КОДИРУЮЩИЕ ФАКТОР VIII ВАРИАНТЫ С ПОНИЖЕННЫМ СОДЕРЖАНИЕМ CPG, КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ, И ПРИМЕНЕНИЕ В ЛЕЧЕНИИ НАРУШЕНИЙ ГЕМОСТАЗА

1. Вариант нуклеиновой кислоты, кодирующей фактор VIII (FVIII), имеющий делецию B-домена, при этом вариант нуклеиновой кислоты имеет идентичность 92% или более с SEQ ID NO:7.
2. Вариант нуклеиновой кислоты по п.1, при этом вариант нуклеиновой кислоты имеет 93% или большую идентичность последовательности с SEQ ID NO:7.
3. Вариант нуклеиновой кислоты по п.1, при этом вариант нуклеиновой кислоты имеет 94% или большую идентичность последовательности с SEQ ID NO:7.
4. Вариант нуклеиновой кислоты по п.1, при этом вариант нуклеиновой кислоты имеет 95% или более идентичность последовательности с SEQ ID NO:7.
5. Вариант нуклеиновой кислоты по п.1, при этом вариант нуклеиновой кислоты имеет 95%-100% идентичность последовательности с SEQ ID NO:7.
6. Вариант нуклеиновой кислоты по п.1, при этом вариант нуклеиновой кислоты имеет 20 или меньше, 15 или меньше, или 10 или меньше динуклеотидов цитозин-гуанин (CpG).
7. Вариант нуклеиновой кислоты по п.1, при этом вариант нуклеиновой кислоты имеет не более 5 динуклеотидов цитозин-гуанин (CpG).
8. Вариант нуклеиновой кислоты по п.1, при этом вариант нуклеиновой кислоты имеет 4, 3, 2, 1 или 0 динуклеотидов цитозин-гуанин (CpG).
9. Вариант нуклеиновой кислоты по п.1, при этом вариант нуклеиновой кислоты имеет 0 динуклеотидов цитозин-гуанин (CpG).
10. Вариант нуклеиновой кислоты по п.1, при этом вариант нуклеиновой кислоты кодирует SEQ ID NO:25, имеющую делецию одной или более аминокислот последовательности SFSQNPPVLKRHQR (SEQ ID NO:29), или делецию всей последовательности SFSQNPPVLKRHQR.
11. Вариант нуклеиновой кислоты по п.1, при этом вариант нуклеиновой кислоты кодирует SEQ ID NO:25.
12. Вариант нуклеиновой кислоты, кодирующей фактор VIII (FVIII), имеющий делецию В-домена (FVIII-BDD), при этом вариант нуклеиновой кислоты имеет меньше динуклеотидов цитозин-гуанин (CpG), чем SEQ ID NO:19.
13. Вариант нуклеиновой кислоты по п.12, при этом указанный FVIII-BDD относится к млекопитающему.
14. Вариант нуклеиновой кислоты, кодирующей фактор VIII человека, имеющий делецию В-домена (hFVIII-BDD), при этом вариант нуклеиновой кислоты имеет не более 2 динуклеотидов цитозин-гуанин (CpG).
15. Вариант нуклеиновой кислоты по п.14, при этом вариант нуклеиновой кислоты имеет 1 динуклеотид цитозин-гуанин (CpG).
16. Вариант нуклеиновой кислоты по п.14, при этом вариант нуклеиновой кислоты не имеет динуклеотидов цитозин-гуанин (CpG).
17. Вариант нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-16, в котором кодируемые FVIII-BDD или hFVIII-BDD идентичны hFVIII-BDD, кодируемому SEQ ID NO:19.
18. Вариант нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-17, при этом вариант нуклеиновой кислоты отличается от FVIII-V3 (SEQ ID NO:20) и CO3 (SEQ ID NO:21).
19. Вариант нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-18, при этом вариант нуклеиновой кислоты кодирует SEQ ID NO:25, имеющую делецию одной или более аминокислот последовательности SFSQNPPVLKRHQR (SEQ ID NO:29) или делецию всей последовательности SFSQNPPVLKRHQR.
20. Вариант нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-18, при этом вариант нуклеиновой кислоты кодирует SEQ ID NO:25.
21. Вектор, содержащий вариант нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-20.
22. Экспрессионный вектор, содержащий вариант нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-20.
23. Экспрессионный вектор по п.22, выбранный из группы, состоящей из аденовирус-ассоциированного вирусного (AAV) вектора, пертовирусного вектора, аденовирусного вектора, плазмиды или лентивирусного вектора.
24. Экспрессионный вектор по п.23, при этом указанный AAV вектор содержит серотип AAV или псевдотип AAV, при этом указанный псевдотип AAV содержит серотип AAV капсида, отличающийся от серотипа ITR.
25. Экспрессионный вектор по п. 23 или 24, дополнительно содержащий интрон, контролирующий экспрессию элемент, один или более инвертированный концевой повтор (ITR) аденоассоциированный вирус (AAV) и/или полинуклеотидную последовательность-филлер.
26. Экспрессионный вектор по п.25, в котором интрон находится внутри или фланкирует вариант нуклеиновой кислоты.
27. Экспрессионный вектор по п.25, в котором контролирующий экспрессию элемент функционально связан с вариантом нуклеиновой кислоты.
28. Экспрессионный вектор по п.25, в котором ITR AAV фланкируют 5'- или 3'-конец варианта нуклеиновой кислоты.
29. Экспрессионный вектор по п.25, в котором полинуклеотидная последовательность-филлер фланкирует 5'- или 3'-конец варианта нуклеиновой кислоты.
30. Экспрессионный вектор по любому из пп. 25-29, в котором интрон, контролирующий экспрессию элемент, один или более инвертированных концевых повторов (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV) и/или полинуклеотидная последовательность-филлер были модифицированы, чтобы иметь пониженное содержание динуклеотидов цитозин-гуанин (CpG).
31. Экспрессионный вектор по любому из пп. 25-29, в котором интрон, контролирующий экспрессию элемент, один или более инвертированных концевых повторов (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV) и/или полинуклеотидная последовательность-филлер были модифицированы, чтобы иметь 20 или менее, 15 или менее, 10 или менее, 5 или менее или 0 динуклеотидов цитозин-гуанин (CpG).
32. Экспрессионный вектор по любому из пп. 25, 27, 30 и 31, в котором контролирующий экспрессию элемент содержит конститутивный или регулируемый контролирующий элемент, или тканеспецифический контролирующий экспрессию элемент, или промотор.
33. Экспрессионный вектор по любому из пп. 25, 27, 30 и 31, в котором контролирующий экспрессию элемент представляет собой элемент, который обеспечивает экспрессию в печени.
34. Экспрессионный вектор по любому из пп. 25, 27, 30 и 31, в котором контролирующий экспрессию элемент содержит промотор TTR или мутантный промотор TTR.
35. Экспрессионный вектор по п.34, в котором мутантный промотор TTR содержит SEQ ID NO:22.
36. Экспрессионный вектор по любому из пп. 25-35, в котором ITR содержит один или более ITR любого из: серотипов AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 или AAV-2i8 AAV или их комбинацию.
37. Экспрессионный вектор по любому из пп. 24-30, при этом вектор содержит ITR, промотор, поли-А-сигнал и/или интронную последовательность, изложенную в SEQ ID NO:23.
38. AAV вектор, содержащий вариант нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-20 или экспрессионный вектор по любому из пп. 25-37.
39. AAV вектор по п.38, при этом AAV вектор содержит модифицированную или вариантную последовательность капсида AAV VP1, VP2 и/или VP3 или последовательность капсида AAV VP1, VP2 и/или VP3 дикого типа.
40. AAV вектор по п.38, в котором AAV вектор содержит модифицированную или вариантную последовательность капсида AAV VP1, VP2 и/или VP3, имеющую 90% или большую идентичность с последовательностями AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 или AAV-2i8 VP1, VP2 и/или VP3.
41. AAV вектор по п.38, в котором вектор AAV содержит последовательность капсида VP1, VP2 или VP3, выбранную из любого из: серотипов AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 или AAV-2i8 AAV.
42. AAV вектор по п.38, в котором вектор AAV содержит капсид, имеющий 90% или большую идентичность последовательности с капсидом LK03 (SEQ ID NO:27).
43. AAV вектор по п.38, в котором вектор AAV содержит капсид, имеющий 90% или большую идентичность последовательности с капсидом SPK (SEQ ID NO:28).
44. AAV вектор по п.38, в котором AAV вектор содержит капсид LK03 (SEQ ID NO:27).
45. AAV вектор по п.38, в котором AAV вектор содержит капсид SPK (SEQ ID NO:28).
46. AAV вектор по п.38, в котором AAV вектор содержит вариант нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:7 и последовательность капсида LK03 (SEQ ID NO:27).
47. AAV вектор по п.38, в котором AAV вектор содержит вариант нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:7 и капсид SPK (SEQ ID NO:28).
48. AAV вектор по п.38, в котором AAV вектор содержит вариант нуклеиновой кислоты и одно или более из мутированного промотора TTR (TTRmut), синтетического интрона, поли-A и ITR в SEQ ID NO:23.
49. AAV вектор по п.38, в котором AAV вектор содержит вариант нуклеиновой кислоты и одно или более из мутированного промотора TTR (TTRmut), синтетического интрона, поли-A и ITR в SEQ ID NO:23 и последовательности капсида LK03 (SEQ ID NO:27) или капсида SPK (SEQ ID NO:28).
50. Клетка-хозяин, содержащая вариант нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-20, или вектор или экспрессионный вектор по любому из пп. 21-37.
51. Клетка-хозяин по п.50, при этом указанные клетки-хозяева экспрессируют FVIII, кодируемый указанным вариантом нуклеиновой кислоты.
52. Клетка-хозяин, содержащая AAV вектор по любому из пп. 38-49.
53. Клетка-хозяин по п.52, при этом указанные клетки-хозяева вырабатывают AAV вектор по любому из пп. 38-49.
54. Фармацевтическая композиция, содержащая вариант нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-20, вектор или экспрессионный вектор по любому из пп. 21-37 или AAV вектор по любому из пп. 38-49 в биологически совместимом носителе или эксципиенте.
55. Вариант нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-20, вектор или экспрессионный вектор по любому из пп. 21-37 или AAV вектор по любому из пп. 38-49, инкапсулированный в липосоме или смешанный с фосфолипидами или мицеллами.
56. Фармацевтическая композиция по п.54, дополнительно содержащая пустой капсид AAV.
57. Фармацевтическая композиция по п.54, дополнительно содержащая пустой капсид серотипа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 и/или AAV-Rh74.
58. Фармацевтическая композиция по п.54, дополнительно содержащая пустой капсид AAV такого же серотипа, как и введенный AAV вектор.
59. Фармацевтическая композиция по п.54, в которой пустой капсид представляет собой капсид LK03 (SEQ ID NO:27) или капсид SPK (SEQ ID NO:28).
60. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 56-59, в которой соотношение указанных пустых капсидов с указанным AAV вектором составляет приблизительно 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 или 10:1.
61. Способ доставки или переноса последовательности нуклеиновых кислот в клетку млекопитающего, включающий введение или контакт варианта нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-20, вектора или экспрессионного вектора по любому из пп. 21-37 или AAV вектора по любому из пп. 38-49 указанному млекопитающему или в клетку млекопитающего, тем самым доставляя или перенося в клетку млекопитающего последовательность нуклеиновых кислот.
62. Способ лечения млекопитающего, нуждающегося в факторе VIII, включающий:
(a) предоставление варианта нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-20, вектора или экспрессионного вектора по любому из пп. 21-37 или AAV вектора по любому из пп. 38-49; и
(b) введение некоторого количества варианта нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-20, вектора или экспрессионного вектора по любому из пп. 21-37 или AAV вектора по любому из пп. 38-49 млекопитающему, при этом указанный фактор VIII экспрессируется у млекопитающего.
63. Способ по пп. 61 или 62, при этом указанный фактор VIII, кодируемый вариантом нуклеиновой кислоты, экспрессируется в клетке, ткани или органе указанного млекопитающего.
64. Способ по п.63, при этом клетка представляет собой секреторную клетку.
65. Способ по п.63, в котором клетка представляет собой эндокринную клетку или эндотелиальную клетку.
66. Способ по п.63, в котором клетка представляет собой гепатоцит, синусоидальную эндотелиальную клетку, мегакариоцит, тромбоцит или гемопоэтическую стволовую клетку.
67. Способ по п.63, в котором ткань или орган указанного млекопитающего представляет собой печень.
68. Способ по любому из пп. 61-67, при этом у млекопитающего вырабатывается недостаточное количество белка фактора VIII, или дефектного или аберрантного белка фактора VIII.
69. Способ по любому из пп. 61-67, при этом у млекопитающего имеется гемофилия A.
70. Способ по любому из пп. 61-67, в котором фактор VIII, кодируемый вариантом нуклеиновой кислоты, экспрессируется на уровнях, имеющих благотворное или терапевтическое действие на млекопитающее.
71. Способ лечения нарушения гемостаза нуждающегося в этом больного, содержащий введение терапевтически эффективного количества варианта нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-20, вектора или экспрессионного вектора по любому из пп. 21-37 или AAV вектора по любому из пп. 38-49 в биологически совместимом носителе больному.
72. Способ по пп. 61, 62 или 71, при этом указанное млекопитающее или указанный больной имеет расстройство, выбранное из группы, состоящей из гемофилии A, болезни фон Виллебранда и кровотечения, связанного с травмой, повреждением, тромбозом, тромбоцитопенией, инсультом, коагулопатией, диссеминированным внутрисосудистым свертыванием (ДВС) и лечением расстройств, сопровождающихся чрезмерным угнетением свертывания.
73. Способ по любому из пп. 61-72, при этом вариант нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-20, вектор или экспрессионный вектор по любому из пп. 21-37 или AAV вектор по любому из пп. 38-49 доставляют указанному млекопитающему или указанному больному внутривенно, внутриартериально, внутримышечно, подкожно, внутрь полости, или интубационно или через катетер.
74. Способ по любому из пп. 61-72, при этом FVIII экспрессируется на уровнях по существу без повышенного риска тромбоза.
75. Способ по п.74, при этом указанный риск тромбоза определяют посредством измерения продуктов разложения фибрина.
76. Способ по любому из пп. 61-72, при этом FVIII экспрессируется на уровнях более 1% от уровней FVIII, обнаруженных у субъекта без гемофилии A.
77. Способ по любому из пп. 61-72, при этом FVIII экспрессируется на уровнях более 3% от уровней FVIII, обнаруженных у субъекта без гемофилии A.
78. Способ по любому из пп. 61-72, при этом активность FVIII определяют в течение по меньшей мере 1, 2, 3 или 4 недель, или по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 месяцев, или по меньшей мере 1 года.
79. Способ по любому из пп. 61-72, при этом FVIII экспрессируется на уровнях более 1% или 3% от уровней FVIII, обнаруженных у субъекта без гемофилии A в течение по меньшей мере 1, 2, 3 или 4 недель, или по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 месяцев, или по меньшей мере 1 года.
80. Способ по любому из пп. 61-72, при этом FVIII экспрессируется на уровнях, имеющих терапевтическое действие, в тчение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней, недель или месяцев.
81. Способ по любому из пп. 61-72, при этом указанный FVIII присутствует у млекопитающего или больного на уровнях, составляющих приблизительно 20% активности FVIII или более 20% активности в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 календарных дней, недель или месяцев.
82. Способ по любому из пп. 61-72, при этом указанный FVIII экспрессируется на уровнях по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49% или 50% от нормальных уровней FVIII.
12
83. Способ по любому из пп. 61-72, в котором AAV вектор вводят в дозе, меньшей, чем 1×10 векторных геномов на килограмм (вг/кг) млекопитающего или больного, и указанный FVIII вырабатывается у млекопитающего или больного на уровнях, составляющих приблизительно 20% активности или более 20% активности в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 календарных дней, недель или месяцев.
11
84. Способ по любому из пп. 61-72, в котором AAV вектор вводят в дозе, составляющей приблизительно 5×10 векторных геномов на килограмм (вг/кг) млекопитающего или больного, и указанный FVIII вырабатывается у млекопитающего или больного на уровнях, составляющих приблизительно 20% активности или более 20% активности в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 календарных дней, недель или месяцев.
85. Способ по любому из пп. 61-84, при этом указанным млекопитающим или указанным больным является человек.
86. Способ по любому из пп. 61-85, при этом указанное млекопитающее, указанный больной или указанный человек являются AAV-серопозитивными или -серонегативными.
87. Способ по любому из пп. 61-86, дополнительно включающий введение пустого капсида AAV указанному млекопитающему или указанному больному.
88. Способ по любому из пп. 61-86, дополнительно включающий введение пустого капсида серотипа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 и/или AAV-Rh74.
89. Способ по любому из пп. 61-86, дополнительно включающий введение пустого капсида AAV такого же серотипа, как и вводимый AAV вектор.
90. Способ по п.89, в котором пустой капсид представляет собой капсид LK03 (SEQ ID NO:27) или капсид SPK (SEQ ID NO:28).
91. Способ по любому из пп. 87-90, в котором соотношение указанных пустых капсидов и указанного AAV вектора составляет приблизительно 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 или 10:1.
92. Способ по любому из пп. 61-91, дополнительно включающий введение иммуносупрессивного средства.
93. Способ по любому из пп. 61-91, дополнительно включающий введение иммуносупрессивного средства после введения AAV вектора.
94. Способ по любому из пп. 61-91, дополнительно включающий введение иммуносупрессивного средства от момента времени в течение 1 часа вплоть до 45 дней после введения AAV вектора.
95. Способ по любому из пп. 92-94, в котором иммуносупрессивное средство содержит стероид, циклоспорин (напр., циклоспорин A), микофенолат, ритуксимаб или его производное.
8
14
96. Способ по любому из пп. 61-95, в котором вектор AAV вводят в диапазоне от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 векторных геномов на килограмм (вг/кг) массы млекопитающего или больного.
9
13
97. Способ по любому из пп. 61-95, в котором AAV вектор вводят в диапазоне от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 векторных геномов на килограмм (вг/кг) массы млекопитающего или больного.
10
12
98. Способ по любому из пп. 61-95, в котором AAV вектор вводят в диапазоне от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 векторных геномов на килограмм (вг/кг) массы млекопитающего или больного.
11
12
99. Способ по любому из пп. 61-95, в котором AAV вектор вводят в диапазоне от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 векторных геномов на килограмм (вг/кг) массы млекопитающего или больного.
12
13
100. Способ по любому из пп. 61-95, в котором AAV вектор вводят в диапазоне от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 векторных геномов на килограмм (вг/кг) массы млекопитающего или больного.
13
14
101. Способ по любому из пп. 61-95, в котором AAV вектор вводят в диапазоне от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 векторных геномов на килограмм (вг/кг) массы млекопитающего или больного.
11
12
102. Способ по любому из пп. 61-95, в котором AAV вектор вводят в диапазоне от приблизительно 5×10 до приблизительно 1×10 векторных геномов на килограмм (вг/кг) массы млекопитающего или больного.
11
103. Способ по любому из пп. 61-95, в котором AAV вектор вводят в дозе, составляющей приблизительно 5×10 векторных геномов на килограмм (вг/кг) массы млекопитающего или больного.
104. Способ по любому из пп. 61-103, дополнительно включающий обследование или мониторинг млекопитающего на наличие или количество антител к AAV, иммунного ответа против AAV, антител к FVIII, иммунного ответа против FVIII, количеств FVIII, уровня активности FVIII, количеств или уровней одного или более печеночных ферментов или частоты и/или тяжести и продолжительности эпизодов кровотечения.
105. Способ выработки белка FVIII, включающий экспрессию в клетке варианта нуклеиновой кислоты, по любому из пп. 1-20, или вектора или экспрессионного вектора по любому из пп. 21-37, и извлечение указанного белка FVIII, выработанного клетками.
106. Способ по п.105, дополнительно включающий очистку или выделение указанного белка FVIII, выработанного клетками.