УЛУЧШЕННЫЕ СПОСОБЫ ОБРАЗОВАНИЯ ДИСУЛЬФИДНЫХ СВЯЗЕЙ

1. Способ образования дисульфидной связи, включающий: вызов или обеспечение возможности присоединения первого (поли)пептида/белка ко второму (поли)пептиду/белку, где указанное присоединение вызвано образованием дисульфидной связи между первым цистеиновым остатком, содержащимся в указанном первом (поли)пептиде/белке, и вторым цистеиновым остатком, содержащимся в указанном втором (поли)пептиде/белке, где один из указанных (поли)пептидов/белков содержит аминокислоту, имеющую рI выше 8, которая положительно влияет на реакционную способность по меньшей мере одного из указанных цистеиновых остатков.
2. Способ по п.1, где указанная аминокислота, имеющая рI выше 8, содержится в указанном первом (поли)пептиде/белке.
3. Способ по п.1, где указанная аминокислота, имеющая рI выше 8, содержится в указанном втором (поли)пептиде/белке.
4. Способ по п.2 или 3, где указанная аминокислота, имеющая рI выше 8, отсутствует в соответствующем аминокислотном положении в указанном (поли)пептиде/белке дикого типа.
5. Способ по п.4, где указанная аминокислота, имеющая рI выше 8, была введена искусственно.
6. Способ по п.1, где указанная аминокислота, имеющая рI выше 8, содержится в пределах десяти аминокислот, соседних с указанным цистеиновым остатком в этом же (поли)пептиде/белке.
7. Способ по п.6, где указанная аминокислота, имеющая рI выше 8, содержится в пределах пяти аминокислот, соседних с указанным цистеиновым остатком в этом же (поли)пептиде/белке.
8. Способ по п.1, где указанный первый цистеиновый остаток присутствует на N-конце или С-конце указанного первого (поли)пептида/белка или вблизи него.
9. Способ по п.8, где указанный первый цистеиновый остаток является N-концевым или С-концевым цистеиновым остатком.
10. Способ по п.1, где указанный второй цистеиновый остаток присутствует на N-конце или С-конце указанного второго (поли)пептида/белка или вблизи него.
11. Способ по п.10, где указанный второй цистеиновый остаток является N-концевым или С-концевым цистеиновым остатком.
12. Способ по п.1, где указанный второй (поли)пептид/белок экспронирован на поверхности бактериофаговой частицы.
13. Способ по п.12, где указанный первый и указанный второй (поли)пептид/белок экспрессируются и собираются в подходящей клетке-хозяине.
14. Способ по п.1, где указанная дисульфидная связь образуется в периплазматическом пространстве клетки-хозяина.
15. Способ по п.1, где указанная дисульфидная связь представляет собой межмолекулярную дисульфидную связь.
16. Способ по п.1, где указанная аминокислота, имеющая рI выше 8, выбрана из лизина и аргинина.
17. Способ по п.16, где указанная аминокислота представляет собой лизин.
18. Способ по п.1, где указанный первый (поли)пептид/белок и указанный второй (поли)пептид/белок являются разными.
19. Способ по п.1, где указанный первый (поли)пептид/белок является компонентом белковой оболочки бактериофаговой частицы.
20. Способ по п.19, где указанный компонент белковой оболочки является укороченным вариантом белка оболочки бактериофага дикого типа, где указанный укороченный вариант содержит по меньшей мере ту часть указанного белка оболочки дикого типа, которая вызывает включение указанного белка оболочки в белковую оболочку бактериофаговой частицы.
21. Способ по п.19, где указанный компонент белковой оболочки представляет собой модифицированный вариант белка оболочки бактериофага дикого типа, где указанный модифицированный вариант способен включаться в белковую оболочку бактериофаговой частицы.
22. Способ по п.19, где указанный первый цистеиновый остаток, содержащийся в указанном первом (поли)пептиде/белке, присутствует в соответствующем аминокислотном положении в белке оболочки бактериофага дикого типа.
23. Способ по п.19, где указанный первый цистеиновый остаток, содержащийся в указанном первом (поли)пептиде/белке, отсутствует в соответствующем аминокислотном положении в белке оболочки бактериофага дикого типа.
24. Способ по п.23, где указанный первый цистеиновый остаток был искусственно введен в белок оболочки бактериофага дикого типа.
25. Способ по п.20, где указанный первый цистеиновый остаток был искусственно введен в укороченный вариант белка оболочки бактериофага дикого типа.
26. Способ по п.21, где указанный первый цистеиновый остаток был искусственно введен в модифицированный вариант белка оболочки бактериофага дикого типа.
27. Способ по п.12, где указанная бактериофаговая частица представляет собой бактериофаговую частицу нитчатого бактериофага.
28. Способ по п.19, где указанный компонент белковой оболочки бактериофаговой частицы представляет собой белок оболочки pIII дикого типа или происходит от него.
29. Способ по п.19, где указанный компонент белковой оболочки бактериофаговой частицы представляет собой белок оболочки рIХ дикого типа или происходит от него.
30. Способ по п.1, где указанный второй цистеиновый остаток содержащийся в указанном втором (поли)пептиде/белке, отсутствует в соответствующем аминокислотном положении в указанном втором (поли)пептиде/белке дикого типа.
31. Способ по п.30, где указанный второй цистеиновый остаток был искусственно введен в указанный второй (поли)пептид/белок.
32. Способ по п.1, где указанный второй (поли)пептид/белок содержит иммуноглобулин или его функциональный фрагмент.
33. Способ по п.32, где указанный функциональный фрагмент представляет собой scFv- или Fab-фрагмент.
34. Способ экспонирования второго (поли)пептида/белка на поверхности бактериофаговой частицы, включающий: вызов или обеспечение возможности присоединения указанного (поли)пептида/белка после экспрессии к компоненту белковой оболочки, где указанное присоединение вызвано образованием дисульфидной связи между первым цистеиновым остатком, содержащимся в указанном компоненте белковой оболочки, и вторым цистеиновым остатком, содержащимся в указанном (поли)пептиде/белке, где указанный (поли)пептид/белок или указанный компонент белковой оболочки содержит аминокислоту, имеющую рI выше 8, что положительно влияет на реакционную способность указанного первого или указанного второго цистеинового остатка.
35. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая модифицированный вариант белка оболочки бактериофага дикого типа, где указанный модифицированный вариант содержит:
(а) один или более чем один участок указанного белка оболочки бактериофага дикого типа, где один из указанных участков содержит по меньшей мере тот участок, который вызывает или обеспечивает возможность включения указанного белка оболочки в фаговую оболочку,
(б) первый цистеиновый остаток и
(в) аминокислоту, имеющую рI выше 8, которая положительно влияет на реакционную способность указанного первого цистеинового остатка.
36. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая модифицированный иммуноглобулин или его функциональный фрагмент, где указанный модифицированный иммуноглобулин или функциональный фрагмент содержит:
(а) иммуноглобулин или его функциональный фрагмент,
(б) цистеиновый остаток и
(в) аминокислоту, имеющую рI выше 8, которая положительно влияет на реакционную способность указанного цистеинового остатка.
37. Последовательность нуклеиновой кислоты по п.36, где указанный функциональный фрагмент модифицированного иммуноглобулина представляет собой scFv- или Fab-фрагмент.
38. Последовательность нуклеиновой кислоты по любому из пп.35-37, где указанная последовательность нуклеиновой кислоты дополнительно кодирует одну или более чем одну пептидную последовательность с целью очистки и/или определения.
39. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп.35-38.
40. Вектор по п.39, дополнительно содержащий одну или более чем одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую второй (поли)пептид/белок, содержащий второй цистеиновый остаток.
41. Клетка-хозяин, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты по любому из пп.35-38 или вектор по любому из пп.39-40.
42. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.39 и второй вектор, содержащий одну или более чем одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую второй (поли)пептид/белок, содержащий второй цистеиновый остаток.
43. (Поли)пептид/белок, кодируемый последовательностью нуклеиновой кислоты по любому из пп.35-38, вектором по любому из пп.39 или 40 или продуцируемый клеткой-хозяином по пп.41 или 42.
44. Бактериофаговая частица, экспонирующая (поли)пептид/белок на своей поверхности, получаемая способом по п.34.
45. Бактериофаговая частица по п.44, где указанный (поли)пептид/белок представляет собой иммуноглобулин или его функциональный фрагмент.
46. Многообразная совокупность бактериофаговых частиц по п.44 или 45, где каждая из указанных бактериофаговых частиц экспонирует второй (поли)пептид/белок из многообразной совокупности вторых (поли)пептидов/белков.
47. Способ получения (поли)пептида/белка, обладающего нужным свойством, включающий:
(а) предоставление многообразной совокупности бактериофаговых частиц по п.46 и
(б) скрининг указанной многообразной совокупности и/или выбор из указанной многообразной совокупности с получением по меньшей мере одной бактериофаговой частицы, экспонирующей (поли)пептид/белок, обладающий нужным свойством.
48. Способ по п.47, где стадия (б) дополнительно включает:
(ба) приведение указанной многообразной совокупности бактериофаговых частиц в контакт с интересующей мишенью;
(бб) элюирование бактериофаговых частиц, не связавшихся с интересующей мишенью; и
(бв) элюирование бактериофаговых частиц, связавшихся с интересующей мишенью, путем обработки комплексов интересующей мишени и бактериофагов, связавшихся с указанной интересующей мишенью, образующихся на стадии (ба) в восстанавливающих условиях.
49. Способ по п.47 или 48, где указанным нужным свойством является связывание с интересующей мишенью, ингибирование интересующей мишени, блокирование интересующей мишени, активация реакции, опосредованной мишенью, ферментативная активность.
50. Комплекс, содержащий:
(а) первый (поли)пептид/белок, содержащий первый цистеиновый остаток, и
(б) второй (поли)пептид/белок, содержащий второй цистеиновый остаток, где один из указанных (поли)пептидов/белков дополнительно содержит аминокислоту, имеющую рI выше 8, которая положительно влияет на реакционную способность по меньшей мере одного из указанных цистеиновых остатков, и где указанный первый и указанный второй (поли)пептид/белок образуют дисульфидную связь через указанные цистеиновые остатки.
51. Комплекс по п.50, где указанный второй (поли)пептид/белок является компонентом многобразной совокупности вторых (поли)пептидов/белков, экспонированных на многообразной совокупности множества бактериофаговых частиц.
52. Комплекс по п.50, где указанный первый (поли)пептид/белок представляет собой белок оболочки фага.
53. Комплекс по п.50, где указанный второй (поли)пептид/белок содержит иммуноглобулин или его функциональный фрагмент.
54. Комплекс по п.53, где указанный функциональный фрагмент представляет собой scFv- или Fab-фрагмент.
55. Клетка-хозяин, содержащая комплекс по любому из пп.50-54.
56. Способ образования дисульфидной связи, включающий: вызов или обеспечение возможности присоединения первого (поли)пептида/белка ко второму (поли)пептиду/белку, где указанное присоединение вызвано образованием дисульфидной связи между первым цистеиновым остатком, содержащимся в указанном первом (поли)пептиде/белке, и вторым цистеиновым остатком, содержащимся в указанном втором (поли)пептиде/белке, где один из указанных (поли)пептидов/белков содержит аминокислоту, имеющую рI выше 8.
57. Способ по п.56, где указанная аминокислота, имеющая рI выше 8, положительно влияет на реакционную способность по меньшей мере одного из указанных цистеиновых остатков.