СПОСОБ ИЗБИРАТЕЛЬНОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ТРИПТОФАНА В СМЕСИ α-АМИНОКИСЛОТ
METHOD FOR SELECTIVE IDENTIFICATION OF TRYPTOPHAN IN MIXTURE OF α-AMINO ACIDS

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам конструирования тест-систем, применяемых для экспресс-обнаружения, идентификации и определения неорганических и органических соединений.
Триптофан относится к важнейшим биологически активным веществам - незаменимым кодируемым альфа-аминокислотам, входящим в состав многих белков, мировое производство которого превышает 200 т/год. Он широко применяется в смесях аминокислот для парэнтального питания больных, в животноводстве как добавка к кормам, входит в состав белковых гидролизатов и т.п.
Известен способ обнаружения триптофана по реакции с бромом (F.G.Hopkins, S.W.Col, J.Physjol., 27, 427 (1901). Способ включает обработку капли раствора пробы сильно разбавленным раствором бромной воды, нагревание в течение 30 сек раствора на кипящей водяной бане. При достаточно большом содержании триптофана (5 мкг) появляется розовое (красное) окрашивание. Экстракция эфиром повышает чувствительность реакции.
Однако данный способ нельзя отнести к экспрессным и экологически выдержанным, а также он не предусмотрен для обнаружения триптофана в смеси α-аминокислот вследствие мешающего влияния других аминокислот и продуктов их разложения.
Известен другой способ обнаружения триптофана по реакции с п-диметиламинобензальдегидом (ДМАБА). (Р.Шрайнер, Д.Кертин, Т.Моррилл «Идентификация органических соединений» М., Мир, 1983, с.276). Способ включает обработку капли исследуемого раствора пробы раствором ДМАБА в концентрированной соляной кислоте. Обнаружение триптофана производится по появлению фиолетового окрашивания раствора.
Однако данный способ также не предусмотрен для обнаружения триптофана в смеси α-аминокислот, поскольку не является избирательным, и весь ряд незаменимых аминокислот обнаруживает схожие эффекты при реакциях с ДМАБА.
Наиболее близким к предложенному способу является способ обнаружения триптофана в водном растворе с помощью нингидрина (Ф.Файгль «Капельный анализ органических веществ» Гос. Научно-техн. Издат-во хим. литературы, М., 1962, с.372). Способ включает пропитку бумаги раствором нингидрина, высушивание, нанесение испытуемого раствора и снова высушивание до появления фиолетового окрашивания. Применение нингидрина позволяет обнаружить наличие триптофана (до 1 мкг) в чистом водном растворе.
Однако данный способ не предусмотрен для обнаружения триптофана в присутствии других незаменимых аминокислот, т.к. все они с нингидрином в аналогичных условиях образуют окрашенные (преимущественно в фиолетовые и красно-фиолетовые цвета) продукты взаимодействия.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка простого, экспрессного, дешевого и экологически чистого способа избирательного тестирования триптофана в смесях аминокислот различного состава, что упрощает и удешевляет анализ при сохранении его качественных параметров.
Технический результат заключается в обеспечении возможности проведения избирательной идентификации триптофана в смеси α-аминокислот.
Поставленная задача решается тем, что в способе идентификации триптофана в испытуемом растворе, включающем нанесение на бумажную тест-полоску испытуемого раствора и реагента, высушивание тест-полоски после нанесения соответствующего вещества, определение наличия триптофана по изменению окраски тест-полоски, согласно решению в качестве реагента используют раствор изатина, а в качестве испытуемого раствора используют смесь α-аминокислот.
Тест-полоску предварительно пропитывают ацетатно-аммиачным буферным раствором до значения pH 3-11, после чего высушивают тест-полоску.
В качестве растворителя изотина используют ацетон или этанол.
В качестве материала для тест-полосы выбрана фильтровальная бумага.
Раствор изатина наносят на тест-полоску путем распыления.
Буферные растворы с разными pH готовят следующим образом. Смешивают химически чистую уксусную кислоту, ГОСТ 61-75 и аммиак водный, ч.д.а., ГОСТ 3760-79. Для предварительной пропитки бумажной тест-полоски размером 1×7 см буферные растворы со значением pH 3-11 готовят в соответствии с нижеприведенной таблицей 1.
Таблица1
Буферные растворы pH 3-11 (СН<sub>3</sub>СООН- NH<sub>4</sub>OH)
pH
2н СН<sub>3</sub>СООН
2н NH<sub>4</sub>OH
3
99,3
0,7
4
85,9
14,1
5
59,7
40,3
6
51,2
48,8
7
50,0
50,0
8
49,3
50,7
9
44,1
55,9
10
20,6
79,4
11
2,4
97,6
4
4
Раствор 2н NHOH готовили разбавлением дистиллированной водой 165 мл концентрированного NHOH (плотность 1,1 г/мл) в мерной колбе вместимостью 1 л.
3
Раствор 2н СНСООН (плотность 1,24 г/мл) готовили разбавлением дистиллированной водой 120 мл концентрированной уксусной кислоты в мерной колбе емкостью 1 л.
3
Раствор 30% СНСООН (плотность 1,24 г/мл) готовили разбавлением дистиллированной водой 318 мл концентрированной уксусной кислоты в мерной колбе вместимостью 1 л.
Кроме того, высушивание бумажной тест-полоски после погружения в испытуемый раствор и после опрыскивания изатином проводят в сушильном шкафу 5-10 мин при температуре 100-105°С или на воздухе.
В качестве реагента используют раствор изатина (2,3-индолиндион).
Изатин трудно растворим в воде, хорошо в этаноле, ацетоне, водных растворах щелочей. В спиртовом растворе он находится в таутомерном равновесии с лактимной (оксо-гидрокси) (II) формой. При взаимодействии аминокислот с изатином нуклеофильная атака аминогруппы α-аминокислоты происходит по карбонильному атому С3.
В описанных условиях только пролин мешает идентификации триптофана в смеси α-аминокислот, образуя соединение синего цвета. Остальные незаменимые аминокислоты окрашенных продуктов реакции не образуют.
На образование конечного продукта реакции сильное влияние оказывает растворитель изатина. В серии растворителей: ацетон, этанол, вода, амиловый спирт, хлороформ, бутанол, изобутанол наилучшие результаты достигнуты в случае ацетона и этанола.
Пример 1. Идентификация триптофана в смесях нейтральных α-аминокислот: глицина, валина, лейцина. Аминокислоты с исходной концентрацией 10-2 М смешивались по 0,5 мл и доводились дистиллированной водой до 2,5 мл. Тест-полоски бумаги пропитывались предварительно буферными растворами со значениями pH 3; 5; 7; 9; 11 и высушивались в сушильном шкафу при температуре 100-105°С. Затем на одну тест-полоску наносился 0,1 мл раствора смеси α-аминокислот без триптофана, на другую - с триптофаном и полоски вновь высушивались. Затем полоски опрыскивали 0,4%-ным раствором изатина в ацетоне и снова высушивали. В случае смеси α-аминокислот без триптофана наблюдалось устойчивое желтое окрашивание, при наличии триптофана тест-полоска окрашивалась в яркий красно-коричневый цвет.
Пример 2. Обнаружение триптофана в смеси алифатических и гидроксиаминокислот: серина и треонина. Методика проведения тестирования соответствует методике, описанной в примере 1. В случае смеси α-аминокислот без триптофана наблюдалось устойчивое желтое окрашивание, при наличии триптофана тест-полоска окрашивалась в яркий красно-коричневый цвет.
Пример 3. Обнаружение триптофана в смеси основных и серусодержащих α-аминокислот: цистеина, лизина, аргинина, гистидина. Методика проведения тестирования соответствует методике, описанной в примере 1. В случае смеси α-аминокислот без триптофана наблюдалось устойчивое желтое окрашивание, при наличии триптофана тест-полоска окрашивалась в яркий красно-коричневый цвет.
Пример 4. Обнаружение триптофана в смеси фенилаланина, тирозина, аспарагиновой и глутаминовой кислот. Методика проведения тестирования соответствует методике, описанной в примере 1. В случае смеси α-аминокислот без триптофана наблюдалось устойчивое желтое окрашивание, при наличии триптофана тест-полоска окрашивалась в яркий красно-коричневый цвет.
Пример 5. Обнаружение триптофана в смеси 15 α-аминокислот: глицина, аланина, валина, лейцина, изолейцина, серина, треонина, цистеина, лизина, аргинина, гистидина, аспарагиновой и глутаминовой кислот, фенилаланина, тирозина. Приготавливались два раствора: смесь указанных α-аминокислот без триптофана и с добавлением триптофана. Для этого α-аминокислоты с исходной концентрацией 1.10-2 М смешивались по 0,5 мл и доводились дистиллированной водой до общего объема 9 мл. Тест-полоски предварительно пропитывались буферным раствором со значением pH 10. После высушивания тест-полоски в сушильном шкафу при температуре 100-105°С на тест-полоску наносился 0,1 мл испытуемого раствора, тест-полоска снова высушивалась и опрыскивалась 0,4%-ным раствором изатина в ацетоне, снова высушивалась на воздухе. В случае смеси α-аминокислот без триптофана наблюдалось устойчивое желтое окрашивание, при наличии триптофана тест-полоска окрашивалась в яркий красно-коричневый цвет.
Полученные таким образом тест-полоски могут быть использованы для избирательного определения триптофана в смесях α-аминокислот. Чувствительность определения составляет 0,1 мкг триптофана.