Способ выявления структурных перестроек генома опухолевых клеток (химерных генов), определяющих выбор терапии и прогноз при острых лейкозах у детей, с использованием ОТ-ПЦР и последующей гибридизацией с олигонуклеотидным биологическим микрочипом (биочипом)
METHOD FOR DETECTION OF STRUCTURAL REARRANGEMENTS OF TUMOR CELLS (CHEMERIC GENES) GENOME, DETERMINING SELECTION OF THERAPY AND PREDICTION IN ACUTE LEUKOSIS IN CHILDREN, USING OT-PCR AND SUBSEQUENT HYBRIDIZATION WITH OLIGONUCLEOTIDE BIOLOGICAL MICROCHIP (BIOCHIP)

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области генетики, молекулярной биологии и медицины и касается выявления структурных перестроек генома опухолевых клеток (химерных генов), определяющих выбор терапии и прогноз при острых лейкозах у детей, с использованием обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) и последующей гибридизацией с олигонуклеотидным биологическим микрочипом (биочипом).
Уровень техники
Известен ряд способов определения структурных перестроек генома опухолевых клеток, в которых используются различные подходы.
Цитогенетический анализ определяет различные структурные изменения генома, включая изменения числа хромосом, однако обладает низким разрешением, не способен выявлять скрытые (криптические) перестройки, не дает возможности установить молекулярную природу перестроенного участка. Метод заключается в окраске в очень кислой среде краской Гимзы (Giemsastain), в результате чего хромосомы приобретают специфическое неравномерное окрашивание в виде полос, которые принято называть G-бэндами. Каждая пара хромосом имеет свое специфическое окрашивание, которое изменяется в случае хромосомных аберраций (делеции, транслокации, инверсии). Несмотря на ограничения в аналитической чувствительности и доступности делящихся клеток в клиническом образце, этот метод продолжает предоставлять ценную информацию о перемещениях, а также числовые изменения в числе хромосомы и структуре [Fluorescence immunophenotypic and interphase cytogenetic characterization of nodal lymphoplasmacytic lymphoma./ Sargent RL, Cook JR, Aguilera NI, Surti U, Abbondanzo SL, Gollin SM, Swerdlow SH.// Am J Surg Pathol. - 2008 - Vol. 32. - P. 1643-53.; Chromosomal aberrations in childhood acute lymphoblastic leukemia: 15-year single center experience/ Jarosova M, Volejnikova J, Porizkova I, Holzerova M, Pospisilova D, Novak Z, Vrbkova J, Mihal V.//Cancer Genet. - 2016 – Vol. 209 - Р. 340-7].
С помощью FISH (флуоресцентной гибридизации insitu) возможно определение нормальной или аномальной локализации гена, числа его копий, а также структурных перестроек хромосомного аппарата опухолевой клетки. Зонд, меченный биотином или непосредственно флуоресцентным красителем, наносят на образец интерфазных клеток или метафазных пластинок, иммобилизованных на подложке или в твердом субстрате. Ядерную ДНК иммобилизованных клеток и меченный зонд предварительно денатурируют, далее происходит ренатурация последовательности ДНК ядра и зонда и образование гибридных дуплексов, в том случае если в ДНК ядра или хромосом имеется комплементарная зонду последовательность. Не полностью связанный и некомплементарный меченый зонд удаляют интенсивным промыванием препарата. Метод FISH является одним из базовых методов в молекулярной диагностике лейкозов. С помощью этого метода можно обнаружить криптические транслокации, что является его преимуществом по сравнению с цитогенетическим методом. Более высокая разрешающая способность позволяет выявлять изменения на субмикроскопическом уровне, например, определять делеции или амплификации участков хромосом, содержащих несколько генов, или даже один ген [Cytogenetic abnormalities detected by fluorescence in situ hybridization on paraffin-embedded chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic lymphoma lymphoid tissue biopsy specimens./ Flanagan MB, Sathanoori M, Surti U, Soma L, Swerdlow SH.// Am J Clin Pathol. - 2008. - Vol. 130. - P. 620-7.; Soszynska K, Mucha B, Debski R, Skonieczka K, Duszenko E, Koltan A, Wysocki M, Haus O. The application of conventional cytogenetics, FISH, and RT-PCR to detect genetic changes in 70 children with ALL.Ann Hematol. 2008 Dec; 87(12):991-1002]. К недостаткам метода относится невозможность точного определения места слияния генов, необходимость в дорогостоящем оборудовании и расходных материалах, высокие требования к специалистам-исследователям.
Использование нескольких флуоресцентных меток одновременно позволяет проводить многоцветную гибридизацию и определять широкий спектр хромосомных перестроек в одной клетке. Этот подход получил название спектрального кариотипирования (SKY, spectralcaryotyping) и удобен при анализе пациентов, имеющих сложный кариотип с множественными аберрациями [Betts DR, Stanchescu R, Niggli FK, Cohen N, Rechavi G, Amariglio N, Trakhtenbrot L. SKY reveals a high frequency of unbalanced translocations involving chromosome 6 in t(12;21)-positive acute lymphoblastic leukemia. Leuk Res. 2008. 32(1):39-43].
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) широко используется для выявления химерных генов при диагностике острых лейкозов. Сущность метода заключается в многократном избирательном увеличении определенного участка нуклеиновой кислоты. Существует большое количество методов обнаружения химерных генов, основанных на ПЦР. Анализ последовательностей химерных генов можно проводить как на уровне ДНК, так и на уровне РНК.
Для определения уникальных для пациента мест разрывов на уровне геномной ДНК используется длинная инвертированная ПЦР (LDI-PCR). Метод применяется в том случае, когда известен один из генов, вовлеченных в перестройку. Геномную ДНК фрагментируют с помощью рестриктаз, полученные фрагменты сшивают в кольцо и проводят серию ПЦР с различными праймерами, специфичными для разных участков известного гена. Секвенирование полученных ПЦР-продуктов позволяет идентифицировать второй ген-партнер [Meyer С, Schneider В, Reichel М, Angermueller S, Strehl S, Schnittger S, Schoch C, Jansen MW, van Dongen JJ, Pieters R, Haas OA, Dingermann T, Klingebiel T, Marschalek R. Diagnostic tool for the identification of MLL rearrangements including unknown partner genes. ProcNatlAcadSciUSA2005; 102(2):449-54]. С одной стороны, этот метод открывает возможности для очень специфичного анализа характерной для данного пациента перестройки. С другой стороны, такой анализ является трудоемким, длительным, требует высококвалифицированного персонала и не подходит для рутинной диагностики.
Для определения химерных генов широко применяют обратную транскрипцию-полимеразную цепную реакцию (ОТ-ПЦР). Суть метода заключается в выявлении химерной РНК в опухолевых клетках на основе ее перевода с кДНК с помощью реакции обратной транскрипции. Химерная кДНК далее может быть амплифицирована в стандартной ПЦР реакции со специфическими к данной перестройке праймерами [Detection of minimal residual disease in acute myelomonocytic leukemia with abnormal marrow eosinophils by nested polymerase chain reaction with allele specific amplification./  J, Cayuela JM, Daniel MT, Berger R, Sigaux F.// Blood. - 1994. - Vol. 84. - P. 2291-2296]. В американском патенте US 20120171670 (дата публикации 2012-07-05) применяют гнездовую ПЦР амплификации области 195INS BCR-ABL1 и 243INS BCRABL1. Полученный фрагмент экстрагируют из геля, очищают и секвенируют.
В диагностике хромосомных перестроек используют ОТ-ПЦР в реальном времени. Суть метода состоит в регистрации классической S-образной кривой накопления амплифицируемого продукта, в случае наличия соответствующей матрицы, содержащей транслокацию. Отсутствие S-образной кривой свидетельствует об отсутствии соответствующей химерной матрицы [Novel real-time polymerase chain reaction assay for simultaneous detection of recurrent fusion genes in acute myeloid leukemia./ Dolz S,  E, Fuster  Llop M, Cervera J, Such E, De Juan I, Palanca S, Murria R, Bolufer P, Luna I, Gomez I,  M,  M, Sanz MA.// J Mol Diagn. - 2013. - Vol. 5. - P. 678-686.9]. Преимуществом метода является быстрота получения результата, высокая чувствительность, недостатком - малопараметричность. Иными словами, для получения информации, необходимо поставить отдельные тесты с праймерами к каждой транслокации и большинству мест перестройки. Метод в большей степени подходит для подтверждения и определения более точной локализации уже обнаруженной другими методами транслокации, а также для отслеживания рецидивов (MRD, minimal residual disease, минимальная остаточная болезнь).
Различные варианты постановки ПЦР в реальном времени описаны в ряде патентов. Китайский патент CN 102251031 (дата публикации 2013-07-24) основан на применении TaqMan MGB probe для определения ряда химерных генов: AML1-ETO, BCR-ABL190, BCR-ABL210, CBFb-MYH11(A), CBFb-MYH11(D), CBFb-MYH11(E), Е2А-РВХ1, MLL-AF4, PML-RARa (bcr1), PML-RARa(bcr2), PML-RARa(bcr3), SIL-TAL1 and TEL-AML1. В китайском патенте CN 102827937 (дата публикации 2014-03-19) описан метод для определения транслокаций в генах BCR-ABL, AML1-ETO и PML-RARa, а в CN 102925558 (дата публикации 2014-09-17), французском ЕР2204457 (дата публикации 2010-07-07) и корейском KR 1020060000840 (дата публикации 2014-09-17) только гена PML-RARA. Такое большое количество тест-систем, основанных на методе ПЦР в реальном времени, объясняется тем, что данный метод достаточно прост в освоении, часто не требует дополнительных навыков, но для его осуществления требуется приобретение дорогостоящего оборудования.
В исследованиях природы рака для анализа свойств опухолевых клеток и классификации опухолей широкое применение нашли микрочипы [A diagnostic biochip for the comprehensive analysis of MLL translocations in acute leukemia./ Maroc N, Morel A, Beillard E, De La Chapelle AL, Fund X, Mozziconacci MJ, Dupont M, Cayuela JM, Gabert J, Koki A, Fert V, Hermitte F.//Leukemia.l - 2004. - Vol. 18. - P. 1522-1530; Development of a biochip-based assay integrated in a global strategy for identification of fusion transcripts in acute myeloid leukemia: a work flow for acute myeloid leukemia diagnosis./ Giusiano S1, Formisano-Treziny C, Benziane A, Maroc N, Picard C, Hermitte F, Taranger-Charpin C, Gabert J.// International Journal of Laboratory Hematology. - 2010. - Vol. 32. - P. 398-409.; A pipeline with multiplex reverse transcription polymerase chain reaction and microarray for screening of chromosomal translocations in leukemia./ Xiong FF, Li BS, Zhang CX, Xiong H, Shen SH, Zhang QH.// BioMed Research International. - 2013. - Vol. 2013].
Опубликовано несколько патентов и патентных заявок, в которых приведены различные технологии гибридизации с биочипами. Например, в американском патенте US 20030198977 (дата публикации 2003-10-23) разработан метод определения хромосомных транслокаций с образованием химерных генов E2A-Pbx1, MLL-AF4, AML1-ЕТО, BCR-ABL (P190), BCR-ABL1 (Р210), TEL-AML1, PML-RARA, CBFB-MYH11, SIL-TAL1 в единой реакционной смеси с использованием микрочипов. В китайском патенте CN 101955991 (дата публикации 2014-05-28) и патентной заявке WO 2011120398 (дата публикации 2011-10-06) ПЦР-продукты химерных генов, связанных с лейкемией, гибридизуют со смесью зондов для обнаружения флуоресцентных сигналов.
Гелевые биочипы, которые давно и успешно разрабатываются в Лаборатории биологических микрочипов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, являются примером диагностических микрочипов низкой плотности. Метод гибридизации с аллель-специфическими олигонуклеотидами включает амплификацию фрагментов ДНК и последующую гибридизацию флуоресцентно меченой ДНК мишени с аллель-специфичными олигонуклеотидами [Т.V. Nasedkina, V.S. Zharinov, Е.A. Isaeva et al., "Clinical Screening of Gene Rearrangements in Childhood Leukemia by Using a Multiplex Polymerase Chain Reaction-Microarray Approach," Clinical Cancer Research, vol. 9, no. 15, pp. 5620-5629, 2003.].
Используя метод ultra high-throughput sequencingChromPET в американском патенте US20120178635 (дата публикации 2012-07-12), выявляли хромосомные аберрации BCR-ABL1. Анализ обладает хорошей чувствительностью и специфичностью, но для его осуществления требуется приобретение дорогостоящего оборудования, расходных материалов и реактивов. В патентной заявке WO 1994026930 (дата публикации 1994-11-24) используют Northern и Southern блот для идентификации AF-9, AF-4, AF-6, AF-17. Данная технология не дешевая, трудоемкая и требует высокой квалификации персонала.
Раскрытие изобретения
Задача настоящего изобретения состоит в создании способа выявления структурных перестроек генома опухолевых клеток. Сущность изобретения заключается в обеспечении способа выявления хромосомных транслокаций в образцах костного мозга или периферической крови, которые приводят к образованию химерных генов и определяют выбор терапии и прогноз при острых лейкозах. Данный способ позволяет выявлять 22 хромосомные транслокации, которые являются наиболее информативными маркерами, определяющими различные подтипы заболевания, выбор терапии и прогноз у детей с острыми лейкозами.: ETV6/RUNX1; BCR/ABL1p210; MLL/AFF1; BCR/ABL1p190; PML/RARA; RUNX1/RUNX1T1; TCF3/PBX1; MLL/MLLT3; CBFB/MYH11; MLL/MLLT10; MLL/MLLT1; SIL/TAL1; MLL/MLLT4; NPM1/ALK; TCF3/HLF; MLL/ELL; MLL/EPS15; PICALM/MLLT10; MLL/MLLT11; DEK/NUP214; RBM15/MKL1; FUS/ERG.
Основными признаками данного изобретения являются ОТ-ПЦР с последующей ПЦР и гибридизацией на биочипе, содержащем набор иммобилизованных олигонуклеотидных зондов.
Первый важный признак изобретения - смесь специфических праймеров для обратной транскрипции, которая используется для получения кДНК на матрице РНК, выделенной из костного мозга или периферической крови пациента. Последовательность праймеров для обратной транскрипции приведена в табл. 1 и Перечне последовательностей (SEQ ID NO: 1-25).
Второй важный признак изобретения - праймеры для специфичной амплификации последовательностей химерных генов, с помощью которых флуоресцентно меченый ПЦР-продукт нарабатывается только при наличии химерного транскрипта в образце. ПЦР осуществляется в 4 отдельных мультиплексных реакциях. Последовательности праймеров для проведения ПЦР приведены в табл. 2 и Перечне последовательностей (SEQ ID NO: 26-75).
Третий важный признак изобретения - биочип, содержащий набор иммобилизованных олигонуклеотидных зондов, высоко специфичных и комплементарных участкам химерных генов, в том числе и в местах слияния генов. Последовательности зондов приведены в табл. 3 и Перечне последовательностей (SEQ ID NO: 76-138). Олигонуклеотидные зонды иммобилизуются в ячейках гидрогелевого микрочипа, как описано в патенте RU 2206575 (дата публикации 2003-06-20) в концентрации 4000 мкМ. Схема расположения зондов в ячейках биочипа для выявления структурных перестроек генома опухолевых клеток (химерных генов) приведена на Фиг. 1.
Смеси специфических праймеров для обратной транскрипции, комплементарных 3'-участкам исследуемых химерных генов используются для получения кДНК на матрице РНК, выделенной из образцов костного мозга или периферической крови. Набор праймеров для ПЦР используется для амплификации интересующих фрагментов с одновременным флуоресцентным мечением продукта. Далее проводится гибридизация флуоресцентно меченных фрагментов ДНК, полученных в ходе ПЦР, с иммобилизованными в ячейках геля олигонуклеотидными зондами, расположенными на пластиковой подложке. После проведения гибридизации и отмывки биочипа проводится анализ полученной флуоресцентной картины, на основании которого делается вывод о наличии химерного гена в исследуемом образце. Примеры картин гибридизации приведены на Фиг. 2.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Схема биочипа для выявления структурных перестроек генома опухолевых клеток (химерных генов): (а) схема расположения ячеек на биочипе; (б) расшифровка условных обозначений. В угловых позициях нанесены ячейки (М), содержащие флуоресцентный краситель Су5, светящийся перманентно, для ориентировки и контроля интенсивности свечения.
Фиг. 2. Гибридизационные картины, полученные с помощью биочипа для выявления структурных перестроек генома опухолевых клеток (химерных генов). А - образец с транслокацией t(8;21) RUNX1/RUNX1T1; Б - контрольный образец, не несущий транслокацию.
Осуществление изобретения
Для обеспечения оптимальных условий обратной транскрипции и ПЦР необходимо использовать специфические праймеры, отжиг которых на мишени происходит при одинаковой температуре (для каждого этапа), и они не образуют при этой температуре вторичных структур. Для оптимальной наработки необходимого для гибридизации на биочипе количества флюоресцентно-меченого ПЦР-продукта должны быть подобраны такие параметры как концентрации реагентов, состав мультиплексных реакций, временной и температурный режим обратной транскрипции и ПЦР. В результате проведенной работы подобраны праймеры для ОТ, условия ПЦР, которые позволяют осуществлять эффективную специфическую наработку фрагмента, соответствующего последовательностям химерных генов.
Олигонуклеотиды для иммобилизации на биочипе подбираются таким образом, чтобы идентифицировать все выбранные для анализа химерные гены.
При дизайне ДНК-зондов руководствовались следующими принципами:
1) последовательность зонда выбирали комплементарной «плюс» или «минус» - цепи ДНК, нарабатывающейся в ходе асимметричного этапа ПЦР, в зависимости от того, с какого праймера (прямого или обратного) было целесообразно проводить ассиметричную ПЦР;
2) при выборе структур избегали стабильных вторичных структур - шпилек и димеров, т.к. их присутствие снижает эффективность гибридизации;
3) выбранная последовательность не должна быть комплементарной другим областям ПЦР-продукта, кроме целевой, либо другим ПЦР-продуктам, нарабатывающимся в мультиплексной ПЦР.
На биочипе для выявления структурных перестроек генома опухолевых клеток (химерных генов) иммобилизовано 63 высокоспецифичных олигонуклеотидных зондов (табл. 2 и Перечень последовательностей (SEQ ID NO: 76-138)), структура которых обеспечивает специфичное связывание с полностью комплементарными ДНК-мишенями. Зонды подобраны таким образом, что флюоресцентный сигнал наблюдается только в ячейках, с которых образовался совершенный дуплекс между олигонуклеотидным зондом и флюоресцентно-меченым ПЦР-продуктом.
Приведем последовательность анализа с использованием данного метода. Обратная транскрипция на матрице РНК для получения кДНК проводится со смесью специфических праймеров с использованием обратной транскриптазы вируса лейкемии мышей Молони (Moloney Murine Leukemia Virus) - MMLV различных производителей. Наработка флюоресцентно меченных ПЦР-продуктов для последующей гибридизации на биочипе проводится посредством ПЦР, при этом в качестве матрицы для проведения реакции используется кДНК, полученная на этапе обратной транскрипции.
ПЦР может быть проведена с использованием любого вида термостабильной полимеразы (Taq-полимераза, Tth-полимераза, Tf1-полимераза, Pfu-полимераза, Vent-полимераза, DeepVent-полимераза и другие коммерчески доступные ферменты, выделенные из термофилов), работающей в соответствующем буфере. Для построения новой цепи в буфер добавляется смесь дНТФ (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ), при этом вместо дТТФ может быть использован дУТФ. Для проведения ПЦР могут быть использованы готовые коммерчески доступные наборы, содержащие все необходимые компоненты за исключением праймеров, например QIAGEN Multiplex PCR Kit.
На этапе ПЦР проходит амплификация ДНК-локусов, соответствующих только химерной кДНК. ПЦР проходит в 2 стадии: на первой амплификация целевых продуктов осуществляется с использованием комбинированных праймеров, состоящих из участка, комплементарного последовательности химерного гена, и короткой универсальной вставки на 5'-конце, на второй стадии в работу вступают универсальные праймеры, последовательности которых соответствует последовательностям универсальных вставок. ПЦР осуществляется в 4 мультиплексных реакциях. В мультиплексе №1 содержатся праймеры для выявления транслокаций MLL/AFF1; MLL/MLLT4; MLL/ELL; MLL/MLLT1; CBFB/MYH11 (SEQ ID NO: 26-35), в мультиплексе №2 - праймеры для контрольного гена ABL1 и праймеры для транслокаций MLL/MLLT10; PICALM/MLLT10; SIL/TAL1; DEK/NUP214; TCF3/HLF (SEQ ID NO: 36-51), в мультиплексе №3 - праймеры для транслокаций ETV6/RUNX1; BCR/ABL1p210; BCR/ABL1p190; PML/RARA; RUNX1/RUNX1T1; TCF3/PBX1 (SEQ ID NO: 52-63), в мультиплексе №4 - праймеры для транслокаций MLL/MLLT3; NPM1/ALK; MLL/EPS15; MLL/MLLT11; RBM15/MKL1; FUS/ERG (SEQ ID NO: 26-28, 64-73). Помимо локус-специфичных праймеров все мультиплексы содержат универсальные праймеры Т3 и Т7 (SEQ ID NO: 74-75) в ассиметричном соотношении (например, 1:50) для преимущественной наработки одноцепочечного продукта. В качестве флуоресцентной метки используется Су5-дУТФ, встраивающийся de novo в синтезируемую ДНК-цепь. В качестве флуоресцентной метки также может быть использован любой флуорохром без ограничения (например, FITC, Texas red, Су-3 и т.д.), а также биотин.
Для синтеза праймеров и олигонуклеотидных зондов используют такие химические подходы как фосфодиэфирный метод, гидрофосфорильный метод и т.д., при этом наиболее распространенным в настоящее время является фосфоамидитный синтез. Синтез праймеров осуществляется на автоматических ДНК/РНК синтезаторах, например производства фирмы «Applied Biosystems» (США). Олигонуклеотидные зонды модифицируются путем добавления к 5'- или 3'-концу активной группы, обеспечивающей иммобилизацию, в астоматическом или постсинтетически в ручном режиме. Например, при синтезе олигонуклеотидных зондов с помощью 3'-Amino-Modifier С7 CPG 500 («Glen Research)), США) на 3'-конец олигонуклеотидов вводится спейсер со свободной аминогруппой, используемый для последующей иммобилизации олигонуклеотида на биочипе.
Далее проводится гибридизация флуоресцентно меченных фрагментов ДНК, полученных в ходе ПЦР, с иммобилизованными в ячейках геля олигонуклеотидами, которые представляют собой участки, соответствующие последовательностям участков химерных генов.
Гибридизация ПЦР-продукта с олигонуклеотидными зондами на биочипе может быть проведена в любом гибридизационном буфере, например в гуанидиновом или SSPE-буфере. Перед постановкой гибридизации ПЦР-продукт прогревают при 95°С в течение 5 мин., затем охлаждают на льду в течение 2 минут, после чего наносят гибридизационную смесь на биочип. Гибридизация проводится 8-14 ч. при 37°С. Отмывка биочипа после проведения гибридизации может быть проведена в любом известном в данной области техники буфере с добавлением соли (SSC, SSPE и т.п.) или более короткое время в дистиллированной воде [Molecular cloning: a laboratory manual / J.F. Sambrook, D.W. Russell // Cold Spring Harbor Laboratory Press. - 2001].
ПЦР-продукт, нанесенный в гибридизационную камеру биочипа, в условиях (состав реакции, время и температура), при которых осуществляется гибридизация, образует совершенные дуплексы только с комплементарными ему олигонуклеотидными зондами. Сигнал флюоресценции детектируется только в ячейках, в которых образовался совершенный дуплекс. Таким образом, при наличии в образце химерного гена, происходит его амплификация в ходе ПЦР и специфичная гибридизация с зондами на биочипе.
После проведения гибридизации и отмывки биочипа проводится визуализация результатов гибридизации с помощью любой детектирующей системы, возбуждающей флюоресценцию и распознающей флуоресцентный сигнал (флуоресцентный микроскоп с ПЗС-камерой, лазерный сканер, портативный анализатор биочипов и т.п. коммерчески доступные флуоресцентные анализаторы, например, портативный анализатор биочипов, снабженный ПЗС-камерой и специальным программным обеспечением, производства ООО «БИОЧИП-ИМБ» (Москва, Россия).
Изготовление биочипов может осуществляться посредством последовательного нанесения на поверхность подложки из стекла ячеек акриламидного геля, активации ячеек и иммобилизации в ячейках модифицированных олигонуклеотидов [Analysis of SNPs and other genomic variations using gel-based chips / A. Kolchinsky, A. Mirzabekov // Hum Mutat. - 2002. - Vol. 19. - P. 343-360. Review]. В качестве подложки кроме стекла может быть использован другой материал, в том числе металл, гибкие мембраны и пластик (Патент RU 2309959, опубликован 2007-11-10). Биочипы также могут быть изготовлены любыми другими известными специалисту в данной области способами [Arrays of immobilized oligonucleotides--ontributions to nucleic acids technology / H. Seliger, M. Hinz, E. Happ // Curr Pharm Biotechnol. - 2003. - Vol.4. - P. 379-395].
Для изготовления биочипа в настоящем изобретении используется набор олигонуклеотидов SEQ ID NO: 76-138, приведенный в Перечне последовательностей, а также в табл. 2. Расположение конкретных олигонуклеотидных зондов на биочипе может варьироваться в зависимости от удобства интерпретации результатов.
Далее приводятся примеры, которые показывают применение способа выявления структурных перестроек генома опухолевых клеток, определяющих выбор терапии и прогноз при острых лейкозах у детей. Следует понимать, что приводимые примеры служат исключительно для иллюстрации и не предназначены для ограничения объема притязаний, выраженных в формуле изобретения. На основании настоящего описания специалист в данной области сможет легко предложить свои варианты и модификации осуществления изобретения, не отходя от общей концепции настоящего изобретения и без привлечения собственной изобретательской деятельности, так что должно быть понятно, что такие варианты и модификации также будут входить в объем притязаний настоящего изобретения.
Пример 1. Амплификация участков химерных генов методом ОТ-ПЦР с целью получения флуоресцентно меченного ПЦР-продукта в количестве, неоходимом для гибридизации на биочипе.
Из костного мозга пацента, больного острым лейкозом, выделяли общую РНК с помощью набора RNeasy MiniKit (Qiagen, США).
2
Проводили обратную транскипцию в объеме 25 мкл. РНК (2 мкг) инкубировали при 70°С в течение 5 мин со смесью специфичных праймеров (по 5 пикомоль каждого праймера на реакцию), затем проводили реакцию с обратной транскриптазой M-MLV («Силекс», Россия) 200 ед. на 25 мкл реакционной смеси, содержащей 25 ед. ингибитора РНКазы («Promega», США), по 1 мМ каждого dNTP («Силекс», Россия), 10 мМ дитиотрейтол, 50 мМТ рис-HCl, рН 8.3, 75 мМ KCl и 3 мМ MgCl при 42°С в течение 90 мин с последующей инактивацией при 70°С в течение 10 мин.
4
2
4
2
Наработку ПЦР-продуктов, соответствующих последовательности контрольного гена ABL1 и исследуемых химерных генов проводили методом ПЦР в 4 реакциях. ПЦР проводили на приборе Dyad («Bio-Rad», США). ПЦР-смесь общим объемом 25 мкл включала в себя: 1×ПЦР-буфер (67 мМ Трис-HCl, рН 8.6, 166 мМ (NH)SO, 0,01% Тритон Х-100), 1.5 мМ MgCl, 0.2 мМ каждого из дНТФ («Силекс», Россия), 1 ед. акт. HotTaq-полимеразы («СибЭнзим», Россия), по 2 пмоль каждого локус-специфичного праймера, праймеры-адаптеры Т3 и Т7 по 1 и 50 пмоль соответственно, 1 мкл кДНК. Амплификацию проводили по следующей схеме: денатурация при 95°С (10 мин); 45 циклов: 94°С (30 с), 62°С (40 с), 72°С (30 с); 40 циклов: 94°С (30 с), 52°С (30 с), 72°С (20 с).
Пример 2. Олигонуклеотидный биочип для выявления структурных перестроек генома опухолевых клеток.
Олигонуклеотиды для иммобилизации на микрочипе синтезируют на автоматическом синтезаторе 394 DNA/RNA Synthesizer («Applied Biosystems», США) с использованием стандартной фосфоамидитной процедуры. 3'-конец олигонуклеотидов содержит спейсер со свободной аминогруппой, который вводят в состав олигонуклеотида при синтезе путем использования 3'-Amino-Modifier С7 CPG 500 («Glen Research)), США). Присоединение флуоресцентной метки к олигонуклеотидам по свободной аминогруппе осуществляют в соответствии с рекомендациями производителя.
Биочип изготовляют методом сополимеризации олигонуклеотида в акриламидном геле, как описано ранее в патентах RU 2309959 (дата публикации 2007-11-10) и RU 2175972 (дата публикации 2001-11-20). Биочип содержит 63 иммобилизованных олигонуклеотидных зонда (SEQ ID NO: 76-138), список которых представлен также в табл.2. Ячейки наносят согласно схеме на Фиг. 1.
Пример 3. Гибридизация меченного продукта на биочипе
Реакционную смесь, полученную после проведения ПЦР, описанного в Примере 1, используют для гибридизации на биочипе. Гибридизационная смесь общим объемом 44 мкл состояла из 6х SSPE («Promega», США), 2М раствора гуанидин-изотиоцианата и амплификата. Гибридизационную смесь денатурировали при 95°С 5 минут, охлаждали во льду 2 минуты, наносили на биочип и оставляли на 12 часов при 37°С. После проведения гибридизации биочип отмывали в 1x SSPE в течение 10 мин при комнатной температуре.
Пример 4. Регистрация и интерпретация результатов гибридизации
Регистрацию гибридизационной картины производят с помощью портативного анализатора биочипов, снабженного ПЗС-камерой, производимого ООО «Биочип-ИМБ». Описание алгоритма автоматического анализа изображения с помощью программы Image Ware™ выходит за рамки настоящего изобретения.
Пример картины гибридизации для образца с транслокацией t(8;21) RUNX1/RUNX1T1 приведен на Фиг. 2 (А). Наблюдается свечение ячеек, соответствующих последовательностям химерного гена RUNX1/RUNX1T1 и в ячейках, соответствующих последовательности контрольного гена ABL1. Пример картины гибридизации для контрольного образца без транслокации приведен на Фиг. 2 (Б). Наблюдается свечение ячеек только контрольного гена ABL1.
Таблица 1.
Последовательности праймеров для обратной транскипции
<b>SEQ ID NO:</b>
<b>Название</b>
<b>Последовательность 5’->3’</b>
1
PBX1:476
GCCACGCCTTC
2
MYH11:1555L12
GTACTGCTGGGT
3
MYH11:2270L13
AGCTGCTTGATGG
4
ORA (ABL)
GGACACACCATAGACAGT
5
AF4:1719L14
CACTGTCACTGTCC
6
AML1A:875L15
CGGTAGCATTTCTCA
7
RARA:698L12
CGGTCGTTTCTCAC
8
ETO:648L12
AGTGGAGTTCACTAG
9
AF9:1541L12
CTATCGCTGCCAT
10
AF9:1910L12
GATGCATCCAGTTGT
11
ELL:454L14
CCAGCCTTGATGAC
12
ENL:138L14
CCTTCTCCACGAAG
13
NPMALK:714L12
CAGCGAACAATGTTC
14
TAL1:690L
TCGTCTCCTTGG
15
AF10:1150L12
ACCTGAGCTGTG
16
AF10:2392L12
CCACTGCCTCTC
17
AF10:750L13
GTAGCCACAGTAT
18
AF6:355L12
CCGATCATCTTT
19
RARA:589
CGGTGACACGTGTAC
20
EPS15
CTGAACAAACAAGAAT
21
AF1q
CTGAAGGTGATGGC
22
DEK/CAN
GAGACACTGTTTAAC
23
FUS/ERG
GCGCTGGGGAGAG
24
RBM15/MKL1
GAGACCTCGGCTG
25
TCF3-HLF
GCCTCGTTCCTG
Таблица 2. Последовательности праймеров для ПЦР
SEQ ID NO:
Название
Последовательность 5’->3’
26
MLL 3964-T7
GTAATACGACTCACTATAGGACCACTCCTAGTGAGCCCAA
27
MLL 4178-T7
GTAATACGACTCACTATAGGTTCCAGCAGATGGAGTCCACA
28
MLL 4252-T7
GTAATACGACTCACTATAGGGGAGGCTTAGGAATCTTGACTTC
29
AF4 1629-T3
AACCCTCACTAAAGGGAGAGTGAGTTTTTGAAGATGTATCATATTGT
30
L-AF6 257-T3
AACCCTCACTAAAGGGAGAGTGAATACTTGGGAGAGGACA
31
ELL 326-T3
AACCCTCACTAAAGGGAGACAGGCAGTCCAGGTGAACTT
32
ENL 121-T3
AACCCTCACTAAAGGGAGAAAGTGCTGGATGTCACATTG
33
CBFB344-T7
GTAATACGACTCACTATAGGGGGCTGTCTGGAGTTTGATG
34
II_Rj1-T3
AACCCTCACTAAAGGGAGAAGCTGCGTCTTCATCTCCTC
35
MYH 1387-T3
AACCCTCACTAAAGGGAGATCCTCGTCCAGCTGGTCTTG
36
ABL Fw-T7
GTAATACGACTCACTATAGGAGAGTGAGAGCAGTCCTGGCCAG
37
ABL Rw-T3
AACCCTCACTAAAGGGAGAGAGACGTAGAGCTTGCCATCAGAA
38
MLL Fw1-T7
GTAATACGACTCACTATAGGACCGCCAAGAAAAGAAGTTCCCA
39
MLL Fw3-T7
GTAATACGACTCACTATAGGCAGCAGATGGAGTCCACAGGAT
40
L-AF10 823-T3
AACCCTCACTAAAGGGAGAGTGAGAGGAAGAATCACTTAAACTTTG
41
L-AF10 1032-T3
AACCCTCACTAAAGGGAGAGCATTTGTAAATCGTGCAGTAGTATCT
42
L-AF10 2327-T3
AACCCTCACTAAAGGGAGAAACTGCTGTTGCCTGGTTGAT
43
PICALM  Fw_B-T7
GTAATACGACTCACTATAGGGGATCTAACTGGCAACCAAAGGT
44
PICALM  Fw_A+C-T7
GTAATACGACTCACTATAGGGAAGTGTTCCTGTAATGACGCAACC
45
SIL_TAL Fw-T3
AACCCTCACTAAAGGGAGAGCGACCCCAACGTCCCAGAGGC
46
SIL_TAL Rw-T7
GTAATACGACTCACTATAGGATGCACACCCGGGTCTTTGCTTTCC
47
DEK_CAN Fw-T3
AACCCTCACTAAAGGGAGACCCCTACAGATGAAGAGTTAAAGGAAA
48
DEK_CAN Rw-T7
GTAATACGACTCACTATAGGAACATCATTCACATCTTGGACAGCAA
49
E2A_HLF_ex12 Fw-T3
AACCCTCACTAAAGGGAGAACACGCTGCTGCCTGGCCACGG
50
E2A_HLF_ex13 Fw-T3
AACCCTCACTAAAGGGAGATCATGCACAACCACGCGGCCCT
51
E2A_HLF Rw-T7
GTAATACGACTCACTATAGGGACGCTTGGCTGCCATGTTGTTC
52
TEL/AML1  Fw_v2-T7
GTAATACGACTCACTATAGGCGGGAAGACCTGGCTTACATGAACC
53
TEL/AML1  Rw v2-T3
AACCCTCACTAAAGGGAGACCTCGCTCATCTTGCCTGGG
54
p190 Fw v1-T7
GTAATACGACTCACTATAGGGCAGATCTGGCCCAACGATG
55
p190 Rw-T3
AACCCTCACTAAAGGGAGATGGAGTTCCAACGAGCGGCTTC
56
p210  Fw v3-T7
GTAATACGACTCACTATAGGGCTGCAGATGCTGACCAACTCG
57
PML/RARA  Fw1-T7
GTAATACGACTCACTATAGGCGCCTGCAGGACCTCAGCTCTT
58
PML/RARA  Fw2-T7
GTAATACGACTCACTATAGGACAGCAACCACGTGGCCAGT
59
PML/RARA  Rw-T3
AACCCTCACTAAAGGGAGAAGGCTTGTAGATGCGGGGTAGAG
60
AML/ETO Fw-T7
GTAATACGACTCACTATAGGCATCAAAATCACAGTGGATGGGCC
61
AML/ETO Rw-T3
AACCCTCACTAAAGGGAGAGAGGTGGCATTGTTGGAGGAGTCAG
62
E2A/PBX1 Fw-T7
GTAATACGACTCACTATAGGCACCCTCCCTGACCTGTCTCG
63
E2A/PBX1 Rw-T3
AACCCTCACTAAAGGGAGACATGTTGTCCAGCCGCATCAG
64
AF9(I) 1818-T3
AACCCTCACTAAAGGGAGATCTTCTATAAGGTTCACGATCTGCT
65
AF9(2) 1426-T3
AACCCTCACTAAAGGGAGATCCTCCTCATTGTCATCAGAATG
66
EPS Rw _2-T3
AACCCTCACTAAAGGGAGACAGCAGCATCAGAAGCCAACACCCT
67
AF1q Rw-T3
AACCCTCACTAAAGGGAGACCTTCCAGCTCCGACAGATCCAGTT
68
NPM 403U21-T3
AACCCTCACTAAAGGGAGAGGTTCAGGGCCAGTGCATATT
69
NPMALK 590L19-T7
GTAATACGACTCACTATAGGCTTGGGTCGTTGGGCATTC
70
RBM15_MKL1 Fw-T3
AACCCTCACTAAAGGGAGACAGTTCCTGGATTCCCCTGCCA
71
RBM15_MKL1 Rw-T7
GTAATACGACTCACTATAGGATAGTCCTCTGTCCTGGCCCGCTCC
72
FUS_ERG Fw v2-Т3
AACCCTCACTAAAGGGAGATGGTTACAACCGCAGCAGTGGTG
73
FUS_ERG Rw v3-T7
GTAATACGACTCACTATAGGGAAGGAGATGGTTGAGCAGCTTTCG
74
T7
GTAATACGACTCACTATAGG
75
T3
AACCCTCACTAAAGGGAGA
Таблица 3. Последовательности олигонуклеотидных зондов, используемых для иммобилизации в ячейках биочипа.
SEQ ID NO:
Название
Последовательность 5’->3’
76
MLL_ex 8
TGGTGGTGGAGGCTGCTTTTTCTT
77
MLL_ex 9
CACTTTTTTCTGTTTGCTCTGCTCTGGAC
78
MLL_ex 10
CTTAAAGTCCACTCTGATCCTGTGG
79
MLL_ex 11
CCTGGGTGTTATAGGAACAGAAGTCAAGA
80
(4;11)_AF4_Ex4
CTGTACTAGGCGTATGTATTGCTGTCA
81
(4;11)_AF4_Ex5
GGTTACAGAACTGACATGCTGAGAG
82
(6;11)_AF6
AGCGTTTCGATTACATCTTGAGTGGTGG
83
(9;11)_AF9_A
GCTGGCAGGACTGGGTTGTTCA
84
(9;11)_AF9_B
CATTAACCTTCTGTGAAGCTCTACCAG
85
(9;11)_AF9_C
GGTATGAATACTCCTATTAGGGTC
86
(9;11)_AF9_D
TTCATCTAGGTATGCCTTGTCACATTCAC
87
(10;11) AF10_ 1
CATCCTTATGGGGACAAAGTTCACATC
88
(10;11) AF10_ 2
TCCAGATATAGAGTTGTTGCTAGTGC
89
(10;11) AF10_ 3
CGATACTGCTACATCATTGCTG
90
(10;11) AF10_ 4
ACTAGGTTGCGGCTATTGTCTCCAAGA
91
(10;11) AF10_ 5
CAAGCACCAGTGGCTGCTTTG
92
(10;11) AF10_6
CAATGCAGGTGATGGTTCTGGC
93
(11;19) ENL
TCTAACCTCACCTGGACGGTGCA
94
(11;19)  ELL 1
CGGATAGATGGCCTCAGTGAAACAGAAT
95
(11;19)  ELL 2
CCGATGTTGGAGAGGTAGAAGGAGAA
96
(11;19)  ELL 2a
AGTCAGGCTGGGGGATGGAGAT
97
(1q;11) AF1q
CTGTACTGGCTACTCACAGGGTCC
98
(1p11)  EPS15
CCAGTATTGCCTGTATCAACCTGTC
99
(10;11) PICALM_A
CTGTGCTCCTGATACAGGGC
100
(10;11) PICALM_B
TGTTGCAGCATTCCAAGCGG
101
(10;11) PICALM_C
TTGGAGGTCTCATGACAGGCT
102
(1;19) E2A/PBX1 (j)
GGATACTCAAAACACTGTAGGAGTCG
103
(1;19) PBX1
TTCCTCCTCCTGGGCTCCTCG
104
(12;21) TEL/AML1 (j2)
TCGTGCTGGCATCTGCTATTCTCC
105
(12;21)_AML_ j1
CGTCTCTAGAAGGATTCATTCCAAG
106
(12;21) TEL
AATGGGCATGGCGTGCTCTTCAG
107
Inv 16_j3
CTAGGTTCGCCTTGGCCTCCATTT
108
Inv 16_j2
CTCAACTTCATTCTCCATTTCCTCC
109
Inv 16_j1
CTCCAGCTCATGGACCTCCATTTCC
110
Inv16_CBFB
GACCTGTCTCTATCTTCAAATTCGCG
111
(9;22) p210_b3a2
CTTTTGAACTCTGCTTAAATCCAGTGGCT
112
(9;22) p210_b2a2
CCTTATTGATGGTCAGCG
113
(9;22) p190_e1a2
CTTCTGCGTCTCCATGG
114
(9;22)_ABL
TGCTACTGGCCGCTGAA
115
(8;21) AML1/ETO (j)
TCTCAGTACGATTTCGAGGTTCTCG
116
(8;21)_ETO
GATTGCGTCTTCACATCCACAGGTG
117
(15;17) PML/RARA  bcr3
GGTCTCAATGGCTTTCCCCTGGGT
118
(15;17) PML/RARA bcr1
GGTCTCAATGGCTGCCTCCCCG
119
(15;17) RARA
CTGGGCACTATCTCTTCAGAACTGC
120
(6;9) DEK/CAN(j)
CAGATTTGCAAAAAGGAAATTCGGCG
121
(6;9) DEK
GGCCAGTGCTAACTTGGAAGAAG
122
(6;9) CAN
GCGCCTTCATCAGTATGTGA
123
(1;22)  RBM15/MKL1(j)
CATTGTCCGTGCTTTGAAAAGTCC
124
(1;22) RBM15
TTACCTGGTCATGATCATTGTCCG
125
(1;22) MKL1
CAGAGAAGGAGCTTGGAGCG
126
(16;21) FUS/ERG(j)
AATAAATTTGGTGGCAGTGGCCAG
127
(16;21) FUS
AAGTGACCGTGGTGGCTTC
128
(16;21) ERG
CAGCTTTGGCAGTTCCTCCTG
129
Del(1) SIL/TAL1(j)
GAAGTTGCGATCGCCCAGGA
130
Del(1) SIL
CTACCCTGCAAACAGACCTCAG
131
Del(1) TAL1
GTAACTGCAGGCCTCTCAGC
132
(2;5) NPM1/ALK(j)
GACAGCACTTAGTAGTGTACCGCCG
133
(2;5) NPM1
AGTGTGGTTCAGGGCCAGTG
134
(2;5) ALK
GAAGCACCAGGAGCTGCAAG
135
(17;19) E2A ex12
CACCAGTCCCATGTCGCT
136
(17;19) E2A ex13
CTCCCTGACCTGTCTCGGC
137
(17;19) HLF ex4
CTGGGCAAGGCGCAGAAAG
138
ABL - контрольный ген
TAATGGTACACCCTCCCTTC