Способ идентификации вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней на основе ПЦР в реальном времени
METHOD FOR IDENTIFICATION OF THE PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS BASED ON REAL-TIME PCR

Настоящее изобретение относится к ветеринарии и касается способов измерения, использующих вирусы, а именно нуклеиновые кислоты. Данное изобретение может быть использовано в ветеринарии при идентификации вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС) в организме свиней различных пород и возрастов.
Вирус РРСС (род Porartevirus, семейство Arteriviridae) - это вирус, вызывающий заболевание свиней, которое называется репродуктивно-респираторным синдромом свиней. Это экономически значимое панзоотическое заболевание вызывает нарушение репродуктивной функции у племенного скота и заболевание дыхательных путей у молодых свиней (Mengeling W.L., Lager K.М. and Vorwald А.С. Diagnosis of porcine reproductive and respiratory syndrome. J. Vet. Diagn. Invest. 1995, vol. 7, pp. 3-16). При этом вирус РРСС имеет иммуносупрессивные свойства, что создает условия для инфицирования вторичными вирусными или бактериальными инфекциями (Сюрин В.Н. и др. Вирусные болезни животных. М.:ВНИТИБП, 1998. С. 552-558). К возбудителю РРСС восприимчивы свиньи всех возрастных категорий и пород. Источником возбудителя инфекции являются переболевшие и больные свиньи, которые выделяют вирус с носовой слизью, фекалиями, мочой и спермой. Массовые вспышки РРСС наносят существенный экономический ущерб свиноводству (Pileri Ε. and Mateu Ε. Review on the transmission porcine reproductive and respiratory syndrome virus between pigs and farms and impact on vaccination. Veterinary Research. 2016, vol. 47(1), p. 108). Возбудителем данного заболевания является РНК-содержащий вирус, который относится к роду Arterivirus из семейства Arteriviridae (Kappes М.А. and Faaberg K.S. PRRSV structure, replication and recombination: Origin of phenotype and genotype diversity. Virology. 2015, vol. 479-480, pp. 475-486). Большие трудности при идентификации вируса представляет наличие большого количества (несколько сотен) штаммов РРСС, которые различаются между собой по последовательности РНК, в серологических реакциях, а также по некоторым биологическим свойствам (Takikawa N. et al. Detection of antibodies against porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in swine sera by enzyme-linked immunosorbent assay. J. Vet. Med. Sci. 1996, vol. 58, pp. 355-357).
На данный момент идентификацию болезни проводят путем комплексного исследования, которое учитывает эпизоотическую обстановку, клинические признаки болезни, а также патоморфологические изменения с последующим лабораторным исследованием (окончательный диагноз). Для лабораторной идентификации используют пробы крови и легких, экссудат из брюшной и грудной полостей, средостенные лимфатические узлы от абортированных плодов или убитых нежизнеспособных поросят. Чаще всего при лабораторных исследованиях выявляют антитела к вирусу.
Зачастую необходимо быстро выявить присутствие вируса РРСС у свиней ввиду их быстрого распространения между контактирующими животными, чтобы предотвратить массовую вспышку заболевания, обеспечить иммунизацию животных и провести карантинные мероприятия. Наиболее подходящим для этого является использование молекулярно-биологических методик на основе ПНР в реальном времени ввиду их высокой чувствительности, специфичности, универсальности и низкой трудоемкости. Большой проблемой является выявление консервативных последовательностей РНК вируса для разработки метода генетической идентификации ввиду его высокой вариабельности. В ходе обширного биоинформатического анализа нами были идентифицированы участки РНК вируса, которые консервативны между разными штаммами вируса РРСС, что позволило разработать праймеры и TaqMan зонд для специфичной идентификации вируса РРСС.
Известен способ дифференциальной диагностики репродуктивно-респираторного синдрома свиней (заявка на изобретение RU 97103225, МПК G01N 33/53, A61K 39/12, опубл. 10.11.1998), взятый за прототип, включающий использование культуры клеток, инфицированной вирусом РРСС, фиксацию данной культуры, инкубирование ее последовательно с исследуемыми сыворотками и антисвиными ПХ-иммуноглобулинами, обработку субстратом, при этом используют стандартную перевиваемую культуру клеток MARC-145, инфицированную вирусом РРСС.
Недостатком данного способа является высокая трудоемкость, продолжительность анализа и потребность в наличии живых культур клеток, инфицированных вирусом РРСС, что требует дополнительных финансовых и временных затрат как на приобретение клеток, так и на их культивирование и поддержание жизнеспособности.
Задачей настоящего изобретения является разработка высокоспецифичного и оперативного способа идентификации вируса РРСС в организме свиней.
Технический результат заключается в высокочувствительном, общедоступном и безопасном способе идентификации вируса РРСС, а также в сокращении времени проведения диагностической работы с целью выявления вируса.
Технический результат достигается тем, что в способе идентификации вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней на основе ПЦР в реальном времени, согласно изобретению, из предварительно отобранной крови свиней получают сыворотку крови, из неё выделяют вирусную РНК и осуществляют обратную транскрипцию для получения кДНК вируса с последующим проведением ПЦР в реальном времени, при этом для амплификации используют праймеры: прямой №1 (SEQ ID NO: 1): TGGCTGCTGAAGATGA, прямой №2 (SEQ ID NO: 2): ACAGCTCCRATGGGGA и обратный (SEQ ID NO: 3): GAAGTCACGCGAATYA, а также TaqMan зонд (SEQ ID NO: 4): FAM-TGCAATCGATCCAGAC-BHQ1, причем логарифмическое повышение уровня флуоресценции в канале FAM амплификатора в реальном времени свидетельствует о наличии вируса РРСС в крови свиней.
Предварительно проведен анализ нуклеотидной последовательности участка ORF7 вирусной РНК. Установлены консервативные участки нуклеиновой кислоты вируса, которые позволяют разработать метод экспресс-идентификации вируса на основе ПЦР в реальном времени с использованием TaqMan зонда, который представляет собой олигонуклеотид, к которому присоединены молекула флуорофора и молекула гасителя флуоресценции. При проведении ПЦР гибридизованный с кДНК TaqMan зонд расщепляется ДНК-полимеразой (вследствие её экзонуклеазной активности) и высвобождается флуоресцентная метка. Таким образом, наблюдается повышение уровня флуоресценции.
На фиг. 1 приведены кривые флуоресценции трёх проб РНК (кДНК), выделенной из крови животных больных вирусом, полученные в ходе проведения ПЦР в реальном времени, на фиг. 2 - кривые флуоресценции двух проб РНК (кДНК), выделенной из сыворотки крови свиней, предположительно больных РРСС.
Способ идентификации вируса РРСС с помощью проведения ПЦР в реальном времени с использованием TaqMan зонда в представленном способе реализуется следующим образом:
1. Производится отбор крови у свиней. Для анализа достаточно 1 мл биологического материала.
2. Из крови любым доступным способом получают сыворотку крови.
3. Производится выделение вирусной РНК из сыворотки крови. Выделение РНК можно осуществлять как с помощью коммерческих наборов, так и методами органической экстракции.
4. С выделенной вирусной РНК проводят обратную транскрипцию (любым доступным способом) для получения кДНК.
5. Проводят ПЦР в реальном времени. Используют следующие температурные циклы: 94°С 3 мин, 40 циклов: 94°С 20 сек, 54°С 30 сек, 72°С 40 сек.
Используются следующие праймеры и TaqMan зонд:
Прямой №1 (SEQ ID NO: 1): TGGCTGCTGAAGATGA
Прямой №2 (SEQ ID NO: 2): ACAGCTCCRATGGGGA
TaqMan зонд (SEQ ID NO: 4): FAM-TGCAATCGATCCAGAC-BHQ1
Обратный (SEQ ID NO: 3): GAAGTCACGCGAATYA
Данные праймеры амплифицируют продукт ПЦР, который содержит нуклеотидные полиморфизмы, характерные только для вируса РРСС, с которыми взаимодействует TaqMan зонд.
6. В случае, если наблюдается логарифмическое повышение уровня флуоресценции в канале FAM амплификатора, это означает, что в крови животного содержится вирус РРСС.
Способ поясняется примером.
Из двух образцов сыворотки крови свиней (Проба №1 и Проба №2) с помощью набора Viral RNA Kits (Zymo Research, США) была изолирована вирусная РНК. С изолированной вирусной РНК была проведена обратная транскрипция с помощью набора MMLV RT (Евроген, Россия). Далее была проведена ПЦР в реальном времени на амплификаторе CFX 96 (Bio-Rad, США) с праймерами TGGCTGCTGAAGATGA (SEQ ID NO: 1), ACAGCTCCRATGGGGA (SEQ ID NO: 2) и GAAGTCACGCGAATYA (SEQ ID NO: 3), также TaqMan зондом FAM-TGCAATCGATCCAGAC-BHQ1 (SEQ ID NO: 4). Наблюдалось логарифмическое повышение флюоресценции в канале FAM для двух анализируемых образцов (фиг. 2). Таким образом, в образцах сыворотки крови свиней Проба №1 и Проба №2 содержится вирус РРСС.
Предлагаемый способ является высокочувствительным, хорошо воспроизводимым и экономичным. Анализ можно проводить в лабораториях, имеющих амплификатор в реальном времени, центрифугу, сопутствующие реактивы и расходные материалы.