ИМПЛАНТАТ C ПОВЕРХНОСТЬЮ С КАЛЬЦИЕМ И СПОСОБЫ МОДИФИКАЦИИ ПОВЕРХНОСТИ ИМПЛАНТАТА ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ УКАЗАННОЙ ПОВЕРХНОСТИ С КАЛЬЦИЕМ
IMPLANT WITH SURFACE WITH CALCIUM AND METHODS OF MODIFYING SURFACE OF IMPLANT TO PROVIDE SAID SURFACE WITH CALCIUM

Область техники
Настоящее изобретение относится к имплантату с поверхностью, содержащей кальций, и к способу модификации поверхности имплантата для обеспечения указанной поверхности с кальцием, где целью является получение новых химических и биологических эффектов для получения в числе других преимуществ улучшения остеоинтеграции имплантата в окружающую ткань.
Уровень техники
Процесс, приводящий к удовлетворительной остеоинтеграции имплантата в прилежащей ткани, является комплексным, где указанный процесс начинается с инициации коагуляционного каскада, агрегации тромбоцитов и образования сгустка крови вокруг имплантата, приводящих к возникновению матрикса или временной фибриновой сети вокруг имплантата. Такая временная сеть выполняет две важные функции: она обеспечивает начальную стабильность имплантата, и она обеспечивает постепенное выделение тромбоцитарных факторов и клеточных маркеров. Среди других процессов клеточные маркеры с этой целью стимулируют миграцию клеток к области раны, их адгезию, дифференцировку и пролиферацию и выделение внеклеточного матрикса с его последующей минерализацией, которая заканчивается образованием характерного костного матрикса вокруг имплантата.
Касательно поверхности имплантата существует, в частности, три фактора, которые влияют на остеоинтеграционную способность имплантата в прилежащей ткани: во-первых, важными являются вещества, используемые при получении имплантата; во-вторых, важна шероховатость поверхности имплантата; в-третьих, поверхность имплантата можно подвергать обработкам для подготовки к обработке дополнительным биологически подходящим покрытием.
Касательно веществ, используемых в имплантологии, их считают биологически совместимыми, если их поверхность позволяет химически взаимодействовать с ключевыми биологическими молекулами в развитии указанного выше процесса и в рассматриваемой биологической ткани. Как правило, эти вещества состоят из титана или сплавов на основе титана или циркония или сплавов на основе циркония. Необязательно вещества могут содержать добавки в форме биологически совместимых металлов, таких как ниобий или тантал.
Что касается шероховатости поверхности имплантата, показано, что обеспечение микро- и наношероховатости поверхности таких веществ значительно увеличивает соединение имплантат-кость по сравнению с нешероховатыми поверхностями. Существует много известных способов для получения шероховатости, такие как обработка абразивом или кислотой (или их комбинация).
Наконец, что касается обработки поверхности имплантатов, известный уровень техники включает ряд известных способов получения или обработки имплантатов, в которых имплантат имеет покрытие, предназначенное улучшать некоторые свойства имплантата, и, таким образом, усиливать и ускорять его остеоинтеграцию и/или уменьшать риск его отторжения у пациента.
Такие обработки поверхности включают способы, в которых на поверхность имплантата наносят фосфаты кальция (Ca/P) (в том числе, в частности, гидроксиапатит) для обеспечения керамического покрытия имплантата, аналогичного минеральной части кости. Целью указанного керамического покрытия является увеличение остеоинтеграционных свойств имплантата для стимуляции периимплантной регенерации костной ткани. Такие способы нанесения фосфатов кальция включают способы, в которых фосфаты кальция наносят на имплантат мокрыми способами или посредством SBF (смоделированной межтканевой жидкости см. Kim H.M., Miyaji F., Kokubo T. & Nakamura T., (1996): "Preparation of bioactive Ti and its alloys via simple chemical surface treatment", J. Biomed. Mater. Res. 32(3), 409-417). В таких способах имплантат погружают в раствор, содержащий ряд ионов, в число которых входят ионы Ca и P, увеличивающих осаждение фосфатов кальция на поверхности имплантата. Примеры таких способов, как мокрые способы или посредством SBF, можно найти в EP 0389713, EP 1384524 и в US 426114. Также известны другие способы, в которых фосфаты кальция наносят на имплантат электрохимическими способами. В таких способах имплантат погружают в раствор, который содержит ряд ионов, в число которых входят ионы Ca и P, слои фосфата кальция образуются на имплантате более ускоренным образом благодаря применению электрохимических процессов (см. Yang B., Uchida M., Kim H.-M., Zhang X. & Kokubo T., (2004): "Preparation of bioactive titanium metal via anodic oxidation treatment", Biomaterials 25(6), 1003-1010; см. Rossler S., Sewing A., Stolzel M., Born R., Scharnweber D., Dard M. & Worch H., (2003): "Electrochemically assisted deposition of thin calcium phosphate coatings at near-physiological pH and temperature", J. Biomed. Mater. Res. A 64(4), 655-663). Примеры таких электрохимических способов можно найти в EP 1264606, US 5478237 и в WO 2004024200. Альтернативно, также известны способы, в которых фосфаты кальция наносят на имплантат физическими способами. В указанных способах предшественников Ca/P распыляют на имплантат плазменным напылением или лазером (см. Arias J.L., Garda-Sanz F.J., Mayor M.B., Chiussi S., Pou J., Leon B. & Perez-Amor M., (1998): "Physicochemical properties of calcium phosphate coatings produced by pulsed laser deposition at different water vapour pressures", Biomaterials 19(10), 883-888). Примеры таких способов можно найти в EP 0202908, EP 0864332 и в WO 9821380. Во всех указанных выше способах конечное покрытие поверхности является сухим.
В дополнение к указанному выше, существуют другие способы, известные как способы кондиционирования поверхности имплантата, в которых свойства поверхности имплантата изменяют выдерживанием имплантата в разбавленных растворах хлорида натрия (NaCl) (см., например, документ US 20040210309A1) или их предварительным погружением в разбавленные растворы гидроксида натрия (NaOH) (см., например, Stadlinger B., Lode A.T., Eckelt U., Range U., Schlottig F., Hefti T. & Mai R., (2009): "Surface-conditioned dental implants: an animal study on bone formation", J. Clin. Periodontol. 36(10), 882-891). В первом случае целью является хранение имплантата в среде, не содержащей загрязняющие углеводороды атмосферы, и в которой поддерживается начальный уровень чистоты. Кроме того, хранение в ионной жидкости помогает бороться с гидрофобностью, вызванной шероховатостью поверхности имплантата, которая увеличивает смачиваемость указанной поверхности полярными жидкостями. Во втором случае целью является экспонирование поверхностных гидроксильных групп, участвующих в образовании фосфатов кальция (Ca/P) на поверхности имплантата, после его помещения в зубную альвеолу. Эта последняя обработка обеспечивает улучшенную смачиваемость по сравнению с немодифицированными свойствами, но не предотвращает предварительного загрязнения поверхности, т.к. погружение в жидкость происходить в то же самое время, что и использование.
Существуют другие способы обработки поверхности имплантатов, которые основаны на модификации кристаллической решетки титана добавлением кальция для получения титанатов кальция. Такие обработки проводят с применением электрохимических или термических способов в конкретные периоды времени. Один из примеров такого типа обработки можно найти в JP 2006102212. Полагают, что апатит образуется быстрее на титановых поверхностях с такими обработками.
Целью настоящего изобретения является альтернативный способ получения имплантата, в котором имплантат имеет различную поверхность, которая не только обеспечивает высокую гидрофильность поверхности, сохраняющуюся относительно постоянное время, а также обеспечивающую новые биологические свойства, приводящие к оптимальной остеоинтеграции и имплантации имплантата в костной ткани и в организме пациента.
Краткое описание изобретения
Целью настоящего изобретения является имплантат для организма человека или животного с такой характерной особенностью, что его внешняя поверхность содержит по меньшей мере одну кальциевую соль, которая является растворимой в полярной жидкости, т.е. где кальций образует часть соединения со способностью растворяться по существу немедленно, когда подвергается действию полярного растворителя (такого как вода, этанол и т.д.). Растворение кальция эквивалентно ионизации кальция, т.е. он высвобождается в форме ионов из исходного соединения.
3
Таким образом, имплантат по настоящему изобретению является таким, что при контактировании с полярной жидкостью он содержит на своей поверхности свободные ионы кальция. Ионы кальция способны свободно действовать и обеспечивать ряд полезных эффектов, которые объяснены в дальнейшем (в частности, указанные эффекты включают прокоагуляционное действие) и которые продемонстрированы в тестах. Напротив, в описанных общепринятых имплантатах, поверхность которых содержит фосфаты кальция (Ca/P) или титанаты кальция (CaTiO), кальций содержится в форме нерастворимого соединения ("нерастворимый" понимают как любое соединение с растворимостью в воде менее 1 г/л), это означает, что в общепринятых имплантатах кальций на поверхности не способен выделяться в окружающую среду и свободно взаимодействовать. Таким образом, в указанных общепринятых имплантатах кальций не способен обеспечивать биологические функции, обеспечиваемые кальцием в настоящем изобретении.
Растворимая в полярных жидкостях кальциевая соль, содержащаяся на поверхности имплантата, может принимать различные предпочтительные формы. В одном из предпочтительных вариантов осуществления кальциевая соль находится в твердом состоянии (т.е. имплантат имеет сухое покрытие поверхности или сухой внешний вид). В другом предпочтительном варианте осуществления внешняя поверхность имплантата содержит ионы кальциевой соли в диссоциированной форме, другими словами, содержит кальциевую соль, растворенную в полярной жидкости (т.е. имплантат имеет влажное покрытие поверхности). В третьем предпочтительном варианте осуществления внешняя поверхность имплантата содержит по меньшей мере одну растворимую в полярных жидкостях кальциевую соль в частично диссоциированном состоянии (т.е. имплантат имеет гидратное покрытие, где часть ионов соли является диссоциированной).
Также целью настоящего изобретения являются различные способы модификации поверхности имплантата для обеспечения его поверхности по меньшей мере одной растворимой в полярных жидкостях кальциевой солью. Указанные способы основаны на временном или постоянном погружении имплантата в раствор по меньшей мере одной растворимой в полярных жидкостях кальциевой соли. Конечная форма имплантата может быть сухой или влажной в зависимости от способа.
Свободный кальций (после того как диссоциирует из растворимой в полярных жидкостях кальциевой соли, содержащейся на поверхности имплантата) обеспечивает указанной поверхности четыре химически и биологически предпочтительные характеристики: гидрофильность, защиту от загрязнения в результате контакта с атмосферой, прокоагуляционное свойство и способствующее минерализации свойство.
Гидрофильное свойство поверхности имплантата представляет интерес, поскольку оно обуславливает то, что биологические полярные жидкости, такие как кровь или ее производные, являются полностью аффинными к поверхности имплантата. Таким образом, существует немедленное и в равной степени взаимодействие крови или ее производных со всеми точками поверхности имплантата, максимально увеличивающее биологический ответ на единицу поверхности и способность костной ткани формироваться вокруг всей поверхности имплантата. Этот эффект особенно представляет интерес в случае шероховатых поверхностей имплантата, т.к. он ослабляет обусловленную шероховатостью гидрофобность и обеспечивает в равной степени контактирование всей поверхности имплантата с биологической средой.
Защита от загрязнения в результате контакта с атмосферой представляет собой способность поверхности имплантата сохраняться чистой от внешних загрязняющих средств из атмосферы. Указанная защита обусловлена тем, что более высокая аффинность оксидов титана на поверхности к кальцию и гигроскопичность водорастворимой соли, образованной кальцием, формируют гидратированный слой на поверхности имплантата, который предотвращает проникновение углеводородов атмосферы через поверхность оксида и их абсорбцию указанной поверхностью. Таким образом, способ по настоящему изобретению позволяет сохранять поверхность имплантата без загрязнения, таким образом, поддерживая гидрофильность в течение продолжительного периода времени. Способом также сохраняют имплантат в его исходном чистом состоянии, которое можно предварительно получать, подвергнув некоторым известным способам (очистке растворителем, очистке плазмой, очистке УФ-облучением).
Прокоагуляционное свойство означает, что поверхность имплантата, которая содержит кальций в определенном диапазоне поверхностных концентраций, вызывает активацию коагуляционного каскада при контактировании с содержащей тромбоциты кровью или производными крови. Известно, что свободные ионы кальция инициируют многие процессы в рамках коагуляционного каскада, что приводит к формированию и стабилизации сгустка крови. По существу в настоящем изобретении кальций на поверхности имплантата формирует поверхность имплантата сходную с депо ионов кальция.
2
Наконец, способствующее минерализации свойство поверхности имплантата обусловлено тем, что избыточный кальций или связанный с гидроксильными группами кальций на поверхности имплантата (см. Ellingsen J.E. (1991): "A study on the mechanism of protein adsorption to TiO", Biomaterials 12(6), 593-596) может выступать в качестве центра гетерогенной нуклеации кристаллической фазы при локальном увеличении перенасыщения одним из ключевых элементов образования апатита - кальцием.
Исходя из приведенных выше преимуществ, имплантат, являющийся целью настоящего изобретения, предоставляет значительное преимущество, обеспечивая более быструю и улучшенную остеоинтеграцию. Увеличение скорости остеоинтеграции и/или процента аппозиции костной ткани вокруг имплантата, являющегося целью изобретения, увеличивает шансы имплантации, снижает риск воспаления, а также уменьшает время ожидания проведения функциональной нагрузки имплантата.
Краткое описание чертежей
Подробное описание изобретения можно видеть на прилагаемых неограничивающих чертежах:
2
2
- На фигуре 1 показана масса кальция (мкг) на единицу поверхности (мм) после быстрого погружения (в течение 5 секунд) в раствор CaCl в этаноле при различных концентрациях и после сушки в течение 1 часа в условиях вакуума при 65ºC для гладкой и шероховатой поверхностей.
- На фигуре 2 показан микроснимок, полученный сканирующей электронной микроскопией шероховатой поверхности без кальциевого покрытия.
2
- На фигуре 3 показан микроснимок, полученный сканирующей электронной микроскопией шероховатой поверхности с кальциевым покрытием 2,4 мкг/мм.
2
- На фигуре 4 показан микроснимок, полученный сканирующей электронной микроскопией шероховатой поверхности с кальциевым покрытием 2,4 мкг/мм после погружения поверхности в полярную жидкость.
- На фигуре 5 показан спектр рассеяния, полученный для шероховатой поверхности, не покрытой кальцием.
2
- На фигуре 6 показан спектр рассеяния, полученный для шероховатой поверхности с кальциевым покрытием 2,4 мкг/мм.
2
- На фигуре 7 показан спектр рассеяния, полученный для шероховатой поверхности с кальциевым покрытием 2,4 мкг/мм после погружения поверхности в полярную жидкость.
2+
- На фигуре 8 показано изменение в градусах угла смачивания в зависимости от количества Ca на поверхности и времени экспонирования.
2+
- На фигуре 9 показано изменение в градусах угла смачивания в зависимости от количества Ca на поверхности и способа промывания.
- На фигуре 10 показана конечная степень коагуляции в объеме, нормализованная по отношению к положительному контролю, в зависимости от количества доступного кальция. Конечная концентрация кальция в плазме показана в скобках.
- На фигуре 11 показана конечная степень коагуляции, нормализованная по отношению к положительному контролю, в зависимости от различных типов обработки поверхности. В скобках показана расчетная концентрация кальция в плазме, если весь кальций на поверхности диффундирует в плазму, вызывая коагуляцию.
- На фигуре 12 показана конечная степень коагуляции, нормализованная по отношению к положительному контролю, в зависимости от количества кальция на поверхности.
2
- На фигуре 13 показан инфракрасный спектр обработанного кальцием (2,4 мкг/мм) образца и образца без кальция на поверхности, подвергнутого электрохимически активированному осаждению фазы фосфатов кальция.
2
2
- На фигуре 14 показана выживаемость клеток относительно положительного контроля после 24 часов экспонирования на поверхностях без кальция (TiO) и с кальцием (1,79 и 3,26 мкг/мм).
Подробное описание изобретения
Целью настоящего изобретения является имплантат, поверхность которого содержит по меньшей мере одну кальциевую соль, которая является растворимой в полярной жидкости (в дальнейшем растворимая в полярных жидкостях кальциевая соль). Являясь частью соли, ионы кальция диссоциируют по существу немедленно, когда подвергаются действию полярного растворителя. Таким образом, когда имплантат по изобретению приводят в контактирование с кровью или плазмой, ионы кальция становятся свободными (свободные ионы кальция), и, таким образом, способными, в числе других эффектов, вызывать коагуляцию вокруг имплантата и ускорять и улучшать остеоинтеграцию имплантата. Более конкретно, такие свободные ионы кальция обеспечивают поверхность имплантата по меньшей мере со следующими биологически и химически предпочтительными свойствами, которые были объяснены выше: гидрофильностью, защитой от загрязнения в результате контакта с атмосферой, прокоагуляционным свойством и способствующим минерализации свойством.
Имплантат по изобретению можно использовать различным образом: его можно помещать в бедро или колено, чтобы обеспечивать фиксацию бедренного или коленного протеза, его можно помещать в нижнюю челюсть, чтобы обеспечивать фиксацию зубного протеза и т.д.
Имплантат по изобретению предпочтительно получают из коммерчески чистого титана, титанового сплава, циркония или смеси сплавов титана и циркония. Альтернативно, имплантат может также содержать биологически совместимые добавки металлов, таких как ниобий или тантал. Поверхность имплантата может иметь микрошероховатость, предпочтительно обеспеченную резьбой на самом имплантате (имплантаты, как правило, включают резьбовой корпус) или полученную макроскопическими углублениями на поверхности имплантата. Кроме того, поверхность имплантата может иметь, если считают подходящим, дополнительную микро- и наношероховатость, наложенную на макрошероховатость. Как правило, микрошероховатость поверхности включает диапазон от 1 до 75 мкм (высота от высшей точки до низшей точки) и предпочтительно диапазон от 5 до 40 мкм. Наношероховатость, наложенная на микрошероховатость, включает диапазон от 0,1 до 1 мкм и предпочтительно диапазон от 0,5 мкм до 0,9 мкм.
Кроме того, изобретение включает три способа получения или модификации поверхности имплантата для обеспечения указанной поверхности по меньшей мере одной растворимой в полярных жидкостях кальциевой солью. Во всех трех способах имплантат временно или постоянно погружают в раствор по меньшей мере одной растворимой в полярных жидкостях кальциевой соли. В зависимости от способа конечное покрытие поверхности может быть сухим или влажным.
Первый способ модификации поверхности имплантата по изобретению включает этапы погружения имплантата в раствор по меньшей мере одной растворимой в полярных жидкостях кальциевой соли, извлечение имплантата, в результате чего растворимая в полярных жидкостях кальциевая соль откладывается на его поверхности, и хранение имплантата в контейнере, внутри которого находится сухая атмосфера (под сухой атмосферой понимают атмосферу, в которой не содержатся взвешенные частицы воды). Имплантат контактирует с указанной сухой атмосферой, в результате чего растворимая в полярных жидкостях кальциевая соль остается на поверхности имплантата в твердом состоянии. Таким образом, конечное покрытие поверхности имплантата является сухим, т.к. поверхность имплантата содержит кальциевую соль в твердом состоянии. Имплантат остается сухим до тех пор, пока его не извлекают из контейнера, в этот момент он проявляет склонность к гидратации взвешенных частицы воды в зависимости от относительной влажности окружающей среды. Учитывая то, что имплантат, как правило, извлекают непосредственно перед его постановкой пациенту и что указанное извлечение, таким образом, проводят в операционной, имплантат становится гидратированным в очень чистой среде. Таким образом, такое сухое предоставление гарантирует минимальное загрязнение имплантата (взвешенными частицами в воздухе) до его постановки пациенту.
Сухую атмосферу внутренней части контейнера можно получать, например, сохраняя внутреннюю часть контейнера в вакууме после помещения туда имплантата. Применение вакуума приводит к полному отсутствию молекул воды, которые в ином случае могут гидратировать покрытие совместно с соединением кальция. В результате этого способа поверхность имплантата сохраняют и упаковывают в ее исходном чистом состоянии. В другом варианте осуществления сухую атмосферу создают путем помещения в контейнер высушивающего средства, которое является более гигроскопичным, чем кальций поверхности имплантата. В этом случае сухое состояние имплантата сохраняют посредством высушивающего средства, которое поглощает молекулы воды из окружающей среды, без необходимости применять вакуум к упаковке. Высушивающее средство может представлять собой силикагель, хлорид кальция или ацетат кальция.
2
Второй способ модификации поверхности имплантата по изобретению включает этапы погружения имплантата в раствор по меньшей мере одной растворимой в полярных жидкостях кальциевой соли, извлечение имплантата, в результате чего растворимая в полярных жидкостях кальциевая соль откладывается на его поверхности, и хранение имплантата в контейнере, внутри которого находится окружающая атмосфера, где имплантат контактирует с указанной окружающей атмосферой. Таким образом, кальциевая соль остается в сухом состоянии за исключением тех случаев, когда она является растворяющейся за счет поглощения влаги солью, такой как CaCl, в случае которой конечное покрытие поверхности имплантата является влажным, т.е. имплантат является гидратированным в результате самогидратации или поглощения влаги из атмосферы осажденным на поверхности кальцием. В этом последнем случае самогидратация имплантата происходит при упаковке и, таким образом, в условиях наибольшей чистоты. В результате самогидратации образуется тонкий слой гидратированного кальция, защищающего поверхность от потенциальных загрязнений из атмосферного воздуха, которые могут происходить на более поздней стадии.
Оба описанные способа могут включать дополнительный этап сушки имплантата после его извлечения из раствора по меньшей мере одной растворимой в полярных жидкостях кальциевой соли, где дополнительный этап сушки имплантата проводят до хранения имплантата. Предпочтительно сушку проводят одним или более из следующих способов: применение тепла, проведение обезвоживания и применение вакуума. Применение тепла можно проводить, например, помещая имплантат в сушильную печь при температурах от 50 до 150ºC в течение периода от одной минуты до трех часов (время и температура зависят от гигроскопической способности используемого раствора и условия того, применяют ли вакуум, который значительно уменьшает время и температуры при сушке в печи). Применение обезвоживания можно проводить, например, помещением имплантата в десикатор или контейнер с обезвоживающими средствами, которые являются более гигроскопичными, чем покрытие поверхности имплантата, в течение периода времени, как правило, 10 минут. В любом из этих случаев экспонирование на нормальном атмосферном воздухе после сушки должно быть ограниченным для предотвращения регидратации поверхности.
Третий способ модификации поверхности имплантата по изобретению включает основной этап хранения имплантата (постоянного до его использования) в герметичном контейнере, который содержит раствор по меньшей мере одной растворимой в полярных жидкостях кальциевой соли, где концентрация раствора находится в диапазоне от 20 до 2000 мМ. Имплантат хранят в контакте с указанным раствором и изолированным от внешнего мира. В этом случае имплантат естественным образом имеет конечное покрытие поверхности, где соль является диссоциированной на ионы, и кальций, таким образом, является свободным. Вследствие того, что он является погруженным все время со стадии упаковки и в дальнейшем, имплантат защищен от внешнего загрязнения.
Касательно типа раствора по меньшей мере одной растворимой в полярных жидкостях кальциевой соли, который необходимо использовать, то в первом и втором способах по изобретению предпочтительно использовать раствор хлорида кальция в любых его состояниях гидратации в деминерализованной воде или в этаноле или, альтернативно, раствор ацетата кальция в любых его состояниях гидратации в деминерализованной воде. Такие кальциевые соли являются предпочтительными вследствие их высокой растворимости в воде: более 60 г/100 мл при температуре окружающей среды в случае хлорида кальция и более 30 г/100 мл в случае ацетата кальция, которые означают, что при рассматриваемых концентрациях ионы этих солей полностью диссоциированны. Раствор хлорида кальция в этаноле является пригодным, поскольку он увеличивает смачиваемость подлежащей обработке поверхности, т.к. этанол обладает меньшим поверхностным натяжением, чем вода. В этом способе имплантат в его конечном состоянии до его применения содержит хлорид кальция или гидрат ацетата кальция (с молекулами воды) независимо от типа используемого растворителя (деминерализованной воды или этанола). Таким образом, в том случае, когда растворитель представляет собой этанол, этанол испаряется и при нормальных условиях замещается атмосферной водой до наступления предела гидратации избытка осажденного кальция на поверхности. Этот предел гидратации обусловлен относительной влажностью окружающей среды. Более высокие или более низкие уровни гидратации не влияют на эффективное количество кальция на поверхности имплантата, которое определяется удерживанием кальция во время процесса погружения в раствор кальция и которое увеличивается с увеличением концентрации кальция основного раствора и доступной поверхности (см. тест 1). Время погружения должно составлять по меньшей мере 5 секунд для того, чтобы обеспечить равномерное покрытие кальцием всей поверхности имплантата.
В третьем способе по изобретению предпочтительно использовать раствор хлорид кальция в любом его состоянии гидратации в деминерализованной воде или, альтернативно, раствор ацетата кальция в любом его состоянии гидратации в деминерализованной воде. В этом третьем способе не применяют раствор хлорид кальция в этаноле, который можно использовать в первом и втором способах. Причина этого заключается в том, что поскольку имплантат хранится в растворе, смачиваемость всей поверхности имплантата уже обеспечена, и в случае использования этанола клиническое применение следует отсрочить до испарения этанола (как только имплантат извлекают из контейнера) и до того, как ионизованный кальций станет гидратированным частицами атмосферной воды. Следует учитывать, что установка имплантата, пока его покрытие все еще содержит этанол, не является подходящей, т.к. этанол обладает антикоагуляционным действием на кровь.
Для первого и второго способов концентрация раствора по меньшей мере одной растворимой в полярных жидкостях кальциевой соли предпочтительно находится в диапазоне от 20 до 2000 мМ, тогда как для третьего способа концентрация раствора обязательно находится в этом диапазоне. Такой диапазон обеспечивает то, что имплантат обладает указанными выше гидрофильными свойствами, защитой от загрязнения при контакте с атмосферой и способствующим минерализации свойством, как показано в подробно описанных ниже экспериментах. Для обеспечения того, чтобы имплантат также обладал прокоагуляционными свойствами, концентрация раствора по меньшей мере одной растворимой в полярных жидкостях кальциевой соли должна находится в диапазоне от 100 до 1000 мМ, как было также показано в тестах.
Кроме того, обладая поверхностью, которая является гидрофильной, защищенной от загрязнения при контакте с атмосферой, с прокоагуляционными свойствами и способствующим минерализации свойством, имплантат по изобретению обладает дополнительным преимуществом, которое подробно объяснено ниже.
-
-
2+
2+
-
2+
3-x
x
4
Как известно, поверхность титанового зубного имплантата представляет собой полярную поверхность, т.к. она содержит ионы O и OH наряду с оксидами титана поверхности. Когда имплантат устанавливают пациенту, полярная поверхность имплантата контактирует с кровотоком. Как известно, большое количество водорастворимых биологических молекул, содержащихся у пациента, которые участвуют в процессах регенерации костной ткани и которые обладают электрическими зарядами, потенциально притягиваются полярной поверхностью имплантата. В частности известно, что содержащиеся в кровотоке свободные ионы кальция Ca (приблизительно 0,4 мг/мл, см. Ellingsen J.E., 1991, Biomaterials) заканчиваются, образуя электростатические связи с отрицательными зарядами поверхности имплантата, и что указанные электростатические связи очень помогают в среднем и длительном постимплантационном периоде, способствуя остеоинтеграции имплантата. Конкретно ионы Ca электростатических связей OH-Ca вызывают адсорбцию HPO из биологической среды, способствуя образованию фаз фосфатов кальция, которые являются предшественниками кости. Кроме того, кальций способен притягивать многие белки с кислотными остатками (отрицательно заряженные), которые участвуют в процессе регенерации кости посредством специфических кальций-связывающих механизмов. В кратком изложении, эффективность титана в качестве биоматериала объясняется тем фактом, что его связь с содержащимся в крови кальцием является основным принципом механизма адсорбции белков его поверхностью (его оксидами) и последующих процессов, приводящих к остеоинтеграции.
2+
Способом по настоящему изобретению, где поверхность с оксидом титана предварительно подвергнута действию (до контактирования с пациентом) растворов с ионами кальция, обеспечивают то, что часть такого кальция электростатически связана с частично отрицательными зарядами поверхности до того, как контактирует с пациентом. Таким образом, эффективное использование основано на потенциале поверхности адсорбировать ионы Ca (улучшенная эффективность адсорбции на единицу поверхности), ввиду того, что поверхность не является объектом загрязнения из атмосферы.
В основном поверхность имплантата, являющаяся целью настоящего изобретения, обеспечивает более быструю и лучшую остеоинтеграцию по двум причинам: во-первых, вследствие мгновенной доступности ионов кальция поверхности; во-вторых, вследствие большего числа ионов кальция поверхности способных действовать в качестве центров нуклеации кристаллической фазы, вследствие того, что используются фактически все группы OH поверхности имплантата. Таким образом, изобретение обеспечивает то, что инициированные кальцием процессы возникают в самые ранние постимплантационные моменты времени и что получают более быструю и более высококачественную периимплантную регенерацию костной ткани.
Способ по изобретению также обладает отличиями и отличными эффектами по сравнению с общепринятыми способами, в которых имплантат хранят в разбавленных растворах хлорида натрия (NaCl) или гидроксида натрия (NaOH). Во всех способах гидрофобность имплантата устранена в результате шероховатости имплантата (посредством выделения воздуха, сохраняющегося в шероховатости), и имплантат защищен от контактирования с определенными углеводородами атмосферы (за исключением случая, указанного у Stadlinger B., 2009, J. Clin. Periodontol., т.к. в этом случае, имплантат погружают непосредственно перед использованием вместо того, чтобы консервировать или хранить в растворе, или когда имплантат с защитным слоем, как в настоящем изобретении), что приводит к тому, что поверхность является более чистой. Однако в указанных общепринятых способах имплантат хранят в NaCl или NaOH с отсутствием биологической активностью в коагуляционном каскаде (как будет видно из подробного объяснения фигуры 5), тогда как в имплантате по изобретению получают два указанных выше полезных эффекта: во-первых, предварительное связывание ионов кальция с гидроксильными группами поверхности имплантата, которое способствует биоминерализации и формирование характерного матрикса вокруг имплантата, т.е. остеоинтеграции, во-вторых, избыток кальция, не связанного с гидроксильными группами поверхности имплантата, высвобождается для обеспечения его собственных преимуществ (инициации процесса коагуляции и формирования временного матрикса в ранний период после введения и т.д.). Свойства имплантата по изобретению также представлены с самого первого момента и в местах наибольшей клинической важности, т.е. на поверхности раздела кость-имплантат.
Кроме того, касательно способа, описанного в патенте WO 0224243A1 (в котором описана обработка поверхности имплантата посредством его последовательной обработки в ванной с различными кислотами с последующей нейтрализацией, промыванием и применением плазмы, обогащенной факторами роста, PRGF), улучшения проведены в клинической применимости, т.к. для PRGF не требуется активация хлоридом кальция, но она активируется только при контактировании с поверхностью имплантата, т.к. имплантат по изобретению уже содержит кальциевые соли, которые являются растворимыми в PRGF.
Экспериментальные результаты
Ниже подробно описана серия экспериментов, результаты которых демонстрируют, что поверхность имплантата по изобретению фактически обладает гидрофильностью, защитой от загрязнения при контакте с атмосферой и прокоагуляционными и способствующими минерализации свойствами, которые все упоминаются на всем протяжении настоящего описания. Кроме того, в последующем эксперименте изучали минерализующую способность поверхности и тестировали способность кальциевых покрытий образовывать апатит в сравнении с поверхностями без покрытия (т.е. тестировали способствующее минерализации свойство поверхности). Наконец, проводили исследование цитотоксичности, позволяющее исключить любой отрицательный эффект таких покрытий на остеобластические клетки (т.е. выявлено, что покрытие по настоящему изобретению обеспечивает протекание правильной адгезии остеобластических клеток на имплантат).
Указанные эксперименты представляли собой следующие:
- Тест 1: Основания для расчета количества кальция на поверхности.
- Тест 2: Топографическая характеристика и композиционный анализ.
- Тест 3: Гидрофильность и защита от загрязнения.
- Тест 5: Способствующее минерализации свойство.
- Тест 6: Цитотоксичность.
Тест 1: Основания для расчета количества кальция на поверхности
1. Цель
2
2
Целью первого теста являлось определение количества кальция, смываемого с единицы поверхности, по следующим параметрам: того факта, что для раствора CaCl в качестве растворителя используют деминерализованную воду или этанол; концентрации CaCl указанного раствора.
2. Вещества и способы
Все используемые реактивы были получены от Scharlab S.L., Barcelona, Spain.
Получали поверхности имплантатов. Использовали имплантаты с шероховатостью Sa=0,7 мкм и Sdr=35%. Указанные имплантаты промывали ультразвуком с Triton X-100, ацетоном и этанолом в течение 20 минут. Использовали пять имплантатов для каждых концентраций исходного раствора.
2
2
2
Получали растворы. В качестве растворяемого вещества использовали дигидрат хлорида кальция CaCl·2HO (CaCl). В качестве растворителя использовали 95 масс.% этанол и деминерализованную воду. Концентрации раствора находились в диапазоне от 28 до 912 мМ.
Затем проводили быстрое погружение и проводили титрования. Конкретно, имплантаты подвергали быстрому погружению (5 секунд) во флаконы, содержащие 1 мл различных растворов хлорида кальция. Имплантаты затем извлекали и помещали во флаконы с 1 мл воды. Через пять часов содержимое каждого флакона (имплантат + вода) помещали в колбу Эрленмейера. Затем во флакон четыре раза добавляли один мл воды, а затем в колбу Эрленмейера для смывания внутреннего содержимого флакона. Имплантат оставался погруженным во время титрования. В качестве титрующего средства использовали 0,05M EDTA, подведенного 2M NaOH до pH 11. В качестве индикатора использовали мурексид.
После быстрого погружения имплантаты затем сушили, экспонируя при 65ºC в вакуумной печи в течение 1 часа.
3. Результаты и обсуждение
3.1 Выбор растворителя
Таблица 1Уменьшение количества кальция, смываемого с единицы поверхности, в виде процента в зависимости от используемого растворителя
Растворитель
Вода
Этанол
Этанол и сушка
Коэффициент среднего отклонения (%)
16,91
13,30
13,15
2
2
В предварительных тестах определения количества кальция, смываемого с поверхностей, в зависимости от типа используемого растворителя показано, что, когда кальций растворен в этаноле, он образует покрытия с меньшим разбросом значения кальция на поверхности кальция, чем в случае, когда кальций растворен в воде (таблица 1). Это вызвано тем, что поскольку этанол представляет собой жидкость с меньшим поверхностным натяжением по сравнению с водой, смачивание всей шероховатой поверхности является более равномерным. В случае CaCl в этаноле, но без сушки, может происходить так, что этанол не испаряется полностью, приводя к частичной регидратации водой. Для получения большей воспроизводимости, таким образом, был выбран способ, включающий быстрое погружение в CaCl в этаноле и последующую сушку.
3.2 Количество кальция, смываемого с единицы поверхности
2
2
На фигуре 1 показана взаимосвязь между количеством кальция на поверхности и начальной концентрацией кальция растворов, которым обрабатывали имплантаты (конкретно на фигуре показана масса кальция (мкг) на единицу поверхности (мм) после быстрого погружения (5 секунд) в раствор CaCl в этаноле при различных концентрациях и последующей сушке в течение 1 часа при 65ºC и в вакууме для шероховатой поверхности). Использование этанола в качестве растворителя означает, что отклонения для каждого значения являются минимальными.
-2
-1
Коэффициент нагрузки на единицу поверхности, установленный из линейной регрессии полученных данных, составляет 3,4±3 нг·мм·мМ.
2
Результаты следующих ниже тестов выражены согласно количеству кальция на поверхности, рассчитанному с этим коэффициентом, а не из начальных концентраций раствора CaCl.
Тест 2: Топографическая характеристика и композиционный анализ
1. Цель
Целью этого теста является оценка структуры покрытой кальцием поверхности и определение ее композиции до и после подвергания погружению в полярную жидкость.
2. Вещества и способы
Все используемые реактивы получали от Scharlab S.L., Barcelona, Spain.
Поверхности имплантатов получали с использованием дисков с диаметром 6 мм, высотой 3 мм и шероховатостью Sa=0,7 мкм и Sdr=35%. Указанные диски промывали ультразвуком с Triton X-100, ацетоном и этанолом в течение 20 минут.
2
2
Получали растворы. В качестве растворяемого вещества использовали CaCl·HO (дигидрат). В качестве растворителя использовали 95 масс.% этанол.
2
Для получения покрытий осаждали объем, равный смытому с аналогичных поверхностей имплантата для обеспечения конечной концентрации 2,4 мкг/мм.
Затем диски сушили, экспонируя при 65ºC в вакуумной печи в течение 1 часа, после покрывания растворами. Диски, подвергнутые промыванию, также погружали три раза в деминерализованную воду и оставляли сушиться на воздухе.
Образцы анализировали с использованием сканирующего электронного микроскопа JEOL JSM-5500LV (Akishima City, Tokyo, Japan) и энергодисперсионного спектрометра Oxford Inca 300 (EDS) (Witney, Oxon, UK), который позволяет детектировать элементы, расположенные выше углерода (включительно) в периодической таблице. Фотографии получали при ускоряющем напряжении 20 кВ.
3. Результаты и обсуждение
3.1 Структура покрытий
В отличие от непокрытых дисков (фигура 2) на покрытых кальцием дисках можно видеть слой на расположенной ниже шероховатой поверхности (фигура 3). Поскольку поверхность промывают в деминерализованной воде, то можно видеть, что кальциевое покрытие выглядит исчезнувшим (фигура 4), предположительно растворенным в полярной среде, в которой его обрабатывали. Это является желательным эффектом, в случае его контактирования с кровью или плазмой (см. тест 4).
3.2 Анализ компонентов
2
Композиционным анализом содержащих кальций покрытий показано наличие соли на поверхности (фигура 6). Соотношение Ca/Cl точно соответствует составу соли (CaCl), где присутствует приблизительно двойное количество Cl по сравнению с Ca. После промывания, и как показано посредством электронного микроскопа (фигура 4), можно видеть, что большая часть соли исчезла с поверхности (фигура 7) и перешла в полярную среду, в которую ее погружали. Это является необходимым эффектом для инициации коагуляции на поверхности, в случае если полярная жидкость, которой экспонируют поверхность, представляет собой кровь или плазму (см. тест 4). Однако небольшое количество все еще детектируют посредством EDS, результат, который соответствует предварительно полученному XPS (рентгеновской фотоспектроскопией, см. Ellingsen J.E., 1991, Biomaterials) и который подтверждает наличие количества кальция на поверхности, которое может быть благоприятным для последующих стадий биоминерализации (см. тест 5).
С другой стороны отсутствие углеродных пиков на спектрах обработанных кальцием поверхностей, промытых или непромытых (фигуры 6 и 7), указывает на то, что обработка кальцием после очистки предотвращает загрязнение в результате адсорбции углеводородов из атмосферы, которые появляются в образцах, не обработанных кальцием (фигура 5).
Такой тест помогает устанавливать структуру покрытий, а также определять их состав до и после экспонирования полярными жидкостями. Результаты этого теста также очень пригодны для анализа результатов тестов 3, 4 и 5.
Тест 3: Гидрофильность и защита от загрязнения
1. Цель
Целью третьего теста являлось определение изменения угла смачивания в зависимости от количества кальция, удерживаемого имплантатами, и распространенности кальция на поверхности в зависимости от времени и различных промываний.
2. Вещества и способы
Все используемые реактивы получали от Scharlab S.L., Barcelona, Spain.
Поверхности имплантатов получали с использованием дисков с диаметром 12,7 мм, высотой 1 мм и шероховатостью Sa=0,7 мкм и Sdr=35%. Указанные диски промывали ультразвуком с Triton X-100, ацетоном и этанолом в течение 20 минут. Для каждых концентраций исходных растворов использовали восемь дисков.
2
2
Получали растворы. В качестве растворяемого вещества использовали CaCl·2HO (дигидрат). В качестве растворителя использовали 95 масс.% этанол.
2
Для получения покрытий осаждали объем, равный смытому с аналогичных поверхностей имплантата, для обеспечения конечных концентраций 0,2, 0,7, 1,4, 2,4 и 2,9 мкг/мм.
Затем разделяли три образца дисков: a) первый образец не подвергают промыванию, используют для определения влияния времени экспонирования на воздухе на загрязнение поверхности и ее потенциальную потерю гидрофильности, b) второй образец, который подвергали аккуратному промыванию (трижды погружали в деионизованную воду), c) третий образец, который подвергали интенсивному промыванию (ультразвуковое промывание в течение пяти минут).
После покрытия растворами диски затем сушили, экспонируя при 65ºC в вакуумной печи в течение 1 часа. Диски экспонировали воздухом в течение одних и трех суток для определения их стабильности в течение продолжительного периода времени.
Для измерения угла смачивания использовали оптическое устройство для измерения натяжения KSV Theta T-200 (Attension, Helsinki, Finland). Брали среднее значение измерения левого и правого угла смачивания через 30 секунд после экспонирования.
3. Результаты и обсуждение
3.1 Влияние времени обработки
Определяли влияние времени инкубации каждого диска в исходных растворах при различных концентрациях на угол смачивания для периодов времени обработки быстрым погружением (5 секунд), погружением в течение трех часов и погружения в течение 50 суток. Результаты (не показаны) демонстрируют отсутствие значимых отличий в зависимости от времени инкубации в исходных растворах, в результате чего, был принят общий протокол быстрого погружения в течение 5 секунд и сушка в печи, как описано в способах.
3.2 Защита от загрязнения
2+
После получения покрытий поверхности оставляли экспонироваться на воздухе в течение различных периодов времени для оценки эффекта экспонирования покрытий на атмосферном воздухе и для определения потенциальной потери гидрофильности в результате включения взвешенных в воздухе гидрофобных частиц. На фигуре 8 показано изменение угла смачивания в градусах в зависимости от количества Ca на поверхности и времени экспонирования. Результаты демонстрируют, что угол смачивания едва изменяется, если поверхности подвергают действию загрязнения среды в течение от одних до трех суток. Другими словами, тест свидетельствовал о том, что осаждение кальция на поверхности предотвращает гидрофобизацию вследствие загрязнения углеводородами атмосферы (см. также тест 2, на химический состав поверхности с и без кальция).
3.3 Стабильность осаждения кальция
После покрытия и сушки диски подвергали двум типам очистки в воде. Целью являлось определить, останется ли достаточно кальция на поверхности после промывания для поддержания гидрофильных условий исходного покрытия. Для этого диски подвергали аккуратной промывке, включающей их погружение три раза в деминерализованную воду, а также интенсивное промывание, в котором их подвергали ультразвуковой очистке в течение 5 минут.
2+
На фигуре 9 показано изменение угла смачивания в градусах в зависимости от количества Ca на поверхности и способа промывания. Как можно видеть:
2
- В непромытых дисках (квадратные символы на фигуре), от 0,7 мкг/мм кальция на единицу поверхности, покрытие обеспечивает поверхность со сверхгидрофильным свойством (угол смачивания <5°).
- В дисках подвергнутых аккуратному промыванию (круглые символы на фигуре), имитирующему условия погружения имплантата в другую полярную жидкость (вода, плазма, кровь), в которой часть кальция на поверхности может диффундировать в среду и, таким образом, становиться несвязанной с поверхностью, видно, что угол смачивания увеличивается по отношению к непромытым поверхностям, но остается в крайне гидрофильных условиях (<20°) по сравнению с непокрытым образцом сравнения.
2
- В дисках, подвергнутых интенсивному промыванию (треугольные символы на фигуре), имитирующему предельные условия - 5 минут ультразвукового промывания, измеренное значение угла смачивания никогда не опускается ниже 20°, что не происходило при аккуратном промывании даже с покрытием с наименьшим количеством кальция. Кажется логичным, что такой тип очистки удаляет значительный процент кальциевого покрытия, приводя к значительному увеличению угла смачивания. Однако для 1,4 мкг/мм кажется, что интенсивная очистка не влияет на избыток, и угол смачивания остается в диапазоне 20-30°. Однако следует отметить, что даже ультразвуковая очистка не способна изменить то, что поверхности с кальцием являются более гидрофильными, чем поверхности, не содержащие кальций. Можно предположить, что значительное количество покрытия остается в полостях шероховатой поверхности.
В случае образцов сравнения, которые не содержат кальций, разница между углами смачивания обусловлена тем, что последней стадией до сушки и измерения угла смачивания являлась вода в случае "промытых" образцов и этанол в случае "непромытых" образцов. Этот последний растворитель обеспечивает более высокую степень гидроксилирования поверхности, таким образом, уменьшает угол смачивания в этих типах образцов.
Таким образом, касательно гидрофильных свойств тест продемонстрировал, что свойства имплантатов, обработанных описанными способами, остаются по существу более гидрофильными, чем необработанных имплантатов, даже после подвергания экстремальным способам механической очистки.
Тест 4: Прокоагуляционное свойство
1. Цель
Целью четвертого теста являлось определение количеств кальция на единицу поверхности необходимых для обеспечения инициирования коагуляции плазмы крови. Для этого определяли диапазон концентраций кальция в плазме, который является наиболее подходящим для инициирования объемной коагуляции (без поверхности), затем определяли диапазоны концентраций кальция на поверхности, индуцирующие коагуляцию, на этот раз в присутствии поверхности. Также исследовали дополнительные обработки поверхности на основе натрия (NaOH и NaCl) для подтверждения их непрокоагуляционной природы.
2. Вещества и способы
Все используемые реактивы получали от Scharlab S.L., Barcelona, Spain.
Плазму крови получали отбором крови у здоровых пациентов. Для получения обогащенной факторами роста (PRGF) плазмы применяли способ, аналогичный описанному в патенте EP 1066838B1 способу: кровь центрифугировали в течение восьми минут при 460×g, затем столбик плазмы отделяли от красных кровяных телец и белых кровяных телец ручным пипетированием (в отличие от протокола, описанного в EP 1066838B1, в данном случае вследствие критерия объема для проведения экспериментов отбирали весь столбик плазмы, а не только часть, более богатую тромбоцитами). Удаляли красные кровяные тельца и белые кровяные тельца.
Для определения, какие диапазоны концентрации кальция в растворах способны инициировать коагуляцию плазмы и в качестве предварительного этапа модифицировать поверхности указанными растворами, определяли степень коагуляции в зависимости от объемной концентрации кальция, как указано ниже:
a) Коагуляция в зависимости от объемной концентрации кальция
2
Для определения диапазонов концентрации ионов кальция в плазме, при которых инициируется коагуляция, 10 мкл CaCl·EtOH в концентрациях от 28 до 2000 мМ помещали на дно многолуночного планшета, содержащего 96 лунок. Содержимое лунок оставляли высыхать (т.е. происходило испарение этанола и последующая самогидратация), затем в лунки помещали 200 мкл плазмы для получения конечных концентраций 1,3, 2,5, 12,5, 22,8, 45,6 и 100 мМ кальция в плазме. Для положительного контроля (Ctrl +), до его помещения в планшет, в 200 мкл плазмы вводили 10 мкл 10 масс.% гексагидрата кальция (для конечной концентрации 22,8 мМ), а затем помещали в контрольные лунки. Отрицательный контроль (Ctrl -) получали аналогичным образом, но без активации 10 мкл 10 масс. гексагидрата кальция. В каждом случае использовали восемь повторений образцов. Немедленно измеряли оптическую плотность, как описано ниже.
b) Коагуляция в присутствии поверхностей с или без кальция
В первую очередь получали поверхности. Для исследования коагуляции, в котором измеряли избыток кальция на поверхности, использовали тонкостенные трубки для обеспечения движения луча ридера в продольном направлении. Трубки имели диаметр 6 мм, размер стенок 1 мм и обладали шероховатостью Sa=0,7 мкм и Sdr=35%. Их подвергали ультразвуковой промывке с Triton X-100, ацетоном и этанолом в течение 20 минут. Использовали восемь трубок на концентрацию.
2
2
Получали растворы. Во-первых, получали растворы кальций с растворяемым веществом CaCl·2HO (дигидрат) и растворителями 95 масс.% этанолом и деминерализованной водой. Во-вторых, получали 50 мМ раствор NaOH в деминерализованной воде и в 0,9 масс.% изотоническом растворе NaCl.
Затем трубки подвергали быстрому погружению (5 секунд) в лунки, 1 мл растворов хлорида кальция в различных исследуемых концентрациях. После погружения трубки сушили, экспонируя при 65ºC в печи в вакууме в течение 1 часа. Обрабатываемые NaOH и NaCl трубки подвергали действию указанных растворов и немедленно использовали, не давая им высыхать, точно так же, как их используют в их коммерческих версиях.
Все трубки в лунках наполняли 140 мкл плазмы с помощью многоканальной пипетки. Положительные и отрицательные контроли получали аналогичным образом, как при измерении в объеме, но на этот раз с трубками в лунках. Кроме того, количество 10 масс.% гексагидрата кальция, используемого для положительного контроля, выбирали в зависимости от объема плазмы (140 мкл), т.е. 7,4 мкл.
Незамедлительно после наполнения трубок измеряли поглощение (оптическую плотность) на спектрофотометре при длине волны 450 нм. Температура измерений составляла 37ºC, и регистрацию проводили каждую минуту измерения в течение 100 минут. Результаты нормализовали относительно положительного контроля (степень коагуляции контроля = 1).
3. Результаты и обсуждение
Построенные кривые кинетики коагуляции (не включены вследствие сложности их сравнительного исследования) демонстрируют, что существует латентный период от пяти до десяти минут, в котором оптическая плотность сохраняется неизмененной, равной начальному значению (0), и что с определенного момента значение постепенно увеличивается в течение периода, т.к. формируется фибриновая сеть и уплотняется как часть коагуляционного процесса. Такое постепенное образование поперечных связей постепенно блокирует прохождение луча ридера, таким образом, оптическая плотность увеличивается. Значение оптической плотности стабилизируется приблизительно через 30 минут после начала процесса, что свидетельствует о том, что процесс завершился. Именно в этот момент сравнивают значения поглощения (оптической плотности), таким образом, сравнения можно проводить между различными образцами.
Таким образом, на фигуре 10 показана конечная степень коагуляции в объеме (без поверхностей), нормализованная относительно положительного контроля (Ctrl +=1), в зависимости от количества доступного кальция (конечная концентрация кальция в плазме приведена в скобках). На графике показано, что в диапазоне концентрации кальция в плазме от 2,5 до 45,6 мМ степень коагуляции иногда даже выше, чем степень коагуляции положительного контроля.
На фигуре 11 показана степень коагуляции внутри титановых трубок, нормализованная относительно положительного контроля, в зависимости от различных обработок поверхности (в скобках приведена расчетная концентрация кальция в плазме, если образцы содержали кальций на поверхности, и предполагают, что весь кальций на поверхности перешел в плазму, вызывая коагуляцию). На графике показана степень коагуляции внутри трубок после наступления завершения процесса коагуляции. На фигуре 12 также показана степень коагуляции только для случая покрытий с кальцием на поверхности при различных концентрациях на поверхности.
На фигурах 11 и 12 показан аналогичный эксперимент, как на фигуре 10, но где измерения проводили с включенным в поверхности кальцием. Также исследовали доступные на рынке модификации поверхности NaOH и NaCl, устанавливая, способны ли они инициировать поверхностную коагуляцию (фигура 11). Положительный контроль проводили аналогичным образом, как в предыдущем случае: 10 масс.% гексагидрата кальция смешивали с плазмой в 22,8 мМ и помещали в лунку (с необработанной поверхностью).
2
2
2
2
2
2
В случае поверхностей без кальция (отрицательный контроль, NaOH и NaCl) недостаток коагуляции является очевидным. В случае поверхностей с кальцием процесс коагуляции является более выраженным или менее в диапазоне определенных концентраций кальция. Конкретно, концентрация 0,52 мкг/мм является недостаточной для активации коагуляции, тогда как в диапазоне от 0,7 до 3,5 мкг/мм в некоторых случаях получали даже больший сигнал, чем в положительном контроле. От 1 мкг/мм полученная степень коагуляции поверхностями с кальцием по меньшей мере является такой же как степень коагуляции положительного контроля (т.е. по меньшей мере 1), и кажется, что это значение не увеличивается значительно в диапазоне 1-3,5 мкг/мм. Однако от 3,5 мкг/мм существует уменьшение степени конечной коагуляции так, что от 5 мкг/мм процесс коагуляции полностью ингибирован.
В кратком изложении, данный тест подтвердил для поверхности то, что известно для объема, другими словами, что существует диапазон концентраций кальция на поверхности, который инициирует идеальный процесс коагуляции, но вне этого диапазона коагуляция не возникает. Поскольку в них недостаточно кальция, коммерческие покрытия на основе NaOH и NaCl также не могут способствовать коагуляции.
Тест 5: Способствующее минерализации свойство
1. Цель
Целью данного теста являлась оценка способности фаз фосфата кальция формироваться в образцах подвергнутых обработке поверхности кальцием для определения способности поверхностей стимулировать образование апатита.
2. Вещества и способы
Все используемые реактивы получали от Scharlab S.L., Barcelona, Spain.
Поверхности имплантатов получали с использованием дисков с диаметром 8 мм, высотой 3 мм и шероховатостью Sa=0,7 мкм и Sdr 35%. Указанные диски подвергали ультразвуковой промывке с Triton X-100, ацетоном и этанолом в течение 20 минут. Измерения проводили в различных точках трех дисков, различных по типу поверхности (с кальцием, без кальция).
2
2
Получали раствор кальция. В качестве растворяемого вещества использовали CaCl·2HO (дигидрат). В качестве растворителя использовали 95 масс.% этанола.
2
Для получения покрытий осаждали объем, равный тому, что смывался с аналогичных поверхностей имплантатов, для обеспечения конечной концентрации 2,4 мкг/мм.
2
2
4
2
4
4
Для электрохимически активированного осаждения (ECAD) фаз фосфата кальция использовали комбинированный потенциостат/гальваностат PGSTAT T302N (Metrohm Autolab B.V., Utrecht, Holland). Это устройство прикрепляли к снабженной рубашкой электрохимической ячейке для обеспечения постоянной температуры 36±1ºC во время электролиза. Рабочий электрод был выполнен в виде катода, и поляризация проходила в гальваностатическом режиме. В эксперименте для каждого образца применяли плотность тока -15 мА/см в течение 30 минут. Используемый для осаждения фаз фосфата кальция электролит получали с концентрациями 1,66 мМ CaCl и 1 мМ NHHPO. pH электролита доводили NHOH до 6,4.
После минерализующей обработки образцы ополаскивали пять раз в деминерализованной воде для удаления всех подвижных остатков и оставляли сушиться на воздухе до последующего анализа.
Для оценки минерализации образцов использовали инфракрасный спектрометр с преобразованием Фурье FTIR Nicolet 6700 FT-IR (Thermo Fisher Scientific, Waltam, USA) с модулем ATR (нарушенного полного внутреннего отражения) для тонких поверхностей. Проводили в общей сложности 32 сканирования на образец в пяти различных точках каждого образца для проверки однородности покрытия.
3. Результаты и обсуждение
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
3
Шероховатость образцов и тонкость их покрытия из фосфата кальция сделала невозможным выделение достаточного количества образца для проведения анализа на KBr осадки. Именно по этой причине использовали способ ATR. В настоящем случае недостаток информации в диапазоне 400-600 см в результате использования способа ATR не является важным, т.к. оба покрытия образованы гидроксиапатитами. На фигуре 13 показаны инфракрасные спектры образцов с кальцием и образцов без кальция. Разделение пика поглощения фосфата (ν в 1020 и 1090 см) и вершины при 965 см являются характеристиками гидроксиапатитов. Небольшой пик при 875 см объясняется замещением углерода в кристаллической решетке, который свидетельствует о том, что он является карбонатным гидроксиапатитом. Пик при 1420 см также является признаком этого типа гидроксиапатита. Хотя карбонатный гидроксиапатит получали в обоих образцах, в случае образцов с кальцием более высокая интенсивность пиков указывает на то, что эти покрытия способны вызывать повышенное осаждение апатитов в одних и тех же экспериментальных условиях. Покрытия с кальцием также образовывали значительно более гидратированные гидроксиапатиты, где характерный образ колебаний гидроксилов становится очень выраженным приблизительно при 3400 см. В дополнение к более высокой интенсивности пиков, другой аспект, на который следует обратить внимание в случае образцов с кальцием, является наличие дополнительных пиков карбонатных гидроксиапатитов (1460 и 1550 см) и гидратированных гидроксиапатитов (1630 см), которые не присутствуют в образцах без кальция.
В кратком изложении, этот тест показал, что предварительно обработанные кальцием диски способны вызывать более быстрое осаждение гидроксиапатита на поверхности по сравнению с необработанными дисками в одних и тех же экспериментальных условиях.
Тест 6: Цитотоксичность
1. Цель
Целью шестого теста являлась биологическая оценка токсичности покрытий с кальцием после 24 часов контактирования с клетками hFOB 1.19 согласно стандарту UNE-EN ISO 10993-5:2000.
2. Вещества и способы
Растили клеточную культуру. Клеточную линию hFOB 1,19 (ATTC CRL 11372) культивировали в DMEM-F12 (Invitrogen 11039-021) совместно с 10% эмбриональной телячьей сывороткой, 1% пенициллином-стрептомицином, 1% глутамином и 0,3 мг/мл G418.
Поверхности получали в форме дисков с диаметром 6 мм, высотой 3 мм и шероховатостью Sa=0,7 мкм и Sdr=35%. Их подвергали ультразвуковой промывке с Triton X-100, ацетоном и этанолом в течение 20 минут. Использовали пять дисков на концентрацию.
2
2
Растворы получали с использованием CaCl·2HO (дигидрат) в качестве растворяемого вещества и 95 масс.% этанола в качестве растворителя.
2
Получали покрытия: для каждой концентрации осаждали объем, эквивалентный смытому с аналогичной поверхности имплантатов объему, на покрытые кальцием диски для обеспечения конечных концентраций 0,36, 1,79 и 3,26 мкг/мм.
Касательно обработки образцов, то все образцы подвергали стерилизации β 25-50 кГр. В качестве негативного контроля использовали тестовые пробирки из PVC и в качестве положительного контроля использовали тестовые пробирки из PE высокой плотности. Контроли стерилизовали с использованием этанола. В стерильных условиях образцы помещали в 96-луночные планшеты, куда позже добавляли клетки.
4
2
2
Касательно клеточной линии и проведения теста, выращивали клетки клеточной линии hFOB 1,19 и получали клеточную суспензию. Рассеивали 1,5×10 клеток в среде/лунке на вершину исследуемых образцов. Планшет инкубировали в течение 24 часов при 37ºC и 5% CO. Использовали пять повторений для каждого образца/контроля и одно повторение для каждого образца/контроля в качестве "холостого опыта" (питательная среда без клеток) для определения фонового сигнала каждого образца/контроля. По окончании времени контактирования определяли количество клеток/образцы тестом WST-1. Для этого добавляли 10 мкл WST-1/лунка и инкубировали в течение четырех часов (37ºC и 5% CO, темнота). Наконец, среду удаляли из каждой лунки в другой планшет и регистрировали оптическую плотность планшета при длине волны 450 нм планшет-ридером оптической плотности.
Для определения количества клеток/образец строили кривую, связывающую известное количество клеток с оптической плотностью, полученной способом WST-1. Способ WST-1 представляет собой колориметрический способ, которым детектируют митохондриальную активность клеток.
Что касается оценки теста, результаты были основаны на количественной оценке культивирования после 24 часов контактирования. Получали процент выживаемости клеток каждого тестируемого образца по сравнению с результатами, полученными для положительного контроля.
Относительная выживаемости клеток (%)= количество клеток образца/количество клеток контроля (+)×100
Результаты подвергали статистической обработке, применяя статистический t-критерий Стьюдента, для проверки, являются ли значимыми различия по отношению к положительному контрою или нет (p<0,05).
3. Результаты и обсуждение
2
2
На фигуре 14 показаны результаты теста на цитотоксичность согласно стандарту UNE-EN ISO 10993-5:2000, показывающие, в частности, выживаемость клеток относительно положительного контроля после 24 часов экспонирования поверхностями без кальция (TiO) и c кальцием (1,79 и 3,26 мкг/мм). Ни одна из оцениваемых поверхностей не является цитотоксической для используемых остеобластических клеток, так же как и не было обнаружено статистически значимых отличий между результатами положительного контроля и образцов, и ни один из них не превышал пороговую величину цитотоксичности (70% относительной выживаемости). По-видимому, осаждение кальция на поверхности не оказывает отрицательных эффектов на клеточную адгезию и выживаемость клеток после 24 часов культивирования. Поскольку они являются очень гигроскопичными покрытиями, можно было опасаться, что такие покрытия могут разрывать клеточные стенки, когда они подвергаются действию высокого осмотического давления. Также было основание полагать, что мембранные рецепторы могут быть насыщенными вследствие избытка кальция. Данный тест исключил такие эффекты. В частности, высокая гигроскопичность кальциевого покрытия означает, что оно быстро гидратирует молекулы воды из среды, в результате чего в момент контакта с клетками и клеточной средой осмотический градиент понижается до безопасных уровней в отношении клеточного лизиса.
Заключения по тестам
2
2
Настоящее изобретение обеспечивает получение однородного кальциевого покрытия на титановых субстратах с очень небольшим разбросом его распределения по поверхности. Накопление растворителя кальциевыми солями является почти мгновенным и не увеличивается с увеличением времени экспонирования, но увеличивается с концентрацией растворенного вещества в растворителе. Гигроскопическое свойство хлорида кальция позволяет формировать гидратированный слой на поверхности, который предотвращает "гидрофобизирующий" эффект в результате загрязнения при контакте с атмосферой оксида титана углеводородами атмосферы. Эта защита сохраняется в течение продолжительного периода времени. Кроме того, такие покрытия обеспечивают поверхность высокогидрофильной природы, основанной на относительно низких концентрациях ионов кальция на единицу поверхности. Набольшие потери в гидрофильности наблюдают только, когда проводят очень тяжелые промывания, и даже тогда поверхности обладают большим гидрофильным свойством, чем исходно не покрытые кальцием поверхности. Конкретное свойство таких поверхностей заключается в том, что они могут растворяться в присутствии полярных жидкостей, таких как кровь или плазма. Вследствие того, что кальций является основным компонентом коагуляционного каскада и его инициирования, основной характеристикой поверхностей является то, что они вызывают коагуляцию, когда контактируют с указанными выше биологическими жидкостями. Этот процесс зависит от концентрации кальция и, таким образом, в настоящем описании определен диапазон концентраций кальция на поверхности, при которых происходит коагуляция оптимальным образом: в случае обработки CaCl от 0,70 до 3,5 мкг/мм или при концентрациях исходного раствора от 100 до 1000 мМ. Исследование минерализующей способности (способствующее минерализации свойство) демонстрирует, что кальциевые покрытия обладают более высокой способностью образовывать апатиты, чем необработанные поверхности. Наконец, исследование цитотоксичности исключает любые отрицательные эффекты таких покрытий на остеобластические клетки.