ПЛАНКТОННЫЙ ШТАММ CHLORELLA VULGARIS, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПИЩЕВОЙ БИОМАССЫ
PLANKTONIC STRAIN OF CHLORELLA VULGARIS MEANT FOR PRODUCING FOOD BIOMASS

Область применения
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новый планктонный штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris, предназначенный для получения пищевой биомассы.
Уровень техники
Известен типовой штамм 132-1 Chlorella vulgaris f. suboblonga. Клетки эллипсоидные, 2,8-6,1 мкм длиной и 1,7-5,5 мкм шириной, при образовании автоспор 8,0 и 5,5 мкм соответственно. Оболочка тонкая. Хлоропласт широкий поясковидный незамкнутый или корытовидный. Положение хлоропласта может быть ориентировано по отношению к длинной оси клетки продольно или поперечно. Автоспоры по 2-4, реже по 8, сразу после освобождения неправильно эллипсоидные. Типовой штамм 132-1 хранится в Ботаническом институте РАН и является музейным образцом [Андреева В.М., 1975 (стр. 41)].
Известен штамм (прототип) одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris ИФР №С-111, предназначенный для получения биомассы и отвечающий требованиям промышленного культивирования (патент RU 1751981). Клеточная оболочка состоит из внутреннего и внешнего слоев, причем внешний слой содержит обширный миофибриллярный материал (Skaloud P. et al. 2014).
Недостатком штамма Chlorella vulgaris ИФР №С-111 является стойкий асинхронный цикл развития клеток, прочная и сравнительно толстая клеточная оболочка, а также длительный срок культивирования, который составляет четверо суток.
Раскрытие изобретения
Цель данного изобретения состоит в создании нового планктонного штамма микроводоросли для получения пищевой биомассы, использующейся как продукт питания в виде напитка, концентрата, пасты или сухого порошка.
Техническим результатом настоящего изобретения является получение штамма микроводоросли, обладающего тонкой оболочкой и способного активно продуцировать биомассу в синхронном режиме культивирования на модифицированной питательной среде с включением в ее состав раствора углекислого газа, полученного с использованием зерноматериала (голозерного овса), сокращение срока культивирования до одних суток, за которые хлорелла проходит два жизненных цикла, что позволяет ей набрать нормативную оптическую плотность суспензии в пределах 1,8-2,0 D (440).
Описание изобретения
Исходным для селекции Chlorella vulgaris GKO, депонированным во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ А1-24, был штамм Chlorella vulgaris ИФР №С-111 из коллекции Института физиологии растений РАН, который культивировался на питательной среде с включением в ее состав зерноматериала (голозерного овса) для получения раствора углекислого газа. Для достижения синхронной культуры использовалась автоматическая установка (патент RU 2540011).
В результате селекции был отобран штамм, наделенный тонкой оболочкой, способный интенсивно воспроизводить биомассу в синхронном режиме культивирования и поддерживать монокультуру в процессе производства.
Морфологические признаки. Клетки эллипсоидные, особенно молодые, 2,5 мкм длиной и 1,6 мкм шириной, взрослые клетки 5,4 мкм длиной и 4,2 мкм шириной, при образовании автоспор до 7,0 мкм длиной и 5,2 мкм шириной. Оболочка клеток тонкая. Хлоропласт корытовидный, положение его по отношению к длинной оси клетки может быть продольным или поперечным. При поперечном расположении хлоропласта он имеет вид незамкнутого пояска, при этом оба конца клетки остаются свободными, может выстилать только один конец клетки. Пиреноид широкоэллипсоидный, крахмальная обертка состоит из двух полусферических скорлупок. Обычно ядро в живых клетках не видно. Автоспор по 2 и реже по 4, сразу после освобождения имеют эллипсоидную форму. Число спор только четное. Пустая оболочка материнской клетки имеет один разрыв. На агаризированной минеральной среде на седьмой день на свету образуются выпуклые гладкие блестящие колонии с ровными краями. Диаметр колоний 1-2 мм, окрашены в темно-зеленый цвет, размер клеток 4,8 мкм длиной и 4,0 мкм шириной. Цвет клеток как молодых, так и взрослых темно-зеленый.
Физиологические признаки. Штамм автотрофный, в лабораторных условиях растет на модифицированной минеральной питательной среде, в состав которой входит раствор углекислого газа, приготовленного на основе голозерного овса. Состав питательной среды (1) следующий:
1. Аммиачная селитра, ГОСТ 2-2013 - 0,18 г.
2. Аммофос, ГОСТ 18918-85, 15% раствор - 0,09 мл.
3. Калий сернокислый, ГОСТ 4145-74, 12% раствор - 0,33 мл.
4. Железо хлорид, ГОСТ 4147-74, 1% раствор - 0,15 мл.
5. Кобальт азотнокислый, ГОСТ 4528-78, 0,01% раствор - 0,5 мл.
6. Медь сернокислая, ГОСТ 4165-78, 0,01% раствор - 0,5 мл.
7. Углекислый газ, раствор (рН 3-5) - 2,0-5,0 мл.
8. Водопроводная вода по СанПиН 2.1.4.1074-01 - 1000 мл.
В производственных условиях используется рабочая питательная среда, в которую входят растворы четырех составов химических реактивов и раствора углекислого газа, приготовленного на голозерном овсе. Состав рабочей питательной среды (2) на один литр водопроводной воды по СанПиН 2.1.4.1074-01 следующий:
1. Азотно-фосфорный - 0,25 мл.
2. Железисто-натриевый - 0,15 мл.
3. Медно-кобальтовый - 0,15 мл.
4. Сернокислого калия - 0,30 мл.
5. Углекислый газ, раствор (рН 3-5) - 2,0-5,0 мл.
Штамм не требует постоянного перемешивания, подачи баллонного углекислого газа и барботирования культуры воздухом.
2
Использование для культивирования хлореллы раствора углекислого газа, приготовленного на голозерном овсе, способствует поддержке в суспензии СО в процессе роста водорослей и образованию бактериально-альгологического микробиоценоза, что в значительной мере ускоряет протекание биологических процессов в экосистеме аквакультуры (Богданов Н.И., 1986).
Освещение культуры штамма производится лампами ДНаТ- или ДРИ-250. Учитывая, что можно использовать как солнечное, так и искусственное освещение, суточный ритм состоит из двух фаз, которые относятся к световой и темновой с различными периодами освещения. Первая фаза составляет 20 часов, вторая - 4 часа, при этом световая включает два равных периода по 10 часов. После первого светового периода (этапа фотосинтеза) на 4 часа отключается освещение лампами для исполнения режима темновой фазы - этапа образования спор и выхода их из материнской клетки. Учитывая, что культура работает в синхронном режиме, ей для спорообразования и деления клеток необходимо не менее 4 часов. За период темновой фазы автоспоры освобождаются и выходят из клеток в культуру, где они готовы к дальнейшему росту. Далее светильники включаются на 10 часов для исполнения второго периода световой фазы. Таким образом, в течение суток хлорелла проходит два жизненных цикла, что позволяет ей набрать нормативную оптическую плотность клеток.
Как при солнечном, так и при искусственном освещении оптимальная температура культуры во время световой фазы 28-30°С, как снижение температуры ниже 28°С, так и повышение выше 30°С приводит к задержке роста клеток в культуре. В темновой фазе температура может снижаться до 23-25°С.
Культуральные свойства. Штамм относится к планктонным, и клетки обладают свойствами, присущими этим водорослям, т.е. они находятся во взвешенном состоянии и свободно парят в водной толще, им свойственно равномерное распределение в культуральной среде, чему способствует наличие отрицательного заряда клеток.
Штамм культивируется круглый год, сезонных изменений не отмечается, в процессе выращивания подавляет патогенную микрофлору, дрожжи, грибы и вирусы, агглютинация не происходит, автолиз клеток не наблюдается, алкалоиды отсутствуют.
Штамм выращивается в условиях монокультуры, он строго соблюдает эти условия по отношению к прочим водорослям и обладает невосприимчивостью к фагам.
Биотехнологические свойства и особенности культивирования. Для культивирования штамма используется «Установка для выращивания планктонных водорослей и светильник установки для выращивания планктонных водорослей» (патент RU 2540011), которая позволяет использовать как искусственное, так и солнечное освещение. Установка содержит систему биореакторов хлореллы, реактор раствора углекислого газа, станцию подготовки питательного раствора, светильники в виде электроламп, снабженные системой охлаждения. Устройства заполнения, регулирования, мойки и дренажа размещены и подключены под системой секций биореактров. Емкости для приготовления питательного раствора и для сбора и хранения готовой суспензии соединены с аквариумами трубопроводами. Установка позволяет обеспечить процесс производства суспензии хлореллы в автоматическом режиме. Оптимальные условия культивирования, которые создаются в установке, позволяют за одни сутки получить нормативную оптическую плотность суспензии в пределах 1,8-2,0 D (440). Культивирование штамма ведется с соблюдением требований санитарии, однако создание условий стерильности не требуется.
Клетки в культуре чувствительны к динамическим ударам и погибают при механическом перемешивании культуры в установках с электрическими насосами, а также при барботировании культуры воздухом или углекислым газом. В установке, где культивируется хлорелла, не допускается соприкосновение суспензии с металлическими предметами, трубопроводы в установке должны иметь пищевую сертификацию. Культивирование штамма выполняется при строгом соблюдении биотехнологии выращивания хлореллы.
Культивирование планктонного штамма Chlorella vulgaris GKO с использованием раствора углекислого газа, приготовленного на основе голозерного овса, способствует получению пищевой биомассы и исключает постоянное перемешивание суспензии, причем без подачи баллонного углекислого газа и барботирования ее воздухом.
Пример получения пищевой биомассы
В емкости аквариумов установки (патент RU 2540011) вводят рабочую питательную среду (2) и маточную культуру планктонного штамма Chlorella vulgaris GKO с оптической плотностью 1,8-2,0 D (440) в соотношении 1:1. Включают освещение на 10 часов. В процессе культивирования температуру суспензии в аквариумах поддерживают на уровне 28-30°С. По истечении этого периода лампы отключают на 4 часа. По окончании 4 часов повторно включают лампы на 10 часов.
По окончании второго светового периода культуру сливают и используют как пищевую биомассу для приготовления напитка, концентрата, пасты или сухого порошка. За суточный период культивирования биомасса составляет 1,0 г/л сухого веса.
Следующие материалы иллюстрируют достижение цели. Получена пищевая биомасса в автоматической установке (патент RU 2540011) с использованием планктонного штамма Chlorella vulgaris GKO в процессе синхронного культивирования на рабочей питательной среде (2), которая за одни сутки достигла нормативного показателя по оптической плотности 1,8-2,0 D (440).
Штамм микроводоросли Chlorella vulgaris GKO успешно прошел этап лабораторного, экспериментального, полупромышленного, промышленного культивирования и используется для приготовления пищевых продуктов.
Таким образом, получен новый планктонный штамм микроводоросли Chlorella vulgaris GKO, обладающий тонкой оболочкой, способный активно продуцировать биомассу в синхронном режиме культивирования на модифицированной питательной среде с включением в ее состав раствора углекислого газа, приготовленного с использованием зерноматериала (голозерного овса), и предназначенный для получения пищевой биомассы, которая может быть использована для приготовления напитка, концентрата, пасты или сухого порошка.
Источники информации
1. Андреева В.М. Род Chlorella. Морфология, систематика, принципы классификации. Л.: «Наука», Ленингр. отд., 1975. - 110 с.
2. Патент РФ 1751981 от 14 декабря 1987, кл. 6 C12N 1/12. Штамм микроводоросли Chlorella vulgaris - продуцент биомассы. Богданов Н.И. 10.02.97. Бюл. №4.
3. Skaloud P., Nemcova Y., Pytela J., Bogdanov N.I., Bock С, Pickinpaugn S.H. Planktochlorella nurekis gen. et. sp. nov. (Trebouxiophyceae, Chlorophyta), a novel coccoid green alga carrying significant biotechnological potential. Fottea, Olomouc, 14 (1): 53-62, 2014.
4. Патент РФ 2540011 от 10 декабря 2013, кл. С12М 1/00. Установка для выращивания планктонных водорослей и светильник установки для выращивания планктонных водорослей. Грабарник В.Е., Карелин Н.В. 27.01.2015.
5. Богданов Н. И. Культивирование хлореллы и ее продуктивность в Таджикистане. Доклады АН Таджикской ССР. Том XXIX, №6. Душанбе, 1986. - С. 370-372.