Способ оценки ангиогенного потенциала скаффолдов
METHOD FOR ASSESSING ANGIOGENIC POTENTIAL OF SCAFFOLDS

Изобретение относится к медицине, биологии, ветеринарии, фармакологии и предназначено для количественной оценки способности биодеградируемых матриц (скаффолдов) к васкуляризации или их ангиогенного потенциала при имплантационных тестах на животных.
Согласно межгосударственному стандарту ISO оценка способности скаффолдов к васкуляризации при имплантационных тестах имеет большое значение в оценке биологического действия медицинских изделий. Ангиогенный потенциал напрямую определяет регенераторный потенциал скаффолдов, так как формирующееся сосудистое русло обеспечивает трофику заселяющих скаффолд клеточных элементов. Морфологическая верификация наличия в скаффолде сосудов через определенный период времени является единственным, рекомендованным действующим стандартом ГОСТ ISO 10993-6 - 2011, методом, позволяющим характеризовать ангиогенный потенциал биодеградируемых матриц [ГОСТ ISO 10993-6 – 2011]. Межгосударственный стандарт. Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 6. Исследования местного действия после имплантации /Medical devices. Biological evaluation of medical devices. Part 6. Tests for local effects after implantation. Дата введения: 01.01.2013). Изготовление гистологических препаратов является крайне трудоемким процессом. При этом морфологическая оценка в стандартных окрасках затруднена в связи с тем, что визуализируются только хорошо перфузируемые сосуды. Идентифицировать капилляры возможно только в областях, где в них находятся эритроциты, что резко снижает точность оценки. Согласно ранее опубликованным данным с помощью морфологических методов оценки выявление признаков васкуляризации биодеградируемых матриц возможно с 14-х суток после имплантации под кожу белым крысам [Исследование биосовместимости матриц на основе поликапролактона и гидроксиапатита в условиях in vivo / А.Н. Иванов, M.Н. Козадаев, Н.В. Богомолова, О.В. Матвеева, Д.М. Пучиньян, И.А. Норкин, Ю.Е. Сальковский, Г.П. Любунь // Цитология. 2015. Т. 57, № 4. C. 286-293].
Известны модификации морфологической оценки интенсивности васкуляризации, в частности, за счет применения методов иммуногистохимии, что позволяет повысить точность оценки. Так, предложен способ определения удельной плотности сосудов при иммунохимическом исследовании ткани. Образец ткани подвергают исследованию с использованием моноклональных антител к CD34 ,выявляющих эндотелиальные клетки сосудов. Некоторое снижение трудоемкости достигается оцифровыванием всей площади среза исследуемой ткани и использованием автоматизированной системы анализа изображений. Рассчитывают отношение количества сосудов к площади исследуемой ткани-удельную плотность сосудов [патент RU на изобретение №2366951]. Однако, при реализации данного способа не устраняется необходимость приготовления гистологического препарата, а иммуногистохимическая техника его окрашивания только усложняет методику.
Наиболее близким аналогом к заявляемому изобретению является способ оценки интенсивности ангиогенеза у животных при имплантационных тестах биодеградируемых скаффолдов [Особенности процесса регенерации костной ткани у крыс при имплантации скаффолда, минерализованного ватеритом, с адсорбированной таниновой кислотой/ А.Н. Иванов, М.С. Савельева, М.О. Куртукова, С.В. Кустодов, Е.В. Гладкова, В.В. Блинникова, И.В. Бабушкина, Б.В. Парахонский, В.Ю. Ульянов, И.А. Норкин// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2019. Т. 167. № 2. С. 236-239), основанный на определении концентрации в кровотоке фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Однако, было обнаружено, что имплантация небиосовместимых матриц также индуцирует повышение уровня VEGF, которое не приводит к васкуляризации такой матрицы, а направлено на формирование барьера грануляционной ткани и отграничение скаффолда. Следовательно, сам по себе уровень VEGF в сыворотке крови не может являться критерием для оценки ангиогенного потенциала скаффолдов при имплантационных тестах на животных. Для адекватной количественной характеристики ангиогенного потенциала путем определения концентрации VEGF необходимо верифицировать направление ангиогенных процессов при помощи морфологических методов исследования.
Задачей заявляемого изобретения является модернизация методологии количественной биохимической оценки ангиогенного потенциала биодеградируемых скаффолдов на ранних сроках субкутанных имплантационных тестов на животных для повышения ее точности и снижения трудоемкости.
Сущность заявляемого изобретения заключается в том, что в способе оценки ангиогенного потенциала скаффолдов, включающем имплантацию скаффолда в форме диска под кожу крысам, после чего под наркозом выполняют забор крови в объеме 3-5 мл, кровь центрифугируют для получения сыворотки, в которой определяют концентрацию фактора роста эндотелия сосудов-А (VEGF), забор крови производят через 7 суток после имплантации, дополнительно в сыворотке крови определяют концентрацию синдекана-1, рассчитывают соотношение VEGF и синдекана-1, для нормировки величины соотношения концентраций VEGF и синдекана-1 ее умножают на поправочный коэффициент К, определяемый как соотношение медианного значения концентраций синдекана-1 и VEGF у интактных животных, если нормированная величина соотношения концентраций VEGF и синдекана-1 не превышает 2, то матрицы не обладают ангиогенным потенциалом, если соотношение больше 2, то выраженность ангиогенного потенциала оценивается прямо пропорционально нормированной величине указанного соотношения.
Технический результат заявляемого изобретения.
Использование комбинации концентрации маркеров индукции ангиогенеза и стабильности эндотелиального гликокаликса при реализации данного способа, позволяет охарактеризовать интенсивность и направление структурного ремоделирование микроциркуляторного русла за счет чего достигается повышение точности оценки ангиогенного потенциала биодеградируемого скаффолда на ранних сроках подкожного имплантационного теста.
Проведение оценки ангиогенного потенциала с помощью заявляемого способа, не требует верификации биохимических данных путем приготовления морфологических препаратов, что позволяет добиться сокращения сроков исследования до 7 суток и снизить трудоемкость.
Сохранение дублей аликвот сыворотки в условиях морозильной камеры дополнительно обеспечивает возможность контроля воспроизводимости и точности результатов биохимических исследований при сравнении различных скаффолдов.
Нормирование результатов измерения концентраций маркеров ангиогенного потенциала посредством поправочного коэффициента позволяет добиться универсальности данного метода с возможностью использования реагентов различных производителей, а также разных линий животных. Сохранение дублей аликвот сыворотки в условиях морозильной камеры дополнительно обеспечивает возможность контроля воспроизводимости и точности результатов биохимических исследований при использовании различных реагентов, пород белых крыс, а также изучаемых скаффолдов.
Способ оценки ангиогенного потенциала скаффолдов используют следующим образом.
Белым крысам выполняют имплантацию скаффолда в форме диска под кожу крысам. Согласно действующему стандарту ГОСТ ISO 10993-6 – 2011 образцы имплантируют в виде дисков (пластин) диаметром от 10 до 12 мм и толщиной от 0,3 до 1 мм. Через 7 суток после имплантации под наркозом выполняют забор крови в объеме 3-5 мл в пробирки с активатором свертывания и разделительным гелем путем пункции правых отделов сердца; кровь центрифугируют для получения сыворотки (возможно хранение аликвот сыворотки крови при температуре -20 С). Определяют концентрацию фактора роста эндотелия сосудов-А (VEGF) и синдекана-1 методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием наборов видоспецифических реагентов на микропланшентном спектрфотометре. Рассчитывают соотношение концентраций VEGF и синдекана-1. Для нормировки величины соотношения концентраций VEGF и синдекана-1 ее умножают на поправочный коэффициент К, определяемый как соотношение медианного значения концентраций синдекана-1 и VEGF у интактных животных. Если нормированная величина соотношения концентраций VEGF и синдекана-1 не превышает 2, то матрицы не обладают ангиогенным потенциалом. Если соотношение больше 2, то выраженность ангиогенного потенциала оценивается прямо пропорционально нормированной величине указанного соотношения.
Пример 1
Заявляемый способ был апробирован при оценки ангиогенного потенциала скаффолдов на основе поликапролактона и ватерита на 44 лабораторных белых крысах-самцах массой 200-250 г. Животные были разделены на 3 группы: 1-я группа включала 8 интактных крыс, 2-я группа – 18 крыс, которым проводилась имплантация в рану скаффолда на основе поликапролактона с адсорбированным на нем чужеродным белком (отрицательный контроль – скаффолд, не обладающий биосовместимостью), 3-я группа – 18 крыс, которым проводилась подкожная имплантация скаффолда из поликапролактона и ватерита. Забор крови у 8 крыс 2-й и 8 крыс 3-й групп осуществлялся на 7-й день эксперимента. Морфологическая верификация васкуляризации скаффолдов осуществлялась в соответствии с требованиями стандарта ГОСТ ISO 10993-6 – 2011 при исследовании гистологического материала, полученного от 10 крыс из 2-й и 10 крыс их 3-й групп, выведенных из эксперимента на 21 после имплантации матриц.
При проведении экспериментов на животных соблюдались этические принципы в соответствии с Женевской конвенцией (Geneva, 1990). Всем животным за 5 минут до проведения манипуляций вводилась внутримышечно комбинация золетила («Virbac Sante Animale», Франция) в дозе 0,1 мл/кг и ксилазина («Interchemie», Нидерланды) в дозе 1 мг/кг для достижения наркоза.
Во второй и третьей группах белым крысам в межлопаточной области (в области холки) проводилась подкожная имплантация скаффолда в форме диска диаметром 10 мм, толщиной 1 мм.
Кровь забирали в объеме 5 мл в пробирки Vacuettе с активатором свертывания и разделительным гелем. Сыворотку крови получали путем центрифугирования 3000 об/мин. Аликвоты сыворотки крови замораживали и хранили при температуре -20°С.
Для оценки механизмов регуляции ангиогенеза проводилось определение концентрации VEGF в сыворотке крови экспериментальных животных методом ИФА с использованием набора реактивов Rat VEGF Immunoassay (R&D Systems, США). Для оценки стабильности микрососудистого русла оценивали концентрацию фрагментов гликокаликса эндотелиальных клеток – растворимых форм синдекана-1 в сыворотке крови методом ИФА с использованием наборов реагентов «ELISA Kit For Syndecan 1 Rat» (Cloud-Clone Corp., США). ИФА реализован в точном соответствии с инструкциями производителей реагентов на микропланшентном спектрфотометре Anthos 2020 (Biochrom, Великобритания).
При использовании наборов реагентов Rat VEGF Immunoassay (R&D Systems, США) и ELISA Kit For Syndecan 1 Rat (Cloud-Clone Corp., США) концентрация в сыворотке крови VEGF у 8 интактных животных составила 9,4 (7,3;15,7) пг/мл, а концентрация синдекана-1 1,11 (0,82;1,51). Поправочный коэффициент определен как частное от деления медиан концентраций синдекана-1 и VEGF в сыворотке крови: К=1,11/9,4=0,12.
Для верификации использовались морфологические методы оценки состояния мягких тканей области имплантации на 21-е сутки. После выведения животных из эксперимента путем передозировки препаратов для наркоза забирали материал для морфологического исследования. Для этого скаффолд с окружающими тканями извлекали единым блоком. Материал для исследования фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина (ООО «Биовитрум», Россия), обезвоживали в спиртах. После чего заливали в парафин. Срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином Майера (ООО «Биовитрум», Россия) и эозином (ООО «Биовитрум», Россия). Для покрытия срезов применяли среду Bio-Monht («BioOptica», Италия).
Препараты исследовали при помощи микроскопа AxioImager Z2 (CarlZeiss, Германия) и микровизора проходящего света серии μVizo-103 (ООО «ЛОМО ФО-ТОНИКА», Россия). На гистологических препаратах выявляли локальные признаки воспалительной реакции: отек, гиперемия, инфильтрация скаффолда иммунокомпетентными клетками. Проводили морфометрический подсчет количества клеток каждой клеточной популяции: фибробластов, фиброцитов, полиморфоядерных лейкоцитов (нейтрофилов и эозинофилов), лимфоцитов, и макрофагов в пяти полях зрения скаффолда при увеличении объектива 63х. Качественно определяли наличия сосудов в скаффолде.
Статистическую обработку данных осуществляли средствами программ MS Excel 2013 и Statistica 10.0. Большинство полученных данных имели распределение отличное от нормального, поэтому при статистической обработке вычислялись медианна, верхний и нижний квартили, а для сравнения групп использовали U-критерий Мана-Уитни, на основании которого рассчитывался показатель достоверности р. Для оценки взаимосвязи рассчитывали коэффициент корреляции Спирмена и показатель достоверности р. Различия считали значимыми при р < 0,05.
У крыс группы отрицательного контроля на 7-е сутки после имплантации матриц, не обладающих биосовместимостью, концентрации VEGF в сыворотке крови в 3,3 раза выше, чем у интактных животных группы контроля (табл. 1). При этом на 7-е сутки эксперимента у крыс группы отрицательного контроля в два раза по сравнению с контролем увеличена концентрация в сыворотке крови синдекана-1, что свидетельствует о его интенсивном отщеплении с поверхности эндотелиальных клеток.
На 7-е сутки эксперимента у животных группы отрицательного контроля соотношение концентраций в сыворотке крови VEGF и синдекана-1 варьирует от 7,77 до 16,73 составляя в среднем 12,5 (10,7;15), что статистически значимо превышает значения контроля. Нормированная величина данного соотношения у животных группы отрицательного контроля изменялась в пределах от 0,93 до 2,0 составляя в среднем 1,5 (1,3;1,8), что также значимо выше, чем у крыс контрольной группы (табл. 1).
Таблица 1
Концентрация VEGF и Синдекана-1 в сыворотке крови у экспериментальных животных на 7-е сутки после имплантации матриц с чужеродным белком в сравнении с интактными крысами группы контроля
ПоказателиГруппы
VEGF, пг/мл
Синдекан-1, нг/мл
<u>VEGF</u>Синдекан-1
<u>К х VEGF</u>Синдекан-1
Контроль: интактные животные(n=8)
9,4(7,3; 15,7)
1,11(0,82;1,51)
7,6 (4,4; 12,9)
0,9 (0,5; 1,5)
Отрицательный контроль: поликапролактон с чужеродным белком(n=8)
30,8(26,1;34,4)р=0,003405
2,31 (1,91; 2,67)р=0,001348
12,5 (10,7;15)р=0,012420
1,5 (1,3;1,8)р=0,012420
Примечание – в каждом случае приведены медиана, нижний и верхний квартили. Р - по сравнению с животными группы контроля.
При морфологической верификации ангиогенного потенциала и параметров воспалительной реакции в соответствии с рекомендациями стандарта ГОСТ ISO 10993-6—2011 на 21-е сутки после имплантации матрицы с чужеродным белком у 10 животных группы отрицательного контроля вокруг скаффолда обнаружен соединительнотканный барьер, инфильтрированный лейкоцитами, отек тканей перифокальной области, а также полнокровие сосудов артериального и венозного русла в этой зоне. Количество фибробластов и фиброцитов в 5 полях зрения матрицы, не обладающей биосовместимостью, при увеличении объектива 63х в среднем по группе достигало соответственно 5 (1;12) и 2 (0;6), что составляло 19 и 7% клеток скаффолда, характеризуя слабо выраженное заселение матрицы элементами фибробластического ряда (низкий регенераторный потенциал). В поликапролактоновых скаффолдах с адсорбированным чужеродным белком наблюдалось преобладание полиморфных лейкоцитов (в основном нейтрофилов), число которых достигало в среднем по группе 13 (5;16) в 5 полях зрения при увеличении объектива 63х, что составляло около 48% от общего числа клеток. Определялись лимфоциты и макрофаги, число которых достигало в среднем 3 (2;3) и 4 (2;6) в 5 полях зрения при увеличении объектива 63х, что составляло 11% и 15% клеток скаффолда с адсорбированным чужеродным белком. В совокупности 74% клеток матрицы у животных группы отрицательного контроля представлены различными разновидностями лейкоцитов, что характеризует воспалительную инфильтрацию матрицы и отсутствие ее биосовместимости. Признаков васкуляризации скаффолдов с адсорбированным чужеродным белком не обнаружено, что свидетельствует об отсутствии ангиогенного потенциала данного типа матриц.
Таким образом, соотношение концентраций в сыворотке крови VEGF и синдекана-1 от 7,77 до 16,73 и его нормированная величина от 0,93 до 2,0 на 7-е сутки после имплантации скаффолда соответствуют отсутствию васкуляризации матриц, то есть отсутствию у них ангиогенного потенциала.
Пример 2
У животных опытной группы на 7-е сутки после имплантации скаффолдов из поликапролактона и ватерита концентрация VEGF в сыворотке крови значимо выше, чем у крыс групп контроля и отрицательного контроля в 5,3 и 1,6 раза соответственно. При этом в отличие от животных группы отрицательного контроля у крыс опытной группы не отмечается значимого увеличения концентрации синдекана-1 в сыворотке крови, что свидетельствует об отсутствии признаков повреждения гликокаликса эндотелиоцитов (табл. 2).
На 7-е сутки эксперимента у животных опытной группы соотношение концентраций в сыворотке крови VEGF и синдекана-1 варьирует от 20,1 до 57,5 составляя в среднем 30,1 (24,9; 55,8), что статистически значимо превышает как значения контроля, так и отрицательного контроля. Нормированная величина данного соотношения у животных опытной группы варьировала от 2,41 до 6,9 составляя в среднем 3,6 (3;6,7), что также значимо выше, чем у крыс контрольной группы и группы отрицательного контроля (табл. 2).
Таблица 2
Концентрация VEGF и Синдекана-1 в сыворотке крови у животных опытной группы на 7-е сутки после имплантации матриц в сравнении с крысами группы отрицательного контроля
ПоказателиГруппы
VEGF, пг/мл
Синдекан-1, нг/мл
<u>VEGF</u>Синдекан-1
<u>К х VEGF</u>Синдекан-1
Отрицательный контроль: поликапролактон с чужеродным белком(n=8)
30,8(26,1;34,4)
2,31 (1,91; 2,67)
12,5 (10,7;15)
1,5 (1,3;1,8)
Опытная группа: поликапролактон, минерализованный ватеритом (n=8)
50,02(32,34;66,2)р<sub>1</sub>=0,002165р<sub>2</sub>=0,038320
1,31 (1,11; 1,78)р<sub>1</sub>=0,344563р<sub>2</sub>=0,011658
30,1(24,9;55,8)р<sub>1</sub>=0,002165р<sub>2</sub>=0,003405
3,6 (3;6,7)р<sub>1</sub>=0,002165р<sub>2</sub>=0,003405
1
2
Примечание – в каждом случае приведены медиана, нижний и верхний квартили. р- по сравнению с животными группы контроля; р – по сравнению животными группы отрицательного контроля.
При морфологической верификации ангиогенного потенциала и параметров воспалительной реакции в соответствии с рекомендациями стандарта ГОСТ ISO 10993-6—2011 на 21-е сутки после имплантации поликапролактоновых скаффолдов, минерализованных ватеритом, у животных опытной в перифокальной зоне, отмечено преимущественно умеренное кровенаполнение сосудов как артериального, так и венозного русла. Отеков, лейкоцитарной инфильтрации признаков формирования отграничивающего барьера вокруг поликапролактоновых скаффолдов, минерализованных ватеритом, не выявлено. На 21-е сутки после имплантации поликапролактоновых скаффолдов, минерализованных ватеритом, заселяются фибробластическими элементами и васкуляризуются. Количество фибробластов и фиброцитов в поликапролактоновых скаффолдов, минерализованных ватеритом, в 2,5 раза больше, чем в матрицах, не обладающих биосовместимостью (табл. 3). Доля этих клеточных популяций в поликапролактоновых скаффолдах, минерализованных ватеритом,  достигала в среднем по группе 34% и 60% от общего числа клеток соответственно, что отражает высокий регенераторный потенциал. Количество фибробластических элементов матрицы прямо коррелировало с величиной нормированного соотношения VEGF и Синдекана-1 в сыворотке крови, что подтверждает прямую зависимость регенераторного потенциала от величины указанного соотношения. Количество лейкоцитов в поликапролактоновых скаффолдах, минерализованных ватеритом, в 1,5-2 раза ниже, чем в матрицах, не обладающих биосовместимостью, у крыс группы отрицательного контроля (табл. 3).
Таким образом, соотношение концентраций в сыворотке крови VEGF и синдекана-1 выше 16,73 и его нормированная величина выше 2 на 7-е сутки после имплантации скаффолда соответствуют эффективной васкуляризации и заселению клеточными элементами, что характеризует высокий ангиогенный потенциал матриц из поликапролактона и ватерита.
Таблица 3
Клеточные популяции поликапролактоновых скафолдов с ватеритом в сравнении с матрицами с адсорбированным чужеродным белком
Группы животныхСреднее число клетокв 5 полях зрения
Отрицательный контроль: поликапролактонс чужеродным белком (n=10)
Опытная группа: поликапролактон, минерализованный ватеритом (n=10)
Фибробласты
5 (1;12)
38 (21;47)р=0,000002
Фиброциты
2 (0;6)
22 (13;32)р=0,000002
Полиморфоядерные лейкоциты
13 (5;16)
0 (0;1)р=0,000005
Лимфоциты
3 (2;3)
2 (0;4)р=0,625375
Макрофаги
4 (2;6)
2 (0;4)р=0,037999
Примечание – в каждом случае приведены медиана, верхний и нижний квартили; р – статистическая значимость различий между группами.