СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИОФИЛИЗИРОВАННОГО ПРОТИВОВИРУСНОГО СРЕДСТВА
METHOD FOR PREPARING LYOPHILISED ANTIVIRAL AGENT

Заявляемое изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, в частности к способам получения лекарственных препаратов в виде лиофилизата, обладающих противовирусным действием.
Из уровня техники известно значительное количество противовирусных препаратов, таких как арбидол, амиксин (тилорон), рибавирин, ацикловир и другие, большинство из которых выпускается в виде твердых лекарственных форм, а именно таблеток и капсул (см., например, Машковский М.Д. Лекарственные средства. - 15-е изд. М.: ООО «Новая волна». - 2006 г.).
В настоящее время наибольшее распространение и применение получили лекарственные препараты, выполненные в виде желатиновых капсул, состоящих из частично или полностью прозрачной мягкой оболочки, внутренний объем которой заполнен гранулами или порошком полезного агента - лекарственного вещества, при этом гранулы высвобождают лекарственное вещество немедленно или постепенно. Известные препараты применяют для лечения кашля, простуды и/или аллергических симптомов (см., например, заявка на изобретение №96102843 «Частицы, заключенные в мягкие желатиновые капсулы», дата подачи 09.02.1996 г., дата публикации 20.05.1998 г.).
К недостаткам желатиновых капсул можно отнести, прежде всего, высокую чувствительность к влаге, поэтому для сохранения лекарственного препарата необходимо соблюдение определенных условий. Кроме того, желатиновые капсулы являются благоприятной средой для размножения микроорганизмов, для предотвращения воздействия которых в состав лекарственного препарата необходимо добавлять консерванты, такие как нипагин, сорбиновая кислота и другие (см., например, Чуешов В.И., Чернов М.Ю. Промышленная технология лекарств. - X.: МТК-Книга, 2002, - т.2.; Никитин Е.Е., Звягин И.В. Замораживание и высушивание биологических препаратов. М.: Колос, 1971. - 270 с.).
На основании этого для лекарственных препаратов, содержащих пептидные молекулы, капсулирование не применяют. Для пептидных препаратов, в основном, используют лиофильное высушивание.
Лиофилизация - способ мягкой сушки веществ, при котором высушиваемый препарат замораживают, а потом помещают в вакуумную камеру, в которой происходит возгонка растворителя.
Преимуществами такого способа высушивания являются: отсутствие воздействия на препарат высоких температур, сохранение дисперсной фазы препарата, возможность использования летучих растворителей.
Метод лиофилизации позволяет получать сухие ткани, препараты, продукты и тому подобное без потери их структурной целостности и биологической активности. При лиофилизации большинство белков не подвергается денатурации и может длительно сохраняться при умеренном охлаждении (около 0°С).
Лиофилизированные ткани и препараты при увлажнении восстанавливают свои первоначальные свойства (см. Дэвени Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды и белки. - М.: Мир, 1976. - 364 с.; Белоус A.M., Цветков Ц.Д. Научные основы технологии сублимационного консервирования. - Киев: Наук. думка, 1985. - 208 с.; Mackenzie A.P. Collaps during freeze-drying - qualitative and quantitative aspects. Freeze-during and advanced food technology / Eds. S.A.Goldbith, L.Rey, Rothmayr. - London: Academic Press. - P.277-308).
Наиболее близким техническим к заявляемому способу получения лиофилизированного лекарственного средства является способ, включающий растворение 1 вес.ч. Cetrorelix-ацетата в 30-15 вес.ч. уксусной кислоты, перевод его в воду и смешение полученного таким образом раствора с одним или несколькими структурирующими веществами, стерилизацию и лиофилизацию (см. патент РФ на изобретение №2145234 «Лиофилизат на основе пептида и способ его получения», дата подачи 18.02.1994 г., опубликовано 10.02.2000 г.).
Техническим результатом, на который направлено заявляемое изобретение, является оптимизация процесса, позволяющего получать лиофилизированное противовирусное средство широкого действия, в том числе для лечения заболеваний, вызываемых вирусами герпеса, папилломы человека, иммунодефицитными состояниями, характеризуемыми частыми рецидивами или хроническим течением вирусных инфекций, для профилактики онкологических заболеваний вирусной этиологии и состояний, вызванных радиационными, физическими и химическими воздействиями, а также соответствие его показателям фармакопейной статье предприятия.
Указанный результат достигается тем, что в способе получения лиофилизированного противовирусного средства, состоящем из растворения пептида в воде, смешения полученного раствора с несколькими структурирующими веществами, стерилизации и лиофилизации, включающей вымораживание и высушивание, согласно изобретению стерилизацию осуществляют путем двойной фильтрации, лиофилизацию проводят в лиофилизаторе Usifroid, после вымораживания, скорость которого составляет 2°С/мин, осуществляют сублимацию раствора, при этом в качестве пептида используют пептид His-Gly-Val-Ser-Gly-Trp-Gly-Gln-His-Gly-Thr-His-Gly, при смешении раствора дополнительно вводят стабилизирующий компонент в виде аспарагиновой и/или глутаминовой кислоты, а в качестве структурирующих веществ используют манит, аланин и/или глицин при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Пептид His-Gly-Val-Ser-Gly-Trp-Gly-Gln-His-Gly-Thr-His-Gly
0,19-6,6
Маннит
66,0-92,0
Аланин и/или глицин
3,6-13,0
Аспарагиновая кислота и/или Глутаминовая кислота
3,6-13,0.
Лиофилизированное противовирусное лекарственное средство, полученное заявляемым способом, применяют для лечения заболеваний, вызываемых вирусами герпеса, папилломы человека, иммунодефицитными состояниями, характеризуемыми частыми рецидивами или хроническим течением вирусных инфекций, а также для профилактики онкологических заболеваний вирусной этиологии.
Кроме того, возможно клиническое использование лекарственного средства при лечении состояний, вызванных радиационными, физическими и химическими воздействиями.
Технических решений, совпадающих с совокупностью существенных признаков заявляемого изобретения, не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности как «новизна».
Заявляемые существенные признаки, предопределяющие получение указанного технического результата, явным образом не следуют из уровня техники, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности как «изобретательский уровень».
Условие патентоспособности «промышленная применимость» подтверждено на примере конкретного применения.
Пример конкретного способа выполнения.
Были использованы компоненты при следующем соотношении: пептид His-Gly-Val-Ser-Gly-Trp-Gly-Gln-His-Gly-Thr-His-Gly в количестве 0,01-10 мг; в качестве структурообразующих веществ - маннит в 5-100 мг и/или аланин - 0,2- 20 мг (гидрофобное, разветвленная структура); для повышения стабильности в композицию вводят аспарагиновую кислоту в количестве 0,2-20 мг, которая нейтрализует сильно основной (положительный) заряд, повышает стабильность и уменьшает распадаемость средства.
В стеклянную колбу, вместимостью 2 л, помещают примерно 1,5 л воды для инъекций. На электронных весах взвешивают 1 мг пептида и растворяют его в колбе с водой для инъекций. Затем взвешивают 42 мг маннита, 2 мг аланина, 2 мг аспарагиновой кислоты. Переносят в колбу с водой для инъекций, все тщательно перешивают.
3
рН готового раствора 5,9-6,4; плотность: 1,007-1,012 г/см при 20°С.
Стерилизацию раствора осуществляют путем двойной стерилизующей фильтрации через мембранные фильтры при асептических условиях, при этом размер пор фильтров равен 0,22 мкм. 100 мл первого погона отбрасывают. Фильтры стерилизуют с помощью водяного пара. Раствор после приготовления сразу же дозированно вносят в ампулы (флаконы) для инъекции. Применяют ампулы бесцветные, гидролитического класса 1, при асептических условиях, предварительно простерилизованные. Наполненные ампулы для инъекций переносят в установку для лиофильного высушивания и сушат при заданной температуре. Процесс лиофилизации растворов, адаптированный к объему лиофилизата и емкости состоит из следующих этапов: раствор проходит цикл вымораживания, затем сублимации и высушивания. Лиофилизацию осуществляют в лиофилизаторе Usifroid (Франция) типа SMH 15, SMJ 100 или SMH 2000, при этом скорость вымораживания предпочтительно выбирают близкой к - 2°С в минуту. Высушивание осуществляют с помощью программы высушивания при температуре плиты, повышающейся от -40°С до +20°С. Затем установку заполняют стерильным азотом, ампулы запаивают (флаконы в установке закрывают и пробки снабжают клапаном с бортиком). Проводят визуальный контроль на наружные дефекты первичной упаковки, контроль на механические включения и прозрачность проводят с применением растворения образца. Ампулы для инъекций с дефектами отделяют и уничтожают.
Готовое средство представляет собой белый порошок или пористую массу. Условия хранения полученного лиофилизата предполагают хранение в сухом, защищенном от света и недоступном для детей месте при температуре 2-8°С.
Все компоненты, входящие в состав противовирусного средства, разрешены к применению в медицинской практике и выпускаются в соответствии с требованиями, предъявляемыми Государственной фармакопеей.
На основании экспериментальных данных и в соответствии с требованиями ГФ XI в ФСП введена норма для теста «Однородность дозирования».
Исходя из того, что в ампуле находится крайне малое количество материала, определение средней массы средства путем взвешивания является невозможным.
В соответствии с Государственной фармакопеей XI, выпуск 2, с.143 в этом случае проводят испытание на однородность дозирования. Испытанию подвергают содержимое 10 сосудов порознь. Содержание средства в каждом сосуде не должно отличаться от номинального более чем на ±15%. Если в одном сосуде отклонение превышает ±15%, но не выходит за пределы 75-125%, проводят дополнительное испытание содержимого еще 20 сосудов. В таком случае в каждом из 20 сосудов отклонение содержания средства от номинального не должно превышать ±15%.
Кроме того, введена норма для теста «Пирогенность».
Испытания на пирогенность проводят в соответствии с требованиями Государственной фармакопеи XI, выпуск 2, с.183-185. Для проведения испытаний раствор подогревают до 37°С и асептически медленно в течение 30 секунд вводят в ушную вену трем кроликам в дозе 1 мг/кг (0,1 мл/кг).
Температуру измеряют до начала исследования и три раза с промежутками в 1 час после введения. Измерения температуры проводят с помощью электрического медицинского термометра ТПЭМ-1 или аналогичного (допустимая основная погрешность от диапазона измеряемых температур, ±1%). При внутривенном введении установленной тест-дозы средство должно выдерживать требования Государственной фармакопеи XI, вып.2.
Тест на «Стабильность».
Срок годности препарата устанавливается экспериментально согласно требованиям ОСТ 42-2-72 «Лекарственные средства. Порядок установления сроков годности» в течение 3-4 лет. При выборе температуры хранения и степени освещенности места хранения исходили из физико-химических свойств активного вещества (термо- и фотолабильность). Средство хранили при температуре не выше -10°С в сухом защищенном от света месте (условия морозильной камеры) в течение 2,5 лет. По истечении срока хранения все показатели соответствовали фармакопейной статье предприятия.
В заявляемом изобретении активное вещество, обладающее противовирусной активностью, представляет собой синтетический линейный олигополипептид, состоящий из 13 L-аминокислот (Тридекапептид состава His-Gly-Val-Ser-Gly-Trp-Gly-Gln-His-Gly-Thr-His-Gly) - далее «пептид». Пептид является активатором системы интерферона и системы естественных киллеров - ключевых звеньев иммунной систем.
Проведенные экспериментальные доклинические исследования, объектами которых являлись мыши, крысы, собаки показали, что получаемое описанным способом лекарственное средство:
- не обладает общей токсичностью (острой, субхронической и хронической);
- не обладает аллергенными свойствами, выявляемыми в реакциях гиперчувствительности замедленного типа, дегрануляции тучных клеток, иммунных комплексов и конъюнктивальных пробах;
- не влияет на репродуктивную функцию, в частности, крыс при подкожном введении.
В отношении упомянутых показателей были проведены доклинические исследования и получены следующие результаты.
1. Результаты исследования острой токсичности.
Для определения показателей острой токсичности «Композиция» у мышей и крыс использовались группы по 5 животных, которые сравнивались с контрольными группами (аналогичными по численности). Животные распределялись по группам случайным образом. В качестве критерия приемлемости рандомизации считали отсутствие внешних признаков заболеваний и гомогенность групп по массе тела (±20%).
Полученное заявляемым способом лекарственное средство вводили белым крысам и мышам обоего пола подкожно (п/к) и перорально (внутрижелудочно через зонд) в возрастающих дозах по Литчфилду-Уилкоксону. Для достижения больших доз композиции средство вводили животным повторно с временными интервалами, равными 30 минутам, в течение 2-3 часов (до 6 повторных введений). Контрольным животным вводились аналогичные максимальные объемы изотонического раствора хлорида натрия (по 6 введений).
Наблюдения за животными, во время которых регистрировали клинические симптомы интоксикации, показатели общего состояния проводили в течение 14 дней. Через 14 дней животные всех экспериментальных групп были подвергнуты эвтаназии (передозировкой эфира) и подвергнуты патоморфологическому исследованию.
Ни в одном из случаев летальных эффектов достичь не удалось даже при введении максимально возможных технически доз - 1000 мг/кг при п/к и в/ж введениях. Доза 1000 мг/кг в 20 тысяч раз превышает дозы, применяемые для человека.
Никаких клинических проявлений действия противовирусного средства не наблюдалось. Введение полученного в результате осуществления способа состава не вызывало макроскопических изменений головного мозга, внутренних и эндокринных органов, отека внутренних органов и др. Во все дни наблюдения по общему состоянию и поведению опытные животные не отличались от контрольных.
Таким образом, результаты токсикометрии, данные наблюдений за экспериментальными животными в периоде после острого применения, а также данные патоморфилогических исследований позволяют отнести получаемое в результате противовирусное средство к V классу практически нетоксичных лекарственных веществ (см. Н.Hodge et al. Clinical Toxicology of Commercial Products. Acute Poisoning. Ed. IV, Baltimore, 1975, 427 p.; K.K.Сидоров, 1973). Состояние переживших острые эксперименты животных свидетельствует о хорошей переносимости и безвредности композиции в дозах, превышающих максимальные терапевтические для человека в десятки тысяч раз.
1.2. Результаты исследования субхронической и хронической токсичности.
По результатам некропсии и гистологического исследования ежедневное подкожное введение средства в дозах 0.05,2 и 5 мг/кг в течение 90 дней крысам обоего пола не вызывает раздражения, воспаления или деструкции тканей в местах инъекций, а также не сопровождается развитием дистрофических, деструктивных, очаговых склеротических изменений в паренхиматозных клетках и строме внутренних органов, что свидетельствует о хорошей переносимости и безвредности заявляемого состава.
Ежедневное подкожное введение композиции в разных дозах в течение 90 дней собакам обоего пола не вызывает дистрофических, деструктивных, очаговых склеротических изменений в паренхиматозных клетках и строме изучаемых органов, а также не сопровождается местно-раздражающим действием или некрозом тканей на месте введения.
1.3. Результаты изучения возможных аллергизирующих свойств.
Реакция общей анафилаксии (анафилактический шок)
Оценена возможность развития анафилактического шока после подкожного введения полученного описанным способом средства морским свинкам обоего пола в дозах 0,05 и 0,5 мг/кг в течение 5 дней. В контроле животные получали равный объем дистиллированной воды.
Через 21 день после окончания введения композиции внутрисердечно всем опытным и контрольным группам была введена разрешающая доза лекарственного средства. Оценку реакции проводили в индексах по Weigle. Полученные данные приведены в таблице 1.
Таблица 1
Оценка реакции общей анафилаксии (индексы по Weigle) у морских свинок после введения противовирусного средства
Экспериментальные группы
Пол
Номера животных
1
2
3
4
5
6
Контроль
М
0
0
0
0
0
0
F
0
0
0
0
0
0
0,05 мг/кг
М
0
0
0
0
0
0
F
0
0
0
0
0
0
0,5 мг/кг
М
0
0
0
0
0
0
F
0
0
0
0
0
0
Таким образом, признаки даже умеренного шока не были выявлены ни у одного животного из группы самок и из группы самцов, получавших композицию в исследованных дозах.
Реакция непрямой дегрануляции тучных клеток
Эксперименты выполнены на морских свинках, у которых на 10 день после подкожного введения средства в дозах 0,05 и 0,5 мг/кг была взята кровь для получения сыворотки. Полученные показатели дегрануляции тучных клеток крыс в присутствии опытных и контрольных сывороток, композиции или физиологического раствора в контроле представлены в таблице 2.
Таблица 2
Реакция дегрануляции тучных клеток крыс в присутствии сывороток морских свинок, получавших противовирусное средство
Экспериментальные группы
Пол
Номера животных
1
2
3
4
5
6
Контроль
М
0,11
0,12
0,11
0,13
0,12
0,13
F
0,12
0,13
0,13
0,13
0,13
0,10
0,05 мг/кг
М
0,12
0,12
0,13
0,14
0,12
0,12
F
0,12
0,11
0,11
0,15
0,11
0,10
0,5 мг/кг
М
0,11
0,12
0,13
0,12
0,12
0,14
F
0,13
0,13
0,12
0,12
0,10
0,12
Среди полученных показателей дегрануляции тучных клеток (ПДТК) ни в одном из случаев не превышали значения 0,2, после которого эта реакция считается положительной (Методические рекомендации по оценке аллергизирующих свойств фармакологических веществ).
Во всех случаях показатель был ниже указанного значения, следовательно, он считается отрицательным. Полученные данные представлены в таблице 3.
Таблица 3
Сравнение показателей дегрануляции тучных клеток в опытных и контрольных группах морских свинок
Экспериментальные группы
Пол
ПДТК, (M±m)
t-критерий Стьюдента
Вероятность (Р)
1
2
3
4
5
Контроль
М
0,12±0.2
-
-
F
0,13±0.1
-
-
0,05 мг/кг
М
0,12±0.2
0,75
>0,05
F
0,12±0.3
0,15
>0,05
0,5 мг/кг
М
0,12±0.2
0,60
>0,05
F
0,14±0.2
1,25
>0,05
Таким образом, достоверных отличий в средних значениях ПДТК в опытных и контрольных группах самок и самцов морских свинок, получавших композицию в дозах 0,05 и 0,5 мг/кг в течение месяца, не выявлено. Эти данные позволяют заключить, что при подкожном введении композиция не обладает аллергенными свойствами, выявляемыми в непрямой реакции дегрануляции тучных клеток.
Конъюктивальная проба
Конъюнктивальную пробу проводили на 10-ый день после окончания подкожного введения средства в дозах 0,05 и 0,5 мг/кг (опытные группы) или равного объема растворителя в течение 5 дней.
Ни у одного животного из опытных групп не было реакции на введение композиции. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии у получаемой заявляемым способом композиции аллергенных свойств, выявляемых в конъюнктивальной пробе, и позволяют сделать вывод о том, что исследуемая композиция не обладает аллергизирующим действием при подкожном введении.
1.4. Результаты изучения влияния композиции на репродуктивную функцию
В период введения средства снижения темпов прироста массы тела изменений в поведении, гибели животных не отмечалось ни в одной из изучаемых групп самцов или самок. Индекс беременности достоверно не отличался в изучаемых группах.
При вскрытии самок не было выявлено повышения уровней пред- и постимплантационной смертности в подопытных группах по сравнению с соответствующими контрольными группами. У оставленных рожать самок, каких-либо особенностей в протекании родов и заботе о потомстве не отмечено.
Уровни гибели новорожденных крысят, соотношение самцов и самок в помете в изучаемых группах не различались. Сроки отлипания ушной раковины, появления первичного волосяного покрова, прорезывания резцов были синхронны в пометах подопытной и контрольной групп. Открытие глаз у потомства самцов и самок, получавших композицию, произошло практически в те же сроки, как и в контрольной группе. Опускание семенников и открытие влагалища по срокам также не отличались в изучаемых группах.
Известно, что активное вещество - пептид при стерилизации склонно к разложению, для предотвращения этого процесса используют лиофилизат. В готовой форме количество биологически активного вещества в лиофилизируемом растворе составляет порядка 0,01 до 10 мг. Если проводить лиофилизацию только активного вещества, то на выходе получают крайне малое количество рыхлого порошка, который осаждается, в основном, на стенках ампулы или флакона, а после стерилизации водяным паром это малое количество порошка выносится из ампулы или флакона.
Для предотвращения уноса активного вещества в состав препарата добавляют вспомогательные вещества, в том числе и структурообразующие, благодаря которым происходит образование стабильных осадков. В качестве такого структурообразующего вещества используется, например, манит.
Маннит одновременно выполняет две функции, а именно поддерживает твердую и жесткую структуру объема лиофилизата, соответствующего объему лиофилизируемого раствора, а также обеспечивает регулировку изотоничности восстанавливаемого раствора для инъекции (см., например, Hora M.S., Rana R.K., Smith E.W., Liophilized formulations recombinant tumor necrosis factor, Pharm. Res., 9 (1), 33-36 (1992).
Из уровня техники известно, что степень гидролиза тридекапептида в лиофилизированной форме может повышаться в присутствии маннита, причем эта степень гидролиза повышается с увеличением количества маннита, находящегося в лиофилизате. Это объясняется тем фактом, что кристаллизация маннита в процессе лиофилизации изменяет распределение воды в матрице лиофилизата. Увеличение количества воды, присутствующей в образующемся микроокружении действующего начала, благоприятствует гидролизу действующего начала и уменьшает его стабильность (см. Herman B.D., Sinclair B.D., Milton N., Nail S.L., The effect of bulking agent on the solid state stability of freeze-dried methylprednisolone sodium succinate, Pharma. Res., 11 (10), 1467-1473 (1994).
Во избежание избыточного гидролиза добавляют аминокислоты, например, аланин, который обеспечивает большую гидрофобность лиофилизату и предотвращает гидролиз. Аланин в данном случае выполняет функцию дополнительного структурообразующего компонента и препятствует ухудшению свойств лиофилизата в процессе сублимации и высушивания, позволяя получать лиофилизат с более значительной удельной поверхностью и, следовательно, позволяет осуществлять более быстрое высушивание (см. Pikal M.J., Freeze-drying of proteins, Biopharm., 26-30 October 1990).
Из источников информации известно, что присутствие глицина в лиофилизате вызывает кристаллизацию находящихся в растворе молекул во время стадии замораживания процесса лиофилизации (см. Korey D.J., Schwartz J.B., Effects of excipiens on the cristallization of pharmaceutical compounds during lyophylization, J. Parenteral Sci. Tech., 43, 2, 80-83 (1989). Такая кристаллизация действующего начала позволяет улучшать его стабильность.
Известно, что олигополипептиды склонны к гелеобразованию (см., например Powell M.F.: Pharmaceutical Resarch, 1258-1263 (8), 1991; Dathe M: Int. J. Peptide Protein Res. 344-349(36), 1990; Szejtli J: Pharmaceutical Technology International, 16-22, 1991). При стерильной фильтрации на фильтре остается желеобразный слой, из-за чего поддержать точную концентрацию вещества невозможно. Для предотвращения гелеобразования добавляют, например, хлорид натрия, аспарагиновую и/или глутаминовую кислоту. В силу того, что общий заряд тридекапептида сильно основной (положительный), для нейтрализации заряда и, соответственно, повышения стабильности и уменьшения распадаемости добавляют, например, аспарагиновую кислоту.