Модификация матриц из поликапролактона сосудистым эндотелиальным фактором роста для потенциального применения в разработке тканеинженерных сосудистых графтов

модификация матриксов из поликапролактона сосудистым эндотелиальным фактором роста для потенциального применения в разработке тканеинженерных сосудистых графтов

В.В. Севостьянова, А.С. Головкин, Л.В. Антонова, Т.В. Глушкова, ОЛ. Барбараш, Л.С. Барбараш Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний, Кемерово, Россия

Modification of polycaprolactone scaffolds with vascular endothelial growth factors for potential application in development of tissue engineered vascular grafts

V.V. Sevostyanova, A.S. Golovkin, L.V. Antonova, T.V. Glushkova, O.L. Barbarash, L.S. Barbarash Research institute for complex issues of cardiovascular diseases, Kemerovo, Russia

В данном исследовании изучали биологическую активность нетканых матриксов из поликапролактона для контролируемой доставки сосудистого эндотелиального фактора роста . Изготовление трубчатых матриксов с инкорпорированным сосудистым эндотелиальным фактором роста (VEGF) осуществляли методом электроспиннинга . Поликапролактоновый матрикс, содержащий фактор роста, обладал морфологией, сходной с нативным межклеточным матриксом . Устойчивый выход VEGF из матрикса с сохранением его биологической активности наблюдали в течение 80 дней . Оценка адгезии и пролиферации муль-типотентных мезенхимальных стромальных клеток и эн-дотелиальных клеток на поверхности материала показала, что матриксы с VEGF способны поддерживать клеточную активность . Результаты исследования демонстририровали, что инкорпорированный фактор роста способствует активной пролиферации эндотелиальных клеток на пористом материале с их проникновением во внутренние слои полимерной конструкции . Данный подход к созданию биоактивной среды в области матрикса обладает большим потенциалом в разработке графтов для восстановления кровеносных сосудов

Ключевые слова: поликапролактон, сосудистый эндо-телиальный фактор роста, электроспиннинг, полимерный матрикс

In this study, we investigated a biological activity of nonwoven polycaprolactone scaffolds for controlled delivery of vascular endothelial growth factors . The tube scaffolds with incorporated vascular endothelial growth factors were fabricated by method of electrospinning . The polycaprolactone scaffold containing growth factor provided a morphology similar to the native extracellular matrix . The sustained release of biologically active growth factor from scaffold was observed for 80 days . The assessment of adhesion and proliferation of multipotent mesenchymal stem cells and endothelial cells on the material surface showed that scaffolds with vascular endothelial growth factors are able to maintain the cellular activity . Results of study demonstrated that incorporated growth factors provide active proliferation of endothelial cells on porous material and cells penetration inside the scaffold This approach to the creation of a biologically active environment in the scaffold has a great potential in the development of grafts for blood vessels regeneration

Keywords: polycaprolactone, vascular endothelial growth factor, electrospinning, polymeric scaffold

Введение

Традиционным способом лечения заболеваний, связанных со значительным поражением коронарных и периферических артерий, является хирургическое вмешательство с имплантацией биологических или синтетических протезов . «Золотым стандартом» для протезирования сосудов малого диаметра (<5 мм) являются аутотрансплантаты [1]. Однако использование аутогенных вен и артерий в большинстве случаев приводит к повторным операциям, связанным с деструктивными изменениями и окклюзией шунтов в течение 10 лет после трансплантации . Также около 30% пациентов не обладают подходящими для данной операции сосудами из-за перенесенных операций и других заболеваний [2, 3].

Потребность в альтернативе аутотрансплантатам привела к попыткам создания кровеносных сосудов из клеток пациента на основе подходов тканевой инженерии . Существенные успехи были достигнуты в тканевой инженерии кровеносных сосудов с использованием биодеградируемых пористых матриксов из природных и синтетических материалов . Некоторые из недавно проведенных исследований были посвящены возможности формирования кровеносного сосуда на основе биодеградируемых графтов in vivo . Хорошую прочность, эластичность, а также эндотелизацию после имплантации в кровеносное

e-mail: sevostyanova . victoria@gmail . com

русло крыс продемонстрировали графты из поликапролактона (polycaprolactone (PcL)), его комбинации с полигликолиевой и полимолочной кислотой, а также PcL графты, покрытые полиглицерол себакатом [4-6]. Тем не менее, в долгосрочных исследованиях было показано развитие гиперплазии неоинтимы в данных графтах, а также их недостаточная регенерация [7].

Одним из перспективных способов регуляции формирования кровеносных сосудов является использование молекул сосудистого эндотелиального фактора роста (vascular endothelial growth factor (VEGF)). VEGF оказывает влияние на миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток, а также ва-зодилятацию Однако было показано, что неконтролируемое введение этого фактора роста приводит к неупорядоченному росту кровеносных сосудов с образованием гемангиомы, стимулирует ангиогенез в злокачественных опухолях, а также вызывает формирование сосудов с повышенной проницаемостью стенки [8, 9]. Таким образом, физиологическая функция VEGF в развитии и поддержании кровеносных сосудов контрастирует с его способностью индуцировать «некорректный» ангиогенез . При этом в эксперименте с введением в организм миобластов, трансфицированных геном vegf, в результате которой клетки постоянно продуцировали фактор роста,

было показано формирование стабильной капиллярной сети [10]. Эти данные свидетельствуют о том, что контролируемая доставка VEGF в зону регенерации тканей может быть использована для васкуляри-зации тканеинженерных конструкций и стимуляции ангиогенеза на сосудистых графтах .

Настоящее исследование было направлено на изучение эффективности использования графтов из поликапролактона, изготовленных методом электроспиннинга, в качестве средства пролонгированной доставки молекул VEGF.

Материал и методы

Для изготовления графтов использовали синтетический биодеградируемый полимер поликапролак-тон с молекулярной массой 80000 (Sigma-Aldrich Co . LLC, США) и рекомбинантный сосудистый эн-дотелиальный фактор роста крысы (R&D Systems, США) в фосфатно-солевом буфере (Gibco, США) в концентрации 1 мкг/мл .

Изготовление графтов

PCL графты толщиной 200 мкм изготавливали методом электроспиннинга на приборе Nanon-01A (MECC CO, Япония) из 14% раствора PCL в хлороформе . Подаваемое напряжение составило 15 кВ, скорость подачи раствора — 0,5 мл/ч, расстояние до коллектора — 15 см, в качестве коллектора использовали вращающийся штифт диаметром 4 мм . Для изготовления графтов с инкорпорированным VEGF раствор PCL смешивали с раствором фактора роста (1 мкг/мл) в соотношении 20:1 до получения суспензии и проводили электроспиннинг, как описано выше . Из трубчатых нетканых образцов с помощью острых хирургических ножниц вырезали плоские PCL и PCL/VEGF-матриксы .

Характеристика структуры матриксов

Структуру отдельных волокон, изготовленных методом электроспиннинга, изучали методом световой микроскопии с помощью микроскопа Axio Observer Z1 (Carl Ziess, Германия) .

Для определения морфологии образцы PCL и PCL/VEGF-матриксов размером 0,5x0,5 мм покрывали золотым токопроводящим напылением толщиной 30 нм и далее изучали на сканирующем электронном микроскопе S3400N (Hitachi, Япония) .

Кинетика выхода VEGF

Из PCL/VEGF-графтов с помощью острых хирургических ножниц вырезали кусочки 1x2 см2 . Полученные матриксы стерилизовали этиленоксидом в условиях централизованного ЦСО, а затем отмывали фосфатно-солевым буфером . Каждый образец помещали в пробирки объемом 1,5 мл и инкубировали при 37°С . Через установленные промежутки времени (12, 24, 48 ч . и далее через каждые 48 ч . ) в течение 80 сут , из каждой пробирки отбирали 200 мкл раствора и восстанавливали исходный объем свежим буфером В собранных образцах определяли количественное содержание фактора роста с использованием наборов для иммуноферментного анализа VEGF (R&D System, США), а также биологическую активность VEGF.

Определение биологической активности

ростового фактора

Биологическую активность вышедшего из ма-трикса VEGF изучали по способности стимулировать пролиферацию эндотелиальных клеток человека линии EA. Hy 926, которая была любезно предоставлена Dr . Cora-Jean C . Edgell из Университета Северной Каролины, США Клетки EA Hy926 воспроизводят основные морфологические, фенотипи-ческие и функциональные характеристики, присущие эндотелиальным клеткам макрососудов [11]. EA . Hy 926 культивировали в питательной среде DMEM/ F12 (Sigma-Aldrich Co . LLC, США), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (Gibco, США), 1% раствора L-глутамина с пенициллином и стрептомицином (Gibco, США), 0,4% амфотерицина Б (Gibco, США), 1% HEPES буфера (Gibco, США), 2% HAT (Sigma-Aldrich Co LLC, США) при 5% CO2 и температуре 37°С 2

Пролиферацию EA . Hy 926 под действием VEGF оценивали с помощью MTT-теста [12]. В 96-луноч-ный планшет помещали EA Hy 926 по 4000 на лунку и инкубировали 24 ч в питательной среде После чего к клеткам добавляли по 150 мкл буферных растворов с разным содержанием VEGF, получение которых описано в подразделе «кинетика выхода VEGF» . Клетки оставляли еще на 72 ч . при 5% CO2 и температуре 37°С . Затем среду удаляли и заменяли ее на 200 мкл свежей . В каждую лунку вносили 20 мкл раствора MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]- 2,5-diphenyltetrazolium bromide) (Sigma-Aldrich Co LLC, США) и инкубировали 4 ч при 37°С Далее среду удаляли, в лунки добавляли по 200 мкл диметилсульфоксида (Gibco, США) . Через 10 мин . определяли оптическую плотность при длине волны 530 нм с использованием планшетного спектрофотометра Униплан (Пикон, Россия) . В качестве контроля использовали клетки, культивированные в среде без фактора роста Отрицательный контроль представлял собой среду с добавлением MTT .

Оценка адгезии клеток на матриксах

Пригодность поверхности PCL и PCL/VEGF-матриксов для адгезии клеток изучали с использованием культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) костного мозга крыс и эндотелиальных клеток человека линии EA . Hy 926 . ММСК выделяли из костного мозга бедренных костей крыс популяции Wistar и культивировали в питательной среде DMEM (Gibco, США) c добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (Gibco, США), 1% раствора L-глутамина с пенициллином и стрептомицином (Gibco, США), 0,4% амфотерици-на Б (Gibco, США), 1% HEPES буфера (Gibco, США). Для проведения эксперимента использовали клетки 3 пассажа Клетки EA Hy 926 культивировали, как описано выше

Из PCL и PCL/VEGF-графтов вырезали плоские образцы диаметром 1,93 см2 по размеру лунки 24-лу-ночного планшета Матриксы помещали в 2 планшета и инкубировали 24 ч . с культуральной средой для ММСК в одном и со средой для эндотелиальных клеток — в другом . Далее на образцы наносили по 2,5x104 клеток . Для каждой комбинации вида материала и типа клеток проводили по 5 дублирующих исследований В качестве контроля использовали

клетки, культивированные на поверхности пластика без матрикса . Через 2, 4 и 6 сут . клетки окрашивали флуоресцентным красителем PKH26 (Sigma-Aldrich Co . LLC, США) и изучали на инвертированном микроскопе Axio Observer Z1 (Carl Ziess, Германия) с использованием программного модуля ApoTome .

Статистический анализ

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета прикладных программ «STATISTICA 6 . 0» (StatSoft Inc . , США) . Нормальность распределения оценивали при помощи критерия Колмогорова-Смирнова . Достоверность различий определяли с помощью непараметрического критерия Манна — Уитни, а также непараметрического дисперсионного анализа Краскела — Уоллиса . Различия считали стати-

стически значимыми при р<0,01. Данные представлены как медиана и 25% и 75% процентили, Me (25%;75%).

Результаты

Структура матриксов

Световая микроскопия показала наличие в PCL/ VEGF волокнах доменов c VEGF, расположенных внутри полимерного волокна (рис . 1). Оценка морфологии PCL матриксов сканирующей электронной микроскопией показала, что все образцы состояли из разнонаправленных переплетенных волокон . При этом волокна PCL матриксов были равномерными по толщине с диаметром 2,521 ±0,490 мкм и не имели выраженных дефектов . Матриксы с VEGF были образованы волокнами, варьирующими в диаметре от 0,142 до 10,714 мкм (рис . 2).

I (im

10 fun

10 цт

Рис. 1.

Полимерные волокна, изготовленные методом электроспиннинга: А, В - PCL волокна; Б, Г - PCL волокна с VEGF. Световая микроскопия полимерных волокон. Ув. А, Б х100; В, Г х400

Выход фактора роста

Высвобождение VEGF из графта происходило на протяжении 80 дней, в течение которых из матрикса выделилось 531,88 пг фактора роста (рис . 3). В первые четыре дня наблюдался значительный выброс биоактивных молекул, который в среднем составил 207 пг . Начиная с пятых суток, выделение VEGF в буфер происходило с относительно постоянной скоростью — 30,08±2,82 пг в 4 дня .

пг

Рис. 3. Динамика накопления VEGF в буфере

Биологическая активность VEGF

VEGF, выделившийся из полимерного материала за первые сутки, не оказывал выраженного влияния на пролиферацию эндотелиальных клеток по отношению к отрицательному контролю (рис. 4) . Значительную биологическую активность продемонстрировала инкубационная среда с VEGF, вышедшим в течение 4 сут , по сравнению с контрольной средой, а также фосфатно-солевым буфером, взаимодействовавшим с материалом графта в течение 2 сут . С увеличением времени инкубации материала с VEGF наблюдали усиление способности инкубационного раствора оказывать пролиферативное действие на эндотелиальные клетки .

оп

1 -,

0,9 0,8 0,7

Рис. 4. Пролиферация клеток EA.Hy 926 в среде, контактировавшей с PCL/VEGF-матриксом в разные интервалы времени в течение 80 сут.

Адгезия клеток на PCL матриксах с VEGF

Результаты продемонстрировали низкий уровень адгезии ММСК к образцам из PCL, как ненагружен-ным VEGF, так и с таковым (рис . 5) . Через 2 сут . культивирования число ММСК на PCL-матриксах составило 44 (37; 64) клеток в поле зрения, на PCL/VEGF - 47,5 (34,5; 61) клеток в поле зрения, что в среднем в 1,7 раза меньше, чем в контрольной группе — 79,5 (72,5; 88) (рис . 6) . Достоверных различий в отношении клеточной адгезии на PcL и PCL/VEGF-матриксах не обнаружено . К 6 сут . количество клеток на культуральном пластике превысило число клеток на PCL-матриксах в 7 раз, а на PCL/VEGF-матриксах — в 4,3 раза (p<0,01). Несмотря на отсутствие количественных различий в адгезии ММСК на обоих видах полимерных образцов, было обнаружено, что на PCL-матриксах без фактора роста ММСК располагались преимущественно на поверхности . В то же время на матриксах с VEGF клетки находились не только на поверхности, но и проникали в глубину матрикса

Эндотелиальные клетки также демонстрировали адгезию к PCL и PCL/VEGF-матриксами после 2 сут . культивирования (рис . 8). Разницы в количестве клеток между двумя видами материала обнаружено не было (рис 9) С 2 до 4 сут на матриксах из PCL рост клеточной культуры был незначительным — c 183 (157,5; 198) до 297,5 (251,5; 330) клеток в поле зрения, а на PCL с VEGF наблюдали пролиферацию c возрастанием числа EA. Ну 926 с 141,5 (118; 173) до 632,5 (607,5; 661,5) клеток в поле зрения . Через 4 сут . число EA. Ну 926 на

PCL/VEGF-матриксах в 2,1 раза превысило количество клеток на PCL (p<0,01).

Такая же картина наблюдалась и через 6 сут . Наличие VEGF в структуре PCL-матриксов способствовало увеличению числа клеток на материале в 3,3 раза по сравнению с чистым PCL-образцом (p<0,01) . На 6 сут . культивирования клетки полностью покрывали матрикс с VEGF, а также значительно проникали во внутренние слои

Обсуждение

Для формирования новой ткани на основе тка-неинженерного графта важным является баланс между искусственным матриксом и биологически активными молекулами [13]. Инкорпорирование в полимерный графт факторов роста представляет собой многообещающий подход для восстановления поврежденных тканей [14]. Метод электроспиннинга позволяет инкапсулировать в полимер различные лекарственные и биологически активные молекулы [15]. После проведения электроспиннинга раствора PCL с VEGF, внутри полимерного волокна образовывались домены, содержащие фактор роста . Однако введение в полимер водной фазы приводило к изменению структуры материала

Несмотря на неоднородность волокон графта после инкорпорирования VEGF, сохранялась пористая структура матрикса Кроме того, образовавшиеся наноразмерные волокна делали материал более сходным по структуре с внеклеточным матриксом, для которого характерны фибриллярные белки, имеющие наноразмеры Волокна же с большим диаметром способствовали формированию крупных пор, которые должны обеспечить лучшее проникновение клеток внутрь полимерных матриксов

Низкая скорость выхода молекул VEGF из PCL-матрикса может быть обусловлена тем, что в результате стерилизации и отмывки в буфере произошло удаление фактора роста с поверхности волокон и поверхностных пор . Следовательно, выход VEGF из PCL-матриксов происходил за счет высвобождения из внутренних резервуаров волокна. Учитывая слабую устойчивость VEGF, нельзя предполагать, что после выхода PCL-матрикса он может сохраняться в растворе в течение 80 сут . Вероятно, концентрация VEGF в растворе поддерживалась и увеличивалась также за счет его постоянного выхода из полимерных волокон .

Данные, полученные при оценке пролиферации эндотелиальных клеток, которые культивировали в питательной среде с добавлением аналитов, содержащих VEGF, показали, что молекулы фактора роста после выхода из PCL-графта сохраняли свою биологическую активность . Кроме того, низкие дозы VEGF обуславливали его способность поддерживать плавный митогенный эффект на эндотелиальные клетки .

Важным феноменом, оказывающим влияние на морфологию клеток, их миграцию, рост и дифферен-цировку на поверхности биоматериала является адгезия [16]. На сегодняшний день известны свойства биодеградируемых полимеров, позволяющие использовать их в качестве искусственного матрикса для культивирования клеток Особое внимание уделяется матриксам, изготовленным методом электроспиннинга [17]. Значительная площадь поверхности данных материалов способствует абсорбции белков, которые обеспечивают сайты связывания для клеток [18].

2 суток

4 суток

6 суток

а Р ä Л , , $ с- * ь •> % .v Я ,-jk 'ЭДц а

" 'Щ я <яг V е

f V С * * «5 % 1 200 Jim |

& «*> , 1 » » V »

•V,

.. П - Ч>' у

- ' к /Т.  г»

- " w

Т v-Д

• А лч -«ГчЛ. .

v '^'. V

1 ' * , / • • „<•

\

l 1 *

* ^ А .* •

•

• # ♦

0 Л * ,

1 I 200 цт |

N % ^

' Г

< С

Рис. 5. ММСК на матриксах PCL и PCL с VEGF в течение 6 сут. культивирования. Флуоресцентная микроскопия. Визуализация клеток: PKH26. Ув. х100

* - p<0 ** - p<0 *** - p<0

,01 относительно образцов, культивированных без матрикса 2 суток ,01 относительно образцов, культивированных без матрикса 4 суток ,01 относительно образцов, культивированных без матрикса 6 суток

Рис. 6. Количество ММСК на PCL и PCL/VEGF-матриксах в течение 6 сут. культивирования

2 суток

4 суток

6 суток

Рис. 7. Эндотелиальные клетки EA.Hy 926 на PCL и PCL/VEGF-матриксах в течение 6 сут. культивирования. Флуоресцентная микроскопия. Визуализация клеток: PKH26. Ув. х100

* - p<0,01 относительно образцов, культивированных без матрикса 2 суток

** - p<0,01 относительно образцов, культивированных без матрикса и на PCL 4 суток

*** - p<0,01 относительно образцов, культивированных без матрикса и на PCL 6 суток

Рис. 8.

Количество эндотелиальных клеток EA.Hy 926 на PCL и PCL/VEGF-матриксах в течение 6 сут. культивирования

Для оценки сродства клеток к материалу использовали эндотелиальные клетки линии ЕА. Ну926 и ММСК крысы . Эндотелиальные клетки имеют значение в формировании новой сосудистой ткани, они обеспечивают тромборезистентность внутренней поверхности кровеносного сосуда и препятствуют гиперплазии неоинтимы [19]. ММСК мигрируют в зону повреждения и, осуществляя секрецию растворимых факторов, создают микросреду, благоприятную для

регенерации тканей [20]. Исследования in vitro и in vivo позволили определить, что ММСК костного мозга вносят значительный вклад в формирование кровеносных сосудов у взрослых, так называемый неоваскулогенез [21].

PCL представляет собой гидрофобный полимерный материал . Угол смачивания для изделий из данного полимера, как пленочных, так и состоящих из волокон, превышает 80° . Известно, что материалы

с такими свойствами без дополнительной модификации препятствуют клеточной адгезии и пролиферации [22]. Данный эффект может объяснять низкую адгезию и пролиферацию ММСК на поверхности PCL-матриксов .

Введение в полимер молекул VEGF никак не повлияло на пролиферацию ММСК . Однако в работе S . G . Ball с соавт . (2007) было показано, что VEGF способен индуцировать миграцию и пролиферацию ММСК через связывание с рецепторами PDGFRa и PDGFRp . Для обнаружения данного эффекта авторы использовали 10 нг/мл VEGF [23]. В настоящем исследовании не наблюдалось подобного влияния ма-триксов с VEGF на клетки, что может быть связано с недостаточной концентрацией биомолекул, вышедших из матрикса за время культивирования .

Несмотря на свою слабую адгезивную способность PCL-матриксы, как с фактором роста, так и без него, выступали в качестве механической основы и способствовали поддержанию жизнеспособности прикрепившихся клеток . Нами не было обнаружено достоверного снижения количества ММСК на протяжении эксперимента .

Интерес вызывает разница в расположении клеток в структуре графтов . ММСК на PCL-матриксах находились в основном на поверхности материала, в то время как на образцах с VEGF — между полимерными волокнами в более глубоких слоях Очевидно, что проникновение ММСК внутрь PCL/VEGF-матрикса обусловлено более крупными порами данного ма-трикса по сравнению с чистым PCL . Уменьшение диметра волокон с одновременным увеличением размера пор после введения молекул ростового фактора способствовало миграции клеток внутрь графта и его заселению . В то же время эндотелиальные клетки могли проникать между волокнами как в PCL, так

ЛИТЕРАТУРА:

I. Taggart D . P . Current status of arterial grafts for coronary artery bypass grafting . Ann . Cardiothorac . Surg . 2013; 2 (4): 427-30 .

2 . Бокерия Л .А ., Беришвили И . И ., Солнышков Л . Э . и др . Повторные операции у больных ишемической болезнью сердца — современное состояние проблемы . Бюллетень НЦССХ им . Бакулева РАМН . 2009; 10(3): 5-27 .

3 . Taylor L. M . , Edwards J . M ., Porter J . M . Present status of reversed vein bypass grafting: five-year results of modern series . J . Vasc . Surg . 1990; 11(2): 193-205 .

4 . Iwasaki K . , Kojima K ., Kodama S . et al . Bioengineered three-layered robust and elastic artery using hemodynamicallyequivalent pulsatile bioreactor . Circulation 2008; 118(14, Sup . ): S52-7 .

5 . Pektok E ., Nottelet B ., Tille J . et al . Degradation and healing characteristics of small-diameter poly(e-caprolactone) vascular grafts in the rat systemic arterial circulation . Circulation 2008; 118(24): 2563-70 .

6 . Wu W ., Allen R, Wang Y . et al . Fast-degrading elastomer enables rapid remodeling of a cell-free synthetic graft into a neoartery . Nat . Med . 2012; 18(7): 1148-53 .

7 . De Valence S ., Tille J ., Mugnai D . et al . Long term performance of polycaprolactone vascular grafts in a rat abdominal aorta replacement model . Biomaterials 2012; 33(1): 38-47 .

8 . Bates D . O . Vascular endothelial growth factors and vascular permeability . Cardiovasc . Res . 2010; 87(2): 262-71.

9 . Hiroyuki T ., Shibuya M . The vascular endothelial growth factor (VEGF)/VEGF receptor system and its role under physiological and pathological conditions . Clin . Science . 2005; 109(3): 227-41.

10 . Misteli H ., Wolff T., Fuglistaler P . et al . High-throughput flow cytometry purification of transduced progenitors expressing defined levels of vascular endothelial growth factor induces controlled angiogenesis in vivo . Stem Cells 2010; 11(28): 611-9 .

II. Ahn K ., Pan S ., Beningo K . et al . A permanent human cell line (EA . hy926) preserves the characteristics of endothelin converting enzyme from primary human umbilical vein endothelial cells . Life Sci . 1995; 56(26): 2331-41.

12 . Yang X., Luo P ., Yang B . et al . Antiangiogenesis response of endothelial cells to the antitumour drug 10-methoxy-9-nitrocamptothecin . Pharmacol . Res . 2006; 54(5): 334-40 .

и в PCL/VEGF-матриксах, что обусловлено меньшим размером EA. Hy 926 клеток относительно ММСК . Так размер ММСК, адгезированных на поверхности полимерных образцов, составлял 37,44±6,65 мкм, а эндотелиальных клеток — 17,63±2,99 мкм . Способность обеспечивать миграцию клеток внутрь стенки полимерного каркаса является важной характеристикой тканеинженерного графта . Это связано с тем, что на искусственных матриксах клетки в большинстве случаев быстро адгезируются и пролифери-руют по внешнему краю, препятствуя клеточной инфильтрации материала и формированию ткани [24].

Полученные результаты свидетельствуют о том, что структура PCL матриксов с инкорпорированным VEGF благоприятна для заселения материала клетками . Кроме того, ангиогенный фактор роста создает биологически активное окружение, приводя к активной пролиферации эндотелиальных клеток in vitro .

Заключение

Таким образом, PCL графты, содержащие инкорпорированный VEGF, могут обеспечивать пролонгированное высвобождение фактора роста в окружающую среду с сохранением его биологической активности Данные матриксы удобоваримы для адгезии ММСК и эндотелиальных клеток, а инкорпорированный VEGF стимулирует пролиферацию последних .

Благодарности

Исследование выполнено за счет средств гранта Российского научного фонда (проект № 14-25-00050) и проведено в Научно-исследовательском институте.

13 . Owen S . C ., Shoichet M . S . Design of three-dimensional biomimetic scaffolds . J . of biomed . Mater . Resear. A . 2010; 94a(4): 1321-31.

14 . Lee K ., Silva E . A ., Mo D . J . Growth factor delivery-based tissue engineering: general approaches and a review of recent developments . J . R . Soc . Interface 2011; 8(55): 153-70 .

15 . Zhang Y . Z . , Su B ., Venugopa J . et al . Biomimetic and bioactive nanofibrous scaffolds from electrospun composite nanofibers . Int . J . Nanomedicine 2007; 2(4): 623-38 .

16 . Rigogliusoa S ., Paviab F ., Brucatob V . et al . Use of modified 3D scaffolds to improve cell adhesion and drive desired cell responses . Chemical engineering transactions 2012; 27: 415-20 .

17 . Rim N . G . , Shin C . S . , Shin H . Current approaches to electrospun nanofibers for tissue engineering . Biomed . Mater. 2013; 8(1): 1-14 .

18 . Mijovic B ., Trcin M ., Agic A. et al . Study on cell adhesion detection onto biodegradable electrospun PCL scaffolds . J . Fiber Bioengin . Inform . 2012; 5(1): 33-40 .

19 . Naito Y. , Shinoka T., Duncan D . et al .Vascular tissue engineering: towards the next generation vascular grafts . Adv . Drug . Deliv. Rev . 2011; 63(4-5): 312-23 .

20 . O'Cearbhaill E . D . , Murphy M . , Barry F . et al . Behaviour of human mesenchymal stem cells in fibrin-based vascular tissue engineering constructs . Ann . Biomed . Eng . 2010; 38(3): 649-57

21. Ball S . G ., Shuttleworth C . A, Kielty C . M . Vascular endothelial growth factor can signal through platelet-derived growth factor receptors . J . Cell Biol . 2007; 177(3); 489-500 .

22 . Kosorn W., Thavornyutikarn B ., Uppanan P . Surface modification of polycaprolactone scaffolds by plasma treatment for chondrocyte culture . IPCBEE . 2012; 43: 44-8 .

23 . Ball S . G ., Shuttleworth C .A ., Kielty C . M . Mesenchymal stem cells and neovascularization: role of platelet-derived growth factor receptors . J . Cell . Mol . Med . 2007; 11(5): 1012-30 .

24 . Dunn J ., Chan W ., Cristini V . et al . Analysis of cell growth in three-dimensional scaffolds . Tissue Eng . 2006; 12(4): 705-16 .

Поступила: 25.02.2015