СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ, АЛЛЕРГИЧЕСКИХ, АУТОИММУННЫХ И ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR INFECTIOUS, ALLERGIC, AUTOIMMUNE AND ONCOLOGICAL DISEASES

Изобретение относится к медицине и может быть применено в области клинической лабораторной диагностики.
Предлагается способ диагностики инфекционных, аллергических, аутоиммунных и онкологических заболеваний путем обработки жидких биологических сред воздействием энергии акустического поля ультразвука с целью кавитационной дезинтеграции иммунных комплексов, для получения свободных антител и антигенов, которые в дальнейшем используются для проведения иммуноферментного анализа (далее - ИФА).
Известен способ раннего выявления специфических антигенов и антител с помощью ИФА (патент РФ на изобретение №2185629, опубл. 20.07.2002). Способ обеспечивает повышение точности диагностики ранних поражений нервной системы при туберкулезе, а именно определяют антитела к основному белку миелина в сыворотке крови с помощью ИФА по оптической плотности и при их содержании больше 0,199 оптических единиц, диагностируя туберкулезное поражение нервной системы на ранних стадиях.
Ранняя диагностика, например ВИЧ-инфекции, одинаково важна как для здоровья зараженного пациента, так и для всего общества. Чем раньше будет определен ВИЧ-статус пациента, тем более эффективной может быть терапия, тем раньше можно будет ограничить дальнейшее распространение инфекции.
В настоящее время для клинической лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции, широко используются различные способы обнаружения ВИЧ, основанные на выявлении антигенов вируса и антител к ВИЧ, а также генетического материала вируса иммунодефицита. Все эти способы обладают различной эффективностью, требуют различного оборудования и разного уровня профессиональной подготовки персонала, а результаты исследований - грамотной интерпретации.
Наиболее близким по своей технической сущности к предполагаемому изобретению, выбранный в качестве прототипа, является способ диагностика ВИЧ-инфекции с помощью обнаружения антигенов и антител к ВИЧ-инфекции методом ИФА (Руководство для врачей «Вирус Иммунодефицита Человека - медицина», Н.А. Беляков, А.Г. Рахманов и др. Санкт-Петербург, 2011 г.).
Этот способ включает:
- этап иммунной реакции: получение иммунохимического комплекса в результате поэтапного или одномоментного добавления иммунных реагентов, один из которых содержит ферментную метку;
- этап промывки, целью которой является удаление не связавшихся компонентов;
- этап проведения ферментативной реакции за счет добавления субстрата (или субстрата и хромогена) с последующим внесением стоп-реагента для остановки реакции;
- этап учета и интерпретации результатов анализа.
При обследовании пациента на ВИЧ-инфекцию методом ИФА возможно получение ложноотрицательных результатов. Это может иметь место в период «серологического окна», когда инфицирование произошло относительно недавно, уровень антител в крови пациента еще очень низкий и чувствительность тест-систем недостаточна для их выявления. Ложноотрицательные результаты могут наблюдаться и в терминальной стадии болезни, характеризующейся тяжелым поражением иммунной системы с глубоким нарушением процесса образования антител.
Недостатком этого способа является то, что ИФА выявляет свободные антитела и антигены, находящиеся в жидкой биологической среде, но циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК), состоящие из связанных между собой антигенов и антител в результате этого анализа не выявляются, тем самым, не могут быть использованы для диагностики различных заболеваний.
Задачей предлагаемого изобретения является решение проблемы ранней и экспертной диагностики инфекционных, аллергических, аутоиммунных и онкологических заболеваний.
Для решения поставленной задачи предлагается способ диагностики инфекционных, аллергических, аутоиммунных и онкологических заболеваний, который, как и наиболее близкий, выбранный в качестве прототипа, включает ИФА жидких биологических сред, содержащих ЦИК, состоящие из антигенов и связанных с ними антител.
В отличие от прототипа, в предлагаемом способе перед ИФА жидких биологических сред дополнительно проводят воздействие ультразвука на жидкую биологическую среду, при котором происходит высвобождение свободных антигенов и антител без нарушения их биологической активности в течение 3-10 минут, частотой 22 кГц, мощностью 400 Вт при температуре 25°-38°С.
Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что с помощью ультразвукового воздействия на жидкую биологическую среду происходит диссоциация ЦИК, сопровождающаяся высвобождением свободных антигенов и антител без нарушения их биологической активности.
Границы частоты ультразвукового воздействия 22 кГц и его мощности 400 Вт обусловлены необходимостью получения эффекта кавитации в жидких биологических средах, содержащих биологические объекты белковой и липопротеидной природы - антитела и антигены, активации химических реакций, в том числе с разрывом иммунохимических связей между биомолекулами ЦИК.
При ультразвуковом воздействии на жидкую биологическую среду с частотой большей, чем 22 кГц происходят конформационные изменения биомолекул и иммунных комплексов, и, как следствие, потеря иммунной активности входящих в них антител и антигенов.
Диапазон температур обусловлен теми же причинами - необходимостью сохранения антителами и антигенами, входящих в состав ЦИК, биологической активности.
Заявленный способ осуществляют следующим образом.
Пластиковую пробирку с 1,0 мл жидкой биологической среды, например, сыворотки крови, помещают в устройство, позволяющее производить ультразвуковой воздействие на ЦИК сыворотки крови. Под действием ультразвука на сыворотку крови в течение 3-10 мин, частотой 22 кГц, мощностью 400 Вт при температуре 25°-38°С из ЦИК сыворотки крови происходит высвобождение свободных, сохраняющих биологическую активность антигенов и антител и их наличие выявляется далее методом ИФА или иммунного блотинга (далее - ИБ).
С помощью ИБ выявляют различные антитела, например, специфические к ВИЧ антигенам. Эти антитела относятся к классу Ig G. Например, выявлены Ig G специфические антитела к gp 41 антигенам ВИЧ.
При аллергических заболеваниях выявляют антитела двух основных классов Ig G и Ig Е. Ig Е специфические антитела выявляют к аллергенам (их более 1000).
В таблице 1 проиллюстрирована возможность достижения технического результата - выявление свободных Ig G специфических антител к ВИЧ во всем заявленном интервале значений.
По результатам экспериментов выявили, что при указанных условиях возможно выявление Ig G специфических антител к ВИЧ с возрастанием их диагностического титра после ультразвукового воздействия. За диагностический титр принимали значение максимального разведения сыворотки крови, в котором методом ИФА выявлялись Ig G специфические антитела к ВИЧ.
Было произведено обследование 7 больных ВИЧ-инфекцией, у которых ранее в сыворотке крови методами ИФА и ИБ были выявлены свободные специфические антитела к ВИЧ класса Ig G в диагностических титрах 1:1000 и 1:2000.
Для выделения из состава ЦИК свободных Ig G специфических антител к ВИЧ было проведено ультразвуковое воздействие на сыворотку крови с помощью источника ультразвука частотой 22 кГц, мощностью 400 Вт на активной нагрузке в течение 10 мин при температуре 25°С - 38°С.
Как видно из таблицы 1 после воздействия ультразвука на сыворотку крови в течение 3-10 минут диагностический титр специфических антител к ВИЧ вырос во всех подвергнутых ультразвуковому воздействию пробах. Это является свидетельством того, что возросла концентрация свободных специфических антител к ВИЧ класса Ig G. Рост диагностического титра находится в пределах от 4 раз (пробы №№2, 3, 4, 6) до 8 раз (проба №7).
При воздействии ультразвука на сыворотку крови диагностический титр специфических антител к ВИЧ достиг максимальных значений на 5 минуте, при дальнейшем воздействии от 6 до 10 минут достигнутые максимальные значения не менялись.
При повышении температуры от 26°С до 38°С результаты диагностических титров были так же неизменны. Биологическая иммунная активность специфических антител к ВИЧ класса Ig G, выделенных из ЦИК, была подтверждена в исследованиях методом ИФА.
Итак, предлагаемое изобретение решает поставленную задачу, а именно, решает проблему ранней и экспертной диагностики инфекционных, аллергических, аутоиммунных и онкологических заболеваний.