ЖИДКАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ VIBRIO CHOLERAE ВО ФЛАКОНАХ И БУТЫЛЯХ
LIQUID NUTRIENT MEDIUM FOR CULTIVATION OF VIBRIO CHOLERAE IN MATRASSES AND BOTTLES

Изобретение относится к биотехнологии и касается усовершенствования состава питательной среды, пригодной для использования на начальных этапах технологии получения ИБП на основе V. cholerae. Для накопления, диагностики, идентификации и выращивания холерных вибрионов используют большое количество разнообразных питательных сред. Однако большинство из них в силу дороговизны, применения дефицитных компонентов, относящихся к пищевому сырью, трудоемкости и многоэтапности в приготовлении непригодно для использовании в технологии получения посевных материалов и посевных культур.
Предложенная нами питательная среда содержит набор относительно простых и доступных органических и неорганических соединений: лимонную кислоту, янтарную кислоту, калий фосфорнокислый двузамещенный, натрий фосфорнокислый двузамещенный, сульфат железа, сульфат магния, сульфат цинка, натрий хлористый, дистиллированную воду. Изобретение позволяет получить качественную и дешевую питательную среду для культивирования холерного вибриона.
Изобретение относится к биотехнологиии касается усовершенствования состава питательной среды для культивирования холерного вибриона при производстве медицинских иммунобиологических препаратов.
Для культивирования холерных вибрионов используют различные питательные среды (Лабинская А.С. Руководство по медицинской микробиологии, 2015). Большинство питательных сред, применяемые для культивирования возбудителя холеры в качестве основы содержат ферментативный (кислотный) гидролизат казеина или ферментативный гидролизат мяса крупного рогатого скота (КРС) по способу Хоттингера (Козлов Ю.А. Питательные среды в медицинской микробиологии, 1950; Виноградова И.Н. Производственные питательные среды / Руководство по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных болезней, 1962).
Основными недостатками указанных сред являются дороговизна, сложность и длительность их приготовления.
2
4
2
Наиболее широко используемой питательной средой для лабораторного культивирования микроорганизмов, в том числе и холерных вибрионов, является среда на основе гидролизата мяса говяжьего ферментативного. Содержание аминного азота в питательной среде составляет 0,10-0,12%, натрия хлористого (NaCl) 0,3-0,4%, натрия фосфорнокислого двузамещенного (NaHPO×12HO) - 0,1%, калия хлористого (KCl) - 0,02%. Данная питательная среда полноценна по аминокислотному составу и обеспечивает питательные потребности возбудителя холеры. Однако гидролизаты говяжьего мяса различных производителей зачастую значительно отличаются друг от друга как по качественному, так и количественному составу питательных веществ, что существенно влияет на ростовые характеристики питательных сред. Это связано, на наш взгляд, не только с техническими особенностями приготовления гидролизатов, но и с возможным использованием антибиотиков, гормонов и т.п. соединений на этапах выращивания КРС. Кроме того, питательные основы и среды отечественных производителей имеют достаточно непродолжительные сроки годности и часто даже после недлительного хранения (в пределах сроков годности) ростовые характеристики их значительно снижаются.
Так же необходимо отметить, что недостатком данной питательной среды является достаточно высокая стоимость и использование в составе пищевого сырья.
Целью настоящего изобретения является разработка качественной более дешевой питательной среды контролируемого состава (которая бы обеспечивала накопительный эффект), характеризующейся простотой приготовления и не имеющей дефицитных компонентов, представляющих пищевую ценность.
Техническим результатом изобретения является создание новой питательной среды для культивирования холерных вибрионов, не уступающей по своим ростовым свойствам питательным средам основе белков животного происхождения и отличающейся более стандартными и воспроизводимыми результатами при получении биомассы. Экономический эффект от использования изобретения заключается в снижении себестоимости конечного продукта - иммунобиологических препаратов.
Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что питательная среда содержит нижеперечисленные химические ингредиенты вследующем соотношении, г/л:
лимонная кислота
3,0
янтарная кислота
3,0
калий фосфорнокислый двузамещенный
2,0
натрий фосфорнокислый двузамещенный
3,0
сульфат железа
0,05
сульфат магния
0,6
сульфат цинка
0,03
натрий хлористый
1,5
дистиллированная вода
до 1 литра
Питательную среду для выращивания холерного вибриона готовят следующим способом. Лимонную и янтарную кислоты, калий фосфорнокислый двузамещенный, натрий фосфорнокислый двузамещенный, сульфат железа, сульфат цинка, натрий хлористый последовательно растворяют в дистиллированной воде и с помощью 20% раствора натрия гидроокиси устанавливают рН 7,5±0,2. После этого в раствор вносят сульфат магния и добавляют дистиллированную воду до необходимого объема среды.
Питательную среду разливают во флаконы объемом 100 мл по 50 мл и в бутыли объемом 20 л по 10 л. Стерилизацию проводят в автоклаве при 0,5 атм в течение 30 мин.
Сравнительную оценку качества предлагаемой питательной среды проводят согласно нормативным документам (Инструкция по бактериологическому контролю диагностических питательных сред для холерного вибриона). Для определения качества питательных сред используют культуру тест-штамма V. cholera не O1 Р-9741. Для этого культуру, хранившуюся на полужидком агаре, высевают в 1% пептонную воду или бульон Мартена рН 7,7±0,1 и инкубируют при температуре 37±1°С в течение 3-5 часов. Затем культуру высевают бактериологической петлей на чашку с агаром Хоттингера рН 7,7±0,1 (1 пассаж).
Через 18-20 ч роста с поверхности агара отбирают типичные по морфологии колонии холерных вибрионов, пересевают их на агаровые пластинки и инкубируют при температуре 37±1°С в течение 3-5 часов (2-пассаж).
9
-7
Для контроля питательных сред готовят взвесь вибрионов в 0,9%-м растворе натрия хлорида с рН 7,2±0,1, соответствующую 10 единицам по стандартному образцу мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича (ОСО 42-28-85П), эквивалентную 2,2×10 м.к./мл. Приготовленную взвесь в объеме 1,0 мл стерильной пипеткой переносят в пробирку, содержащую 1,2 мл стерильного 0,9%-ого физиологического раствора натрия хлорида. Затем осуществляют десятикратные последовательные разведения, перенося 0,5 мл взвеси холерных вибрионов в пробирки, содержащие 4,5 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида до разведения 10.
-6
-7
Культурой холерных вибрионов из разведений 10 и 10 (что соответствует содержанию 100 и 10 м.к.) стерильной бактериологической пипеткой засевают по 0,1 мл по 3 флакона опытной и контрольной сред. В качестве контрольной используют заранее проверенную высококачественную 1% пептонную воду, приготовленную на дистиллированной воде. Посевы инкубируют при температуре 37±1°С в течение 6 ч, после чего из каждого флакона петлей №5 осуществляют высев на чашку Петри с заранее поверенной высококачественной плотной питательной средой. Выращивание производят при температуре 37±1°С в течение 12-18 ч.
-6
-7
Согласно нормативным документам жидкая питательная среда считается пригодной в том случае, если при посеве 100 м.к. (разведение 10) и 10 м.к. (разведение 10) тест-штамма в 100 мл через 6 ч выращивания и последующего высева на агаровые пластинки вырастают соответственно не менее 10 и 1 колонии. Оценку ростовых свойств питательной среды проводят путем подсчета количества выросших колоний холерного вибриона при посеве содержимого флаконов на пластинки с плотной питательной средой.
Пример 1. Тест-штамм выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: кислоту лимонную 1,5; кислоту янтарную 1,5; калий фосфорнокислый двузамещенный 2,0; натрий фосфорнокислый двузамещенный 3,0; железа сульфат 0,05; магния сульфат 0,6; цинка сульфат 0,03; натрий хлористый 1,5; дистиллированную воду до 1 л. При таком соотношении ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинках агара, для холерного вибриона высеянных из флаконов при посевной дозе 100 и 10 м.к., составило соответственно 15 и 2 колонии.
Пример 2. Тест-штамм выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: кислоту лимонную 3,0; кислоту янтарную 3,0; калий фосфорнокислый двузамещенный 2,0; натрий фосфорнокислый двузамещенный 3,0; железа сульфат 0,05; магния сульфат 0,6; цинка сульфат 0,03; натрий хлористый 1,5; дистиллированную воду до 1 л. При таком соотношении ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинках агара, для холерного вибриона высеянных из флаконов при посевной дозе 100 и 10 м.к., составило соответственно 29 и 6 колонии.
Пример 3. Тест-штамм выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: кислоту лимонную 4,5; кислоту янтарную 4,5; калий фосфорнокислый двузамещенный 2,0; натрий фосфорнокислый двузамещенный 3,0; железа сульфат 0,05; магния сульфат 0,6; цинка сульфат 0,03; натрий хлористый 1,5; дистиллированную воду до 1 л. При таком соотношении ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинках агара, для холерного вибриона высеянных из флаконов при посевной дозе 100 и 10 м.к., составило соответственно 19 и 2 колонии.
Полученные результаты позволили определить оптимальный вариант питательной среды жидкой для культивирования холерного вибриона (пример 2). Питательная среда технически проста в приготовлении (без предварительного этапа подготовки основы), не содержит дорогостоящих ингредиентов.
3
Основной этап оценки предусматривал использование заявленной питательной среды в реальных условиях при получении посевных материалов и посевных культур холерных вибрионов во флаконах объемом 100 мл и бутылях объемом 20 л в условиях аэрации. Для этого исходную культуру холерных вибрионов в количестве 0,1-0,2 мл стерильно вносили во флаконы с жидкой питательной средой и выращивали в статических условиях при температуре 37±1°С в течение 18-24 ч. Затем посевной материал из флаконов в объеме около 500 мл стерильно с помощью вакуума вводили в 20-литровые бутыли, которые инкубировали с аэрацией (не менее 10,0 дм воздуха в минуту на объем среды) при температуре 37±1°С в течение 18-20 ч. В качестве контроля параллельно осуществляли приготовление посевных материалов и посевных культур с использованием жидкой питательной среды из гидроли-зата говяжьего мяса в аналогичных условиях.
Необходимо отметить, что процесс приготовления посевных культур (в бутылях с аэрацией) с использованием питательной среды из гидролизата говяжьего мяса (как и других сред, имеющих белковую основу) неизменно сопровождается пенообразованием, которое может повлечь за собой загрязнение как самой культуры, так и систем подачи воздуха и вакуума. Для предотвращения этого в питательную среду добавляли пеногаситель - стерильное растительное масло. В случае использования заявленной питательной среды введения пеногасителя не требуется, т.к. пенообразования не наблюдается.
По окончании инкубирования из каждой бутыли с посевной культурой отбирали пробу и осуществляли высев последовательных десятикратных разведений на чашки Петри с заранее поверенной высококачественной плотной питательной средой.
Показано, что прикультивировании V. cholerae Р-9741 во флаконах и бутылях на заявленной питательной среде было получено на 25-35% больше биомассы, чем на питательной среде из гидролизата мяса говяжьего ферментативного.
Показатель эффективности среды, содержащей лимонную и янтарную кислоты, калий фосфорнокислый двузамещенный, натрий фосфорнокислый двузамещенный, железа сульфат, магния сульфат, цинка сульфат, натрий хлористый, дистиллированную воду выше по сравнению со средой, полученной на основе гидролизата мяса говяжьего ферментативного. Увеличение выхода биомассы микроорганизмов обусловлено введением лимонной и янтарной кислот, а также более полноценному и сбалансированному солевому составу, которые способствуют повышению обмена веществ и росту клеток. Кроме того, органические кислоты улучшают растворимость химических ингредиентов и более полно обеспечивают питательные потребности холерных вибрионов.
Таким образом, предлагаемая питательная среда включает комплекс легкоусвояемых органических кислот и неорганических соединений, обеспечивает полноценную замену питательным средам на основе гидролизата мяса говяжьего ферментативного при культивировании холерных вибрионов. При этом использование в питательной среде относительно дешевых и доступных органических и неорганических соединений позволяет существенно сократить себестоимость питательной среды без потери ее эффективности.
Предлагаемая питательная среда обеспечивает получение необходимых выходов биомассы и создание требуемых посевных доз на начальных этапах производства иммунобиологических препаратов.