СПОСОБ ИЗМЕРЕНИЙ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ (КАТАЛИТИЧЕСКОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ) ФЕРМЕНТОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДОВ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ И СПЕКТРОФОТОМЕТРИИ С ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ ИДЕНТИФИКАЦИЕЙ ЦЕЛЕВОГО АНАЛИТА И ОПРЕДЕЛЕНИЕМ ЧИСТОТЫ ВЕЩЕСТВ
METHOD OF MEASURING CATALYTIC ACTIVITY (CATALYTIC CONCENTRATION) OF ENZYMES USING METHODS OF MASS SPECTROMETRY AND SPECTROPHOTOMETRY WITH PRELIMINARY IDENTIFICATION OF TARGET ANALYTE AND DETERMINATION OF PURITY OF SUBSTANCES

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области клинической диагностики и биохимии, в части создания методов, позволяющих измерять каталитическую активности веществ и может использоваться для идентификации и определения параметров каталитической активности предварительно неизвестных биологически активных веществ.
Уровень техники
Для решения различных диагностических задач необходимо количественно оценивать активность ферментов в единицах каталитической концентрации «катал».
Существует значительное число запатентованных способов и устройств определения каталитической активности веществ [1-6]. Известны способы определения активности ферментов, одобренные Международной федерацией клинической химии (IFCC). Согласно положений методики [1] измерение активности α-амилазы заключается в спектрофотометрическом измерении накопления окрашенного продукта реакции. Скорость изменения оптической плотности прямо пропорциональна активности общей α-амилазы. В качестве субстрата используется 4,6-ethylidene-(G7)-p-nitrophenil-(G1)-α,D-maltoheptaoside (4,6-этилден-(G7)-п-нитрофенил-(G1)-α,D-мальтогептазид; Et-G7PNP). В процессе реакции α-амилаза расщепляет Et-G7PNP до G2PNP, G3PNP, G4PNP, Et-G3, Et-G4 и Et-G5. После этого α-глюкозидаза гидролизует G2PNP, G3PNP и G4PNP с образованием глюкозы и окрашенного вещества п-нитрофенола [7]. Наиболее близким по технической сущности является способ измерения каталитической активности, приведенный в [1] (далее - прототип).
Упомянутые в аналогах изобретения прямые оптические методы имеют ограничения, связанные с возможностью измерения каталитической концентрации образцов, содержащих априорно известные ферменты, в узком диапазоне анализируемых веществ.
Данная техническая проблема не могла быть решена при осуществлении или использовании прототипа изобретения в связи с:
- отсутствием идентификации неизвестных соединений;
- отсутствием определения чистоты целевого аналита - фермента.
С помощью изобретения, решается техническая проблема идентификации неизвестных соединений с применением базы данных масс-спектров высокого разрешения, с последующим определением чистоты целевого аналита и измерения его каталитической активности.
Раскрытие сущности изобретения
Изобретение направлено на создание метода метрологического обеспечения измерений каталитической активности/концентрации «неизвестных» аналитов, на устранение ограничения в измерении характеристик только известных ферментов, расширение возможностей измерений характеристик неизвестных веществ, совместное использование обоих методов.
При использовании предлагаемого к патентованию способа достигаются:
- возможность измерений каталитической активности/концентрации априорно неизвестного соединения благодаря его идентификации, определения его чистоты, позволяющие подобрать оптимальные условия протекания реакции, определить продукт реакции, необходимые коферменты, кофакторы;
- повышение точности измерений неизвестных соединений (достигаемая благодаря предварительной идентификации и определению чистоты аналита).
Таким образом, изобретаемый способ позволяет метрологически обеспечить анализ каталитической концентрации неизвестных образцов. Неизвестными образцами могут быть растворы, биологические жидкости, фармсубстанции.
Существенные признаки изобретения:
1. Идентификация биологически активных веществ осуществляется масс-спектрометрическим методом с использованием базы данных масс-спектров.
2. Вычисление чистоты целевого аналита проводится путем вычитания из общей массы вещества массы примесей, измеренной масс-спектрометром.
3. Достижение следующих метрологических характеристик метода:
-7
-6
3
- диапазон измерений каталитической активности (каталитической концентрации) биологических веществ, (от 7,8⋅10 до 9,4⋅10) кат/дм,
- расширенная неопределенность измерений каталитической активности (k=2), (от 1,5 до 15) %.
Техническим результатом изобретения является расширение числа анализируемых ферментов; достижение точности измерений «неизвестных» ферментов, гарантированной референтными методиками IFCC для априорно известных; обеспечение достоверной идентификации и определения чистоты аналитов.
Указанный технический результат для априорно известных идентифицированных ферментов достигается за счет выполнения всех прописанные в методиках измерений операций. Для известных и «неизвестных» веществ с помощью масс-спектрометра определяют чистоту исходных веществ. Для «неизвестных» веществ проводят (при необходимости) идентификацию «неизвестного» анализируемого фермента, определяют количественное содержание аналита в пробе. Высокоэффективный жидкостный хроматограф применяют для разделения компонентов пробы, идентификации и определения характеристик аналита. Спектрофотометр позволяет определять оптическую плотность субстрата или продукта реакции в кинетическом режиме. Измерение каталитической активности (каталитической концентрации) веществ, субстраты или продукты реакции которых имеют поглощение в УФ-видимой части спектра, проводят спектрофотометрическим способом.
Осуществление изобретения
Изобретение осуществляется следующим образом:
1. Идентификация и измерение концентрации «неизвестного» фермента
1.1. Проводят идентификацию анализируемого фермента. Готовят раствор аналита в соответствующем растворителе. При необходимости анализа твердых проб, переводят пробу в раствор. Вводят пробу через ВЭЖХ в масс-спектрометр, проводят идентификацию и определяют химическую структуру аттестуемого вещества методами:
- масс-спектрометрии с электронной ионизацией и идентификацией по электронным библиотекам масс-спектров,
- квадрупольной масс-спектрометрией с времяпролетным детектором QTOF для веществ, анализируемых методами ВЭЖХ/УФ и ВЭЖХ/МС/МС.
1.2. Измеряют концентрацию фермента в пробе. При необходимости проводят пробоподготовку, освобождающую образец от большинства примесей.
1.3. Устанавливают аттестованное значение массовой доли чистых соединений, применяемых для измерения каталитической активности ферментов.
1.3.1. Предварительно подтверждают химическую структуру аттестуемого вещества методами:
- масс-спектрометрии с электронной ионизацией и идентификацией по электронным библиотекам масс-спектров,
квадрупольной масс-спектрометрией с времяпролетным детектором QTOF для веществ, анализируемых методами ВЭЖХ/УФ и ВЭЖХ/МС/МС.
1.3.2. Измеряют массовую долю всех примесей по соответствующим методикам. Массовую долю основного компонента вычисляют как 100% минус примеси по формуле (1).
ОК
где w - массовая доля основного компонента в измеряемом образце, %;
пр
w - массовая доля примесей, %.
В число рассматриваемых примесей включают все возможные для нахождения родственные примеси, ингибиторы реакции.
1.4. Определение специфической системы (набор реагентов) для осуществления конкретной каталитической реакции с данным ферментом:
- определение оптимальных условий протекания реакции - температуры, значения рН, наличия коферментов, стабилизаторов;
- приготовление соответствующего для выбранного катализатора субстрата;
- определение чистоты субстрата (п. 1.1).
1.5. Определение концентрации субстрата методом ВЭЖХ/УФ или ВЭЖХ/МС/МС.
1.6. Приготовление растворов реагентов, включающих коферменты и стабилизаторы каталитической реакции.
1.7. Измерение полученного значения рН растворов реагентов и доведение его до значения, необходимого для оптимального протекания реакции (как правило с абсолютной погрешностью не более ±0,001), при точно измеренном значении температуры раствора (37,00°С).
1.8. Для контроля правильности приготовления растворов реагентов и контроля точности методики измерений, с помощью спектрофотометра проводят измерение каталитической концентрации стандартного образца фермента и проверяют их соответствие значениям, приведенным в сертификате на стандартный образец. Положительный результат доказывает, что навески реагентов взяты точно, все растворы приготовлены правильно, условия приготовления и проведения реакции соблюдены.
1.9. Измеряют скорость изменения оптической плотности холостой пробы (не содержащей фермент), которая не должна превышать 1% от скорости изменения оптической плотности фермента. Это измерение проводят для того, чтобы учесть каталитическую активность холостой пробы, так как даже в отсутствии фермента каталитическая реакция может протекать (в связи с возможным загрязнением пробы во время приготовления растворов или от недостаточно чистых растворителей, или от влияния матрицы) с очень малой скоростью. При превышении этого значения находят источники загрязнения и устраняют их. С помощью графика зависимости абсорбции от времени скорость изменений оптической плотности вычисляют вычитанием значения тангенсов углов наклона аппроксимирующих прямых результата измерений и холостой пробы (фиг. 1).
1.10. Отбирают необходимую для анализа аликвоту пробы фермента (объема или навески).
1.11. Для постановки каталитической реакции соединяют необходимые для конкретного фермента реагирующие растворы и выдерживают время, необходимое для получения продукта реакции для конкретного фермента. На спектрофотометре в течении определенного времени записывают кинетику реакции [9].
1.12. Определяют каталитическую концентрацию продукта реакции, путем измерения приращения скорости протекания реакции. Каталитическая концентрация фермента вычисляется по формуле (2):
-1
где  - изменение абсорбции (c) после корректировки скорости изменения оптической плотности холостого реагента;
фермента
3
b - каталитическая концентрация фермента (мккат/дм);
k - коэффициент пропорциональности, зависящий от фермента.
Для контроля правильности приготовления растворов реагентов и контроля точности методики измерений, при наличии стандартного образца анализируемого фермента, с помощью спектрофотометра проводят измерение каталитической концентрации стандартного образца фермента и проверяют его соответствие значению, приведенному в сертификате на стандартный образец. При отсутствии стандартного образца используют аттестованные по процедуре приготовления образцы для сравнения.
2. Расчет неопределенности измерений каталитической концентрации фермента
2.1. Среднее значение измерений каталитической концентрации вычисляется по формуле (3):
Неопределенность измерений типа А вычисляется по формуле (4):
2.2. Неопределенность измерений типа В при измерении каталитической концентрации известного фермента в общем случае складывается из следующих составляющих:
- неточность измерений изменения скорости реакции в присутствии катализатора - измерений, проводимых с помощью спектрофотометра,
- неточность измерений периода времени реакции,
- неточность измерений объема реагентов дозатором,
- неточность измерений объема реагентов колбами,
- неточность измерений масс реагентов,
- неточность измерений рН растворов,
- неточность измерений температуры растворов,
- неточность линейной апроксимации графика зависимости абсорбции от времени.
Неопределенность типа В оценивается по формуле (5):
Суммарная неопределенность вычисляется по формуле (6):
Расширенная неопределенность с коэффициентом охвата k=2 вычисляется по формуле (7):
2.3. Неопределенность измерений типа В при измерении каталитической концентрации «неизвестного» фермента в общем случае складывается из тех же составляющих, что приведены в п. 3.2, с добавлением неопределенности от идентификации фермента.
Неопределенность типа В в этом случае оценивается по формуле (8):
Суммарная и расширенная неопределенность вычисляются по формулам (6) и (7).
Применение способа метрологического обеспечения измерений каталитической активности/концентрации неизвестных ферментов с их предварительной идентификацией и определением чистоты веществ позволяет расширить число анализируемых проб веществ - ферментов в биологической матрице, дает возможность измерять каталитическую активность/концентрацию априорно неизвестного соединения благодаря его идентификации, проводить измерения «неизвестных» соединений с высокой точностью, достигаемой благодаря предварительной идентификации и определению чистоты аналита.
Список источников:
1. Gerhard Schumann et al. IFCC Primary Reference Procedures for the Measurement of Catalytic Activity Concentrations of Enzymes at 37°C Part 8. Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of α-amylase. Clin Chem Lab Med 2006; 44(9): 1146-1155.
2. Реагент для определения активности общей α-амилазы: патент №RU 2417374 С1, РФ: МПК G01N 33/52 Яковлева Галина Евгеньевна, Черемисина Ксения Александровна, заявитель и правообладатель: Закрытое акционерное общество "Вектор-Бест".
3. Средства и способы определения количества полипептида нейротоксина и его каталитической и протеолитической активностей: патент №2545783, ЕР: МПК G01N 33/569, G01N 33/577 Пфайль Михаэль, Фридрих Йозеф, заявитель и правообладатель: МерцФарма ГмбХундКо. КгаА.
4. Способ определения неспецифической устойчивости патогенных микроогранизмов к антибиотикам на основании измерения каталитической активности фосфодиэстераз, расщепляющих циклический дигуанозинмонофосфат: патент №2518249, РФ: МПК C12Q 1/02, C12Q 1/44, G01N 33/569, G01N 33/573, G01N 33/577, Колесников А.В., Козырь А.В., Шемякин И.Г., заявитель и правообладатель: ФГБУН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.
5. Mass Spectrometric Determination Of Blood Enzyme Activity: патент US 2009/0305327 A1 МПК C12Q 1/02, C12Q 1/00, Jochen Franzen, Karsten Michelmann, Markus Kostrzewa, заявитель и правообладатель: Bruker Daltonik GmbH.
6. Method for Assaying Plasma Enzymes in Whole Blood: патент №US 2011/0104712 A1, МПК G01N 33/573, C12M 1/40, Myriam-LaureCubizolles, Marie-LineCosner, MagaliFaivre, PatrikPouteau, заявитель и правообладатель: Commissariat a l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives.
7. Kruse-Jarres J.D., Kaiser C., Hafkenscheid J.C.M. et al. Evaluation of a new a-amylase assay using 4,6-ethylidene-(G7)-1-4-nitrophenil-(G1)-α-D-maltoheptaoside as substrate // J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1988. Vol. 27. P. 103-113.
8. IRMM Catalogue. Certified Reference Materials 2017. https://crm.jrc.ec.europa.eu/graphics/cms_docs/rm_catalogue.pdf
9. Siekmarm L. et al. IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37 degrees C. Part 1. The concept of reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes. Clin Chem Lab Med 2002; 40(6):631-4.