Способ определения количества повреждений митохондриальной ДНК картофеля при тестировании токсичности пестицидов in vitro
METHOD FOR DETERMINING AMOUNT OF DAMAGE TO MITOCHONDRIAL DNA OF POTATOES WHEN TESTING TOXICITY OF PESTICIDES IN VITRO

Настоящее изобретение относится к области сельского хозяйства, а именно к способам количественной оценки повреждения митохондриальной ДНК картофеля (Solarium tuberosum). Данное изобретение может быть использовано для тестирования токсичности пестицидов, которые используются против вредителей картофеля.
Известно, что картофель сильно подвержен поеданию со стороны насекомых (колорадский жук, медведка, проволчники и т.д.) и заболеваниям грибковой природы (парша, фитофтороз). По этой причине нередко семенной материал картофеля обрабатывается инсектицидами и фунгицидами. Известно, что значительная часть пестицидов является митохондриально-направленными и способны угнетать метаболизм не только в организме вредителя, но и в нетаргетных организмах. Это может негативно сказываться на росте и плодовитости сельскохозяйственных культур. Однако влияние пестицидов на метаболизм клубней картофеля слабо изучено. В частности, лабораторные и вегетационные опыты показали, что некоторые коммерчески доступные инсектициды и фунгициды могут угнетать ростовые процессы на начальных стадиях онтогенеза (Бочаров С.С. Влияние гуминовых препаратов на адаптацию картофеля к пестицидной нагрузке / С.С.Бочаров, Н.А. Фомин // Нива Поволжья. - 2013. - Т. 4, №29. - С. 1-8). Кроме того, после обработки вегетативных частей растений, данные пестициды могут накапливаться в почве, что так же может приводить к нарушениям метаболизма клубней картофеля (Dynamics of Pesticides in Potato Crops / G.C. Lopez-Perez [et al.] // J Agric Food Chem, - 2006. -Vol.54, №5, - P. 1797-1803).
Митохондриальная ДНК является удобным маркером окислительного стресса, в связи со своим расположением в матриксе митохондрий, то есть непосредственной близости от источника активных форм кислорода. Кроме того, митохондриальная ДНК лишена гистоновых белков, которые частично защищают ядерную ДНК от повреждений. Прототипом настоящего изобретения является патент РФ №2663719, касающийся способа определения генотоксичности ксенобиотиков на основе анализа повреждений митохондриальной ДНК земляного шмеля (Bombus terrestris). Данный метод предусматривает следующие этапы: 1) забор биологического материала, 2) выделение ДНК, 3) определение количественного уровня повреждений митохондриальной ДНК методом ПЦР в реальном времени, 4) сравнение количественного уровня повреждений митохондриальной ДНК экспериментальной и контрольной группы. При этом предварительно ведут кормление земляных шмелей (Bombus terrestris) тестируемым ксенобиотиком на протяжении суток, ДНК выделяют из грудных мышц шмеля, ПЦР проводят при температуре элонгации 66,1±0,5°С в течение 5 минут с использованием Encyclo-полимеразы и соответствующего ей Encyclo-буфера с парами праймеров, имеющих определенные последовательности. Однако недостатком данного метода является то, что он не учитывает эффективность ПЦР, которая, в случае митохондриальной ДНК растений, может значительно отличаться от 100%.
Данный метод не позволяет тестировать пестициды на митохондриальной ДНК растений. Так как в прототипе используется in vivo эксперимент, в то время в случае клубней картофеля целесообразней проводить in vitro эксперимент, который требует предварительного изолирования митохондрий. Кроме того, в прототипе используется только короткий референсный фрагмент, на основании которого производится нормализация количества копий митохондриальной ДНК. Это не применимо для картофеля, как так митохондриальная ДНК растений зачастую это не единая молекула и может быть представлена в виде различных кольцевых и линейных фрагментов различной длины. По этой причине в настоящем изобретении каждый целевой ПЦР фрагмент нормализуется относительно соответствующего ему короткого фрагмента.
Задачей изобретения является разработка способа тестирования различных пестицидов на способность повреждать митохондриальную ДНК.
Технический результат заключается в разработке высокочувствительного, хорошо воспроизводимого способа определения количества повреждений митохондриальной ДНК клубней картофеля при тестировании токсичности пестицидов in vitro, угнетающих рост растения и снижающих продуктивность.
Технический результат достигается тем, что в способе определения количества повреждений митохондриальной ДНК картофеля при тестировании токсичности пестицидов in vitro, включающем получение препарата митохондрий, выделение ДНК из препарата; определение количества повреждений митохондриальной ДНК с помощью ПЦР в реальном времени; сравнение количества повреждений митохондриальной ДНК экспериментальной и контрольной группы, где более высокий уровень повреждений у экспериментальной группы является показателем токсичности пестицида, согласно изобретению ведут получение интактных митохондрий из клубней картофеля путем осаждения митохондрий, их очистки; затем осуществляют инкубирование тестируемого пестицида, взятого в тестируемой концентрации, и интактных митохондрий экспериментальной группы с дыхательным субстратом, взятым в количестве, необходимым для создания концентрации, равной 10 мкМ, в течение 30 минут, при этом инкубирование митохондрий контрольной группы ведут в отсутствии пестицидов; выделение ДНК при использовании любого из коммерческих наборов, который использует сорбирующие материалы; определение количества повреждений митохондриальной ДНК клубней картофеля с помощью ПЦР в реальном времени длинных фрагментов митохондриальной ДНК с использованием Encyclo-полимеразы и соответствующего ей Encyclo-буфера с парами праймеров, имеющих последовательности согласно Перечню последовательностей; амплификацию фрагментов митохондриальной ДНК, кодирующих гены Сох2 длиной фрагмента 1986 п.н и 26s рибосомальной РНК длиной фрагмента 2080 п.н.; при этом длина коротких фрагментов для гена Сох2 и 26s рибосомальной РНК не превышает 200 п.н.; общую денатурацию осуществляют при 95°С 3 мин; денатурацию в начале цикла - при 95°С 10 с; отжиг праймеров ведут при 59°С 30 с; элонгацию - при 72°С 4 мин; количество циклов равно 25, при этом более высокий уровень повреждений и/или большее количество повреждаемых фрагментов у экспериментальной группы является показателем большей токсичности пестицида.
Последовательности праймеров для определения количества повреждений в митохондриальной ДНК клубней картофеля приведены в Перечне последовательностей. Длина длинного ПЦР фрагмента для гена Сох2 составляет 1986 п. н, для гена 26s рибосомальной РНК - 2080 п. н. Длина коротких фрагментов для гена Сох2 и 26s рибосомальной РНК не превышает 200 п. н.
В основе метода лежит получение препарата интактных митохондрий (Гуреев А.П. Спецпрактикум по биоэнергетике: учебно-методическое пособие для вузов / А.П. Гуреев, М.Ю. Сыромятников, В.Н. Попов // Воронеж: Издательский дом ВГУ. - 2017. - 39 с). Среда для выделения митохондрий должна содержать следующие компоненты: 100 мМ маннитола; 225 мМ сахарозы; 1 мМ этиленгликольтетрацетата; 20 мМ HEPES; 1 мМ дитиотреитола; свободного от жирных кислот БСА в концентрации 1,5 мг/л; все компоненты были растворены в Milli-Q воде; рН 7.4. Рекомендуется для одного выделения использовать от 180 гр до 500 гр очищенных клубней картофеля. Гомогенизировать картофель в среде для выделения в массовом соотношении картофельных клубней и среды для выделения 1:1 соответственно при температуре +4°С. Полученный гомогенат центрифугируется в течение 5 мин при 1000 g. К полученному супернатанту добавляется среда для выделения по меньшей мере в количестве 20 мл, затем осуществляется центрифугирование в течение 5 мин при 4000 g. Далее проводится осаждение фракций свободных митохондрий при помощи центрифугирования в течение 15 мин при 15000 g. Полученный супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют в 500 мкл среды для выделения. Далее требуется провести очистку полученных митохондрий в градиенте 17% Перколла при помощи градиентного центрифугирования в течение 30 мин при 30000 g. После центрифугирования требуется провести промывку полученных митохондрий средой для выделения, взятой в объеме, равном по меньшей мере 20 мл, путем центрифугирования при 18000 g в течение 15 мин, отделение супернатанта, ресуспендирование осадка по меньшей мере в 20 мл среды для выделения и центрифугирование при 16000 g 10 мин., удаление супернатанта, ресуспендирование осадка по меньшей мере в 20 мкл среды для выделения и провести инкубирование тестируемого пестицида в тестируемой концентрации с интактными митохондриями экспериментальной группы, содержащими 10 мМ дыхательных субстратов в течение 30 минут. При этом инкубирование митохондрий контрольной группы поводили в отсутствии пестицидов. Для последующего выделения ДНК подходит любой из коммерческих наборов, который использует сорбирующие материалы. Не рекомендуется использовать методы, которые включают в себя поэтапное осаждение клеточных компонентов, так как используемые в данных методах агрессивные реагенты, такие как фенол и хлороформ, могут повреждать митохондриальную ДНК, что может привести к получению ложноположительных результатов. Определение количества повреждений митохондриальной ДНК осуществляют с помощью ПЦР в реальном времени длинных фрагментов митохондриальной ДНК с использованием Encyclo-полимеразы и соответствующего ей Encyclo-буфера с парами праймеров, имеющих последовательности согласно Перечню последовательностей. При этом амплификацию ведут фрагментов митохондриальной ДНК, кодирующих гены Сох2 и 26s рибосомальной РНК. Длина длинного ПЦР фрагмента для гена Сох2 составляет 1986 п.н, для гена 26s рибосомальной РНК - 2080 п.н. Длина коротких фрагментов для гена Сох2 и 26s рибосомальной РНК не превышает 200 п.н. Для расчета эффективности ПЦР необходимо сделать серию минимум из четырех 10-кратных последовательных разведений контрольной ДНК и произвести постановку ПЦР с каждой парой праймеров. Реакционная смесь для оценки эффективности ПЦР и дальнейшего измерения количества повреждений включает в себя: 2 мкл 10Х Encyclo буфер, 0,4 мкл 5 0Х смеси полимераз Encyclo, 0,4 мкл смеси dNTP (10 мМ каждого), 1 мкл 20Х SYBR-green, 1-10 нг ДНК-матрицы, 0,5 мкл 10 мкМ прямого и 0.5 мкл 10 мкМ обратного праймера (Перечень последовательностей). Доводится водой MilliQ до объема 20 мкл. Условия ПЦР: Общая денатурация: 95°С 3 мин, денатурация в начале цикла: 95°С 10 с, отжиг праймеров: 59°С 30 с, элонгация: 72°С 4 мин, 25 циклов. Расчет полученных результатов производится по формуле:
-(Δкор-Δдлин)*10000 п.o.
длина фрагмента п.о.,
Повреждения на 10 kb=(1-Е/
где Е - значение эффективности ПЦР
Δкор=Cq короткого таргетного фрагмента - Cq короткого контрольного фрагмента,
Δдлин=Cq длинного таргетного фрагмента - Cq длинного контрольного фрагмента.
Способ поясняется примером.
Для одного выделения использовали 500 гр очищенного картофеля. Картофель гомогенизировали в среде для выделения в массовом соотношении клубней картофеля и среды для выделения 1:1 соответственно при температуре +4°С. Гомогенат переносили в центрифужные пробирки. Центрифугировали в течение 5 мин при 1000 g. Полученный супернатант переносили в чистые пробирки и добавляли, 20 мл среды для выделения. Центрифугировали в течение 5 мин при 4000 g. Осаждение фракций свободных митохондрий осуществляли при помощи центрифугирования в течение 15 мин при 15000 g. Полученный супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в 500 мкл среды для выделения. После этого осадок перекомбинировали в одну чистую пробирку и аккуратно наносили по 500 мкл сверху на 17% раствор Перколла. Центрифугирование в градиенте Перколла проводили в течение 30 мин при 30000 g при ускорении центрифуги равном 6. После центрифугирования наблюдалось разделение на фазы. Аккуратно отбирали средний слой, переносили в чистые пробирки и добавляли 20 мл среды для выделения. Следующую промывку осуществляли путем центрифугирования в течение 15 мин при 18000 g (ускорение 9). Супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в 20 мл среды для выделения и перекомбинировали в одну пробирку и центрифугировали при 16000 g 10 мин. Супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в 20 мкл среды для выделения. Затем проводили инкубирование тестируемого пестицида с интактными митохондриями экспериментальной группы, содержащими 10 мМ дыхательных субстратов в течение 30 минут. Для этого к 100 мкл полученных митохондрий добавляли 1 мкл одномолярного раствора сукцината натрия, использующегося в качестве дыхательного субстрата. При этом инкубирование митохондрий контрольной группы поводили в отсутствии пестицидов. Для последующего выделения ДНК подходит любой из коммерческих наборов, который использует сорбирующие материалы. Не рекомендуется использовать методы, которые включают в себя поэтапное осаждение клеточных компонентов, так как используемые в данных методах агрессивные реагенты, такие как фенол и хлороформ, могут повреждать митохондриальную ДНК, что может привести к получению ложноположительных результатов. Определение количества повреждений митохондриальной ДНК проводили с помощью ПЦР в реальном времени длинных фрагментов митохондриальной ДНК с использованием Encyclo-полимеразы и соответствующего ей Encyclo-буфера с парами праймеров, имеющих последовательности согласно Перечню последовательностей. При этом амплификацию ведут фрагментов митохондриальной ДНК, кодирующих гены Сох2 и 26s рибосомальной РНК. Длина длинного ПЦР фрагмента для гена Сох2 составляет 1986 п.н, для гена 26s рибосомальной РНК - 2080 п.н. Длина коротких фрагментов для гена Сох2 и 26s рибосомальной РНК не превышает 200 п.н. Для расчета эффективности ПЦР необходимо сделать серию минимум из четырех 10-кратных последовательных разведений контрольной ДНК и произвести постановку ПЦР с каждой парой праймеров. Реакционная смесь для оценки эффективности ПЦР и дальнейшего измерения количества повреждений включает в себя: 2 мкл 10Х Encyclo буфер, 0,4 мкл 50Х смеси полимераз Encyclo, 0,4 мкл смеси dNTP (10 мМ каждого), 1 мкл 20Х SYBR-green, 1-10 нг ДНК-матрицы, 0,5 мкл 10 мкМ прямого и 0.5 мкл 10 мкМ обратного праймера (Перечень последовательностей). Доводится водой MilliQ до объема 20 мкл. Условия ПЦР: Общая денатурация: 95°С 3 мин, денатурация в начале цикла: 95°С 10 с, отжиг праймеров: 59°С 30 с, элонгация: 72°С 4 мин, 25 циклов.
Расчет полученных результатов производится по формуле:
-(Δкор-Δдлин)*10000 п.o.
длина фрагмента п.о.,
Повреждения на 10 kb=(1-Е/
где Е - значение эффективности ПЦР
Δкор=Cq короткого таргетного фрагмента - Cq короткого контрольного фрагмента,
Δдлин=Cq длинного таргетного фрагмента - Cq длинного контрольного фрагмента.
Для инициации повреждений, митохондрии, изолированные из клубней картофеля, инкубировали в течение 30 минут с пестицидами дитианон и дельтаметрин (оба, Sigma Aldrich, США) в концентрации 20-200 мкМ. Для этого к 100 мкл полученных митохондрий добавляли 2, 5 и 20 мкл 1 мМ раствора пестицида. Контрольная группа инкубировалась в отсутствии пестицидов.
Эффективность амплификации длинного фрагмента 26s рРНК составила 79,1%, длинного фрагмента Сох2 составляла 71,1%. Для длинного фрагмента 26s рРНК значение Е=1,791. Для длинного фрагмента Сох2 значение Е=1,711.
Было показано, что дитианон вызывает повреждения в гене сох2 в концентрации 200 мкМ (1,51±0,43 повреждений / 10 т.п.н, р<0.01), в то время как в концентрациях 50 мкМ и 20 мкМ в гене сох2 повреждений не было выявлено, также, как и в концентрациях 20, 50 и 200 мкМ в гене 26s.
Дельтаметрин увеличивал количество окислительных повреждений мтДНК в гене сох2 в концентрациях 50 мкМ (1,09±0,39 повреждений / 10 т.п.н, р<0.001) и 200 мкМ (2,87±0,23 повреждений /10 т.п.н, р<0.05) и в гене 26s в концентрации 200 мкМ (1,81±0,63 повреждений /10 т.п.н, р<0.05), в то время как в концентрациях 20 мкМ в гене сох2 и 20 мкМ и 50 мкМ в гене 26s повреждений не было выявлено.
Можно сделать вывод, что дельтаметрин является более токсичным для митохондриальной ДНК клубней картофеля в сравнении с дитианоном, так как выявлено повреждение в фрагменте Сох2 при использовании дельтаметрина в концентрации 50 мкМ.
Таким образом, данный метод может применяться для оценки количества повреждений митохондриальной ДНК клубней картофеля-пестицидами при тестировании токсичности пестицидов in vitro, а также поиска биологически активных веществ, которые могут увеличивать адаптивный потенциал культурного растения к пестицидной нагрузке.
Предлагаемый способ определения количества повреждений митохондриальной ДНК картофеля при тестировании токсичности пестицидов in vitro является высокочувствительным и хорошо воспроизводимым. Анализ можно проводить в лабораториях, в которых имеются рефрежераторные центрифуги, термоциклер с системой детекции флюоресценции для ПЦР в реальном времени, камеру для электрофореза, спектрофотометр или флюориметр, сопутствующие реактивы и расходные материалы.
--->
Перечень последовательностей
Прямой 26sF               CAT CCG CCC CAG ATA AAC TA   (SEQ ID NO: 1)
Обратный 26s Sh            ATA GGT GGG AGG TGG TGA CA  (SEQ ID NO: 2)
Обратный 26s Long          GTA CCG TGA GGG AAA GGT GA  (SEQ ID NO: 3)
Прямой Cox2 F             CAC  AAG GAG CAA TTG TGA GG  (SEQ ID NO: 4)
Обратный Cox2 Sh          CAC AAG GAG CAA TTG TGA GG   (SEQ ID NO: 5)
Обратный Cox2 Long         TTT AAA CGA CCC GGT ACA GC  (SEQ ID NO: 6)
<---