Способ получения аутологичных регуляторных Т-лимфоцитов путем культивирования ex vivo в присутствии хорионического гонадотропина
METHOD FOR OBTAINING AUTOLOGOUS REGULATORY T-LYMPHOCYTES BY EX VIVO CULTIVATION IN PRESENCE OF HUMAN CHORIONIC GONADOTROPIN

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Изобретение относится к области клеточной биотехнологии и может применяться в медицине для лечения ряда аутоиммунных расстройств, а также в реакции «хозяин против трансплантата» (РХПТ), которая возникает при отторжении тканей и органов в случаях их аллогенной пересадки. Кроме того, изобретение может найти применение в научных исследованиях. Изобретение направлено на разработку способа получения композиции, основу которой составляют регуляторные Т-клетки, пригодной для лечения и профилактики таких заболеваний и состояний, как отторжение трансплантата, аутоиммунные патологии.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В настоящее время известные методы получения регуляторных Т- клеток (Treg) можно разделить на две основные стратегические группы: выделение Treg из периферической крови различными методами сортировки или выделение Т-хелперов и дальнейшая направленная дифференцировка в Treg in vitro с использованием специально разработанных для этого наборов.
+
+
+
К первой группе относится технология получения регуляторных Т-лимфоцитов из цельной крови с использованием позитивной и негативной селекции клеток [1]. Суть ее сводится к тому, что методом иммуномагнитной сепарации из суспензии сначала удаляют CD8 CD14 и CD19-клетки, а затем оставшиеся клеточные популяции подвергают позитивной селекции по маркеру CD25. Минусом данной стратегии является невозможность выделения Treg сразу по нескольким характеристикам.
Известен метод выделения Treg, основанный на сортировке клеток по нескольким маркерам. Данный метод предполагает использование проточной сортировки сразу по нескольким соответствующим маркерам, тем самым позволяя получить чистую популяцию целевых Treg. В целом приведенный метод решает проблему использования сразу нескольких клеточных характеристик, однако для подтверждения супрессорной функции Treg осуществляется внутриклеточное измерение уровня транскрипционного фактора FOXP3. Несмотря на очевидные плюсы этой стратегии, есть также очевидные недостатки, в частности, малочисленность Treg в периферической крови (5-10% среди всех CD4 Т-лимфоцитов), а также непригодность дальнейшего использования клеток в клинической практике из-за необходимой пермеабилизации и фиксации клеточной мембраны. Этот минус критичен для проведения клинических исследований, при котором важен большой выход функционально - активной клеточной популяции, поскольку известно, что для подавления РХПТ требуются большие дозы Treg. Эта проблема может быть решена разработкой протоколов генерации и экспансии функционально-активных регуляторных клеток ex vivo.
С этой точки зрения привлекают внимание две описанных стратегии генерации регуляторных Т-клеток in vitro.
+
+
+
+
Одна из таких стратегий - направленная цитокиновая индукция дифференцировки наивных Т-клеток (CD4CD45R0) в фенотип регуляторных Т-лимфоцитов. Особенностью данной методики является получение пула наивных Т-хелперных клеток из периферической крови донора и дальнейшее их культивирование с цитокинами IL-2 и TGF-β [2], а также с антителами против CD3 и CD28 [3]. В ряде случаев в среду культивирования вносят ретиноевую кислоту, рапамицин и бутират [4]. Стоит отметить, что количество наивных Т-хелперов (CD4CD45R0) в периферической крови крайне мало, что создает препятствия для получения этих клеток.
+
Второй путь основан на получении пула Т-хелперов (CD4) из периферической крови донора, с дальнейшим их культивированием с цитокинами, что на сегодняшний день является наиболее перспективным и оправданным, поскольку позволяет получить популяцию Treg в достаточном для адаптивного переноса объеме, с сохранением функциональной активности клеток [5].
+
3
+
+
+
2
2
Наиболее близким к заявляемому решению по технической сущности и достигаемому результату является способ, предложенный Быковской и соавт. [6]. Суть его сводится к тому, что из крови выделяют мононуклеарные клетки периферической крови, которые подвергают позитивной селекции CD4-клеток методом магнитной сепарации. После чего полученные клетки помещают во флаконы 25 см в полную питательную среду и добавляют смесь цитокинов - IL-2, TGF-β и антитела к CD2, CD3 и CD28. Затем клетки инкубируют в СО-инкубаторе в условиях содержания 5% СО при 37°С в течение 7-12 суток. Смена среды производится каждые 3-4 суток. В итоге можно получить популяцию CD4CD25Foxp3 Т-лимфоцитов человека.
+
-
С позиции критики необходимо отметить, что, несмотря на эффективность схемы, в данном случае происходит пролиферация и эффекторных клеток тоже, поскольку активированные Т-клетки начинают временно экспрессировать молекулу CD25, правда в меньшей степени. Поэтому главной проблемой культивирования Treg является существенная контаминация CD25FOXP3 Т-клетками. Существует и другой аспект проблемы получения Treg, связанный со стабильностью молекулы FOXP3, которая индуцируется только TGF-β. Дело в том, что под действием таких цитокинов, как IL-6 или IL-1 может произойти переход Treg в Th17-клетки и экспрессия FOXP3 будет потеряна [7].
Заявляемый способ позволяет решать задачу повышения стабильности экспрессии белка FOXP3 за счет добавления в ростовую среду при культивировании Treg хорионического гонадотропина человека (ХГЧ). Хорионический гонадотропин - это гормон, вырабатываемый тканью хориона после имплантации эмбриона. Помимо своих прямых функций, а именно, стероидогенеза и поддержания функциональной активности плаценты, он способен проявлять также иммуномодулирующие функции во время беременности. В данном случае важно, что одним из известных свойств этого белка является определенный молекулярный механизм передачи сигнала через цАМФ, повышение которого приводит к экспрессии молекулы FOXP3 [8]. Этот аспект может послужить дополнительным сигналом, приводящим к экспрессии FOXP3, что отразится на стабильности функционально активных Treg.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
+
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка эффективного способа выделения и культивирования регуляторных Т-лимфоцитов (Treg) в количестве и качестве, удовлетворяющем перспективам применения их в осуществлении способов лечения заболеваний, при которых свойственно снижение концентрации и/или функциональной активности Treg. Такой способ подразумевает изначальное выделение CD4-Т-лимфоцитов из крови пациентов, для их дальнейшей обработки смесью цитокинов, антител и ХГЧ с целью последующего введения аутологичных клеток, обогащенных регуляторными Т-лимфоцитами, этому же пациенту. Кроме того, предлагаемый способ получения Treg может быть использован при трансплантации органов для уменьшения реакции «хозяин против трансплантата» (РХПТ), что заметно повышает шансы приживления аллотрансплантата. Преимуществом использования клеточной аллоспецифичной терапии является также то, что Treg будут осуществлять свою модулирующую функцию в области аллоантигена, а не системно во всем организме, как при применении медикаментозной терапии.
Представленная работа выполнена при финансовой поддержке Фонда содействия малых форм предприятий в научно-технической сфере (программа «Умник»).
Сущность изобретения.
Достигаемый изобретением технический результат заключается в том, что достигается значимый прирост числа Т-регуляторньгх клеток, позволяющий сократить время культивирования с 7-14 суток до трех.
+
2
2
Из крови, полученной венепункцией, выделяют мононуклеарные клетки периферической крови (МПК) путем ее центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина (ρ=1,077). После чего из фракции МПК методом магнитной сепарации выделяют CD4 Т-лимфоциты. Полученную клеточную суспензию помещают в 96-луночный планшет, добавляя смесь цитокинов и антител, которые обеспечивают дальнейшее развитие клеток в популяцию Treg. Эта смесь содержит цитокины IL-2, TGF-β, моноклональные антитела к CD2, CD3, CD28 - антигену человека, а также гормон беременности - хорионический гонадотропин человека. После этого планшет с клетками, активирующей смесью и полной питательной средой культивируют в СО-инкубаторе при 5% СО, 37°С в течение трех суток. В результате происходит дифференцировка и пролиферация функционально активных регуляторных Т-клеток.
+
Признаки способа, отвечающие критерию новизны, состоят в том, что предлагаемый способ увеличения количества аутологичных регуляторных Т-лимфоцитов пациента в условиях in vitro с использованием смеси цитокинов, антител и ХГЧ для обработки CD4- клеток пациента. В результате достигается высокая гомогенность получаемой популяции лимфоцитов, а также стабильность маркера FOXP3, отражающего функциональную активность Treg. Помимо того, что достигается значимый прирост клеток (в среднем на 64%), данная экспериментальная схема предполагает и сокращение времени культивирования клеток- с 7-14 суток до трех. В целом данная технология позволяет получить стабильную экспрессию FOXP3 за счет применения ХГЧ, сократить объем забираемого образца и времени культивирования клеток.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ ИЗОБРАЖЕНИЙ
Сущность заявляемого изобретения поясняется графическими изображениями.
На фигуре 1 представлены репрезентативные графики экспрессии маркеров Treg в популяции клеток, выделенных методом магнитной сепарации до начала культивирования клеток.
Фиг. 1а. График прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния. На графике выделен гейт лимфоцитов (19%).
+
-
+
+
Фиг. 1б. График жизнеспособных лимфоцитов, несущих маркер CD3 (CD3 7-AAD, Т-лимфоциты) - 98,13%. Жизнеспособность была определена с помощью витального красителя 7-AAD. Фиг. 1в. Гистограмма общего пула жизнеспособных Т-лимфоцитов, несущих маркер CD4 (CD3CD4, Т-хелперы) - 99,58%.
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
-
+
+
+
-
Фиг. 1г. График четырех популяций Т-хелперов, основанных на экспрессии молекул CD25 и CD127. Левый верхний квадрант - эффекторные Т- клетки (CD3CD4CD25CD127), правый верхний квадрант - активированные Т-хелперы (CD3CD4CD25CD127), левый нижний квадрант - неактивированные Т-хелперы (CD3CD4CD25CD127), правый нижний квадрант - регуляторные Т-лимфоциты (CD3CD4CD25CD127). Уровень Treg периферической крови после магнитной сепарации - 3,15%.
На фигуре 2 представлены репрезентативные графики экспрессии маркеров Treg, после трех суток культивирования клеток с добавлением ХГЧ в концентрации 10 МЕ/ мл. Тактика гейтирования соответствует таковой на фигуре 1.
Фиг. 2а. Общий гейт лимфоцитов (32%). Увеличение процента лимфоцитов в сравнении с первым днем культивирования связано с активированием клеток.
+
Фиг. 2б. живые CD3- лимфоциты (96,69%).
Фиг. 2в. Т-хелперы (98,22%).
Фиг. 2г. Treg (62,02%).
После трех суток инкубирования растет процент Treg (%), при этом роста остальных популяций не происходит, что показывает специфичность действия выбранных цитокинов, активатора и ХГЧ.
На фигуре 3 представлены репрезентативные графики экспрессии маркеров Treg, после трех суток культивирования клеток с добавлением ХГЧ в концентрации 100 МЕ/ мл.
Фиг. 3а. Общий гейт лимфоцитов (28,91%).
+
Фиг. 3б. Живые CD3- лимфоциты (96,55%).
Фиг. 3в. Т-хелперы (97,82%).
Фиг. 3г. Treg (64,43%). При сравнении двух схем культивирования с добавлением разных физиологических концентраций ХГЧ, является очевидным отсутствие дозозависимого эффекта, что позволяет использовать белок в диапазоне концентраций 10-100 МЕ/мл.
Предлагаемое техническое решение иллюстрируется следующими примерами.
Нижеследующие примеры приводятся только с целью демонстрации возможностей настоящего изобретения, и не ограничивают спектр клеток-мишеней и их свойств, которые могут быть использованы и/или улучшены при помощи предлагаемого способа культивирования.
Приводимые в тексте и примерах конкретные количественные параметры, даже в области указываемых диапазонов, не фиксируются формулой изобретения, потому что не являются принципиальными условиями осуществления заявляемого способа.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Пример 1
+
+
high
low/-
1. Способ выделения и культивирования CD3CD4CD25 CD 127
Все процедуры проводят в ламинарных шкафах II класса биологической защиты с использованием стерильной одноразовой посуды и реагентов.
Периферическую кровь получают методом венепункции из локтевой вены в стерильные пробирки с гепарином (2 пробирки объемом по 9 мл).
Выделение мононуклеарных клеток
3
Образцы крови разводят в соотношении 1:1 раствором Хэнкса (ПанЭко, Россия), после чего наслаивают на раствор фиколл-урографина (ρ=1,077 г/см, ДиаМ, Россия) в пробирках объемом 15 мл. Пробирки центрифугируют при 400g в течение 40 минут при комнатной температуре. В процессе центрифугирования происходит стандартное разделение крови на фракции: эритроциты и гранулоциты оседают на дно пробирки, а кольцо мононуклеарных клеток располагается на границе градиента. Отобранную пипеткой фракцию МПК разводят раствором Хэнкса в два раза, проводят двукратную отмывку центрифугированием в течение 20 минут при 350 g и комнатной температуре, после чего ее избавляют от тромбоцитов. Для этого извлекают супернатант, а клетки ресуспендируют в растворе Хенкса, до конечного объема суспензии 14 мл и центрифугируют при 200 g и 4°С в течение 20 минут.
Супернатант удаляют пипеткой, а осадок клеток ресуспендируют в 1 мл раствором Хэнкса для дальнейшего подсчета общего количества выделенных МПК и оценки числа жизнеспособности клеток.
Для определения количества живых МПК к 25 мкл суспензии клеток добавляют 25 мкл красителя трипанового синего (Sigma Aldrich, Англия). Подсчет жизнеспособности клеток проводят в камере Горяева, процент живых клеток при описанных условиях составляет не менее 96%.
+
Иммуномагнитная сепарация CD4-клеток из МПК по технологии MACS
7
7
Суспензию МПК осаждают центрифугированием 10 минут при 300 g. Осадок клеток ресуспендируют в буфере Auto Macs Rinse Solution, содержащем 0,5% BSA, из расчета 80 мкл на каждые 10 клеток. В полученную суспензию добавляют парамагнитные микрочастицы, конъюгированные с мышиными моноклональными антителами против молекулы CD4 лимфоцитов человека (Miltenyi Biotec, Германия), исходя из расчета 20 мкл частиц на 10 клеток. Полученную смесь инкубируют 15 минут при 4°С.
7
После инкубации к смеси клеток и магнитных частиц добавляют буфер Auto Macs Rinse Solution, содержащий 0,5% BSA, из расчета 1-2 мл на 10 клеток и проводят процедуру отмывки центрифугированием в течение 10 минут при 300g и 4°С.
8
+
Супернатант удаляют и ресуспендируют клетки в том же буфере из расчета 500 мкл на 10 клеток. В колонку, находящуюся в магнитном поле, вносят 500 мкл буфера для ее промывки, а затем весь объем полученной клеточной суспензии. Колонку промывают буфером, извлекают ее из магнитного поля сепаратора и резким нажатием поршня проводят элюцию CD4-лимфоциты в стерильную пробирку. Все процедуры магнитной сепарации проводят на холоде. Описанную процедуру позитивной селекции осуществляют по протоколу изготовителя набора (Miltenyi Biotec, Германия).
+
Часть клеток отбирают для подсчета в камере Горяева, а часть для оценки чистоты полученных CD4- клеток. Для этого клетки окрашивают антителами и анализируют методом проточной цитофлуориметрии. Тактика гейтирования представлена на фиг. 1 Чистота составляла CD4+- клеток составляет в среднем 97% (n=5). На фигуре 2 представлены основные маркеры Treg и чистота выделенных CD4-лимфоцитов.
+
high
-/low
2. Направленная дифференцировка и экспансия Treg (CD4CD25CD127) ex vivo
+
Полученные CD4- клетки вносят в лунки 96-луночного планшета в концентрации 1 млн/мл в культуральную среду, содержащую среду TexMACS (Miltenyi Biotec), 1% смеси антибиотиков (стрептомицин, амфотерицйн, пенициллин, «BI», Израиль), 10% ЭТС (эмбриональная телячья сыворотка, BI, Израиль), 2 мМ L-глутамина и 10 мМ Hepes («ICN Ph.», США). Кроме того, в культуральную среду добавляют цитокины TGF-β (в подобранной концентрации 5 нг/мл, Miltenyi Biotec, Германия) и IL-2 (166 нг/мл, Miltenyi Biotec, Германия). Концентрации рассчитаны исходя из биологической активности каждого цитокина. Помимо этого, в культуру вносят активатор, включающий мышиные моноклональные антитела к рецептору CD2, CD3 и CD28 (Miltenyi Biotec, Германия) из расчета 25 мкл активирующих частиц на каждые 5 млн клеток. Хорионический гонадотропин человека (ХГЧ) (Ovidrell, Merck Serono, Италия) вносят в двух физиологических концентрациях 10 и 100 МЕ/мл, которые характеризуют начало и окончание первого триместра беременности.
2
2
Клетки культивируют в плоскодонных 96-луночных планшетах в СО -инкубаторе при 37°С в атмосфере 5% СО в течение трех суток.
Для идентификации Treg на проточном цитометре CytoFLEX S (Beckman Coulter, США) клетки окрашивают антителами к CD3 (АРС / Су7), CD4 (FITC), CD25 (АРС) и CD 127 (РЕ / Су7) (BioLegend, США) по методике, предложенной производителем. Для оценки жизнеспособности клеток используют краситель 7-AAD (PC 5.5), входящий в панель идентификации Treg. В результате после трех суток культивирования жизнеспособность клеток варьирует от 89 до 98%.
Для оценки уровня FOXP3 производят внутриклеточное окрашивание с предварительной пермеабилизацией клеток.
В таблице представлены результаты цитофлуориметрического анализа CD4+-клеток до начала и после трех суток культивирования.
+
После трех суток культивирования CD4- лимфоцитов с ХГЧ, общее количество Treg увеличивается на 64±4,4%, при этом процент эффекторных Т-лимфоцитов уменьшается (табл. 1). Использование ХГЧ в качестве дополнительной стимуляции увеличивает общий выход Treg на 23±4,1%. Уровень регуляторных Т-лимфоцитов, экспрессирующих FOXP3, увеличивается в 2 раза (данные не представлены). Обе концентрации ХГЧ (10 и 100 МЕ/ мл) демонстрируют одинаковый эффект на дифференцировку Treg и экспрессию FOXP3, что позволяет использование ХГЧ в диапазоне выбранных концентраций.
+
Таким образом предложенный способ направленной дифференцировки CD4-клеток в фенотип регуляторных Т-лимфоцитов позволяет получить существенное увеличение количества функционально активных жизнеспособных Treg за счет добавления в культуру ХГЧ. При этом получаемый эффект позволяет сократить время культивирования до трех суток, что в свою очередь не требует замены среды. Данное обстоятельство обеспечивает стабильность процесса культивирования, что существенным образом нивелирует негативное влияние процедурных операций.
Применение разработанного способа может найти свою реализацию не только в научных исследованиях, но и в разработке подходов к лечению ряда аутоиммунных расстройств и снижении рисков возникновения реакции «хозяин против трансплантата».
Библиографический список
1. Riley J.L., June С.Н., Blazar B.R. Human T regulatory cell therapy: take a billion or so and call me in the morning // Immunity. 2009. Vol. 30. №5. P. 656-65. DOI: 10.1016/j.immuni.2009.04.006.
2. Schmidt A., Éliás S., Joshi R.N., Tegner J. In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Naive CD4+ T Cells Using a TGF-β-containing Protocol // J Vis Exp. 2016. Vol. 118. DOI: 10.3791/55015.
3. Earle K.E., Tang Q., Zhou X., Liu W., Zhti S., Bonyhadi M.L., Bluestone J.A. In vitro expanded human CD4+CD25+ regulatory T cells suppress effector T cell proliferation // Clin Immunol. 2005. Vol. 115. №1. P. 3-9. DOI: 10.1016/j. clim 2005.02.017.
4. Schmidt A., Eriksson M., Shang M.-M., Weyd H., Tegnér J. Comparative Analysis of Protocols to Induce Human CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells by Combinations of IL-2, TGF-beta, Retinoic Acid, Rapamycin and Butyrate// PLoS ONE. 2016. Vol. 11. №2.
5. Kanjana K., Paisooksantivatana K., Matangkasombut P., Chevaisrakul P., Lumjiaktase P. Efficient short-term expansion of human peripheral blood regulatory T cells for co-culture suppression assay // J Immunoassay Immunochem. 2019. Vol. 40. №6. P. 573-589. DOI: 10.1080/15321819.2019.1659813.
6. СПОСОБ ОБОГАЩЕНИЯ РЕГУЛЯТОРНЫХ CD4+CD25+FOXP3+T-КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА ex vivo //Патент РФ №2010131841/10. 2008 / Быковская Светлана Нюневна, Караулов Александр Викторович, Лысюк Елена Юрьевна.
7. Yang Х.О., Nurieva R., Martinez G.J., Kang H.S., Chung Y., Pappu B.P. et al. Molecular antagonism and plasticity of regulatory and inflammatory T cell programs // Immunity. 2008. Vol. 29. №1. P. 44-56.
8. Bodor J., Bopp T., Vaeth M., Klein M. et al. Cyclic AMP underpins suppression by regulatory T cells // Eur J Immunol. 2012. Vol. 42. №6. P. 1375-84.