Ультраструктурные основы патологических изменений в пищеварительной системе животных при нарушении абсорбционных процессов

Ответственный за коррекции и корректирующие действия - ветеринарный врач комплекса, зоотехник комплекса.

Регистрационно-учетные документы: 1. «Журнал учета заболеваний, отхода и ветеринарной обработки животных в карантине и изоляторе». 2. «Журнал ветеринарного контроля отправки скота для убоя». 3. «Журнал для записи противоэпизоотических мероприятий». 4. «Журнал для регистрации больных животных».

Место хранения - кабинет ветеринарного врача комплекса.

Верификация записей по мониторингу. Главный ветеринарный врач - 1 раз в неделю, «Журнал для регистрации больных животных», «Журнал ветеринарного контроля отправки скота для убоя», «Журнал для записи противоэпизоотических мероприятий», «Журнал учета заболеваний, отхода и ветеринарной обработки животных в карантине и изоляторе».

Заключение. Таким образом, можно сделать вывод, что процедуры, основанные на принципах НАССР, применимы в условиях промышленного выращивания и откорма бычков. Использование принципов НАССР будет способствовать повышению безопасности говядины и экономической эффективности производства за счет создания стройной системы менеджмента, изменения психологии сотрудников, оптимизации производственных процессов и предупреждения поставок убойных бычков, несоответствующих требованиям ТНПА.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ветеринарное законодательство Республики Беларусь:сб. нормативно--правовых актов по ветеринарии. В 4-х т. Т. 3 / Гл. упр. ветеринарии с Гос. вет. и Гос. прод. инспекциями; редкол. Пивоварчик Ю. А. [и др.]. - Минск, 2010. - 808 с.

2. Донченко, Л.В. Безопасность пищевой продукции: учеб. 2-е изд., перераб. и доп. / Л.В. Донченко, В.Д. Надыкта. -М.: ДеЛи принт, 2007. - 539 с.

3. Кантере, В.М. Системы менеджмента безопасности пищевой продукции на основе международного стандарта ИСО 22000 / В.М. Кантере, В.А. Матисон, Ю.С. Сазонов: Монография. - М.: Типография РАСХН, 2006. - 454 с.

4. Мейес, Т. Эффективное внедрение НАССР: Учимся на опыте других / Т. Мейес, С. Мортимор; пер. с англ. В. Широкова. - СПб: Профессия, 2005. - 288 с.

5. Методические предложения по использованию системы ХАССП в сельскохозяйственном производстве / П.В.Расторгуев [и др.]. - Минск: Ин-т системных исследований в АПК НАН Беларуси, 2009. - 36 с.

6. Система безопасности продуктов питания на основе принципов НАССР / В.М. Кантере [и др.]: Монография. - М.: Типография РАСХН, 2004. - 462 с.

7. Системы менеджмента безопасности пищевых продуктов. Требования к организациям участвующим в пищевой цепи: СТБ 22000-2006. - Введ. 16.10.2006. - Минск: Белорус. Гос. ин-т стандартизации и сертификации, 2006. - 29 с.

8. Системы менеджмента безопасности пищевых продуктов. Управление безопасностью пищевых продуктов на основе анализа опасностей и критических контрольных точек. Общие требования: СТБ 1470-2012. - Введ. 18.01.2012. - Минск: Белорус. Гос. ин-т стандартизации и сертификации, 2012. - 119 с.

УДК636.53:591.2

УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ ОСНОВЫ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ В ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЕ ЖИВОТНЫХ ПРИ НАРУШЕНИИ АБСОРБЦИОННЫХ ПРОЦЕССОВ

В. В. МАЛАШКО, А. М. КАЗЫРО, Н. К. ГОЙЛИК, В. Т. БОЗЕР, Д. В. МАЛАШКО, АЛИ ОМАР ХУСЕЙН АЛИ, А. А. ЛЕГУН

УО «Гродненский государственный аграрный университет», г. Гродно, Республика Беларусь, 230008

Резюме. Приведены результаты электронно-микроскопических исследований тонкого кишечника телят при диарейном процессе. Установлены значительные изменения со стороны слизистой оболочки тонкого кишечника, которые сопровождаются атрофией слизистой оболочки, толщина которой уменьшается на 40 % по отношению к клинически здоровым животным. Отношение длины крипт ворсинки к глубине крипты при патологии составляло 0,7-1,6, без патологических процессов-0,4-0,5. На основании цитохимических исследований установлен кранио-каудальный градиент падения активности щелочной фосфатазы в тонком кишечнике телят. В структурах двенадцатиперстной кишки активность щелочной фосфа-тазы была выше на 18,7-26,8 % по отношению к тощей кишке и по отношению к подвздошной кишке - на 32,4-41,4 %. Среди отдельных энтероцитов (в пределах 15-22 %) регистрировались ядра с маргинацией и конденсацией хроматина, фагоцитированные апоптозные тельца, что свидетельствует о возможной гибели энтероцитов путем апоптоза.

Ключевые слова: телята, ультраструктура, патология, пищеварительная система, ферменты электронная микроскопия.

Summary: The article presents the findings of the electron microscopical study of small intestine in calves when there is scour. We have determined significant changes in mucous membrane of the small intestine with its atrophy. The thickness of mucous membrane of the small intestine was reduced by 40 % as compared to that in healthy animals. Length-to-depth ratio of villus crypt was 0.7-1.6 under pathological conditions and 0.4-0.5 without pathological findings. With the help of cytochemical analysis a cranio-caudal gradient of decline in alkaline phosphatase activity in the small intestine of calves has been established. Alkaline phosphatase activity in the structures of duodenum was higher by 18.7-26.8 % than in the empty intestine, and higher by 32.4-41.4 % than in the twisted intestine. Nuclei with marginalia and chromatin condensation as well as phagocytosed apoptotic bodies have been found among certain enterocytes (within 15-22 %), which is evidence of possible death of enterocytes because of apoptosis.

Key words: calves, ultrastructure, pathology, digestive system, enzymes, electron microscopy.

Введение. Патология пищеварительной системы является одной из наиболее распространенных заболеваний молодняка незаразной этиологии. Большинство исследователей, рассматривая механизм развития гастроэнтерита, в его основе видят нарушения моторной, секреторной, всасывательной функции желудка (сычуга) и кишечника. Тем не менее процессы нарушения в системе пищеварения далеко не исчерпывают включающиеся механизмы развития заболевания [1, 2, 3, 13].

Как отмечает J. J. Thiebault [17], длительное время диарею рассматривали как следствие гипермоторики пищеварительного тракта. Сегодня представления изменились о диарее и ее считают: нарушение водного обмена в кишечнике; увеличение потерь пассивной воды и секреции; уменьшение абсорбции или сочетание обоих факторов инфекционного или алиментарного происхождения; выраженная способность реабсорбции задними отделами пищеварительного тракта (в особенности ободочной кишкой).

Анализ источников. Известно, что тонкий кишечник имеет несколько уровней, обеспечивающих защиту внутренней среды от чужеродных агентов. К ним относится полость кишечника, где осуществляется полостное и симбионтное пищеварение. Вторым барьером является подэпителиальный слой слизи, в котором сосредоточены ферменты поджелудочной железы, экструзированных энтеро-цитов и микроорганизмы. Следующий уровень барьера составляют водно-электролитный слой и гли-кокаликс, характеризующиеся постоянством рН, ионов, высокой концентрацией ферментов энтеро-цитов и секреторного IgA [4, 7, 12, 18]. Нарушение указанных барьеров в конечном итоге приводит к энтеральной недостаточности и патологии пищеварения [5, 6, 9, 16,].

При энтеральной патологии имеются выраженные нарушения механизмов, обеспечивающих полостное, мембранное пищеварение, а также всасывание. Дефекты пищеварения обусловлены атрофией ворсинок и микроворсинок, нарушением структуры и ультраструктуры энтероцитов, сорбционных свойств структуры слизистой оболочки и ультраструктуры щеточной каймы [11, 14]. Известно, что с энтероцитами тонкой кишки высокую активность углеводного и липидного обменов. Для энтероци-тов характерна высокая активность систем биотрансформации и детоксикации. Все эти процессы связаны с функционированием ферментных систем, локализованных в гранулярной эндоплазматической сети [8, 10, 15].

Цель работы - исследовать на ультраструктурном уровне изменения цитологических структур тонкого кишечника телят при диарейном процессе.

Материал и методика исследований. Для электронно-микроскопического исследования брали соответствующие участки тонкого кишечника около 3-6 см, которые были лигированы, и внутрилю-минально вводился методом диффузии 2 %-ый раствор глютарового альдегида. В последующем ткани помещали в 5 %-ый раствор глютарового альдегида на 2 часа. Глютаровый альдегид готовился на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,2-7,4 и фиксировали при t+4 0С. Затем делали вертикальные разрезы по отношению к оси кишки и изготовляли кубики с длиной края 1-1,5 см. После 3-кратной промывки в 0,1 М фосфатном буфере, материал обрабатывали 2 %-ым раствором четырехокиси осмия, дегидрировали в спиртах возрастаюшей концентрации, контрастировали уранил ацетатом и заключали в аралдит. Срезы готовили на ультрамикротоме ЛКБ (Швеция), контрастировали цитратом свинца и просматривали под микроскопом JEM-100CX «JEOL» (Япония). Из гистохимических методов использовали метод Гомори, позволяющий определить активность щелочной фосфатазы (КФ 3.1.1.1) и одновременно выявить морфофункциональную активность микроциркуляторного русла тонкого кишечника, т. к. фермент локализуется в эндотелии кровеносных сосудов. Время инкубации составляло 1,5-2 часа. Активность фермента выражали в относительных единицах оптической плотности (отн. ед. оп. пл.). Всего было исследовано 6 телят, павших на почве поражения пищеварительного тракта, (контрольный базисный вариант) и 4 теленка с летальным исходом от других причин, не связанных с поражением алиментарной системы (опытный сравнительный вариант). Возраст животных к моменту исследований был в пределах от 8- до 28-дневного возраста. Статистическую оценку достоверности

межгрупповых различий проводили с применением метода ЛКОУЛ в программной среде «81ай8йса 8,0». Различия считали достоверными при Р<0,05.

Результаты исследований и их обсуждение. В результате комплексных исследований установлено, что значительные колебания глубина крипт были связаны с разной толщиной слизистой оболочки тонкой кишки, которая изменяется у больных животных от 388±6,34 мкм до 650±7,27 мкм. Отношение длины крипт ворсинки к глубине крипты при патологии составляло 0,7-1,6, то без патологии тонкого кишечника - 0,4-0,5. Атрофия слизистой оболочки тощей кишки, когда ее толщина не превышала 450 мкм, была выявлена почти у :/3 больных животных. Достаточно часто в слизистой оболочке тонкой кишки можно было наблюдать признаки отека эпителия. При световой микроскопии полутонких срезов, отечные энтероциты имели меньшее сродство к красителю (толуидиновому синему) и выглядели более светлыми.

Особенно это касается энтероцитов, расположенных на люминальной поверхности атрофированных ворсинок - в области контакта клеток с нутриентами. Эпителий на вершине ворсинок чаще уплощен, энтероциты приобретали кубическую форму, объем клеток уменьшался на 25,7-35,5 % (Р<0,05) по отношению к опытному варианту. Следует заметить, что в период болезни наблюдалось увеличение лизосом, возможно, это связано с усилением лизосомального пищеварения - одного из механизмов обеспечивающих надежность защитного барьера тонкого кишечника.

Существенно уменьшалась высота микроворсинок апикальной плазмолеммы энтероцитов, причем клетки, завершающие свой жизненный цикл, почти полностью теряли микроворсинки «феномен облысения энтероцита». По нашему мнению, уменьшение высоты микроворсинок энтероцитов можно рассматривать не только как следствие атрофических процессов или неполной дифференцировки клеток, но и как результат более интенсивного расходования материала апикальной мембраны на осуществление абсорбции по механизму эндоцитоза.

Одним из интересных патологоморфологических признаков является появление в слизистой оболочке тощей кишки пальцевидных или листовидных выростов эпителиального пласта, которые можно назвать микрополиповидными структурами, особенно это заметно у животных, болевших более 34 дней. Такие образования не имеют стромы и лишены кровеносных и лимфатических капилляров. В случае полной атрофии ворсинок небольшие пальцевидные микрополипы встречаются на вершине эпителиального пласта, а также в криптах. Среди энтероцитов отмечены расхождения межклеточных промежутков, имеющих апикально-базальную ориентацию и расположенных вблизи базальной мембраны эпителия ворсинок. Чаще подобные полости (лакуны) заполнены гомогенным материалом разной электронной плотности. В лакунах обнаруживаются миелиноподобные структуры и в просвете крипт. Среди отдельных энтероцитов (в пределах 15-22 %) регистрировались ядра с маргинацией и конденсацией хроматина, фагоцитированные апоптозные тельца, что свидетельствует о возможной гибели энтероцитов путем апоптоза.

Исследование ультраструктуры энтероцитов показало наличие гидропических изменений, что выражалось в набухании митохондрий с матриксом слабой электронной плотности и редуцированными кристами, расширении цистерн эндоплазматической сети с истончением их мембран, деструкции микроворсинок апикальной плазмолеммы, уменьшением протяженности профилей аппарата Гольд-жи, цитоплазма клеток обеднена рибосомами и полисомами. По отношению митохондрий можно отметить, что реактивные изменения приводят к нарушению энергообразования и уменьшается число активных форм органелл. Это связано со снижением числа резервных (ортодоксальных митохондрий), что свидетельствует о глубоких нарушениях энергетического метаболизма. В бокаловидных клетках обычного и гранулированного типов муцигенные гранулы сливались, теряли окружающую их мембрану. Наблюдалось некоторое просветление содержимого клеток, происходил разрыв мембраны и активная экструзия разжиженной слизи.

При электронной микроскопии в структурах тонкого кишечника телят выявлены нарушения микроциркуляции с кровоизлияниями, некрозом слизистой оболочки с отслоением эпителиального пласта и полного отсутствия каемчатых энтероцитов, выраженный отек и диффузная инфильтрация собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основы лимфоцитами, макрофагами, плазмоцитами, нейтрофилами и дегенерирующими клетками, реже обнаруживались эозинофилы. В отдельных местах собственной пластинки слизистой оболочки наблюдается диффузное фиброзирование, о чем свидетельствует увеличение на 18,7-23,3 % активных форм фибробластов по отношению к опытным образцам. Выраженная лимфоплазмоцитарная инфильтрация собственной пластинки слизистой оболочки тонкой кишки - свидетельство морфофункциональных характеристик острых, а также хронических заболеваний пищеварительной системы разной этиологии. Лимфоплазмоцитарная инфильтрация сопровождает-

ся лимфоангиогенезом, которая усиливает ремоделирование собственной пластинки, ее фиброзирова-ние. С учетом собственных и литературных данных разработана схема, показывающая, какие факторы оказывают влияние на абсорбцию в тонком кишечнике животных (рисунок).

Прием корма

Нервный контроль

Гормональный и паракринный контроль

Кишечные полостные^ факторы, микробные токсины, желчь, ми-котоксины

Моторика

Абсорбция

Секреция

I

Экскреция

Я N Нервный контроль, г внутрисистемный, внесистемный

Перистальтика кишечника

Количество

и зрелось энтероцитов

Морфофункцио-< 5 нальное состояние энтероцитов

Микроциркуляция и лимфоток

Рис. Факторы, влияющие на абсорбционные процессы в тонком кишечнике животных

Изучение активности щелочной фосфатазы связно с тем, что этот фермент принимает участие в различных биосинтетических процессах, его содержание отражает состояние пролиферативной активности клеток. Значительные изменения активности щелочной фосфатазы свидетельствуют не только об изменении специфического внутриклеточного обмена веществ, но и нарушении внутрисекреторной функции тонкого кишечника. Щелочная фосфатаза служит в качестве гисто- и цитохимического маркера дифференцировки клеток, локализуясь вдоль плазматической мембраны, обеспечивает ее высокую проницаемость для метаболитов.

На основании цитохимических исследований установлен кранио-каудальный градиент падения активности щелочной фосфатазы в тонком кишечнике телят. В структурах двенадцатиперстной кишки активность щелочной фосфатазы была выше на 18,7-26,8 % по отношению к тощей кишке и по отношению к подвздошной кишке - на 32,4-41,4 % (Р<0,05). Уменьшение активности щелочной фосфатазы, очевидно, связано с замедлением расщепления белков, углеводов и липидов. В свою очередь недостаток биосинтеза щелочной фосфатазы приводит к нарушению обмена гликогена и натрия, образованию фибриллярных белков.

Заключение. Механизмы, регулирующие эффективность полостного гидролиза и скорость переноса пищевых субстратов через кишечный барьер, являются важным звеном в цепи процессов, ответственных за поддержание питательного гомеостаза в период интенсивного пищеварения. Согласно современным представлениям, ферментативный гидролиз пищевых субстратов в тонкой кишке животных последовательно осуществляется в полости тонкого кишечника (полостное пищеварение), на мембранах щеточной каймы энтероцитов (мембранное пищеварение) и после проникновения не полностью расщепленных субстратов (внутриклеточное пищеварение). Следовательно, при патологии субклеточных структур тонкого кишечника, ответственных за описанные выше пищеварительные процессы, происходит нарушение абсорбции нутриентов и обменных процессов в организме животных.

ЛИТЕРАТУРА

1. Абрамов, С. С. К вопросу патогенетической терапии телят, больных абомазоэнтеритом / С. С. Абрамов, Д. Д. Морозов, С. В. Засинец // Весщ НАН Беларуси серыя аграрных навук. - 2006. - № 3. - С. 97-100.

2. Аруин, Л. И. Тонкая кишка / Л. И. Аруин // Морфологическая диагностика болезней желудка и кишечника. - М.: Триада-Х, 1998. - С. 301- 339.

3. Валенкевич, Л. Н. Кишечные энзимопатии как проявление дефектов мембранного пищеварения / Л. Н. Валенкевич // Проблемы клинической и экспериментальной энтерологии: сб. науч. тр. - М., 1981. - Т. 2. - С. 207-209.

4. Гальперин, Ю. М. Пищеварение и гомеостаз / Ю. М. Гальперин, П. И. Лазарев. - М.: Наука, 1986. - 303 с.

5. Калюта, Л. Л. Специфическая и экономическая эффективность препарата «Поливисол» при токсической диспепсии у телят / Л. Л. Калюта, М. П. Кучинский, Н. В. Москалева // Сельское хозяйство - проблемы и перспективы: сб. науч. тр. / Гродн. гос. аграр. ун-т; В. К. Пестис (отв. ред.) [и др.]. - Гродно, 2014. -Т. 25. - С. 96-102.

6. Малашко, В. В. Структурно-метаболические процессы при патологии органов пищеварения у молодняка сельскохозяйственных животных / В. В. Малашко, А. Н. Казыро, Н. К. Гойлик // Животноводство и ветеринарная медицина. - 2013. -№ 3(10). - С. 42-47.

7. Парфенов, А. И. Энтерология / А. И. Парфенов. - М.: Триада-Х, 2002. - 744 с.

8. Пиманов, С. И. Динамика морфологических изменений слизистой оболочки желудка при оценке отдаленных результатов эрадикации Heliobacterpylori / А. В. Пиманов, Е. В. Макаренко, Ю. В. Крылов // Архив патологии. - 2011. -Т. 73. - № 1. - С. 19-24.

9. Фролькис, А. В. Энтеральная недостаточность / А. В. Фролькис. - Л.: Наука, 1989. - 207 с.

10. Cerf, M. Phenomenesimmunitairey en pathologieintestinale / M. Cerf, M. Hansen // Rev. Practic. - 2012. - Vol. 22. -P. 174-191.

11. Heinrichs, A. J. Dairy calf management / A. J. Heinrichs // Anim. Health Nutrit. - 207. - Vol. 42. - N 17. - P. 20- 25.

12. Kuitenen, P. Malabsorption syndrome with cow's milk intolerance / P. Kuitenen, B. Seetharam, D. H. Alpers // Gasteroen-terology. - 2005. - Vol. 89. - P. 214-216.

13. Niemegers, C. J. Dissociation between opiatelike and antidiarrheal activities of antidiarrheal drugs / C. J. Niemegers, J. L. McGill, J. J. Heykants // J. Pharmacol. Exp. Ther. - 2009. - Vol. 210. - P. 327-333.

14. Rummel, W. Action mechanismus of antiabsorptive and hydragogue drugs / W. Rummel, G. Nell, R. Wanitschke // Intestinal absorption and malabsorption. - New York, 2005. - P. 209-217.

15. Shizgal, H. M. Nutrition and immune function / H. M. Shizgal // Ann. Surg. - 2001. - Vol. 13. - P. 15-29.

16. Silk, D. B. Disorders of nitrogen absorption / D. B. Silk // Clinic Gastroenter. - 2002. - Vol. 11. - P. 47-72.

17. Thiebault, J. J. Physiopathologie de la diarrhea / J. J. Thiebault // Rec. Med. veter. - 1988. - Vol. 139. - N 10. - P. 961966.

18. Wang, H.-K. Robust production and passaging HPV in sguamous epithelium of primary human keratinocytes / H.-K. Wang, A. A. Duffy, T. R. Broker // Genes Dev. - 2009. - Vol. 23. - P. 181-194.