СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВОВИРУСНОГО ВОДОРАСТВОРИМОГО ПОЛИМЕРНОГО КОМПЛЕКСА АРБИДОЛА
METHOD FOR PREPARING ANTIVIRAL WATER-SOLUBE POLYMER COMPLEX OF ARBIDOL

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к получению полимерного комплекса противовирусного средства арбидола с природным полисахаридом арабиногалактаном (АГ).
Создание водорастворимых полимерных комплексов арбидола должны найти применение в фармакологии, так как расширяют номенклатуру новых эффективных и безопасных противовирусных средств.
Арбидол - этиловый эфир 6-бром-4-диметиламинометил-1-метил-5-окси-2-фенилтиометилиндолинил-3-карбоновой кислоты гидрохлорид моногидрат, обладает высокой противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа А и В и других острых респираторных инфекций. Препарат широко распространен на рынке России. Существенный его недостаток в том, что он практически нерастворим в воде, что ограничивает его биодоступность. Кроме того, препарат эффективен только на ранних сроках заболевания - не более 2-х суток. В связи с этим, создание препарата пролонгированного действия на основе арбидола весьма актуально.
Высокомолекулярная природа, водорастворимость, мембранотропные свойства, способность к рецепторному промежуточному эндоцитозу природного полисахарида арабиногалактана вызвали интерес к нему, как к носителю фармакологических молекул для получения биологически активных препаратов пролонгированного действия. Природные качества перспективно отличают полимерную наноструктурированную матрицу арабиногалактана от других широко распространенных полисахаридов, таких как декстран, целлюлоза, гидроксиэтилкрахмал, гепарин, крахмал, декстрансульфат, карбоксиметилцеллюлоза, используемых в качестве носителей. Немаловажным фактором является и внедрение в практику промышленного производства природного арабиногалактана из древесины лиственницы [Патент РФ №2413432, 2008 г.;. В.А.Бабкин и др./ Ресурсосберегающая и экологически безопасная переработка древесины и коры лиственницы // Наука - производству, 2004, в.1. С.52-58].
50

В последние годы исследования биологической активности АГ резко активизировались. Этому способствуют такие его свойства как высокая растворимость в воде, уникально низкая вязкость растворов, узкое молекулярно-массовое распределение, а также биоразлагаемость. Величины ЛД при в/ж введении у мышей и крыс разного пола колеблются от 18 до 20 г/кг, при в/б - от 2000 до 4000 мг/кг. Пероральное введение беспородным собакам в дозе 2 г/кг не вызывает каких-либо существенных изменений общего состояния, поведения и структуры внутренних органов. Это позволяет однозначно отнести субстанцию к малотоксичным - практически нетоксичным лекарственным веществам [Отчет об экспериментальном доклиническом изучении безопасности и фармакологической активности субстанции «Фибролар» (арабиногалактан), Санкт-Петербург, 2010].
Макромолекула АГ из древесины лиственницы имеет высоко разветвленное строение; главная цепь ее состоит из звеньев галактозы, соединенных гликозидными связями β-(1→3), а боковые цепи со связями β-(1→6) - из звеньев галактозы и арабинозы, из единичных звеньев арабинозы, а также уроновых кислот, в основном глюкуроновой. Макромолекула арабиногалактана полифункциональна. Каждое галактозное звено ее основной цепи содержит две, а концевые звенья и звенья боковых цепей - три незамещенные гидроксильные группы, причем последние являются вицинальными. Все они потенциально способны участвовать в химических реакциях, характерных для алифатической гидроксильной группы, и их активность будет определяться стереохимической доступностью.
Использование АГ в качестве матрицы-носителя фармаконов позволит снизить токсичность, обеспечить биодоступность и пролонгированность действия последних. При этом может наблюдаться усиление терапевтического действия фармакона [Е.Н.Медведева и др. /Арабиногалактан лиственницы - свойства и перспективы использования (Обзор) //Химия растительного сырья, 2003, №1, с.27-37].
Перспективным способом химической модификации АГ является механическая обработка ударно-истирающими воздействиями, осуществляемая в специальных мельницах - механохимических активаторах. Механохимический путь позволяет получать целевые продукты модификации без участия растворителей, в одну технологическую стадию. Установлено снижение токсичности и повышение биодоступности известных лекарственных средств при совместной механохимической обработке их с АГ, что позволило на порядок уменьшить лечебную дозу этих препаратов.
Известен один способ получения водорастворимого полимерного комплекса арбидола с сополимером акриламида и 2-акриламидо-2-метилпропансульфокислоты, имеющим молекулярную массу 20-31 кДа [Патент 2394618 РФ]. Авторы декларируют получение полимерномодифицированного арбидола, обладающего существенной противовирусной активностью, соизмеримой с таковой для исходного арбидола, и более низкой токсичностью.
Недостатками этого способа является следующее.
1. Многоступенчатость процесса получения сополимера акриламида и его комплекса с арбидолом.
2. Использование акриламидного сополимера, мономер которого обладает токсическими свойствами. Акриламид является химическим реактивом, относящимся ко 2-му классу опасности. Установлено, что его прооксидантный эффект обусловлен действием образующихся в системе микросомального окисления метаболитов, вызывающих деструкцию цитохрома Р-450 [Тарских М.М. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2009. - N2. - С.49-51; Хотимченко С.А. и др. Вопросы питания. 2010. - N1. - С.4-12]. Есть также данные, что вызывая цитогенетические нарушения и изменение пролиферации клеток щитовидной железы, акриламид приводит к развитию новообразований в этом органе [Алтаева А.А. Токсикологический вестник. 2010. - N 5. - С.46-49].
Задачей настоящего изобретения является разработка водорастворимого производного арбидола с пониженной токсичностью и сохранением высокой биологической активности.
Решение поставленной задачи достигается тем, что комплексообразование арбидола с природным полисахаридом арабиногалактаном проводят путем механохимической обработки компонентов в сухом виде.
По данным эксклюзивной ВЭЖХ исходный образец АГ, выделенный из древесины лиственницы по способу [Патент РФ №2256668, 2005 г.], имеет среднюю молекулярную массу 14-16 кДа и характеризуется узким молекулярно массовым распределением (ММР). (Рис. Хроматограмма АГ, полученная методом эксклюзивной ВЭЖХ).
Для получения комплексов использовали мягкий режим механической обработки сухих образцов арбидола и арабиногалактана в пропорции 1:2,5 и 1:3, соответственно. Механообработка смеси проводилась с применением валковой мельницы ВМ-1 с барабаном, имеющим фторопластовую футеровку. В качестве мелющих тел использовались стальные шары (марка стали ШХ-15) диаметром 15 мм, загрузка шаров 675 г. Ускорение мелющих тел - 1g (свободное падение). Объем барабана - 300 мл. Общая загрузка компонентов обрабатываемой смеси составляла 20 г, продолжительность механической обработки - 2 ч. В результате получены водорастворимые полимерные комплексы с содержанием в них арбидола от 28,7 до 33,2%.
Полученные комплексы растворяли в дистиллированной воде из расчета 3 мг/мл, смесь перемешивали на магнитной мешалке в течение 40 минут, фильтровали и высушивали до постоянного веса. Содержание арбидола в полученных комплексах определяли методом УФ-спектроскопии при длине волны 315 нм (максимум поглощения арбидола в УФ-области). Стандартный образец - исходная субстанция немодифицированного арбидола, практически нерастворимого в воде (для растворения 1 г вещества необходимо более 10000 мл растворителя, ГФ XII, т.1; ОФС 42-0049-07).
Растворимость арбидола в воде в составе комплексов с АГ представлена в таблице 1. Для сравнения приведены данные по растворимости смеси арбидола с АГ без механообработки.
Таблица 1
Растворимость арбидола в составе комплекса с АГ
Состав комплексов Арбидол:АГ
1:2,5без мех. обработки
1:3без мех. обработки
1:2,5ВМ*, 2 ч
1:3ВМ*, 2 ч
Растворимость арбидола, % от внесенного
33,74
37,47
99,1
99,9
*- Механообработка в валковой мельнице
Преимущества предлагаемого способа.
1. Механохимический путь позволяет получать целевые продукты модификации без участия растворителей, в одну технологическую стадию.
2. При создании водорастворимого комплекса используется нетоксичный природный полисахарид арабиногалактан, обладающий самостоятельной биологической активностью (гастропротекторное, иммуномодулирующее и мембранотропное действие, способность к рецепторному промежуточному эндоцитозу [Е.Н.Медведева и др. ХРС. 2009, №3, с.49-56]), удачно дополняющей активность арбидола. Кроме того, при исследовании противовирусной активности АГ показано, что он проявляет защитные свойства на модели летальной гриппозной инфекции при использовании разных доз вируса. При этом активность АГ составляла 50% при малой инфицирующей дозе и 22% - при высокой [В.В.Зарубаев и др., Бюл. ВСНЦ РАМН, №1(71), 2010, С.76-81].
3. Практически нерастворимый в воде арбидол (в соответствии с классификацией по ГФ XII, ОФС 42-0049-07) растворяется на 99,9% в составе комплекса, полученного механообработкой сухой смеси арбидола с природным полисахаридом арабиногалактаном, что повышает биодоступность арбидола. Определено оптимальное соотношение компонентов в комплексе (АГ:арбидол): 2,5:1 или 3:1. Содержание арбидола в комплексе от 33 до 28%, соответственно, что является существенным при создании лекарственной формы (в прототипе соотношение АГ: Лекарственное вещество 10:1 или 20:1, т.е. содержание лекарственного вещества 9,0-4,8% [А.В.Душкин и др. Механохимическое получение и фармакологическая активность комплексов арабиногалактана и лекарственных веществ, Известия АН. Сер. хим., 2008, №6, с.1-9]). Таким образом, получен дополнительный технический результат от использования изобретения - сохранение требуемой (необходимой) противовирусной активности комплекса при существенном уменьшении дозы вводимого лекарственного препарата. Результат обеспечивается за счет увеличения на порядок химиотерапевтического индекса арбидола. Сверхсуммарный результат получен за счет выбранных авторами параметров механической обработки.
2
Предварительно образцы арбидола и полученных комплексов были проверены на токсичность в условиях in vitro на монослойной эпителиальной культуре клеток MDCK (почка собаки), являющейся модельной культурой клеток для выделения и накопления вирусов гриппа. Проверка токсичности препаратов осуществлялась по следующей схеме: навеска препарата весом 5 мг отвешивалась в стерильную пробирку объемом 5 мл. Далее добавляли 50 мкл спирта и инкубировали навеску 30 мин при 37°С, после чего препарат разводили ростовой средой для клеток MDCK (α-МЕМ, Биолот, Санкт-Петербург) до концентрации 1 мг/мл, получая таким образом базовый раствор. Далее этой же средой делали 5 последовательных разведений (100; 50; 20; 10 и 1 мкг/мл соответственно), которые и использовали для проверки токсичности препарата. Опыт ставили в 4 параллелях для каждой концентрации. Односуточную культуру клеток MDCK, выращенных на 96-луночных планшетах (Orange Scientific), проверяли визуально в инвертированном микроскопе на целостность монослоя. Планшеты дважды отмывали средой, не содержащей сыворотки, после чего вносили препарат в соответствующей концентрации в объеме 100 мкл в каждую лунку. Планшеты инкубировали 72 часа при 37°С в присутствии 5% CO, после чего регистрировали результаты опыта визуально, оценивая целостность монослоя по сравнению с контролем клеток, и методом МТТ (количественно оценивающем жизнеспособность клеток) с использованием планшетного ридера Thermofisher VarioScan. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Statistica 6.0.
2
2
Оценку противовирусной активности образцов проводили для 3 концентраций каждого препарата: максимальной концентрации (из протестированных разведений), при которой выживало 100% клеток монослоя и двух последующих после нее. Для оценки противовирусной активности использовали эталонные вирусы A/Puerto Rico/08/34 (H1N1) и A/Victoria/3/75 (H3N2). Односуточную культуру клеток MDCK, выращенных на 96-луночных планшетах (Orange Scientific), проверяли визуально в инвертированном микроскопе на целостность монослоя. Далее готовили десятикратные вирусные разведения на поддерживающей ростовой среде с добавлением трипсина (с -1 по -6). Планшеты с монослоем клеток дважды отмывали средой, не содержащей сыворотки, после чего вносили вирусные разведения в соответствующие лунки планшета в объеме 50 мкл. Контрольные лунки заполняли ростовой средой в равном объеме. Планшеты инкубировали 60 мин при 37°С в присутствии 5% СO после чего отмывали средой для того, чтобы удалить несвязавшиеся с клетками вирусные частицы. Далее вносили препарат в лунки с вирусными разведениями по 100 мкл в соответствующей концентрации. Каждая концентрация препарата была поставлена в двух параллелях для каждого вирусного разведения и протестирована не менее, чем в трех независимых опытах. Контрольные лунки заполняли ростовой средой в том же объеме. Также оставляли лунки для повторной проверки токсичности используемых концентраций. Планшеты инкубировали 72 часа при 37°С в присутствии 5% СO, после чего регистрировали результаты опыта визуально, оценивая целостность монослоя по сравнению с контролем клеток и степень цитопатического действия вируса на культуру клеток, ставили реакцию гемагглютинации и использовали метод МТТ для количественной оценки жизнеспособности клеток с использованием планшетного ридера Thermofisher VarioScan. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Statistica 6.0.
Оценка токсичности препарата.
Оценка токсичности арбидола и полученных комплексов производилась двумя методами.
1. Наблюдение и оценка целостности монослоя клеток под инвертированным микроскопом. Подразумевает сравнение морфологии клеток контрольных лунок с опытными и регистрацию изменений под воздействием агента (препарата, вируса и т.д.). Изменение морфологии может включать нарушение целостности монослоя, изменения формы клеток, проявление цитопатического действия при вирусной инфекции.
2. Метод МТТ. Метод, используемый при оценке лекарственной чувствительности, основанный на способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать неокрашенные формы 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола (МТТ-реагента) до голубого кристаллического фармазана, растворимого в диметилсульфоксиде или 96% спирте. Насыщенность окраски свидетельствует об интенсивности метаболических процессов в клетках, т.е. о нормальном уровне жизнеспособности. Интенсивность окраски фиксируется с помощью спектрофотометра и получаемые значения оптической плотности могут быть использованы для статистической обработки данных.
Сущность способа получения полимерного комплекса представлена следующими примерами.
Пример 1
Комплексобразование арбидола проводили механической обработкой в валковой мельнице ВМ-1 в условиях, описанных выше.
Загружали в барабан мельницы 5,7 г сухого порошка арбидола и 14, 3 г порошка арабиногалактана. Соотношение АГ/арбидол 2,5:1. Время обработки 2 часа. Полученные комплексы после выгрузки из барабана растворяли в дистиллированной воде из расчета 3 мг/мл, смесь перемешивали на магнитной мешалке в течение 40 минут, фильтровали и высушивали с использованием лиофильной сушки. Содержание арбидола в полученном комплексе определяли методом УФ-спектроскопии в описанных выше условиях. Получили растворимый комплекс с содержанием исходного количества арбидола 99,1%.
Пример 2
В условиях примера 1 загружали в барабан мельницы ВМ-1 5 г арбидола и 15 г АГ.
Соотношение АГ/арбидол 3:1. Дальнейшую обработку проводили как описано в примере 1. Получили растворимый комплекс с содержанием исходного количества арбидола 99,9%.
Пример 3. Комплексобразование проводили без механической обработки.
Смешивали в 5,7 г сухого порошка арбидола и 14,3 г порошка арабиногалактана. Соотношение АГ/арбидол 2,5:1. Смесь тщательно растирали в ступке. Полученные комплексы растворяли в дистиллированной воде из расчета 3 мг/мл, смесь перемешивали на магнитной мешалке в течение 40 минут, фильтровали и высушивали с использованием лиофильной сушки. Содержание арбидола в полученном комплексе определяли методом УФ-спектроскопии в описанных выше условиях. Получили раствор с содержанием арбидола 33.74% от внесенного в смесь.
Пример 4. Комплексобразование проводили без механической обработки.
В условиях примера 3 смешивали 5 г арбидола и 15 г АГ. Соотношение АГ: арбидол 3:1. Дальнейшую обработку проводили как описано в примере 3. Получили растворимый комплекс с содержанием исходного количества арбидола 37,47% от внесенного в смесь.
Химические и биологические свойства полученных водорастворимых комплексов арбидола с арабиногалактаном представлены в таблицах 1 и 2.
Из таблицы 2 видно, что при введении арбидола в состав комплексов с АГ растворимость арбидола повышается практически до 100%, что способствует повышению его биодоступности и пролонгации действия, доза введенного арбидола может быть снижена в три раза при сохранении адекватного уровня противовирусной активности немодифицированного препарата.
Таблица 2
Химические и биологические свойства полученных водорастворимых комплексов арбидола с арабиногалактаном
Номер примера по Заявке
Характеристика арабиногалактана
Содержание арбидола, %
Полимерный комплекс
ММ, кДа
Содержание, %
Массовое соотношение Арб/ АГ
Растворимость Арб,%
Токсичность IС<sub>50</sub>, мкг/мл*
Противовирусная активность в отношении вирусов гриппа H1N1 и H3N2, Δ lg ТИД<sub>50</sub>
1
14-16
66,8
33,2
1: 2,5
99,1
50
3,0
2
14-16
71,3
28,7
1:3
99,9
50
2,5-3,0
Контроль на АГ
14-16
100
Контроль на Арбидол
Практически нерастворим
20
3,0
* Среднетоксическая концентрация на культуре клеток MDCK