ПЕПТИДЫ, ПРОНИКАЮЩИЕ В КЛЕТКУ
CELL-PENETRATING PEPTIDES

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к новому пептиду, проникающему через клеточную мембрану, и к фармацевтической композиции, содержащей пептид и гидрофильное физиологически активное вещество.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Клетки изолированы от внешней среды посредством клеточной мембраны, которая непроницаема для гидрофильных физиологически активных веществ, таких как белки и нуклеиновые кислоты. Отсутствие способов доставки таких гидрофильных физиологически активных веществ внутрь клетки препятствует клиническому применению многих гидрофильных физиологически активных веществ, чьи участки воздействия локализованы в клетках.
Было описано несколько методов для доставки таких, не проникающих в клетку, гидрофильных физиологически активных веществ. Наиболее известным способом является тот, который при помощи липида придает гидрофобность гидрофильному физиологически активному веществу, и, посредством этого, может быть увеличено проникновение через мембрану клетки. Дополнительно описан способ, где для увеличения проницаемости применяют пептидный лиганд.
Пептидный лиганд, свойства которого позволяют ему перемещаться снаружи от клетки внутрь клетки без разрушения клеточной мембраны, называют проникающим в клетку пептидом. Примеры хорошо известных пептидов, проникающих в клетку, включают олигоаргинины, где аргинины связаны друг с другом; Tat (патентный документ 1), который получают из вируса ВИЧ-1; и пенетратин (патентный документ 2), который представляет собой пептид, полученный из Drosophila. В дополнение к этим пептидам, также были описаны различные проникающие в клетку пептиды, такие как те, что характеризуются простой основностью, те, что характеризуются амфипатичностью первичной или вторичной структуры пептида, и те, механизм которых неясен. В дополнение к способности проникать в клетку пептида обособленно, широко исследуется его применение для доставки в клетку гидрофильного физиологически активного вещества, такого как ген, с которым эти пептиды связаны в качестве носителя. Однако, хотя эти пептиды успешно проявили себя как реагенты в исследованиях, только небольшое число пептидов можно использовать для клинического применения. Таким образом, пептиды изучают различными способами и в каждом случае ищут последовательности пептидов, с которыми они могут наиболее эффективно перемещаться внутрь клеток.
Описано, что часть пептидов, проникающих в клетку, способна содействовать проникновению гидрофильного физиологически активного вещества через слой эпителиальных клеток слизистой оболочки в случаях, когда они перорально или интраназально вводятся вместе с гидрофильным физиологически активным веществом, позволяя гидрофильному физиологически активному веществу проникать с высокой интенсивностью в общий кровоток. Считают, что не все пептиды, проникающие в клетку, обладают свойством усиливать проникновение через слизистую и что не только проницаемость клеточной мембраны, но также внутриклеточная динамика, отделение от клетки и т.п. участвуют в способности содействовать проникновению. Таким образом, считается, что только часть проникающих в клетку пептидов, которые удовлетворяют этим условиям, обладает свойством способствовать абсорбции гидрофильных физиологически активных веществ через слизистую. Однако описано только небольшое число типов пептидов с такой функцией. Дополнительно пептиды, для которых описана способность усиливать абсорбцию через слизистую, это те, у которых эффект может быть подтвержден только в случаях, когда их применяют в формах конъюгатов с конкретными физиологически активными веществами (патентные документы 2 и 3); и те, которые требуют больших количеств пептидов, проникающих в клетку, для того, чтобы получить достаточный эффект, даже в случаях, когда показана возможность того, что пептиды можно использовать в формах, не требующих ковалентного связывания с лекарственным средством (патентный документ 4). Таким образом, многие проблемы остаются нерешенными перед практическим применением пептидов.
В последние годы в дополнение к низкомолекулярным гидрофобным лекарственным средствам, которые в основном применяли до сих пор, привлекают внимание гидрофильные физиологически активные вещества в качестве кандидатных соединений лекарственных средств. Хотя гидрофильные физиологически активные вещества демонстрируют заметные терапевтические эффекты, их плохая абсорбция через слизистую ограничивает способ их введения практически только инъекцией. Таким образом, крайне желательно развитие технологии, позволяющей гидрофильным физиологически активным веществам абсорбироваться через слизистую, для неинъекционного введения гидрофильных физиологически активных веществ. В частности, ожидается, что усиливающий абсорбцию способ с применением пептидов, проникающих в клетку, покажет более низкий уровень стимуляции слизистой по сравнению с усиливающим абсорбцию методом с применением поверхностно-активных веществ, которые широко изучались до сих пор, и открытие проникающих в клетку пептидов, которые вызывают эффективное усиление абсорбции, может привести к развитию перспективного метода.
ДОКУМЕНТЫ ИЗВЕСТНОГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ
Патентные документы
Патентный документ 1: JP 10-33186 A
Патентный документ 2: переведенная японская выложенная патентная заявка РСТ № 2002-530059
Патентный документ 3: WO 2004/037859
Патентный документ 4: JP 10-95738 A
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Задачи, решаемые изобретением
Данное изобретение направлено на создание нового пептида, проникающего в клетку, который может позволить гидрофильному физиологически активному веществу проникать внутрь клетки.
Средства решения задач
Авторы данного изобретения искали последовательности пептидов, способных проникать через мембрану клеток, и открыли новые последовательности пептидов с желаемой способностью проникать через мембрану клеток. То есть настоящее изобретение имеет следующий состав.
(1) Проникающий в клетку пептид, который является любым от (A) до (D), указанных ниже:
(А) пептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:1;
(В) пептид с аминокислотной последовательностью, такой же, что и аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:1, за исключением того, что одна или несколько основных аминокислот замещены, удалены, вставлены и/или добавлены, этот пептид обладает способностью проникать через мембрану клеток;
(С) пептид с аминокислотной последовательностью, такой же, что и аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:1, за исключением того, что 1-5 аминокислот замещены, удалены, вставлены и/или добавлены, этот пептид обладает способностью проникать через мембрану клеток;
(D) пептид с аминокислотной последовательностью, представленной обратной последовательностью любого от (A) до (C); аминокислотная последовательность, такая же, как и аминокислотная последовательность, представленная обратной последовательностью (A), за исключением того, что одна или несколько основных аминокислот замещены, удалены, вставлены и/или добавлены; или аминокислотная последовательность, такая же, как и аминокислотная последовательность, представленная обратной последовательностью (A), за исключением того, что 1-5 аминокислот замещены, удалены, вставлены и/или добавлены; этот пептид обладает способностью проникать через мембрану клеток.
(2) Проникающий в клетку пептид согласно абзацу (1), где пептид (B) имеет аминокислотную последовательность, представленную любой из SEQ ID NO:2-4, 9-10 и 13.
(3) Проникающий в клетку пептид согласно абзацу (1) или (2), где пептид (С) имеет аминокислотную последовательность, представленную любой из SEQ ID NO:12 и 15-30.
(4) Проникающий в клетку пептид согласно абзацам (1)-(3), где пептид (D) имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:5 или 14.
(5) Фармацевтическая композиция, которая содержит проникающий в клетку пептид согласно любому из абзацев (1)-(4) и гидрофильное физиологически активное вещество.
(6) Фармацевтическая композиция для перорального введения, фармацевтическая композиция, которая содержит проникающий в клетку пептид согласно любому из абзацев (1)-(4) и гидрофильное физиологически активное вещество.
(7) Фармацевтическая композиция для интраназального введения, фармацевтическая композиция, которая содержит проникающий в клетку пептид согласно любому из абзацев (1)-(4) и гидрофильное физиологически активное вещество.
(8) Фармацевтическая композиция согласно любому из абзацев (5)-(7), где гидрофильное физиологически активное вещество представляет собой пептид, белок или нуклеиновую кислоту.
Эффект изобретения
Посредством настоящего изобретения возможен эффективный перенос гидрофильного физиологически активного вещества внутрь клеток, и возможна новая фармакотерапия, направленная на молекулы в клетке. Дополнительно, гидрофильное физиологически активное вещество, которое можно было вводить только при помощи инъекции, можно вводить путем перорального введения, интраназального введения или т.п., позволяя проводить простую и ориентированную на пациента фармакотерапию.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг.1 представляет собой график, показывающий перемещение проникающих в клетку пептидов внутрь клеток HeLa.
Фиг.2 представляет собой график, показывающий усиление перемещения инсулина внутрь клеток HeLa при помощи проникающих в клетку пептидов.
Фиг.3 представляет собой график, показывающий усиление перемещения полистироловых гранул внутрь клеток HeLa при помощи проникающих в клетку пептидов.
Фиг.4 представляет собой график, показывающий уровень глюкозы в крови как индикатор интраназальной абсорбции инсулина, которую наблюдали при использовании проникающего в клетку пептида.
Фиг.5 представляет собой график, показывающий уровень инсулина в плазме как индикатор интраназальной абсорбции инсулина, которую наблюдали при использовании проникающего в клетку пептида.
Фиг.6 представляет собой график, показывающий биодоступность как индикатор интраназальной абсорбции инсулина, которую наблюдали при использовании проникающих в клетку пептидов.
Фиг.7 представляет собой график, показывающий уровень интерферона-β в плазме как индикатор интраназальной абсорбции интерферона-β, которую наблюдали при использовании проникающих в клетку пептидов.
Фиг.8 представляет собой график, показывающий уровень экзендина-4 в плазме как индикатор интраназальной абсорбции экзендина-4, которую наблюдали при использовании проникающих в клетку пептидов.
Фиг.9 представляет собой график, показывающий уровень глюкозы в крови как индикатор кишечной абсорбции инсулина, которую наблюдали при использовании проникающих в клетку пептидов.
Фиг.10 представляет собой график, показывающий уровень инсулина в плазме как индикатор кишечной абсорбции инсулина, которую наблюдали при использовании проникающих в клетку пептидов.
Фиг.11 представляет собой график, показывающий выделение лактатдегидрогеназы (ЛДГ) как индикатор интраназальной токсичности проникающего в клетку пептида.
Фиг.12 представляет собой изображения с конфокального лазерного микроскопа, показывающие усиление перемещения инсулина внутрь клеток HeLa при помощи соответствующих проникающих в клетку пептидов. На каждой диаграмме A (вверху слева) показывает локализацию инсулина, меченного родамином; B (вверху справа) показывает мембрану клетки, окрашенную DiD'Oil; C (внизу слева) показывает изображение, полученное методом дифференциальной интерференции; и A+B (внизу справа) показывает наложенное изображение картинки A и картинки B.
Фиг.13 представляет собой график, показывающий усиление перемещения инсулина внутрь клеток HeLa при помощи проникающих в клетку пептидов.
Фиг.14 представляет собой график, показывающий AUC как индикатор интраназальной абсорбции инсулина, которую наблюдали при использовании проникающих в клетку пептидов.
Фиг.15 представляет собой график, показывающий перемещение проникающих в клетку пептидов внутрь клеток HeLa.
Фиг.16 представляет собой график, показывающий усиление перемещения инсулина внутрь клеток HeLa при помощи проникающих в клетку пептидов.
ЛУЧШИЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы настоящего изобретения вновь открыли, что пептид с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:1 (далее в настоящем документе обозначаемый как пептид с SEQ ID NO:1), или его модифицированный пептид представляет собой проникающий в клетку пептид, завершив тем самым настоящее изобретение. Проникающие в клетку пептиды по настоящему изобретению будут описаны ниже подробно.
Способность проникать через мембрану клеток у проникающего в клетку пептида по настоящему изобретению означает свойство проходить через липидную мембрану, отделяющую внутреннюю часть клетки от ее внешнего окружения. Можно подтвердить, может пептид или нет проходить через клеточную мембрану, посредством связывания флуоресцентного вещества с пептидом и добавлением полученной субстанции к клеткам с последующим наблюдением клеток при помощи конфокального лазерного микроскопа или т.п. для того, чтобы увидеть, можно ли обнаружить флуоресцентное вещество в клетках. Дополнительно, количественное подтверждение проницаемости внутрь клеток можно проводить путем внедрения пептида, связанного с флуоресцентным веществом, внутрь клеток и гомогенизацией клеток с последующим измерением интенсивности флуоресценции гомогената при помощи спектрофотометра. В настоящем описании в случаях, когда количество проникшего внутрь клеток пептида, связанного с флуоресцентным веществом (например, флуоросцеином), не менее чем в 3 раза выше, чем количество не проникающего в клетки и связанного с флуоресцентным веществом пептида с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:6, первый из упомянутых пептидов считают проникающим в клетку пептидом.
Дополнительно, проникающие в клетку пептиды по настоящему изобретению имеют свойство придавать гидрофильным физиологически активным веществам способность проникать через клеточную мембрану. В настоящем описании, когда эффективность проникновения флюоресцентно меченного гидрофильного физиологически активного вещества внутрь клеток не менее чем в 3 раза выше в случаях, когда флюоресцентно меченное гидрофильное физиологически активное вещество связано или смешано с пептидом и находится в контакте с клетками, чем в случаях, когда флюоресцентно меченное гидрофильное физиологически активное вещество само по себе находится в контакте с клетками, считают, что пептид имеет свойство придавать гидрофильному физиологически активному веществу способность проникать через клеточную мембрану.
Дополнительно, проникающие в клетку пептиды по настоящему изобретению имеют свойство придавать гидрофильным физиологически активным веществам способность абсорбироваться через слизистую оболочку (предпочтительно кишечная абсорбция или интраназальная абсорбция). Более конкретно, даже в случаях, когда гидрофильное физиологически активное вещество с трудом абсорбируется само по себе внутри живого организма через слизистую, его абсорбция через слизистую (предпочтительно кишечная абсорбция или интраназальная абсорбция) повышается при контакте с тканями слизистой оболочки (предпочтительно ткань кишечника или интраназальная ткань) гидрофильного физиологически активного вещества, связанного или смешанного с проникающим в клетку пептидом.
Пептид с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:1, представляет собой новый пептид, открытый путем скрининга проникающих в клетку пептидов. Тип клетки, в которую проникает пептид, не ограничен, и клетка может быть или прокариотической клеткой или эукариотической клеткой, и пептид может предпочтительно проходить через клеточную мембрану эукариотической клетки, предпочтительно клетки млекопитающего, еще более предпочтительно через мембрану клеток слизистой оболочки млекопитающего. Пептид сам по себе проникает через клеточную мембрану и, кроме того, за счет ковалентного связывания с гидрофильным физиологически активным веществом, придает способность проникать через клеточную мембрану гидрофильному физиологически активному веществу. Предпочтительно, пептид может придавать способность проникать через клеточную мембрану гидрофильному физиологически активному веществу даже в случаях, когда пептид и гидрофильное физиологически активное вещество присутствуют в композиции независимо друг от друга.
Дополнительно, модифицированный пептид с аминокислотной последовательностью, такой же, как и аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:1, за исключением того, что одна или несколько основных аминокислот замещены, удалены, вставлены и/или добавлены, также представляет собой проникающий в клетку пептид по настоящему изобретению при условии, что модифицированный пептид проникает через клеточную мембрану. В настоящем документе основная аминокислота означает любую из аминокислот аргинин, лизин и гистидин. Количество замещенных, удаленных, вставленных и/или добавленных основных аминокислот составляет предпочтительно от одной до семи, более предпочтительно от одной до пяти, еще более предпочтительно от одной до трех, особенно предпочтительно - одну. В аминокислотной последовательности, которая была мутирована путем замены, делеции и/или вставки, предпочтительно сохранена последовательность не менее чем из трех последовательных аминокислот в изначальной аминокислотной последовательности, и предпочтительно сохранена последовательность не менее чем из пяти последовательных аминокислот в изначальной аминокислотной последовательности. Дополнительно, в случае модифицированного пептида, полученного путем замещения основной аминокислоты/аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:1, другой основной аминокислотой(-ами), модификация является наиболее приемлемой, поскольку замещение другой аминокислотой с тем же свойством не меняет общие свойства пептида. Предпочтительные примеры пептида с аминокислотной последовательностью, такой же, как и аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:1, за исключением того, что одна или несколько основных аминокислот удалены, замещены и/или добавлены, при этом пептид проникает через клеточную мембрану, включают в себя пептиды с аминокислотными последовательностями, представленными любыми из SEQ ID NO:2-4, 9-10 и 13.
Дополнительно, модифицированный пептид с аминокислотной последовательностью, такой же, как и аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:1, за исключением того, что от одной до пяти, предпочтительно от одной до трех, более предпочтительно от одной до двух, еще более предпочтительно одна аминокислота(-ы), которые не ограничиваются основной аминокислотой(-ами), замещены, удалены, вставлены и/или добавлены, также представляет собой проникающий в клетку пептид по настоящему изобретению при условии, что модифицированный пептид проникает через клеточную мембрану. В аминокислотной последовательности, полученной путем замещения, делеции, вставки и/или добавления аминокислоты(-лот) в SEQ ID NO:1, предпочтительно сохранена последовательность не менее чем из трех последовательных аминокислот в изначальной аминокислотной последовательности, и более предпочтительно сохранена последовательность не менее чем из пяти последовательных аминокислот в изначальной аминокислотной последовательности. Дополнительно, например, в случаях, когда основная аминокислота(-ы) в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:1, замещена/замещены другой/другими основными аминокислотами; в случаях, когда гидрофильная аминокислота(-ы) в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:1, замещена/замещены другой/другими гидрофильными аминокислотами; и в случаях, когда гидрофобная аминокислота(-ы) в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:1, замещена/замещены другой/другими гидрофобными аминокислотами; модификация является наиболее приемлемой, поскольку замещение аминокислотой с тем же свойством не меняет общие свойства пептида. Предпочтительные примеры пептида с аминокислотной последовательностью, такой же, что и аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:1, за исключением того, что от одной до пяти аминокислот, которые не ограничиваются основными аминокислотами, замещены, удалены, вставлены и/или добавлены, при этом пептид обладает способностью проникать через мембрану клеток, включают пептиды с аминокислотными последовательностями, представленными любой из SEQ ID NO:12 и 15-30.
Дополнительно, пептид с аминокислотной последовательностью, представленной обратной последовательностью пептида с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:1; пептид с аминокислотной последовательностью, представленной обратной последовательностью аминокислотной последовательности, такой же, как и аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:1, за исключением того, что одна или несколько основных аминокислот замещены, удалены, вставлены и/или добавлены; пептид с аминокислотной последовательностью, такой же, как и обратная последовательность аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:1, за исключением того, что одна или несколько основных аминокислот замещены, удалены, вставлены и/или добавлены; пептид с аминокислотной последовательностью, представленной обратной последовательностью аминокислотной последовательности, такой же, как и аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:1, за исключением того, что от одной до пяти аминокислот, которые не ограничиваются основными аминокислотами, замещены, удалены, вставлены и/или добавлены; пептид с аминокислотной последовательностью, такой же, как и обратная последовательность аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:1, за исключением того, что от одной до пяти аминокислот, которые не ограничиваются основными аминокислотами, замещены, удалены, вставлены и/или добавлены; также являются проникающими в клетку пептидами по настоящему изобретению при условии, что они проникают через клеточную мембрану. В настоящем документе пептид с обратной последовательностью означает, что последовательность аминокислот, идущих друг за другом, является обратной, и, например, когда последовательность аминокислот с N-конца по направлению к C-концу представляет собой аргинин, глутамин, изолейцин и лизин, ее обратный пептид означает пептид, чья последовательность аминокислот с N-конца по направлению к C-концу представляет собой лизин, изолейцин, глутамин и аргинин. Конкретные примеры включают пептиды с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:5 или 14, которые имеют аминокислотную последовательность, представленную обратной последовательностью пептида с последовательностью аминокислот из SEQ ID NO:1, и которые проникают через клеточную мембрану.
В качестве аминокислот, входящих в состав проникающих в клетку пептидов по настоящему изобретению, можно использовать аминокислоты с L-конфигурацией, которые являются природными аминокислотами, а также неприродные аминокислоты, такие как производные, полученные путем частичной модификации структуры природных аминокислот. Например, поскольку аминокислоты с D-конфигурацией вряд ли будут разрушаться протеазами и, таким образом, могут быть эффективно использованы, часть аминокислотной последовательности пептида может иметь D-конфигурацию.
Аминокислоты, которые входят в состав проникающих в клетку пептидов по настоящему изобретению, не ограничены при условии, что они представляют собой молекулы с карбоксильной группой и аминогруппой, независимо от того, существуют ли такие аминокислоты в природе, и могут также быть аминокислотами, модифицированными при помощи посттрансляционных модификаций, наблюдаемых в норме в живом организме, таких как гидроксилирование, фосфорилирование или гликозилирование. Аминокислотная последовательность предпочтительно состоит из природных аминокислот, существующих в норме в клетках млекопитающих, и/или их оптических изомеров, и примеры последовательности аминокислот включают в себя последовательности, состоящие из аргинина (Arg), лизина (Lys), аспарагиновой кислоты (Asp), аспарагина (Asn), глутаминовой кислоты (Glu), глутамина (Gln), гистидина (His), пролина (Pro), тирозина (Tyr), триптофана (Trp), серина (Ser), треонина (Thr), глицина (Gly), аланина (Ala), метионина (Met), цистеина (Cys), фенилаланина (Phe), лейцина (Leu), валина (Val), изолейцина (Ile) и/или т.п.
Проникающие в клетку пептиды по настоящему изобретению при необходимости можно модифицировать способами, известными специалистам в данной области, и более конкретно, эти пептиды могут быть производными, которые химически модифицированы полиэтиленгликолизацией (пегилирование), ацетилированием N-конца, амидированием C-конца и/или т.п. Следует отметить, что в случаях, когда проникающий в клетку пептид по настоящему изобретению применяют для нижеописанной фармацевтической композиции, пептид предпочтительно является немодифицированным. Дополнительно, проникающие в клетку пептиды по настоящему изобретению могут быть либо линейными, либо замкнуты в кольцо.
Проникающие в клетку пептиды по настоящему изобретению можно использовать в сочетании с другими известными проникающими в клетку пептидами. Дополнительно, проникающие в клетку пептиды по настоящему изобретению можно использовать в формах слитых пептидов или слитых белков, полученных слиянием пептидов с другими пептидами или белками посредством способа, описанного далее, при условии, что сохраняется способность проникать через клеточную мембрану.
Проникающие в клетку пептиды по настоящему изобретению можно получать обычными способами химического синтеза. Примеры способа получения включают в себя способы пептидного синтеза путем общеупотребительного способа жидкой фазы или твердофазного способа. Примеры таких способов пептидного синтеза включают способ пошагового удлинения, в котором каждая аминокислота последовательно связывается, удлиняя цепь, и способ конденсации фрагментов, в котором фрагменты, состоящие из нескольких аминокислот, синтезируются предварительно, а затем соответствующие фрагменты подвергаются реакции связывания. Синтез проникающих в клетку пептидов по настоящему изобретению можно проводить любым из этих способов.
Способ конденсации, применяемый для вышеуказанного пептидного синтеза, можно также проводить согласно любому из различных известных способов. Конкретные примеры таких способов включают азидный способ, способ смешанных ангидридов, DCC способ (дициклогексилкарбодиимидный), способ активированных сложных эфиров, окислительно-восстановительный способ, способ DPPA (дифенилфосфорилазидный), DCC+добавки (например, 1-гидроксибензотриазол, N-гидроксисукцинимид и N-гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимид) и способ Вудворда. Растворитель, который можно использовать для любого из этих способов, может быть соответствующим образом выбран из общеупотребительных растворителей, применение которых хорошо известно для таких типов реакций конденсации пептидов. Примеры растворителя включают диметилформамид (ДМФА), диметилсульфоксид (ДМСО), гексаметилфосфорамид, диоксан, тетрагидрофуран (ТГФ), этилацетат и их смеси.
В вышеописанных реакциях пептидного синтеза карбоксильные группы аминокислот или пептидов, которые не участвуют в реакциях, можно, как правило, защитить посредством этерификации с образованием низкоалкильного сложного эфира, такого как метильный сложный эфир, этильный сложный эфир или трет-бутильный сложный эфир; или аралкильного сложного эфира, такого как бензильный сложный эфир, п-метоксибензильный сложный эфир или п-нитробензильный сложный эфир. Дополнительно, гидроксильные группы аминокислот, имеющих функциональные группы в своих боковых цепях, например гидроксильную группу тирозина, можно защитить посредством ацетильной группы, бензильной группы, бензилоксикарбонильной группы, трет-бутильной группы или т.п., но такая протекция не обязательно нужна. Дополнительно, гуанидиновую группу аргинина можно защитить соответствующей защитной группой, такой как нитрогруппа, тозильная группа, 2-метоксибензолсульфонильная группа, метилен-2-сульфонильная группа, бензилоксикарбонильная группа, изоборнилоксикарбонильная группа или адамантилоксикарбонильная группа. Реакции снятия защиты для этих защитных групп в аминокислотах, пептидах и конечных пептидах по настоящему изобретению можно также проводить общепринятыми способами, такими как способ каталитического восстановления и способы с использованием жидкого аммиака/натрия, фторида водорода, бромида водорода, хлорида водорода, трифторуксусной кислоты, уксусной кислоты, муравьиной кислоты и метансульфоновой кислоты.
Альтернативно, проникающие в клетку пептиды по настоящему изобретению можно получить общепринятыми способами с использованием технологий генетической инженерии. Полученные таким образом проникающие в клетку пептиды по настоящему изобретению при необходимости можно очистить способами, которые широко используются в области пептидной химии, такими как способы с использованием ионообменных смол, разделительной хроматографией, гель-хроматографией, аффинной хроматографией, высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) и способом противоточного распределения.
Альтернативно, проникающие в клетку пептиды по настоящему изобретению можно использовать в формах нуклеиновых кислот, кодирующих пептиды. Конкретные примеры нуклеиновых кислот включают в качестве неограничивающих примеров плазмидные векторы, вирусные векторы, фагмиды и транспозоны, которые содержат рекомбинантные нуклеиновые кислоты, кодирующие слитые белки с пептидами по настоящему изобретению и которые позволяют экспрессировать эти пептиды. Дополнительно, рекомбинантные нуклеиновые кислоты предпочтительно используют, например, для промышленного производства проникающего в клетку пептида по настоящему изобретению или слитого белка с проникающим в клетку пептидом по настоящему изобретению; введения экспрессирующего вектора, кодирующего проникающий в клетку пептид по настоящему изобретению, в клетки живого организма, изъятые из организма; и введения проникающего в клетку пептида по настоящему изобретению в организм для создания в организме клетки, экспрессирующей проникающий в клетку пептид по настоящему изобретению или слитый с ним белок. В частности, рекомбинантные нуклеиновые кислоты предпочтительно используют для способов продукции in vitro проникающих в клетку пептидов по настоящему изобретению или слитых белков с проникающими в клетку пептидами по настоящему изобретению.
Рекомбинантная нуклеиновая кислота означает ДНК или РНК, которые получены искусственно. Примеры рекомбинантной нуклеиновой кислоты включают нуклеиновые кислоты, синтезированные путем связывания нуклеиновых кислот, таких как аденин, цитозин, гуанин, тимин и/или урацил, друг с другом; нуклеиновые кислоты, полученные путем расщепления части ДНК или РНК, содержащейся в организме, и ее модификации путем удаления части ее оснований, связывания ее с другими основаниями и/или т.п.; и нуклеиновые кислоты, полученные путем репликации этих рекомбинантных нуклеиновых кислот.
Дополнительно, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит проникающий в клетку пептид и гидрофильное физиологически активное вещество, и к способу введения гидрофильного физиологически активного вещества в живой организм за счет комбинированного применения проникающего в клетку пептида по настоящему изобретению и гидрофильного физиологически активного вещества.
Поскольку фактом является не только то, что проникающие в клетку пептиды по настоящему изобретению могут проникать через клеточную мембрану сами по себе, но также то, что пептиды могут придавать гидрофильным физиологически активным веществам способность проникать через клеточную мембрану, возможна доставка in vivo гидрофильного физиологически активного вещества через клеточную мембрану за счет смешивания проникающего в клетку пептида по настоящему изобретению с фармацевтической композицией, содержащей в качестве действующего компонента гидрофильное физиологически активное вещество, или за счет введения гидрофильного физиологически активного вещества и проникающего в клетку пептида по настоящему изобретению в комбинации. Более конкретно, поскольку проникающий в клетку пептид по настоящему изобретению может не только предпочтительно проходить через клеточные мембраны слизистой оболочки, но дает возможность абсорбироваться через слизистую гидрофильному физиологически активному веществу (предпочтительно кишечная абсорбция или интраназальная абсорбция), возможна доставка in vivo гидрофильного физиологически активного вещества через слизистую оболочку. Абсорбция гидрофильного физиологически активного вещества через слизистую оболочку означает, что гидрофильное физиологически активное вещество, вводимое на слизистую оболочку, поступает в кровь через слой слизистой, и это можно подтвердить по увеличению уровня гидрофильного физиологически активного вещества в крови или проявлению фармакологической активности. Уровень гидрофильного физиологически активного вещества в крови можно измерить способом, который обычно используют специалисты в данной области, таким как иммунологический анализ. Фармакологическую активность можно измерить с использованием индикатора, в случае фермента - его ферментативной активности или, в случае вещества, которое воздействует на клеточный рецептор, свойства изменять функцию клетки-мишени или уровень выработки маркерного вещества. Например, фармакологическую активность инсулина можно измерить, используя в качестве индикатора уровень глюкозы в крови животного, которому вводили инсулин.
Проникающий в клетку пептид, который придает гидрофильному физиологически активному веществу способность проникать через клеточную мембрану, предпочтительно, абсорбироваться через слизистую оболочку, не ограничен, при условии, что пептид представляет собой указанный выше проникающий в клетку пептид по настоящему изобретению, и его конкретные примеры включают пептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:1, и модифицированный пептид, полученный путем замещения, удаления, вставки и/или добавления от одной до семи, предпочтительно от одной до пяти, более предпочтительно от одной до двух основных аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:1, при этом модифицированный пептид может проникать через клеточную мембрану. В частности, примеры проникающего в клетку пептида по настоящему изобретению, который дает возможность интраназальной абсорбции гидрофильному физиологически активному веществу и который предпочтительно применяют для фармацевтической композиции для интраназального введения, включают пептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:1, и модифицированный пептид, полученный путем замещения, удаления, вставки и/или добавления одной или двух основных аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:1, при этом модифицированный пептид может проникать через клеточную мембрану. Конкретные примеры пептида, который является проникающим в клетку пептидом по настоящему изобретению и дает возможность интраназальной абсорбции гидрофильному физиологически активному веществу; который является модифицированным пептидом, полученным путем замещения, удаления, вставки и/или добавления одной или двух основных аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:1, и который может проникать через клеточную мембрану; показаны в таблице 1. В модифицированном пептиде замещение основных аминокислот(-ы) в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:1, другой/другими основными аминокислотами(-ой) является наиболее приемлемым, поскольку замещение пептидом, который имеет то же свойство, не изменяет общие свойства пептида.
<b>Таблица 1</b>
SEQ ID NO:1
R W F K I Q M Q I R R W K N K K
Последовательность A
K W F K I Q M Q I R R W K N K K
Последовательность B
R W F R I Q M Q I R R W K N K K
Последовательность C
R W F K I Q M Q I K R W K N K K
Последовательность D
R W F K I Q M Q I R K W K N K K
Последовательность E
R W F K I Q M Q I R R W R N K K
Последовательность F
R W F K I Q M Q I R R W K N R K
Последовательность G
R W F K I Q M Q I R R W K N K R
SEQ ID NO:10
K W F K I Q M Q I R R W K N K R
SEQ ID NO:9
K W F K I Q M Q I R R W K N R K
Последовательность H
K W F K I Q M Q I R R W R N K K
Последовательность I
K W F K I Q M Q I R K W K N K K
Последовательность J
K W F K I Q M Q I K K W K N K K
Последовательность K
K W F R I Q M Q I R R W K N K K
Последовательность L
R W F R I Q M Q I R R W K N K R
Последовательность M
R W F R I Q M Q I R R W K N R K
Последовательность N
R W F R I Q M Q I R R W R N K K
Последовательность O
R W F R I Q M Q I R K W K N K K
Последовательность P
R W F R I Q M Q I K R W K N K K
Последовательность Q
R W F K I Q M Q I K R W K N K R
Последовательность R
R W F K I Q M Q I K R W K N R K
Последовательность S
R W F K I Q M Q I K R W R N K K
Последовательность T
R W F K I Q M Q I K K W K N K K
Последовательность U
R W F K I Q M Q I R K W K N K R
Последовательность V
R W F K I Q M Q I R K W K N R K
Последовательность W
R W F K I Q M Q I R K W R N K K
Последовательность X
R W F K I Q M Q I R R W R N K R
Последовательность Y
R W F K I Q M Q I R R W R N R K
Последовательность Z
R W F K I Q M Q I R R W K N R R
Предпочтительные примеры пептида с аминокислотной последовательностью, такой же, что и аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:1, за исключением того, что одна или несколько основных аминокислот удалены, замещены и/или добавлены, пептида, который дает возможность абсорбироваться через слизистую гидрофильному физиологически активному веществу, включают пептид с аминокислотной последовательностью, представленной любой из SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10, и, в частности, предпочтительные примеры пептида, который дает возможность абсорбироваться через слизистую носа гидрофильному физиологически активному веществу, включают пептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:9 или 10.
Дополнительно, проникающий в клетку пептид по настоящему изобретению, который является модифицированным пептидом с последовательностью, такой же, как аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:1, за исключением того, что от одной до пяти, предпочтительно от одной до трех, более предпочтительно одна или две, еще более предпочтительно одна аминокислота(ы), которые не ограничиваются основной аминокислотой(-ами), замещены, удалены, вставлены и/или добавлены, при этом модифицированный пептид дает возможность абсорбироваться через слизистую гидрофильному физиологически активному веществу, также можно использовать для фармацевтической композиции по настоящему изобретению. В последовательности, которая мутирована посредством замены, делеции и/или вставки, предпочтительно сохранена последовательность не менее чем из трех последовательных аминокислот в изначальной аминокислотной последовательности, и более предпочтительно, сохранена последовательность не менее чем из пяти последовательных аминокислот в изначальной аминокислотной последовательности. Дополнительно, замена другим пептидом с тем же свойством, такая как замена основных аминокислот(-ы) другой/другими основной аминокислотой(-ами), замена гидрофильных аминокислот(-ы) другой/другими гидрофильной аминокислотой(-ами) и/или замена гидрофобных аминокислот(-ы) другой/другими гидрофобной аминокислотой(-ами) в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:1, является наиболее приемлемым изменением, поскольку в этом случае общее свойство пептида не может измениться.
Дополнительно, проникающий в клетку пептид по настоящему изобретению, который дает возможность абсорбироваться через слизистую гидрофильному физиологически активному веществу, представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью, представленной обратной последовательностью пептида с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:1; пептид с аминокислотной последовательностью, представленной обратной последовательностью аминокислотной последовательности, такой же, как аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:1, за исключением того, что одна или несколько основных аминокислот замещены, удалены, вставлены и/или добавлены; пептид с аминокислотной последовательностью, такой же, как обратная последовательность аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:1, за исключением того, что одна или несколько основных аминокислот замещены, удалены, вставлены и/или добавлены; пептид с аминокислотной последовательностью, представленной обратной последовательностью аминокислотной последовательности, такой же, как аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:1, за исключением того, что от одной до пяти аминокислот, которые не ограничены основными аминокислотами, замещены, удалены, вставлены и/или добавлены; или пептид с аминокислотной последовательностью, такой же, как и обратная последовательность аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:1, за исключением того, что от одной до пяти аминокислот, которые не ограничены основными аминокислотами, замещены, удалены, вставлены и/или добавлены; также можно использовать для фармацевтической композиции по настоящему изобретению.
Гидрофильное физиологически активное вещество означает физиологически активное вещество со свойством гидрофильности. Гидрофильность означает высокую растворимость в воде, и в настоящем описании вещество определяется как гидрофильное, когда не менее чем 1 мкг вещества растворим в 1 мл воды. Физиологически активное вещество означает любое вещество, которое воздействует на живой организм и вызывает изменение в живом организме, и примеры таковых включают белки, которые связываются с рецепторами на специфических клетках, и ферменты, имеющие сродство к веществам в живом организме. Дополнительно, физиологически активное вещество может также быть веществом, которое не взаимодействует напрямую с веществом в живом организме, и, например, оно может также быть веществом, которое можно вводить в живой организм с медицинской целью, таким как декстран, который используют для увеличения объема крови в качестве альтернативы плазме. Физиологически активное вещество представляет собой предпочтительно пептид, белок или нуклеиновую кислоту, более предпочтительно пептид или белок, который плохо проникает через биологические барьеры, такие как клеточная мембрана или клеточный слой, составляющий слизистую оболочку. Дополнительно, гликопротеины, где цепи сахара связаны с белками, которые являются гидрофильными физиологически активными веществами, и производные белков, полученные путем химической модификации, такой как полиэтиленгликолизация (пегилирование), также предпочтительны для применения в качестве гидрофильных физиологически активных веществ.
Молекулярная масса гидрофильного физиологически активного вещества не ограничена, но в случаях, когда молекулярная масса слишком велика, прохождение вещества через клеточную мембрану иногда ограничено, так что молекулярная масса составляет предпочтительно не более 500000, более предпочтительно, не более 30000.
Конкретные предпочтительные примеры гидрофильного физиологически активного вещества включают паратиреоидный гормон (PTH), кальцитонин, инсулин, ангиотензин, глюкагон, глюкагоноподобный пептид (GLP-1), экзендин-4, гастрин, гормон роста, пролактин (лютеотропный гормон), гонадотропин (гонадотропный гормон), цитотропный гормон, адренокортикотропный гормон, меланоцит-стимулирующий гормон, вазопрессин, окситоцин, протирелин, лютеинизирующий гормон (LH), кортикотропин, соматропин, тиротропин (тироид-стимулирующий гормон), соматостатин (стимулирующий фактор гормона роста), гипоталамический гормон (GnRH), колониестимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF), эритропоэтин, фактор роста гепатоцитов (HGF), эндотелиальный фактор роста (EGF), сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), ангиопоэтин, интерферон-α, интерферон-β, интерферон-γ, интерлейкины, супероксиддисмутазу (SOD), урокиназу, лизоцим и вакцины; и гидрофильное физиологически активное вещество более предпочтительно представляет собой инсулин, кальцитонин, паратиреоидный гормон, гормон роста, интерферон, интерлейкин, G-CSF, глюкагоноподобный пептид (GLP-1) или экзендин-4.
В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, проникающий в клетку пептид и гидрофильное физиологически активное вещество образуют конъюгат. "Конъюгат" в настоящем документе означает состояние, где не менее двух веществ могут перемещаться одновременно, и понятие «конъюгат» также включает вещества, связанные друг с другом посредством ковалентной связи; вещества, электростатически связанные друг с другом посредством ионной связи; и вещества, которые не связаны друг с другом, но имеют пространственные структуры, посредством которых одно из этих веществ может ограничивать перемещение другого/других, позволяя веществам перемещаться вместе. Например, можно сказать, что частица, такая как мицелла, липосома или макромолекула, чья поверхность модифицирована пептидом по настоящему изобретению и внутри которой содержится биологически активное лекарственное средство, формирует "конъюгат". Примеры конъюгата включают пример, где пептид по настоящему изобретению и гидрофильное физиологически активное вещество ковалентно связаны друг с другом. Примеры такого конъюгата включают фармацевтическую композицию, где аминогруппа, или карбоксильная группа, или тиоловая группа цистеина в белке, который является гидрофильным физиологически активным веществом, и проникающий в клетку пептид по настоящему изобретению ковалентно связаны друг с другом.
В случаях, когда проникающий в клетку пептид и белок, представляющий собой гидрофильное физиологически активное вещество, приготовлены в виде конъюгата, конъюгат можно получать в виде слитого белка. Участок присоединения проникающего в клетку пептида по настоящему изобретению не ограничен, и предпочтительно, пептид, который проникает через клеточную мембрану, расположен снаружи белка и не влияет в значительной степени на активность и функцию белка после слияния. Проникающий в клетку пептид предпочтительно слит с N-концом или C-концом. Тип белка для слияния не ограничен, но поскольку лекарственное средство не имеет возможности проходить через клеточную мембрану в случаях, когда его молекулярная масса слишком велика, молекулярная масса белка составляет предпочтительно не более 500000, более предпочтительно не более 30000.
Слитый белок с проникающим в клетку пептидом можно получать обычным способом химического синтеза. Примеры способа включают способ, где проникающий в клетку пептид по настоящему изобретению и инсулин смешивают и связывают друг с другом путем добавления конденсирующего средства, и способ с использованием пептидного синтезатора (например, Applied Biosystems Medel 433). Дополнительно, слитый белок можно получать, опираясь на информацию о последовательности нуклеиновой кислоты, с использованием технологии генетической инженерии в соответствии с общепринятым способом. Примеры способа включают способ, где последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует проникающий в клетку пептид по настоящему изобретению и белок для слияния, вводят в экспрессирующий генетический вектор с промотором для экспрессии белка с последующей выработкой слитого белка.
Дополнительно, в другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, проникающий в клетку пептид и гидрофильное физиологически активное вещество применяют в состоянии, когда они не связаны ковалентно друг с другом. Даже в случаях, когда проникающий в клетку пептид и гидрофильное физиологически активное вещество не образуют конъюгат посредством ковалентного связывания при введении фармацевтической композиции по настоящему изобретению, желаемый эффект можно получать путем процесса, при котором проникающий в клетку пептид и гидрофильное физиологически активное вещество смешивают друг с другом после введения и затем пептид и гидрофильное физиологически активное вещество образуют конъюгат посредством ионного связывания, гидрофобного взаимодействия и/или взаимодействия зарядов. Поскольку в таких случаях не нужна непосредственная модификация гидрофильного физиологически активного вещества, отсутствует воздействие на биоактивность, которой изначально обладает гидрофильное физиологически активное вещество, что является предпочтительным.
В настоящем изобретении слизистая оболочка, через которую возможна абсорбция гидрофильного физиологически активного вещества, не ограничена, и ее примеры включают слизистую оболочку глаза, носовой полости, нижней поверхности языка, легкого, полости рта, кожи, влагалища и кишечника. Слизистая оболочка является предпочтительно слизистой оболочкой носовой полости или кишечника. Дополнительно, способ введения для абсорбции гидрофильного физиологически активного вещества по настоящему изобретению через слизистую не ограничен, и примеры способа введения включают пероральное, назальное, ректальное и чрескожное введение и введение посредством инъекции. Способ введения представляет собой предпочтительно пероральное, назальное или ректальное введение.
В настоящем изобретении доза и число доз для введения гидрофильного физиологически активного вещества и проникающего в клетку пептида живому организму можно выбирать соответствующим образом в зависимости от гидрофильного физиологически активного вещества, лекарственной формы, возраста пациента, массы тела и тяжести симптомов, и, как правило, их вводят в дозе от 0,01 до 50 мг, предпочтительно от 0,1 до 20 мг взрослому в сутки в зависимости от состава гидрофильного физиологически активного вещества. Соотношение в смеси проникающего в клетку пептида и гидрофильного физиологически активного вещества не ограничено, и соотношение определяют предпочтительно в зависимости от типа гидрофильного физиологически активного вещества, которое смешивают, и способа смешивания проникающего в клетку пептида и гидрофильного физиологически активного вещества. Для того чтобы оказать достаточное действие на гидрофильное физиологически активное вещество, проникающий в клетку пептид используют, при любом способе смешивания, в количестве предпочтительно не менее чем в один раз больше, более предпочтительно не менее чем в два раза больше, чем молярное количество гидрофильного физиологически активного вещества, которое будет воздействовать. Это означает, что в случаях, когда проникающий в клетку пептид и гидрофильное физиологически активное вещество образуют конъюгат посредством ковалентного связывания, не менее чем один проникающий в клетку пептид связан с каждым гидрофильным физиологически активным веществом, и, в случаях, когда их применяют независимо, не менее чем 1 моль проникающего в клетку пептида содержится на 1 моль применяемого гидрофильного физиологически активного вещества.
В настоящем изобретении способ введения гидрофильного физиологически активного вещества и проникающего в клетку пептида животному (в том числе человеку) конкретно не ограничен. Например, их можно вводить в сухом виде или в форме раствора, или можно заполнять капсулы вместе с носителем, с последующим введением капсулы. Дополнительно, вещества в сухом состоянии можно однократно растворить или диспергировать в воде и затем вводить.
Примеры формы фармацевтической композиции по настоящему изобретению включают порошковые формы, состоящие из проникающего в клетку пептида и гидрофильного физиологически активного вещества, а также фармацевтически приемлемой добавки; жидкие формы, состоящие из смеси со средой, такой как вода, и фармацевтически приемлемой основой, иной, чем среда и т.п.; и твердые или полутвердые формы, состоящие из комбинации с фармацевтически приемлемой основой. Примеры основ включают различные органические и неорганические вещества, общеупотребительные в качестве материалов для препаратов, такие как носители, смазочные средства, связывающие средства, дезинтегрирующие средства, растворители, солюбилизаторы, суспендирующие средства, средства для придания изотоничности, буферные средства, смягчающие вещества и усилители абсорбции. Конкретные примеры таковых включают воду, фармацевтически приемлемые органические растворители, коллаген, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, карбоксивинилполимеры, карбоксиметилцеллюлозу натрия, натрий полиакрилат, альгинат натрия, водорастворимый декстран, натрий карбоксиметилкрахмал, пектин, метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, ксантановую камедь, гуммиарабик, казеин, желатин, агар, диглицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, вазелин, парафин, стеариловый спирт, стеариновую кислоту, сывороточный альбумин человека (HSA), маннит, сорбит, лактозу и поверхностно-активные вещества, приемлемые в качестве фармацевтических добавок.
Дополнительно, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть предпочтительно использована в комбинации не только с простыми добавками, но также с современными технологиями доставки. Например, для доставки фармацевтической композиции по настоящему изобретению в кишечник путем перорального введения, предпочтительно инкапсулировать фармацевтическую композицию в кишечную капсулу, или в мукоадгезивную гидроксипропилцеллюлозу, или в Smart Hydrogel полиметакриловую кислоту, сополимеризованную с поли(этиленгликолем) P(MAA-г-EG), или т.п., для того, чтобы избежать деградации пептида и лекарственного средства пищеварительными ферментами.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Оценка проникновения пептида внутрь клеток
Способ
2
0,2 мл клеток HeLa высевали в среде DMEM с добавлением 10% FBS на 96-луночный планшет со стеклянным дном и культивировали клетки при 37°C от 48 до 72 часов, чтобы клетки могли прикрепиться к поверхности дна. После 3-кратного промывания 200 мкл PBS, в каждую лунку добавляли 50 мкл среды DMEM, содержащей каждый из пептидов с SEQ ID NO:1-6, меченных флуоресцеином с аминоконца (синтез по договору от Sigma-Genosys), в конечной концентрации 5 мкМ и FBS в конечной концентрации 10%. Планшет инкубировали в инкубаторе с CO в течение 3 часов и затем три раза промывали средой DMEM, дополненной 10% FBS, с последующим добавлением 50 мкл лизирующего раствора (10 мМ Tris-HCl, 5 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 1% SDS, 100 мкг/мл протеиназы K) и 1 час инкубировали при комнатной температуре, для того чтобы разложить клетки и пептиды, попавшие в клетки. Лизирующий раствор полностью заменяли и количество флуоресцеина, попавшего в клетки, измеряли при помощи аппарата для измерения интенсивности флуоресценции (HORIBA FLUOROMAX-3) при длине волны возбуждения 494 нм и длине волны флуоресценции 512 нм.
Результаты
Количество флуоресцеина, попавшего в клетки, по отношению к количеству флуоресцеина, добавленного к каждой лунке, показано на фиг.1. Для каждой величины показаны среднее значение и стандартная ошибка, полученные при трехкратном измерении. В отличие от случайного пептида с SEQ ID NO:6, который почти не встраивается в клетки и, таким образом, не является проникающим в клетку пептидом, меченные флуоресцеином пептиды с SEQ ID NO:1-5, которые представляют собой пептиды по настоящему изобретению, встраивались в клетки с не менее чем в десять раз большей эффективностью, чем случайный пептид с SEQ ID NO:6.
Пример 2: Оценка усиления перемещения инсулина внутрь клеток
Способ
2
0,2 мл клеток HeLa в среде DMEM, дополненной 10% FBS, высевали на 96-луночный планшет со стеклянным дном и культивировали клетки при 37°C от 48 до 72 часов, чтобы клетки могли прикрепиться к поверхности дна. После 3-кратного промывания 200 мкл PBS, в каждую лунку добавляли 50 мкл среды DMEM, содержащей каждый из пептидов с SEQ ID NO:1-6, меченных флуоресцеином с аминоконца (синтез по договору от Sigma-Genosys), в конечной концентрации 5 мкМ, инсулин человека, меченный родамином, в конечной концентрации 100 мкг/мл и 10% FBS. Планшет инкубировали в инкубаторе с CO в течение 3 часов и затем три раза промывали средой DMEM, дополненной 10% FBS, с последующим добавлением 50 мкл лизирующего раствора (10 мМ Tris-HCl, 5 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 1% SDS, 100 мкг/мл протеиназы K) и 1 час инкубировали при комнатной температуре, для того чтобы разложить клетки и инсулин, меченный родамином, который инкорпорировал в клетки. Лизирующий раствор полностью заменяли и количество попавшего в клетки инсулина, меченного родамином, измеряли при помощи аппарата для измерения интенсивности флуоресценции при длине волны возбуждения 555 нм и длине волны флуоресценции 580 нм.
Дополнительно, тем же способом раствор, содержащий инсулин человека, меченный родамином, и каждый из пептидов с SEQ ID NO:1-6 добавляли к клеткам HeLa и инкубировали с последующим трехкратным промыванием 300 мкл среды DMEM, дополненной 10% FBS, фиксировали 3 часа 4% раствором параформальдегида и 3 раза промывали 300 мкл PBS. После этого клетки инкубировали в 5% растворе DiD'Oil (Molecular probes, Inc.) в течение ночи и наблюдали локализацию инсулина, меченного родамином, при помощи конфокального лазерного микроскопа (FV-1000, Olympus Corporation).
3
Инсулин, меченный родамином, получали следующим способом. В 0,5 мл 0,1 н. хлористоводородной кислоты растворяли 20 мг инсулина человека, затем добавляли 3 мл PBS и 0,5 мл 0,1 н. гидроксида натрия для нейтрализации раствора. Полученный раствор подвергали обмену растворов с использованием обессоливающей колонки (колонка PD-10) для получения 5 мл 50 мМ раствора NaHCO (концентрация инсулина, 4 мг/мл). К полученному раствору добавляли 4 мг NHS-родамина (Pierce), растворенного в 0,5 мл ДМСО, и оставляли реакцию протекать при комнатной температуре в течение ночи. К реакционному раствору добавляли 0,5 мл 1 M Tris-HCl (pH 8) и полученную смесь дополнительно оставляли для протекания реакции при комнатной температуре в течение 30 минут с последующим обессоливанием с использованием колонки PD-10 и добавлением воды для получения раствора с конечным объемом 10 мл (2 мг/мл относительно концентрации инсулина).
Результаты
Количество попавшего в клетки инсулина, меченного родамином, по отношению к количеству инсулина, меченного родамином, добавленного к каждой лунке, показано на фиг.2. Каждая величина представлена как среднее значение и стандартная ошибка, полученные при трехкратном измерении. Хотя добавление инсулина, меченного родамином, по отдельности и добавление инсулина, меченного родамином, вместе с пептидом со случайной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:6, к клеткам почти не привело к инкорпорации инсулина, меченного родамином, внутрь клеток, добавление инсулина, меченного родамином, вместе с пептидами с SEQ ID NO:1-5, которые являются пептидами по настоящему изобретению, привело к инкорпорации инсулина, меченного родамином, внутрь клеток с не менее чем в 50 раз большей эффективностью, чем для случайного пептида из SEQ ID NO:6.
Результаты наблюдений с использованием конфокального лазерного микроскопа после добавления каждого из пептидов с SEQ ID NO:1-6 вместе с инсулином, меченным родамином, показаны на фиг.12. В отличие от случайного пептида из SEQ ID NO:6, который не является проникающим в клетку пептидом и не делает возможным проникновение инсулина, меченного родамином, внутрь клеток, проникающие в клетку пептиды из SEQ ID NO:1-5 по настоящему изобретению подтверждали, что они дают возможность проникновения инсулина, меченного родамином, внутрь клеток.
Пример 3: Оценка увеличения перемещения полистироловых гранул внутрь клеток
Способ
2
0,2 мл клеток HeLa в среде DMEM, дополненной 10% FBS, высевали на 96-луночный планшет со стеклянным дном и культивировали клетки при 37°C от 48 до 72 часов, чтобы клетки могли прикрепиться к поверхности дна. После 3-кратного промывания 200 мкл PBS, в каждую лунку добавляли 50 мкл среды DMEM, содержащей каждый из пептидов из SEQ ID NO:1-6, меченных флуоресцеином с аминоконца (синтез по договору от Sigma-Genosys) в конечной концентрации 1 мкМ, флуоресцентные полистироловые гранулы (Fluorospheres Carboxylated Microbeads, 0,1 мкм; производства Molecular probes, Inc.) в конечной концентрации 1 мкл/лунку и 10% FBS. Планшет инкубировали в инкубаторе с CO в течение 3 часов и затем три раза промывали средой DMEM, дополненной 10% FBS, с последующим добавлением 50 мкл лизирующего раствора (10 мМ Tris-HCl, 5 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 1% SDS, 100 мкг/мл протеиназы K) и 1 час инкубировали при комнатной температуре для разложения клеток. Лизирующий раствор полностью заменяли и количество флуоресцентных полистироловых гранул, попавших в клетки, измеряли при помощи аппарата для измерения интенсивности флуоресценции при длине волны возбуждения 580 нм и длине волны флуоресценции 605 нм.
Результаты
Количество флуоресцентных полистироловых гранул, попавших в клетки, по отношению к количеству флуоресцентных полистироловых гранул, добавленных в каждую лунку, показано на фиг.3. Для каждой величины показаны среднее значение и стандартная ошибка, полученные при трехкратном измерении. Хотя добавление к клеткам флуоресцентных полистироловых гранул по отдельности и добавление гранул вместе со случайным пептидом с SEQ ID NO:6, который не является проникающим в клетку пептидом, практически не привело к инкорпорации гранул внутрь клеток, добавление гранул вместе с пептидами из SEQ ID NO:1-5, которые представляют собой пептиды по настоящему изобретению, привело к получению не менее чем 0,7% от добавленных флуоресцентных полистироловых гранул.
Пример 4: Интраназальное введение инсулина
Способ
Определенное количество порошка инсулина (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) помещали в пробирку на 1,5 мл (Eppendorf) и растворяли в 0,1 н. HCl, с последующим добавлением такого же количества 0,1 н. NaOH для приготовления раствора инсулина. Получали раствор инсулина отдельно и 40 мкл смешанного раствора для каждого экспериментального введения, при этом смешанный раствор получали путем растворения в PBS пептида с SEQ ID NO:1, чья аминокислотная последовательность целиком состоит из аминокислот с L-конфигурацией (синтез по контракту от Sigma-Genosys), и соединения полученного раствора с вышеуказанным раствором инсулина таким образом, что смешанный раствор содержит инсулин (1 МЕ/кг) и каждый пептид в концентрации 0,5 мМ. Крысе-самцу SD с массой тела приблизительно 200 г, которая голодала в течение 24 часов, делали инъекцию 50 мг/кг пентобарбитала интраперитонеально для анестезии с последующим рассечением шеи для доступа к трахее. Вставляли в трахею полиэтиленовую трубку (INTRAMEDIC PE205, Clay Adams) и рассекали часть пищевода, далее аккуратно вставляли трубку такого же диаметра от надрезанной части пищевода в хоану таким образом, чтобы не повредить ткани. Конец трубки, который вставляли в хоану, предварительно герметизировали ватой и клейкой лентой. Для предотвращения вытекания раствора лекарственного средства носонебный канал в верхнечелюстной области, выходящий в ротовую полость, закрывали синтетической клейкой лентой ("Aron alfa A", произведенный Daiichi-Sankyo Company, Limited). Перед введением и через 5, 10, 15, 30, 60, 120, 180 и 240 минут после введения приготовленной смеси инсулина и пептида или инсулина по отдельности, собирали 0,25 мл крови из шейной вены и измеряли уровень глюкозы в крови с использованием аппарата для измерения уровня глюкозы в крови "Novo Assist Plus" (Novo Nordisk Pharma Ltd.). Остаток крови центрифугировали для отделения плазмы крови и измеряли уровень инсулина в плазме с использованием набора EIA (Revis). Биодоступность рассчитывали путем сравнения с подкожным введением инсулина.
Результаты
Изменение уровня глюкозы в крови со временем после введения показано на фиг.4, и изменение уровня инсулина в крови со временем после введения показано на фиг.5. Для каждой величины показаны среднее значение и стандартная ошибка, полученные при трехкратном или шестикратном измерении. У крыс, которым интраназально вводили только инсулин, повышение уровня инсулина в крови можно было подтвердить с трудом, но у крыс, которым инсулин вводили вместе с пептидом с SEQ ID NO:1, перенос инсулина в кровь наблюдали сразу же после введения. Дополнительно, наблюдали снижение уровня глюкозы в крови, что является фармакологическим действием, связанным с переносом инсулина в кровь, при этом снижение уровня глюкозы в крови соответствовало уровню инсулина в крови.
Пример 5: Интраназальное введение инсулина 2
Способ
Инсулин получали тем же самым способом, что и в примере 4, и получали отдельно раствор инсулина и 40 мкл смешанного раствора для каждого экспериментального введения, при этом смешанный раствор получали путем растворения в PBS пептида с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:7 (олигоаргинин) или SEQ ID NO:8 (пенетратин), чья аминокислотная последовательность целиком состоит из аминокислот с L-конфигурацией (синтез по контракту от Sigma-Genosys), и соединения полученного раствора с вышеуказанным раствором инсулина таким образом, что смешанный раствор содержит инсулин (1 МЕ/кг) и каждый пептид в концентрации 0,5 мМ. Каждый смешанный раствор вводили крысам тем же самым способом, как описано в примере 4, и с течением времени проводили забор крови и измерение, таким образом, измеряли уровень инсулина в плазме с последующим расчетом биодоступности путем сравнения с подкожным введением инсулина.
Результаты
Средняя величина и стандартная ошибка биодоступности, рассчитанные из трехкратного измерения введения инсулина по отдельности или смешанного раствора инсулина и каждого из пептидов с SEQ ID NO:1, 7 и 8, показаны на фиг.6. Проникающий в клетку пептид по настоящему изобретению с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:1, продемонстрировал значительно более высокую биодоступность, чем известные проникающие в клетку пептиды, представленные SEQ ID NO:7 и 8.
Пример 6: Интраназальное введение интерферона-β
Способ
6
1 мл PBS, дополненного Tween 20, добавляли к человеческому интерферону-β дикого типа на льду ("Feron", произведенный Toray Industries, Inc.) для достижения концентрации 6000000 МЕ/мл, и 100 мкл этого раствора разделяли на аликвоты, с последующим добавлением к аликвоте 566 мкл PBS, дополненного Tween 20, для приготовления раствора 900000 МЕ/мл. Получали раствор интерферона-β отдельно и 40 мкл смешанного раствора для каждого экспериментального введения, при этом смешанный раствор получали путем растворения в PBS пептида с SEQ ID NO:1 или 4, чья аминокислотная последовательность целиком состоит из аминокислот с L-конфигурацией (синтез по контракту от Sigma-Genosys) и соединения полученного раствора с вышеуказанным раствором интерферона-β таким образом, что смешанный раствор содержит интерферон-β (0,18×10 МЕ/кг) и каждый пептид в концентрации 0,5 мМ. Анализ проводили тем же способом, как описано в примере 4. Уровень интерферона-β в плазме измеряли посредством набора "human interferon β ELISA kit" (Kamakura Techno-Science Inc.).
Результаты
Изменение уровня интерферона-β в плазме после введения показано на фиг.7. Для каждой величины показаны среднее значение и стандартная ошибка, полученные при трехкратном измерении. Хотя крысы, которым интраназально вводили только интерферон-β, показали только небольшое увеличение уровня интерферона-β в крови, крысы, которым вводили интерферон-β вместе с пептидом c SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:4, показали перенос интерферона-β в кровь сразу же после введения.
Пример 7: Интраназальное введение экзендина-4
Способ
Получали отдельно раствор экзендина-4 (синтез по контракту от Sigma-Genosys) и 40 мкл смешанного раствора для каждого экспериментального введения, при этом смешанный раствор получали путем растворения в PBS пептида с SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:4, чья аминокислотная последовательность целиком состоит из аминокислот с L-конфигурацией (синтез по контракту от Sigma-Genosys), и соединения полученного раствора с вышеуказанным раствором экзендина-4 таким образом, что смешанный раствор содержит экзендин-4 (0,25 мг/кг) и каждый пептид в концентрации 0,5 мМ. Анализ проводили тем же способом, как описано в примере 4. Уровень экзендина-4 в плазме измеряли посредством способа сэндвич-ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) с использованием в качестве твердой фазы моноклонального антитела против экзендина-4, и меченное биотином поликлональное антитело против экзендина-4 и стрептавидин-HRP для детекции.
Результаты
Изменение уровня экзендина-4 в плазме после введения показано на фиг.8. Для каждой величины показаны среднее значение и стандартная ошибка, полученные при трехкратном измерении. Хотя крысы, которым интраназально вводили только экзендин-4, не показали увеличения уровня экзендина-4 в крови, крысы, которым вводили экзендин-4 вместе с пептидом с SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:4, показали перенос экзендина-4 в кровь сразу же после введения.
Пример 8: Кишечное введение инсулина
Способ
Раствор инсулина получали тем же самым способом, что и в примере 4. Получали отдельно раствор инсулина и 500 мкл смешанного раствора для каждого экспериментального введения, при этом смешанный раствор получали путем растворения в PBS пептида с SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:4, чья аминокислотная последовательность целиком состоит из аминокислот с L-конфигурацией (синтез по контракту от Sigma-Genosys), и соединения полученного раствора с вышеуказанным раствором инсулина таким образом, что смешанный раствор содержит инсулин (50 МЕ/кг) и каждый пептид в концентрации 0,5 мМ. Крысе-самцу SD с массой тела приблизительно 200 г, которая голодала в течение 24 часов, делали инъекцию 50 мг/кг пентобарбитала интраперитонеально для анестезии с последующим рассечением брюшины по срединной линии для получения доступа к кишечнику. Вставляли силиконовую трубку в положении от 2 до 3 см от илеоцекального соединения по направлению к подвздошной кишке и вставляли иглу для подачи приблизительно в 10 см выше. Дополнительно накладывали швы в области 6 см между трубкой и иголкой. Через иглу для подачи подавали 20 мл предварительно прогретого до 37°C фосфатно-солевого буфера (PBS) с pH 7,4 со скоростью потока 5 мл/мин, для того чтобы удалить содержимое, и закупоривали силиконовую трубку с последующим введением 1 мл предварительно прогретого до 37°C PBS через иглу для подачи, и оставляли его в течение 30 минут. После введения иглу для подачи быстро закупоривали и возвращали кишечник в брюшную полость с последующим закрытием места проникновения зажимом, и оставляли крысу в покое. После выдерживания удаляли пробки из иглы для подачи и силиконовой трубки и подавали 20 мл предварительно прогретого до 37°C PBS внутрь петли со скоростью потока 5 мл/мин, для того чтобы удалить содержимое, с последующей перевязкой участка в 6 см, через который были предварительно наложены швы, для формирования петли. В эту петлю вводили отдельно 0,5 мл раствора инсулина или смесь инсулина и пептид с SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:4, возвращали кишечник в брюшную полость, закрывали место разреза зажимом и оставляли крысу в покое. Крыса в течение эксперимента для регулирования температуры тела была фиксирована на спине, на горячей пластине, в которой поддерживалась температура 37°C за счет насоса с циркуляцией горячей воды. Перед введением и через 5, 10, 15, 30, 60, 120 и 180 минут после введения приготовленной смеси инсулина и пептида или инсулина по отдельности, собирали 0,25 мл крови из шейной вены и измеряли уровень глюкозы в крови с использованием аппарата для измерения уровня глюкозы в крови "Novo Assist Plus" (Novo Nordisk Pharma Ltd.). Остаток крови центрифугировали для отделения плазмы крови и уровень инсулина количественно определяли посредством твердофазного иммуноферментного анализа. Также собирали кровь крыс, которым вводили подкожно такое же количество инсулина, и проводили измерения тем же способом.
Результаты
Изменение уровня глюкозы в крови со временем после введения показано на фиг.9, и изменение уровня инсулина в крови со временем после введения показано на фиг.10. Для каждой величины показаны среднее значение и стандартная ошибка, полученные при трехкратном или шестикратном измерении. По сравнению с введением инсулина по отдельности, которое использовали в качестве контроля, в случаях комбинированного введения пептида с SEQ ID NO:1 или 4 и инсулина наблюдали повышение в крови уровня инсулина и понижение в крови уровня глюкозы (фиг.9 и фиг.10).
Пример 9: Оценка повреждения полости носа
Способ
Тем же способом, что и в примере 4, вводили интраназально инсулин по отдельности; инсулин и пептид с SEQ ID NO:1; или 5% (масс./об.) раствор тауродезоксихолевой кислоты. Через 15 минут носовую полость промывали 10 мл PBS, подогретого до 37ºC, со скоростью потока 2 мл/мин. Промывочный раствор полностью заменяли и измеряли выделившуюся в раствор лактатдегидрогеназу (ЛДГ) при помощи набора для измерения активности ЛДГ (Pointe Scientific, Inc.).
Результаты
Активность ЛДГ в промывочном растворе показана на фиг.11. Для каждой величины показаны среднее значение и стандартная ошибка, полученные при трехкратном измерении. По сравнению с введением 5% (масс./об.) тауродезоксихолата натрия, высвобождение ЛДГ в полости носа было значительно ниже у тех мышей, которым вводили смешанный раствор пептида с SEQ ID NO:1 и инсулина, и высвобождение в последнем случае было таким же низким, как и в случае, когда вводили PBS или инсулин по отдельности.
Пример 10: Оценка усиления перемещения инсулина внутрь клеток 2
Способ
2
Оценку усиления перемещения инсулина внутрь клеток HeLa проводили тем же способом, что и в примере 2, за исключением того, что использовали пептиды с SEQ ID NO:1, 6 и 9-11, чьи аминоконцы не были мечены (синтез по контракту от Sigma-Genosys). Время инкубации в инкубаторе с CO составило 5 часов, и количество попавшего в клетки инсулина, меченного родамином, измеряли при помощи аппарата для измерения интенсивности флуоресценции.
Результаты
Количество попавшего в клетки инсулина, меченного родамином, по отношению к количеству инсулина, меченного родамином, добавленного в каждую лунку, показано на фиг.13. Для каждой величины показаны среднее значение и стандартная ошибка, полученные при трехкратном измерении. В случаях, когда инсулин добавляли к клеткам вместе со случайным пептидом с SEQ ID NO:6 или 11, который не является проникающим в клетку пептидом, всего лишь не более чем 0,05% добавленного инсулина, меченного родамином, попало внутрь клеток, в то время как в случаях, когда инсулин добавляли вместе с пептидом с SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:9 или 10, не менее чем 0,7% добавленного инсулина, меченного родамином, попало внутрь клеток.
Пример 11: Интраназальное введение инсулина 2
Способ
Инсулин получали тем же способом, что и в примере 4, и получали отдельно раствор инсулина и 40 мкл смешанного раствора для каждого экспериментального введения, при этом смешанный раствор получали путем растворения в PBS пептида с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10, чья аминокислотная последовательность целиком состоит из аминокислот с L-конфигурацией (синтез по контракту от Sigma-Genosys) и соединения полученного раствора с вышеуказанным раствором инсулина таким образом, что смешанный раствор содержит инсулин (1 МЕ/кг) и каждый пептид в концентрации 0,5 мМ. Каждый смешанный раствор вводили крысам тем же способом, как описано в примере 4, и проводили забор крови и измерения с течением времени, таким образом, измеряли уровень инсулина в плазме с последующим расчетом AUC (площадь под кривой концентрация в крови-время) на основании изменения уровня в крови (мкЕ/мл) со временем (минуты).
Результаты
Среднее значение и стандартная ошибка AUC, рассчитанные посредством трех или шести измерений, для инсулина отдельно; или смеси пептида с SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:9 или 10 и инсулина; показаны на фиг.14. В случаях, когда проникающий в клетку пептид с SEQ ID NO:1, 9 или 10 вводили вместе с инсулином, наблюдали значительно более высокую интраназальную абсорбцию инсулина по сравнению со случаем, когда вводили только инсулин.
Пример 12: Оценка усиления перемещения инсулина внутрь клеток 3
Способ
2
Оценку усиления перемещения инсулина внутрь клеток HeLa проводили тем же способом, что и в примере 2, с использованием пептидов с SEQ ID NO:6 и от 12 до 30, чьи аминоконцы были мечены флуоресцеином (синтез по контракту от Sigma-Genosys). Время инкубации в инкубаторе с CO составило 5 часов, и количество попавшего в клетки инсулина, меченного родамином, измеряли при помощи аппарата для измерения интенсивности флуоресценции. Дополнительно, количество флуоресцеина, попавшего в клетки, измеряли тем же самым способом, что и в примере 1.
Результаты
Количество флуоресцеина, попавшего в клетки, по отношению к количеству флуоресцеина, добавленного к каждой лунке, показано на фиг.15. Для каждой величины показаны среднее значение и стандартная ошибка, полученные при двухкратном измерении. Хотя только приблизительно 0,2% от добавленного флуоресцеина попало в клетки в случае пептида с SEQ ID NO:6 со случайной последовательностью, не менее чем 0,8% от добавленного флуоресцеина попало в клетки во всех случаях с проникающими в клетку пептидами с SEQ ID NO:12-30 по настоящему изобретению.
Количество попавшего в клетки инсулина, меченного родамином, по отношению к количеству инсулина, меченного родамином, добавленного в каждую лунку, показано на фиг.16. Для каждой величины показаны среднее значение и стандартная ошибка, полученные при двухкратном измерении. Только приблизительно 0,2% от добавленного инсулина, меченного родамином, попало в клетки в случае случайного пептида с SEQ ID NO:6, который не является проникающим в клетку пептидом, в то время как не менее чем 1% попал в клетки во всех случаях, когда вместе с инсулином добавляли проникающие в клетку пептиды с SEQ ID NO:12-30 по настоящему изобретению.
ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ
При помощи настоящего изобретения становится возможным введение гидрофильного физиологически активного вещества внутрь клетки, что до сих пор представляло сложность, и можно ожидать развития новой медицинской технологии. Более конкретно, поскольку состав, который позволяет введение гидрофильного физиологически активного вещества через слизистую оболочку, можно получать с использованием проникающего в клетку пептида по настоящему изобретению, вопросы боли и неудобства пациентов, связанные с общепринятыми составами (например, растворами для инъекций), содержащими гидрофильные физиологически активные вещества, могут быть в значительной степени решены, и, таким образом, пациенто-ориентированная медицинская помощь может быть реализована на базе клиники. Дополнительно, проникающие в клетку пептиды по настоящему изобретению могут фундаментально изменить концепцию составов, содержащих гидрофильные физиологически активные вещества, приводя к созданию составов, открывающих новую эру.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ (ОТКРЫТЫЙ ТЕКСТ)
SEQ ID NO:1-5
Проникающие в клетку пептиды по настоящему изобретению
SEQ ID NO:6
Случайный пептид
SEQ ID NO:7
Олигоаргинин
SEQ ID NO:8
Пенетратин
SEQ ID NO:9-10
Проникающие в клетку пептиды по настоящему изобретению
SEQ ID NO:11
Случайный пептид 2
SEQ ID NO:12-30
Проникающие в клетку пептиды по настоящему изобретению