СПОСОБ ОБРАБОТКИ ЛИПОАСПИРАТА
METHOD FOR LIPOASPIRATE PROCESSING

Изобретение относится к медицине, а именно к регенеративной медицине, и может быть использовано для обработки жировой ткани, полученной при липосакции, для дальнейшего использования в качестве источника мезенхимальных стромальных клеток, стромальной васкулярной фракции жировой ткани, для липофилинга или криоконсервирования.
Трансплантация аутологичной жировой ткани нашла широкое применение для заполнения дефектов и увеличения объема мягких тканей (липофилинг), кроме того, жировая ткань является ценным источником мезенхимальных стромальных клеток, которые могут быть использованы для терапевтических целей.
Одной из наиболее острых проблем, связанных с использованием жировой ткани, является сохранение жизнеспособности ее клеточной фракции при заготовке, обработке, хранении и использовании ткани. Клеточная фракция жировой ткани представлена преадипоцитами, фибробластами, гладкомышечными клетками, эндотелиоцитами, резидентными моноцитами/макрофагами, лейкоцитами периферической крови и мезенхимальными стромальными клетками жировой ткани. Существенное негативное влияние на жизнеспособность клеток жировой ткани оказывает механическое воздействие на нее в процессе извлечения, отмывки, подготовки к криоконсервированию, заморозки, разморозки и введения. Влияние различных способов обработки жировой ткани на сохранность жизнеспособности ее клеточной фракции явилось предметом многочисленных исследований, вместе с тем помимо механического повреждения клеток существенное влияние на жизнеспособность клеточной фракции жировой ткани могут оказывать биологические факторы, в частности цитокины, выделяющиеся при дегрануляции тучных клеток.
В настоящее время известно несколько способов первичной обработки липоаспирата, направленных на отделение клеточной фракции жировой ткани от контаминирующих фракций, таких как свободный жир и эритроциты и получение продукта, пригодного для криоконсервирования, немедленного применения для липофилинга или получения из него клеточных продуктов.
Известен способ первичной обработки липоаспирата центрифугированием, способ осуществляют следующим образом: липоаспират помещают в пробирку, содержащую фосфатный буфер и центрифугируют 4 минуты при 500 g. Верхнюю (жир) и нижнюю (эритроциты) фракции удаляют, после чего жировую ткань переносят в мешки для криоконсервации (Chaput В, Orio J, Garrido I, De Bonnecaze G, Espagnolle N, Gadelorge M, Chavoin JP, Grolleau-Raoux JL, Casteilla L, Planat V, Bourin P. A clinical scalable cryopreservation method of adipose tissue for reconstructive surgery assessed by stromal vascular fraction and mice studies. Plast Reconstr Surg. 2014 Apr; 133 (4): 815-26)
Способ имеет следующие недостатки:
- центрифугирование оказывает существенное механическое повреждающее воздействие на клетки жировой ткани, снижая, таким образом, их жизнеспособность;
- способ не обеспечивает защиты клеточной фракции жировой ткани от повреждающего воздействия цитокинов, высвобождающихся при дегрануляции тучных клеток, присутствующих в жировой ткани.
Известен способ первичной обработки липоаспирата путем его отстаивания. Способ осуществляют следующим образом: шприцы с липоаспиратом оставляют в вертикальном положении на две минуты для отделения туменесцентной жидкости, после чего последнюю удаляют и оставляют шприцы еще на две минуты до фракционирования липоаспирата (Hoareau L, Bencharif К, Girard AC, Gence L, Delarue P, Hulard O, Festy F, Roche R. Effect of centrifugation and washing on adipose graft viability: a new method to improve graft efficiency. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2013 May; 66 (5): 712-9)
Способ имеет следующие недостатки:
- не обеспечивает полного удаления контаминирующих фракций из жировой ткани;
- не обеспечивает защиты клеточной фракции жировой ткани от повреждающего воздействия цитокинов, высвобождающихся при дегрануляции тучных клеток, присутствующих в жировой ткани.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу является способ первичной обработки липоаспирата путем его промывания. Способ осуществляют следующим образом: липоаспират из шприцев объемом 10 мл, которые использовали для получения липоаспирата, переносят в шприцы объемом 20 мл, в которые дополнительно добавляют изотонический раствор хлорида натрия, для получения жировой ткани, свободной от жира и крови, раствор хлорида натрия меняют один или два раза, после чего удаляют (Khater R, Atanassova Р, Anastassov Y, Pellerin P, Martinot-Duquennoy V. Clinical and experimental study of autologous fat grafting after processing by centrifugation and serum lavage. Aesthetic Plast Surg. 2009 Jan; 33 (1): 37-43).
Способ имеет следующие недостатки:
- не обеспечивает защиты клеточной фракции жировой ткани при ее подготовке к замораживанию, размораживании и трансплантации от повреждения, вызванного цитокинами, высвобождающимися при дегрануляции тучных клеток.
Техническим результатом предлагаемого способа является повышение жизнеспособности клеточной фракции жировой ткани при первичной обработке липоаспирата.
Указанный технический результат достигается тем, что в липоаспират до его отмывки добавляют 0,25% раствор кетотифена в дозе 1 мл раствора на 20 мл липоаспирата
Способ осуществляют следующим образом. Через анестезированную кожу делают небольшой (не более 0,5 см) разрез или прокол. После чего в подкожное пространство через канюлю вводят раствор Кляйна. Через 15 минут в подкожное пространство вводят 3-миллиметровую отсасывающую канюлю и аспирируют жировую ткань в шприц объемом 60 мл. Липоаспират сразу перемещают в туми-шприц, содержащий 0,25% раствор кетотифена из расчета 1 мл раствора на 20 мл липоаспирата. Шприц встряхивают 5-6 раз для перемешивания раствора кетотифена и липоаспирата. Липоаспират помещают в политетрафторэтиленовый мешок, в который добавляют 10% раствор реополиглюкина из расчета 100 мл раствора реополиглюкина на 100 мл липоаспирата, липоаспират и раствор реополиглюкина перемешивают путем проглаживания мешка, после чего жидкую фракцию сливают, процедуру повторяют 3 раза.
Изобретение иллюстрируется следующим примером.
Доброволец А., 57 лет. После подписания информированного согласия проводилась шприцевая липосакция в абдоминальной области с эстетической целью. 300 мл липоаспирата были помещены в 60 мл туми-шприцы, 3 из которых содержали по 3 мл 0,25% раствора кетотифена, а другие 3 туми-шприца содержали 3 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Шприцы немедленно транспортировали в лабораторию. В условиях ламинарного шкафа обработанные раствором кетотифена и контрольные образцы жировой ткани переносили в разные политетрафторэтиленовые мешки и отмывали путем добавления 150 мл 10% раствора реополиглюкина. Процедуру отмывки повторяли 3 раза. Отмытую жировую ткань из каждого мешка разделили на 6 равных частей по 25 мл, которые переносили в 50 мл пробирки и выделяли стромально-васкулярную фракцию клеток путем ферментативной обработки 0,15% раствором коллагеназы I типа в течение 30 минут. После этого производили подсчет и оценку жизнеспособности клеток. Стромально-васкулярная фракция клеток жировой ткани, предварительно обработанной раствором кетотифена, содержала 97,3 (96,8-98,1)% (медиана и межквартильный интервал) жизнеспособных клеток, что было значимо (р<0,05, критерий Вилкоксона) выше, чем в контроле, где процент жизнеспособных клеток составил 92,7 (92,3-94,0) (медиана и межквартильный интервал).
Применение способа позволит повысить клиническую эффективность применения жировой ткани и полученных из нее продуктов (стромально-васкулярной фракции, мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани).