ПРОДУКТЫ И СПОСОБЫ ДЛЯ УХОДА ЗА ПОЛОСТЬЮ РТА, СОДЕРЖАЩИЕ ГИДРОКСИАПАТИТ-СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ
ORAL CARE PRODUCTS AND METHODS CONTAINING HYDROXYAPATITE-BINDING PROTEINS

Уровень техники
Зубная эмаль представляет собой тонкий твердый слой кальцинированного материала, который покрывает коронки зубов. Основным минеральным компонентом зубной эмали является гидроксиапатит, кристаллическая форма фосфата кальция. Химическая эрозия зубной эмали может возникать из-за воздействия на зубы кислых пищевых продуктов и напитков или желудочного сока, появляющегося в результате желудочно-кишечного рефлюкса. Эрозия зубной эмали может привести к повышенной чувствительности зубов из-за увеличения воздействия на канальцы дентина и увеличения видимости дентина, что приводит к появлению более желтых зубов. Слюнная пелликула (тонкий слой слюнных гликопротеинов, расположенных на зубах) является неотъемлемой частью защиты зубов от поражения эрозией. В результате люди, которые испытывают ксеростомию, более подвержены повреждению кислотной эрозией.
Существующие методы, разработанные для предотвращения эрозии эмали, включают включение источника свободного фторида в композиции для ухода за полостью рта. Фторид уменьшает повреждение эмали путем образования фторапатита, который растворяется при более низком значении рН, чем гидроксиапатит, и поэтому более устойчив к кислотному повреждению. Соли двухвалентного олова также были включены в композиции средства для чистки зубов для защиты поверхности эмали подобным образом, путем образования более устойчивого к кислоте минерального слоя. Полимеры также были описаны, которые покрывают и защищают поверхность эмали.
Кислоты также образуются в полости рта, когда бляшка, содержащая кариесогенные бактерии, метаболизирует углеводы. Поскольку бляшка образует барьер, контролирующий кинетику протонной и минеральной диффузии через эмаль, кислоты бляшки вызывают кариозные поражения. Включение фторидных ионов в композиции средства для чистки зубов является наиболее распространенным методом смягчения воздействия кислот бляшек. Фторид снижает скорость деминерализации и усиливает реминерализацию. Было также разработано несколько подходов для стабилизации фосфатных солей кальция или контроля значения рН бляшек для улучшения реминерализации.
Несмотря на то что были разработаны методы для смягчения воздействия небактериально и бактериально образованных кислот на зубах, все еще существует потребность в обеспечении улучшенных композиций для ухода за полостью рта, которые эффективно восстанавливают эмаль после воздействия кислотной эрозии и бактериальных кислот.
Сущность изобретения
Авторами настоящего изобретения неожиданно было обнаружено, что гидроксиапатит-связывающие полипептиды (НАВР) эффективны для восстановления или смягчения эффектов зубной эрозии, способствуя зубной реминерализации, и усиливая противокариозные эффекты фторида.
2
Например, в одном варианте выполнения настоящего изобретения, НАВР получают для введения в композицию с ингредиентами подходящего перорально приемлемого носителя, посредством разбавления в буфере, например, фосфатном буфере, таком как Na2HPO4 буфер (1.5 мМ) и CaCl (2.5 мМ), с обеспечением буферизованного раствора, имеющего почти нейтральное или слегка основное значение рН, например, рН 7-8, например, около рН 7.5, фильтрации и центрифугирования раствора с получением фильтрата, содержащего НАВР. Биоцид (например, цетилпиридиния хлорид при 0.1%) и фторид могут быть добавлены в фильтрат. НАВР зачем может быть объединен с компонентами перорально приемлемого носителя, например, основой зубной пасты или жидкости для полоскания рта, с обеспечением композиции для ухода за полостью рта для восстановления или смягчения эффектов зубной эрозии, способствуя зубной реминерализации, и усиливая противокариозные эффекты фторида.
Настоящее изобретение, таким образом, относится к композиции для ухода за полостью рта (Композиция 1), например, средству для чистки зубов, содержащей:
a) НАВР;
b) перорально приемлемый носитель,
где НАВР присутствует в композиции в количестве от 0.01 мас. % до 3 мас. % от общей массы композиции. Например, настоящее изобретение обеспечивает:
1.1. Композицию 1, в которой НАВР имеет полипептидную последовательность SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4.
1.2. Любую вышеуказанную композицию, содержащую фторид.
1.3. Любую вышеуказанную композицию, в которой НАВР был нейтрализован до почти нейтрального или слегка основного значения рН, например, рН 7-8, например, применяя фосфатный буфер.
1.4. Любую вышеуказанную композицию, в которой НАВР содержит биоцид, например, цетилпиридиния хлорид (СРС), при эффективной концентрации, например, 0.1% по массе фильтрата.
1.5. Любую вышеуказанную композицию, в которой НАВР присутствует в композиции в количестве от 0.1 мас. % до 3 мас. % от общей массы композиции, например, от 0.2 мас. % до 2 мас. %, например, около 0.2 мас. %, около 1 мас. %, около 1.5 мас. % или около 2 мас. % от общей массы композиции.
1.6. Любую вышеуказанную композицию, где композиция содержит эффективное количество фторида.
1.7. Любую вышеуказанную композицию, которая содержит количество фторида от 100 частей на миллион до 2500 частей на миллион, например, от 250 частей на миллион до 750 частей на миллион, например, около 500 частей на миллион фторид.
1.8. Любую вышеуказанную композицию, содержащую перорально приемлемую соль цинка или оксид, например, выбранный из оксида цинка, цитрата цинка, лактата цинка, фосфата цинка, ацетата цинка, хлорида цинка, комплексов цинка с аминокислотами, и смесей любого из вышеуказанного, например, в которой количество цинка составляет от 0.1 мас. % до 3 мас. %, например, от около 1 до около 2 мас. %, как вычислено на основе массы иона цинка.
2
2
1.9. Любую вышеуказанную композицию, содержащую перорально приемлемую соль двухвалентного олова, например, SnF или SnCl.
1.10. Любую вышеуказанную композицию, где композиция находится в форме, выбранной из средства для полоскания рта, зубной пасты, геля для ухода за зубами, зубного порошка, неабразивного геля, мусса, пены, средства для ароматизации рта в аэрозольной упаковке и таблетки, например, средства для чистки зубов, например, зубной пасты или средства для полоскания рта.
1.11. Любую вышеуказанную композицию, где композиция дополнительно содержит одно или более средств, выбранных из: абразивных материалов, рН-модифицирующих средств, поверхностно-активных веществ, модуляторов пены, загустителей, модификаторов вязкости, смачивающих средств, предупреждающих образование конкрементов средств или контролирующих образование зубного камня средств, подсластителей, ароматизаторов и красителей.
1.12. Любую вышеуказанную композицию, в которой композиция представляет собой зубную пасту.
1.13. Любую вышеуказанную композицию, содержащую одну или более растворимых фосфатных солей, например, где "растворимые фосфатные соли" означают перорально приемлемую фосфатную соль, имеющую растворимость в воде по меньшей мере 1 г/100 мл при 25°С; например, в которой одной или более растворимыми фосфатными солями являются натриевые и/или калиевые соли пирофосфатов и/или полифосфатов, например, триполифосфаты; например, в которой одна или более растворимых фосфатных солей содержат тетранатрия пирофосфат (TSPP), триполифосфат натрия (STPP) или комбинацию TSPP и STPP; например, где одна или более растворимые фосфатные соли присутствуют в количестве 1-20%, например, 2-8%, например, около 5%, по массе композиции.
1.14. Любую вышеуказанную композицию, в которой фторид обеспечивается посредством соли, выбранной из фторида двухвалентного олова, фторида натрия, фторида калия, монофторфосфата натрия, фторсиликата натрия, фторсиликата аммония, аминфторида (например, N-октадецилтриметилендиамин-N,N,N'-трис(2-этанол)-дигидрофторид), аммония фторида, фторида титана, гексафторсульфата и их комбинаций.
1.15. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее смачивающее средство, например, выбранное из глицерина, сорбитола, пропиленгликоля, полиэтиленгликоля, ксилита и их смесей, например содержащее по меньшей мере 30%, например, 40-50% глицерина, по массе композиции.
1.16. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее одно или более поверхностно-активных веществ, например, выбранных из анионных, катионных, цвиттер-ионных и неионных поверхностно-активных веществ, и их смесей, например, где основа средства для чистки зубов содержит анионное поверхностно-активное вещество, например, поверхностно-активное вещество, выбранное из лаурилсульфата натрия, простоэфирного лаурилсульфата натрия и их смесей, например в количестве от около 0.3% до около 4.5 мас. %, например 1-2% лаурилсульфата натрия (SLS) по массе композиции.
1.17. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее цвиттер-ионное поверхностно-активное вещество, например, бетаиновое поверхностно-активное вещество, например, кокамидопропилбетаин, например в количестве от около 0.1% до около 4.5 мас. %, например 0.5-2% кокамидопропилбетаина по массе композиции.
1.18. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее модифицирующее вязкость количество одного или более из полисахаридных камедей, например, ксантановой камеди или каррагенана, кремнезёмного сгустителя и их комбинаций.
1.19. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее полоски или фрагменты камеди.
1.20. Любую вышеуказанную композицию, содержащую отдушку, ароматизатор и/или краситель.
1.21. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее эффективное количество одного или более противомикробных средств, например, содержащее противомикробный агент, выбранный из галогенированного дифенилового простого эфира (например, триклозан), экстрактов трав и эфирных масел (например, экстракт розмарина, экстракт чая, экстракт магнолии, тимол, ментол, эвкалиптол, гераниол, карвакрол, цитраль, хинокитол, катехин, метилсалицилат, галлат эпигаллокатехина, эпигаллокатехин, галловая кислота, экстракт мисуака, экстракт облепихи крушиновидной, прополис), бигуанидных антисептиков (например, хлоргексидин, алексидин или октенидин), соединений четвертичного аммония (например, цетилпиридиний хлорид (СРС), бензалконий хлорид, тетрадецилпиридиний хлорид (ТРС), N-тетрадецил-4-этилпиридиний хлорид (TDEPC)), фенольных антисептиков, гексетидина, октенидина, сангвинарина, повидон-йода, делмопинола, салифтора, ионов металлов (например, соли цинка, например, цитрат цинка, соли олова, соли меди, соли железа), сангвинарина, прополиса и оксигенирующих средств (например, перекись водорода, забуференный пероксиборат или пероксикарбонат натрия), фталевой кислоты и ее солей, моноперфталевой кислоты и ее солей и сложных эфиров, аскорбилстеарата, олеилсаркозина, алкилсульфата, диоктилсульфосукцината, салициланилида, домифенбромида, делмопинола, октапинола и других производных пиперидина, препаратов ницина, хлоритных солей, а также смесей любых из вышеперечисленных; например, содержащее триклозан или цетилпиридиния хлорид.
1.22. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее отбеливающее средство, например, выбранное из группы, состоящей из пероксидов, хлоритов металлов, перборатов, перкарбонатов, пероксикислот, гипохлоритов, а также их комбинаций; например, пероксид водорода или источник пероксида водорода, например, перекись мочевины или пероксидную соль или комплекс (например, такой как соли пероксифосфат, пероксикарбонат, перборат, пероксисиликат или персульфат, например пероксифосфат кальция, перборат натрия, перекись карбоната натрия, пероксифосфат натрия и персульфат калия).
1.23. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее агент, которые вмешивается в прикрепление бактерий или препятствует ему, например, solbrol или хитозан.
1.24. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее растворимую кальциевую соль, например, выбранную из сульфата кальция, хлорид кальция, нитрат кальция, ацетат кальция, лактат кальция и их комбинации.
1.25. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее физиологически или перорально приемлемую калиевую соль, например, нитрат калия или хлорид калия, в количестве, эффективном для уменьшения чувствительности зубов.
1.26. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее анионный полимер, например, синтетический анионный полимерный поликарбоксилат, например, в котором анионный полимер выбирают из от 1:4 до 4:1 сополимеров малеинового ангидрида или кислоты с другим полимеризуемым этиленненасыщенным мономером; например, в котором анионный полимер представляет собой сополимер метилвинилового простого эфира/малеинового ангидрида (PVM/MA), имеющий средневесовую молекулярную массу (M.W.) от около 30,000 до около 1,000,000, например от около 300,000 до около 800,000, например, в котором анионный полимер составляет около 1-5%, например, около 2%, от массы композиции.
1.27. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее освежитель дыхания, отдушку или ароматизатор.
1.28. Любую из вышеуказанных композиций, в которой значение рН композиции является почти нейтральным, например, около рН 7.
1.29. Любую из вышеуказанных композиций для применения для уменьшения и ингибирования кислотной эрозии, очищения зубов, уменьшения бактериально-образованной биопленки и бляшки, уменьшения восстановления десен, ингибирования зубного кариеса и образования полостей, и уменьшения зубной гиперчувствительности.
1.30. Любую вышеуказанную композицию для применения для уменьшения, ингибирования или восстановления эрозии зубной эмали.
1.31. Любую вышеуказанную композицию для применения, чтобы промотировать зубную реминерализацию.
1.32. Любую вышеуказанную композицию для применения для усиления противокариозных эффектов фторида.
В конкретном варианте выполнения настоящего изобретения Композиция 1 представляет собой средство для чистки зубов, содержащее
а) НАВР; например, содержащее сухое вещество в количестве по меньшей мере 20.0 %, общий азот в количестве по меньшей мере 2.5 %, имеющее значение рН 4.0-5.0, и содержание золы 1.0 % или менее; в котором частично гидролизованный пшеничный белок был нейтрализован до почти нейтрального или слегка основного значения рН;
b) необязательно эффективное количество фторида;
c) перорально приемлемый носитель,
например, в котором количество НАВР составляет от 0.1 мас. % до 2 мас. %, и
например, где фторид присутствует в количестве от 100 частей на миллион до 1000 частей на миллион, например, около 500 частей на миллион.
Одним объектом настоящего изобретения является любая из композиций 1 и последующих, для применения для восстановления или ингибирования зубной эрозии, способствуя реминерализации и/или усиливая противокариозные эффекты фторида; например, для применения в любом из следующих способов согласно способу 1 и последующим.
Другим объектом настоящего изобретения является способ (способ 1) восстановления или ингибирования зубной эрозии, способствуя зубной реминерализации, и/или усиливая противокариозные эффекты фторида, включающий нанесение на зубы композиции, например, любой из композиции 1 и последующих, например, композиции для ухода за полостью рта, содержащей:
a) НАВР
b) перорально приемлемый носитель,
где НАВР присутствует в композиции в количестве от 0.01 мас. % до 3 мас. % от общей массы композиции. Например, настоящее изобретение обеспечивает:
1.1. Способ 1, в котором НАВР имеет полипептидную последовательность SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4
1.2. Любой вышеуказанный способ, в котором НАВР содержит фторид.
1.3. Любой вышеуказанный способ, в котором НАВР был нейтрализован до почти нейтрального или слегка основного значения рН, например, рН 7-8, например, применяя фосфатный буфер.
1.4. Любой вышеуказанный способ, в котором НАВР содержит биоцид, например, цетилпиридиния хлорид (СРС) при эффективной концентрации, например, 0.1% по массе фильтрата.
1.5. Любой вышеуказанный способ, в котором НАВР присутствует в композиции в количестве от 0.1 мас. % до 3 мас. % от общей массы композиции, например, от 0.2 мас. % до 2 мас. %, например, около 0.2 мас. %, около 1 мас. %, около 1.5 мас. % или около 2 мас. % от общей массы композиции.
1.6. Любой вышеуказанный способ, в котором композиция содержит эффективное количество фторида.
1.7. Любой вышеуказанный способ, в котором количество фторида составляет от 100 частей на миллион до 1000 частей на миллион, например, около 500 частей на миллион фторид.
1.8. Любой вышеуказанный способ, в котором композиция находится в форме, выбранной из средства для полоскания рта, зубной пасты, геля для ухода за зубами, зубного порошка, неабразивного геля, мусса, пены, средства для ароматизации рта в аэрозольной упаковке и таблетки.
1.9. Любой вышеуказанный способ, в котором композиция дополнительно содержит одно или более средств, выбранных из: абразивных материалов, рН-модифицирующих средств, поверхностно-активных веществ, модуляторов пены, загустителей, модификаторов вязкости, смачивающих средств, предупреждающий образование конкрементов или контролирующих образование зубного камня средств, подсластителей, ароматизаторов и красителей.
1.10. Любой вышеуказанный способ, в котором композиция представляет собой средство для чистки зубов, например, зубную пасту.
1.11. Любой вышеуказанный способ, в котором композицию выбирают из любой из Композиций 1 и последующих, указанных выше.
1.12. Любой вышеуказанный способ, который представляет собой способ для уменьшения, ингибирования или восстановления зубной эрозии, например, эрозии эмали, например, в котором композицию наносят на зуб пациента, идентифицированного как имеющий зубную эрозию или имеющий повышенный риск развития зубной эрозии.
1.13. Любой вышеуказанный способ, который представляет собой способ промоторования зубной реминерализации, например, реминерализации зубной эмали, например, в котором композицию наносят на зуб пациента, идентифицированного как имеющий деминерализацию.
1.14. Любой вышеуказанный способ, который представляет собой способ усиления противокариозных эффектов фторида, например, в которой в котором композицию наносят на зуб пациента, идентифицированного как имеющий первые признаки зубного кариеса, например, начальный кариес эмали, или как имеющий активный кариес, или имеющий повышенный риск развития зубного кариеса.
1.15. Способ 1.15, в котором композиция содержит эффективное количество фторида и/или, в котором способ дополнительно содержит введение продукта для ухода за полостью рта, ополаскивателя для полости рта, содержащего эффективное количество фторида, или зубной пасты, содержащей эффективное количество фторида.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения, настоящее изобретение обеспечивает применение НАВР для получения композиции для ухода за полостью рта, например, согласно любой из композиций 1 и последующих, для восстановления или ингибирования зубной эрозии, способствуя реминерализации, и/или усиливая противокариозные эффекты фторида, например, в любом из способов 1 и последующих.
Другим объектом настоящего изобретения является способ (способ 2) получения продукта для ухода за полостью рта, например, продукта для ухода за полостью рта, полезного для восстановления или ингибирования зубной эрозии, способствуя зубной реминерализации, и/или усиливая противокариозные эффекты фторида, например, продукта в соответствии с любой из композиции 1 и последующих, включающий
a) нейтрализацию НАВР посредством разбавления водным буферным раствором, например, фосфатным буферным раствором, с получением раствора, имеющего почти нейтральное или слегка основное значение рН, например, рН 7-8;
b) фильтрацию и центрифугирование раствора продукта согласно а) с получением фильтрата, содержащего НАВР;
c) добавление фторида (например, в форме перорально приемлемой соли, содержащей фторид, например, фторид натрия или монофторфосфат натрия), и необязательно биоцида (например, цетилпиридиния хлорида в эффективном количестве, например, от 0.01 до 1%, например, около 0.1% по массе фильтрата) к фильтрату продукта b);
d) подмешивание продукта с) к компонентам перорально приемлемого носителя с получением композиции для ухода за полостью рта, содержащей НАВР в количестве от 0.01 мас. % до 3 мас. % от общей массы композиции.
Например, настоящее изобретение обеспечивает композицию для ухода за полостью рта, содержащую НАВР, например, композиция в соответствии с любой из композиции 1 и последующих, в которой композицию для ухода за полостью рта получают, или она является получаемой способом согласно способу 2 и последующим.
Другие области применимости настоящего изобретения станут очевидными на основании подробного описания, представленного ниже. Следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры, с указанием предпочтительного варианта выполнения настоящего изобретения, предназначены только для иллюстрации и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.
Подробное описание изобретения
Нижеследующее описание предпочтительного варианта (вариантов) выполнения настоящего изобретения является просто иллюстративным по своей природе и никоим образом не предназначено для ограничения настоящего изобретения, его применения или использований.
Как применяется в настоящей заявке, диапазоны используются в качестве сокращения для описания каждого значения, находящегося в пределах диапазона. Любое значение в пределах диапазона может быть выбрано как конечная точка диапазона. Кроме того, все ссылки, приведенные в настоящей заявке, включены в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме. В случае конфликта в определении в настоящей заявке и в процитированной ссылке настоящее описание преобладает.
Если не указано иное, все проценты и количества, приведенные в настоящей заявке и в другом месте в описании, следует понимать как относящиеся к процентам по массе. Указанные количества основаны на активной массе вещества.
Гидроксиапатит-связывающие полипептиды (НАВР)
Гидроксиапатит-связывающие полипептиды (НАВР) согласно настоящему изобретению представляют собой полипептиды, которые были разработаны для специфического связывания с гидроксиапатитом, который является основным компонентом зубной эмали, а также для промотирования зубной реминерализации, и для усиления противокариозных эффектов фторида.
НАВР могут быть описаны посредством общей формулы (I)
где
a, d независимо друг от друга представляют собой гидрофобии или последовательность антифризного белка или активный ингредиент для ухода за полостью рта, например охлаждающее соединение, противомикробное соединение, отбеливающее соединение
b, с независимо друг от друга представляют собой аминокислоту у представляет собой полипептидную последовательность согласно SEQ ID NO: 1 до SEQ ID NO: 16.
3
НАВР имеет сердцевинную последовательность ("у"), которая представляет собой полипептид, выбранный из группы SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Предпочтительными последовательностями у являются SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4. НАВР может иметь одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять у последовательностей. В случае множества у-последовательностей у могут быть идентичными («гомомер») или различными («гетеромер»), или частично идентичным и частично различными. Например, у может представлять собой полипептид SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 11, т.е. 21 аминокислота.
0-10
0-10
4
НАВР может иметь при амино- и/или при карбокситерминальном конце у дополнительные аминокислоты b и с. "b" и "с" представляют собой любую из 20 природных аминокислот (Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr), и индексы 0-10 представляют собой ни одной (0), одну (1), две (2), три (3) … до десяти (10) аминокислот. В случае, например, четырех аминокислот, эти четыре аминокислоты могут быть одинаковыми или разными. Например, b может представлять собой Ala-Gly-Ser-Ser. Последовательности "b" и "с" являются спейсерными или дополнительными последовательностями, которые иногда создаются путем клонирования соответствующих фрагментов генов (сайтов распознавания для рестрикционных ферментов или праймера) и которые, как правило, не оказывают специфического эффекта на связывание гидроксиапатита или усиление зубной реминерализации. Последовательности "b" и "с" могут при необходимости содержать сайт рестрикции для протеаз, которые происходят в полости рта.
Предпочтительными аминокислотами для b и с являются незаряженные аминокислоты с необъемными боковыми цепями, как например, Gly, Ala, Ser, Thr.
Кроме того, НАВР может содержать в дополнение к "у" и - если желательно "b" и/или "с" дополнительные полипептиды "а" и/или "d", которые могут представлять собой гидрофобин-полипептид и/или антифризный белок (AFP) или активный ингредиент для ухода за полостью рта. Например, один вариант выполнения НАВР может иметь гидрофобин-полипептид, слитый с у-последовательностью, сопровождающийся другим гидрофобином. Другим вариантом выполнения НАВР может быть полипептид AFP ("а"), слитый с последовательностью у, слитой с другой у-последовательностью, сопровождающийся активным ингредиентом для ухода за полостью рта.
Гидрофобии означает хорошо описанный класс белков (Wessels, 1997, Adv. Microb. Physio. 38: 1-45; Wosten, 2001, Annu Rev. Microbiol. 55: 625-646), способных к самосборке на гидрофобной/гидрофильной границе раздела, и имеющих консервативную последовательность:
где X представляет собой любую аминокислоту, и n и m независимо представляют собой целое число. Как правило, гидрофобии имеет длину до 125 аминокислот. Цистеиновые остатки (С) в консервативной последовательности являются частью дисульфидных мостиков. В контексте настоящего изобретения термин гидрофобии имеет более широкое значение, чтобы включать функционально эквивалентные белки, все еще проявляющие характеристику самосборки при гидрофобно-гидрофильной границе раздела, приводя к белковой пленке, или их части, все еще проявляющие характеристику самосборки на гидрофобно-гидрофильной границе раздела, приводя к белковой пленке. В соответствии с определением в контексте настоящего изобретения самосборку можно обнаружить путем адсорбции белка полихлортрифторэтиленом и с использованием циркулярного дихроизма, чтобы установить наличие вторичной структуры (в общем, а-спирали) (De Vocht et al., 1998, Biophys. J. 74:2059-68).
Образование пленки может быть установлено посредством инкубации полихлортрифторэтиленового листа в белковом растворе с последующими по меньшей мере тремя промывками водой или буфером (Wosten et al., 1994, Embo. J. 13: 5848-54). Белковая пленка может быть визуализирована любым подходящим методом, таким как внесение метки флуоресцентным маркером или посредством применения флуоресцентных антител, а также как установлено в данной области техники, тип, как правило, имеют значения в интервале от 0 до 2000, но более типично m и п в общем составляют менее 200 или 300. Определение гидрофобина в контексте настоящего изобретения означает слитые белки гидрофобина и другого полипептида, а также конъюгаты гидрофобина и других молекул, таких как полисахариды.
Гидрофобии, идентифицированные на сегодняшний день, обычно классифицируются как класс I или класс II. Оба типа были идентифицированы в грибах как секретируемые белки, которые способны к самосборке на гидрофобно-гидрофильных границах раздела в амфипатические пленки.
Гидрофобины могут быть получены экстракцией из природных источников, таких как мицелиальные грибы, любым подходящим способом. Например, гидрофобины можно получить путем культивирования мицелиальных грибов, которые секретируют гидрофобии в среду для выращивания, или путем экстракции из мицелия грибов с 60% этанолом. Особенно предпочтительно выделять гидрофобины из организмов-хозяев, которые естественным образом секретируют гидрофобии. Предпочтительными хозяевами являются гифомицеты (например, Trichoderma), базидиомицеты и аскомицеты. Особенно предпочтительными хозяевами являются пищевые организмы, такие как Cryphonectria parasitica, который секретирует гидрофобии, называемый крипарином (Maccabe and Van Alfen, 1999, Арр. Environ. Microbiol 65: 5431-5435).
Альтернативно, гидрофобины можно получить с использованием рекомбинантной технологии. Например, клетки-хозяева, как правило, микроорганизмы, могут быть модифицированы для экспрессии гидрофобинов, и гидрофобины могут быть затем выделены и использованы в соответствии с настоящим изобретением. Способы введения конструкций нуклеиновых кислот, кодирующих гидрофобии, в клетки-хозяева, хорошо известны в данной области техники. Было клонировано более 34 генов, кодирующих гидрофобии, из более чем 16 видов грибов (смотрите, например, W096/41882, в которой приводится последовательность гидрофобинов, идентифицированных в Agaricus bisporus; и Wosten, 2001, Annu. Rev. Microbiol. 55: 625-646). Рекомбинантную технологию можно также использовать для модификации гидрофобиновых последовательностей или синтеза новых гидрофобинов с желательными/улучшенными свойствами. Обычно подходящую клетку-хозяин или организм трансформируют с помощью конструкции нуклеиновой кислоты, которая кодирует желаемый гидрофобии. Нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, можно вставить в подходящий вектор экспрессии, кодирующий необходимые элементы транскрипции и трансляции, и таким образом, чтобы она экспрессировалась в соответствующих условиях (например, в правильной ориентации и правильной рамке считывания и с соответствующими нацеливающими и экспрессионными последовательностями). Способы, необходимые для конструирования этих векторов экспрессии, хорошо известны специалистам в данной области техники.
Для экспрессии полипептидной кодирующей последовательности может быть использован ряд систем экспрессии. Они включают, но не ограничиваются ими, бактерии, грибы (включая дрожжи), системы на основе клеток насекомых, системы культивирования на основе растительных клеток и растения, все трансформированные соответствующими векторами экспрессии.
Предпочтительными хозяевами являются те, которые считаются пищевыми - «в общем считаются безопасными» (GRAS).
Подходящие виды грибов включают дрожжи (но без ограничения к этому) рода Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, Schizo saccharomyces и тому подобное, и нитеобразные виды, такие как (но без ограничения к этому) рода Aspergillus, Trichoderma, Mucor, Neurospora, Fusarium и тому подобное.
Последовательности, кодирующие гидрофобины, являются предпочтительно на по меньшей мере 80% идентичными на уровне аминокислот гидрофобину, идентифицированному в природе, более предпочтительно по меньшей мере на 95% или 100% идентичны. Однако специалисты в данной области могут сделать консервативные замены или другие аминокислотные замены, которые не уменьшают биологическую активность гидрофобина. В целях настоящего изобретения эти гидрофобины, обладающие этим высоким уровнем идентичности с гидрофобином естественного происхождения, также охватываются термином "гидрофобины".
Гидрофобины можно очистить от культуральной среды или клеточных экстрактов, например, методикой, описанной в WO 01/57076, которая включает адсорбцию гидрофобина, присутствующего в гидрофобин-содержащем растворе, на поверхности и последующий контакт поверхности с поверхностно-активным веществом, таким как Tween 20, чтобы элюировать гидрофобии с поверхности. Смотрите также Collen et al., 2002, Biochim Biophys Acta. 1569: 139-50; Calonje et al., 2002, Can. J. Microbiol. 48: 1030-4; Askolin et al., 2001, Appl Microbiol Biotechnol. 57: 124-30; и De Vries et al., 1999, Eur J Biochem. 262: 377-85. Как правило, гидрофобии находится в нерастворимой форме, как правило является по меньшей мере частично очищенным, как например, по меньшей мере 10% чистота, на основе массы твердых веществ. Под «выделенной формой» подразумевают, что гидрофобии не добавляется как часть естественно происходящего организма, такого как гриб, который естественно экспрессирует гидрофобины. Вместо этого гидрофобии, как правило, либо был экстрагирован из природного источника или получен рекомбинантной экспрессией в организме-хозяине.
Гидрофобиновые белки могут быть поделены на два класса: класс I, которые в большей мере не растворимы в воде, и класс II, которые легко растворимы в воде.
Предпочтительно, выбранные гидрофобины представляют собой гидрофобины класса I. Более предпочтительно используемыми гидрофобинами являются гидрофобии класса I, такие как DewA, RodA. Гидрофобии может быть из одного источника или множества источников, например, смесь двух или более разных гидрофобинов. Общее количество гидрофобина в композициях согласно настоящему изобретению в общем составляет по меньшей мере 0,001%, более предпочтительно по меньшей мере 0,005 или 0,01%, и в общем не более 2% от общей массы гидрофобии из расчета на общую массу композиции.
Гидрофобины согласно определению, применяемому в настоящем изобретении, включают также слитые белки гидрофобина и другого белка. Они могут быть описаны общей формулой (II)
n
m
где X может представлять собой любую из 20 природных аминокислот (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, Ile, Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly), и индексы при X показывают число аминокислот, причем индексы пит представляют собой числа от 0 до 500, предпочтительно от 15 до 300, и причем С представляет собой цистеин, при условии, что по меньшей мере одна из пептидных последовательностей, обозначенных как X или X представляет собой пептидную последовательность из по меньшей мере 20 аминокислот в длину, которая не связана с гидрофобином в природе, где полипептиды изменяют угол контакта на по меньшей мере 20° после нанесения в виде покрытия на стеклянную поверхность.
1
8
1
2
3
4
5
6
7
8
Цистеины, обозначенные как С-С, могут быть либо в редуцированной форме, либо образуют дисульфидные мостики друг с другом в белках согласно настоящему изобретению. Особенно предпочтительным является внутримолекулярное образование С-С мостиков, в частности цистеины имеют по меньшей мере один, предпочтительно 2, особенно предпочтительно 3, и наиболее предпочтительно 4, внутримолекулярных дисульфидных мостиков, выбранных из следующей группы: С с С; С с С, С с С, С с С.
Если цистеины также применяются в положениях, обозначенных X, нумерация отдельных цистеиновых положений в общих формулах может изменяться соответствующим образом.
Особенно предпочтительными являются полипептиды общей формулы (III)
n
m
где X может представлять собой любую из 20 природных аминокислот (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, Ile, Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly), и индексы при X показывают число аминокислот, причем индексы пит представляют собой числа от 2 до 300, и причем С представляет собой цистеин, при условии, что по меньшей мере одна из пептидных последовательностей, обозначенных как X или X представляет собой пептидную последовательность из по меньшей мере 35 аминокислот в длину, которая не связана с гидрофобином в природе, где полипептиды которой изменяют угол контакта на по меньшей мере 20° после нанесения в виде покрытия на стеклянную поверхность.
Наиболее предпочтительными являются полипептиды общей формулы (IV)
n
m
где X может представлять собой любую из 20 природных аминокислот (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, Ile, Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly), и индексы при X показывают число аминокислот, причем индексы пит представляют собой числа от 0 до 200, и причем С представляет собой цистеин, при условии, что по меньшей мере одна из пептидных последовательностей, обозначенных как X или X представляет собой пептидную последовательность из по меньшей мере 40 аминокислот в длину, которая не связана с гидрофобином в природе, где полипептиды изменяют угол контакта на по меньшей мере 20° после нанесения в виде покрытия на стеклянную поверхность.
Предпочтительными вариантами выполнения описываемого изобретения являются полипептиды, имеющие общую структурную формулу (I), (II) или (III), причем эта структурная формула содержит по меньшей мере один гидрофобии класса I, предпочтительно по меньшей мере один гидрофобии dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basf1, basf2, или их части или производные. Указанные гидрофобины структурно характеризуются приведенным далее перечне последовательностей. Также возможно, чтобы множество, предпочтительно 2 или 3, структурно идентичных или разных гидрофобинов были связаны друг с другом и с соответствующей подходящей полипептидной последовательностью, которая естественным образом не связана с гидрофобином.
Особенно предпочтительными вариантами выполнения настоящего изобретения являются гидрофобиновые белки, имеющие полипептидные последовательности согласно SEQ ID NO: 17 (dewA), SEQ ID NO: 18 (rodA), SEQ ID NO: 19 (HypA), SEQ ID NO: 20 (HypB), SEQ ID NO: 21 (Sc3), SEQ ID NO: 22 (BASF1), SEQ ID NO: 23 (BASF2).
n
m
Белки согласно настоящему изобретению имеют в по меньшей мере одном положении, обозначенном X или X, полипептидную последовательность, содержащую по меньшей мере 20, предпочтительно по меньшей мере 35, особенно предпочтительно по меньшей мере 50, и в частности по меньшей мере 100, аминокислот (также упоминаемую далее в настоящей заявке как партнер слияния), которая в природе не связана с гидрофобином. Это предназначено для того, чтобы выразить тот факт, что белки согласно настоящему изобретению состоят из гидрофобинового фрагмента и части партнера слияния, которые не встречаются вместе в этой форме в природе.
n
m
n
m
Фрагмент партнера слияния может быть выбран из множества белков. Также возможно связать множество партнеров слияния с одним гидрофобным фрагментом, например, при аминоконце (X) и при карбоксильном конце (X) гидрофобинового фрагмента. Однако также можно связать, например, два партнера слияния с одним положением (X или X) белка согласно настоящему изобретению.
Особенно подходящими партнерами слияния являются полипептиды, которые встречаются в природе в микроорганизмах, в частности в Е. coli или Bacillus subtilis. Примерами таких партнеров слияния являются последовательности yaad (SEQ ID NO: 24), yaae (SEQ ID NO: 25), приводящие к новым гидрофобиновым слитым белкам, например SEQ ID NO: 26 и NO: 27. Другим предпочтительным партнером слияния является тиоредоксин. Очень полезны также фрагменты или производные указанных последовательностей, которые содержат только часть, предпочтительно 70-99%, особенно предпочтительно 80-98%, указанных последовательностей, или в которых отдельные аминокислоты или нуклеотиды были заменены по сравнению с указанной последовательностью. Например, дополнительные аминокислоты, в частности, две дополнительные аминокислоты, предпочтительно аминокислоты Arg, Ser, могут быть присоединены к С-концу последовательностей yaad и уаае. Кроме того, возможно предпочтительно вставлять дополнительные аминокислоты, например, аминокислоту No. 2 (Gly) в последовательность уаае или yaad по сравнению с последовательностью природного происхождения.
AFP означает антифризные белки (AFP), которые являются белками из организмов, таких как определенные позвоночные, растения, грибы и бактерии, которые обеспечивают их выживание в неблагоприятных условиях. AFP также называют белками, структурирующими лед. AFP связываются с небольшими кристаллами льда, чтобы ингибировать рост и перекристаллизацию льда, который в противном случае был бы фатальным для организмов. Общей особенностью AFP является тепловой гистерезис, который представляет собой разницу между температурой плавления и точкой замерзания. Добавление AFP на границе раздела между твердым льдом и жидкой водой ингибирует термодинамически благоприятный рост кристалла льда. Рост льда кинетически ингибируется AFP, покрывающими поверхности льда, доступные для воды. Тепловой гистерезис легко измеряется в лаборатории с помощью нанолитрового осмометра.
Нет общей консенсусной последовательности AFP из различных организмов Crit Rev Biotechnol. 2008; 28: 57-82., Properties, potentials, and prospects of antifreeze proteins, Venketesh SI, Dayananda C; Journal of Experimental Biology 2015; 218: 1846-1855., Animal ice-binding (antifreeze) proteins and glycolipids: an overview with emphasis on physiological function, John G Duman.
Полезными для настоящего изобретения являются AFP из рыбы, такой как, например, американская бельдюга, или из растений, таких как плевел многолетний. Предпочтительные AFP являются такие, как из насекомых. Существуют два известных типа AFP насекомых, AFP Tenebrio и Dendroides, которые находятся в разных семействах насекомых. Они похожи друг на друга и состоят из различного числа 12 или 13-мерных повторов приблизительно 8,3-12,5 кДа. Особенно предпочтительными AFP из насекомых являются AFP из choristoneura fumiferana.
Особенно предпочтительными AFP являются имеющие следующие полипептидные последовательности:
ВМ 82 (SEQ ID NO: 28),
ВМ 80 (SEQ ID NO: 29),
ВМ 83 (SEQ ID NO: 30).
AFP в контексте настоящего изобретения также означает, что множество копий (т.е. мультимеры) AFP слиты вместе, например, два или три AFP - имеющие идентичную структуру (т.е. гомомеры) или различную структуру (т.е. гетеромеры) - образуют "супер AFP". Например, AFP из рыбы может быть слит вместе с AFP из насекомых, или два идентичных AFP из рыбы слиты вместе.
Кроме того, НАВР может содержать в дополнение к "у" и - если желательно "b" и/или "с" другие активные ингредиенты "а" или "d", которые могут быть активными ингредиентами для ухода за полостью рта.
Активный ингредиент для ухода за полостью рта означает соединения, особенно низкомолекулярные соединения, которые могут оказывать благоприятный, защитный, терапевтический (например хлоргексидин) или косметический эффект (например декспантенол ((+)-(R)-2,4-дигидрокси-N-(3-гидроксипропил)-3,3-диметилбутирамид), витамин Е) для зубов или полости рта. Активные ингредиенты для ухода за полостью рта содержат вещества, которые оказывают противомикробные эффекты в полости рта, такие как триклозан, или соединения, которые эффективны для ощущения охлаждения во рту, такие как ментол, или даже некоторые стимулирующие агенты, такие как кофеин. Также отбеливающие зубы соединения могут применяться в качестве активных ингредиентов для ухода за полостью рта в контексте настоящего изобретения.
Охлаждающие соединения, такие как ментол, известны специалистам в данной области техники и были описаны, например, в заявке на патент US 20150086491 A1. Известные примеры охлаждающих соединений включают ментол, ментон, N-этил-п-ментан карбоксамид (WS-3, также известный как ментан-3-карбоновой кислоты N-этиламид), N-2,3-триметил-2-изопропилбутанамид (WS-23), ментиллактат (Frescolate ML), ментонглицеринацеталь (Frescolate MGA), мономентилсукцинат (Physcool), мономентилглутарат, О-ментилглицерин, и ментил-N,N-диметилсукцинамат.
Таким образом, НАВР согласно настоящему изобретению представляют собой полипептиды длиной от семи аминокислот до нескольких сотен аминокислот. Все НАВР имеют одну или две или 3 или до 10 у последовательностей и, возможно, также некоторые спейсерные или терминальные аминокислоты b и с и, возможно, некоторые дополнительные компоненты, выбранные из группы гидрофобинов и/или AFP и/или активных ингредиентов для ухода за полостью рта (например охлаждающие соединения, противомикробные соединения, отбеливающие соединения). Самые короткие НАВР с только одной последовательностью у уже обладают специфическим связыванием гидроксиапатита и свойством зубной реминерализации. С дополнительной последовательностью а и/или d, т.е. с гидрофобином и/или белком АФР, этот реминерализирующий эффект усиливается соответственно дополнительными свойствами, направленными на поверхность эмали/дентин.
НАВР могут быть получены химически известными методами синтеза пептидов, например, твердофазным синтезом в соответствии с Меррифилдом. Этот способ особенно предпочтителен для более короткого НАВР, такого как пептид с длиной цепи от 7 до 18 аминокислот.
Особенно полезными, однако, являются генетические способы получения, в которых последовательности нуклеиновых кислот, в частности последовательности ДНК, кодирующие НАВР, комбинируют таким образом, что экспрессия гена комбинированной последовательности нуклеиновой кислоты создает желаемый белок в организме-хозяине.
Подходящими организмами-хозяевами (организмы-производители) в контексте настоящего изобретения могут быть прокариоты (в том числе археи) или эукариоты, особенно бактерии, включая галобактерии и метанококки, грибы, клетки насекомых, растительные клетки и клетки млекопитающих, особенно предпочтительно Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Pichiapastoris, Pseudomonas spec, Lactobacillen, Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, SF9 (или родственные клетки), и другие.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к экспрессионным конструкциям, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид согласно настоящему изобретению под генетическим контролем регуляторных последовательностей нуклеиновых кислот, а также векторы, содержащие по меньшей мере одну из указанных экспрессионных конструкций.
Предпочтение отдается таким конструкциям согласно настоящему изобретению, содержащим промотор 5' против хода транскрипции от конкретной кодирующей последовательности, и терминирующую последовательность 3' по ходу транскрипции, а также, при необходимости, дополнительные обычные регулирующие элементы, в каждом случае функционально связанные с указанной кодирующей последовательностью.
«Функциональная связь» означает последовательное расположение промотора, кодирующей последовательности, терминатора и, при необходимости, дополнительных регуляторных элементов таким образом, что каждый из регуляторных элементов способен выполнять свою функцию в соответствии с его предполагаемым использованием в связи с экспрессией кодирующей последовательности.
Примерами последовательностей, которые могут быть функционально связаны, являются нацеливающие последовательности, а также энхансеры, сигналы полиаденилирования и тому подобное. Другие регуляторные элементы содержат селектируемые маркеры, сигналы амплификации, точки начала репликации и т.п. Примеры подходящих регуляторных последовательностей описаны в Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
В дополнение к этим регуляторным последовательностям естественная регуляция этих последовательностей может все еще присутствовать против хода транскрипции от фактических структурных генов и, при необходимости, была генетически модифицирована, так что естественная регуляция была отключена, и экспрессия генов была увеличена.
Предпочтительная конструкция нуклеиновой кислоты предпочтительно также содержит одну или более упомянутых ранее энхансерных последовательностей, которые функционально связаны с промотором и обеспечивают увеличение экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты. Дополнительные предпочтительные последовательности, такие как дополнительные регуляторные элементы или терминаторы, также могут быть вставлены при 3'-конце ДНК последовательностей.
Нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению могут присутствовать в конструкции в количестве одной или более копий. Конструкция может содержать еще дополнительные маркеры, такие как антибиотические резистентности или гены, которые дополняют ауксотрофию, для селекции конструкции, если это необходимо.
Примеры регуляторных последовательностей, которые предпочтительны для способа согласно настоящему изобретению, представлены в промоторах, таких как cos, tac, trp, tet, trp-tet, Ipp, lac, Ipp-lac, laclq-T7, T5, T3, gal, trc, ara, rhaP(rhaPBAD) SP6, lambda-PR или lambda-P промотор, которые предпочтительно применяются в грамотрицательных бактериях. Другие примеры предпочтительных регуляторных последовательностей представлены в грамположительных промоторах amy и SP02, в промоторах дрожжей или грибов ADC1, MFalpha, АС, Р-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH. Также возможно использовать искусственные промоторы для регуляции.
Чтобы экспрессироваться в организме-хозяине, конструкцию нуклеиновой кислоты предпочтительно вставляют в вектор, такой как, например, плазмида или фаг, что позволяет генам оптимально экспрессироваться в хозяине. Помимо плазмид и фагов, векторы также означают любые другие векторы, известные специалисту, т.е., например, вирусы, такие как SV40, CMV, бакуловирусы и аденовирусы, транспозоны, элементы IS, фазмиды, космиды и линейные или циклические ДНК, а также систему Agrobacterium.
Эти векторы могут либо реплицироваться автономно в организме-хозяине, либо реплицироваться хромосомально. Эти векторы составляют другой вариант выполнения настоящего изобретения. Примерами подходящих плазмид являются pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III''3-B1, tgt11 или pBdCl в E. coli, pIJ101, pIJ364, pIJ702 или pIJ361 в Streptomyces, pUB110, pC194 или pBD214 в Bacillus, pSA77 или pAJ667 в Corynebacterium, pALS1, pIL2 или рВВ116 в грибах, 2alpha, pAG-1, YEp6, YEp13 или pEMBLYe23 в дрожжах или pLGV23, pGHIac+, pBIN19, pAK2004 или pDH51 в растениях. Вышеуказанные плазмиды представляют собой небольшую часть возможных плазмид. Другие плазмиды также известны специалистам в данной области техники и раскрываются, например, в книге Cloning Vectors (Eds. Pouwels P.H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0444904018).
Предпочтительно конструкция нуклеиновой кислоты дополнительно содержит с целью экспрессии других присутствующих генов также 3'- и/или 5'-концевые регуляторные последовательности для усиления экспрессии, которые выбраны для оптимальной экспрессии в зависимости от организма-хозяина и выбранного гена или генов.
Эти регуляторные последовательности предназначены для того, чтобы обеспечить экспрессию экспрессию генов и белков. В зависимости от организма-хозяина это может означать, например, что ген экспрессируется или сверхэкспрессируется только после индукции, или что он экспрессируется и/или сверхэкспрессируется немедленно.
В этом контексте, регуляторные последовательности или факторы могут предпочтительно оказывать благоприятное влияние на генную экспрессию введенных генов и тем самым увеличивать ее. Таким образом, регуляторные элементы могут преимущественно усиливаться на уровне транскрипции, посредством применения сильных сигналов транскрипции, таких как промоторы и/или энхансеры. Помимо этого, однако, также возможно усилить трансляцию путем улучшения стабильности мРНК, например.
В другом варианте выполнения вектора, вектор, содержащий конструкцию нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению или нуклеиновую кислоту согласно настоящему изобретению, также может быть предпочтительно введен в форме линейной ДНК в микроорганизмы и интегрирован в геном организма-хозяина посредством гетерологичной или гомологичной рекомбинации. Указанная линейная ДНК может состоять их линеаризованного вектора, такого как плазмида, или только из конструкции нуклеиновой кислоты или нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению.
Чтобы достичь оптимальной экспрессии гетерологичных генов в организмах, целесообразно модифицировать последовательности нуклеиновых кислот в соответствии с конкретной частотой использования кодона, применяемого в организме. Частоту использования кодона можно легко определить на основе компьютерных анализов других известных генов рассматриваемого организма.
Экспрессионную кассету согласно настоящему изобретению получают посредством слияния подходящего промотора с подходящей кодирующей нуклеотидной последовательностью и сигналом терминации или сигналом полиаденилирования. Для этой цели используются известные методы рекомбинации и клонирования, которые описаны, например, в Т. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989), а также в T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) и в Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987).
Для экспрессии в подходящем организме-хозяине конструкцию рекомбинантной нуклеиновой кислоты или генную конструкцию преимущественно вставляют в специфичный для хозяина вектор, который позволяет оптимально экспрессировать гены в хозяине. Векторы хорошо известны квалифицированному специалисту и могут быть найдены, например, в "Cloning Vectors" (Pouwels Р.Н. et al., Eds. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985).
Векторы согласно настоящему изобретению могут быть использованы для получения рекомбинантных микроорганизмов, которые трансформированы, например, по меньшей мере одним вектором согласно настоящему изобретению, и могут быть использованы для получения полипептидов согласно настоящему изобретению. Предпочтительно вышеописанные рекомбинантные конструкции согласно настоящему изобретению вводятся в и экспрессируются в подходящей системе-хозяине. Предпочтительным согласно настоящему изобретению является применение общих методов клонирования и трансфекции, известных квалифицированному специалисту, таких как, например, соосаждение, слияние протопластов, электропорация, ретровирусная трансфекция и тому подобное, с целью экспрессии указанных нуклеиновых кислот в конкретной экспрессионной системе. Подходящие системы описаны, например, в существующих на сегодняшний день протоколах в Molecular Biology, F. Ausubel et al., Eds. Wiley Interscience, New York 1997, или Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
В соответствии с настоящим изобретением также возможно получение гомологично рекомбинантных микроорганизмов. С этой целью получают вектор, который содержит по меньшей мере одну часть гена согласно настоящему изобретению или кодирующей последовательности, в который, при необходимости, по меньшей мере одна аминокислотные деления, добавление или замещение были введены для того, чтобы модифицировать, например, функционально разрушить, последовательность согласно настоящему изобретению (нокаут вектор). Введенная последовательность может, например, также быть гомологом из родственного микроорганизма или быть получена из источника млекопитающих, дрожжей или насекомых. Вектор, используемый для гомологичной рекомбинации, альтернативно может быть сконструирован таким образом, что эндогенный ген мутирует или модифицируется каким-либо другим образом во время гомологичной рекомбинации, но все же кодирует функциональный белок (например, апстрим регуляторная последовательность быть модифицирована таким образом, который модифицирует экспрессию эндогенного белка). Модифицированный участок гена согласно настоящему изобретению находится в гомологичном рекомбинантном векторе. Конструкции подходящих векторов для гомологичной рекомбинации описана, например, в Thomas, K.R. and Capecchi, M.R. (1987) Cell 51: 503.
Любые прокариотические или эукариотические организмы в принципе пригодны для использования в качестве рекомбинантных организмов-хозяев для нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению или конструкции нуклеиновой кислоты. Предпочтительно используемые организмы-хозяева представляют собой микроорганизмы, такие как бактерии, грибы или дрожжи. Предпочтительно применяются грамположительные или грамотрицательные бактерии, предпочтительно бактерии семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae или Nocardiaceae, особенно предпочтительно бактерии рода Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium или Rhodococcus.
В зависимости от организма-хозяина, организмы, используемые в способе согласно настоящему изобретению, выращиваются или культивируются способом, известным специалисту. Микроорганизмы обычно выращивают в жидкой среде, содержащей источник углерода, обычно в форме сахаров, источник азота, обычно в форме органических источников азота, таких как дрожжевой экстракт или соли, такие как сульфат аммония, микроэлементы, такие как соли железа, марганца, магния, и, при необходимости, витамины, при температуре от 0 до 100°С, предпочтительно между 10 и 60°С, при газировании кислородом. Значение рН питательной жидкости может поддерживаться или не поддерживаться в контексте настоящего изобретения при фиксированном значении, т.е. регулируется во время роста. Рост может происходить периодически, полунепрерывно или непрерывно. Питательные вещества могут вводиться изначально в начале ферментации или впоследствии подаваться полунепрерывно или непрерывно. Ферменты могут быть выделены из организмов с использованием способа, описанного в примерах, или могут быть использованы для реакции в виде неочищенного экстракта.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способам рекомбинантного получения полипептидов согласно настоящему изобретению или их функциональных биологически активных фрагментов, где способы включают культивирование продуцирующего полипептид микроорганизма, при необходимости индукцию экспрессии указанных полипептидов и выделение их из культуры. Таким образом, полипептиды могут также быть получены в промышленном масштабе, если это необходимо. Рекомбинантный микроорганизм можно культивировать и ферментировать известными способами. Например, бактерии могут размножаться в среде ТВ или среде LB и при температуре от 20 до 40°С и при значении рН от 6 до 9. Соответствующие условия культивирования подробно описаны, например, в Т. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).
Если полипептиды не секретируются в культуральную среду, клетки затем разрушают, и продукт выделяют из лизата известными способами выделения белков. Клетки могут необязательно разрушаться посредством высокочастотного ультразвука, посредством высокого давления, например, в прессе Френча, посредством осмолиза, посредством действия детергентов, лизирующих ферментов или органических растворителей, с использованием гомогенизаторов, или посредством комбинации нескольких перечисленных способов.
Полипептиды могут быть очищены с помощью известных хроматографических методов, таких как хроматография на молекулярных ситах (гель-фильтрация), таких как хроматография на Q-сефарозе, ионообменная хроматография и гидрофобная хроматография, а также с помощью других обычных методов, таких как ультрафильтрация, кристаллизация, высаливание, диализ и нативный гель-электрофорез. Подходящие методы описаны, например, в Cooper, F.G., Biochemische Arbeitsmethoden [оригинальное название: The tools of biochemistry], Verlag Water de Gruyter, Berlin, New York или в Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin.
Другим вариантом выполнения настоящего изобретения являются новые НАВР согласно Формуле I:
где
a, d независимо друг от друга представляют собой гидрофобии или последовательность антифризного белка или активный ингредиент для ухода за полостью рта
b, с независимо друг от друга представляют собой аминокислоту у представляет собой полипептидную последовательность согласно SEQ ID NO: 1 до SEQ ID NO: 61
Предпочтительными НАВР являются те, в которых у представляет собой SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4.
SEQ ID NO: 1 IDDYTRA
SEQ ID NO: 2 HPPLHHA
SEQ ID NO: 3 SPSTHWK
SEQ ID NO: 4 GSPATAA
SEQ ID NO: 5 GKVQAQS
SEQ ID NO: 6 YPVTPSI
SEQ ID NO: 7 IPTLPSS
SEQ ID NO: 8 YQGASEN
SEQ ID NO: 9 EHITTSN
SEQ ID NO: 10 RJLITIP
SEQ ID NO: 11 DPITNLR
SEQ ID NO: 12 TTSTRHI
SEQ ID NO: 13 NERALTL
SEQ ID NO: 14 MQTVEVT
SEQ ID NO: 15 SWGTQTD
SEQ ID NO: 16 TLPASSV
В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения НАВР присутствует в композиции в количестве от 0.01 мас. % до 3 мас. % от общей массы композиции. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, НАВР присутствует в композиции в количестве от 0.1 мас. % до 3 мас. %, или от 0.1 мас. % до 2 мас. %, или от 0.1 мас. % до 1 мас. % от общей массы композиции. В других вариантах выполнения настоящего изобретения, НАВР присутствует в композиции в количестве от 0.05 мас. % до 1 мас. %, или от 0.1 мас. % до 0.5 от общей массы композиции. В других вариантах выполнения настоящего изобретения, НАВР присутствует в композиции в количестве от 0.5 мас. % до 3 мас. %, или от 0.5 мас. % до 2 мас. %, или от 0.5 мас. % до 1 мас. % от общей массы композиции. В других вариантах выполнения настоящего изобретения, НАВР присутствует в композиции в количестве от 1 мас. % до 3 мас. %, или от 1 мас. % до 2 мас. % от общей массы композиции.
Активный ингредиент для ухода за полостью рта может быть связан в форме "НВАР пептид - активный ингредиент для ухода за полостью рта-гибридные молекулы" с описанными НВАР пептидами. Предпочтительно, "НВАР пептид - охлаждающее соединение гибридные молекулы" образуются. Специалисту в данной области техники известны пути связывания активных ингредиентов для ухода за полостью рта, таких как охлаждающие соединения с НВАР пептидами. Пригодность отдельных методов зависит от наличия функциональных групп на активном ингредиенте для ухода за полостью рта, предпочтительно охлаждающем соединение. Активные группы на пептидах НВАР включают амино, карбоксильные, гидроксильные и тиольные группы. Предпочтительным является связывание через терминальную аминогруппу или терминальную карбоксильную группу пептида НВАР.
В одном варианте выполнения настоящего изобретения, активный ингредиент для ухода за полостью рта, предпочтительно охлаждающее соединение, непосредственно связан с НВАР пептидами.
В одном варианте выполнения настоящего изобретения, активный ингредиент для ухода за полостью рта, предпочтительно охлаждающее соединение, связан с НВАР пептидами через бифункциональный линкер/кросслинкер/спейсер. Доступны различные молекулы, и специалист в данной области техники может выбрать наиболее подходящую.
Кросслинкеры могут быть выбраны из гомо бифункциональных и гетеробифункциональных кросслинкеров. Гомобифункциональными кросслинкерами являются те, которые имеют две идентичные реакционноспособные группы и часто используются в одностадийных реакционных методиках для сшивания белков/пептидов/активного ингредиента для ухода за полостью рта друг с другом.
Гетеробифункциональные кросслинкеры в соответствии с настоящим изобретением обладают двумя различными реакционноспособными группами, которые обеспечивают последовательные (двухстадийные) конъюгации, помогая минимизировать нежелательную полимеризацию или самосопряжение. Потенциальные фрагменты, такие как амин, сульфгидрилы, карбоксилы, фенолы и углеводы, могут быть мишенями реакции. Эта двухстадийная стратегия позволяет модифицировать молекулы, имеющие разные доступные группы. Неограничивающим примером подходящих кросслинкеров являются те, которые являются амино-реакционноспособными на одном конце и сульфгидрил-реакционноспособными на другом конце. В последовательных методиках гетеробифункциональные реагенты могут реагировать с одним партнером реакции, используя, например, первую самую реакционноспособную группу кросслинкера. После удаления избытка непрореагировавшего кросслинкера модифицированный первый партнер реакции может быть добавлен к раствору, содержащему второй партнер реакции, где может протекать реакция через вторую реакционноспособную группу кросслинкера.
Подходящие гетеробифункциональные кросслинкеры включают те, которые имеют один амин-реакционноспособный сукцинимидиловый сложный эфир (например, NHS-сложный эфир) на одном конце и сульфгидрил-реакционноспособную группу на другом конце. Сульфгидрил-реакционноспособными группами обычно являются малеимиды, пиридилдисульфиды и α-галоацетили. Реакционная способность NHS-сложного эфира может быть менее стабильной в водном растворе и поэтому может сначала реагировать в последовательных процедурах сшивания. NHS-сложные эфиры могут реагировать с аминами с образованием амидных связей.
Карбодиимиды являются кросслинкерами нулевой длины (например, EDC) и могут влиять на прямую связь между карбоксилатами (-СООН) и первичными аминами (-NH2). Другие подходящие гетеробифункциональные реагенты могут иметь одну реакционноспособную группу, которая является скорее фотореактивной, а не термореактивной. Эта реакционная способность может допускать специфическое присоединение термореактивных групп в первую очередь; впоследствии конъюгация с любыми соседними N-H или С-Н сайтами может быть инициирована через фотореактивную группу путем активации ультрафиолетовым светом. Реакционная способность фотохимического реагента может позволить образование конъюгата, который может быть невозможен с группа-специфичным реагентом. SFAD (сульфосукцинимидил(перфторазидобензамидо = этил-1,3'-дитиопропионат) является примером фотоактивируемого реагента, который содержит перфторфенилазид с эффективностью введения около 70%.
Дальнейшие подходящие линкеры/спейсеры/кросслинкеры являются коммерчески доступными (например, на веб-сайте -www.thermo.com/pierce- указано руководство по выбору кросслинкера с соответствующими параметрами и функциями "Crosslinking Technical Handbook"). Неограничивающие примеры включают реакционноспособные кросслинкерные группы и их целевые функциональные группы и/или амин/карбоксил, амин/сульфгидрил, сульфо-SMCC амин/сульфгидрил, MBS амин/сульфгидрил, сульфо-MBS амин/сульфгидрил, SMPB амин/сульфгидрил, SMPB амин/сульфгидрил, GMBS амин/сульфгидрил и сульфо-GMBS амин/сульфгидрил. Специалист в данной области техники хорошо разбирается в выборе подходящих соединений и соответствующих реакций сочетания.
Подходящий кросслинкер включает поли(этиленгликоль) (ПЭГ), поскольку он, как известно, обычно инертен и обеспечивает гидрофильный спейсер между пептидом и представляющей интерес активной молекулой. Длина спейсер ной цепи линкера может варьироваться в зависимости от размера пептида или другой молекулы, которая прикреплена к дистальному концу линкера. Однако предпочтительной является длина от одного до двадцати этиленгликолевых единиц.
Подходящий линкер/спейсер/кросслинкер включает бикарбоновые кислоты (например, щавелевая кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, глутаровая кислота, адипиновая кислота, пимелиновая кислота, субериновая кислота, азелаиновая кислота, себациновая кислота, декандиовая кислота, брассиловая кислота, тапсиевая кислота) и диамины (например, этилендиамин, и родственные производные включают N-алкилированные соединения, 1,1-диметилэтилендиамин, 1,1-диметилэтилендиамин, этамбутол и TMEDA; 1,3-диаминопропан; путресцин (бутан-1,4-диамин); кадаверин (пентан-1,5-диамин); гексаметилендиамин; фенилендиамины, 2,5-диаминотолуол; диметил-4-фенилендиамин, N,N'-ди-2-бутил-1,4-фенилендиамин; 4,4'-диаминобифенил; 1,8-диаминонафталин).
Охлаждающие соединения, подлежащие связыванию с пептидами через кросслинкеры, как описано, включают, но без ограничения к этому ментол и производные ментола (например, L-ментол, D-ментол, рацемический ментол, изоментол, неоизоментол, неоментол), ментон, ментонглицеринацеталь (Frescolate MGA), мономентилсукцинат (Physcool), мономентилглутарат, О-ментилглицерин или ментил-N,N-диметилсукцинамат) ментиловый простой эфир (например (1-ментокси)-1,2-пропандиол, (1-ментокси)-2-метил-1,2-пропандиол, 1-ментил-метиловый простой эфир), ментиловый сложный эфир (например, ментилформиат, ментилацетат, ментилизобутират, ментиллактаты, L-ментил-L-лактат, L-ментил-D-лактат, ментил-(2-метокси)ацетат, ментил-(2-метоксиэтокси)ацетат, ментилпироглутамат), ментилкарбонаты (например ментилпропиленгликоля карбонат, ментиэтиленгликоля карбонат, ментилглицерина карбонат или их смеси), сложные полуэфиры ментолов с дикарбоновой кислотой или их производные (например мономентилсукцинат, мономентилглутарат, мономентилмалонат, О-ментилянтарной кислоты сложный эфир-N,N-(диметил)амид, О-ментилянтарной кислоты сложного эфира амид), ментанкарбоновой кислоты амид (например, ментанкарбоновая кислота-N-этиламид [WS3], Nα-(ментан-карбонил)глицина этиловый сложный эфир [WS5], ментанкарбоновая кислота-N-(4-цианофенил)амид, ментанкарбоновая кислота-N-(алкоксиалкил)амид), ментон и производные ментона (например L-ментон глицерин кеталь), 2,3-диметил-2-(2-пропил)-масляной кислоты производные (например 2,3-диметил-2-(2-пропил)-масляной кислоты-N-метиламид [WS23]), изопулегол или его сложные эфиры (1-(-)-изопулегол, I-)-изопулегол ацетат), ментановые производные (например п-ментан-3,8-диол), кубебол или синтетические или природные смеси, содержащие кубебол, пирролидоновые производные циклоалкилдионовых производных (например 3-метил-2(1-пирролидинил)-2-циклопентен-1-он) или тетрагидропиримидин-2-оны (например, ицилин или родственные соединения, такие как описанные в WO 2004/026840). Другие примеры могут быть раскрыты в US 20150086491 A1 и считаются подходящими охлаждающими соединениями в контексте настоящего изобретения. Предпочтительными являются ментол и производные ментола, такие как 5-метил-2-(пропан-2-ил) циклогексан-1-карбоновая кислота.
Другим вариантом выполнения настоящего изобретения является способ связывания с поверхностью эмали и/или дентина или нацеливания на поверхность эмали и/или дентина, включающий нанесение на зуб композиции для ухода за полостью рта, содержащей:
a. НАВР;
b. перорально приемлемый носитель,
где НАВР присутствует в композиции в количестве от 0.01 мас. % до 3 мас. % от общей массы композиции.
Другим объектом настоящего изобретения является способ восстановления или ингибирования зубной эрозии, включающий нанесение на зуб композиции для ухода за полостью рта, содержащей:
a. НАВР;
b. перорально приемлемый носитель,
где НАВР присутствует в композиции в количестве от 0.01 мас. % до 3 мас. % от общей массы композиции.
В одном варианте выполнения настоящего изобретения, связывание "НВАР пептид - активный ингредиент для ухода за полостью рта-гибридные молекулы" с поверхностью эмали является нековалентным по своей природе. Предпочтительно, охлаждающие соединения нековалентно связываются через НАВР с эмалью. Охлаждающее соединение может, следовательно, со временем высвобождаться с поверхности эмали посредством механических сил и/или ферментативного расщепления и/или спонтанного выделения. Форма медленного высвобождения охлаждающего соединения может приводить к длительному охлаждающему эффекту благодаря иной кинетике по сравнению с охлаждающим соединением, не связанным с НАВР.
Другим вариантом выполнения настоящего изобретения является способ промотирования зубной реминерализации, и/или усиления противокариозных эффектов фторида, включающий нанесение на зуб композиции для ухода за полостью рта, содержащей:
a. НАВР;
b. перорально приемлемый носитель,
где НАВР присутствует в композиции в количестве от 0.01 мас. % до 3 мас. % от общей массы композиции.
Выражение «перорально приемлемый носитель», как используется в настоящей заявке, обозначает носитель, изготовленный из материалов, которые являются безопасными и приемлемыми для перорального применения в предназначенных количествах и концентрациях, например, веществ, которые можно найти в традиционной зубной пасте и жидкости для полоскания рта. Такие вещества включают воду или другие растворители, которые могут содержать смачивающее средство, такой как глицерин, сорбит, ксилит и тому подобное. В некоторых аспектах термин «перорально приемлемый носитель» охватывает все компоненты композиции для ухода за полостью рта, за исключением гидролизованного растительного белка и фторида. В других аспектах термин относится к инертным или неактивным ингредиентам, которые служат для доставки гидролизованного растительного белка, и/или любых других функциональных ингредиентов, в полость рта.
Перорально приемлемые носители для использования в настоящем изобретении включают обычные и известные носители, используемые при изготовлении ополаскивателей для полости рта или жидкостей для полоскания рта, зубных паст, гелей для ухода за зубами, зубного порошка, пастилок, жвачек, шариков, съедобных полосой, таблеток и тому подобного. Носители должны быть выбраны с точки зрения совместимости друг с другом и с другими ингредиентами композиции.
Приведены следующие неограничивающие примеры. В композиции зубной пасты носителем обычно является система вода/смачивающее средство, которая обеспечивает основную фракцию по массе композиции. Альтернативно, компонент носителя композиции зубной пасты может содержать воду, один или более смачивающих средств и другие функциональные компоненты, отличные от гидролизованного белка пшеницы или гидролизованного белка риса. В композиции ополаскивателя для полости рта или жидкости для полоскания рта носитель обычно представляет собой водно-спиртовую жидкую смесь, в которой гидролизованный белок пшеницы или гидролизованный белок риса растворяют или диспергируют. В растворяемой пастилке носитель обычно содержит твердый матричный материал, который медленно растворяется в полости рта. В жевательных резинах носитель обычно содержит гуммиоснову, тогда как в съедобной полосе носитель обычно содержит один или более пленкообразующих полимеров.
Композиции для ухода за полостью рта, представленные в настоящей заявке, могут дополнительно содержать один или более дополнительных ингредиентов, выбранных из абразивных материалов, рН-модифицирующих средств, поверхностно-активных веществ, модуляторов пены, загустителей, модификаторов вязкости, смачивающих средств, предупреждающих образование конкрементов или контролирующих образование зубного камня средств, подсластителей, ароматизаторов, красителей и консервантов. Эти ингредиенты также могут рассматриваться как материалы-носители. Ниже приведены неограничивающие примеры.
В одном варианте выполнения настоящего изобретения композиция согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере один абразивный материал, полезный, например, в качестве полирующего агента. Можно использовать любой перорально приемлемый абразивный материал, но тип, тонкость (размер частиц) и количество абразивного материала следует выбирать так, чтобы зубная эмаль не подвергалась чрезмерному стиранию при стандартном использовании композиции. Подходящие абразивные материалы включают, без ограничения, диоксид кремния, например, в виде силикагеля, гидратированного диоксида кремния или осажденного диоксида кремния, оксид алюминия, нерастворимые фосфаты, карбонат кальция, смолистые абразивные материалы, такие как продукты конденсации мочевиноформальдегида и тому подобное. Среди нерастворимых фосфатов, полезных в качестве абразивных материалов, упоминают ортофосфаты, полиметафосфаты и пирофосфаты. Иллюстративными примерами являются дигидрат дикальция ортофосфата, кальция пирофосфат, [бета]-кальция пирофосфат, трикальция фосфат, полиметафосфат кальция и нерастворимый полиметафосфат натрия. Один или более абразивных материалов необязательно присутствуют в композиции для ухода за полостью рта согласно настоящему изобретению в количестве от 1 мас. % до 5 мас. % от общей массы композиции. Средний размер частиц абразивного материала, если он присутствует, обычно составляет от 0,1 до 30 мкм и предпочтительно от 5 до 15 мкм.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения композиция для ухода за полостью рта согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну бикарбонатную соль, полезную, например, для придания «ощущения чистоты» зубов и десен из-за вспучивания и выделения углекислого газа. Можно использовать любой перорально приемлемый бикарбонат, включая, без ограничения, бикарбонаты щелочных металлов, такие как бикарбонаты натрия и калия, бикарбонат аммония и тому подобное. Одна или более бикарбонатных солей необязательно присутствуют в общем количестве от 1 мас. % до 10% по массе композиции.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения композиция для ухода за полостью рта согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере один рН-модифицирующий агент. Такие агенты включают подкисляющие агенты для снижения значения рН, подщелачивающие агенты для повышения значения рН и буферные агенты для контроля значения рН в желаемом диапазоне. Например, одно или более соединений, выбранных из подкисляющих, подщелачивающих и буферных агентов, могут быть включены для обеспечения значения рН от 2 до 10 или в различных иллюстративных вариантах осуществления значения рН от 2 до 8, от 3 до 9, от 4 до 8, от 5 до 7, от 6 до 10 или от 7 до 9. Может быть использован любой перорально приемлемый рН-модифицирующий агент, включая, без ограничения, карбоновые, фосфорные и сульфоновые кислоты, кислотные соли (например, мононатрия цитрат, цитрат динатрия, мононатрия малат), гидроксиды щелочных металлов, такие как гидроксид натрия, карбонаты, такие как карбонат натрия, бикарбонаты, бораты, силикаты, фосфаты (например, мононатрия фосфат, тринатрия фосфат, пирофосфатные соли), имидазол и тому подобное. Одно или более рН-модифицирующих средств необязательно присутствуют в общем количестве, эффективном для поддержания композиции в перорально приемлемом диапазоне рН.
8-20
8-20
8-20
В другом варианте выполнения настоящего изобретения композиция согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, полезное, например, для обеспечения повышенной стабильности композиции и содержащихся в ней компонентов, чтобы помочь очистить поверхность зубов посредством действия моющих средств и для обеспечения пены при перемешивании (например, при чистке с помощью композиции средства для чистки зубов композиция согласно настоящему изобретению). Можно использовать любое перорально приемлемое поверхностно-активное вещество, в том числе анионное, неионное или амфотерное. Подходящие анионные поверхностно-активные вещества включают, без ограничения, растворимые в воде соли Салкилсульфатов, сульфонированные моноглицериды С жирных кислот, саркозинаты, таураты и тому подобное. Подходящие неионные поверхностно-активные вещества включают, без ограничения, полоксамеры, полиоксиэтиленсорбитана жирные кислоты, этоксилаты жирных спиртов, алкилфенола этоксилаты, третичные амины, оксиды, третичные фосфиноксиды, диалкилсульфоксиды и тому подобное. Подходящие амфотерные поверхностно-активные вещества включают, без ограничения, производные С алифатических вторичных и третичных аминов, имеющих анионную группу, такую как карбоксилат, сульфат, сульфонат, фосфат или фосфонат. Подходящим примером является кокоамилопропилбетаин. Одно или более поверхностно-активные вещества необязательно присутствуют в общем количестве от 0.01 мас. % до 10 мас. %, например, от 0.05 мас. % до 5 мас. % или от 0.1 мас. % до 2 мас. % от общей массы композиции.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения, композиция для ухода за полостью рта согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере один модулятор пены, полезный, например, чтобы увеличить количество, вязкость или стабильность пены, образуемой композицией при перемешивании. Может применяться любой перорально приемлемый модулятор пены, включая, без ограничения, полиэтиленгликоли (ПЭГ). Один или более ПЭГ необязательно присутствуют в общем количестве от 0.1 мас. % до 10 мас. % от общей массы композиции.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения композиция для ухода за полостью рта согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере один загуститель, полезный, например, чтобы придать композиции желаемую консистенцию и/или ощущение во рту. Любой перорально приемлемый загуститель может быть использован, включая, без ограничения, карбомеры (карбоксивиниловые полимеры), каррагинаны, целлюлозные полимеры, такие как гидроксиэтилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза (CMC) и их соли, природные камеди, такие как камедь карайи, ксантановая камедь, гуммиарабик и трагакантовая камедь, коллоидный магния алюминия силикат, коллоидный диоксид кремния и тому подобное. Один или более загустителей необязательно присутствуют в общем количестве от 0,01 мас. % до 15 мас. %, от общей массы композиции.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения композиция согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере один модификатор вязкости, полезный, например, для ингибирования осаждения или разделения ингредиентов или для содействия повторному диспергированию ингредиентов при перемешивании жидкой композиции. Любой перорально приемлемый модификатор вязкости может быть использован, включая, помимо прочего, минеральное масло, вазелин, глины, диоксид кремния и тому подобное. Один или более модификаторов вязкости необязательно присутствуют в общем количестве от 0,01 мас. % до 10 мас. % от общей массы композиции.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения, композиция для ухода за полостью рта согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере одно смачивающее средство, которое может быть использовано для предотвращения затвердевания зубной пасты при воздействии воздуха. Может быть использован любое перорально приемлемое смачивающее средство, включая, помимо прочего, многоатомные спирты, такие как глицерин, сорбит, ксилит или низкомолекулярные ПЭГ. Большинство смачивающих средств также функционируют как подсластители. Одно или более смачивающих средств необязательно присутствуют в общем количестве от 1 мас. % до 50 мас. % от общей массы композиции.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения, композиция для ухода за полостью рта согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере один подсластитель, который придает композиции вкус. Любой перорально приемлемый природный или искусственный подсластитель моно использовать, включая, без ограничения, декстрозу, сахарозу, мальтозу, декстрин, маннозу, ксилозу, рибозу, фруктозу, левулозу, галактозу, кукурузный сироп, частично гидролизованный крахмал, гидрогенизированный гидролизат крахмала, сорбит, маннит, ксилит, мальтит, изомальт, аспартам, неотам, сахарин и их соли, интенсивные подсластители на основе дипептида, цикламаты и тому подобное. Один или более подсластителей необязательно присутствуют в общем количестве от 0,005 мас. % до 5 мас. % от общей массы композиции.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения, композиция для ухода за полостью рта согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере один ароматизатор, который усиливает вкус композиции. Любой перорально приемлемый природный или синтетический ароматизатор можно использовать, включая, но без ограничения, ванилин, шалфей, майоран, масло петрушки, масло мяты курчавой, коричное масло, масло грушанки (метилсалицилат), масло перечной мяты, масло гвоздики, лавровое масло, анисовое масло, эвкалиптовое масло, цитрусовые масла, фруктовые масла и эссенции и тому подобное. Также к ароматизаторам относятся ингредиенты, которые обеспечивают аромат и/или другие сенсорные эффекты во рту, включая эффекты охлаждения или потепления. Такие ингредиенты иллюстративно включают ментол, ментилацетат, ментиллактат, камфару, эвкалиптовое масло, эвкалиптол, эвгенол, кассию, оксанон, α-иризон, тимол, линалоол, бензальдегид, циннамальдегид, N-этил-п-ментан-3-карбоксамин, Н,2,3-триметил-2-изопропилбутанамид, 3-(1-ментокси)-пропан-1,2-диол, глицерилацеталь коричного альдегида (CGA), ментон глицерин ацеталь (MGA) и тому подобное. Один или более ароматизаторов необязательно присутствуют в общем количестве от 0,01 мас. % до 5 мас. % от общей массы композиции.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения, композиция для ухода за полостью рта согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере один краситель. Краситель может выполнять ряд функций. К ним относятся обеспечение окрашенного в белый или светлый цвет покрытия на поверхности зуба, что указывает на места на поверхности зуба, которые эффективно контактировали с композицией, и/или модификация внешнего вида композиции, чтобы повысить привлекательность для потребителя. Любой перорально приемлемый краситель может быть использован, включая, без ограничения, тальк, слюду, карбонат магния, карбонат кальция, силикат магния, магния алюминия силикат, диоксид кремния, диоксид титана, оксид цинка, оксид железа, железоаммониевый ферроцианид, марганцово-фиолетовый, титанированную слюду, оксихлорид висмута и тому подобное. Один или более красителей необязательно присутствуют в общем количестве от 0.001 мас. % до 20 мас. % от общей массы композиции.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения, композиция для ухода за полостью рта согласно настоящему изобретению содержит консервант. Консервант может быть выбран из парабенов, сорбата калия, бензилового спирта, феноксиэтанола, полиаминопропилбигуанида, каприловой кислоты, бензоата натрия и цетилпиридиния хлорида. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, консервант присутствует при концентрации от около 0.001 до около 1 мас. %, от общей массы композиции.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения, композиция для ухода за полостью рта согласно настоящему изобретению представляет собой жевательную резинку, содержащую гуммиоснову, ароматизатор, подслащивающее вещество и НАВР. Гуммиоснова присутствует в количестве от около 4,8% до около 90%, ароматизатор присутствует в количестве от около 0,1% до около 10%, подслащивающее вещество присутствует в количестве от около 0,1% до около 95%, и НАВР присутствует в количестве от около 0,01% до около 0,5%.
Следующие примеры иллюстрируют композиции согласно настоящему изобретению и их использование. Приведенные примеры композиций являются иллюстративными и не ограничивают объем настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1 - анализ связывания
i. Внесение метки в пептид/белок
Для изучения связывания 5(6)-карбоксифлюоресцеин конъюгировали с N-концом пептидов/белков посредством применения соответствующего сукцинимидилового сложного эфира (Invitrogen, Darmstadt, Germany). Реакцию внесения метки осуществляли в соответствии с протоколом производителя (Invitrogen, Darmstadt, Germany). После конъюгирования меченный пептид/белок очистили либо с помощью PD-10 обессоливающей колонки для белков больше 5 кДа, либо с помощью PD MidiTrap G-10 для более маленьких белков (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK), либо для пептидов посредством ВЭЖХ на RP18 колонке.
ii. Связывание пептида/белка
Для экспериментов по связыванию меченные на N-конце пептиды/белки применяли при конечной концентрации 2 мкМ. Связывание осуществляли в HBS-T буфере (150 мМ NaCl, 50 мМ HEPES рН 7.5, 0.1% Tween 20). Пептиды/белки подвергали взаимодействию с 10 мг порошка гидроксиапатита (Fluka) в течение 2 ч при 37°С. После пяти стадий промывок с помощью HBS-T буфера, связывание пептида/белка визуализировали посредством флуоресцентной микроскопии с подходящими фильтрами (возбуждение 475/50; эмиссия 525/50). Для количественной оценки связывания, интенсивность флюоресценции раствора до (Fi) и после (Ff) связывания измерили с помощью Fluostar Galaxy (BMG, Ortenberg, Germany), и оценили количество связанного пептида/белка (cbound=[1-(Ff/Fi)]xc0). Пептид LIKHILHRL, который был описан как пептид, не связывающийся с гидроксиапатитом, применяли в качестве отрицательного контроля [Yarbrough DK, Hagerman Е, Eckert R, Не J, Choi H, Cao N, et al. Specific binding and mineralization of calcified surfaces by small peptides. Calcif Tissue Int 2010; 86(1):58-66.]. Все эксперименты по связыванию проводили с тремя повторениями.
Оценка: +: 30-50% связанного пептида на НАР; ++: 50-100% связанного пептида на НАР
Пример 2 - Анализ зародышеобразования гидроксиапатита
2+
2
4
2
4
2
2
2
2
2
4
2
4
Для определения противоэрозионных/НАР-зародышеобразующих способностей немеченных пептидов/белков, измеряли увеличение концентрации Са. Зародышеобразование осуществляли в искусственной слюне [Panich М, Poolthong S. The effect of casein phosphopeptide-amorphous calcium phosphate and a cola soft drink on in vitro enamel hardness. J Am Dent Assoc 2009; 140:455-60.]. Кратко, один 10х сток-раствор 46.2 мМ KHPO, 26.8 мМ KHPO и второй сток-раствор 87.2 мМ KCl, 6.1 мМ MgCl, 14.9 мМ CaCl получили. Для экспериментов по зародышеобразованию, искусственную слюну, содержащую 8.7 мМ KCl, 0.6 мМ MgClb, 1.5 мМ CaCl, 4.6 мМ KHPO, 2.7 мМ KHPO и 25 мкМ пептида/белка получили с конечным объемом 1 мл. В качестве отрицательного контроля применяли только раствор для зародышеобразования без какого-либо пепитда/белка. Все растворы отфильтровали (0.2 мкм) перед применением, чтобы избежать неконтролируемого зародышеобразования из-за небольших частиц. Периодически, образца с объемом 30 мкл отбирали каждый час в общем в течение 5 ч, центрифугировали 2 минуты, 13000 оборотов в минуту, и определили концентрацию кальция в супернатанте. Для обнаружения кальция 30 мкМ о-крезолфталеина, 2.7 мМ 8-гидроксихинолина, 20 мМ 2-амино-2-метил-1-пропанола, рН 10.5, и 20 мкл образца смешали, и коэффициент поглощения контролировали при 575 нм, применяя Spectramax (Molecular Devices, Biberach, Germany). Все эксперименты по зародышеобразованию проводили при 37°С и с тремя повторами. Добавление немеченых пептидов (Seq No. 1 - No. 16) приводило к увеличению зародышеобразования в 1.3 - 2 раз.
Пример 3 - НАВР пептид - охлаждающие соединения гибридные молекулы
Пептиды согласно SEQ ID NO: 1-16 могут быть связаны с охлаждающими соединениями посредством применения, например, оксалата (формула А), глутарата (формула В), или сукцината (формула С) в качестве кросслинкера:
Пример 4 - НАВР пептид - ментол гибридная молекула
Связывание 5-метил-2-(пропан-2-ил) циклогексан-1-карбоновой кислоты осуществляли при N-конце связанных со смолой НВАР пептидов согласно SEQ ID No: 6, 7, 8, и 16, с образованием молекулы согласно формуле D:
Пример 5 - Высвобождение НАВР пептид - ментол гибридных молекул из дисков фосфата кальция
Гибридные молекулы по примеру 4 (5 мкМ в буфере Tris, рН 8) инкубировали с дисками фосфата кальция (НА-диски от Himed) при 37°С в течение 1 часа. Несвязанные молекулы удаляли посредством промывок 3-раза с помощью буфера Tris.
Покрытые диски фосфата кальция инкубировали с буфером в качестве контроля и параллельно с объединенной слюной людей (5 доноров; 37°С, в течение 2 часов). Супернатант центрифугировали и оценивали на охлаждающую активность посредством специфической активации холодового рецептора человека TRPM8.
Пример 6 - Инкубация НАВР пептид - ментол гибридные молекул из дисков фосфата кальция (НА-диски)
НАВР пептид - охлаждающее соединение-гибридные молекулы по примеру 4 (1 мкМ в буфере Tris, рН 8) инкубировали с объединенной слюной людей (5 доноров) 1:1 или в качестве контроля 1:1 в буфере Tris, рН 8; 37°С, в течение 2 часов при 37°С. Образцы замораживали перед оценкой в исследование на клетках для активации человеческого рецептора TRPM8.
Пример 7 - Анализ активации TRPM8
2+
2+
2+
2+
Провели тест, сопоставимый с ранее описанным в литературе Behrendt Н. J. et al., Br. J. Pharmacol. 141, 2004, 737-745 (смотрите также US 20150086491 A1). Агонизацию или антагонизацию рецептора количественно определили посредством Са-чувствительного рецептора (например FURA, Fluo-4, и т.д.). Агонисты сами по себе приводят к увеличению Са-сигнала; антагонисты в присутствии, например, ментола приводят к уменьшению Са-сигнала (в каждом случае обнаружено посредством красителя Fluo-4, который благодаря Са имеет другие флуоресцентные свойства).
Для начала, по существу известным способом, в колбах для культивирования клеток была получена свежая культура трансформированных HEK клеток. HEK293-TRPM8 тестируемые клетки удаляли, применяя трипсин из колб для клеточной культуры, и 40000 клеток/лунка высеивали с 100 мкл среды в 96-луночные планшеты (Greiner #655948 поли-D-лизин покрытые). Чтобы индуцировать TRPM8 рецептор тетрациклин подмешали к среде для роста (DMEM/HG, 10% FCS тетрациклин-свободная, 4 мМ L-глютамин, 15 мкг/мл бластицидин, 100 мкг/мл гигромицин В, 1 мкг/мл тетрациклин). На следующий день к леткам загрузили краситель Fluo-4 (нефлуоресцентный ацетоксиметиловый сложный эфир Fluo-4 AM; 2,2'-((2-(2-(2-(бис(карбоксиметил)амино)-5-(2,7-дифтор-6-гидрокси-3-оксо-3Н-ксантен-9-ил)фенокси)этокси)-4-метилфенил)азандиил)диуксусная кислота), и осуществили тестирование. Методика была следующей: Добавление 100 мкл/лунка раствора красителя Са-4 Kit (RB 141, Molecular Devices) на 100 мкл среды (DMEM/HG, 10% FCS тетрациклин-свободная, 4 мМ L-глютамин, 15 мкг/мл бластицидин, 100 мкг/мл гигромицин В, 1 мкг/мл тетрациклин).
2
Инкубирование в инкубаторе в течение 30 минут/37°С/5% CO, 30 минут/20°С.
Получение тестовых образцов = супернатант дисков фосфата кальция или пептид-активный ингредиент-гибрид + слюна инкубировали с тремя повторениями (различное разбавление образцов: 1/5/10 мкл в 200 мкл HBSS буфере), и положительных контролей (различные концентрации ментола или ицилина или ионмицина в 200 мкл HBSS буфере) и отрицательных контролей (только 200 мкл HBSS буфера).
Добавление тестовых образцов в количествах 50 мкл/лунка, и измерение изменения флуоресценции (например, посредством устройства для анализа FLIPR, Molecular Devices или NovoStar, BMG) при возбуждении при 485 нм, эмиссии при 520 нм, и оценка эффективности различных веществ/концентраций и определение ЕС50 значений.
Результаты оценки по TRPM8 рецептору (ощущение охлаждения):
Оценка показала, что контрольная молекула ментол является биоактивной в отношении холодового рецептора человека TRPM8 (до и после инкубации со слюной), но нет связывания с гидроксиапатитом. Модификация пептидом ментола приводит к изменению свойства: гибридная молекула связывалась с гидроксиапатитом и высвобождалась в качестве охлаждающего активного ингредиента после инкубации с человеческой слюной.
В то время как конкретные варианты выполнения настоящего изобретения были проиллюстрированы и описаны, специалисту в данной области техники должно быть очевидно, что различные изменения и модификации могут быть сделаны без отклонения от объема настоящего изобретения, как определено в приложенной формуле изобретения.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> BASF SE
<120> ПРОДУКТЫ И СПОСОБЫ ДЛЯ УХОДА ЗА ПОЛОСТЬЮ РТА, СОДЕРЖАЩИЕ
ГИДРОКСИАПАТИТ-СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ
<130> 0000078607
<150> 62246165
<151> 20 October 2015
<160> 30
<170> BiSSAP 1.2
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> синтетический пептид
<400> 1
Ile Asp Asp Tyr Thr Arg Ala
1               5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> синтетический пептид
<400> 2
His Pro Pro Leu His His Ala
1               5
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> синтетический пептид
<400> 3
Ser Pro Ser Thr His Trp Lys
1               5
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> синтетический пептид
<400> 4
Gly Ser Pro Ala Thr Ala Ala
1               5
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> синтетический пептид
<400> 5
Gly Lys Val Gln Ala Gln Ser
1               5
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> синтетический пептид
<400> 6
Tyr Pro Val Thr Pro Ser Ile
1               5
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> синтетический пептид
<400> 7
Ile Pro Thr Leu Pro Ser Ser
1               5
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> синтетический пептид
<400> 8
Tyr Gln Gly Ala Ser Glu Asn
1               5
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> синтетический пептид
<400> 9
Glu His Ile Thr Thr Ser Asn
1               5
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> синтетический пептид
<400> 10
Arg Ile Leu Ile Thr Ile Pro
1               5
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> синтетический пептид
<400> 11
Ile Pro Ile Thr Asn Leu Arg
1               5
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> синтетический пептид
<400> 12
Thr Thr Ser Thr Arg His Ile
1               5
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> синтетический пептид
<400> 13
Asn Glu Arg Ala Leu Thr Leu
1               5
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> синтетический пептид
<400> 14
Met Gln Thr Val Glu Val Thr
1               5
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> синтетический пептид
<400> 15
Ser Trp Gly Thr Gln Thr Asp
1               5
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> синтетический пептид
<400> 16
Thr Leu Pro Ala Ser Ser Val
1               5
<210> 17
<211> 135
<212> PRT
<213> синтетический пептид
<400> 17
Met Arg Phe Ile Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala
1               5                   10                  15
Thr Ala Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser
20                  25                  30
Ala Ala Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser
35                  40                  45
Ile Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu
50                  55                  60
Ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr
65                  70                  75                  80
Gly Ser Ala Cys Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu
85                  90                  95
Ala Leu Val Asp His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val
100                 105                 110
Ala Cys Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala
115                 120                 125
Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu
130                 135
<210> 18
<211> 157
<212> PRT
<213> синтетический пептид
<400> 18
Met Lys Phe Ser Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val
1               5                   10                  15
Ala Ala Leu Pro Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val
20                  25                  30
Gly Asn Lys Gly Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val
35                  40                  45
Thr Val Lys Gln Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser
50                  55                  60
Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu
65                  70                  75                  80
Gly Leu Leu Ser Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly
85                  90                  95
Ala Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala
100                 105                 110
Val Leu Ile Gly Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn
115                 120                 125
Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile
130                 135                 140
Gly Val Gly Leu Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu
145                 150                 155
<210> 19
<211> 112
<212> PRT
<213> синтетический пептид
<400> 19
Met Ile Ser Arg Val Leu Val Ala Ala Leu Val Ala Leu Pro Ala Leu
1               5                   10                  15
Val Thr Ala Thr Pro Ala Pro Gly Lys Pro Lys Ala Ser Ser Gln Cys
20                  25                  30
Asp Val Gly Glu Ile His Cys Cys Asp Thr Gln Gln Thr Pro Asp His
35                  40                  45
Thr Ser Ala Ala Ala Ser Gly Leu Leu Gly Val Pro Ile Asn Leu Gly
50                  55                  60
Ala Phe Leu Gly Phe Asp Cys Thr Pro Ile Ser Val Leu Gly Val Gly
65                  70                  75                  80
Gly Asn Asn Cys Ala Ala Gln Pro Val Cys Cys Thr Gly Asn Gln Phe
85                  90                  95
Thr Ala Leu Ile Asn Ala Leu Asp Cys Ser Pro Val Asn Val Asn Leu
100                 105                 110
<210> 20
<211> 119
<212> PRT
<213> синтетический пептид
<400> 20
Met Val Ser Thr Phe Ile Thr Val Ala Lys Thr Leu Leu Val Ala Leu
1               5                   10                  15
Leu Phe Val Asn Ile Asn Ile Val Val Gly Thr Ala Thr Thr Gly Lys
20                  25                  30
His Cys Ser Thr Gly Pro Ile Glu Cys Cys Lys Gln Val Met Asp Ser
35                  40                  45
Lys Ser Pro Gln Ala Thr Glu Leu Leu Thr Lys Asn Gly Leu Gly Leu
50                  55                  60
Gly Val Leu Ala Gly Val Lys Gly Leu Val Gly Ala Asn Cys Ser Pro
65                  70                  75                  80
Ile Thr Ala Ile Gly Ile Gly Ser Gly Ser Gln Cys Ser Gly Gln Thr
85                  90                  95
Val Cys Cys Gln Asn Asn Asn Phe Asn Gly Val Val Ala Ile Gly Cys
100                 105                 110
Thr Pro Ile Asn Ala Asn Val
115
<210> 21
<211> 136
<212> PRT
<213> синтетический пептид
<400> 21
Met Phe Ala Arg Leu Pro Val Val Phe Leu Tyr Ala Phe Val Ala Phe
1               5                   10                  15
Gly Ala Leu Val Ala Ala Leu Pro Gly Gly His Pro Gly Thr Thr Thr
20                  25                  30
Pro Pro Val Thr Thr Thr Val Thr Val Thr Thr Pro Pro Ser Thr Thr
35                  40                  45
Thr Ile Ala Ala Gly Gly Thr Cys Thr Thr Gly Ser Leu Ser Cys Cys
50                  55                  60
Asn Gln Val Gln Ser Ala Ser Ser Ser Pro Val Thr Ala Leu Leu Gly
65                  70                  75                  80
Leu Leu Gly Ile Val Leu Ser Asp Leu Asn Val Leu Val Gly Ile Ser
85                  90                  95
Cys Ser Pro Leu Thr Val Ile Gly Val Gly Gly Ser Gly Cys Ser Ala
100                 105                 110
Gln Thr Val Cys Cys Glu Asn Thr Gln Phe Asn Gly Leu Ile Asn Ile
115                 120                 125
Gly Cys Thr Pro Ile Asn Ile Leu
130                 135
<210> 22
<211> 161
<212> PRT
<213> синтетический пептид
<400> 22
Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val
1               5                   10                  15
Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val
20                  25                  30
Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr
35                  40                  45
Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr
50                  55                  60
Tyr Ala Gly Asp Val Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly
65                  70                  75                  80
Leu Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly
85                  90                  95
Leu Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly
100                 105                 110
Ile Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln
115                 120                 125
Asn Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu
130                 135                 140
Val Asn Leu Gly Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His
145                 150                 155                 160
Met
<210> 23
<211> 155
<212> PRT
<213> синтетический пептид
<400> 23
Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val
1               5                   10                  15
Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val
20                  25                  30
Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr
35                  40                  45
Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr
50                  55                  60
Tyr Ala Gly Asp Val Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu
65                  70                  75                  80
Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu
85                  90                  95
Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile
100                 105                 110
Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys
115                 120                 125
Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly
130                 135                 140
Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met
145                 150                 155
<210> 24
<211> 294
<212> PRT
<213> синтетический пептид
<400> 24
Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met
1               5                   10                  15
Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys
20                  25                  30
Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
35                  40                  45
Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro
50                  55                  60
Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala
65                  70                  75                  80
Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met
85                  90                  95
Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu
100                 105                 110
Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly
115                 120                 125
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser
130                 135                 140
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala
145                 150                 155                 160
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala
165                 170                 175
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro
180                 185                 190
Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
195                 200                 205
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met
210                 215                 220
Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys
225                 230                 235                 240
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr
245                 250                 255
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly
260                 265                 270
Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg
275                 280                 285
Met Gln Glu Arg Gly Trp
290
<210> 25
<211> 197
<212> PRT
<213> синтетический пептид
<400> 25
Met Gly Leu Thr Ile Gly Val Leu Gly Leu Gln Gly Ala Val Arg Glu
1               5                   10                  15
His Ile His Ala Ile Glu Ala Cys Gly Ala Ala Gly Leu Val Val Lys
20                  25                  30
Arg Pro Glu Gln Leu Asn Glu Val Asp Gly Leu Ile Leu Pro Gly Gly
35                  40                  45
Glu Ser Thr Thr Met Arg Arg Leu Ile Asp Thr Tyr Gln Phe Met Glu
50                  55                  60
Pro Leu Arg Glu Phe Ala Ala Gln Gly Lys Pro Met Phe Gly Thr Cys
65                  70                  75                  80
Ala Gly Leu Ile Ile Leu Ala Lys Glu Ile Ala Gly Ser Asp Asn Pro
85                  90                  95
His Leu Gly Leu Leu Asn Val Val Val Glu Arg Asn Ser Phe Gly Arg
100                 105                 110
Gln Val Asp Ser Phe Glu Ala Asp Leu Thr Ile Lys Gly Leu Asp Glu
115                 120                 125
Pro Phe Thr Gly Val Phe Ile Arg Ala Pro His Ile Leu Glu Ala Gly
130                 135                 140
Glu Asn Val Glu Val Leu Ser Glu His Asn Gly Arg Ile Val Ala Ala
145                 150                 155                 160
Lys Gln Gly Gln Phe Leu Gly Cys Ser Phe His Pro Glu Leu Thr Glu
165                 170                 175
Asp His Arg Val Thr Gln Leu Phe Val Glu Met Val Glu Glu Tyr Lys
180                 185                 190
Gln Lys Ala Leu Val
195
<210> 26
<211> 443
<212> PRT
<213> синтетический пептид
<400> 26
Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met
1               5                   10                  15
Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys
20                  25                  30
Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
35                  40                  45
Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro
50                  55                  60
Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala
65                  70                  75                  80
Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met
85                  90                  95
Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu
100                 105                 110
Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly
115                 120                 125
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser
130                 135                 140
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala
145                 150                 155                 160
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala
165                 170                 175
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro
180                 185                 190
Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
195                 200                 205
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met
210                 215                 220
Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys
225                 230                 235                 240
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr
245                 250                 255
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly
260                 265                 270
Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg
275                 280                 285
Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Arg Phe Ile
290                 295                 300
Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Leu Pro
305                 310                 315                 320
Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser Ala Ala Phe Ala
325                 330                 335
Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser Ile Ala Cys Cys
340                 345                 350
Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu
355                 360                 365
Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr Gly Ser Ala Cys
370                 375                 380
Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu Ala Leu Val Asp
385                 390                 395                 400
His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val Ala Cys Cys Pro
405                 410                 415
Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala Gly Ala Gly Thr
420                 425                 430
Lys Ala Glu Gly Ser His His His His His His
435                 440
<210> 27
<211> 465
<212> PRT
<213> синтетический пептид
<400> 27
Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met
1               5                   10                  15
Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys
20                  25                  30
Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
35                  40                  45
Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro
50                  55                  60
Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala
65                  70                  75                  80
Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met
85                  90                  95
Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu
100                 105                 110
Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly
115                 120                 125
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser
130                 135                 140
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala
145                 150                 155                 160
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala
165                 170                 175
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro
180                 185                 190
Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
195                 200                 205
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met
210                 215                 220
Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys
225                 230                 235                 240
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr
245                 250                 255
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly
260                 265                 270
Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg
275                 280                 285
Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser
290                 295                 300
Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro
305                 310                 315                 320
Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Gly
325                 330                 335
Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val Thr Val Lys Gln
340                 345                 350
Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys
355                 360                 365
Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu Gly Leu Leu Ser
370                 375                 380
Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly Ala Glu Gly Leu
385                 390                 395                 400
Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala Val Leu Ile Gly
405                 410                 415
Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys Cys
420                 425                 430
Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile Gly Val Gly Leu
435                 440                 445
Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu Gly Ser His His His His His
450                 455                 460
His
465
<210> 28
<211> 178
<212> PRT
<213> Zoarces americanus
<400> 28
Met Ala Glu Gln Ser Asp Lys Asp Val Lys Tyr Tyr Thr Leu Glu Glu
1               5                   10                  15
Ile Gln Lys His Lys Asp Ser Lys Ser Thr Trp Val Ile Leu His His
20                  25                  30
Lys Val Tyr Asp Leu Thr Lys Phe Leu Glu Glu His Pro Gly Gly Glu
35                  40                  45
Glu Val Leu Gly Glu Gln Ala Gly Gly Asp Ala Thr Glu Asn Phe Glu
50                  55                  60
Asp Val Gly His Ser Thr Asp Ala Arg Glu Leu Ser Lys Thr Tyr Ile
65                  70                  75                  80
Ile Gly Glu Leu His Pro Asp Asp Arg Ser Lys Ile Ala Lys Pro Ser
85                  90                  95
Glu Thr Leu Asp Asp Asp Asp Lys His Met Asn Gln Ala Ser Val Val
100                 105                 110
Ala Asn Gln Leu Ile Pro Ile Asn Thr Ala Leu Thr Leu Val Met Met
115                 120                 125
Arg Ser Glu Val Val Thr Pro Val Gly Ile Pro Ala Glu Asp Ile Pro
130                 135                 140
Arg Leu Val Ser Met Gln Val Asn Arg Ala Val Pro Leu Gly Thr Thr
145                 150                 155                 160
Leu Met Pro Asp Met Val Lys Gly Tyr Pro Pro Ala His His His His
165                 170                 175
His His
<210> 29
<211> 97
<212> PRT
<213> Choristoneura fumiferana
<400> 29
Met Asp Gly Ser Cys Thr Asn Thr Asn Ser Gln Leu Ser Ala Asn Ser
1               5                   10                  15
Lys Cys Glu Lys Ser Thr Leu Thr Asn Cys Tyr Val Asp Lys Ser Glu
20                  25                  30
Val Tyr Gly Thr Thr Cys Thr Gly Ser Arg Phe Asp Gly Val Thr Ile
35                  40                  45
Thr Thr Ser Thr Ser Thr Gly Ser Arg Ile Ser Gly Pro Gly Cys Lys
50                  55                  60
Ile Ser Thr Cys Ile Ile Thr Gly Gly Val Pro Ala Pro Ser Ala Ala
65                  70                  75                  80
Cys Lys Ile Ser Gly Cys Thr Phe Ser Ala Asn His His His His His
85                  90                  95
His
<210> 30
<211> 317
<212> PRT
<213> Lolium perenne
<400> 30
Met Thr Thr Gln Ser Pro Leu Asn Ser Phe Tyr Ala Thr Gly Thr Ala
1               5                   10                  15
Gln Ala Val Ser Glu Pro Ile Asp Val Glu Ser His Leu Gly Ser Ile
20                  25                  30
Thr Pro Ala Ala Gly Ala Gln Gly Ser Asp Asp Ile Gly Tyr Ala Ile
35                  40                  45
Val Trp Ile Lys Asp Gln Val Asn Asp Val Lys Leu Lys Val Thr Leu
50                  55                  60
Arg Asn Ala Glu Gln Leu Lys Pro Tyr Phe Lys Tyr Leu Gln Ile Gln
65                  70                  75                  80
Ile Thr Ser Gly Tyr Glu Thr Asn Ser Thr Ala Leu Gly Asn Phe Ser
85                  90                  95
Glu Thr Lys Ala Val Ile Ser Leu Asp Asn Pro Ser Ala Val Ile Val
100                 105                 110
Leu Asp Lys Glu Asp Ile Ala Val Leu Tyr Pro Asp Lys Thr Gly Tyr
115                 120                 125
Thr Asn Thr Ser Ile Trp Val Pro Gly Glu Pro Asp Lys Ile Ile Val
130                 135                 140
Tyr Asn Glu Thr Lys Pro Val Ala Ile Leu Asn Phe Lys Ala Phe Tyr
145                 150                 155                 160
Glu Ala Lys Glu Gly Met Leu Phe Asp Ser Leu Pro Val Ile Phe Asn
165                 170                 175
Phe Gln Val Leu Gln Val Gly Gly Gly Ser Gly Gly Asp Pro Gly Gly
180                 185                 190
Met Asp Glu Gln Pro Asn Thr Ile Ser Gly Ser Asn Asn Thr Val Arg
195                 200                 205
Ser Gly Ser Lys Asn Val Leu Ala Gly Asn Asp Asn Thr Val Ile Ser
210                 215                 220
Gly Asp Asn Asn Ser Val Ser Gly Ser Asn Asn Thr Val Val Ser Gly
225                 230                 235                 240
Asn Asp Asn Thr Val Thr Gly Ser Asn His Val Val Ser Gly Thr Asn
245                 250                 255
His Ile Val Thr Asp Asn Asn Asn Asn Val Ser Gly Asn Asp Asn Asn
260                 265                 270
Val Ser Gly Ser Phe His Thr Val Ser Gly Gly His Asn Thr Val Ser
275                 280                 285
Gly Ser Asn Asn Thr Val Ser Gly Ser Asn His Val Val Ser Gly Ser
290                 295                 300
Asn Lys Val Val Thr Asp Ala His His His His His His
305                 310                 315
<---