Способ дифференциации генома вакцинного штамма НИСХИ от полевых изолятов вируса оспы овец методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с анализом пиков высокого разрешения
METHOD FOR DIFFERENTIATING THE GENOME OF THE NISHI VACCINE STRAIN FROM FIELD ISOLATES OF SHEEP POX VIRUS BY REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION WITH HIGH-RESOLUTION PEAK ANALYSIS

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, к средствам молекулярной диагностики, а именно к дифференциации генома вакцинного штамма НИСХИ от полевых изолятов вируса оспы овец методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с анализом пиков высокого разрешения.
Классификация и понимание генетических вариаций между различными изолятами и штаммами микроорганизмов является важной задачей в области геномики. Быстро растет интерес к поддающимся количественной оценке методам скрининга мутаций в исследованиях в области естественных наук. Такие методы используются для обнаружения генов, ответственных за различные признаки [1].
Особый интерес для генетических исследований вызывает вирус оспы овец (Sheeppox virus) - сложный двухцепочечный ДНК-вирус рода Capripoxvirus, подсемейства Chordopoxvirinae, семейства Poxviridae [2]. Данный микроорганизм является одним из самых крупных (170-260 нм × 300-450 нм) вирусов, покрытых оболочкой [3].
Гены вируса оспы овец экспрессируются каскадоподобным механизмом в цитоплазме клетки-хозяина в ранние, промежуточные и поздние сроки (0,5, 1,5-2,0 и 8 часов, соответственно) [4]. Вирион Sheeppox virus связывается с гликозаминогликанами на поверхности клетки и проникает в цитоплазму клетки. Вирус оспы овец немедленно экспрессирует свои ранние гены, и эти ранние белки участвуют в репликации вирусной ДНК в цитоплазме клетки-хозяина. Эти ранние белки вируса оспы (VETF-82 кДа, VETF-70 кДа, кэппинг-фермент, ТВР и т.д.) участвуют в транскрипции промежуточных и поздних вирусных генов. Раннее заражение вирусом оспы овец активирует первую линию защитного механизма (врожденный иммунный ответ против инфекционного агента) в клетках хозяина [5].
В связи с экономической важностью разведения овец и потенциалом быстрого трансграничного распространения вируса оспа овец Всемирная организация здравоохранения животных (МЭБ) рассматривает ее как заболевание, которое подлежит учету, контролю и прогнозированию [3].
Оспа овец является эндемичным заболеванием в Африке, за исключением Южной Африки, Ближнего Востока и в Азии. О возникновении очагов оспы овец также сообщалось в Болгарии и Греции. В начале 2018 года вспышки данного заболевания в Греции вышли из-под контроля, несмотря на проведение масштабной кампании по искоренению. Согласно веб-порталу Всемирной информационной системы по охране здоровья животных (WAHIS) в период с 2008 по 2019 гг. в Российской Федерации было зарегистрировано несколько спорадических вспышек [4, 6].
Живые аттенуированные вакцины, изготовленные на основе вируса оспы овец, широко применяются во многих эндемичных странах Африки, Ближнего Востока и Азии для борьбы с данным заболеванием. В России и странах СНГ применяют вакцину против оспы овец, разработанную с применением штамма НИСХИ. Полногеномная нуклеотидная последовательность данного представителя вируса оспы овец представлена в GenBank (AY077834.1, Taxonomy ID: 376854) [7].
Учитывая, что не инактивированный вирус оспы овец может вызывать побочные реакции у вакцинированных животных, крайне важно использовать диагностические инструменты, которые могут быстро и специфически дифференцировать ослабленные вакцинные штаммы и вирулентные полевые изоляты вируса оспы овец. Это помогло бы выяснить происхождение заболевания в случае легких или системных поствакцинальных реакций у вакцинированных животных [6, 8].
Важно разработать средства прямого скрининга исследуемых образцов при предположительном заболевании оспой, собранных в невакцинированных стадах, и для проведения эпидемиологических расследований, когда вспышка данного заболевания возникает после вакцинации в стадах мелких жвачных животных или крупного рогатого скота [6]. Таким образом, рутинную диагностику оспы овец требуется усовершенствовать благодаря разработке анализа, позволяющего проводить дифференциацию вакцинного штамма НИСХИ, применяемого на территории РФ и странах СНГ, от полевых изолятов вируса оспы овец.
В связи с этим целесообразно провести поиск способа дифференциации генома вакцинного штамма НИСХИ от полевых изолятов вируса оспы овец. Для решения поставленной задачи требуется провести молекулярно-биологический анализ генома вируса оспы овец, что даст возможность разработать уникальный метод для скрининга образцов при вспышке заболевания и для осуществления эпидемиологических исследований в ранее вакцинированных стадах.
В настоящее время методы молекулярно-биологического анализа находят широкое применение в диагностике различных инфекционных заболеваний. Благодаря созданию нового поколения флуоресцирующих красителей и технологическим усовершенствованиям платформ количественной ПЦР анализ кривой плавления с высоким разрешением стал важным и перспективным методом генотипирования микроорганизмов, который возможно применять для дифференциации вакцинных штаммов от полевых изолятов вирусов [9, 10].
Проведено изучение истории исследований, предшествующих появлению предложенной технологии. В 1960-х годах плавление двухцепочечной ДНК контролировалось по поглощению ультрафиолетового излучения (гиперхромный эффект). Анализ требовал количества ДНК в мкг и часто занимал часы, в то время как образцы медленно нагревались со скоростью 0,1-1,0°С/мин. В современном анализе плавления ДНК используется флуоресценция, и поскольку это более чувствительный метод, для него требуется всего несколько нг ДНК (количества, которые легко получить с помощью ПЦР) [11, 12].

Флуоресцентный анализ плавления ДНК стал популярным с появлением в 1997 году прибора для ПЦР в реальном времени LightCycler. Данный прибор позволяет достовернее контролировать температуру и обеспечить высокую скорость плавления 0,1-1,0°С/сек, сократив время плавления до нескольких минут. Индикатором флуоресценции, использованным еще в 1997 году, был краситель SYBRGreen I, чувствительный и удобный краситель для мониторинга амплификации и плавления амплифицированных продуктов в режиме реального времени [13, 14].
Анализ плавления с высоким разрешением - новый метод, представленный в 2003 году, который использует сбор данных с высокой плотностью и обнаруживает небольшие различия в последовательностях фрагментов ПЦР только путем прямого плавления. Кривые плавления можно использовать для сканирования мутаций, сопоставления последовательностей и анализа мультиплексного генотипирования. Благодаря своей скорости и простоте популярность этого метода в последние годы увеличивается [15, 16, 17].
Анализ плавления ампликонов с высоким разрешением представляет собой количественный анализ кривой плавления фрагмента ДНК после амплификации методом ПЦР. Для данного метода требуется система ПЦР-детекции в режиме реального времени с высокой термостабильностью и чувствительностью. Комбинация улучшенного инструментария количественной детекции продуктов ПЦР и насыщающих ДНК-связывающих красителей позволила идентифицировать генетические вариации в последовательностях нуклеиновых кислот путем контролируемого плавления двухцепочечного ампликона [18, 19].
Анализ кривых плавления с высоким разрешением позволяет выявлять новые варианты генов, проводить скрининг образцов ДНК на однонуклеотидные полиморфизмы, выявлять вставки/делеции и другие неизвестные мутации, и определять процент метилированной ДНК в образцах. Данный анализ проводится в амплификаторах в режиме реального времени [20].
Сущность представленного метода заключается в следующем: после проведения ПЦР с интеркалирующим красителем смесь постепенно нагревают, и при достижении определенной температуры двухцепочечные молекулы ДНК начинают разъединяться, флуорофор постепенно высвобождается, и флуоресценция падает. Изменение свечения детектируется оптической системой амплификатора. При этом ампликоны с разной последовательностью «плавятся» при разной температуре. Чувствительность метода достигает одного нуклеотида, благодаря чему с помощью данного анализа можно проводить детекцию однонуклеотидных полиморфизмов [13].
Следует отметить, что основываясь на функциональном тестировании имеющихся в настоящее время приборов, получение 10 точек данных на градус Цельсия во время операций плавки, вероятно, является минимальным требованием для обеспечения определенного уровня сканирования мутаций. «Высокое разрешение» будет означать большее количество точек данных на °С [15].
Прототипным вариантом проведения дифференциального анализа является постановка полимеразной цепной реакции с электрофорезом с оригинальными праймерами и с последующим секвенированием по Сенгеру [21]. Однако данный метод является очень дорогостоящим, продолжительным во времени, поскольку предполагает проведение дополнительных этапов работы с последующим расшифровыванием нуклеотидной последовательности и анализом их с помощью BioEdit и MEGA 7 или аналогов. В условиях, при которых требуется проводить скрининговые исследования полевых образцов, экономически нецелесообразно применять данный метод по указанным выше причинам. Исходя из этого необходимо разработать альтернативный способ исследования образцов.
Задачей настоящего изобретения является разработка чувствительного и специфичного, экспрессного способа дифференциации генома вакцинного штамма НИСХИ от полевых изолятов вируса оспы овец методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с анализом пиков высокого разрешения с целью устранения вышеуказанных недостатков.
Данная задача решена благодаря разработки способа дифференциации генома вакцинного штамма НИСХИ от полевых изолятов вируса оспы овец методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с анализом пиков высокого разрешения. Разработанный способ дает возможность: 1) сократить время проведения анализа до 2-3 ч; 2) применять современный интеркалирующий краситель EvaGreen, который обеспечивает более высокую флуоресценцию по сравнению с SYBR Green, что повышает точность и чувствительность проводимого анализа; 3) проводить контроль реакции амплификации с применением модифицированного плазмидного вектора; 4) увеличить чувствительность и специфичность анализа за счет использования высокоспецифичных оригинальных праймеров, рассчитанных для участка ДНК вируса оспы овец в диапазоне 113683…113791 п.н., поскольку именно данная область позволила разработать прямой и обратный олигонуклеотидные праймеры для однозначной дифференциации вакцинного штамма НИСХИ и полевых изолятов вируса оспы овец. Данная разработка позволит расширить арсенал для проведения эпидемиологического надзора и диагностики оспы овец в период вакцинации.
Сущность изобретения отражена на графических изображениях:
Фиг. 1 - График температуры плавления для каждой позиции в нуклеотидной последовательности прямого F-SPPV-Diff-NISKHI-праймера.
Фиг. 2 - График температуры плавления для каждой позиции в нуклеотидной последовательности обратного R-SPPV-Diff-NISKHI-праймера.
Фиг. 3 - Множественные выравнивания последовательностей 15 репрезентативных вирусов оспы овец, в том числе штамма НИСХИ (NISKHI). Прямоугольниками выделены участки для отжига олигонуклеотидных праймеров.
Фиг. 4 - Нормализованные графики процесса плавления ампликонов для исследуемых образцов вируса оспы овец. Примечание: А - графики для штамма НИСХИ и полевого изолята Saudi Arabia вируса оспы овец, Б - графики для штамма НИСХИ и других исследуемых штаммов и изолятов вируса оспы овец.
Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:
SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов участка ДНК в диапазоне 113683…113791 п.н. вируса оспы овец, в том числе штамма НИСХИ;
SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот, соответствующего участку ДНК в диапазоне 113683…113791 п.н. вируса оспы овец, в том числе штамма НИСХИ.
Сущность изобретения заключается в новом подходе по дифференциации генома вакцинного штамма НИСХИ от полевых изолятов вируса оспы овец методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с анализом пиков высокого разрешения. Заявляемый способ основан на: 1) элюировании ДНК вируса оспы овец из исследуемого биологического материала; 2) проведении амплификации специфического фрагмента ДНК вируса оспы овец в диапазоне 113683…113791 п.н. с применением разработанных оригинальных олигонуклеотидных специфических праймеров F-SPPV-Diff-NISKHI и R-SPPV-Diff-NISKHI; 3) проведении плавления ампликонов в разработанном режиме с учетов пиков высокого разрешения; 4) детекции результатов анализа с определением максимального значения температуры плавления и проведении инструментального дифференциального анализа генома вакцинного штамма НИСХИ от полевых изолятов вируса оспы овец методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с анализом пиков высокого разрешения.
В публикациях многих авторов также показана необходимость проведения дифференциации вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса оспы овец. По данным проведенного анализа литературных данных, в настоящее время доступно несколько анализов для определения вируса оспы овец с помощью ПЦР и ПЦР в реальном времени [8, 22], но при этом ни один из них не предназначен для дифференциации вакцинного штамма НИСХИ от полевых изолятов. При анализе публикаций способ дифференциации вакцинного штамма НИСХИ оспы овец с помощью молекулярно-генетических методов также не представлен. Таким образом, сведений об аналогах предлагаемого способа дифференциации генома вакцинного штамма НИСХИ от полевых изолятов вируса оспы овец методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с анализом пиков высокого разрешения авторами не обнаружено.
Разработанный способ дифференциации генома вакцинного штамма НИСХИ от полевых изолятов вируса оспы овец методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с анализом пиков высокого разрешения по сравнению с прототипом отличается экономической выгодой и экспрессностью выполнения анализа, что позволяет проводить масштабные скрининговые исследования.
В отличие от прототипа разработанный способ позволил провести анализ выравнивания множественных нуклеотидных последовательностей геномов штаммов и изолятов вируса оспы овец и идентифицировать область с 113756-нуклеотидной заменой Т на С, уникальной для вакцинного штамма НИСХИ. Данный способ предусматривает проведение реакции амплификации специфического фрагмента ДНК вируса оспы овец в диапазоне 113683…113791 п.н. с применением разработанных оригинальных олигонуклеотидных специфических праймеров F-SPPV-Diff-NISKHI и R-SPPV-Diff-NISKHI для амплификации фрагмента размером 109 п.н., содержащего нуклеотидную замену Т→С в последовательности ДНК штамма НИСХИ. Разработанный способ предусматривает проведение плавления ампликонов в разработанном режиме с учетов пиков высокого разрешения, а также детекцию результатов анализа с определением максимального значения температуры плавления и проведением инструментального дифференциального анализа генома вакцинного штамма НИСХИ от полевых изолятов вируса оспы овец методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с анализом пиков высокого разрешения. Таким образом, актуально применять предложенный способ для дифференциации генома вакцинного штамма НИСХИ от полевых изолятов вируса оспы овец методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с анализом пиков высокого разрешения.
Ключевым элементом заявляемого способа является определение с высоким разрешением пиковых значений температур плавления амплифицированных продуктов ПЦР и дифференциация генома вакцинного штамма НИСХИ от полевых изолятов вируса оспы овец по результатам анализа максимумов графиков плавления ампликонов.
Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключается в применении способа ПЦР в режиме реального времени, оригинальных специфичных олигонуклеотидных праймеров F-SPPV-Diff-NISKHI и R-SPPV-Diff-NISKHI, рассчитанных для амплификации участка ДНК вируса оспы овец в диапазоне 113683…113791 п.н. и технологии анализа пиков высокого разрешения для графиков плавления продуктов ПЦР.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена на графическом материале - нормализованные графики процесса плавления ампликонов для исследуемых образцов вируса оспы овец (А - графики для штамма НИСХИ и полевого изолята Saudi Arabia вируса оспы овец, Б - графики для штамма НИСХИ и других исследуемых штаммов и изолятов вируса оспы овец) (фиг. 4А и 4Б).
С целью дифференциации генома вакцинного штамма НИСХИ от полевых изолятов вируса оспы овец методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с анализом пиков высокого разрешения заранее, до начала основного этапа работы подготавливают положительный контрольный образец в виде модифицированной плазмиды pGEM-T (Promega), содержащей участок ДНК вакцинного штамма вируса оспы овец в диапазоне 113683…113791 п.н.. Вектор pGEM-T-NISKHI конструируют путем лигирования соответствующих продуктов ПЦР (ампликоны размером 109 п.н. в диапазоне 113683…113791 п.н. ДНК вируса оспы овец) в векторную систему. Лигированные продукты используют для трансформации компетентных клеток Е. coli. Положительные клоны размножают, плазмидную ДНК экстрагируют с использованием системы PureYield plasmid Midiprep (Promega). Данная система предназначена для выделения высококачественной плазмидной ДНК и обеспечивает быстрый способ очистки 100-200 мкг ДНК из трансформированных культур Е. coli с использованием колонки с кремнеземной мембраной. Очищенные плазмиды секвенируют для подтверждения наличия правильной вставки [23].
На основном этапе исследования проводят выделение нуклеиновой кислоты из анализируемых образцов, содержащих вирус оспы овец с применением твердофазного способа с использованием набора «ДНК-сорб» в соответствии с инструкцией производителя (Ampli Sens).

На следующем этапе проводят ПЦР в режиме реального времени для исследования стандартных образцов и проб. Для постановки реакции готовят реакционную смесь в соответствии с наставлением к набору "SsoFast™ EvaGreen Supermix". В анализе используют компоненты данного набора, а также разработанные олигонуклеотидные праймеры в концентрации 5 пМ на реакцию. Элюаты ДНК вируса каждого образца добавляют к реакционной смеси по 5 мкл. Итоговый объем смеси для проведения одной реакции составляет 25 мкл.
При проведении реакции применяют положительный контроль (плазмида) и отрицательный контроль (деионизированная вода без нуклеаз MilliQ вместо ДНК-матрицы).
Постановку реакции осуществляют в детектирующем термоциклере любой марки при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 3.
Предварительную денатурацию проводят при температуре 98°С в течение 2 минут. ПЦР в режиме реального времени включает в себя 3 подэтапа: денатурацию, отжиг олигонуклеотидов, элонгацию. Денатурацию осуществляют при температуре 95°С в течение 5 секунд, отжиг олигонуклеотидов и элонгацию - при температуре 60°С в течение 20 секунд. Далее проводят важный этап для осуществления дифференциального анализа - плавление, начиная с 65 до 90°С. Увеличение температуры составляет - 0,1°С за каждый шаг. При этом после первого шага плавления требуется ждать 90 секунд при температуре первого шага. Для каждого последующего шага время ожидания составляет 2 секунды.

Для детекции сигнала устанавливают канал HRM, для которого длина волны источника составляет 460 нм, детектора - 610 нм. В качестве красителя применяется EvaGree, спектральные характеристики которого близки к SYBR Green и FAM, поэтому данный флуорофор можно анализировать также в системе детекции с длиной волны 488 нм по рекомендации производителя набора "SsoFast™ EvaGreen Supermix".
Исследование кривой плавления с высоким разрешением для анализа данных и профилей плавления образцов выполняют с использованием программного обеспечения для сканирования генов того детектирующего амплификатора, на котором осуществляют реакцию амплификации и процесс плавления (в частности, LigthCycler 480 (LC 480), RotorGene Q (RG-Q) и CFX 96). Проводят построение кривых плавления в виде параболических функций и детектируют пики высокого разрешения для полученных графиков. Выявляют, что для вакцинного штамма вируса оспы овец в отличии от других штаммов и изолятов характерен очень узкий диапазон температуры плавления, по данным которого можно судить о принадлежности исследуемого образца к вакцинному штамму НИСХИ или полевым изолятам вируса.
Пример 1. Разработка оригинальных олигонуклеотидных праймеров для способа дифференциации генома вакцинного штамма НИСХИ от полевых изолятов вируса оспы овец методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с анализом пиков.
Для разработки оригинальных олигонуклеотидных праймеров для использования в способе дифференциации генома вакцинного штамма НИСХИ от полевых изолятов вируса оспы овец методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с анализом пиков проводили подборку и анализ выравнивания множественных последовательностей геномов штаммов и изолятов вируса оспы овец. Так, для выявления регионов вирусной ДНК с уникальными различиями между вакцинным штаммов НИСХИ и полевыми изолятами вируса оспы овец проводят выравнивание последовательностей полногеномных последовательностей исследуемых изолятов и штамма. Для анализа из Genbank были взяты последовательности 15 следующих изолятов и штаммов вируса оспы овец: NISKHI (AY 077834), OSPA-M18, OSPA-Tula 2019, М19, A/Kazakhstan/2000 (AY 077833), TU-V02127 Turkey 1977 (AY 077832), Springer passage-40 vaccine (MT 137384.1), Saudi Arabia vaccine (MN 072627.1), Turkey vaccine (MN 072631.1), 10700-99 TU-V02127 (AY 077832.1), V293 (AY 167071.1), Saudi Arabia (MN 072630), Pendik (MN 072629.1), Nigeria (MN 072628.1), Abu Charib (MN 072626.1). Данные последовательности выравнивали с помощью сервиса BioEdit. Анализ позволил идентифицировать область с 113756-нуклеотидной заменой Т на С, уникальной для вакцинного штамма НИСХИ. Данная замена была обнаружена в результате сравнительного анализа, проведенного с помощью программы BioEdit и MEGA7. Сравнительный анализ представленных нуклеотидных последовательностей отражен на фиг. 3.
В результате сравнительного анализа был выбран регион в диапазоне 113683…113791 п.н., поскольку именно данная область позволила разработать прямой и обратный олигонуклеотидные праймеры для однозначной дифференциации вакцинного штамма НИСХИ и полевых изолятов вируса оспы овец для оценки в анализе в ПНР пиков высокого разрешения. Были разработаны праймеры, которые были гомологичны выбранным 15 последовательностям и позволили проводить амплификацию фрагмента размером 109 п.н., содержащего нуклеотидную замену Т→С в последовательности ДНК штамма НИСХИ. Дизайн олигонуклеотидов представлен в таблице 1 и имеет следующий вид:
F-SPPV-Diff-NISKHI-праймер - 5'-CACACGGTGCAGCAAATACT-3' и R-SPPV-Diff-NISKHI-праймер -5'-CCTTGTATCTGTGCTGTTATATCTCC-3'.
m
Для подтверждения возможности применения разработанных праймеров в анализе пиков высокого разрешения для дифференциации вакцинного штамма НИСХИ и полевых изолятов вируса оспы овец провели моделирование in-silico с предсказанными ампликонами для анализируемых последовательностей нуклеотидов, используя программное обеспечение uMelt28. Вышеупомянутые праймеры были отобраны, синтезированы и очищены. Специфичность последовательностей праймеров проверяли с помощью Базового инструмента поиска локального выравнивания (NCBI/Primer-BLAST). Определены температуры плавления (T) для каждого олигонуклеотида, сведения о которых представлены на фиг. 1 и 2. Термодинамические характеристики праймеров отражены в таблице 2, из которой следует, что температуры плавления разработанных олигонуклеотидов составляют около 65°С (учитывая метод анализа концентрации солей и результаты исследования с помощью обеспечения uMelt), а прогнозируемые температуры их отжига - около 60°С.
При анализе нуклеотидных последовательностей олигонуклеотидов установили, что для праймеров не характерно образование «шпилек», а также не выявлено 3'-комплементарности и сайтов, отжигающих сами на себя. Расчет вероятности образования «шпилек» и димеров олигонуклеотидов проводили при условии, что минимальное количество пар оснований, необходимых для димеризации, - 5, а для образования «шпилек», - 4. Таким образом, были разработаны оригинальные олигонуклеотидные праймеры, которые позволили проводить дифференциации генома вакцинного штамма НИСХИ от полевых изолятов вируса оспы овец методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с анализом пиков.
Пример 2. Определение пиков высокого разрешения графиков плавления ампликонов для разработки способа дифференциации генома вакцинного штамма НИСХИ от полевых изолятов вируса оспы овец методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с анализом пиков.
Для определения показателей, позволяющих проводить дифференциации генома вакцинного штамма НИСХИ от полевых изолятов вируса оспы овец методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с анализом пиков, проводили следующие этапы по исследованию полевых изолятов и вакцинных штаммов, в том числе производственного штамма НИСХИ вируса оспы овец.
На первом этапе исследования проводили выделение нуклеиновой кислоты из анализируемых образцов, содержащих вирус оспы овец, с применением твердофазного способа с использованием набора «ДНК-сорб» в соответствии с инструкцией производителя (Ampli Sens). Для анализа использовали суспензии вируса оспы овец разных изолятов и штаммов, в том числе вакцинный штамм НИСХИ, а также Amur, Pskov, Kaluga, Tula, Tver, Dagestan, M18, M19.
-1
-4

На следующем этапе осуществляли ПЦР в режиме реального времени для исследования проб. В качестве положительного контроля применяли модифицированную плазмиду со вставкой участка ДНК в позициях 113683…113791 п.н. Отрицательным контролем служила деионизированная вода без нуклеаз MilliQ вместо ДНК-матрицы. В реакции амплификации исследовали экстракты ДНК в цельном виде, а также в разведения от 10 до 10 с шагом 10. Для постановки реакции готовили реакционную смесь в соответствии с наставлением к набору "SsoFast™ EvaGreen Supermix". В анализе использовали компоненты данного набора, а также разработанные олигонуклеотидные праймеры в концентрации 5 пМ на реакцию. Элюаты ДНК вируса каждого образца добавляли к реакционной смеси по 5 мкл. Итоговый объем смеси для проведения одной реакции составлял 25 мкл.
Постановку реакции проводили в детектирующем амплификаторе марки RotorGene Q (Qiagen). Предварительную денатурацию проводили при температуре 98°С в течение 2 минут. ПЦР в режиме реального времени включала в себя 3 подэтапа: денатурацию, отжиг олигонуклеотидов, элонгацию. Денатурацию проводили при температуре 95°С в течение 5 секунд, отжиг олигонуклеотидов и элонгацию - при температуре 60°С в течение 20 секунд. Далее осуществляли важный этап для дифференциального анализа - плавление, начиная с 65 до 90°С. Увеличение температуры составляло 0,1°С за каждый шаг. При этом после первого шага плавления требовалось ждать 90 секунд при температуре первого шага. Для каждого последующего шага время ожидания составляло 2 секунды.
Исследование кривой плавления с высоким разрешением для анализа данных и профилей плавления образцов выполняли с использованием программного обеспечения для сканирования генов программного обеспечения RotorGene Q. Проводили построение кривых плавления в виде параболических функций и детектируют пики высокого разрешения для полученных графиков. Впоследствии провели анализ ожидаемых профилей и пиков плавления прогнозируемых ампликонов для исследуемых изолятов/штаммов с использованием программного обеспечения uMelt [23, 24, 25]. Полученные данные для некоторых исследуемых образцов представлены на фиг. 4А и 4Б.
-1
-4
Анализ пиков высокого разрешения проводили для образцов ДНК вируса оспы овец в цельном виде и в разведениях от 10 до 10. Результаты исследования отражены в таблице 4. Выявили, что для вакцинного штамма НИСХИ вируса оспы овец в отличии от других штаммов и изолятов характерен очень узкий диапазон температуры плавления, равный 76,46±0,12°С (n=30, р<0,005). При этом для других штаммов и изолятов вируса оспы овец данные значения составили 75,65±0,04°С (n=30, р<0,005). При этом пики обнаружены при dF/dT=2,43±0,02 у.е. для вакцинного штамма НИСХИ и 2,76±0,11 у.е. для других исследуемых изолятов и штаммов. По полученным данным можно судить о принадлежности исследуемого образца к вакцинному штамму НИСХИ или полевым изолятам вируса оспы овец.
Таким образом, для штамма НИСХИ график плавления отличается от остальных заявленных образцов вируса оспы овец. Это указывало на возможность применения разработанного способа для дифференциации вакцинного штамма НИСХИ от других изолятов и штаммов с помощью анализа пиков высокого разрешения.
Пример 3. Исследование аналитической специфичности разработанного способа дифференциации генома вакцинного штамма НИСХИ от полевых изолятов вируса оспы овец методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с анализом пиков высокого разрешения.
Специфичность анализа дифференциации генома вакцинного штамма НИСХИ от полевых изолятов вируса оспы овец методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с анализом пиков высокого разрешения оценивали путем тестирования 8 экстрактов ДНК от других патогенов жвачных животных (2 изолята вируса герпеса крупного рогатого скота - BOHV-1 404/2018, BOHV-2 95-5/2016; 3 биоматериала, содержащего Mycoplasma capricolum ssp., 3 суспензии от разных изолятов кДНК вируса чумы мелких жвачных животных - PPRV/Israel-2536/Hebron/1997, clone Karth99, clone Chirg98). Для проведения исследования использовали детектирующий амплификатор марки Rotor-Gene Q. В результате исследования амплификация с неспецифичными нуклеиновыми кислотами других инфекционных агентов не была обнаружена (таблица 5).
В результате исследования обнаружили, что для проб, не содержащих нуклеиновую кислоту вируса оспы овец, и отрицательного контроля не формировали графики плавления и не были обнаружены пиковые значения при анализе высокого разрешения. При исследовании положительного контроля обнаружен пик температуры, равный 75,65±0,04°С (n=3). Таким образом, полученные результаты свидетельствовали о 100%-ной специфичности разработанного способа дифференциации генома вакцинного штамма НИСХИ от полевых изолятов вируса оспы овец методом ПЦР в режиме реального времени с анализом пиков высокого разрешения.
Пример 4. Исследование кросс-платформенной совместимости разработанного способа дифференциации генома вакцинного штамма НИСХИ от полевых изолятов вируса оспы овец методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с анализом пиков высокого разрешения. Для оценки кросс-платформенной совместимости разработанного способа дифференциации генома вакцинного штамма НИСХИ от полевых изолятов вируса оспы овец методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с анализом пиков высокого разрешения провели анализ с использованием выбранной панели образцов, включающей как плазмидную, так и вирусную ДНК, извлеченную из супернатантов клеточных культур, а также клинических образцов на трех различных термоциклерах ПЦР в реальном времени: RotorGene Q (Qiagen), CFX96 (Bio Rad) и LightCycler 480 (Roche).
m
Этот анализ был успешно проведен на всех трех платформах с использованием одной и той же смеси и протокола и позволил дифференцировать полевые изоляты и вакцинный штамм НИСХИ вируса оспы овец. При использовании различных платформ были отмечены небольшое изменение значений температур плавления ампликонов (таблица 6), а именно, при исследовании вируса оспы овец штамма НИСХИ в ПЦР в режиме реального времени приборами RotorGene Q, LigthCycler 480, и CFX 96 пики были определены при температурах 76,46±0,12°С, 76,04±0,14°С, 77,41±0,10°С, соответственно. В результате анализа полевых изолятов вируса оспы овец в ПЦР-РВ термоциклерами LigthCycler 480, RotorGene Q и CFX 96 значения T были равны 75,65±0,04°С, 75,13±0,09°С, 76,45±0,07°С, соответственно. Таким образом, с помощью трех приборов проведено исследование кросс-платформенной совместимости способа дифференциации генома вакцинного штамма НИСХИ от полевых изолятов вируса оспы овец методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с анализом пиков высокого разрешения. Полученные данные являются экспериментальными значениями для проведения дифференциального анализа генома вируса оспы овец штамма НИСХИ и полевых изолятов.
Пример 5. Определение диагностических показателей разработанного способа дифференциации генома вакцинного штамма НИСХИ от полевых изолятов вируса оспы овец методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с анализом пиков высокого разрешения.
Для исследования разработанного способа дифференциации генома вакцинного штамма НИСХИ от полевых изолятов вируса оспы овец методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с анализом пиков высокого разрешения исследовали стандартные диагностические показатели. Для определения диагностической чувствительности разработанной тест-системы анализировали 145 суспензий вируса оспы овец штамма НИСХИ, которые являлись заведомо положительными. Постановку ПЦР в режиме реального времени с последующим плавлением ампликонов проводили, как отражено в примере 2. С помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что из 145 исследуемых образцов вируса оспы овец штамма НИСХИ все определены в качестве положительных.
Для исследования специфичности метода тестировали 130 суспензий вируса оспы овец других штаммов и изолятов, в том числе Amur, Pskov, Kaluga, Tula, Tver, Dagestan, M18, M19. С помощью метода секвенирования доказана видовая принадлежность указанных изолятов и штаммов. В результате исследования с помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что все 130 проб содержали геном вируса оспы овец, но при этом не включали в свой состав вакцинный штамм НИСХИ. Пользуясь представленными выше статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 97,49-100,00%, диагностическая специфичность (DSp) - 97,20-100,0%, k-критерий - 1,000; прогностичность положительного результата (PPV) - 100%, прогностичность отрицательного результата (NPV) - 100,00%), общая точность (DAc) - 98,67-100,00% (таблица 7).
Основными преимуществами предлагаемого изобретения является возможность проводить за короткий промежуток времени (не более 3 ч) дифференциации генома вакцинного штамма НИСХИ от полевых изолятов вируса оспы овец методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с анализом пиков высокого разрешения. Разработанный способ впервые применили для решения данной задачи. Выявили, что в анализируемом участке ДНК вируса оспы овец штамма НИСХИ в диапазоне 113683…113791 п.н. имеется нуклеотидная замена T→С (позиция 113756 п.н.), которая характерна для данного штамма и отсутствует в других штаммах и изолятах данного вируса, что позволило разработать олигонуклеотиды F-SPPV-NISKHI-праймер и R-SPPV-NISKHI-праймер для детекции данного участка генома размером 109 п.н. с помощью ПЦР-РВ с последующим анализом температур плавления для анализируемых проб вируса. Впервые представлена идентификация специфических генетических профилей геномов различных наиболее часто используемых штаммов и изолятов вируса оспы овец и их использование в ПЦР-РВ с анализом пиков высокого разрешения для дифференциации вакцинного штамма НИСХИ и полевых изолятов данного вируса.
Разработанный способ дифференциации генома вируса оспы овец вакцинного штамма НИСХИ от полевых изолятов методом ПЦР-РВ с анализом пиков высокого разрешения характеризуется аналитической специфичностью, равной 100%. В 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность для данного способа составляет 97,49-100,00%, диагностическая специфичность - 97,20-100,0%.
Источники информации
1. Cousins MM, Swan D, Magaret СА, Hoover DR, Eshleman SH. Analysis of HIV using a high resolution melting (HRM) diversity assay: automation of HRM data analysis enhances the utility of the assay for analysis of HIV incidence. PLoS One. 2012;7(12):e51359.
2. Buller, R.M. et al. Family poxviridae. In Virus taxonomy: Classification and nomenclature of viruses. Eighth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (eds Mayo, M.A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L.A., editors. F.С.) 117-133 (Elsevier Academic Press San Diego, 2005).
3. OIE. Sheep pox and goat pox. In Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals (2018).
4. Babiuk S, Bowden TR, Boyle DB, Wallace DB, Kitching RP. Capripoxviruses: An Emerging Worldwide Threat to Sheep, Goats and Cattle. Transbound. Emerg. Dis. 2008; 55:263-272.
5. Broyles S.S.J. Vaccinia virus transcription, 84 (9) (2003), pp. 2293-2303.
6. Cam VM. Control of capripoxvirus infections. Vaccine. 1993; 11:1275-1279.
7. GenBank. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/21326696. (Дата обращения: 16.05.2022).
8. Gelaye E, et al. Development of a Cost-Effective Method for Capripoxvirus Genotyping Using Snapback Primer and dsDNA Intercalating Dye. PLoS One. 2013; 8:e75971.
9. Er TK, Chang JG. High-resolution melting: applications in genetic disorders. Clin Chim Acta. 2012 Dec 24; 414:197-201.
10. Gelaye E, et al. A novel HRM assay for the simultaneous detection and differentiation of eight poxviruses of medical and veterinary importance. Sci. Rep.2017; 7:42892.
11. Huebner C, Weber R, Lloydd R. A HRM assay for identification of low level BRAF V600E and V600K mutations using the CADMA principle in FFPE specimens. Pathology. 2017 Dec; 49(7):776-783.
12. Hussmann D, Hansen LL. Methylation-Sensitive High Resolution Melting (MS-HRM). Methods Mol Biol. 2018; 1708:551-571.
13. Nikodem D, Clapa T, Narozna D. Technologia HRM-PCR w diagnostyce medycznej [HRM-PCR in medical diagnostic]. Postepy Biochem. 2021 Mar 4; 67(1):59-63. Polish, doi: 10.18388/pb.2021_373. PMID: 34378898.
14. Pakbin B, Basti AA, Khanjari A, Briick WM, Azimi L, Karimi A. Development of high-resolution melting (HRM) assay to differentiate the species of Shigella isolates from stool and food samples. Sci Rep. 2022 Jan 10; 12(1):473.
15. Robinson CV, Uren Webster TM, Consuegra S. Data on optimisation of a multiplex HRM-qPCR assay for native and invasive crayfish as well as the crayfish plague in four river catchments. Data Brief. 2018 May 29; 19:1092-1109.
16. Rojas A, Rojas D, Montenegro VM, Baneth G. Detection of Dirofilaria immitis and other arthropod-borne filarioids by an HRM real-time qPCR, blood-concentrating techniques and a serological assay in dogs from Costa Rica. Parasit Vectors. 2015 Mar 23; 8:170.
17. Schiwek S, Beule L, Vinas M, Pfordt A, von Tiedemann A, Karlovsky P. High-Resolution Melting (HRM) Curve Assay for the Identification of Eight Fusarium Species Causing Ear Rot in Maize. Pathogens. 2020 Apr 7; 9(4):270.
18. Van der Heyden H, Fortier AM, Savage J. A HRM Assay for Rapid Identification of Members of the Seedcorn Maggot Complex (Delia florilega and D. platura) (Diptera: Anthomyiidae) and Evidence of Variation in Temporal Patterns of Larval Occurrence. J Econ Entomol. 2020 Dec 9; 113(6):2920-2930.
19. Zhang L, Ma X, You G, Zhang X, Fu Q. A Novel Multiplex HRM Assay to Detect Clopidogrel Resistance. Sci Rep. 2017 Nov 22; 7(1): 16021.
20. Zhang L, Zhang X, You G, Yu Y, Fu Q. A novel dNTP-limited PCR and HRM assay to detect Williams-Beuren syndrome. Clin Chim Acta. 2018 Jun; 481:171-176.
21. Crossley BM, Bai J, Glaser A, Maes R, Porter E, Killian ML, Clement T, Toohey-Kurth K. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. J Vet Diagn Invest. 2020 Nov; 32(6):767-775.
22. Lamien CE, et al. Real time PCR method for simultaneous detection, quantitation and differentiation of capripoxviruses. J. Virol. Methods. 2011; 171:134-140.
23. Williams CT, Musicha P, Feasey NA, Adams ER, Edwards T. ChloS-HRM, a novel assay to identify chloramphenicol-susceptible Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in Malawi. J Antimicrob Chemother. 2019 May 1; 74(5):1212-1217.
24. Dwight Z, Palais R, Wittwer CT. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 2011 Apr 1; 27(7): 1019-1020.
25. Service uMelt. URL: https://dna-utah.org/Hi-Res/TOP_Hi-Res%20Melting.html (Дата обращения: 14.06.2022).
--->
Перечень последовательностей
<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр
охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») Federal Governmental Budgetary
Institution «Federal Centre for Animal Health» (FGBI «ARRIAH»)
<120> Способ дифференциации генома вакцинного штамма НИСХИ от полевых
изолятов вируса оспы овец методом полимеразной цепной реакции в режиме
реального времени с анализом пиков высокого разрешения
<160>    2
<210>    1
<211>    109
<212>    ДНК
<213>    вирус оспы овец
<400>    1
1      CACACGGTGC AGCAAATACT ATAACAGAAG TATTAAAAGA TTCGGAAGAG GACTATCAAG       60
61     ATGTGTATGT TTGTGAAAAC TGTGGAGATA TAACAGCACA GATACAAGG                  109
<210>    2
<211>    36
<212>    ПРТ
<213>    вирус оспы овец
<400>    2
1    His Gly Ala Ala Asn Thr Ile Thr Glu Val Leu Lys Asp Ser Glu              15
16   Glu Asp Tyr Gln Asp Val Tyr Val Cys Glu Asn Cys Gly Asp Ile              30
31   Thr Ala Gln Ile Gln Gly                                                  36
<---