Морфологические изменения перевитого рака почки у крыс при введении флавоноидсодержащего экстракта аврана лекарственного

Бюллетень медицинских Интернет-конференций

2017. Том 7. № 2_577

ID: 2017-02-1276-A-13114 Оригинальная статья

Маслякова Г.Н., Полуконова Н.В., Наволокин Н.А., Мудрак Д.А., Бучарская А.Б., Тычина С.А., Корчаков Н.В.

Морфологические изменения перевитого рака почки у крыс при введении флавоноидсодержащего

экстракта аврана лекарственного

ФГБОУ ВО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России

Резюме

В экспериментах in vivo проведено исследование противоопухолевой активности экстракта аврана лекарственного при различных способах введениях в дозе 110 мг/кг/сут на протяжении 12 дней у крыс с перевитым раком почки ^А). Установлено, что внутримышечное введение экстракта является наиболее эффективным, и приводит к замедлению темпов роста опухоли и уменьшению конечного объема опухоли на 40% по сравнению c размерами опухоли у животных без воздействия экстракта. При пероральном введении экстракта также происходит замедление темпов роста опухоли, а к окончанию эксперимента (14 сутки) объем опухоли уменьшается на 23% по сравнению с группой крыс без воздействия. Гистологические изменения в опухолевой ткани были более выражены при внутримышечном введении и проявлялись некробиотическими и атрофическими изменениями в клетках, снижением пролиферативной активности, отсутствием митозов и уменьшением экспрессии ядерной РНК, что может говорить о блокировке синтетических процессов на уровне ядра. Таким образом, наиболее выраженный патоморфоз перевитого рака почки под влиянием экстракта аврана лекарственного наблюдается при внутримышечном пути введения эстракта.

Ключевые слова: флавоноиды, рак почки, экстракт аврана лекарственного, патоморфоз

Введение

В настоящее время нет ни одного противоопухолевого препарата, который был бы безопасен в рекомендуемых для клинического применения дозах и не имел бы ограничений для использования [1]. Недостатками имеющихся противоопухолевых препаратов являются их токсическое влияние на неизмененные органы и ткани организма и развитие к ним устойчивости опухолей [2]. Это делает необходимым поиск новых, более безопасных и высокоэффективных лекарственных средств.

Особое внимание уделяется созданию лекарственных средств растительного происхождения с минимальными побочными эффектами. Препараты из растительного сырья могут использоваться не только для уничтожения опухолевых клеток, но и защиты нормальных клеток (в том числе, и стволовых клеток костного мозга) при проведении стандартного курса химио- и радиотерапии [1,2,3].

Самой перспективной группой, по мнению ряда авторов, являются флавоноиды, так как обладают наибольшим количеством биологических эффектов, оказывающих положительное влияние на результат лечения новообразований [2,3]. Открытие в 2011 году способности растительного флавоноида вогонина к активации апоптоза в опухолевых клетках [4] позволило продолжить поиск и других биофлавоноидов, обладающих противоопухолевой активностью.

При различных способах извлечений из цветков и листьев аврана можно получать биологически активные композиции, обладающие различными свойствами: слабительным, рвотным, спазмолитическим, диуретическим, дигиталисоподобным действием на сердце, противовоспалительным, антиоксидантным, иммуномодулирующим, противотуберкулезным и др. [5-9].

Ранее на лабораторных животных с перевитыми опухолями нами было показано, что флавоноидсодержащий экстракт аврана лекарственного (Gratiola officinalis L.), наряду с малой токсичностью, обладает противоопухолевой активностью в отношении перевиваемого рака печени [10-14]. Исследований противоопухолевого действия экстракта аврана на перевитые опухоли почки у крыс ранее не проводили.

Цель исследования: в экспериментах in vivo исследовать противоопухолевую активность флавоноидсодержащего экстракта аврана лекарственного на модели перевитого рака почки у крыс.

Материал и методы

Использовали водные растворы экстракта аврана лекарственного (Gratiola officinalis L.), собранного в экологически чистом районе, на острове Чардым Саратовской области. Экстракты были получены нами авторским способом (Патент РФ 2482863), позволяющим существенно повысить выход биофлавоноидов и предусматривающим минимальный выход токсичных соединений (алкалоидов, гликозидов и др.) [15], что особенно актуально при получении нетоксичных экстрактов ядовитых растений, к которым относится авран лекарственный. Ранее в составе травы аврана была описана бетулиновая кислота, обладающая противоопухолевой активностью, но использованная нами технология получения экстракта исключала выход данного соединения [15]. Экстракт, полученный данным способом из аврана лекарственного имеет следующий химический состав: 4-винил-2-метоксифенол; 2,3-дигидро-3,5-дигидрокси-6-метил-4Н-пиран-4-он; 2,3-дигидробензофуран; 3-фуранкарбоновая кислота; 5-гидроксиметил-2-фуральдегид; этил^^-рибозид; 4-пропилфенол; пирокатехин; L-луксоза (пентоза); 6-деоксигексоза L-галактоза; бензоилуксусной кислоты этиловый эфир; гексадекановая кислота (пальмитиновая кислота); гомованилиновая кислота; глюкоза; 1,4-ангидро- d-маннитол; бензойная кислота; кверцетин. Среднее значение кверцетина в данном экстракте с использованием градуировочного графика стандартного образца кверцетина (98%) Sigma, составляет 0,66%. Установленное нами методом жидкостной хроматографии количество кверцетина в сухом остатке экстрактивных веществ (получаемого из 10 г сухой травы аврана) составило 350 мкг [15]. Экстракт получен на Кафедре общей биологии, фармакогнозии и ботаники СГМУ им В.И, Разумовского, вводили животным в виде водного раствора (концентрация экстракта 100 мг/мл ).

Работу с лабораторными животными осуществляли согласно протоколу исследований, не противоречащему Женевской Конвенции 1985 г. о «Международных принципах биомедицинских исследований с использованием животных». Протокол исследований одобрены этической комиссией ФГБОУ ВО СГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава РФ (протокол №13 от 3 мая 2011 г.).

Bulletin of Medical Internet Conferences

2017. Volume 7. Issue 2

В эксперименте, проведенном в соответствии с руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ [17] на базе Центра коллективного пользования НИИ фундаментальной и клинической уронефрологии СГМУ, было использовано 30 самцов белых лабораторных крыс линии Wistar, массой 150±50 г, которым имплантировали подкожно в области лопатки по 0,5 мл 25% опухолевой взвеси рака почки РА в растворе Хэнкса. Опухоль была получена из банка опухолевых штаммов РОНЦ им. Н.Н. Блохина.

Животные с перевитым раком почки методом случайной выборки были разделены на три группы по 10 крыс: первую и вторую -опытные, крысы получали экстракт аврана либо перорально, либо внутримышечно в дозе 110 мг сухой массы экстракта/кг/сутки. Третью группу - сравнения, составили животные с перевитой опухолью, но без введения экстракта. В опытных группах через 72 ч после трансплантации опухоли крысам вводили физиологический раствор ежедневно в течение двух недель, после чего животных всех групп выводили из эксперимента путем декапитации и производили забор образцов ткани опухоли.

Динамику роста опухоли оценивали по изменению ее объема по формуле: V=АхВхС, где А- ширина, В - толщина, С - высота опухоли. Измерения проводили электронным штангенциркулем каждый день от начала эксперимента. Высчитывали индекс торможения роста опухоли (ИТРО) - показатель эффективности противоопухолевого препарата, вычисляемый по формуле: ИТ= [(Мконтр -Мопыт)/ Мконтр]*100%, где Мконтр- средняя масса опухоли в группе контроль, а Мопыт - опытной группы (Вычисляется масса опухоли, полученная на конец эксперимента).

Для изучения патоморфоза опухоли применяли морфологические и морфометрические методы с использованием стандартных гистологических методик окраски гематоксилином и эозином, по Романовскому-Гимзе; гистохимические методики: PAS реакция, а также окраска метиловым зеленым пиронином по Браше для выявления ДНК и РНК, иммуногистохимическое окрашивание на маркер пролиферации Ki-67. Индекс пролиферации рассчитывался, как отношение положительно окрашенных клеток (Ki67), к общему количеству клеток в поле зрения. Учитывали наличие дистрофических и некробиотических изменений в опухолевых клетках, а также такие цитоморфометрические показатели, как диаметр опухолевой клетки, диаметр ядра опухолевой клетки, ядерно-цитоплазматический индекс (ЯЦИ), среднее количество клеток в поле зрения. Подсчет проводили на 100 клеток в 10 полях зрения каждого микропрепарата, с помощью Микровизора медицинского проходящего света |Vizo-103 на увеличении 774. При статистической обработке данных нормальность распределения показателей в группах была проверена при помощи критерия Шапиро-Уилка. Для сравнения средних полученных показателей был использован критерий Крамера-Уэлча (Т), при котором разность средних арифметических двух выборок (контрольной и экспериментальной) делится на естественную оценку среднего квадратического отклонения этой разности. При данном методе разность средних с вероятностью в 95% определяется при Т>1,96. Весь статистический анализ выполнен при помощи программного обеспечения STATISTICA 10.0 Interprise.

Результаты и обсуждение

При внутримышечном введении экстракта аврана отмечали статистически значимое (Т>1,96) замедление темпов роста перевиваемого рака почки, чем в группе сравнения во все дни измерений. На момент окончания эксперимента объем опухоли в этой группе составил 6.7±0.53 см3 и был на 40 % меньше (Т>1,96), чем в группе сравнения (11±0.92 см3).

При пероральном ведении экстракта аврана наблюдали замедление темпов роста опухоли (Т>1,96) по сравнению с крысами группы сравнения с пятого по десятый день и с двенадцатого по четырнадцатый день введения экстракта. На момент окончания эксперимента объем опухоли в этой группе с составил 8,55±0.26 см3 и был на 23 % меньше (Т>1,96), чем в группе сравнения (11±0.92 см3). Следует отметить, что именно в этой группе животных с 9 по 11 день отмечали самый медленный темп прибавки массы опухоли. (Рис.1).

Индекс торможения по массе опухоли составил 71% для перорального введения и 73 для внутримышечного пути введения экстракта аврана лекарственного.

Патоморфоз рака почки

При гистологическом исследовании в ткани опухоли под действием аврана обнаружены обширные зоны некроза и дистрофические изменения опухолевых клеток, а также апоптозные тельца (рис. 2б). В группе сравнения (без лечения) встречали фигуры митозов (до 2 в поле зрения), чего не отмечали в опытных группах.

Таблица 1. Средняя масса опухоли на конец эксперимента

Группа Масса опухоли ИТРО

Группа сравнения 11,52±2,34 0

Экстракт аврана в/м 3,1±1,16 73

Экстракт аврана per os 3,29±1,23 71

Примечание: ИТРО -индекс торможения роста опухоли по массе

Таблица 2. Морфометрические показатели клеток опухоли почки (РА) в контрольной группе и после внутримышечного и перорального введения экстракта аврана

Группа Число кл. в п/зр (ув.774) Диаметр ядра (мкм) Диаметр клетки (мкм) ЯЦИ Индекс пролиферации

Группа сравнения 106,47 0,0104 0,0164 0,63 0,48

±2,36 ±0,0003 ±0,001 ±0,024 ±0,053

Экстракт аврана в/м 52,33 ±4,8* 0,0062 ±0,0003* 0,0103 ±0,0005* 0,61 ±0,031 0,000 ±0,0000*

Экстракт аврана per os 63,0 0,0088 0,0250 0,60 0,01

±2,43* ±0,0009* ±0,0120 ±0,079 ±0,0001*

Примечание: * - Т>1.96 достоверность различий более 95% между опытной группой и группой сравнения

Бюллетень медицинских Интернет-конференций (ISSN 2224-6150) 2017. Том 7. № 2

При проведении морфометрии наблюдали статистически значимое снижение среднего числа клеток в поле зрения в два раза при внутримышечном введении и 1,6 раза при пероральном введении (табл. 2).

Рисунок 1. Динамика роста рака почки (РА), привитого крысам в группе сравнения и группах с пероральным и внутримышечным введением водного раствора экстракта аврана лекарственного. Примечание: * "Г>1.96 достоверность различий более 95% при анализе значений группы с пероральным введением и группой сравнения. + - "Г>1.96 достоверность различий более 95% при анализе значений группы с внутримышечным введением и группой сравнения.

Рисунок 2. Морфологические изменения в перевитом раке почки. А - контрольная группа, H&E; Б - дистрофические и некротические изменения, апоптозные тельца, при в/м введении экстракта аврана, H&E; В - контрольная группа, окраска по Браше; Г -снижение экспрессии окраски на ДНК при в/м введении экстракта аврана, окраска по Браше; Д - ядерная экспрессия Ю67 клеток рака почки в контроле; E - отсутствие экспрессии Ю67 при в/м введении экстракта аврана, апоптозные тельца. Ув. х774.

SB0

Bulletin of Medical Internet Conferences

2017. Volume 7. Issue 2

Выявили уменьшение размеров диаметра ядра при внутримышечном введении в 1,8 раза и в 1,2 раза - при пероральном введении и статистически значимое уменьшение среднего диаметра клетки при внутримышечном введении в 1,5 раза по сравнению с группой без воздействия, что свидетельствовало об атрофических изменениях в клетках.

При этом ядерно-цитоплазматический индекс не менялся при введении экстракта. При окраске по Браше отмечали уменьшение экспрессии ядерной РНК в ткани опухоли крыс, как в группе перорального, так и внутримышечного введения, что возможно говорит о снижении ее транскрипционной активности.

Сравнительный анализ двух различных методов введения экстракта аврана показал, что внутримышечное введение является наиболее эффективным, и сопровождается плавной положительной динамикой снижения роста опухоли, с уменьшением конечного объема опухоли на 40% по сравнению динамикой изменения опухоли в группе сравнения.

При пероральном введении экстракта аврана динамика роста опухоли статистически значимо отличалась только до девяти суток, а к окончанию эксперимента объем опухоли стал приближаться к показателям группы сравнения. Влияние экстракта аврана лекарственного на морфологию опухолевой ткани проявлялся выраженными некробиотическими и атрофическими изменениями в опухолевых клетках. Эти данные подтверждаются также отсутствием митозов и уменьшением экспрессии ядерной РНК, снижением пролиферативной активности клеток, что говорит о снижении синтетической активности ядра и отсутствием активного деления опухолевых клеток. Также при воздействии экстракта отмечали появление признаков апоптоза в опухолевых клетках в виде апоптозных телец. Все описанные изменения были более выражены при внутримышечном пути введения.

Заключение

Экстракт аврана лекарственного в дозе 110 мг/кг/сут при внутримышечном пути введения вызывает торможение роста перевитого рака почки (РА) крыс и приводит к развитию некробиотических и дистрофических процессов в опухолевых клетках, появлению признаков апоптоза, снижению пролиферативной активности клеток и уменьшения ядерной РНК.

Литература

1. Корман Д.Б. Основы противоопухолевой химиотерапии. Москва: Практическая медицина, 2014.

2. Корсун В.Ф., Корсун Е.В., Лахтин В.М., Фитолектины: руководство по клинической фитотерапии. Москва: Практическая медицина, 2007.

3. Гольдберг Е.Д., Разина Т.Г., Зуева Е.П. и др. Растения в комплексной терапии опухолей. Москва: Издательство РАМН, 2008.

4. Polier, Ding, Konkimalla, et al., Wogonin and related natural flavones are inhibitors of CDK9 that induce apoptosis in cancer cells by transcriptional suppression of Mcl-1.//Cell Death Dis. 2011. №2. P. e182

5. Наволокин Н.А., Мудрак Д.А., Тычина С.А., Корчаков Н.В. Изменения лейкоцитарной формулы, красного костного мозга и опухоли лабораторных крыс с перевитой саркомой-45 при введении экстрактов аврана лекарственного, бессмертника песчаного, кукурузы антациановой. //Саратовский научно-медицинский журнал. 2015. Т. 11. № 3. С. 328-332.

6. Наволокин Н.А., Полуконова Н.В., Маслякова Г.Н. и др., Противоопухолевая активность растительных экстрактов, содержащих биофлавоноиды.// Российский биотерапевтический журнал. 2013 Т.12 . №2. С. 59-59a.

7. Наволокин Н.А., Полуконова Н.В., Маслякова Г.Н. и др., Морфология внутренних органов и опухоли лабораторных крыс с перевитым раком печени РС-1 при пероральном введении флавоноидсодержащих экстрактов аврана лекарственного (Gratiola officinalis l.) и кукурузы антоциановой (Zea mays l.) //Саратовский научно-медицинский журнал. 2013. Т.9. №2. С.213-220.

8. Наволокин Н.А., Скворцова В.В., Полуконова Н.В. и др. Противотуберкулезная активность экстракта аврана лекарственного (Gratiola officinalis l.) In vitro. // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2015. Т. 78. №4. С.10-13.

9. Полуконова Н.В., Наволокин Н.А., Райкова С.В. и др., Противовоспалительная, жаропонижающая и антимикробная активность флаваноидсодержащего экстракта аврана лекарственного (Gratiola officinalis l.). Экспериментальная и клиническая фармакология. 2015. -Т.-78. - №1, С.34 -38

10. Наволокин Н.А., Павлова А.В. Морфологические изменения в мышцах у лабораторных крыс и определение токсичности при введении экстракта аврана // Бюллетень медицинских интернет-конференций. 2012. Т. 2. № 2. С. 82.

11. Полуконова А.В., Наволокин Н.А., Бибикова О.А. Цитотоксическая активность in vitro экстракта аврана на культуре клеток почек эмбрионов свиньи, зараженных онковирусом. // Бюллетень медицинских интернет-конференций. 2013.Т.3. № 2. С.375.

12. Наволокин Н.А., Полуконова А.В., Бибикова О.А. и др. Цитоморфологические изменения в культуре клеток почки эмбриона свиньи при воздействии экстракта аврана лекарственного (Gratiola officinalis l.). //Фундаментальные исследования. 2014. №10-17. С. 1369-1374.

13. Скворцова В.В., Наволокин Н.А. Патоморфоз саркомы s45 при внутримышечном введении флавоноидсодержащего экстракта лабораторным крысам//Бюллетень медицинских интернет-конференций. 2013. Т.3. 2. С. 258.

14. Polukonova N.V., Kurchatova M.N, Navolokin N.A., et al. A new extraction method of bioflavanoids from poisonous plant (Gratiola officinalis l.). //Russian Open Medical Journal. 2014. V3. 3. P. 304.

15. Полуконова Н.В., Дурнова Н.А., Курчатова М.Н., Наволокин Н.А. Химический анализ и способ получения новой билогически активной композиции из травы аврана лекарственного (Gratiola officinalis l.). //Химия растительного сырья. 2013. №4. C.165-173.

16. Boryczka, Bebenek, Jastrzebska etc., Crystal structure of betulinic acid-DMSO solvate. Crystalline Materials. - 2012. - V.227. - №6. - pp. 379-384

17. Миронов А.Н., Бунатян Н.Д., Васильев А.Н., Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. Москва: Гриф и К, 2012.