Совершенствование условий биосинтеза молочной кислоты лактобактериями

Д. С. Дворецкий, О. В. Зюзина, И. В. Маркин, М. В. Козодаева, Я. В. Устинская

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ УСЛОВИЙ БИОСИНТЕЗА

МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ ЛАКТОБАКТЕРИЯМИ

Ключевые слова: условия биосинтеза, накопление биомассы, молочная кислота.

Исследованы условия биосинтеза молочной кислоты L-формы на модифицированной питательной среде. Отмечено стимулирующее воздействие фильтрата культуральной жидкости после накопления биомассы Chlorella vulgaris (C. vulgaris) на накопление биомассы молочнокислых бактерий и биосинтез молочной кислоты. Предложен состав питательной среды на основе 5 % - ного раствора мелассы с добавлением 20 % культуральной жидкости после накопления биомассы C. vulgaris ИФР №С- 111. Определена величина удельной скорости роста бактерий Lactobacillus casei В-3241 на среде оптимального состава при разном титре клеток в посевном материале и степень превращения углеродсодержащего субстрата.

Keywords: conditions of biosynthesis, biomass accumulation, lactic acid.

The conditions of biosynthesis of L-lactic acid in a modified nutrient medium have been studied. The culture fluid filtrate formed after the accumulation of C. vulgaris biomass has had a stimulatory effect on the accumulation of lactobacilli and lactic acid biosynthesis. The paper proposes a composition of a nutrient medium on the basis of a 5% solution of molasses with the addition of 20% of culture fluid after the accumulation of C. vulgaris IFR C-111 biomass. The value of specific growth rate of L. casei B-3241 in the optimal nutrient media with different cell titre in cell stock has been determined and the degree of carbonaceous substrate conversion has been identified.

ОБЩАЯ БИОЛОГИЯ

УДК 663.11

Введение

Лактобактерии как продуценты молочной кислоты используются в технологиях продуктов питания, а также в биотехнологических производствах для получения органических веществ и т.д. Биосинтез лактата с последующей поликонденсацией в биоразлагаемый пластик PLA является одним из перспективных экологических и экономических направлений для реализации в регионах, обладающих техническим потенциалом и возобновляемой растительной сырьевой базой, в частности значительными объемами отходов перерабатывающих предприятий, например сахарных заводов в виде мелассы [1]. Как углеродсодержащее сырье, меласса зарекомендовала себя как значимый компонент питательных сред в биотехнологических производствах из-за присутствия в составе, наряду с сахарозой, ценных для метаболизма и биосинтеза органических и неорганических соединений.

Для получения значительных объемов лактата как материала для полимеризации важным является решение классических задач биотехнологии: оптимизация состава питательной среды, адаптация высокопродуктивных продуцентов к

производственным условиям, обеспечение эффективного выделения целевого продукта и очистки от сопутствующих примесей.

Целью настоящей работы являлось исследование условий биосинтеза молочной кислоты L-формы на модифицированной питательной среде.

Для достижения указанной цели решались следующие задачи: поиск и апробация альтернативных солодовым росткам новых источников стимулирующих веществ в питательной

среде на основе мелассы; определение дозы стимулирующей подпитки на основе фильтрата культуральной жидкости после накопления биомассы C. vulgaris ИФР №С-111; изучение влияния дозы посевного материала на кинетику биосинтеза молочной кислоты на

модифицированной среде.

1. Методы и материалы

Определение количества стимулирующей подпитки на основе фильтрата культуральной жидкости после накопления биомассы C. vulgaris ИФР №С-111 и определение дозы посевного материала осуществляли при глубинном культивировании бактерий Lactobacillus casei В-3241 без нейтрализации молочной кислоты в объеме питательной среды 0,35 дм3: при начальной активной кислотности питательной среды рН 7, температуре культивирования 37 °С,

продолжительности биосинтеза 65 часов без перемешивания и аэрации. В качестве продуцента молочной кислоты в экспериментальной работе использовался штамм Lactobacillus casei В-3241, синтезирующий при молочнокислом брожении L-форму молочной кислоты, необходимую для получения полилактидов [2].

Для поддержания исходной культуры бактерий использовалась питательная среда MRS следующего состава: бактопептон - 10,0 г/л; мясной экстракт - 10,0 г/л; дрожжевой экстракт -5,0 г/л; глюкоза - 20,0 г/л; твин-80 - 1,0 г/л; аммоний лимоннокислый - 2,0 г/л; натрий уксуснокислый - 5,0 г/л; MgSO4 7H2O - 0,1 г/л; Na2HPO4 - 2,0 г/л; агар - 20,0 г/л, pH 6,5,

выращивание осуществляли при температуре 3637 °С [3].

В качестве источника редуцирующих веществ использовалась свекловичная меласса с содержанием -79 % (мас.) сухих веществ, из которых около 54 % по весу составляла сахароза, 14, 8 % -азотистые вещества, 16,7 % - безазотистые (кроме сахара) органические вещества и 8,5 % составляла зола (соли калия 10 %, и органические 20 %), инвертный сахар и раффиноза (до 2 %) [4].

В качестве источника стимулирующих веществ использовали в контрольной среде экстракт солодовых ростков, в модифицированных средах -разные объемы фильтрата культуральной жидкости (образцы №1, 2, 3, 4 (табл. 1)) как отхода технологии культивирования микроводоросли C. vulgaris ИФР №С-111 на питательной среде Тамийя OPTIMUM [5].

Таблица 1 - Характеристика образцов питательной среды

Приготовление питательной среды включает операции дозирования фильтрата или экстракта солодовых ростков в предварительно стерилизованный раствор мелассы с 5 %-ным содержанием сухих веществ. Посевной материал представлял суспензию клеток чистой культуры, получаемую смывом стерильной водой клеток бактерий со скошенной агаризованной среды. Доза суспензии, вносимая в питательную среду, составляла 10 мл при титре около 350 млн. кл/мл.

В течение ферментации контролировали следующие показатели: активную кислотность (pH) определяли потенциометрическим методом с использованием рН-метра (Анион 4110); концентрацию молочной кислоты - по ГОСТ Р 51196-98; количество усвояемого азота - по ГОСТ 33045-2014; редуцирующие вещества - по ГОСТ 12575-2001; количество биомассы бактерий устанавливали прямым подсчетом с использованием светового микроскопа «Levenhuk C310 NG».

2. Результаты и их обсуждение

2.1. Определение количества стимулирующей подпитки на основе фильтрата культуральной жидкости после накопления биомассы C. vulgaris ИФР №С-111

Для биосинтеза молочной кислоты рекомендуют вносить в состав питательных сред экстракт солодовых ростков, как источник органического азота и биоактивных соединений [6]. Несмотря на явный положительный эффект этого компонента на

биосинтез, использование солодовых ростков имеет ряд недостатков: дополнительные энергозатраты и время на проведение экстракции. В качестве альтернативной замены апробирован фильтрат культуральной жидкости после накопления биомассы микроводоросли C. vulgaris ИФР №С-111. В его состав входят макроэлементы KNO3, FeSO4, KH2PO4 [7] и биологически активные вещества (пиридоксин, тиамин, рибофлавин) [8].

В ходе изучения кинетики накопления биомассы лактобактерий было установлено, что концентрация клеток в образцах с питательной средой, содержащей 10 %, 20 % стимулирующей добавки, отличается примерно на такие же величины от контрольной среды на протяжении всех фаз развития культуры при периодической ферментации. Увеличение количества добавки в питательной среде до тридцати и сорока процентов не приводит к активации размножения клеток, а прослеживается явное снижение числа особей в популяции. В конце экспоненциальной фазы количество микроорганизмов в объеме культуральной жидкости в сравнении с контролем в два раза меньше, что можно объяснить ингибирующем эффектом ионов металлов, присутствующих в добавляемом фильтрате культуральной жидкости.

Биосинтетическая активность по молочной кислоте биомассы бактерий Lactobacillus casei В-3241 в зависимости от количества введенной в состав питательной среды стимулирующей добавки была самой высокой с 20 %-ной концентрацией. Напротив, чрезвычайно медленно биосинтез протекал при 40 % содержании фильтрата; концентрация молочной кислоты на протяжении периода наблюдений была в 2-3 раза меньше, чем в условиях контрольной среды.

Стимулирующее воздействие фильтрата культуральной жидкости на накопление биомассы молочнокислых бактерий и биосинтез молочной кислоты можно объяснить присутствием в его составе витаминов группы В - пиридоксина, тиамина, рибофлавина. Так как пиридоксин является коферментом биокатализаторов азотистого обмена клеток, он способствует активации реакций синтеза белков, и, как следствие, прирост биомассы лактобактерий при культивировании происходит интенсивнее.

Присутствие тиамина и рибофлавина в питательной среде способствует интенсификации реакций гликолиза и образованию пирувата, который при гомоферментативном молочнокислом брожении, характерном для Lactobacillus casei В-3241, превращается в молочную кислоту, количество которой в экспериментальных средах увеличивается по сравнению с контрольной. Также на этом этапе в последовательности биохимических реакций брожения в клетках увеличивается активность фермента лактатдегидрогеназы из-за присутствующего в фильтрате ниацина.

Следует отметить, что самая высокая концентрация клеток 550-600 млн в 1 мл культуральной жидкости была достигнута на 40-й

№ образца Содержание фильтрата культуральной жидкости, % (об.) Содержание редуцирующих веществ, % (об.) Содержание общего азота, мг/л

1 10 4,6 13,2

2 20 4,2 11,0

3 30 3,7 9,2

4 40 3,2 8,0

контроль экстракт солодовых ростков 4,9 15,0

час в питательной среде №2, что на 20-30 % больше, чем в контрольном образце.

Для созданных условий культивирования лактобактерий время активного накопления биомассы соответствовало промежутку в 25-40 часов. Далее относительная скорость роста уменьшалась, и популяция переходила в фазу замедления роста, достигнув максимальной величины примерно в 550 млн. кл/мл. К этому времени в культуральной среде возрастало количество молочной кислоты (до 4 мг/мл), и начинало сказываться ее тормозящее действие на рост и размножение бактерий. При этом замедление скорости реакций гомоферментативного

молочнокислого брожения, которые являются частью энергетического обмена, характерного для этого вида микроорганизмов, не наблюдалось.

16 ч 14

S 12

tf

I 10

U 8 &

я

а 6 я

И

\ о контроль бразец №1  бразец №2 бразец №3 ' бразец №4

с

\ \ \ V \ О о А о

ч ч \ Г-

^—- Е=—Щ-М k-----А------j

0

20 40

Время, час Динамика изменения

60

концентрации

О контроль v образец №1 п образец №2 . О образец №3 образец №4

Рис. 1

азота

х= 4.5'

Ох ^ 1

[5 4

0

« < Це 3.5

м

А

1 3

2

>,2.5 а к

я , £ 2

и

^ 1.5

10 20 40

Время, час

Рис. 2 - Динамика изменения редуцирующих веществ

Анализ рисунков 1, 2 показывает, что количество редуцирующих веществ на сороковом часе культивирования во всех образцах культуральной среды находится в диапазоне 0,5^2,4 %, общего азота - в диапазоне 3,0^4,5 мг/л, несмотря на разное содержание азота в образцах до начала брожения. Изменения концентрации азота и редуцирующих веществ в образцах питательных сред с разными дозами фильтрата культуральной жидкости при периодическом культивировании биомассы бактерий имеет вид гиперболы. Наибольшая концентрация молочной кислоты (6,6 мг/мл) наблюдалась при

использовании образца №2, что на 10 % превышает значение контрольного образца.

Для количественной оценки преобразования наиболее значимых компонентов питательной среды - углеводов и азотных соединений -бактериями применили стехиометрические

коэффициенты балансовых уравнений [9].

При выполнении расчетов использовали эмпирическую формулу С-моля биомассы бактерий - СН^вО^гв^дэ. Так как углеродсодержащим компонентом питательной среды выступала свекловичная меласса, обобщенная химическая формула источника углерода - сахарозы, как Смоля, имеет вид СН1>83О0,91. Продуктами биотехнологического процесса биосинтеза молочной кислоты для рассматриваемого конкретного случая является биомасса бактерий и молочная кислота. Используя экспериментальные данные для всех образцов питательных сред (табл. 2): концентрацию клеток (Х), концентрацию молочной кислоты (Р), концентрацию редуцирующих веществ и аммонийного азота (ЫН4), на период завершения экспоненциальной фазы развития биомассы клеток бактерий, определили расходные коэффициенты (табл. 2) по компонентам для стехиометрического уравнения синтеза молочной кислоты (1) в обобщенном виде.

Таблица 2- Исходные данные и результаты расчета стехиометрических коэффициентов

№ образца Концентрация редуцирующих веществ (S), % Концентрация аммонийного азота (NHt), мг/л P, мг/мл Стехиометрические коэффициенты

начальная конечная начальная конечная иост. Us UN Up

1 4,6 2,0 13,2 4,1 5,9 0,24 0,55 0,02 0,02

2 4,2 1,4 11,0 4,3 7,0 0,17 0,50 0,01 0,03

3 3,7 2,4 9,2 4,6 5,5 0,29 0,45 0,01 0,02

4 3,2 2,3 8,0 5,0 2,3 0,28 0,39 0,01 0,01

контроль 4,9 1,6 15,0 4,8 6,2 0,19 0,60 0,02 0,03

Стехиометрическое уравнение с рассчитанными коэффициентами для условий биосинтеза молочной кислоты бактериями Lactobacillus casei В-3241 на питательной среде №2 с 20 %-ым введением фильтрата культуральной жидкости имеет вид:

0,5[СН1)8ЗОО,91] + 0,01[NHJ ^ [СЩ^з N0,2] +

+ 0,03[СзН6Оз]+0,17 [СН1,8ЗОО,91]

Для этого варианта было установлено, что около 55 % углерода питательной среды затрачивается на рост и метаболизм биомассы, а 37 % - на синтез молочной кислоты.

2.2 Определение дозы посевного материала

Известно, что начальная концентрация клеток продуцента и их физиологическое состояние в засеянной питательной среде является одним из факторов, влияющих на экономические показатели биотехнологического производства. Изучение влияния дозы посевного материала на кинетику накопления биомассы и молочной кислоты, а также динамику изменения усвояемого азота и

4

редуцирующих веществ во время протекания молочнокислого брожения в стационарных условиях проводились при исходном титре клеток в посевном материале 175, 300, 700, 900 млн. кл./мл. Для этого этапа экспериментальной работы предпочтение было отдано питательной среде с 20 %-ым содержанием фильтрата культуральной жидкости,

обеспечивающей высокие показатели выхода целевого продукта.

Время, час

Рис. 3 - Кинетика накопления биомассы при разных дозах посевного материла

лишь в 1,1 раза, а во втором в 1,3 раза по сравнению с первоначальными значениями.

Закономерность накопления молочной кислоты для трех титров, кроме наименьшего, имеет одинаковый вид (рис. 4) и достигает своего максимума на 80-й час наблюдений.

В процессе накопления молочной кислоты нейтрализация ее не проводилась, и изменяющаяся кислотность среды оказывала влияние на жизнедеятельность организмов, подавляя их рост. Особенно четко это прослеживается после пятидесятого часа развития популяции. Анализ экспериментальных данных позволил рассчитать степени превращения углеводного субстрата при разной начальной концентрации лактобактерий (табл. 3).

Таблица 3 - Характеристики процесса культивирования

Опыт Начальный титр, млн.кл./мл Степень превращения, % (масс.) Удельная скорость роста ч1 Время генерации & ч

БМ МК

1 175 29,7 27,6 0,120 3,52

2 350 49,3 32,5 0,188 3,53

3 700 52,2 39,7 0,196 3,68

4 900 61,2 31,3 0,196 3,45

ч 7

S 6 tf

ё 5 ч

4

¡г о

J32

о 175

v 350

° 700

О 900

J.I

_____-о-

-Л------о------9

20

60

40

Время, час

Рис. 4 - Кинетика накопления молочной кислоты при разных дозах посевного материла

На рис. 3 приведены результаты процесса изменения биомассы бактерий Lactobacillus casei В-3241 в зависимости от количества клеток в посевном материале. Кривые для каждого из анализируемых четырех образцов имеют вид, характерный для развития популяции клеток в условиях глубинной периодической ферментации. Можно отметить следующую закономерность - наибольшая концентрация клеток (около 1400 млн. кл./мл) наблюдалась в образце при начальном значении 900 млн. кл./мл на 30-й час культивирования, когда популяция достигла стационарной фазы развития. Тогда как к этому же времени в среде с 700 млн. кл./мл, что меньше на 23 % в сравнении предыдущим случаем, уровень плотности популяции был на треть ниже. Для культуральных жидкостей с титрами 175 и 350 млн. кл./мл при большем количестве доступного питания увеличение концентрации клеток в первом случае произошло

При периодическом культивировании максимальная скорость размножения характерна для стадии экспоненциального роста. Используя аналитический метод, по формуле (2) для каждого из четырех начальных титров бактерий рассчитана удельная скорость роста. Также было рассчитано время генерации биомассы культуры.

X=X0e^T,

где Т - время роста (приняли при расчетах равным 20 часам); X0 - концентрация клеток в среде после засева, млн. кл./мл; X - концентрация клеток в среде на 20-й час культивирования, млн. кл./мл.

Выводы

1. Подтверждена возможность замены экстракта солодовых ростков фильтратом культуральной жидкости после накопления биомассы C. vulgaris ИФР №С-111 в питательной среде для биосинтеза молочной кислоты бактериями Lactobacillus casei В-3241.

2. Установлена зависимость между концентрацией культуральной жидкости после накопления биомассы C. vulgaris ИФР №С-111 в составе среды и скоростью накопления биомассы и молочной кислоты. Предложен состав питательной среды на основе 5 %-ного раствора мелассы с добавлением 20 % культуральной жидкости после накопления биомассы C. vulgaris ИФР №С- 111.

3. Определена величина удельной скорости роста бактерий Lactobacillus casei В-3241 на среде оптимального состава при разном титре клеток в посевном материале и степень превращения углеродсодержащего субстрата.

4. Выявлена зависимость превращения углеродсодержащего субстрата в органические

8

1

вещества биомассы и молочную кислоту от

исходного количества клеток лактобактерий в

засеянной питательной среде.

Литература

1. Калугина Н.А. Создание биоразрушаемых полимерных материалов / Н.А. Калугина, С.В. Краус// Девятая международная конференция молодых ученых "Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений". - Казань, 1988. - 266 с.

2. Беспоместных К.В. Исследование биохимических и морфологических свойств штаммов бактерий рода Lactobacillus / К.В. Беспоместных, А.Г. Галстян, Е.В. Короткая // Техника и технология пищевых производств. - Кемерово. - 2011. - № 2. - С. 94-98.

3. ВКПМ - Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов [Электронный ресурс].- режим доступа: http://www.genetika.ru, свободный

4. Способ получения молочной кислоты / В.В. Евелева, Э.А. Гаджиев, И.Н. Филимонова, Т.М. Черпалова // Патент РФ № 2149188, МПК С 12 Р 7/56, 20.05.2000.

5. Dvoretsky D.S. Optimization of the Process of Cultivation of Microalgae Chlorella Vulgaris Biomass with High Lipid

© Д. С. Дворецкий - д.т.н., профессор, заведующий кафедрой "Технологии и оборудование пищевых и химических производств" ФГБОУ ВО "ТГТУ", dvoretsky@tambov.ru; О. В. Зюзина - к.т.н., доцент, доцент кафедры "Технологии и оборудование пищевых и химических производств" ФГБОУ ВО "ТГТУ"; И. В. Маркин - аспирант той же кафедры; М. В. Козодаева - студент той же кафедры; Я. В. Устинская - студент той же кафедры.

© D.S. Dvoretsky - Doctor of science, Professor, Head of the chair "Technology and equipment of food and chemical productions", е-mail: dvoretsky@tambov.ru; O.V. Zyuzina - Ph.D., associate professor of the chair "Technology and equipment of food and chemical productions"; I. V. Markin - Ph.D-student the same Department; M. V. Kozodayeva - bachelor-student the same Department; Y. V. Ustinskaya - bachelor-student the same Department.

Content for Biofuel Production / D.S. Dvoretsky, S.I. Dvoretsky, E.V. Peshkova et al. // Chemical Engineering Transactions. - 2015. - N 43. - P. 361 - 366.

6. ГОСТ Р 52304-2005. Меласса свекловичная. Технические условия.

7. Богданов Н.И. Суспензия хлореллы в рационе сельскохозяйственных животных / Н. И. Богданов. -Пенза, 2-е изд. перераб. и доп, 2007. - С. 5.

8. Дворецкий Д.С. Технология получения липидов из микроводорослей [Электронный ресурс] / Д.С. Дворецкий, С.И. Дворецкий, М.С. Темнов [и др.]. - Электронные данные. - Тамбов: Изд-во ФГБОУ ВПО «ТГТУ», 2015. - 1 эл. опт. диск

9. Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии: учеб. пособие / В.В. Бирюков. -М. :КолосС, 2004. - 296 с.

10. Лисовой В.В. Применение ЭМП СВЧ в технологиях переработки растительного сырья и вторичных ресурсов / Лисовой В.В., Першакова Т.В., Корнен Н.Н., Ачмиз А.Д., Викторова Е.П. Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. 2016. № 118. С. 1350-1362.