Способ получения устойчивой метанотрофной ассоциации для производства кормового белка на метане
METHOD FOR OBTAINING A STABLE METHANOTROPHIC ASSOCIATION FOR PRODUCING FEED PROTEIN ON METHANE

Изобретение относится к биотехнологической области, а именно, к способу получения стабильно растущей  метанотрофной ассоциации с устойчивыми метаболическими связями для производства кормового белка на метане. В основе способа лежит длительное культивирование многокомпонентного природного сообщества в проточном режиме с использованием метана в качестве субстрата.
Перспективным путем получения полноценного белкового кормового продукта является культивирование метанотрофных бактерий в ферментерах. Метанотрофные бактерии в оптимальных условиях активно перерабатывают природный газ, быстро размножаются и наращивают свою биомассу, богатую ценным белком, витаминами и иными биологически активными веществами.
Использование метана для получения кормового белка имеет ряд преимуществ, в числе которых большие запасы природного газа, его хорошая транспортабельность, возможность получения готового продукта без дополнительной очистки от субстрата.
Methylococcus capsulatus
Ralstonia
Aneurinibacillus
Brevibacillus agri
Stenotrophomonas acidaminiphila
Сupriavidus gilardii
Klebsiella pneumonia
Используемая в качестве кормовой добавки бактериальная биомасса производится за счет культивирования в ферментере штамма метанотрофа-продуцента и нескольких бактерий, образующих ассоциацию. Пример такой ассоциации фигурирует в международной заявке WO 01/60974:  (Bath) (штамм NCIMB 11132),  sp. DB3 (штамм NCIMB 13287),  sp. DB4 (штамм NCIMB 13288) и  DB5 (штамм NCIMB 13289). Также в качестве ассоциантов в патентах и патентных заявках предлагаются следующие виды бактерий:  GBS-15-2 (патент РФ RU 2687136 C1),  GBS-15-1 (Евразийская заявка EA 201900121 А),  1-17 (патент РФ RU 2687137 C1). В этих документах, однако, не приводится полный состав ассоциации, а характеризуются лишь отдельные бактериальные спутники. Биомасса бактериальной культуры может использоваться как конечный продукт (хотя в основном после обезвоживания и стерилизации), или она может быть вначале переработана с целью разрушения бактериальных клеток, например, путем гомогенизации, гидролиза или автолиза. Такие виды обработки описаны в международных заявках WO 01/60974, PCT/GB03/000610 и PCT/GB03/000640, поданных 12 февраля 2003 г.
Природные сообщества значительно более стабильны, чем искусственно созданные. Из уровня техники известен исходный состав многокомпонентного сообщества активного ила (Ning Xie, Liping Zhong, Liao Ouyang, Wang Xu, Qinghuai Zeng, Keju Wang , Madiha Zaynab, Huirong Chen, Fangfang Xu, Shuangfei Li. Community Composition and Function of Bacteria in Activated Sludge of Municipal Wastewater Treatment Plants. Water (2021) 13:852).
Существующие подходы к формированию микробной ассоциации для производства кормового белка на метане включают культивирование метанотрофа-продуцента  в режиме незащищенной ферментации и/или подсев чистых культур бактериальных спутников с целью их закрепления в составе микробного сообщества. Недостатком обоих подходов является отсутствие экспериментально верифицированных данных о метаболической совместимости  бактериальных спутников с метанотрофным штаммом-продуцентом. Стабильность бактериальной ассоциации может не достигаться при искусственном объединении индивидуальных изолятов-спутников. Постоянство состава ранее предложенных ассоциаций и возможность закрепления индивидуальных бактерий-спутников в составе ассоциаций никогда ранее не контролировалось.
Proteobacteria
Bacteroidetes
Acidobacteria
Firmicutes
Nitrospirae
Chloroflexi
Actinobacteria
Candidatus
Gemmatimonadetes
Spirochaetes
Armatimonadetes
Planctomycetes
Cyanobacteria
Candidatus
Euryarchaeota
Более эффективным подходом может являться формирование устойчивой ассоциации на основе микробных сообществ как из природных, так и антропогенных местообитаний. Такие сообщества, как правило, отличаются высоким микробным разнообразием. Например, сообщество из приведенной выше публикации по анализу сообщества из активного ила включало представителей следующих крупных бактериальных групп , , , , , , ,  Latescibacteria, , , , , ,  Saccharibacteria,  с общим числом видов от 1253 до 2399.
Задачей настоящего изобретения является получение стабильно растущей метанотрофной ассоциации с устойчивыми метаболическими связями между ее компонентами с использованием широкого разнообразия бактерий, населяющих природные или антропогенные местообитания.
-1
Настоящая задача достигается за счет инокулирования ферментера природным образцом с последующим культивированием в накопительном и проточном режимах. Скорость разбавления культуры в проточном режиме следует повышать ступенчато (с шагом до 0.05 ч) с целью закрепления микробных компонентов в составе ассоциации на каждом из этапов культивирования. Точный состав ассоциации был определен путем секвенирования фрагментов последовательностей генов 16S рРНК микроорганизмов, слагающих метанокисляющую ассоциацию.
-1
-1
-1
Способ получения устойчивой метанотрофной ассоциации для производства кормового белка на метане, характеризующийся двухэтапным культивированием природного образца в полуторалитровом ферментере с объемом минеральной среды 1 л общей длительностью от нескольких недель до одного месяца. Первый этап представляет собой накопительный рост до достижения мутности культуры, соответствующий величине оптической плотности OD600 0.5-4, на втором этапе осуществляется переход в проточный режим культивирования со скоростью протока 0.05 ч, с последующим увеличением скорости потока ступенчато с шагом 0.05 ч до достижения 0.2 ч, при этой скорости культивирование проводится в течение периода времени от 14 до 40 дней со средней оптической плотностью OD600=2.5-3, с получением стабильной малокомпонентной ассоциации.
Способ получения устойчивой метанотрофной ассоциации для производства кормового белка на метане, характеризующийся тем, что в качестве природного образца может применяться активный ил или осадок пресноводных водоемов.
Methylococcus
Sphingobacteriales
Hydrotalea
Hyphomicrobium
Способ получения устойчивой метанотрофной ассоциации для производства кормового белка на метане, характеризующийся тем, что компонентами стабильной малокомпонентной ассоциации являются бактерии рода  (55%), неохарактеризованные бактерии порядка  (22%), а также представители родов  (19%) и  (4%).
Methylococcus
Hydrotalea
Methylophilus
Edaphobaculum
Pleomorphomonadaceae
Chitinophagales
Способ получения устойчивой метанотрофной ассоциации для производства кормового белка на метане, характеризующийся тем, что компонентами стабильной малокомпонентной ассоциацией являются бактерии родов  (25%),  (30%),  (20%),  (12%), а также неохарактеризованные представители семейства  (11%) и порядка  (2%).
Пример 1
-1
-1
-1
В данном примере ферментер был инокулирован образцом активного ила из локации в г. Москве. Культивирование проводили в два этапа, первый из которых представлял накопительный рост до достижения мутности культуры, соответствующей величине оптической плотности OD600 = 0.5. На втором этапе был осуществлен переход в проточный режим культивирования со скоростью протока 0.05 ч. Далее скорость протока увеличивали ступенчато с шагом 0.05 ч до достижения 0.2 ч. С этой скоростью проводили культивирование в течение 5 дней со средней оптической плотностью 3.1.
Длительность культивирования – 16 дней.
Methylococcus
Hydrotalea
Methylophilus
Edaphobaculum
Pleomorphomonadaceae
Chitinophagales
По истечении двух недель культивирования было выполнено профилирование состава ассоциации за счет молекулярного анализа гена 16S рРНК. В составе ассоциации были идентифицированы представители родов  (25%),  (30%),  (20%),  (12%), а также неохарактеризованные представители семейства  и (11%) и порядка  (2%).
Применение данного способа культивирования позволило получить стабильное малокомпонентное сообщество, способное к устойчивому и эффективному росту на метане.
Пример 2
-1
-1
-1
В данном примере ферментер был инокулирован образцом активного ила из локации в г. Иркутске. Культивирование проводили в два этапа, первый из которых представлял накопительный рост до достижения мутности культуры, соответствующей величине оптической плотности OD600 = 4. На втором этапе был осуществлен переход в проточный режим культивирования со скоростью протока 0.05 ч. Далее скорость протока увеличивали ступенчато с шагом 0.05 ч до достижения 0.2 ч. С этой скоростью проводили культивирование в течение 11 дней со средней оптической плотностью 2.6.
Длительность культивирования – 36 дней.
Methylococcus
Sphingobacteriales
Hydrotalea
Hyphomicrobium
По истечении месяца культивирования было выполнено профилирование состава ассоциации с помощью молекулярного анализа гена 16S рРНК. В составе ассоциации были идентифицированы бактерии рода (55%), неохарактеризованные бактерии порядка  (22%), а также представители родов  (19%) и  (4%).
Данный способ отличался переходом в проточный режим при более высоких значениях оптической плотности и в 2 раза более долгим периодом культивирования. В результате в составе сообщества была выше доля метанотрофных бактерий, в то время как число неметанотрофоных представителей было меньше.
Выводы:
Более длительное культивирование в проточном режиме (в течение месяца, как в примере 2 способствует формированию малокомпонентной бактериальной ассоциации, в которой доминирует метанотрофный штамм-продуцент, а остальные бактерии в составе ассоциации представлены всего несколькими спутниками.