Применение дигидрохлорида N,N'-бис-(2,3-бутадиенил)-1,4-диаминобутана (MDL72.527) для подавления репродукции вируса SARS-CoV-2
APPLICATION OF N,N'-BIS-(2,3-BUTADIENYL)-1,4-DIAMINOBUTANE DIHYDROCHLORIDE (MDL72.527) FOR SUPPRESSING REPLICATION OF SARS-COV-2 VIRUS

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и медицины, а именно, к новому способу подавления репликации новой коронавирусной инфекции (SARS-CoV-2, SARS-nCoV) за счет ингибирования катаболизма биогенных полиаминов спермина и спермидина.
Уровень техники
Известно, что новая коронавирусная инфекция, вызываемая бета-коронавирусом SARS-CoV-2, появилась в Китае в конце 2019 г и быстро распространилась по всему миру. По данным на последнюю декабря 2020 года этот вирус инфицировал около 80 млн человек по всему миру, в том числе 3 миллиона человек в России [https://www.worldometers.info/coronaviras/]. Первичное инфицирование вирусом часто сопровождается проявлением целого спектра симптомов поражения дыхательной системы человека, включающих сухой кашель, температуру, одышку, затрудненность дыхания [Matthew J Cummings et. al Epidemiology, clinical course, and outcomes of critically ill adults with COVID-19 in New York City: a prospective cohort study Lancet. 2020 6-12 June; 395(10239): 1763-1770, doi:10.1016/S0140-6736(20)31189-2 Wei-Jie Guan et. al Clinical Characteristics of Coronavirus Disease 2019 in China N Engl J Med 2020 Apr 30;382(18):1708-1720, doi: 10.1056/NEJMoa2002032. Epub 2020 Feb 28.]. Кроме того, инфекция затрагивает и другие жизненно-важные системы человека, такие как кровеносную, нервную и желудочно-кишечный тракт, приводя к нарушениям свертываемости крови и появлению тромбов, нарушению пищеварения, повышению риска сердечных осложнений, неврологической, а в ряде случаев и психиатрической симптоматики. У значительного числа пациентов вирус-индуцированное воспаление усиливается, что приводит к появлению дыхательной недостаточности и острому респираторному дистресс-синдрому (АРДС), которые являются следствием цитокинового шторма. АРДС и тромбозы являются основными причинами гибели пациентов от коронавирусной инфекции и делают данный вирус крайне опасным для человека. По оценкам на конец декабря 2020 года, SARS-CoV-2 уже стал причиной гибели более 1,7 млн человек на планете, из которых 54 тыс. жили в России [https://www.worldometers.info/coronaviras/]. Таким образом, SARS-CoV-2 создает беспрецедентную нагрузку на системы здравоохранения во всем мире, что требует создания подходов к профилактике и лечению этой коронавирусной инфекции.
Лечение пациентов с коронавирусной инфекцией в настоящее время в основном основана на терапии вирус-ассоциированных патологий: воспаления и тромбоза. Воспаление лечится использованием кортикостероидов (дексаметазон, преднизолон, метилпреднизолон) [Peter Horby et. al. Dexamethasone in Hospitalized Patients with Covid-19 - Preliminary Report N Engl J Med, 2020 Jul 17;NEJMoa2021436, doi: 10.1056/NEJMoa2021436; Paula Mattos-Silva et. al. Pros and cons of corticosteroid therapy for COVID-19 patients 2020 Respir Physiol Neurobiol Sep; 280:103492, doi: 10.1016/j.resp.2020.103492. Epub 2020 Jul 10.], а в тяжелый случаях - биологическими препаратами - моноклональными антителами к различным провоспалительным цитокинам и их рецепторам [Т Klopfenstein et. al. Tocilizumab therapy reduced intensive care unit admissions and/or mortality in COVID-19 patients Med Mai Infect, 2020 Aug; 50(5): 397-400, doi: 10.1016/j.medmal.2020.05.001. Epub 2020 May 6; Rafael Leon Lopez et. al. Efficacy and safety of early treatment with sarilumab in hospitalised adults with COVID-19 presenting cytokine release syndrome (SARICOR STUDY): protocol of a phase II, open-label, randomised, multicentre, controlled clinical trial BMJ Open, 2020 Nov 14;10(ll):e039951, doi: 10.1136/bmjopen-2020-039951.]. Нарушения свертываемости крови лечится различными антикоагулянтами: эноксапарин и его аналогами, ривароксабан (Ксарелто) и подобными им препаратами. В то же время терапия самой вирусной инфекции намного менее развита. За последний год было предпринято много попыток выявить в системах in vitro противовирусную активность различных веществ, включая лекарственные препараты, использующиеся против других болезней. Так, было найдено, что лопинавир и ритонавир, хлорохин и гидроксихлорохин, интерфероны, арбидол, тилорон, тиоридазин, осельтамивир, рибавирин и многие другие противовирусные препараты [напр., X. Xiao et al, Identification of Potent and Safe Antiviral Therapeutic Candidates Against SARS-CoV-2 Front Immunol 2020; M. Zhao et al. Recent progress of antiviral therapy for coronaviras disease 2019. European Journal of Pharmacology 2021; D. Bojkova et al, Proteomics of SARS-CoV-2-infected host cells reveals therapy targets. Nature 2020] способны подавлять репродукцию данной коронавирусной инфекции. Многие из этих веществ пытались вводить в клиническую практику, особенно в начале пандемии, но анализ результатов не выявил от их применения пользы для пациента: сокращения времени болезни и снижения ее тяжести [P. Shende et al, Drug repurposing: new strategies for addressing COVID-19 outbreak. Expert Review in Antiinfective Drugs, 2020]. На данный момент Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) единственно разрешенным препаратом против коронавирусной инфекции является ремдесивир - нуклеозидный аналог, который изначально разрабатывался для борьбы с лихорадкой Эбола, а позднее оказался эффективным в борьбе с возбудителями коронавирусов SARS и MERS [Sheahan TP, Sims AC, Leist SR, et al. Comparative therapeutic efficacy of remdesivir and combination lopinavir, ritonavir, and interferon beta against MERS-CoV. Nat Commun. 2020;11(1):222. doi: 10.1038/s41467-019-13940-6.; Siegel D. et al., Discovery and synthesis of a phosphoramidate prodrug of a pyrrolo[2,l-f][triazin-4-amino] adenine C-nucleoside (GS-5734) for the treatment of Ebola and emerging viruses. J. Med. Chem. 60, 1648-1661 (2017).; ClinicalTrials.gov, GS-5734 to assess the antiviral activity, longer-term clearance of Ebola virus and safety in male Ebola survivors with evidence of Ebola virus persistence in semen. https://clinicaltrials.gov/ct2/show/?term=GS-5734&rank=l. Accessed 23 April 2019.; de Wit E. et al., Prophylactic and therapeutic remdesivir (GS-5734) treatment in the rhesus macaque model of MERS-CoV infection. Proc. Natl. Acad. Sc.i U.S.A. 117, 6771-6776 (2020).]. Данный препарат также разрешен для использования и регуляторными органами и других стран, включая Россию. Другим препаратом, который также используется в ряде стран для лечения SARS-CoV-2, является фавипиравир, также являющийся аналогом нуклеозидов [Alberto Boretti Favipiravir use for SARS CoV-2 infection Pharmacol Rep.2020 Oct 27: 1-11. doi: 10.1007/s43440-020-00175-2; Furuta Y., Komeno Т., Nakamura T. Favipiravir (T-705), a broad spectrum inhibitor of viral RNA polymerase. Proc. Japan Acad. Ser. B: Phys. Biol. Sci. 2017;93(7):449-463. doi: 10.2183/pjab.93.027.]. Однако следует отметить, что несмотря на ряд положительных сообщений о клинической пользе фавипиравира и ремдесивира [Ka-Tim Choy, Alvina Yin-Lam Wong, Prathanporn Kaewpreedee, Sin Fun Sia, Dongdong Chen, Kenrie Pui Yan Hui, Daniel Ka Wing Chu, Michael Chi Wai Chan, Peter Pak-Hang Cheung, Xuhui Huang, Malik Peiris, Hui-Ling Yen Remdesivir, lopinavir. emetine, and homoharringtonine inhibit SARS-CoV-2 replication in vitro Antiviral Res. 2020 Jun; 178: 104786. Published online 2020 Apr 3. doi: 10.1016/j.antiviral.2020.104786.], их эффект при лечении пациентов с коронавирусной инфекцией до сих пор оценивается как не полностью доказанным [М. Zhao et al. Recent progress of antiviral therapy for coronavirus disease 2019. European Journal of Pharmacology 2021]. Другие препараты, хоть и остаются в клинических рекомендациях ряда стран (включая Россию) для лечения короновирусной инфекции, считаются неэффективными [М. Zhao et al. Recent progress of antiviral therapy for coronavirus disease 2019. European Journal of Pharmacology 2021]. Следовательно, на данный момент, задача разработки новых препаратов, блокирующих репродукцию SARS-CoV-2 стоит достаточно остро.
Одним из классов потенциальных антикоронавирусных препаратов рассматриваются ингибиторы белков клетки-хозяина. Считается, что подобные вещества могут воздействовать на все штаммы целевого вируса с одинаковой эффективностью, и к ним не может выработаться резистентность. Кроме того, известно, что ряд веществ этого класса уже является лекарственными препаратами для лечения других заболеваний (например, онкологических). Это может дать возможность быстро перепрофилировать препарат и ввести его в использование в отношении лечения коронавирусной инфекции. Вирус SARS-Cov-2 действительно меняет экспрессию множества генов в клетке, включая гены ферментов различных метаболических путей [D. Bojkova et al, Proteomics of SARS-CoV-2-infected host cells reveals therapy targets. Nature 2020], нарушая тем самым уровни метаболитов центральных путей метаболизма углерода, метаболизма компонентов нуклеиновых кислот и т.д. [Н. Delattre et al., Inhibiting the reproduction of SARS-CoV-2 through perturbations in human lung cell metabolic network. Life Science Alliance 2020]. В случае новой коронавирусной инфекции показано, что в in vitro системах противовирусной активностью обладают ингибитор гликолиза - 2-дезоксиглюкоза [D. Bojkova et al, Proteomics of SARS-CoV-2-infected host cells reveals therapy targets. Nature 2020], ингибитор длинноцепочечной АсСоА-синтазы - Триасцин С [J. Silvas et al., Inhibitors of VPS34 and lipid metabolism suppress SARS-CoV-2 replication. BioRxiv 2020], ингибитор АсСоА:диацилглицеролацетилтрансферазы 1 - вещество A922500 [S. Dias et al., Lipid droplets fuel SARS-CoV-2 replication and production of inflammatory mediators. 2020], и ряд других соединений [Н. Delattre et al., Inhibiting the reproduction of SARS-CoV-2 through perturbations in human lung cell metabolic network. Life Science Alliance 2020]. Однако до сих пор неизвестно о противовирусной активности в отношении SARS-CoV-2 ни одного из известных ингибиторов метаболизма такого класса веществ, как биогенные полиамины.
Одной из метаболических систем является система биогенных полиаминов. Полиамины, такие как, спермин и спермидин, присутствуют во всех типах клеток млекопитающих в высоких концентрациях (мили- и субсмилимолярных) и принимают участие в широком спектре процессов: репликации, транскрипции и трансляции, сплайсинге, защите от активных форм кислорода и т.д. [L. Miller-Fleming et al. Remaining Mysteries of Molecular Biology: The Role of Polyamines in the Cell. J. Mol. Biol., 2015., 427, 3389-3406; A.E. Pegg., Mammalian polyamine metabolism and function. IUBMB Life. 2009, 61(9)., 880-894]. Полиамины образуются из общего предшественника - 1,4-диаминобутана (путресцина), который в клетках млекопитающих синтезируется из непротеиногенной аминокислоты орнитина - метаболита цикла мочевины [Olga A. Smirnova, Birke Bartosch, Natalia F. Zakirova, Sergey N. Kochetkov, Alexander V. Ivanov Polyamine Metabolism and Oxidative Protein Folding in the ER as ROS-Producing Systems Neglected in Virology Int J Mol Sci. 2018 Apr; 19(4): 1219. Published online 2018 Apr 17. doi: 10.3390/ijmsl9041219]. Превращение орнитина в путресцин под действием орнитиндекарбоксилазы (ODC) является регулирующимся и скорость-лимитирующим процессом биосинтеза полиаминовв клетке. Кроме того, еще одним регулируемым ферментом анаболизма спермина и спермидина является S-аденозилметиониндекарбоксилаза (AdoMetDC), продукт которой выступает донором аминопропильного фрагмента при превращении путресцина в спермидин и далее в спермин. Деградация полиаминов осуществляется двумя разными путями. Классический путь представляет собой ацетилирование спермидина или спермина ферментом спермидин/спермин-К'-ацетилтрансферазой (SSAT) с последующей быстрой деградацией до путресцина и спермидина ацетилполиаминоксидазой (АРАО, РАОХ), соответственно. Следует отметить, что экспрессия SSAT регулируется в клетке, а сам фермент представляет собой мишень для создания фармакологических препаратов, прежде всего противоопухолевых. Другой путь представляет собой прямое превращение спермина в спермидин под действием фермента сперминоксидазы (SMO, SMOX). Еще одной мишенью в метаболизме полиаминов являются два фермента гипузинилирования фактора инициации трансляции 5 альфа (eIF5a): дезоксигипузинсинтаза (DHS) и дезоксигипузингидроксилаза (DOHH).
Метаболизм полиаминов тесно связан с развитием различных заболеваний: онкологических, аутоиммунных, инфекций, вызванных бактериями, которые часто вызывают повышение уровней спермина и/или спермидина [L. Miller-Fleming et al. Remaining Mysteries of Molecular Biology: The Role of Polyamines in the Cell. J. Mol. Biol., 2015., 427, 3389-3406; R.A. Casero and A.E. Pegg. Polyamine catabolism and disease. Biohem J. 2009. 421, 323-338; V. Broshtilova et al., Polyamine metabolism changes in psoriasis. Indian J Dermatol. 2013., 58(4), 306-309]. Поэтому понижение внутриклеточных концентраций полиаминов при использовании ингибиторов ферментов биосинтеза (ODC, AdoMetDC) или индукторов ферментов катаболизма (прежде всего SSAT) полиаминов рассматривается как перспективная стратегия лечения таких болезней. Среди низкомолекулярных регуляторов ферментов метаболизма полиаминов следует назвать DFMO и DENSpm [L. Miller-Fleming et al. Remaining Mysteries of Molecular Biology: The Role of Polyamines in the Cell. J. Mol. Biol., 2015., 427, 3389-3406; R.A. Casero and A.E. Pegg. Polyamine catabolism and disease. Biohem J. 2009. 421, 323-338; R.A. Casero Jr and L.J. Maton. Targeting polyamine metabolism and function in cancer and other hyperproliferative diseases. Nat Rev Drug Discovery. 2007, 6, 373-390]. DFMO представляет собой необратимый ингибитор ODC, a DENSpm - индуктор SSAT, вызывающий резкое усиление катаболизма полиаминов. Оба этих вещества снижают уровни полиаминов и исследуются в качестве антипролиферативных лекарственных средств.
1
11
1
11
В научных источниках имеется мало данных о взаимосвязи полиаминов и ферментов их метаболизма с вирусными инфекциями. Многие такие работы суммированы в обзоре [Olga A. Smirnova, Birke Bartosch, Natalia F. Zakirova, Sergey N. Kochetkov, Alexander V. Ivanov Polyamine Metabolism and Oxidative Protein Folding in the ER as ROS-Producing Systems Neglected in Virology Int J Mol Sci. 2018 Apr; 19(4): 1219. Published online 2018 Apr 17. doi: 10.3390/ijmsl9041219]. За последние тридцать лет имеется лишь несколько серий публикаций из нескольких групп, показывающих противовирусную активность веществ - регуляторов ферментов полиаминов на вирусные инфекции и роль самих полиаминов в репликации вирусов и в защите клетки от них. Так, группы Bryan Mounce и John Connor продемонстрировали, что полиамины важны для репликации вирусов лихорадок Марбург и Эбола [М.Е. Olsen et al., mBio. 2016, 7(4), e00882-16], Зика и Чикунгунья [B.C. Mounce et al., Interferon-Induced Spermidine-Spermine Acetyltransferase and Polyamine Depletion Restrict Zika and Chikungunya Viruses. Cell Host & Microbe., 2016, 20, 167-177], а также новой коронавирусной инфекции [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsinfecdis.0c00491]. Наша группа ранее выявила, что и вирус гепатита С нарушает метаболиз полиаминов в хозяйской клетке [О.А. Smirnova et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 2017, 483, 904-909]. Среди веществ - ингибиторов или активаторов ферментов метаболизма основное внимание получили ингибитор орнитиндекарбоксилазы дифторметилорнитин (DFMO, eflornithine), блокирующий биосинтез полиаминов, и представитель бис-алкилированных полиаминов N,N-диэтилнорспермин (N,N-бисэтилнорспермин, DENSpm, BENSp), который усиливает катаболизма спермина и спермидина. Серия работ группы Mounce сообщила о том, что DFMO обладает широким спектром активности в отношении целого ряда различных вирусов (исключая SARS-CoV-2)[B.C. Mounce et al., Inhibition of polyamine biosynthesis is a broad-spectrum strategy against RNA viruses. J.Virol., 90 (21), 9683-9692]. Эта же группа показала возможность подавления репродукции вирусов коксаки и везикулярного стоматита при помощи DENSpm [B.C. Mounce et al., Inhibition of polyamine biosynthesis is a broad-spectrum strategy against RNA viruses. J.Virol., 90 (21), 9683-9692]. Наша группа выявила противовирусную активность в отношении вируса гепатита С у вещества MDL72.527, ингибитора сперминоксидазы и ацетилполиаминоксидазы и блокирующего деградацию полиаминов [патент RU 2667123]. Наконец, появляются работы о том, что возможно подавлять репродукцию вирусов, блокируя гипузинилирование (напр., репликацию вируса лихорадки Эбола при помощи ингибитора дезоксигипузинсинтазы - вещества GC7) [https://jvi.asm.org/content/92/20/e01260-18]. Имеются сведения и о подавлении репликации вируса мышиного гепатита - родственного SARS-CoV-2 бета-коронавируса различными ингибиторами гипузинилирования фактора eIF5a [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsinfecdis.0c00491], Однако ни одна работа об ингибиторах гипузинилирования и полиаминоксидаз не касается новой коронавирусной инфекции.
Раскрытие сущности изобретения
Сущность изобретения заключается в новом способе блокирования репродукции новой коронавирусной инфекции, вызываемой SARS-CoV-2.
Задачей предлагаемого изобретения является создание новых, высокоэффективных, селективных и малотоксичных антивирусных агентов для лечения новой коронавирусной инфекции, вызываемой SARS-CoV-2.
1
Результатом является новый способ использования дигидрохлорида N,Nс-(2,3-бутадиенил)-1,4-диаминобутана (MDL72.527), известного ингибитора сперминсинтазы и ацетилполиаминоксидазы, а именно для подавления репликации новой коронавирусной инфекции, вызываемой SARS-CoV-2.
Для осуществления изобретения необходимо получить пермиссивную к вирусу SARS-CoV-2 линию клеток человека. Далее для воплощения изобретения необходимо подобрать диапазон концентраций тестируемого соединения, в котором не наблюдается цитотоксического эффекта для линии клеток. И в своем последнем исполнении оценить влияние MDL72.527 на репликацию вируса в инфекционной in vitro системе.
Краткое описание фигур и таблиц
Фигура 1. Цитотоксичность MDL72.527 в клетках А549-АСЕ2
Фигура 2. Активность MDL72.527 в отношении SARS-CoV-2, определенная как уровни внеклеточной вирусной РНК отновительно контроля, шкала логарифмическая
Осуществление изобретения
Для поиска противовирусных агентов против новой коронавирусной инфекции необходимо было получить пермиссивную к вирусу линию клеток человека. Нами была выбрана линия аденокарциномы легкого А549, которая является моделью эпителиальных клеток легкого - поражаемого SARS-CoV-2 органа. Пермиссивность линии зависит от наличия на поверхности клетки рецептора для вируса - ангиотензин-превращающего фермента 2 (АПФ2, АСЕ2). Так как в клетках линии А549 экспрессия его гена крайне низкая, необходимо было гиперэкспрессировать данный ген в клетках. Сам ген был получен клонированием из тотальной РНК, выделенной из линии глиобластомы человека А172, и вставлен в лентивирусный вектор pL-CMV-L4-NP-Puro, позволяющий доставлять целевой ген в клетки человека и быстро проводить селекцию при помощи агента пуромицина. На основе данного вектора был сконструирован лентивирус, и его частицами трансдуцировали клетки линии А549 с последующей селекцией. Анализ экспрессии гена АСЕ2 подтвердил его гиперэкспрессию в полученной линии А549-АСЕ2.
Анализ цитотоксичности соединения MDL72.527 проводили в диапазоне его концентраций от 1 до 300 мкМ, инкубируя клетки А549-АСЕ2 в течение 3 суток. Анализ жизнеспособности проводили при помощи красителя МТТ (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide), который превращается в окрашенный формазан под действием оксидоредуктаз живых клеток. Эксперимент показал, что MDL72.527 обладает слабовыраженной токсичностью: гибель 50% клеток наблюдалась лишь в концентрациях около 270-300 мкМ, тогда как в стандартных концентрациях, при которых соединение ингибирует полиаминоксидазы клеток (20-70 мкМ) гибель клеток не превышала 30% от контрольного уровня (Фигура 1). Таким образом, для исследования противовирусной активности MDL72.527 был выбран диапазон от 10 до 100 мкМ.
Противовирусную активность MDL72.527 анализировали, инфицируя клетки А549-АСЕ2 вирусом SARS-CoV-2 при множественности инфицирования (TCID50) 500. Соединение добавляли к клеткам за 2 ч до инфицирования, затем вместе с вирусом и еще раз после отмывки клеток от вирионов. Противовирусный эффект определяли через 72 ч двумя методами: микроскопически (оценивая нарушение монослоя клеток и появление других признаков цитопатогенного эффекта) и измеряя уровни вирусной РНК в кондиционной среде методом обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени. Было отмечено, что вещество снижало цитопатогенный эффект вируса уже в концентрации 25 мкМ, что сопоставимо с его терапевтическими концентрациями на других клеточных моделях, а также с концентрациями, в которых вещество ингибирует активности полиаминоксидаз. Кроме того, вещество показывало дозозависимое действие на уровни РНК вируса в культуральной среде, то есть на репродукцию вируса и образование/секрецию его вирионов (Фигура 2). Это говорит о наличии противовирусной активности у ингибитора сперминоксидазы и ацетилполиаминоксидазы - вещества MDL72.527. Далее изобретение будет проиллюстрировано примерами, предназначенными для обеспечения лучшего понимания сущности заявленного изобретения, но которые при этом не должны рассматриваться как ограничивающие данное изобретение. Пример 1. Оценка цитотоксичности соединений
Все клеточные линии культивировали при +37°С во влажной атмосфере на культуральном пластике фирмы ТРР (Швецария) в среде DMEM (Life Technologies, США) с добавлением 10% фетальной сыворотки телят (BioSera, Франция), если нет иного уточнения.
Линию А549-АСЕ2 получали клонированием гена ангиотензин-превращающего фермента 2 (АСЕ2) в лентивирусный вектор вектор pL-CMV-L4-NP-Puro, сборкой лентивирусных частиц и трансдукцией ими клеток А549 с последущей селекцией. Клонирование проводили выделением тотальной РНК из клеток А172 набором "High Pure RNA Isolation Kit" (Roche, Швецария) по инструкции производителя, получением кДНК при помощи гексамера случайной последовательности как описано в работе [Smirnova et.al. Viruses 2015], амплификацией гена олигонуклеотидами SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 1, а также ДНК-полимеразы Phusion (New England Biolabs, США) по инструкции производителя и клонированием продукта в вектор по сайтам рестрикции Xbal и EcoRI, отбирая клоны с полноразмерным геном. Структуру полученной плазмиды подтверждали секвенированием (ЦКП «Геном», ИМБ РАН). Далее смесью полученной плазмиды и упаковочных плазмид pLPl, pLP2 (Invitrogen, США) и pCMV-VSV-G (Addgene, США) трансфицировали клетки НЕК293Т при помощи реагента для трансфекции Lipofectamine2000 (Invitrogen, США) и собирали содержащую вирионы кондиционную среду через 48 ч после трансфекции. Полученной средой трансдуцировали клетки линии А549 (АТСС, США), через 24 ч добавляли пуромицин до концентрации 1,5 мкг/мл на 96 ч. Затем клетки, рассевали на 60-мм чашку Петри (ТРР, Швецария), и подтверждали гиперэкспрессию гена АСЕ2 методами обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени и вестерн-блоттинга.
4
Цитотоксичность MDL72.527 в линии А549-АСЕ2 оценивали при помощи красителя МТТ (Panreac AppliChem, Испания). За 24 ч до добавления вещества клетки рассаживали на 96-луночный планшет в плотности 4×10 клеток на лунку в среде DMEM с добавлением 2% фетальной сыворотки телят. Вещество добавляли в концентрациях от 1 до з00 мкМ. Контролем служили клетки без добавления препарата. Через 72 ч цитопатогенный эффект вируса анализировали микроскопией и прибавляли краситель МТТ (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) до концентрации 0,5 мг/мл, и выдерживали клетки 3 ч при +37°С. Затем культуральную среду удаляли, окрашенный продукт растворяли в 100 мкл 2-пропанола, содержащего 0,04 М НС1, и определяли оптическую плотность растворов на планшетном анализаторе Chameleon V (Hydex Оу, Финляндия) при 544 нм. Токсичность различных концентраций препарата определяли по жизнеспособности клеток относительно контроля, по полученным данным строили график зависимости жизнеспособности клеток от концентрации препарата и определяли концентрацию, снижающую жизнеспособность клеток на 50% (ЦТД50).
Из Фигуры 1 видно, что MDL72.527 не проявляет заметной цитотоксичности в исследуемом диапазоне концентраций.
Пример 2. Оценка способности соединений подавлять репродукцию вируса SARS-CoV-2 in vitro
2
Монослой клеток А549-АСЕ2 заражали стоком вируса SARS-CoV-2 с концентрацией TCID50 500 в присутствии тестируемого соединения (в субтоксичных концентрациях). Через 2 часа инкубации при +37°С в СО-инкубаторе клетки отмывали от несвязавшихся вирионов фосфатно-солевым буфером (PBS) и прибавляли свежую ростовую среду. Тестируемое соединение добавляли к клеткам до, вовремя и после заражения. Через три дня после инфицирования собирали культуральную среду и выделяли из нее вирусную РНК с помощью набора «High Pure RNA Isolation Kit» в соответствии с инструкцией производителя. Анализ уровней вирусной РНК проводили амплификацией двух фрагментов генома вируса из полученной кДНК методом ПЦР в реальном времени при использовании двух пар олигонуклеотидов (SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6) и смеси для ПЦР qPCR-HS-SYBR (Евроген, Россия). Концентрация каждого олигонуклеотида составляла 0,8 мкМ. Амплификацию проводили на приборе LightCycler 96 (Roche, Швецария) по следующей схеме: преинкубация (+95°С, 5 мин), 45 циклов, состоящих из денатурации ДНК (+95°С, 10 сек.), отжига праймеров (+55°С, 20 сек) и непосредственно амплификации (+72°С, 25 сек), и последующего анализа плавления продуктов нагревом реакций от +65°С до +97°С со скоростью 0,2 С/сек. Контролем служили клетки без добавления вируса SARS-CoV-2.
Из Фигуры 2 видно, что MDL72.527 подавляет репродукцию SARS-CoV-2 в микромолярных концентрациях, снижая уровни его РНК в культуральной среде.