Способ изготовления вакцины инактивированной эмульсионной против ящура и вакцина инактивированная эмульсионная против ящура
METHOD OF MANUFACTURING THE VACCINE INACTIVATED EMULSION AGAINST MURRAIN AND EMULSION INACTIVATED VACCINE AGAINST MURRAIN

Изобретение относится к биотехнологии, ветеринарной вирусологии и микробиологии.
Иммуногенность и эффективность вакцин в значительной степени увеличивается с использованием в технологии их изготовления неспецифических стимуляторов иммунитета - адъювантов.
Известно, что при изготовлении средств специфической профилактики инфекционных болезней животных нашли применение, главным образом, два типа адъювантов: сорбционные (гидроксид алюминия, оксид кремния, алюмокалиевые квасцы) и масляные - для получения эмульсионных вакцин (адъювант Фрейнда                                                                                                                                                                                                                                                       и многочисленные его разновидности).
Преимущества эмульсионных вакцин перед сорбционными заключаются в пролонгировании действия антигена, лучшей его сохранности, возможности введения менее концентрированной антигенной части, позволяет не проводить дополнительную вакцинацию животных за счет адъювантных свойств.
Свойства масляных эмульсионных вакцин описываются положениями коллоидной химии и в соответствии с ними классифицируются по типу получаемой эмульсии: «вода в масле» или обратные эмульсии (антиген находится внутри мицелл и закрыт эмульгатором и маслом; «вода в масле в воде» или сложные эмульсии (антиген находится как внутри мицелл, так и в водной фазе), «масло в воде» или прямые эмульсии (антиген находится в водной фазе) [1, 2].
Процесс изготовления вакцины инактивированной эмульсионной против ящура состоит из следующих этапов:
- культивирование вирусного антигена в суспензионной культуре, преимущественно в культуре клеток ВНК-21,
- очистка вирусной суспензии от балластных примесей,
- инактивация вирусной суспензии,
- концентрирование полученного антигена вируса ящура,
- соединение концентрата антигена с масляным адъювантом (эмульгирование).
3
Известен способ изготовления вакцины против ящура и вакцина против ящура типа А [3], который заключается в том, что изготовление вакцины против ящура типа А включает репродукцию вирусного антигена в суспензионной культуре клеток ВНК-21, инактивацию вирусного антигена, очистку от балластных примесей и концентрирование антигена при помощи проточной ультрафильтрации или полиэтиленгликоля. Для изготовления эмульсионной вакцины используют антигенный материал с содержанием иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура, по меньшей мере, 2,0 мкг/см.
Недостатком указанного способа является то, что предлагаемое количество иммуногенных компонентов не обеспечивает образования высокого уровня гуморального иммунитета. Количество иммуногенных компонентов повышают за счет увеличения прививной дозы для КРС.
3
Известен способ изготовления вакцины против ящура и вакцина против ящура типа О [4], который заключается в том, что изготовление вакцины против ящура типа О включает репродукцию вирусного антигена в суспензионной культуре клеток ВНК-21, инактивацию вирусного антигена, очистку от балластных примесей и концентрирование антигена при помощи проточной ультрафильтрации или полиэтиленгликоля. Для изготовления адсорбат и эмульсионной вакцины используют антигенный материал с содержанием иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура, по меньшей мере, 4,0 мкг/см.
3
Недостатком указанного способа является то, что вакцина обладает выраженной иммуногенной активностью для КРС в дозе 5 см.
Известна вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа А [5]. Вакцина содержит авирулентный и очищенный антигенный материал, полученный в перевиваемой культуре клеток ВНК-21.
Антигенный материал представляет собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура. Кроме того, вакцина содержит поддерживающую среду и масляный адъювант в эффективных соотношениях. В качестве поддерживающей среды используют раствор Эрла без сыворотки с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при рН 7,4-7,6. Из масляных адъювантов вакцина содержит масляный адъювант ВНИИЗЖ или масляный адъювант марок Montanide ISA-70 или Montanide ISA-206 производства фирмы «Seppic» (Франция).
3
Недостатком указанного способа является то, что вакцина обладает иммуногенной активностью для КРС в дозе 5,0 см.
Наиболее близким аналогом является способ изготовления и вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа А [5].
Проблема, на решение которой направлено настоящее изобретение - получить препарат, обладающий высокими иммуностимулирующими свойствами при использовании различных антигенных материалов вируса ящура разных типов.
Для этого был разработан новый способ изготовления вакцины инактивированной эмульсионной против ящура.
Решение проблемы в части способа, включающем культивирование вирусного антигена в суспензионной культуре клеток ВНК-21, очистку вирусной суспензии от балластных примесей, инактивацию, концентрирование полученного антигена вируса ящура и соединение концентрата антигена с масляным адъювантом, заключается в результате использования в качестве адъюванта масляного адъюванта Montanide ISA-61 VG (Seppic, Франция), разработки режимов, определения соотношения водной и масляной фаз и параметров производства противоящурной вакцины.
Montanide ISA-61 VG - адъювант на основе минерального масла, который был разработан для производства эмульсий вода в масле (В/М). Он содержит особое обогащенное светлое минеральное масло и высокоочищенное ПАВ, полученное из маннитола и очищенной олеиновой кислоты растительного происхождения. Montanide ISA-61 VG не содержит компонентов животного происхождения.
В результате разработки нами было установлено, что рецептуры вакцин против ящура с Montanide ISA 61 VG вызывают напряженный и продолжительный иммунный ответ. По сравнению с традиционными масляными эмульсиями, эмульсия с Montanide ISA 61 VG является более стабильной и обладает низкой вязкостью. Обеспечивая высокую и долговременную защиту, вакцина с этим адъювантом может содержать антиген вируса ящура в низких концентрациях.
Вирус ящура культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21 в течение 10-18 ч при температуре 36-37°С. При достижении количества мертвых клеток 90-95% прекращают культивирование. Вируссодержащую суспензию контролируют на стерильность и содержание 146S иммуногенных компонентов. Сразу по окончании цикла репродукции вируса, не прекращая термостатирования, в вируссодержащую суспензию добавляют 15-20% раствор АЭЭИ, подкисленный ледяной уксусной кислотой до рН 8,0-8,5. Инактивацию инфекционности вируса проводят в течение 12-24 часов при 36-37°С и рН 7,2-7,6 с перемешиванием через 5-6 часов в течение 3-5 минут. Остаток АЭЭИ нейтрализуют добавлением тиосульфата натрия.
При температуре суспензии 36-37°С добавляют 10% раствор ПГМГ до концентрации 0,005-0,007% для флокуляции балластных примесей и инактивации возможных контаминантов. Флокулированные балластные примеси подвергают седиментации с последующей декантацией.
Полученный антиген контролируют на авирулентность в первично-трипсинизированной культуре клеток свиной почки, содержание вирусспецифического белка, 146S иммуногенных компонентов вируса и стерильность.
После контроля на авирулентность и стерильность вируссодержащую суспензию фильтруют через фильтр с порами 1,2 и 0,6 мкм для удаления оставшихся частиц с помощью фильтровальной установки.
3
Необходимое количество 146S иммуногенных компонентов в 1 см концентрата достигают с помощью проточной ультрафильтрации. Ультрафильтрацию проводят под давлением 1,5 атм.
3
В полученном концентрате проверяют количество растворимого балластного белка и прозрачность. При показании прозрачности ниже 90% или наличие растворимого балластного белка выше 10 мг/см, полученный концентрат дополнительно фильтруют через фильтры с порами 0,45 мкм.
Адъювант Montanide ISA-61 VG стерилизуют через фильтр с порами 0,20 мкм при давлении 1,1-1,2 атм.
Эмульгирование (соединение концентрата антигена с адъювантом Montanide ISA-61 VG) проводят при помощи проточного смесителя в соотношении от 40÷60 до 50÷:50 по весу, при температуре 18-25°С.
При разработке способа изготовления особое внимание было уделено, способам концентрирования, очистки инактивированной суспензии и концентрата, определению наиболее оптимального соотношения масляной и водной фазы. Масляные адъюванты, предназначенные для получения эмульсии вода в масле, обычно используют в соотношении 70:30.
Обычно при изготовлении эмульсионной вакцины против ящура с типом эмульсии «вода в масле в воде» получают путем смешивания концентрата антигена и масляного адъюванта при температуре 30-33°С в соотношении 50:50 по весу.
При изготовлении эмульсионной вакцины с адъювантом Montanide ISA-61 VG антиген и масляный адъювант смешивают в соотношении от 40÷60 до 50÷:50 как по весу, так и по объему, что дает возможность увеличения количества 146S иммуногенных компонентов в прививном объеме препарата. Увеличение количества 146S иммуногенных компонентов позволяет повысить иммунный статус животных. Смешивание антигена и масляного адъюванта в равных пропорциях дает возможность концентрировать полуфабрикат примерно в 2 раза меньше.
При использовании адъюванта Montanide ISA-61 VG удалось избежать потерь вирусной суспензии вследствие щадящей очистки.
3
Соединение концентрата с масляным адъювантом Montanide ISA-61 VG проводят без предварительного подогрева вирусной суспензии и адъюванта. Подогрев антигена вируса ящура отрицательно влияет на иммуногенные компоненты. За счет этого еще дополнительно удалось увеличить количество 146S иммуногенных компонентов в прививном объеме препарата, что позволяет эффективно применять прививную дозу 2,0 см для КРС.
Способ изготовления вакцины интактивированной эмульсионной против ящура состоит из следующих этапов:
- в качестве вирусного антигена используют вирус ящура типа А и/или вирус ящура типа О, и/или вирус ящура типа Азия-1;
- для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы используют предпочтительно суспензионную культуру клеток ВНК-21, а в качестве поддерживающей среды раствор Эрла без сыворотки с добавлением ферментативных гидролизатов мышц сухого (ФГМС), гидролизатов белков крови сухого (ГБКС) и антибиотиков при рН 7,4-7,6;
- культивирование проводят в течение 10-18 ч при температуре 36-37°С;
- после окончания процесса культивирования вирусного антигена к нему добавляют хлороформ до конечной концентрации 0,2%;
- для инактивации вируса используют АЭЭИ, который добавляют в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,025-0,05%. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением в суспензию тиосульфата натрия [6].
- очистку вирусной суспензии осуществляют путем добавления полигексаметиленгуанидина гидрохлорида (ПГМГ), который вносят в суспензию до концентрации 0,005-0,007% [7];
- дополнительную очистку вируссодержащей суспензии проводят путем пропускания через фильтры с порами 1,2 и 0,6 мкм под давлением 1,5 атм;
- для изготовления эмульсионной вакцины антиген концентрируют проточной ультрафильтрацией под давлением 1,5 атм;
3
- при показании прозрачности ниже 90% или наличии растворимого балластного белка выше 10 мг/см, полученный концентрат дополнительно очищают через фильтры с порами 0,45 мкм;
3
- для изготовления эмульсионной вакцины используют авирулентный и очищенный антигенный материал с содержанием иммуногенных (146S) компонентов вируса ящура не менее 6 мкг по каждому типу в 1 см;
- масляный адъювант Montanide ISA-61 VG стерилизуют при помощи фильтровальной установки, пропуская масляный адъювант через фильтр с размером пор 0,2 мкм при давлении 1,1-1,2 атмосферы;
- эмульсионную вакцину получают путем диспергирования при помощи проточного смесителя концентрата ящурного антигена и масляного адъюванта Montanide ISA-61 VG в соотношении от 40÷60 до 50÷50 по массе при температуре 18-25°С.
При этом в части вакцины, полученной заявленным способом, содержащей авирулентный и очищенный антигенный материал вируса ящура типа А и/или вируса ящура типа О, и/или вируса ящура типа Азия-1 в эффективном количестве, содержащий преимущественно 146S иммуногенные компоненты и масляный адъювант Montanide ISA-61 VG названная проблема решается тем, что:
3
1. в качестве авирулентного очищенного антигенного материала вируса ящура типа А вакцина содержит авирулентный очищенный антигенный материал штамма вируса ящура типа А в количестве не менее 3,0 мкг 146S иммуногенных компонентов в 1 см готового препарата;
3
2. в качестве авирулентного очищенного антигенного материала вируса ящура типа А вакцина содержит авирулентный очищенный антигенный материал штамма А №2155/Забайкальский/2013 [8] в количестве не менее 3,0 мкг 146S иммуногенных компонентов в 1 см готового препарата;
3
3. в качестве авирулентного очищенного антигенного материала вируса ящура типа О вакцина содержит авирулентный очищенный антигенный материал штамма вируса ящура типа О в количестве не менее 3,0 мкг 146S иммуногенных компонентов в 1 см готового препарата;
3
4. в качестве авирулентного очищенного антигенного материала вируса ящура типа О вакцина содержит авирулентный очищенный антигенный материал штамма О №2123/Южная Осетия/2011 [9] в количестве не менее 3 мкг 146S иммуногенного компонента в 1 см готового препарата;
3
5. в качестве авирулентного очищенного антигенного материала вируса ящура типа Азия-1 вакцина содержит авирулентный очищенный антигенный материал штамма вируса ящура типа Азия-1 в количестве не менее 3,0 мкг 146S иммуногенных компонентов в 1 см готового препарата;
3
6. в качестве авирулентного очищенного антигенного материала вируса ящура типа Азия-1 вакцина содержит авирулентный очищенный антигенный материал штамма Азия-1 №1946/Шамир 3/89 [9] в количестве не менее 3 мкг 146S иммуногенного компонента в 1 см готового препарата;
3
7. вакцина содержит авирулентный очищенный антигенный материал вируса ящура и масляный адъювант Montanide ISA-61 VG в соотношении от 40÷60 до 50÷50 при следующем количестве, мкг в 1 см готового препарата:
Технический результат группы изобретений заключается в повышении уровня гуморального иммунитета, изготовлении эмульсионной вакцины в разных пропорциях водной и масляной фазы, увеличении содержания иммуногенных компонентов в меньшем прививном объеме, уменьшении потерь компонентов при изготовлении эмульсионной вакцины в соотношении от 40÷60 до 50÷50, уменьшении кратности концентрирования для получения более эффективных, безопасных и экономически целесообразных противоящурных препаратов, повышении напряженности и продолжительности иммуногенной активности вакцин против ящура, снижении реактогенности, улучшении стабильности.
Технический результат от изобретения в части вакцины заключается в повышении напряженности и продолжительности иммуногенной активности вакцин против ящура, снижении реактогенности, улучшении стабильности препарата, а также в расширении арсенала имеющихся средств специфической профилактики ящура.
Основной технический результат заключается в уменьшении содержания антигенов в прививной дозе, за счет значительного снижения содержания иммуногенных компонентов в вирусной суспензии, которая используется для получения вакцины.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают его объем.
3
Пример 1. Для изготовления вакцины используют вирус ящура А №2155/Забайкальский/2013, который культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при температуре 36-37°С. Через 6-7 часов инкубирования проводят подсчет живых и мертвых клеток при окраске трипановым синим. При достижении количества мертвых клеток 90-95% культивирование прекращают и вируссодержащую суспензию контролируют на стерильность и содержание 146S компонентов. Количество 146S компонентов в суспензии не менее 0,5 мкг/см. Сразу по окончании цикла репродукции вируса, не прекращая термостатирования, в вируссодержащую суспензию добавляют 15-20% раствор АЭЭИ, подкисленный ледяной уксусной кислотой до рН 8,0-8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,025-0,05%. Инактивацию инфекционности вируса проводят в течение 12-24 часов при 36-37°С и рН 7,2-7,6 с перемешиванием через 5-6 часов в течение 3-5 минут. Остаток АЭЭИ нейтрализуют добавлением тиосульфата натрия.
При температуре суспензии 36-37°С добавляют 10% раствор ПГМГ до концентрации 0,005-0,007% для флокуляции балластных примесей и инактивации возможных контаминантов. Флокулированные балластные примеси подвергают седиментации с последующей декантацией.
3
Необходимое количество иммуногенных компонентов 146S достигают при помощи ультрафильтрации. Конечная концентрация 146S компонентов вируса ящура должна быть, не менее 3,0 мкг в 1 см готового препарата. Адъювант Montanide ISA-61 VG стерилизуют через фильтр с порами 0,2 мкм. Затем антиген смешивают с масляным адъювантом Montanide ISA-61 VG при температуре 18-25°С.
Приготовленную вакцину расфасовывают во флаконы и проверяют на стерильность, авирулентность, безвредность, иммуногенность и стабильность.
Пример 2. Для изготовления вакцины использовали вирус ящура О №2123/Южная Осетия/2011. Вакцину готовили так, как описано в примере 1.
Приготовленную вакцину расфасовывают во флаконы и проверяют на стерильность, авирулентность, безвредность, иммуногенность и стабильность.
Пример 3. Для изготовления вакцины используют вирус ящура Азия-1 №1946/Шамир 3/89. Вакцина изготавливалась так, как описано в примере 1.
Приготовленную вакцину расфасовывают во флаконы и проверяют на стерильность, авирулентность, безвредность, иммуногенность и стабильность.
Пример 4. Инактивированную эмульсионную вакцину против ящура типов А и О изготавливают из штаммов вируса ящура А №2155/Забайкальский/2013 и О №2123/Южная Осетия/2011. Штаммы вируса ящура культивируют в отдельных биореакторах. После этого штаммы концентрируют либо по отдельности и затем смешивают в зависимости от содержания иммуногенных компонентов, либо после смешивания также проводят концентрирование. После этого добавляют масляный адъювант Montanide ISA-61 VG.
Приготовленную вакцину расфасовывают во флаконы и проверяют на стерильность, авирулентность, безвредность, иммуногенность и стабильность.
Пример 5. Инактивированную эмульсионную вакцину против ящура типов А, О, Азия-1 изготавливают из штаммов вируса ящура А №2155/Забайкальский/2013, О №2123/Южная Осетия/2011 и Азия-1 №1946/Шамир 3/89. Штаммы вируса ящура культивируют в отдельных биореакторах. После этого штаммы концентрируют по отдельности и затем смешивают в зависимости от содержания иммуногенных компонентов. После этого добавляют масляный адъювант Montanide ISA-61 VG.
Приготовленную вакцину расфасовывают во флаконы и проверяют на стерильность, авирулентность, безвредность, иммуногенность и стабильность.
3
Пример 6. Проведены испытания иммуногенной активности инактивированной эмульсионной вакцины против ящура типа А №2155/Забайкальский/2013 на подсвинках с масляными адъювантами Montanide ISA-206 и Montanide ISA-61 VG, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мкг в 2,0 см:
3
Животных прививали внутримышечно в дозе 2,0 см.
Результаты испытаний представлены в таблице 2. Из результатов, представленных в таблице видно, что титр антител на 21 сутки после иммунизации у животных привитых вакциной на основе масляного адъюванта Montanide ISA-61 VG был в 2 раза выше, чем у животных инокулированных вакциной с адъювантом Montanide ISA-206.
3
Пример 7. Проведены испытания иммуногенной активности инактивированной эмульсионной вакцины против ящура типа О №2123/Южная Осетия/2011 на КРС с масляными адъювантами Montanide ISA-206 и Montanide ISA-61 VG, изготовленной так, как описано в примере 2, и содержащей, мкг в 2,0 см:
3
Животных вакцинировали внутримышечно в дозе 2,0 см.
Результаты опыта отображены в таблице 3. Эмульсионная вакцина с Montanide ISA-61 VG стимулировала выработку вируснейтрализующих антител в 2 раза больше, чем с Montanide ISA-206.
3
Пример 8. Проведены испытания иммуногенной активности инактивированной эмульсионной вакцины против ящура типа Азия-1 №1946/Шамир 3/89 на КРС с масляными адъювантами Montanide ISA-70 и Montanide ISA-61 VG, изготовленной так, как описано в примере 3, и содержащей, мкг в 2,0 см:
3
Животных вакцинировали внутримышечно в дозе 2,0 см.
2
2
Результаты опыта показаны в таблице 4. Данные представленные в таблице показывают, что вакцина с Montanide ISA-61 VG индуцировала на 21 сутки титр антител на уровне 5,90±0,27 log, вакцина с Montanide ISA-70 - 4,95±0,18 log.
3
Пример 9. Проведены испытания иммуногенной активности инактивированных эмульсионных вакцин против ящура типов А №2155/Забайкальский/2013 и О №2123/Южная Осетия/2011 на КРС с масляными адъювантами Montanide ISA-206 и Montanide ISA-61 VG, изготовленных так, как описано в примере 4, и содержащей, мкг в 2,0 см:
3
Животных вакцинировали внутримышечно в дозе 2,0 см.
Результаты опыта отображены в таблице 5. Из таблицы следует, что индукция антител против вируса ящура после инокуляции вакциной с масляным адъювантом Montanide ISA-61 VG по типу А была в 2,1 раза выше, а по типу О в 3,5 раза выше, чем у вакцины с масляным адъювантом Montanide ISA-206.
3
Пример 10. Проведены испытания иммуногенной активности инактивированной эмульсионной вакцины против ящура типов А №2155/Забайкальский/2013, О №2123/Южная Осетия/2011 и Азия-1 №1946/Шамир 3/89, изготовленной так, как описано в примере 5, и содержащей, мкг в 2,0 см:
3
Животных вакцинировали внутримышечно в дозе 2,0 см.
Результаты опыта показаны в таблице 6. По результатам испытаний можно сделать вывод, что уровень гуморального иммунитета у животных привитых вакциной с масляным адъювантом Montanide ISA-61 VG на 70 сутки превышал гуморальный иммунитет животных инокулированных вакцинами с масляным адъювантом Montanide ISA-70 и масляным адъювантом Montanide ISA-206 по типу А в 3,5 и в 1,5 раза, соответственно. Индуцирование вируснейтрализующих антител у животных привитых вакцинами с масляным адъювантом Montanide ISA-61 VG и масляным адъювантом Montanide ISA-206 по типу О не отличался. Выработка антител по типу О у животных иммунизированных вакциной с масляным адъювантом Montanide ISA-61 VG была в 3,4 раза выше, чем у животных привитых вакциной с масляным адъювантом Montanide ISA-70. По типу Азия-1 индуцирование гуморального иммунитета у животных привитых вакциной с масляным адъювантом Montanide ISA-61 VG в 2,5 раза и в 3,4 раза выше, чем у животных инокулированных вакцинами с масляным адъювантом Montanide ISA-206 и с масляным адъювантом Montanide ISA-70, соответственно.
Пример 11. Проведены испытания реактогенности инактивированной эмульсионной вакцины против ящура типов А №2155/Забайкальский/2013, О №2123/Южная Осетия/2011, Азия-1 №1946/Шамир 3/89. Результаты исследований представлены в таблице 7.
3
3
3
3
3
3
3
3
Исследования показали, что при введении эмульсионной вакцины с адъювантом Montanide ISA-61 VG гранулема на 7 сутки была только у одного животного, объем которой составил 0,006 см при внутримышечном введении, а при подкожном введении на 7 сутки гранулемы были объемом 39,9 и 177,4 см. Тогда как после введения вакцины с адъювантом Montanide ISA-206 гранулемы на 7 сутки наблюдались у всех животных размером 0,5-3 см при внутримышечном введении. При подкожном введении объем гранулем составил 52 и 180,5 см. При внутримышечном введении вакцины с адъювантом Montanide ISA-70 на 7 сутки гранулема наблюдалась у одного животного размером 0,05 см, а при подкожном введении объем гранулем составил 54,81 и 1618,75 см. На 14 сутки гранулемы не наблюдались ни у одного животного. Животные, привитые подкожно вакцинами с адъювантом Montanide ISA-61 VG и адъювантом Montanide ISA-206 на 35 сутки имели незначительные гранулемы объемом 1,00 и 1,04 см. Тогда как животные, иммунизированные вакциной с адъювантом Montanide ISA-70, имели гранулемы 1,12 и 8,7 см.
Пример 12. Проведены испытания стабильности инактивированной эмульсионной вакцины против ящура типов А, О, Азия-1. Результаты исследований отображены в таблицах 8, 9, 10.
Как видно из таблиц, вакцина, приготовленная на основе масляного адъюванта Montanide ISA-61 VG более стабильна при равных условиях испытаний.
Источники информации
1. Пат. РФ 2510845, МПК A61K 39/39, A61K 39/113, Адъювант, опубл. 10.04.2014 г.
2. Сумм Б.Д. Основы коллоидной химии. - 2007, М., 240 с.
3. Пат. РФ 2143921, МПК A61K 39/135, C07K 14/09, C12N 7/04, Вакцина против ящура типа А и способ ее изготовления, опубл. 10.01.2000 г.
4. Пат. РФ 2212895, МПК A61K 39/135, C12N 7/04, Вакцина против ящура типа О и способ ее изготовления, опубл. 27.09.2003 г.
5 Пат. РФ 2294759 A61K 39/135, А61Р 31/12, Вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа А, опубл. 10.03.2007 г.
6. А.С. 594771, А61K 39/12, C12N 7/04, Средство для инактивации вирусов при изготовлении противовирусных препаратов, опубл. 07.07.1993 г.
7. Пат. РФ 2054039, C12N 7/02, А61K 39/135, Способ очистки и стерилизации культурального вируса ящура, опубл. 10.02.1996 г.
8. Пат. РФ 2603255, A61K 39/135, C12N 7/04, Штамм А №2155/Забайкальский/2013 вируса ящура Aphtae epizooticae типа А для контроля антигенной и иммуногенной активности и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А, опубл. 27.11.2016 г.
9. Пат. РФ 2593718, A61K 39/135, C12N 7/04, Вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типов А, О, Азия-1, опубл. 10.08.2016 г.
Примечание: п/к - подкожно, в/м - внутримышечно
Примечание: А - прозрачное масло в верхней фракции; В - опалесцирующее масло; С - нормальное масло; D - плотная эмульсия (коалесцент); Е - водная фракция на дне пробирки.
Примечание: А - прозрачное масло в верхней фракции; В - опалесцирующее масло; С - нормальное масло; D - плотная эмульсия (коалесцент); Е - водная фракция на дне пробирки.
Примечание: А - прозрачное масло в верхней фракции; В - опалесцирующее масло; С - нормальное масло; D - плотная эмульсия (коалесцент); Е - водная фракция на дне пробирки.