Изменение морфологии корневой системы пшеницы при инокуляции Azospirillum brasilense Sp7 и бактериофагом ФAb-Sp7

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 50, № 3, с. 315-322

УДК 633.11:581.43:581.55 doi: 10.15389/agrobiology.2015.3.315rus

ИЗМЕНЕНИЕ МОРФОЛОГИИ КОРНЕВОЙ СИСТЕМЫ ПШЕНИЦЫ ПРИ ИНОКУЛЯЦИИ Azospirillum brasilense Sp7 И БАКТЕРИОФАГОМ

ФАЬ^р7

О.И. ГУЛИЙ1. 2> 3, М.К. СОКОЛОВА1, О.И. СОКОЛОВ1, О.В. ИГНАТОВ1

Одними из распространенных объектов при исследовании ассоциативных взаимодействий растений с бактериями служат представители рода Azospiiillum. В ризосфере злако-вих азоспириллы формируют высокоэффективные ассоциации, оказывающие стимулирующий эффект на рост и развитие растений, включая пшеницу. Однако детали этого взаимодействия пока остаются неизвестными. Например, отсутствуют какие-либо данные о том, инфицированны или неинфицированны клетки азоспирилл бактериофагами и какова роль бактериофагов почвенных микроорганизмов в ассоциативном взаимоотношении микроорганизм—растение. В то же время бактериофаги играют важную роль в качестве фактора, регулирующего численность микробных клеток, и в переносе генетической информации посредством трансдукции. В большинстве случаев бактериофаги выделяют из различных объектов среды, в том числе из почвы, и лишь незначительная часть работ посвящена описанию бактериофагов из ассоциативных почвенных бактерий. Мы изучали изменения морфологии корневой системы яровой пшеницы (сорт Саратовская 29) при инокуляции клетками бактерий Azospiiillum brasilense Sp7 и бактериофагом ФАЬ^р7, выделенным из этих клеток. Инокуляция 3-суточных проростков пшеницы клетками A. brasilense Sp7 с плотностью суспензии 108, 106, 104 кл/мл (объем — 20 мл) приводила к уменьшению длины корня, при этом число боковых корней существенно увеличивалось при плотности суспензии 102 кл/мл. При обработке проростков пшеницы препаратом бактериофага ФАЬ-Бр7 среднее число корней практически не изменялось. Показано, что при инокуляции проростков пшеницы только суспензией азоспирилл происходило уменьшение зоны растяжения корня в 3,0 раза и уменьшение зоны всасывания в 1,5 раза. Обработка проростков пшеницы суспензией, содержащей как клетки азоспирилл, так и бактериофаги, вызывала уменьшение зоны растяжения (в 3,3 раза), но не приводила к уменьшению зоны всасывания (корневых волосков). С помощью конфокальной микроскопии показано, что при инкубации проростков пшеницы с клетками азоспирилл (102 кл/мл) значительно увеличивалась длина и число корневых волосков (в среднем на 40 %) по сравнению с контролем. Установлено также увеличение длины и числа корневых волосков в среднем на 60 % по сравнению с контролем при одновременной инокуляции проростков клетками азоспирилл штамма Sp7 и бактериофагом ФАЪ^р7. Высказано предположение, что бактериофаги азоспирилл участвуют в сложном процессе взаимодействия бактерий с корневой системой пшеницы и могут влиять на эффективность ассоциативных взаимоотношений растение—микроорганизм и, в конечном счете, определять эту эффективность.

Ключевые слова: Azospiiillum brasilense, бактериофаги, пшеница, корневая система.

Представители рода Azospirillum — одни из широко распространенных объектов при изучении ассоциативных взаимодействий бактерий с растениями (1). Азоспириллы принадлежат к группе а-протеобактерий семейства Rhodospirillaceae, которые обладают способностью ассимилировать атмосферный азот. В природе они могут колонизировать как поверхность, так и внутренние ткани корней растений, преимущественно злаковых (2-4), и образование подобных симбиозов приводит к повышению продуктивности злаковых растений (5-8). В отношении A. brasilense Sp7 в 1990-е годы в цикле исследований было показано присутствие клеток штамма только на поверхности корня (3-4, 9).

Известно, что положительное влияние бактерий рода Azospirillum на рост, развитие и урожайность растений многофакторно. В этой связи значимыми признаками считаются высокая азотфиксирующая активность, продукция индолил-3-уксусной кислоты и других фитогормонов, фунгицидная и бактерицидная активность, а также способность синтезировать высокомолекулярные физиологически активные вещества (7).

315

Бактериофаги почвенных микроорганизмов привлекают внимание исследователей из-за повсеместного распространения, многообразия и важной экологической роли (10, 11). В большинстве случаев бактериофаги выделяли из различных объектов среды, в том числе из почвы (12-17), и лишь незначительная часть работ посвящена описанию бактериофагов из ассоциативных почвенных бактерий. Так, при изучении бактериофагов из 24 штаммов четырех видов почвенных бактерий, стимулирующих рост растений, впервые было установлено (18), что большинство изолятов принадлежат бактериям из семейства Azospirillum. Бактериофаги были выделены у 11 из 24 проанализированных штаммов, в том числе у A. bra-silense Сd, A. brasilense Sp7, A. brasilense Sp245, A. brasilense Wb1, A. lipo-ferum B-518, А. dobereinerae, и у ряда других штаммов. Особое значение придается роли бактериофагов в ассоциативных взаимодействиях клеток азоспирилл с растениями.

Нашей целью было изучение влияния бактериофагов азоспирилл на роста и развития корневой системы у проростков пшеницы in vitro в системе микроорганизм—растение.

Методика. В качестве модели для изучения ассоциативного взаимодействия использовали проростки яровой пшеницы (сорт Саратовская 29), Azospirillum brasilense штамм Sp7 (коллекция Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН), а также бактериофаг ФЛЬ-Sp7, выделенный нами из того же штамма. A. brasilense Sp7 выращивали на плотной питательной среде LB, затем высевали в жидкую питательную среду LB (19) и культивировали в колбах Эрленмейера (250 мл) LB на круговой качалке с аэрацией (160 об/мин) при 30±1 °С в течение 18-20 ч.

Препараты бактериофагов получали согласно описанию (19). Культуру микроорганизмов охлаждали при +4 °С в течение 1,5-2,0 ч для стимуляции выхода бактериофагов из клеток, после чего клетки отделяли центрифугированием при 2500 g в течение 40 мин. К супернатанту добавляли Vs объема 20 % раствора полиэтиленгликоля (PEG-6000 Panreac, Испания) с 1,6 М NaCl (PEG-NaCl), обкладывали льдом и помещали в холодильник на 2,0 ч для флокуляции частиц. Образцы центрифугировали при 12000 g в течение 30 мин, супернатант удаляли. К осадку добавляли 1 мл ТЕ-буфера (10 мМ Tris-HCl, 1 мМ EDTA, рН 7,5-8,0), тщательно перемешивали и центрифугировали 5 мин при 10000 g. Супернатант отбирали в стерильную посуду, приливали объема PEG-NaCl, образовавшийся осадок быстро взмучивали и центрифугировали 5 мин при 6500 g. Полученный осадок ресуспендировали в 1 мл ТЕ-буфера и хранили при -16 °С).

Титр микробных клеток определяли по величине OD540 на приборе Specol-221 (ГДР) в кювете с длиной оптического пути 1,0 см и пересчитывали на массу сухих клеток (г/л) по предварительно построенным калибровочным кривым. Титр фаговых частиц определяли спектрофотометрически на приборе Specord BS-250 («Analytik Jena», Германия) в кювете 1 мм. Исходили из того, что 30 опт. ед. соответствуют плотности фаговой суспензии 2*1014 частиц/мл (20). Для расчетов титра фаговых частиц использовали следующую формулу: (A269 - Л320) х 5*1014/15.

Семена пшеницы Triticum aestivum L. (Саратовская 29) промывали дистиллированной водой с 1 % бытовым детергентом, обрабатывали 6 % раствором гипохлорита кальция в течение 10 мин и трижды промывали стерильной дистиллированной водой. Для ускорения прорастания семена замачивали в теплой (45 °С) стерильной дистиллированной воде на 1 ч, после чего их раскладывали по 10-12 шт. в стерильные чашки Петри с капроновой подложкой, добавляли 10 мл стерильной дистиллированной во-

316

ды и помещали в термостат при температуре 24 °С на 3 сут.

При оценке влияния A. brasilense Sp7 на проростки бактерии отмывали от среды стерильной дистиллированной водой, используя 3-кратное центрифугирование при 3000 g в течение 5 мин. К 3-суточным проросткам добавляли 20 мл стерильной суспензии A. brasilense Sp7 разной плотности — 108; 106; 104; 102 кл/мл (без внесения бактериофагов) и продолжали их выращивать еще 4 сут при 23 °С (повторность для каждого варианта — 3-кратная). Результаты учитывали на 7-е сут. Контролем служили необработанные проростки, полученные в стерильной дистиллированной воде при аналогичных условиях.

Для изучения воздействия бактериофагов на ростовые процессы использовали препарат ФAb-Sp7, выделенный из клеток A. brasilense Sp7 в разных разведениях. При этом 3-суточные проростки пшеницы помещали в стерильные стеклянные пробирки и обрабатывали корни в течение 3 ч суспензией бактериофага в стерильной воде. Далее проростки раскладывали в стерильные чашки Петри со стерильной водой и оставляли в термостате при температуре 23 °С. Учет результатов проводили на 7-е сут. Контролем служили проростки, не обработанные бактериофагами и выращенные в стерильной дистиллированной воде в аналогичных условиях.

Корневые волоски на 1 мм длины корня подсчитывали с использованием конфокального микроскопа TCS SP5 («Leica Microsystems GmbH», Германия). По 10 корешков окрашивали в течение 5 мин в водном растворе метиленового синего по общепринятой методике, затем промывали водой. Зоны корня измеряли на влажных препаратах с помощью бинокулярного микроскопа МБС-9 (Россия).

При статистической обработке показателей рассчитывали средние арифметические значения и их стандартные ошибки.

Результаты. В ризосфере злакових азоспириллы формируют высокоэффективные микроассоциации, оказывающие стимулирующий эффект на рост и развитие растений, в частности пшеницы (21). Методами световой и электронной микроскопий с использованием флуоресцентных антител и нуклеотидных зондов было установлено, что азоспириллы располагаются в муцигеле на поверхности корней, а также в ряде случав во внутренних слоях паренхимы (21). В доступной специальной литературе мы не нашли сведений о влияния инфицированных и неинфицированных бактериофагами бактерий на ассоциативное взаимодействие с растением, а также об участии самих бактериофагов во взаимодействии почвенных микроорганизмов с растениями. В то же время бактериофаги играют важную роль в качестве фактора, регулирующего численность микробных клеток, и в переносе генетической информации посредством трансдукции (22). Поэтому мы попытались выявить феномен влияния бактериофагов на ассоциативные взаимоотношениях микроорганизм—растение.

Поскольку большинство микроорганизмов лизогенны, сначала изучили влияние клеток A. brasilense Sp7, находящихся в лизогенном состоянии, на линейные ростовые параметры корневой системы у проростков пшеницы Саратовская 29. Было показано, что при обработке проростков суспензиями азоспирилл во всех изученных дозах не происходило значительных изменений среднего числа корней на проросток (табл. 1). Тем не менее, изменялась морфология корневой системы: при обработке проростков суспензиями с высокой плотностью клеток (108, 106, 104 кл/мл) уменьшалась длина корней (рис. 1), в то же время число боковых корней значительно изменялось только при плотности суспензии 102 кл/мл (см. табл. 1).

317

Последнее может свидетельствовать об усилении формирования корневой системы, что согласуется с данными литературы о стимулирующем эффекте азоспирилл на растения пшеницы (23, 24).

1. Морфометрические показатели корневой системы у проростков яровой пшеницы

Вариант Число корней на проросток, шт. Длина корней, см Число боковых корней, шт.

максимальная | минимальная

I 5,2±0,2 8,3±0,1 2,9±0,2 3,4±0,2

II 4,8±0,2 4,3±0,3 1,0±0,2 3,0±0,2

III 4,9±0,1 4,2±0,3 1,0±0,1 3,0±0,2

IV 4,8±0,2 6,8±0,2 1,9±0,2 2,6±0,4

V 4,9±0,2 7,6±0,2 2,1±0,2 4,1±0,1

Примечание. I — контроль (без инокуляции); II-V — инокуляция суспензией A. brasilense Sp7 (20 мл, плотность соответственно 108 кл/мл, 106 кл/мл, 104 кл/мл и 102 кл/мл). Представлены средние арифметические величины и стандартные отклонения (ошибки) для 286 проростков в каждом варианте.

А Б

В Г

Рис. 1. Изменение морфологии корневой системы у 7-суточных проростков яровой пшеницы (Tnticum aestivum L.) сорта Саратовская 29 после инокуляции Azospirillum brasilense Sp7: А, Б, В и Г — плотность суспензии при инокуляции соответственно 108 кл/мл, 106 кл/мл, 104 кл/мл и 102 кл/мл (объем — 20 мл). В верхних рядах — контроли (без инокуляции), в нижних — инокулированные образцы (лабораторный опыт).

2. Морфометрические показатели корневой системы у проростков яровой пшеницы

Вариант Число корней на проросток, шт. Длина корней, см Число боковых корней, шт.

максимальная максимальная

I 4,7±0,2 8,3±0,3 2,9±0,2 4,0±0,2

II 5,1±0,1 6,5±0,1 1,6±0,2 4,2±0,2

III 5,0±0,1 7,6±0,2 2,1±0,3 5,5±0,2

Примечание. I — контроль (без инокуляции); II и III — инокуляция (20 мл суспензии бактериофага с титром соответственно 108 частиц/мл и 106 частиц/мл). Представлены средние арифметические величины и стандартные отклонения (ошибки) для 264 проростков в каждом варианте.

318

Некоторые свойства бактериофага ФАЬ^р7, выделенного из клеток A. brasilense Sp7, описаны ранее (18). В наших исследованиях среднее число корней после обработки проростков пшеницы препаратом бактериофага практически не изменялось (табл. 2). С увеличением плотности суспензии бактериофага уменьшалась максимальная и минимальная длина корня. Число боковых корней увеличивалось только при использовании суспензии с плотностью 106 фаговых частиц на 1 мл.

Одновременная инокуляция проростков пшеницы суспензией азос-пирил и фаговых частиц приводила к незначительному увеличению среднего числа корней, а также к уменьшению максимальной длины корня в

1.5 раза, минимальной — в 1,8 раза и увеличению числа боковых корней в

1.5 раза (табл. 3).

3. Морфометрические показатели корневой системы у проростков яровой пшеницы

Вариант Число корней на проросток, шт. Длина корней, см Число боковых корней, шт.

максимальная |максимальная

I 4,8±0,2 8,3±0,3 2,9±0,2 4,0±0,2

II 4,9±0,2 7,6±0,2 2,1±0,2 4,1±0,1

III 5,2±0,3 7,9±0,4 1,7±0,3 6,1±0,4

IV 5,0±0,1 7,6±0,2 2,1±0,3 5,5±0,2

Примечание. I — контроль (без инокуляции); II — инокуляция A. brasilense Sp7 (102 кл/мл, 20 мл); III — совместная инокуляция A. brasilense Sp7 (102 кл/мл) и бактериофагом ФAb-Sp7 (титр 106 час-тиц/мл) (20 мл); IV — инокуляция бактериофагом ФAb-Sp7 (титр 106 частиц/мл, 20 мл). Представлены средние арифметические величины и стандартные отклонения (ошибки) для 264 проростков в каждом варианте.

При инокуляции проростков суспензией азоспирилл зона растяжения корня уменьшался в 3,0 раза, зоны всасывания — в 1,5 раза (табл. 4). При обработке суспензией азоспирилл, в которую был добавлен бактериофаг, зона растяжения сокращалась в 3,3 раза, зоны корневых волосков — в 1,5 раза.

4. Размер зон и развитие корней и корневых волосков у проростков яровой пшеницы

Вариант Размер зоны, сма Общая длина корней, см Корневых волосков на 1 мм, шт.

растяжения корня | корневых волосков

I 0,38±0,2 9,3±0,2 9,69 55,0

II 0,11±0,1 6,1±0,2 6,17 70,9

III 0,12±0,2 6,3±0,3 6,38 63,1

IV 0,18±0,1 8,0±0,4 8,18 55,6

Примечание. I — контроль (без инокуляции); II — совместная инокуляция A. brasilense Sp7 (108 кл/мл) и бактериофагом ФAb-Sp7 (титр 1011 частиц/мл) (20 мл); III — инокуляция A. brasilense Sp7 (108 кл/мл, 20 мл); IV — инокуляция бактериофагом ФAb-Sp7 (1011 частиц/мл, 20 мл); а — представлены средние арифметические величины и стандартные отклонения (ошибки) для 40 корней в каждом варианте.

При инкубации проростков пшеницы в присутствии клеток азоспириллы наблюдали увеличение числа корневых волосков (в среднем на 15 % по сравнению с контролем), в присутствии бактериофага ФAb-Sp7 значительных изменений этого показателя не отмечали (вклейка, рис. 2, см. табл. 4). При одновременной инокуляции проростков бактериофагами ФAb-Sp7 и азоспириллами штамма Sp7 происходило значительное (на 29 %) увеличение числа корневых волосков при отсутствии существенных отклонений в образовании боковых корней.

В целом после инокуляции азрспириллой A. brasilense Sp7, находя-

319

щейся в лизогенном состоянии, препаратом бактериофага ФАЬ^р7 и при их сочетании общая длина корня, число боковых корней, размеры зон корня, число и длина корневых волосков изменялись в той или иной степени, при этом значительно — в варианте с одновременной инокуляцией.

Накопленная к настоящему времени информация свидетельствует о положительном эффекте инокуляции корневой системы растений пшеницы азотфиксирующими бактериями рода Azospirillum, однако механизмы такого воздействия пока неизвестны. Например, отсутствуют какие-либо данные о том, инфицированы или неинфицированы клетки азоспирилл бактериофагами и как лизогенное состояние бактерий влияет на ассоциативное взаимодействие с растением. Несмотря на длительную историю использования бактериофагов, они крайне слабо изучены у почвенных микроорганизмов, особенно это касается их участия в ассоциации микроорганизмов с растениями. Возможно, эффект бактериофагов связан с их функций регуляторов численности и состояния популяции ассоциативных почвенных бактерий. Тем самым, они способны определять взаимодействие с корневой системой растений и, в конечном счете, их продуктивность, что может быть одним из направлений повышения продуктивности микробно-растительных систем.

Итак, образование симбиозов с корневой системой злаковых растений приводит к повышению продуктивности последних. Особое внимание привлекает исследование роли бактериофагов в изучении ассоциативных взаимодействий клеток азоспирилл с растениями. В работе на примере модельного штамма A. brasilense Sp7 и бактериофага ФAb-Sp7, выделенного из этого же штамма, а также проростков пшеницы, исследовано влияние бактериофагов азоспирилл на изменение морфологии корней пшеницы. Показаны изменения общей длины корня, числа боковых корней, размер зон корня, числа и длины корневых волосков, происходящие в корневой системе проростков пшеницы после инокуляции как клетками A. brasilense Sp7, находящихся в лизогенном состоянии, так и бактериофагом ФAb-Sp7, а также при одновременной инокуляции клетками азоспирилл и бактериофагом. Установлено, что значительные изменения в корневой системе проростках пшеницы зафиксированы после одновременной инокуляции клетками азоспирилл и бактериофагами. На основании полученных данных высказано предположение, что бактериофаги азоспирилл относятся к числу участников сложного процесса взаимодействия бактерий с корневой системой пшеницы и могут влиять на эффективность ассоциативных взаимоотношений растение—микроорганизм и, в конечном счете, определять эту эффективность.

ЛИТЕРАТУРА

1. Волкогон В.В., Мамчур А.Е., Лемешко С.В., Миняйло В.Г. Азоспириллы — эндофиты семян злаковых растений. Микробиологический журнал, 1995, 57(1): 14-19.

2. D о bereiner J., Pedrosa F.O. Nitrogen-fixing bacteria in non leguminous crop plants. Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, NY, 1987.

3. Schloter M., Kirchhof G., Heinzmann U. Immunological studies of the wheat-root-colonization by the Azospirillum brasilense strains Sp7 and Sp245 using strain-specific monoclonal antibodies. In: Nitrogen fixation with non-legumes. Cairo, American University of Cairo press, 1994: 291-297.

4. Assmus B., Hutzler P., Kirchhof G., Amann R., Lawrence J.R., Hartmann A. In situ localization of Azospiiillum brasilense in the rhizosphere of wheat with fluorescently labeled, rRNA-targeted oligonucleotide probes and scanning confocal laser microscopy. Appl. Environ. Microbiol., 1995, 61(3): 1013-1019.

5. Bashan Y. Azospirillum plant growth-promoting strains are nonpathogenic on tomato, pep-

320

per, cotton, and wheat. Can. J. Microbiol., 1998, 44: 168-174 (doi: 10.1139/w97-136).

6. Bashan Y., Holguin G. AzospiiiHum-plant relationships: environmental and physiological advances (1990-1996). Can. J. Microbiol., 1997, 43: 103-121 (doi: 10.1139/m97-015).

7. Bashan Y., Holguin G., de-Bashan L.E. AzospiiiHum-plant relationships: physiological, molecular, agricultural, and environmental advances (1997-2003). Canad. J. Microbiol., 2004, 50: 521-577 (doi: 10.1139/w04-035).

8. Thirunavukkarasu N., Mishra M.N., Spaepen S., Vanderleyden J. Gross C.A., Tripathi A.K. An extra-cytoplasmic function sigma factor and anti-sigma factor control carotenoid biosynthesis in Azospirillum brasilense. Microbiology, 2008, 154: 2096-2105 (doi: 10.1099/mic.0.2008/016428-0).

9. Hartmann A., Baldani J.I., Kirchhof G. et al. Taxonomic and ecological studies of diazotrophic rhizosphere bacteria using phylogenetic probes. In: Azospiiillum VI and related microorganisms: genetics, physiology, ecology (Series G: Ecological Sciences, V. 37). Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, NY, 1995: 415-427.

10. Bacteriophages: Methods and protocols. Volume 1: Isolation, characterization, and interaction /A.M. Kropinski, M.R.J. Clokie (eds.). Humana Press, NY, 2009 (doi: 10.1007/978-1-60327-164-6).

11. Dwivedi B., Schmieder R., Goldsmith D.B., Edwards R.A., Breitbart M. PhiSiGns: an online tool to identify signature genes in phages and design PCR primers for examining phage diversity. BMC Bioinformatics, 2012, 13: 37 (doi: 10.1186/1471-2105-13-37).

12. Ashelford K.E., Norris S.J., Fry J.C., Bailey M.J., Day M.J. Seasonal population dynamics and interactions of competing bacteriophages and their host in the rhizosphere. Appl. Environ. Microbiol., 2000, 66(10): 4193-4199 (doi: 10.1128/AEM.66.10.4193-4199.2000).

13. Williamson K.E., Wommack K.E., Radosevich M. Sampling natural viral communities from soil for culture-independent analyses. Appl. Environ. Microbiol., 2003, 69: 6628-6633 (doi: 10.1128/AEM.69.11.6628-6633.2003).

14. Williamson K.E., Radosevich M., Wommack K.E. Abundance and diversity of viruses in six Delaware soils. Appl. Environ. Microbiol., 2005, 71: 3119-3125 (doi: 10.1128/AEM.71.6.3119-3125.2005).

15. Helton R.R., Liu L., Wommack K.E. Assessment of factors influencing direct enumeration of viruses within estuarine sediments. Appl. Environ. Microbiol., 2006, 72(7): 4767-4774 (doi: 10.1128/AEM.00297-06).

16. Srinivasiah S., Bhavsar J., Thapar K., Liles M., Schoenfeld T., Wommack K.E. Phages across the biosphere: contrasts of viruses in soil and aquatic environments. Res. Microbiol., 2008, 159(5): 349-357 (doi: 10.1016/j.resmic.2008.04.010).

17. Romero-Suarez S., Jordan B., Heinemann J.A. Isolation and characterization of bacteriophages infecting Xanthomonas arboricola pv. juglandis, the causal agent of walnut blight disease. World J. Microbiol. Biotechnol., 2012, 28(5): 1917-1927 (doi: 10.1007/s11274-011-0992-z).

18. Boyer M., Haurat J., Samain S., Segurens B., Gavory F., Gonzalez V., Mavingui P., Rohr R., Bally R., Wisniewski-Dy e F. Bacteriophage prevalence in the genus Azospirillum and analyses of the first genome sequence of an Azospirillum brasilense integrative phage. Appl. Environ. Microbiol., 2008, 74(3): 861-874 (doi: 10.1128/AEM.02099-07).

19. Maniatis Т., Frisch E.F., Sambrook J. Molecular doning: а laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982.

20. Smith G.P., Scott J.K. Libraries of peptides and proteins displayed on filamentous phage. Meth. Enzymol., 1993, 217: 228-257.

21. Копылов Е.П. Селекция эффективных штаммов диазотрофов для инокуляции яровой пшеницы. Микробиология и биотехнология, 2007, 1: 67-73.

22. Шестаков С.В. Как происходит и чем лимитируется горизонтальный перенос генов у бактерий. Экологическая генетика, 2007, 5(2): 12-24.

23. Антонюк Л.П., Игнатов В.В. Почвенные ассоциативные симбиозы бактерий и злаков: от фундаментальных исследований к практическому использованию. В сб.: Фундаментальные и прикладные исследования саратовских ученых для процветания России и Саратовской губернии. Саратов, 1999: 153-155.

24. Волкогон В.В. Ассоциативные азотфиксирующие микроорганизмы. Мжробюлопчний журнал, 2000, 62(2): 51-68.

1ФГБНУ Институт биохимии и физиологии Поступила в редакцию

растений и микроорганизмов РАН, 30 марта 2015 года

410049 Россия, г. Саратов, пр. Энтузиастов, 13, e-mail: guliy_olga@mail.ru;

2ФГБОУ ВПО Саратовский государственный аграрный университет им. НИ Вавилова,

410012 Россия, г. Саратов, Театральная пл., 1;

3Саратовский научно-исследовательский

321

ветеринарный институт РАН,

410028 Россия, г. Саратов, ул. 53-й Стрелковой дивизии, 6

Sel’skokhozyaistvennaya biologiya [Agricultural Biology], 2015, V. 50, № 3, pp. 315-322

CHANGES IN THE MORPHOLOGY OF THE ROOT SYSTEM OF WHEAT INOCULATED WITH Azospirillum brasilense Sp7 AND BACTERIOPHAGE FAb-Sp7

O.I Gulii1 2 3, M.K. Sokolova1, O.I Sokolov1, O. V Ignatov1

institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Russian Academy of Sciences, 13, Prospekt Entuziastov, Saratov, 410049 Russia. e-mail guMy_olga@mail.ru;

2N.I. Vavilov Saratov State Agrarian University, 1, Teatralnaya Ploshchad’, Saratov, 410012 Russia;

3Saratov Veterinary Research Institute, Russian Academy of Sciences, 6, Ulitsa 53-i Strelkovoi Divizii, Saratov, 410028 Russia

Received March 30, 2015 doi: 10.15389/agrobiology.2015.3.315eng

Abstract

The Azospirillum is one of the most common objects to study associative interactions between bacteria and plants. In the rhizosphere of cereals the Azospirillum cells form effective association and demonstrate a stimulating effect on plant growth and development, in particular in wheat. However, the details of these positive effects are still unknown. For example, there is no evidence of whether the Azospirillum cells are infected with bacteriophages, and little is known about the role that the bacteriohages of soil microorganisms can play in the development of associative relationship between microorganisms and plants. Nevertheless, the bacteriophages are well known to control the bacteria number in the population and be involved in genetic transduction. Note that the studied bacteriophages are mostly isolated from environment, in particular, from soil, while the bacteriphages of associative soil bacteria still remain poorly studied. To evaluated changes in the morphology of the wheat (Triticum aestivum L.) root system in Saratovskaya 29 variety after inoculation with Azospirillum brasilense Sp7 bacterial cells and bacteriophage FAb-Sp7, isolated from these cells, we first inoculated the 3-day old wheat seedlings with A. brasilense Sp7 at 108, 106, 104 cells per 1 ml. It resulted in a decrease in the length of the root, and the number of lateral roots grew considerably at 102 cells per 1 ml. After treatment wiht bacteriophage FAb-Sp7 an average number of roots remained unchanged. It was shown that wheat seedling inoculation with Azospirillum suspension resulted in a 3-fold decrease in root elongation zone, and the suction zone reduced 1.5 times. Treatment of wheat seedlings with a suspension containing Azospirillum and phages resulted in a 3.3-fold decrease in the tensile zone, but the root hair zone remained unchanged. Using confocal microscopy we demonstrated that incubation of wheat seedlings with Azospirillum at 102 cells per 1 ml significantly increased the number and length of root hairs (on average by 40 %) compared with the control. It was shown that a simultaneous inoculation with Azospirillum Sp7 cells and bacteriophage FAb-Sp7 also increased the number and length of root hairs (60 % on average) compared with control. It is suggested that bacteriophages of Azospirillum are involved into complex interaction of bacteria with wheat root system, and can influence on and, ultimately, determine the effectiveness of associative relationships between the plant and microorganisms.

Keywords: Azospirillum brasilense, bacteriophages, wheat, root system.

Научные собрания

9-й МЕЖДУНАРОДНЫЙ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ФОРУМ-ВЫСТАВКА

РосБиоТех-2015

(28-30 октября 2015 года, г. Москва,

ЦВК «Экспоцентр», павильон 8, выставочный зал 4)

ИНФОРМАЦИОННЫЙ ПАРТНЕР

ЯАТнло-птеизвпиствеи^Рый кптяр

Журнал

Фармацевтическая

1ромьнш1енно<те>

доотюй

ЭКОШ'ИШКИЙ

ЖШ1А..1

-iPocFlром Портал

Контакты и информация: http://www.rosbiotech.com, info@rosbiotech.com

322

Гулий О.И., Соколова М.К., Соколов О.И. и др. Изменение морфологии корневой системы пшеницы при инокуляции Azospirillum biasilense Sp7 и бактериофагом ФАЬ-Sp?

А

В

Б

Рис. 2. Участок корешка 7-суточных проростков яровой пшеницы (Tiiticum aestivum L.) сорта Саратовская 29 при инокуляции Azospiiiilum biasilense Sp7 и бактериофагом ФЛЪ-8р7, выделенным из этого штамма: А — контроль (без инокуляции); Б — инокуляция A. biasilense Sp7 (рост числа корневых волосков); В — инокуляция ФАЪ^р7; Г — совместная инокуляция A biasilense Sp7 и ФАЪ^р7 (значительный рост числа корневых волосков). Конфокальная микроскопия (TCS SP5, «Leica Microsystems», Германия). Окрашивание метиленовым синим, увеличение *360.

Вишнякова М.А., Семенова Е.В., Косарева И.А. и др. Метод экспресс-оценки алюмотолерантности у гороха посевного

1 2 3 4 5 6

Рис. 3. Внешний вид растений гороха посевного (Pisum sativum L.) при экспресс-оценке алюмотолерантности (3 мг Al/л) методом окрашивания корней эриохромцианином R: 1 —

к-2759, 2 — к-3654, 3 — к-3283 (чувствительные к алюминию); 4 — к-4376, 5 — к-9504, 6 — к-7307 (устойчивые к алюминию). Представлены образцы из коллекции Всероссийского НИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова (коллекция ВИР).