СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРЕАЗНОЙ АКТИВНОСТИ РОТОВОЙ ЖИДКОСТИ ДЛЯ СКРИНИНГА ОБСЕМЕНЕННОСТИ ПОЛОСТИ РТА УРЕАЗОПОЗИТИВНОЙ МИКРОБИОТОЙ
METHOD OF DETERMINING UREASE ACTIVITY OF ORAL FLUID FOR SCREENING OF CONTAMINATION OF THE ORAL CAVITY BY UREASE-POSITIVE MICROBIOTA

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, и может быть использовано для скрининга обсемененности полости рта уреазопозитивной микробиотой с целью обоснованного применения противомикробных средств для профилактики образования твердых зубных отложений и воспалительных заболеваний пародонта.
Аналогом предлагаемого способа является фотометрический метод определения уреазной активности, основанный на измерении количества образующегося аммиака с помощью реактива Несслера [1].
Недостатком аналога является присутствие в реактиве Несслера двуйодистой или металлической ртути, что в связи с ее токсичностью ограничивает применение этой реакции в практическом здравоохранении.
В качестве прототипа авторы предлагают методику определения уреазной активности в моче, применяемую при осуществлении способа раннего выявления возможности инфекции мочевыводящих путей у детей 3-7 лет фотометрическим методом [2].
Суть способа в том, что для каждого образца мочи (по 0,25 мл) проводят измерение оптических плотностей в двух лунках микропланшета для выполнения иммуноферментного анализа - с 0,025 мл 10% водного раствора хлористого кальция и с 0,025 мл дистиллированной воды. Параллельно с рабочими лунками готовят 2 отрицательных и 2 положительных контроля. В одном 96-луночном микропланшете одновременно можно исследовать мочу от 46 человек. Измеряют оптические плотности контрольных и рабочих лунок с помощью микропланшетного ридера при длине волны 620 нм. Затем микропланшет с приготовленными смесями заклеивают пленкой и инкубируют при температуре 37°С в течение 1 часа и повторно измеряют оптические плотности. Уреазную активность мочи рассчитывают по формуле:
УА (Е/л)=ΔD×11655,
где УА - уреазная активность, ΔD - разница оптической плотности опыта и контроля пробы мочи после и до термостатирования, 11655 - коэффициент перевода в Е/л, который был получен авторами опытным путем.
Недостатками прототипа являются следующие:
1. недостаточная точность метода, поскольку концентрация солей в ротовой жидкости существенно ниже, чем в моче, но реакция проводится с хлористым кальцием, при которой происходит его взаимодействие с солями мочи, что, в свою очередь, приводит к образованию плохо растворимых в воде солей, а учет реакции выполняется по определению нарастания мутности путем измерения оптической плотности при длине волны 620 нм;
2. длительность и трудозатратность при проведении исследования, поскольку время инкубации составляет 1 час и фотометрия выполняется дважды;
3. сложность перевода показателей уреазной активности в международные единицы активности ферментов (Ед/л) за счет необходимости применения рассчитанного авторами специального коэффициента перевода.
В предлагаемом нами способе определения уреазной активности ротовой жидкости для скрининга обсемененности полости рта уреазопозитивной микробиотой перечисленные недостатки устранены.
Целью предлагаемого способа определения уреазной активности ротовой жидкости для скрининга обсемененности полости рта уреазопозитивной микробиотой является скрининговое определение уреазной активности ротовой жидкости для оценки обсемененности полости рта уреазопозитивной микробиотой с целью обоснованного применения противомикробных средств для профилактики образования твердых зубных отложений и воспалительных заболеваний пародонта.
Технический результат изобретения заключается в том, что в связи с низкой концентрацией солей в ротовой жидкости предложено проводить реакцию с реактивами, образующими растворимые в воде окрашенные комплексы, оптическая плотность которых пропорциональна концентрации уреазы, при этом измерение оптической плотности содержимого лунок микропланшета проводится при длине волны 546 нм.
Для определения концентрации уреазы в ротовой жидкости не применяется расчетный коэффициент, поскольку используется стандартный раствор уреазы в трех концентрациях, по измерению оптической плотности которых компьютерная программа микропланшетного ридера строит калибровочную кривую, по которой автоматически рассчитывается концентрация уреазы в образцах.
Инкубация реакционных смесей проводится в течение 20 минут с последующей однократной фотометрией.
Заявленный технический результат достигается путем измерения значений оптической плотности каждой лунки 96-луночного микропланшета при длине волны 546 нм после взаимодействия образца слюны с реактивами из коммерческого набора реагентов для определения концентрации мочевины в биологических жидкостях уреазным фенол/гипохлоритным методом (например, «Мочевина-Витал», Россия; Кат. № В 08.02) после термостатирования при температуре 37°С в течение 15 минут.
Уреазную активность определяли в 93 образцах ротовой жидкости. Ротовая жидкость для исследования собирается утром натощак и до чистки зубов в сухую стерильную посуду в объеме 0,5-1,0 мл. Для осаждения муцина ротовой жидкости с целью снижения ее вязкости (при полном сохранении уреазной активности) образец помещается в морозильную камеру холодильника (-18°С) на 5 минут. Затем проводится центрифугирование в течение 5 минут при 1500 оборотов в минуту, для продолжения анализа используется надосадочная жидкость. Используются реактивы из коммерческого набора реагентов для определения концентрации мочевины в биологических жидкостях уреазным фенол/гипохлоритным методом («Мочевина-Витал», Россия; Кат. № В 08.02).
В лунку 1 (отрицательный контроль, концентрация уреазы - 0 Ед/л) вносят 90 мкл фосфатного буфера (50 ммоль/л, рН 7,0), 10 мкл водного раствора мочевины (5 ммоль/л) и 10 мкл дистиллированной воды.
В лунки 2 и 3 (лунки с известной концентрацией уреазы для построения калибровочной кривой) вносят по 90 мкл фосфатного буфера (50 ммоль/л, рН 7,0), по 10 мкл водного раствора мочевины (5 ммоль/л) и по 10 мкл растворов уреазы (концентрацией 5, 10 Е/л соответственно), приготовленных из раствора уреазы (10 Е/л), входящего в состав набора.
Следующие лунки микропланшета (93 лунки) - опытные, в них вносят по 90 мкл фосфатного буфера (50 ммоль/л, рН 7,0), по 10 мкл водного раствора мочевины (5 ммоль/л) и по 10 мкл образцов ротовой жидкости.
Содержимое лунок осторожно перемешивают, инкубируют 5 минут при температуре 20-25°С. Затем во все лунки вносят по 100 мкл фенол/нитропруссидного реагента и гипохлорита, осторожно перемешивают и инкубируют 15 минут при температуре 37°С.
После инкубации измеряют значение оптических плотностей на микропланшетном ридере «Zenith 1100» (Anthos, Австрия) при длине волны 546 нм согласно инструкции. Предварительно в программе микропланшетного ридера обозначают лунки с отрицательным контролем, количество лунок и концентрацию в них уреазы (в Ед/л) и лунки с образцами ротовой жидкости. На основании фотометрии программа микропланшетного ридера строит калибровочную кривую, по которой программа автоматически рассчитывает концентрацию уреазы в образцах ротовой жидкости в Ед/л.
Уреаза в ротовой жидкости имеет микробное происхождение, следовательно, повышенная концентрация уреазы в ротовой жидкости является следствием обсемененности полости рта уреазопозитивной микробиотой (актиномицеты, стафилококки, протеи, клебсиеллы и другие). Также известно, что повышенное содержание уреазы в ротовой жидкости вносит вклад в ее защелачивание, что, в свою очередь, является фактором, способствующим образованию твердых зубных отложений, что приводит либо к развитию, либо к усугублению протекания воспалительных заболеваний пародонта. Таким образом, определение уреазной активности ротовой жидкости может быть использовано для опосредованного скрининга обсемененности полости рта уреазопозитивной микробиотой с целью обоснованного включения противомикробных средств в комплекс мер по профилактике образования твердых зубных отложений и, следовательно, воспалительных заболеваний пародонта.
Опытным путем нами при проведении опосредованного скрининга обсемененности полости рта уреазопозитивной микробиотой у 26 добровольцев, не имеющих воспалительных заболеваний пародонта, и 48 пациентов с хроническими воспалительными заболеваниями пародонта определено, что максимально допустимой величиной показателя уреазной активности, характерной для практически здоровых пациентов является значение 15,85±2,11 Ед/л. Превышение этого значения в 95% случаев характерно для обсемененности полости рта уреазопозитивной микробиотой.
Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами.
Пример 1
Пациент К., 40 лет, обратился по поводу хронического пародонтита. Уреазная активность ротовой жидкости составила - 34,4 Ед/л. Заключаем, что в составе микробиоценоза полости рта имеется уреазопозитивная микробиота. Данному пациенту показано включение в комплекс лечебно-профилактических мер местного применения противомикробных средств и слабокислых растворов для гигиены полости рта, а также следует после употребления алкалогенных пищевых продуктов (сыр, орехи и другие) употреблять нейтральные, слабокислые напитки или фрукты.
Пример 2
Пациент H., 38 лет, обратился по поводу хронического пародонтита. Уреазная активность ротовой жидкости составила - 10,2 Ед/л. Заключаем, что в составе микробиоценоза полости рта мало уреазопозитивной микробиоты. Данному пациенту не показано включение в комплекс лечебно-профилактических мер местного применения противомикробных средств и слабокислых растворов для гигиены полости рта, а также нет необходимости после употребления алкалогенных пищевых продуктов (сыр, орехи и другие) употреблять нейтральные, слабокислые напитки или фрукты.
Список литературы
1. Руководство по клиническим лабораторным исследованиям / Под ред. Л.Г. Смирновой и Е.А. Кост. - М.: Медгиз, 1960. - 963 с.
2. Способ раннего выявления возможности инфекции мочевыводящих путей у детей 3-7 лет фотометрическим методом / Федотова Т.А., Горшкова М.А., Сергеева С.Ф., Калинина О.В., Брянцева В.М. // Патент на изобретение зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 29.04.2014. №2521201.