ИММУНОГЛОБУЛИН С ТАНДЕМНЫМ РАСПОЛОЖЕНИЕМ FAB-ФРАГМЕНТОВ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
IMMUNOGLOBULIN WITH TANDEM ARRANGEMENT OF FAB FRAGMENTS AND APPLICATION THEREOF

ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ
[0001] Настоящая заявка заявляет приоритет по предварительной международной заявке № PCT/CN2013/090923, поданной 30 декабря 2013 года, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0002] Настоящее изобретение относится к мультивалентным и мультиспецифическим связывающим белкам, и к способам получения и применения мультивалентных и мультиспецифических связывающих белков.
ОПИСАНИЕ ТЕКСТОВОЕО ФАЙЛА, ПОДАННОЕО В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ
[0003] Содержание текстового файла, поданного в электронном виде, включено в данный документ в полном объеме посредством ссылки: копия перечня последовательностей в формате, читаемом на компьютере (имя файла: EPBl_001_01WO_SeqList_ST25.txt, дата записи: 2 декабря 2014 года, размер файла 98 KB).
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0004] Биспецифические или мультиспецифические антитела были созданы при попытках получения молекул, подходящих для лечения различных воспалительных заболеваний, злокачественных новообразований и других нарушений.
[0005] Биспецифические антитела были получены с использованием квадромной технологии (см. Milstein, С. and А.С. Cuello, Nature, 1983. 305(5934): p. 537-40), основанной на слиянии протопластов двух разных клеточных линий гибридом, экспрессирующих моноклональные антитела мыши с требуемыми уровнями специфичности биспецифического антитела. Биспецифические антитела также можно получать путем химической конъюгации двух разных мАТ (см. Staerz, U.D., et al., Nature, 1985. 314(6012): p. 628-31). В других подходах была использована химическая конъюгация двух разных моноклональных антител или меньших фрагментов антител (см. Brennan, М., et al., Science, 1985. 229(4708): p. 81-3).
[0006] Другой способ заключается в соединении двух родительских антител с помощью гетеробифункционального сшивающего средства. В частности, два разные Fab-фрагмента были химически и сайт-специфически сшиты по цистеиновым остаткам шарнирной области (см. Glennie, M.J., et al., J Immunol, 1987. 139(7): p. 2367-75).
[0007] За последнее время были разработаны другие форматы рекомбинантных биспецифических антител (см. Kriangkum, J., et al., Biomol Eng, 2001. 18(2): p. 31-40). Из их числа для конструирования рекомбинантных биспецифических антител были использованы тандемные одпоцепочечные Fv-молекулы и диатела, а также разные их производные. Как правило, конструкция этих молекул начинается с двух одноцепочечных Fv-фрагментов (scFv), которые распознают разные антигены (см. Economides, A.N., et al., Nat Med, 2003. 9(1): p. 47-52). Тандемные scFv-молекулы (taFv) имеют простую конструкцию, в которой две молекулы scFv соединены дополнительным пептидным линкером. Два scFv-фрагмента, содержащиеся в таких тандемных scFv-молекулах, формируют отдельные элементы пространственной структуры. Для соединения двух scFv-фрагментов могут быть использованы различные линкеры и линкеры, длина которых составляет до 63 остатков (см. Nakanishi, К., et al. Annu Rev Immunol, 2001. 19: p. 423-74).
[0008] В недавнем исследовании сообщалось об экспрессии тандемного scFv, направленного против CD28, и ассоциированного с меланомой протеогликана, in vivo у трансгенных кроликов и крупного рогатого скота (см. Grade, J.A., et al., J Clin Invest, 1999. 104(10): p. 1393-401). В этой конструкции две scFv-молекулы были связаны с помощью линкера СН1, и было установлено, что концентрация биспецифического антитела в сыворотке крови составляет до 100 мг/л. В настоящее время в нескольких исследованиях сообщалось об экспрессии растворимых тандемных scFv-молекул у бактерий (см. Leung, В.P., et al., J Immunol, 2000. 164(12): p. 6495-502; Ito, A., et al., J Immunol, 2003. 170(9): p. 4802-9; Karni, A., et al., J Ncuroimmunol, 2002. 125(1-2): p. 134-40) с использованием либо очень короткого линкера А1а3, либо длинных линкеров, богатых глицином/серином.
[0009] В недавнем исследовании с помощью фагового дисплея набора тандемных scFv, содержащих промежуточные линкеры произвольной длины от 3 или 6 остатков, был расширен спектр тех молекул, которые получают в растворимой и активной форме в клетках бактерий. В результате применения этого подхода была выделена предпочтительная тандемная scFv-молекула с использованием линкера, состоящего из 6 аминокислотных остатков (см. Arndt, М. and J. Krauss, Methods Mol Biol, 2003. 207: p. 305-21).
[0010] Для экспрессии биспецифических диател (Db) применяют формат диатела. Диатела получают из scFv-фрагментов путем уменьшения длины линкера, соединяющего VH- и VL- домен, до приблизительно 5 остатков (см. Peipp, М. and Т. Valerius, Biochem Soc Trans, 2002. 30(4): p. 507-11). Уменьшение длины линкера способствует димеризации двух полипептидных цепей путем попарного соединения доменов VH и VL с образованием перекрестных связей между ними. Биспецифические диатела получают путем экспрессии двух полипептидных цепей либо со структурой VHA-VLB и VHB-VLA (конфигурация VH-VL), либо VLA-VHB и VLB-VHA (VL-VH конфигурация) в одной и той же клетке. Недавнее сравнительное исследование показывает, что ориентация вариабельных доменов может оказывать влияние на экспрессию и формирование активных сайтов связывания (см. Mack, М., G. Riethmuller, and P. Kufer, Proc Natl Acad Sci USA, 1995. 92(15): p. 7021-5).
[0011] Одним из подходов, обеспечивающих создание биспецифических диател, является получение диател со структурой типа «выступ-во-впадину» (см. Holliger, Р., Т. Prospero, and G. Winter, Proc Natl Acad Sci USA, 1993. 90(14): p. 6444-8.18). Это было показано для биспецифического диатела, направленного против HER2 и CD3. Был сформирован большой выступ в VH-домене путем замены Val37 на Phe и Leu45 на Trp, а комплементарная впадина в VL-домене была создана путем замены с помощью мутации Phe98 на Met и Tyr87 на Ala, в вариабельных доменах, специфичных либо к HER2, либо к CD3. С помощью использования этого подхода производство биспецифических диател может быть увеличено до 72% за счет родственных диател, до более 90% за счет диател со структурой типа «выступ-во-впадину».
[0012] Получение одноцепочечных диател (scDb) представляет собой альтернативную стратегию для улучшения образования биспецифических молекул, подобных диателам (см. Holliger, P. and G. Winter, Рак Immunol Immimother, 1997. 45(3-4): p. 128-30; Wu, A.M., et al., Immunotechnology, 1996. 2(1): p. 21-36). Биспецифические одноцепочечные диатела получают путем соединения двух диатело-формирующих полипептидных цепей с использованием дополнительного промежуточного линкера с диной приблизительно 15 аминокислотных остатков. Следовательно, все молекулы с молекулярной массой, соответствующей мономерным одноцепочечным диателам (50-60 кДа), являются биспецифическими. В нескольких исследованиях было продемонстрировано, что биспецифические одноцепочечные диатела экспрессируются в клетках бактерий в растворимой и активной форме, причем большинство очищенных молекул содержатся в виде мономеров (см. Holliger, P. and G. Winter, Рак Immunol Immunother, 1997. 45(3-4): p. 128-30; Wu, A.M., et al., Immunotechnology, 1996. 2(1): p. 21-36; Pluckthun, A. and P. Pack, Immunotechnology, 1997. 3(2): p. 83-105; Ridgway, J.B., et al., Protein Eng, 1996. 9(7): p. 617-21).
[0013] Диатела были слиты с Fc-фрагментом для создания более Ig-подобных молекул, называемых ди-диатела (см. Lu, D., et al., J Biol Chem, 2004. 279(4): p. 2856-65). В дополнение к этому, была описана конструкция мультивалентного антитела, содержащая два Fab-повтора в тяжелой цепи IgG и способная к связыванию четырех молекул антигена (см. патент США 8722859 В2 и Miller, K., et al., J Immunol, 2003. 170(9): p. 4854-61).
[0014] Наиболее новыми примерами являются тетравалентные слитые одноцепочечные вариабельные фрагменты IgG (scFv) (Dong J, et al., 2011 MAbs 3:273-288; Coloma MJ, Morrison SL 1997 Nat Biotechnol 15:159-163; Lu D, et al., 2002 J Immunol Methods 267:213-226), катумаксомаб, трифункциональное химерное (крыса/мышь) биспецифическое антитело к молекулам адгезии CD3 эпителиальных клеток (Lindhofer Н, et al 1995 J Immunol 155:219-225), биспецифическое scFv-антитело блинатумомаб к CD19-CD3 (Bargou R, et al., 2008 Science 321:974-977), антитела типа «Fab двойного действия» (DAF) (Bostrom J, et al., 2009 Science 323:1610-1614), содержащие фармакофорные группы пептиды, ковалентно связанные с каталитическими антителами (Doppalapudi VR, et al. 2010 Proc Natl Acad Sci USA 107:22611-22616), использование динамического обмена между половинами молекул IgG4 для создания биспецифических антител (van der Neut Kolfschoten M, et al., 2007 Science 317:1554-1557; Stubenrauch K, et al., 2010 Drug Metab Dispos 38:84-91), или путем обмена доменами тяжелой цепи и легкой цепи внутри антигенсвязывающего фрагмента (Fab) одной половины биспецифического антитела (формат CrossMab) (Schacfcr W et al., 2011 Proc Natl Acad Sci 108:11187-92).
[0015] В данной области техники существует необходимость в получении одиночных молекул, обладающих способностью связывать два антигена, и в способах создания таких мультивалентных и мультиспецифических связывающих белков. Настоящее изобретение направлено на решение этой задачи.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0016] В настоящем изобретении предложены мультивалентные и мультиспецифические связывающие белки и способы получения и использования таких связывающих белков. В одном варианте реализации изобретения мультивалентными и мультиспецифическими связывающими белками, предложенными в данном документе, являются иммуноглобулины с тандемным расположением Fab-фрагментов (FIT-Ig), и они способны к связыванию двух или более антигенов, или двух или более эпитопов одного и того же антигена, или двух или более копий одного и того же эпитопа. Мультивалентные и мультиспецифические связывающие белки, предложенные в данном документе, могут быть использованы для лечения и/или предотвращения острых и хронических воспалительных заболеваний и нарушений, аутоиммунных заболеваний, злокачественных опухолей, повреждений спинного мозга, сепсиса и других заболеваний, нарушений и состояний. В данном документе предложены фармацевтические композиции, содержащие мультивалентные и мультиспецифические связывающие белки. В дополнение к этому, в данном документе предложены нуклеиновые кислоты, рекомбинантные экспрессирующие векторы и клетки-хозяева для получения таких FIT-Ig. Также настоящим изобретением охватываются способы использования FIT-Ig по настоящему изобретению для детекции специфических антигенов in vivo или in vitro.
[0017] В настоящем изобретении предложено семейство связывающих белков, которые способны к связыванию двух или более антигенов, например, с высокой аффинностью. В одном аспекте в настоящем изобретении предложен подход к конструированию биспецифического связывающего белка с использованием двух родительских моноклональных антител: мАТ А, которое связывается с антигеном А, и мАТ В, которое связывается с антигеном В. Связывающие белки, раскрытые в данном документе, В одном варианте реализации изобретения способны к связыванию антигенов, цитокинов, хемокинов, рецепторов цитокинов, рецепторов хемокинов, молекул, родственных цитокинам или хемокинам, или белков клеточной поверхности.
A
B
A
B
A
B
[0018] Таким образом, в одном аспекте предложены связывающие белки способны к связыванию двух или более антигенов. В одном варианте реализации изобретения в настоящем изобретении предложен связывающий белок, содержащий по меньшей мере две полипептидные цепи, причем пары полипептидных цепей образуют IgG-подобные молекулы, способные к связыванию двух или более антигенов. В одном варианте реализации изобретения связывающий белок содержит две, три, четыре, пять, или более полипептидных цепей. В одном варианте реализации изобретения связывающий белок содержит по меньшей мере один VL, по меньшей мере один VL, по меньшей мере один VH, по меньшей мере один VH, по меньшей мере один CL, и по меньшей мере один СН1, причем VL представляет собой вариабельный домен легкой цепи, VH представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи, CL представляет собой константный домен легкой цепи, СН1 представляет собой первый константный домен тяжелой цепи, А представляет собой первый антиген, а В представляет собой второй антиген. В дополнительном варианте реализации изобретения первая полипептидная цепь содержит VL, CL, VH и CH1. В дополнительном варианте реализации изобретения связывающий белок дополнительно содержит Fc. В другом варианте реализации изобретения Fc-область представляет собой вариант Fc-области. В дополнительном варианте реализации изобретения вариант Fc-области обладает измененной эффекторной функцией, такой как ADCC или CDC. В другом варианте реализации изобретения вариант Fc-области проявляет измененную аффинность или авидность по отношению к одному или более FcγR.
A
B
A
B
A
B
A
B
[0019] В одном варианте реализации изобретения связывающий белок содержит три полипептидные цепи, причем первая полипептидная цепь содержит VL, CL, VH и CH1, вторая полипептидная цепь содержит VH и СН1, и третья полипептидная цепь содержит VL и CL. В дополнительном варианте реализации изобретения первая полипептидная цепь связывающего белка дополнительно содержит Fc. В другом варианте реализации изобретения связывающий белок содержит две полипептидные цепи, причем первая полипептидная цепь содержит VL, CL, VH и CH1, вторая полипептидная цепь содержит VH, CH1, VL, и CL. В дополнительном варианте реализации изобретения первая полипептидная цепь дополнительно содержит Fc.
[0020] В одном варианте реализации изобретения связывающий белок содержит три полипептидные цепи, а молярное соотношение соответствующих кДНК первая : вторая : третья при осуществлении котрансфекции составляет 1:1:1, 1:1.5:1, 1:3:1, 1:1:1.5, 1:1:3, 1:1.5:1.5, 1:3:1.5, 1:1.5:3 или 1:3:3. В другом варианте реализации изобретения связывающий белок содержит две полипептидные цепи, а молярное соотношение соответствующих кДНК первая : вторая при осуществлении котрансфекции составляет 1:1, 1:1,5 или 1:3, или они используются в любых других соотношениях, что достигается посредством оптимизации, с целью получения максимального выхода фракции мономерных FIT-Ig при каждой конкретной трансфекции.
4
4
[0021] В одном варианте реализации изобретения связывающий белок по настоящему изобретению не содержит пептидного линкера. В одном варианте реализации изобретения связывающий белок по настоящему изобретению содержит по меньшей мере один аминокислотный или полипептидный линкер. В дополнительном варианте реализации изобретения линкер выбран из группы, состоящей из G,GS, SG,GGS, GSG, SGG, GGG, GGGS, SGGG, GGGGS, GGGGSGS, GGGGSGS, GGGGSGGS, GGGGSGGGGS, GGGGSGGGGSGGGGS, AKTTPKLEEGEFSEAR, AKTTPKLEEGEFSEARV, AKTTPKLGG, SAKTTPKLGG, AKTTPKLEEGEFSEARV, SAKTTP, SAKTTPKLGG, RADAAP, RADAAPTVS, RADAAAAGGPGS, RADAAAA(GS), SAKTTP, SAKTTPKLGG, S AKTTPKLEEGEFSEARV, ADAAP, ADAAPTVS1FPP, TVAAP, TVAAPSVFIFPP, QPKAAP, QPKAAPSVTLFPP, AKTTPP, AKTTPPSVTPLAP, AKTTAP, AKTTAPSVYPLAP, ASTKGP, ASTKGPSVFPLAP, GENKVEYAPALMALS, GPAKELTPLKEAKVS и GHEAAAVMQVQYPAS. Линкеры также могут представлять собой пептидные линкеры, расщепляемые in vivo, линкеры, чувствительные к протеазам (таким как ММР), линкеры на основе дисульфидной связи, которые могут расщепляться путем восстановления и т.д., как было ранее описано (Fusion Protein Technologies for Biopharmaceuticals: Applications and Challenges, edited by Stefan R. Schmidt), или любые расщепляемые линкеры, известные в данной области техники. Такие расщепляемые линкеры могут быть использованы для высвобождения верхнего Fab in vivo для различных целей, для того чтобы улучшить проникновение в ткани/клетки и распределение, усилить связывания с мишенями, уменьшить потенциальное побочное действие, а также модулировать in vivo функциональный и физический период полувыведения 2 разных Fab-областей.
A
B
A
B
B
B
[0022] В одном варианте реализации изобретения связывающий белок содержит первый полипептид, содержащий в направлении от амино- к карбоксильному концу VL-CL-VH-CH1-Fc, вторую полипептидную цепь, содержащую в направлении от амино- к карбоксильному концу VH-CH1, и третью полипептидную цепь, содержащую в направлении от амино- к карбоксильному концу VL-CL; причем VL представляет собой вариабельный домен легкой цепи, CL представляет собой константный домен легкой цепи, VH представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи, СН1 представляет собой первый константный домен тяжелой цепи, А представляет собой первый эпитоп или антиген, и В представляет собой второй эпитоп или антиген. В одном варианте реализации изобретения Fc-область представляет собой IgG1 человека. В другом варианте реализации изобретения Fc-область представляет собой вариант Fc-области. В дополнительном варианте реализации изобретения аминокислотная последовательность Fc-области по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере па 99% или на 100% идентична SEQ ID NO: 20. В дополнительном варианте реализации изобретения CL первой полипептидной цепи слит непосредственно с VH. В другом варианте реализации изобретения CL первой полипептидной цепи связан с VH через аминокислотный или олигопептидный линкер. В дополнительном варианте реализации изобретения линкер представляет собой GSG (SEQ ID NO: 26) или GGGGSGS (SEQ ID NO: 28).
B
A
A
B
A
A
[0023] В другом варианте реализации изобретения связывающий белок содержит первый полипептид, содержащий в направлении от амино- к карбоксильному концу VH-CH1-VL-CL-Fc, вторую полипептидную цепь, содержащую в направлении от амино- к карбоксильному концу VH-СН1, и третью полипептидную цепь, содержащую в направлении от амино- к карбоксильному концу VL-CL; причем VL представляет собой вариабельный домен легкой цепи, CL представляет собой константный домен легкой цепи, VH представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи, СН1 представляет собой первый константный домен тяжелой цепи, А представляет собой первый эпитоп или антиген, и В представляет собой второй эпитоп или антиген. В одном варианте реализации изобретения Fc-область представляет собой IgG1 человека. В другом варианте реализации изобретения Fc-область представляет собой вариант Fc-области. В дополнительном варианте реализации изобретения аминокислотная последовательность Fc-области по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична SEQ ID NO: 20. В одном варианте реализации изобретения СН1 первой полипептидной цепи слит непосредственно с VL. В другом варианте реализации изобретения СН1 первой полипептидной цепи связан с VL через аминокислотный или олигопептидный линкер. В дополнительном варианте реализации изобретения линкер представляет собой GSG (SEQ ID NO: 26) или GGGGSGS (SEQ ID NO: 28).
A
B
A
B
B
B
[0024] В другом варианте реализации изобретения связывающий белок содержит первый полипептид, содержащий в направлении от амино- к карбоксильному концу VL-CL-VH-CH1-Fc, и вторую полипептидную цепь, содержащую в направлении от амино- к карбоксильному концу VH-CH1-VL-CL; причем VL представляет собой вариабельный домен легкой цепи, CL представляет собой константный домен легкой цепи, VH представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи, CH1 представляет собой первый константный домен тяжелой цепи, А представляет собой первый эпитоп или антиген, и В представляет собой второй эпитоп или антиген. В одном варианте реализации изобретения Fc-область представляет собой IgG1 человека. В другом варианте реализации изобретения Fc-область представляет собой вариант Fc-области. В дополнительном варианте реализации изобретения аминокислотная последовательность Fc-области по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична SEQ ID NO: 20. В дополнительном варианте реализации изобретения CL первой полипептидной цепи слит непосредственно с VH. В другом варианте реализации изобретения CL первой полипептидной цени связан с VH через аминокислотный или олигопептидный линкер. В дополнительном варианте реализации изобретения линкер представляет собой GSG (SEQ ID NO: 26) или GGGGSGS (SEQ ID NO: 28).
B
A
B
A
A
A
[0025] В другом варианте реализации изобретения связывающий белок содержит первый полипептид, содержащий в направлении от амино- к карбоксильному концу VH-CH1-VL-CL-Fc, и вторую полипептидную цепь, содержащую в направлении от амино- к карбоксильному концу VL-CL-VH-CH1; причем VL представляет собой вариабельный домен легкой цепи, CL представляет собой константный домен легкой цепи, VH представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи, СН1 представляет собой первый константный домен тяжелой цепи, А представляет собой первый эпитоп или антиген, и В представляет собой второй эпитоп или антиген. В одном варианте реализации изобретения Fc-область представляет собой IgG1 человека. В другом варианте реализации изобретения Fc-область представляет собой вариант Fc-области. В дополнительном варианте реализации изобретения аминокислотная последовательность Fc-области по меньшей мере па 65%, по меньшей мере па 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична SEQ ID NO: 20. В одном варианте реализации изобретения CHI первой полипептидной цепи слит непосредственно с VL. В другом варианте реализации изобретения СН1 первой полипептидной цепи связан с VL через аминокислотный или олигопептидный линкер. В дополнительном варианте реализации изобретения линкер представляет собой GSG (SEQ ID NO: 26) или GGGGSGS (SEQ ID NO: 28).
[0026] Связывающие белки по настоящему изобретению способны к связыванию пар цитокинов. Например, связывающие белки по настоящему изобретению способны к связыванию пар цитокинов, выбранных из группы, состоящей из ИЛ-1α и ИЛ-1β; ИЛ-12 и ИЛ-18, TNFα и ИЛ-23, TNFα и ИЛ-13; ФНО и ИЛ-18; ФНО и ИЛ-12; ФНО и ИЛ-1-бета; ФНО и MIF; ФНО и ИЛ-6, ФНО и рецептора ИЛ-6, ФНО и ИЛ-17; ИЛ-17 и ИЛ-20; ИЛ-17 и ИЛ-23; ФНО и ИЛ-15; ФНО и VEGF; VEGFR и EGFR; PDGER и VEGF, ИЛ-13 и ИЛ-9; ИЛ-13 и ИЛ-4; ИЛ-13 и ИЛ-5; ИЛ-13 и ИЛ-25; ИЛ-13 и TARC; ИЛ-13 и MDC; ИЛ-13 и MIF; ИЛ-13 и TGF-β; ИЛ-13 и агониста LHR; ИЛ-13 и CL25; ИЛ-13 и SPRR2a; ИЛ-13 и SPRR2b; ИЛ-13 и ADAM8; и TNFα, и PGE4, ИЛ-13 и PED2, ФНО и PEG2. В одном варианте реализации изобретения связывающие белки по настоящему изобретению способны к связыванию ИЛ-17 и ИЛ-20. Связывающие белки по настоящему изобретению в одном варианте реализации изобретения способны к связыванию ИЛ-17 и ИЛ-20 и содержат вариабельные области тяжелых и легких цепей, полученные из антитела LY к ИЛ-17 и антитела 15D2 к ИЛ-20. В одном варианте реализации изобретения связывающие белки по настоящему изобретению способны к связыванию ИЛ-17 и ФНО. Связывающие белки по настоящему изобретению в одном варианте реализации изобретения способны к связыванию ИЛ-17 и ФНО и содержат вариабельные области тяжелых и легких цепей, полученные из антитела LY к ИЛ-17 и антитела голимумаб, специфичного к ФНО.
[0027] В одном варианте реализации изобретения связывающие белки по настоящему изобретению связывают ИЛ-17 и ИЛ-20 и содержат первый полипептид, включающий, состоящий, по существу, из или состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, 25 и 27; вторую полипептидную цепь, содержащую, состоящую преимущественно из или состоящую исключительно из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 21; и третью полипептидную цепь, содержащую, состоящую преимущественно из или состоящую исключительно из последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 23. В другом варианте реализации изобретения связывающие белки по настоящему изобретению связывают ИЛ-27 и ИЛ-20 и содержат первую полипептидную цепь, содержащую, состоящую преимущественно из или состоящую исключительно из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, 25 и 27, и вторую полипептидную цепь, содержащую, состоящую преимущественно из или состоящую исключительно из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29, 30 и 31.
[0028] В одном варианте реализации изобретения связывающие белки по настоящему изобретению связывают ФНО и ИЛ-17 и содержат первый полипептид, включающий, состоящий, по существу, из или состоящий из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 87; вторую полипептидную цепь, содержащую, состоящую преимущественно из или состоящую исключительно из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 89; и третью полипептидную цепь, содержащую, состоящую преимущественно из или состоящую исключительно из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 91.
[0029] В другом варианте реализации изобретения связывающий белок способен к связыванию пар мишеней, выбранных из группы, состоящей из CD137 и CD20, CD137 и EGFR, CD137 и Her-2, CD137 и PD-1, CD137 и PDL-1, VEGF и PD-L1, Lag-3 и TIM-3, ОХ40 и PD-1, TIM-3 и PD-1, TIM-3 и PDL-1, EGFR и DLL-4, CD138 и CD20; CD138 и CD40; CD19 и CD20; CD20 и CD3; CD3 и CD33; CD3 и CD133; CD47 и CD20, CD38 и CD138; CD38 и CD20; CD20 и CD22; CD38 и CD40; CD40 и CD20; CD-8 и ИЛ-6; CSPG и RGM A; CTLA-4 и BTNO2; IGF1 и IGF2; IGF1/2 и Erb2B; IGF-1R и EGFR; EGFR и CD13; IGF-1R и ErbB3; EGFR-2 и IGFR; VEGFR-2 и Met; VEGF-A и Ангиопоэтина-2 (Ang-2); ИЛ-12 и TWEAK; ИЛ-13 и ИЛ-1-бета; PDGFR и VEGF, ЕрСАМ и CD3, Her2 и CD3, CD19 и CD3, EGFR и Her3, CD16a и CD30, CD30 и PSMA, EGFR и CD3, CEA и CD3, TROP-2 и HSG, TROP-2 и CD3, MAG и RGM A; NgR и RGM A; NogoA и RGM A; OMGp и RGM A; PDL-1 и CTLA-4; CTLA-4 и PD-1; PD-1 и TIM-3; RGM А и RGM В; Те38 и ФНО; ФНО и Blys; ФНО и CD-22; ФНО и домена CTLA-4; ФНО и GP130; ФНО  и ИЛ-12р40; и ФНО и лиганда RANK, Фактора IXa, Фактора X. В одном варианте реализации изобретения связывающие белки по настоящему изобретению способны к связыванию CD3 и CD20. Связывающие белки по настоящему изобретению в одном варианте реализации изобретения способны к связыванию CD3 и CD20 и содержат вариабельные области тяжелых и легких цепей, полученных из антитела OKT3 к CD3 и антитела офатумумаб, специфичного к CD20. В одном варианте реализации изобретения связывающие белки по настоящему изобретению способны к связыванию CTLA-4 и PD-1. Связывающие белки по настоящему изобретению в одном варианте реализации изобретения способны к связыванию CTLA-4 и PD-1 и содержат вариабельные области тяжелых и легких цепей, полученных из антитела ипилимумаб, специфичного к CTLA-4, и антитела ниволумаб, специфичного к PD-1.
[0030] В одном варианте реализации изобретения связывающие белки по настоящему изобретению связывают CD3 и CD20 и содержат первую полипептидную цепь, содержащую, состоящую преимущественно из или состоящую исключительно из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 41 и 48; вторую полипептидную цепь, содержащую, состоящую преимущественно из или состоящую исключительно из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 44; и третью полипептидпую цепь, содержащую, состоящую преимущественно из или состоящую исключительно из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 46.
[0031] В одном варианте реализации изобретения связывающие белки по настоящему изобретению связывают CTLA-4 и PD-1 и содержат первую полипептидную цепь, содержащую, состоящую преимущественно из или состоящую исключительно из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 92; вторую полипептидную цепь, содержащую, состоящую преимущественно из или состоящую исключительно из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 95; и третью полипептидную цепь, содержащую, состоящую преимущественно из или состоящую исключительно из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 97.
[0032] В одном варианте реализации изобретения связывающий белок, предложенный в данном документе, способен к связыванию одного или более эпитопов на CTLA-4. В одном варианте реализации изобретения связывающий белок, предложенный в данном документе, способен к связыванию одного или более эпитопов на PD-1.
[0033] В одном варианте реализации изобретения связывающий белок способен к связыванию одного или более эпитопов на одном или более белках иммунной контрольной точки на Т-клетках, таких как, например, TIM-3, Lag3, ICOS, BTLA, CD160, 2В4, KIR, CD137, CD27, OX40, CD40L и A2aR. В другом варианте реализации изобретения связывающий белок способен к связыванию одного или более эпитопов на одном или более белках поверхности опухолевых клеток, которые вовлечены в сигнальные пути иммунных контрольных точек, таких как, например, PD-L1, PD-L2, Галектин-9, HVEM, CD48, В7-1, В7-2, ICOSL, В7-Н3, В7-Н4, CD137L, OX40L, CD70 и CD40.
[0034] В одном аспекте настоящего изобретения предложены фармацевтические композиции, содержащие связывающие белки, описанные в данном документе. В одном варианте реализации изобретения предложены фармацевтические композиции, содержащие связывающий белок по любому из предшествующих пунктов и одного или более фармацевтически приемлемых носителей.
[0035] В другом аспекте, настоящего изобретения предложены способы лечения или предотвращения воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, нейродегенеративного заболевания, рака, сепсиса или повреждения спинного мозга у субъекта, который в этом нуждается. В одном варианте реализации изобретения способ включает введение субъекту эффективного количества одного или более связывающих белков, предложенных в данном документе, или одной или более фармацевтических композиций, содержащих связывающие белки, предложенные в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель. В данном документе также предложены области применения связывающих белков, описанных в данном документе, в производстве лекарственного средства для лечения или предотвращения воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, нейродегенеративного заболевания, рака или повреждения спинного мозга. В одном варианте реализации изобретения воспалительное заболевание, аутоиммунное заболевание или нейродегенеративное заболевание выбраны из группы, состоящей из астмы, ревматоидного артрита, системной красной волчанки, множественного склероза, болезни Альцгеймера или болезни Паркинсона.
[0036] В одном варианте реализации изобретения в настоящем раскрытии предложены способы лечения или предотвращения ревматоидного артрита, псориаза, остеопороза, инсульта, заболевания печени или рака роговой полости у субъекта, который в этом нуждается, причем способ включает введение субъекту связывающего белка FIT-Ig, описанного в данном документе, причем связывающий белок способен к связыванию ИЛ-17 и ИЛ-20. В дополнительном варианте реализации изобретения связывающий белок FIT-Ig содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15, 25 и 27; и аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 21; и аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 23. В другом варианте реализации изобретения связывающий белок FIT-Ig содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15, 25 и 27; и аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 29, 30 и 31.
[0037] В одном варианте реализации изобретения в настоящем раскрытии предложены способы лечения или предотвращения В-клеточного рака у субъекта, который в этом нуждается, причем способ включает введение субъекту связывающего белка FIT-Ig, причем связывающий белок FIT-Ig способен к связыванию одного или более В-клеточных антигенов. В дополнительном варианте реализации изобретения связывающий белок FIT-Ig способен к связыванию CD20. В дополнительном варианте реализации изобретения связывающий белок FIT-Ig способен к связыванию CD20 и другого антигена. В дополнительном варианте реализации изобретения связывающий белок способен к связыванию CD3 и CD20. В дополнительном варианте реализации изобретения рак представляет собой В-клеточный рак. Еще в одном варианте реализации изобретения В-клеточный рак выбран из группы, состоящей из лимфомы Ходжкина, пеходжкинской лимфомы [НХЛ], лимфобластного лейкоза/лимфомы из В-клеток-предшественников, опухолей из зрелых В-клеток, В-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза/мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, В-клеточного пролимфоцитарного лейкоза, лимфоплазмоцитарной лимфомы, мантийноклеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, кожной лимфомы из клеток фолликулярного центра, В-клеточной лимфомы маргинальной зоны, волосатоклеточного лейкоза, диффузной В-крупноклеточной лимфомы, лимфомы Бёркита, плазмацитомы, плазмоклеточной миеломы, посттрансплантационного лимфопролиферативного расстройства, макроглобулинемии Вальденстрема и анапластической крупноклеточной лимфомы. В одном варианте реализации изобретения в настоящем раскрытии предложены способы лечения или предотвращения В-клеточного рака у субъекта, который в этом нуждается, причем способ включает введение субъекту связывающего белка FIT-Ig, причем связывающий белок FIT-Ig содержит аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 41 или 48; и аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 44, и аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 46.
[0038] В одном варианте реализации изобретения в настоящем раскрытии предложены способы лечения или предотвращения аутоиммунного заболевания, воспалительного заболевания или инфекции у субъекта, который в этом нуждается, причем способ включает введение субъекту связывающего белка FIT-Ig, описанного в данном документе, причем указанный связывающий белок способен к связыванию ФНО и ИЛ-17. В дополнительном варианте реализации изобретения связывающий белок FIT-Ig содержит последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 87, 89 и 91. В другом варианте реализации изобретения в настоящем раскрытии предложены способы лечения или предотвращения аутоиммунного или воспалительного заболевания, причем способ включает введение субъекту связывающего белка FIT-Ig, причем указанный связывающий белок способен к связыванию ФНО и ИЛ-17, и причем аутоиммунное или воспалительное заболевание выбрано из группы, состоящей из болезни Крона, псориаза (включая бляшечный псориаз), артрита (включая ревматоидный артрит, псориатический артрит, остеоартрит или ювенильный идиопатический артрит), множественного склероза, анкилозирующего спондилита, деформирующей артропатии, системной красной волчанки, увеита, сепсиса, нейродегенеративных заболеваний, регенерации нейронов, повреждения спинного мозга, первичного и метастатического рака, респираторного нарушения; астмы; аллергической и неаллергической астмы; астмы, вызванной инфекцией; астмы, вызванной инфекцией респираторно-синцитиальным вирусом (РСВ); хронического обструктивного заболевания легких (ХОЗЛ); заболевания, характеризующегося воспалением дыхательных путей; эозинофилии; фиброза и избыточной выработки слизи; кистозного фиброза; фиброза легких; атопического заболевания; атопического дерматита; крапивницы; экземы; аллергического ринита; аллергического гастроэнтерита; воспалительного и/или аутоиммунного заболевания кожи; воспалительного и/или аутоиммунного заболевания органов желудочно-кишечного тракта; воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК); язвенного колита; воспалительного и/или аутоиммунного заболевания печени; цирроза печени; фиброза печени; и фиброза печени, вызванного вирусом гепатита В и/или С; склеродермы. В другом варианте реализации изобретения в настоящем раскрытии предложены способы лечения или предотвращения рака у субъекта, который в этом нуждается, причем способ включает введение субъекту связывающего белка FIT-Ig, описанного в данном документе, причем указанный связывающий белок способен к связыванию ФНО и ИЛ-17. В дополнительном варианте реализации изобретения рак представляет собой гепатоклеточную карциному; глиобластому; лимфому; или лимфому Ходжкина. В другом варианте реализации изобретения в настоящем раскрытии предложены способы лечения или предотвращения инфекции у субъекта, который в этом нуждается, причем способ включает введение субъекту связывающего белка FIT-Ig, описанного в данном документе, причем инфекция представляет собой вирусную инфекцию, бактериальную инфекцию, паразитарную инфекцию, инфекции HTLV-1. В одном варианте реализации изобретения в настоящем раскрытии предложены способы подавления проявления защитных иммунных реакций типа 1 и подавления проявления защитной иммунной реакции типа 1 на протяжении вакцинации.
[0039] В одном варианте реализации изобретения в настоящем раскрытии предложены способы лечения ревматоидного артрита у субъекта, который в этом нуждается, причем способ включает введение субъекту связывающего белка FIT-Ig, причем указанный связывающий белок содержит последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 87, 89 и 91.
[0040] В одном варианте реализации изобретения в настоящем раскрытии предложены способы лечения или предотвращения рака у субъекта, который в этом нуждается, причем способ включает введение субъекту связывающего белка FIT-Ig, описанного в данном документе, причем указанный связывающий белок способен к связыванию CTLA-4 и PD-1. В дополнительном варианте реализации изобретения связывающий белок FIT-Ig содержит аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 92, 95 и 97. В другом варианте реализации изобретения в настоящем раскрытии предложены способы лечения или предотвращения рака у субъекта, который в этом нуждается, причем связывающий белок способен к связыванию CTLA-4 и PD-1, и причем рак представляет собой вид рака, обычно поддающийся иммунотерапии. В другом варианте реализации изобретения рак представляет собой рак, который не был ассоциирован с иммунотерапией. В другом варианте реализации изобретения рак представляет собой рак, который представляет собой резистентную или рецидивирующую злокачественную опухоль. В другом варианте реализации изобретения связывающий белок ингибирует рост или выживаемость опухолевых клеток. В другом варианте реализации изобретения рак выбран из группы, состоящей из меланомы (например, метастатическая злокачественная меланома), рака почек (например, светлоклеточная карцинома), рака предстательной железы (например, гормонорезистентная аденокарцинома предстательной железы), аденокарциномы поджелудочной железы, рака молочной железы, рака толстой кишки, рака легких (например, немелкоклеточный рак легких), рака пищевода, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, рака печени, рака яичников, рака шейки матки, рака щитовидной железы, глиобластомы, глиомы, лейкоза, лимфомы и других злокачественных новообразований.
[0041] В одном варианте реализации изобретения в настоящем раскрытии предложены способы лечения или предотвращения меланомы у субъекта, который в этом нуждается, причем способ включает введение субъекту связывающего белка FTT-Ig, описанного в данном документе, причем указанный связывающий белок способен к связыванию CTLA-4 и PD-1. В дополнительном варианте реализации изобретения в настоящем раскрытии предложены способы лечения или предотвращения меланомы у субъекта, который в этом нуждается, причем способ включает введение субъекту связывающего белка FIT-Ig, содержащего аминокислотные последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 92, 95 и 97.
[0042] В другом варианте реализации изобретения в настоящем раскрытии предложены способы лечения или предотвращения инфекций или инфекционного заболевания у субъекта, который в этом нуждается, причем способ включает введение субъекту связывающего белка FIT-Ig, описанного в данном документе, причем указанный связывающий белок способен к связыванию CTLA-4 и PD-1. В одном варианте реализации изобретения связывающий белок FIT-Ig вводят отдельно или в комбинации с вакцинами, для стимуляции иммунного ответа на патогены, токсины и аутоантигены. Таким образом, в одном варианте реализации изобретения связывающие белки, предложенные в данном документе, могут быть использованы для стимуляции иммунного ответа на вирусы, заражающие людей, такие как, в том числе, вирусы иммунодефицита человека, вирусы гепатита класса А, В и С, вирус Эпштейна-Барра, цитомегаловирус человека, вирус папилломы человека, герпесвирусы, бактерии, паразитические грибы или другие патогены.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0043] На Фигуре 1А показана структура FIT-Ig, которые состоят из трех конструкций, таких как FIT1-Ig, FIT2-Ig и FIT3-Ig. На Фигуре 1В показаны три конструкции, использованные для получения таких FIT1-Ig.
[0044] На Фигуре 2А показана основная структура FIT-Ig, которые состоят из двух конструкций. На Фигуре 2В показаны две конструкции, использованные для получения таких FIT-Ig.
[0045] На Фигуре 3 представлены результаты по биспецифическому связыванию антигенов FIT1-Ig, которые были оценены с помощью Biacore. На верхней панели Фигуры 3 показаны результаты анализа связывания с использование Biacore, в котором сначала происходило насыщение FIT1-Ig ИЛ-17, а затем ИЛ-20. На нижней панели Фигуры 3 показаны результаты анализа с использование Biacore, в котором сначала происходило насыщение FIT1-Ig ИЛ-20, а затем ИЛ-17.
[0046] На Фигуре 4 показана растворимость FIT Ig к ИЛ-17/ИЛ-20 или моноклонального антитела ритуксимаб при разных значениях рН, которая была оценена с помощью ПЭГ-индуцированной преципитации.
[0047] На Фигуре 5 показана стабильность развития устойчивой линии клеток СНО как в системе DG44 (5А и 5В), так и CHO-S (5С и 5D).
[0048] На Фигуре 6 показано связывание FIT10-Ig или родительских антител Ипилимумаба и Ниволумаба с CTLA-4 (6А) или PD-1 (Фигура 6В), которое было оценено с помощью ИФА.
[0049] На Фигуре 7 показаны результаты исследования множественного связывания FTT10-Tg как с CTLA-4, так и PD-1. Связывание с CTLA-4, а затем с PD-1; и связывание PD-1, а затем с CTLA-4, показаны на Фигуре 7.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0050] Настоящее изобретении относится к мультивалентным и мультиспецифическим связывающим белкам, способам получения связывающих белков и их применению в предотвращении и/или лечении острых и хронических воспалительных заболеваний, и нарушений, злокачественных новообразований и других заболеваний. Настоящее изобретение относится к мультивалентным и/или мультиспецифическим связывающим белкам, способным к связыванию двух или более антигенов. В частности, настоящее изобретение относится к иммуноглобулинам с тандемным расположением Fab-фрагментов (FIT-Ig) и их фармацевтическим композициям, а также к нуклеиновым кислотам, рекомбинантным экспрессирующим векторам и клеткам-хозяевам для получения таких FIT-Ig. В настоящем изобретении также охватываются способы применения FIT-Ig по настоящему изобретению для детекции специфических антигенов либо in vitro, либо in vivo.
[0051] Новое семейство связывающих белков, предложенных в настоящем документе, способно к связыванию двух или более антигенов, например, с высокой аффинностью. В частности, в настоящем изобретении предложен подход к конструированию биспецифического связывающего белка с использованием 2 родственных моноклональных антител: мАт А, которое связывается с антигеном а; и мАт В, которое связывается с антигеном b.
[0052] В одном аспекте в настоящем изобретении предложен связывающий белок, содержащий вариабельную область легкой цепи, специфичную по отношению к первому антигену или эпитопу, первый константный домен легкой цепи, вариабельную область тяжелой цепи, специфичную по отношению ко второму антигену или эпитопу, первый СН1 тяжелой цепи, вариабельную область тяжелой цепи, специфичную по отношению к первому антигену или эпитопу, второй СН1 тяжелой цепи, вариабельную область тяжелой цепи, специфичную по отношению ко второму антигену или эпитопу, и второй константный домен легкой цепи. В одном варианте реализации изобретения связывающий белок дополнительно содержит Fc-область. Связывающий белок может дополнительно содержать один или более аминокислотных или полипептидных линкеров, соединяющих два или более компонентов связывающего белка. Например, связывающий белок может содержать полипептидный линкер, соединяющий вариабельную область легкой цепи с константной областью легкой цепи.
A
B
B
[0053] В одном варианте реализации изобретения в настоящем описании предложен связывающий белок, содержащий полипептидную цепь, содержащую VL-CL-(X1)n-VH-CH1-(X2)n, причем VLA представляет собой вариабельный домен легкой цепи мАт A, CL представляет собой константный домен легкой цепи, X1 представляет собой аминокислотный или олигопептидный линкер, VH представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи мАт В, СН1 представляет собой первый константный домен тяжелой цепи, Х2 представляет собой Fc-область или другой домен димеризации, и n представляет собой 0 или 1.
A
B
B
A
A
B
B
[0054] В одном варианте реализации изобретения в настоящем изобретении предложен связывающий белок, содержащий три разные полипептидные цепи (Фигура 1), причем первая полипептидная цепь (конструкция №1) содержит VL-CL-(X1)n-VH-CH1-(X2)n, при этом VLA представляет собой вариабельный домен легкой цепи мАт A, CL представляет собой константный домен легкой цепи, X1 представляет собой аминокислотный или олигопептидный линкер, VH представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи мАт В, СН1 представляет собой первый константный домен тяжелой цепи, Х2 представляет собой Fc-область или другой домен димеризации, и n представляет собой 0 или 1. Вторая полипептидная цепь (конструкция №2) содержит VH-CH1, причем VH представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи мАт А, и CH1 представляет собой первый константный домен тяжелой цепи. Третья полипептидная цепь (конструкция №3) содержит VL-CL, причем VL представляет собой вариабельный домен легкой цепи мАт В, и CL представляет собой константный домен легкой цепи.
B
A
A
B
A
A
B
B
[0055] В другом варианте реализации изобретения предложен связывающий белок, содержащий три разные полипептидные цепи с общим молекулярным дизайном, подобным предыдущему варианту реализации изобретения, за исключением того, что используется обратный порядок вариабельных доменов. В данном варианте реализации изобретения первая полипептидная цепь содержит VH-CH1-(X1)n-VL-CL-(X2)n, причем VL представляет собой вариабельный домен легкой цепи мАт A, CL представляет собой константный домен легкой цепи, X1 представляет собой аминокислотный или олигопептидный линкер, VH представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи мАт В, СН1 представляет собой первый константный домен тяжелой цепи, Х2 представляет собой Fc-область или другой домен димеризации, и n представляет собой 0 или I. Вторая полипептидная цепь содержит VH-CH1, причем VH представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи мАт А, и СН1 представляет собой первый константный домен тяжелой цепи. Третья полипептидная цепь содержит VL-CL, причем VL представляет собой вариабельный домен легкой цепи мАт В, и CL представляет собой константный домен легкой цепи.
A
B
A
B
A
B
A
B
[0056] В другом варианте реализации изобретения предложен связывающий белок, содержащий две разные полипептидные цепи (Фигура 2), причем первая полипептидная цепь (конструкция №1) содержит VL-CL-(X1)n-VH-CH1-(X2)n, при этом VL представляет собой вариабельный домен легкой цепи мАт A, CL представляет собой константный домен легкой цепи, X1 представляет собой аминокислотный или олигопептидный линкер, VH представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи мАт В, СН1 представляет собой первый константный домен тяжелой цепи, Х2 представляет собой Fc-область или другой домен димеризации, и n представляет собой 0 или 1. Вторая полипептидная цепь (конструкция №4) содержит VH-CH1-(X3)n-VL-CL, причем VH представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи мАт А, СН1 представляет собой первый константный домен тяжелой цепи, Х3 представляет собой аминокислоту или полипептид, который является не константным доменом, n представляет собой 0 или 1, VL представляет собой вариабельный домен легкой цепи мАт В, и CL представляет собой константный домен легкой цепи.
B
A
A
B
B
A
A
B
[0057] В другом варианте реализации изобретения предложен связывающий белок, содержащий две полипептидные цепи с общим молекулярным дизайном, подобным предыдущему варианту реализации изобретения, за исключением того, что используется обратный порядок вариабельных доменов. В этом варианте реализации изобретения первая полипептидная цепь содержит VH-CH1-(X1)n-VL-CL-(X2)n, причем VL представляет собой вариабельный домен легкой цепи мАт A, CL представляет собой константный домен легкой цепи, X1 представляет собой аминокислотный или олигопептидный линкер, VH представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи мАт В, СРП представляет собой первый константный домен тяжелой цени, Х2 представляет собой Fc-область или другой домен димеризации, и n представляет собой 0 или 1. Вторая полипептидная цепь содержит VL-CL-(X3)n-VH-CH1, причем VH представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи мАт А, СН1 представляет собой первый константный домен тяжелой цепи, Х3 представляет собой аминокислотный или олигопептидный линкер, n представляет собой 0 или 1, VL представляет собой вариабельный домен легкой цепи мАт В, и CL представляет собой константный домен легкой цепи.
A
A
B
B
A
A
B
B
[0058] В одном варианте реализации изобретения VH- и VL-домены в связывающем белке выбраны из группы, состоящей из вариабельных доменов тяжелой/легкой цепей антитела мыши, вариабельных доменов тяжелой/легкой цепей, полностью идентичных человеческим, вариабельных доменов тяжелой/легкой цепей с пересадкой CDR, гуманизированных вариабельных доменов тяжелой/легкой цепей и их комбинаций. В предпочтительном варианте реализации изобретения VH/VL и VH/VL способны к связыванию одинакового антигена. В другом варианте реализации изобретения VH/VL и VH/VL способны к связыванию разных антигенов.
A
B
B
B
B
A
A
A
4
4
[0059] В одном варианте реализации изобретения первая полипептидная цепь содержит VL-CL-VH-CH1-Fc, и CL, а также VH первой полипептидной цепи непосредственно слиты друг с другом. В другом варианте реализации изобретения CL и VH соединены с помощью аминокислотного или олигопептидного линкера. В другом варианте реализации изобретения первая полипептидная цепь содержит VH-CH1-VL-CL-Fc, и СН1, а также VL непосредственно слиты друг с другом. В другом варианте реализации изобретения СН1 и VL соединены с помощью аминокислотного или олигопептидного линкера. В дополнительном варианте реализации изобретения олиго- или полипептидный линкер содержит 1 или более аминокислот, имеющих любую приемлемую последовательность, которая обеспечивает гибкость. Преимущественно, чтобы линкер был выбран из группы, состоящей из C,GS, SG,GGS, GSG, SGG, GGG, GGGS, SGGG, GGGGS, GGGGSGS,GGGGSGS, GGGGSGGS, GGGGSGGGGS, GGGGSGGGGSGGGGS, AKTTPKLEEGEFSEAR, AKTTPKLEEGEFSEARV, AKTTPKLGG, SAKTTPKLGG, AKTTPKLEEGEFSEARV, SAKTTP, SAKTTPKLGG, RADAAP, RADAAPTVS, RADAAAAGGPGS, RADAAAA(GS),SAKTTP, SAKTTPKLGG, S AKTTPKLEEGEFSEARV, ADAAP, ADAAPTVSIFPP, TVAAP, TVAAPSVF1FPP, QPKAAP, QPKAAPSVTLFPP, AKTTPP, AKTTPPSVTPLAP,AKTTAP, AKTTAPSVYPLAP,ASTKGP, ASTKGPSVFPLAP, GENKVEYAPALMALS,GPAKELTPLKEAKVS и GHEAAAVMQVQYPAS. В одном варианте реализации изобретения аминокислотная последовательность линкера может быть выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO. 26, 28 и 49-86. В одном варианте реализации изобретения линкер представляет собой GSG (SEQ ID NO: 26) или GGGGSGS (SEQ ID NO: 28). Линкеры также могут представлять собой расщепляемые in vivo пептидные линкеры, линкеры, чувствительные к протеазам (таким как ММР), линкеры на основе дисульфидной связи, которые могут расщепляться путем восстановления и т.д., как было ранее описано (Fusion Protein Technologies for Biopharmaceuticals: Applications and Challenges, edited by Stefan R. Schmidt), или любые расщепляемые линкеры, известные в данной области техники. Такие расщепляемые линкеры могут быть использованы для высвобождения верхнего Fab in vivo для различных целей, для того чтобы улучшить проникновение и распределение тканях/клетки, усилить связывания с мишенями, уменьшить потенциальное побочное действие, а также модулировать in vivo функциональный и физический период полувыведения 2 разных Fab-областей. В одном варианте реализации изобретения связывающий белок содержит Fc-область. Используемый в данном документе термин «Fc-область» относиться к С-концевой области тяжелой цепи IgG. Примером аминокислотной последовательности, содержащей Fc-область IgG1 человека, является SEQ ID NO: 20. Fc-область IgG содержит два константных домена, СН2 и СН3.
[0060] В одном варианте реализации изобретения Fc-область представляет собой вариант Fc-области. В одном варианте реализации изобретения вариант Fc-области имеет одну или более аминокислотных модификаций, таких как замещения, делении или вставки, по сравнению с родительской Fc-областью. В дополнительном варианте реализации изобретения аминокислотные модификации Fc-области изменяют эффекторную функциональную активность по сравнению с родительской Fc-областью. Например, в одном варианте реализации изобретения вариант Fc-области может характеризоваться измененной (т.е. повышенной или сниженной) антителозависимой цитотоксичностыо (ADCC), комплементзависимой цитотоксичностыо (CDC), фагоцитозом, опсонизацией или связыванием клеток. В другом варианте реализации изобретения аминокислотные модификации Fc-области могут изменять (т.е. повышать или снижать) аффинность варианта Fc-области, по отношению к FcγR по сравнению с родительской Fc-областью. Например, вариант Fc-области может изменять аффинность по отношению к FcγRI, FcγRII, FcγRIII.
[0061] В одном предпочтительном варианте изобретения связывающие белки, предложенные в настоящем документе, способны к связыванию одной или более мишеней. В одном варианте реализации изобретения мишень выбрана из группы, состоящей из цитокинов, белков клеточной поверхности, ферментов и рецепторов. Предпочтительно, чтобы связывающий белок был способен модулировать биологическую функцию одной или более мишеней. Более предпочтительно, чтобы связывающий белок был способен нейтрализовать одну или более мишеней.
[0062] В одном варианте реализации изобретения связывающий белок по настоящему изобретению способен к связыванию цитокинов, выбранных из группы, состоящей из лимфокинов, монокинов и полипептидных гормонов. В дополнительном варианте реализации изобретения связывающий белок способен к связыванию пар цитокинов, выбранных из группы, состоящей из ИЛ-1α и ИЛ-1β; ИЛ-12 и ИЛ-18, TNFα и ИЛ-23, TNFα и ИЛ-13; TNF и ИЛ-18; TNF и ИЛ-12; TNF и ИЛ-1-бета; TNF и MIF; TNF и ИЛ-6, TNF и рецептора ИЛ-6, TNF и ИЛ-17; ИЛ-17 и ИЛ-20; ИЛ-17 и ИЛ-23; TNF и ИЛ-15; TNF и VEGF; VEGFR и EGFR; ИЛ-13 и ИЛ-9; ИЛ-13 и ИЛ-4; ИЛ-13 и ИЛ-5; ИЛ-13 и ИЛ-25; ИЛ-13 и TARC; ИЛ-13 и MDC; ИЛ-13 и MIF; ИЛ-13 и TGF-β; ИЛ-13 и агониста LHR; ИЛ-13 и CL25; ИЛ-13 и SPRR2a; ИЛ-13 и SPRR2b; ИЛ-13 и ADAM8; и TNFα и PGE4, ИЛ-13 и PED2, TNF и PEG2.
[0063] В другом варианте реализации изобретения связывающий белок по настоящему изобретению способен к связыванию пар мишеней, выбранных из группы, состоящей из CD137 и CD20, CD137 и EGFR, CD137 и Her-2, CD137 и PD-1, CD 137 и PDL-1, VEGF и PD-L1, Lag-3 и TIM-3, ОХ40 и PD-1, TIM-3 и PD-1, TIM-3 и PDL-1, EGFR и DLL-4,VEGF и EGFR, HGF и VEGF, VEGF и VEGF (с тем же самым или другим эпитопом), VEGF и Ang2, EGFR и eMet, PDGF и VEGF, VEGF и DLL-4, OX40 и PD-L1, ICOS и PD-1, ICOS и PD-L1, Lag-3 и PD-1, Lag-3 и PD-L1, Lag-3 и CTLA-4, ICOS и CTLA-4, CD138 и CD20; CD138 и CD40; CD19 и CD20; CD20 и CD3; CD3 и CD33; CD3 и CD133; CD38 и CD138; CD38 и CD20; CD20 и CD22; CD38 и CD40; CD40 и CD20; CD47 и CD20, CD-8 и ИЛ-6; CSPG и RGM A; CTLA-4 и BTNO2; CTLA-4 и PD-1; IGF1 и IGF2; IGF 1/2 и Erb2B; IGF-1R и EGFR; EGFR и CD13; IGF-1R и ErbB3; EGFR-2 и IGFR; Her2 и Her2 (с тем же самым или другим эпитопом); Фактора IXa, Фактора X,VEGFR-2 и Met; VEGF-A и Ангиопоэтина-2 (Ang-2); ИЛ-12 и TWEAK; ИЛ-13 и ИЛ-1-бета; MAG и RGM A; NgR и RGM A; NogoA и RGM A; OMGp и RGM A; PDL-1 и CTLA-4; PD-1 и TIM-3; RGM А и RGM В; Те38 и TNFα; TNFα и Blys; TNFα и CD-22; TNFα и домена CTLA-4; TNFα и GP130; TNFα и ИЛ-12р40; и TNFα и лиганда RANK.
[0064] В одном варианте реализации изобретения связывающий белок способен к связыванию ИЛ-17 человека и ИЛ-20 человека. В дополнительном варианте реализации изобретения связывающий белок способен к связыванию ИЛ-17 человека и ИЛ-20 человека и содержит последовательность полипептидной цепи №1 FIT-Ig, которая на около 65%, около 70%, около 75%о, около 80%, около 85%, около 90%, около 95%, около 99% или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO. 15, 25 и 27; последовательность полипептидной цепи №2, которая на около 65%, около 70%, около 75%, около 80%, около 85%, около 90%, около 95%, около 99% или 100% идентична SEQ ID NO. 21; и последовательность полипептидной цепи №3, которая на около 65%, около 70%, около 75%, около 80%, около 85%, около 90%, около 95%, около 99% или 100% идентична SEQ ID NO. 23. В другом варианте реализации изобретения связывающий белок способен к связыванию ИЛ-17 человека и ИЛ-20 человека и содержит последовательность полипептидной цепи №1 FIT-Ig, которая на около 65%, около 70%, около 75%, около 80%, около 85%, около 90%, около 95%, около 99% или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO. 15, 25 и 27; и полипептидную цепь №4, которая на около 65%, около 70%, около 75%, около 80%, около 85%, около 90%, около 95%, около 99% или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO. 29, 30 и 31.
[0065] В одном варианте реализации изобретения связывающий белок способен к связыванию CD3 человека и CD20 человека. В дополнительном варианте реализации изобретения связывающий белок содержит последовательность полипептидной цепи №1 FIT-Ig, которая на около 65%, около 70%, около 75%, около 80%, около 85%, около 90%, около 95%, около 99% или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO. 41 и 48; последовательность полипептидной цепи №2, которая на около 65%, около 70%, около 75%, около 80%, около 85%, около 90%, около 95%, около 99% или 100% идентична SEQ ID NO. 44; и последовательность полипептидной цепи №3, которая па около 65%, около 70%, около 75%, около 80%, около 85%, около 90%, около 95%, около 99% или 100% идентична SEQ ID NO. 46.
[0066] В одном варианте реализации изобретения связывающий белок способен к связыванию ИЛ-17 человека и TNF человека. В дополнительном варианте реализации изобретения связывающий белок способен к связыванию ИЛ-17 человека и TNF человека и содержит последовательность полипептидной цепи №1 FIT-Ig, которая на около 65%, около 70%, около 75%, около 80%, около 85%, около 90%, около 95%, около 99% или 100% идентична SEQ ID NO. 87; последовательность полипептидной цепи №2, которая на около 65%, около 70%, около 75%, около 80%, около 85%, около 90%, около 95%, около 99% или 100% идентична SEQ TD NO. 89; и последовательность полипептидной цепи №3, которая на около 65%, около 70%, около 75%, около 80%, около 85%, около 90%, около 95%, около 99% или 100% идентична SEQ ID NO. 91.
[0067] В одном варианте реализации изобретения связывающий белок способен к связыванию CTLA-4 человека и PD-1 человека. В дополнительном варианте реализации изобретения связывающий белок способен к связыванию CTLA-4 человека и PD-1 человека и содержит последовательность полипептидной цепи №1 FIT-Ig, которая на около 65%, около 70%, около 75%, около 80%, около 85%, около 90%, около 95%, около 99% или 100% идентична SEQ ID NO. 92; последовательность полипептидной цепи №2, которая на около 65%, около 70%, около 75%, около 80%, около 85%, около 90%, около 95%, около 99% или 100% идентична SEQ ID NO. 95; и последовательность полипептидной цепи №3, которая на около 65%, около 70%, около 75%, около 80%, около 85%, около 90%, около 95%, около 99% или 100% идентична SEQ ID NO. 97.
[0068] В другом варианте реализации изобретения связывающий белок по настоящему изобретению способен к связыванию одного или двух цитокинов, белков, родственных цитокинам, и рецепторов цитокинов, выбранных из группы, состоящей из ВМР1, ВМР2, ВМР3В (GDF10), ВМР4, ВМР6, ВМР8, CSF1 (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (G-CSF), ЕРО, FGF1 (aFGF), FGF2 (bFGF), FGF3 (int-2), FGF4 (HST), FGF5, FGF6 (HST-2), FGF7 (KGF), FGF9, FGF10, FGFU, FGF12, FGF12B, FGF14, FGF16, FGF17, FGF19, FGF20, FGF21, FGF23, IGF1, IGF2, IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, 1FNB1, IFNG, IFNW1, FIL1, FIL1 (EPSILON), FIL1 (ZETA), IL1A, IL1B, IL2, IL3, IL4, ИЛ5, ИЛ6, ИЛ7, ИЛ8, ИЛ9, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL13, IL14, IL15, IL16, ИЛ-17, ИЛ-17В, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL30, PDGFA, FGER1, FGFR2, FGFR3, EGFR, ROR1, 2B4, KIR, CD137, CD27, OX40, CD40L, A2aR, CD48, B7-1, B7-2, ICOSL, B7-H3, B7-H4, CD137L, OX40L, CD70, CD40, PDGFB, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, LTA (ФНО-b), LTB, TNF (ФНО-а), TNFSF4 (лиганд OX40), TNFSF5 (лиганд CD40), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (лиганд CD27), TNFSF8 (лиганд CD30), TNFSF9 (лиганд 4-1ВВ), TNFSF10 (TRAIL), TNFSF11 (TRANCE), TNFSF12 (APO3L), TNFSF13 (April), TNFSF13B, TNFSF14 (HVEM-L), TNFSF15 (VEGI), TNFSF18, FIGF (VEGFD), VEGF, VEGFB, VEGFC, ИЛ1R1, ИЛ1R2, ИЛ1RL1, ИЛ1RL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3RA, IL4R, ИЛ5RA, ИЛ6R, ИЛ7R, ИЛ8RA, ИЛ8RB, ИЛ9R, IL10RA, IL10RB, IL11RA, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, ИЛ-17Я, IL18R1, IL20RA, IL21R, IL22R, IL1HY1, IL1RAP, IL1RAPL1, IL1RAPL2, IL1RN, ИJI6ST, IL18BP, IL18RAP, IL22RA2, AIF1, HGF, LEP (лептин), PTN и THPO.
[0069] Связывающий белок по настоящему изобретению способен к связыванию одного или более хемокинов, рецепторов хемокинов и белков, родственных хемокинам, выбранных из группы, состоящей из CCL1 (I-309), CCL2 (МСР -1 / MCAF), CCL3 (MIP-1a), CCL4 (MIP-1b), CCL5 (RANTES), CCL7 (МСР-3), CCL8 (mep-2), CCL11 (эотаксин), CCL13 (МСР-4), CCL15 (MIP-1d), CCL16 (НСС-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19 (MIP-3b), CCL20 (MIP-3a), CCL21 (SLC/эксодус-2), CCL22 (MDC/STC-1), CCL23 (MPIF-1), CCL24 (MPIF-2/эотаксин-2), CCL25 (TECK), CCL26 (эотаксин-3), CCL27 (CTACK/ILC), CCL28, CXCL1 (GRO1), CXCL2 (GRO2), CXCL3 (GRO3), CXCL5 (ENA-78), CXCL6 (GCP-2), CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP 10), CXCL11 (I-TAC), CXCL12 (SDF1), CXCL13, CXCL14, CXCL16, PF4 (CXCL4), PPBP (CXCL7),CX3CL1 (SCYD1), SCYE1, XCL1 (лимфотактин), XCL2 (SCM-1b), BLR1 (MDR15), CCBP2 (D6 / JAB61), CCR1 (CKR1 / HM145), CCR2 (mep-1RB / RA), CCR3 (CKR3 / CMKBR3), CCR4, CCR5 (CMKBR5 / ChemR13), CCR6 (CMKBR6 / CKR-L3 / STRL22 / DRY6), CCR7 (CKR7 / EBI1), CCR8 (CMKBR8 / TER1 / CKR-L1), CCR9 (GPR-9-6), CCRL1 (VSHK1), CCRL2 (L-CCR), XCR1 (GPR5 / CCXCR1), CMKLR1, CMKOR1 (RDC1), CX3CR1 (V28), CXCR4, GPR2 (CCR10), GPR31, GPR81 (FKSG80), CXCR3 (GPR9/CKR-L2), CXCR6 (TYMSTR /STRL33 / Bonzo), HM74, IL8RA (IL8Ra), IL8RB (IL8Rb), LTB4R (GPR16), TCP10, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSF8, BDNF, C5R1, CSF3, GRCC10 (С10), EPO, FY (DARC), GDF5, HIF1A, IL8, PRL, RGS3, RGS13, SDF2, SLIT2, TLR2, TLR4, TREM1, TREM2 и VHL.
[0070] В другом варианте реализации изобретения связывающий белок по настоящему изобретению способен к связыванию белка клеточной поверхности, такого как, например, интегрины. В другом варианте реализации изобретения связывающий белок по настоящему изобретению способен к связыванию ферментов, выбранных из группы, состоящей из киназ и протсаз. Еще в одном варианте реализации изобретения связывающий белок по настоящему изобретению способен к связыванию рецепторов, выбранных из группы, состоящей из рецепторов лимфокинов, рецепторов монокинов и рецепторов полипептидных гормонов.
[0071] В одном варианте реализации изобретения связывающий белок является мультивалентным. В другом варианте реализации изобретения связывающий белок является мультиспецифическим. Мультивалентные и/или мультиспецифические связывающие белки, описанные выше, обладают желательными свойствами, в частности, с терапевтической точки зрения. Например, мультивалентный и/или мультиспецифический связывающий белок может (1) быть интернализирован (и/или катаболизирован) быстрее, чем бивалентное антитело клеткой, экспрессирующей антиген, с которым связываются антитела; (2) быть антителом-агонистом; и/или (3) индуцировать некроз и/или апоптоз клетки, экспрессирующей антиген, с которым способно связываться мультивалентное антитело. «Родительское антитело», которое обладает по меньшей мере одной антигенсвязывающсй специфичностью, характерной для мультивалентных и/или мультиспецифических связывающих белков, может быть антителом, которое интернализуется (и/или катаболизируется) клеткой, экспрессирующей антиген, с которым связывается антитело; и/или может быть агонистом, антителом, индуцирующим некроз и/или индуцирующим апоптоз клетки, и одно или более из указанных свойств мультивалентного и/или мультиспецифического связывающего белка, описанного в данном документе, может (могут) быть улучшено (улучшены). Более того, родительское антитело может быть лишено любого одного или более из этих свойств, но может быть наделено ими при конструировании в виде мультивалентного связывающего белка, описанного в данном документе.
2
-1
-1
3
-1
-1
4
-1
-1
5
-1
-1
6
-1
-1
2
-1
-1
3
-1
-1
3
-1
-1
4
-1
-1
4
-1
-1
5
-1
-1
5
-1
-1
6
-1
-1
[0072] В другом варианте реализации изобретения связывающий белок по настоящему изобретению имеет константу скорости ассоциации (Kon) по отношении к одной или более мишеней, выбранную из группы, состоящей из значений указанной константы, составляющих: по меньшей мере около 10Мс; по меньшей мере около 10Мс; по меньшей мере около 10Мс; по меньшей мере около 10Мс; и по меньшей мере около 10Мс по результатам измерений поверхностного плазмонного резонанса. Предпочтительно, чтобы связывающий белок по настоящему изобретению имел константу скорости ассоциации (Kon) по отношении к одной или более мишеней, составляющую от 10Mc до 10Mc; от 10Мс до 10Mc; от 10Мс до 10Mc; или от 10Мс до 10Mc по результатам измерений поверхностного плазмонного резонанса.
-3
-1
-4
-1
-5
-1
-6
-1
-3
-1
-4
-1
-4
-1
-5
-1
-5
-1
-6
-1
[0073] В другом варианте реализации изобретения связывающий белок имеет константу скорости диссоциации (Koff) по отношению к одной или более мишеней, выбранную из группы, состоящей из значений указанной константы, составляющих: не более чем 10с; не более чем 10с; не более чем 10с; и не более чем 10c по результатам измерений поверхностного плазмонного резонанса. Предпочтительно, чтобы связывающий белок по настоящему изобретению имел константу скорости диссоциации (Koff) по отношению к одной или более мишеней, составляющую от 10с до 10c; от 10c до 10c; или от 10с до 10с по результатам измерений поверхностного плазмонного резонанса.
-7
-8
-9
-10
-11
-12
-13
-7
-8
-8
-9
-9
-10
-10
-11
-11
-12
-12
-13
D
[0074] В другом варианте реализации изобретения связывающий белок имеет константу диссоциации (KD) по отношению к одной или более мишеней, выбранную из группы, состоящей из значений указанной константы, составляющих: не более чем, около 10 М; не более чем около 10 М; не более чем около 10 М; не более чем около 10 М; не более чем около 10 0М; не более чем около 10 М; и не более чем 10 М по результатам измерении поверхностного плазмонного резонанса. Предпочтительно, чтобы связывающий белок по настоящему изобретению имел константу диссоциации (K) по отношению к ИЛ-12 или ИЛ-23 от 10 М до 10 М; от 10 М до 10 М; от 10 М до 10 М; от 10 до 10 М; от 10 М до 10 М; или от 10 М до 10 М.
3
14
35
90
99
111
125
131
177
166
153
[0075] В другом варианте реализации изобретения связывающий белок, описанный выше, представляет собой конъюгат, дополнительно содержащий средство, выбранное из группы, состоящей из иммуноадгезивной молекулы, средства для визуализации, терапевтического средства и цитотоксического средства. В одном варианте реализации изобретения средство для визуализации выбрано из группы, состоящей из радиоактивной метки, фермента, флуоресцентной метки, люминесцентной метки, биолюминесцентной метки, магнитной метки и биотина. В дополнительном варианте реализации изобретения средством для визуализации является радиоактивная метка, выбранная из группы, состоящей из: Н, С, S, Y, Тс, In, I, I, Lu, Но и Sm. В одном варианте реализации изобретения терапевтическое или цитотоксическое средство выбрано из группы, состоящей из иммунодепрессанта, иммуностимулятора, антиметаболита, алкилирующего средства, антибиотика, фактора роста, цитокина, антиангиогенного средства, антимитотического средства, антрациклина, токсина и апоптического средства. В одном варианте реализации изобретения связывающий белок непосредственно конъюгирован с указанным средством. В другом варианте реализации изобретения связывающий белок конъюгирован со средством с помощью линкера. Подходящие линкеры включают, в том числе, аминокислотные и полипептидные линкеры, описанные в данном документе. Линкеры могут быть расщепляемыми или не расщепляемыми.
[0076] В другом варианте реализации изобретения связывающий белок, описанный выше, представляет собой кристаллический связывающий белок и существует в кристаллической форме. Предпочтительно, чтобы кристаллическая форма представляла собой фармацевтический препарат в кристаллической форме без вспомогательных веществ с контролируемым высвобождением. Более предпочтительно, чтобы кристаллический связывающий белок имел больший период полувыведения in vivo, чем растворимый аналог указанного связывающего белка. Более предпочтительно, чтобы кристаллический связывающий белок сохранял биологическую активность.
[0077] В другом варианте реализации изобретения связывающий белок, описанный выше, является гликозилированным. Предпочтительно, чтобы белок имел профиль гликозилирования, характерный для человека.
[0078] В одном аспекте настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей любой из связывающих белков, описанных выше. В дополнительном варианте реализации изобретения предложен вектор, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту, описанную выше, причем указанный вектор выбран из группы, состоящей из pcDNA; рТТ (Durochcr et al., Nucleic Acids Research 2002, Vol 30, No. 2); рТТ3 (рТТ с дополнительным сайтом множественного клонирования; pEFBOS (Mizushima, S. and Nagata, S., (1990) Nucleic acids Research Vol 18, No. 17); pBV; pJV; pcDNA3.1 TOPO, pEF6 TOPO и pBJ. Предложены мультиспецифические связывающие белки и такие же способы их получения. Связывающий белок можно получить с использованием различных методов. В данном описании приведены экспрессирующие векторы, клетки-хозяева и способы получения связывающих белков.
[0079] Антигенсвязывающие вариабельные домены связывающих белков по настоящему изобретению можно получить из родительских связывающих белков, включая поликлональные Ат, моноклональные Ат и/или рецепторы, способные к связыванию представляющих интерес антигенов. Эти родительские связывающие белки могут быть природного происхождения или могут быть получены с помощью рекомбинантной технологии. Специалист в данной области техники хорошо знаком со многими способами получения антител и/или выделенных рецепторов, включая, в том числе, использование гибридомной технологии, метода получения антител с помощью селекции отдельных специфических лимфоцитов (selected lymphocyte antibody method, SLAM), применение фагового, дрожжевого дисплея или дисплея слитых молекул РНК-белка (RNA-protein fusion display) или другой библиотеки, иммунизацию животного, отличного от человека, содержащего по меньшей мере некоторые из локусов иммуноглобулина человека и получение рекомбинантных антител с пересаженными CDR-участками и гуманизированных антител. См., например, публикацию патента США №20090311253 А1. Вариабельные домены также могут быть получены с использованием методов созревания аффинности. Связывающие вариабельные домены связывающих белков также могут быть получены из выделенных рецепторных молекул, полученных методами экстракции, известными в данной области техники (например, с использованием растворителей, детергентов и/или методов аффинной очистки), или могут быть обнаружены с использованием биофизических методов, известных в данной области техники (например, рентгенокристаллография, ЯМР, интерферометрия и/или компьютерное моделирование).
[0080] Один вариант реализации изобретения включает селекцию родительских связывающих белков, обладающих по меньшей мере одним или более свойствами, желательными для связывающей белковой молекулы. В одном варианте реализации изобретения желательное свойство представляет собой одно или более из свойств, используемых для характеристики параметров антител, такое как, например, антигенная специфичность, аффинность по отношению к антиген}-, активность, биологическая функция, распознавание эпитопов, стабильность, растворимость, эффективность производства, иммуногенность, фармакокинетика, биодоступность, перекрестная тканевая реактивность или связывание ортологического антигена. См., например, публикацию патента США №20090311253.
[0081] Мультиспецифические антитела также могут быть сконструированы таким образом, что один или более антигенсвязывающих доменов окажется нефункциональным. Вариабельные домены можно получить с использованием технологий рекомбинантных ДИК из родительских связывающих белков, полученных любым из способов, описанных в данном документе. В одном варианте реализации изобретения вариабельный домен представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цени иммуноглобулина мыши. В другом варианте реализации изобретения вариабельный домен представляет собой вариабельный домен с пересаженными CDR-участками или гуманизированный вариабельный домен тяжелой или легкой цепи. В одном варианте реализации изобретения вариабельный домен представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина человека.
[0082] В одном варианте реализации изобретения один или более константных доменов связаны с вариабельными доменами с использованием технологий рекомбинантной ДНК. В одном варианте реализации изобретения последовательность, содержащая один или более вариабельных доменов тяжелой цепи, связана с константным доменом тяжелой цепи, а последовательность, содержащая один или более вариабельных доменов легкой цепи, связана с константным доменом легкой цепи. В одном варианте реализации изобретения константные домены представлены человеческими константными доменами тяжелой цепи и человеческими константными доменами легкой цепи, соответственно. В одном варианте реализации изобретения тяжелая цепь дополнительно связана с Fc-областью. Fc-область может представлять собой Fc-область с нативной последовательностью или вариант Fc-области. В другом варианте реализации изобретения Fc-область представляет собой Fc-область иммуноглобулина человека. В другом варианте реализации изобретения Fc-область включает Fc-область из IgG1, lgG2, lgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, или IgD.
[0083] В дополнение к этому, связывающие белки, предложенные в настоящем документе, могут использоваться для тканеспецифической доставки могут быть использованы для тканеспецифической доставки (направленной на тканевые маркеры и медиаторы воспалительного процесса для улучшения локальных фармакокинетических показателей, а следовательно и более высокой эффективности и/или низкой токсичности), включая внутриклеточную доставку (направленную на рецептор трансферрина и медиатор заболевания ЦНС для пересечения гематоэнцефалического барьера). Связывающие белки также могут послужить в качестве белка-носителя для доставки антигена в специфическое местоположение посредством связывания с ненейтрализующим эпитопом данного антигена, а также для увеличения периода полувыведения антигена. Кроме того, связывающие белки могут быть сконструированы либо для физического связывания с медицинскими устройствами, имплантируемыми пациентам, либо для направленного взаимодействия с этими медицинскими устройствами (см. Burke et al. (2006) Advanced Drug Deliv. Rev. 58(3): 437-446; Hildebrand et al. (2006) Surface and Coatings Technol. 200(22-23): 6318-6324; Drug/device combinations for local drug therapies and infection prophylaxis, Wu (2006) Biomaterials 27(11):2450-2467; Mediation of the cytokine network in the implantation of orthopedic devices, Marques (2005) Biodegradable Systems in Tissue Engineer. Regen. Med. 377-397). Направление подходящих типов клеток к сайту локализации медицинского имплантата может стимулировать заживление и восстановление нормальной функции ткани. В качестве альтернативы, также предложено ингибирование медиаторов (включая, в том числе, цитокины), высвобождаемых после имплантации устройства, посредством слитого белка, состоящего из антитела и рецептора, нанесенного на устройство или направленно связанного с устройством.
[0084] В одном аспекте клетку-хозяина трансформируют вектором, описанным выше. В одном варианте реализации изобретения клеткой-хозяином является прокариотическая клетка. В дополнительном варианте реализации изобретения клеткой-хозяином является Escherecia coli. В другом варианте реализации изобретения клеткой-хозяином является эукариотическая клетка. В дополнительном варианте реализации изобретения эукариотическая клетка выбрана из группы, состоящей из клетки одноклеточного организма, клетки животного, клетки растения и клетки гриба. В одном варианте реализации изобретения клеткой-хозяином является клетка млекопитающего, включая, в том числе, 293, COS, NS0 и СНО, и/или клетка гриба, такая как Saccharomyces cerevisiae; или клетка насекомого, такая как Sf9.
[0085] В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения связывающего белка, описанного выше, включающий культивирование любой из клеток-хозяев, также описанных выше, в культуральной среде в условиях, достаточных для выработки связывающего белка. Предпочтительно 50%-75% связывающего белка, получаемого указанным способом, приходятся на четырехвалентный связывающий белок с двойной специфичностью. Более предпочтительно 75%-90% связывающего белка, получаемого указанным способом, приходятся на четырехвалентный связывающий белок с двойной специфичностью. Более предпочтительно 90%-95% связывающего белка, получаемого указанным способом, приходятся на четырехвалентный связывающий белок с двойной специфичностью.
[0086] В другом варианте настоящего изобретения предложен связывающий белок, полученный в соответствии с описанном выше способом.
[0087] В одном варианте настоящего изобретения предложена композиция для высвобождения связывающего белка, причем композиция содержит лекарственную форму, которая, в свою очередь, содержит кристаллический связывающий белок, который описан выше, и ингредиент; и по меньшей мере один полимерный носитель. Предпочтительно полимерным носителем является полимер, выбранный из одной или более группы, состоящей из: поли (акриловой кислоты), поли (цианоакрилатов), поли (аминокислот), поли (ангидридов), поли (депсипептидов), поли (сложных эфиров), поли (молочной кислоты), сополимера молочной и гликолевой кислот или PLGA, поли (b-гидроксибутирата), поли (капролактона), поли (диоксанона); поли (этиленгликоля), поли (гидроксипропил) метакриламида, поли [(органо)фосфацепа], поли (сложных ортоэфиров), поли (винилового спирта), поли (винилпирролидона), сополимеров малеипового ангидрида и алкилвинилового эфира, полиолов плуроников, альбумина, альгината, целлюлозы и производных целлюлозы, коллагена, фибрина, желатина, гиалуроновой кислоты, олигосахаридов, гликаминогликанов, сульфатированных полисахаридов, их смесей и сополимеров. Предпочтительно ингредиент выбран из группы, состоящей из альбумина, сахарозы, трегалозы, лактита, желатина, гидроксипропил-β-циклодекетрина, метоксиполиэтиленгликоля и полиэтиленгликоля. В другом варианте реализации изобретения предложен способ лечения млекопитающего, включающий стадию введения млекопитающему эффективного количества композиции, описанной выше.
[0088] В настоящем изобретении также предложена фармацевтическая композиция, содержащая связывающий белок, описанный выше, и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемые носители, включают, в том числе, фосфатный буфер или солевой раствор. Другие общепринятые носители для парентеральных препаратов включают растворы фосфата натрия, раствор Рингера с декстрозой, декстрозу и хлорид натрия, раствор Рингера с лактатом, или жирные масла. Носители для внутривенных препаратов включают жидкость и добавки питательных веществ, добавки электролитов, такие как лежащие в основе раствора Рингера с декстрозой, и тому подобное. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, такие как, например, противомикробные вещества, антиоксиданты, хелатирующие вещества и инертные газы и тому подобное. Конкретнее, фармацевтические композиции, подходящие для инъекционного применения, включают стерильные водные растворы (если водорастворимые) или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий непосредственно перед употреблением. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, многоатомный спирт (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и тому подобное) и их подходящие смеси. В некоторых случаях в композицию предпочтительно включить изотонические вещества, например, сахара, полиспирты, такие как маннитол, сорбитол или хлорид натрия. Пролонгированное всасывание инъекционных композиций может обеспечиваться за счет включения в композицию средства, которое задерживает всасывание, например, моностеарат алюминия и желатин.
[0089] В дополнительном варианте реализации изобретения фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство для лечения нарушения. В одном варианте реализации изобретения дополнительное средство выбрано из группы, состоящей из: терапевтических средств, средств для визуализации, цитотоксического средства, ингибиторов ангиогенеза (включая, в том числе, антитела к VEGF антитела или белок-ловушка для VEGF); ингибиторов киназ (включая, в том числе, ингибиторы KDR и TIE-2); блокаторов костимулирующих молекул (включая, в том числе, антитела к В7.1, В7.2, CTLA4-Ig, PD-1, CD20); блокаторов молекул адгезии (включая, в том числе, Ат к LFA-1, Ат к E/L селектину, низкомолекулярные ингибиторы); антитела к цитокину или его функциональных фрагментов (включая, в том числе, антитела к ИЛ-18, ФНО, антитела к рецептору цитокина ИЛ-6); метотрексата; циклоспорина; рапамицина; FK506; детектируемой метки или репортера; антагониста ФНО; противоревматического средства; миорелаксанта, наркотического средства, нестероидного противовоспалительного лекарственного средства (NSAID), аналгезирующего средства, анестезирующего средства, седативного средства, местного анестезирующего средства, нервно-мышечного блокатора, противомикробного агента, антипсориатического средства, кортикостероида, анаболического стероида, эритропоэтина, иммунизации, иммуноглобулина, иммунодепрессанта, гормона роста, гормонзаместительного лекарственного средства, радиофармацевтического средства, антидепрессанта, антипсихотического средства, стимулятора, противоастматического средства, бета-агониста, ингалируемого стероида, эпинефрина или его аналога, цитокина и антагониста цитокина.
[0090] В другом аспекте в настоящем изобретении предложен способ лечения субъекта, страдающего нарушением, причиняемым мишенью(-ями), которая(-ые) может(-гут) связываться с вышеописанным белком, оказывают негативное влияние, предусматривающий введение этому субъекту описанного выше связывающего белка таким образом, чтобы ингибировать активность мишени или мишеней у субъекта и вылечить или предотвратить нарушение. В одном варианте реализации изобретения заболевание или нарушение представляет собой воспалительное заболевание, аутоиммунное заболевание или злокачественное новообразование. В одном варианте реализации изобретения заболевание или нарушение выбрано из группы, состоящей из артрита, остеоартрита, хронического ювенильного артрита, септического артрита, артрита Лайма, псориатического артрита, реактивного артрита, спондилоартропатии, системной красной волчанки, болезни Крона, язвенного колита, воспалительного заболевания кишечника, инсулинозависимого сахарного диабета, тирсоидита, астмы, аллергических заболеваний, псориаза, дерматита, склеродермии, болезни трансплантат против хозяина, отторжения трансплантатов органов, острого или хронического иммунного заболевания, ассоциированного с трансплантацией органов, саркоидоза, атеросклероза, диссеминированного внутрисосудистого свертывания, болезни Кавасаки, болезни Грейвса, нефротического синдрома, синдрома хронической усталости, гранулематоза Вегенера, пурпуры Геноха-Шенлейна, микроскопического васкулита почек, хронического активного гепатита, увеита, септического шока, синдрома токсического шока, синдрома сепсиса, кахексии, инфекционных заболеваний, паразитарных заболеваний, синдрома приобретенного иммунодефицита, острого поперечного миелита, хореи Гентингтона, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, инсульта, первичного билиарного цирроза, гемолитической анемии, злокачественных заболеваний, сердечной недостаточности, инфаркта миокарда, болезни Аддисона, спорадической плюригландулярной недостаточности типа I и плюригландулярной недостаточности типа II, синдрома Шмидта, (острого) респираторного дистресс-синдрома взрослых, алопеции, гнездной (очаговой) алопеции, сероотрицательной артропатии, артропатии, болезни Рейтера, псориатической артропатии, артропатии язвенного колита, энтеропатического синовита, ассоциированной с Chlamydia, Yersinia и Salmonella артропатии, спондилоартропатии, атероматозного заболевания/артериосклероза, агонической аллергии, аутоиммунного буллезного заболевания, пузырчатки обыкновенной, листовидной пузырчатки, немфигоида, линейного IgA-заболевания, аутоиммунной гемолитической анемии, положительной гемолитической анемии Кумбса, приобретенной пернициозной анемии, ювенильной пернициозной анемии, миалгического энцефалита/британского миалгического энцефалита, хронического кожно-слизистого кандидоза, гигантоклеточного артериита, первичного склерозирующего гепатита, криптогенного аутоиммунного гепатита, синдрома приобретенного иммунодефицита, заболеваний, родственных приобретенному иммунодефициту, гепатита В, гепатита С, общего транзиторного иммунодефицита (общей транзиторной гипогаммаглобулинемии), дилатационной кардиомиопатии, женского бесплодия, угасания функции яичников, преждевременного угасания функции яичников, фибротического заболевания легких, криптогенного фиброзирующего альвеолита, послевоспалительного интерстициального заболевания легких, интерстициального пневмонита, ассоциированной с болезнью соединительной ткани интерстициальной болезни легких, ассоциированной с болезнью смешанной соединительной ткани болезни легких, ассоциированной с системным склерозом интерстициальной болезни легких, ассоциированной с ревматоидным артритом интерстициальной болезни легких, ассоциированной с системной красной волчанкой болезни легких, ассоциированной с дерматомиозитом/полимиозитом болезни легких, ассоциированной с болезнью Шегрена болезни легких, ассоциированной с анкилозирующим спондилитом болезни легких, васкулитной диффузной болезни легких, ассоциированной с гемосидерозом болезни легких, индуцированной лекарственным средством интерстициальной болезни легких, фиброза, лучевого фиброза, облитерирующего бронхиолита, хронической эозинофильной пневмонии, лимфоцитарного инфильтративного заболевания легких, постинфекционного интерстициального заболевания легких, подагрического артрита, аутоиммунного гепатита, аутоиммунного гепатита типа-1 (классического аутоиммунного или люноидного гепатита), аутоиммунного гепатита типа-2 (гепатита с антителами к LKM), аутоиммунно опосредованной гипогликемии, инсулинорезистентности типа В с папиллярно-пигментной дистрофией кожи (acanthosis nigricans), гипопарат иреоза, острого иммунного заболевания, ассоциированного с трансплантацией органа, хронического иммунного заболевания, ассоциированного с трансплантацией органа, остеоартроза, первичного склерозируюшего холангита, псориаза типа 1, псориаза типа 2, идиопатической лейкопении, аутоиммунной нейтропении, почечного заболевания NOS (БДУ), гломерулонефрита, микроскопического васкулита почек, болезни Лайма, дискоидной красной волчанки, мужского бесплодия идиопатического или NOS (БДУ), аутоиммуниости спермы, множественного склероза (всех подтипов), симпатической офтальмии, легочной гипертензии, вторичной относительно заболевания соединительной ткани, синдрома Гудпасчера, легочной манифестации нодозного полиартериита, острой ревматической лихорадки, ревматоидного спондилита, болезни Сгилла, системного склероза, синдрома Шегрена, болезни Такаясу/артериита, аутоиммунной тромбоцитопении, идиопатической тромбоцитопении, аутоиммунного заболевания щитовидной железы, гипертиреоза, зобного аутоиммунного гипотиреоза (болезни Хашимото), атрофического аутоиммунного гипотиреоза, первичной микседемы, факогенного увеита, первичного васкулита, витилиго, острого заболевания печени, хронического заболевания печени, алкогольного цирроза, индуцированного алкоголем повреждения печени, холестаза, идиосинкратической болезни печени, индуцированного лекарственным средством гепатита, неалкогольного стеатогепатита, аллергии и астмы, стрептококковой инфекции группы В (GBS), психических нарушений (например, депрессии и шизофрении), Th типа 2- и Th типа 1-опосредованных заболеваний, острой и хронической боли (различных форм боли) и раковых заболеваний, таких как рак легкого, молочной железы, желудка, мочевого пузыря, ободочной кишки, поджелудочной железы, яичников, предстательной железы и прямой кишки, и гемопоэтических злокачественных заболеваний (лейкоза и лимфомы), абеталипопротеинемии, акроцианоза, острых и хронических паразитарных или инфекционных процессов, острого лейкоза, острого лимфобластного лейкоза (ALL), острого миелоидного лейкоза (AML), острой или хронической бактериальной инфекции, острого панкреатита, острой почечной недостаточности, аденокарцином, предсердных эктопических систол, комплекса СПИД-деменция, индуцированного алкоголем гепатита, аллергического конъюнктивита, аллергического контактного дерматита, аллергического ринита, отторжения аллотрансплантата, недостаточности альфа-1-антитрипсина, амиотрофического бокового склероза, анемии, стенокардии, дегенерации клеток переднего рога спинного мозга, терапии антителами к cd3, антифосфолипидного синдрома, аллергических реакций на противорецепторные антитела, аневризмы аорты и периферических сосудов, рассечения аорты, артериальной гипертензии, артериосклероза, атриовентрикулярной фистулы, атаксии, предсердной фибрилляции (стойкой или пароксизмальной), трепетания предсердий, атриовентрикулярной блокады, В-клеточной лимфомы, отторжения костного трансплантата, отторжения трансплантата костного мозга (ВМТ), межжелудочковой блокады, лимфомы Беркитта, ожогов, сердечных аритмий, синдрома временной остановки сердца, опухолей сердца, кардиомиопатии, воспалительной реакции при искусственном кровообращении, отторжения трансплантата хряща, церебеллярных кортикальных дегенерации, церебеллярных нарушений, хаотической или мультиочаговой предсердной тахикардии, ассоциированных с химиотерапией нарушений, хронического миелоцитарного лейкоза (CML), хронического алкоголизма, хронических воспалительных патологий, хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), хронической обструктивной болезни легких (COPD), хронической интоксикации салицилатом, рака ободочной кишки, застойной сердечной недостаточности, конъюнктивита, контактного дерматита, легочного сердца, болезни коронарных артерий, болезни Крейтцфельдта-Якоба, отрицательного в культуре сепсиса, муковисцидоза, ассоциированных с терапией цитокинами нарушений, боксерской деменции, демиелинизирующих заболеваний, геморрагической лихорадки Денге, дерматита, дерматологических состояний, диабета, сахарного диабета, диабетического артериосклеротического заболевания, заболевания с диффузными тельцами Леви, дилатационной застойной кардиомиопатии, нарушений базальных (подкорковых) ядер головного мозга, синдрома Дауна в среднем возрасте, индуцированных лекарственными средствами нарушений движения, нарушений, индуцированных лекарственными средствами, которые блокируют рецепторы допамина ЦНС, чувствительности к лекарственным средствам, экземы, энцефаломиелита, эндокардита, эндокринопатии, эпиглоттита, инфекции вирусом Эпштейна-Барр, эритромелалгии, экстрапирамидных и церебеллярных нарушений, семейного гематофагоцитарного лимфоцитарного гистиоцитоза, отторжения имплантата фетальной вилочковой железы, атаксии Фридрейха, функциональных периферических артериальных нарушений, грибкового сепсиса, газовой (анаэробной) гангрены, язвы желудка, гломерулонефрита, отторжения трансплантата любого органа или любой ткани, грамотрицательного сепсиса, грамположительного сепсиса, гранулем, вызываемых внутриклеточными организмами, лейкемического ретикулоэндотелиоза, болезни Халлеррордена-Шнатца, тиреоидита Хашимото, сенной лихорадки, отторжения трансплантата сердца, гемохроматоза, гемодиализа, гемолитического уремического синдрома/тромболитической тромбоцитопенической пурпуры, кровотечения, гепатита (А), аритмии пучка Гиса, ВИЧ-инфекции/ВИЧ-невропатии, болезни Ходжкина, гиперкинетических нарушений движения, аллергических реакций, аллергического пневмонита, гипертензии, гипокинетических нарушений движения, диагностики системы гипоталамус-гипофиз-надпочечники, идиопатической болезни Аддисона, идиопатического легочного фиброза, опосредованной антителами цитотоксичности, астении, детской спинально-мышечной атрофии, воспаления аорты, гриппа А, воздействия ионизирующей радиацией, иридоциклита/увеита/неврита зрительного нерва, ишемического/реперфузионного повреждения, ишемического инсульта, ювенильного ревматоидного артрита, ювенилыюй спинально-мышечной атрофии, саркомы Капоши, отторжения трансплантата почки, инфекций микобактерией Legionella, лейшманиоза, проказы, повреждений кортикоспинальной системы, жирового отека, отторжения трансплантата печени, лимфатического отека, малярии, злокачественной лимфомы, злокачественного гистиоцитоза, злокачественной меланомы, менингита, менингококкемии, метаболической/идиопатической, кластерной головной боли, митохондриального мультисистемного нарушения, заболевания смешанной соединительной ткани, моноклональной гаммопатип, множественной миеломы, дегенерации множественных систем (Mencel Dejcrine-Thomas Shi-Drager и Machado-Joseph), тяжелой псевдопаралитической миастении, Mycobacterium avium intracellulare, туберкулезной бациллы, синдрома мислодисплазии, инфаркта миокарда, ишемических нарушений миокарда, рака носоглотки, хронического заболевания легких новорожденных, нефрита, нефроза, нейродегенеративпых заболеваний, пейрогенных I мышечных атрофии, нейрогенной лихорадки, неходжкинской лимфомы, закупорки брюшной аорты и ее ответвлений, окклюзивных артериальных нарушений, okt3-терапии, орхита/эпидидимита, процедур после лечения орхита/вазэктомии, органомегалии, остеопороза, отторжения трансплантата поджелудочной железы, рака поджелудочной железы, паранеопластического синдрома/гиперкальциемии при злокачественных заболеваниях, отторжения трансплантата паращитовидной железы, воспалительного заболевания почечных лоханок, круглогодичного ринита, заболевания перикарда, периферического атеросклеротического заболевания, периферических васкулярных нарушений, перитонита, пернициозной анемии, пневмонии, вызываемой Pneumocystis carinii, пневмонии, синдрома POEMS (полиневропатии, органомегалии, зндокринопатии, моноклональной гаммопатии и синдрома изменений кожи), постперфузионного синдрома, постгемодиализного синдрома, синдрома пост-MI-кардиотомии, пре-эклампсии, прогрессирующего супрануклеарного паралича, первичной легочной гипертензии, лучевой терапии, феномена и болезни Рейно, болезни Рейно, болезни Рефсума, тахикардии с регулярными узкими QRS, рсноваскулярной (почечно-сосудистой) гипертензии, реперфузионного повреждения, рестриктивной кардиомиопатии, сарком, склеродермии, сенильной хореи, сепильной деменции, ассоциированной с тельцами Леви, сероотрицательных артропатий, шока, серповидно-клеточной анемии, отторжения аллотрансплантата кожи, синдрома изменений кожи, отторжения трансплантата тонкой кишки, солидных опухолей, специфических аритмий, спинальной атаксии, спинально-церебеллярных дегенерации, стрептококкового миозита, структурных повреждений мозжечка, подострого склерозирующего панэнцефалита, обморока (синкопе), сердечно-сосудистого сифилиса, системной анафилаксии, синдрома системной воспалительной реакции, системного ювенильного ревматоидного артрита, Т-клеточного или FAB ALL (острого лимфобластного лейкоза), телангиэктазии, облитерирующего тромбоангиита, тромбоцитопении, токсичности, трансплантатов, травмы/кровотечения, аллергических реакций типа III, аллергии типа IV, нестабильной стенокардии, уремии, уросепсиса, крапивницы, вальвулярных сердечных заболеваний, варикозных вен, васкулита, венозных заболеваний, венозного тромбоза, фибрилляции (мерцания) желудочков, вирусных и грибковых инфекций, острого энцефалита с высоким риском смертельного исхода/асептического менингита, гемафагоцитарного синдрома, ассоциированного с высоким риском смертельного исхода, синдрома Вернике-Корсакова, заболевания Вильсона, отторжения ксенотрансплантата любого органа или любой ткани.
[0091] В другом аспекте настоящего изобретение предложен способ лечения пациента, страдающего от нарушения, предусматривающий стадию введения любого из описанных выше связывающих белков, до, одновременно, или после введения второго средства, как обсуждалось выше. В предпочтительном варианте настоящего изобретения второе средство выбрано из группы, состоящей из буденозида, эпидермального фактора роста, кортикостероидов, циклоспорина, сульфасалазина, аминосалицилатов, 6-меркаптопурина, азатиоприна, метронидазола, ингибиторов липоксигеназы, месаламина, олсалазина, балсалазида, антиоксидантов, ингибиторов тромбоксана, антагонистов рецептора ИЛ-1, моноклональных антител к ИЛ-1β, моиоклональных антител к ИЛ-6, факторов роста, ингибиторов эластазы, пиридинилимидазольных соединений, антител или агонистов TNF, LT, ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-12, ИЛ-13, ИЛ-15, ИЛ-16, ИЛ-18, ИЛ-23, ЕМАР-II, GM-CSF, FGF и PDGF, антител CD2, CD3, CD4, CD8, CD-19, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 или их лигандов, метотрексата, циклоспорина, FK506, рапамицина, микофенолята мофетила, лефлуномида, NSAID, ибупрофена, кортикостероидов, преднизолона, ингибиторов фосфодиэстеразы, агонистов аденозина, антитромботических агентов, ингибиторов комплемента, адренергических агентов, IRAK, NIK, IKK, р38, ингибиторов МАР-киназы, ингибиторов ИЛ-1β-превращающего фермента, ингибиторов TNFα-превращающего фермента, ингибиторов передачи сигнала Т-клеток, ингибиторов металлопротсиназы, сульфасалазина, азатиоприна, 6-меркаптопуринов, ингибиторов ангиотензин-превращающего фермента, растворимых рецепторов цитокинов, растворимого рецептора TNF р55, растворимого рецептора TNF р75, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, противовоспалительных цитокинов, ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-11, ИЛ-13 и TGFβ.
[0092] В одном варианте реализации изобретения фармацевтические композиции, описанные выше, вводят субъекту по меньшей мере одним способом, выбранным из парентерального, подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрисуставного, внутрибронхиального, внутрибрюшного, интракапсулярного, внутрихрящевого, внутриполостного, внутриклеточного, интрацеребеллярного, интрацеребровентрикулярного, внутрикишечного, интрацервикального, внутрижелудочного, внутрипеченочного, интрамиокардиального, внутрикостного, внутритазового, интраперикардиального, внутрибрюшинного, внутриплеврального, внутрипростатического, внутрилегочного, интраректального, интраренального, интраретинального, интраспинального, интрасиновиального, внутригрудного, внутриматочного, интравезикулярного, болюсного, вагинального, ректального, буккального, сублингвального, интраназального и трансдермального способов.
[0093] В одном аспекте настоящего изобретения предложено по меньшей мере одно антиидиотипическое антитело по меньшей мере для одного связывающего белка настоящего изобретения. Это антиидиотипическое антитело включает в себя любую содержащую белок или пептид молекулу, которая содержит по меньшей мере часть молекулы иммуноглобулина, такую как, без ограничения, по меньшей мере один определяющий комплементарность участок (CDR) тяжелой или легкой цепи или его связывающую лиганд часть, вариабельный район тяжелой цепи или легкой цепи, константный район тяжелой цепи или легкой цепи, каркасный район или любую их часть, которые могут быть включены в связывающий белок по настоящему изобретению.
[0094] В другом варианте реализации изобретения связывающие белки настоящего изобретение способны связывать одну или более мишеней, выбранных из группы, состоящей из ABCF1; ACVR1; ACVR1B; ACVR2; ACVR2B; ACVRL1; ADORA2A; аггрекан; AGR2; AICDA; AIF1; AIG1; AKAP1; AKAP2; АМН; AMHR2; ANGPT1; ANGPT2; ANGPTL3; ANGPTL4; ANPEP; АРС; АРОС1; AR; AZGP1 (цинк-а-гликопротеин); В7.1; В7.2; BAD; BAFF; BAG1; ВАТ1; BCL2; BCL6; BDNF; BLNK; BLR1 (MDR15); BlyS; ВМР1; ВМР2; ВМР3В (GDF10); ВМР4; ВМР6; ВМР8; BMPR1A; BMPR1B; BMPR2; BPAG1 (плектин); BRCA1; C19orf10 (IL27w); С3; С4А; С5; C5R1; CANT1; CASP1; CASP4; CAV1; ССВР2 (D6 / JAB61); CCL1 (1-309); CCL11 (эотаксин); CCL13 (МСР-4); CCL15 (MIP-1d); CCL16 (НСС-4); CCL17 (TARC); CCL18 (PARC); CCL19 (MIP-3b); CCL2 (МСР-1); MCAF; CCL20 (MIP-3а); CCL21 (MIP-2); SLC; эксодуса-2; CCL22 (MDC / STC-1); CCL23 (MPIF-1); CCL24 (MPIF-2 / эотаксин -2); CCL25 (TECK); CCL26 (эотаксин-3); CCL27 (CTACK / ILC); CCL28; CCL3 (MIP-1a); CCL4 (MP-1b); CCL5 (RANTES); CCL7 (MCP-3); CCL8 (mcp-2); CCNA1; CCNA2; CCND1; CCNE1; CCNE2; CCR1 (CKR1 / HM145); CCR2 (mcp-1RB / RA);CCR3 (CKR3 / CMKBR3); CCR4; CCR5 (CMKBR5 / ChemR13); CCR6 (CMKBR6 / CKR-L3 / STRL22 / DRY6); CCR7 (CKR7 / EBI1); CCR8 (CMKBR8 / TER1 / CKR-L1); CCR9 (GPR-9-6); CCRL1 (VSHK1); CCRL2 (L-CCR); CD164; CD19; CD1C; CD20; CD200; CD-22; CD24; CD28; CD3; CD37; CD38; CD3E; CD3G; CD3Z; CD4; CD40; CD40L; CD44; CD45RB; CD47, CD48, CD52; CD69; CD70, CD72; CD74; CD79A; CD79B; CD8; CD80; CD81; CD83; CD86; CD137, CD138, B7-1, B7-2, ICOSL, B7-H3, B7-H4, CD137L, OX40L, CDH1 (Е-кадгерин); CDH10; CDH12; CDH13; CDH18; CDH19; CDH20; CDH5; CDH7; CDH8; CDH9; CDK2; CDK3; CDK4; CDK5; CDK6; CDK7; CDK9; CDKN1A (p21Wap1/Cip1); CDKN1B (p27Kip1); CDKN1C; CDKN2A (pl6INK4a); CDKN2B; CDKN2C; CDKN3; CEBPB; CER1; CHGA; CHGB; хитиназы; CHST10; CKLFSF2; CKLFSF3; CKLFSF4; CKLFSF5; CKLFSF6; CKLFSF7; CKLFSF8; CLDN3; CLDN7 (клаудин-7); CLN3; CLU (кластерин); CMKLR1; CMKOR1 (RDC1); CNR1; COL18A1; COL1A1; COL4A3; COL6A1; CR2; CRP; CSF1 (M-CSF); CSF2 (GM-CSF); CSF3 (GCSF); CTLA-4; CTNNB1 (b-катенин); CTSB (катепсин В); CX3CL1 (SCYD1); CX3CR1 (V28); CXCL1 (GRO1); CXCL10 (IP-10); CXCL11 (1-TAC / 1P-9); CXCL12 (SDF1); CXCL13; CXCL14; CXCL16; CXCL2 (GRO2); CXCL3 (GRO3); CXCL5 (ENA-78 / LIX); CXCL6 (GCP-2); CXCL9 (MIG); CXCR3 (GPR9/CKR-L2); CXCR4; CXCR6 (TYMSTR /STRL33 / Bonzo); CYB5; CYC1; CYSLTR1; DAB21P; DES; DKFZp451J0118; DNCL1; DPP4; E2F1; ECGF1; EDG1; EFNA1; EFNA3; EFNB2; EGF; EGFR; ELAC2; ENG; ENO1; ENO2; ENO3; EPHB4; EPO; ERBB2 (Her-2); EREG; ERK8; ESR1; ESR2; F3 (TF); FADD; FasL; FASN; FCER1A; FCER2; FCGR3A; FGF; FGF1 (aFGF); FGF10; FGF11; FGF12; FGF12B; FGF13; FGF 14; FGF 16; FGF 17; FGF 18; FGF 19; FGF2 (bFGF); FGF20; FGF21; FGF22; FGF23; FGF3 (int-2); FGF4 (HST); FGF5; FGF6 (HST-2); FGF7 (KGF); FGF8; FGF9; FGFR3; F1GF (VEGFD); FTL1 (EPS1LON); FTL1 (ZETA); FLJ12584; FLJ25530; FLRT1 (фибронектин); FLT1; FOS; FOSL1 (FRA-1); FY (DARC); GABRP (GABAa); GAGEB1; GAGEC1; GALNAC4S-6ST; GAT A3; GDF5; GFI1; GGT1; GM-CSF; GNAS1; GNRH1; GPR2 (CCR10); GPR31; GPR44; GPR81 (FKSG80); GRCC10 (C10); GRP; GSN (гелсолин); GSTP1; HAVCR2; HDAC4; HDAC5; HDAC7A; HDAC9; HGF; HIF1A; HIP1; гистамина и рецепторов гистамина; HLA-A; HLA-DRA; HM74; HMOX1; HUMCYT2A; ICEBERG; ICOSL; ID2; IFN-α; IFNA1; IFNA2; IFNA4; IFNA5; IFNA6; IFNA7; IFNB1; IFNгaмма; IFNW1; IGBP1; IGF1; IGF1R; IGF2; IGFBP2; IGFBP3; IGFBP6; ИЛ-1; IL10; IL10RA; IL10RB; IL11; IL11RA; ИЛ-12; IL12A; IL12B; IL12RB1; IL12RB2; 1L13; IL13RA1; IL13RA2; IL14; 1L15; IL15RA; IL16; ИЛ-17; ИЛ-17 В; ИЛ-17С; RH-17R; IL18; IL18BP; IL18R1; IL18RAP; 1L19; ILIA; IL1B; IL1F10; IL1F5; IL1F6; IL1F7; IL1F8; IL1F9; IL1HY1; IL1RI; IL1R2; IL1RAP; IL1RAPL1; IL1RAPL2; IL1RL1; IL1RL2 IL1RN; IL2; IL20; IL20RA; IL21R; IL22; IL22R; IL22RA2; IL23; IL24; IL25; IL26; IL27; IL28A; IL28B; IL29; IL2RA; IL2RB; IL2RG; IL3; IL30; IL3RA; IL4; IL4R; IL5; IL5RA; IL6; IL6R; IL6ST (гликопротеин 130); IL7; IL7R; IL8; IL8RA; IL8RB; IL8RB; IL9; IL9R; ILK; INHA; INHBA; INSL3; INSL4; IRAK1; IRAK2; ITGA1; ITGA2; ITGA3; ITGA6 (интегрин а6); TTGAV; ITGB3; TTGB4 (интегрин b4); JAG1; JAK1; JAK3; JUN; K6HF; KAI1; KDR; KTTLG; KLF5 (GC Box BP); KLF6; KLK10; KLK12; KLK13; KLK14; KLK15; KLK3; KLK4; KLK5; KLK6; KLK9; KRT1; KRT19 (кератин 19); KRT2A; KRTHB6 (специфический для волос кератин типа 11); LAMA5; LEP (лептин); Lingo-p75; Lingo-Troy; LPS; LTA (ФНО-b); LTB; LTB4R (GPR16); LTB4R2; LTBR; MACMARCKS; MAG или Omgp; MAP2K7 (c-Jun); MDK; MIB1; мидкин; MIF; MIP-2; MKI67 (Ki-67); MMP2; MMP9; MS4A1; MSMB; MT3 (металлотиоиектин-III); MTSS1; MUC1 (муцин); MYC; MYD88; NCK2; нейрокапа; NFKB1; NFKB2; NGFB (NGF); NGFR; NgR-Lingo; NgR-Nogo66 (Nogo); NgR-p75; NgR-Troy; NME1 (NM23A); NOX5; NPPB; NR0B1; NR0B2; NR1D1; NR1D2; NR1H2; NR1H3; NR1H4; NR1I2; NR1I3; NR2C1; NR2C2; NR2E1; NR2E3; NR2F1; NR2F2; NR2F6; NR3C1; NR3C2; NR4A1; NR4A2; NR4A3; NR5A1; NR5A2; NR6A1; NRP1; NRP2; NT5E; NTN4; ODZ1; OPRD1; PCSK9; P2RX7; PAP; PARTI; PATE; PAWR; PCA3; PCNA; PD-I; PD-L1; alpha4beta7, OX40, GITR, TIM-3, Lag-3, B7-H3, B7-H4, GDF8, CGRP, Lingo-1, Фактор IXa, Фактор X, ICOS, GARP, BTLA, CD160, ROR1, 2B4, KIR, CD27, OX40, CD40L, A2aR, PDGFA; PDGFB; PECAM1; PF4 (CXCL4); PGF; PGR; фосфокана; PIAS2; PIK3CG; PLAU (uPA); PLG; PLXDC1; PPBP (CXCL7); PPID; PR1; PRKCQ; PRKD1; PRL; PROC; PROK2; PSAP; PSCA; PTAFR; PTEN; PTGS2 (COX-2); PTN; RAC2 (P21Rac2); RARB; RGS1; RGS13; RGS3; RNF110 (ZNF144); ROB02; S100A2; SCGB1D2 (липофилин В); SCGB2A1 (маммаглобин 2); SCGB2A2 (маммаглобин 1); SCYE1 (эндотелиальный моноцит-активирующий цитокин); SDF2; SERPINA1; SERPINA3; SERPINB5 (маспин); SERPINE1 (PAI-1); SERPINF1; SHBG; SLA2; SLC2A2; SLC33A1; SLC43A1; SLIT2; SPP1; SPRR1B (Spr1); ST6GAL1; STAB 1; STAT6; STEAP; STEAP2; TB4R2; ТВХ21; TCP 10; TDGF1; ТЕК; TGFA; TGFB1; TGFB1I1; TGFB2; TGFB3; TGFBI; TGFBR1; TGFBR2; TGFBR3; TH1L; THBS1 (тромбоспондин-1); THBS2; THBS4; THPO; TIE (Tie-1); TIMP3; фактор тканевой; TLR10; TLR2; TLR3; TLR4; TLR5; TLR6; TLR7; TLR8; TLR9; TNF; TNF-α; TNFAIP2 (B94); TNFAIP3; TNFRSF11A; TNFRSF1A; TNFRSF1B; TNFRSF21; TNFRSF5; TNFRSF6 (Fas); TNFRSF7; TNFRSF8; TNFRSF9; TNFSF10 (TRAIL); TNFSF11 (TRANCE); TNFSF12 (AP03L); TNFSF13 (April); TNFSF13B; TNFSF14 (HVEM-L); TNFSF15 (VEGI); TNFSF18; TNFSF4 (лиганд OX40); TNFSF5 (лиганд CD40); TNFSF6 (FasL); TNFSF7 (лиганд CD27); TNFSF8 (лиганд CD30); TNFSF9 (лиганд 4-1ВВ); TOLLIP; Toll-подобных рецепторов; TOP2A (топоизомераза Iia); ТР53; ТРМ1; ТРМ2; TRADD; TRAF1; TRAF2; TRAF3; TRAF4; TRAF5; TRAF6; TREM1; TREM2; TRPC6; TSLP; TWEAK; VEGF; VEGFB; VEGFC; всрсикана; VHL C5; VLA-4; XCL1 (лимфотактин); XCL2 (SCM-1b); XCR1 (GPR5 / CCXCR1); YY1; и ZFPM2.
3
14
35
90
99
111
125
131
177
166
153
[0095] Учитывая способность связывающих белков к связыванию с двумя или более антигенами, связывающие белки по настоящему изобретению могут быть использованы для детекции антигенов (например, в биологическом образце, таком как сыворотка или плазма крови) с помощью стандартного иммуноанализа, такого как твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), радиоиммуиоанализ (РИА) или иммуногистохимия ткани. FIT-Ig прямо или опосредованно метят детектируемым веществом для облегчения детекции связанного или несвязанного антитела. Подходящие детектируемые вещества включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные вещества, люминесцентные вещества и радиоактивные вещества. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, [3-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных веществ включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламин-флуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин; пример люминесцентного вещества включает люминол; и примеры подходящего радиоактивного вещества включают Н, С, S, Y, Тс, In, I, I, Lu, Но или Sm.
[0096] Связывающие белки по настоящему изобретению в одном варианте реализации изобретения способны нейтрализовать активность антигенов как in vitro, так и in vivo. Таким образом, такие FIT-Ig могут быть использованы для ингибирования активности антигенов, например, в клеточной культуре, содержащей эти антигены, у субъектов-людей или у других субъектов-млекопитающих, имеющих антигены, с которыми перекрестно реагирует связывающий белок по настоящему изобретению. В другом варианте реализации в настоящем изобретении предложен способ уменьшения активности антигена у субъекта, страдающего заболеванием или нарушением, обусловленным негативным воздействием этого антигена. Связывающий белок по настоящему изобретению можно вводить субъекту-человеку для терапевтических целей.
[0097] Используемый в данном документе термин «нарушение, при котором активность антигена оказывает негативное влияние», включая заболевания и другие нарушения, при которых конкретного антигена у субъекта, страдающего от этого нарушения, является, как было показано, ответственным, или ожидается, что оно либо является ответственным за патофизиологию этого нарушения, либо является фактором, который способствует ухудшение этого нарушения. Соответственно, нарушение, при котором активность антигена является вредной, представляет собой нарушение, при котором, как ожидается, уменьшение активности антигена будет ослаблять симптомы и/или прогрессирование этого нарушения. Такие нарушения могут быть обнаружены, например, по увеличению концентрации антигена в биологической жидкости субъекта, страдающего от этого нарушения (например, по увеличению концентрации антигена в сыворотке, плазме, синовиальной жидкости, и т.д. субъекта). Неограничивающие примеры нарушений, которые можно лечить связывающими белками по настоящему изобретению, включают эти нарушения, рассмотренные ниже и в разделе, относящемся к фармацевтическим композициям антител по настоящему изобретению.
[0098] FIT-Ig по настоящему изобретению могут связывать один антиген или множество антигенов. Такие антигены включают, в том числе, мишени, перечисленные в следующих базах данных, которые включены в данный документ посредством ссылки. Эти целевые базы данных включают в том числе следующие перечни:
• Терапевтические мишени (http://xin.cz3.nus.edu.sg/group/cjttd/ttd.asp);
• Цитокины и рецепторы цитокинов (http://www.cytokinewebfacts.com/, http://www.copewithcytokin.de/cope.cgi и
• http://cmbi.bjmu.edu.cn/cmbidata/cgf/CGF_Database/cytokine.medic.kumaraoto-u.ac.jp/CFC/indexR.html);
• Хемокины (http://cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/CFC/CK/Chemokine.html);
• Рецепторы хемокинов и GPCR (http://csp.medic.kumamoto-u.ac.jp/CSP/Receptor.html, http://www.gpcr.org/7tm/);
• Обонятельные рецепторы (http://senselab.med.yale.edu/senselab/ORDB/default.asp);
• Рецепторы (http://www.iuphar-db.org/iuphar-rd/list/index.htm);
• Мишени, ассоциированные со злокачественными опухолями (http://cged.hgc.jp/cgi-bin/input.cgi);
• Секретируемые белки как потенциальные мишени антител (http://spd.cbi.pku.edu.cn/);
• Протеинкиназы (http://spd.cbi.pku.edu.cn/) и
• Маркеры CD человека (http://content.labvelocity.com/tools/6/1226/CD_table_final_locked.pdf) и (Zola Н, 2005 CD molecules 2005: human cell differentiation molecules Blood, 106:3123-6).
[0099] FIT-Ig применимы в качестве терапевтических средств для одновременной блокировки двух разных мишеней для усиления эффективности/безопасности и/или расширения охвата пациентов. Такие мишени могут включать растворимые мишени (ИЛ-13 и ФНО) и мишени-рецепторы клеточной поверхности (VEGFR и EGFR). Можно также использовать индукцию изменения направления цитотоксичности между опухолевыми клетками и Т-клетками (Her2 и CD3) для раковой терапии или между аутореактивной клеткой и эффекторными клетками для аутоиммунитета/трансплантации, или между любой клеткой-мишенью и эффекторной клеткой для элиминации индуцирующих заболевание клеток при любом конкретном заболевании.
[00100] В дополнение к этому, FIT-Ig может быть использован для запуска кластеризации и активации рецепторов, когда он сконструирован с возможностью направленного связывания двух различных эпитопов на одном и том же рецепторе. Это может быть выгодным при получении агонистических и антагонистических терапевтических средств, специфичных по отношению к GPCR. В этом случае FIT-Ig может быть использован для направленного связывания двух различных эпитопов па одной клетке для кластеризации/передачи сигнала (две молекулы клеточной поверхности) или передачи сигнала (на одной молекуле). Аналогично, молекула FIT-Ig может быть сконструирована таким образом, чтобы инициировать связывание рецептора CTLA-4 и отрицательный сигнал путем направленного взаимодействия с двумя различными эпигонами (или 2 копиями одного и того же эпигона) внеклеточного домена CTLA-4, следствием чего является подавление иммунного ответа. CTLA-4 является клинически валидированной мишенью для терапевтического лечения ряда иммунологических нарушений. Взаимодействия CTLA-4/B7 негативно регулируют активацию Т-клеток аттенуацией прогрессирования клеточного цикла, продуцирования ИЛ-2 и пролиферации Т-клеток после активации, и участие CTLA-4 (CD 152) может отрицательно регулировать активацию Т-клеток и стимулировать индукцию иммунологической толерантности. Однако стратегия аттенуации Т-клеток участием агонистического антитела с использованием CTLA-4 была безуспешной, так как активация CTLA-4 требует связывания. Молекулярное взаимодействие CTLA-4/B7 происходит в рядах «перекошенной молнии», как показано структурным анализом кристаллов (Stamper 2001 Nature410:608). Однако ни один из доступных в настоящее время агентов связывания CTLA-4 не обладает свойствами связывания, включая моноклональные антитела к CTLA-4. Предпринималось несколько попыток преодоления этой проблемы. В одном случае генерировали связанное с клеточной мембраной одноцепочечное антитело, которое значительно ингибировало аллогенное отторжение у мышей (Hwang 2002 JI 169:633). В другом случае генерировали искусственное связанное с поверхностью АРС одноцепочечное антитело к CTLA-4 и показали, что оно аттенуирует Т-клеточные реакции (Griffin 2000 JI 164:4433). В обоих случаях связывание CTLA-4 достигалось близко локализованными мембраносвязанными антителами в искусственных системах. Хотя эти эксперименты обеспечивают доказанную концепцию иммунной понижающей регуляции путем запуска CTLA-4 негативной передачи сигнала, реагенты, используемые в указанных сообщениях, не подходят для терапевтического использования. Для данной цели связывание CTLA-4 может быть достигнуто путем использования молекулы FIT-Ig, которая нацелена на два разных эпитопа-мишени (или 2 копии одного и того же эпитопа) внеклеточного домена CTLA-4. Основанием для этого является то, что расстояние, разделяющее два сайта связывания IgG, приблизительно 150-170 Ангстрем, является слишком большим для активного связывания CTLA-4 (30-50  между 2 гомодимерами CTLA-4). Однако расстояние между двумя сайтами связывания на FIT-Ig (на одном плече) является гораздо более коротким, также в диапазоне 30-50 , что делает возможным правильное связывание CTLA-4.
[00101] Аналогично, FIT-Ig может быть нацелен на два различных члена комплекса рецепторов клеточной поверхности (например, ИЛ-12R альфа и бета). Кроме того, FIT-Ig может быть нацелен на CR1 и растворимый белок/патоген для запуска быстрого клиренса растворимого белка/патогена-мишени.
[00102] В дополнение к этому, FIT-Ig настоящего изобретения могут быть использованы для тканеспецифической доставки (направленное связывание с тканевым маркером и медиатором заболевания для усиления локальной фармакокинетики и, следовательно, обеспечения более высокой эффективности и/или более низкой токсичности), включая внутриклеточную доставку (направленное связывание с интернализующимся рецептором и внутриклеточной молекулой), доставку во внутреннюю часть головного мозга (направленное связывание с рецептором трансферрина и медиатором заболевания ЦНС для пересечения гематоэнцефалического барьера). FIT-Ig может также служить в качестве белка-носителя для доставки антигена в специфическое местоположение посредством связывания с ненейтрализующим эпитопом данного антигена, а также для увеличения периода полувыведения антигена. Кроме того, FIT-Ig может быть сконструирован либо для физического связывания с медицинскими устройствами, имплантируемыми пациентам, либо для нацеливания этих медицинских устройств (Burke, Sandra Е.; Kuntz, Richard Е.; Schwartz, Lewis B. Zotarolimus (ABT-578) eluting stents. Advanced Drag Delivery Reviews (2006), 58(3), 437-446; Surface coatings for biological activation and functionalization of medical devices. Hildebrand, H.F.; Blanchemain, N.; Mayer, G.; Chai, F.; Lefebvre, M.; Boschin, F.Surface and Coatings Technology (2006), 200 (22-23), 6318-6324; Drug/ dcvicccombinations for local drag therapies and infection prophylaxis. Wu, Peng; Grainger, David W. Biomaterials (2006), 27 (11), 2450-2467; Mediation of the cytokine network in the implantation of orthopedic devices. Marques, A.P.; Hunt, J.A.; Reis, Rui L.Biodegradable Systems in Tissue Engineering and Regenerative Medicine (2005), 377-397; Page: 52.
[00103] Mediation of the cytokine network in the implantation of orthopedic devices. Marques, A.P.; Hunt, J.A.; Reis, Rui L. Biodegradable Systems in Tissue Engineering and Regenerative Medicine (2005), 377-397). Кратко, направление подходящих типов клетки к сайту медицинского имплантата может стимулировать заживление и восстановление нормальной функции ткани. В качестве альтернативы обеспечено также ингибирование медиаторов (включая, в том числе, цитокинов), высвобождаемых после имплантации устройства, посредством FIT-Ig, нанесенного на поверхность устройства или направленно связанного с поверхностью устройства. Например, в течение многих лет в инвазивной кардиологии использовали стенты для очистки блокированных артерий и для улучшения тока крови к сердечной мышце. Однако известно, что традиционные стенты из оголенного металла вызывают рестеноз (повторное сужение артерии в обработанной зоне) у некоторых пациентов и могут приводить к тромбам. Недавно был описан покрытый антителом к CD34 стент, который уменьшал рестеноз и предотвращал появление тромбов путем захвата эндотелиальных клеток-предшественников (ЕРС), циркулирующих в крови. Эндотелиальные клетки являются клетками, которые выстилают кровеносные сосуды, обеспечивая гладкое протекание крови. ЕРС прикрепляются к твердой поверхности стента, образуя гладкий слой, который не только стимулирует заживление, но и предотвращает рестеноз и тромбы, осложнения, ранее ассоциированные с применением стентов (Aoji et al., 2005 J Am Coll Cardiol. 45(10):1574-9). Кроме улучшения исходов для пациентов, которым необходимы стенты, имеются также осложнения для пациентов, требующих операции для сердечно-сосудистого шунтирования. Например, протезный сосудистый канал (искусственная артерия), покрытая антителами к ЕРС, мог бы исключить необходимость применения артерий ног или рук пациента для трансплантатов обходного шунтирования. Это могло бы уменьшить время операции и анестезии, что, в свою очередь, будет уменьшать количество смертей при аортокоронарном шунтировании. FIT-Ig конструируют таким образом, что он связывается с маркером клеточной поверхности (таким как CD34), а также белком (или эпитопом любого рода, в том числе, но не только, с липидами и полисахаридами), который был нанесен на имплантированном устройстве для облегчения рекрутинга клеток. Такие подходы могут быть также использованы для других медицинских имплантатов в общем. В качестве альтернативы FIT-Ig могут быть нанесены на медицинские устройства и после имплантации и высвобождения всех FIT из этого устройства (или при любой другой необходимости, которая может требовать дополнительного свежего FIT-Ig, включая старение и денатурацию уже нанесенного FIT-Ig) это устройство могло бы перезагружаться системным введением свежего FIT-Ig пациенту, причем этот FIT-Ig предназначается для связывания с представляющей интерес мишенью (цитокином, маркером клеточной поверхности (таким как CD34) и т.д.) с использованием одного набора сайтов связывания и с мишенью, нанесенной на это устройство (включая белки, эпигон любого рода, в том числе, но не только, липиды, полисахариды и полимеры), с использованием другого набора сайтов связывания. Данный способ обладает преимуществом пролонгирования применимости покрытых имплантатов.
[00104] Молекулы FIT-Ig по настоящему изобретению применимы также в качестве терапевтических молекул для лечения различных заболеваний. Такие молекулы FTT-Tg могут связывать одну или более мишеней, участвующих в конкретном заболевании. Примеры таких мишеней в разных заболеваниях описаны ниже.
[00105) Многие белки участвуют в общих аутоиммунных и воспалительных реакциях, включая С5, CCL1 (I-309), CCL11 (эотаксин), CCL13 (mcp-4), CCL15 (МТР-1d), CCL16 (НСС-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19, CCL2 (mcp-1), CCL20 (MIP-3a), CCL21 (MIP-2), CCL23 (MPIF-1), CCL24 (MPIF-2 / эотаксин-2), CCL25 (TECK), CCL26, CCL3 (MIP-1a), CCL4 (MIP-1b), CCL5 (RANTES), CCL7 (mcp-3), CCL8 (mcp-2), CXCL1, CXCL10 (IP-10), CXCL11 (I-TAC / 1P-9), CXCL12 (SDF1), CXCL13, CXCL14, CXCL2, CXCL3, CXCL5 (ENA-78 / LIX), CXCL6 (GCP-2), CXCL9, IL13, IL8, CCL13 (mcp-4), CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CX3CR1, IL8RA, XCR1 (CCXCR1), IFNA2, IL10, IL13, ИЛ-17С, IL1A, IL1B, IL1F10, IL1F5, IL1F6, IL1F7, IL1F8, IL1F9, IL22, IL5, IL8, IL9, LTA, LTB, MIF, SCYE1 (эндотолиальный моноцит-активирующый цитокин), SPP1, TNF, TNFSF5, IFNA2, IL10RA, IL10RB, IL13, IL13RA1, IL5RA, TL9, IL9R, ABCF1, BCL6, СЗ, C4A, CEBPB, CRP, ICEBERG, IL1R1, IL1RN, IL8RB, LTB4R, TOLLIP, FADD, IRAKI, IRAK2, MYD88, NCK2, TNFAIP3, TRADD, TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAF5, TRAF6, ACVR1, ACVR1B, ACVR2, ACVR2B, ACVRL1, CD28, CD3E, CD3G, CD3Z, CD69, CD80, CD86, CNR1, CTLA-4, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, FCGR3A, GPR44, HAVCR2, OPRD1, P2RX7, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, BLR1, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CX3CL1, CX3CR1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCR4, GPR2, SCYE1, SDF2, XCL1, XCL2, XCR1, АМН, AMHR2, BMPR1A, BMPR1B, BMPR2, C19orfl0 (IL27w), CER1, CSF1, CSF2, CSF3, DKFZp451J0118, FGF2, GFI1, IFNA1, TFNB1, IFNG, IGF1, ILIA, IL1B, IL1R1, TL1R2, TL2, TL2RA, TL2RB, TL2RG, TL3, TL4, TL4R, TL5, IL5RA, TL6, IL6R, IL6ST, IL7, IL8, IL8RA, IL8RB, IL9, IL9R, IL10, IL10RA, IL10RB, IL11, IL11RA, IL12A, IL12B, IL12RB1, IL12RB2, IL13, IL13RA1, IL13RA2, 1L15, IL15RA, 1L16, ИЛ-17, ИЛ-17R, IL18, IL18R1, IL19, IL20, KITLG, LEP, LTA, LTB, LTB4R, LTB4R2, LTBR, MIF, NPPB, PDGFB, TBX21, TDGF1, TGFA, TGFB1, TGFB1I1, TGFB2, TGFB3, TGFBI, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, TH1L, TNF, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF11A, TNFRSF21, TNFSF4, TNFSF5, TNFSF6, TNFSF11, VEGF, ZFPM2 и RNF110 (ZNF144). Также представлены FIT-Ig, способные к связыванию одной или более мишеней, перечисленных выше.
[00106] Аллергическая астма характеризуется наличием эозинофилии, метаплазии бокаловидных (эпителиальных) клеток, изменений эпителиальных клеток, гиперреактивности дыхательных путей (AHR) и экспрессии цитокинов Th2 и Th1, а также повышенными уровнями сывороточного IgE. В настоящее время широко признается, что воспаление дыхательных путей является ключевым фактором, лежащим в основе патогенеза астмы, включающим в себя сложное взаимодействие воспалительных клеток, таких как Т-клетки, В-клетки, эозинофилы, тучные клетки и макрофаги, и их секретируемых медиаторов, включая цитокины и хемокины. В настоящее время кортикостероиды являются наиболее важными противовоспалительными средствами в лечении астмы, однако их механизм действия является неспецифическим и существуют проблемы безопасности, особенно в популяции юношеских пациентов. Таким образом, оправданной является разработка более специфических и нацеленных методов терапии. Имеется растущее доказательство того, что ИЛ-13 у мышей имитирует многие признаки астмы, включая AHR, гиперсекрецию слизи и фиброз дыхательных путей, независимо от эозинофильного воспаления (Finotto et al., International Immunology (2005), 17(8), 993-1007; Padilla et al., Journal of Immunology (2005), 174(12), 8097-8105).
[00107] Предполагалось, что ИЛ-13 играет центральную роль в индукции патологических реакций, ассоциированных с астмой. Развитие терапии с использованием моноклональных антител к ИЛ-13 для уменьшения эффектов ИЛ-13 в легком является захватывающим новым подходом, который предоставляет важную перспективу в качестве нового лечения астмы. Однако другие медиаторы дифференциальных иммунологических путей также участвуют в патогенезе астмы, и блокирование этих медиаторов, наряду с ИЛ-13, могут принести дополнительную терапевтическую пользу. Такие пары мишеней включают в том числе ИЛ-13 и провоспалительный цитокин, такой как фактор-а некроза опухолей (TNF-α). TNF-α может усиливать воспалительную реакцию при астме и может быть связан с тяжестью заболевания (McDonnell, et al., Progress in Respiratory Research (2001), 31 (New Drugs for Asthma, Allergy and COPD), 247-250.). Это предполагает, что блокирование как ИЛ-13, так и TNF-α может иметь благоприятные действия, в частности, при тяжелом заболевании дыхательных путей. В предпочтительном варианте реализации изобретения FIT-Ig по настоящему изобретению связывается с мишенями ИЛ-13 и TNF-α и используется для лечения астмы.
[00108] Модели на животных, такие как модель OVA-индуцированной астмы мыши, где могут оцениваться как воспаление, так и AHR, известны в данной области и могут быть использованы для определения способности различных молекул FIT-Ig в лечении астмы. Модели на животных для изучения астмы описаны у Coffman, et al., Journal of Experimental Medicine (2005), 201(12), 1875-1879; Lloyd, et al., Advances in Immunology (2001), 77, 263-295; Boyce et al., Journal of Experimental Medicine (2005), 201(12), 1869-1873; и Snibson, et al., Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology (2005), 35(2), 146-52. Кроме стандартных способов оценивания безопасности этих пар мишеней, специфические тесты на степень иммуносупрессии могут быть оправданными и полезными в отборе наилучших пар мишеней (смотри Luster et al., Toxicology (1994), 92(1-3), 229-43; Descotes, et al., Developments in biological standardization (1992), 77 99-102; Hart et al., Journal of Allergy and Clinical Immunology (2001), 108(2), 250-257).
[00109] На основе описанного выше обоснования и с использованием той же самой модели оценивания на эффективность и безопасность могут быть определены другие пары мишеней, которые могут связывать молекулы FIT-Ig и быть применимы для лечения астмы. Предпочтительно такие мишени включают, в том числе, ИЛ-13 и ИЛ-1-бета, поскольку ИЛ-1-бета также участвует в воспалительной реакции при астме; ИЛ-13 и цитокины и хемокины, которые участвуют в воспалении, такие как ИЛ-13 и ИЛ-9; ИЛ-13 и ИЛ-4; ИЛ-13 и ИЛ-5; ИЛ-13 и ИЛ-25; ИЛ-13 и TARC; ИЛ-13 и MDC; ИЛ-13 и MIF; ИЛ-13 и TGF-β; ИЛ-13 и агонист LHR; ИЛ-13 и CL25; ИЛ-13 и SPRR2a; ИЛ-13 и SPRR2b; и ИЛ-13 и ADAM8. Настоящее изобретение обеспечивает также FIT-Ig, способные связывать одну или более мишеней, участвующих в астме, выбранных из группы, состоящей из CSF1 (MCSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (GCSF), FGF2, IFNA1, IFNB1, IFNG, гистамина и рецепторов гистамина, IE1A, IL1B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL13, IL14, IL15, IL16, ИЛ-17, IL18, IL19, KITLG, PDGFB, IL2RA, IL4R, IL5RA, IL8RA, IL8RB, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL18R1, TSLP, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL13, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL22, CCL24, CX3CL1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, XCL1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CX3CR1, GPR2, XCR1, FOS, GATA3, JAK1, JAK3, STAT6, TBX21, TGFB1, TNFSF6, YY1, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, LTB4R, TB4R2, LTBR и хитиназы.
[00110] Ревматоидный артрит (РА), системное заболевание, характеризуется хронической воспалительной реакцией в синовии суставов и ассоциировано с дегенерацией хряща и эрозией околосуставной кости. В заболевших суставах экспрессируются многие провоспалительные цитокины, включая ФНО, хемокины и факторы роста. Было показано, что системное введение антитела к ФНО или слитого белка sTNFR в модели РА мыши является противовоспалительным и защищающим суставы. Клинические исследования, в которых активность ФНО у пациентов с РА блокировали введенным внутривенно инфликсимабом (Harriman G, Harper LK, Schaible TF. 1999 Summary of Clinical trials in rheumatoid arthritis using infliximab, an anti-TNFalpha treatment. Ann Rheum Dis 58 Suppl 1:I61-4), химерным моноклональным антителом к ФПО (мАТ), обеспечивали доказательство того, что ФНО регулирует продуцирование ИЛ-6, ИЛ-8, МСР-1 и VEGF, рекрутинг иммунных и воспалительных клеток в суставы, ангиогенез и уменьшение уровней в крови матриксных металлопротеиназ-1 и -3. Лучшее понимание воспалительного пути в ревматоидном артрите привело к идентификации других терапевтических мишеней, участвующих в ревматоидном артрите. Подающие надежду способы лечения, такие как способы с использованием антагонистов интерлейкина-6 (MRA), CTLA4Ig (абатацепта, Genovese Me et al., 2005 Abatacept for rheumatoid arthritis refractory to tumor necrosis factor alpha inhibition. N Engl J Med. 353:1114-23.), и анти-В-клеточной терапии (ритуксимаб, Okamoto Н, Kamatani N. 2004 Rituximab for rheumatoid arthritis. N Engl J Med. 351:1909) уже были испытаны в рандомизированных контролируемых испытаниях на протяжении прошлого года. Были идентифицированы другие цитокины, и было показано, что они являются полезными в моделях животных, в том числе иптерлейкин-15, интерлейкин-17 и интерлейкин-18, и клинические испытания этих агентов проводятся в настоящее время. Терапия с использованием антитела с двойной специфичностью, объединяющая антитело к ФНО и другой медиатор, имеет большой потенциал в увеличении клинической эффективности и/или охвата пациентов. Например, блокирование как ФНО, так и VEGF может потенциально ликвидировать воспаление и антиогенез, оба из которых участвуют в патофизиологии РА. Обсуждается также блокирование других пар мишеней, участвующих в РА, включающих, в том числе, ФНО и ИЛ-18; ФНО и ИЛ-12; ФНО и ИЛ-23; ФНО и ИЛ-1-бета; ФНО и MIF; ФНО и ИЛ-17; и ФНО и ИЛ-15, специфическими FIT-Ig. Кроме рутинных способов оценивания безопасности этих пар мишеней, специфические тесты на степень иммуносупрессии могут быть оправданными и полезными в отборе наилучших пар мишеней (см. Luster et al., Toxicology (1994), 92(1-3), 229-43; Descotes, et al, Developments in biological standardization (1992), 77 99-102; Hart et al., Journal of Allergy and Clinical Immunology (2001), 108(2), 250-257). Будет ли молекула FIT-Ig применима для лечения ревматоидного артрита, может быть оценено с использованием доклинических моделей РА на животных, таких как мышиные модели индуцированного коллагеном артрита. Другие применимые модели также хорошо известны в данной области (см. Brand DD., Comp Med. (2005) 55(2): 114-22).
[00111] Отличительным признаком иммунопатогенеза SLE является активация поликлональных В-клеток, которая приводит к гиперглобулинемии, продуцированию аутоантител и образованию иммунных комплексов. Фундаментальной аномалией является, по-видимому, неспособность Т-клеток подавлять запретные клоны В-клеток вследствие генерализованной нарушенной регуляции Т-клеток. Кроме того, взаимодействие В- и Т-клеток облегчается несколькими цитокинами, такими как ИЛ-10, а также костимулирующими молекулами, такими как CD40 и CD40L, В7 и CD28, и CTLA-4, которые инициируют второй сигнал. Эти взаимодействия вместе с нарушенным фагоцитарным клиренсом иммунных комплексов и апоптотического материала сохраняют навсегда эту иммунную реакцию с полученным тканевым повреждением. Следующие мишени могут участвовать в SLE и могут быть потенциально использованы для подхода на основе FIT-Ig к терапевтическому вмешательству: методы анти-В-клеточной терапии: CD-20, CD-22, CD-L9, CD28, CD4, CD80, HLA-DRA, IL10, IL2, IL4, TNFRSF5, TNFRSF6, TNFSF5, TNFSF6, BLR1, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, ICOSL, IGBP1, MS4A1, RGS1, SLA2, CD81, IFNB1, IL10, TNFRSF5, TNFRSF7, TNFSF5, AICDA, BLNK, GALNAC4S-6ST, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, IL10, IL11, IL4, INHA, INHBA, KLF6, TNFRSF7, CD28, CD38, CD69, CD80, CD83, CD86, DPP4, FCER2, IL2RA, TNFRSF8, TNFSF7, CD24, CD37, CD40, CD72, CD74, CD79A, CD79B, CR2, IL1R2, ITGA2, ITGA3, MS4A1, ST6GAL1, CD1C, CHST10, HLA-A, HLA-DRA и NT5E.; костимулирующие сигналы: CTLA4 или В7.1/В7.2; иигибирование выживания В-клеток: BlyS, BAFF; инактивация комплемента: С5; модуляция цитокинов: ключевым принципом является то, что чистая биологическая реакция в любой ткани является результатом баланса между локальными уровнями провоспалительных или противовоспалительных цитокинов (см. Sfikakis РР et al., 2005 Curr Opin Rheumatol 17:550-7). Считается, что SLE является запускаемым Th-2 заболеванием с документально подтвержденным увеличением уровней ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10 в сыворотке крови. Обсуждаются также FTT-Ig, способные связывать одну или более мишеней, выбранных из группы, состоящей из ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10, IFN-α и ФНО-α. Комбинация обсуждаемых выше мишеней будет увеличивать терапевтическую эффективность в отношении SLE, которая может быть испытана в ряде доклинических моделей волчанки (см. Peng SL (2004) Methods Mol Med.; 102:227-72).
[00112] Множественный склероз (МС) является комплексным заболеванием аутоиммунного типа человека преимущественно неизвестной этиологии. Иммунологическая деструкция миелинового основного белка (МВР) во всей нервной системе является основной патологией множественного склероза. МС является заболеванием комплексных патологий, которое включает в себя инфильтрацию CD4+ и CD8+ Т-клетками и реакцию в центральной нервной системе. Экспрессия в ЦНС цитокинов, реакционноспособные молекулы азота и костимулирующие молекулы - все были описаны в МС. Наиболее важными являются иммунологические механизмы, которые способствуют развитию аутоиммунитета. В частности, экспрессия антигенов, взаимодействия цитокинов и лейкоцитов и регуляторные Т-клетки, которые способствуют балансу /модуляции других Т-клеток, таких как клетки Th1 и Th2, являются важными областями для идентификации терапевтических мишеней.
[00113] ИЛ-12 является провоспалительным цитокином, который продуцируется АПК и стимулирует дифференцировку Th1-эффекторных клеток. ИЛ-12 продуцируется при развивающихся повреждениях у пациентов с МС, а также у ЕАЕ-пораженных животных. Ранее было показано, что вмешательство в ИЛ-12-пути эффективно предотвращает ЕАЕ у грызунов и что нейтрализация in vivo ИЛ-12р40 с помощью мАт к ИЛ-12 оказывает благоприятные действия в индуцированной миелином модели ЭАЭ у обыкновенных мартышек.
[00114] TWEAK является представителем ФНО-семейства, конститутивно экспрессируемым в центральной нервной системе (ЦНС), с провоспалительным, пролиферативным или апоптотическим действиями в зависимости от типов клеток. Его рецептор, Fn14, экспрессируется в ЦНС эндотелиальными клетками, реактивными астроцитами и нейронами. Экспрессия мРНК TWEAK и Fn14 увеличивалась в спинном мозге во время экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ). Лечение антителом к TWEAK при ЭАЭ, индуцированном миелин-олигодендроцитным-гликопротеином (MOG), у мышей линии C57BL/6 приводило к уменьшению тяжести заболевания и инфильтрации лейкоцитами при лечении мышей после фазы праймирования.
[00115] Один аспект данного изобретения относится к молекулам FIT-Ig, способным к связыванию одной или более, предпочтительно двух мишеней, выбранных из группы, состоящей из ИЛ-12, TWEAK, ИЛ-23, CXCL13, CD40, CD40L, ИЛ-18, VEGF, VLA-4, ФНО, CD45RB, CD200, IFN-гамма, GM-CSF, FGF, С5, CD52 и CCR2. Предпочтительный вариант реализации изобретения включает биспецифический FIT-Ig, специфичный по отношению к ИЛ-12/TWEAK, в качестве терапевтического средства, оказывающего благоприятное воздействие при лечении МС. В данной области известны несколько моделей на животных для оценки применимости молекул FIT-Ig для лечения МС (см. Steinman L, et al., (2005) Trends Immunol. 26(11):565-71; Lublin FD., et al., (1985) Springer Semin Immunopathol. 8(3): 197-208; Genain CP, et al., (1997) J Mol Med. 75(3):187-97; Tuohy VK, et al., (1999) J Exp Med. 189(7): 1033-42; Owens T, et al., (1995)Neurol Clin. 13(1):51-73; and 't Hart BA, et al., (2005) J Immunol 175(7):4761-8. Кроме стандартных способов оценивания безопасности этих пар мишеней, специфические тесты на степень иммуносупрессии могут быть оправданными и полезными в отборе наилучших пар мишеней (см. Luster et al., Toxicology (1994), 92(1-3), 229-43; Descotes, et al., Developments in biological standardization (1992), 77 99-102; Jones R. 2000 Rovelizumab (ICOS Corp). IDrugs. 3(4):442-6).
[00116] Патофизиология сепсиса инициируется компонентами наружной мембраны как грамотрицательных организмов (липосахаридом [ЛПС], липидом А, эндотоксином), так и грамположительных организмов (липотейхоевой кислотой, пептидогликаном). Эти компоненты наружной мембраны способны связываться с CD14-рецептором на поверхности моноцитов. Затем, посредством недавно описанных toll-подобных рецепторов сигнал переносится в клетку, приводя к конечному продуцированию провоспалительных цитокинов фактора некроза опухолей альфа (ФПО-α) и интерлейкина-1 (ИЛ-1). Сокрушительные воспалительные и иммунные реакции являются важными признаками септического шока и играют центральную роль в патогенезе повреждения ткани, недостаточности множественных органов и смерти, индуцированных сепсисом. Было показано, что цитокины, в частности фактор некроза опухолей (ФНО) и интерлейкин (ИЛ-1), являются решающими медиаторами септического шока. Эти цитокины оказывают прямое токсическое действие на ткани; они также активируют фосфолипазу А2. Эти и другие действия приводят к увеличенным концентрациям активирующего тромбоциты фактора, стимуляции активности синтазы оксида азота, стимуляции инфильтрации тканей нейтрофилами и стимуляции активности нейтрофилов.
[00117] Лечение сепсиса и септического шока остается клинической загадкой, и недавние перспективные испытания с модификаторами биологических реакций (т.е. антитела к ФНО, антитела к MIF), нацеленными на воспалительную реакцию, показали только умеренную клиническую пользу. Недавно интерес переместился в направлении способов терапии, нацеленных на обращение сопутствующих периодов иммунной супрессии. Исследования на экспериментальных животных и критически больных пациентах показали, что увеличенный апоптоз лимфоидных органов и некоторых паренхимных тканей способствует иммунной супрессии, анергии и дисфункции системы органов. Во время синдромов сепсиса апоптоз лимфоцитов мог запускаться отсутствием ИЛ-2 или высвобождением глюкокортикоидов, гранзимов или так называемых цитокинов «смерти»: фактора альфа некроза опухолей или Fas-лиганда. Апопотоз протекает через аутоактивацию цитозольных и митохондриальных каспаз, па которые влияют про- и антиапоптотические члены Bcl-2-семейства. У экспериментальных животных лечение ингибиторами апоптоза может не только предотвращать апоптоз лимфоидных клеток; оно может также улучшать исход заболевания. Хотя клинические испытания с использованием антиапоптотических средств остаются отдаленными, по большей части, вследствие технических трудностей, связанных с их введением и нацеливанием на ткани, ингибирование апоптоза лимфоцитов представляет привлекательную терапевтическую мишень для септического пациента. Подобным образом, обладающее двойной специфичностью средство, направленно связывающее как воспалительный медиатор, так и апоптотический медиатор, может иметь дополнительное преимущество. Один аспект данного изобретения относится к FIT-Ig, способным связывать одну или более мишеней, участвующих в патогенеза сепсиса, предпочтительно две мишени, выбранные из группы, состоящей из ФНО, ИЛ-1, MIF, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-18, ИЛ-12, ИЛ-23, FasL, LPS, Toll-подобных рецепторов, TLR-4, тканевого фактора, MIP-2, ADORA2A, CASP1, CASP4, IL10, IL1B, NFKB1, PROC, TNFRSF1A, CSF3, ИЛ-10, ИЛ-1 В, ИЛ-6, ADORA2A, CCR3, ИЛ-10, ИЛ-IB, ИЛ-IRN, MIF, NFKB1, PTAFR, TLR2, TLR4, GPR44, HMOX1, мидкин, IRAKI, NFKB2, SERPINAI, SFRPTNFI и TREM1. Эффективность таких FIT-Ig в отношении сепсиса можно оценить на доклинических моделях животных, известных в данной области (см. Buras JA, et al., (2005) Nat Rev Drug Discov. 4(10):854-65 и Calandra T, et al., (2000) Nat Med. 6(2): 164-70).
[00118] Хронические нейродегенеративные заболевания обычно связанными со старением заболеваниями, характеризующимися прогрессирующей потерей нейронных функций (смертью нервных клеток, демиелинизацией), потерей подвижности и потерей памяти. Появляющееся знание механизмов, лежащих в основе хронических нейродегенеративных заболеваний (например, болезни Альцгеймера) показывает комплексную этиологию, и было признано, что различные факторы способствуют их развитию и прогрессированию, например, старение, гликемический статус, продуцирование и мультимеризация амилоида, накопление прогрессирующих конечных продуктов гликозилирования (AGE), которые связываются с их рецептором (RAGE) (рецептором AGE), увеличенный окислительный стресс головного мозга, уменьшенный церебральный кровоток, нейровоспаление, включая высвобождение воспалительных цитокинов и хемокинов, дисфункцию нейронов и активацию микроглии. Таким образом, эти хронические нейродегенеративные заболевания представляют комплексное взаимодействие между множественными тинами клеток и медиаторами. Стратегии лечения для таких заболеваний ограничены и в основном составляют либо блокирование воспалительных процессов неспецифическими противовоспалительными агентами (например, кортикостероидами, ингибиторами СОХ) или агентами для предотвращения потери нейронов и/или синаптических функций. Эти способы лечения не могут остановить прогрессирование заболевания. Недавние исследования предполагают, что более направленно воздействующие терапевтические средства, такие как антитела к растворимому А-β-пептиду (включая олигомерные формы А-b) могут не только останавливать прогрессирование заболевания, но и могут также поддерживать память. Эти предварительные наблюдения предполагают, что специфические терапевтические воздействия, направленные более чем один медиатор (например, А-β и провоспалительный цитокин, такой как ФНО), могут обеспечивать даже лучшую терапевтическую эффективность в отношении хронических дегенеративных заболеваний, чем эффективность, наблюдаемая в случае направленного воздействия на один механизм развития заболевания (например, только растворимый А-β отдельно) (см. С.Е. Shepherd, et al., Neurobiol Aging. 2005 Oct 24; Nelson RB., Curr Pharm Des. 2005; 11:3335; William L. Klein.; Neurochem Int. 2002; 41:345; Michelle С Janelsins, et al., J Neuroinflammation. 2005; 2:23; Soloman В., Curr Alzheimer Res. 2004; 1:149; Igor Klyubin, et al., Nat Med. 2005; 11:556-61; Arancio O, et al., EMBO Journal (2004) 1-10; Bornemann KD, et al., Am J Pathol. 2001; 158:63; Deane R, et al., Nat Med. 2003; 9:907-13; и Eliezer Masliah, et al., Neuron. 2005; 46:857).
[00119] Молекулы FIT-Ig по настоящему изобретению могут связывать одну или более мишеней, участвующих в патогенезе хронических нейродегенерагивных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера. Такие мишени включают, в том числе, любой медиатор, растворимый или находящийся на клеточной поверхности, участвующий в патогенезе AD, например, AGE (S100 А, амфотерин), провоспалительные цитокины (например, ИЛ-1), хемокины (например, МСР 1), молекулы, которые ингибируют регенерацию нерва (например, Nogo, RGM А), молекулы, которые усиливают рост нейритов (нейротрофины). Эффективность молекул FIT-Ig может быть валидирована в доклинических моделях на животных, таких как трансгенные мыши, которые характеризуются чрезмерной экспрессией белка-предшественника амилоида или RAGE и развитием симптомов болезни, подобной болезни Альцгеймера. В дополнение к этому, молекулы FIT-Ig могут быть сконструированы и исследованы в отношении эффективности в моделях на животных, и наилучшие терапевтические FIT-Ig могут быть отобраны для исследования на пациентах. Молекулы FIT-Ig могут быть также использованы для лечения других нейродегенерагивных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона. Альфа-синуклеин участвует в патологии болезни Паркинсона. FIT-Ig, способные направленно связываться с альфа-синуклеином и воспалительными медиаторами, такими как ФНО, ИЛ-1, МСР-1, могут оказаться эффективной терапией для болезни Паркинсона и также рассматриваются в данном изобретении.
[00120] Несмотря на увеличение знания патологических механизмов, повреждение спинного мозга (SCI) все еще является разрушительным состоянием и представляет собой медицинское показание, характеризуемое высокой потребностью в лекарственных препаратах. Большинство повреждений спинного мозга являются контузионными или компрессионными повреждениями, и за первичным повреждением обычно следуют вторичные механизмы повреждения (воспалительные медиаторы, например, цитокины и хемокины), которые ухудшают начальное повреждение и приводят к значительному увеличению площади повреждения, иногда более чем в 10 раз. Эти первичные и вторичные механизмы в SCI очень сходны с механизмами в повреждении головного мозга, вызванном иным образом, например, инсультом. Не существует удовлетворительное лечение, и болюсная инъекция высокой дозы метилпреднизолона (MP) является единственной используемой терапией в узком окне времени 8 ч после повреждения. Однако эта обработка предназначена только для предотвращения вторичного повреждения, не вызывая любое значимое функциональное восстановление. Она в сильной степени критикуется за отсутствие недвусмысленной эффективности и тяжелые вредные побочные действия, такие как иммуносупрессия с последующими инфекциями и тяжелыми гистопатологическими мышечными изменениями. Не существуют одобренные другие лекарственные средства, биологические агенты или малые молекулы, стимулирующие эндогенный регенерационный потенциал, но в недавние годы перспективные принципы лечения и лекарства-кандидаты обнаруживали эффективность на животных моделях SCI. В большой степени отсутствие функционального восстановления в SCI человека обусловлено факторами, ингибирующими рост нейритов в участках повреждения, в ткани рубцов, в миелине, а также ассоциированных с повреждением клетках. Такими факторами являются миелин-ассоциированные белки NogoA, OMgp и MAG, RGM А, связанные с рубцами CSPG (хондроитинсульфатпротеогликаны) и ингибирующие факторы на реактивных астроцитах (некоторые семафорины и эфрины). Однако в участке повреждения обнаружены не только ингибирующие рост молекулы, но также стимулирующие рост нейритов факторы, такие как нейротрофины, ламинин, LI и другие. Этот ансамбль ингибирующих рост нейритов и стимулирующих рост молекул может объяснить то, что блокирующие единственные факторы, такие как NogoA или RGM А, приводили к значимому функциональному восстановлению на моделях SCI грызунов, поскольку уменьшение ингибирующих действий могло смещать баланс с иигибирования роста к стимуляции роста. Однако наблюдаемые восстановления с блокированием молекулы, ингибирующей вырост единственного нейрита, были неполными. Для достижения более быстрых и более ярко выраженных проявлений восстановления может быть желательным либо блокирование двух молекул, ингибирующих вырост нейрита, например, Nogo и RGM А, либо блокирование молекулы, ингибирующей вырост нейрита и усиливающей функции увеличивающей вырост нейрита молекулы, например, Nogo и нейротрофинов, либо блокированием молекулы, ингибирующей вырост нейрита, например, Nogo и провоспалительной молекулы, например, ФНО (см. McGee AW, et al., Trends Neurosci. 2003; 26:193; Marco Domeniconi, et al., J Neurol Sci. 2005; 233:43; Milan Makwanal, et al., FEBS J. 2005; 272:2628; Barry J. Dickson, Science. 2002; 298:1959; Felicia Yu Hsuan Teng, et al., J Neurosci Res. 2005; 79:273; Tara Karnezis, et al., Nature Neuroscience 2004; 7, 736; Gang Xu, et al., J. Neurochem. 2004; 91; 1018).
[00121] Предусмотрены другие FIT-Ig, способные к связыванию пар мишеней, таки как таких как NgR и RGM A; NogoA и RGM A; MAG и RGM A; OMGp и RGM A; RGM А и RGM В; CSPG и RGM А; аггрекан, мидкин, нейрокан, версикан, фосфокан, Те38 и ФНО-а; Аβ глобуломер-специфические антитела, комбинированные с антителами, стимулирующими спрутинг дендритов и аксонов. Патология дендритов является очень ранним признаком AD, и известно, что NOGO А ограничивает рост дендритов. Можно комбинировать такой тип Ab с любым из SCI-кандидатных (миелиновые белки) Ab. Другие мишени FIT-Ig могут включать в себя любую комбинацию NgR-p75, NgR-Troy, NgR-Nogo66 (Nogo), NgR-Lingo, Lingo-Troy, Lingo-p75, MAG или Omgp. В дополнение к этому, мишени могут включать в себя также любой медиатор, растворимый или находящийся на клеточной поверхности, участвующий в ингибировании нейрита, например, Nogo, Ompg, MAG, RGM А, семафорины, эфрины, растворимый A-b, провоспалительные цитокины (например, ИЛ-1), хемокины (например, MIP 1а), молекулы, которые ингибируют регенерацию нейронов. Эффективность молекул FIT-Ig, специфичных по отношению к nogo/RGM А или подобных молекул FIT-Ig может быть валидирована на доклинических моделях повреждения спинного мозга животных. В дополнение к этому, эти молекулы FIT-Ig могут быть сконструированы и исследованы в отношении эффективности на моделях животных, и наилучшие терапевтические FIT-Ig могут быть отобраны для тестирования па пациентах. В дополнение к этому, могут быть сконструированы молекулы FIT-Ig, которые нацелены на два разных сайта связывания лиганда на единственном рецепторе, например, рецепторе Nogo, который связывает три лиганда Nogo, Ompg и MAG, и RAGE, который связывает А-b и S100 А. Более того, ингибиторы выроста нейритов, например, nogo и рецептор nogo, также играют роль в предотвращении регенерации нервов при иммунологических заболеваниях, таких как множественный склероз. Было показано, что взаимодействие nogo-рецептор nogo усиливает восстановление на моделях множественного склероза животных. Таким образом, молекулы FIT-Ig молекулы, которые могут блокировать функцию одного иммунного медиатора, например, цитокина, такого как ИЛ-12, и молекулы ингибирования выроста нейрита, например, nogo или RGM, могут обеспечивать более быструю и более высокую эффективность, чем блокирование только либо иммунной молекулы, либо молекулы ингибитора выроста нейрита.
[00122] Терапия моноклональными антителами появилась как важный способ терапии рака (von Mehren М, et al., 2003 Monoclonal antibody therapy for cancer. Annu Rev Med.; 54:343-69). Антитела могут проявлять противоопухолевое действие индуцированием апоптоза, изменением направленности цитотоксичности, вмешательством во взаимодействия лиганд-рецептор или предотвращением экспрессии белков, которые являются критическими в отношении неопластического фенотипа. В дополнение к этому, антитела могут быть нацелены на компоненты-мишени опухолевого окружения для искажения жизненных структур, например, образования опухоль-ассоциированной сосудистой сети. Антитела могут быть также нацелены на рецепторы-мишени, лигандами которых являются факторы роста, такие как рецептор эпидермального фактора роста. Таким образом, это антитело ингибирует природные лиганды, которые стимулируют рост клеток, препятствуя их связыванию с опухолевыми клетками-мишенями. В качестве альтернативы антитела могут индуцировать антиидиотипическую сеть, комплемент-опосредованную цитотоксичность или антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC). Применение биспецифического антитела, которое нацелено на два отдельных опухолевых медиатора, будет, по-видимому, создавать дополнительное преимущество по сравнению с моноспецифической терапией. Рассматриваются также FIT-Ig, способные к связыванию следующих пар мишеней, для лечения онкологического заболевания: IGF1 и IGF2; TGF1/2 и Erb2B; VEGFR и EGFR; CD20 и CD3, CD138 и CD20, CD38 и CD20, CD38 и CD138, CD40 и CD20, CD138 и CD40, CD38 и CD40. Другие комбинации мишеней включают один или более представителей семейства EGF/erb-2/erb-3. Другие мишени (одна или более), вовлеченные в развитие онкологических заболеваний, с которыми могут связываться FIT-Ig, включают, в том числе, мишени, выбранные из группы, состоящей из: CD52, CD20, CD19, CD3, CD4, CD8, ВМР6, IL12A, IL1A, 1L1B, IL2, IL24, 1NHA, ФНО, TNFSF10, ВМР6, EGF, FGF1, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, GRP, IGF1, IGF2, IL12A, IL1A, IL1B, IL2, INHA, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, VEGF, CDK2, EGF, FGF 10, FGF 18, FGF2, FGF4, FGF7, IGF1, IGF 1R, TL2, VEGF, BCL2, CD164, CDKN1A, CDKNIB, CDKN1C, CDKN2A, CDKN2B, CDKN2C, CDKN3, GNRH1, IGFBP6, TLI A, IL1B, ODZ1, PAWR, PLC, TGFB1T1, AR, BRCA1, CDK3, CDK4, CDK5, CDK6, CDK7, CDK9, E2F1, EGFR, ENO1, ERBB2, ESR1, ESR2, IGFBP3, IGFBP6, IL2, INSL4, MYC, NOX5, NR6A1, PAP, PCNA, PRKCQ, PRKD1, PRL, TP53, FGF22, FGF23, FGF9, IGFBP3, IL2, INHA, KLK6, ТР53, CHGB, GNRH1, IGF1, IGF2, INHA, INSL3, INSL4, PRL, KLK6, SHBG, NR1D1, NR1H3, NR1I3, NR2F6, NR4A3, ESRL ESR2, NR0B1, NR0B2, NR1D2, NR1H2, NR1H4, NR1T2, NR2C1, NR2C2, NR2E1, NR2E3, NR2F1, NR2F2, NR3C1, NR3C2, NR4A1, NR4A2, NR5A1, NR5A2, NR6A1, PGR, RARB, FGF1, FGF2, FGF6, KLK3, KRT1, APOC1, BRCA1, CHGA, CHGB, CLU, COL1A1, COL6A1, EGF, ERBB2, ERK8, FGF1, FGF10, FGF11, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, GNRH1, IGF1, IGF2, IGFBP3, IGFBP6, IL12A, ILIA, IL1B, IL2, IL24, INHA, INSL3, INSL4, KLK10, KLK12, KLK13, KLK14, KLK15, KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK9, MMP2, MMP9, MSMB, NTN4, ODZ1, PAP, PLAU, PRL, PSAP, SERPEN A3, SHBG, TGFA, TIMP3, CD44, CDH1, CDH10, CDH19, CDH20, CDH7, CDH9, CDH1, CDH10, CDH13, CDH18, CDH19, CDH20, CDH7, CDH8, CDH9, ROB02, CD44, ILK, ITGA1, APC, CD164, COL6A1, MTSS1, PAP, TGFB1I1, AGR2, AIG1, AKAP1, AKAP2, CANT 1, CAV1, CDH12, CLDN3, CLN3, CYB5, CYC1, DAB2TP, DES, DNCL1, ELAC2, EN02, EN03, FASN, FLJ12584, FLJ25530, GAGEB1, GAGEC1, GGT1, GSTP1, HIP1, HUMCYT2A, TL29, K6HF, KAI1, KRT2A, MIB1, PARTI, PATE, PCA3, PIAS2, PIK3CG, PPID, PR1, PSCA, SLC2A2, SLC33A1, SLC43A1, STEAP, STEAP2, TPM1, TPM2, TRPC6, ANGPT1, ANGPT2, ANPEP, ECGF1, EREG, FGF1, FGF2, F1GF, FLT1, JAG1, KDR, LAMA5, NRP1, NRP2, PGF, PLXDC1, STAB1, VEGF, VEGFC, ANGPTL3, BAI1, COL4A3, IL8, LAMA5, NRP1, NRP2, STAB1, ANGPTL4, PECAM1, PF4, PROK2, SERPINF1, TNFAIP2, CCLI1, CCL2, CXCL1, CXCL10, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL9, IFNA1, IFNB1, IFNG, IL1B, IL6, MDK, EDG1, EFNA1, EFNA3, EFNB2, EGF, EPHB4, FGFR3, HGF, IGF1, ITGB3, PDGFA, TEK, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFBR1, CCL2, CDH5, COL18A1, EDG1, ENG, ITGAV, ITGB3, THBS1, THBS2, BAD, BAG1, BCL2, CCNA1, CCNA2, CCND1, CCNE1, CCNE2, CDH1 (E-кадгерин), CDKN1B (p27Kip1), CDKN2A (p16INK4a), COL6A1, CTNNB1 (b-катенин), CTSB (катенсин В), ERBB2 (Her-2), ESR1, ESR2, F3 (TF), FOSL1 (FRA-1), GATA3, GSN (гельсолин), IGFBP2, IL2RA, IL6, IL6R, IL6ST (гликопротеин 130), ITGA6 (а6-интегрин), JUN, KLK5, KRT19, MAP2K7 (c-Jun), MKI67 (Ki-67), NGFB (NGF), NGFR, NME1 (NM23A), PGR, PLAU (uPA), PTEN, CTLA-4, OX40, GITR, TIM-3, Lag-3, B7-H3, B7-H4, GDF8, CGRP, Lingo-1, ICOS, GARP, BTLA, CD160, ROR1, SERPINB5 (маслин), SERPINE1 (PAI-1), TGFA, THBS1 (тромбоспондин-1), TIE (Tie-1), TNFRSF6 (Fas), TNFSF6 (FasL), TOP2A (топоизомераза Iia), TP53, AZGP1 (цинк-а-гликопротеин), BPAG1 (плектин), CDKN1A (p21Wapl/Cip1), CLDN7 (клаудин-7), CLU (кластерин), ERBB2 (Her-2), FGF1, FLRT1 (фибронектин), GABRP (GABAa), GNAS1, ID2, ITGA6 (интегрин а6), ITGB4 (интегрин b 4), KLF5 (GC-блок BP), KRT19 (кератин 19), KRTHB6 (кератин, специфического для волос типа 11), MACMARCKS, МТ3 (металлотиоиектин-III), MUC1 (муцин), PTGS2 (СОХ-2), RAC2 (p21Rac2), S100A2, SCGB1D2 (липофилин В), SCGB2A1 (маммаглобин 2), SCGB2A2 (маммаглобин 1), SPRR1B (Spr1), THBS1, THBS2, THBS4 и TNFAIP2 (В94).
[00123] В одном варианте реализации изобретения заболевания, которые можно лечить или диагностировать с использованием композиций и способов, предложенных в данном документе, включают, в том числе, первичные и метастатические злокачественные опухоли, включая карциномы молочной железы, толстой кишки, прямой кишки, легкого, ротовой части глотки, гортанной части глотки, пищевода, желудка, поджелудочной железы, печени, желчного пузыря и желчных протоков, тонкого кишечника, мочевыводящих путей (включая почки, мочевой пузырь и уротелий), женских половых путей (включая шейку матки, матку и яичники, а также хориокарциному и гестационную трофобластическую болезнь), мужских половых путей (включая предстательную железу, семенные пузырьки, яички и эмбрионально-клеточные опухоли), эндокринных желез (включая щитовидную железу, надпочечники и гипофиз) и кожи, а также гемангиомы, меланомы, саркомы (включая те, что возникают из костных и мягких тканей, а также саркому Капоши), опухоли головного мозга, нервной ткани и оболочек головного мозга (включая астроцитомы, глиомы, глиобластомы, ретинобластомы, невромы, нейробластомы, шванпомы и менингиомы), солидные опухоли, возникающие из гемопоэтических злокачественных заболеваний, таких как лейкозы и лимфомы (как лимфомы Ходжкина, так и неходжкинские лимфомы).
[00124] В одном варианте реализации изобретения антитела, предложенные в данном документе, или их антигенсвязывающие участки, используют для лечения рака или в предотвращении метастазов из опухолей, описанных в данном документе, либо при использовании отдельно, либо в комбинации с радиотерапией и/или другими химиотерапевтическими средствами.
[00125] В соответствии с другим вариантом реализации настоящего изобретения эффекторная клетка иммунной системы человека является представителем лимфоидной клеточной линии человека. В этом варианте реализации изобретения эффекторная клетка предпочтительно может представлять собой Т-клетку человека, В-клетку человека или натуральный киллер (NK) человека. Предпочтительно, чтобы такая клетка оказывала либо цитотоксическое, либо апоптическое действие на клетку-мишень. Особенно предпочтительно, чтобы лимфоидная клетка человека представляла собой цитотоксическую Т-клетку, которая при активации оказывала бы цитотоксическое действие на клетку-мишень. В соответствии с этим вариантом реализации изобретения, таким образом, направляемая активность эффекторной клетки человека - это цитотоксическая активность этой клетки.
[00126] В соответствии с предпочтительным вариантом реализации изобретения активация цитотоксических Т-клеток может происходить вследствие связывания антигена CD3 как эффекторного антигена на поверхности цитотоксических Т-клеток биспецифическим антителом этого варианта реализации настоящего изобретения. Антиген CD3 человека присутствует как на хелперных Т-клетках, так и цитотоксических Т-клетках. CD3 человека обозначает антиген, который экспрессирован на Т-клетках в составе мультимолекулярного Т-клеточного комплекса и который содержит три разные цепи: CD3-эпсилон, CD3-дельта и CD3-гамма.
[00127] Активация цитотоксического потенциала Т-клеток представляет собой сложное явление, которое требует взаимодействия множества белков. Белок Т-клеточный рецептор («TCR») представляет собой мембраносвязанный связанный дисульфидной связью гетеродимер, состоящий из двух разных гликопротеиновых субъединиц. TCR распознает и связывает чужеродный пептидный антиген, который сам по себе был связан представителем очень разнообразного класса белков главного комплекса гистосовместимости («МНС») и презентирован, связан с МНС, на поверхности антиген-презентирующих клеток («АПК»).
[00128] Хотя вариабельный TCR связывает чужеродный антиген, как было обозначено выше, передача сигнала Т-клеткам, свидетельствующего о том, что это связывание произошло, зависит от присутствия других, невариабельных, сигнальных белков, ассоциированных с TCR. Эти сигнальные белки в ассоциированной форме вместе называются комплексом CD3, что в данном документе вместе называются антигеном CD3.
[00129] Активация Т-клеточной цитотоксичности, таким образом, обычно в первую очередь зависит от связывания TCR с белком МНС, который сам по себе связан с чужеродным антигеном, локализованным на отдельной клетке. Только когда происходит это первоначальное связывание TCR-MHC может реализоваться CD3-зависимый сигнальный каскад, отвечающий за клональную экспансию Т-клеток и, в конечном итоге, Т-клеточная цитотоксичность.
[00130] Однако связывание антигена CD3 человека первым или вторым участком биспецифического антитела по настоящему изобретению активирует Т-клетки для оказания цитотоксического эффекта па другие клетки в отсутствие независимого связывания TCR-MHC. Это означает, что в Т-клетках могут быть цитотоксически активированы клонально независимым образом, т.е. таким способом, который не зависит от специфического клона TCR, который несет Т-клетка. Это обеспечивает активацию целого Т-клеточного компартмента, а не только специфических Т-клеток определенной клональной принадлежности.
[00131] В свете вышеизложенного обсуждения, таким образом, в особенно предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения предложено биспецифическое антитело, при этом эффекторный антиген представляет собой антиген CD3 человека. Биспецифическое антитело в соответствии с этим вариантом реализации настоящего изобретения может содержать, в целом, либо два, либо три вариабельных домена антитела.
[00132] В соответствии с дополнительными вариантами реализации настоящего изобретения другие эффекторные антигены, ассоциированные с лимфоидными клетками, которые связывает биспецифическое антитело по настоящему изобретению, могут представлять собой антиген CD16 человека, антиген NKG2D человека, антиген NKp46 человека, антиген CD2 человека, антиген CD28 человека или антиген CD25 человека.
[00133] В соответствии с другим вариантом реализации настоящего изобретения эффекторная клетка иммунной системы человека является представителем миелоидной клеточной линии человека. Предпочтительно эффекторная клетка может представлять собой моноцит человека, нейтрофильный гранулоцит человека или дендритную клетку человека. Предпочтительно, чтобы такая клетка оказывала либо цитотоксическое, либо апоптическое действие на клетку-мишень. Предпочтительные антигены в рамках этого варианта реализации, которые может связывать биспецифическое антитело по настоящему изобретению, могут представлять собой антиген CD64 человека или антиген CD89 человека.
[00134] В соответствии с другим вариантом реализации настоящего изобретения аптиген-мишепь представляет собой антиген, который уникальным образом экспрессирован на клетке-мишени или эффекторной клетке при патологическом состоянии, но который либо не экспрессируется, экспрессируется на низком уровне, либо недоступен при нормальном состоянии здоровья. Примеры таких антигенов-мишеней, которые может специфически связывать биспецифическое антитело но настоящему изобретению, предпочтительно могут быть выбраны из ЕрСАМ, CCR5, CD19, HER-2 neu, HER-3, HER-4, EGFR, PSMA, CEA, MUC-1 (муцин), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, βhCG, Lewis-Y, CD20, CD33, CD30, ганглиозида GD3, 9-O-ацетил-GD3, GM2, Globo H, фукозил-GM1, полисиаловой кислоты (ПСА), GD2, карбоангидразы IX (MN/CA IX), CD44v6, Sonic Hedgehog (Shh), Wue-1, плазмоцитарного антигена, (мембраносвязанного) IgE, хондроитинсульфат-протеогликана меланомы (MCSP), CCR8, предшественника ФНО-альфа, STEAP, мезотелина, антигена А33, антигена стволовых клеток простаты (PSCA), Ly-6; десмоглеина 4, нео-эпитопа Е-кардерина, рецептора фетального ацетилхолина, CD25, маркера СА19-9, маркера СА-125 и рецептора типа II мюллеровой ингибирующей субстанции (МНС), sTn (сталированный Tn-антиген; TAG-72), FAP (антигена активации фибробластов), эндосиалина, EGFRvIII, LG, SAS и CD63.
[00135] В соответствии с конкретным вариантом реализации изобретения антиген-мишень, который специфически связывает биспецифическое антитело, может представлять собой опухолеспецифический антиген, то есть антиген, связанный со злокачественными новообразованиями. Такой антиген либо экспрессирован, либо экспонирован на клетке злокачественного новообразования, тогда как указанный антиген либо не содержится, содержится в незначительном количестве, либо не экспонирован на нормальной клетке. Соответственно, биспецифическое антитело в соответствии с этим вариантом реализации настоящего изобретения представляет собой биспецифическое антитело, которое направляет активность эффекторных клеток иммунной системы против злокачественных клеток-мишеней, несущих антиген-мишень или обеспечивающих к нему доступ.
[00136] Генная терапия: в конкретном варианте реализации последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие связывающий белок, предложенный в данном документе, или другое профилактическое или терапевтическое средство, предложенное в данном документе, применяют для лечения, предотвращения, ведения или облегчения течения нарушения или одного, или более симптомов, ассоциированных с ними, путем генной терапии. Генная терапия относится к терапии, проводимой путем введения пациенту экспрессированной или экспрессируемой нуклеиновой кислоты. В этом варианте реализации нуклеиновые кислоты продуцируют кодируемое ими антитело или профилактическое, или терапевтическое средство, предложенное в данном документе, которое опосредует профилактический или терапевтический эффект.
[00137] Любой из способов генной терапии, доступных в данной области, может быть использован в соответствии с данным изобретением. В отношении общего обзора способов генной терапии см. Goldspiel et al. (1993) Clin. Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu (1991) Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev (1993) Ann Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan (1993) Science 260:926-932; Morgan and Anderson (1993) Ann Rev. Biochcm. 62:191-217; и May (1993) TIBTECH 11(5): 155-215. Способы, широко известные в области технологии рекомбинантных ДНК, которые могут быть использованы, описаны у Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); и Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990). Подробное описание различных способов генной терапии приведено в публикации патента США №. US 20050042664.
[00138] Диагностика: в настоящем описании также предложены применения в диагностических целях включая, в том числе, методы диагностического анализа, диагностические наборы, содержащие один или более связывающих белков, и адаптацию способов и наборов для применения в автоматических и/или полуавтоматических системах. Предложенные способы, наборы и адаптации могут быть использованы при выявлении, мониторинге и/или лечении заболевания или нарушения у индивидуума. Это дополнительно освещается ниже.
[00139] А. Способ анализа: в настоящем описании также предложен способ определения наличия, количества или концентрации аналита или его фрагмента в исследуемом образце с использованием по меньшей мере одного связывающего белка, который описан в данном документе. Любой подходящий анализ, который известен в данной области техники, может быть использован в данном способе. Примеры включают, в том числе, иммуноанализы и/или способы, подразумевающие использование масс-спектрометрии. Иммуноанализы, предложенные в настоящем описании, могут включать, в том числе, иммуноанализы сэндвич-типа, радиоиммуноанализ (РИА), ферментный иммуноанализ (ФИА), твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), иммуноанализы на основе конкурентного ингибирования, флуоресцентный поляризационный иммуноанализ (ФПИА), метод иммуноанализа с ферментативным усилением (EMIT), метод резонансного переноса энергии биолюминесценции (BRET) и гомогенный хсмилюминссцснтныс анализы. Примером иммуноанализа может послужить хемилюминесцентный иммуноанализ на микрочастицах, в частности, подразумевающий применение автоматического анализатора ARCHITECT (Abbott Laboratories, Abbott Park, Ill.). Способы, подразумевающие применение масс-спектрометрии, предложены в настоящем описании, и включают, в том числе, MALDI (матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация), или SELDI (усиленная поверхностью лазерная десорбция/ионизация).
[00140] Способы сбора, манипуляции, обработки и анализа биологических исследуемых образцов с использованием иммуноанализов и масс-спектрометрии, хорошо известные специалистам в данной области техники, предусмотрены для практического воплощения настоящего изобретения (US 2009-0311253 A1).
[00141] В. Набор: также предложен набор для анализа исследуемого образца на наличие, количество или концентрацию аналита или его фрагмента в исследуемом образце. Набор содержит по меньшей мере один компонент для анализа исследуемого образца на наличие аналита или его фрагмента и инструкции для анализа исследуемого образца на наличие аналита или его фрагмента. По меньшей мере один компонент для анализа исследуемого образца на наличие аналита или его фрагмента может включать композицию, содержащую связывающий белок, который описан в данном документе, и/или связывающий белок, специфичный по отношению к аналиту (или его фрагменту, варианту или фрагменту варианта), который необязательно иммобилизован на твердой фазе. Набор необязательно может содержать калибратор или контроль, который может содержать выделенный или очищенный аналит. Набор может содержать по меньшей мере один компонент для анализа исследуемого образца на наличие аналита путем иммуноанализа и/или масс-спектрометрии. Компоненты набора, включающие аналит, связывающий белок, и/или связывающий белок, специфичный по отношению к аналиту, или его фрагмент, необязательно могут быть меченными с использованием любой известной в данной области техники детектируемой меткой. Материалы способы создания, предусмотренные для практического воплощения настоящего изобретения, известны специалистам в данной области техники (US 2009-0311253 A1).
[00142] С. Адаптация набора и способа: набор (или его компоненты), а также способ определения наличия, количества или концентрации аналита в исследуемом образце с помощью анализа, такого как иммуноанализ, который описан в данном документе, могут быть адаптированы для применения в целом ряде автоматических и полуавтоматических систем (включая те, в которых твердая фаза содержит микрочастицы), которые описаны, например, в патентах США №5089424 и 5006309 и которые коммерчески доступны на рынке, например, Abbott Laboratories (Abbott Park, Ill.), в качестве ARCHITECT. Другие платформы, доступные от Abbott Laboratories, включают, в том числе, AxSYM, IMx (см., например, патент США №5294404, PRISM, EIA (bead) и Quantum™ II, а также другие платформы. В дополнение к этому, анализы, наборы и компоненты набора могут быть использованы в других форматах, например, на потенциометрических или других переносных, или портативных аналитических системах. Настоящее изобретение, например, применимо к коммерческой портативной системе Abbott (i-STAT, Abbott Laboratories) для потенциометрического иммуноанализа, которая осуществляет иммуноанализы сэндвич-типа. Иммуносенсоры и способы их изготовления и эксплуатации в испытательных устройствах одноразового применения описаны, например, в патентах США №.5063081, 7419821 и 7682833; и публикациях патентов США №.20040018577, 20060160164 и 20090311253. Специалистам в данной области техники без труда станет понятно, что другие подходящие модификации и адаптации способов, описанных в данном документе, являются очевидными и могут быть применены с использованием подходящих эквивалентов, не отклоняясь от объема вариантов реализации изобретения, описанных в данном документе. Из подробного описания определенных вариантов реализации изобретения они будут в большей степени понятны посредством ссылки на следующие примеры, которые включены только с иллюстративной целью и не носят ограничительного характера.
[00143] Хотя вышеизложенное изобретение было довольно подробно описано в качестве иллюстрации и примера в целях обеспечения ясности понимания, специалисту в данной области техники без труда будет понятно в свете идей настоящего изобретения, что определенные изменения и модификации могут быть внесены в настоящее изобретение без отступления от сущности и объема прилагаемой формулы изобретения. Следующие примеры приведены только с иллюстративной целью и не носят ограничительного характера. Специалистам в данной области техники без труда будут понятен целый ряд некритических параметров, которые могут быть изменены или модифицированы, с получением, по сути, подобных результатов.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Конструирование, экспрессия, очистка и анализ иммуноглобулина с тандемным расположением Fab-фрагментов, специфичного по отношению к ИЛ-17/ИЛ-20 (FIT-Ig)
[00144] Чтобы продемонстрировать технологию FIT-Ig, была создана группа молекул FIT-Ig, специфичных по отношению к ИЛ-17/ИЛ-20: FIT1-Ig, FIT2-Ig и FIT3-Ig, все из которых содержат 3 разных полипептида, как показано на Фигуре 1, где антиген А представляет собой ИЛ-17, а антиген В представляет собой ИЛ-20. ДНК-конструкция, использованная для создания FIT-Ig, способного к связыванию ИЛ-17 и ИЛ-20, проиллюстрирована на Фигуре 1 В. Вкратце, родительские мАт включали два высокоаффинных антитела, антитело к ИЛ-17 (клон LY) (патент США №7838638) и антитело к hIL-20 (клон 15D2) (публикация заявки на патент США №US2014/0194599). Для создания конструкции FIT-Ig №1, VL-CL клона LY непосредственно (FIT1-Ig) или через линкер, состоящий из 3 аминокислот (FIT2-Ig) или 7 аминокислот (FTT3-Ig), был слит с N-концом тяжелой цепи 15D2 (как показано в Таблице 1). Конструкция №2 представляет собой VH-CH1 клона LY, а третья конструкция представляет собой VL-CL клона 15D2. Три конструкции для каждого FIT-Ig были котрансфицированы в клетки 293, что приводило к экспрессии и секреции белка FIT-Ig.
[00145] Также была создана группа молекул FIT-Ig, специфичных по отношению к ИЛ-17/ИЛ-20: FIT4-Ig, FIT5-Ig и FIT6-Ig, каждая из которых содержит 2 разных полипептида, как показано на Фигуре 2. ДНК-конструкции, использованные для создания FIT-Ig, способного к связыванию ИЛ-17 и ИЛ-20, проиллюстрированы на Фигуре 2 В, где антиген А представляет собой ИЛ-17, а антиген В представляет собой ИЛ-20. Вкратце, родительские мАт включали два высокоаффинных антитела, антитело к ИЛ-17 (клон LY) и антитело к hIL-20 (клон 15D2). Для создания конструкции FIT-Ig №1, VL-CL клона LY непосредственно (FIT4-Ig) или через линкер, состоящий из 3 аминокислот (FIT5-Tg) или 7 аминокислот (FIT6-Ig), был слит с N-концом тяжелой цепи 15D2 (как показано в Таблице 1). Для создания конструкции FIT-Ig №4, VH-CH1 клона LY непосредственно (FIT4-Ig) или через линкер, состоящий из 3 аминокислот (FIT5-Ig) или 7 аминокислот (FIT6-Ig), был слит с N-концом легкой цепи 15D2. 2 ДНК-конструкции (конструкция №1 и №4) для каждого FIT-Ig были котрансфицированы в клетки 293, что приводило к экспрессии и секреции белка FIT-Ig. Методики ПЦР-клонирования подробно описаны ниже
Пример 1.1: молекулярное клонирование FIT-Ig, специфичных по отношению к ИЛ-17/ИЛ-20:
[00146] Для клонирования конструкции №1 легкую цепь LY амплифицировали путем ПЦР с использованием прямых праймеров, гибридизующихся с сигнальной последовательностью легкой цепи, и обратных праймеров, гибридизующихся с С-концом легкой цепи. Тяжелую цепь 15D2 амплифицировали путем ПЦР с использованием прямых праймеров, гибридизующихся с N-концом 15D2 VH, и обратных праймеров, гибридизующихся с С-концом СН. Эти 2 ПЦР-фрагмента разделяли на агарозном геле и объединяли с помощью ПЦР с перекрывающимися праймерами с использованием пары праймеров для сигнального пептида и СН. Объединенный ПЦР-продукт клонировали в вектор для экспрессии в клетках 293, который изначально содержал последовательность Fc-области человека.
[00147] Для клонирования конструкции №2 LY VH-CH1 амплифицировали путем ПЦР с использованием прямых праймеров, гибридизующихся с сигнальным пептидом тяжелой цепи, и обратного праймера, гибридизующегося с С-концом СН1. ПЦР-продукт разделяли на агарозном геле до клонирования в вектор для экспрессии в клетках 293.
[00148] Для клонирования конструкции №3 легкую цепь 15D2 амплифицировали путем ПЦР с использованием прямого праймера, гибридизующегося с N-концом сигнального пептида легкой цепи, и обратного праймера, гибридизующегося с концом CL. ПЦР-продукт разделяли на агарозном геле до клонирования в вектор для экспрессии в клетках 293.
[00149] Для клонирования конструкции №4 LY VH-CH1 амплифицировали путем ПЦР с использованием прямого праймера, гибридизующегося с N-концом сигнального пептида тяжелой цепи, и обратного праймера, гибридизующегося с концом CH1. 15D2 VL амплифицировали с использованием праймеров, гибридизующихся с концом 15D2 VL. Оба ПЦР-продукта разделяли на агарозном геле и объединяли с помощью ПЦР с перекрывающимися праймерами. Объединенный ПЦР-продукт разделяли на агарозном геле клонировали в вектор для экспрессии в клетках 293. В Таблице 2 показаны последовательности ПЦР-праймеров, использованных для описанного выше клонирования.
[00150] Полученные в результате последовательности hTL-17/hTL-20 FTT1-Ig, FTT2-Ig, FIT3-Ig, FTT4-Ig, FTT5-Ig и FIT6-Ig приведены в Таблице 3.
Пример 1.2: экспрессия, очистка и анализ белков FIT-Ig, специфичных по отношению к ИЛ-17/ИЛ-20:
6
2
[00151] Все ДНК-конструкции каждого FIT-Ig субклонировали в векторы на основе pBOS и секвенировали в целях обеспечения точности. Конструкцию №1, №2 и №3 каждого FIT-Ig (1, 2 и 3) или конструкцию №1 и №4 каждого FIT-Ig (4, 5 и 6) подвергали временной коэкспрессии с использованием гюлиэтиленимина (ПЭИ) в клетках 293Е. Вкратце, ДНК в среде для экспрессии FreeStyle™ 293 Expression Medium смешивали с ПЭИ в соотношении конечной концентрации ДНК к ПЭИ 1:2, инкубировали в течение 15 мин (не более, чем 20 мин) при комнатной температуре и затем добавляли к клеткам 293Е (1,0-1,2 × 10/мл, жизнеспособность клеток > 95%) в концентрации 60 мкг ДНК/120 мл культуры. Через 6-24 часа культивирования на шейкере к трансфецированным клеткам добавляли пептон в конечной концентрации 5% со встряхиванием при 125 об/мин при 37°С, 8% CO. На 6-7-е сутки супернатант собирали путем центрифугирования и фильтрации, а белок FIT-Ig очищали с использованием хроматографии на белке А (Pierce, Rockford, ИЛ) в соответствии с инструкциями производителя. Белки анализировали с помощью электрофореза в ДСП-ПААГ, а их концентрации определяли по поглощению А280 и с использованием ВСА (Pierce, Rockford, ИЛ).
[00152] Для экспрессии FIT1-Ig, FIT2-Ig и FIT3-Ig использовали разные молярные соотношения ДНК для 3 конструкций, включая соотношение конструкций №1:№2:№3 = 1:1:1, соотношение конструкций №1:№2:№3 = 1:1,5:1,5 и соотношение конструкций №1:№2:№3 = 1:3:3 (Таблица 4). Белки FIT-Ig очищали с использованием хроматографии на белке А. Выход очищенного белка (7-16 мг/л) был сопоставим с содержанием hIgG в среде для экспрессии для каждого белка. Состав и содержание очищенных FIT-Ig анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ как в восстанавливающих, так и невосстанавливающих условиях. В невосстанавливающих условиях FIT-Ig мигрировал в виде одной дорожки, соответствующей приблизительно 250 кДа. В восстанавливающих условиях при разгонке каждого из белков FIT-Ig получали две дорожки, одна дорожка с более высокой молекулярной массой относится к конструкции №1 приблизительно 75 кДа, и одна дорожка с более низкой молекулярной массой соответствует как конструкции №2, так и №3, которые перекрываются при приблизительно 25 КДа. Электрофорез в ДСН-ПААГ показал, что каждый FIT-Ig экспрессируется в виде одного продукта, и 3 полипептидные цепи эффективно объединяются в пары с образованием IgG-подобной молекулы. Размеры цепей, а также полноразмерных молекул белков FIT-Ig сопоставимы с рассчитанной для них молекулярной массой на основе аминокислотных последовательностей.
[00153] Для дополнительного изучения физических свойств FIT-Ig в растворе использовали эксклюзионную хроматографию (ЭХ) для анализа каждого белка. Для ЭХ-анализа FIT-Ig, очищенный FIT-Ig в PBS наносили на колонку TSKgel SuperSW3000, 300 × 4,6 мм (TOSON). Прибор для ВЭЖХ, Model U3000 (DIOHEKC),использовали для ЭХ. Все белки определяли с использованием УФ-детекции при 280 нм и 214 нм. Использовали изократическое элюирование со скоростью потока 0,25 мл/мин. Все 3 белка FIT-Ig характеризовались наличием одного основного пика, демонстрирующего физическую гомогенность в виде мономерных белков (Таблица 4). Соотношение конструкции №1:№2:№3 = 1:3:3 показало лучший мономерный профиль по результатам ЭХ для всех 3 белков FIT-Ig (Таблица 4).
[00154] В Таблице 4 также показано, что уровни экспрессии всех белков FIT-Ig сопоставимы с таковыми стандартных мАт, что означает, что FIT-Ig может быть экспрессирован эффективно в клетках млекопитающих. Для экспрессии FIT4-Ig FIT5-Ig и FIT6-Ig соотношение ДНК конструкции №1:№4 = 1:1, и уровень экспрессии находился в пределах 1-10 мг/л, и процентное содержание мономерной фракции в хроматографическом пике, которое было установлено с помощью ЭХ, находилось в пределах 58-76%. На основе результатов, полученных для этой конкретной комбинации мАт (LY и 15D2), конструкции FIT-Ig, состоящие из 3 полипептидов (FIT1-Ig, FIT2-Ig и FIT3-Ig), показали лучший профиль экспрессии, чем таковой конструкций FIT-Ig, состоящих из 2 полипептидов (FIT4-Ig, FIT5-Ig и FIT6-Ig), поэтому FIT1-Ig, FIT2-Ig и FIT3-Ig подвергались дополнительному анализу на предмет функциональных свойств.
Пример 1.3 Определение антигенсвязывающей аффинности FIT-Ig, специфичного по отношению к ИЛ-17/ИЛ-20
[00155] Кинетику связывания FIT-Ig phIL-17 и phIL-20 определяли с помощью поверхностного плазмонного резонанса (Таблица 5) с использованием прибора Biacore Х100 (Biacore АВ, Уппсала, Швеция) с использованием HBS-ЕР (10 мМ HEPES, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA и 0,005% поверхностно-активного вещества Р20) при 25°С. Вкратце, поликлоналыгое козье антитело, специфическое по отношению к Fcγ-фрагменту IgG человека (Pierce Biotechnology Inc, Rockford, ИЛ), непосредственно иммобилизировали по всей площади биосенсорного чипа СМ5 для исследовательских целей с использованием стандартного набора для присоединения через аминогруппу в соответствии с инструкциями производителя. Образцы очищенного FIT-Ig разводили в забуференном HEPES солевом растворе для захвата по всей площади реакционых поверхностей, содержащих козьий IgG к Fc-фрагменту человека, и пропускали по реакционным матрицам со скоростью потока 5 мкл/мин. Константы скоростей ассоциации и диссоциации, Kon (М-1 с-1) и koff (с-1) определяли при постоянной скорости потока 30 мкл/мин. Константы скорости были получены путем проведения измерений кинетики связывания при десяти разных концентрациях антигенов в пределах от 1,25 до 1000 нМ. Затем была рассчитана равновесная константа диссоциации (М) реакции между FIT-Ig и белками-мишенями, исходя из кинетических констант скорости по следующей формуле: KD=koff/Kon. Аликвоты образцов антигенов также одновременно пропускали через контрольную ячейку и реакционную поверхность чипа СМ для регистрации и вычитания любого неспецифического фонового связывания для удаления большинства изменений показателя преломления и неспецифического сигнала, возникающего при протекании антигена. Поверхности подвергали регенерации путем двух последовательных пропусканий 25 мл 10 мМ Глицина (рН 1,5) со скоростью потока 10 мкл/мин. Поверхности с иммобилизованным антителом к Fc-фрагменту были полностью регенерированы и полностью сохранили свойственную им способность к захвату на протяжении двенадцати циклов.
[00156] Анализ Biacore свидетельствовал о том, что общие параметры связывания трех FIT-Ig с hIL-17 и hIL-20 были похожи, причем значения аффинности FIT-Ig были очень близки значениям родительского мАТ LY и 15D2, и не наблюдалось никакой утраты аффинности связывания по отношению к любым антигенсвязывающим доменам (Таблица 5).
[00157] В дополнение к этому, тетравалентное биспецифическое связывание антигена FIT-Ig также анализировали с помощью Biacore. Сначала осуществляли связывание FIT1-Ig с использованием козьего антитела к Fc-фрагменту имуноглобулина человека на сенсорном чипе Biacore, а также пропускали первый антиген и наблюдали сигнал, свидетельствующий о связывании. По мере насыщения FIT1-Ig первым антигеном затем пропускали второй антиген и регистрировали второй сигнал. Это осуществляли либо путем пропускания сначала ИЛ-17, а затем ИЛ-20, либо путем пропускания сначала ИЛ-20, а затем ИЛ-17 для FIT2-Ig (Фигура 3). В любой последовательности было обнаружено биспецифическое связывание, и связывание обеих антигенов достигало насыщения при 25-30 RU. Подобные результаты были получены для FIT2-Ig и FIT3-Ig. Таким образом, каждый FIT-Ig был способен связывать оба антигена одновременно, будучи биспецифической тетравалентной молекулой.
[00158] Профиль экспрессии и свойства бивалентного связывания FIT-Ig ясно продемонстрировали, что в молекуле FIT-Ig оба домена VL-CL правильно соединялись с соответствующими доменами VH-СН1 с образованием 2 функциональных связывающих доменов, и они были экспрессированы в виде одного мономерпого, тетравалентного и биспецифического полиоразмерпого белка FIT-Ig. Это происходило в отличие от типа молекул мультивалентных антител (Miller and Presta, патент США 8722859), которые характеризовались свойствами тетравалентного, а не моноспецифического связывания с одним антигеном-мишенью.
Пример 1.4 Определение биологической активности FIT-Ig, специфичного по отношению к ИЛ-17/ИЛ-20
[00159] Биологическая активность FIT-Ig в отношении нейтрализации функции ИЛ-17 была оценена с использованием биоанализа GROα. Вкратце, клетки Hs27 высевали в количестве 10000 клеток/50 мкл/лунка в 96-луночные планшеты. FIT-Ig или контрольное антитело к ИЛ-17 (25 мкл) добавляли в лунки в двух повторностях с начальной концентрацией 2,5 нМ с последующими серийными разведениями 1:2 до 5 пМ. Затем в каждую лунку добавляли ИЛ-17А (25 мкл). Конечная концентрация ИЛ-17А составляла 0,3 нМ. Клетки инкубировали при 37°С в течение 17 ч до сбора культурального супернатанта. Концентрации GRO-α в культуральных супернатантах измеряли с помощью набора human CACL1/GRO alpha Quantihine kit в соответствии с протоколом производителя (R&D системах).
+
[00160] Биологическая активность FIT-Ig в отношении нейтрализации функции ИЛ-20 была оценена с использованием анализа пролиферации клеток ИЛ-20КBAF3. Вкратце, 25 мкл рекомбинантного ИЛ-20 человека в концентрации 0,8 нМ добавляли в каждую лунку 96-луночных планшетов (конечная концентрация ИЛ-20 составляла 0,2 нМ). Антитело к ИЛ-20 или FIT-Ig, или другое контрольное антитело разводили до 400 нМ (рабочая концентрация составляла 100 нМ) с последующими 5-кратными серийными разведениями и добавляли в 96-луночныс аналитические планшеты (25 мкл на лунку). Клетки BAF3, стабильно трансфецированные геном рецептора ИЛ-20, затем добавляли в каждую лунку в концентрации 10000 клеток/лунка в объеме 50 мкл ОБ/МИН1 1640 плюс 10% FBS, Гигромицин В в концентрации 800 мкг/мл, G418 в концентрации 800 мкг/мл. Через 48 ч после инкубации 100 мкл буфера CellTitter-Glo Luminescent добавляли в каждую лунку. Содержимое перемешивали в течение 2 минут на орбитальном шейкере для индукции клеточного лизиса, и планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут для стабилизации люминесцентного сигнала. Уровень люминесценции определяли с помощью SpectraMax М5.
[00161] Как показано в Таблице 5, все FIT-Ig были способны к нейтрализации как hIL-20, так и hIL-17 со значениями аффинности, сходными с таковых родительских антител. На основе функционального анализа с использованием как Biacore, так и анализов на клетках по выявлению нейтрализующих антител, установлено, что все 3 FIT-Ig полностью сохраняют уровни активности родительских мАт. Не было выявлено никаких значительных функциональных различий среди трех FIT-Ig, что означает, что присутствие линкера было необязательным, и что конструкция FIT-Ig обеспечивала достаточную гибкость и соответствующие размерные параметры для двойного связывания в отсутствие пептидного спейсера между 2 Fab-связывающими областями. Это происходило в отличие от DVD-типа молекул, в которых линкер между 2 вариабельными доменами на каждой из 2 полипептидных цепей требуется для сохранения уровней активности нижнего (второго) вариабельного домена.
Пример 1.5 Исследование стабильности FIT-Ig, специфичного по отношению к ИЛ-17/ИЛ-20
[00162] Образцы белка FIT1-Ig в цитратном буфере (рН=6,0) по отдельности инкубировали при постоянной температуре 4°С, 25°С и 40°С в течение 1 суток, 3 суток и 7 суток; аналогичным образом, образцы белка FIT1-Ig подвергали замораживанию-опаиванию один, два или три раза. Фракционный состав интактного полноразмерного мономерного белка во всех образцах определяли с помощью ЭХ-ВЭЖХ, причем 10 мкг каждого образца белка вводили в колонку Utimate 3000 HPLC equipping Superdex200 5/150 GL со скоростью потока 0,3 мл/мин в течение 15 мин, и регистрировали результаты измерений, а также анализировали с использованием программного обеспечения Chromeleon, поставляемого производителем. В Таблице 6 показано, что в этих условиях температурного воздействия сохранялась полпоразмерная интактная мономерная молекула FIT-Ig и FIT3-Ig.
Пример 1.6 Исследование растворимости FIT-Ig, специфичного по отношению к ИЛ-17/ИЛ-20
[00163] Растворимость FIT1-Ig анализировали на основании преципитации в присутствии увеличивающейся концентрации PEG6000 (РЕG6000 покупали от Shanghai lingfeng chemical reagent со.Ltd). Вкратце, растворимость белка в присутствии PEG6000 оценивали в зависимости от концентрации PEG6000 (0, 5%, 10%, 15%, 20%, 25% и 30%). исследования растворимости проводили при температуре 25°С при рН раствора 6,0. Вкратце, белок преципитировали путем смешивания соответствующего количества забуференных стоковых растворов белка, PEG и буфера для получения требуемой концентрации компонентов, конечный объем доводили до 200 мкл, и концентрацию белка устанавливали па уровне 1,0 мг/мл. Конечные растворы тщательно перемешивали и уравновешивали в течение 16 ч. После уравновешивания растворы центрифугировали при 13000 об/мин в течение 10 мин для разделения белкового преципитата. Растворимость белка была оценена при 280 нм с использованием Spectra Мах Plus384 (Molecular Device) и получена из значений абсорбции супернатанта и расчета концентрации на основе калибровочной кривой для определения концентрации белка (Фигура 4А). Также было проанализировано коммерческое антитело Ритуксан с использованием того же экспериментального метода при 3 разных условиях рН (Фигура 4В). Установлено, что растворимость белка зависит от условий рН, и что предсказанная растворимость FIT-Ig попадает в пределы растворимости моноклональных антител.
Пример 1.7 Исследование фармакокинетических свойств FIT-Ig, специфичного по отношению к ИЛ-17/ИЛ-20
[00164] Фармакокинетические свойства FIT-Ig оценивали на самцах крыс линии Спрэг-Доули (СД). Белки FIT-Ig вводили самцам крыс линии СД внутривенно в однократной дозе 5 мг/кг через канюлю, введенную в яремную вену, или под кожу на спине. Образцы сыворотки крови собирали через разные интервалы времени на протяжении 28 суток при серийном взятии образцов крови из хвостовой вены в различных временных точках - 0, 5, 15 и 30 мин; 1, 2, 4, 8 и 24 ч; и на 2, 4, 7, 10, 14, 21 и 28-е сутки; образцы анализировали на связывание ИЛ-17 и/или ИЛ-20 человека методом ИФА. Вкратце, планшеты для ИФА покрывали козьим антителом к биотину (5 мкг/мл, 4°С, на протяжении ночи), блокировали с использованием Superblock (Pierce) и инкубировали с биотинилированным ИЛ-17 человека (ИФА захвата ИЛ-17) или ИЛ-20 (ИФА захвата ИЛ-20) в концентрации 50 нг/мл в 10% Superblock ТТВ8 при комнатной температуре в течение 2 ч. Образцы сыворотки крови подвергали серийному разведению (0,5% сыворотка крови, 10% Superblock в ТТВS) и инкубировали в планшетах в течение 30 мин при комнатной температуре. Детекцию осуществляли с использованием меченого пероксидазой хрена козьего антитела к иммуноглобулину человека, а концентрации определяли при помощи калибровочных кривых с использованием четырехпараметрической логистической аппроксимации. У нескольких животных, особенно в группе с подкожным введением, отмечалось резкое снижение концентраций FIT-Ig через 10 суток, вероятно, из-за развития реакции на антитела человека. Этих животных исключали из итоговых расчетов. Значения фармакокинетических параметров определяли с помощью некомпартментной модели с использованием программного обеспечения WinNonlin (Pharsight Corporation, Маунтин-Вью, Калиф.).
~
~
[00165] Исследование ФК-параметров на крысах, концентрации FIT1-Ig в сыворотке крови были очень похожими при определении двумя разными методами ИФА, что означает, что молекула была интактной и способной к связыванию обоих антигенов in vivo. При внутривенном введении FIT1-Ig характеризовался бифазным фармакокинетическим профилем, состоящим из фазы распределения с последующей фазой выведения, который был похож на ФК-профиль стандартной молекулы IgG. Фармакокинетические параметры, рассчитанные на основе двух разных аналитических методов, были очень похожими и показаны в Таблице 7. Клиренс FIT-Ig был низким (12 мл/сутки/кг), причем низкий объем распределения (Vss130 мл/кг) приводил к увеличению периода полувыведения (Т1/2>10 суток). После подкожного введения FIT-Ig всасывался медленно, причем максимальная концентрация в сыворотке крови, равная приблизительно 26,9 мкг/мл, достигалась через 4 суток после введения. Конечный элиминационный период полувыведения составлял примерно 11 суток, а биодоступность при подкожном введении была близка 100%. Эти результаты продемонстрировали, что свойства FIT1-Ig очень похожи на свойства стандартной молекулы IgG in vivo, что свидетельствует о потенциале для его применения в терапевтических целях с использованием сопоставимых режимов дозирования.
[00166] Исследование фармакокинетики FIT-Ig продемонстрировало поразительное достижение в области разработки мультиспецифических Ig-подобных биопрепаратов. Система для исследования фармакокинетических параметров на крысах широко используется в фармацевтической промышленности для доклинической оценки терапевтических мАт и позволяет точно предсказать фармакокинетический профиль мАт у людей. Благодаря длительному периоду полувыведения и низкому клиренсу FIT-Ig становится возможным обеспечение терапевтического эффекта при хроническом применении при снижении частоты введения алогично терапевтическим мАт. В дополнение к этому, FIT-Ig, будучи на 100 кДа большим, чем IgG, как оказалось, проникал эффективно в ткани, исходя из его IgG-подобного параметра объема распределения, определенного из исследования ФК-парамеров.
Пример 1.8 Исследование создания стабильной линии клеток FIT-Ig СНО
6
5
5
2
[00167] Было установлено, что временно трансфецированные клетки 293Е успешно вырабатывают FIT-Ig. Для того чтобы дополнительно определить осуществимость производства FIT-Ig, проводили стабильную трансфекцию как клеточной линии СНО-DG44, так и СНО-S и последующую селекцию клонов, а также анализ выработки белка. Вкратце, клетки СНО трансфецировали путем злектропорации с использованием 8×10 клеток в 400 мкл раствора для трансфекции и 20 мкг ДНК (для клеток СНО DG44) или 25 мкг ДНК (для клеток СНО-S), субклонировали в вектор Freedom рСНО (Life Technologies). Селекцию стабильной клеточной линии проводили с использованием стандартных методик. Вкратце, для селекции СНО-DG44 после трансфекции проводили селекцию пула стабильных (-НТ/2Р/400G, где Р представляет собой мкг/мл Пуромицина, G представляет собой мкг/мл G418), и анализировали выработку белка с помощью ИФА содержания IgG. Проводили селекцию клеточных пулов с наибольшей продуктивностью и в дальнейшем амплифицировали на протяжении нескольких раундов с использованием увеличивающихся концентраций МТХ (50, 100, 200 и 500 нМ), затем проводили анализ выработки белка с помощью ИФА содержания IgG. Затем проводили селекцию клеточных пулов с наибольшей продуктивностью для субклонирования. Для селекции клеток СНО-S первую фазу селекции осуществляли в среде, содержащей 10Р/400G/100М (М представляет собой нМ МТХ), затем проводили анализ выработки белка. Затем проводили селекцию клеточных пулов с наибольшей продуктивностью и в дальнейшем осуществляли вторую фазу селекции либо в 30Р/400G/500М, либо 50Р/400G/1000М, затем оценивали выработку белка с помощью ИФА. Затем проводили селекцию клеточных пулов с наибольшей продуктивностью для субклонирования. Для анализа выработки белка полностью восстановленные клеточные пулы (жизнеспособность >90%) высевали в количестве 5×10 жизнеспособных клеток/мл (СНО DG44) или 3×10 жизнеспособных клеток/мл (СНО-S) с использованием 30 мл свежей среды (среда CD FortiCHO™ дополненная 6 мМ L-глутамина) в шейкерные флаконы объемом 125 мл. Клетки инкубировали на орбитальном шейкере при 37°С, 80% относительной влажности, 8% CO и 130 об/мин. Образцы культур анализировали ежесуточно или через регулярные интервалы времени (например, на 0-е, 3-е, 5-е, 7-е, 10-е, 12-е и 14-е сутки), чтобы определить плотность клеток, жизнеспособность и уровень выработки белка до тех пор, пока жизнеспособность культур не снижалась до 50% или по достижению 14-х суток культивирования. После получения образцов при необходимости в культуры добавляли глюкозу.
[00168] Общий процесс создания стабильной клеточной линии FIT1-Ig СНО в целом подобен процессу получения моноклональных антител в клетках СНО. Например, на протяжении анализа пула DG44 при 2Р/400G VCD продолжал увеличиваться до 10-12-х суток вплоть до примерно 1,3Е7, тогда как жизнеспособность клеток сохранялась на уровне выше 80% вплоть до 13-14-х суток и уровень выработки достигал почти 40 мг/мл на 14-е сутки (Фигура 5А). После амплификации при 5Р/400G/50М уровень выработки достигал выше 50 мг/мл на 14-с сутки (Фигура 5В). В случае селекции клеток СНО-S титр достигал выше 200 мг/мл на протяжении фазы 1 селекции (Фигура 5С) и выше 370 мг/мл на фазе 2 селекции (Фигура 5D). Эти уровни выработки подобны таковым, что ранее отмечались при получении стандартных человеческих мАт в нашей лаборатории, что указывает па то, что FIT-Ig характеризуется мАт-подобной осуществимостью производства для применений в коммерческих целях.
Пример 2: Конструирование, экспрессия и очистка иммуноглобулина с тандемным расположением Fab-фрагментов (FIT-IG), специфичного по отношению к CD3/CD20
[00169] Чтобы продемонстрировать, способен ли FIT-Ig связываться с антигенами клеточной поверхности, была создана молекула FIT-Ig FIT7-18 и FIT8-Ig, специфичная по отношению к CD3/CD20, которая представляет собой состоящую из 3 полипептидов конструкцию, которая показана на Фигуре 1. Конструкция, использованная для создания FIT-Ig, способного к связыванию CD3 и CD20 клеточной поверхности, проиллюстрирована на Фигуре 1В. Вкратце, родительские мАт включали два высокоаффинных антитела, антитело к CD3 (OKT3) и антитело к CD20 (Офатумумаб). Для создания конструкции FIT7-Ig №1 VL-CL OKT3 был непосредственно слит (FIT7-Ig) или через линкер, состоящий из 7 аминокислот (FIT8-Ig), с N-концом тяжелой цепи Офатумумаба (как показано в Таблице 8). Конструкция №2 представляет собой VH-СН1 OKT3, а третья конструкция представляет собой VL-CL Офатумумаба. Три конструкции для FIT-Ig были котрансфецированы в клетки 293, что приводило к экспрессии и секреции белков FIT-Ig. Подробно описанные методики ПЦР-клонирования описаны ниже:
Пример 2.1 молекулярное клонирование FIG-Ig, специфичного по отношению к CD3/CD20:
[00170] Были использованы аналогичные способы молекулярного клонирования, что и для FIT-Ig, специфичного но отношению к hIL-17/hIL-20.
[00171] В Таблице 9 показана последовательности ПЦР-праймеров, использованных для молекулярного конструирования, описанного выше.
[00172] Полученные в результате последовательности FIT-Ig, специфичного по отношению к CD3/CD20, представлены в Таблице 10.
Пример 2.2 Экспрессия и очистка FIT-Ig, специфичного по отношению к CD3/CD20:
6
2
[00173] Все ДНК-конструкции каждого FIT-Ig субклонировали в векторы на основе pBOS и секвенировали в целях обеспечения точности. Конструкция №1, №2 и №3 каждого FIT-Ig подвергали временной коэкспрессии с использованием полиэтиленимина (ПЭИ) в клетках 293Е. Вкратце, ДНК в среде для экспрессии FreeStyle™ 293 Rxpression Medium смешивали с ПЭИ в соотношении конечной концентрации ДНК к ПЭИ 1:2, инкубировали в течение 15 мин (не более чем 20 мин) при комнатной температуре и затем добавляли к клеткам 293Е (1,0-1,2×10/мл, жизнеспособность клеток >95%) при 60 мкг ДНК/120 мл культуральной среды. Через 6-24 часа культивирования на шейкере, добавляли пептон к трансфецированным клеткам в конечной концентрации 5% со встряхиванием при 125 об/мин при 37°С, 8% CO. На 6-7-е сутки супернатант собирали путем центрифугирования и фильтрации, а белок FIT-Ig очищали с использованием хроматографии на белке А (Pierce, Rockford, ИЛ) в соответствии с инструкциями производителя. Белки анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и их концентрацию определяли по поглощению А280 и с использованием ВСА (Pierce, Rockford, ИЛ) (Таблица 11).
Пример 2.3 Уровни связывания молекул FIT-Ig, специфичных по отношению к CD3/CD20:
5
[00174] Связывание FIT-Ig, специфичного по отношению к CD3/CD20, с обеими мишенями анализировали с помощью FACS с использованием клеток Jurcat, которые экспрессируют CD3 на клеточной поверхности, а также клеток Raji, которые экспрессируют CD20 на клеточной поверхности. Вкратце, 5×10леток промывали в охлажденном на льду FBS и блокировали 2% FBS на льду в течение 1 ч. Клетки инкубировали с антителом, FIT-Ig (100 нМ), или изотипическим контролем на льду в течение 1 ч промывали 3 раза FBS. Добавляли вторичное антитело (козьи антитела к IgG человека, меченные Alexa Fluor 488, Invitrogen) и инкубировали с клетками на льду в течение 1 ч в темноте, затем промывали три раза FBS. Образцы анализировали с помощью FACs calibur. Связывание с клеточной поверхностью показывают, что как FIT7-Ig, так и FIT8-Ig были способны к связыванию с обоими антигенами клеточной поверхности CD3 и CD20 в зависимости от концентрации. По сравнению с уровнями связывания родительских мАт Интенсивность связывания FIT-Ig с CD3 на клетках Jurcat снижалась, по интенсивность связывания с CD20 па клетках Raji повышалась. Во всех исследованиях по связыванию отмечались аналогичные уровни связывания FIT7-Ig и FIT8-Ig с обоими антигенами, что свидетельствовало о том, что линкер не оказывал значительного влияния на способность связывания с FIT8-Ig (Таблица 12).
Пример 3: Конструирование, экспрессия и очистка иммуноглобулина с тандемным расположением Fab-фрагментов (FIT-Ig), специфичного к ФНО/ИЛ-17
[00175] Также был создан другой FIT-Ig, который может связываться с ИЛ-17 человека и TNFα человека (FIT9-Ig) с использованием клона LY мАт, специфичного по отношению к ИЛ-17, и мАт Голимумаб, специфичного по отношению к ФНО, в виде 3-х полипептидных конструкций, которые показаны на Фигуре 1. Для создания конструкции FIT9-Ig №1, VL-CL Голимумаба был слит непосредственно с N-концом тяжелой цепи LY (как показано в Таблице 13). Конструкция №2 представляет собой VH-СН1 Голимумаба, а третья конструкция представляет собой VL-CL клона LY. Три конструкции для получения FIT9-Ig были котрансфецированы в клетки 293, что приводило к экспрессии и секреции белков FIT9-Ig. Полученные в результате последовательности FIT-Ig, специфичного по отношению к ФНО/ИЛ-17, представлены в Таблице 14.
Пример 3.1 молекулярное клонирование FIT-Ig, специфичного по отношению к ФНО/ИЛ-17:
[00176] Были использованы аналогичные способы молекулярного клонирования, что и для FIT-Ig, специфичного по отношению к hIL-17hIL-20.
Пример 3.2 Экспрессия, очистка и анализ белков FIT-Ig, специфичных по отношению к ФНО/ИЛ-17:
[00177] Все ДНК-конструкции каждого FIT-Ig субклонировали в векторы на основе pBOC и секвенировали в целях обеспечения точности. Конструкцию №1, №2 и №3 FIT9-Ig подвергали временной коэкспрессии с использованием полиэтилснимина (ПЭИ) в клетках 293Е, как было описано ранее, и белки FIT9-Ig очищали с использованием хроматографии на белке А. Уровень экспрессии составлял 10-23 мг/л. Очищенный белок подвергали функциональному анализу с использованием клеточной системы для ИЛ-17 (продукция GROα клетками Hs27) и ФНО (продукция ИЛ-8 клетками L929). Нейтрализующая активность FIT9-Ig против ФНО человека составляла 11,6 пМ (по сравнению с 15,9 пМ для Голимумаба в том же самом эксперименте) и против ИЛ-17 человека составляла 122 пМ (по сравнению с 51,5 пМ для LY в том же самом эксперименте). В целом, FIT9-Ig сохранял биологическую активность, присущую родительским мАт.
Пример 4: конструирование, экспрессия и очистка иммуноглобулина с тандемным расположением Fab-фрагментов (FIT-Ig), специфичного по отношению к CTLA-4/PD-1
[00178] Был создан другой FIT-Ig, который может связываться с CTLA-4 человека и PD-1 человека (FIT10-Ig) с использованием мАт Ипилимумаб, специфичного по отношению к CTLA-4, и мАт Ниволумаб, специфичного по отношению к PD-1, в виде 3-х полипептидных конструкций, которые показаны на Фигуре 1. Для создания конструкции FIT10-Ig №1, VL-CL Ипилимумаба был слит непосредственно с N-концом тяжелой цепи Ниволумаба (как показано в Таблице 15). Конструкция №2 представляет собой VH-СН1 Ипилимумаба, а третья конструкция представляет собой VL-CL Ниволумаба. Три конструкции для получения FIT10-Ig были котрансфецированы в клетки 293, что приводило к экспрессии и секреции белков FIT10-Ig.
Пример 4.1 молекулярное клонирование FIT-Ig, специфичного по отношению к CTLA-4/PD-1:
[00179] Были использованы аналогичные способы молекулярного клонирования, что и для FIT-Ig, специфичного по отношению к hIL-17/hIL-20. Полученные в результате последовательности FIT-Ig, специфичного по отношению к CTLA-4/PD-1, представлены в Таблице 16.
Пример 4.2 Экспрессия, очистка и функциональный анализ белков FIT-Ig, специфичных по отношению к CTLA-4/PD-1:
[00180] Все ДНК-конструкции каждого FIT-Ig субклонировали в векторы на основе pBOS и секвенировали в целях обеспечения точности. Конструкцию №1, №2 и №3 FIT10-Ig подвергали временной козкспрессии с использованием полиэтилен и мина (ПЭИ) в клетках 293Е, как было описано ранее, и белки FIT9-Ig очищали с использованием хроматографии на белке А до получения 98% мономерного полноразмерного белка. Уровни экспрессии составляли вплоть до 43 мг/л. Очищенный белок подвергали анализу связывания с использованием ИФА против рскомбинантных CTLA-4Ig и PD1. Вкратце, для связывания с CTLA-4, CTLA-4Ig человека (R&D Системах) иммобилизировали на 96-луночных планшетах с последующими стандартными процедурами отмывки и блокировки. Затем в планшеты добавляли FIT-10-Ig или Ипилимумаб в различных концентрациях с последующей инкубацией и многочисленными этапами отмывки, и детектировали с использованием меченого пероксидазой хрена антитела к Fab-фрагменту человека. Для связывания с PD-1, PD-1 человека (с his-меткой) (R&D Системах) иммобилизировали на 96-луночных планшетах с последующими стандартными процедурами отмывки и блокировки. Затем в планшеты добавляли FIT-10-Ig или Ниволумаб в различных концентрациях с последующей инкубацией и многочисленными этапами отмывки, и детектировали с использованием меченого пероксидазой хрена антитела к Fc-фрагменту человека (Фигура 6). Установлено, что FIT10-Ig был способен к связыванию как CTLA-4 (А), так и PD-1 (В) с подобными уровнями активности, что и родительские мАт Ипилимумаб и Ниволумаб, соответственно.
[00181] В дополнение к этому, было проведено исследование по множественному связыванию антигенов с использованием OctetRed, чтобы определить был ли FIT10-Ig способен к связыванию рскомбинантных CTLA-4 и PD-1 одновременно. Вкратце, FIT10-Ig иммобилизировали на сенсор AR2G в концентрации 10 мкг/мл с последующим связыванием CTLA-4Ig, а затем PD-1 (или сначала PD-1, а затем CTLA-4Ig) в реакционном буфере (FBS рН 7,4, 0,1% BSA, 0,02% Tween) в концентрации 80 нМ. По окончанию эксперимента поверхность регенерировали с использованием 10 мМ глицина при рН 1,5 пять раз (Фигура 7). Этот эксперимент показывает, что FIT10-Ig был способен к связыванию PD-1, после того, как он уже связался с CTLA-4, и наоборот, что означает, что FIT10-Ig был способен к связыванию как CTLA-4Ig, так и PD-1 одновременно.
[00182] Все публикации, патентные заявки и выданные патенты, процитированные в этом описании, включены в данный документ посредством ссылки, как если бы о каждой отдельной публикации, патентной заявке или выданном патенте были специально и отдельно указано, что они включены посредством ссылки в полном объеме.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  ЭПИМАБ БИОТЕРЕПЬЮТИКС
У, Чэнбинь
<120>  ИММУНОГЛОБУЛИН С ТАНДЕМНЫМ РАСПОЛОЖЕНИЕМ FAB-ФРАГМЕНТОВ И
ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
<130>  EPBI-001/01WO
<150>  PCT/CN2013/090923
<151>  2013-12-30
<160>  98
<170>  PatentIn, версия 3.5
<210>  1
<211>  31
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный праймер
<400>  1
caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgaa g                                      31
<210>  2
<211>  51
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный праймер
<400>  2
gctggacctg agagcctgaa ccgccaccac cacactctcc cctgttgaag c                51
<210>  3
<211>  52
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный праймер
<400>  3
ggtggtggcg gttcaggctc tcaggtccag cttgtgcaat ctggcgccga gg               52
<210>  4
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный праймер
<400>  4
gtctgcggcc gctcatttac ccggagacag ggagag                                 36
<210>  5
<211>  31
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный праймер
<400>  5
taagcgtacg gtggctgcac catctgtctt c                                      31
<210>  6
<211>  59
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный праймер
<400>  6
cggcgccaga ttgcacaagc tggacctggc ctgaaccaca ctctcccctg ttgaagctc        59
<210>  7
<211>  51
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный праймер
<400>  7
gctggacctg agagcctgaa ccgccaccac cacactctcc cctgttgaag c                51
<210>  8
<211>  52
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный праймер
<400>  8
ggtggtggcg gttcaggctc tcaggtccag cttgtgcaat ctggcgccga gg               52
<210>  9
<211>  59
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный праймер
<400>  9
tacctcggcg ccagattgca caagctggac ctgacactct cccctgttga agctctttg        59
<210>  10
<211>  56
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный праймер
<400>  10
catgacacct taacagaggc cccaggtcgt tttacctcgg cgccagattg cacaag           56
<210>  11
<211>  37
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный праймер
<400>  11
caataagctt tacatgacac cttaacagag gccccag                                37
<210>  12
<211>  40
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный праймер
<400>  12
tcgagcggcc gctcaacaag atttgggctc aactttcttg                             40
<210>  13
<211>  51
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный праймер
<400>  13
gctgctgctg tggttccccg gctcgcgatg cgctatacag ttgacacagt c                51
<210>  14
<211>  53
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный праймер
<400>  14
gaagatgaag acagatggtg cagccaccgt acgcttgatc tctacctttg ttc              53
<210>  15
<211>  676
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Полипептид FIT1-Ig, специфичный по отношению к IL-17/IL-20
<400>  15
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Ser Leu Val His Ser
20                  25                  30
Arg Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ile Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Thr His Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gln Val Gln Leu Val
210                 215                 220
Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser
225                 230                 235                 240
Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Asp Ile Ile His Trp Val
245                 250                 255
Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Ala
260                 265                 270
Gly Tyr Gly Asn Thr Gln Tyr Ser Gln Asn Phe Gln Asp Arg Val Ser
275                 280                 285
Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ile Ser
290                 295                 300
Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Pro Leu
305                 310                 315                 320
Trp Phe Gly Glu Ser Ser Pro His Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
325                 330                 335
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
340                 345                 350
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
355                 360                 365
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
370                 375                 380
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
385                 390                 395                 400
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
405                 410                 415
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
420                 425                 430
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
435                 440                 445
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
450                 455                 460
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
465                 470                 475                 480
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
485                 490                 495
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
500                 505                 510
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
515                 520                 525
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
530                 535                 540
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
545                 550                 555                 560
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
565                 570                 575
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
580                 585                 590
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
595                 600                 605
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
610                 615                 620
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
625                 630                 635                 640
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
645                 650                 655
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
660                 665                 670
Ser Pro Gly Lys
675
<210>  16
<211>  112
<212>  ПРТ
<213>  Homo sapiens
<400>  16
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Ser Leu Val His Ser
20                  25                  30
Arg Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ile Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Thr His Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  17
<211>  107
<212>  ПРТ
<213>  Homo sapiens
<400>  17
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1               5                   10                  15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20                  25                  30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35                  40                  45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50                  55                  60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65                  70                  75                  80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85                  90                  95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100                 105
<210>  18
<211>  127
<212>  ПРТ
<213>  Mus sp.
<400>  18
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Asp
20                  25                  30
Ile Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Ala Gly Tyr Gly Asn Thr Gln Tyr Ser Gln Asn Phe
50                  55                  60
Gln Asp Arg Val Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ile Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Pro Leu Trp Phe Gly Glu Ser Ser Pro His Asp Tyr Tyr
100                 105                 110
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120                 125
<210>  19
<211>  103
<212>  ПРТ
<213>  Homo sapiens
<400>  19
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
100
<210>  20
<211>  227
<212>  ПРТ
<213>  Homo sapiens
<400>  20
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1               5                   10                  15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20                  25                  30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35                  40                  45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50                  55                  60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85                  90                  95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100                 105                 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115                 120                 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130                 135                 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145                 150                 155                 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165                 170                 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180                 185                 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195                 200                 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210                 215                 220
Pro Gly Lys
225
<210>  21
<211>  222
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Полипептид FIT1-Ig, специфичный по отношению к IL-17/IL-20
<400>  21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Val Ile Asn Pro Met Tyr Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Gln Arg Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Tyr Asp Tyr Phe Thr Gly Thr Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210                 215                 220
<210>  22
<211>  119
<212>  ПРТ
<213>  Homo sapiens
<400>  22
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Val Ile Asn Pro Met Tyr Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Gln Arg Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Tyr Asp Tyr Phe Thr Gly Thr Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  23
<211>  214
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Полипептид FIT1-Ig, специфичный по отношению к IL-17/IL-20
<400>  23
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>  24
<211>  107
<212>  ПРТ
<213>  Mus sp.
<400>  24
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  25
<211>  679
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Полипептид FIT2-Ig, специфичный по отношению к IL-17/IL-20
<400>  25
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Ser Leu Val His Ser
20                  25                  30
Arg Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ile Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Thr His Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Ser Gly Gln Val
210                 215                 220
Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Ala Ser Val
225                 230                 235                 240
Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Asp Ile Ile
245                 250                 255
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Trp
260                 265                 270
Ile Asn Ala Gly Tyr Gly Asn Thr Gln Tyr Ser Gln Asn Phe Gln Asp
275                 280                 285
Arg Val Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu
290                 295                 300
Leu Ile Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
305                 310                 315                 320
Glu Pro Leu Trp Phe Gly Glu Ser Ser Pro His Asp Tyr Tyr Gly Met
325                 330                 335
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
340                 345                 350
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
355                 360                 365
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
370                 375                 380
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
385                 390                 395                 400
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
405                 410                 415
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
420                 425                 430
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
435                 440                 445
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
450                 455                 460
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
465                 470                 475                 480
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
485                 490                 495
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
500                 505                 510
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
515                 520                 525
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
530                 535                 540
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
545                 550                 555                 560
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
565                 570                 575
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
580                 585                 590
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
595                 600                 605
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
610                 615                 620
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
625                 630                 635                 640
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
645                 650                 655
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
660                 665                 670
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
675
<210>  26
<211>  3
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  26
Gly Ser Gly
1
<210>  27
<211>  683
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Полипептид FIT3-Ig, специфичный по отношению к IL-17/IL-20
<400>  27
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Ser Leu Val His Ser
20                  25                  30
Arg Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ile Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Thr His Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser
210                 215                 220
Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro
225                 230                 235                 240
Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
245                 250                 255
Asn Asp Ile Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu
260                 265                 270
Trp Met Gly Trp Ile Asn Ala Gly Tyr Gly Asn Thr Gln Tyr Ser Gln
275                 280                 285
Asn Phe Gln Asp Arg Val Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr
290                 295                 300
Ala Tyr Met Glu Leu Ile Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr
305                 310                 315                 320
Tyr Cys Ala Arg Glu Pro Leu Trp Phe Gly Glu Ser Ser Pro His Asp
325                 330                 335
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
340                 345                 350
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
355                 360                 365
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
370                 375                 380
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
385                 390                 395                 400
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
405                 410                 415
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
420                 425                 430
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
435                 440                 445
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
450                 455                 460
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
465                 470                 475                 480
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
485                 490                 495
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
500                 505                 510
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
515                 520                 525
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
530                 535                 540
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
545                 550                 555                 560
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
565                 570                 575
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
580                 585                 590
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
595                 600                 605
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
610                 615                 620
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
625                 630                 635                 640
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
645                 650                 655
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
660                 665                 670
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
675                 680
<210>  28
<211>  7
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  28
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser
1               5
<210>  29
<211>  436
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Полипептид FIT4-Ig, специфичный по отношению к IL-17/IL-20
<400>  29
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Val Ile Asn Pro Met Tyr Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Gln Arg Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Tyr Asp Tyr Phe Thr Gly Thr Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Ala Ile
210                 215                 220
Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg
225                 230                 235                 240
Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala
245                 250                 255
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp
260                 265                 270
Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
275                 280                 285
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
290                 295                 300
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe
305                 310                 315                 320
Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser
325                 330                 335
Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala
340                 345                 350
Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val
355                 360                 365
Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser
370                 375                 380
Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr
385                 390                 395                 400
Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys
405                 410                 415
Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn
420                 425                 430
Arg Gly Glu Cys
435
<210>  30
<211>  439
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Полипептид FIT5-Ig, специфичный по отношению к IL-17/IL-20
<400>  30
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Val Ile Asn Pro Met Tyr Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Gln Arg Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Tyr Asp Tyr Phe Thr Gly Thr Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Ser
210                 215                 220
Gly Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
225                 230                 235                 240
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser
245                 250                 255
Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
260                 265                 270
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
275                 280                 285
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
290                 295                 300
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro
305                 310                 315                 320
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
325                 330                 335
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
340                 345                 350
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
355                 360                 365
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
370                 375                 380
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
385                 390                 395                 400
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
405                 410                 415
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
420                 425                 430
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
435
<210>  31
<211>  443
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Полипептид FIT6-Ig, специфичный по отношению к IL-17/IL-20
<400>  31
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Val Ile Asn Pro Met Tyr Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Gln Arg Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Tyr Asp Tyr Phe Thr Gly Thr Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly
210                 215                 220
Gly Gly Ser Gly Ser Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
225                 230                 235                 240
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
245                 250                 255
Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
260                 265                 270
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro
275                 280                 285
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
290                 295                 300
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe
305                 310                 315                 320
Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
325                 330                 335
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
340                 345                 350
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
355                 360                 365
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
370                 375                 380
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
385                 390                 395                 400
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
405                 410                 415
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
420                 425                 430
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
435                 440
<210>  32
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный праймер
<400>  32
gtctgcggcc gctcatttac ccggagacag ggagag                                 36
<210>  33
<211>  40
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный праймер
<400>  33
tcgagcggcc gctcaacaag atttgggctc aactttcttg                             40
<210>  34
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный праймер
<400>  34
caggtccagc tgcagcagtc tg                                                22
<210>  35
<211>  59
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный праймер
<400>  35
gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc tcgcccgtca caaagagctt caacagggg        59
<210>  36
<211>  50
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный праймер
<400>  36
tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa gtcacccatc agggcctgag                  50
<210>  37
<211>  50
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный праймер
<400>  37
tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa                  50
<210>  38
<211>  59
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный праймер
<400>  38
ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgtgaa gtgcagctgg tggagtctg        59
<210>  39
<211>  51
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный праймер
<400>  39
gctgctgctg tggttccccg gctcgcgatg cgaaattgtg ttgacacagt c                51
<210>  40
<211>  52
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный праймер
<400>  40
aagatgaaga cagatggtgc agccaccgta cgtttaatct ccagtcgtgt cc               52
<210>  41
<211>  665
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Полипептид FIT7-Ig, состоящий из OKT3/Офатумумаба
<400>  41
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20                  25                  30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35                  40                  45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85                  90                  95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Thr Val Ala Ala Pro
100                 105                 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115                 120                 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130                 135                 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165                 170                 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180                 185                 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195                 200                 205
Asn Arg Gly Glu Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
210                 215                 220
Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
225                 230                 235                 240
Thr Phe Asn Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
245                 250                 255
Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly
260                 265                 270
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
275                 280                 285
Lys Lys Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
290                 295                 300
Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr
305                 310                 315                 320
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
325                 330                 335
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
340                 345                 350
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
355                 360                 365
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
370                 375                 380
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
385                 390                 395                 400
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
405                 410                 415
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
420                 425                 430
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
435                 440                 445
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
450                 455                 460
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
465                 470                 475                 480
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
485                 490                 495
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
500                 505                 510
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
515                 520                 525
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
530                 535                 540
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
545                 550                 555                 560
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
565                 570                 575
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
580                 585                 590
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
595                 600                 605
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
610                 615                 620
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
625                 630                 635                 640
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
645                 650                 655
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
660                 665
<210>  42
<211>  106
<212>  ПРТ
<213>  Mus sp.
<400>  42
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20                  25                  30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35                  40                  45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85                  90                  95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn
100                 105
<210>  43
<211>  122
<212>  ПРТ
<213>  Homo sapiens
<400>  43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  44
<211>  222
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Полипептид FIT7-Ig, состоящий из OKT3/Офатумумаба
<400>  44
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20                  25                  30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210                 215                 220
<210>  45
<211>  119
<212>  ПРТ
<213>  Mus sp.
<400>  45
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20                  25                  30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210>  46
<211>  214
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Полипептид FIT7-Ig, состоящий из OKT3/Офатумумаба
<400>  46
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>  47
<211>  107
<212>  ПРТ
<213>  Homo sapiens
<400>  47
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  48
<211>  672
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Полипептид FIT8-Ig, состоящий из OKT3/Офатумумаба
<400>  48
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20                  25                  30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35                  40                  45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85                  90                  95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Thr Val Ala Ala Pro
100                 105                 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115                 120                 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130                 135                 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165                 170                 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180                 185                 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195                 200                 205
Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Val Gln Leu
210                 215                 220
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu
225                 230                 235                 240
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr Ala Met His Trp
245                 250                 255
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser
260                 265                 270
Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
275                 280                 285
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn
290                 295                 300
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Ile
305                 310                 315                 320
Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
325                 330                 335
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
340                 345                 350
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
370                 375                 380
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
385                 390                 395                 400
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
405                 410                 415
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
420                 425                 430
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
435                 440                 445
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
450                 455                 460
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
465                 470                 475                 480
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
485                 490                 495
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
500                 505                 510
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
515                 520                 525
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
530                 535                 540
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
545                 550                 555                 560
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
565                 570                 575
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
580                 585                 590
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
595                 600                 605
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
610                 615                 620
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
625                 630                 635                 640
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
645                 650                 655
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
660                 665                 670
<210>  49
<211>  3
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  49
Gly Gly Ser
1
<210>  50
<211>  3
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  50
Ser Gly Gly
1
<210>  51
<211>  3
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  51
Gly Gly Gly
1
<210>  52
<211>  4
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  52
Gly Gly Gly Ser
1
<210>  53
<211>  4
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  53
Ser Gly Gly Gly
1
<210>  54
<211>  5
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  54
Gly Gly Gly Gly Ser
1               5
<210>  55
<211>  8
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  55
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1               5
<210>  56
<211>  10
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  56
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10
<210>  57
<211>  15
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  57
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
<210>  58
<211>  16
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  58
Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg
1               5                   10                  15
<210>  59
<211>  17
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  59
Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg
1               5                   10                  15
Val
<210>  60
<211>  9
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  60
Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Gly Gly
1               5
<210>  61
<211>  10
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  61
Ser Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Gly Gly
1               5                   10
<210>  62
<211>  16
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  62
Lys Thr Thr Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val
1               5                   10                  15
<210>  63
<211>  6
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  63
Ser Ala Lys Thr Thr Pro
1               5
<210>  64
<211>  10
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  64
Ser Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Gly Gly
1               5                   10
<210>  65
<211>  6
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  65
Arg Ala Asp Ala Ala Pro
1               5
<210>  66
<211>  9
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  66
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
1               5
<210>  67
<211>  12
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  67
Arg Ala Asp Ala Ala Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ser
1               5                   10
<210>  68
<211>  27
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  68
Arg Ala Asp Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20                  25
<210>  69
<211>  6
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  69
Ser Ala Lys Thr Thr Pro
1               5
<210>  70
<211>  10
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  70
Ser Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Gly Gly
1               5                   10
<210>  71
<211>  18
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  71
Ser Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala
1               5                   10                  15
Arg Val
<210>  72
<211>  5
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  72
Ala Asp Ala Ala Pro
1               5
<210>  73
<211>  12
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  73
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro
1               5                   10
<210>  74
<211>  5
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  74
Thr Val Ala Ala Pro
1               5
<210>  75
<211>  12
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  75
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
1               5                   10
<210>  76
<211>  6
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  76
Gln Pro Lys Ala Ala Pro
1               5
<210>  77
<211>  13
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  77
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro
1               5                   10
<210>  78
<211>  6
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  78
Ala Lys Thr Thr Pro Pro
1               5
<210>  79
<211>  13
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  79
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Thr Pro Leu Ala Pro
1               5                   10
<210>  80
<211>  6
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  80
Ala Lys Thr Thr Ala Pro
1               5
<210>  81
<211>  13
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  81
Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro
1               5                   10
<210>  82
<211>  6
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  82
Ala Ser Thr Lys Gly Pro
1               5
<210>  83
<211>  13
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  83
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
1               5                   10
<210>  84
<211>  15
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  84
Gly Glu Asn Lys Val Glu Tyr Ala Pro Ala Leu Met Ala Leu Ser
1               5                   10                  15
<210>  85
<211>  15
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  85
Gly Pro Ala Lys Glu Leu Thr Pro Leu Lys Glu Ala Lys Val Ser
1               5                   10                  15
<210>  86
<211>  15
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность пептидного линкера
<400>  86
Gly His Glu Ala Ala Ala Val Met Gln Val Gln Tyr Pro Ala Ser
1               5                   10                  15
<210>  87
<211>  664
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Полипептид FIT9-Ig, специфичный по отношению к TNF/IL-17
<400>  87
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Tyr Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85                  90                  95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala
100                 105                 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115                 120                 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130                 135                 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145                 150                 155                 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165                 170                 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180                 185                 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195                 200                 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
210                 215                 220
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
225                 230                 235                 240
Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro
245                 250                 255
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Val Ile Asn Pro Met Tyr Gly Thr
260                 265                 270
Thr Asp Tyr Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp
275                 280                 285
Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
290                 295                 300
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Asp Tyr Phe Thr Gly Thr
305                 310                 315                 320
Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
325                 330                 335
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
340                 345                 350
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
355                 360                 365
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
370                 375                 380
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
385                 390                 395                 400
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
405                 410                 415
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
420                 425                 430
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
435                 440                 445
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
450                 455                 460
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
465                 470                 475                 480
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
485                 490                 495
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
500                 505                 510
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
515                 520                 525
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
530                 535                 540
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
545                 550                 555                 560
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
565                 570                 575
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
580                 585                 590
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
595                 600                 605
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
610                 615                 620
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
625                 630                 635                 640
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
645                 650                 655
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
660
<210>  88
<211>  108
<212>  ПРТ
<213>  Homo sapiens
<400>  88
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Tyr Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85                  90                  95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100                 105
<210>  89
<211>  229
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Полипептид FIT9-Ig, специфичный по отношению к TNF/IL-17
<400>  89
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Phe Met Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Lys Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Arg Gly Ile Ala Ala Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly
100                 105                 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115                 120                 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
130                 135                 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145                 150                 155                 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165                 170                 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180                 185                 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
195                 200                 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
210                 215                 220
Glu Pro Lys Ser Cys
225
<210>  90
<211>  126
<212>  ПРТ
<213>  Homo sapiens
<400>  90
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Phe Met Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Lys Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Arg Gly Ile Ala Ala Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly
100                 105                 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120                 125
<210>  91
<211>  219
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Полипептид FIT9-Ig, специфичный по отношению к TNF/IL-17
<400>  91
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Ser Leu Val His Ser
20                  25                  30
Arg Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ile Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Thr His Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  92
<211>  658
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Полипептид FIT10-Ig, специфичный по отношению к CTLA-4/PD-1
<400>  92
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85                  90                  95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100                 105                 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115                 120                 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130                 135                 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145                 150                 155                 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165                 170                 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180                 185                 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195                 200                 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
210                 215                 220
Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser
225                 230                 235                 240
Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro
245                 250                 255
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys
260                 265                 270
Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
275                 280                 285
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
290                 295                 300
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln
305                 310                 315                 320
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
325                 330                 335
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
340                 345                 350
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
355                 360                 365
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
370                 375                 380
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
385                 390                 395                 400
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
405                 410                 415
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
420                 425                 430
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
435                 440                 445
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
450                 455                 460
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
465                 470                 475                 480
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
485                 490                 495
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
500                 505                 510
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
515                 520                 525
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
530                 535                 540
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
545                 550                 555                 560
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
565                 570                 575
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
580                 585                 590
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
595                 600                 605
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
610                 615                 620
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
625                 630                 635                 640
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
645                 650                 655
Gly Lys
<210>  93
<211>  108
<212>  ПРТ
<213>  Homo sapiens
<400>  93
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85                  90                  95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  94
<211>  113
<212>  ПРТ
<213>  Homo sapiens
<400>  94
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100                 105                 110
Ser
<210>  95
<211>  221
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Полипептид FIT10-Ig, специфичный по отношению к CTLA-4/PD-1
<400>  95
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210                 215                 220
<210>  96
<211>  118
<212>  ПРТ
<213>  Homo sapiens
<400>  96
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  97
<211>  214
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Полипептид FIT10-Ig, специфичный по отношению к CTLA-4/PD-1
<400>  97
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>  98
<211>  107
<212>  ПРТ
<213>  Homo sapiens
<400>  98
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<---