Капиллярный титрационный калориметр для исследования митохондрий
CAPILLARY TITRATION CALORIMETER FOR INVESTIGATING MITOCHONDRIA

Изобретение относится к измерениям тепловой мощности в процессах трансформации и диссипации энергии в суспензиях живых митохондрий в исследованиях в области митохондриальной термодинамики, направленных на создание новых фармсредств и перспективных биотехнологий. Калориметр предназначен для исследований митохондрий, белков и других объектов, исследуемых на современных его аналогах.
Все современные титрационные калориметры, например, описанные в работах [1, 2], Omega [3], VP-ITC, iTC200, Auto iTC200 (MicroCal, USA) и др., не пригодны для работы с митохондриями, так как они предусматривают термостатирование введенного в калориметр реагента в течение десятков минут, что недопустимо, поскольку живой микрообъект, каковым являются митохондрии, за указанное время теряет свою жизнеспособность при отсутствии кислорода в замкнутой системе.
В работе [4] описан первый капиллярный титрационный калориметр. Добавка распределяется в виде тонкого слоя по всей длине исследуемого образца за счет разных скоростей линейного перемещения корпуса шприцов и поршней этих шприцов. Калориметрическая камера выполнена в виде капилляра с диаметром 1,2 мм. Для выравнивания концентраций добавки по объему образца механическое перемешивание не применяется, а используется только концентрационное перемешивание за счет диффузии добавки в образец. Этот калориметр для исследований митохондрий не пригоден, так как в нем не предусмотрено механическое перемешивание реагентов в калориметрической камере, исключающее выпадение митохондрий в осадок.
Ближайшим аналогом является капиллярный титрационный калориметр для изучения трансформации и диссипации энергии в митохондриях [5]. Этот калориметр содержит рабочую и эталонную калориметрические камеры в виде прямых капилляров, корпус, объединяющий дозирующие шприцы, снабженные дозирующими иглами, на каждую из которых надето по одной вспомогательной трубке, служащей для передачи принудительных колебаний от привода к дозирующим иглам, при этом корпус, объединяющий шприцы, размещен в переходной втулке, обеспечивающей соосность шприцов и калориметрических камер, средство измерения тепловой мощности, управляющий компьютер.
В исследованиях используются суспензии митохондрий, которые необходимо перемешивать для предотвращения выпадения их в осадок. В прототипе используются микрошприцы Hamilton с длинными тонкими дозирующими иглами длиной 102 мм и диаметром 0,5 мм. Использование таких игл необходимо для выравнивания в шунтах температуры добавки с температурой образца. Кроме этого используемые шприцы позволяют легко заменять дозирующие иглы, что в исследовательской практике очень важно ввиду того, что при работе с различными добавками происходит частое засорение этих игл, а их прочистка затруднительна. В прототипе использовано удачное техническое решение перемешивания реагентов в калориметрической камере тонкими дозирующими иглами путем принудительного колебания этих игл с использованием вспомогательных трубок диаметром порядка 0,8 мм, которые надеваются и закрепляются на участке дозирующих игл, выходящих из шприцов. Это решение надежно обеспечивает принудительные колебания тонких дозирующих игл через колебания вспомогательных трубок. Однако в калориметре в процессе работы нарушается соосность дозирующих игл и калориметрических камер из-за деформации уплотнительного вкладыша из фторопласта в шприцах. Регулировка усилия сжатия в узле уплотнения предусматривает деформацию этого вкладыша, что приводит к нарушению соосности корпуса шприца и дозирующей иглы и проявляется в том, что концы дозирующих игл даже без колебательных движений могут упираться в стенки камер. Данное обстоятельство не позволяет использовать необходимую амплитуду колебаний дозирующих игл и снижает эффективность перемешивания. Это устраняется путем сгибания дозирующих игл в поиске положения, при котором концы игл не ударяются о стенки камер. Регулировка усилия сжатия в уплотнительном узле шприца проводится практически перед каждым экспериментом, что значительно снижает эксплуатационные характеристики калориметра из-за необходимости проведения указанных регулировок.
Задача изобретения - улучшение эксплуатационных характеристик калориметра, заключающееся в исключении регулировочных операций для обеспечения соосности дозирующих игл и калориметрических камер при перемешивании реагентов в калориметрических камерах.
Краткое описание существа изобретения
Предлагается калориметр для исследований митохондрий, содержащий рабочую и эталонную калориметрические камеры в виде прямых капилляров; корпус, объединяющий дозирующие шприцы, снабженные дозирующими иглами, на каждую из которых надето по одной вспомогательной трубке, служащей для передачи принудительных колебаний от привода к дозирующим иглам, при этом корпус, объединяющий шприцы, размещен в переходной втулке, обеспечивающей соосность шприцов и калориметрических камер; средство измерения тепловой мощности; управляющий компьютер, при этом корпус, объединяющий шприцы, состоит из двух соединяемых частей, первая из которых служит для обеспечения соосности шприцов и калориметрических камер, а вторая служит для закрепления вспомогательных трубок и для обеспечения соосности вспомогательных трубок и калориметрических камер.
Предложенное решение предусматривает восстановление соосности шприцов, дозирующих игл и калориметрических камер после уплотнения игл в дозирующих шприцах. Достигнутая при этом соосность сохраняется также при длительной эксплуатации, сопровождающейся пластической деформацией вкладыша в узле уплотнения, благодаря тому, что требуемая соосность обеспечивается вспомогательными трубками, соосность которых со шприцами и калориметрическими камерами сохраняется всегда, так как указанные трубки устанавливаются соосно калориметрическим камерам и корпусу шприцов. При соединении второй и первой частей корпуса шприцов дозирующие иглы проходят внутри вспомогательных трубок, что приводит к компенсации нарушения требуемой соосности в процессе уплотнения дозирующих игл в шприцах.
На прилагаемой фигуре представлена функциональная схема калориметра для исследований митохондрий, имеющего эталонную 1 и рабочую 2 калориметрические камеры в виде прямых капиллярных трубок с внутренним диаметром 2,0 мм. Полный объем калориметрической камеры равен 268 мкл, рабочий объем равен 156 мкл. Рабочим объемом калориметрических камер является объем части трубок, расположенный между дном камер и границей контакта с пассивным тепловым шунтом 3. Длина капилляров рабочего объема камер равна 50 мм. Калориметрические камеры заключены в термостатирующую оболочку 4. На выводных концах капилляров калориметрических камер установлен активный тепловой шунт 5, который исключает теплообмен калориметрических камер и пассивного теплового шунта с внешней средой через выводную часть капиллярных трубок. Калориметрические камеры снабжены измерительной термобатареей 6. Калориметрические камеры, заключенные в термостатирующую оболочку 4, защищены от внешней среды пассивным экраном 7. На термостатирующей оболочке установлен датчик температуры 8, а на активном шунте установлен датчик температуры 9. Датчики температуры 8 и 9 подсоединены к многоканальному измерительному усилителю 10, связанному с компьютером 11, содержащим многоканальный АЦП NI PCIe 6341 и модуль счетчиков/таймеров NI PCI-6602, связанные с блоком усилителей мощности 12, соединенным с нагревателем 13 термостатирующей оболочки и нагревателем 14 активного шунта. Калориметр снабжен измерителем мощности тепловых процессов, состоящим из измерительной термобатареи 6, связанной своим выходом со входом нановольтметра 15, который снабжен интерфейсом RS-232, связывающим нановольтметр с компьютером 11.
Для введения реагентов в калориметрические камеры служит дозирующий шприц 16 с регулировочной гайкой узла уплотнения 17 с иглой 18 для эталонной камеры и дозирующий шприц 19 с регулировочной гайкой узла уплотнения 20 с иглой 21 для рабочей камеры, размещенных в первой части корпуса шприцов 22. При этом дозирующая игла эталонного шприца, выходя из узла уплотнения шприца, входит во вспомогательную трубку 23, жестко установленную во второй части корпуса шприцов 24. Дозирующая игла рабочего шприца, выходя из узла уплотнения шприца, входит во вспомогательную трубку 25, жестко установленную во второй части корпуса шприцов 24. Выносной элемент А фигуры иллюстрирует компенсацию смещения осей дозирующих игл. Первая и вторая части корпуса шприцов, объединенные штифтовым соединением, устанавливаются в переходную втулку 26.
Поршни через штоки дозирующих шприцов 27 и 28 объединены связывающей их пластиной 29. Для обеспечения введения реагентов в калориметрические камеры корпус шприцов связан с винтовым механизмом 30, состоящим из винта и гайки, а пластина связана с винтовым механизмом 31, состоящим из винта и гайки. Винтовой механизм 30 приводится в движение шаговым двигателем 32, а винтовой механизм 31 шаговым двигателем 33. Управление шаговыми двигателями осуществляется компьютером через блок усилителей мощности 12. Колебательный режим дозирующих игл обеспечивается приводом 34 колебательных движений через шток 35, частота колебаний от долей герц до десятков герц которого управляется компьютером через блок усилителей мощности 12.
Предлагаемый калориметр для исследований митохондрий работает следующим образом.
Тепловая мощность, для измерения которой предназначен предложенный калориметр, возникает в рабочей калориметрической камере следующим образом: например, в режиме введения добавки при движении дозирующей иглы в камеру в рабочей камере 2 реагент добавки выделяется из иглы непосредственно в объем камеры. Сигнал разбаланса по температуре между камерами поступает на вход цифрового нановольтметра 15. Практически во всех современных калориметрах для этих целей используются высокочувствительные цифровые вольтметры, имеющие интерфейс RS-232. При пороге чувствительности нановольтметра на уровне 2 нВ в современных калориметрах обеспечивается порог чувствительности по мощности порядка 50 нВт. Сигнал разбаланса тепловой мощности поступает на СОМ-порт компьютера 11, считывается управляющей программой, индицируется на экране управляющего компьютера и архивируется для дальнейшей обработки. В процессе опускания дозирующих игл в объем камеры реагент добавки распределяется равномерно по всей длине камеры. В рабочую камеру дозируется реагент добавки, а в эталонную камеру дозируется такое же количество нейтрального вещества (буфер и др.). Часть калориметрических камер ниже границы теплового шунта 3 является измерительным объемом. При прохождении сопла дозирующей иглы в зоне шунта 3 тепловой эффект от взаимодействия реагента добавки с образцом не дает вклад в сигнал от измеряемой тепловой мощности, так как полностью шунтируется в системе шунтов 3 и 5.
Введение добавок осуществляется следующим образом: при введении дозы производится продольное перемещение объединенного корпуса шприцов 22 и 24 на всю длину калориметрических камер винтовым механизмом 30, управляемым шаговым двигателем 32. Одновременно с этим производится перемещение связанных пластиной 29 штоков поршней 27 и 28 винтовым механизмом 31, управляемым шаговым двигателем 33. За счет различной величины перемещений винтовых механизмов шприцами осуществляется дозирование заданного количества реагентов. Управление шаговыми двигателями 32 и 33 осуществляется компьютером 11. При этом добавка распределяется в исследуемом образце по всей длине рабочего объема калориметрической камеры в виде тонкого слоя. В процессе эксперимента добавка может вводиться многократно.
Термостатирование калориметрических камер обеспечивается термостатирующей оболочкой 4 и тепловыми шунтами 3 и 5, на которых соответственно установлены датчики температуры 8 и 9, подключенные к многоканальному измерительному усилителю 10. Температура термостатирующей оболочки и активного теплового шунта автоматически регулируется по сигналам датчиков соответственно 8 и 9, связанных с компьютером через многоканальный измерительный усилитель. Сигналы с усилителя 10 поступают в компьютер на многоканальный АЦП NI PCIe 6341. Сформированные сигналы ШИМ с выходов таймеров модуля NI PCI-6602 подаются в нагреватель термостатирующей оболочки и нагреватель шунта через усилитель мощности, обеспечивая автоматическое регулирование температуры в соответствии с уставкой, заданной на компьютере.
Юстировка, предусматривающая совмещение осей дозирующих игл и осей калориметрических камер, не требуется, поскольку вспомогательные трубки 23 и 25 устанавливаются неподвижно на второй части корпуса 24, что обеспечивает совмещение осей вспомогательных трубок и осей калориметрических камер и устраняет имеющиеся в прототипе смещения положения дозирующих игл, возникающие в узле уплотнения 17 и 20. Таким образом, изобретение устраняет имеющиеся недостатки в прототипе за счет неочевидного решения вместо очевидного на момент создания прототипа, ошибочно предполагавшего наличие соосности дозирующей иглы и шприца без дополнительной юстировки. Новое решение является существенным, поскольку решает задачу изобретения.
Колебательный режим дозирующих игл 18 и 21 реализуется посредством принудительных колебаний вспомогательных трубок 23 и 25 в пределах их упругости, вызываемых движением штока 35 привода 34. Оси дозирующих игл при отсутствии колебаний совпадают с осями калориметрических камер. Наличие второй части корпуса 24, устанавливаемой на штифтах, также позволяет значительно упростить эксплуатацию калориметра, так как обеспечивает при необходимости легкую смену дозирующих игл, а также контроль и регулировку уплотнения дозирующих игл. Требуемая интенсивность перемешивания, определяемая условиями эксперимента, обеспечивается использованием соответствующей частоты принудительных колебаний, подаваемой с компьютера 11 через усилитель мощности 12 на привод 34 колебательных движений. Соосность дозирующих игл и калориметрических камер исключает удары дозирующих игл о стенки камер, сопровождающиеся возникновением тепловых шумов, снижающих отношение сигнал/шум при измерениях тепловой мощности. Таким образом, эксплуатация калориметра не требует частой юстировки дозирующих игл, что обеспечивает высокие эксплуатационные характеристики калориметра.
Литература
1. Velazguez-Campoy A., Mayorga O.L. and Cabrerizo-Vilchez М.А. Development of an isothermal titration microcalorimetric system with digital control and dynamic power Peltier compensation. I. Description and basic performance // Review of Scientific Instruments. - 2000. - Vol. 71. - P. 1824-1840.
2. Garcia-Fuentes L., Baron C. and Mayorga O.L. Influence of dynamic power compensation in an isothermal titration microcalorimeter // Analytical Chemistry. - 1998. - Vol. 70. - P. 4615-4623.
3. Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter. / Wiseman Т., Williston S., Brandts J.F. and Lin L. // Analytical Biochemistry. - 1989. - Vol. 179. - P. 131-137.
4. METHOD OF SEPARATING THE SENSITIVE VOLUME OF CALORIMETRIC CELLS IN A DIFFERENTIAL TITRATION CALORIMETER / G.V. Kotelnikov, S.P. Moiseyeva, E.V. Mezhburd and V.P. Krayev // Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. - 2000. - Vol. 62. - P. 39-50.
5. Калориметрические измерения тепловых процессов при трансформации и диссипации энергии в митохондриях / Г.В. Котельников, С.П. Моисеева, Гришина Е.В., Маевский Е.И. // Приоритетные направления развития науки и технологий: тезисы докладов XV всероссийской научн.-техн. конф.; под общ. ред. В.М. Панарина. - Тула: Инновационные технологии. - 2014. - с. 21-27.