Фармацевтическая композиция с пролонгированным действием гонадотропинов для проведения индукции суперовуляции у самок млекопитающих
PHARMACEUTICAL COMPOSITION WITH PROLONGED ACTION OF GONADOTROPINS FOR INDUCTION OF SUPEROVULATION IN FEMALE MAMMALS

Изобретение относится к области репродуктивных биотехнологий, предназначенных для ускоренного воспроизводства и тиражирования потомства животных.
Репродуктивные биотехнологии, в частности проведение индукции суперовуляции (полиовуляции), применяемой у самок животных, широко используются в животноводстве для увеличения числа потомства и генетического улучшения практически всех видов сельскохозяйственных животных, таких как крупный рогатый скот, овцы, козы, свиньи, кролики и т.д., при значительном сокращении интервала между поколениями, а также для формирования криобанка генетического материала (ооциты, яйцеклетки, эмбрионы) с целью создания и сохранения генофонда редких исчезающих видов домашних и диких млекопитающих.
Биологически определено, что в яичниках млекопитающих содержатся сотни тысяч незрелых половых клеток (ооцитов), но, несмотря на такой огромный репродуктивный резерв, в условиях физиологической нормы в течение одного полового цикла, например, у коров, коз, овец созревает, как правило, один-два фолликула (остальные подвергаются атрезии), оплодотворяются одна-две яйцеклетки, что обуславливает получение ограниченного числа потомства или генетического материала. Поэтому для максимального использования биологического репродуктивного и генетического потенциала животных существует необходимость вызывать (индуцировать) синхронный рост множества фолликулов за счет введения в организм самки животного экзогенных гормонов. В этой связи метод индукции суперовуляции занимает первостепенное место среди биотехнологических инструментов, используемых для управления половым циклом у широкого круга животных с целью ускоренного воспроизводства и тиражирования их потомства.
Проведение процедуры индукции суперовуляции у самок животных включает в себя введение гонадотропных гормонов в концентрациях, превышающих физиологический эндогенный уровень, в частности введение фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), обладающего действием стимуляции роста (развития) незрелых фолликулов яичника. Для полноценного протекания интроовариальных процессов и достижения успеха при проведении индукции суперовуляции в организме животного помимо ФСГ необходимо одномоментное присутствие лютеинизирующего гормона (ЛГ). ФСГ вызывает и стимулирует рост и созревание фолликулов в яичниках, а ЛГ инициирует, в последующем, их овуляцию. Соотношение ФСГ/ЛГ имеет большое значение для проведения качественной индукции суперовуляции. При этом возможным диапазоном их соотношений, необходимых для оптимальной реакции суперовуляции у млекопитающих, является соотношение ФСГ/ЛГ, которое составляет 1/0,001-1/1 и используется при производстве коммерческих препаратов (Инструкция к препарату «ФСГ-супер», сайт Интернет: http://www.vettorg.net/pharmacy/62/81/, 2016 г.; Инструкция к препарату «Плюсет», сайт Интернет http://www.vetlek.ru/directions/?id=801,2016 г.; В.В. Мадисон, В.Л. Мадисон. Трансплантация эмбрионов в практике разведения молочного скота. – М.: ВО «Агропромиздат", 1988 г., стр. 58; патент РФ №2561057). Наиболее используемыми на практике по эффективности индукции суперовуляции являются препараты, содержащие гонадотропины гипофизарного происхождения. В настоящее время получают ФСГ и ЛГ из гипофиза животных (свиней, овец) или рекомбинантным способом. В отличие от гонадотропных препаратов, полученных, например, из сыворотки крови жеребых кобыл, гипофизарные гонадотропины имеют короткий период полураспада, не нарушают воспроизводительную функцию животного после проведения процедуры индукции суперовуляции, сохраняют чувствительность яичников к вводимым гонадотропинам, не вызывают аллергических реакций.
В связи с тем, что ФСГ имеет короткий период полураспада, и, как следствие, короткий период его инактивации в организме животного, при проведении индукции суперовуляции общепринятым является 8-10-кратное введение в лютеальную фазу полового цикла самкам млекопитающим активных веществ ФСГ и ЛГ каждые 12 часов в течение 4-5 дней. Данный период времени (4-5 дней) является типичным для полного созревания множества фолликулов с образованием полноценных качественных яйцеклеток.
При этом короткий период инактивации является одним из серьезных недостатков ФСГ, используемого при проведении индукции суперовуляции в качестве вещества, вызывающего рост и созревание большого количества фолликулов, что определяет необходимость многократного введения ФСГ в организм животного для постоянного поддержания эффективного уровня гормона в крови, необходимого для роста и созревания такого количества фолликулов. Недостатком многократного введения является трудоемкий процесс, требующий поимки, фиксации животного и введения ему препарата, четкого соблюдения временных интервалов между инъекциями. При этом появляются условия для колебания концентрации вводимых гонадотропинов в сыворотке крови животного, которые создают стрессы, негативно влияющие на физиологические и метаболические процессы в организме самок млекопитающих, и, как следствие, возникают предпосылки к получению низкого результата суперовуляции. В связи с этим возникает целесообразность однократного введения препарата, содержащего гипофизарные гонадотропины. Возможность отказаться от многократного введения такого препарата появляется в случае пролонгирования действия ФСГ с помощью различных вспомогательных веществ (пролонгаторов), увеличивающих время нахождения этого экзогенного гонадотропина в организме и обеспечивающих равномерное его высвобождение, приводящее к поддержанию необходимого уровня этого гормона в крови.
Проблема повышения эффективности результата суперовуляции с предпочтительным однократным введением гонадотропинов в настоящее время остается актуальной и решается в разных направлениях: совершенствуются протоколы индукции суперовуляции с использованием различных схем введения гонадотропинов в сочетании с известными и апробированными на практике вспомогательными веществами (пролонгаторами), ведется поиск новых, более эффективных вспомогательных веществ или их композиций, имеющих различную природу происхождения.
Известны вещества, способные продлевать действие однократной инъекции ФСГ с использованием в качестве пролонгаторов карбоксиметилцеллюлозы и поливинилпирролидона, 3,2%-го раствора желатина (Smith L.E., Sitton G.D., Vincent C.K. Limitedinqectionoffolliclestimula-tinghormoneformultiplebirthsinbeefcattle. // J. Anim. Sci., 1973, 37, 523-527). Известен пролонгатор - пролонгон, позволяющий при однократной инъекции ФСГ вызывать суперовуляцию у 75% животных при числе овуляций от 9,9 до 10,7 (при использовании различных препаратов ФСГ) и выходе качественных эмбрионов от 2,9 до 3,5 на донора. При этом был отмечен более высокий уровень приживляемости эмбрионов, полученных от коров, обработанных ФСГ с пролонгоном (Довгопол В.Ф., Осташко Ф.И., Исаченко И.И. Совершенствование нехирургического метода трансплантации эмбрионов. // Зоотехния, 1992, 2, 14-17). Однако вышеуказанные пролонгаторы не обеспечивают оптимального времени эффективного действия фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), необходимого для вызывания множественного роста фолликулов, либо обеспечивают высокое число овуляций, но при этом количество полученных пригодных эмбрионов ниже на 50% от среднестатистического, либо вызывают поликистоз яичников, который может привести к вынужденной выбраковке животного.
Известно пролонгирующее действие сывороточного гонадотропина, позволяющего продолжить начатое действие фолликулостимулирующего гормона при его однократном введении, которое приводит к началу роста и развития примордиальных фолликулов в яичниках овцематок-доноров и доводит эти развивающиеся фолликулы до полноценного их созревания и множественной овуляции (патенты РФ №97118484, 1999 г.; 2136310, 1997 г.). Пролонгирующее действие сывороточного гонадотропина на рост и развитие фолликулов обусловлено тем, что он имеет более высокое содержание карбогидратов, сиаловых кислот и белковых веществ. Эти вещества и кислоты находятся в связанном состоянии с молекулами гонадотропных гормонов (ФСГ и ЛГ), содержащихся в сывороточных гонадотропинах, и не захватываются рецепторами паренхиматозных клеток печени, и тем самым обеспечивается длительность (пролонгация) действия фолликулостимулирующего гормона. Недостатками применения сывороточного гонадотропина в качестве пролонгирующего вещества являются его аллергенность, негативное воздействие на воспроизводительную функцию животного (возникновение фолликулярных кист и поликистозов яичников), а также ограниченность видового использования млекопитающих.
Известен порошкообразный полимер поливинилового спирта (ПВС), используемый в качестве средства, пролонгирующего действие фолликулостимулирующего гормона, индуцирующего суперовуляцию у коров-доноров (патент BY 12490, 2003 г.). ПВС разводят в физиологическом растворе с температурой 50-60°С до концентрации 12-процентной суспензии, которую охлаждают до 40-42° и в количестве 5-7 мл смешивают с 50 мг натурального ФСГ. Полученный рабочий раствор однократно вводят подкожно коровам-донорам в область лопатки по 5-7 мл/голову. Недостатком является низкая эффективность пролонгирующего действия поливинилового спирта на ФСГ, используемый в виде препарата торговой марки «ФСГ-супер». В этой связи, недостаточно индуцируется синхронный рост, созревание и овуляция множества фолликулов, что приводит к получению большого количества неоплодотворенных яйцеклеток, а также эмбрионов с дегенерированными формами, находящихся на разных стадиях развития.
Известна полутвердая фармацевтическая композиция (прототип - патент РФ №2453329, 2010 г.), содержащая ФСГ, ЛГ и биологически деградируемый полимер полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярной массой в пределах между 500 и 5000 Дальтон, по отношению к которому в рамках описания к патенту-прототипу применяется термин "полиэтиленгликоль с очень низкой молекулярной массой". Указанную композицию используют парентеральным путем, таким как подкожная или внутримышечная инъекция. ФСГ и ЛГ, используемые в качестве активных веществ в этой композиции, являются гонадотропинами, применяемыми в методах индукции суперовуляции и обуславливающими рост и овуляцию множества фолликулов во вспомогательных репродуктивных технологиях. Когда полутвердую композицию помещают в водную физиологическую окружающую среду, такую как телесные или тканевые жидкости, органический растворитель полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярной массой в пределах между 500 и 5000 Дальтон, являясь в этой композиции вспомогательным веществом, обеспечивает высвобождение активных веществ (пролонгацию действия активных веществ) в течение периода, по меньшей мере, в одну неделю.
Недостатком композиции по прототипу является слишком долгий период высвобождения введенных активных веществ ФСГ и ЛГ, составляющий одну неделю, тогда как при проведении индукции суперовуляции у самок животных необходимым промежутком времени для полного созревания множества фолликулов с образованием полноценных качественных яйцеклеток является период воздействия введенных гонадотропинов на яичники, как правило, составляющий 4-5 дней. В этой связи, высвобождение введенных гонадотропинов, составляющее, как минимум, 7 дней, обуславливает воздействие активных веществ в более низких дозах, приводит к асинхронным росту, созреванию и овуляции фолликулов и, как следствие, получению большого количества неполноценных ооцитов и яйцеклеток.
Задачей изобретения является создание фармацевтической композиции с пролонгированным действием гонадотропинов для проведения индукции суперовуляции у самок млекопитающих, позволяющей повысить количество синхронно созревших фолликулов с последующей их овуляцией и выходом качественных яйцеклеток, пригодных для оплодотворения.
Техническим результатом изобретения является повышение количества яйцеклеток, пригодных для оплодотворения, при проведении индукции суперовуляции у самок млекопитающих.
Технический результат достигается тем, что фармацевтическая композиция с пролонгированным действием гонадотропинов для проведения индукции суперовуляции у самок млекопитающих содержит гипофизарные гонадотропины - фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) и лютеинизирующий гормон (ЛГ) при соотношениях ФСГ/ЛГ (1/0,001-1/1) и пролонгатор действия фолликулостимулирующего гормона - биологически деградируемый полимер полиэтиленгликоль (ПЭГ). При этом согласно изобретению композиция дополнительно содержит 0,25-1% раствор новокаина, а в качестве пролонгатора используют ПЭГ с молекулярной массой от 6000 до 70000 Да, при следующих соотношениях компонентов, вес. %:
ФСГ/ЛГ (1/0,001-1/1) активностью 800-1000 ME
в 0,25-1%-ном растворе новокаина
65-90
ПЭГ с массой от 6000 до 70000 Да
10-35
Сущность изобретения заключается в комбинации указанных компонентов. ФСГ и ЛГ в данной композиции являются активными (действующими) веществами, а 0,25-1% раствор новокаина и ПЭГ с молекулярной массой от 6000 до 70000 Да - вспомогательными веществами. Во вспомогательное вещество 0,25-1% раствор новокаина объемом от 3 до 15 мл добавляют действующие вещества ФСГ/ЛГ (1/0,001-1/1) активностью 800-1000 ME и добавляют вспомогательное вещество ПЭГ с молекулярной массой от 6000 до 70000 Да в количестве от 0,5 г до 7 г. При этом в патентуемой композиции весовые % ФСГ/ЛГ (1/0,001-1/1) активностью 800-1000 ME в смеси с 0,25-1%-ным раствором новокаина составляют 65-90 вес. %, а ПЭГ с молекулярной массой от 6000 до 70000 Да - 10-35 вес. %.
Патентуемая фармацевтическая композиция содержит полную дозу действующего вещества, которая необходима для проведения индукции суперовуляции у самок крупного рогатого скота и подлежит однократному введению в полном объеме. Для проведения индукции суперовуляции самкам других видов млекопитающих однократному введению подлежит часть данной фармацевтической композиции, содержащей необходимое количество ME активного вещества на одну самку в зависимости от вида млекопитающего (см. примеры 1-3).
Фармацевтическую композицию используют следующим образом (на примере самок крупного рогатого скота). У телки или коровы, отобранной для проведения суперовуляции, выявляют признаки половой охоты, которая может быть как естественной, так и вызванной искусственно посредством введения животному гормональных препаратов. Факт выявления признаков половой охоты, которая длится у самок крупного рогатого скота, в среднем, 12-24 часа (примечание: в данный период времени животное не подлежит осеменению), регистрируют как условно нулевой день полового цикла у самки, с которого начинают отсчет дней этого полового цикла. С 9-го по 12-й день полового цикла (в лютеиновую фазу), предпочтительно на 10-й день, проводят индукцию суперовуляции у самок крупного рогатого скота с введением патентуемой фармацевтической композиции, содержащей ФСГ/ЛГ (1/0,001-1/1) активностью 800-1000 ME, способствующей индуцированному физиологическому процессу роста и созреванию множества фолликулов в течение необходимого периода времени (4-5 дней). Фармацевтическую композицию в полном объеме однократно инъецируют животному либо в подкожную клетчатку, либо внутримышечно (в область лопатки, шеи, тазобедренной части и т.д.). Через 48 часов вводят один из препаратов-аналогов простагландина F2α (эстрофан, магэстрофан, броэстрофан и т.п.) в соответствии с инструкцией по применению. Простагландин F2α способствует рассасыванию желтого тела и индукции половой охоты, которая наступает через 48-72 часов после введения простагландина F2α. На этом процедура проведения индукции суперовуляции с применением патентуемой композиции является завершенной. В итоге, биологическая доступность и терапевтический эффект активных веществ ФСГ и ЛГ сохраняется в течение периода времени, который составляет 4-5 дней (96-120 часов) и соответствует общепринятым временным параметрам, достаточным для синхронного созревания полноценных яйцеклеток, которые в последующем способны оплодотвориться и развиться до качественных эмбрионов.
Для сравнения эффективности применения патентуемой композиции и композиции по прототипу была проведена индукция суперовуляции у самок крупного рогатого скота. Были сформированы 3 группы животных, состоящие из коров и телок (см. таблицу 1). Все группы формировались по принципу пар-аналогов. Первая группа животных была обработана композицией по прототипу, а в группах 2 и 3 была проведена индукция суперовуляции с применением патентуемой фармацевтической композиции, которая в составе установленных изобретением компонентов включала ПЭГ с молекулярной массой 6000 Да. Во всех трех группах применяли ФСГ/ЛГ (1/0,001) активностью 1000 ME. При этом для объективного выявления эффективности высокомолекулярного ПЭГ коровы и телки в группе 2 были обработаны патентуемой композицией, в которую не включали раствор новокаина (вместо раствора новокаина использовали физраствор), а в группе 3 патентуемая композиция использовалась с 0,25% раствором новокаина. При этом в группе 2 при применении патентуемой композиции с ПЭГ с молекулярной массой 6000 Да весовые проценты ФСГ/ЛГ (1/0,001) в физрастворе составляли 65 вес. %, а ПЭГ 6000 Да - 35 вес. %. В группе 3 при применении патентуемой композиции с ПЭГ с молекулярной массой 6000 Да весовые проценты ФСГ/ЛГ (1/0,001) в 0,25% растворе новокаина составляли 65 вес. %, а ПЭГ 6000 Да - 35 вес. %. Для полноценной овуляции созревших фолликулов через 48 часов после введения композиции вводили простагландин F2α, в результате чего происходит синхронная овуляция множества выросших и созревших фолликулов и на их месте образуются желтые тела, которые отчетливо пальпируются «per rectum» и визуализируются при помощи техники для ультразвуковой диагностики. При этом каждый созревший и овулировавший фолликул продуцирует одну яйцеклетку, пригодную для оплодотворения. Определяли количество яйцеклеток, пригодных для оплодотворения, посредством подсчета образовавшихся желтых тел на яичниках их пальпированием, так как количество желтых тел на поверхности яичников признано условно идентичным количеству созревших и овулировавших фолликулов, из которых выходят яйцеклетки, пригодные для оплодотворения. В связи с этим, количество желтых тел на яичниках служит индикатором эффективности применения патентуемой фармацевтической композиции. Для лучшей градации полученных результатов было проведено разделение животных каждой группы на 4 подгруппы в зависимости от количества зафиксированных овуляций у исследуемых животных (так называемый «лимит числа овуляций»). При этом лимит числа овуляций по подгруппам распределялся следующим образом: в первую подгруппу были включены животные с 3-5 желтыми телами, во вторую подгруппу - с 6-10 желтыми телами, в третью подгруппу - с 11-20 желтыми телами, в четвертую подгруппу - с более 20-ю желтыми телами на яичниках.
Было установлено, что при сравнительном анализе полученных результатов количество животных, положительно отреагировавших на индукцию суперовуляции, было неодинаковым в процентном соотношении по количеству желтых тел. Также было установлено, что во 2-й и 3-й группах в подгруппах с высоким лимитом овуляций (3 и 4 подгруппы) при использовании ПЭГ с молекулярной массой 6000 Да процент прореагировавших животных от общего числа суперовулировавших животных был выше более чем на 10% и на 4% по сравнению с аналогичными подгруппами группы 1 (прототип). Аналогичная ситуация просматривается в этих же подгруппах по среднему количеству желтых тел на одного животного. По количеству неовулировавших фолликулов результат был обратный: количество неовулировавших фолликулов, в среднем, на одного животного, во всех подгруппах 1-й группы (прототип) было больше, чем в группах 2 и 3 (с применением патентуемой композиции).
При проведении дополнительных исследований (см. таблицу 2) были проведены процедуры индукции суперовуляции у самок крупного рогатого скота. Были сформированы 3 группы животных, состоящие из коров молочного направления продуктивности (группы 4, 5, 6 в таблице 2), которые были отобраны с учетом живой массы, продуктивности и репродуктивного здоровья. Во всех трех группах применяли ФСГ/ЛГ (1/1) активностью 800 ME. При этом в композицию включали ПЭГ с молекулярной массой 45000 Да (среднее значение заявленного в изобретении диапазона молекулярной массы ПЭГ, таблица 2, столбец 2, группа 4), а также с молекулярной массой 70000 Да (максимальное значение заявленного в изобретении диапазона молекулярной массы ПЭГ, таблица 2, столбец 3, группа 5). При этом при применении патентуемой композиции с ПЭГ с молекулярной массой 45000 Да весовые проценты ФСГ/ЛГ (1/1) в 1% растворе новокаина составляли 80 вес. %, а ПЭГ с молекулярной массой 45000 Да - 20 вес. %. При применении патентуемой композиции с ПЭГ с молекулярной массой 70000 Да весовые проценты ФСГ/ЛГ (1/1) в 1% растворе новокаина составляли 90 вес. %, а ПЭГ с молекулярной массой 70000 Да - 10 вес. %. Аналогично исследованиям, отраженным в таблице 1, для лучшей градации полученных результатов, показанных в таблице 2, было проведено разделение животных каждой группы на 4 подгруппы в зависимости от количества зафиксированных овуляций у исследуемых животных (так называемый «лимит числа овуляций»). При этом лимит числа овуляций по подгруппам распределялся следующим образом: в первую подгруппу были включены животные с 3-5 желтыми телами, во вторую подгруппу - с 6-10 желтыми телами, в третью подгруппу - с 11-20 желтыми телами, в четвертую подгруппу - с более 20-ю желтыми телами на яичниках.
Были получены результаты (см. описание ниже), также показывающие более высокую эффективность применяемой патентуемой композиции по сравнению с прототипом, как и при использовании ПЭГ с молекулярной массой 6000 Да. Кроме того, были проведены исследования, где в композицию включали ПЭГ более 70000 Да (а именно 75000 Да: см. таблицу 2, столбец 4, группа 6), при этом показатели результатов отличались и были хуже, чем при применении ПЭГ с молекулярной массой 70000 Да (см. описание ниже).
Приведенные в таблице 2 результаты исследований показывают, что при использовании ПЭГ 45000 Да из 12-ти обработанных животных прореагировало 11, что составило 91,6%. При этом животных с числом овуляций 3-5 было 3 и среднее количество желтых тел на одно животное составило 4, животных с числом овуляций 6-10 было 5 и среднее количество желтых тел на одно животное составило 8, животных с числом овуляций 11-20 было 3 и среднее количество желтых тел на одно животное составило 13,6. В то же время животных с числом овуляций более 20 в данной группе не было. При использовании ПЭГ 70000 Да из 12-ти обработанных животных прореагировало 7, что составило 58,3%. При этом животных с числом овуляций 3-5 было 2 и среднее количество желтых тел на одно животное составило 4, животных с числом овуляций 6-10 было 4 и среднее количество желтых тел на одно животное составило 7,7, животных с числом овуляций 11-20 было 1 и среднее количество желтых тел на одно животное составило 11. С числом овуляций более 20 ни одного животного не отмечено. При использовании ПЭГ 75000 Да из 12-ти обработанных животных прореагировало 4, что составило 33,3%. При этом животных с числом овуляций 3-5 было 3 и среднее количество желтых тел на одно животное составило 3, животных с числом овуляций 6-10 было 1 и среднее количество желтых тел на одно животное составило 6, животных с числом овуляций 11-20 и более 20-ти не зафиксировано.
Данные, отраженные в таблице 2, наглядно показывают, что с увеличением молекулярной массы ПЭГ относительное количество животных, положительно прореагировавших на введение патентуемой фармацевтической композиции, уменьшалось, но оставалось приемлемым для практического применения, а при применении ПЭГ с молекулярной массой более 70000 Да было наиболее низким. Также, с увеличением молекулярной массы ПЭГ увеличивалось количество неовулировавших фолликулов у обработанных животных. Это объясняется тем, что с повышением молекулярной массы ПЭГ уменьшается его доля весового %, которой не достаточно для связывания остальных ингредиентов композиции, и, как следствие, увеличивается скорость инактивации активных веществ (ФСГ и ЛГ), что приводит к асинхронному росту и овуляции фолликулов и к увеличению количества неовулировавших фолликулов.
Как видно из таблиц 1 и 2, сравнительные исследования выявили значимое превосходство патентуемого фармацевтического средства.
В настоящее время в патентной и научно-технической литературе не известна фармацевтическая композиция в заявляемой совокупности компонентов, позволяющей сократить число инъекций ФСГ до одной и поддерживающей терапевтически активный уровень ФСГ в сыворотке крови с обеспечением успешного проведения индукции суперовуляции у самок животных, что позволяет сделать выводы о соответствии заявляемого решения критериям «новизна» и «изобретательский уровень».
Включение в заявляемую композицию 0,25-1% раствора новокаина значительно повышает фармакологические свойства этой композиции и способствует достижению технического результата - повышению количества яйцеклеток, пригодных для оплодотворения. Авторами было неожиданно обнаружено, что новокаин, благодаря своим холинолитическим свойствам, позволяющим купировать негативные явления, которые возникают вследствие инъекции экзогенных веществ и выражаются в виде спазмов гладкой мускулатуры и периферических сосудов, возникающих в месте инъецирования и ограничивающих биодоступность вводимых веществ, при введении патентуемой композиции позволяет улучшить кровоснабжение в месте ее инъецирования, оказывая дилятационное действие как на артериолы и венулы, так и на лимфатические капилляры. В этой связи, элиминация возможных вазоспазмов периферических сосудов и спазма гладкой мускулатуры в месте инъекции позволяет осуществить непрерывную доставку гонадотропинов из интерсициального пространства подкожной клетчатки, обеспечивая биодоступность и терапевтический эффект гонадотропинов. Таким образом, новокаин, воздействуя не только на кровеносную систему, но и на лимфатическую, оказывает триггерное влияние, позволяющее одномоментно побудить и усилить синхронный физиологический рост множества фолликулов, для которых первые 5-12 часов от момента введения композиции являются «подготовительным периодом» для последующего воздействия на них более высоких доз ФСГ и ЛГ, концентрация которых в крови увеличивается с уменьшением действия новокаина. В результате этого, уровень концентрации ФСГ и ЛГ, достаточный для синхронного созревания «подготовленных ранее» (в первые 5-12 часов от момента введения смеси) множества фолликулов, достигается через 36-48 часов от момента введения смеси и удерживается примерно на том же уровне до 96 часов от момента введения смеси.
Введение в патентуемую композицию раствора новокаина в процентном выражении в диапазоне 0,25-1% обеспечивает наиболее эффективную нарастающую волну высвобождения ФСГ/ЛГ/ПЭГ в организме животного. При введении раствора новокаина в концентрации менее 0,25% новокаин выполняет функцию обычного растворителя и не оказывает замедляющего свойства высвобождения сочетанных с ним ФСГ/ЛГ/ПЭГ. При введении раствора новокаина в концентрации более 1% замедляется местное кровоснабжение в точке инъецирования, снижается степень всасываемости ФСГ/ЛГ/ПЭГ, при этом новокаин выполняет функцию только анестетика и не позволяет в полной мере высвобождать ФСГ/ЛГ/ПЭГ, что приводит к недостатку уровня фолликулостимулирующего гормона в сыворотке крови и прерыванию роста фолликулов. При использовании 0,25-1% раствора новокаина с растворенным в нем ФСГ/ЛГ (1/0,001-1/1) активностью 800-1000 ME в количестве менее 65 вес. % происходит частичная связка между указанными ингредиентами, и после введения в организм животного распределение ФСГ/ЛГ/ПЭГ осуществляется непропорционально, и уровень ФСГ колеблется. Это приводит к нестабильной реакции яичников с низким выходом качественных яйцеклеток при овуляции. При использовании 0,25-1% раствора новокаина с растворенным в нем ФСГ/ЛГ (1/0,001-1/1) активностью 800-1000 ME в количестве более 90 вес. % консистенция композиции становится настолько жидкой, что после введения она распределяется в месте инъецирования, увеличивая площадь всасываемости, и дает обратный результат, снижая эффективность пролонгирующего действия ПЭГ. Как следствие, активные вещества ФСГ и ЛГ всасываются гораздо быстрее (в течение 2-3 суток) от необходимого времени, достаточного для полноценного процесса суперовуляции (4-5 дней).
ПЭГ с молекулярной массой от 6000 до 70000 Да, по отношению к которому в настоящем описании к патенту употребляются термины «полиэтиленгликоль (ПЭГ) с высокой молекулярной массой» или «высокомолекулярный ПЭГ», также способствует наиболее эффективному достижению технического результата - повышению количества яйцеклеток, пригодных для оплодотворения.
Была исследована эффективность пролонгирующего действия ПЭГ с молекулярной массой от 6000 до 70000 Да, оказываемого на ФСГ в организме животного, при введении этого полиэтиленгликоля в смеси с ФСГ и ЛГ, но без использования раствора новокаина (см. таблицу 1). Было выявлено, что ПЭГ с высокой молекулярной массой как пролонгатор ФСГ демонстрирует хорошие результаты по количеству желтых тел на яичниках у наиболее результативно прореагировавших на индукцию суперовуляции коров.
Полиэтиленгликоль с молекулярной массой менее 6000 Да при его использовании в качестве пролонгатора ФСГ в организме животного не оказывает необходимого пролонгирующего действия не только у коров крупных пород (голштинская, айрширская, аббердин-ангусская, герефордская и т.д.), но и у коров мелких пород (джерсейская и т.д.). Молекулярная масса ПЭГ более 70000 Да приводит к очень долгому высвобождению ФСГ, при этом введенное количество ФСГ не успевает высвободиться в течение того промежутка времени, который необходим для полного созревания фолликулов с образованием полноценных качественных яйцеклеток (4-5 дней), и, кроме того, не достигается уровень концентрации ФСГ в организме животного, достаточный для стимулирования яичников при проведении индукции суперовуляции. Введение ПЭГ с молекулярной массой более 70000 Да приводит к морфофункциональным нарушениям яичников со снижением их активности и, как следствие, к нарушению воспроизводительной функции у животного с образованием различного рода патологий в репродуктивных органах, приводящих к вынужденной выбраковке животных.
Количество вводимого ПЭГ с молекулярной массой от 6000 до 70000 Да в количестве 10-35 вес. % способствует наиболее эффективному достижению технического результата. Это объясняется тем, что введение указанного ПЭГ в количестве менее 10 вес. % приводит к снижению активности и пролонгирующего свойства ПЭГ, при этом он не удерживает необходимый уровень ФСГ в тот период времени, в течение которого проводится индукция суперовуляции в соответствии с патентуемым способом. Данное снижение эффективности действия ПЭГ приводит к преждевременному высвобождению ФСГ в организме животного и к дегенерации и атрезии образовавшихся фолликулов. Введение указанного полиэтиленгликоля в количестве более 35 вес. % приводит к превышению времени, необходимого для высвобождения ФСГ, к отсутствию овуляции образовавшихся фолликулов и их последующему росту с образованием поликистозов яичников в тот период времени, в течение которого проводится индукция суперовуляции в соответствии с патентуемым способом.
Гипофизарные гонадотропины ФСГ и ЛГ использованы в патентуемой композиции с учетом известного диапазона соотношений фракций ФСГ/ЛГ (1/0,001-1/1) и известного количества их введения с активностью 800-1000 ME, необходимых для вызывания успешной суперовуляции у коров. При этом для успешной индукции суперовуляции у самок других видов млекопитающих данная фармацевтическая композиция с активностью действующих веществ 800-1000 ME подлежит делению на части объема таким образом, чтобы на одну самку в зависимости от вида млекопитающих приходилось бы необходимое количество ME активного вещества.
Сущность изобретения поясняется примерами.
Пример 1. Телке джерсейской породы №1277, возраст 13 месяцев, провели индукцию суперовуляции с использованием патентуемой композиции. Для этого на 10-й день полового цикла (в лютеиновую фазу) однократно подкожно вводили композицию в полном объеме с содержанием действующих веществ ФСГ/ЛГ (1/0,001) активностью 1000 ME, растворенных в 7,5 мл 0,25%-го раствора новокаина, что составляет 75 вес. % от всей композиции, и с содержанием пролонгатора ПЭГ с молекулярной массой 6000 Да в количестве 2,5 г, что составляет 25 вес. % от всей композиции. Через 48 часов ввели простагландин F2α в соответствии с инструкцией по применению. После овуляции фолликулов на их месте образовались желтые тела, которые подсчитывали посредством пальпации «per rectum», а также визуализировали при помощи техники для ультразвуковой диагностики. Было определено, что у данной телки на правом и левом яичниках были сформированы 11 и 9 четко выраженных желтых тел. Таким образом, общее количество вышедших яйцеклеток, пригодных к оплодотворению, составляет 20 штук.
Пример 2. Овцематкам в количестве 5 голов провели индукцию суперовуляции с использованием патентуемой композиции, при этом им на 10-й день полового цикла (в лютеиновую фазу) однократно подкожно вводили эту композицию с содержанием действующих веществ ФСГ/ЛГ (1/1) активностью 200 ME. Для этого каждому животному вводили 5-ю часть от патентуемой композиции с содержанием действующих веществ ФСГ/ЛГ (1/1) активностью 1000 ME, растворенных в 7,5 мл 0,25% раствора новокаина, что составляет 75 вес. % от всей композиции, и с содержанием ПЭГ с молекулярной массой 6000 Да в количестве 2,5 г, что составляет 25 вес. % от всей композиции. Через 48 часов ввели простагландин F2α в соответствии с инструкцией по применению. После овуляции фолликулов на их месте образовались желтые тела, которые подсчитывали у каждого животного методом лапароскопии. У 2-х овцематок было по 12 желтых тел на яичниках у каждого животного, у остальных трех овцематок - 16, 18 и 19 желтых тел на яичниках. Таким образом, зафиксированное количество желтых тел на яичниках у каждой самки идентично количеству вышедших яйцеклеток, пригодных к оплодотворению, и составляет от 12 до 19 штук.
Пример 3. Лабораторным белым мышам в количестве 50 штук (далее - общее количество обработанных мышей) провели индукцию суперовуляции с использованием патентуемой композиции, однократно подкожно вводили эту композицию с содержанием действующих веществ ФСГ/ЛГ (1/1) активностью 20 ME. Для этого каждому животному вводили 50-ю часть от патентуемой композиции, содержащей действующие вещества ФСГ/ЛГ (1/1) активностью 1000 ME, растворенные в 7,5 мл 0,25%-ного раствора новокаина, что составляет 75 вес. % от всей композиции, и содержащей ПЭГ с молекулярной массой 6000 Да в количестве 2,5 г, что составляет 25 вес. % от всей композиции. Через 12 часов ввели простагландин F2α в соответствии с инструкцией по применению. После овуляции фолликулов на их месте образовались желтые тела, для определения количества которых каждому исследуемому животному провели лапаротомию с последующей овариоэктомией. Полученные яичники взвешивали на электронных весах для установления массы яичников. Полученные показатели массы яичников сравнивали со среднестатистическим показателем веса яичников для данного вида животных в аналогичный промежуток времени естественного полового цикла, при котором в норме образуются желтые тела. У каждого исследуемого животного было установлено увеличение веса яичников, свидетельствующее об их функциональной активности, и большое количество лютеальной ткани в период проведения индукции суперовуляции. Затем проводили морфологическое исследование под микроскопом на наличие и количественный состав желтых тел на поверхности яичников. Было определено, что из 50 исследуемых мышей 3 (6% от общего количества обработанных мышей) не показали существенной разницы реакционного ответа яичников, а 47 (94% от обработанного количества мышей) дали положительную реакцию на индукцию суперовуляции с использованием патентуемой композиции. Из положительно прореагировавших 47 мышей 19 голов (38% от общего количества обработанных мышей) показали средний реакционный ответ яичников, на которых количество желтых тел варьировало в пределах 8-10. Также было установлено, что у 14 мышей (28% от общего количества обработанных мышей) количество желтых тел варьировало в пределах 10-12 шт. У 8 мышей (16% от обработанного количества мышей) количество желтых тел варьировало в пределах 13-15, и 6 мышей (12% от общего количества обработанных мышей) дали реакционный ответ яичников на индукцию суперовуляции с образованием более 15 желтых тел. Так как количество полученных яйцеклеток в результате проведения индукции суперовуляции составляло от 8 до 15 и более штук, и при этом известно, что естественная плодовитость у лабораторных белых мышей составляет примерно 5 мышат на один помет одной взрослой особи, то полученные результаты свидетельствуют об эффективности применения патентуемой композиции.