Биосенсорное определение особенностей микробного окисления алканов нормального строения с длиной цеписб-с1б

Далее динамика показателей гемостаза сохранялась. На 3 сутки включения реамберина в терапию исследуемой патологии время свертывания и показатель протромбинового времени были выше данных показателей в контроле на 12,97 и 11,41% (р<0,05) соответственно, причем первый из них достоверно от нормы не отличался. Время рекальцификации плазмы было сопоставимо с исходом. Содержание антитромбина III и толерантность плазмы к гепарину повышались относительно контроля на 9,16 и 11,29% (р<0,05) соответственно, последний показатель статистически значимо от исходных данных не отличался.

Тромбиновое время снижалось на всех этапах эксперимента, достигая минимума к его окончанию, когда оно статистически не отличалось от нормальных цифр. Время свертывания и время рекальцификации прогрессивно снижались так же, как и в контрольной группе, но и к пятым суткам эксперимента были ниже нормы на 10,95 и 21,98% (р<0,05) соответственно. На фоне применения реамберина выявлено изменение антикоагулянтной активности плазмы: показатель антитромбина III к окончанию эксперимента был сопоставим с исходными данными, превышая контроль на 17,12% (р<0,05). Уровень продуктов деградации фибриногена возрастал на 27,22% относительно нормы, оставаясь ниже контроля на 17,18% (р<0,05). Остальные гемостатические показатели на данном этапе динамического наблюдения на фоне терапии реамберином относительно контроля не изменялись.

При исследовании коагуляционно-литического потенциала крови на фоне применения мексидола было установлено, что на первые сутки протромбиновое время было сопоставимо с нормой и превышало контроль на 7,07% (р<0,05). ПДФ и вязкость крови снижались, на данном этапе наблюдения данные показатели были ниже контроля на 17,29 и 18,28% (р<0,05) соответственно, причем вязкость крови достоверно от нормальной не отличалась. Спонтанный фибринолиз возрастал относительно контроля, превосходя его на 22,97% (р<0,05), и был сопоставим с нормой. Остальные показатели на данном этапе наблюдения достоверно не отличались ни от контроля, ни от нормы.

При применении антиоксидантов при эндогенной интоксикации панкреатогенного генеза происходит коррекция нарушений гуморального компонента системы гемостаза. Эффект антиоксидантов проявляется с первых суток их применения, что делает перспективным их использование для предотвращения осложнений синдрома эндогенной интоксикации.

Литература

1.Буянов В.М. и др.// Клин. хир.- 1989.- № 11.- С. 24-26.

2.Власов А.П. и др. Системный липидный дистресс-синдром в хирургии - М.: Наука.- 2009.

3.Кубышкин В.А. и др. // Хирургия.- 1989.- № 7.- С. 138.

4.Рябов Г.Л. и др. // Вест. интен. тер.- 2002.- № 4.- С. 4-7.

5. Чаленко В.В., Кутушев Ф.Х. // Вестн. хир. им.

И.И. Грекова.- 1990.- № 4.- С. 3-8.

УДК 579.222.2:543.553

БИОСЕНСОРНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ МИКРОБНОГО ОКИСЛЕНИЯ АЛКАНОВ НОРМАЛЬНОГО СТРОЕНИЯ С ДЛИНОЙ ЦЕПИ С6-С16

Н.Л. ЛАГУНОВА*

На основе биосенсорной регистрации изменения дыхательной активности штамма-нефтедеструктора Pseudomonas chlororaphis PCL1391(pOV17) в присутствии алканов нормального строения отмечен ряд особенностей окисления алифатических субстратов, связанных с длиной углеродного скелета субстрата, его растворимостью, токсичностью самого алкана, а также интермедиатов его микробной трансформации. Выявлена корреляция между результатами биосенсорных исследований и ростовыми и культуральными характеристиками штамма при выращивании в парах алканов.

Ключевые слова: активность штамма-нефтедеструктора Pseudomonas chlororaphis PCL1391

В последнее время перспективным способом очистки почв и вод от нефтепродуктов считается биоремедиация, осуществляемая путем стимуляции аборигенных микроорганизмов, селекции и последующей реинтродукции бактерий-нефтедеструкторов, фиторемедиации и биоаугментации [1]. Для подбора технологии восстановления загрязненных почв и вод необходимо предвари-

тельно исследовать особенности микробной трансформации нефтекомпонентов. Представляется важным изучение механизмов окисления бактериями-нефтедеструкторами наиболее токсичной легкой фракции нефти, большую часть которой составляют метановые углеводороды нормального строения.

Окисление алканов микроорганизмами непосредственно связано с потреблением кислорода [2], что дает возможность использовать биосенсоры амперометрического типа на основе кислородного электрода для характеристики биохимического поведения микробных клеток [3].

Цель работы - применить биосенсорные технологии для изучения закономерностей микробного окисления алканов нормального строения с длиной цепи С6-С16.

Материалы и методы. Исследуемый штамм-нефтедеструктор P^Mororaphis PCL1391(pOV17) предоставлен лабораторией биологии плазмид ИБФМ РАН. Сочетание бактериального хозяина P^Mororaphis PCL1391 и катаболической плазмиды pOV17 было признано наилучшим при определении окислительных свойств и жизнеспособности 3 штаммов Pseudomonas, модифицированных плазмидами деградации нафталина, а также аналитических характеристик биосенсоров на их основе [4]. Культивирование бактерий вели на чашках Петри с агаризованной минимальной средой Эванса [5] в парах нафталина в течение 3-х дней при комнатной температуре.

Формирование рецепторного элемента осуществляли включением бактериальных клеток в агаровый гель согласно предложенной ранее методике [6]. Биосенсорные измерения производили по методике, описанной в [6]. Измеряемыми параметрами (сигналами сенсора) являлись максимальная скорость (нА/с) и амплитуда (нА) изменения выходного сигнала (отклика) биосенсора при добавлении субстратов.

В работе использовали алканы нормального строения со степенью чистоты х.ч.: гексан, октан, нонан, декан, ундекан, додекан, гексадекан (Химмед, Россия) (содержание данных веществ в кювете составляло 0,34 мМ) и дизельное топливо (ДТ). Исследуемые соединения вводили автоматическими пипетками с варьируемым объемом (5-40 мкл, 50-200 мкл) (Ленпипет, Россия).

Статистическую обработку результатов проводили по программам М8 Excel 2003, Sigma Plot 9.0. Повторяемость экспериментов трехкратная, если нет дополнительного описания.

Результаты. Фактор природы доступного бактериальным клеткам субстрата является лимитирующим экзогенным экологическим фактором, непосредственно влияющим на интенсивность метаболических процессов микроорганизмов.

Влияние субстратов, вводимых в измерительную кювету биосенсорной установки, оценивали по величине ответа и виду отклика биосенсора, а также по изменению уровня базового тока, количественно отражающего эндогенное дыхание бактериальных клеток, в результате последовательных заколов порций субстратов в течение нескольких часов и дней.

Величины скоростей развития отклика на алканы (рис.1) невысоки по сравнению с величинами сигналов биосенсора на ароматические субстраты и глюкозу [4] (0,015 нА/с в среднем на алканы против 0,13 нА/с в среднем на глюкозу и ароматические кислоты). Предпочтительное использование энергоемких субстратов характерно для бактерий рода Pseudomonas.

ТулГУ, каф. химии, 300600, г. Тула, пр.Ленина,92, т.8-(4872)35-18-40

Рис. 1. Величины скоростей изменения силы тока при введении алканов с длиной цепи С6-С16

Также необходимо отметить, что при поступлении в измерительную кювету биосенсора только алканов в течение суток и

более, уровень базового тока постепенно снижался, что свидетельствует об уменьшении количества бактериальных клеток в рецепторном элементе. За неделю эндогенное дыхание псевдомонад уменьшается на 50-60% (соответствует относительному росту содержания О2 в кювете на 0,63 г/л), что говорит о превалировании процессов гибели микроорганизмов над размножением в 2 раза. Все это позволяет заключить, что алканы являются недостаточными субстратами для плазмидосодержащих клеток.

Быстрее всех в катаболизм вовлекаются гексан и ундекан, гексадекан окисляется медленнее, что может быть объяснено ограничениями диффузии крупной молекулы в агар рецепторного элемента. Это подтверждается внешним видом отклика - зависимостью изменения силы тока от времени (рис. 2 А, Б).

А

« too 300 МО •» МС ЮС 7К>

ные мембраны [2]. Вид кривой зависимости величины силы тока от времени для гексана (рис.2В) может свидетельствовать о процессах ингибирования мембранлокализованных ферментных систем окисления алканов токсичным для клеток гексаном.

Градуировочная зависимость ответов сенсора от содержания гексана в измерительной кювете также имеет вид пика (рис.3А), причем зависимость с выбранным параметром амплитуды силы тока (данный параметр отражает общий объем кисло-родзависимых превращений субстрата) характеризуется более выраженным экстремумом (рис.ЗБ).

Содержание гексана, мМ

Б.

Рис. 3. Градуировочная зависимость ответов сенсора от содержания гексана в измерительной кювете, измеряемый параметр: А - скорость изменения тока, Б - амплитуда изменения силы тока

Классические зависимости величины ответа сенсора от концентрации субстрата имеют сигмоидальный вид, их аппроксимация проводится с помощью уравнения Хилла с тремя параметрами (программа Sigma Plot 9.0):

А

Б

В

Рис. 2. Вид типичного отклика сенсора

При вовлечении гексадекана в клеточный метаболизм не происходит выхода кривой зависимости силы тока от времени на плато в течение 10 минут. Такие же ограничения свойственны ходу реакций окисления нонана, декана и ундекана, но в меньшей степени. Самая низкая скорость развития отклика биосенсора характерна для додекана и ДТ (рис.1), более того, в случае с додеканом отклика может не быть вовсе. Эти данные можно объяснить присутствием в ДТ присадок и антиокислителей и бактериостатическими свойствами интермедиатов окисления додекана - додеканола и додеканаля [7].

Высокая скорость окисления алканов, содержащих в цепочке менее 9 атомов углерода, объясняется лучшей растворимостью в воде и легким проникновением наиболее токсичных короткоцепочечных соединений в клетки бактерий через дезорганизован-

где:

а - максимальный ответ биосенсора прямо пропорционален максимальной скорости ферментативной реакции Vmax,

с - константа Михаэлиса, КМ - концентрация полунасы-щения, т.е. концентрация субстрата, при которой v=Vmax/2, х - концентрация субстрата [5],

b - коэффициент кооперативности h (коэффициент Хилла), при h = 1 это уравнение превращается в классическое уравнение Михаэлиса - Ментена:

v = V max [S ] .

KM + [S ]

Зависимость ответов сенсора от уровня гексана в измерительной кювете имеет вид пика и описывается логарифмическим уравнением с коэффициентом смешанной корреляции R2=0,9996:

Проведенный анализ литературных данных показал, что именно экстремальная зависимость скорости реакции от концентрации субстрата описывает в ферментативной кинетике процесс ингибирования фермента субстратом [8].

Учитывая тот факт, что вид градуировочной зависимости изменения амплитуды силы тока от содержания гексана в кювете более ярко отражает процесс ингибирования микробных ферментов окисления алканов данным субстратом (рис.3Б), был проведен анализ величин амплитуд изменения силы тока биосенсора при окислении алканов с различной длиной углеродного скелета. Результаты позволили сделать вывод, что объем кислородзави-симых превращений примерно одинаков для всех субстратов, кроме додекана и ДТ (рис. 4).

ТЇ h ҐІ ІІ

-г 3

Таким образом, использование биосенсорных технологий позволяет определить особенности окисления алканов бактериальными клетками, связанные с длиной углеродного скелета субстрата, его растворимостью, токсичностью самого алкана, а также интермедиатов его микробной трансформации.

Благодарности. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 08-04-99019-р_офи.

Литература

1. Margesin R., Schinner F. // Appl. Microbiol. Biotechnol.-1997.- Vol.47, № 4.- P.462-468.

2. Van Hamme J.D, et а1. // Microbiol.Mol.Biol.Rev.- 2003.-Vol.67, № 4.- Р.503-549.

3. Beyersdorf-Radeck B. et а1.П Microbiol Res.- 1998.- Vol. 153, №3.- Р.239-245.

4. Лагунова Н.Л. и др. // Известия ТулГУ. Серия ЕН, Вып.1.- 2007.- С.243-252.

5. Evans C., et а1. // Methods in Microbiology.- 1970.- Vol.2, №4.- P.277-327.

6. Лагунова Н.Л. и др. // Известия ТулГУ. Серия Химия, Вып.6.- 2006.- С.179-188.

7. Петров А.А. Химия алканов.- М., 1986.- 394 с.

8. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика.- М.: ФА-ИР-ПРЕСС, 1999.- 720 с.

THE BIOSENSOR DETERMINATION OF THE CHARACTERISTICS OF MICROBIAL OXIDATION OF N-ALKANE WITH C6-C16 CHAIN LENGTH

N.L. LAGUNOVA Summary

The method based on measurement of respiration activity of immobilized microorganisms by Clark electrode was used for assessment. The characteristics of n-alkane oxidation by Pseudomonas chlororaphis PCL1391(pOV17), which able to degrade the hydrocarbons from crude oil, were obtained. The biosensor assessment shown, that respiration activity of microorganisms depend on n-alkane properties: length of carbonic backbone, solubility, alkane toxicity, as well as toxicity of intermediaties of alkane microbial transformation.

Key words: biosensor, respiration activity, microorganisms

Рис. 4. Величины амплитуд изменения силы тока при введении алканов с длиной цепи С6-С16

Этот факт может свидетельствоваговорить о том, что био-сенсорным способом регистрируются лишь начальные этапы метаболических превращений субстрата - окисление алкана с участием кислорода до соответствующих спирта, альдегида и карбоновой кислоты [2]. Полученные данные по закономерностям окисления алканов нормального строения с длиной цепи С6-С16 с помощью биосенсорного подхода были подтверждены ростовыми и культуральными характеристиками бактерий на данных субстратах (табл.1).

Таблица 1

Ростовые и культуральные характеристики Р.сЬ1огогарЬІ8РСЬ1391(рОУ17) при выращивании в парах алканов

Субстрат Размер колоний, мм Интенсивность роста Продолжительность роста, нед.

Гексан < 0,1 + + 1

Октан < 0,1 + + 1

Нонан 0,1 - 0,5 + + 2

Декан 0,1 - 0,5 + + 2

Ундекан 0,1 - 0,5 + + 2

Додекан < 0,1 + 1

Г ексадекан 0,5 - 1,0 + + + 3

Самая низкая интенсивность роста у микроорганизмов на додекане, колонии практически неразличимы. Наименьший размер колоний и длительность бактериального роста характерны и для токсичных низкомолекулярных алканов - гексана и октана.

Несмотря на своевременную замену кольцевых шлангов с алканами по мере испарения, продолжительность роста колоний штамма Р.сЫогогарШзРСЬ1391(рОУ17) на данных субстратах (кроме гексадекана) невысокая (1-2 недели). Это подтверждает сделанный ранее вывод по результатам биосенсорных измерений о том, что алканы являются недостаточными субстратами для бактерий, содержащих нафталиновую плазмиду. Самый интенсивный рост, крупные колонии и наибольшая продолжительность роста данного штамма отмечена на гексадекане, что объясняется большей энергоемкостью длинной молекулы при р-окислении.

УДК 616/711-002

СИСТЕМНЫЙ АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ КИНЕЗОТЕРАПИИ НА ФОСФОРНО-КАЛЬЦИЕВЫЙ ОБМЕН И СОСТОЯНИЕ МИНЕРАЛЬНОЙ ПЛОТНОСТИ КОСТНОЙ ТКАНИ У ЛЮДЕЙ С ОСТЕОХОНДРОЗОМ ПОЗВОНОЧНИКА

Г.С. КОЗУПИЦА, В.М. ЕСЬКОВ, И.А. ВАСЕЛЬЦОВА, О.Н. БИЛЕНЬКАЯ*

Проблема остеохондроза позвоночника привлекает большое внимание отечественных и зарубежных специалистов, что обусловлено как распространённостью данного заболевания, так и полиморфизмом синдромов. Отмечается устойчивая тенденция к увеличению количества больных с этой патологией.

Ключевые слова: остеохондроз позвоночника, кинезотерапия

Ситуация осложняется рецидивами, которые возникают зачастую спустя некоторое время после лечения в стационаре [3, 10]. Сказанное связано с тем, что проведённое лечение коснулось лишь симптомов заболевания, не вторгаясь в патогенетический механизм проблемы [2, 4, 5]. Поэтому в последние годы большое внимание уделяется разработке новых способов лечения и реабилитации больных с применением безмедикаментозных средств: современные физиотерапевтические методы, массаж, мануальная терапия, лечебная физическая культура, кинезотерапия [3, 8, 9].

Цель исследования - улучшение результатов лечения больных с остеохондрозом позвоночника путём разработки и внедрения в практику комплексного лечения метода кинезотера-пии. В настоящем исследовании ставилась задача по выяснению влияния занятий кинезотерапией у больных с остеохондрозом позвоночника на состояние фосфорно-кальциевого обмена и минеральной плотности костной ткани.

Материал и методы. Был проведён анализ лечения 97 больных с остеохондрозом позвоночника, прошедших курс лечения в неврологическом отделении Городской клинической

* ХМАО, г. Сургут, ул. Энергетиков 14, СурГУ