СРЕДСТВО ДЛЯ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ, РЕГЕНЕРАТИВНОЙ, ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ, ДЕТОКСИКАЦИОННОЙ, АДАПТОГЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ И СПОСОБНОЕ РЕГУЛИРОВАТЬ МЕТАБОЛИЗМ
AGENT FOR CATTLE, HAVING ANTI-INFLAMMATORY, REGENERATIVE, IMMUNOMODULATING, DETOXIFICATION, ADAPTOGENIC ACTIVITY AND ABLE TO REGULATE METABOLISM

Область техники
Изобретение относится к ветеринарии, в частности к ветеринарной терапии, и может быть использовано для стимуляции регенеративных процессов в организме крупного рогатого скота, для иммунокоррекции, коррекции нарушений обмена веществ, для детоксикации организма при инфекционных заболеваниях, пищевых или химических отправлениях, воспалительных процессах в организме животного, а также для адаптации к смене условий содержания.
Уровень техники
В профилактике и лечении заболеваний крупного рогатого скота, связанных с воспалением и повреждением тканей, нарушением функций иммунной системы, нарушениями обмена веществ, а также для адаптации животных к транспортному стрессу и стрессу при смене условий содержания применяются различные подходы, включающие узконаправленные средства и способы.
Известен способ лечения воспалительных заболеваний опорно-двигательного аппарата у крупного рогатого скота, включающий локальное воздействие на точки акупунктуры, которое выполняют выносным терапевтическим массажным электродом с чередованием частоты 77 и 10 Гц на биологически активные точки, расположенные в области пястного и запястного суставов, с последующим переходом к биологически активным точкам предплечья, плеча, лопатки и холки пояса грудных конечностей, при этом сеансы терапии проводят ежедневно в течение 11-15 минут на протяжении 7-10 дней (патент RU 2626599). Данный способ имеет очень узкую направленность и несет риски, связанные с воздействием токов на животное.
В профилактике и лечении таких послеродовых осложнений у коров, как эндометриты, применяются различные методы с применением антибиотиков. Однако, известен способ профилактики послеродового эндометрита у коров (заявка на патент RU 2016122507), включающий введение бактериофагового препарата однократно в дозе 30 мл внутриматочно через пластиковый одноразовый катетер после отделения последа. Преимуществом данного метода является неиспользование антибиотиков, однако безопасность бактериофагового препарата для животного и получаемой от него продукции недостаточно изучена.
Для профилактики и лечения маститов также зачастую применяются препараты антибиотикового ряда. Вместе с тем, известны и другие средства синтетического происхождения. Так, для лечения субклинического мастита, а также профилактики маститов других форм применяют препарат, диоксомаст (Заболеваемость коров маститом и применение нового эффективного препарата для лечения его субклинической формы // В.Ю. Комаров, Б.Л. Белкин), в состав которого входят диоксидин, ксантановая смола, лактам тетраметилендиэтилентетрамин, преднизолон и дистиллированная вода. Препарат обладает высоким антимикробным эффектом, широким спектром воздействия.
Для снижения последствий транспортного стресса у крупного рогатого скота применяют способ (патент RU 2271211), включающий введение в корм минеральной добавки - нейтрализованный белый шлам глиноземного производства известного состава, который вводят в корм один раз в сутки в течение 5-7 дней до транспортировки в дозе 200-300 г на голову в сутки. Применение минеральных добавок, получаемых в качестве отходов горнодобывающей промышленности несут большие риски, как для животных, так и для продукции от них получаемой.
Вместе с тем для адаптации крупного рогатого скота к новым условиям содержания применяется способ, описанный в патенте RU 2490011. Для этого животным внутримышечно в дозе 5,0-6,0 мл на голову с интервалом между инъекциями 7-10 дней вводят смесь медицинского раствора формальдегида с раствором хлорида натрия 0,85-0,95%-ной концентрации при их соотношении весовых частей 2-6:994-998, при этом композицию вводят двукратно. Раствор формальдегида несет риски не только для животного и продукции, от него получаемой, но для персонала, который сданным средством работает.
Как можно убедиться из приведенных аналогов, для решения описанных проблем со здоровьем крупного рогатого скота применяются различные разрозненные узконаправленные методы, которые не позволяют добиться полного восстановления структуры и функции поврежденных органов, а также восстановить нарушение в регуляторных системах организма (иммунная, нервная) и устранить системные нарушения обмена веществ.
Для комплексного решения приведенных проблем возможно применение достижений регенеративной медицины.
В области регенеративной медицины известен ряд изобретений. В частности, полученные химическим синтезом пептиды общей формулы (относительно короткие (по 11, 12, 13 и 14 аминокислотных остатков) фрагменты интерлейкина-2 человека) являются индукторами и/или потенциаторами ростстимулирующей активности макрофагов in vitro и обладают регенеративно-репаративным действием in vivo (заявка на изобретение RU 94023808/04). Данные пептиды могут применяться в медицине для лечения ряда заболеваний, сопровождающихся генерализованной активацией макрофагов (поражения печени, кожные раны, ожоги, политравма, диабет и др.). Подобные пептиды, получаемые синтетически имеют более низкую аффинность, а как следствие, и активность, по сравнению с соединениями, извлекаемыми из биологических систем при помощи биотехнологии.
В настоящее время разрабатывается ряд средств и способов в области регенеративной медицины, основанных на применении мезенхимальных стволовых клеток.
Известно изобретение, в котором изложены способы и композиции для применения в клеточной терапии (патент RU 2610427). В описываемом изобретении применение мезенхимальных стволовых клеток отдельно либо в сочетании с различными антигенами путем одновременного или последовательного введения в лимфатическую систему при иммуноопосредованных воспалительных заболеваниях.
0
Также известна кондиционная среда (патент RU 2292212), обладающая лечебным эффектом при термических ожогах на основе мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека и среды для их культивирования. Указанную среду получают путем сбора на стадии стационарного роста культуры стабильной клеточной линии мезенхимальных стволовых клеток, находящихся в G периоде клеточного цикла.
На основе различных клеток разработано средство для изменения скорости роста или репродукции клеток, которое стимулирует заживление ран и ожогов, позволяет корректировать косметический дефект, а также ингибирования старения кожи и способ стимуляции роста волос (патент RU 2280459). Композиции кондиционированной клеточной среды настоящего изобретения могут состоять из любой известной определенной или неопределенной среды и могут быть кондиционированы с использованием любых эукариотических клеток (стромальными клетками, паренхимными клетками, мезенхимными стволовыми клетками, резервными клетками печени, стволовыми нервными клетками, стволовыми клетками поджелудочной железы и/или эмбриональными стволовыми клетками). Также кондиционированная среда может быть также обработана для выделения и очистки продукта, например, в целях удаления нежелательных протеаз (гель-хроматография (с использованием матриц, таких как сефадекс), ионообменная хроматография, аффинная хроматография на хелате металла с нерастворимой матрицей, такой как перекрестно-сшитая агароза, ВЭЖХ-очистка и гидрофобная хроматография кондиционированной среды). Альтернативно, может оказаться необходимой стерилизация, и она может быть осуществлена методами, позволяющими обеспечить сохранение нужной биологической активности.
Следует отметить, что для описанных выше изобретений характерна крайне узкая направленность действия, в то время как мезенхимальные стволовые клетки обладают комплексным действием. Средство на их основе способно решить весь комплекс проблем, связанных с воспалением и повреждением тканей, нарушением функций иммунной системы, нарушениями обмена веществ, а также для адаптации животных к транспортному стрессу и стрессу при смене места содержания.
Выделение мезенхимальных стволовых клеток животных также известно. Это относится и к крупному рогатому скоту (патент RU 2482182).
В качестве прототипа заявляемого изобретения можно рассматривать комплексное средство иммуномодулятор-метаболик-детоксикант-адаптоген-радиопротектор (патент RU 2194502). В указанном средстве содержатся по крайней мере один экстракт плаценты, одно производное нуклеиновой кислоты и дополнительно хотя бы один витамин. Главным преимуществом описанного изобретения является комплексность действия. Вместе с тем, применение клеток плаценты несет некоторые риски, связанные с возможной малигнизацией клеток. Дополнение композиции производными нуклеиновых кислот и витаминов не способствуют стабилизации фармацевтической композиции, могут антагонистически влиять на основное действующее вещество. Вместе с тем, возможность применения указанного средства для решения проблем со здоровьем крупного рогатого скота, как и равно и побочные действие неизвестны.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение ставит перед собой задачу создания комплексного средства для крупного рогатого скота (далее - КРС), которое через воздействие на ствологенные элементы тканей обеспечивает замещение поврежденных клеточных элементов, что приводит к восстановлению поврежденной структуры и нарушенных функций органов и систем. Подобный подход позволит сконструировать безопасное средство, практически не обладающее побочными действиями, но вместе с тем проявляющее целый ряд фармакологических активностей: регенеративная (восстановление печени, органов опорно-двигательной системы, кожи и ее производных), иммуномодулирующая (профилактика и лечение инфекционных заболеваний, профилактика иммунодефицитов у животных и их потомства), детоксикационная (устранение последствий интоксикации различной этиологии), адаптогенная (снижение стресса и укрепление иммунитета при смене места содержания).
Технический результат достигается путем разработки ветеринарного средства для КРС на основе кондиционной среды, получаемой при культивировании видоспецифичных мезенхимальных стволовых клеток, содержащий комплекс биологически активных веществ белково-пептидной природы, обеспечивающих перечисленные виды фармакологической активности. При разработке описываемого средства применена биологическая стандартизация.
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) обладают способностью секретировать широкий спектр хемокинов и ростовых факторов, быстро реагировать на изменение гомеостаза ткани модификацией профиля их секреции, что обеспечивает природный механизм регенерации тканей. Показано, что основной вклад в регенерацию тканей вносит не замещение поврежденных клеток вводимыми клетками, а стимуляция собственного ствологенного потенциала организма. Указанный факт применен при создании описанного средства.
Описываемое изобретение представляет собой средство, состоящее из кондиционной среды мезенхимальных стволовых клеток КРС, может содержать экстракт мезенхимальных стволовых клеток, стабилизатор (глицин, сахароза или иной стабилизатор), консервант (хлорбутанолгидрат, фенол, хлороформ, нипагин или иной консервант), обладающее регенеративной, иммуномодулирующей, детоксикационной, адаптогенной, метаболической активностью. Применение видоспецифичных мезенхимальных стволовых клеток позволяет минимизировать риски от применения заявленного изобретения, связанные с возникновением аллергических реакций, непереносимостью препарата целевыми животными, а также онкогенностью.
Основу терапевтической активности заявляемого средства обеспечивают низкомолекулярные пептиды массой до 10 кДа. Это позволяет при необходимости применять очистку продукции методом ультрафильтрации, отсекая высокомолекулярные белковые фракции.
Изготовление заявляемого средства выполняется в следующие этапы:
2
Накопление клеточной массы и формирование кондиционной среды. На данном этапе могут применяться как свежевыделенные мезенхимальные стволовые клетки КРС, так и клетки после криогенного хранения. В качестве источника получения мезенхимальных стволовых клеток КРС применяют жировую ткань или костный мозг. Культивирование производят на жидкой питательной среде (DMEM, среда Игла, 199 или другая пригодная для этих целей среда) с добавлением сыворотки фетальной КРС в концентрации от 10±5% при температуре 37±2°С, содержании СО 5±0,2%. Накопление клеток проводится с целью сбора кондиционной среды, пригодность которой оценивают биологическим методом по обеспечению регенеративной активности на модели дермальных фибробластов мыши. Полученная кондиционная среда представляет собой активную фармацевтическую субстанцию.
Приготовление средства на основе кондиционной среды. Полученную кондиционную среду подвергают стерилизации (стерилизующая фильтрация с применением фильтра с диаметром пор не более 0,45 мкм или иной приемлемый метод), после чего асептически разливают и укупоривают. Дополнительно могут быть предусмотрены этапы сведения с экстрактом мезенхимальных стволовых клеток КРС (экстракт получают путем разрушения клеток физическими - замораживание-оттаивание, ультразвуковые волны - или иными методами), добавление стабилизатора (глицин, сахароза или иной приемлемый стабилизатор), добавление консерванта (хлорбутанолгидрат, фенол, хлороформ, нипагин или иной приемлемый консервант), а также сублимационное высушивание.
Краткое описание иллюстративного материала
Изобретение поясняется таблицами.
Таблица 1. Регенеративная активность фракций кондиционной среды.
Таблица 2. Данные биохимических показателей крови крыс.
Таблица 3. Данные по концентрации иммуноглобулинов в крови телят.
Таблица 4. Данные по содержанию соматических клеток в молоке.
Таблица 5. Данные биохимических показателей крови КРС.
Возможность осуществления изобретения и эффективность его применения поясняется примерами.
Пример 1. Описание получения средства.
3
3
Мезенхимальные стволовые клетки получали из подкожной жировой ткани коровы: под местной анестезией делали кожный разрез длиной 2-4 см, из места разреза отбирали кусок подкожного жира объемом 0,5-1,0 см, помещали в пробирку с буферным раствором (Biowest, USA), содержащим гентамицин (80 мкг/см, Биолот, Россия). Жировую ткань фрагментировали до однородной массы и проводили ферментативную обработку с добавлением антибиотика и антимикотика, а также фермента трипсина (Biowest, USA), выдерживали 20±10 минут при температуре 37±2°С и постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Повторяли описанную операцию дважды со снижением времени инкубации до 20±5 минут. Клеточную суспензию очищали от остатков тканей путем центрифугирования, клетки высевали в культуральные флаконы в ростовую среду, содержащую 90% питательной среды DMEM (ПанЭко, Россия) и 10% сыворотки фетальной КРС, культивировали при температуре 37±2°С и концентрации углекислого газа 5,0±0,2%.
После 24 часов культивирования производили замену среды. В дальнейшем замену среды выполняли раз в 3-4 суток. По достижении конфлюентности монослоя (контролируется визуально при помощи инвертированного микроскопа) не менее 85% его дезагрегировали диспергирующим раствором (0,05-0,1% трипсина (Biowest, USA) в растворе Версена (ПанЭко, Россия)) и проводили посев в новые культуральные флаконы с коэффициентом пересева от 1:3 до 1:6.
3
2
Для получения кондиционной среды культуру перевивали в течение не менее 3-4 пассажей, после чего выполняли посев в культуральные флаконы из расчета 5-20×10 клеток на 1 см площади ростовой поверхности и культивировали в описанных выше условиях. Качество кондиционной среды оценивали биологическим методом по обеспечению регенеративной активности на модели дермальных фибробластов мыши.
Полученная кондиционная среда может использоваться непосредственно по назначению для получения средства или храниться в течение продолжительного времени в определенных условиях (до семи суток - при температуре 5±3°С, более длительно хранение требует температуры не выше минус 18°С).
3
2
После сбора кондиционной среды, получали экстракт МСК: клеточный монослой дезагрегировали указанным выше диспергирующим раствором добавляли 0,9%-й раствор хлорида натрия (5-10 см на 25 см площади ростовой среды), подвергали замораживанию при температуре минус 20±2°С, после чего выполняли оттаивание при комнатной температуре. Полученный экстракт очищали от остатков клеток путем центрифугирования в течение 10 минут и добавляли в кондиционную среду.
3
При получении средства производилась добавление глицина в концентрации 22,5±2,5 мг/см, стерилизующая фильтрация через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм, асептический розлив и укупорка.
3
Оставшаяся кондиционная среда была разделена на три части: первая часть подвергалась стерилизующей фильтрации без предварительных воздействий, для второй части перед стерилизующей фильтрацией выполняли ультрафильтрацию на мембране с рейтингом пор 50 кДа, третью часть фильтровали на мембране с порами, отсекающими вещества массой свыше 10 кДа. Затем во все три полученные фракции добавляли глицин в концентрации 22,5±2,5 мг/см, после чего они подвергались по отдельности стерилизующей фильтрации через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм, после чего асептически разливались и лиофильно высушивались.
Таким образом, получали средство в виде двух лекарственных форм - раствор для инъекций и лиофилизат для приготовления раствора для инъекций.
Пример 2. Определение фракции, содержащей действующее вещество.
Для исследования фракции кондиционной среды, содержащей действующее вещество, была проведена ультрафильтрация через мембраны с рейтингом пор 1, 10 и 50 кДа. Полученные фракции исследовали биологическим методом на модели дермальных фибробластов мыши с целью установить биологическую активность. Контроль - ростовая среда, нормой активности считали не менее 10% зарастания нанесенного на клеточный монослой повреждения.
Было установлено (таблица 1), что в контроле и ультрафильтрате, содержащем вещества менее 1 кДа активность ниже нормы. Фракции цельной кондиционной среды, ультрафильтраты, содержащие фракции менее 10 и менее 50 кДа обладают активностью. Статистически значимых различий между ними не выявлено. Из изложенного можно заключить, что активные компоненты кондиционной среды обладают массой от 1 до 10 кДа.
Пример 3. Коррекция патологии печени.
Применение средства для коррекции патологии печени исследовалось на модели острого поражении печени (МОПП) крыс. Модель острого поражения печени была выполнена путем однократного введения крысам в желудок через зонд парацетамола (N-4-гидроксифенил)ацетамида) в виде суспензии в дозе 700 мг на 1 кг массы тела. В исследовании были три группы животных:
- интактные животные (не моделировали патологию);
3
- опытные животные (моделировали патологию, проводили терапию заявляемым средством; курс внутримышечного введения на 0, 3 и 5 сутки по 0,5 см на 100 г массы тела);
3
- контрольные животные (моделировали патологию, не проводили терапию, вводили по 1,0 см физиологического раствора).
За животными производили наблюдение в течение 10 дней, после чего животных выводили из эксперимента путем декапитации под легким эфирным наркозом. У животных отбирали кровь, в которой производилось биохимическое исследование. Перед забоем проводили исследование детоксикационной функции печени при помощи гексеналовой пробы.
В сыворотке крови определяли концентрацию общего белка (биуретовый метод), таких ферментов, как щелочная фосфатаза, аспартат-(АсАТ) и аланинаминотрансферазы (АлАТ), а также общий и конъюгированный билирубин. Исследованные биохимические параметры отражают функциональное состояние печени. Ферменты АсАТ и АлАТ присутствуют в значительных количествах в печени, почках и сердце, поэтому в норме концентрации АсАТ и АлАТ в крови невелики. При повреждении гепатоцитов происходит потеря ферментов АсАТ и АлАТ, и концентрация этих биохимических маркеров в крови возрастает.
Результаты исследования приведены в таблице 2. Полученные результаты свидетельствуют о следующем. Модель патологии сработала, так как в контрольной группе все исследованные показатели отличаются от показателей в группе интактных животных (время гексаналового сна и концентрации ферментов превышают, а концентрация белка сильно снижена). Так как исследованные показатели в группе опытных животных не отличаются от группы интактных животных, что указывает на исправление смоделированной патологии, можно заключить, что средство возможно применить для коррекции патологии печени.
Пример 4. Применение средства в терапии заболеваний кожи и ее производных.
Была исследована эффективность применения средства при заболеваниях кожи (раны, язвы, некрозы, абсцессы, дерматиты и другие заболевания), а также ее производных - копыт (флегмона венчика, дерматиты) у крупного рогатого скота.
Были отобраны животные с указанными заболеваниями - в контрольную и опытную группы. В контрольной группе применяли лечение традиционными средствами наружного применения, обычными для данного животноводческого хозяйства, в опытной группе - заявляемое средство в виде курса внутримышечных инъекций. Было показано сокращение сроков выздоровления (в среднем на 31,4%), более полное излечение заболевание, восстановление кожного покрова и структуры копыт. В опытной группе, в отличие от контрольной, не наблюдалось рецидивов.
Пример 5. Применение средства в терапии заболеваний опорно-двигательной системы.
Была исследована эффективность применения средства при заболевании опорно-двигательной системы (заболевания суставов - артрит, артроз, бурсит; заболевания костей - перелом, остеомаляция у телят).
Были отобраны животные с указанными заболеваниями - в контрольную и опытную группы. В контрольной группе применяли консервативное лечение, обычными для данного животноводческого хозяйства средствами, в опытной группе - заявляемое средство в виде курса внутримышечных инъекций. Было показано сокращение сроков выздоровления (в среднем на 42,3%), более полное излечение заболевания, восстановление структуры и функций кости и сустава. В опытной группе, в отличие от контрольной, не наблюдалось рецидивов.
Пример 6. Применение средства для профилактики иммунодефицитов у потомства коров.
Было исследовано влияние препарата на формирование иммунитета у телят на ранних сроках жизни. Было сформировано три группы телят: от коров, которым не вводили заявляемое средство, от коров, которым вводили заявляемое средство внутримышечно в день отела, а также от коров, которым вводили заявляемое средство дважды - за три дня до и в день отела.
3
3
3
Известно, что концентрация иммуноглобулина G (Ig G) в крови телят указывает на состояние иммунной системы теленка на ранних сроках жизни и позволяет прогнозировать его выживаемость. Так, при концентрации Ig G менее 5 мг/см выживаемость крайне низкая, при концентрации от 5 до 10 мг/см - средняя, если выше 10 мг/см, то высокая.
3
3
В проведенном исследовании (результаты приведены в таблице 3) показано, что в контрольной группе у телят Ig G в среднем ниже 10 мг/см, в то время как в опытных группах - выше 15 мг/см. Различия между контрольной и опытной группами статистически значимы. При двукратном применении коровам заявляемого средства наблюдается тенденция по увеличению данного показателя у телят, однако она статистически не значима.
Пример 7. Применение средства при субклинических маститах.
3
Было исследовано применение заявляемого средства в лечении скрытого (субклинического) мастита. Данный диагноз устанавливался на основании содержания соматических клеток в молоке (при содержании свыше 1 млн. клеток в см). Было сформировано 3 группы животных - контрольная (однократно применяли интрацистернальное средство), две опытные - однократно вводили внутримышечно средство без ультрафильтрации (цельная кондиционная среда) и средство после ультрафильтрации на мембране 50 кДа.
3
Результаты приведены в таблице 4. В контрольной группе концентрация соматических клеток в молоке не менялась в течение всего периода наблюдения. В то же время в опытных группах к третьим суткам в молоке увеличивалось содержание соматических клеток, что указывает на ускоренный выход поврежденных тканевых элементов, а уже с пятых суток наблюдения пришло в норму и в дальнейшем снизилось до значения около 300 тыс. кл./см, что характерно для высокосортового молока.
Пример 8. Применение средства при послеродовых осложнениях у коров.
Была исследована эффективность применения средства при послеродовых осложнениях у коров (задержание последа, эндометрит и другие).
Были отобраны животные с указанными заболеваниями - в контрольную и опытную группы. В контрольной группе применяли консервативное лечение, обычными для данного животноводческого хозяйства средствами, в опытной группе - заявляемое средство в виде курса внутримышечных инъекций. Было показано сокращение сроков выздоровления (в среднем на 23,4%), более полное излечение заболевания, восстановление формы матки (показано ректальным исследованием), а также ускоренными темпами наступало улучшение общего самочувствия животного (двигательная активность, аппетит, прием корма и воды).
Пример 9. Применение средства в качестве адаптогена.
Была исследована эффективность заявляемого средства в качестве адаптогена для крупного рогатого скота при смене места содержания. Для этого животных, предназначенных для отправки в другое хозяйство (расстояние более 200 км) разделили на две группы: контрольную (не применяли никаких манипуляций) и опытную (ввели однократно заявляемое средство). После транспортировки за животными наблюдали в течение одного месяца.
Было показано, что заболеваемость животных в контрольной группе инфекционными заболеваниями статистически значимо выше (47,5% от поголовья группы), чем в опытной (12,5% от поголовья группы).
Пример 10. Применение средства для детоксикации организма КРС.
Была исследована детоксикационная активность заявляемого средства. Для этого отбирались животные с атонией преджелудков различной этиологии, у которых наблюдалась выраженная картина интоксикации.
Животных с указанным заболеванием разделяли на контрольную и опытную группы. Для животных контрольной группы применяли консервативное лечение, для животных опытно группы его дополняли курсом внутримышечного введения заявляемого средства.
После 5 дней наблюдения животные контрольной группы начинали проявлять интерес к корму и воде, наблюдалась слабая руминация. В то же время, животные опытной группы проявляли интерес к корму и воде, наблюдалась руминация и повышение активности уже к концу третьих суток, а на пятые сутки были полностью здоровы.
Биохимические исследования крови, проведенные с целью изучения детоксикационной функции печени, показали, что у животных контрольной группы клиническая картина интоксикации подтверждается биохимическими маркерами (таблица 5). У животных опытной группы исследованные биохимические показатели были в норме уже на пятые сутки наблюдения.
Примечание * - здесь и далее статистически значимые различия на уровне р<0,05 по сравнению с контрольной группой