СПОСОБ УСКОРЕННОГО ФОРМИРОВАНИЯ КОСТНОЙ МОЗОЛИ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ
METHOD FOR FASTER FORMATION OF CALLUS IN MAMMALS

Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарии, а именно к способу ускоренного формирования костной мозоли у млекопитающих.
В настоящее время возможность использования технологий клеточной и тканевой инженерии для улучшения заживления и восстановления функциональной активности ткани при различных повреждениях опорно-двигательного аппарата вызывает все больший интерес [1, 4, 8]. Поиск в этой области ведется, в основном, по двум направлениям: совершенствование носителей для доставки клеточного материала в область повреждения и направленное изменение свойств самих клеток, вводимых в область дефекта. Изменение свойств клеток может осуществляться как с помощью введения дополнительного генетического материала [10], так и за счет модификации свойств клеток, вызванных изменением параметров окружающей их среды [11]. Улучшение регенерации костной ткани после введения в область дефекта ММСК (мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток) было продемонстрировано в ряде исследований, результаты которых обобщены в обзорах [1, 2, 8].
Введение ММСК экспериментальным животным при различных повреждениях, таких как острая почечная недостаточность [12], блеомицин-индуцированное повреждение легких [13], дефекты хряща [14], костно-хрящевые дефекты [15] и др., приводит к улучшению различных параметров регенерации тканей.
Известно, что введение костномозговых мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) влияет на формирование костной мозоли после перелома. В настоящее время, в связи со стремительным развитием клеточных подходов в регенеративной и восстановительной медицине, все больший интерес привлекает возможность получения в короткий срок достаточно большого количества клеточного материала за счет экспансии in vitro клеток, полученных из организма. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки или мезенхимальные стромальные клетки-предшественники (МСК) являются стволовыми клетками взрослого организма, которые локализуются в костном мозге, жировой ткани, а также в ряде других тканей и органов. Эти клетки обладают высоким пролиферативным потенциалом, являются самообновляющейся популяцией клеток, поддерживающих свое недифференцированное состояние, а также способны к дифференцировке в определенные типы клеток под действием дифференцировочных стимулов. В свою очередь, мультипотентность МСК определяет выполняемую ими уникальную функцию формирования, поддержания и репарации тканей, а также лежит в основе современных технологий тканевой инженерии. В связи с этим, со времен открытия этих клеток А.Я.Фриденштейном интерес к ним непрерывно растет, однако все большее число работ ставит новые вопросы в отношении функционирования МСК in vivo и in vitro.
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), которые могут быть выделены из костного мозга, являются в настоящее время наиболее востребованными для репарации различных тканевых дефектов, в связи с их высокой пролиферативной активностью в условиях in vitro и способностью к остеогенной, адипогенной, хондрогенной и, возможно, ангиогенной дифференцировке [1, 2, 3, 4, 5]. Способность ММСК к дифференцировке в остеогенном направлении дала основание предполагать, что их применение при лечении переломов и повреждений больших участков костей может улучшить процесс заживления, что и было продемонстрировано в ряде исследований [6, 7, 8].
Ранее авторами было показано, что культивирование ММСК из костного мозга крыс в условиях пониженного содержания кислорода приводит к увеличению их пролиферативной активности и повышению устойчивости к различным повреждающим факторам [5].
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Авторами были протестированы клеточные препараты ММСК, предкультивированных в условиях нормоксии (20% O, 5% CO, 75% N) и пониженного содержания кислорода (5% O, 5% СО, 90% N). Нами было неожиданно обнаружено, что введение ММСК, культивируемых при различном содержании О, имеет различное влияние на формирование костной мозоли в области экспериментального перелома у млекопитающих. Гистоморфометрический анализ костной мозоли на 14 сутки после операции продемонстрировал достоверное увеличение коэффициента утолщения при использовании ММСК, предкультивированных в условиях пониженного содержания кислорода (5% O, 5% СО, 90% N).
Известен способ восстановления целостности кости при использовании импланта на основе культуры клеток, содержащей клетки-предшественники остеогенеза [RU 2240135 С1]. Однако указанный способ имеет ряд недостатков. Так, в соответствии с данным способом необходимо предварительное формирование импланта, а также использование индукторов остеогенеза.
2
2
2
Известен способ репаративного остеогенеза при введении суспензионного клеточного ксенотрансплантата мезенхимальных стволовых клеток человека, включающий введение мезенхимальных стволовых клеток в область дефекта кости, что обеспечивало ускорение и улучшение качества регенерации. При этом на 90-е сутки эксперимента во всех группах в области дефекта сформировался полноценный костный регенерат, и костная ткань успешно встраивалась в костный орган [7]. Данный способ взят в качестве ближайшего аналога. Отличием является использование ММСК, предкультивированных в условиях пониженного содержания кислорода (5% O, 5% CO, 90% N), что позволяет быстрее наращивать костную мозоль.
Примеры конкретного осуществления изобретения.
В работе использовали среду роста: α-МЕМ (ICN, США) с добавлением 2 мМ L-глутамина (Sigma, США), 1 мМ пирувата натрия, 100 ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина (Gibco, США) и 10% фетальной коровьей сыворотки (ФКС) (Hyclone, США) для культивирования клеток; 20 mM фосфатный буфер (ФБ) (Gibco, США) для отмывки клеток; 0,02% раствор трипсина с 0,05% ЭДТА (Gibco, США) для открепления клеток от подложки.
2
2
2
2
2
2
2
2
Получение и культивирование ММСК из костного мозга крыс проводили следующим образом. Клетки выделяли из костного мозга бедренной кости 1,5 месячной крысы-самца линии Вистар, как описано в [5]. Культивирование выделенных ММСК проводили в CO-инкубаторе (20% O, 5% CO, 75% N). После первого пассажа часть клеток помещали в СО-инкубатор (N-MMCK), а другую часть - в мультигазовый инкубатор, в котором поддерживалась газовая среда 5% О, 5% CO и 90% N (НУР-ММСК).
В экспериментах по изучению регенеративного потенциала ММСК были использованы клетки второго пассажа.
2
Для анализа прироста клеток в культуре использовали метод видеомикроскопии. С помощью микроскопа Leica DM IL (объектив х10) (Leica, Germany), снабженного цифровой видеокамерой, изображение архивировали и, впоследствии, в каждом флаконе анализировали 10 стационарных полей зрения площадью 1,0 мм каждые 24 часа, начиная с первого дня после посадки и до момента пассирования. Клетки подсчитывали с помощью программы анализа изображения SigmaScan Pro 5.0 Image Analysis Software (SPSS Inc. USA). Количество клеточных удвоений рассчитывали по формуле:
0
П=3,32lg(x/x).
Иммунофенотип ММСК на втором пассаже был охарактеризован с помощью моноклональных антител к следующим маркерным молекулам: CD90, CD45, CD54, CD73, CD11b, CD44 (BD Bioscience, США), а жизнеспособность клеток оценивали с помощью набора AnnexinV-FITC Kit (Immunotech, Франция) на проточном цитофлуориметре Epics XL (Beckman Coulter, США).
Клеточные препараты.
Для приготовления клеточных препаратов ММСК открепляли от пластика трипсинизацией, инактивировали фермент добавлением среды роста, после чего клетки ресуспендировали в необходимом количестве культуральной среды, не содержащей ФКС. Транспортировку и хранение клеточных препаратов осуществляли на льду в течение 2-4 часов при температуре +4°С. Перед введением клеточного препарата клетки ресуспендировали и отбирали необходимую аликвоту.
Экспериментальная модель операционного перелома малой берцовой кости у крыс.
В эксперименте были использованы крысы-самцы линии Вистар (32 особи весом около 300 г). Программа исследования была одобрена Комиссией ГНЦ РФ-ИМБП РАН по биомедицинской этике. Наркотизация животных осуществлялась путем введения в левую икроножную мышцу 0,1% атропина в количестве, соответствующем весу животного (согласно инструкции производителя). Затем в эту же мышцу вводили «Золитил-100» в дозе 8 мг/кг (согласно инструкции производителя). После того, как животное переставало реагировать на раздражение, его фиксировали, выстригали шерсть в зоне планируемого операционного вмешательства, трижды обрабатывали 3% йодом и 96% спиртом и проводили рассечение в средней части малой берцовой кости [9].
5
5
Экспериментальные животные были разделены на 4 группы. Животным 1-й группы проводили операционный перелом (группа П) без каких-либо последующих дополнительных воздействий. Животным 2-й группы после перелома в зону повреждения и прилежащую мышечную ткань вводили 0,25 мл среды роста без ФКС (группа П+С). Животным 3-й и 4-й групп непосредственно в область перелома сразу после хирургического вмешательства вводили суспензию N- или НУР-ММСК в малом объеме культуральной среды. Животным 3-й группы - 0,25 мл среды роста без ФКС, содержащей 5-10 N-MMCK (группа П+N-MMCK), крысам 4-й группы - 0,25 мл среды роста без ФКС, содержащей 5-10 НУР-ММСК (группа П+НУР-ММСК). После операции раны послойно зашивали хирургической нитью. В пред- и послеоперационный периоды животные содержались в стандартных условиях вивария. В периоде реабилитации подвижность животных была в пределах нормы.
Гистологический анализ.
Оценку состояния костной мозоли у животных проводили через 14 суток после оперативного вмешательства. Крыс декапитировали, выделяли оперированную кость и очищали ее от мягких тканей. Отделяли зону костной мозоли и фиксировали в 4% парафармальдегиде на 0,1 М ФБ (рН 7,0-7,2) с 2,5% сахарозы при 4°С. После фиксации в течение 10 суток проводили декальцинацию в 10% ЭДТА (рН 7,0-7,2). Затем образцы обезвоживали, заливали в гистопласт и готовили срезы толщиной 5 мкм. Препараты окрашивали гематоксилин-эозином, толуидиновым синим пикрофуксином. Далее на срезах определяли объем костных мозолей, объем хряща и объем новообразованной кости при помощи программы «МОП-ВИДЕОПЛАН», после чего рассчитывали коэффициент утолщения по формуле: диаметр костной мозоли/диаметр зрелой кости.
Статистический анализ.
Полученные данные подвергали статистической обработке с использованием Т-критерия Стьюдента.
Результаты.
2
Культивирование при пониженном содержании кислорода приводило к двукратному увеличению пролиферативной активности ММСК. На 6-й день культивирования число клеточных удвоений при пониженном содержании кислорода (5%) составляло 4,02±0,9, а в нормальных условиях (20% O) - 1,9±0,3, что согласуется с ранее полученными данными [5].
Культивируемые N-MMCK и НУР-ММСК различались морфологически: в культурах N-MMCK на первом пассаже преобладали сильно распластанные клетки, а среди НУР-ММСК было больше мелких вытянутых клеток. (См. чертеж. Морфологическая гетерогенность МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования в нормоксии и гипоксии. Представлены двухпараметрические гистограммы распределения клеток по размеру (ось ординат) и гранулярности (ось абсцисс) для клеток 4 пассажа, а также микрофотографии (х200) для клеток 2 пассажа после инкубации в течение 96 часов в нормоксии (а) и гипоксии (б). Иммунофенотипирование клеток к маркерам, специфичным для ММСК: CD90 (99,8-100%), CD54 (99,5-98,9%), CD73 (94,70-99,8%), CD44 (96,3-97,0%), не выявило различий между N-ММСК и НУР-ММСК. Те и другие клетки были негативны по маркерам CD11b (0,39-1,25%), CD45 (0,35-1,43%). Жизнеспособность N-ММСК и НУР-ММСК в исследуемых культурах также не отличалась и составляла 91,6±2% (4,36% апоптотических клеток, 3,98% некротических клеток).
Визуальный осмотр малых берцовых костей экспериментальных животных показал, что у крыс всех 4-х групп в месте перелома произошло образование веретенообразной костной мозоли различной величины, достаточно прочно скрепляющей проксимальные и дистальные отломки кости.
Гистологическое исследование области перелома у животных контрольной и экспериментальных групп позволило установить, что сращение костных отломков во всех случаях шло по типу вторичного заживления. Костная мозоль состояла из эндостальной мозоли, соединяющей костные отломки и представляющей собой фиброзную ткань, и периостальной мозоли, включающей хрящевую ткань, балки ретикулофиброзной кости и фиброзную ткань. Во всех исследуемых группах в эндостальной мозоли обнаруживались дистальные и/или проксимальные отломки малой берцовой кости. Большинство отломков были смещены друг относительно друга. Балки ретикулофиброзной кости располагались проксимально и дистально относительно хряща. Поверхность трабекул покрывали остеобласты. Таким образом, на срезах во всех исследуемых группах можно было видеть участки тканей, характерных для костной мозоли, соотношение которых было различным в сравниваемых группах.
В группе П периостальная мозоль состояла из массива хрящевых клеток и широко петлистой ретикулофиброзной костной ткани. На границе ретикулофиброзной кости и хряща новообразованная кость содержала большое количество сосудов и остеокластов. В центре трабекул, на границе с хрящом, наблюдались мелкие изогенные группы хрящевых клеток. Пространство между некрозированными участками кости было заполнено фиброзной тканью, врастающей со стороны эндоста.
У животных группы П+С, костная мозоль в качественном отношении не отличалась от группы П, но количественные различия были довольно значительными. Размеры костной мозоли у крыс группы П+С были больше, чем у группы П, в основном, за счет увеличения объема хрящевой части периостальной мозоли. Сосудистая сеть в этой группе была слабо развита.
В группе П+HYP-MMCK размеры костной мозоли у крыс были наиболее крупными по сравнению с костной мозолью животных других групп. Увеличение размеров костной мозоли происходило за счет разрастания хрящевой ткани, в которой определялись врастающие со стороны внутренних слоев надкостницы пучки соединительной ткани. Кроме того, соединительная ткань обнаруживалась в толще самого хряща в виде отдельных островков. Со стороны молодой костной ткани в хрящевую ткань внедрялись пальцевидные костные отростки, которые замещали разрушающийся хрящ. На поверхности отростков наблюдались остеобласты, а между отростками - многочисленные кровеносные сосуды. В трабекулах молодой кости часто находились единичные хондроциты. Эндостальная мозоль, в основном, состояла из клеток молодой костной ткани.
У животных группы П+N-MMCK объем хрящевой ткани был меньше, чем у крыс группы П+HYP-MMCK. В целом, костная мозоль походила на таковую у крыс группы П+HYP-MMCK и отличалась только меньшими размерами.
Результаты количественного гистометрического анализа костных мозолей, которые подтвердили гистологические наблюдения, представлены в таблице.
Таблица
Гистоморфометрический анализ костных мозолей у крыс с экспериментальным переломом малоберцовой кости
Экспериментальная группа
Объем костной мозоли (мм<sup>3</sup>)
Объем хряща (мм<sup>3</sup>)
Объем новообразованной костной ткани (мм<sup>3</sup>)
Коэффициент утолщения
П
10,3±2,3
1,1±0,7
5,7±1,8
3,8±0,7
П+С
12,7±3,4*
1,9±0,7*
5,8±1,6
3,6±0,6
П+N-MMCK
14,6±2,7*
1,9±0,8*
6,5±2,1
4,5±0,7<sup>*,**</sup>
П+HYP-MMCK
13,7±2,0*
2,4±0,5<sup>*,**</sup>
6,0±1,8
5,0±1,6<sup>*,**</sup>
Обозначения:
* - достоверные различия по отношению к группе П;
** - достоверные различия по отношению к группе П+С.
Как следует из таблицы, объем хрящевой ткани у крыс в группах П+С, П+N-MMCK и П+HYP-MMCK по сравнению с контрольными животными (группа П) достоверно увеличивался, что хорошо совпадает с увеличением объема костных мозолей в этих же группах животных. В группах П+N-ММСК и П+HYP-MMCK коэффициент утолщения превышал значения такового как по сравнению с контрольной группой П, так и группой П+С. При этом коэффициент утолщения у крыс группы П+HYP-MMCK был больше, чем у животных П+N-MMCK. Что же касается объема новообразованной костной ткани, заместившей хрящевую ткань периостальной костной мозоли, то различий в сравниваемых группах не наблюдалось.
Суммируя данные гистологических и гистоморфометрических исследований, можно констатировать, что у крыс с переломом малоберцовой кости, которым вводили ММСК, был увеличен размер развившейся костной мозоли, причем это увеличение было больше в группе животных, которым инъецировали ММСК, выращенные в гипоксической среде.
В результате было выяснено, что ММСК, культивированные в условиях различного газового содержания, по-разному влияют на параметры заживления костных дефектов.
Таким образом, проведенное исследование продемонстрировало эффективность введения суспензии ММСК, предварительная экспансия которых проведена in vitro в условиях различного содержания кислорода, для улучшения формирования костно-хрящевого регенерата на раннем этапе формирования костной мозоли при экспериментальном переломе малоберцовой кости у крыс.
Литература
1. Prockop D.J. Further proof of the plasticity of adult stem cells and their role in tissue repair. J. Cell Biol. 2003; 160 [6]: 807-809.
2. Bianco P., Riminucci M., Grothos S., et al. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential application. Stem Cells. 2001; 19: 180-192.
3. Lennon D.P., Edmison J.M., Caplan A.I. Cultivation of rat marrow-derived mesenchymal stem cells in reduced oxygen tension: effects on in vitro and in vivo osteochondrogenesis. J. Cell Physiol. 2001; 187 [3]: 345-355.
4. Davani S., Marandin A., Mersin N., et al. Mesenchymal progenitor cells differentiate into an endothelial phenotype, enhance vascular density and improve heart function in a rat cellular cardiomyoplasty model. Circulation. 2003; 108 [10]: 253-258.
5. Буравкова Л.Б., Анохина Е.Б. Влияние гипоксии на стромальные клетки-предшественники из костного мозга крыс на ранних этапах культивирования. Бюл. эксперим. биол. и мед. 2007; 143 (4): 386-389.
6. Кругляков П.В., Соколова И.Б., Зинькова Н.Н. и др. Влияние сингенных мезенхимальных стволовых клеток на восстановление костной ткани у крыс при имплантации деминерализованного костного матрикса. Цитология. 2005; 47 [6]: 466-477.
7. Фатхутдинов Т.Х., Гольдштейн Д.В., Пулин А.А., и др. Особенности репаративного остеогенеза при трансплантации мезенхимальных стволовых клеток. Бюл. эксперим. биол. и мед. 2005; 140 [7]: 109-113.
8. Деев Р.В., Исаев В.В., Кочиш А.Ю., и др. Клеточные технологии в травматологии и ортопедии; пути развития. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2007; 2 [4]: 18-30.
9. Дурнова Г.И., Логинов В.И., Капланский А.С. Заживление перелома малоберцовой кости у крыс при длительном вывешивании. Авиакосм. и эколог. мед. 2002; 36 [3]: 52-55.
10. Tsuchida H., Hashimoto J., Crawford E. et al. Engineered allogeneic mesenchymal stem cells repair femoral segmental defect in rats. Orthop. Res. 2003; 2 [1]: 44-53.
11. Hu X., Yu S.P., Fraser J.L., et al. Transplantation of hypoxia-preconditioned mesenchymal stem cells improves infarcted heart function via enhanced survival of implanted cells and angiogenesis. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2008; 135 [4]: 799-808.
12. Morigi I.M, Imberti В., Zoja C, et al. Mesenchymal stem cells are renotropic, helping to repair the kidney and improve function in acute renal failure. Am. Soc. Nephrol. 2004; 15: 1794-1804.
13. Rojas M., Xu J., Woods Ch. R., et al. Bone Marrow-Derived mesenchymal stem cells in repair of the injured lung. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2005; 33: 145-152.
14. Ponticiello M.S., Shingle R.M., Kadiyala S, et al. Gelatin-based resorbable sponge as a carrier matrix for human mesenchymal stem cells in cartilage regeneration therapy. J. Biomed. Mater. Res. 2000; 52 [2]: 246-55.
15. Im G-L, Kim D-Y., Shin J-H., et al. Repair of cartilage defect in the rabbit with cultured mesenchymal stem cells from bone marrow. J. Bone Joint Surg. [Br] 2001; 83-B: 289-94.