АНТИТЕЛА ПРОТИВ БЕЛКА-1 ЗАПРОГРАММИРОВАННОЙ КЛЕТОЧНОЙ СМЕРТИ (PD-1) И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
PROGRAMMED CELL DEATH (PD-1) PROTEIN-1 ANTIBODIES AND USE THEREOF

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение касается антител против белка-1 запрограммированной клеточной смерти (PD-1), либо их антигенсвязывающих фрагментов, кодирующих их нуклеиновых кислот, векторов, содержащих эти нуклеиновые кислоты, выделенных клеток, трансформированных этими векторами, способа получения антител либо их антигенсвязывающих фрагментов и содержащих их композиций для профилактики или лечения рака.
Уровень техники
Химиотерапевтические противораковые препараты первого поколения и целевые противораковые препараты второго поколения, которые широко применяются в настоящее время, имеют проблемы с побочными эффектами из-за токсичности противораковых средств, высокого риска лекарственной устойчивости и ограниченности в том, что их можно назначать только пациентам, имеющим специфические генные мутации. Иммунные противораковые препараты (иммуноонкологические средства), которые называют “противораковыми препаратами третьего поколения”, преодолевают эти проблемы, действуя на сигнальные пути иммунных клеток и активируя их, тем самым атакуя раковые клетки и обеспечивая при этом терапевтические эффекты. В отличие от традиционных противораковых препаратов, иммунные противораковые препараты могут применяться при различных заболеваниях, включая рак, с тем чтобы лечить заболевания с помощью иммунной системы человека, причем отмечается, что они вызывают меньше побочных эффектов, чем традиционные противораковые препараты.
PD-1 (также известный как “CD279”) представляет собой рецепторный белок в 55 кД, связанный с семейством костимулирующих/ингибирующих рецепторов CD28/CTLA4 (Blank et al., 2005 Cancer Immunol Immunother. 54: 307-314).
Его характеристики изучают на мышах и людях путем клонирования гена и кДНК, кодирующей PD-1 (Ishida et al., 1992 EMBO J. 11: 3887-3395; Shinohara et al., 1994 Genomics 23: 704-706). Полноразмерный PD-1 содержит 288 аминокислотных остатков (номер доступа в NCBI: NP_005009). Внеклеточный домен состоит из аминокислотных остатков 1-167, а цитоплазматический С-концевой участок содержит аминокислотные остатки 191-288, которые содержат два гипотетических иммунорегуляторных мотива, а именно ингибиторный мотив иммунорецептора на основе тирозина (ITIM; Vivier et al. al., 1997 Immunol Today 18: 286-291) и мотив тирозинового переключателя иммунорецептора (ITSM; Chemnitz et al., 2004 J Immunol 173: 945-954).
К настоящему времени известно, что с PD-1 специфически взаимодействуют два родственных по последовательности лиганда, PD-L1 (B7-H1) и PD-L2 (B7-DC), вызывая внутриклеточную передачу сигналов и ингибируя опосредованную CD3 и CD28 активацию Т-клеток (Riley, 2009 Immunol Rev. 229: 114-125), которая в конечном счете регулирует активность Т-клеток, например, снижает секрецию других факторов роста и цитокинов, а также рост клеток и секрецию IL-2 и IFN-γ.
Экспрессия PD-1 часто встречается в таких иммунных клетках, как T-клетки, B-клетки, мононуклеары и клетки естественных киллеров (NK), но почти не экспрессируется в других тканях человека типа мышц, эпителия и нервной ткани. Кроме того, высокие уровни экспрессии PD-1 часто связаны с активностью иммунных клеток. Например, при активации T-клеточной линии Jurkat человека с помощью PHA (фитогемагглютинина) или TPA (12-O-тетрадеканоилфорбол-13-ацетата) усиливается экспрессия PD-1, как это видно при Вестерн-блоттинге. Такое же явление наблюдалось на стимулированных Т- и В-лимфоцитах мыши и первичных Т-клетках CD4+ человека при стимуляции антителом против CD3. Повышение экспрессии PD-1 вызывает стимуляцию эффекторных Т-клеток и ведет активированные эффекторные Т-клетки в направлении истощенной и пониженной иммунной активации. Таким образом, опосредованные PD-1 ингибиторные сигналы играют ключевую роль в иммунотолерантности.
Повышение экспрессии PD-1 в инфильтрирующих опухоли лимфоцитах (TILs) и экспрессии лигандов PD-1 в опухолевых клетках отмечалось при различных раковых заболеваниях и отмечалось и в других типах тканей и органов, включая легкие, печень, желудок, молочные железы, яичники, поджелудочную железу, меланоциты и пищевод. Чаще всего экспрессия PD-1 и PD-L1 при таких раковых заболеваниях связана с плохим прогнозом по выживаемости пациентов. Важность сигнального пути PD-1 по регуляции иммунной системы для устранения рака или толерантности к раку была более подробно описана на трансгенных мышах, у которых при нокауте генов PD-1 ингибируется рост клеток раковых ксенотрансплантатов.
Повышающая регуляция сигнализации PD-1 приводит к иммуннотолерантной пролиферации рака, а также к вирусным инфекциям и метастазированию у человека. Пандемический вирус гепатита B, HBV и HCV индуцируют гиперэкспрессию лигандов PD-1 в гепатоцитах и активируют сигнализацию PD-1 в эффекторных T-клетках, что ведет к истощению T-клеток и толерантности к вирусной инфекции. Точно так же ВИЧ-инфекция зачастую избегает иммунной системы человека по аналогичному механизму. Сигнализацию PD-1 можно терапевтически модулировать при помощи антагонистических молекул с тем, чтобы иммунные клетки могли излечиться от толерантности и реактивироваться для устранения рака и хронических вирусных инфекций.
Ниволумаб и пембролизумаб, которые являются моноклональными антителами, известны как лекарственные средства, нацеленные на PD-1, и применяются в качестве терапевтических средств при злокачественной меланоме и немелкоклеточном раке легких. Однако сообщалось, что эти препараты ложатся огромным финансовым бременем на пациентов из-за высокой стоимости, и требуется их точная проверка. Следовательно, существует острая потребность в разработке новых терапевтических средств, нацеленных на PD-1, которые могут преодолеть ограниченность традиционных препаратов.
На этом техническом фоне авторы настоящего изобретения приложили усилия для разработки антител для лечения рака, которые специфически связываются с PD-1. В результате они разработали антитела против PD-1, которые связываются с высоким сродством с PD-1, используя технологию фагового дисплея, и обнаружили, что такие антитела против PD-1 могут значительно ингибировать образование комплекса PD-1/PD-L1, и тем самым совершили настоящее изобретение.
Сущность изобретения
Техническая проблема
Итак, одной из целей настоящего изобретения является получение новых антител к PD-1 либо их антигенсвязывающих фрагментов.
Другой целью настоящего изобретения является получение нуклеиновых кислот, кодирующих эти антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты.
Другой целью настоящего изобретения является создание вектора, включающего нуклеиновую кислоту, рекомбинантной клетки, в которую вводится вектор, и способ ее получения.
Еще одной целью настоящего изобретения является получение композиций для профилактики или лечения рака, содержащих эти антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты.
Техническое решение
В соответствии с настоящим изобретением, вышеуказанные и другие цели могут быть достигнуты путем получения антител, связывающихся с PD-1, либо их антиген-связывающего фрагмента, содержащих: вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 1-30, CDR2 тяжелой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 31-56, и CDR3 тяжелой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 57-79; и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 198-222, CDR2 легкой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 223-241, и CDR3 легкой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 242-269.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предусмотрены нуклеиновые кислоты, кодирующие данные антитела или антигенсвязывающие фрагменты.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предусмотрены экспрессионные векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предусмотрены клетки, трансформированные данным экспрессионный вектором.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предусмотрен способ получения антител либо их антигенсвязывающих фрагментов, включающий (a) культивирование клеток и (b) извлечение антител либо их антигенсвязывающих фрагментов из культивированной клетки.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предусмотрены композиции для профилактики или лечения рака, содержащие в качестве активного ингредиента данные антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты.
Краткое описание фигур
Вышеуказанные и другие цели, особенности и другие преимущества настоящего изобретения станут более понятными из следующего подробного описания в сочетании с прилагаемыми чертежами.
На фиг. 1 представлена схематическая диаграмма экспрессионного PD-1 вектора, содержащего Fc человека или Fc мыши, слитый с его карбоксильным концом.
На фиг. 2A-D представлены результаты по очистке белка PD-1, а именно:
на фиг. 2A представлены результаты по идентификации белка в отношении PD1-hFc в 10% геле SDS-PAGE в восстановительных (RE) и невосстановительных (NR) условиях;
на фиг. 2B представлены результаты по SEC-HPLC в G-3000 SWXL при скорости потока 1 мл/мин с использованием PBS в качестве рабочего растворителя;
на фиг. 2C представлены результаты по идентификации белка в отношении PD1-mFc в 10% геле SDS-PAGE в восстановительных (RE) и невосстановительных (NR) условиях;
на фиг. 2D представлены результаты по SEC-HPLC в G-3000 SWXL при скорости потока 1 мл/мин с использованием PBS в качестве рабочего растворителя.
На фиг. 3 представлена способность антител к связыванию с PD-1 в зависимости от количества раундов пэннинга.
На фиг. 4 представлены результаты по ELISA для измерения способности монофагов к связыванию с PD1-His.
На фиг. 5 представлены результаты анализа SDS-PAGE для определения чистоты антител к PD-1.
На фиг. 6 представлены результаты по оценке эффективности антител к PD-1 in vitro.
На фиг. 7 представлены результаты по оценке зависимой от концентрации эффективности антител к PD-1 in vitro.
На фиг. 8 представлена способность антител к зависимому от концентрации связыванию с PD-1 человека, гиперэкспрессированным на клеточной поверхности, на основании средней интенсивности флуоресценции (MFI).
На фиг. 9 представлены результаты по измерению кинетики связывания между PD1-hFc и антителами 45D6 и 49A2 к PD1.
На фиг. 10 представлены результаты скрининга при оптимизации моноклонов.
На фиг. 11 представлен сравнительный анализ степени экспрессии между антителами к PD1 и исходным антителом.
На фиг. 12 представлены результаты по оценке эффективности in vitro в отношении антител к PD1 по настоящему изобретению.
На фиг. 13 представлены результаты по оценке зависимой от концентрации эффективности in vitro антител к PD1 по настоящему изобретению.
На фиг. 14 представлены результаты по идентификации моноклональных антител в отношении связывания выбранных вариантов антител к PD1 с PD-1, экспрессированным на клеточной поверхности.
На фиг. 15 представлены результаты по измерению способности выбранных вариантов антител к PD1 к связыванию с PD-1, экспрессированным на клеточной поверхности.
На фиг. 16 представлены результаты по идентификации при иммуноадсорбции фермента в отношении ингибирующей активности выбранных антител по предотвращению образования комплекса PD-1/PD-L1 или PD-1/PD-L2.
На фиг. 17 представлены результаты по измерению кинетики связывания между белком PD1-hFc и антителами 45D6, 49A2 и 49A2 (2B9).
На фиг. 18 представлена схематическая диаграмма мутантов PD1.
На фиг. 19 представлены результаты по идентификации при иммуноадсорбции фермента в отношении способности выбранных фагов к связыванию с мутантами PD-1, причем при снижении способности к связыванию уменьшается и соответствующая величина.
На фиг. 20 представлены результаты по идентификации при иммуноадсорбции фермента в отношении способности выбранных антител к связыванию с мутантами PD-1.
На фиг. 21 представлены результаты по идентификации при иммуноадсорбции фермента в отношении специфичности связывания.
На фиг. 22 представлены результаты по сравнению продуктивности после краткосрочной экспрессии в клетках HEK293.
На фиг. 23 представлены результаты по идентификации в отношении повышения активности под действием моноклональных антител к PD1 при гетерогенной MLR (реакции смешанных лимфоцитов).
Раскрытие сущности изобретения
Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такие же значения, как те, которые известны специалистам в той области, к которой относится настоящее изобретение. В общем, используемая здесь номенклатура хорошо известна в данной области, обычно она и применяется.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитела, связывающиеся с PD-1, либо их антигенсвязывающий фрагмент, содержащее: вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 1-30, CDR2 тяжелой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 31-56, и CDR3 тяжелой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 57-79; и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 198-222, CDR2 легкой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 223-241, и CDR3 легкой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 242-269.
Авторы настоящего изобретения приложили усилия для разработки антител для химиотерапии, связывающихся с PD-1, который, как известно, экспрессируется при различных формах рака. В результате авторы изобретения получили антитела против PD-1, которые связываются с PD-1 с высоким сродством, используя технологию фагового дисплея, и обнаружили, что такие антитела против PD-1 могут ингибировать активность PD-1.
В настоящем изобретении понятие “белок-1 запрограммированной клеточной смерти (PD-1)” означает сигнальный белок, который функционирует для регуляции активации и функций Т-клеток. При связывании PD-1 из Т-клеток со своим лигандом PD-L1, который экспрессируется в раковых клетках, в микроокружении опухоли активируется сигнальный путь PD-1, который затем индуцирует инактивацию Т-клеток. Это явление встречается при различных формах рака, как-то злокачественной меланоме, немелкоклеточном раке легких и раке почек.
В настоящем изобретении термин “антитело” означает антитело против PD-1, которое специфически связывается с PD-1. В рамки настоящего изобретения входят не только полные антитела, специфически связывающиеся с PD-1, но также и антигенсвязывающий фрагмент молекулы антитела.
Полное антитело означает структуру, содержащую две полноразмерные легкие цепи и две полноразмерные тяжелые цепи, причем каждая легкая цепь связана с соответствующей тяжелой цепью дисульфидной связью. Константная область тяжелой цепи бывает типа гамма (γ), мю (μ), альфа (α), дельта (δ) или эпсилон (ε) и подразделяется на гамма-1 (γ1), гамма-2 (γ2), гамма-3 (γ3), гамма-4 (γ4), альфа-1 (α1) и альфа-2 (α2). Константная область легкой цепи бывает типа каппа (κ) и лямбда (λ).
2
H1
Н1
2
2
Антигенсвязывающий фрагмент антитела или же фрагмент антитела означает такой фрагмент, который по меньшей мере обладает способностью к связыванию антигена, и охватывает Fab, F(ab′), F(ab′) и Fv. Из всех фрагментов антител Fab означает структуру, включающую вариабельную область каждой из тяжелых и легких цепей, константный домен легкой цепи и первый константный домен (C) тяжелой цепи, каждый из которых содержит один антигенсвязывающий сайт. Fab′ отличается от Fab тем, что он дополнительно включает шарнирный участок, содержащий по меньшей мере один остаток цистеина на С-конце домена С тяжелой цепи. F(ab′) образуется по дисульфидной связи между остатками цистеина в шарнирном участке Fab′. Fv – минимальный фрагмент антитела, содержащий только вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, а рекомбинантная технология получения Fv изложена в таких международных публикациях PCT, как WO 88/01649, WO 88/06630, WO 88/07085, WO 88/07086 и WO 88/09344. Двухцепочечный Fv представляет собой фрагмент, в котором вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи связаны нековалентной связью, а одноцепочечный Fv представляет собой фрагмент, в котором вариабельная область тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи обычно связаны ковалентной связью через пептидный линкер или непосредственно связаны на С-конце, образуя димероподобную структуру типа двухцепочечного Fv. Такие фрагменты антител могут быть получены с помощью протеаз (например, Fabs могут быть получены путем рестрикционного расщепления всего антитела папаином, а F(ab′)-фрагмент может быть получен путем рестрикционного расщепления всего антитела пепсином), а также могут быть получены методами генетической рекомбинации.
В одном воплощении антитело по настоящему изобретению представлено в виде Fv (к примеру, scFv), Fab или полного антитела. Кроме того, константная область тяжелой цепи может быть выбрана из изотипов, состоящих из гамма (γ), мю (μ), альфа (α), дельта (δ) или эпсилон (ε). Например, константная область может быть типа гамма-1 (IgG1), гамма-3 (IgG3) или гамма-4 (IgG4). Константная область легкой цепи может быть типа каппа или лямбда.
H
Н1
Н2
Н3
L
L
В настоящем изобретении термин “тяжелая цепь” охватывает как полноразмерную тяжелую цепь, которая включает вариабельный домен (V), аминокислотная последовательность которого содержит достаточную последовательность вариабельной области для придания специфичности к антигену, и три константных домена (С, С и С), так и её фрагмент. В настоящем изобретении термин “легкая цепь” охватывает как полноразмерную легкую цепь, которая включает вариабельный домен (V), содержащий аминокислотную последовательность, содержащую достаточную последовательность вариабельной области для придания специфичности к антигену, и константный домен (C), так и её фрагменты.
Антитела по настоящему изобретению включают, без ограничения, моноклональные антитела, мультиспецифичные антитела, человеческие антитела, гуманизованные антитела, химерные антитела, короткоцепочечные Fv (scFv), короткоцепочечные антитела, Fab-фрагменты, F(ab′)-фрагменты, связанные дисульфидными связями Fv (sdFVs), антиидиотипические (анти-Id) антитела или же эпитоп-связывающие фрагменты таких антител и т.п.
Моноклональные антитела означают одинаковые антитела, исключая возможные природные мутации, причем антитела получены из популяции практически однородных антител, то есть каждое антитело, составляющее эту популяцию, может присутствовать в незначительном количестве. Моноклональные антитела очень специфичны и вырабатываются против одного антигенного сайта.
Нечеловеческие (например, мышиные) антитела “гуманизованной” формы представляют собой химерные антитела, содержащие минимальную последовательность, происходящую не из иммуноглобулина человека. В большинстве случаев гуманизованные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (антитела-реципиенты), у которых остатки из гипервариабельной области реципиента заменены на остатки из гипервариабельной области другого вида, чем человек (донора), как-то мыши, крысы, кролика или приматов, отличных от человека, обладающие требуемой специфичностью, сродством и способностью.
Термин “человеческое антитело” обозначает молекулы, происходящие из иммуноглобулина человека, у которых все аминокислотные последовательности, составляющие антитело, включая определяющие комплементарность участки и структурные участки, состоят из иммуноглобулина человека.
Некоторые части тяжелой цепи и/или легкой цепи идентичны или гомологичны соответствующей последовательности у антител, происходящих из определенного вида или принадлежащих к определенному классу или подклассу антител, тогда как остальные части включают “химерные” антитела (иммуноглобулины), которые идентичны или гомологичны соответствующим последовательностям у антител, происходящих из другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, проявляющие требуемую биологическую активность.
H
L
В настоящем изобретении термин “вариабельный домен антитела” относится к областям легкой и тяжелой цепи молекул антител, включающим аминокислотные последовательности определяющих комплементарность участков (CDR; т.е. CDR1, CDR2 и CDR3) и каркасной области (FR). V означает вариабельный домен тяжелой цепи. V означает вариабельный домен легкой цепи.
Термин “определяющий комплементарность участок” (CDR; т.е. CDR1, CDR2 и CDR3) относится к таким аминокислотным остаткам вариабельного домена антител, которые необходимы для связывания антигена. Каждый вариабельный домен обычно содержит три участка CDR, обозначаемые как CDR1, CDR2 и CDR3.
В настоящем изобретении антитела, связывающиеся с PD-1, либо их антигенсвязывающие фрагменты содержат:
вариабельную область тяжелой цепи, включающую:
CDR1 тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1-30;
CDR2 тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 31-56; и
CDR3 тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 57-79;
а также вариабельную область легкой цепи, включающую:
CDR1 легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 198-222;
CDR2 легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 223-241; и
CDR3 легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 242-269.
В частности, антитела, связывающиеся с PD-1, либо их антигенсвязывающие фрагменты содержат:
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 32 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 2, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 33 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 59;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 2, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 33 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 60;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 2, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 33 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 61;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 2, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 33 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 62;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 3, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 34 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 63;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 4, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 35 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 64;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 5, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 36 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 65;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 6, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 37 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 66;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 32 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 67;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 7, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 38 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 68;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 8, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 39 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 69;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 9, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 40 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 70;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 10, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 41 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 71;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 11, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 42 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 72;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 12, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 43 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 73;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 13, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 44 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 74;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 14, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 45 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 75;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 15, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 46 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 76;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 8, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 47 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 77;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 16, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 48 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 78;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 17, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 49 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 18, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 50 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 19, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 51 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 20, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 52 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 21, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 51 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 22, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 53 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 23, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 49 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 17, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 54 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 24, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 55 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 21, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 51 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 25, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 56 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 26, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 27, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 28, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 29, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 30, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 32 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 79; или
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 32 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57.
Кроме того, антитела, связывающиеся с PD-1, либо их антигенсвязывающие фрагменты содержат:
вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 198, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 223 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 242;
вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 199, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 224 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 243;
вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 200, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 225 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 244;
вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 201, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 226 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 245;
вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 202, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 227 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 246;
вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 203, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 228 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 247;
вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 204, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 229 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 248;
вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 249;
вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 206, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 231 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 250;
вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 207, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 232 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 251;
вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 208, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;
вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 209, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 233 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 253;
вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 210, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 234 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 254;
вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 211, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 235 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 255;
вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 212, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 236 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 256;
вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 213, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 257;
вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 214, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 237 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 258;
вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 215, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 249;
вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 211, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 238 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 259;
вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 216, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 238 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 260;
вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 217, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 239 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 261;
вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 218, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 240 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 262;
вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 219, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 241 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 263;
вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 220, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;
вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 215, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;
вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 264;
вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 265;
вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 221, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 266;
вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;
вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 267;
вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 257;
вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 220, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 267;
вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 222, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 268; или
вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 220, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 269.
А конкретно антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению могут содержать следующие вариабельные области тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи:
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 2, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 33 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 62, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 201, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 226 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 245;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 3, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 34 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 63, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 202, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 227 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 246;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 4, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 35 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 64, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 203, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 228 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 247;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 5, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 36 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 65, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 204, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 229 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 248;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 32 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 249;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 6, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 37 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 66, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 206, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 231 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 250;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 32 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 67, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 207, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 232 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 251;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 208, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 7, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 38 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 68, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 209, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 233 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 253;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 8, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 39 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 69, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 210, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 234 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 254;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 11, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 42 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 72, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 213, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 257;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 3 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 215, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 249;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 13, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 44 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 74, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 211, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 238 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 259;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 15, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 46 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 76, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 217, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 239 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 336; или
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 8, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 47 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 77, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 218, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 240 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 337.
В соответствии с одним воплощением настоящего изобретения, антитела далее подвергаются скринингу по процедуре оптимизации, причем антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты по изобретению могут содержать следующие вариабельные области тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи:
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 17, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 49 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 220, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 18, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 50 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 215, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 19, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 51 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 218, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 240 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 337;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 20, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 52 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 264;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 21, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 51 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 265;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 22, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 53 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 221, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 266;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 23, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 49 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 17, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 54 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 215, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 249;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 24, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 55 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 267;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 21, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 51 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 220, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 221, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 266;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 215, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 220, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 215, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 25, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 56 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 257;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 26, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 220, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 267;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 27, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 28, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 29, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252; или
вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 30, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 220, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 267.
Термин “каркасный участок” (FR) относится к остаткам вариабельного домена, отличным от остатков CDR. Каждый вариабельный домен обычно содержит четыре FR, обозначаемых как FR1, FR2, FR3 и FR4.
В соответствии с одним воплощением настоящего изобретения, антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты могут включать в себя:
FR1 вариабельной области тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 80-95;
FR2 вариабельной области тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 96-113;
FR3 вариабельной области тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 114-134; и
FR4 вариабельной области тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 135-145.
Кроме того, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может включать:
FR1 вариабельной области легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 270-294;
FR2 вариабельной области легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 295-315;
FR3 вариабельной области легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 316-355; и
FR4 вариабельной области легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 356-367.
Фрагмент “Fv” представляет собой фрагмент антитела, содержащий полные сайты распознавания и связывания антител. Такая область включает димер, к примеру, scFv, который состоит из одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи, весьма крепко связанных ковалентно друг с другом.
H1
“Fab”-фрагмент содержит вариабельный и константный домены легкой цепи и вариабельный и первый константный домен (C) тяжелой цепи. F(ab′)2-фрагмент антител обычно включает пару Fab-фрагментов, ковалентно связанных через шарнирный цистеин, расположенный между ними вблизи карбоксильного конца.
H
L
H
L
“Одноцепочечный Fv” или “scFv”-фрагмент антитела включает домены V и V антитела, причем эти домены присутствуют в виде одной полипептидной цепи. Полипептид Fv может дополнительно содержать полипептидный линкер между доменом V и доменом V для того, чтобы scFv образовывал структуру, необходимую для связывания антигена.
-5
-12
-6
-12
-7
-12
-8
-12
-9
-12
-5
-11
-6
-11
-7
-11
-8
-11
-9
-11
-10
-11
-5
-10
-6
-10
-7
-10
-8
-10
-9
-10
-5
-9
-6
-9
-7
-9
-8
-9
-5
-8
-6
-8
-7
-8
-5
-7
-6
-7
-5
-6
Антитела к PD-1 являются моновалентными или бивалентными и включают в себя короткие или двойные цепи. Функционально, сродство связывания антител к PD-1 составляет от 10 M до 10 M. К примеру, сродство связывания антител к PD-1 составляет от 10 M до 10 M, от 10 M до 10 M, от 10 M до 10 M, от 10 M до 10 M, от 10 M до 10 M, от 10 M до 10 M, от 10 M до 10 M, от 10 M до 10 M, от 10 M до 10 M, от 10 M до 10 M, от 10 M до 10 M, от 10 M до 10 M, от 10 M до 10 M, от 10 M до 10 M, от 10 M to 10 M, от 10 M to 10 M, от 10 M до 10 M, от 10 M to 10 M, 10 M до 10 M, 10 M до 10 M, 10 M до 10 M, от 10 M до 10 M, от 10 M до 10 M, от 10 M до 10 M или от 10 M до 10 M.
Антитела, связывающиеся с PD-1, либо их антигенсвязывающие фрагменты могут содержать вариабельную область тяжелой цепи, включающую последовательность, которая на 90% или больше идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 146-193. Антитела, связывающиеся с PD-1, либо их антигенсвязывающие фрагменты могут содержать вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 146-193. В одном воплощении настоящего изобретения антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты могут содержать вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 163, 165, 166, 168, 169 или 171-188.
Кроме того, антитела, связывающиеся с PD-1, либо их антигенсвязывающие фрагменты могут содержать вариабельную область легкой цепи, включающую последовательность, которая на 90% или больше идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 368-420. Антитело, связывающееся с PD-1, либо его антигенсвязывающий фрагмент может содержать вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 368-420. В одном воплощении настоящего изобретения антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты могут содержать вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 371-380, 383, 385, 386, 388, 389 или 391-415.
В одном конкретном воплощении настоящего изобретения антитела, связывающиеся с PD-1, либо их антигенсвязывающие фрагменты могут включать в себя:
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 151 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 371;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 152 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 372;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 153 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 373;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 154 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 374;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 155 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 375;
вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 156 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 376;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 157 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 377;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 158 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 378;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 159 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 379;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 160 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 380;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 163 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 383;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 165 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 385;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 166 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 386;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 168 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 388;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 169 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 389;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 171 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 391;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 172 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 392;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 173 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 393;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 174 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 394;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 175 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 395;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 176 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 396;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 177 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 397;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 178 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 398;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 179 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 399;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 180 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 400;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 181 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 401;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 181 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 402;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 181 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 403;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 181 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 404;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 181 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 405;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 182 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 406;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 182 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 407;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 182 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 408;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 182 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 409;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 183 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 410;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 184 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 411;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 185 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 412;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 186 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 413;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 187 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 414; или
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 188 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 415.
В другом конкретном воплощении настоящего изобретения антитела, связывающиеся с PD-1, либо их антигенсвязывающие фрагменты могут включать в себя:
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 155 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 375;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 158 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 378;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 165 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 385;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 171 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 391;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 175 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 395;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 176 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 396;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 178 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 398;
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 181 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 401; или
вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 181 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 405.
Часть, представленная X или Xaa в последовательности по настоящему изобретению, означает неопределенную аминокислоту и указывает, что здесь может находиться любая аминокислота.
“Фаговый дисплей” представляет собой метод выставления мутантных полипептидов в виде слитых белков с по меньшей мере частью белка оболочки, к примеру, на поверхности частиц фага, к примеру, филаментного фага. Полезность фагового дисплея состоит в быстрой и эффективной классификации тех последовательностей, которые связываются с целевыми антигенами с высоким сродством, в больших библиотеках рандомизованных мутантов белка. Выставление пептидов и библиотек белков на фагах применяется для скрининга миллионов полипептидов с тем, чтобы идентифицировать полипептиды с определенными свойствами связывания.
Технология фагового дисплея оказалась мощным инструментом для создания и скрининга новых белков, связывающихся с определенными лигандами (например, антигенами). По технологии фагового дисплея можно создавать большие библиотеки мутантов белка и быстро классифицировать последовательности, связывающиеся с целевыми антигенами с высоким сродством. Нуклеиновую кислоту, кодирующую мутантные полипептиды, сливают с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей белки оболочки вируса, например, белки гена III или белки гена VIII. Разработана монофазная система фагового дисплея, в которой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей белок или полипептид, сливается с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей часть белка гена III. В монофазной системе дисплея слитый ген экспрессируется на низком уровне, также экспрессируется белок гена III дикого типа, при этом сохраняется инфекционность частиц.
При разработке библиотек антител типа фагового дисплея важно продемонстрировать экспрессию пептидов на поверхности филаментного фага и экспрессию функциональных фрагментов антител в периферической цитоплазме E. coli. Библиотеки антител либо антигенсвязывающих полипептидов получают рядом методов, к примеру, путем модификации одного гена при вставке случайной последовательности ДНК или клонирования последовательности родственного гена. Библиотеки можно подвергать скринингу на экспрессию антител или антигенсвязывающих белков с требуемыми характеристиками.
Технология фагового дисплея имеет ряд преимуществ перед стандартными гибридомными и рекомбинантными методами получения антител с нужными характеристиками. Этот метод обеспечивает получение больших библиотек антител с разнообразными последовательностями за короткое время без использования животных. Для получения гибридом и получения гуманизованных антител может потребоваться время в несколько месяцев. Кроме того, поскольку иммунитет не требуется, то фаговые библиотеки антител могут вырабатывать антитела против антигенов, которые являются токсичными или обладают слабой антигенностью. Фаговые библиотеки антител также можно использовать для получения и идентификации новых терапевтических антител.
Можно использовать методы получения человеческих антител от неиммунизованных людей, из гаметных последовательностей или Ig-репертуаров наивных В-клеток, которых иммунизировали с помощью библиотек фагового дисплея. Можно использовать различные лимфатические ткани для получения библиотек нативных или неиммуногенных антигенсвязывающих полипептидов.
Для выделения новых терапевтических антител важны методы идентификации и выделения антител с высоким сродством из библиотек фагового дисплея. Выделение антител с высоким сродством из библиотек может зависеть от размера библиотеки, эффективности продукции в бактериальных клетках и разнообразия библиотек. Размер библиотек уменьшается при неэффективной укладке антител или антигенсвязывающих белков и неэффективной продукции из-за присутствия стоп-кодона. Экспрессия в бактериальных клетках может ингибироваться при неправильной укладке антител или антигенсвязывающего домена. Экспрессия может быть улучшена путем попеременного мутирования остатков на поверхности границ вариабельных/константных областей или выбранных остатков CDR. Последовательность каркасной области является тем элементом, который обеспечивает надлежащую укладку при получении фаговых библиотек антител в бактериальных клетках.
При выделении антител с высоким сродством важно создавать разнообразные библиотеки антител или антигенсвязывающих белков. Участки CDR3, как оказалось, зачастую участвуют в связывании антигена. Поскольку участки CDR3 в тяжелой цепи значительно различаются по размерам, последовательности и структурно-пространственной морфологии, то с их помощью можно получать разнообразные библиотеки.
Кроме того, можно создавать разнообразие путем рандомизации участков CDR у вариабельных тяжелых и легких цепей, используя все 20 аминокислот в каждом положении. Использование всех 20 аминокислот ведет к получению последовательностей антител с повышенным разнообразием и повышенной вероятностью выявления новых антител.
Антитела или фрагменты антител по настоящему изобретению могут включать в себя описанные здесь последовательности антител против PD-1 по настоящему изобретению, а также их биологические эквиваленты, если только эти антитела или фрагменты антител могут специфически распознавать PD-1. Например, в аминокислотной последовательности антитела могут производиться дополнительные вариации с тем, чтобы еще больше улучшить сродство связывания и/или другие биологические свойства антитела. Такие вариации включают, к примеру, делеции, вставки и/или замены остатков в аминокислотной последовательности антитела. Такие вариации аминокислот проводятся на основании относительного сходства (идентичности) заместителей в боковой цепи аминокислот типа гидрофобности, гидрофильности, заряда или размера. Анализ размеров, формы и типа заместителей в боковой цепи аминокислот показывает, что аргинин, лизин и гистидин являются положительно заряженными остатками, аланин, глицин и серин имеют близкие размеры, а фенилаланин, триптофан и тирозин имеют близкие формы. Так, исходя из этих соображений, аргинин, лизин и гистидин; аланин, глицин и серин; фенилаланин, триптофан и тирозин считаются биологически функционально эквивалентными.
В другом аспекте настоящее изобретение касается нуклеиновых кислот, кодирующих антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты.
Антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены рекомбинантным способом путем выделения нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело либо его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению. Нуклеиновую кислоту выделяют и вставляют в реплицирующийся вектор для дальнейшего клонирования (амплификации ДНК) или дальнейшей экспрессии. Исходя из этого, в другом аспекте настоящее изобретение касается векторов, содержащих нуклеиновые кислоты.
Термин “нуклеиновая кислота” служит для обозначения молекул ДНК (гДНК и кДНК) и РНК, а нуклеотиды, которые являются основными составляющими единицами нуклеиновой кислоты, включают как нуклеотиды природного происхождения, так и их аналоги, у которых модифицированы молекулы сахаридов или оснований. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельные области тяжелой и легкой цепи по настоящему изобретению, может варьироваться. Такие вариации включают добавление, делеции или неконсервативные либо консервативные замены нуклеотидов.
Аминокислотная последовательность антител или их антигенсвязывающих фрагмента либо кодирующей их нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению также может включать в себя последовательности, проявляющие существенную идентичность с последовательностью, приведенной в соответствующем SEQ ID NO. Термин “последовательность, проявляющая существенную идентичность” означает такую последовательность, которая проявляет идентичность по меньшей мере на 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95%, 96% и более, 97% и более, 98% и более или 99% и более при совмещении последовательности по настоящему изобретению таким образом, чтобы она как можно больше соответствовала какой-либо другой последовательности, и анализе совмещенных последовательностей с помощью алгоритма, который обычно используется в данной области.
Исходя из этого, антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению могут проявлять идентичность последовательности на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% и больше. Такая идентичность определяется путем сравнения и/или совмещения последовательностей методами, известными в данной области. Например, степень идентичности последовательности нуклеиновой кислоты или белка по настоящему изобретению можно определить с помощью алгоритма сравнения последовательностей (т.е. BLAST или BLAST 2.0), совмещения вручную или визуального осмотра.
ДНК, кодирующая антитело, может быть легко выделена или синтезирована по стандартной методике (например, с помощью олигонуклеотидного зонда, специфически связывающегося с ДНК, кодирующей тяжелые и легкие цепи антитела). Доступны различные векторы. Компоненты векторов обычно включают, без ограничения, один или несколько из следующих компонентов: сигнальные последовательности, точки начала репликации, один или несколько маркерных генов, элементы энхансеров, промоторы и последовательности терминации транскрипции.
В настоящем изобретении термин “вектор” означает средство для экспрессии целевых генов в клетках хозяина и включает: плазмидные векторы; космидные векторы; и вирусные векторы, как-то бактериофаговые векторы, аденовирусные векторы, ретровирусные векторы и аденоассоциированные вирусные векторы. Нуклеиновая кислота, кодирующая антитело в векторе, оперативно связана с промотором.
Термин “оперативно связанный” означает функциональную связь между последовательностью, регулирующей экспрессию нуклеиновой кислоты (например, промотором, сигнальной последовательностью или набором сайтов связывания регуляторов транскрипции), и другой последовательностью нуклеиновой кислоты, которая регулируется при транскрипции и/или трансляции последовательности нуклеиновой кислоты.
При использовании в качестве хозяина прокариотических клеток вектор обычно содержит сильный промотор, способный осуществлять транскрипцию (как-то промотор tac, промотор lac, промотор lacUV5, промотор lpp, промотор pLλ, промотор pRλ, промотор rac5, промотор amp, промотор recA, промотор SP6, промотор trp или промотор T7), сайт связывания рибосомы для инициации трансляции и последовательность терминации транскрипции/трансляции. Кроме того, к примеру, при использовании в качестве хозяина эукариотических клеток вектор содержит промотор (например, промотор металлотионеина, промотор β-актина, промотор гемоглобина человека или промотор мышечного креатина человека), полученный из генома клеток млекопитающих, промотор, происходящий из вируса животных, как-то поздний промотор аденовируса, промотор 7.5K вируса коровьей оспы, промотор SV40, промотор цитомегаловируса (CMV), tk-промотор HSV, промотор вируса опухоли молочной железы мыши (MMTV), промотор LTR ВИЧ, промотор вируса Молони, промотор вируса Эпштейна-Барра (EBV) и промотор вируса саркомы Рауса (RSV), а также обычно содержит последовательность полиаденилирования в качестве последовательности терминации транскрипции.
Необязательно вектор может быть слит с другой последовательностью для облегчения очистки экспрессируемых из него антител. Последовательности для слияния включают, к примеру, глутатион-S-трансферазу (Pharmacia, USA), мальтозосвязывающий белок (NEB, USA), FLAG (IBI, USA), 6xHis (гексагистидин; Quiagen, USA) и др.
Векторы содержат гены устойчивости к антибиотикам, обычно используемые в данной области в качестве отборочных маркеров, примеры которых включают гены устойчивости к ампициллину, гентамицину, карбенициллину, хлорамфениколу, стрептомицину, канамицину, генетицину, неомицину и тетрациклину.
В другом аспекте настоящее изобретение касается клеток, трансформированных вышеупомянутыми векторами. Клетки, используемые для получения антител по настоящему изобретению, могут представлять собой прокариотические клетки, дрожжевые клетки или высшие эукариотические клетки, без ограничения.
Можно использовать штаммы из рода Bacillus типа Escherichia coli, Bacillus subtilis и Bacillus tuligensis, Streptomyces, Pseudomonas (к примеру, Pseudomonas putida) и такие прокариотические клетки хозяина, как Proteus mirabilis и Staphylococcus (к примеру, Staphylococcus carnosus).
Наибольший интерес представляют клетки животных, а примеры полезных линий клеток хозяина включают, без ограничения, COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S или HT1080.
В другом аспекте настоящее изобретение касается способа получения антител либо их антигенсвязывающих фрагментов, включающего: (a) культивирование клетки; и (b) выделение антител либо их антигенсвязывающих фрагментов из культивированной клетки.
Клетки можно культивировать в различных средах. В качестве культуральной среды можно использовать любые коммерчески доступные среды без ограничения. Все другие необходимые добавки, хорошо известные специалистам в данной области, могут быть включены в соответствующих концентрациях. Условия культивирования типа температуры и pH уже использовались с выбранными для экспрессии клетками хозяина и должны быть известны специалистам в данной области.
В настоящем изобретении термин “трансформация” означает введение вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую целевой белок, в клетки хозяина с тем, чтобы кодируемый нуклеиновой кислотой белок мог экспрессироваться в клетках хозяина. Трансформирующая нуклеиновая кислота охватывает и трансформирующую нуклеиновую кислоту, вставленную и встроившуюся в хромосому клетки хозяина, так и трансформирующую нуклеиновую кислоту, расположенную вне хромосом, если только она может экспрессироваться в клетках хозяина. Кроме того, нуклеиновая кислота включает ДНК и РНК, кодирующие целевой белок. Нуклеиновая кислота может быть введена в любой форме, если только она может вводиться в клетки хозяина и экспрессироваться в них. Например, нуклеиновая кислота может быть введена в клетки хозяина в виде экспрессионной кассеты, которая представляет собой генную конструкцию, содержащую все элементы, необходимые для самостоятельной экспрессии. Экспрессионная кассета обычно включает промотор, сигнал терминации транскрипции, сайт связывания рибосомы и сигнал терминации трансляции, которые функционально связаны с нуклеиновой кислотой. Экспрессионной кассета может иметь вид экспрессионного вектора, обеспечивающего саморепликацию. Нуклеиновая кислота также может быть введена в клетки хозяина в своем собственном виде и функционально связана с последовательностью, необходимой для экспрессии в клетках хозяина.
Извлечение антител либо их антигенсвязывающих фрагментов может проводиться, к примеру, путем центрифугирования или ультрафильтрации для удаления примесей и очистки полученного препарата, к примеру, методом аффинной хроматографии. Можно использовать и другие методы очистки типа анионообменной или катионообменной хроматографии, хроматографии гидрофобных взаимодействий, хроматографии на гидроксиапатите и др.
В другом аспекте настоящее изобретение касается получение композиций для профилактики или лечения рака, содержащих антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты в качестве активного ингредиента.
Настоящим изобретением предусмотрены, к примеру, композиции для профилактики или лечения рака, содержащие: (a) фармацевтически эффективное количество антитела к PD-1 или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению; и (b) фармацевтически приемлемый носитель. Настоящим изобретением также предусмотрен способ профилактики или лечения рака, включающий введение антител к PD-1 либо их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению в эффективном количестве, необходимом для пациента.
В настоящем изобретении рак предпочтительно выбирают из группы, состоящей из меланомы, рака легких, рака печени, глиоцитомы, рака яичников, рака толстой кишки, рака головы и шеи, рака мочевого пузыря, рака почек, рака желудка, рака молочной железы, метастатического рака, лимфомы Ходжкина, рака простаты и рака поджелудочной железы, не ограничиваясь этим.
В настоящем изобретении термин “лечение” означает подавление или облегчение рака либо вызванного им одного или нескольких симптомов, а также предотвращение прогрессирования рака или такое лечение рака, которое нормализирует симптомы заболевания, путем введения композиции, а термин “предотвращение” означает любое действие, которое тормозит или замедляет прогрессирование рака путем введения композиции. В настоящем изобретении профилактика или лечение рака происходит путем связывания между антителом, полученным по настоящему изобретению, и PD-1. Антитело, которое связывается с PD-1, значительно ингибирует активность PD-1, тем самым вызывая предотвращение или лечение рака.
Термин “фармацевтически приемлемый носитель” в настоящем изобретении означает такой носитель или разбавитель, который не нарушает биологическую активность или свойства вводимого соединения и не вызывает раздражения в организме. Для композиций, составленных в виде жидких растворов, приемлемыми фармацевтическими носителями являются стерилизованные и биосовместимые, а их примеры включают солевые растворы, стерильную воду, раствор Рингера, забуференные солевые растворы, растворы для инъекций с альбумином, растворы декстрозы, растворы мальтодекстрина, глицерин, этанол и смеси одного или нескольких из них. При необходимости можно добавлять и другие стандартные добавки типа антиоксидантов, буферов и бактериостатических средств. Кроме того, при составлении растворов для инъекций типа водных растворов, суспензий и эмульсий, пилюль, капсул, гранул или таблеток можно еще добавлять разбавители, диспергаторы, поверхностно-активные вещества, связующие и смазывающие вещества.
Композиции для профилактики или лечения рака, содержащие антитела и фармацевтически приемлемый носитель, можно вносить в лекарственные формы, содержащие их в качестве активного ингредиента, в виде препаратов для перорального или парентерального введения. Фармацевтические формы могут включать препараты, подходящие для перорального, ректального, назального, местного (в том числе защечного и подъязычного), подкожного, вагинального или парентерального (в том числе внутримышечного, подкожного и внутривенного) введения либо ингаляции или инсуффляции.
Примеры лекарственных форм для перорального введения, содержащих композиции по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, включают таблетки, пастилки, леденцы, водные или масляные суспензии, готовые порошки или гранулы, эмульсии, твердые или мягкие капсулы, сиропы или эликсиры. Для получения таких форм, как таблетки и капсулы, можно включать связующие вещества, такие как лактоза, сахароза, сорбит, маннит, крахмал, амилопектин, целлюлоза или желатин, эксципиенты типа дикальцийфосфата, разрыхлители типа кукурузного или картофельного крахмала, смазывающие вещества типа стеарата кальция, стеарилфумарата натрия или полиэтиленгликолевого воска, а капсульные формы могут дополнительно содержать жидкий носитель типа жирного масла, в дополнение к вышеупомянутым ингредиентам.
Примеры форм для парентерального введения, содержащих композиции настоящего изобретения в качестве активного ингредиента, включают формы для инъекций типа подкожных инъекций, внутривенных инъекций или внутримышечных инъекций, свечи или формы для распыления типа аэрозолей, вдыхаемых через дыхательный аппарат. Для получения форм для инъекций можно смешивать композиции настоящего изобретения в воде со стабилизаторами или буферами для приготовления растворов или суспензий, а растворы или суспензии можно составлять для введения на основе ампул или флаконов. Для введения в виде свечей можно составлять композиции для ректального введения типа свечей или препаратов для клизмы, содержащих стандартную основу для свечей типа масла какао или других глицеридов. Для распылительных форм типа аэрозолей можно вводить добавки типа вытеснителей с тем, чтобы диспергировался воднодисперсный концентрат или влажный порошок.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на способы профилактики или лечения рака, включающие введение композиций для предотвращения или лечения рака, содержащих антитела.
В настоящем изобретении термин “введение” означает введение пациентам фармацевтических композиций по настоящему изобретению любым подходящим способом. Способы введения композиций настоящего изобретения могут быть любыми, включая пероральное или парентеральное введение. В частности, фармацевтические композиции можно вводить стандартным способом типа перорального, ректального, местного, внутривенного, внутрибрюшинного, внутримышечного, внутриартериального, трансдермального, интраназального, ингаляционного, глазного или интрадермального введения.
Способ лечения по настоящему изобретению включает введение фармацевтически эффективного количества композиции для профилактики или лечения рака по настоящему изобретению. Специалистам в данной области должно быть известно, что подходящая общая суточная доза может быть определена по суждению медицинского специалиста. Конкретное терапевтически эффективное количество для определенного пациента предпочтительно зависит от многих факторов, включая тип и степень достигаемой реакции, а также от присутствия других используемых средств, конкретной композиции и возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола, диеты пациента, времени введения, способа введения и скорости выведения композиции, продолжительности лечения и препаратов, используемых в сочетании или одновременно с данной композицией, и других подобных факторов, хорошо известных в области фармацевтики. Поэтому эффективное количество композиции для профилактики или лечения рака, которое подходит для цели настоящего изобретения, предпочтительно определяется с учетом вышеприведенных факторов.
Кроме того, способ лечения по настоящему изобретению может применяться к любым животным, у которых могут возникать такие заболевания, как опухоли и неоваскуляризация вследствие чрезмерной активности PD-1, причем животные включают людей и приматов, а также домашний скот типа коров, свиней, овец, лошадей, собак и кошек.
В другом аспекте настоящее изобретение касается композиций для диагностики рака, содержащих антитела к PD-1 либо их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению. Кроме того, настоящее изобретение касается способа диагностики рака путем обработки антителами к PD-1 либо их антигенсвязывающими фрагментами по настоящему изобретению.
Рак можно диагностировать путем измерения уровня экспрессии PD-1 в образцах с помощью антител к PD-1 по настоящему изобретению. Уровень экспрессии может быть измерен стандартным методом иммуноанализа, включая, без ограничения, методы радиоиммуноанализа, радиоиммунопреципитации, иммунопреципитации, иммуногистохимического окрашивания, иммуноферментного анализа (ELISA), ELISA с захватом, анализа ингибирования или конкуренции, сэндвич-анализа, проточной цитометрии, иммунофлуоресцентного окрашивания и иммуноаффинной очистки с помощью антител к PD-1.
Рак можно диагностировать путем анализа интенсивности конечного сигнала в процессе иммуноанализа. А именно, рак диагностируется тогда, когда в биологическом образце сильно экспрессируется белок маркера по настоящему изобретению, при этом сигнал от биологического образца будет более сильным, чем у нормального биологического образца (к примеру, нормальной ткани желудка, крови, плазмы или сыворотки).
В другом аспекте настоящее изобретение касается наборов для диагностики рака, содержащих композиции для диагностики рака. Наборы по настоящему изобретению содержат антитела к PD-1 по настоящему изобретению, а рак диагностируется путем анализа сигнала, возникающего при реакции между образцом и антителом. Сигналы могут включать, без ограничения, конъюгированные с антителами ферменты типа щелочной фосфатазы, β-галактозидазы, пероксидазы хрена, люциферазы или цитохрома P450. В том случае, когда в качестве фермента используется щелочная фосфатаза, в качестве субстрата для фермента используется хромогенный субстрат реакции, как-то бромхлориндолфосфат (BCIP), нитросиний тетразолий (NBT), нафтол-AS-B1-фосфат или ECF (для усиления хемифлуоресценции), а при использовании пероксидазы хрена используется такой субстрат, как хлорнафтол, аминоэтилкарбазол, диаминобензидин, D-люциферин, люцигенин (бис-N-метилакридиния нитрат), бензиловый эфир резоруфина, люминол, реагент Amplex Red (10-ацетил-3,7-дигидроксифеноксазин), HYR (п-фенилендиамин-HCl и пирокатехол), TMB (тетраметилбензидин), ABTS (2,2′-азин-ди[3-этилбензтиазолинсульфонат]), о-фенилендиамин (OPD) и нафтол/пиронин, глюкозооксидаза, t-NBT (нитросиний тетразолий) или m-PMS (феназин метосульфат), но настоящее изобретение этим не ограничивается.
14
125
32
35
Кроме того, набор по настоящему изобретению также может включать метку для генерирования детектируемого сигнала, а метка может означать химическое вещество (например, биотин), фермент (щелочная фосфатаза, β-галактозидаза, пероксидаза хрена или цитохром P450), радиоактивное вещество (типа C, I, P и S), флуоресцентное вещество (типа флуоресцеина), люминесцентное вещество, хемилюминесцентное вещество и FRET (флуоресцентно-резонансный перенос энергии), без ограничения.
Измерение активности фермента, используемого для диагностики рака или измерения сигнала, может проводиться различными способами, известными в данной области. Таким образом, можно качественно или количественно анализировать экспрессию PD-1.
Примеры
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно с привлечением примеров. Однако специалистам в данной области должно быть ясно, что эти примеры приводятся только для иллюстрации настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения.
Пример 1. Экспрессия и очистка антигена PD-1
1. Получение векторов для экспрессии белка PD-1
Для клонирования PD-1 проводили амплификацию методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью праймеров для PD1, содержащих сайты для рестрикционного фермента SfiI на 5′- и 3′-концах (таблица 1), с тем чтобы получить только внеклеточный домен, используя библиотеки кДНК в клетах Jurkat (Stratagene, USA). Амплифицированный продукт ПЦР получали путем слияния Fc человека (SEQ ID NO: 196) и Fc мыши (SEQ ID NO: 197) с карбоксильным концом с помощью вектора N293F (фиг. 1).
Таблица 1
Название
Последовательность 5′−>3′
SEQ ID NO:
PD1-F
CCAGGATGGTTCTTAGACTCCCC
194
PD1-R
CACCAGGGTTTGGAACTGGC
195
2. Экспрессия и очистка антигена PD-1
6
2
Для того, чтобы экспрессировать антиген в клетках животных, клетки HEK293F трансфецировали плазмидной ДНК. Готовили реакционный раствор полиплекса для трансфекции путем смешивания 25 мкг плазмидной ДНК с 3 мл экспрессионной среды Freestyle 293, а затем в полученную смесь добавляли 2 мг/мл PET (полиэтиленимин, PolyplusA-transfection, USA) и опять перемешивали. Реакционный раствор полиплекса инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин, а затем культивировали в 40 мл культуральной среды при концентрации 1×10 клеток/мл в течение 24 часов при 37°C и 8% CO при 120 об/мин. Через 24 часа после трансфекции добавляли Soytone (BD, USA) в качестве добавки до конечной концентрации 10 г/л. Антитела получали в системе краткосрочной экспрессии в клетках HEK293F в течение 7 дней. Для выделения антигена из культурального раствора проводили аффинную хроматографию. Получали супернатант центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин для удаления клеток и обломков клеток из культуральной среды, извлеченной на 7-й день. Супернатант подвергали реакции с промытой DPBS агарозной смолой с рекомбинантным белком A при 4°C в течение 16 часов.
При использовании агарозной смолы с рекомбинантным белком A для проведения первичной очистки белок элюировали 0,1 М глицином и нейтрализировали 500 мкл 1М трис-HCl. После первичной очистки белок подвергали вторичной очистке методом гель-фильтрационной хроматографии на Superdex 200 (1,5 см ×100 см).
Чистоту очищенного белка определяли методом SDS-PAGE и эксклюзионной хроматографии [TSK-GEL G-3000 SWXL для эксклюзионной хроматографии (SEC) (Tosoh)].
В результате было установлено, что очищенный белок PD1 имеет чистоту в 95% или больше, как видно из фиг. 2А–2D.
Пример 2. Скрининг человеческих антител против PD-1
1. Подготовка антигенов
В качестве белковых антигенов PD1-hFc и PD1-mFc, полученные в примере 1, и PD1-his (кат. № 10377-H08H), приобретенный у Sino Biological Inc., фиксировали в дозе 50 мкг на иммуносорбционных пробирках, а затем блокировали.
2. Биопэннинг (просеивание)
10
Получали фаговую библиотеку человеческих антител путем инфицирования бактерий библиотекой scFv человека с разнообразием в 2,7×10, а затем культивирования при 30°C в течение 16 ч. Культуральный раствор после культивирования центрифугировали, а супернатант концентрировали с помощью PEG и затем растворяли в буфере PBS для получения библиотеки человеческих антител. Фаговую библиотеку человеческих антител вносили в иммунологическую пробирку и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. После отмывки 1 раз PBS/T и 1 раз PBS элюировались только scFv-фаги, специфически связавшиеся с антигеном.
Элюированными фагами опять инфицировали E. coli и проводили амплификацию (процесс пэннинга), получая пул положительных фагов. Проводили второй и третий раунд пэннинга, используя фаги, амплифицированные в первом раунде пэннинга, таким же образом, как описано выше, за исключением того, что увеличилось только количество стадий промывки PBST.
В результате, как видно из таблицы 2, оказалось, что количество фагов, связавшихся с антигеном (на выходе) при третьем раунде пэннинга, намного повысилось по сравнению с количеством фагов на входе.
Таблица 2
Раунд пэннинга
Количество фагов на входе
Количество фагов на выходе
1
2,0×10<sup>13</sup>
3,6×10<sup>7</sup>
2
1,2×10<sup>13</sup>
7,0×10<sup>7</sup>
3
2,0×10<sup>13</sup>
2,0×10<sup>9</sup>
3. Полифаговый ELISA
Проводили полифаговый ELISA (иммуноферментный анализ) для изучения специфичности к антигенам у пула положительных к поли-scFv-фагам антител, полученных при каждом раунде процесса пэннинга в Примере 2.
2
600
600
2
Исходные клетки, замороженные после каждого из трех раундов пэннинга, вносили в среду, содержащую 5 мл 2×YTCM, 2% глюкозы и 5 мМ MgCl, до значения OD = 0,1, а затем культивировали при 37°C в течение 2-3 часов (OD = 0,5-0,7). Клетки инфицировали фагом-помощником M1 и культивировали в среде, содержащей 2×YTCMK, 5 мМ MgCl и 1 мМ IPTG при 30°C в течение 16 ч. Культивируемые клетки центрифугировали (4500 об/мин, 15 мин, 4°С), а супернатанты переносили в новые пробирки (поли-scFv-фаги от каждого из трех пэннингов). На 96-луночных иммунопланшетах (NUNC 439454) фиксировали по два вида антигенов при плотности 100 нг на лунку в буфере для покрытия при 4°C в течение 16 часов, а затем каждую лунку блокировали раствором PBS с 4% обезжиренного молока.
Лунки промывали 0,2 мл PBS/T, в каждую лунку добавляли по 100 мкл поли-scFv-фагов от каждого из трех пэннингов и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Каждую лунку снова промывали 4 раза по 0,2 мл PBS/T, добавляли вторичное антитело против M13-HRP (Amersham, 27-9421-01) в разведении 1:2000 и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывки PBS/T растворяли таблетки OPD (Sigma, 8787-TAB) в буфере PC и полученный раствор добавляли в лунки по 100 мкл на лунку, индуцируя развитие окраски в течение 10 мин. Затем измеряли поглощение при 490 нм на спектрофотометре (Molecular Devices).
Результаты представлены на фиг. 3. Как видно из фиг. 3, анализ по ELISA показал, что у третьих поли-scFv-фагов повышается способность к связыванию с двумя антигенами PD-1.
4. Скрининг положительных фагов
2
600
600
2
Колонии, полученные из группы поликлональных фаговых антител (из третьего пэннинга) с высокой способностью к связыванию, культивировали в 96-луночном планшете с глубокими лунками на 1 мл (Bioneer, 90030) при 37°C в течение 16 часов. По 100-200 мкл выращенных при этом клеток вносили в среду, содержащую 2×YTCM, 2% глюкозы и 5 мМ MgCl, до значения OD = 0,1, и добавляли в среду, содержащую 1 мл 2 х YTCM, 2% глюкозы и 5 мМ MgCl2, а затем культивировали в глубоком 96-луночном планшете при 37°C в течение 2-3 часов до OD = 0,5-0,7. Клетки инфицировали фагом-помощником M1 при MOI 1:20 и культивировали в среде, содержащей 2×YTCMK, 5 мМ MgCl, 1 мМ IPTG при 30°C в течение 16 часов.
На 96-луночных иммунопланшетах фиксировали антиген PD1 при плотности 100 нг на лунку при 4°C в течение 16 ч, а затем каждую лунку блокировали раствором PBS с 4% обезжиренного молока. В каждую лунку вносили по 100 мкл моноклонального scFv-фага (100 scFv-фагов) после промывки 0,2 мл PBS/T и культивирования в течение 16 часов и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Лунки опять промывали 4 раза по 0,2 мл PBS/T, добавляли вторичное антитело против M13-HRP в разведении 1:2000 и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывки 0,2 мл PBS/T проводили развитие окраски и измеряли поглощение при 490 нм.
В результате, как видно из фиг. 4, было получено в общей сложности несколько десятков одиночных фаговых клонов для PD1 в виде моноклонов с высокой способностью к связыванию с каждым антигеном.
5. Анализ нуклеотидных последовательностей положительных фаговых антител
H
L
Из отобранных одиночных клонов выделяли ДНК с помощью набора для очистки ДНК (Qiagen, Germany) и заказывали анализ последовательностей этих ДНК (Solgent). Исходя из результатов анализа последовательностей, идентифицировали участки CDR из V и V у выбранных антител и исследовали сходство (идентичность) между этими антителами и группами гаметных антител с помощью программы Ig BLAST на веб-сайте NCBI по адресу http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/. В результате было получено 15 видов фаговых антител, специфичных к PD1, которые приведены ниже в таблице 3.
Таблица 3. Характеристики моноклонов PD1
Название клона
V<sub>H</sub>
Идентичность
V<sub>L</sub>
Идентичность
Группа
Ниволумаб
VH3-33
91,80%
L6
98,90%
Пембролизумаб
VH1-2
79,60%
L25
80,80%
PD1-29A2
VH3-9
91,80%
V2-17
86,50%
1
PD1-29H3
VH3-9
90,80%
V1-11
88,50%
2
PD1-31F3
VH1-69
92,90%
V1-13
93,90%
3
PD1-32A6
VH1-69
87,80%
L5
91,60%
4
PD1-41C9
VH3-30
95,80%
O1
92,10%
5
PD1-42G4
VH3-11
93,80%
O2
93,80%
6
PD1-44B5
VH3-30
99,00%
V1-16
85,60%
7
PD1-45D6
VH3-30
95,80%
O1
93,10%
8
PD1-45F1
VH1-46
91,80%
V2-13
93,80%
9
PD1-45F4
VH3-9
90,80%
V2-1
77,70%
10
PD1-48A9
VH1-69
79,60%
O1
96,00%
11
PD1-49B9
VH3-9
88,70%
V1-2
93,90%
12
PD1-49A2
VH3-30
97,90%
O1
93,10%
13
PD1-51D9
VH1-3
82,70%
A3
94,00%
14
PD1-52E8
VH3-9
91,80%
V2-17
90,50%
15
Антитела, включая последовательности участков CDR и FR тяжелой и легкой цепи выбранных антител, а также содержащие их вариабельные области тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи, представлены ниже в таблицах 4 и 5.
Таблица 4. Вариабельные области тяжелой цепи у клонов PD1
Название
FR1
CDR1
FR2
CDR2
FR3
CDR3
FR4
PD1-45D6
QVQLVESG GGVVQPGRS LRLSCAAS
GFTFSSYA
MHWVRQ VPGKGLE WVAV
ISYDGNDK
YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC
VPTTFEY
WGQGSQ VTVSS
SEQ ID NO:
80
1
96
31
114
57
135
PD1-49A2
QVQLVESG GGVVQPGRS LRLSCAAS
GFTFSSYA
MHWVRQ APGKGLE WVAV
ISYDGSNK
YYADSVKGRFTISRD NPKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC
TTTTFDS
WGRGTL VTVSS
SEQ ID NO:
80
1
97
32
115
58
136
PD1-27A12
QVQLVESG GGLVQPGRS LRLSCAAS
GFTFNDYA
MHWVRQ VPGKGLE WVSG
ISWNSGRI
VYADSMKGRFTISRD NAKNSLYLQMNSLR AEDTAVYYC
ARSQQQ ILDY
WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:
81
2
98
33
116
59
137
PD1-27B1
QVQLVESG GGLVKPGGS LRLSCAAS
GFTFNDYA
MHWVRQ VPGKGLE WVSG
ISWNSGRI
VYADSMKGRFTISRD NAKNSLYLQMNSLR AEDTAVYYC
ARSIRQI LDY
WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:
82
2
98
33
116
60
137
PD1-28D12
QVQLVESG GGLVQPGRS LRLSCAAS
GFTFNDYA
MHWVRQ VPGKGLE WVSG
ISWNSGRI
VYADSMKGRFTISRD NAKNSLYLQMNSLR AEDTAVYYC
ARSLPXS RSRLDV
WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:
81
2
98
33
116
61
137
PD1-29A2
QVQLVESG GGLVQPGRS LRLSCAAS
GFTFNDYA
MHWVRQ VPGKGLE WVSG
ISWNSGRI
VYADSMKGRFTISRD NAKNSLYLQMNSLR AEDTAVYYC
ARAXTS PLDMSL DY
WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:
81
2
98
33
116
62
137
PD1-29H3
QMQLVESG GNLVQPGRS LRLSCAAS
GFTFDDYG
MHWVRQ APGKGLE WVSS
ISWNSGTI
GYADSVKGRFTISRD NAKNSLYLQMNSLR SEDTAVYYC
ARLLHQ MNEHEF MDV
WGQGTT VTVSS
SEQ ID NO:
83
3
99
34
117
63
138
PD1-31F3
QVQLVQSG AEVKKPGSS VKVSCKAS
GGTFSSYA
ISWVRQA PGQGLEW MGG
IIPLFSTA
HSAQKFQGRVTITAD ESSSTAYMELSSLRSE DTAVYYC
AKHKGL PFDWSP DGFDT
WGQGT MVTVSS
SEQ ID NO:
84
4
100
35
118
64
139
PD1-32A6
QVQLVQSG AEVKKPGSS VKVSCKAS
GDTFTRNA
VSWVRQA PGEGLEW MAD
IIPIFGSA
NYAQKFQGRLTLTA DVSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC
ARTIEGA FDI
WGQGT MVTVSS
SEQ ID NO:
84
5
101
36
119
65
139
PD1-41C9
QMQLVESG GGVVQPGRS LRLSCAAS
GFTFSSYA
MHWVRQ APGKGLE WVAV
ISYDGSNK
YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNRLR SEDTAVYYC
TTTTFDS
WGQGTL ITVSS
SEQ ID NO:
85
1
97
32
120
58
140
PD1-42G4
QVQLVESG GGLVKPGGS LRLSCAAS
GFTFSDYY
MSWIRQA PGKGLEW VSD
ISASGNSI
YYADSVKRRFTISRD NSKNSLYLQMNSLR AEDTAVYYC
VTSGPFGEFRN
WGLGTL VTVSS
SEQ ID NO:
82
6
102
37
121
66
141
PD1-44B5
QVQLVESG GGVVQPGRS LRLSCAAS
GFTFSSYA
MHWVRQ APGKGLE WVAV
ISYDGSNK
YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC
ARLMHT FSVQYF LDV
WGQGTT VTVSS
SEQ ID NO:
80
1
97
32
114
67
138
PD1-45D6
QVQLVESG GGVVQPGRS LRLSCAAS
GFTFSSYA
MHWVRQ VPGKGLE WVAV
ISYDGNDK
YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC
VPTTFEY
WGQGSQ VTVSS
SEQ ID NO:
80
1
96
31
114
57
135
PD1-45F1
QVQLVQSG AEVKKPGAS VKLSCKAS
GYTFNSYY
VHWVRQ APGQGLE WMGI
INPSDGSA
TYAQKFQGRVTMTS DTSTSSVYMELSSLR SEDTAVYYC
ARDGNY YDSRGY YYDTFDM
WGQGTL ITVSS
SEQ ID NO:
86
7
103
38
122
68
140
PD1-45F4
QMQLVESG GGLVQPGRS LRLSCAAS
GFTFDDYA
MHWVRQ APGQGLE WVSG
ISWNSNNI
KYADSVKGRFTISRD NSKNSLYLQMNSLR AEDTAVYYC
ARGALTPLDV
WGQGTP VTVSS
SEQ ID NO:
87
8
104
39
123
69
142
PD1-47B8
QMQLVQSG AEVKKPGAS VKVSCKAS
GYTFTSYD
INWVRQA SGQAPEW MGW
LHADSGKT
GYAQTFQGRVTMTR DTSIDTAYLELSSLRS EDTAVYYC
ARGTHWLDS
WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:
88
9
105
40
124
70
137
PD1-48A6
QVQLVQSG GGLIQPGGSL RLSCAAS
GFTVSRNS
MNWVRQ TPGKGPE WVSL
IFSGGTTK
YKDSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCA
AREEQF LIALAGR YFDY
WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:
89
10
106
41
125
71
138
PD1-48A9
QMQLVQSG AEVKKPGSS VKVSCKAS
GDTFTRYI
INWVRQA PGQGLEW MGR
VIPTLGLT
TYAQNFQDTVTIIAD KSTNTAYMELKNLRS EDTAVYYC
ARGYGS GAFDI
WGQGT MITVSS
SEQ ID NO:
90
11
107
42
126
72
143
PD1-48G6
QMQLVESG GGVVQPGRS LRLSCAAS
GFTFSHYA
MHWVRQ APGKGLE WVAV
ISYDGSKI
YYADSVKGRFTVSR DNSKNTLYLQMNSL RAEDTAVYYC
ARIGYK DAFDI
WGQGT MVTVSS
SEQ ID NO:
85
12
97
43
127
73
139
PD1-49A2
QVQLVESG GGVVQPGRS LRLSCAAS
GFTFSSYA
MHWVRQ APGKGLE WVAV
ISYDGSNK
YYADSVKGRFTISRD NPKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC
TTTTFDS
WGRGTL VTVSS
SEQ ID NO:
80
1
97
32
115
58
136
PD1-49B9
QMQLVESG GGLVQPGRS LRLSCAAS
GFTFEDYA
MHWVRQ PPGKGLE WVSS
ISWNSHNI
AYADSVKGRFTISRD NSKNSLYLQMNSLR AEDTAVYYC
STSGLGVHA
WGQGT MVTVSS
SEQ ID NO:
87
13
108
44
128
74
139
PD1-51A6
QVQLVESG GGLVQPGGS LRLSCAAS
GLSFSSYW
MTWVRQ APGKGLE WVAN
IKQDGSEK
YYVDSVKGRFTISRD NAKNSLYLQMNSLR AEDTAVYYC
ARDSFG GHLDL
WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:
91
14
109
45
129
75
137
PD1-51D9
QVQLVESG AEVKKPGAS VKLSCKAS
GYTFSSYW
MHWVRQ APGQRLE WMGE
INPGNGHT
NYNEKFKSRVTITVD KSASTAYMELSSLRS EDTAVYYC
AREGDG SYWGYFDS
WGQGTP ITVSS
SEQ ID NO:
92
15
110
46
130
76
144
PD1-52E8
QVQLVQSG GNLVQPGRS LRLSCAAS
GFTFDDYA
MHWVRQ APGKGLE WVSG
ISWNSGTP
GYADSVQGRFTISRD NAKNSLYLQMNSLR AEDTAVYYC
ARGHNY LDSSYYDY
WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:
93
8
111
47
131
77
137
PD1-62E1
QVQLVESG GDLVKPGRS LRLSCTGS
GFTFGDHP
LTWVRQI PGKGLEW VGF
IRSKAYGE
TTEYAASVKGRFTIS RDDSKSIAYLQMNSL RAEDTAVY
ASVSYC SGGSCY QGTFDY
WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:
94
16
112
48
132
78
137
PD1-72D10
QVQLVESG GGVVQPGRS LRLSCAAS
GFTFSSYA
MHWVRQ APGKGLE WVAV
ISYDGSNK
YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC
TTTTFDS
WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:
80
1
97
32
114
58
137
PD1-74A11
QVQLVQSG GGVVQPGRS LRLSCAAS
GFTFSSYA
MHWVRQ APGKGLE WVAV
ISYDGSNK
YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC
ARTTFDY
WGQGTL ITVSS
SEQ ID NO:
95
1
97
32
114
79
140
PD1-75C10
QVQLVESG GGVVQPGRS LRLSCAAS
GFTFSSYA
MHWVRQ APGKGLE WVAV
ISYDGSNK
YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC
VPTTFEY
WGQGSQ VTVSS
SEQ ID NO:
80
1
97
32
114
57
135
PD1-74A01
QVQLVESG GGVVQPGRS LRLSCAAS
GFTFSSYA
MHWVRQ APGKGLE WVAV
ISYDGSNK
YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRS EDTAVYYC
VPTTFEY
WGQGSQ VTVSS
SEQ ID NO:
80
1
97
32
133
57
135
PD1-74H12
QVQLVESG GGVVQPGRS LRLSCAAS
GFTFSSYA
MHWVRQ APGKGLE WVAV
ISYDGSNK
YYADSVKGRFTISRD NSKNMLYLEMNSLR AEDTAVYYC
VPTTFEY
WGQGSQ VTVSS
SEQ ID NO:
80
1
97
32
134
57
135
Таблица 5. Вариабельные области легкой цепи у клонов PD1
Название
FR1
CDR1
FR2
CDR2
FR3
CDR3
FR4
PD1-27A12
DIQMTQSPSS VSASVGDRV TITCRAS
RDISRW
LAWYQQKP GEAPKLLIY
GAS
SLRSGVSSRFSGSGS GTDFTLTISSLQPED FATYFC
QQGKSF PYT
FGQGTK VDIK
SEQ ID NO:
270
198
295
223
316
242
356
PD1-27B1
DIVMTQTPLS SPVTLGQPAS ISCRSS
QSLVH
LNWFHQRP GQPPRLLIH
KIS
NRVSGVPDRFSGSG AGTDFTLKISRVEA EDVGVYYC
MQSTQF PYT
FGQGTK VDIK
SEQ ID NO:
271
199
296
224
317
243
356
PD1-28D12
DIQMTQSPSS VSASLGDRV TITCRAS
QAISNW
LTWYQQKP GKAPKLLIY
ATS
SLQSGVPSRFSGSGS GTDFTLTISSLQPED VATYYC
QQTDSF PLT
FGGGTK VDIK
SEQ ID NO:
272
200
297
225
318
244
357
PD1-29A2
SYELTQSPSV SMSPGQTARI TCSGD
ALSKQY
ASWYQLKP GQAPVVVMY
KDT
ERPSGIPDRFSGSSS GTTVTLTISGVQAE DGADYYC
QSITDKS GTDVI
FGGGTK LTVL
SEQ ID NO:
273
201
298
226
319
245
358
PD1-29H3
QLVLTQPSS MSEAPGQRV TISCSGG
TSNIGTNA
VNWYQQPP GKAPTLLIY
YDD
RLTSGVSDRFSGSK SGTSASLAISRLQSE DEADYYC
AAWDDS LNGWV
FGGGTK LTVL
SEQ ID NO:
274
202
299
227
320
246
358
PD1-31F3
QFVLTQPPSV SGAPGQRVII SCTGS
SSNIGAGYD
VHWYQQLP GTAPKVLIY
GNS
DRPSGVPDRFSASK SATSASLAITGLQA EDEADYYC
QSYDSS LSGYV
FGTGTK VTVL
SEQ ID NO:
275
203
300
228
321
247
359
PD1-32A6
DIQMTQSPSS VSASVGDRV TITCRAS
QGIVSW
LAWYQQKP GKAPRLLIY
RAS
DLETGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPE DVATYYC
QQADSF PLT
FGGGTK VEIK
SEQ ID NO:
270
204
301
229
322
248
360
PD1-41C9
DIVMTQTPLS LPVTPGEAAS ISCRSS
QSLLDSE DGNTY
LDWYLQKP GQSPQLLIY
TLS
HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVAA EDVGLYYC
LQRMGF PYT
FGQGTK LDIK
SEQ ID NO:
276
205
302
230
323
249
361
PD1-42G4
DIQMTQSPSS LSASVGDRV TTTCRAS
QGISSY
LAWYQQKP GKAPKLLIY
AAS
TLQSGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPE DFATYFC
QQSYTSPRT
FGQGTK LDIK
SEQ ID NO:
277
206
303
231
324
250
361
PD1-44B5
QFVLTQSPSA SGTPGQNIVI SCSAS
TFNIGTTT
VNWYQRLP GTAPKLLIY
NYD
QRPSGVPDRFSGSK SGTSASLAISGLQSE DEADYYC
AAWDDS LNAWL
FGGGTK LTVL
SEQ ID NO:
278
207
304
232
325
251
358
PD1-45D6
DIVMTQTPLS LPVTPGEAAS ISCRSS
QSLLDSD DGKTY
LDWYLQKP GQSPQLLIY
TLS
YRASGVPDRFSGSG SGTEFNLRISRVEAE DVGIYYC
MQRVEF PFT
FGQGTK LDIK
SEQ ID NO:
276
208
302
230
326
252
361
PD1-45F1
SYELTQDPA VSVALGQTV RITCQGD
SLRTYY
ASWYQQKP GQAPILVIY
GKN
NRPSGIPDRFSGSSS GNTASLTITAAQAE DEADYYC
NSRDSS GKSLV
FGGGTK LTVL
SEQ ID NO:
279
209
305
233
327
253
358
PD1-45F4
SYELTQAPSL SVSPGQTANI ICSGD
NLRTKY
VSWYQQKP GQSPLLVIY
QDT
RRPSGIPARFSGSNS GNTATLTISGTQTR DESTYYC
MTWDV DTTSMI
FGGGTK LTVL
SEQ ID NO:
280
210
306
234
328
254
358
PD1-47B8
QSALTQPASV SGSPGQSITIS CTGT
SSDVGG YNY
VSWYQQHP GKAPKLMIY
DVS
KRPSGVSNRFSGSK SGNTASLTISGLQA EDEADYYC
SSFTSSSTVV
FGGGTK LTVL
SEQ ID NO:
281
211
307
235
329
255
358
PD1-48A6
QFVLTQPPSV SGAPGQRVTI SCTGS
RSNFGA GHD
VHWCQQLP GTAPKLLIY
GNN
NRPSGVPDRFSGSK SGTSASLAITGLQA EDEAEYYC
QSYDSSLSAWG
VRRRDQ ADRP
SEQ ID NO:
282
212
308
236
330
256
362
PD1-48A9
DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS
QSLLDS HDGNTY
LDWYLQKP GQSPQLLIY
TLS
HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGLYYC
MQRIDFPYT
FGQGTK VEIK
SEQ ID NO:
283
213
302
230
331
257
363
PD1-48G6
NFMLTQPPST SGTPGQRVTI SCSGR
SSNIGINT
VTWYQQLP GTAPKVLMY
RDD
QRPSGVPDRFSGSR SGISASLAISGLQSE DEADYYC
ASWDDTLNGWV
FGGGTKLTVL
SEQ ID NO:
284
214
309
237
332
258
358
PD1-49A2
DIVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSS
QSLFDSD DGNTY
LDWYLQKP GQSPQLLIY
TLS
HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGIYYC
LQRMGFPYT
FGQGTKVEIK
SEQ ID NO:
285
215
302
230
333
249
363
PD1-49B9
QSALTQPPSA SGSPGQSVTI SCTGT
SSDVGG YNY
VSWYQQHP GKAPKLMIY
EVS
KRPSGVPDRFSGSK SGNTASLTVSGLQP EDEADYYC
SSFARNSNYV
FGTGTKVTVL
SEQ ID NO:
286
211
307
238
334
259
359
PD1-51A6
DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSS
QSLLYIDGETY
LFWYLQKP GQSPQLLIY
EVS
SRFSGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGVYYC
MQGIHLPLT
FGQGTRLEIK
SEQ ID NO:
287
216
310
238
335
260
364
PD1-51D9
DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS
QSLLHS NGNNY
LDWYLQKP GQSPQLLIY
LGS
YRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGLYYC
MQGLQIPST
FGPGTKVDIK
SEQ ID NO:
283
217
302
239
336
261
365
PD1-52E8
SYELTQPLSL SVAPGQTARI TCSGD
ALSKEY
SYWYQQKP GQAPVLVMY
KDS
ERPSGIPERFSGSSS GTTVTLTISGVQAE DEADYYC
QSVDSSDTSVV
FGGGTKLTVL
SEQ ID NO:
288
218
311
240
337
262
358
PD1-62E1
DIQMTQSPAI LSLSPGERAT LSCRAS
QSVTSD
VAWYQHIR GQAPRLLIY
DAS
NRASGIPARFSGGG SGTEFTLTISSLEPE DFAVYYC
QQYNNWPLT
FGGGTKVEIK
SEQ ID NO:
289
219
312
241
338
263
360
PD1-72D10
DIVMTQTPLS LPVTPGEAAS ISCRSS
QSLLDS EDGNTY
LDWYLQKP GQSPQLLIY
TLS
HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGIYYC
MQRVEFPFT
FGQGTKLEIK
SEQ ID NO:
276
205
302
230
333
252
366
PD1-74A11
DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS
QSLFDSDDGNTY
LDWYLQKP GQSPQLLIY
TLS
YRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVAAEDVGIYYC
MQRVEFPFT
FGQGTKVDIK
SEQ ID NO:
283
215
302
230
353
252
356
PD1-75C10
DIVMTQTPLS LPVTPGEAAS ISCRSS
QSLLDS EDGNTY
LDWYLQKP GQSPQLLIY
TLS
HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKITRVEA EDVGVYYC
MQRIEFPYT
FGQGTKLEIK
SEQ ID NO:
276
205
302
230
354
264
366
PD1-74A01
DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS
QSLLDR GGGHTY
LDWYLQKP GQSPQLLIY
TLS
HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAEDVGIYYC
MQRKEFPLT
FGPGTKLEIK
SEQ ID NO:
283
222
302
230
333
268
367
PD1-74H12
DIVMTQTPLS LSVTPGEPAS ISCRSS
QSLLDSD DGNTY
LDWYLQKP GQSPQLLIY
TLS
HRASGVPDRFSGRG SHTDFTLTISSVEAE DVGVYYC
MQRIHFPLT
FGQGTRLEIK
SEQ ID NO:
294
220
302
230
355
269
364
Пример 3. Получение человеческих антител к PD-1
1. Преобразование из формата scFv в формат IgG
Для перевода выбранных 15 видов моноклональных фаговых антител к PD1 из фагов в целый IgG-вектор проводили ПЦР (iCycler iQ, BioRad) на тяжелых и легких цепях. В результате получали тяжелые и легкие цепи, а векторы и тяжелые и легкие цепи каждого из клонов разрезали (расщепляли) рестрикционными ферментами. Из каждого вектора и тяжелой цепи выделяли ДНК с помощью набора для экстракции ДНК из геля (Qiagen). Проводили лигирование путем смешивания 1 мкл (10 нг) вектора, 15 мкл (100-200 нг) тяжелой цепи, 2 мкл 10-кратного буфера, 1 мкл лигазы (1 ед./мкл) и дистиллированной воды, а затем инкубации смеси при комнатной температуре в течение 1-2 часов. Полученную смесь вводили в трансформируемые клетки (компетентные клетки, XL1-blue), помещали клетки на лед на 5 мин и подвергали их тепловому шоку при 42°C в течение 90 сек.
После теплового шока к клеткам добавляли 1 мл среды, а затем культивировали клетки при 37°C в течение 1 часа, рассеивали шпателем по чашке с LB Amp и инкубировали при 37°C в течение 16 часов. Полученные при этом колонии инокулировали в 5 мл среды LB Amp, культивировали при 37°C в течение 16 часов и проводили выделение ДНК с помощью набора DNA-prep (Nuclogen). Заказывали анализ последовательностей полученных ДНК (Solgent).
В результате было подтверждено, что последовательности тяжелых цепей и легких цепей у 15 клонов для PD1, переведенных в целые IgG, соответствуют последовательностям фаговых антител 15 клонов, приведенных в таблице 3. Для трансфекции в клетки HEK293F тяжелые и легкие цепи соответствующих клонов, переведенных в целые IgG, культивировали в 100 мл среды LB Amp и выделяли ДНК с помощью набора Midi-prep (QIAgen).
2. Получение человеческих антител
Клонированные векторы pNATVH и pNATVL в соотношении 6:4 совместно трансфецировали в клетки HEK293F, на 7-й день собирали супернатанты, удаляли клетки и обломки клеток центрифугированием и через фильтры на 0,22 мкм, а супернатанты собирали и подвергали аффинной хроматографии на белке A для очистки IgG-антител. Антитела после очистки проводили через глициновый буфер и заменяли буфер таким образом, чтобы конечным буфером при ресуспендировании был PBS. Проводили количественное определение очищенных антител методом BCA и Nanodrop, а затем каждое из 15 видов антител наносили в дозе 5 мкг в восстановительных и невосстановительных условиях и анализировали методом SDS-PAGE для определения чистоты и подвижности очищенного белка (фиг. 5).
В результате, как видно из фиг. 5, в невосстановительных условиях все 15 антител детектировались при молекулярной массе 150 кДа и больше, а в качестве контрольного антитела был получен ниволумаб.
Пример 4. Характеристики моноклональных антител к PD-1
1. Оценка активности антител
Проводили тестирование выбранных антител на активность с помощью набора для биоанализа блокировки PD1/PD-L1 (Promega, J1250). В 96-луночный планшет высеивали клетки линии CHO с высокой экспрессией PD-L1, культивировали в течение 16 часов или дольше, обрабатывали каждым антителом в серийном разведении при постоянной концентрации, а затем культивировали вместе с клетками линии Jurkat с высокой экспрессией PD-1 человека в течение 6 часов. Определяли степень восстановления ингибирования у антител на спектрофотометре (SpectraMax M5, Molecular Devices, USA) по интенсивности люминесценции, возникающей при расщеплении субстрата люциферазой. Активность 16 видов антител к PD-1, включая контрольное антитело, определяли по значениям для восстановления пониженного сигнала при образовании комплекса PD-1/PD-L1, причем 41C9, 45D6 и 49A2 проявляли активность, близкую контрольному антителу (фиг. 6).
50
50
Для измерения активности антител 41C9, 45D6 и 49A2 к PD-1 в зависимости от концентрации делали серийные разведения и опять проводили биоанализ блокирования PD1/PD-L1 по восстановлению пониженного сигнала зависимым от концентрации образом. Степень восстановления выражали в виде EC (эффективная концентрация mAb при 50%-м уровне восстановления сигнала) при анализе с помощью Graphpad Prism6, а значения EC по способности к восстановлению ингибирования in vitro представлены на фиг. 7.
2. Сродство антител к PD1 к гиперэкспрессированным клеткам
Обращаясь к пулам трансформированных клеток с высокой экспрессией PD-1, клетки HEK293E трансформировали плазмидой pcDNA3.1, содержащей PD-1 человека (NM_005018.2), и проводили скрининг в селективной среде, содержащей 150 мкг/мл зеоцина (#R25001, Thermo Fisher). Каждый пул клеток идентифицировали и отбирали методом активируемой флуоресценцией сортировки клеток (FACS) с помощью антитела против PD-1 (#557860, BD) и использовали для таких функциональных анализов, как анализ связывания по FACS или анализ конкуренции по FACS.
6
d
Из пулов трансформированных клеток с высокой экспрессией PD-1 человека отбирали образцы по 0,5-1×10 клеток, готовили серийные разведения антител при постоянной степени разведения и проводили реакцию с полученными клетками при 4°C в течение 20 мин. Затем клетки трижды промывали PBS (#LB001-02, Welgene), содержащим 2% фетальной телячьей сыворотки, и проводили реакцию при 4°C в течение 20 мин с антителом против IgG человека (#FI-3000, Vectorlabs), конъюгированным с флуоресцентным веществом FITC (флуоресцеин-изотиоцианат). Клетки опять промывали так же, как описано выше, а затем суспендировали в 0,5 мл PBS, содержащем 2% FBS (#26140-079, Thermo Fisher), и проводили проточную цитометрию на проточном цитометре FACSCanto II (BD Biosciences, USA). При этом все три антитела к PD-1 специфически связывались, а их способность к связыванию определяли по константе равновесной диссоциации (K), полученной через функцию анализа Graphpad Prism6.
В результате, как видно из фиг. 8, способность к связыванию у антител при зависимом от концентрации связывании с PD-1 человека, гиперэкспрессированным на клеточной поверхности, можно определять по MFI (средней интенсивности флуоресценции).
3. Скрининг положительных фаговых антител со сходной последовательностью с PD1-45D6 и 49A2
Проводили дополнительный скрининг антител на близость к 45D6 и 49A2, наряду с 41C9, которые проявляли отличную активность и способность к связыванию при анализе методом FACS.
Антитела со сходной последовательностью с PD1-45D6 и 49A2 подвергали дальнейшему скринингу по той же методике, что и в Примере 2. Их характеристики приведены ниже в таблице 6.
Таблица 6. Характеристики проходивших дополнительный скрининг клонов антител, близких к 45D6 и 49A2
Название клона
V<sub>H</sub>
Идентичность
V<sub>L</sub>
Идентичность
Группа
PD1-72D10
VH3-30
96,90%
O1
94,10%
1
PD1-74A11
VH3-30
97,96%
O1
95,05%
2
PD1-75C10
VH3-30
96,94%
O1
95,05%
3
PD1-74A01
VH3-30
95,92%
O1
92,08%
4
PD1-74H12
VH3-30
94,90%
O1
92,08%
5
4. Сродство антител к PD1 на приборе ProteOn XPR36
Использовали прибор ProteOn XPR36 (BioRad). На приборе устанавливали сенсорный чип GLC (BioRad) и промывали его буфером PBST, а поверхность карбоксиметилдекстрана активировали смесью растворов EDC и сульфо-NHS. На сенсорный чип GLC наносили и иммобилизировали PD1-hFc, растворенный при концентрации 5 мкг/мл в буферном растворе 10 мМ ацетата натрия (pH 5,0).
Для того, чтобы дезактивировать активированные карбоксильные группы, не прореагировавшие с белком PD1, пропускали 1М этаноламин и вводили 10 мМ глицина (рН 2,0) с тем, чтобы смыть белки, не связавшиеся с сенсорным чипом. Затем регистрировали данные для сенсограммы при связывании и диссоциации по времени, пропуская антитела со скоростью подачи 30 мкл/мин (от 30 нМ до 0,123 нМ) в течение 10 мин с помощью буфера PBST.
D
D
Рассчитывали равновесные константы диссоциации (K) путем нанесения на график и аппроксимации данных по сенсограмме в состоянии равновесия в зависимости от концентрации. При этом 45D6 и 49A2 проявляли значения K 0,001 нМ и 0,019 нМ, соответственно, что указывает на высокое сродство к антигену PD1 (фиг. 9).
Пример 5. Оптимизация антител PD1-45D6 и 49A2
1. Получение библиотек для оптимизации антител PD1-45D6 и 49A2
5
6
Для оптимизации антител получали новые библиотеки с перетасовкой LC путем иммобилизации тяжелой цепи и введения пула 10-10 легких цепей (LC) от фирмы Ybiologics, Inc. Также проводили оптимизацию антител следующими тремя способами: перетасовки LC; базовой упаковки + перетасовки LC, включая сравнительный анализ остатков в структурно важных сайтах типа гидрофобной сердцевины тяжелых цепей, открытых остатков, кластеров зарядов, солевых мостиков, мутационное превращение их в консервативные остатки, а затем проведение перетасовки LC; и горячих точек CDR + перетасовки LC в случае ДНК вариабельных областей антител, включая случайный мутагенез мутационных горячих точек, которые часто могут мутировать в процессе созревания сродства in vivo, а затем проведение перетасовки LC.
7
Для получения библиотек с перетасовкой LC расщепляли гены LC антител 45D6 и 49A2 с помощью BstXI и затем использовали их в качестве векторов, а библиотечные пулы фирмы Ybiologics, Inc. расщепляли с помощью BstXI и использовали в качестве вставок. После лигирования с помощью лигазы проводили трансформацию клеток методом электропорации. Библиотеки антител получали, собирая трансформированные клетки на квадратной пластине. При этом получали библиотеки с разнообразием в 1,5×10. Результаты анализа последовательностей показали, что все последовательности HC были идентичными, а последовательности LC отличались друг от друга.
6
Чтобы получить библиотеки упаковки ядра + перестановки LC, сайты каркаса (FR) антител 45D6 и 49A2 были заменены консервативными аминокислотными последовательностями, гены LC были разрезаны BstX I и затем использованы в качестве векторов, а пулы библиотеки принадлежащие Ybiologics, Inc. были вырезаны с помощью BstX I, а затем использованы в качестве вставок. После лигирования с лигазой трансформацию осуществляли с использованием клеток для электропорационной трансформации. Библиотеки антител были получены путем сбора трансформированных клеток на квадратной пластине. В результате были получены библиотеки с разнообразием 8,4х10. Результат анализа последовательностей показал, что сайты FR HC были заменены консервативными аминокислотными последовательностями, а последовательности LC отличались друг от друга.
6
Для получения библиотек ядра горячей точки + тасования LC сайты каркаса (FR) антител 45D6 были заменены консервативными аминокислотными последовательностями, библиотеки с горячими точками в CDR1 были вырезаны с помощью Sfi I и использованы в качестве вставок, а пулы библиотек, принадлежащие Ybiologics, Inc., разрезали с помощью Sfi I и затем использовали в качестве векторов. После лигирования с лигазой трансформацию осуществляли с использованием клеток для электропорационной трансформации. Библиотеки антител были получены путем сбора трансформированных клеток на квадратной пластине. В результате было получено около 5,6х10 различных библиотек. Результат анализа последовательностей показал, что сайты FR HC были заменены консервативными аминокислотными последовательностями, последовательности горячих точек CDR1 были мутированы случайным образом, а последовательности LC отличались друг от друга.
Пример 6. Скрининг человеческих антител к PD-1
1. Подготовка антигенов
В качестве белковых антигенов PD1-hFc и PD1-mFc, полученные на фирме Ybiologics, Inc, и PD1-his (кат. № 10377-H08H), приобретенный у Sino Biological Inc., фиксировали в дозе 50 мкг на иммуносорбционных пробирках, а затем блокировали.
2. Биопэннинг (просеивание)
10
Получали фаговую библиотеку человеческих антител путем инфицирования бактерий библиотекой scFv человека с разнообразием в 2,7×10, а затем культивирования при 30°C в течение 16 ч. Культуральный раствор после культивирования центрифугировали, а супернатант концентрировали с помощью PEG и затем растворяли в буфере PBS для получения библиотеки человеческих антител. Фаговую библиотеку человеческих антител вносили в иммунологическую пробирку и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. После отмывки 1 раз PBS/T и 1 раз PBS элюировались только scFv-фаги, специфически связавшиеся с антигеном.
Элюированными фагами опять инфицировали E. coli и проводили амплификацию (процесс пэннинга), получая пул положительных фагов. Для оптимизации антител проводили только первый раунд пэннинга. В результате, как видно из таблицы 7, оказалось, что количество фагов, связавшихся с антигеном (на выходе) при первом раунде пэннинга, немного повысилось по сравнению с количеством фагов на входе.
Таблица 7. Сравнение титра антител при оптимизационном пэннинге
Образец
Количество фагов на входе
Количество фагов на выходе
45D6 (LS)
1,3×10<sup>13</sup>
2,8×10<sup>7</sup>
45D6 (базовая упаковка + LS)
1,1×10<sup>13</sup>
4,8×10<sup>7</sup>
45D6 (горячие точки в CDR + LS)
1,1×10<sup>13</sup>
3,6×10<sup>6</sup>
49A2 (LS)
1,3×10<sup>13</sup>
1,8×10<sup>7</sup>
49A2 (горячие точки в CDR + LS)
1,1×10<sup>13</sup>
1,6×10<sup>6</sup>
3. Скрининг положительных фагов
2
600
600
2
Колонии, полученные при пэннинге, культивировали в 96-луночном планшете с глубокими лунками на 1 мл (Bioneer, 90030) при 37°C в течение 16 часов. По 100-200 мкл выращенных при этом клеток вносили в среду, содержащую 1 мл 2×YTCM, 2% глюкозы и 5 мМ MgCl, до значения OD = 0,1, а затем культивировали в глубоком 96-луночном планшете при 37°C в течение 2-3 часов до OD = 0,5-0,7. Клетки инфицировали фагом-помощником M1 при MOI 1:20 и культивировали в среде, содержащей 2×YTCMK, 5 мМ MgCl, 1 мМ IPTG при 30°C в течение 16 часов.
На 96-луночных иммунопланшетах фиксировали антиген PD1 при плотности 100 нг на лунку при 4°C в течение 16 ч, а затем каждую лунку блокировали раствором PBS с 4% обезжиренного молока. В каждую лунку вносили по 1 мкл моноклонального scFv-фага (100 scFv-фагов) после промывки 0,2 мл PBS/T и культивирования в течение 16 часов и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Лунки опять промывали 4 раза по 0,2 мл PBS/T, добавляли вторичное антитело против M13-HRP в разведении 1:2000 и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывки 0,2 мл PBS/T проводили развитие окраски и измеряли поглощение при 490 нм.
В результате были получены одиночные фаговые клоны с более высокой способностью к связыванию с каждым антигеном, чем у исходных антител (49A2 или 45D6), а результаты представлены на фиг. 10.
4. Анализ нуклеотидных последовательностей положительных фаговых антител
H
L
Из отобранных одиночных клонов выделяли ДНК с помощью набора для очистки ДНК (Qiagen, Germany) и заказывали анализ последовательностей этих ДНК (Solgent). Исходя из результатов анализа последовательностей, идентифицировали участки CDR из V и V у выбранных антител, и исследовали сходство (идентичность) между этими антителами и группами гаметных антител с помощью программы Ig BLAST на веб-сайте NCBI по адресу http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/. В результате было получено 25 видов фаговых антител (49A2: 10 видов, 45D6: 15 видов) с более высокой способностью к связыванию, чем у исходных антител, а результаты приведены ниже в таблице 8.
Таблица 8. Характеристики моноклонов PD1 от вариантов антител, отобранных при оптимизации
Название клона
V<sub>H</sub>
Идентичность
V<sub>L</sub>
Идентичность
Группа
PD1-49A2(A/1B2)
VH3-30
92,86%
O1
93,07%
1
PD1-49A2(A/1D11)
VH3-30
91,84%
O1
97,03%
2
PD1-49A2(A/1F12)
VH3-30
92,86%
O1
93,07%
3
PD1-49A2(A/1H4)
VH3-30
92,86%
O1
92,08%
4
PD1-49A2(A/1H8)
VH3-30
92,86%
O1
90,10%
5
PD1-49A2(A/2A6)
VH3-30
91,84%
O1
89,11%
6
PD1-49A2(A/2A11)
VH3-30
93,88%
O1
90,10%
7
PD1-49A2(A/2B9)
VH3-30
92,86%
O1
93,07%
8
PD1-49A2(A/2B10)
VH3-30
93,88%
O1
95,05%
9
PD1-45D6(A/3D2)
VH3-30
93,88%
O1
94,06%
10
PD1-45D6(A/3G1)
VH3-30
93,88%
O1
95,05%
11
PD1-45D6(A/3H4)
VH3-30
93,88%
O1
93,07%
12
PD1-45D6(A/3H6)
VH3-30
93,88%
O1
95,05%
13
PD1-45D6(A/3H7)
VH3-30
93,88%
O1
92,08%
14
PD1-45D6(A/4C1)
VH3-30
94,90%
O1
96,04%
15
PD1-45D6(A/4C9)
VH3-30
94,90%
O1
93,07%
16
PD1-45D6(A/4D4)
VH3-30
94,90%
O1
92,08%
17
PD1-45D6(A/4H6)
VH3-30
94,90%
O1
95,05%
18
PD1-49A2(A/2D7)
VH3-30
92,86%
O1
95,05%
19
PD1-45D6(A/5A6)
VH3-30
91,84%
O1
96,04%
20
PD1-45D6(A/5B2)
VH3-30
93,88%
O1
94,06%
21
PD1-45D6(A/5B5)
VH3-30
92,86%
O1
92,08%
22
PD1-45D6(A/5B12)
VH3-30
93,88%
O1
94,06%
23
PD1-45D6(A/5C8)
VH3-30
92,86%
O1
95,05%
24
PD1-45D6(A/5H9)
VH3-30
92,86%
O1
94,06%
25
Антитела, включая последовательности участков CDR и FR тяжелой и легкой цепи выбранных антител, а также содержащие их вариабельные области тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи, представлены ниже в таблицах 9 и 10.
Таблица 9. Вариабельные области тяжелой цепи у человеческих антител PD1
Название
FR1
CDR1
FR2
CDR2
FR3
CDR3
FR4
PD1-49A2 (A/1B2)
QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS
GFTFLRYA
MHWVRQ APGKGLE WVAV
ISYDGQDK
YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC
TTTTFDS
WGRGTL VTVSS
SEQ ID NO:
80
17
97
49
114
58
136
PD1-49A2 (A/1D11)
QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS
GFTFKNNA
MHWVRQ APGKGLE WVAV
ISYDGRHK
YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC
TTTTFDS
WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:
80
18
97
50
114
58
137
PD1-49A2 (A/1F12)
QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS
GFTFRNYA
MHWVRQ APGKGLE WVAV
ISYDGQHK
YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC
TTTTFDS
WSQGTL VTVSS
SEQ ID NO:
80
19
97
51
114
58
145
PD1-49A2 (A/1H4)
QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS
GFTFPIYA
MHWVRQ APGKGLE WVAV
ISYDGAHK
YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC
TTTTFDS
WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:
80
20
97
52
114
58
137
PD1-49A2 (A/1H8)
QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS
GFTFKTYA
MHWVRQ APGKGLE WVAV
ISYDGQHK
YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC
TTTTFDS
WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:
80
21
97
51
114
58
137
PD1-49A2 (A/2A6)
QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS
GFTFKYYA
MHWVRQ APGKGLE WVTV
ISYDGQYK
YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC
TTTTFDS
WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:
80
22
113
53
114
58
137
PD1-49A2 (A/2A11)
QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS
GFTFRSYA
MHWVRQ APGKGLE WVAV
ISYDGQDK
YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC
TTTTFDS
WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:
80
23
97
49
114
58
137
PD1-49A2 (A/2B9)
QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS
GFTFLRYA
MHWVRQ APGKGLE WVAV
ISYDGRYK
YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC
TTTTFDS
WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:
80
17
97
54
114
58
137
PD1-49A2 (A/2B10)
QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS
GFTFLVYA
MHWVRQ APGKGLEWVAV
ISYDGSHK
YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC
TTTTFDS
WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:
80
24
97
55
114
58
137
PD1-49A2 (A/2D7)
QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS
GFTFKTYA
MHWVRQ APGKGLEWVAV
ISYDGQHK
YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC
TTTTFDS
WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:
80
21
97
51
114
58
137
PD1-45D6 (A/3D2)
QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS
GFTFSSYA
MHWVRQ VPGKGLEWVAV
ISYDGNDK
YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC
VPTTFEY
WGQGSQ VTVSS
SEQ ID NO:
80
1
96
31
114
57
135
PD1-45D6 (A/3G1)
QVQLVESG GGVVQPGRSLRLSCAAS
GFTFSSYA
MHWVRQ VPGKGLEWVAV
ISYDGNDK
YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC
VPTTFEY
WGQGSQ VTVSS
SEQ ID NO:
80
1
96
31
114
57
135
PD1-45D6 (A/3H4)
QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS
GFTFSSYA
MHWVRQ VPGKGLE WVAV
ISYDGNDK
YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC
VPTTFEY
WGQGSQ VTVSS
SEQ ID NO:
80
1
96
31
114
57
135
PD1-45D6 (A/3H6)
QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS
GFTFSSYA
MHWVRQ VPGKGLE WVAV
ISYDGNDK
YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC
VPTTFEY
WGQGSQ VTVSS
SEQ ID NO:
80
1
96
31
114
57
135
PD1-45D6 (A/3H7)
QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS
GFTFSSYA
MHWVRQ VPGKGLE WVAV
ISYDGNDK
YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC
VPTTFEY
WGQGSQ VTVSS
SEQ ID NO:
80
1
96
31
114
57
135
PD1-45D6 (A/4C1)
QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS
GFTFSSYA
MHWVRQ APGKGLE WVAV
ISYDGNDK
YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC
VPTTFEY
WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:
80
1
97
31
114
57
137
PD1-45D6 (A/4C9)
QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS
GFTFSSYA
MHWVRQ APGKGLE WVAV
ISYDGNDK
YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC
VPTTFEY
WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:
80
1
97
31
114
57
137
PD1-45D6 (A/4D4)
QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS
GFTFSSYA
MHWVRQ APGKGLEWVAV
ISYDGNDK
YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC
VPTTFEY
WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:
80
1
97
31
114
57
137
PD1-45D6 (A/4H6)
QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS
GFTFSSYA
MHWVRQ APGKGLEWVAV
ISYDGNDK
YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC
VPTTFEY
WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:
80
1
97
31
114
57
137
PD1-45D6 (A/5A6)
QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS
GFTFRLYA
MHWVRQ APGKGLEWVAV
ISHDGNDK
YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC
VPTTFEY
WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:
80
25
97
56
114
57
137
PD1-45D6 (A/5B2)
QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS
GFTFSFYA
MHWVRQ APGKGLEWVAV
ISYDGNDK
YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC
VPTTFEY
WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:
80
26
97
31
114
57
137
PD1-45D6 (A/5B5)
QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS
GFTFRTYA
MHWVRQ APGKGLEWVAV
ISYDGNDK
YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC
VPTTFEY
WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:
80
27
97
31
114
57
137
PD1-45D6 (A/5B12)
QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS
GFTFSVYA
MHWVRQ APGKGLE WVAV
ISYDGNDK
YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC
VPTTFEY
WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:
80
28
97
31
114
57
137
PD1-45D6 (A/5C8)
QVQLVESG GGVVQPGRSLRLSCAAS
GFTFMRYA
MHWVRQ APGKGLE WVAV
ISYDGNDK
YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC
VPTTFEY
WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:
80
29
97
31
114
57
137
PD1-45D6 (A/5H9)
QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS
GFTFWTYA
MHWVRQ APGKGLE WVAV
ISYDGNDK
YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC
VPTTFEY
WGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:
80
30
97
31
114
57
137
Таблица 10. Вариабельные области легкой цепи у человеческих антител PD1
Название
FR1
CDR1
FR2
CDR2
FR3
CDR3
FR4
PD1-49A2 (A/1B2)
DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS
QSLLDS DDGNTY
LDWYLQKPG QSPQLLIY
TLS
HRASGVPDRFSGSG SGTEFNLRISRVEAE DVGIYYC
MQRVEFPFT
FGQGTK LEIK
SEQ ID NO:
283
220
302
230
339
252
366
PD1-49A2 (A/1D11)
DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS
QSLFDS DDGNTY
LDWYLQKPG QSPQLLIY
TLS
YRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGVYYC
MQRVEFPFT
FGQGTK VEIK
SEQ ID NO:
283
215
302
230
340
252
366
PD1-49A2 (A/1F12)
DIVMTQTPHS LPVTPGEPASISCRSS
QSLLDS EDGNTY
LDWYLQKPG QSPQLLIY
TLS
HRALGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DSGIYYC
MQRIEFPYT
FGQGTK LEIK
SEQ ID NO:
290
205
302
230
341
264
366
PD1-49A2 (A/1H4)
DIVMTQSPLS LPVTPGEAAS ISCRSS
QSLLDS EDGNTY
LDWYLQKPG QSPQLLIY
TLS
HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DSGIYYC
MQRVEFPYT
FGQGTK LDIK
SEQ ID NO:
291
205
302
230
342
265
361
PD1-49A2 (A/1H8)
DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS
QSLLD RDGGHTY
VDWYLQKPG QSPRLLIY
TLS
HRALGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEA DDVGLYYC
MQRIEFPFT
FGQGTK VEIK
SEQ ID NO:
283
221
313
230
343
266
363
PD1-49A2 (A/2A6)
DIVMTQTPLS LPVTPGEAAS ISCRSS
QSLLDS EDGNTY
LDWYLQRPG QSPQLLIY
TLS
HRASGVPGRFSGSG SGTEFNLRISRVEAE DVGIYYC
MQRVEFPFT
FGQGTK VEIK
SEQ ID NO:
276
205
314
230
344
252
363
PD1-49A2 (A/2A11)
DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS
QSLFDS DDGNTY
LDWYLQKPG QSPRLLIY
TLS
HRALGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVAA EDVGLYYC
LQRMGFPYT
FGQGTK LEIK
SEQ ID NO:
283
215
315
230
345
249
366
PD1-49A2 (A/2B9)
DIVMTQTPLS LPVTPGEAASISCRSS
QSLLDS EDGNTY
LDWYLQKPG QSPQLLIY
TLS
HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLEISRVEAE DVGVYYC
MQRRDFPFT
FGQGTK VDIK
SEQ ID NO:
276
205
302
230
346
267
356
PD1-49A2 (A/2B10)
DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS
QSLLDS DDGNTY
LDWYLQKPG QSPQLLIY
TLS
HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVAA EDVGLYYC
MQRVEFPFT
FGQGTK LDIK
SEQ ID NO:
283
220
302
230
323
252
361
PD1-49A2 (A/2D7)
DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS
QSLLD RDGGHTY
VDWYLQKPG QSPRLLIY
TLS
HRALGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEA DNVGLYYC
MQRIEFPFT
FGQGTK VEIK
SEQ ID NO:
283
221
313
230
347
266
363
PD1-45D6 (A/3D2)
DIVMTQTPLS LPVTPGEAAS ISCRSS
QSLLDS EDGNTY
LDWYLQKPG QSPQLLIY
TLS
HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGIYYC
MQRVEFPFT
FGQGTK VEIK
SEQ ID NO:
276
205
302
230
333
252
363
PD1-45D6 (A/3G1)
DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS
QSLLDS EDGNTY
LDWYLQKPG QSPQLLIY
TLS
HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLEISRVEAE DVGVYYC
MQRVEFPFT
FGQGTK LDIK
SEQ ID NO:
283
205
302
230
346
252
361
PD1-45D6 (A/3H4)
DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS
QSLFDS DDGNTY
LDWYLQKPG QSPQLLIY
TLS
HRASGVSDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DSGIYYC
MQRVEFPFT
FGQGTK LDIK
SEQ ID NO:
283
215
302
230
348
252
361
PD1-45D6 (A/3H6)
DIVMTQTPLS LPVTPGEAAS ISCRSS
QSLLDS EDGNTY
LDWYLQKPG QSPQLLIY
TLS
HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGVYYC
MQRVEFPFT
FGQGTK LEIK
SEQ ID NO:
276
205
302
230
349
252
366
PD1-45D6 (A/3H7)
DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS
QSLLDS DDGNTY
LDWYLQKPG QSPQLLIY
TLS
HRASGVPGRFSGSG SGTEFNLRISRVEAE DVGIYYC
MQRVEFPFT
FGQGTK LEIK
SEQ ID NO:
283
220
302
230
344
252
366
PD1-45D6 (A/4C1)
DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS
QSLLDS DDGNTY
LDWYLQKPG QSPQLLIY
TLS
HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGIYYC
MQRVEFPFT
FGQGTK LDIK
SEQ ID NO:
283
220
302
230
333
252
361
PD1-45D6 (A/4C9)
DIVMTQTPLS LPVTPGEAAS ISCRSS
QSLLDS EDGNTY
LDWYLQKPG QSPQLLIY
TLS
HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVAA EDVGIYYC
MQRVEFPFT
FGQGTK LEIK
SEQ ID NO:
276
205
302
230
350
252
366
PD1-45D6 (A/4D4)
DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS
QSLLDS EDGNTY
LDWYLQKPG QSPQLLIY
TLS
HRASGVPDRFSGSG SGTEFNLRISRVEAE DVGIYYC
MQRVEFPFT
FGQGTK VDIK
SEQ ID NO:
283
205
302
230
339
252
356
PD1-45D6 (A/4H6)
DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS
QSLFDS DDGNTY
LDWYLQKPG QSPQLLIY
TLS
HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGLYYC
MQRVEFPFT
FGQGTK LEIK
SEQ ID NO:
283
215
302
230
331
252
366
PD1-45D6 (A/5A6)
DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS
QSLLDS EDGNTY
LDWYLQKPG QSPQLLIY
TLS
HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGVYYC
MQRIDFPYT
FGQGTK LDIK
SEQ ID NO:
283
205
302
230
349
257
361
PD1-45D6 (A/5B2)
DIVMTQTPLS PPVTPGEPASI SCRSS
QSLLDS DDGNTY
LDWYLQKPG QSPQLLIY
TLS
HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLEISRVEAE DVGVYYC
MQRRDFPFT
FGQGTK LDIK
SEQ ID NO:
292
220
302
230
346
267
361
PD1-45D6 (A/5B5)
DIVMTQTPLS LPVMPGEAA SISCRSS
QSLLDS EDGNTY
LDWYLQKPG QSPQLLIY
TLS
HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEA DDVGIYYC
MQRVEFPFT
FGQGTK VEIK
SEQ ID NO:
293
205
302
230
351
252
363
PD1-45D6 (A/5B12)
DIVMTQTPLS LPVTPGEAAS ISCRSS
QSLLDS EDGNTY
LDWYLQKPG QSPQLLIY
TLS
HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGIYYC
MQRVEFPFT
FGQGTK VEIK
SEQ ID NO:
276
205
302
230
333
252
363
PD1-45D6 (A/5C8)
DIVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSS
QSLLDS EDGNTY
LDWYLQKPG QSPQLLIY
TLS
HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGVYYC
MQRVEFPFT
FGQGTK LDIK
SEQ ID NO:
285
205
302
230
349
252
361
PD1-45D6 (A/5H9)
DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS
QSLLDS DDGNTY
LDWYLQKPG QSPQLLIY
TLS
HRASGVSDRFSGSG SGTDFTLEISRVEAE DVGVYYC
MQRRDFPFT
FGQGTK VEIK
SEQ ID NO:
283
220
302
230
352
267
363
Пример 7. Получение человеческих антител к PD-1
1. Преобразование из формата scFv в формат IgG
Для перевода выбранных 25 видов моноклональных фаговых антител к PD1 из фагов в целый IgG-вектор проводили ПЦР (iCycler iQ, BioRad) на тяжелых и легких цепях. В результате получали тяжелые и легкие цепи, а векторы и тяжелые и легкие цепи каждого из клонов разрезали (расщепляли) рестрикционными ферментами. Из каждого вектора и тяжелой цепи выделяли ДНК с помощью набора для экстракции ДНК из геля (Qiagen). Проводили лигирование путем смешивания 1 мкл (10 нг) вектора, 15 мкл (100-200 нг) тяжелой цепи, 2 мкл 10-кратного буфера, 1 мкл лигазы (1 ед./мкл) и дистиллированной воды, а затем инкубации смеси при комнатной температуре в течение 1-2 часов. Полученную смесь вводили в трансформируемые клетки (компетентные клетки, XL1-blue), помещали клетки на лед на 5 мин и подвергали их тепловому шоку при 42°C в течение 90 сек.
После теплового шока к клеткам добавляли 1 мл среды, а затем культивировали клетки при 37°C в течение 1 часа, рассеивали шпателем по чашке с LB Amp и инкубировали при 37°C в течение 16 часов. Полученные при этом колонии инокулировали в 5 мл среды LB Amp, культивировали при 37°C в течение 16 часов и проводили выделение ДНК с помощью набора DNA-prep (Nuclogen). Заказывали анализ последовательностей полученных ДНК (Solgent).
В результате было подтверждено, что последовательности тяжелых цепей и легких цепей у 25 клонов для PD1, переведенных в целые IgG, соответствуют последовательностям фаговых антител. Для трансфекции в клетки HEK293F тяжелые и легкие цепи соответствующих клонов, переведенных в целые IgG, культивировали в 100 мл среды LB Amp и выделяли ДНК с помощью набора Midi-prep (QIAgen).
2. Получение человеческих антител
Клонированные векторы pNATVH и pNATVL в соотношении 6:4 совместно трансфецировали в клетки HEK293F, на 7-й день собирали супернатанты, удаляли клетки и обломки клеток центрифугированием и через фильтры на 0,22 мкм, а супернатанты собирали и подвергали аффинной хроматографии на белке A для очистки IgG-антител. Антитела после очистки проводили через глициновый буфер и заменяли буфер таким образом, чтобы конечным буфером при ресуспендировании был PBS. Проводили количественное определение очищенных антител методом BCA и Nanodrop, а затем каждое из 25 видов антител наносили в дозе 5 мкг в восстановительных и невосстановительных условиях и анализировали методом SDS-PAGE для определения чистоты и подвижности очищенного белка. Кроме того, некоторые из супернатантов наносили на SDS-PAGE для сравнения скорости экспрессии с исходным антителом, причем большинство антител экспрессировались сильнее, чем исходное антитело, а результаты представлены на фиг. 11.
Пример 8. Характеристики моноклональных антител к PD-1
1. Оценка активности антител
Проводили тестирование выбранных антител на активность с помощью набора для биоанализа блокировки PD1/PD-L1 (Promega, J1250). В 96-луночный планшет высеивали клетки линии CHO с высокой экспрессией PD-L1, культивировали в течение 16 часов или дольше, обрабатывали каждым антителом в серийном разведении при постоянной концентрации, а затем культивировали вместе с клетками линии Jurkat с высокой экспрессией PD-1 человека в течение 6 часов. Определяли степень восстановления ингибирования у антител на спектрофотометре (SpectraMax M5, Molecular Devices, USA) по интенсивности люминесценции, возникающей при расщеплении субстрата люциферазой. Активность 24 видов антител к PD-1 определяли по значениям для восстановления пониженного сигнала при образовании комплекса PD-1/PD-L1, причем 45D6-3D2, 45D6-3H7, 45D6-5B2 и 45D6-5B5 из числа антител 45D6 и 49A2-1B2, 49A2-1H8, 49A2-2A6 и 49A2-2B9 из числа антител 49A2 проявляли большую активность, чем исходное антитело, близкую к активности контрольного антитела (фиг. 12).
50
50
Для измерения активности 8 видов антител к PD-1 (45D6-3D2, 45D6-3H7, 45D6-5B2, 45D6-5B5, 49A2-1B2, 49A2-1H8, 49A2-2A6, 49A2-2B9) в зависимости от концентрации делали серийные разведения и опять проводили биоанализ блокирования PD1/PD-L1 по восстановлению пониженного сигнала зависимым от концентрации образом. Степень восстановления выражали в виде EC (эффективная концентрация mAb при 50%-м уровне восстановления сигнала) при анализе с помощью Graphpad Prism6, причем 49A2-1B2 проявляло наибольшую способность к восстановлению ингибирования in vitro по значению EC (фиг. 13, таблица 11).
Таблица 11. Активность моноклонов PD1 от выбранных вариантов антител
Антитело
EC<sub>50</sub> [нM]
Антитело
EC<sub>50</sub> [нM]
PD-1-41C9
3,91
PD-1-49A2
3,78
PD-1-45D6
2,00
PD-1-49A2-A-1B2
1,30
PD-1-45D6-A-3D2
2,16
PD-1-49A2-A-1D11
2,89
PD-1-45D6-A-3G1
0,98
PD-1-49A2-A-1F12
1,03
PD-1-45D6-A-3H4
1,67
PD-1-49A2-A-1H4
0,84
PD-1-45D6-A-3H6
1,49
PD-1-49A2-A-1H8
1,21
PD-1-45D6-A-3H7
1,98
PD-1-49A2-A-2A11
0,79
PD-1-45D6-A-4C1
1,76
PD-1-49A2-A-2A6
1,51
PD-1-45D6-A-4C9
2,72
PD-1-49A2-A-2B10
0,65
PD-1-45D6-A-4D4
1,74
PD-1-49A2-A-2B9
1,23
PD-1-45D6-A-4H6
1,19
PD-1-51D9
~4,695
PD-1-45D6-A-5A6
0,92
PD-1-52E8
8,43
PD-1-45D6-A-5B12
0,80
PD-1-62E1
2,73
PD-1-45D6-A-5B2
1,48
PD1-72D10
1,21
PD-1-45D6-A-5B5
1,68
PD1-74A11
1,31
PD-1-45D6-A-5C8
1,44
PD1-75C10
0,81
PD-1-45D6-A-5H9
2,00
PD1-74A01
1,01
PD-1-48A9
8,64
PD1-74H12
0,98
2. Сродство антител к PD1 к гиперэкспрессированным клеткам
6
Обращаясь к пулам трансформированных клеток с высокой экспрессией PD-1, клетки HEK293E трансформировали плазмидой pcDNA3.1, содержащей PD-1 человека (NM_005018.2) или PD-L1 человека (NM_014143.2), и проводили скрининг в селективной среде, содержащей 400 мкг/мл зеоцина (#R25001, Thermo Fisher). Каждый пул клеток идентифицировали и отбирали методом активируемой флуоресценцией сортировки клеток (FACS) с помощью антитела против PD-1 (#557860, BD) и использовали для таких функциональных анализов, как анализ связывания по FACS или анализ конкуренции по FACS. Из пулов трансформированных клеток с высокой экспрессией PD-1 человека отбирали образцы по 0,5-1×10 клеток, готовили серийные разведения антител при постоянной степени разведения и проводили реакцию с полученными клетками при 4°C в течение 20 мин. Затем клетки трижды промывали PBS (#LB001-02, Welgene), содержащим 2% фетальной телячьей сыворотки, и проводили реакцию при 4°C в течение 20 мин с антителом против IgG человека (#FI-3000, Vectorlabs), конъюгированным с флуоресцентным веществом FITC (флуоресцеин-изотиоцианат). Клетки опять промывали так же, как описано выше, а затем суспендировали в 0,5 мл PBS, содержащем 2% FBS (#26140-079, Thermo Fisher), и проводили проточную цитометрию на проточном цитометре FACSCanto II (BD Biosciences, USA).
6
d
От 0,5 до 1 × 10 клеток на каждый образец получали из пулов трансформированных клеток с высокой экспрессией человеческого PD-1, и антитела серийно разводили с постоянной скоростью разведения и реагировали с полученными клетками при 4°С в течение 20 минут. Затем клетки трижды промывали PBS (# LB001-02, Welgene), содержащим 2% фетальной бычьей сыворотки, и подвергали реакции при 4°С в течение 20 минут с антителом против человеческого IgG (# FI-3000, Vectorlabs), конъюгированным с флуоресцентным веществом FITC (флуоресцеин изотиоцианат). Затем клетки подвергали тому же процессу промывания, что и выше, и затем суспендировали в 0,5 мл PBS, содержащий 2% FBS (# 26140-079, Thermo Fisher), с помощью проточного цитометра FACSCanto II (BD Biosciences, США) в качестве проточного цитометра. Определяли способность к связыванию по константе равновесной диссоциации (K), полученной через функцию анализа Graphpad Prism6. При этом, как видно из фиг. 15, способность к связыванию у антител при зависимом от концентрации связывании с PD-1 человека, гиперэкспрессированным на клеточной поверхности, можно определять по MFI (средней интенсивности флуоресценции). Как видно из фиг. 14 и 15, антитела, за исключением 49A2 (исходное 49A2), проявляли близкие способности к связыванию.
3. Способность антител ингибировать образование комплекса PD-1/PD-L1 или PD-1/PD-L2 при иммуноадсорбции фермента

В лунки 96-луночного иммунопланшета (#439454, Thermo) вносили PD-1-Fc (S1420, Y-Biologics) или PD-L2-Fc (#10292-H02H, Sino) человека, а затем трижды промывали PBS, содержащим 0,05% Tween-20 (#P9416, Sigma-Aldrich), после чего оставляли на 1 час при комнатной температуре в чистящем растворе, содержащем 4% обезжиренного молока (#232120, Becton, Dickinson and Company), для блокировки неспецифического связывания. В то же время проводили реакции человеческих PD-L1-His (S1479, Y-Biologics) или PD-1-His (S1352, Y-Biologics) с серийными разведениями антител при постоянной степени разведения при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего оставляли в том же микропланшете при комнатной температуре на 1 час. Затем полученные продукты промывали так же, как и выше, в лунки микропланшета добавляли антитело против биотина-His (#MA1-21315-BTIN, Thermo) в разведении 1:2000 и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа, затем добавляли антитело против стрептавидина с поли-HRP (#21140, Pierce) в разведении 1:5000 и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа, а затем промывали таким же образом. К продуктам реакции добавляли 100 мкл раствора субстрата TMB (#T0440, Sigma-Aldrich), заслоняли от света и инкубировали при комнатной температуре в течение 3 мин. Добавляли 50 мкл 2,5 М серной кислоты (#S1478, Samchun) для остановки реакции и измеряли поглощение при 450 нм на спектрофотометре GM3000 (Glomax Discover System, Promega). Результаты представлены на фиг. 16.
4. Сродство антител к PD1 на приборе ProteOn XPR36
Использовали прибор ProteOn XPR36 (BioRad). На приборе устанавливали сенсорный чип GLC (BioRad) и промывали буфером PBST, а поверхность карбоксиметилдекстрана активировали смесью растворов EDC и сульфо-NHS. На сенсорный чип GLC наносили и иммобилизировали PD1-hFc, растворенный при концентрации 5 мкг/мл в буферном растворе 10 мМ ацетата натрия (pH 5,0).
Для того, чтобы дезактивировать активированные карбоксильные группы, не прореагировавшие с белком PD1, пропускали 1М этаноламин и вводили 10 мМ глицина (рН 2,0) с тем, чтобы смыть белки, не связавшиеся с сенсорным чипом. Затем регистрировали данные для сенсограммы при связывании и диссоциации по времени, пропуская антитела со скоростью подачи 30 мкл/мин (от 30 нМ до 0,123 нМ) в течение 10 мин с помощью буфера PBST.
D
D
Рассчитывали равновесные константы диссоциации (K) путем нанесения на график и аппроксимации данных по сенсограмме в состоянии равновесия в зависимости от концентрации. При этом 49A2 (2B9) проявляло значение K 0,001 нМ, что указывает на высокое сродство к антигену PD1 (фиг. 17).
Сродство других антител к белку PD-1 человека, сродство к белку PD-1 обезьян и сродство к белку PD-1 крыс представлены в таблице 12-14.
Таблица 12. Кинетика связывания между белком PD-1 человека и выбранными антителами
Антитело
K<sub>D</sub> (M)
K<sub>a</sub> (1/Ms)
K<sub>d</sub> (1/s)
PD1-49A2
2,371×10<sup>-10</sup>
3,953×10<sup>5</sup>
9,372×10<sup>-5</sup>
PD1-49A2-1H8
1,245×10<sup>-11</sup>
2,201×10<sup>5</sup>
2,741×10<sup>-6</sup>
PD1-49A2-1B2
1,659×10<sup>-10</sup>
3,853×10<sup>5</sup>
6,390×10<sup>-5</sup>
PD1-49A2-2A6
6,907×10<sup>-11</sup>
3,101×10<sup>5</sup>
2,142×10<sup>-5</sup>
PD1-49A2-2B9
1,0×10<sup>-12</sup>
3,774×10<sup>5</sup>
1,00×10<sup>-7</sup>
PD1-45D6
1,0×10<sup>-12</sup>
2,701×10<sup>5</sup>
1,07×10<sup>-7</sup>
PD1-45D6-3D2
1,0×10<sup>-12</sup>
1,810×10<sup>5</sup>
1,00×10<sup>-7</sup>
PD1-45D6-3H7
2,530×10<sup>-11</sup>
3,076×10<sup>5</sup>
7,781×10<sup>-6</sup>
PD1-45D6-5B2
5,818×10<sup>-11</sup>
3,315×10<sup>5</sup>
1,928×10<sup>-5</sup>
PD1-45D6-5B5
4,773×10<sup>-11</sup>
2,960×10<sup>5</sup>
1,413×10<sup>-5</sup>
Таблица 13. Кинетика связывания между белком PD-1 обезьяны и выбранными антителами
Антитело
K<sub>D</sub> (M)
K<sub>a</sub> (1/Ms)
K<sub>d</sub> (1/s)
PD-1-49A2
1,0×10<sup>-12</sup>
1,683×10<sup>5</sup>
1,0×10<sup>-7</sup>
PD-1-49A2-2B9
1,0×10<sup>-12</sup>
1,853×10<sup>5</sup>
1,0×10<sup>-7</sup>
PD-1-45D6
1,0×10<sup>-12</sup>
1,535×10<sup>5</sup>
1,0×10<sup>-7</sup>
PD-1-45D6-5B2
1,0×10<sup>-12</sup>
2,078×10<sup>5</sup>
1,0×10<sup>-7</sup>
Таблица 14. Кинетика связывания между белком PD-1 крысы и выбранными антителами
Антитело
K<sub>D</sub> (M)
K<sub>a</sub> (1/Ms)
K<sub>d</sub> (1/s)
PD-1-49A2-2B9
4,231×10<sup>-9</sup>
1,478×10<sup>5</sup>
6,252×10<sup>-4</sup>
PD-1-45D6
2,391×10<sup>-9</sup>
5,544×10<sup>4</sup>
1,326×10<sup>-4</sup>
PD-1-45D6-5B2
4,590×10<sup>-9</sup>
1,879×10<sup>5</sup>
8,626×10<sup>-4</sup>
Пример 9. Определение эпитопов у моноклональных антител к PD-1
2
2
600
600
2
Моноклональные scFv-фаги, связывающиеся с антигеном PD1, культивировали в среде, содержащей 2×YTCM, 2% глюкозы и 5 мМ MgCl, при 37°C в течение 16 часов. Полученные при этом клетки вносили в среду, содержащую 2×YTCM, 2% глюкозы и 5 мМ MgCl, при OD = 0,1, а затем культивировали при 37°С в течение 2-3 часов до OD = 0,5-0,7. Клетки инфицировали фагом-помощником M1 при MOI 1:20 и культивировали в среде, содержащей 2×YTCMK, 5 мМ MgCl и 1 мМ IPTG, при 30°C в течение 16 часов.
На 96-луночных иммунопланшетах фиксировали антиген PD1 дикого типа (WT) или некоторые варианты (фиг. 18) при плотности 100 нг на лунку при 4°C в течение 16 ч, а затем блокировали лунки раствором PBS с 4% обезжиренного молока. Каждую лунку промывали 0,2 мл PBS/T, а затем вносили одиночный клон scFv-фага (по 100 scFv-фагов) после культивирования в течение 16 часов, в дозе 100 мкл и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. Лунки опять промывали 4 раза по 0,2 мл PBS/T, добавляли вторичное антитело против M13-HRP в разведении 1:2000 и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывки 0,2 мл PBS/T проводили развитие окраски и измеряли поглощение при 490 нм.
В результате оказалось, что выбранные одиночные клоны scFv-фагов, контрольный scFv-фаг и варианты PD-1 проявляли разные характеристики связывания, следовательно, они содержат разные эпитопы (фиг. 19).
На 96-луночных иммунопланшетах фиксировали антиген PD1 дикого типа (WT) или некоторые варианты (фиг. 18) при плотности 100 нг на лунку при 4°C в течение 16 ч, а затем блокировали лунки раствором PBS с 4% обезжиренного молока. Каждую лунку промывали 0,2 мл PBS/T, а затем вносили одиночный клон scFv-фага после культивирования в течение 16 ч в дозе 100 мкл (1 мкг/мл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. Лунки опять промывали 4 раза по 0,2 мл PBS/T, добавляли вторичное антитело против Fab в разведении 1:2000 и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывки 0,2 мл PBS/T проводили развитие окраски и измеряли поглощение при 490 нм.
В результате оказалось, что контрольный scFv-фаг и варианты PD-1 проявляют разные характеристики связывания, следовательно, они содержат разные эпитопы (фиг. 20).
Пример 10. Специфическое связывание исходного антитела к PD-1
Для определения способности к связыванию у исходного антитела к PD1 и контрольного антитела (ниволумаб) с другими антигенами, чем антиген PD1 (таблица 15), на 96-луночных иммунопланшетах фиксировали около 90 неспецифических антигенов при плотности 100 нг на лунку при 4°C в течение 16 часов и блокировали соответствующие лунки раствором PBS с 4% обезжиренного молока. Лунки промывали 0,2 мл PBS/T, а затем в каждую лунку вносили исходное антитело и контрольное антитело в дозе 100 мкл (1 мкг/мл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. Лунки опять промывали 4 раза по 0,2 мл PBS/T, а затем добавляли вторичное антитело против каппа с HRP в разведении 1:2000 и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывки 0,2 мл PBS/T проводили развитие окраски и измеряли поглощение при 490 нм.
В результате оказалось, что и контрольное антитело, и исходное антитело специфически связываются только с антигеном PD1 и не связываются с неспецифическими антигенами (фиг. 21).
Пример 11. Сравнение продуктивности в системе краткосрочной экспрессии моноклональных антител к PD1
Как оказалось, оптимизированные антитела обладают сравнительно однородной и высокой продуктивностью благодаря превосходным физическим свойствам при получении и очистке в системе краткосрочной экспрессии. Некоторые антитела обладают большей продуктивностью, чем обычные коммерчески доступные антитела (фиг. 22).
Пример 12. Повышение активности под действием моноклональных антител к PD1 при аллогенной реакции MLR
Смешивали Т-клетки с происходящими из моноцитов дендритными клетками, выделенными от разных людей, в соотношении 1:10 и культивировали в течение 5 дней, а затем измеряли количество γ-интерферона в культуральной среде. При этом культуральные среды, содержащие исходные антитела 45D6 и 49A2, проявляли зависимое от концентрации повышение количества γ-интерферона (фиг. 23).
Пример 13. Испытание моноклональных антител к PD1 на термостабильность
Белок антител разводили в DPBS до 3 мкМ, отбирали 45 мкл и смешивали с 5 мкл 200-кратного красителя Sypro Orange (#S6650, Thermo), а затем по 50 мкл вносили в пробирки для qPCR (#B77009, B57651, Bioplastics). Проводили количественный ПЦР (qPCR) в реальном времени на установке BioRad CFX96. Условия qPCR задавали следующим образом: реакция при 25°C в течение 30 сек, повышение температуры на 1°C вплоть до 99°C и в то же время реакция при каждой температуре в течение 1 мин, а затем заключительная реакция при 25°C в течение 10 сек. В качестве константы, характеризующей разупорядочение структуры антител, использовали Tm (температура плавления). Результаты представлены ниже в таблице 16.
Таблица 16
Образец
Tm
Пембролизумаб
63
Опдиво
64
45D6
63
49A2
63
49A2-2B9
64
Промышленная применимость
Новые антитела, связывающиеся с PD-1, либо их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению могут связываться с PD-1 и ингибировать активность PD-1, поэтому они применимы для разработки иммунотерапевтических средств от различных заболеваний, связанных с PD-1.
Хотя конкретные конфигурации настоящего изобретения были описаны подробно, однако специалистам в данной области должно быть ясно, что данное описание приводится в качестве предпочтительных воплощений для иллюстративных целей и не должно рассматриваться как ограничивающее объем настоящего изобретения. Таким образом, существенный объем настоящего изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения и её эквивалентами.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Y-BIOLOGICS INC.
<120> NOVEL ANTIBODY AGAINST PROGRAMMED CELL DEATH PROTEIN (PD-1), AND
USE THEREOF
<130> PF-B2149
<140> PCT/KR2017/008494
<141> 2017-08-07
<150> KR10-2016-0100210
<151> 2016-08-05
<160> 420
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 1
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 2
Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr Ala
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 3
Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Gly
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 4
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 5
Gly Asp Thr Phe Thr Arg Asn Ala
1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 6
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr
1 5
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 7
Gly Tyr Thr Phe Asn Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 8
Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala
1 5
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 9
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asp
1 5
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 10
Gly Phe Thr Val Ser Arg Asn Ser
1 5
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 11
Gly Asp Thr Phe Thr Arg Tyr Ile
1 5
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 12
Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr Ala
1 5
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 13
Gly Phe Thr Phe Glu Asp Tyr Ala
1 5
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 14
Gly Leu Ser Phe Ser Ser Tyr Trp
1 5
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 15
Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp
1 5
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 16
Gly Phe Thr Phe Gly Asp His Pro
1 5
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 17
Gly Phe Thr Phe Leu Arg Tyr Ala
1 5
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 18
Gly Phe Thr Phe Lys Asn Asn Ala
1 5
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 19
Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr Ala
1 5
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 20
Gly Phe Thr Phe Pro Ile Tyr Ala
1 5
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 21
Gly Phe Thr Phe Lys Thr Tyr Ala
1 5
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 22
Gly Phe Thr Phe Lys Tyr Tyr Ala
1 5
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 23
Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr Ala
1 5
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 24
Gly Phe Thr Phe Leu Val Tyr Ala
1 5
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 25
Gly Phe Thr Phe Arg Leu Tyr Ala
1 5
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 26
Gly Phe Thr Phe Ser Phe Tyr Ala
1 5
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 27
Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr Ala
1 5
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 28
Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr Ala
1 5
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 29
Gly Phe Thr Phe Met Arg Tyr Ala
1 5
<210> 30
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 30
Gly Phe Thr Phe Trp Thr Tyr Ala
1 5
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 31
Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asp Lys
1 5
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 32
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 33
Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile
1 5
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 34
Ile Ser Trp Asn Ser Gly Thr Ile
1 5
<210> 35
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 35
Ile Ile Pro Leu Phe Ser Thr Ala
1 5
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 36
Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ser Ala
1 5
<210> 37
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 37
Ile Ser Ala Ser Gly Asn Ser Ile
1 5
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 38
Ile Asn Pro Ser Asp Gly Ser Ala
1 5
<210> 39
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 39
Ile Ser Trp Asn Ser Asn Asn Ile
1 5
<210> 40
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 40
Leu His Ala Asp Ser Gly Lys Thr
1 5
<210> 41
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 41
Ile Phe Ser Gly Gly Thr Thr Lys
1 5
<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 42
Val Ile Pro Thr Leu Gly Leu Thr
1 5
<210> 43
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 43
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Lys Ile
1 5
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 44
Ile Ser Trp Asn Ser His Asn Ile
1 5
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 45
Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys
1 5
<210> 46
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 46
Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr
1 5
<210> 47
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 47
Ile Ser Trp Asn Ser Gly Thr Pro
1 5
<210> 48
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 48
Ile Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Glu
1 5
<210> 49
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 49
Ile Ser Tyr Asp Gly Gln Asp Lys
1 5
<210> 50
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 50
Ile Ser Tyr Asp Gly Arg His Lys
1 5
<210> 51
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 51
Ile Ser Tyr Asp Gly Gln His Lys
1 5
<210> 52
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 52
Ile Ser Tyr Asp Gly Ala His Lys
1 5
<210> 53
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 53
Ile Ser Tyr Asp Gly Gln Tyr Lys
1 5
<210> 54
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 54
Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Tyr Lys
1 5
<210> 55
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 55
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser His Lys
1 5
<210> 56
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 56
Ile Ser His Asp Gly Asn Asp Lys
1 5
<210> 57
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 57
Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr
1 5
<210> 58
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 58
Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser
1 5
<210> 59
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 59
Ala Arg Ser Gln Gln Gln Ile Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 60
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 60
Ala Arg Ser Ile Arg Gln Ile Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 61
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 61
Ala Arg Ser Leu Pro Xaa Ser Arg Ser Arg Leu Asp Val
1 5 10
<210> 62
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 62
Ala Arg Ala Xaa Thr Ser Pro Leu Asp Met Ser Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 63
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 63
Ala Arg Leu Leu His Gln Met Asn Glu His Glu Phe Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 64
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 64
Ala Lys His Lys Gly Leu Pro Phe Asp Trp Ser Pro Asp Gly Phe Asp
1 5 10 15
Thr
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 65
Ala Arg Thr Ile Glu Gly Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 66
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 66
Val Thr Ser Gly Pro Phe Gly Glu Phe Arg Asn
1 5 10
<210> 67
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 67
Ala Arg Leu Met His Thr Phe Ser Val Gln Tyr Phe Leu Asp Val
1 5 10 15
<210> 68
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 68
Ala Arg Asp Gly Asn Tyr Tyr Asp Ser Arg Gly Tyr Tyr Tyr Asp Thr
1 5 10 15
Phe Asp Met
<210> 69
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 69
Ala Arg Gly Ala Leu Thr Pro Leu Asp Val
1 5 10
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 70
Ala Arg Gly Thr His Trp Leu Asp Ser
1 5
<210> 71
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 71
Ala Arg Glu Glu Gln Phe Leu Ile Ala Leu Ala Gly Arg Tyr Phe Asp
1 5 10 15
Tyr
<210> 72
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 72
Ala Arg Gly Tyr Gly Ser Gly Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 73
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 73
Ala Arg Ile Gly Tyr Lys Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 74
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 74
Ser Thr Ser Gly Leu Gly Val His Ala
1 5
<210> 75
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 75
Ala Arg Asp Ser Phe Gly Gly His Leu Asp Leu
1 5 10
<210> 76
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 76
Ala Arg Glu Gly Asp Gly Ser Tyr Trp Gly Tyr Phe Asp Ser
1 5 10
<210> 77
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 77
Ala Arg Gly His Asn Tyr Leu Asp Ser Ser Tyr Tyr Asp Tyr
1 5 10
<210> 78
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 78
Ala Ser Val Ser Tyr Cys Ser Gly Gly Ser Cys Tyr Gln Gly Thr Phe
1 5 10 15
Asp Tyr
<210> 79
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 79
Ala Arg Thr Thr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 80
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 80
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 81
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 81
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 82
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 82
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 83
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 83
Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asn Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 84
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 84
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 85
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 85
Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 86
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 86
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 87
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 87
Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 88
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 88
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 89
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 89
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 90
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 90
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 91
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 91
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 92
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 92
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 93
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 93
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Asn Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 94
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 94
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Gly Ser
20 25
<210> 95
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 95
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 96
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 96
Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10 15
Val
<210> 97
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 97
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10 15
Val
<210> 98
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 98
Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10 15
Gly
<210> 99
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 99
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10 15
Ser
<210> 100
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 100
Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10 15
Gly
<210> 101
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 101
Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Met Ala
1 5 10 15
Asp
<210> 102
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 102
Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10 15
Asp
<210> 103
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 103
Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10 15
Ile
<210> 104
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 104
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10 15
Gly
<210> 105
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 105
Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Gln Ala Pro Glu Trp Met Gly
1 5 10 15
Trp
<210> 106
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 106
Met Asn Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser
1 5 10 15
Leu
<210> 107
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 107
Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10 15
Arg
<210> 108
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 108
Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10 15
Ser
<210> 109
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 109
Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10 15
Asn
<210> 110
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 110
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10 15
Glu
<210> 111
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 111
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10 15
Gly
<210> 112
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 112
Leu Thr Trp Val Arg Gln Ile Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly
1 5 10 15
Phe
<210> 113
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 113
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Thr
1 5 10 15
Val
<210> 114
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 114
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 115
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 115
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Pro Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 116
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 116
Val Tyr Ala Asp Ser Met Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 117
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 117
Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 118
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 118
His Ser Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu
1 5 10 15
Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 119
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 119
Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Leu Thr Leu Thr Ala Asp Val
1 5 10 15
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 120
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 120
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 121
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 121
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 122
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 122
Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr
1 5 10 15
Ser Thr Ser Ser Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 123
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 123
Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 124
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 124
Gly Tyr Ala Gln Thr Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr
1 5 10 15
Ser Ile Asp Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 125
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 125
Tyr Lys Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
1 5 10 15
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
35
<210> 126
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 126
Thr Tyr Ala Gln Asn Phe Gln Asp Thr Val Thr Ile Ile Ala Asp Lys
1 5 10 15
Ser Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Lys Asn Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 127
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 127
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 128
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 128
Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 129
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 129
Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 130
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 130
Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Ser Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys
1 5 10 15
Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 131
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 131
Gly Tyr Ala Asp Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 132
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 132
Thr Thr Glu Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
1 5 10 15
Asp Asp Ser Lys Ser Ile Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
20 25 30
Glu Asp Thr Ala Val Tyr
35
<210> 133
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 133
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 134
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 134
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ser Lys Asn Met Leu Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 135
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 135
Trp Gly Gln Gly Ser Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 136
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 136
Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 137
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 137
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 138
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 138
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 139
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 139
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 140
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 140
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Ile Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 141
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 141
Trp Gly Leu Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 142
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 142
Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 143
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 143
Trp Gly Gln Gly Thr Met Ile Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 144
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 144
Trp Gly Gln Gly Thr Pro Ile Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 145
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 145
Trp Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 146
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 146
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 147
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 147
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 148
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 148
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Val Tyr Ala Asp Ser Met
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gln Gln Gln Ile Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 149
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 149
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Val Tyr Ala Asp Ser Met
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ile Arg Gln Ile Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 150
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (102)..(102)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 150
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Val Tyr Ala Asp Ser Met
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Pro Xaa Ser Arg Ser Arg Leu Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 151
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (100)..(100)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 151
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Val Tyr Ala Asp Ser Met
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Xaa Thr Ser Pro Leu Asp Met Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 152
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 152
Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asn Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Trp Asn Ser Gly Thr Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Leu His Gln Met Asn Glu His Glu Phe Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 153
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 153
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Leu Phe Ser Thr Ala His Ser Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys His Lys Gly Leu Pro Phe Asp Trp Ser Pro Asp Gly Phe Asp
100 105 110
Thr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 154
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 154
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Thr Phe Thr Arg Asn
20 25 30
Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Ala Asp Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ser Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Leu Thr Leu Thr Ala Asp Val Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Ile Glu Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 155
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 155
Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Ile Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 156
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 156
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Asp Ile Ser Ala Ser Gly Asn Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Thr Ser Gly Pro Phe Gly Glu Phe Arg Asn Trp Gly Leu Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 157
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 157
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Met His Thr Phe Ser Val Gln Tyr Phe Leu Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 158
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 158
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 159
<211> 126
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 159
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Ser Tyr
20 25 30
Tyr Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Asp Gly Ser Ala Thr Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Ser Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Asn Tyr Tyr Asp Ser Arg Gly Tyr Tyr Tyr Asp Thr
100 105 110
Phe Asp Met Trp Gly Gln Gly Thr Leu Ile Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 160
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 160
Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Asn Asn Ile Lys Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Leu Thr Pro Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Pro
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 161
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 161
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Gln Ala Pro Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Leu His Ala Asp Ser Gly Lys Thr Gly Tyr Ala Gln Thr Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr His Trp Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 162
<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 162
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Arg Asn
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Leu Ile Phe Ser Gly Gly Thr Thr Lys Tyr Lys Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Glu Gln Phe Leu Ile Ala Leu Ala Gly Arg Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 163
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 163
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Ile Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Val Ile Pro Thr Leu Gly Leu Thr Thr Tyr Ala Gln Asn Phe
50 55 60
Gln Asp Thr Val Thr Ile Ile Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Lys Asn Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Ser Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Ile Thr Val Ser Ser
115
<210> 164
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 164
Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Lys Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ile Gly Tyr Lys Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 165
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 165
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 166
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 166
Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Trp Asn Ser His Asn Ile Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Thr Ser Gly Leu Gly Val His Ala Trp Gly Gln Gly Thr Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 167
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 167
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Ser Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Phe Gly Gly His Leu Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 168
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 168
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Asp Gly Ser Tyr Trp Gly Tyr Phe Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Pro Ile Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 169
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 169
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Asn Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Thr Pro Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly His Asn Tyr Leu Asp Ser Ser Tyr Tyr Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 170
<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 170
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp His
20 25 30
Pro Leu Thr Trp Val Arg Gln Ile Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Glu Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ser Val Ser Tyr Cys Ser Gly Gly Ser Cys Tyr Gln Gly
100 105 110
Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 171
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 171
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Leu Arg Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Gln Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 172
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 172
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Asn Asn
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Arg His Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 173
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 173
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Gln His Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 174
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 174
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Pro Ile Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ala His Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 175
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 175
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Thr Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Gln His Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 176
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 176
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Tyr Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Val Ile Ser Tyr Asp Gly Gln Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 177
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 177
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Gln Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 178
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 178
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Leu Arg Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 179
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 179
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Leu Val Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser His Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 180
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 180
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Thr Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Gln His Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 181
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 181
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 182
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 182
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 183
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 183
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Leu Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser His Asp Gly Asn Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 184
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 184
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Phe Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 185
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 185
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 186
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 186
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 187
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 187
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Met Arg Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 188
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 188
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Thr Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 189
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 189
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 190
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 190
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Ile Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 191
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 191
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 192
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 192
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 193
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 193
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Met Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 194
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 194
ccaggatggt tcttagactc ccc 23
<210> 195
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 195
caccagggtt tggaactggc 20
<210> 196
<211> 232
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 196
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 197
<211> 233
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 197
Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro
1 5 10 15
Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
20 25 30
Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val
35 40 45
Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe
50 55 60
Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu
65 70 75 80
Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His
85 90 95
Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys
100 105 110
Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser
115 120 125
Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met
130 135 140
Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro
145 150 155 160
Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn
165 170 175
Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met
180 185 190
Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser
195 200 205
Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
225 230
<210> 198
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 198
Arg Asp Ile Ser Arg Trp
1 5
<210> 199
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 199
Gln Ser Leu Val His
1 5
<210> 200
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 200
Gln Ala Ile Ser Asn Trp
1 5
<210> 201
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 201
Ala Leu Ser Lys Gln Tyr
1 5
<210> 202
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 202
Thr Ser Asn Ile Gly Thr Asn Ala
1 5
<210> 203
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 203
Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp
1 5
<210> 204
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 204
Gln Gly Ile Val Ser Trp
1 5
<210> 205
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 205
Gln Ser Leu Leu Asp Ser Glu Asp Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 206
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 206
Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 207
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 207
Thr Phe Asn Ile Gly Thr Thr Thr
1 5
<210> 208
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 208
Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Asp Gly Lys Thr Tyr
1 5 10
<210> 209
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 209
Ser Leu Arg Thr Tyr Tyr
1 5
<210> 210
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 210
Asn Leu Arg Thr Lys Tyr
1 5
<210> 211
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 211
Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr
1 5
<210> 212
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 212
Arg Ser Asn Phe Gly Ala Gly His Asp
1 5
<210> 213
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 213
Gln Ser Leu Leu Asp Ser His Asp Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 214
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 214
Ser Ser Asn Ile Gly Ile Asn Thr
1 5
<210> 215
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 215
Gln Ser Leu Phe Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 216
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 216
Gln Ser Leu Leu Tyr Ile Asp Gly Glu Thr Tyr
1 5 10
<210> 217
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 217
Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Asn Tyr
1 5 10
<210> 218
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 218
Ala Leu Ser Lys Glu Tyr
1 5
<210> 219
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 219
Gln Ser Val Thr Ser Asp
1 5
<210> 220
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 220
Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 221
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 221
Gln Ser Leu Leu Asp Arg Asp Gly Gly His Thr Tyr
1 5 10
<210> 222
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 222
Gln Ser Leu Leu Asp Arg Gly Gly Gly His Thr Tyr
1 5 10
<210> 223
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 223
Gly Ala Ser
1
<210> 224
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 224
Lys Ile Ser
1
<210> 225
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 225
Ala Thr Ser
1
<210> 226
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 226
Lys Asp Thr
1
<210> 227
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 227
Tyr Asp Asp
1
<210> 228
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 228
Gly Asn Ser
1
<210> 229
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 229
Arg Ala Ser
1
<210> 230
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 230
Thr Leu Ser
1
<210> 231
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 231
Ala Ala Ser
1
<210> 232
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 232
Asn Tyr Asp
1
<210> 233
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 233
Gly Lys Asn
1
<210> 234
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 234
Gln Asp Thr
1
<210> 235
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 235
Asp Val Ser
1
<210> 236
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 236
Gly Asn Asn
1
<210> 237
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 237
Arg Asp Asp
1
<210> 238
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 238
Glu Val Ser
1
<210> 239
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 239
Leu Gly Ser
1
<210> 240
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 240
Lys Asp Ser
1
<210> 241
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 241
Asp Ala Ser
1
<210> 242
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 242
Gln Gln Gly Lys Ser Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 243
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 243
Met Gln Ser Thr Gln Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 244
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 244
Gln Gln Thr Asp Ser Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 245
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 245
Gln Ser Ile Thr Asp Lys Ser Gly Thr Asp Val Ile
1 5 10
<210> 246
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 246
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Trp Val
1 5 10
<210> 247
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 247
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Tyr Val
1 5 10
<210> 248
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 248
Gln Gln Ala Asp Ser Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 249
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 249
Leu Gln Arg Met Gly Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 250
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 250
Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Arg Thr
1 5
<210> 251
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 251
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Ala Trp Leu
1 5 10
<210> 252
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 252
Met Gln Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr
1 5
<210> 253
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 253
Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Lys Ser Leu Val
1 5 10
<210> 254
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 254
Met Thr Trp Asp Val Asp Thr Thr Ser Met Ile
1 5 10
<210> 255
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 255
Ser Ser Phe Thr Ser Ser Ser Thr Val Val
1 5 10
<210> 256
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 256
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Ala Trp Gly
1 5 10
<210> 257
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 257
Met Gln Arg Ile Asp Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 258
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 258
Ala Ser Trp Asp Asp Thr Leu Asn Gly Trp Val
1 5 10
<210> 259
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 259
Ser Ser Phe Ala Arg Asn Ser Asn Tyr Val
1 5 10
<210> 260
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 260
Met Gln Gly Ile His Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 261
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 261
Met Gln Gly Leu Gln Ile Pro Ser Thr
1 5
<210> 262
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 262
Gln Ser Val Asp Ser Ser Asp Thr Ser Val Val
1 5 10
<210> 263
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 263
Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 264
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 264
Met Gln Arg Ile Glu Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 265
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 265
Met Gln Arg Val Glu Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 266
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 266
Met Gln Arg Ile Glu Phe Pro Phe Thr
1 5
<210> 267
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 267
Met Gln Arg Arg Asp Phe Pro Phe Thr
1 5
<210> 268
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 268
Met Gln Arg Lys Glu Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 269
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 269
Met Gln Arg Ile His Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 270
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 270
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
20 25
<210> 271
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 271
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
20 25
<210> 272
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 272
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
20 25
<210> 273
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 273
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Met Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp
20 25
<210> 274
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 274
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Met Ser Glu Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly
20 25
<210> 275
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 275
Gln Phe Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Ile Ile Ser Cys Thr Gly Ser
20 25
<210> 276
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 276
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
20 25
<210> 277
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 277
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Thr Thr Cys Arg Ala Ser
20 25
<210> 278
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> QFVLTQSPSA SGTPGQNIVI SCSAS
<400> 278
Gln Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Asn Ile Val Ile Ser Cys Ser Ala Ser
20 25
<210> 279
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 279
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp
20 25
<210> 280
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 280
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Ala Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Asn Ile Ile Cys Ser Gly Asp
20 25
<210> 281
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 281
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr
20 25
<210> 282
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 282
Gln Phe Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser
20 25
<210> 283
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 283
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
20 25
<210> 284
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 284
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Pro Ser Thr Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Arg
20 25
<210> 285
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 285
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
20 25
<210> 286
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 286
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr
20 25
<210> 287
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 287
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser
20 25
<210> 288
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 288
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Leu Ser Leu Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp
20 25
<210> 289
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 289
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser
20 25
<210> 290
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 290
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro His Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
20 25
<210> 291
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 291
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
20 25
<210> 292
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 292
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Pro Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
20 25
<210> 293
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 293
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Met Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
20 25
<210> 294
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 294
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
20 25
<210> 295
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 295
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 296
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 296
Leu Asn Trp Phe His Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile
1 5 10 15
His
<210> 297
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 297
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 298
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 298
Ala Ser Trp Tyr Gln Leu Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Met
1 5 10 15
Tyr
<210> 299
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 299
Val Asn Trp Tyr Gln Gln Pro Pro Gly Lys Ala Pro Thr Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 300
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 300
Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 301
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 301
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 302
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 302
Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 303
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 303
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 304
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 304
Val Asn Trp Tyr Gln Arg Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 305
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 305
Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Val Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 306
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 306
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Leu Leu Val Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 307
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 307
Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 308
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 308
Val His Trp Cys Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 309
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 309
Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val Leu Met
1 5 10 15
Tyr
<210> 310
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 310
Leu Phe Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 311
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 311
Ser Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Met
1 5 10 15
Tyr
<210> 312
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 312
Val Ala Trp Tyr Gln His Ile Arg Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 313
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 313
Val Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 314
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 314
Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 315
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 315
Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 316
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 316
Ser Leu Arg Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
20 25 30
Thr Tyr Phe Cys
35
<210> 317
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 317
Asn Arg Val Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 318
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 318
Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 319
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 319
Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly
1 5 10 15
Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu Asp Gly Ala
20 25 30
Asp Tyr Tyr Cys
35
<210> 320
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 320
Arg Leu Thr Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Arg Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala
20 25 30
Asp Tyr Tyr Cys
35
<210> 321
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 321
Asp Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ala Ser Lys Ser Ala
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
20 25 30
Asp Tyr Tyr Cys
35
<210> 322
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 322
Asp Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 323
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 323
His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Asp Val Gly
20 25 30
Leu Tyr Tyr Cys
35
<210> 324
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 324
Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
20 25 30
Thr Tyr Phe Cys
35
<210> 325
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 325
Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala
20 25 30
Asp Tyr Tyr Cys
35
<210> 326
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 326
Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Glu Phe Asn Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly
20 25 30
Ile Tyr Tyr Cys
35
<210> 327
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 327
Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly
1 5 10 15
Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Ala Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala
20 25 30
Asp Tyr Tyr Cys
35
<210> 328
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 328
Arg Arg Pro Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly
1 5 10 15
Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Thr Arg Asp Glu Ser
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 329
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 329
Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
1 5 10 15
Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
20 25 30
Asp Tyr Tyr Cys
35
<210> 330
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 330
Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
20 25 30
Glu Tyr Tyr Cys
35
<210> 331
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 331
His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly
20 25 30
Leu Tyr Tyr Cys
35
<210> 332
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 332
Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly
1 5 10 15
Ile Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala
20 25 30
Asp Tyr Tyr Cys
35
<210> 333
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 333
His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly
20 25 30
Ile Tyr Tyr Cys
35
<210> 334
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 334
Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
1 5 10 15
Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu Gln Pro Glu Asp Glu Ala
20 25 30
Asp Tyr Tyr Cys
35
<210> 335
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 335
Ser Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 336
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 336
Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly
20 25 30
Leu Tyr Tyr Cys
35
<210> 337
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 337
Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly
1 5 10 15
Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala
20 25 30
Asp Tyr Tyr Cys
35
<210> 338
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 338
Asn Arg Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 339
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 339
His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Glu Phe Asn Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly
20 25 30
Ile Tyr Tyr Cys
35
<210> 340
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 340
Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 341
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 341
His Arg Ala Leu Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ser Gly
20 25 30
Ile Tyr Tyr Cys
35
<210> 342
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 342
His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ser Gly
20 25 30
Ile Tyr Tyr Cys
35
<210> 343
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 343
His Arg Ala Leu Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Val Gly
20 25 30
Leu Tyr Tyr Cys
35
<210> 344
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 344
His Arg Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Glu Phe Asn Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly
20 25 30
Ile Tyr Tyr Cys
35
<210> 345
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 345
His Arg Ala Leu Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Asp Val Gly
20 25 30
Leu Tyr Tyr Cys
35
<210> 346
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 346
His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Glu Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 347
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 347
His Arg Ala Leu Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Asp Asn Val Gly
20 25 30
Leu Tyr Tyr Cys
35
<210> 348
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 348
His Arg Ala Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ser Gly
20 25 30
Ile Tyr Tyr Cys
35
<210> 349
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 349
His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 350
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 350
His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Asp Val Gly
20 25 30
Ile Tyr Tyr Cys
35
<210> 351
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 351
His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Val Gly
20 25 30
Ile Tyr Tyr Cys
35
<210> 352
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 352
His Arg Ala Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Glu Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 353
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 353
Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Asp Val Gly
20 25 30
Ile Tyr Tyr Cys
35
<210> 354
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 354
His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Thr Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 355
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 355
His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser His
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Val Gly
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 356
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 356
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
1 5 10
<210> 357
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 357
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
1 5 10
<210> 358
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 358
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
1 5 10
<210> 359
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 359
Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
1 5 10
<210> 360
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 360
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 361
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 361
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys
1 5 10
<210> 362
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 362
Val Arg Arg Arg Asp Gln Ala Asp Arg Pro
1 5 10
<210> 363
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 363
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 364
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 364
Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 365
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 365
Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
1 5 10
<210> 366
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 366
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 367
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 367
Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 368
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 368
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Asp Ile Ser Arg Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Arg Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Lys Ser Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 369
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 369
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Leu
20 25 30
Asn Trp Phe His Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile His
35 40 45
Lys Ile Ser Asn Arg Val Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser Thr Gln Phe Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 370
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 370
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Ser Asn Trp
20 25 30
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asp Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 371
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 371
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Met Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Ser Lys Gln Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Leu Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Met Tyr
35 40 45
Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Gly Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ile Thr Asp Lys Ser Gly Thr
85 90 95
Asp Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 372
<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 372
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Met Ser Glu Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Thr Ser Asn Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Pro Pro Gly Lys Ala Pro Thr Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Tyr Asp Asp Arg Leu Thr Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Arg Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 373
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 373
Gln Phe Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Ile Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asp Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Ala Ser Lys Ser Ala Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 374
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 374
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Val Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Asp Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asp Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 375
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 375
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Glu Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Leu Gln
85 90 95
Arg Met Gly Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile
100 105 110
Lys
<210> 376
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 376
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Thr Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys
100 105
<210> 377
<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 377
Gln Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Asn Ile Val Ile Ser Cys Ser Ala Ser Thr Phe Asn Ile Gly Thr Thr
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Arg Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Tyr Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Ala Trp Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 378
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 378
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Asn Leu Arg
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile
100 105 110
Lys
<210> 379
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 379
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Thr Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Ala Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Lys Ser
85 90 95
Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 380
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 380
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Ala Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Asn Ile Ile Cys Ser Gly Asp Asn Leu Arg Thr Lys Tyr Val
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Leu Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Thr Arg Arg Pro Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Thr Arg
65 70 75 80
Asp Glu Ser Thr Tyr Tyr Cys Met Thr Trp Asp Val Asp Thr Thr Ser
85 90 95
Met Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 381
<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 381
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Phe Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 382
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 382
Gln Phe Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Arg Ser Asn Phe Gly Ala Gly
20 25 30
His Asp Val His Trp Cys Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Ala Trp Gly Val Arg Arg Arg Asp Gln Ala Asp Arg Pro
100 105 110
<210> 383
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 383
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
His Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Ile Asp Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 384
<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 384
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Pro Ser Thr Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Arg Ser Ser Asn Ile Gly Ile Asn
20 25 30
Thr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val Leu
35 40 45
Met Tyr Arg Asp Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Arg Ser Gly Ile Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Asp Thr Leu
85 90 95
Asn Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 385
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 385
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asp Ser
20 25 30
Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln
85 90 95
Arg Met Gly Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 386
<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 386
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Phe Ala Arg Asn
85 90 95
Ser Asn Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 387
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 387
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ile
20 25 30
Asp Gly Glu Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Ile His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 388
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 388
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Leu Gln Ile Pro Ser Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105 110
<210> 389
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 389
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Leu Ser Leu Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Ser Lys Glu Tyr Ser
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Met Tyr
35 40 45
Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Val Asp Ser Ser Asp Thr Ser
85 90 95
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 390
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 390
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln His Ile Arg Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 391
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 391
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Asn Leu Arg
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 392
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 392
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asp Ser
20 25 30
Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 393
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 393
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro His Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Glu Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Leu Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ser Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Ile Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 394
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 394
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Glu Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ser Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Val Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile
100 105 110
Lys
<210> 395
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 395
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Arg
20 25 30
Asp Gly Gly His Thr Tyr Val Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Leu Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Ile Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 396
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 396
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Glu Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Asn Leu Arg
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 397
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 397
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asp Ser
20 25 30
Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Leu Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Leu Gln
85 90 95
Arg Met Gly Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 398
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 398
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Glu Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Glu
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Arg Asp Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile
100 105 110
Lys
<210> 399
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 399
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile
100 105 110
Lys
<210> 400
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 400
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Arg
20 25 30
Asp Gly Gly His Thr Tyr Val Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Leu Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Asp Asn Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Ile Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 401
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 401
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Glu Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 402
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 402
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Glu Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Glu
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile
100 105 110
Lys
<210> 403
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 403
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asp Ser
20 25 30
Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ser Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile
100 105 110
Lys
<210> 404
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 404
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Glu Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 405
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 405
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Asn Leu Arg
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 406
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 406
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile
100 105 110
Lys
<210> 407
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 407
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Glu Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 408
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 408
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Glu Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Asn Leu Arg
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile
100 105 110
Lys
<210> 409
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 409
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asp Ser
20 25 30
Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 410
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 410
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Glu Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Ile Asp Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile
100 105 110
Lys
<210> 411
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 411
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Pro Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Glu
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Arg Asp Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile
100 105 110
Lys
<210> 412
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 412
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Met Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Glu Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 413
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 413
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Glu Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 414
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 414
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Glu Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile
100 105 110
Lys
<210> 415
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 415
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Glu
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Arg Asp Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 416
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 416
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Glu Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 417
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 417
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asp Ser
20 25 30
Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile
100 105 110
Lys
<210> 418
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 418
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Glu Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Thr Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Ile Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 419
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 419
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Arg
20 25 30
Gly Gly Gly His Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Lys Glu Phe Pro Leu Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 420
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 420
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser His Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Ile His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<---