Иммуноморфологические аспекты строения тимуса у детей первого года жизни при врожденных пороках сердца

NK

МЕДИЦИНСКИЙ

АЛЬМАНАХ

направленностью, сохраняется энергообес-печенность гомеостаза. III фаза - истощение механизмов адаптации -практически исчезают коррелятивные связи между отдельными показателями обмена веществ, резко снижается энергообеспеченность метаболических превращений.

Заключение

Таким образом, проведенные исследования расширяют наши представления о характере метаболических превращений при рахите, позволяют объективно оценивать состояние гомеостаза в организме больного и могут составить основу для разработки методов направленной терапевтической коррекции.

ЛИТЕРАТУРА

1. Захарова И.Н., Коровина Н.А., Боровик Т.Э., Дмитриева Ю.А. Рахит и гиповитаминоз Д новый взгляд на давно существующую проблему. М. 2010.

Zacharova I.N., Korovina N.A. Borovik T.E., Dmitrieva Y. A. Rachit i gipovitaminoz D novii vzgljad na davno suchestvujuchuju problemu. M. 2010.

2. Туш Е.В. Рахит и рахитоподобные заболевания. Н. Новгород: Изд-во Нижегородской государственной медицинской академии, 2007. 100 с.

Tuch E.V. Rachit i rachitopodobnie zabolevanija. N. Novgorod: Izd-vo Nigegorodskoi medizinskoi academii, 2007. 100 s.

3. Рывкин А.И. Клинико-функциональная оценка современных методов диагностики, профилактики и лечения рахита у детей (клинико-эксперимен-тальное исследование): дис. ... д. м. н. Иваново, 1984.

Ryvkin A.I. Kliniko-funkzionalnaya ozenka sovremennih metodov diagnostiki, profilaktiki i lecheniya rahita u detei (kliniko-experimentalnoe issledovanie): diss.... d. m. n. Ivanovo, 1984.

4. Меньшиков В.В. Методические указания по применению унифицированных клинических лабораторных методов исследования. М. 1977.

Menshikov V.V. Metodicheskie ukazaniya po primeneniyu unificirovannih klinicheskih laboratornih metodovissledovaniya. M. 1977. IT 1

УДК 616.12-022-007-053.31-07-092

ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СТРОЕНИЯ ТИМУСА У ДЕТЕЙ ПЕРВОГО ГОДА ЖИЗНИ ПРИ ВРОЖДЕННЫХ ПОРОКАХ СЕРДЦА

Н.П. Логинова,

ГБОУ ВПО «Пермский государственный медицинский университет им. акад. Е.А. Вагнера»

Логинова Наталья Павловна - e-mail: nataiitsa@yandex.ru

Исследованы биоптаты тимусов от детей 1-го года жизни (n=77) при врожденных пороках сердца разной степени сложности. Иммуногистохимическим методом верифицировано накопление кератинов в эпителиоретикулоцитах (PanCK); тимопоэз оценен по экспрессии CD3+. В сыворотке крови исследован уровень тимулина. Установлено, что степень сложности порока сердца определяет морфологические изменения в органе, при которых формируется комплекс значительных тканевых реакций. В течение первого года жизни (1, 6, 11 мес.) в тимусе наблюдалось снижение экспрессии кератинов, сопровождающееся нарушением архитектоники эпителиальной стромы, что влияло на уровень тимопоэза, понижая его. Исследования показали, что иммуноморфологические особенности коррелировали со степенью сложности сердечного порока и уровнем гормонов в периферической крови, который был существенно ниже, чем у здоровых детей.

Ключевые слова: тимус, врожденные пороки сердца, тимопоэз, тимулин.

Thymuses investigated biopsies from children 1 year of age (n=77) in patients with congenital heart defects of varying difficulty. Immunohistochemistry verified the accumulation of keratin in epitelioretkulotsitah (PanCK), thymopoiesis assessed by expression of CD3+. Serum levels thymuline investigated. The degree of complexity of heart disease determines the morphological changes in the body, under which a large complex tissue reactions. During the first year of life (1, 6, 11 months.) In the thymus was observed decrease in the expression of keratins, accompanied by a breach of the architectonics of epithelial stroma, which affect the level of thymopoiesis, lowering it. Studies have shown that immunomorfologicheskie features correlated with the degree of complexity of a heart defect and the level of hormones in the peripheral blood, which was significantly lower than in healthy children.

Key words: thymus, congenital heart disease, thymopoiesis, thymuline.

Иммунная система - это отлаженный в процессе эволюции многофункциональный механизм, обеспечивающий невосприимчивость к факторам окружающей среды. Лимфоциты - основные клеточные элементы иммунной системы. Среди них большую часть составляют Т-лимфоциты, цикл дифференцировки которых проходит в тимусе. Постоянно циркулируя между органами и тканями, они играют центральную роль во всех иммунологических реакциях.

Тимус, как первичный орган иммунной системы, играет жизненно важную роль в эмбриональном периоде и сразу после рождения. У людей он имеет максимальную массу в возрасте 1 года, после чего начинается возрастная инволюция, и ежегодно происходит потеря около 3% активной ткани тимуса [1, 2].

Богатое микроокружение тимуса обеспечивает формирование клонального разнообразия Т-лимфоцитов через процессы положительной и отрицательной селекции

клонов с формированием толерантности к «своему» и функциональной гетерогенности Т-клеток [3, 4, 5, 6]. На этапе своего развития Т-лимфоцит приобретает уникальный антигенраспознающий рецептор (TCR - T- cell receptor), ассоциированный с CD3- комплексом, обеспечивающим после связывания с антигеном проведение сигнала внутрь клетки [7].

На иммунологическое становление Т-лимфоцитов в тимусе играют гуморальные факторы, синтезируемые в органе. Среди них ключевое значение имеют гормоны тимуса, один из которых - тимулин [8]. Количество тиму-лина в сыворотке является важным параметром для оценки гормональной функции тимуса [9, 10].

Возрастное снижение уровня тимических гормонов, удаление тимуса, а также действие неблагоприятных факторов окружающей среды и ряда врожденных и приобретенных заболеваний ведут к ослаблению функции Т-лимфоцитов. Это может служить основой для развития иммунодефицита состояний.

Тимус чрезвычайно чувствителен к различным внешним и внутренним воздействиям. Нарушение его структуры, и, как следствие, функции при действии многих стрессорных факторов (ишемия, гипоксия, облучение, вирусная и бактериальная инфекция и т. д.) может определить дефектное состояние иммунной системы в целом, что особенно проявляется в детском возрасте.

По данным литературы последних лет, дети с врожденными пороками сердца часто подвержены различным заболеваниям в связи с имеющимся у них иммунным дисбалансом [11, 12, 13, 14].

В патогенезе данного заболевания лежит механизм нарушения системной гемодинамики, ведущий к развитию тканевой гипоксии, что нарушает функцию многих органов и тканей, являясь одной из причин развития акцидентальной инволюции тимуса.

Вопрос о морфофункциональном состоянии и иммуно-морфологическом статусе тимуса развивающегося организма в условиях циркуляторной гипоксии, обусловленной врожденными пороками сердца разной степени сложности, на сегодняшний день остается нерешенным.

Таким образом, целью работы явилось изучение иммуноморфологического и гормонального состояния тимуса у новорожденных детей с врожденными пороками сердца разной степени сложности.

Материал и методы

Исследование проведено на биоптатах тимуса (n=77), полученных во время операций от детей в возрасте до 1 года при коррекции врожденных пороков сердца. Тимэктомия проводилась в соответствии с существующей хирургической практикой Федерального краевого центра сердечно-сосудистой хирургии г. Перми. Исследования проводили согласно Хельсинской Декларации ВМА 2000 г. и протоколу Конвенции Совета Европы о правах человека и биомедицине 1999 года. Критерием включения явилось наличие добровольного согласия на обследование со стороны законных представителей несовершеннолетних детей.

В патогенезе врожденных пороков сердца лежит механизм нарушения системной гемодинамики, зависящий от сложности сердечного порока и вызывающий цианоз

слизистых и кожных покровов. По наличию цианоза было выделено 2 группы: 1-я - тимусы (n=35) от детей с белыми пороками сердца, без цианоза слизистых и кожных покровов (дефект межжелудочковой перегородки; дефект межпредсердной перегородки); 2-я - тимусы (n=42) от детей с более выраженной патологией - синие пороки сердца, вызывающие цианоз (тетрада Фалло; аномалия Эбштейна; транспозиция магистральных сосудов). В качестве группы сравнения исследованы тимусы от случайно погибших детей (n=8).

Биоптаты тимуса фиксировали в 10%-м нейтральном формалине на фосфатном буфере (рН 7,2). Для исследования иммуногистохимического состояния клеток проводили окраску мечеными моноклональными антителами (Daco, США): 1) CD3 - для идентификации зрелых тимо-цитов; 2) панцитокератин AbsAE1/AE3 (PanCK) - для идентификации эпителиоретикулоцитов. Для визуализации результатов использовали системы детекции Ultra Vision ONE Detection System HRP Polymer. Препараты инкубировали с хромогеном - DAV Plus Substrate System и докрашивали гематоксилином Майера с заключением в БиоМаунт-среду. Для оценки качества реакции использовали стекла с позитивным контролем для каждого из антигенов (фирма Labvision, США).

Положительным результатом иммуногистохимической реакции являлось специфическое окрашивание цитоплазмы клеток при выявлении антигена PanCK и CD3. Численную плотность позитивно окрашенных CD3 тимо-цитов определяли с использованием квадратной тестовой системы (программа Image J). Полученные результаты рассчитывали по формуле: Ni=(Pi/Pt)*%, где Pi - количество точек тестовой системы, попавших на позитивно окрашенные CD3 лимфоциты, Pt - общее число точек закрытой тестовой системы (81). Подсчеты проводили в 10 полях зрения каждого среза.

Морфометрическое исследование проводили с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений на морфометрической установке «Olympus».

Содержание гормона тимулина в сыворотке периферической крови определяли у детей с ВПС до операции. Кровь забирали из локтевой вены в объеме 0,5 мл. Группу сравнения составили здоровые дети (n=12) в возрасте до 1,5 лет. Для оценки уровня гормона использовали метод твердофазного иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем согласно инструкции производителя (Тимулин, Immundiagnostik, Германия).

Полученные результаты обработаны с помощью пакетов MicrosoftExcel 2007 и Statistica 6,0. Для статистического анализа использовались непараметрические критерии. В результатах представлены средние значения со стандартными отклонениями, а также медиана, нижний квартиль и верхний квартиль. Различие оценивалось с помощью критерия Манна-Уитни. За статистически значимые результаты принималась величина ошибки р=0,05.

Результаты исследования

В пределах дольки тимуса положительная экспрессия PanCK в клетках стромы позволила идентифицировать весь эпителиальный компонент и оценить целостность стромы.

МЕДИЦИНСКИЙ

АЛЬМАНАХ

Основные события тимопоэза проходят в коре дольки тимуса. На уровне субкапсулярной зоны в эпителиальных клетках стромы верифицировалась экспрессия РапСК. В группе детей с белыми пороками распределение кератина было аналогично группе сравнения. Позитивно окрашенные клетки соединялись отростками и формировали ровный пласт, идущий вдоль базальной мембраны. Большая часть клеток имела крупное ядро, занимающее центральную часть цитоплазмы. В этой зоне дольки тимуса позитивно окрашенные клетки формировали от 2 до 3 слоев и имели контакт с тимоцитами. В группе детей с синими пороками (2-я группа) позитивное окрашивание нередко определялось в одиночно лежащих клетках. Целостность пласта часто была нарушена, в некоторых случаях наблюдали фрагменты окрашенных клеток. В этой группе детей определена динамика состояния эпителио-ретикулоцитов, зависящая от возраста. Сравнивая тимусы детей в возрасте 1 мес., 6 мес. и 11 мес. жизни, установлено, что у детей к 11 мес. жизни в субкапсулярной зоне имелось снижение экспрессии РапСК.

В пределах глубокой коры экспрессия кератина в клетках стромы в течение первого года жизни отличалась и зависела от сложности сердечного порока. В норме эпителиальная строма формирует трехмерный каркас (рис. 1). Соединяясь отростками, клетки создают сеть, в ячейках которой на этапе своего развития располагаются Т-лимфоциты.

ТАБЛИЦА

Численная плотность CD3+ тимоцитов в коре дольки тимуса

^"^^группы контроль 1

1 месяц 57,4±3,1* 48,6±3,71**

6 месяцев 49,6±5,7** 43,5±7,2**

11 месяцев 75,9±6,6 49,3±2,2** 44,4±4,1**

Примечание: * - различия по сравнению с показателями группы контроля значимы при р=0,05 и ** - при р=0,001.

В группе со слабыми пороками позитивное окрашивание определялось в пределах основной части коры в клетках, лежащих как по одиночке, так и формирующих группы (кластеры). Часть клеток теряли связь между собой, сеть разрывалась, отростки клеток выпрямлялись (рис. 2). В группе синих пороков позитивно окрашенные клетки чаще выявлялись одиночно, кластеры наблюдались реже и состояли из меньшего количества клеток. В период наблюдения (от 1 до 11 мес.) экспрессия РапСК постепенно снижалась и к концу года выявлялась единично в виде фрагментов (рис. 3). В части долек эпителиальные клетки вообще не проявляли реакции на окрашивание.

В пределах коры на этапах антигеннезависимой диффе-ренцировки тимоциты последовательно перемещаются по зонам и, находясь в контакте с ретикулоэпителиоцитами, приобретают основные рецепторы (TCR-CD3+). В каждой зоне этому способствуют специфические стимулирующие факторы, выделяемые клетками микроокружения. Изменения в строении ретикулоэпителиальной сети отразились и на внутритимических процессах развития тимоцитов.

Интенсивность тимопоэза оценивали по положительной экспрессии CD3. В группах сердечных пороков численная плотность зрелых лимфоцитов в коре зависела

РИС. 1.

Экспрессия РапСК в эпителиоретикулоцитах дольки тимуса. Группа контроля, 11 мес.

РИС. 3.

Экспрессия РапСК в эпителиоретикулоцитах дольки тимуса. 2-я группа (синие пороки), 11 мес.

от типа ВПС и была ниже, чем в группе сравнения (75,9±6,6%): в 1-й группе (белый порок) - 64,2±5,7%, а во 2-й (синий порок) - 53,7±7,2% (р=0,05). Независимо от сложности сердечного порока в течение года жизни (1 мес., 6 мес. и 11 мес.) в корковом веществе наблюдали тенденцию к снижению тимопоэза (таблица).

В тимусе 2-й группы наблюдали замедление выхода CD3+ тимоцитов в периферическую кровь и, как результат, их накопление в мозговом веществе. Число CD3+ Т-лимфоцитов в мозговом веществе этой группы было достоверно самое высокое и составило 55,5±3,9% (р=0,007); в группе сравнения - 40,7±2,8%.

Морфологические события в тимусе отразились на его гормональной функции. Содержание тимулина в сыворотке крови в группе детей с ВПС определялось на уровне 0,418 [0,346-0,502] пг/мл, у здоровых детей - 0,446 [0,389-0,484] пг/мл. Внутри пороков наблюдали разницу. При синих врожденных пороках, где морфологические изменения в тимусе носили более выраженный характер, содержание гормона было 0,372 [0,295-0,546] пг/мл. В группе детей с белыми пороками, не вызывающими цианоза, уровень тимулина составил 0,428 [0,333-0,684] пг/мл.

Обсуждение

Результаты исследования показали, что у детей с ВПС имеются изменения в структуре эпителиальной стромы тимуса. Накопление в клетках кератина и целостность эпителиальной стромы зависят от сложности сердечного порока. Исчезновение в течение года эпителиальных маркеров РапСК и, как результат, нарушение архитектоники эпителиальной сети, вероятно, связано с особенностью становления эпителиоретикулоцитов на этапе их эмбрионального развития. Известно, что эмбриогенез эпителиальной стромы тимуса контролирует клетки краниального отдела нервного гребня, параллельно участвующие в развитии и становлении соединительнотканных перегородок сердца и крупных сосудов [15, 16]. Установленная нами взаимосвязь является тому подтверждением.

Нарушение целостности эпителиальной сети способствует потере контакта с тимоцитами на этапе их кортикального развития, снижается реализация их дифферен-цировочного потенциала, что проявляется изменением численной плотности CD3+ тимоцитов с накоплением их в мозговом веществе. Замедление эмиграции тимоцитов в кровь, вероятно, связано с низкой силой хемотаксическо-го сигнала, исходящего от эпителиальных клеток стромы и клеток сосудистой стенки. Ранее нами сообщалось, что у детей с ВПС в периферической крови установлен низкий уровень недавних тимусных мигрантов [17].

Уровень тимулина в крови коррелировал со степенью сложности ВПС. Известно, что в тимусе клетками-продуцентами гормона являются субкапсулярные и медуллярные эпителиоретикулоциты [18, 19, 20, 21]. По результатам иммуногистохимических исследований структура эпителиального ретикулума этих зон у детей с ВПС не носила серьезного характера, что обеспечивало поддержание тимоцитов на начальных этапах их развития. Но несмотря на это, у детей с синими пороками сердца явления тимопоэза протекали слабее, чем у детей с белыми пороками, и значительно отличались от группы здоровых детей.

Заключение

Таким образом, полученные результаты расширяют представление о морфологическом статусе первичного органа иммунитета - тимуса, в условиях циркуляторной гипоксии, обусловленной врожденными пороками сердца разной степени сложности. Замедление тимопоэза влечет за собой уменьшение в организме Т-клеточного ресурса. Без сомнений, это может явиться причиной нарушения формирования адаптивного иммунитета у данной категории больных детей.

ЛИТЕРАТУРА

1. Харченко В.П., Саркисов Д.С., Ветшев П.С. и др. Болезни вилочковой железы. М.: «Триада-Х», 1998. 232 с.

Harchenko V.P., Sarkisov D.S., Vetshev P.S. i dr. Bolezni vilochkovoj zhelezy. M.: «Triada-H», 1998. 232 s.

2. Киселева Е.М. Механизмы инволюции тимуса при опухолевом росте. Успехи современной биологии. 2004. Т. 124. № 6. C. 589-601.

Kiseleva E.M. Mehanizmy involjucii timusa pri opuholevom roste. Uspehi sovremennoj biologii. 2004. Т. 124. № 6. S. 589-601.

3. Пальцев М.А., Кветной И.М. Руководство по нейроиммуноэндокриноло-гии. 2-е изд. М.: ОАО «Медицина», 2008. C. 512.

Pal'cev M. A., Kvetnoj I. M. Rukovodstvo po nejroimmunojendokrinologii. 2-e izd. M.: OAO «Medicina», 2008. S. 512.

4. Куклина Е.М. Молекулярные механизмы дифференцировки тимоцитов. Онтогенез. 2003. Т. 34. № 5. С. 342-357.

Kuklina E.M. Molekuljarnye mehanizmy differencirovki timocitov. Ontogenez. 2003. T. 34. № 5. S. 342-357.

5. Hale L.P. Histologic and molecular assessment of human thymus. Annals of Diagnostic Pathology. 2004. № 8 (1). P. 50-60.

6. Shah D.K., Zuniga-Pflucker J.C. An overview of the intrathymic intricacies of T cell development. J.Immunology. 2014. № 192. P. 4017-4023.

7. Черешнев В.А., Шмагель К.В. Иммунология. М.: НП «Центр стратегического партнерства», 2014. C. 520.

Chereshnev V.A., Shmagel' K.V. Immunologija. M.: NP «Centr strategicheskogo partnerstva», 2014. S. 520.

8. Ярилин А.А. Тимус как орган эндокринной системы. Иммунология. 1996. № 1. C. 4-10.

Jarilin A.A. Timus kak organ jendokrinnoj sistemy. Immunologija. 1996. № 1. S. 4-10.

9. Consolini R., Legitimo A., Calleri A., Milani M. Distribution of age-related thymulin titres in normal subjects through the course of life. Clinical & Experimental Immunology. 2001. V. 121 (3). Р. 444-447.

10. Reqqiani P.C., Schwerdt J.I., Console G.M. et al. Physiology and therapeutic potential of thymic peptide thymulin. Curr. Pharm. Des. 2014. № 20 (29). P. 46904696.

11. Виноградов К.В. Врожденные пороки сердца у детей: распространенность и современное состояние проблемы. Здоровье ребенка. 2007. Т. 6. № 9. http://pediatric.mif-ua.com.

Vinogradov K.V. Vrozhdennye poroki serdca u detej: rasprostranennost' i sovremennoe sostojanie problemy. Zdorov'e rebenka. 2007. Т. 6. № 9. http:// pediatric.mif-ua.com.

12. Фроленко А.Л. Клинико-иммунологическая характеристика детей после тимэктомии: автореф. дис. ... к. м. н. 2011. 24 с.

Frolenko A.L. Kliniko-immunologicheskaja harakteristika detej posle timjektomii: avtoref. dis.... k. m. n. 2011. 24 s.

13. Haynes B.F., Markert M.L., Sempowski G.D. et al. The role of the thymus in immune reconstitution in aging, bone morrow transplantation, and HIV-1 infection. Annu. Rev. Immunol. 2000. № 18. Р. 529-560.

14. Turan T., Turan A., Arslan C. et al. How does neonatal thymectomy effect on the immune system. Acta cardiol. 2004. № 5. Р. 511-513.

15. Kirby M.L., Waldo K.L. Role of neural crest in congenital heart disease. Circulation. 1990. № 82 (2). Р. 332-340.

16. Erickson C.A. Neural Crest: Origin, Migration and Differentiation. Encyclopedia of life science, London: nature publishing group, 2011. Р. 2084-2100.

NK

МЕДИЦИНСКИЙ

АЛЬМАНАХ

17. Логинова Н.П., Четвертных В.А., Семченко В.В. и др. Особенности экспрессии цитокератинов 5 и 8 в клетках эпителиальной стромы тимуса и количество TREC в периферических Т-лимфоцитах у детей с врожденными пороками сердца. Иммунология. 2014. Т. 35. № 6. С. 333-337.

Loginova Ы.Р., Chetvertnyh УА, Semchenko М i dr. Osobennostijekspressii citokeratinov 5 i 8 V kletkah jepitelial'noj stromy Ит^а i kolichestvo TREC V perifericheskih T-limfocitah и detej s vrozhdennymi роюкат'1 serdca. lmmunologija. 2014.. Т. 35. № 6. S. 333-337.

18. Поверенный А.М., Виноградова Ю.Э., Дейгин В.И. Геморегуляторные синтетические пептиды. Тер. архив. 2000. Т. 72. № 7. С. 74-76.

Poverennyj A.M., Vinogradova Ju.Je, Dejgin V.I. Gemoreguljatornye sinteticheskie peptidy. Ter. arhiv. 2000. Т. 72. № 7. S. 74-76.

19. Kendall M.D. Functional anatomy of the thymic microenvironment. J. Anat. (Lond.). 1991. Vol. 177. Р. 1-29.

20. Ярилин А.А. Цитокины в тимусе. Выработка и рецепция цитокинов. Цитокины и воспаление. 2003. № 1. С. 1-13.

Jarilin A.A. Citokiny v timuse. Vyrabotka i recepcija citokinov. Citokiny i vospalenie. 2003. № 1. S. 1-13.

21. Abilko T., Sekino H. Synthesis of an immunologically active analog of thymic humoral factor-gamma 2 with enhanced enzymatic stability. Bioorg. Med. Chem. 1994. Vol. 2. Р. 787-92. гщ