СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ СИНДРОМА ПРАДЕРА-ВИЛЛИ
METHOD FOR TREATMENT OF PRADER-WILLI SYNDROME

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США №62/345,133, поданной 3 июня 2016 г., по предварительной заявке на патент США №62/375,662, поданной 16 августа 2016 г., каждая из которых полностью включена в настоящий документ путем ссылки.
ПРАВИТЕЛЬСТВЕННАЯ ПОДДЕРЖКА
Данная работа была выполнена частично при поддержке гранта Национального института здравоохранения R01DK052431; следовательно, Правительство США может иметь определенные права на настоящее изобретение.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к способам регулирования активности прогормон-конвертазы (РС1), а также к соединениям и лекарственным средствам, которые повышают уровни РС1.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Синдром Прадера-Вилли (СПВ) - это заболевание, причиной которого является утрата отцовских экспрессируемых генов импринтингового участка хромосомы 15q. К классическим фенотипическим проявлениям относится гиперфагия, центральный гипогонадизм и низкий уровень гормона роста. Редкая микроделеция у пациентов с СПВ определяет делецию в критическом участке размером минимум 91 п. н., охватывающую 3 гена, включая некодирующий ген SNORD116. Мы обнаружили, что при СПВ количество NHLH2 и РС1 снижено в нейронах, полученных из ИПСК, по сравнению со здоровыми контрольными образцами. Уровни транскрипта Nhlh2 и Pcsk1 снижаются в гипоталамусе мышей Snord116p-/m+ в состоянии натощак.
Дефицит Nhlh2 у мышей вызывает ожирение, гипогонадизм и задержку роста. Nhlh2 стимулирует экспрессию прогормон-конвертазы (РС1). У людей и мышей с дефицитом РС1 наблюдается гиперфагия, гипогонадизм, низкий уровень гормона роста и диабет вследствие нарушения процессинга прогормона. Например, у мышей Snord116p-/m+ in vivo наблюдаются функциональные дефекты процессинга прогормона проинсулина, про-РГГР и прогрелина, связанные со снижением количества РС1.
В настоящее время отсутствуют лекарственные средства для пациентов с СПВ, поэтому остро необходимы эффективные лекарственные средства и модельные системы.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способы настоящего изобретения предусматривают регулирование активности прогормон-конвертазы путем введения эффективного количества ингибитора фосфодиэстеразы-4 (ингибитор ФДЭ-4 или ФДЭ4и). Экспрессия прогормон-конвертазы может повышаться путем введения терапевтически эффективного количества ингибитора ФДЭ-4. Ингибитор ФДЭ-4 может вводиться в клетку или пациенту с синдромом Прадера-Вилли. Ингибитор ФДЭ-4 может вводиться субъекту с ожирением. Также ожидается, что эти способы будут полезны для лечения пациентов с синдромом Шааф-Янга и расстройством аутического спектра.
Ингибитор ФДЭ-4 может вводиться перорально, внутривенно, подкожно, интратекально, местно, интраназально или в легкие.
Ингибитор ФДЭ-4 может включать в себя теофиллин, рофлумиласт, апремиласт, ибдуласт, GSK356278, MK0952, ИБМК, а также комбинации этих препаратов.
В некоторых вариантах осуществления ингибитор ФДЭ-4 может включать в себя любой из ингибиторов, представленных в таблице 1А или таблице 1В.
В дополнительных вариантах осуществления комбинации ингибиторов ФДЭ-4 могут использоваться в способах настоящего изобретения.
Способы настоящего изобретения также включают в себя введение терапевтически эффективного количества активатора аденилатциклазы. Активатор аденилатциклазы может вводиться в клетку или пациенту с синдромом Прадера-Вилли. Активатор аденилатциклазы может вводиться субъекту с ожирением.
Активатор аденилатциклазы может вводиться перорально, внутривенно, интратекально, интраназально, местно или в легкие. Активатор аденилатциклазы может включать в себя форсколин, FD1, FD2, FD3, FD4, FD5 (NKH477), FD6, а также комбинации этих препаратов.
Ингибитор ФДЭ-4 также может вводиться вместе с активатором аденилатциклазы.
Способы настоящего изобретения также включают в себя введение терапевтически эффективного количества агониста MC4R. Агонист MC4R может вводиться в клетку или пациенту с синдромом Прадера-Вилли. Агонист MC4R может вводиться субъекту с ожирением.
Агонист MC4R может вводиться перорально, внутривенно, интратекально, интраназально, местно или в легкие. Агонист MC4R может включать в себя RM-493 (сетмеланотид), ТТР2515, производные 2-аминотиазола, MK-0493 и их комбинации. Агонист MC4R может вводиться в комбинации с ингибиторами ФДЭ-4 и/или активаторами аденилатциклазы, описанными в настоящем документе.
Способы настоящего изобретения также включают в себя способы, в которых введение приводит к одному или более из следующих улучшений у пациента: уменьшению или улучшению гиперфагии; повышению уровней PCSK1; повышению уровня и/или активности РС1; снижению соотношения циркулирующего проинсулина к инсулину, повышая, таким образом, секрецию инсулина; снижению соотношения циркулирующего прогрелина к грелину; снижению соотношения циркулирующего ПОМК к АКТГ; облегчению гипотиреоза, снижению соотношения циркулирующего проокситоцина к окситоцину, повышая, таким образом, выработку окситоцина в мозге и повышая выработку альфа-МСГ в мозге; снижению соотношения циркулирующего про-НФГМ к НФГМ (повышение уровня НФГМ в мозге); а также повышению соотношения прогормона к гормону (снижению уровней незрелых гормонов); причем симптомы, уровни или соотношения употребляются применительно к симптомам, уровням или соотношениям заболевания пациента.
В некоторых вариантах осуществления способы предусматривают лечение синдрома Прадера-Вилли (СПВ), включающее введение ингибитора фосфодиэстеразы-4 (PDE4i) нуждающемуся в этом субъекту, улучшая, устраняя или предотвращая, таким образом, один или несколько симптомов СПВ.
В некоторых вариантах осуществления введение PDE4i повышает у субъекта концентрации или активность циклического аденозинмонофосфата (цАМФ).
В некоторых вариантах осуществления СПВ характеризуется пониженной экспрессией NHLH2.
В дополнительных вариантах осуществления пониженная экспрессия NHLH2 приводит к пониженной экспрессии PCSK1.
В некоторых вариантах осуществления повышение концентраций или активности цАМФ повышает экспрессию Pcsk1.
В дополнительных вариантах осуществления PDE4i является селективным PDE4L В дополнительных вариантах осуществления PDE4i является неселективным PDE4i.
В некоторых вариантах осуществления селективный PDE4i выбирают из AN2728, апремиласта, циломиласта, диазепама, ибудиласта, лютеолина, мезембренона, пикламиласта, рофлумиласта, ролипрама, Е6005, GSK356278 и MK0952.
В некоторых вариантах осуществления неселективный PDE4i выбирают из метилированных ксантинов и их производных, кофеина, аминофиллина, 3-изобутил-1-метилксантина, параксантина, пентоксифиллина, теобромина и теофиллина.
В других дополнительных вариантах осуществления один или более симптомов включают в себя гиперфагию, пониженную интенсивность метаболизма, ожирение, гипогонадизм, гипоадренализм, сниженную выработку гормона роста, пониженный мышечный тонус, нарушения сна, нарушения со стороны желудочно-кишечного тракта, пониженную выносливость, пониженную способность к концентрации, ухудшение когнитивной деятельности, поведенческие нарушения, тревожное расстройство, задержку роста, пониженную способность превращения незрелых гормонов в зрелые и активные формы, а также сахарный диабет и несахарный диабет.
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает в себя введение одного или нескольких дополнительных терапевтических агентов, эффективных для лечения или улучшения одного или более симптомов СПВ.
В некоторых вариантах осуществления незрелые гормоны включают в себя один или более из инсулина, грелина, РГГР, альфа-МСГ, окситоцина, орексина, НФГМ, вазопрессина, нейропептида Y, АПБ и гонадотропинов, АКТГ.
В некоторых вариантах осуществления один или более дополнительных терапевтических агентов, эффективных для лечения или улучшения СПВ, включают в себя инсулин, агонист рецептора инсулина, грелин, агонист рецептора грелина, РГГР, агонист рецептора РГГР, альфа-МСГ, агонист рецептора альфа-МСГ, окситоцин, агонист рецептора окситоцина, орексин, агонист рецептора орексина, НФГМ, агонист рецептора НФГМ, вазопрессин, агонист рецептора вазопрессина, нейропептид Y, агонист рецептора нейропептида Y, АПБ, агонист рецептора АПБ, гонадотропин, агонист рецептора гонадотропина или их комбинации.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На фиг. 1 представлена модель, показывающая, каким образом дефицит Nhlh2 и РС1 может обуславливать основные нейроэндокринные фенотипические проявления СПВ. Дефицит процессинга прогормона вследствие дефицита выработки РС1 и Nhlh2 может быть причиной основных нейроэндокринных фенотипических проявлений СПВ. Было высказано предположение, что утраты отцовского гена SNORD116 может быть достаточно, чтобы вызвать дефицит Nhlh2 и РС1, что в свою очередь вызовет функциональные дефекты процессинга прогормона. Пунктирные стрелки/линии обозначают теоретические связи. Сплошные стрелки/линии обозначают пути, которые были исследованы.
На фиг. 2 представлена схема, содержащая обоснование лечения СПВ с применением агентов, которые повышают клеточные уровни цАМФ, чтобы повысить уровень и/или активность клеточной РС1 и увеличить процессинг прогормона.
На фиг. 3А-Р представлены графики, показывающие, что снижение регуляции РС1 в моделях СПВ связано с нарушением процессинга прогормона; уровни транскрипта PCSK1 можно повысить в здоровых контрольных образцах путем обработки форсколином.
На фиг. 4 представлена схема, содержащая терапевтическое обоснование совместного введения агонистов MC4R и/или ингибиторов АПБ в комбинации с форсколином и/или теофиллином индивидам с СПВ и, возможно, другими типами ожирения, включая обычное ожирение.
На фиг. 5А-Н представлены графики, показывающие, что применение агониста АЦ форсколина повышает уровни транскрипта PCSK1/Pcsk1 в первичных нейронах мыши, нейронах, полученных из ИПСК, а также в первичных панкреатических островках мыши.
На фиг. 6A-F представлены графики, показывающие, что применение ингибиторов фосфодиэстеразы к нейронам, полученным из ИПСК, повышает уровни транскрипта PCSK1 и увеличивает процессинг прогормона. Фиг. 6А: Теофиллин повышает уровни транскрипта PCSK1 в нейронах дугообразного ядра гипоталамуса, полученных из ИПСК (линия 1023А), в день 34 при концентрации 10 мМ. Фиг. 6В-С: Рофлумиласт повышает уровни транскрипта PCSK1 в нейронах, полученных из ИПСК, в день 40 дифференциации (линия 1043D3) при концентрации 1 мМ. Фиг. 6D-E: Комбинированное лечение рофлумиластом (100 нМ) и форсколином (1 мкМ) повышает уровни транскрипта PCSK1 и увеличивает переработку ПОМК в АКТГ при более низких концентрациях, чем каждый агент по отдельности, что указывает на аддитивный или возможный синергетический эффект. Фиг. 6F: MK0952, применяемый в концентрации 10 мкМ в комбинации с 1 мкМ форсколина, повышает уровни транскрипта PCSK1 приблизительно в 2 раза в нейронах, полученных из ИПСК (линия 1043D3).
На фиг. 7А-В представлены графики, показывающие, что лечение только MK0952 повышает уровень Pcsk1 в гипоталамусе мышей дикого типа. На фиг. 7А представлен график, показывающий, что массы тела всех использованных мышей были сопоставимы. На фиг. 7 В представлен график, показывающий, что MK0952, вводимый через желудочный зонд в 10% метилцеллюлозе в дозе 10 мг/кг массы тела, повышал уровни Pcsk1 в гипоталамусе приблизительно на 25%. Лечение форсколином в дозе 25 мг/кг не вызывало повышение уровней Pcsk1 в гипоталамусе. Комбинированное лечение MK0952 (10 мг/кг) и форсколином (25 мг/кг) также приводило к 25%-ному повышению уровней транскрипта Pcsk1 в гипоталамусе, вероятно, в основном вследствие воздействия MK0952.
На фиг. 8А-С представлены схемы, таблицы и графики, показывающие аспекты дизайна клинического исследования.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение предусматривает способы регулирования уровней РС1 (прогормон-конвертазы 1) in vitro или in vivo. Способы могут использоваться для повышения регуляции (повышения экспрессии) или повышения уровней и/или активности РС1. Настоящее изобретение также охватывает способы лечения синдрома Прадера-Вилли (СПВ) и других форм ожирения. Способы могут включать в себя этап введения терапевтически эффективного количества ингибитора ФДЭ-4 и/или активатора аденилатциклазы. Также ожидается, что эти способы будут полезны для лечения пациентов с синдромом Шааф-Янга и расстройством аутического спектра (Fabienne Schaller Francoise Watrin Rachel Sturny Annick Massacrier Pierre Szepetowski Francoise Muscatelli; Hum Mol Genet (2010), 19(24): 4895-4905. DOI: https://doi.org/10.1093/hmg/ddq424; Green L, Fein D, Modahl C, Feinstein C, Waterhouse L, Morris M. Oxytocin and autistic disorder: alterations in peptide forms. Biol Psychiatry. 2001 Oct 15; 50(8): 609-13.
К теоретическим механизмам повышения клеточных уровней/активности прогормон-конвертазы 1 относится, помимо прочего: (1) повышение регуляции на уровне транскрипта путем задействования эндогенных промоторов, (2) непосредственное повышение ферментной активности РС1, (3) повышение скорости трансляции PCSK1 в РС1, (4) снижение деградации фермента/белка РС1, один возможный подход заключается в снижении уровней (с помощью «генетического нокдауна» антисмыслового олигонуклеотида, традиционного низкомолекулярного ингибирования и т.д.) эндогенного ингибитора PC1 ProSAAS, (5) снижение деградации (нацеленная на миРНК, нонсенс-опосредованная деградация, уровни метилирования предполагаемой мРНК) транскрипта PCSK1, повышая, таким образом, трансляцию, (6) РС1 сама по себе перерабатывается из зимогена массой 92 кДа в зрелый фермент массой 66 кДа, таким образом, повышение уровней переработки препро-PC1 также может иметь терапевтическую пользу, (7) доставка дополнительной кДНК PCSK1 в клетку с помощью методов генной терапии, (8) доставка РНК SNORD116 с помощью методов генной терапии и (9) непосредственная доставка фермента РС1 в кровоток и/или ткани с помощью ферментозаместительной терапии.
Текущие данные показывают, что основные нейроэндокринные проявления СПВ скорее всего обусловлены функциональным дефицитом РС1. См. фиг. 1. Поскольку кодирующий РС1 ген PCSK1 является интактным при СПВ, повышение уровней экспрессии и/или активности РС1 у пациентов с СПВ исправит этот функциональный дефицит РС1. С фармакологической точки зрения такое повышение уровней РС1 может быть достигнуто путем введения агентов, которые повышают уровни циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) или блокируют деградацию цАМФ.
Фосфодиэстеразы циклических нуклеотидов (ФДЭ) катализируют гидролиз циклического АМФ и циклического ГМФ, регулируя, таким образом, внутриклеточные концентрации этих циклических нуклеотидов, их сигнальные пути и, следовательно, множество биологических ответов в норме и при патологии. Maurice с соавт. Advances in targeting cyclic nucleotide phosphodiesterases. Nat. Rev. Drug. Discov. 13(4): 290-314 (2014). Изоформы ФДЭ-4 высоко экспрессируются в клетках, которые регулируют иммуновоспалительные ответы и ремоделирование тканей. Id. Ингибирование ФДЭ-4 приводит к повышению уровней цАМФ в клетке. Доступно большое количество ингибиторов ФДЭ-4. К неограничивающим примерам ингибиторов ФДЭ-4 относится: Теофиллин, рофлумиласт, апремиласт, ибудиласт, GSK356278, MK0952, ИБМК (3-изобутил-1-метилксантин), мезембренон, ролипрам, пикламиласт, лютеолин, дротаверин, AN2728, циломиласт, диазепам, лютеолин и Е6005. К другим ингибиторам фосфодиэстеразы относятся метилированные ксантины и их производные (такие как кофеин, аминофиллин, параксантин, пентоксифиллин, теобромин и теофиллин).
Уровни цАМФ также можно повысить с помощью агентов, которые активируют аденилатциклазу. К неограничивающим примерам активаторов аденилатциклазы относится: Форсколин, FD1, FD2, FD3, FD4, FD5 (NKH477) и FD6.
Ингибиторы ФДЭ-4 и активаторы аденилатциклазы могут по отдельности или в комбинации называться терапевтическими агентами.
Аббревиатуры
АКТГ - адренокортикотропный гормон.
АПБ - агути-подобный белок; белок также вырабатывается в дугообразном ядре и является обратным агонистом MC4R. Про-АПБ перерабатывается в АПБ с помощью РС1.
цАМФ - циклический аденозинмонофосфат
GH - грелин («гормон голода», также известный как леноморелин (МНН)), пептидный гормон, вырабатываемый энтероэндокринными клетками на дне желудка, функционирующий в качестве нейропептида в центральной нервной системе.
про-РГГР - рилизинг-гормон прогормона роста.
РГГР - рилизинг-гормон гормона роста (РГГР), также известный под названием соматолиберин или под несколькими другими названиями в своих эндогенных формах и под названием соматорелин (МНН) в своей фармацевтической форме, является рилизинг-гормоном гормона роста (ГР). Он представляет собой 44-аминокислотный пептидный гормон, вырабатываемый в дугообразном ядре гипоталамуса.
РС1 - пропротеинконвертаза 1, также известная как прогормон-конвертаза 1, прогормон-конвертаза 3, пропротеинконвертаза 3, нейроэндокринная конвертаза 1 или нейроэндокринная конвертаза 3 и часто сокращаемая как PC1/3, является ферментом, который у людей кодируется геном PCSK1. РС1 и РС2 - белковые продукты генов PCSK1 и PCSK2 - дифференциально расщепляют многие нейроэндокринные и эндокринные гормоны, включая проопиомеланокортин, проинсулин и проглюкагон.
РС2 - пропротеинконвертаза 2 (РС2), также известная как прогормон-конвертаза 2 или нейроэндокринная конвертаза 2 (NEC2), является серин-протеазой, пропротеинконвертаза РС2, как и пропротеинконвертаза 1 (РС1), является ферментом, отвечающим за первый этап созревания многих нейроэндокринных пептидов из своих предшественников, например, превращение проинсулина в промежуточные продукты инсулина. Чтобы получить биоактивную форму инсулина (и многих других пептидов), требуется второй этап, включающий удаление С-концевых основных остатков; данный этап опосредован карбоксипептидазами Е и/или D. РС2 играет лишь незначительную роль в первом этапе биосинтеза инсулина, но в первом этапе биосинтеза глюкагона ее роль значительно больше по сравнению с PC1. РС2 связывается с нейроэндокринным белком под названием 7В2, а если этот белок отсутствует, про-РС2 не может стать ферментативно активной. 7В2 осуществляет это, предотвращая агрегацию про-РС2 с неактивируемыми формами. С-концевой домен 7В2 также ингибирует активность РС2, пока она не будет расщепленной на меньшие неактивные формы. Таким образом, 7В2 является как активатором, так и ингибитором РС2. У людей пропротеинконвертаза 2 кодируется геном PCSK2. Он связан с бактериальным ферментом субтилизином, и всего у млекопитающих существует 9 различных субтилизинподобных генов: фурин, РАСЕ4, РС4, РС5/6, РС7/8, PCSK9 и SKI1/S1P.
PCSK1 - ген, кодирующий PC1.
PCSK2 - ген, кодирующий РС2.
ПОМК - проопиомеланокортин (ПОМК) является предшественником полипептида с 241 аминокислотным остатком. ПОМК синтезируется в гипофизе из полипептидного предшественника пре-про-опиомеланокортина длиной 285 аминокислот (пре-ПОМК) путем удаления сигнальной пептидной последовательности длиной 44 аминокислоты во время трансляции.
ФДЭ-4 - фосфодиэстераза 4.
СПВ - синдром Прадера-Вилли.
SNORD 116 - SNORD116 (также известный как НВП-85) является молекулой некодирующей РНК (нкРНК), которая функционирует в модификациях других низкомолекулярных ядерных РНК (няРНК). Данный тип модификации РНК, как правило, расположен в ядре эукариотической клетки, которая является основным сайтом биогенеза няРНК. Он известен как малая ядрышковая РНК (мякРНК), и часто его также называют как направляющая РНК. SNORD116 принадлежит к классу C/D box мякРНК, которые содержат консервативные мотивы последовательностей, известные как С box (UGAUGA) и D box (CUGA). Большинство членов семейства box C/D выполняют функцию направления сайт-специфического 2'-O-метилирования субстратных РНК. В человеческом геноме присутствует 29 тандемных копий SNORD116 на участке СПВ хромосомы 15. Кроме того, другие виды некодирующей РНК кодируются в локусе SNORD116, включая длинные некодирующие РНК, 116HG, пять мяк-днкРНК и две spa-днкРНК. SNORD116 является сиротским локусом некодирующей РНК, у которого отсутствуют четко определенные мишени. Мышиные модели с утратой отцовского Snord116 демонстрируют аналогичные симптомы, что и у человека при СПВ, включая гиперфагию и задержку роста.
Устройства/ингаляторы ИСП - ингаляторы сухого порошка; как правило, ручные.
Устройства ДАИ - дозированные аэрозольные ингаляторы; как правило, ручные.
αМСГ - это эндогенный лиганд рецептора меланокортина 4.
MC2R - рецептор меланокортина 2.
MC4R - рецептор меланокортина 4.
ДТ - дикий тип.
Определения
Как используется в настоящем документе, термин «фармацевтически приемлемый носитель» обозначает фармацевтически приемлемый материал, композицию или носитель, такие как жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, вспомогательное вещество, растворитель или инкапсулирующий материал, вовлеченный в доставку или транспортировку химического вещества. Ингредиенты разбавителя или носителя не должны быть такими, которые снижают терапевтический эффект активных соединений.
Как используется в настоящем документе, термин «композиция» обозначает продукт, который получают в результате смешивания или объединения более одного элемента или ингредиента.
«Лечить» или «лечение» состояния, нарушения или заболевания включают в себя:
(1) предотвращение или задержку появления клинических симптомов состояния, нарушения или заболевания, которые развиваются у человека, страдающего от состояния, нарушения или заболевания или предрасположенного к ним, однако у которого еще не возникли или не проявились клинические симптомы состояния, нарушения или заболевания; или
(2) ингибирование состояния, нарушения или заболевания, т.е. остановку, снижение скорости или задержку развития заболевания или его рецидива (в случае поддерживающей терапии) или по меньшей мере одного клинического симптома, признака или реакции этого заболевания; или
(3) облегчение заболевания, т.е. вызывание регресса состояния, нарушения или заболевания или по меньшей мере одного из их клинических или субклинических симптомов или признаков.
Польза для подлежащего лечению субъекта является либо статистически значимой, либо по меньшей мере ощутимой для пациента или врача.
Термины «пациент» или «субъект» относятся к млекопитающим и включают в себя людей и животных.
Термины «ингибиторы» и «антагонисты» или «активаторы» и «агонисты» относятся к ингибирующим или активационным молекулам, соответственно, например, для активации, например, лиганда, рецептора, кофактора, гена, клетки, ткани или органа. Модулятор, например, гена, рецептора, лиганда или клетки - это молекула, которая изменяет активность гена, рецептора, лиганда или клетки, причем активность может быть активирована, ингибирована или изменена по своим регуляторным свойствам. Модулятор может действовать самостоятельно или может использовать кофактор, например, белок, ион металла или небольшую молекулу. Ингибиторы - это соединения, которые снижают, блокируют, предотвращают, задерживают активацию, инактивируют, снижают чувствительность или понижают регуляцию, например, гена, белка, лиганда, рецептора или клетки. Активаторы - это соединения, которые повышают, активируют, способствуют, усиливают активацию, повышают чувствительность или повышают регуляцию, например, гена, белка, лиганда, рецептора или клетки. Ингибитор можно также определить как соединение, которое понижает, блокирует или инактивирует конститутивную активность. «Агонист» - это соединение, которое взаимодействует с мишенью, чтобы вызвать повышение активации мишени или способствовать ему. «Антагонист» - это соединение, действия которого противоположны агонисту. Антагонист препятствует, снижает, ингибирует или нейтрализует активность агониста. Антагонист может также препятствовать, ингибировать или снижать конститутивную активность мишени, например, рецептора-мишени, даже в отсутствие идентифицированного агониста.
Для исследования степени ингибирования, например, образцы или анализы, содержащие определенные, например, белок, ген, клетку или организм, обрабатываются потенциальным активатором или ингибитором и сравниваются с контрольными образцами без ингибитора. Контрольным образцам, т.е. образцам, не обработанным антагонистом, присваивается значение относительной активности, равное 100%. Ингибирование достигается, когда значение активности относительно контрольного образца составляет 90% или менее, типично 85% или менее, более типично 80% или менее, наиболее типично 75% или менее, в общем случае 70% или менее, в более общем случае 65% или менее, в наиболее общем случае 60% или менее, как правило, 55% или менее, обычно 50% или менее, чаще 45% или менее, наиболее часто 40% или менее, предпочтительно 35% или менее, более предпочтительно 30% или менее, еще более предпочтительно 25% или менее и наиболее предпочтительно менее чем 25%. Активация достигается, когда значение активности относительно контрольного образца составляет около 110%, в общем случае по меньшей мере 120%, в более общем случае по меньшей мере 140%, в более общем случае по меньшей мере 160%, часто по меньшей мере 180%, чаще по меньшей мере в 2 раза выше, наиболее часто по меньшей мере в 2,5 раза выше, обычно по меньшей мере в 5 раз выше, чаще по меньшей мере в 10 раз выше, предпочтительно по меньшей мере в 20 раз выше, более предпочтительно по меньшей мере в 40 раз выше и наиболее предпочтительно более чем в 40 раз выше.
Дозировка терапевтического состава может широко варьироваться в зависимости от характера заболевания, анамнеза пациента, частоты введения, способа введения, выведения агента из хозяина и т.п. Исходная доза может быть больше с последующим введением меньших поддерживающих доз. Доза может вводиться с частотой раз в неделю или раз в две недели, либо ее могут разделить на меньшие дозы и вводить ежедневно, два раза в неделю и т.д., чтобы поддерживать эффективный уровень дозирования. В некоторых случаях при пероральном введении будет требоваться более высокая доза, чем при внутривенном введении. В некоторых случаях местное введение будет включать в себя применение несколько раз в день по необходимости в течение нескольких дней или недель, чтобы обеспечить эффективное местное дозирование.
Термин «носитель» относится к разбавителю, адъюванту, вспомогательному веществу или носителю, с которыми вводится данное соединение. Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая нефтяные масла, масла животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, оливковое масло, кунжутное масло и т.п. Предпочтительно в качестве носителей применяют воду или водные солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина, в частности, в качестве инъекционных растворов. В альтернативном варианте носитель может представлять собой носитель в виде твердой дозированной формы, включая, но не ограничиваясь этим, один или более из связующего вещества (для прессованных пилюль), глиданта, инкапсулирующего агента, ароматизатора и красителя. Подходящие фармацевтические носители описаны в "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin.
Описанные в настоящем документе терапевтические композиции могут вводиться любым известным в данной области техники способом, включая, помимо прочего, интраназальное, пероральное, трансдермальное, окулярное, внутрибрюшинное, ингаляционное, внутривенное, интрацеребровентрикулярное, в виде интрацистернальной инъекции или инфузии, подкожное, в виде импланта, вагинальное, сублингвальное, уретральное (например, в виде уретрального суппозитория), подкожное, внутримышечное, внутривенное, ректальное, сублингвальное, мукозальное, офтальмологическое, спинальное, интратекальное, внутрисуставное, внутриартериальное, субарахноидальное, бронхиальное или лимфатическое введение. Местный состав может быть в форме геля, мази, крема, аэрозоля и т.д.; интраназальный состав может быть доставлен в виде спрея или капель; трансдермальный состав может вводиться через трансдермальный пластырь или путем ионтофореза; или ингаляционные составы могут быть доставлены с помощью небулайзера или аналогичного устройства. Композиции могут также быть в форме таблеток, пилюль, капсул, мягких лекарственных форм, порошков, составов с замедленным высвобождением, растворов, суспензий, эликсиров, аэрозолей или любых других подходящих композиций.
Чтобы получить такую фармацевтическую композицию, один или несколько ингибиторов ФДЭ-4, и/или один или несколько активаторов аденилатциклазы, и/или один или несколько агонистов MC4R могут смешиваться вместе с фармацевтически приемлемым носителем, адъювантом и/или вспомогательным веществом в соответствии с обычными методиками приготовления фармацевтических препаратов. Фармацевтически приемлемые носители, которые могут использоваться в настоящих композициях, охватывают любой из стандартных фармацевтических носителей, таких как фосфатно-солевой буферный раствор, вода и эмульсии, такие как эмульсии масло/вода или вода/масло, а также различные типы смачивающих агентов. Композиции могут дополнительно содержать твердые фармацевтические вспомогательные вещества, такие как крахмал, целлюлоза, тальк, глюкоза, лактоза, сахароза, желатин, солод, рис, мука, мел, силикагель, стеарат магния, стеарат натрия, моностеарат глицерина, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко и т.п. Жидкие и полужидкие вспомогательные вещества могут выбираться из глицерина, пропиленгликоля, воды, этанола и различных масел, включая нефтяные масла, масла животного, растительного или синтетического происхождения, например, арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. Жидкие носители, в частности для растворов для инъекций, включают в себя воду, солевой раствор, водный раствор декстрозы и гликоли. Примеры носителей, стабилизаторов и адъювантов см. у Remington's Pharmaceutical Sciences, edited by E.W. Martin (Mack Publishing Company, 18th ed., 1990). Композиции также могут содержать стабилизаторы и консерванты.
Как используется в данном документе, термин «терапевтически эффективное количество» означает количество, достаточное для лечения конкретного нарушения или заболевания или, альтернативно, для получения фармакологического ответа при лечении нарушения или заболевания in vitro или in vivo у млекопитающего, такого как человек или животное. Методы определения наиболее эффективных способов и дозировок введения могут варьироваться в зависимости от используемой для лечения композиции, цели лечения, подвергаемой лечению клетки-мишени и подвергаемого лечению субъекта. Лечебные дозировки обычно могут титроваться для оптимизации безопасности и эффективности. Однократное или многократное введение может осуществляться с использованием уровня дозы и схемы приема дозы, выбранных лечащим врачом. Специалисты в данной области техники смогут легко определить подходящие лекарственные формы и способы введения агентов. Например, композиция вводится в дозе от около 0,01 мг/кг до около 200 мг/кг, от около 0,1 мг/кг до около 100 мг/кг или от около 0,5 мг/кг до около 50 мг/кг. Если описанные в настоящем документе соединения вводятся совместно с другим агентом или препаратом, эффективное количество может быть меньше, равняться или быть больше, чем то количество, когда любой из агентов будет применяться отдельно.
Трансдермальные составы могут быть приготовлены путем введения активного агента в тиксотропный или гелеобразный носитель, такой как целлюлозная среда, например, метилцеллюлоза или гидроксиэтилцеллюлоза, при этом полученный в результате состав затем упаковывается в трансдермальное устройство, адаптированное для фиксации на коже владельца. Если композиция выполнена в форме геля, эту композицию можно втирать в мембрану пациента, например, в кожу, предпочтительно интактную, чистую и сухую кожу, плеча, или верхней части руки, и/или верхней части торса и сохранять ее там в течение периода времени, достаточного для доставки ингибитора ФДЭ-4 и/или активатора аденилатциклазы в сыворотку крови пациента. Композиция настоящего изобретения в форме геля может содержаться в тюбике, саше или дозирующем насосе. Такой тюбик или саше могут содержать одну однократную дозу или более чем одну однократную дозу композиции. Дозирующий насос может быть способен выдавать одну дозу композиции.
Данное изобретение также предлагает композиции, как описано выше, для интраназального введения. Таким образом, композиции могут дополнительно содержать усилитель проницаемости. Southall с соавт. Developments in Nasal Drug Delivery, 2000. Ингибитор ФДЭ-4 и/или активатор аденилатциклазы могут вводиться интраназально в жидкой форме, такой как раствор, эмульсия, суспензия, капли, или в твердой форме, такой как порошок, гель или мазь. Устройства для доставки интраназальных препаратов хорошо известны в данной области техники. Назальная доставка препаратов может осуществляться с помощью устройств, включая, помимо прочего, интраназальные ингаляторы, интраназальные распылители, атомайзеры, флаконы для назального спрея, контейнеры с одной дозой, насосы, капельницы, пластмассовые бутылки-пульверизаторы, небулайзеры, дозированные аэрозольные ингаляторы (ДАИ), компрессорные ингаляторы, инсуфляторы и двунаправленные устройства. Устройство для интраназальной доставки может быть дозирующим для введения точного эффективного количества дозы в носовую полость. Устройство для интраназальной доставки может быть предназначено для доставки однократной дозы или многократных доз. В конкретном примере электронный атомайзер ViaNase производства компании Kurve Technology (Бетель, штат Вашингтон) может использоваться в данном изобретении (http://www.kurvetech.com). Соединения настоящего изобретения также могут быть доставлены через трубку, катетер, с помощью шприца, пакета с раствором для инфузий с трубкой, компресса, назального тампона или путем подслизистой инъекции. Публикации патента США №№20090326275, 20090291894, 20090281522 и 20090317377.
Ингибитор ФДЭ-4 и/или активатор аденилатциклазы могут быть составлены в виде аэрозолей с использованием стандартных методик. Ингибитор ФДЭ-4 и/или активатор аденилатциклазы могут быть составлены с растворителями или без них, а также с носителями или без них. Состав может представлять собой раствор или водную эмульсию с одним или более поверхностно-активными веществами. Например, аэрозольный спрей может быть получен из находящегося под давлением контейнера с подходящим пропеллентом, таким как дихлордифторметан, трихлорфторметан, дихлортетрафторэтан, углеводороды, сжатый воздух, азот, углекислый газ или другой подходящий газ. Дозированная форма может быть определена благодаря наличию клапана для доставки дозированного количества. Пульверизаторы с дозатором могут дозировать отмеренную дозу или дозу с конкретным размером частиц или капель. Как используется в данном документе, термин «аэрозоль» относится к суспензии мелких твердых частиц или капель жидкого раствора в газе. В частности, аэрозоль содержит газовую суспензию капель ингибитора ФДЭ-4 и/или активатора аденилатциклазы, которая может быть получена с помощью любого подходящего устройства, такого как ДАИ, небулайзер или распылитель. Аэрозоль также содержит композицию сухого порошка в соответствии с композицией настоящего изобретения, суспендированную в воздухе или другом газе-носителе. Gonda (1990) Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 6: 273-313. Raeburn с соавт., (1992) Pharmacol. Toxicol. Methods 27: 143-159.
Ингибитор ФДЭ-4 и/или активатор аденилатциклазы могут быть доставлены в носовую полость в виде порошка в такой форме, как микросферы, доставленные с помощью назального инсуфлятора. Ингибитор ФДЭ-4 и/или активатор аденилатциклазы могут быть абсорбированы в твердой поверхности, например, носителе. Порошок или микросферы могут вводиться в сухой дозируемой в воздух форме. Порошок или микросферы могут храниться в контейнере инсуфлятора. Альтернативно, порошок или микросферы могут быть помещены в капсулу, такую как желатиновая капсула, или в другую емкость однократной дозы, адаптированную для назального введения.
Фармацевтическая композиция может быть доставлена в носовую полость путем непосредственного размещения этой композиции в носовой полости, например, в форме геля, мази, назальной эмульсии, лосьона, крема, назального тампона, капельницы или биоадгезивной полоски. В некоторых вариантах осуществления может быть необходимым продление времени удержания фармацевтической композиции в носовой полости, например, для повышения абсорбции. Таким образом, фармацевтическая композиция может необязательно быть составлена с биоадгезивным полимером, смолой (например, ксантановой камедью), хитозаном (например, высокоочищенным катионным полисахаридом), пектином (или любым углеводом, который загустевает наподобие геля или превращается в эмульсию при нанесении на слизистую оболочку носа), микросферой (например, крахмалом, альбумином, декстраном, цикл о декстрином), желатином, липосомой, карбамером, поливиниловым спиртом, альгинатом, аравийской камедью, хитозанами и/или целлюлозой (например, метилом или пропилом; гидроксилом или карбокси; карбоксиметилом или гидроксипропилом).
Композиция, содержащая ингибитор ФДЭ-4 и/или активатор аденилатциклазы, может вводиться путем пероральной ингаляции в дыхательные пути, т.е. в легкие.
К типичным системам доставки ингалируемых агентов относятся небулайзерные ингаляторы, ингаляторы сухого порошка (ИСП) и дозированные аэрозольные ингаляторы (ДАИ).
Небулайзеры вырабатывают высокоскоростной поток воздуха, который заставляет терапевтический агент в форме жидкости распыляться в виде спрея. Терапевтический агент составляется в жидкой форме, такой как раствор или суспензия из частиц подходящего размера. В одном варианте осуществления частицы будут тонкоизмельченными. Термин «тонкоизмельченный» означает такой, который имеет около 90% или более частиц с диаметром менее чем около 10 μм. Подходящие небулайзеры предлагаются в продаже, например, производства компании PARI GmbH (Штарнберг, Германия). К другим небулайзерам относится Respimat (Boehringer Ingelheim) и такие, которые описаны, например, в патентах США №№7,568,480, 6,123,068 и WO 97/12687. Ингибитор ФДЭ-4 и/или активатор аденилатциклазы могут быть составлены для применения в небулайзере в виде водного раствора или жидкой суспензии.
Устройства ИСП, как правило, вводят терапевтический агент в форме свободно текучего порошка, который может быть диспергирован в воздушном потоке пациента во время вдоха. Устройства ИСП, которые используют внешний источник питания, также могут использоваться в настоящем изобретении. Для получения свободно текучего порошка терапевтический агент может быть составлен с подходящим вспомогательным веществом (например, лактозой). Сухой порошкообразный состав может быть изготовлен, например, путем смешивания сухой лактозы с размером частиц от около 1 μм до 100 μм с тонкоизмельченными частицами соединений настоящего изобретения и путем сухого смешивания. Альтернативно, соединения настоящего изобретения могут быть составлены без вспомогательных веществ. Состав загружается в дозатор сухого порошка или в ингаляционные картриджи или капсулы для использования с устройством доставки сухого порошка. Примеры предлагаемых коммерчески устройств ИСП включают Diskhaler (GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, штат Северная Каролина) (см., например, патент США №5,035,237); Diskus (GlaxoSmithKline) (см., например, патент США №6,378,519; Turbuhaler (AstraZeneca, Уилмингтон, штат Делавер) (см., например, патент США №4,524,769) и Rotahaler (GlaxoSmithKline) (см., например, патент США №4,353,365). Дополнительные примеры подходящих устройств ИСП описаны в патентах США №№5,415,162, 5,239,993 и 5,715,810, а также в приведенных там ссылках.
Устройства ДАИ, как правило, выдают отмеренное количество терапевтического агента, используя сжатый газ-пропеллент. Составы для введения с помощью ДАИ включают в себя раствор или суспензию активного ингредиента в сжиженном пропелленте. К примерам пропеллентов относятся гидрофторалканы (ГФА), такие как 1,1,1,2-тетрафторэтан (ГФА 134а) и 1,1,1,2,3,3,3-гептафтор-н-пропан, (ГФА 227), а также хлорфторуглероды, такие как CCl3F. К дополнительным компонентам составов ГФА для введения с помощью ДАИ относятся сорастворители, такие как этанол, пентан, вода; а также поверхностно-активные вещества, такие как сорбитан триолеат, олеиновая кислота, лецитин и глицерин. (См., например, патенты США №№5,225,183, ЕР 0717987 и WO 92/22286). Состав загружается в аэрозольную канистру, которая образует часть устройства ДАИ. Примеры устройств ДАИ, специально разработанные для использования с пропеллентами ГФА, предлагаются в патентах США №№6,006,745 и 6,143,227. Примеры процессов приготовления подходящих составов и примеры устройств, подходящих для ингаляционного дозирования, см. в патентах США №№6,268,533, 5,983,956, 5,874,063 и 6,221,398, и WO 99/53901, WO 00/61108, WO 99/55319 и WO 00/30614.
Ингибитор ФДЭ-4 может быть инкапсулирован в липосомах или микрокапсулах для доставки путем ингаляции. Липосома - это везикула, состоящая из липидной бислойной мембраны и водного внутреннего пространства. Липидная мембрана может быть изготовлена из фосфолипидов, к примерам которых относится фосфатидилхолин, такой как лецитин и лизолецитин; кислотных фосфолипидов, таких как фосфатидилсерин и фосфатидилглицерин; а также из сфингофосфолипидов, таких как фосфатидилэтаноламин и сфингомиелин. Альтернативно, может добавляться холестерин. Микрокапсула - это частица, покрытая покрывающим материалом. Например, покрывающий материал может состоять из смеси пленкообразующего полимера, гидрофобного пластификатора, поверхностного активатора и/или смазочного азотсодержащего полимера. Патенты США №№6,313,176 и 7,563,768.
Ингибитор ФДЭ-4 и/или активатор аденилатциклазы могут вводиться самостоятельно или в комбинации с другими препаратами для лечения описанных выше заболеваний в течение короткого или продолжительного периода времени, например, в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 60 дней, либо 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев, либо постоянно на протяжении жизни пациента. Композиции настоящего изобретения могут вводиться млекопитающему, предпочтительно человеку. К млекопитающим относятся, помимо прочего, мыши, крысы, кролики, обезьяны, крупный рогатый скот, овцы, свиньи, псовые, кошачьи, сельскохозяйственные животные, животные в спорте, домашние животные, лошади и приматы.
Далее приводятся неограничивающие примеры.
ПРИМЕР 1
Манипулирование экспрессией и активностью РС1 в нейронах и β-клетках гипоталамуса, полученных из ИПСК
Активация циклазы форсколином и/или ингибирование катаболизма цАМФ путем ингибирования фосфодиэстеразы (теофиллин, ИБМК) повышает уровни РС1 в моделях СПВ in vitro с последующими повышениями процессинга прогормонов. Идентификация очевидного мультитканевого дефицита в PCSK1 в моделях СПВ in vivo и in vitro обеспечивает рациональное терапевтическое таргетирование, которое может облегчить основные нейроэндокринные симптомы СПВ (фиг. 1).
Промоторная область гена PCSK1 содержит два элемента ответа на циклический аденозинмонофосфат (цАМФ) (Conkright с соавт.2003; Udupi с соавт.1998). Агенты, которые повышают клеточные уровни цАМФ, повышают мРНК PCSK1 и повышают секрецию прогормонов, перерабатываемых с помощью РС1 (фиг. 2) (Udupi 1998). Форсколин и теофиллин - это два одобренных FDA препарата, в целом, с безопасным профилем лечения для пациентов детского возраста. Форсколин связывается с аденилатциклазой возле ее каталитического домена посредством гидрофобных взаимодействий и водородных связей (Tang and Hurley 1998, Tesmer с соавт.1999). Связывание с форсколином заставляет конформацию аденилатциклазы переходить в свою активную форму, повышая, таким образом, активность АЦ и повышая клеточные уровни цАМФ (Onda с соавт. 2001). Теофиллин и другие ингибиторы фосфодиэстеразы 4 (ФДЭ-4), такие как MK0952, повышают клеточные уровни цАМФ путем блокирования его деградации.
К неограничивающим примерам ингибиторов ФДЭ-4 относится теофиллин, MK0952, а также другие ингибиторы ФДЭиз таблиц 1А-В. К неограничивающим примерам активаторов аденилатциклазы (АЦ) относится форсколин и активаторы из таблицы 2.
К агентам, которые могут использоваться в рамках настоящего способа, также относятся агенты, которые могут изменять активность G-белка, такие как активаторы или ингибиторы G-белка, а также агонисты рецептора, связанного с G-белком.
Количество NHLH2 и PCSK1 снижено в нейронах, полученных из ИПСК, при микроделеции и крупной делеции СПВ, как показано секвенированием РНК (фиг. 3А, 3С). Фиг. 3А: Количество NHLH2 снижено в нейронах, полученных из ИПСК, при микроделеции и крупной делеции СПВ по сравнению со здоровыми контрольными образцами. Фиг. 3В: Количество белка NHLH2 снижено больше 90% в нейронах, полученных из ИПСК, при микроделеции и крупной делеции СПВ по сравнению со здоровыми контрольными образцами. Фиг. 3C-D: Количество транскрипта PCSK1 и его белкового продукта РС1 снижено больше 55% и больше 80%, соответственно, в нейронах, полученных из ИПСК, при микроделеции и крупной делеции СПВ по сравнению со здоровыми контрольными образцами. Фиг. 3E-F: Мыши, у которых была удалена только отцовская копия гена Snord116 (остальная область СПВ осталась интактной), демонстрируют более 40%-ное снижение количества белка РС1 и РС2 в изолированных островках. Фиг. 3G: Правильный процессинг проинсулина зависит от РС1. Наблюдается функциональное нарушение процессинга проинсулина у мышей Snord116p-/m+ по сравнению с однопометными животными ДТ через 30 минут после инъекции глюкозы. Фиг. 3Н: наблюдается 60%-ное повышение соотношения проинсулина к инсулину в плазме индивидов с СПВ по сравнению с контрольными образцами, соответствующими по возрасту и индексу массы тела, в состоянии натощак, что указывает на дефект переработки проинсулина в инсулин. Эффект будет меньше по сравнению с эффектом, наблюдаемым у пациента с мутацией РС1, что соответствует приблизительно 50%-ному снижению РС1 в моделях СПВ. Фиг. 3I: Прогрелин также перерабатывается с помощью РС1; нарушение процессинга прогрелина происходит в желудочных лизатах мышей Snord116p-/m+ по сравнению с однопометными животными ДТ. Желудочные лизаты нулевых по РС1 мышей включают в качестве положительного контроля для нарушения процессинга прогрелина. Фиг. 3J: Нарушение процессинга про-РГГР также может происходить в гипоталамических лизатах мышей Snord116p-/m+ по сравнению с однопометными животными ДТ, р представляет собой 0,06. Нарушение процессинга про-РГГР связано с низким уровнем циркулирующего ГР и карликовостью нулевых по РС1 мышей. Мыши Snord116p-/m+ также демонстрируют низкий уровень ГР и тяжелую атрофию лимфоидной ткани. Фиг. 3K: Предварительные данные указывают на то, что обработка нейронов гипоталамуса, полученных из ИПСК, в здоровых контрольных образцах форсколином (ФСК) может повысить уровни транскипта PCSK1 дозозависимым образом. Уровни транскрипта ПОМК могут не измениться. Фиг. 3L: Обработка β-клеток, полученных из ИПСК, в здоровых контрольных образцах форсколином повышает уровни транскрипта PCSK1. Уровни транскрипта SNORD116 и INS могут измениться минимально. Фиг. 3М: Уровни транскрипта Pcsk1 снижаются на 41% в гипоталамусе мышей Snord116p-/m+ в состоянии натощак; после возобновления кормления уровни Pcsk1 не меняются. Фиг. 3N: Уровни транскрипта Nhlh2 снижаются как в состоянии натощак, так и после возобновления кормления в гипоталамусе мышей Snord116p-/m+ по сравнению с однопометными животными ДТ. Фиг. 3О-Р: Уровни транскрипта АБП и нейропептида Y повышаются в гипоталамусе мышей Snord116p-/m+ после возобновления кормления по сравнению с мышами ДТ. При последующем наблюдении независимые эксперименты подтвердили эти изменения при помощи количественной ПЦР (экспрессия генов) и вестерн-блоттинга (уровень белка) (фиг. 3В, 3D). Индивиды с СПВ демонстрируют пониженные уровни инсулина в состоянии натощак по сравнению с контрольными образцами, соответствующими по возрасту и индексу массы тела. Было высказано предположение, что это может быть обусловлено нарушением процессинга проинсулина. Текущие данные показывают, что в мышиной модели СПВ, в которой удалена только отцовская копия гена Snord116, уровни белка РС1 и РС2 будут понижены в изолированных островках и связаны с функциональным нарушением переработки проинсулина в инсулин (фиг. 3E-3G). Нарушение процессинга проинсулина (р представляет собой 0,089) также происходит в плазме пациентов-людей с СПВ по сравнению с контрольными образцами, соответствующими по возрасту и индексу массы тела, в состоянии натощак (фиг. 3Н). Плазма, полученная в состоянии натощак от пациента, имеющего мутацию РС1, была включена в качестве положительного контроля для нарушения процессинга проинсулина.
Гипергрелинемия у пациентов с СПВ - это уникальное фенотипическое проявление, которое может быть связано с нарушением переработки прогрелина в зрелый грелин. Действительно, текущие результаты показывают, что нарушение переработки прогрелина в зрелый грелин происходило в желудочных лизатах мышей Snord116p-/m+ по сравнению с однопометными животными ДТ (фиг. 3I). Желудочные лизаты нулевых по РС1 мышей включали в качестве положительного контроля для нарушения процессинга прогрелина.
Как и у индивидов с СПВ, у пациентов с мутацией РС1 наблюдаются пониженные уровни циркулирующего ГР. Нулевые по РС1 мыши демонстрируют тяжелую атрофию лимфоидной ткани и сниженный уровень циркулирующего ГР, связанный с нарушением переработки про-РГГР в РГГР. Мы обнаружили, что у мышей Snord116p-/m+, которые также являются карликовыми и имеют низкий уровень циркулирующего ГР, демонстрируют тенденцию к нарушению переработки про-РГГР в РГГР в гипоталамических лизатах (фиг. 3J).
Как показано на фиг. 2, идентификация снижения уровня РС1 и нарушения процессинга прогормона при СПВ указывает на общую молекулярную теорию, которая может объяснить многие нейроэндокринные проявления этого заболевания. Таким образом, агенты, которые повышают активность РС1 и тем самым повышают процессинг прогормонов, представляют рациональную таргетную терапию основных нейроэндокринных проявлений СПВ.
Известно, что форсколин повышает клеточные уровни Pcsk1 и может повышать процессинг прогормонов. Форсколин применяли к нейронам и β-клеткам, полученным из ИПСК, пациентов без СПВ, и результаты показывают, что уровни транскрипта PCSK1 были выше по сравнению с необработанными клетками (фиг. 3K-L). Будут проводиться исследования нейронов и β-клеток, полученных от пациентов с СПВ.
Ответ уровней транскрипта PCSK1, белковых уровней РС1 и соответствующих уровней процессинга прогормонов будут протестированы на модельных системах in vitro и in vivo. Мы будем обрабатывать нейроны гипоталамуса, полученные из ИПСК, и нейроны здоровых контрольных образцов возрастающими уровнями форсколина, теофиллина и форсколина + теофиллина и измерять уровень транскрипта и белка РС1, транскрипта и белка ПОМК, а также белковые уровни переработанных продуктов ПОМК, включая: αМСГ, β-эндорфин и АКТГ. Данные пептиды будут количественно оцениваться в цельноклеточных лизатах, а также будут оцениваться уровни, секретируемые в клеточную среду. Клетки будут обрабатываться различными концентрациями форсколина и теофиллина, чтобы определить, могут ли уровни РС1 повышаться дозозависимым образом, и чтобы идентифицировать оптимальный диапазон доз для повышения уровней РС1 и процессинга ПОМК. В рамках этих анализов также будут тестироваться и другие ингибиторы ФДЭ-4 и аденилатциклазы (см. таблицы 1А-В и 2).
Будет проводиться серийное секвенирование РНК и/или секвенирование РНК одиночной клетки, чтобы идентифицировать другие транскрипты, которые более всего подвергаются воздействию фармакологических препаратов. Ожидается, что такой подход позволит прогнозировать побочное действие при обработке in vivo. Секвенирование РНК одиночной клетки будет особенно информативным в отношении повышения уровней транскрипта PCSK1 после обработки нейронов, экспрессирующих ПОМК. Другие ингибиторы ФДЭ-4 и аденилатциклазы (таблицы 1А-В, 2) будут тестироваться в нейронах гипоталамуса, полученных из ИПСК, в соответствии с аналогичным протоколом исследования, как было описано выше.
Мы будем дифференцировать ИПСК здоровых контрольных образцов и пациентов с СПВ (крупная и минимальная делеция) от β-клеток, полученных из ИПСК. Мы будем обрабатывать β-клетки, полученные из ИПСК, форсколином, теофиллином и форсколином + теофиллином и измерять уровни РС1 на уровне транскрипта и белка. Кроме того, мы будем измерять уровни транскрипта INS, а также уровни белковой части проинсулина, инсулина и с-пептида в цельноклеточных лизатах, а также будем измерять концентрации белков, секретируемых β-клетками в среду. Эти клетки могут быть трансплантированы голым мышам, чтобы обеспечить их мутацию; эти клетки могут тестироваться in vivo на предмет процессинга инсулина; удаленные клетки будут тестироваться в соответствии с тем, как было описано. Мы также будем использовать человеческие изолированные островки индивидов, не страдающих диабетом и ожирением (они доступны нам через Национальный регистр доноров поджелудочной железы), чтобы протестировать влияние форсколина, теофиллина и форсколлина + теофиллина на уровни РС1 в полнозрелых панкреатических островках человека.
ПРИМЕР 2
Подтверждающая молекулярная физиология метаболизма РС1 у мышей Snord116p-/m+, Pe1-/- и Рс1+/-.
Повышение уровней цАМФ вследствие активации аденилатциклазы (АЦ) с одновременным ингибированием ФДЭ будет повышать уровни РС1 в моделях СПВ ех vivo и in vivo и может в свою очередь повысить процессинг прогормонов в модели СПВ мышей Snord116p-/m+ . Поскольку у мышей с делецией отцовского гена Snord116 (мышиная модель СПВ) наблюдается нарушение переработки проинсулина в инсулин, связанное со снижением уровней транскрипта и белка РС1, у мышей дикого типа (ДТ) и мышей Snord116p-/m+ будут выделены островки и будут проанализированы ответы таких клеток на форсколин, теофиллин и форсколин + теофиллин. Аналогичные манипуляции и измерения будут осуществляться для β-клеток, полученных из ИПСК. Если процессинг проинсулина удастся сохранить в изолированных островках, полученных от мышей Snord116p-/m+, по сравнению с однопометными животными ДТ, в таком случае будут проведены исследования in vivo сохранения процессинга проинсулина у мышей Snord116p-/m+, получавших форсколин, теофиллин и форсколин + теофиллин.
Текущие результаты показывают, что у мышей Snord116p-/m+ наблюдается снижение переработки проинсулина в инсулин, которое связано с пониженным содержанием РС1 и РС2 в островках (фиг. 3E-G). Более того, процессинг прогрелина также нарушается в желудке мышей Snord116p-/m+, а также нарушается переработка про-РГГР в РГГР в гипоталамусе мышей Snord116p-/m+ по сравнению с однопометными животными ДТ (фиг. 3I-J). Более того, соотношение проинсулина к инсулину повышается у индивидов с СПВ в состоянии натощак по сравнению с контрольными образцами, соответствующими по возрасту и индексу массы тела, что указывает на нарушение переработки проинсулина в инсулин (фиг. 3Н).
Изолированные островки, полученные от нулевых по Pc1 мышей и гетерозиготных мышей, будут включены в качестве контроля для нарушения процессинга проинсулина, а также в качестве предполагаемого отрицательного ответа на фармакологическое лечение. Периферические уровни глюкозы, проинсулина, инсулина и с-пептида будут измеряться в состоянии натощак, а также через 15, 30, 60 и 120 минут после внутрибрюшинной инъекции глюкозы. Оптимальная продолжительность фармакологического лечения мышей Snord116p-/m+ и мышей ДТ перед проведением периферических измерений процессинга проинсулина будет определяться эмпирическим путем. Нулевые по Pc1 мыши и гетерозиготные мыши также будут включены в качестве контроля для нарушения процессинга проинсулина в эксперименты in vivo. Исходные периоды времени для тестирования будут составлять 3 дня, 1 неделю и 1 месяц. Также будут протестированы несколько методов доставки препаратов.
Анализы, в которых может проводиться различие между прогрелином и зрелым грелином и которые, таким образом, можно использовать для измерения процессинга прогрелина в кровотоке, будут разработаны как для людей, так и для мышей. Будет измеряться процессинг пргрелина после фармакологических обработок in vivo, описанных выше, у животных Snord116p-/m+, нулевых по РС1 животных, гетерозиготных РС1 животных и животных ДТ.
Гипоталамус мышей Snord116p-/m+, мышей ДТ, нулевых по Pc1 мышей и гетерозиготных Pc1 мышей, получавших форсколин, теофиллин и форсколин+теофиллин, а также измеренные белковые уровни РС1, ПОМК, αМСГ, β-эндорфина и АКТГ будут анализироваться с целью оценки того факта, может ли лечение in vivo повлиять на уровни процессинга РС1 и ПОМК.
Поскольку животные Snord116p-/m+ являются карликовыми и у них не развивается ожирение, основной моделью, по которой будет оцениваться процессинг ПОМК, являются человеческие нейроны, полученные из ИПСК, в которых наблюдаются более экстремальные снижения количества NHLH2 и РС1. Однако ответы РС1 и ПОМК на эти фармакологические агенты также могут анализироваться в первичных нейронах молодых мышей ПОМК-ЗФБ ДТ. Нейроны, экспрессирующие ПОМК, могут быть специфически изолированы с использованием мышей, в которых нейроны ПОМК экспрессируют ЗФБ. Мы осуществим нокдаун Pcsk1 в качестве контроля для нарушения процессинга ПОМК. Мы также попытаемся осуществить нокдаун специфических изоформ гена Snord116 in vitro, используя подходы на основе миРНК или 2-О-метил-модифицированных антисмысловых олигонуклеотидов; миРНК представляют собой малые двухцепочечные интерферирующие РНК, которые широко применяются для нокдауна цитоплазматических РНК, тогда как 2-О-метил-модифицированные антисмысловые олигонуклеотиды используются для нокдауна мякРНК, которые, как правило, располагаются в ядре (Liang с соавт. 2011). Затем мы будем измерять уровни РС1 и уровни процессинга ПОМК и исследовать тот факт, может ли фармакологическое лечение повышать уровни РС1 и уровни процессинга ПОМК в первичных нейронах мыши, у которых ген Snord116 был выключен, по сравнению с мышами ДТ.
Кроме того, будут получены или созданы мыши с условными гипоморфными аллелями гена SNORD116. Взрослые животные с такими аллелями будут иметь ген Snord116, четко редуцированный в специфических ядрах гипоталамуса (например, дугообразном ядре) путем введения подходящих cre-экспрессирующих конструкций, включая конструкции, обусловленные специфическими промоторами, например, ПОМК. Данный подход позволит избежать соматического влияния на развитие (задержку роста) гипоморфизма Snord116 у мышей.
Эффект активатора циклазы и/или ингибитора фосфодиэстеразы равный 50%-ному или более высокому повышению процессинга соответствующего прогормона по меньшей мере в одной протестированной модели: Нейроны, полученные из ИПСК, при СПВ; β-клетки, полученные из ИПСК, при СПВ; изолированные островки мышей Snord116p-/m+; циркулирующие прогормоны мышей Snord116p-/m+ или первичные нейроны с выключенным Snord116. Данные фенотипы будут сопровождаться повышениями уровней соответствующих транскриптов и/или белков в пораженных клетках.
Активация циклазы
Форсколин применяли в различных клеточных моделях, и результаты показывают, что он устойчиво и эффективно повышает уровни транскрипта PCSK1, белковые уровни РС1 и функционально повышает процессинг прогормонов. Уровни транскрипта PCSK1/Pcsk1, повышенные в 2-3 раза в нейронах, полученных из ИПСК, и первичных нейронах мыши, подвергали воздействию 10 мкМ форсколина (фиг. 5А, С, D).
Концентрации циклического АМФ, повышенные приблизительно в 8,5 раз в нейронах дугообразного ядра гипоталамуса, полученных из ИПСК, подвергали воздействию 10 мкМ форсколина, поддерживая предположение, что применение форсколина повышает уровни транскрипта PCSK1 путем повышения клеточных уровней цАМФ, что в свою очередь активирует промотор PCSK1 элемента ответа на цАМФ. На фиг. 5А представлен график, показывающий, что первичные переднемозговые нейроны были выделены из эмбрионов мышей дикого типа на гестационном сроке 19,5 дней (Е19,5) и культивированы в течение 72 часов. Впоследствии клетки подвергали воздействию 10 мкМ форсколина или его носителя, диметилсульфоксида (ДМСО), в течение 20 часов. Уровень транскрипта Pcsk1 увеличился в 2,5 раза в первичных нейронах, которые подвергались воздействию форсколина. На фиг. 5В представлен график, показывающий, что здоровые контрольные образцы нейронов дугообразного ядра гипоталамуса (линия Hes Nkx2-1 hESC) в день 37 (D37) дифференциации обрабатывались 10 мкМ форсколина или носителя в течение 30 минут. Уровни циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) увеличились приблизительно в 8,5 раз в клетках, которые подвергались воздействию форсколина. На фиг. 5С представлен график, показывающий, что воздействие повышающихся концентраций форсколина на здоровые контрольные образцы нейронов гипоталамуса, полученных из ИПСК (линия 1023А), в день 30 дифференциации вызывает дозозависимый ответ уровней транскрипта PCSK1. На фиг. 5D представлен график, показывающий, что в результате воздействия 10 мкМ форсколина на нейроны, полученные из ИПСК (линия 1043D3), в течение нескольких временных интервалов регуляция PCSK1 значительно не повышается через всего лишь 1 час воздействия, однако она значительно повышается через 4 и 18 часов воздействия. Через 4 часа воздействия было достигнуто максимальное повышение регуляции приблизительно в 2,5 раза для всех протестированных моментов времени. На фиг. 5E-F представлены графики, показывающие, что обработка здоровых контрольных образцов (1023А) нейронов дугообразного ядра гипоталамуса, полученных из ИПСК, в день 30 дифференциации повышающимися концентрациями форсколина определяет дозозависимое повышение переработки ПОМК как в β-эндорфин (РЭФ), так и в α-меланоцитостимулирующий гормон (αМСГ). На фиг. 5G-Н представлены графики, показывающие, что обработка изолированных островков взрослых (8-12 недель) мышей ДТ различными концентрациями форсколина демонстрирует повышение белковых уровней РС1, но не РС2, при концентрациях форсколина 25 и 50 мкМ, соответственно.
Обработка форсколином не только повышала уровни транскрипта, но и имела функциональные последствия, выражающиеся в повышении переработки ПОМК как в β-эндорфин, так и в αМСГ (фиг. 5E-F). Более того, применение форсколина к изолированным островкам, полученным у мышей дикого типа, привело к 3-кратному повышению белковых уровней РС1 (фиг. 5G). Белковые уровни РС2 не изменились (фиг. 5Н). В совокупности эти результаты показывают, что уровни РС1 повышаются в ответ на форсколин в трех отдельных модельных системах: в нейронах, полученных из ИПСК, в первичных нейронах и в изолированных островках. Более того, вызванное форсколином повышение уровней РС1 является функциональным следствием, что приводит к повышению уровней процессинга прогормонов.
Ингибирование фосфодиэстеразы
Ингибиторы ФДЭ также были протестированы в нейронах, полученных из ИПСК, и было обнаружено, что ингибирование фосфодиэстеразы также может повышать транскрипцию PCSK1. Однако эффект ингибирования ФДЭ на уровни транскрипта PCSK1 меньше, чем эффект, вызванный агонизмом АЦ с форсколином. Теофиллин (10 мМ) и рофлумиласт (1 мМ) повышают транскрипцию PCSK1 в виде отдельных агентов, тогда как MK0952 до сих пор повышал транскрипцию PCSK1 только в комбинации с форсколином in vitro (фиг. 6А-С, F). Комбинированное лечение форсколином и рофлумиластом демонстрирует, что эти агенты могут работать вместе аддитивным, возможным синергетическим образом, индуцируя и повышая транскрипцию PCSK1 при более низких концентрациях (1 мкМ форсколина, 100 нМ рофлумиласта), чем когда любой из агентов будет применяться отдельно (фиг. 6D). Опять же, повышение транскрипции PCSK1 вследствие комбинированного лечения форсколином и рофлумиластом также повышает переработку прогормона ПОМК в АКТГ (фиг. 6Е). В частности, тесты с повышающимися концентрациями форсколина в изолированных островках мыши демонстрируют 3-кратное повышение белковых уровней РС1 при концентрациях 25 мкМ и 50 мкМ. Никаких изменений белковых уровней РС2 в ответ на применение форсколина не наблюдалось. Мы также обнаружили, что 10 мкМ форсколина, применяемого к первичным нейронам мыши, выделенным у мышей Е19,5, повышало уровни транс крипта Pcsk1 в 2 раза.
MK0952
Наиболее ограничивающим фенотипическим проявлением у пациентов с СПВ является гиперфагия, которая, скорее всего, опосредована процессами, происходящими в центральной нервной системе, в частности, в гипоталамусе. Таким образом, агенты, которые нацелены на улучшение гиперфагии, должны быть способны проникать сквозь гематоэнцефалический барьер. MK0952 является по существу высокоактивным (IC50 представляет собой 0,6 нМ) проникающим в мозг ингибитором ФДЭ-4 с ограниченной активностью в цельной крови (IC50 представляет собой 555 нМ) (М. Gallant с соавт. 2010). Как было описано в настоящем документе, MK0952 является на текущий момент основным кандидатом для ингибирования ФДЭ.
Предварительные тесты MK0952 in vivo были проведены на мышах дикого типа. Однократное введение MK0952 в дозе 10 мг/кг массы тела приводит к 25%-ному повышению уровней транскрипта Pcsk1 в гипоталамусе (фиг. 7А). Введение форсколина в дозе 25 мг/кг не вызывало повышение уровней транскрипта Pcsk1 в гипоталамусе. Совместное введение MK0952 в дозе 10 мг/кг и форсколина в дозе 25 мг/кг опять таки вызвало приблизительно 25%-ное повышение уровней Pcsk1 в гипоталамусе, указывая на то, что подобное повышение было обусловлено, главным образом, действием MK0952 (фиг. 7 В). Мы также проанализируем уровни циркулирующего цАМФ, кортикального про-НФГМ/НФГМ, мозжечкового Pcsk1, желудочного Pcsk1 и желудочного прогрелина/грелина, концентрации циркулирующего проинсулина и инсулина (а также их соотношения) и, наконец, уровни транскрипта легочного Pcsk1 и цАМФ от этих животных.
Было завершено первое исследование in vivo, в котором MK0952 вводился через желудочный зонд, а форсколин вводился один раз внутрибрюшинно мышам дикого типа, которые не получали пищу в течение приблизительно 4 часов. Уровни транскрипта Pcsk1 в гипоталамусе повысились на приблизительно 25% после введения либо 10 мг/кг MK0952 в качестве одного агента, либо 10 мг/кг MK0952 и 25 мг/кг форсколина вместе. Однако введение только 25 мг/кг форсколина не привело к повышению уровней Pcsk1 в гипоталамусе, указывая на то, что форсколин в такой дозе не способен попасть в гипоталамус в достаточном количестве, чтобы воздействовать на транскрипцию Pcsk1. Это также указывает на то, что повышение уровня Pcsk1 в гипоталамусе после введения 25 мг/кг форсколина и 10 мг/кг MK0952 вместе было обусловлено, главным образом, действием MK0952 в гипоталамусе. Эта разница, скорее всего, отображает более высокую проницаемость препарата MK0952 в центральную нервную систему, а не общее значение активатора циклазы для терапии СПВ. Никаких изменений соотношения циркулирующего проинсулина к инсулину после введения MK0952 или форсколина обнаружено не было. Поскольку переработка проинсулина в инсулин и так достаточно эффективна у животных ДТ, в ретроспективе маловероятно, что она будет дополнительно повышаться в состоянии натощак. Однако эти «исходные» данные все равно являются полезными для оценки переработки проинсулина в инсулин в условиях интраперитонеального теста толерантности к глюкозе в дозе 3 мг/кг глюкозы у мышей ДТ и Snord116p-/m+ . Кроме того, образцы были собраны для измерения уровней циркулирующего цАМФ, кортикального про-НФГМ/НФГМ, мозжечкового Pcsk1, желудочного Pcsk1 и желудочного прогрелина/грелина и, наконец, уровней транскрипта легочного Pcsk1 и цАМФ.
ПРИМЕР 3
Клиническое исследование соединений у пациентов с синдромом Прадера-Вилли (СПВ)
Предварительный дизайн предложенного клинического исследования у индивидов с СПВ основывается на гипотезе, что экспрессия проконвертазы 1 (РС1) снижена в нейронах индивидов с СПВ (Burnett с соавт.2017). Экспериментальное воздействие in vitro и in vivo агонистами аденилатциклазы и ингибиторами ФДЭ-4 приводит к повышению экспрессии и активности РС1 в человеческих нейронах, полученных из стволовых клеток, и переднемозговых нейронах грызунов, а также в человеческих фибробластах. Ожидается, что введение этих препаратов увеличит степень конверсии вовлеченных прогормонов в активные гормоны.
Клиническое исследование затрагивает и демонстрирует эффективность препарата с точки зрения увеличения активности РС1 следующим образом:
1. Чтобы проиллюстрировать воздействие потенциально пригодных терапевтических агентов на поведенческие и эндокринные фенотипические проявления СПВ.
2. Чтобы отслеживать клинический профиль безопасности таких агентов. Дизайн исследования:
В клиническом исследовании будет использоваться дизайн перекрестного исследования (Cleophas с соавт.2006, Wellek and Blettner 2012, и Louis с соавт. 1984). Этот дизайн обеспечивает статистическую мощность для оценки эффективности лечения с учетом вариабельности субъектов в небольшой когорте (фиг. 8А). Период «отмывки» между двумя группами лечения смягчит влияние предшествующей терапии; небольшая продолжительность исследования минимизирует показатель «время-эффект» (эффект на изменение механизма заболевания со временем).
Критерии включения*:
1. Генетически установленный диагноз СПВ
2. Возраст больше 18 лет
* Лечение рекомбинантным гормоном роста является допустимым.
Критерии исключения:
1. Острое психическое расстройство
2. Отсутствие сотрудничества при приеме лекарственного препарата
3. Системное заболевание, например, тяжелое заболевание пищеварительной системы, такое как воспалительное заболевание кишечника, сердечное заболевание, в частности, нарушение сердечного ритма, диагностированный диабет, печеночное или почечное заболевание или недостаточность.
4. Анемия, определенная как гемоглобин менее 10 мг/дл
5. Пациенты, принимающие препараты, которые могут потенциально взаимодействовать с целевым препаратом, например, ингибиторы ФДЭ-4 взаимодействуют с противосудорожными препаратами, циметидином, омепразолом, антибиотиками и т.д. Многие из этих препаратов изменяют активность ферментов печени и могут препятствовать метаболизму ингибитора ФДЭ-4. Полный список препаратов исключения будет основан на фармакокинетических и фармакодинамических свойствах идентифицированного терапевтического агента.
Привлечение к участию: Привлечение субъектов к участию будет осуществляться благодаря сотрудничеству с Фондом СПВ (Фонд исследований синдрома Прадера-Вилли и Ассоциация больных с синдромом Прадера-Вилли), группами по поддержке пациентов и медицинскими работниками, которые осуществляют уход за детьми с СПВ. С помощью телефонного скрининга можно будет идентифицировать потенциально подходящих субъектов, которых пригласят на скрининговый визит.
Исследование будет проводиться в течение 4-6 недель и будет состоять из следующих визитов:
1. Скрининговый визит: Во время этого визита будет проводиться полная проверка медицинской документации и лекарственных препаратов, физическое обследование, а также скрининговые лабораторные тесты (на фиг. 8В, аналогично профилю безопасности, кроме уровня препарата). Субъектам предоставят препарат плацебо на одну неделю вводного периода для оценки приверженности лечению. Это будет короткий амбулаторный визит (приблизительно 3 часов). Все остальные визиты исследования будут длиться 6-8 часов в условиях стационара.
2. Исходный визит (t1 и t3 на фиг. 8А): Субъектов, которые успешно пройдут вводный период, пригласят для участия в данном исследовании. Подходящие субъекты будут рандомизированы в одну из двух групп: в АР группу или РА группу (фиг. 8А). Субъектам порекомендуют воздерживаться от приема пищи в течение более 8 часов перед визитом. Физиологический профиль будет включать в себя рост, вес, измерение телесного жира, показатели жизненно важных функций, расход энергии в состоянии покоя и комплексное обследование. Будет получен полный гипофизарный профиль, включающий в себя АКТГ, кортизол, ФСГ/ЛГ, эстроген/тестостерон, ТТГ/свободный Т4, ГР, ИФР-1, ИФРСБ-3. Субъекты пройдут тест на толерантность к смешанной пищи (ТТСП) с использованием стандартной пищи, и будут получены измерения показателей крови через 0, 30, 60, 90, 120 и 180 минут с помощью постоянного в/в катетера (фиг. 8В).
Первичные опекуны заполнят опросники, связанные с гиперфагией (Dykens или измененный Dykens), а с помощью опросника исследования окситоцина будет получена поведенческая оценка (25-28). Кроме этого, они заполнят полный опросник частоты потребления различных пищевых продуктов в течение 3 разных дней, чтобы включить в него по меньшей мере один выходной день. Ожидается, что этот визит будет длиться 6-8 часов. Будет выдан исследуемый препарат на 1 неделю с инструкциями для опекуна.
3. Визит последующего наблюдения (t2 и t4 на фиг. 1): Субъект вернется для проведения визита последующего наблюдения через 1 неделю после начала приема исследуемого препарата. Во время этого визита будут повторно проводиться измерения, упомянутые выше, также будет проверяться количество препарата и будет проведено стандартизированное анкетирование для оценки токсичности. Каждый из этих визитов будет длиться 6-8 часов. Перед началом второй фазы исследования предусмотрен период «отмывки» в течение 1-2 недель.
Критерии эффективности:
3
3
1. Гормональный профиль в ответ на стандартную пищу: На основании влияния РС1 на конверсию прогормонов (например, проинсулина в инсулин и т.д.) ожидается, что введение препарата приведет к повышению соотношения прогормона к гормону (например, проинсулина к инсулину) (Burnett с соавт. 2017). Это будут оценивать с помощью гормонального ответа на стандартный ТТСП. Тест ТТСП проводится путем введения жидкой пищи (6 см/кг Boost или эквивалента максимально до 360 см) с последующим периодическим измерением инсулина, проинсулина, прогормона ПОМК, АКТГ, АПБ, проглюкагона, глюкагона, ГПП-1, окситоцина (и пропептида), грелина, прогрелина, свободных жирных кислот и глюкозы. Тест ТТСП был подтвержден в клинических исследованиях с участием субъектов с СПВ (P. Gumus Balikcioglu с соавт. 2015).
По отношению к значениям, полученным до введения препарата, ожидается, что будет наблюдаться абсолютное увеличение высвобождения инсулина, снижение высвобождения проинсулина и повышение соотношения инсулин/проинсулин. Все это будет находиться в 25%-ном диапазоне. Также ожидается, что концентрации глюкозы снизятся на 15-20, а также снизятся концентрации свободных жирных кислот. Ожидается, что в плазме, полученной до проведения ММТ, уровень ПОМК увеличится, а уровень АПБ снизится на приблизительно 25%. Уровень окситоцина также должен увеличиться на 15-20%. Кроме того, ожидается, что уменьшится соотношение прогрелин/грелин. Спинномозговая жидкость также может быть изучена/исследована у этих субъектов, однако ее не будут оценивать в связи с приемом пищи. Могут оцениваться следующие компоненты: прогормон ПОМК, бета-эндорфин, альфа-МСГ, АПБ и окситоцин, при этом ожидается, что эти препараты снизят уровень прогормона ПОМК и повысят уровень бета-эндорфина, альфа-МСГ и окситоцина, а также снизят уровень АПБ по сравнению с субъектами, не получавшими лечение.
2. Фармакометаболомический профиль: Метаболомический профиль обеспечивает дополнительную возможность для понимания воздействия препарата на метаболические фенотипические проявления. Метаболомический профиль субъектов исследования до и после лечения данным препаратом будет получен с целью идентификации биомаркеров для а) ответа на лечение в интересующих путях, а именно в пути метаболизма инсулина и других, b) для идентификации отличий в лечении путем идентификации путей, регуляция которых избирательно повышается или снижается у разных индивидов, и с) для идентификации профилей побочных эффектов или токсичности, используя анализ на основе пути, который может не быть очевидным при стандартном исследовании установленного молекулярного профилирования более широкого масштаба (R. Kaddurah-Daouk, R. Weinshilboum, N. 2015; R.D. Beger с соавт. 2016).
3. Изменения связанного с гиперфагией поведения: Опросник Dykens (и измененный Dykens) оценивает поведение, степень тяжести голода и тягу к нему. Кроме этих критериев, опросник исследования окситоцина будет оценивать социальное и эмоциональное поведение, связанное с приемом пищи. Эти критерии будут дополнены анализом опросников частоты потребления различных пищевых продуктов. Ожидается, что лечение также улучшит поведение и/или эмоциональное состояние.
Объем выборки: для участия в данном исследовании будет привлечена предварительная выборка, включающая 6 субъектов. Статистическая мощность этого размера выборки для определения интересующих критериев будет зависеть от величины эффекта, установленного in vivo гормональным или фармакометаболомическим профилем в моделях животных. Как показано на фиг. 8С, чтобы определить значимое изменение в когорте из 6 субъектов, требуется величина эффекта приблизительно 1,47. Величина эффекта рассчитывается как разница средних значений при наблюдении с использованием плацебо по сравнению с активным препаратом, разделенная на стандартное отклонение изменения. Поскольку каждый субъект выступает в качестве своего собственного контроля, дизайн перекрестного исследования ограничивает вариабельность и позволяет достичь статистической мощности у  субъектов для аналогичного дизайна исследования в параллельной группе.
Дополнительная информация по исследованию:
1. Основываясь на предыдущих исследованиях с участием детей с СПВ и учитывая необходимость достичь значительной величины эффекта, для данного исследования была выбрана стандартная смешанная пища.
2. Исследование будет проводиться в амбулаторной клинике Института Ирвинга клинических и трансляционных исследований (Irving Institute for Clinical and Translational Research).
3. Протокол ЭСО для исследования будет подготовлен и направлен на соответствующий ингибитор ФДЭ и/или активатор циклазы.
4. Метаболомический профиль, если он будет получен в этом предварительном исследовании, будет выполнен в Главном центре исследований гормонов и метаболитов Исследовательского центра диабета и эндокринологии.
ПРИМЕР 4
Способы лечения синдрома Прадера-Вилли - комбинированное лечение эндогенного и экзогенного агонизма MC4R.
Индивиды с СПВ будут получать лечение с помощью агентов, которые повышают эндогенные уровни переработанных гормонов за счет повышения выработки РС1 вследствие повышения уровней клеточной выработки цАМФ и/или блокирования его деградации.
В дугообразном ядре ПОМК перерабатывается в αМСГ при помощи проконвертазы-1 (PC1) (S.L. Wardlaw 2011). αМСГ - это эндогенный лиганд рецептора меланокортина 4 (MC4R). Люди и мыши с инактивирующими мутациями в ПОМК, PCSK1 (продуктом гена PCSK1 является РС1) или MC4R страдают от гиперфагии и ожирения (С.Vaisse с соавт. 1998). Мутации в MC4R являются наиболее распространенной моногенной причиной ожирения у людей (R.J. Loos с соавт. 2008). АПБ также вырабатывается в дугообразном ядре и является обратным агонистом MC4R. Про-АПБ перерабатывается в АПБ с помощью PCI (S.L. Wardlaw 2011).
Возможно, что повышения выработки РС1 могут повышать выработку как αМСГ, так и АПБ, что имеет обратный эффект в MC4R (фиг. 4). Применение низкомолекулярных агонистов MC4R или агонистов MC4R на основе пептида может способствовать тому, что внеклеточные пулы агентов, которые агонизируют MC4R, будут превышать такие, которые антагонизируют MC4R (фиг. 4, таблица 3). Ожидается, что это будет стимулировать сдвиг сигнализации в сторону анорексигенных ответов (фиг. 4). Агенты, которые связываются с АПБ и блокируют его воздействие в MC4R, также могут быть полезной стратегией в подобной ситуации (таблица 3) (Е.С. Lee and P.A Carpino 2016). Полезными также могут быть соединения, которые действуют подобным образом и которые не упоминаются в таблице 3. Данная стратегия может быть эффективной не только для лечения СПВ, но и для лечения других форм моногенного/синдромного ожирения, а также обычного ожирения.
РЕЗЮМЕ/ВЫВОДЫ
Несмотря на то что регуляция кодирующего РС1 гена PCSK1 снижена в клеточных и животных моделях СПВ, ген сам по себе является интактным и поэтому может подвергаться фармакологическим манипуляциям. Текущие данные предлагают результаты продолжающихся доклинических исследований для фармакологического манипулирования клеточными уровнями PCSK1/PC1. Эксперименты in vitro демонстрируют, что применение агониста аденилатциклазы форсколина устойчиво и эффективно повышает экспрессию гена PCSK1 в человеческих нейронах, полученных из стволовых клеток, первичных нейронах мыши, а также повышает белковый уровень РС1 в изолированных островках мыши. Более того, лечение форсколином также повышает процессинг прогормона ПОМК в нейронах гипоталамуса, полученных из стволовых клеток. Применение ингибиторов ФДЭ теофиллина и рофлумиласта к нейронам, полученным из стволовых клеток, повышает уровни транскрипта PCSK1 как в качестве отдельных агентов, так и в комбинации с форсколином. Комбинированное лечение рофлумиластом и форсколином также дополнительно повышает процессинг прогормона ПОМК (в анорексигенные пептиды) в нейронах гипоталамуса, полученных из стволовых клеток. Обработка нейронов, полученных из стволовых клеток, форсколином вместе с MK0952 (ингибитор ФДЭ класса 4) повышает мРНК PCSK1. Наконец, однократная пероральная доза 10 мг/кг MK0952 повышает уровни транскрипта Pcsk1 в гипоталамусе на 25% у мышей дикого типа. Далее будет протестировано более длительное применение MK0952 in vivo как у мышей дикого типа, так и у мышей с гипоморфным отцовским геном Snord116. Кроме того, мы будем сотрудничать с Andrea Haqq и коллегами для измерения уровней циркулирующих прогормонов и переработанных гормонов (например, проинсулина, ПОМК, проокситоцина, про-НФГМ) в индивидах с СПВ и соответствующих контрольных образцах.
Также предлагается протокол предварительного клинического исследования MK0952 и других потенциально пригодных соединений с участием индивидов с СПВ. Основными целями этого клинического исследования будет мониторинг клинического профиля безопасности этих агентов для индивидов с СПВ, а также измерение поведенческих и нейроэндокринных конечных точек с целью оценки предварительной эффективности.
Ссылки:
Conkright М.D. et al. Genome-Wide Analysis of CREB Target Short Article Genes Reveals A Core Promoter Requirement for cAMP Responsiveness. Molecular Cell 11, 1101-1108 (2003).
Udupi, V., Townsend, С.M. & Greeley, G.H. Stimulation of Prohormone Convertase-1 mRNA Expression by Second Messenger Signaling Systems. BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS 246, 463-465 (1998).
Tang, W.-J. & Hurley, J. Catalytic Mechanism and Regulation of Mammalian Adenylyl Cyclases. Molecular Pharmacology 54, 231-240 (1998).
Tesmer, J.J.G. et al. Two-Metal-Ion Catalysis in Adenylyl Cyclase. Science 285, 756-760 (1999).
Onda, T. et al. Type-specific regulation of adenylyl cyclase. Selective pharmacological stimulation and inhibition of adenylyl cyclase isoforms. J Biol Chem 276, 47785-47793, doi:10.1074/jbc.M107233200 (2001).
Liang, X.H., Vickers, T.A., Guo, S. & Crooke, S.T. Efficient and specific knockdown of small non-coding RNAs in mammalian cells and in mice. Nucleic Acids Res 39, e13, doi:10.1093/nar/gkq1121 (2011).
Sunahara, R.K. & Taussig, R. Isoforms of Mammalian Adenylyl Cyclase: Multiplicities of Signaling. Molecular Interventions 2, 168-184 (2002).
S.L. Wardlaw, Hypothalamic proopiomelanocortin processing and the regulation of energy balance. European journal of pharmacology 660, 213-219 (2011).
C. Vaisse, K. Clement, B. Guy-Grand, P. Froguel, A frameshift mutation in human MC4R is associated with a dominant form of obesity. Nature Genetics 20, 113-114 (1998).
R.J. Loos et al., Common variants near MC4R are associated with fat mass, weight and risk of obesity. Nat Genet 40, 768-775 (2008).
E.C. Lee, P.A. Carpino, Melanocortin-4 receptor modulators for the treatment of obesity: a patent analysis (2008-2014). Pharmaceutical Patent Analyst 4, 95-107 (2016).
Fimia GM, Sassone-Corsi P. 2001. Cyclic AMP signaling. J Cell Sci 114: 1971-1972.
L.C. Burnett et al., Deficiency in prohormone convertase PC1 impairs prohormone processing in Prader-Willi syndrome. J Clin Invest 127, 293-305 (2017).
F.D.P. Deborah J. Good, Kathleen A. Mahon, Albert F. Parlow, Heiner Westphal, Ilan R. Kirsch, Hypogonadism and obesity in mice with a targeted deletion of the Nhlh2 gene. Nature Genetics 15, 397-401 (1997).
D.L. Fox, Dissertation, University of Massachusetts Amherst, Ann Arbor, MI (2007).
P. Stijnen, B. Ramos-Molina, S. , J.W.M. Creemers, PCSK1 mutations and human endocrinopathies: from obesity to gastrointestinal disorders. Endocrine Reviews 17, (2016).
M.D. Conkright et al., Genome-Wide Analysis of CREB Target Short Article Genes Reveals A Core Promoter Requirement for с AMP Responsiveness. Molecular Cell 11, 1101-1108 (2003).
V. Udupi, С.M. Townsend, G. H. Greeley, Stimulation of Prohormone Convertase-1 mRNA Expression by Second Messenger Signaling Systems. Biochemical and Biophysical Research Communications 246, 463-465 (1998).
W.-J. Tang, J. Hurley, Catalytic Mechanism and Regulation of Mammalian Adenylyl Cyclases. Molecular Pharmacology 54, 231-240 (1998).
J.J.G. Tesmer et al., Two-Metal-Ion Catalysis in Adenylyl Cyclase. Science 285, 756-760(1999).
T. Onda et al., Type-specific regulation of adenylyl cyclase. Selective pharmacological stimulation and inhibition of adenylyl cyclase isoforms. J Biol Chem 276, 47785-47793 (2001).
M. Gallant et al., Discovery of MK-0952, a selective PDE4 inhibitor for the treatment of long-term memory loss and mild cognitive impairment. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 20, 6387-6393 (2010).
Q. Zhang, G.J. Bouma, K. McClellan, S. Tobet, Hypothalamic expression of snoRNA Snord116 is consistent with a link to the hyperphagia and obesity symptoms of Prader-Willi syndrome. Int J DevNeurosci 30, 479-485 (2012).
Y. Qi et al., Snord116 is critical in the regulation of food intake and body weight. Sci Rep 6, 18614(2016).
L. Wang et al., Differentiation of hypothalamic-like neurons from human pluripotent stem cells. J Clin Invest 125, 796-808 (2015).
V. Grinevich, M.G. Desarmenien, B. Chini, M. Tauber, F. Muscatelli, Ontogenesis of oxytocin pathways in the mammalian brain: late maturation and psychosocial disorders. Front Neuroanat 8, 164 (2014).
M. Tauber et al., The Use of Oxytocin to Improve Feeding and Social Skills in Infants With Prader-Willi Syndrome. Pediatrics 139, (2017).
R.J. Kuppens, S.H. Donze, A.C. Hokken-Koelega, Promising effects of oxytocin on social and food-related behaviour in young children with Prader-Willi syndrome: a randomized, double-blind, controlled crossover trial. Clin Endocrinol (Oxf) 85, 979-987 (2016).
G. Alvarez-Bolado, F.A. Paul, S. Blaess, Sonic hedgehog lineage in the mouse hypothalamus: from progenitor domains to hypothalamic regions. Neural development 7, 4 (2012).
S. Blaess, N. Szabo, R. Haddad-Tovolli, X. Zhou, G. Alvarez-Bolado, Sonic hedgehog signaling in the development of the mouse hypothalamus. Front Neuroanat 8, 156 (2014).
E.O. Mazzoni et al., Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. NatNeurosci 16, 1219-1227 (2013).
P. Arlotta, O. Hobert, Homeotic Transformations of Neuronal Cell Identities. Trends Neurosci 38, 751-762 (2015).
E.S. Deneris, O. Hobert, Maintenance of postmitotic neuronal cell identity. Nat Neurosci 17, 899-907 (2014).
T.J. Cleophas, A.H. Zwinderman, T.F. Cleophas, in Statistics Applied to Clinical Trials. (Springer Netherlands, Dordrecht, 2006), pp.219-228.
S. Wellek, M. Blettner, On the Proper Use of the Crossover Design in Clinical Trials: Part 18 of a Series on Evaluation of Scientific Publications. Deutsches Arzteblatt International 109, 276-281 (2012).
T.A. Louis, P.W. Lavori, J.С.I. Bailar, M. Polansky Crossover and Self-Controlled Designs in Clinical Research. New England Journal of Medicine 310, 24-31 (1984).
E.M. Dykens, M.A. Maxwell, E. Pantino, R. Kossler, E. Roof, Assessment of Hyperphagia in Prader-Willi Syndrome. Obesity 15, 1816-1826 (2007).
S.R. Crawford et al., The International Development of The Modified Hyperphagia Questionnaire. Value in Health 18, A761.
J.M. MD, D.D. MD, A. Chen, Т.E. Hughes, D.D. Kim, paper presented at the Obesity Week 2014, Boston, MA, 2014.
R.J. Kuppens, S.H. Donze, A.C.S. Hokken-Koelega, Promising effects of oxytocin on social and food-related behaviour in young children with Prader-Willi syndrome: a randomized, double-blind, controlled crossover trial. Clinical Endocrinology 85, 979-987 (2016).
P. Gumus Balikcioglu et al., Macronutrient Regulation of Ghrelin and Peptide YY in Pediatric Obesity and Prader-Willi Syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 100, 3822-3831 (2015).
R. Kaddurah-Daouk, R. Weinshilboum, N. on behalf of the Pharmacometabolomics Research, Metabolomic Signatures for Drug Response Phenotypes: Pharmacometabolomics Enables Precision Medicine. Clinical Pharmacology & Therapeutics 98, 71-75 (2015).
R.D. Beger et al., Metabotomics enables precision medicine: "A White Paper, Community Perspective". Metabolomics 12, 149 (2016).
Объем настоящего изобретения не ограничивается тем, что было конкретно показано и описано выше. Многочисленные ссылки, включая патенты и различные публикации, цитируются и обсуждаются в данном описании настоящего изобретения. Цитирование и обсуждение этих ссылок предоставляется просто для разъяснения описания настоящего изобретения и не является признанием того факта, что любая из ссылок является прототипом изобретения, описанного в настоящем документе. Все ссылки, цитируемые и обсуждаемые в этом описании, в полном объеме включены в данный документ посредством ссылки. Вариации, модификации и другие реализации описанного в настоящем документе будут очевидны специалистам в данной области техники без отхода от сущности и объема изобретения. Хотя были показаны и описаны некоторые варианты осуществления настоящего изобретения, специалистам в данной области техники будет очевидно, что могут быть сделаны изменения и модификации без отклонения от сущности и объема настоящего изобретения. Предмет, приведенный в описании выше и сопроводительных графических материалах, предлагается с целью иллюстрации, а не с целью ограничения. Фактический объем настоящего изобретения предназначен для охвата следующими пунктами формулы изобретения.