СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ АНТИБИОТИКОВ
METHOD OF INCREASING ANTIBIOTICS EFFICIENCY

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, в частности к производству антибиотиков, в том числе бета-лактамовых.
В результате исследований выявлено, что снижение эффективности антибиотиков связано с их инактивацией бактериальными ферментами - бета-лактамазами, продуцируемыми бактериальными клетками (стафилококками и др.), повышением выведения антибиотиков из клетки, мутациями рибосомальных белков и соответственно подавлением синтеза бактериальных белков и в целом торможения взаимодействия т-РНК с рибосомами (Никитин А.В. Титециклин: антимикробное действие и химиотерапевтическая эффективность // Антибиотики и химиотерапия, 2009, 54; 1-2. С.63-65; Соколова Г.Б., Краснов В.А. Новый противотуберкулезный препарат Рифалекс // Антибиотики и химиотерапия, 2009, 54; 1-2. С.38-41).
Повышение химиотерапевтической активности антибиотиков проводится комбинацией разных групп антибиотиков, в том числе с клавулановой кислотой (антибиотик, полученный в 1976 году из продукта метаболизма гриба Streptomyces clavuligerus), а также введением в их химическую структуру фтора, пиперазинового радикала и совместное применение с лимонной, янтарной и изоянтарной кислотами и их солями - сукцинатами, а также пробиотиками (Андреева Н.Л., Войтенко В.Д. Повышение эффективности химиопрепаратов с помощью органических кислот // Международный вестник ветеринарии, 2004, №1. - С.55-58; Шевелева М.А., Раменская Г.В. Современные представления о применении пробиотических средств при антибиотикотерапии // Антибиотики и химиотерапия, 2009, 54; 3-4. - С.61-64).
Однако на фоне снижения бактериальной резистентности, повышения токсичности и особенно нефротоксичности антибиотиков арсенал использования средств антибактериальной терапии резко сужается. В России пока не выявлены патогены, резистентные к метициллину, ванкомицину, линезолиду, но в Западной Европе выделено до 20%, а в США - до 55% устойчивых к указанным антибиотикам микроорганизмов. Поэтому появление резистентных микроорганизмов в других регионах мира и в России является вопросом времени.
Современные подходы совершенствования изготовления антибиотиков нуждаются в иных направлениях, так как существующий потенциал разработки инновационных антибактериальных препаратов ограничен, и принципиально новых антибиотиков создать не удается.
Создание новых лекарственных форм и комбинаций антибиотиков не обеспечивает качественного прорыва и снижения токсичности в фармокинетике антимикробных препаратов.
Известен способ создания более эффективного антибиотика комбинацией амоксициллина с клавуланатом (Карпов О.И. Флемоклавсолютат - новая лекарственная форма амоксициллина/клавуланата // Клиническая фармакология и терапия. - 2006. - 15. - №4. - С.1-4).
Несмотря на замену ампициллина на амоксициллин, обладающий более эффективным бактерицидным действием и проникновением в ткани и жидкости организма, и последующее создание ряда комбинированных антибиотиков - аугментина, сулациллина и т.д., основные недостатки, присущие антибиотикам, сохранились. Это - токсичность, появление лекарственноустойчивых видов микроорганизмов, депрессивное их воздействие на иммунную систему организма, дороговизна и дефицитность из-за прекращения изготовления в РФ антибиотиков (Медуницын Н.В. Биопрепараты. 2006, №4. С.2-3).
Для устранения указанных недостатков, для повышения бактерицидной эффективности антибиотиков, снижения их токсичности и аллергизации организма, повышения их устойчивости к действию бактериальных ферментов за счет создания у них стабильной структуры предлагается полимеризация и детоксикация антибиотиков двумя детоксикаторами - вначале 0,15±0,05% раствором формалина при 40,0±2,0°С в течение 3-5 суток, а затем 0,15±0,05% раствором этония (бисчетвертичного аммониевого соединения) при 40,0±2,0°С в течение 3-5 суток из расчета 100-150 мг/мл антибиотика.
Правомерность использования формалина и этония для полимеризации и детоксикации антибиотиков основана на производстве и применении анатоксинов, толерогенов (аллергоидов), инактивированных вирусных вакцин.
Однако сведений об использовании этих соединений при изготовлении антибиотиков в патентной и научной литературе не обнаружено.
Использование этония в качестве полимеризатора и детоксикатора доказало свою эффективность при получении ряда инактивированных вакцин, разработанных авторами заявляемого способа (RU 2360697, 2371197, 2372937, 2377013, 2377014, 2377016). Этоний обладает инактивирующим действием на токсины ряда микроорганизмов и стимулирует заживление ран, поэтому используется при лечении трофических язв, маститов, стоматитов, кератитов и т.д. (Покровский В.И. Медицинская микробиология, 1999. С.138). При этом этоний менее токсичен и не обладает канцерогенными свойствами в отличие от формалина. При получении вакцин формалин и этоний практически подавляют индукцию экзотоксинов и обеспечивают их детоксикацию.
Изучение действия формалина и этония на антибиотики показало их эффективность в усилении бактерицидного действия антибиотиков, повышении их резистентности к ферментам, вырабатываемым патогенными микроорганизмами, снижении токсичности самих антибиотиков.
На основании изученных свойств был разработан режим полимеризации и детоксикации, дозировка формалина и этония и предложен способ повышения эффективности антибиотиков.
Цель изобретения - повышение эффективности антибиотиков на основе усиления их бактерицидных свойств, снижения токсичности, усиления резистентности антибиотиков к бета-лактамным ферментам бактерий. В результате повысится эффективность терапии инфекционных болезней животных.
Поставленная цель достигается полимеризацией и детоксикацией антибиотиков вначале 0,15±0,05% раствором формалина при 40,0±2,0°С в течение 3-5 суток, а затем 0,15±0,05% раствором этония при 40,0±2,0°С в течение 3-5 суток из расчета 100-150 мг/мл антибиотика. При таком способе детоксикации и полимеризации концентрация антибиотика сохраняется, а содержание формалина и этония снижается в 10 и более раз, а при изготовлении лиофилизированных препаратов полностью утрачивается.
Способ заключается в том, что эффективность антибиотиков повышают полимеризацией и детоксикацией при 42°С в течение 3-5 суток сначала раствором формалина, а затем в том же режиме раствором этония. При этом в антибиотики поочередно вводят 0,2% растворы формалина и этония и применяют их в жидком состоянии. При использования 0,1% растворов формалина и этония после полимеризации и детоксикации антибиотики подвергают лиофилизации.
Теоретическое обоснование и экспериментальное подтверждение обеспечения стабильной и полной детоксикации и полимеризации антибиотиков и получения в результате безвредных препаратов, обладающих бактерицидным действием в отношении лекарственноустойчивых микроорганизмов позволило предложить рациональный и экономически выгодный способ изготовления и повышения эффективности антибиотиков, то есть получить технико-биологический эффект.
Полученные результаты иллюстрированы следующими примерами и таблицами.
Пример 1. Осуществление способа.
Во флаконы с лиофилизированным антибиотиком (пенициллин, метициллин, эритромицин, амоксициллин, амоксиклав, стрептомицин, тетрациклин, энфроксацин и др.) с помощью шприца внесли по 5,0 мл 0,2% раствора формалина для детоксикации и полимеризации при 42°С в течение 3-5 суток, а затем во флаконы с растворенным в 0,2% растворе формалина антибиотиком ввели с помощью шприца 5,0 мл 0,2% раствора этония для продолжения детоксикации и полимеризации в термостате при 42°С в течение 3-5 суток.
Полученные растворы антибиотиков при комнатной температуре сохраняли прозрачность, бактерицидную активность в течение 1 года (срок наблюдения).
Для изготовления препаратов в лиофилизированном виде детоксикацию и полимеризацию антибиотиков проводили в уменьшенном вдвое объеме формалина и этония. При этом лиофилизированный тюбик с антибиотиком сохранял свою исходную форму в течение 1 года (срок наблюдения).
Пример 2. Испытание ряда модифицированных антибиотиков на токсичность.
В исследованиях использовали 24 белых мышей массой 18-20 г и 24 цыплят-бройлеров 20-суточного возраста, которых разделили на 4 группы по 6 голов в каждой. Испытание на токсичность проводили ежедневно в течение трех суток путем подкожного введения по 0,5 мл модифицированного пенициллина, тетрациклина, амоксициллина и энфроксацина (байтрила). При этом на месте введения модифицированных антибиотиков не было гнойных или некротических поражений, а все животные (мыши и бройлеры) остались живыми в течение 15 суток (срок наблюдения).
Пример 3. Сравнительная оценка бактерицидной эффективности коммерческих и модифицированных антибиотиков.
Для оценки бактерицидной эффективности модифицированных антибиотиков использовали бумажные диски, пропитанные антибиотиками, результаты исследования представлены в таблице 1.
Таблица 1.
Сравнительная оценка эффективности коммерческих и модифицированных антибиотиков по диаметрам подавления роста микроорганизмов на агаре Хоттингера.
№№ п/п
Наименование антибиотика
Содержание в бумажном диске, мкг
Диаметры подавления роста (в мм)
S.aureus
E.coli
S.dublin
Bac.subtilis
1
Пенициллин
10
15-20
18-22
20-22
20-22
2
М*-пенициллин
10
30-35
30-35
30-35
30-35
3
Метициллин
10
20-22
22-25
20-22
22-23
4
М-метициллин
10
30-35
35-40
30-35
30-35
5
Эритромицин
15
20-22
20-25
18-20
20-22
6
М-эритромицин
15
30-35
35-40
30-35
30-35
7
Амоксициллин
5
20-22
22-25
18-20
20-22
8
М-амоксициллин
5
25-35
30-35
30-35
30-35
9
Амоксициллин /клавуланат
5
30-35
25-27
25-27
25-27
10
М-амоксициллин /клавуланат
5
40-50
35-40
35-40
35-40
11
Стрептомицин
10
15-20
20-22
20-22
18-20
12
М-стрептомицин
10
30-35
30-35
30-35
30-35
13
Тетрациклин
30
20-25
25-27
25-28
22-25
14
М-тетрациклин
30
30-35
35-40
35-40
35-40
*М - модифицированный антибиотик
Учитывая, что показатели эффективности антибиотиков по диаметрам задержки роста микроорганизмов по бумажным дискам являются относительными, для более точной оценки использовали мясопептонный глицериновый бульон (МПГБ) с определенной концентрацией микроорганизмов и антибиотиков. Полученные результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2.
Бактерицидная эффективность антибиотиков (ЕД/мл, мкг/мл) в МПГБ, содержащем 10 тысяч микробных клеток в 1 мл
№№ п/п
Наименование антибиотика
Объем МПГБ, мл
S.aureus
E.coli
S.dublin
Bac.subtilis
1.
Пенициллин
10
12-15
10-12
12-14
15-16
100
12-15
10-12
12-14
15-16
2.
М*-пенициллин
10
5-7
5-6
6-7
6-7
100
5-9
5-6
6-7
6-7
3.
Метициллин
10
10-12
10-12
10-12
10-12
100
10-12
10-12
10-12
10-12
4.
М-метициллин
10
5-6
5-6
5-6
5-6
100
5-6
5-6
5-6
5-6
5.
Эритромицин
10
12-15
10-12
12-13
12-13
100
12-15
10-12
12-13
12-14
6.
М-эритромицин
10
5-7
5-6
5-6
5-6
100
5-8
5-6
5-6
5-7
7.
Амоксициллин
10
10-12
9-10
9-10
9-10
100
10-12
9-10
9-10
9-10
8.
М-амоксициллин
10
7-8
4-5
4-5
4-5
100
6-8
4-5
4-5
4-5
9.
Амоксициллин/
10
5-6
5-6
5-7
5-7
клавуланат
100
5-6
5-7
5-7
5-7
10.
М-амоксициллин/
10
3-4
2-3
2-3
2-3
клавуланат
100
3-4
2-3
2-3
2-3
11.
Стрептомицин
10
10-12
9-10
8-10
8-10
100
10-12
9-10
8-10
9-10
12.
М-стрептомицин
10
10-12
9-10
8-10
8-10
100
10-12
9-10
8-10
9-10
13.
Тетрациклин
10
20-22
18-20
18-20
18-22
100
20-22
18-22
18-20
18-20
14.
М-тетрациклин
10
12-15
9-10
7-9
7-9
100
12-15
7-9
7-9
7-9
15.
Энфроксацин
10
10-12
10-12
10-12
12-14
100
10-12
10-12
10-12
12-14
16.
М-энфроксацин
10
5-6
5-6
5-6
5-6
100
5-6
5-6
5-6
5-7
*М - модифицированный антибиотик
Из данных, представленных в таблице 1, следует, что диаметры подавления роста микроорганизмов по бумажным дискам на агаре Хоттингера у модифицированных антибиотиков превышают показатели для известных коммерческих препаратов практически вдвое. Идентичные показатели бактерицидной активности у модифицированных антибиотиков получены в сравнении с коммерческими препаратами в отношении 10 тысяч в 1 мл МПГП указанных микроорганизмов (табл.2).