СПОСОБ СОРБЦИОННО-ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЕТРАЦИКЛИНА В МОЛОКЕ И МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТАХ
METHOD OF SORPTION-CHROMATOGRAPHIC DETERMINATION OF TETRACYCLINE IN MILK AND DAIRY PRODUCTS

Изобретение относится к аналитической химии и касается количественного определения тетрациклина в молоке и молочных продуктах.
Потребность общества в росте производительности и снижении себестоимости пищевой продукции диктует необходимость применения антибиотиков в качестве ингибиторов патогенной микрофлоры. Среди антибактериальных препаратов, используемых в животноводстве и пищевой промышленности, ведущую роль занимают тетрациклины - антибиотики широкого спектра действия, характеризующиеся общим спектром и механизмом антимикробного действия, близкими фармакологическими и химическими свойствами. Особенно широко применяется тетрациклин.
Известен фотометрический способ определения тетрациклина, основанный на внесении в анализируемую пробу раствора хлорамина с последующим фотометрированием полученного раствора [1].
3
Недостатками способа являются низкая чувствительность (0,05 мг/см) и селективность, т.к. невозможно проводить определение в окрашенных растворах и в присутствии других антибиотиков.
Известен способ определения тетрациклина путем обработки анализируемой пробы раствором гидроксида натрия при рН 9,0-10,5 с последующим фотометрированием полученного раствора [2].
Токсические свойства тетрациклина (возникновение аллергических реакций, дисбактериозов, подавление активности некоторых ферментов, изменение микрофлоры кишечника и т.д.), проявляющиеся при его поступлении в организм человека в дозах, превышающих ПДК, делают необходимым проведение мониторинга сырья и продуктов животного происхождения, в частности молока и молочных продуктов, на наличие в них остатков данного антибиотика.
Недостатком данного способа является то, что в щелочной среде тетрациклин неустойчив. В зависимости от концентрации тетрациклина скорость деструкции настолько различна, что количественное определение с установленным доверительным интервалом на уровне 10% практически невозможно. Это означает, что в одной и той же пробе найденная концентрация тетрациклина может быть в 10 раз больше или в 10 раз меньше. Это обстоятельство является препятствием к применению данной методики.
6
4-
Известен также способ сорбционно-цветометрического определения тетрациклина, основанный на сорбционном концентрировании тетрациклина на минеральном сорбенте и формировании на сорбенте окрашенного соединения при участии тетрациклина, хлорида железа (III) и [Fe(CN)] [3].
Недостатком данного способа является визуальное детектирование аналитического сигнала путем его сравнения с колориметрической тест-шкалой. Данный метод является полуколичественным, а регистрация сигнала субъективной, что ограничивает применение данной методики.
Недостатками способа определения остаточных количеств тетрациклина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с масс-спектрометрическим детектором [4] является высокая себестоимость анализа, связанная с использованием дорогостоящих сорбционных патронов и оборудования.
Наиболее надежным из известных способов определения тетрациклина является иммуноферментный анализ (ИФА) [5].
К достоинствам ИФА можно отнести высокую чувствительность и возможность учета результатов через несколько часов от момента начала исследования.
К недостаткам метода относят сложность проведения анализа, трудности оценки специфичности полученных результатов и высокую стоимость.
Целью изобретения является создание способа определения содержания тетрациклина в молоке и молочных продуктах.
Технический результат заключается в возможности количественного определения содержания тетрациклина в молоке и молочных продуктах с достаточно высокой чувствительностью, селективностью, экспрессностью при низкой себестоимости анализа.
Метод основан на предварительном сорбционном концентрировании тетрациклина природным цеолитом Хотынецкого месторождения Орловской области и последующем его определении с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Изобретение включает стадии: а) пробоподготовка - удаление из молока или молочного продукта белков и молочного жира, б) сорбция тетрациклина цеолитом, в) десорбция тетрациклина с поверхности сорбента, г) хроматографическое определение тетрациклина.
Следующий пример представлен для того, чтобы наиболее полно проиллюстрировать изобретение.
3
3
3
Пример 1. Первая стадия определения тетрациклина в молоке и молочных продуктах включает пробоподготовку - удаление из пробы белков и молочного жира. Для этого в 100-250 см анализируемого продукта вносят 2-3 см концентрированной уксусной кислоты и термостатируют при 40- 45°C в течение 5-10 мин. Не рекомендуется вести процесс при температуре выше 55-60°С, т.к. это может вызвать частичную деструкцию тетрациклина. Далее пробу перемешивают и центрифугируют 5-7 мин при 3000-5000 об/мин. Центрифугат переносят в колбу, доводят рН среды до ≈2,55 М азотной кислотой и добавляют 25 см универсальной буферной смеси (рН=2,50).
3
Вторая стадия: сорбция тетрациклина. В полученный центрифугат вносят 0,5-1,0 г цеолита, перемешивают 20 мин, фильтруют через фильтр «белая лента», промывают дистиллированной водой и 10 см 50% этилового спирта.
3
3
Третья стадия: десорбция тетрациклина с поверхности сорбента. Фильтр с цеолитом переносят в химический стакан, добавляют 15 см насыщенного раствора оксалата аммония и термостатируют при 50°С в течение 5-7 мин. Полученную суспензию фильтруют через фильтр «синяя лента» и доводят объем до 20 см дистиллированной водой.
Четвертая стадия: хроматографическое определение тетрациклина. Определение тетрациклина проводят методом обращено-фазовой (ОФ) ВЭЖХ с ультрафиолетовым (УФ) детектированием при длине волны 350 нм в режиме градиентного элюирования. Первоначально смесь элюируют раствором вода - ацетонитрил (10:90) в течение 2 мин на скорости 130 мкл/мин, затем в течение 0,1 мин содержание ацетонитрила уменьшают до 50% при скорости 170 мкл/мин, после чего элюирование ведут на скорости 200 мкл/мин, не изменяя состав смеси, до полного выхода из колонки тетрациклина. На рисунке 1 в качестве примера представлена типичная хроматограмма пробы молока с добавкой тетрациклина, получаемая на четвертой стадии предлагаемого способа (колонка 80×2 мм, Сепарон С18). Определяют площадь пика тетрациклина (обозначен символом * на рисунке 1) и по заранее построенному градуировочному графику его концентрацию в анализируемой пробе.
3
3
3
3
3
3
Построение градуировочной кривой. В 5 колб на 100 см вносят 0,1; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 см 16 мкг/мл раствора тетрациклина, 20 см универсальной буферной смеси (рН=2,50) и доводят объем до метки дистиллированной водой. В каждую колбу вносят по 0,5-1,0 г цеолита и перемешивают 20 мин, фильтруют через фильтр «белая лента», промывают дистиллированной водой и 10 см 50% этилового спирта. Фильтр с цеолитом переносят в химический стакан, добавляют 15 см насыщенного раствора оксалата аммония и термостатируют при 50°С в течение 5-7 мин. Полученную суспензию фильтруют через фильтр «синяя лента» и доводят объем до 20 см дистиллированной водой. Полученный раствор хроматографируют при λ=350 нм, используя режим градиентного элюирования, как при анализе образца молока или молочного продукта. По полученным данным строят график в координатах «площадь хроматографического пика - содержание тетрациклина в пробе».
Результаты определения тетрациклина в молоке и молочных продуктах методом «введено-найдено» по предлагаемой методике представлены в таблице 1.
Таблица 1
Результаты определения тетрациклина в молоке и молочных продуктах (n=5, Р=0,95)
Введено, мкг/см<sup>3</sup>
Найдено, мкг/см<sup>3</sup>
S<sub>r</sub>
0,00о
-
-
0,04о
0,035±0,00<sub>6</sub>
0,12
0,08о
0,085±0,01<sub>1</sub>
0,10
0,16о
0,159±0,01<sub>5</sub>
0,07
0,48о
0,482±0,04<sub>1</sub>
0,06
Анализ метрологических характеристик способа определения тетрациклина в молоке и молочных продуктах показывает высокую чувствительность, избирательность и воспроизводимость результатов. Предел определения тетрациклина по предлагаемой методике составляет 8 мкг/кг. Для сравнения предел определения тетрациклина одним из наиболее чувствительных, но при этом более дорогим (с точки зрения себестоимости анализа) методом ИФА [5] составляет до 36 мкг/кг.
Таким образом, предлагаемый способ определения тетрациклина в молоке и молочных продуктах, включающий стадию предварительного сорбционного концентрирования антибиотика природным цеолитом и последующее определение аналита методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, позволяет уменьшить погрешность анализа, отличается достаточной простотой исполнения и экономичностью, не требует применения дорогостоящего оборудования. Он может быть использован в практике лабораторий, осуществляющих химический анализ пищевых продуктов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Соловей Н.В., Сааведра Н.Ф. Фотометрическое определение тетрациклина гидрохлорида. - Фармация, 1974, Т.23, №4, С.72-73.
2. Соболева О.Н. Способ определения тетрациклина: А.с. SU 1081487 А1; заявл. 1982.08.02; опубл. 1984.03.23.
3. Алыков Н.М., Алыкова Т.В., Салмахаева A.M. Способ экспрессного сорбционно-цветометрического определения тетрациклина в моче (патент РФ №2350950).
4. ГОСТ Р 53601-2009. Метод определения остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы с помощью высокоэффективной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором.
5. ГОСТ Р 53774-2010. Молоко и молочные продукты. Иммуноферментные методы определения наличия антибиотиков.