Способ оценки качества рогового слоя клеточных моделей кожи человека
METHOD FOR ASSESSMENT OF QUALITY OF CORNEAL LAYER OF HUMAN SKIN CELL MODELS

Изобретение относится к медицине, сфере исследований и испытаний безопасности химической продукции, фармакологических препаратов и косметической продукции для здоровья человека, в частности, к лабораторной технике, и может быть использовано для оценки качества объекта таких испытаний - клеточных моделей кожи человека, определяющего возможность получения точных количественных результатов.
Отдельные виды продукции: химические вещества, лекарственные препараты и косметические средства считаются потенциально опасными для здоровья человека. В РФ и в мире при выводе на рынок новых видов такой продукции или их ввозе в страну в обязательном порядке требуется проведение лабораторных испытаний, устанавливающих степень их опасности (безопасности) для здоровья человека. При этом широкое распространение в получили, так называемые, альтернативные методы проведения исследований и испытаний (in vitro), предполагающие использование в качестве объекта клеточных культур или биоинженерных конструкций, имитирующих отдельные ткани и органы человека.

В частности, для оценки наличия/отсутствия у тестируемой продукции свойства вызывать раздражение/повреждение кожных покровов, изучения параметров трансдермального транспорта химических соединений (включая лекарственные средства), а также оценки потребительских свойств косметической продукции широко используются стандартизованные клеточные модели кожи человека (КМКЧ) [1, 2]. Такие как продукты EpiSkin™, EpiDerm™, SkinEthic™ RHE и VitroSkin. Для их получения используют нормальные кератиноциты человека, выращенные по специальным протоколам на мембранных вставках для культуральных планшетов типа transwell, имеющие стандартизованное (постоянное) многослойное строение: сразу над мембраной располагаются несколько слоев ядросодержащих клеток, на поверхности которых имеется не менее 5 слоев роговых чешуек. Таким образом воссоздаются барьерные функции кожи, которые должны препятствовать прохождению исследуемых веществ через роговой слой эпидермиса в подлежащие слои кожи. Принцип использования КМКЧ заключается в следующем. В случае, если тестируемое вещество способно нарушать роговой слой КМКЧ (обладает повреждающим действием на кожу), оно получает возможность оказать воздействие на нижерасположенные ядросодержащие клетки КМКЧ, что приводит к снижению их жизнеспособности. Чем выше способность вещества повреждать роговой слой, тем в большей степени окажется сниженной жизнеспособность ядросодержащих клеток КМКЧ. В свою очередь, показатели жизнеспособности этих клеток могут быть измерены количественно, например, методом МТТ. При исследовании процессов трансдермального транспорта веществ через кожу также необходимо присутствие в структуре КМКЧ стандартизованного стабильного по структуре рогового слоя.
Таким образом, уникальные характеристики КМКЧ, обуславливающие возможность использования КМКЧ в качестве измерительной тест-системы, определяет именно роговой слой. К нему выдвигаются жесткие требования: он должен быть максимально стандартизован в различных образцах (партиях) готовой продукции, обладать одинаковой сопротивляемостью к однотипным повреждениям. При этом основной технической характеристикой КМКЧ является показатель устойчивости рогового слоя к воздействию контрольного вещества, обладающего способностью его разрушать (например, Тритона Х-100, додецилсульфата натрия или эквивалентов). Данный параметр оценивается количественно с помощью контрольного цитотоксического вещества на основании показателей: ЕТ50 (время, за которое жизнеспособность клеток КМКЧ снижается на 50% при воздействии определенной концентрации контрольного вещества, в часах) или IC50 (концентрация контрольного вещества, при нанесении которой на поверхность КМКЧ на определенное время происходит снижение жизнеспособности клеток на 50%, в мкг/мл). Необходимо, чтобы все КМКЧ в партии соответствовали этому нормативному показателю.
Настоящее изобретение касается оценки качества рогового слоя КМКЧ.
Известен способ оценки качества рогового слоя КМКЧ с коммерческим названием EpiSkin™, получаемой на основе нормальных кератиноцитов человека, культивированных на коллагеновой матрице. Способ подразумевает выборочный контроль партии продукта: о качестве всей партии судят по результатам технических испытаний отдельных образцов. Случайным образом отобранные для контроля качества образцы продукции оцениваются на основании гистологического исследования: анализируется общее строение КМКЧ, наличие ядер в клетках базального слоя, наличие роговых чешуек, размеры межклеточного пространства, степень адгезии базального слоя КСКЧ к подложке, толщина слоя ядросодержащих клеток, толщина рогового слоя. Каждый критерий оценивается в баллах, от 0 до 4. Максимально возможный результат бальной оценки при этом - 28, а минимально допустимый - 19. Также исследуется воспроизводимость ответа выбранных случайным образом образцов КМКЧ (из партии продукта) на воздействие контрольного вещества - додецилсульфата натрия (ДСН). Используется показатель IC50. Он определяется на основании МТТ теста, который проводится после 18-часового контакта поверхности КМКЧ клеток с ДСН. Нормативное значение данного показателя при оценке качества продукта EpiSkin™ составляет IC50≥1 мг/мл [3].
Недостатком данного способа является то, что контролируется качество выборочных образцов продукта из партии, таким образом нельзя исключить брак (ненадлежащее качество) КМКЧ в партии, не выбранных для случайного исследования. Кроме того, используемые для контроля качества образцы КМКЧ после проведения исследования теряют свою функциональную пригодность.
Ближайшим аналогом заявленного способа контроля является способ контроля качества продукта EpiDerm™. Данная КМКЧ производится на основе эпидермальных кератиноцитов человека и нормальных дермальных фибробластов человека, полученных от единого донора. Таким образом, продукт имитирует два слоя кожи: эпидермис и дерму. Для контроля качества продукта используется контрольное вещество - 1% раствор тритона Х-100. Как и в предыдущем случае, используется выборочный контроль партии продукта - о качестве всех продуктов в партии судят по результатам испытаний отдельных образцов. Контрольное вещество наносят на поверхность КМКЧ с целью определения времени воздействия, необходимого для снижения жизнеспособности ткани на 50% (определяется с использованием метода МТТ) [4]. Нормативное значение показателя находится в диапазоне от 4.77 до 8.72 часов.
Данный способ имеет те же недостатки, что и у способа, описанного ранее: не исключает появления в серии отдельных некачественных ККТС; используемые для контроля качества образцы КМКЧ после проведения исследования становятся непригодными.
Проблемой, на решение которой направлено изобретение, является оценка качества рогового слоя КМКЧ.
Технический результат - упрощение процедуры контроля качества КМКЧ и повышение точности за счет тотального неинвазивного контроля качества всех образцов КМКЧ в партии без потери их функциональной пригодности.
В результате собственных исследований было установлено, что надежным параметром, характеризующим качество и сохранность рогового слоя КМКЧ, является его электрическое сопротивление. Известно, что клеточные модели эпителиальных тканей, в том числе, и эпидермиса человека с неповрежденным роговым слоем, обладают определенным электрическим сопротивлением за счет формирования плотных межклеточных контактов. Для его определения используют метод измерения трансэпителиального электрического сопротивления (transepithelial electrical resistance, TEER) [5]. Важно, что этот показатель снижается в случае деструкции рогового слоя. При этом чем более выражена деструкция рогового слоя и межклеточных контактов в ККТС, тем меньше величина TEER.
Заявленный способ оценки качества рогового слоя КМКЧ заключается в следующем.
Контролю качества подвергаются все КМКЧ в производственной партии.
Способ может осуществлять только в отношении продуктов, в число характеристик которых входят количественные показатели оценки сопротивляемости рогового слоя КМКЧ к контрольному веществу (для продукта известно значение нормативного показателя ЕТ50 или IC50).
Первоначально для продукта экспериментально устанавливается нормативное значение показателя TEER. Для этого используется партия готовых КМКЧ в количестве, достаточном для получения статистически достоверных данных.
Сначала во всех КМКЧ партии измеряется электрическое сопротивление методом TEER.
Измерения электрического сопротивления КМКЧ проводят с помощью прибора EVOM (World Precision Instruments, Inc., США) или аналогичных приборов следующим образом:
1) включают прибор для измерения трансэпителиального сопротивления (TEER) EVOM (World Precision Instruments, Inc., США);
2) заменяют питательную среду в базальном отсеке мембраной вставки с КМКЧ;
3) в апикальный отсек мембранной вставки добавляют 100 мкл полной питательной среды;
4) помещают электроды в апикальный и базальный отсеки мембранной вставки;
5) измеряют базовый уровень сопротивления (TEER) мембранной вставки, свободной от клеток (контроль);
6) измеряют уровень сопротивления (TEER) мембранной вставки с КМКЧ (опыт);
2
2
7) переводят полученные значения TEER в Ом*см по формуле: [измеренное значение (опыт-контроль)]*S (площадь роста клеток) = [измеренное значение] Ом*см;
Для каждой КМКЧ измерение проводят трехкратно. Результаты измерений для каждого КМКЧ записывают (фиксируют).
Затем, также для всех КМКЧ, в отношении которых ранее была измерена величина показателя электрического сопротивления методом TEER, оценивают значение технического параметра, характеризующего устойчивость рогового слоя к воздействию контрольного вещества (показатель ET50/IC50).
Количественные данные, полученные в результате этих двух экспериментов (метод TEER и метод оценки жизнеспособности клеток в составе КМКЧ по показателю ET50/IC50) сопоставляют. Выбирают те ККТС, в отношении которых выполнено требование по достижению нормативного показателя ET50/IC50. Значения TEER для этих ККТС также считают нормальными. В результате формируется диапазон числовых значений, характеризирующих величину электрического сопротивления КМКЧ с качественным роговым слоем. Этот диапазон далее используют как нормативный для данного продукта. Качество других партий продукта оценивают только методом TEER тотально, во всех образцах партии. В случае, если показатель TEER контролируемого образца соответствует ранее установленному нормативному показателю, образец считают качественным. В случае, если показатель TEER контролируемого образца выходит за пределы нормативного диапазона, образец отбраковывают.
Пример конкретного выполнения
В соответствии с заявленным способом, была проведена оценка качества рогового слоя продукта «VitroSkin», представляющего собой КМКЧ, полученную на основе нормальных кератиноцитов человека. Нормативный технический параметр, характеризующий сопротивляемость рогового слоя данной КМКЧ воздействию контрольного вещества (раствор ДСН, воздействие в течение 18 ч), в соответствии с паспортом на продукт составляет IC50≥1 мг/мл. Оценку качества КМКЧ «VitroSkin» проводили на производственном участке компании-производителя - ООО НПО «ВитроЛаб» (Новосибирск).
В соответствии с заявленным способом, сначала установили нормативный диапазон для величины электрического сопротивления КМКЧ. Для этого использовали партию из 5 готовых тест-систем «VitroSkin» в формате 24-луночных планшета, каждый из которых содержал по 12 мембранных вставок с КМКЧ. Таким образом, всего было исследовано 60 КМКЧ.
Измерение величины электрического сопротивления ККТС проводили как описано выше. Результаты измерений представлены таблице №1.
Примечание: номер объекта испытаний обозначает номер планшета и номер ККТС в составе планшета в формате Х-Х.
2
Величина электрического сопротивления ККТС в составе объектов испытаний составила от 2700 до 9000 Ом*см.
Затем, в соответствии с заявленным способом, в этих же КМКЧ было оценено соответствие нормативному показателю IC50≥1 мг/мл для раствора ДСН при нанесении на 18 часов.
Исследование проводили следующим образом. В качестве контрольного вещества использовали раствора ДСН в концентрации 1 мг/мл. Время инкубации составило 18 часов. В соответствии с паспортом на продукцию, роговой слой КМКЧ считается качественным, если жизнеспособность клеток КМКЧ в этих условиях снижается не более, чем на 50%.
Оценку жизнеспособности клеток КМКЧ проводили методом МТТ:
1) по истечении срока воздействия отбирают из лунок питательную среду, промывают КМКЧ фосфатным солевым буфером (ФСБ) и переносят их в лунки планшета, в которые предварительно добавлено 200 мкл 0,5 мг/мл раствора МТТ в ФСБ.
2
2
2) Инкубируют КМКЧ в течение 3 часов в CO-инкубаторе при t=37°С, 5% CO.
3) Отбирают среду, промывают 200 мкл ФБС и добавляют в каждую лунку 200 мкл изопропилового спирта.
4) После двух часов инкубации при комнатной температуре в темноте измеряют оптическую плотность растворов на длине волны 520 нм (за вычетом фонового поглощения на длине волны 655 нм) с помощью планшетного спектрофотометра iMark (BioRad).
5) Жизнеспособность определяют по формуле:
(ОП опытных лунок - ОП среды / ОП контрольных лунок - ОП среды)×100%, где ОП - оптическая плотность.
Результаты испытаний приведены в таблице 2.
Таким образом, тотальная оценка образцов КМКЧ «VitroSkin» нормативному показателю IC50, позволила установить, что 2 образца КМКЧ в составе производственной партии из 60 КМКЧ, имели роговой слой ненадлежащего качества: устойчивость рогового слоя к повреждающему действию контрольного вещества ТС была ниже нормативного значения (составила 31 и 40% соответственно, при нормативном показателе 50% и выше).
2
Далее, согласно заявленному способу, для всех исследованных образцов КМКЧ «VitroSkin» сопоставили величины параметров, характеризующих электрическое сопротивление КМКЧ (таблица 1) и сопротивляемость рогового слоя КМКЧ контрольному веществу по показателю IC50 (таблица 2) и пришли к выводу, что нормативная величина параметра «величина электрического сопротивления КМКЧ «VitroSkin» составляет 4000 Ом*см и выше.
Используя этот нормативный диапазон, далее проводили тотальную проверку качества КМКЧ «VitroSkin» в производственных партиях. Способ позволял осуществлять выбраковку КМКЧ с роговым слоем ненадлежащего качества, в результате чего в состав готового продукта включались образцы КМКЧ надлежащего качества.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1 Netzlaff F., Lehr С.М., Wertz P.W., Schaefer U.F. The human epidermis models EpiSkin, SkinEthic and EpiDerm: an evaluation of morphology and their suitability for testing phototoxicity, irritancy, corrosivity, and substance transport. Eur. J. Pharm. Biopharm. 2005; 60(2): 167-78.
2 OECD, 2013a. OECD Guideline for the Testing of Chemicals (No. 431.): In Vitro Skin Corrosion: Reconstructed Human Epidermis (Rhe) Test Method, OECD, Paris.
3 Qiu J., Zhong L., Zhou M., Chen D., Huang X., Chen J., Chen M., Ni H., Cai Z. Establishment and characterization of a reconstructed Chinese human epidermis model. Int. J. Cosm. Sci. 2016; 38: 60-67.
4  H., Hayden P., Klausner M., Kubilus J., Sheasgreen J. An In Vitro Skin Irritation Test (SIT) using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal (RHE) Model. J Vis Exp. 2009; (29): 1366.
5 Guth К.,  M., Fabian E., Landsiedel R., van Ravenzwaay B. Suitability of skin integrity tests for dermal absorption studies in vitro. Toxicol. In Vitro. 2015; 29(1): 113-23.