РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pFastBac-G2R-IgG, СОДЕРЖАЩАЯ ФРАГМЕНТ ГЕНОМА ВИРУСА НАТУРАЛЬНОЙ ОСПЫ, КОДИРУЮЩИЙ ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ СВЯЗЫВАЮЩИЙ БЕЛОК, И ФРАГМЕНТ ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА, КОДИРУЮЩИЙ УЧАСТОК ТЯЖЕЛОЙ ЦЕПИ ИММУНОГЛОБУЛИНА G, И ШТАММ БАКУЛОВИРУСА BvG2RIgG, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ РАСТВОРИМЫЙ ХИМЕРНЫЙ БЕЛОК, СОСТОЯЩИЙ ИЗ БЕЛКА ВИРУСА НАТУРАЛЬНОЙ ОСПЫ, СВЯЗЫВАЮЩЕГО ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ, И ФРАГМЕНТА ТЯЖЕЛОЙ ЦЕПИ ИММУНОГЛОБУЛИНА G ЧЕЛОВЕКА
RECOMBINANT PLASMID DNA pFastBac-G2R-IgG, WHICH CONTAINS FRAGMENT OF SMALLPOX VIRUS GENOME, CODING FACTOR OF TUMOUR NECROSIS, BINDING PROTEIN, AND FRAGMENT OF HUMAN GENOME, CODING SECTION OF HEAVY CHAIN OF ANTIBODY G, AND STRAIN OF BACULOVIRUS BvG2RIgG, WHICH PRODUCES SOLUBLE CHIMERIC PROTEIN, WHICH CONSISTS OF SMALLPOX VIRUS PROTEIN, BINDING FACTOR OF TUMOUR NECROSIS, AND FRAGMENT OF HEAVY CHAIN OF HUMAN ANTIBODY G

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может найти применение как лекарственное средство нового поколения для борьбы с тяжелыми заболеваниями человека, связанными с гиперпродукцией фактора некроза опухолей (ФНО).
Фактор некроза опухолей является одним из ключевых цитокинов воспалительного ответа, он модулирует иммунные реакции организма, играет важную роль в регуляции жизнеспособности клеток [1]. Однако гиперпродукция ФНО приводит к ряду заболеваний человека, таких как болезнь Крона, ревматоидный артрит (РА), псориаз, псориатический артрит, сердечная недостаточность и других [2]. Тяжелой патологией, обусловленной высоким уровнем ФНО и часто завершающейся летальным исходом, является эндотоксический шок [2, 3]. В настоящее время препараты с анти-ФНО действием можно отнести к четырем различным группам в соответствии с тем, на каком этапе они блокируют ФНО: на стадии транскрипции, трансляции, процессинга (протеолитического отщепления мембраносвязанной формы цитокина) или блокируют взаимодействие ФНО с их рецепторами и передачу сигнала [2]. Анти-ФНО препараты, применяющиеся в клинической практике и проходящие клинические испытания, приведены в таблице.
Как видно, одним из направлений разработки терапевтических средств для коррекции этих иммунопатологий является создание препаратов, связывающих данный цитокин. Такими препаратами могут быть моноклональные антитела (МАТ) и растворимые клеточные рецепторы, связывающие ФНО. Растворимые рекомбинантные клеточные рецепторы ФНО ранее синтезировали в мономерной форме, и, несмотря на эффективное ингибирование цитотоксического действия ФНО in vitro, они практически не оказывали протективного действия in vivo на модели эндотоксического шока [24]. Добавление Fc-фрагментов иммуноглобулина G (IgG) к лиганд-связывающим доменам рецепторов ФНО первого (р55) [25] и второго (р75) [24] типов привело к их синтезу в виде ковалентно связанных димеров. Такие химерные молекулы в 1000 раз более эффективно ингибировали in vitro цитотоксическое действие ФНО, чем их прототипные варианты, и в значительной степени повышали выживаемость животных в модели эндотоксического шока [24, 25]. Препарат Etanercept, представляющий собой химерную молекулу внеклеточного домена белка р75 с Fc-фрагментом IgGl человека, в настоящее время используется для терапии некоторых заболеваний человека [2].
Создание химерных молекул с фрагментом тяжелой цепи IgG получило широкое распространение. Данный класс химерных белков, включающий в себя цитокины, рецепторы цитокинов, комплементсвязывающие белки, ферменты, молекулы адгезии, насчитывает более 50 членов, представляющих собой ковалентно-связанные димеры, напоминающие молекулы иммуноглобулинов. Такие молекулы отличаются от своих прототипных аналогов значительным увеличением авидности и времени полужизни [26].
Наиболее близким аналогом (прототипом) является ФНО-связывающие белки ортопоксвирусов, которые эффективно ингибируют цитопатическое действие ФНО на культуре клеток мышиных фибробластов L929 [27]. Для клеточных рецепторов ФНО было показано, что химерные с IgG человека белки оказываются гораздо более эффективными антагонистами ФНО in vitro и in vivo.
Однако эффективных средств для борьбы с тяжелыми заболеваниями человека, связанными с гиперпродукцией фактора некроза опухолей (ФНО), явно недостаточно.
Техническим результатом настоящего изобретения является расширение спектра средств нового поколения, предназначенных для лечения заболеваний человека, связанных с гиперпродукцией фактора некроза опухолей путем добавления Fc-фрагмента IgGl человека к ФНО-связывающему белку ВНО.
Технический результат достигается путем конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pFastBac-G2R-IgG, содержащей фрагмент генома вируса натуральной оспы, кодирующей аминокислотную последовательность ФНО-связывающего белка без терминирующего кодона, и фрагмент генома человека, кодирующего фрагмент тяжелой цепи IgGl человека с 117 по 329 (нумерация для Fc-фрагмента, кодируемого геном AF237583(GenBank)) и создания с ее использованием нового рекомбинантного штамма бакуловируса - продуцента растворимого химерного белка, состоящего из белка вируса натуральной оспы, связывающего фактор некроза опухолей, и фрагмента тяжелой цепи иммуноглобулина G человека.
Целевая плазмида pFastBac-G2R-IgG (фиг.1) имеет размер 6444 п.н. и молекулярную массу 4,18 мДа и состоит из:
- фрагмента генома вируса натуральной оспы штамма India-67 длиной 1068 п.н., кодирующего ФНО-связывающий белок;
- фрагмента генома человека длиной 699 п.н., кодирующего фрагмент тяжелой цепи IgGl человека с 117 по 329 а.к.;
- векторной плазмиды pFastBacl [28], длиной 4677 п.н., обеспечивающей сайт-специфическую транспозицию целевого фрагмента ДНК в геном бакуловируса.
Рекомбинантный штамм бакуловируса, полученный в результате сайт-специфической транспозиции целевого фрагмента ДНК из донорной плазмиды pFastBac-G2R-IgG в бакуловирусный вектор (бакмиду), находящийся в E.coli [28], после заражения им клеток насекомых Sf21 продуцирует растворимый химерный белок, состоящий из белка вируса натуральной оспы, связывающего фактор некроза опухолей, и фрагмента тяжелой цепи иммуноглобулина G человека.
В качестве фрагмента генома вируса натуральной оспы используют фрагмент ДНК длиной 1068 п.н., полученный с помощью полимеразной цепной реакции. Матрицей для амплификации служит ДНК вируса натуральной оспы штамма India-1967. Олигонуклеотидные праймеры для амплификации ФНО-связывающего белка вируса натуральной оспы имеют следующую структуру:
В структуру праймеров 1 и 2 заложены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции ВаmHI и XbaI, соответственно (выделены в последовательности праймеров жирным курсивом).
В качестве фрагмента генома человека используют фрагмент ДНК длиной 699 п.н., выделенный из плазмиды pBluescript-IgG1 после гидролиза эндонуклеазами рестрикции XbaI и HindIII.
В качестве плазмидного вектора, обеспечивающего сайт-специфическую транспозицию целевого фрагмента ДНК в бакмиду pMON14272 [28], используют плазмиду pFastBacl [28], содержащую бакуловирусный специфический промотор pPolh для экспрессии белков в клетках насекомых, мини-Tn7-транспазон, гены устойчивости к ампициллину и гентамицину, полилинкер для клонирования целевых генов и сигнал для полиаденилирования вируса SV-40. Бакмида pMON14272 содержит низкокопийный мини-F репликон, ген устойчивости к канамицину и фрагмент ДНК, кодирующий α-донорный пептид β-галактозидазы E.coli и обеспечивает α-комплементацию при размножении в штамме E.coli DH10Bac™ в присутствии хромогенного субстрата X-gal и индуктора IPTG.
Выбранная бакуловирусная система экспрессии обеспечивает высокий уровень синтеза целевого продукта и его правильную посттрансляционную модификацию по сравнению с другими системами экспрессии.
Сущность настоящего изобретения заключается в том, что фрагмент ДНК, содержащий ген фактор некроза опухолей связывающего белка G2R вируса натуральной оспы штамма India-1967 без стоп-кодона, получается с помощью ПЦР из вирусного генома; фрагмент ДНК, содержащий фрагмент гена IgG1 с 117 по 329 а.к. человека, выделяется из плазмиды pBluescript-IgG1 после гидролиза эндонуклеазами рестрикции XbaI и HindIII; затем полученные фрагменты ДНК клонируются в донорной плазмиде pFastBacl и путем сайт-специфической транспозиции в бактериальных клетках образуется рекомбинантная бакмида, которая используется для трансфекции клеток насекомых, в результате чего генерируется рекомбинантный вирус BvG2RIgG, экспрессирующий указанный химерный ген. Нуклеотидная последовательность встроенного фрагмента приведена на фиг.2.
Штамм характеризуется следующими признаками:
-
Морфологические признаки. Штамм обладает свойствами типичного представителя бакуловирусов, но в отличие от векторного вируса на среде с XGa1 бляшки, формируемые рекомбинантным бакуловирусом, имеют фенотип Lac.
Физиолого-биохимические характеристики и культуральные свойства штамма. ДНК рекомбинантного бакуловируса имеет длину около 140000 п.н. Наличие в его геноме целевой вставки длиной 1767 п.н. подтверждено с помощью метода ПЦР. При размножении рекомбинантного бакуловируса на культуре клеток насекомых Spodoptera frugiperda (Sf21) его титр не отличается от титра, получаемого при размножении вируса, не содержащего в своем геноме чужеродных фрагментов ДНК.
Основным отличием штамма является его способность синтезировать химерный ФНО-связывающий белок ВНО с ковалентно-связанным с ним фрагментом тяжелой цепи IgG человека при инфицировании им культуры клеток насекомых Sf21.
Полученный штамм рекомбинантного бакуловируса BvG2RIgG депонирован в коллекции микроорганизмов Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» за номером V-354 от 06.10.06.
Изобретение иллюстрируется следующими чертежами:
r
r
Фиг.1. Физическая карта плазмиды pFastBac-G2R-IgG. За первый нуклеотид плазмиды принимается нуклеотид А межцистронной области фага f1; Tn7L, Tn7R-фрагменты транспозона Tn7; SV40polyA - сайт полиаденилирования вируса SV40; G2R-IgG - химерный ген, состоящий из гена фактора некроза опухолей связывающего белка ВНО штамма India-67 без терминирующего кодона и фрагмента гена тяжелой цепи IgG1 человека с 117 по 329 а.к.; pPolh - промотор полиэдрина; Ori - сайт инициации репликации; Ap, Gm - маркеры устойчивости к ампициллину и гентамицину, соответственно.
Фиг.2. Нуклеотидная последовательность гена G2R ВНО (штамм India-1967) и фрагмента гена тяжелой цепи IgG1 человека, соответствующего кодирующей последовательности с 117 по 329 а.к., и расположение специфических праймеров (показаны жирным шрифтом) на матрице. Сайты эндонуклеаз рестрикции Xbal, Hindlll, ВаmHI, используемые при конструировании плазмиды интеграции pFastBac-G2R-IgG, показаны жирным курсивом. Инициирующий кодон и стоп-кодоны выделены жирным шрифтом и подчеркиванием, сайты рестрикции - жирным курсивом.
Фиг.3. Электрофоретический анализ в 1% агарозе ПЦР-фрагментов, содержащих химерный ген фактор некроза опухолей связывающего белка ВНО с фрагментом гена тяжелой цепи IgG1 человека, соответствующего кодирующей последовательности с 117 по 329 а.к., амплифицированных с помощью специфических праймеров с плазмиды pFastBac-G2R-IgG (дорожки 2, 3) и с бакмиды bMON14272-G2R-IgG (дорожки 4, 5). Дорожка 1 - маркеры длин «bp 100» («СибЭнзим», Россия), дорожка 6 - отрицательный контроль (нерекомбинантная бакмида).
Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его осуществления.
Пример 1. Способ амплификации фрагмента ДНК, содержащего ген ФНО-связывающего белка ВНО.
2
Реакцию амплификации проводят в пробирках Eppendorf в объеме 50 мкл в амплификаторах с горячей крышкой. Реакционная смесь содержит 10 мМ Tris-HCl рН 8.8, 50 мМ KCl, 2.5 мМ MgCl, 0.1% Tween 20, 0.2 мМ dATP, 0.2 мМ dCTP, 0.2 мМ dGTP, 0.2 мМ dTTP, олигонуклеотидные праймеры в количестве 10 пмоль каждого, 2 ед.а. Tth-полимеразы, 2-10 нг ДНК-матрицы.
Амплификацию вели в течение 30 циклов по следующей схеме:
Номер цикла
Температура (°С)
Время (мин)
1
93
2 мин
48
1 мин
72
1 мин
2-4
93
1 мин
48
1 мин
72
1 мин
5-29
93
1 мин
53
1 мин
72
1 мин
30
93
1 мин
53
1 мин
70
10 мин
Наличие амплифицированного продукта проверяют с помощью электрофореза в 1% агарозном геле.
Пример 2. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pFastBac-G2R-IgG.
r
5-10 мкг плазмиды pFastBac [28] гидролизуют эндонуклеазами рестрикции BamHI и HindIII; 1-5 мкг амплифицированного продукта, соответствующего гену G2R ВНО без терминирующего кодона, гидролизуют эндонуклеазами рестрикции BamHI и XbaI; плазмиду pBluescript-IgG1 гидролизуют эндонуклеазами рестрикции XbaI и HindIII в стандартных условиях. Полученные фрагменты выделяют электрофорезом в 1% агарозном геле с последующей элюцией. 0.2 мкг вектора и по 0.6 мкг фрагментов лигируют в стандартных условиях и полученной лигазной смесью трансформируют компетентные клетки E.coli штамма XL-blue. Клеточные Ap-клоны выращивают при 37°С в LB среде, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, до стационарной фазы. Рекомбинантную плазмидную ДНК выделяют по стандартной методике и анализируют с помощью эндонуклеаз рестрикции BamHI, XbaI и HindIII. Из клонов, содержащих встроенный фрагмент, выделяют плазмидную ДНК, структуру которой в районе встройки подтверждают определением нулеотидной последовательности методом терминации синтезируемой цепи на автоматическом секвенаторе ABM PRISM™ 310 (Perkin Elmer, США). Полученную таким образом целевую плазмиду обозначают pFastBac-G2R-IgG.
Пример 3. Получение бакмиды pMON14272-G2R-IgG.
-
К 100 мкл компетентных клеток E.coli штамма DH10Bac™ добавляют 1 нг плазмиды pFastBac-G2R-IgG. Полученную смесь инкубируют во льду в течение 30 мин, затем при 42°С в течение 45 сек с последующим охлаждением во льду в течение 2 мин. Реакционную смесь разводят 1:10 LB-бульоном и подращивают на качалке при интенсивной аэрации при 37°С в течение четырех часов. Далее клетки высевают на селективную среду - LB-агар, содержащий 100 мкг/мл X-ga1, 40 мкг/мл IPTG, 50 мкг/мл канамицина, 7 мкг/мл гентамицина, 10 мкг/мл тетрациклина, и инкубируют в термостате при 37°С в течение суток. Клоны с фенотипом Lac засевают в пробирки с 5 мл LB-бульона, содержащего 50 мкг/мл канамицина, 7 мкг/мл гентамицина, 10 мкг/мл тетрациклина, и выращивают при интенсивной аэрации при 37°С до стационарной фазы. Культуру переносят в 1.5 мл пробирки Eppendorf, осаждают клетки центрифугированием в течение 40 сек при 14000 g, удаляют среду. Процедуру добавления культуры, осаждения и удаления среды повторяют еще два раза. Осадок ресуспендируют в 0.3 мл раствора 1 (10 мМ ЭДТА, 15 мМ Tris-HCl pH 8.0, 100 мкг/мл РНКазы), добавляют 0.3 мл раствора 2 (0.2 М NaOH, 1% SDS) и инкубируют при комнатной температуре 5 мин. К смеси медленно добавляют 0.3 мл раствора 3 (3 М КАс рН 5.2). Инкубируют во льду 10 мин. Центрифугируют при 14000 g в течение 10 мин. Супернатант переносят в чистую пробирку, добавляют 0.8 мл изопропанола, перемешивают и охлаждают при -20°С 5 мин, затем осаждают при 14000 g 15 мин. Осадок промывают два раза этанолом, высушивают, растворяют в 40 мкл буфера ТЕ. Наличие в геноме бакмиды интегрированного фрагмента ДНК подтверждают с помощью ПЦР. Полученную бакмидную ДНК pMON14272-G2R-IgG используют для трансфекции клеток насекомых линии Sf21.
Пример 4. Трансфекция клеток насекомых Sf21 рекомбинантной бакмидной ДНК pMON14272-G2R-IgG и получение рекомбинантного вируса.
6
7
Клетки Sf21 засевают в лунки 6-ти луночного планшета из расчета, чтобы на следующий день был монослой (2×10 клеток/лунку). На следующий день готовят два раствора: 10 мкл вирусной ДНК + 100 мкл среды Грейса и 6 мкл реактива CellFECTIN фирмы LifeTechnologies (США) + 100 мкл среды Грейса. Растворы смешивают, инкубируют при комнатной температуре 25 мин. В это время промывают монослой клеток два раза средой Грейса. К клеткам добавляют по 0.8 мл/лунку среды Грейса и 200 мкл приготовленного раствора. Инкубируют клетки при 28°С в течение 5 ч. После этого отбирают среду и добавляют к клеткам по 2 мл среды Грейса с 10% эмбриональной сывороткой коров (ЭСК) (ООО «БиолоТ», Россия). Клетки инкубируют при 28°С в течение 2-5 суток. Далее клетки ресуспендируют (интенсивным пипетированием), центрифугируют 5 мин при 5000 g и осветленный супернатант расфасовывают в стерильные пробирки. Титр вируса определяют следующим образом. К монослою клеток Sf21 добавляют 200 мкл разведения вируса и проводят адсорбцию в течение 60 мин при комнатной температуре. Далее готовят 2% легкоплавкую агарозу («Sigma», США) и смешивают ее в расплавленном виде со средой Грейса с 10% ЭСК в соотношении 1:1. Полученную среду охлаждают в термостате до 37°С и добавляют по 2 мл на лунку, а после застывания добавляют по 2 мл на лунку среды Грейса с 10% ЭСК. Инкубируют в термостате при 28°С 5 суток. Далее добавляют по 2 мл на лунку краситель нейтральный красный, разведенный в среде Грейса с 10% ЭСК, в соотношении 1:20. Инкубируют при 28°С в течение суток. Титр определяют путем подсчета окрашенных бляшек. Последний составляет 10 БОЕ/мл. Суспензию рекомбинантного вируса хранят при -20°С.
Пример 5. Заражение клеток насекомых Sf21 рекомбинантным вирусом.
7
200 мкл размороженного вирусного материала с титром 10 наносят на монослой клеток насекомых Sf21 в матрасе для культивирования объемом 25 мл. Инкубируют 30 мин при комнатной температуре. После инкубации добавляют 2 мл среды Грейса с 10% ЭСК. Инкубируют при 28°С в течение 2-3 суток. Далее клетки ресуспендируют интенсивным пипетированием и центрифугируют 5 мин при 5000 g.
Пример 6. Очистка рекомбинантного химерного белка.
Целевой белок выделяют из культуральной среды клеток Sf21 методом аффинной хроматографии. Для этого синтезируют аффинный сорбент на основе поперечно-сшитой агарозной матрицы - сефарозы CL-6B с иммобилизованным белком А. К 2 мл сефарозы CL-6B добавляли 20 мл 0,1 М раствора периодата натрия и инкубируют при 16°С в течение 16 ч. Активированный гель промывают водой и добавляют 1 мг высокоочищенного препарата белка А в 50 мМ натрий-карбонатном буфере, рН 8,5. После 20 ч инкубации при 6°С в раствор добавляют 20 мг боргидрида натрия, перемешивая 2 ч. После этого сорбент последовательно промывают водой, 0,2 М раствором глицин-НСl, рН 2,5 и уравновешивают буфером PBS (10 мМ калий-фосфат, рН 7,0, 150 мМ NaCl). Содержание белка А составляет 0,4±0,1 мг/мл геля. Для очистки растворимого химерного фактор некроза опухолей связывающего белка вируса натуральной оспы с фрагментом тяжелой цепи иммуноглобулина G человека используют культуральную жидкость клеток Sf21, зараженных рекомбинантными бакуловирусами, клеточный дебрис удаляют низкоскоростным центрифугированием. Для уменьшения объема раствора белки предварительно осаждают сульфатом аммония (50% насыщения). После растворения осадка и диализа раствор наносят на аффинную колонку со скоростью протока жидкости 1 объем колонки в час. Сорбент отмывают буфером, содержащим 0,2 М NaCl, и элюцию проводят 0,2 М раствором глицин-HCl, рН 2,5, нейтрализуя раствор в собираемых фракциях 1 М раствором Трис-HCl, рН 8,8. Выход гомогенного белка составляет 4-6 мг из 1 л культуральной жидкости инфицированных клеток.
Пример 7. Определение биологической активности продукта экспрессии химерного гена G2R-IgG in vitro.
Биологическую активность химерного ФНО-связывающего белка ВНО с фрагментом тяжелой цепи IgG человека определяли по его способности ингибировать цитотоксическое действие ФНО человека и мыши на культуре клеток фибробластов мыши L929.
2
2
Клетки L929 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, стрептомицина (50 мкг/мл) и пенициллина (50 единиц/мл) при 37°С в СО-инкубаторе (концентрация СО составляла 5%) до формирования клеточного монослоя на 75-85% поверхности лунок 96-луночного планшета.
При достижении необходимой плотности клеток ростовую среду заменяли на DMEM с 2% фетальной бычьей сывороткой и актиномицином D (1 мкг/мл), содержащую 100 нг/мл химерного ФНО-связывающего белка ВНО с фрагментом тяжелой цепи IgG человека и последовательные двукратные разведения и препараты ФНО (2 нг/мл).
2
2
Планшеты инкубировали при 37°С в СО-инкубаторе (концентрация СО составляла 5%).
Через 18 часов количество живых клеток определяли окрашиванием красителем нейтральный красный [29]. Измерение оптической плотности (ОП) проводили на приборе Microplate Reader ELX808 («BIO-ТЕК INSTRUMENTS, INC», США). Результаты выражали в процентном отношении выживших клеток относительно количества клеток в необработанных ФНО контрольных пробах. Каждая проба бралась в трех повторах, и среднее значение процента выживаемости высчитывали по формуле:
ФНО + ФНО-связывающий белок
ФНО
клетки
ФНО
(ОП-ОП)/(ОП-ОП)×100%,
ФНО
ФНО + ФНО-связывающий белок
клетки
где ОП - фоновое значение ОП в лунках планшета, содержащих клетки L929 + ФНО; ОП - ОП в лунках планшета, содержащих клетки L929+ФНО+ФНО-связывающий белок; ОП - ОП в лунках планшета, содержащих клетки L929.
По данным ингибирования цитотоксического действия ФНО человека и мыши на культуре клеток фибробластов мыши L929 50% гибель клеток достигается при добавлении 40-100 нг/мл химерного ФНО-связывающего белка ВНО с фрагментом тяжелой цепи IgG человека.
Пример 8. Определение биологической активности продукта экспрессии химерного гена G2R-IgG in vivo.
Биологическую активность химерного варианта ФНО-связывающего белка ВНО изучают in vivo на модели ЛПС-индуцированного эндотоксического шока. В работе используют самцов мышей линии BALB/c, возраст 3-4 недели, из питомника лабораторных животных ГНЦ ВБ «Вектор», Россия. Опыты на животных проводят после двухнедельной адаптации, в соответствии с Протоколом, утвержденным Биоэтическим комитетом ГНЦ ВБ «Вектор». Группы по 8-10 мышей формируют для визуального наблюдения и изучения выживаемости. Контрольным животным дважды, через 16 ч, вводят внутрибрюшинно по 100 мкл PBS с 1% BSA либо с 10 мкг/мышь изучаемого рекомбинантного белка. Для контроля индукции эндотоксического шока животным вводят внутрибрюшинно сенсибилизирующую (150 мкг/мышь) и, через 16 ч, разрешающую дозы ЛПС (250 мкг/мышь) в 100 мкл PBS. Всем животным экспериментальных групп вводят ЛПС по такой же схеме, как и для контрольной группы. Рекомбинантный химерный ФНО-связывающий белок ВНО с фрагментом тяжелой цепи IgG человека вводят мышам внутрибрюшинно за 30 мин до введения разрешающей дозы ЛПС в дозах 0,4 и 4 мкг/мышь. Наблюдение за животными и учет гибели проводят в течение 72 ч.
Мыши, получившие инъекции бактериального ЛПС, становились вялыми и малоподвижными, с взъерошенной и влажной шерстью. В течение 72 ч наблюдения смертность животных составила 80-100%. Эти изменения, а также выявляемая гистологическая картина внутренних органов экспериментальных животных [30] соответствуют таковым, описанным в литературе при развитии экспериментального эндотоксического шока у мышей [31, 32, 33]. В отрицательных контрольных группах не было зафиксировано ни одного случая падежа, поведение и внешний вид животных не изменялись по сравнению с интактными животными. Как было показано ранее [30], в сыворотках крови контрольных животных, получавших ЛПС, в течение 1 ч после индукции шока концентрация ФНО резко возрастала, затем постепенно снижалась и достигала уровня контрольных образцов к 24 ч наблюдения. Полученные результаты свидетельствуют, что используемая экспериментальная модель развития эндотоксического шока сопровождается резким ростом продукции ФНО.
При введении рекомбинантного химерного ФНО-связывающего белка ВНО с фрагментом тяжелой цепи IgG человека (0,4 или 4 мкг/мышь) выживаемость животных увеличилась до уровня до 56+7,2% и 70+9,7%, соответственно. Как видно, химерный ФНО-связывающий белок ВНО с фрагментом тяжелой цепи IgG человека обусловливал достоверный терапевтический эффект.
Таким образом, получен рекомбинантный бакуловирус BvG2RIgG, обеспечивающий экспрессию химерного гена ФНО-связывающего белка ВНО штамма India-1967 с фрагментом тяжелой цепи IgG человека в клетках насекомых линии Sf21.
Полученный штамм может быть использован для разработки терапевтического препарата нового поколения для борьбы с заболеваниями человека, связанными с гиперпродукцией фактора некроза опухолей.