Генотипическое разнообразие вируса лейкоза крупного рогатого скота разной породной принадлежности

Ветеринария

ГЕНОТИПИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА РАЗНОЙ ПОРОДНОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ

П.Н. СМИРНОВ,

доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ,

В.А. БЕЛЯВСКАЯ,

Н.В. ГРАЧЕВА,

В.А. РЯБИНИНА,

соискатели, Новосибирский ГАУ, г. Новосибирск

Ключевые слова: BLV, вирус лейкоза, генотипирование, ретровирус, ген gag.

Этиологическим агентом энзоотического лейкоза крупного рогатого скота является BLV (bovine leukemia virus), относящийся к классу Deltaretrovirus, семейству Retroviridae [3, 4, 7, 16]. Вирус поражает В-лимфоциты, кроме того, он может поражать Т-лимфоци-ты, моноциты и гранулоциты [13, 18].

Также установлено, что BLV в большей (чем другие вирусы) степени отражает генетические и биологические сходства с ВИЧ [8].

В структуре BLV обнаружены шесть основных белков, четыре из них - негликолизированные, составляют сердцевину вириона (белок р24 присутствует в наибольшем количестве). Из двух гликопротеидных белков важное значение имеет gp51, расположенный на поверхности вириона и ответственный за ин-фекционность и активность гемаг-глютининов. Обнаружение специфических противовирусных антител легло в основу предположенных серологических методов диагностики [1, 2, 11, 12, 14].

BLV имеет следующую генетическую структуру: s-LTR-gag-pol-env-pXbl-LTR-3. LTR состоит из 530 пар оснований. Донорный сайт сплайсинга находится в R-участке. За LTR следует лидерная последовательность в 97 пар. Первую открытую рамку считывания составляет ген gag (нуклеотиды 628-1806). Данный ген кодирует трансляцию группоспецифического белка предшественника структурных белков, в частности, р24. Через 500 пар после концевого триплета gag начинается вторая рамка считывания для pol, кодирующая 852 аминокислоты (позиции 2317-4875). Ген pol кодирует полипептиды, обладающие ре-вертазной (РНК-зависимой ДНК-поли-меразной) активностью. Возможно, что этот же ген кодирует эндонуклеазу. Третью рамку составляет ген env (позиции 4821-6368) и кодирует 515 аминокислот, составляющих поверхностный гликопротеид gp51 и трансмембранный белок gp30. В противо-

положность pol-продукту gp 30 выявляет большую гомологию с вирусами лейкозов мышей, чем с вирусами лейкозов птиц, что позволяет предполагать химерную природу BLV [8].

В дополнение к структурным белкам pol, env и gag эти вирусы имеют между env и 3long terminal repeat (LTR) уникальную область pX-кодирующих ряд протеинов (Tax, Rex, R3, G4).

BLV обладает тропизмом к лимфоидным клеткам и размножается в них, то есть является лимфотроп-ным. Местом локализации BLV является лимфоцит. Он также обнаруживается в лимфоцитах молока и молозива у естественно зараженных животных. В слюне, носовых истечениях, моче и сперме инфицированных животных вирус лейкоза отсутствует. Зараженные BLV остаются инфицированными пожизненно [6, 11, 14].

В 1970 году был раскрыт способ закрепления в клетке генома РНК-со-держащих вирусов (онкогенных) с передачей генетической информации от РНК к ДНК (D. Baltimore, 1970). Катализация этих процессов происходит под действием фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы (ревер-тазы или обратной транскриптазы). Позднее наличие фермента было подтверждено рядом других авторов [5].

В организме хозяина хронически персистирующий вирус может претерпевать мутационные изменения, направленные на увеличение патогенности, на преодоление более эффективных защитных механизмов хозяина. Поэтому наряду с генетическим статусом макроорганизма во внимание необходимо принимать генетическую изменчивость самого патогена, который, возможно, в процессе длительной персистенции способен изменять свою патогенность как в сторону комменсализма, так и усиления патогенных свойств.

Диагностика является важным этапом в борьбе и профилактике инфекции BLV. В нашей стране согласно утвержденным Правилам по профи-

лактике и борьбе с лейкозом крупного рогатого скота (М., 1999) и методическим указаниям по диагностике лейкоза крупного рогатого скота диагностические исследования на лей-козную инфекцию проводят серологическими (РИД, ИФА), молекулярно-"биологическим (ПЦР) методами.

Для постановки ПЦР используют лейкоцитарную массу [12, 15].

Генетическая вариабельность BLV у инфицированного крупного рогатого скота достаточно хорошо охарактеризована [16]. На основании метода ПДРФ и ДНК секвенирования BLV классифицировано три подгруппы вируса: бельгийская, австралийская и японская [18]. Методом ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) выявлено шесть BLV вариантов по гену env-gp51 из Японии [16, 18], Америки и Европы. Географическое распределение генотипов BLV неоднородно. По гену gag генотипы методом ПДРФ на данный момент не установлены.

По данным Y. Asfaw (2004), встречаются животные, в организме которых циркулирует более чем один генотип вирус лейкоза одновременно.

Имеются сообщения о возможной роли различных вариантов ВЛКРС в развитии инфекционного процесса [12]. Данные о функциональной значимости полиморфизмов, патогенных свойствах генотипов, их способности избегать иммунного надзора со стороны организма хозяина остаются не до конца изученными. Некоторые исследователи отмечают, что основные отличия в патогенезе обусловлены изменчивостью функционирования цитокиновой сети и особенностью стратегии выживания BLV, нацеленной на дисрегуляцию цитоки-нового профиля и изменения апопто-тических путей сигналинга. По мнению R.G. Felmer (2005), за атипичные формы инфекции ответственны особые варианты ВЛКРС по гену env gp51. Так как заболевание лейкозом наблюдается после длительного периода латенции, для того, чтобы клетки, инфицированные провирусной ДНК, не были подвергнуты апоптозу, BLV и HTLV приобрели способность ограничивать экспрессию собствен-

Bovine leukemia virus, genotype, retrovirus, gene gag.

ных белков до крайне низкого уровня в течение длительного периода [9]. Животные, инфицированные такими вариантами вируса, остаются серонегативными на протяжении длительного времени и таким образом являются источником распространения инфекции.

По данным Е.В. Дробот (2007), 6-й генотип, циркулирующий на территории Новосибирской области, является менее иммуногенным, чем 1-й генотип. Поэтому животные, инфицированные 6-м генотипом BLV, длительное время могут оставаться в стаде источником инфекции.

Таким образом, важно установить различия в проявлении видов вируса лейкоза с целью своевременной изоляции животных - носителей менее иммуногенных типов вируса.

Цель исследований Изучить генотипическое разнообразие вируса лейкоза крупного рогатого скота разной породной принадлежности в хозяйствах Краснодарского края.

Материалы и методы исследований Работа выполнена на базе кафедры физиологии и биохимии животных НГАУ и лаборатории биохимии вирусов ГНЦ ВБ «Вектор».

Объектом исследования являлся крупный рогатый скот черно-пестрой голштинизированной, красной степной и айрширской пород, принадлежащий хозяйствам Краснодарского края ЗАО «Агроном», СПК «Колос», ЗАО «Племзавод имени В.И. Чапаева».

Предметом исследования являлись пробы крови животных, инфицированных BLV, больных лейкозом и интактных в отношение к BLV, а также ДНК, ген gag вируса лейкоза крупного рогатого скота.

В процессе работы ПЦР диагностике было подвергнуто 90 проб. Проведен рестрикционный анализ по гену gag 83 проб крови.

Сформированные панели ДНК, выделенные из разных биологических образцов, с помощью ПЦР были использованы для сравнительного анализа распространения лейкоза.

Генотипирование по гену gag проводили собственным методом ПЦР-ПДРФ с использованием рестриктаз HAEIII, Nla III, Tsp509 I. Для поиска консервативных последовательностей, фланкирующих ген, проводили сравнительный анализ шести вариантов последовательности гена, представленных в Gene Bank (Acc. num. AF033818, AF257515, AY189715, AY 1 8971 6, AY 1 8971 7, AY189718). Структуру праймеров оптимизировали с использованием программы Primer3 Output (http://frodo.wi.mit.edu/ cgi-bin/primer3/primer3_results.cgi). LEFT PRIMER 5' tgacccaacaatcagctcag 3'

RIGHT PRIMER 5'

gtcgggaaggttgtcagcta 3

Выбор оптимального режима амплификации проводили исходя из длины амплифицируемого фрагмента после проведения температурного градиента. Стадии начальной денатурации (2 мин. при 94°C) и конечной полимеризации (3 мин. при 72°C) были обязательными в каждом варианте амплификации. Количество циклов подбирали эмпирически для наиболее высокого выхода специфичного амп-ликона при минимальном содержании неспецифических фрагментов. Смесь помещали в амплификатор Eppendorf Mastercycler Gradient. ПЦР проводили в 25 мкл реакционной смеси, которую помещали в амплификатор с заданной программой температурно-временных циклов: Тден 94°C - 2 мин., (Тден 95°C - 0,2 мин., Тотж 64°C, Тэ-лон 72°C - 0,5 мин.) - 29 циклов, Тэ-лон 72°C - 3 мин.

Итак, нами проведено предварительное изучение генотипического разнообразия BLV трех хозяйств Краснодарского края, неблагополучных по инфекции BLV ранее не описанная генотипическая гетерогенность (не менее трех генотипов) популяции вируса по гену gag. Установлен факт циркуляции BLV в популяциях крупного рогатого скота как в биварианте (два генотипа), так и в триварианте (три генотипа).

Генотипическое разнообразие BLV и результаты сравнительного исследования в контексте их эпизоотической значимости в неблагополучных по лейкозу стадах открывают новые методические подходы в

Ветеринария

разработке научно обоснованных схем оздоровления неблагополучных по лейкозу стад.

Установление принадлежности BLV к определенному генотипу может служить основанием для расширения исследований в данном направлении, в частности, проведении исследований по выявлению патогенетических особенностей развития лейкозного процесса как в экспериментальном, так и в спонтанном вариантах.

Изучение генотипического разнообразия по гену gag популяции вируса лейкоза крупного рогатого скота на территории Краснодарского края и в России в целом ранее не проводилось.

Ген gag кодирует белки, формирующие сердцевину вируса (необходимы для внутриклеточной сборки вируса и его высвобождения из клетки); p24 (gag) - капсидный белок, входит в состав нуклеокапсида.

Количество копий эндогенных ретровирусов в пределах зародышевой линии может увеличиваться без репликации. Для этого существуют два альтернативных механизма: 1) ретротранспозицией в cis - когда вирусы используют собственные гены белков для мобилизации; они копируют сами себя и вставляются в новые участки хромосомы в пределах той же клетки без обычной для ретровирусов экстрацеллюлярной фазы жизненного цикла; 2) через комплементацию в trans, когда белки, необходимые для пролиферации вирусов, добавляются другими эндогенными и экзогенными вирусами. Ретротранс-

Таблица

Результаты генотипирования BLV в пробах крови коров из трех хозяйств

Место нахождения Год отбора проб Наименование хозяйства Генотип BLV

I II III

Краснодарский край 2007 ЗАО «Агроном» 21 4 -

2007 СПК «Колос» 17 - 11

2007 ЗАО «ПЗ им. В.И. Чапаева» 10 8 12

ЗАО "Афоном1' Динского р-на Краснодарского края 1 2 3 4 5 6 7- S 9 10 11 12 13 14 15 16 17 К- К+

Рисунок 1. Электрофореграмма в 2% агарозном геле продуктов амплификации гена gag ВЛКРС. Дорожки: 1-17 - опытные образцы ДНК; 18 - отрицательный контроль; 19 - положительный контроль.

НасШ 5,117,122, 205,329,378,390,400, 594,875,952

1000

___ 900

800

700

600

500

400

300

— 200

100

Nla III 157, 188, 248,534,715,1037 1000 Tsp509 I 3,119,121, 202,327,377,389,396, 597,872,954, 1000

900 900

ЯПП 800

OUU 700 700

600

OUU 500 400 500

400

300 300

200 200

1ПП 100

і \j\j

Ветеринария

Рисунок 2. Сайты рестрикции области p24 гена gag (ожидаемые

фрагменты)

позиция в cis не требует интактного гена env (он необходим вирусу для перемещения за пределы клетки), соответственно, диагностировать BLV по гену gag возможно на более ранних стадиях вирусоносительства (R. Belshaw et al., 2004), чего не скажешь по гену env.

Генотипирование BLV по гену gag. На начальном этапе образцы ДНК животных были исследованы в

ПЦР. При проведении Nested-ПЦР сегмента гена gag был обнаружен провирус лейкоза крупного рогатого скота в 83 образцах. На рисунке 1 приведена типичная картина электрофореза продуктов амплификации (фрагмент гена gag), свидетельствующая о наличие провирусной ДНК в геноме животного.

Распределение фрагментов рес-триктаз, ожидаемое и полученное

при проведении ПДРФ-анализа, и результаты анализа представлены на рисунке 2.

Сайты 952, 875 и 594 обнаружены в образцах ДНК коров черно-пестрой породы, 952 и 875 - в ДНК коров айр-ширской породы, 952 и 594 - в ДНК коров красной степной породы с помощью эндонуклеазы Нае III.

Распределение вируса лейкоза крупного рогатого скота на территории Краснодарского края в зависимости от его генотипа неоднородно.

Снижение интенсивности мониторинга и несвоевременная изоляция реагирующих ПЦР животных неминуемо приводят к росту показателей инфицированности и заболеваемости. Согласно литературным данным, это может быть результатом сочетанной эволюции вируса и хозяина, приведшей, с одной стороны, к появлению нового генетического варианта вируса, способного более эффективно распространяться благодаря снижению собственных антигенных и иммуногенных характеристик и избегать благодаря этому иммунного надзора, а с другой стороны - к увеличению в стадах доли животных с низкой эффективностью реагирования на данный генотип, что может быть связано с особенностями кровной и породной принадлежности и наличием в геноме хозяина определенных генотипов по некоторым генам цито-киновой сети [9].

Литература

1. Агол В. И. Генетически запрограммированная смерть клеток // Вестник РАСХН. 1996. № 6. С. 20-24.

2. Альбертс Б., Брей Б., Льюис Дж. и др. Молекулярная биология клетки. М. : Мир, 1994. Т. 3.

3. Крикун В. А. Лейкоз крупного рогатого скота и иммунологическая толерантность // Ветеринария. 2002. №

6. С.

7-9.

4. Прохватилова Л. Б., Ломакин А. И., Колосов С. Н., Дрыгин В. В., Рыбаков С. С., Гусев А. А. Диагностика лейкоза КРС методом полимеразной цепной реакции // Вестник РАСХН. 1998. № 5. С. 65-68.

5. Парфанович М. И. Обнаружение онкорнавируса в культурах клеток тканей больных лейкозом коров // Ветеринария. 1974. № 4. С. 47-49.

6. Смирнов П. Н., Смирнова В. В., Левашев А. Т. и др. Диагностика лейкоза крупного рогатого скота : метод. рекоменд. Новосибирск, 1989. 46 с.

7. Смирнов П. Н., Незавитин А. Г., Смирнова В. В., Храмцов В. В. Проблемы лейкоза животных. Новосибирск, 1992. 468 с.

8. Смирнов П. Н. Болезнь века - лейкоз крупного рогатого скота. Новосибирск, 2007. 302 с.

9. Сюрин В. Н., Самуйленко А. Я., Соловьев Б. В., Фомина Н. В. Вирусные болезни животных. М., 1998. 928 с.

10. Чичинина С. В. Роль аллельной вариабельности генов цитокинов в формировании резистентности крупного рогатого скота к лейкозу : автореф. дис. ... канд. биол. наук. Новосибирск, 2005. 24 с.

11. Bicka L., Kuzmak J., Kozaczynska B. et al. Expression of bovine leukemia virus protein p24 in Escherichia coli and its use

in the immunoblotting assay. J.Acta Biochimica Polonica. 2001. № 1. V. 48. P. 227-232.

1 2. Felmer R. G. Molecular analysis of a 444 bp fragment of the BLV gp51 env gene reveals a high frequency of non-silent point mutations and suggest the presence of two subgroups of BLV in Chile // Vet. Microbiology. 2005. № 108. P 39-47.

13. Heeney J., Valli P, Jacobs R., Valli V. Evidence for bovine leukemia virus infection of peripheral blood monocytes and limited antigen expression in bovine lymphoid tissue. Lab.Invest. 1992. № 66. P. 608-617.

1 4. Klasse P J. and Sattentau. Occupancy and mechanism in antibody-mediated neutralization of animal viruses // Journal of General Virology. 2002. V. 83. P. 2091-2108.

15. Kucleburg G. J., Chase C. C., Nelson E. A., Marras S. A., Dammen M. A, Christofer-Hennings J. Detection of bovine leukemia virus in blood and milk by nested and real-time polymerase chain reaction // J. Vet. Diagn Invest. 2003. № 15 (1).

16. Licursi M., Inoshima Y., Wu D., Yokoyama T., Gonzales E. T., Sentsui H. Genetic heterogeneity bovine leukemia virus genotypes and its relation to humoral responses in hosts // Virus Research. 2002. № 86: P. 101-110.

17. Pringl C. R. Virus taxonomy. 1999. ICTV. Arch. Virol. P. 144, 421-429.

18. Sagata N., Yasunaga T., Tsuzuku-Kawamura J., Ohishi K., Ogawa Y., Ikawa Y. Complete nucleotide sequence of the genome of bovine leukemia virus: its evolutionary relationship to oher retroviruses /PNAS/ 1985. № 82. P. 677-681.

19. Schwartz I., Levy D. Pathobiology of bovine leukemia virus // Vet Res. 1994. № 25. P. 521-536.