ПЕПТИДОПОДОБНОЕ СОЕДИНЕНИЕ, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
PEPTIDE-LIKE COMPOUND SHOWING ANTIVIRAL ACTIVITY, AND METHOD FOR PREPARING IT

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, а именно к расширению спектра противовирусных препаратов для нужд ветеринарии. Изобретение относится также к области получения этого вещества.
В настоящее время известен ряд противовирусных препаратов пептидной природы для лечения вирусных инфекций человека и животных. Примерами таких препаратов могут служить смесь димеров рибонуклеазы А и лизоцина (См. патент РФ №2092183 от 10.10.1997, МПК А61К 38/57, А61К 9/02, А61К 9/09) или коммерческий препарат Аллокин-альфа - противовирусный препарат, созданный на основе биологически активных пептидов, выделенных из иммунной системы личинок падальных мух семейства Каллифорид. Главное составляющее вещество препарата - цитокиноподобный пептид аллоферон противовирусного и противоопухолевого свойства, усиливающий цитотоксическую активность имеющихся в наличии иммунных клеток человека. Несмотря на высокую противовирусную активность данных препаратов, им присущ ряд недостатков. Наиболее существенным из них является высокая стоимость получения. Недостатком этих препаратов также является то, что они легко инактивируются в силу своей белковой природы, поэтому требуют специальных условий хранения и высокой степени очистки; имеют небольшой срок хранения (до 1 года). Все это делает невозможным широкое применение данных препаратов для нужд ветеринарии.
Наиболее близким решением, принятым за прототип к заявляемому по технической сущности и достигаемому эффекту, является препарат лигавирин, получаемый путем экстракции слабощелочным раствором растительного сырья (опилки, солома, лузга подсолнуха), подвергнутого предварительно частичной биодеградации и модификации ксилотрофными грибами Pleurotus ostreatus, с последующим кислотным осаждением, промывкой водой и сушкой при комнатной температуре. Лигавирин представляет собой комплексное соединение, состоящее из пептидов в количестве 12-21% (См. патент РФ №2070411 от 20.12.1996, МПК А61К 47/38, А61К 47:36, А61К 38:04, А61К 35:84).
К недостаткам данного препарата можно отнести то, что он не является гомогенным соединением. Способом его получения является микробиологическая переработка растительного сырья, без выделения конкретного вещества. Данный препарат не имеет постоянного состава (содержание пептидов 12-21%) и фиксированных противовирусных свойств.
Технической задачей изобретения является расширение арсенала противовирусных средств.
32
46
12
8
10
Сущность изобретения заключается в том, что предложено новое пептидоподобное соединение, обладающее противовирусной активностью и отвечающее составу CHFNO.
α
im
3
2
2
Сущность изобретения заключается также в том, что предложен способ получения пептидоподобного соединения, заключающийся в том, что синтез осуществляют при 22°С в течение 24 ч и мольном соотношении следующих компонентов: 1,12-додекандиамин-этилдиизопропиламин-N-гидроксисукцинимидный эфир N,N-ди-трет-бутилоксикарбонил-L-гистидина 2.3:5.1:5.1 в этилацетате как растворителе, добавляют в реакционную смесь N,N-диметилэтилендиамин (1 моль, 110 мкл) и перемешивают ее в течение 30 мин, затем промывают последовательно 2%-ным раствором лимонной кислоты (20 мл), водой (20 мл), насыщенным раствором NaHCO (20 мл) и водой (20 мл), удаляют растворитель в вакууме, путем растворения остатка в смеси ТФУ:СНС1=1:1 (5 мл), выдерживают реакционную смесь 1 ч при комнатной температуре, удаляют защитные группы трифторуксусной кислотой в вакууме и упаривают остаток с этанолом (3×10 мл).
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Синтез
α
im
3
2
4
2
2
К раствору 1,12-додекандиамина (2.3 ммоль, 0.46 г) и этилдиизопропиламина (5.1 ммоль, 0.87 мл) в 10 мл этилацетата добавляли при перемешивании раствор N-гидроксисукцинимидного эфира N,N-ди-трет-бутилоксикарбонил-L-гистидина (5.1 ммоль, 2.3 г) в 5 мл этилацетата. Реакционную смесь перемешивали 24 ч при 22°С. Затем в реакционную смесь добавляли N,N-диметилэтилендиамин (1 ммоль, 110 мкл) и перемешивали 30 мин. Реакционную смесь промывали последовательно 2%-ным раствором лимонной кислоты (20 мл), водой (20 мл), насыщенным раствором NaHCO (20 мл) и водой (20 мл). Органический слой сушили над безводным NaSO. Растворитель удаляли в вакууме. Остаток растворяли в смеси ТФУ:CHCl=1:1 (5 мл) и выдерживали реакционную смесь 1 ч при комнатной температуре. Растворитель и ТФУ удаляли в вакууме, остаток упаривали с этанолом (3×10 мл). Выход трифторацетата N,N'-бис-L-гистидил-1,12-додекандиамина 0.81 г, 37.7%.
1
Im
Im
+
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
32
46
12
8
10
H
H
H
H
H
Данные Н ЯМР-спектра для трифторацетата N,N'-бис-L-гистидил-1,12-додекандиамина (DO) δ, м.д. (J/Гц): 1.61 (м, 4Н, -О-CH(C)СНО-); 1.71 (м, 4Н, -NH-CHCHCO-); 2.87-3.12 (м, 4Н, His-CH-C); 3.20 (м, 4Н, -NH-C-); 4.03 (т, 2Н, His-C, J=7.3); 7.27 (с, 2Н, CH); 8.56 (с, 2Н, CH). ESI-MS, m/z найдено 475.6 [М+H] вычислено 474.64. Элементный анализ. Найдено С 41,01; Н 4,67; F 24,80; N 11,90. CHFNO. Вычислено С 41,29; Н 4,98; F 25,49; N 12,04.
1
Исходя из метода синтеза, данных элементного анализа, Н ЯМР и ESI - мас-спектроскопии полученному соединению была приписана структурная формула:
Полученному пептидоподобному соединению присвоено рабочее название ринумид.
Пример 2. Определение влияния условий и сроков хранения ринумида на стабильность его химического состава.
Ринумид хранили в условиях бытового холодильника при -4±2°С и при комнатной температуре 20±2°С в течение двух лет (срок наблюдения). Проводили элементный анализ препарата с периодичностью один раз в три месяца. В результате проведенных исследований не было отмечено отклонений в его составе.
Таким образом, полученный препарат стабилен (срок наблюдения 2 года), не требует особых условий хранения.
Пример 3. Оценка цитотоксичности ринумида
2
Цитотоксичность ринумида оценивали путем добавления его разведений в среде Игла MEM к выращенному монослою перевиваемой клеточной культуры КСТ (коронарные сосуды теленка) в лунки 96-луночного планшета (Costar), до конечных концентраций 39,06-5000,0 мкг/мл (по четыре лунки на каждую дозу) с последующим культивированием при 37°С в СО-инкубаторе в течение 3 суток.
Токсичность препаратов оценивали по четырехкрестовой системе, анализируя морфологию клеток и целостность монослоя при микроскопировании в инвертированном микроскопе.
Таблица 1
Доза препарата
Цитотоксическое действие (ЦТД)
5 мг/мл
++++
2,5 мг/мл
++++
1,25 мг/мл
++++
625,0 мкг/мл
++++
312,5мкг/мл
-+-+
156,25 мкг/мл
----
78,125 мкг/мл
----
39,06 мкг/мл
----
Из данных таблицы 1 видно, что минимальная нетоксичная доза ринумида для культуры клеток КСТ составляет 156,25 мкг/мл.
Учитывая результаты определения нетоксичной дозы, рассчитали максимально переносимую концентрацию (МПК) препарата для культуры клеток КСТ, которая составила 78,125 мкг/мл. За МПК принимали 1/2 дозы, при которой отсутствовало цитопатическое действие вещества.
Пример 4. Оценка противовирусной активности ринумида в отношении вируса вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота (ВД-БС КРС) в условиях in vitro в культуре клеток.
Для оценки противовирусного действия препарата ринумида культуру клеток КСТ заражали вирусом вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота (штамм «ВК-1») в дозе не менее 1-10 ТЦД/кл. Через 1,5 часа после заражения в лунки с культурой клеток вносили ринумид в дозе 78,0±1,0 мкг/мл (опыт) или разводящую питательную среду (контроль). Культивировали при 37°С в течение 72 часов, после чего вируссодержащую суспензию титровали для определения инфекционной активности вируса ВД-БС КРС.
Противовирусный эффект препарата рассчитывали по разнице инфекционных активностей вируса в контрольных и опытных образцах (Вирусология. Методы, под ред. Б.Мейхи, М.: «Мир», 1988) и выражали в lg снижения титров вируса (Н.Д.Львов и соавт., Вопросы вирусологии, 1986, №2). В каждом опыте проводили дополнительный контроль на токсичность испытуемой дозы препарата.
50/0,1 мл
Определение инфекционного титра вируса ВД-БС КРС проводили микрометодом (Вирусология. Методы, под ред. Б.Мейхи, М.: «Мир», 1988) в 96-луночных культуральных планшетах с культурой клеток КСТ с использованием не менее 4 параллельных рядов. Инфекционный титр вируса выражали в ТЦД (50%-ная тканевая цитопатическая доза).
50/мл
Разница титра вируса в опытных и контрольных образцах более чем в 21g ТЦД свидетельствует о противовирусной активности ринумида.
В таблице 2 представлены показатели снижения инфекционной активности вируса (выраженной в lg) в контроле, где вирус репродуцировался без препарата, и в опыте, где репродукция осуществлялась в присутствии препаратов.
Таблица 2
Титр вируса (lg ТЦД<sub>50/мл</sub>)контроль
Титр вируса (lg ТЦД<sub>50/мл</sub>)опыт
4,83±0,07
2,75±0,12
50/мл
50/мл
Из данных таблицы 2 видно, что ринумид в значительной степени (на 2,08 lg ТЦД) подавляет инфекционную активность вируса вирусной диареи крупного рогатого скота. Снижение титра вируса было достоверным (более 2 lg ТЦД) при внесении препарата через 1,5 часа после заражения культуры клеток.
Пример 5. Оценка противовирусной активности ринумида, после его хранения
Ринумид хранили в течение двух лет в условиях бытового холодильника при -4±2°С и при комнатной температуре +20±2°С в течение двух лет (срок наблюдения). С периодичностью один раз в шесть месяцев проводили оценку его противовирусной активности в отношении вируса вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота.
50/МЛ
В результате проведенных исследований ринумид показал противовирусную активность в отношении тестируемого вируса на протяжении всего срока наблюдения, вызывая снижение его активности на 2,0-2,25 lg ТЦД.
Таблица 3
Срок хранения, мес.
Титр вируса (lg ТЦД<sub>50/мл</sub>) контроль
Титр вируса (lg ТЦД<sub>50/мл</sub>) опыт
При -4±2°С
При +20±2°С
6
5,08±0,14
2,92±0,07
2,83±0,07
12
5,67±0,07
3,67±0,07
3,58±0,07
18
5,5±0,12
3,5±0,12
3,42±0,07
24
5,58±0,07
3,58±0,07
3,5±0,12
Установлено, что полученное соединение обладает противовирусной активностью, которая сохраняется на протяжении двух лет (срок наблюдения) при режиме его хранения -4±2°С и +20±2°С.
Таким образом, заявляемое пептидоподобное соединение позволяет достоверно снижать репродукцию вируса ВД-БС КРС в чувствительной культуре клеток, т.е. обладает противовирусной активностью.
Полученное пептидоподобное соединение имеет стабильный химический состав, сохраняет противовирусную активность на протяжении двух лет (срок наблюдения) при режиме его хранения -4±2°С и +20±2°С.
Ринумид может использоваться в ветеринарной практике при разработке методов профилактики и лечения инфекций крупного рогатого скота, вызванных вирусами семейства Flaviviridae, рода Pestivirus, в частности вирусом вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота.