СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ "СУХОЙ" ФОРМЫ ВОЗРАСТНОЙ МАКУЛЯРНОЙ ДЕГЕНЕРАЦИИ
METHOD OF TREATING "DRY" FORM OF AGE-SPECIFIC MACULAR DEGENERATION

Изобретение относится к медицине, а точнее к офтальмологии, и может быть использовано для лечения «сухой» формы возрастной макулярной дегенерации.
Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) - одно из самых распространенных и малоизученных глазных заболеваний, являющееся основной причиной полной потери зрения у людей старше 60 лет в индустриально развитых странах. По данным Всемирной организации здравоохранения, 25-30 миллионов человек в мире страдают ВМД. Ввиду постоянного старения общества, ВМД является одной из серьезных медицинских и социальных проблем. Наиболее распространенной клинической формой ВМД является неэкссудативная или «сухая» форма, встречающаяся в 90% случаев и характеризующаяся медленным прогрессирующим снижением зрения (Т.Н.Киселева, Г.С.Полунин, Э.Г.Елисеева и др. Современные аспекты патогенеза и клиники возрастной макулярной дегенерации // Офтальмология. - 2005. - Т.2. - №1).
Существующие методы лечения «сухой» формы возрастной макулярной дегенерации (Киселева Т.Н., Лагутина Ю.М., Кравчук Е.А. и др. Комплексное лечение возрастной макулярной дегенерации с применением препарата Фезам // Офтальмология. - 2005. - №2. - С.63-67) отличаются непродолжительностью достигаемого эффекта.
Одним из перспективных методов лечения дистрофической патологии сетчатки может явиться применение мезенхимальных стволовых клеток (МСК), однако такие методы еще недостаточно разработаны.
Стволовые клетки обладают рядом существенных достоинств: могут обеспечивать регенерацию поврежденных участков через продукцию различных факторов роста и ключевых метаболитов; способны разворачивать программы пролиферации и дифференцировки, восполняя тем самым недостаток активно работающих клеток; могут интегрироваться в патологически измененные участки сетчатки и образовывать клетки с ретинальным фенотипом. В офтальмологии терапевтический потенциал стволовых клеток изучался на животных с наследственной ретинальной патологией, близкой к пигментному ретиниту человека (Lund et al. Subretinal transplantation of genetically modified human cell lines attenuates loss of visual function in dystrophic rats // PNAS. - 2001. - V.98. - N.17. P.9942-9947; Rander et al. Light-driven retinal ganglion cell responses in blind rd mice after neuronal transplantation // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 2001. - V.42. - P.1057-1065; Woch et al., 2001; Sagdullaev et al. Retinal transplantation-induced recovery ofretinotectal visual function in rodent model ofretinitis pigmentosa // Invest. Ophthal. Vis. Sci - 2003. - V.44. - P.1686-1695).
Хотя мезенхимальные стволовые клетки взрослого организма обладают более ограниченным потенциалом дифференцировки, чем эмбриональные стволовые клетки, получаемые при культивировании клеток бластоцисты, их применение более безопасно. Кроме того, с точки зрения этики, они являются более приемлемым для клинического использования материалом.
Существенной проблемой клеточной терапии является направленная доставка стволовых клеток к патологическому очагу и удержание их в нем в течение времени, необходимого для достижения лечебного эффекта.
Задачей изобретения является повышение эффективности лечения возрастной макулярной дегенерации.
Техническим результатом является улучшение или стабилизация зрительных функций. Технический результат достигается за счет того, что:
1. Субретинальное (под мембрану Бруха в макулярной области) введение аутологичных культивированных МСК костного мозга пациента сопровождается их направленной избирательной адгезией в патологическом очаге, что способствует активации репаративных процессов за счет приживления трансплантированных стволовых клеток в поврежденных участках с последующим размножением и дифференцировкой как трансплантированных, так и резидентных стволовых клеток.
Возможность подобных процессов для эмбриональных стволовых клеток и для стволовых клеток взрослого организма показана в экспериментах на животных (Lamba D.A., Karl M.O., Ware C.B., Reh T.A. Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells // PNAS, 2006, v.103, n.34, pp.12769-12774. Meyer J.S., Katz M.L., Maruniak J.A., Kirk M.D. Embrionic stem cell-derived neural progenitors incorporate into degenerating retina and enhance survival of host photoreceptora // Stem Cells, 2006, v.24, n.2, pp.274-283. Fiedlander M. Fibosis and diseases of the eye // J. Clin. Invest., 2007, v.117, n.3, pp.576-586), хотя многие из механизмов реализации терапевтического эффекта изучены не до конца.
2. Используют МСК, меченные магнитными микрочастицами, в комбинации с экстрасклеральной имплантацией в проекции макулярной зоны магнитного материала с индукцией постоянного магнитного поля 3 мТл, с многополюсным реверсивным намагничиванием, что обеспечивает удержание и равномерное распределение МСК в патологическом очаге в течение времени, необходимого для достижения лечебного эффекта, за счет взаимодействия магнитных полей микрочастиц и магнитного материала экстрасклерального имплантата.
Способ осуществляется следующим образом.
На предварительном этапе экстрасклерально имплантируют магнито-лазерный имплантат в проекции макулярной области.
Магнито-лазерный имплантат выполнен из эластичного биоустойчивого полимера, например на основе полиорганосилоксана или силиконового каучука, покрытого гидрогелевым материалом, в форме плоской прямоугольной пластины длиной 20 мм, шириной 8 мм, толщиной 2 мм с одним закругленным концом. Внутри имплантата со стороны закругленного конца размещена плоская вставка, например, в форме эллипса или прямоугольника из магнитного материала, например, системы самарий-кобальт или ниодим-железо-бор с индукцией постоянного магнитного поля 3 мТл с многополюсным реверсивным намагничиванием. Площадь магнитной вставки составляет 1/3 от площади имплантата. Толщина магнитной вставки - 1 мм. Намагничивание магнитного материала вставки может быть произведено, например, как описано в патенте РФ №2187162. Внутри магнитной вставки размещена короткофокусная рассеивающая линза лазерного излучателя, оснащенная световодом для подключения к источнику лазерного излучения.
Магнито-лазерный имплантат имплантируют экстрасклерально следующим образом. В верхненаружном квадранте в 4 мм от лимба выполняют разрез конъюнктивы длиной 6 мм концентрично лимбу и с помощью шпателя формируют туннель в субтеноновом пространстве по направлению к заднему полюсу глаза. В туннель вводят магнито-лазерный имплантат, при этом с помощью шпателя производят склерокомпрессию для локализации положения имплантата при постоянном контроле с помощью бинокулярного офтальмоскопа. Магнитную вставку с рассеивающей линзой лазерного излучателя, расположенную на дистальном конце имплантата, размещают в зоне проекции макулярной области сетчатки. Проксимальный конец имплантата фиксируют к склере в экваториальной области двумя узловыми швами. Конъюнктиву ушивают непрерывным швом.
После завершения экстрасклеральной имплантации выполняют витрэктомию, удаляют заднюю гиалоидную и внутреннюю пограничную мембраны, производят замену жидкости на воздух. В среде воздуха в области верхней височной аркады в бессосудистой зоне с использованием иглы 41 gauge выполняют прокол сетчатки движением иглы в сторону макулы, к светящейся точке от линзы лазерного излучателя магнито-лазерного имплантата, имплантированного экстрасклерально, и субретинально, под мембрану Бруха, не повреждая хориоидею, вводят 0,1 мл аутологичных культивированных МСК собственного костного мозга, меченных магнитными микрочастицами.
2
3
7
МСК выращивают в культуре клеток костного мозга, взятых у пациента во время диагностической пункции из грудины или подвздошной кости (объем - 0,5-1,0 мл). Выращивание культуры проводят в специальном боксе для клеточных культур с использованием следующего оборудования - центрифуга с одноразовыми стерильными центрифужными пробирками на 50 мл, термостат воздушный, ламинарный бокс, инвертированный и обычный микроскопы, автоматические пипетки, баллоны с углекислым газом и воздухом, камеры Горяева для подсчета концентрации клеток. Для культивирования клеток исходного костного мозга используют стерильные одноразовые пластиковые культуральные флаконы с площадью дна в 25 и 150 см. При размножении МСК используют следующие среды и растворы: среда RPMI-1640, среда 199, антибиотики: пенициллин, амфотерицин, - раствор L-глютамина, эмбриональная телячья сыворотка. За 12-14 последовательных удвоений (в течение 25-30 суток) из исходного количества недифференцированных МСК, содержащихся в полученном пунктате костного мозга пациента и составляющем примерно 10клеток, продуцируется примерно (1-2)×10 МСК, необходимых для проведения успешной трансплантации стволовых клеток. Это количество клеток путем центрифугирования и четырехкратной отмывки освобожденное от культуральной среды взвешивается в 0,1 мл стерильного физиологического раствора и передается в операционную для введения пациенту - донору исходного костного мозга.
2
Метку МСК магнитными микрочастицами (⌀0,96 мкм) выполняют известным способом, например, как описано в: [Кониева А.А., Холоденко И.В., Шрагина О.А. и др. Функциональная оценка мезенхимальных стволовых клеток, меченных магнитными микрочастицами, in vitro и анализ их распределения в организме после трансплантации // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2010. - №3. - С.147-152]. По достижении 80-90% конфлюентности к культуре МСК добавляют суспензию магнитных частиц. Клетки инкубируют с частицами 24 ч в СO-инкубаторе. После инкубации культуральную среду меняют. Эффективность мечения МСК магнитными частицами по данной технологии составляет порядка 90%.
Магнито-лазерный имплантат удаляют через 1 неделю после имплантации.
Изобретение поясняется следующими данными.
Под наблюдением находилось 3 пациента (3 глаза) с «сухой» формой ВМД в возрасте от 64 до 75 лет. Острота зрения до лечения у пациентов варьировала от 0,08 до 0,12.
Пациенты были пролечены по предложенному способу.
На предварительно этапе экстрасклерально имплантировали магнито-лазерный имплантат в проекции макулярной области. В верхненаружном квадранте в 4 мм от лимба выполняли разрез конъюнктивы длиной 6 мм концентрично лимбу и с помощью шпателя формировали туннель в субтеноновом пространстве по направлению к заднему полюсу глаза. В туннель вводили магнито-лазерный имплантат, при этом с помощью шпателя производили склерокомпрессию для локализации положения имплантата при постоянном контроле с помощью бинокулярного офтальмоскопа. Магнитную вставку с рассеивающей линзой лазерного излучателя, расположенную на дистальном конце имплантата, размещали в зоне проекции макулярной области сетчатки. Проксимальный конец имплантата фиксировали к склере в экваториальной области двумя узловыми швами. Конъюнктиву ушивали непрерывным швом.
После завершения экстрасклеральной имплантации выполняли витрэктомию, удаляли заднюю гиалоидную и внутреннюю пограничную мембраны, производили замену жидкости на воздух. В среде воздуха в области верхней височной аркады в бессосудистой зоне с использованием иглы 41 gauge выполняли прокол сетчатки движением иглы в сторону макулы, к светящейся точке от линзы лазерного излучателя магнито-лазерного имплантата, имплантированного экстрасклерально, и субретинально, под мембрану Бруха, не повреждая хориоидею, вводили 0,1 мл аутологичных культивированных МСК собственного костного мозга пациента, меченных магнитными микрочастицами.
Во всех случаях магнито-лазерный имплантат удалили через 1 неделю после имплантации.
Через 12 месяцев после проведенного лечения у пациентов наблюдали следующие результаты терапии. Во всех случаях острота зрения повысилась (на 0,15, 0,2 и 0,32, соответственно), отмечено повышение фовеальной светочувствительности сетчатки по данным компьютерной периметрии, а также увеличение амплитуды а-волны и б-волны по данным макулярной электроретинограммы, которое свидетельствовало о повышении функциональной активности сетчатки. При исследовании гемодинамики у всех пациентов отмечалось увеличение средней скорости кровотока в глазничной артерии, центральной артерии сетчатки и в задних коротких цилиарных артериях.
Полученные результаты оставались стабильными в течение всего периода наблюдения. Сроки наблюдения составляют от 12 до 36 месяцев.
Таким образом, предложенный способ обеспечивает улучшение или стабилизацию зрительных функций у пациентов с «сухой» формой возрастной макулярной дегенерации.