ПИРРОЛИДОН-КАРБОНОВАЯ КИСЛОТА (РСА) ДЛЯ ОФТАЛЬМОЛОГИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ
PYRROLIDONE-CARBOXYLIC ACID (PCA) FOR OPHTHALMIC USE

Объектом по настоящему изобретению является пирролидон-карбоновая кислота (PCA) и/или ее фармацевтически приемлемые соли или производные для применения при лечении глазных заболеваний и/или нарушений.
Дополнительными объектами по настоящему изобретению являются композиции, содержащие пирролидон-карбоновую кислоту (PCA) и/или ее фармацевтически приемлемые соли или производные, по меньшей мере, один физиологически приемлемый эксципиент, и необязательно, по меньшей мере, один дополнительный активный ингредиент для применения при лечении глазных заболеваний и/или нарушений.
СУЩЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Заболевание и/или нарушения глаз может произойти в любом возрасте, начиная с  детского возраста.
Заболевание сухого глаза является нарушением, которое является результатом недостаточной продукции слезы (слезная гипосекреция): из-за частичной или полной атрофии, или из-за изменений часто на гормональной основе железы не способны более производить достаточно слезной жидкости, и глаз становится, таким образом, более или менее сухим.
Иногда, дренажная система является слишком активной.
Все это приводит к большему травматизму из-за постоянного движения век на глазной поверхности при каждом моргании, и недостаточного очищения их от чужеродных частиц или микробов. Кроме того, существует недостаток антител и лизоцима, слезных компонентов с высокой бактерицидной силой: риск контакта с инфекциями является, таким образом, очень высоким, даже с обычно безопасными возбудителями. Наиболее распространенными симптомами заболевания сухого глаза являются жжение, ощущение инородного тела в глазу, фотофобия, трудность раскрытия век при пробуждении и, в тяжелых случаях, боль и нечеткое зрение. Все эти нарушения увеличиваются в сухом, ветряном окружении, или там, где работает обогреватеть и кондиционер. Иногда, у пациентов, страдающих от слезной гипосекреции обильно слезятся глаза (особенно при наличии кератита, повреждения поверхности роговицы): слезная жидкость является однако очень водянистой, содержит мало слизистых компонентов, и быстро испаряется предоставляя роговицу действию внешних факторов. Многие люди с заболеванием сухого глаза также страдают от нарушений горла и околоносовой пазухи, таких как заложенность носа или синусит, хронический кашель, частые простуды, сезонные аллергии, заложенность в среднем ухе, головные боли.
Как правило, различают две формы заболеваний сухого глаза:
- первичная (синдром Шегрена), т.е. глазное проявление общего аутоиммунного заболевания, такого как, например, красная волчанка, ревматоидный артрит, склеродермия;
- вторичная, вследствие избыточного испарения слезной пленки (блефарит, конъюнктивит, продолжительное применение контактных линз, старческое снижение секреции, пониженная секреция вследствие приема лекарств, гиповитаминоз A, продолжительное применение глазных капель).
Заболевание сухого глаза является наиболее широко распространенной глазной патологией в мире; 11% людей в возрасте от 30 до 60 лет, и 14% людей старше 65 лет страдают от этого нарушения или заболевания.
Заболевание сухого глаза (также называемое «сухой глаз») может привести к серьезным нарушениям зрения и нестабильности слезной пленки, с возможным серьезным повреждением глазной поверхности.
В большинстве случаев, сухой глаз включает гиперосмолярность слезной пленки, и воспаление глазной поверхности.
Ключевыми патогенетическими механизмами сухого глаза являются: сниженная продукция слезы и/или избыточное испарение, гиперосмолярность, воспаление с повреждением эпителиальных клеток, и нестабильность слезной пленки (поверхность раздела роговица-слезы).
В таком случае, можно получить преходящий профиль (т.е. предполагающий выздоровление) или, когда патологический профиль существует в течение долгого времени, с продолжающимся повреждением клеток без лечения, заболевание становится необратимым.
До настоящего времени не существует эффективного метода лечения заболевания сухого глаза или связанных с ним нарушений (гиперосмолярность или воспаление). Несмотря на доступность многих местных терапевтических средств (заменители слезы), долговременные результаты терапии заболеваний слезной пленки часто разочаровывают и не являются очень длительными.
Применение заменителя слезы должно поддерживать хорошую остроту зрения у пациента и восстановить комфорт.
Как правило, лакримальный pH составляет около 7,2-7,4. Пациенты сообщают о хорошем самочувствии с щелочными глазными каплями. Как правило, искусственные слезы являются pH буферными. Частота числа капель в сутки может варьировать в зависимости от фазы заболевания и используемого заменителя слезы; иногда, в острых фазах, введение заменителей слезы требуется каждый час, в то время как в лучших случаях это количество может доходить до 5-6 раз в сутки.
Однако для пациента является важным поддерживать всегда хорошо гидратированный глаз и в большинстве случаев это требует введение заменителя слезы каждый час, или, по меньшей мере, каждые 2-3 часа. Очевидно, что большое количество повторяющихся введений не делает лечение легким и приятным для пациента, и создает дискомфорт.
Существует решение, предоставляемое контактными линзами, к которому часто прибегают, когда заменители слезы не предоставляет никаких возможностей. Однако применение контактных линз часто не является по настоящему целесообразным, в случае слезной гипосекреции с значимым снижением водного компонента контактные линзы не переносятся пациентом.
Существует хирургическое решение, которое в некоторых случаях может помочь регенерации глазной поверхности. Наиболее простым и наиболее широко применяемым хирургическим лечением при терапии заболеваний сухого глаза является закрыть, временно или постоянно, нижнюю и/или верхнюю слезную точку посредством маленьких силиконовых крышечек («точечные пробки»). Однако является очевидным, что хирургическое решение содержит в себе недостатки и неудобства для пациента.
Воспаление или инфекция роговицы, также называемое кератит, может иметь вирусное (например, аденовирусы, герпесвирусы), бактериальное или грибковое происхождение. Роговица является прозрачной мембраной, расположенной спереди глаза, таким образом, чтобы быть обращенной наружу. Этот тип воспалений или инфекций может прогрессировать до возникновения эрозий или язв роговицы, что повлияет на остроту зрения и сделает ее мутной. В настоящее время наиболее распространенным лечением является введение антибактериальных или антивирусных капель. В случае кератита герпетического происхождения, лечение с применением противовирусных средств часто является незаменимым.
Очень часто воспаления или инфекции бактериального, вирусного или грибкового происхождения происходят, когда глаз уже подвержен сухости сам по себе. В случае сухого глаза, фактически, очень частым является возникновение воспалительного или инфекционного явления различного происхождения, лечение которого является более сложным и трудным.
Таким образом, все еще ощущается необходимость в эффективном лечении заболеваний и/или нарушений глаза, в частности в таком, которое способно обеспечить улучшенную гидратацию, длящуюся в течение долгого времени. Кроме того, все еще ощущается необходимость в эффективном лечении, чтобы бороться с инфекцией и/или воспалениями различного происхождения, которые часто образуются на глазном уровне, особенно в случае глазной сухости.
Пирролидон-карбоновая кислота (PCA), представленная в формуле ниже, является циклическим органическим соединением, также известным как пироглутаминовая кислота.
В литературе давно уже было описано действие PCA в качестве вектора для стимуляции улучшенной желудочно-кишечной адсорбции лекарственных средств (Barel et al. Handbook of Cosmetic Science и Technology, Third Edition, pages 357-370, 2009; Smith et al. Percutaneous Penetration Enhancers, CRC Press, pages 214, 1995). Смягчающее и увлажняющее свойства этого продукта также известны, когда его применяют в различных косметических композициях для ухода за кожей и волосами.
PCA добавляют в Европейский банк данных косметических ингредиентов в качестве увлажнителя и смягчающего средства: ec.Europa.eu/consumers/cosmetics/cosing.
Никаких токсических и/или неблагоприятных эффектов никогда не было выявлено, ни в случае, когда это соединение было использовано местно, ни в случае, когда оно было введено, даже в высоких дозах, людям и лабораторным животным.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Если не определено иначе, все термины в этой области, условные сокращения и другие научные термины, применяемые в настоящем документе, предназначены иметь значения, понятные всем специалистам в данной области, к которой принадлежит данное описание. В некоторых случаях, термины со значениями, которые являются общепонятными, определены в настоящем документе для ясности и/или справки; таким образом, включение таких определений в настоящий документ не должно истолковываться, как представляющее существенную разницу в отношении того, что обычно понимают в данной области.
Термин «фармацевтически приемлемые соли или производные» относится к таким солям или производным, которые обладают биологической активностью и свойствами образующего соль или производное соединения, и которые не приводят к неблагоприятным реакциям при введении млекопитающему, предпочтительно человеку. Фармацевтически приемлемые соли могут быть неорганическими или органическими солями; примеры фармацевтически приемлемых солей в качестве неограничивающих примеров включают: карбонат, гидрохлорид, гидробромид, сульфат, водород сульфат, цитрат, малеат, фумарат, трифторацетат, 2-нафталинсульфонат, и пара-толуолсульфонат. Дополнительную информацию о фармацевтически приемлемых солях можно найти в Handbook of pharmaceutical salts, P. Stahl, C. Wermuth, WILEY-VCH, 127-133, 2008, включенной в настоящий документ в качестве ссылки. Фармацевтически приемлемые производные включают сложные эфиры, простые эфиры и N-оксиды.
Термин «физиологически приемлемый эксципиент» относится к веществу, лишенному какого-либо собственного фармакологического эффекта и который не приводит к неблагоприятным реакциям при введении млекопитающему, предпочтительно человеку. Физиологически приемлем эксципиенты хорошо известны в данной области и описаны, например, в Handbook of pharmaceutical Excipients, sixth edition 2009, включенный в настоящий документ в качестве ссылки.
Термин «одновременное, раздельное или последовательное применение» относится к одновременному введению первого и второго соединения, или таким образом, что два соединения воздействуют на глаз пациента в одно и то же время, или к введению соединения после другого соединения таким образом, чтобы обеспечить терапевтическ эффект. В некоторых вариантах осуществления соединение вводят пациенту в течение периода времени, следующего после введение другого соединения.
Термины «содержащий», «имеющий», «включающий» и «содержащий» должны рассматриваться как открытые термины (т.е. означающие «содержащий, но не ограниченный»), и должны рассматриваться также в качестве поддержки для терминов, таких как «состоит по существу из», «состоящий по существу из», или «состоящий из».
Термин «  детский возраст» относится к популяции в возрасте 0-18 лет.
Термин «в количестве, достаточном для» относится к количеству, необходимому для достижения указанного целевого объема.
ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ
Фигура 1 - Профиль проникновения пирролидон-карбоновой кислоты (PCA) через изолированную роговицу кролика, после эксперимента, произведенного в примере 9.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К настоящему времени,   неожиданно было обнаружено, что пирролидон-карбоновая кислота является особенно эффективной для применения при лечении глазных заболеваний и/или нарушений.
Объектом настоящего изобретения является таким образом пирролидон-карбоновая кислота и/или ее соли или фармацевтически приемлемые производные для применения при лечении глазных заболеваний и/или нарушений.
Целью настоящего изобретения является также пирролидон-карбоновая кислота и/или ее соли или фармацевтически приемлемые производные, в комбинации с, по меньшей мере, одним дополнительным активным ингредиентом для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении глазных заболеваний и/или нарушений.
Дополнительным объектом по настоящему изобретению является фармацевтический состав, содержащий пирролидон-карбоновую кислоту и/или ее соли или фармацевтически приемлемые производные, и по меньшей мере один физиологически приемлемый эксципиент для применения при лечении глазных заболеваний или нарушений.
Также  дополнительным объектом по настоящему изобретению является фармацевтический состав, содержащий пирролидон-карбоновую кислоту и/или ее соли или фармацевтически приемлемые производные, и по меньшей мере, один дополнительный активный ингредиент, и по меньшей мере один физиологически приемлемый эксципиент для применения при лечении глазных заболеваний и/или нарушений.
Согласно предпочтительному аспекту по изобретению, указанные глазные заболевания и/или нарушения выбраны из глазной сухости (заболевание сухого глаза, также называемое «сухой глаз»), глазной гиперосмолярности, глазного воспаления и/или глазных инфекций.
Согласно более предпочтительному аспекту по изобретению, указанное глазное заболевание и/или нарушение является глазной сухостью. Глазная сухость по настоящему изобретению может быть первичной или вторичной.
Очень часто, глазная сухость возникает из-за или приводит к гиперосмолярности, результатом которой является ухудшение профиля сухого глаза, в конечном счете переходя в необратимое заболевание.
Согласно предпочтительному аспекту  изобретения, указанная гиперосмолярность может быть обусловлена сухим глазом или может быть первичной и вызывать сухость глаза.
В соответствии с другим предпочтительным аспектом изобретения, указанные глазные воспаления и/или инфекции являются воспалениями и/или инфекциями роговицы (кератит), и могут быть бактериального, вирусного или грибкового происхождения. Когда указанные кератиты имеют вирусное происхождение, они преимущественно вызваны аденовирусом или вирусом герпеса.
Очень часто, такие воспаления и/или инфекции роговицы происходят в глазу, уже характеризующемуся сухостью; затем становится все более и более сложным эффективно воздействовать на них.
По одному из аспектов изобретения, указанный, по меньшей мере, один дополнительный активный ингредиент можно выбирать из соли металла, гиалуроновой кислоты, производного целлюлозы, полиакрилата, осмопротектора, полисахаридов и их производных.
Согласно другому аспекту изобретения, указанная соль металла выбрана из соли меди, цинка, натрия или марганца, или их смеси.
Согласно другому аспекту изобретения, указанная соль металла выбрана из сульфата, фосфата или их смеси. По предпочтительному аспекту, указанная соль металла является сульфатом меди.
В соответствии с дополнительным аспектом изобретения, указанный осмопротектор выбран из эритритола, таурина, L-карнитина или их смеси.
В соответствии с еще одним дополнительным аспектом изобретения, указанное производное целлюлозы выбрано из карбоксиметилцеллюлозы, этилцеллюлозы, гидроксипропил целлюлозы или их смеси.
Согласно  одному из аспектов изобретения, указанный, по меньшей мере, один физиологически приемлемый эксципиент выбран из консервантов, антиоксидантов, буферных средств, увлажнителей, стабилизаторов, поверхностно-активных веществ, водных носителей, маслянистых носителей, увлажнителей, гелеобразующих средств, или их смесей. По предпочтительному аспекту, указанный, по меньшей мере, один эксципиент является буферной системой и/или консервантом.
Согласно одному из аспектов изобретения, фармацевтический состав по изобретению находится в жидкой или полутвердой форме. Согласно предпочтительному аспекту, состав по изобретению находится в форме раствора (более предпочтительно водного раствора), суспензии, крема, мази, геля или спрея. Гелевый состав по изобретению может быть в форме приспособленного для сбрасывания геля, т.е. гель, который может быть применен капельно (не в полутвердом носителе). Кроме того, состав может быть раствором для введения предпочтительно в форме спрея, в частности при формах блефарита вследствие сухости.
Согласно одному из аспектов изобретения, фармацевтический состав по изобретению вводят в форме глазных примочек, глазных капель, искусственных слез или предназначенного для сбрасывания геля, и может в каждом случае находиться в однодозовой или многодозовой лекарственной форме; более предпочтительно в однодозовой лекарственной форме.
Согласно предпочтительному аспекту, фармацевтический состав по изобретению находится в форме однодозовой глазной примочки, однодозовых глазных капель, или однодозового предназначенного для сбрасывания геля.
По одному из аспектов изобретения, фармацевтический состав имеет pH между 6 и 7,5, предпочтительно между 6,6 и 7, таким образом, чтобы быть физиологически приемлемым для глаз, без возникновения каких-либо нежелательных эффектов. Сходным образом, фармацевтический состав имеет оптимальные характеристики химической и физической стабильности; образование преципитатов на дне не наблюдается, даже после суток хранения при 4°C (например, в холодильнике). Указанный pH получают посредством добавления подходящих буферов, таких как, например, фосфатный буфер.
Согласно предпочтительному аспекту, пирролидон-карбоновая кислота (PCA) и/или ее фармацевтически приемлемые соли или производные состоят из фармацевтического состава по изобретению в количестве, находящемся между 0,05% и 1%, на основе общей массы состава, более предпочтительно в количестве приблизительно 0,1-0,2% по массе.
Согласно предпочтительному аспекту, указанный, по меньшей мере, один дополнительный активный ингредиент содержится в фармацевтическом составе по изобретению в количестве, находящемся между 0,0005% и 0,2% по массе, на основе общей массы состава, более предпочтительно в количестве приблизительно 0,001-0,002%, где указанным активным ингредиентом является соль металла; когда он вместо гиалуроновой кислоты или других активных ингредиентов входит в состав в количестве, находящемся между 0,05 и 1%, предпочтительно в количестве приблизительно 0,1-0,2%.
В соответствии с дополнительным предпочтительным аспектом, настоящее изобретение относится к применению при лечении глазных заболеваний и/или нарушений у людей, предназначенному как для взрослого, так и педиатрического возраста.
Пирролидон-карбоновая кислота (PCA) по изобретению продемонстрировала поразительный эффект в отношении улучшения и достижения максимума гидратации глаза, особенно в отношении продолжительности гидратации и воздействия на удержание воды внутри ткани глаза.
Пирролидон-карбоновая кислота (PCA) сохраняется фактически на уровне глазной ткани в течение гораздо более долгого периода времени, чем соединения, в настоящее время применяемые при лечении глазной сухости. PCA сохраняется в глазной ткани в течение периода времени гораздо большего, чем 3 часа, когда, как правило, продукт, предназначенный для лечения глазной сухости сохраняется там в течение не более, чем 1 часа.
Таким образом, очевидно, что состав, содержащий пирролидон-карбоновую кислоту (PCA) может быть применен к глазу, который требует гидратации, число раз, существенно более низкое по сравнению с составами, известными в настоящее время. Предположительно, в случае глазной сухости, известные продукты применяют от 6 до 8 раз в сутки, в то время как состав, содержащий PCA по настоящему изобретению следует применять от 1 до 3 раз в сутки, улучшая приверженность пациента или другого индивидуума лечению.
В случае глазной сухости уменьшение повторения введения представляет большую важность для улучшения лечения, и его влияние на жизнь индивидуума или пациента. Результатом улучшенной гидратации является также освежающая сила, которую состав обеспечивает при введении.
Комбинация, по меньшей мере, одного дополнительного активного ингредиента с PCA производила синергическое действие при глазном лечении по изобретению.
В частности, добавление сульфата меди к PCA к удивлению приводила к синергическому действию при глазном лечении, особенно в случае воспалений и/или инфекций роговицы (кератит) бактериального или вирусного происхождения. Благодаря комбинации PCA и сульфата меди, было возможным максимизировать антибактериальный и/или антивирусный эффект двух активных ингредиентов, со снижением значения минимальной ингибирующей концентрации для патогена, приводящего к воспалениям и/или инфекции, приблизительно в восемь раз.
Комбинация PCA и сульфата меди является конкретно преимущественной, так как она способна проникать и действовать на уровне конъюнктивального мешка, где аттака бактерий и/или вирусов из внешнего окружения является особенно раздражающей.
Добавление, по меньшей мере, одного осмопротектора наоборот, к удивлению, производило синергическое действие с PCA при восстановлении клеточного объема, делая глазную ткань, способной сохранять большие количества воды, что приводит к улучшенной стабилизации функций клетки и блокированию гиперосмолярности, что очень часто приводило к случаю сухого глаза.
Добавление гиалуроновой кислоты наоборот, к удивлению, производило синергическое действие в отношении увлажняющего эффекта. Гиалуроновая кислота является, фактически, коадгезивной и связывается с поверхностью роговицы, удерживающей PCA, которая оказывает влагоудерживающий и увлажняющий эффект, длящийся даже больше увлажняющего эффекта PCA.
Дополнительным преимуществом, предоставляемым посредством пирролидон-карбоновой кислоты, а также посредством ее комбинации с дополнительными активными ингредиентами, является его способность оказывать освежающий эффект на глазную ткань, в частности в случае глазной сухости и/или гиперосмолярности.
Следующие примеры предназначены для лучшей иллюстрации настоящего изобретения без его ограничения каким-либо образом.
Пример 1
Однодозовые глазные капли
г/ 100 мл
Пирролидон-карбоновая кислота (PCA)
0,10 г
дистиллированная вода ромашки
10,00 г
Двухосновный фосфат натрия додекагидрат
0,60 г
Моноосновный фосфат натрия моногидрат
0,06 г
Хлорид натрия
0,70 г
Динатрия эдетат дигидрат
0,05 г
Вода в кол-ве, достаточном для
100 мл
Состав является прозрачным, бесцветным.
В нем отсутствуют преципитаты или осадки на дне, даже после нескольких суток хранения в холодильнике.
pH= 6,60
Осмоляльность (mOsmol/Kg)= 298
Пример 2
Однодозовые глазные капли
г/ 100 мл
Пирролидон-карбоновая кислота (PCA)
0,10 г
Гиалуроновая кислота
0,20 г
Моноосновный фосфат натрия моногидрат
0,06 г
Двухосновный фосфат натрия додекагидрат
0,60 г
Хлорид натрия
0,70 г
Вода в кол-ве, достаточном для
100 мл
Состав является прозрачным, бесцветным.
В нем отсутствуют преципитаты или осадки на дне, даже после нескольких суток хранения в холодильнике.
pH= 6,60
Осмоляльность (mOsmol/Kg)= 289
Пример 3
Офтальмологический гель
г/ 100 мл
Пирролидон-карбоновая кислота (PCA)
0,1000 г
Сульфат меди
0,0001 г
Карбопол 980
0,2000 г
Лемонграсс (эфирное масло цитронеллы)
0,025 г
ЭДТА
0,0100 г
20% Гидроксид натрия
0,4200 г
Сорбит
4,0000 г
Вода в кол-ве, достаточном для
100 мл
Этот препарат является приспособленным для сбрасывания гелем. В нем отсутствуют преципитаты или осадки на дне, даже после нескольких суток хранения в холодильнике.
pH= 6,13
Осмоляльность (mOsmol/Kg)= 248
Пример 4
Многодозовые глазные капли
г/ 100 мл
Пирролидон-карбоновая кислота (PCA)
0,1
Сульфат меди
0,0001
дистиллированная вода гамамелиса
10,000 г
дистиллированная вода очанки лекарственной
10,000 г
Дистиллированная вода ромашки
10,000 г
дистиллированная вода василька
10,000 г
Двухосновный фосфат натрия додекагидрат
0,30 г
Моноосновный фосфат натрия моногидрат
0,03 г
Хлорид натрия
0,80 г
Динатрия эдетат дигидрат
0,050 г
Хлорид бензалкония
0,01 г
Вода в кол-ве, достаточном для
100 мл
Пример 5
Однодозовые глазные капли
г/ 100 мл
Пирролидон-карбоновая кислота (PCA)
0,05
Сульфат меди
0,0001
Гиалуроновая кислота
0,2 г
Моноосновный фосфат натрия моногидрат
0,01 г
Двухосновный фосфат натрия додекагидрат
0,10 г
Хлорид натрия
0,6 г
Хлорид бензалкония EP
0,01 г
Динатрия эдетат дигидрат
0,05 г
Вода в кол-ве, достаточном для
100 мл
Пример 6
Однодозовые глазные капли
г/ 100 мл
Пирролидон-карбоновая кислота (PCA)
0,05
Сульфат меди
0,0001
Гиалуроновая кислота
0,2 г
Моноосновный фосфат натрия моногидрат
0,01 г
Двухосновный фосфат натрия додекагидрат
0,10 г
Хлорид натрия
0,80 г
Вода в кол-ве, достаточном для
100 мл
Пример 7
Многодозовые глазные капли
г/ 100 мл
Пирролидон-карбоновая кислота (PCA)
0,1
Сульфат меди
0,0001
Карбоксиметилцеллюлоза натрия (кармеллоза натрия)
3,50 г
Хлорид натрия
0,80 г
Хлорид бензалкония
0,010 г
Вода в кол-ве, достаточном для
100 мл
Пример 8
Офтальмологический гель
г/ 100 мл
Пирролидон-карбоновая кислота (PCA)
0,1
Сульфат меди
0,0001
Гиалуроновая кислота
0,40 г
Гидроксиэтилцеллюлоза
1,00 г
Трометамин
0,20 г
Лемонграсс (эфирное масло цитронеллы)
0,025 г
Борная кислота
0,40 г
цетримид
0,01 г
Эдетат натрия
0,05
Вода в кол-ве, достаточном для
100 мл
Пример 9
Оценка биосовместимости составов из примеров 1, 2 и 4 посредством теста на раздражающее действие вещества на слизистую оболочку глаза (тест Дрейза)
Тест на раздражающее действие вещества на слизистую оболочку глаза предназначен для оценки любого раздражения, которое могут вызвать составы из примеров 1, 2 и 4 при введении in vivo. Отсутствие раздражения глаз указывает на биосовместимость составов и их потенциальную терапевтическую эффективность. Фактически, после введения составы из примеров 1, 2 и 4 сохраняют контакт с глазной поверхностью в течение периода времени, достаточного для проявления терапевтической активности, и их удаление является следствием нормальных физиологических процессов of the прекорнеальной области. Напротив, появление раздражающих эффектов, даже легких, отрицает возможность пирролидон-карбоновой кислоты (PCA), доставляемой в составах из примеров 1, 2 и 4 сохранять контакт с глазной поверхностью в течение периода времени, достаточного для проявления терапевтической активности. Появление раздражающих эффектов будет фактически стимулировать активацию физиологических защитных систем в глазу (повышенное слезотечение, усиление непродуктивной абсорбции, повышенная скорость элиминации из прекорнеальной области), приводящая к резкому снижению биодоступности.
ДИЗАЙН ЭКСПЕРИМЕНТА
Тестируемые препараты (композиция) и схема лечения:
Экспериментальные растворы:
Раствор 1 (состав из примера 1):
- Пирролидон-карбоновая кислота (PCA) 0,10 г/100 мл;
- Дистиллированная вода ромашки 10,0 г/100 мл;
- Моноосновный фосфат натрия моногидрат 0,06 г/100 мл;
- Двухосновный фосфат натрия додекагидрат 0,60 г/100 мл;
- Динатрия эдетат дигидрат 0,05 г/100 мл;
- Хлорид натрия 0,7 г/ 100 мл.
Раствор 2 (состав из примера 2):
- Пирролидон-карбоновая кислота (PCA) 0,10 г/100 мл;
- Гиалуроновая кислота 0,20 г/100 мл;
- Моноосновный фосфат натрия моногидрат 0,06 г/100 мл;
- Двухосновный фосфат натрия додекагидрат 0,60 г/100 мл;
- Хлорид натрия 0,70 г/100 мл.
Раствор 3 (состав из примера 4):
- Пирролидон-карбоновая кислота (PCA) 0,10 г/100 мл;
- Сульфат меди 0,0001 г/100 мл;
- Дистиллированная вода гаммамелиса 10,0 г/100 мл;
- дистиллированная вода очанки лекарственной 10,0 г/100 мл;
- Дистиллированная вода ромашки 10,0 г/100 мл;
- дистиллированная вода василька 10,0 г/100 мл;
- Моноосновный фосфат натрия моногидрат 0,03 г/100 мл;
- Двухосновный фосфат натрия додекагидрат 0,30 г/100 мл;
- Хлорид натрия 0,80 г/100 мл;
- Динатрия эдетат дигидрат 0,05 г/100 мл;
- Хлорид бензалкония 0,01 г/100 мл
Стандартные растворы
Стандартные растворы имели композицию, соответствующую экспериментальным растворам (Sol 1 - Sol 3), но в них отсутствовали активные ингредиенты, т.е. пирролидон-карбоновая кислота (стандарт 1), пирролидон-карбоновая кислота и гиалуроновая кислота (стандарт 2), пирролидон-карбоновая кислота и сульфат меди (стандарт 3).
Таблица 1- In vivo схема лечения
Глаз
Препарат
Лечениеобъем/доза
Правый (OD)
Экспериментальный раствор 1 (группа 1)
10 мкл
Правый (OD)
Экспериментальный раствор 2 (группа 2)
10 мкл
Правый (OD)
Экспериментальный раствор 3 (группа 3)
10 мкл
Левый (OS)
Стандартный раствор 1 (группа 1)
10 мкл
Левый (OS)
Стандартный раствор 2 (группа 2)
10 мкл
Левый (OS)
Стандартный раствор 3 (группа 3)
10 мкл
Вид животных
Новозеландские белые кролики. Новозеландский белый кролик был выбран по той причине, что он считается подходящей экспериментальной моделью для оценки глазного раздражения. Кролики часто являются предпочтительными по сравнению с другими животными, поскольку их глаз является хорошо известным органом в отношении анатомии и физиологии, а также из-за его большого размера. Кроме того, глаза кроликов, как правило, являются более восприимчивыми к раздражающим веществам, чем глаза людей.
Число животных, предназначенных для лечения, зависит от задач, которые необходимо решить, однако всегда следует учитывать, что наименьшее число животных должно быть подвергнуто воздействию токсических веществ; как правило, используют от 3 до 6 животных.
Способ введения
Глазное введение предполагается для людей.
Число животных и происхождение
18 самцов новозеландских белых кроликов, Pampaloni Fauglia (PI), случайным образом были распределены в 6 групп по три штуки в каждой.
Фармакологическое лечение
Фридвальд и Дрейз применяли объем 100 мкл (Wilhelmus, 2001; Survey Ophthalmology, 45:493-515), и это количество было выбрано как количество, широко используемое для инстилляции или инъекции в глаз. Последующие исследователи продемонстрировали, что объем 10 мкл или ниже лучше представляет реальную ситуацию in vivo.
В настоящем экспериментальном исследовании фармакологическое лечение проводили в соответствии с двумя способами введения:
a) одну каплю (10 мкл) вливали непосредственно на поверхность роговицы правого глаза кролика с применением микропипетки. В левый глаз с применением того же способа вливали только носитель (соответствующий стандартный раствор).
b) 6 инстилляций (10 мкл) в течение периода 18-20 минут непосредственно на поверхность роговицы правого глаза. В левый глаз, с применением того же способа, вливали только носитель (соответствующий стандартный раствор).
Оценка лечения
Глаза кроликов проверяли в конце каждого лечения (время 0), и в последующие часы (через 1 и 3 часа после воздействия), и в последующие сутки (24 часа после лечения).
В следующем порядке проверяли: конъюнктиву, радужную оболочку и роговицу.
Поражения роговицы и радужной оболочки детектировали с помощью непосредственного осмотра и с помощью освещения посредством фиолетовой лампы после инстилляции изотонического водного раствора флуоресцеина.
Тяжесть поражений выражали в балл лах в соответствии со шкалой оценок, представленной в таблице 2.
Баллы, приписываемые различным наблюдениям, обрабатывали в соответствии с недавней модернизацией оригинального способа Дрейза (Wilhelmus, 2001). Балл ы, полученные для различных глазных областей анализировали (конъюнктива, радужная оболочка и роговица) для каждого животного в определенной временной точке, суммировали вместе, чтобы получить общий индекс раздражения. В отличие от того, что было предложено Дрейзом в оригинальном способе, балл, полученный для единичных переменных, не умножали на поправочный коэффициент, но каждой переменной был поставлен в соответствие балл, находящийся в разном диапазоне. Например, диапазон баллов для непрозрачности роговицы находился между 0 и 4, в то время как для радужной оболочки он находился между 0 и 2.
Индекс глазного раздражения в отдельности не позволял произвести оценку силы раздражения глаза.
Общую оценку производили, следуя рекомендациям FDA, в соответствии с которыми вещество рассматривают в качестве раздражающего глаз, если, по меньшей мере, четыре животных из шести демонстрировали какую-либо положительную реакцию в, по меньшей мере, одной из трех областей, принятой во внимание. Вещество, вызывающее какие-либо поражения роговицы или радужной оболочки, которое не излечивалось в течение семи суток, классифицировали как крайне раздражающее.
Таблица 2 - Шкала баллов для оценки раздражения роговицы
Локализация поражения
Тип поражения
Присвоенный балл
Непрозрачность роговицы
Отсутствие язв или непрозрачности
0
Непрозрачность роговицы
Отдельные или сливающиеся области непрозрачности (отличающиеся от легкого помутнения нормального блеска); мелкие детали радужной оболочки четко видимы
1
Непрозрачность роговицы
Легко различимая просвечивающаяся область; мелкие детали радужной оболочки слегка затемнена
2
Непрозрачность роговицы
Опалесцирующие области; нет видимых мелких деталей радужной оболочки и размер зрачка едва различим
3
Непрозрачность роговицы
Полностью непрозрачная роговица; радужная оболочка не различима через непрозрачность
4
Радужная оболочка
Нормальная
0
Радужная оболочка
Складки заметно более углублены, чем нормальные; застой, отек, умеренная перикорнеальная инъекция; реакция на свет сохранена
1
Радужная оболочка
Отсутствие реакции на свет, кровотечение; грубое разрушение
2
Конъюнктивальная краснота (бульбарная и пальпебральная конъюнктива)
Нормальные кровеносные сосуды
0
Конъюнктивальная краснота (бульбарная и пальпебральная конъюнктива)
Кровеносные сосуды слегка инъецированы; гиперемия
1
Конъюнктивальная краснота (бульбарная и пальпебральная конъюнктива)
Диффузный кармазинный цвет; с трудом различимые отдельные инъецированные сосуды
2
Конъюнктивальная краснота (бульбарная и пальпебральная конъюнктива)
Диффузная мясистая краснота
3
Общий балл равен сумме всех баллов, присвоенных роговице, радужной оболочке и конъюнктиве.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Ни одно животное не умерло во время курса лечения (a и b), и никаких глазных эффектов не наблюдали во время инстилляции растворов (моргание, сомкнутые веки, слезящиеся глаза). Кроме того, никакого клинического влияния или изменений не наблюдали у какого-либо из животных, получавших лечение.
Результаты глазной реакции сообщены в таблицах 3-5 для лечения a), и 6-8 для лечения b).
Исходя из полученных результатов, можно заключить, что составы не являются раздражающими, и они являются биосовместимыми после двух обработок.
Таблица 3 - Лечение a) с применением раствора 1
Раствор 1
Ref 1
Время(часов)
Индивидуальные баллы
Среднее
Индивидуальные баллы
Среднее
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
3
0
0
0
0
0
0
0
0
24
0
0
0
0
0
0
0
0
Таблица 4 - Лечение a) с применением раствора 2
Раствор 2
Ref 2
Время(часов)
Индивидуальные баллы
Среднее
Индивидуальные баллы
Среднее
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
3
0
0
0
0
0
0
0
0
24
0
0
0
0
0
0
0
0
Таблица 5 - Лечение a) с применением раствора 3
Раствор 3
Ref 3
Время(часов)
Индивидуальные баллы
Среднее
Индивидуальные баллы
Среднее
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
3
0
0
0
0
0
0
0
0
24
0
0
0
0
0
0
0
0
Таблица 6 - Лечение b) с применением раствора 1
Раствор 1
Ref 1
Время(часов)
Индивидуальные баллы
Среднее
Индивидуальные баллы
Среднее
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
3
0
0
0
0
0
0
0
0
24
0
0
0
0
0
0
0
0
Таблица 7 - Лечение b) с применением раствора 2
Раствор 2
Ref 2
Время(часов)
Индивидуальные баллы
Среднее
Индивидуальные баллы
Среднее
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
3
0
0
0
0
0
0
0
0
24
0
0
0
0
0
0
0
0
Таблица 8 - Лечение b) с применением раствора 3
Раствор 3
Ref 3
Время(часов)
Индивидуальные баллы
Среднее
Индивидуальные баллы
Среднее
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
3
0
0
0
0
0
0
0
0
24
0
0
0
0
0
0
0
0
Пример 10
Оценка PCA ex vivo транскорнеального проникновения композиции в соответствии с примером 2 через изолированную роговицу кролика.
Местное введение является желательным способом введения офтальмологического лекарственного средства, действующего на окологлазную область и/или передний сегмент.
Роговица является главным барьером для абсорбции лекарственных средств (Ghate and Edelhauser, 2008; J Glaucoma, 17:147-156), и она является структурой, сстоящей из нескольких слоев: эпителия, стромы и эндотелия. Диффузию через эпителий роговицы считают этапом, определяющим скорость транскорнеального проникновения большинства лекарственных средств. Таким образом, способность соединений проникать через роговицу является доминантным процессом, и обсуловлена главным образом балансом между гидрофильными и липофильными свойствами соединения. В дополнение к действию в качестве диффузионного барьера для ограничения проникновения лекарственного средства роговица экспрессирует определенные ферменты, которые метаболизируют лекарственные средства, и активные транспортные системы, которые могут участвовать в метаболизме лекарственного средства (эстераза) (Shirasaki, 2008; J Pharmaceutical Sciences, 97:2462-2496).
Ex vivo исследование проницаемости роговицы
Для определения ex vivo проницаемости роговицы использовали роговицы кроликов, полученные после проптоза глаза, произведенного сразу после эвтаназии животного. Кроликов, являющихся новозеландскими белыми кроликами (n= 3), подвергали эвтаназии посредством внутривенной инъекции пентотала натрия (Farmaceutici Gellini, Aprilia, Italy). После того, как глаза были подвергнуты проптозу, роговицу с 2 мм склеры незамедлительно удаляли и помещали в перфузионный аппарат. Во время препарирования особое внимание уделяли предотвращению отслоению эпителия роговицы и его контакта с любыми твердыми поверхностями.
Перфузионный аппарат, применяемый для определения PCA проницаемости роговицы, был изготовлен полностью из оргстекла, и состоял из камеры для образца (эпителиальная сторона, 1,0 мл объем) и принимающего отсека (эндотелиальная сторона, объем равен 5,0 мл), чтобы обеспечить условия достаточного разбавления (Saettone et al., 1996; Int. J Pharmaceutics, 142:103-113). Два отдела разделяли посредством интерпозиции изолированной роговицы, и аппарат был термостатом, с температурой поддерживаемой на уровне 32°C посредством контакта с нагретой пластиной. Роговицу фиксировали с физиологическим изгибом в результате разницы давлений, создаваемой колонкой с раствором на эндотелиальной стороне, без каких-либо механических ограничений, которые могли бы вызвать повреждение клеточных структур. Во время исследования проникновения область поверхности роговицы, контактирующая с донорским раствором, составляла 1,52 см2.
Донорский раствор состоял из бикарбонатного буферного раствора Рингера (RBB) с pH=7,6 и осмоляльностью 290-295 mOsmol/Kg. Композиция буфера состояла из следующего: хлорид натрия 6,200 г/л, хлорид калия 0,358 г/л, первичный кислый фосфат калия дигидрат 0,103 г/л, бикарбонат натрия 2,454 г/л, хлорид кальция дигидрат 0,115 г/л, хлорид магния гексагидрат 0,159 г/л и глюкоза 0,900 г/л в очищенной воде (Milli-Q), с добавлением 0,02% масс./масс. PCA и 0,04% масс./масс. гиалуроновой кислоты (HA).
Количества PCA и HA были в пять раз ниже, чем присутствующие в экспериментальном растворе n. 2 (Раствор 2 из примера 2), но поддерживали такое же процентное соотношение PCA vs HA. RBB раствор как таковой был принимающей фазой.
Для обеспечения оксигенации, необходимой для сохранения жизнеспособности роговицы, и перемешивания растворов, O2/CO2 (95:5) смесь барботировали через каждый компартмент при скорости потока приблизительно 3-4 пузырька/сек. До начала эксперимент по проникновению роговицу уравновешивали посредством поддержания ее в контакте с RBB раствором, как с эндотелиальной, так и с эпителиальной стороны, в течение 10 мин; затем раствор, помещенный на эпителиальную сторону, прекращали подавать и замещали 1,0 мл свежего RBB раствора, содержащего установленное количество PCA. Количество PCA, добавленное в донорскую фазу, позволило достичь достаточного градиента концентрации для содействия диффузии лекарственного средства из донорского в принимающий отдел, и было сравнимо с разведением, сообщаемым в подобных исследованиях в литературных данных.
После начала эксперимента по проникновению, в соответствующие промежутки времени (15, 30, 60, 90, 120, 180 и 240 минут), 0,50 мл раствора изымали из принимающего отсека (эндотелиальная сторона) и замещали свежим RBB. В конце эксперимента собирали всю донорскую фазу и отсылали для количественного определение активного ингредиента аналогичным образом с образцами принимающей фазы.
Количественный анализ PCA проводили посредством ВЭЖХ с применением C18 колонки с обращенной фазой C18 (Bondclone 10 мкм 300 × 3,9 мм), и элюентом была смесь 98:2 буферного раствора и ацетонитрила. Буферный раствор состоял из 4,3 мМ HCl и 0,1 мМ натрий гексансульфоната. Анализ образца проводили при λ=210 нм, и время удержания составляло 2,89 мин при экспериментальных условиях. Для стандартной концентрации PCA, составляющей от 0,0996 до 10,0601 мкг/мл, линейная корреляция (R2) между экспериментальными точками составила 0,9992.
РЕЗУЛЬТАТЫ
На фигуре 1 можно увидеть профиль проникновения пирролидон-карбоновой кислоты (PCA) через изолированную роговицу кролика.
Полученные результаты демонстрируют тенденцию PCA к проникновению через изолированную роговицу кролика в экспериментальных условиях; фактически, небольшой процент PCA проникал в принимающий отсек, где, как было обнаружено, его количество в конце эксперимента составляло 0,051% масс./масс. от количества, присутствующего в донорском отсеке. Результаты позволяют подсчитать PCA проницаемость роговицы 0,395 10-5 см/сек.
PCA является сильно гидрофильной молекулой с коэффициентом распределения октанол/вода (PO/W) 0,069, и которая использует трансклеточный путь для проникновения через эпителиальный барьер, который является основным барьером для проникновения через роговицу в соответствии с тем, что сообщали в литературе для флуоресцеина натрия, который часто используют в качестве модели лекарственного средства для гидрофильного лекарственного средства. Однако значение PO/W для флуоресцеина натрия составляет 2,18, т.е. он является менее гидрофильным, чем PCA, с проницаемостью через роговицу свиньи 0,05 10-5 см/сек (Pescina et al, 2015; J Pharmaceutical Sciences, 104:63-71). По-видимому, флуоресцеин обладает большей аффинностью для эпителия по сравнению с PCA.
Из литературных данных известно, что проницаемость лекарственных средств через бычью и свиную роговицу, как правило, от трех до девяти раз ниже чем для роговицы кролика; таким образом, удивляет, что PCA, значительно более гидрофильная, способна проникать через роговицу кролика с проницаемостью почти равной таковой для флуоресцеина.
В заключение, несмотря на наличие эффекта эпителиального барьера роговицы против PCA, несмотря на ее слабую способность к трансдермальному проникновению, демонстрирует аффинность лекарственного средства для роговицы, и ее способность лишь частично подвергаться эффекту эпителиального барьера роговицы.
Кроме того, способность PCA, хотя и слабая, проникать через роговицу означает определенную аффинность лекарственного средства для этой ткани и предполагает возможный обратный захват более сильно гидрофильной стромой роговицы, которая может действовать как депо для этой молекулы. Лекарственное средство может, таким образом, не пересекать барьер роговицы в количественном отношении, но сохраняет контакт с тканью в течение дополнительного времени.