СПОСОБ КЛОНИРОВАНИЯ КОГНАТНЫХ АРТИТЕЛ

1. Способ получения библиотеки когнатных пар, содержащей сцепленные кодирующие последовательности вариабельной области, где указанный способ включает:
a) получение от донора клеточной фракции, содержащей лимфоциты,
b) получение популяции выделенных единичных клеток, включающее распределение клеток из указанной клеточной фракции индивидуально во множество резервуаров, где, по меньшей мере, субпопуляция клеток экспрессирует антиген CD43 и CD138 или антиген MHCII и B220,
c) амплификацию и осуществление сцепления кодирующих последовательностей вариабельных областей, содержащихся в указанной популяции выделенных единичных клеток, посредством амплификации в мультиплексной процедуре молекулярной амплификации представляющих интерес нуклеотидных последовательностей с использованием матрицы, полученной из выделенной единичной клетки или популяции изогенных клеток, и осуществления сцепления представляющих интерес амплифицированных нуклеотидных последовательностей.
2. Способ по п.1, в котором индивидуальную выделенную единичную клетку из популяции единичных клеток размножают до популяции изогенных клеток перед проведением амплификации и сцепления (стадия 1.c).
3. Способ по п.1, в котором клеточная фракция, содержащая лимфоциты, включает спленоциты, цельную кровь, костный мозг, мононуклеарные клетки или лейкоциты.
4. Способ по п.1, в котором клеточная фракция, содержащая лимфоциты, включает спленоциты или костный мозг, предпочтительно, спленоциты.
5. Способ по п.1, в котором клеточная фракция, содержащая лимфоциты, или линия B-лимфоцитов обогащена плазмацитами или плазмабластами.
6. Способ по п.1, в котором представляющие интерес нуклеотидные последовательности содержат кодирующие последовательности вариабельной области иммуноглобулина, а сцепление создает когнатную пару кодирующей последовательности вариабельной области легкой цепи, связанной с кодирующей последовательностью вариабельной области тяжелой цепи.
7. Способ сцепления множества представляющих интерес несмежных нуклеотидных последовательностей случайным образом, где указанный способ включает:
a) амплификацию в мультиплексной процедуре молекулярной амплификации представляющих интерес нуклеотидных последовательностей с использованием матрицы, полученной из популяции генетически различных клеток,
где генетически различные клетки извлечены из клеточной фракции, содержащей лимфоциты, от донора, и где, по меньшей мере, субпопуляция клеток экспрессирует антиген CD43 и CD138 или антиген MHCII и B220, и
b) осуществление сцепления представляющих интерес нуклеотидных последовательностей, амплифицированных на стадии a).
8. Способ по п.7, в котором указанная популяция клеток лизирована.
9. Способ по п.7 или 8, в котором указанные представляющие интерес нуклеотидные последовательности содержат кодирующие последовательности вариабельной области, и сцепление создает комбинаторную библиотеку пар кодирующих последовательностей вариабельной области.
10. Способ по п.9, в котором указанные представляющие интерес нуклеотидные последовательности содержат кодирующие последовательности вариабельной области иммуноглобулина, и сцепление создает комбинаторную библиотеку пар кодирующих последовательностей вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи.
11. Способ по п.1 или 7, дополнительно включающий перед мультиплексной молекулярной амплификацией оценку того, содержит ли популяция клеток, содержащая лимфоциты, клетки, экспрессирующие антиген CD43 и CD138 или антиген MHCII и B220, предпочтительно, CD43 и CD138.
12. Способ по п.1 или 7, дополнительно включающий обогащение указанной клеточной фракции, содержащей лимфоциты, популяцией лимфоцитов, экспрессирующих антиген CD43 и CD138 или антиген MHCII и B220, перед мультиплексной молекулярной амплификацией.
13. Способ по п.1 или 7, дополнительно включающий выделение из указанной популяции, содержащей лимфоциты, клеток, экспрессирующих антиген CD43 и CD138 или антиген MHCII и B220, перед мультиплексной молекулярной амплификацией.
14. Способ по п.1 или 7, в котором выделенные клетки или субпопуляция клеток представляют собой клетки CD138 High/CD43 High или CD138 Intermediate/CD43 High по отношению к клеточной фракции, содержащей лимфоциты.
15. Способ по п.14, в котором выделенные клетки или субпопуляция клеток представляет собой клетки CD138 High/CD43 High по отношению к клеточной фракции, содержащей лимфоциты.
16. Способ по п.12, в котором обогащение или выделение включает процедуру автоматического сортинга.
17. Способ по п.16, в котором процедура автоматического сортинга представляет собой MACS или FACS.
18. Способ по п.1 или 7, в котором клетки получены от млекопитающего.
19. Способ по п.18, в котором млекопитающее не является человеком.
20. Способ по п.19, в котором млекопитающее, не являющееся человеком, является трансгенным и экспрессирует иммуноглобулины человека.
21. Способ по п.18, в котором донором является грызун.
22. Способ по п.21, в котором донором является мышь.
23. Способ по п.18, в котором донором является примат.
24. Способ по п.18, в котором донором является кролик.
25. Способ по п.1 или 7, в котором указанная процедура мультиплексной молекулярной амплификации представляет собой мультиплексную амплификацию RT-PCR.
26. Способ по п.25, в котором указанная мультиплексная амплификация RT-PCR представляет собой двухстадийный процесс, включающий отдельный стадия обратной транскрипции (RT) перед мультиплексной амплификацией PCR.
27. Способ по п.25, в котором указанную мультиплексную амплификацию RT-PCR проводят в одну стадию, включающий в начале добавление всех компонентов, необходимых для осуществления как обратной транскрипции (RT), так и мультиплексной амплификации PCR в одном резервуаре.
28. Способ по п.1 или 7, в котором указанное сцепление представляющих интерес нуклеотидных последовательностей проводят в том же самом резервуаре, что и мультиплексную молекулярную амплификацию.
29. Способ по п.25, в котором указанное сцепление представляющих интерес нуклеотидных последовательностей производится в сочетании с мультиплексной амплификацией PCR с применением мультиплексной смеси праймеров перекрывания-удлинения.
30. Способ по п.1 или 7, в котором указанное сцепление представляющих интерес нуклеотидных последовательностей производится посредством лигирования.
31. Способ по п.1 или 7, в котором проводится дополнительная молекулярная амплификация с использованием смеси праймеров, адаптированной для амплификации представляющих интерес сцепленных последовательностей нуклеиновой кислоты.
32. Способ по п.29, в котором мультиплексная смесь праймеров перекрывания-удлинения содержит наборы праймеров, где, по меньшей мере, один праймер из каждого набора праймеров содержит хвост перекрывания-удлинения, способный гибридизироваться с хвостом перекрывания-удлинения праймера из второго набора праймеров.
33. Способ по п.29 или 32, в котором мультиплексная смесь праймеров перекрывания-удлинения содержит:
a) по меньшей мере, один праймер mKappa1 или hmJK, комплементарный смысловой цепи кодирующей последовательности области легкой цепи иммуноглобулина,
b) по меньшей мере, один праймер mVK, комплементарный антисмысловой цепи кодирующей последовательности вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина или лидерной последовательности вариабельной области легкой цепи, который способен образовывать набор праймеров с праймером (праймерами) со стадии a),
c) по меньшей мере, один праймер mCHrev1, mHCrev1-ext или mJH, комплементарный смысловой цепи кодирующей последовательности домена тяжелой цепи иммуноглобулина, и
d) по меньшей мере, один праймер mVH, комплементарный антисмысловой цепи кодирующей последовательности вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина или лидерной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, который способен образовывать набор праймеров с праймером (праймерами) со стадии c),
34. Способ по п.1 или 7, дополнительно включающий инсерцию сцепленных нуклеотидных последовательностей или библиотеки когнатных пар в вектор.
35. Способ по п.34, в котором указанный вектор выбран из векторов клонирования, челночных векторов, векторов дисплея или векторов экспрессии.
36. Способ по п.34, в котором сцепленные нуклеотидные последовательности или отдельные члены библиотеки когнатных пар содержат кодирующую последовательность вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, ассоциированную с кодирующей последовательностью вариабельной области легкой цепи, и указанные последовательности вставлены в рамку считывания вектора, уже содержащего кодирующие последовательности одного или нескольких константных доменов иммуноглобулина или их фрагментов.
37. Способ по п.34, дополнительно включающий создание вспомогательной библиотеки посредством отбора подмножества когнатных пар сцепленных последовательностей вариабельной области, которые кодируют связывающие белки с желаемой специфичностью к мишени, что позволяет создать библиотеку специфичных к мишени когнатных пар кодирующих последовательностей вариабельной области.
38. Способ по п.36 или 37, дополнительно включающий перенос указанной когнатной пары или библиотеки специфных к мишени когнатных пар кодирующих последовательностей вариабельной области в вектор экспрессии млекопитающего.
39. Способ по п.38, в котором вектор экспрессии млекопитающего кодирует один или несколько доменов константной области, которые выбраны из классов иммуноглобулинов человека IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, легкой цепи каппа или легкой цепи лямбда.
40. Способ по п.34, дополнительно включающий следующие стадии:
a) введения вектора, кодирующего сегмент сцепленных нуклеотидных последовательностей, в клетку-хозяина,
b) культивирование указанных клеток-хозяев в условиях, адаптированных для экспрессии, и
c) получение белкового продукта, экспрессированного из вектора, вставленного в указанную клетку-хозяина.
41. Способ по п.40, в котором указанный белковый продукт представляет собой антитело, содержащее когнатную пару вариабельной области легкой цепи, ассоциированную с вариабельной областью тяжелой цепи.
42. Многолуночный планшет, содержащий в большинстве лунок:
- одну клетку, извлеченную из клеточной фракции, содержащей лимфоциты, причем указанная клетка экспрессирует антиген CD43 и CD138 или антиген MHCII и B220, а также
- буферы и реактивы, необходимые для осуществления обратной транскрипции мРНК и для амплификации кодирующих последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепи.
43. Способ получения вектора, кодирующего химерное антитело с константными областями человека и вариабельными областями, отличными от человеческих, где указанный способ включает:
a) получение клеточной фракции, содержащей лимфоциты, от животного, не являющегося человеком,
b) получение популяции выделенных единичных клеток, включающее распределение клеток из указанной клеточной фракции индивидуально во множестве емкостей,
c) амплификацию и осуществление сцепления кодирующих нуклеиновых кислот вариабельной области, содержащихся в указанной популяции выделенных единичных клеток посредством амплификации указанных нуклеиновых кислот в мультиплексной процедуре молекулярной амплификации с использованием матрицы, полученной из выделенной единичной клетки или популяции изогенных клеток, и осуществления сцепления амплифицированных нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельные области тяжелой и легкой цепей,
d) осуществление сцепления амплифицированных вариабельных областей с константными областями человека, и
e) инсерцию полученных нуклеиновых кислот в вектор.
44. Способ по п.43, в котором указанная мультиплексная процедура молекулярной амплификации представляет собой мультиплексную амплификацию RT-PCR.
45. Способ по п.44, в котором указанная мультиплексная амплификация RT-PCR представляет собой двухстадийный процесс, включающий отдельную стадию обратной транскрипции (RT) перед мультиплексной амплификацией PCR.
46. Способ по п.44, в котором указанную мультиплексную амплификацию RT-PCR проводят в одну стадию, включающий в начале добавление всех компонентов, необходимых для осуществления как обратной транскрипции (RT), так и мультиплексной амплификации PCR в одном резервуаре.
47. Способ по любому из предыдущих пп.43-46, в котором указанное сцепление представляющих интерес нуклеотидных последовательностей проводят в том же самом резервуаре, что и мультиплексную молекулярную амплификацию.
48. Способ по п.43, в котором указанное сцепление представляющих интерес нуклеотидных последовательностей производится в сочетании с мультиплексной амплификацией PCR с использованием мультиплексной смеси праймеров перекрывания-удлинения.
49. Способ по п.43, в котором указанное сцепление представляющих интерес нуклеотидных последовательностей производится посредством лигирования.
50. Способ по п.43, в котором проводится дополнительная молекулярная амплификация с использованием смеси праймеров, адаптированной для амплифицирования представляющих интерес сцепленных последовательностей нуклеиновой кислоты.
51. Способ по п.48, в котором мультиплексная смесь праймеров перекрывания-удлинения содержит наборы праймеров, где, по меньшей мере, один праймер из каждого набора праймеров содержит хвост перекрывания-удлинения, способный гибридизироваться с хвостом перекрывания-удлинения праймера из второго набора праймеров.
52. Способ по п.48 или 51, в котором мультиплексная смесь праймеров перекрывания-удлинения содержит:
a) по меньшей мере, один праймер mKappa1 или hmJK, комплементарный смысловой цепи кодирующей последовательности участка легкой цепи иммуноглобулина,
b) по меньшей мере, один праймер mVK, комплементарный антисмысловой цепи кодирующей последовательности вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина или лидерной последовательности вариабельной области легкой цепи, который способен образовывать набор праймеров с праймером (праймерами) со стадии a),
c) по меньшей мере, один праймер mCHrev1, mHCrev1-ext или mJH, комплементарный смысловой цепи кодирующей последовательности домена тяжелой цепи иммуноглобулина, и
d) по меньшей мере, один праймер mVH, комплементарный антисмысловой цепи кодирующей последовательности вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина или лидерной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, который способен образовывать набор праймеров с праймером (праймерами) со стадии c).
53. Способ по п.44, в котором продукт PCR вставлен в вектор экспрессии.
54. Способ по п.53, в котором двойная промоторная кассета вставлена в экспрессирующую конструкцию, причем двойная промоторная кассета способна управлять одновременной экспрессией тяжелой и легкой цепей, где предпочтительно двойная промоторная кассета является двунаправленной.
55. Способ по п.54, в котором двойная промоторная кассета дополнительно включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую двойные сигнальные пептиды.
56. Способ по п.53, в котором скелет вектора экспрессии содержит кодирующую последовательность константной легкой цепи человека или ее фрагмент и/или кодирующую последовательность константной тяжелой цепи человека или ее фрагмент.
57. Способ по п.43, включающий дополнительную стадию амплификации, в которой полинуклеотид, кодирующий константную легкую цепь человека или ее фрагмент с перекрыванием, способным обеспечить сцепление с вариабельной легкой цепью, добавляют к смеси PCR вместе с набором праймеров, способным обеспечить амплификацию конструкции содержащей в следующем порядке: мышиную цепь VH, линкер, мышиную цепь VL и константную легкую цепь человека.
58. Способ по п.43, включающий дополнительную стадию амплификации, в которой полинуклеотид, кодирующий константную тяжелую цепь человека или ее фрагмент с перекрыванием, способным обеспечить сцепление с вариабельной тяжелой цепью, добавляют к смеси PCR вместе с набором праймеров, способным обеспечить амплификацию конструкции содержащей в следующем порядке: константную тяжелую цепь человека, мышиную цепь VH, линкер и мышиную цепь VL.
59. Библиотека векторов, кодирующих химерные антитела, где каждый член, относящийся к антителу состоит из кодирующих последовательностей вариабельной области иммуноглобулина отличного от человеческого и константных областей тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина человека.
60. Библиотека по п.59, в которой указанные векторы получены способом по п.1, 7 или 43.
61. Библиотека по п.59, в которой константная область легкой цепи представляет собой константную область каппа.
62. Библиотека по п.59, в которой последовательности отличные от человеческих являются последовательностями грызунов, предпочтительно, мышей.
63. Библиотека по п.59, в которой последовательности отличные от человеческих являются последовательностями кролика.
64. Библиотека по п.59, в которой векторы представляют собой векторы экспрессии.
65. Библиотека по п.59, в которой вариабельные области представляет собой когнатные пары.
66. Библиотека по п.59, в которой константная область иммуноглобулина человека выбрана из классов иммуноглобулинов человека IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или IgM.
67. Библиотека по п.66, в которой константная область выбрана из IgG1 и IgG2.