Антимикробная активность тромбодефенсинов разных видов животных

Антимикробная активность тромбодефенсинов разных видов животных

М.В. Сычёва, к.биол.н, завлабораторией, Е.В. Шейда, аспирантка, О.Л. Карташова, д.биол.н., профессор, А.П. Жуков, д.биол.н., профессор, Оренбургский ГАУ

Катионные антимикробные пептиды (КАМП) и белки являются составляющей молекулярного механизма врождённого иммунитета животных [1]. Обладая антимикробной активностью, эти соединения характеризуются относительно низкой токсичностью по отношению к собственным клеткам макроорганизма, что в перспективе делает их альтернативой конвенциальным (общепринятым) антибиотикам микробного происхождения, к которым у бактерий очень быстро формируется резистентность.

В настоящее время описано более 900 индивидуальных антимикробных пептидов и белков, принадлежащих к разным гомологическим семействам [2]. Относящиеся к дефенсинам антимикробные пептиды, выделенные из тромбоцитов животных и человека, обладают не только выраженной антимикробной, но и иммуномодулирующей и цитолитической активностями [3, 4]. Они способны влиять на течение фагоцитарного и воспалительных процессов [5]. Вместе с тем имеются лишь единичные, порой противоречивые сведения о наличии тромбодефенсинов у сельскохозяйственных животных.

Всё вышеописанное и предопределило цель настоящего исследования: выделение катионных белков из тромбоцитов разных видов сельскохозяйственных животных и изучение их антимикробной активности.

Материалы и методы. Тромбоциты мы получали из цитратной крови клинически здоровых

кур-несушек, лошадей, свиней, коз и собак. Обогащенную тромбоцитами плазму отделяли центрифугированием при 250 g в течение 30 минут. Супернатант снова центрифугировали при 1000 g 30 минут. Осаждённые тромбоциты отмывали трижды средой 199 (с добавлением 3,8%-ного цитрата натрия в соотношении 1:10). Тромбоцитарную массу ресуспендировали в 10%-ной уксусной кислоте в соотношении 1:10 и инкубировали при -15°С в течение 24 часов. После дефростации полученный экстракт центрифугировали при 1000 g в течение 40 минут. Супернатант использовали для определения антимикробной активности.

Антимикробные свойства кислоторастворимых белков тромбоцитов оценивали in vitro в отношении грамположительного микроорганизма Bacillus subtilis. Суточную агаровую культуру В. subtilis смывали физиологическим раствором, содержащим 0,1%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина, и готовили микробную взвесь с оптической плотностью 0,270 при длине волны 650 нм. Суспензию В. subtilis разбавляли в соотношении 1:1000 физиологическим раствором с альбумином. Перед работой рН кислотного экстракта тромбоцитов доводили 0,1%-ным раствором аммиака до 5,5—5,8.

Стерильно в изотоническом растворе хлорида натрия готовили разведения тромбоцитарного катионного белка (ТКБ): 0; 1/2; 1/4; 1/8; 1/16; 1/ 32. К 0,1 мл взвеси тестируемого штамма микроорганизма добавляли 0,9 мл разведения антимикробного препарата (в контрольные пробы вместо исследуемого препарата добавляли 0,9 мл изотонического раствора хлорида натрия). По-

Антимикробное действие ТКБ сельскохозяйственных животных

т

ч

лученную смесь инкубировали при 37 °С в течение 1 часа, после чего высевали по 0,2 мл на питательный агар и инкубировали 24 часа при

37 °С.

После инкубации подсчитывали количество выросших колоний на опытных и контрольных чашках. За минимальную бактерицидную концентрацию антимикробного препарата принимали концентрацию, подавляющую рост 50% колоний бактерий по сравнению с контролем.

Полученные результаты. Получив тромбо-цитарный катионный белок у разных видов животных, мы предприняли попытку изучить в эксперименте антимикробное действие этого вещества в отношении В. .ъыЬИШ как наиболее чувствительной культуры. Результаты оценки влияния ТКБ, выделенного из тромбоцитов разных видов животных, на рост В. .ъыЬИШ представлены в таблице.

Нативный препарат тромбоцитарного катионного белка, полученный от кур, полностью подавлял рост В. .ъыЬИШ, от лошадей — 99,2% КОЕ, от коз — 74,1% КОЕ, от свиньи — 99,7% КОЕ, полученный от собак — 83% КОЕ. Количество выживших микроорганизмов при обработке кислотным экстрактом тромбоцитов, полученным от разных видов животных, изменялось в широких пределах — от 1 КОЕ у свиньи до 141 КОЕ у коз. При разведении ТКБ 1/2 зафиксирован рост 33 КОЕ В. зыЫШ.? после инкубации с белком, выделенным у кур, 59 КОЕ — у лошадей, 208 КОЕ — у коз, 14 КОЕ — у свиньи и 195 КОЕ у собак.

Следует отметить, что при разведении препарата 1/4 антимикробное действие белка, выделенного из тромбоцитов кур и лошадей, было значительно выше, чем активность ТКБ коз (99,

38 и 225 КОЕ соответственно), но меньше, чем активность белка у свиньи, — 20 КОЕ. При разведении ТКБ собак 1/4 зафиксирован рост КОЕ (311±23,71), что почти на 50% меньше, чем в контроле (р<0,05). Следовательно, активность тромбоцитарного катионного белка собак составила 4 единицы.

ТКБ лошадей в разведении 1/8 задерживал рост 77,7% В. .ъыЬИШ, тогда как кур — 58,6%; коз — 56,9%. Тромбодефенсины собак в этом же разведении задерживали рост 45% В. .ъиЬИШ(р<0,01), а свиней — 89,5% бацилл. Разведение ТКБ 1/16 у птиц и лошадей оказалось минимальной бак-

терицидной концентрацией, подавляющей рост 50% В. subtШs. В разведении нативного препарата 1:32 отмечался рост 380 КОЕ у кур; количество колоний в пробах с ТКБ лошадей и коз практически не отличалось от контрольных значений (количество КОЕ В. зиЬНШ в контроле составило 509—546).

В разведении 1/16 кислотный экстракт из тромбоцитов свиньи подавлял рост 82% бацилл, количество выживших микроорганизмов составило 53 КОЕ. Разведение ТКБ свиней 1:32 оказалось минимальной бактерицидной концентрацией, ингибирующей рост 50% В. зиЬНШ.

Таким образом, нами установлено наличие пептидов, обладающих антимикробной активностью, в тромбоцитах кур, лошадей, коз, свиньи и собаки. В сравнительном аспекте наиболее выраженным антимикробным действием обладает смесь пептидов из тромбоцитов свиньи — 32 единицы активности (рис. 1). Показатели активности тромбодефенсинов коз (8 единиц) занимали промежуточное положение между значениями активности тромбодефенсинов курицы и лошади, с одной стороны, собаки — с другой.

Планируемое в перспективе получение и структурно-функциональное изучение чистого препарата, а также определение минимальной бактерицидной и подавляющей концентрации очищенного КАМП относительно разнообразных представителей кокковых, а также палочковидных грамположительных и грамотрицатель-ных форм бактерий, позволит отобрать наиболее эффективный с точки зрения антимикробной активности ТКБ и создаст предпосылки для разработки и производства химически или биологи-

'

и

]

:

о

Курица Лошадь Коза Свинья Собака

х

Рис. 1 - Антимикробная активность тромбодефенсинов разных видов животных

чески синтезированных гомологов этих соединений. Последние могли бы найти применение в медицине и ветеринарии не только в качестве антимикробных средств, но и в качестве иммуномодулирующих и даже химиотерапевтических препаратов.

Литература

1. Jenssen, Н. Peptide antimicrobial agents / Н. Jenssen, P. Harnill, R.E.W. Hancock // Clinical Microbiology Reviews. 2006. Vol. 19. No 3. P. 491-511.

2. Кокряков, В.Н. Очерки о врождённом иммунитете / В.Н. Ко-кряков. СПб.: Наука, 2006. 261 с.

3. Бухарин, О.В. Антимикробный белок тромбоцитов / О.В. Бухарин, В.А. Черешнев, К.Г. Сулейманов. Екатеринбург, 2000. 200 с.

4. Effects of chicken intestinal antimicrobial peptides on humoral immunity of chickens and antibody titres after vaccination with infectious bursal disease virus vaccine in chicken / Yurong Y., Yibao J., Ruiping S. et al. // Z. Arch. Anim. Nutr. 2006. No. 60(5). P. 427-435.

5. Бухарин, О.В. Природа и биологическая роль тромбоци-тарного катионного белка / О.В. Бухарин, К.Г. Сулейманов // Успехи современной биологии. 1997. № 3. С. 10—15.