Актомиозины скелетных мышц глубоководных рыб

2003

Известия ТИНРО

Том 134

УДК 597-1.05

Е.П.Караулова, С.В.Леваньков, Е.В.Якуш, В.Н.Акулин

АКТОМИОЗИНЫ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ ГЛУБОКОВОДНЫХ РЫБ

Выполнено сравнительное исследование свойств актомиозинов и миозинов скелетных мышц глубоководных рыб. Изучены их общие свойства и отличительные особенности, установлен количественный состав миозинов и актомиозинов мышечных тканей некоторых видов глубоководных рыб: лемонемы (Podonema longipes), пепельного (Coryphaenoides cinereus) и малоглазого (Coryphaenoides pectoralis) макрурусов. Используя методы селективной экстракции миозина и актомиозина из скелетных мышц глубоководных рыб, удалось выделить основные миофибриллярные белки, охарактеризовать их биохимические свойства, количественный состав и определить молекулярные массы. Методом электрофореза установлены различия молекулярно-массовых и количественных характеристик состава миозинов скелетных мышц исследованных объектов.

Karaulova E.P., Levan'kov S.V., Yakush E.V., Akulin V.N. Actomyo-sins of deep-sea fishes skeletal muscles // Izv. TINRO. — 2003. — Vol. 134. — P. 321-333.

Actomyosins and myosins of skeletal muscles of deep-sea fishes (Podonema longipes, Coryphaenoides cinereus and Coryphaenoides pectoralis) were examined comparatively; their general properties and distinctive features were described; the quantitative composition was determined.

Purity of the myosin and actomyosin preparations was checked by means of disc-SDS-electrophoresis (PAGE-mode) and by means of ATP-sensitivity determination; stability of specific ATP-ase activity value was taken into account, as well. The native state of myosin and actomyosin preparations was inspected with ultraviolet fluorescence spectrum characteristics as the intensity of signal maximum, wavelength of emission, signal half-width, and the ratio of emission at 320 and 360 nm. Methods of selective extraction of myosin and actomyosin from skeletal muscles were used for the actomyosin and myosin separation. Basic myofibril proteins were extracted , their biochemical properties were described , the quantitative composition was determined, and the molecular weights were calculated. The myosin and actomy-osin specific activities, viscous properties and ultraviolet fluorescence characteristics were compared. The kinetics parameters of actomyosin superprecipitation were determined.

Stability of the actomyosin and myosin of skeletal muscles of deep-sea fishes at heat treatment was examined. The rate of heat denaturation had logarithmic dependence on heating time and exponential dependence on temperature value.

Distinction of molecular weights and quantitative composition of the myosin subunits from different fish species was determined by means of disc-SDS-electro-phoresis (PAGE-mode) and densitometry.

Актин и миозин — главные сократительные белки — являются, с одной стороны, основой надмолекулярных структур, а с другой, — взаимодействуя между собой (с образованием актомиозина), выполняют главную функцию мышечной системы — движение.

Актомиозины выделяют из различных видов мышц, используя растворы с высокой ионной силой. На основании многочисленных данных по сравнению исходных экстрактов установлены условия максимального и селективного экстрагирования миозинов и актомиозинов. Состав последних зависит от большого числа факторов, в том числе и от состояния и типа мышц, биологии объекта исследования. В основном миозин выделяют раствором Перри (Parry, 1981). Общее свойство всех актомиозинов и миозинов — расщеплять АТФ с образованием АДФ и неорганического фосфата. Миозиновая АТФаза активируется ионами кальция и ингибируется ионами магния. Образующийся при взаимодействии миозина и актина актомиозин обладает АТФазной активностью, активируемой ионами магния. В присутствии АТФ актомиозин диссоциирует на составляющие его актин и миозин в растворе с высокой ионной силой (более 0,5) и суперпреципитирует в растворе с низкой ионной силой (0,05-0,15). Миозины, выделенные из мышц разных типов (скелетная белая и красная, сердечная, гладкая), на разных стадиях онтогенеза, у животных разных видов, имеют характерные особенности, как функциональные, так и структурные (Johnson et al., 1977; Mornet et al., 1981; Bennet, 1983; Гиоева и др., 1984).

От объекта зависят прежде всего величина АТФазной активности миозинов и, что особенно важно, в том числе, при выделении данных белков, их устойчивость к денатурирующим воздействиям.

Составляя основу сократительного аппарата мышц, эти белки предопределяют особенности строения мышечных тканей и во многом биологическую подвижность в целом (Поглазов, Левицкий, 1982).

Цель данной работы — сравнительное исследование состава и свойств актомиозинов скелетных мышц некоторых видов глубоководных рыб.

В качестве объектов исследования использовали белые быстрые мышцы глубоководных рыб — макрурусов малоглазого (Coryphaenoides pectoralis), пепельного (Coryphaenoides cinereus) и лемонемы (Podonema longipes). Тушку рыбы разделывали: извлекали внутренности, снимали кожу, отделяли мышцы и удаляли красные боковые мышцы. Филе белых мышц замораживали в 50 %-ном глицерине при температуре минус 40 оС, хранили при температуре минус 24 оС и доставляли в лабораторию в течение 1 мес.

Актомиозины получали способом, описанным нами (Караулова и др., наст. сб.).

Миозины из скелетных мышц глубоководных рыб извлекали следующим образом. Мышечную ткань гомогенизировали 2 мин в растворе 0,1 М KCl, 10 мМ MgCl2, 1 мМ ЭДТА, 7,5 мМ KH2PO4 при рН 7. Миозин экстрагировали 1,56 М раствором сульфата аммония в этом же буфере. К полученному экстракту добавляли насыщенный раствор сульфата аммония. Осадок, полученный в интервале насыщения 35-50 %, отделяли фильтрованием, суспендировали в небольшом количестве раствора сульфата аммония 50 %-ной степени насыщения и диализовали против воды до полного растворения осадка в диализной ячейке и далее против пятикратного объема раствора Хассельбаха-Шнайдера (0,6 М KC1, 10 мМ Na4P2O7, 1 мМ MgCl2, 0,1 М K2HPO4), разбавленного в 10 раз. Полученный в диализной ячейке осадок миозина суспендировали в растворе Губа-Штрауба (0,15 М K2HPO4, 0,3 М KCl), разбавленном в 10 раз. Окончательную очистку миозина проводили "batch''-процедурой на DEAE-Sepharose 4В (Pharmacia Biotech AB, Швеция). Для этого суспензию миозина отфильтровали через слой сорбента, предварительно уравновешенного десятикратно разбавленным раствором Хассельбаха-Шнайдера, после чего слой сорбента промыли 20 объемами эквилибровочного буфера и 10 объемами воды. Затем перенесли сорбент в коническую колбу и добавили 2 объема 0,5 М KCl, рН 7. Перемешивали периодически 10 мин и отфильтровывали на фильтре

Шотта. Полученный в результате раствор очищенного миозина (по данным электрофореза не менее 95 %) использовали для работы. Выход очищенных миозинов составил 10-14 мг из 100 г сырой мышцы. По описанной процедуре получали миозин с максимальной АТФазной активностью.

АТФазную активность (ЕС 3.6.1.3) определяли методом Като (Kato et al., 1977; Seki, Narita, 1980) в следующих условиях: 0,1 мг/мл белка, 0,6 или 0,15 М KCl, 30 мМ трисхлоридный буфер, 2,5 мМ АТФ, 10 мин, 25 оС. Величину рН устанавливали на уровне 7,0 для вариантов определения при ионной силе 0,15 и 7,5 — при ионной силе 0,6 (Mori et al., 1980). Реакцию останавливали добавлением ТХУ.

АТФ-чувствительность (АТФчувств) миозинов определяли по методу Вебе-ра (Weber, Portzehl, 1952). Для этого с помощью капиллярных вискозиметров измеряли вязкость растворов 2-3 мг/мл белка в 0,5 М KCl до (потн) и после (Потн АТФ) добавления 1 мМ АТФ при 25 оС. Чувствительность к АТФ рассчитывали по формуле:

АТФчувСТв = (lgn - lgn АТФ) • 100/lgn АТФ.

чувств v 0 *отн 0 *отн. АТФ' 0 *отн. АТФ

Суперпреципитацию актомиозинов исследовали спектрофотометрическим методом. К реакционной смеси, содержащей 60 мМ KCl, 2 мМ MgCl2, 0,1 мМ CaCl2, 20 мМ трисгидрохлорида, рН 6,8 и 0,1 мг/мл актомиозина, при температуре 20 0С добавляли 1 мМ АТФ. Величину и скорость суперпреципитации определяли по графической зависимости абсорбции от времени при 540 нм.

Диссоциацию молекул миозина проводили используя различные варианты:

1. Диссоциация под действием растворов мочевины

Раствор миозина (актомиозина) 5-8 мг/мл в растворе Хассельбаха-Шнайдера перемешивали 2 ч при комнатной температуре с равным объемом 2-4 М мочевины, 5 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотреитола. Тяжелые цепи осаждали разбавлением водой, промывали раствором ЭДТА и исследовали методом электрофореза.

2. Термодиссоциация миозина

Раствор миозина 3-5 мг/мл в растворе Хассельбаха-Шнайдера инкубировали 4 мин при 53 оС или при 40 оС в течение 1 ч. Реакционную смесь быстро охлаждали до температуры 4 оС, отфильтровали. Из раствора осаждали белок добавлением сухого сульфата аммония до достижения степени насыщения 33 %. Выпавший осадок центрифугировали, промывали дважды раствором 0,05 М KCl, 5 мМ ЭДТА, 25 мМ трисхлорида, рН 7,2 и исследовали методом электрофореза.

3. Диссоциация под действием хлорида аммония

На льду к раствору миозина в 0,6 М KCl добавляли равный объем 9,4 М хлорида аммония. Через 10 мин добавляли свежеприготовленную суспензию сульфата аммония в 4,7 М растворе хлористого аммония. Выпавший после экспозиции реакционной смеси на холоду осадок отделяли центрифугированием, растворяли в 0,5 М KCl и диализовали против воды. Образовавшийся в диализной ячейке осадок отделяли центрифугированием, промывали раствором 0,05 М KCl, 5 мМ ЭДТА, 25 мМ трисхлоридного буфера, рН 7,2 и исследовали методом электрофореза.

4. Диссоциация под действием 5,5'-дитио-бас-2-нитробензойной кислоты

К раствору миозина (12-15 мг/мл) в 0,5 М KCl, 10 мМ ЭДТА, 0,01 М трисхлорида, рН 8,5 на льду добавляли небольшими порциями раствор ДТНБ до конечной концентрации 10 мМ. Ход реакции контролировали по величине оптической плотности раствора при 412 нм. Приблизительно через 10 мин реакцию останавливали, добавляя 10 объемов холодной воды для осаждения миозина. Осадок отделяли центрифугированием, промывали большим объемом воды и исследовали методом электрофореза.

Чистоту получаемых препаратов белков оценивали методом диск-ДСН-электрофореза в полиакриламидном геле. В качестве концентрирующего геля использовали полиакриламидный гель с концентрацией 3,5 %. Концентрирование осуществляли при силе тока 15 мА и напряжении 210-220 В. В качестве разделяющего геля использовали гели с постоянной концентрацией полиакрила-мида 10 и 15 %, а также градиентные гели с диапазоном концентраций 10-15 % полиакриламида. Разделяли при силе тока 5-7 мА и напряжении 100-110 В в течение 6-8 ч.

О степени нативности препаратов белков судили по величине соотношения А320/А360 (Туроверов, Щелчков, 1970) спектров ультрафиолетовой флуоресценции растворов или суспензий белков. Спектры флуоресценции записывали на приборе RF-5000 (Shimadzu, Япония) при длинах волн экстинкции (A,Ex) 260, 280 и 290 нм. Спектры ультрафиолетовой флуоресценции (УФФ) регистрировали в автоматическом режиме при ширине щели экстинкции 3-10 нм и эмиссии 5-15 нм. Для расчетов степени денатурационных изменений белков использовали формулу Туроверова-Щелчкова (Туроверов и др., 1975).

Концентрацию белка в растворах определяли по методу Варбурга—Христиана (Warburg, Christian, 1941; Layne, 1957). УФ-спектры регистрировали на приборе Hitachi 330 (Япония).

На рис. 1 приведена электрофореграмма миофибриллярных белков мышечных тканей глубоководных рыб.

Рис. 1. Состав и электрофоретическая подвижность белков лемонемы (1), макруруса пепельного (2), макруруса малоглазого (3) и белки-маркеры (4). Электрофорез выполнен в градиентном геле с диапазоном концентрации 10-15 %

Fig. 1. Composition and electrophoretïc mobility of proteins of Podonema longipes (1), Cory-phaenoides cinereus (2), Coryphaenoides pectora-lis (3) and standard proteins (4). Gradient PAGE with concentration diapason of polyacrylamide from 10 to 15 % was used

Анализ денситограмм, полученных сканированием окрашенных кумасси голубым пластинок электрофореграмм, позволил установить количественные соотношения основных миофибриллярных белков — актина и миозина (табл. 1). Эти соотношения являлись основным критерием при выборе удовлетворительного способа экстракции актомиозина, чтобы соотношение миозина и актина актомиозинового комплекса в экстракте было таким же, как в целой мышце.

Актомиозин скелетных мышц глубоководных рыб гидролизует АТФ, его АТФаза активируется ионами кальция и магния (табл. 2).

Таблица 1 Соотношение миозин/актин актомиозинового комплекса миофибрилл глубоководных рыб

Table 1

Myosin/actin ratio of deep-sea fishes myofibril's actomyosin complexes

Объект Соотношение

Макрурус пепельный

(Coryphaenoides cinereus) 2,85 Лемонема

(Podonema longipes) 2,76 Макрурус малоглазый

(Coryphaenoides pectoralis) 2,56

Таблица 2

активность (ЕС 3.6.1.3) актомиозинов, мкМ Pi мг-1мин-1

Table 2

ATPase activity (ЕС 3.6.1.3) of actomyosins, цМ P. mg-1min-1_

Источник актомиозина Катион присутствующий добавляемый Специфическая Ионная сила 0,15 активность Ионная сила 0,6

Лемонема 2,5 мМ Ca2+ 2,5 мМ Ca2+ 2,5 мМ Mg2+ 0,231 0,324 0,162 0,196 0,221 0,163

(Podonema longipes) 2,5 мМ Mg2+ 2,5 мМ Ca2+ 2,5 мМ Mg2+ 0,181 0,164 0,187 0,178 0,161 0,196

Макрурус пепельный 2,5 мМ Ca2+ 2,5 мМ Ca2+ 2,5 мМ Mg2+ 0,224 0,317 0,142 0,201 0,257 0,144

(Coryphaenoides cinereus) 2,5 мМ Mg2+ 2,5 мМ Ca2+ 2,5 мМ Mg2+ 0,167 0,138 0,179 0,171 0,140 0,178

Макрурус малоглазый 2,5 мМ Ca2+ 2,5 мМ Ca2+ 2,5 мМ Mg2+ 0,097 0,114 0,098 0,091 0,108 0,097

(Coryphaenoides pectoralis) 2,5 мМ Mg2+ 2,5 мМ Ca2+ 2,5 мМ Mg2+ 0,091 0,101 0,094 0,092 0,099 0,102

В присутствии АТФ актомиозины мышц глубоководных рыб диссоциируют на актин и миозин в растворах с высокой ионной силой (рис. 2).

Важной особенностью актомиозинов скелетных мышц глубоководных рыб является отсутствие эффекта восстановления вязкости даже в течение длительного (до 30 мин) промежутка времени, при том что разбавление в результате внесения раствора Mg-АТФ в раствор актомиозина было сведено к минимуму. Аналогичный эффект наблюдался и при исследовании диссоциации актомиози-нов под действием АТФ методом УФФ (рис. 3; табл. 3, на примере актомиозина скелетных мышц лемонемы).

Как видно из данных табл. 3, в отличие от изменений полуширины сигнала в спектре УФФ ^^^ денатурированных образцов, для процесса взаимодействия актомиозинов с АТФ наблюдается увеличение этого показателя без смещения сигнала в длинноволновую область спектра. В условиях эксперимента (реакции с АТФ) изменения характеристик УФФ-спектров необратимы. Характеристики УФФ-спектра актомиозина восстанавливаются только после переосаждения белка.

Из данных табл. 2 видно, что для актомиозинов мышц лемонемы и пепельного макруруса величины АТФа-зы, катализируемой ионами кальция в условиях низкой ионной силы, заметно выше. В то же время катализируемая ионами магния АТФаза в условиях как низкой, так и высокой ионной силы имеет соизмеримые величины. Для актомиозина мышц мак-руруса малоглазого величина АТФа-зы практически не зависит ни от ионной силы раствора, ни от типа иона-катализатора.

Время, мин

Рис. 2. Изменение относительной вязкости растворов актомиозинов скелетных мышц глубоководных рыб в процессе реакции с АТФ в растворах с высокой ионной силой: 1 — макрурус пепельный, 2 — лемонема, 3 — макрурус малоглазый

Fig. 2. Changing of relative viscosity of deep-sea fish's skeletal muscle actomyosins during reaction with ATP in high ionic strength solutions: 1 — Coryphaenoides cinereus, 2 — Podonema longipes, 3 — Coryphaenoides pectoralis

Рис. 3. Изменение УФФ-спектров актомиозина скелетных мышц лемонемы под действием различных концентраций АТФ в растворе с высокой ионной силой. Концентрация АТФ, мМ: 1 — 0; 2 — 0,5; 3 — 1,0; 4 — 2,0

Fig. 3. Changing of Ultra Violet Fluorescence (UVF) spectrums of Podonema longipes actomyosin of skeletal muscle during reaction with ATP in high ionic strength solution. ATP concentration, mM: 1 — 0; 2 — 0.5; 3 — 1.0; 4 — 2.0

В растворах с низкой ионной силой диссоциация (Магиуата, Geгgely, 1962) актомиозинов скелетных мышц глубоководных рыб сопровождается суперпреципитацией (СПП) (рис. 4, табл. 4).

Данные табл. 2 и 4 свидетельствуют, что величина СПП актомиозинов в растворах с низкой ионной силой коррелирует со значениями Mg-ATФазной активности, в то время как скорость СПП не зависит ни от величины АТФазы, ни от величины СПП.

Нами показано, что агрегация актомиозинов происходит также под действием температуры. С ростом температуры скорость агрегации существенно возрастает. Однако причиной снижения растворимости белка в данном случае

является тепловая денатурация. Методом УФФ (Туроверов, Щелчков, 1970; Ту-роверов и др., 1975) было установлено, что доля денатурированного белка логарифмически зависит от продолжительности нагревания (рис. 5, а), а константа скорости денатурации актомиозина имеет экспоненциальную зависимость от температуры в диапазоне 35-55 °С (рис. 5, б).

Таблица 3

Характеристики УФФ-спектра актомиозина лемонемы в зависимости от концентрации АТФ

Table 3

Characteristics of Ultra Violet Fluorescence spectrum of Podonema longipes actomyosin at the different ATP concentrations

№ спектра САТФ> мМ К , Em' нм AM , Max' отн. ед. A /A 320' 360 нм

1 0 332,0 30,27 1,536 306,6-366,4

59,8

2 0,5 332,0 3,50 1,675 304,6-367,2

62,6

3 1 332,0 1,04 1,593 302,0-369,2

67,2

4 2 332,0 - - -

Денатуриро ванный

образец* 346,4 7,2 0,367 321,6-402,8

±1,2 81,2

Примечание. САТф — концентрация АТФ; — длина волны максимума эмиссии; АМах — максимум эмиссии; А320 — эмиссия, соответствующая длине волны эмиссии 320 нм; А360 — эмиссия, соответствующая длине волны эмиссии 360 нм; ^1/2Ь — полуширина сигнала эмиссии. * — денатурация в 10 М мочевине при 80 оС, 5 мин.

Рис. 4. Суперпреципитация акто-миозинов скелетных мышц глубоководных рыб при взаимодействии с АТФ в растворах с низкой ионной силой: 1 — макрурус малоглазый; 2 — лемонема; 3 — макрурус пепельный

Fig. 4. Deep-sea fish's skeletal muscle actomyosins superprecipitation during interaction with ATP in low ionic strength solutions: 1 — Coryphaenoides pectora-lis; 2 — Podonema longipes; 3 — Coryphaenoides cinereus

0,04

012345678

<

0,2

о 0,18

4

5

ÈL0,16

с

S3 0,14 о

о0,12

ц

с

к

пз ^

о

¡Г 0,08

0,1

0 0,06

;

; 2 ,

; 3

; — jet**** .ШШШШШ ________________ 7.....Î

; t я * я • Я m 1

; j r".....»2 > t

: < / t к •

_.......» j - m

_ * ; 4'

Время, мин

Несмотря на то что диссоциация актомиозинового комплекса миофибрилл глубоководных рыб происходит достаточно легко, проблема изоляции миозинов требовала решения нескольких задач.

Основной задачей был подбор подходящего экстрагирующего раствора, который обеспечивал бы максимальные соотношение миозин/ актин и концентрацию белка в растворе после экстракции. Для этой цели использовали растворы с высокой ионной силой и различными значениями рН.

Таблица 4

Суперпреципитация актомиозинов

Table 4

Superprecipitation of actomyosins

Объект АЦ (max) Величина СПП AUMax - AUo Скорость СПП 11 /2' мин

Макрурус малоглазый

(Coryphaenoides pectoralis) 0,140 0,070 1,40

Лемонема

(Podonema longipes) 0,210 0,113 1,80

Макрурус пепельный

(Coryphaenoides cinereus) 0,155 0,106 1,13

Константа скорости денатурации, мин 1

0 1 2 3 4 5 35 40 45 50 55

Время термообработки, мин Температура, 0с

Рис. 5. Денатурация актомиозинов скелетных мышц глубоководных рыб

Fig. 5. Deep-sea fishes skeletal muscle actomyosin heat denaturation

График зависимости соотношения миозин/ актин и выхода белков от рН экстрагирующего раствора представлен на рис. 6, на котором видно, что наиболее селективно выделение миозина идет при рН 6,4-6,8. Этому условию удовлетворяют растворы Губа-Штрауба, Хассельбаха-Шнайдера и Перри (Шелудько, 1978). Максимальный выход миозина (экстрагируемых белков) достигается при более щелочных значениях рН экстрагирующего раствора (использовался раствор Ве-бера (Шелудько, 1978)). Однако раствор Вебера обладает низкой избирательностью и при длительной экстракции извлекает так называемый "нативный акто-миозин", содержащий практически все миофибриллярные белки, в то время как другие использованные нами растворы экстрагировали значительно меньшее количество регуляторных белков.

Для повышения селективности экстракции миозина мы исследовали влияние некоторых добавок и специальных условий на соотношение миозина и актина в конечном экстракте (рис. 7).

В качестве базового экстрагента использовали 0,3 М раствор хлористого калия с добавкой 5 мМ ЭДТА и 1 мМ дитиотреитола (1). Добавка к этому раствору до 10 мМ пирофосфата натрия (2) не увеличивала ни селективность, ни эффективность экстракции. В то же время добавка всего 1 мМ АТФ и 2 мМ хлористого магния при незначительном увеличении селективности экстракции обеспечивала заметное увеличение эффективности (3). Наоборот, предваритель-

ная обработка концентрата миофибрилл раствором с низкой ионной силой (4) сама по себе или в совокупности с последующей экстракцией с использованием Mg-ATP (5) обеспечивала максимальную селективность при невысокой эффективности экстракции. Однако при этом не удавалось избежать присутствия в экстрактах заметного количества регуляторных белков, что в значительной степени затрудняло получение препаратов индивидуальных миозинов.

Наиболее удовлетворительный результат по выделению свободного миозина был нами получен с использованием метода Б раггманна—Дженни (Bruggmann, Jenny, 1975) в сочетании с "batch''-процедурой. Несмотря на низкие выходы миозинов, данная схема позволила получить из скелетных мышц глубоководных рыб миозины с максимальной АТФазной активностью и минимальной АТФ-чувствительностью (табл. 5).

Соотношение миозин/актин в экстракте

2,5

1,5

0,5

Концентрация белков, мг/мл

6,2 6,4 6,6 6,! pH

7,2

Макрурус малоглазый  Макрурус пепельный  Лемонема

Рис. 6. Зависимость соотношения миозин/актин в экстрактах из мышц глубоководных рыб и экстрактивности белков миофибрилл (макрурус пепельный) от рН экстрагирующего раствора

Fig. 6. Dependence on myosin/actin ratio in extracts from deep-sea fishes muscles, extract content of myofibrillar proteins (example for Coryphaenoides cinereus is shown) and extractive solvent pH

Таблица 5

Характеристика миозинов скелетных мышц глубоководных рыб

Table 5

Characteristics of myosins of deep-sea fish's muscles

Объект

AU280/260 Са2+-АТФаза, АТФчувств, A320/A360

Лемонема

(Podonema longipes) 1,78 0,641 ±0,008 2,61 ±0,02 1,349

Макрурус пепельный

(Coryphaenoides cinereus) 1,82 0,534 ±0,004 2,32 ±0,03 1,423

Макрурус малоглазый

(Coryphaenoides pectoralis) 1,76 0,376±0,009 1,21 ±0,05 1,638

Миозины скелетных мышц глубоководных рыб в результате различных воздействий (табл. 6) диссоциировали с полным или селективным отделением легких миозиновых цепей. Это позволило точно определить молекулярные массы всех легких цепей, используя электрофорез в геле с высокой концентрацией акриламида (до 20 %) (рис. 8; приведены профили фрагментов денситограмм,

соответствующих подвижности белков с молекулярными массами 15-40 кДа), а также установить количественные соотношения субъединиц миозинов и рассчитать их молекулярные массы (табл. 7).

о о О

2,26

2,34

Рис. 7. Селективность и эффективность экстракции миозина из миофибрилл глубоководных рыб: 1 — 0,3 М KC1, 5 мМ ЭДТА, 1 мМ дитио-треитола; 2 — 0,3 М KC1, 5 мМ ЭДТА, 1 мМ дитио-треитола, 10 мМ Na4P207; 3 — 0,3 М KC1, 5 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреи-тола 1 мМ АТФ, 2 мМ MgCl2; 4 — предварительная экстракция 20 мМ трис-HCl, pH 7; экстракция по варианту 1; 5 — предварительная экстракция 20 мМ трис-HC1, pH 7; экстракция по варианту 3

Fig. 7. Selectivity and effectiveness of myosin extraction from myofibrils of deep-sea fishes: 1 — 0.3 М KC1, 5 тМ EDTA, 1 тМ dithiothrei-tol; 2 — 0.3 М KC 1, 5 тМ EDTA, 1 тМ dithiothrei-tol, 10 тМ Na4P207; 3 — 0.3 М KCl, 5 тМ EDTA, 1 тМ dithiothreitol 1 тМ ATP, 2

5,12

3,64

с

D Ю

8732""

5,13

3,56

3,85

1

2

3

4

mM MgCl2; 4

extraction by 20 mM TRIS-HCl, pH 7; extraction by the means of 1; 5 extraction by 20 mM TRIS-HCl, pH 7; extraction by the means of 3

Диссоциация миозинов Myosin subunits dissociation

5

preliminary preliminary

Таблица 6 Table 6

Объект

Условия обработки

Удаленные компоненты Мол. масса, ^a Отнесение

Лемонема б) 2,8 М мочевина 16,8-17,5-27,0 LC1-3

(Podonema в) 53 °С, 4 мин 16,8-17,5-27,0 LC1-3

longipes) г) 40 оС, 60 мин 16,8-27,0 LCp LC3

д) 4,7 М хлорид аммония 16,8 LC3

е) ДТНБ 17,5 LC2

Макрурус б) 2,8 М мочевина 16,5-17,3-27,2 LC1-3

пепельный в) 53 оС, 4 мин 16,5-17,3-27,2 LC1-3

(Coryphaenoides г) 40 оС, 60 мин 16,5-27,2 LCp LC3

cinereus) д) 4,7 М хлорид аммония 16,5 LC3

е) ДТНБ 17,3 LC2

Макрурус б) 2,8 М мочевина 16,8-18,0-28,5 LC1-3

малоглазый в) 53 оС, 4 мин 16,8-18,0-28,5 LC1-3

(Coryphaenoides г) 40 оС, 60 мин 16,8-28,5 LCp LC3

pectoralis) д) 4,7 М хлорид аммония 16,8 LC3

е) ДТНБ 18,0 LC2

6

Рис. 8. Диссоциация миозинов скелетных мышц глубоководных рыб: 1 — макрурус пепельный, 2 — лемонема, 3 — макрурус ма-логлазый; а — солераство-римые белки; б—е — соответствуют условиям обработки, приведенным в табл. 6. Фрагмент денситограм-мы — 15-40 кДа. Серым цветом выделены сигналы, соответствующие компонентам тропонинового и тропо-миозинового комплексов "нативных актомиозинов" Вебера; черным — сигналы легких цепей миозина

Fig. 8. Dissociation of deep-sea fishes skeletal muscle myosins: 1 — Coryphaenoides cinereus\ 2 — Podonema longipes\ 3 — Coryphaenoides pectoralis\ a — salt-soluble proteins; 6— e — treatment under the stipulations that are adjusted in tabl. 6. Densitogramm fragment — 15-40 kDa. ^ Grey lines — troponin and ^ tropomyosin subunits. Black lines — myosin light chains

Таблица 7

Соотношение субъединиц и молекулярные массы миозинов

Table 7

Myosin subunits ratio and molecular weights of myosin

Объект Мол. масса Соотношение Moл. масса

субъединиц, кДа цепей миозина, кДа

Лемонема 207,0 2,0 492

(Podonema 16,8 1,1

longipes) 17,5 2,0

27,0 0,9

Макрурус 207,0 2,0 490

пепельный 16,5 1,2

(Coryphaenoides 17,3 2,0

cinereus) 27,2 0,8

Макрурус 207,0 2,0 494

малоглазый 16,8 1,13

(Coryphaenoides 18,0 2,0

pectoralis) 28,5 0,87

Из данных табл. 7 видно, что для миозинов скелетных мышц глубоководных рыб характерно одинаковое соотношение тяжелых цепей и легкой цепи LC2, а соотношение легких цепей LC3: LCj — в пределах от 1,2: 1,0 до 2,5: 1,0. Однако это практически не влияет на молекулярные массы миозинов. Для всех исследованных объектов они составляют близкие величины — 490—494 кДа.

Таким образом, из миофибрилл скелетных мышц глубоководных рыб методом селективной экстракции актомиозина и миозина эти белки были выделены и охарактеризованы. Методом электрофореза и селективной диссоциации установлен количественный состав и определены молекулярные массы актомиози-нов скелетных мышц исследованных объектов. Изучены ферментативные свойства актомиозинов и миозинов скелетных мышц глубоководных рыб, определены величины активности кальций- и магний-катализируемых АТФаз. Вискози-метрическими и спектральными методами исследована реакция актомиозинов с АТФ в растворах с высокой и низкой ионной силой. Определены физико-химические параметры суперпреципитации актомиозинов скелетных мышц глубоководных рыб.

Литература

Гиоева Ф.К., Гельфанд В.И., Розенблат В.А. Белок, образующий с актином гель в экстракте селезенки, является миозином // ДАН СССР. — 1984. — Т. 274, вып. 5. — С. 1248-1249.

Караулова Е.П., Леваньков С.В., Якуш Е.В., Акулин В.Н. Качественный и количественный состав миофибриллярных белков некоторых видов глубоководных рыб // Наст. сб.

Поглазов Б.Ф., Левицкий Д.И. Миозин и биологическая подвижность. — М.: Наука, 1982.

Туроверов К.К., Хайтлина С.Ю., Пинаев Г.П. Флуоресцентные свойства и определение содержания нативного актина в его препаратах // Биохимия. — 1 975. — Т. 40, вып. 2. — С. 316-322.

Туроверов К.К., Щелчков Б.В. Исследование тепловой денатурации белков с помощью двухволнового метода регистрации изменений спектра их ультрафиолетовой флуоресценции // Биофизика. — 1 970. — Т. 1 5, вып. 6. — С. 965-972.

Шелудько Н.С. Исходные экстракты в методах выделения сократительных белков // Биофизические и биохимические методы исследования мышечных белков. — Л.: Наука, 1978. — С. 23-40.

Bennet H.S. The functional, comparative and evolutionary anatomy of myosins // Acta Biol. Hung. — 1983. — Vol. 34, № 1. — P. 1-23.

Bruggmann S., Jenny E. The immunological specificity of myosins from cross-strained muscles as revealed by quantitative microcomplement fixation and enzyme inhibition by antisera // Biochem. Biophys. Acta. — 1975. — Vol. 412, № 1. — P. 39.

Johnson D .H., Mccubbin W.D., Kay C.M. Isolation and characterization of myosin-like protein from bovin adrenal medulla // FEBS Lett. — 1977. — Vol. 77. — P. 69-74.

Kato N., Uchiiyama H., Tsukamoto S., Arai K. A biochemical study on fish myofibrillar ATPase // Nippon Suisan Gakkaishi. — 1977. — Vol. 43. — P. 857-867.

Layne E. Proteinbestimmung über UV-Extinktion (280/260 nm) // Meth. Enzy-mol. — 1957. — Vol. 3. — P. 447-454.

Maruyama K., Gergely J. Interaction of actomyosin with adenosine triphosphate at low ionic strength. I. Dissociation of actomyosin during the clear phase // J. Biol. Chem. — 1962. — Vol. 237, № 4. — P. 1095-1099.

Mori Y., Horie N., Tsuchiya T., Matsumoto J.J. Characterization of adenosine-triphosphatase of squid actomyosin // Bull. Jap. Soc. Sci. Fisheries. — 1980. — Vol. 46, № 12. — P. 1533-1537.

Mornet D., Bertrand R., Pantel P. et al. Structure of the actin-myosin interface // Nature. — 1981. — Vol. 292. — P. 301-306.

Parry D.A.D. Structure of rabbit skeletal myosin // J. Mol. Biol. — 1981. — Vol. 153. — P. 459-464.

Seki N., Narita N. Changes in ATPase activities and other properties of carp myo-fibrillar proteins during ice-storage // Nippon Suisan Gakkaishi. — 1980. — Vol. 46. — P. 207-213.

Warburg O., Christian W. Isolierung und Kristallisation des Gärungsferments Eno-lase // Biochem. Z. — 1941. — Vol. 310. — P. 384-421.

Weber H.H., Portzehl H. Muscle contraction and fibrous muscle proteins // Adv. Prot. Chem. — 1952. — Vol. 7. — P. 161-236.

Поступила в редакцию 24.04.03 г.