СПОСОБ УСКОРЕННОЙ ОКРАСКИ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА
METHOD FOR ACCELERATED STAINING OF HISTOLOGICAL SPECIMEN FOR IDENTIFYING TUBERCULOSIS MYCOBACTERIA

Изобретение относится к медицине, в частности к патологической анатомии и фтизиатрии, и касается способа ускоренной методики окраски гистологических препаратов для выявления микобактерий туберкулеза.
Известно большое количество способов окраски для выявления микобактерий туберкулеза. Ближайший аналог: это метод, описанный Г.Г.Автандиловым (Основы патологоанатомической практики. - Москва - 1994 г. - С.383). Методика окраски: срезы депарафинируют и доводят до спирта. На срез, покрытый фильтровальной бумагой, наливают карбол-фуксин и подогревают над пламенем спиртовки до появления паров. Потом подогревание ведут в течение 1-2 минут, затем краску оставляют на срезе после прекращения подогревания еще на 20-25 минут. Краску сливают, снимают фильтровальную бумагу. Дифференцируют в 1% солянокислом спирте (70°) до появления бледно-розового тона. Промывают в водопроводной воде 1-2 минуты. Докрашивают срезы метиленовым синим Лефлера в течение 0,5-0,6 минуты. Окрашивают несильно, затем дифференцируют в 0,5-1% солянокислом спирте и хорошо промывают в воде. Быстро проводят через спирты, ксилол и заключают в бальзам.
Однако предложенный способ неудобен тем, что окраска препаратов занимает большое количество времени. Поэтому необходимо усовершенствовать данный метод для достоверности и объективизации посмертного патологоанатомического исследования туберкулеза с целью более быстрой диагностики.
Задачей настоящего изобретения является разработка ускоренного метода окраски, позволяющего за более короткий промежуток времени достоверно проводить посмертную диагностику туберкулеза легких.
Сущность изобретения заключается в том, что в способе ускоренной окраски гистологических препаратов для выявления микобактерий туберкулеза, включающем приготовление гистологических препаратов по общепринятой методике, окрашивание их по Циль-Нильсону, после стандартной подготовки препаратов к окраске срезы проходят процедуру депарафинизации путем последовательного помещения их в ксилол и спирты нисходящей концентрации по 5 минут в термостат при температуре 54°C с последующим помещением их в воду, затем в 1% раствор йодной кислоты на 2 мин и промыванием в проточной воде в течение 10 секунд, после чего на срез, покрытый фильтровальной бумагой, наливают карбол-фуксин Циля и подогревают над пламенем спиртовки до появления паров в течение 2 минут, оставляют краску на срезе после прекращения подогревания на 3-5 минут, убирают фильтровальную бумагу и ополаскивают срезы в воде, дифференцируют их 1% кислотным буфером, ополаскивают в водопроводной воде в течение 1 минуты, после чего на срез помещают раствор митиленового синего по Лефлеру и подогревают над пламенем спиртовки до появления паров, промывают в воде, дифференцируют в 1% кислотном буфере и хорошо промывают водой, обезвоживают в спиртах восходящей крепости в течение 1 минуты, помещают в ксилол и заключают в бальзам, причем просветление в карбол-ксилоле не допустимо, так как это может привести к вымыванию красителя.
Задача достигается следующим образом.
По общепринятой методике ткань легких, лимфатических узлов, бронхов извлекаются при аутопсии. Помещаются в емкость, заполненную 10% раствором нейтрального формалина. Через 12-24 часа из материала вырезаются продольные кусочки исследуемых тканей толщиной до 05, -1,0 см и вновь погружают в емкость с 10% раствором нейтрального формалина. Затем через 12 часов после тщательной промывки в течение 5 часов в проточной воде материал обезвоживают в спиртах восходящей крепости (50% (3 часа), 60% (3 часа), 70% (12 часов), 80% (12 часов), 96% (12 часов), 100% (12 часов)) с последующим погружением в касторовое масло на 12-24 часа.
Для удаления спиртов кусочки погружают в хлороформ (3 порции со сменой через 1,5 часа), далее для удаления хлороформа помещают поочередно в три порции расплавленного парафина по 1,5 часа в каждой. После всего этого кусочки заливаются расплавленным парафином в специальные бумажные коробочки с этикетировкой материала. Полученные блоки наклеиваются на пластиковую кассету и с помощью микротома изготавливаются гистологические срезы толщиной 5 мкм. И наклеиваются на предметное стекло с последующим окрашиванием по Циль-Нильсону. Сначала срезы проходят процедуру депарафинизации путем последовательного помещения их в ксилол и спирты нисходящей концентрации по 5 минут в термостат при температуре 54°C с последующим помещением в воду. Затем срезы помещают в 1% раствор йодной кислоты на 2 мин. Промывают в проточной воде в течение 10 секунд. На срез, покрытый фильтровальной бумагой, наливают карбол-фуксин Циля и подогревают над пламенем спиртовки до появления паров в течение 2 минут, затем оставляют краску на срезе после прекращения подогревания на 3-5 минут. Далее убирают фильтровальную бумагу и ополаскивают срезы в воде, дифференцируют 1% кислотным буфером, ополаскивают в водопроводной воде в течение 1 минуты. Далее на срез помещают раствор метиленового синего по Лефлеру и подогревают над пламенем спиртовки до появления паров, промывают в водопроводной воде, дифференцируют в 1% кислотном буфере и хорошо промывают водой. Обезвоживают в спиртах восходящей крепости в течение 1 минуты, помещают в ксилол и заключают в бальзам. Просветление в карбол-ксилоле не допустимо, так как это может привести к вымыванию красителя. Общее время окраски данным методом 20-25 минут, а предложенными методами других авторов более одного часа.
Пример использования предложенного способа.
Предложенным способом были окрашены ткань легких, лимфатических узлов и бронхов у 105 умерших больных лекарственно-устойчивым туберкулезом в возрасте от 21 до 60 лет. Исследуемый материал извлекался, фиксировался, промывался, обезвоживался и заливался в парафин. Далее проводилась окраска по Цилю-Нильсону. Сначала срезы проходят процедуру депарафинизации путем последовательного помещения их в ксилол (5 минут в термостате при температуре 54°C) и спирты нисходящей концентрации (5 минут в термостате при температуре 54°C) с последующим помещением в воду. Затем срезы помещают в 1% раствор йодной кислоты на 2 мин. Промывают в проточной воде в течение 10 секунд. На срез, покрытый фильтровальной бумагой, наливают карбол-фуксин Циля и подогревают над пламенем спиртовки до появления паров в течение 2 минут, затем оставляют краску на срезе после прекращения подогревания на 3-5 минут. Убирают фильтровальную бумагу и ополаскивают срезы в воде, дифференцируют 1% кислотным буфером, ополаскивают в водопроводной воде в течение 1 минуты. Далее на срез помещают раствор метиленового синего по Лефлеру и подогревают над пламенем спиртовки до появления паров, промывают водой, дифференцируют в 1% кислотном буфере и хорошо промывают водой. Обезвоживают в спиртах восходящей крепости в течение 1 минуты, помещают в ксилол и заключают в бальзам. Просветление в карбол-ксилоле не допустимо, так как это может привести к вымыванию красителя. Общее время окраски данным методом 20-25 минут, а предложенными методами других авторов более одного часа.
Технический результат использования изобретения:
1. Достоверность и объективизация посмертной патологоанатомической диагностики туберкулеза.
2. За счет нагревания растворов в термостате и над пламенем спиртовки улучшается качество окраски гистологических срезов.
3. Сокращается время исследования, что позволяет сделать заключение в более ранние сроки, снизить токсическое влияние реагентов на медицинский персонал.
4. Данный способ может применяться для дифференцированной диагностики различных гранулематозных образований.
5. Способ может быть использован для срочной интраоперационной диагностики (путем изготовления гистологических срезов на замораживающем микротоме).
Литература
1. Автандилов Г.Г. Основы патологоанатомической практики. - Москва, 1994, - с.383.
2. Волкова О.В. Елецкий Ю.К. Основы гистологии и гистологической техники. Москва. «Медицина». 1982.
3. Гринберг Л.М. Баранова Е.Ю, Кондратов Д.Л. Гистобактериоскопия в морфологической диагностике туберкулеза легких: Пособие для врачей.- Уральский НИИ фтизиопульмонологии. - Екатеренбург, 2004.
4. Цинзерлинг А.В. Обработка и окраска мазков и срезов для выявления микроорганизмов // Архив патологии 1992. №5, - с.35-40.
5. Хмельницкий O.K., Белянин В.Л. Выявление возбудителей инфекционных болезней при морфологическом исследовании: Пособие для врачей. - Санкт-Петербург: СПбМАПО, 1996, - с.62.