Способ дифференциальной диагностики герпесвирусной микст-инфекции
METHOD FOR DIFFERENTIAL DIAGNOSIS OF HERPES VIRUS MIXED INFECTION

Изобретение относится к молекулярной биологии и медицине и касается дифференциальной диагностики герпесвирусной инфекции различной этиологии.
Герпесвирусные инфекции представляют собой группу инфекционных заболеваний человека, вызываемых вирусами семейства Herpesviridae. К этому семейству в настоящее время относятся 9 типов герпесвирусов. Филогенетически данные вирусы относятся к подсемействам: Alphaherpesvirinae - вирус простого герпеса (ВПГ) 1-го-2-го типов и вирус ветряной оспы (Varicella Zoster Virus); к Betaherpesvirinae - цитомегаловирус (ЦМВ), вирусы герпеса человека (ВГЧ) -6А и -6В типов и ВЧГ-7; к Gammaherpesvirinae - вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ) и ВГЧ-8 типа (вирус саркомы Капоши) [Babcock J.G., Hochberg D., Thorley-Lawson A.D. The expression pattern of Epstein-Barr virus latent genes in vivo is dependent upon the differentiation stage of the infected В cell // Immunity.- 2000. 13.- P. 497-506. ; Hislop A.D., Taylor G.S., Sauce D., Rickinson A.B. Cellular responses to viral infection in humans: lessons from Epstein-Barr virus // Annu. Rev. Immunol.- 2007. 25. - P. 587-617.]. Герпесвирусы характеризуются сходными механизмами и путями передачи, которые обусловливают их широкое распространение в популяции и высокую частоту встречаемости герпесвирусных микст-инфекций. Инфицирование происходит преимущественно в раннем возрасте в условиях формирования иммунной системы, что создает условия для пожизненной персистенции вирусов [Merlo A., Turrini R., Dolcetti R., Martorelli D., Muraro E., Comoli P, Rosato A. The interplay between Epstein-Barr virus and the immune system: a rationale for adoptive cell therapy of EBV-related disorders // Haematologica. - 2010. 95(10). - P. 1769-1777.]. Персистенция представляет собой способность герпесвирусов сохраняться в функционально активном состоянии в клетках тропных тканей, что создает постоянную угрозу реактивации инфекционного процесса. Пожизненная персистенция герпесвирусов обусловлена их способностью уклоняться от иммунного надзора путем связывания и инактивации молекул системы комплемента, угнетения транскрипции IFN-стимулированных генов, нарушения презентации вирусных антигенов в комплексе с HLA 1 типа, блокирования апоптоза инфицированной клетки [Paludan S.R., Bowie A.G., Horan K.А., Fitzgerald K.A. Recognition of herpesviruses by the innate immune system // Nat. Rev. Immunol. - 2011. 11. - P. 143-154.].
Главными клиническими симптомами герпесвирусной микст-инфекции являются длительная слабость, потливость, непостоянные боли в горле, мышцах и суставах, головные боли, субфебрильная температура, лимфаденопатия, нарушение сна, снижение внимания, реже - психогенная депрессия. Нередко имеют место герпес-ассоциированные повторные острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ), хронические рецидивирующие ВПГ-1 и ВПГ-2 инфекции, хронические ЦМВ и ВГЧ-6 инфекции, хронические бактериальные и грибковые инфекции [Kutok J., Wang F. Spectrum of Epstein-Barr virus-associated diseases // Annu. Rev. Pathol. 2006. Vol. 1. - P. 375-404.].
В группе пациентов с герпесвирусными инфекциями встречаемость микст-инфекции составляет более 40%. Так, по результатам обследования на герпесвирусную инфекцию детей, поступивших в инфекционное отделение одной из детских городских клинических больниц г. Москвы, у 71% пациентов выявлялась ВГЧ-6 инфекция в комплексе с другими герпесвирусами. Герпесвирусные микст - инфекции выявляются более чем у половины пациентов с острой респираторной инфекцией, а также и у здоровых носителей. Герпесвирусные микст-инфекции представлены следующими сочетаниями: ВЧГ-6 + 2 и более герпесвирусов - 39%, ВГЧ-6 + ЦМВ - 23%, ВГЧ-6 + ВЭБ - 31%, ВГЧ-6 + ВПГ-1 - 7%. В группе здоровых носителей: ВГЧ-6 + 2 и более герпесвирусов - 50%, ВГЧ-6 + ЦМВ - 20%, ВГЧ-6 + ВЭБ - 25%, ВГЧ-6 + ВПГ-1 - 5% [Музыка А.Д. Диагностика, клинико-лабораторные особенности и лечение активных форм инфекции вируса герпеса человека 6 типа у детей: дис. канд. мед. наук: 14.01.08. - Москва, 2017. - 163 с.]. В группе пациентов с моно- и микст-герпесвирусными инфекциями в возрасте 23-60 лет микст-инфекциями было инфицировано 63,7% [И.В. Нестерова, Е.О. Халтурина Моно и микст герпесвирусные инфекции: ассоциированность с клиническими синдромами иммунодефицита // Вестник РУДН. Серия: Медицина. - 2018. - Т. 22. - №2. - С. 226-234.]. У детей с инфекционным мононуклеозом в 42% случаев заболевание протекало как микст-инфекция [О.В. Шамшева, Ф.С. Харламова, Н.Ю. Егорова, О.В. Молочкова, Е.В. Новосад, Е.В. Симонова, Т.М. Лебедева, Н.А. Гусева. Результаты многолетнего изучения герпесвирусной инфекции на кафедре инфекционных болезней у детей РНИМУ // Детские инфекции. - 2017. - 16(2). - 5-12.].
При микст-инфекции ВГЧ-6 с ВЭБ и ЦМВ усиливается степень выраженности и длительность клинических симптомов заболевания, повышается риск развития осложнений [Cavallo М. L., Castrovilli A., D'Introno A., Perrone A., Polito A., Lenato G.М., Sabba С.A. A systemic and severe infection via Cytomegalovirus and other Herpesviruses in a young apparently immunocompetent patient: a case report // Journal of medical cases. - 2017. 8(9). - P. 265-268.]. Таким образом, этиология герпесвирусной микст-инфекции влияет, с одной стороны, на тяжесть клинических проявлений заболевания, и, с другой стороны, определяет выбор стратегии ее лечения.
Задача изобретения - способ дифференциальной диагностики ассоциированной с вирусом Эпштейна-Барр в сочетании с цитомегаловирусом и вирусом герпеса человека 6 типа с применением молекулярно-генетических маркеров.
Техническим результатом предлагаемого способа является обеспечение точности дифференциальной диагностики герпесвирусной микст-инфекции различной этиологии.
Технический результат достигается тем, что в лейкоцитах периферической крови пациентов с герпесвирусной микст-инфекцией детектируют уровни экспрессии мРНК BTK-NM_001287345, CASP8AP2-NM001137667, CASP8-NM 033356, DAPK2-NM_014326, FAF1-NM_007051 и генов FAS, ITCH, ВВСЗ и при их повышении по сравнению со здоровыми донорами диагностируют микст-инфекцию в виде сочетания вируса Эпштейна-Барр, цитомегаловируса и вирус герпеса человека 6 типа.
Сущность способа поясняется примером.
Пример. Осуществление способа.

Материалом исследования явились образцы периферической крови, полученные от детей и подростков в возрасте 7-17 лет с герпесвирусной микст-инфекцией разной этиологии. Клинические симптомы герпесвирусной инфекции оценивались на основании физикального исследования и лабораторных данных. Ведущими клиническими симптомами пациентов были острый тонзиллит, тонзиллофарингит, лимфаденопатия, гепатоспленомегалия, лихорадка, фебрильный судорожный приступ, реже инфекционная экзантема. Из лабораторных анализов пациентам проводился общий (определение доли атипичных мононуклеарных клеток) и биохимический (определение уровней ферментов печени - АСАТ и АЛАТ) анализ крови. Выявление этиологических агентов инфекции (ВЭБ, ЦМВ, ВГЧ-6) проводили методами ИФА и ПЦР в реальном времени. Наличие антител классов IgM и IgG к антигенам ВГЧ-6, ВЭБ и ЦМВ в сыворотке крови пациентов определяли с помощью наборов «Вектор-Бест» (Россия), наличие ДНК ЦМВ, ВЭБ и ВГЧ-6 в образцах периферической крови пациентов - с помощью наборов «Ампли-СенсEBV-CMV-HHV6-скрин-FL». Микст-инфекцию выявляли при наличии в крови ДНК и антител IgM/IgG к антигенам ВЭБ, ЦМВ и ВГЧ-6 в разных сочетаниях. В качестве группы сравнения были взяты образцы крови 23 клинически здоровых детей. Критериями включения в группу здоровых детей были: возраст от 7 до 17 лет, отсутствие признаков хронической соматической патологии, отсутствие установленных проявлений герпесвирусной инфекции (инфекционный мононуклеоз, внезапная экзантема, герпетический стоматит) в течение года.
Пробоподготовка и гибридизация РНК. Из образцов периферической крови выделяли лейкоцитарную фракцию с помощью раствора «Гемолитик» (ЦНИИЭ, Россия). Далее из данной фракции выделяли пул тотальной РНК с помощью набора «МАГНО-сорб» (ЦНИИЭ, Россия) и концентрировали смесью фенола и хлороформа в соотношении 1:1. Обратную транскрипцию тотальной РНК и достройку второй цепи проводили с применением набора «Mint cDNA synthesis kit» («Евроген», Россия), при этом 3'-олиго-Т-праймер заменяли на содержащий Т7 промотор-олиго-Т-праймер («ДНК-синтез», Россия). Далее производили достройку второй цепи и амплификацию кДНК. Полученную кДНК транскрибировали с использованием Т7 РНК-полимеразы («Thermo Scientific)), ЕС), при этом добавляли биотинилированные УТФ («ДНК-синтез)), Россия). Полученную меченую РНК гибридизовали на ДНК-биочип собственного дизайна, выполненного на базовой платформе «CustomArray Inc.)) (США), содержащий набор зондов для детекции уровней экспрессии мРНК и для оценки суммарной экспрессии генов (далее - экспрессии генов). Селекцию зондов осуществляли согласно описанному ранее алгоритму [Солнцев Л.А., Старикова В.Д., Сахарнов Н.А., Князев Д.И., Уткин О.В. Стратегия подбора зондов для изучения совокупности мРНК участников рецептор-опосредованного сигналинга апоптоза // Молекулярная биология. - 2015. - Т. 49, №3. - С. 515-524.] Считывание сигналов гибридизации целевых РНК и генов на соответствующие зонды биочипа производили амперометрическим способом с применением устройства и программного обеспечения «ElectraSense» («CustomArray Inc.», США). Полученные сигналы рассматривали как уровни экспрессии мРНК и генов.
Для расчета относительных уровней экспрессии мРНК и генов использовались средние значения сигналов гибридизации зондов в группах пациентов (ВЭБ+ЦМВ микст-инфекция ВГЧ-6+ВЭБ+ЦМВ микст инфекция) и здоровых доноров. Проводились сравнения между группами пациентов и здоровых доноров с использованием Т-теста с поправкой на ожидаемую долю ложных отклонений. В качестве порогового уровня значимости был выбран q=0,05.
Далее определяли этиологическую структуру герпесвирусной микст-инфекции в соответствии с заявленным способом (ВЭБ+ЦМВ микст-инфекция - отсутствие изменений уровней экспрессии мРНК BTK-NM_001287345, CASP8AP2-NM_001137667, CASP8-NM_033356, DAPK2-NM_014326, FAF1-NM_007051 и генов FAS, ITCH, ВВС3; ВЭБ+ЦМВ+ВГЧ-6 - микст-инфекция - повышение уровней экспрессии мРНК BTK-NM_001287345, CASP8AP2-NM_001137667, CASP8-NM_033356, DAPK2-NM_014326, FAF1-NM_007051 и генов FAS, ITCH, ВВС3). Результаты представлены в таблице 1.
Примечание: положительные значения экспрессии - повышение уровня экспрессии мРНК по сравнению со здоровыми донорами, отрицательные значения экспрессии - снижение уровня экспрессии мРНК по сравнению со здоровыми донорами.
Как видно из таблицы 1, при ВГЧ-6+ВЭБ+ЦМВ микст-инфекции выявляется значительное повышение уровней экспрессии мРНК BTK-NM_001287345, CASP8AP2-NM_001137667, CASP8-NM_033356, DAPK2-NM_014326, FAF1-NM_007051 и генов ВВС3, FAS, ITCH при этом при ВЭБ+ЦМВ микст-инфекции изменения уровней экспрессии данных мРНК и генов не детектируются.
Осуществимость способа подтвердили результатами физикального исследования и лабораторных данных. Результаты представлены в таблице 2.
Проведенные исследования показали, что молекулярно-генетические маркеры (мРНК BTK-NM_001287345, CASP8AP2-NM_001137667, CASP8-NM_033356, DAPK2-NM_014326, FAF1-NM_007051 и гены FAS, ITCH, ВВС3) являются прогностическими факторами герпесвирусной микст-инфекции с участием ВГЧ-6.