Тест-система на основе ПЦР в реальном времени для обнаружения парвовируса свиней

Г.С. Бурмакина, А.С. Малоголовкин, А.В. Николаев, А.В. Луницин, С.Ж. Цыбанов

из расчета 100 LD50. У инфицированных кроликов через 15...25 ч отмечали клинические проявления болезни: угнетение, отказ от корма, носовое кровотечение и гибель в течение 24.96 ч.

Животных, которые не погибли после инфицирования вирусом ГБК, подвергли эвтаназии на 7-е сутки. Пробы органов и тканей от инфицированных кроликов исследовали методом ОТ-ПЦР.

С использованием ОТ-ПЦР РНК ВГБК была выявлена в печени, селезенке, сердце, легких, мышцах, почках, коже и шерсти зараженных животных. Кроме того, посредством разработанной методики можно выявлять РНК вируса в пробах печени инфицированных кроликов в ранние (1-е сутки) и поздние (4-5-е сутки) сроки после заражения. В ходе экспериментов методом ОТ-ПЦР было установлено наличие РНК возбу-

Библиография

1. Moss S.R., Turner S.L., Trout R.C., White P.J., Hudson P.J., Desai A., Armesto M., Forrester N.L., Gould E.A. Molecular epidemiology of Rabbit haemorrhagic disease virus // J. Gen. Virol., 2002; 83: 2461—2467.

2. Tian L., Liao J., Li J., Zhou W., Zhang X., Wang H. Isolation and identification of a non-haemagglutinating strain of rabbit hemorrhagic

дителя ВГБК в печени инфицированных кроликов, не павших после заражения, даже в тех случаях, когда результат РГА и ИФА был отрицательным.

Выводы

Разработана методика ОТ-ПЦР, посредством которой можно обнаруживать геном вируса ГБК в пробах различных органов и тканей. Специфичность метода подтверждена его отрицательными показаниями при исследовании проб органов интактных животных, а также вирусов миксомы кроликов и везикулярной экзантемы. Аналитическая чувствительность ОТ-ПЦР составляет 101,5 LD5o/мл. Посредством разработанной методики удается выявлять РНК вируса в пробах печени инфицированных кроликов в разные сроки после заражения.

disease virus from China and sequence analysis for the VP60 Gene // Virus Genes, 2007; 35: 745—752.

3. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Sixth Edition. Office intrrnational des epizooties, 2008. — http://www.oie.int/international-standard-setting/terrestrial-manual/.

Summary

G.S. Burmakina, A.S. Malogolovkin, A.V. Nikolaev, A.V. Lunitsin, S.G. Cibanov. Identification of the rabbit hemorrhagic disease virus genome by PCR. In the article the results of RT-PCR elaboration for RHDV detection are presented. High specificity and sensitivity of this method were shown experimentally. Samples of different organs (liver, spleen, lungs, heart, kidneys, muscles, skin and hair) of infected animals were tested for RHDV genome identification RT-PCR. The elaborated technique allows to detect RHDV genome in all these organs on different days after infection.

УДК 619: 616.98: 616-076

Тест-система на основе ПЦР

в реальном времени

для обнаружения парвовируса свиней

О.В. Елисеева1, О.Е. Латышев1, Т.В. Гребенникова12, Т.И. Алипер1,2

1 ФГБУ «НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития РФ (Москва).

2 АНО «Научно-исследовательский институт диагностики и профилактики болезней человека и животных» (Москва).

Ключевые слова: парвовирус свиней, полимеразная цепная реакция в реальном времени Сокращения: КЧС—классическая чума свиней, ПВИС— парвовирусная инфекция свиней, ПВС—парвовирус свиней, п.н. — пары нуклеотидов, ППЭС—перевиваемая линия клеток почек эмбрионов свиней, ПЦР—полимеразная цепная реакция, РГА — реакция гемагглютинации, РРСС—репродуктивно-респираторньй синдром свиней, СПМИ — синдром послеотъемного мультисистемно-го истощения, ЦВС-2 — цирковирус свиней 2-го типа

Введение

Парвовирус свиней относится к категории важных патогенов, которые вызывают нарушения репродуктивной функции свиноматок и наносят значительный экономический ущерб свиноводческим хозяйствам [12]. Болезнь, вызванная данным вирусом, клинически проявляется только у супоросных свиноматок и характеризуется малочисленными пометами, гибелью эмбрионов и плодов с рассасыванием и мумификацией, рождением мертвых плодов, бесплодием, повторным

РВЖ • СХЖ • № 1/2012

приходом в охоту, гибелью новорожденных поросят и реже абортами [3, 4]. У животных других возрастных групп заболевание обычно протекает в латентной форме. Однако имеются сообщения, что ПВС вызывает кожные поражения у поросят [10, 11, 19], интерстициальный нефрит у свиней убойного возраста [7] и негнойный миокардит у поросят-сосунов [6]. Согласно последним данным, ПВС может усиливать проявление клинических признаков СПМИ, вызванного ЦВС-2 [9].

ПВС относится к роду Parvovirus семейства Par-voviridae [17]. Его геном представлен однонитевой молекулой ДНК (приблизительно 5 тыс. нуклеотидов), и имеет две основные открытые рамки считывания. Открытая рамка считывания, расположенная на 3' -конце генома, кодирует неструктурные белки (NS). Открытая рамка считывания, расположенная на 5' -конце генома, кодирует структурные белки (VP). Каждая из этих рамок кодирует минимум по два белка [5, 18]. Генетическая вариабельность штаммов ПВС представлена изменениями в структурном белке VP-2. В последнее время выявлены новые антигенные варианты (типы) ПВС, выделенные из полевых изолятов [14, 20].

Классические методы выявления ПВИС — выделение вируса, РГА и иммунофлуоресценция [2, 8, 15]. Для определения вирусного антигена на исследование направляют мумифицированные плоды, мертворожденных поросят, сперму хряков, кровь свиноматок с нарушениями репродуктивной функции. Однако мумифицированные плоды старше 70-дневного возраста и мертворожденные поросята не пригодны для выделения вируса, поскольку содержат вирусный антиген, связанный с антителами. В последнее время для диагностики широко применяют метод ПЦР, основанный на ферментативной амплификации специфических участков генома [1, 16]. Данный метод чувствителен, специфичен, экономичен, прост в исполнении и, кроме того, позволяет выявлять вирус, несмотря на его связь с антителами.

В настоящее время широкое распространение получает современная модификация метода ПЦР — ПЦР с детекцией специфического продукта амплификации в режиме реального времени. Метод обладает рядом преимуществ по сравнению с обычной ПЦР и позволяет получать результаты в течение нескольких часов, снижает риск контаминации. Кроме того, посредством ПЦР в реальном времени доступен не только качественный, но и количественный анализ.

Цель исследования

Разработать тест-систему для выявления ПВС методом ПЦР в режиме реального времени с использованием праймеров для амплификации фрагмента ДНК, кодирующего неструктурный белок NS-1. Данная область генома ПВС является высококонсервативной и позволяет выявлять все штаммы ПВС.

Материалы и методы

Вирусы, клетки, исследуемые образцы. Для проведения ПЦР в реальном времени использовали образцы ДНК, выделенные из культур клеток ППЭС, зараженных ПВС (штамм ИЛ-82). Титр данного вируса в РГА сос-

^ 3,68 х 10*

3 500fr S’ Z

3.68 х |0Л ^ 3.68 х 104

о ^ § 200fr

I ^ 3.68 * 10:

0- /у ^ 3.68 х Ю'

11 16 21 26 31 Номер цикла

Рис. 1. Результаты ПЦР в реальном времени на матрице серии последовательных разведений рекомбинантной плазмиды. Кривые флуоресценции соответствуют положительным результатам обнаружения ДНК ПВС

тавлял 1/1048. Суспензии внутренних органов абортированных плодов и кровь были получены из свиноводческих хозяйств РФ.

Праймеры и зонды. Последовательности синтетических олигонуклеотидов (праймеров и зонда) для детекции фрагмента ДНК (193 п.н.), кодирующего неструктурный белок NS-1, разрабатывали с использованием компьютерных программ Assembly Lign (Oxford Molecular Group PLC, США), Amplify версия 1.0 (University of Wisconsin, США); Oligo версия 4.0 (США). Зонд метили на 5'-конце флуорофором FAM и на З'-конце гаситетелем флуоресценции BHQ1.

Конструирование рекомбинанной плазмиды. Фрагмент ДНК, кодирующий неструктурный белок NS-1, размером 193 п.н., был амлифицирован с матричной ДНК ПВС (штамм ИЛ-82) с использованием праймеров Rt PPV-F и Rt PPV-R. Для этого использовали следующие температурный режим: 1 цикл: 940С — 5 мин, 35 циклов: 940С — 15 с, 600С — 15 с, 720С — 1 мин. Наработанный ПЦР-фрагмент клонировали в вектор pGEM T-Easy с использованием набора «p-GEM-T Easy Vector System I» (Promega, США). Полученную рекомбинантную плазмиду наращивали в компетентных клетках E.coli (Top Ten). Для выделения рекомбинантной плазмиды использовали набор «DNA Purification System, Wiz-ardPlus, SV Minipreps» (Promega, США). Концентрацию плазмиды определяли спектрофотометрически. Выделенную рекомбинантную плазмиду хранили при -200С.

Оптимизация проведения ПЦР в реальном времени. Реакцию для наработки фрагмента ДНК проводили в объеме 25 мкл. К 5 мкл ДНК добавляли реакционную смесь для ПЦР, содержащую 2,5 мкл 10X буфера для ПЦР (Fermentas), 10 пМ каждого праймера, 5 пМ зонда, 0,25мМ каждого dNTP, 1,25 ед. Taq-полимеразы и 11, 75 мкл деионизованной стерильной воды. Для проведения ПЦР в реальном времени использовали следующий температурный режим: 1 цикл: при 940С — 5 мин, 35 циклов: при 940С — 15 с, 600С — 15 с, 720С — 1 мин. Ставили реакцию и учитывали результаты с использованием детектирующего амплификатора ДТ-96 (ДНК-технология, Россия). Результаты отображались на экране монитора компьютера в виде зависимости интенсивности флуоресценции от цикла реакции.

О.В. Елисеева, О.Е. Латышев, Т.В. Гребенникова, Т.И. Алипер

Линейный фит

Стандарты

Образцы

Е » 118%

5Ю = 0,569 й_2 = 0,9943

1$

Рис. 2. Калибровочный график для количественного анализа

Чувствительность и специфичность ПЦР в реальном времени. Для определения абсолютной чувствительности разработанной тест-системы делали десятикратные разведения рекомбинантной плазмиды на деионизованной стерильной воде. Молекулярная концентрация плазмиды при этом составила от 3,68 х 1010 до 3,68 х 100 копий/мкл. Так же определяли сравнительную чувствительность тест-системы на основе ПЦР в реальном времени, тест-системы на основе ПЦР и РГА, используя 10-кратные разведения культурального ПВС. Специфичность разработанной тест-системы исследовали, используя различные вирусы, вызывающие сходную с ПВИС клиническую картину (вирусы РРСС, КЧС, ЦВС-2).

Результаты

При подборе оптимальных условий для выделения ДНК ПВС из клеточной культуры и патологического материала использовали выделение на неорганическом носителе, который применяют в коммерческих диагностических наборах «ООО Ветбиохим». Это позволяет быстро и эффективно выделять ДНК.

Для определения чувствительности использовали рекомбинантную плазмиду, содержащую фрагмент генома ПВС, кодирующий часть неструктурного белка NS1. Массовая концентрация рекомбинантной плазмиды составила 0,13 мкг/мкл, молекулярная концентрация рекомбинантной плазмиды — 3,68 х 1010 молекул/мкл. Готовили серию стандартных растворов рекомбинантной плазмиды. Диапазон полученных концентраций — от 3,68 х 1010 до 3,68 х 100 копий/мкл.

На рисунке 1 представлены результаты ПЦР в реальном времени серии стандартных растворов калибровочного графика, которые отображены в виде зависимости флюоресценции от номера цикла. В серии экспериментов была определена чувствительность разработанной тест-системы, которая составила 20.30 молекул/мкл в исследуемом образце.

Важной характеристикой метода ПЦР в реальном времени служит возможность проведения не только качественного, но и количественного анализа. Для этого необходимо построить калибровочный график, который выражает линейную зависимость значений порогового цикла Ct и десятичного логарифма концентрации ДНК Log10 (рис. 2). По калибровочному графику, в соответствии с полученным значением &, расчитывают концентрации ДНК исследуемых образцов.

1од10

Качественный анализ

Номер лунки Идентификатор пробирки Ср, Fam Ср, Нех Результат

В1 КЧС_проба_1 (РРУ) -

В3 РРСС (РРУ) -

В5 ЦВС_проба_2 (РРУ) -

В6 ПВС (РРУ) 23,1 +

1 В7 К- (РРУ) -

Зависимость флуоресценции канала FAM от номера цикла

1 б 11 16 21 26 31

Номер цикла

Рис. 3. Специфичность тест-системы ПЦР «в реальном времени» для определения ПВС. В1- культуральный вирус классической чумы свиней, В3- культуральный вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней, В5- культуральный цирковирус свиней 2-го типа, В6- культуральный парвовирус свиней, В7- контроль (деионизованная стерильная вода).

В России для обнаружения парвовирусного антигена в суспензии внутренних органов абортированных плодов обычно используют метод РГА. Сегодня для диагностических исследований также применяют метод ПЦР, основанный на ферментативной амплификации специфических участков генома. Данный метод характеризуется большей чувствительностью по сравнению с РГА и позволяет выявлять вирус несмотря на его связь с антителами, исследовать кровь и сыворотку животных.

В нашей работе мы сравнили чувствительность различных диагностических тест-систем (табл.).

Сравнение чувствительности различных диагностических методов на матрице культуры клеток ППЭС, зараженной парвовирусом свиней

Разведение культуры клеток ППЭС, Метод исследования

зараженной ПВС ПЦР «в реальном времени» ПЦР РГА

Исходный + + +

10-1 + + +

10-2 + + +

10-3 + + +

10-4 + + -

10-5 + +/- -

10-6 - - -

10-7 - - -

Отрицательный контроль - - -

РВЖ • СХЖ • № 1/2012

Анализ полученных данных показал, что разработанная тест-система для обнаружения ДНК ПВС на основе ПЦР в реальном времени имеет примерно такую же чувствительность, что и обычная ПЦР тест-система, но в 100 раз чувствительней РГА.

Специфичность тест-системы исследовали с использованием различных штаммов вирусов, вызывающих сходные с ПВИС симптомы заболевания. Результаты исследований приведены на рисунке 3.

С помощью разработанной тест-системы для обнаружения ПВС методом ПЦР в реальном времени исследовали кровь и сыворотку свиней убойного возраста, а также абортированные плоды. Предварительно все образцы исследовали с помощью тест-системы для обнаружения ПВС методом ПЦР, разработанной НПО «НАРВАК» (Наставление по применению от 21.05.2009,

Библиография

1. Гребенникова Т.В. и др. Медицинская вирусология. —

М.: МИА, 2008.

2. Орлянкин Б.Г. и др. Парвовирусные инфекции и их влияние на продуктивность животных. — М.: ВНИИТЭИСХ, 1985.

3. Орлянкин Б.Г. Биология парвовирусов животных // Сельскохозяйственная биология, 1986; 11: 104.

4. Сергеев В.А. Вирусы и вирусные вакцины. — М.: Библи-оника, 2007.

5. Bergeron J. et al. Genomic organization and mapping of transcription and translation products of the NADL-2 Strain of Porcine parvovirus // Virology, 1993. 197: 86—98.

6. Bolt D.M. et al. Non-suppurative myocarditis in piglets associated with porcine parvovirus infection // J.Comp.Pathology, 1997; 117 (2): 107—118.

7. Drolet R. et al. Infectious agents identified in pigs with multifocal interstitial nephritis at slaughter // Vet. Record, 2002; 150 (5): 139—143.

8. Joo H.S. et al. Pathogenesis of porcine parvovirus infec-tion:pathology and immunofluorescence in the foetus // J.Comp.Pathology, 1977; 87: 383—391.

9. Krakowka S. et al. Viral wasting syndrome of swine: Experimental reproduction of Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome in gnotobiotic swine by coinfection with porcine circovirus 2 and porcine parvovirus // Vet. Pathology, 2000; 37: 254—263.

10. Kresse J.I. et al. Parvovirus infection in pigs with necrotic and vesicle-like lesions // Vet. Microbiology, 1985; 10: 525—531.

11. Lager K.M. et al. Porcine parvovirus associated with cutaneous lesions in piglets // J. Vet. Diag. Investigation, 1994; 6 (3): 357—359.

СТО 42418073-002-2007). Образцы, которые дали положительные результаты в ПЦР, также оказались положительными в ПЦР в реальном времени. По результатам исследований можно сделать выводы о возможности использования разработанной тест-системы для обнаружения ПВС методом ПЦР в реальном времени для диагностики ПВИС у животных.

Выводы

Разработанная тест-система для обнаружения ПВС методом ПЦР в реальном времени, характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью. Она пригодна для рутинных диагностических исследований в региональных лабораториях для выявления ПВС в пробах биологического материала разного происхождения, полученного от животных.

12. Maldonado J. et al. Identification of viral pathogens in aborted fetuses and stillborn piglets from cases of swine reproductive failure in Spain // The Veterinary J., 2005; 169:454—456.

13. Martinez C. et al. Production of porcine parvovirus empty capsids with high immunogenic activity // Vaccine, 1992; 10: 684—690.

14. Martins S.R. et al. Genetic variability of porcine parvovirus isolates revealed by analysis of partial sequences of the structural coding gene VP2 // J. Gen. Virology, 2003; 84: 1505—1515.

15. Mengeling W.L. et al. A current assessment of the role of porcine parvovirus as a cause of fetal porcine death. J // J. Vet. Diag. Investigation, 1991; 3: 33—35.

16. Molitor W.T. et al. Polymerase chain reaction (PCR) amplification for the detection of porcine parvovirus // J.Virol. Methods, 1991; 32: 201—211.

17. Murphy F.A. et al. The Classifications and Nomenclature of Viruses // 6th Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. — Vienna.: Springer - Verlag, 1995.

18. Shackelton L.A. et al. Comparative analysis reveals frequent recombination in the parvoviruses // J. Gen. Virology, 2007; 88: 3294—3301.

19. Whitaker H.K. et al. Parvovirus Infection in Pigs with Exudative Skin Disease // J. Vet. Diag. Investigation, 1990; 2: 244—246.

20. Zeeuw E.J. et al. Study of the virulence and crossneutralization capability of recent porcine parvovirus field isolates and vaccine viruses in experimentally infected pregnant gilts // J. Gen. Virology, 2007; 88: 420—427.

Summary

O.V. Eliseeva, O.E. Latushev, T.V. Grebennikova, T.I. Aliper. Kit based on Real-time PCR for detection of porcine parvovirus. Parvoviral infection of swine is caused by a small non-enveloped virus (Porcine parvovirus, PPV) and leads to serious reproductive disorders in pregnant sows. The present work it has been shown the results of the development of diagnostic test kits for detection of porcine parvovirus by a TaqMan-based real-time polymerase chain reaction. A test system has a high sensitivity, specificity and can detect parvovirus antigen in mummified fetuses, in the blood and serum, as well as in the semen of boars.