Способ повышения термостойкости желатина при модификации его дигидрокверцетином и температурой
METHOD FOR INCREASING THE HEAT RESISTANCE OF GELATIN BY MODIFICATION OF IT WITH DIHYDROQUERCETIN AND TEMPERATURE

Изобретение относится к биомедицине, а именно к повышению температурной стабильности желатина при изготовлении клеточных продуктов.
Продукт переработки коллагена, желатин является перспективным кандидатом на роль структурного компонента подложек для биомедицинских клеточных продуктов /1, Ji S and Guvendiren М, (2017), Recent Advances in Bioink Design for 3D Bioprinting of Tissues and Organs. Front. Bioeng. Biotechnol. 5:23. doi: 10.3389/fbioe.2017.00023/.
Одно из ограничений применения желатина заключается в том, что он обладает низкой термостабильностью, приводящей к нарушению структуры, даже при незначительном повышении температуры образца. Имеющиеся способы повышения термостойкости желатина, заключаются в использовании токсичных химических веществ, таких как формальдегид или глутаровый альдегид (2, Ai Н, Mills D.K., Jonathan A.S. et al. Gelatin-glutaraldehyde cross-linking on silicone rubber to increase endothelial cell adhesion and growth. In Vitro Cell. Dev. Biol. - Animal (2002) 38:487. doi: 10.1290/1071-2690(2002)038<0487:GCOSRT>2.0.CO;2; 3, Yue, K. et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of gelatin methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials (2015) 73, 254-271. doi: https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2015.08.045/.
В связи с этим можно выделить следующие недостатки этих способов:
1. Указанные химические вещества высоко токсичны и являются мутагенами для живых клеток, в связи с чем использование в биомедицинских клеточных продуктах ограничено.
2. Полученные образцы модифицированного желатина необходимо тщательно очищать от остатков альдегидов, в связи с их высокой цитотоксичностью.
3. Отсутствие стандартных процедур модификации желатина указанными альдегидами, что приводит к различным свойствам получаемых продуктов.
В результате проведенного патентно-информационного поиска ближайший аналог выявлен не был.
Технической проблемой, решаемой данным изобретением, является создание способа, позволяющего повысить температурную стойкость желатина без использования цитотоксичных веществ.
Для решения проблемы был использован дигидрокверцетин - флавоноид, получаемый из коры лиственницы дальневосточной и широко применяемый в медицине и косметологии /4, Л.С. Коренеева, В.А. Доровских и др. Эффективность применения дигидрокверцитина при экспериментальной гипергликемии. Дальневосточный медицинский журнал (2009) №1, 90-92/. Имеющиеся научные данные свидетельствуют о способности дигидрокверцитина образовывать химические сшивки между отдельными волокнами коллагена, повышая стойкость последнего к воздействию различных химических и физических факторов /5, Yu.V. Shatalin, V.S. Shubina. A New Material Based on Collagen and Taxifolin: Preparation and Properties. Biophysics (2015) 3, №60; 474-478/. Данный эффект можно экстраполировать на желатин, так как он является продуктом гидролиза коллагена. Помимо этого дигидрокверцетин является изученным антиоксидантом /6, Л.Р. Якупова, В.Р. Хайрулилина и др. Антиокислительная активность флавоноидов коры лиственницы сибирской. Башкирский химический журнал (2007) 14, №1; 51-54/, способным обеспечить цитопротективное действие при добавлении его к биомедицинскому клеточному продукту. При этом дополнительную термостабильность и физическую устойчивость образца можно получить при дополнительном инкубировании желатина при низкой температуре - от 5 до 20°С /7, Sio-Mei Lien, Liang-Yu Ko, Ta-Jen Huang. Effect of crosslinking temperature on compression strength of gelatin scaffold for articular cartilage tissue engineering. Materials Science and Engineering: С (2010) 30, №4; 631-635/.
Сущность изобретения заключается в том, что в способе повышения термостойкости желатина при модификации его дигидрокверцетином и температурой смешивают 20% раствор желатина с 10% раствором дигидрокверцетина, приготовленных на изотоническом растворе NaCl, в объемном соотношение растворов 9:1, с последующей инкубацией смеси в течение 30 минут при температуре 4°С и экспозиции смеси в чашке Петри в течение 30 минут при температуре 37°С и влажности воздуха 55-75%.
Способ получения модифицированного желатина осуществляют следующим образом. Приготавливают раствор №1 - 20% желатина на изотоническом растворе NaCl, после чего помещают его на 30 минут в термостат с температурой 56°С для ускорения растворения вещества. Приготавливают раствор №2 - 10% раствор дигидрокверцитина на изотоническом растворе NaCl. После полного растворения желатина, его раствор охлаждают до комнатной температуры (22-23°С). Производят смешивание раствора №1 и раствора №2 в объемном соотношении 9:1. Полученный после смешивания раствор помещают в чашку Петри на 30 минут при температуре 4°С, что позволяет добиться дополнительной полимеризации желатина, связанной с воздействием холодового фактора. Избытки раствора №2, не вступившие в химическую реакцию, удаляются путем двукратного промывания образца физиологическим раствором после полимеризации желатина.
Изобретение было опробовано на экспериментальных исследованиях температурной стойкости образцов желатина. Способ был отработан в серии экспериментальных работ, основанных на изучении потери стабильности раствора желатина и его модификаций при комнатной температуре (22-23°С) и при 37°С. Получены следующие данные: в исследованиях термостойкости желатина и его модификаций при 37°С, 20% раствор желатина начинал терять стабильность, проявляющуюся в виде растворения на 60±5 секунде, полная потеря стабильности на 130±10,5 секунде; 20% раствор желатина с добавленным 10% раствором дигидрокверцетина (объемное соотношение 9:1) - начало растворения на 85±6,3 секунде, полное растворение на 167±8,3 секунде. 20% раствор желатина с добавлением 10% раствора дигидрокверцетина (объемное соотношение 9:1) и инкубацией при 4°С - начало растворения на 99±5 секунде, полное растворение на 185±7,2 секунде. Статистическая значимость полученных результатов оценивалась параметрическим методом с использованием t-критерия Стьюдента при р<0,01. Выявлены достоверные различия времени начала растворения и времени полного растворения образцов 20% желатина и образцов 20% желатина, модифицированных 10% раствором дигидрокверцитина, что свидетельствует о повышении термостойкости желатина при его модификации дигидрокверцетином. При этом отличия между образцами с использованием дигидрокверцетина и дигидрокверцетина с инкубацией при 4°С также статистически значимы. Следовательно, инкубация при 4°С статистически увеличивает температурную стабильность желатина. Также исследовалась температурная стабильность желатина и модифицированного желатина при комнатной температуре (22-23°С). Полученные результаты следующие: термостабильность 20% раствора желатина - 14±0,3 часа, термостабильность 20% раствора желатина, модифицированного 10% раствором дигидрокверцетина (объемное соотношение 9:1) - 27±1,5 часов, термостабильность 20% раствора желатина, модифицированного 10% раствором дигидрокверцетина с инкубацией при 4°С - 35±2 часа. Данные результаты статистически значимы при p<0,01 при использовании параметрического метода с применением t-критерия Стьюдента.
Технический результат от использования способа - повышение температурной стабильности раствора желатина с наличием цитопроективного эффекта при модификации дигидрокверцетином в соотношении 9:1 с инкубацией при 4°С для биомедицинских клеточных продуктов, что может быть использовано для создания биомедицинского клеточного продукта, например эквивалента кожи, для лечения термических и трофических повреждений кожи.
Литература
1. Ji S and Guvendiren М., (2017), Recent Advances in Bioink Design for 3D Bioprinting of Tissues and Organs. Front. Bioeng. Biotechnol. 5:23. doi: 10.3389/fbioe.2017.00023.
2. Ai H, Mills D.K., Jonathan A.S. et al. Gelatin-glutaraldehyde cross-linking on silicone rubber to increase endothelial cell adhesion and growth. In Vitro Cell. Dev. Biol. - Animal (2002) 38:487. doi: 10.1290/1071-2690(2002)038<0487:GCOSRT>2.0.CO;2.
3. Yue, K. et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of gelatin methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials (2015) 73, 254-271. doi: https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2015.08.045.
4. Л.С. Коренеева, B.A. Доровских и др. Эффективность применения дигидрокверцитина при экспериментальной гипергликемии. Дальневосточный медицинский журнал, (2009), №1, 90-92.
5. Yu.V. Shatalin, V.S. Shubina. A New Material Based on Collagen and Taxifolin: Preparation and Properties. Biophysics (2015) 3, №60; 474-478.
6. Л.Р. Якупова, B.P. Хайрулилина и др. Антиокислительная активность флавоноидов коры лиственницы сибирской. Башкирский химический журнал, (2007), 14, №1; 51-54.
7. Sio-Mei Lien, Liang-Yu Ko, Та-Jen Huang. Effect of crosslinking temperature on compression strength of gelatin scaffold for articular cartilage tissue engineering. Materials Science and Engineering: С (2010) 30, №4; 631-635.