Идентификация представителей белкового семейства hnRNP и других белков, обеспечивающих сплайсинг, в культивируемых клетках человека

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ БЕЛКОВОГО СЕМЕЙСТВА HNRNP И ДРУГИХ БЕЛКОВ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИХ СПЛАЙСИНГ, В КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА

Н.В. Пашинцева, Л.С. Еремина, К.В. Лисицкая, A.B. Иванов, Л.И. Ковалев, М.А. Ковалева, С.С. Шишкин

ФГУ«Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН»; Россия, 119071 Москва, Ленинский просп., 33/2

Введение. Гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин А1 (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1, hnRNP А1) и другие РНК-связывающие белки, участвующие в сплайсинге, играют значительную роль в реализации наследственной информации, и их представленность в клетках может сильно меняться при различных заболеваниях, в частности при злокачественных опухолях.

Цель исследования — протеомное изучение hnRNP А1 и других РНК-связывающих белков, участвующих в процессах сплайсинга, в 10 культивируемых линиях человеческих злокачественных и нормальных клеток эпителиального и мезенхимального происхождения.

Материалы и методы. Для изучения белковых профилей использовался двумерный электрофорез культивируемых клеточных линий аденокарцином (LNCaP, DU-145, PC-3, 769-P), сарком (U2-OS, SK-UT-1B, RD), а также незлокачественныхмезен-химальных клеток (SC5-MSC), миобластов и линии доброкачественной гиперплазии предстательной железы (BPH-1) с последующей масс-спектрометрической идентификацией белковых фракций.

Результаты. Белок hnRNP А1 определялся как мажорный во всех исследованных линиях злокачественных опухолей человека. В культивируемых мезенхимальных клетках и нормальных миобластах человека hnRNP А1 присутствовал в существенно меньших количествах, чем в опухолевых клетках, и исчезал после индукции дифференцировки миобластов. Выводы. Повышенное содержание белка hnRNP А1 может свидетельствовать об активном процессе пролиферации клеток, в том числе опухолевых. HnRNP А1 и другие белки, участвующие в процессах сплайсинга, представляются перспективными объектами для дальнейшего изучения в трансформированных клетках человека.

Ключевые слова: саркома, аденокарцинома, белок hnRNP A1, ядерные белки, протеомика

DOI: 10.17650/1726-9784-2017-16-2-82-90

PROTEOMIC IDENTIFICATION OF HNRNP FAMILY MEMBERS AND OTHER PROTEINS INVOLVED IN SPLICING

IN HUMAN CULTURED CELLS

N.V. Pashintseva, L.S. Eremina, K.V. Lisitskaya, A.V. Ivanov, L.I. Kovalev, M.A. Kovaleva, S.S. Shishkin A.N. Bakh Institute of Biochemistry of Russian Academy of Sciences; 33/2 Leninskiy Ave., Moscow 119071, Russia

Introduction. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 (hnRNP A1) and other RNA-binding proteins involved in splicing participate in realization of genetic information and can be greatly changed in pathological conditions including tumors. Objective. Proteomic study of hnRNP A1 and other RNA-binding splicing proteins in 10 human malignant and non-malignant cultured cell lines of mesenchymal and epithelial origin.

Materials and methods. Two-dimensional gel electrophoresis of adenocarcinomas (LNCaP, DU-145, PC-3, 769-P) and sarcomas (U2-OS, SK-UT-1B, RD) cell lines with following protein identification by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry have been carried out.

Results. HnRNP A1 has been identified as an abundant protein in all studied malignant cell lines. It has been revealed in lower amount in normal mesenchymal cells compared to malignant cultured cells and achieved undetectable levels in myoblasts after induction of differentiation.

Conclusion. High cellular level of hnRNP A1 can suggest high proliferative activity of cells including malignant those. Hence, hnRNP A1 and other RNA-binding splicing proteins hold promise to its further investigation in human transformed cells.

Key words: sarcoma, adenocarcinoma, protein hnRNP A1, nuclear proteins, proteomics

Контакты: Наталья Валентиновна Пашинцеваpashintseva2009@yandex.ru

Оригинальные статьи SB

Введение ных и нормальных клеток эпителиального и мезен- Сплайсинг является одним из ключевых этапов химального происхождения (линий аденокарцином в реализации генетической информации. Принци- и сарком, а также незлокачественных мезенхималь-пиальным условием для вовлечения в сплайсинг ных клеток). первичных РНК-транскриптов в эукариотических клетках является их связывание со специальными Материалы и методы белками и образование гетерогенных ядерных Клеточные линии и их культивирование рибонуклеопротеинов (heterogeneous nuclear Материалом для исследований послужили линии ribonucleoproteins, hnRNP) [1]. HnRNP, содержащие аденокарцином предстательной железы LNCaP (по-специальные РНК-связывающие домены и мотивы лучена от д. б. н. И.Г. Шемякина, ФБУН «Государ-(RNA-recognition motifs, RRM), наряду со структур- ственный научный центр прикладной микробиоло-ной (гистоноподобной) функцией обладают и более гии и биотехнологии», Россия), DU-145, BPH-1, тонкой функциональной специализацией. В насто- PC-3 (получены из German Collection of Microorgan-ящее время они считаются (наряду с малыми ядер- isms and Cell Cultures GmbH, Германия), 769-Р (полу-ными РНК) «ключевыми игроками» процессинга чена из American Type Culture Collection, США), РНК (включая альтернативный сплайсинг) и пост- рабдомиосаркомы RD (получена из НИИ вирусоло-транскрипционной регуляции генной экспрессии гии им. Д.И. Ивановского РАМН), лейомиосаркомы [2]. Большинство из белков hnRNP способны SK-UT-1B и остеомиосаркомы U2-OS (получены не только связывать молекулы РНК и участвовать из Института цитологии РАН). Кроме того, в работе в сплайсинге, но и выполнять ряд других важных анализировали белки нормальных миобластов [13] функций. Так, они участвуют в регуляции длины и мезенхимальных стволовых клеток человека SCS-теломерной ДНК [3], контроле синтеза миелина [4], MSC (получены из Российской коллекции клеточных формировании сердечной мышцы [5] и гладких культур позвоночных Института цитологии РАН). мышц [6] на ранних стадиях эмбриогенеза. Семей- Для выращивания клеток линий LNCaP, DU-145, ство hnRNP включает 16 главных и 19 минорных 769-P, BPH-1, PC-3 и U2-OS использовали среду белков, многие из которых характеризуются как по- RPMI-1640 с добавлением 10 % телячьей эмбриональ-всеместно встречающиеся (в том числе и hnRNP А1), ной сыворотки (ТЭС), гентамицина и L-глутамина. однако их представленность в клетках может сильно Клетки линии SK-UT-1B культивировали в среде меняться при различных патологических состояниях, Игла МЕМ, а RD и мезенхимальные клетки — в среде в частности, при опухолевой трансформации [7]. DMEM, содержащей L-глутамин, гентамицин и ТЭС. Имеются доказательства вовлеченности отдельных Клетки миобластов культивировали в среде F-12. hnRNP в процессы канцерогенеза, прогрессирования С целью инициирования процесса дифференцировки и метастазирования опухолей эпителиального про- проводилось инкубирование миобластов в среде, со-исхождения. Например, повышенную продукцию держащей 2 % лошадиной сыворотки. Все реагенты белка hnRNP А1 связывают с опухолевой трансфор- для культивирования были произведены в фирмах мацией клеток толстого кишечника и высокой инва- «ПанЭко» (Россия) и Biowest (Франция). Выращива-зивностью клеток гепатокарциномы [S, 9]. Данные ние клеток производилось с использованием культу-о белках hnRNP в опухолевых клетках мезенхималь- рального пластика фирм Costar Group (США) и Nunc ного происхождения ограничены [10]. (Дания) в СО2-инкубаторе фирмы Sanyo Electric Co. Надо отметить, что, хотя hnRNP широко пред- (Япония). Манипуляции, требующие стерильных ставлены в клетках человека, данные об их исследо- условий, выполнялись в ламинарном шкафу II класса вании протеомными методами в различных типах защиты фирмы Jouan Robotics (Франция). После до-нормальных и злокачественных клеток крайне огра- стижения необходимой биомассы (10—20 х 106 клеток) ничены [10, 11]. Известно, что культивируемые клет- выращенные клетки механически снимали с поверх-ки человека представляют собой удобные модели ности матрасов, предварительно проинкубировав для изучения молекулярных механизмов нормальной в бессывороточной среде в течение 1 ч при темпера-клеточной дифференцировки и ее нарушений в зло- туре +4 °С, чтобы смыть с поверхности клеток адсор-качественных опухолях разного происхождения. бированные белки сыворотки, использованной Для решения подобных задач, включающих иденти- при культивировании. Полученные препараты клеток фикацию представителей отдельных белковых се- до проведения протеомного анализа хранили при тем-мейств, широко используются протеомные техноло- пературе —70 °С. гии [12]. Целью данной работы стало протеомное Экстракция клеточных белков и получение ядер-исследование hnRNP и других РНК-связывающих ных белков белков, участвующих в процессах сплайсинга, в 10 Для экстракции белков препараты выращенных линиях культивируемых человеческих злокачествен- клеток гомогенизировали в 200 мкл традиционного

2'2017 том 16 I vol. 16 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ I RUSSIAN JOURNAL OF BÍOTHERAPY

лизирующего раствора, который содержал 9 моль мочевины и 2 % амфолинов рН 3,5—10,0, а также неионный детергент и восстановитель дисульфидных групп. Для последующего проведения двумерного электрофореза использовали лизирующий раствор с добавлением 2 % Тритона Х-100 и 5 % р-меркапто-этанола [14].

Для получения ядерных белков культивируемые клетки суспендировали в фосфатно-солевом буфере и разрушали в мягких условиях (добавление Тритона Х-100 до конечной концентрации 1 % и проведение нескольких циклов замораживания — оттаивания), затем центрифугированием осаждали клеточные ядра и 3-кратно промывали их фосфатно-солевым буфером.

Двумерный электрофоретический анализ белков

Для разделения белков использовался двумерный электрофорез с проведением неравновесного изо-электрофокусирования (ИЭФ) в собственной модификации метода О»Фаррелла [14], которое проводилось в градиенте рН в стеклянных трубках (2,4 х 180 мм), заполненных 4 % полиакриламидным гелем (ПААГ), приготовленным на 9 моль раствора мочевины с 2 % Тритона Х-100 и 2 % смеси амфолинов. В основных экспериментах использовали амфо-лины рН 5—7 и 3,5—10,0 в соотношении 4 : 1, а для уточнения распределения белков в краевых зонах в ряде экспериментов применяли амфолины рН 4—6 (или 7—9) и 3,5—10,0 в том же соотношении. Белковые экстракты (100—150 мкл) наносили на «кислотный» край геля. ИЭФ проводили в приборе фирмы Bio-Rad Laboratories (США), модель 175, при 2400 В/ч суммарно на каждую колонку ПААГ. После ИЭФ колонки ПААГ использовали для фракционирования во 2-м направлении, проводившегося, как в 1-м варианте. Далее эта модификация, отличавшаяся по условиям фракционирования от классической NEPHGE-модификации, будет обозначена как NPGE (nonequilibrium pH gradient electrophoresis — неравновесный электрофорез в градиенте pH). На каждую клеточную линию получалось от 4 (ме-зенхимальные стволовые клетки) до 50 и более (линия DU-145) двумерных электрофореграмм (ДЭ).

Визуализацию белков окрашиванием Кумасси бриллиантовым голубым R-250 и нитратом серебра с последующим анализом полученных ДЭ выполняли, как описано ранее [14], с небольшими модификациями. Для определения молекулярных масс (Мм) белковых фракций использовали набор рекомби-нантных белков «SM0671» Мм = 10—170 кДа (Fermentas, США). Денситометрию ДЭ проводили после сканирования (сканер Epson Expression 1680) и получения цифровых изображений с помощью специализированного пакета программ ImageMaster 2D Platinum 7.0 (GE Healthcare, США).

Идентификация белков методами масс-спектро-метрии

Выделение белковых фракций на пластинах ПААГ, гидролиз трипсином и экстракцию пептидов для идентификации белков с помощью времяпролет-ной масс-спектрометрии с ионизацией на матрице (matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS) проводили, как описано ранее [12], с небольшими модификациями. Образец (0,5 мкл) смешивали на мишени с таким же объемом раствора 20 % ацетонитрила, содержащего 0,1 % трифторуксусной кислоты и 20 мг/мл 2,5-дигидроксибензойной кислоты (Sigma-Aldrich, США), и высушивали на воздухе. Масс-спектры получали на MALDI-TOF-масс-спектрометре Reflex III (Bruker, США) с ультрафиолетовым лазером (336 нм) в режиме положительных ионов в диапазоне Мм от 500 до 8000 Да. При MS/MS-анализе масс-спектры фрагментов регистрировали на масс-спектрометре в тандемном режиме при детекции положительных ионов. Фрагментация ионов индуцировалась подачей гелия в область начального участка траектории свободного дрейфа ионов (давление инертного газа 2 х 10-7 Па). Погрешность измерения масс-фрагментов для MS и MS/MS не превышала 0,005 % (50 ppm). На масс-спектре присутствовали только сигналы С-концевых фрагментов пептида, претерпевших разрыв по пептидной связи (y-ионы). Идентификацию белков проводили с помощью программы Mascot, опция Peptide Fingerprint (Matrix Science, США) с использованием программного обеспечения FlexAnal-ysis Software (Bruker Daltonics GmbH, Германия) и поиском различных модификаций с помощью программы BioTools в базе данных NCBInr.

Результаты

На типичных ДЭ клеточных линий при окраске нитратом серебра регистрировалось 550—600 фракций, подавляющее большинство которых распределялось в диапазоне Мм от 170 до 10 кДа. Использованная модификация NPGE обеспечивает достаточно высокое разрешение фракционирования, в том числе и щелочных белков с pI >8,70. Среди белков с pI >8,70, идентифицированных на всех ДЭ культивируемых клеток опухолей человека, оказались как минимум 2 изоформы белка hnRNP А1, эукариотический фактор элонгации трансляции альфа-1 (eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1, EEF1A1) и сплайсинг-фактор, богатый про-лином и глутамином (splicing factor proline- and glutamine-rich, SFPQ) (рис. 1).

На рис. 2 представлены отдельные фрагменты ДЭ белков из клеток 3 аденокарцином и 3 сарком, на которых обозначен hnRNP А1. Как видно из рис. 2, белок hnRNP А1 на всех ДЭ культивируемых клеток

кДа

130

95

72

55 43

34 26

I-

HSPD1

у - TCP1

* SFPQ

HNRPH1 f

EEF1A1 /

GAPDH

HNRPH1ei

HNRNPA1

17

TCTP

10

--1-h

+

pl

-Ч"

8,6 9,2

рис. 1. Двумерная электрофореграмма РНК-связывающих белков из культивируемых клеток линии DU-145, окраска нитратом серебра: HSPD1— шаперонин 60; ТСР1 — белок Т-комплекса 1 альфа; HNRPH1 — гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин Н1; HNRPH1ei — электрофоретическая изоформа гетерогенного ядерного рибонуклеопротеина Н1; ТСТР — фортилин; GAPDH — глицераль-дегид-3-фосфат-дегидрогеназа; SFPQ — сплайсинг-фактор, богатый пролином и глутамином; РАВРС1 — полиаденилат-связывающий белок 1; EEF1A1 — эукариотический фактор элонгации трансляции альфа-1; HNRNPA1 — гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин А1

злокачественных опухолей был представлен в виде нескольких изоформ и выявлялся даже при окрашивании ДЭ Кумасси бриллиантовым голубым R-250, что свидетельствует об относительно большом количестве этого белка в исследуемых биологических образцах. Таким образом, белок hnRNP А1 можно рассматривать как мажорный в опухолевых клетках. При компьютерной денситометрии самый высокий уровень белка hnRNP А1 определялся в лейомиосар-коме SK-UT-1B. Результаты идентификации hnRNP

А1 в различных клеточных линиях представлены в табл. 1. В качестве примера в табл. 1 приведены характеристики всех выявленных изоформ hnRNP А1 в линии 769-Р.

Фракция hnRNP А1 на ДЭ мезенхимальных клеток выявлялась в существенно меньших количествах, чем в опухолевых клетках (рис. 3, а). В культивируемых миобластах человека фракция белка hnRNP А1 также выявлялась в меньшем количестве, чем в опухолевых клетках, причем она визуализировалась только на ДЭ клеток в стадии активной пролиферации и отсутствовала на гелях, где миобласты находятся в стадии дифференцировки (рис. 3, б и в). В миобла-стах и мезенхимальных стволовых клетках данная фракция выявлялась только на ДЭ, окрашенных нитратом серебра, и не определялась на ДЭ, окрашенных Кумасси бриллиантовым голубым R-250. Корректное сравнение содержания белка hnRNPA1 в нормальных мезенхимальных клетках и клеточных линиях злокачественных опухолей человека при денситометрии ДЭ, окрашенных нитратом серебра, не представлялось возможным, так как интенсивность окраски нитратом серебра зависит не только от количества белка в геле, но в значительной степени и от времени экспозиции красителя. Тем не менее, повышенное содержание белка hnRNP А1 свидетельствует об активном процессе пролиферации в клетках.

В большинстве исследованных клеточных линий белок hnRNP А1 был представлен сплайсинг-вариантом А1-А с экспериментальной Мм 33—36 кДа. В то же время фракция hnRNP А1, обнаруженная в мезенхимальных стволовых клетках человека, по электрофоретическим характеристикам и результатам масс-спектрометрической идентификации, вероятнее всего, соответствовала изо-форме 2 hnRNP А1 (Р09 651—3 по каталогу

б

1

/

V

\

а

2

д

г

е

2

2

рис. 2. Фрагменты двумерной электрофореграммы белков из культивируемых клеток 3 линий аденокарцином и 3 линий сарком, окраска Кумасси бриллиантовым голубым R-250: а — линия DU-145; б — линия 769-Р; в — линия LNCaP; г — линия U2-OS; д — линия RD; е — линия SK-UT-1B; 1 — фракция белка hnRNPА1; 2 — фракция глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы

Таблица 1. Результаты масс-спектрометрической идентификации hnRNP A1 в исследуемых клеточных линиях

Клеточная линия Название белка (обозначение гена) Номера в Protein NCBI/UniProt S/M/C* Мм, кДа/pI (эксп.)** Мм, кДа/pI (расчет.)***

DU-145 164/16/57 34,00/9,70

769-Р 495/45/83 960/54/97 405/49/84 34,00/9,20 34,00/9,25 34,00/9,30

LNCaP Гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин A1 (hnRNP A1) 195/20/41 33,00/9,15

U2-OS 47939618/P09651 235/26/66 34,00/9,70 34,20/9,28

RD 136/14/40 34,00/9,35

SK-UT-1B 266/68/66 34,00/9,35

SC5-MSC 349/33/79 29,40/9,35

Миобласты 216/6/21 34,00/9,38

*S/M/C — традиционные показатели идентификации, принятые в англоязычной литературе: Score — показатель соответствия или «счет очков»; Match peptides — количество совпавших пептидов; Coverage — % покрытия полной аминокислотной последовательности белка выявленными пептидами. **Мм/р1 (эксп.) — значения определены экспериментально по электрофоретическим характеристикам; Мм — молекулярная масса белка в кДа, pI — изоэлектрическая точка этого белка. ***Мм/р1 (расчет.) — значения рассчитаны по аминокислотным последовательностям из базы данных UniProt с помощью программы Compute pI/Mw ExPASy с учетом удаления сигнального пептида, но без учета других постсинтетических модификаций.

170

170 130 95

72

та

^55 43

34 26

PABPC2, PABPC1

б

GAPDH

/

HNRNPA1

GAPDH

HNRNPA1

GAPDH

Г

Рис. 3. Фрагменты двумерной электрофореграммы белков культивируемых незлокачественных клеток мезенхимального происхождения, окраска нитратом серебра: а — стволовые мезенхимальные клетки (SC5-MSC); б — культивируемые миобласты (нулевой день, стадия активной пролиферации); в — культивируемые миобласты (6-й день, стадия дифференцировки). РАВРС1 — полиаденилат-связывающий белок 1; РАВРС2 — полиаденилат-связывающий белок 2; GAPDH — глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа; HNRNPA1 — гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин А1

а

UniProt). Эта изоформа, о существовании которой на белковом уровне нет информации в базах данных и литературе, имеет расчетную Мм 29,4 кДа и отличается от изоформы А1-А отсутствием последовательности с 203-го аминокислотного остатка (а. о.) по 255-й а. о. Обнаруженная нами изо-

форма hnRNP А1 имела экспериментальную Мм около 29 кДа (рис. 3а).

Практически во всех изученных клеточных линиях были выявлены различающиеся по значениям р1 электрофоретические изоформы белка hnRNP А1, существование которых, скорее всего, обусловлено

Оригинальные статьи 87

Рис. 4. Двумерная электрофореграмма белков из препаратов ядер клеток DU-145, цифрами 1—11 отмечены белки, участвующие в процессе сплайсинга мРНК

наличием каких-либо посттрансляционных модификаций, например, фосфорилирования. Прицельный анализ выявленных пептидов этого белка в различных линиях клеток человека не позволил обнаружить сайтов фосфорилирования. Однако в ходе масс-спектро-метрического анализа электрофоретических изоформ белка hnRNP А1 в линии аденокарциномы почки 769-Р удалось выявить ряд посттрансляционных модификаций, не встречавшихся в других линиях адено-карцином и сарком. В частности, диметилирование по аргинину было обнаружено сразу в нескольких выявленных пептидах, экспериментальная Мм которых отличалась от расчетной на 28 Да. По результатам тандемной масс-спектрометрии такая посттрансляционная модификация была подтверждена в 4 положениях: 194, 206, 218 и 225, соответствующих аминокислотному остатку аргинина (показатели Score 114, 49, 140 и 116 соответственно). Тем не менее эта модификация вряд ли существенно влияет на изоэлектри-ческую точку белка и в полной мере не может объяснять появление нескольких изоэлектрофоретических изоформ. Кроме hnRNP А1 в исследованных клеточных линиях были идентифицированы и другие представители семейства hnRNP, в частности, в клетках рака предстательной железы линии LNCaP удалось обнаружить hnRNP A2B1 и hnRNP G, в клетках PC-3 — hnRNP A2B1, в клетках доброкачественной гиперплазии предстательной железы BPH-1 — hnRNP А3, hnRNP G и hnRNP H1. Следует отметить, что в исследуемых злокачественных клетках был найден сплайсинг-фактор SFPQ — белок, выполняющий важные функции при реализации генетической информации

[15—17] и, возможно, вовлеченный в возникновение и прогрессию злокачественных опухолей [18, 19]. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что белок SFPQ может представлять интерес как потенциальный биомаркер злокачественных опухолей, в том числе мезенхимального происхождения [20]. В клетках рака предстательной железы линий LNCaP и РС-3 были найдены такие участники процессов сплайсинга, как полиаденилат-связывающий белок 1 (polyadenylate-binding protein cytoplasmic 1, PABPC1) и белок NUDT21 (nudix (nucleoside diphosphate linked moiety X) — type motif 21). Ранее было показано, что подавление экспрессии гена, кодирующего белок NUDT21, способствует подавлению опухолевых лим-фобластов [21]. В ряде клеточных линий, выведенных из злокачественных опухолей (LNCaP, OKP-GS и RD), были идентифицированы 2 белка теплового шока HSPB1 (HSP 27) и HSPB5, стресс-индуцируемое фосфорилирование которых, по данным литературы, приводит к их ассоциации с ядерными пятнышками (nuclear speckles) — крупными субъядерными доменами, вовлеченными в сплайсинг РНК [22, 23].

В связи с широким динамическим диапазоном и сложным составом клеточных протеомов на общих ДЭ многие фракции ядерных белков оказываются минорными или не выявляются вовсе. Поэтому в данной работе было проведено параллельное изучение белков в препаратах ядер, полученных из культивируемых клеток аденокарцином и рабдомиосар-комы. С помощью протеомного анализа в препаратах ядерных белков при окраске нитратом серебра обычно удавалось детектировать более 400 белковых фракций. Типичная ДЭ белков из препаратов ядерных белков клеток DU-145 показана на рис. 4, и на ней отмечены те из идентифицированных белков, которые имеют отношение к процессу сплайсинга мРНК. Шесть из них оказались различными представителями семейства hnRNP, еще 2 были идентифицированы как изоформы белка SFPQ (табл. 2). Протеомное изучение ядерных белков клеток RD также позволило обнаружить белки SFPQ (S/M/C 192/15/28), hnRNP A1 (2 изоформы с S/M/C 241/21/61 и 192/18/56) и A2/B1 (2 изоформы с S/M/C 235/23/55 и 278/27/56), а кроме того, 2 изоформы белка hnRNP С1/С2 (S/M/ C 144/13/32 и 121/13/29). Проведенный анализ публикаций, зарегистрированных в базе данных PubMed, не выявил сообщений об обнаружении большинства белков семейства hnRNP, перечисленных в табл. 2, в злокачественных опухолевых клетках.

Обсуждение результатов

HnRNP А1 — представитель отдельного семейства полифункциональных РНК-связывающих белков, участвующих в сплайсинге мРНК. По данным ряда

Таблица 2. Сплайсинг-белки, идентифицированные в ядерных фракциях клеток аденокарциномы линии DU-145; нумерация соответствует данным на рис. 4

№ Название белка (обозначение гена) Номера в Protein NCBI/UniProt S/M/C* Мм, кДа/pI (эксп.) ** Мм, кДа/pI (расчет.) ***

1 Галектин 1 (LGALS1) 4504981/P09382 155/9/63 14,50/5,0 14,70/5,30

2 МНР2-подобный белок 1 (NHP2L1) 4826860/P55769 119/7/56 14,50/9,0 14,20/8,72

3 Гетерогенный ядерный нуклеопротеин А1, изоформа А ^пШР А1) 4504445/P09651 180/18/57 34,00/9,50 34,20/9,27

4 Гетерогенный ядерный нуклеопротеин А2/В1, изоформа А2 ^пШР А2В1) 4504447/P22626 292/27/70 35,80/8,70 36,00/8,67

5 Гетерогенный ядерный нуклеопротеин А2/В1, изоформа А2 (hnRNP А2В1), электрофоретический вариант 4504447/P22626 261/23/53 35,80/8,30 36,00/8,67

6 Гетерогенный ядерный нуклеопротеин Н3 (hnRNP Н3) 7739445/P31942 206/19/80 38,00/7,05 31,50/6,76

7 Гетерогенный ядерный нуклеопротеин F (hnRNP Г) 4826760/P52597 164/16/37 48,00/5,70 45,70/5,37

8 Гетерогенный ядерный нуклеопротеин Н1, изоформа СИА_Ь ^пЖР Н1) 119574194/P31943 216/23/44 52,00/6,95 43,70/6,47

9 Гетерогенный ядерный нуклеопротеин L, изоформа а ^пШР L) 52632383/P14866 153/15/42 65,00/7,95 64,10/8,46

10 Сплайсинг-фактор, богатый пролином и глутамином (SFPQ) 4826998/P23246 221/28/42 96,00/9,15 76,20/9,50

11 Сплайсинг-фактор, богатый пролином и глутамином, электрофоретическая изоформа (SFPQ) 4826998/P23246 116/18/41 96,00/8,70 76,20/9,50

*S/M/C — традиционные показатели идентификации, принятые в англоязычной литературе: Score — показатель соответствия или «счет очков»; Match peptides — количество совпавших пептидов; Coverage — % покрытия полной аминокислотной последовательности белка выявленными пептидами. **Мм/pI (эксп.) — значения определены экспериментально по электрофоретическим характеристикам; Мм — молекулярная масса белка в кДа, pi — изоэлектрическая точка этого белка. ***M^/pI(расчет.) — значения рассчитаны по аминокислотным последовательностям из базы данных UniProt с помощью программы Compute pI/Mw ExPASy с учетом удаления сигнального пептида, но без учета других постсинтетических модификаций.

исследований, количественное содержание белка hnRNP А1 изменяется при опухолевой трансформации клеток, что указывает на его вовлеченность в процессы туморогенеза [24, 25]. Согласно полученным нами данным, белок hnRNP А1 присутствовал как мажорный (выявлялся даже при окрашивании ДЭ Кумасси бриллиантовым голубым R-250) практически во всех исследованных клеточных линиях злокачественных опухолей человека. В культивируемых мезенхимальных клетках и нормальных миобластах человека hnRNP А1 выявлялся в существенно меньших количествах, чем в опухолевых клетках (определялся только при окраске нитратом серебра), и исчезал после индукции дифференцировки миобластов. Таким образом, содержание белка hnRNP А1 в клетках может свидетельствовать об их пролиферативной активности. Наличие hnRNP A1 в активно пролифе-рирующих клетках объясняется тем, что он участвует в сплайсинге мРНК белков-регуляторов клеточной пролиферации, например, c-Src и CD44 [26]. По данным UniProtKB (Universal Protein Knowledgebase),

имеется 3 сплайсинг-варианта белка hnRNP A1. Каноническим вариантом считается изоформа A1-B (38,7 кДа, 372 а. о.), но наиболее распространена в клетках человека другая изоформа — А1 -А (34,2 кДа, 320 а. о.), отличающаяся от канонической отсутствием фрагмента аминокислотной последовательности с 252-го а. о. по 303-й а. о. Соотношение изоформ А1-А и A1-B в клетках рака шейки матки HeLa составляет примерно 20 : 1 [27]. Третья изоформа — так называемая изоформа 2 (29,4 кДа, 267 а. о.) — отличается от канонической отсутствием а. о. с 203-го по 307-й, однако экспериментальное подтверждение существования данной изоформы до настоящего времени отсутствовало. При протеомном исследовании мезенхимальных стволовых клеток человека нам удалось обнаружить изоформу hnRNP А1, по элек-трофоретическим характеристикам и результатам масс-спектрометрической идентификации, вероятнее всего, соответствовавшую изоформе 2. Фракция на ДЭ, соответствующая этой изоформе, обладала Мм около 29 кДа и достаточно убедительными зна-

чениями показателей масс-спектрометрической идентификации (S/M/C 349/33/79). Однако для окончательного вывода о присутствии в мезенхималь-ных стволовых клетках человека именно изоформы 2 hnRNP А1 необходимо масс-спектрометрическое обнаружение диагностического для данной изоформы пептида и получение его спектра фрагментации.

Поскольку в большинстве изученных клеточных линий присутствовали различающиеся по значениям pI электрофоретические изоформы белка hnRNP А1, был осуществлен поиск посттрансляционных модификаций данного белка, в ходе которого в клеточной линии 769-Р были обнаружены ацетилирование по се-рину в положении 2 и диметилирование по аргинину в положениях 194, 206, 218 и 225. Для белка hnRNP А1 метилирование по аргинину является почти столь же распространенной посттрансляционной модификацией, как фосфорилирование по серину. Очевидно, что эта стабильная модификация играет важную роль в функционировании белка. Рядом авторов было показано, что метилирование вовлечено в процессы белок-белкового взаимодействия, созревания рибону-клеопротеинов и клеточного сигналинга [28]. Все обнаруженные на данный момент сайты метилирования входят в RGG-box — последовательность полипептидной цепи с 190-го а. о. по 240-й а. о., богатую аргинином и глицином, которая содержит консервативный мотив связывания нуклеиновых кислот. Очевидно, метилирование hnRNP A1 на этом участке вовлечено в регуляцию связывания нуклеиновых

кислот. Действительно, ранее было показано, что способность белка связывать нуклеиновые кислоты обратно пропорциональна степени его метилирования по аргинину [29]. В базе данных UniProt сообщается о 5 сайтах метилирования белка hnRNP А1 с присоединением 2 метильных групп в 1 сайте. Сайты диме-тилирования по аргинину в положениях 194, 206, 218 и 225 были обнаружены у hnRNP А1, выделенного из клеток рака шейки матки HeLa [30, 31]. Нам удалось подтвердить наличие у этого белка диметилирования по аргинину в указанных позициях в клетках рака почки человека 769-Р.

Заключение

Представленные результаты, свидетельствующие о присутствии в культивируемых клетках аденокарци-ном и сарком белка hnRNP А1 в качестве мажорного, указывают на возможную роль этого белка в реализации генетической информации в злокачественных опухолях. Участие данных белков в сплайсинге мРНК и других внутриклеточных процессах регулируется, в числе прочего, посттрансляционными модификациями, например, фосфорилированием и диметили-рованием. Соответственно, белок hnRNP А1, его различные изоформы, а также некоторые другие выявленные протеомными методами РНК-связывающие белки, вовлеченные в процессы сплайсинга, представляются интересными и перспективными объектами для дальнейшего изучения в трансформированных и нормальных клетках человека.

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES

1. Kumar A., Williams K.R., Szer W. Purification and domain structure of core hnRNP proteins A1 and A2 and their relationship to single-stranded DNA-binding proteins. J Biol Chem 1986;261(24):11266-73. PMID: 3733753.

2. Han S.P., Tang YH., Smith R. Functional diversity of the hnRNPs: past, present and perspectives. Biochem J 2010;430(3):379-92. DOI: 10.1042/BJ20100396.

PMID: 20795951.

3. Ford L.P., Wright W.E., Shay J.W. A model for heterogeneous nuclear ribonucleopro-teins in telomere and telomerase regulation. Oncogene 2002;21(4):580-3.

DOI: 10.1038/sj.onc.1205086. PMID: 11850782.

4. White R., Gonsior C., Bauer N.M. et al. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP) F is a novel component of oligo-dendroglial RNA transport granules contributing to regulation of myelin basic protein (MBP) synthesis. J Biol Chem 2012;287(3):1742-54.

DOI: 10.1074/jbc.M111.235010. PMID: 22128153.

5. Blech-Hermoni Y., Ladd A.N. RNA binding proteins in the regulation of heart development. Int J Biochem Cell Biol 2013;45(11):2467-78.

DOI: 10.1016/j.biocel.2013.08.008. PMID: 23973289.

6. Liu J., Beqaj S., Yang Y., Honoré B.

et al. Heterogeneous nuclear ribonucleo-

protein-H plays a suppressive role

in visceral myogenesis. Mech Dev

2001;104(1-2):

79-87. PMID: 11404082.

7. Chaudhury A., Chander P., Howe P.H. Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins (hnRNPs) in cellular processes: focus on hnRNP E1's multifunctional regulatory roles. RNA 2010;16(8):1449-62.

DOI: 10.1261/rna.2254110. PMID: 20584894.

8. Ushigome M., Ubagai T., Fukuda H. et al. Up-regulation of hnRNP A1 gene in sporadic human colorectal cancers.

Int J Oncol 2005;26(3):635-40. PMID: 15703818. 9. Zhou Z.J., Dai Z., Zhou S.L. et al. Overexpression of HnRNP A1 promotes tumor invasion through regulating CD44v6 and indicates poor prognosis for hepatocellular carcinoma. Int J Cancer 2013;132(5):1080-9. DOI: 10.1002/ijc.27742. PMID: 22821376.

10. Niforou K.M., Anagnostopoulos A.K., "Vbugas K. et al. The proteome profile of the human osteosarcoma U2-OS cell line. Cancer Genomics Proteomics 2008;5(1):63-78. PMID: 18359981.

11. Ko C.C., Chen Y.J., Chen C.T. et al. Chemical proteomics identifies heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP) A1 as the molecular target of quercetin in its anti-cancer effects in PC-3 cells. J Biol Chem 2014;289(32):22078-89.

DOI: 10.1074/jbc.M114.553248. PMID: 24962584.

12. 12. Shishkin S., Kovaleva M., Ivanov A.

et al. Comparative proteomic study of pro-

teins in prostate cancer and benign hyperplasia cells. J. Cancer Sci Ther 2011;S1:003. DOI: 10.4172/1948.

13. Крохина Т.Б., Шишкин С.С., Раевская Г.Б. и др. Бюлл. эксп. биол. мед. 1996;122:314-7.

14. Kovalyov L.I., Shishkin S.S., Efimoch-kin A.S. et al. The major protein expression profile and two-dimensional protein database of human heart. Electrophoresis 1995;16(7):1160-9. PMID: 7498159.

15. Lee M., Sadowska A., Bekere I. et al. The structure of human SFPQ reveals a coiled-coil mediated polymer essential for functional aggregation in gene regulation. Nucleic Acids Res 2015;43(7):3826-40. DOI: 10.1093/nar/gkv156.

PMID: 25765647.

16. Rajesh C., Baker D.K., Pierce A.J. et al. The splicing-factor related protein SFPQ/ PSF interacts with RAD51D and is necessary for homology-directed repair and sister chromatid cohesion. Nucleic Acids Res 2011;39(1):132-45.

DOI: 10.1093/nar/gkq738. PMID: 20813759.

17. Lowery L.A., Rubin J., Sive H. Whitesnake/SFPQ is required for cell survival and neuronal development in the ze-brafish. Dev Dyn 2007;236(5):1347-57. PMID: 17393485.

18. Dolnik A., Engelmann J.C., Scharfen-berger-Schmeer M. et al. Commonly altered genomic regions in acute myeloid leukemia are enriched for somatic mutations involved in chromatin remodeling and splicing. Blood 2012;120(18):e83-92. DOI: 10.1182/blood-2011-12-401471. PMID: 22976956.

19. Jiang F.N., He H.C., Zhang Y.Q. et al. An integrative proteomics and interaction network-based classifier for prostate cancer diagnosis. PLoS One 2013;8(5):e63941. DOI: 10.1371/journal.pone.0063941. PMID: 23737958.

20. Pashintseva N.Y, Shishkin S.S., Lisitskaya K.V et al. Study of splicing factor, proline- and glutamine-rich by proteomic techniques in human malignant and nonmalignant cell lines. Protein Pept Lett 2016;23(11):958-66.

21. Gennarino V.A., Alcott C.E., Chen CA. et al. NUDT21-spanning CNVs lead

to neuropsychiatric disease and altered MeCP2 abundance via alternative polyad-enylation. Elife 2015;8:4. DOI: 10.7554/eLife.10782. PMID: 26312503.

22. den Engelsman J., Bennink E.J., Doer-wald L. et al. Mimicking phosphorylation of the small heat-shock protein al-phaB-crystallin recruits the F-box protein FBX4 to nuclear SC35 speckles.

Eur J Biochem 2004;271(21):4195-203. DOI: 10.1111/j.1432-1033.2004.04359.x. PMID: 15511225.

23. Vos M.J., Kanon B., Kampinga H.H. HSPB7 is a SC35 speckle resident small heat shock protein. Biochim Biophys Acta 2009;1793(8):1343-53.

DOI: 10.1016/j.bbamcr.2009.05.005. PMID: 19464326.

24. Ushigome M., Ubagai T., Fukuda H. et al. Up-regulation of hnRNP A1 gene in sporadic human colorectal cancers. Int J Oncol 2005;26(3):635-40. PMID: 15703818.

25. Zhou Z.J., Dai Z., Zhou S.L. et al. Overexpression of hnRNP A1 promotes tumor

invasion through regulating CD44v6 and indicates poor prognosis for hepatocellular carcinoma. Int J Cancer 2013;132(5):1080-9. DOI: 10.1002/ijc.27742. PMID: 22821376.

26. Rooke N., Markovtsov V., Cagavi E. et al. Roles for SR proteins and hnRNP A1

in the regulation of c-src exon N1. Mol Cell Biol 2003;23(6):1874-84. PMID: 12612063.

27. Buvoli M., Cobianchi F., Bestagno M.G. et al. Alternative splicing in the human gene for the core protein A1 generates another hnRNP protein.

EMBO J 1990;9(4):1229-35. PMID: 1691095.

28. Liu Q., Dreyfuss G. In vivo and in vitro ar-ginine methylation of RNA-binding proteins. Mol Cell Biol 1995;15(5):2800-8. PMID: 7739561.

29. Rajpurohit R., Paik W.K., Kim S. Effect of enzymic methylation of heterogeneous ri-bonucleoprotein particle A1 on its nucleic-acid binding and controlled proteolysis. J Biochem 1994;304(Pt 3):903-9. PMID: 7818496.

30. Kim S., Merrill B.M., Rajpurohit R. et al. Identification of NG-methylarginine residues in human heterogeneous RNP protein A1: Phe/Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Gly-Gly/Phe is a preferred recognition motif. Biochemistry 1997;36(17):5185-92. DOI: 10.1021/bi9625509.

31. Ong S.E., Mittler G., Mann M. Identifying and quantifying in vivo methylation sites by heavy methyl SILAC. Nat Methods 2004;1(2):119-26.

PMID: 15782174.