2
СПОСОБ ОЦЕНКИ ИНДУЦИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ НА СОДЕРЖАНИЕ S-ФОСФОЛИПАЗЫ A В ГОМОГЕНАТЕ ПЛАЦЕНТЫ В ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ ГЕСТАЦИИ
2
METHOD FOR ASSESSING INDUCING ACTION OF CYTOMEGALOVIRUS INFECTION ON PLACENTAL HOMOGENATE S-PHOSPHOLIPASE A IN THIRD TRIMESTER OF GESTATION

2
1. Цель изобретения - выявить, что при обострении цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации повышается активность S-фосфолипазы А в гомогенате плаценты, что создает угрозу повреждения фетоплацентарного барьера в период гестации.
2
2. Изобретение относится к медицине, а именно к разработке способа диагностики повреждения фетоплацентарного барьера при обострении цитомегаловирусной инфекции, ведущей к увеличению содержания S-фосфолипазы А в гомогенате плаценты.
3. Раскрытие изобретения
2
2
2
2
2
S-фосфолипаза А находится большей частью в тромбоцитах, а также в местах воспаления различных органов, особенно в синовиальных оболочках суставов, в миокарде при ишемической болезни [8, 11, 12]. Наличие в фосфолипазах окисленных форм жирных кислот увеличивает активность секреторных фосфолипаз, что предполагает их участие в регуляции вязкости мембран при окислительном стрессе. S-фосфолипаза А принимает участие при различных воспалительных заболеваниях [5, 6]. В большом количестве при воспалительных процессах в организме S-фосфолипаз А можно найти в моноцитах, макрофагах, фибробластах [2, 3, 10]. Активность фермента регулируется интерлейкинами 1 и 6, TNFα, интерфероном-α [4]. Под влиянием S-фосфолипазы А арахидоновая кислота выполняет синтез простаноидов [9], а также может стимулировать экспрессию циклооксигеназы-2 [1]. Окисленные фосфолипиды увеличивают активность S-фосфолипаз А [7].
4. Новая техническая задача
2
Определяя уровень содержания S-фосфолипазы А в гомогенате плаценты на третьем триместре гестации при обострении цитомегаловирусной инфекции, диагностируют повреждение фетоплацентарного барьера.
5. В доступной литературе аналогов по данному вопросу не отмечено.
6. Осуществление изобретения
6.1. Исследования проводились на базе акушерского отделения ФГБУ Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания СО РАМН. Обследовано 20 рожениц в возрасте 18-25 лет с хронической цитомегаловирусной инфекцией в стадии обострения (основная группа) и 10 беременных без патологии (контрольная группа). Диагноз обострения хронической цитомегаловирусной инфекции устанавливался при комплексном исследовании периферической крови на наличие IgM или четырехкратного и более нарастания титра антител IgG в парных сыворотках в динамике через 10 дней, индекса авидности (65%), а также наличия ДНК к ЦМВ.
6.2. Исследования проводились с учетом требований Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с учетом человека» с поправками 2008 г. и правилами клинической практики в Российской Федерации, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г.
6.3. Верификация ЦМВ, определение типоспецифических антител, индекса авидности осуществлялись методами ИФА на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» (USA) с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), методами ПЦР на аппарате ДТ-96 (Россия) с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).
2
2
6.4. S-фосфолипаза А выявлялась в гомогенате плаценты методом иммуноферментного анализа на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» (USA) с использованием набора Cayman Chemical sPLA (human Type II A) EIA.
6.5. Для получения гомогената плодовая часть плаценты (ворсинчатый хорион) срезалась скальпелем небольшими пластинками площадью до 2-3 см и толщиной 1 мм. Кусочки ткани помещали в химические стаканы, содержащие 200 мл физиологического раствора, отмывали от клеток крови, перемешивая на магнитной мешалке в течение 15 мин и подсушивали на фильтровальной бумаге. Затем ткань растирали пестиком в фарфоровой ступке и гомогенизировали до однородной массы. К полученному гомогенату добавляли физиологический раствор в объеме, равном изначальному весу ткани (на 1 г - 1 мл физиологического раствора). Гомогенат замораживали при -20°С в течение суток. Затем его размораживали и центрифугировали при 1500 g при температуре +4°С в течение 15 минут. Надосадочную жидкость разливали мелкими аликвотами и хранили при -20°С до проведения иммуноферментного анализа.
7. На гистологических срезах плаценты подсчитывали количество ядер в синцитиотрофобласте, находящихся в состоянии апоптоза с помощью иммуногистохимического ISEL-метода. Морфологическая классификация апоптоза на парафиновых срезах проводилась по метке концов фрагментов ДНК (in situ end labeling metod, ISEL) с инкубацией в смеси 4 нуклеотидов dATF, dGTF, dCTF biotin II dUTP, ДНК полимераза - E.Coli («Sigma», USA).
8. Статистическая обработка проводилась непарным параметрическим критерием Стьюдента и методом Фишера.
2
В процессе исследования установлено, что обострение хронической цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации связано с нарастанием в гомогенате плаценты S-фосфолипазы А.
2
При нарастании в гомогенате плаценты S-фосфолипазы А до 12,0±0,95 нг/мл (контроль 9,6±0,85 нг/мл) отмечается у беременной на третьем триместре гестации обострение цитомегаловирусной инфекции до титра 1:1600 к цитомегаловирусу, что приводит к увеличению содержания ядер в состоянии апоптоза до 3,0±0,15% (контроль - 0,5±0,02%).
Литература
2
1. Aarsman A., Neys F. Sera of patients suffering from inflammatory diseases contain group II A but not group V phospholipase A // Biochem Biophys. Acta. 2000. 1502; 257-263.
2
2. Altken M.A., Thomas T. Localization of type II phospholipase A messenger RNA and immunoactivity in human placenta and fetal membranes//Placenta. 1999. 17(7). 423-439.
2
3. Aviram M., Maori Phospholipase A - modified LDL is taken up at enhanced rate by macrophages // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. 185(1). 465-472.
4. Blascucei L.M., Vitelli A. Elevated, levels of interleukin-6 in unstable angina // Circulation. 1997. 96. 2099.
2
5. Boyanovsky В., Webb N.R. Biology of secretory Phospholipase A // Cardiovasc. Drugs. Ther. 2009. 23. 61-72.
2
6. Burk J.E., Dennis E.A. Phospholioase A Bichemistry. Cardiovase. Drugs Ther. 2009. 23. 49-59.
7. Chai Y.C., Binion D.G. Relationship of molecular structure to the mechanism of lysophospholipid-induced smooth muscule cell proliferation // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 2000. 279. H1830-38.
2
8. Elinder L.S., Dumitrescu A. Expression of phospholipase A isoforms in human normal and atherosclerotic arterial wall // Ateriscler. Thromb. Vase Biol. 1997. 17.2257-2263.
9. Fonteh A.N., Bass D.A., Marshall L.A. Evidence that secretory phospholipase A2 plays a role in arachidonic acid release and eicosanoid biosynthesis by mast cells // J. Immunol. 1994. 152(11). 5438-5446.
2
10. Jacobson P.S., Schrier D.J. Regulation of CD-I ib/CD18 expression in human neutrophils by phospholipase A // J. Immunol. 1993. 151. 5639-5652.
2
11. Menshikowski M., Hagelgans A., Siegert G. Secretory phospholipase A of II A is it an offensive or a defensive player during atherosclerosis other inflammatory diseases? // Prostaglandins. Other Lipid Medial. 2006. 79(1-2). 1-33.
2
12. Piek J., Winter R. Type II secretory phospholipase A. The emerging role of biochemical markers of plaque inflammation // J. Eur Heart 2002. 24. 1804-1806.