Изучение противогерпетических свойств экстрактов из березового гриба Inonotus obliquus

acterization of a fundamental passage-dependent transformation of a cell line. J. Pharm. Sci. 2011; 100: 3751-62.

18. Chiapponi C., Zanni I., Garbarino C. et al. Comparison of the usefulness of the CaCo-2 cell line with standart substrates for isolation of swine influenza A viruses. J. Virol. Meth. 2010; 163: 162-5.

19. Jahangir A., Ruenphet S., Hara K. et al. Evaluation of human intestinal epithelial differentiated cells (CaCo-2) for replication, plaque formation and isolation of avian influenza viruses. J. Virol. Meth. 2010; 169: 232-8.

20. Li I.W.S., Chan K.H., To K.W.K. et al. Differential susceptibility of different cell lines to swine-origin influenza A H1N1, seasonal human influenza A H1N1, and avian influenza A H5N1 viruses. J. Clin. Virol. 2009; 46 (4): 325-30.

REFERENCES

1. WHO manual on influenza diagnosis and surveillance. 2011. http://whqlib-doc.who.int/publications/2011/9789241548090_eng.pdf - 10.11.2011

2. Mochalova L., Gambaryan A., Romanova J. et al. Receptor-binding properties of modern human influenza viruses primarily isolated in Vero and MDCK cells and chicken embryonated eggs. Virology. 2003; 313: 473-80.

3. Madin S.H., Darby N.B. Established kidney cell lines of normal adult bovine and ovine origin. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1958; 98: 574-6.

4. Tobita K., Sugiura A., Enomoto C., FuruyamaM. Plaque assay and primary isolation of influenza A viruses in an established line of canine kidney cells (MDCK) in the presence of trypsin. Med. Microbiol. Immunol. 1975; 162: 9-14.

5. Bouvier N., Palese P. The biology of influenza viruses. Vaccine. 2008; 26 (Suppl. 4): D49-53.

6. Matrosovich M., Matrosovich J., Carr N.A et al. Overexpression of the a-2,6-syaliltransferase in MDCK cells increses influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors. J. Virol. 2003; 77: 8418-25.

7. Hatakeyama S., Sakai-Tagawa Y., Kiso M. et al. Enhanced expression of an a-2,6-linked sialic acid on MDCK cells improves isolation of human influenza viruses and evaluation of their sensitivity to a neuraminidase inhibitor. J. Clin. Microbiol. 2005; 43: 4139-46.

8. Chu C., Lugovtsev V., Lewis A. et al. Production and antigenic properties of influenza virus from suspension MDCK-siat7e cells in

a bench-scale bioreactor. Vaccine. 2010; 28: 7193-201.

9. Li N., Zhang F.Y., Yu X.H. et al. Overexpression of a-2,6 sialyltransferase stimulates propagation of human influenza viruses in Vero cells. Acta Virol. 2011; 55: 147-53.

10. Pinto M., Robin-Leon S., Appay M.T. et al. Entorocyte-like differentiation and polarization of the human colon carcinoma cell line CaCo-2 in culture. Biol. Cell. 1983; 7: 323-30.

11. YoshinoS., YamamotoS., KawabataN. Use of CaCo-2 cells for isolation of influenza virus. Kansenshogaku Zasshi. 1998; 72: 347-51.

12. Zhirnov O., Klenk H.D. Human influenza A viruses are proteolyti-cally activated and do not induce apoptosis in CaCo-2 cells. Virology. 2003; 15: 198-212.

13. Jackman M.R., Shurety W., Ellis J.A. et al. Inhibition of apical but not basolateral endocytosis of ricin and folate in CaCo-2 cells by cytochalasin D. J. Cell Sci. 1994; 107: 2547-56.

14. DanilenkoD.M., SmirnovaТ.D., Gudkova Т.М. et al. Voprosy viruso-logii. 2011; 56 (6): 14-9 (in Russian).

15. ReedL.J., Muench H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 1938; 27: 493-7.

16. Woodcook S., Williamson I., Hassan I. et al. Isolation and characterization of clones from the CaCo-2 cell line displaying increased taurocholic acid transport. J. Cell Sci. 1991; 98: 323-32.

17. Jahn K.A., Biazik J.M., Braet F. GM1 expression in CaCo-2 cells: characterization of a fundamental passage-dependent transformation of a cell line. J. Pharm. Sci. 2011; 100: 3751-62.

18. Chiapponi C., Zanni I., Garbarino C. et al. Comparison of the usefulness of the CaCo-2 cell line with standart substrates for isolation of swine influenza A viruses. J. Virol. Meth. 2010; 163: 162-5.

19. Jahangir A., Ruenphet S., Hara K. et al. Evaluation of human intestinal epithelial differentiated cells (CaCo-2) for replication, plaque formation and isolation of avian influenza viruses. J. Virol. Meth. 2010; 169: 232-8.

20. Li I.W.S., Chan K.H., To K.W.K. et al. Differential susceptibility of different cell lines to swine-origin influenza A H1N1, seasonal human influenza A H1N1, and avian influenza A H5N1 viruses. J. Clin. Virol. 2009; 46 (4): 325-30.

Поступила 16.01.13

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014

УДК 615.281.8.03:616.98:578.825.12].015.44

М.В. Полковникова, Н.Н. Носик, Т.М. Гараев, Н.Г. Кондрашина, М.П. Финогенова, В.А. Шибнев

Изучение противогерпетических свойств экстрактов из березового гриба Inonotus Obliquus

фГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского», Минздрава России,123098, г. Москва

Разработаны различные схемы получения экстрактов березового гриба - чаги (Inonotus obliquus), обладающего высоким содержанием биологически активных веществ. Установлено, что водные, водноспиртовые и щелочные экстракты мало токсичны для клеток и обладают способностью защищать культуру клеток Vero от цитодеструктивного действия вируса простого герпеса. изученная более детально фракция iV, полученная методом щелочной экстракции, в концентрации 5,0 мкг/мл полностью защищала клетки при внесении до или в течение часа после инфицирования вирусом простого герпеса, тип 1.

Ключевые слова: березовый гриб чага; вирус простого герпеса; противовирусное действие; культура клеток Vero.

A study of the antiherpetic activity of the chaga mushroom (Inonotus Obliquus) extracts in the Vero cells infected with the herpes simplex virus

M. V. Polkovnikova, N. N. Nosik, T. M. Garaev, N. G. Kondrashina, M. P. Phinogenova, V. A. Shibnev

D.I. Ivanovsky Institute of Virology, Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow, Russia

The chaga mushroom (Inonotus obliquus) contains a wide range of excellent bioactive compounds. However, limited information exists on the antiviral activity of the compounds extracted from chaga. A number of subfractions of chaga were obtained using different solvents and different procedures. The subfractions of chaga extracted with water, alcohol, alkali were tested for their toxicity for the Vero cell culture and antiviral effect in the Vero cells infected with the Herpes simplex virus (HSV), Type 1. it was shown that most of the subfractions were not toxic for the Vero cells and had protective effect on the Vero cells infected with HSV. The subfraction iV in the concentration 5 gg/ml protected the Vero cells from cytodestructive action of HSV and no viral DNA was detected in infected cells treated with chaga extracts. Best protective effect was observed when compound was added before or within one hour after the Vero cells were infected with HSV.

Key words: chaga mushroom (Inonotus obliquus); herpes simplex virus; protective effect, Vero cells.

45

Введение

Березовый гриб, известный на Руси как чага, с древних времен используется в народной медицине [1]. Впервые чага всесторонне изучена в СССР специалистами Ботанического института им. В.Н. Комарова АН СССР и Первого Ленинградского медицинского института им. И.П. Павлова в середине XX столетия (П.К. Булатов, М.П. Березина, Г.А. Якимов, Е.Я. Мартынова и др.). Эти исследования не потеряли своей актуальности до настоящего времени [2, 3].

Лечебными свойствами обладает та чага, которая растет на березе. Для медицинских целей используют только гриб, растущий на живых стволах. Чага распространена в европейской части России, Западной Сибири, на Дальнем Востоке, Северном Кавказе и Урале [4, 5].

Особенностью этого гриба-паразита является высокое содержание биологически активных веществ. Их идентификация и выделение до настоящего времени изучены мало.

Известно лишь то, что основная масса их относится к так называемым полифенол-карболовым кислотам, в чаге также содержатся жирные кислоты, полисахариды, лигнин, клетчатка, стерины [6].

Установлено, что чага повышает защитные реакции организма, активизирует обмен веществ в мозговых тканях, снижает артериальное и венозное давление, оказывает противовоспалительное действие не только при внутреннем, но также и при наружном применении. Наибольшую известность получил водный экстракт чаги в качестве противоопухолевого средства [6].

такой широкий спектр биологической активности позволил предположить наличие в чаге противовирусных свойств. На это указывают и данные японских исследователей, установивших эффект ингибирования протеазы ВИЧ [7].

Нами были получены экстракты из березового гриба с использованием различных схем экстракции, которые были испытаны на их способность оказывать противовирусное действие.

Материалы и методы.

Получение экстрактов чаги. Наружный слой березового гриба, собранного в Подмосковье, подвергался измельчению и экстракции. Были разработаны различные схемы экстракции.

Вирус. В качестве модельного вируса использовали вирус простого герпеса (ВПГ), 1-го типа (ВПГ-1) штамм Л2, полученный из Государственной коллекции вирусов ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского». Вирус культивировали в перевиваемых клетках Vero. титр вируса 4,5 lg тЦИД50.

Клетки. Исследования проводили в перевиваемой культуре фибробластов почки зеленой мартышки (Vero). Клетки культивировали в 96-луночных культуральных планшетах в среде Игла МЕМ с 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (Панэко).

Критерии определения противовирусного действия. Противовирусную активность экстрактов чаги определяли цитомикроскопическим методом по степени защиты инфицированных клеточных культур от цитодеструктивного действия 100 ТЦИД50 /0,2мл вируса герпеса ( от 0 до 100% - полная защита). В качестве подтверждающего теста отсутствия репликации ВПГ использовали полимеразную цепную реакцию.

Схема получения экстрактов из березового гриба Inonotus obliquus

Inonotus obliquus

Экстракция NH4OH 10%, 20°С

Экстракт

Центрифугирование,

фильтрация

Раствор 1

Вакуум-выпаривание Фракция 1

100

Рис. 2. Противогерпетический эффект разной концентрации фракции IV.

По оси ординат - степень (в %) защиты клеток от цитодеструктивного действия ВПГ-1; по оси абсцисс - концентрация (в мкг/мл) экстракта чаги.

Результаты и обсуждения

Получение экстрактов чаги. Для получения экстрактов чаги использовали следующую общую схему: из измельченного и высушенного верхнего слоя гриба проводили экстракцию различными растворителями. Полученный экстракт центрифугировали, фильтровали и выпаривали под вакуумом (рис.1). По такой схеме были получены водные, спиртовые, щелочные и кислотные экстракты.

Определение цитотоксичности экстрактов чаги. Полученные фракции чаги испытывали на токсичность для клеток Vero. Для этого на монослой клеток вносили водные растворы экстрактов в концентрации 5, 10 или 50 мкг/мл и инкубировали в течение 48 ч при 3 70С и 5% СО2. Все испытанные экстракты, за исключение одного (табл.1), в концентрации до 50 мкг/мл не оказывали токсического действия на культуру клеток Vero. Фракция, полученная спиртовой экстракцией, в концентрации 50 мкг/мл вызывала деструкцию клеток.

Для корреспонденции:

Носик Николай Николаевич, проф.; e-mail: nosiknn@yandex.ru

46

Таблица 1

Цитотоксическое действие различных фракций экстрактов чаги

Способ получения фракции

Иссле-

дуемая

фракция

Цитодеструктивное действие фракций на клетки, %

5 мкг/мл 10 мкг/мл 50 мкг/мл

Водная экстракция I

II

Спиртовая экстракция (этиловым спиртом) III

Щелочная экстракция (гидроксидом аммиака) IV 51

53

Экстракция гидрокар- V

бонатом аммония 52

54

Экстракция уксусной VI

кислотой VII

0 0 0

0 0 0

0 0 100

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

Исследование противогерпетической активности экстрактов чаги. Исследование противовирусной активности проводили при внесении фракций чаги на монослой клеток за 2 ч до инфицирования вирусом -оптимальная схема для выявления противовирусных свойств большинства противовирусных агентов при проведении скрининга. Определяли способность экстрактов в концентрации 5, 10 и 50 мкг/мл (спиртовой экстракт 5 и 10 мкг/мл) защищать клетки от цитодеструктивного действия 100 ТЦИД50 ВПГ. Как видно из представленных данных (табл. 2), уже при концентрации 5 мкг/мл большинство фракций экстрактов обеспечивает защиту клеток от 87,5 до 100%. Исключение составляют фракции, полученные экстракцией кислотой. Однако при концентрации 50 мкг/мл все фракции обеспечивали полную защиту клеток от цитодеструктивного действия ВПГ.

Таким образом, фракции чаги, полученные водной и щелочной экстракцией, обладали наиболее выраженными противогерпетическими свойствами. Ниже представлены данные, полученные при исследовании фракции

5 мкг/мл

О 10 мкг/мл

50 мкг/мл

Рис. 3. Зависимость защитного эффекта экстракта чаги (фракция IV) от времени введения относительно инфицирования клеток ВПГ-1.

По оси ординат - степень (в %) защиты клеток; по оси абсцисс - время (в ч) введения фракции чаги относительно времени инфицирования.

Таблица 2

Противогерпетический эффект фракций экстрактов чаги

Способ получения фракции Иссле- дуемая фракция Степень защиты клеток от цитодеструктивного действия ВПГ, %

5 мкг/мл 10 мкг/мл 50 мкг/мл

Водная экстракция I 91,66 93,75 100

II 100 100 100

Спиртовая экстракция (этиловым спиртом) III 87,5 100 Н.и.

Щелочная экстрак- IV 100 100 100

ция (гидроксидом аммиака) 51 89,58 100 100

53 87,5 100 100

Экстракция гидрокар- V 100 100 100

бонатом аммония 52 25 93,75 100

54 6,25 81,25 100

Экстракция уксусной VI 6,25 75 100

кислотой VII 0 0 100

Примечание. Н.и. - не исследовали.

IV, полученной щелочной экстракцией 10% раствором гидроксида аммиака.

Определение эффективной дозы фракции IVэкстракта чаги. Исследовали эффективность защиты клеток Vеro при одновременном инфицировании клеток 100 ТЦИД50 вируса герпеса и внесении экстракта чаги в концентрациях 0,3, 1, 3,3, 10 и 33,3 мкг/мл. Полученные результаты представлены на рис.2. Таким образом, ЭД50 составила 3,3 мкг/мл, а ЭД90 - 10 мкг/мл.

Исследование оптимальных схем защитного действия экстрактов чаги, фракция IV Исследовали эффективность защитного действия фракции IV экстракта чаги при внесении его в клеточную культуру клеток Vero в различное время по отношению ко времени инфицирования клеток вирусом герпеса в дозе 100 ТЦИД50. Экстракт чаги вносили за 2 или 1 ч до инфицирования клеток, одновременно с инфицированием или через 1 или 2 ч после него. Введение экстракта чаги до инфицирования клеток (за 2 или 1 ч) и одновременно с инфицированием обеспечивало полную защиту клеток от цитодеструктивного действия ВПГ (рис.3) при всех использованных концентрациях экстракта, и ДНК вируса герпеса не обнаруживалась. При внесении экстракта чаги (фракция IV) через час после инфицирования защита составляла 70,83% при дозе 5 мкг/мл, 91,67% при дозе 10 мкг/мл и 100% при дозе 50 мкг/мл. При внесении экстракта чаги через 2 ч после заражения защита клеток от цитодеструктивного действия вируса герпеса была еще меньше : при дозе 5 и 10 мкг/мл - менее 50% ( 45,83 и 47,92% соответственно). При дозе 50 мкг/мл защита клеток приближалась к 100% и составила 93,75%.

Таким образом, максимальный защитный эффект экстракта чаги (фракция IV) наблюдается при профилактическом его применении при сохранении дозовой зависимости.

Противовирусная активность фракции IV экстракта чаги была исследована в течение 10 нед, хранение при комнатной температуре в темноте не приводило к снижению противовирусной активности.

Заключение

Разработанные схемы получения экстрактов березового гриба Inonotus obliquus показали, что фракции верхнего слоя березового гриба (чага), полученные водной,

47

спиртовой или щелочной экстракцией, обладают способностью защищать чувствительные клетки от цитодеструктивного действия ВПГ. Более детально изученная фракция IV, полученная щелочной экстракцией, обладала способностью защищать клетки при концентрации 5 мкг/мл. Максимальный защитный эффект наблюдали при внесении экстрактов до инфицирования клеток или в течение часа после него.

Проведенные исследования показали, что березовый гриб Inonotus obliquus, имеющий широкий спектр биологической активности, в том числе и противоопухолевой [8, 9, 10], также обладает и противовирусной активностью в отношении ДНК- содержащего вируса - ВПГ.

ЛИТЕРАТУРА

1. Березина М.П., Булатов П.К. Чага и ее лечебное применение. Медгиз; 1959: 160-87.

2. БерезинаМ.П., Булатов П.К., Вандышева Ф.Я. Чага и ее лечебное применение при раке IV стадии. Медгиз; 1959: 119-26.

3. ШашкинаМ.Я., ШашкинП.Н., Сергеев А.В., ГоряйноваЛ.К. Чага, чаговит, чагалюкс в лечебной и профилактической практике. М.: РОНЦ им. Н.Н. Блохина, ОАО «Холдинг «ЭДАС», М. 2008, 64.

4. МартыноваЕ.Я. Высшие грибы и их физиологически активные соединения. Л.: Наука; 1973: 83-94, 108-15.

5. Шашкина М.Я., Шашкин П.Н., Сергеев А.В. Химические и медико-биологическиесвойствачаги.Химико-фармацевтический журнал. 2006; 40 (10): 37-44.

6. РыжоваГ.Л., Кравцова С.С., Матасова С.А., Грибель Н.В. и др. Химические и фармакологические свойства сухого экстракта чаги. Химико-фармацевтический журнал. 1997; 10: 44-7.

7. Ichimura T., Watanabe O., Maruyama S. Inhibition 0f HIV-1 protease by water-soluble lignin-like substances from edible mushroom Fusco-poria oblique// Biosci. Biotechnol. Biochem. 1998; 62 (3): 575-7.

8. Ham S.S., Oh S.W., Kim Y.K., Shin K.S., Chang H.Y., Chung G.H. Antimutagenic and cytotoxic effects of ethanol extract from the Inonotus obliquus. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 2003; 32: 1088-94.

9. Lee S.H., HwangH.S., Yun J.W. Antitumor activity of water extract of a mushroom, Inonotusobliquus, against HT-29 human colon can-

cer cells. Phytother. Res. 2009; 23: 1784-9.

10. Mi Ja Chung, Cha Kwon Chung, Yoonhwa Jeong, Seung Shi Ham. Anticancer activity of subfractions containing pure compounds of Chaga mushroom (Inonotusobliquus) extract in human cancer cells and in Balbc/c mice bearing Sarcoma-180 cells. Nutr. Res. Pract. 2010; 4 (3): 177-82.

REFERENCES

1. Berezina M.P., Bulatov P.K. Chagaand its medical application. M.: Medgiz; 1959: 160-87 (in Russian).

2. Berezina M.P., Bulatov P.K., Vandysheva F.Ja. Chaga and its medical application at a cancer of the IV stage. M.: Medgiz. 1959: 119-26 (in Russian).

3. ShashkinaM.Ja., ShashkinP.N., SergeevA.V, GoijajnovaL.K. Chaga, chagovit, chagalux in medical and preventive practice. M.: RONC im. N.N. Blohina, OAO «Holding «JeDAS»; 2008: 64 (in Russian).

4. Martynova E.Ja. Higher fungi and their physiologically active compounds. Leningrad: Nauka; 1973: 83-94; 108-15 (in Russian).

5. Shashkina M.Ja., Shashkin P.N., Sergeev A.V Chemical and medico-biological properties of chaga. Himiko-farmatsevticheskij zhurnal. 2006; 40 (10): 37-44 (in Russian).

6. Ryzhova G.L., Kravtsova S.S., Matasova S.A., Gribel’ N.V et al. Chemical and pharmacological properties of the dry chaga’s extract. Himiko-farmatsevticheskij zhurnal. 1997; 10: 44-7 (in Russian).

7. Ichimura T., Watanabe O., MaruyamaS. Inhibition 0f HIV-1 protease by water-soluble lignin-like substances from edible mushroom Fuscoporia oblique. Biosci. Biotechnol. Biochem. 1998; 62 (3): 575-7.

8. Ham S.S., Oh S.W., Kim Y.K., Shin K.S., Chang H.Y., Chung G.H. Antimutagenic and cytotoxic effects of ethanol extract from the Inonotusobliquus. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 2003; 32: 1088-94.

9. Lee S.H., HwangH.S., Yun J.W. Antitumor activity of water extract of a mushroom, Inonotusobliquus, against HT-29 human colon cancer cells. Phytother. Res 2009; 23: 1784-9.

10. Mi Ja Chung, Cha Kwon Chung, Yoonhwa Jeong, Seung Shi Ham. Anticancer activity of subfractions containing pure compounds of Chaga mushroom (Inonotusobliquus) extract in human cancer cells and in Balbc/c mice bearing Sarcoma-180 cells. Nutr. Res. Pract. 2010; 4 (3): 177-82.

Поступила 21.03.13

Журнал "Вопросы вирусологии" входит в Перечень ведущих научных журналов и изданий ВАк, в которых должны быть опубликованы значимые результаты диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук

Уважаемые читатели!

Подписаться на журнал "Вопросы вирусологии" можно во всех отделениях связи.

Индивидуальные подписчики могут подписаться на журнал и получать его непосредственно в ОАО «Издательство "Медицина"» без наценок за доставку. Доставка через издательство осуществляется в пределах РФ.

Тел. для справок: 8 (499) 264-57-92.

Подписные индексы на журнал

в каталоге «Роспечать»: в каталоге «Пресса России»:

Индекс 71416 Индекс 40798

Электронная подписка на журнал осуществляется через сайт Научной электронной библиотеки www.elibrary.ru.

48