СПОСОБ АМПЛИФИКАЦИИ ТРАНСКРИПТОМА ОТДЕЛЬНЫХ КЛЕТОК

1. Способ амплификации матричной цепи РНК, включающий:
обратную транскрипцию матричной цепи РНК в матричную цепь кДНК с помощью обратной транскриптазы и последовательности праймера для обратной транскрипции, содержащего 3'- поли-T последовательность, комплементарную 5'- поли-A последовательности матричной цепи РНК, причем последовательность праймера обратной транскрипции также включает 5'-последовательность самогибридизации, сайт отжига праймера баркода, последовательность первого клеткоспецифичного баркода, содержащую от 4 до 12 нуклеотидов, и последовательность баркода первого уникального молекулярного идентификатора, содержащую от 10 до 30 нуклеотидов, причем матричная цепь кДНК содержит последовательность праймера обратной транскрипции с 5'-стороны матричной цепи кДНК и матричная цепь кДНК гибридизуется с цепью РНК;
расщепление избыточных последовательностей праймера обратной транскрипции с помощью фермента;
деградации цепи РНК с получением матричной цепи кДНК в виде одиночной цепи;
инактивацию обратной транскриптазы;
инактивацию фермента;
(a) получение комплементарной цепи к матричной цепи кДНК, включающей последовательность праймера обратной транскрипции, с помощью ДНК-полимеразы и праймера для элонгации, содержащего последовательность самогибридизации на 5'-конце праймера, причем комплементарная цепь включает последовательность самогибридизации на 5'-конце и комплементарную ей на 3'-конце;
(b) денатурацию с отделением матричной цепи кДНК от комплементарной цепи и замыкание комплементарной цепи путем отжига последовательности самогибридизации на 3'-конце и комплементарной ей на 5'-конце с тем, чтобы ингибировать амплификацию комплементарной цепи;
повторение стадий (а) и (b) множество раз с получением множества петлевидных комплементарных цепей из матричной цепи кДНК;
денатурацию множества петлевидных комплементарных цепей и амплификацию денатурированных комплементарных цепей с помощью праймера для амплификации, содержащего последовательность самогибридизации, с получением двухцепочечных ампликонов, содержащих последовательность праймера обратной транскрипции;
денатурацию двухцепочечных ампликонов и повторяющуюся амплификацию денатурированных ампликонов множество раз с помощью (1) праймера внешнего баркода, содержащего 3'-последовательность, комплементарную сайту отжига праймера баркода, причем праймер внешнего баркода также включает 5'-последовательность самогибридизации, последовательность прайминга секвенирования и последовательность второго клеткоспецифичного баркода, содержащую от 4 до 12 нуклеотидов, и (2) праймера, содержащего 3'-последовательность самогибридизации, получая при этом двухцепочечные ампликоны, содержащие последовательность первого клеткоспецифичного баркода, последовательность второго клеткоспецифичного баркода и последовательность баркода первого уникального молекулярного идентификатора.
2. Способ по п. 1, при этом РНК представляет собой матричную РНК, транспортную РНК, рибосомальную РНК, длинную некодирующую РНК или небольшую интерферирующую РНК.
3. Способ по п. 1, при этом РНК происходит из единственной клетки.
4. Способ по п. 1, при этом РНК происходит из отдельной клетки в гетерогенной популяции клеток.
5. Способ по п. 1, при этом РНК происходит из единственной пренатальной клетки.
6. Способ по п. 1, при этом РНК происходит из единственной раковой клетки.
7. Способ по п. 1, при этом РНК происходит из единственно циркулирующей опухолевой клетки.
8. Способ по п. 1, при этом обратная транскриптаза представляет собой SuperScript II, III или IV, обратную транскриптазу M-MLV, обратную транскриптазу Maxima, обратную транскриптазу Protoscript или обратную транскриптазу Thermoscript.
9. Способ по п. 1, при этом 3'- поли-T последовательность содержит от 10 до 30 нуклеотидов T (SEQ ID NO: 6).
10. Способ по п. 1, при этом последовательность самогибридизации представлена GAT5 или GAT1.
11. Способ по п. 1, при этом сайт отжига праймера баркода представлен RT3, Read1SP или Read2SP.
12. Способ по п. 1, при этом фермент представляет собой полимеразу, обладающую активностью вытеснения цепи или 5'-3'-экзонуклеазной активностью.
13. Способ по п. 1, при этом фермент представляет собой полимеразу Ф29, полимеразу Bst, полимеразу пирофага 3173, полимеразу Vent, полимеразу Deep Vent, ДНК-полимеразу TOPO Taq, полимеразу Taq, полимеразу T7, (экзо)полимеразу Vent, (экзо)полимеразу Deep Vent, полимеразу 9 Nm, фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I, обратную транскриптазу MMLV, обратную транскриптазу AMV, обратную транскриптазу ВИЧ, мутантную форму ДНК-полимеразы фага Т7, лишенную 3'-5'-экзонуклеазной активности, полимеразу Taq, ДНК-полимеразу Bst (полноразмерную), ДНК-полимеразу E. coli, Taq-полимеразу LongAmp, ДНК-полимеразу OneTaq, Q5, Phusion или Kapa HiFi.
14. Способ по п. 1, при этом цепочка РНК деградирует при температуре от 75°C до 85°C.
15. Способ по п. 1, при этом обратная транскриптаза и фермент инактивируются при температуре от 75°C до 85°C.
16. Способ по п. 1, при этом праймер для элонгации отжигается с матричной цепью кДНК при температуре от 0°C до 10°C.
17. Способ по п. 1, при этом комплементарная цепь образуется при температуре от 10°C до 65°C.
18. Способ по п. 1, при этом замыкание комплементарной цепи происходит при температуре от 55°C до 60°C.
19. Способ по п. 1, при этом стадии (a) и (b) повторяются от 7 до 12 раз.
20. Способ по п. 1, при этом амплификация денатурированных комплементарных цепей проводится с помощью полимеразной цепной реакции.
21. Способ по п. 1, при этом амплификация денатурированных комплементарных цепей проводится с помощью от 15 до 20 циклов полимеразной цепной реакции.
22. Способ по п. 1, при этом амплификация денатурированных ампликонов проводится с помощью полимеразной цепной реакции.
23. Способ по п. 1, при этом денатурированные ампликоны подвергаются многократной амплификации с помощью от 3 до 7 циклов ПЦР.
24. Способ по п. 1, при этом образовавшиеся двухцепочечные ампликоны подвергаются обработке для секвенирования.
25. Способ по п. 1, при этом последовательность баркода первого уникального молекулярного идентификатора имеет полуслучайный паттерн последовательности.
26. Способ по п. 1, при этом стадия расщепления избытка праймеров транскрипции с помощью фермента включает добавление праймеров обратной транскрипции с последовательностью баркода второго уникального молекулярного идентификатора, содержащего от 10 до 30 нуклеотидов с полуслучайным паттерном последовательности, который отличается от последовательности баркода первого уникального молекулярного идентификатора.