СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ FAB ФРАГМЕНТОВ ИЗ ЕДИНИЧНЫХ КЛЕТОК, ПРОДУЦИРУЮЩИХ АНТИТЕЛА, ПУТЕМ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР В КОМБИНАЦИИ С TAQMAN ЗОНДАМИ

1. Способ амплификации и количественного определения полученных из единичной клетки нуклеиновых кислот, кодирующих родственные IgG тяжелые и легкие цепи, включающий следующий этап:
- выполнение обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в одну стадию с использованием первого и второго 5'-праймера, первого и второго 3'-праймера, а также первого и второго TaqMan зонда.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что:
а) первый 5'-праймер комплементарен нуклеотидной последовательности, кодирующей лидерный пептид тяжелой цепи или первую каркасную область тяжелой цепи, и/или
б) второй 5'-праймер комплементарен нуклеотидной последовательности, кодирующей лидерный пептид легкой цепи или первую каркасную область легкой цепи, и/или
в) первый 3'-праймер комплементарен нуклеотидной последовательности, кодирующей С-концевые аминокислотные остатки константного домена СН1 тяжелой цепи, и/или
г) второй 3'-праймер комплементарен нуклеотидной последовательности, кодирующей С-концевые аминокислотные остатки константного домена легкой цепи, и/или
д) первый TaqMan зонд комплементарен нуклеотидной последовательности, кодирующей N-концевые аминокислотные остатки константного домена СН1 тяжелой цепи, и/или
е) второй TaqMan зонд комплементарен нуклеотидной последовательности, кодирующей N-концевые аминокислотные остатки константного домена легкой цепи.
3. Способ получения моноклонального антитела, включающий следующий
этап:
- трансляцию in vitro нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент иммуноглобулина, причем указанная нуклеиновая кислота получена путем специфической амплификации фрагментов кДНК, которые получены из мРНК, выделенной из одной клетки, продуцирующей
молекулы иммуноглобулина, при помощи способа по любому из п.п. 1 или 2.
4. Способ по п. 3, дополнительно включающий следующий этап:
- последующую транскрипцию ПЦР продукта в мРНК и трансляцию этих мРНК in vitro с использованием лизата Е. coli.
5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что в праймере предусмотрены липкие концы, кодирующие трансляционный старт-кодон ATG в случае 5'-праймера и/или трансляционный стол-кодон ТТА в случае 3'-праймера.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что он включает дополнительный
этап:
- обеспечение единичной клетки и выделение из нее мРНК.
7. Способ получения Fab фрагмента иммуноглобулина, включающий следующие этапы:
- обеспечение единичной клетки, продуцирующей иммуноглобулин,
н
- выделение из этой клетки нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельные домены легких и тяжелых иммуноглобулиновых цепей, а также необязательно кодирующей часть константного домена легкой цепи и часть домена С1 тяжелой цепи, для амплификации и количественного определения нуклеиновых кислот, кодирующих родственные IgG тяжелые и легкие цепи, с помощью мультиплексной ген-специфической полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени в одной пробирке согласно любому из пп. 1 или 2,
- производство матрицы линейной экспрессии, содержащей полученную нуклеиновую кислоту,
- трансляцию нуклеиновой кислоты in vitro и получение посредством этой трансляции Fab фрагмента иммуноглобулина.
8. Способ получения иммуноглобулина, включающий следующие этапы:
- обеспечение единичной клетки, продуцирующей иммуноглобулин,
- выделение из этой клетки нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельные домены легких и тяжелых иммуноглобулиновых цепей, для амплификации и количественного определения нуклеиновых кислот, кодирующих родственные IgG тяжелые и легкие цепи, с помощью мультиплексной ген-специфической полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени в одной пробирке согласно любому из пп. 1 или 2,
- функциональное связывание каждой из нуклеиновых кислот, полученных на предыдущем этапе с нуклеиновой кислотой, кодирующей аминокислотные остатки некодируемого С-концевого константного домена соответствующей легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина,
- трансфекцию эукариотической или прокариотической клетки нуклеиновыми кислотами, полученными на предыдущем этапе, культивирование трансфицированной клетки в условиях, пригодных для экспрессии иммуноглобулина,
- выделение иммуноглобулина из клетки или культуральной среды и получение иммуноглобулина посредством этого выделения.
9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что иммуноглобулин представляет собой иммуноглобулин класса G (IgG).
10. Способ по п. 1, 3, 7 или 8, отличающийся тем, что единичная клетка представляет собой единичную В-клетку или единичный плазмабласт или единичную плазматическую клеткуI.
11. Нуклеиновая кислота, имеющая следующие нуклеотидные последовательности: SEQ ID NO:05 или SEQ ID ΝΟ:06, или SEQ ID NO:07, или SEQ ID NO:08, или SEQ ID NO:09, или SEQ ID NO:10.
12. Набор, включающий нуклеиновые кислоты со следующими нуклеотидными последовательностями: SEQ ID NO:05, SEQ ID NO:06, SEQ ID NO:07, SEQ ID NO:08, SEQ ID NO:09, и SEQ ID NO:10.