Рост устойчивости микроорганизмов к белому фосфору в результате селекции

DOI: 10.24411/9999-010A-2019-10078

А.З. МИНДУБАЕВ1, А.Д. ВОЛОШИНА1, С.Т. МИНЗАНОВА1, Л.Г. МИРОНОВА1, Х.Р. ХАЯРОВ2, Е.К. БАДЕЕВА1

1 Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН, г. Казань, Россия

2 Казанский (Приволжский) федеральный университет, г. Казань, Россия

РОСТ УСТОЙЧИВОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ К БЕЛОМУ ФОСФОРУ В РЕЗУЛЬТАТЕ СЕЛЕКЦИИ

Белый фосфор Р4 - это один из самых опасных загрязнителей окружающей среды (Toxicological profile..., 1997). В то же время, у элемента фосфора есть уникальное качество - будучи сильнейшим ядом в виде простого вещества, в окисленном состоянии он абсолютно необходим для всех форм жизни. Таким образом, представляется целесообразным использовать это свойство для полной детоксикации исходного фосфора. Биодеградация становится одним из наиболее популярных методов обезвреживания промышленных стоков (Миндубаев, 2018).

Целью проведенного нами исследования являлась переработка при помощи микроорганизмов белого фосфора. В литературных источниках не найдено сведений о доказанных примерах биологической деградации белого фосфора. Предыдущие работы нашего коллектива (Миндубаев и др., 2017а, 2018) позволили пролить свет на практически неизученный вопрос токсичности белого фосфора для прокариот. До сих пор биодеградация Р4 наблюдалась в осадках сточных вод. Следовательно, дальнейшую работу было необходимо вести в искусственных культуральных средах, имеющих стандартный, постоянный состав. Только в таких средах можно выращивать чистые культуры устойчивых микроорганизмов, устанавливать их таксономическую принадлежность, выводить новые штаммы, наконец, вести селекцию микроорганизмов на способность обезвреживать все возрастающие концентрации белого фосфора.

Посевы производились в модифицированную среду Придхем-Готлиба. Классическая среда Придхем-Готлиба не содержит источники углерода: в качестве таковых выступают нефтепродукты. Наша модификация включает глюкозу, но не содержит источники фосфора (в качестве такового выступает белый фосфор). Посев Aspergillus niger, споры которого были внесены вместе с белым фосфором, производили в среду, содержащую белый фосфор в концентрации 0.01 и 0.05% по массе. В контрольные среды К (+) вносился фосфат. В контрольные среды К (-) источники фосфора не вносились. Произвели посев выросших A. niger в контрольные среды К (+) и К (-). Второй пересев A. niger произведен в среды аналогичного состава, третий - в среды с увеличенной концентрацией белого фосфора: 0.05, 0.1 и 0.2% по массе. Аналогично был произведен посев Streptomyces sp. A8. Четвертый пересев проводился в среды с концентрацией белого фосфора 0.1, 0.5 и 1% по массе. В этом посеве, помимо аспергилла и стрептомицета, высевался гриб Trichoderma asperellum F-1087, любезно предоставленный кафедрой биохимии ИФМиБ КФУ.

Посев A. niger АМ1 в четыре варианта сред был произведен аналогично вышеописанным. Однако эксперимент был усложнен по сравнению с предыдущими. Культура A. niger АМ1 выращивалась в чашках Петри с подложкой из фильтровальной бумаги над агаризованной средой. При этом посев производился не в трех, а в четырех вариантах: модифицированная среда Придхем-Готлиба без источников фосфора, с фосфатом, с 0.2% белого фосфора и, четвертый вариант - с 0.2% Р4 и с фосфатом (в той

© 2019 Миндубаев Антон Зуфарович, mindubaev@iopc.ru; mindubaev-az@yandex.ru; Волошина Александра Дмитриевна; Минзанова Салима Тахиятулловна; Миронова Любовь Геннадьевна; Хаяров Хасан Рафаэлевич; Бадеева Елена Казимировна

же концентрации, что во втором варианте). Такая схема посева позволяет получить больше информации об экспрессии генов при росте в разных условиях. Все четыре варианта посева произведены в трех повторах.

На пятые сутки пересеяли культуру А. niger, выросшую при 0.05% белого фосфора, в контрольные среды К (+) и К (-). Через шесть суток после посева наблюдалась следующая картина. В среде К (+) с фосфатом выросло значительное число сравнительно мелких колоний: это означает, что большинство спор проросло, что естественно в благоприятных условиях. В среде К (-) без источников фосфора колонии выросли немногочисленные, занимающие сравнительно большую площадь, но очень слабые (практически прозрачные, с неразвитым мицелием и отдельными конидиеносцами, выглядящими, как россыпь черных точек, а не сплошное черное поле). По всей видимости, сказалась нехватка фосфора: агар, используемый для приготовления среды, содержит примесь фосфата, но недостаточную для полноценного роста грибов. Любопытно, что в среде с 0.05% белого фосфора колоний выросло меньше, чем в К(+), однако они производят впечатление совершенно нормальных, не испытывающих дефицит питательных веществ. Отсюда следует вывод, что в среде с белым фосфором выживают не все споры гриба, но выжившие обладают способностью использовать в качестве источника фосфора либо сам белый фосфор, либо продукты его химических превращений.

Рис. 1. Первый пересев устойчивых грибов A. niger. К(+) - среда с фосфатом: наблюдался рост 49 спорообразующих колоний A. niger. К(-) - среда без источника фосфора: на ней наблюдался рост 33 ослабленных колоний. Опыт - среда с 0.05% белого фосфора: наблюдался рост 11 крупных спорообразующих колоний A. niger.

Чашки сфотографированы через шесть суток после пересева

Очередной (третий) пересев на 84 день после первого посева, был произведен в среды с более высокой концентрацией белого фосфора, с целью адаптации гриба к ней. Были выбраны концентрации 0.05, 0.1 и 0.2% Р4. Последняя, самая высокая, концентрация ранее нами никогда не использовалась. Согласно J.C. Barber (1996), она соответствует тысячекратному превышению ПДК белого фосфора в сточных водах! Тем не менее, даже при столь высоком содержании белого фосфора в среде наблюдался интенсивный рост колоний гриба. На четвертый день после посева при всех трех концентрациях белого фосфора наблюдалось начало спороношения, но при 0.1 и 0.2% Р4 грибы отставали в развитии по сравнению с 0.05%. Возможно, использованные концентрации исследуемого токсиканта отрицательно сказываются на фертильности грибов, хотя полностью не подавляют ее. Тем не менее, результаты посева позволяют заключить, что черный аспергилл легко переносит присутствие белого фосфора в среде даже в концентрации 0.2%.

Четвертый пересев аспергилла (и второй стрептомицетов) был произведен через 112 суток после первого посева. Концентрацию белого фосфора в среде снова

увеличили до 0.5 и 1% по массе. При внесении столь большого количества Р4 густой черный осадок в средах выпадает моментально. Среды издают сильный специфический запах белого фосфора даже спустя несколько суток после посева. Через сутки рост посеянных микроорганизмов еще не наблюдался. Через четверо суток в среде с содержанием белого фосфора 0.5% наблюдался рост мелких колоний аспергилла, имеющих еще белый цвет (то есть рост сильно замедлен). В средах с 1% белого фосфора через четверо суток после посева рост не наблюдался. По-видимому, выпавший черный осадок фосфидов перевел в нерастворимую форму микроэлементы, присутствующие в среде и необходимые для роста микроорганизмов. Следует отметить, что по J.C. Barber (1996), концентрация белого фосфора 0.5% соответствует 2500 ПДК! Кроме того, был посеян гриб Trichoderma asperellum F-1087 при концентрации 0.1, 0.5 и 1 %. Через четверо суток в среде с самой малой концентрацией выросла одна крупная колония триходермы, т.е. данный гриб тоже способен усваивать белый фосфор. Грибы развиваются очень медленно. По-видимому, данные концентрации белого фосфора близки к предельным, при которых еще возможен рост грибов. Рост стрептомицетов при 0.5% не наблюдается и спустя 19 суток после посева. На восьмые сутки на поверхности колоний аспергилла наблюдается россыпь спор, т.е. гриб сохранил способность к размножению! На восьмые же сутки наблюдается рост колонии триходермы на белом фосфоре в концентрации 0.5%. В средах с 1% Р4 рост триходермы стал наблюдаться только на 11 сутки после посева. В случае триходермы прослеживается четкая зависимость: чем выше концентрация белого фосфора в субстрате, тем медленнее растет гриб. На 12 сутки после посева при 0.1% белого фосфора гриб уже сформировал воздушный мицелий и имеет розовую окраску, при 0.5% колония еще бесцветная, но уже всплыла на поверхность субстрата и имеет форму, близкую к правильному кругу, а при 1% колония состоит из субстратного мицелия.

Триходерма T. asperellum F-1087 проявила большую устойчивость к белому фосфору, чем A. niger и тем более стрептомицеты. На восемнадцатые сутки после посева приобрела окраску и начала спороносить триходерма при 0.5% белого фосфора. Следует особо подчеркнуть, что триходерма адаптировалась к таким высоким концентрациям белого фосфора сразу, без предварительного культивирования с рядом пересевов. Ранее данный штамм гриба никогда не выращивался в присутствии белого фосфора. Напомним о том, что концентрация белого фосфора 1% это превышение ПДК в сточных водах в 5000 раз!

Третий пересев Streptomyces sp. впервые продемонстрировал рост устойчивости микроорганизмов к белому фосфору в процессе селекции. На 22 сутки после посева наблюдался рост стрептомицета в среде, содержащей 0.5% белого фосфора! В предыдущих посевах S. sp. рос при концентрациях не более 0.2. Разумеется, рост начался после длительной задержки. Даже на 20 сутки после посева признаки роста были неочевидными. На 22 сутки стрептомицет еще не имел развитый мицелий.

На 27 сутки после шестого посева A. niger наблюдается начало роста гриба в среде с 1% белого фосфора. В предыдущих посевах максимальная концентрация белого фосфора, при которой рос аспергилл, составляла 0.5%. То есть, A. niger, как и стрептомицет, после нескольких пересевов выработал значительно большую устойчивость по сравнению с изначальной. Итак, наилучшую приспособляемость к белому фосфору проявили именно стрептомицеты. Через пять последовательных посевов их устойчивость возросла пятикратно. Грибы растут и адаптируются медленнее (у аспергилла после восьми посевов устойчивость выросла вдвое), однако их устойчивость изначально была выше, чем у актиномицетов, особенно у триходермы (Миндубаев и др., 2015а).

Исходный штамм а Штамм после направленной селекции

Рис. 2. Адаптация и рост устойчивости микроорганизмов к белому фосфору после

направленной селекции

Для генетической идентификации микромицета, устойчиво метаболизирующего белый фосфор и по морфологическим признакам отнесенного к виду A. niger, была определена нуклеотидная последовательность его регионов ITS1 и ITS2. Сравнение с последовательностями базы данных GenBank с помощью системы BLAST (Altschul et al., 1990), выявила 99% гомологию с ITS1 и ITS2 регионами описанных штаммов Aspergillus niger, что позволяет идентифицировать данный микроорганизм, как новый штамм Aspergillus niger. Ему мы присвоили номер A. niger АМ1 (Миндубаев и др., 2015б). Нуклеотидная последовательность штамма опубликована в базе данных GenBank, где ей присвоен номер KT805426.

На 12 сутки после посева A. niger АМ1 в четыре варианта среды, наблюдалась следующая картина. В средах без источников фосфора рост практически не наблюдается (одна-две крошечные колонии без спороношения на чашку). В средах с фосфатом аспергилл хорошо растет и спороносит, однако культура не чистая. В ней, помимо черных колоний аспергилла, присутствуют колонии других микроорганизмов. В средах с 0.2% белого фосфора колонии аспергилла имеют бледно-серый цвет (пониженная фертильность). Очень интересный результат показал четвертый вариант посева - с белым фосфором и фосфатом. Колонии растут очень хорошо, даже более развитые, чем в среде с фосфатом, причем в двух случаях из трех выросла чистая культура (в одном появилась колония неизвестного вида). То есть медленный рост аспергилла в среде с белым фосфором объясняется не токсичностью последнего для данного штамма, а исключительно его труднодоступностью как источника фосфора (Миндубаев и др., 2016)! Судя по всему, Р4 в исследуемых концентрациях нетоксичен для данного гриба.

В опытном спектре 31Р ЯМР, снятом с водной фазы, проявились сигналы в области 0.3, 3.7 и 6.2 ppm, соответствующие фосфиту и гипофосфиту. Таким образом, он соответствует соединениям, которые, предположительно, являются метаболитами белого фосфора, т.е., является подтверждением предполагаемого нами метаболического пути (Миндубаев и др., 2017б). Ниже мы приводим предполагаемую схему метаболизма белого фосфора (рис. 3).

Поскольку в литературе отсутствуют сведения о микроорганизмах, устойчивых к P4, представленная работа имеет бесспорную новизну.

X О О о

р^р _. II _. д _. Д

Г/ /Чн-* н пн34 -

н

Белый Фосфор поватистая Фосфористая Фосфорная

фосфор кислота кислота кислота

Рис. 3. Предполагаемый метаболический путь белого фосфора

Список литературы

Миндубаев А.З. Кто съел полиэтилен? // Наука и жизнь. 2018. № 4. С. 32-38.

Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Горбачук Е.В., Кулик Н.В., Алимова Ф.К., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Сапармырадов К.А., Хаяров Х.Р., Яхваров Д.Г. Включение белого фосфора в природный круговорот веществ. Культивирование устойчивой микрофлоры // Бутлеровские сообщения. 2015а. Т. 41, № 3. С. 54-81.

Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Горбачук Е.В., Валидов Ш.З., Кулик Н.В., Алимова Ф.К., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Белостоцкий Д.Е., Сапармырадов К.А., Тухбатова Р.И., Яхваров Д.Г. Адаптация микроорганизмов к белому фосфору, как результат направленной селекции. Генетическая идентификация устойчивого аспергилла и метаболическое профилирование стрептомицета А8 // Бутлеровские сообщения. 2015б. Т. 44, № 12. С. 128.

Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Валидов Ш.З., Кулик Н.В., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Яхваров Д.Г., Аккизов А.Ю. Рост культуры Aspergillus niger АМ1 в среде с двумя источниками фосфора. Обоснованность определения «биодеградация» в отношении

белого фосфора // Бутлеровские сообщения. 2016. Т. 46, № 5. С. 1-20.

Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Валидов Ш.З., Яхваров Д.Г. Биодеградация белого фосфора // Природа. 2017а. №5. С. 29-43.

Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Бабынин Э.В., Валидов Ш.З., Сапармырадов К.А., Хаяров Х.Р., Бадеева Е.К., Барсукова Т.А., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Акосах Й.А., Яхваров Д.Г. Обезвреживание белого фосфора посредством микробиологического разложения // Бутлеровские сообщения. 2017б. Т. 52, № 12. С. 87-118.

Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Бабынин Э.В., Бадеева Е.К., Хаяров Х.Р., Минзанова С.Т., Яхваров Д.Г. Микробиологическая деградация белого фосфора // Экология и промышленность России. 2018. Т. 22, № 1. С. 33-37.

Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. Basic local alignment search tool // J. Mol. Biol. 1990. Vol. 215, No. 3. Pp. 403-410.

Barber J.C. Processes for the disposal and recovery of phossy water // Патент US5549878, заявлен: 24 мая 1995, выдан: 27 августа 1996.

Toxicological profile for white phosphorus // U.S. Department of health and human services. USA. 1997. 248 p.