СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАНОЧАСТИЦ МАГНЕТИТА, СТАБИЛИЗИРОВАННЫХ БИОСОВМЕСТИМЫМ ПОЛИМЕРОМ, ИМЕЮЩИМ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ФОРМИЛЬНЫЕ ГРУППЫ
METHOD FOR MAKING MAGNETITE NANOPARTICLES STABILISED BY BIOCOMPATIBLE POLYMER HAVING FUNCTIONAL FORMYL GROUPS

Настоящее изобретение относится к области получения магнитовосприимчивых сорбентов и может быть использовано для мониторинга и диагностики эпидемических инфекций, например, таких как туберкулез.
Современные исследования в области наноматериалов свидетельствуют о больших перспективах в использовании магнитовосприимчивых композитных материалов в медицине, биологии и диагностике эпидемических инфекционных заболеваний.
3
4
Для существующих методик получения магнитовосприимчивых композитов с использованием магнетита (FeO), включающего железо(3+) и железо(2+), основными проблемами являются: получение наноразмерных частиц магнетита, предотвращение агломерации наночастиц магнетита в процессе его выделения, создание устойчивой композиции частиц магнитного сорбента, несущего на своей внешней поверхности реакционноспособные группы, пригодные для иммобилизации биологических объектов, например антител.
Доступным способом предотвращения агломерации наночастиц с образованием более крупных агрегатов является стабилизация наночастиц магнетита в электронейтральных полимерных, поликатионных или полианионных матрицах, образующих устойчивые композиты с магнетитом. Полимерная матрица предполагает отсутствие ее непосредственного химического взаимодействия с магнетитом, что позволяет сохранить его магнитные свойства в процессах дальнейшего использования при создании бионанокомпозитов на его основе. Образовавшаяся пространственная структура полимера препятствует агрегации частиц магнетита, позволяя получить частицы заданного размера.
Матрица, со своей стороны, должна обладать способностью связывать биологические макромолекулы, в частности антитела, т.е. ее надо поверхностно модифицировать с введением активных химических групп.
Известен способ получения частиц магнетита, стабилизированных хитозаном и обработанных глутаровым альдегидом, для иммобилизации пуллуланазы, применяемых для гидролиза пуллулана и амилопектина (Lianying Zhang, Photochemical preparation of magnetic beads for immobilization of pullunase, Biochemical Engineering Journal, 2009, v.46(1), 83-87).
Способ включает следующие стадии: а) получение частиц магнетита с использованием хлорного железа(3+) и сульфита натрия в качестве восстанавливающего агента в присутствии избытка аммиака, б) модификацию поверхности магнетита раствором солянокислой соли хитозана в присутствии N,N'-метилен-бис-акриламида в качестве сшивающего агента в присутствии перекиси водорода и облучении ультрафиолетовой лампой при pH 5,5, в) модификацию частиц глутаровым альдегидом.
Этот способ достаточно трудоемок и его основным недостатком является использование перекиси водорода, которая приводит к деполимеризации хитозана (C.Q.Qin, Effect of hydrogen peroxide treatment on the molecular weight and structure of chitosan. Polymer Degradation and Stability, 2002, v.76, 211-218), образованию восстанавливающих хитоолигосахаридов в комплексе и, как следствие, восстановлению железа(3+) в железо(2+), что приводит к быстрому разрушению композита и не позволяет использовать такие композиты многократно.
Известен также способ получения магнитных микросфер на основе хитозана для его использования в качестве сорбента. Способ включает следующие стадии: а) приготовление смеси готового магнетита в растворе хитозана в 5% уксусной кислоте; б) эмульгирование этой смеси в минеральном масле с добавлением петролейного эфира и эмульгатора при энергичном перемешивании; в) добавление глутарового альдегида и перемешивание всей эмульсии до образования микросфер; г) отделения микросфер с размерами 1-5 мкм (1000-5000 нм), отмывки их от масла петролейным эфиром (Emir Baki Dekba, Magnetic chitosan microspheres: preparation and characterization. Reactive and Functional Polymers, 2002, v.50(3), 225-232).
Однако этот способ трудоемок, требует использования огнеопасных веществ и пригоден лишь для получения крупных частиц, что снижает эффективность их использования, т.к. микрочастицы имеют меньшее соотношение поверхность/вес, чем наночастицы.
3
4
Ближайшим аналогом настоящего изобретения является способ получения композитных гранул на основе хитозана для применения в медицине с целью иммобилизации биологических объектов. Метод включает следующие стадии: 1) получение магнетита (FeO) добавлением аммиака к раствору солей Fe(3+) и Fe(2+); 2) диспергирование полученного магнетита в спирте; 3) добавление уксуснокислого производного хитозана и диспергирование его под действием ультразвука; 4) отделение и промывание композиции и в итоге получение нанометровых гранул хитозанового магнитного композита для медицинских применений. (CN 101129339 (А), A61K 9/16, опубл. 2008-02-27).
Однако данный способ обладает рядом существенных недостатков, таких как: а) по данному способу частицы магнетита покрывают стабилизатором (хитозаном) только с поверхности с содержанием хитозана в композите не более 2% по весу; б) в результате низкого содержания стабилизатора устойчивость композита недостаточна для многоразового использования; в) стабилизирующий поверхностный слой неоднороден и разрушается под действием кислот и окислителей; г) отсутствие стабилизатора внутри композита приводит к его высокой удельной плотности по отношению к плотности физиологических водных растворов и быстрому самоосаждению частиц композита из водных сред, что вызывает отсутствие необходимости для таких быстроосаждающихся частиц обладать магнитными свойствами; д) отсутствие активных групп на поверхности гранул.
Предлагаемое изобретение решает задачу создания устойчивых наночастиц магнетита стабилизированных биосовместимым полимером, пригодных для многоразового использования.
Поставленная задача решается способом получения композитных наночастиц магнетита стабилизированных биосовместимым полимером, имеющим доступные функциональные формильные группы, включающим получение магнетита из смеси солей двух- и трехвалентного железа, адсорбированного в полимерных матрицах с последующей модификацией полимера. Новизна способа заключается в том, что получение магнетита, адсорбированного в полимерных матрицах, осуществляют совместным осаждением в щелочной среде смеси солей двух- и трехвалентного железа и по крайней мере одного полимера, выбранного из ряда: хитозан, поливиниловый спирт, сополимер блоксополимер полистирола и полиэтиленоксида, так, чтобы получить композитные частицы с весовым содержанием полимеров от 4 до 46 вес.%, после чего полученный композит диспергируют и осуществляют его модификацию глутаровым альдегидом, при этом все операции проводят при непрерывном ультразвуковом воздействии. Под понятием «композит» здесь мы понимаем магнетит, влючающий указанные полимеры как во внутренней свой части, так и на внешней поверхности.
Для получения конечного продукта с наибольшей удельной намагниченностью весовое содержание полимеров в исходной смеси составляет от 4 до 18 вес.%.
Совместное осаждение смеси солей двух- и трехвалентного железа и полимера в щелочной среде с восстановлением солей железа до магнетита позволяет упростить технологию получения частиц магнетита, стабилизированных полимерной матрицей с одновременным повышением их устойчивости.
При этом предпочтительным условием осаждения является применение водного раствора аммиака, что позволяет использовать легко отделяемые щелочные растворы.
Технический результат, достигаемый выполнением предлагаемого способа, позволяет решить поставленную задачу за счет:
1) получения активированных частиц композита, способных ковалентно связывать биологически активные вещества и аффинные лиганды за счет присутствия реакционноспособных формильных групп как на поверхности, так и в массе композита;
2) снижения удельной плотности композита и достижения его повышенной стабилизации в водных средах;
3) повышения устойчивости композитных частиц в процессах многоразового использования.
Предлагаемым способом указанные эффекты достигаются за счет синергетического воздействия одного или двух полимеров, из перечисленного ряда, включаемых в композитные частицы полимер/магнетит, и позволяют создать внутреннюю структуру композита, обеспечивающую стабильность магнетита во времени. Такой эффект невозможно было предсказать из ранее известных в научной литературе сведений и патентных данных. Обработка глутаровым альдегидом позволяет как закрепить внутреннюю структуру композита, так и химически связать полимеры в композите ковалентными связями и обеспечить наличие реакционноспособных формильных групп на поверхности частиц.
-1
-1
-1
-1
При взаимодействии композита с глутаровым альдегидом происходит одновременная модификация и сшивка полимерного слоя по гидроксильным и аминогруппам. Наличие перечисленных в предлагаемом изобретении полимеров и альдегидных групп в комплексе подтверждается методом ИК-спектроскопии. Так, в ИК-спектре композита присутствуют наиболее сильные полосы поглощения 593-595 нм, отнесенные к магнетиту, а также сильные полосы в области 1036-1149 см, характерные для С-О-С колебаний фрагментов 1,4-полисахаридов, полоса 1641 см (амид II). В ИК - спектре модифицированного глутаровым альдегидом композита, кроме вышеуказанных полос поглощения, содержалась интенсивная полоса 1659 см, характерная для алифатических оснований Шиффа, и полоса при 1713 см (С=O), характерная для алифатических альдегидов.
Образующиеся альдегидные (формильные) группы количественно определены методом, основанным на использовании меркаптоэтанола. Метод определения содержания альдегидных групп в композите с использованием меркапроэтанола основан на известной количественной реакции альдегидных групп с меркапроэтанолом в водной среде по реакции:
2
2
2
2
-СНО+HSCHCHOH→-CH(OH)SCHCHOH
Для анализа полученного продукта отбирают 3 пробы по 2 мл дисперсии. К первой порции добавляют 0,1 мл меркаптоэтанола, выдерживают 1 час, а затем отмывают водой, собирая с помощью постоянного магнита. Затем этот продукт и две другие порции дисперсии высушивают сначала лиофильно, а затем в вакууме 1-2 мм рт.ст. при температуре 60°С. В первой порции определяют содержание серы элементным анализом. Содержание серы непосредственно коррелирует с содержанием альдегидных групп. Во второй порции определяют содержание твердого остатка весовым методом и углерода, железа и азота методом элементного анализа. Состав композита рассчитывают по данным элементного анализа.
3
Магнитные свойства образцов исследовали с помощью вибрационного магнитометра типа Фонера. Удельная намагниченность композита составляла от 47 до 70 гаусс·см/г (см. таблицу 1).
На фиг.1 приведено изображение просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) частиц магнетита, адсорбированных в матрице хитозана.
На фиг.2 приведено изображение ПЭМ частиц магнетита, адсорбированных в матрице смесь хитозана и блоксополимера полистирола и полиэтиленоксида.
В таблице приведены свойства композита в зависимости от состава исходных компонентов.
Приведенные примеры подтверждают, но не исчерпывают предлагаемое изобретение.
Пример 1. Получение наночастиц магнетита, стабилизированных хитозаном.
2
4
3
2
4
2
Растворяют 1,4 г Fe(SO)·9HO и 0,9 г FeSO·12HO в 25 мл деионизованной воды и добавляют 1,2 мл 2% раствора хитозана. Затем добавляют избыток концентрированного аммиака. После этого собирают магнитный композит и промывают его водой, собирая с помощью постоянного магнита.
Образовавшийся композит обрабатывают водным раствором глутарового альдегида и снова отмывают, собирая частицы композита с помощью постоянного магнита. Все операции проводят при непрерывном ультразвуковом воздействии с частотой 22 кГц.
На фиг.1 изображены с помощью ПЭМ частицы магнетита, адсорбированные в матрице хитозана. Как видно на фиг.1, частицы магнетита, адсорбированные в матрице хитозана, слабо агрегированы между собой, имеют достаточно узкую дисперсию и размеры частиц магнетита составляют 5-10 нм.
3
Содержание альдегидных (формильных) групп в композите составляет 4 мкмоль/мг, удельная намагниченность композита 69,0 гаусс·см/г.
В таблице приведены данные об изменении свойства композита в зависимости от состава исходных компонентов.
Как видно из приведенных в таблице данных, удельная намагниченность композитов магнетита показывает, что она снижается при увеличении содержания полимеров и снижении содержания магнетита в комплексе. Для получения наибольшей удельной намагниченности поверхностную модификацию магнетита надо проводить с уменьшенным количеством полимеров (4-18%). Композиты с увеличенным содержанием полимеров также могут найти свое применение, т.к. они обладают более высоким содержанием функциональных групп и большей устойчивостью. Однако превышение содержания полимеров в композите выше 46%, хотя и повышает содержание формильных групп, но одновременно приводит к неприемлемому снижению магнитной восприимчивости и уменьшению устойчивости композита.
Пример 2. Получение наночастиц магнетита, стабилизированных хитозаном и поливиниловым спиртом.
2
4
3
2
4
2
Растворяют 1,4 г Fe(SO)·9HO и 0,9 FeSO·12HO в 25 мл деионизованной воды и добавляют 0,6 мл 2% раствора хитозана и 0,6 мл 2% раствора поливинилового спирта. Затем добавляют избыток концентрированного аммиака. После этого собирают магнитный композит и промывают его водой, собирая с помощью постоянного магнита.
Образовавшийся композит обрабатывают водным раствором глутарового альдегида и снова отмывают, собирая частицы композита с помощью постоянного магнита.
Все операции проводят при непрерывном ультразвуковом воздействии с частотой 22 кГц.
3
Содержание альдегидных (формильных) групп в композите составляет 4 мкмоль/мг, удельная намагниченность композита 70,0 гаусс·см/г.
Пример 3. Получение наночастиц магнетита, стабилизированных хитозаном и блоксополимером полистирола и полиэтиленоксида.
2
4
3
2
4
2
Растворяют 1,4 г Fe(SO)·9HO и 0,9 г FeSO·12HO в 25 мл деионизованной воды и добавляют 1,2 мл 2% раствора хитозана и 4,2 мл 2% раствора блоксополимера полистирола и полиэтиленоксида. Затем при одновременном воздействии ультразвука добавляют избыток концентрированного аммиака. После этого собирают магнитный композит и промывают его водой, собирая с помощью постоянного магнита.
Образовавшийся композит обрабатывают водным раствором глутарового альдегида и снова отмывают, собирая частицы композита с помощью постоянного магнита.
Все операции проводят при непрерывном ультразвуковом воздействии с частотой 22 кГц.
На фиг.2 изображены с помощью ПЭМ частицы магнетита, адсорбированные в матрице смесь хитозана и блоксополимер полистирола и полиэтиленоксида. Как видно на фиг.2, частицы магнетита, адсорбированные в матрице хитозана и блоксополимер полистирола и полиэтиленоксида, имеют размеры от 5 до 10 нм и некоторые достигают величины 20 нм.
3
Содержание альдегидных (формильных) групп в композите составляет 9 мкмоль/мг, удельная намагниченность композита 47,0 гаусс·см/г.
Пример 4. Получение наночастиц магнетита, стабилизированных поливиниловым спиртом.
2
4
3
2
4
2
Растворяют 1,4 г Fe(SO)·9HO и 0,9 г FeSO·12НО в 25 мл деионизованной воды и добавляют 5,4 мл 2% раствора поливинилового спирта. Затем добавляют избыток концентрированного аммиака. После этого собирают магнитный композит и промывают его водой, собирая с помощью постоянного магнита.
Образовавшийся композит обрабатывают водным раствором глутарового альдегида и снова отмывают, собирая частицы композита с помощью постоянного магнита.
Все операции проводят при непрерывном ультразвуковом воздействии с частотой 22 кГц.
3
Содержание альдегидных (формильных) групп в композите составляет 9,5 мкмоль/мг, удельная намагниченность композита 47,2 гаусс·см/г.
Пример 5 Получение наночастиц магнетита, стабилизированных блоксополимером полистирола и полиэтиленоксида.
2
4
3
2
4
2
Растворяют 1,4 г Fe(SO)·9HO и 0,9 г FeSO·12HO в 25 мл деионизованной воды и добавляют 10,4 мл 2% раствора блоксополимера полистирола и полиэтиленоксида. После этого собирают магнитный композит и промывают его водой, собирая с помощью постоянного магнита.
Образовавшийся композит обрабатывают водным раствором глутарового альдегида и снова отмывают, собирая частицы композита с помощью постоянного магнита.
Все операции проводят при непрерывном ультразвуковом воздействии с частотой 22 кГц.
3
Содержание альдегидных (формильных) групп в композите составляет 2 мкмоль/мг, удельная намагниченность композита 37,0 гаусс·см/г.
Дальнейшее увеличение содержания данного полимера приводит к снижению удельной намагниченности.
Как видно из приведенных примеров при сравнении с прототипом, устойчивость композита, изготовленного по предлагаемому нами способу, резко возрастает (в 4-40 раз), а содержание функциональных формильных групп в 2-12 раза.
Способ получения наночастиц магнетита, стабилизированных биосовместимым полимером, имеющим функциональные формильные группы
Масса полимера, вес.%
Масса Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>, вес.%
Содержание формильных групп, мг-экв/г
Устойчивость композита, сутки
Удельная намагниченность насыщения, 20°С, гаусс·см<sup>3</sup>/г
2 (прототип)
98
0
0,25
71,0
4
96
4,5
1
69,0
4
96
4,5
1
70,0
18
82
10,0
5
46,3
18
82
9,0
5
47,0
18
82
9,5
6
47,2
36
64
2,0
10
37,0
46
56
2,5
15
27,7
50
50
2,7
10
19,0