Днк-повреждения в мультипотентных мезенхимных стромальных клетках человека при разных сроках культивирования

ДНК-повреждения в мультипотентных мезенхимных стромальных клетках человека при разных сроках культивирования

А.И. Чаушева 1, В.А. Никитина 1, А.К. Жанатаев 2 , А.Д. Дурнев 2, Н.П. Бочков 1

1 Медико-генетический научный центр РАМН, Москва

2 НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН, Москва

DNA damage in human multipotent mesenchymal stromal cells at different terms of cultivation

A.I. Chausheva 1, V.A. Nikitina 1, A.K. Zhanataev2, A.D. Durnev2, N.P. Bochkov1

1 Research Centre for Medical Genetics RAMS, Moscow

2 V.V. Zakusov Institute of Pharmacology RAMS, Moscow

Методом ДНК-комет проведена оценка уровней ДНК-повреждений и 8-оксигуанина в ДНК мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) на разных пассажах. Проанализированы двадцать восемь культур ММСК костного мозга здоровых доноров. Уровень ДНК-повреждений в ММСК, оцениваемый по показателю %ДНК в хвосте комет статистически значимо не менялся в процессе культивирования (3,9±0,4% на 3—4 пассажах и 3,8±0,6 % на 10—12 пассажах). Не выявлено значимых различий в содержании 8-оксигуанина в ДНК клеток на разных сроках культивирования (1,9±0,24 о.е 3—4 пассажах и 2,1±0,22 о.е на 10—12 пассажах). В двух культурах ММСК наблюдался повышенный уровень ДНК-повреждений и апоптоти-ческих ДНК-комет.

Ключевые слова: метод ДНК-комет, мультипотентные мезенхимные стромальные клетки, апоптотические кометы, генетическая стабильность.

Клеточная терапия мультипотентными мезенхимными стромальными клетками (ММСК) — перспективный метод лечения различных заболеваний. Простые процедуры выделения и культивирования, возможность введения непосредственно в кровоток, отсутствие существенной иммуногенно-сти позволяют использовать ММСК в клинических испытаниях при лечении несовершенного остеогенеза [1], метахроматической лейкодистрофии [2, 3], синдрома Гурлера [2], болезни «трансплантат против хозяина» [4], сердечно-сосудистых заболеваний [5].

В силу методических особенностей ММСК до терапевтического использования нуждаются в культивировании, что может приводить к возникновению генетически аберрантных клеток [6], их позитивной селекции в популяции и контаминации ими материала для трансплантации. Последствия применения генетически измененных клеток в организме непредсказуемы, что определяет необходимость проведения оценки генетической стабильности ММСК перед их трансплантацией. ДНК-повреждения лежат в основе возникновения хромосомных аномалий, мутаций в генах, контролирующих процессы клеточной пролиферации, дифференцировки и гибели, ведущих к генетической нестабильности клеток.

Цель настоящей работы — сравнительная оценка уровней ДНК-повреждений в ММСК на разных сроках культивирования.

e-mail: alaska.77@mail.ru

The levels of DNA-damage and 8-oxiguanine were estimated using the comet assay in multipotent mesenchymal stromal cells (MSC) on different passages. Twenty eight cultures MSC from bone marrow of healthy donors have been analyzed. The level of DNA-damages in MSC, estimated as percent of DNA in comet tail (%DNA in comet tail), didn’t change in the process of cultivation (3,9±0,4 % on 3—4 passages and 3,8±0,6 % on 10—12 passages). No significant differences in the content of 8-oxiguanine in the DNA of cells at different stages of cultivation (1,9±0,24 p.u. 3—4 passages and 2,1 ±0,22 p.u. on 10—12 passages) haven't been revealed. The higher levels of DNA damage and apoptotic comets observed in two cultures of MSC.

Key words: comet-assay, multipotent mesenchymal stromal cells, apoptotic cells, genetic stability.

Материал и методы

Для исследований использовали культуры ММСК, выделенные из костного мозга здоровых доноров, по методу, предложенному А.Я. Фриденштейном с со-авт. [7]. Во всех случаях получено письменное информированное согласие на использование образцов для научных целей.

Культуры ММСК дважды отмывали от культуральной среды охлажденным фосфатно-солевым буфером и снимали со дна флакона с помощью силиконового скребка. Клетки переносили в пробирки и центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 мин. Супернатант удаляли, осадок разводили в буфере до концентрации клеток 1—5х105/мл и помещали до использования в холодильник при температуре 4°С. К ранним пассажам относили культуры прошедшие 3—4 пассажа культивирования, к поздним — 10—12. Метод ДНК-комет в щелочной версии проводили в соответствии с рекомендациями [8]. Микропрепараты окрашивали флюоресцирующим красителем SYBR Green I. Микроскопирование проводили на эпифлуоресцентном микроскопе Axio-Imager A1 (Zeiss, Германия) при увеличении х200. Полученные изображения ДНК-комет анализировали с использованием программного обеспечения «CASP 1.2.2» [9]. В качестве показателя повреж-денности ДНК использовали процентное содержание ДНК в хвосте (%ДНК в хвосте). С каждого микропре-

парата анализировали не менее 100 клеток. ДНК-кометы характерной формы с содержанием ДНК в хвосте более 70% рассматривались как апоптотиче-ские и подсчитывались отдельно.

Для оценки содержания 8-оксигуанина в ДНК клеток использовали набор «Human 8-oxoGuanine DNA Glycosylase (OGG1) FLARE Assay» (R&D Systems Inc., USA), а также FLARE (Fragment Length Analysis using Repair Enzymes), который является модификацией метода ДНК-комет и основан на регистрации уровней одно- и двухнитевых разрывов ДНК индивидуальных клеток после обработки hOGG1 — ферментом экс-цизионной репарации 8-оксигуанина. Приготовление препаратов для анализа проводили в соответствии с инструкцией производителя. Уровень 8-оксигуанина выражали в относительных единицах (о.е.), определяемых как отношение показателя %ДНК в хвосте для ДНК клеток, обработанных hOGG1 к показателю для клеток, обработанных буфером для фермента.

Полученные результаты обрабатывались с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Исследовано 28 культур ММСК на разных пассажах. Уровень ДНК-повреждений в ММСК на ранних пассажах (табл. 1) составил в среднем 3,9±0,4% ДНК в хвосте. На поздних пассажах аналогичные значения составили 3,8±0,6% (табл. 2). Статистическое сравнение уровней ДНК-повреждений на ранних и поздних пассажах не выявило статистически значимых различий (р > 0,05).

Метод ДНК-комет в щелочной версии фиксирует различные виды повреждений ДНК: одноцепочечные, двухцепочечные разрывы, апуриновые-апиримидиновые сайты (АП-сайты), разрывы, возникающие в процессах репликации и репарации в делящейся клетке. Взаимосвязь между уровнем ДНК-повреждений и активностью ферментов системы репарации определяет спонтанный уровень ДНК-повреждений в клетке, который может меняться еще и в зависимости от стадии деления клетки, воздействия внешних и внутренних повреждающих факторов. В работах, проведенных на лейкоцитах периферической крови и клетках костного мозга здоровых доноров, спонтанный уровень ДНК-повреждений так же как, в нашем исследовании, варьировал от 0 до 8-9% [10-12].

Одним из типов ДНК-повреждений является окислительная модификация азотистых оснований ДНК. Известно, что в этиологии рака важную роль играет окислительное повреждение ДНК, инициирующее возникновение соматических мутаций. В настоящем исследовании оценивали уровень продукта окислительного повреждения гуанина — 8-оксигуанина в культурах ММСК. На 3-4 пассажах уровень 8-оксигуанина составил 1,9±0,24 o^. и 2,1 ±0,22 о.е. на 10—12 пассажах. При этом показатель варьировал от 1,1 о.е. до 3,1 о.е. на ранних пассажах и от 1,5 о.е до 2,6 о.е на поздних пассажах. Статистическое сравнение уровней 8-оксигуанина на ранних и поздних пассажах не выявило различий (р > 0,05). Аналогичный показатель, полученный при исследовании лимфоцитов периферической крови здоровых людей среднего возраста, варьировал 0,5 до 2,0 o.e.[13].

Повышение клеточной выживаемости и подавление апоптоза является одним из патогенетических механизмов опухолевой трансформации клетки. Параллельно с оценкой ДНК-повреждений и определения уровня 8-оксигаунина, в исследовании оценивали уровень апоптотических ДНК-комет в культурах ММСК на ранних и поздних этапах культивирования. По результатам наших исследований, частота апоп-тотических ДНК-комет в разных культурах ММСК составила в среднем 2,1±0,4% на 3—4 пассажах и 2,5±0,6% на 10—12 пассажах. Частота апоптотиче-ских комет не менялась в процессе культивирования ММСК (р > 0,05). Вместе с тем, сравнение с данными литературы показывает, что частота апоптотических ДНК-комет в ММСК выше, чем в соматических клетках человека [13].

Таблица 1. Уровень ДНК-повреждений в культурах ММСК костного мозга на ранних пассажах

№ культуры Количествово клеток %ДНК в хвосте е и к с е Ї* Н — тоты С Ф ом по Ак

1 2б0 3,7 4,4

2 2Б7 7,0 2,4

3 1бб 5,4 2,0

4 177 5,9 Б,б

Б 14б 4,0 3,1

б 107 2,8 3,3

7 17б 4,9 1,9

В 1бВ 3,7 0,8

9 10Б 3,3 0,9

10 112 0,б 0,9

11 97 2,б 1,0

12 ББ 2,3 0

13 1Б3 4,1 2,б

14 137 б,1 1,9

1Б 10б 3,2 2,8

1б 91 3,5 1,1

17 132 3,4 0,8

Cреднее±SE 244Б 3,9±0,4 2,1±0,4

Таблица 2. Уровень ДНК-повреждений в культурах ММСК костного мозга на поздних пассажах

№ культуры Количество клеток %ДНК в хвосте е и к с е Н — тоты С Ф 2 2 5 0 < *

1 257 4,1 5,1

2 249 3,5 3,2

3 318 4,5 3,6

4* 112 16,5 18,3

5 240 3,5 0,4

6* 155 9,1 10,2

7 55 0,9 0

8 122 2,7 4,1

9 131 3,1 0

10 220 3,7 3,2

11 158 8,5 3,1

Среднее±БЕ 1750 3,8±0,6 2,5±0,6

Примечание: * — данные культуры исключены из подсчета среднего и ошибки среднего.

В двух культурах ММСК (см. табл. 2) наблюдался повышенный уровень ДНК-повреждений (16,5% и 9,1% ДНК в хвосте комет). Частота апоптотических ДНК-комет в этих культурах также была высокая (18,3% и 10,2% соответственно). Условия культивирования всех клеточных культур ММСК костного мозга были стандартными. В рамках настоящего исследования сложно объяснить высокий уровень ДНК-повреждений и апоптотических ДНК-комет именно в этих культурах. Вероятно, в процессе культивирования ММСК возникают клоны аберрантных клеток, имеющих селективное преимущество в размножении [6], либо подобные изменения связаны не с условиями культивирования, а с индивидуальными характеристиками донора клеток. Истинная причина генетической нестабильности в данных культурах ММСК пока не ясна. Значения этих двух культур были исключены из анализа подсчета среднего.

Таким образом, результаты настоящего исследования показывают, что при длительном культивировании ММСК, в некоторых культурах наблюдается повышенный уровень ДНК-повреждений. Безусловно, это является серьезным препятствием для применения таких культур в целях клеточной трансплантации из-за возможных побочных эффектов. Однако в большинстве культур ММСК уровень ДНК повреждений и 8-оксигуанина не менялись в процессе культивирования. Повышенный уровень апоптоти-ческих клеток в культурах ММСК ранних и поздних пассажей, по сравнению с таковым в лимфоцитах периферической крови, возможно, указывает на процесс элиминации клеток с ДНК-повреждениями, возникающими в процессе культивирования.

Оценка ДНК-повреждений в ММСК может служить важным критерием при оценке генетической стабильности для обеспечения безопасности клеточной трансплантации.

Выражаем благодарность сотрудникам ФНКЦ «Детской гематологии, онкологии и иммунологии» Росздрава за предоставленные культуры ММСК и сотрудничество.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Horwitz E.M., Gordon P.L., Koo W. et al. Isolated allogeneic bone marrow-derived mesenchymal cells engraft and stimulate growth in children with osteogenesis imperfecta: Implications for cell therapy of bone. PNAS USA 2002; 99(13): 8932—7.

2. ^с O.N., Day J., Nieder M. et al. Allogeneic mesenchymal stem cell infusion for treatment of metachromatic leukodystrophy tMLD) and Hurler syndrome tMPS-IH). Bone Marrow Transplant. 2002; 30(4): 215—22.

3. Meuleman N., Vanhaelen G., Tondreau T. et al. Reduced intensity conditioning haematopoietic stem cell transplantation with mesenchymal stromal cells infusion for the treatment of metachromatic leukodystrophy: a case report. Haematologica 2008; 93(1): 11—3.

4. Le Blanc K., Frassoni F., Ball L. et al. Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistant, severe, acute graft-versus-host disease: a phase II study. Lancet 2008; 371(9624): 1579—86.

5. Фатхудинов Т.Х., Дьячков А.В., Коротеев А.В. и др. Безопасность и эффективность трансплантации аллогенных мультипотент-ных стромальных клеток при хирургическом лечении дилатационной кардиомиопатии. Клет. Тех. Биол. Мед. 2010; 1: 1—16.

6. Бочков Н.П., Воронина Е.С., Катосова Л.Д. и др. Цитогенетическое исследование мультипотентных мезенхимных стромальных клеток человека в процессе культивирования. Медицинская генетика 2009; 8(12): 3—6.

7. Фриденштеин А.Я., Чаилахян Р.К. Стромальные клетки костного мозга и кроветворное микроокружение. Архив патол. 1982; 10: 3—11.

8. Дурнев А.Д., Жанатаев А.К., Анисина Е.А. и др. Российская Академия медицинских наук и Российская Академия сельскохозяйственных наук. Применение метода щелочного гель-электрофореза изолированных клеток для оценки генотоксических свойств природных и синтетических соединений. Метод. Рекомендации. М., 2006.

9. Konca K., Lankoff A., Вanasik A. A cross-platform public domain PC image-analysis program for the comet assay. Mutat. Res. 2003; 534(1-2): 15—20.

10. Сирота Н.П., Е.А.Кузнецова. Уровень спонтанных повреждений ДНК в лейкоцитах периферической крови людей разного возраста. Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 2008; 145(2): 154—7.

11. Novotna B., Neuwirtova R., Siskova M. et al. DNA instability in low-risk myelodysplastic syndromes: refractory anemia with or without ring sideroblasts. Human Mol. Gen. 2008. 17(14): 2144-9.

12. Moller P. Assessment of reference values for DNA damage detected by the comet assay in human blood cell DNA. Mutation Research 2006; 612: 84—104.

13. Мороз В.В., Решетняк В.И., Муравьева М.Ю. и др. Обмен холестерина, ДНК-повреждения, апоптоз и некроз клеток в крови при тяжелой сочетанной травме. Общая реаниматология 2008; 1: 5—12.

Поступила 21.07.2011