Результаты изучения безопасности и иммуногенности отечественных субъединичных адъювантных пандемических моновакцин группы Гриппол® у детей от 6 месяцев до 17 лет

Результаты изучения безопасности и иммуногенности отечественных субъединичных адъювантных пандемических моновакцин группы Гриппол у детей от 6 месяцев до 17 лет

Г.А. Ельшина1, С.М. Харит2 (kharit-s@mail.ru), В.В. Романенко3, С.В. Комлева4, Н.Г. Пучкова5, Н.В. Чирун5, М.А. Абрамова5, Н.И. Лонская1, М.А. Горбунов1

ТИСК им. Л.А. Тарасевича, Москва 2НИИ детских инфекций, Санкт-Петербург

3Центр гигиены и эпидемиологии в Свердловской области, г. Екатеринбург "Детская городская больница № 8 г. Екатеринбурга 5Фармацевтическая компания «Петровакс», Москва

Резюме

В задачи данного исследования входили оценка безопасности и реактогенности пандемических вакцин МоноГриппол плюс, МоноГриппол Нео и МоноГриппол для детей и подростков в возрасте от 6 месяцев до 17 лет, а также оценка иммуногенности препаратов после их однократного и двукратного введения детям младших возрастных групп. Результаты исследования моновакцин группы Гриппол показали, что все препараты обладают низкой реактогенностью, хорошей переносимостью и безвредны при вакцинации детей. Серьезные нежелательные события и поствакцинальные осложнения не выявлены ни у одного из вакцинированных. На основании результатов оценки иммуногенности рекомендована двукратная вакцинация детям младшего возраста (до 6 лет) и однократная - детям 7 - 17 лет. Результаты клинических исследований позволили рекомендовать вакцины МоноГриппол Нео и МоноГриппол для вакцинопрофилактики пандемического гриппа у детей с 3-х лет; вакцину МоноГриппол плюс - для вакцинопрофилактики у детей с 6 месяцев. Ключевые слова: грипп, пандемические вакцины, вакцинация детей, безопасность, МоноГриппол

The Results of Studying the Safety and Immunogenicity of Domestic Subunit Adjuvanted Pandemic Monovaccines Group Grippol to Children from 6 Months to 17 Years

G.A. Elshina1, S.M. Kharit2 (kharit-s@mail.ru), V.V. Romanenko3, S.V. Komleva4, N.G. Puchkova5, N.V. Chirun5, M.A. Abramova5, N.I. Lonskaya1, M.A. Gorbunov1 1L.A. Tarasevich State Research Institute of Standards and Control Medical Biologicals, Moscow 2Research Institute of Children's Infections, St. Petersburg 3Center for Hygiene and Epidemiology in Sverdlovsk Region, Ekaterinburg

4Children's City Hospital № 8, Ekaterinburg 5Pharmaceutical Company Ltd. «Petrovax», Moscow Abstract

In this study the pandemic vaccines MonoGrippol, MonoGrippol Neo and MonoGrippol plus safety and reactogenicity after single and repeated immunization of children from 6 months and adolescents up to 17 years old was assessed. Besides, vaccines immunogenicity following one or two vaccination also was analyzed. Pandemic Grippol family monovaccines' safety and tolerability evaluation data demonstrated all three tested vaccines low reac-togenicity and high safety profile. No serious side effects or postvaccination complications were detected neither following the first, nor following the second vaccination.

Based on immunogenicity data, twice immunization for children from 6 months and up to 6 years old, and single vaccination for children of 7 - 17 years old is recommended. Clinical trials results allowed to recommend the vaccines MonoGrippol, and MonoGrippol Neo for pandemic influenza prophylaxis in children from 3 years old; and MonoGrippol plus for pandemic influenza prophylaxis in children from 6 months old. Key words: influenza, pandemic vaccines, immunization of children, safety, MonoGrippol

Введение

Быстрое распространение нового штамма вируса гриппа А(Н1И1)/Калифорния/07/2009 по многим странам мира и объявление ВОЗ в июне 2009 года о шестом уровне угрозы пандемии потребовало принятия кардинальных решений и опе-

ративной реализации комплекса превентивных мероприятий по подготовке и борьбе с пандемическим гриппом.

Стремительное беспрепятственное распространение вируса по всему миру объяснялось тем, что большинство населения оказалось иммунонаив-

ным к новому штамму, который представляет собой реассортант и имеет в своей структуре гены возбудителей североамериканского гриппа свиней (HA, NP, NS), гриппа свиней евроазиатской линии (NA, М), гриппа птиц (РВ2, РА) и человека (РВ1). Результаты серологического исследования сывороток крови здоровых россиян показали, что процент лиц с защитным титром составил по регионам 0 - 14%, а среднее геометрическое титров антител не превышало 1:16. Вследствие этого эпидемия отличалась высокой заболеваемостью взрослого населения и школьников [1]. Показатели госпитализации на пике пандемии превышали обычно регистрируемые в период сезонных эпидемий в три - пять раз в зависимости от возрастных групп. Анализ клинических материалов от умерших больных показал, что около 53% смертельных случаев вызвано пандемическим вирусом гриппа, при этом в основном умирали люди в возрасте 15 - 64 лет от пневмоний и острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС). По данным врачей-инфекционистов из разных регионов России, представленным на IX Общероссийском конгрессе детских инфекционистов в декабре 2010 года, более 50% зарегистрированных случаев пандемического гриппа приходилось на детей в возрасте до 18 лет. При этом было обращено внимание на то, что более чем у 70% детей заболевание протекало в тяжелой и среднетя-желой форме.

Для снижения заболеваемости тяжелыми формами гриппа и создания иммунной прослойки среди населения необходима вакцинация. Задачей производителей вакцин стало в сжатые сроки обеспечить тестирование и выпуск моновакцин от пандемического гриппа в объемах, достаточных для иммунизации групп повышенного риска.

Осенью 2009 года в Европе и США ведущими фармацевтическими компаниями с использованием технологий производства сезонных вакцин и подходов, разработанных в течение последних пяти лет в преддверии пандемии птичьего гриппа, были завершены исследования и проведена регистрация ряда моновакцин: инактивированной цель-новирионной моновакцины Цеваплан («Бакстер»), инактивированной цельновирионной адъювант-ной моновакцины Флювал («Омнивест»), адъювант-ной сплит-моновакцины Пандемрикс («ГлаксоСмит-Кляйн»), субъединичной адъювантной моновакцины Фоцетрия («Новартис»), адъювантной моновакцины Хьюменза и безадъювантной моновакцины Паненза («Санофи Пастер» - подразделение по производству вакцин Sanofi-Aventis Group).

В России производство пандемических моновакцин осуществлялось тремя производителями: ФГУП «Микроген» (живая вакцина Инфлювир, субъединичная сорбированная на гидроокиси алюминия Пандефлю), ООО «ФК «Петровакс» (инактиви-рованные субъединичные адъювантные вакцины МоноГриппол плюс, МоноГриппол Нео), Санкт-Петербургский НИИ вакцин и сывороток (инакти-

вированная субъединичная адъювантная вакцина МоноГриппол).

Клинические исследования субъединичных адъ-ювантных пандемических моновакцин группы Грип-пол на первом этапе включали оценку безопасности и эффективности однократной и двукратной вакцинации взрослых добровольцев. Результаты исследований показали безопасность и хорошую переносимость препаратов. Полученные результаты также свидетельствовали, что для формирования выраженного иммунного ответа у взрослых достаточно однократного введения.

В задачи данного исследования входили оценка безопасности и реактогенности пандемических вакцин МоноГриппол плюс, МоноГриппол Нео и МоноГриппол у детей и подростков (от 6 месяцев до 17 лет), а также оценка иммуногенности препаратов после их однократного и двукратного введения детям младших возрастных групп.

Материалы и методы

Клинические исследования III фазы с участием детей 3 - 17 лет проведены в соответствии с утвержденными протоколами на трех клинических базах в Санкт-Петербурге и Екатеринбурге. Дизайн исследования - проспективное, открытое, в параллельных группах.

Дети были разделены на три возрастные группы (3 - 6, 7 - 11 и 12 - 17 лет) по 30 человек, привитых каждой вакциной. Вакцинация проводилась в три этапа. Первыми были вакцинированы подростки от 12 до 17 лет. После оценки реактогенности в старшей группе детей (в течение пяти дней после введения препаратов) была проведена иммунизация детей 7 - 11 лет и затем - детей 3 - 6 лет.

По завершении клинических исследований с участием детей 3 - 17 лет был проведен следующий этап исследований - по оценке реактогенности и иммуногенности пандемической вакцины МоноГриппол плюс у детей от 6 месяцев до 2-х лет (n = 30).

Исследуемые препараты. Пандемические субъединичные вакцины МоноГриппол, МоноГриппол плюс и МоноГриппол Нео являются инактиви-рованными, субъединичными, адъювантными препаратами.

МоноГриппол Нео содержит антигены вируса пандемического гриппа, выращенного в культуре клеток MDCK, МоноГриппол плюс - антигены, выращенные в куриных эмбрионах. Обе вакцины произведены, согласно правилам GMP, на современном фармацевтическом заводе, не имеют в своем составе ни консервантов, ни антибиотиков и выпускаются в готовых к применению упаковках (шприц-дозах).

Вакцина МоноГриппол содержит высокоочи-щенные антигены пандемического вируса гриппа, выращенного в эмбрионах куриных яиц. В качестве консерванта включает тиомерсал.

Каждая вакцина содержит в 0,5 мл 5 мкг гемаг-глютинина пандемического штамма вируса гриппа А(Н1И1)/Калифорния/07/2009 и 500 мкг иммуно-адъюванта Полиоксидоний.

Все исследуемые вакцины проконтролированы в ГИСК им. Л.А. Тарасевича на соответствие нормативной документации.

Исследуемые препараты вводили в дельтовидную мышцу плеча. Вторую иммунизацию осуществляли через 21 день после первой. Продолжительность исследования составила 42 - 45 дней, включая период наблюдения после второй вакцинации.

Для получения объективных данных на каждого ребенка была заведена индивидуальная регистрационная карта, в которую вносили результаты ежедневных осмотров. Особое внимание обращали на симптомы, соответствующие клиническим проявлениям гриппа, аллергическим и неврологическим реакциям. Местные реакции оценивали по диаметру гиперемированного участка кожи на месте введения препарата, болезненности, припухлости кожи, увеличению регионарных лимфатических узлов. Также проводили мониторинг интеркуррентной заболеваемости после вакцинации. В день прививки наблюдение проводили до вакцинации и спустя 30 минут, а в последующем - ежедневно в течение пяти дней, с обязательной термометрией. За лицами, у которых была отмечена реакция на вакцинацию, наблюдение проводили до полного исчезновения симптомов.

Течение поствакцинального периода оценивали как гладкое или осложненное. Под осложненным течением поствакцинального периода понимали присоединение интеркуррентных заболеваний после иммунизации, под гладким - отсутствие интеркур-рентных заболеваний в течение пяти дней после прививки. Согласно принятым методам трактовки течения вакцинального процесса оценка местных и общих реакций проводилась только у участников с гладким течением вакцинального процесса [3, 4].

Для оценки иммуногенности у привитых детей 3 - 6 лет осуществляли забор крови до вакцинации, через 21 день после первой и второй вакцинации. У детей младшей возрастной группы (от 6 месяцев до 3-х лет) забор образцов крови производили однократно, на 21-й день после второй вакцинации.

Сыворотки исследовали в реакции торможения ге-магглютинации (РТГА) по стандартной методике в лаборатории гриппа, парагриппа и других ФГБУ «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» Минздравсоцразвития России в зашифрованном виде. Расшифровку проводили после представления полученных результатов.

Для оценки иммуногенности гриппозных вакцин у детей за основу брали международные критерии, принятые для взрослых:

• четырехкратные сероконверсии по сравнению

с фоновой сывороткой (не менее 40%);

• уровень серологической защищенности (доля лиц с защитным титром антител > 1:40, то есть не менее 70%);

• кратность нарастания титров антител по сравнению с фоновой сывороткой (не менее 2,5).

Результаты исследований статистически обработаны с использованием t-критерия Стьюдента и X2 с применением пакета прикладных программ Statistica 6.0. Различия считали достоверными при Р < 0,05. В таблицах указаны средние значения соответствующих параметров и ошибки средней (M ± m) или процент и его ошибка (% ± m).

Результаты и обсуждение

Результаты оценки реактогенности пандемических моновакцин группы Гриппол. У детей 3 - 17 лет в течение 30 минут после первой вакцинации не было отмечено ни местных, ни общих реакций.

При гладком течении вакцинального процесса общие реакции после первой прививки вакцинами МоноГриппол, МоноГриппол Нео и МоноГриппол плюс у детей 3 - 17 лет были выявлены в 4,5% случаев (4 ребенка), 1,1% (1 ребенок) и 3,4% случаев (3 ребенка) соответственно (табл. 1). Из симптомов нарушения общего состояния только у одного пациента была зарегистрирована температурная реакция слабой степени выраженности. В единичных случаях регистрировали жалобы на головную боль, дискомфорт в области живота и нарушение аппетита. Все выявленные симптомы были слабовыра-женными, купировались самостоятельно и по длительности не превышали одного дня.

Следует отметить, что половина выявленных реакций (4 случая) наблюдалась у детей средней возрастной группы (7 - 11 лет), 3 случая - у детей старшей возрастной группы (12 - 17 лет) и 1 случай - в младшей группе (3 - 6 лет).

Местные реакции после первой прививки были зарегистрированы у 5,5% привитых вакциной МоноГриппол (5 случаев), у 2,3% привитых вакциной МоноГриппол Нео (2 случая) и у 3,4% иммунизированных МоноГрипполом плюс (3 случая) (см. табл. 1). Местные реакции выражались в болезненности, припухлости и покраснении в месте инъекции. По степени выраженности все эти реакции были классифицированы как слабые, их продолжительность составляла не более двух дней. Выявленные реакции отмечали в старшей (6 случаев) и средней (4 случая) возрастных группах.

Таким образом, полученные данные по частоте выявления общих и местных реакций после однократного введения моновакцин МоноГриппол, МоноГриппол Нео и МоноГриппол плюс свидетельствуют о низкой реактогенности препаратов. При этом следует отметить, что в младшей возрастной группе (3 - 6 лет) общие и местные реакции практически отсутствовали.

В поствакцинальном периоде (с 6-го по 21-й день после первой прививки) у привитых де-

Таблица 1.

Частота общих и местных реакций у детей 3 - 17 лет после первой вакцинации

Возраст Привитые вакцинами, абс./%

привитых МоноГриппол

Общие реакции

3 - 6 лет 0 0 1

7 - 11 лет 3 1 0

12 - 17 лет 1 0 2

Всего 4/4,5 1/1,1 3/3,4

Местные реакции

3 - 6 лет 0 0 0

7 - 11 лет 2 0 2

12 - 17 лет 3 2 1

Всего 5/5,5 2/2,3 3/3,4

тей в единичных случаях регистрировали респираторные заболевания, что может быть обусловлено сезонным подъемом заболеваемости ОРЗ.

Результаты наблюдений после первой прививки показали, что все исследуемые вакцины являются слабореактогенными и могут быть использованы для проведения повторной иммунизации.

При наблюдении в течение пяти дней после повторной прививки во всех возрастных группах привитых моновакцинами МоноГриппол, Моно-Гриппол Нео и МоноГриппол плюс отмечали нормальную температуру тела (до 37,0 °С). Жалобы на нарушение общего состояния у привитых вакцинами МоноГриппол и МоноГриппол Нео отсутствовали. В средней и старшей группах привитых вакциной МоноГриппол плюс у 3,6% пациентов (3 человека) зарегистрированы жалобы на нарушение общего состояния, которые были связаны с нарушением аппетита, головной болью и заложенностью носа (табл. 2).

Местные реакции на повторную прививку были выявлены у привитых вакциной МоноГриппол в 1,1% случаев (1 ребенок), вакциной МоноГриппол Нео - в 2,4% (2 ребенка) и вакциной МоноГриппол плюс - в 2,4% случаев (2 ребенка). Местные реакции выражались в слабой болезненности в месте введения длительностью не более двух дней. При этом следует отметить, что кожные реакции во всех случаях отсутствовали.

В поствакцинальном периоде после второй прививки с 6-го по 21-й день наблюдения у привитых в единичных случаях регистрировали острые респираторные заболевания.

Клинико-лабораторные данные, характеризующие вакцинальный процесс при введении моновакцин, показали, что все средние значения результатов анализов крови и мочи находились в пределах нормы.

Результаты оценки переносимости и безопасности пандемических моновакцин МоноГриппол, МоноГриппол Нео и МоноГриппол плюс после первой и второй прививки у детей в возрасте от 3-х до 17 лет показали, что все исследуемые препараты являются слабореактогенными.

При наблюдении за детьми в возрасте от 6 месяцев до 3-х лет с гладким течением вакцинального процесса после первой иммунизации из общих реакций у одного ребенка отмечали нарушение аппетита в течение двух дней после прививки и у одного - кратковременный подъем температуры (до 37,8 °С), сочетавшийся с легким недомоганием. Наблюдаемые симптомы не требовали медицинского вмешательства и по длительности не превышали одного дня.

Местных реакций после первой прививки не выявлено.

После второй прививки общие и местные реакции на прививку отсутствовали.

Итак, результаты наблюдения после первой и второй прививки за детьми в возрасте от 6 месяцев до 3-х лет, иммунизированными вакциной МоноГриппол плюс, свидетельствуют о слабой реак-тогенности препарата при его применении в младшей возрастной группе.

Результаты оценки иммуногенности. Оценку иммуногенности пандемических моновакцин проводили в младших возрастных группах: 3 - 6 лет и от 6 месяцев до 3-х лет.

Результаты оценки иммуногенности вакцин МоноГриппол, МоноГриппол Нео и МоноГриппол плюс после однократной и двухкратной иммунизации у детей 3 - 6 лет представлены в таблицах 3 и 4.

После первой прививки в сыворотках крови детей наблюдали нарастание титров антител, при этом кратность прироста во всех случаях была больше двух. Однако доля лиц с четырехкратными серокон-версиями только в группе привитых МоноГриппо-

Таблица 2.

Частота общих и местных реакций у детей 3 - 17 лет после второй вакцинации

Возраст привитых Привитые вакцинами, абс. количество/%

МоноГриппол

Общие реакции

3 - б лет 0 0 0

7 - 11 лет 0 0 1

12 - 17 лет 0 0 2

Всего 0 0 3/3,б

Местные реакции

3 - б лет 0 0 0

7 - 11 лет 2 0 1

12 - 17 лет 3 2 1

Всего 1/1,1 2/2,4 2/2,4

Таблица 3.

Число лиц с четырехкратным приростом (уровень сероконверсий) и кратность прироста титров антител у серонегативных детей 3 - 6 лет после первой (I) и второй (II) вакцинации

Препарат Число парных сывороток Уровеньсероконверсий, % (абс.) Кратность прироста титров антител

I II I II I II

МоноГриппол 22 21 27,3 ± 9,5 (б) 71,4 ± 9,9* (15) 2,1 б,8*

МоноГриппол Нео 24 24 29,2 ± 9,3 (7) 91,7 ± 5,б* (22) 2,3 10,1*

МоноГриппол плюс 27 22 44,4 ± 9,б (12) 100,0 ± 0,0* (22) 2,9 18,3*

* P < 0,05 по сравнению с соответствующей группой после первой вакцинации.

лом плюс превышала 40%. Процент лиц с защитным титром (показатель серопротекции) после первой прививки также не соответствовал стандартным требованиям и колебался в пределах от 33,3 до 41,4%. Эти результаты согласуются с данными, опубликованными зарубежными исследователями, согласно которым однократная вакцинация пандемическими моновакцинами обеспечивала эффективную защиту менее чем у половины детей [5, 6].

После повторной прививки моновакцинами во всех сыворотках наблюдали статистически достоверное нарастание титров антител: уровень се-роконверсий достигал 71,4 - 100%; число лиц с защитным титром в группах возросло до 64,3 -92%, а кратность прироста титров антител составила 6,8 - 18,3 (см. табл. 3, 4).

Итак, представленные данные свидетельствуют, что двукратная вакцинация моновакцинами способствует формированию выраженного иммунного ответа у детей 3 - 6 лет.

Результаты оценки иммуногенности вакцины МоноГриппол плюс после двукратной вакцинации детей в возрасте от 6 месяцев до 2-х лет представлены в таблице 5.

Учитывая анамнез детей, которые не болели и не были привиты ранее против гриппа, все они (n = 28) были отнесены к серонегативным.

Кратность нарастания титров антител после второй вакцинации составила 18,6. Уровень сероконверсий достиг 78,6%, уровень серопротекции -75% (см. табл. 5).

Таким образом, после двукратной вакцинации детей в возрасте от 6 месяцев до 2-х лет вакциной МоноГриппол плюс все показатели иммуногенности соответствовали критериям СРМР.

На основании результатов оценки иммуногенности, а также с учетом данных ВОЗ [7] для вак-цинопрофилактики пандемического гриппа детям до 6 лет рекомендована двукратная вакцинация с интервалом не менее 21 дня, детям от 7 до 17 лет и взрослым - однократная.

Исследования показали, что все три исследуемых вакцины - безопасны и хорошо переносятся детьми.

По итогам проведенного клинического исследования вакцины МоноГриппол и МоноГриппол Нео рекомендованы для вакцинопрофилактики пандемического гриппа у детей с 3-х лет и старше; вакцина МоноГриппол плюс рекомендована для детей с 6 месяцев [2].

Таблица 4.

Число лиц с защитным титром антител (уровень серопротекции > 1:40) после первой (I) и второй (II) вакцинации детей 3 - 6 лет

Препарат Число парных сывороток Уровень серопротекции, %

I II I II

МоноГриппол 29 28 41,4 ± 9,1

МоноГриппол Нео 27 27 33,3 ± 9,1

МоноГриппол плюс 30 25 36,7 ± 8,8

* P < 0,05 по сравнению с соответствующей группой после первой вакцинации.

Таблица 5.

Результаты исследования сывороток детей в возрасте от 6 месяцев до 2-х лет, двукратно привитых вакциной МоноГриппол плюс, спустя 21 день после второй вакцинации

Число сывороток Из них с 4-кратным приростом

абс. % ± m до вакц. после вакц. абс. % ± m

28 22 78,6 ± 7,8 1:5 1:93 1:14 - 1:600 18,6 21 75,0 ± 8,2

Выводы

Оценка безопасности и переносимости пандемических вакцин МоноГриппол, МоноГриппол Нео и МоноГриппол плюс показала, что все эти препараты обладают низкой реактогенностью, хорошей переносимостью и безвредны при вакцинации детей. Серьезных поствакцинальных осложнений не выявлено ни у одного из вакцинированных.

На основании оценки иммуногенности вакцин рекомендована двукратная вакцинация детей младшего возраста (до 6 лет) и однократная - детей 7 - 17 лет.

Результаты клинических исследований позволили рекомендовать препараты МоноГриппол Нео и МоноГриппол для вакцинопрофилактики пандемического гриппа у детей с 3-х лет, МоноГриппол плюс - для вакцинопрофилактики у детей с 6 месяцев. ш

Литература

Карпова Л.С., Маринич И.Г., Поповцева Н.М., Столярова Т.П. Эпидемия гриппа А/Калифорния (H1N1) в России в 2009 году. Материалы II Ежегодного всероссийского конгресса по инфекционным болезням. - М., 2010. С. 137.

Письмо Роспотребнадзора от 13.04.2010 г. № 01/5578-10-32 «Об итогах пандемии гриппа A/H1N1/09 в мире и Российской Федерации в эпидсезон 2009 - 2010 гг. и прогнозе на эпидсезон 2010 - 2011 гг.».

Таточенко В.К., Озерецковский Н.А., Федоров А.М. Иммунопрофилак-тика-2010. Справочник. - Екатеринбург, 2010. - 198 с.

Харит С.М., Лакоткина Е.А., Черняева Т.В., Токаревич Т.К. Вакцинопрофилактика инфекций. - СПб., 2008. - 128 с.

H1N1 (swine) flu: Pediatric H1N1 Vaccine Clinical Studies, доступно на сайте: http://www.nlald.nlh.gov/toplcs/Flu/H1N1/CllnlcalStudles/Pages/ children.aspx

Wood D.J. Update on immunogenicity of pandemic influenza A(H1N1) vaccines: Preliminary results from clinical trials. QSS/IVB/WHO, SAGE, 28 October 09, Geneva.

Wood D.J. Update on H1N1 vaccine immunogenicity, safety and effectiveness. QSS/IVB/WHO. SAGE 14 Apr 10, Geneva. Доступно на сайте ВОЗ: http://www.who.lnt/lmmunlzatlon/sage/Influenza_2_H1N1_vac-cine_immunogenicity_D_Wood_SAGE_April_2010.pdf

5.