СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГРИБНОЙ БЕЛКОВОЙ БИОМАССЫ
METHOD OF OBTAINING FUNGAL PROTEIN BIOMASS

Область техники
Изобретение относится к биотехнологии и фармакологии и касается способа получения пищевого белка путем микробиологического синтеза. Наиболее эффективно настоящее изобретение может быть использовано в пищевой и медицинской промышленности.
Уровень техники
Традиционными источниками грибного белка в рационе питания человека являются плодовые тела штаммов высших съедобных грибов родов Agaricus, Flammulina, Lentinula, Morchella, Panus, Pholiota, Pleurotus, Volvariella и др., получаемые методом твердофазного культивирования. Применение индустриальных методов получения грибной биомассы путем микробиологического синтеза способствует не только интенсификации процесса культивирования изученных штаммов высших съедобных грибов, но также расширяет диапазон потенциально возможных продуцентов.
Известен способ получения белковой биомассы штамма Pleurotus ostreatus ВКПМ F - 697 методом глубинного культивирования в условиях аэрации на питательной среде с последующими стадиями выделения и сушки биомассы [RU 2092559, С12Р 21/00, C12N 1/14, C12N 1/14, C12R1:645, опубл. 10.10.1997]. Процесс ферментации осуществляют в диапазоне рН от 6,0 до 7,5 и температуре от 26 до 28°С в условиях аэрации (0,5 л воздуха/л среды в мин) на различных питательных средах с добавлением от 0,1 до 3% ПАВ (костный жир или растительные масла - подсолнечное, кукурузное) по объему. Посевной материал предварительно «захолаживают» при температуре от 4 до 6°С в течение от 4 до 24 ч, что, по мнению авторов, позволяет в дальнейшем значительно сократить длительность ферментации за счет получения нескольких максимумов в динамике роста культуры. Отделение биомассы осуществляют путем фильтрации культуральной жидкости. Процесс ферментации продолжается от 24 до 48 ч. Выход сухой биомассы составляет от 13 до 23 г/л, массовая доля сырого протеина - от 20 до 50% на АСМ. Недостатком данного способа является длительный способ подготовки посевного материала методом «захолаживания», а также применение дополнительного компонента питательной среды - ПАВ (костный жир или растительные масла - подсолнечное, кукурузное), что удорожает процесс получения биомассы, а также периодичность процесса, что является технологически не эффективным.
Известен способ получения белковой биомассы штамма Pleurotus ostreatus ВКПМР-720 [RU 2126835, С12Р 21/00, С12N 1/14, С12R 1:645, опубл. 27.02.1999] в глубинных условиях, в основе которого лежит отъемно-доливной метод. Продолжительность одного цикла составляет от 30 до 35 часов, при этом объем отбираемой культуральной жидкости составляет от 40 до 50% от общего объема. Продолжительность процесса составляет от 2,5 до 3 месяцев. Посевной материал предварительно "захолаживают" при температуре от 4 до 12°С в течение от 4 до 8 ч. Процесс ферментации осуществляют в диапазоне рН от 6,0 до 7,5 и температуре от 26 до 28°С в условиях аэрации (0,5л/л/мин) на различных питательных средах с добавлением 0,1-1% ПАВ по объему. Выход сухой биомассы составляет от 13 до 20 г/л, массовая доля сырого протеина - от 20 до 50% на АСМ. Недостатком способа является сравнительно невысокая продуктивность штамма по биомассе, а также использование дорогостоящих ПАВ.
4
2
4
4
2
4
Известны способы получения белковой биомассы штаммов Pleurotus ostreatus 2-204 ВКПМ F-811 [RU 2189395, С12Р 21/00, C12N 1/14, C12N 1/14, C12R1:645, опубл. 20.09.2002] и штамма Panus tigrinus 3-204 ВКПМ F-810 [RU 2186851, С12Р 21/00, C12N 1/14, C12N 1/14, C12R1:645, опубл. 10.08.2002] в глубинных условиях отъемно-доливным методом с последующими стадиями отделения биомассы путем фильтрации культуральной жидкости и сушки биомассы при температуре 60°С. Продолжительность одного цикла составляет 60 ч с отъемом культуральной жидкости в количестве от 40 до 50% от общего объема. Процесс ферментации осуществляют в диапазоне рН от 5,8 до 6,2 и температуре от 26 до 28°С и от 32 до 34°С для штаммов Pleurotus ostreatus и Panus tigrinus соответственно, в условиях аэрации (от 0,8 до 1,0 л/л/мин) и перемешивания на питательной среде, содержащей сухую или нативную молочную сыворотку от 80 до 100 г/л, (NH)SO - 0,250 г/л или (NH)HPO - 0,125 г/л. На начальной стадии в течение от 18 до 20 ч культивирования штаммов в качестве пеногасителя используют стерильное подсолнечное нерафинированное масло в концентрации 0,05 об.% к рабочему объему аппарата. Выход сухой биомассы составляет от 17 до 25 г/л, массовая доля сырого протеина для штаммов Pleurotus ostreatus и Panus tigrinus - от 28 до 40% и от 36 до 40% на АСМ соответственно. Недостатком данных способов является длительность процесса культивирования штаммов, а также сравнительно небольшое значение массовой доли сырого протеина в биомассе.
Известен способ получения белковой биомассы пищевого и кормового назначения штаммов Penicillium nonatum и Penicillium chrysogenum [US 3865951; C12j 13/06, A23j 3/00, опубл. 11.02.1975] методом глубинного культивирования с последующими стадиями отделения биомассы от культуральной жидкости, промывки биомассы, фильтрации, сушки. В качестве субстратов для культивирования штаммов-продуцентов предполагается использование различного растительного сырья, например фуражная пшеница, гидролизаты картофеля, мелассы, багассы и/или цитрусовых отходов. Культивирование предполагается осуществлять в диапазоне температур от 25 до 35°С, предпочтительно около 30°С, в диапазоне рН от 4,0 до 7,0, поддерживая значение рН на уровне, соответствующем максимальной скорости роста. Количество посевного материала на стадии ферментации составляет от 5 до 10% по объему, предпочтительно 10%. Целесообразно внесение в питательную среду витаминов (например, биотина) для обеспечения максимальной скорости роста культуры, а также нетоксичного пеногасителя. Продолжительность периодического процесса культивирования в условиях аэрации и перемешивания составляет от 20 до 48 часов, в случае применения лактозы в качестве углеродного субстрата время культивирования может быть увеличено до 72 часов. Процесс лимитирован по основному субстрату. Массовая доля сырого протеина в полученной биомассе составляет от 43 до 47% (общий азот по Къельдалю - от 6,81 до 7,53%, коэффициент пересчета -6,25). Недостатком данного способа является сравнительно невысокое содержание белковых веществ в полученной биомассе.
Известен способ получения белковой биомассы штамма Neurospora sitophila [US4938972, A23L 1/00; опубл. 03.07.1990; Moo-Young, 1993. Fermentation of cellulosic materials to mycoprotein foods/ Murray Moo-Young, Yusuf Chisti, Dagmar Vlach // Biotech Adv. - 1993. - Vol.11, - pp.469-479] методом глубинного культивирования на различных зерновых отходах, подвергнутых предварительному щелочному гидролизу. Культивирование осуществляют в диапазоне рН от 5,5 до 7,5 и температуре от 20 до 40°С, предпочтительно при 26°С, в условиях аэрации (от 0,5 до 1,0 л/л/мин) и перемешивания. Необходимое содержание растворенного кислорода в среде составляет около 50%, уровень ниже 30% приводит к резкому снижению продуктивности. Количество посевного материала составляет от 3 до 10% от рабочего объема ферментера. Процесс осуществляют периодическим и непрерывным способом. При этом наиболее эффективными для данного процесса являются аппараты с относительно невысокой интенсивностью перемешивания (аэрлифтный биореактор), нежели аппараты с механическим перемешиванием. Окончание процесса определяют по достижении культурой стационарной фазы роста. Массовая доля сырого протеина в биомассе составляет от 30 до 60% на АСМ. Недостатком данного способа является низкая продуктивность по белковым веществам - от 2,2 до 2,6 г/л.
4
3
2
4
Известен способ получения пищевой мицелиальной биомассы штаммов рода Polyporus. Polyporus squamosus и Polyporus brumalis [US 4212947, C12N 1/14, C12R 1/645, опубл. 10.07.1980] методом глубинного культивирования с последующими стадиями выделения биомассы путем фильтрации (на фильтр-прессе или вакуум-фильтре) или сепарирования и распылительной сушкой биомассы. Культивирование осуществляют отъемно-доливным методом при температуре от 24 до 28°С, рН от 6,0 до 7,0, аэрации от 0,6 до 1,0 л/л/мин на питательной среде следующего состава, мас.%: меласса от 4 до 5%, NHNO - 0,2%, КНРO - 0,12%, растительное масло - 0,04% в качестве пеногасителя. Концентрация посевного материала составляет 10 об.%. Продолжительность первого цикла составляет 24 ч, последующих циклов от 5 до 7 ч с отъемом культуральной жидкости в количестве 50% от общего объема. Продолжительность процесса составляет от 1 до 5 суток. Выход биомассы - 9 г/л АСМ. Массовая доля сырого протеина - от 50 до 60%. Недостатком данного способа является незначительное накопление биомассы, что приводит к увеличению количества производственных циклов и большим затратам воды.
Известен способ получения пищевой мицелиальной биомассы грибов рода Fusarium: штаммов видов Fusarium graminearum, Fusarium oxyspomm и Fusarium solani [US 4501765, A23J 3/00, опубл. 26.02.1985; US 4555485, С12Р 21/00, C12R 1/77, опубл. 26.11.1985] методом глубинного культивирования с последующими стадиями отделения биомассы от культуральной жидкости, промывки, фильтрации, денуклеинизации биомассы, сушки. В качестве субстратов для культивирования штаммов-продуцентов предполагается использование различного углеродсодержащего сырья (крахмал, крахмалсодержащее сырье, а также продукты их гидролиза, сахароза, сахарозосодержащее сырье и их гидролизаты (инвертный сахар и т.д.), гидролизованный картофель, меласса, глюкоза, мальтоза, гидролизованный крахмал бобовых или кассава). Культивирование осуществляют в диапазоне температур от 25 до 34°С, предпочтительно 30°С, количеством посевного материала на стадии ферментации от 5 до 10% по объему, в диапазоне рН от 3,5 до 7,0, предпочтительно поддерживать на постоянном уровне, соответствующем максимальной скорости роста культуры. Предпочтительно внесение в питательную среду витаминов (например, биотина) для обеспечения максимальной скорости роста культуры, а также нетоксичного пеногасителя. Процесс осуществляют периодическим [US 4501765, A23J 3/00, опубл. 26.02.1985] и непрерывным [US 4501765, A23J 3/00, опубл. 26.02.1985; US 4555485, С12Р 21/00, C12R 1/77, опубл. 26.11.1985] способом. Продолжительность периодического процесса культивирования в условиях аэрации и перемешивания составляет от 20 до 48 часов. Процесс лимитирован по основному субстрату. Массовая доля сырого протеина в полученной биомассе составляет от 45 до 61% (общий азот по Къельдалю - от 7,2 до 9,9%, коэффициент пересчета - 6,25). Процесс снижения содержания РНК в биомассе осуществляют путем воздействия на нее растворителей (низших спиртов, содержащих не более 3 атомов углерода) в концентрации от 40 до 100% в течение от 1,5 до 40 мин при температуре от 45 до 60°С [US 4501765, A23J 3/00, опубл. 26.02.1985] или путем резкого нагревания биомассы до температуры свыше 68°С, предпочтительно от 72 до 74°С, в течение от 30 до 45 мин [US 5739030, C12N 1/14, опубл. 14.04.1998]. Способ позволяет снизить содержание РНК до уровня менее 2%, однако потери биомассы при этом составляют от 30 до 33%. Недостатком данного способа является повышенное содержание в полученной биомассе РНК (от 7 до 12%), что существенно снижает допустимое для потребления человеком количество биомассы (не более 2 г в сутки) и требует проведения стадии ее денуклеинизации, что, в свою очередь, приводит к потере биомассы (от 30 до 33% АСМ).
Таким образом, в настоящее время не известен способ получения пищевой грибной биомассы методом глубинного культивирования, обеспечивающий при высокой скорости роста накопление высокобелковой биомассы с повышенной концентрацией ценных ненасыщенных жирных кислот и низкой концентрацией нуклеиновых кислот (от 3,0 до 4,1% АСМ), позволяющей использовать эту биомассу для питания человека.
Раскрытие изобретения
Целью изобретения является разработка способа получения пищевой
биомассы грибов с высоким содержанием белка (от 53 до 63% АСМ) и низким количеством нуклеиновых кислот (от 3,1 до 4,1% АСМ) методом глубинного культивирования с высокой скоростью роста.
Способ получения пищевой белковой биомассы характеризуется тем, что в качестве штамма-продуцента используют штамм Fusarium sambucinum Fuck. var. ossicolum (Berk. et Curt.) D-104, депонированный в ВКПМ под номером F-1161, процесс культивирования осуществляют в глубинных условиях в диапазоне рН от 3,5 до 7,0 в условиях аэрации (от 0,5 до 2,0 л/л/мин с линейной скоростью перемешивающего устройства от 1 до 4,9 м/с). В качестве источника углерода используют различное углеродсодержащее сырье (продукты переработки различных видов зерна (пшеница, рожь, тритикале), картофеля, сахарной свеклы и тростника, соки корнеплодов и зеленой части топинамбура, турнепса, столовой свеклы и других видов, а также их гидролизаты) в количестве от 2,0 до 6,0 мас.%.
Температурный режим процесса культивирования в каждом цикле ферментации поддерживают от начала цикла до точки переключения на уровне от 26 до 30°С, далее до конца цикла - на уровне от 22 до 25°С, причем точку переключения определяют по накоплению биомассы до концентрации от 45 до 60% от максимально достижимой в данном аппарате (максимально достижимая концентрация биомассы зависит от массообменных характеристик ферментера, в котором проводится культивирование микроорганизма, а ее конкретная величина определяется экспериментально на основе пробных загрузок).
В другом варианте способа точку переключения определяют по концентрации растворенного кислорода после ее снижения до величины от 20 до 40% от насыщения (в пересчете на атмосферное давление воздуха).
Процесс является многоциклическим. В первом цикле количество посевного материала составляет от 1 до 5 об.%. В последующих циклах отъем культуральной жидкости из аппарата составляет от 95 до 99 об.%.
-1
Используемый штамм Fusarium sambucinum Fuck. var. ossicolum (Berk. et Curt.) D-104 депонирован в коллекции ВКПМ под номером F-1161. Штамм характеризуется высокой скоростью роста (от 0,28 до 0,32 ч) в условиях жидкофазного глубинного культивирования и накапливает биомассу с высоким содержанием белка от 53 до 63%, полноценного по аминокислотному составу, с повышенным количеством ценных ненасыщенных жирных кислот (от 83 до 87% от суммы жирных кислот) и содержанием нуклеиновых кислот от 4 до 5% АСМ.
Изобретение способствует интенсификации процесса получения пищевой биомассы гриба с высоким содержанием белка и повышенным количеством ценных ненасыщенных жирных кислот и позволяет обеспечить низкое содержание нуклеиновых кислот в биомассе (от 3,1 до 4,1% АСМ) без применения дополнительных дорогостоящих и трудоемких операций.
Изобретение поясняется примерами.
Пример 1
Культуру штамма Fusarium sambucinum D-104 хранили на скошенном агаризованном сусле в пробирках при температуре +4°С с периодическими пересевами через каждые 6 месяцев. Выращивание посевного материала проводили в асептических условиях при температуре от 26 до 28°С в качалочных колбах объемом 250 мл, содержащих 100 мл питательной среды следующего состава: крахмал пшеничный - 20 г/л, аммоний азотнокислый - 2,8 г/л, фосфат калия однозамещенный - 1,2 г/л, кукурузный экстракт сгущенный - 10 г/л, вода водопроводная - остальное, рН 5,8, путем пересева культуры с твердой питательной среды (косяк) из расчета 1 косяк на 1 качалочную колбу - первый пассаж. Продолжительность выращивания посевного материала: первый пассаж - 96 ч, второй - 48 ч, третий и последующие - 24 ч.
Глубинное культивирование осуществляли в периодическом режиме в ферментационном аппарате 30 л с рабочим объемом 20л, в режиме рН-статирования при значении 4,0, избыточном давлении 0,4 атм, аэрации воздухом в стерильных условиях 1,0 л/л/мин с механическим перемешиванием 400 об/мин мешалкой турбинного типа на питательной среде следующего состава: крахмал пшеничный - 45,0 г/л; нитрат аммония - 4,5 г/л; калий фосфорнокислый однозамещенный - 1,8 г/л; кукурузный экстракт сгущенный - 10,0 г/л, пропинол Б-400 - 0,4 г/л. Крахмал подвергали предварительному гидролизу ферментным препаратом амилосубтилин в расчете 0,024% к объему питательной среды (4,8 г/л). Среду инокулировали мицелиальной взвесью (второй и последующие пассажи) в количестве 3% по объему. Предварительно была определена максимально достижимая на данной среде для штамма-продуцента концентрация биомассы в конце ферментационного цикла, которая составила 2 5 г/л АСМ. Температурный режим процесса культивирования поддерживали от начала цикла до точки переключения на уровне от 26 до 30°С, далее до конца цикла - на уровне от 22 до 25°С, причем точку переключения определяли по накоплению биомассы до концентрации 11,0 г/л АСМ, что составляло около 45% от максимально достижимой концентрации в данном аппарате. Обезвоживание культуральной жидкости осуществляли на нутч-фильтре, сушку влажной биомассы проводили в сушилке с псевдоожиженным слоем.
Химический состав биомассы, % к АСМ:
Общий белок - 58,0;
Липиды - 7,8;
Нуклеиновые кислоты - 3,1.
Пример 2
Культивирование штамма-продуцента осуществляли аналогично изложенному в примере 1, однако точку переключения определяли по накоплению биомассы до концентрации 15,0 г/л АСМ, что соответствовало 60% от максимально достижимой концентрации в данном аппарате. Обезвоживание культуральной жидкости осуществляли на нутч-фильтре, сушку влажной биомассы проводили в сушилке с псевдоожиженным слоем.
Химический состав биомассы, % к АСМ:
Общий белок - 62,1;
Липиды - 6,5;
Нуклеиновые кислоты - 3,7.
Пример 3
Культивирование штамма-продуцента осуществляли аналогично изложенному в примере 1, однако точку переключения определяли по концентрации растворенного кислорода после ее снижения до величины 20% от насыщения (в пересчете на атмосферное давление воздуха). Обезвоживание культуральной жидкости осуществляли на барабанном вакуум-фильтре, сушку влажной биомассы проводили в сушилке с псевдоожиженным слоем.
Химический состав биомассы, % к АСМ:
Общий белок - 63,0;
Липиды - 6,4;
Нуклеиновые кислоты - 4,0.
Пример 4
Культивирование штамма-продуцента осуществляли аналогично изложенному в примере 1, однако точку переключения определяли по концентрации растворенного кислорода после ее снижения до величины 40% от насыщения (в пересчете на атмосферное давление воздуха). Обезвоживание культуральной жидкости осуществляли на барабанном вакуум-фильтре, сушку влажной биомассы проводили в сушилке с псевдоожиженным слоем.
Химический состав биомассы, % к АСМ:
Общий белок - 60,8;
Липиды - 7,0;
Нуклеиновые кислоты - 3,3.
Таким образом, использование данного способа позволяет получить высококачественную грибную белковую биомассу пищевого назначения с низким содержанием нуклеиновых кислот (от 3,1 до 4,1% АСМ), что не требует дополнительной стадии денуклеинизации биомассы и, следовательно, позволяет избежать наличия нежелательных продуктов расщепления НК. Способ может быть успешно применен в пищевой промышленности и фармакологии для производства пищевой грибной белковой биомассы.