Slow calcium channel visualization as a means of determination of sensor nerve ending structure

УДК 616.248:612.2:577.352.56

В.И.Кириченко, М.Т.Луценко, Н.Н.Дорофиенко

ВЫЯВЛЕНИЕ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ СЕНСОРНЫХ НЕРВНЫХ ОКОНЧАНИЙ ОРГАНОВ ДЫХАНИЯ С ПОМОЩЬЮ ВИЗУАЛИЗАЦИИ В НИХ МЕДЛЕННЫХ

КАЛЬЦИЕВЫХ КАНАЛОВ

Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания СО РАМН

РЕЗЮМЕ

С помощью новых методов идентификации кальциевых каналов, основанных на использовании солей металлов (Co2+, Mn2+, La3+) получена дополнительная информация о структуре афферентного нервного аппарата органов дыхания (лёгкие, бронхи) у животных (крысы) и человека на биопсийном материале слизистой оболочки бронхов при бронхиальной астме. Обсуждается современное представление о роли кальциевых каналов в функционировании чувствительных нервных окончаний органов дыхания.

SUMMARY V.I.Kirichenko, M.T.Lutsenko, N.N.Dorofienko

SLOW CALCIUM CHANNEL VISUALIZATION AS A MEANS OF DETERMINATION OF SENSOR NERVE ENDING STRUCTURE

New methods of calcium channel identification based on the metal salt use (Co2+, Mn2+, La3+) provide with additional information on afferent nerve apparatus structure of respiratory tract (lungs, bronchi) in animals (rats) and in patients with bronchial asthma. New concept of calcium channel role in respiratory sensor nerve ending functioning is being discussed.

Анализ современной научной литературы свидетельствует о резко возросшем интересе к проблеме Ca2+ и Ca^-каналов в мембранах возбудимых и невозбудимых клеток организма как в норме, так и при патологии [4, 5, 14, 21]. Это обстоятельство не является случайным, поскольку роль внутриклеточного кальция [Са2+] исключительно важна для нормальной жизнедеятельности практически всех клеточных элементов [1, 3, 6, 12, 15]. Более подробные сведения можно почерпнуть в ряде великолепных обзоров и монографий [2, 6, 7, 8, 13].

Следует лишь ещё раз подчеркнуть, что в результате физиологического, фармакологического, молекулярно-клеточного подходов к изучению кальциевой сигнализации в клетке достигнут весьма ощути-

мый прогресс в этой области науки.

В настоящий момент выяснены основные пути входа ионов Са2+ внутрь клетки из окружающей её среды по различным Са2+-каналам, которых насчитывается 6 (L, T, N, P, R, Q) и которые отличаются по своим электрофизиологическим и фармакологическим параметрам, а соответственно и по функциональной значимости для клетки [6, 26, 28]. Определена роль эндоплазматического/саркоплазматичес-кого ретикулума (ЭР/СР), ядра, митохондрий и каль-циосом клетки в мобилизации и иммобилизации Са2+ [8, 19, 20].

Начаты исследования по выделению разнообразных Са2+-каналов, изучению канальных белков и клонирование кДНК, кодирующих их субъединицы [22]. Установлены различные классы органических блокаторов Са2+-каналов [27]. Показано, что ионы

многих тяжелых металлов (La3+, Zn2+, Co2+, Fe2+, Mn2+, Ni2+, Cd2+) конкурируют с Са2+ за связывание в

канале [8, 16, 17, 23].

В месте с тем, несмотря на достигнутые успехи, структура Са2+-каналов и механизмы транспорта ионов Са2+ внутрь клетки, а также значение Са2+ в протекании тех или иных биохимических реакций в клеточной системе в норме и особенно при патологии остаются до конца невыясненными. Более того в литературе отсутствуют сведения морфологического характера о наличии Са2+-каналов в клетках как возбудимых, так и невозбудимых тканей.

Целью данного исследования является разработка методов морфологической идентификации медленных кальциевых каналов L-типа в сенсорных нервных структурах органов дыхания у животных и людей на биопсийном материале слизистой оболочки бронхов при бронхиальной астме (БА).

Материал и методы исследования

Материалом служили лёгкие беспородных крыс (10), подвергшихся в течении 30 суток воздействию низкой температуры (-15°С) в климатокамере (тип 3101, «Ilka») с влажностью воздуха от 70% до 80% по 3 часа ежедневно, а также биопсийный материал слизистой оболочки бронхов, взятый у больных бронхиальной астмой (5) до базисного лечения.

Рис. 1. Сенсорный нервный аппарат в интер-стиции и в стенке альвеолы лёгких крысы, подвергшейся воздействию низкой температуры (по 3 часа ежедневно) в течение 30 суток. Отмечается неравномерность диаметра по ходу нервных проводников и крупные варикозы. Кобальт-сульфидный метод (без докраски). Увеличение х 630.

Рис. 2. Рецепторный прибор компактного типа в висцеральной плевре лёгких крысы, подвергшейся воздействию низкой температуры (по 3 часа ежедневно) в течение 30 суток. Наибольшее количество осадка химической реакции имеется в толстом приводящем нервном волокне и варикозностях самого сенсорного нервного окончания. Марганец-ферроцианидный метод (без до-краски). Увеличение х 630.

В качестве маркёров (блокаторов) медленных Са2+-каналов Ь-типа использовали соли Со2+ и Мп2+ согласно прописям, предложенным нами ранее [4, 5]. При изучении биопсийного материала слизистой оболочки бронхов у больных БА в методику была внесена коррекция, заключавшаяся в том, что все манипуляции производили на нефиксированных срезах, изготовленных в криостате. Результаты при этом были вполне удовлетворительные.

Нам удалось разработать и внедрить в практику нейроморфологии новый метод (ноу-хау) выявления медленных Са2-каналов на базе использования солей Ьа3+. Известно, что катионы этих металов в силу близости их ионных радиусов (по Гольдшмидту - 0,122 нм, по Полингу - 0,115 нм, по Белову и Бокию -

0,104; в среднем - 0,114 нм) к таковому ионов Са2+ (0,103 нм) [10], весьма избирательно реагируют с Са2+-каналами. Морфологически это положение подтверждается. Результаты оказались существенно лучше.

Во всех случаях продукт реакции (малорастворимый осадок черного цвета) четко маркировал сенсорные нервные окончания и одиночные нервные проводники во всех тканевых и органных компонентах органов дыхания.

Результаты и обсуждение

Анализ нейрогистологических препаратов на светооптическом уровне свидетельствует о том, что сродство ионов Со2+, Мп2+ и Ьа3+ к нервным структурам очень высоко. При этом следует подчеркнуть тот факт, что при соблюдении всех процедур предлагаемых нами методов выявляются практически только

нервные структуры изученных органов, в то время как остальные тканевые компоненты (эпителий, соединительная ткань) остаются неокрашенными.

Надо полагать, что присутствие контрастных осадков химической реакции на поверхности нервных структур, относящихся к высоко возбудимым тканевым компонентам органов дыхания, приурочено прежде всего к медленным Са2-каналам. Считается, что сродство Са2 -каналов к катионам 2- и 3-валентных металлов обусловлено наличием карбоксильных групп (СОО), локализованных в селективных фильтрах самих каналов. Вместе с тем не следует исключать частичного проникновения ионов Со2+, Мп2+ и Ьа3+ в нейроплазму нервных структур. Таким образом продукт химической реакции в виде контрастного осадка может располагаться главным образом, в самой мембране аксолеммы (Са2+-каналы Ь-типа) и частично в нейроплазме.

Обращает на себя внимание тот факт, что плотность осадка в сенсорных нервных элементах резко возрастает при усилении их функционирования по сравнению с состоянием относительного покоя. Так, в лёгких крыс, подвергшихся воздействию низкой температуры в течение 30 суток (по 3 часа ежедневно), значительно увеличивается количество и качество выявляемых нервных структур, а также их контрастность. В интерстициальной ткани лёгкого и в стенках альвеол чётко выявляются одиночные нервные волокна типа В и С, формирующие хорошо выраженное нервное сплетение, различного диаметра ва-рикозности по их ходу, сенсорные нервные окончания в форме крупных наплывов нейроплазмы, что свидетельствует о раздражении афферентного нерв-

Рис. 3. Больной Г. Бронхиальная астма средней степени тяжести (до лечения). Афферентный нервный аппарат в интерстиции слизистой оболочки бронха (биопсийный материал). Интенсивно чёрный осадок продукта химической реакции приурочен к претерминальным нервным волокнам и терминальным расширениям рецепторных приборов. Метод с Ьа3+ (без докраски). Увеличение х 280.

Рис. 4. Больной Г. Бронхиальная астма средней степени тяжести (до лечения). Обширный чувствительный нервный прибор на гладкой мускулатуре слизистой оболочки бронха (биопсийный материал). Неравномерное распределение осадка в составе самого рецептора. Метод с Ьа3+ (без докраски). Увеличение х 280.

ного аппарата (рис. 1). По ходу некоторых тонких нервных проводников осадок располагается неравномерно: он обилен в области варикозностей (расширений) и едва виден в межварикозных участках.

Множество рецепторов компактного типа обнаружено нами в висцеральной плевре (рис. 2). В таких сенсорных приборах легко обнаружить толстое (типа В или А) приводящее нервное волокно, диаметр которого по его ходу варьирует, и терминальный отдел, представленный множественными натёками нейроплазмы различной величины, между которыми имеются нервные связи. Плотность продукта гистохимической реакции наиболее высока в расширениях нервной субстанции. Необходимо указать на то, что при проведении указанных выше методов лучше всего выявляется афферентная нервная формация по сравнению с эфферентной. В сенсорных же нервных структурах плотность осадка выше в рецепторных приборах и ниже в претерминальных отделах, а также в одиночных нервных проводниках.

Отсюда можно заключить, что наибольшей плотностью медленных кальциевых каналов Ь-типа обладают прежде всего чувствительные нервные окончания органов дыхательной системы. В период общего охлаждения организма сенсорные нервные приборы начинают прокрашиваться гораздо интенсивнее в результате открытия дополнительного количества Са2+-каналов, ибо в стрессовой ситуации возрастает функциональная нагрузка именно на рецепторный нервный аппарат.

В связи с указанным выше представляет значительный интерес исследование медленных Са2-каналов Ь-типа в сенсорных нервных структурах слизистой оболочки бронхов на биопсийном материале у

больных БА. Предварительный анализ гистохимических препаратов показал, что рецепторные нервные приборы, обладающие высоким сродством к ионам Ьа3+, имеют место во всех тканевых компонентах (в эпителиальном пласте, соединительной и мышечной тканях) слизистой оболочки бронха. Наибольшей плотностью продукта гистохимической реакции обладают различного размера натёки нейроплазмы, локализующиеся в терминальных отделах рецептора, а также концевые бляшки и одиночные, неравномерные по диаметру, нервные волокна (рис. 3).

Весьма распространены обширные, занимающие несколько полей зрения, чувствительные нервные окончания. Характерно, что плотность продукта гистохимической реакции в пределах такого диффузного рецептора неодинакова (рис. 4). Этот факт свидетельствует, по всей вероятности, о различном функциональном состоянии отдельных частей самого рецептора. Другими словами, в пределах одного и того же чувствительного нервного окончания плотность Са2-каналов в одно и тоже время варьирует.

Кроме диффузных сенсорных нервных приборов встречаются и компактные их формы. Терминальные отделы одних представлены различными по форме и величине расширениями нейроплазмы, соединенными нервными волокнами (рис. 5). Другие же чувствительные нервные окончания характеризуются наличием переплетения волокон типа В и С, а также кольцевидными структурами (рис. 6). В меньшем количестве здесь обнаруживаются варикозы и наплывы нейроплазмы. По-видимому диффузные чувствительные нервные окончания, снимающие информацию с обширных рецептивных полей (рецепторы с большими рецептивными полями) следует

Рис. 5. Больной Г. Бронхиальная астма средней степени тяжести (до лечения). Сенсорный нервный прибор в интерстициальной ткани слизистой оболочки бронха (биопсийный материал). Маркируются приводящие нервные волокна, а также концевые варикозы и бляшки рецептора. Метод с Ьа3+ (без докраски). Увеличение х 630.

отнести в большей степени к хеморецепторам или обменным рецепторам. Компактные же чувствительные нервные окончания (рецепторы с малыми рецептивными полями) выполняют в большей мере функцию механорецепторов, отвечающих на растяжение, а возможно и спадение бронхиальной стенки. Не исключена их бивалентная функция: механо-хеморецепторная. Наши исследования показывают, что сенсорный нервный аппарат всех тканевых компонентов слизистой оболочки бронхов у больных БА подвержен серьёзным структурно-функциональным изменениям, характеризующимися явлениями раздражения (неравномерным диаметром по ходу нервных проводников и наличием крупных варикозов в терминальном отделе), деструкции и фрагментации (отрывом терминалей), активации транспорта Са2+ через Са2-каналы в нейроплазму. Вопрос о том первичны ли эти изменения, т.е. связаны ли они с первичным нарушением структурно-функциональной организации афферентного нейрона, или же вторичны и зависят от воспалительного процесса, является до сих пор открытым.

Наши исследования, проведённые с помощью катионных блокаторов Са2+-каналов (Со2+, Мп2+, Ьа3+) и позволившие морфологически их идентифицировать в периферической нервной системе органов дыхания (лёгких, плевре, слизистой бронхов) у животных и человека при патологии (бронхиальной астме), свидетельствует о том, что наибольшей плотностью указанных каналов обладают чувствительные нервные окончания, т. е. терминальное афферентное звено рефлекторных дуг. Несколько меньшая плотность медленных Са2+-каналов отмечается по ходу претер-минальных отделов. Этот факт служит основанием

Рис. 6. Больной Ч. Бронхиальная астма средней степени тяжести (до лечения). Компактный рецепторный прибор в интерстициальной ткани слизистой оболочки бронха (биопсийный материал). Продукт реакции локализуется неравномерно в нервных волокнах и в концевых бляшках чувствительного нервного окончания. Метод с Ьа3+ (без докраски). Увеличение х 630.

для постулирования положения, согласно которому сенсорные нервные приборы афферентных нейронов, иннервирующих органы дыхания (и возможно другие органы) для своего нормального функционирования крайне нуждаются в притоке ионов Са2+ извне. Другими словами, в формировании потенциала действия (ПД) принимает участие на только натриевый ток 1Ма [9, 11], но и кальциевый ток 1Са. Согласно литературным данным [18] в теле некоторых нейронов моллюсков потенциал действия формируется преимущественно за счёт ионов Са2+. Не является ли кальциевый механизм образования потенциала действия более древним в эволюционном плане, нежели натриевый? Сосуществование в рецепторных приборах обоих механизмов создания потенциала действия приводит к своеобразию их функционирования. При этом удлинняется время самого потенциала действия за счёт более длительной фазы реполяризации (плато ПД) [16]. Это может создать условия для авторитми-ческой деятельности сенсорного нервного прибора, которая характеризуется множественными ответами рецептора на воздействие лишь одного стимула в результате понижения порогового потенциала. Не исключена роль кальциевого механизма в регуляции ритма импульсации при сравнительно низкой частоте, проницаемости для других ионов, например, К+ и т.д. Все эти вопросы нуждаются в дальнейшей разработке.

Весьма примечательно, что сенсорные нервные окончания слизистой оболочки бронхов больных БА весьма активны в отношении медленных кальциевых каналов Ь-типа, что свидетельствует об усиленном транспорте ионов Са2+ в нейроплазму варикозов рецепторных приборов. Механизмы активации каль-

циевых каналов до сих пор полностью не выяснены [2]. Согласно предположению ряда авторов [24, 25] Са2+-каналы могут существовать в состояниях «0», «1» и «2». В состоянии «0» каналы закрыты, в состоянии «1» канал открыт в течение короткого времени (1 мс - одно открывание) и в состоянии «2» канал открыт в течение длительного промежутка времени (до 20 мс). В покое превалируют состояния Са2+-каналов «0» и «1». У больных БА в сенсорном нервном аппарате слизистой оболочки бронхов Са2-каналы находятся по всей вероятности в состоянии «2». Факторы, способствующие переходу Са2+-каналов в состояние «2» до сих пор не ясны. По нашему мнению такими факторами могут быть, во-первых, генетическая несостоятельность белков Са2+-каналов и/или, во-вторых, Са2+-зависимое фосфори-лирование белковых субъединиц канала. Все эти вопросы нуждаются в дополнительных исследованиях.

ЛИТЕРАТУРА

1. Авдонин П.В., Ткачук В.А. Рецепторы и внутриклеточный кальций.-М.: Наука, 1994.-288 с.

2. Александрова Е.А. Кальцийтранспортирую-щие системы и регуляция концентрации кальция в кардиомиоцитах//Успехи физиол. наук.-2001.-Т.32, №3.-С.40-48.

3. Гусев Н.В. Внутриклеточные Са-связывающие белки Ч.1. Классификация и структура. Ч.2. Структура и механизм функционирования//Соросовский образовательный журнал.-1998.-Т.4, №5.-С.2-16.

4. Кириченко В.И. Структурная организация афферентного нервного аппарата лёгких на различных этапах постнатального онтогенеза в норме и при воздействии на организм низких температур (экспериментальное исследование): Автореф. дис. ...д-ра мед.наук.-Иркутск, 1994.-44 с.

5. Кириченко В.И., Луценко М.Т. Новые методы исследования в нейроморфологии//Бюл. физиол. и патол. дыхания.-1998.-Вып.1.-С.35-45.

6. Крутецкая З.И., Лионский А.В. Биофизика мембран.- СПб.: Изд-во СПбГУ.- 1994.- 288 с.

7. Крутецкая З.И., Лебедев О.Е. Механизмы сигнализации в клетках//Цитология.-2001.-Т.43, №1.-

С.5-32.

8. Крутецкая З.И., Лебедев О.Е., Крутецкая Н.И. и др. Роль структур цитоскелета в регуляции Са2-ответов в макрофагах//Там же.- С.61-71.

9. Куффлер С., Николс Дж. От нейрона к мозгу.-М.: Мир, 1979.-439 с.

10. Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии.- М.: Химия, 1979.-480 с.

11. Окс С. Основы нейрофизиологии М.: Мир, 1969.-448 с.

12. Реутов В.П., Каюшин Л.П., Сорокина Е.Г. Фи-зиологичесая роль цикла окиси азота в организме человека и животных//Физиол. человека.-1994.-Т.20, №3.-С.165-174.

13. Ткачук В. А. Молекулярные механизмы эндокринной регуляции//Соросовский образовательный ЖУрнал.-1998.-Т.4, №6.-С.16-20.

14. Ткачук В.А. Мембранные рецепторы и внутриклеточный кальций//Соросовский образовательный журнал.-2001.-Т.7, №1.-С.10-15.

15. Филиппов П.П. Как внешние сигналы передаются внутрь клетки//Соросовский образовательный журнал.-1998.-Т.4, №3.-С.29-34.

16. Ходоров Б.И. Общая физиология возбудимых мембран.-М.: Наука, 1975.-406 с.

17. Хьюз М. Неорганическая химия биологических процессов.-М.: Мир, 1983.-416 с.

18. Шепперд Г. Нейробиология.-М.: Мир, 1987.-Т.1.-454 с.

19. Alvarez J., Montero M., Garcia-Sancho J. Sub-cellular Ca2+ dynamics//News Phisiol. Sci.-1999.-Vol.14.- P.161-168.

20. Babcock D.F., Hille B. Mitochondrial oversight of cellular Ca2+ signalling//Curr. Opin. Neurobiol.-1998.-Vol.8.- P.398-404.

21. Berridge M.J., Bootman M.D., Lipp P. Calcium -a life and death signal//Naturе.-1998.-Vol.395.-P.645-648.

22. Catterall W.A. Molecular properties of Na+ and Ca2+ channels//J. Bioenergetics and Biomembranes.-1996.- Vol.28.-P.219-230.

23. Hagiwara S., Takahashi K. Surface density of calcium ions and calcium spikes in the barnacle muscle fiber membrane//J. Gen. Physiol.-1967.-Vol.50.-P.583-603.

24. Hess P., Lansman J.B. Different modes of Ca2+ channel gating behavior favored by dihydropyridine Ca agonists and antagonists//Nature.-1984.-Vol.311.- P.538.

25. Hess P., Tsien R.W. Mechanism of ion permeation through calcium channell//Nature.-1984.-Vol.309.-P.453.

26. Hille B. Ionic channels of exitable membranes.-Sunderland, MA, USA,1992.-607 p.

27. Mori Y., Mikala G., Varadi G. et al. Molecular pharmacology of voltage-dependent calcium chan-nels//Jap. J..Pharmacol.-1996.-Vol.72.-P.83-109.

Randall A.D. The molecular basis of voltage-gated Ca2+-channel diversity: is it time for T?//J. Membr. biol.-1998.-Vol.161.-P.207-213.