Биопрепарат на основе продуктов метаболизма триходермы с минеральной компонентой и способ его получения
BIOPREPARATION BASED ON TRICHODERM METABOLISM PRODUCTS WITH A MINERAL COMPONENT AND A METHOD FOR ITS PREPARATION

Изобретение относится к области сельского хозяйства, к биологическим средствам, регулирующим развитие и защитные функции растений.
Известно, что представители рода Триходерма (Trichoderma) оказывают биоцидное действие на патогенные грибы, бактерии - возбудители болезней растений, также оказывают инсектицидный и акарицидный эффект. Триходерма находит широкое применение в сельском хозяйстве. Благодаря способности не только подавлять рост и развитие других грибов, но и паразитировать на них, не нанося вреда растениям, триходерма используется в качестве биологического метода защиты растений от грибковых заболеваний, против почвенных нематод в теплицах и открытом грунте.
Кроме того, в последнее время выяснено, что выделения мицелия некоторых видов Trichoderma позволяют переводить микроэлементы (ионы Fe, Cu, Zn, Со и т.д) из трудно растворимых и плохо усваиваемых растениями солей в биодоступные. Триходерма выделяет сидерофоры и способна расти в условиях с низким содержанием железа за счет использования остаточного иммобилизованного железа. Большинство грибов, включая Trichoderma, продуцируют различные формы сидерофоров, которые помогают грибам преодолевать неблагоприятные почвенные условия. Синтез сидерофоров может быть полезным для растений по двум причинам: производство сидерофоров грибами-антагонистами может подавлять рост патогенов растений, лишая их источника железа, сидерофоры могут помочь в растворении железа, делая его более доступным для растений.
Наиболее известны жидкие препараты на основе видов Триходерма с использованием биомассы, полученной при глубинном культивировании (Патент RU2658430 C1), или обработка конидеоспорами, полученными в результате твердофазного или поверхностного культивирования (Патент RU2186847 C2). Недостатком глубинного культивирования является короткий срок хранения полученных препаратов, тем самым сложность получения товарных форм. Недостатком твердофазного культивирования, при котором получают воздушные конидии и конидиоспоры, является отсутствие вторичных метаболитов, накапливающихся при глубинном культивировании. Вторичные метаболиты в культуральной жидкости содержат регуляторы роста, сидерофоры и антибиотики, которые также можно использовать в растениеводстве.
Известен препарат Триходермин (патент RU2035145 C1), представляющий собой сконцентрированную биомассу грибов Trichoderma lignorum с глицерином, поливинилпирролидоном или полиэтиленоксидом для увеличения срока годности, однако недостатком способа получения является необходимость применения методов концентрирования биомассы и использование дорогостоящих компонентов, для увеличения срока биологической активности. Кроме того, биологическая активность препарата сохраняется не более трех месяцев и требует особых температурных условий хранения.
Из известных технических решений наиболее близким по назначению и технической составляющей к заявляемому объекту является препарат по патенту RU2380906 C2. Данный препарат представляет из себя сконцентрированную биомассу гриба Триходерма или высушенную порошкообразную форму. Недостатком данного препарата являются стадии концентрирования биомассы, что требует дополнительного оборудования, применение солей тяжелых металлов, таких как ртуть и серебро, а также использование дорогостоящих компонентов в качестве наполнителя, а именно кристаллическую микроцеллюлозу, поливиниловый спирт, цеолит. Кроме того, для данного препарата заявлена только фунгицидная и бактерицидная активность.
Одним из направлений в биопрепаратах на сегодняшний день является универсальность и комплексность воздействия. Введение в состав минеральных и органических компонентов в комплексе с биологическим агентом, расширяет сферу применения биопрепаратов. Наиболее доступны растениям хелатные формы микроэлементов. Сидерофоры Триходермы обладают большим сродством, например к трехвалентной форме железа, чем к двухвалентной. Одной из проблем получения хелатных соединений является низкая устойчивость получаемых комплексов к кислотности среды, а именно устойчивость хелатного комплекса наблюдается в узком диапазоне рН от 6 до 7,5. Из известных технических решения получения хелатов наиболее близким по назначению и технической сущности является способ из патента US4189462 A, где в качестве поддерживающего комплекс компонента используют сахара, а именно сахарозу, глюкозу, маннитол и сорбитол.
Биопрепарат из данного изобретения представляет высушенную биомассу: культуральную жидкость и мицелий грибов Триходерма с добавлением смеси растворимых солей железа, кобальта, марганца в нативной и хелатной форме, где в качестве стабилизирующего хелатный комплекс компонента используется меласса и глицерин. Препарат является универсальным и пригоден для широкого списка видов и культур растений.
Задачей изобретения, является создание биопрепарата с минеральной компонентой, влияющего на рост, развитие и устойчивость к бактериальным и грибным заболеваниям, а также, разработка способа получения высушенного препарата, представляющего собой культуральную жидкость и мицелий грибов Триходерма.
Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что биопрепарат получают путем глубинного культивирования видов Триходерма с внесением на финальных стадиях культивирования растворов солей железа, кобальта, марганца и цинка в нативной и хелатной форме, последующем добавлением инертного наполнителя и сушкой. Первоначальную культуру грибов Триходерма поддерживают на картофельно-декстрозном агаре при плюс 4 градусах Цельсия. Первоначальную культуру инокулируют в жидкую питательную среду и культивируют при плюс 30 градусах Цельсия в колбах при постоянном перемешивании или ферментерах при постоянном перемешивании и дополнительной аэрации от трех суток и более. В течение культивирования в культуральную жидкость добавляют раствор солей железа, кобальта, марганца, цинка по отдельности или в смеси, в нативной или хелатной форме. После прекращения роста мицелия в биомассу вносят инертный наполнитель, тальк или бентонит с постоянным перемешиванием до получения влажного порошка. Далее влажный порошок сушат при температуре не более плюс 40 градусов Цельсия до 70-95% влажности.
Тем самым полученный биопрепарат может иметь следующее соотношение компонентов, % к массе:
Биомасса грибов - 20-50,
Наполнитель - не более 80,
Смесь солей железа, марганца, цинка и кобальта - не более 5%.
Способ его получения включает этапы первоначального культивирования грибов Триходерма и хранения при плюс 4 градусах Цельсия на картофельно-декстрозном агаре или среде Чапека с последующим инокулированием культуры Триходерма на жидкую картофельно-декстрозную питательные среду или среду Чапека и культивированием в течение 3-7 суток при 30 градусах Цельсия, отличающийся тем, что на стадии культивирования в жидких питательных средах добавляются соли железа, марганца, цинка и кобальта в хелатной форме полученных следующим способом: 12 гр. хлорида железа, 1 гр. хлорида кобальта, 2 гр. хлорида марганца, 2 гр. хлорида цинка и 20 гр. Трилона Б растворяют в 70 мл воды; постоянно перемешивая, вливают 30 гр. 70% мелассы, сахарозы или патоки, рН доводят до 7,0, добавляя по каплям 50% гидроксид калия.
Изобретение осуществляется следующими примерами:
Пример 1. Хранящийся на твердых питательных средах мицелий Три-ходермы инокулируют в колбы объемом 1 литр с 300 мл питательной среды следующего состава: 300 гр. картофельного отвара, 1 гр. дрожжевого экстракта, 20 гр. глюкозы, вода до 1 л. Культивирование осуществляют при перемешивании при 180 об/мин., при 30 градусов Цельсия в течение 7 суток. Полученную биомассу переносят в месильное устройство и добавляют инертный наполнитель тальк или бентонит до 70% от первоначального веса биомассы в культуральной жидкости. Перемешивают до формирования влажного порошка. Готовый препарат хранится при температуре плюс 4 -плюс 10 градусов Цельсия не менее 3 месяцев. При необходимости более длительного хранения полученный влажный порошок высушивают при температуре плюс 40 градусов Цельсия.
Пример 2. В культуральную жидкость по примеру 1, на 3 сутки добавляют 1 мл 13% раствора хлорида железа, 1 мл 5% раствора хлорида марганца, 1 мл 1% хлорида цинка, 1 мл 1% раствора хлорида кобальта.
Пример 3. В культуральную жидкость по примеру 1, на 3 сутки добавляют 10 мл раствора хелатов железа, цинка, марганца и кобальта, полученных следующим способом: 12 гр. хлорида железа, 1 гр. хлорида кобальта, 2 гр. хлорида марганца, 2 гр. хлорида цинка и 20 гр. Трилона Б растворяют в 70 мл воды. Постоянно перемешивая влить 30 гр. 70% мелассы, рН довести до 7,0 добавляя по каплям 50% гидроксид калия.
Пример 4. В способе получения хелатов по примеру 3, вместо поддерживающей комплекс мелассы добавляют 30 гр. глицерина.
Эффективность получаемого по предлагаемому способу биопрепарата исследовали, оценивая время проращивания, скорость роста тестовых культур растений и процент растений с признаками хлороза выращиваемых на обедненном грунте.
Семена гороха Первый Ранний, огурца Засолочный, капусты белокочанной Бабушкин секрет, перца Красный богатырь замачивали в 5% растворе биопрепарата приготовленного по примеру 3, контрольные - в дистиллированной воде и проращивали при температуре +25°С от 4 до 10 суток. Всхожесть оценивают из процентного соотношения проросших семян к не проросшим. Скорость роста оценивают по 5 бальной шкале. Полученные результаты представлены в таблице 1.
Растения высаживали в обедненный грунт (торфо-песчаная смесь, с добавлением необходимого минимального количества азота, фосфора, калия). рН почвенной смеси 7,0, культивировали при температуре +25°С наблюдали рост и развитие в течении 50 суток. Оценивали проявление хлороза. К хлорозным растениям относились все растения с проявлением его в верхушечной формации листьев (верхние листья), а также при наличии хлороза у не менее 1/3 низовой и срединной формации листьев. Выборка каждой культуры составляла 100 растений.
Таким образом, заявленный биопрепарат обладает комплексным воздействием: позволяет регулировать рост и развитие, а также устойчивость растений к грибковым и бактериальным заболеваниям, является простым и эффективным средством. Важно отметить, что благодаря входящим в состав композиции метаболитам Триходермы и микроэлементам при использовании достигается эффект многофункциональности, происходит общее развитие растения, включая стимуляцию развития.