3
4
Применение наночастиц Fe-FeO со структурой ядро-оболочка для повышения чувствительности бактерий к антибиотикам
3
4
APPLICATION OF Fe-Fe O NANOPARTICLES WITH A CORE-SHELL STRUCTURE TO INCREASE THE SENSITIVITY OF BACTERIA TO ANTIBIOTICS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Изобретение относится к медицине, а именно к потенцированию действия антибиотиков и может быть использовано для лечения ран кожного покрова и мягких тканей, инфицированных множественно-устойчивыми бактериями.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Известен магнитный нанокомпозит, раскрытый в [RU 2565677, опубл. 20.10.2015]. Магнитный нанокомпозит имеет структуру «ядро-оболочка-матрица», где ядром являются наночастицы железа с подавляющим преобладанием железа в нульвалентном состоянии Fe⁰ (74,5%), и его оксидов 25,5%, оболочкой, покрывающей наночастицы, является феррит, а матрицей - пироуглерод в состоянии в sp2-гибридизации. Общее содержание железа Fe⁰ в полученном магнитном нанокомпозите материале составляет 31,01-38,25%, намагниченность насыщения составляет 3-59 Гс•см3/г.
К недостаткам можно отнести наличие гидрофобного углеродного слоя на поверхности частиц, ухудшающего мембранотропные свойства наночастиц.
biomedical applications
В статье авторов You Qiang, Jiji Antony, Amit Sharma, Joseph Nutting, Daniel Sikes and Daniel Meyer [Iron/iron oxide core-shell nanoclusters for  // Journal of Nanoparticle Research (2006) 8: 489–496] описаны наночастицы размером до 100 нм со структурой «ядро-оболочка», где ядро – это железо, а оболочка – оксид железа толщиной примерно 2,5 нм независимо от размера частиц.Описанные наночастицы предлагается использовать в биомедицинских приложениях как контраст, для разделения клеток или доставки лекарств.
К недостатком таких частиц можно отнестинизкую величину дзета-потенциала наночастиц, обусловленную тонкой оксидной оболочкой на поверхности железного ядра, которая не обеспечивает мембранотропные свойства наночастиц.
2
3
2
3
2
Известно применение пористых наноструктур FeO для преодоления устойчивости бактерий к антибиотикам [RU 2720238 C1, опубл.: 28.04.2020] раскрытие которого основано на неожиданном наблюдении, что пористые наноструктуры FeO(гематит), имеющие удельную поверхность не менее 50 м/г; положительный дзета-потенциал, у которых отношение объема мезопор к объему микропор больше или равно 2 обладают свойством повышать чувствительность резистентных штаммов бактерий к антибиотикам.
К недостаткам данного применения (или частиц) можно отнести то, что такие структуры оказывают потенцирующее действие при высокой концентрации наноструктур – не менее 1 мг/мл и антибиотика – 50 мкг/мл.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
3
4
2
2
Настоящее раскрытие основано на неожиданном наблюдении, что наночастицы Fe-FeOсо структурой ядро-оболочка, имеющие положительный дзета-потенциал в деионизованной воде при рН 7,4 и температуре 37 °С от +3,6 мВ до +10,4 мВ; средний размер частиц менее 100 нм; величину удельной поверхности от 6,7 м/г до 9,3 м/г, содержание оксида железа от 3 до 92 масс.%, обладают свойством повышать чувствительность бактерий к антибиотикам.
3
4
,
Задачей настоящего изобретения является применение вышеописанных наночастиц Fe-FeO для снижения действующей концентрации антибиотиков за счёт повышения чувствительности бактерийв том числе резистентных штаммов, к лекарственным препаратам.
Технический результат - уменьшение дозы антибиотика, возможность применения низкотоксичных антибиотиков, повышение эффективности лечения.
3
4
3
4
2
2
Поставленная задача достигается тем, чтонаночастицы Fe-FeO (железо-оксид железа) со структурой ядро-оболочка, где ядро это Fe, а оболочка – FeO, имеющие положительный дзета-потенциал в деионизованной воде при рН 7,4 и температуре 37 °С от +3,6 мВ до +10,4 мВ, величину удельной поверхности от 6,7 м/г до 9,3 м/г, содержание оксида железа от 3 до 92 масс.% применяют в качестве средства повышения чувствительности бактерий, в том числе резистентных штаммов, к антибиотикам.
3
4
При этом содержание оксида железа (FeO) предпочтительно составляет не менее 39 масс.% при толщине оболочки оксида железа, предпочтительно составляющей не менее 3 нм.
При этом толщина оболочки оксида железа, составляет не менее 3 нм.
Предпочтительно, что величина дзета-потенциала наночастиц в деионизованной воде при рН 7,4 и температуре 37 °С составляет от 8 мВ до 13 мВ.
Предпочтительно, что средний размер частиц составляет не менее 100 нм; предпочтительно 60-80 нм.
Причем упомянутые структуры используют в качестве средства повышения чувствительности как грамположительной, так и грамотрицательной бактерии к антибиотикам.
Кроме того, бактерия представляет собой грамотрицательную и выбрана из родов Pseudomonas aeruginosa, которая устойчива к ампициллину.
Кроме того, бактерия представляет собой грамположительную и выбрана из рода Staphylococcus aureus и представляет собой клинический штамм или клинический изолят метициллин-резистентный золотистый стафилококк (MRSA), который устойчив к ампициллину.
При этом антибиотик выбран из β-лактамов, например, ампициллин, и из аминогликозидов, например, амикацин.
Синергетический потенцирующий эффект (когда концентрация живых клеток после инкубированияя меньше 50 % относительно контроля) по отношению к MRSA достигается при использовании концентрации наночастиц от 0,025 до 0,075 мг/мл, и ампициллина с концентрацией не менее 16 мкг/мл или амикацина с концентрацией не менее 8 мкг/мл. По отношению к P. aeruginosa синергетический потенцирующий эффект достигается при использовании концентрации наночастиц от 0,05 до 0,125 мг/мл и ампициллина с концентрацией не менее 64 мкг/мл или амикацина с концентрацией не менее 8 мкг/мл.
3
4
3
4
Потенцирующим действием обладают наночастицы Fe-FeO, содержащиене менее 39 масс.% FeO. Это связано с величиной дзета-потенциала наночастиц, которая для данных наночастиц в деионизованной воде при рН 7,4 и температуре 37 °С составляет 9,6±1,8 мВ. Положительный дзета-потенциал наночастиц способствует более интенсивной адгезии к отрицательно заряженным бактериальным мембранам, что, в свою очередь, приводит к деполяризации мембран и более интенсивному проникновению антибиотика к мишеням действия, более интенсивному проникновению наночастиц вместе с антибиотиками внутрь бактерий, а также нарушению защитных функций бактерий, например инактивации ферментов, отвечающих за выработку бета-лактамазы.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Сущность изобретения поясняется также нижеприведенными примерами конкретного выполнения.
В таблице 1 представлены основные характеристики использованных синтезированных наночастиц для оценки их антимикробной активности.
3
4
Таблица 1 – Характеристики наночастиц Fe-FeO
Образец
Содержание оксида железа, масс. %
Расчетное значение толщины оболочки, нм
Дзета-потенциал в деионизованной воде при рН 7,4 и температуре 37 °С
Величина удельной поверхности, м<sup>2</sup>/г
Средний размер частиц, нм
1
3
0,5±0,2
3,6±1,1
9,3±1,0
66±1
2
19
3,9±0,7
5,6±1,3
8,5±1,1
68±2
3
39
7,9±2,0
9,6±1,8
6,7±0,9
81±5
4
92
20,2±2,2
10,4±2,3
7,3±0,8
78±3
Пример 1
(
Оценка антимикробной активности наночастиц в комбинации с ампициллином или амикацином по отношению к метициллин-резистентному золотистому стафилококкуMRSA), штамм AATCC 43300.
5
Для оценки потенцирующей способности наночастиц по отношению к ампициллину или амикацину определяли дозы наночастиц и антибиотиков, при которых выживает не более 50 % бактерий (IC50). В исследовании использовали суточную культуру MRSA. При определении IC50 наночастиц, 1 мл бактериальной культуры MRSA в концентрации 5×10 КОЕ/мл помещали в 3 мл бульона Мюллера-Хинтона, содержащего наночастицы в концентрации: 2000, 1000, 500, 400, 300, 200, 100 мкг/мл. Суспензию наночастиц и бактерий встряхивали в орбитальном шейкере и инкубировали в течение 24 часов при 37 °С.
5
При определении IC50 антибиотиков, 1 мл бактериальной культуры MRSA в концентрации 5×10 КОЕ/мл помещали в 3 мл бульона Мюллера-Хинтона, содержащего антибиотик в концентрации: 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4 мкг/мл. Суспензию бактерий с антибиотиком встряхивали в орбитальном шейкере и инкубировали в течение 24 часов при 37 °С.
После инкубирования, методом серийных разведений высевали содержимое пробирок на чашки Петри с питательным агаром, инкубировали в течение 24 часов при 37 °С, осуществляли подсчет колоний и определяли количество выживших бактерий после инкубирования с наночастицами или антибиотиками. Концентрацию, при которой выжило 50 % бактерий, принимали за IC50. Для подтверждения достоверности результатов исследования проводили с шестикратным повторением.
Результаты представлены в таблице 2.
3
4
Таблица 2 – Антибактериальная активность наночастиц Fe-FeO по отношению к MRSA
Действующее вещество
IC50 мкг/мл
Fe-Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub> (3 масс. % Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>)
200
Fe-Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub> (19 масс. % Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>)
200
Fe-Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub> (39 масс. % Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>)
200
Fe-Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub> (92 масс. % Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>)
200
Ампициллин
32
Амикацин
16
3
4
Результаты, представленные в таблице 2, показывают, что выживаемость бактерий MRSA составляет 50% при применении наночастиц Fe-FeO в концентрации 200 мкг/мл. Для ампициллина эта концентрация составляет 32 мкг/мл, а для амикацина – 16 мкг/мл.
(
Для оценки комбинированного воздействия использовали наночастицы в концентрации 75, 50, 25 мкг/мл (ниже IC50 более, чем в 2 раза), при которых наблюдается низкий ингибирующий эффект (эффект подавления роста бактерий) и субоптимальные концентрации антибиотиков – 16 мкг/мл для ампициллина и 8 мкг/мл для амикацина в 2 раза ниже IC50).
5
Для этого использовали суточную культуру MRSA. 1 мл бактериальной культуры MRSA в концентрации 5×10 КОЕ/мл помещали в 2 мл бульона Мюллера-Хинтона, чтобы концентрация наночастиц составляла 75, 50 и 25 мкг/мл.
Далее, в пробирки добавляли 1 мл раствора антибиотика, так, чтобы концентрация ампициллина в пробирках составила 16 мкг/мл, а амикацина – 8 мкг/мл, и инкубировали в течение 24 часов при 37 °С.
После инкубирования, методом серийных разведений высевали содержимое пробирок на чашки Петри с питательным агаром, инкубировали в течение 24 часов при 37 °С, осуществляли подсчет колоний и определяли комбинацию наночастиц и антибиотика, при концентрации которых выживало не более 50 % бактерий. Для подтверждения достоверности результатов исследования проводили с шестикратным повторением.
Результаты представлены в таблице 3.
3
4
Таблица 3 – Комбинированное антибактериальное действие наночастиц Fe-FeO с антибиотиками по отношению к MRSA.
Образец
Концентрация, мкг/мл
Количество выживших бактерий, %
Ампициллин,16 мкг/мл
Амикацин,8 мкг/мл
Без антибиотика
Fe-Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub> (3 масс. % Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>)
75
56±3
55±3
83±4*
50
72±3
69±2
91±4*
25
88±4
83±4
95±5*
Fe-Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub> (19 масс. % Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>)
75
53±2
58±3
81±4*
50
64±2
67±3
85±5*
25
71±4
73±4
93±5*
Fe-Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub> (39 масс. % Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>)
75
11±3
6±2
81±3*
50
27±3
21±4
86±4*
25
44±4
38±4
91±4*
Fe-Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub> (92 масс. % Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>)
75
0
0
85±5*
50
11±3
6±2
88±5*
25
29±4
34±5
93±6*
Без наночастиц
0
86±4*
81±3*
100*
* Результаты из эксперимента по определению IC50 наночастиц и IC50 антибиотиков
3
4
Комбинированное применение наночастиц, содержащих 3 и 19 масс. % FeO и ампициллина или амикацина не приводит к существенному подавлению роста бактерий по сравнению с их раздельным применением. Следовательно, при инкубировании бактерий MRSA в комбинации с антибиотиками и наночастицами с тонкой оксидной пленкой толщиной не более 3,9 нм в диапазоне концентраций наночастиц от 25 мкг/мл до 75 мкг/мл не наблюдается потенцирующее синергетическое действие.
3
4
Комбинированное применение наночастиц, содержащих 39 и 92 масс % FeO и ампициллина или амикацина приводит к существенному подавлению роста бактерий по сравнению с их раздельным применением. При инкубировании бактерий MRSA в комбинации с антибиотиками и наночастицами в диапазоне концентраций наночастиц от 25 мкг/мл до 75 мкг/мл наблюдается потенцирующее синергетическое действие.
Пример 2
Оценка антимикробной активности наночастиц в комбинации с ампициллином или амикацином по отношению к синегнойной палочке P.aeruginosa, штамм ATCC 9027.
Для оценки потенцирующей способности наночастиц по отношению к ампициллину или амикацину определяли дозы наночастиц и антибиотиков, при которой выживает не более 50 % бактерий (IC50). В исследовании использовали суточную культуру P.aeruginosa.
5
При определении IC50 наночастиц, 1 мл бактериальной культуры P.aeruginosa в концентрации 5×10 КОЕ/мл помещали в 3 мл бульона Мюллера-Хинтона, содержащего наночастицы в концентрации: 2000, 1000, 500, 400, 300, 200, 100 мкг/мл. Суспензию наночастиц и бактерий встряхивали в орбитальном шейкере и инкубировали в течение 24 часов при 37 °С.
5
При определении IC50 антибиотиков, 1 мл бактериальной культуры P.aeruginosa в концентрации 5×10 КОЕ/мл помещали в 3 мл бульона Мюллера-Хинтона, содержащего антибиотик в концентрации: 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4 мкг/мл. Суспензию бактерий с антибиотиком встряхивали в орбитальном шейкере и инкубировали в течение 24 часов при 37 °С.
После инкубирования, методом серийных разведений высевали содержимое пробирок на чашки Петри с питательным агаром, инкубировали в течение 24 часов при 37 °С, осуществляли подсчет колоний и определяли количество выживших бактерий после инкубирования с наночастицами или антибиотиками. Концентрацию, при которой выжило 50 % бактерий, принимали за IC50. Для подтверждения достоверности результатов исследования проводили с шестикратным повторением.
Результаты представлены в таблице 4.
3
4
Таблица 4 – Антимикробная активность наночастиц Fe-FeO по отношению к P.aeruginosa
Действующее вещество
IC50 мкг/мл
Fe-Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub> (3 масс. % Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>)
500
Fe-Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub> (19 масс. % Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>)
500
Fe-Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub> (39 масс. % Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>)
500
Fe-Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub> (92 масс. % Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>)
500
Ампициллин
128
Амикацин
16
3
4
Результаты, представленные в таблице 4, показывают, что выживаемость бактерий P.aeruginosa составляет 50% при применении наночастиц Fe-FeO в концентрации 500 мкг/мл. Для ампициллина эта концентрация составляет 128 мкг/мл, а для амикацина – 16 мкг/мл.
При комбинированном воздействии с антибиотиками использовали наночастицы в концентрации 125, 75, 50 мкг/мл (ниже IC50 более, чем в 2 раза), при которых наблюдается низкий ингибирующий эффект (эффект подавления роста бактерий) и субоптимальные концентрации антибиотиков – 64 мкг/мл для ампициллина и 8 мкг/мл для амикацина (в 2 раза ниже IC50).
5
Для этого использовали суточную культуру P.aeruginosa. 1 мл бактериальной культуры P.aeruginosa в концентрации 5×10 КОЕ/мл помещали в 2 мл бульона Мюллера-Хинтона, содержащего наночастицы в концентрации 125, 75 или 50 мкг/мл.
Далее, в пробирки добавляли 1 мл раствора антибиотика, так чтобы концентрация ампициллина в пробирках составила 64 мкг/мл, а амикацина – 8 мкг/мл и инкубировали в течение 24 часов при 37 °С.
После инкубирования, методом серийных разведений высевали содержимое пробирок на чашки Петри с питательным агаром, инкубировали в течение 24 часов при 37 °С, осуществляли подсчет колоний и определяли комбинацию наночастиц и антибиотика, при концентрации которых выживало не более 50 % бактерий. Для подтверждения достоверности результатов исследования проводили с шестикратным повторением.
Результаты представлены в таблице 5.
3
4
Таблица 5 – Комбинированное антимикробное действие наночастиц Fe-FeO с антибиотиками по отношению к P.aeruginosa
Образец
Концентрация, мкг/мл
Количество выживших бактерий, %
Ампициллин,64 мкг/мл
Амикацин,8 мкг/мл
Без антибиотика
Fe-Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub> (3 масс. % Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>)
125
62±2
56±3
80±4*
75
74±3
64±2
85±4*
50
79±3
73±3
93±4*
Fe-Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub> (19 масс. % Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>)
125
57±3
53±2
82±3*
75
65±3
63±3
87±4*
50
73±3
69±4
94±4*
Fe-Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub> (39 масс. % Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>)
125
21±2
17±2
80±3*
75
29±3
23±2
84±4*
50
40±3
35±3
92±4*
Fe-Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub> (92 масс. % Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>)
125
13±3
9±2
83±4*
75
23±3
17±2
91±5*
50
33±4
31±5
94±5*
Без наночастиц
0
93±5*
97±3*
100*
* Результаты из эксперимента по определению IC50 наночастиц и IC50 антибиотиков
3
4
Комбинированное применение наночастиц, содержащих 3 и 19 масс. % FeO и ампициллина или амикацина не приводит к существенному подавлению роста бактерий по сравнению с их раздельным применением. Следовательно, при инкубировании бактерий P.aeruginosa в комбинации с антибиотиками и наночастицами с тонкой оксидной пленкой толщиной не более 3,9 нм в диапазоне концентраций наночастиц от 50 мкг/мл до 125 мкг/мл не наблюдается потенцирующее синергетическое действие.
3
4
Комбинированное применение наночастиц, содержащих 39 и 92 масс % FeO и ампициллина или амикацина приводит к существенному подавлению роста бактерий по сравнению с их раздельным применением.
При инкубировании бактерий P.aeruginosa в комбинации с антибиотиками и наночастицамив диапазоне концентраций наночастиц от 50 мкг/мл до 125 мкг/мл наблюдается потенцирующее синергетическое действие.