СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ АЛЛЕРГЕННЫХ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ
METHOD OF IDENTIFYING ALLERGENIC PROTEINS AND PEPTIDES

Область изобретения, к которому относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу идентификации аллергенных белков и пептидов. Более конкретно, изобретение относится к способу идентификации аллергенных белков и/или пептидов молока, включающему стадии: получение по меньшей мере одной экспрессионной библиотеки, содержащей ДНК или кДНК, полученную из ткани молочной железы лактирующего млекопитающего, предпочтительно, лактирующей коровы; экспрессии по меньшей мере одного белка или пептида, кодируемого указанной экспрессионной библиотекой; определения связывающей способности по меньшей мере одного белка или пептида с IgE по меньшей мере одной сыворотки у индивидуума, который чувствителен к молоку млекопитающего, предпочтительно, молоку коровы; контактирования по меньшей мере одного белка или пептида, проявляющего IgE-связывающую способность, определенную в стадии с), с базофильными клетками, эозинофильными клетками или тучными клетками и идентификации по меньшей мере одного белка или пептида как аллергена, если указанные базофильные клетки, эозинофильные клетки или тучные клетки выделяют по меньшей мере один медиатор после контакта с указанным по меньшей мере одним белком или пептидом стадии d).
В этом описании цитируется ряд документов, в том числе заявки на патент и инструкции производителя. Описание этих документов, хотя и не считающееся релевантным в отношении патентоспособности изобретения, включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Более конкретно, все цитируемые документы включены в качестве ссылки также, как если бы каждый отдельный документ был конкретно и отдельно включен в качестве ссылки. Ни один из этих документов не является уровнем техники настоящего изобретения.
Уровень техники
Приблизительно 2-8% младенцев, младше трех лет и приблизительно 2% взрослой популяции страдают пищевыми аллергиями. Приблизительно 80% аллергических реакций у детей являются результатом повышенной чувствительности (аллергии) к коровьему молоку (КМ), куриным яйцам и бобовым (например, арахису и сое). При этом, во взрослой популяции наиболее преобладающими являются аллергии на фрукты, арахис и лесные орехи.
Коровье молоко находится среди лидирующих пищевых продуктов, вводимых в рацион ребенка и, следовательно, является одной из наиболее частых причин пищевой аллергии у детей младшего возраста. Приблизительно у 2,5% новорожденных отмечаются побочные реакции на коровье молоко в первом году их жизни.
Симптомы аллергии на молочную сыворотку коровы (CMA) являются аллергической реакцией немедленного типа или аллергической реакцией замедленного типа, и они находятся в диапазоне от легкой реакции до тяжелой реакции, и их проявления затрагивают кожу, дыхательные пути, желудочно-кишечный тракт и в самом тяжелом случае являются угрожающими жизни системными реакциями (анафилаксией). В отличие от клеточно-опосредованных реакций замедленного типа, реакции немедленного типа обусловлены продукцией антител иммуноглобулина Е (IgE) в ответ на безвредные в другом случае антигены (повышенной чувствительностью Типа I). Взаимодействие IgE-антител с аллергенной молекулой приводит к специфической активации эффекторных клеток (тучных клеток, базофильных гранулоцитов) и к последующему высвобождению медиаторов воспаления, таких как гистамин, простагландин и лейкотриен, которые являются ответственными за аллергические реакции немедленного типа.
Молоко коровы содержит более 25 белков, и известно, что некоторые из них являются аллергенными. Под действием химозина (ренина) или при подкислении молока до рН 4,6 получают две фракции: двадцать процентов белков обнаружены во фракции сыворотки и 80% белков составляют фракцию казеина. Аллергенные молекулы содержатся в обеих фракциях и считаются основными и минорными аллергенами в зависимости от частоты встречаемости документированных аллергических реакций в популяции СМА.
Основными аллергенами, присутствующими в молоке коровы, являются альфа-лактальбумин, бета-лактоглобулин, альфаS1-казеин, бета-казеин и каппа-казеин. Минорными аллергенами, присутствующими в молоке коровы, являются альфаS2-казеин, лактоферрин, бычий сывороточный альбумин и иммуноглобулин.
Альфа-лактальбумин (Bos d 4), бета-лактоглобулин (Bos d 5), иммуноглобулины (Bos d 7), BSA и лактоферрин хорошо известны как IgE-реактивные компоненты сыворотки молока. АльфаS1-казеин, альфаS2-казеин, бета-казеин и каппа-казеин являются сильными аллергенами во фракции казеина (Bos d 8) (Wal, 2004).
Во фракции молочной сыворотки главными аллергенами считаются бета-лактоглобулин (BLG) и альфа-лактальбумин (ALA). Бета-лактоглобулин является глобулярным и очень стабильным белком, который относится к липокаинам, семейству белков, которые связывают гидрофобные лиганды. Другие аллергены, такие как главные аллергены Can f 1 и Can f 2 собаки, и аллергены других имеющих шерсть животных (лошади, кошки и морской свинки) также относятся к этому суперсемейству белков. Природный бета-лактоглобулин находится в димерной форме и имеет молекулярную массу 36 кДа. Существует две основные изоформы бета-лактоглобулина, генетические варианты А (BLGA) и B (BLGB), которые различаются в аминокислотах 64 и 118 (аспарагиновая кислота и валин в BLGA, глицин и аланин в BLGB). Стабильность и тот факт, что бета-лактоглобулин относится к семейству липокалинов, могут объяснять высокий аллергенный потенциал этой молекулы.
2+
Альфа-лактальбумин является кислотным Ca-связывающим мономером 14 кДа, стабилизированным четырьмя дисульфидными мостиками. Он является регуляторным компонентом в системе галактозилтрансферазы, которая синтезирует лактозу. Анализ последовательности показал высокую гомологию аминокислотной последовательности с альфа-лактальбумином человека (hALA) и лизоцимом из куриного яйца; главным аллергеном куриного яйца. Аллергенность альфа-лактальбумина может объясняться его стабильностью.
В суспензии белки фракции казеина образуют упорядоченные агрегаты (мицеллы) с константной долей отдельных молекул: альфаS1- и альфаS2-казеина 37% (каждого), бета- и каппа-казеина 13% (каждого). Эти четыре молекулы казеина имеют малую гомологию первичной структуры, имеют разные функциональные свойства, но являются, все, фосфорилированными белками с реоморфными, высоко гидратированными четвертичными структурами, которые могут быть легко деградированы некоторыми протеазами. Такая чувствительность к протеолитическому расщеплению является довольно необычной характеристикой для важного аллергена. Казеины молока коровы гомологичны по аминокислотной последовательности на 90% казеинам других млекопитающих, таких как коза и овца. Эта гомология последовательности может быть причиной часто наблюдаемой перекрестной реактивности между молоком коровы и молоком других животных.
Настоящее изобретение направлено на необходимость способов, которые позволят идентифицировать аллергенные белки и пептиды, присутствующие в биологическом источнике. Тем самым изобретение относится к необходимости обеспечения способов, которые позволят идентифицировать неаллергенные белки и пептиды, присутствующие в биологическом источнике, особенно, в молоке млекопитающего, и, в частности, в молоке коровы и пищевых смесях, содержащих такое молоко. Кроме того, изобретение относится к средствам и способам диагностики и лечения аллергии у индивидуума.
Сущность изобретения
Один из аспектов изобретения относится к способу идентификации аллергенных белков и пептидов молока, который включает стадии получения по меньшей мере одной экспрессионной библиотеки, содержащей ДНК или кДНК, полученную из ткани молочной железы лактирующего млекопитающего, предпочтительно, лактирующей коровы, экспрессии по меньшей мере одного белка или пептида, кодируемого указанной экспрессионной библиотекой, определения связывающей способности указанного по меньшей мере одного белка или пептида с IgE по меньшей мере одной сыворотки у индивидуума, который чувствителен к молоку млекопитающего, предпочтительно, молоку коровы, контактирования указанного по меньшей мере одного белка или пептида, проявляющего IgE-связывающую способность, с базофильными клетками, эозинофильными клетками или тучными клетками и идентификации по меньшей мере одного белка или пептида как аллергена, если указанные базофильные клетки, эозинофильные клетки или тучные клетки выделяют по меньшей мере один медиатор после контакта с указанным по меньшей мере одним белком или пептидом. В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу идентификации по меньшей мере одного аллергенного белка или пептида молока, включающему стадии получения по меньшей мере одной экспрессионной библиотеки, содержащей ДНК или кДНК, полученную из ткани молочной железы лактирующего млекопитающего, предпочтительно, лактирующей коровы, экспрессии по меньшей мере одного белка или пептида, кодируемого указанной экспрессионной библиотекой, определения связывающей способности указанного по меньшей мере одного белка или пептида с IgE по меньшей мере одной сыворотки у индивидуума, который чувствителен к молоку млекопитающего, предпочтительно, молоку коровы, контактирования указанного по меньшей мере одного белка или пептида, проявляющего IgE-связывающую способность, с базофильными клетками, эозинофильными клетками или тучными клетками и идентификации по меньшей мере одного белка или пептида как аллергена, если указанные базофильные клетки, эозинофильные клетки или тучные клетки выделяют по меньшей мере один медиатор после контакта с указанным по меньшей мере одним белком или пептидом. Таким образом, изобретение относится к способу, описанному в настоящей заявке выше, в котором аллергенными белками и пептидами являются аллергенные белки и пептиды молока, по меньшей мере одна экспрессионная библиотека содержит ДНК или кДНК, полученную из ткани молочной железы лактирующего млекопитающего, предпочтительно, лактирующей коровы, и индивидуумом, который чувствителен к аллергенному источнику, является индивидуум, который чувствителен к молоку млекопитающего, предпочтительно, молоку коровы.
Согласно следующему аспекту изобретения, способы по изобретению, описанные выше, могут дополнительно включать стадию определения аминокислотной последовательности по меньшей мере одного белка или пептида, идентифицированного при помощи этих способов.
Настоящее изобретение также относится к способу идентификации аллергенных белков и/или пептидов, кодируемых экспрессионной библиотекой ДНК или кДНК, включающему стадии получения по меньшей мере одной экспрессионной библиотеки, содержащей ДНК или кДНК, полученную по меньшей мере из одного источника аллергена, экспрессии по меньшей мере одного белка или пептида, кодируемого указанной экспрессионной библиотекой, определения связывающей способности указанного по меньшей мере одного белка или пептида с IgE по меньшей мере одной сыворотки у индивидуума, который чувствителен по меньшей мере к одному источнику аллергена, в частности, молоку млекопитающего, предпочтительно, молоку коровы, и пищевым композициям, содержащим молоко млекопитающего, предпочтительно, молоко коровы, контактирования указанного по меньшей мере одного белка или пептида, проявляющего IgE-связывающую способность, с базофильными клетками, эозинофильными клетками или тучными клетками и идентификации по меньшей мере одного белка или пептида как аллергена, если указанные базофильные клетки, эозинофильные клетки или тучные клетки выделяют по меньшей мере один медиатор после контакта с указанным по меньшей мере одним белком или пептидом. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу идентификации по меньшей мере одного аллергенного белка или пептида, кодируемого экспрессионной библиотекой ДНК или кДНК, включающему стадии получения по меньшей мере одной экспрессионной библиотеки, содержащей ДНК или кДНК, полученную по меньшей мере из одного источника аллергена, экспрессии по меньшей мере одного белка или пептида, кодируемого указанной экспрессионной библиотекой, определения связывающей способности указанного по меньшей мере одного белка или пептида с IgE по меньшей мере одной сыворотки у индивидуума, который чувствителен по меньшей мере к одному источнику аллергена, контактирования указанного по меньшей мере одного белка или пептида, проявляющего IgE-связывающую способность, с базофильными клетками, эозинофильными клетками или тучными клетками, и идентификации по меньшей мере одного белка или пептида как аллергена, если указанные базофильные клетки, эозинофильные клетки или тучные клетки выделяют по меньшей мере один медиатор после контакта с указанным по меньшей мере одним белком или пептидом.
,
В другом аспекте изобретение относится к способу детектирования аллергенных белков и пептидов в пробе, содержащей молоко коровы, включающему стадию определения присутствия по меньшей мере одного белка или пептида из фиг.1A 1B и 1C (SEQ ID NO:22-84), и таблицы 1A, 1B и таблицы 2 (SEQ ID NO:1-21).
Согласно аспекту изобретения, молоко млекопитающего, предпочтительно, молоко коровы, может быть гидролизованным молоком млекопитающего, предпочтительно, гидролизованным молоком коровы. Кроме того, указанное присутствие по меньшей мере одного белка или пептида может быть определено масс-спектрометрией. Предпочтительно, белки и пептиды, присутствующие в этой пробе, выделяют перед масс-спектрометрией. Белки и пептиды могут быть выделены электрофоретическим способом или высокоэффективной жидкостной хроматографией. Предпочтительно, этим электрофоретическим способом может быть двухмерный электрофорез.
В другом аспекте изобретение относится к белку или пептиду, идентифицированному способом по настоящему изобретению. В одном из дополнительных аспектов изобретение относится к белку или пептиду или является белком или пептидом, выбранным из фиг.1A, 1B, 1C (SEQ ID NO:22-84), таблиц 1A, 1B или таблицы 2 (SEQ ID NO:1-21).
В другом аспекте изобретение относится по меньшей мере к одному белку или пептиду по изобретению для применения в диагностике аллергии или предрасположенности к аллергии у индивидуума. Предпочтительно, эта аллергия является аллергией на молоко.
В другом аспекте изобретение относится к способу диагностики аллергии или предрасположенности к аллергии у индивидуума, включающему введение по меньшей мере одного белка или пептида, указанных выше, индивидууму, предположительно страдающему аллергией или имеющему предрасположенность к аллергии, и оценку, возникает ли у этого индивидуума аллергическая реакция на этот белок или пептид.
Согласно этому аспекту изобретения, предпочтительно, аллергия или предрасположенность к аллергии является аллергией на молоко или предрасположенностью к аллергии на молоко. Способ этого аспекта, предпочтительно, включает дополнительно выполнение кожного теста и/или анализа крови. Кожный тест, предпочтительно, выбран из (i) кожной инъекционной пробы, (ii) внутрикожного аллерготеста, (iii) аппликационной кожной пробы или (iv) комбинации тестов (i)-(iii), где положительный результат этих тестов (i)-(iv) указывает на аллергию или предрасположенность к аллергии у индивидуума. Анализ крови, предпочтительно, включает стадии (i) контактирования по меньшей мере одного белка или пептида по изобретению с пробой крови, пробой сыворотки или пробой плазмы из указанного индивидуума и (ii) определения, связывается ли указанный по меньшей мере один белок или пептид с IgE-антителом в указанной пробе крови, пробе сыворотки или пробе плазмы, где связывание указанного по меньшей мере одного белка или пептида с IgE-антителом является показателем аллергии или предрасположенности к аллергии у индивидуума; и/или (i') контактирования по меньшей мере одного белка или пептида по изобретению с базофильными клетками, эозинофильными клетками или тучными клетками указанного индивидуума и (ii') определения, выделяют ли указанные базофильные клетки, эозинофильные клетки или тучные клетки после контакта по меньшей мере с одним белком или пептидом по меньшей мере один медиатор, или дегранулируются ли эти клетки после контакта по меньшей мере с одним белком или пептидом, причем высвобождение указанного по меньшей мере одного медиатора после контакта с указанным по меньшей мере одним белком или пептидом является показателем аллергии или предрасположенности к аллергии у указанного индивидуума.
Другой аспект изобретения относится по меньшей мере к одному белку или пептиду по изобретению для использования в аллерген-иммунотерапии аллергии у индивидуума. Предпочтительно, аллергия является аллергией на молоко.
В одном из дополнительных аспектов изобретение относится к способу антиген-иммунотерапии аллергии у индивидуума, включающему введение по меньшей мере одного белка или пептида по изобретению. Предпочтительно, эта аллергия является аллергией на молоко.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу определения аллергии или предрасположенности к аллергии у индивидуума, включающему: а) приведение в контакт по меньшей мере одного белка или пептида по изобретению с пробой крови, пробой сыворотки или пробой плазмы, где указанная проба крови, проба сыворотки или проба плазмы является пробой указанного индивидуума или была выделена из указанного индивидуума, и b) определение, связывается ли указанный по меньшей мере один белок или пептид с IgE-антителом в указанной пробе крови, пробе сыворотки или пробе плазмы, причем связывание указанного по меньшей мере одного белка или пептида с IgE-антителом является показателем аллергии или предрасположенности к аллергии у указанного индивидуума; и/или а') приведение в контакт по меньшей мере одного белка или пептида по изобретению с базофильными клетками, эозинофильными клетками или тучными клетками, где указанные базофильные клетки, эозинофильные клетки или тучные клетки являются клетками указанного индивидуума или были выделены из указанного индивидуума, и b') определение, i) выделяют ли указанные базофильные клетки, эозинофильные клетки или тучные клетки после контакта по меньшей мере с одним белком или пептидом по меньшей мере один медиатор, или (ii) дегранулируются ли эти клетки после контакта по меньшей мере с одним белком или пептидом, причем высвобождение указанного по меньшей мере одного медиатора после контакта с указанным по меньшей мере одним белком или пептидом является показателем аллергии или предрасположенности к аллергии у указанного индивидуума.
Согласно этому аспекту изобретения, предпочтительно, эта аллергия или предрасположенность к аллергии является аллергией на молоко или предрасположенностью к аллергии на молоко. Предпочтительно, способ по этому аспекту дополнительно включает выделение индивидуумов с тяжелой аллергией от индивидуумов, которые чувствительны, но бессимптомны, и выделение индивидуумов, которые с возрастом утрачивают аллергию, от индивидуумов, которые с возрастом не утрачивают аллергию.
В следующем аспекте изобретение относится к способу идентификации IgE-реактивного неаллергенного белка или пептида молока, кодируемого ДНК или кДНК, по меньшей мере одной экспрессионной библиотеки, включающему стадии: а) получения по меньшей мере одной экспрессионной библиотеки, содержащей ДНК или кДНК, полученную из ткани молочной железы лактирующего млекопитающего, предпочтительно, лактирующей коровы; b) экспрессии по меньшей мере одного белка или пептида, кодируемого указанной экспрессионной библиотекой; с) определения связывающей способности указанного по меньшей мере одного белка или пептида с IgE по меньшей мере одной сыворотки у индивидуума, который чувствителен к молоку млекопитающего, предпочтительно, молоку коровы; d) контактирования указанного по меньшей мере одного белка или пептида, проявляющего IgE-связывающую способность, определенную в стадии с), с базофильными клетками, эозинофильными клетками или тучными клетками; e) определения, (i) выделяют ли указанные базофильные клетки, эозинофильные клетки или тучные клетки после контакта по меньшей мере с одним белком или пептидом по меньшей мере один медиатор, или (ii) дегранулируются ли после контакта по меньшей мере с одним белком или пептидом; и f) идентификации по меньшей мере одного белка или пептида как неаллергена, если указанные базофильные клетки, эозинофильные клетки или тучные клетки (i') не высвобождают после контакта по меньшей мере с одним белком или пептидом по меньшей мере один медиатор, или (ii') не дегранулируются после контакта по меньшей мере с одним белком или пептидом.
Согласно этому аспекту изобретения, этот по меньшей мере один белок или пептид, идентифицированный по способу, конкретно описанному в настоящем описании, используются для лечения аллергии. Согласно изобретению, также представлен способ лечения аллергии у индивидуума, включающий введение по меньшей мере одного белка или пептида, идентифицированного по способу или конкретно описанному в настоящем описании способу.
Во всех возможных для применения вариантах осуществления изобретения указанным индивидуумом или пациентом является, предпочтительно, человек. Эозинофильные клетки, тучные клетки или базофильные клетки получают, как правило, от млекопитающего и из человека. Обычно термин “лактирующее млекопитающее” включает такие виды млекопитающих, как коза, овца, лошадь, буйвол, верблюд, но не ограничиваются ими. Особенно предпочтительным видом является корова.
Краткое описание фигур
На фиг.1А показаны расшифрованные аминокислотные последовательности кДНК, кодирующих IgE-реактивный полноразмерный альфаS1- и альфаS2-казеин и IgE-реактивные фрагменты альфаS1- и альфаS2-казеина. Аминокислотная последовательность полноразмерного альфаS1- и альфа-S2-казеина показана в верхней части. Последовательности IgE-реактивных фрагментов альфаS1- и альфаS2-казеина (цифры клонов на правом крае) изображены в виде линий. Эти цифры указывают первую и последнюю аминокислоту каждого клона.
На фиг.1B показаны расшифрованные аминокислотные последовательности кДНК, кодирующих IgE-реактивные полноразмерные бета-, каппа-казеин и бета-лактоглобулин и IgE-реактивные фрагменты этих белков.
В верхней части показаны аминокислотные последовательности полноразмерного бета-, каппа-казеина и бета-лактоглобулина. Последовательности IgE-реактивных фрагментов (цифры клонов на правом крае) изображены в виде линий. Эти цифры указывают первую и последнюю аминокислоту каждого клона. Подчеркнутые последовательности в последовательности бета-казеина (в верхней части) соответствуют неаллергенным пептидам, идентифицированным масс-спектрометрическим анализом экстенсивно гидролизованной гипоаллергенной молочной смеси.
На фиг.1С показаны аминокислотные последовательности альфа-лактальбумина, бычьего сывороточного альбумина и лактоферрина.
125
На фиг.2 показаны IgE-скрининг экспрессии кДНК-библиотеки из молочных желез коровы. Для индукции синтеза рекомбинантных белков клетки E. coli Y1090 инфицировали фагами, несущими кДНК-библиотеку. Эти белки переносили на нитроцеллюлозный фильтр и контактировали с сывороточным IgE из пациентов с аллергией на молоко с последующей инкубацией с I-мечеными антителами против IgE человека. На этом радиоавтографе фильтра IgE-реактивные клоны видны в виде черных точек.
На фиг.3 показана аллергенная активность проб и компонентов молока. Биологическую активность определяли в RBL-анализах. Проценты сывороток пациентов (n=78), дающих положительную реакцию в анализах RBL человека, показаны в виде черных столбцов (y-ось). Анализировали следующие компоненты молока: пробы молока из различных видов (GM, молоко козы; CM, молоко коровы; SM, молоко овцы; HM, молоко человека; MM, молоко кобылы), фракции казеина различных видов (GC, казеин козы; CC, казеин коровы; SC, казеин овцы), природные очищенные белки (AC, альфа-казеин; BC, бета-казеин; KC, каппа-казеин; ALA, альфа-лактальбумин, BLGB, вариант В бета-лактоглобулина; BLGA, вариант А бета-лактоглобулина; BSA, бычий сывороточный альбумин; SSA, сывороточный альбумин овцы; hALA, альфа-лактальбумин человека; Lf, лактоферрин), рекомбинантные белки (rAS1C, рекомбинантный альфаS1-казеин; rAS2C, рекомбинантный aS2-казеин; rBC, рекомбинантный бета-казеин; rKC, рекомбинантный каппа-казеин; rALA, рекомбинантный альфа-лактальбумин; rBLG, рекомбинантный бета-лактоглобулин), рекомбинантные фрагменты BSA (F1, рекомбинантный фрагмент 1 BSA; F2, рекомбинантный фрагмент 2 BSA; F3, рекомбинантный фрагмент 3 BSA) и синтетические белки aS1-казеин (Cas1-Cas6).
На фиг.4 показан перечень аллергенных последовательностей, обнаруженных в молоке.
На фиг.5 показано разделение гидролизованной молочной формулы с использованием нано-жидкостной хроматографии с последующей ионизационной МС. Представление общей ион-хроматограммы пробы 1 мкл гидролизованного молока. Время удерживания показано на х-оси и интенсивности сигналов в импульсах в секунду изображены на y-оси.
На фиг.6 показаны Mascot-поиск и идентификация полученных из бета-казеина пептидов в гидролизованном молоке коровы.
На фиг.7 показаны полученные из бета-казеина пептиды, идентифицированные в гидролизованном молоке коровы как не-IgE-реактивные.
Подробное описание
Целью настоящего изобретения является способ идентификации аллергенных белков и/или пептидов молока, включающий стадии получения по меньшей мере одной экспрессионной библиотеки, содержащей ДНК или кДНК, полученной из ткани молочной железы лактирующего млекопитающего, предпочтительно, лактирующей коровы, экспрессии по меньшей мере одного белка или пептида, кодируемого указанной экспрессионной библиотекой, определения связывающей способности указанного по меньшей мере одного белка или пептида с IgE по меньшей мере одной сыворотки у индивидуума, который чувствителен к молоку млекопитающего, предпочтительно, молоку коровы, контактирования указанного по меньшей мере одного белка или пептида, проявляющего IgE-связывающую способность, с базофильными клетками, эозинофильными клетками или тучными клетками и идентификации по меньшей мере одного белка или пептида как аллергена, если указанные базофильные клетки, эозинофильные клетки или тучные клетки выделяют по меньшей мере один медиатор после контакта с указанным по меньшей мере одним белком или пептидом.
Настоящее изобретение относится также к способу, включающему следующие стадии: получение по меньшей мере одной экспрессионной библиотеки, содержащей ДНК или кДНК, полученную по меньшей мере из одного источника аллергена, экспрессию по меньшей мере одного белка или пептида, кодируемого указанной экспрессионной библиотекой, определение связывающей способности указанного по меньшей мере одного белка или пептида с IgE по меньшей мере одной сыворотки у индивидуума, который чувствителен по меньшей мере к одному источнику аллергена, контактирование указанного по меньшей мере одного белка или пептида, проявляющего IgE-связывающую способность, с базофильными клетками, эозинофильными клетками или тучными клетками и идентификацию по меньшей мере одного белка или пептида как аллергена, если указанные базофильные клетки, эозинофильные клетки или тучные клетки выделяют по меньшей мере один медиатор после контакта с указанным по меньшей мере одним белком или пептидом.
Способ по настоящему изобретению особенно эффективен для идентификации белков и пептидов, проявляющих аллергенные свойства. Для идентификации аллергенных свойств белков или пептидов требуются только количества в диапазоне микрограммов или нанограммов. Эти белки и пептиды кодируются библиотекой ДНК или кДНК, которую получают из источника, о котором известно, что он содержит или синтезирует белки и/или пептиды, индуцирующие аллергенную реакцию индивидуума. Этот аллергенный источник может содержать различные типы тканей и клеток, которые могут быть ответственными за биосинтез этих аллергенов. Если эти клетки и ткани известны, можно создавать специфически библиотеки ДНК или кДНК из указанных клеток и тканей, которые могут быть использованы в способе в соответствии с настоящим изобретением. Например, аллергены молока млекопитающего, в частности, из коровы, могут быть идентифицированы выделением ДНК или кДНК из ткани молочной железы лактирующих млекопитающих.
Экспрессированные белки и пептиды экспрессионной библиотеки ДНК и кДНК контактируют с IgE по меньшей мере одной сыворотки по меньшей мере одного индивидуума, который чувствителен по меньшей мере к одному источнику аллергена. В этой первой стадии идентифицируют те белки и пептиды, которые способны связываться с IgE, что является необходимой предпосылкой для аллергических реакций. Термин "IgE-реактивный" по настоящему изобретению означает способность аминокислотной последовательности связывать IgE. В следующей стадии пептиды и белки, связывающиеся с IgE, дополнительно контактируют с базофильными клетками, эозинофильными клетками или тучными клетками, которые были предварительно загружены IgE по меньшей мере из одного индивидуума, о котором известно, что он является аллергическим против по меньшей мере одного аллергена этого источника аллергенов. Базофильные клетки, эозинофильные клетки или тучные клетки, несущие аллерген-специфические IgE-молекулы, высвобождают после контакта с соответствующим аллергеном медиаторы, такие как гистамин и/или другие аллергические медиаторы, высвобождаемые базофильными клетками, эозинофильными клетками или тучными клетками, что указывает на то, что пептиды и белки, способные связываться с IgE, способны также индуцировать дегрануляцию базофильных клеток, эозинофильных клеток или тучных клеток после контактирования с этими клетками. Подходящими аллергенными медиаторами являются, предпочтительно, гистамин, гепарин, простагландин, лейкотриен, хемокины, цитокины. Другие аллергенные медиаторы, которые могут быть использованы в контексте настоящего изобретения, включают β-гексозаминидазу, пероксидазу эозинофилов, рибонуклеазу (РНКазу), дезоксирибонуклеазу, липазу, плазминоген и большой основной белок. Среднему специалисту в данной области хорошо известны медиаторы, выделяемые клетками, которые могут быть идентифицированы при помощи описанных в руководствах способов (см., например, Janeway et al. 2002: Immunology, Spektrum Akademischer Verlag; Auflage: 5. Auflage; Paul et al. 1989: Fundamental Immunology, Raven Press Ltd.; Second edition).
Члены библиотеки ДНК или кДНК, которые связываются с IgE аллергенного индивидуума и способны индуцировать дегрануляцию базофильных клеток, эозинофильных клеток или тучных клеток, могут быть выделены, и их ДНК- или кДНК-инсерт может быть секвенирован способами, известными в данной области. Альтернативно, белки и пептиды, экспрессируемые соответствующими членами библиотеки, могут быть выделены способами, известными в данной области, и анализированы, например, масс-спектроскопией или секвенированием аминокислот.
Члены библиотеки ДНК или кДНК могут быть получены из любого источника, несущего биологический материал, о котором известно или неизвестно, что он индуцирует аллергические реакции при контакте с индивидуумом. Таким образом, термин "источник аллергенов" относится в контексте настоящего изобретения к любому типу биологического материала, способному синтезировать аллергены.
Термин "пептид" или "белок" предназначен для обозначения последовательности аминокислот, удерживаемых вместе пептидными связями. "Пептид” обозначает в данном контексте, что содержащая аминокислоты молекула содержит по существу до 250 аминокислотных остатков, например, до 200 аминокислотных остатков, например, до 150 аминокислотных остатков, например, до 100 аминокислотных остатков, например, до 50 аминокислотных остатков, например, до 45 аминокислотных остатков, в частности, до 40 аминокислотных остатков, например, до 30 аминокислотных остатков, например, до 20 аминокислотных остатков и, предпочтительно, более 2 аминокислотных остатков. "Белок” обозначает, в данном контексте, что эта содержащая аминокислоты молекула содержит по существу более 250 аминокислот. В этом более высоком диапазоне (т.е. около 250 аминокислот) настоящее изобретение может использовать термин белок и пептид для одного и того же типа молекулы.
Аллергены (вещества, которые способны вызывать аллергенную реакцию индивидуума) синтезируются различными организмами, в том числе растениями и животными. Согласно предпочтительному варианту изобретения по меньшей мере одним источником аллергенов является животное, более конкретно, млекопитающее. Известно, что животные являются источником аллергенов. Эти аллергены обычно присутствуют в животных (например, кошке и собаке) в перхоти или кожных чешуйках, а также в слюне и моче. Млекопитающие, например, секретируют аллергены также в молоко. Таким образом, млекопитающие, такие как корова, лошадь, коза, овца, верблюд и буйвол, могут содержать высокое количество аллергенов. кДНК и ДНК, используемые для идентификации таких аллергенов, могут быть выделены из лактирующих млекопитающих, таким образом, ДНК или кДНК получают, предпочтительно, из ткани молочной железы.
Другим источником аллергенов являются клещи, например, как клещи домашней пыли, рыба, яйца и т.д. Известно, что эти животные продуцируют вещества, которые вызывают аллергическую реакцию в индивидуумах.
Следующим источником аллергенов являются растения. Известно, в частности, что злаковые сорняки и орехи являются высокоаллергенными. Конечно, деревья, такие как береза, также являются источником аллергенов.
ДНК (такая как геномная ДНК и другие типы ДНК, за исключением кДНК) или кДНК может быть получена из источника аллергенов, такого как молоко млекопитающих, предпочтительно, молоко коровы, или пищевые композиции, содержащие молоко млекопитающего, предпочтительно, молоко коровы, способами, известными в данной области. Эти молекулы нуклеиновых кислот получают предпочтительно, из клеток и тканей, о которых известно или предполагается, что они продуцируют аллергены. Однако для уменьшения количества клонов, подлежащих скринингу для идентификации аллергенов, предпочтительно, встраивать молекулы кДНК (кДНК-молекулы получают из мРНК) в экспрессионные библиотеки, так как эти молекулы отражают пул белков и пептидов, экспрессируемых в соответствующих клетках и ткани. Согласно настоящему изобретению, для получения кДНК из клетки, которая экспрессирует (потенциально) аллерген, может быть использован любой способ. Такие способы хорошо известны среднему специалисту в данной области (см., например, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 2nd ED. (1989) и Ausubel, F. M. et al., "Current Protocols in Molecular Biology," (Current Protocol, 1994)). Имеются также многочисленные коммерчески доступные наборы для получения двухцепочечной кДНК, например, набор Superscript II или Superscript III (Invitrogen, USA, номер по каталогу 18580008), набор для синтеза кДНК большой длины (Clontech, USA, номер по каталогу K-1048-1), набор для синтеза кДНК (Stratagene, USA, номер по каталогу 200301) и т.п.
Молекулы кДНК и ДНК могут быть лигированы с линкерными ДНК-последовательностями, содержащими подходящие сайты узнавания рестрикционных ферментов. Такие линкерные ДНК также известны в данной области и коммерчески доступны, например, из Promega Corporation, USA и из New England Bioiabs, USA. Эти молекулы кДНК и ДНК могут быть дополнительно подвергнуты расщеплению рестрикционными ферментами, фракционированию по размеру на колонках или гелях или с использованием любого другого подходящего способа, известного среднему специалисту в данной области.
изопропилтиол-b-D-галактозида
E. coli, Streptomyces
Salmonella typhimurium
Затем библиотеку кДНК или ДНК встраивают в экспрессирующие векторы, которые могут содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую метку, последовательности, которые управляют репликацией ДНК в бактериальных клетках, последовательности, которые управляют транскрипцией ДНК и трансляцией мРНК в эукариотических клетках и т.п. Подходящие экспрессирующие векторы, которые содержат описанные регуляторные элементы, известные в данной области. кДНК- или ДНК-молекула, описанная в настоящей заявке выше, может быть сконструирована для прямого введения или для введения посредством липосом, фаговых векторов или вирусных векторов (например, аденовирусных, ретровирусных) в клетку. Характерные экспрессирующие векторы млекопитающих содержат промоторный элемент, который опосредует инициацию транскрипции мРНК, кодирующую белок последовательность и сигналы, необходимые для терминации транскрипции и полиаденилирования транскрипта. Кроме того, могут быть также включены такие элементы, как сайт инициации репликации, ген устойчивости к лекарственным средствам, регуляторы (в виде части индуцируемого промотора). Промотор lac является типичным индуцируемым промотором, применимым для прокариотических клеток, который может быть индуцирован с использованием лактозного аналога  ("IPTG"). Для рекомбинантной экспрессии и секреции может быть лигирована представляющая интерес молекула кДНК или ДНК (как описано в Ghahroudi et al, 1997, FEBS Letters 414:521-526). Дополнительные элементы могут включать в себя энхансеры, последовательности Козака и промежуточные последовательности, фланкированные донорным и акцепторным сайтами для сплайсинга РНК. Высокоэффективная транскрипция может достигаться с ранними и поздними промоторами из SV40, длинными концевыми повторами (LTR) из ретровирусов, например, RSV, HTLVI, HIVI, и ранним промотором цитомегаловируса (CMV). Однако могут быть также использованы клеточные элементы (например, промотор актина человека). Альтернативно, рекомбинантный белок или пептид может быть экспрессирован в стабильных клеточных линиях, которые содержат эту генную конструкцию, интегрированную в хромосому. Котрансфекция с селектируемым маркером, таким как dhfr, gpt, неомицин, гигромицин, позволяет идентифицировать и выделить трансфицированные клетки. Экспрессирующие векторы будут предпочтительно включать в себя по меньшей мере один селектируемый маркер. Репрезентативные примеры подходящих хозяев включают в себя, но не ограничиваются ими, бактериальные клетки, такие как клетки  и ; грибные клетки, такие как дрожжевые клетки; клетки насекомых, такие как клетки Drosophila S2 и Spodoptera Sf9; клетки животных, такие как CHO, COS, 293 и клетки меланомы Bowes; и клетки растений. Подходящие культуральные среды и условия для вышеописанных клеток-хозяев известны в данной области. Инсертирование библиотеки молекул кДНК и ДНК (пула кДНК или ДНК конкретной клетки или ткани) приводит к экспрессионным библиотекам.
Экспрессионной библиотекой, используемой для экспрессии молекул кДНК и ДНК источника аллергенов, является, предпочтительно, библиотека фагового дисплея или бактериальная экспрессионная библиотека. Затем члены ("конструкции") этих библиотек встраивают в клетки, способные экспрессировать белки и пептиды, кодируемые этими кДНК и ДНК. Предпочтительные клетки выбирают в зависимости от типа векторов, используемых для создания библиотек кДНК и ДНК. Если эти векторы предназначены для бактериальной экспрессии, эти клетки являются бактериальными клетками. Эти библиотеки кДНК и ДНК вводят в клетки с использованием способов (например, трансформации), хорошо известных среднему специалисту в данной области и описанных, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, N.Y. 1989). Следующие стадии культивирования бактериальных клеток для отбора трансформантов и получения индивидуальных бактериальных колоний (клонов) хорошо известны в данной области. После отбора трансформантов на чашках с агаром культивируемые бактериальные колонии могут быть извлечены из агара индивидуально и использованы для инокуляции жидких культуральных сред, расположенных рядами в виде решетки с образованием решетчатых исходных бактериальных запасов, например, в 96-луночных микротитрационных планшетах. Это размещение делает возможным репрезентативный рост каждого бактериального клона в отдельной лунке и облегчает последующий суб-отбор пулов клонов с положительной оценкой.
Особенно предпочтительно использовать векторы для экспрессионной библиотеки, которые способны секретировать продуцируемые белки и пептиды в наружное пространство клетки. Секретируемые белки и пептиды могут дополнительно содержать заякоривающийся в мембране домен, который позволяет иммобилизовать экспрессируемые молекулы на поверхности этих клеток. Способы и средства для получения таких библиотек известны среднему специалисту в данной области.
Для определения связывания аллерген-специфических IgE-молекул с пептидами и/или белками, кодируемыми библиотеками кДНК и ДНК, по меньшей мере один белок или пептид иммобилизуют на твердом носителе. Затем твердый носитель вступает в контакт с IgE-молекулами, полученными из индивидуумов, страдающих от аллергии, и определяют связывание указанных IgE-молекул на указанном твердом носителе.
Связывание IgE с белками и пептидами, иммобилизованными на твердом носителе, может достигаться с использованием антител или их фрагментов, способных связываться с IgE. Такие антитела хорошо известны в данной области.
Твердым носителем для использования в соответствии с настоящим изобретением может быть мембрана, предпочтительно нитроцеллюлозная мембрана. В одном особенно предпочтительном варианте осуществления эти мембраны контактируют с бактериальными колониями, несущими библиотеку кДНК или ДНК, присутствующими на чашке с агаром, для образования реплики этих колоний. Эта реплика может быть использована для детектирования связывания аллерген-специфических IgE с конкретными колониями.
Базофильные клетки, эозинофильные клетки или тучные клетки, которые были загружены аллерген-специфическим IgE из индивидуумов, страдающих от аллергии, могут быть использованы для определения аллергенного потенциала белков или пептидов, кодируемых библиотекой ДНК или кДНК. Эти базофильные клетки, эозинофильные клетки или тучные клетки могут быть клетками любого млекопитающего, причем предпочтительно использование гуманизированных клеток базофильного лейкоза крысы (RBL) (например, клона RBL-703/21). Клетки могут быть гуманизированы введением и экспрессией ДНК, которая кодирует весь Fc-рецептор человека или часть Fc-рецептора человека, предпочтительно, ДНК, которая кодирует весь IgE-рецептор I человека или часть IgE-рецептора человека. Способы получения гуманизированных клеток известны в данной области. Предпочтительно для получения культур гуманизированных клеток используют способ, описанный в Hoffmann et al. (loc. lit.). Способы получения очищенных базофилов описаны Kleine Budde et al. (Int Arch Allergy Immunol, 126(4)).
После идентификации белков/пептидов, которые способны связываться с аллерген-специфическим IgE, определяют предпочтительно аминокислотную последовательность по меньшей мере одного белка или пептида, проявляющего IgE-связывающую способность, определенную в стадии с), и этот по меньшей мере один белок или пептид, который способен связываться с аллерген-специфическим IgE, химически синтезируют или получают рекомбинантно перед стадией d), и он может быть использован в стадии d).
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения способ по настоящему изобретению дополнительно включает стадию определения аминокислотной последовательности по меньшей мере одного белка или пептида, идентифицированного в стадии е).
Аминокислотная последовательность белков или пептидов, кодируемых и экспрессируемых этой библиотекой ДНК или кДНК, может быть определена, например, масс-спектрометрией или при помощи деградации Эдмана. При использовании такого способа, белки и/или пептиды, экспрессируемые библиотекой ДНК или кДНК, должны быть выделены перед секвенированием аминокислот. Выделение может достигаться способами, известными в данной области. Для облегчения выделения этих белков и пептидов они могут быть слиты с меткой (например, гистидиновой меткой). Альтернативно, можно также выделить соответствующий клон ДНК или кДНК и секвенировать инсерт ДНК или кДНК.
Подходящие способы определения аминокислотной последовательности белков и пептидов включают в себя, но не ограничиваются ими, деградацию Эдмана, (тандемную) масс-спектрометрию и т.п. (см., например, Edman, P. Mol. Biol. Biochem. Biophys., (1970), 8:211-255; US 6799121). Аминокислотная последовательность белков и пептидов может быть сравнена с аминокислотными последовательностями известных белков.
Термин "масс-спектрометрия" включает в себя в данном контексте различные способы, такие как тандемная масс-спектрометрия, выполняемая на основе матрикса лазерная десорбционная/ионизационная (MALDI) с измерением времени пролета индивидуальных ионов (TOF) масс-спектрометрия, масс-спектрометрия MALDI-TOF-TOF, масс-спектрометрия MALDI Quadrupole-time-of-flight (время пролета) (Q-TOF), масс-спектрометрия с ионизацией распылением электронов (ESI)-TOF, ESI-Q-TOF, ESI-TOF-TOF, масс-спектрометрия ECI с ионной ловушкой (ion trap), ESI Triple quadrupole-масс-спектрометрия, масс-спектрометрия ESI с преобразованием Фурье (FTMS), MALDI-FTMS, MALDI-Ion Trap-TOF и ESI-Ion Trap-TOF. Эти способы масс-спектрометрии хорошо известны в данной области (см., например, Gary Siuzdak, "Mass Spectrometry for Biotechnology", Academic Press, NY, (1996)). При ее наиболее базовом уровне, масс-спектрометрия включает в себя ионизацию молекулы и затем измерение массы полученного иона. Поскольку молекулы ионизируются способом, который хорошо известен, молекулярная масса молекулы может быть обычно точно определена из массы этого иона. Например, тандемная масс-спектрометрия может быть использована для идентификации белков, так как она может обеспечивать информацию, кроме молекулярной массы исходного иона. Тандемная масс-спектрометрия включает в себя получение сначала масс-спектра, представляющего интерес иона, затем фрагментирование этого иона и получение масс-спектра фрагментов. Таким образом, тандемная масс-спектрометрия обеспечивает информацию как о молекулярной массе, так и о распределении (паттерне) фрагментации, которая может быть использована в комбинации вместе с информацией о молекулярной массе для идентификации точной последовательности пептида или белка (см., например, Hunt et al. (1986) PNAS USA 83:6233-6237; Shevchenko et al, (1996) PNAS USA 93:14440-14445; Figeys et al. (1996) Anal. Chem. 68:1822-1828 и Wilm et al. (1996) Nature 379:466-469.
Как упоминалось, другой аспект настоящего изобретения относится к способу идентификации аллергенных белков и/или пептидов молока, включающему стадии получения по меньшей мере одной экспрессионной библиотеки, содержащей ДНК или кДНК, полученную из ткани молочной железы лактирующего млекопитающего, предпочтительно, лактирующей коровы, экспрессии по меньшей мере одного белка или пептида, кодируемого указанной экспрессионной библиотекой, определения связывающей способности указанного по меньшей мере одного белка или пептида с IgE по меньшей мере одной сыворотки у индивидуума, который чувствителен к молоку млекопитающего, предпочтительно, молоку коровы, контактирования указанного по меньшей мере одного белка или пептида, проявляющего IgE-связывающую способность, с базофильными клетками, эозинофильными клетками или тучными клетками и идентификации по меньшей мере одного белка или пептида как аллергена, если указанные базофильные клетки, эозинофильные клетки или тучные клетки выделяют по меньшей мере один медиатор после контакта с указанным по меньшей мере одним белком или пептидом. В другом аспекте изобретения, этот способ дополнительно включает стадию определения аминокислотной последовательности по меньшей мере одного белка или пептида, идентифицированного при помощи обсуждаемого ранее способа. Таким образом, способ по изобретению для идентификации аллергических белков и/или пептидов, описанный выше, предпочтительно используют для идентификации аллергенных белков и/или пептидов молока. Таким образом, все приведенные выше определения и предпочтительный аспект применимы также к этому аспекту настоящего изобретения.
Дополнительный аспект изобретения относится к способу детектирования аллергенности содержащей молоко коровы пробе, включающему стадию определения присутствия по меньшей мере одного белка или пептида из фиг.1A, 1B и 1C (SEQ ID NO:22-84) и таблицы 1A, 1B и таблицы 2 (SEQ ID NO:1-21). Термин "содержащая молоко млекопитающего, предпочтительно, содержащая молоко коровы проба" в соответствии с данной заявкой, относится к пищевой пробе или питательной пробе, содержащей молоко млекопитающего, предпочтительно, молоко коровы. Неограничивающими примерами являются молоко (коровы), творог, сливки, масло, йогурт и пищевой продукт, содержащий любые из этих продуктов. В указанной содержащей молоко, предпочтительно, молоко коровы, пробе указанный по меньшей мере один из белков или пептидов присутствует в количестве, которое позволяет определение аллергенности содержащей молоко, предпочтительно, молоко коровы, пробы. Обычно количество в диапазоне микрограммов или нанограммов белка или пептида является достаточным для определения аллергенности.
,
Белки и пептиды, идентифицированные на фиг.1A 1B и 1C (SEQ ID NO:22-84) и таблице 1A, 1B и таблице 2 (SEQ ID NO:1-21), могут быть использованы для определения, содержит ли проба, содержащая молоко коровы, аллергенные молекулы. Если только один из указанных белков или пептидов присутствует в содержащей молоко коровы пробе, эта проба считается являющейся аллергенной пробой.
Способ по настоящему изобретению особенно пригоден для определения аллергенности гидролизованного молока млекопитающих, в частности молока коровы.
,
По меньшей мере один белок или пептид определяют предпочтительно при помощи иммуноанализа, с использованием антител или их фрагментов, связывающихся с белками и пептидами, идентифицированными на фиг.1A 1B и 1C (SEQ ID NO:22-84) и таблице 1A, 1B и таблице 2 (SEQ ID NO:1-21).
По меньшей мере один белок и/или пептид, предпочтительно, определяют при помощи масс-спектрометрии. Для идентификации компонентов молока млекопитающих, предпочтительно, молока коровы, присутствующих в пробе, содержащей молоко млекопитающих, предпочтительно, молоко коровы, может быть использована масс-спектрометрия. Масс-спектрометрия позволяет идентифицировать компоненты молока, идентифицированные на фиг.1A, 1B и 1C (SEQ ID NO:22-84) и таблице 1A, 1B и таблице 2 (SEQ ID NO:1-21). Сравнение между фрагментами, присутствующими в этой пробе, с белками и пептидами фиг.1A, 1B и 1C (SEQ ID NO:22-84) и таблиц 1A, 1B и таблицы 2 (SEQ ID NO:1-21) позволяет определить, содержит ли указанная проба аллергенные вещества, полученные из молока коровы.
Для достижения лучших результатов белки и пептиды, присутствующие в этой пробе, предпочтительно, выделяют перед масс-спектрометрией. Это выделение может выполняться электрофоретическим способом, предпочтительно, двухмерным электрофорезом, или высокоэффективной жидкостной хроматографией.
Скрининг продукта/белков/пептидов в анализе связывания IgE (стадии с)) и дегрануляции (утраты зернистости) базофильных (гуманизированных тучных клеток) действительно обеспечивает данные о потенциальной аллергенности, и эти способы используют в клинической практике. Однако данные экспрессионной библиотеки кДНК будут пополнять перечень потенциальных аллергенных пептидов/пептидных последовательностей в отношении конкретных аллергенов (например, молока коровы). Настоящее изобретение объединяет эти способы (улучшенное детектирование потенциальных аллергенных структур), позволяя использовать масс-спектрометрию для подтверждения присутствия этих потенциальных аллергенных структур в матриксах продуктов. Это объединение базы данных последовательностей аллергенных белков и пептидов молока, установленных в комбинации с IgE-реактивностью и дегрануляцией (биоактивностью), служит в качестве основы для развития более надежного, чувствительного и репродуцируемого способа для оценивания и предсказания аллергенности продуктов, содержащих молоко. Хотя сходный способ был использован для идентификации аллергенов пыльцы злаковых трав (Ball et al. 1994, Journal of Biological Chemistry, Vol.269; Issue of Nov 11, pp.28323-28328), открытия настоящего изобретения являются тем не менее неожиданными, так как средний специалист не мог бы предполагать, что способ, описанный Ball et al. 1994, или сходный способ мог бы быть успешно применен к аллергенам молока. Для дальнейшего объяснения, IgE-связывание аллергенов злаковых трав, а также IgE-связывание с другими респираторными аллергенами решающим образом зависит от аминокислотных остатков, которые распределены по всему аллергену. Так, аллергены пыльцы злаковых трав и респираторные аллергены обычно собираются в конформационные (перемежающиеся) IgE-эпитопы. Vrtatla et al. (J. Clin. Invest, Vol.99, № 7, pp.1673-1681) показывают, что потеря этой конформации, например, в рекомбинантных фрагментах, полученных из конформационных аллергенов, приводит к значительно уменьшенной способности IgE-связывания и высвобождения гистамина из базофилов пациентов. В отличие от аллергенов злаковых трав и респираторных аллергенов, аллергены молока и пищевые аллергены обычно имеют эпитопы, которые являются не конформационными, а развернутыми (Jarvinen et al., Int Arch Allergy Immunol, Vol.126, pp.111-118 и Jarvinen et al., Allergy, Vol.62, pp.758-765). Таким образом, известный уровень техники признавал только IgE-связывание развернутых аллергенов, полученных из молока и яйца. Высвобождение медиатора из базофильных клеток, тучных клеток и эозинофильных клеток не было показано или не предполагалось, насколько известно авторам настоящего изобретения. При рассмотрении утверждений Vrtatla et al. (loc. lit.) средний специалист мог бы предположить, что фрагменты аллергенов и рекомбинантно полученные аллергены молока, которые не имеют IgE-реактивности, не имеют также способности индуцирования высвобождения гистамина из базофилов пациента. Подобным образом, при рассмотрении утверждений Vrtatia et al. (loc. lit.) квалифицированный специалист мог бы предположить, что фрагменты аллергенов и рекомбинантно полученные аллергены молока, которые имеют IgE-реактивность, имеют также способность индуцирования высвобождения гистамина из базофилов пациента. Таким образом, стадия дополнительного тестирования высвобождения гистамина IgE-реактивными белками и пептидами молока казалась ненужной в соответствии с уровнем техники. В противоположность этому, авторы изобретения неожиданно обнаружили, что только способ, включающий стадии IgE-реактивности и высвобождения медиатора из базофильных клеток, тучных клеток или эозинофильных клеток, может надежно идентифицировать аллергенные белки и пептиды молока. Кроме того, следует отметить, что только объединенное тестирование IgE-реактивности и высвобождения медиатора позволяет надежным образом оценивать аллергенность белка или пептида, полученного из молока. В зависимости от подлежащего тестированию индивидуума белки и пептиды могут либо индуцировать, либо не индуцировать высвобождение медиатора. Таким образом, неаллергенные белки и пептиды, которые имеют только IgE-реактивность без опосредования высвобождения медиатора из базофильных клеток, тучных клеток или эозинофильных клеток, могут быть отделены от аллергенных белков или пептидов (аллергенов). Таким образом, только способ согласно этому изобретению может надежным образом оценивать аллергенность белка или пептида по изобретению для конкретного индивидуума, т.е. специфически отделять от неаллергенного IgE-связывания. В частности, неожиданным образом способы по изобретению привели к идентификации пептидов, показанных в таблицах 1А, 1В и таблице 2 (SEQ ID NO:1-22), так как все эти пептиды являются развернутыми пептидами и, следовательно, не имеют конформационных эпитопов.
Один улучшенный способ детектирования потенциальных аллергенов с использованием экспрессионной библиотеки кДНК довел до конца фаговую систему экспрессии пептидов и функциональный скрининг с использованием IgE-связывания и IgE-опосредованной дегрануляции базофильных клеток, дегрануляции эозинофильных клеток и дегрануляции тучных клеток. Этот подход позволяет проводить мониторинг/скрининг и прогноз (предсказание) присутствия потенциальных пищевых аллергенов в необработанных материалах, ингредиентах и конечном продукте для цели развития и производства пищевых композиций.
Аллергенные белки или пептиды, конкретно описанные в настоящем описании или идентифицированные описанными способами по изобретению, могут быть использованы для диагностики аллергии или предрасположенности к аллергии у индивидуума, предпочтительно, аллергии на молоко, или предрасположенности к аллергии на молоко. Таким образом, в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу диагностики аллергии или предрасположенности к аллергии у индивидуума, включающему введение по меньшей мере одного аллергенного белка или пептида, конкретно описанного в настоящем описании или идентифицированного описанными в настоящем описании способами, индивидууму, предположительно являющемуся аллергическим или развивающим аллергию, и оценивание, возникает ли у этого индивидуума аллергическая реакция против белка или пептида. Средства и способы введения описаны в настоящем описании ниже.
Диагностика аллергии обычно включает кожный тест или анализ крови для обнаружения, какое вещество, или какой аллерген может запускать аллергическую реакцию у индивидуума. Обычно предпочтительными являются кожные тесты, так как они являются быстрыми, надежными и обычно менее дорогими, чем анализы крови, но может быть использован любой тип теста. Для кожного теста подходящее количество по меньшей мере одного аллергенного белка или пептида, конкретно описанного в настоящем описании или идентифицированного описанными в настоящем описании способами, помещают на кожу или под кожу для определения, развивается ли аллергическая реакция. Предпочтительными являются три типа тестов: (1) Кожный аллергический тест уколом выполняют помещением капли раствора, содержащего указанный по меньшей мере один аллергенный белок или пептид (раствора аллергена), на кожу, и несколько царапин или уколов иглой позволяют этому раствору входить в кожу. Если кожа развивает красную, вызывающую зуд зону (называемую пустулой), это обычно означает, что этот индивид является аллергиком к этому аллергену. Это называют положительной реакцией. (2) Во время внутрикожного теста, небольшое количество раствора аллергена инъецируют в кожу. Внутрикожный аллерготест может выполняться, когда вещество не вызывает реакции в кожном прик-тесте, но все еще предположительно является аллергеном для этого индивида. (3) Для аппликационной кожной пробы раствор аллергена помещают на контактную подкладку, которую приклеивают к коже на приблизительно 24-72 часа. Этот тест используется для детектирования кожной аллергии, называемой контактным дерматитом. В анализе крови аллергия у индивидуума может быть определена посредством стадий: (i) контактирования по меньшей мере одного белка или пептида, идентифицированного способами по изобретению или конкретно описанного в настоящем описании, с пробой крови, пробой сыворотки или пробы плазмы указанного индивидуума и (ii) определения, связывается ли указанный по меньшей мере один белок или пептид с IgE-антителом в указанной пробе крови, пробе сыворотки или пробе плазмы, причем связывание указанного по меньшей мере одного белка или пептида с IgE-антителом указывает на аллергию или предрасположенность к аллергии у указанного индивидуума; и/или (i') контактирования по меньшей мере одного белка или пептида, идентифицированного способами по изобретению или конкретно описанного в настоящем описании, с базофильными клетками, эозинофильными клетками или тучными клетками указанного индивидуума, и (ii') определения, выделяют ли указанные базофильные клетки, эозинофильные клетки или тучные клетки по меньшей мере один медиатор или дегранулируются ли (утрачивают зернистость) после контакта по меньшей мере с одним белком или пептидом, причем выделение указанного по меньшей мере одного медиатора после контакта с указанным по меньшей мере одним белком или пептидом или дегрануляция после контакта с указанным по меньшей мере одним белком или пептидом указывает на аллергию или предрасположенность к аллергии у указанного индивидуума.
Кроме того, в соответствии с другим вариантом осуществления изобретения, аллергенные белки или пептиды, конкретно описанные в настоящем описании или идентифицированные описанными способами по изобретению, могут быть использованы в аллерген-иммунотерапии аллергии у индивидуума. Таким образом, один вариант осуществления изобретения относится к способу аллерген-иммунотерапии аллергии у индивидуума, включающему введение по меньшей мере одного аллергенного белка или пептида, конкретно описанного в настоящем описании или идентифицированного описанными в настоящем описании способами. Предпочтительно, эта аллергия является аллергией на молоко.
Аллерген-иммунотерапия (также называемая гипосенсибилизирующей терапией, иммунологической десенсибилизацией или аллерген-специфической иммунотерапией) в соответствии с настоящим изобретением является формой иммунотерапии для аллергенных нарушений, в которых пациента вакцинируют увеличивающимися дозами аллергена с целью индуцирования иммунологической толерантности. Антиген-иммунотерапия является единственной стратегией лечения, которая лечит основное заболевание аллергического нарушения. Она представляет собой высоко эффективную стратегию лечения, которая приводит к улучшенному качеству жизни и уменьшению аллергических и связанных с аллергеном симптомов. Было показано, что иммунотерапия дает долгосрочную ремиссию аллергических симптомов, уменьшает тяжесть ассоциированных аллергических реакций, а также уменьшает шансы развития новых сенсибилизаций к аллергенам. Это достигается посредством иммунотерапии, модулирующей реакцию иммунной системы на аллергены. Аллерген-иммунотерапия может либо уменьшать необходимость в лекарственной терапии, тяжесть симптомов, либо элиминировать аллергию вообще. Кроме того, аллерген-специфическая иммунотерапия является единственной возможностью лечения, о которой известно, что она модифицирует процесс заболевания аллергии (с возможным шансом излечения этого заболевания), тогда как другие терапии лишь подавляют симптомы аллергии.
Предпочтительно, по меньшей мере один белок или пептид по изобретению для использования в любом из описанных в настоящем описании способов или применений присутствует в фармацевтической композиции. Согласно настоящему изобретению, термин "фармацевтическая композиция" относится к композиции для введения пациенту, предпочтительно, пациенту-человеку. Фармацевтическая композиция по изобретению содержит описанные в настоящем описании соединения. Иногда она может содержать дополнительные молекулы, способные изменять характеристики соединений по изобретению, стабилизируя, модулируя и/или активируя тем самым их функцию. Эта композиция может находиться в твердой, жидкой или газообразной форме и может, inter alia, быть в форме порошка (порошков), таблетки (таблеток), раствора (растворов) или аэрозоля (аэрозолей). Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может необязательно или дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель. Примеры подходящих фармацевтических носителей хорошо известны в данной области и включают в себя забуференные фосфатом солевые растворы, воду, эмульсии, такие как эмульсия типа масло/вода, различные типы увлажняющих агентов, стерильные растворы, органические растворители, в том числе ДМСО, и т.д. Композиции, содержащие такие носители, могут быть приготовлены хорошо известными общепринятыми способами. Фармацевтические композиции могут вводиться индивиду в подходящей дозе. Схема введения доз будет определяться лечащим врачом и зависеть от клинических факторов. Как хорошо известно в областях медицины, дозы для любого индивида зависят от многих факторов, включающих размер пациента, площадь поверхности тела, возраст, конкретное подлежащее введению соединение, пол, время и способ введения, общее здоровье и другие лекарственные средства, вводимые одновременно. Терапевтически эффективное количество для конкретной ситуации может быть легко определено рутинным экспериментированием и находится в рамках квалификации и суждения обычного клинициста или врача. Фармацевтическая композиция для применения в соответствии с настоящим изобретением может быть приготовлена общепринятым способом в соответствии со способами, известными в данной области, с использованием одного или нескольких физиологических носителей или эксципиента, см., например, Ansel et al., "Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems", 7th edition, Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 1999. Фармацевтическая композиция может, следовательно, вводиться перорально, парентерально, например, подкожно, внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутриоболочечно, чрезкожно, через слизистую оболочку, субдурально, местно или локально через ионтофорез, подъязычно, посредством ингаляционного спрея, аэрозоля или ректально и т.п. в унифицированных лекарственных формах, необязательно содержащих общепринятые фармацевтически приемлемые эксципиенты. Фармацевтическая композиция по изобретению может вводиться в виде единственного активного агента или может вводиться в комбинации с другими агентами.
В другом варианте осуществления изобретение относится к способу определения аллергии или предрасположенности к аллергии у индивидуума, включающему контактирование по меньшей мере одного белка или пептида, описанного в настоящем описании или идентифицированного описанными в настоящем описании способами, с базофильными клетками, эозинофильными клетками или тучными клетками, выделенными из указанного индивидуума, и идентификацию по меньшей мере одного белка или пептида как аллергенного у указанного индивидуума, когда указанные базофильные клетки, эозинофильные клетки или тучные клетки выделяют после контакта с по меньшей мере одним белком или пептидом по меньшей мере один медиатор или дегранулируются после контакта по меньшей мере с одним белком или пептидом. В дополнительном варианте изобретения эта аллергия или предрасположенность к аллергии является аллергией на молоко или предрасположенность к аллергии на молоко. В одном дополнительном варианте изобретения эти способы для диагностики аллергии или предрасположенности к аллергии дополнительно включают в себя выделение индивидуумов с тяжелой аллергией от индивидуумов, которые чувствительны, но бессимптомны, и/или выделение индивидуумов, которые с возрастом утрачивают аллергию, от индивидуумов, которые с возрастом не утрачивают аллергию. В этом отношении, термин "утрачивают аллергию" означает, что аллергия не является стойкой, а будет уменьшаться или предпочтительно исчезать при увеличении возраста индивидуума, имеющего аллергию. В этом смысле, предпочтительным является случай, когда индивид с возрастом утрачивает аллергию, которую он имел в детстве, и не является аллергическим, когда он становится взрослым.
По меньшей мере один белок или пептид способа определения аллергии или предрасположенности к аллергии у индивидуума может быть иммобилизован на твердом носителе (например, нитроцеллюлозе). Твердый носитель после этого контактирует с базофильными клетками, эозинофильными клетками или тучными клетками, выделенными из указанного индивидуума и определяют высвобождение медиатора или дегрануляцию. Альтернативно, клетки могут быть иммобилизованы на твердом носителе и контактированы по меньшей мере с одним белком или пептидом. Кроме того, по меньшей мере один белок или пептид может быть белком или пептидом, выделенным из природного источника, или рекомбинантным белком или пептидом, полученным описанными в настоящей заявке выше способами.
В другом варианте осуществления изобретение относится к способу идентификации IgE-реактивного неаллергического белка или пептида молока, кодируемого ДНК или кДНК по меньшей мере одной экспрессионной библиотеки, включающему стадии: а) получения по меньшей мере одной экспрессионной библиотеки, содержащей ДНК или кДНК, полученную из ткани молочной железы лактирующего млекопитающего, предпочтительно, лактирующей коровы; b) экспрессии по меньшей мере одного белка или пептида, кодируемого указанной экспрессионной библиотекой; c) определения связывающей способности указанного по меньшей мере одного белка или пептида с IgE по меньшей мере одной сыворотки у индивидуума, который чувствителен к молоку млекопитающего, предпочтительно, молоку коровы; d) контактирования по меньшей мере одного белка или пептида, проявляющего IgE-связывающую способность, определенную в стадии с), с базофильными клетками, эозинофильными клетками или тучными клетками, e) определения, (i) выделяют ли указанные базофильные клетки, эозинофильные клетки или тучные клетки после контакта по меньшей мере с одним белком или пептидом по меньшей мере один медиатор, или (ii) дегранулируются ли после контакта по меньшей мере с одним белком или пептидом, и f) идентификации по меньшей мере одного белка или пептида как неаллергена, если указанные базофильные клетки, эозинофильные клетки или тучные клетки (i') не высвобождают после контакта по меньшей мере с одним белком или пептидом по меньшей мере один медиатор, или (ii') не дегранулируются после контакта по меньшей мере с одним белком или пептидом. В этом отношении, отмечается, что неаллергенный белок или пептид может быть обычно IgE-реактивным, но не запускает высвобождение медиатора из базофильных клеток, эозинофильных клеток или тучных клеток или запускает дегрануляцию базофильных клеток, эозинофильных клеток или тучных клеток после контакта с указанными клетками. Таким образом, является ли белок или пептид молока аллергенным или неаллергенным, может быть определено способами по изобретению. Неаллергенные белки или пептиды молока определяют по их IgE-реактивности, но отсутствию аллергенной активности на этих клетках.
IgE-реактивные неаллергенные белки или пептиды молока, идентифицированные способом по настоящему изобретению, могут быть использованы для насыщения связанного с тучными клетками IgE перед воздействием на аллерген и могут быть полезными кандидатами для безопасной иммунотерапии аллергических заболеваний. Таким образом, настоящее изобретение относится к другому варианту способа для лечения аллергии у индивидуума, включающему введение по меньшей мере одного IgE-реактивного неаллергенного белка или пептида молока указанному индивидууму. Предпочтительно, этот по меньшей мере один IgE-реактивный неаллергенный белок или пептид готовят в виде фармацевтической композиции, как описано в настоящей заявке выше.
Примеры иллюстрируют настоящее изобретение. Широкий объем изобретения наилучшим образом понимается со ссылкой на следующие примеры, которые не предназначены для ограничения изобретения этими конкретными примерами.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Идентификация кДНК-последовательностей, кодирующих
-реактивные компоненты молока и их фрагменты
IgE
Для идентификации IgE-реактивных белков и IgE-реактивных фрагментов белков, содержащихся в молоке коровы, сначала конструируют экспрессионную библиотеку кДНК с использованием ткани молочной железы из лактирующей коровы. Эту библиотеку подвергают скринингу с сывороткой пациентов, аллергических в отношении сыворотки молока коровы. Были идентифицированы кДНК, кодирующие IgE-реактивный полноразмерный альфаS1-, альфаS2-, бета-, каппа-казеин и бета-лактоальбумин, а также их IgE-реактивные фрагменты. Это был довольно удивительный результат, так как белки млекопитающих получали в бактериальной системе, которая не добавляет эукариотических посттрансляционных модификаций, которые иногда играют роль в IgE-связывании, как сообщалось для основных клещевых аллергенов домашней пыли (Jacquet et al., 2002). Расшифрованные аминокислотные последовательности показаны на фиг.1A-C (SEQ ID NO:22-84). Полученные IgE-реактивные аллергенные фрагменты позволяют сделать выводы о местоположении IgE-эпитопов.
Экспериментальный протокол
125
Молочные железы коровы получали из коровы (породы "Fleckvieh") и свежую ткань замораживали и хранили при -80°C до использования. Общую РНК из этой ткани выделяли и кДНК получали с использованием Системы синтеза кДНК. Очищенные кДНК встраивали в фаги лямбда с использованием набора для клонирования Lambda gt11/EcoR I/CIAP-Treated/Gigapack III (Stratagene, La JoIIa, CA). Клетки E. coli Y1090 инфицировали этой фаговой библиотекой, высевали на чашки с LB Amp (с диаметром 145 мм). Экспрессию бактериального белка индуцировали с применением нитроцеллюлозной мембраны (Whatman Schleicher & Schueli, Dassel, Germany). Адсорбированные белки инкубировали с сыворотками из пациентов с CMA и связанные IgE-антитела детектировали с использованием I-меченого анти-IgE-антитела (IBL, Hamburg, Germany). Мембраны экспонировали на рентгеновских пленках (Kodak, Rochester, NY). Положительные клоны, белки которых были способны связывать IgE человека, появлялись в виде темных пятен на рентгеновских пленках (один пример радиоавтографа такой мембраны показан на фиг.2).
ДНК фага положительных клонов амплифицировали с использованием прямого праймера lambda gt11 (5' CGG GAT CCC GGT TTC CAT ATG GGG ATT GGT GGC GAC GAC TCC TGG AGC CCG TGA GTA TCG GCG GAA TTC 3') и обратного праймера lambda gt11 (5' GAA TTC CAG CTG AGC GCC GGT CGC TAC CAT TAC CAG TTG GTC TGG TGT CAA CGG GAT CGC CG 3') и амплифицированные ПЦР-продукты секвенировали. Полученные нуклеотидные последовательности анализировали сравнением их с базой данных последовательностей (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).
Пример 2
Противоречие аллергенной активности и
-реактивности компонентов молока
IgE
Для оценки, имеет ли молекула аллергенный потенциал, должна быть продемонстрирована не только ее IgE-реактивность, но также ее биологическая активность. Научно улучшенной моделью для тестирования биологической реактивности молекул является индукция высвобождения гистамина из базофильных гранулоцитов человека (Purohit 2005). Для этой цели использовали линию клеток базофильного лейкоза крысы, экспрессирующую α-цепь FcεRI-рецептора человека (Hoffmann et al., Int Arch Allergy Immunol, Vol.126(4), pp.277-285). Тестировали различные компоненты молока (n=33), в том числе экстракты цельного молока из различных видов, фракции молока, очищенные природные и рекомбинантные белки молока коровы и фрагменты рекомбинантных белков. Определяли проценты 78 пациентов, IgE-антитела сыворотки которых запускают высвобождение β-гексозаминидазы гуманизированных клеток RBL в ответ на индивидуальные компоненты молока (фиг.3).
Наиболее сильным активирующим клетки компонентом было молоко коровы со степенью стимуляции 47,4% (фиг.3, панель "пробы молока"). Но молоко козы и овцы также давало величины 35,9 и 28,2% соответственно, подтверждая перекрестную реактивность белков молока из различных видов. Из отдельных компонентов, очищенные белки, казеины (АС, ВС, КС), а также бета-лактоглобулин А (BLGA) показали наивысшие активности и запускали высвобождение в случае 25-34,6% сывороток пациентов. Интересно, что рекомбинантная форма альфа-лактальбумина (rALA) запускала гораздо более высокое высвобождение, чем ее природная копия. Каждый из синтетических пептидов имел довольно низкий потенциал активации клеток при достижении степеней стимуляции 2,6-7,7%. Биологическую активность сравнивали с IgE-реактивностью (Таблица 2).
Таблица 2
IgE-связывающая способность и биологическая активность компонентов молока; противоречие между IgE и аллергической активностью компонентов молока. Компоненты молока имеют более высокую IgE-реактивность, чем аллергическую активность в анализах RBL человека
<b>Биологическая активность (% пациентов)</b>
IgE<b>-связывание (% пациентов)</b>
пробы молока
GM
35,9
69,2
CM
47,4
85,9
SM
28,2
82,1
HM
9,0
17,9
MM
9,0
29,5
фракции казеина
GC
24,4
46,2
CC
41,0
52,6
SC
28,2
46,2
природные очищенные белки
AC
25,6
50,0
BC
34,6
44,9
KC
25,6
30,8
ALA
11,5
65,4
BLGA
28,2
50,0
BLGB
19,2
51,3
BSA
2,1
6,4
SSA
2,7
1,3
hALA
6,4
30,8
Lf
2,6
5,1
рекомбинантные белки BSA
rAS1C
19,2
48,7
rAS2C
5,1
9,0
rBC
10,3
55,1
rKC
6,4
21,8
rBLG
12,8
23,1
rALA
21,8
25,6
рекомбинантные фрагменты
BSA_F1
4,3
2,1
BSA_F2
4,3
8,5
BSA_F3
8,5
8,5
синтетические белки AS1C
Cas 1
6,4
43,6
Cas 2
3,8
15,4
Cas 3
2,6
46,2
Cas 4
3,8
35,9
Cas 5
5,1
41,0
Cas 6
7,7
37,2
Огромное большинство тестированных компонентов молока, такого как молоко коровы и молоко козы, очищенный вариант А и В природного бета-лактоглобулина (BLGA and BLGB) и рекомбинантный альфаS1-казеин (rAS1C) и альфаS2-казеин (rAS2C), имели при комнатной температуре в два раза более высокие проценты IgE-реактивности, чем биологическая активность. Такие открытия могут объясняться присутствием IgE-связывающих эпитопов, которые способны связывать IgE, но не способны к перекрестному сшиванию с рецептором, связыванию IgE и запуску высвобождения медиаторов. Только в случае пяти компонентов (рекомбинантного фрагмента BSA 3 (F3), рекомбинантного альфа-лактальбумина (rALA), фракции казеина коровы (CC), природного очищенного каппа- (КС) и бета-казеина (ВС)) проценты IgE-реактивности и биологическая активность достигают сходных величин. Степень дегрануляции с синтетическими полученными из альфаS1-казеина пептидами была довольно низкого диапазона от приблизительно десятой (Cas 3, Cas 4, Cas 5) до одной четвертой (Cas 2, Cas 6) активности полного белка.
Было обнаружено, что многие из IgE-реактивных пептидов альфаS1-казеина не могли индуцировать дегрануляцию в анализе высвобождения базофилов и, следовательно, представляют собой IgE-реактивные гаптены. Таким образом, эти пептиды (гаптены) являются неаллергическими. Этот результат подразумевает, что исключительное IgE-тестирование могло бы привести к ложно-положительным выводам в отношении оценивания аллергенности. С другой стороны, IgE-реактивные гаптены могут быть полезными в качестве терапевтических агентов для насыщения связанного с тучными клетками IgE перед воздействием аллергеном и могут быть полезными кандидатами для безопасной иммунотерапии аллергических заболеваний. Дополнительно были идентифицированы полученные из альфаS1-казеина пептиды, которые связывали IgE и запускали высвобождение базофилов, и были идентифицированы несколько сывороток пациентов, которые не имеют IgE-реактивности относительно некоторых пептидов, но индуцировали базофильную дегрануляцию с этими пептидами. Последний результат мог объясняться более высокой чувствительностью анализа высвобождения базофилов.
В целом, сравнение между измерениями IgE-реактивности и биологической активности выявило, что сыворотки пациентов имеют более высокую способность в связывании IgE, чем в индукции деградации базофилов. Тот факт, что анализы аллергенности отражают потенциал молекулы вызывать аллергические симптомы, подразумевает, что измерение только IgE-реактивности не может быть использовано с уверенностью для идентификации аллергенных компонентов, но должно быть дополнено биологическим анализом.
Объединение обоих анализов, оценивания IgE-связывающей способности и биологической активности позволяет создавать базу данных, содержащую аллергенные белки/фрагменты/пептиды, которые могут быть идентифицированы масс-спектрометрией. Фигура 4 показывает перечень последовательностей аллергенных пептидов и белков молока, который представляет прототип такой базы данных. Перечислены компоненты молока, тестированные на IgE-реактивность в сыворотке, как и на аллергенную активность. В перечне дается информация в отношении названий аллергенов, молекулярных масс (MW) в килоДальтонах (кДа), функции и получения этих аллергенов, а также ссылки.
Экспериментальный протокол
Использовали сыворотки из 78 пациентов, которые были отобраны в соответствии с историей положительных случаев, положительных кожных-прик-реакций и с использованием специфического IgE в отношении экстракта молока коровы с применением Системы CAP-FEIA (Phadia, Uppsala, Sweden). Сыворотки получали от пяти взрослых и 73 детей (30 женского пола и 43 мужского пола) из Австрии, Германии, Италии, Испании и Франции.
Очищенные белки и фракции казеина приобретали из Sigma Aldrich (St. Louis, US). Рекомбинантные белки и рекомбинантные фрагменты BSA экспрессировали в E. coli, как описано (Vrtala et al., 1997). Пептиды альфаS1-казеина синтезировали на модели 433А синтезатора пептидов Applied Biosystems, как описано (Focke et al., 2001).
2
2
2
2
ex
em
S
Sp
Z
Sp
S
Sp
Z
Гуманизированные клетки базофильного лейкоза крысы (RBL) (клон RBL-703/21) инкубировали в микротитрационных планшетах в течение ночи при 37°C (7% CO, влажности 95%) с 50 мкл сывороток человека, разведенными 1:10. После этого клетки промывали и подвергали действию компонентов молока, разведенных до 0,3 мкг/мл белка в Tyrodes-буфере, содержащем 50% DO и 0,1% BSA/HAS, в течение 1 часа при 37°С (7% CO, влажности 95%). Оценивали также самопроизвольное высвобождение этих клеток. Наконец, супернатанты клеток инкубировали с 50 мкл раствора для анализа (0,1 М лимонная кислота или цитрат натрия, рН 4,5, 160 мкМ 4-метилумбеллиферил-N-ацетил-β-D-глюкозаминид) в новых микротитрационных планшетах при 37°C (7% CO, влажность 95%) в течение 1 часа. Эти реакции останавливали добавлением 100 мкл глицинового буфера на лунку и флуоресценцию измеряли при λ: 360 и λ: 465 с использованием микропланшет-ридера для флуоресценции. Конкретное высвобождение гексозаминидазы каждой пробы рассчитывали с использованием формулы: [(FI-FI):(FI-FI)]×100 (где FI является флуоресценцией пробы; FI является флуоресценцией самопроизвольного высвобождения и FI является флуоресценцией общего высвобождения).
Пример 3
Идентификация белков и/или пептидов с аллергенной активностью и без аллергенной активности в пробах молока и вполученных из
молока продуктах при помощи масс-спектрометрии
База данных последовательностей аллергенных белков и пептидов, созданная комбинацией IgE-реактивности и аллергенной активности, может служить в качестве основы для развития надежного, воспроизводимого, аналитического способа для оценивания и предсказания аллергенности проб молока и полученных из молока продуктов. Для детектирования потенциально аллергенных компонентов в комплексных пробах молока использовали масс-спектрометрию. В качестве примера, масс-спектрометрию в комбинации с предшествующей высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЖХ) применяли для этого анализа коммерчески доступной, экстенсивно гидролизованной гипоаллергенной молочной смеси. Анализ хроматограммы, показанной на фиг.5, и полученные масс-спектры показали, что все белки были гидролизованы до малых пептидов с максимальной длиной 14 аминокислот.
В частности, фиг.5 показывает, разделение гидролизованной молочной смеси с использованием нано-жидкостной хроматографии с последующей электрораспылительной ионизационной МС. Представление хроматограммы общих ионов 1 мкг пробы гидролизованного молока. Времена удерживания показаны на х-оси, а интенсивность сигналов (в импульсах в секунду) на y-оси.
125
Поиск в базе данных с использованием алгоритмов MASCOT Search приводило к идентификации нескольких малых пептидов, из которых три были идентифицированы как полученный из молока аллерген, а именно бета-казеин (Bos d 8 beta, фиг.6). На фиг.6 изображены Mascot-search и идентификация полученных из бета-казеина пептидов в гидролизованном молоке коровы. В верхней части бета-казеин, единственный идентифицированный аллерген молока в масс-спектрометрии, упомянут с его молекулярной массой и рассчитанной pI. Ниже приведены параметры поиска и охват последовательности бета-казеина. Нижняя часть изображает последовательность бета-казеина с совпадающими пептидами, напечатанными жирным шрифтом. Этот бета-казеиновый аллерген идентифицировали с совпадениями пептидов: HQPHQPLPPT (рассчитанная масса 1,25 кДа, соответствующая аминокислотам (аа) 160-170 бета-казеина), VYPFPGPIPN (рассчитанная масса 1,19 кДа, соответствующая аминокислотам (аа) 74-84 бета-казеина), SSSEE (рассчитанная масса 0,65 кДа, соответствующая аминокислотам (аа) 31-36 бета-казеина), и PVVVPP (рассчитанная масса 0,87 кДа, соответствующая аминокислотам 96-103 бета-казеина). На фиг.7 показано тестирование IgE-реактивности этих пептидов (таблица 1: cas b-1, 2, 3 и 4; фиг.7). Полученные из бета-казеина пептиды, идентифицированные в гидролизованном молоке коровы, не являются IgE-реактивными. IgE-реактивность нанесенных на нитроцеллюлозу в виде точек молока коровы (СМ), рекомбинантного бета-казеина (rBC), синтетических полученных из бета-казеина пептидов (cas b-1, cas b-2, cas b-3, cas b-4), и рекомбинантного альфаS1-казеина (rAS1C) анализировали дот-блот-анализом. Связанные с нитроцеллюлозой компоненты молока инкубировали с сыворотками из трех аллергических в отношении молока пациентов (дорожки 1, 2 и 3) и неаллергического индивидуума (дорожка С). Связанные IgE-антитела детектировали с использованием I-меченых анти-IgE-антител. Эта фигура и эти результаты показывают, что они представляют собой неаллергенные пептиды, т.е. они являются слишком короткими, чтобы связывать IgE-антитела, и могут быть выделены от аллергенных и IgE-реактивных пептидов, как определено в базе данных IgE-реактивных и аллергенных полученных из молока пептидов/белков. Кроме того, они отличаются от опубликованных основных IgE-связывающих областей бета-казеина (аминокислот (аа) 1-16, аа 83-92, аа 135-144; Chatchatee 2001). Ни один из других IgE-реактивных аллергенов и фрагментов аллергенов молока, полученных скринингом этой экспрессионной библиотеки кДНК (фиг.1) не были детектированы в пробе гидролизованного молока, которое, следовательно, могло бы быть идентифицировано как неаллергенный препарат. Таким образом, было продемонстрировано - с использованием экстенсивно гидролизованного молока - что анализ LC-MS может быть использован для идентификации неаллергенных препаратов/проб молока.
B) Синтетические пептиды β-казеина. В списке приведены названия пептидов, их аминокислотная последовательность, длина, pI и молекулярная масса в кДа.
Экспериментальный протокол
125
Гидролизованную молочную смесь анализировали обращенно-фазовой ВЖХ с использованием наножидкостной системы хроматографии (Ultimate, LC Packings Dionex, The Netherlands), сопряженной с нанораспылительным интерфейсом масс-спектрометра НСТ-Ultra (Bruker Daltonik, Germany). Полученные масс-спектры подвергали поиску против банка данных SwissProt с использованием алгоритмов программного обеспечения MASCOT (Matrix Science, London, United Kingdom). Для дот-блот-анализа 1 мкг белка наносили в виде точек на нироцеллюлозу и инкубировали с сыворотками из пациентов с аллергией на молоко, разведенными 1:20 в PBST (PBS, 0,5% о/о Tween 20). Связанные IgE-антитела детектировали разведенными 1:15 I-мечеными антителами против IgE человека (IBL, Germany).
Пример 4
Картирование эпитопов альфа-лактальбумина (ALA) коровы для идентификации полученных из ALA пептидов
Способы
Синтез полученных из ALA пептидов: полученные из ALA пептиды (Lac1-Lac8), изображенные в таблице 1, синтезировали с использованием Fmoc (9-флуоренилметоксикарбонил)-стратегии с HBTU [гексафторфосфат (2-/1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония]-активацией (с малыми 0,1 ммоль-циклами) на синтезаторе пептидов Applied Biosystems Model 433A (Foster City, CA) и очищали, как описано (Focke et al., Faseb J 15:2042-2044).
Тестирование IgE-реактивности полученных из ALA пептидов:IgE-реактивности полученных из ALA пептидов определяли анализом микроматриц, как описано (Schulmeister et al., J Immunol. 182(11):7019-29). Вкратце, компоненты молока наносили в виде пятен на капиллярную мембрану на обычном предметном стекле для микроскопа и инкубировали с 25 мкл сывороток пациентов. Связанные IgE-антитела детектировали конъюгированным с флуоресцентным агентом анти-IgE-антителом при длине волны 670 нм. Уровень предела устанавливали для каждого пациента в виде двойной величины этого индивидуума, достигаемой с сывороточным альбумином человека.
Результаты
Идентификация эпитопов ALA, которые являются реактивными с IgE-антителами
Для идентификации IgE-реактивных эпитопов ALA авторы изобретения синтезировали 8 пептидов, охватывающих последовательность ALA (таблица 2). Эти 8 пептидов имеют длину 19-20 аминокислот с состоящими из 5 аминокислот перекрываниями. IgE-реактивность этих 8 перекрывающихся пептидов оценивали анализом микроматрицы с использованием сывороток из 36 пациентов, имеющих IgE-реактивность в отношении rALA. Авторы изобретения обнаружили, что 30,6% этих пациентов реагировали на Lac1, 33,3% на Lac2, 5,6% на Lac4, 2,8% на Lac5, Lac6 и Lac7 и 11,1% на Lac8 (таблица 3). В целом, 19 из 36 пациентов с IgE-реактивностью на rALA реагировали по меньшей мере с одним полученным из ALA синтетическим пептидом.
<img file="00000004.tif" he="68" wi="126" img-content="undefined" img-format="tif" />
<sup>а</sup>Сокращения, используемые в этой таблице: Lac1-Lac8, полученные из ALA пептиды 1-8; аа, аминокислоты; pI, изоэлектрическая точка; MW, молекулярная масса; кДа, килоДальтон.
Кроме того, настоящее изобретение включает в себя следующие пункты:
1. Способ идентификации аллергенных белков и пептидов, кодируемых экспрессионной библиотекой ДНК или кДНК, включающий стадии:
a) получения по меньшей мере одной экспрессионной библиотеки, содержащей ДНК или кДНК, полученную по меньшей мере из одного источника аллергенов,
b) экспрессии по меньшей мере одного белка или пептида, кодируемого указанной экспрессионной библиотекой,
с) определения связывающей способности по меньшей мере одного белка или пептида с IgE по меньшей мере одной сыворотки у индивидуума, который чувствителен по меньшей мере к одному источнику аллергенов,
d) контактирования по меньшей мере одного белка или пептида, проявляющего IgE-связывающую способность, определенную в стадии с), с базофильными клетками или тучными клетками, и
е) идентификации по меньшей мере одного белка или пептида как аллергена, если указанные базофильные клетки высвобождают после контакта по меньшей мере с одним белком или пептидом стадии d) по меньшей мере один медиатор.
2. Способ по п.1, где по меньшей мере один источник аллергенов является животным.
3. Способ по п.2, где это животное является млекопитающим.
4. Способ по п.3, где этим млекопитающим является корова.
5. Способ по п.3, где этим млекопитающим является кошка.
6. Способ по п.3, где этим млекопитающим является собака.
7. Способ по п.2, где указанное млекопитающее является лактирующим млекопитающим и эти ДНК или кДНК получены из ткани молочной железы.
8. Способ по п.2, где это животное является клещом.
9. Способ по п.1 где это животное является рыбой.
10. Способ по п.2, где этот источник аллергенов является яйцом.
11. Способ по п.1, где этот по меньшей мере один источник аллергенов является растением.
12. Способ по п.11, где это растение является злаковым сорняком.
13. Способ по п.11, где это растение является орехом.
14. Способ по п.11, где это растение является деревом.
15. Способ по п.1, где эта экспрессионная библиотека является библиотекой фагового дисплея или бактериальной экспрессионной библиотекой.
16. Способ по п.1, где IgE-связывающую способность определяют иммобилизацией по меньшей мере одного белка или пептида на твердом носителе, контактированием этого твердого носителя с IgE и детектированием связывания IgE на указанном твердом носителе.
17. Способ по п.1, где эти базофильные клетки являются гуманизированными клетками базофильного лейкоза крысы (RBL) (клона RBL-703/21).
18. Способ по п.1, где аминокислотную последовательность по меньшей мере одного белка или пептида, проявляющего IgE-связывающую способность, определяют в стадии с) и по меньшей мере один белок или пептид химически синтезируют или рекомбинантно получают перед стадией d).
19. Способ по п.1, где способ дополнительно включает стадию определения аминокислотной последовательности по меньшей мере одного белка или пептида, идентифицированного в стадии е).
20. Способ по п.19, где аминокислотную последовательность определяют масс-спектрометрией.
21. Способ по п.19, где аминокислотную последовательность определяют с использованием деградации Эдмана.