УСТРОЙСТВО ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОЧИПОВ
DEVICE FOR DIAGNOSIS USING BIOCHIPS

Область техники
Изобретение относится к устройству для сканирования результатов диагностики в медицине, ветеринарии, контроле пищевых продуктов, в криминалистике и других сферах диагностики, связанной с анализом биологически активных компонентов. В частности, изобретение относится к устройствам сканирования разных типов объектов, нанесенных на твердый носитель, например, выполненных в виде биочипов.
Уровень техники
Существует много технических решений, связанных с формированием и регистрацией оптических сигналов, полученных в процессе диагностики биологических образцов. Для регистрации сигнала и идентификации объектов чаще всего используют колориметрические или флуоресцентные метки [1].
Наиболее широкий класс диагностических устройств и сканеров проблемно-ориентирован на работу с биологически активными веществами, иммобилизованными на твердом носителе. В качестве твердого носителя наиболее распространены прозрачные твердые носители, выполненные из стекла [2], из полимеров [3] или из комбинации гибких пленок, нанесенных на твердый носитель [4].
Получают распространение более дорогие биочипы, на лицевую [5], или заднюю [6, 7] поверхность которых напыляют зеркальный слой, способствующий увеличению уровня флуоресцентного сигнала.
Тем не менее, существует потребность в простых и доступных по ценовым характеристикам диагностических устройствах, ориентированных, в основном, на небольшие лаборатории и группы, занимающиеся анализом качества пищевой продукции или проведением массовых скринингов в медицинской диагностике, или при контроле окружающей среды. В этом случае, вопросы экономии каждого анализа являются определяющими. С целью снижения расходов на один анализ в основном используются широко зарекомендовавшие себя биологические чипы, выполненные на основе микроскопных стеклянных слайдов размером 25×75 мм [1].
В группе недорогих чипов особую роль играют биочипы, в которых в качестве метки используются флуоресцентные красители [8] и поверхность биочипа освещается УФ излучением для формирования флуоресцентного сигнала.
Известны две группы оптических приборов, используемых для измерения флуоресцентного сигнала в процессе диагностики. К первой группе относятся оптические устройства, основанные на конфокальном принципе измерения [9]. Во вторую группу входят устройства, использующие темнопольный принцип освещения и съема сигналов флуоресценции [10, 11].
В практике применения оптических систем выявились достоинства и недостатки известных устройств. К главному недостатку конфокального принципа измерения и схем с использованием лазерных источников излучения относится необходимость применения дорогостоящей точной механики для перемещения в координатах ХY предметного стола, на котором закреплен биочип [12, 13, 14], либо оптической системы над неподвижным объектом диагностики [15, 16].
Недостаток темнопольного принципа освещения и измерения флуоресцентного сигнала до недавнего времени был связан с выбором источников излучения. По аналогии с конфокальными системами при конструировании темнопольных систем, использовали лазерное излучение от одного или нескольких лазеров, что также требовало перемещения объекта в координатах ХY для сканирования рабочего поля [17]. В последнее время с развитием производства эффективных светоизлучающих диодов стали известны конструкциии оптических систем с более широкой зоной освещения [11, 18]. Тем не менее и в данных конструкциях освещается только незначительная часть (6 мм × 10 мм) рабочей поверхности стандартного биочипа (25 мм × 75 мм), что также требует перемещения биочипа по ХY координатам при сканировании.
Известны микроскопы, в которых уровень светового потока от исследуемого объекта повышают, формируя принцип двойного прохождения светового потока через прозрачный носитель. Этот принцип реализуют в некоторых типах микроскопов, которые освещают объект в очень малой рабочей зоне и используют комбинацию из двух линз и зеркала [19, 20]. Данные схемы микроскопов не предназначены для измерения флуоресценции от таких объектов как биочипы. В используемых оптических схемах не используются элементы, позволяющие снижать уровень паразитного излучения, а эффект двойного прохождения светового потока не позволяет различать слабые сигналы на ярком фоне засветки отраженными сигналами.
Важным узлом в конструкции микроскопов, диагностической аппаратуры или сканеров биочипов является держатель биочипов, от которого зависят точность установки биочипов в рабочее поле оптической системы, удобство работы оператора при смене биочипов, возможность расширения функций аппаратуры при сканировании нестандартных биочипов.
Известны конструкции держателей биочипов для работы сканеров, использующих узкий пучок лазерного излучения [21]. Разработанные конструкции держателей ориентированы на перемещение биочипов или сканирующих оптических систем в координатах ХY и содержат дорогостоящие узлы, обеспечивающие точность установки. Известны конструкции держателей стандартных 25×75 мм микроскопных слайдов [1] (Белецкий И.П. и др., 2005), в которых биочип вводится своей торцевой частью в пазы для крепления. Известны конструкции держателей чипов, использующих меньшие размеры биочипов по отношению к стандартным [22]. К недостатку конструкции таких держателей относится необходимость прецизионного выполнения размеров как самих биочипов, так и рамок, в которые они вставляются. Это необходимо для установки чипов либо с помощью вдавливания в предназначенное место крепления, либо для установки биочипов в пазы, сформированные в держателе [22]. Известны варианты держателей выполненных в виде специальных рамок, содержащих дополнительные элементы, формирующие место для установки нестандартных биочипов [23]. Известны держатели, представляющие твердую основу, на которую наклеены небольшие пластины из стекла, на которые наносятся кластеры [24]. Большинство из известных вариантов держателей выполняют только одну основную функцию, связанную с функцией установки биочипов в рабочее поле оптической системы. В некоторых случаях держатели комбинируют с элементами, выполняющими дополнительные функции.
Наиболее близким устройством к рассматриваемому в настоящем описании является сканер биочипов, приведенный в патенте KR 20050008148 [25]. Сканер содержит излучатель на основе ксеноновой лампы, дополнительные коллимационные линзы для формирования параллельного пучка света, узел сменных фильтров, оптическую приемную систему, снабженную светофильтром и ПЗС камерой. Источник света формирует один световой поток, который направлен под углом к поверхности биочипа, с его боковой стороны. Держатель дополнительно содержит узел отражения светового потока. Биочип установлен в держатель таким образом, что его задняя поверхность обращена к узлу отражения, выполненному в виде сферических (параболических) рефлекторов или в форме множества микропризм, которые предназначены для концентрации и отражения потока флуоресценции. В соответствии с графическими материалами, представленными в описании, поверхность отражающего элемента размещена на расстоянии от нижней поверхности носителя биочипа таким образом, чтобы падающий возбуждающий свет не попадал на вход оптической системы за счет отражения от рефлекторов, и возбуждал флуоресценцию меток расположенных на поверхности биочипа один раз. Первая часть потока флуоресценции, вызываемая падающим потоком света поступает на вход оптической системы, а другая часть потока флуоресценции проходит через прозрачный носитель биочипа и, отразившись от зеркальных концентраторов, расположенных за задней поверхностью биочипа, возвращается через прозрачный носитель биочипа на вход оптической системы в качестве второго потока флуоресценции. Таким образом, усиление сигнала флуоресценции не может происходить более чем в два раза.
К недостатку устройства можно отнести необходимость использования сложных типов концентраторов, которые не выпускаются в виде готовых изделий, а также применение ксеноновой лампы, которая обладает определенным сроком службы и может менять свои характеристики по интенсивности светового потока в течение работы.
Одной из задач настоящего изобретения является расширение функций устройства за счет разработки многофункционального держателя биочипов для установки разных типов прозрачных носителей, например, биочипов, ячеек, слайдов.
Другой задачей изобретения является повышение уровня сигнала флуоресценции, детектируемой оптической системой.
Следующей задачей изобретения является обеспечение возможности проведения дифференциального сравнения исследуемого биочипа с тестовым чипом или двух биочипов друг относительно друга.
Другой задачей изобретения является разработка оптической системы, позволяющей осветить всю рабочую зону биочипа без снижения соотношения сигнал-шум.
Поставленные задачи реализуются с помощью комплексного технического решения, связанного с формированием двойного прохождения света через прозрачный носитель с иммобилизированным биополимером, повышением соотношения сигнал-шум за счет введения в обратный ход световых потоков поглотителей и выбора недорогих оптических элементов зеркала или световозвращающей поверхности для формирования двойного прохождения пучка света.
Сущность изобретения состоит в том, что устройство для диагностики биологических образцов, размещенных на прозрачном носителе, содержащее оптическую приемную систему, осветитель, узел позиционирования образца, содержащий отражающий элемент и прозрачный носитель, установленные друг перед другом вдоль направления оптической оси, и обеспечивающий размещение рабочей поверхности носителя в зоне освещения первого осветителя, размещение отражающего элемента и рабочей поверхности носителя на расстоянии, обеспечивающем прохождение падающего и отраженного света через прозрачный носитель в рабочей зоне оптической системы, дополнительно снабжено вторым осветителем, узел позиционирования образца выполнен с возможностью установки второго прозрачного носителя над поверхностью первого носителя вдоль направления оптической оси, плоскость которого перпендикулярна оптической оси, а рабочая поверхность размещена в зоне освещения, формируемой первым и вторым осветителем, при этом осветители снабжены светопоглощающим слоем для гашения отраженного света от поверхности носителя образца и от поверхности отражающего элемента.
Другим объектом изобретения является узел позиционирования, который оснащен направляющими с возможностью вертикального перемещения держателя носителей и отражающего элемента.
Другим объектом изобретения является узел позиционирования, который оснащен направляющими с возможностью вертикального перемещения держателя с первым носителем и отражающим элементом и дополнительно снабжен горизонтальными направляющими с возможностью продольного перемещения по координате X второго носителя и его установки перед первым носителем и отражающим элементом.
Другим объектом изобретения является держатель, который дополнительно содержит неподвижные или поворотные прижимные узлы и упоры для фиксации носителей и отражающего элемента, причем прижимные узлы содержат элементы скольжения и пружинные элементы.
Другим объектом изобретения является отражающий элемент, который выполнен на основе твердого носителя с нанесенной на его поверхность зеркальной или световозвращающей поверхностью. Зеркальная поверхность может быть нанесена с помощью напыления или выполнена из самоклеящейся пленки с зеркальным покрытием или выполнена из фольги, приклеенной на твердую основу. Световозвращающая поверхность выполнена на основе самоклеящегося материала, приклеенного на твердую основу. В качестве световозвращающих элементов могут быть использованы шаровые, призматические, треугольные поверхности.
Другим объектом изобретения является источник света, который выполнен на основе гексогонально размещенных светодиодов, которые расположены на расстоянии от 1 до 5 мм от лицевой поверхности осветителя, причем лицевая поверхность и кожух осветителя снабжены поглощающим слоем.
Другим объектом изобретения является держатель, который выполнен с возможностью установки биочипа, ячейки, слайда. Причем на поверхности биочипа иммобилизованы зонды, которые выбирают из группы, состоящей из: ДНК, олигонуклеотидов, белков, ферментов, антител. Ячейка содержит гомогенный раствор биополимеров, часть из которых помечена флуоресцентными метками, входящими в группу, состоящую из: Су3, Су5, Су7, Alexa 647, Alexa 660, FAM, TAMRA, R6G, R110, ROX или JOE. Прозрачный носитель выполнен в виде биочипа, ячейки, слайда. Слайд содержит образец биологической ткани.
Синергический эффект от одновременного решения нескольких взаимосвязанных технических задач, связанных с одновременным увеличением сигнала и повышением отношения сигнал-шум, возможностью сравнения двух биочипов в одном тесте - дает возможность получить более эффективный положительный результат, чем в известных изобретениях.
Перечень фигур
Фиг.1. Блок схема устройства для съема данных с диагносических носителей.
Фиг.2. Фрагменты сечений конструкции узла позиционирования (40) биологического образца, где а) биочип (41) с исследуемым образцом позиционируется по координате X по отношению к отражающему элементу (54) с зеркальной поверхностью; б) второй биочип (41) с исследуемым образцом позиционируется по координате X по отношению к первому биочипу (43), установленному над отражающим элементом (55) с зеркальной поверхностью, в) отражающий элемент (55) с возможностью вывода из зоны освещения рабочего поля биочипа (41) с помощью перемещения держателя (70) по координате Y.
Фиг.3. Фронтальная структура держателя (70) биочипов и отражателя (55).
Фиг.4. Фрагмент разреза устройства вдоль фронтальной поверхности биочипа (41), позиционируемого по координате X в направлении держателя (70) с отражающим элементом (55).
Фиг.5. Фрагменты разреза держателя (70), где а) фрагмент разреза держателя, в котором установлен биочип (41) и отражающий элемент (53) с световозвращающей поверхностью (48); б) фрагмент разреза держателя, в котором установлена ячейка (57) над отражающим элементом (54).
Фиг.6. Фрагмент разреза держателя (70) и фронтальный вид первого (43) и второго (41) биочипов, где а) фрагмент разреза держателя (70) с установленными первым (43) и вторым (41) биочипами над зеркальным отражающим элментом (55); б) фронтальный вид первого (43) и второго (41) биочипов.
Фиг.7. Схема формирования коллимированного пучка света, где а) диаграмма направленности (индикатриса) излучения СИД; б) индикатриса излучения СИД, установленного в черном цилиндре; в) сечение держателя СИД.
Фиг.8. Внешний вид элементов излучателей светового потока, где а) излучатель в сборе; б) излучатель с установленным оптическим фильтром; в) держатель светодиодов.
Фиг.9. Схема конструктивного размещения узлов устройства.
Фиг.10. Изображение кластеров, состоящих из 13 точек, для разных расстояний от отражающей зеркальной поверхности, где а) изображение кластеров без зеркальной поверхности; б), в), г) изображение кластеров с применением зеркального отражающего элемента, размещенного соответственно на расстоянии 1,1 мм, 3 мм и 6 мм от рабочей поверхности биочипа.
Структурная схема
Структурная блок-схема устройства приведена на фиг.1. Устройство состоит из оптической приемной системы (10), подключенной к входу регистрирующей и управляющей системы (80), первого (31а) и второго (31б) осветителей, формирующих световой поток с шириной конуса 2β. При этом оптические оси осветителей расположены под углом α к оптической оси приемной системы (15), которая имеет угол сбора γ. Оптическая система (10) состоит из первой (11) и второй (12) частей, между которыми введен первый (14) светофильтр, светочувствительный детектор (21). В регистрирующую и управляющую систему (80) входит компьютер (83) для сбора и обработки данных, поступающих от светочувствительного детектора (21), дисплей (81) для отражения данных, а также узел преобразования сигналов (82) для выработки управляющих сигналов на переключение режимов работы узла (84), предназначенного для управления источником питания. Конструкция узла позиционирования образца (40) обеспечивает установку, по меньшей мере, одного прозрачного носителя образца (41) строго перпендикулярно оптической оси (15) устройства таким образом, чтобы рабочее пространство АВ, на котором размещен исследуемый объект на поверхности прозрачного носителя образца, располагалось внутри поля зрения регистрирующей оптической системы (10). При этом рабочая поверхность АВ совмещена с фокальной плоскостью первой части (11) оптической системы (10).
В зависимости от режима работы узла позиционирования образца (40) обеспечивается возможность установки одного или двух прозрачных носителей с образцами, например, одного или двух биочипов. Узел позиционирования (40) образца дополнительно обеспечивает возможность установки носителя (54), содержащего отражающую поверхность.
Узел позиционирования
На фиг.2 приведен схематический разрез конструкции узла позиционирования (40) биологического образца. Приведенные варианты, представленные на фиг.2а-в включают, но не ограничивают других вариантов построения узла позиционирования.
Для обеспечения возможности ввода/вывода носителей образцов из траектории (15) оптической системы узел позиционирования (40) содержит держатель (70). Держатель снабжен боковыми направляющими (71), которые установлены в пазы вертикальных стоек (77), что обеспечивает возможность вертикального перемещения по координате Y держателя (70) с помощью ручки (74), как это представлено на фиг 2в.
Дополнительно, узел позиционирования оснащен направляющими (78), обеспечивающими возможность продольного перемещения по координате X носителей (41) образцов и их установки перед зеркальным отражающим элементом (54) (фиг.2а) при последовательном сканировании носителей с образцами или обеспечивает возможность перемещения носителей (41) образцов и их установки перед вторым носителем (43) и зеркальным отражающим элементом (55) (фиг.26) при дифференциальном режиме сравнения двух образцов, размещенных, например, на биочипах.
Для крепления носителей образцов и отражающего элемента держатель (70) дополнительно содержит неподвижные или поворотные прижимные узлы (72) и упоры (79) для фиксации первого и/или второго носителей и отражающего элемента (фиг.3). В свою очередь прижимные узлы (72) содержат элементы качения (75) и пружинные элементы (76).
Рабочие поверхности носителей размещены в зоне освещения, формируемой первым (31а) и вторым (316) осветителями, при этом отражатель и рабочие поверхности носителей размещены на расстоянии друг относительно друга, обеспечивающем прохождение падающего и отраженного света через один или два прозрачных носителя в рабочей зоне АВ оптической системы. При этом значение расстояния между рабочей поверхностью носителя и поверхностью отражающего элемента составляет от 0,01 мм до 5 мм.
В зависимости от режима работы устройства узел позиционирования может обеспечивать возможность сканирования индивидуальных носителей с биологическими объектами без перемещения носителей по координате X. В этом случае для установки носителей и отражательного элемента используют разные варианты держателей (70), обеспечивающих установку одного или двух носителей и отражающего элемента таким образом, чтобы рабочая поверхность исследуемого носителя лежала в фокальной плоскости оптической системы.
Режимы работы
Согласно изобретению при применении устройства для диагностики биочипов оно может работать в нескольких режимах.
Первый режим предназначен для анализа небольшой партии биочипов. Биочип (41), содержащий иммобилизованные кластеры (3), устанавливают в держатель (70) лицевой или задней поверхностью к фокальной плоскости приемной оптической системы. На поверхность биочипа (41) непосредственно или через прокладку накладывают отражающий элемент (фиг.5), который может иметь зеркальную или световозвращающую поверхность. В случае когда световозвращающая или зеркальная поверхность защищена от повреждения тонким слоем полимера, предпочтительно накладывать зеркальную поверхность непосредственно на поверхность носителя. Затем держатель помещают в узел позиционирования (40) таким образом, чтобы рабочая площадь биочипа с нанесенными кластерами была введена в зону освещения поверхности биочипа. Проводят измерение интенсивности сигналов флуоресценции с помощью ПЗС матрицы (21). Сигнал с выхода ПЗС матрицы (21) поступает на вход узла преобразования сигналов (82), выход которого подключен к компьютеру (83). Узел преобразования сигналов (82) содержит схемы управления работой матрицы (21), производит аналого-цифровое преобразование сигнала яркости от каждой ячейки матрицы (21), задает параметры съемки (экспозицию кадра, усиление и т.д.), осуществляет взаимодействие с компьютером (прием и передачу данных) по заданному интерфейсу (например, шине USB), синхронизирует работу осветителей, управляя работой источников питания.
Данные, поступившие с ПЗС матрицы (21) на узел преобразования сигналов (82) запоминают в дисковых накопителях компьютера (83), оператор устанавливает параметры обработки данных и с помощью программного обеспечения проводит обработку сырых данных, выводя результаты обработки на дисплей (81). Конечные результаты обработки заносятся в базу данных с использованием соответствующего номера идентификации. Данный номер может быть аналогичен кодовой последовательности, отраженной на штрих-коде (9) установленного на вспомогательной поверхности биочипа.
В соответствии со вторым режимом работы (см. фиг.6а, 6б) в держатель (70) устанавливают диагностируемый биочип (41) и тестовый биочип (43), размещая их рабочие поверхности друг над другом. В результате съема данных на общем поле изображения формируется, по меньшей мере, две зоны. Первая зона (6а) относится к изображению данных с диагностируемого чипа, вторая зона (8) относится к изображению данных, снятых с тестового чипа. В зависимости от целей диагностики количество диагностируемых зон может быть более 1. На фиг.6б представлен вариант симметричного размещения двух рабочих зон (6а, 6б) симметрично центра диагностируемого биочипа (41) и одной тестовой зоны (8), размещенной в центре тестового биочипа (43). Данный вариант включает, но не ограничивает других вариантов расположения зон диагностируемого и тестового биочипов.
В соответствии с третьим режимом работы в держатель (70) устанавливают слайд с зеркальной или светоотражающей поверхностью, как это представлено на фиг.2а, а носитель (41) с исследуемым образцом вводят в поле зрения АВ оптической системы (10) с помощью направляющих (78), обеспечивающих возможность продольного перемещения по координате X носителей (41) образцов и их установки перед зеркальным элементом (54). Этот режим позволяет провести быстрое сканирование партии образцов, размещенных на прозрачных носителях.
В соответствии с четвертым режимом работы в держатель (70) устанавливают первый носитель (43), на котором иммобилизирован тестовый образец (3а) и слайд (55) с зеркальной или светоотражающей поверхностью. На фиг.2б представлено изображение слайда с зеркальной поверхностью. Второй носитель с исследуемым образцом (3б), который иммобилизован на носителе (41), вводят в поле зрения АВ оптической системы (10) с помощью направляющих (78), обеспечивающих возможность продольного перемещения по координате X носителей (41) и их установки перед первым носителем (43) и зеркальным элементом (54). Это обеспечивает возможность сканирования носителей (41) с образцами (3б) при дифференциальном режиме сравнения уровня флуоресценции двух образцов, тестового (3а) и исследуемого (3б).
На фиг.4 представлен фрагмент разреза устройства вдоль фронтальной поверхности биочипа (41) вводимого по координате X в направляющие (78) до совмещения с зоной, в которой установлен отражатель (55) в держателе (70). Держатель установлен в пазы вертикальных стоек (77) с возможностью его вывода из оптической зоны освещения для замены типа отражателя (55) или установки дополнительного носителя при работе в дифференциальном режиме.
На фиг.3 представлен внешний вид фронтальной проекции одного из вариантов держателя (70) индивидуальных биочипов. Данный вариант включает, но не ограничивает других вариантов конструкции держателя (70). Держатель состоит из П-образного основания, крышки (73), ручки (74), первого (72а) и второго (72б) прижимов. П-образное основание с внешней боковой стороны содержит уступы (71), для установки держателя в вертикальные пазы стоек (77), для обеспечения возможности перемещения держателя (70) в вертикальной плоскости по координате Y.
В отличие от известных держателей, предназначенных для сканирования биочипов узким лучом лазера, в данном изобретении, которое использует принцип темнопольного освещения, не требуется высокой точности установки прозрачного носителя в держатель при сканировании. Главное условие состоит в надежной фиксации биочипов во время съема данных. Этому требованию удовлетворяет элемент скольжения (75) снабженный пружиной (76), которая фиксирует положение прозрачного носителя по отношению к держателю или положение двух носителей в форме диагностического и тестового биочипов по отношению к держателю и положение носителя с отражающей поверхностью.
В основании держателя (70) выполнены упоры для фиксации (79а) и (79б), которые служат в качестве направляющих для установки прозрачных носителей (41, 42) и отражающего элемента, имеющего зеркальную поверхность (54, 55) или световозвращающую поверхность (53). Длина упоров для фиксации (79а) и (79б) и расстояние между упорами должно быть не менее ширины и длины выбранного типа прозрачного носителя. Для стандартных стеклянных слайдов оно равно 25 мм × 75 мм. В случае, если используются нестандартные прозрачные носители их помещают в рамки, габариты которых совпадают с габаритами стандартных носителей.
Держатель содержит два прижимных узла, которые расположены параллельно боковым фиксаторам и прижимают прозрачные носители и отражающий элемент в зоне освещения и съема данных диагностики. Прижимной узел состоит из пружины (76), держателя элемента качения (72) и элемента качения (75). Верхняя часть пружин (76) может быть зафиксирована или может давать возможность поворота прижимных узлов при установке носителей и отражающего экрана. В качестве элементов качения предпочтительно использовать подшипники диаметром от 4 мм до 8 мм.
Данная конструкция держателя и узла позиционирования дает возможность осуществить несколько вариантов размещения прозрачных носителей и отражающего элемента относительно друг друга. Возможен вариант, когда носители и отражающий элемент расположены последовательно друг за другом, или возможен вариант, когда прозрачные носители размещаются лицом друг к другу. Поскольку толщина прозрачных носителей не превышает 1 мм, суммарное расстояние от лицевой поверхности верхнего носителя до отражающей поверхности экрана не будет превышать 2,5 мм, что гарантирует увеличение сигнала почти в три раза.
Преобразование падающего света
В процессе разработки устройства было обнаружено, что технические задачи изобретения, связанные с повышением чувствительности, можно выполнить за счет введения дополнительного отражающего элемента, обеспечивающего двойное прохождение светового потока через прозрачный носитель образца. Отражающий элемент может быть выполнен с зеркальной или световозвращающей поверхностью, расположенной на твердом носителе.
На фиг.5а, 6 и 6а представлены варианты преобразования падающего света (22) в зависимости от выбранного режима диагностики, типа носителя образца и типа отражающего элемента.
На фиг.5а представлен вариант преобразования падающего света при работе с диагностическим (41) биочипом, а отражательный элемент (53) включает световозвращающую поверхность, выполненную из самоклеющей пленки, состоящей из гибкого слоя (48) и клеящего слоя (47), установленного на твердой поверхности носителя (46). Световой поток (22), падающий под углом α к оптической оси (10), вызывает поток R1 флуоресценции меток, которые содержатся в кластере (3). Потоки флуоресценции распространяются в разные стороны, в том числе и падают в сторону светоотражающей поверхности (48). За счет свойств световозвращающей поверхности падающий поток дважды преломляется на треугольной поверхности светоотражателя и возвращается в сторону оптической приемной поверхности в виде потока R2 флуоресценции. Падающий поток (22), пройдя через прозрачный носитель (41) и кластер (3), также преломляется на световозвращающей поверхности (48) и возвращается обратно в сторону излучателя света (31). Проходя через кластер (3), отраженный свет возбуждает второй поток R3 флуоресценции. Часть потока флуоресценции отражается от световозвращающей поверхности (48) и поступает на вход оптической системы (10) в виде потока R4 флуоресценции. Суммарный поток флуоресценции, поступающий на вход оптической системы (10), равен сумме четырех потоков Rсум.=R1+R2+R3+R4. Общий сигнал флуоресценции теоретически может быть в четыре раза больше, чем в обычных схемах сканеров флуоресценции. Однако с учетом поглощения и рассеяния света на носителе образца и с учетом эффективности работы световозвращающей поверхности, которая снижается при увеличении угла наклона α падающего потока (22), а также от типа и качества светоотражающей поверхности и от увеличения расстояния от рабочей поверхности (42) с иммобилизированными кластерами (3) до световозвращающей поверхности (48) данное техническое решение позволяет обеспечить возврат светового потока и повысить дополнительную освещенность объекта максимально не в четыре раза, как в случае с зеркалом, а от двух до трех раз, в зависимости от типа световозвращающего материала и величины угла наклона α. Следует отметить, что световозвращающее покрытие, выпускаемое в промышленных масштабах, существенно дешевле, чем светоотражающая поверхность, которую необходимо выполнить в соответствии с требованиями патента, касающимися концентрации флуоресцентного сигнала [25], который выбран в качестве прототипа. Известны технические решения [2б] по увеличению эффективности световозвращающих структур при малых углах наклона падающего света по отношению к светоотражающей поверхности, что делает применение светоотражающих поверхностей еще более привлекательным.
На фиг.5б представлен вариант преобразования падающего света (22) для случая, когда объектом исследования является плоскопараллельная кювета (57) с объемом жидкости (56), в которой размещен исследуемый образец (5). Световой поток (22) проникает через прозрачный материал кюветы (57) и далее, частично преломившись на границах раздела между задней поверхностью первой стенки кюветы и жидкостью (56), походит через жидкостной слой, в котором размещен образец (5), вызывая первый поток флуоресценции образца S1, поступающий на вход оптической системы (10). Далее световой поток (22) проходит через вторую прозрачную стенку кюветы (57) и отражается от зеркальной поверхности (51), покрытой защитным слоем (52). Зеркальная поверхность (52) наклеена с помощью клея (50) на твердую поверхность слайда (49) и формирует отражающий элемент (53). Отраженный сигнал (23) проходит через прозрачный носитель, прозрачную стенку кюветы и возбуждает второй поток флуоресценции S3, воздействуя на очередной образец. Образец (5) испускает поток флуоресценсии в разные стороны, в том числе и в направлении, противоположном входу оптической системы. При этом поток флуоресценции отражается от зеркального слоя (51) и возвращается на вход оптической системы в виде потоков S2, S4. Таким образом, от одного падающего потока (22) формируется четыре потока флуоресценции Sсум.=S1+S2+S3+S4. Для удобства крепления кюветы используется П-образная рамка (93) в которой кювета фиксируется и размещается в рабочем поле оптической системы АВ (см. фиг.1).
На фиг.6а представлен вариант преобразования падающего света (22) при параллельном сравнении двух биочипов с целью выявления отличий в уровне флуоресценции между первым и вторым чипами в дифференциальном режиме.
Световой поток (22) проникает через прозрачный материал твердой основы (43) биочипа и далее, частично преломившись на границах раздела между задней поверхностью основы (43) и воздухом, походит через воздушный промежуток и падает на кластер (3а), расположенный на носителе (41), вызывая первый поток флуоресценции образца S1, поступающий на вход оптической системы (10). Далее световой поток (22) проходит через прозрачный носитель (41) второго биочипа и отражается от зеркальной поверхности (45), нанесенной на твердый носитель (44). Отраженный сигнал (23) проходит через прозрачный носитель (41) и возбуждает второй поток флуоресценции S3, воздействуя на очередной кластер (36). Для простоты на фиг.6а представлен вариант сечения держателя (70) и первого (43) и второго (41) носителей в упрощенной форме без соблюдения геометрических соотношений между деталями. Следует отметить, что отраженный сигнал (23) не является продолжением падающего светового потока (22), изображенного на фиг. 6а, и его местоположение приведено в качестве иллюстрации.
Части потоков флуоресценции S1 и S3 отражаются от зеркальной поверхности (45) и формируют потоки S2 и S4, которые суммируются с потоками S1 и S3. Таким образом, от одного падающего потока (22) формируется четыре потока флуоресценции Sсум.=S1+S2+S3+S4.
2
Общий сигнал, поступающий в оптическую систему (10), теоретически может быть в (1+k) раз больше (k - коэффициент отражения зеркала), чем в обычных схемах измерения флуоресценции биочипов.
Оптическую схему установки с использованием зеркала легко представить, если вместо него поместить сзади чипа мнимые источники света, эквивалентные действительным (светящиеся кластеры и осветители), симметрично относительно поверхности зеркала. Реальные кластеры всегда изображаются на картинке резко. Так как мнимое их изображение находится за зеркалом (на удвоенном расстоянии между передней поверхностью чипа и зеркалом), оно будет расфокусировано тем больше, чем дальше находится зеркало от поверхности с иммобилизованными кластерами.
Так как мнимые источники удаляются по мере перемещения зеркала, суммарная регистрируемая яркость кластеров уменьшается, что демонстрируют данные Таблицы 1 в примере 1. Очевидно, что зеркало следует располагать на минимально возможном расстоянии от иммобилизованных кластеров чипа. Предпочтительное расстояние составляет 0,1 мм, однако даже при расстояниях до 3 мм регистрируемая яркость почти в 3 раза превышает уровень потока флуоресценции при отсутствии отражающего экрана.
Предлагаемая конструкция устройства обеспечивает сканирование данных не только тех объектов, которые приведены в аналоге и в прототипе, но и расширяет перечень конструкций, которые могут быть использованы, что выполняет требование технической задачи по расширению функциональных возможностей устройства.
Конструкция слайда с отражающей поверхностью
Отражающий элемент выполнен на твердой основе, которую выбирают из группы, состоящей из стекла, металла, полимера, керамики. Предпочтительно использовать основу, выполненную из твердых полимеров, например полиметилметакилата. На твердую основу (44) (см. фиг.6а) нанесен слой отражающей поверхности (45), которая может быть выполнена в процессе напыления на полированную поверхность стеклянного полимерного или металлического слайда. Для тестирования биочипов возможно применять отражающие элементы с зеркальной поверхностью, у которых коэффициент отражения к выбирают в диапазоне от 0,99 до 0,85. Для создания зеркальных поверхностей с коэффициентом 0,85 можно применять полимерные пленки с напыленной поверхностью (51) (см. фиг. 5б) и содержащие слой клея (50), например приклеиваемые с помощью давления. Таким же образом можно на поверхности отражающего элемента (53) создать световозвращающую поверхность (48) (см. фиг.5а). Световозвращающие поверхности защищены слоем полимерного носителя и могут быть установлены в прямом контакте с рабочими поверхностями биочипов. В другом варианте, зеркальную поверхность отражающего элемента, например, напыленную на поверхность носителя, защищают от повреждения, используя дополнительные прокладки (91, 92).
Известно применение световозвращающих устройств при изготовлении световозвращающих панелей [27] и световозвращающих устройств, выполненных в форме листа [28]. Известны гибкие световозвращающие материалы, которые содержат световозвращающую структуру с плоской лицевой поверхностью и с множеством расположенных на ее тыльной поверхности основных и дополнительных световозвращающих элементов [29].
Наиболее предпочтительно использовать в качестве световозвращающих материалов покрытия, разработанные фирмой ЗМ. Фирма предлагает широкий спектр мультислойных световозвращающих покрытий, которые выполнены с применением сфер [30], микроструктурированных поверхностей [26, 31,32].
Наиболее перспективны световозвращающие пленки алмазного типа. Например, пленка серии 3990 VIP фирмы 3М представляет собой материал на основе микропризм, которые обеспечивают более высокую световозвращающую способность. Пленки с нанесенным световозвращающим слоем снабжены самоклеящимся составом и наклеиваются при комнатной температуре. Наиболее продолжительный срок службы достигается при наклейке на предварительно подготовленную поверхность твердого носителя отражающего элемента.
Световозвращающая поверхность материалов, основанная на использовании кубических уголковых призм, изготавливается методом литья или формовки призматических элементов на нижней поверхности очень тонкой подложки. В зависимости от типа материала на одном квадратном сантиметре поверхности размещается от 7300 до более чем 15500 призм (техническое описание фирмы 3М [46]).
В качестве световозвращающего слоя предпочтительно использовать световозвращающие материалы, выполненные в виде панелей, листов или пленок, снабженных клеевым слоем.
Оптическая система
Было обнаружено, что дополнительное увеличение отношения сигнал-шум можно выполнить за счет введения дополнительных поглощающих слоев, размещенных на лицевых поверхностях каждого из двух осветителей устройства. Задача обеспечения равномерного освещения всего рабочего поля с одновременной узкополосной фильтрацией излучаемого светового потока выполнена за счет специальной конструкции крепления светоизлучающих диодов (СИД), которые установлены в гексогональной проекции друг относительно друга, причем для формирования коллимированного пучка света светодиоды установлены в цилиндры, внутренняя поверхность которых снабжена светопоглощающим слоем, а светодиоды расположены внутри цилиндров на расстоянии от 1 до 5 мм от верхней границы лицевой поверхности излучателя.
Поле зрения АВ на рабочей поверхности носителя (41) (см. фиг.1) освещается с помощью двух одинаковых, симметрично расположенных относительно оптической оси (15) устройства источников возбуждающего излучения (31а, 31б). Конструкция держателей осветителей выполнена с возможностью ручной или автоматической смены осветителей.
В устройстве реализован принцип темнопольного освещения. Оптическая ось (16а, 16б) осветителей составляет острый угол α с оптической осью (15) устройства, при этом выполняется соотношение (α-β)>γ/2. В этом случае возбуждающее излучение (в том числе зеркально отраженное от объекта) не попадает в оптическую систему (10).
Угол α и расстояние от осветителей (31а, 31б) до исследуемого объекта можно менять в процессе юстировки устройства для улучшения равномерности освещения. На фиг.1 пунктиром показаны крайние лучи AD и ВС, собираемые регистрирующей оптикой. При поглощении возбуждающего излучения молекулы флуорохрома, связанные с объектом, флуоресцируют. Свет флуоресценции собирается первой частью (11) оптической системы (10), имеющей числовую апертуру NA=sin(γ/2). Входной люк CD ограничивает поле зрения оптической системы. На ее выходе имеет место телецентрический ход лучей, т.к. рабочая поверхность объекта совмещена с фокальной плоскостью первой части (11) оптической системы. Формирование телецентрического хода лучей необходимо для корректной работы первого интерференционного светофильтра (14). Далее свет проходит через полосовой интерференционный светофильтр (14), спектральные характеристики которого выбираются таким образом, чтобы с одной стороны пропустить максимум полезного сигнала (света флуоресценции метки), а с другой - обеспечить минимум проникновения паразитного фонового света на детектор (21).
Последнее условие обеспечивается, в основном, тремя факторами: а) минимальным проникновением возбуждающего света в канал регистрации. На этот фактор влияют угол падения пучка возбуждающего света α, угол расходимости пучка β, качество поверхностей объекта и зеркал (отсутствие паразитного рассеяния света), общее поглощение возбуждающего излучения внутри прибора, б) минимальным интегралом перекрывания спектров пропускания возбуждающего (32а, 32б) и регистрирующего (14) светофильтров, а также способностью светофильтра (14) подавлять возбуждающее излучение; в) минимальной собственной флуоресценцией материала носителя (91) объекта и светофильтра (14) в полосе пропускания светофильтра (14). Конструкция устройства позволяет менять светофильтры (14) в ручном или автоматическом режиме. Свет, прошедший через светофильтр (14), собирается второй частью (12) оптической системы, в задней фокальной плоскости которой находится фоточувствительный слой матрицы светочувствительных элементов (21), например, ПЗС-матрицы. Заметим, что размер поля зрения АВ связан с размером изображения А'В', формируемого на поверхности матрицы, соотношением AB=A'B'×(F1/F2), где F1 - фокусное расстояние первой части (11) оптической системы, a F2 - фокусное расстояние второй части (12) оптической системы. Параметры оптических систем выбираются таким образом, чтобы изображение А'В' полностью заполняло матрицу (21), входное отверстие PQ второй части (12) оптической системы равнялось выходному отверстию КМ первой, а числовые апертуры были максимально большими.
Светочувствительные элементы матрицы (21) преобразуют световой сигнал в электрический. Далее этот сигнал считывается, преобразуется линейным образом, оцифровывается и передается электронным устройством (82) в компьютер (83), на дисплее (81) которого формируется изображение рабочей области объекта.
Первая 11 и вторая 12 части оптической системы (10) представляют собой высококачественные оптические системы (объективы) с высоким светопропусканием, свободные в значительной степени от геометрических и хроматических аберраций. Хроматические аберрации в меньшей степени способны влиять на точность измерений, т.к. оптика работает в квазимонохроматическом свете, выделяемом светофильтром 14. Неточность фокусировки, возникающая при смене длин волн, не сказывается на работе, т.к. глубина резкости оптической системы достаточно велика (порядка 0,5-0,7 мм).
Среди прочих характеристик объективов можно выделить: разрешающую способность, коэффициент передачи контраста, коэффициент интегрального и спектрального пропускания света, коэффициент светорассеяния, падение освещенности по полю изображения.
Большинство известных оптических систем для формирования первой части оптической системы (11) используют короткофокусные объективы с небольшим рабочим отрезком. Это приводит к сокращению пространства между первой частью (11) оптической системы и поверхностью носителя (91) объекта исследования. Сокращение пространства создает проблемы с формированием освещения рабочей зоны. В известном патенте RU 2182328 [11] в одном из вариантов устройства держатели осветителей устанавливают непосредственно на объектив. Такое решение не позволяет включать между первой частью оптической системы и поверхностью носителя образца вспомогательные элементы, например, конструкции держателей ячеек или нагреватели ячеек для регистрации процессов в режиме реального времени.
В предлагаемом устройстве в качестве первой части (11) оптической системы (10) использован объектив с большим фокусным расстоянием, что позволяет расширить размеры рабочей области. Размер рабочей области объекта можно варьировать в широких пределах (например, от 10 до 90 мм) в зависимости от выбранного соотношения F1/F2. В качестве первой части (11) оптической системы целесообразно использовать проекционный или фотографический пленочный объективы, серийно выпускаемые промышленностью. Важными параметрами являются фокусное расстояние, рабочий отрезок, линейное поле зрения, числовая апертура, входной и выходной люки. Например, фокусное расстояние F1 фото- и проекционных объективов может меняться от 50 до 110 мм, апертура от 0,17 до 0,26, поле зрения от 36×24 мм до 90×60 мм, рабочий отрезок от 45 до 95 мм.
Рабочий отрезок (расстояние от первой линзы до фокальной плоскости) объектива 11 должен быть достаточно большим, чтобы не препятствовать прохождению света от осветителей. Разрешение первой оптической системы должно быть не менее 20 линий на 1 мм.
В качестве второй оптической системы целесообразно выбирать объектив, специально рассчитанный на работу со светочувствительными матрицами, например, ТВ-объектив или объектив цифровой камеры. Достаточно использовать объектив с фиксированным фокусным расстоянием (монофокальный) и с ручной установкой диафрагмы. ТВ-объективы целесообразно использовать с фокусным расстоянием F2 от 25 до 12 мм, рассчитанными на матрицу 2/3” или 1/2”. ТВ-объективы необходимо выбирать с высоким разрешением («мегапиксельные»), предназначенные для машинного зрения (минимум геометрических аберраций).
Используемый объектив должен быть рассчитан на работу с матрицей определенного размера. Однако он может использоваться и с матрицами меньшего размера. Например, объектив, имеющий маркировку 2/3” может также работать с матрицами 1/2”, 1/3” и т.д. В настоящее время выпускается широкая номенклатура монохромных ПЗС и КМОП-матриц с типоразмерами от 1/6” до 1,8” и более. Наиболее употребительными являются размеры 1/3” (диагональ 6 мм), 1/2” (диагональ 8 мм) и 2/3” (диагональ 11 мм). Матрицы от 1” и более дороги, а матрицы 1/4” и менее имеют малый динамический диапазон и большие шумы.
Линейное увеличение, даваемое системой, равно Г=F2/F1. Поэтому фокусное расстояние ТВ-объектива выбирают исходя из размеров рабочей зоны объекта исследования, фокусного расстояния первого объектива и размеров матрицы. Важно, чтобы входной люк PQ второго объектива примерно равнялся выходному люку КМ первого объектива и светопропускающему диаметру интерференционного светофильтра 14 (все три примерно одинаковы).
6
8
Интерференционные светофильтры (32а, 32б) имеют полосу пропускания от 40 до 60 нм, светофильтры 14 - от 30 до 50 нм. Очень важно, чтобы интеграл перекрывания спектров пропускания светофильтров был минимальным, т.к. от этого напрямую зависит соотношение сигнал-шум устройства. Фильтры имеют гарантированное ослабление света вне полосы пропускания, равное 10, а фактически 10 (по данным производителя Semrock Inc. США). Эмпирически установлен критерий подбора пары фильтров 14-32 как отсутствие видимого свечения светоизлучающих диодов (СИД), оцениваемое визуально в темном помещении при наложении светофильтра 14 на светофильтр 32 при включенном на максимальную мощность осветителе.
Используемые технические решения позволяют работать с ПЗС-матрицами без охлаждения.
Осветитель
Для того чтобы реализовать возможности сканирования больших поверхностей в простых оптических системах необходимо добиваться максимальной равномерности освещенности объекта. Эта задача не является тривиальной. Существуют ограничения в использовании лазерных источников из-за резкой неравномерности плотности излучения по сечению лазерного пучка, что приводит к необходимости сканирования положения лазера по отношению к рабочей поверхности биочипа [17], а также ксеноновых ламп, формирующих широкий спектр светового потока, из-за необходимости введения в конструкцию элементов, которые увеличивают ее габариты и стоимость. Более предпочтительным в настоящее время являются осветители на основе матриц СИД, имеющих малую стоимость и габариты.
Известно применение СИД для создания флуоресцентных сканеров или микроскопа, ориентированного на сканирование биочипов [11, 33]. С помощью СИД возможно обеспечить освещение образца и возбуждение его флуоресценции для разных схем регистрации флуоресценции. Из-за малых размеров СИД их можно размещать рядом с объективом или в корпусе объектива, или использовать световоды для передачи возбуждающего света от удаленных источников света, создавать освещение, падающее под углом к лицевой или к задней поверхности биочипа или формировать пучок, который направлен перпендикулярно задней поверхности прозрачного твердого носителя [34].
При использовании интерференционной оптики в устройствах необходимо формировать параллельный пучок света. Эту проблему решают введением дополнительных коллимационных линз [35, 36], параболических рефлекторов [37], комбинаций щелевых экранов и цилиндрических линз [38], а также с помощью комбинаций матриц СИД с матрицами, состоящими из множества линз [39]. К недостаткам таких решений можно отнести дополнительное увеличение стоимости осветителей и увеличение количества конструктивных узлов.
В процессе разработки устройства было обнаружено, что смещение индивидуального СИД, имеющего цилиндрическую форму и сферическую или параболическую линзу на торце, относительно внешней поверхности держателя СИД внутрь цилиндрического отверстия, в которое установлен СИД, на глубину Н позволяет, в случае нанесения поглощающего слоя (36) на стенки отверстия, сформировать коллимированный пучок света без применения дополнительных линз или сложных конструктивных решений. Таким образом, устраняется часть паразитного фона, которая возникала бы при облучении поверхности объекта источником, рассеивающим свет на окружающие поверхности осветителя и держателя образца.
На фиг.7 представлена схема формирования коллимированного пучка с помощью черного цилиндра, выполненного в корпусе осветителя. На фиг.7а представлена диаграмма направленности (индикатриса) излучения СИД (34). На фиг.7б представлена индикатриса излучения СИД, установленного в черном цилиндре или в отверстии, сформированном в держателе (33) в соответствии с фиг.4в и снабженном поглощающим слоем (36). В устройстве используются СИД с собирающей линзой на торце, излучающей узконаправленный пучок света (угол расходимости β лежит в пределах от 4 до 7,5 градусов). Расстояние Н между лицевой поверхностью держателя СИД (33) и торцом СИД лежит в пределах от 1 до 5 мм, что обеспечивает формирование пучка светового потока, удовлетворяющего условию допустимой расходимости пучка, при котором угол β не превышает предельно допустимого угла, указанного в технических условиях эксплуатации используемого светофильтра (32) (обычно 5 градусов). Необходимо отметить, что в данном устройстве поглощается не более 10% излучаемого света.
На фиг.8 представлен один из вариантов конструкции осветителя (31), который включает, но не ограничивает объем изобретения. Каждый осветитель (31) состоит из трех основных элементов - светонепроницаемого кожуха (37), внутренние поверхности которого снабжены светопоглощающим слоем (38), интерференционного светофильтра (32) и держателя (33), в котором выполнены отверстия для крепления индивидуальных СИД (34), формирующих упорядоченный массив СИД, отверстия для крепления светофильтра (32) и кожуха (37).
Держатель (33) представляет собой металлическую пластину, в которой сформирован упорядоченный массив круглых сквозных отверстий, диаметр которых соответствуют диаметру СИД (предпочтительно 5,0 мм или 3,0 мм). Оси отверстий перпендикулярны передней поверхности держателя.
Существенным отличием технического решения, используемого в данном изобретении, по отношению к известным схемам гашения паразитного фона [40-44], является включение поглотителей светового потока не в виде отдельных узлов, предназначенных для гашения отраженного сигнала от лицевой поверхности твердого носителя и от отражающего элемента, а в виде слоя, нанесенного на лицевую поверхность держателя и кожуха СИД. Таким образом, компоненты, входящие в состав осветителя, выполняют две независимые функции, тем самым снижая конструктивную сложность устройства.
Поглощающий слой (38а, 38б) может быть размещен на дополнительных элементах, имеющих прямоугольную или квадратную форму. Поверхность элементов (38а, 38б) может быть выполнена в виде планарной, вогнутой цилиндрической или сферической формы. Предпочтительно, чтобы размеры гасящего экрана превышали или были равны размерам светового пучка, отраженного от поверхности (42) носителя образца. В качестве поверхности, на которой размещен поглощающий слой, может выступать поверхность держателя (33), отверстий (36) и кожуха (37). Поглотитель света может быть выполнен в виде абсорбирующего покрытия [45], поглощающей краски или за счет химического чернения внутренней поверхности держателя СИД после выполнения в нем отверстий. В последнем случае держатель диодов выполняют из дюралюминия. В нем сверлят отверстия для установки светодиодов и затем чернят по известным технологиям. В общем случае поглощающий слой может быть выполнен на основе абсорбирующего материала, входящего в группу, состоящую из пленок, формируемых химическим способом, композиции, включающей носитель и диспергированный пигмент, полимерных или текстильных материалов, снабженных клеящим слоем.
Упорядоченный массив отверстий обладает свойствами поворотной симметрии 6-го или 4-го порядка (гексагональная или ортогональная упаковка). Благодаря этому достигаются максимальная плотность монтажа СИД и/или равномерность освещения. В отверстия плотно монтируются круглые СИД стандартного типоразмера (диаметром 5,0 мм или 3,0 мм). Металлический держатель (33) служит теплоотводящим элементом. Круглые отверстия позволяют в процессе изготовления осветителя поворачивать СИД относительно их продольной оси на произвольный угол, располагая их в совокупности так, чтобы обеспечить максимальную равномерность освещения рабочей области объекта.
Форма и размеры образованного таким образом массива СИД выбирается так, чтобы его (массива) проекция на плоскость объекта примерно соответствовала форме рабочей области исследуемого объекта. Массив СИД может образовывать форму круга, овала, прямоугольника, квадрата, многоугольника, треугольника. На фиг.8 приведен вариант выполнения массива в виде многоугольника с соотношением длины горизонтальной оси к длине вертикальной оси, составляющей 3/4. Форму массива выбирают с учетом размера и формы серийно выпускающихся интерференционных светофильтров. Светофильтр должен полностью покрывать все отверстия массива, не ограничивая свет. Предпочтительным являются светофильтры круглой формы с внешними диаметрами 25 мм, 30 мм, 50 мм как наиболее массово производимые и, следовательно, дешевые.
Светофильтр (32) плотно примыкает к передней поверхности держателя (33), располагаясь строго перпендикулярно продольным осям СИД. С этой целью держатель СИД имеет круглую проточку для точной фиксации светофильтра, являющуюся одновременно оптическим затвором, препятствующим боковому распространению света СИД.
Собранный таким образом осветитель является распределенным излучателем. Равномерность и интенсивность освещения зоны измерения возрастает за счет наложения световых пятен от каждого СИД. Применение двух симметрично расположенных осветителей повышает равномерность и мощность освещения.
Расстояние от осветителей (31а, 31б) до центра рабочей зоны АВ, в которой размещен исследуемый объект, выбирается таким образом, чтобы световое пятно, формируемое на поверхности объекта одним СИД, примерно соответствовало минимальному размеру освещаемой зоны.
Угол падения лучей α может меняться от 40 до 60 градусов и зависит от параметров (рабочего отрезка, числовой апертуры) первой части (11) оптической системы (10). Чем больше угол α, тем меньше расстояние от задней поверхности носителя объекта до экранов (компактнее конструкция), но тем меньше освещенность объекта.
Расстояние между осветителями (31а, 31б) и лицевой поверхностью носителя (42), а также угол α можно менять незначительно во время юстировки устройства. При этом оптические оси осветителей (16а, 16б) после настройки могут не проходить через центр объекта, сопряженный с оптической осью (15). Предпочтительное расстояние между осветителями (31а, 31б) и центром объекта исследования составляет порядка 70 мм при угле α=55° для объектов, размещенных на биочипах размером 26x76 мм.
Конструкция устройства выполнена с возможностью смены осветителей, предназначенных для возбуждения флуоресценции различных флуорохромов.
Полосовые интерференционные светофильтры (32а, 32б) выделяет такой спектральный диапазон света, который необходим для возбуждения флуоресценции метки. Полоса пропускания может варьировать в пределах 30-50 нм.
Доминантные длины волн выпускаемых СИД УФ и видимого диапазона: 365÷375 нм; 405±5 нм; 475±5 нм; 505 нм; 525 нм; 565 нм; 575 нм; 595 нм; 625±5 нм; 660 нм; белый свет. Мощность излучения СИД выбирают в диапазоне от 10 до 25 мВт. СИД выбираются таким образом, чтобы их доминантная длина волны излучения попадала в полосу пропускания фильтра и максимально соответствовала максимуму спектра возбуждения флуорохрома. Использование массива СИД не только многократно повышает интенсивность возбуждающего света, но и значительно увеличивает равномерность освещения рабочей области объекта.
Питание СИД
Источник питания (84) позволяет осуществлять четыре режима питания СИД или их комбинацию.
1. Последовательное включение СИД и питание их высокостабильным током. Все диоды работают в одинаковых условиях.
2. Последовательное включение СИД и питание их стабильным по амплитуде импульсным током с ШИМ (широтно-импульсная модуляция). Амплитуда тока равна максимально допустимой для данного СИД согласно ТУ. Позволяет регулировать интенсивность света осветителя (31) не изменяя спектр свечения СИД.
3. Параллельное включение СИД и питание их стабильным током. Позволяет индивидуально подстраивать интенсивность свечения каждого СИД для улучшения равномерности освещения.
4. Параллельное включение СИД и питание их стабильным по амплитуде импульсным током с ШИМ. Позволяет как подстраивать свечение каждого СИД, так и регулировать светоотдачу осветителя (31).
Источник питания (84) содержит отключаемую электронную цепь синхронизации питания СИД с сигналом, управляющим длительностью работы электронного затвора светочувствительной матрицы (21) и формирует питающие напряжения (85 a-n), поступающие на источники света (31). Включение синхронизации позволяет питать СИД (освещать объект) только на короткое время экспозиции кадра (не более 10 сек). При этом средний ток питания СИД может быть увеличен в несколько раз (до 4 раз), что в свою очередь примерно во столько же раз увеличивает интенсивность освещения объекта. Отключение синхронизации переводит работу осветителя в непрерывный режим, например, когда ведется непрерывный покадровый ввод изображений в компьютер.
Особенности объектов исследований
Для повышения чувствительности анализа важно, чтобы материал, из которого изготовлен объект, не флуоресцировал под действием возбуждающего излучения. В частности, при работе со стеклянными ячейками и кюветами целесообразно использовать возбуждающее излучение с максимумом в районе 625-635 нм.
В качестве носителя объекта исследования может выступать, по крайней мере, одна тонкая (толщина 1 мм) стандартная спектрофотометрическая кювета (см фиг.5б). В этом случае измеряется флуоресценция раствора биополимеров, снабженных флуоресцентными метками в кювете. В случае дифференциального способа измерения возможно установить в боковые направляющие (78) измерительную кювету и кювету сравнения последовательно друг за другом. При малом размере кювет, например 25×25 мм, они полностью займут рабочее поле АВ оптической системы. Для установки кювет предпочтительно использовать дополнительные рамки (93) (см. фиг.5б), которые можно вводить и непосредственно в рабочее пространство держателя (70).
Носителем биологических объектов может быть и проточная кювета.
Предлагаемое устройство может быть произвольно ориентировано в пространстве, в частности, оптическая ось 15 может располагаться в горизонтальной или вертикальной плоскости. Это позволяет использовать как закрытые, так и открытые кюветы, ячейки, микроплашки.
Конструкция устройства
На фиг.9 приведен пример размещения основных узлов устройства без установки дополнительных горизонтальных направляющих (78). Устройство содержит оптическую систему (10), состоящую из первой (11) и второй (12) частей, между которыми установлен первый (14) светофильтр, светочувствительный детектор (21), узел (82) для связи с регистрирующей и управляющей системой (80) (приведенной на фиг.1), первый (31а) и второй (31б) осветители, вертикальные направляющие (77), в которые установлен держатель (70) с верхней крышкой (73), котором имеются узлы прижима (72) носителя и отражающего элемента (55).
Примеры
Ниже показан пример, который подтверждает возможности устройства. Приведено измерение зависимости яркости свечения кластеров, размещенных в ячейке, от расстояния между задней поверхностью ячейки и зеркалом.
Таблица 1.
Зависимость яркости свечения кластеров в ячейке толщиной 1,0 мм от расстояния между задней поверхностью ячейки и зеркалом, которое имеет коэффициент отражения света k=0,87.
Условия регистрации
Расстояние от рабочей поверхности биочипа до зеркала (мм)
Среднее значение яркости свечения кластеров (усл. ед.)
Увеличение яркости
Без зеркала
-
41,8
1
С зеркалом
1,1
143,6
3,44
2
123,6
2,96
3
114,0
2,73
6
92,0
2,20
11
70,0
1,67
Проведенный эксперимент показывает, что приведенная в описании конструкция устройства позволяет работать не только с хорошими и дорогими зеркалами (при k>0,95), но и с зеркалами среднего качества (например, с k=0,87). В последнем случае снижение яркости по отношению к теоретически достижимой величине (для k=0,87), равной 3,5, составляет несколько процентов (измеренная величина увеличения яркости равна 3,44).
На фиг.10 представлены фотографии кластеров при различных расстояниях от задней поверхности ячейки до зеркала, при которых проводились измерения (столбец 2 Таблицы 1).
Как видно из результатов эксперимента, даже при расстоянии в 11 мм яркость точек кластеров увеличивается в 1,67 раза.
Таким образом, сочетание введенных новых элементов (новой конструкции узла позиционирования, поглощающих слоев на осветителях, новых типов световозвращающих элементов), взятое в совокупности с элементами прототипа (темнопольный принцип освещения), дает устройству новые свойства при диагностике разных типов биополимеров, размещенных на прозрачных носителях, при существенной простоте конструкции, не имеющей сложных механических узлов для перемещения носителей при сканировании.
Промышленная применимость
Устройство имеет простую оптическую схему, недорого в изготовлении и может быть доступно для проведения медицинской, ветеринарной и других типов диагностик в небольших лабораториях.
Дополнительно устройство может работать в качестве флуориметра. Например, измерять концентрацию ДНК, белка и т.д. в растворе или контролировать количество выделенной ДНК, наработанной в ходе ПЦР и т.д.
Устройство, созданное согласно изобретению, обладает рядом значительных преимуществ по сравнению с известными решениями. Оно имеет очень простую конструкцию, не предъявляет высоких требований к применяемым оптическим компонентам и, что особенно важно, не ставит никаких специальных условий для ввода излучения возбуждения флуорохрома и/или вывода флуоресцентного излучения. Кроме того, устройство позволяет проводить дифференциальный режим сравнения при диагностике биочипов или биологических объектов в гомогенных растворах.
Изготовление основных узлов устройства не требует высоких затрат, поэтому даже одноразовое использование отражающих элементов окупается простотой и удобством.
Источники информации
1. Белецкий И.П. и др. Набор праймеров для детекции и/или идентификации трансгенных последовательностей ДНК в растительном материале и его содержащих продуктах (варианты), праймер (варианты), пара праймеров (варианты), способ детекции и/или идентификации с их использованием (варианты) и устройство для осуществления способа. Патент RU 2265668 (2005.12.10).
2. Zeleny R. et al. Automatic imaging and analysis of microarray biochips. US Patent 6215894 (April 10, 2001).
3. Yokoyama K. et al. Plastic substrate for microchips. US Patent Applic. 20050176003 (August 11,2005).
4. Lebrun S. Substrate chemistry for protein immobilization on a rigid support. US Patent Appl. 20040063220 (April 1,2004).
5. Garini Y. Optical detection method for improved sensitivity. US Patent 6552794 (April 22,2003).
6. Matsushita T. et al. Component, apparatus, and method for analyzing molecules. US Patent 6999166 (February 14,2006).
7. Microarray High Sensitivity Mirror Substrates. Материалы фирмы TeleChem International Inc. (http://airayit.com/Products/Substrates/Mirror/mirror.html).
8. Мирзабеков А.Д. и др. Способ идентификации трансгенных последовательностей ДНК в растительном материале и продуктах на его основе, набор олигонуклеотидов и биочип для осуществления этого способа. Патент RU 2270254 (2006.02.20).
9. Ellis G. et al. Confocal laser scanning transmission microscope. US Patent 5035476 (July 30, 1991).
10. Bevis C. et al. Darkfield inspection system having photodetector array. US Patent 7061598 (June 13,2006).
11. Барский B.E и др. Флуоресцентный микроскоп.Патент RU 2182328 (2002.05.10).
12. Perov A. et al. Portable biochip scanner device. US Patent 6407395 (June 18, 2002)
13. Dorsel A.N. et al. Biopolymer array scanner with real-time saturation detection. US Patent Applic. 20040063105 (April 1,2004).
14. Kureshy F. et al. Microarray detector and methods. US Patent Appl.20050118640 (June 2, 2005).
15. Perov A. et al. Biochip scanner device. US Patent 6329661 (December 11, 2001).
16. Hueton I. et al. High-speed fluorescence scanner. US Patent 5459325 (October 17, 1995).
17. Барский B.E Флуоресцентный микроскоп.Патент RU 2166201 (2001.04.27).
18. Montagu J. et al. Reading of fluorescent arrays. US Patent Appl. 20060127946 (June 15,2006).
19. Mueller G. et al. Microscope for reflected-light and transmitted-light microscopy. US Patent 7081994 (July 25,2006).
20. Muller G. et al. Optical system for transmitted-light microscopy with incident illumination. US Patent 4515445 (May 7,1985).
21. Schembri T. et al. Arrays and their reading. US Patent 6864097 (March 8, 2005).
22. Lee H. et al. Microarray holding device. US Patent Appl. 20050271557(December 8, 2005)
23. Kronick M.N. et al. Manufacture and use of non-standard size microarray slides. US Patent Applic. 20060141507 (June 29,2006).
24. Henninger D. et al. Array substrate holder. US Patent Applic. 20020085960 (July 4,2002).
25. Kim. Y.M. Biochip scanner having means of collecting fluorescence to minimize loss of fluorescence and reduce noises produced by environment kights. Patent KR 20050008148 (2005-01-21).
26. Smith K. Retro-reflective sheeting having high retroreflectance at low observation angles. US Patent Appl. 20070081245 (April 12, 2007).
27. Велигдан Д. Светоперенаправляющая панель. Заявка RU 2001104428 (2003.04.10).
28. Араки Й. Светоизлучающий световозвращающий лист и способ его изготовления. Патент RU 2204154 (2003.05.10).
29. Молохина Л. и др. Гибкий световозвращающий материал. Патент RU 2183336 (2002.06.10).
30. Mori Y. Retroreflective sheet comprising microspheres, the diameter and refractive index of which being specifically related to the refractive indices of layers directly in contact therewith. 5962121 (October 5, 1999).
31. Smith K. et al. Cube corner cavity based retroreflectors with transparent fill material. 20010033907 (October 25, 2001).
32. Smith K. et al. Flexible cube-corner retroreflective sheeting. 20020126382 (September 12, 2002).
33. Yershov G. et al.Biochip reader with enhanced illumination and bioarray positioning apparatus. US Patent 6620623 (September 16,2003).
34. Douglas-Hamilton D. et al. Motility scanner and method. US Patent 4896967 (January 30, 1990).
35. Hart S. Light emitting diode (LED) array for excitation emission matrix (EEM) fluorescence spectroscopy. US Patent 6985224 (January 10,2006).
36. Panagotacos G. et al. Illuminator assembly. US Patent 7163318 (January 16, 2007).
37. Stopa J. et al. Led light assembly. US Patent Appl. 20030156416 (August 21, 2003).
38. Tsikos C. et al. Planar LED-based illumination array (PLIA) chips. US Patent 6959870 (November 1, 2005).
39. Lee K. LED package, display panel, illumination system and projection system employing the same. US Patent Appl. 20060146297 (July 6, 2006).
40. Chhibber R. et al. Method and apparatus for illuminating a substrate during inspection. US Patent Appl. 20050146719 (July 7, 2005).
41. Xu J. et al. Defect review system and method. US Patent Appl. 20050094136 (May 5, 2005).
42. Engelhardt J. et al. Optical system in the ray path of a confocal fluorescence microscope. US Patent 6785302 (August 31, 2004).
43. Ince С.System and method for imaging the reflectance of a substrate. US Patent Appl. 20060241364 (October 26,2006).
44. Rao N. et al. Optical method and apparatus for inspecting large area planar objects. US Patent Appl. 20020088952 (July 11, 2002).
45. Харрис Д. и др. Композиция покрытия, поглощающего УФ излучение. Заявка RU 2003133667 (2005.05.10).
46. 3М Diamond Grade VIP Reflective Sheeting Series 3990. Техническое описание фирмы Minnesota Mining and Manufacturing (3M) Product Bulletin 3990 November 2003 (http://multimedia.mmm.com/).