Способ обнаружения ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) в ультранизких концентрациях и специфические олигонуклеотиды для использования в способе
METHOD FOR DETECTING DNA OF JOHN CUNNINGHAM VIRUS (JCPYV) AT ULTRA-LOW CONCENTRATIONS AND SPECIFIC OLIGONUCLEOTIDES FOR USE IN METHOD

Область техники
Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии, а именно к числу средств - направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas12 в составе рибонуклеопротеиновых комплексов для выявления (обнаружения, детекции) ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV), а также к диагностическим способам и наборам.
Изобретение позволяет in vitro выявлять единичные копии ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV).
Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для детекции ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) после проведения специфической амплификации фрагментов ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV). Амплификация при этом может быть проведена различными способами, среди которых полимеразная цепная реакция (PCR); петлевая изотермическая амплификация (LAMP); геликаза-зависимая амплификация (HDA); рекомбиназа-опосредованная амплификация (RPA); амплификация со смещением цепи (SDA); амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (NASBA); опосредованная транскрипцией амплификация (TMA); амплификация, опосредованная никирующим ферментом (NEAR); круговая амплификация (RCA) и многие другие виды амплификации.
Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для разработки высокочувствительных и высокотехнологичных диагностических систем нового поколения на основе CRISPR технологий для совершенствования методов диагностики инфекционных заболеваний.
Уровень техники
Для решения эпидемиологических задач по расшифровке вспышек инфекционных болезней, выявления и идентификации возбудителя, а также детекции специфических бактериальных и вирусных генов необходимы разработка и внедрение в практику работы надзорных и мониторинговых служб современных технологий молекулярной эпидемиологии. Одной из таких технологий является использование элементов генетического редактирования системы CRISPR/CAS. Данная технология развивается достаточно эффективно в отношении создания средств лечения некоторых болезней, несмотря на ряд трудностей, связанных с возникновением непредвиденных мутаций. При углубленных исследованиях в области применения CRISPR/CAS системы, было выяснено, что она может быть использована для тонких диагностических процедур при выявлении возбудителя/ей инфекции у человека, а также их генотипирования.
В 2018 г. было показано, что один из ферментов CRISPR системы - Cas12 после распознавания своей целевой ДНК-мишени начинает неспецифически гидролизовать одноцепочечную ДНК. Такое свойство Cas12 можно использовать в качестве индикатора присутствия определенной мишени, например, генома вируса или бактерии. Исследователи использовали это открытие для создания технологической платформы обнаружения нуклеиновых кислот, известной как DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter - ДНК-нацеленная эндонуклеаза CRISPR трансрепортер). Предложенная платформа объединяет нуклеазу Cas12a, ее направляющую РНК, специфичную к нуклеиновой кислоте, и флуоресцентную репортерную молекулу. Впервые технология DETECTR была использована для выявления и генотипирования вируса папилломы человека. DETECTR в течение 1 ч позволила дифференцировать HPV16 и HPV18 в неочищенных экстрактах ДНК из культивируемых клеток человека и клинических образцов. При этом DETECTR корректно (сопоставимо с результатами ПЦР-анализа) идентифицировала HPV16 в 25 и HPV18 - в 23 из 25 клинических образцов (Chen J.S., Ma E., Harrington L.B., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 2018; 360(6387): 436-9. doi: 10.1126/science.aar6245).
Science
Не менее важным приложением системы CRISPR/Cas является идентификация патогенов и детекция специфических бактериальных генов с помощью платформы SHERLOCK (specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking - ферментативная специфическая высокочувствительная разблокировка репортера). Предложенная платформа объединяет нуклеазу Cas13a, ее направляющую РНК, специфичную к нуклеиновой кислоте, и флуоресцентную репортерную молекулу. Комплекс Cas13a связывает и расщепляет предварительно амплифицированную нуклеиновую кислоту-мишень с высокой специфичностью. С помощью SHERLOCK удалось корректно дифференцировать близкородственные штаммы вируса Зика и Денге (Gootenberg J.S., Abudayyeh O.O., Lee J.W., et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. . 2017; 356(6336): 438-42. doi: 10.1126/science.aam9321).
SHERLOCK была усовершенствована (SHERLOCKv2) и позволила выявлять в одном анализе до 4 мишеней. Мультиплексирование было достигнуто путем объединения нескольких нуклеаз Cas13 и нуклеазы Cas12 со специфичными флуоресцентными репортерными комплексами, которые обеспечивали детекцию сигнала на разных длинах волн. Количественное обнаружение было достигнуто путем оптимизации концентраций олигонуклеотидов, используемых на этапе предварительной амплификации, чтобы входной сигнал и интенсивность сигнала тесно коррелировали в широком диапазоне концентраций образца. Повышенная чувствительность была достигнута путем добавления Csm6 для увеличения интенсивности расщепления флуоресцентного репортера. Стоит отметить, что SHERLOCKv2 является портативным анализом за счет того, что обнаружение показаний флуоресценции в предложенной технологии заменено на визуальную детекцию на тест-полосках (Gootenberg J.S., Abudayyeh O.O., Kellner M.J., et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018; 360(6387): 439-44. doi: 10.1126/science.aaq0179).
Science
На основе SHERLOCK была разработана технология HUDSON (heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases - нагревание неэкстрагированных диагностических образцов для уничтожения нуклеаз), которая устраняет необходимость в экстракции нуклеиновых кислот и позволяет обнаруживать патогены непосредственно в биологических образцах пациента (образец крови, сыворотки или плазмы крови, клеток крови, слюны, мокроты, лимфоидных тканей, тканей кроветворных органов и других биологических материалов). В HUDSON нагревание и химическое восстановление инактивируют нуклеазы, присутствующие в высоких концентрациях в биологических образцах пациента, после чего вирусные частицы лизируются, высвобождая нуклеиновые кислоты в раствор. HUDSON позволяет в течение 2 ч с высокой чувствительностью обнаружить вирус Денге в образцах цельной крови, сыворотки и слюны пациентов. Кроме того, HUDSON позволяет дифференцировать четыре серотипами вируса Денге и выявлять 6 наиболее распространенных мутаций обратной транскриптазы ВИЧ (Myhrvold C., Freije C.A., Gootenberg J.S., et al. Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13. . 2018; 360(6387): 444-8. doi: 10.1126/science.aas8836).
В связи с этим крайне актуальной является задача разработки новых эффективных методик выявления нуклеиновых кислот возбудителей инфекционных заболеваний, основанных на генетических технологиях, таких как CRISPR/Cas.
В ходе изучения уровня техники были найдены патенты на изобретения и научные статьи, описывающие разработку и получение терапевтических направляющих РНК для удаления ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) из клетки-хозяина, инфицированной JCPyV, и устранения риска реактивации JCPyV с помощью технологии CRISPR/Cas (WO 2016070070 опубл. 06.05.2016, WO2018106268 опубл. 14.06.2018, WO2017100431 опубл 15.06.2017, WO2018140269 опубл 02.08.2018, WO2017210380 опубл. 07.12.2017, WO2020068643 опубл. 02.04.2020, Wollebo HS, Bellizzi A, Kaminski R, Hu W, White MK, Khalili K. CRISPR/Cas9 System as an Agent for Eliminating Polyomavirus JC Infection. PLoS One. 2015 Sep 11;10(9): e0136046. doi: 10.1371/journal.pone.0136046). Из перечисленных выше материалов ни один нельзя отнести к ближайшим аналогам настоящего изобретения в виду того, что направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, предназначены для разработки высокочувствительных и высокотехнологичных диагностических (но не терапевтических) систем нового поколения на основе CRISPR технологий для совершенствования методов диагностики инфекционных заболеваний.
Исходя из этого, возникает техническая проблема, заключающаяся в необходимости получения направляющих РНК для выявления единичных копий ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) in vitro и разработке соответствующих способов ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV).
Раскрытие сущности
Предложенная технология перспективна для разнообразных применений, включая количественное определение ДНК/РНК, быструю мультиплексную детекцию экспрессии, другие виды чувствительной детекции, например, выявление загрязнения образцов нуклеиновыми кислотами. Технология основанная на CRISPR/Cas является многофункциональной, устойчивой к ошибкам технологией детекции ДНК, пригодной для быстрой постановки диагнозов, включая инфекционные заболевания, генотипирование инфекционных агентов и выявление генов антибиотикоустойчивости бактериальных патогенов.
Применение предложенной технологии делает возможным создание диагностических систем нового поколения, которые будут обладать следующими свойствами:
• высокая чувствительность;
• возможность проведения диагностики у постели больного;
• возможность проведения диагностики в полевых условиях без применения специализированного высокотехнологичного оборудования;
• скорость и простота анализа;
• сниженная стоимость анализа;
• отсутствие необходимости оснащения диагностической лаборатории дорогостоящим оборудованием;
• отсутствие необходимости проведения выделения нуклеиновых кислот возбудителя.
Изобретение относится к новым средствам - направляющим РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas12 для ультрачувствительного выявления, идентификации, обнаружения или детекции ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) в биологических образцах.
Технической задачей предложенного изобретения является разработка новых средств - направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas12 с белками Cas12, такими как белок LbCpf1 из Lachnospiraceae, для ультрачувствительного выявления ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV).
При осуществлении настоящего изобретения, согласно приведенной в формуле изобретения совокупности существенных признаков, достигается неожиданный технический результат - возможность ультрачувствительного выявления ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) до единичных копий ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) в одной реакции. Изобретение обеспечивает повышение эффективности выявления ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) с 500 до 100 копий/мл.
Технический результат достигается за счет:
• разработки молекул направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas12 для ультра чувствительного выявления ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV), где указанные направляющие РНК выбраны из последовательностей SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, способны связываться с целевыми высоко консервативными участками ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV), содержат РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae, с обеспечением выявления единичных копий ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV).
• применения РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы LbCpf1 из Lachnospiraceae, полученной согласно способу по патенту № 2707542 (дата приоритета 28.03.2019), разработанному авторами заявляемого решения ранее, для создания рибонуклеопротеиновых комплексов (РПК) системы CRISPR/Cas, пригодных для детекции ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) в ультра низких концентрациях (единичные копии).
• разработки набора специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 3-6, для предварительной амплификации фрагментов генома вируса Джона Каннингема (JCPyV).
• оптимизации условий проведения предварительной амплификации фрагментов ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV).
• определения условий проведения ультрачувствительной детекции ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) и установления последовательности стадий метода.
Направляющие РНК согласно настоящему изобретению соответствуют высоко консервативным фрагментам ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV). Наиболее предпочтительны направляющие РНК, распознающиеся РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae, характеризующиеся, имеющие или содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из:
• SEQ ID NO: 1;
• SEQ ID NO: 2;
• или идентичной любой из них по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%,
• или комплементарной любой из них,
• или гибридизующейся с любой из них в строгих условиях.
Набор специфических олигонуклеотидов для проведения предварительной амплификации фрагментов ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) согласно настоящему изобретению соответствуют высоко консервативным участкам генома вируса Джона Каннингема (JCPyV). Наиболее предпочтительны олигонуклеотиды, характеризующиеся, имеющие или содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из:
• SEQ ID NO: 3;
• SEQ ID NO: 4;
• SEQ ID NO: 5;
• SEQ ID NO: 6;
• или идентичной любой из них по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%,
• или комплементарной любой из них,
• или гибридизующейся с любой из них в строгих условиях.
Согласно предложенному изобретению получают рибонуклеопротеиновые комплексы (РПК), состоящие из по меньшей мере одной направляющей РНК и РНК-направляемой ДНК-нуклеазы системы CRISPR/Cas LbCpf1 из Lachnospiraceae, пригодные для использования для выявления ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) в ультранизких концентрациях (единичные копии).
Препараты РПК представляют собой растворы, содержащие направляющую РНК, выбранную из SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, объединенную с белком системы CRISPR/Cas (LbCpf1 из Lachnospiraceae) или лиофильно высушенные РПК.
Полученные направляющие РНК могут быть использованы в составе набора для обнаружения ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) с инструкцией по применению.
Способ обнаружения ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) предусматривает:
i) проведение предварительной амплификации материала образца от пациента, предположительно содержащего вирус Джона Каннингема (JCPyV) с использованием одного или нескольких специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 3-6, с целью получения мишени - предварительно амплифицированного фрагмента ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV),
ii) приготовление реакционной смеси для детекции, содержащей мишень, полученную на стадии (i); рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR/Cas, сформированный из РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы LbCpf1 из Lachnospiraceae, и по меньшей мере одной направляющей РНК c SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2; флюоресцентный зонд и буфер для детекции,
iii) проведение 30-60 циклов детекции в реакционной смеси, полученной на стадии (ii), в амплификаторе,
с обнаружением таким образом ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV).
Предварительно амплифицированные фрагменты ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) согласно предложенному способу могут быть представлены фрагментами размером 195 п.о. и 196 п.о. генома вируса Джона Каннингема (JCPyV).
Предложенный способ обеспечивает выявление ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) в ультранизких концентрациях, вплоть до единичных копий.
Специфический олигонуклеотид для использования в способе выбирается из группы SEQ ID NO: 3-6 и используется для предварительной амплификации высококонсервативных фрагментов генома вируса Джона Каннингема (JCPyV), которые распознаются рибонуклеопротеиновыми комплексами.
Набор для использования в способе обнаружения ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) содержит рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR/Cas, сформированный из РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы LbCpf1 из Lachnospiraceae, и по меньшей мере одной направляющей РНК c SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2; флюоресцентный зонд, буфер для детекции и инструкцию по применению.
Набор может дополнительно включать компоненты для проведения предварительной амплификации высококонсервативных фрагментов генома вируса Джона Каннингема (JCPyV), в том числе один или несколько специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 3-6.
При этом по меньшей мере одна направляющая РНК в составе набора может находиться в комплексе с белком системы CRISPR/Cas (LbCpf1 из Lachnospiraceae) в одном контейнере или отдельно в разных контейнерах.
Предложенная технология позволяет определить единичные копии ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) в биологических образцах пациента, выбранных из жидкости и/или ткани, предположительно содержащих вирус Джона Каннингема (JCPyV). Биологическим образцом может быть образец крови, сыворотки или плазмы крови, спинномозговой жидкости, клеток крови, слюны, мокроты, лимфоидных тканей, тканей кроветворных органов и других биологических материалов от пациента, которые могут быть использованы для анализа на наличие вируса Джона Каннингема (JCPyV).
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Визуализация фрагмента ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) №518 (размером 195 п.о.) после предварительной амплификации при помощи электрофореза в агарозном геле, где цифрами 1-8 обозначены:
1 - ПЦР-продукт JCPyV №518, полученный в ходе амплификации 28 пг модельной матрицы pGEM-T-JCPyV;
2 - ПЦР-продукт JCPyV №518, полученный в ходе амплификации 2,8 пг модельной матрицы pGEM-T-JCPyV;
3 - ПЦР-продукт JCPyV №518, полученный в ходе амплификации 0,28 пг модельной матрицы pGEM-T-JCPyV;
4 - ПЦР-продукт JCPyV №518, полученный в ходе амплификации 0,028 пг модельной матрицы pGEM-T-JCPyV;
5 - ПЦР-продукт JCPyV №518, полученный в ходе амплификации 0,0028 пг модельной матрицы pGEM-T-JCPyV;
6 - ПЦР-продукт JCPyV №518, полученный в ходе амплификации 0,00028 пг модельной матрицы pGEM-T-JCPyV;
7 - ПЦР-продукт JCPyV №518, полученный в ходе амплификации 0,000028 пг модельной матрицы pGEM-T-JCPyV;
8 - отрицательный контроль, не содержащий модельной матрицы pGEM-T-JCPyV;
М - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).
Фиг. 2. Визуализация фрагмента ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) №4390 (размером 196 п.о.) после предварительной амплификации при помощи электрофореза в агарозном геле, где цифрами 1-8 обозначены:
1 - ПЦР-продукт JCPyV №4390, полученный в ходе амплификации 28 пг модельной матрицы pGEM-T-JCPyV;
2 - ПЦР-продукт JCPyV №4390, полученный в ходе амплификации 2,8 пг модельной матрицы pGEM-T-JCPyV;
3 - ПЦР-продукт JCPyV №4390, полученный в ходе амплификации 0,28 пг модельной матрицы pGEM-T-JCPyV;
4 - ПЦР-продукт JCPyV №4390, полученный в ходе амплификации 0,028 пг модельной матрицы pGEM-T-JCPyV;
5 - ПЦР-продукт JCPyV №4390, полученный в ходе амплификации 0,0028 пг модельной матрицы pGEM-T-JCPyV;
6 - ПЦР-продукт JCPyV №4390, полученный в ходе амплификации 0,00028 пг модельной матрицы pGEM-T-JCPyV;
7 - ПЦР-продукт JCPyV №4390, полученный в ходе амплификации 0,000028 пг модельной матрицы pGEM-T-JCPyV;
8 - отрицательный контроль, не содержащий модельной матрицы pGEM-T-JCPyV;
М - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).
Фиг. 3. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) №518, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA JCPyV №518 и белок LbCpf1.
Фиг. 4. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) №4390, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA JCPyV №4390 и белок LbCpf1.
Фиг. 5. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированных мишеней ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) №518 и №4390, обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК sgRNA JCPyV №518 и sgRNA JCPyV №4390 соответственно.
Фиг. 6. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированных с клинических образцов мишеней ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) №518 и №4390, обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК sgRNA JCPyV №518 и sgRNA JCPyV №4390 соответственно.
Примеры осуществления изобретения
ПРИМЕР 1: ПОДБОР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ-МИШЕНЕЙ В ГЕНОМЕ ВИРУСА ДЖОНА КАННИНГЕМА (JCPyV) ДЛЯ СОЗДАНИЯ НАПРАВЛЯЮЩИХ РНК
Для подбора последовательностей-мишеней в геноме вируса Джона Каннингема (JCPyV) для создания направляющих РНК были использованы современные алгоритмы in silico анализа нуклеотидных последовательностей и программы, находящиеся в открытом доступе, включая Benchling (https://www.benchling.com/molecular-biology/). Был составлен перечень участков в геноме вируса Джона Каннингема (JCPyV) с теоретически рассчитанной вероятностью их расщепления в высоко консервативных участках (Таблица 1. Перечень участков генома вируса Джона Каннингема (JCPyV) с теоретически рассчитанной вероятностью их расщепления LbCpf1 из Lachnospiraceae).
Таблица 1. Перечень участков генома вируса Джона Каннингема (JCPyV) с теоретически рассчитанной вероятностью их расщепления LbCpf1 из Lachnospiraceae.
Участок
Последовательность, 5’-3’
Оценка специфичности, %
518
AGGTTCATGGGTGCCGCACT(кодирующая цепь)
98,9
4390
TAGGTGCCAACCTATGGAAC (некодирующая цепь)
98,3
Направляющие РНК, специфически узнающие фрагменты в геноме вируса Джона Каннингема (JCPyV), представлены уникальными последовательностями SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2.
ПРИМЕР 2: ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ДНК ВИРУСА ДЖОНА КАННИНГЕМА (JCPyV) МЕТОДОМ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ АМПЛИФИКАЦИИ
Подготовку материала для обнаружения ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) проводят методом предварительной амплификации. В качестве модельной матрицы генома вируса Джона Каннингема (JCPyV) биологического образца используют плазмидную ДНК pGEM-T-JCPyV, содержащую в своем составе полный геном вируса Джона Каннингема (JCPyV) (размером 5139 п.о.).
Предварительную амплификацию участков, соответствующих фрагментам генома вируса Джона Каннингема (JCPyV) №518 и №4390, проводят с использованием специфических олигонуклеотидов с SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, приведенных в Таблице 2. Специфические олигонуклеотиды для предварительной амплификации фрагментов генома вируса Джона Каннингема (JCPyV), соответственно. ПЦР-продукты, кодирующие фрагменты генома вируса Джона Каннингема (JCPyV) №518 и №4390, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов (ГенТерра, Россия), перечисленных в Таблице 2. Специфические олигонуклеотиды для предварительной амплификации фрагментов генома вируса Джона Каннингема (JCPyV). Размер амплифицированных фрагментов №518 и №4390 составляет 195 пар нуклеотидов и 196 пар нуклеотидов соответственно.
Таблица 2. Специфические олигонуклеотиды для предварительной амплификации фрагментов генома вируса Джона Каннингема (JCPyV).
№ п/п
Наименование
Последовательность, 5’-3’
Мишень
1
JCPyV-518-For
ATACAGTGCTTTGCCTGAACC
№518
2
JCPyV-518-Rev
GCAATTTCAACTTCTATAGTAGCAGC
№518
3
JCPyV-4390-For
GGATCCTGTGTTTTCATCATCAC
№4390
4
JCPyV-4390-Rev
AAGCTTTAAGGTAAACCAC
№4390
Температурный профиль амплификации для получения ПЦР-продуктов, соответствующих фрагментам генома вируса Джона Каннингема (JCPyV) №518 и №4390:
1. денатурация: 95°С в течение 3 минут;
2. 40 циклов амплификации:
95°С - 15 сек,
55°С - 45 сек,
72°С - 30 сек;
3. финальная элонгация: 72°С в течение 5 минут.
В ходе подготовки материала для обнаружения ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) методом предварительной амплификации проводят титрование модельной матрицы pGEM-T-JCPyV путем приготовления серийных разведений (Таблица 3. Серийные разведения образцов модельной матрицы, содержащей геном вируса Джона Каннингема (JCPyV), и клинических образцов).
Таблица 3. Серийные разведения образцов модельной матрицы, содержащей геном вируса Джона Каннингема (JCPyV), и клинических образцов.
Разведение,№
1
2
3
4
5
6
7
8
Концентрация матрицы, пг/мкл
280
28
2,8
0,28
0,028
0,0028
0,00028
0,000028
Количество копий ДНК на реакцию
3,4×10<sup>7</sup>
3,4×10<sup>6</sup>
3,4×10<sup>5</sup>
3,4×10<sup>4</sup>
3400
340
34
3,4
Для оценки эффективности предварительной амплификации полученные ПЦР-продукты, соответствующие фрагментам генома вируса Джона Каннингема (JCPyV) №518 и №4390, визуализируют при помощи электрофореза в агарозном геле (Фиг. 1 и Фиг. 2 соответственно).
Подготовленный описанным способом материал используют для экспериментов по выявлению ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae, содержащих направляющие РНК sgRNA JCPyV №518 и sgRNA JCPyV №4390, без предварительной очистки.
ПРИМЕР 3: ПОЛУЧЕНИЕ НАПРАВЛЯЮЩИХ РНК И СОЗДАНИЕ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ДНК ВИРУСА ДЖОНА КАННИНГЕМА (JCPyV)
Для получения направляющих РНК для обнаружения ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) разработан набор специфических олигонуклеотидов, приведенных в Таблице 4. Специфические олигонуклеотиды для получения ПЦР-продукта, кодирующего направляющие РНК, специфичные к ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV).
Таблица 4. Специфические олигонуклеотиды для получения ПЦР-продукта, кодирующего направляющие РНК, специфичные к ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV).
№ п/п
Наименование
Последовательность, 5’-3’
Направляющая РНК
1
T7pr
CCCTAATACGACTCACTATAGGAATTTCTACTAAGTGTAGAT
sgRNA JCPyV №518, sgRNA JCPyV №4390
2
sgRNA-JCPyV-518-Rev
AGTGCGGCACCCATGAACCTATCTACACTTAGTAGAAATT
sgRNA JCPyV №518
3
sgRNA-JCPyV-4390-Rev
GTTCCATAGGTTGGCACCTAATCTACACTTAGTAGAAATT
sgRNA JCPyV №4390
Получение направляющих РНК проводят в несколько этапов:
1. получение ПЦР-продукта с использованием набора специфических олигонуклеотидов (Таблица 4. Специфические олигонуклеотиды для получения ПЦР-продукта, кодирующего направляющие РНК, специфичные к ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV)), кодирующего направляющую РНК, способную связываться с целевым фрагментом генома вируса Джона Каннингема (JCPyV), содержащую РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae;
2. очистка ПЦР-продукта, кодирующего направляющую РНК, специфичную к фрагменту генома вируса Джона Каннингема (JCPyV);
3. синтез направляющей РНК, специфичной к фрагменту генома вируса Джона Каннингема (JCPyV);
4. очистка направляющей РНК, специфичной к фрагменту генома вируса Джона Каннингема (JCPyV).
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК sgRNA JCPyV №518, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и sgRNA-JCPyV-518-Rev (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего sgRNA JCPyV №518, составляет 62 пары нуклеотидов.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК sgRNA JCPyV №4390, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и sgRNA-JCPyV-4390-Rev (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего sgRNA JCPyV №4390, составляет 62 пары нуклеотидов.
Температурный профиль амплификации для получения ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК:
1. денатурация: 95°С в течение 3 минут;
2. 35 циклов амплификации:
95°С - 15 сек,
55°С - 45 сек,
72°С - 30 сек;
3. финальная элонгация: 72°С в течение 5 минут.
ПЦР-продукты, кодирующие направляющие РНК, специфичные к фрагменту генома вируса Джона Каннингема (JCPyV), визуализируют при помощи электрофореза в агарозном геле.
Очистку ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК, специфичные к фрагменту генома вируса Джона Каннингема (JCPyV), проводят с использованием коммерчески доступного набора ISOLATE II PCR and Gel Kit (BioLine, США) согласно инструкции производителя. Очищенные ПЦР-продукты, кодирующие направляющие РНК, специфичные к фрагменту генома вируса Джона Каннингема (JCPyV), используют в качестве матрицы для синтеза направляющих РНК.
Синтез направляющих РНК, специфичных к фрагменту генома вируса Джона Каннингема (JCPyV), осуществляется методом in vitro транскрипции с использованием коммерчески доступных наборов реагентов (HiScribe™ T7 High Yield RNA Synthesis Kit, NEB, США) согласно инструкции производителя. Продукты реакции in vitro транскрипции переосаждают из реакционной смеси добавлением хлорида натрия до конечной концентрации 400 mM и равного объема изопропилового спирта. Такие модификации протокола производителя, внесенные авторами, позволяют увеличить выход продукта реакции и получить желаемую концентрацию финального препарата направляющей РНК.
Создание готового рибонуклеопротеинового комплекса, содержащего белок семейства CRISPR/CAS LbCpf1 из Lachnospiraceae, и направляющую РНК авторы проводят по стандартному протоколу с некоторыми модификациями (In vitro enzymology of Cas9 // Anders C, Jinek M. Methods Enzymol. 2014;546:1-20. doi: 10.1016/B978-0-12-801185-0.00001-5).
Непосредственно перед объединением с Cas-белком препарат направляющей РНК (в количестве 250 нг) прогревают при 90°С в течение 5 минут и позволяют медленно остыть до комнатной температуры (инкубация при комнатной температуре не менее 10 минут). Такое прогревание необходимо для формирования корректной конформации шпильки, содержащейся в направляющей РНК. Многие производители коммерческих препаратов Cas-белков пропускают данный этап при подготовке рибонуклеопротеинового комплекса.
Для формирования готового рибонуклеопротеинового комплекса 250 нг Cas-белка LbCpf1 из Lachnospiraceae и подготовленную направляющую РНК смешивают и инкубируют 15 минут при комнатной температуре. Полученный таким способом рибонуклеопротеиновый комплекс готов для выявления фрагментов генома вируса Джона Каннингема (JCPyV).
ПРИМЕР 4: ОБНАРУЖЕНИЕ ЕДИНИЧНЫХ КОПИЙ ДНК ВИРУСА ДЖОНА КАННИНГЕМА (JCPyV) С ПОМОЩЬЮ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ CRISPR/CAS НА ПРИМЕРЕ МОДЕЛЬНОЙ МАТРИЦЫ
Предварительно амплифицированный материал, полученный способом, описанным в Примере 2, используют в качестве матрицы для обнаружения ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, полученных способом, описанным в Примере 3.
Для обнаружения ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas готовят реакционную смесь, содержащую следующие компоненты:
• 10× буфер (100 mM TrisHCl pH 8,0, 1 M NaCl);
50 mM•  MgCl2 (конечная концентрация в реакционной смеси 10 mM);
• 250 нг рибонуклеопротеинового комплекса (LbCpf1 из Lachnospiraceae и направляющие РНК sgRNA JCPyV №518 и sgRNA JCPyV №4390);
• 20 pmol флуоресцентный зонд (6FAM-TTATT-BHQ1);
• мишень (предварительно амплифицированный фрагмент генома вируса Джона Каннингема (JCPyV));
• вода mQ.
Реакционные смеси, содержащие все необходимые компоненты, помещают в амплификатор QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific, США) и задают следующие параметры реакции:
60 циклов:
37°С - 35 сек,
37°С - 25 сек,
съемка флуоресценции.
В первую очередь были проведены эксперименты по обнаружению единичных копий ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, сформированных на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae, с использованием в качестве мишени модельной матрицы - плазмидной ДНК pGEM-T-JCPyV, содержащей в своем составе полный геном вируса Джона Каннингема (JCPyV) размером 5139 п.о. Было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/Cas обладают способностью выявлять единичные копии ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV). Типичные результаты анализа приведены на примерах профилей флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированных мишенях №518 и №4390, обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК sgRNA JCPyV №518 и sgRNA JCPyV №4390 и белок LbCpf1, на Фиг. 3 и Фиг. 4 соответственно. Отметим, что уже на 5-ом цикле анализа (5 минут) значение сигнала, полученного в ходе детекции единичных копий (3,4 копий/реакция) ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV), превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) минимум в 10 раз.
В ходе работ была оценена эффективность выявления единичных копий генома вируса Джона Каннингема (JCPyV), содержащегося в составе модельной матрицы, с использованием различных направляющих РНК (Фиг. 5). Было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/Cas, сформированные на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae и направляющих РНК, выявляют единичные копии генома вируса Джона Каннингема (JCPyV) с различной эффективностью, и их можно расположить в следующем порядке по уменьшению активности: sgRNA JCPyV №4390 > sgRNA JCPyV №518.
ПРИМЕР 5: ОБНАРУЖЕНИЕ ЕДИНИЧНЫХ КОПИЙ ДНК ВИРУСА ДЖОНА КАННИНГЕМА (JCPyV) С ПОМОЩЬЮ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ CRISPR/CAS НА ОГРАНИЧЕННОЙ ПАНЕЛИ КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ
Разработанные направляющие РНК были апробированы на ограниченной панели клинических образцов (12 шт.), содержащих вирус Джона Каннингема (JCPyV) (ранее подтверждено с помощью ПЦР в реальном времени).
Для обнаружения единичных копий ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas была проведена предварительная амплификация фрагментов №518 и №4390. Для проведения предварительной амплификации были подготовлены серийные (согласно Таблице 3. Серийные разведения образцов модельной матрицы, содержащей геном вируса Джона Каннингема (JCPyV), и клинических образцов) разведения препаратов ДНК, выделенных из клинических образцов 12 пациентов с помощью коммерчески доступного набора «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) согласно инструкции производителя.
ПЦР-продукты, кодирующие фрагменты ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) №518 и №4390, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) как описано в Примере 2, применяя описанный температурный профиль и продолжительность реакции амплификации.
Полученный таким способом материал используют в качестве матрицы для обнаружения единичных копий ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, полученных способом, описанным в Примере 3.
Обнаружение единичных копий ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas проводят способом, описанным в Примере 4.
В ходе проведенного анализа было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/Cas обладают способностью выявлять единичные копии (2 копии/реакция) вируса Джона Каннингема (JCPyV) в препаратах ДНК, выделенных из клинических образцов. При этом уже на 5 цикле (5 минут) анализа значение сигнала превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) в десять раз, а к 20 циклу (20 минут) анализа - более чем в 100 раз. На Фиг. 6 приведены типичные результаты анализа на примерах значений флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированных мишеней фрагментов ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) №518 и №4390 (12 независимых клинических образцов), обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК sgRNA JCPyV №518 и sgRNA JCPyV №4390 и белок LbCpf1.
Таким образом, разработанные направляющие РНК позволяют в составе рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas ультрачувствительно выявлять единичные копии ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) в реакции после предварительной амплификации в препаратах ДНК, выделенных из клинических образцов, содержащих вирус Джона Каннингема (JCPyV).