Способ ранней диагностики ревматоидного артрита
METHOD FOR EARLY DIAGNOSIS OF RHEUMATOID ARTHRITIS

Изобретение относится к области медицины, биологии, молекулярной иммунологии и может быть использовано в качестве метода обследования при ранней диагностике пациента с подозрением на ревматоидный артрит (РА).
Ревматоидный артрит является одним из наиболее распространенных хронических воспалительных заболеваний и охватывает от 0,5 до 1% населения в мире. Несмотря на разработку новых способов диагностики, существует проблема ранней диагностики и пациенты проходят длительный многомесячный путь до постановки диагноза, что приводит к отсрочке начала лечения и развитию необратимых повреждений суставов.
Раннее выявление ревматоидного артрита (РА) представляет собой важный шаг для контроля прогрессирования заболевания. Уже в 1970-х годах появились данные, подтверждающие важность ранней диагностики и раннего терапевтического вмешательства (Arnett FC, Edworthy SM, Bloch DA, et al. The American rheumatism association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 1988 Mar; 31(3):315e24. PubMed PMID: 3358796. Epub 1988/03/01. Eng). За последующие годы были собраны данные, показывающие, что лечение пациента с РА в первые 12-16 недель от появления неспецифических симптомов действительно может привести к клинически значимым результатам. Полученные данные показывают, что ранняя диагностика ревматоидного артрита представляет собой наилучшую возможность для достижения ремиссии заболевания (Emery Р, Hammoudeh М, FitzGerald О, et al. Sustained remission with etanercept tapering in early rheumatoid arthritis. N Engl J Med 2014 Nov 6; 371(19):1781e92. PubMed PMID: 25372086).
Серологическим тестом, наиболее часто используемым в настоящее время из-за дешевизны и доступности, является определение ревматоидного фактора. Наибольшее значение в клинической практике имеет определение иммуноглобулин М (далее - IgM) (Ревматология: Клинические рекомендации. Под ред. Насонова Е.Л. Издательство ГЭОТАР-Медиа; 2010:19-76). Стандартными методами определения IgM служат реакция агглютинации сенсибилизированных IgG частиц латекса (латекс-тест) или эритроцитов барана (реакция Ваалер-Розе), иммунонефелометрия и ИФА (А). В качестве скринингового теста может использоваться полуколичественный иммунохроматографический экспресс-метод измерения IgM в цельной крови с помощью сухих тест-полосок. Положительные результаты обнаружения IgM в сыворотке крови служат диагностическим критерием РА.
Недостатком данного метода является то, что маркер (IgM) является чувствительным, но недостаточно специфичным для диагностики РА, так как обнаруживается в сыворотках при других ревматических заболеваниях, хронических инфекциях, злокачественных новообразованиях и т.д. Также к недостаткам метода относится то, что отсутствие ревматоидного фактора при первом обследовании не исключает диагноза серонегативного РА. Следует отметить, что отрицательный результат при определении IgM ревматоидного фактора на ранней стадии РА, является недостаточным для исключения данного заболевания и требует повторного обследования через 12 месяцев.
Кроме того, в диагностике раннего РА необходимо всегда дополнять выявление IgM ревматоидного фактора выявлением антицитруллиновых антител (АЦА). Среди антицитруллиновых антител наилучшими клинико-лабораторными параметрами обладают антитела к циклическому цитруллиновому пептиду (АЦЦП/anti-CCP) и антитела к модифицированному цитруллиннированному виментину (АМЦВ/anti-MCV)
Недостатком метода выявления АЦА являются ложноположительные результаты у пациентов с системной красной волчанкой (СКВ), с хроническим деструктивным/деформирующим артритом и пациентов с туберкулезом легких, а также у пациентов с синдромом Дауна без суставных проявлений. Для уточнения диагноза у серонегативных по АЦА пациентов существует необходимость повторного определения АЦА на ранней стадии РА 1 раз в 6 месяцев. У АЦА-низко позитивных больных исследование АЦА на ранней стадии РА следует проводить 1 раз в 3-6 месяцев.
Существующие на данный момент методы серологической диагностики не удовлетворяют полностью требования для своевременной и достоверной диагностики ревматоидного артрита, поэтому перспективным является поиск дополнительных критериев определения данного заболевания, которыми могут являться иммунологические маркеры.
Известен способ определения того, имеет ли пациент ревматическое воспалительное заболевание или подвержен его риску, или нет. Указанный способ включает этап измерения в образце жидкости организма, полученного от указанного пациента: а) уровень экспрессии фурина и/или б) уровень активности фурина и/или в) отношение уровней экспрессии зрелой формы субстрата фурина к необработанной форме указанного субстрата фурина (WO 2014177719, G01N 33/68, 06.11.2014).
Недостатком способа является то, что роль фурина в патогенезе РА очень слабо изучена, а также, то, что этот белок имеет внутриклеточное расположение, что затрудняет его определение.
Известен способ диагностики воспалительного процесса при раннем РА (RU 2417263, C12Q 1/68, 24.04.2011), заключающийся в том, что из периферической крови выделяют мононуклеары, из которых выделяют РНК, на основе количественного определения экспрессии мРНК генов цитокинов иитерлейкин-2 (ИЛ-2), интерлейкин-4 (ИЛ-4) и интерлейкин-10 (ИЛ-10) методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с регистрацией накопления продуктов реакции по флоуресценции непосредственно во время реакции оценивают баланс цитокинов по формуле:
[ИЛ']/[ИЛ'']=Е ИЛ''^Ct''/Е ИЛ'^Ct',
где [ИЛ'] - концентрация мРНК гена цитокина, характеризующегося повышенной экспрессией;
[ИЛ''] - концентрация мРНК гена цитокина, характеризующегося пониженной экспрессией;
Е - эффективность амплификации - величина, характеризующая прирост матрицы на каждом цикле амплификации;
Ct' и Ct'' - значение пороговых циклов для соответствующего цитокина, и констатируют наличие воспалительного процесса при получении следующих балансов:
ИЛ-10/ИЛ-2>1,5;
ИЛ-10/ИЛ-4>1,0.
Недостатком способа является то, что уровень цитокинов может повышаться при различных воспалительных заболеваниях, что не может быть использовано для точной диагностики РА.
Известен способ диагностики РА у субъекта, причем указанный способ включает этап обнаружения в биологическом образце, полученном от субъекта, одного или нескольких аутоантител, распознающих один или несколько биомаркеров белка, выбранных из группы белков, состоящей из WIBG-белок, ТРМ2-белок, C17orf85-белок, TCP10L-белок, ZNF706-белок, MGC17403-белок, CCDC72-белок, ELOF1-белок и GABARAPL2-белок (US 2015133322, G01N 33/564, 14.05.2015).
Недостатком способа является сложность идентификации данных белков.
Известен способ диагностики, РА который относится к парам олигонуклеотидов (праймерам), обеспечивающим амплификацию областей CDR3-V-β-Jbeta TCR, при РА, способу диагностики и/или мониторинга указанного заболевания с использованием указанных олигонуклеотидов, диагностического набора для диагностики и/или мониторинга ревматоидный артрит, содержащий указанные олигонуклеотиды, нуклеотидные последовательности, амплифицированные из указанных олигонуклеотидов в качестве маркеров РА, аминокислотные последовательности, кодируемые указанными нуклеотидными последовательностями, имеющие такие аминокислотные последовательности, как маркеры ревматоидного артрита и сами пептиды, вместе с одним или несколькими приемлемыми иммуностимуляторными адъювантами и фармацевтически приемлемыми адъювантами вспомогательные вещества, как полипептидные вакцины против ревматоидного артрита (WO 2009019657, C12Q 1/6883, 12.02.2009).
Недостатком способа является то, что Т-клеточный ответ может проявляться при других заболеваниях и/или состояниях.
Известен способ диагностики РА с использованием дифференциально метилированных областей, идентифицированных в мононуклеарных клетках периферической крови, Т-клетках, В-клетках и моноцитах. Способ диагностики РА у субъекта-млекопитающего, включающий следующие стадии: выделение ДНК у пациента; определение статуса метилирования панели из по меньшей мере 3 локусов ДНК от указанного пациента; а также коллективно анализируя состояние метилирования локусов на панели с помощью компьютера, чтобы установить вероятность того, что у пациента PA (WO 2014036314, C12Q 1/68, 06.03.2014).
Недостатком данного способа является то, что ДНК доступны в ограниченном количестве, сильно фрагментированы, и часто необходимо определять статус метилирования отдельных молекул, составляющих минорную часть пула всех ДНК, что снижет точность полученных данных.
Известен способ диагностики РА на основе многомерного анализа 131 биомаркера. Было установлено, что только выявление антицитруллиновых антител (АЦА) отдельно или в комбинации с определением уровня интерлейкина-6, имеет наибольшее значение для диагностики РА с чувствительностью 75,8% и специфичностью 94,0% (Diagnosis of Rheumatoid Arthritis: Multivariate Analysis of Biomarkers N Wild et al. Biomarkers 13 (1), 88-105. Feb 2008.)
Недостатком данного метода является то, что не все биомаркеры, играющие важную роль в патогенезе РА, были исследованы, что снижает диагностическую ценность данного метода.
Известен метод диагностики РА с использованием критериев ACR/EULAR, включающих поражение суставов, аутоиммунную серологию, остро-фазовые реактанты и длительность симптоматики. Метод использует систему баллов. Пациенты с суммой баллов <6/10 не классифицируются как больные РА. Критерии предназначены для классификации (диагностики) первичных пациентов. Также пациенты с эрозивным заболеванием, типичным для ревматоидного артрита (РА) с анамнезом, который удовлетворяет критериям этим года, должны быть классифицированы как имеющие ревматоидный артрит. Пациенты с длительным заболеванием, включая тех пациентов, у которых заболевание неактивно (без или на фоне лечения), однако которые в прошлом удовлетворяли этим критериям, должны быть классифицированы как ревматоидный артрит (Daniel Aletaha et. al. 2010 Rheumatoid Arthritis Classification Criteria An American College of Rheumatology/European League Against Rheumatism Collaborative Initiative arthritis & rheumatism Vol. 62, No. 9, September 2010, pp 2569-2581).
Недостатком данного метода является то, что метод может быть ложнонегативным у больных с нетипичной клинической картиной РА, или ложнопозитивным при таких заболеваниях, как системная красная волчанка, псориатический артрит и подагра.
В целом, доступные в настоящее время лабораторные тесты для раннего диагноза RA неточны и несовершенны, в том числе и утвержденные АРР (Ассоциация ревматологов России) в 2013 г. "Федеральные клинические рекомендации по "ревматологии" с дополнениями от 2016 года.
Иммунологическое обследование является важным для диагностики РА на ранних этапах заболевания, поскольку для этого заболевания зачастую характерна нетипичная клиническая картина именно в начале заболевания.
Патогенез РА тесно связан с различными иммунными клетками, и каждый тип клеток вносит свой вклад в развитие данного заболевания. Существует несколько типов иммуномодулирующих молекул, в основном цитокины (например, ФНО-α), секретируемые иммунными клетками, которые участвуют в патогенезе РА.
Фактор некроза опухолей (TNF-α) обладает широким спектром биологических эффектов на клетки и участвует во многих физиологических и патологических процессах. TNF-α проявляет свои эффекты через два типа рецепторов - TNFR1 и TNFR2. При этом оба типа рецептора осуществляют проведение сигнала в клетку, и, несмотря на функциональные различия, их эффекты в определенной мере перекрываются, а конечный эффект на клетку может зависеть, в том числе, и от соотношения количества молекул обоих типов рецепторов на мембране клеток. Каждый из типов рецепторов может находиться как в мембраносвязанной, так и в растворимой форме. Непосредственно биологические эффекты TNF реализуются через мембраносвязанные рецепторы. (Wajant Н, Pfizenmaier K, Scheurich P. Tumor necrosis factor signaling. Cell Death Differ. 2003 Jan; 10(1):45-65) Известно, что регуляция экспрессии рецепторов может осуществляться на уровне генов (аллельный полиморфизм генов рецепторов), на транскрипционном уровне, а также регулироваться различными факторами, в частности, цитокинами, в том числе TNF-α.
Связывание медиатора TNF-α с рецепторами I типа (TNFR1) может приводить к образованию двух различных комплексов, обуславливающих разные сигнальные пути: 1) Комплекс I (провоспалительный путь), обуславливает выживаемость клетки; 2) Комплекс II (проапоптотический путь), обуславливает клеточную гибель (Micheau О, Tschopp J. Induction of TNF receptor l-mediated apoptosis via two sequential signaling complexes. Cell. 2003 Jul 25; 114(2):181-90.)
На данный момент принято считать, что баланс сигнальных путей рецепторов TNFRI, определяющий дальнейшую судьбу клетки, регулируется транскрипционными белками, а также возможно и количеством рецепторов связавшихся с цитокином (Wajant Н, Scheurich P. TNFR1-induced activation of the classical NF-κВ pathway. FEBS. J. 2011 Apr; 278(6):862-76. doi: 10.1111/j.1742-4658.2011.08015.x) соотношением рецепторов разных типов на субпопуляциях (Fotin-Mleczek М, Henkler F, Samel D, Reichwein M, Hausser A, Parmryd I, Scheurich P, Schmid JA, Wajant H. Apoptotic crosstalk of TNF receptors: TNF-R2-induces depletion of TRAF2 and IAP proteins and accelerates TNF-R1-dependent activation of caspase-8. J Cell Sci. 2002 Jul 1; 115(Pt 13):2757-70.0). Поскольку изменение числа рецепторов к цитокинам на клетках является мощным регулятором биологических эффектов цитокинов и вариабельности их функций (Conti L, Cardone М, Varano В, Puddu Р, Belardelli F, Gessani S. Role of the cytokine environment and cytokine receptor expression on the generation of functionally distinct dendritic cells from human monocytes. Eur J Immunol. 2008 Mar; 38(3):750-62), изучение взаимосвязи между количеством рецепторов к TNF-α на клетках-мишенях и эффектами TNF-α на эти клетки позволяет дополнить знания о функционировании TNF-α в организме.
Показатели экспрессии рецепторов разных типов к TNF-α на отдельных субпопуляций клеток, активно вовлеченных в патологические процессы, могут значительно изменятся при патологиях. Было показано, значительное увеличение уровня TNF-α и растворимых рецепторов sTNF-RI и sTNF-RII в сыворотке пациентов с острым РА. Полученные данные свидетельствуют о различиях в экспрессии рецепторов к TNFα на различных субпопуляциях иммунокомпетентных клеток в норме и при патологии, и о вовлеченности в патологический процесс при ревматоидном артрите не только самого TNFα, но и его рецепторов. Результаты исследования позволяют говорить, что разная способность отдельных субпопуляций иммунокомпетентных клеток реагировать на TNFα связана как с разным процентом клеток этой субпопуляции, несущих рецепторы к TNFα, так и с разным количеством рецепторов, экспрессирующихся на клетках. При этом моноцитарные клетки больных РА имели достоверно более высокий уровень экспрессии мембраносвязанных рецепторов по сравнению со здоровыми донорами, что подтверждает активную вовлеченность иммунокомпетентных клеток больных ревматоидным артритом в TNF-опосредованные процессы (Альшевская А.А., Васильев Ф.Ф., Лопатникова Ю.А., Сенников С.В. Мембраносвязанные и растворимые рецепторы к фактору некроза опухоли-α в норме и при ревматоидном артрите. Acta Biomedica Scientifica. 2012; (3(2)):23-28.), что создало предпосылки для более углубленного изучения уровня экспрессии мембраносвязанных и растворимых рецепторов на различных субпопуляциях иммунных клеток в норме и при патологиях. Для подсчета количества рецепторов и оценки процентного соотношения клеток, несущих рецепторы TNF-α был разработан протокол калибровки, позволяющий получать данные для различных субпопуляций иммунных клеток с целью дальнейшей обработки полученных результатов (Lopatnikova JA, Vasilyev FF, Alshevskaya AA, Sennikov SV. Quantitative flow cytometric analysis of expression of tumor necrosis factor receptor types I and II on mononuclear cells. J Recept Signal Transduct Res. 2013; 33(1):49-55).
Далее были проведены исследования количества рецепторов TNFR1 и TNFR2 и процентного содержания клеток несущих рецепторы на моноцитах, общих пулах Т-лимфоцитах и В-лимфоцитах пациентов с РА и атопическим дерматитом, в которых мононуклеарные клетки, выделенные из цельной периферической крови больных РА культивировали в течение 24 ч в присутствии и отсутствие липополисахарида. Анализ фенотипических характеристик проводили методом проточной цитометрии. Для определения абсолютного количества рецепторов TNFR1 и TNFR2 использовали калибровочные частицы BD Quantibrite™ РЕ Beads. Было установлено, что плотность экспрессии рецепторов на поверхности моноцитов у больных РА выше по сравнению со здоровыми донорами и является показателем, отражающим реакцию клеток при активации в зависимости от состояния здоровья и стадии заболевания. (Sennikov SV, Alshevskaya AA, Shkaruba NS, Chumasova OA, Sizikov AE, Lopatnikova JA. Expression of TNFα membrane-bound receptors in the peripheral blood mononuclear cells (PMBC) in rheumatoid arthritis patients. Cytokine. 2015 Jun; 73(2):288-94.). Полученные данные свидетельствовали о роли количества рецепторов TNFR1 и TNFR2 и процентного содержания клеток, несущих рецепторы в патогенезе ревматоидного артрита.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Однако, для более полного понимания механизма влияния уровня экспрессии TNFR1 и TNFR2 на функциональный ответ клетки необходимо было исследовать больше субпопуляций общих пулов иммунокомпетентных клеток. С целью определения роли количества рецепторов TNFR1 и TNFR2 и процентного содержания клеток, несущих рецепторы, было проведено исследование этих показателей на различных субпопуляциях иммунных клеток у здоровых доноров. Определение экспрессии TNFRI и TNFR2 на субпопуляциях осуществляли способом добавления в пробы крови моноклональных антител к TNFRI, TNFR2, CD4, CD8, CD45R0, CD45RA, CD3, CD14, CD19, CD25, CD45 и CD127. Анализ мононуклеарных клеток периферической крови проводили методом проточной цитометрии для моноцитов, В-лимфоцитов, Т-лимфоцитов, а также среди цитотоксических Т-клеток (CD8), Т-хелперных клеток (CD4), активированных CD8 клеток, активированных CD4 клеток, субпопуляций Т-клеток памяти (CD4CD45R0) и наивных Т-клеток (CD4CD45RA) среди цитотоксических и Т-хелперных клеток, Т-регуляторных клеток (CD4CD25highCD127low). Подсчет количества рецепторов на отдельных клетках, изучаемых субпопуляций осуществляли с помощью калибровочные частицы BD Quantibrite™ РЕ Beads. Сравнение проводилось по всем популяциям. Определялось, какой процент клеток субпопуляции несет только рецепторы TNFRI, только TNFR2 и одновременно TNFRI и TNFR2 двойные положительные клетки). Самый высокий процент двойных положительных клеток был обнаружен в активированных цитотоксических Т-клетках (25,8%), с несколько более низким процентом двойных положительных клеток, наблюдаемых в моноцитах (15,2%), цитотоксических Т-хелперных клетках памяти (14,3%), и общий пул В-клеток и активированных Т-хелперов (по 11,5% каждая). Для других субпопуляций процент двойных положительных клеток был ниже 10%, что рассматривается как потенциальный маркер для диагностики заболеваний патогенетически связанных с данными субпопуляциями клеток и плотностью экспрессии рецепторов TNF-α. Данное исследование легло в основу определения нормативных показателей экспрессии рецепторов TNFR1 и TNFR2 и создало предпосылки для изучения этих показателей при РА с целью разработки диагностической модели определения вероятности наличия РА у пациентов без специфических клинических и лабораторных проявлений (Co-expression of membrane-bound TNF-alpha type 1 and 2 receptors differ in the subsets of immunocompetent cells Sergey Sennikov, Immunology Letters Volume 207, March 2019, Pages 1-5). Дальнейшие исследования были направлены на создание диагностической модели для определения вероятности наличия у пациентов ревматоидного артрита.
Данное исследование легло в основу определения нормативных показателей экспрессии рецепторов TNFR1 и TNFR2 и создало предпосылки для изучения этих показателей при РА с целью разработки диагностической модели определения вероятности наличия РА у пациентов без специфических клинических и лабораторных проявлений.
Задачей изобретения является создание способа ранней диагностики РА путем оценки субпопуляций мононуклеарных клеток у пациентов с подозрением на РА.
+-
+
+
+
+
Поставленная задача решается в способе ранней диагностики ревматоидного артрита, заключающийся в том, что в пробы крови добавляют моноклональные антитела к TNFRI, TNFR2, CD4, CD45R0, CD45RA, CD3, производят анализ мононуклеарных клеток периферической крови методом проточной цитометрии, выделяют гейтированием CD3-Т-лимфоциты, наивные Т-хелперные клетки (CD4CD45RA), Т-хелперные клетки памяти (CD4CD45R0); определяют показатели экспрессии рецепторов TNFR1 и TNFR2 путем подсчета количества рецепторов на клетках изучаемых субпопуляций, определяют процент клеток, несущих рецепторы TNFRI и TNFR2 в каждой выделенной субпопуляции, после чего рассчитывают на основе параметрической логистической регрессионной модели вероятность наличия РА по формуле:
где
е = 2,7182818 - математическая константа - основание натурального логарифма,
0
α = 2.38669717005736 - коэффициент,
1
α = -0.00276285111326 - коэффициент,
2
α = 0,00189985337763 - коэффициент,
3
α = -0.28206543500757 - коэффициент,
1
+
х - количество рецепторов TNFR2 на CD3 Т-лимфоцитах,
2
+
+
х - количество TNFR1 на Т-хелперных клетках памяти CD4CD45R0,
3
+
+
х - процент TNFR1 положительных клеток среди наивных Т-хелперных клеток CD4CD45RA,
при этом, если Р≥0,5, то имеется вероятность наличия ревматоидного артрита.
Формула способа содержит конкретные числовые значения коэффициентов:
Способ содержит итоговую формулу для расчета вероятности:
Изобретение, на наш взгляд, является новым и соответствует критерию изобретательский уровень.
Предложенный способ основан на следующем. При описанных выше исследованиях, сначала в пробы крови здоровых доноров добавлялись моноклональные антитела к TNFRI, TNFR2, CD4, CD8, CD45R0, CD45RA, CD3, CD14, CD19, CD25, CD45 и CD127. Далее исследовался уровень экспрессии и ко-экспрессии TNFRI и TNFR2 на субпопуляциях иммунных клеток здоровых доноров. Основные субпопуляции Т-клеток варьируют по сочетанной экспрессии рецепторов TNFR1 и TNFR2, что может приводить к различному уровню и типу ответа клеток на цитокин TNFα. Таким образом, были установлены все изучаемые показатели у здоровых доноров.
При создании данного способа брали пробы крови у пациентов заведомо больных РА, и были выявлены достоверные отличия заведомо больных РА от здоровых доноров по показателям:
+
- количества TNFR2 на CD3 Т-лимфоцитах;
+
+
- количества TNFR1 на CD4CD45R0 (Т-хелперные клетки памяти);
+
+
- процент TNFR1 положительных на CD4CD45RA (наивные Т-хелперные клетки).
Сравнение экспрессии TNFR1 и TNFR2 больных РА и здоровых доноров показано на рисунках 1-3. Данные представлены в виде медиан с интерквартильным размахом.
+
+
+
+
+
На рис. 1 показано количество TNFR2 на клетках общего пула CD3 Т-лимфоцитов; на рис. 2 показано количество TNFR1 на Т-хелперных клетках памяти (CD4CD45R0); на рис. 3 показан процент TNFR1 положительных клеток (CD4CD45RA) среди наивных Т-хелперных.
0
1
2
3
Коэффициенты α, α, α, α были вычислены из отношения показателей экспрессии рецепторов TNFR1 и TNFR2 у больных РА и здоровых доноров.
Исследованные показатели были использованы для построения диагностической формулы с использованием однофакторного и многофакторного логистического регрессионного анализа с постепенной редукцией незначимых показателей.
Способ осуществляется следующим образом.
1. Подготовка образцов периферической крови
1.1. Осуществление забора крови натощак из локтевой вены в стерильных условиях по 9 мл в вакуумные пробирки с антикоагулянтом Выполнение общего анализа крови, с подсчетом общего количество лейкоцитов.
1.2. Аликвотирование необходимого объема крови, содержащего 1 млн. лейкоцитов, в цитометрические пробирки.
2. Пробоподготовка образцов:
2.1. Внесение моноклональных антител: anti-human CD3 АРС/Су7 (Аллофикоцианин-цианин7), anti-human CD45R0 FITC (изотиоцианатфлуоресцеина), anti-human CD45RA PacificBlue (тихоокеанский синий), anti-human CD4 Ре/Су7 (фикоэритрин-цианин 7)., anti-human TNFRI-РЕ (фикоэритрин), anti-human TNFRII-РЕ (фикоэритрин), anti-human TNFRI-АРС (Аллофикоцианин), anti-human TNFRII-АРС (Аллофикоцианин) (R&D Systems, Minneapolis, MN), в объеме, указанном производителем для окраски 1 млн. кл.,
2.2. Внесение десятикратно разведенного в PBS (натрий - фосфатный буфер) лизирующего буфера BDFACSLysingSolution (кат. номер 349202; BD, США) согласно инструкции производителя в десятикратном объеме по отношению к объему пробы. Инкубация в течении 15 минут при комнатной температуре.
2.3. Внесение PBS в объеме 1 мл на пробу.
2.4. Центрифугирование при 1500 об/мин, 10 минут.
2.5. Удаление надосадочной жидкости, внесение 100 мкл. PBS.
3. Анализ на проточном цитофлуориметре
3.1. Настройка переднего и бокового светорассеивания на пробе №1.
3.2. Настройка вольтажа лазеров и чувствительности ФЭУ (фотоумножительное устройство) всех каналов с использованием контрольных проб №2, 6, 10, 14.
3.3 Гейтирование
+
CD3+ Т-лимфоциты гейтировались как CD3 клетки из лимфоцитарного пула по показателям FSC на SSC (прямого и бокового светорассеивания).
+
+
+
+
Т-клетки памяти (CD4CD45R0) гейтировались как CD4 и CD45R0 из общего лимфоцитарного пула по показателям FSC на SSC.
+
+
+
+
Наивные Т-хелперные клетки (CD4CD45RA), гейтировались как CD4 и CD45RA из общего лимфоцитарного пула по показателям FS на SSC.
4. Определение процента клеток, несущих рецепторы TNFR1 и TNFR2,
Определение процента клеток, несущих рецепторы TNFR1 и TNFR2 осуществляется при помощи программного обеспечения BD FACSDiva™ Software | BDBiosciences-US В результате получаем данные по проценту клеток, несущих рецепторы TNFR1
5. Определение показателей экспрессии рецепторов TNFR1 и TNFR2
+
+
+
+
+
Определение показателей экспрессии рецепторов TNFR1 и TNFR2 осуществляется путем проведения анализа частиц BD QuantiBRITE РЕ (фикоэритрина) (BD, кат. номер 340495) для перевода значений интенсивности флуоресценции по каналу РЕ в число молекул РЕ на субпопуляциях CD3+ Т-лимфоцитах и Т-хелперных клетках памяти (CD4CD45R0). В результате мы получаем данные по количеству TNFR2 на CD3 Т-лимфоцитах и TNFR1 на Т-хелперных клетках памяти (CD4CD45R0)
6. Расчет на основе параметрической логистической регрессионной модели вероятность наличия РА по формуле:
где,
1
+
х = количество рецепторов TNFR2 на CD3 Т-лимфоцитах
2
+
+
х = количество TNFR1 на Т-хелперных клетках памяти (CD4CD45R0)
3
+
+
х = процент TNFR1 положительных клеток среди наивных Т-хелперных клеток (CD4CD45RA).
Далее подставляем полученные данные в формулу и рассчитываем значение Р.
При полученном значении р≥0.5 имеется вероятность наличия РА.
Предложенный способ демонстрируется конкретными примерами.
Пример 1. Пациент А., женщина 46 лет, обратилась в клинику с жалобами на боли в лучезапястных суставах, возникающих периодически в течении года. Объективно: состояние удовлетворительное, сознание ясное, конституциональный тип - нормостенический, кожные покровы обычной окраски. Периферические лимфоузлы не увеличены, отеков нет. При осмотре костно-суставного аппарата деформаций не выявлено, отмечается болезненность при пальпации лучезапястных суставов, больше справа. Объем активных и пассивных движений не изменен. Со стороны органов дыхания и пищеварения, а также сердечно-сосудистой системы патологии не выявлено. ЧДД 16 в мин, ЧСС 66 в мин, АД 120\70 мм.рт.ст.
3
При лабораторно-инструментальном исследовании: гемоглобин 125 г\л, лейкоциты 8,8×10, СОЭ 20 мм\ч. По классификации ACR/EULAR 2010 г 3 балла (Тесты на ревматоидный фактор и АЦЦП отрицательны) на рентгенограмме характерных для РА рентгенологических изменений не выявлено. При проведении анализа мононуклеарных клеток периферической крови методом проточной цитометрии, были выявлены следующие показатели:
+
Кол-во TNFR2 на CD3 Т-лимфоциты-728(Х1)
+
+
Кол-во TNFR1 на CD4CD45R0-452(X2)
+
+
Процент TNFR1 положительных клеток среди CD4CD45RA-0,6 (Х3)
Используем формулу
1
где X = 728
2
Х = 452
3
Х = 0,6
Подставляем данные в формулу:
Р = 0,7436
В результате Р = 0,7436, что является больше 0,5, следовательно вероятности наличия ревматоидного артрита нет.
Пример 2. Пациент Т., мужчина 33 года обратился в клинику с жалобами на боли в плечевых суставах, возникающих периодически в течении 5 месяцев. Объективно: состояние удовлетворительное, сознание ясное, конституциональный тип - гиперстенический, кожные покровы обычной окраски. Периферические лимфоузлы не увеличены, отеков нет. При осмотре костно-суставного аппарата деформаций не выявлено, отмечается болезненность при пальпации плечевых суставов, больше справа. Объем активных и пассивных движений не изменен. Со стороны органов дыхания и пищеварения, а также сердечно-сосудистой системы патологии не выявлено. ЧДД 18 в мин, ЧСС 76 в мин, АД 120\80 мм.рт.ст.
3
При лабораторно-инструментальном исследовании: гемоглобин 155 г\л, лейкоциты 8,8×10, СОЭ 15 мм\ч. По классификации ACR/EULAR 2010 г 2 балла (Тесты на ревматоидный фактор и АЦЦП отрицательны) на рентгенограмме характерных для РА рентгенологических изменений не выявлено. При проведении анализа мононуклеарных клеток периферической крови методом проточной цитометрии, были выявлены следующие показатели:
+
Кол-во TNFR2 на CD3 Т-лимфоциты-457
+
+
Кол-во TNFR1 на CD4CD45R0-3522
+
+
Процент TNFR1 положительных клеток среди CD4CD45RA-0,1
Данные были поставлены в формулу, в результате Р = 0,999597, что является больше 0,5, следовательно вероятности наличия ревматоидного артрита нет.
Пример 3. Пациент X., женщина 58 года обратился в клинику с жалобами на боли в проксимальных межфаланговых суставах, периодически в течении 2-х лет. Объективно: состояние удовлетворительное, сознание ясное, конституциональный тип - нормостенический, кожные покровы обычной окраски. Периферические лимфоузлы не увеличены, отеков нет. При осмотре костно-суставного аппарата деформаций не выявлено, отмечается болезненность при пальпации плечевых суставов, больше справа. Объем активных и пассивных движений не изменен. Со стороны органов дыхания и пищеварения, а также сердечно-сосудистой системы патологии не выявлено. ЧДД 17 в мин, ЧСС 76 в мин, АД 110\70 мм рт.ст.
3
При лабораторно-инструментальном исследовании: гемоглобин 137 г\л, лейкоциты 7.2×10, СОЭ 22 мм\ч. По классификации ACR/EULAR 2010 г 4 балла (Тесты на ревматоидный фактор и АЦЦП отрицательны) на рентгенограмме характерных для РА рентгенологических изменений не выявлено. При проведении анализа мононуклеарных клеток периферической крови методом проточной цитометрии, были выявлены следующие показатели:
+
Кол-во TNFR2 на CD3 Т-лимфоциты-889
+
+
Кол-во TNFR1 на CD4CD45R0-2416
+
+
Процент TNFR1 положительных клеток среди CD4CD45RA-2.8
Данные были поставлены в формулу, в результате Р = 0,999597, что является больше 0,5, следовательно вероятности наличия ревматоидного артрита нет.
Пример 4. Пациент Г., женщина 45 года обратилась в клинику с жалобами на боли в лучезапястных суставах, возникающих периодически в течении 2-х лет. Объективно: состояние удовлетворительное, сознание ясное, конституциональный тип - нормостенический, кожные покровы обычной окраски. Периферические лимфоузлы не увеличены, отеков нет. При осмотре костно-суставного аппарата деформаций не выявлено, отмечается болезненность при пальпации лучезапястных суставов, больше справа. Объем активных и пассивных движений не изменен. Со стороны органов дыхания и пищеварения, а также сердечно-сосудистой системы патологии не выявлено. ЧДД 17 в мин, ЧСС 68 в мин, АД 120\80 мм.рт.ст.
3
При лабораторно-инструментальном исследовании: гемоглобин 104 г\л, лейкоциты 4,4×10, СОЭ 21 мм\ч. По классификации ACR/EULAR 2010 г 3 балла (Тесты на ревматоидный фактор и АЦЦП отрицательны) на рентгенограмме характерных для РА рентгенологических изменений не выявлено. При проведении анализа мононуклеарных клеток периферической крови методом проточной цитометрии, были выявлены следующие показатели:
+
Кол-во TNFR2 на CD3 Т-лимфоциты - 834
+
+
Кол-во TNFR1 на CD4CD45R0 - 832
+
+
Процент TNFR1 положительных клеток среди CD4CD45RA-9,3
Данные были поставлены в формулу, в результате Р=0,2768, что является меньше 0,5, следовательно есть вероятность наличия ревматоидного артрита
Пример 5. Пациент С., мужчина 59 года обратился в клинику с жалобами на боли в проксимальных межфаланговых суставах периодически в течении 3-х лет. Объективно: состояние удовлетворительное, сознание ясное, конституциональный тип - нормостенический, кожные покровы обычной окраски. Периферические лимфоузлы не увеличены, отеков нет. При осмотре костно-суставного аппарата деформаций не выявлено, отмечается болезненность при пальпации плечевых суставов, больше справа. Объем активных и пассивных движений не изменен. Со стороны органов дыхания и пищеварения, а также сердечно-сосудистой системы патологии не выявлено. ЧДД 16 в мин, ЧСС 78 в мин, АД 130\90 мм.рт.ст.
3
При лабораторно-инструментальном исследовании: гемоглобин 133 г\л, лейкоциты 6,6×10, СОЭ 12 мм\ч. По классификации ACR/EULAR 2010 г 3 балла (Тесты на ревматоидный фактор и АЦЦП отрицательны) на рентгенограмме характерных для РА рентгенологических изменений не выявлено. При проведении анализа мононуклеарных клеток периферической крови методом проточной цитометрии, были выявлены следующие показатели:
+
Кол-во TNFR2 на CD3 Т-лимфоциты-2517
+
+
Кол-во TNFR1 на CD4CD45R0-736
+
+
Процент TNFR1 положительных клеток среди CD4CD45RA-4,35
Данные были поставлены в формулу, в результате Р = 0,01217, что является меньше 0,5, следовательно есть вероятность наличия ревматоидного артрита.
+
Предложенный способ ранней диагностики РА путем оценки субпопуляций мононуклеарных клеток у пациентов с подозрением на РА позволяет различать показатели здоровых доноров и больных РА на ранней стадии. Формула включает в себя процент TNFR1+TNFR2 - клеток среди наивных Т-хелперных клеток, количество рецепторов 1 типа на Т-хелперных клетках памяти и количество рецепторов 2 типа на CD3 Т-клетках и позволяет дифференцировать пациентов с РА с чувствительностью 93% и специфичностью 90%.
Дополнительные материалы
ПОЯСНЕНИЯ ПО МАТЕМАТИЧЕСКОЙ ФОРМУЛЕ
Для оценки уровня экспрессии и ко-экспрессии рецепторов TNFRI и TNFR2 использовались мононуклеарные клетки (МНК), выделенные из периферической крови условно-здоровых доноров (образцы цельной крови были получены в пункте заготовки крови №1 ГБУЗ НСО «Новосибирский центр крови») и больных ревматоидным артритом, находящихся на стационарном лечении в ревматологическом отделении клиники иммунопатологии НИИФКИ.
В исследование включены 46 условно-здоровых доноров в возрасте 18-77 лет (медиана (ИКР) 36.5 (30:54) года), среди которых 16 мужчин (34.8%) и 30 (65.2%) женщин, 64 пациента с ревматоидным артритом в возрасте 22-83 год (медиана (ИКР) 55 (45:65) лет), среди которых большинство женщин - 54 (85.4). Демографическая и клиническая характеристика включенных пациентов и здоровых доноров представлены в таблице 1.
Подготовка образцов периферической крови
1.1. Осуществление забора крови натощак из локтевой вены в стерильных условиях по 9 мл в вакуумные пробирки с антикоагулянтом К3-EDTA (3-х замещенной калиевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты, Vacuette К3-EDTA, GreinerBio-OneGmbH, Austria).
1.2. Выполнение общего анализа крови, с подсчетом общего количество лейкоцитов
1.3. Аликвотирование необходимого объема крови, содержащего 1 млн. лейкоцитов, в цитометрические пробирки.
2. Пробоподготовка образцов:
2.1. Внесение моноклональных антител с флюорохромом (красителем): anti-human CD3 АРС/Су7 (Аллофикоцианин-цианин7), anti-human CD19 РЕ/Су7 (фикоэритрин-цианин 7), anti-human CD8 АРС/Су7, anti-human CD14 PerCP (перидинин-хлорофилл протеин), anti-human CD25 PITC (изотиоцианатфлуоресцеина), anti-human CD127 (IL-7Rα) АРС/Су7 (Аллофикоцианин-цианин7), anti-human CD45R0 FITC (изотиоцианатфлуоресцеина), anti-human CD45RA PacificBlue (тихоокеанский синий), anti-human CD45 PerCP (перидинин-хлорофилл протеин), anti-human CD4 Ре/Су7 (фикоэритрин-цианин 7)., anti-human TNFRI-РЕ (фикоэритрин), anti-human TNFRII-РЕ (фикоэритрин), anti-human TNFRI-АРС (Аллофикоцианин), anti-human TNFRII-АРС (Аллофикоцианин) (R&D Systems, Minneapolis, MN), в объеме, указанном производителем для окраски 1 млн. кл.,
2.2. Внесение десятикратно разведенного в PBS (натрий-фосфатный буфер) лизирующего буфера BDFACSLysingSolution (кат. номер 349202; BD, США) согласно инструкции производителя в десятикратном объеме по отношению к объему пробы. Инкубация в течении 15 минут при комнатной температуре
2.3. Внесение PBS в объеме 1 мл на пробу.
2.4. Центрифугирование при 1500 об/мин, 10 минут.
2.5. Удаление надосадочной жидкости, внесение 100 мкл. PBS.
3. Анализ на проточном цитофлуориметре
3.1. Настройка переднего и бокового светорассеивания на пробе №1
3.2. Настройка вольтажа лазеров и чувствительности ФЭУ (фотоэлектронный умножитель) всех каналов с использованием контрольных проб №2, 6, 10, 14.
3.3 Гейтирование
+
+
1. CD3 Т-лимфоциты гейтировались как CD3 клетки из лимфоцитарного пула по показателям FSC на SSC (прямого и бокового светорассеивания).
+
2. Моноциты гейтировались как CD14 клетки из общего моноцитарного пула по показателям FSC на SSC
+
3. В-клетки гейтировались как CD19 клетки из общего пула лимфоцитарных клеток по показателям FSC на SSC
+
4. Цитотоксические Т клетки гейтировались как CD8 клетки из общего пула лимфоцитарных клеток по показателям FSC на SSC
+
5. Т-хелперные клетки гейтировались как CD4 клетки из общего пула лимфоцитарных клеток по показателям FSC на SSC
+
+
6. Активированные цитотоксические Т клетки гейтируются как CD8CD25 клетки из общего пула лимфоцитарных клеток по показателям FSC на SSC
+
+
7. Активированные Т-хелперные клетки гейтируюся как CD4, CD25 клетки из общего пула лимфоцитарных клеток по показателям FSC на SSC
+
+
8. Т-хелперные клетки памяти гейтируются как CD4, CD45R0 клетки из общего пула лимфоцитарных клеток по показателям FSC на SSC
+
+
9. Наивные Т-хелперные клетки гейтируются как CD4, CD45RA клетки из общего пула лимфоцитарных клеток по показателям FSC на SSC
+
+
10. Цитотоксические Т-клетки памяти гейтируются как CD8, CD45R0 клетки из общего пула лимфоцитарных клеток по показателям FSC на SSC
+
+
11. Наивные цитотоксические Т-клетки гейтируются как CD8, CD45RA клетки из общего пула лимфоцитарных клеток по показателям FSC на SSC
+
12. Т-регуляторные клетки гейтируются как CD4, CD25high, CD127low клетки из общего пула лимфоцитарных клеток по показателям FSC на SSC
4. Определение процента клеток, несущих рецепторы TNFR1 и TNFR2,
Определение процента клеток, несущих рецепторы TNFR1 и TNFR2, осуществлялось при помощи программного обеспечения BDFACSDiva™ Software | BDBiosciences-US для каждой из 12 исследуемых субпопуляций определялось по 2 параметра экспрессии рецепторов TNFR1 и TNFR2 (процент TNFR1 положительных клеток среди клеток субпопуляции, процент TNFR2 положительных клеток среди клеток субпопуляции.)
5. Определение показателей экспрессии рецепторов TNFR1 и TNFR2
Определение показателей экспрессии рецепторов TNFR1 и TNFR2 осуществляется путем проведения анализа частиц BD QuantiBRITEPE (фикоэритрина) (BD, кат. номер 340495) для перевода значений интенсивности флуоресценции по каналу РЕ в число молекул РЕ. Среднее количество рецепторов TNFR1 на клетках субпопуляции и среднее количество рецепторов TNFR2 на клетках субпопуляции проводится при тех же параметрах вольтажа ФЭУ по РЕ-детектору, что и при проведении анализа калибровочных бус, это позволяет нам конвертировать значения интенсивности флуоресценции в число РЕ молекул на клетку. Далее, число РЕ молекул на клетку можно перевести в число молекул антител на клетку с помощью известного соотношения молекул РЕ на антитело, равное 1:1, согласно инструкции производителя.
+
+
+
+
2
Таким образом для каждого человека получалось по 48 параметров. Эти 48 параметров включались в однофакторный логистический регрессионный анализ для определения их ассоциированности с ревматоидным артритом. По результатам однофакторного анализа были выбраны 7 параметров, статистически значимо ассоциированных с РА, и они были включены в многофакторный анализ. В результате постепенной редукции статистически незначимых параметров было построен набор моделей, из которого была выбрана оптимальная модель по критерию качества AIC [Sakamoto, Y., Ishiguro, М., andKitagawa G. (1986). AkaikeInformationCriterionStatistics. D. ReidelPublishingCompany], и в итоговую многофакторную модель вошли 3 показателя: количествово рецепторов TNFR2 на CD3+ Т-лимфоцитах, количество TNFR1 на Т-хелперных клетках памяти (CD4CD45R0) и процент TNFR1 положительных клеток среди наивных Т-хелперных клеток (CD4CD45RA) (таблица 2). Полученная модель имела R=0.68 (коффициент детерминации). Для полученной модели логистической регрессии ниже приводим Отношения Шансов для каждой из независимых переменных, определяемых как .
Параметрическая логистическая регрессионная модель построена на основании различий в показателях экспрессии между здоровыми донорами и пациентами с РА, и определены параметры модели (Kuhn, М., &Johnson, K. (2013). AppliedPredictiveModeling. doi:10.1007/978-1-4614-6849ссылка https://link.springer.com/book/10.1007/978-1-4614-6849-3) с использованием свободно распространяемого программного инструментария (пакет программ R-Studio версия 1.0.136 (FreeSoftwareFoundationInc., США) с R-пакетами версии 3.3.1 (The R FoundationforStatisticalComputing, Австрия)) с алгоритмами построения регрессионных моделей и формул расчета вероятности прогнозируемого события (McCullagh P. and Nelder, J.А. (1989) GeneralizedLinearModels. London: Chapman and Hall.; Dobson, A.J. (1983) An Introduction to Statistical Modelling. London: Chapman and Hall.; Cox, D.R. and Snell, E.J. (1981). Applied Statistics; Principles and Examples. London: Chapman and Hall.; Hastie, T.J. and Pregibon, D. (1992) Generalized linear models. Chapter 6 of Statistical Models in S eds J.M. Chambers and T.J. Hastie, Wadsworth & Brooks/Col).
Построенная логистическая регрессионная модель включала в себя следующие коэффициенты:
0
α = 2.386696717005736
1
α = -0.00276285111326
2
α = 0,00189985337763
3
α = -0.28206543500757
Эти коэффициенты были вычислены из отношения показателей экспрессии рецепторов TNFR1 и TNFR2 у больных РА и здоровых доноров.
Формула расчета вероятности РА:
где,
в качестве коэффициентов используются рассчитанные коэффициенты α в качестве независимых параметров -
1
+
х - количество рецепторов TNFR2 на CD3 Т-лимфоцитах
2
+
+
x - количество TNFR1 на Т-хелперных клетках памяти (CD4CD45R0)
3
+
+
х - процент TNFR1 положительных клеток среди наивных Т-хелперных клеток CD4CD45RA,
е = 2,7182818 - математическая константа (основание натурального логарифма)
Подставляя в формулы полученные значения коэффициентов, получаем:
Итоговая формула для расчета вероятности:
При полученном значении р≥0.5 имеется вероятность наличия ревматоидного артрита.