СПОСОБ ПОДГОТОВКИ МИЦЕЛИЯ БАЗИДИОМИЦЕТОВ ДЛЯ МИКОРИЗАЦИИ ПОЧВЫ ПРИ ИСКУССТВЕННОМ ВЫРАЩИВАНИИ ХВОЙНЫХ РАСТЕНИЙ
METHOD FOR PREPARATION OF MYCELIUM OF BASIDIOMYCETES FOR SOIL MYCORIZATION IN ARTIFICIAL CULTIVATION OF CONIFEROUS PLANTS

Данное изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, экспериментальной и прикладной микологии, и представляет собой способ подготовки мицелия базидиомицетов для микоризации почвы при искусственном выращивании хвойных растений.
Восстановление лесных насаждений хвойных пород является важной научно-экологической задачей, решающей проблему восстановления разрушенных экосистем, увеличения концентрации кислорода в атмосфере Земли. Естественное восстановление -длительный процесс, который происходит за счет подростания молодняка в лиственных ярусах, поэтому здесь необходимо вмешательство человека. Выращивание хвойных деревьев в питомниках требует создания специальных условий для улучшения приживаемости саженцев. Метод микоризации почвы обеспечивает формирование симбиоза микоризного гриба с корнем растения. Микориза способствует лучшей приживаемости сеянцев за счет улучшения физиолого-химического состояния растений. [Дармов И.В., Савиных Н.П., Пересторонина О.Н. Оценка перспектив создания биопрепарата для микоризации сеянцев Pinus sylvestris применительно к эколого-географическим условиям Кировской области // Сохранение лесных экосистем: проблемы и пути их решения. - 2017. - С. 50-56.].
Все вышесказанное обосновывает целесообразность разработки способа подготовки мицелия с целью использования его для микоризации почвы при искусственном выращивании хвойных растений.
В настоящее время используется ряд способов искусственной микоризации сеянцев хвойных. В питомниках открытого грунта используется метод микоризации почвой, которую берут из насаждений соответствующих лесных пород. Суть данного способа заключается в том, что перед посадкой сеянцев на поверхность гряды помещают слой микоризованной естественным способом почвы, толщиной не менее 10 см. Минусом данного метода является низкая эффективность микоризации, использование большого объема почвы, вероятность занесения с почвой патогенов [Бурцев Д.С. Зарубежный опыт искусственной микоризации сеянцев лесных древесных пород с закрытой корневой системой // Труды Санкт-Петербургского научно-исследовательского института лесного хозяйства. - 2014. - №. 1. - С. 47-61.; Landis, T.D. The container tree nursery manual. The biological component: nursery pests and mycorrhizae / T.D. Landis - USA, Washington, DC: US department of agriculture, forest service, 1989. - 171 p.].
3
Еще один способ микоризации - микоризация спорами. Для подготовки материала для микоризации необходимо только что собранные плодовые тела грибов промыть, измельчить на кусочки размером 1-3 см и поместить в центрифугу. Полученной смесью обработать семена, либо сам грунт через 6-12 недель после посадки семян. Этот метод имеет ряд недостатков: необходимость проводить сбор плодовых тел; а также короткие сроки хранения материала, содержащего споры [Garbaye, J. Effect of mycorrhizospheric microorganism on ectomycorrhizal infection of Pinus radiata / J. Garbaye, G.D. Bowen // 7th North American Conference on Mycorrhizae. - Gainesville, FL: University of Florida. - 1987. -P. 196; Kormanik, P.P. Influence of endomycorrhizae on growth of sweetgum seedlings from eight mother trees / P.P. Kormanik, W.C. Bryan, R.C. Schultz // Forest Science. - 1977. - №23. - P. 500-506.; Linderman, R.G. Mycorrhizal interactions with rhizosphere microflora: The mycorrhizosphere effect / R.G. Linderman // Phytopathology. - 1988. - №78. - P. 366-371.].
Наиболее близким к заявленному изобретению является способ микоризации хвойных растений мицелием. Преимуществом данного способа является то, что используется чистая культура эктомикоризного гриба [Molina, R. Isolation, maintenance and pure culture manipulation of ectomycorrhizal fungi / R. Molina, J.G. Palmer // Methods and principles of mycorrhizal research. - St. Paul, MN: American Phytopathological Society. - 1982. - P. 115-129]. Кроме того, мицелиальная культура гриба имеет более длительные сроки хранения - до 6 месяцев в жидком виде и до нескольких лет в замороженном в криопротекторных средах состоянии [Hung, L.L. Temperature and time in storage influence the efficacy of selected isolates of fungi in commercially produced ectomycorrhizal inoculum / L.L. Hung, R. Molina // Forest Science. - 1986a. - №32. - P. 534-545.].
Однако в литературе нет стандартной методики подготовки мицелия для микоризации почвы при искусственном выращивании хвойных растений, которая может быть использована для широкомасштабного применения с целью восстановления все уменьшающихся лесных массивов. Все это обосновывает актуальность работы.
Технический результат изобретения - разработка способа подготовки мицелия базидиомицетов для микроризации почвы при искусственном выращивании хвойных растений.
Технический результат достигается путем отработки методики гомогенизации мицелиальных культур базидиомицетов, перспективных в качестве микоризообразователей хвойных деревьев, и определения оптимального разведения суспензии гомогенизированных мицелиальных культур относительно их исходной концентрации.
В работе использовали мицелий базидиомицетов трех видов грибов, которые по морфологическим признакам были идентифицированы как Tricholoma equestre (зеленушка), Lactarius rufus (горькушка) и Suillus bovinus (козляк).
Выделение мицелия проводили следующим образом. Плодовые тела базидиомицетов промыли сначала в проточной, а затем в стерильной воде, обработали 95% этиловым спиртом с последующим фламбированием. После этого плодовое тело каждого гриба надрезали прокаленным скальпелем в нижней части ножки вдоль волокон и расщепляли в направлении разреза вместе со шляпкой. Из места перехода ножки в шляпку (наиболее толстое и стерильное место), вырезали кусочек волокон гриба длиной несколько миллиметров и помещали на плотную питательную среду. Культивирование материала проводили на сусло-агаре в течение 3-5 суток при температуре 25±1°С.
Культивирование мицелия опытного и контрольного образцов проводили на чашках Петри с сусло-агаром, содержащим пивное сусло в концентрации 8° по Баллингу, в термостате («Термостат ТС-200 СПУ», Россия) при температуре 25±1°С в течение 5 суток. В качестве контроля использовали готовый препарат мицелия белого гриба Boletus pinophilus («Грибное лукошко», Россия). Анализ культур осуществляли путем визуальной оценки морфологии колоний.
Измельчение кусочков мицелия осуществляли на гомогенизаторе («SilentCrusherM», Украина).
Для стандартизации процесса, после гомогенизации полученную суспензию мицелия доводили до стандарта мутности ОСО 42-28-85-2014 10 ME (ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России).
Микроскопию цельного и измельченного после гомогенизации мицелия проводили в камере Горяева, используя микроскоп «Микмед-5» (Россия) под иммерсией при увеличении ×1500. При этом для каждого образца мицелия камеру заполняли суспензией препарата три раза и просматривали под микроскопом 5 больших квадратов (80 малых).
Учет концентрации фрагментов мицелия проводили до и после гомогенизации в камере Горяева по формуле (1):
3
3
3
3
3
2
где М - концентрации фрагментов мицелия в 1 см (далее по тексту - фр./см); а среднее число фрагментов мицелия в малом квадрате камеры Горяева; 10 - коэффициент перевода мм в см; h - глубина камеры, мм (0,1±0,004 мм); S - площадь малого квадрата сетки, мм (0,025±0,004 мм2); n - разведение исследуемой суспензии.
Для оценки жизнеспособных и нежизнеспособных фрагментов, полученных в результате гомогенизации гиф, использовали краситель - трипановый синий («ApplliChem», Германия). Кроме этого, с целью оценки жизнеспособности проводили посев фрагментов гиф на почвенный субстрат («Грунт питательный для хвойных растений», «Буйский химический завод», Россия), тем самым, приближая эксперимент к естественным условиям среды обитания мицелия. Перед посевом проводили стерилизацию грунта в сухожаровом шкафу (ШСС-80п, Россия). Режим стерилизации - 60 мин при 180°С.
На первом этапе исследования получили мицелиальные культуры базидиомицетов, являющиеся перспективными микоризообразователями хвойных деревьев.
Анализ выросших культур осуществляли путем визуальной оценки морфологии колоний по следующим признакам: характеру роста (наличию разрастания мицелия вокруг посевного материала, краю колоний); по преобладанию воздушного мицелия, над субстратным мицелием, его цвету, особенности спороношения; цвету субстратного мицелия. Препараты мицелия для микроскопии готовили путем нанесения капли воды на заранее приготовленное предметное стекло, после чего в нее помещали кусочек мицелия и накрывали препарат покровным стеклом. При микроскопии оценивали наличие пряжек, как показатель принадлежности к базидиомицетам.
На втором этапе провели отработку режимов подготовки выделенного мицелия эктомикоризообразующих грибов, которым планировалось обрабатывать почву при выращивании сеянцев хвойных деревьев в искусственных условиях.
Для этого мицелий каждого гриба, выросший на питательной среде в чашке Петри, смывали 10 мл раствора натрия хлорида с рН 7,2-7,4. Полученные суспензии гомогенизировали, используя различные режимы: 5000, 8000 и 11000 об/мин в течение 2 мин.
Процесс гомогенизации обеспечивает измельчение длинных нитей мицелия и помогает добиться увеличения концентрации жизнеспособных фрагментов гиф, каждый из которых может дать начало новой мицелиальной культуре.
Для оценки различных способов гомогенизации проводили анализ доли жизнеспособных и нежизнеспособных фрагментов мицелия. Для этого к полученной после гомогенизации суспензии мицелия, доведенной до концентрации стандарта мутности ОСО 42-28-85-2014 10 ME, добавляли 0,5%-ный раствор трипанового синего, смешивая суспензию мицелия с раствором красителя в объемном соотношении 1:1. При этом мертвые фрагменты мицелия окрашивались в синий цвет, а жизнеспособные оставались бесцветными. В рамках данного исследования подсчитывали только неокрашенные (живые) фрагменты.
Исходя из результатов исследования, представленных в таблице, в качестве наиболее перспективного был выбран режим гомогенизации 8000 об/мин в течение 2 мин. Данный режим приводил к достоверному увеличению концентрации жизнеспособных фрагментов мицелия у штаммов грибов Т. equestre и L. rufus. Режим гомогенизации 5000 об/мин в течение 2 мин не обеспечивает достоверного увеличения количества фрагментов. Режим 11000 об/мин в течение 2 мин, по-видимому, оказывает повреждающее действие, что приводит к уменьшению концентрации жизнеспособных фрагментов и увеличению нежизнеспособных. Концентрация жизнеспособных фрагментов мицелия гриба S. bovinus достоверно не отличалась до и после гомогенизации при различных режимах. Возможно, это связано с тем, что данный вид образует большое количество спор, которые свободно растворяются в суспензии без дополнительной обработки.
Кроме оценки концентрации жизнеспособных фрагментов мицелия методом микроскопии, проводили анализ эффективности использования выбранного способа гомогенизации путем высева суспензии мицелия исследуемых грибов Т. equestre, L. rufus, S. bovinus на почвенный субстрат.
Для этого выросший мицелий каждого гриба смывали с чашки Петри 10 мл пивного сусла в концентрации 8° по Баллингу и подвергали гомогенизации при выбранном на предыдущем этапе работы режиме - 8000 об/мин в течение 2 мин. В качестве контроля использовали суспензию мицелия каждого гриба без гомогенизации.
-4
5
-6
-6
-7
-8
Для стандартизации процесса суспензию мицелия без гомогенизации и с гомогенизацией доводили до стандарта мутности ОСО 42-28-85-2014 10 ME, разводя полученные суспензии 0,9% раствором натрия хлорида. Далее проводили подсчет количества жизнеспособных гиф в камере Горяева и делали ряд десятикратных разведений. Высевы осуществляли из 4, 5, 6 разведений (10, 10-, 10) для мицелия грибов рода Т. equestre, L. Rufus; из 6, 7, 8 (10, 10, 10) разведений - для S. bovinus; по 7,5 мл каждого вида суспензии на 25 г почвы, добиваясь ее равномерного увлажнения. Для каждой концентрации мицелия, каждого вида гриба засевали по три чашки. Результат оценки концентрации жизнеспособных фрагментов мицелия до и после гомогенизации при посеве на чашки Петри с почвой представлен в таблице 2.
Анализируя результаты таблицы 2, можно сделать вывод о том, что гомогенизация
при режиме 8000 об/мин в течение 2 мин обеспечивает как достоверное увеличение (р≤0,05) жизнеспособных фрагментов мицелия грибов Т. equestre, L. rufus, так и приводит к увеличению количества колоний при посеве мицелия на почву. Концентрация мицелия в каждом конкретном случае была пропорциональна выросшим на почве колониям. Гомогенизация незначительно повлияла на увеличение количества жизнеспособных фрагментов S. bovinus.
При искусственном внесении в почву мицелия перспективных для микоризообразования грибов с целью улучшения развития и роста сеянцев хвойных деревьев очень важным является концентрация внесенного биопрепарата-микоризообразователя. Это следует и из таблицы 2 - при внесении в почву высокой концентрация мицелия отмечается массивный рост мицелия в виде сплошного роста. Внесение высокой концентрации мицелия в почву может негативно повлиять на рост и приживаемость растений, а слишком низкая - снизить вероятность образования эктомикоризы.
На следующем этапе работы опытным путем были определены наиболее оптимальные концентрации суспензий мицелия исследуемых грибов, вносимых в почву. Для этого мы повторили опыт, результаты, которого представлены в таблице 2, но использовали более широкий диапазон концентраций.
Выросший на чашках Петри мицелий каждого гриба смывали с питательной среды 10 мл пивного сусла в концентрации 8° по Баллингу и гомогенизировали при 8000 об/мин в течение 2 мин. Далее доводили концентрацию мицелия до стандарта мутности ОСО 42-28-85-2014 10 ME и проводили подсчет фрагментов гиф в камере Горяева.
7
3
7
3
10
3
-1
-9
-1
-3
-5
-7
-9
Исходная концентрация жизнеспособных фрагментов мицелия, определенная методом микроскопии, составила для Т. Equestre - 8,1±0,4⋅10фр./см, для L. Rufus - 8,3±0,2⋅10 фр./см, для S. bovinus - 1,3±0,2⋅10 фр./см. Из суспензии каждого гриба с определенной концентрацией приготовили девять разведений - от 10 до 10. Из разведений 10, 10, 10, 10 и 10 проводили высев 7,5 мл сусла с мицелием на 25 г почвы, добиваясь ее равномерного увлажнения. Для каждой концентрации мицелия, каждого вида гриба засевали по три чашки.
2
3
2
3
Результат анализа данного этапа работы показал, что наиболее оптимальные значения концентраций жизнеспособных фрагментов мицелия в суспензии для внесения в почву и оценки влияния эктомикоризобразования на развитие сеянцев могут быть следующими: для Т. equestre - 8,1±0,4⋅10фр./см (5-е разведение), для L. rufus - (8,3±0,2)⋅10 фр./см (5-е разведение). Для S. bovinus по результатам данного опыта не удалось определить разведение. Можно предположить, следуя из таблицы 2, что это 8-е разведение. При внесении девятого разведения гриба выросло только 8 колоний, что является недостаточным для микоризации почвы. Данный факт мы учли в последующем при проверке правильности разработанного способа и представили ниже.
Таким образом, проведена отработка методики гомогенизации мицелия базидиомицетов, на примере мицелия, полученного из трех видов грибов. Определен оптимальный режим гомогенизации (8000 об/мин в течение 2 мин), обеспечивающий достоверное увеличение фрагментов мицелия, и разведения суспензий мицелия, относительно их исходных концентраций, которые обеспечивают получение оптимальной для внесения в почву концентрации препарата базидиомицетов для эктомикоризообразования.
Изобретение иллюстрируется примером, подтверждающим правильность разработанного способа подготовки мицелия базидиомицетов для микоризации почвы при искусственном выращивании хвойных растений, заключающегося в предварительной гомогенизации выращенного мицелия при 8000 об/мин в течение 2 мин.
Работу провели, используя три вида грибов: Т. equestre, L. rufus, S. bovinus. Выделение мицелия проводили по стандартной методике, представленной выше при описании отработки способа. Культивирование мицелия опытных и контрольного образцов проводили на чашках Петри с сусло-агаром, содержащим пивное сусло в концентрации 8° по Баллингу, в термостате при температуре 25±1°С в течение пяти суток. На пятые сутки мицелий каждого гриба смывали 10 мл пивного сусла в концентрации 8° по Баллингу и гомогенизировали при 8000 об/мин в течение 2 мин. Далее доводили полученные суспензии до стандарта мутности ОСО 42-28-85-2014 10 ME 0,9% раствором натрия хлорида, для простоты и стандартизации методики. Проводили подсчет фрагментов мицелия каждого гриба методом микроскопии в камере Горяева трехкратно в пяти больших квадратах до и после гомогенизации (таблица 4).
3
3
2
3
1
3
3
3
2
3
1
3
1
3
0
3
Из полученных исходных концентраций делали разведения, включая соседние, относительно выбранных выше (см. таблицу 3): для Т. equestre - 7,8±0,3⋅10 фр./см (4-е разведение), 7,8±0,3⋅10 фр./см (5-е разведение), 7,8±0,3⋅10 фр./см (6-е разведение), для L. rufus - 8,1±0,2⋅10 фр./см (4-е разведение), 8,1±0,2⋅10 фр./см (5-е разведение), 8,1±0,2⋅10 фр./см (6-е разведение); для S. bovinus - 10,2±0,1⋅10 фр./см (8-е разведение), 10,2±0,1⋅10 фр./см (9-е разведение).
Для посева на почвенный субстрат брали 7,5 мл каждой концентрации мицелия отдельно взятого вида гриба, и засевали на 25 г почвы в чашку Петри. Для каждой концентрации мицелия, каждого вида гриба засевали по три чашки.
Результаты оценки выросших на почве колоний из приготовленных концентраций мицелия представлен в таблице 4.
7
3
7
3
Данные, представленные в таблице 4, подтверждают положительное влияние отработанной методики гомогенизации (8000 об/мин в течение 2 мин) на процесс увеличения фрагментов мицелия, каждый из которых может являться источником роста нового базидиомицета. Достоверное увеличение фрагментов мицелия при выбранном режиме гомогенизации было отмечено в отношении видов Т. equestre и L. rufus. Оптимальным для высева на почву было определено 5-е разведение суспензии грибов относительно исходной концентрации, определенной для T. equestre ((7,8±0,3)⋅10фр./см) и L. rufus ((8,1±0,2)⋅10 фр./см). Из данных разведений соответствующих видов грибов выросло в первом случае 59, а во втором - 60 колоний, достаточное для эктомикоризообразования при искусственном выращивании хвойных деревьев.
9
3
При гомогенизации S. bovinus, несмотря на отсутствие достоверного увеличения фрагментов мицелия, наблюдался значимый рост колоний при восьмом разведении относительно исходной концентрации 10,2±0,1⋅10 фр./см - 76 колоний. Данный факт свидетельствует о ранее высказанном предположении в пользу наличия у данного вида большого количества спор, которые являются источником активного размножения.
Техническим результатом изобретения является разработка способа подготовки мицелия базидиомицетов для микроризации почвы при искусственном выращивании хвойных растений, который заключается в предварительной гомогенизации полученных мициалиальных культур при режиме 8000 об/мин в течение 2 мин и внесении их в определенном разведении относительно исходных концентраций в почву.