Анализ экспрессии генов tlrs и ассоциации полиморфизмов гена DEFB1 у детей с бронхиальной астмой

анализ экспрессии генов tlrs и ассоциации полиморфизмов

гена defb1 у детей с бронхиальной астмой

М. А. Зайцева1 Б. Г. Брагвадзе1, О. А. Свитич1*2, Л. С. Намазова-Баранова3, Л. В. Ганковская1

1 Кафедра иммунологии, медико-биологический факультет,

Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова, Москва

2 Лаборатория молекулярной иммунологии,

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И. И. Мечникова, Москва

3 Научный центр здоровья детей, Москва

Бронхиальная астма (БА) — одно из наиболее распространенных заболеваний органов дыхания. Активно исследуется роль элементов врожденного иммунитета в патогенезе бронхиальной астмы, в частности, противомикробных пептидов. К ним относятся р-дефенсины, предотвращающие вторжение патогенов в слизистую оболочку респираторного тракта, наиболее активным из которых является р-дефенсин-1 (human beta defensin-1, HBD-1), кодируемый геном DEFB1. В исследовании была изучена ассоциация трех однонуклеотидных полиморфизмов в 5'-нетранслируемой области гена — rs11362, rs1799946 и rs1200972 — с бронхиальной астмой у детей. Также оценивали уровень экспрессии генов toll-подобных рецепторов TLR2, TLR4 и TLR9. В опытную группу включили 48 пациентов в возрасте 3-7 лет с БА и 70 здоровых детей. Генотип АА полиморфизма rs11362 и генотип СС полиморфизма rs1799946 достоверно ассоциированы с заболеванием, а генотип GG полиморфизма rs1799946 и генотип АА полиморфизма rs120097 являются протективными. Генотип АА полиморфизма rs11362 также ассоциирован с пониженной экспрессией, а генотип AG — с повышенной экспрессией гена р-дефенсина-1 DEFB1. У детей с БА выявили повышение уровня экспрессии гена TLR2 в сравнении с контрольной группой в 19,5 раз, TLR9 — в 9,5 раз, TLR4 — в 8,3 раза.

Ключевые слова: бронхиальная астма, р-дефенсин-1, toll-подобные рецепторы, DEFB1, TLR2, TLR4, TLR9, одно-нуклеотидный полиморфизм, полиморфный маркер

gg Для корреспонденции: Зайцева Маргарита Алексеевна

143090, Московская область, г. Краснознаменск, ул. Связистов, д. 10, кв. 68; astice@list.ru

Статья получена: : 14.06.2016 Статья принята в печать: 23.06.2016

analysis of tlrs genes expression and defbi polymorphisms association in children with bronchial asthma

Zaitseva MA1^, Bragvadze BG1, Svitich OA1,2, Namazova-Baranova LS3, Gankovskaya LV1

1 Department of Immunology, Biomedical Faculty,

Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow, Russia

2 Laboratory of Molecular Immunology,

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia

3 Scientific Center of Children's Health, Moscow, Russia

Bronchial asthma (BA) is one of the most common respiratory system diseases. The role of innate immunity components in the pathogenesis of bronchial asthma is studied widely, with particular focus on the antimicrobial peptides. Those include beta defensins that prevent pathogen intrusion into the respiratory tract mucosa, the most active of such pathogens being P-defensin-1 (human beta defensin-1, HBD-1) encoded by the DEFB1 gene. We studied the association of three single nucleotide polymorphisms in the 5'- untranslated region of the gene, namely, rs11362, rs1799946 and rs1200972, with bronchial asthma in children. We also evaluated gene expression of toll-like receptors TLR2, TLR4 and TLR9. The experimental group included 48 patients of 3 to 7 years of age with BA and 70 healthy children. The АА genotype of the rs11362 polymorphism and the СС genotype of the rs1799946 polymorphism were reliably associated with the disease, while the GG genotype of the rs1799946 polymorphism and the АА genotype of the rs120097 polymorphism were found protective. Also, the АА genotype of the rs11362 polymorphism was associated with the reduced expression of DEFB1, the human beta defensin-1 encoding gene, while the AG genotype was associated with its increased expression. In children with BA, TLR2 expression increased 19.5 times in comparison with the controls; TLR9 expression increased 9.5 times, while TLR4 expression increased 8.3 times.

Keywords: bronchial asthma, human beta defensin-1, toll-like receptors, DEFB1, TLR2, TLR4, TLR9, single nucleotide polymorphism, polymorphic marker

1^1 Correspondence should be addressed: Margarita Zaitseva

ul. Svyazistov, d.10, kv. 68, Krasnoznamensk, Moscow oblast, Russia, 143090; astice@list.ru

Recieved: 14.06.2016 Accepted: 23.06.2016

Бронхиальная астма (БА) — это хроническое воспалительное заболевание верхних дыхательных путей, которое сопровождается обструкцией бронхов и их гиперреактивностью и проявляется эпизодами затруднения дыхания, хрипов, кашля, приступами удушья. Относится к числу патологий с высоким темпом роста заболеваемости, особенно в экономически развитых странах. По данным Российского респираторного общества, на сегодняшний день количество больных БА в России приближается к 10 млн человек, при этом доля детей среди них составляет более 20 % [1].

Замечено, что больные БА тяжелее переносят заболевания, вызванные респираторными инфекциями, нежели здоровые люди [2, 3]. С острыми респираторными инфекциями верхних дыхательных путей связана высокая частота обострений БА: около 85 % обострений у детей и 50 % — у взрослых вызываются именно респираторными вирусами [2]. Возбудители повреждают мерцательный эпителий слизистой оболочки дыхательного тракта, тем самым увеличивая ее проницаемость для аллергенов и токсических веществ и усиливая бронхиальную гиперреактивность. Тяжелое обострение может угрожать жизни больного, причем оно может развиться при БА любой степени [3].

Многие современные исследования посвящены углубленному изучению патогенеза БА, в частности, роли элементов врожденного иммунитета. Активно изучают новый класс эффекторных молекул — противомикробные пептиды, к которым относятся р-дефенсины. Противомикроб-ные свойства последних обусловлены электростатическим взаимодействием между отрицательно заряженными поверхностными компонентами бактериальной мембраны, такими как липополисахариды грамотрицательных бактерий и тейхоевые и липотейхоевые кислоты грамположи-тельных бактерий, и положительно заряженной молекулой Р-дефенсина. При критической концентрации р-дефенси-нов на поверхности клетки-мишени в ее мембране образуются поры и происходит лизис клетки. Кроме того, р-де-фенсины обладают иммунорегуляторной активностью: участвуют в хемотаксисе, индукции адаптивного иммунитета, созревании дендритных клеток и пр. [4].

Наиболее важную роль в защите слизистых оболочек респираторного тракта играет р-дефенсин-1 (human beta defensin-1, HBD-1), конститутивно синтезируемый эпителиальными клетками [5]. р-дефенсин-1 кодируется геном DEFB1, который расположен на коротком плече хромосомы 8 (8p23.1) в высокополиморфном кластере. Мутации в гене могут снижать его экспрессию, а недостаточная секреция р-дефенсинов вызывает ассоциированное прилипание и инвазию бактерий в слизистую и начало воспаления [6, 7].

Другой важный элемент врожденного иммунитета — toll-подобные рецепторы (toll-like receptors, TLRs) эпителиальных клеток слизистой оболочки дыхательных путей, которые распознают патоген-ассоциированные молекулярные структуры (pathogen-associated molecular patterns, РАМРs) микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности, передают сигнал внутрь клетки и вызывают повышение функциональной активности лейкоцитов, а также экспрессию генов провоспалительных цитокинов и ин-терферонов. Наиболее широкий спектр бактериальных и вирусных патогенов распознается TLR2, TLR4, TLR9, которые могут активировать врожденный иммунитет локально, на уровне слизистых оболочек дыхательных путей.

Целью работы являлась комплексная оценка показа-

телей врожденного иммунитета — уровней экспрессии генов TLR2, TLR4, TLR9 и DEFB1, а также изучение ассоциации некоторых однонуклеотидных полиморфизмов (single nucleotide polymorphism, SNP), локализованных в 5'-нетранслируемой области гена DEFB1, с бронхиальной астмой у детей. В качестве маркеров интереса выбрали три SNP: rs1799946, rs1800972 и rs11362. Установлено, что они ассоциированы с ВИЧ-инфекцией, инфекциями, вызываемыми Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa и другими микроорганизмами, развитием сепсиса [8, 9], однако данные об их ассоциации с аллергическими заболеваниями отсутствуют.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В исследовании приняли участие пациенты отделения восстановительного лечения детей с аллергическими болезнями и заболеваниями органов дыхания Научного центра здоровья детей (г. Москва): 48 детей в возрасте 3-7 лет с бронхиальной астмой. В контрольную группу включили 70 детей без заболеваний органов дыхания, инфек-ционно-воспалительных и аллергических заболеваний. В качестве клинического материала использовали сос-кобы со слизистой оболочки полости носа, взятые в период обострения БА на фоне острого респираторного заболевания.

Для исследования полиморфизмов гена DEFB1 ДНК из клинического материала выделяли с использованием набора «АмплиПРАЙМ Рибо-сорб» («ИнтерЛабСервис», Россия) и ставили полимеразную цепную реакцию «в реальном времени» (ПЦР-РВ) с использованием набора «ПЦР-комплект» (в присутствии красителя SYBR Green I) («Син-тол», Россия). Статистическую обработку данных проводили в MO Excel 2007 со статистическим пакетом Statistica 10.0 (StatSoft, США). Рассчитывали критерий согласия Пирсона и Odd Ratio (OR >1 — ассоциация генотипа с БА, OR <1 — протективный в отношении БА генотип) [10].

Уровень экспрессии генов DEFB1, TLR2, TLR4 и TLR9 исследовали относительно уровня экспрессии гена ß-ак-тина. РНК выделяли из клинического материала с использованием набора «АмплиПРАЙМ Рибо-сорб», проводили реакцию обратной транскрипции с использованием набора «ОТ-1» («Синтол») и ставили ПЦР-РВ с использованием набора «ПЦР-комплект» (в присутствии красителя SYBR Green I). При статистической обработке данных использовали критерий Манна-Уитни (р <0,05).

Исследование было одобрено этическим комитетом Российского национального исследовательского медицинского университета имени Н. И. Пирогова. Родители подписали информированное согласие на участие детей в исследовании.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Распределение частот генотипов полиморфных маркеров ге1799946, ге1800972 и ^11362 гена DEFB1 показало, что с риском развития бронхиальной астмы у детей ассоциированы генотипы АА маркера ге11362 и СС маркера ге1799946, а генотипы ЭЭ и АА маркеров ге1799946 и т1200972 соответственно являются протективными (рис. 1). Характер распределения частот аллелей гена DEFB1 в обеих группах был сходным.

44

ВЕСТНИК РГМУ | 3, 2016 | VESTNIKRGMU.RU

0,8 -

0,6 -

0,4

0,2

АА АЭ ЭО

Генотипы полиморфизма 1ъ11362 Дети с бронхиальной астмой | Здоровые дети

ОО ЭЭ ЭО

Генотипы полиморфизма ГЭ1799946 Дети с бронхиальной астмой Здоровые дети

Уровень экспрессии гена йЕРВ1 у больных детей был в 3,5 раза ниже, чем у здоровых (рис. 2). Однонуклеотид-ная замена в промоторной области гена может повлиять на эффективность его транскрипции гена и количество синтезируемого белка. Мы разделили пациентов опытной группы на три подгруппы в соответствии с уровнями экспрессии гена р-дефенсина-1: с низкими (выше уровня экспрессии гена р-актина менее чем в 10 тыс. раз), средними (выше уровня экспрессии гена р-актина в 10-30 тыс. раз) и высокими (выше уровня экспрессии гена р-актина более чем в 30 тыс. раз). Было установлено, что генотип АЭ маркера гэ11362 ассоциирован с увеличением уровня экспрессии р-дефенсина-1 в эпителиальных клетках. Так, частота генотипа АЭ в группах пациентов с высоким и низким уровнями экспрессии гена ОЕГВ1 составила 0,67 и 0,30 соответственно. Генотип АА ассоциирован с пониженной экспрессией гена дефенсина. Другие генотипы выбранных маркеров не ассоциированы с изменением уровня экспрессии гена дефенсина в исследованной нами группе.

У больных бронхиальной астмой выявили повышение уровня экспрессии гена ЛН2 в сравнении с контрольной группой в 19,5 раз, ЛН9 — в 9,5 раз, ЛН4 — в 8,3 раза. Результаты представлены в таблице.

3,5Е5

3,Е5

2,5Е5

2Е5

1,5Е5

1Е5

50000

р = 0,00006

п МеС1ап  25%-75% X Мт-Мах

Дети с бронхиальной астмой

Здоровые дети

Рис. 2. Уровень экспрессии гена ОЕРБ1 в эпителии слизистой носа у детей с бронхиальной астмой и здоровых детей

Уровни экспрессии генов ЛЯ2, ЛИ4, Т1Я9 и DEFB1 в эпителии слизистой носа у детей с бронхиальной астмой и здоровых детей

АА АЭ ЭО

Генотипы полиморфизма ГЭ1200972

Щ Дети с бронхиальной астмой Щ Контрольная группа

Рис. 1. Распределение частот генотипов однонуклеотидных полиморфизмов гэ11362, гэ1799946 и гэ1200972 в гене DEFB1 у детей с бронхиальной астмой

Ген Дети с бронхиальной астмой Здоровые дети

ПН2 130 000

ПИ4 150

ПИ9 30 000

йЕЕВ! 35 000

Примечание: данные представлены в виде медианы (25 %; 75 %) в копиях кДНК на 1 млн копий кДНК р-актина, р <0,05.

0

0

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные результаты могут указывать на то, что развитие хронического воспаления слизистой бронхов у детей с бронхиальной астмой отчасти обуславливается мутациями в 5'-нетранслируемой области гена DEFB1. На основании полученных данных об уровнях экспрессии генов DEFB1 и TLR2, TLR4, TLR9 была выдвинута гипотеза о роли р-дефенсина-1 в патогенезе БА. Противомикроб-ные пептиды, продуцируемые эпителием слизистой оболочки респираторного тракта, предотвращают вторжение патогенов в слизистую. Однако если продукция противо-микробных пептидов снижена, а бактериальная нагрузка увеличена, то патогены распознаются TLRs эпителиальных клеток и запускается каскад провоспалительных реакций, в том числе индукция синтеза интерлейкинов (IL-1 в, IL-6, IL-12), интерферона а, интерферона в и хемокинов. Кроме того, через активацию эпителиальных TLRs индуцируется выработка тимусного стромального лимфопоэтина (thymic stromal lymphopoietin, TSLP) и интерлейкина IL-33, которые взаимодействуют с дендритными клетками, увеличивают активность костимулирующих молекул CD40, CD80 и направляют дифференцировку клеток Th0 в Th2, а также напрямую взаимодействуют с тучными клетками, вызывая их дегрануляцию [11, 12]. Это приводит к развитию хронической воспалительной реакции (рис. 3).

ВЫВОДЫ

Генотип АА полиморфизма т11362 и генотип СС полиморфизма т1799946, расположенных в 5'-нетранслиру-емой области гена DEFB1, достоверно ассоциированы с бронхиальной астмой у детей. Генотип вв полиморфизма т1799946 и генотип АА полиморфизма т120097) являются протективными. Генотип АА полиморфизма т11362 также ассоциирован с пониженной экспрессией, а генотип АО — с повышенной экспрессией гена р-дефенсина-1 DEFB1. Таким образом, некоторые мутации в гене DEFB1 приводят к возникновению дисбаланса в системе врожденного иммунитета на уровне слизистой оболочки полости носа, который становится причиной частых обострений БА на фоне респираторных инфекций.

Литература

1. Чучалин А. Г., Оспельникова Т. П., Осипова Г. Л., Лизо-губ Н. В., Гервазиева В. Б., Кривицкая В. З. и др. Роль респираторных инфекций в обострениях бронхиальной астмы. Пульмонология. 2007; (5): 32-4.

2. Wark РА, Johnston SL, Bucchieri F, Powell R, Puddicombe S, Laza-Stanca V, et al. Asthmatic bronchial epithelial cells have a deficient innate immune response to infection with rhinovirus. J Exp Med. 2005 Mar 21; 201 (6): 937-47.

3. Cirillo I, Marseglia G, Klersy C, Ciprandi G. Allergic patients have more numerous and prolonged respiratory infections than nonallergic subjects. Allergy. 2007 Sep. 62 (9): 1087-90.

4. Ковальчук Л. В., Ганковская Л. В., Мешкова Р. Я. Клиническая иммунология и аллергология с основами общей иммунологии. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2011. с. 148-65.

5. Свитич О. А., Ганковская Л. В., Рахманова И. В., Зайцева И. А., Ганковский В. А. Ассоциация полиморфных маркеров, локализованных в 5'-нетранслируемой области гена в-дефенсина DEFB1, с гипертрофией аденоидных вегетаций. Вестн. РГМУ. 2012; (3): 59-62.

46

Рис. 3. Механизм развития хронической воспалительной реакции при бронхиальной астме

При первичном контакте слизистой с аллергеном нарушается эпителиальный барьер. Это приводит к продукции эпителиальным клетками таких ци-токинов, как ТЭ1_Р, 11_-25 и 11_-33. При повторном контакте с аллергеном в присутствии цитокинов индуцируется созревание дендритных клеток (ДК) и их миграция в лимфатические узлы, где ДК передают информацию об аллергене Т-хелперам ТИ0 с участием молекул главного комплекса гисто-совместимости (МНС-11), инициируя их пролиферацию и дифференцировку в ТИ-2. Активированные аллергенспецифичные ТИ-2 продуцируют широкий спектр цитокинов: 11_-4 (усиление пролиферации В-лимфоцитов, ростовой и дифференцировочный фактор В-лимфоцитов, переключение изотипа В-клеток на синтез иммуноглобулинов 1дЕ), 11_-5 (стимуляция пролиферации эозинофилов и высвобождения ими основного белка), 11_-9 (активация тучных клеток). Аллергенспецифичные 1дЕ-антитела связываются с высокоаффинными рецепторами (РееЯ1) на тучных клетках и базофилах и с низкоаффинными рецепторами (РееЯН) на эозинофилах и макрофагах. При повторном поступлении аллергенов в организм происходит их связывание с молекулами 1дЕ, расположенными на мембранах тучных клеток, что обусловливает дегрануляцию этих клеток. При повышенной бактериальной нагрузке не все патогены элиминируются противомикробными пептидами. Часть из них распознается ТЬЯэ эпителия респираторного тракта, что приводит к поддержанию воспалительного процесса в бронхах.

6. Noutsios GT, Floros J. Childhood asthma: causes, risks, and protective factors; a role of innate immunity. Swiss Med Wkly. 2014 Dec 24; 144: w14036.

7. Arslan F, Babakurban ST, Erbek SS, Sahin FI, Terzi YK. Chronic tonsillitis is not associated with beta defensin 1 gene polymorphisms in Turkish population. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 2015 Apr; 79 (4): 557-60. doi: 10.1016/j.ijporl.2015.01.028. Epub 2015 Jan 30.

8. Milanese M, Segat L, Pontillo A, Arraes LC, de Lima Filho JL, Crovella S. DEFB1 gene polymorphisms and increased risk of HIV-1 infection in Brazilian children. AIDS. 2006 Aug 1; 20 (12): 1673-5.

9. Ганковская О. А., Бахарева И. В., Ганковская Л. В., Зверев В. В. Ассоциация полиморфных маркеров G(-20)A, C(-44) G и G(-52)A гена DEFB1 с развитием преждевременных родов и внутриутробным инфицированием плода. Рос. имму-нол. журн. 2011; 5 (1): 26-33.

10. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1999. 459 с.

ВЕСТНИК РГМУ | 3, 2016 | VESTNIKRGMU.R

11. Spann KM, Baturcam E, Schagen J, Jones C, Straub CP, Preston FM, et al. Viral and host factors determine innate immune responses in airway epithelial cells from children with wheeze and

References

1. Chuchalin AG, Ospel'nikova TP, Osipova GL, Lizogub NV, Gervazieva VB, Krivitskaya VZ, et al. Rol' respiratornykh infektsii v obostreniyakh bronkhial'noi astmy. Pul'monologiya. 2007; (5): 32-4. Russian.

2. Wark RA, Johnston SL, Bucchieri F, Powell R, Puddicombe S, Laza-Stanca V, et al. Asthmatic bronchial epithelial cells have a deficient innate immune response to infection with rhinovirus. J Exp Med. 2005 Mar 21; 201 (6): 937-47.

3. Cirillo I, Marseglia G, Klersy C, Ciprandi G. Allergic patients have more numerous and prolonged respiratory infections than nonallergic subjects. Allergy. 2007 Sep. 62 (9): 1087-90.

4. Koval'chuk LV, Gankovskaya LV, Meshkova RYa. Klinicheskaya immunologiya i allergologiya s osnovami obshchei immunologii. Moscow: GEOTAR-Media; 2011. p. 148-65. Russian.

5. Svitich OA, Gankovskaya LV, Rakhmanova IV, Zaitseva IA, Gankovskii VA. Assotsiatsiya polimorfnykh markerov, lokalizovannykh v 5'-netransliruemoi oblasti gena ß-defensina DEFB1, s gipertrofiei adenoidnykh vegetatsii. Vestnik RGMU. 2012; (3): 59-62. Russian.

6. Noutsios GT, Floros J. Childhood asthma: causes, risks, and protective factors; a role of innate immunity. Swiss Med Wkly. 2014 Dec 24; 144: w14036.

atopy. Thorax. 2014 Oct. 69 (10): 918-25. 12. Islam SA, Luster AD. T cell homing to epithelial barriers in allergic disease. Nat Med. 2012 May 4; 18 (5): 705-15.

7. Arslan F, Babakurban ST, Erbek SS, Sahin FI, Terzi YK. Chronic tonsillitis is not associated with beta defensing 1 gene polymorphisms in Turkish population. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 2015 Apr; 79 (4): 557-60. doi: 10.1016/j. ijporl.2015.01.028. Epub 2015 Jan 30.

8. Milanese M, Segat L, Pontillo A, Arraes LC, de Lima Filho JL, Crovella S. DEFB1 gene polymorphisms and increased risk of HIV-1 infection in Brazilian children. AIDS. 2006 Aug 1; 20 (12): 1673-5.

9. Gankovskaya OA, Bakhareva IV, Gankovskaya LV, Zverev VV. Assotsiatsiya polimorfnykh markerov G(-20)A, C(-44)G i G(-52)A gena DEFB1 s razvitiem prezhdevremennykh rodov i vnutriutrobnym infitsirovaniem ploda. Russ J Immunol. 2011; 5 (1): 26-33. Russian.

10. Glantz S. [Primer of biostatistics]. Moscow: Praktika, 1999. 459 p. Russian.

11. Spann KM, Baturcam E, Schagen J, Jones C, Straub CP, Preston FM, et al. Viral and host factors determine innate immune responses in airway epithelial cells from children with wheeze and atopy. Thorax. 2014 Oct. 69 (10): 918-25.

12. Islam SA, Luster AD. T cell homing to epithelial barriers in allergic disease. Nat Med. 2012 May 4; 18 (5): 705-15.