СПОСОБ ОЦЕНКИ СТРЕССОУСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ
METHOD TO ESTIMATE STRESS RESISTANCE OF PLANTS

Изобретение относится к сельскохозяйственному растениеводству и может быть использовано в селекции для быстрой и точной оценки потенциальной устойчивости видов и сортов растений к стрессорам внешней среды.
Растения в естественных условиях подвергаются воздействию неблагоприятных факторов среды, таких как засуха, низкая или высокая температура, высокие концентрации тяжелых металлов и ксенобиотиков. Ответом растения на такие воздействия является сверхпродукция активных форм кислорода и окислительный стресс - изменение в организме баланса между образованием активных форм кислорода и активностью антиоксидантной защиты в пользу первого. Для защиты от окислительного стресса растительные клетки содержат разнообразные компоненты антиоксидантной системы, которые подавляют образование свободных радикалов, поддерживают на нормальном уровне образование активных форм кислорода в тканях. Т.е. активность антиоксидантной системы является одним из механизмов защиты растений от неблагоприятных факторов среды.
Известны лабораторные методы определения устойчивости растений к различным стрессовым факторам, в основе которых лежит учет всхожести семян при неблагоприятных воздействиях, скорость роста первичного корня, время наступления плазмолиза, активность ферментов и др. [Диагностика устойчивости растений к стрессовым воздействиям. / Под ред. Г.В.Удовенко, ВИР. - Л., 1988].
Названные методы отличаются относительно низкой объективностью, продолжительным временем оценки, невозможностью проведения массовых анализов, что препятствует их широкому использованию в сельскохозяйственной практике.
Известен способ оценки засухоустойчивости растений. В основе способа лежит определение степени накопления свободного пролина в листьях десятисуточных проростков в процессе воздействия на них водного стресса, которая выражается в виде индексов устойчивости. В процессе оценки выделяется три группы культур: высокоустойчивая /индекс устойчивости 4,1 и выше/, среднеустойчивая /2,0-4,0/ и слабоустойчивая /1,9 и ниже/ (RU №2229214 С1, МПК A01G 7/00, 2004.05.27).
Известный способ требует сложной препаративной биохимической технологии, дорогостоящего лабораторного оборудования, что не позволяет широко использовать для серийной оценки стрессоустойчивости растений.
Технический результат заключается в упрощении и повышении точности процесса оценки адаптивного потенциала сравниваемых растений.
Технический результат достигается тем, что в способе оценки стрессоустойчивости растений, включающем проращивание замоченных семян и разделение проростков на группы растений, определяют антиоксидантную активность растительной ткани в одной группе растений без стрессового воздействия, в остальных - после стрессовых воздействий по ингибированию радикалов 1,1-дифенил-2-пикрилгидразила растительной тканью, и по разности антиоксидантной активности до и после стрессовых воздействий определяют стрессовую устойчивость.
Способ осуществляют следующим образом.
Семена растений проращивают в водной культуре в чашках Петри или сосудах.
По достижении растениями возраста семи дней сосуды разделяют на несколько групп, одна из которых - контрольная (без стрессового воздействия), находится в оптимальных условиях; остальные переносят в стрессовые условия (низкая или высокая температура, засоление, высокая освещенность и т.п.). После стрессового воздействия сосуды с растениями переносят в исходные условия и определяют общую АОА. Для этого навеску ткани листьев и стеблей (1 г) растения измельчают, разбавляют этанолом и делают этанольную вытяжку объемом 10 мл, центрифугируют в течение 15 минут при 1500g. К 2 мл полученного экстракта растений добавляют 1 мл 200 мкМ 1,1-дифенил-2-пикрилгидразила (DPPH) в 50% этаноле и сразу измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 517 нм против 50% этилового спирта. В контрольном варианте (без стрессового воздействия) к DPPH приливают 50% этанол (без растительного материала). Далее инкубируют в течение 30 минут на свету при температуре 21-23°С и повторно измеряют оптическую плотность. Процент ингибирования радикалов 1,1-дифенил-2-пикрилгидразила растительной ткани рассчитывают по следующей формуле:
с(0)
A(t)
с(0)
Ингибирование DPPH (%)=[(А-A))/А]×100%,
с(0)
где А - оптическая плотность контроля, в начальный период времени;
A(t)
A - оптическая плотность варианта опыта, при времени светового инкубирования реакционной смеси 30 минут.
Чем больше процент ингибирования DPPH, тем выше АОА растительной ткани. Отсюда можно заключить, что чем сильнее снижается АОА при стрессовом воздействии, тем сильнее стрессовое действие фактора на растение и ниже стрессоустойчивость растения.
Пример 1. Растения кукурузы сорта «РОСС 299», выращенные при температуре 25°С до возраста 7 суток, делили на три группы. Первую выдерживали при температуре 25°С в темноте, а две другие охлаждали или прогревали в темноте в течение суток при 3°С или 44°С соответственно.
При пониженной температуре антиоксидантная активность снижалась сильнее и составила 55% от контрольного уровня (фиг.1). При повышенной температуре антиоксидантная активность составила 64% по отношению к контролю.
Сравнение действия различных регуляторов роста на антиоксидантную активность в тканях кукурузы под действием температурного стресса показало, что обработка растений кукурузы синтетическими регуляторами роста приводила к повышению антиоксидантной активности (фиг.2).
Из чертежа видно, что из трех сравниваемых регуляторов роста наибольшее влияние на антиоксидантную активность оказывает «Рибав». Он увеличивает уровень антиоксидантной активности как при оптимальной температуре (25°С), так и при температурном стрессе в 2,5 раза. Иммуноцитофит (ИЦФ) увеличивает уровень антиоксидантной активности на 50% по сравнению с контролем. 6-БАП (6-бензиламинопурин) оказал наибольшее влияние на растения кукурузы при повышенной температуре - уровень антиоксидантной активности увеличивается на 30% по отношению к контролю.
Пример 2. Растения огурца сорта «Изящный» выращивали на дистиллированной воде с добавлением различных концентраций соли тяжелого металла цинка (контрольный вариант выращивали без добавления тяжелого металла). В качестве иммуномодуляторов использованы синтетические регуляторы роста цитодеф и тидиазурон.
В таблице 1 приведены данные по определению влияния различных вариантов опыта действия ионов цинка и регуляторов роста на антиоксидантную активность растительных тканей семидневных растений огурца сорта Изящный.
Таблица 1
вариант опыта
время фиксации результатов, мин
0
30
40
50
60
контроль
0,557±0,002
0,531±0,006
0,482±0,008
0,453±0,009
0,436±0,008
раст. (вода)
0,658±0,003
0,551±0,001
0,542±0,001
0,536±0,001
0,534±0,001
цинк 1 мМ
0,653±0,004
0,598±0,003
0,584±0,003
0,567±0,003
0,565±0,004
цинк 1 мМ + цитодеф
0,529±0,004
0,402±0,002
0,377±0,004
0,341±0,008
0,335±0,004
цинк 1 мМ + тидиазурон
0,579±0,008
0,443±0,004
0,356±0,003
0,329±0,003
0,523±0,003
Можно видеть, что у растений, выращенных на 1 мМ цинке, антиоксидантная активность снижена почти в 2 раза по сравнению с растениями, выращенными на дистиллированной воде (она составляет 52% к водному контролю). У растений, дополнительно обработанных регулятором роста цитодефом, АОА увеличивается на 20% к уровню водного контроля. Т.е. обработка цитодефом на фоне повреждающего уровня ионов цинка в среде не только восстанавливает исходный уровень АОА, но даже увеличивает ее. Обработка тидиазуроном увеличивает АОА на 27% к уровню водного контроля, т.е. тидиазурон является более эффективным иммуномодулятором.
Пример 3. Растения огурца пяти сортов (Изящный, Водолей, Единство, Монастырский, Вязниковский 37) выращивали при температуре 25°С, затем переносили на 1 сутки в температуру 3°С и оценивали АОА в листьях охлажденных и неохлажденных растений (табл.2).
Таблица 2
Сорт
Контроль (25°С)
Охлаждение (3°С)
% снижения АОА к контролю
Изящный
0,107±0,003
0,047±0,001
43,9
Водолей
0,089±0,002
0,051±0,002
57,3
Единство
0,094±0,003
0,056±0,001
59,6
Монастырский
0,102±0,002
0,066±0,001
64,7
Вязниковский 37
0,114±0,004
0,087±0,001
76,3
Анализ полученных результатов показывает, что степень снижения АОА у растений разных сортов огурца зависит от генетически детерминированной холодоустойчивости сорта. Самая высокая устойчивость к охлаждению антиоксидантной системы выявлена у сорта Вязниковский 37, а самая низкая - у сорта Изящный.
Таким образом, сравнительная оценка по АОА действия стрессового фактора на сорта и виды растений позволяет выявить их антиоксидантный потенциал, а также возможности повышения или снижения потенциала при действии экзогенных соединений различной природы (регуляторов роста, иммуномодуляторов, ксенобиотиков). Оценка антиоксидантной активности (АОА) растительных тканей при воздействии экологических стрессоров может дать более точную оценку устойчивости растительных тканей к стрессовым воздействиям, а также позволит количественно сравнить действие протекторных соединений и экзогенных иммуномодуляторов.