СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ВЛИЯНИЯ ГЕРПЕС-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ НА АКТИВНОСТЬ СКВАЛЕНДЕГИДРОГЕНАЗЫ НА ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ СРЕЗАХ ПЛАЦЕНТЫ ПРИ ВВЕДЕНИИ В ИНКУБАЦИОННЫЙ РАСТВОР СОДЕРЖИМОГО ГЕРПЕСНЫХ ПУЗЫРЬКОВ БЕРЕМЕННОЙ
METHOD FOR DETECTING ACTION OF HERPES VIRAL INFECTION ON SQUALEN DEHYDROGENASE ACTIVITY IN PLACENTAL HISTOLOGICAL SECTIONS WHEN INTRODUCING PREGNANT WOMAN'S HERPES VESICLES CONTENTS INTO INCUBATION SOLUTION

Цель работы - представить способ прямого действия вируса герпеса на синтез холестерина в плаценте путем определения гистохимическим методом активности сквалендегидрогеназы, принимающей участие в формировании сквалена - ключевого продукта синтеза холестерина.
Синтез холестерина проходит много последовательных этапов [1, 2, 3, 5]. Однако ключевыми этапами принято считать синтез мевалоновой кислоты, сквалена и дегидрохолестерина. После образования мевалоновой кислоты происходит ее фосфорилирование и декарбоксилирование с образованием изопентилпирофосфата, а затем фарназилпирофосфата, две молекулы которого в свою очередь конденсируются концами, несущими пирофосфатные группы и превращаются в сквален [4, 5]. Перед стадией циклизации сквален превращается, в эндоплазматическом ретикулуме, в 2, 3-оксидсквален под действием сквален-эпоксидазы [7]. Этот этап протекает с участием кислорода и фермента сквалендегидрогеназы. Сквален занимает ключевую позицию на дальнейшем пути синтеза холестерина.
Холестерин - циклический стероид, без которого невозможен синтез плацентарных гормонов во время беременности.
Заявленный способ имеет следующие приемы:
1. Исследовали плаценту рожениц (15 женщин), не болевших герпес-вирусной инфекцией ни до начала беременности, ни в период беременности;
2. Материал забирали в течение 60 мин после родов и в криостате изготовляли срезы, которые помещали на предметные стекла;
3. При температуре 37°C был заготовлен инкубационный раствор следующего состава (согласно рекомендации Z.Lojda (1962; 1965):
а) 0,1 М фосфатный буфер, pH 7,6 - 1 мл;
б) 2 ммоль раствора сквалена (фирмы "Ferak", Германия);
в) нитросиний тетразолий (фирма "ICN") 1 мг/мл фосфатного буфера (5 ммоль);
г) НАДФ (фирмы "Serva") 1 мг/мл фосфатного буфера (5 ммоль);
д) инкубация производилась при 37°C в течение 30 мин,
е) к инкубационному раствору добавляли содержимое из герпесных пузырьков, расположенных на слизистой гениталий беременных женщин в количестве 0,1 мл;
4. Контрольной инкубационной средой служил раствор, к которому не добавляли содержимое из герпесных пузырьков;
5. После инкубации срезы ополаскивались в дистиллированной воде и заключались в глицерин-желатину. Аналогичные операции проводились и с контрольными срезами.
В существующей литературе нет сведений, касающихся выявления активности сквалендегидрогеназы in vitro с добавлением в инкубационный раствор содержимого герпесных пузырьков, взятого у беременных;
6. После изготовления срезы просматривались под электрофотомикроскопом "Opton" (Германия), а участки срезов, как контрольных, так и опытных препаратов, фотографировали на одну пленку "Kodak color" (USA). После проявки сфотографированные участки цитофотометрировали с помощью компьютерной программы на цитофотометрической установке "Mekos" (регистрационное удостоверение МЗ РФ 29/10010198/1282-01). Руководство по эксплуатации 27543786.9443 001 РЭ;
7. Титр антител к вирусу герпеса определяли в крови рожениц иммуноферментным методом на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» (USA);
8. Исследования проводились на базе стационара акушерского отделения клиники Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН учреждения Российской академии медицинских наук. Все исследования были проведены с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. №266.
Изобретение относится к области медицины, а именно к способу выявления влияния герпес-вирусной инфекции на активность сквалендегидрогеназы гистохимическим методом на гистологических срезах плаценты при введении в инкубационный раствор содержимого герпесных пузырьков беременной со слизистой гениталий.
Прототипом аналогичного исследования может служить работа Довжиковой И.В. и Луценко М.Т. («Воздействие лазерного излучения на активность гистохимической реакции холестеринового обмена in vitro», журнал «Информатика и системы управления», 2009, №2 (20)). Однако эта работа существенно не сравнима с представленной заявкой по следующим показателям:
1. В ней речь идет об оценке изменения активности синтеза холестерина на заключительном его этапе - 7-дегидрохолестериндегидрогеназы, а не сквалендегидрогеназы; как разбирается в настоящей заявке;
2. Фактором воздействия на синтез холестерина в прототипе избрано действие лучей лазера, влияющих на конформацию молекулы холестерина. В представленной работе действующим началом является биологический объект - вирус герпеса, подавляющий синтез сквалендегидрогеназы, что угнетает дальнейший путь синтеза в направлении холестерина, а следовательно, и плацентарного гормонообразования, что, как общеизвестно, создает угрозу формирования фетоплацентарной недостаточности.
Активность сквалендегидрогеназы в наших исследованиях выявлялась по принципу метода, позволяющего оценить гистохимическим методом интенсивность стероидных дегидрогеназ, предложенному З.Лойда (1965).
- Реакция проходила, как предполагалось, когда в инкубационный раствор добавляется живой вирус герпеса, который может изменить активность реакции.
- Интенсивность реакции оценивалась цитофотометрически.
- В литературе не затрагивался вопрос исследования активности сквалендегидрогеназы, принимающей участие в синтезе холестерина, как предшественники плацентарных гормонов.
Причиной нарушения цепной реакции синтеза холестерина в плаценте мы избрали действие герпес-вирусной инфекции, взятой у беременных, перенесших обострение герпес-вирусной инфекции различной степени агрессивности; из герпесных пузырьков слизистой гениталий.
Цитофотометрический компьютерный анализ показал, что после добавления в инкубационный раствор 0,1 мл содержимого герпесных пузырьков со слизистой гениталий беременной, перенесшей обострение герпес-вирусной инфекции с титром антител к вирусу герпеса 1:3200, интенсивность реакции на сквалендегидрогеназу в плаценте снижалась до 3,01±0,28 усл.ед. (контроль - 3,81±0,5 усл.ед.; p<0,001). Если титр антител к вирусу герпеса в крови беременной определялся 1:6400, то активность сквалендегидрогеназы на срезах плаценты уменьшалась до 2,65±0,25 усл.ед. И, наконец, при увеличении титра антител к вирусу герпеса в крови беременной до
1:12 800, активность сквалендегидрогеназы снижалась до 2,31±0,3 усл.ед. (фигура 1, 2). Полученные данные показывают, что обострение герпес-вирусной инфекции во время беременности угнетающе действует на сквалендегидрогеназу и тем сильнее, чем выше титр антител к вирусу герпеса. Снижение активности скваленлегидрогеназы угнетает синтез холестерина, который крайне необходим для синтеза плацентарных стероидных гомонов, что в свою очередь создает угрозу формирования фетоплацентарной недостаточности.
На фигуре 1 изображена реакция на сквалендегидрогеназу в синцитиотрофобласте плаценты здоровой женщины через 60 мин после родов. Интенсивная реакция - 3,81±0,5 усл.ед.
На фигуре 2 изображена реакция на сквалендегидрогеназу в синцитиотрофобласте плаценты через 60 мин после родов. При выполнении реакции в инкубационный раствор добавлено 0,1 мл содержимого пузырьков герпеса G2 типа, взятых у беременной. Интенсивность реакции резко снизилась до 2,31±0,3 усл.ед.
Литература
1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. - 3-е изд. переработ. и доп. - М.: "Медицина", 1998. - 704 с.
2. Евстигнеева Р.П., Звонкова Г.А., Серебреннеков Г.А. Химия липидов. - М.: 1983. - 296 с.
3. Климов А.Н., Полякова Э.Д., Васильева Л.Е. - 1987. - Т.52. - в.2. - С.239-246.
4. Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Липиды, липопротеиды и атеросклероз. - СПб. Изд-во "Питер-Пресс", 1995. - 228 с.
5. Марир М., Гренер Д., Мейес П. Биохимия человека. - М.: "Мир", 1993. - Т.1. 384 с.
6. Лойда З., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы. Перевод с английского. - М.: «Мир», 1962. - 265 с.
7. Lojda Z. Remark on histochemical detection of dehydrogeniases. Intracellular localization. Folia Morphology. - 1965. - №3. - P.84-96.
8. Viola F., Brusa P., Balliano G. Inhibition of 2, 3 oxidosqualenecyclase and sterol biosynthesis by 10-and 19 azasqulene derivatives. // Biochem. Pharmacol. - 1995. - Vol.50. - №6. - P.787-796.