Способ получения олиго[(N,N-диметилэтилендиамино)-(триазолил)фосфазена]
METHOD FOR PRODUCING OLIGO[(N,N-DIMETHYLETHYLENEDIAMINO)-(TRIAZOLYL)PHOSPHAZENE]

Изобретение относится к способам получения аминозамещённых олигомерных линейных фосфазенов, содержащих гетероциклические амины в качестве боковых групп и может быть использовано в качестве носителя средств защиты растений в сельском и лесном хозяйствах. Благодаря наличию положительно заряженных аминных фрагментов в составе фосфазена, возможно обеспечение связывания с отрицательно заряженными молекулами, такими как ДНК или РНК, и создание полиплексов на их основе. Подобные электростатически связанные структуры могут быть использованы в качестве систем доставки генетических последовательностей, обладающих инсектицидным эффектом.
При создании средств защиты растений значимыми являются такие параметры, как селективность действия, низкий класс опасности, а также эффективность воздействия на насекомое-вредителя. Последовательности нуклеотидов с инсектицидным эффектом были показаны как соединения, обладающие избирательным действием на конкретный вид насекомого (Oberemok V. et al. A Half-Century History of Applications of Antisense Oligonucleotides in Medicine, Agriculture and Forestry: We Should Continue the Journey // Molecules. 2018. Vol. 23, № 6. P. 1302.), однако, указанный подход не имеет достаточной эффективности, поскольку ДНК и РНК в отсутствии носителя подвергаются воздействию факторов окружающей среды, что приводит к разрушению таких инсектицидных препаратов, а также имеют низкую эффективность трансфекции сквозь мембрану клетки насекомого. Избежать указанных недостатков возможно при использовании дополнительного носителя, способствующего связыванию с целевыми генетическими последовательностями.
Фосфазеновые линейные олигомеры и полимеры являются перспективными соединениями в области создания комплексных систем доставки олигонуклеотидов, обладающих инсектицидным эффектом за счёт возможности тонкого регулирования свойств итоговых продуктов путём варьирования химической структуры боковых фрагментов (Gleria M., De Jaeger R. Polyphosphazenes: A Review // New Aspects in Phosphorus Chemistry V / ed. Majoral J.-P. Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg, 2005. Vol. 250. P. 165-251.). Введение в фосфазеновую структуры линейных алифатических аминов в сочетании с гетероциклическими фрагментами, такими как имидазол и триазол, способствует не только связыванию фосфазенового олигомера или полимера с отрицательно заряженными молекулами, но и обеспечивает эффект «протонной губки», благодаря которому возможно добиться повышения эффективности трансфекции через мембраны целевых клеток насекомых-вредителей.
Известен способ получения циклического тримерного фосфазена, содержащего полиэтиленгликоль и пептидные фрагменты в качестве боковых групп, который предлагается использовать в качестве носителя биологически активных веществ (Патент № KR100567397B1). Указанный олигофосфазен обладает чувствительностью к изменению температуры, и, образуя мицеллярные структуры, обеспечивает контролируемое высвобождение доставляемого вещества. Недостатком известного способа является применение низких температур в процессе синтеза (-78°С).
Также известен способ синтеза фосфазена, содержащего аминогруппы в качестве боковых (Патент № KR101209266B1), предлагаемого как носитель наночастиц железа. Такую систему доставки возможно использовать в качестве контрастного агента при проведении магнитно-резонансной томографии. Недостатком данного способа является многостадийность процесса синтеза.
Известен способ получения аминозамещённого полифосфазена, представленного в патенте № US7235295B2 (прототип). В указанном патенте в качестве примеров получения аминозамещённых фосфазенов рассматривается синтез поли[бис(этилаланато)фосфазена], а также фосфазена, содержащего смешанные заместители - этилаланин и метилфенокси. Синтез предлагается проводить классическим методом нуклеофильного замещения. Недостатком данного метода синтеза является использование в качестве боковых заместителей легко гидролизующиихся аминокислотных фрагментов, что приводит к увеличению скорости разложения и, тем самым, потере активности комплексной системы доставки.
Технической задачей предлагаемого изобретения является разработка способа получения олигомерного линейного фосфазена, содержащего диметилэтилендиаминные и триазольные фрагменты в качестве боковых групп, формула которого представлена ниже (1), где соотношение звеньев различного строения 0,2:10:18,7, способного выступать в качестве носителя биологически активных веществ.
, (1)
Решение поставленной задачи заключается в том, что олигодихлорфосфазен в среде осушенного тетрагидрофурана и триэтиламина взаимодействует с триазолом в течение 72 часов при температуре 23°С при последующем добавлении N,N-диметилэтилендиамина и выдержке в течение 72 часов при температуре 23°С с отгонкой растворителя, диализом против воды и сушкой при давлении 6 Па и температуре 0°С.
При других условиях ведения процесса поставленная задача не достигается.
Полученные результаты подтверждаются примером:
Пример 1.
2
3
В трёхгорлую круглодонную колбу, снабжённую обратным холодильником и магнитным мешальником, загружают 3 г (0,04925 моль) олигодихлорфосфазена, предварительно растворённого в 80 мл (0,9863 моль) осушенного тетрагидрофурана. Затем при непрерывном перемешивании добавляют 19,9348 г (0,1970 моль) триэтиламина. С помощью капельной воронки в реакционную массу постепенно добавляют 3,4013 г (0,04925 моль) триазола в 50 мл (0,6164 моль) терагидрофурана. Реакционную смесь выдерживают при Т=23°С в течение 72 часов. Далее аналогичным образом в реакционную массу добавляют 4,341 г (0,04925 моль) N,N-диметилэтилендиамина. Реакционную смесь также выдерживают при Т=23° в течение 72 часов. После окончания выдержки раствор помещают в одногорлую круглодонную колбу и отгоняют растворитель из реакционной смеси на роторном испарителе при Т=40°С. Затем полученный олигомер очищают диализом против дистиллированной воды, рН которой доводят до 11 добавлением KCO. Беспримесный олигомер сушат при помощи роторного испарителя при Т=23°С. Остаточные количества растворителя удаляют при помощи сушки при пониженном давлении (6 Па) при поддержании температуры около 0°С. Продукт представляет собой вязкую массу оранжевого цвета. Выход итогового олигомера 5,7396 г (58,27 %).
1
31
2
Получены результаты H и Р  ЯМР-спектроскопии полученного продукта. Исследования указанным методом проводят на спектрометре «Bruker CXP-200» на частотах 200 и 81 МГц соответственно. В качестве внутреннего стандарта используют сигналы растворителя DO.
На протонном ЯМР-спектре наблюдают сигналы, характерные для атомов водорода этильного фрагмента в области 2,5-3 м.д., метильных групп - 2,3 м.д., а также атомов водорода триазольного фрагмента в левой части спектра. Отсутствие атома водорода аминогруппы N,N-димтилэтилендиамина типично для подобных случаев.
На фосфорном спектре наблюдают сигналы, характерные для атомов фосфора ди-N,N-этилендиаминного звена (6,8 м.д.), дитриазольного звена (9,2 м.д.) и звена, содержащего оба вида заместителей (7,3 м.д.).
В результате электрофореза наблюдают типичное движение к аноду в случае отрицательно заряженного олигонуклеотида (лунка 4), а также незначительное движение к катоду в случае образовавшегося на основе олигофосфазена полиплекса (лунка 5). Незначительное движение к катоду или же отсутствие движения подтверждает связывание с антисмысловым олигонуклеотидом, обладающим инсектицидной активностью.
Результаты получены при использовании оборудования ЦКП им. Д.И. Менделеева.