ФОСФОДИЭСТЕРАЗА 4D7 КАК МАРКЕР РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
PHOSPHODIESTERASE 4D7 AS PROSTATE CANCER MARKER

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к фосфодиэстеразе 4D7 (PDE4D7) для применения в качестве маркера рака предстательной железы и к применению PDE4D7 в качестве маркера для диагностики, выявления, мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы или прогрессирования рака предстательной железы. Настоящее изобретение относится также к композиции для диагностики, выявления, мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы или прогрессирования рака предстательной железы, соответствующему способу и иммунологическому анализу, способу диагностики, мониторинга или прогнозирования гормонорезистентного рака предстательной железы по сравнению с гормоночувствительным раком предстательной железы, соответствующему иммунологическому анализу, способу сбора данных, иммунологическому анализу для диагностики, выявления, мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы или прогрессирования рака предстательной железы, способу идентификации индивидуума на предмет пригодности для лечения рака предстательной железы, иммунологическому анализу для стратификации индивидуума или группы индивидуумов с раком предстательной железы, иммунологическому анализу для стратификации индивидуума с раком предстательной железы, а также к фармацевтической композиции, содержащей соединение, непосредственно стимулирующее или модулирующее активность PDE4D7, соединение, опосредованно стимулирующее или модулирующее активность PDE4D7, белок PDE4D7 или его биологически активный эквивалент, нуклеиновую кислоту, кодирующую и экспрессирующую PDE4D7, ингибитор miРНК, специфичный для miРНК PDE4D7, деметилирующий агент и/или фактор вытеснения фосфодиэстераз.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Рак представляет собой класс заболеваний, при которых группа клеток демонстрирует неконтролируемый рост, инвазию и, иногда, метастазирование. Указанные три злокачественных свойства рака отличают его от доброкачественных опухолей, которые являются самоограничивающимися, не инвазируют и не дают метастазов. В развитых странах у мужчин наиболее часто диагностируемыми раками являются рак предстательной железы, рак легкого и колоректальный рак. Особенно рак предстательной железы является наиболее распространенной злокачественной опухолью у мужчин в Европе. В 2002 г. в Европе 225000 мужчинам был впервые поставлен диагноз рака предстательной железы, и около 83000 умерло от данного заболевания.
Некоторые фосфодиэстеразы были связаны с развитием рака. Например, как было показано, фосфодиэстераза PDE7 связана с хроническим лимфолейкозом (Zhang L. et al., PNAS, 2008, 105(49): 19532-7). Для многих типов рака или прогрессирующих форм рака все еще не существует доступной молекулы адекватного маркера.
Рак предстательной железы традиционно диагностируют по сывороточному уровню простатспецифического антигена (ПСА). Однако ПСА не является специфичным только для рака предстательной железы и может быть повышен при других обстоятельствах, что ведет к большому количеству ложноположительных результатов (рак не обнаруживают приблизительно у 70% мужчин с повышенными уровнями ПСА после проведения биопсии). Помимо этого, будет наблюдаться непредсказуемое количество пациентов с ложноположительными результатами, у которых позднее развивается рак предстательной железы при наличии «нормального» теста ПСА.
Таким образом, существует потребность в новой и эффективной, альтернативной диагностической перспективе для выявления, мониторинга и прогнозирования рака предстательной железы.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение отвечает указанной потребности и предоставляет средства и способы, которые позволяют диагностировать и выявлять рак предстательной железы.
Указанная выше задача обеспечивается фосфодиэстеразой 4D7 (PDE4D7) для использования в качестве маркера рака предстательной железы.
Как показано авторами данного изобретения, фосфодиэстераза 4D7 регулируется в понижающем направлении в клеточных линиях рака предстательной железы и в ткани предстательной железы, полученной от пациентов. PDE4D7, таким образом, рассматривают в качестве биомаркера для прогнозирования рака предстательной железы и инструмента принятия решений для стратификации определенных режимов надзора над раком, а также прогноза и мониторинга прогрессирования рака предстательной железы. В частности, заявителями было показано, что PDE4D7 подвержена понижающей регуляции в клеточных линиях гормонорезистентного рака предстательной железы, полученных от человека, а также в соответствующих образцах человеческих тканей. Диагностические методы и применение, основанные на PDE4D7 как маркере рака предстательной железы, могут, таким образом, использоваться для (i) выявления и диагностики угрожающих жизни форм рака предстательной железы, (ii) прогнозирования угрожающих жизни форм рака предстательной железы, (iii) мониторинга прогрессирования рака в сторону угрожающих жизни форм рака предстательной железы и (iv) различения неактивных и угрожающих жизни форм рака предстательной железы.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к композиции для диагностики, выявления, мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы или прогрессирования рака предстательной железы, содержащей аффинный лиганд, представляющий собой нуклеиновую кислоту, и/или аффинный лиганд, представляющий собой пептид, для продукта экспрессии или белка PDE4D7.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанная композиция содержит аффинный лиганд, представляющий собой нуклеиновую кислоту, и/или аффинный лиганд, представляющий собой пептид, который модифицирован для функционирования в качестве контрастного агента.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанная композиция содержит ряд олигонуклеотидов, специфичных для продукта экспрессии PDE4D7, зонд, специфичный для продукта экспрессии PDE4D7, аптамер, специфичный для продукта экспрессии или белка PDE4D7, антитело, специфичное для белка PDE4D7, и/или вариант антитела, специфичный для белка PDE4D7.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению PDE4D7 в качестве маркера для диагностики, выявления, мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы или прогрессирования рака предстательной железы.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики, выявления, мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы или прогрессирования рака предстательной железы, включающему определение уровня PDE4D7.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики, выявления, мониторинга или прогнозирования гормонорезистентного рака предстательной железы или прогрессирования в направлении гормонорезистентного рака предстательной железы; указанный способ различает гормоночувствительный и гормонорезистентный рак предстательной железы и включает этапы:
(а) определения уровня PDE4D7 в образце;
(b) определения уровня экспрессии референтного гена в образце;
(с) стандартизации измеренного уровня экспрессии PDE4D7 по уровню экспрессии референтного гена; и
(d) сравнения стандартизированного уровня экспрессии с заранее определенной отсекающей величиной, выбранной для исключения гормоночувствительного рака предстательной железы, в котором стандартизированный уровень экспрессии ниже отсекающей величины является показательным для гормонорезистентного рака предстательной железы, в котором указанная отсекающая величина находится в пределах приблизительно от 1 до 7, предпочтительно, приблизительно 5.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу сбора данных, включающему этапы:
(а) тестирования индивидуума на предмет экспрессии PDE4D7; и
(b) сравнения экспрессии, определенной на этапе (а), с контрольным уровнем.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения диагностику, выявление, мониторинг, прогнозирование или сбор данных следует осуществлять с использованием образца, полученного от индивидуума.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к иммунологическому анализу для выявления, диагностики, мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы или прогрессирования рака предстательной железы, включающему этапы:
(а) тестирования образца на предмет экспрессии PDE4D7,
(b) тестирования контрольного образца на предмет экспрессии PDE4D7,
(с) определения разницы в экспрессии PDE4D7 между этапами (а) и (b); и
(d) принятия решения о наличии или стадии рака предстательной железы или о прогрессировании рака предстательной железы на основании результатов, полученных на этапе (с);
в котором указанные этапы тестирования основаны на использовании антитела, специфичным образом связывающегося с PDE4D7.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к иммунологическому анализу для различения гормоночувствительного и гормонорезистентного рака предстательной железы, включающему этапы:
(а) определения уровня PDE4D7 в образце;
(b) определения уровня экспрессии референтного гена в образце;
(с) стандартизации измеренного уровня экспрессии PDE4D7 по уровню экспрессии референтного гена; и
(d) сравнения стандартизированного уровня экспрессии с заранее определенной отсекающей величиной для исключения гормоночувствительного рака предстательной железы, в котором стандартизированный уровень экспрессии ниже отсекающей величины является показательным для гормонорезистентного рака предстательной железы, в котором указанная отсекающая величина находится в пределах приблизительно от 1 до 7, предпочтительно, приблизительно 5.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу идентификации индивидуума, подходящего для терапии рака предстательной железы, включающему этапы:
(а) тестирования образца, полученного от индивидуума, на предмет экспрессии PDE4D7;
(b) тестирования указанного образца на предмет экспрессии референтного гена и/или тестирование контрольного образца на предмет экспрессии PDE4D7;
(с) классификации уровней экспрессии с этапа (а) относительно уровней в контрольных образцах PDE4D7 с этапа (b); и
(d) идентификации индивидуума как подходящего для получения лечения по поводу рака предстательной железы, когда образец от индивидуума классифицируют как имеющий пониженный уровень экспрессии PDE4D7.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к иммунологическому анализу для стратификации индивидуума или группы индивидуумов с раком предстательной железы, включающему этапы:
(а) тестирования образца, полученного от индивидуума, на предмет экспрессии PDE4D7;
(b) тестирования указанного образца на предмет экспрессии референтного гена и/или тестирования контрольного образца на предмет экспрессии PDE4D7;
(с) определения разницы между экспрессией PDE4D7 с этапа (а) и экспрессией PDE4D7 и/или референтного гена с этапа (b); и
(d) стратификации индивидуума или группы индивидуумов для терапии рака предстательной железы на основании результатов, полученных на этапе (с), в котором образец от индивидуума имеет пониженный уровень экспрессии PDE4D7.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанное тестирование или определение экспрессии осуществляют или дополнительно осуществляют измерением уровней нуклеиновой кислоты или белка или определением биологической активности PDE4D7 или референтного гена.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный способ или иммунологический анализ включает дополнительный этап сравнения измеренных уровней нуклеиновой кислоты или белка или измеренной биологической активности с контрольным уровнем.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный референтный ген представляет собой ген «домашнего хозяйства», особенно предпочтительно, GAPDH или PBGD, или другую фосфодиэстеразу, особенно предпочтительно, PDE4D5.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный способ или иммунологический анализ включает дополнительный этап определения уровня простатспецифического антигена (ПСА).
В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения образец, упоминаемый выше, представляет собой образец ткани, образец мочи, образец осадка мочи, образец крови, образец слюны, образец спермы, образец, содержащий циркулирующие опухолевые клетки, или образец, содержащий экзосомы, секретируемые предстательной железой.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один элемент, выбранный из следующей группы:
(а) соединение, непосредственно стимулирующее или модулирующее активность PDE4D7, предпочтительно аллостерический агонист ферментативной активности PDE4D7;
(b) соединение, опосредованно стимулирующее или модулирующее активность PDE4D7;
(с) белок PDE4D7 или его биологически активный эквивалент;
(d) нуклеиновая кислота, кодирующая и экспрессирующая PDE4D7;
(е) ингибитор miРНК, специфичный в отношении miРНК PDE4D7;
(f) деметилирующий агент; и
(g) фактор вытеснения фосфодиэстераз.
Поскольку фосфодиэстераза 4D7 подвергается понижающей регуляции в связанных с заболеванием клеточных линиях, сама PDE4D7 и агенты, модифицирующие PDE4D7, модифицирующие экспрессию PDE4D7 или модифицирующие взаимодействия PDE4D7, можно успешно применять в качестве лекарственных средств. Таким образом, путем противодействия наблюдающемуся процессу понижающей регуляции, PDE4D7 и/или агенты, модифицирующие PDE4D7, можно использовать в качестве лекарственного средства, например, в качестве лекарственного средства, противодействующего всем или некоторым эффектам, связанным с низкой экспрессией PDE4D7 или ее понижающей регуляцией.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения или профилактики рака предстательной железы, содержащей по меньшей мере один элемент, выбранный из следующей группы:
(а) соединение, непосредственно стимулирующее или модулирующее активность PDE4D7, предпочтительно аллостерический агонист ферментативной активности PDE4D7;
(b) соединение, опосредованно стимулирующее или модулирующее активность PDE4D7;
(с) белок PDE4D7 или его биологически активный эквивалент;
(d) нуклеиновая кислота, кодирующая и экспрессирующая PDE4D7;
(е) ингибитор miРНК, специфичный в отношении miРНК PDE4D7;
(f) деметилирующий агент; и
(g) фактор вытеснения фосфодиэстераз.
Поскольку фосфодиэстераза 4D7 подвергается понижающей регуляции в раковых клеточных линиях, сама PDE4D7 и агенты, модифицирующие PDE4D7, модифицирующие экспрессию PDE4D7 или модифицирующие взаимодействия PDE4D7, можно успешно применять в качестве лекарственных средств для лечения рака, в частности, для лечения рака предстательной железы. Таким образом, путем противодействия наблюдающемуся процессу понижающей регуляции, PDE4D7 и/или агенты, модифицирующие PDE4D7, можно использовать в качестве лекарственного средства, противодействующего низкой экспрессии PDE4D7 и/или понижающей регуляции PDE4D7, в раковых клетках, в частности, в клетках рака предстательной железы.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения терапия рака предстательной железы, упоминающаяся в настоящем документе выше, включает введение фармацевтической композиции, как определено в настоящем документе выше, или введение фармацевтической композиции, как определено в настоящем документе выше, в комбинации с дополнительным противораковым лечением, предпочтительно, облучением или химиотерапией.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики рака, в частности, рака предстательной железы, включающему введение:
(а) соединения, непосредственно стимулирующего или модулирующего активность PDE4D7, предпочтительно аллостерического агониста ферментативной активности PDE4D7;
(b) соединения, опосредованно стимулирующего или модулирующего активность PDE4D7;
(с) белка PDE4D7 или его биологически активного эквивалента;
(d) нуклеиновой кислоты, кодирующей и экспрессирующей PDE4D7;
(е) ингибитора miРНК, специфичного в отношении miРНК PDE4D7;
(f) деметилирующего агента; и
(g) фактора вытеснения фосфодиэстераз индивидууму.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный фактор вытеснения фосфодиэстераз, упоминаемый выше, представляет собой пептид, пептидомиметик, малую молекулу, антитело или аптамер.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный рак предстательной железы представляет собой гормонорезистентный рак предстательной железы.
Указанные и другие характеристики, признаки и задачи настоящего изобретения будут понятны из следующего подробного описания, в сочетании с прилагающимися фигурами и примерами, которые показывают, путем иллюстрации, принципы изобретения.
Описание приводится только в качестве примера, без ограничения объема изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1 дает обзор образцов, которые тестировались на предмет уровней экспрессии. АД означает «андроген-зависимый», АЧ означает «андроген-чувствительный», а АН означает «андроген-независимый». Образцы от «ксенотрансплантата РС346Р» по «346Flu2» представляют собой клеточные линии, образцы от «РС295» по «РС374» представляют собой ксенотрансплантаты.
Фиг. 2 изображает относительную экспрессию мРНК PDE4D7 в нескольких клеточных линиях рака предстательной железы и ксенотрансплантатах, стандартизированных по GAPDH, по сравнению с LNCaP. Фигура дает обзор всех изученных образцов, включая клеточные линии и ксенотрансплантационный материал.
Фиг. 3 изображает относительную экспрессию мРНК PDE4D7 в клеточных линиях рака предстательной железы, стандартизированных по GAPDH, по сравнению с LNCaP.
Фиг. 4 изображает относительную экспрессию мРНК PDE4D7 в ксенотрансплантатах рака предстательной железы, стандартизированных по GAPDH, по сравнению с LNCaP.
Фиг. 5 показывает содержание PDE4D7, выраженное как процент от общей мРНК PDE4D, в клеточных линиях и ксенотрансплантатах рака предстательной железы. Фигура дает обзор всех изученных образцов, включая клеточные линии и ксенотрансплантационный материал.
Фиг. 6 показывает содержание PDE4D7, выраженное как процент от общей мРНК PDE4D, в клеточных линиях рака предстательной железы.
Фиг. 7 показывает содержание PDE4D7, выраженное как процент от общей мРНК PDE4D, в ксенотрансплантатах рака предстательной железы.
Фиг. 8 показывает относительную экспрессию гена человеческой PDE4D7 в образцах человеческих тканей от пациентов. Информация получена в целом от 16 различных образцов, как изображено в таблице 1 (включая резецированные ткани лимфатических узлов). Группа образцов «1=нет» определена как гормоночувствительные первичные опухоли предстательной железы, группа образцов «2=да» определена как гормонорезистентные опухоли предстательной железы. Обозначены индивидуальные величины относительной экспрессии для человеческой PDE4D7 в человеческих тканях предстательной железы. Результаты были стандартизированы по экспрессии GAPDH и PBGD. Медиана относительных измерений данных указана для каждой группы пациентов.
Фиг. 9 показывает относительную экспрессию гена человеческой PDE4D7 в образцах человеческих тканей от пациентов. Информация получена в целом от 16 различных образцов, как изображено в таблице 1 (включая резецированные ткани лимфатических узлов). Группа образцов «1» определена как гормоночувствительные первичные опухоли предстательной железы, группа образцов «2» определена как гормонорезистентные опухоли предстательной железы. Результаты были стандартизированы по экспрессии GAPDH и PBGD. Фигура показывает столбчатую диаграмму индивидуальных данных измерений относительной экспрессии для человеческой PDE4D7, в которой столбец включает 75% всех измерений. Медианная величина относительной экспрессии обозначена как граница между двумя окрашенными столбцами.
Фиг. 10 показывает относительную экспрессию гена человеческой PDE4D7 в образцах человеческих тканей от пациентов. Информация получена в целом от 12 различных образцов, как изображено в таблице 1 (исключая резецированные ткани лимфатических узлов). Группа образцов «1=нет» определена как гормоночувствительные первичные опухоли предстательной железы, группа образцов «2=да» определена как гормонорезистентные опухоли предстательной железы. Результаты были стандартизированы по экспрессии GAPDH и PBGD. Обозначены индивидуальные величины относительной экспрессии для человеческой PDE4D7 в человеческих тканях предстательной железы. Медиана относительных измерений данных указана для каждой группы пациентов.
Фиг. 11 показывает относительную экспрессию гена человеческой PDE4D7 в образцах человеческих тканей от пациентов. Информация получена в целом от 12 различных образцов, как изображено в таблице 1 (исключая резецированные ткани лимфатических узлов). Группа образцов «1» определена как гормоночувствительные первичные опухоли предстательной железы, группа образцов «2» определена как гормонорезистентные опухоли предстательной железы. Результаты были стандартизированы по экспрессии GAPDH и PBGD. Фигура показывает столбчатую диаграмму индивидуальных данных измерений относительной экспрессии для человеческой PDE4D7, в которой столбец включает 75% всех измерений. Медианная величина относительной экспрессии обозначена как граница между двумя окрашенными столбцами.
in vivo
Фиг. 12 показывает влияние экспрессии человеческой PDE4D7  на пролиферацию клеток рака предстательной железы РС3.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Заявители установили, что PDE4D7 подвергается сильной понижающей регуляции в определенных клеточных типах, связанных с раком предстательной железы, и человеческих тканях пациентов, и, таким образом, может использоваться в качестве биомаркера рака предстательной железы. PDE4D7, а также агенты, модифицирующие PDE4D7 или модифицирующие экспрессию PDE4D7, можно использовать также в качестве лекарственных средств, в частности, для лечения рака предстательной железы.
Несмотря на то, что настоящее изобретение будет описано с помощью конкретных вариантов осуществления, данное описание не должно истолковываться в ограничительном смысле.
Перед подробным описанием типичных вариантов осуществления настоящего изобретения приводятся определения, важные для понимания настоящего изобретения.
Используемые в настоящем описании и прилагающейся формуле изобретения формы существительных единственного числа также включают в себя множественные числа, если контекст четко не диктует иное.
В контексте настоящего изобретения термины «около» и «приблизительно» обозначают интервал точности, который будет понятен специалистам, чтобы дополнительно убедиться в техническом эффекте рассматриваемого признака. Термин обычно указывает отклонение от указанной численной величины ±20%, предпочтительно ±15%, более предпочтительно ±10% и еще более предпочтительно ±5%.
Следует понимать, что термин «содержащий» не является ограничительным. Для целей настоящего изобретения термин «состоящий из» рассматривается как предпочтительный вариант термина «содержащий». Если далее в настоящем документе группу определяют как содержащую по меньшей мере определенное количество вариантов, это означает также, что сюда входит и группа, которая предпочтительно состоит только из указанных вариантов.
Помимо этого, термины «первый», «второй», «третий» или «(a)», «(b)», «(с)», «(d)» и т.п. в описании и в формуле изобретения используются для различения сходных элементов и, необязательно, для описания последовательного или хронологического порядка. Следует понимать, что используемые таким образом термины являются взаимозаменяемыми в соответствующих условиях, и что варианты осуществления настоящего изобретения, описанные в настоящем документе, способны действовать в других последовательностях, отличающихся от описанных или проиллюстрированных в настоящем документе.
В случае если термины «первый», «второй», «третий» или «(a)», «(b)», «(с)», «(d)» и т.п. относятся к этапам способа или применения, между этапами не существует связи по времени или интервалу времени, т.е. этапы могут осуществляться одновременно, или могут иметь место интервалы времени в секунды, минуты, часы, дни, недели, месяцы или даже годы между указанными этапами, если иное не указывается в данной заявке выше или ниже.
Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается отдельной методологией, протоколами, белками, бактериями, векторами, реагентами и т.п., описанными в настоящем документе, поскольку они могут варьировать. Следует понимать также, что терминология, использующаяся в настоящем документе, служит только целям описания отдельных вариантов осуществления настоящего изобретения и не предназначается для ограничения объема настоящего изобретения, который будет ограничен только прилагающейся формулой изобретения. Если не указано иное, все технические и научные термины, использующиеся в настоящем документе, имеют общепринятые значения, известные специалистам.
Как было упомянуто выше, настоящее изобретение относится в одном аспекте к фосфодиэстеразе 4D7 (PDE4D7) для применения в качестве маркера рака предстательной железы. Термин «фосфодиэстераза 4D7» или «PDE4D7» относится к сплайсинговому варианту 7 человеческой фосфодиэстеразы PDE4D7, т.е. к гену человеческой фосфодиэстеразы PDE4D7, предпочтительно к последовательности, определенной номером в каталоге Genbank AF536976 (версия AF536976.1, GI:22901883 как от 3 марта 2009 г.), более предпочтительно, к нуклеотидной последовательности, представленной как SEQ ID NO: 1, которая соответствует номеру последовательности указанного выше транскрипта PDE4D7 в каталоге Genbank, а также относится к аминокислотной последовательности, представленной как SEQ ID NO: 2, которая соответствует номеру последовательности указанного выше полипептида PDE4D7 в каталоге Genbank, кодируемого транскриптом PDE4D7. Термин также включает нуклеотидные последовательности, демонстрирующие высокую степень гомологичности в отношении PDE4D7, например, нуклеотидные последовательности, являющиеся по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% идентичными последовательности, представленной как SEQ ID NO: 1, или аминокислотные последовательности, являющиеся по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% идентичными последовательности, представленной как SEQ ID NO: 2, или последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих аминокислотные последовательности, являющиеся по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% идентичными последовательности, представленной как SEQ ID NO: 2, или аминокислотные последовательности, кодируемые последовательностями нуклеиновых кислот, являющимися по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% идентичными последовательности, представленной как SEQ ID NO: 1.
Термин «ген человеческой фосфодиэстеразы PDE4D7», «ген PDE4D7» или «маркерный ген PDE4D7», используемый в настоящем документе, относится к гену, кодирующему фосфодиэстеразу 4D. Предпочтительно, термин относится к гену, экспрессирующему фосфодиэстеразу 4D как сплайсинговый вариант 7, например, специфическую комбинацию экзонов, определенную номером в каталоге Genbank AF536976 (версия AF536976.1, GI:22901883 как от 3 марта 2009 г.), или представленную как SEQ ID NO: 1. Термин относится также к молекулам ДНК, полученным с транскриптов мРНК, кодирующим фосфодиэстеразу 4D, сплайсированную как вариант 7, предпочтительно, к молекулам кДНК.
Термин «маркер» или «маркер PDE4D7», используемый в настоящем документе, относится к гену, генетической единице или последовательности (нуклеотидной последовательности или аминокислотной или белковой последовательности), как определено в настоящем документе выше, уровень экспрессии которого является модифицированным, предпочтительно пониженным, в раковой клетке или раковой ткани или в любом типе образца, включающего раковые клетки или раковые ткани или их части или фрагменты, по сравнению с контрольным уровнем или состоянием. Термин также относится к любому продукту экспрессии указанной генетической единицы или последовательности, в частности, к транскрипту мРНК PDE4D7, полипептиду, кодируемому транскриптом PDE4D7 или его вариантами или фрагментами, а также к их гомологичным производным, как описано выше в настоящем документе. Термин «уровень экспрессии», используемый в настоящем документе, относится к количеству транскрипта PDE4D7 и/или белка PDE4D7, которое можно получить из определенного количества клеток или определенной доли ткани, предпочтительно, к количеству транскрипта PDE4D7 и/или белка PDE4D7, которое можно получить с использованием стандартной процедуры экстракции нуклеиновой кислоты (например, РНК) или белка. Подходящие способы экстракции известны специалистам.
Термин «контрольный уровень» (или «контрольное состояние»), используемый в настоящем документе, относится к уровню экспрессии, который может быть определен в одно и то же время и/или при сходных или сравнимых состояниях в качестве тест-образца путем использования (а) образца (образцов), который ранее взяли у субъекта/субъектов и хранили, чье болезненное состояние, например, нераковой природы, является известным. Термин «болезненное состояние» или «раковое болезненное состояние» относится к любому состоянию или типу клеточного или молекулярного состояния, от неракового клеточного состояния до (включая) терминального ракового клеточного состояния. Предпочтительно, термин включает различные раковые стадии или уровни пролиферации/развития опухоли в организме, от (и исключая) неракового клеточного состояния до (включая) терминального ракового клеточного состояния. Указанные стадии развития могут включать все стадии классификационной системы злокачественных опухолей TNM (опухоль, лимфоузлы, метастазы), как определено UICC, например, стадии 0 и от I до IV. Термин также включает до стадии 0 TNM, например, стадии развития, при которых биомаркеры рака, известные специалистам, показывают модифицированную экспрессию или паттерн экспрессии.
Уровень экспрессии, упомянутый выше, может, предпочтительно, представлять собой уровень экспрессии PDE4D7, как определено выше в настоящем документе. Альтернативно или дополнительно, уровень экспрессии может представлять собой уровень экспрессии любого другого подходящего гена или генетического элемента, экспрессированного в клетке, предпочтительно, в контексте PDE4D7, например, уровень экспрессии другой фосфодиэстеразы, уровень экспрессии гена «домашнего хозяйства», например, GAPDH или PBGD.
Термин «раковый» в контексте настоящего изобретения относится к раковому болезненному состоянию, как определено выше в настоящем документе. Предпочтительный контрольный уровень в контексте раковых контролей представляет собой экспрессию PDE4D7 в злокачественных гормоночувствительных опухолях.
Термин «нераковый» в контексте настоящего изобретения относится к состоянию, при котором невозможно выявить ни доброкачественной, ни злокачественной пролиферации. Подходящие средства для указанного выявления известны специалистам. Предпочтительный контрольный уровень в контексте нераковых контролей представляет собой экспрессию PDE4D7 в нормальной, т.е. здоровой, нераковой ткани или экспрессию PDE4D7 в ткани доброкачественной опухоли предстательной железы. Термин «доброкачественная опухоль предстательной железы», упомянутый в настоящем документе, относится к опухоли предстательной железы, не имеющей всех трех злокачественных свойств рака, т.е. не растет неограниченным, агрессивным образом, не проникает в окружающие ткани и не дает метастазов. Обычно доброкачественная опухоль предстательной железы предполагает мягкое и непрогрессирующее неопластическое или опухолевое заболевание, не обладающее инвазивными свойствами рака. Помимо этого, доброкачественные опухоли предстательной железы обычно инкапсулированы и, таким образом, ограничены в способности вести себя подобно злокачественным опухолям. Доброкачественную опухоль или здоровое состояние можно определить любым подходящим, независимым молекулярным, гистологическим или физиологическим методом, известным специалистам.
Альтернативно, контрольный уровень можно определить с использованием статистического метода, основанного на результатах, полученных анализом ранее определенного уровня (уровней) экспрессии маркерного гена PDE4D7 по настоящему изобретению в образцах от субъектов, чье болезненное состояние известно. Помимо этого, контрольный уровень можно получить из базы данных паттернов экспрессии ранее изученных субъектов или клеток. Более того, уровень экспрессии маркерных генов по настоящему изобретению в биологическом образце, подлежащем исследованию, можно сравнить с множественными контрольными уровнями, определенными в множестве стандартных образцов. Предпочтительно использовать контрольный уровень, определенный в стандартном образце, полученном из типа ткани, сходного с биологическим образцом, полученным от пациента. Особенно предпочтительно использовать образец (образцы), полученный от субъекта/субъектов, чье болезненное состояние является нераковым, как определено выше в настоящем документе, т.е. которое представляет собой здоровое состояние, при котором невозможно выявить ни доброкачественной, ни злокачественной пролиферации. В другом варианте осуществления настоящего изобретения контрольный уровень может быть определен в стандартном образце, полученном от субъекта, которому был поставлен диагноз рака предстательной железы, например, гормононезависимого или гормонорезистентного рака предстательной железы.
Альтернативно, стандартные образцы могут включать материал, полученный из клеточных линий, например, имморталилизованных раковых клеточных линий, или полученный из тканевых ксенотрансплантатов. Предпочтительно, материал, полученный из клеточных линий рака предстательной железы, или материал, полученный из тканевых ксенотрансплантатов с тканью человеческой предстательной железы, в частности, с доброкачественной и полученной из опухоли ткани человеческой предстательной железы, может содержаться в стандартном образце по настоящему изобретению. Примеры предпочтительных раковых клеточных линий включают в себя клеточные линии PC346P, PC346B, LNCaP, VCaP, DuCaP, PC346C, PC3, DU145, PC346CDD, PC346Flu1, PC346Flu2. Примеры предпочтительных ксенотрансплантатов включают в себя PC295, PC310, PC-EW, PC82, PC133, PC135, PC324 и РС374. Предпочтительно, можно использовать полную панель клеточных линий и ксенотрансплантатов, например, панель человеческой PC346. Помимо этого, предпочтительными являются клеточные линии и ксенотрансплантаты, описанные в Marques et al., 2006, Eur. Urol., 49(2):245-57.
В других, предпочтительных альтернативных, вариантах осуществления настоящего изобретения, стандартные образцы можно получать из тканей пациентов или тканевых панелей или тканевых коллекций, полученных в клинических условиях. Образцы можно, например, получать от пациентов мужского пола, подвергающихся оперативному вмешательству. Образцы можно получать из любого подходящего тканевого типа, например, из ткани предстательной железы или лимфатических узлов. Предпочтительные примеры коллекций тканей пациентов получают в ходе оперативных вмешательств на предстательной железе (например, в ходе простатэктомии).
Кроме того, предпочтительно использовать стандартную величину уровней экспрессии маркера PDE4D7 по настоящему изобретению в популяции с известным болезненным состоянием. Стандартную величину можно получать любым способом, известным специалистам. Например, пределы среднее±2СО (стандартное отклонение) или среднее±3СО можно использовать в качестве стандартной величины.
Помимо этого, контрольный уровень может быть также определен в одно и то же время и/или при сходных или сравнимых состояниях в качестве тест-образца путем использования (а) образца (образцов), который ранее взяли у субъекта/субъектов и хранили, о чьем болезненном состоянии известно, что оно является раковым, т.е. у субъектов, которым независимо был поставлен диагноз определенного типа рака, например, рака предстательной железы, в частности, гормонозависимого, гормоночувствительного или гормонорезистентного рака предстательной железы.
В контексте настоящего изобретения контрольный уровень, определенный в биологическом образце, о котором известно, что он не является раковым, называется «нормальным контрольным уровнем». Если контрольный уровень определен в раковом биологическом образце, например, в образце от субъекта, которому диагноз рака предстательной железы, в частности, гормонозависимого, гормоночувствительного или гормонорезистентного рака предстательной железы, был поставлен независимо, его можно обозначить как «раковый контрольный уровень».
Термин «рак предстательной железы» относится к раку предстательной железы в мужской репродуктивной системе, который наблюдается, когда клетки предстательной железы мутируют и начинают бесконтрольно размножаться. Обычно рак предстательной железы связан с повышенным уровнем простатспецифического антигена (ПСА). В одном варианте осуществления настоящего изобретения термин «рак предстательной железы» относится к раку, при котором уровни ПСА превышают 4,0. В другом варианте осуществления настоящего изобретения термин относится к раку, при котором уровни ПСА превышают 2,0. Термин «уровень ПСА» относится к концентрации простатспецифического антигена (ПСА) в крови, в нг/мл.
Термин «гормонозависимый рак предстательной железы» означает, что рост и/или пролиферация рака предстательной железы или клеточных линий рака предстательной железы зависят от стимуляции мужскими половыми гормонами.
Термин «гормоночувствительный рак предстательной железы» означает, что рост и пролиферация рака предстательной железы или клеточных линий рака предстательной железы являются чувствительными к стимуляции мужскими половыми гормонами. Термин «чувствительный» относится к ситуациям, при которых рак предстательной железы или клеточные линии рака предстательной железы демонстрируют паттерн биохимических или клеточных реакций в присутствии мужских половых гормонов, но не нуждаются в мужском половом гормоне для роста и/или пролиферации.
Термин «гормонорезистентный рак предстательной железы» означает, что рост и пролиферация рака предстательной железы или клеточных линий рака предстательной железы являются резистентными к стимуляции мужскими половыми гормонами. Термин относится также к поздней стадии развития рака предстательной железы, которая больше не поддается лечению введением антигормонов, предпочтительно антиандрогенов, как определено выше в настоящем документе. Термин «мужской половой гормон», используемый в настоящем документе, относится к андрогену, предпочтительно тестостерону, андростенедиону, дигидротестостерону, дегидроэпиандростерону, андростенедиолу или андростерону.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению PDE4D7 в качестве маркера для диагностики, выявления, мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы или прогрессирования рака предстательной железы.
Термин «диагностика рака предстательной железы», используемый в настоящем документе, означает, что субъекта или индивидуума можно считать страдающим раком предстательной железы, когда уровень экспрессии маркера PDE4D7 по настоящему изобретению является модифицированным, предпочтительно, пониженным и регулируемым в сторону понижения, по сравнению с контрольным уровнем, как определено выше в настоящем документе, предпочтительно, по сравнению с нормальным контрольным уровнем, как определено выше в настоящем документе. Термин «диагностика» также относится к заключению, сделанному в результате указанного процесса сравнения.
Термин «модифицированный» или «модифицированный уровень экспрессии» в контексте настоящего изобретения обозначает изменение уровня экспрессии. Уровни экспрессии считаются «измененными», когда экспрессия гена PDE4D7, например, в исследуемом образце, отличается, например, на 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% и более чем на 50% от контрольного уровня, или по меньшей мере в 0,1 раза, по меньшей мере в 0,2 раза, по меньшей мере в 1 раз, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 10 раз или более отличается от контрольного уровня. Контрольный уровень может представлять собой нормальный контрольный уровень или раковый контрольный уровень, как определено выше в настоящем документе. Если предстоит осуществить сравнение с раковым контрольным уровнем, предпочтительно осуществить дополнительное сравнение с нормальным контрольным уровнем. Указанное дополнительное сравнение позволяет определить тенденцию модификации, т.е. повышение или понижение уровня экспрессии.
Термин «модифицированный» относится, предпочтительно, к понижению или регуляции в сторону понижения уровня экспрессии маркера PDE4D7 или к полному ингибированию экспрессии маркера PDE4D7, если исследуемый образец сравнивают с контрольным уровнем. Контрольный уровень может представлять собой нормальный контрольный уровень или раковый контрольный уровень, как определено выше в настоящем документе. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения контрольный уровень представляет собой раковый контрольный уровень, полученный из гормонозависимых опухолей или тканей предстательной железы или связанный с ними, более предпочтительно, полученный из гормоночувствительных опухолей или тканей предстательной железы или связанный с ними. Термин «пониженный уровень экспрессии» или «подверженный понижающей регуляции уровень экспрессии» или «уменьшение уровня экспрессии» (можно использовать взаимозаменяемым образом) в контексте настоящего изобретения обозначает, таким образом, уменьшение уровня экспрессии PDE4D7 между анализируемой ситуацией, например, исследуемым образцом, взятым у пациента, и стандартной величиной, которая может представлять собой нормальный контрольный уровень или раковый контрольный уровень, который можно получать на любой подходящей стадии рака, известной специалистам, предпочтительно, на гормонозависимой, более предпочтительно, гормоночувствительной, стадии опухоли предстательной железы. Уровни экспрессии считаются «пониженными» или «подверженными понижающей регуляции, когда экспрессия гена PDE4D7, уменьшается, например, на 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% и более чем на 50% по сравнению с контрольным уровнем, или по меньшей мере в 0,1 раза, по меньшей мере в 0,2 раза, по меньшей мере в 1 раз, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 10 раз или более уменьшается по сравнению с контрольным уровнем, предпочтительно, при сравнении с гормонозависимым или гормоночувствительным контролем опухоли предстательной железы.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения дополнительное сходство в общем паттерне экспрессии гена между образцом, полученным от субъекта, и стандартом, как определено выше в настоящем документе, который является раковым, показывает, что субъект страдает раком. В другом варианте осуществления настоящего изобретения диагноз можно комбинировать с трактовкой уровней экспрессии дополнительных раковых биомаркеров. Например, можно исследовать экспрессию такхи биомаркеров, как ПСА.
Рак, в частности, рак предстательной железы, можно считать диагностированным, когда уровень экспрессии маркера PDE4D7 по настоящему изобретению является модифицированным, предпочтительно пониженным или подверженным понижающей регуляции, по сравнению с контрольным уровнем, как определено выше в настоящем документе, например, с нормальным контрольным уровнем, как определено выше в настоящем документе.
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения рак предстательной железы можно считать диагностированным, если уровень экспрессии PDE4D7, как определено выше в настоящем документе, является пониженным на величину от 20% до 80%, предпочтительно на величину 30%, 40%, 50%, 60% или 70% в исследуемом образце по сравнению с контрольным уровнем экспрессии, полученным из гормонозависимого опухолевого контроля или гормоночувствительного контроля опухоли предстательной железы. В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения гормонорезистентный рак предстательной железы можно считать диагностированным, если уровень экспрессии PDE4D7, как определено выше в настоящем документе, является пониженным на величину от 20% до 90%, предпочтительно на величину 30%, 40%, 50%, 60%, 70% или 80% в исследуемом образце по сравнению с контрольным уровнем. Контрольный уровень может представлять собой нормальный контрольный уровень или раковый контрольный уровень, предпочтительно полученный из гормонозависимого или гормоночувствительного рака предстательной железы.
Термин «выявление рака предстательной железы», используемый в настоящем документе, означает, что наличие ракового заболевания или расстройства в организме может быть определено, или что раковое заболевание или расстройство в организме может быть идентифицировано. Определение или идентификацию ракового заболевания или расстройства можно осуществлять сравнением уровня экспрессии маркера PDE4D7 по настоящему изобретению и нормальных контрольных уровней, как определено выше в настоящем документе. Рак, в частности, рак предстательной железы, может быть выявлен, когда уровень экспрессии маркера PDE4D7 является сходным с раковым контрольным уровнем, как определено выше в настоящем документе. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения рак предстательной железы может быть выявлен, если уровень экспрессии маркера PDE4D7 является сходным с раковым контрольным уровнем в клетке или клеточной линии установленного рака предстательной железы, например, клеточной линии рака предстательной железы, как упомянуто выше в настоящем документе.
Термин «мониторинг рака предстательной железы», используемый в настоящем документе, относится к сопровождению диагностированного или выявленного ракового заболевания или расстройства, например, во время процедуры лечения или во течение определенного периода времени, обычно в течение 2 месяцев, 3 месяцев, 4 месяцев, 6 месяцев, 1 года, 2 лет, 3 лет, 5 лет, 10 лет или в течение любого другого периода времени. Термин «сопровождение» означает, что состояния заболевания, как определено выше в настоящем документе, и, в частности, изменения указанных состояний заболевания, можно выявить путем сравнения уровня экспрессии маркера PDE4D7 по настоящему изобретению в образце с нормальным или раковым контрольным уровнем, как определено выше в настоящем документе, предпочтительно с контрольным уровнем экспрессии, полученным из гормонозависимого опухолевого контроля или гормоночувствительного контроля опухоли предстательной железы, при любом типе периодического отрезка времени, например, каждую неделю, каждые 2 недели, каждый месяц, каждые 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев, каждые 1,5 года, каждые 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 лет, в течение любого периода времени, например, в течение 2 недель, 3 недель, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 месяцев, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 или 20 лет, соответственно. Раковый контрольный уровень можно получить из образцов, соответствующих различным стадиям развития рака, например, стадиям от 0 и I до IV по классификационной системе TNM. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный термин относится к сопровождению диагностированного рака предстательной железы, более предпочтительно, к сопровождению гормонозависимого и гормоночувствительного рака предстательной железы. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения мониторинг можно также использовать для сопровождения гормонорезистентного рака предстательной железы, например, во время процедуры лечения. Мониторинг также может включать выявление экспрессии дополнительных генов или генетических элементов, например, генов «домашнего хозяйства», таких как GAPDH или PBGD, или других фосфодиэстераз, предпочтительно PDE4D5.
Термин «прогнозирование рака предстательной железы», используемый в настоящем документе, относится к предсказанию течения или исхода диагностированного или выявленного ракового заболевания, например, в течение определенного периода времени, во время лечения или после лечения. Термин также относится к определению шансов выживания или выздоровления от болезни, а также к предсказанию ожидаемого времени выживания субъекта. Прогноз может, конкретно, включать установление вероятности выживания субъекта в течение определенного периода времени в будущем, например, в течение 6 месяцев, 1 года, 2 лет, 3 лет, 5 лет, 10 лет или в течение любого другого периода времени.
Термин «прогрессирование рака предстательной железы», используемый в настоящем документе, относится к переходу между различными стадиями развития рака предстательной железы, например, от стадии 0 и I до IV по классификации TNM, или любыми другими стадиями или подстадиями, начиная со здорового состояния до терминального рака. Обычно указанные переходы сопровождаются модификацией уровня экспрессии PDE4D7, предпочтительно понижением, в исследуемом образце по сравнению с предыдущим исследованным образцом от того же самого индивидуума, например, по сравнению с образцом, полученным от гормонозависимой опухоли предстательной железы или опухолевого контроля или гормоночувствительной опухоли предстательной железы или опухолевого контроля. Прогрессирование рака предстательной железы можно считать выявленным или диагностированным, если уровень экспрессии PDE4D7, как определено выше в настоящем документе, понижается на величину от 3% до 50%, предпочтительно на величину 10%, 15%, 20% или 25% в исследуемом образце по сравнению с предыдущим исследованным образцом от того же самого индивидуума. Модификация может быть выявлена через любой период времени, предпочтительно через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 месяцев, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 или 20 лет, т.е. указанную выше величину можно рассчитать путем сравнения уровня экспрессии PDE4D7 в первой точке времени и второй точке времени после указанного периода времени. Прогрессирование может представлять собой, в конкретном варианте осуществления настоящего изобретения, прогрессирование в сторону гормонорезистентного рака предстательной железы.
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения термин «прогрессирование рака предстательной железы» относится к переходу от состояния гормонозависимого или гормоночувствительного рака предстательной железы к состоянию гормонорезистентного рака предстательной железы.
Прогрессирование от состояния гормонозависимого или гормоночувствительного рака предстательной железы к состоянию гормонорезистентного рака предстательной железы можно считать выявленным или диагностированным, если уровень экспрессии PDE4D7, как определено выше в настоящем документе, понижается на величину от 3% до 50%, предпочтительно на величину 10%, 15%, 20% или 25% в исследуемом образце по сравнению с предыдущим исследованным образцом от того же самого индивидуума, которому был поставлен диагноз гормоночувствительного или гормонозависимого рака предстательной железы. Прогрессирование также можно считать выявленным, если сравнение осуществляется с исследуемыми образцами от других индивидуумов, с исследуемыми образцами из коллекций тканей, с величинами из баз данных и т.п.
Модификация может быть выявлена через любой период времени, предпочтительно через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 месяцев, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 или 20 лет, т.е. указанную выше величину можно рассчитать путем сравнения уровня экспрессии PDE4D7 в первой точке времени и второй точке времени после указанного периода времени.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к диагностике и выявлению предрасположенности к развитию рака предстательной железы, более предпочтительно, гормонорезистентного рака предстательной железы. «Предрасположенность к развитию рака предстательной железы» и, в частности, «предрасположенность к развитию гормонорезистентного рака предстательной железы» в контексте настоящего изобретения представляет собой состояние риска развития рака предстательной железы, в частности гормонорезистентного рака предстательной железы. Предпочтительно, предрасположенность к развитию гормонорезистентного рака предстательной железы может иметь место в тех случаях, когда уровень экспрессии PDE4D7, как определено выше в настоящем документе, находится ниже ракового контрольного уровня, как определено выше в настоящем документе, например, стандартного уровня экспрессии, полученного из тканей или образцов субъекта, который несомненно страдает гормоночувствительным раком предстательной железы. Термин «ниже», используемый в настоящем документе, означает, что уровень экспрессии PDE4D7 уменьшен приблизительно на величину от 40% до 80% по сравнению c раковым контрольным уровнем, предпочтительно уменьшен приблизительно на 50%.
Альтернативно, предрасположенность к развитию рака, в контексте настоящего изобретения, может иметь место в таких ситуациях, в которых дан определенный уровень экспрессии PDE4D7, как определено выше в настоящем документе, а дополнительные, альтернативные маркеры рака, например, ПСА, не демонстрируют модификации уровня экспрессии или паттерна экспрессии. Подходящие дополнительные маркеры рака известны специалистам.
Таким образом, предрасположенность к раку предстательной железы, в частности, к гормонорезистентному раку предстательной железы, можно считать диагностированной или выявленной, если имеет место одна из изображенных выше ситуаций.
Разницу между уровнями экспрессии в исследуемом биологическом образце и контрольным уровнем можно стандартизировать по уровню экспрессии дополнительных контрольных нуклеиновых кислот, например, генов «домашнего хозяйства», уровни экспрессии которых, как известно, не различаются в зависимости от ракового или неракового состояния клетки. Показательные контрольные гены включают, среди прочих, β-актин, глицеринальдегид-3-фосфат дегидрогеназу (GAPDH), порфобилиноген-дезаминазу (PBGD) и рибосомальный белок Р1. Стандартизацию также можно осуществлять с другими фосфодиэстеразами, предпочтительно с человеческой фосфодиэстеразой, демонстрирующей неизмененный паттерн экспрессии на различных опухолевых стадиях. Предпочтительной фосфодиэстеразой является PDE4D5 или любая другая изоформа семейства PDE4D, например, PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D6, PDE4D8 или PDE4D9.
В контексте настоящего изобретения термины «диагностика» и «прогнозирование» также включают предсказания и анализы вероятности. PDE4D7 в качестве маркера можно, соответственно, использовать в клинических условиях для принятия решений, касающихся выбора способов лечения, включая терапевтическое вмешательство или диагностические критерии, такие как надзор за заболеванием. Согласно настоящему изобретению, можно получать промежуточный результат для исследования состояния субъекта. Указанный промежуточный результат можно объединять с дополнительной информацией в помощь врачу, медицинской сестре или другому практикующему медику для постановки диагноза о наличии заболевания у субъекта.
Субъект или индивидуум, которому необходима диагностика, мониторинг или у которого необходимо выявить или прогнозировать рак предстательной железы, прогрессирование рака предстательной железы или предрасположенность к развитию рака предстательной железы по настоящему изобретению, представляет собой животное, предпочтительно млекопитающее, более предпочтительно человека.
Особенно предпочтительным является использование молекулярных инструментов визуализации, известных специалистам, например, ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и/или фотонного резонансного теста (ФРТ), в контексте использования PDE4D7 в качестве маркера для диагностики, выявления, мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы или прогрессирования рака предстательной железы. Например, PDE4D7 можно использовать в качестве маркера для диагностики, выявления, мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы или прогрессирования рака предстательной железы, при таких подходах, как ЯМР или ФРТ, которые позволяют обнаружить диагностический маркер в режиме реального времени у субъекта-человека.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции для диагностики, выявления, мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы или прогрессирования рака предстательной железы или предрасположенности к развитию рака предстательной железы у индивидуума. Композиция по настоящему изобретению может содержать аффинный лиганд, представляющий собой нуклеиновую кислоту, и/или аффинный лиганд, представляющий собой пептид, для продукта экспрессии или белка PDE4D7.
Термин «аффинный лиганд для продукта экспрессии PDE4D7, представляющий собой нуклеиновую кислоту», используемый в настоящем документе, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной специфичным образом связываться с транскриптом или молекулой ДНК PDE4D7, полученными из сплайсингового варианта 7 PDE4D, еще более предпочтительно, к последовательности ДНК, изображенной в SEQ ID NO: 1, или к последовательности ДНК, комплементарной последовательности, изображенной в SEQ ID NO: 1, или соответствующей молекуле РНК. Аффинный лиганд, представляющий собой нуклеиновую кислоту, также может быть способен специфичным образом связываться с последовательностью ДНК, которая является по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности, представленной как SEQ ID NO: 1, или последовательностью ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности, представленной как SEQ ID NO: 2, или любыми фрагментами указанных последовательностей.
Термин «аффинный лиганд для белка PDE4D7, представляющий собой пептид», используемый в настоящем документе, относится к пептидной молекуле, способной специфичным образом связываться с белком PDE4D7. Пептидная молекула, предпочтительно, может быть способна специфичным образом связываться с белком или полипептидом, содержащими аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 2. Аффинный лиганд, представляющий собой пептид, также может быть способен специфичным образом связываться с белком или полипептидом, содержащими аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью ДНК, которая является по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности, представленной как SEQ ID NO: 1, или белком или полипептидом, содержащими аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности, представленной как SEQ ID NO: 2, или любыми фрагментами указанных последовательностей. Термин «пептид» относится к любому типу аминокислотной последовательности, содержащей более 2 аминокислот, например, к полипептидным структурам или их функциональным производным. Помимо этого, пептид можно комбинировать с другими химическими частями или функциональными группами.
Термин «продукт экспрессии», используемый в настоящем документе, относится к транскрипту или молекуле мРНК PDE4D7, генерированным экспрессией гена PDE4D. Более предпочтительно, термин относится к транскрипту PDE4D, прошедшему процессинг, как описано выше в настоящем документе, например, через последовательность, представленную как SEQ ID NO: 1.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения композиция по настоящему изобретению содержит аффинные лиганды, представляющие собой нуклеиновую кислоту и пептид, выбранные из группы, состоящей из ряда олигонуклеотидов, специфичных для продукта экспрессии PDE4D7, зонда, специфичного для продукта экспрессии PDE4D7, аптамера, специфичного для продукта экспрессии PDE4D7 или для белка PDE4D7, антитела, специфичного для белка PDE4D7, и варианта антитела, специфичного для белка PDE4D7.
Композиция по настоящему изобретению может, например, содержать ряд олигонуклеотидов, специфичных для продукта экспрессии PDE4D7, и/или зонд, специфичный для продукта экспрессии PDE4D7. Термин «олигонуклеотид, специфичный для продукта экспрессии PDE4D7», используемый в настоящем документе, относится к нуклеотидной последовательности, которая является комплементарной смысловой или антисмысловой цепи сплайсингового варианта 7 PDE4D. Предпочтительно, олигонуклеотид является комплементарным последовательности ДНК, изображенной в SEQ ID NO: 1, или последовательности ДНК, комплементарной последовательности, изображенной в SEQ ID NO: 1. Олигонуклеотидная последовательность может также быть комплементарной последовательности ДНК, которая является по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности, представленной как SEQ ID NO: 1, или последовательности ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности, представленной как SEQ ID NO: 2.
Олигонуклеотид может иметь подходящую длину и последовательность, известные специалистам, который можно получить из последовательности SEQ ID NO: 1 или ее комплемента. Обычно олигонуклеотид может иметь длину от 8 до 60 нуклеотидов, предпочтительно от 10 до 35 нуклеотидов, более предпочтительно длину 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 или 33 нуклеотида. Олигонуклеотидные последовательности, специфичные для продукта экспрессии PDE4D7, можно определить с помощью компьютерных программ, известных специалистам.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения олигонуклеотидные последовательности могут быть комплементарными последовательностям, локализованным в экзоне 1 или экзоне 2 гена PDE4D7, последовательностям, локализованным на границе между экзоном 1 и экзоном 2 гена PDE4D7, или последовательностям, локализованным только в экзоне 2 гена PDE4D7, предпочтительно, протяженности из 271 уникального нуклеотида PDE4D7, т.е. 42 нуклеотидам на 3’-конце экзона 1 и 229 нуклеотидам на 5’-конце экзона 2 PDE4D. Например, олигонуклеотид, который можно использовать в качестве прямого праймера, может быть локализованным на границе между экзоном 1 и экзоном 2 гена PDE4D7, а олигонуклеотид, который можно использовать в качестве обратного праймера, может быть локализованным в экзоне 2 гена PDE4D7.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ряд олигонуклеотидов имеет последовательности, изображенные в SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4. Помимо этого, предпочтительными являются олигонуклеотиды, имеющие или содержащие последовательность, изображенную в SEQ ID NO: 7 и/или SEQ ID NO: 8.
Термин «зонд, специфичный для продукта экспрессии PDE4D7», используемый в настоящем документе, означает нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной смысловой или антисмысловой цепи сплайсингового варианта 7 PDE4D. Предпочтительно, зонд является комплементарным последовательности ДНК, изображенной в SEQ ID NO: 1, или последовательности ДНК, комплементарной последовательности, изображенной в SEQ ID NO: 1. Последовательность зонда также может быть комплементарной последовательности ДНК, которая является по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности, представленной как SEQ ID NO: 1, или последовательности ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности, представленной как SEQ ID NO: 2.
Зонд может иметь любую подходящую длину и последовательность, известные специалистам, который можно получить из последовательности SEQ ID NO: 1 или ее комплемента. Обычно зонд может иметь длину от 6 до 300 нуклеотидов, предпочтительно от 15 до 60 нуклеотидов, более предпочтительно длину 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 нуклеотидов. Последовательности зондов, специфичные для продукта экспрессии PDE4D7, можно определить с помощью компьютерных программ, известных специалистам.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения последовательность зонда может быть комплементарной последовательности, локализованной в экзоне 1 или экзоне 2 гена PDE4D7, предпочтительно, протяженности из 271 уникального нуклеотида PDE4D7, т.е. 42 нуклеотидам на 3’-конце экзона 1 и 229 нуклеотидам на 5’-конце экзона 2 PDE4D. Если зонд предназначается для использования для реакций количественной ПЦР, например, ПЦР в режиме реального времени, зонд можно сконструировать таким образом, что он локализуется на позиции между позициями связывания прямого и обратного праймера. Предпочтительно, зонд можно сконструировать таким образом, что он локализуется вблизи от одного из праймерных олигонуклеотидов. Более предпочтительно, он может локализоваться вблизи от прямого праймера.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения зонд имеет последовательность, изображенную в SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 9.
Композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать аптамер, специфичный для продукта экспрессии или белка PDE4D7. Термин «аптамер, специфичный для продукта экспрессии или белка PDE4D7», используемый в настоящем документе, относится к короткой молекуле нуклеиновой кислоты, например, РНК, ДНК, ПНК, CNA, HNA, LNA или ANA или к любому другому подходящему формату нуклеиновой кислоты, известному специалистам, которая способна специфическим образом связываться со сплайсинговым вариантом 7 PDE4D, предпочтительно к молекуле ДНК, полученной из сплайсингового варианта 7 PDE4D. Более предпочтительно, молекула аптамера нуклеиновой кислоты может специфичным образом связываться с последовательностью ДНК, изображенной в SEQ ID NO: 1 или ее двухцепочечным производным. Аптамер нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может также связываться с молекулой РНК, соответствующей транскрипту PDE4D7, предпочтительно с молекулой РНК, соответствующей последовательности ДНК, изображенной в SEQ ID NO: 1.
Аптамер нуклеиновой кислоты может дополнительно специфическим образом связываться с последовательностью ДНК, которая является по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности, представленной как SEQ ID NO: 1, или последовательности ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности, представленной как SEQ ID NO: 2, или молекулам РНК, соответствующим указанным последовательностям.
Специфичность аптамера нуклеиновой кислоты по отношению к сплайсинговому варианту 7 PDE4D может обеспечиваться специфичным связыванием с последовательностями, присутствующими исключительно в указанном сплайсинговом варианте, например, в экзоне 2 или на границе между экзоном 1 и 2 PDE4D. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения специфичность аптамера нуклеиновой кислоты по отношению к сплайсинговому варианту 7 PDE4D может обеспечиваться специфичным связыванием с последовательностью, локализованной в протяженности из 271 уникальных нуклеотидов PDE4D7, т.е. 42 нуклеотидов на 3’-конце экзона 1 и 229 нуклеотидов на 5’-конце экзона 2 PDE4D. Аптамеры нуклеиновой кислоты можно генерировать в соответствии с любым подходящим способом, известным специалистам, например, путем in vitro селекции или с использованием способов SELEX. Предпочтительно, аптамеры нуклеиновой кислоты можно генерировать и/или конструировать, согласно руководству, представленному в Ellington and Szostak, 1990, Nature, 346:818-822. Аптамер нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению можно затем комбинировать с дополнительными частями, например, с взаимодействующими частями, такими как биотин или ферментативные функциональности, такие как рибозимные элементы.
Термин «аптамер, специфичный для белка PDE4D7», используемый в настоящем документе, относится к короткому пептиду, способному взаимодействовать и специфичным образом связываться с белком PDE4D7. Пептидный аптамер может быть, предпочтительно, способен специфичным образом связываться с белком или полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 2. Пептидный аптамер может быть также способен специфичным образом связываться с белком или полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью ДНК, которая является по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности, представленной как SEQ ID NO: 1, или с белком или полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности, представленной как SEQ ID NO: 2. Обычно пептидный аптамер представляет собой вариабельную пептидную петлю, содержащую, например, от 10 до 20 аминокислот. В контексте настоящего изобретения пептидный аптамер может быть, предпочтительно, присоединен одним или обоими концами к скаффолдной структуре. Скаффолдная структура может представлять собой любую молекулу, предпочтительно белок, которая обладает хорошей растворимостью. Подходящие скаффолдные молекулы известны специалистам. Предпочтительной скаффолдной молекулой для использования в контексте настоящего изобретения является бактериальный белок тиоредоксин-А. Аптамерная пептидная петля может быть, предпочтительно, инсерцирована в редуцирующий активный сайт молекулы скаффолда. Альтернативно, стафилококковый белок А и его домены и производные указанных доменов, такие как белок Z или липокалины, можно использовать в качестве скаффолдных структур в контексте настоящего изобретения.
Пептидные аптамеры можно генерировать в соответствии с любым подходящим способом, известным специалистам, например, с использованием дрожжевых двухгибридных подходов.
2
2
HH
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения композиция может содержать или может дополнительно содержать антитело, специфичное для белка PDE4D7, предпочтительно моноклональное или поликлональное антитело. Также предпочтительными являются варианты или фрагменты антител, такие как одноцепочечное антитело, диатело или минимальное антитело, одноцепочечный фрагмент Fv (sc(Fv)), антитело sc(Fv), фрагмент Fab или фрагмент F(ab’), основанные на моноклональном антителе, специфичном для PDE4D7, малый модулярный иммунофармацевтик (SMIP), домен-связывающий иммуноглобулиновый гибридный белок, камелизированное антитело, V-содержащее антитело и т.п. Антитело может быть моно-, би-, три- или мультивалентным. Антитело может быть любого происхождения, например, мышиное, человеческое или химерное, или гуманизированное мышиное антитело. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения коммерчески доступные анти-PDE4D7 антитела, такие как NB300-652 (Novus Biologicals, Inc.) или GTX14629 (GeneTex, Inc.), можно включать в состав композиции или можно использовать в диагностических целях.
Антитела можно производить любым подходящим способом, известным специалистам. Поликлональные антитела можно производить иммунизацией животных антигеном выбора, в то время как моноклональные антитела определенной специфичности можно производить с использованием, например, гибридомной технологии, разработанной Köhler и Milstein (Köhler and Milstein, 1976, Eur. J. Immunol., 6:511-519).
Аффинный лиганд, как описано выше в настоящем документе, могут быть помечены различными маркерами или могут быть обнаружены с помощью вторичного аффинного лиганда, меченного различными маркерами, чтобы обеспечить обнаружение, визуализацию и/или количественную оценку. Это можно осуществить с использованием любых подходящих меток, которые можно конъюгировать с аффинным лигандом, способным взаимодействовать с продуктом экспрессии PDE4D7 или белком PDE4D7, или с любым вторичным аффинным лигандом, с использованием любой подходящей методики или способов, известных специалистам. Термин «вторичный аффинный лиганд» относится к молекуле, которая способна связываться с аффинным лигандом, как определено выше в настоящем документе (т.е. с «первичным аффинным лигандом», если используется в контексте системы с двумя взаимодействующими аффинными лигандами). Взаимодействие связывания предпочтительно представляет собой специфичное связывание.
Примеры меток, которые можно конъюгировать с первичными и/или вторичными аффинными лигандами, включают в себя флуоресцентные краски или металлы (например, флуоресцеин, родамин, фикоэритрин, флуорескамин), хромофорные краски (например, родопсин), хемилюминесцентные соединения (например, люминал, имидазол) и биолюминесцентные белки (например, люциферин, люциферазу), гаптены (например, биотин).
3
14
32
33
35
125
11
13
15
18
64
62
124
76
82
68
18
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения аффинный лиганд, предназначенный для использования в качестве зонда, в частности, зонда, специфичного для продукта экспрессии PDE4D7, как определено выше в настоящем документе, можно метить флуоресцентной меткой, такой как 6-FAM, HEX, TET, ROX, Cy3, Cy5, техасская красная или родамин, и/или в то же время гасительной меткой, такой как TAMRA, Dabcyl, гаситель Black Hole, BHQ-1 или BHQ-2. Ряд других подходящих флуоресцентов и хромофоров описан в Stryer, 1968, Science, 162:526-533. Аффинные лиганды также можно метить ферментами (например, пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой, бета-лактамазой), радиоактивными изотопами (например, H, C, P, P, S, I, C, N, O, F, Cu, Cu, I, Br, Rb, Ga или F) или частицами (например, золота).
Различные типы меток можно конъюгировать с аффинным лигандом с использованием различных химических реакций, например, реакции с амином или реакции с тиолом. Однако можно использовать не только амины или тиолы, но и другие группы, например, альдегиды, карбоновые кислоты и глутамин.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения аффинный лиганд, представляющий собой нуклеиновую кислоту, или пептидный аффинный лиганд по настоящему изобретению можно модифицировать для функционирования в качестве контрастного агента.
Термин «контрастный агент», используемый в настоящем документе, относится к молекулярному соединению, которое способно специфичным образом взаимодействовать с маркером PDE4D7 и который можно обнаружить с помощью аппарата, расположенного вне тела человека или животного. Предпочтительно, указанные контрастные агенты являются пригодными для использования в ядерном магнитном резонансе (ЯМР) или фотонном резонансном тесте (ФРТ). Термин «специфичное взаимодействие» относится к свойству молекулярного соединения взаимодействовать с маркером PDE4D7 на поверхности клеток, присутствующих в теле человека или животного, предпочтительным перед другими белками, которые экспрессируются указанными клетками. Предпочтительные контрастные агенты, которые также могут обозначаться как композиции контрастных агентов, будут способны специфичным образом обнаруживать молекулы, имеющие нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, или их производные или гомологичные варианты, как определено выше в настоящем документе. Предпочтительные контрастные агенты представляют собой аптамеры, специфичные для продукта экспрессии PDE4D7 или белка PDE4D7, как определено выше в настоящем документе, а также антитела, специфичные для белка PDE4D7, как определено выше в настоящем документе.
Контрастные агенты, помимо их свойства специфичным образом распознавать маркер PDE4D7, будут, в типичном случае, дополнительно включать еще одну молекулу, которая поддается обнаружению с помощью конкретной используемой методики обнаружения. Термин «модифицированный для функционирования», используемый в настоящем документе, относится, таким образом, к любым подходящим модификациям, известным специалистам, которые могут быть необходимы, чтобы осуществлять использование контрастного агента в методиках молекулярной визуализации, в частности, ЯМР или ФРТ. Например, если в качестве средства обнаружения используется флуоресцентная спектроскопия, указанные молекулы могут включать в себя флуорофоры в качестве выявляемых маркерных молекул, которые могут приходить в возбужденное состояние при конкретной длине волны. Альтернативно, можно использовать радиоактивную метку, например, радиоактивный изотоп, как описано выше в настоящем документе. Что касается предпочтительных контрастных агентов в соответствии с настоящим изобретением, которые являются подходящими для ЯМР, контрастные агенты, такие как описанные выше антитела, могут включать в себя маркерную молекулу, которая поддается обнаружению с помощью ЯМР. Указанные поддающиеся обнаружению метки включают, например, USPIOS и 19Fluor.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения композиция может дополнительно содержать вспомогательные ингредиенты, такие как ПЦР буферы, дНТФ, полимеразу, ионы, такие как двухвалентные катионы или одновалентные катионы, гибридизационные растворы, вторичные аффинные лиганды, такие как, например, вторичные антитела, краски для обнаружения и любое другое подходящее соединение или жидкость, необходимые для осуществления обнаружения, на основе любого из аффинных лигандов или контрастных агентов, как определено выше в настоящем документе, которые известны специалистам.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению аффинного лиганда, представляющего собой нуклеиновую кислоту или пептид, для продукта экспрессии или белка PDE4D7, как определено выше в настоящем документе, для изготовления композиции для диагностики, выявления, мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы или прогрессирования рака предстательной железы или предрасположенности к развитию рака предстательной железы у индивидуума, как описано выше в настоящем документе.
В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению ряда олигонуклеотидов, специфичных для продукта экспрессии PDE4D7, и/или зонда, специфичного для продукта экспрессии PDE4D7, как описано выше в настоящем документе, для изготовления композиции для диагностики, выявления, мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы или прогрессирования рака предстательной железы или предрасположенности к развитию рака предстательной железы у индивидуума, как описано выше в настоящем документе. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению аптамера, специфичного для продукта экспрессии или белка PDE4D7, как описано выше в настоящем документе, для изготовления композиции для диагностики, выявления, мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы или прогрессирования рака предстательной железы или предрасположенности к развитию рака предстательной железы у индивидуума, как описано выше в настоящем документе.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению антитела, специфичного для белка PDE4D7, или варианта антитела, специфичного для белка PDE4D7, как описано выше в настоящем документе, для изготовления композиции для диагностики, выявления, мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы или прогрессирования рака предстательной железы или предрасположенности к развитию рака предстательной железы у индивидуума, как описано выше в настоящем документе.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения композиция, как определено выше в настоящем документе, представляет собой диагностическую композицию.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к диагностическому набору для диагностики, выявления, мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы или прогрессирования рака предстательной железы или предрасположенности к развитию рака предстательной железы у индивидуума, включающему в себя ряд олигонуклеотидов, специфичных для продукта экспрессии PDE4D7, зонд, специфичный для продукта экспрессии PDE4D7, и/или аптамер, специфичный для продукта экспрессии или белка PDE4D7, и/или антитело, специфичное для белка PDE4D7, и вариант антитела, специфичный для белка PDE4D7.
Обычно диагностический набор по настоящему изобретению содержит один или более агентов, позволяющих специфичным образом обнаруживать PDE4D7, как определено выше в настоящем документе. Агенты или ингредиенты диагностического набора могут, согласно настоящему изобретению, помещаться в одном иди более контейнеров или отдельных емкостях. Природа агентов определяется способом обнаружения, для которого предназначен набор. Если предусматривается обнаружение на уровне экспрессии мРНК PDE4D7, т.е. через продукт экспрессии PDE4D7, то агенты в наборе могут представлять собой ряд олигонуклеотидов, специфичных для продукта экспрессии PDE4D7, и/или зонд, специфичный для продукта экспрессии PDE4D7, как определено выше в настоящем документе, которые, необязательно, могут быть помечены способами, известными специалистам, например, метками, описанными выше в настоящем документе. Помимо этого, или альтернативно, в состав набора может быть включен аптамер, специфичный для продукта экспрессии PDE4D7. Если предусматривается обнаружение на уровне белка PDE4D7, то агенты в наборе могут представлять собой антитела или соединения, содержащие антиген-связывающий фрагмент антитела, или варианты антител, специфичные для белка PDE4D7, как описано выше в настоящем документе. Помимо этого, или альтернативно, в состав набора может быть включен аптамер, специфичный для белка PDE4D7. Альтернативно, диагностический набор может включать контрастный агент, как определено выше в настоящем документе.
Присутствие специфичных белков также можно обнаружить с использованием других соединений, которые специфичным образом взаимодействуют с PDE4D7, например, специфичных субстратов или лигандов.
Предпочтительно, диагностический набор по настоящему изобретению содержит реагенты обнаружения для продукта экспрессии PDE4D7 или белка PDE4D7. Указанные реагенты обнаружения включают, например, буферные растворы, метки или жидкости для промывания и т.п. Кроме того, набор может включать такое количество известной молекулы нуклеиновой кислоты или белка, которое можно использовать для калибровки набора или в качестве внутреннего контроля. Обычно диагностический набор для обнаружения продуктов экспрессии PDE4D7 может включать дополнительные ингредиенты, такие как ПЦР буферы, дНТФ, полимеразу, ионы, такие как двухвалентные катионы или одновалентные катионы, гибридизационные растворы и т.п. Диагностический набор для обнаружения белков PDE4D7 может также включать дополнительные ингредиенты, такие как вторичные аффинные лиганды, например, вторичные антитела, краски для обнаружения и любое другое подходящее соединение или жидкость, необходимые для осуществления обнаружения белка, которые известны специалистам. Указанные ингредиенты известны специалистам и могут варьироваться в зависимости от осуществляемого способа обнаружения. Помимо этого, набор может включать листовку-инструкцию и/или может обеспечивать информацию, касающуюся полученных результатов.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики, выявления, мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы или прогрессирования рака предстательной железы у индивидуума, включающему по меньшей мере этап определения уровня PDE4D7 в образце. Термин «определение уровня PDE4D7» относится к определению наличия или количества продуктов экспрессии PDE4D7, например, транскрипта (транскриптов) PDE4D7, и/или к определению наличия и/или количества белка (белков) PDE4D7. Термин «уровень PDE4D7», таким образом, означает наличие или количество продуктов экспрессии PDE4D7, например, транскрипта (транскриптов) PDE4D7, и/или определение наличия или количества белка (белков) PDE4D7. Определение наличия или количества продуктов экспрессии PDE4D7, например, транскрипта (транскриптов) PDE4D7 или белка (белков) PDE4D7, можно осуществлять средствами, известными специалистам.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения определение наличия или количества продуктов экспрессии PDE4D7, например, транскрипта (транскриптов) PDE4D7 и/или белка (белков) PDE4D7, осуществляют измерением уровней нуклеиновой кислоты или белка или определением биологической активности PDE4D7. Таким образом, уровень (уровни) экспрессии PDE4D7 можно определить способом, включающим обнаружение мРНК, кодируемой геном PDE4D7, обнаружение белка PDE4D7, кодируемого транскриптом PDE4D7, и/или обнаружение биологической активности PDE4D7.
Например, измерение уровня экспрессии нуклеиновых кислот PDE4D7 можно осуществить сепарацией молекул нуклеиновых кислот (например, РНК или кДНК), полученных из образца, в агарозных или полиакриламидных гелях, с последующей гибридизацией со специфичными в отношении PDE4D7 олигонуклеотидными зондами, как определено выше в настоящем документе. Альтернативно, уровень экспрессии можно определить нанесением метки на нуклеиновую кислоту, полученную из образца, с последующей сепарацией на секвенирующем геле. Образца нуклеиновой кислоты можно помещать на гель таким образом, чтобы нуклеиновая кислота пациента и контроля или стандартной нуклеиновой кислоты располагались на смежных полосах. Сравнение уровней экспрессии можно осуществлять визуально или посредством денситометра. Способы обнаружения мРНК или продуктов экспрессии известны специалистам. Обычно для данной цели можно использовать анализ норзерн-блот.
Альтернативно, уровень экспрессии нуклеиновых кислот PDE4D7 можно обнаружить с использованием подхода планшетов или микропланшетов ДНК. Обычно образец нуклеиновых кислот, полученных от субъектов, проходящих исследование, обрабатывают и метят, предпочтительно, флуоресцентной меткой. Впоследствии указанные молекулы нуклеиновых кислот можно использовать в гибридизационной методике с иммобилизованными захватывающими зондами, соответствующими маркерному гену PDE4D7 по настоящему изобретению или известному биомаркеру или раковым маркерным генам. Подходящие средства для осуществления микропланшетных анализов известны специалистам.
В стандартном наборе планшет или микропланшет ДНК включает иммобилизованные зонды высокой плотности для обнаружения ряда генов. Зонды на планшете являются комплементарными одной или более частей последовательности маркерного гена или целой кодирующей области маркерного гена. В настоящем изобретении любой тип связанного с PDE4D7 полинуклеотида можно использовать в качестве зонда в планшете ДНК, если только полинуклеотид учитывает специфическую разницу между экспрессией PDE4D7 и экспрессией других генов. Обычно кДНК, продукты ПЦР и олигонуклеотиды являются подходящими в качестве зондов. Предпочтительно, в качестве зонда можно использовать зонд, включающий специфические части сплайсингового варианта 7 PDE4D. Помимо определения экспрессии PDE4D7, можно также определять экспрессию других генов, например, дополнительных биомаркеров или раковых маркерных генов.
Методика, основанная на планшетах и микропланшетах ДНК, обычно включает следующие этапы: (1) выделение мРНК из образца и, необязательно, конвертирование мРНК в кДНК, и, впоследствии, мечение указанной РНК или кДНК. Способы выделения РНК, конвертирования ее в кДНК и мечения нуклеиновых кислот описаны в руководствах по микропланшетной методике. (2) Гибридизация нуклеиновых кислот с этапа (1) с зондами для маркерных генов. Нуклеиновые кислоты из образца можно метить краской, такой как флуоресцентные краски Cy3 (красная) или Cy5 (синяя). Обычно контрольный образец метят другой краской. (3) Выявление гибридизации нуклеиновых кислот из образца с зондами и определение, по меньшей мере качественно, и, более конкретно, количественно, количества мРНК в образце для PDE4D7 и/или для дополнительных исследуемых маркерных генов. Разницу в уровне экспрессии между образцом и контролем можно оценить на основе разницы в интенсивности сигнала. Это можно измерить и проанализировать с использованием подходящей компьютерной программы, такой как, без ограничения, компьютерная программа, например, от Affymetrix.
Не существует ограничений количества зондов, соответствующих используемым маркерным генам, которые наносят на планшет ДНК. Также, маркерный ген может быть представлен двумя или более зондов, которые гибридизируются с различными частями гена. Зонды конструируют для каждого выбранного маркерного гена. Подобный зонд обычно представляет собой олигонуклеотид, включающий 5-50 нуклеотидных остатков. Более длинные ДНК можно синтезировать с использованием ПЦР или химическими способами. Способы синтеза указанных олигонуклеотидов и нанесения их на субстрат хорошо известны специалистам в области микропланшетных методик. Гены, не являющиеся маркерными генами, также можно наносить на планшет ДНК. Например, зонд для гена, уровень экспрессии которого не изменяется значимым образом, можно наносить на планшет ДНК для стандартизации результатов исследования или для сравнения результатов исследования множества планшетов или других исследований.
Альтернативно, уровень экспрессии нуклеиновых кислот PDE4D7 можно обнаружить с использованием количественного подхода ОТ-ПЦР, предпочтительно, подхода ПЦР в режиме реального времени, с последующей обратной транскрипцией транскрипта мРНК PDE4D7. Обычно, в качестве первого этапа, транскрипт обратно транскрибируют в молекулу кДНК с использованием любого подходящего способа, известного специалистам. Количественный подход или подход ПЦР в режиме реального времени впоследствии можно осуществить на основе первой цепи ДНК, полученной, как описано выше.
Предпочтительно, зонды Taqman или Molecular Beacon в качестве принципиальных зондов указанного типа на основе FRET можно использовать для количественного ПЦР-обнаружения. В обоих случаях зонды, предпочтительно, зонды PDE4D7, как определено выше в настоящем документе, служат в качестве внутренних зондов, которые используют в сочетании с парой противоположных праймеров, которые фланкируют область-мишень, представляющую интерес, предпочтительно, ряд олигонуклеотидов PDE4D7, как определено выше в настоящем документе. После амплификации сегмента-мишени зонд может селективно связываться с продуктами на идентифицирующей последовательности между праймерными сайтами, вызывая, таким образом, увеличения сигналинга FRET относительно увеличений частоты-мишени.
Предпочтительно, зонд Taqman, предназначенный для использования в количественном ПЦР-подходе по настоящему изобретению, может содержать олигонуклеотид PDE4D7, как определено выше, приблизительно из 22-30 оснований, который помечен по обоим концам парой FRET. Обычно 5’-конец будет иметь флуорофор более короткой длины волны, например, флуоресцеин (например, FAM), а 3’-конец обычно метят флуоресцентным гасителем более длинной длины волны, (например, TAMRA), или нефлуоресцентным гасителем (например, гасителем Black Hole). Предпочтительно, чтобы зонды, предназначенные для использования для количественной ПЦР, в частности, зонды PDE4D7, как определено выше в настоящем документе, не имели гуанидина (G) на 5’-конце, прилегающем к репортерной краске, с целью избежать гашения флуоресценции репортера после деградации зонда.
Зонд Molecular Beacon, предназначенный для подхода количественной ПЦР по настоящему изобретению, предпочтительно, использует FRET взаимодействия для обнаружения и количественной оценки продукта ПЦР, при этом каждый зонд имеет флуоресцентно меченный 5’-конец и меченный гасителем 3’-конец. Указанная шпилечная или петлевая конфигурация структуры зонда включает, предпочтительно, ствол с двумя короткими самосвязывающимися концами и петлю с длинной внутренней специфичной в отношении мишени областью приблизительно из 20-30 оснований.
Альтернативные механизмы обнаружения, которые также можно применять в контексте настоящего изобретения, направлены на зонд, изготовленный только с петлевой структурой и без короткой комплементарной стволовой области. Альтернативный подход на основе FRET для количественной ПЦР, который также можно использовать в контексте настоящего изобретения, основывается на применении двух гибридизационных зондов, которые связываются со смежными сайтам на мишени, в котором первый зонд имеет флуоресцентную донорскую метку на 3’-конце, а второй зонд имеет флуоресцентную акцепторную метку на 5’-конце.
Измерение уровней белка PDE4D7 или любых его фрагментов, гомологов или производных можно осуществлять посредством любой подходящей методики, известной специалистам. Предпочтительно, уровень белка PDE4D7 и его производных можно определить иммунологически способами, например, использованием антитела, специфичного для белка PDE4D7, предпочтительно антитела, определенного выше в настоящем документе. Альтернативно, можно использовать варианты или фрагменты антитела, как определено выше в настоящем документе. Настоящее изобретение также предусматривает применение пептидных аффинных лигандов, таких как аптамеры, специфичные для белка PDE4D7, как определено выше в настоящем документе.
Определение уровней белка PDE4D7 можно осуществлять, например, сепарацией белков из образца на полиакриламидном геле, с последующей идентификацией белка PDE4D7 с использованием специфично связывающихся антител в анализе вестерн-блот. Альтернативно, белки можно отделять с использованием систем гелевого плоскостного электрофореза. Плоскостной гелевый электрофорез хорошо известен специалистам и обычно включает изоэлектрическое фокусирование вдоль первого измерения, с последующим электрофорезом SDS-PAGE вдоль второго измерения. Анализ гелей плоскостного SDS-PAGE можно осуществлять определением интенсивности белковых пятен на геле или можно осуществлять с использованием иммунного обнаружения. В других вариантах осуществления настоящего изобретения белковые образцы анализируют с использованием масс-спектроскопии.
В контексте настоящего изобретения специфичные для PDE4D7 антитела можно помещать на подложку и иммобилизовывать. Белки, полученные из образцов или тканей, подлежащих анализу, можно впоследствии смешивать в антителами. Затем можно осуществлять реакцию обнаружения, например, с использованием второго аффинного лиганда, как определено выше в настоящем документе, специфичного антитела.
Иммунологические тесты, которые можно использовать в контексте настоящего изобретения, в частности, для диагностических целей по настоящему изобретению, включают, например, конкурентные и неконкурентные аналитические системы, в которых используются такие методики, как вестерн-блоты, радиоиммунологический анализ, такой как RIA (радиоиммуноанализ), ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), иммуноанализы «сэндвич», анализы иммунопреципитации, реакции преципитации, диффузные реакции преципитации в геле, анализы иммунодиффузии, анализы агглютинации, например, агглютинации в латексе, анализы фиксации комплемента, иммунорадиометрические анализы, флуоресцентные иммуноанализы, например, FIA (иммунофлуоресцентный анализ), хемилюминесцентный иммуноанализа (ECLIA) и иммуноанализ с белком А. Указанные анализы являются рутинными и хорошо известны специалистам.
3
125
3
125
Помимо этого, связывающую аффинность антитела в отношении антигена и отдаленное взаимодействие антитело-антиген можно определить путем конкурентных связывающих анализов. Одним примером конкурентного связывающего анализа является радиоиммуноанализ, включающий инкубирование меченого антигена (например, Н или I) с подходящим антителом в присутствии возрастающих количеств немеченого антигена, и обнаружение антитела, связанного с меченым антигеном. Аффинность антитела, представляющего интерес, для конкретного антигена и отдаленные взаимодействия можно определить из данных с использованием любого подходящего аналитического подхода, например, с использованием графика Скэтчарда. Конкуренцию с вторичным антителом также можно определить с использованием радиоиммуноанализа. В данном случае антиген можно инкубировать с подходящим антителом, конъюгированным с меченым соединением (например, Н или I) в присутствии возрастающих количеств немеченого вторичного антитела.
Кроме того, аптамеры, специфичные для белка PDE4D7, предпочтительно, как определено выше в настоящем документе, можно использовать в способе обнаружения белков PDE4D7. Указанные аптамеры могут быть, предпочтительно, помечены, чтобы сделать возможным обнаружение взаимодействия белок-лиганд.
Определение биологической активности PDE4D7 можно осуществить с использованием молекулярных или ферментативных анализов, специфичных для соответствующей функции или функций PDE4D7. Предпочтительно, можно использовать систему считывания данных, основанную на конверсии цАМФ фосфодиэстеразой. Подходящие методики известны специалистам. В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения анализ для определения биологической активности PDE4D7 можно осуществлять в комбинации с ингибированием активности других сплайсинговых вариантов PDE4D, других изоформ PDE4D и/или других PDE, предпочтительно, других PDE, способных осуществлять конверсию цАМФ. Указанное ингибирование активности можно осуществлять любыми подходящими средствами, известными специалистам, предпочтительно, с использованием подходящих антисмысловых нуклеотидов, специфичных молекул siРНК или miРНК.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения биологическую активность PDE4D7 можно исследовать с помощью специфичных ингибиторов PDE4D7. Использование указанных ингибиторов можно комбинировать, например, с системой считывания данных, основанной на конверсии субстрата цАМФ. Типичные ингибиторы PDE4D7, предназначенные для использования, включают антисмысловые молекулы, молекулы siРНК или молекулы miРНК.
Уровень PDE4D7 можно также определить с использованием способов, включающих гистологические или клеточно-биологические процедуры. Обычно можно использовать визуальные методики, такие как световая микроскопия или иммунофлуоресцентная микроскопия, а также проточная цитометрия или люминометрия. Присутствие белка PDE4D7 в клетке можно обнаружить или определить, например, путем удаления клеток, подлежащих исследованию, из образцов, как определено выше в настоящем документе. Для указанных способов можно использовать также тканевые среды или биоптаты. Впоследствии можно применять аффинные лиганды для PDE4D7, предпочтительно антитела или аптамеры. Обычно указанные аффинные лиганды метят, предпочтительно, флуоресцентными метками, как определено выше в настоящем документе. Указанная процедура предусматривает обнаружение PDE4D7, его количественную оценку и, помимо этого, определение ее распределения и относительного уровня экспрессии.
Указанные процедуры включают способы визуализации. Походящие способы визуализации известны специалистам. Типичные способы включают флуорометрические, люминометрические и/или ферментативные методики. Флуоресценцию обычно выявляют и/или количественно оценивают путем воздействия на флуоресцентные метки света со специфической длиной волны, с последующим обнаружением и/или количественной оценкой излучаемого света со специфической длиной волны. Присутствие люминесцентно меченного аффинного лиганда можно обнаружить и/или количественно оценить по люминесценции, проявляющейся во время химической реакции. Обнаружение ферментативной реакции осуществляется по изменению цвета в образце, возникающему в результате химической реакции.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения уровень PDE4D7 можно определить с использованием подходящих молекулярных методик визуализации, например, ядерного магнитного резонанса (ЯМР) или фотонного резонансного теста (ФРТ), и/или с использованием подходящих контрастных агентов, например, контрастных агентов, описанных выше в настоящем документе.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения способ диагностики, выявления, мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы или прогрессирования рака предстательной железы по настоящему изобретению включает дополнительный этап сравнения измеренных уровней нуклеиновых кислот или белка или измеренной биологической активности с контрольным уровнем. Термин «контрольный уровень», используемый в настоящем документе, относится к уровню экспрессии маркера PDE4D7 или других подходящих маркеров в раковом контроле или нераковом контроле, как описано выше в настоящем документе. Статус, природу, количество и состояние контрольного уровня можно подбирать в соответствии с потребностями. Предпочтительно, можно использовать нераковый контроль. Термин «сравнение», используемый в настоящем документе, относится к любому подходящему способу определения, расчетов, оценки или обработки данных.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения дополнительный этап принятия решения и наличии или стадии рака предстательной железы или прогрессирования рака предстательной железы может основываться на результатах этапа сравнения. Рак предстательной железы можно диагностировать или прогнозировать или прогрессирование рака предстательной железы можно диагностировать или прогнозировать с использованием указанного способа, согласно соответствующим определениям, представленным выше в настоящем документе, в контексте PDE4D7 как маркера рака предстательной железы.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу выявления, диагностики, мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы или прогрессирования рака предстательной железы, включающему по меньшей мере этапы:
(а) тестирования по меньшей мере одного образца, полученного по меньшей мере от одного индивидуума с подозрением на рак предстательной железы, на предмет экспрессии продукта экспрессии PDE4D7 или белка PDE4D7;
(b) тестирования по меньшей мере одного контрольного образца, полученного по меньшей мере от одного индивидуума, не страдающего раком предстательной железы, на предмет экспрессии продукта экспрессии PDE4D7 или белка PDE4D7;
(с) определения разницы в экспрессии между этапами (а) и (b); и
(d) принятия решения о наличии или стадии рака предстательной железы или о прогрессировании рака предстательной железы на основании результатов, полученных на этапе (с).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения этапы a), b), c) и/или d) указанного способа диагностики можно осуществлять вне тела человека или животного, например, в образцах, полученных от пациента или индивидуума.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики, мониторинга или прогнозирования гормонорезистентного рака предстательной железы или прогрессирования в направлении гормонорезистентного рака предстательной железы; указанный способ различает гормоночувствительный и гормонорезистентный рак предстательной железы и включает этапы:
(а) определения уровня PDE4D7 в образце;
(b) определения уровня экспрессии референтного гена в образце;
(с) стандартизации измеренного уровня экспрессии PDE4D7 по уровню экспрессии референтного гена; и
(d) сравнения стандартизированного уровня экспрессии с заранее определенной отсекающей величиной, выбранной для исключения гормоночувствительного рака предстательной железы, в котором стандартизированный уровень экспрессии ниже отсекающей величины является показательным для гормонорезистентного рака предстательной железы, в котором указанная отсекающая величина находится в пределах приблизительно от 1 до 7, предпочтительно, приблизительно 5.
Уровень PDE4D7 можно определять по уровню нуклеиновых кислот, белка или активности, как описано выше в настоящем документе. Предпочтительным является определение количества транскрипта (транскриптов) и/или белка PDE4D7. Помимо этого, в образце можно определять уровень референтного гена. Термин «референтный ген», используемый в настоящем документе, относится к любому подходящему гену, например, к любому постоянно экспрессирующемуся и постоянно обнаруживаемому гену, генному продукту, продукту экспрессии, белку или варианту белка в организме выбора. Термин также включает в себя генные продукты, такие как экспрессированные белки, пептиды, полипептиды, а также их модифицированные варианты. Изобретение, следовательно, включает также референтные белки, полученные из референтного гена. Также изобретение включает все виды транскриптов, которые можно получить из референтного гена, а также их модификации или присоединенные к ним вторичные параметры. Альтернативно или дополнительно, другие референтные параметры также можно использовать для референтных целей, например, метаболические концентрации, размеры клеток и т.п.
Экспрессию можно, предпочтительно, определять в одном и том же образце, т.е. уровень PDE4D7 и референтного гена определяют в одном и том же образце. Если тестирование осуществляют в одном и том же образце, можно использовать подход единственного обнаружения или множественного обнаружения, как описано в настоящем документе. Предпочтительно, для множественного обнаружения можно использовать олигонуклеотиды и зонды, имеющие последовательность SEQ ID NO: 7, 8 и 9. Для осуществления множественного обнаружения концентрация праймеров и/или зондовых олигонуклеотидов может быть модифицирована. Помимо этого, концентрации и наличие других ингредиентов, таких как буферы, ионы и т.п., могут быть модифицированы, например, увеличены или уменьшены, по сравнению с инструкциями производителей.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения можно определять экспрессию более чем одного референтного гена или постоянно экспрессирующегося гена. Например, можно определять экспрессию 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 30 или более референтных генов. Результаты указанных измерений можно рассчитывать по отдельности, или их можно объединять, чтобы получить средний индекс экспрессии. Помимо этого, паттерн экспрессии референтного гена можно определять и/или использовать в качестве основы для последующих этапов. Указанный паттерн может основываться на известном экспрессионном поведении генов при определенном раке, в частности, при стадиях или состояниях рака предстательной железы.
Помимо этого, результаты экспрессии можно сравнивать с уже известными результатами от референтных случаев или из баз данных. Сравнение может дополнительно включать процедуру стандартизации с целью улучшения статистической релевантности результатов.
В альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения вместо определения уровня экспрессии референтного гена в образце можно определять экспрессию другого ракового маркера или непостоянно экспрессирующегося гена. Например, можно определять экспрессию гена, о котором известно, что его экспрессия уменьшается при гормонорезистентном раке предстательной железы, или о котором известно, что его экспрессия увеличивается при гормоночувствительном раке предстательной железы.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения можно также выполнять оба определения, т.е. определение экспрессии референтного гена и другого ракового или биомаркерного гена.
Результаты экспрессии можно стандартизировать с использованием любого подходящего способа, известного специалистам, например, согласно статистическим способам стандартизации, таких как стандартная оценка, t-критерий Стьюдента, стьюдентизированный остаточный критерий, стандартизированный моментный критерий или критерий коэффициента вариации. Обычно указанные критерии или соответствующие формулы, которые должны быть известны специалистам, следует использовать для стандартизации данных экспрессии, чтобы сделать возможным различение реальных изменений в экспрессии гена и изменений, возникающих в процессе измерений.
На основе результатов экспрессии, полученных на этапах (а) и (b), и/или стандартизированных результатов, полученных на этапе (с), можно осуществлять сравнение с отсекающей величиной для экспрессии PDE4D7. Отсекающая величина, ниже которой уровень экспрессии PDE4D7 является показательным для гормонорезистентного рака предстательной железы, исключая, таким образом, гормоночувствительный рак предстательной железы или опухолевые формы, составляет приблизительно от 0,75 до 8, от 0,75 до 7,5, от 0,75 до 7, от 0,75 до 6,5, от 0,75 до 6, от 0,75 до 5,5, от 1,0 до 8, от 1,25 до 8, от 1,5 до 8, от 1,75 до 8, от 2 до 8, от 2,25 до 8, от 2,5 до 8, от 2,75 до 8, от 3 до 8, от 3,25 до 8, от 3,5 до 8, от 3,75 до 8, от 4 до 8, от 4,25 до 8, от 4,5 до 8, от 4,75 до 8 или от 5 до 8. Более предпочтительной является отсекающая величина приблизительно 5, например, 4,9, 4,8, 4,7, 4,6, 4,5, 4,4, 4,3, 4,2, 4,1 или 5,9, 5,8, 5,7, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2 или 5,1. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанная отсекающая величина предназначена для использования с геном «домашнего хозяйства» в качестве референтного гена. Еще более предпочтительно, указанная отсекающая величина предназначена для использования с GAPDH и/или PBGD в качестве референтного гена.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения отсекающая величина представляет собой отсекающую величину для PDE4D7 в образцах крови, например, в образцах сыворотки или плазмы, образцах мочи или образцах осадка мочи. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения отсекающая величина представляет собой отсекающую величину для белка или полипептида PDE4D7 или любого их производного, как определено выше в настоящем документе, в образце мочи. В другом, особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения отсекающая величина представляет собой отсекающую величину для белка или полипептида PDE4D7 или любого их производного, как определено выше в настоящем документе, в клетках, содержащихся в моче, или в экзосомах, секретируемых из клеток, содержащихся в моче. В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения отсекающая величина представляет собой отсекающую величину для белка или полипептида PDE4D7 или любого их производного, как определено выше в настоящем документе, в образце осадка мочи и клетках, содержащихся в образце осадка мочи, или в экзосомах, секретируемых из клеток, содержащихся в образце осадка мочи.
Если измеренная и/или стандартизированная экспрессия PDE4D7 выше указанной отсекающей величины, это можно рассматривать как показатель того, что индивидуум не страдает гормонорезистентным раком предстательной железы. Величина может дополнительно указывать, что индивидуум страдает раком предстательной железы, не являющимся гормонорезистентным раком предстательной железы, в частности, гормонозависимым раком предстательной железы или гормоночувствительным раком предстательной железы.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу сбора данных, включающему этапы:
(а) тестирования индивидуума на предмет экспрессии PDE4D7; и
(b) сравнения экспрессии, определенной на этапе (а), с контрольным уровнем.
in vivo
ех vivo
in vitro
Тестирование на предмет экспрессии PDE4D7 можно осуществлять согласно этапам, как описано выше в настоящем документе, предпочтительно, тестирование можно осуществлять как измерение уровней нуклеиновых кислот или белка PDE4D7 или определением биологической активности PDE4D7, более предпочтительно, согласно описанным выше в настоящем документе опциям для указанных измерений. Тестирование можно осуществлять в организме индивидуума, т.е. , или вне организма индивидуума, т.е.  или . Термин «контрольный уровень», используемый в контексте способа сбора данных, относится к уровню экспрессии маркера PDE4D7 или других подходящих маркеров в раковом контроле или нераковом контроле, как описано выше в настоящем документе. Статус, природу, количество и состояние контрольного уровня можно подбирать в соответствии с потребностями. Предпочтительно, можно использовать нераковый контрольный уровень. Более предпочтительно, можно использовать контрольный уровень, полученный из стадий гормоночувствительного рака предстательной железы. Сравнение экспрессии с контрольным уровнем можно осуществлять с использованием любого подходящего способа определения, расчетов, оценки или обработки данных, и особой его целью является выявление различий между двумя группами данных. Далее можно осуществлять статистическую оценку достоверности разницы. Подходящие статистические методы известны специалистам. Полученные данные и информацию можно хранить, аккумулировать или обрабатывать с использованием подходящих информационных или компьютерных технологий или инструментов, известных специалистам, или можно представлять соответствующим образом, чтобы позволить практикующему врачу использовать данные для одного или более последующих этапов логических выводов или заключения.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к иммунологическому анализу для выявления, диагностики, мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы или прогрессирования рака предстательной железы, включающему по меньшей мере этапы:
(а) тестирования образца, полученного от индивидуума, на предмет экспрессии PDE4D7,
(b) тестирования контрольного образца на предмет экспрессии PDE4D7,
(с) определения разницы в экспрессии PDE4D7 между этапами (а) и (b); и
(d) принятия решения о наличии или стадии рака предстательной железы или о прогрессировании рака предстательной железы на основании результатов, полученных на этапе (с).
Иммунологический анализ предпочтительно основан на использовании антитела, специфичным образом связывающегося с PDE4D7, например, одного или более антител PDE4D7, упомянутых в настоящем документе. Альтернативно, иммунологический анализ можно осуществлять или комбинировать с любым другим подходящим агентом. Например, анализ можно комбинировать с обнаружением нуклеиновых кислот или с ферментативными методами тестирования, как описано в настоящем документе.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к иммунологическому анализу для различения гормоночувствительного и гормонорезистентного рака предстательной железы, включающему этапы:
(а) определения уровня PDE4D7 в образце;
(b) определения уровня экспрессии референтного гена в образце;
(с) стандартизации измеренного уровня экспрессии PDE4D7 по уровню экспрессии референтного гена; и
(d) сравнения стандартизированного уровня экспрессии с заранее определенной отсекающей величиной, выбранной для исключения гормоночувствительного рака предстательной железы, в котором стандартизированный уровень экспрессии ниже отсекающей величины является показательным для гормонорезистентного рака предстательной железы, в котором указанная отсекающая величина находится в пределах приблизительно от 1 до 7. Предпочтительно, отсекающая величина составляет приблизительно 5.
Уровень PDE4D7 можно предпочтительно определять по уровню белка или активности, как описано выше в настоящем документе. Предпочтительным является определение количества белка PDE4D7 с помощью специфичных в отношении PDE4D7 антител, например, одного или более антител PDE4D7, упомянутых в настоящем документе. Альтернативно, иммунологический анализ можно осуществлять с любым другим подходящим агентом или комбинировать с определением других параметров. Например, анализ можно комбинировать с обнаружением наличия или количества нуклеиновых кислот или с ферментативными методами тестирования, как описано в настоящем документе.
Помимо этого, можно определять уровень референтного гена в образце, как описано выше в настоящем документе. Для обнаружения референтного гена можно определять количество продукта экспрессии гена (т.е. белка), предпочтительно, с помощью одного или более антител, известных специалистам. Альтернативно, определение референтного гена можно осуществлять с любым другим подходящим агентом или комбинировать с обнаружением наличия или количества нуклеиновых кислот или с ферментативными методами тестирования, как описано в настоящем документе.
На основе результатов экспрессии, полученных на этапах (а) и (b), и/или стандартизированных результатов, полученных на этапе (с), можно осуществлять сравнение с отсекающей величиной для экспрессии PDE4D7. Отсекающая величина, ниже которой уровень экспрессии PDE4D7 является показательным для гормонорезистентного рака предстательной железы, исключая, таким образом, гормоночувствительный рак предстательной железы или опухолевые формы при иммунологическом анализе, составляет приблизительно от 0,75 до 8, от 0,75 до 7,5, от 0,75 до 7, от 0,75 до 6,5, от 0,75 до 6, от 0,75 до 5,5, от 1,0 до 8, от 1,25 до 8, от 1,5 до 8, от 1,75 до 8, от 2 до 8, от 2,25 до 8, от 2,5 до 8, от 2,75 до 8, от 3 до 8, от 3,25 до 8, от 3,5 до 8, от 3,75 до 8, от 4 до 8, от 4,25 до 8, от 4,5 до 8, от 4,75 до 8 или от 5 до 8. Более предпочтительной является отсекающая величина приблизительно 5, например, 4,9, 4,8, 4,7, 4,6, 4,5, 4,4, 4,3, 4,2, 4,1 или 5,9, 5,8, 5,7, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2 или 5,1.
Отсекающая величина может представлять собой отсекающую величину для PDE4D7 в образцах крови, например, в образцах сыворотки или плазмы, образцах мочи или образцах осадка мочи и т.п., как описано ниже в настоящем документе.
Если измеренная и/или стандартизированная экспрессия PDE4D7 выше указанной отсекающей величины, это можно рассматривать как показатель того, что индивидуум не страдает гормонорезистентным раком предстательной железы. Величина может дополнительно указывать, что индивидуум страдает раком предстательной железы, не являющимся гормонорезистентным раком предстательной железы, в частности, гормонозависимым раком предстательной железы или гормоночувствительным раком предстательной железы.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу идентификации индивидуума, подходящего для терапии рака предстательной железы, включающему этапы:
(а) тестирования образца, полученного от индивидуума, на предмет экспрессии PDE4D7;
(b) тестирования указанного образца на предмет экспрессии референтного гена и/или тестирования контрольного образца на предмет экспрессии PDE4D7;
(с) классификации уровней экспрессии с этапа (а) относительно уровней с этапа (b); и
(d) идентификации индивидуума как подходящего для получения лечения по поводу рака предстательной железы, когда образец от индивидуума классифицируют как имеющий пониженный уровень экспрессии PDE4D7.
Уровень PDE4D7 можно определить по уровню нуклеиновых кислот, белка или активности, как определено выше в настоящем документе. Предпочтительным является определение количества транскрипта (транскриптов) PDE4D7 и/или белка. Помимо этого, можно определять уровень референтного гена, как описано выше в настоящем документе. Тестирование на экспрессию референтного гена можно осуществлять в одном и том же образце, т.е. уровень PDE4D7 и референтного гена определяют в одном и том же образце, используемом для определения PDE4D7. Если тестирование осуществляют в одном и том же образце, можно использовать подход единственного обнаружения или множественного обнаружения. Предпочтительно, для множественного обнаружения можно использовать олигонуклеотиды и зонды, имеющие последовательность SEQ ID NO: 7, 8 и 9. Для осуществления множественного обнаружения концентрация праймеров и/или зондовых олигонуклеотидов может быть модифицирована. Помимо этого, концентрации и наличие других ингредиентов, таких как буферы, ионы и т.п., могут быть модифицированы, например, увеличены или уменьшены, по сравнению с инструкциями производителей. Альтернативно, тестирование на экспрессию референтного гена можно осуществлять в другом образце, предпочтительно, в контрольном образце, как описано выше в настоящем документе. Предпочтительно, указанный контрольный образец может представлять собой контрольный образец от того же индивидуума, что и исследуемый образец, или контрольный образец, полученный из другого источника или индивидуума. Контрольный образец может также представлять собой образец, полученный из той же ткани, предпочтительно, ткани предстательной железы, или полученный из другого типа ткани. Примерами предпочтительных альтернативных тканевых типов являются стромальная ткань предстательной железы, эпителиальная ткань мочевого пузыря и эпителиальная ткань уретры.
Помимо этого, тестирование исследуемого образца на предмет экспрессии референтного гена и тестирование контрольного образца на предмет экспрессии PDE4D7 можно объединять.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения контрольный образец можно также тестировать на предмет экспрессии референтного гена. В случае, когда тестируется на предмет экспрессии референтного гена более одного образца, полученные результаты экспрессии можно сравнивать и/или усреднять или стандартизировать, согласно любому подходящему статистическому способу, известному специалистам.
Термин «классификация уровней экспрессии с этапа (а) относительно уровней с этапа (b)», используемый в настоящем документе, означает, что экспрессию PDE4D7 в исследуемом образце и экспрессию PDE4D7 в контрольном образце сравнивают, например, после стандартизации по подходящим параметрам стандартизации. В соответствии с результатом сравнения исследуемый образец обозначается как имеющий сходную с контрольным образцом экспрессию, повышенную экспрессию по сравнению с контрольным образцом или пониженную экспрессию по сравнению с контрольным образцом. Термин также означает, что экспрессию PDE4D7 в исследуемом образце и экспрессию референтного гена в том же образце сравнивают, например, после стандартизации по дополнительному гену как параметру стандартизации. В соответствии с результатом сравнения исследуемый образец обозначается как имеющий сходную с референтным геном экспрессию, повышенную экспрессию по сравнению с референтным геном или пониженную экспрессию по сравнению с референтным геном.
Согласно классификации результатов экспрессии, индивидуума можно рассматривать как подходящего для терапии рака предстательной железы, когда уровни экспрессии PDE4D7 являются пониженными. Уровень экспрессии считается «пониженным», когда экспрессия гена PDE4D7 в исследуемом образце уменьшена, например, на 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% или более чем на 50%, по сравнению с экспрессией PDE4D7 в контрольном образце, или по меньшей мере в 0,1 раза, по меньшей мере в 0,2 раза, по меньшей мере в 1 раз, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере 10 раз или более, по сравнению с экспрессией PDE4D7 в контрольном образце; или когда экспрессия гена PDE4D7 уменьшена, например, на 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% или более чем на 50%, по сравнению с экспрессией референтного гена в контрольном образце, или по меньшей мере в 0,1 раза, по меньшей мере в 0,2 раза, по меньшей мере в 1 раз, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере 10 раз или более уменьшена по сравнению с экспрессией референтного гена. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения экспрессию референтного гена также можно стандартизировать или подбирать по экспрессии дополнительных генов или маркеров, например, генов «домашнего хозяйства».
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к иммунологическому анализу для стратификации индивидуума или группы индивидуумов с раком предстательной железы, включающему этапы:
(а) тестирования образца, полученного от индивидуума, на предмет экспрессии PDE4D7;
(b) тестирования указанного образца на предмет экспрессии референтного гена и/или тестирования контрольного образца на предмет экспрессии PDE4D7;
(с) определения разницы между экспрессией PDE4D7 с этапа (а) и экспрессией PDE4D7 и/или референтного гена с этапа (b); и
(d) стратификации индивидуума или группы индивидуумов для терапии рака предстательной железы на основании результатов, полученных на этапе (с), где образец от индивидуума имеет пониженный уровень экспрессии PDE4D7.
Тестирование экспрессии PDE4D7 можно, предпочтительно, осуществлять посредством определения количества белка PDE4D7 или определения уровня активности PDE4D7, как описано выше в настоящем документе. Предпочтительным является определение количества белка PDE4D7 с использованием специфичных в отношении PDE4D7 антител, например, одного или более антител PDE4D7, упомянутых в настоящем документе. Альтернативно, иммунологический анализ можно осуществлять с любым другим подходящим агентом или комбинировать с определением других параметров. Например, иммунологический анализ можно комбинировать с обнаружением присутствия или количества нуклеиновых кислот или с ферментативными методами тестирования, как описано в настоящем документе. Помимо этого, можно определять уровень референтного гена в образце, как описано выше в настоящем документе. Тестирование на экспрессию референтного гена можно осуществлять в том же образце, который используется для определения PDE4D7. Если тестирование осуществляют в одном и том же образце, можно использовать подход единственного обнаружения или параллельного или множественного обнаружения. Предпочтительно, для параллельного или множественного обнаружения можно использовать первичные или вторичные антитела с различающимися метками.
Альтернативно, тестирование на предмет экспрессии референтного гена можно осуществлять в другом образце, предпочтительно, в контрольном образце, как описано выше в настоящем документе. Предпочтительно, указанный контрольный образец может представлять собой контрольный образец от того же индивидуума, что и исследуемый образец, или контрольный образец, полученный из другого источника или индивидуума. Контрольный образец может также представлять собой образец, полученный из той же ткани, предпочтительно ткани предстательной железы, или полученный из другого типа ткани. Примерами предпочтительных альтернативных тканевых типов являются стромальная ткань предстательной железы, эпителиальная ткань мочевого пузыря и эпителиальная ткань уретры. Кроме того, тестирование исследуемого образца на предмет экспрессии референтного гена и тестирование контрольного образца на предмет экспрессии PDE4D7 можно объединять.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения контрольный образец также можно тестировать на предмет экспрессии референтного гена. В том случае, когда более одного образца тестируют на предмет экспрессии референтного гена, полученные результаты экспрессии можно сравнивать и/или усреднять или стандартизировать с использованием любого подходящего статистического метода, известного специалистам.
Термин «определение разницы в экспрессии PDE4D7 с этапа (а) и экспрессии PDE4D7 и/или референтного гена с этапа (b)», используемый в настоящем документе, означает, что экспрессию PDE4D7 в исследуемом образце и экспрессию PDE4D7 в контрольном образце сравнивают, например, после стандартизации по подходящим параметрам стандартизации. В соответствии с результатом сравнения исследуемый образец обозначается как имеющий сходную с контрольным образцом экспрессию, повышенную экспрессию по сравнению с контрольным образцом или пониженную экспрессию по сравнению с контрольным образцом. Термин также означает, чт, альтернативно или дополнительно экспрессию PDE4D7 в исследуемом образце и экспрессию референтного гена в том же исследуемом образце сравнивают, например, после стандартизации по дополнительному гену как параметру стандартизации. В соответствии с результатом сравнения исследуемый образец обозначается как имеющий сходную с референтным геном экспрессию или имеющий разницу в экспрессии. Разница может представлять собой повышенную экспрессию по сравнению с референтным геном или пониженную экспрессию по сравнению с референтным геном.
Термин «стратификация индивидуума или группы индивидуумов для терапии рака предстательной железы», используемый в настоящем документе, означает, что индивидуума идентифицируют как принадлежащего к группе сходных индивидуумов, у которых оптимальной терапевтической формой является терапия рака предстательной железы, предпочтительно терапия гормонорезистентного рака предстательной железы, в соответствии с результатами теста на экспрессию, как описано выше в настоящем документе. В частности, в соответствии с наблюдающейся разницей в уровне экспрессии PDE4D7 и референтного гена или уровне экспрессии PDE4D7 в различных образцах. Согласно определению разницы в экспрессии индивидуума можно идентифицировать как принадлежащего к группе сходных индивидуумов, у которых оптимальной терапевтической формой является терапия рака предстательной железы, когда уровни экспрессии PDE4D7 являются пониженными. Уровень экспрессии считается «пониженным», когда экспрессия гена PDE4D7 в исследуемом образце уменьшена, например, на 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% или более чем на 50%, по сравнению с экспрессией PDE4D7 в контрольном образце, или по меньшей мере в 0,1 раза, по меньшей мере в 0,2 раза, по меньшей мере в 1 раз, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере 10 раз или более, по сравнению с экспрессией PDE4D7 в контрольном образце; или когда экспрессия гена PDE4D7 уменьшена, например, на 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% или более чем на 50%, по сравнению с экспрессией референтного гена в контрольном образце, или по меньшей мере в 0,1 раза, по меньшей мере в 0,2 раза, по меньшей мере в 1 раз, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере 10 раз или более уменьшена по сравнению с экспрессией референтного гена. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения экспрессию референтного гена также можно стандартизировать или подбирать по экспрессии дополнительных генов или маркеров, например, генов «домашнего хозяйства».
Индивидуум, который был расценен как подходящий для терапии рака предстательной железы или стратифицирован для терапии рака предстательной железы, как описано выше в настоящем документе, может получать любое подходящее терапевтическое лечение от рака предстательной железы, известное специалистам. Обычно индивидуум, который был расценен как подходящий для терапии рака предстательной железы или стратифицирован в соответствующую группу лечения, вследствие пониженной экспрессии PDE4D7, как можно полагать, страдает гормонорезистентным раком предстательной железы или склонен к развитию гормонорезистентного рака предстательной железы в будущем, например, в течение следующих 1-24 месяцев. Соответственно идентифицированного или стратифицированного индивидуума можно лечить фармацевтической композицией по настоящему изобретению, например, как определено ниже в настоящем документе. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения соответственно идентифицированного индивидуума можно лечить фармацевтической композицией по настоящему изобретению в комбинации с дополнительной противораковой терапией. Термин «дополнительная противораковая терапия» относится к любым типам противораковой терапии, известным специалистам. Предпочтительными являются формы противораковой терапии, известные для гормонорезистентного рака предстательной железы. Термин включает в себя, например, все подходящие формы химиотерапии, лучевой терапии, оперативное вмешательство, лечение антителами и т.п.
Альтернативно, соответственно идентифицированного или стратифицированного индивидуума можно также лечить с использованием только одного или более видов противораковой терапии, таких как химиотерапия, лучевая терапия, оперативное вмешательство, лечение антителами и т.п. Предпочтительными являются формы противораковой терапии, обычно используемые для лечения рака предстательной железы, более предпочтительно - формы противораковой терапии, используемые для лечения гормонорезистентного рака предстательной железы.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения классификационный способ идентификации индивидуума, подходящего для терапии рака предстательной железы, или иммунологический анализ для стратификации, как описано выше в настоящем документе, также можно использовать для мониторинга лечения индивидуума, например, индивидуума, который был расценен как страдающий гормонорезистентным раком предстательной железы. Процесс мониторинга можно осуществлять как определение экспрессии в течение длительного периода времени, например, во время или после курсов лечения, в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 недель, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 месяцев или 1, 2, 3 или более лет. Этапы определения можно осуществлять через подходящие интервалы времени, например, каждую неделю, каждые 2 недели, каждые 3 недели, каждый месяц, каждые 2 месяца, каждые 3 месяца, каждые 6 месяцев, каждые 12 месяцев и т.п. В другом варианте осуществления настоящего изобретения любую схему лечения, как упомянуто выше в настоящем документе, можно изменять, например, усиливать или ослаблять, или изменять любым подходящим образом в соответствии с результатами процесса мониторинга.
Тестирование на предмет экспрессии PDE4D7 можно осуществлять согласно этапам, как описано выше в настоящем документе. Предпочтительно, тестирование можно осуществлять как измерение уровней белка PDE4D7, более предпочтительно, согласно описанным выше в настоящем документе опциям для указанных измерений. В качестве контролей или контрольных образцов можно использовать контроли, как определено выше в настоящем документе. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения этапы тестирования могут быть основаны на использовании антитела, специфичным образом связывающегося с PDE4D7, например, коммерчески доступное анти-PDE4D7 антитело, такое как NB300-652 или GTX14629. Рак можно диагностировать или прогнозировать или прогрессирование рака можно диагностировать или прогнозировать с использованием указанного иммунологического анализа, или индивидуума можно идентифицировать как подходящего для терапии рака предстательной железы, или индивидуума или группу индивидуумов можно стратифицировать с использованием иммунологического анализа, согласно соответствующим определениям, представленным выше в настоящем документе, в контексте PDE4D7 как маркера рака. Соответственно, указанное тестирование или определение экспрессии PDE4D7 можно осуществлять или можно дополнительно осуществлять измерением уровней нуклеиновых кислот или белка или определением биологической активности PDE4D7. Аналогичные измерения можно осуществлять для референтного гена.
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения референтный ген представляет собой ген «домашнего хозяйства» или другую фосфодиэстеразу. В организме человека гены «домашнего хозяйства» включают, среди прочих, β-актин, глицеринальдегид-3-фосфат дегидрогеназу (GAPDH), порфобилиноген-дезаминазу (PBGD) и рибосомальный белок Р1. Помимо указанных генов, любой другой подходящий ген можно использовать в качестве гена «домашнего хозяйства», если только ген демонстрирует экспрессию или транскрипцию на постоянном, неизменном уровне, в частности, в течение различных стадий развития рака, более предпочтительно, в течение различных стадий развития рака предстательной железы, более предпочтительно, в течение перехода гормоночувствительного рака предстательной железы в состояния гормонорезистентного рака предстательной железы. Особенно предпочтительным является ген или транскрипт или продукт экспрессии или белок GAPDH. Также особенно предпочтительным является ген или транскрипт или продукт экспрессии или белок PBGD. Данные по экспрессии гена «домашнего хозяйства» можно получать из одного или более образцов от одного и того же индивидуума или от большего количества индивидуумов, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 100, 1000, 5000, 10000 или более. Данные по экспрессии можно также получать из баз данных или коллекций данных, доступных специалистам.
Термин «другая фосфодиэстераза», используемый в настоящем документе относится к другим фосфодиэстеразам, которые не являются PDE4D7. Указанные фосфодиэстеразы, подходящие в качестве референтных генов, должны постоянно экспрессироваться и обеспечивать постоянно обнаруживаемый генный продукт, продукт экспрессии, белок или вариант белка в организме выбора. Особенно предпочтительными являются фосфодиэстеразы семейства PDE4D, например, PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8 и PDE4D9. Более предпочтительной является фосфодиэстераза PDE4D5.
Соответственно, нормализацию и/или сравнение с GAPDH, PBGD и, в частности, с PDE4D5 можно предпочтительно использовать для описанных выше, основанных на отсекающих величинах, диагностических способов и иммунологических анализов, способов идентификации или иммунологических анализов для различения и стратификации индивидуумов. Соответствующие этапы определения можно осуществлять в отдельных реакциях или, особенно предпочтительно, в множественных реакциях. Для осуществления множественного обнаружения концентрация праймеров и/или зондовых олигонуклеотидов может быть модифицирована. Помимо этого, концентрации и наличие других ингредиентов, таких как буферы, ионы и т.п., могут быть модифицированы, например, увеличены или уменьшены, по сравнению с инструкциями производителей. В другом варианте осуществления настоящего изобретения способ идентификации индивидуума на предмет пригодности для лечения рака предстательной железы, основанный на экспрессии PDE4D7, как описано выше в настоящем документе, можно также комбинировать с одним или более сходных способов идентификации на основе экспрессии одного или более других биомаркеров. Предпочтительным является определение уровня простатспецифического антигена (ПСА). Так, если уровень ПСА оказывается равным 10, 20, 30 или, предпочтительно, выше 5,0, индивидуума можно расценивать как страдающего гормонорезистентным раком предстательной железы или имеющего вероятность развития гормонорезистентного рака предстательной железы в ближайшем будущем, т.е. в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 месяцев.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения диагностику, выявление, мониторинг или прогнозирование, как упомянуто выше, следует осуществлять с использованием образца, полученного от индивидуума. Термин «образец, полученный от индивидуума», используемый в настоящем документе, относится к любому биологическому материалу, полученному от индивидуума подходящими способами, известными специалистам. Образец, используемый в контексте настоящего изобретения, следует предпочтительно отбирать клинически приемлемым способом, более предпочтительно способом, при котором сохраняются нуклеиновые кислоты (в частности, РНК) или белки.
Биологические образцы могут включать ткани и жидкости организма, такие как кровь, пот, мокрота или слюна, семенная жидкость и моча, а также образцы фекалий. Помимо этого, биологический образец может содержать клеточный экстракт, полученный из клеточной популяции, или клеточную популяцию, включая эпителиальные клетки, предпочтительно раковые эпителиальные клетки или эпителиальные клетки, полученные из подозрительной на наличие рака ткани. Еще более предпочтительно, биологический образец может содержать клеточную популяцию из железистой ткани, например, образец может быть получен из предстательной железы индивидуума мужского пола. Помимо этого, клетки можно выделять из полученных тканей и жидкостей организма, если это необходимо, а затем использовать в качестве биологического образца.
Образцы, в частности, после первоначальной обработки, можно объединять. Однако также можно использовать не объединенные образцы.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения содержимое биологического образца можно также подвергать этапу обогащения. Например, образец может контактировать с лигандами, специфичными для клеточной мембраны или органелл определенных типов клеток, например, клеток предстательной железы, функционализированными, например, магнитными частицами. Материал, сконцентрированный магнитными частицами, можно впоследствии использовать для этапов обнаружения и анализа, как описано выше или ниже в настоящем документе.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения можно получать и/или использовать образцы, полученные в результате биопсии или резекции. Указанные образцы могут включать клетки или клеточные лизаты.
Кроме того, клетки, например, опухолевые клетки, можно обогащать с использованием процессов фильтрования жидкостей или жидких образцов, например, крови, мочи, пота и т.п. Указанные процессы фильтрования также можно комбинировать с этапами обогащения, основанными на специфических взаимодействиях с лигандами, как описано выше в настоящем документе.
В особенно предпочтительно, варианте осуществления настоящего изобретения образец может представлять собой образец ткани, образец мочи, образец осадка мочи, образец крови, образец слюны, образец спермы, образец, включающий циркулирующие опухолевые клетки, или образец, содержащий экзосомы, секретируемые предстательной железой.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один элемент, выбранный из группы, состоящей из: (а) соединения, непосредственно стимулирующего или модулирующего активность PDE4D7, предпочтительно аллостерического агониста ферментативной активности PDE4D7; (b) соединения, опосредованно стимулирующего или модулирующего активность PDE4D7; (с) белка PDE4D7 или его биологически активного эквивалента; (d) нуклеиновой кислоты, кодирующей и экспрессирующей PDE4D7; (е) ингибитора miРНК, специфичного в отношении miРНК PDE4D7; (f) деметилирующего агента; и (g) фактора вытеснения фосфодиэстераз, предпочтительно пептида, пептидомиметика, малой молекулы, антитела или аптамера.
2+
2+
Термин «соединение, непосредственно стимулирующее или модулирующее активность PDE4D7», используемый в настоящем документе, относится к соединению, которое способно повышать активность PDE4D7 в отношении разложения цАМФ непосредственным взаимодействием с PDE4D7. Указанное соединение может представлять собой любой непосредственно взаимодействующий с PDE4D7 агент, который оказывает положительное влияние на каталитическую активность PDE4D7. Указанное соединение может, предпочтительно, представлять собой аллостерический агонист каталитической активности PDE4D7, например, гомотропный аллостерический модулятор. Предпочтительными аллостерическими агонистами PDE4D7 являются цАМФ или аналоги цАМФ. Другими непосредственно стимулирующими соединениями, предусматриваемыми настоящим изобретением, являются ионы, предпочтительно биологически активные одно- и двухвалентные катионы, такие как Ca, Mg.
Термин «соединение, опосредованно стимулирующее или модулирующее активность PDE4D7», используемый в настоящем документе, относится к соединению, которое способно повышать активность PDE4D7 в отношении разложения цАМФ путем взаимодействия с непосредственно взаимодействующим с PDE4D7 агентом («опосредованно взаимодействующим агентом») или путем опосредованного рабочего пути, не включающего взаимодействие с PDE4D7. Указанное соединение может представлять собой любой агент, непосредственно взаимодействующий с агентом, взаимодействующим с PDE4D7. Эффект, вызываемый агентом, непосредственно взаимодействующим с агентом, взаимодействующим с PDE4D7, может быть положительным, если сам взаимодействующий с PDE4D7 агент оказывает положительное влияние на активность PDE4D7, или может быть отрицательным, если взаимодействующий с PDE4D7 агент оказывает отрицательное влияние на активность PDE4D7. Обычно положительно работающие опосредованно взаимодействующие агенты могут стимулировать агонистический эффект непосредственно взаимодействующих агентов, например, вызывать увеличение концентрации аллостерически работающих соединений, таких как цАМФ или его аналоги, путем ингибирования процессов разложения цАМФ, не обусловленных действием PDE4D7, путем увеличения продукции цАМФ и т.п.
Альтернативно, указанные положительно работающие опосредованно взаимодействующие агенты могут вызывать модификацию связывающего поведения непосредственно связывающихся белков, что приводит к повышению активности PDE4D7. Обычно отрицательно работающие опосредованно взаимодействующие агенты могут оказывать ингибирующее действие на ингибиторы PDE4D7. Примерами указанных взаимодействующих агентов являются ферментативные активности, разлагающие ингибиторы PDE4D7, или белки, способные связываться и гасить ингибиторы PDE4D7. Альтернативно, указанные взаимодействующие агенты могут ингибировать активности, ведущие к разложению PDE4D7, например, ингибиторы протеиназ. Другие примеры и их осуществление должны быть известны специалистам.
Альтернативно, опосредованная стимуляция активности PDE4D7 может вызываться соединениями, активирующими, защищающими или поддерживающими экспрессию эндогенного гена PDE4D7. Примерами указанных соединений являются PDE4D7-специфичные факторы транскрипции, PDE4D7-специфичные мРНК-стабилизирующие активности или сплайсинговые факторы PDE4D7. Другие примеры и их осуществление должны быть известны специалистам.
«Белок PDE4D7», включенный в состав фармацевтической композиции, может представлять собой белок PDE4D7, как определено выше в настоящем документе. В частности, это может быть белок, кодируемый сплайсинговым вариантом 7 человеческой фосфодиэстеразы PDE4D, более предпочтительно, это может быть аминокислотная последовательность, определенной номером в каталоге Genbank AF536976 (версия AF536976.1, GI:22901883 как от 3 марта 2009 г.), и, даже более предпочтительно, к аминокислотной последовательности, представленной как SEQ ID NO: 2. «Белок PDE4D7», используемый в данном контексте, также содержит аминокислотные последовательности, являющиеся по меньшей мере на 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% идентичными последовательности, представленной как SEQ ID NO: 2, или аминокислотные последовательности, кодируемые нуклеотидными последовательностями, являющиеся по меньшей мере на 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% идентичными последовательности, представленной как SEQ ID NO: 1. Гомологичные варианты PDE4D7, в частности, те, которые упомянуты выше, предпочтительно обладают функцией PDE4D7, т.е. способны разлагать цАМФ. В другом варианте осуществления настоящего изобретения гомологичные варианты PDE4D7 могут, дополнительно или альтернативно, иметь сходный или идентичный паттерн локализации, как у PDE4D7, в клетке или в тканевом типе.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения область или гомология между гомологичными вариантами PDE4D7 и PDE4D7 может быть привязана к С-концевой части белка. Например, гомологичный вариант может включать N-концевой домен, присутствующий у PDE4D7, и оставшуюся часть белка, имеющую степень гомологичности с PDE4D7, как указано выше в настоящем документе. N-концевая часть гомологичного варианта может включать аминокислоты от 1 до 120, от 1 до 110, от 1 до 100, от 1 до 90, от 1 до 80, от 1 до 70, от 1 до 60, от 1 до 50, от 1 до 40, от 1 до 30, от 1 до 20 или от 1 до 10, полученных из PDE4D7.
Термин «биологически активный эквивалент PDE4D7», используемый в настоящем документе, относится к белку PDE4D7, который способен выполнять все или большинство функций PDE4D7. Предпочтительно, он относится к белкам, способным разлагать цАМФ. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения биологически активные эквиваленты PDE4D7 могут, дополнительно или альтернативно, иметь сходный или идентичный паттерн локализации, как у PDE4D7, в клетке или в тканевом типе. Биологически активные эквиваленты PDE4D7 могут также включать варианты PDE4D7, как описано выше в настоящем документе.
PDE4D7 или биологически активные эквиваленты PDE4D7 по настоящему изобретению можно изготавливать рекомбинантным путем, с использованием любого подходящего способа, известного специалистам. Настоящее изобретение, таким образом, охватывает также способы изготовления PDE4D7 или биологически активных эквивалентов PDE4D7.
Соответственно, настоящее изобретение предполагает векторы, содержащие полинуклеотиды, кодирующие PDE4D7 или биологически активные эквиваленты PDE4D7, как определено выше в настоящем документе, клетки-хозяева и изготовление PDE4D7 или биологически активных эквивалентов PDE4D7 рекомбинантным путем.
Подходящий вектор может представлять собой, например, фаг, плазмиду, вирусный или ретровирусный вектор. Ретровирусные векторы могут быть репликационно-компетентными или репликационно-дефектными. В последнем случае размножение вирусов обычно будет иметь место только в комплементных клетках-хозяевах. Полинуклеотиды, кодирующие PDE4D7 или биологически активные эквиваленты PDE4D7, можно присоединять к вектору или носителю, содержащему подходящий маркер, для размножения в хозяине. Соответствующая полинуклеотидная инсерция может быть оперативно связана с подходящим промотором, таким как фаговый промотор лямбда PL, промоторы E.coli lac, tac, phoA и trp, ранние и поздние промоторы SV40 и промоторы ретровирусных ДЕК или промотор ПСА. Другие подходящие промоторы известны специалистам. Экспрессионные конструкции могут дополнительно содержать сайты для инициации транскрипции, терминации транскрипции и, в транскрибируемой области, сайт связывания с рибосомами для трансляции. Кодирующая часть транскриптов, экспрессированных конструкциями, будет предпочтительно включать кодон инициации трансляции в начале и кодон терминации трансляции (UAA, UGA или UAG), должным образом расположенный в конце полипептида, подлежащего трансляции.
Полипептиды или белки могут быть гликозилированными или негликозилированными или модифицированными каким-либо иным образом. Помимо этого, полипептиды или белки могут также включать исходно модифицированный остаток метионина, в некоторых случаях, в результате процессов, опосредованных хозяином. Кроме того, полипептид, белок или пептид могут быть модифицированы с использованием ацетилирования, пегилирования, технологии «hesylation», формилирования, амидирования, дериватизации известными защитными/блокирующими группами, специфического химического расщепления, протеолитического расщепления, присоединения к клеточному лиганду или другому белку или технологии «hapylation», т.е. слияния с гомоаминокислотным полимером с высоким содержанием глицина (НАР), и т.п. Указанные модификации можно осуществлять с использованием подходящих методик, известных специалистам. Помимо этого, полипептид, пептид или вариант может содержать одну или более неклассических аминокислот.
Кроме того, PDE4D7 или биологически активные эквиваленты PDE4D7 по настоящему изобретению можно синтезировать химическим путем с использованием методик, известных специалистам, например, с использованием пептидного синтезатора.
«Нуклеиновая кислота, кодирующая и экспрессирующая PDE4D7», содержащаяся в фармацевтической композиции, как определено выше в настоящем документе, относится к любому подходящему носителю, как описано выше в настоящем документе, включающему способный экспрессироваться ген PDE4D7. Предпочтительно, указанный носитель может включать последовательность, определенную номером в каталоге Genbank AF536976 (версия AF536976.1, GI:22901883 как от 3 марта 2009 г.), более предпочтительно, нуклеотидную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 1. Указанный носитель может также включать нуклеотидные последовательности, демонстрирующие высокую степень гомологичности в отношении PDE4D7, например, нуклеотидные последовательности, являющиеся по меньшей мере на 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% идентичными последовательности, представленной как SEQ ID NO: 1, или последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих аминокислотные последовательности, являющиеся по меньшей мере на 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% идентичными последовательности, представленной как SEQ ID NO: 2. Альтернативно, носитель может включать геномную последовательность PDE4D7, предпочтительно последовательность, определенную в ENSEMBL database entry ENSG00000113448 (версия ENSG00000113448.8, выпуск Ensembl 53 - март 2009 г.), которая соответствует SEQ ID NO: 6, или которую можно получить из номера в каталоге Genbank AC008934 (версия AC008934.5, GI:17386235 как от 24 марта 2009 г.) в комбинации с Genbank Accession AC034234 (версия AC034234.4, GI:18390182 как от 24 марта 2009 г.), или которую можно получить от Wang et al., 2003, Cell Signal., 15(9):883-91. Более предпочтительно, носитель может включать геномную последовательность PDE4D7, определенную в SEQ ID NO: 6.
Помимо этого, биологически активные эквиваленты PDE4D7, как определено выше в настоящем документе, могут быть включены в носитель по настоящему изобретению.
Полинуклеотид, кодирующий PDE4D7, можно, предпочтительно, присоединять к вектору, содержащему селектируемый маркер, для размножения в человеческой клетке. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения полинуклеотидная инсерция может быть оперативно связана с промотором ПСА.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения нуклеиновые кислоты, кодирующие и экспрессирующие PDE4D7, как определено выше в настоящем документе, можно получать через живое лекарственное средство. Термин «живое лекарственное средство» означает, что PDE4D7 или биологически активные эквиваленты PDE4D7, как определено выше в настоящем документе, экспрессируются в любом подходящем живом носителе. Соответственно, настоящее изобретение относится к соответствующим полинуклеотидам, которые являются подходящими для экспрессии в живой клетке. Настоящее изобретение также относится к векторам, содержащим указанные полинуклеотиды, к подходящим клеткам-хозяевам и изготовлению полипептидов рекомбинантным путем в указанных клетках-хозяевах.
Термин «живой носитель» относится к любой подходящей живой клетке-хозяину или вирусу, известным специалистам. Показательные примеры подходящих хозяев включают в себя, без ограничения, бактериальные клетки, такие как Escherichia coli или Lactobacillus, грибковые клетки, такие как дрожжевые клетки, простейшие, клетки насекомых или клетки животных. Предпочтительно, термин относится к ослабленным бактериям, ослабленным грибковым клеткам или ослабленным простейшим. Показательные примеры подходящих вирусов включают в себя вирусы группы аденовирусов, ретровирусов или лентивирусов, предпочтительно, ослабленные вирусы группы аденовирусов, ретровирусов или лентивирусов. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения можно использовать пробиотические бактериальные клетки, в частности, пробиотические клетки Escherichia coli или Lactobacillus. Более предпочтительно, можно использовать клетки Escherichia coli Nissle 1973 и, даже более предпочтительно, клетки Lactobacillus casei или Lactobacillus zeae 393.
«Ингибитор miРНК, специфичный в отношении miРНК PDE4D7», содержащийся в фармацевтической композиции, как определено выше в настоящем документе, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную молекуле miРНК PDE4D7 или микроРНК. Термин «комплементарная», используемый в настоящем документе, относится к абсолютной комплементарности между ингибирующей miРНК нуклеиновой кислотой (смысловая молекула) и miРНК (антисмысловая молекула) без каких бы то ни было ошибочных спариваний, а также ситуаций, при которых нуклеиновая кислота содержит любое ошибочное спаривание оснований или опущенные нуклеотиды, по сравнению с молекулой miРНК. В других вариантах осуществления настоящего изобретения две молекулы включают одно или более ошибочных спариваний оснований или различаются по общему количеству нуклеотидов (из-за добавлений или делеций). В других вариантах осуществления настоящего изобретения «комплементарная» ингибирующая miРНК молекула нуклеиновой кислоты включает по меньшей мере десять смежных нуклеотидов, демонстрирующих абсолютную комплементарность в отношении последовательности, содержащейся в молекуле miРНК.
Обычно ингибирующие miРНК молекулы нуклеиновой кислоты представляют собой встречающиеся в естественных условиях молекулы ДНК или РНК или синтетические молекулы нуклеиновых кислот, содержащие в своей последовательности один или более модифицированных нуклеотидов, которые могут представлять собой нуклеотиды одного и того же типа или нуклеотиды одного или более различных типов.
Например, настоящим изобретением предусматривается, что указанные ингибирующие miРНК молекулы нуклеиновой кислоты включают по меньшей мере одну рибонуклеотидную каркасную единицу и по меньшей мере одну дезоксирибонуклеотидную каркасную единицу. Помимо этого, ингибирующая miРНК молекула нуклеиновой кислоты может содержать одну или более модификаций каркаса РНК в 2’-O-метильную группу или в 2’-O-метоксиэтильную группу (также называемые «2’-O-метилированием»), которые предотвращают нуклеазное разложение в культуральных средах и, что важно, также предотвращают эндонуклеолитическое расщепление нуклеазой РНК-индуцированного сайленсингового комплекса, что приводит к необратимому ингибированию miРНК. Другая возможная модификация, которая является функционально эквивалентной 2’-O-метилированию, включает запертые нуклеиновые кислоты (LNA), представляющие собой аналоги нуклеиновых кислот, содержащие один или более нуклеотидных мономеров LNA, как определено выше в настоящем документе.
Другой класс сайленсеров экспрессии miРНК для использования в контексте настоящего изобретения включает в себя химически сконструированные олигонуклеотиды, названные «антагомирами», которые представляют собой одноцепочечные молекулы РНК, конъюгированные с холестерином. Молекулы могут включать от 19 до 25 нуклеотидов. Предпочтительно, молекула включает 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотида. Более предпочтительно, молекула включает 23 нуклеотида (дополнительные подробности см. у Krutzfeldt et al., 2005, Nature, 438:685-689).
В другом варианте осуществления настоящего изобретения ингибиторы miРНК, как определено выше в настоящем документе, могут принимать форму экспрессирующих векторов для введения в ткань или клетки. Альтернативно, указанные векторы также можно вводить в живые носители, как определено выше в настоящем документе.
Обычно РНК можно получать из трансгенов, представленных в форме трансфекционных или транзиторных экспрессирующих векторов или носителей. Например, конкурентные ингибиторы miРНК можно получать в форме транскриптов, экспрессируемых с сильных промоторов, содержащих более одного, предпочтительно множество, тандемных сайтов связывания с микроРНК, представляющей интерес. «Губка микроРНК», как описано в Ebert et al., 2007, Nat. Methods, 4:721-726, представляет собой иллюстративный, неограничивающий пример указанной методики.
«Деметилирующий агент», включенный в состав фармацевтической композиции, как определено выше в настоящем документе, относится к агенту, способному деметилировать хроматиновые структуры, предпочтительно промоторные области, более предпочтительно, промотор PDE4D7. Примерами деметилирующих агентов для использования в контексте настоящего изобретения являются 5-аза-2’-дезоксицитидин и 5-азацитидин, которые реактивируют гены, не должным образом сайленсированные структурными хроматиновыми изменениями, включающими метилирование ДНК, и которые могут реверсировать указанные изменения и, следовательно, восстановить главные клеточные пути. Это обычно приводит к реэкспрессии генов и реверсированию некоторых аспектов трансформированного состояния. 5-Азацитидин и 5-аза-2’-дезоксицитидин обычно инактивируют ДНК цитозин С5-метилтрансферазы через образование стабильных комплексов между остатками 5-аза-2’-дезоксицитидина в ДНК и ферментом, имитируя, таким образом, стабильное промежуточное переходное состояние, когда связываются с ферментом метилтрансферазой.
Еще одним агентом, который можно включать в фармацевтическую композицию по настоящему изобретению, как в отдельности, так и в комбинации с 5-аза-2’-дезоксицитидином и/или 5-азацитидином, является трихостатин А (TSA).
«Фактор вытеснения фосфодиэстераз», включенный в состав фармацевтической композиции, как описано выше в настоящем документе, относится к соединению, которое способно нарушать или разрушать взаимодействие фосфодиэстераз, в частности, PDE4D7, с взаимодействующими партнерами или взаимодействующими агентами. Указанный процесс может в конечном итоге приводить к ассоциации PDE, в частности, PDE4D7, с другими, чем ранее, взаимодействующими партнерами, и, в результате, к перераспределению PDE. Указанные новые взаимодействующие партнеры могут изолировать PDE, в частности PDE4D7, и, соответственно, модифицировать клеточное поведение, например, оказывать влияние на связывание с рецепторами и другие последующие активности. Примерами белковых партнеров, которые могут участвовать в указанной реакции вытеснения и/или которые способны изолировать PDE4D7, в частности, PDE4D7, являются якорные белки, такие как АКАР, скаффолдные белки, такие как DISC1, бета-аррестин или RACK1, регуляторные белки, такие как XAP2/AIP/ARA9, цАМФ-связывающие белки, такие как субъединицы PKA-R или EPAC, или рецепторы, такие как бета1-адренорецептор, а также ферменты, такие как ERK.
Предпочтительными факторами вытеснения фосфодиэстераз являются пептиды, пептидомиметики, малые молекулы, антитела и аптамеры.
«Пептид» в контексте фактора вытеснения фосфодиэстераз относится к цепи из аминокислот, присутствующих на молекуле фосфодиэстеразы или представляющих молекулу фосфодиэстеразы, в частности, PDE4D7, или к взаимодействующему или изолирующему белку, как описано выше в настоящем документе. Цепь из аминокислот, содержащаяся в пептиде, может иметь длину от 5 до 100 аминокислот, предпочтительно от 10 до 50 аминокислот, более предпочтительно от 20 до 30 аминокислот. Цепи могут быть полностью идентичными PDE или ее взаимодействующему белку или их части, или могут включать в себя вариации последовательности. Например, пептидная последовательность может содержать остатки модифицированных аминокислот на позициях до 25% от всех позиций, предпочтительно модификации, которые не изменяют структурные свойства или связывающие свойства молекулы. Аминокислотная последовательность, присутствующая в пептиде, может альтернативно представлять пространственные домены PDE или взаимодействующего белка, и, соответственно, включать смежное положение аминокислотных цепей, которые не граничат с первичной последовательностью молекул.
«Пептидомиметик» в контексте фактора вытеснения фосфодиэстераз относится к малой белковоподобной цепи, сконструированной таким образом, чтобы имитировать пептид. Указанный пептидомиметик можно получать в результате модификации существующего пептида, например, пептида, как определено выше в настоящем документе, с целью изменения свойств молекулы. Пептидомиметик можно получать в результате модификации, которая изменяет стабильность или связывающую способность молекулы. Указанные модификации обычно включают изменения пептида, которые не наблюдаются в естественных условиях. Например, пептидомиметик по настоящему изобретению может иметь измененный пептидный каркас или может содержать неприродные аминокислоты. Предпочтительно, пептидомиметик по настоящему изобретению может представлять собой молекулу фосфодиэстеразы, в частности, PDE4D7, или взаимодействующий или изолирующий белок, как определено выше в настоящем документе.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения пептидомиметик может блокировать взаимодействие между PDE, в частности, PDE4D7, и ее взаимодействующим агентом. В другом варианте осуществления настоящего изобретения пептидомиметик может усиливать взаимодействие между PDE, в частности, PDE4D7, и ее взаимодействующим агентом.
Способы и методики изготовления пептидомиметиков, а также анализы для изучения пептидомиметиков хорошо известны специалистам.
Термин «малые молекулы» в контексте фактора вытеснения фосфодиэстераз относится к малому органическому соединению, которое предпочтительно является биологически активным, т.е. к биомолекуле, но, предпочтительно, не к полимеру. Указанное органическое соединение может иметь любую подходящую форму или химическое свойство. Соединение может представлять собой природное соединение, например, вторичные метаболиты, или искусственное соединение, которое было разработано и получено de novo. В одном варианте осуществления настоящего изобретения малая молекула является способной блокировать взаимодействие между PDE, в частности, PDE4D7, и ее взаимодействующим агентом. В другом варианте осуществления настоящего изобретения пептидомиметик может усиливать взаимодействие между PDE, в частности, PDE4D7, и ее взаимодействующим агентом. Способы и методики идентификации и получения малых молекул, а также анализы для изучения малых молекул хорошо известны специалистам.
«Антитело» или «аптамер» в контексте фактора вытеснения фосфодиэстераз относится к специфичному в отношении PDE4D7 антителу или варианту или фрагменту антитела, как определено выше в настоящем документе, или к специфичному в отношении PDE4D7 аптамеру, как определено выше в настоящем документе, обладающему способностью нарушать или разрушать взаимодействие PDE, в частности, PDE4D7, с одним или более ее взаимодействующих агентов. Альтернативно, указанные термины могут также относиться к антителам или аптамерам, связывающимся с одним или более взаимодействующих с PDE4D7 агентов, как описано выше в настоящем документе, имеющим также способность нарушать или разрушать взаимодействие PDE, в частности, PDE4D7, с одним или более ее взаимодействующих агентов. Способы получения или исследования антител или аптамеров описаны выше в настоящем документе и/или известны специалистам.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция может также содержать дополнительные соединения, активные против раковых клеток, например, цитотоксические соединения или другие химиотерапевтические или радиотерапевтические соединения, известные специалистам.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает также процедуры скрининга и способы идентификации аптамера, специфичного для продукта экспрессии или белка PDE4D7, соединения, непосредственно стимулирующего или модулирующего активность PDE4D7, аллостерического агониста ферментативной активности PDE4D7, ингибитора miРНК, специфичного для miРНК PDE4D7, антагомира, специфичного для PDE4D7 деметилирующего агента, специфичного для PDE4D7 фактора вытеснения фосфодиэстераз, специфичного для PDE4D7 пептидомиметика и специфичной для PDE4D7 малой молекулы или лекарственного средства, как определено выше в настоящем документе. Указанные скрининговые процедуры могут включать этапы (а) получения клеток, которые экспрессируют PDE4D7 как полипептид или секретируемый белок или на клеточной мембране или как внутриклеточный компонент, (b) контактирования полипептида, полученного на этапе (а), с исследуемым образцом, потенциально содержащим взаимодействующую молекулу, например, аптамер, специфичный для белка PDE4D7, соединение, непосредственно стимулирующее или модулирующее активность PDE4D7, аллостерический агонист ферментативной активности PDE4D7, специфичный для PDE4D7 фактор вытеснения фосфодиэстераз, специфичный для PDE4D7 пептидомиметик или специфичную для PDE4D7 малую молекулу или лекарственное средство; и (с) идентификации взаимодействующей молекулы путем наблюдения связывания и/или ингибирования или модулирования активности PDE4D7.
Альтернативно, указанные скрининговые процедуры могут включать этапы (а) контактирования исследуемого образца, потенциально содержащего непосредственно или опосредованно взаимодействующую молекулу, например, аптамер, специфичный для белка PDE4D7, ингибитор miРНК, специфичный для miРНК PDE4D7, специфичный для PDE4D7 деметилирующий агент, специфичный для PDE4D7 фактор вытеснения фосфодиэстераз, специфичный для PDE4D7 пептидомиметик или специфичную для PDE4D7 малую молекулу или лекарственное средство, с одной или более клеток, который экспрессируют PDE4D7 как транскрипт, (b) обнаружения уровня экспрессии указанной последовательности; и (с) идентификации взаимодействующей молекулы путем наблюдения связывания или модулирования или уменьшения уровня экспрессии PDE4D7.
Настоящее изобретение также охватывает аптамер, специфичный для продукта экспрессии или белка PDE4D7, соединение, непосредственно стимулирующее или модулирующее активность PDE4D7, аллостерический агонист ферментативной активности PDE4D7, ингибитор miРНК, специфичный для miРНК PDE4D7, антагомир, специфичный для PDE4D7 деметилирующий агент, специфичный для PDE4D7 фактор вытеснения фосфодиэстераз, специфичный для PDE4D7 пептидомиметик и специфичную для PDE4D7 малую молекулу или лекарственное средство, которые можно получить или которые получены с использованием процедуры скрининга или способа, как описано выше в настоящем документе.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, как определено выше в настоящем документе, для лечения или профилактики рака, в частности, для лечения рака предстательной железы, предпочтительно для лечения гормонорезистентного рака предстательной железы.
Далее, в еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению (а) соединения, непосредственно стимулирующего или модулирующего активность PDE4D7, предпочтительно аллостерического агониста ферментативной активности PDE4D7; (b) соединения, опосредованно стимулирующего или модулирующего активность PDE4D7; (с) белка PDE4D7 или его биологически активного эквивалента; (d) нуклеиновой кислоты, кодирующей и экспрессирующей PDE4D7; (е) ингибитора miРНК, специфичного для miРНК PDE4D7; (f) деметилирующего агента; и/или (g) фактора вытеснения фосфодиэстераз, предпочтительно пептида, пептидомиметика, малой молекулы, антитела или аптамера для изготовления фармацевтической композиции для лечения или профилактики рака, в частности, для лечения рака предстательной железы, предпочтительно для лечения гормонорезистентного рака предстательной железы.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики рака, в частности, лечения рака предстательной железы, предпочтительно лечения гормонорезистентного рака предстательной железы, включающему введение (а) соединения, непосредственно стимулирующего или модулирующего активность PDE4D7, предпочтительно аллостерического агониста ферментативной активности PDE4D7; (b) соединения, опосредованно стимулирующего или модулирующего активность PDE4D7; (с) белка PDE4D7 или его биологически активного эквивалента; (d) нуклеиновой кислоты, кодирующей и экспрессирующей PDE4D7; (е) ингибитора miРНК, специфичного для miРНК PDE4D7; (f) деметилирующего агента; и/или (g) фактора вытеснения фосфодиэстераз, предпочтительно пептида, пептидомиметика, малой молекулы, антитела или аптамера, индивидууму, в частности, индивидууму, страдающему раком или имеющему прогноз развития рака.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить пациенту, субъекту или индивидууму с использованием различных систем доставки, известных специалистам, например, посредством инкапсуляции в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантных клеток, способных экспрессировать соединение, опосредованного рецепторами эндоцитоза, конструирования нуклеиновой кислоты как части ретровирусного или другого вектора и т.п. Способы введения могут быть местными, энтеральными или парентеральными и могут включать внутрикожный, внутримышечный, интраперитонеальный, подкожный, интраназальный, ингаляционный, эпидуральный и пероральный пути. Композицию можно вводить любым удобным путем, например, инфузией или болюсной инъекцией, всасыванием через эпителиальные или слизисто-кожные выстилки (например, через слизистую оболочку рта, слизистую оболочку прямой кишки или других отделов кишечника и т.п.) или ингаляцией, или можно вводить вместе с другими биологически активными агентами. Введение может быть системным или локальным. Предпочтительным способом локального введения является прямая инъекция.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическую композицию можно доставлять непосредственно во внутренние органы, полости тела и т.п., с использованием визуализирующих устройств, используемых для направления инъекционной иглы непосредственно в область, представляющую интерес. Фармацевтическую композицию можно также вводить в области, пораженные заболеванием, во время хирургического вмешательства. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическую композицию можно доставлять с использованием системы с контролируемым высвобождением.
Предпочтительно, фармацевтическая композиция имеет форму, которая является подходящей для перорального, локального или системного введения. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическую композицию вводят локально, перорально или системно.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическую композицию можно вводить после проведения иммунологического анализа для стратификации индивидуума или после способа идентификации индивидуума на пригодность для лечения рака предстательной железы, как описано выше в настоящем документе, в частности, после классификации индивидуума как имеющего пониженный уровень PDE4D7.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество ингредиентов фармацевтической композиции по настоящему изобретению, как определено выше в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель. Термин «фармацевтически приемлемый» означает разрешенный к применению соответствующими контрольными органами или другими общепризнанными фармакопеями для использования для животных и, более предпочтительно, для людей. Термин «носитель» относится к разбавителю, вспомогательному средству, наполнителю или среде, вместе в которыми вводят терапевтический агент. Указанный носитель является фармацевтически приемлемым, т.е. нетоксичным для реципиента в используемой дозировке или концентрации.
Обычно ингредиенты поставляются по отдельности или смешанными друг с другом в стандартной лекарственной форме, например, в форме лиофилизированного порошка или не содержащего воду концентрата в герметически запечатанном контейнере, таком как ампула или саше, с указанием количества активного агента.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно изготавливать в нейтральной или солевых формах.
Предпочтительно, фармацевтическую композицию можно вводить непосредственно или в комбинации с любым подходящим вспомогательным средством, известным специалистам. Композицию по настоящему изобретению можно вводить животному, предпочтительно млекопитающему. Термин «млекопитающее», используемый в настоящем документе, имеет общепринятое значение, известное специалистам. В частности, термин «млекопитающее» охватывает и людей.
Термин «введенный» означает введение терапевтически эффективной дозы вышеупомянутой композиции. Под «терапевтически эффективным количеством» подразумевается доза, которая обеспечивает эффекты, ради которых она вводилась; предпочтительно указанный эффект представляет собой индукцию и усиление PDE4D7. Точная доза будет зависеть от цели лечения и будет поддаваться определению специалистами с использованием известных методик. Как это известно специалистам и описано выше, могут быть необходимыми корректировки для системной доставки по сравнению с локальной, корректировки по возрасту, массе тела, общему состоянию здоровья, полу, характеру питания, времени введения, взаимодействию с другими лекарственными средствами и тяжестью состояния, которые можно установить путем обычного экспериментирования, проведенного специалистами.
Концентрацию активных ингредиентов или соединений фармацевтической композиции по настоящему изобретению можно дополнительно корректировать в соответствии с намеченной схемой введения, намеченной продолжительностью применения, точным количеством и соотношением всех ингредиентов композиции и дополнительными факторами и параметрами, известными специалистам.
Активные агенты или соединения по настоящему изобретению можно вводить отдельно или в комбинации с другими лекарственными средствами. В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить в комбинации с антигормональным лечением, например, антиандрогенной терапией.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению также может содержать любой подходящий консервант, известный специалистам.
Помимо этого, препараты по настоящему изобретению также могут содержать соединения, которые обладают антиоксидантным действием, являются поглотителями свободных радикалов, обладают антиэритематозным, противовоспалительным или антиаллергическим действием, с целью дополнения или усиления их действия.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения активные компоненты фармацевтической композиции, как определено выше в настоящем документе, можно гибридизировать с подходящим белком-носителем, например, с рецепторными белками Ig Fc или полимерными рецепторами Ig. Предпочтительно, PDE4D7 или ее биологически активные эквиваленты, как определено выше в настоящем документе, могут быть изготовлены в форме гибридных белков. Гибридный партнер может находиться на N- или С-конце.
2
12
3
8
Если фармацевтическая композиция по настоящему изобретению предназначается для введения в форме живой клетки или живого лекарственного средства, как определено выше в настоящем документе, трансформированные и подготовленные клетки можно вводить пациенту в любой удобной форме, известной специалистам. Предпочтительно, живые лекарственные средства можно вводить в форме композиции, содержащей микроорганизм, например, Lactobacillus, как описано выше, в количестве приблизительно от 10 до 10 клеток, предпочтительно от 10 до 10 клеток.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения соотношение между двумя или более ингредиентами в фармацевтической композиции или лекарственном средстве можно подходящим образом корректировать, как это известно специалистам.
in vitro
Подходящие анализы можно, необязательно, выполнять, чтобы помочь идентификации оптимальных соотношений и/или пределов доз для ингредиентов фармацевтических композиций по настоящему изобретению. Точная доза и соотношение между ингредиентами фармацевтической композиции, как определено выше в настоящем документе, будут зависеть, среди прочего, от пути введения, точного типа заболевания или расстройства, и должны определяться в соответствии с суждением практикующего врача и обстоятельствами каждого пациента. Эффективные дозы или соотношения ингредиентов можно экстраполировать с кривых доза-ответ, полученных  или к экспериментах на животных.
Типичная доза может, например, находиться в пределах от 0,001 до 1000 мкг; однако предусматриваются дозы ниже или выше указанных типичных пределов, особенно, с учетом упомянутых выше факторов.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к медицинскому набору для лечения или профилактики рака, в частности рака предстательной железы, включающему по меньшей мере один элемент, выбранный из группы, состоящей из (а) соединения, непосредственно стимулирующего или модулирующего активность PDE4D7, предпочтительно аллостерического агониста ферментативной активности PDE4D7; (b) соединения, опосредованно стимулирующего или модулирующего активность PDE4D7; (с) белка PDE4D7 или его биологически активного эквивалента; (d) нуклеиновой кислоты, кодирующей и экспрессирующей PDE4D7; (е) ингибитора miРНК, специфичного в отношении miРНК PDE4D7; (f) деметилирующего агента; и (g) фактора вытеснения фосфодиэстераз.
Медицинский набор можно использовать в контексте введения фармацевтической композиции, как определено выше в настоящем документе. В частности, набор по настоящему изобретению можно использовать для лечения или профилактики рака, в частности рака предстательной железы.
Ингредиенты медицинского набора по настоящему изобретению могут быть помещены в один или более контейнеров или отдельных емкостей. Они могут быть, предпочтительно, изготовлены в форме фармацевтических композиций или лекарственных средств, более предпочтительно, они могут быть изготовлены, как описано выше в настоящем документе в контексте фармацевтических композиций по настоящему изобретению, например, они могут включать подходящие фармацевтические носители и т.п. Особенно предпочтительными являются композиции для местного введения, как упоминалось выше в настоящем документе в контексте фармацевтических композиций по настоящему изобретению. Медицинский набор по настоящему изобретению может, необязательно, включать также документацию, в которой имеются указания по применению медицинского набора и его компонентов. Предпочтительно, инструкции, имеющиеся в медицинском наборе по настоящему изобретению, могут включать рекомендованные варианты лечения, схемы дозирования и т.п. Медицинский набор также может включать листовку-инструкцию и/или может содержать дополнительную информацию по применению, дозировке и т.п.
Медицинский набор по настоящему изобретению можно вводить пациенту в соответствии с любой подходящей схемой дозирования, известной специалистам. Медицинский набор или компоненты набора можно, предпочтительно, вводить один раз в неделю, более предпочтительно, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз или 6 раз в неделю, и, наиболее предпочтительно, каждый день или 2 раза в день или чаще, если не указано иное. По мере прогрессирования лечения дозы можно давать с гораздо более длительными интервалами времени, а в случае необходимости, дозы можно давать с гораздо более короткими интервалами времени, например, несколько раз в день. В предпочтительном случае ответ на лечение можно мониторировать с использованием описанных в настоящем документе способов и других способов, известных специалистам, и соответствующим образом оптимизировать дозировки, например, по времени, количеству и/или композиции. Прогресс можно мониторировать с использованием периодической оценки. Также предусматривается, что медицинский набор будет использоваться в подходах совместной терапии, т.е. для совместного введения с другими лекарственными средствами, например, антибиотиками, противовирусными лекарственными средствами или иммуноглобулинами IgG или IgA, противораковыми лекарственными средствами и, предпочтительно, антигормональными лекарственными средствами, более предпочтительно, антиандрогенами, как упоминалось выше в настоящем документе.
В еще одном, конкретном аспекте настоящее изобретение относится к набору, включающему ингредиенты для определения экспрессии PDE4D7, как определено выше в настоящем документе, вместе с ингредиентами медицинского набора для лечения рака предстательной железы, в частности, гормонорезистентного рака предстательной железы, как определено выше в настоящем документе.
В еще одном, особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения рак, который подлежит диагностике, выявлению, мониторингу или прогнозированию, или прогрессирование которого подлежит диагностике, выявлению, мониторингу или прогнозированию, или который подлежит лечению фармацевтической композицией, как упоминалось выше, или способом лечения по настоящему изобретению, представляет собой рак предстательной железы.
В другом особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения рак, который подлежит диагностике, выявлению, мониторингу или прогнозированию, или прогрессирование которого подлежит диагностике, выявлению, мониторингу или прогнозированию, или который подлежит лечению фармацевтической композицией, как упоминалось выше, или способом лечения по настоящему изобретению, представляет собой гормонорезистентный рак предстательной железы. Термин «гормонорезистентный рак предстательной железы» означает, что рост и пролиферация рака предстательной железы или клеточных линий рака предстательной железы являются резистентными к стимуляции мужскими половыми гормонами. Термин относится также к поздней стадии развития рака предстательной железы, которая больше не поддается лечению введением антигормонов, предпочтительно антиандрогенов, как определено выше в настоящем документе.
Обычно прогрессирование рака предстательной железы сопровождается сдвигом доверия к эндокринным контролям в сторону доверия к паракринным и, в конечном итоге, аутокринным контролям; указанный сложный процесс, как полагают, является результатом изменений, которые наблюдаются на молекулярных уровнях клеточного контроля. В силу возможности метастатического распространения опухолей на указанной стадии гормонорезистентные раки предстательной железы являются главной мишенью для диагностики и лечения по настоящему изобретению, в частности, в соответствии с приведенными выше вариантами осуществления.
Следующие примеры и фигуры служат иллюстративным целям. Таким образом, следует понимать, что примеры и фигуры не должны истолковываться как ограничительные. Специалист легко сможет рассмотреть другие модификации принципов, лежащих в основе настоящего документа.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1 - количественный анализ ОТ-ПЦР человеческих клеточных линий и человеческих тканевых ксенотрансплантатов
Из клеточных линий и человеческих тканевых ксенотрансплантатов, изображенных на фиг. 1 (более подробно см. также в Marques et al., 2006, Eur. Urol., 49(2):245-57), выделяли РНК и транскрибировали в кДНК с использованием стандартных процедур. Приготовленные кДНК образцов с «ксенотрансплантат РС346Р» по «346Flu2», которые являются клеточными линиями, и образцов с «РС295» по «РС374», которые являются ксенотрансплантатами, тестировали на предмет уровней экспрессии PDE4D7.
кОТ-ПЦР: материалы и методы
Образцы РНК обрабатывали ДНКазой, чтобы гарантировать отсутствие контаминации ДНК. Перед синтезом кДНК образцы РНК обрабатывали ДНКазой I (In Vitrogen) в течение 30 минут при 37°С. 1 мкг образца РНК затем обрабатывали Superscript Vilo (In Vitrogen) для синтеза первой цепи ДНК для анализа кПЦР, согласно инструкциям производителя. Образцы ДНК затем обрабатывали РНКазой Н1 в течение 30 минут при 37°С.
Полученную ДНК разбавляли до конечной концентрации 50-60 нг/мкл, из которых 5 мкл добавляли в каждую реакционную лунку 96-луночного оптического реакционного планшета.
Количественные реакции ПЦР осуществляли с использованием машины ABI Prism 7300 в реакционном объеме 15 мкл по следующему протоколу:
7,5 мкл Platinum qPCR SuperMix с ROX (InVitrogen)
2,2 мкл не содержащей нуклеаз воды
0,1 мкл 100 пмоль/мкл зонда
0,1 мкл 100 пмоль/мкл прямого праймера
0,1 мкл 100 пмоль/мкл обратного праймера
Общий объем в каждой реакционной лунке составлял 15 мкл, включая кДНК. Саму ПЦР проводили 40 циклами по следующей программе:
Стадия
Повторы
Температура (°С)
Время
1
1
50
2 секунды
2
1
95
2 минуты
3
40
95
15 секунд
60
1 минута
Праймеры и зонды для кОТ-ПЦР (TAQMAN)
Следующие олигонуклеотидные праймеры и зонды использовали для ОТ-ПЦР на PDE4D7:
Прямой праймер 5’-TGCCTCTGAGGAAACACTAC-3’ (SEQ ID NO: 3), обратный праймер 5’-GCTGAATATTGCGACATGAAAG-3’ (SEQ ID NO: 4) давали продукт длиной 101.
В качестве зонда использовали последовательность 5’-CCAGTAATGAAGAGGAAGACCCTTTCCGC-3’ (SEQ ID NO: 5).
Серия зондов была разработана для нацеливания на уникальные N-концевые области изоформы PDE. Ампликон был разработан таким образом, чтобы находиться в оптимальных пределах для анализов Taqman по технологии ABI Prism. Все анализы выполняли в четырех повторностях для максимизации целостности данных. Также был включен референтный зонд GAPDH, по которому стандартизировали все последующие данные.
кОТ-ПЦР: анализ данных
Осуществляли подход -ddCt, чтобы стандартизировать и сравнивать различные эксперименты ОТ-ПЦР. Величины Ct получали с использованием ручного наблюдения, где каждая серия зондов амплифицировалась экспоненциально при сравнимой эффективности. В частности, выполняли следующие этапы:
1) Вычисляли разницу в количестве циклов (Ct) между референтным геном и геном, представляющим интерес (GAPDH вычитали из гена, представляющего интерес), с получением экспериментального образца (ES) dCt.
2) Один образец выбирали в качестве стандарта для сравнения (LNCaP)(С) и вычисляли его dCt.
3) Изменения разницы в количестве циклов можно было получить dCt(ES)-dCt(C)=ddCt
4) Конечные сравнимые величины экспрессии можно было получить путем 2-ddCt, чтобы учитывать удвоение ДНК после каждого цикла, следовательно, показывая количество мРНК по сравнению с LNCaP.
Указанная операция дает величину по сравнению с LNCaP (который будет иметь величину 1), т.е. любую величину >1 считали увеличением экспрессии, величину <1 считали уменьшением экспрессии.
Соответственно, был сделан вывод о том, что величины эффективности удлинения для всех реакций ПЦР находятся в определенных пределах, дающих величину 1.
Процентный подход к стандартизации и сравнение различных экспериментов ОТ-ПЦР
Для каждой серии зондов получали величину Ct (количество циклов). Ее получали нахождением исходной величины, которая пересекает кривые амплификации во время их экспоненциальной фазы. Исходные величины получали динамически, согласно кривым, полученным в каждом эксперименте. Величины Ct (пересечение или цикл) GOI затем вычитали из величины Ct стандарта GAPDH.
Согласно формуле Ct(GAPDH)-Ct(GOI)=dCt, дано, что величины GOI Ct всегда больше, чем величина dCt референтного гена, выражающаяся отрицательными числами, т.е. величина -dCt.
На основе удваивающего эффекта каждого цикла были определены абсолютные величины, согласно величине сравнительной экспрессии =2-dCt. Из-за очень малых величин, полученных после указанных расчетов, величину умножали на 1000 для удобства использования.
Уровни экспрессии для PDE4D7, полученные с использованием указанного подхода, изображены на фиг. 2-7. В частности, фигуры 2-4 охватывают сравнительную экспрессию кДНК PDE4D7 в различных человеческих клеточных линиях и ксенотрансплантатах рака предстательной железы (см. фиг. 1), стандартизированную согласно подходу -ddCt, в то время как фигуры 5-7 охватывают сравнительную экспрессию кДНК PDE4D7 в различных человеческих клеточных линиях и ксенотрансплантатах рака предстательной железы (см. фиг. 1), стандартизированную относительно общей экспрессии PDE4D7 в отдельных клеточных линиях или материале тканей ксенотрансплантатов.
Как можно видеть из фиг. 2-7, уровень экспрессии (или транскрипции) PDE4D7 достоверно различается между большинством андроген-зависимых или андроген-чувствительных по сравнению с андроген-независимыми клеточными линиями (фиг. 3 и 6) или человеческими ксенотрансплантатами (фиг. 4 и 7). Фиг. 2 и 5 показывают объединенные результаты для клеточных линий и ксенотрансплантатов.
Согласно результатам, представленным на фиг. 2-7, транскрипция PDE4D7 в человеческих клеточных линиях и тканях рака предстательной железы зависит от статуса активности андрогеновых рецепторов в данном клеточном типе. В случае наличия АР и чувствительности клетки к андрогенной гормональной стимуляции, можно наблюдать значимую транскрипцию PDE4D7, в то время как в отсутствии активных АР транскрипция является минимальной, т.е. практически отсутствует.
ПРИМЕР 2 - количественный анализ ОТ-ПЦР человеческих тканевых образцов
Относительную экспрессию гена человеческой PDE4D7 оценивали в тканях рака предстательной железы, полученных от пациентов с гормоночувствительным раком предстательной железы/поддающихся лечению, по сравнению с пациентами с гормонорезистентным раком предстательной железы/устойчивыми к кастрации.
Материалы и методы
Детали образцов, использованных в эксперименте для кПЦР измерений экспрессии гена PDE, представлены в таблице 1, ниже:
<b>Таблица 1</b><b>Информация о пациенте, использованная в эксперименте</b>
Ткань
Тип ткани
Шкала Глисона
Возраст на момент лечения
Статус гормонорезистентности
Предстательная железа
ТУРП
4+4
66
нет
Лимфоузел
4+4
63
нет
Предстательная железа
ТУРП
3+3
67
нет
Предстательная железа
ТУРП
4+4
82
нет
Предстательная железа
ТУРП
5+4
76
да
Предстательная железа
ТУРП
3+4
60
да
Лимфоузел
4+4
66
нет
Предстательная железа
ТУРП
5+3
90
да
Предстательная железа
ТУРП
4+3
66
да
Предстательная железа
ТУРП
3+4
60
да
Предстательная железа
ТУРП
4+4
64
нет
Предстательная железа
ТУРП
6
71
да
Лимфоузел
4+4
62
нет
Предстательная железа
ТУРП
7
75
да
Предстательная железа
ТУРП
3+5
70
да
Лимфоузел
4+4
52
нет
Все образцы были получены от пациентов мужского пола (в возрасте 52-82). Колонка «ткань» определяет ткань, которая была получена во время хирургического вмешательства, ткань предстательной железы или лимфатических узлов для определения стадии. Колонка «тип ткани» описывает подход к резекции ткани. Если не указано иное, ткань была резецирована по время хирургического вмешательства на предстательной железе (простатэктомии). «ТУРП» означает трансуретральную резекцию предстательной железы. Панель кДНК включает в себя 4 образца, полученные от пациентов с гормоночувствительным раком предстательной железы, и 8 образцов, полученных от пациентов с гормонорезистентным раком предстательной железы (обозначаются «да» в колонке «статус гормонорезистентности», и 4 образца из метастазов в лимфатические узлы.
Последовательность праймеров и зонда, использованных для человеческой PDE4D7:
последовательность смыслового праймера: CGGAATGGAACCCTA TCTTGTC (SEQ ID NO: 7)
последовательность антисмыслового праймера: TTGGTCGTTGAATGTTCTCTGAT (SEQ ID NO: 8)
последовательность зонда: CCTCTCGCCTTCAGACAGTTGGAACAAGGAG AGG (меченный FAM) (SEQ ID NO: 9)
PDE4D7-специфичные праймеры (SEQ ID NO: 7 и 8) предварительно смешивали с FAM-зондами (SEQ ID NO: 9) для выполнения количественно ПЦР в режиме реального времени (кПЦР) и использовали в разведении 1:20, согласно описанию производителя (PrimerDesign, UK). Образцы человеческой кДНК помещали в стандартные, готовые для кПЦР 96-луночные микротитрационные (МТ) планшеты.
16 образцов тканей, полученных от 16 разных пациентов, помещали в 96-луночный МТ планшет, в котором каждая из 16 лунок, используемых в планшете, содержала приблизительно 2-3 нг кДНК, обратно транскрибированной с РНК.
В каждую используемую лунку МТ планшета добавляли до 15 мкл мастер-микса Applied Biosystems’ GeneAmp (2x), 13,5 мкл воды, не содержащей РНКазы/ДНКазы, и 2 мкл праймер-микса PrimerDesign PerfectProbe (PrimerDesign, UK).
Все образцы анализировали согласно следующему протоколу ПЦР: 2 мин при 50°С, 10 мин при 95°С, 15 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, с записью флуоресценции, 15 сек при 72°С, и последние три этапа повторяли 50 раз.
Т
Т
Для всех вычислений величин относительной экспрессии генов использовали следующую процедуру: величины С 40 или выше или ниже 16 исключали по причинам плохого качества. (Исследованные гены имели среднюю величину С~33).
Т
Т
Для стандартизации величин С использовали следующий подход: величины С конвертировали в относительное количество копий генов на основе калибровочных кривых. Калибровочные кривые независимо измеряли при различных разведениях кДНК. Впоследствии определяли экспрессию PDE4D7 делением количества копий PDE4D7 на среднее количество копий генов «домашнего хозяйства» (глицеринальдегид-3-фосфат дегидрогеназы (GAPDH) и порфобилиноген-дезаминазы (PBGD)).
Относительная экспрессия человеческой PDE4D7 в тканях человеческой предстательной железы (гормоночувствительных по сравнению с гормонорезистентными), включая образцы тканей резецированных лимфатических узлов
Уровень экспрессии гена изоформы человеческой PDE4D7 определяли с использованием тканей человеческой предстательной железы, как описано выше. Уровни относительной экспрессии определяли в двух определенных тканях предстательной железы - «гормоночувствительной» и «гормонорезистентной». Для первоначального исследования статуса экспрессии человеческой PDE4D7 вместе с образцами первичного рака предстательной железы были включены образцы тканей резецированных лимфатических узлов.
Образцы тканей резецированных лимфатических узлов характеризуются инвазивным ростом, поскольку они были диссеминированы из первичной опухоли в регионарные лимфатические узлы. В данном смысле указанные образцы происходят из молекулярной перспективы, отличающейся от первичных опухолевых клеток, которые характеризуются неконтролируемой пролиферацией, но все еще растут в границах первичного органа. Инвазивный рост подразумевает более агрессивное ростовое поведение, которое также наблюдается в ткани гормонорезистентного рака предстательной железы.
Критерий Стьюдента выполняли, чтобы выяснить, понижается ли незначительно в среднем экспрессия гена человеческой PDE4D7 в тканях гормонорезистентной опухоли по сравнению с гормоночувствительной тканью человеческой предстательной железы.
Как можно видеть из фигур 8 и 9, экспрессия в гормонорезистентных опухолях предстательной железы обычно является пониженной, но нелегко отличимой от экспрессии в гормоночувствительных группах опухолей предстательной железы. Средняя разница в экспрессии PDE4D7 между тестируемыми тканевыми типами была, соответственно, найдена незначимой (величина р=0,22).
Указанный результат можно было бы, возможно, объяснить более агрессивным поведением части образцов, включенных в анализ группы 1. Обдумывался вариант, скрывает ли агрессивное заболевание уже опухолевые клетки, которые утратили свою чувствительность к андрогену, таким образом, что характеристики гормонорезистентного поведения будут присущими агрессивной опухоли. Указанные клетки в результате будут отобраны в условиях андрогенной депривации. Это могло объяснить, почему указанные типы тканей уже имеют тенденцию к пониженным уровням экспрессии человеческой PDE4D7, ведущим к менее значимым величинам р в стандартном Т-критерии. Таким образом, трудность правильного определения статуса образцов тканей резецированных лимфатических узлов, т.е. факта, что нельзя исключить, что указанные опухоли уже содержат до некоторой степени гормонорезистентные популяции опухолевых клеток, могла, возможно, привести к полученным результатам.
Относительная экспрессия человеческой PDE4D7 в человеческих тканях предстательной железы (гормоночувствительных по сравнению с гормонорезистентными), исключая образцы тканей резецированных лимфатических узлов
С целью решения указанных проблем определяли уровни относительной экспрессии в двух определенных тканях предстательной железы: «гормоночувствительных» и «гормонорезистентных»; в то же время, для изучения статуса экспрессии человеческой PDE4D7 в исследование включали только образцы первичного рака предстательной железы, т.е. все образцы, полученные при резекциях лимфатических узлов, отбрасывались.
Осуществляли t-критерий Стьюдента, чтобы понять, уменьшается ли достоверно в среднем экспрессия человеческого гена PDE4D7 в гормонорезистентных опухолевых тканях по сравнению с гормоночувствительной тканью человеческой предстательной железы.
Как можно видеть из фигур 10 и 11, экспрессия в гормонорезистентных опухолях предстательной железы уменьшается, и ее можно легко отличить от экспрессии в группах гормоночувствительных опухолей предстательной железы. Средняя разница в экспрессии PDE4D7 между двумя тканевыми типами (в гормонорезистентных опухолевых тканях и в гормоночувствительных опухолевых тканях) является значимой (р=0,032).
Фигуры 10 и 11 показывают, что экспрессия PDE4D7 в гормонорезистентных опухолях предстательной железы уменьшается по сравнению с гормоночувствительными опухолями предстательной железы. Таким образом, был сделан вывод о том, что уменьшенный уровень активности сАМФ-PDE является благоприятным для усиленной пролиферации клеток. Долгое время предполагали, что следующая по важности после мутаций или амплификации гена андрогеновых рецепторов, активация других клеточных сигнальных путей может поддерживать переход гормоночувствительного к гормононезависимому клеточному росту. Путь цАМФ-РКА представляет собой один из путей, которые участвуют в указанном переходе гормонозависимого роста. Изменение экспрессии PDE4D7 от гормоночувствительной к гормонорезистентной ткани предстательной железы поддерживает данную точку зрения.
ПРИМЕР 3 - влияние экспрессии PDE4D7 на пролиферацию РС3
Для того чтобы изучить влияние гетерологичной экспрессии человеческой PDE4D7 на пролиферацию андроген-независиымх клеточных линий, несколько генных конструкций трансфектировали в клетки РС3, и изучали клеточный рост по сравнению с клеточными линиями, получившими контрольную обработку. Использовали в качестве контролей необработанные клетки РС3, клетки РС3, транфектированные доминантной негативной формой PDE4D7, в которой каталитическая активность PDE4D7 была устранена путем генетической мутации кодирующей последовательности PDE4D7, а также клетки РС3, транфектированные другой изоформой семейства PDE4D7, а именно, PDE4D1.
2
Клетки РС3 выращивали при 5% СО, 37°С, 5% фетальной бычьей сыворотки на среде RPMI, снабженной L-глутамином (конечная концентрация 2 мМ) и PenStrep (1%). Клетки РС3 высевали с плотностью 5000 клеток на лунку на 96-луночный планшет (МТР). Трансфекционные комплексы для гена, представляющего интерес (PDE4D7, PDE4D7 доминантная негативная и PDE4D1), формировали с использованием трансфекционного реагента Fugene 6, согласно инструкциям производителя. Для каждого гена, представляющего интерес, осуществляли ~25 независимых трансфекций, чтобы повысить статистическую мощность теста (каждый столбец представляет ~25 независимых измерений).
Через 4 часа после первоначального посева трансфекционные комплексы добавляли в ростовые среды и клеткам позволяли пролиферировать в течение 60 часов, до добавления соединения Promega MTT. Процедуру анализа МТТ для изучения клеточной пролиферации осуществляли согласно инструкциям производителя.
Данные поглощения получали с использованием системы планшет-ридера Mithras LB940. С каждой лунки считывали 1-секундные данные.
Как показано в описанном выше эксперименте, гетерологичная экспрессия человеческой PDE4D7 в клеточной линии андроген-независимого рака предстательной железы РС3 продемонстрировала отрицательное влияние на пролиферацию in vivo. Клеточная пролиферация в указанных условиях была в целом подавлена на ~15% экспрессией человеческой PDE4D7, по сравнению с необработанными клетками, клетками, трансфектированными неактивной формой PDE4D7, а также по сравнению с экспрессией PDE4D1. Эффект является статистически значимым (p<0,001 по сравнению с РС3).
Данный эксперимент показывает, что активация человеческой PDE4D7 оказывает ингибирующее действие на пролиферацию клеток андроген-независимого рака предстательной железы. Наблюдаемое влияние на клеточную пролиферацию является статистически высокозначимым.
В силу преходящего характера трансфекции, использованной в эксперименте (т.е. в зависимости от эффективности трансфекции, больше или меньше РС3 были трансфектированы и впоследствии демонстрировали избыточную экспрессию фермента PDE), ожидается, что даже еще более высокий уровень ингибирования клеточной пролиферации может быть достигнут, если в клетках РС3 будет достигнута более высокая преходящая эффективность трансфекции.
Настоящая заявка включает следующие дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения:
Пункт 1: Фосфодиэстераза 4D7 (PDE4D7) для применения в качестве маркера рака.
Пункт 2: Композиция для диагностики, выявления, мониторинга или прогнозирования рака или прогрессирования рака, содержащая аффинный лиганд, представляющий собой нуклеиновую кислоту, и/или аффинный лиганд, представляющий собой пептид, для продукта экспрессии или белка PDE4D7.
Пункт 3: Композиция по п. 2, в которой указанный аффинный лиганд, представляющий собой нуклеиновую кислоту, или аффинный лиганд, представляющий собой пептид, модифицирован для функционирования в качестве контрастного агента.
Пункт 4: Композиция по п. 2, в которой указанный аффинный лиганд представляет собой ряд олигонуклеотидов, специфичных для продукта экспрессии PDE4D7, зонд, специфичный для продукта экспрессии PDE4D7, аптамер, специфичный для продукта экспрессии или белка PDE4D7, антитело, специфичное для белка PDE4D7, и/или вариант антитела, специфичный для белка PDE4D7.
Пункт 5: Применение PDE4D7 в качестве маркера для диагностики, выявления, мониторинга или прогнозирования рака или прогрессирования рака.
Пункт 6: Способ диагностики, выявления, мониторинга или прогнозирования рака или прогрессирования рака, включающий по меньшей мере этап определения уровня PDE4D7 в образце.
Пункт 7: Способ по п. 6, в котором этап определения осуществляют измерением уровней нуклеиновых кислот или белков или определением биологической активности PDE4D7.
Пункт 8: Способ по п. 7, в котором указанный способ включает дополнительный этап сравнения измеренных уровней нуклеиновых кислот или белков или измеренной биологической активности с контрольным уровнем.
Пункт 9: Способ сбора данных, включающий по меньшей мере этапы:
(а) тестирования индивидуума на предмет экспрессии PDE4D7; и
(b) сравнения экспрессии, определенной на этапе (а), с контрольным уровнем.
Пункт 10: Применение по п. 2 или способ по любому из п.п. 6-9, в котором диагностику, выявление, мониторинг, прогнозирование или сбор данных следует осуществлять с использованием образца, полученного от индивидуума.
Пункт 11: Иммунологический анализ для выявления, диагностики, мониторинга или прогнозирования рака или прогрессирования рака, включающий по меньшей мере этапы:
(а) тестирования образца, полученного от индивидуума, на предмет экспрессии PDE4D7,
(b) тестирования контрольного образца на предмет экспрессии PDE4D7,
(с) определения разницы в экспрессии PDE4D7 между этапами (а) и (b); и
(d) принятия решения о наличии или стадии рака или о прогрессировании рака на основании результатов, полученных на этапе (с);
в котором указанные этапы тестирования основаны на использовании антитела, специфичным образом связывающегося с PDE4D7.
Пункт 12: Применение по п. 10 или иммунологический анализ по п. 11, в котором указанный образец представляет собой образец ткани, образец мочи, образец осадка мочи, образец крови, образец слюны, образец спермы или образец, включающий циркулирующие опухолевые клетки.
Пункт 13: Фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере один элемент, выбранный из следующей группы:
(а) соединение, непосредственно стимулирующее или модулирующее активность PDE4D7, предпочтительно аллостерический агонист ферментативной активности PDE4D7;
(b) соединение, опосредованно стимулирующее или модулирующее активность PDE4D7;
(с) белок PDE4D7 или его биологически активный эквивалент;
(d) нуклеиновая кислота, кодирующая и экспрессирующая PDE4D7;
(е) ингибитор miРНК, специфичный в отношении miРНК PDE4D7;
(f) деметилирующий агент; и
(g) фактор вытеснения фосфодиэстераз, предпочтительно пептид, пептидомиметик, малая молекула, антитело или аптамер.
Пункт 14: Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики рака, содержащая по меньшей мере один элемент, выбранный из следующей группы:
(а) соединение, непосредственно стимулирующее или модулирующее активность PDE4D7, предпочтительно аллостерический агонист ферментативной активности PDE4D7;
(b) соединение, опосредованно стимулирующее или модулирующее активность PDE4D7;
(с) белок PDE4D7 или его биологически активный эквивалент;
(d) нуклеиновая кислота, кодирующая и экспрессирующая PDE4D7;
(е) ингибитор miРНК, специфичный в отношении miРНК PDE4D7;
(f) деметилирующий агент; и
(g) фактор вытеснения фосфодиэстераз, предпочтительно пептид, пептидомиметик, малая молекула, антитело или аптамер.
Пункт 15: Применение
(а) соединения, непосредственно стимулирующего или модулирующего активность PDE4D7, предпочтительно аллостерического агониста ферментативной активности PDE4D7;
(b) соединения, опосредованно стимулирующего или модулирующего активность PDE4D7;
(с) белка PDE4D7 или его биологически активного эквивалента;
(d) нуклеиновой кислоты, кодирующей и экспрессирующей PDE4D7;
(е) ингибитора miРНК, специфичного в отношении miРНК PDE4D7;
(f) деметилирующего агента; и
(g) фактора вытеснения фосфодиэстераз, предпочтительно пептида, пептидомиметика, малой молекулы, антитела или аптамера,
для изготовления фармацевтической композиции для лечения или профилактики рака.
Пункт 16: Фосфодиэстераза по п. 1, композиция по любому из п.п. 2-4, применение по п. 5, 10 или 12, способ по любому из п.п. 6-10 или 12, иммунологический анализ по п. 11 или 12, фармацевтическая композиция по п. 13 или 14 или применение по п. 15, в которых указанный рак представляет собой рак предстательной железы.
Пункт 17: Фосфодиэстераза, применение, композиция, способ, иммунологический анализ или фармацевтическая композиция по п. 16, в которых указанный рак предстательной железы представляет собой гормонорезистентный рак предстательной железы.