ТЕХНОЛОГИЯ АМПЛИФИКАЦИИ ДНК

1. Олигонуклеотидный праймер для амплификации целевой последовательности нуклеиновой кислоты в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР), содержащий
первый участок, где первый участок комплементарен нити с целевой последовательностью нуклеиновой кислоты и расположен на 3'-конце праймера; и
второй участок, где второй участок расположен на 5'-конце праймера; и
где Tm олигонуклеотидного праймера является повышенной в сравнении с Tm олигонуклеотидного праймера, имеющего только первый участок.
2. Олигонуклеотидный праймер по п. 1, где праймер содержит переходный участок между первым и вторым участками.
3. Олигонуклеотидный праймер по п. 2, где переходный участок включает в себя одиночный нуклеотид, цепочку из атомов углерода, полифункциональный компонент, модифицированные нуклеотиды, модифицированные остовы или их комбинацию.
4. Олигонуклеотидный праймер по п. 1, где Tm олигонуклеотидного праймера находится в пределах по меньшей мере 15°C от Tm целевой последовательности нуклеиновой кислоты.
5. Олигонуклеотидный праймер по п. 1, где Tm олигонуклеотидного праймера находится в пределах по меньшей мере 10°C от Tm целевой последовательности нуклеиновой кислоты.
6. Олигонуклеотидный праймер по п. 1, где Tm олигонуклеотидного праймера находится в пределах по меньшей мере 5°C от Tm целевой последовательности нуклеиновой кислоты.
7. Олигонуклеотидный праймер по п. 1, где Tm олигонуклеотидного праймера находится в пределах по меньшей мере 2,5°C от Tm целевой последовательности нуклеиновой кислоты.
8. Олигонуклеотидный праймер по п. 1, где Tm олигонуклеотидного праймера равна Tm целевой последовательности нуклеиновой кислоты.
9. Олигонуклеотидный праймер по п. 1, где второй участок включает в себя модификации нуклеотидов или остова для оптимизации отжига олигонуклеотидного праймера с целевым участком нуклеиновой кислоты.
10. Олигонуклеотидный праймер по п. 1, где второй участок представляет собой произвольную последовательность, которая не комплементарна ни одной нити с целевой последовательностью нуклеиновой кислоты.
11. Олигонуклеотидный праймер по п. 1, где второй участок комплементарен нити с целевой последовательностью нуклеиновой кислоты, являющейся противоположной по отношению к нити с целевой последовательностью нуклеиновой кислоты, которой комплементарен первый участок.
12. Олигонуклеотидный праймер по п. 11, где второй участок содержит расщепляемые химические структуры для ингибирования расщепления под действием полимеразы.
13. Олигонуклеотидный праймер по п. 1, где праймер содержит последовательность из цитозиновых нуклеотидов, смежную с первой последовательностью из гуанозиновых нуклеотидов.
14. Олигонуклеотидный праймер по п. 13, где количество нуклеотидов между цитозиновыми и гуанозиновыми нуклеотидами составляет меньше 5.
15. Олигонуклеотидный праймер по п. 13, где количество нуклеотидов между цитозиновыми и гуанозиновыми нуклеотидами составляет меньше 4.
16. Олигонуклеотидный праймер по п. 13, где количество нуклеотидов между цитозиновыми и гуанозиновыми нуклеотидами составляет меньше 3.
17. Олигонуклеотидный праймер по п. 13, где количество нуклеотидов между цитозиновыми и гуанозиновыми нуклеотидами составляет меньше 2.
18. Олигонуклеотидный праймер по п. 13, где количество нуклеотидов между цитозиновыми и гуанозиновыми нуклеотидами равняется 0.
19. Олигонуклеотидный праймер по п. 13, где праймер может образовывать гуанозин-квадруплексную структуру.
20. Олигонуклеотидный праймер по п. 13, где праймер дополнительно содержит вторую последовательность из гуанозиновых нуклеотидов, смежную с первой последовательностью из гуанозиновых нуклеотидов.
21. Олигонуклеотидный праймер по п. 20, где вторая последовательность из гуанозиновых нуклеотидов обуславливает сдвиг праймера и образование гуанозин-квадруплексной структуры.
22. Способ повышения температуры плавления (Tm) олигонуклеотидного праймера для амплификации целевой последовательности нуклеиновой кислоты в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающий
идентификацию целевой последовательности нуклеиновой кислоты из одного или более сегментов ДНК;
конструирование олигонуклеотидного праймера, имеющего первый участок и второй участок, где первый участок комплементарен нити с целевой последовательностью нуклеиновой кислоты и расположен на 3'-конце праймера, а второй участок расположен на 5'-конце праймера; и
где Tm олигонуклеотидного праймера является повышенной в сравнении с Tm олигонуклеотидного праймера, имеющего только первый участок.
23. Способ по п. 22, где Tm олигонуклеотидного праймера, имеющего первый участок и второй участок, находится в пределах по меньшей мере 15°C от Tm целевой последовательности нуклеиновой кислоты.
24. Способ по п. 22, где Tm олигонуклеотидного праймера, имеющего первый участок и второй участок, находится в пределах по меньшей мере 10°C от Tm целевой последовательности нуклеиновой кислоты.
25. Способ по п. 22, где Tm олигонуклеотидного праймера, имеющего первый участок и второй участок, находится в пределах по меньшей мере 5°C от Tm целевой последовательности нуклеиновой кислоты.
26. Способ по п. 22, где Tm олигонуклеотидного праймера, имеющего первый участок и второй участок, находится в пределах по меньшей мере 2,5°C от Tm целевой последовательности нуклеиновой кислоты.
27. Способ по п. 22, где Tm олигонуклеотидного праймера, имеющего первый участок и второй участок, равна Tm целевой последовательности нуклеиновой кислоты.
28. Способ по п. 22, где второй участок представляет собой произвольную последовательность, которая не комплементарна ни одной нити с целевой последовательностью нуклеиновой кислоты.
29. Способ по п. 22, где второй участок комплементарен нити с целевой последовательностью нуклеиновой кислоты, являющейся противоположной по отношению к нити с целевой последовательностью нуклеиновой кислоты, которой комплементарен первый участок.
30. Способ амплификации последовательности нуклеиновой кислоты, включающий
идентификацию целевой последовательности нуклеиновой кислоты из одного или более сегментов ДНК, содержащей целевую и нецелевую последовательности нуклеиновой кислоты;
получение первого олигонуклеотидного праймера и второго олигонуклеотидного праймера по любому из пп. 1, 10, 11 и 13 и
осуществление амплификации целевой последовательности нуклеиновой кислоты путем термоциклирования целевой последовательности нуклеиновой кислоты, а также первого и второго олигонуклеотидных праймеров, при этом термоциклирование предусматривает
i. денатурацию целевой нуклеиновой кислоты;
ii. гибридизацию первого олигонуклеотидного праймера с первой нитью и второго олигонуклеотидного праймера со второй нитью денатурированной целевой нуклеиновой кислоты;
iii. элонгацию первого и второго олигонуклеотидных праймеров посредством полимеризации под действием полимеразы с образованием двух новых нитей целевой нуклеиновой кислоты;
iv. денатурацию двух новых нитей, полученных из первой и второй нитей целевой нуклеиновой кислоты;
v. гибридизацию первого олигонуклеотидного праймера с первой нитью и с одной новой нитью и второго олигонуклеотидного праймера со второй нитью и c другой новой нитью целевой нуклеиновой кислоты;
vi. элонгацию первого и второго олигонуклеотидных праймеров посредством полимеризации под действием полимеразы с образованием четырех дополнительных новых нитей целевой нуклеиновой кислоты;
vii. повторение стадий (i) - (vi) с образованием множества нитей целевой нуклеиновой кислоты, в которые были встроены вторые участки первого и второго олигонуклеотидных праймеров; и
где верхнее значение температуры в температурном цикле при термоциклировании выбрано так, чтобы снизить до минимума нецелевую денатурацию и повысить до максимума целевую денатурацию.
31. Способ по п. 30, где в ходе термоциклирования образуется «вздутие», включающее в себя денатурированную целевую последовательность нуклеиновой кислоты и смежную отожженную нецелевую последовательность нуклеиновой кислоты.
32. Способ по п. 31, где олигонуклеотидные праймеры предотвращают амплификацию целевой последовательности нуклеиновой кислоты за пределами «вздутия».
33. Способ амплификации и обнаружения двух или более целевых последовательностей нуклеиновой кислоты в образце, включающий
идентификацию двух или более целевых последовательностей нуклеиновой кислоты из одного или более сегментов ДНК;
A
D
получение пары олигонуклеотидных праймеров, специфичных к каждой целевой последовательности нуклеиновой кислоты, где каждая пара олигонуклеотидных праймеров характеризуется кривой отжига (T), которая перекрывается с кривой денатурации (T) их целевой последовательности нуклеиновой кислоты, для сокращения до минимума диапазона температур от более высокой температуры
плавления пары олигонуклеотидных праймеров до температуры плавления их целевой последовательности нуклеиновой кислоты;
осуществление амплификации каждой целевой последовательности нуклеиновой кислоты путем термоциклирования каждой пары олигонуклеотидных праймеров и их целевой последовательности нуклеиновой кислоты в пределах определенного диапазона температур, где последовательное термоциклирование при разных диапазонах температур приводит к амплификации двух или более целевых последовательностей нуклеиновой кислоты; и
обнаружение двух или более амплифицированных целевых последовательностей нуклеиновой кислоты.
34. Способ по п. 33, где каждая амплифицированная целевая последовательность нуклеиновой кислоты имеет длину приблизительно 400 п. о. или больше.
35. Способ по п. 33, где для каждого диапазона температур выбирают одну или более полимераз, подходящих для применения при конкретной температуре.
36. Способ по п. 33, где одна или более целевых последовательностей нуклеиновой кислоты представляют собой внутренний контроль.
37. Способ по п. 36, где пара олигонуклеотидных праймеров, специфичных в отношении внутреннего контроля, является идентичной паре олигонуклеотидных праймеров, специфичных в отношении целевой последовательности нуклеиновой кислоты, за исключением ошибочных спариваний, обеспечивающих возможность амплификации внутреннего контроля при диапазоне температур, отличном от такового для целевой последовательности нуклеиновой кислоты.
38. Способ по п. 33, где каждую пару олигонуклеотидных праймеров применяют только при свойственном им диапазоне температур термоциклирования.
39. Способ по п. 33, где термоциклирование при каждом диапазоне температур включает столько циклов, сколько требуется для амплификации каждой целевой последовательности нуклеиновой кислоты.
40. Способ по п. 33, где термоциклирование предусматривает последовательное проведение циклов при диапазонах температур, начиная от диапазона самых низких температур и переходя к диапазону самых высоких температур.
41. Способ по п. 33, где термоциклирование предусматривает последовательное проведение циклов при диапазонах температур, начиная от диапазона самых высоких температур и переходя к диапазону самых низких температур.
42. Способ по п. 33, где имеет место перекрывание между одним или более диапазонами температур.
43. Способ по п. 42, где термоциклирование предусматривает диапазоны температур от приблизительно 50°C до приблизительно 65°C, от приблизительно 60°C до приблизительно 95°C и от приблизительно 90°C до приблизительно 105°C.
44. Способ по п. 42, где термоциклирование предусматривает диапазоны температур от приблизительно 45°C до приблизительно 72°C и от приблизительно 72°C до приблизительно 99°C.
45. Способ по п. 42, где термоциклирование предусматривает диапазоны температур от приблизительно 54°C до приблизительно 63°C, от приблизительно 63°C до приблизительно 81°C и от приблизительно 81°C до приблизительно 99°C.
46. Способ по п. 33, где обнаружение предусматривает применение флуоресцентных красителей, электрохимических индикаторов, стратегий иммобилизации мишени или любой их комбинации.
47. Способ по п. 33, где стадия амплификации дополнительно включает термоциклирование каждой пары олигонуклеотидных праймеров, их целевой
последовательности нуклеиновой кислоты и олигонуклеотидного зонда, комплементарного целевой последовательности нуклеиновой кислоты и имеющего расщепляемую последовательность.
48. Способ по п. 47, где каждый олигонуклеотидный зонд содержит флуоресцентный краситель и тушитель, расположенные взаимозаменяемо на 5'- или 3'-конце каждого зонда.
49. Способ по п. 48, где каждый олигонуклеотидный зонд содержит один и тот же флуоресцентный краситель, расположенный взаимозаменяемо на 5'- или 3'-конце каждого зонда.
50. Способ по п. 47, где расщепляемая последовательность каждого олигонуклеотидного зонда расщепляется посредством независимого от полимеризации расщепления или посредством зависимого от полимеризации расщепления под действием полимеразы.
51. Способ по п. 47, где один или более олигонуклеотидных зондов представляют собой гибридный шпилечный/расщепляемый зонд.
52. Способ по любому из пп. 47-51, где стадия обнаружения предусматривает обнаружение сигнала, вырабатываемого в результате расщепления указанного зонда.
53. Способ по п. 33, где один или оба из каждой пары олигонуклеотидных праймеров содержат триплекс-образующий участок (TFR).
54. Способ по п. 53, где праймер с TFR образует нити триплекс-образующей ДНК, если целевая последовательность нуклеиновой кислоты включает в себя последовательность, характеризующуюся комплементарностью с последовательностью праймера с TFR.
55. Способ по п. 53, где целевая последовательность нуклеиновой кислоты содержит природный триплекс-образующий участок.
56. Способ по п. 53, дополнительно предусматривающий один или более зондов на основе триплекс-образующих олигонуклеотидов (TFO), которые гибридизируются с одним или более TFR, образуя таким образом триплекс, в последовательности двухнитевой ДНК, которая была образована в процессе амплификации целевой последовательности нуклеиновой кислоты с помощью одного или более праймеров с TFR.
57. Способ по п. 56, где каждый TFO-зонд содержит компонент-метку, выбранный из группы, включающей флуоресцентный компонент, радиоактивный компонент, окрашенный компонент, флуоресцентный репортерный компонент, тушащий флуоресценцию компонент, один из пары компонентов резонансного переноса энергии флуоресценции и их комбинации.
58. Способ по п. 57, где компонент-метка является одинаковым для каждого TFO-зонда.
59. Способ по п. 56, дополнительно предусматривающий кэп на 3'-конце TFO-зонда, который ингибирует элонгацию с 3'-конца.
60. Способ по п. 53, где один или оба из каждой пары олигонуклеотидных праймеров дополнительно содержат метку.
61. Способ по п. 56, где один или более TFO-зондов представляют собой триплекс-образующий флуоресцентный зонд (TFFP).
62. Способ по п. 56, где один или более TFO-зондов представляют собой триплекс-образующий флуоресцентный зонд (TFFP), а двухнитевая ДНК имеет краситель-рецептор.
63. Способ по п. 56, где двухнитевая ДНК имеет первую метку, и где TFO-зонд имеет вторую метку, при этом первая метка и вторая метка обеспечивают обнаруживаемое излучение после вступления в тесную ассоциацию.
64. Способ по п. 56, где TFO-зонд сконструирован для отжига при приблизительно такой же или более низкой температуре, чем Tm праймера c TFR.
65. Способ по п. 56, дополнительно предусматривающий один или более неспецифичных ДНК-связывающих красителей, которые связываются с гибридизированной триплексной ДНК.
66. Способ по п. 56, дополнительно предусматривающий один или более квадруплекс-связывающих красителей.
67. Способ по п. 56, где TFO-зонд содержит флуоресцентный краситель и тушитель.
68. Способ по п. 56, где TFO-зонд содержит флуоресцентный краситель и тушитель в шпилечной конфигурации.
69. Набор, имеющий один или более олигонуклеотидных праймеров по любому из пп. 1, 10, 11 и 13.
70. Способ по п. 47, где две или более целевых последовательностей нуклеиновой кислоты включают в себя последовательность из Trichomonas и последовательность из Xenorhabdus nematophila.
71. Способ по п. 70, где последовательность из Xenorhabdus nematophila представляет собой контрольную последовательность.
72. Способ по п. 70, где пара олигонуклеотидных праймеров, специфичных в отношении последовательности из Trichomonas, включает SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 57.
73. Способ по п. 70, где олигонуклеотидный зонд, комплементарный последовательности из Trichomonas, включает SEQ ID NO: 59.
74. Способ по п. 70, где пара олигонуклеотидных праймеров, специфичных в отношении последовательности из Xenorhabdus nematophila, включает SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 52.
75. Способ по п. 70, где олигонуклеотидный зонд, комплементарный последовательности из Xenorhabdus nematophila, включает SEQ ID NO: 53.
76. Способ по п. 70, где термоциклирование предусматривает диапазоны температур от приблизительно 89°C до приблизительно 74°C и от приблизительно 63°C до приблизительно 78°C.
77. Способ по п. 76, где термоциклирование при температуре от приблизительно 89°C до приблизительно 74°C приводит к амплификации последовательности из Trichomonas.
78. Способ по п. 76, где термоциклирование при температуре от приблизительно 63°C до приблизительно 78°C приводит к амплификации последовательности из Xenorhabdus nematophila.
79. Способ обнаружения Trichomonas у крупного рогатого скота, включающий
получение пары олигонуклеотидных праймеров, специфичных в отношении целевой последовательности нуклеиновой кислоты из Trichomonas;
получение пары олигонуклеотидных праймеров, специфичных в отношении контрольной последовательности нуклеиновой кислоты из Xenorhabdus nematophila;
A
D
где каждая пара олигонуклеотидных праймеров характеризуется кривой отжига (T), которая перекрывается с кривой денатурации (T) их целевой
последовательности нуклеиновой кислоты, для сокращения до минимума диапазона температур от более высокой температуры плавления пары олигонуклеотидных праймеров до температуры плавления их целевой последовательности нуклеиновой кислоты;
осуществление амплификации каждой последовательности нуклеиновой кислоты путем термоциклирования каждой пары олигонуклеотидных праймеров и их целевой последовательности нуклеиновой кислоты в пределах определенного диапазона температур, где последовательное термоциклирование при разных диапазонах температур приводит к амплификации последовательностей из Trichomonas и Xenorhabdus nematophila; и
обнаружение амплифицированных целевых последовательностей нуклеиновой кислоты.