Способ выявления мутаций 2282del4, R501X, R2447X в гене филаггрина (FLG) при вульгарном ихтиозе и атопическом дерматите
METHOD OF IDENTIFICATION OF MUTATIONS 2282del4, R501X, R2447X IN GENES OF FILAGGRIN (FLG) WITH VULGAR ICHTYOSIS AND ATOPIC DERMATITIS

Изобретение относится к медицине, а именно к области генетики, молекулярной биологии и может быть использовано в дерматологии для быстрого детектирования основных мутаций в гене филаггрина (FLG) на стандартном отечественном оборудовании в широкой клинической практике.
В настоящее время известно около 20 генов, ассоциируемых с атопической предрасположенностью. Это такие гены, как ADAM33, SPINK-5, FLG, среди них выделяют группу генов, которые кодируют белки, участвующие в формировании эпидермального барьера, одним, из которых является ген филаггрина (FLG) (OMIM, https://omim.org/entry/135940). Филаггрин является ключевым белком, участвующим в дифференцировке клеток эпидермиса и осуществлении его барьерной функции. Он образуется в ходе окончательной дифференцировки зернистых клеток эпидермиса, когда профилаггрин кератогиалиновых гранул протеолитически разрезается на молекулы филаггрина, которые быстро агрегируют с кератиновым цитоскелетом, что приводит к коллапсу зернистых клеток в плоские безъядерные чешуйки. Образовавшийся роговой слой является барьером, предотвращающим не только потерю воды, но и попадание аллергенов и инфекционных агентов (Sandilands A,  GM, Liao Н, Zhao Y, Terron-Kwiatkowski A, Watson RM, Cassidy AJ, Goudie DR, Smith FJ, McLean WH, Irvine AD. Prevalent and rare mutations in the gene encoding filaggrin cause ichthyosis vulgaris and predispose individuals to atopic dermatitis // J Invest Dermatol. - 2006. - Vol. 126, N 8. - P. 1770 1775.).
Ген, кодирующий филаггрин, находится на длинном плече 1-й хромосомы (1q21), OMIM 135940, состоит из 3-х экзонов. Ген филаггрина (FLG) содержит от 10 до 12 тандемных повторов и кодирует полипептид-предшественник или профилаггрин. Короткие, связывающие последовательности между повторами филаггрина в синтезированном белке являются мишенью для действия протеолитических ферментов. Мутации в гене филаггрина (FLG) проявляются в развитии таких заболеваний, как вульгарный ихтиоз и атопический дерматит. Вульгарный ихтиоз ассоциирован с мутацией в виде замены С на Т в позиции 1501 вблизи начала первого повтора в 3-м экзоне гена филаггрина (FLG), которая приводит к образованию стоп-кодона, arg501-to-stop (R501X) (Smith FJ, Irvine AD, Terron-Kwiatkowski A, Sandilands A, Campbell LE, Zhao Y, Liao H, Evans AT, Goudie DR, Lewis-Jones S, Arseculeratne G, Munro CS, Sergeant A,  G, Bale SJ, Compton JG, DiGiovanna JJ, Presland RB, Fleckman P, McLean WH. Loss-of-function mutations in the gene encoding filaggrin cause ichthyosis vulgaris. Nat Genet. 2006 Mar; 38 (3): 337-42.).
На сегодняшний день одним из распространенных способов выявления мутаций на участках ДНК в гене филаггрина (FLG), является секвенирование по Сэнгеру (Sandilands A, Terron-Kwiatkowski A, Hull PR et al. Comprehensive analysis of the gene encoding filaggrin uncovers prevalent and rare mutations in ichthyosis vulgaris and atopic eczema. // Nat Genet. 2007 May; 39 (5): 650-4).
Для осуществления этого способа предъявляются определенные требования к помещению, где установлен секвенатор, необходима определенная квалификация сотрудников, а также подготовка исследуемого материала к секвенированию. Способ дорогостоящий и длительный по времени (3-4 недели).
Использование современных методов NGS (Wong XFCC, Denil SLIJ, Foo JN, Chen H, Ling Tay AS, Haines RL, Tang MBY, McLean WHI, Sandilands A, Smith FJD, Lane EB, Liu J, Common JEA. Array-based sequencing of filaggrin gene for comprehensive detection of disease-associated variants. J Allergy Clin Immunol. 2017 Oct 19), которые применяются в клинической практике с целью секвенирования гена филаггрина (FLG) малоэффективно, поскольку в процессе приготовления библиотек получаются короткие фрагменты ДНК длиной от 100 до 400 пар нуклеотидов, что серьезно затрудняет финальную сборку сиквенса. Срок выполнения сиквенса от 1 до 3-х месяцев. Кроме того, требуется дорогостоящее оборудование, реактивы и высококвалифицированные сотрудники как для собственно сиквенса, так и для его биоинформационной обработки. А еще необходимо подтверждение всех находок с помощью секвенирования по Сэнгеру.
Изучение конкретного участка ДНК гена филаггрина (FLG) с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) затруднено, в силу того, что в 3-м экзоне гена филаггрина (FLG) содержится от 10 до 12 повторов, каждый длиной 972 пары нуклеотидов и подобрать праймеры так, чтобы они отжигались только на уникальные для каждого повтора участки сложно из-за высокой гомологии повторов.
Наличие протяженных повторов в гене филаггрина (FLG) затрудняет использование секвенирования для обнаружения мутаций в рутинной лабораторной практике. Капиллярное секвенирование требует значительных материальных и временных затрат.
Известна методика генотипирования отдельных мутаций в гене филаггрин (FLG) (Varbo A, Nordestgaard BG, Benn М. Filaggrin loss-of-function mutations as risk factors for ischemic stroke in the general population. J Thromb Haemost. 2017 Apr; 15 (4): 624-635). Согласно данной методике для генотипирования 2282del4 были использованы пробы с TaqMan (Applied Biosystems), а для генотипирования R501X применялась другая аллель-специфическая система (KASPar).
Данный метод не только дорогостоящий, т.к. требуется дорогое оборудование, реактивы, но и трудоемкий.
Другой подход к генотипированию заключается в использовании Sequenom MassARRAY system с iPLEX Gold assays (Sequenom Inc., San Diego, CA, USA) (Luukkonen TM, Kiiski V, Ahola M, Mandelin J, Virtanen H,  M, Kivirikko S, Surakka I, Reitamo S, Palotie A,  M, Jakkula E, Remitz A. The Value of FLG Null Mutations in Predicting Treatment Response in Atopic Dermatitis: An Observational Study in Finnish Patients. Acta Derm Venereol. 2017 Apr 6; 97 (4): 456-463.).
Этот метод обеспечивает достаточную точность, но дороговизна импортных оборудования и расходных материалов делает его недоступным для большинства лабораторий.
Задачей данного изобретения является создание эффективного, недорогого и быстро выполнимого способа выявления основных мутаций 2282del4, R501X, R2447X в гене филаггрина (FLG), что способствует подбору индивидуального лечения пациентов.
Сущность заявленного способа заключается в том, что в выделенной ДНК, амплификацию участков гена филаггрина (FLG) осуществляют путем проведения полимеразной цепной реакции с использованием праймеров и определяют размер полученных фрагментов с помощью электрофореза, а при проведении полимеразной цепной реакции для выявления мутации 2282del4 используют (5'-TGGTA-GTCAG-GCCAC-TGACA-GTG-3') - прямой праймер и (5'-GGTGA-CCAGC-CTGTC-CATGG-3') - обратный праймер; для выявления мутации R501X используют (5'-TCGCA-CCACG-AGCAG-GTA-3') - прямой праймер и (5'-ATTTA-CCGAT-TGCTC-GTGG-3') - обратный праймер; для выявления мутации R2447X используют (5'-CTAGG-ATCCC-ACCAC-AAGCA-GGTA-3') - прямой праймер и (5'-TGGGA-TGTGG-TGTGG-CTGTG-3') - обратный праймер, причем для выявления мутаций R501X и R2447X применяют эндонуклеазу рестрикции RsaI с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов и при наличии аллелей 83 п.н и 79 п.н; 129 п.н., 109 п.н. и 20 п.н.; 179 п.н., 159 п.н. и 20 п.н. диагностируют соответственно гетерозиготное носительство мутаций 2282del4, R501X и R2447X; при наличии аллелей 79 п.н., 129 п.н. или 179 п.н. диагностируют соответственно гомозиготное носительство мутаций 2282del4, R501X или R2447X.
Заявленный способ осуществляют следующим образом.
Экстракция ДНК из периферической крови, буккального эпителия, слюны может быть осуществлена любым коммерчески доступным набором.
В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПНР) и амплификации нужного фрагмента кодирующего региона гена филаггрина (FLG).
Специфические последовательности олигонуклеотидных праймеров для детекции мутаций 2282del4, R501X, R2447X в гене филаггрина (FLG) выбирали с помощью программы Vector NTI.
Праймеры были синтезированы в ООО «Биосинтез» (г. Новосибирск). Амплификацию проводили на термоциклере "Терцик" (ЗАО НПФ "ДНК-Технология", г. Москва).
Наличие мутации 2282del4 выявляли в первом повторе 3 экзонагена филаггрина (FLG) при помощи ПЦР с фланкирующими исследуемый район праймерами:
5'-TGGTA-GTCAG-GCCAC-TGACA-GTG-3' - прямой праймер;
5'-GGTGA-CCAGC-CTGTC-CATGG-3' - обратный праймер.
Параметры ПЦР были следующими: денатурация 30 сек. при 95°С; отжиг 30 сек. при 64°С; синтез 30 сек. при 72°С, всего 31 цикл.
Реакционная смесь объемом 12,5 мкл содержала: 75 мМ Tris-HCl, рН=9,0; 20 мМ (NH4)2S04; 0,01% Tween-20; 1 мкл тотальной ДНК; по 0,5 мкМ каждого праймера; 1,25 мМ MgCl2; 0,5 mM каждого из dNTP; 0,5 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы («СибЭнзим», г. Новосибирск). Результаты ПЦР подвергали электрофорезу в камере НПФ БИОКЛОН (г. Москва) при постоянном напряжении 50 вольт в 10% полиакриламидном геле с окрашиванием бромистым этидием в течение 3-х минут. Разделенные фрагменты ДНК визуализировали на трансиллюминаторе в ультрафиолетовом свете с помощью системы гель-документирования (Gel Doc XR+, США). Сохранение и обработка изображений электрофоретических гелей проводилась с помощью программы Quantity One.
На фиг. 1 представлена электрофореграмма результатов генотипирования образцов ДНК на наличие мутации 2282del4 в гене филаггрина (FLG), внизу обозначены порядковые номера проанализированных образцов (5 человек).
Размер амплифицированного в ходе ПЦР фрагмента гена филаггрина (FLG) составил в случае гетерозиготы фрагменты по 83 п.н. и 79 п.н. (образцы 1, 5), гомозиготы по инсерции фрагмент 83 п.н. (образец 2, 4), гомозигота по делеции фрагмент 79 п.н. (образец 3).
Для верификации результатов генотипирования часть образцов была секвенирована на автоматическом секвенаторе АВ3500 (США) по протоколу фирмы-изготовителя. Результаты секвенирования образцов ДНК по мутации 2282del4 представлены на фиг. 2 - гомозигота по инсерции, на фиг. 3 - гетерозигота по делеции, на фиг. 4 - мутантная гомозигота.
Наличие мутации R501X выявляли в первом повторе 3 экзона гена филаггрина (FLG) при помощи ПЦР с фланкирующими исследуемый район праймерами: 5'-TCGCA-CCACG-AGCAG-GTA-3' - прямой праймер; 5'-ATTTA-CCGAT-TGCTC-GTGG-3' - обратный праймер.
Параметры ПЦР были следующими: денатурация 30 сек. при 95°С; отжиг 30 сек. при 62°С; синтез 30 сек. при 72°С, всего 33 цикла.
4
2
4
2
Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала: 75 мМ Tris-HCl, рН=9,0; 20 мМ (NH)SO; 0,01% Tween-20; 1 мкл тотальной ДНК; по 1 мкМ каждого праймера; 2,5 мМ MgCl; 1 mM каждого из dNTP; 1 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы («СибЭнзим», г. Новосибирск). Рестрикция проводилась в стандартных условиях с 5 ед. акт.эндонуклеаза рестрикции RsaI («СибЭнзим», г. Новосибирск) при 37°С в течение 12 часов, с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов. Результаты рестрикции подвергали электрофорезу в камере НПФ БИОКЛОН (г. Москва) в 4% полиакриламидном геле с постоянным напряжением 50 вольт и окрашиванием бромистым этидием в течение 3-х минут. Разделенные фрагменты ДНК визуализировали на трансиллюминаторе в ультрафиолетовом свете с помощью системы гель-документирования (Gel Doc XR+, США). Сохранение и обработка изображений электрофоретических гелей проводилась с помощью программы Quantity One.
При наличии в амплифицируемом участке ДНК сайта рестрикции от продукта амплификации размером 129 п.н. отрезается фрагмент размером около 20 п.н., то есть в случае гетерозиготы по мутации R501X образуется три фрагмента длиной 129 п.н., 109 п.н. и 20 п.н., а в случае распространенной гомозиготы - два фрагмента длиной 109 п.н. и 20 п.н. Если же образец ДНК гомозиготен по мутации, то длина ПЦР продукта остается неизменной - 129 п.н.
На фиг. 5 представлена электрофореграмма результатов генотипирования образцов ДНК на наличие мутации R501X в гене филаггрина (FLG). Внизу обозначены порядковые номера проанализированных образцов (5 человек), образец 1 - гетерозигота по мутации R501X (фрагменты 129 п.н. и 109 п.н.), образцы 2, 3, 4, 5 - нормальные гомозиготы (фрагмент 109 п.н.) Для верификации генотипирования образцы была секвенированы на автоматическом секвенаторе АВ3500 (США) по протоколу фирмы-изготовителя. Результаты секвенирования образцов ДНК по мутации R501X представлены на фиг. 6 - нормальная гомозигота, на фиг. 7 - гетерозигота.
Наличие мутации R2447X выявляли в первом повторе 3 экзонагена филаггрина (FLG) при помощи ПЦР с фланкирующими исследуемый район праймерами:
5'-CTAGG-ATCCC-ACCAC-AAGCA-GGTA-3' - прямой праймер;
5'-TGGGA-TGTGG-TGTGG-CTGTG-3' - обратный.
Параметры ПЦР были следующие: денатурация 30 сек. при 95°С; отжиг 30 сек. при 62°С; синтез 30 сек. при 72°С, всего 33 цикла.
4
2
4
2
Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала: 75 мМ Tris-HCl, рН=9,0; 20 мМ (NH)SO; 0,01% Tween-20; 1 мкл тотальной ДНК; по 1 мкМ каждого праймера; 2,5 мМ MgCl; 1 mM каждого из dNTP; 1 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы («СибЭнзим», г. Новосибирск).
Рестрикция проводилась в стандартных условиях с 5 ед. акт. рестриктазы RsaI при 37°С в течение 12 часов, с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов. Результаты рестрикции подвергали электрофорезу в камере НПФ БИОКЛОН (г. Москва) в 4% полиакриламидном геле при напряжении 50 вольт с последующим окрашиванием бромистым этидием в течение 3-х минут. Разделенные фрагменты ДНК визуализировали на трансиллюминаторе в ультрафиолетовом свете с помощью системы гель-документирования (Gel Doc XR+, США). Сохранение и обработка изображений электрофоретических гелей проводилась с помощью программы Quantity One.
В случае гетерозиготы по мутации R2447X образуется три фрагмента длиной 179 п.п., 159 п.н. и 20 п.н., а в случае нормальной гомозиготы - два фрагмента длиной 159 п.н. и 20 п.н.
Следует заметить, что фрагмент 20 п.н. на геле не визуализируется вследствие низкой молекулярной массы.
На фиг. 8 представлена электрофореграмма результатов генотипирования образцов ДНК на наличие мутации R2447X в гене филаггрина (FLG). Внизу обозначены порядковые номера проанализированных образцов (5 человек), образцы 1, 5 - гетерозиготы по мутации R2447X (фрагмент 179 п.н. и 159 п.н.), образцы 2, 3, 4 - нормальной гомозиготы (фрагмент 159 п.н.)
Для верификации методики генотипирования мутаций 2282del4, R501X и R2447X было проведено секвенирование на автоматическом секвенаторе АВ3500 (США) по протоколу фирмы-изготовителя. Во всех случаях секвенирование подтвердило соответствие структуры продукта амплификации ожидаемой нуклеотидной последовательности.
Время исследования - 2 дня.
В сотрудничестве с медико-генетическим отделом диагностического центра Городской клинической больницы №1 г. Новосибирска были сформированы группы больных вульгарным ихтиозом и атопическим дерматитом. Для демонстрации эффективности разработанного способа, выявления наличия основных мутаций 2282del4, R501X и R2447X в гене филаггрина (FLG) при вульгарном ихтиозе и атопическом дерматите было проведено генотипирование у 40 пробандов с вульгарным ихтиозом и 300 больных атопическим дерматитом.
В группе больных вульгарным ихтиозом у 71% обнаружены эти мутации. В группе с атопическим дерматитом у 16% больных обнаружены эти мутации.
Изобретение поясняется следующими примерами конкретного выполнения способа.
Пример 1.
Больной М. 1988 года рождения, жалобы на сухость и шелушение кожи, гиперкератоз на ладонях - больше в зимнее время. Из личного анамнеза: сухость кожных покровов отмечается с рождения, но в летний период времени состояние кожи почти нормализуется. В первые годы жизни пациент наблюдался у дерматолога с диагнозом ксероз, получал местную терапию. Из семейного анамнеза: у матери и отца пробанда - сухость кожи, повышенная исчерченность ладоней и подошв, умеренный гиперкератоз на ладонях. При осмотре пробанда: кожный процесс носит распространенный характер. Изменения кожи в виде средне и мелко пластинчатого шелушения сероватого цвета на голенях и предплечьях с выраженным фолликулярным гиперкератозом, повышенная исчерченность и гиперкератоз ладоней и подошв.
У пробанда, его матери и отца была проведена экстракция ДЬЖ из периферической крови, полученную ДНК использовали в качестве матрицы для ПЦР, наличие мутаций 2282del4, R501X, R2447X выявляли в первом повторе 3 экзона гена филаггрина (FLG), применяя согласно предложенному способу специфические праймеры, реакционную смесь, условия ПЦР.
Для выявления наличия мутации 2282del4 проводили ПЦР применяя прямой праймер: 5'-TGGTA-GTCAG-GCCAC-TGACA-GTG-3' и обратный праймер: 5'-GGTGA-CCAGC-CTGTC-CATGG-3' затем результаты ПЦР подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле с окрашиванием бромистым этидием в течение 3-х минут и последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе.
Для выявления наличия мутаций R501X и R2447X проводили ПЦР с фланкирующими исследуемый район праймерами. Для выявления мутации R501X применяли 5'-TCGCA-CCACG-AGCAG-GTA-3' - прямой праймер; 5'-ATTTA-CCGAT-TGCTC-GTGG-3' - обратный праймер, для выявления мутации R2447X применяли 5'-CTAGG-ATCCC-ACCAC-AAGCA-GGTA-3' - прямой праймер; 5'-TGGGA-TGTGG-TGTGG-CTGTG-3' - обратный праймер, затем применяли эндонуклеазу рестрикции RsaI с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов и определяли размер полученных фрагментов с помощью электрофореза с окрашиванием бромистым этидием в течение 3-х минут и последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе.
При анализе ДНК пробанда, его матери и отца на мутации в гене филаггрина (FLG) обнаружена делеция 2282del4 в гомозиготном состоянии у пробанда (фиг. 1, образец 3; фиг. 4), а у отца пробанда (фиг. 1, образец 1; фиг. 3) и матери пробанда (фиг. 1, образец 5) в гетерозиготном состоянии. По другим мутациям у родителей норма - мать пробанда: мутация R501X (фиг. 5, образец 5), мутация R2447X (фиг. 8, образец 4); отец пробанда: мутация R501X (фиг. 5, образец 4 и фиг. 6), мутация R2447X (фиг. 8, образец 3). Данное исследование проведено в течение 2-х дней.
Таким образом, учитывая клиническую картину и наличие мутации 2282del4 в гомозиготном состоянии, пробанду с диагнозом вульгарного ихтиоза, рекомендовано пожизненное использование эмолентов для замещения функции кожного барьера. При последующих плановых осмотрах отмечается существенное улучшение состояния кожных покровов - шелушение отсутствует, умеренная сухость кожи.
Пример 2.
Девочка К. 2011 г. рождения, с жалобы на сухость и шелушение кожи. Беременность у мамы девочки протекала нормально, роды в срок, кожные покровы при рождении - без патологии, грудное вскармливание до 4 месяцев, потом смешенное с добавлением овощей, фруктов, рисовых каш. Изменения кожи появились в первый месяц жизни в виде мокнутия на коже щек. В 6 месяцев на коже туловища и ягодиц появились участки выраженной сухости кожи с четкими границами. В 8 месяцев процесс принял распространенную форму, с вовлечением не только туловища, но и кожи щек, ног в виде выраженной сухости кожи с эритемой, с присоединением вторичной инфекции. Ребенок наблюдался у педиатра и дерматолога, в разные этапы жизни с диагнозом атопический дерматит, который был выставлен в возрасте 1 месяца. Получала регулярное лечение, основанное на наружной терапии, диетотерапии, системной терапии, дважды в период сильного обострения была на стационарном лечении. Семейный анамнез по атопическому дерматиту не отягощен как со стороны матери, так и со стороны отца пробанда. При осмотре девочки: кожный процесс носит распространенный характер, фолликулярный гиперкератоз в области предплечий и плеч, выраженная сухость кожных покровов на коже голеней, спины, очаги с явлениями лихенификации в области крупных складок, на коже щек эритема с шелушением, хейлит, инфраорбитальная складка. У отца пробанда - сухость кожи, повышенная исчерченность ладоней и подошв, умеренный гиперкератоз на ладонях. У матери пробанда - изменений кожных покровов нет.
У пробанда, его матери и отца была проведена экстракция ДНК из периферической крови, полученную ДНК использовали в качестве матрицы для ПЦР, наличие мутаций 2282del4, R501X, R2447X выявляли в первом повторе 3 экзона гена филаггрина (FLG), применяя согласно предложенному способу специфические праймеры, реакционную смесь, условия ПЦР.
Для выявления наличия мутации 2282del4 проводили ПЦР применяя прямой праймер: 5'-TGGTA-GTCAG-GCCAC-TGACA-GTG-3' и обратный праймер: 5'-GGTGA-CCAGC-CTGTC-CATGG-3' затем результаты ПЦР подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле с окрашиванием бромистым этидием в течение 3-х минут и последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе.
Для выявления наличия мутаций R501X и R2447X проводили ПЦР с фланкирующими исследуемый район праймерами. Для выявления мутации R501X применяли 5'-TCGCA-CCACG-AGCAG-GTA-3' - прямой праймер; 5'-ATTTA-CCGAT-TGCTC-GTGG-3' - обратный праймер, для выявления мутации R2447X применяли 5'-CTAGG-ATCCC-ACCAC-AAGCA-GGTA-3' - прямой праймер; 5'-TGGGA-TGTGG-TGTGG-CTGTG-3' - обратный праймер, затем применяли эндонуклеазу рестрикции RsaI с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов и определяли размер полученных фрагментов с помощью электрофореза с окрашиванием бромистым этидием в течение 3-х минут и последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе.
При анализе ДНК пробанда на мутации в гене филаггрина (FLG) обнаружено гетерозиготное состояние по мутации R501X (фиг. 5, образец 1; фиг. 7) и гетерозиготное состояние по мутации R2447X (фиг. 8, образец 1), по делеции 2282del4 - норма (фиг. 2). У матери пробанда - норма по мутации 2282del4 (фиг. 1, образец 4), по мутации R501X (фиг. 5, образец 3), по мутации R2447X (фиг. 8, образец 2). У отца пробанда - гетерозиготное состояние по мутации R2447X (фиг. 8, образец 5), норма по делеции 2282del4 (фиг. 1, образец 2) и мутации R501X (фиг. 5, образец 2). Выраженная клиническая картина атопического дерматита у пробанда обусловлена компаунд-гетерозиготным состоянием по мутациям R501X и R2447X. Исследование проведено в течение 2-х дней.
Рекомендовано: диетотерапия, пожизненное использование эмолентов для замещения функции кожного барьера, использование топических стероидов и антигистаминных препаратов только в период обострения. При последующих плановых осмотрах отмечается существенное улучшение состояния кожных покровов без выраженных обострений.
Таким образом, заявленный способ выявления наличия часто встречающихся мутаций: 2282del4, R501X и R2447X в гене филаггрина (FLG) при вульгарном ихтиозе и атопическом дерматите делает этот способ доступным для применения в широкой клинической практике, т.к. наличие этих мутаций существенно влияет на тактику ведения пациента (в терапию добавляются эмоленты для замещения функции кожного барьера, снижается длительность применения глюкокортикоидов, ингибиторов кальциневрина). Персонифицированный подход, основанный на знании этиологической основы развития заболевания у конкретного пациента, позволяет быстрее добиться ремиссии и увеличить ее продолжительность за счет уменьшения влияния основного провоцирующего фактора - дефекта кожного барьера.