СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЧИСТОГО МОНОСИАЛОГАНГЛИОЗИДА GM1 ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В МЕДИЦИНЕ
METHOD FOR PREPARING PURE MONOSIALOGANGLIOSIDE GM1 FOR MEDICAL APPLICATIONS

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к моносиаганглиозидам GM1, более конкретно, к способам получения и очистки моносиаганглиозида GM1.
Уровень техники
Ганглиозиды представляют собой класс гликосфинголипидов, имеющих один или более остатков сиаловой кислоты, и находятся в большом количестве в мозговой и нервной ткани людей и животных. Известно много фармацевтических применений моносиалоганглиозида GM1, особенно в восстановлении и лечении расстройств центральной и периферической нервных систем.
Согласно US 4,849,413, ганглиозиды удобно экстрагировать из мозговой ткани быков или свиней. Для того чтобы быть пригодным для фармацевтического применения, моносиалоганглиозид GM1 должен быть потом выделен и очищен.
Известно, что для увеличения выхода моносиалоганглиозида GM1 экстрагированную липидную смесь обрабатывают химическими или ферментативными способами для превращения прочих ганглиозидных компонентов в моносиалоганглиозид GM1. Такие способы включают кислотный гидролиз разбавленной кислотой, как, например, описано в CN 1353112, или энзиматический гидролиз с использованием сиалидазы, например, как описано в US 5,296,360.
Дальнейшая очистка такой обогащенной GM1 липидной смеси вытеснительной хроматографией с использованием элюента хлороформ: метанол: вода 60:30:4,5 описана в ЕР 0150712. ЕР 0489352 описывает очистку обогащенной GM1 липидной смеси ультрафильтрацией раствора липидной смеси с альфа-циклодекстрином с последующим извлечением GM1 селективной экстракцией этанолом. Сообщают, что GM1 может быть получен с чистотой 95%.
Ранее было показано, что при использовании в промышленном масштабе такие процессы имеют недостатки в отношении чистоты и выхода GM1, и в отношении стоимости, эффективности и экономичности.
Для фармацевтического применения требуется производить ганглиозид GM1 высокой чистоты. Соответственно, сохраняется постоянная потребность в способах получения ганглиозида GM1 высокой чистоты.
Раскрытие изобретения
Авторы настоящей заявки неожиданно обнаружили, что ганглиозид GM1 может быть эффективно отделен от других ганглиозидов способом, основанным на ионообменной хроматографии.
Согласно настоящему изобретению было обнаружено, что ганглиозид GM1 может быть получен с высокой чистотой способом, в котором GM1 отделяют из липидной смеси, содержащей моносиалоганглиозид GM1 в качестве основного ганглиозидного компонента, ионообменной колоночной хроматографией с использованием элюента, содержащего ионы калия или цезия.
Согласно настоящему изобретению, предоставляется способ выделения и очистки ганглиозида GM1 по п.1.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения предоставляется способ, включающий общие стадии:
(а) выделение GM1 из липидной смеси, содержащей моносиалоганглиозид GM1 в качестве основного ганглиозидного компонента, ионообменной колоночной хроматографией с использованием элюента, содержащего ионы калия или цезия,
(б) извлечение растворенного вещества из элюированного раствора,
(в) диафильтрация водного раствора извлеченного растворенного вещества,
(г) добавление натриевой соли и диафильтрация полученного раствора, и
(д) извлечение GM1.
Преимущественно способ настоящего изобретения дает препарат моноганглиозида GM1 высокой степени очистки. Согласно настоящему изобретению препарат моносиалоганглиозида GM1 может иметь чистоту, более высокую, чем 98%, даже выше, чем 99,0% и даже 99,9%.
Способ настоящего изобретения использует также преимущественно простые стадии, экономичен и пригоден для применения в промышленном масштабе.
Другие цели и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из формулы и из следующего подробного описания и примеров.
Осуществление изобретения
Настоящее изобретение относится к способу очистки моноганглиозида GM1, в котором GM1 выделяют из липидной смеси, содержащей моносиалоганглиозид GM1 в качестве основного ганглиозидного компонента, хроматографией на ионообменной колонке с использованием элюента, содержащего ионы калия или цезия.
В предпочтительном варианте реализации предоставляется способ получения моносиалоганглиозида GM1 высокой чистоты, включающий стадии:
(а) выделение GM1 из липидной смеси, содержащей моносиалоганглиозид GM1 в качестве основного ганглиозидного компонента хроматографией на ионообменной колонке с использованием элюента, содержащего ионы цезия или калия.
(б) извлечение растворенного вещества из элюированного раствора стадии (в),
(в) диафильтрация водного раствора извлеченного растворенного вещества стадии (г) для удаления остаточных солей калия или цезия,
(г) добавление ионов натрия, предпочтительно в форме подходящей натриевой соли, для вытеснения ионов калия или цезия, связанных с GM1, и диафильтрация водного раствора для удаления остаточной натриевой соли, и
(д) извлечение GM1 в форме его натриевой соли.
Липидную смесь можно получать из сырого липидного экстракта мозговой ткани быка, овцы, лошади или свиньи.
Преимущественно липидную смесь, содержащую моноганглиозид GM1 в качестве преобладающего ганглиозидного компонента, можно получать из липидного экстракта, содержащего по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 50% и более предпочтительно по меньшей мере 70% смеси ганглиозидов. Остаток липидного экстракта может в общем случае состоять из сульфатидов, цереброзидов, жирных кислот и белков.
Для обессоливания раствора липидный экстракт можно сначала подвергать диафильтрации через мембрану, имеющую размер пор от 10000 до 100000 дальтон, предпочтительно примерно 50000 дальтон. Для диафильтрации можно использовать любую обычную диализную мембрану. Преимущественно можно использовать фильтровальные кассеты, например тип полисульфоновых кассет SARTOCON (Sartorius), например, с границей пропускания примерно 50000 дальтон.
Предпочтительно липидный экстракт подвергают обработке гидролизом для превращения других основных ганглиозидных компонентов, таких как GT1b, GD1a и GD1b, в GM1 для увеличения содержания GM1.
Гидролиз можно осуществлять с использованием обычных способов. Преимущественно гидролиз можно осуществлять с использованием любого из двух общих способов гидролиза ганглиозидов, известных в литературе, а именно кислотного гидролиза или ферментативного гидролиза.
Кислотный гидролиз можно осуществлять, например, с использованием разбавленной неорганической кислоты, такой как разбавленная соляная кислота, серная и азотная кислота. Гидролиз в кислой среде можно осуществлять изменением рН водного раствора липидного экстракта до рН между 3,5 и 5, предпочтительно рН около 4,0, и нагреванием раствора до температуры предпочтительно между 90°С и 100°С в течение времени, необходимого для завершения конверсии других основных ганглиозидных компонентов в GM1. Время, необходимое для гидролиза основных ганглиозидов в GM1, зависит от рН и выбранной температуры. В общем случае, чем выше рН, тем более длительное время требуется для завершения гидролиза, и чем выше температура реакции, тем короче время, требуемое для завершения гидролиза. Реакцию гидролиза можно в общем случае проводить более 2-5 часов. Например, если гидролиз осуществляют при рН 4,0 и 95°С, время, требуемое для завершения реакции гидролиза, составляет примерно 3 часа.
2+
Ферментативный гидролиз можно осуществлять с использованием любой подходящей сиалидазы. Предпочтительно можно использовать сиалидазу Arthrobacter ureafaciens штамма S или сиалидазу Vibrio cholerae. Сиалидаза Arthrobacter ureafaciens штамма S и сиалидаза Vibrio cholerae активны преимущественно в отношении GT1a, GD1a, GD1b, но не GM1. Ферментативный гидролиз можно осуществлять, например, изменением рН водного раствора липидного экстракта до рН, при котором используемый фермент имеет свою оптимальную активность, например между рН 4 и рН 6, например, примерно рН 5, добавлением подходящего буфера, такого как ацетатный буфер, добавлением ионов Са в случае, если сиалидаза является сиалидазой Vibrio cholerae, и нагреванием раствора при температуре, при которой используемый фермент имеет оптимальную активность, например около 37°С, в течение времени, необходимого для завершения превращения. Гидролиз можно в общем случае осуществлять более 12-24 часов, в зависимости от добавленных единиц активности фермента.
Кислотный гидролиз является менее предпочтительным, поскольку он является неспецифическим способом гидролиза и в общем случае обеспечивает более низкий выход GM1 вследствие конверсии в другие ганглиозиды. Способ кислотного гидролиза приводит также к образованию примеси асиало-GM1.
2+
Способы ферментативного гидролиза являются предпочтительными, поскольку они в общем случае обеспечивают более высокий выход GM1 вследствие высокой специфичности химического превращения. Для ферментативного гидролиза предпочтительна сиалидаза Arthrobacter ureafaciens, поскольку для ее активности не требуется добавления ионов Са. Также вследствие молекулярной массы 52000 дальтон (по сравнению с 82000 дальтон для сиалидазы Vibrio cholerae) ее можно преимущественно вымывать диафильтрацией.
Для извлечения полученной таким образом липидной смеси, имеющей повышенное содержание моносиалоганглиозида GM1, из реакционного раствора реакционный раствор можно преимущественно диафильтровать, например, через мембрану, имеющую размер пор 10000-100000 дальтон, предпочтительно примерно 50000 дальтон. Для диафильтрации можно использовать любую обычную диализную мембрану. Преимущественно можно использовать фильтровальные кассеты, такие как тип полисульфоновых кассет SARTOCON (Sartorius), предпочтительно с границей пропускания 50000 дальтон. Растворенное вещество можно затем высушить для получения порошка липидной смеси, содержащей моносиалоганглиозид GM1 в качестве основного ганглиозидного компонента. Сушку можно осуществлять обычными способами. Преимущественно сушку можно осуществлять распылительной сушкой или вакуумной сушкой.
Липидная смесь может в общем случае иметь концентрацию GM1 от 10 до 200 г/л и предпочтительно по меньшей мере 100 г/л.
Согласно способу настоящего изобретения ганглиозид GM1 отделяют от других ганглиозидов в липидной смеси с использованием ионообменной хроматографии.
Неожиданно было обнаружено, что при использовании элюента, содержащего ионы калия или цезия, можно успешно отделить GM1 от других моносиалоганглиозидов.
В большинстве случаев было найдено, что традиционно использующиеся методики ионного обмена не позволяют эффективно отделять GM1 от других моносиалоганглиозидов. Особенно известен моносиалоганглиозид Фукозил-GM1, присутствующий в качестве основной ганглиозидной примеси в свиной липидной смеси, произведенной известными обработками гидролизом.
Две молекулы GM1 и Фукозил-GM1 имеют очень похожие физические свойства. Обе имеют единичный отрицательный заряд, предоставленный карбоксильной группой сиаловой кислоты, и имеют близкие молекулярные массы: 1558 и 1704, соответственно. Соответственно, при загрузке в предварительно уравновешенную ионообменную колонку сила связывания двух данных ганглиозидов со смолой является одинаковой.
До настоящего времени наблюдалось, что если к элюенту для увеличения ионной силы элюента добавляют ацетат натрия и обеспечивают условия для замещения ганглиозидов, то как GM1, так и Фукозил-GM1 элюируются при той же самой ионной силе в то же самое время. Разделение данных двух моносиалоганглиозидов не может быть достигнуто.
Тогда как авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что при использовании ионов цезия или калия, например, добавлением метанольного раствора ацетата калия или цезия, GM1 и Фукозил-GM1 элюируются раздельно, при этом первым элюируется Фукозил-GM1. Разделение является полным, и может быть выделен каждый из ганглиозидов GM1 и Фукозил-GM1.
Не желая быть связанными какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения полагают, что наблюдаемое разделение может быть обусловлено тем фактом, что вопреки общепринятой теории ионного обмена растворенные вещества, GM1 и Фукозил-GM1, не только высвобождаются из колонки в порядке прочности их связывания со смолой, но также и в порядке их сродства к противоиону, с которым они должны быть связаны для того, чтобы быть отщепленными из геля. Соответственно, из этой теории следует, что если одно из этих двух растворенных веществ имеет различное сродство к противоиону, то растворенные вещества будут высвобождаться при двух различных ионных силах и может осуществляться очистка.
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что моносиалоганглиозиды GM1 и Fuc-GM1 имеют одинаковое сродство к натрию, но не одинаковое сродство к калию или цезию, несмотря на то, что все три металла принадлежат к одной и той же группе. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что Fuc-GM1 имеет более высокое сродство к калию и цезию, чем GM1, и элюируется первым.
Способ ионообменной хроматографии настоящего изобретения преимущественно дает возможность эффективно отделять GM1 от Фукозил-GM1. Далее, способ настоящего изобретения преимущественно также обеспечивает отделение GM1 от соответствующих жирных кислот. Жирные кислоты имеют такой же заряд, как ганглиозид, но более высокое сродство к ионам цезия или калия.
Для ионообменной хроматографии можно использовать любую подходящую смолу. Преимущественно можно использовать смолу, имеющую четверичную аминогруппу, например, FRACTOGEL EMD TMAE (S) или смолы Sepharose, например, смолы Q-Sepharose HP.
На первой стадии смолу уравновешивают с подходящим растворителем. Подходящие растворители включают этанол, метанол или смесь метанола и хлороформа. Предпочтительно растворитель является метанолом, потому что он является растворителем, в котором растворимы ганглиозиды и соли калия и цезия.
Затем в колонку можно загрузить раствор липидной смеси в подходящем для элюирования растворителе. Растворитель для элюирования должен содержать такие же компоненты растворителя, как растворитель, используемый для уравновешивания смолы. Предпочтительно выбранный растворитель является метанолом. Предварительное элюирование с растворителем для элюирования позволяет элюировать свободные вещества, например, цереброзиды.
Затем к растворителю для элюирования добавляют ионы калия или цезия. Ионы калия или цезия предпочтительно предоставляются в виде метанольного раствора ацетата калия или цезия, формиата, пропионата или в виде соли другой органической кислоты. Предпочтителен метанольный раствор ацетата натрия или калия. Преимущественно ацетаты калия или цезия могут присутствовать в элюенте в количестве, достаточном для обеспечения удельной проводимости элюента 1100-1400 мкСм/см, предпочтительна удельная проводимость 1200-1300 мкСм/см. Данный раствор элюента, содержащий соль натрия или калия, может проходить через колонку изократически при любой подходящей скорости потока, например, при скорости потока от 100 мл/час до 140 мл/час.
Если разделение осуществляют с использованием способа ионообменной хроматографии согласно настоящему изобретению, жирные кислоты и Fuc-GM1 элюируются перед GM1, в то время как сульфатиды, остающиеся связанными с колонкой, могут элюироваться во время промывания колонки.
Элюат, содержащий GM1, собирают, и, преимущественно, элюирующий растворитель, элюированный из колонки, может извлекаться перегонкой.
Раствор, содержащий GM1, может извлекаться сушкой раствора элюата с образованием порошка, содержащего GM1. Сушку можно осуществлять с использованием обычных способов, например, распылительной сушкой или вакуумной сушкой.
Раствор, содержащий GM1, может затем быть очищен диафильтрацией его водного раствора через мембрану, имеющую размер пор 10000-100000 дальтон, предпочтительно примерно 50000 дальтон, для удаления остаточных солей калия или цезия. Необязательно, неорганическая кислота, такая как водная серная кислота, азотная кислота, или предпочтительно соляная кислота, может быть добавлена к раствору для доведения рН между рН 6-8, предпочтительно примерно рН 7 до диафильтрации.
Ионы натрия, соответственно в виде водного раствора натриевой соли, предпочтительно NaCl, можно затем добавить к раствору для вытеснения ионов калия или цезия, связанных с GM1, и получения GM1 в виде физиологической натриевой соли. Раствор можно затем подвергать второй диафильтрации для удаления остаточной соли (например, NaCl), с использованием мембраны, имеющей размер пор от 10000 до 100000 дальтон, предпочтительно примерно 50000 дальтон. Преимущественно можно использовать фильтровальные кассеты, такие как кассеты полисульфонового типа SARTOCON (Sartorius), предпочтительно с границей пропускания 50000 дальтон.
Раствор можно затем высушить для извлечения GM1 в виде порошка. Сушку можно осуществлять обычными способами. Преимущественно сушку можно осуществлять распылительной сушкой или вакуумной сушкой.
GM1, полученный согласно настоящему изобретению, имеет степень чистоты 98% или более, в общем случае примерно от 99,0 до 99,9%. GM1, полученный согласно процессу настоящего изобретения, содержит менее 0,1% примеси Фукозил-GM1.
Способ настоящего изобретения преимущественно позволяет эффективно отделять GM1 от других моносиалоганглиозидов. В частности, способ настоящего изобретения позволяет отделять GM1 от примеси Фукозил-GM1.
Преимущественно способ настоящего изобретения дает препарат моносиалоганглиозида GM1 с высоким уровнем чистоты с хорошим выходом.
GM1, очищенный согласно способу настоящего изобретения, может использоваться в лечении испытуемых людей или животных. В частности, GM1, очищенный согласно настоящему изобретению, рассматривается для лечения людей или млекопитающих, особенно для восстановления и лечения нарушений и заболеваний центральной и периферийной нервной системы, включая мозговой инсульт, болезнь Паркинсона, повреждения спинного мозга, болезнь Альцгеймера, позднюю дискинезию, амиотрофический боковой склероз, периферийную невропатию и автономную невропатию.
Настоящее изобретение далее поясняется следующими примерами.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Получение липидной смеси, содержащей моносиалоганглиозид GM1 в качестве основного ганглиозида
Липидный экстракт, содержащий смесь ганглиозидов, имеющих чистоту 70%, растворяют в очищенной воде при концентрации примерно 25 г/л. Затем данный раствор диафильтруют через полисульфоновые фильтровальные кассеты SARTOCON (Sartorius), имеющие границу пропускания 50000 дальтон.
Затем 200 л раствора уравновешивают до рН 5,5 добавлением 50 мМ ацетатного буфера и 4 мМ хлорида кальция. Добавляют 30000 единиц сиалидазы Vibrio cholerae и нагревают раствор до 37°С в течение 12 часов для завершения превращения других основных ганглиозидов (GT1b, GD1a, GD1b) в GM1. Концентрация GM1 в полученном растворе равна 14-15 г/л.
После энзиматического гидролиза раствор диафильтруют через фильтровальные кассеты, имеющие границу пропускания 50000 дальтон. Затем к ретентату добавляют 1 М NaCl и подвергают раствор второй диафильтрации. После второй диафильтрации ретентат концентрируют до концентрации GM1 100 г/л, оставляя поток пермеата без какого-либо замещения водой. Затем раствор сушат под вакуумом для получения примерно 3200 г порошка, имеющего концентрацию GM1 85%, измеренную ВЭЖХ.
Очистка GM1 из липидной смеси, содержащей моносиалоганглиозид GM1 в качестве основного ганглиозида
Готовят метанольный раствор при концентрации 10 г/л с использованием порошка, полученного на предыдущей стадии, и фильтруют раствор через 0,22 мкм фильтровальный картридж Sartopore (произведенный Sartorius AG).
Затем для каждого цикла загружают 7 л отфильтрованного раствора в колонку ВЭЖХ, содержащую 20 л смолы Fractogel  EMD TMAE (S), уравновешенной в метаноле. Затем колонку элюируют метанолом: метанольным раствором ацетата калия, имеющим удельную проводимость 1200-1300 мкСм/см, при расходе 120 л/ч. Циклы повторялись до исчерпания раствора GM1.
Затем элюат (примерно 60-70 л) концентрируют перегонкой, а потом сушат для получения порошка, а метанол регенерируют. Полученный таким образом порошок является смесью чистого GM1 и ацетата калия.
Полученный таким образом порошок растворяют в очищенной воде при концентрации 25 г/л и уравновешивают до рН 7 добавлением 18% HCl. Раствор диафильтруют через кассетный фильтр, имеющий границу пропускания 50 000 дальтон. Затем добавляют 1М NaCl и раствор снова диафильтруют через кассетный фильтр, имеющий границу пропускания 50 000 дальтон. После данной второй диафильтрации ретентат концентрируют до 100-120 г/л, оставляя поток пермеата без какого-либо замещения водой.
Затем концентрированный раствор фильтруют через 0,22 мкм фильтр и сушат распылительной сушкой для получения примерно 2700 г от белого до бело-бежевого порошка GM1, идентифицированного ТСХ, при этом данный порошок GM1 имеет чистоту 99,8%, измеренную ВЭЖХ. Полученный порошок GM1 имеет содержание Fuc-GM1 менее 0,1%, измеренное ВЭЖХ.
Сравнительный пример
Осуществляли способ получения и очистки GM1, как в вышеописанном Примере 1, за исключением того, что в колоночной хроматографии метанол: метанольный раствор ацетата калия заменяли на метанол: метанольный раствор ацетата натрия.
Получили 3100 г порошка GM1, содержащего 91% GM1 и 8% Fuc-GM1, как измерено ВЭЖХ.
Из вышеупомянутых примеров можно видеть, что получается намного более низкая чистота GM1, если для элюирования GM1 используют ацетат натрия. Данный результат может быть обусловлен тем фактом, что противоион натрия не делает различия между GM1 и Fuc-GM1 в процессе элюирования, по сравнению с противоионами калия или цезия, которые, напротив, полностью разделяют оба пика.