СПОСОБЫ РЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗАЦИИ ТКАНИ ИЛИ ОРГАНА ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПРИЖИВЛЕНИЯ ТРАНСПЛАНТАТА
METHODS OF RE-CELLULARIZATION OF TISSUE OR ORGAN FOR IMPROVEMENT OF TRANSPLANT ENGRAFTMENT

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Данная заявка претендует на приоритет от Предварительной Заявки № 61/379073, поданной 1 Сентября 2010, которая включена здесь посредством ссылки.
ФИНАНСИРУЕМОЕ ИЗ ФЕДЕРАЛЬНОГО БЮДЖЕТА ИССЛЕДОВАНИЕ ИЛИ ПРОЦЕСС
Это изобретение создавалось при поддержке государства при помощи Гранта № HL 063346 и HL 100407-01, врученного Национальными Институтами Здоровья. Государство имеет определенные права на изобретение.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Раскрытие в целом относится к способам рецеллюляризации децеллюляризованной ткани или органа.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Когда повреждается кровеносный сосуд или обнажается внеклеточный матрикс, тромбоциты и фибрин формируют кровяной сгусток для предотвращения потери крови вследствие повреждения. Тромбоз представляет собой формирование кровяного сгустка, называемого тромбом, в кровеносном сосуде. Кровеносный сосуд может представлять собой вену, артерию или капилляр. Тромб обычно перекрывает в различной степени кровоток в системе циркуляции. В живом организме (in vivo) антитромботические и антикоагулянтные средства применяют для снижения реакции свертывания, но они не являются достоверно полезными для снижения или элиминации тромбоза, наблюдаемого во время трансплантации децеллюляризованного органа, ткани или каркаса.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
С одной стороны, предоставлен способ рецеллюляризации ткани или матрикса органа. Этот способ обычно включает перфузию ткани или матрикса органа, например, перфузию децеллюляризованной ткани или матрикса органа, физиологическим буфером под давлением; и реэндотелизацию ткани или матрикса органа путем перфузии ткани или матрикса органа физиологической композицией, включающей популяцию эндотелиальных клеток или эндотелиальных клеток-предшественников. Типичную популяцию дифференцированных эндотелиальных клеток или гладкомышечных клеток можно определить при помощи иммуноцитохимических методов, известных специалистам в данной области техники, включающих, например, двухметочно иммунофлуоресцентный и иммунопероксидазный способы, в которых применяют антибиотики, которые определяют клеточные протеины для распознавания клеточных характеристик или фенотипических свойств эндотелиальных клеток или гладкомышечных клеток. Клеточные маркеры для эндотелиальных клеток включают, например, VE-кадгерин, CD144, CD141, CD 106 или CD142, в то время как клеточные маркеры для гладкомышечных клеток включают Flk. Иммуноцитохимию также можно применять для определения эндотелиальных клеток путем определения экспрессии генов эндотелиальной клетки, таких как CD31 и e-NOS. Популяции зрелых эндотелиальных клеток должны быть относительно свободны от гемопоэтических клеток, таких как популяции CD45+. На месте (in situ) также можно проводить гибридизационную гистохимию с применением кДНК или РНК проб, специфичных для эндотелиального гена мРНК. Эти методы можно комбинировать с иммуноцитохимическими способами для усиления идентификации конкретных фенотипов. Антитела и молекулярные пробы, описанные выше, можно применять к процедурам Вестерн- и Нозерн-блоттинга соответственно для помощи в клеточной идентификации. В одном варианте осуществления практически чистая популяция представляет собой по меньшей мере 50%, 60%, 70% или более, как, например, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% эндотелиальных клеток или эндотелиальных клеток-предшественников. Перфузионная децеллюляризация является ex vivo способом децеллюляризации органа, части (порции) органа или васкуляризованной ткани млекопитающих, где раствор для децеллюляризации пропускают через орган, часть органа или васкуляризованной ткани для облегчения децеллюляризации при сохранении сосудистого русла. Конечный децеллюляризованный орган, матрикс, каркас тканей или трансплантат сохраняет сосудистую систему, включающую артериальное кровоснабжение, интерстициальное пространство, где располагаются ложа капилляров и венозный отток, так что жидкость или клетки могут быть представлены одной или более входными точками, например одним или более сосудами, и выходом из органа, матрикса, ткани или трансплантата по другому пути. Целые органы с первичным артериальным притоком имеют полный венозный возврат жидкости. Изолированные порции органов или тканей сочетают венозный возврат и выход жидкости через обнаженный интерстициальный матрикс, где ткань или порция органа выделены. При наличии капсула органа остается интактной, например, не облегчает передвижение водосодержащей жидкости через капсулу в противоположность органам, подвергнутым иммерсионной децеллюляризации.
Типичные эндотелиальные клетки включают без ограничений эндотелиальные клетки крови, эндотелиальные клетки костного мозга, циркулирующие эндотелиальные клетки, эндотелиальные клетки аорты человека, эндотелиальные клетки капилляров головного мозга человека, эндотелиальные клетки капилляров кожи человека, эндотелиальные клетки капилляров кишечника человека, эндотелиальные клетки капилляров легкого человека, эндотелиальные клетки капилляров человека, эндотелиальные клетки печеночных синусов, эндотелиальные клетки подкожной вены, эндотелиальные клетки пупочной вены человека, лимфатические эндотелиальные клетки, эндотелиальные клетки микрососудов, эндотелиальные клетки капилляров, эндотелиальные клетки легочной артерии, эндотелиальные клетки капилляров сетчатки, эндотелиальные клетки микрососудов сетчатки, эндотелиальные клетки сосудов, эндотелиальные клетки пуповины, эндотелиальные клетки синусов печени, колониеобразующие единицы эндотелиальных клеток (КОЕ-ЭК, CFU-EC), циркулирующие ангиогенные клетки (CAC), циркулирующие эндотелиальные прекурсоры (CEP), эндотелиальные колониеобразующие клетки (ECFC), ECFC с низким пролиферативным потенциалом (LPP-ECFC), ECFC с высоким пролиферативным потенциалом (HPP-ECFC) или комбинации вышеперечисленных веществ. В некоторых вариантах осуществления эндотелиальные клетки или эндотелиальные клетки-предшественники получают из эмбриональных стволовых клеток (ESC), взрослых стволовых клеток, клеток-предшественников или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC).
В конкретных вариантах осуществления ткань или матрикс органа являются биологической тканью или матриксом органа. В конкретных вариантах осуществления биологическая ткань или матрикс органа происходят из органа, выбираемого из группы, состоящей из сердца, почки, печени, легкого, поджелудочной железы, кишечника, мышцы, кожи, молочной железы, пищевода, трахеи или сальника. В конкретных вариантах осуществления биологическая ткань или матрикс органа представляют собой перфузионно- децеллюляризованную ткань или матрикс органа.
В некоторых случаях биологическая ткань или матрикс органа, а также эндотелиальные клетки или эндотелиальные клетки-предшественники являются ксеногенными. В некоторых случаях биологическая ткань или матрикс органа, а также эндотелиальные клетки или эндотелиальные клетки-предшественники являются аллогенными.
В некоторых вариантах осуществления такой способ дополнительно включает введение клеток, отличных от эндотелиальных или клеток-предшественников эндотелиальных клеток, в или на ткань или матрикс органа перед стадией реэндотелизации. В некоторых вариантах осуществления такой способ дополнительно включает введение клеток, отличных от эндотелиальных или клеток-предшественников эндотелиальных клеток, в или на ткань или матрикс органа после стадии реэндотелизации.
С другой стороны, предоставлен способ снижения тромбообразования и иммуногенности в рецеллюляризованной ткани или органа после трансплантации реципиенту. Этот способ обычно включает перфузирование ткани или матрикса органа физиологическим буфером под давлением; реэндотелизацию ткани или матрикса органа путем перфузии ткани или матрикса органа физиологической композицией, включающей популяцию эндотелиальных клеток или эндотелиальных клеток-предшественников; и трансплантацию реэндотелизованной ткани или матрикса органа реципиенту. Тромбогенность в реэндотелизованных тканях или органах можно определять при помощи стандартных тестов гемосовместимости и анализов, включающих, но не ограничивающихся активацией тромбоцитов, оксидантной реакцией, гемолизом, фибринолизом, образованием фибрина, выработкой тромбина, контактной активацией, анализом тромбомодулина и/или активацией комплемента. В одном варианте осуществления реэндотелизованная ткань или матрикс органа являются подходящими для трансплантации и остаются доступными для трансплантации.
Типичные эндотелиальные клетки включают без ограничений эндотелиальные клетки крови, эндотелиальные клетки костного мозга, циркулирующие эндотелиальные клетки, эндотелиальные клетки аорты человека, эндотелиальные клетки капилляров головного мозга человека, эндотелиальные клетки капилляров кожи человека, эндотелиальные клетки капилляров кишечника человека, эндотелиальные клетки капилляров легкого человека, эндотелиальные клетки капилляров человека, эндотелиальные клетки печеночных синусов, эндотелиальные клетки подкожной вены, эндотелиальные клетки пупочной вены человека, лимфатические эндотелиальные клетки, эндотелиальные клетки микрососудов, эндотелиальные клетки капилляров, эндотелиальные клетки легочной артерии, эндотелиальные клетки капилляров сетчатки, эндотелиальные клетки капилляров сетчатки, эндотелиальные клетки сосудов, эндотелиальные клетки пуповины, эндотелиальные клетки синусов печени, колониеобразующие единицы эндотелиальных клеток (КОЕ-ЭК), циркулирующие ангиогенные клетки (CAC), циркулирующие эндотелиальные прекурсоры (CEP), эндотелиальные колониеобразующие клетки (ECFC), ECFC с низким пролиферативным потенциалом (LPP-ECFC), ECFC с высоким пролиферативным потенциалом (HPP-ECFC) или комбинации вышеперечисленных веществ. В некоторых вариантах осуществления эндотелиальные клетки или эндотелиальные клетки-предшественники получают из эмбриональных стволовых клеток (ESC), взрослых стволовых клеток, клеток-предшественников или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC).
В конкретных вариантах осуществления ткань или матрикс органа представляют собой биологическую ткань или матрикс органа. В конкретных вариантах осуществления биологическая ткань или матрикс органа происходят из органа, выбираемого из группы, состоящей из сердца, почки, печени, легкого, поджелудочной железы, кишечника, мышцы, кожи, молочной железы, пищевода, трахеи или сальника. В конкретных вариантах осуществления биологическая ткань или матрикс органа представляют собой перфузионно-децеллюляризованную ткань или матрикс органа.
В некоторых вариантах осуществления биологическая ткань или матрикс органа, а также эндотелиальные клетки или эндотелиальные клетки-предшественники являются ксеногенными. В некоторых случаях биологическая ткань или матрикс органа, а также эндотелиальные клетки или эндотелиальные клетки-предшественники являются аллогенными. В некоторых вариантах осуществления биологическая ткань или матрикс органа являются ксеногенными для реципиента, и там эндотелиальные клетки или эндотелиальные клетки-предшественними являются аллогенными для реципиента.
В конкретных вариантах осуществления такой способ дополнительно включает введение клеток, отличных от эндотелиальных или эндотелиальных клеток-предшественников, в или на ткань или матрикс органа перед стадией реэндотелизации. В конкретных вариантах осуществления этот способ дополнительно включает введение клеток, отличных от эндотелиальных или эндотелиальных клеток-предшественников, в или на ткань или матрикс органа после стадии реэндотелизации. В конкретных вариантах осуществления этот способ дополнительно включает введение клеток, отличных от эндотелиальных или эндотелиальных клеток-предшественников, в или на ткань или матрикс органа после стадии трансплантации. Физиологическую композицию, включающую клетки, отличные от эндотелиальных, полученные из эндотелия, или незрелые эндотелиальные клетки или эндотелиальные клетки-предшественники, можно ввести в ткань или матрикс органа путем, например, перфузии, прямой инъекции, топического нанесения или при помощи комбинации вышеперечисленных способов.
Если не указано иного, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют то же значение, как обычно понимают средние специалисты в данной области техники, к которой относятся способы и композиции. Хотя способы и материалы, сходные или эквивалентные тем, которые описаны здесь, можно применять на практике или для тестирования способов и композиций, подходящие способы и материалы описаны ниже. В дополнение, материалы, способы и примеры являются только демонстрационными и не склонны к ограничению. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, упомянутые здесь, включены во всей полноте посредством ссылки.
ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигура 1 - Блок А является графиком, показывающим наличие клеток на протяжении структур рецеллюляризованного сердца, которое измеряют путем измерения количества DAPI позитивных ядер в областях четырех различных коротких осей, распределенных от основания до верхушки (N=3 сердца на способ). Эндотелиальные клетки аорты крысы (RAEC) доставляют либо в единичной дозе, либо в двойной дозе. Общее число доставленных клеток показано в скобках для каждого способа. Доставки единичных доз клеток касаются как перфузии RAEC в аорту дистальнее третьей ветви (Аорта), так и через плечеголовной ствол (BA). При доставках двойных доз половину клеток доставляли через НПВ (IVC), вслед за этим следовала доставка половины через BA (BA+IVC). Распределение RAEC по всему сердечному матриксу визуализируют при помощи введения меток DiI (КРАСНЫЙ) и DiO (ЗЕЛЕНЫЙ) в клетки перед доставкой. 40 миллионов меченных DiI RAEC доставлены через BA в Блоках В и С, в то время как 20 миллионов меченных DiO клеток доставлены через НПВ, вслед за чем дополнительно 20 миллионов DiI меченных клеток доставлены через BA в Блоках D и Е. Планки погрешностей представляют собой стандартную ошибку средней, и графический масштаб составляет 5 мм. * определяет р>0,05.
Фигура 2 представляет собой фотографии, на которых 20 миллионов меченных DiO (ЗЕЛЕНЫЙ) RAEC доставлены через НПВ и 20 миллионов меченных DiI (КРАСНЫЙ) RAEC доставлены через BA и визуализированы спустя 7 дней после посева в децеллюляризованные каркасы (Блоки А-Е). Меченые RAEC видны в различных распределениях в стенках желудочка (Блоки А-С) и на поверхности эндокарда (Блоки D-Е). DAPI-позитивные ядра показаны СИНИМ (Блоки А-Е). Графический масштаб для Блоков А-Е составляет 50 микрон.
Фигура 3 - Блоки A-D представляют собой фотографии, показывающие гистологическое состояние децеллюляризованного внеклеточного матрикса сердца крысы (ECM), с пересеянными RAEC через BA (40 миллионов клеток, Блоки А-В) или через BA и НПВ (20 миллионов каждая инъекция, Панели C-D). Блоки А и С являются гематоксилин- и эозин-окрашенными секциями, в то время как Блоки B и D являются окрашенными по Вирхову-ван Гисону. Диаметр сосуда измеряют и группируют в соответствии с размерами для стенки левого желудочка (LV) и правого желудочка (RV), данные о которых показаны в Блоке Е (N=3 на группу данных). Графический масштаб составляет 250 микрон. Планки погрешностей представляют собой стандартную ошибку средней. * определяет статистически значимую разницу между способами доставки (p<0,001) для данного диаметра сосуда.
Фигура 4 представляет собой фотографии децеллюляризованной структуры сердца крысы, посеянной на день 0 при помощи 40 миллионов RAEC путем инфузии через BA (Блок А) или 30 миллионов RAEC через НПВ (Блоки B и С). На седьмой день в структуры сердца вводят путем перфузии витальный краситель, CMFDA, через аорту во флуоресцентно меченые живые клетки (ЗЕЛЕНЫЙ). CMFDA-позитивные REAC видны в стенках желудочка (Блоки А и В) и на поверхности эндокарда структуры сердца (Блок С) независимо от пути доставки. Клеточную смерть из-за апоптоза исследовали при помощи окраски по TUNEL (Блоки D-I). Блоки D-F представляют левый желудочек, перегородку и изображения короткой оси правого желудочка для доставленных через ВА клеточных структур. Блоки G-I представляют левый желудочек, перегородку и правый желудочек, изображения TUNEL для клеточных структур, посеянных через ВА и НПВ. Ядра клеток окрашены при помощи DAPI (СИНИЙ), TUNEL-позитивное окрашивание является КРАСНЫМ. Для дополнительного подсчета изменений в жизнеспособности клетки с течением времени образцы среды брали ежедневно и измеряли активность G6PDH(Блок J) (N=6). Планки погрешностей представляют собой стандартную ошибку средней. Графический масштаб составляет 100 микрон в Блоках А-С, в то время как в Блоках D-I графический масштаб составляет 250 микрон. # обозначает TUNEL-позитивное окрашивание. В блоке J графически представлены все данные.
Фигура 5 представляет собой фотографии гистохимически окрашенных RAEC через семь дней на децеллюляризованных структурных каркасах сердца, которые показывают, что клетки по прежнему жизнеспособны, пролиферируют (Блок А, ЗЕЛЕНЫЙ - CMFDA и КРАСНЫЙ - PCNA), а также экспресс-маркеры функционально активных EC (Блок В, КРАСНЫЙ - eNOS, ЗЕЛЕНЫЙ - CMFDA, СИНИЙ - DAPI; Блок С, КРАСНЫЙ - vWF, ЗЕЛЕНЫЙ - CMFDA и СИНИЙ - DAPI). Реэндотелизованные матриксы по-прежнему способны снижать тромбообразование каркасов путем блокирования тромбомодулина (Блок D, N=6 для ацеллюлярных контролей, N=8 для BA и ВА+НПВ). Общее число RAEC, доставленных в каждом способе, показано в скобках. * определяет р>0,05 в сравнении с ацеллюлярными контролями. Планки погрешностей представляют собой стандартную ошибку средней. Графический масштаб составляет 100 микрон.
Фигура 6 представляет собой фотографии, показывающие сравнение между эксплантатами ацеллюлярных каркасов (Блоки А-D) и эксплантатами реэндотелизованных структур (Блоки Е-Н) через семь дней после гетеротипической трансплантации. Макроскопическое исследование ацеллюлярных каркасов аорты и левого желудочка (Блоки А и В, соответственно) и реэндотелизованных структур (Блоки Е и F, соответственно) выявило снижение образования тромбов. Окраска по гематоксилину и эозину ацеллюлярных каркасов (Блоки С-D) и реэндотелизованных структур (Блоки G-H) выявила более жидкую кровь в ацеллюлярных каркасах и сравнимые количества заполненных клеток как в эксплантатах ацеллюлярного каркаса, так и реэндотелизованных каркасах. * обозначает действующие сосуды в каркасах. Графический масштаб составляет: 1мм в Блоках А, В, Е и F, 250 микрон в Блоках С и G, 50 микрон в Блоке D и 100 микрон в Блоке Н.
Фигура 7 представляет собой фотографии VEGF-R2 (КРАСНЫЙ) окрашивания ацеллюлярного каркаса (Блок А) или реэндотелизованных структур (Блок В) через семь дней после трансплантации. PECAM (Красный) окрашивание ацеллюлярного каркаса (Блок С) и реэндотелизованной структуры (Блок D) через 7 дней после трансплантации. DAPI-позитивные ядра являются СИНИМИ. Графический масштаб составляет 100 микрон. * обозначает аутофлуоресценцию крови.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Тромбоз рецеллюляризованной ткани или матрикса органа является феноменом, который происходит после трансплантации и реперфузии кровью тканей или органов. В дополнение, трансплантированные ткани или органы часто являются иммуногенными, и реципиент часто страдает от воспалительной реакции на трансплантированную ткань или орган. Способы рецеллюляризации ткани или матрикса органа, описанные здесь, приводят к снижению тромбогенности при последовательной трансплантации ткани или матрикса органа хозяину и реперфузии кровью. Способы рецеллюляризации, описанные здесь, также приводят к тому, что ткани и органы при трансплантации и реперфузии кровью демонстрируют ограниченное воспаление.
Способы рецеллюляризации ткани или матрикса органа, как описано здесь, можно применять для биологической ткани или матрикса органа. Типичные биологические ткани или матриксы органов включают, например, сердце, печень, почку, легкое, поджелудочную железу, селезенку, матку, мочевой пузырь, пищевод, трахею, спинной мозг, суставы (например, коленные, плечевые или тазобедренные), кожу, молочные железы, мышцы, кишечник, сальник и жировую ткань. Биологический матрикс также может включать, например, коллагеновый матрикс, который секретируют или ремоделируют клетки. Рецеллюризация биологического матрикса, как описано здесь, обычно требует от матрикса быть свободным или практически свободным от живых клеток.
Биологические ткани и органы можно децеллюляризовать при помощи любого количества известных способов. Например, биологическую ткань или орган можно децеллюляризовать при помощи способов перфузии. Смотрите, например, WO 2007/025233 и Ott с соавт. (2008, Nat. Med., 14:213-21) для описаний децеллюляризационных способов, основанных на перфузии. Показано, что перфузионные способы децеллюляризации дают очень хороший матрикс для рецеллюляризации. Смотрите, например, WO 2007/025233; Ott с соавт. (2008, Nat. Med., 14:213-21); Uygun с соавт., 2010, Nat. Med., 16(7):814-20; Petersen с соавт., 2010, Science, e-pub Июнь; и Ott с соавт., 2010, Nat. Med., e-pub Июль.
Альтернативой децеллюляризации биологических тканей и органов, основанной на перфузии, может быть децеллюляризация путем погружения в децеллюляризационный раствор, который удаляет клетки. Смотрите, например U.S. Патент № 6376244 и 6753181. В дополнение, как альтернативу использованию биологических тканей и матриксов органов, способы рецеллюляризации, описанные здесь, можно использовать в отношении синтетических тканей или матриксов органов, таким образом, такие синтетические матриксы приобретают структуру сосудистого ложа. Типичные синтетические ткани и матриксы органов включают, например, гидрогели, полимеры (например, биодеградируемый PLGA, PLA или стойкие полимеры, такие как полиуретан), коллагеновые каркасы, каркасы внеклеточного матрикса (ECM), включая коллаген фибронектин, ламинин и комбинации вышеперечисленных веществ.
Способы рецеллюляризации ткани или матрикса органа, как описано здесь, включают перфузирование ткани или матрикса органа физиологическим буфером под давлением. Это перфузирование ткани или матрикса органа под давлением производят перед введением любых клеток в матрикс и, сходным образом с перфузией, применяемой для децеллюляризационного процесса, описанного в WO 2007/025233, через сосудистое русло или другую полость или систему трубок (например, через трахею в легкие, через желчные пути в печень, через уретру в почку и т. д.) органа или матрикса ткани, и в целом ее начинают с катетеризации сосудистого русла (например, артерий, вен, артериол, венул и капилляров) и/или других полостей и/или трубок (здесь и далее называемых структурами «типа сосудистого русла») органа или матрикса ткани (приблизительно 1 на приблизительно 300 Hg). Катетеризация, таким образом, включает введение канюли в трубку тела, полость или сосуд, например в трахею, мочевой пузырь или кровеносный сосуд, для введения или удаления жидкости, вещества или шлаков. Как применяют здесь, перфузирование органа или матрикса ткани под давлением относится к доставке жидкой композиции (например, физиологического буфера) под достаточным давлением, так что сосудистое русло и структуры типа сосудистого русла в тканях или матриксе органа остаются открытыми и расширенными, но не на таком высоком, чтобы вызывать повреждение или перерастяжение сосудистого русла и структур типа сосудистого русла в тканях или матриксе органа. Физиологический буфер, подходящий для прецеллюлярной перфузии ткани или матрикса органа под давлением, может представлять собой любой буфер, который совместим с тканью или матриксом органа. Например, физиологические буферы могут включать нутриенты, такие как сахара и углеводы, а также могут включать проэндотелиальные факторы (например, соединения, которые оказывают положительный эффект на эндотелиальные клетки и эндотелий), такие как, например, соединения, которые усиливают ангиогенез (например, VEGF, FGF-1 и/или bFGF). Физиологический буфер имеет в целом физиологический pH.
4
2
4
3
2
3
4
2
4
2
2
2
4
2
4
3
2
В одном варианте осуществления физиологический буфер, подходящий для прецеллюлярной перфузии, включает, но не ограничивается физиологическим раствором фосфатного буфера (PBS) или раствором культуральной среды, подходящим для эндотелиальной клеточной культуры, включая без ограничений EGM-2, EGM-2MV, DMEM, PromoCell Endothelial Cell Medium, Medium 200, DMEMF/12, буферы с питательной поддержкой, например, глюкозой, которые можно применять для перфузии органа и/или консервирования, включая трансплантацию. Они включают, например, для сердечной ткани, приготовленный из следующих композиций Модифицированный буфер Krebs-Henseleit (в ммоль): 118 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgSO, 1,2 KHPO, 25 NaHCO, 11 глюкозы, 1,75 CaCl и 2,0 пирувата и 5 ед/л инсулина, или буфер Krebs, содержащий (в ммоль): 118 NaCl, 4,7 KCl, 25 NaHCO, 1,2 MgSO, 1,2 KHPO, 2 CaCl, насыщенный 95% O, 5% CO; или глюкозу (например, 11 ммоль) или глюкозу в комбинации с 1 или 1,2 ммоль пальмитата. Для тканей почек типичным средством является KPS-1 Почечный Перфузионный Раствор. Для тканей печени типичным средством является буфер Krebs-Henseleit, содержащий 118 ммоль NaCl, 4,7 ммоль KCl, 1,2 ммоль MgSO, 1,2 ммоль KHPO, 26 ммоль NaHCO, 8 ммоль глюкозы и 1,25 ммоль CaCl, дополненный 2% бычьим сывороточным альбумином (BSA).
Хотя отсутствует привязка к какому-либо механизму, считается, что эта прецеллюлярная перфузия под давлением открывает и промывает матрикс и, в особенности, сосудистое русло ткани или матрикса органа, таким образом, обнажая больше матрикса для клеток во время реэндотелизации и позволяя жизнеспособному эндотелию утвердиться по всему сосудистому руслу ткани или матрикса органа. Специалистам в данной области техники следует понимать, что различные ткани и матриксы органов (например, из разных источников, например, сердце, печень, легкое, почка, поджелудочная железа и т.д.) могут выдержать различную величину давления. Величина давления, которое может выдержать конкретную ткань или матрикс органа, связана по меньшей мере частично с сосудистым руслом конкретной ткани или матрикса органа.
Способы рецеллюляризации ткани или матрикса органа, как описано здесь, включают реэндотелизацию ткани или матрикса органа эндотелиальными клетками, полученными из эндотелия, незрелыми эндотелиальными клетками или эндотелиальными клетками-предшественниками. Источники эндотелиальных клеток включают полученные аутогенно, например, при помощи биопсии. Аутогенные эндотелиальные клетки можно получить от пациента путем биопсии артерии, вены или специфической ткани и поместить в клеточную культуру для нормального роста популяции. Выделения эндотелиальных клеток достигают как при помощи условий культивирования, где VEGF или bFGF подавляют загрязняющие клеточные популяции, включая гладкомышечные клетки, или при помощи прямого FACS выделения или других доступных ex vivo способов выделения, таких как применение магнитных микроносителей, микрогидродинамики, лаборатории на чипе, колонки для аффинной хроматографии или комбинированного прибора для популяции для выделения чистой популяции эндотелиальных клеток, основанных на любых их следующих утвержденных маркерах поверхности клетки, включающих, но не ограничивающихся CD31, VEGFR-1, VEGFR-2, CD105, CD144, TEM7, CD146 и/или D2-40.
5
6
2
3
6
2
Эндотелиальные клетки-предшественники (EPC) являются незрелыми эндотелиальными клетками, которые обладают способностью к пролиферации, миграции и дифференцировке в эндотелиальные клетки, но пока еще не приобрели свойств зрелых эндотелиальных клеток. EPC могут мобилизоваться из костного мозга в периферическую кровь (циркулирующие EPC) в ответ на конкретный физиологический стимул, например, повреждение тканей. Циркулирующие EPC идентифицируют в крови взрослого человека (Asahara с соавт. (1997) Science 275:964-967), и последующие изучения предполагают роль EPC в поддержании эндотелиальной сохранности и функционирования, так же как и в постнатальной неоваскуляризации. EPC можно выделять из крови, костного мозга или пуповинной крови, и их определяют в CD34+ клеточной фракции в периферических мононуклеарных клетках взрослого человека. Они могут быть выделены при помощи только CD34+ клеток или CD133+ клеток или при помощи комбинации с KDR+, как EPC-богатая клеточная фракция в периферической крови при помощи прямого FACS выделения или других доступных ex vivo способов выделения, таких как применение магнитных микроносителей, микрогидродинамики, лаборатории на чипе, колонки для аффинной хроматографии или комбинированного прибора. EPC можно вводить прямо в матрикс и культивировать в подходящих условиях для достижения пролиферации и дифференцировки, или культивировать in vitro для увеличения общего числа клеток в EPC сохраняющейся культурной среде, например, культивировать в течение семи дней в бессывороточной среде StemSpan (StemCell Technologies, Ванкувер, Канада) в течение начального периода расширения и при поддержке 1% пенициллина-стрептомицина (Sigma-Aldrich, Сент Луис, США) и рекомбинантного человеческого (rh) Flt-3 лиганда (100 нг/мл), rh фактора роста стволовых клеток (100 нг/мл), rh ИЛ-3 (20 нг/мл), rh ИЛ-6 (20 нг/мл). Далее эти клетки можно вводить в матрикс как EPC, или предифференцировать в EC и вводить их в матрикс. Дифференцировки EPC можно достичь при помощи таких способов, как культивирование от приблизительно 3×10 до приблизительно 1×10/1,5 мл/9,6 смв ростовой среде для эндотелиальных клеток-2 (EGM-2), содержащей FBS (2%), гидрокортизон, hFGF, VEGF, R-IGF-1, аскорбиновую кислоту, hEGF, гентамицин, амфотерицин-В и гепарин (Lonza, Базель, Швейцария). Через три дня культивирования клетки можно собрать и перенести на тарелочки, покрытые фибронектином (10 мкг/мл) (Sigma-Aldrich, Сент Луис, США), при плотности приблизительно равной 1×10клеток/1,5 мл/9,6 см, и культивировать в течение дополнительных трех дней в свежей EGM-2 среде.
Популяцию аллогенных эндотелиальных клеток или эндотелиальных клеток-предшественников можно применять и изготавливать из ткани, которая является аллогенной реципиенту, и тестируют для применения хорошо известными способами типирования тканей для наиболее близкого совпадения типа гистосовместимости реципиента. Они включают, но не ограничиваются эндотелиальными клетками пупочной вены человека (HUVEC), генетически модифицированными эндотелиальными клетками для уменьшения иммуногенности, HLA подходящими эндотелиальными клетками, полученными из пуповины эндотелиальными клетками, EC, полученными из EPC, предшественников, iPS или эмбриональными стволовыми клетками. Наиболее аллогенные доступы потребуют применение иммуносупрессирующих средств после трансплантации. Недавние исследования продемонстрировали привилегированное с точки зрения иммунологии положение EC, полученных из EPC (Cardiovasc Res. 2010 Окт 1;88(1):121-9. Epub 2010 Апр 13), где иммунной супрессии после трансплантации не потребуется. Примеры способов EPC дифференцировки включают: выделение EPC из крови путем центрифугирования по градиенту плотности при помощи Pancoll крысы (PAN-Biotech) и проведения CD45-элиминации при помощи CD45 моноклональных антител. Фракцию CD45 (-) культивируют в эндотелиальной дифференцировочной среде [EBM, поддерживаемая 5% FCS, 50 мг/мл гентамицина, 10 нг/мл крысиного VEGF, 1 нг/мл бычьего bFGF, 1- нг/мл мышиного IGF-1 (оба R&D Systems), 10 нг/мл мышиного EGF и 1 мг/мл гидрокортизона] в покрытой 20 мг/мл фибронектина посуде. Не прилипающие клетки удаляют при смене среды каждые 4 дня. Разрастающиеся кластеры клеток появляются спустя приблизительно от 15 до 22 дней культивирования и собираются путем трипсинизации внутри клонзапирающих колец. PECAM-1(+) клетки выбирают при помощи MACS разделения при помощи PECAM-1 антител и IgG1 Микрогранул. PECAM-1(+) фракцию можно дополнительно культивировать до пересева 25 и вводить на множество матриксов.
В дополнение, альтернативой применению иммуносупрессивных технологий, имеются способы замещения гена или нокаута при помощи гомологичной рекомбинации в стволовых клетках, преподаваемые Smithies с соавт., 317 Nature 230-234 (1985) и продолженной в замещении гена или нокауте в линиях клеток (Zheng с соавт., 88 Proc. Natl. Acad. Sci. 8067-8071 (1991)), можно применять в отношении эндотелиальных и полученных из эндотелиальных клеток для абляции генов главного комплекса гистосовместимости (MHC). Клетки, лишенные экспрессии MHC, доступны для трансплантации обогащенных популяций эндотелиальных клеток через аллогенный и, возможно, даже ксеногенный барьер гистосовместимости без необходимости в иммуносупрессии реципиента. Общие обзоры и ссылки по применению рекомбинантных методов для снижения антигенности донорских клеток также раскрыл Gruber, 54 Трансплантация 1-11 (1992). Типичные доступы для снижения иммуногенности трансплантатов путем модифицирования поверхности раскрыты PCT Международной патентной заявкой WO 92/04033 и PCT/US99/24630. Альтернативно, иммуногенность трансплантата можно снизить путем подготовки клеток от трансгенных животных, которая меняет или стирает MHC антигены.
Эндотелиальные клетки-предшественники включают, но не ограничиваются колониеобразующими единицами эндотелиальных клеток (CFU-EC), циркулирующими ангиогенными клетками (CAC), циркулирующими эндотелиальными предшественниками (CEP), эндотелиальными колониеобразующими клетками (ECFC), ECFC с низким пролиферативным потенциалом (LPP-ECFC), ECFC с высоким пролиферативным потенциалом (HPP-ECFC).
В одном варианте осуществления эндотелиальные клетки и эндотелиальные клетки-предшественники получают путем культивирования эмбриональных стволовых клеток (ESC) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) в подходящих условиях, чтобы направить стволовые клетки по эндотелиальной линии дифференцировки. Эндотелиальные клетки-предшественники являются клетками, которые начали дифференцироваться в эндотелиальные клетки (например, например, линейно-специфически; например, клетки, которым суждено стать эндотелиальными клетками), но не считаются полностью дифференцированными эндотелиальными клетками. Например, эндотелиальные клетки-предшественники могут экспрессировать маркер предшественника, такой как CD133, а также могут экспрессировать маркер эндотелиальной клетки, например без ограничений тромбоцитарную эндотелиальноклеточную адгезивную молекулу-1 (PECAM1; также называемый CD31), VEGFR-1 (также называемый Flt-1), VEGFR-2 (также называемый Flk-1), гуанилатсвязывающий протеин-1 (GBP-1), тромбомодулин (также называемый CD141), VE-кадгерин (также называемый CD144), фактор Виллебранда (vWF) и интрацеллюларную адгезивную молекулу (ICAM-2). В целом, эндотелиальные клетки-предшественники также могут абсорбировать ацетилированный LDL и, дополнительно, могут мигрировать по направлению к VEGF и/или формировать трубочки на Матригеле.
ESC или iPSC, такие как человеческие ESC и человеческие iPSC, можно дополнительно культивировать в условиях, которые приведут к полностью дифференцированным эндотелиальным клеткам, например, VEGF и bFGF. Дополнительно или альтернативно эндотелиальные клетки можно получить из любого числа источников, таких как костный мозг, кровь, кожа, печень, сердце, легкое, сетчатка, и любой другой ткани или органа, который содержит эндотелиальные клетки. Например, типичные эндотелиальные клетки включают без ограничений эндотелиальные клетки крови, эндотелиальные клетки костного мозга, циркулирующие эндотелиальные клетки, эндотелиальные клетки аорты человека, эндотелиальные клетки капилляров головного мозга человека, эндотелиальные клетки капилляров кожи человека, эндотелиальные клетки капилляров кишечника человека, эндотелиальные клетки капилляров легкого человека, эндотелиальные клетки капилляров человека, эндотелиальные клетки печеночных синусов, эндотелиальные клетки подкожной вены, эндотелиальные клетки пупочной вены человека, лимфатические эндотелиальные клетки, эндотелиальные клетки микрососудов, эндотелиальные клетки капилляров, эндотелиальные клетки легочной артерии, эндотелиальные клетки капилляров сетчатки, эндотелиальные клетки капилляров сетчатки, эндотелиальные клетки сосудов, эндотелиальные клетки пуповины и их комбинации. Как понимают специалисты в данной области техники, этот список не является исчерпывающим списком эндотелиальных клеток.
2
4
5
5
3
2
EPC можно получить из периферической крови путем выделения мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) путем центрифугирования по градиенту плотности. Суспензии клеток высеивают в любую емкость, способную к подпитыванию клеток, в частности, в колбы для культур, планшеты для культур или роллер-флаконы и, конкретнее, в маленькие колбы для культур, такие как колбы для культур площадью 25 см. Клетки, культивируемые в суспензии, можно ресуспендировать при приблизительно от 5×10 до приблизиелньо 2×10 клеток/мл (например, приблизительно 1×10 клеток/мл). Клетки, помещенные на твердый субстрат, можно высевать на чашку при приблизительно от 2 до приблизительно 3×10клеток/см. Опционально планшеты для культур покрыты матриксным протеином, таким как коллаген. Клетки можно поместить в любую известную культуральную среду, способную поддерживать клеточный рост, включая HEM, DMEM, RPMI, F-12 и т. п., содержащие поддерживающие вещества, которые необходимы для клеточного метаболизма, такие как глутамин и другим аминокислоты, витамины, минералы и протеины, такие как трансферрин и т. п. Культуральная среда также может содержать антибиотики для предотвращения контаминации дрожжами, бактериями и грибками, такие как пенициллин, стрептомицин, гентамицин и т. п. Культуральная среда может содержать бычью, лошадиную, куриную сыворотки и т. п.
Условия для культивирования в целом должны быть близки к физиологическим условиям. pH культуральной среды должен быть приближен к физиологическому pH (например, между pH 6-8, между приблизительно pH 7-7,8 или при pH 7,4). Физиологические температуры варьируют от приблизительно 30°С до 40°С. EPC можно культивировать при температурах между приблизительно 32°С и приблизительно 38°С (например, между приблизительно 35°С и приблизительно 37°С).
Опционально, культуральная среда поддерживается по меньшей мере одним индуцирующим пролиферацию («митогенным») фактором роста. «Фактор роста» представляет собой протеин, пептид или другую молекулу, оказывающую ростовой, индуцирующий пролиферацию, индуцирующий дифференцировку или трофический эффект на EPC. «Индуцирующие пролиферацию факторы роста» представляют собой трофические факторы, которые позволяют ECP пролиферировать, и включают любые молекулы, которые связываются с рецептором на поверхности клетки для вызывания трофического эффекта и эффекта индуцирования роста клетки. Индуцирующие пролиферацию факторы роста включают EGF, амфирегулин, кислотный фактор роста фибробластов (aFGF или FGF-1), основной фактор роста фибробластов (bFGF или FGF-2), трансформирующий фактор роста альфа (TGFa), VEGF и комбинацию вышеперечисленных веществ. Факторы роста обычно добавляют в культуральную среду в концентрации, варьирующей между приблизительно 1 фг/мл до 1 мг/мл. Концентрация между приблизительно 1 и 100 нг/мл обычно является достаточной. Простые титровальные пробы можно легко произвести для определения оптимальной концентрации конкретного фактора роста. Биологические эффекты ростовых и трофических факторов в целом опосредованы связыванием с рецепторами клеточной поверхности. Идентифицированы рецепторы к некоторому количеству этих факторов, и доступны антитела и молекулярные пробы для конкретных рецепторов. EPC можно анализировать на наличие рецепторов к факторам роста на любой стадии дифференцировки. Во многих случаях определение конкретного рецептора предоставляет руководство по стратегии для применения в дополнительных дифференцирующихся клетках наряду со специфичными экспериментальными путями с добавлением экзогенных ростовых или трофических факторов.
В целом, после приблизительно 3-10 дней in vitro культуральную среду EPC снова пополняют путем аспирации среды и добавления свежей среды в колбу для культур. Опционально, аспирированную среду собирают, фильтруют и применяют как среду с условиями для последовательного пересевания EPC. Например, применяют 10%, 20%, 30%, 40% и более среду с условиями. Клеточную культуру EPC можно легко пересеять для реинициации пролиферации. Например, через приблизительно от 3 до 7 дней in vitro колбы для среды хорошо встряхивают, и EPC далее переносят в 50 мл пробирку центрифуги и центрифугируют при низкой скорости. Среду аспирируют, EPC ресуспендируют в малое количество культуральной среды, клетки затем подсчитывают и повторно наносят в желаемой плотности для реинициации пролиферации. Эту процедуру можно повторять еженедельно для получения логарифмического увеличения числа жизнеспособных клеток при каждом пересеве. Процедуру продолжают до получения желаемого количества EPC.
EPC и предшественников EPC можно криоконсервировать любым известным в данной области техники способом до возникновения в них необходимости (Смотрите, например, U.S. Pat. № 5071741, PCT Международные патентные заявки WO93/14191, WO95/07611, WO96/27287, WO96/29862 и WO98/14058, Karlsson с соавт., 65 Biophysical J. 2524-2536 (1993)). EPC можно суспендировать в изотоническом растворе, предпочтительно в клеточной культуральной среде, содержащей определенный криоконсервант. Такие криоконсерванты включают диметилсульфоксид (DMSO), глицерин и т.п. Эти криоконсерванты можно применять в концентрации 5-15% (например, 8-10%). Клетки замораживают постепенно при температуре от -10°C до 150°C (например, от -20°C до -100°C, или от -70°C до -80°C).
2+
В зависимости от условий культивирования EPC могут дифференцироваться в эндотелиальные клетки или гладкомышечные клетки. EPC могут дифференцироваться в эндотелиальные клетки или гладкомышечные клетки на твердом субстрате в культуральной среде с индуцирующим дифференцировку фактором роста. Дифференцировку EPC также можно индуцировать любым способом, известным в данной области техники, который активирует каскад биологических явлений, которые приводят к росту, который включает высвобождение инозитолтрифосфата и внутриклеточного Ca, высвобождение диацилглицерина и активацию протеинкиназы С и других клеточных киназ и т. п. При обработке форболовыми эфирами индуцирующие дифференцировку факторы роста и другие химические сигналы могут индуцировать дифференцировку. Вместо индуцирующих пролиферацию факторов роста для пролиферации EPC (см. выше) можно добавить индуцирующие дифференцировку факторы роста в клеточную среду для влияния на дифференцировку EPC. Другие индуцирующие дифференцировку факторы роста включают тромбоцитарный фактор роста (PDGF), тириотропин релизинг гормон (TRH), трансформирующий фактор роста бета (TGF,s), инсулиноподобный фактор роста (IGF-1) и т.п.
Дифференцированные эндотелиальные клетки или гладкомышечные клетки можно определить при помощи иммуноцитохимических методов, известных в данной области техники. Иммуноцитохимия (например, двухметочно иммунофлуоресцентный и иммунопероксидазный способы) применяет антитела, которые определяют протеины клеток для различения клеточных характеристик или фенотипических свойств эндотелиальных клеток или гладкомышечных клеток. Клеточные маркеры эндотелиальных клеток включают, например, VE-кадгерин, CD144, CD141, CD106 или CD142, в то время как клеточные маркеры для гладкомышечных клеток включают Flk. Иммуноцитохимия также может быть полезной в определении эндотелиальных клеток путем определения экспрессии генов эндотелиальных клеток, таких как CD31 и e-NOS.
In situ также можно применять гибридизационную гистохимию с применением кДНК или РНК проб, специфичных по эндотелиальному гену мРНК. Эти методы можно комбинировать с иммуноцитохимическими способами для усиления идентификации конкретных фенотипов. При необходимости антитела и молекулярные пробы, описанные выше, можно применять для процедур Вестерн- и Нозерн- блоттингов соответственно для помощи в клеточной идентификации.
Эндотелиальные клетки можно получить, например, из одного из многих хранилищ биологического материала по всему миру. Смотрите, например, American Type Culture Collection (ATCC.org в Системе Интернета) или International Depositary Authority of Canada (IDAC; nml-lnm.gc.ca в Системе Интернета). Эндотелиальные клетки или эндотелиальные клетки-предшественники также можно получить от людей, которые являются реципиентами трансплантируемой ткани или матрикса органа. Эти клетки считаются аутогенными реципиенту. Дополнительно при определенных обстоятельствах отношение между тканью или матриксом органа и эндотелиальными клетками или эндотелиальными клетками-предшественниками может быть аллогенным (то есть от разных особей одного вида); в иных случаях отношение между тканью или матриксом органа и эндотелиальными клетками или эндотелиальными клетками-предшественниками может быть ксеногенным (то есть от особей разных видов). В некоторых случаях ткань или матрикс органа является ксеногенным реципиенту, а эндотелиальные клетки или эндотелиальные клетки-предшественники являются аллогенными реципиенту.
Композицию, которая включает эндотелиальные клетки или эндотелиальные клетки-предшественники обычно доставляют в ткань или матрикс органа в растворе, совместимом с клетками (например, в физиологической композиции), в физиологических условиях (например, 37°C). Физиологическая композиция, называемая здесь, может включать без ограничений буферы, нутриенты (например, сахара, углеводы), энзимы, среду для размножения и/или дифференцировки, цитокины, антитела, репрессоры, факторы роста, солевые растворы или полученные из сыворотки протеины. Как применяют здесь, композиция, которая «главным образом состоит из» эндотелиальных клеток или эндотелиальных клеток-предшественников, представляет собой композицию, которая практически не содержит клетки, отличные от эндотелиальных или эндотелиальных клеток-предшественников, но все еще может включать любые компоненты, которые можно обнаружить в физиологической композиции (например, буферы, нутриенты и т. д.).
Для оптимизации реэндотелизации эндотелиальные клетки или эндотелиальные клетки-предшественники в целом помещают в орган или матрикс ткани путем перфузии. Как и прецеллюлярная перфузия, как описано в WO2007/025233, перфузия происходит через сосудистое русло или структур типа сосудистого русла; тем не менее перфузию для реэндотелизации ткани или матрикса органа обычно производят под давлением от низкого до нулевого (например, под меньшим давлением, чем применяют на стадии прецеллюлярной перфузии для расширения и промывания сосудистого ложа). Перфузия с эндотелиальными клетками или эндотелиальными клетками-предшественниками может быть мультинаправленной (например, антеградной и ретроградной) для дополнительной оптимизации реэндотелизации.
3
4
5
6
7
9
10
Число эндотелиальных клеток или эндотелиальных клеток-предшественников, которые вводят в ткань или матрикс органа для реэндотелизации, зависит как от органа или ткани (например, какой это орган или ткань, каков размер органа или ткани, стадия развития органа или ткани и/или степень васкуляризации органа или ткани), так и типа и стадии развития эндотелиальных клеток, производных эндотелиальных клеток, незрелых эндотелиальных клеток или эндотелиальных клеток-предшественников. В дополнение, более одного типа эндотелиальных клеток или эндотелиальных клеток-предшественников (например, смесь эндотелиальных клеток или эндотелиальных клеток-предшественников) можно перфузировать в орган или матрикс ткани. Различные типы эндотелиальных клеток или эндотелиальных клеток-предшественников могут обладать различной склонностью к плотности популяции, которой они достигнут, и, сходным образом, различные органы или матриксы тканей можно реэндотелизировать при различных плотностях. На простом примере по меньшей мере приблизительно 100 (например, по меньшей мере приблизительно 10, 10, 10, 10, 10, 10 или 10) эндотелиальных клеток или эндотелиальных клеток-предшественников можно вводить в орган или матрикс ткани.
2
До имплантации матрикс или трансплантат должен содержать в большинстве зрелые эндотелиальные клетки, как определяют путем экспрессии целлюлярных маркеров для эндотелиоцитов, которые включают, например, VE-кадгерин, CD144, CD141, CD106 или CD142. Иммуноцитохимию также можно применять для определения эндотелиальных клеток путем определения экспрессии генов эндотелиальных клеток, таких как CD31 и e-NOS. Недеструктивный способ эндотелиального выделения представляет собой краткую перфузию трипсина (0,25% или меньше) или другой способ отделения клеток для облегчения удаления небольшой фракции <0,01% эндотелиальных клеток, которые далее могут быть проанализированы на предмет экспрессии маркеров эндотелиальных клеток, включающих, но не ограничивающихся CD105, CD31 и функциональной экспрессией e-NOS. Дополнительную функцию эндотелиальных клеток можно оценить при помощи образования эндотелиальных трубок в анализах Мартигель. Кратко, лунки чашки с 96 лунками покрывают 50 мкл ледяным Martigel ™, вслед за чем инкубируют при 37°C в течение одного часа. Далее 100мкл EGM-2 среды, содержащей приблизительно от 25 000 до 50 000 эндотелиальных клеток, добавляют к Martigel ™. Инкубация продолжается в течение 16 часов в увлажненной среде при 37°C с 5% CO. Образование трубок анализируют при помощи инвертационного микроскопа, и цифровую фотомикрографию каждой отдельной лунки делают при четырехкратном увеличении, и общее число трубок, точки ветвления, длину трубок, также как и сумму длин трубок можно высчитать для каждой лунки, где присутствие эндотелиальных трубок определяет функционирующие эндотелиальные клетки.
Дополнительно, измерение реэндотелизации можно производить, применяя стандартные тесты гемосовместимости и анализы, включающие, но не ограничивающиеся активацией тромбоцитов, оксидантной реакцией, гемолизом, фибринолизом, образованием фибрина, выработкой тромбина, контактной активацией и активацией комплемента. Недеструктивные способы включают применение анализов пролиферации, таких как CellTiter Blue или других метаболических анализов для определения плотности эндотелиальных клеток, присутствующих в матриксе, что может быть экстраполировано на известные значения нативной ткани, где целью является достижение >50% плотности эндотелиальных клеток нативной ткани.
Измерение реэндотелизации можно производить, применяя стандартные тесты гемосовместимости и анализы, включающие, но не ограничивающиеся активацией тромбоцитов, оксидантной реакцией, гемолизом, фибринолизом, образованием фибрина, выработкой тромбина, контактной активацией и активацией комплемента. Недеструктивные способы включают применение анализов пролиферации, таких как CellTiter Blue или другие метаболические анализы для определения плотности эндотелиальных клеток, присутствующих в матриксе, что может быть экстраполировано на известные значения нативной ткани, где целью является достижение >50% плотности эндотелиальных клеток нативной ткани.
Перфузионные давления для введения эндотелиальных клеток в целом соответствуют нативным перфузионным давлениям тканей или органов, из которых матрикс или каркас получают в диапазоне от +/- 300%, поскольку сосудистое русло способно выдержать давление >300 мм рт. ст.
Реэндотелизованную ткань или матрикс органа, как описано здесь, можно трансплантировать реципиенту. Такие реэндотелизованные ткани или матриксы органов проявляют очень низкую тромбогенность и очень низкую иммуногенность. Такую реэндотелизованную ткань или матрикс органа после трансплантации можно подвергать дополнительной рецеллюляризации in vivo (т.е. с нативными клетками реципиента). Рецеллюляризация in vivo может дополнительно включать реэндотелизацию и/или рецеллюляризацию клетками, отличными от эндотелиальных клеток или эндотелиальных клеток-предшественников (например, ткане- или органоспецифичные клетки, такие как гепатоциты, эпителиальные клетки желчного протока, стволовые клетки, клетки-предшественники, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, мононуклеарные клетки костного мозга, гладкомышечные клетки кардиомиоциты, сердечные фибробласты, фибробласты, Купферовские клетки, поперечно-полосатые клетки, клетка-сателлит, париетальная клетка почечного клубочка, подоцит почечного клубочка, клетка щеточной каемки проксимального почечного канальца, клетка тонкого сегмента петли Генле, клетка дистального почечного канальца, клетка собирательного почечного канальца, пневмоцит типа I (выстилающие воздушное пространство клеток легкого), клетка протока поджелудочной железы (центроацинарная клетка), бета-клетка, островковые клетки, клетка, вставочная клетка, клетка щеточной каемки кишечника (с микропилями), клетка исчерченного протока экзокринной железы, эпителиальная клетка желчного пузыря, эпидидимальная главная клетка, интерстициальные почечные клетки и/или эпидидимальные базальные клетки).
Опционально ткань и матрикс органа можно рецеллюляризовать in vitro клетками, отличными от эндотелиальных или эндотелиальных клеток-предшественников до реэндотелизации ткани или матрикса органа или после реэндотелизации ткани или матрикса органа. Как применяют здесь, клетками, «отличными от эндотелиальных, эндотелиально полученных или эндотелиальных клеток-предшественников» называют все другие типы клеток, которые населяют конкретную ткань или орган. В описанных здесь способах стволовые клетки или клетки-предшественники (например, эмбриональные стволовые клетки (ESC), стволовые клетки взрослого или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS)) можно применять для рецеллюляризации паренхимы ткани или органа, или ткане- или органоспецифичные клетки (т.е. дифференцированные или частично-дифференцированные клетки) можно применять для рецеллюляризации паренхимы ткани или органа. С ткане- и органоспецифичными клетками конкретный тип доставляемой клетки обычно зависит от типа ткани или органа, создаваемого в конечном итоге. Например, при рецеллюляризации сердца кардиоциты, гладкомышечные клетки, сердечные фибробласты и/или сердечные стволовые клетки можно вводить в или на ткань или матрикс органа; при рецеллюляризации печени гепатоциты, клетки желчных путей, гладкомышечные клетки, фибробласты и/или клетки-предшественники гепатоцитов можно вводить в или на ткань или матрикс органа; при рецеллюляризации почки подоциты, гломерулярные клетки и/или эпителиальные клетки можно вводить в или на ткань или матрикс органа; при рецеллюляризации легкого эпителиальные клетки, клетки Клара, бокаловидные клетки, клетки альвеолярного типа I и/или альвеолярного типа II можно вводить в или на ткань или матрикс органа; при рецеллюляризации поджелудочной железы бета клетки и/или островковые клетки можно вводить в или на ткань или матрикс органа.
Как и с эндотелиальными клетками или эндотелиальными клетками-предшественниками, клетки, отличные от эндотелиальных или эндотелиальных клеток-предшественников, можно доставить в ткань или матрикс органа с физиологической композицией (например, с буферами, нутриентами, энзимами, средой роста или дифференцировки), и можно доставить или ввести при помощи любого количества путей (например, при помощи инъекции (например, во множество мест), перфузии, инфузии и/или топического нанесения).
В воплощениях, в которых клетки, отличные от эндотелиальных или эндотелиальных клеток-предшественников, вводят вслед за реэндотелизацией ткани или матрикса органа, может быть выигрышным позволить эндотелиальным клеткам или эндотелиальным клеткам-предшественникам в течение некоторого времени прикрепиться и стабилизироваться в сосудистом русле ткани или матрикса органа перед доставкой любых клеток. Достаточное время для прикрепления эндотелиальных клеток и эндотелиальных клеток-предшественников к ткани или матриксу органа составляет, например, от 30 до 180 минут. Тем не менее эндотелиальные клетки или эндотелиальные клетки-предшественники могут прикрепляться и стабилизироваться в ткани или матриксе органа в течение до, например, 28-30 дней (например, приблизительно 1 месяца).
В одном варианте осуществления децеллюляризованный печеночный трансплантат или долю реэндотелизируют эндотелиальными клетками артерий вен и/или печеночных синусов для создания трансплантабельного печеночного трансплантата, способного к трансплантации и анастомозированию с нативным печеночным кровоснабжением. Рецеллюляризацию печеночного трансплантата производят обычно in vivo путем миграции клеток от близлежащей ткани печени.
В другом варианте осуществления децеллюляризованные печеночный трансплантат или доля реэндотелизуют эндотелиальными клетками артерий вен и/или печеночных синусов для создания трансплантабельного печеночного трансплантата, способного к трансплантации и анастомозированию с нативным печеночным кровоснабжением. После трансплантации другие клетки перфузируют через материнское сосудистое русло или инъецируют в интерстиций печеночного трансплантата, такие как гепатоциты (аутогенные, аллогенные, полученные из стволовых клеток или из полученных iPS).
В другом варианте осуществления децеллюляризованный печеночный трансплантат или долю сначала реэндотелизуют, далее туда инъецируют гепатоциты для создания трансплантабельного печеночного трансплантата, способного к трансплантации и анастомозированию с нативным печеночным кровоснабжением.
В другом варианте осуществления децеллюляризованный сердечный трансплантат или заплатку реэндотелизуют для создания трансплантабельного сердечного трансплантата, способного к трансплантации и анастомозированию с нативным сердечным кровоснабжением. Трансплантат анастомозируют и помещают над ишемизированной областью сердца.
В другом варианте осуществления децеллюляризованный сердечный трансплантат или заплатку реэндотелизуют для создания трансплантабельного сердечного трансплантата, способного к трансплантации и анастомозированию с нативным сердечным кровоснабжением. После трансплантации другие клетки перфузируют через материнское сосудистое русло или инъецируют в интерстиций сердечного трансплантата, такой как кардиомиоциты (аутогенные, аллогенные, полученные из стволовых клеток или из полученных iPS).
В другом варианте осуществления децеллюляризованный сердечный трансплантат или заплатку реэндотелизуют для создания трансплантабельного сердечного трансплантата, способного к трансплантации и анастомозированию с нативным сердечным кровоснабжением. Ишемизированную ткань сердца удаляют, и реэндотелизованный трансплантат анастомозируют и имплантируют хирургически.
В другом варианте осуществления децеллюляризованный сердечный трансплантат или заплатку сначала реэндотелизуют, далее туда инъецируют кардиомиоциты для создания трансплантабельного печеночного трансплантата, способного к трансплантации и анастомозированию с нативным сердечным кровоснабжением. Ишемизированную ткань сердца удаляют, сократимый трансплантат анастомозируют и имплантируют хирургически.
В одном варианте осуществления децеллюляризованный легочный трансплантат или долю реэндотелизуют для создания трансплантабельного легочного трансплантата, способного к трансплантации и анастомозированию с нативным печеночным кровоснабжением. Рецеллюляризацию легочного трансплантата производят обычно in vivo путем миграции клеток от близлежащей ткани легкого.
В другом варианте осуществления децеллюляризованные легочный трансплантат или долю реэндотелизуют эндотелиальными клетками артерий вен и/или синусов для создания трансплантабельного печеночного трансплантата, способного к трансплантации и анастомозированию с нативным печеночным кровоснабжением. После трансплантации другие клетки перфузируют через материнское сосудистое русло или инъецируют в интерстиций легочного трансплантата, такие как легочные эпителиальные клетки (аутогенные, аллогенные, полученные из стволовых клеток или из полученных iPS).
В одном варианте осуществления децеллюляризованный почечный трансплантат или долю реэндотелизуют для создания трансплантабельного почечного трансплантата, способного к трансплантации и анастомозированию с нативным печеночным кровоснабжением. Рецеллюляризацию легочного трансплантата производят обычно in vivo путем миграции клеток от близлежащей ткани почки.
В другом варианте осуществления децеллюляризованный почечный трансплантат или долю реэндотелизуют для создания трансплантабельного печеночного трансплантата, способного к трансплантации и анастомозированию с нативным почечным кровоснабжением. После трасплантации другие клетки перфузируют через материнское сосудистое русло или инъецируют в интерстиций почечного трансплантата, такие как почечные клетки почечного канальца (аутогенные, аллогенные, полученные из стволовых клеток или из полученных iPS).
В одном варианте осуществления децеллюляризованный трансплантат или долю поджелудочной железы реэндотелизуют для создания трансплантабельного трансплантата поджелудочной железы, способного к трансплантации и анастомозированию с нативным печеночным кровоснабжением. Рецеллюляризацию легочного трансплантата производят обычно in vivo путем миграции клеток от близлежащей ткани поджелудочной железы.
В другом варианте осуществления децеллюляризованный трансплантат или долю поджелудочной железы реэндотелизуют для создания трансплантабельного печеночного трансплантата, способного к трансплантации и анастомозированию с нативным кровоснабжением поджелудочной железы. После трансплантации другие клетки перфузируют через материнское сосудистое русло или инъецируют в интерстиций трансплантата поджелудочной железы, такие как бета-клетки (аутогенные, аллогенные, полученные из стволовых клеток или из полученных iPS).
В одном варианте осуществления стартовым материалом является перфузированная децеллюляризованная доля печени. В другом варианте осуществления стартовым материалом является часть перфузированной децеллюляризованной доли печени. В другом варианте осуществления стартовым материалом является перфузированный децеллюляризованный сердечный трансплантат, выделенный из левого желудочка. В другом варианте осуществления стартовым материалом является перфузированный децеллюляризованный сердечный трансплантат, выделенный из правого желудочка. В другом варианте осуществления стартовым материалом является перфузированный децеллюляризованный легочный трансплантат, выделенный из доли легкого. В другом варианте осуществления стартовым материалом является перфузированная децеллюляризованная доля легкого. В другом варианте осуществления стартовым материалом является перфузированная децеллюляризованная почка. В другом варианте осуществления стартовым материалом является перфузированный децеллюляризованный почечный трансплантат, выделенный из сегмента почки. В другом варианте осуществления стартовым материалом является перфузированный децеллюляризованный трансплантат поджелудочной железы, выделенный из сегмента поджелудочной железы.
Как отмечено здесь, способы рецеллюляризации, описанные здесь, которые приводят к значительной реэндотелизации ткани или матрикса органа, производят ткань или матрикс органа таким образом, что при трансплантации реципиенту выявляется очень малая тромбогенность. Такая реэндотелизованная ткань или матрикс органа также проявляет очень низкую иммуногенность на основании количества воспалений, наблюдаемых у трансплантированных тканей и органов, и/или воспалительной реакции, перенесенной реципиентом после трансплантации.
В соответствии с настоящим раскрытием, специалисты в данной области техники могут применять метод традиционной молекулярной биологии, микробиологии, биохимии и рекомбинантных ДНК. Объяснение этих методов полностью дано в литературе. Изобретение дополнительно описано в следующих примерах, которые не ограничивают объем методов и композиций, описанных в формуле изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1 - Животные
Все эксперименты проводят в соответствии с Законом о Защите Животных США (US Animal Welfare Act), они одобрены Комитетом по Содержанию и Использованию Лабораторных Животных (Institutional Animal Care and Use Committee) при Университете Минесоты. Матриксы сердца получены от крыс Sprague Dawley (250-319 г) или Fisher 344 (196-296 г). 344 матрикса Fisher использовали в исследованиях трансплантата. Всех крыс, используемых для получения сердечных каркасов, анестезируют 100 мг кетамина на кг веса тела (Phoenix Pharmaceutical) и 10 мг ксилазина на кг веса тела (Phoenix Pharmaceutical), вслед за чем производят системную гепаринизацию.
Пример 2 - Децеллюляризация Трупных Крысиных Сердец
Трупные крысиные сердца децеллюляризуют описанными выше способами (Ott с соавт., 2008; Nature Med., 14(2):213-21). Кратко, крыс анестезируют. Далее производят срединную стернотомию, вслед за этим следует рассечение перикарда и удаление ретростернального жирового тела для выделения сосудов средостения. Первые три ветви восходящей части грудной аорты, а также верхнюю полую вену лигируют и пересекают. Нижнюю полую вену (НПВ) и легочные сосуды (вены и артерии) пересекают. Выделенное сердце далее извлекают из грудной полости, помещают в чашку Петри, содержащую PBS, катетеризируют и наполняют PBS. Далее сердце перфузируют под силой тяжести 1% SDS, далее омывают деионизированной водой, 1% Triton-X100 (Sigma) и антибиотик содержащим PBS (100 ед./мл пенициллина, 100 ед./мл стрептомицина; Gibco).
Пример 3 - Рецеллюляризация Каркасов Крысиного Сердца
2
2
Эндотелиальные клетки крысиной аорты (RAEC) получают от Vec Technologies (Rensselaer, Нью-Йорк). RAEC между пересевами 14 и 20 применяют во всех экспериментах. RAEC культивируют в покрытых желатином Т185 колбах в полноценной MCDB-131 (Vec Technologies) и пропускают при помощи TrypLA Express (Invitrogen). Для рецеллюляризации через аорту производят ретроградное аортальное перфузирование клеточных суспензий в децеллюляризованные каркасы; для рецеллюляризации через плечеголовной ствол (BA) структуры под длительной ретроградной перфузией аортальной среды вводят клетки в ВА. Структуры, рецеллюляризованные через НПВ, имеют катетер, помещаемый в НПВ, вслед за чем производят RAEC перфузирование. Для всех структур клетки вводят в количестве 10 миллионов клеток на мл. Если не указано иное, структуры культивируют при длительном перфузировании среды через аорту (полноценная MCDB-131) в течение семи дней в инкубаторе для культуры ткани. В резервуар со средой длительно вводят карбоген (5% CO и 95% O) на протяжении всего эксперимента.
Пример 4 - Мечение Клеток
18
18
В совокупности исследований RAEC метят DiI или DiO в день проведения рецеллюляризации. Коротко, среду удаляют со сливной чашки RAEC и замещают DPBS, содержащим 5 мкмоль SP-DiIC или SP-DiOC(Invitrogen). Спустя 5 минут инкубации при 37°С чаши перемещают в холодильник и инкубируют в течение 15 минут при 4°С. Чаши далее промывают однократно PBS и оставляют восстанавливаться в течение 2 часов при 37°С в культуральной среде перед выделением и посевом структур. В конце эксперимента структуры удаляют из биореактора и отображают на Stereo Discovery V20 Macro Stereo (Carl Zeiss Inc.), рассекают, помещают в Slowfade (Invitrogen) и отображают на 510 Мета Конфокальном Микроскопе (Carl Zeiss Inc.).
В отдельных исследованиях посевы структур RAEC метят при помощи Cell Tracker Green CMFDA (Invitrogen) на последний день культивирования (День 7) путем удаления полностью культуральной среды и циркулирующих, не содержащих сыворотку CMFDA, включающих DMEM (Cellgro) в течение 45 минут при 37°С. Содержащую CMFDA среду далее помещают с полным MCDB-131 и структуры инкубируют в течение 45 минут. CMFDA-меченые структуры далее удаляют из биореактора, рассекают, помещают в Slowfade (Invitrogen) и отображают на 510 Мета Конфокальном Микроскопе (Carl Zeiss Inc.).
Пример 5 - Гистология и Подсчет Клеточных Ядер/Сосудов
На последний день культивирования структуры удаляют из биореактора, делят на четыре коротких оси, в случайном порядке распределяемые от основания до верхушки и далее заливают парафином. После заливки парафином, приготовления срезов и регидратации их окрашивают гематоксилином, эозином или по Вирхову-ван Гисону по стандартной схеме. Срезы отображают при помощи Nikon Eclipse TE200 инвертационного микроскопа (Fryer Co. Inc.). Для подсчета ядер неокрашенные срезы помещают в Vectashield, содержащий DAPI (Vectorlabs), и делают 5 случайных изображений высокого разрешения на секцию. DAPI-позитивные ядра далее подсчитывают и нормируют к области ткани. Для подсчета диаметра сосуда делают 5 случайных изображений высокого разрешения на секцию, окрашенную по Вирхофу-ван Гисону, и далее все происходит, как описано ранее. Диаметр оценивают путем измерения короткого аксиального диаметра клетки, содержащей сосуд, при помощи ImageJ software (NIH). Все изображения получены при помощи Nikon Eclipse TE200 инвертационного микроскопа (Fryer Co. Inc.).
Пример 6 - Иммунофлюоресцентное Окрашивание
Парафиновые срезы регидратируют путем замены ксилола и набора спиртов увеличивающихся концентраций. Срезы кипятят в 10 ммоль цитратного буфера с 0,05% Tween-20 при рН равном 6,0 в течение 20 минут. Блокаду производят 3% BSA в PBS в течение одного часа. Первичные антитела к PCNA, PECAM-1 (кроличьи поликлональные, Santa Cruz), vWF, eNOS, Calretinin, Vimentin (кроличьи поликлональные, Abcam), vWF (козьи поликлональные, Santa Cruz), FLK-1 (мышиные моноклональные, BD Bioscence), CD34, CD45, CD11b (мышиные моноклональные, Santa Cruz), альфа-гладкомышечный актин (мышиные моноклональные, Sigma) и CD8 (кроличьи моноклональные, Abcam) разводят до 10 мкг/мл в PBS и инкубируют в течение ночи при 4°С. Срезы промывают тремя сменами PBS с 0,05% Tween-20 между стадиями. Подходящие вторичные антитела, родственные FITC или Texas Red (Jackson Immunoresearch), разводят 1:250 и инкубируют в течение одного часа. Срезы погружают в DAPI-содержущюю среду и визуализируют при помощи флюоресцентного микроскопа Nikon Eclipsa TE200.
Пример 7 - Анализ G6PDH
Клетки среды собирают из биореактора ежедневно и хранят при -20°С. В день анализа образцы оттаивают и, следуя инструкциям производителя, измеряют активность G6PDH при помощи Vybrant Cytotoxicity Assay Kit (Invitrogen)
Пример 8 - TUNEL
После семи дней культивирования реэндотелизованные структуры фиксируют формалином, разрезают на четыре представительные короткие оси от основания до верхушки, заливают парафином и далее делают срезы. Систему DeadEnd Colorimetric TUNEL (Promega) применяют для окраски меченой ДНК. Следуют инструкциям производителя для залитых парафином образцов со следующими модификациями: после депарафинизации образцов и регидратации через набор спиртов их нагревают в течение 2 минут в 10 ммоль растворе цитратного буфера (Trater с соавт., 1995, Histochem. Cell Biol., 103 (2):157-60); и вместо применения пероксидазы хрена, конъюгированной со стрептавидином (Jackson ImmunoResearch). Срезы погружают в Vectashield, содержащий DAPI (Vectorlabs), и отображают при помощи Nikon Eclipse TE200 инвертационного микроскопа (Fryer Co. Inc., Huntley, IL).
Пример 9 - In vitro Анализ Тромбомодулина
Анализ тромбомодулина адаптирован из прежней опубликованной работы (Calnek & Grinnell, 1998, Experimen. Cell Res., 238(1):294-8; Ibrahim & Ramamurthi, 2008, J. Tissue Eng. Regen. Med., 2(1):22-32). В последний день культивирования (седьмой день) структуры трижды промывают не содержащим феноловый красный DMEM/F12 (Invitrogen) при расходе жидкости 1 мл/мин в течение всего 45 минут. Четыре миллилитра не содержащего фенолового красного DMEM/F12, содержащего человеческий альфа-тромбин (0,1 NIH ед/мл; Haemotologic Technologies), и человеческий протеин С (12 мкг/мл; Haemotologic Technologies) продолжительно циркулирует через структуры сердца через аорту в течение 45 минут при 1 мл/мин. В трипликате 100мкл среды переносят на чашку с 96 лунками, смешивают с 50 мкл запаса гирудина (12 ATU/мл (антитромботическая единица активности); American Diagnostica) и инкубируют в течение 5 минут при 37°С. К каждой лунке, содержащей образец, добавляют 50 мкл субстрата S-2366 (конечная концентрация 0,75 ммоль; Chromogenix) и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 минут. Абсорбирующую способность при 410 нм и 490 нм измеряют при помощи Sprectra MAX 340 (Molecular Devices). Конечную относительную абсорбирующую способность высчитывают путем вычитания абсорбирующей способности при 490 нм из 410 нм и далее нормируют к контролю ацеллюлярного каркаса.
Пример 10 - Гетеротопический Трансплантат
Крыс-реципиентов, «голых» RNU (213-388 г) или Fisher 344 ( 278-351 г) анестезируют натрия пентобабиталом (60 мг/кг веса тела, интраперитонеальная инъекция). Производят разрез по срединной линии абдоминальной стенки для выделения нисходящей аорты и нижней полой вены. Производят анастомозирование конец-в-бок восходящей части аорты донорского сердца и левой легочной артерии с абдоминальной аортой и полой веной крысы-реципиента при помощи 9-0 швов по Ono & Lindsey (Ono, 1969, J.Thorac. Cardiovasc. Surg., 57(1):225-9). Перед трансплантацией крысам проводят гепаринизацию, с «голыми» только матриксными трансплантатами проводят длительную антикоагулянтную терапию (гепарин натрия на 100 МЕ. на кг веса тела дважды в день трансплантации, 200 МЕ. на кг веса тела подкожно в течение следующих двух дней) и кумадин (0,25 мг/кг веса тела в день) с питьевой водой.
Пример 11 - Перфузия и Распределение Аортальных Эндотелиальных Клеток Крыс
Исследуют три способа рецеллюляризации для определения оптимального метода для доставки эндотелиальных клеток: (а) прямая перфузия RAEC через аорту, (b) клеточная перфузия через BA с фильтрованием среды через аорту или (с) комбинированная доставка клеток: сначала через НПВ, далее путем вторичной инфузии через BA, как описано. После доставки структуры культивируют под ретроградной аортальной перфузией среды в течение одной недели перед началом анализирования. Для верификации локализации клеток и подсчета насыщения клетками через семь дней культивирования структуры фиксируют, разделяют на 4 короткие оси, распределенные от основания до верхушки, заливают парафином, окрашивают и подсчитывают DAPI-позитивные ядра (Фигура 1А). В каждом способе доставки клетки удерживают в структурах и выстланных полостях сосудов. Статистически значимой разницы не наблюдается в количестве эндотелиальных клеток матрикса, когда 20 миллионов клеток доставляют через аорту или ВА (Фигура 1А). Тем не менее доставленные через аорту не достигают равномерного распределения в сердце, но вместо этого, локализуются на верхушке, в то время как основание остается ацеллюлярным. Статистически значимое увеличение подсчитываемого содержания клеток наблюдают, когда количество посеянных клеток удваивается. Наибольшее содержание клеток наблюдают в посеянных через НПВ и ВА структурах, что является статистически значимым даже по сравнению с единичной ВА инфузией такого же количества клеток.
Мечение RAEC при помощи DiI и DiO перед рецеллюляризацией подтверждает равномерное распределение клеток в матриксе сердца для структур, которые засеивали клетками, доставляемыми через ВА (Фигура 1В-С) или НПВ и ВА (Фигура 1D-E). Сходным образом после перфузии RAEC через НПВ (DiO позитивные) клетки можно наблюдать в сердце от верхушки до основания. Изучение структур с посеянными DiO- и DiI мечеными клетками выявило, что в стенке желудочка обнаруживают сосуды, которые заново покрыты клетками, доставленными по одному пути (Фигуры 2А и В) (то есть клетками, доставленными через ВА или через НПВ), или содержат клетки, доставленные по двум путям (Фигура 2С). Эндокардиальную поверхность левого желудочка преимущественно рецеллюляризуют клетки, доставленные в ВА, в то время как эндокардиальную поверхность правого желудочка выстилают RAEC, доставленные через НПВ (Фигуры 2D и Е).
Гистология (окрашивание гематоксилином и эозином и по Вирхофу-ван Гисону) структур, которые культивируют в течение семи дней, показывает, что выстланы сосуды различных диаметров (Фигуры 3А-D), так же как и эластин-позитивные артериальные сосуды и эластин-негативные сосуды (Фигуры 3В и D). Эти результаты означают, что RAEC не показывают заметного предпочтения по сосудам во время децеллюляризации и далее в in vitro культивировании. Подсчет диаметра сосуда в среднем слое стенки желудочка выявил, что комбинированная доставка клеток через НПВ и ВА приводит к статистически значимому увеличению числа маленьких сосудов (диаметром от 11 до 25 микрон) по сравнению с доставкой RAEC только через ВА (Фигура 3Е). При исследования апикальных срезов не наблюдают зависимого от доставки распределения диаметров сосудов.
Пример 12 - Выживание в Культуре Аортальных Эндотелиальных Клеток Крыс
Для верификации достаточности ретроградного перфузирования для поддержания фенотипа RAEC и предотвращения клеточной гибели в рецеллюляризованных структурах применяют три различных анализа: (а) CMFDA мечение клеток в конце культивирования in vitro, (b) TUNEL окрашивание и (с) подсчет глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной (G6PDH) активности в перфузате структуры за период равный семи дням. Структуры рецеллюляризуют как только через ВА, так или через НПВ, культивируют в течение семи дней, как описано, и далее метят CMFDA. CMFDA применяют, поскольку он может метить и прикрепляться только к живым клеткам. И клетки, доставленные через ВА, и клетки, доставленные через НПВ, способны к притягиванию CMFDA (Фигура 4А-С) на седьмой день. Метят эндокардиальные клетки, выстилающие правый желудочек (Фигура 4С), определяя рудиментарные коронарные сосуды. TUNEL анализ показал, что очень малое количество, если вообще такие есть, REAC подвергаются апоптозу на седьмой день (Фигура 4D-I) независимо от локализации клеток (ЛЖ, ПЖ или перегородка). Как показатель происходящей клеточной смерти определяют активность G6PDH. На протяжении эксперимента повышение активности G6PDH не наблюдается независимо от способа доставки клеток (Фигура 4J). Эти результаты говорят о том, что аортальное перфузирование является достаточным для поддержания RAEC в рецеллюляризованной структуре сердца независимо от способа их доставки.
Пример 13 - Фенотипический Анализ Реэндотелизованных Структур In Vitro
+
+,
Фенотип и функцию RAEC исследуют при помощи иммунофлуоресцентного окрашивания клеток в структурах на седьмой день после рецеллюляризации. В структурах можно обнаружить PCNA клетки, предполагая продолжительную пролиферацию (Фигура 5А). Аналогично eNOS клетки можно обнаружить в сосудистой сети, что подразумевает, что клетки все еще функционируют (Фигура 5В). Наконец, RAEC экспрессируют фактор Виллебранда (Фигура 5С), определяя потенциал для регулирования свертывания. Для определения того, являются ли реэндотелизованные структуры способными ингибировать каскад коагуляции, проводят анализ тромбомодулина in vitro в перфузате, циркулирующем через структуры. Для этого на седьмой день раствор, содержащий тромбин и протеин С, пропускают через рецеллюляризованные структуры или ацеллюлярные каркасы. Наблюдают статистически значимое увеличение в 6-8 раз тромбомодулина и тромбин-опосредованной активности протеина С (Фигура 5D). Протеин С является отрицательным регулятором каскада коагуляции; таким образом, эти результаты отражают, что рецеллюляризованные структуры могут потенциально ингибировать каскад коагуляции, поскольку они сохраняют способность активировать протеин С. ВА- и ВА плюс НПВ-рецеллюляризованные структуры ведут себя сходным образом, хотя имеется тенденция к лучшим результатам у структур клеток, доставленных через ВА плюс НПВ.
Пример 14 - Исследование Гетеротопических Эксплантатов
+
+
Как ацеллюлярные каркасы, так и ВА RAEC реэндотелизованные структуры гетеротопически трансплантируют в брюшную полость крыс реципиентов. До трансплантации реэндотелизованные структуры культивируют в течение семи дней для обеспечения прикрепления и роста RAEC. На седьмой день после трансплантации структуры эксплантируют и исследуют (Фигура 6). В аорте формируется тромб, но он уменьшается в рецеллюляризованных структурах (Фигура 6А и Е). Исследование стенки ЛЖ и желудочка показывает большую тромбогенность в трансплантатах ацеллюлярных каркасов по сравнению с реэндотелизованными структурами (Фигуры 6В и F). Наблюдают более жидкую кровь в паренхиме ацеллюлярных каркасов (Фигура 6С и G), в то время как действующие сосуды, заполненные кровью, наблюдают в реэндотелизованных структурах (Фигуры 6D и I). Исследование заполненных клеток путем иммунофлюоресцентного окрашивания (Таблица 1) показывает, что очень малая часть (менее 4%) является позитивной для маркеров макрофагов (CD11b) или лимфоцитов (CD8). Дополнительно, маркеры гладкомышечных клеток (SMA), мезотелия (калретинин), эндотелиальных клеток-предшественников (CD34), эндотелия (фактор Виллебранда) и фибробластов (виментин) экспрессируются у малой группы заполненных клеток (Таблица 1). Большинство заполненных клеток экспрессируют клеточные маркеры PECAM и VEGFR2 независимо от того, была ли структура рецеллюляризована или нет (Фигура 7). Тем не менее маркеры клеток-предшественников, CD34 и гематопоэтиновых клеток-предшественников (CD45) экспрессируются только на малой группе заполненных клеток (Таблица 1).
Таблица 1
Маркер
Позитивные клетки в поле зрения под большим увеличением
% DAPI-позитивных ядер
CD11b
44,00
3,87
CD45
22,50
2,37
CD8
23,20
0,89
Калретинин
20,00
1,69
CD34
6,00
0,13
Фактор Виллебранда
19,00
1,11
Виментин
17,80
0,39
SMA
3,20
0,09
Следует понимать, что поскольку способы и композиции описаны здесь совместно с различными аспектами, вышеизложенное описание различных аспектов должно иллюстрировать и не ограничивать объем способов и композиций. Другие аспекты, преимущества и модификации находятся в пределах объема следующей формулы изобретения.
Раскрыты способы и композиции, которые можно применять для продуктов раскрытых способов и композиций, либо совместно с указанными продуктами или для их приготовления, либо которые являются продуктами раскрытых способов и композиций. Эти и другие материалы раскрыты здесь, и следует понимать, что комбинации, подгруппы, взаимодействия, группы и т.д. этих способов и композиций раскрыты. Другими словами, пока в прямой форме не раскрыты конкретные ссылки на каждые различные индивидуальные и коллективные комбинации и изменения этих композиций и способов, каждый конкретно рассматривается и описывается здесь. Например, если конкретная композиция или конкретный способ раскрыт и обсужден, и обсуждено определенное число композиций и способов, каждые комбинация и изменения композиций и способов рассматриваются конкретно, если специально не указано иное. Другими словами, любая подгруппа или их комбинация также конкретно рассматривается и раскрывается.
Все публикации, патенты и патентные заявки включены здесь посредством ссылки. Поскольку в вышеизложенных инструкциях это изобретение описано относительно конкретных предпочтительных вариантов осуществления и многие детали предложены с целью иллюстрирования, специалистам в данной области техники будет очевидно, что изобретение допускает дополнительные варианты осуществления и что некоторые детали, описанные здесь, могут значительно варьировать без отрыва от базовых принципов изобретения.