Фагоцитарная активность нейтрофилов крови человека в гипотонических средах в присутствии антибиотиков

ФАГОЦИТАРНАЯ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА В ГИПОТОНИЧЕСКИХ СРЕДАХ В ПРИСУТСТВИИ АНТИБИОТИКОВ

PHAGOCYTIC ACTIVITY OF NEUTROPHILS OF HUMAN BLOOD IN HYPOTONIC MEDIUM BY ANTIBIOTIC ACTION

А.А. Мищенко, Э.М. Савельева

A.A. Mischenko, E.M. Savelyeva

Исследована фагоцитарная активность нейтрофилов крови человека в гипотонической среде и в присутствии ряда антибиотиков. Снижение тоничности в 1.5 -2.0 раза вызывает увеличение параметров фагоцитоза на 16%. В присутствии фуросемида действие гипотонии не проявляется. Различные антибиотики вызывают сильное ингибирование фагоцитоза.

Phagocytic reaction of human neutrophils in the hypotonic medium and at presence of antibiotics was investigated. Tonicity decrease of medium in 1.5 - 2 times causes increase of phagocytosis parameters on 16 %. At furosemide presence action of a hypotonia is not shown. Various antibiotics caused strong inhibition of phagocytosis.

Ключевые слова: нейтрофил, фагоцитоз, фагоцитарная активность, гипотония.

Key words: neutrophil, phagocytosis, phagocytic activity, hypotonycity.

Введение

Основным барьером на пути проникновения инфекции в организм служат слизистые оболочки. Будучи многокомпонентными системами, они принимают участие во многих реакциях организма, в том числе в иммунных. В норме в слизистой оболочке содержатся иммуноглобулины и небольшое количество нейтрофилов и макрофагов [2]. Именно эти клетки первыми контактируют с патогенами, в случае же проникновения последних в толщу тканей барьером становятся лимфоидные скопления в толще слизистых.

Поскольку поверхности слизистых оболочек не изотоничны плазме крови, для оценки функционирования клеток иммунной системы в таких условиях целесообразно провести эксперименты в анизотоничной среде in vitro. Так, показано, что в гипотонических растворах в лейкоцитах активируется кислородный взрыв, метаболизм арахидоновой кислоты, увеличивается концентрация ионов кальция [10]. В нашей работе проведены исследования фагоцитарной активности нейтрофилов крови при моделировании гипотонических условий. Поскольку в случае воспалительного процесса в организме врачами часто назначается антибиотиковая терапия, исследовано также действие антибиотиков различных классов на фагоцитарную активность нейтрофилов крови.

Объекты и методы

В экспериментах использована венозная кровь мужчин доноров, полученная из Республиканской станции переливания крови (г. Сыктывкар). По 500 мкл крови помещали в лунки планшета для иммунологических реакций. В каждую лунку добавляли суспензию дрожжевых клеток (ООО «саф-Нева»), предварительно отмытых трижды 0.9% раствором NaCl. Количество дрожжевых клеток в среднем составляло 30 тыс./1 мкл крови.

Для снижения тоничности в 2.0 и 1.5 раза в лунки добавляли дистиллированную воду (рН 7.4). В ряде экспериментов в лунки с изо- и гипотонической средами добавляли также фуросемид в концентрации 1*10-5 Моль/л.

В экспериментах с антибиотиками в лунки добавляли линкомицин, цефтриаксон, амоксиклав и гентамицин в концентрации 30 мг/л.

Пробы инкубировали в термостате при 370С в течение 20 мин. Затем планшет помещали на лед для остановки реакции фагоцитоза и с каждой лунки готовили по 3 мазка. После просушивания и фиксации мазки окрашивали по Гимза-Романовскому, просматривали под микроскопом при иммерсионном увеличении 15*90.

Подсчитывали: 1) фагоцитарную активность - количество активных нейтрофилов из 100 встреченных при просмотре; 2) фагоцитарный индекс -среднее количество дрожжевых клеток, поглощенных одним нейтрофилом. Результаты обработаны метолом парных сравнений, достоверность различий между выборками оценивали по критерию Вилкоксона [4].

Результаты и обсуждение

В контроле фагоцитарная активность лейкоцитов человеческой крови составила 49.5±5%, фагоцитарный индекс - 1.64±0.1(n=20). Данные согласуются с результатами, полученными при изучении фагоцитоза патогенной Candida crusei [19]. Фагоцитарная активность нейтрофилов в данных условиях стимулируется Р-глюканами в клеточной стенке дрожжей, к которым на поверхности фагоцитов имеются рецепторы [7], а также опсонизирующим эффектом имеющихся в плазме крови компонентов системы комплемента C3bi [20] и иммуноглобулинов IgG [6].

При снижении тоничности среды в 1.5 и 2.0 раза (n=20) фагоцитарная активность увеличилась в среднем на 16.5%, составив 58.1±9.1% (p<0.05). Увеличился также фагоцитарный индекс до 1.97±0.06 и 2.14±0.58 при снижении тоничности в 1.5 и 2.0 раза соответственно. Таким образом, гипотония вызвала активацию фагоцитоза, что отразилось в увеличении как доли активных клеток, так и скорости поглощения фагоцитами дрожжей. Одним из механизмов такого

действия гипотонии может быть увеличение концентрации внутриклеточного кальция [10], в результате чего изменяется цитоскелет клеток, их подвижность и фагоцитарная активность. Кроме того, активность клеток в этих условиях может меняться в результате запуска реакции регуляторного уменьшения объема, RVD, в ответ на набухание клеток [12]. С целью исключить влияние последнего было проведено ингибирование фуросемидом K+,Cl" - котранспорта, активация которого приводит к RVD. Поскольку вещество меняет хемотаксическую активность клеток [15], предварительно было исследовано его влияние в изотонической среде. При этом фуросемид не изменял фагоцитарную активность нейтрофилов (n=20), что согласуется с опубликованными данными [16]. На фоне гипотонической среды фуросемид не изменял фагоцитарную активность по сравнению с контролем и снижал ее по сравнению с результатами в гипотонической среде в отсутствие вещества (p<0.05). В частности, в присутствии фуросемида фагоцитарная активность и фагоцитарный индекс составили 45.9±6.7%; 1.83±0.1 и 50.5±5.6%; 1.7±0.1 соответственно при

гипотонии 1.5 и 2.0. Следовательно, блокируя реакцию RVD, фуросемид тем самым предотвращал активацию клеток в условиях гипотонии.

Под действием антибиотиков показатели фагоцитарной активности снизились. При действии цефтриаксона фагоцитарная активность снизилась на 78% до 10±2.3 % (р<0.02), амоксиклав - на 70% до 17±3.9% (р<0.02), линкомицин - на 65% до 16±4.9% (р<0.02), гентамицин - на 76% до 11±3.6% (р<0.02). Фагоцитарный индекс в экспериментах с антибиотиками практически оставался неизменным, следовательно, данные препараты не влияют на скорость поглощения клеток.

Повышение фагоцитарной активности под влиянием антибиотиков отмечено в ряде работ [3, 1, 5]. Согласно другим данным, фагоцитарная активность лейкоцитов подавляется при действии таких антибиотиков, как ауреомицин [17]. Окситстрациклин, эритромицин, хлорамфеникол, полимиксин В не вызывают заметных изменений фагоцитарной активности лейкоцитов [5].

Используемые в опытах антибиотики по действию относятся к разным группам. Амоксиклав и цефтриаксон действуют как бактерицидные препараты (ингибируют развитие клеточной стенки, причем подавляют синтез специфического для клеточной стенки бактерий пептидогликана - муреина). Линкомицин и гентамицин при низких концентрациях действуют как бактериостатики и бактерицидно - при увеличении концентрации (ингибируют синтез белка за счет связывания с 50s и 30 s субъединицами рибосомы). Все антибиотики в наших экспериментах оказали ингибирующий эффект на нейтрофилы. Это может быть связано с изменением структуры

антибактериальных препаратов вследствие метаболических процессов в организме, в результате чего продукты метаболизма становятся токсичными для

самих фагоцитов [9]. Антибиотики являются одной из главных причин нейтропении и агранулоцитоза. Данный эффект оказали пенициллины, цефаллоспорины и сульфаниламиды [8]. Аминогликозид гентамицин увеличивает образование лизосом, содержащих различные факторы вирулентности [9]. Представители Р-лактамных антибиотиков, амоксиклав и цефтриаксон, могут подавлять реакцию окислительного взрыва [14].

Данные о действии линкозаминов, к которым относится используемый линкомицин, на фагоцитарную активность противоречивы [11]. При разных концентрациях препарата авторы отмечают как повышение фагоцитарной активности, так и ее снижение либо отсутствие изменений. Возможно, используемая в наших экспериментах концентрация антибиотиков была токсичной для клеток.

Выводы:

1. В контроле фагоцитарная активность и фагоцитарный индекс составили соответственно 49.5±5% и 1.64±0.1.

2. Замена изотоничной среды на гипотоничную вызывает увеличение как фагоцитарной активности, так и фагоцитарного индекса соответственно на 16.5 % и в 1.5-2 раза.

3. В присутствии фуросемида действие гипотонии на фагоцитарную активность нейтрофилов не проявляется.

4. Антибиотики цефтриаксон, амоксиклав, линкомицин и гентамицин вызывают ингибирование фагоциратной активности нейтрофилов на 78%, 76%, 65 % и 70% соответственно.

1. Алешина Е.Н. Изучение действия аморфного и кристаллического пени-циллинов на чумной микроб // Тр. Ростовского-на-Дону ПЧИ. Ростов-на-Дону, 1959. Т. 15. Вып. 1. С. 153-160.

2. Арефьева Н.А., Азнабаева Л.Ф. Иммунные реакции слизистой оболочки носа: цитологическая диагностика, методы лечения // Consilium Medicum. 2009. Т. 11. №11. С. 30-33.

3. Израэльсон М.И., Шполянский Б.И., Боевская Г.И. Влияние пенициллина на функциональную способность ретикуло-эндотелиальной системы и фагоцитарную активность лейкоцитов // Журн. микр. эпид. и иммун. 1951. № 3. С. 59-62.

4. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высш. школа, 1980. 291 с.

5. Финкель Е.А., Луцкая С.И. Аутовакцинотерапия при туберкулезе: Монография. Кыргызстан, 1972. 154 с.

6. Bazzoni F., Cassatella M.A., Laudanna C., Rossi F. Phagocytosis of opsonized yeast nduces tumor necrosis factor - alpha mRNA accumulation and protein release by human polymorphnonuclear leucocytes // J. Leukoc. Biol. 1991. V. 50. № 3. P. 223-228.

7. Czop J.K., Valiante N.H., Janusz M.J. Phagocytosis of particulate activators of the human alternative complement pathway thought monocyte beta-glucan receptors // Prog. Biol. Res. 1989. V. 297. P. 287-296.

8. De Weck A.L. Pharmacologic and immunochemical mechanisms of drug hypersensitivity // Immunol Allergy Clin North Am. 1991. № 11. Р. 461-474.

9. Gilliland B.C. Drug-induced autoimmune and hematologic disorders // Immunol Allergy Clin North Am. 1991. № 11. Р. 525-553.

10. Hiura M., Ozawa M., Othsuka T. a. o. Stimulation of superoxide anion production in guinea pig polimorphonuclear leucocytes by hypotonic condition with protein kinase C activators // Arch. Biochem. Biophys. 1991. C. 15. № 291. P. 31-37.

11. Kishi K., Hirai K., Hiramatsu K., Yamasaki T., Nasu M. Clindamycin suppresses endotoxin released by ceftazidime-treated Escherichia coli O55 : B5 and subsequent production of tumor necrosis factor alpha and interleukin-1 beta // Antimicrob Agents Chemother. 1999. V. 43. № 3. Р. 616-22.

12. Kovaks T., Stas I. et al. Volume regulatory mechanisms of human granulocytes in hipoosmotic media // Acta Biochim. Biophys. Hung. 1989. V. 24, № 1-2. P. 142-147.

13. De Weck A.L. Pharmacologic and immunochemical mechanisms of drug hypersensitivity // Immunol Allergy Clin North Am. 1991. № 11. Р. 461-474.

14. Labro M.T. Pharmacology of spiramycin in comparison with other macrolides // Drug Invest 1993. 6. Suppl 1. Р. 15-28.

15. Lachani M., Usmani S. et al. In vitro effect of furosemideon hemiluminescence of polymorphonuclear neutrophils in preterm infants // Biol.Neonate. 1997. V. 72. № 3. P. 142147.

16. Muniz-Junqueira MI, Mota LM, Aires RB, Junqueira LF Jr. Digitalis inhibits and furosemide does not change the in vitro phagocytic function of neutrophils of healthy subjects // Int Immunopharmacol. 2003. V. 3. № 10-11. P. 1439-1445.

17. Munoz J., Geister R. Inhibition of phagocytosis by aureomycin // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1950. V. 75. № 2. Р. 367-370.

18. Richardson M.D., Donaldson F. Interaction of Candida crusei with human neutrophils in vitro // J. Med. Microbiol. 1994. V. 41, № 6. P. 380-388.

19. Vetvica V., Thornton B.P., Ross C.P. Soluble beta-glucan polysaccharide binding to the lectin site of neutrophil or natural killer cell complement receptor type 3 (CD 11b/CD 18) generates aprimed state of receptor capable of mediating citotoxicity of IC3b - opsonized target cells // J. Clin. Invest. 1996. V. 98. P. 50-61.