АНТИТЕЛА ПРОТИВ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО CSF-1R И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
ANTIBODIES AGAINST HUMAN CSF-1R AND USES THEREOF

Настоящее изобретение относится к антителам против человеческого CSF-1R (антитело к CSF-1R), способам их получения, фармацевтическим композициям, содержащим указанные антитела и их применению.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Рецептор CSF-1 (CSF-1R; синонимы: рецептор M-CSF; рецептор макрофагального колониестимулирующего фактора 1, ЕС 2.7.10.1, протоонкоген Fms, c-fms, CD115, код в базе данных Swiss Prot Р07333 (SEQ ID NO: 23)) был открыт в 1986 (Coussens, L., et al., Nature 320 (1986) 277-280). CSF-1R представляет собой фактор роста и кодируется протоонкогеном c-fms (см., например, обзор Roth, P. and Stanley, E.R., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 181 (1992) 141-67).
CSF-1R представляет собой рецептор M-CSF (макрофагального колониестимулирующего фактора, также обозначаемого CSF-1) и опосредует биологические эффекты данного цитокина (Sherr, C.J., et al., Cell 41 (1985) 665-676). Клонирование рецептора колониестимулирующего фактора 1 (также обозначаемого c-fms) было впервые описано Roussel, M.F., et al., Nature 325 (1987) 549-552. В данной публикации было продемонстрировано, что трансформирующий потенциал CSF-1R зависит от модификаций С-концевой части белка, таких как потеря ингибиторного сайта фосфорилирования по тирозину 969, с которым связывается Cbl и таким образом опосредует отрицательную регуляцию рецептора (Lee, P.S., et al., Embo J. 18 (1999) 3616-3628).
CSF-1R представляет собой одноцепочечный трансмембранный тирозинкиназный рецептор (RTK, от англ. receptor tyrosine kinase) и является представителем семейства RTK, содержащих иммуноглобулиновый (Ig) мотив, имеющих повторяющиеся Ig домены во внеклеточной части рецептора. Внутриклеточный тирозинкиназный домен белка имеет уникальный вставочный домен, который также имеется у других родственных представителей семейства III класса RTK, например, рецепторов к тромбоцитарному фактору роста (PDGFR, от англ. platelet derived growth factor receptors), рецептора фактора роста стволовых клеток c-Kit и рецептора цитокина FLT3 (от англ. fins-like tyrosine kinase, fins-подобная тирозиновая киназа). Несмотря на структурную гомологию между рецепторами данного семейства факторов роста, они выполняют различные тканеспецифические функции. CSF-1R преимущественно экспрессируется на клетках моноцитарного ряда, репродуктивных органов женщины и плаценты. Кроме того, была описана экспрессия CSF-1R на кожных клетках Лангерганса, разновидности гладкомышечных клеток (Inaba, Т., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 5693-5699), В cells (Baker, А.Н., et al., Oncogene 8 (1993) 371-378) и клетках микроглии (Sawada, Μ., et al., Brain Res. 509 (1990) 119-124).
Основными биологическими эффектами активации сигнального пути CSF-1R являются пролиферация, миграция, выживаемость и дифференцировка гемопоэтических клеток-предшественников в макрофагальном направлении (включая остеокласты). Активация CSF-1R опосредуется его лигандом, M-CSF. Связывание M-CSF и CSF-1R индуцирует образование гомодимеров и активацию киназы за счет фосфорилирования тирозина (Stanley, E.R., et al., Mol. Reprod. Dev. 46 (1997) 4-10). Дальнейшая передача сигнала опосредуется субъединицей р85 PI3K и Grb2, обеспечивающими связь с сигнальными путями PI3K/AKT и Ras/MAPK, соответственно. Эти два важных сигнальных пути участвуют в регуляции пролиферации, выживаемости и апоптоза. Другими сигнальными молекулами, которые присоединяются к фосфорилированному внутриклеточному домену CSF-1R, являются STAT1, STAT3, PLCy и Cbl (Bourette, R.P. and Rohrschneider, L.R., Growth Factors 17 (2000) 155-166).
Сигнальный путь CSF-1R имеет важное физиологическое значение для иммунного ответа, ремоделирования костной ткани, а также для репродуктивной системы. Было продемонстрировано, что у животных с нок-аутом M-CSF-1 (Pollard, J.W., Mol. Reprod. Dev. 46 (1997) 54-61) или CSF-1R (Dai, X.M., etal., Blood 99 (2002) 111-120) наблюдаются остеопетроз, нарушения гемопоэза, функций тканевых макрофагов и репродуктивной функции, что согласуется с ролью CSF-1R в соответствующих типах клеток.
В публикации Sherr, C.J. et al., Blood 73 (1989) 1786-1793 описаны некоторые антитела, направленные против CSF-1R, ингибирующие активность CSF-1 (см. Sherr, C.J., et al., Blood 73 (1989) 1786-1793). В публикации Ashum, R.A., et al., Blood 73 (1989) 827-837 описаны антитела CSF-1R. В публикации Lenda, D., et al., Journal of immunology 170 (2003) 3254-3262 описаны нарушенная мобилизация, пролиферация и активация макрофагов у мышей с недостаточностью CSF-1, что в результате приводит к снижению интенсивности апоптоза в канальцах при воспалении в почках. В публикации Kitaura, Η., et al., Journal of dental research 87 (2008) 396-400 описано антитело к CSF-1, подавляющее перемещение зубов при ортодонтическом лечении. WO 2001/030381 относится к ингибиторам активности CSF-1, таким как антисмысловые нуклеотиды и антитела, при этом раскрывая только антисмысловые нуклеотиды CSF-1. WO 2004/045532 относится к предупреждению метастазирования и потере костной ткани и лечению метастатического рака антагонистами M-CSF, раскрывая в качестве антагонистов только антитела к CSF-1. WO 2005/046657 относится к лечению воспалительных заболеваний кишечника антителами к CSF-1. US 2002/0141994 относится к ингибиторам колониестимулирующих факторов. WO 2006/096489 относится к лечению ревматоидного артрита антителами к CSF-1.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Один аспект изобретения относится к антителу, связывающемуся с человеческим CSF-1R, которое отличается тем, что оно присоединяется к тому же эпитопу, что и депонированное антитело DSM АСС2920, для применения с целью ингибирования клеточной пролиферации CSF-1 лиганд-зависимых и/или CSF-1 лиганд-независимых клеток, экспрессирующих CSF-1-R.
В одном воплощении клетки, экспрессирующие CSF-1-R, представляют собой опухолевые клетки.
В одном воплощении антитело отличается тем, что содержит в качестве участка CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи участок CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 9.
В одном воплощении антитело отличается тем, что
a) вариабельный домен тяжелой цепи содержит участок CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 1, участок CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 2 и участок CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 3, а вариабельный домен легкой цепи содержит участок CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 4, участок CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 5 и участок CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 6, или
b) вариабельный домен тяжелой цепи содержит участок CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 9, участок CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 10 и участок CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 11, а вариабельный домен легкой цепи содержит участок CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 12, участок CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 13 и участок CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 14; или
с) вариант антител согласно а) или b) имеет пересаженный участок CDR, является гуманизированным или у него элиминирован Т-клеточный эпитоп.
Таким образом, антитела по изобретению, связывающиеся с тем же эпитопом, способны ингибировать клеточную пролиферацию CSF-1 лиганд-зависимых и CSF-1 лиганд-независимых клеток.
Другой аспект изобретения относится к антителу, связывающемуся с человеческим CSF-1R, которое отличается тем, что оно связывается с тем же эпитопом, что и депонированное антитело DSM АСС2920.
Другой аспект изобретения относится к антителу, связывающемуся с человеческим CSF-1R, которое отличается тем, что оно связывается с тем же эпитопом, что и депонированное антитело DSM АСС2920; причем связывание с тем же эпитопом определяют при исследовании конкуренции антител in vitro при 25°С методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR, от англ. Surface Plasmon Resonance); и
причем антитело обладает следующими свойствами:
a) ингибирует рост клеток NIH3T3, экспрессирующих рекомбинантный CSF-1R дикого типа, на 90% или более при концентрации антитела 10 мкг/мл; и
b) ингибирует рост клеток NIH3T3, экспрессирующих рекомбинантный CSF-1R с мутациями L301S и Y969F, на 60% или более при концентрации антитела 10 мкг/мл.
В одном воплощении антитело отличается тем, что содержит в качестве участка CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи участок CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 9.
В одном воплощении антитело отличается тем, что
а) вариабельный домен тяжелой цепи содержит участок CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 1, участок CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 2 и участок CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 3, а вариабельный домен легкой цепи содержит участок CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 4, участок CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 5 и участок CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 6, или
b) вариабельный домен тяжелой цепи содержит участок CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 9, участок CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 10 и участок CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 11, а вариабельный домен легкой цепи содержит участок CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 12, участок CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 13 и участок CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 14; или
c) вариант антител согласно а) или b) имеет пересаженный участок CDR, является гуманизированным или у него элиминирован Т-клеточный эпитоп.
В одном воплощении антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R и отличающееся вышеупомянутыми аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей, относится к подклассу IgG1 человека или к подклассу IgG4 человека.
Следующее воплощение изобретения представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую антитело по изобретению.
Изобретение также относится к фармацевтической композиции, которая отличается тем, что она содержит антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R, отличающееся способностью связываться с вышеупомянутыми эпитопами или, в альтернативном случае, вышеупомянутыми аминокислотными последовательностями или фрагментами аминокислотных последовательностей.
Изобретение также относится к применению антитела, причем такие антитела охватывают антитела, связывающиеся с человеческим CSF-1R, отличающиеся способностью связываться с вышеупомянутыми эпитопами или, в альтернативном случае, отличающиеся вышеупомянутыми аминокислотными последовательностями или фрагментами аминокислотных последовательностей, для применения в изготовлении фармацевтической композиции.
Изобретение также относится к применению антитела, причем такие антитела охватывают антитела, связывающиеся с человеческим CSF-1R, отличающиеся способностью связываться с вышеупомянутыми эпитопами или, в альтернативном случае, отличающиеся вышеупомянутыми аминокислотными последовательностями или фрагментами аминокислотных последовательностей, для лечения заболеваний, опосредованных CSF-1R.
Изобретение также относится к применению антитела, причем такие антитела охватывают антитела, связывающиеся с человеческим CSF-1R, отличающиеся способностью связываться с вышеупомянутыми эпитопами или, в альтернативном случае, отличающиеся вышеупомянутыми аминокислотными последовательностями или фрагментами аминокислотных последовательностей, для лечения рака.
Изобретение также относится к применению антитела, причем такие антитела охватывают антитела, связывающиеся с человеческим CSF-1R, отличающиеся способностью связываться с вышеупомянутыми эпитопами или, в альтернативном случае, отличающиеся вышеупомянутыми аминокислотными последовательностями или фрагментами аминокислотных последовательностей, для лечения потери костной ткани.
Изобретение также относится к применению антитела, причем такие антитела охватывают антитела, связывающиеся с человеческим CSF-1R, отличающиеся способностью связываться с вышеупомянутыми эпитопами или, в альтернативном случае, отличающиеся вышеупомянутыми аминокислотными последовательностями или фрагментами аминокислотных последовательностей, для предупреждения или лечения метастазов.
Изобретение также относится к применению антитела, причем такие антитела охватывают антитела, связывающиеся с человеческим CSF-1R, отличающиеся способностью связываться с вышеупомянутыми эпитопами или, в альтернативном случае, отличающиеся вышеупомянутыми аминокислотными последовательностями или фрагментами аминокислотных последовательностей, для лечения воспалительных заболеваний.
-8
-12
Предпочтительно, антитело связывается с человеческим CSF-1R с аффинностью по меньшей мере от 10 моль/л до 10 моль/л.
Предпочтительно, антитело представляет собой гуманизированное или человеческое антитело.
Следующее воплощение изобретения представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен тяжелой цепи и/или вариабельный домен легкой цепи антитела по изобретению. Предпочтительно, нуклеиновая кислота кодирует тяжелую цепь антитела, связывающегося с человеческим CSF-1R, отличающегося тем, что оно содержит в качестве участка CDR3 тяжелой цепи участок CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 17.
Следующее воплощение изобретения представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело по изобретению, отличающееся тем, что
a) вариабельный домен тяжелой цепи содержит участок CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 1, участок CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 2 и участок CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 3, а вариабельный домен легкой цепи содержит участок CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 4, участок CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 5 и участок CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 6, или
b) вариабельный домен тяжелой цепи содержит участок CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 9, участок CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 10 и участок CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 11, а вариабельный домен легкой цепи содержит участок CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 12, участок CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 13 и участок CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 14; или
c) вариант антител согласно a) или b) имеет пересаженный участок CDR, является гуманизированным или у него элиминирован Т-клеточный эпитоп.
В изобретении также предложены экспрессирующие векторы, содержащие нуклеиновую кислоту по изобретению, способные экспрессировать указанную нуклеиновую кислоту в прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах, а также клетки-хозяева, содержащие данные векторы для рекомбинантной продукции данного антитела.
Изобретение также относится к прокариотическим или эукариотическим клеткам-хозяевам, включающим векторы по изобретению.
Изобретение также относится к способу получения рекомбинантного человеческого или гуманизированного антитела по изобретению, отличающемуся экспрессией нуклеиновой кислоты по изобретению в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине и выделением указанного антитела из указанной клетки или надосадочной культуральной жидкости. Изобретение также относится к антителу, которое можно получить указанным рекомбинантным способом.
Антитела по изобретению оказывают положительный эффект на пациентов, нуждающихся в терапии, мишенью которой является CSF-1R. Антитела по изобретению являются новыми и обладают изобретательским уровнем, оказывая положительный эффект на пациентов, страдающих опухолевыми заболеваниями, в частности, страдающих раком.
В изобретении также предложен способ лечения пациента, страдающего раком, включающий введение пациенту, у которого диагностировано данное заболевание (и, следовательно, нуждающегося в такой терапии), эффективного количества антитела, связывающегося с человеческим CSF-1R согласно изобретению. Предпочтительно, антитело вводят в составе фармацевтической композиции.
Следующее воплощение изобретения представляет собой способ лечения пациента, страдающего раком, отличающийся введением пациенту антитела по изобретению.
Изобретение также относится к применению антитела по изобретению для лечения пациента, страдающего раком, и для изготовления фармацевтической композиции согласно изобретению. Кроме того, изобретение относится к способу изготовления фармацевтической композиции согласно изобретению.
Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело по изобретению, возможно в сочетании с буфером и/или адъювантом, обеспечивающими удобство применения антител для фармацевтических целей.
В изобретении также предложены фармацевтические композиции, содержащие антитело по изобретению на фармацевтически приемлемом носителе. В одном воплощении фармацевтическая композиция может входить в состав изделия или набора.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг. 1. Подавление роста опухолевых клеток BeWo в 3D культуре в присутствии различных моноклональных антител к CSF-1R в концентрации 10 мкг/мл.
Ось X: средние значения жизнеспособности, выраженной в относительных световых единицах (RLU, от англ. relative light units), соответствующих содержанию АТФ в клетках (CellTiterGlo assay).
Ось Υ: исследованные образцы: минимальная среда (0,5% эмбриональной телячьей сыворотки), IgG1 мыши (mIgG1, 10 мкг/мл), IgG2a мыши (mIgG2a, 10 мкг/мл), только CSF-1, <CSF-1R>9D11.2Е8, <CSF-1R>10H2.2F12 и SC-02 клон 2-4А5.
Максимальное ингибирование CSF-1-индуцированного роста наблюдалось в присутствии антитела к CSF-1R, предложенного в изобретении.
СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение также относится к антителу, связывающемуся с человеческим CSF-1R, которое отличается тем, что содержит в качестве участка CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи участок CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 9.
Изобретение также относится к указанному антителу, которое отличается тем, что
a) вариабельный домен тяжелой цепи содержит участок CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 1, участок CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 2 и участок CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 3, а вариабельный домен легкой цепи содержит участок CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 4, участок CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 5 и участок CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 6, или
b) вариабельный домен тяжелой цепи содержит участок CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 9, участок CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 10 и участок CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 11, а вариабельный домен легкой цепи содержит участок CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 12, участок CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 13 и участок CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 14; или
c) вариант антител согласно a) или b) имеет пересаженный участок CDR, является гуманизированным или у него элиминирован Т-клеточный эпитоп.
Термин «антитело» охватывает различные формы антител, в том числе целые антитела, фрагменты антител, гуманизированные антитела, химерные антитела, антитела, у которых элиминирован Т-клеточный эпитоп, и антитела, созданные методами генетической инженерии, при условии, что они сохраняют характерные свойства согласно изобретению, но не ограничиваются ими.
H
L
L
H
"Фрагменты антитела" содержат часть полноразмерного антитела, предпочтительно его вариабельный домен, или по меньшей мере его антиген-связывающий сайт. Примеры фрагментов антител включают диатела, одноцепочечные молекулы антител и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. Антитела scFv описаны, например, Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88). Кроме того, фрагменты антител охватывают одноцепочечные полипептиды, которые имеют характеристики V домена, связывающегося с CSF-1R, а именно способного объединяться с V доменом, или характеристики V домена, связывающегося с CSF-1R, а именно способного объединяться с V доменом с образованием функционального антиген-связывающего сайта, обеспечивающего данное свойство.
Термины «моноклональное антитело» или «композиция моноклонального антитела» в данном документе обозначают препарат молекул антитела единого аминокислотного состава.
Термин «химерное антитело» обозначает моноклональное антитело, содержащее вариабельный домен, т.е., связывающий домен мыши и, по меньшей мере, часть константного домена, происходящего из другого источника или вида, как правило, созданного при помощи технологий рекомбинантной ДНК. Химерные антитела, содержащие мышиный вариабельный домен и человеческий константный домен, являются наиболее предпочтительными. Такие химерные антитела крысы/человека представляют собой продукт экспрессируемых генов иммуноглобулинов, содержащих сегменты ДНК, кодирующие вариабельные домены иммуноглобулинов крысы, и сегменты ДНК, кодирующие константные домены иммуноглобулинов человека. Другие виды «химерных антител», охватываемых настоящим изобретением, представляют собой антитела, в которых класс или подкласс был модифицирован или изменен по сравнению с исходным антителом. Такие «химерные» антитела также обозначаются «антитела с переключением класса». Способы получения химерных антител включают традиционные технологии рекомбинантной ДНК и генной трансфекции, хорошо известные в данной области техники. См., например, Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US 5,202,238 и US 5,204,244.
Термин "вариант с пересаженными участками CDR" в данном описании означает вариабельный домен антитела, включающий участки, определяющие комплементарность (CDR, от англ. complementary determining regions, или гипервариабельные участки) из одного источника или вида и каркасные участки (FR, от англ. framework regions) из другого источника или вида, как правило, полученные при помощи технологий рекомбинантной ДНК. Предпочтительными являются варианты вариабельных доменов с пересаженными областями CDR, представляющими собой мышиные CDR, и человеческими FR.
Термин "вариант с элиминированным Т-клеточным эпитопом" в данном описании обозначает вариабельный домен антитела, который подвергли модификации для устранения или снижения иммуногенности за счет удаления человеческих Т-клеточных эпитопов (последовательностей пептидов в составе вариабельных доменов, способных связывать молекулы главного комплекса гистосовместимости (МНС, от англ. major histocompatibility complex) II класса). С помощью этого метода идентифицируют взаимодействия между боковыми цепями аминокислот вариабельного домена и специфическими «карманами» и связывающими желобками молекул МНС II класса. Идентифицированные иммуногенные участки подвергают мутации для устранения иммуногенности. Данные способы описаны, например, в WO 98/52976.
Термин "гуманизированный вариант" в данном описании обозначает вариабельный домен антитела, сконструированный на основе участков, определяющих комплементарность (CDR), не являющихся человеческими, например, происходящими от видов, отличных от человека, и каркасных участков (FR) человеческого происхождения, которые подвергли дальнейшей модификации для восстановления или улучшения аффинности и специфичности связывания исходного вариабельного домена, не являющегося человеческим. Такие гуманизированные варианты, как правило, получают при помощи технологий рекомбинантной ДНК. Восстановление аффинности и специфичности родительского вариабельного домена, не являющегося человеческим, является решающим этапом, и в настоящее время для этого применяют различные способы. При одном способе устанавливают целесообразность введения мутаций, т.н. обратных мутаций, в не являющиеся человеческими CDR, а также в человеческие FR. Подходящие позиции для таких обратных мутаций можно идентифицировать, например, при помощи анализа последовательности или гомологии, выбирая человеческую каркасную последовательность (подход с заданной каркасной последовательностью; установление гомологии или метод наилучшего соответствия), используя консенсусные последовательности, выбирая FR из нескольких различных человеческих моноклональных антител (mAbs) или замещая поверхностные остатки, не являющиеся человеческими, остатками, которые чаще всего встречаются в человеческих моноклональных антителах ("изменение поверхности" или "венирование").
Кроме того, антитела по изобретению охватывают антитела, имеющие "консервативные модификации последовательности", нуклеотидные и аминокислотные модификации, которые не влияют или не изменяют указанные выше свойства антитела по изобретению. Модификации можно осуществлять при помощи стандартных методик, известных в области техники, таких как сайт-специфический мутагенез и мутагенез при помощи ПЦР. Консервативные аминокислотные замены представляют собой замены, при которых аминокислотный остаток замещается аминокислотным остатком, имеющим схожую боковую цепь. В области техники известны семейства аминокислотных остатков, имеющих схожие боковые цепи. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, аминокислотный остаток человеческого антитела к CSF-1R, который предположительно является несущественным, можно заменить на другой аминокислотный остаток с боковой цепью из того же семейства.
Аминокислотные замены можно осуществлять при помощи мутагенеза, основанного на молекулярном моделировании, как описано Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327 и Queen, С., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033.
Рецептор CSF-1 (CSF-1R; синонимы: рецептор M-CSF; рецептор макрофагального колониестимулирующего фактора 1, ЕС 2.7.10.1, протоонкоген Fms, c-fms, CD115, код в базе данных Swiss Prot Р07333, (SEQ ID NO: 23)) был открыт в 1986 (Coussens, L., et al., Nature 320 (1986) 277-280). CSF-1R представляет собой фактор роста, кодируемый протоонкогеном c-fms (например, см. обзор Roth, P., and Stanley, E.R., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 181 (1992) 141-67).
CSF-1R является рецептором M-CSF (макрофагального колониестимулирующего фактора, также обозначаемого CSF-1) и опосредует биологические эффекты этого цитокина (Sherr, C.J., et al., Cell 41 (1985) 665-676). Клонирование рецептора колониестимулирующего фактора 1 (также обозначаемого c-fms) впервые описано Roussel, M.F., et al., Nature 325 (1987) 549-552. В этой публикации было продемонстрировано, что трансформирующий потенциал CSF-1R зависит от модификаций C-концевой части белка, таких как потеря ингибиторного сайта фосфорилирования по тирозину 969, с которым связывается Cbl и таким образом опосредует отрицательную регуляцию рецептора (Lee, P.S., et al., Embo J. 18(1999) 3616-3628).
-8
-9
В данном документе "связывание с человеческим CSF-1R" обозначает специфическое связывание антитела с человеческим антигеном CSF-1R. Аффинность связывания характеризуется значением KD, равным 1,0×10 моль/л или менее при 35°С, предпочтительно значением KD, равным 1,0×10 моль/л или менее при 35°С. Аффинность связывания определяют при помощи стандартного исследования связывания при 35°С, например, с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса (Biacore) (см. Пример 4).
Термин "эпитоп" обозначает белковую детерминанту, способную специфически связываться с антителом. Эпитопы обычно имеют в своем составе химически активные поверхностные группировки молекул, таких как аминокислоты или углеводные боковые цепочки и, как правило, эпитопы обладают определенной трехмерной структурой, а также определенным зарядом. Конформационные и линейные эпитопы различаются тем, что в отличие от последних, связывание с первыми нарушается в присутствии денатурирующих растворителей. Предпочтительно, антитело по изобретению специфически связывается с нативным, но не с денатурированным CSF-1R.
Термин "связывание с тем же эпитопом, что и у депонированного антитела DSM АСС2920" в данном описании обозначает, что анти-CSF-1R антитело по изобретению связывается с тем же эпитопом CSF-1R, с которым связывается антитело <CSF-1R>9D11.2E8 (депонированное под номером DSM АСС2920). Способность антитела к CSF-1R по данному изобретению связываться с эпитопами можно определить при помощи методов, известных в области техники. Антитело к CSF-1R исследуют при 25°С методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR, от англ. Surface Plasmon Resonance), анализируя конкуренцию антител in vitro для определения способности исследуемого антитела ингибировать связывание антитела <CSF-1R>9D11.2E8 (депонированного под номером DSM АСС2920) с CSF-1R. Исследование можно проводить с использованием прибора BIAcore (Pharmacia Biosensor АВ, Uppsala, Sweden), например, как описано в Примере 5. В Примере 5 выраженный в % уровень предполагаемого связывания предложенного в изобретении антитела к CSF-1R, конкурирующего со связанным антителом <CSF-1R>9D11.2E8 (депонированным под номером DSM АСС2920), рассчитывают по формуле: "100 × относительный ответ (в начале фазы диссоциации) / гМах", где гМах рассчитывают по формуле: "относительный ответ (в конце фазы диссоциации) × молекулярный вес антитела / молекулярный вес антигена", согласно описанию в инструкциях к прибору BIAcore для картирования эпитопов. Минимальный уровень связывания также рассчитывают для пар идентичных антител 1 и 2 (см. Пример 5). Полученное при этом максимальное значение + 50% принимают за пороговый уровень, выше которого конкуренцию и, следовательно, связывание с этим же эпитопом считают значимыми (см. Пример 5, где рассчитанный пороговый уровень для антитела <CSF-1R>9D11.2E8 составляет 8+4=12). Таким образом, у антитела, связывающегося с человеческим CSF-1R, отличающегося тем, что оно "связывается с тем же эпитопом, что и <CSF-1R>9D11.2E8 (депонированное под номером DSM АСС2920)", уровень предполагаемого связывания, выраженный в %, составляет менее 12% (уровень предполагаемого связывания в % <12).
L
H
«Вариабельный домен» (вариабельный домен легкой цепи (V), вариабельный домен тяжелой цепи (V)) в данном документе обозначают домен каждой из двух легких и тяжелых цепей, непосредственно участвующий в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены легкой цепи и тяжелой цепи имеют схожую общую структуру, и каждый домен содержит четыре каркасных участка (FR), последовательности которых являются высоко консервативными, связанных с тремя «гипервариабельными участками» (или участками, определяющими комплементарность, CDR, от англ. complementary determining regions). Каркасные участки имеют конформацию β-слоя, а CDR могут формировать петли, соединяющие β-слои. Трехмерная структура CDR каждой цепи поддерживается при помощи каркасных участков, а вместе с CDR другой цепи они формируют антиген-связывающий сайт. Участки CDR3 тяжелой и легкой цепей антитела имеют особенно важную роль для специфичности/аффинности связывания антитела по изобретению и, таким образом, представляют собой следующий объект изобретения.
Термин "антиген-связывающая часть антитела" в данном документе обозначает аминокислотные остатки антитела, отвечающие за связывание антигена. Антиген-связывающая часть антитела содержит аминокислотные остатки «участков, определяющих комплементарность», или «CDR». «Каркасные участки», или «FR» согласно данному описанию представляют собой участки вариабельных доменов, отличные от остатков гипервариабельных участков. Таким образом, легкая и тяжелая цепи антитела содержат в направлении от N-конца к С-концу следующие домены: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. В частности, CDR3 тяжелой цепи является участком, который вносит наибольший вклад в связывание антигена и определяет свойства антитела. Участки CDR и FR определяют в соответствии со стандартной системой определения Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) и/или по остаткам в составе «гипервариабельных петель".
Термины "нуклеиновая кислота" или "молекула нуклеиновой кислоты" в данном документе охватывают молекулы ДНК и молекулы РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двуцепочечной, но предпочтительно является двуцепочечной молекулой ДНК.
Термин "аминокислота" в данном описании обозначает группу карбокси-альфа-аминокислот естественного происхождения, включая аланин (трехбуквенный код: ala, однобуквенный код: А), аргинин (arg, R), аспарагин (asn, Ν), аспарагиновую кислоту (asp, D), цистеин (cys, С), глутамин (gln, Q), глутаминовую кислоту (glu, Ε), глицин (gly, G), гистидин (his, Η), изолейцин (ile, I), лейцин (leu, L), лизин (lys, K), метионин (met, M), фенилаланин (phe, F), пролин (pro, P), серии (ser, S), треонин (thr, T), триптофан (trp, W), тирозин (tyr, Y) и валин (val, V).
Следующее воплощение изобретения представляет собой способ получения предложенного в данном изобретении антитела, направленного против человеческого CSF-1R, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь человеческого антитела класса IgG1, связывающегося с человеческим CSF-1R, и нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь человеческого антитела, встраивают в экспрессирующий вектор, указанный вектор встраивают в эукариотическую клетку-хозяина, кодируемый белок экспрессируют и выделяют из клетки-хозяина или из надосадочной жидкости.
Антитела по изобретению предпочтительно получают рекомбинантными способами. Такие способы хорошо известны в области техники и включают экспрессию белков в прокариотических и эукариотических клетках с последующим выделением полипептида антитела и, как правило, с очисткой до фармацевтически приемлемой степени чистоты. Для экспрессии белка нуклеиновые кислоты, кодирующие легкую и тяжелую цепи или их фрагменты, встраивают в экспрессирующие векторы при помощи стандартных способов. Экспрессию осуществляют в соответствующих прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах, таких как клетки СНО, клетки NS0, клетки SP2/0, клетки HEK293, клетки COS, клетки дрожжей или клетки Е. coli, а антитело выделяют из клеток (из надосадочной жидкости или из клеток после лизиса).
Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих аминокислотные последовательности вариантов антител к CSF-1R, получают при помощи различных способов, известных в области техники. Данные способы включают, но не ограничиваются выделением из природных источников (в случае вариантов аминокислотных последовательностей естественного происхождения) или проведением олигонуклеотид-направленного (или сайт-специфического) мутагенеза, мутагенеза при помощи ПЦР и кассетного мутагенеза полученной ранее вариантной или нонвариантной версии гуманизированного антитела к CSF-1R.
Вариабельные домены тяжелой и легкой цепей согласно изобретению объединяют с последовательностями промотора, инициации трансляции, константного участка, 3ʹ нетранслируемого участка, полиаденилирования и терминации транскрипции с получением конструкций экспрессирующего вектора. Конструкции, экспрессирующие тяжелую и легкую цепи, можно объединять в составе одного вектора, трансфецировать совместно, трансфецировать последовательно или трансфецировать по-отдельности клетки-хозяева, которые затем подвергают слиянию с получением одной клетки-хозяина, экспрессирующей обе цепи.
Рекомбинантная продукция антител хорошо известна в области техники и описана, например, в обзорных статьях Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880.
Антитела могут находиться в целых клетках, в клеточном лизате, в частично очищенном или по существу чистом виде. Очистку проводят для удаления других клеточных компонентов или других примесей, например, других нуклеиновых кислот или белков клетки, при помощи стандартных методик, таких как обработка щелочами/ДСН, центрифугирование в градиенте CsCl, колоночная хроматография, электрофорез в агарозном геле и других методик, хорошо известных в области техники. См. Ausubel, F., et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987).
Экспрессия в клетках NS0 описана, например, Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123 и Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270. Транзиторная экспрессия описана, например, Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9. Клонирование вариабельных доменов описано Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289 и Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87. Предпочтительная система для транзиторной экспрессии (HEK 293) описана Schlaeger, E.-J., and Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83 и by Schlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199.
Контролирующие последовательности, которые можно применять для прокариот, включают, например, последовательность промотора, возможно последовательность оператора и сайт связывания рибосом. Известно, что эукариотические клетки используют промоторы, энхансеры и сигналы полиаденилирования.
Нуклеиновая кислота является "функционально связанной", когда она находится в функциональной связи с другой нуклеотидной последовательностью. Например, ДНК пре-последовательности или лидерной последовательности секретируемого пептида функционально связана с ДНК полипептида, если при ее экспрессии образуется пре-белок, участвующий в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связаны с кодирующей последовательностью, если они влияют на транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосом функционально связан с кодирующей последовательностью, если он располагается таким образом, что способствует трансляции. Как правило, понятие "функционально связаны" означает, что последовательности ДНК, будучи связаны, являются смежными, а в случае лидерной последовательности, являются смежными и находятся в рамке считывания. Однако, энхансеры не обязательно должны быть смежными. Связывание осуществляют путем лигирования по подходящим сайтам рестрикции. Если таких сайтов не существует, то в соответствии со стандартными методами применяют синтетические олигонуклеотидные адапторы или линкеры.
Моноклональные антитела легко выделяются из культуральной среды при помощи стандартных методов очистки иммуноглобулинов, например, таких как, хроматография на сефарозе с белком А, хроматография на гидроксиапатите, электрофорез в геле, диализ или аффинная хроматография. ДНК и РНК, кодирующие моноклональные антитела, легко выделяются и секвенируются с применением стандартных методов. Источником такой ДНК и РНК могут служить клетки гибридом. После выделения ДНК может быть встроена в экспрессирующие векторы, которыми затем трансфецируют клетки-хозяева, такие как клетки HEK 293, клетки CHO или клетки миеломы, которые без этого не продуцируют белок иммуноглобулина, для осуществления синтеза рекомбинантных моноклональных антител в клетках-хозяевах.
В данном документе выражения "клетка", "клеточная линия" и "клеточная культура" используются взаимозаменяемо и все эти обозначения охватывают потомство клеток. Так, термины "трансформанты" и "трансформированные клетки" охватывают первичные клетки и полученные из них культуры, независимо от числа пассажей. Следует понимать, что все потомство может не быть абсолютно идентичным по содержанию ДНК, вследствие неслучайных или случайных мутаций. Термины также охватывают варианты потомства, обладающие такой же функцией или биологической активностью, которая была определена при скрининге у исходно трансформированной клетки.
"Fc часть" антитела не участвует непосредственно в связывании антитела с антигеном, но опосредует различные эффекторные функции. Термин "Fc часть антитела", основанный на расщеплении антител папаином, хорошо известен специалистам. В зависимости от аминокислотной последовательности константного участка тяжелых цепей антитела подразделяются на классы: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, а некоторые из них могут дальше подразделяться на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, IgA1 и IgA2. В зависимости от строения константных участков тяжелые цепи различных классов иммуноглобулинов соответственно обозначаются α, δ, ε, γ и μ. Fc часть антитела непосредственно задействована в антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC, от англ. antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) и комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC, от англ. complement-dependent cytotoxicity), в основе которых лежит активация комплемента, связывание C1q и связывание Fc рецептора. Активация комплемента (CDC) запускается при связывании компонента комплемента C1q с Fc частью антител большинства подклассов IgG. Тогда как влияние антитела на систему комплемента зависит от определенных условий, связывание с C1q определяется некоторыми сайтами связывания в составе Fc части. Такие сайты связывания известны в области техники и описаны, например, Boackle, R.J., et al., Nature 282 (1979) 742-743, Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560, Brunhouse, R. and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917, Burton et al., Nature 288 (1980) 338-344, Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004, Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184, Hezareh, M., et al., J. Virology 75 (2001) 12161-12168, Morgan, Α., et al., Immunology 86 (1995) 319-324, EP 0307434. Такими сайтами связывания являются, например, L234, L235, D270, N297, Е318, K320, K322, Р331 и Р329 (нумерация согласно системе EU index по Kabat, Е.А., см. ниже). Антитела подклассов IgG1, IgG2 и IgG3 как правило вызывают активацию комплемента, а также связывание C1q и С3, тогда как IgG4 не вызывают активации системы комплемента и не связывают C1q и С3.
В одном воплощении антитело по изобретению содержит Fc часть, имеющую человеческое происхождение, и предпочтительно все другие части константных участков человеческого происхождения. В данном описании термин "Fc часть, имеющая человеческое происхождение" обозначает Fc часть, которая представляет собой Fc часть человеческого антитела подкласса IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, предпочтительно Fc часть человеческого IgG1, мутированную Fc часть человеческого IgG1 (предпочтительно с мутациями L234A + L235A), Fc часть человеческого IgG4 или мутированную Fc часть человеческого IgG4 (предпочтительно с мутацией S228P). Наиболее предпочтительными являются константные участки тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 19 (IgG1 человека), SEQ ID NO: 20 (IgG1 человека с мутациями L234A и L235A), SEQ ID NO: 21 (IgG4 человека) или SEQ ID NO: 22 (IgG4 человека с мутацией S228P).
В одном воплощении антитело по изобретению отличается тем, что его константные участки имеют человеческое происхождение. Такие константные участки хорошо известны в области техники и описаны, например Kabat, Е.А., (см., например, Johnson, G. and Wu, Т.Т., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218). Например, подходящий человеческий константный участок тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 17. Например, подходящий человеческий константный участок легкой цепи содержит аминокислотную последовательность константного участка легкой каппа-цепи согласно SEQ ID NO: 18. Предпочтительно, чтобы антитело имело мышиное происхождение и включало рамку последовательности вариабельных участков мышиного антитела согласно Kabat.
Изобретение относится к способу лечения пациента, нуждающегося в терапии, отличающемуся введением пациенту терапевтически эффективного количества антитела по изобретению.
Изобретение относится к применению антитела по изобретению в терапевтических целях.
Таким образом, антитела по изобретению, связывающиеся с тем же эпитопом, способны ингибировать клеточную пролиферацию CSF-1-лиганд-зависимых и CSF-1-лиганд-независимых клеток. В частности, антитела к CSF-1R по данному изобретению можно применять для лечения опосредованных CSF-1R заболеваний, которые являются CSF-1-лиганд-зависимыми и CSF-1-лиганд-независимыми. Это означает, что опосредованное CSF1-R заболевание либо зависит от лиганда CSF-1 и соответствующего сигнального пути CSF-1R и/или не зависит от лиганда CSF-1 и соответствующего сигнального пути CSF-1R. Предполагают, что сигнальный путь CSF-1R опосредует рост опухолей и метастазирование.
Одно воплощение изобретения представляет собой антитела к CSF-1R по данному изобретению для применения в лечении "опосредованных CSF-1R заболеваний" или антитела к CSF-1R по данному изобретению для применения в изготовлении лекарственного препарата для лечения "опосредованных CSF-1R заболеваний", которые можно описать следующим образом.
Предполагают 3 различных механизма, связывающих сигнальный путь CSF-1R с ростом и метастазированием опухолей. Первый механизм основан на том, что экспрессия лиганда и рецептора CSF была обнаружена в опухолевых клетках органов женской репродуктивной системы (молочной железы, яичников, эндометрия, матки) (Scholl, S.M., et al., J. Natl. Cancer Inst. 86 (1994) 120-126; Kacinski, B.M., Mol. Reprod. Dev. 46 (1997) 71-74; Ngan, H.Y., et al., Eur. J. Cancer 35 (1999) 1546-1550; Kirma, N., et al., Cancer Res 67 (2007) 1918-1926) и экспрессия ассоциировалась с ростом ксенотрансплантатов опухоли молочной железы, а также с неблагоприятным прогнозом у пациентов с раком молочной железы. В одном исследовании приблизительно у 10-20% пациентов с острым миелоцитарным лейкозом, хроническим миелоцитарным лейкозом и миелодисплазией были обнаружены две точечные мутации в составе CSF-1R, а одна из мутаций приводила к нарушению жизненного цикла рецептора (Ridge, S.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 87 (1990) 1377-1380). Однако в последующих исследованиях частота мутаций не подтвердилась (Abu-Duhier, F.M., et al., Br. J. Haematol. 120 (2003) 464-470). Мутации были также обнаружены в некоторых случаях при гепатоцеллюлярной карциноме (Yang, D.H., et al., Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int. 3 (2004) 86-89) и идиопатическом миелофиброзе (Abu-Duhier, F.M., et al., Br. J. Haematol. 120 (2003) 464-470).
Пигментный виллонодулярный синовит (ПВНС) и теносиновиальные гигантоклеточные опухоли (ТГКО) могут развиваться вследствие транслокации, которая приводит к слиянию гена M-CSF и гена коллагена COL6A3 и в результате приводит к сверхэкспрессии M-CSF (West, R.B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 690-695). Предполагают, что эффект «ландшафта» связан с формированием опухолевой массы, состоящей из моноцитов, привлекаемых клетками, экспрессирующими M-CSF. ТГКО представляют собой более мелкие опухоли, которые относительно легко поддаются удалению с пальцев, места их преимущественной локализации. ПВНС представляет собой более агрессивное заболевание, поскольку поражает крупные суставы и достаточно плохо поддается хирургическому лечению.
Второй механизм основан на блокировании сигнального пути M-CSF/CSF-1R в очагах метастазирования в костной ткани, запускающего остеокластогенез, резорбцию кости и остеолиз. Рак молочной железы, множественная миелома и рак легкого являются примерами рака, при которых метастазы распространяются в костную ткань и происходит остеолитическое поражение костной ткани, приводящее в результате к костным осложнениям. M-CSF, высвобождаемый опухолевыми клетками и стромой, совместно с лигандом рецептора-активатора ядерного фактора каппа-В (RANKL, от англ. receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand) индуцирует дифференцировку гемопоэтических предшественников клеток миелоидно-моноцитарного ряда в зрелые остеокласты. В ходе данного процесса М-CSF выступает как пермиссивный фактор, подающий остеокластам сигнал на выживание (Tanaka, S., et al., J. Clin. Invest. 91 (1993) 257-263). Ингибирование активности CSF-1R в ходе дифференцировки и созревания остеокластов с помощью антитела к CSF-1R возможно предупреждает нарушение регуляции активности остеокластов, которая вызывает остеолитическое поражение кости и ассоциированные с ней костные осложнения при метастатическом процессе. Если рак молочной железы, рак легкого и множественная миелома, как правило, приводят к остеолитическим поражениям, костные метастазы при раке предстательной железы изначально имеют остеобластический характер, при этом усиление формирующей костную ткань активности приводит к формированию "незрелой" грубоволокнистой кости, которая отличается от нормальной кости, имеющей типичную ламеллярную структуру. При прогрессировании заболевания в костных поражениях присутствует выраженная остеолитическая составляющая и наблюдается высокий сывороточный уровень маркеров резорбции кости, что позволяет предположить, что антирезорбтивная терапия может оказаться целесообразной. Было показано, что бифосфонаты ингибируют образование остеолитических поражений и снижают частоту костных осложнений только у мужчин с гормоно-резистентным метастатическим раком предстательной железы, но на данный момент сведения об их влиянии на остеобластические процессы противоречивы и в настящее время у бифосфонатов не была продемонстрирована способность предупреждать метастазирование в костную ткань или гормоно-чувствительный рак предстательной железы. Эффект антирезорбтивных агентов в клинической практике при смешанной остеолитической/остеобластической форме рака предстательной железы продолжают изучать (Choueiri, Μ.В., et al., Cancer Metastasis Rev. 25 (2006) 601-609; Vessella, R.L. and Corey, E., Clin. Cancer Res. 12 (20 Pt 2) (2006) 6285s-6290s).
Третий механизм предложен на основании обнаруженной корреляции между выявлением опухоль-ассоциированных макрофагов (ОАМ) в солидных опухолях и неблагоприятным прогнозом при раке молочной железы, предстательной железы, яичников и шейки матки (Bingle, L., et al., J. Pathol. 196 (2002) 254-265; Pollard, J.W., Nat. Rev. Cancer 4 (2004) 71-78). Мобилизация макрофагов в опухоль происходит под действием M-CSF и других хемокинов. Макрофаги могут впоследствии способствовать прогрессированию опухоли за счет секреции ангиогенных факторов, протеаз и других факторов роста и цитокинов, а ингибирование сигнального пути CSF-1R может подавлять их активность. Недавно Zins et al. (Zins, K., et al., Cancer Res. 67 (2007) 1038-1045), продемонстрировали на модели с использованием ксенотрансплантатов у мышей, что экспрессия siRNA фактора некроза опухоли альфа (ФНО альфа), M-CSF или их обоих подавляет рост опухоли после внутриопухолевой инъекции соответствующей siRNA на 34%-50%. Адресное воздействие SiRNA на ФНО альфа, секретируемый человеческими клетками SW620, приводило к снижению уровня M-CSF у мышей и к снижению количества макрофагов в опухоли. Кроме того, воздействие антиген-связывающего фрагмента, направленного против M-CSF, на ксенотрансплантаты опухоли MCF7 подавляло рост опухоли на 40%, устраняло резистентность к химиотерапии и улучшало выживаемость мышей при введении в комбинации с химиотерапией (Paulus, P., et al., Cancer Res. 66 (2006) 4349-4356).
ОАМ представляют собой только один пример обнаруженной взаимосвязи между хроническим воспалением и раком. Существуют дополнительные свидетельства наличия связи между воспалением и раком, поскольку многие хронические заболевания ассоциированы с повышенным риском возникновения рака, опухоли развиваются в очагах хронического воспаления, химические медиаторы воспаления обнаруживаются при многих видах рака; устранение клеточных или химических медиаторов воспаления подавляет возникновение злокачественных новообразований в эксперименте, а долгосрочное применение противовоспалительных агентов снижает риск развития некоторых форм рака. Связь с раком выявлена у ряда воспалительных состояний, среди них можно упомянуть гастрит, вызванный Н. pylori, и рак желудка, шистосомоз и рак мочевого пузыря, вирус герпеса человека и саркому Капоши, эндометриоз и рак яичников, а также простатит и рак предстательной железы (Balkwill, F., et al., Cancer Cell 7 (2005) 211-217). Макрофаги являются ключевыми клетками при хроническом воспалении и реагируют различным образом на микроокружение. Существует два типа макрофагов с диаметрально противоположным функциональным фенотипом. М1 макрофаги задействованы в реакциях 1 типа. Эти реакции включают активацию под влиянием продуктов, выделяемых микроорганизмами, и последующее уничтожение патогенных микроорганизмов, сопровождающееся образованием активных форм кислорода. На другом конце спектра находятся М2 макрофаги, задействованные в реакциях 2 типа, которые способствуют пролиферации клеток, регулируют воспалительные реакции и адаптивный иммунный ответ и способствуют ремоделированию ткани, ангиогенезу и репарации (Mantovani, Α., et al., Trends Immunol. 25 (2004) 677-686). Хроническое воспаление, ведущее к возникновению новообразований, как правило ассоциировано с М2 макрофагами. Важнейшим цитокином, опосредующим реакции воспаления, является ФНО альфа, который, оправдывая свое название, может не только стимулировать противоопухолевый иммунитет и геморрагический некроз в высоких концентрациях, но и, как было недавно обнаружено, экспрессируется опухолевыми клетками и выполняет роль стимулятора опухолевого роста (Zins, K., et al., Cancer Res. 67 (2007) 1038-1045; Balkwill, F., Cancer Metastasis Rev. 25 (2006) 409-416). Специфическая роль макрофагов по отношению к опухолям требует дальнейшего изучения, в том числе исследования возможной пространственной и временной зависимости от их функции и значимости для определенных типов опухолей.
Таким образом, одно воплощение изобретения представляет собой антитела к CSF-1R по данному изобретению для применения в лечении рака. Термин "рак" в данном документе например, может обозначать рак легкого, немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ), бронхоальвеолярный рак легкого, рак костей, рак поджелудочной железы, рак кожи, раковые образования головы или шеи, меланому кожи или внутриглазную меланому, рак матки, рак яичников, рак прямой кишки, рак анальной зоны, рак желудка, рак ЖКТ, рак толстого кишечника, рак молочной железы, рак матки, карциному фаллопиевых труб, карциному эндометрия, карциному шейки матки, карциному влагалища, карциному вульвы, болезнь Ходжкина, рак пищевода, рак тонкого кишечника, опухоли эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечников, саркому мягких тканей, рак уретры, рак полового члена, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак почки или мочеточника, почечно-кпеточную карциному, карциному почечной лоханки, мезотелиому, гепатоцеллюлярный рак, рак желчного пузыря, новообразования центральной нервной системы (ЦНС), опухоли позвоночника, глиому ствола мозга, мультиформную глиобластому, астроцитомы, шванномы, эпендимомы, медуллобластомы, менингиомы, плоскоклеточные карциномы, аденому гипофиза, лимфому, лимфоцитарный лейкоз, включая рефрактерные формы любого из видов рака, указанных выше, или сочетание одного или более видов рака, указанных выше. Предпочтительно, рак представляет собой рак молочной железы, рак яичников, рак шейки матки, рак легкого или рак предстательной железы. Предпочтительно, рак также характеризуется экспрессией или сверхэкспрессией CSF-1 или CSF-1R. Одно из следующих воплощений изобретения представляет собой антитела к CSF-1R по настоящему изобретению для применения для одновременного лечения первичных опухолей и новых метастазов.
Таким образом, следующее воплощение изобретения представляет собой антитела к CSF-1R по данному изобретению для применения в лечении периодонтита, гистиоцитоза X, остеопороза, болезни Педжета (костей), потери костной ткани вследствие лечения рака, перипротезного остеолиза, глюкокортикоид-индуцированного остеопороза, ревматоидного артрита, псориатического артрита, остеоартрита, воспалительного артрита и воспаления.
Rabello, D., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 347 (2006) 791-796 продемонстрировали положительную ассоиацию однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) гена CSF1 с агрессивным периодонтитом: воспалительным заболеванием тканей периодонта, приводящим к потере зубов вследствие резорбции альвеолярной кости.
Гистиоцитоз X (также обозначаемый гистиоцитоз клеток Лангерганса, ГКЛ) представляет собой пролиферативное заболевание дендритных клеток Лангерганса, которые дифференцируются в остеокласты в костях и внекостных очагах ГКЛ. Клетки Лангерганса происходят из циркулирующих моноцитов. Было обнаружено, что повышенный уровень M-CSF, выявляемый в сыворотке и в очагах поражения, коррелирует с тяжестью заболевания (da Costa, С.Е., et al., J. Exp. Med. 201 (2005) 687-693). Заболевание возникает преимущественно в детском возрасте и требует проведения химиотерапии, когда заболевание становится системным или рецидивирует.
Патофизиология остеопороза связана с уменьшением количества остеобластов, образующих костную ткань, и повышенной резорбцией кости, опосредуемой остеокластами. Дополнительные данные были представлены Cenci et al, которые показали, что инъекция антитела к M-CSF позволяет сохранить плотность костной ткани и подавляет резорбцию кости у мышей после овариэктомии (Cenci, S., et al., J. Clin. Invest. 105 (2000) 1279-1287). Недавно была установлена возможная связь между потерей костной ткани в постменопаузе вследствие недостатка эстрогенов и было обнаружено, что присутствие Т-клеток, продуцирующих ФНО альфа, оказывает влияние на метаболизм костной ткани (Roggia, С., et al., Minerva Med. 95 (2004) 125-132). Возможный механизм может представлять собой индукцию M-CSF под воздействием ФНО альфа in vivo. Важное значение M-CSF для индуцированного ФНО альфа остеокластогенеза подтверждается влиянием антитела, направленного против M-CSF, блокирующего индуцированный ФНО альфа остеолизис у мышей и, таким образом, делая ингибиторы сигнального пути CSF-1R потенциальными мишенями при воспалительном артрите (Kitaura, Η., et al., J. Clin. Invest. 115 (2005) 3418-3427).
Болезнь Педжета (кости) представляет собой второе по распространенности нарушение костного метаболизма после остеопороза, при котором наличие очагов повышенного ремоделирования кости приводит к таким осложнениям, как боли в костях, деформации, патологические переломы и глухота. Идентифицировали мутации четырех генов, регулирующих нормальную функцию остеокластов, которые предрасполагают индивидов к болезни Педжета и ассоциированным нарушениям: инсерции гена TNFRSF11A, кодирующего рецептор-активатор ядерного фактора каппа-В (RANK, от англ. receptor activator of nuclear factor kappa В) - важный регулятор функции остеокластов, инактивирующие мутации гена TNFRSF11B, кодирующего остеопротегерин (рецептор-ловушку лиганда RANK), мутации гена, кодирующего sequestosome 1 (SQSTM1), важный каркасный белок сигнального пути NFkappaB, и мутации гена валозин-содержащего белка (ВСБ). Данный ген кодирует ВСБ, играющий роль в направленной доставке ингибитора NFkappaB к протеасомам для деградации (Daroszewska, A. and Ralston, S.H., Nat. Clin. Pract. Rheumatol. 2 (2006) 270-277). Адресное ингибиторование CSF-1R препятствует нарушению регуляции сигнального пути RANKL опосредованным путем и обеспечивает дополнительный способ лечения к применяющимся в настоящее время бифосфонатам.
Индуцированная противоопухолевой терапией потеря костной ткани, в частности, у пациентов с раком молочной железы и раком предстательной железы представляет собой дополнительное показание к лечению, при котором адресное ингибирование CSF-1R может предотвратить потерю костной ткани (Lester, J.Ε., et al., Br. J. Cancer 94 (2006) 30-35). Адьювантная терапия улучшает прогноз при начальных стадиях рака молочной железы, но может иметь отдаленные последствия, поскольку некоторые виды терапии, включая химиотерапию, лучевую терапию, лечение ингибиторами ароматазы и абляцию яичников, влияют на костный метаболизм, вызывая понижение минеральной плотности костной ткани, что в результате приводит повышенному риску развития остеопороза и связанных с ним переломов (Lester, J.Ε., et al., Br. J. Cancer 94 (2006) 30-35). Эквивалентом адъювантной терапии ингибиторами ароматазы при раке молочной железы является андрогенная абляция при раке предстательной железы, которая вызывает снижение минеральной плотности костной ткани и значительно повышает риск переломов, связанных с остеопорозом (Stoch, S.A., et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 86 (2001) 2787-2791).
Предполагают, что направленное ингибирование сигнального пути CSF-1R может иметь благоприятный эффект и при других показаниях к лечению, когда типы клеток, на которые направлено воздействие, представляют собой остеокласты и макрофаги, например, при лечении определенных осложнений замены суставов вследствие ревматоидного артрита. Неприживление импланта вследствие потери костной ткани в перипротезной области и последующее отторжение протеза является серьезным осложнением при замене сустава и требует повторных хирургических вмешательств и больших социально-экономических расходов, касающихся как отдельных пациентов, так и системы здравоохранения в целом. В настоящее время не существует одобренных для применения лекарственных препаратов, позволяющих предотвратить или подавить перипротезный остеолиз (Drees, P., et al., Nat. Clin. Pract. Rheumatol. 3 (2007) 165-171).
Глюкокортикоид-индуцированный остеопороз (ГИО) представляет собой еще одно показание к применению, при котором ингибитор CSF-1R может предотвратить потерю костной ткани вследствие долговременного применения глюкокортикоидов, назначаемых при различных патологических состояниях, среди которых можно упомянуть хроническую обструктивную болезнь легких, астму и ревматоидный артрит (Guzman-Clark, J.R., et al., Arthritis Rheum. 57 (2007) 140-146; Feldstein, A.C., et al., Osteoporos. Int. 16 (2005) 2168-2174).
Ревматоидный артрит, псориатический артрит и воспалительный артрит сами по себе являются возможными показаниями к применению для ингибиторов сигнального пути CSF-1R, поскольку они включают макрофагальный компонент и характеризутся различной степенью разрушения костной ткани (Ritchlin, С.Т., et al., J. Clin. Invest. 111 (2003) 821-831). Остеоартрит и ревматоидный артрит явлются воспалительными аутоиммунными заболеваниями, вызванными накоплением макрофагов в соединительной ткани и инфильтрацией макрофагов в синовиальную жидкость, что по меньшей мере отчасти опосредовано M-CSF. Campbell, I.K., et al., J. Leukoc. Biol. 68 (2000) 144-150, продемонстрировали, что in vitro M-CSF продуцируют клетки ткани суставов человека (хондроциты, синовиальные фибробласты) и он обнаруживается в синовиальной жидкости пациентов с ревматоидным артритом, что позволяет предположить его участие в пролиферации синовиальной ткани и инфильтрации макрофагами, связанных с патогенезом заболевания. Предполагают, что ингибирование сигнального пути CSF-1R позволяет контролировать количество макрофагов в суставах и облегчать боль, связанную с разрушением костной ткани. Специфическое ингибирование CSF-1R без направленного воздействия на множество других киназ, таких как Raf-киназа, представляет собой один из способов минимизации побочного действия и более глубокого понимания роли сигнального пути CSF-1R при этих показаниях к лечению.
В недавно опубликованных обзорах литературы показана корреляция повышенного уровня циркулирующего M-CSF с неблагоприятным прогнозом и прогрессированием атеросклероза при хронической ишемической болезни сердца (Saitoh, Т., et al., J. Am. Coll. Cardiol. 35 (2000) 655-665; Ikonomidis, I., et al., Eur. Heart. J. 26 (2005) p. 1618-1624); M-CSF влияет на атеросклеротический процесс, способствуя формированию пенистых клеток (макрофаги, поглотившие окисленные ЛПНП), экспрессирующих CSF-1R и представляющих собой бляшки на ранних стадиях (Murayama, Т., et al., Circulation 99 (1999) 1740-1746).
В активированных клетках микроглии наблюдается экспрессия и сигнализация M-CSF и CSF-1R. Микроглия, представленная резидентными макрофагами центральной нервной системы, может активироваться при различных повреждениях, включая вызванные инфекцией и травматические повреждения. М-CSF считается ключевым регулятором воспалительных ответов в мозге, уровень М-CSF повышается при ВИЧ-1, энцефалитах, болезни Альцгеймера (БА) и опухолях мозга. Микроглиоз как следствие аутокринной сигнализации M-CSF/CSF-1R в результате приводит к индукции воспалительных цитокинов и высвобождению оксида азота, как продемонстрировано, например, с использованием экспериментальной модели повреждения нейронов (Нао, A.J., et al., Neuroscience 112 (2002) 889-900; Murphy, G.M., Jr., et al., J. Biol. Chem. 273 (1998) 20967-20971)., Повышенная экспрессия CSF-1R обнаружена в микроглии, окружающей бляшки, при БА, а также в модели БА на трансгенных мышах, несущих мутацию V717F в гене белка-предшественника амилоида (Murphy, G.M., Jr., et al., Am. J. Pathol. 157 (2000) 895-904). С другой стороны, у мышей ор/ор, имевших меньшее количество клеток микрогии в мозге, наблюдались фибрилярные отложения амилоида бета и потеря нейронов в сравнении с нормальными контрольными животными, что позволяло предположить, что микроглия обладает нейропротективной функцией при развитии БА, отсутствующей у мышей op/op (Kaku, Μ., et al., Brain Res. Brain Res. Protoc. 12 (2003) 104-108).
Экспрессия и сигнализация M-CSF и CSF-1 R ассоциированы с воспалительными заболеваниями кишечника (В3К) (WO 2005/046657). Термин "воспалительные заболевания кишечника" обозначает серьезные хронические нарушения деятельности кишечника, характеризующиеся хроническим воспалением в различных участках желудочно-кишечного тракта, и в частности включает язвенный колит (ЯК) и болезнь Крона.
Изобретение относится к антителу, отличающемуся тем, что оно представляет собой антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R, отличающееся способностью связывать указанные выше эпитопы или, в альтернативном случае, отличающееся указанными выше аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей, для лечения рака.
Изобретение относится к антителу, отличающемуся тем, что оно представляет собой антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R, отличающееся способностью связывать указанные выше эпитопы или, в альтернативном случае, отличающееся указанными выше аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей, для лечения потери костной ткани.
Изобретение относится к антителу, отличающемуся тем, что оно представляет собой антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R, отличающееся способностью связывать указанные выше эпитопы или, в альтернативном случае, отличающееся указанными выше аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей, для предупреждения или лечения метастазов.
Изобретение относится к антителу, отличающемуся тем, что оно представляет собой антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R, отличающееся способностью связывать указанные выше эпитопы или, в альтернативном случае, отличающееся указанными выше аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей, для лечения воспалительных заболеваний.
Изобретение относится к антителу, отличающемуся тем, что оно представляет собой антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R, отличающееся способностью связывать указанные выше эпитопы или, в альтернативном случае, отличающееся указанными выше аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей, для лечения рака или, в альтернативном случае, для изготовления лекарственного препарата для лечения рака.
Изобретение относится к применению антитела, отличающегося тем, что оно представляет собой антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R, отличающееся способностью связывать указанные выше эпитопы или, в альтернативном случае, отличающееся указанными выше аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей, для лечения потери костной ткани или, в альтернативном случае, для изготовления лекарства для лечения потери костной ткани.
Изобретение относится к применению антитела, отличающегося тем, что оно представляет собой антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R, отличающееся способностью связывать указанные выше эпитопы или, в альтернативном случае, отличающееся указанными аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей, для предупреждения или лечения метастазов или, в альтернативном случае, для изготовления лекарства для предупреждения или лечения метастазов.
Изобретение относится к применению антитела, отличающегося тем, что оно представляет собой антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R, отличающееся способностью связывать указанные выше эпитопы или, в альтернативном случае, отличающееся указанными аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей, для лечения воспалительных заболеваний или, в альтернативном случае, для изготовления лекарства для лечения воспалительных заболеваний.
В одном воплощении антитело по изобретению обладает одним или несколькими из следующих свойств:
a) ингибирование роста клеток NIH3T3, экспрессирующих рекомбинантный CSF-1R дикого типа, на 90% или более при концентрации антитела 10 мкг/мл (см. Пример 2);
b) ингибирование роста клеток NIH3T3, экспрессирующих рекомбинантный CSF-1R с мутациями L301S и Y969F, на 60% или более при концентрации антитела 10 мкг/мл (см. Пример 2);
c) ингибирование взаимодействия CSF-1/CSF-1R (например, характеризующееся значением IC50, равным 15 нг/мл или ниже, см. Пример 3);
d) ингибирование CSF-1-индуцированного фосфорилирования CSF-1R у клеток NIH3T3, экспрессирующих рекомбинантный CSF-1R дикого типа (например, характеризующееся значением IC50, равным 80 нг/мл или ниже, см. Пример 4);
e) ингибирование роста опухолевых клеток BeWo (например, на 80% или более, при концентрации антитела 10 мкг/мл, см. Пример 7);
f) ингибирование дифференцировки макрофагов (например, характеризющееся значением IC50, равным 0,8 нМ или ниже, см. Пример 8).
В одном аспекте изобретение относится к антителу, связывающемуся с человеческим CSF-1R, причем антитело связывается с тем же эпитопом, как и депонированное антитело DSM АСС2920, причем антитело обладает одним или более из следующих свойств:
a) ингибирование роста клеток NIH3T3, экспрессирующих рекомбинантный CSF-1R дикого типа, на 90% или более при концентрации антитела 10 мкг/мл (см. Пример 2);
b) ингибирование роста клеток NIH3T3, экспрессирующих рекомбинантный CSF-1R с мутациями L301S и Y969F, на 60% или более при концентрации антитела 10 мкг/мл (например, см. Пример 2);
c) ингибирование взаимодействия CSF-1/CSF-1R (например, характеризующееся значением IC50, равным 15 нг/мл или ниже, см. Пример 3);
d) ингибирование CSF-1-индуцированного фосфорилирования CSF-1R в рекомбинантных клетках NIH3T3, экспрессирующих CSF-1R дикого типа (например, характеризующееся значением IC50, равным 80 нг/мл или ниже, см. Пример 4);
e) ингибирование роста опухолевых клеток BeWo (например, на 80% или более при концентрации антитела 10 мкг/мл, см. Пример 7);
f) ингибирование дифференцировки макрофагов (например, характеризующееся значением IC50, равным 0,8 нМ или ниже, см. Пример 8).
В другом аспекте данного изобретения предложена композиция, например, фармацевтическая композиция, содержащая одно моноклональное антитело или комбинацию моноклональных антител, или его антиген-связывающую часть, согласно настоящему изобретению, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
В данном документе "фармацевтически приемлемый носитель" охватывает любые возможные растворители, дисперсионные среды, покрытия (оболочки), антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие абсорбцию/всасывание агенты и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Предпочтительно, носитель является подходящим для инъекции или инфузии.
Композицию по данному изобретению можно вводить при помощи различных способов, известных в области техники. Специалистам очевидно, что путь и/или способ введения будут варьироваться в зависимости от желаемых результатов.
Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных субстанций известно в области техники. Кроме воды, носитель может, например, представлять собой изотонический забуференный солевой раствор.
Независимо от выбранного пути введения, соединения по данному изобретению, которые можно применять в виде подходящей гидратированной формы и/или фармацевтические композиции по данному изобретению изготавливают в виде фармацевтически приемлемых лекарственных форм при помощи стандартных способов, известных специалистам в данной области.
Фактические уровни доз действующих веществ в фармацевтических композициях по данному изобретению могут варьироваться так, чтобы содержать количество действующего вещества, являющегося эффективным для достижения желаемого терапевтического ответа у конкретного пациента, в зависимости от состава и способа введения, при отсутствии токсичности для пациента (эффективное количество). Выбранный уровень доз зависит от ряда фармакокинетических параметров, таких как активность конкретных применяемых композиций по данному изобретению или их сложных эфиров, солей или амидов, пути введения, времени введения, скорости экскреции конкретных используемых компонентов, других лекарств, компонентов и/или веществ, используемых в сочетании с конкретными композициями, возраста, пола, массы тела, заболевания, общего состояния здоровья и истории болезни пациента, получающего лечение, и подобных им факторов, хорошо известных в медицине.
Изобретение относится к применению антитела по изобретению для лечения пациента, страдающего раком, в частности, раком толстой кишки, легкого или поджелудочной железы.
Изобретение также относится к способу лечения пациента, страдающего данным заболеванием.
В изобретении также предложен способ изготовления фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество антитела по изобретению в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, и применение антитела по изобретению в данном способе.
В изобретении также предложено применение антитела по изобретению в эффективном количестве для изготовления фармацевтического агента, предпочтительно в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, для лечения пациента, страдающего раком.
В изобретении также предложено применение антитела по изобретению в эффективном количестве для изготовления фармацевтического агента, предпочтительно в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, для лечения пациента, страдающего раком.
Приведенные ниже примеры и последовательности помогают лучше понять изобретение, объем которого ограничен прилагаемой формулой. Следует понимать, что указанные методики могут быть модифицированы, но при этом суть изобретения сохранится.
Депонирование антитела
Предпочтительная гибридомная клеточная линия согласно изобретению, гибридомная клеточная линия <CSF-1R>9D11.2E была депонирована в соответствии с правилами Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ от нем. Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), Германия, 10 июня 2008 под регистрационным номером DSM АСС 2920.
Антитела, продуцируемые данной клеточной линией, представляют собой предпочтительные воплощения изобретения.
Описание последовательностей
SEQ ID NO: 1 тяжелая цепь CDR3, <CSF-1R>9D11.2Е8
SEQ ID NO: 2 тяжелая цепь CDR2, <CSF-1R>9D11.2E8
SEQ ID NO: 3 тяжелая цепь CDR1, <CSF-1R>9D11.2E8
SEQ ID NO: 4 легкая цепь CDR3, <CSF-1R>9D11.2E8
SEQ ID NO: 5 легкая цепь CDR2, <CSF-1R>9D11.2E8
SEQ ID NO: 6 легкая цепь CDR1, <CSF-1R>9D11.2E8
SEQ ID NO: 7 вариабельный домен тяжелой цепи, <CSF-1R>9D11.2E8
SEQ ID NO: 8 вариабельный домен легкой цепи, <CSF-1R>9D11.2E8
SEQ ID NO: 9 тяжелая цепь CDR3, <CSF-1R>10H2.2F12
SEQ ID NO: 10 тяжелая цепь CDR2, <CSF-1R>10H2.2F12
SEQ ID NO: 11 тяжелая цепь CDR1, <CSF-1R>10H2.2F12
SEQ ID NO: 12 легкая цепь CDR3, <CSF-1R>10H2.2F12
SEQ ID NO: 13 легкая цепь CDR2, <CSF-1R>10H2.2F12
SEQ ID NO: 14 легкая цепь CDR1, <CSF-1R>10H2.2F12
SEQ ID NO: 15 вариабельный домен тяжелой цепи, <CSF-1R>10H2.2F12
SEQ ID NO: 16 вариабельный домен легкой цепи, <CSF-1R>10H2.2F12
SEQ ID NO: 17 константный участок тяжелой цепи γ1
SEQ ID NO: 18 константный участок легкой цепи κ
SEQ ID NO: 19 константный участок тяжелой цепи, полученный на основе IgG1 человека
SEQ ID NO: 20 константный участок тяжелой цепи, полученный на основе IgG1 человека с мутациями L234A и L235A
SEQ ID NO: 21 константный участок тяжелой цепи, полученный на основе IgG4 человека
SEQ ID NO: 22 константный участок тяжелой цепи, полученный на основе IgG4 человека с мутацией S228P
SEQ ID NO: 23 CSF-1R дикого типа (wt CSF-1R)
SEQ ID NO: 24 CSF-1R с мутациями L301S и Y969F
ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Приведенные ниже примеры и последовательности помогают лучше понять изобретение, объем которого ограничен прилагаемой формулой. Следует понимать, что указанные методики могут быть модифицированы, но при этом суть изобретения сохранится.
Пример 1. Создание гибридомной клеточной линии, продуцирующей антитела к KQSF-1R
Иммунизация мышей NMRI
Мышей NMRI иммунизировали экспрессирующим вектором pDisplay™ (Invitrogen, USA), кодирующим внеклеточный домен (ECD, от англ. extracellular domain) huCSF-1R, при помощи электропорации. Каждую мышь иммунизировали 4-кратно 100 мкг ДНК. При достижении надлежащего уровня сывороточных титров антител к huCSF-1R, мыши дополнительно получали однократную бустерную инъекцию 50 мкг смеси huCSF-1R ECD с химерным белком huCSF-1R ECD/huFc в соотношении 1:1 в 200 мкл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) внутривенно (в/в) за 4 и за 3 дня до процедуры слияния.
Специфический для антигена твердофазный иммуноферментный анализ
Титры антител к CSF-1R в сыворотке иммунизированных мышей определяли при помощи антиген-специфического твердофазного иммуно-ферментного анализа (ИФА).
2

0,3 мкг/мл химерного белка huCSF-1R-huFc (растворимый внеклеточный домен) иммобилизовали на поверхности покрытого стрептавидином планшета (MaxiSorb; MicroCoat, DE, кат. номер 11974998/MC1099) с использованием 0,1 мг/мл биотинилированного антитела, специфического к Fey (Jackson ImmunoResearch., Cat. No. 109-066-098) и добавляли конъюгированный с пероксидазой хрена (HRP, от англ. horse radish peroxidase) F(abʹ) фрагмент, направленный против IgG мыши (GE Healthcare, UK, кат. номер NA9310V), в разведении 1/800 в ФСБ/0,05% Tween20/0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА). Полученные после каждой иммунизации сыворотки разводили 1/40 в ФСБ/0,05% Tween20/0,5% БСА и последовательно разводили до 1/1638400. Разведенную сыворотку вносили в лунки. В качестве отрицательного контроля использовали сыворотку, полученную до иммунизации. В качестве положительного контроля использовали последовательные разведения мышиного антитела Mab3291, направленного против CSF-1R человека (R&D Systems, UK), в концентрации от 500 нг/мл до 0,25 нг/мл. Все компоненты инкубировали вместе в течение 1,5 часов. Лунки промывали 6 раз ФСБТ (ФСБ/0,2% Tween20) и для развития окраски добавляли свежеприготовленный раствор ABTS (1 мг/мл) (ABTS: 2,2ʹ-азино-бис-(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота) на 10 минут при комнатной температуре. Оптическую плотность измеряли при 405 нм.
Создание гибридом
4
Лимфоциты мыши выделяют и сливают с линией клеток миеломы мыши с применением стандартных протоколов создания гибридом, основанных на использовании полиэтиленгликоля (ПЭГ). Затем проводят скрининг полученных гибридом в отношении продукции антиген-специфических антител. Например, суспензии одиночных клеток лимоцитов селезенки иммунизированных мышей сливают с несекретирующими Ig клетками миеломы мыши P3X63Ag8.653 (АТСС, CRL-1580) с использованием 50% ПЭГ. Клетки высаживают приблизительно по 10 в плоскодонные 96-луночные планшеты для микротитрования и затем инкубируют приблизительно в течение двух недель в селективной среде. После этого в отдельных лунках проводят скрининг моноклональных антител типа IgM и IgG к CSF-1R человека методом ИФА. После начала интенсивного роста гибридом гибридомы подвергают повторному скринингу в отношении продукции антител, и положительные в отношении человеческого CSF-1R моноклональные антитела типа IgG затем субклонируют с помощью проточной цитометрии (FACS). Стабильные субклоны затем культивируют in vitro для продукции антитела в культуральную среду и характеризации.
Культивирование гибридом
2
Полученные гибридомы muMAb культивировали в среде RPMI 1640 (PAN - кат. номер РО4-17500) с добавлением 2 мМ L-глутамина (GIBCO - кат. номер 35050-038), 1 мМ пирувата натрия (GIBCO - кат. номер 11360-039), 1х заменимых аминокислот (GIBCO - кат. номер 11140-035), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (РАА - кат. номер А15-649), 1х пенициллина/стрептомицина (Roche - кат. номер 1074440), 1х добаки Nutridoma CS (Roche - кат. номер 1363743), 50 мкМ меркаптоэтанола (GIBCO - кат. номер 31350-010) и 50 ед/мл IL 6 мыши (Roche - кат. номер 1444581) при 37°С и 5% CO.
Пример 2. Отбор антител по ингибированию роста клеток NIH3T3, экспрессирующих рекомбинантный CSF-1R (CSF-1R дикого типа или CSF-1R с мутациями L301S и Y969F) при культивировании в 3D-условиях при воздействии моноклональных антител к CSF-1R (CellTiterGlo-assay)
Клетки NIH 3Т3 (АТСС No. CRL-2795), инфицированные ретровирусами, несущими экспрессирующий вектор полноразмерного CSF-1R дикого типа (SEQ ID NO: 23) или CSF-1R с мутациями L301S и Y969F (SEQ ID NO: 24), культивировали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы (РАА, Pasching, Austria) с добавлением 2 мМ L-глутамина, 2 мМ пирувата натрия, заменимых аминокислот и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma, Taufkirchen, Germany) на чашках, покрытых поли-ГЭМА (поли-(2-гидроксиэтилметакрилатом)) (Polysciences, Warrington, PA, USA)) для предупреждения адгезии к поверхности пластика. Клетки высаживали в среде, в которую вместо сыворотки добавляли 5 нг/мл селенита натрия, 10 мг/мл трансферрина, 400 мкг/мл БСА и 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола. Под воздействием 100 нг/мл huCSF-1 (Biomol, Hamburg, Germany) клетки, экспрессирующие wtCSF-1R, формировали плотные сфероиды, растущие в трехмерном пространстве, что обозначается свободным («безъякорным») ростом. Эти сфероиды обладали трехмерным строением и организацией, напоминающими солидные опухоли in situ.
Рекомбинантные клетки, экспрессирующие мутантный CSF-1R, обладали способностью формировать сфероиды независимо от наличия лиганда CSF-1. Культуры сфероидов инкубировали в течение 3 дней в присутствии антитела в концентрации 10 мкг/мл. Для определения жизнеспособности клеток по содержанию АТФ в клетках использовали наборы CellTiterGlo.
Таким образом, антитела по изобретению, связывающиеся с тем же эпитопом, способны ингибировать клеточную пролиферацию CSF-1-лиганд-зависимых и/или CSF-1-лиганд-независимых клеток.
В следующем эксперименте исследовали способность антитела 1.2.SM1.19 (лиганд-вытесняющее антитело к CSF-1R описано в WO 2009/026303), антитела CXIIG6 (лиганд-вытесняющее антитело к CSF-1R описано в WO 2009/112245) и поликлонального антитела козы ab0676, направленного против CSF-1R (abcam), ингибировать рост клеток NIH3T3, экспрессирующих CSF-1R с мутациями L301S и Y969F. Культуры сфероидов инкубировали в течение 3 дней в присутствии различных концентраций антитела для определения IC30 (концентрации, приводящей к ингибированию жизнеспособности клеток на 30%). Максимальная концентрация составила 20 мкг/мл. Для определения жизнеспособности клеток по содержанию АТФ в клетках использовали набор CellTiterGlo.
У всех трех антител к CSF-1R, 1.2.SM1.19, CXIIG6 и ab0676, степень ингибирования роста рекомбинантных клеток NIH3T3, экспрессирующих CSF-1R с мутациями L301S и Y969F, при наивысшей концентрации 20 мкг/мл составила 0% или ниже (что означает, что 1.2.SM1.19 и CXIIG6 не только не вызывали ингибирования роста клеток NIH3T3, экспрессирующих рекомбинантный CSF-1R с мутациями L301S и Y969F, а наоборот стимулировали рост таких клеток (1.2.SM1.19 демонстрировало стимуляцию на 19% при концентрации 20 мкг/мл, a CXIIG6 демонстрировало стимуляцию на 6% при концентрации 20 мкг/мл).
Пример 3. Ингибирование взаимодействия CSF-1/CSF-1R (твердофазный ИФА)
Исследование выполняли в 384-луночных планшетах для микротитрования (MicroCoat, DE, Cat. No. 464718) при комнатной температуре. После каждого этапа инкубации планшеты 3-кратно промывали ФСБТ.
2
Вначале планшеты покрывали биотинилированным F(abʹ) фрагментом антитела козы, специфическим к Fcγ (Jackson ImmunoResearch., Cat. No. 109-006-170), в концентрации 0,5 мг/мл в течение 1 часа (ч).

После этого лунки блокировали ФСБ с добавлением 0,2% Tween-20 и 2% БСА (Roche Diagnostics GmbH, DE) в течение 0,5 ч. Химерный белок huCSF-1R-huFc (растворимый внеклеточный домен) в концентрации 75 нг/мл иммобилизовали на поверхности планшета в течение 1 ч. Затем инкубировали разведения очищенных антител в ФСБ/0,05% Tween20/0,5% БСА в течение 1 ч. После добавления смеси 3 нг/мл CSF-1 (Biomol, DE, Cat. No. 60530), 50 нг/мл биотинилированного антитела BAF216 (R&D Systems, UK), направленного против CSF-1, и стрептавидина-HRP в разведении 1:5000 (Roche Diagnostics GmbH, DE, Cat. No. 11089153001) в течение 1 ч планшеты 6-кратно промывали ФСБТ. В качестве положительного контроля использовали антитело SC-02 клон 2-4А5 (Santa Cruz Biotechnology, US), направленное против CSF-IR и ингибирующее взаимодействие лиганд-рецептор. Для развития окраски в планшеты добавляли свежеприготовленный раствор субстрата пероксидазы ВМ blue (ВМ blue: 3,3ʹ-5,5ʹ-тетраметилбензидин, Roche Diagnostics GmbH, DE, кат. номер 11484281001) и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Оптическую плотность измеряли при 370 нм. Все антитела к CSF-1R демонстрировали существенное ингибирование связывания CSF-1 с CSF-1R (см. Таблицу 2). Антитело SC-02 клон 2-4А5 (Santa Cruz Biotechnology, US), направленное против CSF-IR, ингибирующее взаимодействие лиганд-рецептор, использовали в качестве референтного контроля.
Пример 4. Ингибирование индуцированного CSF-1 фосфорилирования CSF-1R в клетках NIH3T3, экспрессирующих рекомбинантный CSF-1R
3
4,5×10 клеток NIH 3Т3, инфицированных ретровирусом, содержащим экспрессирующий вектор, кодирующий плоноразмерный CSF-1R (SEQ ID NO: 23), культивировали в среде DMEM (РАА кат. номер Е15-011), с добавлением 2 мМ L-глутамина (Sigma, кат. номер G7513), 2 мМ пирувата натрия, 1х заменимых аминокислот, 10% эмбриональной телячьей сыворотки (РАА, кат. номер А15-649) и 100 мкг/мл пенициллина/стрептомицина (Sigma, кат. номер Р4333 [10 мг/мл]) до достижения конфлюентности. Затем клетки отмывали средой DMEM (РАА кат. номер Е15-011) без добавления сыворотки, с добавлением селенита натрия [5 нг/мл] (Sigma, кат. номер S9133), трансферрина [10 мкг/мл] (Sigma, кат. номер Т8158), БСА [400 мкг/мл] (Roche Diagnostics GmbH, кат. номер 10735078), 4 мМ L-глутамина (Sigma, кат. номер G7513), 2 мМ пирувата натрия (Gibco, кат. номер 11360), 1х заменимых аминокислот (Gibco, кат. номер: 11140-035), 2-меркаптоэтанола [0,05 мМ] (Merck, кат. номер М7522), 100 мкг/мл пенициллина/стрептомицина (Sigma, кат. номер Р4333) и инкубировали в 30 мкл той же самой среды в течение 16 часов для обеспечения активации рецептора. К клеткам добавляли по 10 мкл разведенных антител к CSF-1R на 1,5 ч. Затем клетки стимулировали 10 мкл huM-CSF-1 (Biomol Кат. номер 60530) в концентрации 100 нг/мл в течение 5 мин. После инкубации удаляли надосадочную жидкость, клетки дважды промывали 80 мкл ледяного ФСБ и добавляли 50 мкл свежеприготовленного ледяного лизирующего буфера (150 мМ NaCl/ 20 мМ Tris pH 7,5/ 1 мМ EDTA/ 1 мМ EGTA/ 1% Triton Х-100/ 1 таблетка ингибиторов протеаз (Roche Diagnostics GmbH кат. номер 1836170) на 10 мл буфера/ 10 мкл/мл коктейля-1 ингибиторов фосфатаз (Sigma кат. номер Р-2850, 100х матричный раствор)/ 10 мкл/мл ингибиторов протеаз 1 (Sigma кат. номер Р-5726, 100х матричный раствор) /10 мкл/мл 1 Μ NaF). После инкубации на льду в течение 30 минут планшеты энергично встряхивали на шейкере в течение 3 минут и затем центрифугировали в течение 10 минут при скорости 2200 об/мин (Heraeus Megafuge 10).

Присутствие фосфорилированного и общего рецептора CSF-1 в клеточном лизате исследовали при помощи твердофазного ИФА. Для детекции фосфорилированного рецептора использовали набор R&D Systems (Cat. No. DYC3268-2) в соответствии с инструкциями производителя. Для детекции общего CSF-1R на планшете иммобилизовали 10 мкл лизата при помощи захватывающего антитела, входящего в состав набора. Затем добавляли биотинилированное антитело BAF329 (R&D Systems), направленное против CSF-1R, в разведении 1:750 и конъюгат стрептавидин-HRP в разведении 1:1000. Через 60 минут для развития окраски в планшеты добавляли свежеприготовленный раствор ABTS и определяли оптическую плотность. Результаты выражали в % от положительного контроля в отсутствие антитела и рассчитывали соотношение фосфорилированного рецептора к общему рецептору. Отрицательный контроль не содержал M-CSF-1. Антитело SC-02 клон 2-4А5 (Santa Cruz Biotechnology, US, см. также Sherr, C.J., et al., Cell 41 (1985) 665-676), направленное против CSF-1R, ингибирующее взаимодействие лиганд-рецептор, использовали в качестве референтного контроля.
Пример 5. Определение аффинности к CSF-1R у антител, направленных против CSF-1R

Прибор: BIACORE A100
Чип: СМ5 (Biacore BR-1006-68)
Присоединение: через аминогруппы
Буфер: ФСБ (Biacore BR-1006-72), pH 7,4, 35°С
Для исследования аффинности к поверхности чипа присоединяли антитела козы, направленные против Fcγ мыши (Jackson Immuno Research JIR115-005-071), в концентрации 36 мкг/мл для захвата антител, направленных против CSF-1R. CSF-1R ECD (R&D-Systems 329-MR) или полученный в лаборатории субклонированный pCMV-presS-HisAvitag-hCSF-1R-ECD добавляли в растворе в различных концентрациях. Ассоциацию регистрировали, пропуская CSF-1R в течение 1,5 минут при 35°С; диссоциацию регистрировали при промывании поверхности чипа буфером в течение 10 минут при 35°С. Антитело SC-02 клон 2-4А5 (Santa Cruz Biotechnology, US; see also Sherr, C.J., et al., Cell 41 (1985) 665-676), направленное против CSF-IR, ингибирующее взаимодействие лиганд-рецептор, использовали в качестве референтного контроля.
Для расчета кинетических параметров использовали модель 1:1 Ленгмюра.
Пример 6. Картирование эпитопов моноклональных антител к CSF-1R с использованием метода SPR, основанное на перекрестной конкуренции антител

Прибор: BIACORE А100
Чип: СМ5 (Biacore BR-1006-68)
Присоединение: через аминогруппы
Буфер: ФСБ (Biacore BR-1006-72), pH 7,4, 25°С

Для картирования эпитопов, основанном на перекрестной конкуренции антител, к поверхности чипа присоединяли антитела козы, направленные против Fcγ мыши или Feγ крысы (Jackson Immuno Research кат. номер 115-005-071 и кат. номер 112-005-071) в концентрации 36 мкг/мл для презентации антитела к CSF-1R. После захвата моноклональных антител к CSF-1R, используемых в концентрации 5 мкг/мл, свободные связывающие валентности захватывающих антител блокировали с использованием иммуноглобулинов мыши или крысы в концентрации 250 мкг/мл (Pierce кат. номер 31202 и Pierce кат. номер 31233), с последующим инжектированием CSF-1R (R&D-Systems кат. номер 329-MR) в концентрации 12,5 мкг/мл в течение 2 мин. Присоединение второго антитела к CSF-1R исследовали, пропуская его в течение 2 мин, диссоциацию исследовали при отмывании буфером в течение 5 минут. Исследование и измерения проводили при 25°С. Референтные значения для специфического связывания второго антитела к CSF-1R получали в тех же условиях, но без инжектирования CSF-1R. Результаты перекрестной конкуренции рассчитывали в процентном отношении (%) к ожидаемому связыванию второго антитела к CSF-1R. "Процентное отношение (%) от ожидаемого связывания" для связывания второго анитела рассчитывали по формуле "100 × относительный ответ (в начале фазы диссоциации) / rMax", где rMax рассчитывали как "относительный ответ (в конце фазы диссоциации) × молекулярный вес антитела / молекулярный вес антигена" в соответствии с рекомендациями Biacore по картированию эпитопов (для инструмента BIACORE А100).
Кроме того, рассчитывали минимальное связывание, используя пары идентичных антител 1 и 2. В качестве порогового уровня, выше которого конкуренцию антител считали значимой, устанавливали полученное таким образом максимальное значение+50% (например, для антитела <CSF-1R>9D11.2E8 рассчитанный пороговый уровень составляет 8+4=12, см. Таблицу). Таким образом, у "антитела к CSF-1R, связывающегося с тем же самым эпитопом, что и <CSF-1R>9D11.2E8" уровень предполагаемого связывания, выраженный в %, составляет менее 12%.
Антитело SC-02 клон 2-4А5 (Santa Cruz Biotechnology, US, см. также Sherr, С.J., et al., Cell 41 (1985) 665-676), направленное против CSF-1R, ингибирующее взаимодействие лиганд-рецептор, использовали в качестве референтного контроля.
Результаты указывают, что антитела <CSF-1R>9D11.2E8 и <CSF-1R>10H2.2F12 связываются с тем же самым эпитопом, тогда как, например, SC-2-4А5 связывается с другим эпитопом и не способно перекрестно реагировать (перекрестно конкурировать за связывание) с антителом по изобретению.
Кроме того, в следующих экспериментах исследовали, связываются ли антитела Mab 2F11, 2Е10, 2Н7 и 1G10 по изобретению WO 2011070024, направленные против CSF-1R (способные ингибировать рост рекомбинантных клеток NIH3T3, экспрессирующих CSF-1R дикого типа или CSF-1R с мутациями L301S и Y969F), с теми же эпитопами, что и антитела по данному изобретению. Результаты картирования эпитопов (основанного на перекрестной конкуренции) однозначно свидетельствовали, что антитела <CSF-1R>9D11.2E8 и <CSF-1R>10H2.2F12 связываются с различными эпитопами по сравнению с Mab 2F11, 2Е10, 2Н7 и 1G10 по изобретению WO 2011070024.
В другом отдельном эксперименте, который проводили аналогично описанию в Примере 10 WO 2011070024, устанавливали, связываются ли антитела <CSF-1R>9D11.2E8 и <CSF-1R>10H2.2F12 с доменами D1-D3 внеклеточного домена CSF-1R (CSF-1R-ECD (D1-D3). Это исследование позволило установить, что антитела <CSF-1R>9D11.2E8 и <CSF-1R>10H2.2F12 не связываются с CSF-1R ECD (D1-D3). Таким образом, антитела <CSF-1R>9D11.2E8 и <CSF-1R>10H2.2F12 связываются с внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (содержащим домены D1-D5) и не связываются с доменами D1-D3 внеклеточного домена CSF-1R человека. Следовательно, антитела <CSF-1R>9D11.2Е8 и <CSF-1R>10H2.2F12 связываются с (участвующими в димеризации) доменами D4-D5 внеклеточного домена CSF-1R человека.
Пример 7. Ингибирование роста опухолевых клеток BeWo в 3D культуре под воздействием моноклональных антител к CSF-1R (по набору CellTiterGlo)
4
Клетки хориокарциномы BeWo (АТСС CCL-98) культивировали в среде F12K (Sigma, Steinheim, Germany) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma) и 2 мМ L-глутамина. 5×10 клеток/лунку высаживали в 96-луночные планшеты, покрытые поли-ГЭМА (поли-(2-гидроксиэтилметакрилатом)), содержащие среду F12K с добавлением 0,5% эмбриональной телячьей сыворотки и 5% БСА. Одновременно добавляли 200 нг/мл huCSF-1 и различные моноклональные антитела к CSF-1R в концентрации 10 мкг/мл и инкубировали в течение 6 дней. Для определения жизнеспособности клеток, выраженной в относительных световых единицах (RLU, от англ. relative light units), по содержанию АТФ в клетках использовали наборы CellTiterGlo. При обработке культур сфероидов, образованных клетками BeWo, различными антителами к CSF-1R (10 мкг/мл) наблюдали ингибирование роста, индуцированного CSF-1. Для рассчета антитело-опосредованного ингибирования из показателей всех образцов вычитали среднее значение RLU нестимулированных клеток BeWo. Среднее значение RLU стимулированных CSF-1 клеток условно принимали за 100%. Средние значения RLU клеток, стимулированных CSF-1 и обработанных антителами к CSF-1R, выражали в % от значений RLU при стимуляции CSF-1. В Таблице 6 приведены рассчитанные значения; на Фиг. 1 показаны средние значения RLU. Каждое среднее значение было рассчитано по трем измерениям.
Пример 8. Ингибирование дифференцировки макрофагов под воздействием моноклональных антител к CSF-1R (исследование по набору CellTiterGloi
4
2
50
Моноциты выделяли из периферической крови с помощью коктейля для обогащения моноцитами человека RosetteSep™ (StemCell Tech. - кат. номер 15028). Обогащенные моноцитами популяции высаживали в 96-луночные планшеты для микротитрования (по 2,5×10 клеток/лунку) в 100 мкл среды RPMI 1640 (Gibco - кат. номер 31870) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (GIBCO - кат. номер 011-090014М), 4 мМ L-глутамина (GIBCO - кат. номер 25030) и 1х пенициллина/стрептомицина (Roche кат. номер 1074440) при 37°С и 5% CO. При добавлении в среду 150 нг/мл huCSF-1 наблюдали четкую дифференцировку в адгезированные макрофаги. Эта дифференцировка подавлялась при добавлении антител к CSF-1R. Кроме того, изменялась выживаемость моноцитов, которую оценивали при помощи исследования CellTiterGlo (CTG). Значение IC рассчитывали по ингибированию выживаемости моноцитов под воздействием антител, зависящему от концентрации (см. Таблицу 7).
В отдельном эксперименте исследовали моноциты яванского макака, выделенные из периферической крови при помощи фиколла с последующей магнитной сортировкой по CD14 (Miltenyi Biotec кат. номер 130091097), в аналогичных условиях при концентрации антител 5 мкг/мл. Антитело <CSF-1R>9D11.2E8 демонстрировало ингибирование на 33%, <CSF-1R>10H2.2F12 - ингибирование на 18%. (Напротив, моноклональное антитело 2F11, описанное в WO 2011/070024(A1), направленное против CSF-1R, ингибировало выживаемость моноцитов обезьян на 99%).