СРЕДА ДЛЯ ЗАМОРАЖИВАНИЯ СЕМЕНИ БЫКОВ
BULL SEED FREEZING MEDIUM

Изобретение относится к животноводству, в частности к способам размножения животных, а именно к средам для замораживания семени быков-производителей.
Известна унифицированная комплексонатная среда для разбавления и замораживания семени сельскохозяйственных животных. В се состав на 1000 мл дистиллированной воды входят:
- сахар-рафинад
100 г
- этилендиаминтетрауксусной кислоты
динатриевая соль, кальциевый комплексонат
6-водная
3 г
- этилендиаминтетрауксусной кислоты
дикалиевая соль, магниевый комплексонат,
водная
3 г
- натрий фосфорнокислый, 2-замещенный
0,7 г
- калий фосфорнокислый, 1-замещенный
1,5 г
- 2,6-ди-трет-бутил-1,4-крезол
0,5 г
- глицерин
40 мл
- желток куриного яйца, оранжевой
окраски
50 мл
- спермосан-3
500-700 ед.
(Животноводство, 1985, №7, с.39-41). Среда имеет преимущество над другими своей универсальностью. Она в определенной мере предохраняет от разрушения и обогащает макро- и микроэлементный комплекс семени, а соли ЭДТА снижают нуклеазную активность среды. Однако использование в этой среде сахарозы не обеспечивает в необходимой мере обменные процессы в плазматической мембране живчиков; наличие натриевых солей не обеспечивает оптимальных характеристик поверхностного электрического потенциала плазматических мембран живчиков; уменьшенное содержание желтка в среде вызывает недостаток лецитина и других веществ криопротекторного характера.
Известна среда для разбавления и замораживания семени быка, используемая в Литовской технологии содержания племенных быков (П.Пакенас. Литовская технология содержания и использования племенных быков. МСХ Литвы, 1993). Среда включает (на 100 мл дистиллированной воды):
- лактозу
10,5 г
- натрий лимоннокислый, 3-замещенный,
5-водный
0,2 г
- глицерин
5 мл
- желток куриного яйца
20 мл
- спермосан-3
50 ед.
или спермосан-ППК
50-100 ед.
Известна среда для разбавления семени сельскохозяйственных животных, состоящая из:
- сахар
101,1-101,3 г
- комплексная соль этилендиаминтетра
уксусной кислоты
5,9-6,1 г
- желток куриного яйца
49-51 мл
- глицерин
39-41 мл
- пенициллин
250-350 тыс.и.е.
- стрептомицин сернокислый
250-350 тыс.и.е.
- 2,3,5,7,8-Пента-гидрокси-
6-этил-1,4-нафто-хинон
0,0049-0,0051 г
- вода дистиллированная
до 1000 мл.
(SU 1080819 A, A61D 19/02,23.03.1984. Бюл. №11).
Данная среда, по сравнению с контрольной, обеспечила абсолютный показатель подвижности сперматозоидов выше на 1,9; полупериод подвижности и живучести на 4 часа, сохранность акросом - на 10%. Однако она содержит сравнительно небольшой удельный объем куриного желтка, что снижает ее криопротекторные свойства. Кроме того, сахароза обладает менее выраженными диэлектрическими свойствами в сравнении с лактозой, а это, в свою очередь, отрицательно влияет на распределение электрических зарядов по поверхности спермиев. В среде отсутствует источник макро- и микроэлементов.
Наиболее близкой по технической сущности и достигаемому результату является синтетическая среда для разбавления и замораживания семени быка (в форме гранул) в составе:
- лактоза
11,5 г
- желток куриного яйца
20,0 мл
- глицерин
5 мл
- спермосан-3
50,0 тыс.ед.
- вода дистиллированная
100 мл
Среда была рекомендована для работы станций и предприятий по искуственному осеменению сельскохозяйственных животных («Инструкция по организации и технологии работы станций и предприятий по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных», МСХ СССР, Гл. упр. животноводства. М., Колос, 1981, 159 с.).
Данная среда содержит лактозу, достаточное количество желтка куриных яиц и глицерина. Однако в ней отсутствуют комплексонаты макро- и микроэлементов и компоненты, в достаточной мере обеспечивающие ее бактериостатические свойства.
Техническим результатом настоящего изобретения является повышение сохранности биологической полноценности сперматозоидов и улучшение показателя стельности коров, осемененных семенем с использованием предложенной среды.
Технический результат изобретения достигается тем, что предложена среда для замораживания семени быков, включающая лактозу, желток куриных яиц, глицерин и воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит комплексонаты макро- и микроэлементов - кальциевый комплексонат этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА-кальций), цинковый комплексонат (ЭДТА-цинк), медный комплексонат (ЭДТА-меди) и антибиотики: пенициллин, стрептомицин и полимиксин - при следующем соотношении компонентов:
- лактоза
105-115 г
- ЭДТА-кальций
0,45-0,80 г
- ЭДТА-цинк
1,0-1,7 г
- ЭДТА-меди
0,45-0,80 г
- глицерин
40-70 мл
- желток куриных яиц
170-200 мл
- пенициллин
250-750 тыс.ед.
- стрептомицин
250-750 тыс.ед.
- полимиксин
1,0-2,0 млн ед.
- вода дистиллированная
до 1000 мл
В предложенной среде наличие комплексонатов металлов обеспечивает стабилизацию макро- и микроэлементного состава и снижение ее нуклеазной активности. Наличие ионов меди в комплексе с антибиотиками повышает бактериостатические свойства предлагаемой среды.
Изотонические концентрации компонентов среды найдены криоскопическим (расчетным) методом с последующим уточнением по подвижности и выживаемости живчиков.
Оптимальное соотношение компонентов определяли с использованием биологического метода, то есть по показателям подвижности и выживаемости сперматозоидов после замораживания в том или ином варианте сред (таблица 1).
Таблица 1Качество замороженного семени быков в связи с разной концентрацией лактозы и комплексонатов в среде
Соотношение объемных долей изотонических растворов лактозы и комплексонатов
Подвижность спермиев (%)
Выживаемость после оттаивания (час)
Сохранность акросом (в %)
После замораживания
После оттаивания
80% лактозы + 4% ЭДТА-кальция + 4% ЭДТА меди + 12%ЭДТА цинка
80
50
9,0
82
90% лактозы + 2% ЭДТА-кальция + 2% ЭДТА меди + 6%ЭДТА цинка
80
60
9,5
84
95% лактозы + 1% ЭДТА-кальция + 1% ЭДТА меди + 3%ЭДТА цинка (взята за основу)
80
60
9,5
86
При испытании разных вариантов состава среды применяли метод так называемого расщепленного эякулята, то есть для всех вариантов использовали семя из одного и того же эякулята.
Нуклеазную активность сред в связи с включением в них комплексонатов определяли по степени деградации контрольного образца ДНК (таблица 2).
Таблица 2Нуклеазная активность сред для замораживания семени быка в связи с включением в них комплексонатов металлов
Среды
Степень деградации контрольного образца ДНК фага-лямбда (по длине фрагментов, в нуклеотидных парах). Инкубация - 1 час при + 37°С
Лактозная (контроль)
400-500
Лактозная + комплексонаты
5000-6000
Из представленных в таблице 2 данных следует, что добавление комплексонатов в рекомендуемых количествах способствует снижению нуклеазной активности и меньшей степени деградации контрольного образца ДНК (5000-6000 пар нуклеотидов вместо 400-500 в контроле).
Для замораживания использовали общепринятую технологию. Гранулы замораживали на сухом льду, соломинки - в парах жидкого азота.
Пример 1. В лабораторных условиях ВИЖ было проведено испытание качества бычьего семени, замороженного в предлагаемой среде. Согласно полученным результатам качество семени, замороженного в предлагаемой среде, было выше, чем качество семени, замороженного в известной среде, при всех вариантах степеней разбавления (таблица 3).
Таблица 3Показатели качества оттаянного семени в зависимости от примененной разбавляющей среды и степени разбавления. Средние данные по 14 экспериментам
Среда для замораживания
Кратность разбавления семени
Показатели сразу после оттаивания
Показатели через 5 час инкубации при +37°С
% спермиев с ППД*
% спермиев с целой акросомой
% спермиев с ППД
% спермиев с целой акросомой
Предлагаемая
10
51±4,9
79±9,2
34,6±14,9
54,5±13,6
То же
12,5
52±5,7
68±13,6
32,3±15,7
52,7±2,7
То же
16,7
50±5,1
68±8,7
26,8±15,5
48,8±11,6
То же
25
49±2,6
63±4,8
28,4±12,9
41,8±10,7
Среда-прототип
10
45±6,5
60±9,1
14,3±11,2
35,4±6,8
То же
12,5
44±5,0
58±7,5
12,8±11,2
35,0±7,0
То же
16,7
37±8,2
59±7,3
7,7±8,2
33,6±5,0
То же
25
35±0,1
52±7,2
7,7±8,5
30,0±6,3
* - ППД - сперматозоиды с прямолинейно-поступательным движением.
Как видно из данных таблицы 3, при всех вариантах степени разбавления лабораторные показатели качества семени, замороженного в предлагаемой среде, выше, чем в семени, замороженном в среде-прототипе. Причем при использовании предлагаемой среды (в сравнении со средой-прототипом) увеличение степени разбавления до 25 раз не вызывает снижения показателей качества оттаянного семени.
Пример 2. На фермах экспериментального хозяйства ВИЖ «Кленово-Чегодаево» было осеменено 205 коров с использованием предлагаемой среды и 183 коровы - с использованием среды-прототипа. При использовании предложенной, лактозо-комплексонатной, среды стельность коров после первого осеменения была на 8% выше по сравнению с использованием среды-прототипа.
Изобретение применимо на станциях и предприятиях по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных.