Некоторые результаты изучения этиологии респираторных болезней телят в хозяйствах Московской области

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ « Эпизоотология ♦

УДК 619:616.98: 578

Некоторые результаты изучения этиологии респираторных болезней телят в хозяйствах Московской области

А.В. Пчельников, соискатель ученой степени кандидата наук, С.В. Алексеенкова, кандидат биологических наук, К.А. Диас Хименес, К.П. Юров, доктор ветеринарных наук

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко» (ВИЭВ) ФАНО России (Москва).

Проведено обследование трех животноводческих хозяйств Московской области с целью выяснения этиологии вспышек респираторных болезней телят. На основании результатов, полученных путем прямого обнаружения генома возбудителей в клиническом материале (ПЦР и ОТ-ПЦР) и ретроспективных исследований проб сыворотки крови (ИФА), можно заключить, что основными возбудителями являются вирусы ИРТ и ВД. Исключено участие в этиопатогенезе заболеваний ряда вирусов КРС (парамиксовирусов, аденовирусов, коронавируса). Для выяснения роли лимфотропного гаммагерпесвируса КРС в патологии органов дыхания необходимы дальнейшие исследования.

Ключевые слова: антитела, вирус, вирусная диарея-болезнь слизистых, герпесвирусы, ДНК, иммунитет, иммуноферментный анализ, инфекционный ринотра-хеит, полимеразная цепная реакция, РНК, флавивирусы Сокращения: ВД-БС — вирусная диарея-болезнь слизистых, ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота, ИРТ-ИПВ — инфекционный ринотрахеит-инфек-ционный пустулезный вульвовагинит, ИФА — иммуноферментный анализ, КРС — крупный рогатый скот, ОТ-ПЦР — полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией, ПГ-3 — парагрипп-3, ПИ — персистентно инфицированный, РНК — рибонуклеиновая кислота, ЦПД+ — цитопатогенный,

ЦПД--нецитопатогенный, INSD — International

Nucleotide Sequence Data

Введение

Угроза острых вирусных болезней КРС для российского животноводства возникла в 60-е гг. прошлого века в связи с интенсивным завозом племенного скота из-за рубежа [6, 12]. Импортированные животные часто были источником вирусов — возбудителей ИРТ-ИПВ, ВД-БС, ПГ-3 КРС и других инфекций [5]. Распространение этих возбудителей в неиммунном поголовье местного скота послужило причиной массовых вспышек респираторных инфекций с острым течением и высокой смертностью [4]. Герпесвирусным и пестивирусным инфекциям свойственно значительное разнообразие характера течения и клинического проявления [1].

Вирус ИРТ (герпесвирус коров 1-го типа) вызывает кератоконъюнктивиты, респираторную патологию, поражение половых органов, аборты [3, 8]. Антигенно близкий ему — герпесвирус коров 5-го типа — обуславливает нейропаралитическую инфекцию [9].

Заражение вирусом ВД-БС коров в ранней стадии стельности приводит к бессимптомной инфекции, но действие вируса на эмбрион может быть фатальным и зависит от срока стельности, биотипа и генотипа инфицирующего вируса [2]. Заражение коров вирусом биотипа ЦПД+ или ЦПД- на 1...45-й день беременности вызывает гибель и аутолиз эмбриона [13].

При заражении эмбриона на 40.. .125-й день стельности вирус не распознается как чужеродный агент и диссеминирует в органы и ткани плода, включая лим-фоидные, где интенсивно размножается [11]. При этом иммунная система новорожденных телят не обнаруживает возбудителя, поэтому специфические иммунные реакции в виде образования вирусспецифических антител не выражены [7]. Это состояние определяется как иммунотолерантность. Новорожденные телята, зараженные в этот внутриутробный период, персистент-но инфицированы и в постнатальный период выделяют со всеми экскретами вирус во внешнюю среду. Телята с нормалью сформировавшейся иммунной системой рождаются после 125-го дня [13].

ПИ-телята отстают в росте, плохо наращивают мышечную массу, что служит типичным признаком пер-систентной инфекции. Однако некоторые из них не имеют видимых признаков болезни, достаточно хорошо развиваются, поэтому их оставляют в стаде качестве ремонтного молодняка. При этом они выделяют вирус во внешнюю среду в течение всей жизни, способствуя созданию постоянно инфицированного семейства [10].

Цель исследования

С помощью молекулярно-генетических и иммунологических методов изучить природу респираторных болезней телят в трех животноводческих хозяйствах Московской области. Проследить динамику формирования иммунного ответа у телят к вирусам ИРТ и ВД-БС в хозяйствах с различной эпизоотической обстановкой по респираторным болезням.

Материалы и методы

Гуморальные антитела к вирусам ИРТ и ВД у телят определяли с помощью ИФА. Использовали «Набор для иммуноферментной диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (выявление антител)» и «Набор для иммуноферментной диагностики вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота (выявление антител)» по инструкции разработчика — ФГБНУ ВИЭВ. Результаты ИФА оце-

Некоторые результаты изучения этиологии респираторных болезней телят в хозяйствах Московской области

нивали по коэффициенту S/N — отношению значений оптической плотности исследуемой пробы (S) к отрицательному контролю (N). Полученные результаты приведены на рисунках 1 и 2.

Для обнаружения генома вирусов в клиническом (выделения из носовой полости, кровь) и патологическом материале (паренхиматозные органы, лимфоузлы) применили методы ПЦР и ОТ-ПЦР. Для экстракции вирусной ДНК использовали коммерческий набор «Quick-gDNA MiniPrep» («Zymo Research», США), для выделения РНК — «Комплект реагентов для выделения тотальной РНК из цельной крови, клеточных культур и образцов тканей» («Синтол», Россия). Для ОТ-ПЦР использовали «Набор для проведения реакции обратной транскрипции» («Синтол», Россия). Аплифи-кацию выполняли по методу, рекомендованному ранее [14, 15]. Электрофорез проводили в 1,5%-м агарозном геле с добавлением этидиум бромида в трис-боратном буферном растворе. Результаты учитывали на трансиллюминаторе при длине волны 254 нм.

Определение нуклеотидных последовательностей выполнено в компании ЗАО «Постгеномные и нано-технологические инновации». Полученные результаты анализировали с помощью компьютерной программы «FASTA», разработанной Европейским институтом биоинформатики.

Результаты и обсуждение

Работу проводили в животноводческих хозяйствах молочного направления с поголовьем в 1,2...1,5 тысячи животных. Хозяйства различаются по условиям содержания животных и показателям благополучия по респираторным болезням (заболеваемость, сохранность).

Хозяйство №1. Это хозяйство закрытого типа, на протяжении ряда лет ремонт стада проводят за счет собственного поголовья. Болезни органов дыхания у телят и аборты у коров наблюдают в виде спорадических случаев. Против респираторных и кишечных заболеваний молодняк не вакцинируют. Отел коров проходит в специализированном родильном отделении в индивидуальных боксах. Телят до 5-дневного возраста содержат в боксах (со 2-го дня — по 3.5 голов в боксе) Телят старше 5-дневного возраста переводят в телятник с групповым содержанием. Помещение телятника — сухое, оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, отсутствуют сквозняки.

Хозяйство №2. Ежегодно регистрируют заболевания органов дыхания молодняка КРС, абортов у коров не наблюдают. Телята с рождения до 6-месячного возраста содержатся в сыром помещении с неудовлетворительной вентиляцией, которая не отвечает зооги-гиеническим требованиям. Вследствие этого у телят в возрасте 2.4 месяцев ежегодно в переходный осенне-зимний период обостряются и приобретают массовый характер болезни органов дыхания. Стельным и сухостойным коровам прививают вакцину «ОКЗ».

Хозяйство №3. Длительное время сохраняется статус благополучного по массовым заболеваниям органов дыхания. За последний год в осенне-зимний период зарегистрирована вспышка абортов у коров и заболеваний органов дыхания у телят невыясненной этиологии. Вспышка повторилась в более доброкачест-

венной форме в начале лета. Болели телята 2.6 месяцев с симптомами кашля, ринита, повышенной температурой тела. Результаты молекулярно-генетической диагностики приведены в таблице.

Результаты исследования в ПЦР и ОТ-ПЦР клинического и патологического материала от телят с респираторной патологией

Исследуемые вирусы Гены-мишени, кодирующие полипептиды: Результаты по хозяйствам №1 №2 №3

Герпесвирусы коров типов 1 и 5, Герпесвирус буйволов типа 1 Гликопротеин B + - + *

Герпесвирус КРС типа 4 То же - - -

Герпесвирус КРС типа 2 » - - -

Аденовирус типа 3 Протеин DBP - - -

Коронавирус Гликопротеин S - - -

Герпесвирус коровьих антилоп типа 1 (вирус катаральной горячки) Гликопротеин B - - -

Лимфотропный гаммагерпесвирус КРС ДНК-полимераза - - +

Респираторно-синцитиальный вирус Протеин F - - -

Вирус ПГ-3 КРС Протеин М - - -

Вирус ВД-БС КРС Протеин NS3 - - -

Примечание: * + — обнаружен герпесвирус коров 1-го типа.

Полученные данные позволили исключить участие ряда вирусов в этиологии респираторных заболеваний телят в обследуемых хозяйствах и диагностировать герпесвирусную инфекцию КРС. На основании анализа нуклеотидной последовательности генома вируса, выявленного в хозяйствах №1 и №3, был идентифицирован герпесвирус коров 1-го типа (возбудитель ИРТ).

В хозяйстве №3 была зарегистрирована повторная вспышка респираторного заболевания, в течение которой был выявлен лимфотропный гаммагерпесви-рус КРС. При сравнении последовательности ну-клеотидов выявленного вируса с данными международной базы данных INSD было показано сходство множественного выравнивания нуклеотидных последовательностей на 98 % со штаммом лимфотропно-го герпесвируса КРС, выделенного в провинции Квебек (Канада). В литературных источниках указанный вирус упоминается довольно редко. До обнаружения в 2008 г. в Канаде лимфотропный гаммагерпесви-рус КРС выявили только в США (1998 г.) и Великобритании (2006 г.).

Rovnak ^ с соавт. (1998 г.) считают, что лимфотроп-ный герпесвирус КРС является ко-фактором вируса лейкоза КРС [15]. Однако хозяйство, в котором нами был обнаружен лимфотропный герпесвирус, благополучно по лейкозу КРС, но в то же время неблагополучно по ИРТ. Таким образом, можно предположить, что лим-фотропный гаммагерпесвирус КРС может сопутство-

Щ 2012 IV 2012 12013 [I 201 j KenjiTH-n, г..д

1. Сезонная динамика иммунного ответа (в ИФА) на вирус ИРТ в 3-х животноводческих хозяйствах

А.В. Пчельников, С.В. Алексеенкова, К.А. Диас Хименес, К.П. Юров

2. Сезонная динамика иммунного ответа на вирус ВД-БС (в ИФА) у телят в 3-х животноводческих хозяйствах

вать герпесвирусу коров 1-го типа и играть определенную роль в респираторной патологии телят.

Из представленных данных следует, что максимальный уровень гуморальных антител к вирусам ИРТ и ВД у телят отмечен в последнем квартале 2012 г. и отчасти (хозяйство №2) во 2-м квартале 2013 г. В этом хозяйстве в течение года наблюдали два пика антител к возбудителю ВД, который очевидно и обуславливает респираторную патологию.

В хозяйстве №3 повторная вспышка ассоциируется с гаммагерпесвирусом КРС. Считается, что этот вирус ассоциируются с лейкозом КРС [15]. Однако, исследованное поголовье длительное время благополучно по лейкозу КРС. Мы не располагаем достаточными сведениями об этиологической роли гаммагерпесвируса в респираторной патологии телят, является ли он возбудителем заболевания или исполняет роль вируса-помощника. Мы не обнаружили подобные сообщения в доступной литературе.

Выводы

Таким образом, используя методы молекулярно-ге-нетической (ПЦР, ОТ-ПЦР) и иммунологической диагностики (ИФА), мы обследовали три животноводческих хозяйства Московской области с тем, чтобы выяснить этиологию вспышек респираторных болезней телят. Результаты, полученные путем прямого обнаружения генома возбудителей в клиническом материале и ретроспективным исследованием проб сыворотки крови, позволяют заключить, что основными возбудителями являются вирусы ИРТ и ВД. Исключено участие в этио-патогенезе заболеваний ряда вирусов КРС (парамик-совирусов, аденовирусов, коронавируса). Для выяснения роли лимфотропного гаммагерпесвируса КРС в патологии органов дыхания необходимы дальнейшие исследования.

Библиография

1. Глотов, А.Г. Этиология бронхопневмоний крупного рогатого скота на молочных комплексах / А.Г. Глотов, Т.И. Глотова, О.В. Семенова, К.В. Войтова // Ветеринария. — 2014. — № 4. — С. 7-11.

2. Крюков, Н.Н. О неспецифической профилактике вирусной диареи крупного рогатого скота / Н.Н. Крюков, З.Ф. Зудилина, К.П. Юров, С.А. Жидков // Ветеринария. — 1978. — Т. 1. — С. 37-40.

3. Крюков, Н.Н. Инфекционный ринотрахеит КРС / Н.Н. Крюков, К.П. Юров // Труды ВИЭВ. — 1970. — Т. 37. — С. 148-150.

4. Мищенко, В.А. Проблема респираторной патологии новорожденных телят / В.А. Мищенко, А.В. Мищенко, О.В. Черных // Ветеринария Кубани. — 2013. — № 6. — С. 19-20.

5. Осмаев, И.А. Иммуномодулирующие свойства эндогенного интерферона у телят / И.А. Осмаев, К.П. Юров, М.П. Неустроев // Ветеринария. — 2007. — № 1. — С. 11-12.

6. Щербаков, П.Н. Препарат для лечения и профилактики респираторных болезней молодняка сельскохозяйственных животных / П.Н. Щербаков, Юров К.П., Караваев Ю.Д., Щербакова Т.Б. // Патент на изобретение №2180239 от 22.08.2000.

7. Юров, Г.К. Антигенные свойства нецитопатогенных штаммов вируса диареи КРС // Г.К. Юров, С.В. Алексеенкова, К.А. Диас Хименес, М.П. Неустроев, К.П. Юров / РВЖ. СХЖ. — 2013. — № 2. — С. 24-26.

8. Юров, Г.К. Специфичность гуморальной иммунной реакции у быков-производителей на маркированную вакцину против ИРТ // Г.К. Юров, С.В. Алексеенкова, К.П. Юров // РВЖ. СХЖ. — 2012. — № 3. — С. 14-16.

9. Юров, К.П. Современный подход к диагностике респираторных инфекций крупного рогатого скота, вызываемых корона- и герпесвирусами / К.П. Юров, С.В. Алексеенкова, А.В. Пчельников, Л.А. Мникова, Т.А. Ишкова, Г.К. Юров / Ветеринария,. — 2013. — № 4. — С. 3-8.

10. Юров, К.П. Вирусные заболевания крупного рогатого скота и овец в СССР (проблемы профилактики и борьбы) / К.П. Юров, Ю.Д. Караваев // Труды ВИЭВ. — 1991. — Т. 69. — С. 3-8.

11. Юров, К.П. Профилактика вирусных болезней телят / К.П. Юров // Ветинформ. — 2001. — №2. — С. 12-13.

12. Юров, К.П. Парвовирусная инфекция крупного рогатого скота / К.П. Юров, И.А. Третьякова, А.С. Вечеркин // Ветеринария. — 1994. — №5. — С. 26-27.

13. Grooms, D.L. Reproductive consequences of infection with bovine viral diarrhea virus / D.L. Grooms // Vet Clin North Am Food Anim Pract. — 2004. — N. 20(1). — P. 5-19.

14. Masri, S.A. Rapid detection of bovine herpesvirus 1 in the semen of infected bulls by a nested polymerase chain reaction assay / S.A. Masri, W. Olson, P.T. Nguyen, S. Prins, D. Deregt // Can J Vet Res. — 1996. — N. 60(2). — P. 100-107.

15. Rovnak, J. Detection of a novel bovine lymphotropic herpesvirus / J. Rovnak, S.L. Quacken-bush, R.A. Reyes, J.D. Baines, C.R. Parrish, J.W. Casey // J Virol. — 1998. — N. 72(5). — P. 4237-4242.

SUMMARY

A.V. Pchelnikov, S.V. Alexeyenkova, K.A. Dias Himenes, K.P. Yurov

All-Russian Scientific Research Institute of Experimental Veterinary Medicine named after Ya.R. Kovalenko (Moscow).

Some Results of the Study of the Bovine Respiratory Disease Etiology in Moscow Region. We conducted a survey of three farms of Moscow region in order to clarify the etiology of outbreaks of bovine respiratory disease. The results obtained by direct detection of the genome of pathogens in clinical material (by PCR and RT-PCR) and retrospective studies of samples of blood serum (by ELISA), allow us to conclude that the main pathogens are viruses IBR and BVDV. We excluded the participation of a number of viruses in the etiopathogenesis of respiratory disease in cattle (paramyxoviruses, adenoviruses, coronavirus). We need further research to clarify the role of bovine lymphotropic gammaherpesvirus in respiratory disease.

«Journal of Small Animal Practice/Российское издание» —

первое переводное научно-практическое издание для ветеринарных врачей, освещающее проблемы лечения и профилактики заболеваний мелких домашних животных.

Оригинальное издание «Journal of Small Animal Practice» —

официальный печатный орган Всемирной ассоциации ветеринарии мелких домашних животных

Подписка на журнал осуществляется через редакцию и каталог Почта России. Издательский дом «Логос Пресс», 127055, Москва, а/я 9. Http://logospress.ru/, e-mail: info@logospress.ru. Тел/факс: +7 (495) 220-48-16