бактерии, хорошо растущие на простых питательных средах, факультативные анаэробы, хемоорганотрофы. Оптимальная температура их роста 35-37°С, рН 7,2— 7,4. Существует значительное различие в чувствительности к фотосенсибилизации между грамположительными и грамот-рицательными бактериями, что связано с различиями в их трехмерном строении.

14

Bulletin of the International Scientific Surgical Association

BISSA 2017 Vol. 6 № 1_л

Внешняя мембрана грамотрицательных бактерий образует физический и функциональный барьер для взаимодействия с окружающей средой [7].

Возрастание бактерицидной активности с увеличением рН раствора МС может быть связано с повышением проницаемости мембраны для фотосенсибилизатора за счет снижения поверхностного натяжения. Эффект ФДТ усиливается также вероятно и вследствие соответствия оптических параметров ФС и установки ФДУ-1. В то же время наблюдаемая нами относительно низкая бактерицидная активность фотосен-сибилизированных растворов МС при низких рН, может быть связана со свойством К. pneumoniae приобретать толерантность к повышенной кислотности [4].

ORIGINAL ARTICLES

Выводы

1. Максимальной антибактериальной активностью в отношении К. pneumoniae обладает ФДТ при 10 минутном воздействии с применением в качестве ФС 0,05% буферного раствора метиленового синего с рН 8,0 и ФДТ в течение 5 минут при использовании буферного раствора метиленового синего с рН 9,0.

2. Увеличение рН растворов МС наряду с усилением воздействия на мембрану грамотрицательных микроорганизмов приводит к сдвигу спектра поглощения излучения в длинноволновую сторону.

Список литературы

1. Журавлева Л.А. Светотерапия при тонзиллитах/ Л.А. Журавлева, И.И. Чанков, Т.В, Коннова// Сборник научно-практических материалов первого межрегионального совещания: 15-16 января 2004, Томск. - 2004. - С. 29-32.

2. Захаров С.Д., Иванов А.В.// Квант.электроника, 1999.-Т. 29-С. 192-214.

3. Чанков И. И., Хлусов И. А. Способ лечения хронического тонзиллита. Патент РФ №2235568. Приоритет от 20.01.2003. Опубл. 24.03.2004, Б.И. №30.

4. Aghi P., Chhibber S. Adaptive acid tolerance in Klebsiella pneumoniae // Indian Journal of Medical Microbiology. - 1999. - V.17, Issue 2. - P.81-84.

5. De Paula L., Santos R., Menezes H. et al. A comparative stady of irradiation systems for photoinactivation of microorganisms // J. Braz. Soc. - 2009. - V. 1 - P.1-7.

6. Luksiene Z., Zukauskas A. Prospects of photosenization in control of pathogenic and harmful microorganisms// J. of Applied Microbiology, 2009. - March. - P.11-32.

7. Tarvido J., Giglio A., De Olivera C. et al. Methylene blue in photodynamic therapy: From basic mechanisms to clinical applications // Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. - 2005. - V.2, Issue 3, September.-P.175-191..

Поступила в редакцию 21.02.2017

Сведения об авторах:

Баженов Леонид Григорьевич - Республиканский специализированный центр хирургии им. ак. В.Вахидова, докт.мед.наук, профессор, e-mail: leobaj@tps.uz