СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ГЛИОБЛАСТОМЫ ЧЕЛОВЕКА - T98G В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
METHOD OF HUMAN CELL GROWTH GLIOBLASTOMA CELL GROWTH SUPPRESSION - T98G IN EXPERIMENT

Способ относится к экспериментальной онкологии и может быть использован для подавления роста культуры клеток глиобластомы человека - T98G в эксперименте.
Изобретение основано на развитии открытия СССР, диплом №158 от 23.05.75 г. (см. Л.X. Гаркави, М.А. Уколова, Е.Б. Квакина. «Закономерность развития качественно отличающихся общих неспецифических адаптационных реакций организма» (режим доступа: http://ross-nauka.narod.ru/03/03-158.html), в котором, в зависимости от параметров воздействия магнитного поля, установлены различные изменения, происходящие на клеточном, органном и системном уровнях.
В мире за последнее десятилетие ежегодно отмечается рост заболеваемости злокачественными глиальными опухолями. За 2018 год в Российской Федерации впервые выявлено около 32100 больных с первичными опухолями центральной нервной системы, из них глиобластомы составили 15,6% (см. Первичные опухоли центральной нервной системы. Клинические рекомендации министерства здравоохранения Российской Федерации 2018. Режим доступа: http://cr.rosminzdrav.ru/#!/recomend/853).
Расширение возможностей подавления роста клеток злокачественных глиом путем привлечения вспомогательных физических факторов волновой природы, к которым относятся электромагнитные воздействия, представляют актуальную проблему экспериментальной онкологии.
Сегодня в мире, благодаря новым техническим возможностям, активно изучается и применяется новая технология - импульсная магнитотерапия (ИМТ).
Эта технология положительно зарекомендовала себя в неврологической практике при лечении больных с рассеянным склерозом. По имеющимся литературным данным, опыт применения ее в онкологии не велик, а для лечения больных со злокачественными глиальными опухолями головного мозга - вообще отсутствует. В разных странах, в экспериментах активно изучаются режимы с разными значениями параметров индукции, частоты и времени импульсного магнитного поля для выявления противоопухолевого эффекта и перспективы последующей интеграции в состав комплексного лечения больных злокачественными глиальными опухолями головного мозга.
В США так же проводится работа по изучению ИМП. Примером служит работа 2018 года «Specifically Targeted Electromagnetic Fields Arrest Proliferation of GlioblastomaMultiforme U-87 Cells in Culture» (см. CARMEN J. NARVAEZ et al., Anticancer Res. 2018 Jun; 38(6):3255-3266.doi: 10.21873/anticanres. 12590).
Сущность исследования состояла в том, что авторы проводили воздействие ИМП на культуру клеток глиобластомы U-87 в течение 54 часов, для этого использовали систему, получившую название ResonanceGeneratingFields ™ (RGFIELDS ™), которая может быть адаптирована для отдельных опухолей. Цель исследования состояла в том, чтобы определить, оказывает ли новое неинвазивное неионизирующее излучение ингибирующий эффект на пролиферацию мультиформных клеток глиобластомы.
Авторам удалось добиться противоопухолевого эффекта ИМП, достоверного снижения числа клеток культуры на 40% по сравнению с неэкспонированными контрольными клетками. Это явилось убедительным подтверждением доступности ИМП к механизмам опухолевого роста.
Следует указать, что авторы проводили только монофакторное исследование без вариации параметров воздействий ИМП и без сочетания с ионизирующим излучением, которое является обязательным компонентом лечения злокачественных глиальных опухолей головного мозга.
При этом в рассматриваемой работе длительность непрерывного воздействия ИМП составила более 2-х суток, а именно 54 часа, в то время как, в предлагаемом нами изобретении длительность воздействия ИМП составляет 7 минут - времени, достаточного для проявления ингибирующего влияние на клетки, как в самостоятельном, так и сочетанном с ионизирующим излучением вариантах.
Из патентных источников известен способ «Неинвазивный способ подавления роста опухолевых тканей и их омертвления» (см. патент RU 2665621 С2, опубл. 03.09.2018 г., Бюл. 25), сущность которого состоит в воздействии на ДНК клеток опухоли нетепловым сверхвысокочастотным электромагнитным полем, частота которого совпадает с собственной частотой крутильных колебаний ДНК.
2
Авторами подробно изложена методика расчета параметров применяемого магнитного поля: 1) используется нетепловой уровень плотности потока мощности электромагнитного поля, равной 0,2 мВт/см; 2) частоту выбирают равной собственной частоте крутильных колебаний спиралей ДНК клеток опухоли, которую вычисляют по формуле: ƒ=k⋅N-1/2, где k=2,175×1013 Гц, N - число пар нуклеотидов ДНК клетки опухоли, при этом облучение проводят в течение 6Vd-l, где Vd=(К-Ко)/(КоΔt), где Ко - начальное число клеток опухоли, К - конечное, Δt - отрезок времени между двумя измерениями.
Авторы полагают, что приемлемое время экспозиции должно составлять не менее 4-5 часов поскольку «клетки опухоли, в отличие от других клеток, делятся крайне быстро (высокий коэффициент пролиферации), в то время как в предлагаемом нами способе эффективное разовое воздействие длится не более 7 минут. При всей оригинальности подхода авторы утверждают, что сверхвысокочастотное электромагнитное поле по методике с такой экспозицией будет губительным для опухоли, но, при этом, абсолютно безвредным для окружающих органов и тканей, однако доказательства этого отсутствуют, т.к. эксперименты In VIVO не проводились.
Таким образом, проведенный анализ работ в доступной отечественной и зарубежной литературе показал верность выбора ИМП, как фактора, подавляющего жизнеспособность культуральной формы злокачественной глиомы человека, при этом поиск эффективного воздействия ведется только с использованием режимов высоких частот и большой экспозиции. Это позволяет прийти к заключению об отсутствии достоверных данных о подавлении роста культуры клеток глиобластомы человека с помощью кратковременного низкоинтенсивного низкочастотного импульсного магнитного поля. Кроме того, в настоящее время остаются не разработанными способы подавления роста культуры клеток глиобластомы человека при помощи сочетания ионизирующего излучения и ИМП, что может соответствовать потребностям и перспективам трансляционной медицины.
Техническим результатом предлагаемого способа является повышение летальности и снижение митотического индекса роста культуры клеток глиобластомы человека в эксперименте путем сочетанного воздействия ионизирующего излучения и ИМП.
2
Технический результат достигается тем, что культуру клеток глиобластомы человека T98G подвергают последовательному воздействию сначала ионизирующего излучения в дозе 10 Гр с использованием аппарата TheratronEquinox фирмы BestTheratronics, затем воздействию импульсного магнитного поля с использованием последовательности режимов частот, близких к эндогенным частотам головного мозга, при этом воздействие импульсного магнитного поля проводят при помощи аппарата «Нейро-МС/Д терапевтический расширенный» компании «Нейрософт» в режиме частот F=0,3 Гц (t=5 мин), F=3 Гц (t=1 мин), F=9 Гц (t=1 мин), t общее = 7 мин при В=15 мТл, сразу после этих воздействий культуру помещают в мультигазовый инкубатор СВ 150 с контролируемыми условиями - 5% СО, 37°С и 95% влажности, анализ результатов проводят через двадцать четыре часа после воздействия.
Изобретение «Способ подавления роста культуры клеток глиобластомы человека T98G в эксперименте» является новым, так как сочетание применения импульсного магнитного поля в режимах частот F=0,3 Гц (t=5 мин), F=3 Гц (=1 мин), F=9 Гц (t=1 мин), t общее = 7 мин при параметре индукции - 15 мТл с ионизирующим излучением 10 Гр позволяет достичь повышения летальности и снижение митотического индекса роста культуры клеток глиобластомы человека в эксперименте.
Изобретение является промышленно применимым, так как может быть использовано в экспериментальной онкологии, в научно-исследовательских онкологических институтах, в экспериментальных и клинических исследованиях возможностей сочетанного применения ИМП в определенных режимах и ионизирующего излучения для повышения летальности и снижения митотического индекса роста культуры клеток глиобластомы человека в эксперименте.
Способ подавления роста культуры клеток глиобластомы человека в эксперименте осуществляется следующим образом.
2
Культуру клеток глиобластомы T98G из коллекции КККП ИНЦ РАН засевают в шесть планшетов фирмы Biofil так, чтобы в каждой лунке планшета число клеток составляло не менее 800000 клеток на 3 мл питательной среды, затем инкубируют (в мультигазовом инкубаторе СВ 150 («Binder», Германия) в условиях контролируемых 5% CO, 37°С и 95% влажности) в течение 24 часов до достижения конфлюэнтности выше 70%. После этого проводится ионизирующее излучение на аппарате TheratronEquinox фирмы BestTheratronics, где в качестве источника излучения использовался кобальт-60, при этом доза излучения для каждой лунки составляет 10 Гр. Затем проводится воздействие ИМП с учетом принципов активационной электромагнитотерапии в режимах частот, близких к эндогенным ритмам мозга (см. Атмачиди Д.П. Адъювантная химиолучевая терапия с применением магнитного поля в комплексном лечении злокачественных глиальных опухолей головного мозга. Автореф. дис... кандид. мед.наук. Ростов-на-Дону, 2009.; см. Жукова Г.В., Шихлярова А.И., Солдатов А.В., Бартенева Т.А., Петросян В.И., Гудцкова Т.Н., Брагина М.И., Положенцев О.Е., Шейко Е.А., Мащенко Н.М., Ширнина Е.А., Златник Е.Ю., Куркина Т.А. Некоторые подходы к активизации механизмов противоопухолевой резистентности и функциональные аналоги категорий синергетики. Биофизика. 2016;61(2):303-315.). Процедура выполняется на аппарате «Нейро-МС/Д терапевтический расширенный» компании «Нейрософт» в режиме частот F=0,3 Гц (t=5 мин), F=3 Гц (t=1 мин), F=9 Гц (t=1 мин), t общее = 7 мин при параметре индукции - 15 мТл. Всего в эксперименте используется шесть планшетов. Один планшет подвергается монофакторному воздействию ионизирующего излучения, два планшета - ИМП в двух режимах и два планшета - последовательному сочетанию этих воздействий. Контрольным служит планшет, который не подвергается воздействию вышеуказанных физических факторов (см. 1 табл.).
2
После воздействий культуру помещают в мультигазовый инкубатор СВ 150 с контролируемыми условиями - 5% CO, 37°С и 95% влажности. Анализ результатов проводится в двух контрольных временных точках: через три и через двадцать четыре часа. Для снятия клеток с подложки используется раствор DPBS и раствор Трипсин Версена в соотношении 1:1. Подсчет общего количества клеток, а так же количества живых и мертвых клеток проводится в клеточном анализаторе JuLiFLNanoEntek с использованием 0,4% раствора красителя трипанового синего в соотношении 1:1. Летальность определяется по процентному соотношению числа мертвых клеток к общему количеству клеток. Митотический индекс определяется в десяти полях зрения по процентному соотношению числа делящихся клеток к общему количеству клеток при помощи микроскопа Leica DMIL LED Fluo. Полученные данные обрабатываются на персональном компьютере с использованием пакета статистических программ «Statistica 10.0» с вычислением критерия достоверности Стьюдента (t). Статистически значимым считается различие с вероятностью безошибочного прогноза не менее 95%, т.е. р<0,05.
При сравнении показателей летальности между исследуемыми группами было установлено, что через 3 часа минимальный процент гибели культуры клеток глиобластомы отмечался в контрольной группе. Напротив, максимальный уровень мертвых клеток был зафиксирован в образцах культуры T98G после воздействия ионизирующего излучения (18,7% против 5,2% в контроле, р≤0,05). После сочетания ионизирующего излучения с ИМП с индукцией в 15 мТл результаты были сопоставимы с лучевым воздействием, а при индукции 300 мТл - на 20% ниже. При этом разница с контрольными данными была существенной, и наблюдаемое увеличение летальности клеток культуры T98G в 2,9 раза свидетельствовало о выраженном ингибирующем влиянии используемых факторов.
Применение ИМП в монорежиме (без лучевого воздействия) в режиме частот F=0,3 Гц (t=5 мин), F=3 Гц (t=1 мин), F=9 Гц (t=1 мин), t общее=7 мин с разной индукцией в 15 или 300 мТл характеризовалось самостоятельным противоопухолевым действием, а именно, увеличением показателей летальности клеток глиобластомы соответственно в 2,5-2,8 раза выше по сравнению с контролем (Табл. 2).
Через 24 часа наблюдения показатели в контрольной группе оставались на низком уровне летальности при наивысших значениях митотического индекса клеток культуры T98G. Высокую эффективность проявило сочетание ионизирующего излучения в дозе 10 Грей и ИМП с индукцией 15 мТл. Наиболее глубокое подавление митотической активности глиальных клеток T98G наблюдалось при воздействии в монорежиме ИМП с индукцией 15 мТл: митотический индекс клеток глиобластомы по сравнению с контролем, снизился в 4,7 раза, а летальность увеличилась в 2,3 раза (Табл. 3).
Таким образом, полученные экспериментальные данные по достоверному повышению летальности и снижению митотического индекса в культуре клеток злокачественной глиомы человека T98G, свидетельствуют о высокой значимости сочетанного воздействия факторов специфической и неспецифической природы: ионизирующего излучения и ИМП, оказывающими ингибирующее влияние на клетки опухоли мозга. Кроме того, при использовании ИМП в монофакторном режиме были установлены достоверные различия с контролем: влияние ИМП убедительно демонстрировало эффекты повышения летальности и снижения митотического индекса злокачественных клеток культуры T98G. Вместе с тем, было обнаружено различие в эффективности разных режимов интенсивности при одинаковом поличастотном алгоритме ИМП, свидетельствующее о предпочтительном использовании «малых доз» воздействия в соответствии с принципом нелинейности в реакциях живых клеточных систем.
Технико-экономическая эффективность способа заключается в том, что его применение позволяет достичь подавления жизнеспособности клеток глиобластомы человека за счет повышения летальности и снижения митотического индекса роста культуры клеток глиобластомы человека в эксперименте.