Na210B12H11SH (BSH) - препарат для нейтронозахватной терапии: биораспределение и влияние на клеточный цикл меланомы В16

30 ЛЕКЦИИ

УДК 616-006.81-092.9:615.849.015.1 Е. Yu. Grigorieva, Т. G. Nikolaeva, E. Yu. Koldaeva, M. G. Naidenov, R. A. Spryshkova NA210B12HnSH (BSH) — BORON CARRIER FOR NEUTRON CAPTURE THERAPY: BIODISTRIBUTION AND INFLUENCE ON MELANOMA B16 CELL CYCLE N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow ABSTRACT This article is devoted to influence of BSH — boron carrier at anticancer neutron capture therapy on cell population of murine melanoma В16. It was proved that prevalent accumulation of tumour cells in synthetic and premitotic phases (S and G2/M) of cell cycle was caused by BSH. This phenomenon of cell proliferation may be, probably, linked to compensatoiy population response to damaging factor of BSH. Key words: BSH, neutron capture therapy (NCT), cell cycle, melanoma В16. E. Ю. Григорьева, Т. Г. Николаева,E. Ю. Колдаева, М. Г. Найденов, P. А. Спрышкова NA210B12H11SH (BSH) — ПРЕПАРАТ ДЛЯ НЕЙТРОНОЗАХВАТНОЙ ТЕРАПИИ: БИОРАСПРЕДЕЛЕНИЕ И ВЛИЯНИЕ НА КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ МЕЛАНОМЫ В16 ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва РЕЗЮМЕ Исследование посвящено влиянию BSH — носителя бора на популяцию клеток мышиной меланомы В16 при нейтронозахватной терапии опухоли. Подтверждено, что преимущественное накопление опухолевых клеток в синтетической и премитотической фазах (S и G2/M) клеточного цикла обусловливалось действием BSH. Вероятно, этот феномен клеточной пролиферации может быть связан с компенсаторной реакцией популяции на препарат (BSH) как на повреждающий фактор. Ключевые слова: BSH, нейтронозахватная терапия (НЗТ), клеточный цикл, меланома В16. ВВЕДЕНИЕ ния [7, 8]. Однако при этом возможно влияние BSH как Из двух разрешенных к применению в нейтроно- биологически активного химического соединения на захватной терапии препаратов бора-10 (В-НЗТ) — функционирование опухолевой клетки. Выяснив меха-меркаптоундекагидрододекабората (Na2B12HnSH — низмы подобного воздействия, можно более рацио-BSH) и борофенилаланина (БФА) — в настоящее вре- нально планировать проведение НЗТ. мя наиболее широко используется BSH. Как правило, С этой целью на биологической модели меланомы его рассматривают лишь в качестве поставщика бора В16 мы изучили: в опухоль с целью реализации одного из основных ус- — распределение бора в организме мышей при ловий НЗТ — получения необходимого для разруше- введении BSH; ния опухоли количества энергии в соответствии с ре- — влияние BSH на клеточный цикл опухолевых акцией нейтронного захвата на В-10, продуцирующей клеток, высоко летальные для опухоли альфа-частицы и ядра отдачи 7Li. При выборе оптимального момента облу- МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ чения опухоли нейтронами необходимо учитывать аб- Исследования проведены на мышах-самцах линии солютное количество бора в опухоли и соотношение С57В1/6 массой 17-20 г с подкожно привитой мелано-его концентраций в опухолевой и прилежащих здоро- мой В16 (4-4,5 млн клеток в 0,2 мл раствора Хенкса). вых тканях, особенно крови. Разрабатываемые схемы На 9-11-й день после перевивки, когда опухоль дости-терапевтического применения BSH опираются прежде гала около 1 см в диаметре, мышам внутрибрюшинно всего на фармакокинетические параметры его поведе- вводили водные растворы BSH в дозе 50 и 150 мкг/г

№3/том4/2005 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

массы тела в объеме (мл), составляющем 1/100 массы (г) каждого животного.

1. Для изучения биораспределения бора водный раствор исследуемого соединения вводили в количестве 150 мкг/г массы тела животного. Через 0,25; 1; 3; 6; 12; 24 и 48 ч после однократной инъекции препарата, предварительно забрав кровь из подключичной артерии, животных декапитировали. Для определения бора брали опухоль и прилежащие к ней ткани — кожу, мышцы. Дополнительно анализировали кровь и ткани органов выведения — печень, почки, легкие. Органы промывали в физиологическом растворе, осушали фильтровальной бумагой, взвешивали и высушивали до постоянного веса.

Содержание бора определяли методом нейтронорадиационного анализа по регистрации мгновенного гамма-излучения в тепловом пучке реактора ИР-8 ГУ РНЦ «Курчатовский Институт» [4]. Количество бора выражали в мкг/г сырой ткани.

2. При изучении распределения клеток по фазам клеточного цикла водный раствор исследуемого соединения вводили в количестве 50 и 150 мкг/г массы тела животного.

Через 3, 12 и 24 ч после введения препарата животных (по 3 на точку) умерщвляли путем цервикальной дислокации позвонков, опухоль экстирпировали, разрезали примерно на 2 равные части. Одну часть помещали в среду 199 без сыворотки и исследовали в тот же день или хранили до проведения цитофлюоромет-рического анализа при температуре -20 °С. Вторую часть использовали для определения содержания бора в опухоли.

Опухолевую ткань освобождали от некротических участков, сосудов и измельчали на часовом стекле в 0,5 М сахарозном буфере (pH 7,2). Полученные кусочки помещали в 2,5 мл 0,5 М сахарозного буфера и тщательно растирали в стеклянном гомогенизаторе на холоде (4 °С) до получения гомогенной взвеси клеточных ядер. Полученную взвесь ядер пропускали через нейлоновое сито с отверстиями 100-150 мкм и центрифугировали 20 мин при 1500 об/мин. Осадок ресуспендировали в буфере РМ-16 (Зегуа) и центрифугировали по 1 мин при 500 об/мин. Последнюю процедуру повторяли 3 раза. Окраску образцов для ДНК-цитофлюориметрического анализа производили смесью растворов этидиум-бромида и митрамицина (1:1) (Бегуа).

Окрашенные образцы ядер перед анализом на проточном цитофлюориметре уравнивали по плотности, доводя красителем содержание ядер до 100 тыс. клеток на 1 мл. Анализ материала проводили на проточном цитофлюориметре 1СР-22 (Германия) [2]. В качестве внешнего стандарта использовали лимфоциты крови здорового донора.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

По теоретическим расчетам абсолютное количество бора в опухоли, необходимое для успешной реакции на боре-10 при максимально допустимом суммар-

ном потоке нейтронов на ткань, составляет 20-35 мкг/г опухоли. Соотношение концентраций бора опухоль/здоровая ткань должно быть не меньше 3.

Расчетные концентрации бора при системном введении ВБН в принципе достижимы для опухолей головного мозга как в экспериментальных, так и в клинических условиях.

Иную картину наблюдают в меланоме. Абсолютные концентрации бора в этой опухоли к моменту очищения от него прилежащих тканей и крови значительно ниже по сравнению с глиобластомой [8].

Анализ содержания бора в отобранных образцах органов и тканей после однократного введения В8Н мышам с привитой меланомой В16 в дозе 150 мкг/г массы тела показал, что максимальная концентрация бора в опухоли составила 13,7±5,7 мкг/г ткани, достигалась через час после введения препарата и к 6-му часу снижалась до 6,4±1,6 мкг/г ткани, а далее практически не изменялась в интервале времени наблюдения до 48 ч (рис. 1).

Рис. 1. Содержание бора-10 (мкг/г ткани) у мышей С57 В1/6 с подкожно привитой меланомой В16

Из прилежащих к опухоли тканей, кроме кожи, препарат также быстро выводился печенью и почками.

В результате в интервале 12—48 ч после введения ВБН содержание бора в опухоли в 2,4-4,4 раза превышало его содержание в крови и в 4,9-5,3 раз — в мышцах. В коже количество бора мало отличалось от его содержания в опухоли (рис. 2).

Известно, что, несмотря на относительно низкую концентрацию бора, обеспечиваемую в ткани меланомы препаратом ВБН, биологический эффект при ее облучении оказывается значительным: относительная биологическая эффективность НЗТ по сравнению с контрольным рентгенологическим облучением составляет от 4,6 до 6 [3, 8].

Причина этого заключается в особенностях воздействия ВБН на клетки меланомы.

Прежде всего, ВБН является поставщиком бора в опухоль: в наибольших количествах бор определяется в ее ядерной, митохондриальной и лизосомальной фракциях. Данные о субклеточном распределении бора были получены методом дифференциального цент-

32

ЛЕКЦИИ

ВРЕМЯ ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ ПРЕПАРАТА (ЧАО

Рис. 2. Отношение содержания бора-10 в опухоли и прилежащих к ней тканях мышей С57 В1/6 с подкожно привитой меланомой В16

рифугирования с использованием В8Н, меченного 358, и подтверждены прямым определением бора в субклеточных фракциях меланомы В16 [8].

Известно, что разрыв ядерной ДНК останавливает деление клетки. Для того чтобы произошло нерепари-руемое повреждение ДНК, достаточно одного акта захвата нейтрона бором-10, находящимся в ядре клетки. Таким образом, при включении бора в ядро опухолевой клетки для эффективного проведения В-НЗТ достаточно 2 мкг/г опухоли [6].

Изучение распределения клеток по фазам клеточного цикла в ткани меланомы В16 по содержанию ДНК методом ДНК-цитофлюориметрического анализа показало следующее (табл. 1).

Таблица 1

Влияние Ш210В12НП8Н на фазы клеточного цикла меланомы В16

Время после введения ВБН, ч Доза введенного В5Н, мкг/г массы Фаза клеточного цикла

Ю, 1Ю| Б З-КЗг/М

3 50 19,5±2,0 58,415,7 13,711,4 8,410,9 22,1

150 20,112,1 57,214,5 14,311,5 7,910,8 22,0

12 50 16,711,5 56,415,4 8,911,1 18,712,0 27,6

150 16,211,3 54,615,1 16,611,3 12,7113 29,3

24 50 17,011,8 57,915,6 10,111,1 15,911,6 25,1

150 16,011,4 57,015,5 14,311,3 12,711,3 27,0

24 Контроль 20,111,9 59,215,7 14,011,5 6,710,7 20,7

Пик Ю] содержит клетки стромы в опухолевой ткани меланомы В16. Опухолевые клетки меланомы В16 представлены в пике 1Ю] клетками, находящимися в предсинтетическом периоде С1/0. Последний включает клетки в периоде покоя (О0) и предсинтетическом периоде (в^, которые не различаются по содержанию ДНК. Воздействие препарата ВБН не изменяет содержания опухолевых клеток в этой фазе.

ВБН оказывает воздействие на клетки, находящиеся в синтетической фазе (Б) клеточного цикла при сроке 12 и 24 ч. При дозе 150 мкг/г массы тела возрастание доли 8-клеток более выражено.

При введении В8Н в дозе 50 мкг/г массы тела после 12 ч экспозиции с препаратом отмечено увеличение в 2,8 раза доли клеток в фазе в2/М по сравнению с контролем. Эта фаза наиболее чувствительна к противоопухолевому, особенно радиационному, воздействию.

Несколько меньшее влияние на клетки в той же фазе клеточного цикла сохраняется и после 24 ч действия препарата. При этом концентрация бора относительно введенного уровня была невелика и составляла 2,85 мкг/г опухолевой ткани через 12 ч после введения ВБН и 2,4 мкг/г к 24 ч наблюдения.

Втрое большая доза ВБН (150 мкг/г массы тела) после 12 ч экспозиции приводила к увеличению в 1,9 раза доли клеток меланомы В16 в фазе С2/М по сравнению с контролем, и это соотношение сохранялось в течение 24 ч экспозиции. Концентрация бора в опухолевой ткани в интервале от 12 до 24 ч практически не изменялась и составляла от 5,9 до 5,1 мкг/г ткани.

Таким образом, ВБН вызывал накопление опухолевых клеток в синтетической и премитотической фазах клеточного цикла меланомы В16 в 1,4 раза большее, чем в контроле, что отражало влияние изучаемого препарата на пролиферативную активность клеток меланомы В16.

Скорее всего, такое действие ВБН может быть связано с компенсаторной реакцией популяции на препарат как на химический агент, когда в ответ на токсическое воздействие в популяции активизируются процессы, направленные на восстановление состава клеточной популяции за счет выхода клеток из фазы покоя [1,5].

Таким образом, транспорт бора в ядро и в некоторой степени стимуляция деления фракции покоящихся меланоцитов (при отсутствии выраженных ультра-структурных изменений в опухолевых клетках меланомы) дают основание ожидать значительный радиобиологический эффект В-НЗТ с использованием В8Н в отношении меланомы, несмотря на относительно низкую концентрацию бора, обеспечиваемую в ней данным препаратом.

Комплексное воздействие В8Н на клетки меланомы В16 позволяет учитывать при скрининге новых препаратов для НЗТ не только абсолютное содержание препарата в опухоли и градиент концентрации опухоль/прилежащая ткань, но и его воздействие на опухоль как химического агента.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В8Н выполняет двойную функцию:

1) является поставщиком бора в опухоль, ее жизненно важные клеточные структуры при НЗТ;

2) стимулирует возрастание пула делящихся клеток меланомы (8+С2/М), возможно, делая ее более уязвимой для любых видов облучения.

Результаты исследований свидетельствуют, что проведение 10В-НЗТ на основе В8Н наиболее рацио-

нально в течение первых суток после введения препарата не только по фармакокинетическим параметрам бора, но и по влиянию препарата на пролиферацию. Было бы интересно выяснить зависимость накопления BSH в опухолевых клетках от фазы клеточного цикла, что позволило бы разработать оптимальную схему введения препарата при НЗТ.

ЛИТЕРАТУРА

1. Адо А. Д. Патологическая физиология. — М.: Триада-Х, 2000. — 574 с.

2. Басов Б. Н., Добрынин Я. В., Николаева Т, Г. Программа анализа распределения клеток одной и смеси популяций. — Гос. ФАП № 50890001111 от 29.09.89 г.

3. Количественные закономерности и дозиметрия в радиобиологии / Под ред. И. Б. Кейрим-Маркуса. — М.: Атомиздат, 1984. С. 24.

4. Найденов М. Г., Спрышкова РА., Борисов Г. И. и др. Экспрессный метод количественного определе-

ния бора в нативных биологических образцах // Мед. реф. журн. — 1986. — № 5(IV). — Публ. 1046.

5. Судаков К. В. Общая теория функциональных систем. — М.: Наука, 1984. С. 26.

6. Soloway А. Н., Barth R. F., Alam F., Carey W. E. Boron compounds and boronated antibodies for NCT. In: Boron Neutron Capture Therapy / Ed. H. Hatanaka. — Nishimura: Nigata, 1986. P. 47-59.

7. Spryshkova R. A., Grigorieva E. Yu., Riabkova V. I. et al. Biodistribution of Na2B12HnSCN in C57B1/6 mice bearing melanoma В16 and in Wistar rats bearing glioblastoma 1018. In: Advances in Neutron Capture Therapy, Chemistry and Biology / Eds. B. Larsson, J. Crawford, R. Weinreich. Vol. 2. — 1997. P. 253-257.

8. Spryshkova R A., Grigorieva E. Yu., NaidenovM. G., Borisov G. I. Biological efficacy of BSH-thermal neutron irradiation estimated with different methods on the model of В16 melanoma. In: Advances in Neutron Capture Therapy, Chemistry and Biology / Eds. B. Larsson, J. Crawford, R. Weinreich. Vol. 2. — 1997. P. 563-567.