Гены синтаз оксида азота (NOS1, NOS3) в развитии предрасположенности к сахарному диабету 1 типа

Гены синтаз оксида азота (NOS1, NOS3) в развитии предрасположенности к сахарному диабету 1 типа

Е.И. Кондратьева1, В.П. Пузырев1,2, Н.В. Тарасенко1, Т.В. Косянкова2,

Т.А. Милованова1, Н.Г Гулиева1, Т.К. Гудкова1

1ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет (ректор - акад. РАМН В.В. Новицкий), МЗ РФ I 2ГУ НИИ медицинской генетики (дир. - акад. РАМН В.П. Пузырев), ТНЦ СО РАМН, Томск |

Достижения современной генетики, использование ДНК-технологий и компьютеризации позволили начать активное изучение генетических основ сахарного диабета [1, 2, 6, 7, 16]. Роль генетических факторов в развитии сахарного диабета 1 типа (СД1) обще-признана. СД1 относится к многочисленной группе муль-тифакториальных заболеваний, имеющих полигенную природу наследования, в появлении которых повинны как генетические, так и экзогенные факторы [8, 9, 16].

Одной из наиболее продуктивных современных технологий геномных исследований СД1 является анализ ассоциаций полиморфных генетических маркеров, связанных с локусами генов, вносящих вклад в развитие болезни (кандидатных генов) [8, 9]. Список возможных кандидатных генов СД1 довольно обширен и включает гены многих метаболических и физиологических систем: гены ренин-ангиотензиновой системы, оксида азота, цитокинов и т. д. Эти гены активно исследуют в настоящее время, чтобы оценить силу их влияния на те или иные клинические проявления болезни, выявить их сочетания («генетические ансамбли»), которые либо предрасполагают, либо препятствуют развитию сахарного диабета и его сосудистых осложнений [4, 6, 7, 12-14].

Оксид азота (N0) является участником практически всех метаболических и физиологических процессов, играя роль универсального регулятора. N0 образуется в эндотелии сосудов, гранулоцитах, макрофагах, тромбоцитах, гепатоцитах, гладкомышечных клетках, мез-англиальных и нейронах. Он регулирует тонус кровеносных сосудов, тормозит агрегацию тромбоцитов и их адгезию на стенках сосудов, вызывает расслабление гладких мышц. N0 функционирует в центральной и вегетативной нервной системе [5, 10]. Наряду с регуля-

торными функциями, N0 обладает цитостатической/ цитотоксической активностью, выступая в качестве одного из основных эффекторов системы клеточного иммунитета: гиперпродукция N0 активированными макрофагами и нейтрофилами коррелирует с их цито-токсическим эффектом при аутоиммунных процессах. Особый интерес представляет способность N0 и его производных влиять на синтез ряда важнейших белков и ферментов как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции [10].

Синтез N0 осуществляется семейством цитохром Р-450-подобных гемопротеинов - N0 синтаз (N08). Различают 3 формы N08: нейрональную (Ш08), инду-цибельную ^N08) и эндотелиальную ^N08), которые кодируют соответствующие гены: N081, N082 и N083 [16-18]. Данные гены идентифицированы, установлена их экспрессия в различных клетках и тканях, а также их взаимосвязь с различной патологией человека (табл. 1). Гён N081 картирован на длинном плече 12-й хромосомы (12q24.2-q24.3). Размер гена составляет более 200 кЬ и включает в себя 29 экзонов и 28 интро-нов [16-18]. Описано более 100 полиморфных маркеров гена N081. Показана роль Ш08 в патогенезе диабетической нейропатии в эксперименте (в спинном нервном ганглии крыс с диабетом). Одним из ранних сосудистых осложнений СД является диабетическая ретинопатия; в сетчатке животных с экспериментальным диабетом увеличено количество N0. 1ён N083 картирован на длинном плече 7-й хромосомы (7q36), состоит из 26 экзонов и 25 интронов, размером около 20 кЬ [16-18]. Известно более 100 полиморфных маркеров гена N083, наиболее изученными являются следующие полиморфные маркеры: У^ТЯ, 894в/Т, -691 С/Т, -788С/Т, 774С/Т, 1998СЮ.

Таблица 1

Характеристика изоформ синтаз оксида азоте

Ген/характеристика пЫОБ

Хромосомная локализация 12я24.2-я24.3 7я35-я36

Локализация в клетке Цитоплазма Связаны с мембраной

Типы клеток Нейроны, миоциты скелетной мускулатуры Эндотелий, тромбоциты, миокард

Активация Кальцийзависимая Кальцийзависимая

Ответ на стимуляцию Конститутивный фермент Конститутивный фермент

Сахарный диабет I

Генетика

Таблица 2

Распределение генотипов генов N051, N053 у больных сахарным диабетом 1 типа и здоровых лиц

Группа п Ген Генотип N0 X2 ^. = 1 Н.о.±$.е. Н.е.±$.е.

Больные СД1 142 N051 СС СТ ТТ 70 66 6 3,9386 р<0,05 Н.о. = 0,4648±0,0419 Н.е. = 0,3984±0,0239

Контроль 237 (С/Т) СС СТ ТТ 94 115 28 0,6421 р>0,05 Н.о. = 0,4852±0,0325 Н.е. = 0,4612±0,0123

Больные СД1 124 N053 АА АВ ВВ 5 24 95 4,1059 р<0,05 Н.о. = 0,1935±0,0355 Н.е. = 0,2366±0,0316

Контроль 122 (У№1?) АА АВ ВВ 5 29 88 1,6120 р>0,05 Н.о. = 0,2377±0,0385 Н.е. = 0,2686±0,0318

Больные СД1 148 N053 СС СТ ТТ 117 30 1 0,3870 р>0,05 Н.о. = 0,2027±0,0330 Н.е. = 0,1928±0,0282

Контроль 235 (С691Т) СС СТ ТТ 158 73 4 1,8571 р>0,05 Н.о. = 0,3106±0,0302 Н.е. = 0,2853±0,0228

Больные СД1 147 N053 вв вТ ТТ 66 68 13 0,5910 р>0,05 Н.о. = 0,4626±0,0411 Н.е. = 0,4350±0,0197

Контроль 240 (в894Т) вв вТ ТТ 88 106 46 1,8908 р>0,05 Н.о. = 0,4417±0,0321 Н.е. = 0,4847±0,0080

Больные СД1 143 N053 СС СТ ТТ 103 38 2 0,5234 р>0,05 Н.о. = 0,2657±0,0369 Н.е. = 0,2506±0,0295

Контроль 118 (С774Т) СС СТ ТТ 80 31 7 2,6130 р>0,05 Н.о. = 0,2627±0,0405 Н.е. = 0,3086±0,0316

Примечание: п - количество обследованных; N0 - наблюдаемая численность генотипов; х2 - критерий использован для оценки соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому исходя из равновесия Харди-Вайнберга; ^. - число степеней свободы; Н.о. и Н.е. - наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность с ошибкой; р - значимость различий по сравнению с контролем.

В клетках эндотелия сосудов находится зависимая от Са2+ и кальмодулина еКОБ, вырабатываемый ею N0 является самым мощным из известных эндогенных вазодилататоров. Общей же причиной всех диабетических микроангиопатий является изменение работы клеток эндотелия сосудов - эндотелиальная дисфункция [10]. Данные о роли N0 в патогенезе диабетических ангиопатий (ДА) противоречивы. В ряде исследований обнаружено снижение продукции N0 тромбоцитами при СД: предполагают, что дефицит N0 имеет значение в развитии гиперагрегации тромбоцитов. В других исследованиях выявлено повышение активности тромбоцитарной N0-синтазы у больных СД1 с нефропатией. Вместе с тем содержание метаболитов N0 в плазме при СД может быть как повышенным, так и сниженным [10].

Цель исследования заключалась в изучении полиморфных маркеров генов нейрональной и эндотелиаль-

ной синтаз оксида азота (N081 и N083), а также иммунологических показателей (клеточный иммунитет, гуморальный иммунитет, структурно-метаболический статус и функциональная активность нейтрофильных гранулоцитов) у больных СД1 на популяционном и семейном уровне.

Объект и методы исследования

Для исследования было выбрано два дизайна. Первый дизайн: случай (163 ребенка больных СД1) -контроль (243 индивида русской национальности, проживающих в Томске и не имеющих по данным клинического, инструментального обследования СД1 и признаков сердечно-сосудистых нарушений). Второй дизайн: случай (80 детей и подростков больных СД1) - контроль (родственники первой степени родства - 220 человек). В исследование вошли 80 полных и 30 неполных

Генетика

Таблица 3

Распределение частот аллелей и генотипов полиморфизмов генов N051, N053 среди больных сахарным диабетом типа 1 и здоровых лиц

Группа п Ген Частоты генотипов,% X2 р Частоты аллелей, % X2* р ОІ? р

Больные СД1 142 N051 (С/Т) СС 49 СТ 46 ТТ 5 7,683 0,021 С 72 Т 28 5,586 0,018 1,491 0,016

Контроль 237 СС 40 СТ 48 ТТ 12 С 64 Т 36

Больные СД1 148 N053 (С691Т) СС 79 СТ 20 ТТ 1 6,434 0,040 С 89 Т 11 5,459 0,019 1,718 0,019

Контроль 235 СС 67 СТ 31 ТТ 2 С 83 Т 17

Больные СД1 143 N053 (С774Т) СС 107 СТ 30 ТТ 2 4,786 0,050 С 85 Т 15 4,650 0,031 1,750 0,031

Контроль 118 СС 80 СТ 31 ТТ 7 С 80 Т 20

Больные СД1 147 N053 (в894Т) вв 45 вТ 46 ТТ 9 8,013 0,018 в 68 Т 32 6,290 0,012 1,490 0,012

Контроль 240 вв 37 вТ 44 ТТ 19 в 59 Т 41

Больные СД1 124 N053 (У№1?) АА 4 АВ 19 ВВ 77 5,023 0,643 А 14 В 86 0,320 0,573 1,220 0,573

Контроль 122 АА 4 АВ 24 ВВ 72 А 16 В 86

Примечание: п - число обследованных; х2 - критерий использован для сравнения частот генотипов у больных СД1 и здоровых лиц; X2* - критерий использован для сравнения частот аллелей у больных СД1 и здоровых лиц; 01? - относительный риск; р - значимость различий по сравнению с контролем.

семей пробандов с СД1. Анализ родословных включал данные о 4500 родственниках пробандов с СД1.

Диагноз СД1 устанавливали после детального клинико-инструментального обследования в условиях специализированного стационара на основании критериев Комитета экспертов ВОЗ (1999) и Федеральной целевой программы «Сахарный диабет» (2002) [3].

Были изучены один полиморфный маркер гена N081 - С/Т (в 18 экзоне) и четыре полиморфных маркера гена N083 (VNTR в интроне 4, -691С/Т в области промотора и две нуклеотидные замены - 774С/Т, 894в/Т в 6-м и 7-м экзонах соответственно) (табл. 2).

Выделение тотальной ДНК проводили стандартным методом. Изучение полиморфных маркеров генов N081, N083 проводили с помощью амплификации соответствующих участков генома методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанные

в геномной базе данных (GDB) и литературе [16, 17]. Гёнотипирование полиморфных маркеров осуществляли путем ПДРФ-анализа: продукты амплификации обрабатывали рестриктазами с последующим разделением в 3% агарозном геле. Фрагменты ДНК окрашивали бромистым этидием и визуализировали в УФ-свете с применением компьютерной видеосъемки на приборе «Ц^18 !^ег-П» (США).

Иммунологический блок состоял из методов определения клеточного и гуморального иммунитета, факторов неспецифической защиты и углубленного исследования структурно-метаболического статуса и функциональной активности нейтрофильных грану-лоцитов (НГ) циркулирующего пула. Определение популяций и субпопуляций лимфоцитов проводили цитотоксическим методом. Определение иммуноглобулинов классов А, М, G в сыворотке проводили по методу й МапсЫш (1965). Концентрацию циркули-

Сахарный диабет

Сахарный диабет I

Генетика

Таблица 4

Особенности иммунного статуса пробандов с сахарным диабетом 1 типа в зависимости от генотипов У№1? полиморфизма, полиморфизма С774Т и варианта С894Т гена N053

VNTR полиморфизм

Показатель Генотип ВВ Генотип AB+AA

CD4/CD8 1,04±0,15, p<0,05 2,45±1,12

Полиморфизм С774Т

Показатель Генотип CC Генотип Cr+ТТ

П^, ед 10,95±б,04, p<0,05 18,25±10,51, p<0,05

Полиморфизм G894T

Показатель Генотип GG Генотип GT Генотип ТТ

П^, ед 10,33±б,41, p<0,05 14,З2±7,90, p<0,05 17,80±12,9З, p<0,05

Примечание: р - достоверность различия показателей между группами, ПСН - поглотительная способность нейтрофилов.

рующих иммунных комплексов в крови больных определяли методом Ю.А. Гриневич, А.И. Алферова (1981), фагоцитарную активность нейтрофилов - по методу В.М. Берман и соавт. (1988) с модификациями Д.К. Новикова и В.И. Новиковой (1996).

Статистическая обработка результатов: сравнение частот аллелей между группами проводили точным тестом Фишера [11]. На основании частоты встречаемости аллелей в контрольной группе и группах больных был рассчитан относительный риск развития СД1 (OR). Значения OR>1 указывают на возможную положительную ассоциацию аллеля с заболеванием. Для поиска ассоциации патологии с полиморфными маркерами на семейном уровне был использован тест на неравновесие по сцеплению -Transmission / Diseqilibrium Test (TDT): TDT=(b-c)2/(b+c), где b и c - наследуемые аллели от гетерозиготных родителей [12]. Изучение ассоциаций признаков с полиморфными маркерами проводили с помощью однофакторного дисперсионного анализа. Для всех полиморфных маркеров, кроме G894T, объединяли редких гомозигот с гетерозиготами. Предварительно проводили проверку распределений в сравниваемых группах на гомоскедастичность (однородность дисперсии) по критерию Брауна-Форсайта. В случае незначимого отличия дисперсий для дисперсионного анализа использовали подход Фишера, при статистически значимом отличии дисперсий использовали тест Краскела-Уоллиса (непараметрический аналог дисперсионного анализа по Фишеру). При необходимости парных сравнений (при статистически значимом дисперсионном комплексе с градацией факторного признака более 2) использовали метод линейных контрастов Шеффе.

Результаты и их обсуждение

Результаты исследования показали, что наблюдаемое и ожидаемое распределение генотипов и частот аллелей изучаемых полиморфных маркеров генов у больных СД1 соответствовало равновесию Харди-Вайнберга для всех полиморфных маркеров, за исключением полиморфного маркера С/Т гена NOS1

(х2=4,210; р<0,05) за счет избытка гетерозигот, а для полиморфного маркера VNTR (х2=3,106; р<0,05) гена N083 за счет недостатка гетерозигот (см. табл. 2).

Выявлено значимое различие в частотах аллелей и генотипов между больными СД1 и здоровыми лицами для следующих полиморфных маркеров: С/Т (ген N081), С691Т, С774Т, G894N, VNTR (ген N083) (табл. 3). Анализ методом «случай-контроль» (больные сахарным диабетом - здоровые лица) показал наличие статистически значимой ассоциации полиморфного маркера С/Т гена N081, при этом 0R составил 1,491 (р=0,016). Для полиморфных маркеров гена N083 риск развития СД1 возрастал от 1,490 (р=0,012) для полиморфного маркера G894T до 1,718 (р=0,016) для полиморфного маркера С691Т и максимальные значения были получены для полиморфного маркера C774T -1,750 (р=0,031) (см. табл. 3). Для полиморфного маркера VNTR гена N083 взаимосвязь с заболеванием не обнаружена (0R<1).

Для уточнения результатов, полученных методом случай-контроль, исследование было продолжено на семейном уровне с помощью ТDТ-теста. Поиск ассоциаций с помощью этого теста показал, что аллель В полиморфного маркера VNTR, аллель G полиморфного маркера G894T, аллель С полиморфного маркера С774Т гена N083 ассоциируются с СД1, при этом показатель TDT-теста составил 2,70 (р=0,054), 3,30 (р=0,050), 4,20 (р=0,016) соответственно. Таким образом, для полиморфного маркера С774Т гена N083 ассоциация с СД1 была подтверждена двумя методами на популяционном и семейном уровнях с максимальным значением изучаемого показателя, что значительно повышает достоверность полученных результатов. Для полиморфного маркера С691Т гена N083 не выявлено статистически достоверной ассоциации с СД1 (р>0,05) с помощью TDT-теста.

Патогенетическая роль эндогенного N0 при СД1 изучается с двух точек зрения: как фактора, участвующего в индукции самого заболевания, и как фактора, аномальная экспрессия которого играет заметную роль в формировании ангиопатий [10]. Полученные ассоциации косвенно свидетельствуют о вкладе изучаемых

Генетика

Сахарный диабет

полиморфных маркеров генов N081 и N083 как в само заболевание, так и в связанные с ним осложнения.

В дальнейшем были изучены показатели иммунитета у детей с СД1 в зависимости от генотипов изучаемых полиморфных маркеров генов N081 и N083. С помощью однофакторного дисперсионного анализа были установлены следующие иммунологические особенности больных СД1 с различными генотипами указанных генов.

Дети с генотипом ВВ полиморфного маркера VNTR гена N083 имели достоверно меньшее отношение CD4/CD8, чем дети с генотипами АА и АВ, что обусловлено снижением количества CD4 у детей с генотипом ВВ. Соотношение CD4/CD8 у больных СД1 с генотипами АА и АВ не отличалось от показателей здоровых детей (2,26±0,19) Томска. Нарушение соотношения CD4/CD8 у больных с генотипом ВВ косвенно подтверждают описанную ассоциацию аллеля В с СД1 по данным TDT-теста (табл. 4).

Полиморфные маркеры С774Т и в894Т гена N083 были взаимосвязаны со значениями поглотительной способности нейтрофилов (ПСН), которая была повышена у детей с СД1 с генотипами СТ и ТТ полиморфного маркера С774Т, а также ТТ полиморфного маркера

G894T гена N083. Для СД1 характерна активация НГ циркулирующего пула, детерминируемая хронической гипергликемией на фоне нарушения фагоцитарной активности [5]. Приведенные данные указывают на генетический вклад в активацию НГ у ряда больных СД1 (см. табл. 4) и свидетельствуют о необходимости дальнейших исследований в данной области.

Выводы

1. Больные сахарным диабетом 1 типа русского населения Томской области достоверно чаще являются носителями аллеля С полиморфного маркера С/Т гена нейрональной синтазы N0, аллеля В полиморфного маркера VNTR, аллеля С полиморфного маркера С691Т, аллеля С полиморфного маркера С774Т и аллеля G полиморфного маркера G894Т гена эндотелиальной синтазы N0.

2. Получены следующие ассоциации иммунологических показателей с полиморфными маркерами: CD4/CD8 - VNTR, поглотительная способность ней-трофилов - С774Т поглотительная способность ней-трофилов - G894T гена эндотелиальной синтазы N0.

Литература

1. Aлександровский Я^У/Биохимия. - 1998. - Т.бЗ. - В.11. - C.1470- 7. Носиков В.В.//Молекулярная биология. - 2004. Т. 38. № 1. C. 150-1б4.

1479.

2. Дедов И.И., Кураева Т.Л., Петеркова В.А., Щербачева Л.Н. Сахарный диабет у детей и подростков. - М., 2002.

3. Дедов И.И., Шестакова М.В., Максимова М.А. Федеральная целевая программа «Сахарный диабет» (методические рекомендации). - М. Медиа Сфера, 2002.

4. Дедов И.И., Шестакова М.В. Диабетическая нефропатия М.: Универсум Паблишинг, 2000.

5. Кондратьева Е.И. Клинико-генеалогические и иммуно-метаболические механизмы формирования сахарного диабета 1 типа и его осложнений у детей и подростков и их значение в выборе стратегии реабилитации: Дис. ...д-ра мед. наук - Томск, 2001. (для авторефератов).

6. Косянкова Т.В., Кондратьева Е.И., Тарасенко Н.В., Пузырев В.П.//Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике. Под ред. А.Б. Масленникова. Вып.4. Новосибирск: Альфа Виста. - 2003. С. 107-115.

8. Пузырев В.П.//Медицинская генетика. 2003. Т. 2. № 12. С. 498-508.

9. Пузырев В.П., Степанов В.А. Патологическая анатомия генома человека. -STT, Томск, 1997.

10. Ярек-Мартынова И.Р., Шестакова М.В.//Сахарный диабет. - 2004 -№2. - С. 48 - 52.

11. Allison D.B. // Am. J. Hum. Genet. 1997. V. 60. P. 676-690.

12. Diabetes mellitus. General information. Diabetes Statistics//NIH Publication. 1998. P. 96-3926.

13. Fischmann T.O., Hruza A., Niu X.D., et al.//Nat. Struct. Biol. 1999. V. 6. P. 233-242.

14. Fostermann U., Boissel J.-P., Kleinert H.//The FASEB Journal. 1998. V.

№ 12. P. 773-790.

15. Kelly C.J., Gold D.P.//Semin Nephrol. 1999. № 19. P. 288-295.

16. McKusick V.A.//Genomics. 1997. V. 45. P. 244-249.

17. http://www.dsi.univ-paris5.fr/genatlas/fiche.php?symbol= NOS1,NOS3.

18. http://bioinfo.weizmann.