Способ иммунокоррекции с использованием экстрактов жирных масел из семян чернушки дамасской и эхинацеи пурпурной
METHOD OF IMMUNOCORRECTION USING EXTRACTS OF FATTY OILS FROM SEEDS OF NIGELLA DAMASCENA AND ECHINACEA PURPUREA

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии.
По известным литературным источникам – семена чернушки дамасской Nigella damascena L. содержат 40-44 % жирного масла, в состав которого входит тимохинон [Маширова, С. Ю. Фармакогностическое изучение семян чернушки дамасской (Nigella damascena L.), выращенной в условиях Ставропольского края: диссертация ... кандидата фармацевтических наук: 14.04.02 / Маширова С. Ю.; ГОУВПО "Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия".- Санкт-Петербург, 2013.- 177 с.: ил.], обладающий иммуномодулирующей активностью. Иммуномодулирующие действие тимохинона опосредовано повышением Т-хелперной активности, а также снижением выработки цитокинов: ФНО-α; ИЛ-6; ИЛ-4; ИЛ-10 и повышением образования ИЛ-3 [Gholamnezhad Z, Boskabady MH, Hosseini M. Effect of Nigella sativa on immune response in treadmill exercised rat. BMC Complementary and Alternative Medicine. 2014;14:437].
Биологически активные вещества эхинацеи пурпурной Echinacea purpurea (L.) Moench. применяют в качестве источников эффективных лекарственных средств с иммуностимулирующей активностью (RU 2524658, публ. 27.07.2014).
Растительные масла – продукты, извлекаемые из растительного сырья и состоящие из триглицеридов жирных кислот и сопутствующих им веществ (фосфолипиды, свободные жирные кислоты, воски, стеролы и др.). Масляные экстракты или экстракты жирных масел – это растительное масло, в котором содержатся только полезные вещества, изъятые из растительного сырья [Нечипасова Д.И., Зацепина Е.Е., Ивашев М.Н. УНИФИКАЦИЯ ПОНЯТИЙ «ЖИРНОЕ МАСЛО», «ЭКСТРАКТ ЖИРНОГО МАСЛА» И СИНОНИМИЧНЫХ ИМ ПО СМЫСЛУ ТЕРМИНОВ // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2013. – № 10-3. – С. 473-474], в чем заключается их преимущество.
Известен способ коррекции экспериментального иммунодефицита на примере циклофосфановой модели (Морозова Е.Н. Изменения морфометрических параметров лимфатических узелков пейеровых бляшек тонкой кишки после коррекции иммунодефицитного состояния имунофаном в эксперименте // Клiнiчна анатомiя та оперативна хiрургiя. – Т.10, № 4. – 2011 - С. 19-22), который характеризуется тем, что эксперименты проводили на 36 половозрелых белых крысах-самцах. Крысы были разделены на 2 группы по 18 особей. Животным первой группы вводили циклофосфан однократно в дозе 200 мг/кг (1-е сутки), затем имунофан по схеме (2-е, 4-е, 6-е, 8-е и 10-е сутки) в дозе 0,7 мкг/кг. Второй группой служили интактные крысы. Животных выводили из эксперимента на 7-е, 30-е и 90-е сутки после завершения введения имунофана. Тонкую кишку фиксировали в 10% растворе формалина, затем подвергали стандартной гистологической проводке. Срезы толщиной 5-6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. При помощи автоматизированного морфометрического комплекса измеряли высоту и ширину лимфатических узелков, их герминативных центров и межузелковых зон.
Основным недостатком способа является то, в эксперименте не проводили сравнение морфометрических параметров лимфатических узелков пейеровых бляшек тонкой кишки в группе с коррекцией иммунодефицита имунофаном с показателями в группе животных с иммунодефицитом (группой контроля), вследствие чего не получено достоверных различий морфометрических параметров в группе с патологией и группе с коррекцией патологии, что не подтверждает эффективность применения имунофана на модели циклофосфанового иммунодефицита в эксперименте.
Наиболее близким к заявленному решению является способ иммунокоррекции апи-фитокомпозицией (RU 2524658, публ. 27.07.2014), включающий воспроизведение иммунодефицита у лабораторных животных путем введения циклофосфана однократно в дозе 200 мг/кг массы тела лабораторного животного (1-е сутки эксперимента) с последующей ее коррекцией, причем, коррекцию иммунодефицита проводят апи-фитокомпозицией в виде водной суспензии меда, пыльцы, прополиса, экстракта эхинацеи пурпурной в соотношении 10:1:1:2, которую вводят лабораторному животному внутрижелудочно (через зонд), в дозе 200 мг/кг ежедневно в течение 10 дней на вторые сутки эксперимента.
Недостатком данного решения является то, что мед и прополис являются продуктами, применение которых вызывает аллергические реакции – от зуда в слизистой оболочке полости рта до серьезных системных симптомов и анафилактического шока (Bauer L, Kohlich A, Hirschwehr R et al. Food allergy to honey: pollen or bee products? Characterization of allergenic proteins in honey by means of immunoblotting. J Allergy Clin Immunol. 1996 Jan;97(1 Pt 1):65-73; Hashimoto T, Tori M, Asakawa Y, Wollenweber E. Synthesis of two allergenic constituents of propolis and poplar bud excretion. Z Naturforsch C. 1988 May-Jun;43(5-6):470-2).
Задачей предлагаемого изобретения является создание эффективного способа иммунокоррекции с использованием экстрактов жирных масел из семян чернушки дамасской и эхинацеи пурпурной, обеспечивающих синергетический эффект и исключающего недостаток прототипа.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является эффективный способ иммунокоррекции с использованием экстрактов жирных масел из семян чернушки дамасской и эхинацеи пурпурной, обеспечивающих синергетический эффект, подтверждаемый результатами морфометрических исследований параметров лимфатических узелков пейеровых бляшек тонкой кишки лабораторных крыс на модели циклофосфанового иммунодефицита в эксперименте и исключающий недостаток прототипа.
Поставленная задача достигается тем, что предложен способ иммунокоррекции с использованием экстрактов жирных масел из семян чернушки дамасской и эхинацеи пурпурной, включающий воспроизведение иммунодефицита у лабораторных крыс путем введения циклофосфана однократно в дозе 200 мг/кг массы тела крысы на первые сутки эксперимента с последующей его коррекцией на вторые сутки, причем коррекцию иммунодефицита проводят смесью экстрактов жирных масел из семян чернушки дамасской и эхинацеи пурпурной в объемном соотношении 1:1, которую вводят лабораторной крысе внутрижелудочно, через зонд, в дозе 4,6 мл/кг/сут ежедневно в течение 14 дней.
Сочетание компонентов смеси обеспечивает синергетический эффект, эффективно корректирует экспериментальный иммунодефицит и исключает недостаток прототипа.
Основным преимуществом предлагаемого способа является то, что введение смеси экстрактов жирных масел из семян чернушки дамасской и эхинацеи пурпурной в объемном соотношении 1:1 приводит к выраженной коррекции экспериментального иммунодефицита. Помимо этого, в эксперименте проводили сравнение морфометрических параметров лимфатических узелков пейеровых бляшек тонкой кишки в группе с коррекцией иммунодефицита смесью экстрактов жирных масел из семян чернушки дамасской и эхинацеи пурпурной с показателями группы животных с иммунодефицитом (группой контроля), вследствие чего выявлены достоверные отличия в сравнении с моделью циклофосфанового иммунодефицита.
СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ СЛЕДУЮЩИМ ОБРАЗОМ
Опыты проводят на 50 белых крысах-самцах половозрелого возраста массой 200-250 г. Крысы были разделены на 5 групп по 10 особей в каждой: 1 группа – интактные крысы,
2 группа – крысы с моделью иммунодефицита (контроль),
3 группа – крысы с коррекцией иммунодефицита экстрактом жирного масла из семян чернушки дамасской,
4 группа – крысы с коррекцией иммунодефицита экстрактом жирного масла из эхинацеи пурпурной,
5 группа – крысы с коррекцией иммунодефицита смесью экстрактов жирных масел из семян чернушки дамасской и эхинацеи пурпурной.
Животным 2 группы вводили циклофосфан однократно в дозе 200 мг/кг массы тела на 1-е сутки эксперимента. В 3 группе проводится коррекция иммунодефицита внутрижелудочным введением, через зонд, экстракта жирного масла из семян чернушки дамасской ежедневно, начиная со второго дня эксперимента, в дозе 2,3 мл/кг массы тела крысы в течение 14 дней. В 4 группе проводится коррекция иммунодефицита внутрижелудочным введением, через зонд, экстракта жирного масла из эхинацеи пурпурной ежедневно, начиная со второго дня эксперимента, в дозе 2,3 мл/кг массы тела крысы в течение 14 дней. В 5 группе проводится коррекция экспериментального иммунодефицита путем внутрижелудочного введения, через зонд, смеси экстрактов жирных масел из семян чернушки дамасской и эхинацеи пурпурной в объемном соотношении 1:1, которую вводят лабораторной крысе в дозе 4,6 мл/кг, начиная со второго дня эксперимента в течение 14 дней.
Животных выводили из эксперимента на 15-е сутки. Тонкую кишку фиксировали в 10% растворе формалина, затем подвергали стандартной гистологической проводке. Срезы толщиной 5-6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. При помощи автоматизированного морфометрического комплекса (световой микроскоп Olympus CX 41, цифровая фотокамера, персональный компьютер с набором прикладных программ) измеряли высоту и ширину лимфатических узелков, их герминативных центров.
Достоверность наблюдавшихся при действии изучаемых фармакологических агентов изменений параметров определяли разностным методом с нахождением средних значений сдвигов (M), средней ошибки (±m) и вероятности возможной ошибки (p). Различия оценивали как достоверные при p<0,05. Статистические расчеты проводились с использованием программы Microsoft Excel 2003.
ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ
В иммунном аппарате тонкой кишки выделяют B-зависимую (лимфатические узлы (ЛУ) с герминативным центром) зону. Изменение их морфометрических параметров может отражать функциональные особенности периферического иммунного аппарата. При недостаточности гуморального и клеточного иммунитета периферические лимфоузлы уменьшаются или отсутствуют.
Результаты морфометрического исследования в экспериментальных группах приведены в таблице 1.
Таблица 1
Показатели высоты ЛУ у крыс с моделированием иммунодефицита уменьшались к 15-м суткам эксперимента на 24% по сравнению со средним значением в группе интактных животных (р < 0,05). В группе с коррекцией иммунодефицита экстрактом жирного масла из семян чернушки дамасской данный показатель значимо не отличается от среднего значения группы интактных животных. В группе с коррекцией патологии экстрактом жирного масла из эхинацеи пурпурной данный показатель ниже на 5%, чем в группе 3. В группе 5 наблюдается наиболее близкое к норме значение высоты ЛУ, что указывает на усиление фармакологических эффектов при совместном применении экстрактов жирных масел из семян чернушки дамасской и эхинацеи пурпурной.
Ширина ЛУ у крыс с моделированием иммунодефицита значимо уменьшались к 15-м суткам эксперимента на 23% по сравнению со средним значением в группе интактных животных (р < 0,05). Наиболее эффективная коррекция данного параметра наблюдается в группе 5, что также указывает на усиление иммуностимулирующих эффектов при совместном применении экстрактов жирных масел из семян чернушки дамасской и эхинацеи пурпурной.
Исходя из средних значений высоты и ширины ГЦ в экспериментальных группах, можно сделать вывод, что лучшая коррекция наблюдается при совместном применении экстрактов жирных масел из семян чернушки дамасской и эхинацеи пурпурной, и значения данных показателей достоверно не отличаются от нормы.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о выраженной иммунокоррекции в условиях модели циклофосфанового иммунодефицита у крыс предлагаемой смесью экстрактов жирных масел из семян чернушки дамасской и эхинацеи пурпурной. Сочетание компонентов композиции обеспечивает синергетический эффект и эффективно корректирует экспериментальный иммунодефицит.